【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年2月5日(2007.2.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自由生活微生物を含むワクチンであって、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、ワクチン。
【請求項２】
前記核酸標的化化合物が、核酸アルキル化剤である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記核酸アルキル化剤が、β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記核酸標的化化合物が照射によって活性化される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記核酸標的化化合物が、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記核酸標的化化合物が、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記微生物が、ＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記遺伝的突然変異が、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子内にあるか、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物内にある、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記微生物が、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢの双方における遺伝的突然変異か、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方の機能的等価物における遺伝的突然変異を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物に関して欠損がある、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記微生物が細菌である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記微生物が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記微生物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記微生物が、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方における少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記微生物が、さらに、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＢ遺伝子、または双方の遺伝子における突然変異を含む、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記ワクチンが、さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項２０】
宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項１に記載のワクチンを含む、組成物。
【請求項２１】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項１に記載のワクチンを含み、ここで前記微生物が該抗原を発現する、組成物。
【請求項２２】
自由生活微生物を含む単離されたプロフェッショナル抗原提示細胞であって、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、細胞。
【請求項２３】
樹状細胞である、請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項２４】
前記核酸標的化化合物が、核酸アルキル化剤である、請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項２５】
前記核酸アルキル化剤が、β−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、請求項２４に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項２６】
前記核酸標的化化合物が、照射によって活性化される、請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項２７】
前記核酸標的化化合物が、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である、請求項２６に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項２８】
前記核酸標的化化合物が、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである、請求項２７に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項２９】
前記微生物が、改変されているその核酸を修復する該微生物の能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３０】
前記微生物が、ＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある、請求項２９に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３１】
前記遺伝子突然変異が、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子内にあるか、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物内にある、請求項３０に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３２】
前記微生物が、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方における遺伝的突然変異か、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む、請求項３１に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３３】
前記微生物が、ＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物に関して欠損がある、請求項３１に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３４】
前記微生物が細菌である、請求項２３に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３５】
前記微生物が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである、請求項３４に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３６】
前記微生物が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項３４に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３７】
前記微生物が、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方における少なくとも１つの突然変異を含む、請求項３２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３８】
前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項３９】
請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、ワクチン。
【請求項４０】
宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、組成物。
【請求項４１】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、前記微生物が該抗原をコードする核酸配列を含む、組成物。
【請求項４２】
インビトロにおいてナイーブなＴ細胞を活性化する方法であって、該ナイーブなＴ細胞を活性化するのに適当な条件下で、かつそれに十分な時間の間、該ナイーブなＴ細胞と請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４３】
プロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷する方法であって、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下で、かつそれに十分な時間の間、インビトロにおいて該プロフェッショナル抗原提示細胞と該抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させる工程を包含し、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、方法。
【請求項４４】
プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化および／または成熟させる方法であって、
プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化させ、および／または成熟させるのに適当な条件下で、かつそれに十分な時間の間、インビトロにおいて該プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させる工程を包含し、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、方法。
【請求項４５】
宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、組成物。
【請求項４６】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、プロフェッショナル抗原提示細胞と該抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、組成物。
【請求項４７】
単離された突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であって、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体株。
【請求項４８】
少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある、請求項４７に記載の突然変異体株。
【請求項４９】
ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、またはＵｖｒＡおよびＵｖｒＢ双方に関して減弱されている、請求項４７に記載の突然変異体株。
【請求項５０】
ｕｖｒＡ遺伝子、ｕｖｒＢ遺伝子、またはｕｖｒＡ遺伝子およびｕｖｒＢ遺伝子双方における遺伝子突然変異体を含む、請求項４９に記載の突然変異体株。
【請求項５１】
前記株の細菌の核酸が、該細菌が増殖について減弱されるように改変されている、請求項４７に記載の突然変異体株。
【請求項５２】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって同定されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−株、またはＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、およびＡｃｔＡに関して欠損がある、該寄託された株の突然変異体よりなる群から選択される、請求項４７に記載の突然変異体株。
【請求項５３】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６２によって同定されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｉｎｌＢ−株である、請求項５２に記載の突然変異体株。
【請求項５４】
ワクチンであって、（ａ）請求項４７に記載の突然変異体株、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項５５】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、請求項４７に記載の株の有効量を含み、ここで、該株が該抗原をコードする核酸分子を含む、組成物。
【請求項５６】
宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、請求項４７に記載の株の有効量を含む、組成物。
【請求項５７】
請求項４７に記載の株を含む、プロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項５８】
単離された突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株であって、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体株。
【請求項５９】
少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある、請求項５８に記載の突然変異体株。
【請求項６０】
ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、またはＵｖｒＡおよびＵｖｒＢ双方に関して減弱されている、請求項５９に記載の突然変異体株。
【請求項６１】
ｕｖｒＡ遺伝子、ｕｖｒＢ遺伝子、またはｕｖｒＡ遺伝子およびｕｖｒＢ遺伝子双方における遺伝子突然変異を含む、請求項６０に記載の突然変異体株。
【請求項６２】
前記株の毒性を低下させるｌｅｆ遺伝子、ｃｙａ遺伝子、または双方の遺伝子における１以上の突然変異を含む、請求項５８に記載の突然変異体株。
【請求項６３】
前記株の細菌の核酸が、該細菌が増殖について減弱されるように改変されている、請求項５８に記載の突然変異体株。
【請求項６４】
宿主においてＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、請求項５８に記載の突然変異体株の有効量を含む、組成物。
【請求項６５】
宿主においてＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染を予防または処置するための組成物であって、請求項５８に記載の突然変異体株の有効量を含む、組成物。
【請求項６６】
ワクチンであって、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物を含む、ワクチン。
【請求項６７】
前記微生物が、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子内における遺伝子突然変異か、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物内における遺伝子突然変異を含む、請求項６６に記載のワクチン。
【請求項６８】
前記微生物が、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方における遺伝子突然変異か、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む、請求項６７に記載のワクチン。
【請求項６９】
ＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物に関して欠損がある、請求項６６に記載のワクチン。
【請求項７０】
前記微生物が細菌である、請求項６６に記載のワクチン。
【請求項７１】
前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項６６に記載のワクチン。
【請求項７２】
前記ワクチンが、さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む、請求項６６に記載のワクチン。
【請求項７３】
宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項６６に記載のワクチンを含む、組成物。
【請求項７４】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項６６に記載のワクチンを含み、ここで、該微生物が該抗原を発現する、組成物。
【請求項７５】
少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物を含む、単離されたプロフェッショナル抗原提示細胞。
【請求項７６】
前記微生物が、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子内においてか、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物内において遺伝子突然変異を含む、請求項７５に記載の抗原提示細胞。
【請求項７７】
前記微生物が、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方における遺伝子突然変異か、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む、請求項７６に記載の抗原提示細胞。
【請求項７８】
ＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物に関して欠損がある、請求項７５に記載の抗原提示細胞。
【請求項７９】
前記微生物が細菌である、請求項７５に記載の抗原提示細胞。
【請求項８０】
前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項７５に記載の抗原提示細胞。
【請求項８１】
宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項７５に記載の抗原提示細胞を含む、組成物。
【請求項８２】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項７５に記載の抗原提示細胞を含み、ここで、該微生物が該抗原を発現する、組成物。
【請求項８３】
医療用途のための自由生活微生物であって、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、微生物。
【請求項８４】
医療用途のための抗原提示細胞であって、該抗原提示細胞が、自由生活微生物を含み、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、抗原提示細胞。
【請求項８５】
医療用途のための突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であって、該突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株が、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体株。
【請求項８６】
医療用途のための自由生活微生物であって、該微生物が、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある、微生物。
【請求項８７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項８６に記載の微生物。
【請求項８８】
医療用途のための抗原提示細胞であって、該抗原提示細胞が、自由生活微生物を含み、ここで、該微生物が、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある、抗原提示細胞。
【請求項８９】
キットであって、以下：（ａ）請求項４７に記載の突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株、請求項５８に記載の突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株または自由生活微生物を含む組成物であって、ここで、該自由生活微生物の核酸が、核酸標的化化合物との反応によって改変されている、組成物；および（ｂ）宿主における疾患の予防または処置における該組成物の使用のための指示書、の両方を含む、キット。
【請求項９０】
宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項１に記載のワクチンの有効量の使用。
【請求項９１】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項１に記載のワクチンの有効量の使用。
【請求項９２】
宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞の有効量の使用。
【請求項９３】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項２２に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞の有効量の使用であって、ここで、微生物が該抗原をコードする核酸配列を含む、使用。
【請求項９４】
宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞の使用であって、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、使用。
【請求項９５】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞の使用であって、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている、使用。
【請求項９６】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項４７に記載の株の有効量の使用であって、ここで、該株は該抗原をコードする核酸配列を含む、使用。
【請求項９７】
宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項４７に記載の株の有効量の使用。
【請求項９８】
宿主においてＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項５８に記載の突然変異体株の有効量の使用。
【請求項９９】
宿主においてＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項５８に記載の突然変異体株の有効量の使用。
【請求項１００】
宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項６６に記載のワクチンの有効量の使用。
【請求項１０１】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項６６に記載のワクチンの有効量の使用であって、ここで、微生物が該抗原を発現する、使用。
【請求項１０２】
宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項７５に記載の抗原提示細胞の有効量の使用。
【請求項１０３】
宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項７５に記載の抗原提示細胞の有効量の使用であって、ここで、微生物が該抗原を発現する、使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】改変された自由生活微生物、ワクチン組成物、およびそれらの使用方法
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、その各々の内容を、ここに引用して本開示に一体化させる、２００３年２月６日に出願された米国仮出願第６０／４４６，０５１号、２００３年２月２１日に出願された米国仮出願第６０／４４９，１５３号、２００３年７月２４日に出願された米国仮出願第６０／４９０，０８９号、２００３年１０月１５日に出願された米国仮出願第６０／５１１，８６９号、２００４年２月２日に出願された「Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  Ｎｏｎ−Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」なる発明の名称の米国仮出願に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ワクチン組成物および免疫療法に関する。特に、本発明は、個体に特定の抗原を送達するのに用いることができる改変された自由生活微生物の集団を含むワクチン組成物に関する。そのような組成物において、ワクチンは、微生物それ自体、または微生物に取り込まれた異種抗原に対して向けられる。また、本発明は、樹状細胞のような抗原提示細胞の活性化および成熟を負荷し、誘導するための改変された微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
主に、ウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる感染症の予防を標的とする、臨床的使用のために種々のワクチンが開発されてきた。ワクチンは、生きた弱毒化された微生物、不活化された（死滅した）微生物、または微生物それ自体の成分から調製することができる。生きた弱毒化された微生物は、よりビルレントではない微生物に由来する、ビルレンス因子の欠失のような遺伝的改変を含む。不活化ワクチンでは、微生物は化学的にまたは物理的に不活化することができる。理想的には、そのようなワクチンは感染を引き起こすことはできないが、依然として、所望の免疫応答を刺激することができる。不活化されたワクチンの例はポリオおよびインフルエンザウイルス、およびコレラおよび破傷風に対する細菌ワクチンを含むが、生きた弱毒化ワクチンはポリオ、インフルエンザおよびコレラでは同様に任意である。所望の免疫応答を惹起するためには、不活化微生物は不活化に先立って適当な抗原を含むことが重要である。ある場合には、感染性微生物によるデ・ノボ遺伝子発現が最適な免疫応答を刺激するのに必要な故に、微生物の不活化は有意に低下した免疫応答をもたらすことが観察されている。これは、細胞内細菌で特に重要である。細菌を不活化するのに用いられてきた方法は、アセトン、アルコール、ホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはフェノール、加熱、または紫外線照射の使用を含む［Ｐａｃｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６（１６）：１５６３（１９９８）］。
【０００４】
微生物それ自体によって引き起こされる感染症を予防するための微生物ワクチンの使用に加えて、微生物は、ある種のタンパク質または抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。そのような組換え微生物は送達ビヒクルとして用いられ、異種抗原に対する免疫応答を誘導するためにワクチンとして用いることができる。これらの組換えワクチンは、動物モデルにおいて効果的であることが示されている。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉサーカムスポロザイト抗原を発現するように改変された生きた弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの経口ワクチンは、マウスをマラリアに対して保護することが示されている［Ａｇｇａｒｗａｌら、Ｊ  Ｅｘ  Ｍｅｄ  １７２（４）：１０８３（１９９０）］。同様に、米国特許第６，０５１，２３７号は、癌ワクチンとして用いられる、腫瘍−特異的抗原を増殖させ、拡大させ、発現するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの生きた組換え体形態を記載する。そのような組換えワクチンは効果的であり得るが、各微生物株はワクチンを供するためには遺伝子的に改変されなければならない。従って、微生物が組換え抗原を含むか否かに関わらず、いずれかの微生物に適用することができる安全かつ効果的な微生物ワクチンを生産する方法を開発することが望ましいであろう。樹状細胞（ＤＣ）ベースの免疫療法は、広い範囲の腫瘍タイプの処置のための臨床的利益を提供するために広く調べられ、証明されてきた。オートロガス樹状細胞（ＤＣ）を単離し、作り出し、引き続いて、患者へのワクチン接種に先立ってエキソビボにてそれに抗原またはペプチドを負荷するために、種々の戦略が現在開発されつつある。免疫メカニズムの理解における最近の進歩は、効果的な抗原負荷に加えて、癌免疫療法の効果に対するワクチン接種で用いられるＤＣの活性化および成熟状態の重要性を強調している。未成熟ＤＣは抗原の摂取および加工でより効果的であるが、活性化された／成熟ＤＣはその能力を失うが、ＭＨＣ分子の意味ではナイーブなＴリンパ球に対して抗原を提示するにおいて依然としてより優れている。事実、成熟したＤＣは、初代Ｔリンパ球応答を誘導し、末梢Ｔ細胞寛容を克服し、抗−腫瘍免疫性を増強させるのに優れた抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることが判明している。有望な臨床的データに導いたＤＣの活性化および成熟を負荷し、それを刺激するための種々の方法の開発にもかかわらず、ＤＣ活性化および成熟化を負荷する抗原と組み合わせるための標準的な効果的かつコスト的に有利な方法は依然としてない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は自由生活微生物を含み、ここで、該微生物の増殖は、十分な微生物の遺伝子発現を維持しつつ減弱され、ここで、該減弱は用量依存的に制御することができる。本発明は、自由生活微生物のこの減弱のための方法を含む。本発明は、これらの減弱化された微生物を含むワクチン組成物を含む。また、本発明は、特に、インビトロまたはエキソビボにおいて、樹状細胞のような、抗原提示細胞の活性化および成熟を負荷し、誘導するための、改変された微生物および減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａの新規な使用を提供する。得られた抗原提示細胞はワクチンおよび免疫療法で有用である。特別な具体例において、提供されたワクチンおよび免疫療法は癌に対して向けられる。
【０００６】
１つの態様において、本発明は自由生活微生物を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸（例えば、ゲノム核酸）は、微生物が増殖について減弱されるように改変される。いくつかの具体例においては、微生物の増殖の減弱は用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例においては、微生物における微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物（あるいは、核酸「標的化」化合物ともいう）との反応によって改変されている。１つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物（例えば、ここでは「Ｓ−５９」ともいう４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。いくつかの具体例においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を改変する微生物の能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例においては、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌である。いくつかの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの具体例において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含み、ここで、微生物が抗原を発現する、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０００７】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物（例えば、細菌）を含むワクチンを提供する。いくつかの具体例において、自由生活微生物は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例においては、微生物は、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方において（または微生物の属および種に応じて、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方の機能的等価物における）遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物はＲｅｃＡ（または微生物の属および種に応じてＲｅｃＡの機能的等価物）に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物は抗原（例えば、癌抗原、または微生物に対して外来性の感染症抗原）をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの具体例において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含み、ここで、微生物が抗原を発現する、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０００８】
もう１つの態様において、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のような単離された突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を提供する。いくつかの具体例においては、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−株である。他の具体例においては、該株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、およびＡｃｔＡに関して欠損がある。本発明は、さらに、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含むワクチンおよびプロフェッショナル抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防または処置するために改変されたＬｉｓｔｅｒｉａ株を用いる方法も提供される。
【０００９】
もう１つの態様において、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む単離された突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を提供する。いくつかの具体例においては、該突然変異体株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例においては、突然変異体株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株はＲｅｃＡに関して減弱されている。いくつかの具体例において、突然変異体株はｒｅｃＡ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は株の毒性を減少させるｌｅｆ遺伝子、ｃｙａ遺伝子、または双方の遺伝子における１以上の突然変異を含む。本発明は、さらに、該突然変異体株を含むワクチンおよびプロフェッショナル抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防または処置するための改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を用いる方法も提供される。
【００１０】
１つの具体例において、本発明はソラレン化合物およびＵＶＡ光と反応した細菌を含むワクチンを含み、ここで、細菌の増殖は減弱されている。１つの具体例において、細菌の発現は、ソラレン減弱化細菌が継続してタンパク質抗原を発現できるように、ソラレン改変後に十分に活性であり、ここで、細菌は個体に投与されると、抗原に対する免疫応答が誘導される。１つの具体例において、所望の免疫応答は細菌それ自体に対するものである。１つの具体例において、細菌は異種タンパク質抗原を発現する組換え株であり、ここで、細菌が個体に投与されると、異種抗原に対する免疫応答が誘導される。異種抗原を含むそのようなワクチンは、感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病を含めた種々の疾患を処置または予防するように設計することができる。
【００１１】
感染症の処置または予防には、疾患を引き起こす剤は、ワクチンとして用いられるために本発明の方法に従って調製することができる。１つの具体例において、ワクチンは、ウイルス、細菌または寄生虫のような疾患を引き起こす剤からの異種抗原を含む本発明の微生物から調製することができる。そのようなワクチンは、細菌ベクターを受領する健康の危険性が、感染剤による可能な感染に関連する危険よりも有意に少ない場合に利益のレベルを提供することができる。本発明の方法によって減弱される感染症の処置または予防のための異種ワクチンは同様に他の利点を有することができる。まず、感染剤それ自体から直接的に弱毒化生ワクチンまたは死菌ワクチンを調製することができる。第二に、もし生ワクチンが必要であれば、感染剤を弱毒化し、依然として適当な免疫応答を維持することができないであろう。
【００１２】
もう１つの可能性は、細菌ベクターに挿入された抗原が、細菌ベクターによって誘導された先天的免疫応答の不存在下で、個体における免疫応答を刺激しないことである。例えば、オートロガス細胞が不適切に増殖する疾患は、典型的には免疫応答を刺激しない抗原を含み得る。オートロガス抗原に対するそのような免疫応答を刺激する方法を見出すことによってそのような疾患と戦うのは有用であろう。１つの具体例において、増殖する細胞は、免疫応答が増殖する細胞に対して大いに特異的なように、正常な細胞に対するよりも高いレベルで抗原を発現し、または過剰発現する。そのようなワクチンで処置することができる疾患は、限定されるものではないが、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性細胞病を含む。もう１つの具体例において、ワクチンは、疾患の産物、または疾患となった細胞それ自体よりもむしろ疾患関連標的を標的化することができる。例えば、腫瘍は、腫瘍細胞を育てるのに必要な新しい血管の生成に必須であるワクチン標的化血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）で処置することができる。ＶＥＧＦは腫瘍細胞それ自体に対しては末梢であるが、腫瘍増殖の領域で支配的であり、腫瘍細胞の増殖を潜在的に制限し得る生きたワクチン標的である。もう１つの例は、アルツハイマー病またはクロイツフェルト−ヤコープ病に特徴的なアミロイドプラークを引き起こすタンパク質のような疾患関連タンパク質に対する応答を誘導する抗原を含むワクチンである。同様に、ワクチンは自己免疫またはアレルギー反応に関与する標的タンパク質であり得る。ワクチンは、自己免疫またはアレルギー反応を引き起こす、Ｂ−細胞またはＴ細胞のような、特異的抗体または細胞に対する応答を誘導することができるイディオタイプ抗原を含むことができる。
【００１３】
１つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が減弱されるように改変された自由生活微生物集団を含むワクチン組成物を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。１つの具体例において、微生物遺伝子発現は、抗原が、個体への微生物集団の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルで発現されるように、実質的に影響されない。１つの具体例において、微生物集団の増殖は、少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ減弱される。もう１つの具体例において、微生物集団の増殖は約０．３ないし＞１０ｌｏｇ、約２ないし＞１０ｌｏｇ、約４ないし＞１０ｌｏｇ、約６ないし＞１０ｌｏｇ、約０．３ないし８ｌｏｇ、約０．３ないし６ｌｏｇ、約０．３ないし５ｌｏｇ、約１ないし５ｌｏｇ、または約２ないし５ｌｏｇだけ減弱される。１つの具体例において、微生物集団による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物集団による該抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの具体例において、発現された抗原は、微生物それ自体からの抗原である。１つの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。１つの具体例において、抗原は疾患関連抗原である。１つの具体例において、抗原は、感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病よりなる群から選択される疾患に関連する。１つの具体例において、抗原は、腫瘍関連抗原である。１つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＥｐｈＡ２、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの具体例において、微生物核酸は、微生物の放射線への暴露、および微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と微生物との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい具体例においては、微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物集団とを反応させることによって改変される。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される態様によって核酸に標的化される。１つの具体例において、核酸標的化化合物は核酸アルキル化剤を含む。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。１つの具体例において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはＵＶＡ照射によって化合物の活性化に際して反応する。１つの具体例において、ＵＶＡ照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２―オキサ）ブチル−４，５’、���−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、核酸の改変を間接的に引き起こす。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、照射による、好ましくはＵＶＡ照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。１つの具体例において、微生物は遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱をもたらす。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される遺伝子、またはそれらの機能的同等遺伝子におけるものである。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される遺伝子、またはその機能的同等遺伝子の１を超えるにおけるものである。突然変異がｒｅｃＡ遺伝子である具体例において、単独であるか、あるいは１以上の他の突然変異と組み合わせられるかを問わず、ｒｅｃＡ突然変異は条件突然変異である。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の少なくとも１つの活性における減弱をもたらす。１つの具体例において、ＲｅｃＡの活性における減弱は条件的である。更なる具体例において、これらの突然変異を含む微生物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’８−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの具体例において、微生物は細菌である。１つの具体例において、細菌はマイコバクテリアである。１つの具体例において、マイコバクテリアはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。１つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。１つの具体例において、細胞内細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。１つの具体例において、細胞内細菌はＹｅｒｓｉｎｉａ
ｐｅｓｔｉｓである。好ましい具体例において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの摂取に有意に影響すること無く非−貪食細胞に侵入するＬｉｓｔｅｒｉａの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの具体例においてＬｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子である。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における遺伝子突然子を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、感染細胞のファゴリソソームを逃げ出すＬｉｓｔｅｒｉａの能力も減弱をもたらす突然変異を含む。１つの具体例においてＬｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合の減弱化をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは１を超える突然変異を含む。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方におけるもの、好ましくは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における欠失突然変異である。
【００１４】
１つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が減弱化されるように核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている微生物集団を含むワクチンを含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されておらず、およびここで、該集団の微生物は腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む。１つの具体例において、微生物遺伝子発現は、腫瘍抗原が、個体への微生物の投与に際して免疫応答を誘導するのに十分なレベルで発現されるように実質的に影響されない。１つの具体例において、微生物集団の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ減弱化される。もう１つの具体例において、微生物集団の増殖は約０．３ないし＞１０ｌｏｇ、約２ないし＞１０ｌｏｇ、約４ないし＞１０ｌｏｇ、約６ないし＞１０ｌｏｇ、約０．３ないし８ｌｏｇ、約０．３ないし６ｌｏｇ、約０．３ないし５ｌｏｇ、約１ないし５ｌｏｇ、または約２ないし５ｌｏｇだけ減弱化される。１つの具体例において、微生物集団による腫瘍抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物集団による腫瘍抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐｌ７、ｇｐ１００、ＥｐｈＡ２、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの具体例において、核酸標的化化合物はアルキル化剤を含む。１つの具体例において、アルキル化剤は、マスタード、マスタード中間体およびマスタード等価物よりなる群から選択される。１つの具体例において、核酸標的化化合物はインターカレーター、小溝バインダー、大溝バインダー、静電バインダー、および配列−特異的バインダーよりなる群から選択される核酸標的化群を含む。１つの具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。１つの具体例において、核酸標的化化合物は化合物の活性化に際して核酸と直接的に反応する。１つの具体例において、化合物の活性化は照射によるものである。１つの具体例において、照射はＵＶＡ照射である。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、該集団の微生物は遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱化をもたらす。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群���ら選択される遺伝子におけるものである。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の１以上におけるものである。突然変異がｒｅｃＡ遺伝子におけるものである具体例において、単独であるか、あるいは１以上の他の突然変異と組み合わされているかを問わず、ｒｅｃＡ突然変異は条件突然変異である。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の少なくとも１つの活性における減弱化をもたらす。１つの具体例において、ＲｅｃＡの活性における減弱化は条件的である。さらなる具体例において、これらの突然変異を含む微生物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌類よりなる群から選択される。１つの具体例において、微生物は細菌である。１つの具体例において、細菌は細胞内細菌である、好ましい具体例において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの接種に有意に影響すること無く非−貪食細胞に侵入するＬｉｓｔｅｒｉａの能力の減弱化をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すＬｉｓｔｅｒｉａの能力の減弱化をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合の減弱化をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは１を超える突然変異を含む。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方におけるものであり、好ましくは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における欠失突然変異である。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体は、さらに、ｕｖｒＡＢ遺伝子における欠失突然変異を含む。
【００１５】
１つの具体例において、本発明は、リステリア核酸が、リステリア集団の増殖が減弱化されるように、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ集団を含むワクチンを含み、ここで、リステリア遺伝子発現は実質的に影響されず、ここで、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、リステリア遺伝子発現は、腫瘍抗原が、個体へのＬｉｓｔｅｒｉａの投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルにて発現されるように実質的に影響されない。１つの具体例において、リステリア集団の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ減弱化される。もう１つの具体例において、リステリア集団の増殖は約０．３ないし＞１０ｌｏｇ、約２ないし＞１０ｌｏｇ、約４ないし＞１０ｌｏｇ、約６ないし＞１０ｌｏｇ、約０．３ないし８ｌｏｇ、約０．３ないし６ｌｏｇ、約０．３ないし５ｌｏｇ、約１ないし５ｌｏｇ、または約２ないし５ｌｏｇだけ減弱化される。１つの具体例において、リステリア集団による腫瘍抗原の発現は、リステリア核酸が改変されていないリステリア集団による腫瘍抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＥｐｈＡ２、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰおよびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、改変されている核酸を修復するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの能力の減弱化をもたらす。１つの具体例において、遺伝子突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの具体例において、遺伝子突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される遺伝子の１を超えるものにおけるものである。突然変異がｒｅｃＡ遺伝子におけるものである具体例において、単独であるか、あるいは１以上の他の突然変異と組み合わされたかを問わず、ｒｅｃＡ突然変異は条件突然変異である。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の少なくとも１つの活性における減弱化をもたらす。１つの具体例において、ＲｅｃＡの活性における減弱化は条件的である。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、貪食細胞によるＬｉ���ｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの接種に有意に影響すること無く非−貪食細胞に進入するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの能力の減弱化をもたらす。１つの具体例において、遺伝子突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すＬｉｓｔｅｒｉａの能力の減弱化をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、遺伝子突然変異はＬｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合の減弱化をもたらす。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは１を超える突然変異を含む。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方におけるものであり、好ましくは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方における欠失突然変異である。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ／ｎａｌＢ欠失突然変異体は、さらに、ｕｖｒＡＢ遺伝子における欠失突然変異を含む。
【００１６】
もう１つの態様において、本発明は自由生活微生物を含むプロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物の増殖の減弱化は、用量依存的に制御することができる。いくつかの具体例において、微生物における微生物遺伝子発現は微生物の増殖の減弱化によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体における抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物（例えば、本明細書中では「Ｓ−５９」とも言われる４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物は細菌である。いくつかの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は抗原提示細胞を含むワクチンも提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明が、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は該抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなＴ−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロフェッショナル抗原提示細胞とナイーブなＴ細胞とを接触させることを特徴とする、ナイーブなＴ細胞をエキソビボおよび／またはインビトロ（相互に排除しない）で活性化させる方法を提供する。
【００１７】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物（例えば、細菌）を含む単離されたプロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を提供する。いくつかの具体例において、微生物は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子、またはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。例えば、微生物は、（微生物の属および種に応じて）ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含むことができる。いくつかの具体例において、抗原提示細胞はＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、ここで、微生物が抗原を発現する、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法のように、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む宿主において疾患の予防または処置する方法も提供される。
【００１８】
もう１つの態様において、本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と、プロフェッショナル抗原提示細胞とを（インビトロまたはインビボ）にて接触させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている（例えば、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている）。
【００１９】
さらにもう１つの態様において、本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と、プロフェッショナル抗原提示細胞とを（インビトロまたはインビボ）にて接触させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化および／または成熟させる方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている（例えば、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている）。
【００２０】
なおもう１つの態様において、本発明は以下の工程（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されており；次いで、（ｂ）負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。いくつかの具体例において、微生物は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。
【００２１】
さらにもう１つの態様において、本発明は、抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現する改変された微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボと接触させることを含む、樹上細胞のような該細胞に抗原を負荷する方法を提供する。いくつかの具体例において、微生物の増殖は減弱化される。いくつかの具体例において、微生物は該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は減弱化される。抗原提示はＭＨＣクラスＩ提示またはＭＨＣクラスＩＩ提示であり得る。
【００２２】
もう１つの態様において、本発明は、樹状細胞を活性化し、および／または抗原提示細胞を成熟させるのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、改変された微生物と抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボで接触させることを含む、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を活性化および／または成熟化させる方法を提供する。１つの具体例において、微生物の増殖は減弱化される。もう１つの具体例において、微生物は該細胞の活性化および／または成熟化を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は減弱化される。
【００２３】
さらにもう１つの態様において、本発明は、抗原を提示する（樹状細胞のような）抗原提示細胞を含む有効量の免疫原生組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。１つの具体例において、微生物の増殖は減弱化されている。もう１つの具体例において、微生物は該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖が減弱される。１つの具体例において、免疫応答はＣＤ８＋Ｔ−細胞応答である。もう１つの具体例において、免疫応答はＣＤ４＋Ｔ−細胞応答である。
【００２４】
なおもう１つの態様において、本発明は以下の工程（ａ）抗原提示細胞に抗原を負荷し、および抗原提示細胞の活性化および／または成熟化を行うのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａと（樹状細胞のような）抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボで接触させ；次いで、（ｂ）有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。１つの具体例において、微生物の増殖は減弱化される。もう１つの具体例において、抗原提示細胞と接触される微生物は、抗原提示細胞への抗原の提示、および抗原提示細胞の活性化および／または成熟化の双方を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は減弱化される。１つの具体例において、免疫応答はＣＤ８＋Ｔ−細胞応答である。もう１つの具体例において、免疫応答はＣＤ４＋Ｔ−細胞応答である。
【００２５】
もう１つの具体例において、本発明は改変された微生物を含むエキソビボまたはインビトロプロフェッショナル抗原―提示細胞を提供し、ここで、微生物の増殖は減弱化される。もう１つの具体例において、改変された微生物は樹状細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、微生物の増殖は減弱化される。もう１つの具体例において、抗原提示細胞は樹状細胞である。
【００２６】
なおもう１つの態様において、本発明は（樹状細胞のような）抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。１つの具体例において、微生物はＬｉｓｔｅｒｉａである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖は減弱化されている。もう１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、該細胞への抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖は減弱化される。
【００２７】
なおさらなる態様において、本発明は（樹状細胞のような）抗原提示細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供し、ここで、抗原―提示細胞は改変されたＬｉｓｔｅｒｉａを含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖は減弱化されている。もう１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは該細胞による抗原提示を行うのに十分な遺伝子発現を維持するが、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖は減弱化される。
【００２８】
前記態様の各々のいくつかの具体例において、改変された微生物は改変されたＬｉｓｔｅｒｉａである。前記態様の各々のさらなる具体例においては、ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。なおさらなる具体例において、ＬｉｓｔｅｒｉａはｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、およびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子における突然変異を含む。例えば、前記態様のいずれかにおいて、Ｌｉｓｔｅｒｉａは所望によりｕｖｒＡＢにおける突然変異を含む。別の具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、所望により、ｕｖｒＡＢおよびａｃｔＡにおける双方の突然変異を含む。
【００２９】
前記態様の各々の他の具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの減弱化は架橋剤へのＬｉｓｔｅｒｉａの暴露によって行われたものである。前記態様の各々のいくつかの具体例において、架橋剤はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。前記態様の各々の他の具体例において、架橋剤はソラレン誘導体であって、ＬｉｓｔｅｒｉａはＵＶＡ光に暴露される。前記態様の各々のいくつかの具体例において、架橋剤は（ここでは「Ｓ−５９」ともいわれる）４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。
【００３０】
（発明の詳細な記載）
本発明は改変された自由生活微生物、およびワクチン組成物における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。また、本発明は、抗原負荷のための改変された微生物の使用およびインビトロまたはエキソビボでの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化／成熟化の誘導を含む。抗原は改変された微生物によって天然に生産される抗原であってもよく、あるいは組換え微生物によって発現された異種抗原であってもよい。得られた抗原提示細胞はワクチン組成物における使用、および免疫療法で適当である。得られたワクチン組成物の投与によって刺激された免疫応答はＣＤ４＋またはＣＤ８＋免疫応答であり得る。
【００３１】
１つのそのような改変された微生物はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。本発明者らは、Ｌｉｓｔｅｒｉａが、それが活力が無いように、ソラレン、紫外線Ａ（ＵＶＡ）光での照射の後に細菌のゲノム中で不可逆的架橋を形成する化合物の群によって不活化に対して特に感受性となるように作成した（後記実施例３参照）。モデル抗原の発現を維持しつつ、野生型および改変されたＬｉｓｔｅｒｉａの増殖の減弱化が今回示された（後記実施例１ないし２および１１参照）。また、改変されたＬｉｓｔｅｒｉａは抗−腫瘍応答を供し（後記実施例４および１４ないし１６）、抗原特異的Ｔ−細胞応答（実施例５）およびインビボ細胞傷害性応答（実施例２０）を誘導することも示される。ＬｉｓｔｅｒｉａはＤＣによって迅速に貪食され、ファゴリソソーム区画に輸送される。この遭遇の結果、ＤＣの表現型が成熟し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、およびＴＮＦ−αを含めた免疫刺激性サイトカインの広いプロフィールが引き続いて分泌される。本発明者らは、今回、組換えＬｉｓｔｅｒｉａでの未成熟ＤＣの感染の結果、コードされた異種抗原のＭＨＣクラスＩ−制限提示と共に、迅速なＤＣ活性化／成熟化がもたらされることを示した。加えて、ファゴリソソーム内でのＬｉｓｔｅｒｉａワクチンの劣化の結果、ＭＨＣクラスＩＩ経路を介してコードされた抗原が提示される（後記実施例参照）。
【００３２】
もう１つのそのような改変された微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。また、本発明者らは、ソラレンによる不活化に対して特に感受性であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの減弱化された株も作成した（後記実施例２１参照）。
【００３３】
加えて、本発明は、自由生活微生物を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物も増殖の減弱化は用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例において、微生物における微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱化によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの接種に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物（例えば、本明細書中では「Ｓ−５９」とも言う４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。いくつかの具体例においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例においては、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌である。いくつかの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの具体例において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。
【００３４】
また、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱化させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のような単離された突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ／ΔｕｖｒＡＢ株である。他の具体例において、該株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ／ΔｕｖｒＡＢ株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢおよび、ＡｃｔＡに関して欠損がある。本発明は、さらに、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含むワクチンおよびプロフェッショナル抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防し、または処置するための改変されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の使用方法も提供される。
【００３５】
本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む単離された突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子において遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異株はＲｅｃＡに関して減弱化されている。いくつかの具体例において、突然変異体株はｒｅｃＡ遺伝子において遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は、該株の毒性を減少させるｌｅｆ遺伝子、ｃｙａ遺伝子、または双方の遺伝子において１以上の突然変異を含む。本発明は、さらに、突然変異体株を含むワクチンおよびプロフェッショナル抗原提示細胞を提供する。また、免疫応答を誘導し、疾患を予防しまたは処置するための改変されたＢｕｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株の使用方法も提供される。
【００３６】
加えて、本発明は、自由生活微生物を含むプロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物の増殖の減弱化は、用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例において、微生物中での微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物は細菌である。いくつかの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなＴ−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロフェッショナル抗原提示細胞とナイーブなＴ細胞とを接触させることを含む、ナイーブなＴ細胞をエキソビボまたはインビトロにて活性化する方法を提供する。
【００３７】
本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることを含むプロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。
【００３８】
また、本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることを含む、プロフェッショナル自己−提示細胞を活性化しおよび／または成熟化する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。
【００３９】
本発明は、さらに、以下の工程（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され、次いで、（ｂ）負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。
【００４０】
本発明は、抗原提示細胞を負荷するのに適当な条件下にて、それに十分な時間の間、抗原を発現する改変された微生物と抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボで接触させることを含み、樹状細胞のような抗原提示細胞に抗原を負荷する方法も提供する。
【００４１】
本発明は、樹状細胞の活性化および／または成熟化を行い、および／または抗原提示細胞を成熟させるのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、改変された微生物と抗原―提示細胞とインビトロとエキソビボで接触させることを含む抗原提示細胞を活性化し、および／または成熟化する方法を提供する。
【００４２】
本発明は、抗原を提示する抗原提示細胞を含む有効量の免疫原性組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含む。
【００４３】
加えて、本発明は、以下の工程（ａ）抗原提示細胞に抗原を負荷し、および抗原提示細胞の活性化および／または成熟化を行うのに適した条件下で、かつそれに十分な時間の間、抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａと抗原提示細胞とをインビトロまたはエキソビボで接触させ；次いで、（ｂ）有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。１つの具体例において、微生物の増殖は減弱化される。
【００４４】
また、本発明は、改変された微生物を含むエキソビボまたはインビトロプロフェッショナル抗原提示細胞を提供し、ここで、微生物の増殖は減弱化される。
【００４５】
加えて、本発明は、抗原提示細胞を含むワクチンを提供し、ここで、抗原提示細胞は改変された微生物を含み、また、抗原提示細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供し、ここで、抗原提示細胞は、Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む。
【００４６】
（微生物ベースのワクチン）
本発明は、改変された自由生活微生物、および改変された自由生活微生物のワクチン組成物における使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。
【００４７】
死滅した微生物ワクチンは、しばしば、生きた弱毒化微生物ワクチンよりも劣ることが観察されている［Ｌａｕｖａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１７３５−１７３９（２００１）］。完全に死滅した微生物においては、デ・ノボ微生物遺伝子発現は実質的に排除される。従って、微生物遺伝子発現の十分なレベルを維持しつつ、増殖が減弱されるような、微生物核酸の適当なレベルへの改変は、死滅した微生物ワクチンよりも効果的であり得、ワクチンが微生物ベクターによって引き起こされる感染症の予防を標的化するか、あるいはベクターが異種抗原を送達するのに用いられるかを問わず、いずれかの微生物ベクターに適用することができるワクチン製剤に対するアプローチを提供する。用語微生物の使用は、それが本発明の全ての具体例に関連するので、自由生活微生物を意味することを意図し、ウイルスを含むことを意図しないことは理解されるべきであろう。そのような微生物ベースのワクチンは、特異的抗原を個体に送達するのに用いることができる。１つの具体例において、ワクチンは１を超える抗原を送達する。そのようなワクチンは１以上の抗原に対する免疫応答を刺激するように設計され、その結果、抗原または複数抗原に対して免疫化された個体がもたらされる。生じる免疫応答は抗体媒介応答、細胞媒介応答、またはその双方いずれかであり得る。用語ワクチンは予防ワクチン、すなわち、もし個体が引き続いて天然で抗原に暴露されるならば、予め形成された免疫応答が、剤または抗原を運ぶ細胞と戦う個体の能力を増加させるように、免疫応答を誘導するために与えられるものを含むことを意図する。用語ワクチンは、治療ワクチン、すなわち、ワクチン抗原に関連する疾患をすでに有する個体に与えられるものを含むことを意図し、ここで、ワクチンは免疫応答を誘導し、または個体の存在する抗原に対する免疫応答を増強して、剤または抗原を運ぶ細胞と戦う増大した能力を供することができる。これは、癌細胞のような疾患の細胞に対する免疫応答、ならびにプリオンのような疾患関連タンパク質に対する免疫応答を含む。１つの具体例において、自由生活微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの具体例において、自由生活微生物はグラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内細菌およびマイコバクテリアよりなる群から選択される細菌である。
【００４８】
本発明は、微生物の核酸の種々のレベルの改変を含む。微生物核酸の代謝はいくつかの方法で起こると理解される。微生物の複製は、微生物を複製するために全微生物ゲノムのＤＮＡをコピーし、引き続いて、ＤＮＡ分子を別々の細胞に分けることを含み、すなわち、細胞が分裂した結果、微生物ゲノムのＤＮＡの完全なコピーと共に有する細胞が得られる。微生物核酸代謝は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写、およびＲＮＡのタンパク質を生産するための翻訳の組合せを含む。微生物ゲノムの転写は、微生物ゲノムのＤＮＡの一部を、ＲＮＡ（メッセンジャーまたはトランスファーＲＮＡいずれか）へのコピーを含む。メッセンジャーＲＮＡの翻訳は、ＲＮＡを読んで、特異的なタンパク質またはタンパク質の一部を生産することを含む。本発明においては、微生物の集団の核酸は、微生物の性質およびその意図した使用に基づいて所望の程度まで改変される。いくつかの具体例においては、改変の所望の程度は、微生物のゲノムの複製が、タンパク質の生産が十分に活性なままである（すなわち、微生物が代謝的に活性である）ように有意に減弱化されるようなものである。改変の性質が何であれ、改変のレベルは、微生物ゲノムの塩基対当たりに平均した改変の数で表すことができることが理解されるべきである。例えば、もし改変が核酸への化合物の共有結合によるものであれば（アダクト）、改変はアダクトの間の塩基対の平均数で表すことができる。本発明の微生物は、１０４ないし１０８塩基対当たり約１つの改変、１０４ないし１０７当たり約１つの改変また１０５ないし１０７当たり約１つの改変、または１０５ないし１０６塩基対当たり約１つの改変のレベルまで改変することができる。１つの具体例において、個体遺伝子の転写および翻訳の十分な活性を維持して（すなわち、いくつかの代謝活性を維持して）、安全かつ効果的なワクチンを達成しつつ、集団が観察可能な増殖を示さないように、改変のレベルを微生物集団においてＤＮＡ複製をブロックするのに必要な最小量に調整する。
【００４９】
１つの態様において、本発明は自由生活微生物を含むワクチンを提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱されるように改変される。いくつかの具体例において微生物の増殖の減弱化は用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例において、微生物中での微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱化によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、個体へのワクチンの投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルで抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物（例えば、本明細書中では「Ｓ−５９」とも言う４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）である。いくつかの具体例においては、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌である。いくつかの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。いくつかの具体例において、ワクチンは、さらに、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントを含む。本発明は、さらに、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量のワクチンを宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物が抗原を発現する。
【００５０】
本発明は、さらに、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株または突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を含むワクチンを提供し、ここで、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株または突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株はその核酸を修復するその能力を減弱化させる遺伝子突然変異を含む。
【００５１】
（抗原提示細胞ワクチン）
本発明は自由生活微生物、抗原提示細胞に基づくワクチン組成物の調製における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱化されるように改変されるいくつかの具体例において、改変された微生物の微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。
【００５２】
本発明の１つの具体例において、ワクチンで用いられる抗原提示細胞はプロフェッショナル抗原提示細胞である。プロフェッショナル抗原提示細胞はマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞を含む。他のプロフェッショナル抗原提示細胞は単球、辺縁層クッパー細胞、小グリア細胞、ランゲルハンス細胞、指状突起樹状細胞、小胞樹状細胞、およびＴ細胞を含む。１つの具体例において、プロフェッショナル抗原提示細胞は樹状細胞である。もう１つの具体例において、プロフェッショナル抗原提示細胞はマクロファージまたは樹状細胞（ＤＣ）である。１つの具体例において、抗原提示細胞はヒト細胞である。
【００５３】
１つの具体例において、ＤＣのような未成熟抗原提示細胞は患者から単離され、抗原を発現する改変された微生物で感染される。次いで、得られた負荷された抗原提示細胞をオートロガスＡＰＣワクチンとして患者に戻して導入し、それにより、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋免疫応答いずれかを誘導する。
【００５４】
したがって、本発明の抗原提示細胞ワクチンを調製し、使用する方法の１つの例は以下の通りである：未成熟ＤＣを結腸癌患者から単離し、Ｓ−５９／ＵＶＡ―不活化され、活力の無い代謝的に活性な組換えＬｉｓｔｅｒｉａ−ＣＥＡワクチンで感染させる。ＬｉｓｔｅｒｉａでのＤＣ感染の結果、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路へのＣＥＡ腫瘍抗原の効果的な負荷がもたらされる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染はＤＣを刺激し、インビボにおける初代Ｔ細胞応答を誘導することができる優れたＡＰＣとなるためにＤＣで非常に重要な迅速な活性化および成熟化を受ける。成熟ＤＣはＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６のような共刺激性分子、ならびにＭＨＣ分子の発現をアップレギュレートする。Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチン−負荷ＤＣを洗浄し、オートロガスＤＣワクチンとして患者に戻して、ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞応答を刺激する。
【００５５】
特別な具体例は後にリストする具体的実施例で例示される。しかしながら、本明細書中に記載された一般的な方法および技術は広く種々の改変された微生物、抗原および疾患により広く適用することができる。当業者であれば、本明細書中に記載された教示に容易に適合させることができよう。
【００５６】
別の具体例においては、ＤＣのような未成熟抗原提示細胞を、抗原を発現する改変された微生物でインビトロで感染させる。次いで、得られた負荷された抗原提示細胞を用いてＴ−細胞集団をプライムし、次いで、これを患者に導入し、それにより、抗原に対するＣＤ４＋またはＣＤ８＋免疫応答いずれかを誘導する。
【００５７】
もう１つの態様において、本発明は自由生活微生物を含むプロフェッショナル抗原−提示細胞（例えば、樹状細胞）を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物の増殖の減弱化は用量依存的に制御可能である。いくつかの具体例において、微生物中の微生物遺伝子発現は、微生物の増殖の減弱化によって実質的に影響されない。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、ワクチンの個体への投与に際して個体において抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルにて抗原を発現する。いくつかの具体例において、核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。１つの具体例において、核酸標的化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルのようなアルキル化剤である。他の具体例において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である。いくつかの具体例において、ワクチン中の微生物は、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱化させる遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物は細菌である。いくつかの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。また、本発明は抗原提示細胞を含むワクチンを提供する。本発明は、さらに、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。また、本発明は、有効量の抗原提示細胞を宿主に投与することを含み、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物は抗原を発現する。本発明は、さらに、ナイーブなＴ−細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロフェッショナル抗原提示細胞とナイーブなＴ細胞とを接触させることを含む、エキソビボまたはインビトロでナイーブなＴ細胞を活性化する方法を提供する。
【００５８】
（微生物複製の減弱化）
本発明は、微生物の複製を減弱化するための微生物核酸の改変を含む。複製におけるこの減弱化を用いて、微生物の個体への投与に際して安全性のレベルを増加させることができる。微生物の増殖する能力は、正常な増殖を供する条件下で微生物の集団を培養することによって測定することができる。微生物の集団の正常な増殖は、微生物の核酸に対する改変を有しない微生物の増殖であると考えられる。微生物ゲノムの改変の結果、微生物が正常な増殖を受けないようなある程度の減弱化がもたらされるであろう。幾つかの微生物は、固化された増殖培地上でカウントすることができるコロニーを形成する。かくして、微生物の複製の減弱化は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数の低下として測定することができる。微生物コロニーのストック溶液は、コロニー形成単位の数が容易に測定できるまで（例えば、５０ないし５００ＣＦＵ）系列的に希釈される。典型的には、希釈は１０倍であり、１以上の希釈されたサンプルでカウントされたコロニーの数を用いて、サンプルのｌｏｇ力価を見積もる。例えば、希釈された微生物ストックのアリコットを増殖培地で平板培養し、得られたコロニーをカウントする。希釈のｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）を計算し、（力価として知られた）元のストックのｍＬ当たりのコロニー形成単位を希釈から計算する。ｌｏｇ数はｌｏｇ力価として知られている。例として、１×１０５希釈の０．２ｍＬアリコットを平板培養する２４コロニー形成単位は１．２×１０７力価、または７．０８ｌｏｇ力価ストックを与える。減弱化は、微生物核酸の改変後におけるそれに対する微生物核酸の改変に先立っての微生物力価の比較として測定することができる。改変後における微生物の力価に対する未改変微生物の力価の比率のｌｏｇは、ｌｏｇ減弱化を表す（または単に２つのｌｏｇ力価の差を表す）。例えば、もし未改変微生物力価が１，２×１０７と測定され、改変された微生物力価が４．３×１０２と測定されれば減弱化の得られたレベルは４．４５ｌｏｇである。この方法を用いて、病原体または非−病原体であるかを問わず、いずれかの微生物の減弱化を評価することができる。いくつかの微生物では、直接的に微生物の増殖を測定するよりはむしろ、感染された細胞を殺すその能力によって微生物を測定するプラークアッセイを用いることができる。例えば、ある細胞内細菌は、それが感染できる哺乳動物細胞の群上で増殖させることができる。適当なインキュベーション条件後に該群をプラーク（死滅した細胞を表す細胞層における明瞭な領域）につき観察することができる。前記計算は、プラーク形成単位の数が、微生物の核酸の改変によりプラーク形成単位数の減弱化を評価するためにコロニー形成単位につき置き換えられている場合に同様である。本発明の具体例では、減弱化の所望の量は、安全性の所望のレベルおよび微生物の意図した適用に依存して、実質的に増殖が観察されないレベルを含めた、２倍低下からかなり大きなレベルの減弱化までの範囲とすることができる。複製における２倍減弱化は、もし与えられた希釈につき、微生物の未改変集団にある（約０．３ｌｏｇ減弱化）ものとして核酸が改変される場合に、微生物の集団に半分のコロニー（���たはプラーク）があれば観察されるであろう。幾つかの具体例において、減弱化は少なくとも約０．３ｌｏｇ、約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約５ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇである。いくつかの具体例において、減弱化は約０．３ないし＞１０ｌｏｇ、約２ないし＞１０ｌｏｇ、約４ないし＞１０ｌｏｇ、約６ないし＞１０ｌｏｇ、約０．３ないし８ｌｏｇ、また約０．３ないし７ｌｏｇ、また約０．３ないし６ｌｏｇ、また約０．３ないし５ｌｏｇ、また約０．３ないし４ｌｏｇ、また約０．３ないし３ｌｏｇ、また約０．３ないし２ｌｏｇ、また約０．３ないし１ｌｏｇの範囲にある。いくつかの具体例においては、減弱化は約１ないし＞１０ｌｏｇ、１ないし８ｌｏｇ、１ないし６ｌｏｇ、また約２ないし６ｌｏｇ、また約２ないし５ｌｏｇ、また約３ないし５ｌｏｇの範囲にある。本発明の１つの具体例において、減弱化の結果、実質的に完全な不活化がもたらされる（例えば、コロニーまたはプラークが検出限界まで観察されない場合）、ここで、微生物遺伝子発現は十分に活性である。そのような微生物の集団は、微生物核酸を改変して、コロニーまたはプラークが検出の限界で観察されない最低濃度を見出すのに用いられる剤の濃度を滴定することによって達成することができる。
【００５９】
病原体微生物の場合には、微生物の生物学的効果の項目で減弱化を評価することも可能である。例えば、微生物の病原性は、マウスまたは他の脊椎動物においてメジアン致死率（ＬＤ５０）の測定によって評価することができる。ＬＤ５０は、脊椎動物の集団の半分の死亡がもたらされる脊椎動物に注入された微生物の量（例えば、ＣＦＵ）である。ＬＤ５０値は、減弱化の量の尺度として改変および未改変微生物につき比較することができる。例えば、もし未改変の微生物の集団が１０３微生物のＬＤ５０を有し、核酸が改変されている微生物の集団が１０５微生物のＬＤ５０を有すれば、微生物はそのＬＤ５０が１００倍増加する、または２ｌｏｇだけ増加するように減弱化されている。いくつかの具体例において、ＬＤ５０は２倍ないし１０００倍高い。いくつかの具体例において、すでに比較的高いＬＤ５０を有する減弱化株を用いる。そのような場合には、ＬＤ５０の改変された微生物での増加は、どのように多くの材料が危害を引き起こすこと無く注入できるかによって制限される。例えば、加熱死滅化生物のＬＤ５０は、単に、マウスへの生物学的材料の負荷および／または細菌壁成分への炎症性反応のため、約１ないし５×１０９よりもかなり高いであろう。また、減弱化の程度は、組織病理学の程度または血清肝臓酵素レベルのような他の生物学的効果によって定量的に測定することもできる。典型的には、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルブミンおよびビリルビンレベルは、本発明の微生物を注入したマウスにつき臨床実験室で測定される。マウスまたは他の脊椎動物におけるこれらの効果の比較は、微生物の減弱化を評価する方法として、未改変および改変微生物につきなされるであろう。組織に対する微生物の効果の測定に加えて、時間の関数としての、肝臓または脾臓のような感染組織から回収することができる生きた微生物の量もまた、未改変−対−改変微生物を注入したマウスにおいてこれらの値を比較することによって減弱化の尺度として用いることもできる。
【００６０】
（本発明の微生物によるタンパク質の発現）
微生物の増殖の減弱化に加えて、微生物の核酸の改変は、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないように制御される。実質的に影響されないためには、微生物遺伝子発現は、核酸の改変に際して完全に活性である必要はない。複製を減弱化するように核酸が改変される微生物の集団において、微生物遺伝子発現は、微生物による所望のタンパク質の適切なレベルの発現を供するのに十分に活性であることのみが必要である。適切なレベルの発現は、ある程度、微生物の意図した使用に依存する。例えば、もし微生物がワクチンとして使用されるべき特定の抗原を含むならば、適切な発現は、ワクチンに対する効果的な保護または治療免疫応答を供する発現の最小レベルとして決定されるであろう。微生物遺伝子発現は、そのようなワクチンが効果的な免疫応答を供するか否かを評価するためにインビトロおよびインビボの双方において評価することができる。一般に、核酸が改変されている微生物の集団は、特定の抗原に関して微生物の未改変集団と比較することができる。
【００６１】
１つの可能性は、微生物の集団と混合された抗原提示細胞による注目する抗原の提示を測定することである。微生物は適当な抗原提示細胞または細胞系、例えば、樹状細胞と混合することができ、抗原を認識するＴ細胞への樹状細胞による抗原の提示が測定されることができる。もし微生物が十分なレベルで抗原を発現しつつあるならば、それは、樹状細胞によってペプチド断片に加工され、各々、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの意味で、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。提示された抗原を検出する目的で、特定の抗原に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ細胞系を用いることができる。Ｔ細胞が癌細胞系との融合によって不滅化される場合には、Ｔ細胞はＴ細胞ハイブリドーマであってもよい。そのようなＴ細胞ハイブリドーマ、Ｔ細胞クローン、またはＴ細胞系はＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞いずれかを含むことができる。抗原提示細胞は、抗原がそれにより加工される経路に応じて、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞いずれかに提示することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩの意味で抗原を認識し、他方、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩＩの意味で抗原を認識する。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体による特異的認識を介して提示された抗原によって刺激され、その結果、ＩＬ−２またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のようなある種のタンパク質の生産がもたらされ、これは、（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて）定量的に測定することができる。別法として、ハイブリドーマは、提示された抗原によって、Ｔ細胞ハイブリドーマの刺激に際して活性化されるβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を含むように設計することができる。β−ガラクトシダーゼの生産の増加は、クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドのような基材上のその活性によって容易に測定することができ、その結果容易に色が変化させることができる。色の変化は、特異的抗原提示のインジケーターとして直接的に測定することができる（実施例１、２および１１）。本発明の微生物ワクチンの抗原発現を評価するためのさらなるインビトロおよびインビボ方法は実施例５に見出すことができる。また、本発明の微生物によって特定のタンパク質の発現を直接的に測定することも可能である。例えば、放射性標識アミノ酸を細胞集団に加えることができ、特定のタンパク質に取り込まれた放射能の量を決定することができる。細胞集団によって合成されたタンパク質は、例えば、ゲル電気泳動または毛細管電気泳動によって単離し、例えば、タンパク質に対して特異的な抗体との結合によって注目するタンパク質として同定することができ、放射能の量を定量的に測定して、特定のタンパク質の発現レベルを評価することができる。別法として、タンパク質は放射能無くして発現させ、ＥＬＩＳＡアッセイのような種々の方法によって、または酵素結合抗体または蛍光標識抗体を用いる検出でのゲル電気泳動およびウェスタンブロットによって検出することができる。
【００６２】
微生物核酸の改変は、未改変微生物と比較してタンパク質発現のレベルを低下させる可能性があるが、これは依然として効果的なワクチンを提供することができることを認識すべきである。本発明のいくつかの具体例で重要なのは、増殖の減弱と適切なタンパク質発現との組合せである。ワクチンの効率は、一般に、微生物によって送達することができる抗原の用量に関係しており、いくつかの場合には、微生物による活性遺伝子発現のあるレベルが重要である。微生物の複製の減弱は数ｌｏｇであり得るが、他方、微生物遺伝子発現は依然として十分に維持される。もし減弱化微生物の同一用量を未改変微生物のそれと比較すれば、減弱化微生物集団における（前記した方法によって評価された）得られた抗原発現は、未改変微生物集団における抗原発現の少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。複製において数ｌｏｇ減弱があり得るので、改変された微生物の用量は数ｌｏｇまでは安全に増加させることができ、その結果、ワクチン接種に際して未改変微生物に対する減弱化微生物によって提示された抗原と同等またはそれよりも大きな量がもたらされる。
【００６３】
いくつかの具体例において、タンパク質をコードする異種核酸配列は、タンパク質を発現する細菌宿主のコドン優先性にマッチするようコドンを最適化させることができる。加えて、発現されたタンパク質に融合されたシグナルペプチドをコードする配列も細菌宿主のコドン優先性にマッチするようコドンを最適化することもできる。好ましい具体例においては、細菌宿主はＬｉｓｔｅｒｉａであり、異種タンパク質をコードする配列およびシグナルペプチドをコードする配列いずれかまたはその双方をコドンを最適化することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける抗原およびシグナル配列のコドン最適化のさらなる情報については、ここに引用して援用する米国出願第６０／５３２，５９８号を参照のこと。
【００６４】
（微生物核酸改変）
微生物の集団の核酸は、種々の方法によって改変することができる。微生物の核酸は物理的手段、例えば、紫外線または電離放射線の放射によって改変することができる。Ｘ−線またはγ−線のような電離放射線を用いて、核酸中で一本鎖または二本鎖の破壊を引き起こすことができる、紫外線放射を用いて、核酸中にピリミジンダイマーを生じさせることができる。適切な量の放射線は、前記にて詳細に説明した複製およびタンパク質発現に対する放射線の効果を評価することによって決定される。
【００６５】
微生物の核酸は化学的手段によって、例えば、核酸標的化化合物との反応によって改変することもできる。１つの具体例において、微生物の増殖が減弱されるように、核酸を改変することができる核酸標的化化合物で微生物を処理し、ここで、微生物の集団は、依然として、所望のタンパク質抗原の免疫応答を誘導するのに十分な程度発現させることができる。核酸標的化化合物は、核酸を改変する特定のメカニズムに限定されない。そのような化合物は、核酸と直接的に反応させることによって（すなわち、化合物の全てまたはある割合が核酸に共有結合する）、あるいは（例えば、シングレット酸素または酸素ラジカルの発生を介して酸素ダメージを引き起こすことによってダメージを引き起こす化合物ラジカルを発生させることによってまたは核酸の還元または酸化の他のメカニズムによって）核酸の改変を間接的に引き起こすことによって、核酸を改変する。エンジインは、ＤＮＡ二本鎖の切断をもたらすラジカル種を形成する化合物のクラスの例である［Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８８１−５８８８（１９９３）］。核酸と直接的に反応する化合物は、化合物の活性化に際して、例えば、化合物の照射に際して反応することができる。間接的に反応して核酸の改変を引き起こす化合物は、化合物のいずれかの活性化された種を生じさせ、あるいはいくつかの他の活性な種を生じさせるために同様な活性化を必要とする。核酸標的化化合物の活性化のための手段に限定されないが、本発明の１つの具体例は、核酸と直接的に反応する、あるいは次いで核酸と反応する反応性酸素種（例えば、シングレット酸素）のような反応性種を生じさせる光活性化化合物の使用を含む。
【００６６】
核酸標的化化合物は、生物学的サンプルの他の構成要素を有意に改変すること無く核酸を優先的に改変する。そのような化合物は、細胞膜、タンパク質および脂質を有意に改変または損傷すること無く、核酸の適切な改変を提供する。そのような化合物は、これらの他の細胞構成要素を有意ではない程度まで改変することができる。もしそれらの生物学的機能が十分に維持されるならば、細胞膜、タンパク質および脂質のようなこれらの細胞構成要素は有意には改変されない。核酸標的化化合物で微生物を処理する場合、核酸の改変は、微生物の細胞膜、タンパク質および脂質は、微生物遺伝子発現が活性であり（例えば、これに必要な酵素は有意には影響されない）、微生物の表面は、化合物で処理されなかった微生物と同一の抗原性を本質的に維持するように、本質的には影響されずして、微生物の複製が減弱化されるようなものである。その結果、そのような化合物は、ワクチンとして有用である十分な抗原性または免疫原性を維持しつつ、微生物の増殖が十分に減弱されるので、ワクチンとして用いられる不活化微生物を調製するのに有用である。化合物は核酸を特異的に改変するので、タンパク質発現の十分なレベルを維持しつつ複製が減弱化されるように、改変を所望のレベルまで制御することができる。改変は、化合物濃度、反応媒体のような反応のパラメーターを変化させ、光量またはｐＨのような化合物活性化因子を制御し、あるいは（例えば、脱気することによって物理的に、または酸素スカベンジャーの使用によって化学的に）酸素濃度を制御することにより酸素損傷を引き起こす化合物を制御することによって制御することができる。核酸標的化化合物は、核酸に優先的に結合する傾向を有する、すなわち、核酸に対する測定可能な親和性を有するいずれかの化合物である。そのような化合物は、生物学的サンプルのほとんどの他の構成要素、特にタンパク質、酵素、脂質および膜のような成分に対するよりも核酸に対してより強い親和性を有する。核酸標的化は、遺伝子転写およびタンパク質翻訳についてのマシーナリーのような生物学的サンプルの他の構成要素に有意に影響すること無く、核酸の改変に対する特異性を提供する。
【００６７】
化合物は多数の態様で核酸に標的化することができる。以下の態様のいずれか、またはその組合せによって結合する化合物は、核酸標的化化合物と考えられる。インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合（例えば、リン酸骨格結合）、および（小または大溝における配列認識を介する）配列−特異的結合は、全て、核酸への結合の非−共有結合態様である。結合のこれらの態様の１以上を含む化合物は核酸に対して高い親和性を有するであろう。本発明は以下の化合物に限定されないが、核酸への結合のこれらの態様を有数化合物のいくつかの例は以下の通りである：インターカレーターは、アクリジン、アクリドン、プロフラビン、アクリフラビン、アクチノマイシン、アントラサイクリノン、ベータ−ロドマイシンＡ、ダウノマイシン、チアキサンテノン、ミラシルＤ，アントラマイシン、マイトマイシン、エキノマイシン、キノマイシン、トリオスチン、ジアクリジン、エリプティセン（ダイマー、トリマーおよびアナログを含む）、ノルフィリンＡ、フルオレンおよびフルオレノン、フルオレノジアミン、キナクリン、ベンズアクリジン、フェナジン、フェナントラジン、フェネチアジン、クロルプロマジン、フェノキサジン、ベンゾチアゾール、キサンテン、およびチオキサンテン、アントラキノン、アントラピラゾール、ベンゾチオピラノインドール、３，４−ベンズピレン、ベンゾピレンジオールエポキシド、１−ピレニルオキシラン、ベンズアントラセン−５，６−オキシド、ベンゾジピロン、ベンゾチアゾール、キノロン、クロロキノン、キニン、フェニルキノリンカルボキシアミド、フロクマリン（例えば、ソラレン、イソソラレンおよびその硫黄アナログ）、エチジウム塩、プロピジウム、コラリン、エリプティシンカチオンおよび誘導体、多環炭化水素およびそのオキシラン誘導体、およびエキニマイシンが例示され；小溝バインダーはジスタマイシン、マイトマイシン、ネトロプシン、他のレキシトロプロシン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８および他のＨｏｅｃｈｓｔ染料、ＤＡＰＩ（４，６’−ジアミジン−２−フェニルインドール）、ベレニル、およびトリアニールメタン染料が例示され；大溝バインダーはアフラトキシンが例示され；静電バインダーはスペルミン、スペリミジンおよび他のポリアミンが例示され；および配列−特異的バインダーは三重らせん形成、Ｄ−ループ形成、および一本鎖への直接的塩基対合のような配列−特異的相互作用によって結合する核酸またはアナログが例示される。他の配列−特異的結合化合物はポリピロール化合物、ポリピロールイミダゾール化合物、シクロプロピルピロロインドール化合物および関連する小溝結合化合物を含む［Ｗｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（３）：１６９−１７１（１９９８），Ｗｕｒｔｚら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７（３）：１５３−１６１（２０００），Ａｎｔｈｏｎｅｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １（１）：６７−８１（２００１）］。
【００６８】
核酸を標的化することに加え、化合物は、核酸と反応することもでき、その結果、核酸への共有結合がもたらされる。核酸アルキル化剤は核酸と共有結合により反応することができる化合物のクラスであり、限定されるものではないが、マスタード（例えば、モノまたはビスハロエチルアミン基、およびモノハロエチルスルフィド基）、マスタード同等物（例えば、エポキシド、アルファ−ハロケトン）およびマスタード中間体（例えば、アジリジン、アジリジンニウムおよびその硫黄アナログ）、メタンスルホネートエステル、およびニトロソ尿素を含む。核酸アルキル化剤は、典型的には、核酸上の求核性基と反応する。核酸と特異的に共有結合により反応する能力をそれに与え、本発明で用いられる微生物の核酸の所望の改変を供するのは、これらの化合物の核酸アルキル化活性および核酸標的化能力の組合せである。これらの化合物の特異性は微生物に入らないクエンチャーの使用によってさらに増強させることができる。そのようなクエンチャーは、依然として、核酸標的化化合物を微生物核酸と反応させつつ、微生物の表面との反応を鎮めるであろう。そのようなクエンティングの議論は、ここに引用してその開示を援用する米国特許第６，２７０，９５２号に見出すことができる。微生物核酸の改変は、化合物の濃度および反応の条件を調整することによって制御することができる。適当な濃度および反応条件は、前記にて詳細に記載した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。本発明で用いる化合物は約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１００ｐＭないし１ｍＭ、また約１ｎＭないし１０μＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約１ないし２００ｎＭまたは約１ないし１００ｎＭの濃度で効果的である。標的化された核酸、核酸、特に、微生物核酸との特異的反応についての核酸反応性化合物、の議論は、ここに引用してその開示を援用する米国特許第６，１４３，４９０号および第６，０９３，７２５号に見出すことができる。
【００６９】
核酸は、核酸改変を引き起こすのに放射線での活性化を必要とする核酸標的化化合物を用いることによって改変することができる。そのような化合物は前記したように核酸に標的化される。これらの化合物は、限定されるものではないが、アクリジン、アクリドン、アンスリル誘導体、アロキサジン（例えば、リボフラビン）、ベンゾトリアゾール誘導体、平面状芳香族ジアゾ誘導体、平面状芳香族シアノ誘導体、トルイジン、フラビン、フェノチアジン（例えば、メチレンブルー）、フロクマリン、アンゲリシン、ソラレン、ソラレンの硫黄アナログ、キノロン、キノリン、キノキサリン、ナフチリジン、フルオロキノロン、アントラキノン、およびアントラセンを含む。これらの化合物の多くはＤＮＡ光切断剤として用いられる［Ｄａ  Ｒｏｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ７：１７８１（２００１）］。本発明は核酸標的化化合物の活性化方法に限定されないが、典型的には、化合物は特定の波長の光で活性化することができる。光の効果的な波長は化合物の性質に依存し、ほぼ２００ないし１２００ｎｍのどこかの範囲とすることができる。これらの化合物のあるものでは、例えば、核酸の近傍に反応性酸素種を生じさせることによって、活性化は、核酸への化合物の直接的結合無くして、核酸の改変を引き起こす。化合物のあるものでは、活性化の結果、核酸への化合物の直接的結合がもたらされる（すなわち、化合物は共有結合する）。これらの化合物のあるものは核酸と反応して、ストランド間架橋を形成することができる。ソラレンは、核酸を架橋させる化合物のクラスの例である。これらの化合物は、典型的には、ＵＶＡ光（３２０ないし４００ｎｍ）で活性化される。本発明で用いられるソラレン化合物は、ここに引用してその開示を援用する米国特許第６，１３３，４６０号および第５，５９３，８２３号に例示されている。再度、核酸との特異的反応性を供するのは、核酸標的化、および活性化に際して核酸を改変する能力の組合せである。微生物核酸の改変は、化合物濃度、反応条件および光量を調整することによって制御することができる。適当な濃度および光量は、前記にて詳細に記載した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。化合物濃度および光暴露のレベルに加えて、反応は、サンプルをＵＶＡ光で照射する条件によって影響される。例えば、緩衝化媒体における微生物の集団を照射するための必要な全濃度は、増殖培地（例えば、ＢＨＩ、トリプターゼ・ソイ・ブロス）中で培養される集団から変化しつつある。光反応は増殖培地の内容物によって影響され得、これはソラレンと相互作用でき、それにより、ソラレンのより高い全濃度を必要とする。加えて、微生物の効果的な用量は、生物の成長層、および成長層の間における化合物の存在または不存在に依存するであろう。１つの具体例において、微生物の集団はソラレンＵＶＡ処理の間に増殖培地を含む。１つの具体例において、ソラレンを微生物の集団に加え、集団を培養して、ソラレンおよび増殖培地の存在下で微生物を増殖させ、微生物の成長層でのある地点でＵＶＡ処理を行う。１つの具体例において、適当な量のＵＶＡ光の照射に先立って、ソラ���ンの存在下で集団を０．５ないし１のＯＤ（１×１０７ないし１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）まで増殖させる。ソラレン化合物は約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１００ｐＭないし１ｍＭ、また約１ｎＭないし１０μＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約１ないし２００ｎＭまたは約１ないし１００ｎＭの濃度で効果的であり、ＵＶＡ光の量は約０．１ないし１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１ないし２０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５ないし１０Ｊ／ｃｍ２、０．５ないし６Ｊ／ｃｍ２または約２ないし６Ｊ／ｃｍ２の範囲である。１つの具体例において、微生物は約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１ないし５０００ｎＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約５ないし５００ｎＭ、または約１０ないし４００ｎＭのソラレン濃度にて増殖培地の存在下で処理される。１つの具体例において、増殖培地の存在下で処理された微生物は、約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１ないし５０００ｎＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約５ないし５００ｎＭ、また約１０ないし４００ｎＭの濃度のソラレンの存在下で０．５ないし１のＯＤまで増殖させる。０．５ないし１のＯＤまでの増殖に続き、微生物集団には約０．１ないし１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１ないし２０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５ないし１０Ｊ／ｃｍ２、０．５ないし６Ｊ／ｃｍ２、または約２ないし６Ｊ／ｃｍ２の範囲の量のＵＶＡ光を照射する。
【００７０】
（異種核酸配列を含む微生物）
微生物は、微生物によって発現され得る異種核酸配列を含む様に改変することができる。異種配列は少なくとも１つの特異的タンパク質抗原をコードことができる。微生物は、当業者に知られた方法によって改変することができる［ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００）］。微生物は、１以上の抗原をコードする１以上の配列を含むように改変することができる。特異的抗原をコードする異種核酸配列は、正確な核酸配列に限定されるものではなく、個体に投与されると、所望の免疫応答を誘導するであろう抗原の発現を供するのに十分な配列である。異種配列は、特定の疾患に関連する抗原として発現され得る。そのような抗原を発現する微生物はワクチンとしてもちいることができ、ここで、該ワクチンは予防的処置または治療的処置として用いることができる。そのようなワクチンによって処理することができる疾患は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌および他の過剰増殖性病を含む。
【００７１】
本発明の微生物は、特定の腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む様に改変することができる。Ｔ細胞によって認識される非常に多数の腫瘍特異的抗原が同定されている［Ｒｅｎｋｖｉｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｎｕｍｏｔｈｅｒ  ５０：３−１５（２００１）］。腫瘍抗原は分化抗原（例えば、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ｇｐ１００）、組織−特異的抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ）、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原（例えば、ＨＰＶ  １６Ｅ７）、癌−精巣抗原（例えば）、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、胚抗原（例えば、ＣＥＡ、アルファ−フェトプロテイン）、癌タンパク質抗原（例えば、Ｒａｓ、ｐ５３）、過剰に発現されたタンパク質抗原（例えば、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ）、ＭＵＣ１）、または突然変異したタンパク質抗原であり得る。異種核酸配列によってコードされ得る腫瘍抗原は、限定されるものではないが、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、ＢＣＬ−２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｒ−ａｂｌ  ｐ１９０、ｂｃｒ−ａｂｌ  ｐ２１０、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ９、ＣＴ１０、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｄｅｋ−ｃａｉｎ、ＤＡＭ−６（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＤＡＭ−１０（ＭＡＧＥ−Ｂ１）、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐｈＡ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＧｎＴ−Ｖ、ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＡＬ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、アポトーシスの阻害剤（例えば、サービビン）、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｄ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ＭＤＭ−２、メソセリン、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ネオーポリＡ  ポリメラーゼ、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ａ（ＣＡＧ−３）、ＰＡＧＥ−４、ＰＡＰ、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）、Ｐ１５、ｐ１９０、Ｐｍ１／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＡＳ、ＲＣＡＳ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＰ１７、ＳＰＡＳ−１、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＷＴ−１、および、別法として、翻訳されたＮＹ−ＥＳＯ−ＯＲＦ２およびＣＡＭＥＬタンパク質（ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＬＡＧＥ−１遺伝子由来）を含む。本発明の微生物は、未だ同定されていない抗原を含めた、腫瘍―特異的免疫応答を誘導することができるいずれかの腫瘍抗原を含む。微生物は、１を超える腫瘍抗原をコードする１を超える異種配列を含むように改変することができる。好ましい抗原はメソテリン［Ａｒｇａｎｉｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（１２）：３８６２−８（２００１）］、Ｓｐ１７［Ｌｉｍら、Ｂｌｏｏｄ．９７（５）：１５０８−１０（２００１）］、ｇｐ１００［Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６４５８（１９９４）］、ＰＡＧＥ−４［Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９（７）：１４４５−８（１９９９）］、ＴＡＲＰ［Ｗｏｌｆｇａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１７）：９４３７−４２（２０００）］、ＥｐｈＡ２［Ｔａｔｓｕｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（１５）：４４８１−９（２００３）］、ＰＲ３［Ｍｕｌｌｅｒ−Ｂｅｒａｔら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．７０（１）：５１−９（１９９４）］およびＳＰＡＳ−１［米国特許出願公開番号２００２０１５０５８８］を含む。
【００７２】
本発明の１つの具体例において、改変された微生物によって発現された異種タンパク質はＣＥＡである。ＣＥＡは、結腸直腸、胃および膵臓の９０％、非−小細胞肺癌の７０％、および乳癌の５０％を含めた、ヒト腫瘍のかなりの割合で過剰発現される１８０ｋＤＡ膜細胞内接着糖タンパク質である（Ｈａｍｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓｅｍｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，９：６７−８１）。抗−イディオタイプモノクローナル抗体ミミッキングＣＥＡ（Ｆｏｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８７：９８２−９０（１９９５）、またはＣＥＡを発現する組換えワクシニアウイルスを用いるワクチン接種（Ｔｓａｎｇら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，８７：９８２−９０（１９９５））のような種々の免疫療法が調べられてきたが、あいにくと、成功は限られている。それにもかかわらず、研究者らは、ワクチン接種した患者から生じたヒトＴ細胞系によって認識されるＨＬＡ＊０２０１−制限エピトープ、ＣＡＰ−１（ＣＥＡ６０５−６１３）を同定した。このエピトープでパルスしたＤＣを持つ患者のワクチン接種は、臨床的応答を誘導しなかった（Ｍｏｒｓｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５：１３３１−８（１９９９））。最近、ＣＥＡ６０５−６１３ペプチドアゴニストが、位置６１０における異常なアスパルテートからアスパラギンへの置換を持つものとして同定された（ＣＡＰ１−６Ｄ）。このアミノ酸置換はこのペプチドのＭＨＣ結合親和性を改変しなかったが、改変されたペプチドリガンド（ＡＰＬ）の使用の結果、インビトロにて、ＣＥＡ−特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成が改良された。ＣＡＰ１−６Ｄ−特異的ＣＴＬは、天然ＣＥＡを発現する腫瘍細胞を認識し、それを溶解するその能力を維持した（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：４５７０−７（１９９７）；Ｓａｌａｚａｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８５：８２９−３８（２０００））。Ｆｏｎｇらは、このＡＰＬと共にインキュベートされたＦｌｔ３−リガンド拡大ＤＣでワクチン接種された結腸癌を持つ患者におけるＣＥＡ−特異的免疫の誘導を示した。勇気付けられることには、１２人の患者のうち２人は、ワクチン接種の後、ペプチド−ＭＨＣテトラマー＋Ｔ細胞の誘導と相関する劇的な腫瘍退行を経験した（Ｆｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：８８０９−１４（２００１））。一緒に考えると、この研究は、結腸直腸癌に対するＣＥＡ−標的化免疫療法に対する有利な確認を提供する。
【００７３】
もう１つの具体例において、改変された微生物によって発現された異種抗原はプロテイナーゼ−３であるか、あるいはプロテイナーゼ−３に由来する。例えば、１つの具体例において、抗原はＨＬＡ−Ａ２．１−制限ペプチドＰＲ１を含む（ａａ１６９−１７７；ＶＬＱＥＬＮＶＴＶ（配列番号：５０））。プロテイナーゼ−３および／またはＰＲ１エピトープについての情報は以下の文献で公に入手可能である：米国特許第５，１８０，８１９号、Ｍｏｌｌｄｒｅｍら、Ｂｌｏｏｄ，９０：２５２９−２５３４（１９９７）；Ｍｏｌｌｄｒｅｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅａｓｅｒｃｈ，５９：２６７５−２６８１（１９９９）；Ｍｏｌｌｄｒｅｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：１０１８−１０２３（２０００）；およびＭｏｌｌｄｒｅｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：８６６８−８６７３（２００２）。
【００７４】
従って、いくつかの具体例においては、改変された微生物はメソテリン、ＳＰＡＳ−１、プロテイナーゼ−３、ＥｐｈＡ２、ＳＰ−１７、ｇｐ１００、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、Ｋ−ｒａｓ、またはＣＥＡのような抗原、あるいはそれらのタンパク質の１つの由来する抗原をコードする核酸分子を含む。いくつかの具体例においては、改変された微生物はメソテリン、ＳＰＡＳ−１、プロテイナーゼ−３、ＳＰ−１７、ｇｐ１００、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１またはＣＥＡのような抗原、またはそれらのタンパク質の１つに由来する抗原をコードする核酸分子を含む。いくつかの具体例において、改変された微生物はヒトメソテリン、あるいはヒトメソテリンに由来する抗原をコードする核酸分子を含む。他の具体例において、改変された微生物はヒトＥｐｈＡ２をコードする核酸分子を含むか、あるいはヒトＥｐｈＡ２に由来する。
【００７５】
本発明の微生物は、特異的感染症抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。１つの具体例において、抗原はヒトまたは動物病原体に由来する。該病原体は、所望により、ウイルス、細菌、真菌または原生動物である。例えば、抗原はウイルスまたは真菌または細菌抗原であり得る。
【００７６】
例えば、抗原は（ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇのようなｇａｇ抗原ならびにＨＩＶのｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびＬＴＲ領域に由来するタンパク質のような）ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはヒトまたは動物ヘルペスウイルスに由来することができる。１つの具体例において、抗原は（ｇＤ、ｇＢ、ｇＨ、ＩＣＰ２７のような即時型タンパク質のような）単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）タイプ１および２、（ｇＢおよびｇＨのような）サイトメガロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エプスタインーバールウイルスまたは（ｇｐＩ、ＩＩまたはＩＩＩのような）バリセラゾスタウイルスに由来する（例えば、Ｃｈｅｅら（１９９０）  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  （Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．１２５−１６９）；ＭｃＧｅｏｃｈら（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１−１５７４；米国特許第５，１７１，５６８号；Ｂａｅｒら（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：２０７−２１１；  およびＤａｖｉｓｏｎら（１９８６）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９−１８１６参照）。  
【００７７】
もう１つの具体例において、抗原はＢ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原）Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、またはＧ型肝炎ウイルスのような肝炎ウイルスに由来する。例えば、ＷＯ  ８９／０４６６９；  ＷＯ  ９６／１１０８９；  およびＷＯ  ９０／１４４３６参照。ＨＣＶゲノムはＥ１およびＥ２を含めたいくつかのウイルスタンパク質をコードする。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １４：３８１−３８８（１９９１）参照。
【００７８】
ウイルス抗原である抗原は、所望により、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ポリオウイルス、リノウイルス等）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ルベラウイルス、デングウイルス等）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ロタウイルス等）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ラビエスウイルス等）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ型等）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ  ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、流行性下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器系シンシチウムウイルス、パラインフルエンザウイルス等）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、限定されるものではないが、単離体ＨＩＶＩ１１ｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＴＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮからの抗原を含めた）ＨＴＬＶ−１；ＨＴＬＶ−１１；（ＨＴＬＶ−１１１、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲ等としても知られた）ＨＩＶ−１；ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１；ＨＩＶ−２、とりわけ；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；パピローマウイルス、ダニで生じる脳炎ウイルス等のいずれか１つからのウイルスに由来する。これらのおよび他のウイルスの記載については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｄｉｔｉｏｎ  （Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｄｉｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）参照。
【００７９】
いくつかの別の具体例において、抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢまたはその融合体）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、Ｐ．６９、ＰＴおよびＦＨＡ）のような細菌性病原体に由来し、あるいはプラスモジウムまたはトキソプラズマのような寄生虫に由来する。１つの具体例において、抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  （例えば、ＥＳＡＴ−６、８５Ａ、８５Ｂ、７２Ｆ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（例えば、ＰＡ）、またはＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（例えば、Ｆ１，Ｖ）に由来する。加えて、本発明で用いるのに適した抗原は、限定されるものではないが、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、破傷風（Ｔｅｔａｎｕｓ）、結核（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌または真菌肺炎（ＢａｃｔｅｒｉａｌまたはＦｕｎｇａｌ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、中耳炎（Ｏｔｉｔｉｓ  Ｍｅｄｉａ）、淋病（Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、コレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）、チフス（Ｔｙｐｈｏｉｄ）、髄膜炎（Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、単核細胞症（Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ）、ペスト（Ｐｌａｇｕｅ）、細菌性赤痢（Ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ）またはサルモネラ症（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、在郷軍人病（Ｌｅｇｉｏｎａｉｒｅ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、ライム病（Ｌｙｍｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、らい病（Ｌｅｐｒｏｓｙ）、マラリア（Ｍａｌａｒｉａ）、血線虫（Ｈｏｏｋｗｏｒｍ）、オンコセルカ症（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃｉａｓｉｓ）、充血住吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、トリパノソーマ症（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、リシュマニア症（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、アメーバ症（Ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、フィラリア症（Ｆｉｌａｒｉａｓｉｓ）、ボレリア症（Ｂｏｒｅｌｉａ）および旋毛虫症（Ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ）を含めた疾患の原因である公知の病原体から得ることができるか、またはそれに由来することができる。
【００８０】
本発明の微生物は、自己免疫疾患−特異的抗原をコードする異種核酸配列を含むように改変することができる。Ｔ細胞媒介自己免疫疾患においては、自己抗原に対するＴ細胞応答の結果、自己免疫疾患が起こる。本発明のワクチンで自己免疫疾患を処置するのに用いられる抗原のタイプは、自己免疫応答を担う特異的Ｔ細胞を標的とするであろう。例えば、抗原は自己免疫応答を引き起こすそれらのＴ細胞に特異的なＴ細胞受容体の一部、イディオタイプとすることができ、ここで、本発明のワクチンに取り込まれた抗原は、自己免疫応答を引き起こすそれらのＴ細胞に特異的な免疫応答を誘導するであろう。それらのＴ細胞を排除することは、自己免疫疾患の軽減に対する治療的メカニズムであろう。もう１つの可能性は、自己免疫疾患における自己抗原に対して生成する抗体を標的とする、または抗体を分泌する特異的Ｂ細胞クローンを標的とする免疫応答をもたらすであろう抗原を取り込むことである。例えば、そのようなＢ細胞に対する抗−イディオタイプ免疫応答および／または自己免疫疾患における自己抗原と反応する抗体をもたらす微生物にイディオタイプ抗原を取り込むことができる。本発明のワクチン微生物で処置可能な自己免疫疾患は、限定されるものではないが、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、ろう瘡、重症筋無力症、白斑、強皮症、乾癬、尋常性天疱瘡、線維菌痛、結腸炎および糖尿病を含む。アレルギー反応を処置するのに同様なアプローチを取ることができ、ここで、ワクチン微生物に取り込まれた抗原は、アレルギー反応を変調するのに効果的なＴ細胞、Ｂ細胞または抗体いずれかを標的とする。乾癬のようないくつかの自己免疫疾患において、疾患の結果、同様に標的とすることができる抗原の発現を伴う過剰増殖性細胞増殖がもたらされる。過剰増殖細胞に対する免疫応答をもたらすそのような抗原が考えられる。
【００８１】
疾患の機能不全細胞を標的とするよりはむしろ、本発明の微生物は、ユニークな疾患関連タンパク質の構造を標的とする抗原を含む。これの１つの例は、前記したイディオタイプ抗原を用いる抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞の標的化である。もう１つの可能性は、特定の疾患に由来するユニークなタンパク質構造を標的とすることである。これの例は、アルツハイマー病、クロイツェルフェルト−ヤコープ病（ＣＪＤ）およびウシ海綿状脳障害（ＢＳＥ）のような疾患で観察されるアミロイドプラークを引き起こすタンパク質に対する免疫応答を生じる抗原を取り込むことであろう。このアプローチはプラーク形成の減少を供するに過ぎないかもしれないが、ＣＪＤのような疾患の場合における治癒ワクチンを提供することが可能であろう。この疾患はプリオンタンパク質の感染性形態によって引き起こされる。ワクチンは、該ワクチンによって生じる免疫応答がＣＪＤを引き起こす感染性タンパク質を排除し、減少させまたは制御できるように、プリオンタンパク質の感染性形態に対する抗原を取り込む。
【００８２】
（突然変異を含む微生物）
１つの具体例において、本発明は微生物を含むワクチンを含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変されており、微生物集団は、依然として、免疫応答を誘導するのに十分な程度まで所望の抗原を発現することができ、かつ微生物は、さらに、少なくとも１つの遺伝子突然変異によって減弱される。微生物における突然変異は、微生物の種々の特徴に影響し得る。いくつかの場合において、突然変異は、ある種の細胞に侵入する微生物の能力に影響する。例えば、ある種の細胞内細菌は、細菌に存在する受容体に応じて種々の細胞型を侵入することができる。突然変異は、細菌がある細胞型によって取り込まれるが、他の細胞型によっては取り込まれないように、ある受容体の発現を改変することができる。これの例として、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、典型的には、貪食細胞によって取り込まれ、非−貪食細胞（例えば、肝臓細胞）に活動的に侵入する。非−貪食細胞の侵入が、貪食細胞による摂取が十分に活性でありつつ有意に低下または排除されるＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異を用いることができる。そのような突然変異は良好な免疫応答を提供することができる。というのは、ワクチンは貪食細胞によって優先的に取り込まれ、これは、免疫系に対して細菌抗原を提示するにおいて重要だからである。突然変異は、ある細胞型に侵入する微生物の能力の減弱をもたらすいずれの遺伝子に対するものでもあり得、これはＬｉｓｔｅｒｉａにおけるインターナリン遺伝子（例えば、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ）に対する突然変異が例示される。同様な遺伝子が他の細菌に存在でき（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＹｅｒｓｉｎｉａのインベーシン遺伝子）、これらの遺伝子における突然変異は本発明に含まれる。突然変異は、ビルレンス因子、または増殖および拡大を可能とする遺伝子のような微生物の他の特徴にインパクトを与え、それにより、微生物のビルレンスを低下させる。例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａのａｃｔＡ遺伝子における突然変異は宿主細胞アクチンの重合において欠損を引き起こし、これは、他の細胞まで拡大するＬｉｓｔｅｒｉａの能力を阻害する。Ｌｉｓｔｅｒｉａのｈｌｙ遺伝子における突然変異（リステリオリシン（ＬＬＯ）タンパク質）は、感染細胞のファゴリソソームから逃げるＬｉｓｔｅｒｉａの能力にインパクトを与える。ＬｉｓｔｅｒｉａのｐｌｃＡまたはｐｌｃＢ遺伝子いずれかにおける突然変異は、細胞間を拡大するＬｉｓｔｅｒｉａの能力にインパクトを与える。Ｙｅｒｓｉｎｉａのｙｏｐ遺伝子における突然変異は、マクロファージによる貪食を妨げるＹｅｒｓｉｎｉａの能力に影響する。もう１つの具体例において、遺伝子突然変異はある種の抗原、例えば、通常、微生物それ自体に対する免疫応答をもたらすであろう抗原の発現を減弱させる。もし微生物を、異種抗原を含むワクチンとして用いて、非−突然変異微生物と比較して、送達微生物に対して免疫応答が低下することを除き、異種抗原に対する強力な免疫応答を刺激すれば、そのような突然変異は有用であろう。１つの具体例において、微生物は、１を超える遺伝子における突然変異によって減弱される。１つの具体例において、突然変異の１つは、Ｌｉ���ｔｅｒｉａのインターナリン遺伝子、または他の細菌における同様な遺伝子におけるものである。１つの具体例において、突然変異は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのインターナリン遺伝子または他の細菌における同様な遺伝子の１以上におけるものである。１つの具体例において、突然変異の１つはａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、微生物は、ａｃｔＡ遺伝子および１以上のインターナリン遺伝子において突然変異を持つＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子における突然変異を含み、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、（別法として、本明細書中では、ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢまたはａｃｔＡ−ｉｎｌＢ−という）ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体を含む。本明細書中に記載されたものを含めた種々のＬｉｓｔｅｒｉａ遺伝子の配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ  ００３２１０に見出すことができる。
【００８３】
微生物は、その核酸に対する改変を修復する微生物の能力を有意に低下させる突然変異を含むであろう。そのような突然変異は、微生物のＤＮＡ修復メカニズムに関与する種々の遺伝子のいずれかにおけるものであろう。［Ａｒａｖｉｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７（５）：１２２３−１２４２（１９９９）］。その核酸に対する損傷を修復するその能力が欠ける微生物は、本発明の微生物の使用に対して付加されたレベルの安全性および有効性を提供する。適当な修復欠損突然変異体を用い、微生物は核酸改変に対してかなり感受性である。微生物の核酸を程度は低いが改変して、所望の量の増殖の減弱を確認することができる。これは、微生物核酸の発現が所望のタンパク質を生じさせるのに十分なように作動させる効率のより大きなウィンドウを提供する。デ・ノボ抗原発現が必要とされる場合、これは効果的な免疫応答を誘導するワクチンを提供する。また、それは、付加されたレベルの安全性を提供する。というのは、達成された増幅の減弱のレベルは、改変された核酸の修復によって損なわれないからである。もう１つの具体例において、遺伝子突然変異は、例えば、微生物の化合物に対する浸透性を改変することによって、または微生物核酸に接近し、それに結合する化合物の能力を改変することによって、核酸標的化化合物での処理に対する微生物の感受性を改変する。そのような突然変異は、微生物遺伝子発現を実質的に影響されずして、増殖を減弱させるプロセスの効率にインパクトを与えることもできる。
【００８４】
修復欠損突然変異体を用いる利点を説明すると、微生物増殖の減弱のメカニズムを考えることができる。微生物核酸はストランド破壊またはピリミジンダイマーによって、またはモノアダクトまたは架橋のような化学的改変によって改変される。もしこれらの改変の修復に対するメカニズムが無傷であれば、増殖の十分な減弱を達成するには、ある数の改変が必要であろう。核酸の改変が大きくなれば、タンパク質発現の低下は大きくなる。増殖を減弱するのに必要な改変のレベルはタンパク質発現を停止するのに必要なレベルよりもかなり低いが、タンパク質発現は依然としてある程度まで、恐らくは許容できないレベルまで低下するであろう。修復欠損突然変異体の使用は、より低い改変レベルが増殖の適切な減弱をもたらすように、増殖を減弱するのに必要なレベルを有意に低下させる。核酸改変はかなり低いので、タンパク質の発現はあまり影響されず、注目するタンパク質のより高いレベルの発現を供する。そのような修復欠損突然変異体は、ワクチンの安全性が核酸のわずかな改変によって増加させることができ、十分に高いレベルのタンパク質発現、特に、免疫応答が標的とする抗原を残す場合、微生物それ自体に対するワクチンのようなワクチンの製造で特に有用であろう。１つの具体例において、修復欠損突然変異体は、ピリミジンダイマーを修復するＰｈｒＢ（フォトリアーゼ）を作成する能力を欠く。例えば、突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ遺伝子、または機能的に同等な遺伝子におけるものであろう。そのような突然変異体は、微生物の紫外線照射（例えば、ＵＶＢ、ＵＶＣ）と組み合わせて用いて、微生物核酸においてピリミジンダイマーを生じさせ得る。１つの具体例において、修復欠損突然変異体は、ストランド間架橋を修復することができない。そのような突然変異体は、限定されるものではないが、微生物の属および種に応じて、ｕｖｒ遺伝子、すなわち、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣおよびｕｖｒＤ遺伝子、ならびにｒｅｃＡ遺伝子、または機能的に同等な遺伝子における突然変異を含む。突然変異は１以上のこれらの遺伝子におけるものであろう。これらの突然変異は対応する酵素ＵｖｒＡ（ＡＴＰアーゼ）、ＵｖｒＢ（ヘリカーゼ）、ＵｖｒＣ（ヌクレアーゼ）、ＵｖｒＤ（ヘリカーゼＩＩ）およびＲｅｃＡ（レコンビナーゼ）の活性の減弱をもたらす。これらの突然変異体は、ソラレンのような架橋化合物と組み合わせて用いられるであろう。微生物核酸はいくつかの位置においては架橋され、これらの架橋は修復できないので、微生物は複製することができない。というのは、核酸の元のストランドは分離できないからである。それらは修復できないので、非常に少数の架橋が必要であり、微生物核酸は、大部分は、転写に接近可能であり、タンパク質発現は有意には改変されない。好ましい具体例においては、ストランド間架橋を修復することができない修復欠損微生物突然変異体の集団は、集団中の実質的に各微生物が少なくとも１つの架橋を含み、従って、複製の減弱が実質的に完全であるように、適切に架橋され、ここで、集団の微生物遺伝子発現は十分に活性である。１つの具体例において、ｒｅｃＡ遺伝子における突然変異は条件突然変異である。そのような突然変異においては、ｒｅｃＡ遺伝子の突然変異の結果、適当なｐＨまたは微生物集団の温度のようなある条件（すなわち、非許容条件）下でのみｒｅｃＡの活性の減弱がもたらされる。条件ｒｅｃＡ突然変異を含む微生物は許容条件下で培養して、微生物の十分なレベルを増殖させ、次いで、処理に対する非許容条件下において播種し、核酸を改変し、次いで、核酸損傷が適切には修復されないような非許容条件下に貯蔵することができる。この例として、ｒｅｃＡ温度感受性突然変異体は３０℃において増殖され、そこでは、それは良好に増殖し、処理して、４２℃において核酸を改変し、この変異体は、ソラレン架橋のような処理に対して非常にそれが感受性であるように、ｒｅｃＡに対して非許容性である。処理された微生物を非許容性条件下で貯蔵することができるが、ワクチン接種に際して、条件はｒｅｃＡの発現を可能とし、いくつかの修復をもたらし、安全性の論点を提示するのが可能である。不活化および／または免疫化工程に先立ち、増殖が望ましい場合、株の増殖がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導できるように、ｒｅｃＡをｌａｃリプレッサーの制御下にある微生物を構築することが可能である。次いで、株からさらなるＩＰＴＧを控え、および／または株の環境からＩＰＴＧを排除することによって、ｒｅｃＡ発現の可能性を、不活化および／または免疫化工程のために排除することができる。
【００８５】
１つの具体例において、微生物は、修復メカニズムに関連しない少なくとも１つの突然変異と組合せて、その核酸に対する改変を修復する微生物の能力を有意に低下させる少なくとも１つの突然変異を含む。修復メカニズムに関連しない突然変異は、ある細胞に侵入する微生物の能力、増殖および拡大を可能とするビルレンス因子または遺伝子における突然変異、またはある抗原の発現を減弱させる突然変異のような微生物の種々の特徴に影響し得る。そのような突然変異は前記し、限定されるものではないが、インターナリン遺伝子（例えば、ｉｎｌＢ）、ＬｉｓｔｅｒｉａのａｃｔＡ遺伝子、ｈｌｙ遺伝子、ｐｌｃＡ遺伝子、またはｐｌｃＢ遺伝子、侵入遺伝子（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ）またはＹｅｒｓｉｎｉａのｙｏｐ遺伝子における突然変異を含む。１つの具体例において、微生物は、ａｃｔＡ遺伝子における突然変異を有するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはａｃｔＡ遺伝子およびインターナリン遺伝子における突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはａｃｔＡ突然変異およびｕｖｒＡＢ突然変異、好ましくは（ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢまたはａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−いずれかということができる）ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはａｃｔＡ突然変異、ｉｎｌＢ突然変異およびｕｖｒＡＢ突然変異、好ましくはａｃｔＡ／ｉｎｌＢ／ｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。いくつかの他の具体例において、微生物は欠失のようなｕｖｒＡＢ突然変異を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含む。
【００８６】
もう１つの具体例において、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のような単離された突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体リステリア株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ株である。他の具体例において、株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ株の突然変異体であり、ここで、寄託された株の突然変異体はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、およびＡｃｔＡに関して欠損がある。
【００８７】
いくつかの具体例において、本発明は、（野生型に対して）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある自由生活微生物を提供する。いくつかの具体例において、少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある微生物は、野生型に対してＤＮＡ修復について減弱される。いくつかの具体例において、ＤＮＡ修復についての微生物の能力は、野生型に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％だけ低下する。ＤＮＡ修復を行う微生物の能力を評価する方法は当業者によく知られている。いくつかの具体例において、微生物は以下の酵素：ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤ、およびＲｅｃＡの１以上に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物はＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、または双方の酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物はＲｅｃＡ、またはＲｅｃＡの機能的等価物に関して欠損がある。いくつかの具体例において、微生物は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡよりなる群から選択される１以上の遺伝子の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物はｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方、またはｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ双方の機能的等価物における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物はｒｅｃＡにおける遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、微生物は細菌である。例えば、いくつかの具体例においては、微生物はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。
【００８８】
また、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、単離された突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、ｕｖｒＡ遺伝子、ｕｖｒＢ遺伝子、または双方の遺伝子が欠失される。いくつかの具体例において、突然変異体株はＲｅｃＡに関して減弱される。いくつかの具体例において、突然変異体株はｒｅｃＡ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＰＴＡ−５５６３によって確認されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−株、またはＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、およびＡｃｔＡに関して欠損がある寄託された株の突然変異体である。
【００８９】
また、本発明は、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含む、単離された突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を提供する。いくつかの具体例において、突然変異体株は（ＵｖｒＡおよび／またはＵｖｒＢのような）少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、突然変異体株はｕｖｒＡ遺伝子および／またはｕｖｒＢ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、ｕｖｒＡ遺伝子（配列番号：１８）、ｕｖｒＢ遺伝子（配列番号：１９）、または双方の遺伝子が欠失される。いくつかの具体例において、突然変異体株はＲｅｃＡに関して減弱される。いくつかの具体例において、突然変異体株はｒｅｃＡ遺伝子における遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、突然変異体株は、ｒｅｃＡタンパク質の発現を温度感受性とするｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含む。いくつかの別の具体例において、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの突然変異体株が構築され、それは（ＩＰＴＧによって誘導可能な）ｌａｃリプレッサーの制御下にあり、増殖の間にｒｅｃＡの発現を許容するが、（Ｓ−５９／ＵＶＡを用いて）不活化および／またはポスト免疫化の間にはそうではない。いくつかの具体例において、突然変異体株は、株の毒性を低下させるｌｅｆ遺伝子、ｃｙａ遺伝子、または双方の遺伝子における１以上の突然変異を含む。
【００９０】
本発明のいずれの微生物に関しても、ソラレンでの修復欠損（例えば、ｕｖｒ欠損）細菌のＤＮＡの修復は、化合物の濃度、反応条件および光の量を調整することによって制御することができる。適切な濃度、反応条件および光の量は前記にて詳細に説明した複製およびタンパク質発現に対するその効果を評価することによって決定される。修復欠損突然変異体の使用は、濃度、反応条件および光の量のパラメーターが、微生物の適当な集団を供するための広い範囲の条件にわたって調節することができるように、適切なタンパク質発現を維持しつつ増殖のさらなるレベルの制御を供する。例えば、増殖を、タンパク質発現に有意に影響することなく完全に阻害することができる核酸改変密度のより広い範囲があろう。修復欠損株を完全に阻害するのに必要な改変の最終レベルは、非−修復欠損株についてよりもかなり低い（実施例３、７、１１および２１参照）。その結果、改変レベルは（完全な不活化を確認する）増殖を停止するのに必要な最小レベルよりもより高くできるが、依然として、タンパク質発現に有害なレベル未満である。かくして、本発明は非−修復欠損株で効果的であるが、ｕｖｒ欠損株は、ワクチンとして効果的であろう微生物の望ましい集団を調製するにおいてより大きな柔軟性を提供する。プソアレン化合物は約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１００ｐＭないし１ｍＭ、また約１ｎＭないし１０μＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約１ないし２００ｎＭ、または約１ないし１００ｎＭの濃度において効果的であり、ＵＶＡ光の量は約０．１ないし１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１ないし２０Ｊ／ｃｍ２、また約０．５ないし１０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５ないし６Ｊ／ｃｍ２、または約２ないし６Ｊ／ｃｍ２の範囲である。１つの具体例において、微生物は約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１ないし５０００ｎＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約５ないし５００ｎＭ、または約１０ないし４００ｎＭのソラレン濃度において増殖培地の存在下で処理される。１つの具体例において、増殖培地の存在下で処理された微生物は、約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１ないし５０００ｎＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約５ないし５００ｎＭ、また約１０ないし４００ｎＭの濃度のソラレンの存在下で０．５ないし１のＯＤまで増殖される。０．５ないし１のＯＤまでの増殖に続き、微生物集団に約０．１ないし１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１ないし２０Ｊ／ｃｍ２、また約０．５ないし１０Ｊ／ｃｍ２、０．５ないし６Ｊ／ｃｍ２または約２ないし６Ｊ／ｃｍ２の範囲の量のＵＶＡ光を照射する。
【００９１】
いずれかの微生物、特に、ｕｖｒ欠損突然変異体細菌においてソラレン架橋を一次的に生成させるためには、まずソラレンおよびＵＶＡ光を与えてアダクトを形成させ、これに続き、第二の量のＵＶＡ光単独を与えて、モノアダクトのいくらかまたはほとんどを変換して架橋させることができる。ソラレンの光化学は、適当なエネルギーのフォトンの吸収がまずモノアダクトを形成することである。フラン側モノアダクトが適切にＤＮＡ二重らせん中に適切に位置すると、さらなるフォトンの吸収はこのモノアダクトを架橋に変換するであろう［Ｔｅｓｓｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：１６６９−１６７６（１９８５）］。サンプルに所望の濃度のソラレンにてより低いＵＶＡ量を与えることができ、未反応ソラレンは、例えば、細菌の洗浄、透析または限外濾過によって除去することができる。ソラレンアダクト（モノアダクトおよび架橋）を含む細菌は、ＵＶＡ光をさらに与えて、細菌に対して有意なさらなるアダクトをもたらさずして、モノアダクトのいくらかまたはほとんどを架橋に変換することができる。これは、最初の光量での低い数のソラレンアダクトの制御された付加を可能とし、次いで、実質的な数のいずれかのモノアダクトを第二の量にて架橋に変換する。これは十分に低いレベルでの微生物ゲノムの改変を可能とし、そこでは、形成されたアダクトの大部分は架橋である。これは、ｕｖｒ欠損突然変異体で複製をブロックするのに特に効果的である。そのような具体例において、ソラレン化合物は約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１００ｐＭないし１ｍＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約１ないし２００ｎＭ、または約１ないし１００ｎＭの濃度において効果的であり、ＵＶＡ光の量は約０．１ないし１０Ｊ／ｃｍ２、また約０．１ないし２Ｊ／ｃｍ２、また約０．５ないし２Ｊ／ｃｍ２の範囲である。細菌の洗浄、透析または限外濾過による未処理ソラレンのほとんどの除去に続き、細菌には０．１ないし１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１ないし２０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５ないし１０Ｊ／ｃｍ２、または約２ないし６Ｊ／ｃｍ２の範囲のＵＶＡ光を与えることができる。
【００９２】
（ワクチン組成物およびインビボでの効力）
本発明のワクチン組成物は、微生物核酸が改変されている微生物を含み、および／または抗原−負荷されており、および／または微生物の増殖が減弱されるように微生物核酸が改変された微生物での感染によって活性化された／成熟化された抗原提示細胞を含み、ここで、前記したように、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。本発明のワクチン組成物を用いて、個体において免疫応答を刺激することができる。処方は、種々の投与経路によって個体に投与することができる。そのようなワクチン組成物の投与方法は当該分野で知られており、経口、鼻孔、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下投与経路を含む。ワクチン組成物は、さらに、アジュバントまたはＴ細胞共刺激分子のようなワクチンに対する免疫応答を改良することが当該分野で知られたさらなる成分を含むことができる。また、本発明は、本発明の医薬組成物を含む医薬を含む。そのようなワクチンで処置すべき個体はいずれかの脊椎動物、好ましくは家畜動物、スポーツ用動物を含めた哺乳動物、およびヒトを含めた霊長類である。ワクチンは予防剤として投与することができ、そこでは、個体をワクチン接種して、特定の疾患に対して個体を免疫化する。ワクチンは、いくらかの状況では、癌ワクチンと一緒のようにいずれかの個体に与えることができるが、処置された個体は、癌を発生する高い危険性がある個体に限定される。また、ワクチンは治療剤として投与することができ、そこでは、特定の疾患を有する個体をワクチン接種して、疾患、または疾患関連タンパク質に対する免疫応答を改良する。この具体例において、ワクチンは、疾患に関連する物理的症状の軽減をもたらすことができる。例えば、癌ワクチンでは、ワクチン接種の結果、腫瘍の増殖が停止され、好ましくは平均腫瘍容量が減少され、より好ましくはいずれかの腫瘍が排除される。１つの具体例において、平均腫瘍容量は少なくとも約５％、また約１０％、また約２５％、また約５０％、また約７５％、また約９０％または約１００％だけ減少する。同様に、ワクチン接種の結果、腫瘍の転移が停止され、好ましくは腫瘍転移の数の低下がもたらされる。癌ワクチンのさらなる効果は、個体メジアンの生存の延長であろう。ヒトにおいては、メジアン生存は少なくとも約３ヶ月、また少なくとも約６ヶ月、または少なくとも約１２ヶ月だけ延長される。
【００９３】
ワクチン処方は当該分野で知られており、保存剤、安定化剤、アジュバント、抗生物質および他の物質のような多数の添加剤を含む。チメロサールまたは２−フェノキシエタノールのような保存剤を添加して、特に、多重使用または用量を意図したワクチンバイアルで起こり得る不意の汚染に由来する細菌または真菌の増殖を遅らせ、または停止させる。ラクトースまたはグルタミン酸モノナトリウム（ＭＳＧ）のような安定化剤は、温度変動または凍結乾燥プロセスのような種々の条件に対してワクチン処方を安定化させるのに添加される。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのようなアジュバントは、ワクチンの能力を増加させて、免疫応答をトリガーし、増強しまたは延長するのに添加される。サイトカイン、ケモカイン、ＣｐＧのような細菌核酸配列のようなさらなる物質も潜在的ワクチンアジュバントである。ネオマイシンおよびストレプトマイシンのような抗生物質は、微生物の潜在的に有害な増殖を妨げるために添加される。また、ワクチンは滅菌された水または生理食塩水のような懸濁流体を含むことができる。また、ワクチンは細胞または細菌タンパク質、（卵中で生産されるワクチンからの）卵タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはトキソイド化プロセスからのホルムアルデヒドのような、製造プロセスからの少量の残存物質も含むことができる。
【００９４】
ワクチンの効率は個体、例えば、マウスで見積もることができる。マウスモデルは、人における効率のためのモデルとして認識されており、本発明のワクチンを評価し、規定するのに有用である。マウスモデルを用いて、いずれかの個体におけるワクチンの有効性に対する潜在能力を示す。特定の疾患に対する予防的または治療的効果いずれかを供するその能力につきワクチンを評価することができる。例えば、感染症の場合には、マウスの集団を所望の量の本発明の適切なワクチンでワクチン接種することができ、ここで、微生物は感染症関連抗原を発現する。この抗原は送達微生物それ自体からのものであり得、あるいは異種抗原であり得る。マウスは、引き続いて、ワクチン抗原に関連する感染剤で感染させることができ、感染に対する保護につき評価することができる。感染症の進行は、（ビヒクルのみ、または適当な抗原を含まない微生物でワクチン接種した、または接種していない）コントロール集団に対して観察することができる。
【００９５】
癌ワクチンの場合には、腫瘍細胞モデルを利用でき、そこでは、所望の腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞系を、所望の腫瘍抗原を含む本発明の微生物でのワクチン接種の前（治療モデル）または後（予防モデル）いずれかのマウスの集団に注入することができる。腫瘍抗原を含む微生物でのワクチン接種は、ワクチン接種されていない、ビヒクルをワクチン接種された、または無関係な抗原を発現する微生物を接種されたコントロール集団と比較することができる。加えて、本発明のワクチンの相対的有効性は、微生物核酸が改変されていない微生物の集団と比較することができる。そのようなモデルにおけるワクチンの有効性は、腫瘍注入後の時間の関数としての腫瘍容量の項目にて、あるいは腫瘍注入後の時間の関数としての生存集団の項目にて見積もることができる（例えば、実施例４）。１つの具体例において、核酸改変微生物でワクチン接種したマウスにおける腫瘍容量は、ワクチン接種していないか、またはビヒクル、または無関係な抗原を発現する微生物をワクチン接種したマウスにおける腫瘍容量よりも約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％または約１００％少ない。もう１つの具体例において、腫瘍容量におけるこの差は、マウスへの腫瘍の移植から少なくとも約１０日、約１７日、約２４日後に観察される。１つの具体例において、核酸改変微生物でワクチン接種したマウスにおけるメジアン生存時間は、ワクチン接種されていない、またはビヒクル、または無関係な抗原を発現する微生物でワクチン接種されたマウスにおけるよりも少なくとも約２日、約５日、約７日、または少なくとも約１０日長い。本発明のワクチンに対する効果的な免疫応答に加えて、改変された微生物は、より高い用量の微生物が対応する未改変微生物に対して投与できるように、付加されたレベルの安全性を提供する。本発明の１つの具体例において、核酸改変微生物でのワクチン接種は、対応する未改変微生物の用量と同一である微生物の用量でなされる。もう１つの具体例において、核酸改変微生物のワクチン接種は、対応する未改変微生物のワクチン接種用量よりも少なくとも約２倍、約５倍、約１０倍、約１０２倍、約１０３倍、または少なくとも約１０４倍高く、ここで、前記した得られた腫瘍容量およびメジアン生存時間は核酸改変微生物で観察される。
【００９６】
（使用方法）
本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる種々の方法が本発明によって提供される。例えば、免疫応答を誘導し、および／または疾患を処置しまたは予防するための、本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる方法が提供される。ワクチンおよび他の組成物を調製するための、改変された微生物および／または突然変異体株の使用方法も提供される。
【００９７】
例えば、１つの態様において、本発明は、抗原を発現する自由生活微生物を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物を含む組成物はワクチンである。いくつかの具体例において、微生物を含む組成物はプロフェッショナル抗原提示細胞である。抗原は前記した微生物に対して異種またはオートロガスであり得る。いくつかの具体例において、微生物の核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。
【００９８】
また、本発明は、抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの突然変異体を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。抗原はリステリアまたは非−リステリア抗原であり得る。いくつかの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている（例えば、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理による）。
【００９９】
また、本発明は、抗原を発現するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含み、抗原に対する宿主における免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Ｂａｃｉｌｌｕｓの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている（例えば、Ｓ−５９／ＵＶＡ処置による）。
【０１００】
また、本発明は、自由生活微生物を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている。いくつかの具体例において、微生物を含む組成物はワクチンである。いくつかの具体例において、微生物を含む組成物はプロフェッショナル抗原提示細胞である。
また、本発明は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている（例えば、Ｓ−５９／ＵＶＡ処置による）。いくつかの具体例において、疾患は感染症である。他の具体例において、疾患は癌である。
また、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Ｂａｃｉｌｌｕｓの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている（例えば、Ｓ−５９／ＵＶＡ処置による）。
また、本発明は医療用途のための自由生活微生物を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化される、および／または微生物がＤＮＡ修復酵素に関して欠損があるように改変されている。医療用途は（例えば、ワクチンとして使用するための）治療的および予防的医療適用双方を含むと理解される。いくつかの具体例において、微生物は、微生物が増殖について減弱化されるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの具体例において、微生物はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。
【０１０１】
他の具体例において、本発明は、医療で用いるためのプロフェッショナル抗原提示細胞を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱される、および／または微生物がＤＮＡ修復酵素に関して欠損があるように改変される。いくつかの具体例において、微生物は、微生物が増殖について減弱化されるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの具体例において、微生物はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。
【０１０２】
また、本発明は、医療で用いられる突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株を提供し、ここで、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。
【０１０３】
加えて、本発明は、医療で用いられる突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を提供し、ここで、突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。
【０１０４】
本発明は、さらに、無関係な、および／または自由生活微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のための自由生活微生物の使用を提供し、ここで、核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている。いくつかの具体例において、疾患は癌である。いくつかの具体例において、疾患は自由生活微生物とは無関係な感染症である。
【０１０５】
本発明は、さらに、無関係な、および／または微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のための自由生活微生物の使用を提供し、ここで、微生物は少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、疾患は癌である。いくつかの具体例において、疾患は微生物とは無関係な感染症である。
【０１０６】
加えて、本発明は、無関係な、および／または自由生活微生物によって引き起こされない疾患用の医薬の製造のためのプロフェッショナル抗原提示細胞の使用を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されており、および／またはここで、微生物は少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。いくつかの具体例において、疾患は癌である。いくつかの具体例において、疾患は自由生活微生物とは無関係な感染症である。
【０１０７】
本発明は、さらに、無関係な、および／またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって引き起こされない疾患用の医薬の製造のためのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの突然変異体株の使用を提供し、ここで、突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、疾患は癌である。いくつかの具体例において、疾患はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとは無関係の感染症である。
【０１０８】
もう１つの態様において、本発明は、ナイーブなＴ細胞を活性化するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、プロフェッショナル抗原提示細胞とナイーブなＴ細胞とを接触させることを含む、ナイーブなＴ細胞を活性化する方法を提供し、ここで、抗原提示細胞は自由生活微生物を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変される。この方法の接触工程はインビトロまたはインビボいずれかで行うことができる。ナイーブなＴ−細胞を活性化するための適当な条件および十分な時間は当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的な実施例で提供される。
【０１０９】
また、プロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷する方法も提供される。該方法は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）に負荷するのに適した条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることを含み、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化され、および／または微生物が少なくとも１つのＤＮＡ修復酵素に関して欠損があるように改変される。該方法の接触工程はインビトロ、エキソビボまたはインビボで行うことができる。抗原は微生物にとって異種またはオートロガスであり得る。抗原提示細胞に負荷するのに適当な条件および十分な時間は、一般に、当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的な実施例で提供される。
【０１１０】
もう１つの態様において、本発明は、プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化し、および／またはその成熟化をもたらすのに適当な条件下にて、かつそれに十分な時間の間、抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを（インビトロ、エキソビボ、および／またはインビボで）接触させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞を活性化および／または成熟化する方法を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱かされるように改変される。該方法の接触工程はインビトロまたはインビボいずれかで行うことができる。抗原は微生物にとって異種またはオートロガスであり得る。抗原提示細胞を活性化し、および／または抗原提示細胞を成熟化させるための適当な条件および十分な時間は、一般に、当業者に知られているであろう。加えて、そのような条件の例は以下の具体的実施例で提供される。
【０１１１】
もう１つの態様において、本発明は、以下の工程（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され；次いで（ｂ）負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供する。
【０１１２】
さらにもう１つの態様において本発明は以下の工程（ａ）抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とプロフェッショナル抗原提示細胞とを接触させることによって該細胞に抗原を負荷し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され、次いで、（ｂ）負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０１１３】
（キット）
本発明は、さらに、本発明の改変された微生物および突然変異体株を含むキット（または製品）を提供する。
【０１１４】
１つの態様において、本発明は（ａ）その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され；および（ｂ）宿主において疾患の予防または処置で組成物を用いるための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの具体例において、指示書はラベル上にある。他の具体例において、指示書はキット内に含まれるインサート上にある。
【０１１５】
もう１つの態様において、本発明は、（ａ）その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変され；および（ｂ）宿主への組成物の投与のための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの具体例において、指示書はラベル上にある。他の具体例において、指示書はキット内に含まれるインサート上にある。
【０１１６】
もう１つの態様において、本発明は、（ａ）その核酸を修復するその能力を減弱化させる遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む突然変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ株、または自由生活微生物を含む組成物、ここで、微生物の核酸は、微生物がその増殖について減弱化されるように改変され；および（ｂ）組成物が投与される宿主を選択するための指示書双方を含むキットを提供する。いくつかの具体例において、指示書はラベル上にある。他の具体例において、指示書はキット内に含まれるインサートの上にある。
【０１１７】
前記態様の各々のいくつかの具体例において、組成物はワクチンである。前記態様の各々のいくつかの具体例において、組成物はプロフェッショナル−抗原提示細胞である。前記態様の各々のいくつかの具体例において、自由生活微生物の核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの具体例において、微生物はＳ−５９／ＵＶＡ処理されている。いくつかの具体例において、微生物はＤＮＡ修復酵素に関して欠損がある。
【０１１８】
（本発明のさらなる具体例）
１つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物の増殖が減弱化されるように改変されている自由生活微生物を含む、および／または抗原−負荷されており、および／または微生物核酸が、微生物の増殖が減弱化されるように改変されている自由生活微生物での感染を通じて活性化されたまたは成熟化された抗原提示細胞を含むワクチン組成物を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。１つの具体例において、微生物遺伝子発現は、抗原が、個体への微生物の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルにて抗原が発現されるように実質的に影響されない。１つの具体例において、微生物の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇによって減弱化される。もう１つの具体例において、微生物の増殖は約０．３ないし＞１０ｌｏｇ、約２ないし＞１０ｌｏｇ、約４ないし＞１０ｌｏｇ、約６ないし＞１０ｌｏｇ、約０．３ないし８ｌｏｇ、約０．３ないし６ｌｏｇ、約０．３ないし５ｌｏｇ、約１ないし５ｌｏｇ、または約２ないし５ｌｏｇだけ減弱化される。１つの具体例において、微生物による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物による抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの具体例において、発現された抗原は微生物それ自体からの抗原である。１つの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。１つの具体例において、抗原は疾患関連抗原である。１つの具体例において、抗原は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病よりなる群から選択される疾患に関連する。１つの具体例において、抗原は腫瘍関連抗原である。１つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの具体例において、微生物核酸は、微生物の放射線への暴露、および微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と微生物との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい具体例において、微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物とを反応させることによって改変される。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される態様によって核酸に標的かされる。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、核酸アルキル化剤を含む。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。１つの具体例において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはＵＶＡ照射によって化合物の活性化に際して���応する。１つの具体例において、ＵＶＡ照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、核酸標的化化合物は核酸の改変を間接的に引き起こす。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはＵＶＡ照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。１つの具体例において、微生物は遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、遺伝子突然変異の結果、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱化がもたらされる。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に依存して、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子にある。１つの具体例において、突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の１以上である。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の活性の減弱をもたらす。さらなる具体例において、これらの突然変異を含む微生物は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの具体例において、微生物は細菌である。１つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。好ましい具体例において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの摂取に有意に影響すること無く、非−貪食細胞に侵入するＬｉｓｔｅｒｉａの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方に遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すＬｉｓｔｅｒｉａの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合の減弱をもたらす突然変異を含む。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ遺伝子および１以上のインターナリン遺伝子に突然変異を含む。好ましい具体例において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子に突然変異を含み、好ましくは、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体を含む。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体は、さらに、ｕｖｒＡＢ遺伝子に欠失突然変異を含む。
【０１１９】
１つの具体例において、本発明は、細菌の増殖が減弱化されるように、細菌核酸が改変された細菌を含むワクチン組成物を含み、ここで、細菌遺伝子発現は実質的に影響されない。１つの具体例において、細菌遺伝子発現は、細菌の個体への投与に際して細菌に対する免疫応答を誘導するのに十分なレベルにて抗原が発現されるように実質的に影響されない。１つの具体例において、細菌の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも約１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ減弱される。もう１つの具体例において、微生物の増殖は約０．３ないし＞１０ｌｏｇ、約２ないし＞１０ｌｏｇ、約４ないし＞１０ｌｏｇ、約６ないし＞１０ｌｏｇ、約０．３ないし８ｌｏｇ、約０．３ないし６ｌｏｇ、約０．３ないし５ｌｏｇ、約１ないし５ｌｏｇ、または約２ないし５ｌｏｇだけ減弱される。１つの具体例において、細菌による抗原の発現は、細菌核酸が改変されていない細菌による抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または少なくとも約９０％である。１つの具体例において、細菌核酸は、細菌の放射線への暴露、および細菌核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と細菌との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい具体例において、細菌核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と細菌とを反応させることによって改変される。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される態様によって核酸に標的化される。１つの具体例において、核酸標的化化合物は核酸アルキル化剤を含む。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエーテルである。１つの具体例において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射による、好ましくはＵＶＡ照射による化合物の活性化に際して反応する。１つの具体例において、ＵＶＡ照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、核酸の改変を間接的に引き起こす。１つの具体例において、核酸標的化化合物は照射による、好ましくはＵＶＡ照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。１つの具体例において、細菌は遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、改変されている細菌核酸を修復する細菌の能力の減弱をもたらす。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、細菌の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの具体例において、突然変異はｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の１以上におけるものである。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、���ｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の活性における減弱をもたらす。好ましい具体例において、これらの突然変異を含む細菌は、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。１つの具体例において、細菌はグラム陽性菌、グラム陰性菌、細胞内細菌およびマイコバクテリアよりなる群から選択される。１つの具体例において、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｌｙｍｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌｒａｅｎｓｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓよりなる群から選択される。１つの具体例において、細菌はマイコバクテリアである。１つの具体例において、マイコバクテリアはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。１つの具体例において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓはｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。１つの具体例において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは条件ｒｅｃＡ突然変異を含む。１つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。１つの具体例において、細胞内細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。１つの具体例において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓはｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。１つの具体例において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓは条件ｒｅｃＡ突然変異を含む。１つの具体例において、細胞内細菌はＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓである。１つの具体例において、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓはｕｖｒＡＢ欠失突然変異を含む。１つの具体例において、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓは条件ｒｅｃＡ突然変異を含む。
【０１２０】
本発明は、個体のワクチン接種のような、前記組成物を含む医薬および前記組成物の使用方法を含む。１つの具体例において、本発明は、ワクチンを個体に投与することを含む本発明のワクチンを使用する方法を含む。１つの具体例において、ワクチン接種は、経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下よりなる群から選択される経路によるワクチンの投与によって行われる。１つの具体例において、ワクチンは、それに対してワクチンが標的化される疾患の兆候を有しない個体に対する予防方法を用いて投与される。１つの具体例において、ワクチンは、それに対してワクチンが標的化される疾患の兆候を有する個体に対する治療方法を用いて投与される。１つの具体例において、ワクチンは、癌を標的とする腫瘍抗原を含み、治療的ワクチン接種の結果、癌の兆候が低下する。１つの具体例において、ワクチン接種された個体における平均腫瘍容量は少なくとも約５％、また約１０％、また約２５％、また約５０％、また約７５％、また約９０％、または約１００％だけ減少する。１つの具体例において、ワクチンは予防的または治療的方法いずれかを用いてマウスに投与され、ここで、マウスは、腫瘍細胞を移植してマウスにおいて腫瘍を樹立することができるモデル系であり、ここで、ワクチンは移植された腫瘍の少なくとも１つの抗原を含む。腫瘍は、ワクチンがマウスに投与される後（予防方法）または前（治療方法）いずれかにマウスに移植される。１つの具体例において、予防または治療方法いずれかを用いて接種されたマウスにおける平均腫瘍容量は、ワクチン接種されない、または無関係な抗原を発現する同様なワクチンビヒクルを接種した同様なマウス（コントロールマウス）における腫瘍容量よりも小さい。１つの具体例において、ワクチン接種マウスにおける平均腫瘍容量は、コントロールマウスにおける平均腫瘍容量よりも少なくとも約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％または約１００％低い。１つの具体例において、予防または治療方法いずれかを用いてワクチン接種されたマウスのメジアン生存時間はコントロールマウスにおけるよりも少なくとも約２日、約５日、約７日または少なくとも約１０日長い。
【０１２１】
１つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が減弱されるように改変されるように、微生物集団を処理することを含むワクチン組成物の製法を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。もう１つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物集団の増殖が減弱されるように改変されるように微生物集団を処理し、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されず、次いで、その微生物集団を用いて  抗原提示細胞に抗原を負荷し、抗原提示細胞の活性化／成熟化を誘導することを含む、ワクチン組成物の製法を含む。１つの具体例において、微生物集団は照射によって処理される。１つの具体例において、微生物集団は、核酸の改変を間接的に引き起こす核酸標的化化合物と反応させることによって処理される。さらなる具体例において、核酸標的化化合物は照射によって活性化され、ここで、化合物の活性化は核酸の間接的改変を引き起こす。さらなる具体例において、核酸標的化化合物の活性化は、核酸を改変する反応性酸素種をもたらす。１つの具体例において、微生物集団は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と反応することによって処理される。１つの具体例において、核酸標的化化合物は約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１００ｐＭないし１ｍＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約１ないし２００ｎＭまたは約１ないし１００ｎＭの濃度にて反応する。１つの具体例において、核酸標的化化合物はアルキル化剤を含む。１つの具体例において、アルキル化剤は、マスタード、マスタード中間体およびマスタード等価物よりなる群から選択される。１つの具体例において、核酸標的化化合物はインターカレーター、小溝バインダー、大溝バインダー、静電バインダー、および配列−特異的バインダーよりなる群から選択される核酸標的化基を含む。１つの具体例において、核酸標的化化合物は、化合物の活性化に際して核酸と直接的に反応する。１つの具体例において、化合物の活性化は照射による。１つの具体例において、照射はＵＶＡ照射である。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はＵＶＡ照射によって活性化されたソラレン化合物である。１つの具体例において、ソラレン化合物は約１０ｐＭないし１０ｍＭ、また約１００ｐＭないし１ｍＭ、また約１ないし５００ｎＭ、また約１ないし２００ｎＭ、または約１ないし１００ｎＭの濃度におけるものであり、ＵＶＡ照射は約０．１ないし１００Ｊ／ｃｍ２、また約０．１ないし２０Ｊ／ｃｍ２、または約０．５ないし５Ｊ／ｃｍ２または約２ないし４Ｊ／ｃｍ２の量である。１つの具体例において、微生物集団の増殖は少なくとも約０．３ｌｏｇ、また少なくとも１ｌｏｇ、約２ｌｏｇ、約３ｌｏｇ、約４ｌｏｇ、約６ｌｏｇ、または少なくとも約８ｌｏｇだけ減弱される。もう１つの具体例において、微生物集団の増殖は約０．３ないし＞１０ｌｏｇ、約２ないし＞１０ｌｏｇ、約４ないし＞１０ｌｏｇ、約６ないし＞１０ｌｏｇ、約０．３ないし８ｌｏｇ、約０．３ないし６ｌｏｇ、約０．３ないし５ｌｏｇ、約１ないし５ｌｏｇ、または約２ないし５ｌｏｇだけ減弱される。１つの具体例において、微生物集団による抗原の発現は、核酸を改変するように処理されていない微生物集団に���る抗原の発現の少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または少なくとも約９０％である。１つの具体例において、発現された抗原は微生物それ自体からの抗原である。１つの具体例において、微生物はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであり、抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのものである。１つの具体例において、微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓであり、抗原はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからのものである。１つの具体例において、微生物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む。１つの具体例において、抗原は疾患関連抗原である。１つの具体例において、抗原は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖病よりなる群から選択される疾患に関連する。１つの具体例において、抗原は腫瘍関連抗原である。１つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。１つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Ｓｐ１７、ｇｐ１００、ＰＲ３、ＰＡＧＥ−４、ＴＡＲＰ、ＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳＰＡＳ−１よりなる群から選択される。１つの具体例において、微生物は遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、遺伝子突然変異の結果、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱がもたらされる。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に応じて、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｒｖＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｒｖＣ、ｕｖｒＤおよびｒｅｃＡ、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の１以上におけるものである。１つの具体例において、遺伝子突然変異は、ＰｈｒＢ、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、ＵｖｒＤおよびＲｅｃＡよりなる群から選択されるＤＮＡ修復酵素の活性における減弱をもたらす。さらなる具体例において、これらの突然変異を有する微生物を、ＵＶＡ照射によって活性化されたソラレンで処理する。１つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。１つの具体例において、微生物は細菌である。１つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。好ましい具体例において、細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、貪食細胞によるＬｉｓｔｅｒｉａの摂取に有意に影響すること無く、非−貪食細胞に侵入するＬｉｓｔｅｒｉａの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ遺伝子双方に遺伝子突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すＬｉｓｔｅｒｉａの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はｈｌｙ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌｉｓｔｅｒｉａによるアクチンの重合の減弱をもたらす突然変異を含む。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ突然変異はａｃｔＡ遺伝子におけるものである。１つの具体例において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ遺伝子および１以上のインターナリン遺伝子に突然変異を含む。好ましい具体例において、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子に突然変異を含み、好ましくは、ＬｉｓｔｅｒｉａはａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異を含む。好ましい具体例において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失突然変異体は、さらに、ｕｖｒＡＢ遺伝子に欠失突然変異を含む。
【実施例】
【０１２２】
（実施例１）
（ＯＶＡ抗原の発現を維持しつつ増殖の減弱を供するＬｉｓｔｅｒｉａ株のソラレン処理）
オボアルブミン、異種ニワトリＯＶＡ抗原を発現するように改変されているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのいくつかの株を（４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（Ｂｅｎ  Ｖｅｎｕｅ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨによって３ｍＭ溶液として固体から調製されたＳ−５９（Ａｓｈ−Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｒｉｖｅｒｖｉｅｗ，ＭＩ）（米国特許第５，３９９，７１９号参照））およびＵＶＡ光（３２０ないし４００ｎｍ）と反応させた。得られたＬｉｓｔｅｒｉａをアッセイして、生きたＬｉｓｔｅｒｉａのｌｏｇ力価の低下、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａによるＯＶＡ抗原の発現を評価した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＢｅｒｋｅｌｅｙのＤａｎ  Ｐｏｒｔｎｏｙ博士によって供され、実施例８に記載したようにＯＶＡ抗原を含むように改変した。これらはＤＰ−Ｌ４０５６（野生型）、ＤＰ−Ｌ４０２９（１０４０３Ｓ  ΔａｃｔＡ、ＡｃｔＡ遺伝子におけるファージ治癒欠失突然変異、Ｓｋｏｂｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：５２７−５３７（２０００）およびＬａｕｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８４（１５）：４１７７−４１８６（２００２）参照）、ＤＰ−Ｌ４３６４（１０４０３Ｓ  ΔｌｐｌＡ、ホスホリパーゼＡ遺伝子における欠失突然変異）およびＤＰ−Ｌ４０１７（１０４０３Ｓ  ｈｌｙＬ４６１Ｔ、ヘモリシン遺伝子における点突然変異、Ｇｌｏｍｓｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５６（６）：１０２９−１０３８，（２００２）参照）であった。株を３７℃にて３００ｒｐｍにおいてＢＨＩ培地（ブレイン・ハート・インフュージョン、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で約１×１０９ＣＦＵ／ｍＬの濃度まで（６００ｎｍにおける０．５の吸光度まで）増殖させた。各株の１．０ｍＬアリコットを二連１５ｍＬ試験管に移した。各試験管を４℃にて２３００×ｇにおいて２０分間遠心し、上清を除去し、Ｓ−５９の有りおよび無しにて、１％ＢＳＡを含む５ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を二連試験管に添加した（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）。Ｓ−５９は１００ｎＭの濃度で添加した。サンプルを６ウェル培養プレート中に入れ、ほぼ２Ｊ／ｃｍ２の量でＵＶＡを照射した（ＦＸ１０１９照射デバイス、Ｂａｘｔｅｒ  Ｆｅｎｗａｌ，Ｒｏｕｎｄ  Ｌａｋｅ，ＩＬ）。次いで、各サンプルを１５ｍＬ試験管に移し、前記したように遠心し、上清を除去した。これらを５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、遠心し、上清を除去し、最終細菌ペレットを０．５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁させた。各々の１００μＬサンプルを用いて、系列希釈によって細菌の力価を決定した。各希釈をＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ，Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）プレート上に平板培養し、３７℃で一晩インキュベートし、コロニーをカウントして、細菌の力価を測定した。
【０１２３】
細菌サンプルの抗原提示はネズミＤＣ２．４細胞系（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの樹状細胞、Ｓｈｅｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８（６）：２７２３−３０（１９９７）参照）および（Ｓｈａｓｔｒｉ博士，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙから入手した）Ｂ３ＺＴ細胞ハイブリドーマを用いて評価した。Ｂ３Ｚは、ＭＨＣクラスＩ分子の意味でＯＶＡ抗原の認識に際してβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するｌａｃＺ誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマである。ＣＰＲＧ（クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、β−ガラクトシダーゼに対する基質の代謝を用いて、生産されたβ−ガラクトシダーゼのレベルを評価し、これは、ＤＣ２．４細胞によって提示されたＯＶＡ抗原の量に直接相関する。ＤＣ２．４細胞およびＢ３Ｚ
Ｔ細胞ハイブリッドを、１０％ＦＢＳ（胎児ウシ血清、ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０培養基（ＲＰＭＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。ＤＣ２．４細胞を２００μＬアリコットにて、９６ウェル培養プレートのウェルに移した（ウェル当たり１×１０５ＤＣ２．４）。細菌サンプルを５０μＬストックにて系列的に、１×１０５ＣＦＵ／ｍＬまで低下した４５０μＬ  ＰＢＳまで希釈した（Ｓ−５９処理サンプルはＣＦＵ等価物であり、すなわち、それはＳ−５９処理に先立ってのコロニー形成単位の数である）。各希釈の２０μＬを、ＤＣ２．４細胞を含有するウェルに移して、ほぼ１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、または１×１０８ＣＦＵ／ｍＬを得る。加えて、ＰＢＳのみの２０μＬアリコットを陰性コントロールとして添加した。サンプルを５％ＣＯ２中で３７℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄して、細胞外細菌を除去した。Ｂ３Ｚ  Ｔ細胞（１×１０５細胞）の２００μＬアリコットおよび１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加した。陽性コントロールとして、１００ｎＭ  ＳＬ８  ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（ＳＬ８  ＯＶＡ抗原、ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号：１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ＤＣ２．４およびＢ３Ｚ細胞の各々１×１０５を含有するウェルに添加した。サンプルを５％ＣＯ２中で３７℃にて一晩インキュベートした。プレートを４００×ｇにて３分間遠心し、各ウェルを２５０μＬのＰＢＳで洗浄した。１００μＭの２−メルカプトエタノール、９ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１２５％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（（オクタフェノキシ）ポリエトキシエタノール、Ｓｉｇｍａ）、および０．１５ｍＭのＣＰＲＧを含有するＰＢＳの１００μＬアリコットを各ウェルに添加した。サンプルを３７℃にて少なくとも４時間インキュベートした。プレートリーダーを用い、吸光度を６５５ｎｍにおける参照測定にて５９５ｎｍにて測定した。細菌力価、および未処理に対するＳ−５９処理の抗原提示についての結果を（ＤＣ２．４当たり１００細菌）を表１に掲げる。結果は、ＤＣ２．４当たり添加された１００細菌細胞のレベルでは、抗原提示は未処理サンプルのほぼ５５ないし８５％であることを示す。細菌力価はほぼ１０４だけ低下したので、これは、十分な抗原提示がＬｉｓｔｅｒｉａの増殖のかなりの減弱を伴って維持されることを示す。
【０１２４】
（表１  １００ｎＭソラレンＳ−５９および２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ光で処理されたＯＶＡ抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株のｌｏｇ減弱および抗原提示）
【０１２５】
【表１】
2006521376.tif 000001
【０１２６】
＊ＤＣ２．４細胞当たり１００Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて測定された未処理のパーセント。
【０１２７】
ＤＰ−Ｌ４０５６野生型を用いて同様の手法を行った。細菌を１００、２００、４００、８００または１０００ｎＭ  Ｓ−５９で処理し、残りの力価を決定し、前記で詳細に説明したように抗原提示を測定した。細菌力価および抗原提示（ＤＣ２．４細胞当たり１００Ｌｉｓｔｅｒｉａ）についての結果を表２に示し、図１にプロットする。このデータは、抗原提示が、増殖の完全な阻害（すなわち、検出の限界まで）での抗原の提示を含めた、Ｌｉｓｔｅｒｉａ増殖の広い範囲の減弱につき有意であることを示す。
【０１２８】
（表２  種々の濃度のソラレンＳ−５９および２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ光で処理したＯＶＡ抗原を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６のｌｏｇ減弱および抗原提示）
【０１２９】
【表２】
2006521376.tif 000002
【０１３０】
＊ＤＣ２．４細胞当たり１００Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて測定された未処理のパーセント。
【０１３１】
（実施例２）
（ＯＶＡ抗原の発現を維持しつつ増殖の減弱を供するＬｉｓｔｅｒｉａ株のＤＮＡ標的化アルキル化剤処理）
化合物β−アラニン，（（Ｎ−アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル（化合物１、ＣｈｅｍＳｙｎ，Ｈａｒｒｉｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＭＯ，米国特許第６，０９３，７２５号）のみを用い、手法は実施例１と同様に行った。用いたＬｉｓｔｅｒｉａ株はＤＰ−Ｌ４０５６およびＤＰ−Ｌ４０１７であった。化合物１（酸性ＢＢＳ（血液バンク生理食塩水）中１ｍＭ、１００ｍＬ  ＢＢＳ当たり１．４８Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の１３５μｌ）を、０、０．５、１、２、５および１０μＭの濃度まで、１×１０８ＣＦＵ／ｍＬにおける５ｍＬの細菌に添加し、サンプルを室温にて２時間インキュベートした。インキュベーションの後、細菌力価および抗原提示を実施例１におけるように評価した。抗原提示では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、または１×１０７ＣＦＵ／ｍＬまで希釈した。ｌｏｇ力価、ｌｏｇ減弱、および化合物１の濃度の関数としての未処理（ＤＣ２．４当たり１のＬｉｓｔｅｒｉａ）のパーセントとしての抗原提示を表３および図２Ａ、Ｂに掲げる。結果は、化合物１が、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖のかなりの減弱でもって、十分な抗原提示を供するにおいて、例えば１μＭでやはり効果的である。
【０１３２】
（表３  種々の濃度の化合物１で処理されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のｌｏｇ減弱および抗原提示）
【０１３３】
【表３】
2006521376.tif 000003
【０１３４】
＊ＤＣ２．４細胞当たり１Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて測定された未処理のパーセント。
【０１３５】
（実施例３）
（ｕｖｒＡＢ突然変異体−対−野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのソラレン処理による増殖の減弱の比較）
核酸損傷を修復する能力に欠損がある突然変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のソラレン処理を野生型株と比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５７（野生型）およびＣＳＲ６０３（Ａｚｉｚ  Ｓａｎｃａｒ博士，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  ｃａｒｏｌｉｎａから得られたｕｖｒＡ、ｒｅｃＡ、ｐｈｒ突然変異体、Ｈａｒｍ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：２６３−２７０（１９７９）参照）。この実施例は、２５０ｒｐｍのオービタルシェーカーにて３７℃で一晩、ストレプトマイシンを含む３ｍＬのＬＢ培地で増殖させたＡＢ１１５７−対−突然変異体ＣＳＲ６０３の減弱を比較する。この２ｍＬアリコットを３０℃の１００ｍＬのＬＢ培地に添加し、６００ｎｍにおける吸光度が０．９ＯＤ、ほぼ１×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるまでほぼ５時間シェーカー上に置いた。各株では、ほぼ０．５ｍＬの細菌ストックを１５ｍＬ試験管に加え、２３００×ｇにおいて４℃にて２０分間遠心した。上清を除去し、各ペレットを、０、１、１０、１００および１０００ｎＭのソラレンＳ−５９を含有する５ｍＬのＰＢＳに懸濁させた。各サンプルを６ウェル培養プレートに移し、実施例１におけるように照射した。実施例１におけるように、サンプルを系列希釈し、力価を測定した。結果を表４および図３に示す。結果は、ｕｖｒＡＢＣ突然変異体のソラレン処理が、与えられたソラレン濃度では細菌の増殖のより大きな減弱がもたらされる（より低い力価が残存）ことを示す。
【０１３６】
（表４  ソラレン処理でのＥ  ｃｏｌｉ野生型−対−ｕｖｒ−ＡＢＣ突然変異体の減弱）
【０１３７】
【表４】
2006521376.tif 000004
【０１３８】
（実施例４）
（Ｓ−５９処理の有りおよび無しでの、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を用いるマウスの治療的ワクチン接種）
ワクチンとしてのＳ−５９処理Ｌｉｓｔｅｒｉａの有用性を評価するために、Ｃ５７Ｂ１／６マウスメラノーマ腫瘍モデルを用いた。Ｃ５７Ｂ１／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）の毛を剃り、１００μＬのＨＢＳＳ中の２×１０５Ｂ１６．Ｆ１０．Ｍｏ５２０．１０細胞（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｒｏｃｋ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓｕｃｈｅｓｅｔｔｓから得られたＢ１６−ＯＶＡ発現メラノーマ細胞、Ｍａｎｄｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：８２１６（１９９８）参照）で皮下移植した。ＯＶＡ抗原を含有するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６およびＤＰ−Ｌ４０１７をＳ−５９処理（実施例１のような量の２０ｎＭ  Ｓ−５９ＵＶＡ）の有りまたは無しにて調製した。加えて、ＯＶＡ抗原無しの野生型ＤＰ−Ｌ４０５６をコントロールとして用いた。Ｓ−５９処理サンプルのｌｏｇ力価を測定して、ソラレン処理によるｌｏｇ減弱を評価した（表６）。ＬｉｓｔｅｒｉａをＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩培地、Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させ、１０ないし１２匹のマウスの群を、各株の１００μＬ腹腔内注射で３回ワクチン接種し、ならびにある群をＨＢＳＳビヒクルで注射した。種々の株に対するワクチン接種量（ワクチン接種当たりの合計ＣＦＵ）を表６に示す。量は非Ｓ−５９処理Ｌｉｓｔｅｒｉａに対する０．１  ＬＤ５０、およびＳ−５９処理Ｌｉｓｔｅｒｉａに対する最大可能量に対応した。ワクチン接種は腫瘍移植から３、１０および１７日に行った。マウスを触知可能腫瘍につき観察した。一旦観察されれば、腫瘍の対向直径を一週間に２回測定した。もし腫瘍がいずれかの方向で２０ｍｍに測定されれば、マウスを犠牲にした。Ｂ１６−ＯＶＡ移植後の日数の関数としての平均腫瘍容量を図４および表５に示す。群当たりのマウスのパーセント生存を図５にプロットし、メジアン生存を表６に掲げる。本実施例は、高い量のＳ−５９処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ株がマウスに安全に投与することができ、良好な抗腫瘍応答をもたらすことを示す。
【０１３９】
（表５  Ｂ１６−ＯＶＡを移植し、かつ同定されたＬｉｓｔｅｒｉａ株をワクチン接種したマウスについての移植後日数における腫瘍容量）
【０１４０】
【表５】
2006521376.tif 000005
【０１４１】
（表６  ２０ｎＭ  Ｓ−５９処理（２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）の有りおよび無しでの、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株についてのワクチン接種量およびメジアン生存）
【０１４２】
【表６】
2006521376.tif 000006
＊値は３つの製剤の平均である。
【０１４３】
（実施例５）
（ワクチン接種後における抗原特異的免疫応答の評価）
種々のインビトロおよびインビボ方法を用い、本発明のワクチンを評価することができる。これらの方法をＬｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンを用いて例示するが、これを用いて、本発明のいずれかの微生物ベースのワクチンの優れた効率を見積もることができる。
【０１４４】
いくつかのアッセイは、ワクチン接種されたマウスの脾臓からの抗原特異的Ｔ細胞の分析を含む。Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡ株でワクチン接種し（例えば、０．１ＬＤ５０の腹腔内注射）、ここで、Ｌｉｓｔｅｒｉａを処理して増殖を減弱化させることができる（例えば、Ｓ−５９処理）。ワクチン接種から７日後に、脾臓を氷冷ＲＰＭＩ１６４０培地に入れ、これから単一細胞懸濁液を調製することによって、マウスの脾臓細胞を収集した（典型的には、群当たり３匹のマウス）。別法として、マウスのリンパ節を同様に収集し、単一細胞懸濁液として調製し、後に記載するアッセイにおいて脾臓細胞を置き換えた。典型的には、脾臓細胞をワクチンの静脈内または腹腔内投与につき評価し、他方、脾臓細胞およびリンパ節からの細胞をワクチンの筋肉内、皮下または皮内投与につき評価する。
【０１４５】
特に断りのない限り、本実施例で用いた全ての抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから得ることができる。
【０１４６】
（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＯＶＡ抗原を有するＬｉｓｔｅｒｉａ株を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用い、マウスモデルにおいて免疫化に際して生じた抗原特異的Ｔ細胞の定量的頻度につき評価する。評価した抗原特異的Ｔ細胞はＯＶＡ特異的ＣＤ８＋またはＬＬＯ特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。このＯＶＡ抗原モデルはワクチンに挿入された異種腫瘍抗原に対する免疫応答を評価し、注目するいずれかの抗原で置き換えることができよう。ＬＬＯ抗原はＬｉｓｔｅｒｉａに対して特異的であり、ワクチンビヒクルとして用いられるいずれかの微生物ベクターのための適当な抗原に代えて置き換えることができよう。特異的Ｔ細胞は、特異的抗原の認識に際してサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮ−γ）の検出によって評価される。ＰＶＤＦベースの９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を抗−ネズミＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ｒ４；５μｇ／ｍＬ）で４℃にて一晩被覆する。プレートを洗浄し、２００μＬの完全なＲＰＭＩで室温にて２時間ブロックする。ワクチン接種したマウス（または非ワクチン接種コントロールマウスからの脾臓細胞をウェル当たり２×１０５細胞にて添加し、約０．０１ないし１０μＭの範囲の種々の濃度のペプチドの存在下にて３７℃にて２０ないし２２時間インキュベートする。用いたペプチドはＳＬ８、ＯＶＡ、ＬＬＯ１９０（ＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳ、配列番号：２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についてのＭＨＣクラスＩエピトープ、リステリオリシンＯ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗原）、またはＬＬＯ２９６（ＶＡＹＧＲＱＶＹＬ、配列番号：３）についてのＭＨＣクラスＩＩエピトープ、リステリオリシンＯについてのＭＨＣクラスＩエピトープいずれかであった。洗浄の後、プレートを、ＰＢＳ中に０．５μｇ／ｍＬ中に希釈したＩＦＮ−γに対して特異的な二次ビオチニル化抗体（ＸＭＧ１．２）とともにインキュベートする。室温での２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈した１ｎｍ金ヤギ抗−ビオチンコンジュゲート（ＧＡＢ−１；  １：２００希釈；Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）とともに３７℃にて１時間インキュベートする。徹底的な洗浄の後、プレートを、スポット発生のための基質（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；  ３０μＬ／ウェル；  Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）とともに室温にて２ないし１０分間インキュベートする。次いで、プレートを蒸留水で濯いで、基質反応を停止させる。プレートを風乾した後、各ウェル中のスポットを、自動ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（ＣＴＬ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いてカウントする。サイトカイン応答は、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞またはＬｉｓｔｅｒｉａ特異的Ｔ細胞いずれかにつき、１０６脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット−形成細胞（ＳＦＣ）の数として表す。
【０１４７】
（細胞内サイトカイン染色アッセイ（ＩＣＳ））
抗原特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の数をさらに評価し、結果をＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得られたのと相関付けるために、ＩＣＳを行い、フローサイトメトリー分析によって細胞を評価する。マウスのワクチン接種した、およびコントロール群からの脾臓細胞を、ブレフェルジンＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、ＳＬ８（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋細胞を刺激）またはＬＬＯ１９０（ＬＬＯ特異的ＣＤ４＋細胞を刺激）とともに５時間インキュベートする。ブレフェルジンＡは、Ｔ細胞の刺激に際して生じたサイトカインの分泌を阻害する。無関係なＭＨＣクラスＩペプチドとともにインキュベートした脾臓細胞をコントロールとして用いる。ＰＭＡ（フォルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート，Ｓｉｇｍａ）２０ｎｇ／ｍＬおよびイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）２μｇ／ｍＬ刺激脾臓細胞を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α細胞内サイトカイン染色についての陽性コントロールとして用いる。細胞質サイトカイン発現の検出では、細胞をＦＩＴＣ−抗−ＣＤ４  ｍＡｂ（ＲＭ４−５）およびＰｅｒＣＰ−抗−ＣＤ８  ｍＡｂ（５３−６．７）で染色し、固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で浸透性化し、氷上で、ＰＥ−コンジュゲーテッド抗−ＴＮＦ−α  ｍＡｂ（ＭＰ６−ＸＴ２２）およびＡＴＣ−コンジュゲーテッド抗−ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（ＸＭＧ１．２）で３０分間染色する。細胞内ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αを発現する細胞のパーセンテージはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって決定し、データは、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて分析する。種々の抗体上の蛍光ラベルは全てＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒによって区別できるので、適当な細胞は、抗−ＩＦＮ−γまたは抗−ＴＮＦ−αのいずれかまたは双方で染色されるＣＤ８＋およびＣＤ４＋につきゲーティングすることによって同定される。また、このモデルを用いて微生物ワクチンの免疫原性を決定することもでき、ここで、樹状細胞集団、またはマクロファージ集団のようなもう１つの抗原提示細胞は微生物ベクターとともにインキュベートされる。得られた抗原提示細胞はマウスの足に注入され、リンパ節からの細胞集団を前記したようにＴ細胞につき評価される。
【０１４８】
（刺激された脾臓細胞のサイトカイン発現）
マウスの脾臓細胞によるサイトカイン分泌のレベルもまた、コントロールおよびワクチン接種Ｃ５７Ｂ１／６マウスにつき評価することができる。脾臓細胞はＳＬ８またはＬＬＯ１９０で２４時間刺激する。無関係なペプチドＨＳＶ−ｇＢ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳＳＩＥＦ  ＡＲＬ、配列番号：４）での刺激をコントロールとして用いる。刺激された細胞の上清を収集し、Ｔヘルパー−１およびＴヘルパー−２サイトカインのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＯ）またはＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて決定する。
【０１４９】
（細胞傷害性Ｔ細胞活性の評価）
インビトロにて、またはインビボでＣ５７Ｂ１／６マウスにて直接的に、その細胞傷害性活性を評価することによって、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに評価することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、その各標的細胞を抗原特異的に認識し、溶解させる。インビトロ細胞傷害性は、クロム放出アッセイを用いて決定される。ナイーブおよびＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡ（内部）ワクチン接種マウスの脾臓細胞を、照射されたＥＧ７．ＯＶＡ細胞（ＯＶＡを発現するようにトランスフェクトされたＥＬ−４腫瘍細胞系、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で、または１００ｎＭ  ＳＬ８いずれかで１０：１比率にて刺激して、脾臓細胞集団中のＯＶＡ特異的Ｔ細胞を拡大させる。培養から７日後に、エフェクター細胞の細胞傷害性活性を、標的細胞としてのＥＧ７．ＯＶＡまたはＳＬ８パルスドＥＬ−４細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）および陰性コントロールとしてのＥＬ−４細胞単独を用い、標準的な４時間５１Ｃｒ−放出アッセイで決定する。ＹＡＣ−１細胞系（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を標的として用いて、ＮＫ細胞活性を測定して、Ｔ細胞による活性をＮＫ細胞による活性から区別する。特異的細胞傷害性のパーセンテージは１００×（実験的放出−自然発生的放出）／（最大放出−自然発生的放出）として計算される。自然発生的放出は、エフェクター細胞無くして標的細胞のインキュベーションによって決定される。最大放出は、０．１％トリトンＸ−１００で細胞を溶解することによって決定される。実験は、もし自然発生的放出が最大放出の＞２０％であれば分析につき有効であると考えられる。
【０１５０】
インビボでのＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性の評価では、ナイーブなＣ５７Ｂ１／６マウスからの脾臓細胞を２つの同等なアリコットに分割する。各群を３７℃にて９０分間、０．５μｇ／ｍＬにおいて、特異的ペプチド、標的（ＳＬ８）またはコントロール（ＨＳＶ−ｇＢ２）いずれかでパルスする。次いで、細胞を培地中で３回、およびＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中で２回洗浄した。カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識するために、細胞を温ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（１０ｍＬ以下）にｍＬ当たり１×１０７にて再懸濁する。標的細胞懸濁液に、１．２５μＬのＣＦＳＥの５ｍＭストックを加え、渦巻かせることによってサンプルを混合する。コントロール細胞懸濁液に、ＣＦＳＥストックの１０倍希釈物を加え、渦巻かせることによってサンプルを混合する。細胞を３７℃にて１０分間インキュベートする。大容量（＞４０ｍＬ）の氷冷ＰＢＳの添加によって染色を停止する。細胞を室温にてＰＢＳで２回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントする。各細胞懸濁液をｍＬ当たり５０×１０６まで希釈し、１００μＬの各集団を混合し、ナイーブまたはワクチン接種マウスいずれかの尾静脈を介して注射する。１２ないし２４時間後、脾臓を収集し、フローサイトメトリーによって５×１０６細胞を分析する。高（標的）および低（コントロール）蛍光ピークを数え、２つの比率を用いて、標的細胞溶解のパーセンテージを確立する。インビボ細胞障害性アッセイは、インビトロ再刺激の必要性なくして抗原特異的Ｔ細胞の溶解活性の評価を可能とする。さらに、このアッセイはその天然環境におけるＴ細胞の機能を評価する。
【０１５１】
（実施例６）
（Ｓ−５９処理の有りおよび無しでの、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０５６でワクチン接種したマウスからの脾臓細胞のＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＣＳ分析）
ＯＶＡ抗原の有りまたは無しでＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６をＳ−５９処理の有りまたは無しで調製し、それを用いて、投与が静脈内であったことを除いて実施例４と同様にＣ５７Ｂ１／６マウスをワクチン接種した（同様にＨＢＳＳコントロール）。ワクチン接種は、表７および８に示した用量にてナイーブなマウスに対して行った。ワクチン接種から１２日後に脾臓を収集した。脾臓を、実施例５におけるようにＩＣＳおよびＥＳＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。加えて、ＬＤ５０をこれらのＬｉｓｔｅｒｉａにつき評価した。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ双方につき陽性の細胞のパーセントの項目にて、ＬＬＯ１９０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞双方についてのＩＣＳアッセイ結果を表７および図６Ａ、Ｂに掲げる。２×１０５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γＳＦＣの項目にて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを表８および図７に掲げる。これらの結果は、ＯＶＡを持つＳ−５９処理サンプルは、非Ｓ−５９処理サンプルの１００倍過剰で投与した場合にＯＶＡ特異的応答を刺激することを示す。陽性ＯＶＡ特異的応答はより低い用量では観察されないが、これは、依然として、Ｓ−５９処理サンプルが４ｌｏｇだけ減弱されるにつれて増大した安全性の余地を提供する。加えて、ＬＤ５０は未処理サンプルに対してＳ−５９処理につき１０３倍高く、これは、１００倍高いレベルにおける投与でさえ、未処理Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して安全性の１０倍レベルがあることを示す。
【０１５２】
（表７  Ｓ−５９処理の有りまたは無しでの、ＯＶＡと共にまたはそれなくして、ＤＰ−Ｌ４０５６でワクチン接種したマウスに対するＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ陽性双方である脾臓細胞のパーセント）
【０１５３】
【表７】
2006521376.tif 000007
【０１５４】
（表８  Ｓ−５９処理の有りまたは無しにての、ＯＶＡと共にまたはそれなくして、ＤＰ−Ｌ４０５６でワクチン接種したマウスに対する１０６脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γＳＦＣ）
【０１５５】
【表８】
2006521376.tif 000008
【０１５６】
（実施例７）
（対立遺伝子交換によるＬｉｓｔｅｒｉａからのｕｖｒＡＢの欠失についてのｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢの構築）
ソラレンおよびＵＶＡ光での処理によって誘導されたＤＮＡに対する損傷を修復することができないＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異体株を、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおける紫外線抵抗性（ｕｖｒ）ＡＢ遺伝子（ＵＶＲＡＢ）を実質的に欠失することによって作り出した。これらの突然変異体はＤＮＡ修復突然変異体、あるいはヌクレオチド切出修復（ＮＥＲ）突然変異体として知られている。ＬｉｓｔｅｒｉａからのｕｖｒＡＢの欠失は対立遺伝子交換によって達成された［Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１４７（１９９３）］。ｕｖｒＡＢはいずれかのＬｉｓｔｅｒｉａ株から欠失することができる例として、表９に示すＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株からｕｖｒＡＢを欠失させた。
【０１５７】
（表９  対立遺伝子交換によるｕｖｒＡＢの欠失で用いる親Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株）
【０１５８】
【表９】
2006521376.tif 000009
【０１５９】
ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、およびＵＶおよび他の剤によって与えられたＤＮＡ損傷の他の細菌株においてヌクレオチド−切出修復（ＮＥＲ）で必要なＡＢＣエクシヌクレアーゼ複合体の３つのタンパク質のうち２つをコードする。ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子はＬｉｓｔｅｒｉａゲノム中に同一オペロンを含み、かくして、表９に示すＬｉｓｔｅｒｉａ株において一緒に欠失させた。ｕｖｒＡＢ遺伝子は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｎｔｓ、２５６２５４７ないし２５６５４６１（配列番号：５）からマップされ、およびｕｖｒＢ遺伝子はＬｉｓｔｅｒｉａｎｔｓ、２５６５４６９ないし２５６７４５９（配列番号：６）からマップされる［Ｇｌａｓｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８４９−８５２‘２００１］。対立遺伝子交換によってｕｖｒＡＢを欠失させるために、ｕｖｒＡＢの、各々、ほぼ９００塩基対（ｂｐｓ）上流および下流である順方向および逆方向プライマーを用い、ｕｖｒＡＢ遺伝子をまずＰＣＲによって増幅させた。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢアンプリコンは、ＰＣＲプライマーＬｍ−２５６１６７７Ｆ（配列番号：７）およびＬｍ−２５６８３３０Ｒ（配列番号：８）および鋳型としてのＤＰ−Ｌ４０５６を用いて作り出し、これは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｎｔｓ．２５６１６７７−２５６８３３０（配列番号：９）を含む６６５４塩基対長であった。Ｌｉｓｔｅｒｉａ野生型株ＤＰ−Ｌ４０５６をブレイン・ハート・インフュージョン・ブロス・（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ）中で３０℃にて一晩培養し、（３ｍｌの一晩の培養の遠心、細菌ペレットの５ｍｌのＰＢＳ中への再懸濁、再遠心、および続いてのＬｉｓｔｅｒｉａペレットの１ｍｌのＰＢＳ中への最終再懸濁によって調製された）１０μＬの洗浄された細菌懸濁液を、供給業者の推奨に従い、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液およびＭｇＳＯ４と共に、各々０．２μＭのＬｍ−２５６１６７７ＦおよびＬｍ−２５６８３３０Ｒプライマー、２μＬのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する１００μＬの最終用量を有するＰＣＲ反応に添加した。成功したＰＣＲは、臭化エチジウムでの染色、およびＵＶ光での照射による可視化に続いて、区別される６６５４ｂｐバンドの存在によって示されるように、ＴＡＥ緩衝液中の０．８％アガロースゲル電気泳動によって確認された。アンプリコン生成物は、５０μＬの最終容量の中のＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＰＣＲ反応から精製された。引き続いて、連結混合物中の５μＬの精製されたｕｖｒＡＢアンプリコンを用い、アンプリコンをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入した。制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｕｖｒＡＢプラスミドの正しい構築は、ＢｓｒＦＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）での消化、引き続いての１％アガロース／ＴＡＥ電気泳動によって示され、４６１２、１３８８、１０９４、１８１、８８６および２４２４塩基対の断片を生じた。
【０１６０】
ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｕｖｒＡＢプラスミドを引き続いて用いて、対立遺伝子交換用のプラスミドを作成し、そこでは、ｕｖｒＡＢのｎｔｓ２５６２７０９ないし２５６７３２０（４６１２ｂｐｓ）が欠失された。組換えプラスミド構築のための全ての制限酵素およびＴ４  ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。ｕｖｒＡＢ配列の欠失を達成するために、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ／ｕｖｒＡＢプラスミドの１つのアリコット（ほぼ２μｇ）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｒＦＩ、およびＢｇｌＩＩで消化し、１０９２塩基対断片を１％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎによって精製した。平行して、第２のアリコット（ほぼ２μｇ）をＸｈｏＩ、ＢｓｒＦＩ、およびＢｇｌＩＩ酵素で消化し、１０５０塩基対断片を１％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎによって精製した。適合するＢｓｒＦＩ末端を含有する２つの１０９２ｂｐおよび１０５０ｂｐ断片を一緒に連結し、２１４２ｂｐ連結生成物をＧｅｎｅＣｌｅａｎを用いて精製した。２１４２ｂｐ連結生成物の１つの部分をＰｓｔＩで消化し、１４８６ｂｐ断片を１％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎによって精製した。２１４２ｂｐ連結生成物の第２の部分をＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化し、６２２ｐ断片を１％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎによって精製した。対立遺伝子交換のための親プラスミドベクター、ｐＫＳＶ７［Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１４７（１９９３）］をＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化し、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ適合末端を有する６２２ｂｐ断片をｐＫＳＶ７プラスミドベクターに挿入して、ｐＫＳＶ７−Ｋ／Ｐ−３３８に挿入した。引き続いて、ＰｓｔＩ適合末端を有する１４８６ｂｐ断片を、ＰｓｔＩで消化し、ＣＩＡＰで処理したベクター構築体ｐＫＳＶ７−Ｋ／Ｐ−３３８に挿入した。正しい向きでの１４８６ｂｐ構築体での挿入は、１２５３ｂｐ、８６５ｂｐ、および６．９ｋｂの断片サイズを生じるＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によって決定した。このプラスミド構築体はｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢとして知られている。ｐＫＳＶ７組変えプラスミドのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢ部分を配列決定して、Ｌｉｓｔｅｒｉａ配列の忠実度およびｎｔｓ．２５６２７０９ないし２５６７３２０のｕｖｒＡＢ遺伝子における正しい欠失を確認した（ｕｖｒコーオーディネートｎｔｓ．２５６２５４７ないし２５６７４５９からの欠失）。欠失された領域は配列番号：１０であり、残りのアンプリコン配列は配列番号：１１である。
【０１６１】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９のｕｖｒＡＢ遺伝子（表９）は、従前に記載されているようにプラスミドｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢを用いる対立遺伝子交換によって欠失した（Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１４７（１９９３））。プラスミドｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢは、エレクトロポレーションによって、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９に導入された。まず、３７℃にて振盪しつつ、ＢＨＩ中の単離された細菌コロニーからの１０ｍＬ一晩培養物を増殖させることによって、エレクトロポレーションに対してコンピテントとした。次いで、各株のｌｏｇ期培養は、２ｍＬの一晩培養物を２５０ｍＬフラスコ中の１００ｍＬ  ０．５Ｍスクロース／ＢＨＩ（滅菌濾過したもの）中に接種することによって誘導した。培養は、ＯＤ６００＝０．２の細菌密度に達するまで、３７℃にて２ないし３時間振盪することによって中期ｌｏｇ期まで増殖させた。引き続いて、培養を処理して、スフェロプラストとして知られたペプチドグリカン細胞壁を欠く細菌を作成した。１００ｕＬのペニシリンＧストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ，滅菌濾過したもの）を中期ｌｏｇ期培養に添加し、続いて、３７℃にて２時間振盪した。スフェロプラスト培養を１００ｍＬ遠心瓶中でペレット化し、４５ｍＬの氷冷ＨＥＰＥＳ／スクロースストック溶液（１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／０．５Ｍスクロース、滅菌濾過したもの）で再懸濁し、遠心によって再度ペレット化した。細菌ペレットを２０ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロースで再懸濁し、４０ｍＬ遠心管に移し、ペレット化し、１０ｍＬ  ＨＥＰＥＳ／スクロースに再懸濁した。次いで、１００μＬの１０ｍｇ／ｍＬリソソームストックを細菌溶液に加え、徹底的に混合し、振盪することなく培養を３７℃にて１５分間インキュベートしたが、５分間隔で２回軽く倒立させた。次いで、リソソーム−処理培養を５０００ｒｐｍ（３０００×ｇ）において４℃にて１０分間遠心し、１０ｍＬのＨＥＰＥＳ／スクロースに再懸濁させた；各回注意深くかつ徹底的に再懸濁させて、このプロセスを２回反復した。エレクトロコンピテントＬｉｓｔｅｒｉａを得るための最終工程は、細菌ペレットを５００μＬのＨＥＰＥＳ／スクロースに再懸濁させることであった。
【０１６２】
エレクトロポレーションでは、２μｇのｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡを１０μＬのＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９エレクトロコンピテントＬｉｓｔｅｒｉａに加え、溶液を０．１ｃｍのキュベットに加えた。キュベットを、１ＫＶ、４００オーム、２５μＦＤに設定されたエレクトロポレーションデバイスに入れ、次いで、パルスを与えた。これは、典型的には、約５ミリ秒の時定数をもたらした。細胞を直ちに１ｍＬ  ＢＨＩ／スクロース培地に加え、これを３０℃まで予め温め、次いで、振盪しつつ３０℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション時間に続き、細菌をペレット化し、２００ｍｌのＢＨＩブロスに再懸濁し、懸濁液を、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ＢＨＩ／ｃｍ１０）を含有するＢＨＩ−寒天上で平板培養した。次いで、プレートを３０℃にて一晩インキュベートし、その後、ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミド形質転換体に対応するコロニーが目に見えた。プアスミドｐＫＳＶ７は温度−感受性Ｌｉｓｔｅｒｉａレプリコンを含み、次いで、プレートを３０℃にてインキュベートして、クロラムフェニコール／抵抗性コロニーを可視化しなければならない。
【０１６３】
ｕｖｒＡＢ中に４６１２ｂｐ欠失を含むｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドでのエレクトロポレーションによって形質転換されたＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９中での天然ｕｖｒＡＢ遺伝子の対立遺伝子交換は、従前に記載されているように、プラスミド取り込み、続いての（天然ｕｖｒＡＢを含めた）プラスミド切出および治癒よりなる２工程で達成された［Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１４３−１４７（１９９３）］。ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡでエレクトロポレーションしたＬｉｓｔｅｒｉａ  株ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９の各々から得られた２つの単離されたクロラムフェニコール−抵抗性コロニーを選択し、次いで、各々の選択されたコロニーを新鮮なＢＨＩ／ＣＭ１０プレート上で画線培養し、３０℃にて一晩インキュベートした。翌日、コロニーを各プレートから選択し、これを用いて、２５０ｍＬフラスコ中に含有された１０ｍＬのＢＨＩ／ＣＭ１０を接種し、次いで、これを振盪しつつ３０℃にて一晩インキュベートした。次いで、一晩培養物の各々の１０μＬを用いて、１０ｍＬの新鮮なＢＨＩ／ＣＭ１０  培地（１：１０００希釈）を接種し、次いで、培養物が静止期に到達するまで、これを振盪しつつ４１℃にて培養した。１０μＬのサンプリングに続き、プラスミド調製を残りの一晩Ｌｉｓｔｅｒｉａ培養物で行って、ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡの存在を確認した。一旦静止期においては、１０μＬの培養物を用いて、１０ｍＬの新鮮なＢＨＩ／ｃｍ１０培地を接種し、これを４１℃にて予め加温し、次いで、振盪しつつ４１℃にて一晩インキュベートした。次いで、サンプルを各４１℃一晩培養物から採取し、これを用いてＢＨＩ／ｃｍ１０プレート上で単離されたコロニーにつき画線培養し、これを４１℃にて予め加温した。プラスミドｐＫＳＶ７は温度−感受性Ｌｉｓｔｅｒｉａレプリコンを含むので、４１℃でのインキュベーションは、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノム中の天然ｕｖｒＡＢ遺伝子でのｐＫＳＶ７−ＤＬＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドの相同組換えを介する組み込み、および細菌細胞増殖および分裂を介するクロラムフェニコール薬物−抵抗性マーカーの増殖および発現から得られるコロニーにつき選択する。この時点で、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドの相同組換えによる組込から得られる、天然ｕｖｒＡＢ遺伝子および４６１２ｂｐ欠失ｕｖｒＡＢ遺伝子からなるｕｖｒＡＢ遺伝子につきメロジプロイドである。
【０１６４】
切出、およびｐＫＳＶ７プラスミドでの天然ｕｖｒＡＢ遺伝子の治癒のために、前記工程からの４１℃にてインキュベートしたＢＨＩ／ＣＭ１０プレートの各々から単一コロニーを選択し、これを用いて、クロラムフェニコールを含まない１０ｍＬのＢＨＩ培地を接種し、次いで、振盪しつつ３０℃にて一晩インキュベートした。次いで、培養を、クロラムフェニコールを含まない１０ｍＬの新鮮なＢＨＩ培地中に１：１０００希釈し、次いで、６時間振盪しつつ３０℃にて一晩インキュベートした。この工程を２回反復した。ｐＫＳＶ７プラスミドレプリコンにつき許容性の温度にて薬物−選択圧なくしての数世代のメロジプロイド中間株の継代に際し、組み込まれたｐＫＳＶ７プラスミドの自然発生切出が起こり、結局は、従前の細菌からプラスミドが治癒される［Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１  ４３−１４７（１９９３）］。３番目の１：１０００希釈および６時間のインキュベーション時間に続き、各培養からのサンプルを採取し、これを用いて、（クロラムフェニコールを含まない）ＢＨＩプレート上で単離されたコロニーにつき画線培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。１００の単離されたコロニーを爪楊枝で各ＢＨＩプレートから選択し、５ｍＭ−長ストリークがＢＨＩ／ＣＭ１０プレート上でまず最初のコロニーで作成され、続いてＢＨＩプレートにて作成された。ＢＨＩ／ＣＭ１０およびＢＨＩプレートの各マッチした対が複製であるように、プレートをグリッドを用いてマークした。ＢＨＩ／ＣＭ１０およびＢＨＩ複製プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。ｐＫＳＶ７−ｄｌＢｓｒＦＩ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡでのＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、またはＤＰ−Ｌ４０２９のエレクトロポレーションからの２つのクロラムフェニコール−抵抗性コロニーに由来するＢＨＩ／ＣＭ１０およびＢＨＩプレート上で平板培養したコロニーレプリカのほぼ５％は薬物感受性であった（すなわち、ＢＨＩプレート上のみで増殖）。これらの薬物−感受性コロニーはｕｖｒＡＢに４６１２ｂｐ欠失を含む候補を表す。薬物−感受性コロニーの各々を、ＢＨＩ／ＣＭ１０およびＢＨＩプレート双方上で単離されたコロニーにつき再度画線培養し、３７℃にて一晩インキュベートして、候補クローンが純粋かつ薬物感受性であることを確認した。クロラムフェニコール−感受性コロニーを、プライマーＬｍ−２５６１６７７ＦおよびＬｍ−２５６８３３０Ｒ（ｉｂｉｄ）を用いるＰＣＲに付して、ｕｖｒＡＢ欠失をやはり含むクローンを同定した。天然ｕｖｒＡＢ遺伝子を持つクローンのアンプリコンサイズは６６５４ｂｐｓであり、欠失されたｕｖｒＡＢ遺伝子のアンプリコンサイズは２０４２ｂｐｓであり；クロラムフェニコール−感受性クローンの約５０％はやはり欠失されたｕｖｒＡＢ遺伝子を含んだ。ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０１７、およびＤＰ−Ｌ４０２９に由来するｕｖｒＡＢ欠失株の２つのクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。グリセロールストック（滅菌ＬＢ／４０％グリセロールで１：１希釈した３０℃一晩培養物）を各ｕｖｒＡＢ突然変位体株につき作成し、−８０℃にて貯蔵した。これらの株は表１０に���すように公知である。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ（ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ）を２００３年１０月３日にＡＴＣＣに寄託し、ＰＴＡ−５５６３が割り当てられた。
【０１６５】
（表１０  対立遺伝子交換によって生じたｕｖｒＡＢ突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）ｕｖｒＡＢ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｓｔｒａｉｎ    ｕｖｒＡＢ突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）
【０１６６】
【表１０】
2006521376.tif 000010
【０１６７】
Ｓ−５９ソラレンおよびＵＶＡ光での減弱に対する増大した感受性を示すために、正確に実施例１に記載されたように、表１０に示されたｕｖｒＡＢ突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の１×１０９ＣＦＵの調製物を２、２０、１００および５００ｎＭ  Ｓ−５９（Ｌ４０１７／ｕｖｒＡＢおよびＬ４０５６／ｕｖｒＡＢの双方のクローン）または２、１０、２０および１００ｎＭ  Ｓ−５９（Ｌ４０１７／ｕｖｒＡＢのクローン１およびＬ４０２９／ｕｖｒＡＢの双方のクローン）いずれかで処理し、６Ｊ／ｃｍ２（ＦＸ１０１９）の量にてＵＶＡ照射し、ＤＨＩプレート上での希釈物の平板培養によって生存性につきテストした。この実験の結果を表１１ＡないしＢ（Ｓ−５９の量の関数としてのｌｏｇ減弱）および図８およびＡないしＢ（Ｓ−５９の量の関数としてのｌｏｇ残存力価）に示す。結果は、表１０に示されたＤＮＡ  ＮＥＲ修復突然変異体株が、親株と比較して、プロラレンおよびＵＶＡ照射での光化学減弱に対して劇的により感受性であることを明らかに示す。このデータは、有意かつ実質的により低いレベルのＳ−５９プロラレンを用いて、その同質遺伝子カウンターパートと比較して、同一程度までｕｖｒＡＢ突然変異体細菌を不活化することができるという明白な証拠を提供する。
【０１６８】
（表１１Ａ  示されたＳ−５９濃度における照射（６Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）後におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のｌｏｇ減弱）
【０１６９】
【表１１Ａ】
2006521376.tif 000011
【０１７０】
（表１１Ｂ  示されたＳ−５９濃度における照射（６Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）後におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株のｌｏｇ減弱）
【０１７１】
【表１１Ｂ】
2006521376.tif 000012
【０１７２】
ｕｖｒＡＢ突然変異体株は、悪性な疾患または感染症に関連する異種抗原をコードする発現カセットを組み込むために、親株として直接用いることができる。この配置にて、Ｓ−５９およびＵＶＡ光での光化学減弱に続き、細菌はＭＨＣクラスＩ−制限応答をプログラムするその能力を保持する。なぜならば、そのＤＮＡを複製する能力は架橋によって無くなっているが、その遺伝子相補体を発現する能力は実質的に無傷なままだからである。さらに、ｕｖｒＡＢ突然変異体を不活化する有意により少ないＤＮＡ架橋の要件の結果として、ワクチン容量を含む細菌ゲノムの集団の意味では、いずれか１つの遺伝子の発現は、その与えられた遺伝子において、発現の実質的中断がもたらされない低いレベルのＤＮＡ架橋のため、有意には影響されないであろう。最後に、ｕｖｒＡＢ突然変異をいずれかの他の減弱突然変異と組み合わせて、光化学および遺伝子減弱双方を組み合わせる安全かつ効果的なワクチンプラットフォームを駆動することができる。本明細書中に記載した組成物においては、単独またはいずれかの組合せにて、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、またはｕｖｒＣ遺伝子、またはＮＥＲに関与するいずれかのＬｉｓｔｅｒｉａ遺伝子は、タンパク質の機能的形態が発現されないように突然変異させることができる。これらの組成物は、選択された細菌病原体に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのアプローチとして用いて、ワクチン接種した個体において野生型病原体での攻撃に対して保護することができる。別法として、これらの組成物は、いずれかの選択された感染症または悪性病に関連する異種抗原の発現につき安全かつ効果的な組換えワクチンプラットフォームを誘導するためのアプローチとして用いることができる。
【０１７３】
（実施例８）
（対立遺伝子交換による、または部位−特異的組み込みベクターによる選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムへの抗原発現カセットの挿入）
実施例７に記載された株、いずれかの選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株、またはいずれかの細菌株をさらに改変して、悪性病または感染症に関連する異種タンパク質または抗原を発現させることができる。異種タンパク質の発現は、プラスミドが安定に維持されるように、選択された宿主細菌に適合するレプリコンを含むプラスミドを介することができる。別法として、原核生物発現カセットは、実施例７に記載された対立遺伝子交換を含めた種々の方法を用い、あるいは選択されたトランスポゾンまたはバクテリオファージに由来するランダムまたは部位−特異的に組み込まれるベクターにて、宿主細菌のゲノムに安定に組み込むことができる。
【０１７４】
その例として、リステリオファージＰＳＡ（ＳｃｏｔｔＡからのファージ）に由来する、ｐＰＬ２として知られた部位−特異的組込みベクターを利用することによって、実施例７に記載されたｕｖｒＡＢヌクレオチド切出修復（ＮＥＲ）突然変異体株に由来する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの誘導をここに記載する［Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１８６（２００２）］。具体的には、ｐＰＬ２組込みベクターを作成して、分泌シグナルおよびＰＥＳＴ配列を含む［ＤｅｃａｔｕｒおよびＰｏｒｔｎｏｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２−９９５（２０００）］が、ヘモリシン活性を欠く、ＯＶＡとイン−フレーム融合した、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質のアミノ−末端半分を持つ融合パートナーとしてのニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）モデル抗原を発現させる。切形ＬＬＯ−ＯＶＡ融合タンパク質の発現は、ＬＬＯを含めたＬｉｓｔｒｉａビルレンス遺伝子の発現を駆動するｐｒｆＡ−依存性プロモーターであるｈｌｙプロモーターによって駆動される。このベクターはｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡとして知られる。ｐＰＬ２ベクターは、ｔＲＮＡ遺伝子の天然配列が成功した組込みに際して保存され、かくして、その天然の発現された機能を無傷に維持するように、ＬｉｓｔｅｒｉａのｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子内に組み込まれる。
【０１７５】
ｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡの構築における最初の工程は、順方向プライマーＫｐｎＩ−ＬＬＯ  ｎｔｓ．１２５７ないし１２７６（配列番号：１２）および逆方向プライマーＸｈｏＩ−ＬＬＯ１６６５Ｒ（配列番号：１３）のプライマー対を用いるＰＣＲによって、ＤＰ−Ｌ４０５６野生型ＬｉｓｔｅｒｉａゲノムＤＮＡから一緒にｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ配列を増幅することである。４２６ｂｐアンプリコンをＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製し、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩＤ  消化し、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）での処理によって調製されたｐＰＬ２プラスミドに連結し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製した。ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ配列を含むコレクトプラスミドは、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩでの消化、および１％アガロース／ＴＡＥ電気泳動によって確認し、４１８ｂｐｓおよび６１１２ｂｐｓのＤＮＡ断片が得られる。この中間プラスミドＤＮＡ構築体はｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴとして知られている。
【０１７６】
順方向プライマーＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ  ＯＶＡ  ｃＤＮＡ  ｎｔｓ．１７４ないし１８６（配列番号：１４）および逆方向プライマーＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号：１５）のプライマー対を用い、ＤＰ−Ｅ３６１６  Ｅ．ｃｏｌｉ［Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｍｏｌ．Ｍｏｌｂｉｏｌ．３１：１６３１−１６４１（１９９９）］からのｐＤＰ３６１７プラスミドＤＮＡを含めた、当業者によって用いられるいずれかの数のプラスミドからＰＣＲによってＯＶＡ配列を増幅させることができる。
【０１７７】
１０１３ｂｐアンプリコンをＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴプラスミドに連結し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩでの消化、ＣＩＡＰ−での処理によって調製し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製する。ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴおよびＯＶＡ配列を含むコレクトプラスミド構築体はＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、およびＮｏｔＩでの消化、および１％アガロース／ＴＡＥ電気泳動によって確認し、９９４ｂｐｓ、１５６０ｂｐｓ、および６０３９ｂｐｓのＤＮＡ断片を得る。プラスミドｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡのＬＬＯおよびＯＶＡ領域の正確な予期された配列は配列決定によって確認される。
【０１７８】
正確に、従前に記載された方法に従い［Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４，４１７７−４１８６（２００２）］、ｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡプラスミドを、実施例７に記載された選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖａＡＢ突然変異体株のゲノム中のｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子に組み込む。簡単に述べれば、まず、エレクトロポレーションによって、または化学的手段によって、プラスミドｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡをＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＳＭ１０（Ｓｉｍｏｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：７８４−７９１（１９８３））に導入する。引き続いて、コンジュゲーションによって、ｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡプラスミドを形質転換されたＳＭ１０から選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ株へ移す。記載されたように、ｍｌ当たり７．５μｇのクロラムフェニコールおよびｍｌ当たり２００μｇのストレプトマイシンを含有する薬物−選択的ＢＨＩ寒天プレート上でのインキュベーションに続き、選択されたコロニーを、同一組成を持つプレート上で３回継代によって精製する。ファージ付着部位におけるｐＰＬ２ベクターの組み込みを確認するために、個々のコロニーを拾い、順方向プライマーＮＣ１６（配列番号：１６）および逆方向プライマーＰＬ９５（配列番号：１７）のプライマー対を用い、ＰＣＲによってスクリーニングする。選択されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｕｒＡＢ突然変異体株のゲノム中のｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子に組み込まれたｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡプラスミドを有する選択されたコロニーは、４９９ｂｐｓの診断ＤＮＡアンプリコンを生じる。
【０１７９】
実施例１に記載されたように、クローン化されたＣ５７Ｂ１／６−由来樹状細胞系ＤＣ２．４を用い、抗原提示細胞および、引き続いてのＭＨＣクラスＩ経路を介するＯＶＡのプログラム提示によって取り込まれるべきｐＰＬ２／ＬＬＯＳＳ−ＰＥＳＴ−ＯＶＡの安定な組込体を保有する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ突然変異体の能力をテストする。Ｌｉｓｔｅｒｉａの貪食細胞に続くクラスＩ分子へのＤＣ２．４細胞によるＯＶＡペプチドの提示は、やはり実施例１に記載されているように、Ｂ３Ｚ細胞とのインキュベーションの後に測定する。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が機能的であって、ここに含まれる実施例に記載されたようにさらに用いることができることをこれらの手法は証明する。
【０１８０】
かくして、本実施例は、ｕｖｒＡＢ遺伝子内で欠失を含むＤＮＡ修復突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株へ、選択された感染症および悪性病に関連するいずれかの所望の抗原をコードする原核生物発現カセットを導入するための指示を供する。該組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、実施例１に記載されたソラレンでの処理によって不活化することができ、引き続いて、例えば、感染症および悪性病のための予防および治療ワクチンを含めた種々の適用で用いることができる。
【０１８１】
（実施例９）
（ヌクレオチド−切出修復（ＮＥＲ）突然変異体に由来する細菌ワクチン）
本特許に記載された実施例は、感染症および悪性病に関連する抗原をコードする組換え送達プラットホームの光化学処理を介するゲノム不活化を利用するワクチン組成物の効率を説明する。本組成物に従い、ゲノムは不活化され、複製の間に分離することはできないが、転写プロフィールはほとんど無傷のままであり、かくして、ワクチン接種された個体におけるデ・ノボ抗原発現、およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含めた病原体特異的免疫応答の最適な誘導をもたらす。さらに、実施例７に記載されたように、ＤＮＡヌクレオチド切出修復（ＮＥＲ）マシーナリーが、作成された遺伝子欠失を含めたいずれかの数の手段によって不活化されているこの組成物におけるワクチンプラットフォームを利用することによって、これらの突然変異体における光化学不活化に対する感度は劇的に増大する。
【０１８２】
ＤＮＡ修復突然変異体を不活化するかなり少数のＤＮＡ架橋の要件の結果、ワクチン用量を含む細菌ゲノムの集団の意味で、いずれかの１つの遺伝子の発現は、その与えられた遺伝子において、発現の実施的中断をもたらさない低レベルのＤＮＡ架橋のため、有意には影響されないであろう。
【０１８３】
かくして、病原体に由来する細菌プラットフォームを利用する遺伝子ベースのワクチンの総じての利用性は、ＮＥＲに欠損があるベクターと光化学不活化を組み合わせることによって劇的に増加させることができる。不活化されたワクチンは疾患を引き起こすことができないが、それは、ベクター−発現異種抗原に特異的な、Ｔ−細胞媒介細胞免疫性を含めた優れた免疫性を誘導するその効果的な能力を依然として保持する。さらに、ｕｖｒＡＢ突然変異をいずれかの他の減弱突然変異と組み合わせて、光化学および遺伝子減弱双方を組み合わせる安全かつ効果的なワクチンプラットフォームを誘導することができる。
【０１８４】
有意には、これらの組成物は、選択された細菌病原体に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのアプローチとして用いて、ワクチン接種された個体における野生型病原体での挑戦に対して保護することができる。この適用に従い、多くの場合において、病原体の減弱された生きた形態に由来する安全かつ効果的なワクチンを誘導することが可能でない。というのは、ワクチンの受ける個々の固体における反応性および疾患の原因についての可能性は高いままであるからである。選択された細菌病原体に関連するサブユニットまたは不活化ワクチンは安全であろうが、他方、これらのワクチンはしばしば効果的ではない。なぜならば、それらは、該病原体の野生型形態での挑戦に対してワクチン接種された個体を保護することが要求される病原体−特異的免疫応答の幅、深さおよび持続性を効果的には誘導しないからである。かくして、当該分野においては、保護されるワクチン接種された個体において該型の免疫応答を誘導する効果的な能力と安全性とを組み合わせるワクチン組成物に対する明らかな要求が存在することがよく知られている。
【０１８５】
それ自体、病原体微生物のヌクレオチド−切出修復（ＮＥＲ）経路における突然変異体は、非−ワクチン接種個体において疾患を引き起こすのに十分な量の該微生物で、免疫化された個体における挑戦に対して保護を誘導する安全かつ効果的なワクチンで用いることができる組成物を提供する。ＮＥＲは、ＡＢＣエクシヌクレアーゼとして知られ、かつ遺伝子ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、およびｕｖｒＣによってコードされる３つのサブユニットで作成されたＡＴＰ−依存性ヌクレアーゼによって触媒される。３つのｕｖｒ遺伝子のうちのいずれかの１つ、または１を超えるものにおける突然変異の結果、ソラレンおよびＵＶＡ光を利用する光化学不活化に対して極端に感受性の病原体生物の微生物を含めた細胞がもたらされる。
【０１８６】
その例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ａｎｔｈｒａｘの病因のｕｖｒ遺伝子の突然変異が供される。ヒトで許可されている現在の無細胞ａｎｔｈｒｅｘワクチンは、ミョウバン水酸化物に吸着され（Ｕ．Ｓ．ワクチン）またはミョウバンリン酸塩で沈殿させた（Ｕ．Ｋ．ワクチン）減弱Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの滅菌培養上清に基づく。これらのワクチンはむしろ弱く、保護のための少なくとも６回の免疫化、ならびに年次ブースターを必要とすることはよく知られている。
【０１８７】
本明細書中に記載された組成物において、単独、あるいはいずれかの組合せにおいて、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢまたはｕｖｒＣ遺伝子、またはＮＥＲに関与するいずれかのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ遺伝子は、タンパク質の機能的形態が発現されないように突然変異される。
【０１８８】
その例として、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、またはｕｖｒＣ遺伝子、あるいはＮＥＲに関与するいずれかのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ遺伝子における突然変異は、例えば、実施例７に記載されたように、対立遺伝子交換によって行うことができる。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのｕｖｒ遺伝子は得られた突然変異体株の表現型の標的化欠失および特徴付けを介して同定されていないが、ｕｖｒ遺伝子は、そのｕｖｒ遺伝子が知られている関連生物のゲノムでの相同性サーチを介して同定することができる。例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのゲノム、すなわち、主たる染色体および２つのビルレンスプラスミドはＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓと同一属からの関連細菌と比較することができる。Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ単離体（Ｒｅａｄら２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，２０２８−２０３３）の主な染色体を表すゲノムスカフォールドは、ＡＡＡＣ０１００００００１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓはＮＣ  ０００９６４のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＡ遺伝子はｎｔｓ．３６０９０６４ないし３６１１９９７を含み、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＢ遺伝子はｎｔｓ．３６１２００５−３６１３９９０を含む。  ＢＬＡＳＴサーチは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ配列に対する配列をコードするＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢを用いて行った。この分析は、この生物のｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子に対応するＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのゲノムにおいて７２％配列同一性の領域を同定した。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＡ遺伝子が２２６０２１ないし２２８７８３をマップし、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＡ遺伝子に対して７２％の配列相同性を保有する（２０８２／２８６７同一配列相同性整列）。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＢ遺伝子は２２８８６４ないし２３０７７１をマップし、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｖｒＢ遺伝子に対して７２％配列相同性を保有する（１４０１／１９２５同一配列相同性整列）。かくして、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＡＢ遺伝子はＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの主な染色体のｎｔｓ．２２６０２１ないし２３０７７１を含む。
【０１８９】
主な細菌染色体のｎｔｓ．２２６０２１ないし２３０７７１を含めたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＡＢ遺伝子の欠失は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおけるｕｖｒＡＢ遺伝子の欠失につき実施例７に記載された方法に従って達成することができる。簡単に述べれば、この領域、およびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓゲノムのほぼ１０００ｂｐｓ上流および下流双方をＰＣＲによって増幅し、引き続いて、ｐＫＳＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターにクローン化する。代替法としてＢａｃｉｌｌｕｓ属−特異的またはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ−特異的温度−感受性（ｔｓ）レプリコンは、ｐＫＳＶ７対立遺伝子交換プラスミドベクターに存在するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｔｓレプリコンに代えて置き換えることができる。ｕｖｒＡＢ領域内を特異的にマッピングする便宜な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用い、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢのいずれかの部分、またはｕｖｒＡＢ遺伝子配列の全てを欠失する。最後に、対立遺伝子交換プラスミドをＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに導入し、実施例７に記載されたようにＮＥＲ突然変異体を選択する。いずれかの選択されたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株は、例えば、以下の株：Ａｍｅｓ，Ｖｏｌｌｕｍ、Ａ１．ａ／１０、Ａ１．ｂ／２３、Ａ２／２９、Ａ３．ａ／３４、Ａ３．ｂ／５７、Ａ４／６９、Ｂ８０、Δｓｔｅｒｎｅ、ＶＮ４１Δ１、Ｄａｍｅｓ、ＮＮＲ１Δ１、およびＤＮＨ１を含めた、ＮＥＲ−欠損ワクチンの誘導用の親株として用いることができる。加えて、他の減弱突然変異を選択されたＮＥＲ突然変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株のゲノムに導入して、光化学を遺伝的不活化と組み合せるワクチン組成物を可能とすることができる。そのようなＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓワクチン組成物は、致死因子（ＬＦ）、浮腫因子（ＥＦ）、および保護抗原（ＰＡ）を含めた、ａｎｔｈｒａｘ免疫性および保護の公知の関係に対して免疫応答を誘導することができる。加えて、ＮＥＲ突然変異体ワクチン組成物の発現プロフィールが無傷のままでいるという結果として、２つのビルレンスプラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２および主な染色体から発現されたものを含めた、ａｎｔｈｒａｘ免疫性および保護の他の未知の関係に対する免疫応答も誘導される。
【０１９０】
ワクチンの成分としてＮＥＲ突然変異体を利用する例としてＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを用い、本明細書中に記載された組成物を、皮下、胃腸および呼吸器系を含めた感染の経路に従い、全ての３つのタイプのａｎｔｈｒａｘに対する予防または処置免疫化設定いずれかで用いることができる。さらに、安全かつ効果的なワクチンを誘導するためのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのＮＥＲ突然変異体を生じさせるためのアプローチを採用して、ＮＥＲを利用するいずれかの微生物病原体に対する安全かつ効果的なワクチンを誘導することが認識できる。
【０１９１】
（実施例１０）
（ヒト癌のインビボ処置のための本発明のワクチンの使用）
ヒト癌の処置または予防の例として、微生物核酸が微生物集団の増殖が減弱されるように改変され、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されない微生物集団を含むワクチンが個体に投与される。微生物は実施例７および８のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットは、例えば、実施例８に記載されたｐＰＬ２組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当該分野におけるものに共通したいずれかの方法によって、微生物に取り込まれる。得られた集団は粗製、または好ましくは精製された形態で処方されることができる。それらは、液体懸濁液として調製することができるか、あるいは凍結乾燥し、投与用の適当なキャリアに再懸濁させることができる。加えて、それらは保存剤（例えばチメロサール、フェノキシエタノール）、安定化剤（例えば、ラクトース、グルタミン酸モノナトリウム）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン）、抗生物質（例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン）または他の物質のような添加剤と共に処方することができる。処方は滅菌水、生理食塩水、等張緩衝化生理食塩水（例えば、生理学的ｐＨに緩衝化されたリン酸塩）、または他の適当な希釈剤のような適当な希釈剤に再懸濁または希釈することができる。
【０１９２】
ワクチンは経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下経路、ならびにいずれかの与えられた悪性病または感染症に関連するいずれかの経路を含めた種々の経路によって投与することができる。有効量のワクチンを処置のために個体に投与することができる。治療的処置では、有効量は、所望の免疫応答をもたらす用量であり、ここで、免疫応答は標的化腫瘍の増殖を遅延させ、腫瘍のサイズを低下させ、あるいは好ましくは完全に腫瘍を排除する。ワクチンの投与は適当な間隔で反復することができ、ワクチン接種した個体における複数の区別される部位に同時に投与することができる。予防的処置では、有効量は、癌を発生する個体の確率が有意に低下するように、保護的免疫応答をもたらす用量である。ワクチン接種方法は単一用量よりなることができるか、あるいは保護的免疫応答が確立されるまで適当な間隔で反復することができる。
【０１９３】
個体の治療的処置は、初期処置として癌と診断された個体に対して出発することができ、あるいは他の処置と組み合わせて用いることができる。例えば、腫瘍を外科的に摘出した、あるいは放射線療法で、または化学療法によって処置された個体をワクチンで処置して、個体におけるいずれかの残存する腫瘍を低下または排除することができるか、あるいは癌の再発の危険性を低下させることができる。個体の予防的処置は、環境の条件または遺伝的素因いずれかの他の、ある種の癌を縮小させる増大した危険性を有する個体に対して開始される。
【０１９４】
（実施例１１）
（Ｓ−５９ソラレンＵＶＡ処置に続く、ｕｖｒＡＢ突然変異を持つおよび持たないＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０２９の抗原提示）
実施例７のＬｉｓｔｅｒｉａ株ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ突然変異体クローンを改変して、実施例８の手法を用いてＯＶＡ抗原を発現させた。この株およびＯＶＡを発現するように改変されたＤＰ−Ｌ４０２９を、種々の濃度にてソラレンＳ−５９で処理した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は３７℃にて一晩増殖させ、２ｍＬアリコットを１００ｍＬのＢＨＩに希釈し、３７℃にてほぼ４時間、０．５のＯＤ６００（ほぼ１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）まで増殖させた。各Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の５ｍＬアリコットを１５ｍＬ試験管に加え、２３００×ｇにて２０分間遠心し、上清を除去し、細菌を５ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、ほぼ１×１０９ＣＦＵ／ｍＬが得られた。ｕｖｒＡＢ突然変異体株については、３ｍＭ  Ｓ−５９ストックを１０ｍＬ  ＰＢＳまで３３．３μＬ希釈して、１０μＭ溶液が得られ、これの適当なアリコットを１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｎＭの最終濃度までＬｉｓｔｅｒｉａに添加し、他方、ＤＰ−Ｌ４０２９では、Ｓ−５９を５ｍＬの最終容量中の１００、２００、４００、８００および１０００ｎＭの最終濃度まで添加した。これらを６ウェル培養プレートまで移し、０．５Ｊ／ｃｍ２の用量で照射した（ＦＸ１０１９ＵＶＡデバイス）。サンプルを１５ｍＬ試験管に移し、５ｍＬのＰＢＳを加え、それらを２３００×ｇにて２０分間遠心して、未処理ソラレンを洗浄した。上清を除去し、細菌を５ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、新しい６ウェルプレートに移した。これらを５．５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ量にて照射して、ソラレンモノアダクトを架橋に変換した。また、各Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のサンプルを、７２℃にて３時間処理することによって加熱死滅させた。ｌｏｇ力価およびＯＶＡ抗原提示は実施例１のように評価した。Ｓ−５９処理サンプルについての結果は表１２Ａおよび図９Ａおよび９Ｂに見出される（バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、ＤＣ２．４細胞当たり１のＬｉｓｔｅｒｉａにおける抗原提示）。双方の加熱死滅させた株についての結果は、検出限界未満の力価を示し（完全な不活化、加熱死滅させた細菌はＢ３ＺアッセイにおいてＯＶＡ抗原を提示しなかった。結果は、ｕｖｒＡＢ突然変異体は検出限界まで増殖の減弱でさえ非常に強い抗原提示を示すことを示し、ここで、非ｕｖｒＡＢ突然変異体株は（実質的に完全な不活化でのほぼバックグラウンドレベルまでの）増殖の減弱の関数として抗原提示の大きな低下を示す。これは、ｕｖｒＡＢ突然変異体がソラレン減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａの意味でＭＨＣクラスＩ提示を保持し、有効な免疫応答および有意に増大したレベルの安全性を伴ってワクチンを提供するはずであることを示す。
【０１９５】
（表１２Ａ  種々の濃度のソラレンＳ−５９で処理したＬｉｓｔｅｒｉａ株ＵＶＡのｌｏｇ減弱およびＯＶＡ抗原提示）
【０１９６】
【表１２Ａ】
2006521376.tif 000013
【０１９７】
＊ＤＣ２．４細胞当たり１のＬｉｓｔｅｒｉａにおいて測定された未処理のパーセント
もう１つの実験は同一の株を用いて行った。この実験では、Ｌｉｓｔｅｒｉａを３７℃にて一晩ＢＨＩ中で増殖させた。これらをＢＨＩに１：５０希釈し、３７℃にて３００ｒｐｍで０．５のＯＤ６００まで増殖させ、その時点で、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を表１２Ｂに示したレベルまで加えた。これらのサンプルは３７℃にて３００ｒｐｍにおいてほぼ１時間インキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０、ほぼ１×１０９／ｍＬ）。１ｍＬアリコットを除去して、力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２の量にて照射した（ＦＸ１０１９）。力価後照射を各サンプルにつき決定し、ＯＶＡ抗原提示を前記したように評価した。結果は表１２Ｂおよび図９Ｃおよび９Ｄに見出される（バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、ＤＣ２．４細胞当たり１０のＬｉｓｔｅｒｉａにおける抗原提示）。結果は、親株については、抗原提示がバックグラウンドレベルにあり、そこでは、実質的に完全な不活化があり、他方、ｕｖｒＡＢ突然変異体では、ほぼ１０倍範囲のＳ−５９濃度があり、それを超えて、適切な抗原提示と共に実質的な完全な不活化があることを示す。
【０１９８】
（表１２Ｂ  細菌の増殖の間に種々の濃度の存在するフソラレンＳ−５９で処理したＬｉｓｔｅｒｉａ株ＵＶＡのｌｏｇ減弱およびＯＶＡ抗原提示）
【０１９９】
【表１２Ｂ】
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【０２００】
＊ＤＣ２．４細胞当たり１０のＬｉｓｔｅｒｉａで測定した未処理のパーセント
（実施例１２）
（ＤＰ−Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢと比較したＳ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９におけるタンパク質合成）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９およびＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢを３７℃にて一晩ＢＨＩ中で増殖させた。これらをＢＨＩへ１：５０希釈し、３７℃にて３００ｒｐｍにおいて０．５のＯＤ６００まで増殖させ、その時点において、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を４０２９については２５００ｎＭのレベルまで、４０２９ｕｖｒＡＢ突然変異体株については２００ｎＭのレベルまで加えた。これらのサンプルを３７℃にて３００ｒｐｍにおいてほぼ１時間インキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０）。１ｍＬアリコットを除去して、力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２の量にて照射した（ＦＸ１０１９）。力価後照射を各サンプルについて測定して、不活化のレベルを評価し、その結果、実質的に完全な不活化が得られた。この処置は、双方の株についての検出の限界まで不活化を提供するほぼ最低のＳ−５９量であることが決定された。各株については、ＯＤ６００−対−力価ＣＦＵ／ｍＬ増殖曲線に基づいて、１×１０１０細菌を１５ｍＬ遠心管に移した。サンプルを２３００×ｇにおいて４℃にて２０分間遠心し、上清を除去し、ペレットを５０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。これを合計３回の洗浄のために反復した。最終ペレットをメチオニンまたはシステイン（Ｇｉｂｃｏ）を含まない２ｍＬのＤＭＥＭに懸濁させ、３０分間振盪しつつ５％ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃でインキュベートした。サンプルを１６００ｒｐｍにて２分間、２ｍＬ遠心管中で遠心し、上清を除去し、メチオニンまたはシステインを含まない２ｍＬのＤＭＥＭを加えた。３５Ｓメチオニン−システインの８０μＣｉアリコットを加え（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンプルを３０分間振盪しつつ、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。サンプルを前記したように遠心し、上清を除去した。各上清の５０μＬアリコットをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮｕＰａｇｅ４ないし１２％ビス−トリスゲル）上へと隣接するレーンに負荷し、１００ボルトにてほぼ１．５時間泳動させた。ゲルを１０％酢酸および３０％エタノールで固定し、次いで、エンハンサー（Ｅｎｌｉｇｈｔｎｉｎｇ、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に１５分間浸漬させた。ゲルを８０℃にて３時間乾燥し、Ｘ−線フィルムへの暴露によって可視化した。２つの実験についての結果を図１０に示し、これは、ｕｖｒＡＢ突然変異体株におけるかなりのタンパク質合成を示し、他方、親株は限定されたタンパク質合成を示すことを示す。
【０２０１】
（実施例１３）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖の間における存在するＳ−５９の有りまたは無しにてのＳ−５９／ＵＶＡ不活化の比較）
２つの不活化方法を、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の不活化に関して比較した。第一の方法においては、Ｌｉｓｔｅｒｉａを３００ｒｐｍにおいて３７℃にて一晩ＢＨＩ中で増殖し、次いで、ＢＨＩへ１：５０希釈し、３７℃にて３００ｒｐｍにおいて０．７ないし１．００のＯＤ６００まで増殖させた。これらを遠心し、１％ＢＳＡを含むＢＳ中へ１×１０９／ｍＬのレベルまで懸濁させた。Ｓ−５９を親株については１２０ｎＭのレベルまで、およびｕｖｒＡＢ突然変異体株については３０ｎＭのレベルまで加えた。サンプルを氷上でほぼ６０分間インキュベートし、次いで、１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２の量にて照射した（ＦＸ１０１９）。第２の方法においては、Ｌｉｓｔｅｒｉａを同様に０．５のＯＤ６００まで増殖させ、その時点で、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を親株については２５００ｎＭのレベルまで、およびｕｖｒＡＢ突然変異体株については２００ｎＭのレベルまで加えた。これらのサンプルを３７℃にて３００ｒｐｍにおいてほぼ１時間インキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０、ほぼ１×１０９／ｍＬ）。１ｍＬアリコットを取り出して、力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、第一の方法のように照射した。力価後照射を各サンプルにつき決定し、その結果、全てのサンプルについて増殖の実質的に完全な阻害がもたらされた（＞８ｌｏｇ不活化）。ＤＰ−Ｌ４０２９−対−ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ、第二の方法によって処理されたほぼ１×１０１１細菌を含む全サンプルでなされた実験においては、全サンプルを平板培養し、これは、親株についてはほぼ９ｌｏｇ死滅、およびｕｖｒＡＢ突然変異体については＞１０ｌｏｇ死滅を示す。Ｌｉｓｔｅｒｉａの４つの異なる調製物についての結果を表１３に掲げる。
【０２０２】
（表１３  Ｓ−５９／ＵＶＡでのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−およびａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−の不活化、ｌｏｇ力価不活化を評価するための全サンプルの測定）
【０２０３】
【表１３】
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【０２０４】
１つの実験では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９−ＯＶＡおよびＤＰ−Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡを用いて２つの方法を比較した。サンプルを前記したように調製し、２３００×ｇにおいて２０分間遠心し、上清を除去し、細菌をＰＢＳで１回洗浄した。遠心およびＰＢＳ洗浄液を除去した後、最終ペレットをＰＢＳ中の８％ＤＭＳＯに再懸濁し、次いで、液体窒素またはドライアイスいずれかを用いて低温−バイアル中で凍結させ、−８０℃にて貯蔵した。３つのマウス（Ｃ５７Ｂ１／６）の組を２００μｌ中の１×１０８Ｌｉｓｔｅｒｉａを静脈内注射した（ＨＢＳＳにほぼ１：４０希釈した凍結ストック）。Ｓ−５９／ＵＶＡ処理株に加えて、生きたおよび加熱死滅させたＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ、ならびにＨＢＳＳコントロールで注射をなした。２つのＳ−５９方法の比較のために、マウスを０日に注射した。第２の方法によって調製されたサンプルでは、さらなる組のマウスに第２日および３日または第２日、３日、４日および５日のいずれかに再度注射した。全てのマウスをワクチン接種から７日後に犠牲にし、分析のために脾臓を摘出した。脾臓細胞を実施例５に記載されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＯＶＡ特異的免疫応答につき評価し、ＳＬ８（ＯＶＡ特異的）で細胞集団を刺激した。結果を図１１Ａに示し、これは、親株およびｕｖｒＡＢ突然変異体双方につき、第２の方法によって調製されたＬｉｓｔｅｒｉａの結果、第一の方法によって調製された株についてよりも優れたＯＶＡ特異的免疫応答をもたらす。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、また、ＬＬＯクラスＩＩ抗原ＬＬＯ１９０、またはクラスＩ抗原ＬＬＯ２９６を用いる刺激によって行った。全ての３つの抗原を比較するＥＬＩＳＰＯＴ結果を図１１Ｂに示し、これは、ＬＬＯ特異的ＣＤ４＋応答がＯＶＡ特異的応答と同様であることを示す。また、脾臓細胞を実施例５に記載されたようにＩＣＳによって評価し、ＳＬ８、ＬＬＯ１９０、またはＬＬＯ２９６いずれかで刺激した。結果を図１２ＡないしＣに示し、これは、第２の方法におけるＯＶＡおよびＬＬＯ双方についてのより強力な免疫応答を示す。また、データは、親株よりも優れたｕｖｒＡＢ株についての改良された応答を示す。双方の株において、連続日でのさらなるワクチン接種の結果、ＯＶＡおよびＬＬＯ抗原双方に対する改良された応答がもたらされる（１日−対−３日）
もう１つの実験において、ＤＰ−Ｌ４０２９およびＤＰ−Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢ株を、マウスにおける野生型挑戦に対して保護的免疫性を供するその能力につき評価する。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＨＢＳＳ、ＤＰ−Ｌ４０５６野生型（＋／−加熱死滅）、ＢＰ−Ｌ４０２７（ＬＬＯ欠失）、ＤＰ−Ｌ４０２９  Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（前記した第一および第二の方法）、ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ  Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（前記した第一および第二の方法）にて、表１４に記載された群にてワクチン接種した。ワクチン接種から２７日後、群当たり３匹のマウスに２×ＬＤ５０を挑戦させ、群当たり６匹のマウスに、１００×ＬＤ５０の野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを挑戦させた。挑戦から３日後に、２×ＬＤ５０を挑戦させたマウスを犠牲にし、脾臓および肝臓を摘出し、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖のために培養した。各マウスからの脾臓または肝臓を、０．５％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含む滅菌蒸留水中でホモゲナイズした。系列１０倍希釈をストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＢＨＩ寒天プレート上で平板培養し、３７℃において一晩インキュベートした。脾臓または肝臓当たりのコロニー形成単位の数を、野生型挑戦に対する免疫性のサンプルとして測定した。図１３Ａ、Ｂは、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理サンプルがＨＢＳＳ（非−ワクチン接種）コントロールと比較した器官当たりＣＦＵ中ほぼ３ｌｏｇ低下を与えることを示し、サンプルは第二の方法によって調製されたのであり、これは、第一の方法で調製されたＣＦＵのより大きな低下を示す。加えて、処理されたｕｖｒＡＢ突然変異体株は、処理された親株よりもわずかに良好なＣＦＵ低下を示す。ＣＦＵ低下は野生型でのワクチン接種と同程度に良好ではないが、Ｓ−５９／ｕｖａ処理株はＣＦＵの低下につきいくらか効果を示し、これは、保護的免疫性と大いに相関する。１００×ＬＤ５０で挑戦された６匹のマウスを１０日間生存につきモニターし、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種したマウスのみが生存した。
【０２０５】
（表１４  ２つのＳ−５９／ＵＶＡ方法を比較する保護的免疫性の評価についてのＢａｌｂ／ｃマウスの投与）
【０２０６】
【表１４】
2006521376.tif 000016
【０２０７】
さらなる実験は、ＨＢＳＳ、ＤＰ−Ｌ４０５６野生型（＋／−加熱死滅）、ＤＰ−Ｌ４０２７（ＬＬＯ欠失）、ＤＰ−Ｌ４４０６ａｃｔＡ（ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ欠失二重突然変異体、２００３年１０月３日に寄託、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５６２）、ＤＰ−Ｌ４０２９＋Ｓ−５９／ＵＶＡ（第二の方法）、ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ＋／−Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（第二の方法のみ）または＋加熱死滅を用いてＢａｌｂ／ｃマウスにおいて行い、ここで、ワクチン接種はＳ−５９および加熱死滅株では毎日、１日、３日または５日間行った。投与は表１５にまとめる。最初のワクチン接種から２９日後に、各群からの３匹のマウスを２０×ＬＤ５０で調製し、各群からの６匹に１００×ＬＤ５０の野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにて挑戦した。これらのマウスを生存につき１０日間モニターした。最初のワクチン接種から３２日後、各群からの３匹のマウスに２×ＬＤ５０の野生型で挑戦し、３日後に犠牲にし、脾臓および肝臓を摘出し、Ｌｉｓｔｅｒｉａの増殖につき培養した。加えて、マウス血清の抗−Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体力価を、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことによって評価した。炭酸水素ナトリウム緩衝液中の凍結された粉砕Ｌｉｓｔｅｒｉａを平板培養し、系列希釈にてワクチン接種したマウスからの血清と共にインキュベートし、次いで、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗−マウス抗体で結合した抗体を検出した。ＨＲＰ基質を添加し、色変化を定量的に測定することによって抗体のレベルを測定した。これらをナイーブなマウスと比較してＬｉｓｔｅｒｉａ特異的抗体を評価し、そこでは、もしナイーブ血清サンプルの測定を１標準偏差上回るとサンプルをＬｉｓｔｅｒｉａにつき陽性と考えた。脾臓または肝臓当たりのＣＦＵの結果を図１４Ａ、Ｂに示し、抗−Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体力価を図１５に示し、生存の結果を図１６に示す。この実験は、３または５ワクチン接種でのＳ−５９処理ｕｖｒＡＢ株の良好なＣＦＵ低下および保護免疫性を示し、未処理ｕｖｒＡＢ株のそれに近づき、野生型株とほとんど同程度に効果的である。
【０２０８】
（表１５  Ｓ−５９／ｕｖａ処理株での保護的免疫性、多重ワクチン接種の評価のためのＢａｌｂ／ｃマウスの投与）
【０２０９】
【表１５】
2006521376.tif 000017
【０２１０】
（実施例１４）
（マウスモデルにおいてＳ−５９／ＵＶＡ処理株を用いる免疫寛容の破壊の証明）
実施例１３の第二の方法に従い、Ｇｐ−７０−ＡＨ１Ａ５およびＯＶＡを発現するＤＰ−Ｌ４０２９およびＤＰ−Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢ株をＳ−５９／ｕｖａ処理した。Ｇｐ−７０はＣＴ−２６腫瘍細胞によって発現されるオートロガスマウス抗原である。ＡＨ１Ａ５は、生きた株において発現されると免疫応答を誘導することが示されている天然配列の単一塩基突然変異である（ＡＨ１ペプチドはＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号：２０）、ＡＨ１Ｈ５ペプチドはＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：２１））である。予防免疫化実験では、表１６に従い、Ｂａｌｂ／ｃマウスを８匹のマウスの群にて静脈内ワクチン接種した（１００μＬ）（ワクチン接種の最初の組から７日後に、群当たり３匹のマウスを犠牲にし、脾臓を収集した）。最初のワクチン接種から２１日後に、群当たり残りの５匹のマウスを１×１０５ＣＴ−２６結腸上皮腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）で静脈内注射し、生存につきモニターした。
【０２１１】
（表１６  ワクチン株および処理方法）
【０２１２】
【表１６】
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【０２１３】
収集された脾臓細胞のＴ細胞集団を、細胞を刺激するためにＬＬＯ９１、ＡＨ１、ＡＨ１／Ａ５ペプチドまたはＰ８１５およびＣＴ２６細胞（１５０ｍＭ  Ｓ−５９および３Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡで完全に不活化）を用い、実施例５に従い、ＩＣＳによって評価した。Ｐ８１５細胞をＣＴ２６全細胞刺激についての陰性コントロールとして供する。というのは、Ｐ８１５はｇｐ７０抗原を発現しないからである。結果を図１７に示し、これは、処理されたｕｖｒＡＢと突然変異体が、さらなるワクチン接種で改良することができるＡＨ１Ａ５またはＡＨ１特異的応答をもたらすことを示す。また、実施例５に従い、細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。細胞をＡＨ１Ａ５またはＡＨ１ペプチドいずれかで刺激した。結果を図１８Ａ、Ｂに示し、これはｕｖｒＡＢ突然変異体株でのＡＨ１Ａ５およびＡＨ１双方に対する免疫応答を示す。
【０２１４】
（実施例１５）
（ｕｖｒＡＢ欠失を持つソラレン減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を用いるマウスの治療的ワクチン接種）
Ｃ５７Ｂ１／６マウスを用い、Ｂ１６．Ｆ１０，ＭＯ５．１０．Ｈ３（ＯＶＡ＋、これはＯＶＡ発現に対して増大した均一性を有する実施例４で用いた細胞のサブクローンである）メラノーマ腫瘍細胞をマウスに注射して（１００μＬのＨＢＳＳ  ＩＶ中１×１０６）、肺転移を確立した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９−ＯＶＡ、ＤＰ−Ｌ４０２７−ＯＶＡ、ＤＰ−Ｌ４０３８−ＯＶＡ（ａｃｔＡ／４６１Ｔ二重突然変異体）、およびＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡを１０匹のマウスのワクチン接種群で用いた。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ株をＳ−５９処理の有り、無しにて用い（実施例１３の最初の方法により＞８ｌｏｇ死滅）、加熱死滅させたＤＰ−Ｌ４０２９−ＯＶＡをＨＢＳＳのみと共にコントロールで用いた。マウスを、表１６で与えられた用量での腫瘍移植から３日後にワクチン接種した（ＨＢＳＳ中１００μＬＩＶ）。腫瘍移植から３０日後に、群当たり５匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残り５匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移の数およびメジアン生存日数を表１７に示す。ａｃｔＡ−、ａｃｔＡ−ＯＶＡ、およびａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ  Ｓ−５９／ＵＶＡ処理および加熱死滅についての肺を図１９Ａに示し、肺転移の数を図１９Ｂにプロットし、生存を図１９Ｃにプロットする。このデータは、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理ｕｖｒＡＢ突然変異体が治療ワクチンとして投与でき、それにより、非−ワクチン接種加熱死滅コントロール、またはＯＶＡなくしてのＤＰ−Ｌ４０２９と比較して有意に低下した肺転移および拡大された生存をもたらすことを示す。
【０２１５】
（表１７  ＯＶＡ肺腫瘍モデルにおけるマウスの治療的ワクチン接種）
【０２１６】
【表１７】
2006521376.tif 000019
【０２１７】
（実施例１６）
（ｇｐ７０マウス抗原を発現するＳ−５９不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株での治療的ワクチン接種）
Ｂａｌｂ／ｃマウスを用い、ヒト抗原（該ヒト抗原は本実験とは無関係である）を発現するように改変された（ＡＨ１を発現する）ＣＴ２６腫瘍細胞をマウスに注射して（ＨＢＳＳ中１００μＬ  ＩＶに２×１０５）、肺転移を確立した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９、ＤＰ−Ｌ４０２９−ＡＨ１Ａ５、ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＡＨ１Ａ５、およびＤＰ−Ｌ４４０６ａｃｔＡ−ＡＨ１Ａ５  （ａｃｔＡ／ｉｎｌＢ二重突然変異体）を、１３匹のマウスのワクチン接種群で用いた。ＡＨ１Ａ５株もまたＯＶＡ抗原を発現する。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−ＡＨ１Ａ５株を処理、加熱死滅またはＳ−５９処理なくして用いた（実施例１３の第二の方法による）。マウスをワクチン接種し（１００μＬ  ＨＢＳＳ  ＩＶ）、表１８に従って腫瘍移植後４日に始めた。腫瘍移植から１９日後に、群当たり３匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残りの１０匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移についての結果を図２０Ａ（肺の絵）および２０Ｂ（プロットした肺転移の数）に示し、生存を表１８および図２０Ｃ（ΔａｃｔＡサンプル）および２０Ｄ（ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢサンプル）に示す。ＡＨ１Ａ５抗原は、いずれかの免疫化効果がマウスにおいて免疫寛容を破壊するであろうように、マウスに対して内因性である。結果は、Ｓ−５９処理ｕｖｒＡＢ突然変異体株がマウスにおいて寛容を破壊でき、その結果、有意に低下された肺転移および延長された生存をもたらすことを示す。単一ワクチン接種と比較して３日間にわたってワクチンを投与した場合に、治療的効果が改良される（３日間にわたって送達された合計用量は単一日に等しい）。
【０２１８】
（表１８  ＡＨ１Ａ５を発現するように改変されたＬｉｓｔｅｒｉａを用いるマウスの治療的ワクチン接種）
【０２１９】
【表１８】
2006521376.tif 000020
【０２２０】
（実施例１７）
（蛍光顕微鏡を用いる樹状細胞におけるＳ−５９／ｕｖａ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ局所化の評価）
抗原提示細胞内のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの接種および分布は、蛍光顕微鏡によって評価した。樹状細胞系ＤＣ２．４は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１×非−必須アミノ酸（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、５×１０４Ｉ．Ｕ．ペニシリン／５×１０４μｇストレプトマイシン（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１ｎＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を補足した完全なＲＰＭＩ培地、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中にて、皿当たり５×１０５細胞にてペトリ皿中でカバーグラス上で培養し、３７℃にて一晩インキュベートした（これは他の細胞系、例えば、マクロファージＪ７７４で同様に行うことができた）。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  株（ＤＰ−Ｌ４０５６、ＤＰ−Ｌ４０２７（ＬＬＯ−）およびＤＰ−Ｌ４０５６ｕｖｒＡＢ）の静止相培養物は、３ｍＬのＢＨＩ培地に細菌コロニーを接種し、３０℃にて一晩増殖させることによって調製した。
【０２２１】
Ｌｉｓｔｅｒｉａの一晩培養物を新鮮なＢＨＩ培地中に１：２０希釈し、３０℃における静止相培養物を０．５ないし０．６のＯＤ６００まで増殖させた。ＤＰ−Ｌ４０５６およびＤＰ−Ｌ４０５６ｕｖｒＡＢ株についての一晩培養物のほぼ１ｍＬも７２℃にて３ないし４時間加熱死滅させた。実施例１３の第二の方法に従って調製された、ソラレン不活化ＤＰ−Ｌ４０５６およびＤＰ−Ｌ４０５６ｕｖｒＡＢ  Ｌｉｓｔｅｒｉａの凍結ストックを解凍し、３７℃にて１時間、静止相で回収した。感染に先立ち、全てのＬｉｓｔｅｒｉａ調製物のＯＤ６００読みが得られ、カバーグラス当たりのＤＣ２．４細胞の数をカウントし、各株についての感染の多重度（ＭＯＩ，ＤＣ２．４細胞当たりの細菌の数）を計算した。新鮮なｌｏｇ相培養物を用いて、５のＭＯＩにて細胞を感染させ、加熱−死滅させた培養物を２０のＭＯＩで用い、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理株を１０のＭＯＩで用いた。
【０２２２】
カバーグラスを２４ウェル皿に移し、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを欠くＲＰＭＩで３回洗浄し、所望のＭＯＩを与えるＬｉｓｔｅｒｉａ株の適当な希釈物を、３７℃にて３０分間、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐフリー培地中で細胞と共にインキュベートした。次いで、カバーグラスをＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐフリー培地で３回洗浄し、３７℃にてさらに３０分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、カバーグラスを洗浄し、３７℃にて４時間、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に培地中でインキュベートした。次いで、カバーグラスをＰＢＳ中で洗浄し、室温にて１５分間に、３．５％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定した。固定の後、カバーグラスをＴＢＳ−Ｔｘ緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００）で洗浄／浸透化し、室温にて１５分間、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔｘ中でブロックした。カバーグラスを、室温にて３０分間、ウサギ抗−Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｏ抗原  抗−血清（Ｄｉｆｃｏ）で染色し、ＴＢＳ−Ｔｘ緩衝液中で洗浄した。次いで、サンプルをフルオレセイン標識抗−ウサギ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、アクチンをローダミン−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。カバーグラスをＴＢＳ−Ｔｘ中で洗浄し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩ−ハードセット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中のスライド上に設置して、細胞核につき染色した。スライドを少なくとも８時間乾燥し、細胞をＮｉｋｏｎ  ＴＥ３００−Ｕ倒立顕微鏡で可視化した。ＣＣＤ  Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ４７４２−９５−１２ＮＲカメラを用いてイメージを撮影し、Ｐｈａｓｅ  ３  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＩｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。
【０２２３】
３つのイメージを各視野につき撮影した：１つはＵＶ−２Ｅ／Ｃフィルター（ＣＨＲＯＭＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ，ＤＡＰＩ／核を可視化する）を用い、第２のものはＨＹＱ  ＴＲＩＴＣフィルター（ＣＨＲＯＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ，アクチンを可視化）のものであり、第３のものはＢ−１Ａ（ＨＹＱ−ＦＩＴＣ）フィルター（ＣＨＲＯＭＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ，Ｌｉｓｔｅｒｉａを可視化）を用いるものであった。次いで、３つのイメージを合体させて、Ｌｉｓｔｅｒｉａについての染色がアクチンについての染色と共局所化するか否かを判断した。ファゴリソソームから逃げることができないＬｉｓｔｅｒｉａは緑色で出現し、他方、サイトゾルから逃げることができるものはアクチンを核形成できるものであり、従って、アクチン（赤色）およびＬｉｓｔｅｒｉａ（緑色）の共局所化のため黄色に出現した。リソソームから逃げることができるＬｉｓｔｅｒｉａのパーセンテージを定量するために、視野中のＬｉｓｔｅｒｉａの合計数をカウントし、黄色に出現したＬｉｓｔｅｒｉａの数を、黄色細菌をカウントすることによって、あるいはローダミンイメージからのアクチンの存在を確認することによって決定した（図２１Ａ参照）。ファゴリソソームを逃げるＬｉｓｔｅｒｉａの数は、カウントしたＬｉｓｔｅｒｉａの合計数で割り、ファゴリソソーム逃避のパーセンテージを、表１９に報告し、図２１Ｂに表すように計算した。結果は、加熱死滅株およびＳ−５９／ＵＶＡ処理野生型株はＬＬＯ−株のように振る舞い、すなわち、ファゴリソソームから逃避することができず、他方、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理したｕｖｒＡＢ突然変異体はファゴリソソームから逃避する実質的能力を示すことを示す。
【０２２４】
（表１９  ＤＰ−Ｌ４０５６（＋／−Ｓ−５９／ＵＶＡ、加熱死滅）、ＤＰ−Ｌ４０２７、およびＤＰ−Ｌ４０５６ｕｖｒＡＢ（＋／−Ｓ−５９／ＵＶＡ、加熱死滅）についてのファゴリソソームから逃げるＬｉｓｔｅｒｉａのパーセンテージ）
【０２２５】
【表１９】
2006521376.tif 000021
【０２２６】
（実施例１８）
（グラム染色を用いるＳ−５９ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｕｖｉＡＢ−株の可視化）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの野生型およびｕｖｒＡＢ−株を０．５のＯＤ６００まで増殖させ、その時点で、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を野生型株については２５００ｎＭのレベルまで添加し、ｕｖｒＡＢ−突然変異体株については２００ｎＭのレベルまで添加した。これらのサンプルを３００ｒｐｍにおいて３７℃にてほぼ１時間インキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０、ほぼ１×１０９／ｍＬ）。１ｍＬアリコットを取り出して力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２（ＦＸ−１０１９）のＵＶＡ量にて照射し、その結果、双方の株について＞８ｌｏｇ不活化が得られた。処理した株を実施例１３に記載したように貯蔵凍結した。これらを解凍し、ｍＬ当たりほぼ１ないし２×１０９の濃度にて１５ｍＬの試験管中のＢＨＩ培地に１：１０希釈した。これらを３７℃にて３００ｒｐｍでインキュベートし、０、２、４、６、８時間および一晩（ほぼ１８時間）にてアリコットを取り出した。該アリコットをスライドグラス上に広げ（ほぼ５０μＬ）、風乾した。火炎を３回通すことによってスミヤを加熱固定し、次いで、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｇｒａｍ  Ｓｔａｉｎキット（カタログ番号２８２−４０７）を用いてグラム染色前に冷却した。スライドを顕微鏡で観察し、写真を撮り、ネガイメージを図２２に示す。これは、処理された修復欠損株のユニークな性質を示し、これは、遺伝子発現を示す鎖を示すが、細菌が増殖しないように分裂できない。
【０２２７】
（実施例１９）
（さらなる突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の構築）
突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の調製。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は１０４０３Ｓ（Ｂｉｓｈｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２００５（１９８７））に由来した。示された遺伝子のイン−フレーム欠失を持つＬｉｓｔｅｒｉａ株はＳＯＥ−ＰＣＲおよび確立された方法での対立遺伝子交換によって生じさせた（Ｃａｍｉｌｌｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３（１９９３））。突然変異体株ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ（ＤＰ−Ｌ４０１７）は、引用してここに一体化させるＧｌｏｍｓｋｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５６：１０２９（２００２）に記載されている。ａｃｔＡ−突然変異体（ＤＰ−Ｌ４０２９）は、そのプロファージで治癒されている、ここに引用してその全体を援用する、Ｓｈｏｂｌｅら、Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５０：５２７−５３７（２０００）に記載されているＤＢ−Ｌ３０７８株である（プロファージ治癒は（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７（２００２）；米国特許公開番号２００３／０２０３４７２）に記載されている）。ＬＬＯ−突然変異体（ＤＢ−Ｌ４０２７）（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８４：４１７７−４１８６（２００２））、およびＬＬＯ  Δ２６（ＤＰ−Ｌ４０４２）（Ｄｅｃａｔｕｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２（２０００））もまた従前に記載されている。ａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−株の構築は、Ｌ４０２９／ｕｖｒＡＢ（例えば、その出願の実施例７参照）として、２００３年２月６日に出願された同時係属米国仮出願６０／４４６，０５１に記載されている。ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ（ａｃｔＡ−／ｕｖｒＡＢ−）は２００３年１０月３日にＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−５５６３の受託番号が与えられた。
【０２２８】
対立遺伝子交換によるＬｉｓｔｅｒｉａからのｉｎｌＢの欠失に代えてのｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｉｎｌＢの構築。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０２９からの（または他の選択された突然変異体株からの、または野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａからの）ｉｎｌＢの欠失は、Ｃａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１４３−１４７（１９９３）によって記載されているように、対立遺伝子交換によって行うことができる。重複ＰＣＲを用いて、対立遺伝子交換手法で用いる構築体を調製することができる。インターナリンＢ遺伝子の源は、ここに引用してその全体を援用する、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＬ５９１９７５（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ、完全なゲノム、セグメント３／１２；ｉｎｌＢ遺伝子領域：ｎｔｓ、９７００８−９８９６３）としてリストされた配列および／またはＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ  ００３２１０（Ｌｉｓｔｅｒｉａ
ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＥＧＤ，完全なゲノム、ｉｎｌＢ遺伝子領域；  ｎｔｓ．４５７００８−４５８９６３）としてリストされた配列である。
【０２２９】
一次ＰＣＲ反応において、各々、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｌＢ遺伝子の５’および３‘末端から上流および下流の配列のほぼ１０００ｂｐｓを、以下の鋳型およびプライマーを用いて増幅する：
鋳型：ＤＰ−Ｌ４０５６またはＤＰ−Ｌ４０２９ゲノムＤＮＡ
プライマー対１（ｉｎｌＢの５’末端から上流の領域の増幅用）：
Ｌｍ−９６０３  １Ｆ：
【０２３０】
【化１】
2006521376.tif 000022
【０２３１】
（配列番号：２２）（Ｔｍ：７２℃）
Ｌｍ−（３‘ｉｎｌＢ−Ｒ＋）９７０２０Ｒ：
【０２３２】
【化２】
2006521376.tif 000023
【０２３３】
（配列番号：２３）（Ｔｍ：１１４℃）
（ＩｎｌＢカルボキシ末端の下流の領域に相補的な下線を施した配列）
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：１００７）
プライマー対２（ｉｎｌＢの３‘末端から下流の領域の増幅用）：
Ｌｍ（５‘ｉｎｌＢ−Ｆ＋）９８９１１Ｆ：
【０２３４】
【化３】
2006521376.tif 000024
【０２３５】
（配列番号：２４）（Ｔｍ：１１８℃）（下線を施した配列はＩｎｌＢアミノ末端の上流の領域に相補的である）
Ｌｍ−９９９７０Ｒ：
【０２３６】
【化４】
2006521376.tif 000025
【０２３７】
（配列番号：２５）（Ｔｍ：７４℃）
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：１０７４）
二次ＰＣＲ反応において、一次ＰＣＲアンプリコンは、対１からの逆方向プライマーおよび対２の順方向プライマーの間の相補性を利用し、重複ＰＣＲを介して融合させる。この結果、配列：ｎｔｓ．９７０２１−９８９１０＝１８８９ｂｐｓをコードするｉｎｌＢの正確な欠失がもたらされる。以下の鋳型およびプライマーは二次ＰＣＲ反応で利用した：
鋳型：清浄された一次ＰＣＲ反応
プライマー対：
Ｌｍ−９６０４３Ｆ：
【０２３８】
【化５】
2006521376.tif 000026
【０２３９】
（配列番号：２６）（Ｔｍ：７４℃）
Ｌｍ−９９９６４Ｒ：
【０２４０】
【化６】
2006521376.tif 000027
【０２４１】
（配列番号：２７）（Ｔｍ：７４℃）
（アムプリコンサイズ（ｂｐｓ）：２０３３）
構築プロセスを完成するためのプロトコルは以下の通りである：
一次ＰＣＲ反応（３温度サイクル）を、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）および１０μｌの洗浄された３０℃  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０５６またはＤＰ−Ｌ４０２９一晩培養物を用いて行う。１％アガロースゲルによるＬｉｓｔｅｒｉａアンプリコンの予測されるサイズ（１００７ｂｐｓおよび１０７４ｂｐｓ）。一次ＰＣＲ反応をゲル精製し、ＤＮＡはＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１）で溶出する。
【０２４２】
二次ＰＣＲ反応は、鋳型として各一次反応物のほぼ等量（約５μｌ）を利用して行う。二次ＰＣＲ反応からのＬｉｓｔｅｒｉａアムプリコンの予測されるサイズは１％アガロースゲル（２０３３ｂｐｓ）によって証明される。Ａｄｅｎｏｓｉｎ残基はＴａｑポリメラーゼにてＬｉｓｔｅｒｉａ  ｄｌ  ｉｎｌＢアンプリコンの３‘に加える。
【０２４３】
次いで、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｄｌ  ｉｎｌＢアンプリコンをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入する。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｄｌ  ｉｎｌＢプラスミドＤＮＡをＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、２１２３ｂｐ断片をゲル精製する。ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ  ２１２３ｂｐ断片を、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩでの消化およびＣＩＡＰでの処理によって調製されているｐＫＳＶ７ベクターに挿入する（ｐＫＳＶ７−Ｄｌ  ｉｎｌＢ）。［正しいか？］。次いで、ｐＳＫＶ７−ｄｌｉｎｌＢにおけるｉｎｌＢ配列の忠実度を確認する。ｉｎｌＢ遺伝子はｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｉｎｌＢプラスミドでの対立遺伝子交換によって所望のＬｉｓｔｅｒｉａ株から欠失される。
【０２４４】
抗原−発現株の構築。モデル抗原オボアルブミン（ＯＶＡ）の切形を発現する突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、ＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ；配列番号：２０）として知られたマウス結腸直腸癌（ＣＴ２６）からの免疫優性エピトープ、および改変されたエピトープＡＨ１−Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ；配列番号：２１；  Ｓｌａｎｓｋｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：５２９−５３８（２０００））を調製した。ｐＰＬ２組込みベクター（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７（２００２）；米国特許公開番号２００３：０２０３４７２）を用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムの無毒部位に組み込まれた単一コピーを含むＯＶＡおよびＡＨ１−Ａ５／ＯＶＡ組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を誘導した。
【０２４５】
ＯＶＡ−発現Ｌｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）の構築。切形ＯＶＡと融合され、かつｐＰＬ２組込みベクターに含まれたヘモリシン−欠失ＬＬＯ（ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡ）よりなる抗原発現カセットをまず調製する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡ株は、ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡをファージ−治癒Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６に、ＰＳＡ（ＳｃｏｔｔＡからのファージ）付着部位ｔＲＮＡＡｒｇ−ａｔｔＢＢにて導入することによって誘導される。
【０２４６】
ＰＣＲを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いてヘモリシン−欠失ＬＬＯを増幅する：
源：ＤＰ−Ｌ４０５６ゲノムＤＮＡ
プライマー：
順方向（ＫｐｎＩ−ＬＬＯ  ｎｔｓ．１２５７ないし１２７６）：
【０２４７】
【化７】
2006521376.tif 000028
【０２４８】
（配列番号：２８）
（Ｔｍ：  ＬＬＯ−ｓｐｅｃ：５２℃、総じて：８０℃）
逆方向（ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−ＬＬＯ  ｎｔｓ．２８１１−２７９２）：
【０２４９】
【化８】
2006521376.tif 000029
【０２５０】
（配列番号：２９）
（Ｔｍ：  ＬＬＯ−ｓｐｅｃ：５２℃、総じて：１０２℃）
また、ＰＣＲを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いて切形ＯＶＡを増幅する：
源：ＤＰ−Ｅ３６１６  Ｅ．ＣｏｌｉからのｐＤＰ３６１６プラスミドＤＮＡ（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｍｏｌ．Ｍｏｌｂｉｏｌ．３１：１６３１−１６４１（１９９９））。
【０２５１】
プライマー：
順方向（ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ  ＯＶＡ  ｃＤＮＡ  ｎｔｓ．１７４−１８６）：
【０２５２】
【化９】
2006521376.tif 000030
【０２５３】
（配列番号：３０）
（Ｔｍ：ＯＶＡ−ｓｐｅｃ：６０℃、総じて：８８℃）
逆方向（ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）：
【０２５４】
【化１０】
2006521376.tif 000031
【０２５５】
（配列番号：３１）
（Ｔｍ：総じて：８２℃）
構築プロセスを完了させるための１つのプロトコルは、まず、ＬＬＯアンプリコンをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断し、次いで、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩベクターをｐＰＬ２ベクター（ｐＰＬ−ＬＬＯ）に挿入することを含む。次いで、ＯＶＡアンプリコンをＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで切断し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで切断されているｐＰＬ２−ＬＬＯに挿入する（注：ｐＰＬ２ベクターはいずれのＸｈｏＩ部位も含まず；ｐＤＰ−３６１６は、ＯＶＡ逆方向プライマー設計で開発される１つのＸｈｏＩ部位を含む）。構築体ｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡは、制限分析（ＫｐｎＩ−ＬＬＯ−ＸｈｏＩ−ＯＶＡ−ＮｏｔＩ）および配列決定によって確認される。正確にＬａｕｅｒらによって記載されているように、プラスミドｐＰＬ２／ＬＬＯ−ＯＶＡを形質転換によってＥ．ｃｏｌｉに導入し、続いて、コンジュゲーションによってＬｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）にまたはｉｎｌＢ−突然変異体またはｉｎｌＢ−ａｃｔＡ−二重突然変異体のようなＬｉｓｔｅｒｉａのもう１つの所望の株に）導入し、それに組み込む。
【０２５６】
ＯＶＡを発現する抗原発現カセットの挿入の記載は、２００３年１０月１５日に出願された「Ｆｒｅｅ−Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｓ」なる発明の名称の米国仮出願第６０／５１１，８６９号の実施例８に見出すこともできる。
【０２５７】
ＡＨ１／ＯＶＡまたはＡＨＺ−Ａ５／ＯＶＡを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の構築。ＡＨ１／ＯＶＡまたはＡＨ１−Ａ５／ＯＶＡ抗原配列いずれかを発現するＬｉｓｔｅｒｉａを調製するために、抗原を担うインサートをまずオリゴヌクレオチドから調製し、次いで、（前記したように調製された）ベクターｐＰＬ２−ＬＬＯ−ＯＶＡに連結する。
【０２５８】
以下のオリゴヌクレオチドをＡＨ１またはＡＨ１−Ａ５インサートの調製で用いる：
ＡＨ１エピトープインサート（ＣｌａＩ−ＰｓｔＩ適合性末端）：
頂部ストランドオリゴ（ＡＨ１頂部）：
【０２５９】
【化１１】
2006521376.tif 000032
【０２６０】
（配列番号：３２）
底部ストランドオリゴ（ＡＨ１底部）：
【０２６１】
【化１２】
2006521376.tif 000033
【０２６２】
（配列番号：３３）
ＡＨ１−Ａ５エピトープインサート（ＣｌａＩ−ＡＶＡＩＩ適合性末端）：
ＡＨ１−Ａ５エピトープの配列はＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：２１）である。
【０２６３】
【化１３】
2006521376.tif 000034
【０２６４】
（配列番号：３４）
頂部：
【０２６５】
【化１４】
2006521376.tif 000035
【０２６６】
（配列番号：３５）
底部：
【０２６７】
【化１５】
2006521376.tif 000036
【０２６８】
（配列番号：３６）
与えられたエピトープのためのオリゴヌクレオチド対を等モル比で一緒に混合し、９５℃にて５分間加熱する。次いで、オリゴヌクレオチド混合物をゆっくりと冷却する。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチド対を、関連制限酵素での消化によって調製したｐＰＬ２−ＬＬＯ／ＯＶＡプラスミドと２００対１モル比で連結する。新しい構築体の同一性は、制限分析および／または配列決定によって確認することができる。
【０２６９】
正確にＬａｕｅｒらによって記載されているように、次いで、形質転換によってプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに導入し、続いてコンジュゲーションによってＬｉｓｔｅｒｉａ（ＤＰ−Ｌ４０５６）に（またはｉｎｌＢ−突然変異体またはｉｎｌＢ−ａｃｔＡ−二重突然変異体のようなＬｉｓｔｅｒｉａのもう１つの所望の株）に導入し、それに組み込む。
【０２７０】
（実施例２０）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでワクチン接種したマウスにおけるインビボ細胞傷害性活性の評価）
一連の実験を行って、インビボで抗原特異的標的細胞を溶解させるワクチン接種マウスの能力を評価した。最初の実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ−）、ＡＨ１／Ａ５を発現するＤＰ−Ｌ４０２９、およびＡＨ１／Ａ５を発現するＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ−いずれかで静脈内（ＩＶ）でワクチン接種した。また、ＡＨ１／Ａ５発現株を、実施例１３の第二の方法に従ってＳＳ−５９ＵＶＡで処理した。また、ＡＨ１−Ａ５を発現するＬｉｓｔｅｒｉａ構築対もＬＬＯおよびＯＶＡを発現する。ワクチン接種は、表２０に示された用量（０．１ＬＤ５０）にて、全ての群について０日に、加えて、Ｓ−５９処理株については１日および２日に行った。各株およびコントロールでは、３匹のマウスの２つの群をワクチン接種した。標的細胞集団は、ＲＰＭＩ１６４０培地中の２０のナイーブなＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓を収集することによって調製した。細胞を解離し、赤血球細胞を溶解させた。白血球細胞をカウントし、４つの等しい集団に分けた。各群に、３７℃において９０分間、０．５μｇ／ｍＬにて、特異的ペプチド、標的ＡＨＩ（ＳｙｎＰｅｐ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡからのＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号：２０））、標的ＡＨ１−Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号：２１）、ＳｙｎＰｅｐ）、またはコントロールの２つの集団（β―ｇａｌ、ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ（配列番号：３７））いずれかでパルスした。次いで、細胞を培地中で３回、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中で２回洗浄した。カルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で標識するために、細胞をｍＬ当たり１×１０７にて、温かいＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（１０ｍＬ以下）に再懸濁した。細胞懸濁液を標的化するために、１．２５μＬのＣＦＳＥの５ｍＭストックを加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。コントロール細胞懸濁液に、ＣＦＳＥストックの１０倍希釈を加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。細胞を３７℃にて１０分間インキュベートした。大容量の（＞４０ｍＬ）の氷冷ＰＢＳの添加によって染色を停止した。細胞を室温にてＰＢＳで２回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントした。各細胞懸濁液をｍＬ当たり５０×１０６に希釈し、１００μＬの各集団を混合し、第６日に、ナイーブなまたはワクチン接種したマウスいずれかの尾静脈を解して注射した。各株またはコントロールにつき、３匹のマウスの群にβ−ｇａｌおよびＡＨ−１またはβ−ｇａｌおよびＡＨ１−Ａ５を注射した。１２ないし２４時間後、脾臓を収集し、合計５×１０６細胞をフローサイトメトリーによって分析した。高い（標的）および低い（コントロール）で蛍光ピークを数え、２つの比率を用いて、ＨＢＳＳコントロール集団に対する標的細胞溶解のパーセンテージを確立した。結果を表２０および図２３Ａに示す（本実施例における表は３匹のマウスについての平均を示し、他方図面は示されたサンプルについての個々のマウスからの代表的なヒストグラムである（必ずしも同一のマウスではない））。Ｓ−５９処理株を用いるワクチン接種は、ｕｖｒＡ−��然変異体についてのＡＨ１に対するわずかに良好な応答、およびＳ−５９処理ａｃｔＡ−株に対するｕｖｒＡＢ−突然変異体についてのＡＨ１−Ａ５に対する有意により高い応答を示す。
【０２７１】
（表２０  ０日における、またＳ−５９処理株については２日および３日に示されたワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスのインビボ細胞傷害性）
【０２７２】
【表２０】
2006521376.tif 000037
【０２７３】
この実験は、全ての群について１４日に、加えて、Ｓ−５９処理株については１５日および１６日に、さらなるワクチン接種を反復した。標識した標的細胞を２０日に注射した。結果を表２１および図２３Ｂに示す。Ｓ−５９処理ｕｖｒＡＢ−突然変異体に対する応答は、追加免疫ワクチン接種で有意に改良することができ、これはＳ−５９処理ａｃｔＡ−株には当てはまらない。
【０２７４】
（表２１  ０および１４日、またＳ−５９処理については２、３、１５および１６日に示されたワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスのインビボ細胞傷害性）
【０２７５】
【表２１】
2006521376.tif 000038
【０２７６】
ＯＶＡ発現株についてはＳ−５９処理の有りおよび無しを含めた、同様の実験をａｃｔＡ−、ＯＶＡを発現するａｃｔＡ−、およびＯＶＡを発現するａｃｔＡ−ｕｖｒＡＢ−を行った。この実験ではＣ５７Ｂ１／６マウスを用いた。６匹のマウスの群を０日（Ｓ−５９処理については１および２日にも）ワクチン接種し、各群の３匹には６日に標識した標的細胞を注射した。残りのマウスには１４日に（Ｓ−５９処理については１５および１６日に）ワクチン接種し、２０日に標識した標的細胞を注射した。この実験においては、ナイーブな標的脾臓細胞をβ−ｇａｌ（低いＣＦＳＥ）またはＳＬ８（高いＣＦＳＥ）でパルスした。結果を表２２および図２３Ｃに示す。再度、Ｓ−５９処理ｕｖｒＡＢ−突然変異体に対する応答は、追加免疫ワクチン接種で有意に増強される。
【０２７７】
（表２２  示されたようにワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスのインビボ細胞傷害性）
【０２７８】
【表２２】
2006521376.tif 000039
【０２７９】
（実施例２１）
（ｕｖｒＡＢ欠失の有りおよび無しにての、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＳ−５９／ＵＶＡ処理）
実施例７ないし９、およびＣａｍｉｌｌｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏ．，８．１４３−１４７（１９９３）に詳細に記載された対立遺伝子交換方法を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅ株を改変した。この株のビルレンスを減弱化する（ｐＸＯ１＋、ｐＸＯ２−）。
【０２８０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからのｕｖｒＡＢ遺伝子を同定し（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥ０１７０４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｍｅｓ株、完全なゲノムのセクション１７または１８、配列：ｎｔｓ．２１２６１３−２１７４７１をコードするｕｖｒＡＢ遺伝子）、ｕｖｒＡＢ遺伝子欠失を持つｐＫＳＶ７に基づくプラスミドを、Ｓｐｌｉｃｅ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  （スプライス重複延長）（ＳＯＥ）ＰＣＲおよび以下に記載する工程を用いて構築した（ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢ）：
一次ＰＣＲ反応：各々、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｕｖｒＡＢ遺伝子５’および３’末端から上流および下流のほぼ１０００ｂｐｓを増幅した。
【０２８１】
鋳型：Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｔｅｒｎｅゲノムＤＮＡ
プライマー対１：  ｕｖｒＢ．の５’末端から１０００ｂｐ上流の領域の増幅
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：１０２９）
Ｂａ−２２５０９９Ｆ：
【０２８２】
【化１６】
2006521376.tif 000040
【０２８３】
（配列番号：３８）（Ｔｍ：７４℃）
Ｂａ−（３’ｕｖｒＡ−Ｒ＋）２２６１０９Ｒ：
【０２８４】
【化１７】
2006521376.tif 000041
【０２８５】
（配列番号：３９）（Ｔｍ：１２０℃）（下線を施した配列はｕｖｒＡカルボキシ末端の下流の領域に相補的である）またはＢａ−２２６１０９Ｒ：
【０２８６】
【化１８】
2006521376.tif 000042
【０２８７】
（配列番号：４０）（Ｔｍ：７２℃）
プライマー対２：ｕｖｒＡの３’末端から下流の領域の増幅
（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ）：９９０）
Ｂａ−（３‘ｕｖｒＡ−Ｒ＋）２３０７７９Ｆ：
【０２８８】
【化１９】
2006521376.tif 000043
【０２８９】
（配列番号：４１）（Ｔｍ：１２６℃）（下線を施した配列はｕｖｒＢアミノ末端の上流の領域に対して相補的である）またはＢａ−２３０７７９Ｆ：
【０２９０】
【化２０】
2006521376.tif 000044
【０２９１】
（配列番号：４２）（Ｔｍ：７０℃）
Ｂａ−２３１７６９Ｒ：
【０２９２】
【化２１】
2006521376.tif 000045
【０２９３】
（配列番号：４３）（Ｔｍ：７６℃）
二次ＰＣＲ反応：対１の逆方向プライマーおよび対２の順方向プライマーの間の相補性を利用する、ＳＯＥ  ＰＣＲを介する一次ＰＣＲアンプリコンの融合。配列：ｎｔｓ．２２６１１０−２３０７７９＝４６７０ｂｐｓをコードするｕｖｒＡＢの正確な欠失における結果。
【０２９４】
鋳型：清浄化された一次ＰＣＲ反応
プライマー対：（アンプリコンサイズ（ｂｐｓ：１９７３）
Ｂａ−２２５１１８Ｆ：
【０２９５】
【化２２】
2006521376.tif 000046
【０２９６】
（配列番号：４４）（Ｔｍ：７８℃）
Ｂａ−２３１７６１Ｒ：
【０２９７】
【化２３】
2006521376.tif 000047
【０２９８】
（配列番号：４５）（Ｔｍ：７４℃）
構築：一次ＰＣＲ反応（３温度サイクル）を、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）およびＳｔｅｒｎｅ株ゲノムＤＮＡを用いて行う。４つの一次ＰＣＲ反応は、スプライス重複延長（ＳＯＥ）で用いるプライマーの有りおよび無し双方にて行う（もしＢａ−（３’ｕｖｒＡ―Ｒ＋）２２６１０９ＲまたはＢａ−（３’ｕｖｒＡ−Ｒ＋）２２６１０９Ｒプライマーを含む反応が有意なアンプリコン産物を生じなかったならば、Ｂａ−２２５０９９Ｆ／Ｂａ−２２６１０９ＲまたはＢａ−２３０７７９Ｆ／Ｂａ−２３１７６９Ｒプライマー対との反応からのアンプリコンに対するこれらのプライマーを用いた）。１％アガロースゲルによるａｎｔｈｒａｃｉｓ一次アンプリコンの予測されるサイズ（１０２９ｂｐｓおよび９９０ｂｐｓ）が確認された。反応物はＳ６カラム（ＢｉｏＲａｄ）またはＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ  １０１）で洗浄した。
【０２９９】
鋳型として各一次反応物のほぼ等量（約５μｌ）を利用し、二次ＰＣＲ反応を行った。１％アガロースゲルによる二次ＰＣＲ反応からのＬｉｓｔｅｒｉａアンプリコンの予測されるサイズ（１９７３ｂｐｓ）を確認した。
【０３００】
ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｄｌ  ｕｖｒＡＢアンプリコンをｐＣＲ２．１−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターに挿入した。プラスミドＢｃｒ２．１−ＴＯＰＯ−ｄｌ  ｕｖｒＡＢプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化し、２０３３ｂｐ断片をゲル−精製した。ＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ２０３３ｂｐ断片を、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩでの消化、およびＣＩＡＰでの処理によって調製されているｐＫＳＶ７ベクターに挿入した（ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢ）。ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢにおけるｄｌ  ｕｒｖＡＢ配列の忠実度を確認した。
【０３０１】
ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢプラスミドでの対立遺伝子交換によって、ｕｖｒＡＢ遺伝子をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅから欠失した。エレクトロポレーションによってプラスミドｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢをＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅ株に導入し、クロラムフェニコール抵抗性につき選択した。エレクトロポレーションの頻度を有意に増大させる凍結工程を用い、エレクトロポレーションを行った。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ培養を３７℃にて振盪しつつ、３ｍｌのＢＨＩ０．５％グリセロールチュでＯ／Ｎ増殖させた。０．５ｍｌ培養物を、５００ｍｌのＥ−フラスコ中の５０ｍｌ  ＢＨＩ０．５％グリセロール（ＯＤ６００＝０．１）に移した。サンプルを２００ｒｐｍおよび３７℃にてインキュベートした（または２５０ｍｌフラスコ中の０．１ないし０．２ｍｌから２５ｍｌのＢＨＩ０．５％グリセロール）。ＯＤ６００＝０．６ないし０．８において（ほぼ１時間４５分）、微生物を５００ｍｌのディスポーサブル滅菌フィルター装置に集めた。微生物を各々冷エレクトロポレーション緩衝液（１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １０％グリセロール  ｐＨ７．４）で３×２５ｍｌ洗浄した。細胞を１／２０の元の容量（５０ｍｌ培養用の２．４５ｍｌのｅ−ポレーション緩衝液）に再懸濁し、氷上に保持した。０．２ｃｍギャップｅ―ポレーションキュベット中の０．２ｍｌ細胞に対して１μｇ（１ないし５ｕｌのミニプレプ）の「非常に清浄な」未メチル化プラスミドＤＮＡ（コントロール＝ＤＮＡ無し）。次いで、サンプルを１５分間氷上に保持した。次いで、細胞を２５μＦＤ、２００Ω、２．５ｋＶでパルスした（別法として、０．４ｍｌ細胞を４００Ωにおいて０．４ｃｍキュベット中でパルスした）。時定数はほぼ４ないし５ｍ秒であった。パルスの直後、１ｍｌのＢＧＧＭ（１０％グリセロール、０．４％グルコースおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＢＨＩ）を加えた。細胞を滅菌したポリプロピレンチューブに移し、振盪しつつ、３７℃にて１時間３０分インキュベートした。細胞をペレット化し、２００μｌのＢＧＧＭに再懸濁し、選択培地上で平板培養した。
【０３０２】
ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢを４１℃にてＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体に組み込んだ。ｐＫＳＶ７−ｄｌ  ｕｖｒＡＢを切り出し、許容される温度にて治癒し、その結果、クロラムフェニコール感受性コロニーが得られた。ＰＣＲプライマーは、染色体上での欠失を検出するように設計した。２０％のクロラムフェニコール感受性コロニーは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体中に欠失を保有した。ｕｖｒＡＢ−株のＰＣＲ分析は、ｐＸＯ１ビルレンスプラスミドの保持を示した。
【０３０３】
３７℃において３００ｒｐｍにてＢＨＩを０．３のＯＤ６００まで増殖させることによって、親株と共に、２つのＵＶＲＡＢ−クローン（クローン８およびクローン３２Ａ）をＳ−５９−処理し、その時点で、５０ｍＬの溶液を清浄なフラスコに移し、Ｓ−５９を表２３に示した濃度まで加えた。これらのサンプルをほぼ１時間激しく振盪しつつ３７℃において３００ｒｐｍにてインキュベートした（ＯＤ６００ほぼ１．０、ほぼ１×１０９／ｍＬ）。１ｍＬのアリコットを取り出して力価を評価し、残りを１５０ｍｍペトリ皿に移し、６Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ量で照射し（ＦＸ−１０１９）、その結果、以下の表２３および図２４に示すように、親株と比較して６ｌｏｇ低下がもたらされた。これは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｕｖｒＡＢ−株につき観察されたのと同様なＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓにおけるソラレン処理に対する感度を示す。
【０３０４】
（表２３  ソラレンＳ−５９／ＵＶＡ処理でのＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅ株−対−ｕｖｒＡＢ−突然変異体の減弱化）
【０３０５】
【表２３】
2006521376.tif 000048
【０３０６】
（実施例２２）
（ヒト癌のインビボ処置のための本発明のワクチンの使用）
ヒト癌の処置または予防の例として、負荷され、かつ微生物の増殖が減弱化されるように改変された微生物による感染によって活性化された抗原提示細胞を含むワクチンであって、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないワクチンを個体に投与する。微生物は実施例４および５のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットを、例えば、実施例８に記載されたｐＰＬ２組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当業者に常識であるいずれかの方法によって微生物に取り込ませる。次いで、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を負荷し、本明細書中に概説したもののような方法を用いて改変された微生物で活性化させる。
【０３０７】
得られたＡＰＣワクチンを粗製、または好ましくは精製された形態で処方することができる。ワクチン組成物は液体懸濁液として調製することができる。加えて、それらは保存剤（例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノール）、安定化剤（例えば、ラクトース、グルタミン酸モノナトリウム）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン）、抗生物質（例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン）、または他の物質のような添加剤とで処方することができる。処方は、滅菌水、生理食塩水、等張緩衝化生理食塩水、（例えば、生理学的ｐＨに緩衝化されたリン酸塩）、または他の適当な希釈剤のような適当な希釈剤に再懸濁または希釈することができる。
【０３０８】
ワクチンは、経口、鼻孔内、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下経路を含めた種々の経路によって、ならびにいずれかの与えられた悪性病または感染症に関係のあるいずれかの経路によって投与することができる。有効量のワクチンが処置のために個体に投与されるであろう。治療的処置では、有効量は所望の免疫応答をもたらすであろう用量であり、ここで、免疫応答は標的化腫瘍の増殖を遅らせ、腫瘍のサイズを低下させ、あるいは好ましくは腫瘍を完全に排除するのいずれかである。ワクチンの投与は適切な間隔で反復することができ、かつワクチン接種された個体において複数の区別される部位に同時に投与することができる。予防的処置では、有効量は、癌を発生する個体の確立が有意に低下するような保護的免疫応答をもたらす用量である。ワクチン接種方法は単一用量よりなることができるか、あるいは保護的免疫応答が確立されるまで適当な間隔で反復することができる。
【０３０９】
個体の治療的処置は、初期処置として癌と診断された個体で開始することができるか、あるいは他の処置と組み合わせて用いることができる。例えば、外科的に腫瘍が除去された、あるいは放射線療法で、または化学療法によって処置された個体をワクチンで処置して、個体におけるいずれかの残存する腫瘍を減少または排除し、あるいは癌の再発の危険性を低下させることができる。個体の予防的処置は、環境条件または遺伝的素因のためある癌に罹患する増大した危険性を有する個体で開始されるであろう。
【０３１０】
（実施例２３）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａの減弱化株に基づく組換え腫瘍Ａｇ分泌ワクチンの生成）
抗原分泌およびＭＨＣクラスＩプロセッシングを容易とするためにリステリオシリン（Ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ（ＬＬＯ）の切形された形態と融合させたニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を、選択された減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を評価するための実験においてモデル抗原として用いた。腫瘍抗原発現カセットを、独占的ｐＰＬ２組込みベクターで減弱化されたＬｉｓｔｅｒｉａ株のパネルの染色体上の無毒部位に部位−特異的に組み込んだ。組換えＬｉｓｅｔｒｉａ株は、ウェスタンブロット分析によって測定されるように予測された改変ＬＬＯ−ＯＶＡ融合タンパク質を発現し、分泌した（データは示さず）。液体ブロス培養ならびに細胞内増殖動態学におけるこれらの組換え体の各々の増殖もその親から区別することができた。さらに、組換えＯＶＡ発現株は、未改変親株の２のファクター内にあるＩＶ  ＬＤ５０を有することが示された（表２４）。
【０３１１】
（表２４  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの選択された株）
【０３１２】
【表２４】
2006521376.tif 000049
【０３１３】
組込みベクターは、複数組換えＬｉｓｔｅｒｉａワクチン候補の迅速な誘導を促進する。単一構築体を、平行して、いずれかの数のユニークな遺伝子バックグラウンドと接合させて、同質遺伝子株を迅速に作成することができる。
【０３１４】
（実施例２４）
（生きていないが、代謝的には活性なＬｉｓｔｅｒｉａを生産するためのソラレン−誘導ＤＮＡ架橋）
Ｌｉｓｔｅｒｉａベースのエキソビボ抗原送達プラットホームに対する安全性を確認するために、遺伝子的に減弱されたＬｉｓｔｅｒｉａを用いることに加えて、本発明者らは、ソラレンでの処理を通じて十分に不活化することができるが、代謝的には活性であり、細胞に感染し、ファゴリソソームから逃避し、かつクラスＩ経路を介してコードされた抗原の提示を促進するその能力をかくして保有するＬｉｓｔｅｒｉａ株を作成した。作成されたＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ソラレン、それらが増殖できないように、ＵＶＡ光照射後に細菌のゲノムにおいて不可逆的な架橋を形成する化合物の群での不活化に対して非常に感受性である。ソラレンー媒介ＤＮＡ損傷を修復することができないＬｉｓｔｅｒｉａの突然変異体株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａおよび他の細菌におけるヌクレオチド−切出修復に必要な、紫外線光抵抗性（ｕｖｒ）ＡＢ遺伝子（ｕｖｒＡＢ）を欠失することによって創製された（Ｓａｎｃａｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７：２９−６７（１９８８））。ソラレンＳ−５９はＨｅｌｉｎｘとして知られたＤＮＡ架橋技術で用いられるＣｅｒｕｓ化合物のメンバーの１つである（Ｌｉｎ，Ｎ．，Ｐｓｏｒａｌｅｎ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （１９９８）；  Ｈｅｉ，ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３９：２３９−４８（１９９９））。検出の限界までＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ欠失突然変異体を不活化するソラレン濃度において、無傷ＤＮＡ修復メカニズムを有する親非−突然変異体株はＵＶＡ光不活化に対して４ｌｏｇ以上感受性が低い（図２５Ｂ）。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢは、ＭＴＴアッセイにおいて測定されたようにそのミトコンドリア活性を維持し、３５Ｓ−メチオニン−標識パルス−チェイス実験によって測定されたように、そのゲノムレパートリーを発現するその能力を保持した（図２６および図１０）。不活化親株はそうではなかったが、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢは、その遺伝子レパートリーの継続した発現を示した。不活化親株の発現レベルは有意に減少し、これは、十分な不活化に必要なＳ−５９濃度におけるＳ−５９／ＵＶＡ処理が、同様にコードされた腫瘍抗原の発現を含めた、Ｌｉｓｔｅｒｉａ遺伝子産物の発現を有意に減少させることを示す。
【０３１５】
（実施例２５）
（生きていないＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ株はＤＣに感染し、ファゴリソソームから逃避する能力を保有する）
代謝活性を維持するに加え、樹状細胞（ＤＣ）の感染に際して、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ株によるＭＨＣクラスＩ経路への効果的な抗原負荷を示すのは重要である。本発明者らは、今回、ＬＬＯをコードするｈｌｙ遺伝子の欠失によりファゴリソソームから逃避することができないＬｉｓｔｅｒｉａ突然変異体（ＤＰ−Ｌ４０２７）でのＤＣの感染は、ＭＨＣクラスＩの意味において、抗原の提示を排除することを示した。
【０３１６】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ感染ＤＣのファゴリソソームからの逃避を示すために、本発明者らは、蛍光顕微鏡測定によって可視化することができる宿主−細胞アクチンフィラメント、いわゆる「アクチンクラウズ」によって細胞質Ｌｉｓｔｅｒｉａが囲まれるという事実を利用する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ表面でのアクチンの重合は、細菌ＡｃｔＡタンパク質および他の宿主細胞因子によって媒介される。ネズミＤＣ細胞系ＤＣ２．４を、３７℃にて３０分間、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｔ、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ΔＬＬＯ（ＤＰ−Ｌ４０２７）で、１の感染多重度（ＭＯＩ）にて感染させた。細胞外細菌を何回かの洗浄によって注意深く除去し、ゲンタマイシンの存在下でＤＣを３７℃にてさらに５時間インキュベートして、細胞外細菌の成長を妨げた。野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢで感染されたＤＣ２．４は、Ｌｉｓｔｅｒｉａの細胞質局所化に典型的な、典型的なアクチンクラウズまたはアクチンコメットテイルを示した（図２７）。しかしながら、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＬＬＯヌル突然変異体で感染させたＤＣ２．４細胞において、アクチンおよびＬｉｓｔｅｒｉａの共局所化は観察されず、これは、細菌がファゴリソソームから逃避することができなかったことを示す。この結果は、これらのＤＮＡ修復突然変異体が、ファゴリソソームから逃避し、感染した細胞のサイトゾルに入る能力を保有することを示し、そこで、抗原は分泌することができ、これは、ＭＨＣクラスＩ経路を介する直接的提示のための必要な工程である。また、前記実施例１７および図２１を参照されたし。
【０３１７】
（実施例２６）
（生きていないＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢは、感染された樹状細胞（ＤＣ）のＭＨＣクラスＩ経路に抗原を効果的に負荷する）
感染した細胞内のファゴリソソームを逃避するＳ−５９ソラレン不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢのユニークな能力のため、サイトゾルＬｉｓｔｅｒｉａによって分泌された遺伝子産物はプロセッシングされ、ＭＨＣクラスＩ経路を介して提示される。ＤＣのＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷するＳ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢの能力をテストするため、ＤＣ２．４細胞を、異なる濃度のＳ−５９で不活化された、ＯＶＡ−発現Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡで１の感染多重度（ＭＯＩ）にて感染させた。親ＬｉｓｔｅｒｉａＯＶＡおよび加熱−死滅Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡはコントロールとして供した。Ｌｉｓｔｅｒｉａの貪食作用に続くクラスＩ分子へのＤＣ２．４によるＯＶＡペプチドの提示は、Ｂ３Ｚ細胞とのインキュベーションの後に測定した。Ｂ３Ｚは、ネズミＫｂクラスＩ分子上に提示されたＯＶＡ２５７−２６４（ＳＬ８）エピトープに特異的なＬａｃＺ−誘導性ＣＤ８＋Ｔ−細胞ハイブリドーマである（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：３６９−７６（１９９４））。Ｂ３Ｚ細胞へのＳＬ８のクラスＩ−制限提示の結果、Ｂ３Ｚによるβーｇａｌ合成の誘導がもたらされる。生じたβ−ｇａｌの量は発色性基質ＧＰＲＧの加水分解によって測定することができ、ＡＰＣの表面に提示されたＳＬ８／Ｋｂ複合体の量の指標である。図９Ａおよび９Ｂに示されたように、同族親株はそうでなかったが、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡ株は、増殖するその能力とは独立してＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷するその能力を維持した（これは、実施例１１に記載されたのと同一のデータである）。７０ないし１００ｎＭのＳ−５９濃度を用いる十分な不活化においてさえ、９０％を超えるＢ３Ｚ活性化が維持された。対照的に、無傷ＤＮＡ修復を持つ親Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＯＶＡ株は、より高い濃度のＳ−５９を不活化で用いる場合、Ｂ３Ｚ  Ｔ−細胞ハイブリドーマを活性化するその能力を喪失した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡ株とは対照的に、Ｂ３Ｚ活性化、およびＢＨＩ寒天プレート上でコロニーを形成する親Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＯＶＡ株の能力は密接に関連し、これは、生きたＬｉｓｔｅｒｉａ  ＯＶＡのみがＤＣ２．４細胞を感染でき、かつＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷できることを示唆する。さらに、加熱−死滅化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡはＢ３Ｚ活性化をもたらさなかった。この結果は、ＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷するＬｉｓｔｅｒｉａの能力は、ソラレン−媒介ＤＮＡ損傷を修復するその能力を妨げるように改変された、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａを用いる増殖ようの要件とはリンクできないことを示す。
【０３１８】
一次ＤＣのＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を負荷するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡの能力をテストするために、未成熟ネズミＢＭ−ＤＣを、十分に不活化されたＳ−５９ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡで感染させた。生きたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡ、親株およびＬ４０２７をコントロールとして供した。図２８に示すように、ＯＶＡ−発現株で感染させたＢＭ−ＤＣはインビトロでＢ３Ｚ細胞を刺激したが、親株は刺激しなかった。生きたおよび生きていないＳ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＵＶＡ突然変異体株（Ｌ５０２９  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡ）の間に有意な差は観察されず、これは、一次ＤＣのＭＨＣクラスＩ分子に、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢの増殖する無能力にもかかわらず、ファゴリソソームからサイトゾルへの細菌の逃避に続いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−由来ペプチドが効果的に負荷されることを示唆する。重要なことには、加熱−死滅化によって不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ  ＯＶＡは、ＭＨＣクラスＩ経路においてＯＶＡペプチドのいずれかの有意な提示をもたらさず、これは、加熱−死滅化細菌とのＤＣのインキュベーションの結果、ＭＨＣクラスＩ分子のいずれかの有意な抗原負荷をもたらされないことを示唆する。
【０３１９】
（実施例２７）
（ＬｉｓｔｅｒｉａはヒトＤＣを直接的に感染し、活性化させる）
優れた抗原送達プラットホームの開発のためには、ＭＨＣクラスＩ経路へ抗原を効果的に送達することに加え、ＤＣの活性化／成熟化が必要であると広く考えられる。イン・サイチュでは、未成熟ＤＣは末梢組織に存在し、そこで、それは継続的に抗原を取り込み、それを加工するが、それは、活性化／成熟化プロセスを開始するいずれの細菌が提供するかのような活性化刺激の遭遇であり、ケモカイン受容体の変調、およびリンパ節を排出するＴ細胞領域へのＤＣのＴ細胞領域への移動に至る。我々は、ヒト単球−由来ＢＣの表現型成熟化およびサイトカイン生産を誘導する野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ（Ｌ−４０５６）の能力を評価した。図２９に示すように、ヒト未成熟ＤＣとＬｉｓｔｅｒｉａとの遭遇は、活性化マーカー、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ（図２９Ａ）、ならびに成熟化マーカー、ＣＤ８３（図２９Ｂ）のアップーレギュレーションに導いた。さらに、Ｌｉｓｔｅｒｉａへのヒト未成熟ＤＣの暴露は、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αのような高レベルのプロ−炎症性サイトカインを分泌するその能力によって示されるように、その免疫―刺激能力を増加させた（図２９Ｃ）。
【０３２０】
（実施例２８）
（Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡはインビトロにてＯＶＡ−特異的免疫性を誘導する）
我々は、インビボにてＯＶＡ−特異的免疫性を誘導するＳ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡワクチンの能力を評価した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡの１×１０８粒子で静脈内ワクチン接種した。ＯＶＡ−特異的免疫性の誘導はワクチン接種から７日後に評価した。顕著には、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡは、図３０に示すように、有意なＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示したが、親Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＯＶＡ株はそうでなかった。さらに、加熱―死滅化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ
ＯＶＡでのマウスのワクチン接種は、ＯＶＡ−特異的免疫性の誘導をもたらさなかった。
【０３２１】
（実施例２９）
（天然（ＣＡＰ１）または増強されたアゴニスト細胞障害性Ｔリンパ球エピトープ（ＣＡＰ−１−６Ｄ）いずれかを含む全長ＣＥＡを発現する２つの組換え減弱化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ株の構築）
ＣＥＡは、皮内で誘導された消化系上皮および胎児結腸の腺癌で見出される１８０ｋＤａの大きなタンパク質である。ＣＥＡはＧＰＩ−アンカーによって細胞の膜に付着される。該タンパク質は７つの免疫グロブリン−様ドメインを含み、Ｃ−末端は、非特異的交差反応タンパク質、ＮＣＡ、癌性胚抗原遺伝子ファミリーのメンバーと相同性を示す。我々は、ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限ＣＥＡ天然Ｔ細胞エピトープＣＡＰ１（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ）（配列番号：５１）または癌患者においてＣＥＡ−特異的免疫性を誘導するのにより優れていることが示されたエンハンサーアゴニスト細胞傷害性Ｔリンパ球ペプチドＣＡＰ１−６Ｄ（ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ）（配列番号：５２）（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：４５７０−７（１９９７））いずれかを含む全長ＣＥＡを構築することを提案する（表２５）（Ｆｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：８８０９−１４（２００１））。
【０３２２】
（表２５）
【０３２３】
【表２５】
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【０３２４】
ＣＥＡ腫瘍抗原発現プラスミドをｐＰＬ２骨格、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムに部位−特異的に組み込まれるベクター（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４１７７−８６（２００２））上に構築する。２つのプラスミドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＬＬＯに由来する分泌シグナルおよびＰＥＳＴエレメントが全長ＣＥＡ  ｃＤＮＡと遺伝子的に融合されるように構築されるであろう。遺伝子構築体の５’末端から出発し、融合タンパク質は、ＣＥＡに融合した細菌分泌を促進するためのＬＬＯの末端領域よりなる。ドメインの正確な連結は、重複ＰＣＲによって達成されるであろう。全てのプラスミド構築対の忠実度は、ＤＮＡ配列決定によって確認されるであろう。
【０３２５】
（実施例３０）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ株Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢに組み込まれたｐＰＬ２  ＣＥＡｗｔおよびｐＰＬ２  ＣＥＡ−６１０Ｄを含む２つの減弱化組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の誘導、およびＣＥＡ抗原の発現および分泌の確認）
ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子に隣接するｐＰＬ２−ＣＥＡ構築体の、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株Ｌ４０２９  ｕｖｒＡＢのゲノムへの組込みは、Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４１７７−８６（２００２）によって従前に記載されたように達成される。簡単に述べれば、まず、形質転換によってプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＳＭ１０に導入し、次いで、コンジュゲーションによってＬｉｓｔｅｒｉａの所望の株に導入する。Ｌｉｓｔｅｒｉａトランス−コンジュガントはクロラムフェニコール（ｐＰＬ２）およびストレプトマイシン（Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）選択培地によって選択され；このプロセスの効率はほぼ１×１０−４である。トランス−コンジュガントの純度を確認し、細菌染色体へのｐＰＬ２骨格の組込みを確認するために、限定された数の候補コロニーを、新鮮な選択培地への画線培養によって３回継代する。ＬｉｓｔｅｒｉａゲノムへのＣＥＡ構築体への正確な取込みはコロニー−ＰＣＲによって確認される。
【０３２６】
抗原発現およびＬＬＯ−ＣＥＡ融合タンパク質の分泌は、全細胞溶解物、およびＴＣＡ沈殿細菌培養流体のウエスタンブロッティングによって測定される。ＬＬＯ−特異的ウサギポリクローナル抗体およびＣＥＡ−特異的モノクローナル抗体を用いて、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからのＬＬＯ−ＣＥＡ融合タンパク質の発現および分泌を確認する。ＣＥＡを発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の生物学的特性をその各親株と比較することができる。新鮮な培地への静止相培養物の１：１００希釈による接種に続いてのブレイン・ハート−・インフージョン（ＢＨＩ）ブロスにおける増殖動態学が測定される。過去に、我々は、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて同様なまたはより大きなサイズのタンパク質を発現させた。しかしながら、細菌における哺乳動物遺伝子産物の組換えタンパク質発現は、各個々のタンパク質に依存した挑戦を主張する。もしＬｉｓｔｅｒｉａにおけるＣＥＡ発現が問題を持ち出すならば、ＣＥＡの断片またはＴ細胞ミニ−エピトープいずれかを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株を構築することができる。ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限ＣＥＡ天然Ｔ細胞エピトープＣＡＰ１（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ）（配列番号：５１）またはエンハンサーアゴニスト細胞傷害性Ｔリンパ球ペプチドＣＡＰ１−６Ｄ（ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ）（配列番号：５２）、我々の現存する発現構築体のオボアルブミン（ＯＶＡ）内にイン−フレームにて埋め込まれ、それにより、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＬＬＯに由来する分泌シグナルおよびＰＥＳＴエレメントは遺伝子的にＯＶＡに融合される。Ｔ細胞ミニ−エピトープの発現および免疫原性は、ｇｐ７０Ｔ細胞ミニ−エピトープ、ＡＨ１およびＡＨ１−Ａ５およびＢ１６Ｔｒｐ１、Ｔｒｐ２、およびｇｐ１００で以前に示されているように保存されている（データは示さず）。
【０３２７】
（実施例３１）
（Ｓ−５９／ＵＶＡ処理によってＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株を十分に不活化するが、最適な代謝活性、腫瘍抗原発現、抗原提示細胞の感染およびファゴリソソーム逃避を保持する条件の確率）
遺伝子発現の結果としての代謝活性は、最小数の架橋で最良に維持される。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡワクチンを十分に不活化し、抗原発現レベルを無傷のまま残す最小量のＳ−５９／ＵＶＡ処理のための条件は容易に確立することができる。不活化条件の例は、ＯＤ６００＝０．５のｌｏｇ−相培養における２００ｎＭまでのＳ−５９ソラレンの付加、続いての、培養が１の光学密度に到達した場合の６Ｊ／ｍ２のＵＶＡ光での不活化である。不活化条件は、Ｓ−５９の濃度、ＵＶＡ用量、ＵＶＡ処理に先立ってのＳ−５９暴露の時間を変化させることによって、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａ
ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株の細菌増殖の間における処理の時間を変化させることによって最適化される。親Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はコントロールとして用いられる。Ｌｉｓｔｅｒｉａの不活化（ｌｏｇ−死滅）は、ＢＨＩ（ブレイン・ハート・インフージョン）寒天プレート上でコロニーを形成する細菌の無能力によって測定される。加えて、３５Ｓ−パルス−チェイス実験を用いてＳ−５９／ＵＶＡ不活化ＬｉｓｔｅｒｉａのＬＬＯおよびｐ６０のようなＣＥＡの発現およびビルレンス因子を確認して、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化後に新しく発現されたタンパク質の合成および分泌を測定することができる。３５Ｓ−代謝標識を用いるＬＬＯおよびｐ６０の発現はルーチン的に測定することができる。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡは３５Ｓ−メチオニンの存在下で１時間インキュベートされる。抗原発現、およびＬＬＯ−ＣＥＡ融合タンパク質、内因性ＬＬＯ、およびｐ６０の分泌は全細胞溶解物、および細菌培養流体のＴＥＡ沈殿双方で測定されるであろう。ＬＬＯ−、ｐ６０−およびＣＥＡ−特異的モノクローナル抗体を免疫沈澱で用いて、不活化後に、組換えＬｉｓｔｅｒｉａからの継続した発現および分泌を確認する。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡの発現レベルは、優れた抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導をもたらす我々の現在のＬｉｓｔｅｒｉａ−ＯＶＡワクチン株と比較されるであろう。評価された遺伝子産物の発現レベルに対する限定的影響を持つ再現可能な十分な不活化に導くＳ−５９／ＵＶＡ条件を選択することができる。
【０３２８】
（実施例３２）
（ＭＨＣクラスＩの意味でＣＥＡの効果的な提示をもたらす、不活化（Ｓ−５９／ＵＶＡ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ＵＶＲ  ＡＢ  ＣＥＡワクチンでのヒト未成熟樹状細胞（ＤＣ）の感染のためのプロトコルおよびワクチン株の確立）
ＤＣのエキソビボ感染のための最適条件は３つの独立したアッセイ：（１）感染に際してのヒト未成熟ＤＣの表現型およびサイトカインプロフィールの変化、（２）同種異系Ｔリンパ球応答を誘導するＬｉｓｔｅｒｉａ−感染ＤＣの能力、および（３）インビトロでＣＥＡ−特異的ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限Ｔ細胞系を刺激するＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ感染ＤＣの能力の結果に基づいて決定される。
【０３２９】
（１．生きたおよび十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ−ＣＥＡ株で感染されたヒト未成熟ＤＣの表現型およびサイトカイン分泌プロフィールの測定および比較。ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびα−ＣＤ４０のような通常に使用される活性化シグナルとＬｉｓｔｅｒｉａ−感染ヒトＤＣの活性化との比較）
一次ヒトＤＣを感染し、それを活性化する、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ
ａｃｔＡ／ＵＶＲ  ＡＢ  ＣＥＡ株の効率を特徴付け、それを最適化することができる。ヒトＤＣを、従前に記載されているように（Ｆｏｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：１１０３３−４１（２００２））、不動化末梢血液から豊富化する。簡単に述べれば、従前に記載されているように（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：１２９７−３０２（１９９５））、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国）上での遠心によって得、次いで、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通す密度遠心によって単球枯渇させる。単球−枯渇ＰＢＭＣを、外因性サイトカインを添加しない、１０％のプールしたヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中でインキュベートする。３７℃における１０％ＣＯ２を含む湿潤化インキュベーター中での２４時間の培養の後、１５％（ｗ／ｖ）メトリザミドグラジエント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を通す遠心によってＤＣをさらにリンパ球から豊富化する。豊富化されたＤＣ集団の表現型はフローサイトメトリー（ＨＬＡ−ＤＡ発現、およびＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ５６発現の欠如）およびデキストラン接種によって確認される。ＤＣのＬｉｓｔｅｒｉａでの感染性を評価するために、ＤＣを、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株と共に異なるＭＯＩにて１時間インキュベートする。生きたＬｉｓｔｅｒｉａは比較として用いる。いずれの細胞外Ｌｉｓｔｅｒｉａも除去するための広範な洗浄の後、感染したＤＣを５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンの存在下でさらにインキュベートして、細胞外細菌を死滅させる。ＤＣのＬｉｓｔｅｒｉａ  ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株での感染に際しての表現型変化を、感染後の異なる時点でフローサイトメトリーを用い、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現を測定することによって評価する。Ｔヘルパー−１およびＴヘルパー−２タイプサイトカインの発現は、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、感染したＤＣ培養の上澄みから測定する。感染および活性化条件は、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびα−ＣＤ４０のような通常に使用される刺激体と比較する。インビトロでヒトＤＣの優れたかつ一定した刺激および活性化、ならびに親生Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と最も似ているサイトカインの分泌をもたらす感染条件を選択する。もしサイトカインを用いることのない末梢血液から単離されたＤＣの総じての感染性が低ければ、密度勾配遠心に先立ってのＤＣの感染を評価する。さらに、単球−由来ＤＣのようなＤＣのさらなる源は、生きていないおよび生きたＬｉｓｔｅｒｉａに対するその感染性を評価する。簡単に述べれば、陰性選択を用いてヒト単球を豊富化し、１０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４を補足した、１×１０６細胞／ｍＬの培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ）に懸濁させる。培養の６ないし７日後に、インビトロ培養したＤＣ集団の表現型を、フローサイトメトリーおよびデキストラン摂取によって確認���る。表現型の変化、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａ感染に際しての単球−由来ＤＣのサイトカイン分泌パターンを従前に記載されているように評価する。
【０３３０】
（２．インビトロで同種異系Ｔ細胞を活性化する、生きたまたは十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ−ＣＥＡ株で感染させたヒト未成熟ＤＣの刺激能力の測定および比較）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ−感染ＤＣ集団の刺激能力に取り組むために、混合白血球反応（ＭＬＲ）において一次アロー−反応性Ｔ細胞を刺激するその能力を測定することができる。その活性化／成熟化状態に依存する、インビボで免疫応答を誘導するＡＰＣの相対的能力は、インビトロで同種異系Ｔ細胞応答を刺激するその能力によって反映されると広く信じられている（Ｊｕｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１７：２１１（２００２））。簡単に述べれば、ＤＣを単離し、十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡで感染させる。感染された細胞集団の表現型はフローサイトメトリーによって確認される。種々の数の照射された（３０００ｒａｄ）ＤＣを、９６−ウェルＵ−底部プレート中で５×１０４同種異系レスポンダーと共に培養する（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。ランダムドナーからのＰＢＭＣをレスポンダーとして用いる。６日後、培養を１μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１８時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、［３Ｈ］チミジンの取込を、シンチレーションカウンターで放射能を測定することによって決定する。生きていないＬｉｓｔｅｒｉａで感染させたＤＣの刺激能力を、生きたＬｉｓｔｅｒｉａで感染させたＤＣ、ならびにＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびα−ＣＤ４０のような刺激体を用いて活性化されたＤＣと比較する。
【０３３１】
（３．インビトロでＣＥＡ−特異的ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限Ｔ細胞系を活性化するＬｉｓｔｅｒｉａ−感染ヒトＤＣ能力の評価。生きたまたは十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａいずれかで感染された未成熟ヒトＤＣと、ペプチド−パルスドＤＣとの比較）
表現型の変化、サイトカイン分泌のプロフィール、ならびにＤＣのアロー−刺激能力は、インビボで抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するＤＣの能力についての間接的尺度を表す。十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株によって発現された組換え腫瘍抗原を発現するＤＣの能力は、Ｌ．Ｆｏｎｇによって創製されたＣＥＡ−特異的ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限Ｔ細胞系の活性化に基づいて評価される（未公表データ）。簡単に述べれば、Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ  ３−１に記載されているように、ＨＬＡ＊Ａ０２０１陽性ドナーの末梢血液からＤＣを単離する。最適条件下で感染させた種々の数の照射（３０００ｒａｄ）ＤＣを、５×１０４ＣＥＡ−特異的ＨＬＡ＊Ａ０２０１−制限Ｔ細胞と共に９６−ウェルＵ−底プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中で共培養した。２４時間後、細胞上清を収集する。Ｔ細胞活性化を、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−２分泌に基づいて測定する。分泌されたサイトカインを、商業的に入手可能なＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定する。生きていないＬｉｓｔｅｒｉａで感染させたＤＣの刺激能力を生きたＬｉｓｔｅｒｉａで感染させたＤＣ、ならびにＬＰＳ、ＴＮＦ−α、およびα−ＣＤ４０のような刺激体を用いて活性化したＤＣと比較する。
【０３３２】
（実施例３３）
（インビトロでＣＥＡ−特異的免疫性をプライムし、リードＬｉｓｔｅｒｉａ株を選択する、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−負荷一次ヒトＤＣの能力のさらなる開発のための確認）
Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ−感染ＤＣが、インビトロでナイーブなＣＥＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をプライミングできることを確認するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡで確立された最適条件下で感染させたヒト未成熟ＤＣを用いて、インビトロでナイーブなＴ細胞を刺激する。天然または改変されたＴ細胞エピトープいずれかを含むリードＬｉｓｔｅｒｉａ  ａｃｔＡ／ｕｖｒＡＢ  ＣＥＡ株は、３つの独立したアッセイ：（１）ＤＣ−プライムしたＴ細胞培養の［３Ｈ］チミジン取込；（２）５１Ｃｒ放出アッセイで測定された、プライムしたＣＥＡ−特異的Ｔ細胞培養の細胞傷害性活性；および（３）ペプチド：ＭＨＣテトラマー染色によって測定されたＣＥＡ−特異的Ｔ細胞の頻度によって測定して、ナイーブなＣＥＡ−特異的Ｔ細胞応答を誘導するその能力に基づいて選択される。最適感染をＤＣの表現型変化によって確認し、フローサイトメトリーを用いてＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現、ならびに感染したＤＣによって分泌されたサイトカインプロフィールを測定することによって評価する。一次Ｔ細胞応答の誘導のために、一定数のＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球（２×１０５／ウェル）を種々の数の照射された（３，０００Ｒ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ−負荷ＤＣとともに、９６−ウェルの丸底マイクロタイタープレート中で７日間共インキュベートする。６日後、培養を１μＣｉの［３Ｈ］チミジンで１８時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、［３Ｈ］チミジンの取込を、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド国）で放射能を測定することによって決定する。さらに、ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞の誘導を細胞傷害性Ｔ細胞アッセイで評価する。簡単に述べれば、５×１０６ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球を平行して、５×１０６細胞／１．５ｍｌ培地にて、２４−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で、１０：１の比率で、照射された（３，０００Ｒ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ−負荷ＤＣと共に培養する。Ｔ細胞の細胞傷害性活性は、７日後に、標準的な４時間５１Ｃｒ−放出アッセイで評価する。簡単に述べれば、標的細胞系ＳＷ４０３、ＳＷ１４１７、Ａ３７５、およびＴ２を２５０μＣｉの［５１Ｃｒ］中で２時間インキュベートする。この標識工程の間に、Ｔ２細胞もまたＨＬＡ＊０２０１−制限標的ペプチドＣＡＰ１およびＣＡＰ１−６Ｄ無くして、またはそれと共にインキュベートする。標的細胞系をＲＰＭＩで３回洗浄し、９６−ウェルＵ−底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で少なくとも５，０００標的／ウェルと共に三連で平板培養する。エフェクター細胞を記載されたエフェクター／標的比にて５１Ｃｒ−標識標的細胞と共にインキュベートする。４時間の培養の後、上清を収集し、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド国）でカウントする。パーセント特異的溶解は、式：１００％×（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）によって計算される。最大放出は、０．５％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中での標的細胞の溶解によって測定される。最後に、従前に記載されているように（Ｆｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎ���ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：８８０９−１４（２００１）、ＣＡＰ１またはＣＡＰ１−６Ｄを提示するＭＨＣ／テトラマーを用い、インビトロプライミングの後のＣＥＡ−特異的Ｔ細胞の頻度を測定することができる。インビトロプライミング前に得られた低温保存ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を、平行して、インビトロプライムした培養Ｔ細胞培養物で分析する。合計１×１０６細胞が、室温にて３０分間で、対応するＨＬＡ＊Ａ０２０１フィコエリスリン−標識ＭＨＣ／テトラマーで染色されるであろう。（陽性ゲートで用いられる）ＣＤ８、およびＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ５６（陰性「ダンプ」ゲート）に対する抗体を推奨される濃度で加え、４℃にて３０分間インキュベートする。染色に続き、サンプルを２回洗浄し、４−色フローサイトメトリーで分析する。我々は、テトラマー染色のために以前バックグラウンドを確立した。２０人のボランティア血液提供者を同一方法で評価し、彼らは、各々、ＣＥＡ６０５−６１３および６１０Ｄテトラマーに対して０．３０％±０．１８％および０．２７％±０．１４％を有した（Ｆｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：８８０９−１４（２００１））。
【０３３３】
（実施例３４）
（異種抗原としてのプロテイナーゼ３またはＰＲ１の使用）
前記した具体的な実施例で概説した手法のいくつかは、改変されたＬｉｓｔｅｒｉａによって発現される抗原としてのＣＥＡ抗原の使用を記載するが、当業者であれば、同様な手法を用いて、プロテイナーゼ−３またはプロテイナーゼ−３由来抗原のような異なる抗原を発現する改変されたＬｉｓｔｅｒｉａを調製して、インビトロまたはエキソビボで樹状細胞を感染させ、負荷および活性化／成熟化を行うことができるのは容易に認識するであろう。当業者であれば、次いで、得られたＤＣワクチンを動物または患者に投与して、プロテイナーゼ−３および／またはＰＲ１に対する免疫応答を誘導することができるのも認識するであろう。
【０３３４】
例えば、前記実施例に記載されたＬ４０２９−ｕｖｒＡＢ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、プロテイナーゼ−３遺伝子および／またはＰＲ１エピトープをコードするｐＰＬ２ベクター骨格などを含むベクターで改変して、Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムに抗原−発現配列を取り込むことができる。１つの例において、ＰＲ１抗原は、ＰＲ１エピトープが埋め込まれている、ＯＶＡに融合された切形ＬＬＯ配列を含むＬＬＯ−ＯＶＡ／ＰＲ１融合タンパク質のような融合タンパク質の一部として発現させることができる。改変されたＬｉｓｔｅｒｉａによって発現され得る抗原性タンパク質（ＬＬＯ−ＯＶＡ／ＰＲ３）のような配列を図３１に示す。
【０３３５】
（実施例３５）
（ファゴリソソームから逃避し、クラスＩ抗原提示を促進する突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａの能力の測定）
抗原提示細胞のファゴリソソームを逃避し、該細胞によるクラスＩ抗原提示を促進する特定の候補突然変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａの能力を評価するための例示的プロトコルは以下の通りである：まず、ＤＣ２．４細胞をカバーグラス上で増殖させる。次いで、細胞を所望のＬｉｓｔｅｒｉａ株で感染させる（ＭＯＩ＝１００）。０．５ｈｐｉにおいて、細胞を濯いで遊離Ｌｉｓｔｅｒｉａを洗浄除去する。１ｈｐｉにおいて、ゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬで加える。５ｈｐｉにおいて、カバーグラスを洗浄し、３．５％ホルムアルデヒド中で固定する。カバーグラスをブロックし、ウサギ−抗−Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体（Ｄｉｆｃｏ）で染色し、ヤギ−抗−ウサギＦＩＴＣ二次（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で検出する。アクチンをファロイジン−ローダミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で検出する。カバーグラスをＶｅｃｔａｍｏｕｎｔ＋ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で設置し、調査する。前記した実施例１７および実施例２５も参照されたし。
【０３３６】
（実施例３６）
（ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびＬｉｓｔｅｒｉａワクチンでの感染）
ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびＬｉｓｔｅｒｉａワクチンでの感染のための例示的プロトコルの概略を以下に掲げる。
【０３３７】
材料：ヒト末梢血液（血液提供者からのバフィコートが好ましい）；Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；ｄＰＢＳｗ／ｏ  Ｃａ、Ｍｇ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）；ＲＰＭＩ−１６４０  ｗ／Ｌ−グルタミン（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）；胎児ウシ血清、明確化、加熱不活化（ＨｙＣｌｏｎｅ）；ヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）−５００Ｕ／μＬで作成し、−２０℃で貯蔵されたストック溶液；２００Ｕ／μＬで作成され、−２０℃で貯蔵されたストック溶液；Ｃｏｓｔａｒ  ２４−ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ）。
【０３３８】
単球単離培地（ＭＩＭ）：溶液１（Ｉｓｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｅｒｃｏｌｌ）を作成するために、５０ｍＬのＮａＣｌ溶液（５００ｍＬ  ｄＨ２Ｏ、４３．８４ｇのＮａＣｌ（１．５Ｍ））を４５０ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌに加え、混合する。溶液２（ＰＢＳ／クエン酸塩）は、１００ｍＬのｄＨ２Ｏ、２０５．６ｍｇのＮａＨ２ＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１．４９ｍＭ）、１．３０ｇのＮａ２ＨＰＯ４（９．１５ｍＭ））、８．１８ｇのＮａＣｌ（１３９．９７ｍＭ）、および３．８２ｇのＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７＊２Ｈ２Ｏ（１３ｍＭ）を混合し、ｐＨを７．２とすることによって調製される。次いで、２５０ｍＬのｉｓｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｅｒｃｏｌｌを２５０ｍＬのＰＢＳ／クエン酸塩と混合する。溶液を滅菌濾過し、４℃で貯蔵する。
【０３３９】
培養培地：ＲＰＭＩ−１６４０ｗ．ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％胎児子牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅからの明確化された加熱不活化ＦＣＳを用いる）。
【０３４０】
方法：ＦｉｃｏｌｌおよびＭＩＭを室温まで温める。２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌを２５０ｍＬ円錐試験管の各々に入れる。血液をｄＰＢＳで二倍希釈し、十分に混合する。２５ｍＬの血液を各試験管中のＦｉｃｏｌｌの頂部に重ねる。試験管を１８ないし２０℃にて３０分間、４００×ｇにおいて遠心する。
【０３４１】
単核界面中核をグラジエントから注意深く収集し、清浄な５０ｍＬ試験管に入れる。試験管の残りをｄＰＢＳで満たす。試験管を１００×ｇにて１５分間遠心する。これはリンパ球および単球をペレット化するが、血小板を浮遊したままとする。上清を吸引する。試験管の残りにｄＰＢＳを満たし、遠心し、吸引する工程を、合計３回の洗浄の間に、さらに２回反復する。
【０３４２】
ペレットを２０ｍＬのｄＰＢＳに再懸濁させる。懸濁液を２０ｍＬのＭＩＭに重ねる。サンプルを室温にて３５分間、４００×ｇで遠心する。単球を界面から収集し、培養基を含有する清浄な試験管に移す。もし細菌と共に用いるためにＤＣを培養するならば、抗生物質を用いてはならない。
【０３４３】
サンプルを４００×ｇにて１０分間遠心し、上清を吸引する。ペレットをｄＰＢＳ中で４回洗浄する。最後の洗浄後、細胞ペレットをＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳに再懸濁する。次いで、トリパンブルーを用い、または自動カウンターを用いてヘマサイトメーターでサンプルをカウントする。細胞懸濁液をｍＬ当たり１×１０６細胞まで希釈する。細胞懸濁液の各ｍＬについて、５００Ｕ  ＧＭ−ＣＳＦおよび２００Ｕ  ＩＬ−４を加える（もしストックが前記したように作成されれば、各々のｍＬ当たり１μＬ）。ウェル当たり１ｍＬをＣｏｓｔａｒ２４−ウェルプレートに平板培養する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度に４８時間置く。
【０３４４】
２日目に、樹状細胞用のフィーディング培地を作成する。これは５００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦおよび２００Ｕ／Ｍｌ  ＩＬ−４と共に、培養されたウェル当たり０．５ｍＬ培養基（用いる前に３７℃まで加温）よりなり、各ウェルの頂部からの０．５ｍＬを吸引し、０．５ｍＬの新鮮なフィーディング培地と置き換える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度にさらに４８時間置く。フィーディングを４日に反復する。５日に、細胞は用いる準備ができている。細胞は、常に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４含有培地中に維持しなければならず、あるいはそれをマクロファージに戻す。樹状細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、およびＣＤ８６を見るサイトメーターで表現型により調べる。
【０３４５】
ヒトＤＣのＬｉｓｔｅｒｉａ感染：  
第５日樹状細胞（ＤＣ）をペレット化し、ｍＬ当たり２×１０６細胞にて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む新鮮な培地に再懸濁させる。５００μＬの懸濁液を２４ウェルプレートの各ウェルに小分けする。成熟化刺激体または細菌を５００μＬ中に加える。１μｇのＬＰＳを成熟化制御のために用いる（１０００ＵのＩＦＮ−γまたは１μｇのｓＣＤ４０Ｌを加えて、この応答を高めることができる）。Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染では、ＤＣ当たり１０ないし１００Ｌｉｓｔｅｒｉａの間を用いる。細胞を１時間感染し、次いで、細胞外細菌を洗浄して除去し、細胞を、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有する培地に再懸濁させる。ｓＣＤ４０Ｌを加えて、ＤＣの生存を増強させ、より大きなＩＬ−１２ｐ７０の放出を促進する。１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γを加えて、成熟化およびＩＬ−１２ｐ７０分泌を高める。ＤＣを、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、およびＣＤ８６を見るサイトメーターで表現型により調べる。
【０３４６】
（実施例３７）
（無胞子Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓワクチン株）
ｓｐｏＩＩＥイン−フレーム欠失。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのｓｐｏＩＩＥ領域は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中の同一遺伝子に対する相同性によって同定される。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｐｏｉｉｅのイン−フレーム欠失を単離するために、ｓｐｏＩＩＥ遺伝子をまずＰＣＲによって増幅し、それをｐｃｒ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化する。次に、ｓｐｏＩＩＥ遺伝子のほとんどは、重複延長（ＳＯＥ）による遺伝子スプライシングの技術を用いて欠失される（Ｈｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：５２８−３５（１９９０））。このイン‐フレーム欠失ｓｐｏＩＩＥ遺伝子を、クロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を担い、４２℃では複製することができないシャトルベクターｐＫＳＶ７にクローン化する（Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７４：７０５−１１（１９９２））：次いで、欠失されたｓｐｏＩＩＥ遺伝子を含むｐＫＳＶ７をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓにエレクトロポレーションし、細胞をクロラムフェニコールの存在下で４２℃で増殖させて、プラスミドが相同組換えによってｓｐｏＩＩＥ遺伝子に組み込まれた株を選択する。クロラムフェニコール選択無しの３０℃におけるさらなる増殖により、プラスミドが切り出され、喪失する。クロラムフェニコール−感受性株は少なくとも１％見出され、その約半分は欠失されたｓｐｏＩＩＥ対立遺伝子を含むはずである（Ｃａｍｉｌｌｉら、（１９９３））。欠失の存在はＰＣＲおよびサザーンブロット分析によって確認される。
【０３４７】
ｓｐｏＩＩＥ／ｕｖｒＡＢ二重欠失株。ｓｐｏＩＩＥ欠失株で開始し、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子のイン−フレーム欠失を行う。もう一度、注目する遺伝子を増幅し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯにクローン化する。次いで、ＳＯＥ技術によってｕｖｒＡおよびｕｖｒＢ遺伝子のほとんどを欠失させるべきである。このイン−フレーム欠失ｕｖｒＡＢ領域をｐＫＳＶ７にクローン化し、構築体をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｐｏＩＩＥ欠失株にエレクトロポレーションする。クロラムフェニコール−抵抗性を４２℃で選択して、プラスミドのｕｖｒＡＢ領域への組込みにつき選択する。薬物選択無しの３０℃における増殖を行って、プラスミドを喪失した分離体の増殖を促進する。クロラムフェニコール−感受性コロニーを拾い、ＰＣＲによってｕｖｒＡＢ領域の喪失につきテストし、その喪失はサザーンブロット分析によって確認されるであろう。
【０３４８】
（実施例３８）
（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの温度感受性ｒｅｃＡ突然変異体）
３０Ｃでよく増殖し、４２Ｃでソラレンに対して非常に感受性であるＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの温度感受性ｒｅｃＡ突然変異体を作り出すために、Ｅ．ｃｏｌｉの温度感受性ｒｅｃＡ突然変異体、ｒｅｃＡ４４（Ｋａｗａｓｈｉｍａら、１９３：２８８−９２（１９８４））のＶ２４６Ｍ突然変異に類似した突然変異をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓで行う。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ突然変異体を作成するために、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの間で保存される配列２４５ＫＶＶＫＮＫ２５０（配列番号：４６）を突然変異させる。Ｖ２４６Ｍ突然変異を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅキットを用い、ミスマッチしたオリゴヌクレオチド突然変異誘発によってクローン化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｒｅｃＡ遺伝子に導入する。突然変異は配列分析によって確認し、それを対立遺伝子交換によってＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｐｏＩＩＥ  ｕｖｒＡＢの染色体に導入することができるように、突然変異した遺伝子をｐＫＳＶ７に導入する。別法として、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株からのｒｅｃＡ遺伝子を欠失させ、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｅｃＡ４４（ｔｓ）対立遺伝子で置き換える（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｒｅｃＡはＥ．ｃｏｌｉ中で機能することが知られている（Ｋｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：３９１７−２２（２００２）））。
【０３４９】
（実施例３９）
（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原の活性部位への突然変異の導入）
致死因子突然変異Ｈ６８６Ａはそのプロテアーゼ活性を不活化し、浮腫因子突然変異Ｋ３４６ＱおよびＫ３５３Ｑが（一緒になって）そのアデニルシクラーゼ活性を不活化する（Ｂｒｏｓｓｉｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：１７８１−６（２０００））。これらの突然変異をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株に導入して、ｓｐｏＩＩＥ  ｕｖｒＡＢおよびｓｐｏＩＩＥ  ｕｖｒＡＢ  ｒｅｃＡｔｓ株のような、ワクチンで用いる。ｌｅｆ（致死因子）およびｃｙａ（浮腫因子、アデニルシクラーゼ）遺伝子をクローン化し、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で突然変異誘発して、突然変異体遺伝子を創製する。次いで、突然変異体遺伝子をｐＫＳＶ７に移し、最終的に、対立遺伝子交換によって宿主ｐＸＯ１プラスミドに導入する。
【０３５０】
（実施例４０）
（高レベルで保護抗原を発現するためのＳＯＳ調節配列の使用）
Ｃｈｅｏら（Ｃｈｅｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：５９０７−１５（１９９３））は、コンセンサス配列ＧＡＡＣＮ４ＧＴＴＣ（配列番号：４７）が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳＯＳ応答において遺伝子のためのＬｅｘＡレプレッサー部位を規定することを示している。ＳＯＳレギュロンの一部であるＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｒｅｃＡおよびｕｖｒＡＢ遺伝子のためのプロモーターの上流の同様なコンセンサス配列を位置させる。高レベルで保護抗原を発現するＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を作成するために、保護抗原遺伝子をＳＯＳ調節配列の制御下に置き、ソラレンでの処置が高レベルの保護抗原を作るように、それをＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｓｐｏＩＩＥ  ｕｖｒＡＢ株に導入する。この人工遺伝子をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ染色体に挿入するために、ｐＰＬ２のような組込みベクターを用いる（Ｌａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４１７７−８６（２００２））。注目する遺伝子、この場合には、プロモーターの制御下にある保護抗原遺伝子をマルチクローニング部位に挿入する。プラスミドはＥ．ｃｏｌｉからＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株に接合させる。それはグラム−陽性菌では複製できないので、それは、染色体への組込みによって維持できるに過ぎない。現在のｐＰＬ２ベクターはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのファージインテグラーゼおよびファージ付着部位を含み、従って、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓファージインテグラーゼ遺伝子およびファージ付着部位を除去し、それらをガンマファージ（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．，９６：３４−９（１９５５））のようなＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのファージからの同様なエレメントで置き換えることによって改変されなければならない。また、ｐＰＬ２ベクターは、典型的には、選択のためのクロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を含む。薬物抵抗性遺伝子は、ワクチンの働きでは望ましくないので、それは除去される。薬物抵抗性遺伝子の１つは、Ｄ−アラニンを合成し、Ｄ−アラニン栄養要求性突然変異体をＤ−アラニンの添加無くして豊富な培地で増殖させるＤ−アラニンラセマーゼについての遺伝子によって置き換えられている。他の薬物抵抗性遺伝子は、グルタミンを合成し、グルタミンを含まない豊富な培地でグルタミンシンテターゼ突然変異体細菌の増殖を可能とするグルタミンシンテターゼについての遺伝子によって置き換えられる。
【０３５１】
（実施例４１）
（例示的突然変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株）
前記実施例に記載された方法の組合せを用い、種々の異なる突然変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を調製する。ワクチン組成物で用いるべき例示的突然変異体Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株を表２６にリストする。
【０３５２】
（表２６  Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株および候補ワクチン）
【０３５３】
【表２６】
2006521376.tif 000051
【０３５４】
１ＮＥＲ、ヌクレオチド切出修復
３ｌａｃＩ抑制可能プロモーターの制御下にある条件ｒｅｃＡ株も誘導される。
４ＨＲ、相同組換え
（実施例４２）
（ソラレン−不活化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株における、保護抗原およびカプセルを含めた、タンパク質発現レベルの特徴付け）
不活化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株が依然として代謝することができるのを示すために、細胞を炭酸水素塩を含む最小培地中でインキュベートする（Ｔｈｏｒｎｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：５０５−１６（１９５７））。そのようなインキュベーションの後、細胞を遠心によって除去し、上清を保存する。上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。クーマシーブルーでの染色の後、保護抗原が目立ち、その存在はウェスタンブロット分析（Ｂｒｏｓｓｉｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：５７３１−４（２０００））によって、および質量分析によって確認される。加えて、質量分析を用いて、Ｌｅｎｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：１２４３２−１２４３７（２００３）に記載された方法を用い、これらの条件下で分泌される他のタンパク質を同定する。ポリグリタメートカプセルがこれらの条件下で作成されるかを評価するために、カプセル合成のための遺伝子をコードするｐＸＯ２を形質導入によって株に導入する（Ｇｒｅｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４９：２９１−７（１９８５））。カプセルはロケット免疫電気泳動によって測定される（Ｕｃｈｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２３：１２２９−４０（１９９７））。
【０３５５】
（実施例４３）
（減弱化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株で免疫化したＳｗｉｓｓ  ＷｅｂｓｔｅｒおよびＡ／Ｊマウスにおける液性および粘膜応答の特徴付け）
マウス免疫化。マウスに筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）経路によってＳ−５９／ＵＶＡワクチンを注射して、いずれの経路の免疫化が最良の細菌−特異的液性および細胞性応答をもたらすかを判断する。また、マウスの鼻孔内（ＩＮ）免疫化をテストして、候補ワクチンによって誘導された粘膜応答を評価する。５μｌの設計されたワクチン製剤の、軽く麻酔したマウスの各鼻孔へのＩＮ免疫化を従前に記載されているように行う（Ｂｏｙａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：５６３６−４３（２００３））。マウスを０．１  ＬＤ５０用量の候補ワクチンで免疫化する。メジアン致死レベルが観察されない８つのＳ−５９／ＵＶＡ不活化ワクチン候補のいずれかを１０８粒子の初期用量で与える。１を超える経路によって免疫化されたマウスを、０．１  ＬＤ５０用量を超えるか、あるいは１０８粒子よりも大きな組合せ用量で注射しない。複数免疫化を与えられたマウスは、全ての注射での終始一貫したワクチン用量を受け取る。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢでの３連続日での免疫化の結果、単一免疫化と比べて増大した液性および細胞性免疫がもたらされるので、同一戦略をＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株ワクチンで用いる。また、マウスには、一次免疫化後１４日および２８日にブースター免疫化を与える。
【０３５６】
ＰＡ、ＬＦ、ＥＦ、カプセルおよび全細菌に対する抗体の定量。種々のワクチン候補で免疫化したマウスにおける粘膜および抗体応答を特徴付ける。免疫化に先立って、ならびに免疫化から１週間後に、血清を眼窩後叢から採取する（我々は、週当たり１を超えず、交互の目から取るように、血液サンプリングに関してマウス当たりの最大５つの眼窩後叢手法のためのＩＡＣＵＵＣ認可を有する）。ＩｇＡレベルの測定のための唾液および鼻洗浄を最終免疫化から１週間後に犠牲時に行う。また、最終免疫化から４５日後に候補ワクチンによって誘導された液性および粘膜免疫性の持続も特徴付ける。ＰＡ、カプセル、および栄養細菌（Ｓｔｅｒｎｅ株）に対する液性および粘膜応答を、従前に公表されているように（Ｂａｌｌａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１２５３１−４（１９９６）；Ｒｈｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：１０９２５−３０（２００３））、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。簡単に述べれば、Ｉｍｍｕｌｏｎ９６−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）を、まず、従前に記載されているように（Ｒｈｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：１０９２５−３０（２００３））、調製されたポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）カプセルと、または４℃にて１６時間、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で乳鉢および乳棒を用いて液体窒素下で粉砕し、ＴＳＴＡ緩衝液（５０ｍＭトリス［ｐＨ７．６］、１４２ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、２％ウシ血清アルブミン）でブロックしたＳ−５９ソラレン／ＵＶＡ不活化細菌と結合した５μｇ精製ＰＡ、ＬＦ、ＥＦ、ＢＳＡによって被覆する。マウス血漿または粘膜分泌物の系列二倍希釈を、各々、ＰＡ、ＰＧＡ−ＢＳＡ、またはＳｔｅｒｎｅで被覆した９６−ウェルプレートに添加する。固定化抗原へのＡｂｓの結合は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）からのイソタイプ−特異的ペルオキシダーゼ・ヤギ抗−マウスμ、γまたはαＨ鎖−特異的抗体とのインキュベーションによって測定する。ビオチニル化ラット抗−マウスγ１（クローンＧ１−７．３）、γ２ａ（クローンＲ１９−１５）、γ２ｂ（クローンＲ１２−３）、またはγ３（クローンＲ４０−８２）Ｈ鎖−特異的ｍＡｂｓ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびストレプトアビジン−結合ペルオキシダーゼをＩｇＧ  Ａｂサブクラス分析で用いる（Ｃｏｌｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１０７：８４６−５２（１９７１）；Ｃｏｌｅら、Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５Ｂ：４８７−９５（１９７５））。比色反応は、ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の添加によって発色させる。終点力価は、ｌｏｇ２希釈の逆数として表し、コントロールの非−免疫化マウスで得られたものを２標準偏差を超えるＯＤ４１５を与える。
【０３５７】
Ｉｇ−分泌細胞の検出のための酵素−結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ。ＰＡ−特異的Ｉｇ−分泌リンパ球の頻度はＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定される（Ｂｏｙａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：５６３６−４３（２００３））。簡単に述べれば、ワクチン接種およびコントロールマウスの脾臓または頸部リンパ節を迅速に切開し、氷冷ＲＰＭＩ  １６４０培地に入れ、単一細胞懸濁液を調製する。９６−ウェルＰＶＤＦ−系プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）を２．５μｇ／ｍｌの精製されたＰＡ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）で一晩被覆する。プレートを洗浄し、３７℃にて２００μｌの完全ＲＰＭＩで２時間ブロックし、細胞懸濁液の系列希釈を９６−ウェルプレートに加える。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２中で６時間平板培養する。抗原特異的抗体形成性細胞（ＡＦＣ）を、イソタイプ−特異的ビオチン−標識抗−マウスμ、γまたはαＨ鎖−特異的抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）で検出する。２時間の室温でのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ヤギ抗−ビオチン：１ｎｍ  Ｇｏｌｄコンジュゲート（ＧＡＢ１；Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）を室温にて１時間加える。広範な洗浄の後、３０μｌの銀基質（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；  Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）を各ウェルに加え、スポットの発生をモニターする。各ウェルにおけるスポットを、自動ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（ＣＴＬ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）を用いてカウントする。液性応答は、１０６脾臓またはリンパ節細胞当たりの抗体形成性細胞の数として表される。
【０３５８】
トキシン中和アッセイ。ワクチン候補で免疫化されたマウスで誘導された中和抗体を、致死トキシン（ＰＡ＋ＬＦ）からＪ７７４マクロファージ細胞系を保護する能力につき評価する（Ｍｏｃｋら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５：６４７−７１（２００１）；Ｂｏｙａｋａら（２００３）；Ｒｈｉｅら（２００３））。簡単に述べると、Ｊ７７４細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓｕｓ，ＶＡ）を５×１０４細胞／ウェルにて９６−ウェル平坦−底プレート（Ｎｕｎｃ）に加え、５％ＣＯ２中で３７℃にて１２時間インキュベートする。テスト血清または粘膜分泌物をＴＳＴＡ緩衝液に系列的に二倍希釈する。ＰＡおよびＬＦ（４００ｎｇ／ｍｌのＰＡおよび４０ｎｇ／ｍｌのＬＦ）を抗血清希釈物に加える。１時間のインキュベーションの後、抗血清／致死トキシン複合体混合物を細胞懸濁液に加え、さらに５時間インキュベートする。細胞生存性はＭＴＴアッセイによってモニターする（５４０ｎｍで測定された吸光度）。アッセイは各プレートに含まれた陰性コントロール（清浄な血清）および陽性コントロール（ＭＡｂｓ、１４Ｂ７および１Ｇ３）（Ｍｉｋｅｓｅｌｌら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，３９：３７１−６（１９８３）；Ｓｔａｒｎｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ９（２００３））で三連にて行う。各三連サンプル希釈物の平均および標準偏差を計算する。終点は、清浄なコントロール血清と比較して、ａｎｔｈｒａｘトキシンの５０％中和を呈する最大血清希釈として表される。
【０３５９】
（実施例４４）
（改変されたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓでワクチン接種されたＡ／ＪマウスにおけるＰＡ−、ＬＦ−、およびＥＦ−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞−媒介応答の特徴付け）
Ｔ細胞増殖。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は、ワクチン接種したおよびナイーブなＡ／ＪマウスのＰＢＭＣ、脾臓およびリンパ節細胞から測定する。脾臓および頸部リンパ節を分散させて、従前に記載されたように単一細胞懸濁液を得る（Ｂｏｙａｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：１２２−８（１９９９）；Ｌｉｌｌａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１６２−１６９（２００１）；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．，６５：５１７１−５（１９９７））。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）からのマウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを用いて陰性選択によって単離する。プールされたリンパ節またはＰＢＭＣからの個々のマウス脾臓からの精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を４×１０６細胞／ｍｌで培養し、完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２３．８ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５×１０５−５Ｍのμ−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ）中のＴ−細胞−枯渇非−分裂同系間ナイーブ脾臓フィーダー細胞（８×１０６細胞／ｍｌ）の存在下で種々の濃度のＰＡ、ＬＦまたはＥＦで刺激する。脾臓フィーダー細胞の複製は、Ｓ−５９ソラレンでの軽い光化学処理によって阻止される。最終１８ないし２０時間の０．５μＣｉのトリチウム化チミジン（［３Ｈ］ＴｄＲ）の添加に先立って、培養物を３７℃および５％ＣＯ２において４日間インキュベートする。細胞をガラス繊維シートに収集し、取り込まれたチミジンの量を、シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド国）にて放射能を測定することによって決定する。
【０３６０】
ＰＡ−、ＥＦ−またはＬＦ−誘導サイトカイン応答の分析。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  （Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）からのマウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを用いて陰性選択によって単離する。個々のマウスの脾臓またはリンパ節からの精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、１×１０５細胞／ウェルにて、丸底９６−ウェルプレート中で培養し、完全ＲＰＭＩ中、Ｔ細胞−枯渇、非−分裂同系間ナイーブ脾臓フィーダー細胞（１×１０５細胞／ウェル）の存在下で種々の濃度のＰＡ、ＬＦまたはＥＦで刺激する。Ｔ細胞−枯渇脾臓フィーダー細胞を、Ｓ−５９での軽い光化学処理によって阻止する。Ｔ細胞培養は３７℃および５％ＣＯ２において２日間インキュベートする。Ｔヘルパー−１およびＴヘルパー−２サイトカインの発現は、Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、抗原−刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞の上清から側定する。
【０３６１】
（実施例４４）
（改変されたＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓワクチンでの最後の免疫化用量から４５日後におけるＳｗｉｓｓ  ＷｅｂｓｔｅｒおよびＡ／Ｊマウスにおける胞子および致死トキシン挑戦に対する保護の程度の特徴付け）
致死トキシン挑戦に対するマウスの保護。選択された候補ワクチンで免疫化されたマウスを、従前に記載されているごとく（Ｐｒｉｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：４５０９−１５（２００１）；Ｒｈｉｅら（２００３））、致死トキシンでの尾静脈注射によって挑戦する。致死トキシンは、記載されているごとく（Ｒｈｉｅら（２００３））、組換えＰＡおよびＮＦ組換えタンパク質（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）を混合することによって調製される。マウス当たりの致死トキシンＩＶ  ＬＤ５０は６μｇのＬＦと混合したほぼ１２μｇのＰＡである。新たに調製された致死トキシンのマウスにおけるメジアン致死性は、公表された値の０．１ないし１０のＬＤ５０用量範囲にわたる尾静脈注射によって測定される。保護実験は、同様に、ＬＤ５０用量の５ないし１０倍の範囲にわたる致死トキシン挑戦を含む。このモデルにおいては、未保護マウスは２４時間以内に死亡する。最初に、ａｎｔｈｒａｘによる死亡は、トリプシンソイ寒天上で血液を平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートすることによって選択されたマウスで確認される。平板を、２ないし３ｍｍの典型的なａｎｔｈｒａｃｉｓ−様「すりガラス」外観を持つコロニーにつき観察する。致死トキシンで処理した全てのマウスは毎日モニターし、２週間後に実験を停止し、全ての保護マウスを犠牲にする。
【０３６２】
胞子調製。Ｓｔｅｒｎｅ株胞子を記載されているように調製する（Ｂａｒｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，１９９９）。簡単に述べると、１００ｍｌ瓶に含有され、３７℃にて５時間振盪された５ｍｌのＦＡ培地（３．３％トリプトン、２％酵母エキス［水に対して一晩透析］、０．２％Ｌ−ヒスチジン、０．８％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４％ＫＨ２ＰＯ４、０．７４％ＮａＣｌ）に単一コロニーを接種する。１／１０ミリリットルのアリコットをＬ寒天プレート上に広げ、３７℃にてインキュベートする。菌叢をプレートから掻き取り、滅菌水で十分に洗浄し、６０℃にて３０分間加熱ショックを与え、水で洗浄し、従前に記載されているように（Ｐａｌｕｃｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：８６８−８７０（１９９９））、水中の５８％Ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ−７６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）上で精製し、次いで、水でもう１回洗浄する。次いで、胞子を１０，０００×ｇにてペレットに沈積させ、水中の１％フェノールに再懸濁させる。このプロセスのこの収率はプレート当たり０．５×１０９ないし５．０×１０９胞子の範囲であると公表されている。
【０３６３】
致死胞子挑戦に対するマウスの保護。筋肉内（ＩＭ）注射によって与えられる加熱−ショックＳｔｅｒｎｅ株胞子のＬＤ５０値は、１０３ないし１０８胞子の用量範囲にわたって決定する。吸入ａｎｔｈｒａｘに対するワクチン接種マウスにおける保護を評価するために、従前に記載されているように（Ｂｒｏｏｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：７０２−１１（２００１））、気管内（ＩＴ）胞子投与によって挑戦実験を行う。簡単に述べれば、固定化し麻酔したマウスの舌をピンセットで外方向かつ横方向に軽く引き、先端からほぼ１インチわずかな角度だけ曲げた平滑１．５インチ２２−ゲージ針を嵌合させたシリンジを用いてワクチンを送達する。我々は、ＩＭまたはＩＴ経路によって投与されたＳｔｅｒｎｅ株ＬＤ５０値はＡ／Ｊマウスにおいてほぼ１０３であり、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいては１０倍高いまでであると予測する。保護実験は１００ＬＤ５０用量胞子挑戦までを含む。胞子で処理した全てのマウスを毎日モニターし、実験は２週間後に停止し、全ての保護されたマウスを犠牲にする。全ての挑戦実験において、死亡までの平均時間は非−生存群において決定する。
【０３６４】
（実施例４５）
（マウスにおけるＯＶＡモデル抗原を発現するワクシニアでの挑戦に対するＬｉｓｔｅｒｉａワクチンの保護免疫）
本発明のワクチンは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ挑戦に対して保護的免疫化を示す。病原体に対して免疫化し、保護する能力をさらに説明するために、ＯＶＡ抗原を含むまたは含まない、およびＳ−５９ＵＶＡ処理（前記実施例１３の第二の方法）の有りおよび無しにてのＬｉｓｔｅｒｉａワクチンの方法を用いて、もう１つの微生物、例えば、ＯＶＡ抗原を発現するワクシニアウイルス（ＶＶ−ＯＶＡ）に対して免疫化する。これは、他の微生物に対する抗原特異的免疫化がＬｉｓｔｅｒｉａワクチンで達成できることを示す。
【０３６５】
ＯＶＡを発現するワクシニアウイルス（ＷＲ株）はＬａ  Ｊｏｌｌａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手し、Ｏｐｔｉｃｅｌｌチャンバー（ＢｉｏＣｒｙｓｔａｌ，ＯＨ）を用いてＶｅｒｏ細胞中で調製する。Ｏｐｔｉｃｅｌｌチャンバーを、Ｌ−グルタミン、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、ＮＥＡＡ（非−必須アミノ酸）、ＮａＨＣＯ３、および１０％ＦＢＳを補足したイーグルの最小必須培地中のＶｅｒｏ細胞で接種する。細胞がほぼ７５％密集となれば、増殖培地を取り出し、１×１０５ＰＦＵ／ｍＬのＶＶ−ＯＶＡを含有する新鮮な培地で置き換える。単層が＞５０％細胞病理効果を示せば、細胞および上清を収集し、３凍結−解凍サイクルに付し、清澄化し、−８０℃にて貯蔵する。力価はＶｅｒｏ−７６細胞でのプラークアッセイによって測定する。ワクチンによるオボアルブミン発現は、マウスへの注射に先立ってウェスタンブロット分析によって確認する。
【０３６６】
Ｃ５７Ｂ１／６マウス（群当たり３）を表２７に従ってＩＶワクチン接種し、１×１０７ＰＦＵのＶＶ−ＯＶＡのＩＰ注射で７日に挑戦する。１２日に、マウスを安楽死させ、卵巣を収集し、肉眼での病理学につき観察する。また、卵巣をワクシニアプラーク形成単位につきアッセイする。個々のマウスからの対となった卵巣を１ｍＬの緩衝液中でホモゲナイズし、凍結（液体窒素）し、各サイクルの間は渦巻かせつつ、３サイクルだけ解凍（３７℃）し、次いで、−８０℃にて貯蔵する。アッセイをするために、サンプルを解凍し、４℃にて遠心してデブリスを除去し、Ｖｅｒｏ細胞への適用のために系列希釈する。Ｖｅｒｏ−７６細胞を６−ウェル組織培養プレート中で平板培養する。細胞単層が約７０ないし８５％の密集に到達すると、培地を各ウェルから吸引し、細胞を、卵巣ホモゲネート調製物の適当な希釈１ｍＬを接種する。少なくとも１時間後、培地を吸引し、３ｍＬの１：１  ２×増殖培地：１．５％アガロースで置き換える。プラークを培養から３ないし４日後に数える。
【０３６７】
（表２７  ＯＶＡを発現し、かつＯＶＡを発現するワクシニアで攻撃したＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでのマウスのワクチン接種）
【０３６８】
【表２７】
2006521376.tif 000052
【０３６９】
＊初期用量、１日および２日用量は１０倍より低い。全ての用量１００μＬ  ＨＢＳＳ。
【０３７０】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列双方を含めた）受託番号は、全ての目的で、ここに引用して、その全体を、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個々に引用により一体化されるように示されるのと同程度援用される。
【表Ａ】
2006521376.tif 000053
【０３７１】
【表Ｂ】
2006521376.tif 000054
【０３７２】
【表Ｃ】
2006521376.tif 000055
【０３７３】
【表Ｄ】
2006521376.tif 000056
【図面の簡単な説明】
【０３７４】
【図１】図１は、樹状細胞系へのＯＶＡ抗原提示の測定と共に、ソラレンＳ−５９濃度（２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）の関数としてのＯＶＡ抗原を含む野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０５６の減弱化を示す。細菌ｌｏｇ力化価および未処理に対する抗原提示の％（データはＤＣ２．４細胞当たり１００Ｌｉｓｔｅｒｉａについてのものである）をｎＭ  Ｓ−５９に対してプロットする。
【図２】図２は、樹状細胞系へのＯＶＡ抗原提示の測定と共に、アルキル化剤化合物Ｉ濃度の関数としての、ＯＶＡ抗原を含む野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＤＰ−Ｌ４０５６（２Ａ）およびＬＬＯ−突然変異体ＤＰ−Ｌ４０２７（２Ｂ）の減弱化を示す。細菌ｌｏｇ力価および未処理に対する提示された抗原の％（データはＤＣ２．４細胞当たりの１Ｌｉｓｔｅｒｉａについてのものである）をμＭ化合物Ｉに対してプロットする。
【図３】図３は、Ｓ−５９濃度（２Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡ）の関数としての、欠損突然変異体ＣＳＲ６０３（ｕｖｒＡ  ｒｅａＡ  ｐｈｒ突然変異体）を修復する野生型Ｅ．ｃｏｌｉの不活化の比較を示す。細菌ｌｏｇ力価をｎＭ  Ｓ−５９に対してプロットする（ｌｏｇスケール）。
【図４】図４は、３、７および１４日にワクチン接種されたＣ５７Ｂ１／６マウスへのＢ１６ＯＶＡ腫瘍の移植後の日数の関数としての平均腫瘍容量を示す。テストされたワクチンはＳ−５９処置を伴い、または伴わない。
【図５】図５は、３、７および１４日にワクチン接種されたＣ５７Ｂ１／６マウスへのＢ１６ＯＶＡ腫瘍の移植後の日数の関数としてのパーセント生存を示す。テストされたワクチンはＳ−５９処置を伴い、または伴わない。
【図６Ａ】図６は、Ｓ−５９ＵＶＡ処置（ＰＣＴ）を伴う、および伴わない、ＯＶＡ発現を伴う、および伴わない、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種したマウスからのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ陽性である脾臓細胞の集団を示すフローサイトメトリーの結果を示す。図６ＡはＬＬＯ１９０−２１０に特異的な細胞の集団を示す。図６ＢはＯＶＡに特異的な細胞の集団を示す。
【図６Ｂ】図６は、Ｓ−５９ＵＶＡ処置（ＰＣＴ）を伴う、および伴わない、ＯＶＡ発現を伴う、および伴わない、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａでワクチン接種したマウスからのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ陽性である脾臓細胞の集団を示すフローサイトメトリーの結果を示す。図６ＡはＬＬＯ１９０−２１０に特異的な細胞の集団を示す。図６ＢはＯＶＡに特異的な細胞の集団を示す。
【図７】図７は、Ｓ−５９ＵＶＡ処置（ＰＣＴ）を伴うまたは伴わない、示された野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ株でワクチン接種されたマウスからの、ＳＬ８、ＬＬＯ１９０−２０１またはＬＬＯ２９６−３０４いずれかでの刺激に際して、２×１０５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数を示すＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図８Ａ】図８は、ｕｖｒＡＢの欠失を伴うおよび伴わない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の減弱化を示す。ｌｏｇ力価は用いたソラレンＳ−５９（６Ｊ／ｃｍ２）のｎＭ濃度に対してプロットする。図８Ａ、株ＤＰ−Ｌ４０１７（Ｌ４６１ＴＬＬＯ突然変異体）および野生型（ＤＰ−Ｌ４０５６）。図８Ｂ、株ＤＰ−Ｌ４０１７およびＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）。
【図８Ｂ】図８は、ｕｖｒＡＢの欠失を伴うおよび伴わない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の減弱化を示す。ｌｏｇ力価は用いたソラレンＳ−５９（６Ｊ／ｃｍ２）のｎＭ濃度に対してプロットする。図８Ａ、株ＤＰ−Ｌ４０１７（Ｌ４６１ＴＬＬＯ突然変異体）および野生型（ＤＰ−Ｌ４０５６）。図８Ｂ、株ＤＰ−Ｌ４０１７およびＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）。
【図９ＡＢ】図９は、樹状細胞系に対するＯＶＡ抗原提示の測定と共に、ソラレンＳ−５９濃度の関数としての、ＯＶＡ抗原を含むＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の減弱化を示す。親株（この場合は、ΔａｃｔＡ；９Ａ，９Ｃ）をｕｖｒＡＢ欠失を持つ株（ΔｕｖｒＡＢ；９Ｂ，９Ｄ）と比較する。細菌ｌｏｇ力価および未処理に対する抗原提示の％をｎＭ  Ｓ−５９に対してプロットする。図９Ａ、９Ｂ、０．５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡの線量、Ｌｉｓｔｅｒｉａで１回洗浄、再度５．５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡの線量、ＤＣ２．４細胞当たり１  Ｌｉｓｔｅｒｉａで測定された抗原提示。図９Ｃ、９Ｄ，ＬｉｓｔｅｒｉａはＳ−５９の存在下で増殖させ、次いで、６Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡを照射し、抗原提示は、ＤＣ２．４細胞当たり１０のＬｉｓｔｅｒｉａにて測定した（データの拡大されたプロットを図９Ｃおよび９Ｄにも掲げる）。
【図９ＣＤ】図９は、樹状細胞系に対するＯＶＡ抗原提示の測定と共に、ソラレンＳ−５９濃度の関数としての、ＯＶＡ抗原を含むＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の減弱化を示す。親株（この場合は、ΔａｃｔＡ；９Ａ，９Ｃ）をｕｖｒＡＢ欠失を持つ株（ΔｕｖｒＡＢ；９Ｂ，９Ｄ）と比較する。細菌ｌｏｇ力価および未処理に対する抗原提示の％をｎＭ  Ｓ−５９に対してプロットする。図９Ａ、９Ｂ、０．５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡの線量、Ｌｉｓｔｅｒｉａで１回洗浄、再度５．５Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡの線量、ＤＣ２．４細胞当たり１  Ｌｉｓｔｅｒｉａで測定された抗原提示。図９Ｃ、９Ｄ，ＬｉｓｔｅｒｉａはＳ−５９の存在下で増殖させ、次いで、６Ｊ／ｃｍ２ＵＶＡを照射し、抗原提示は、ＤＣ２．４細胞当たり１０のＬｉｓｔｅｒｉａにて測定した（データの拡大されたプロットを図９Ｃおよび９Ｄにも掲げる）。
【図１０】図１０は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）およびＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ（ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ）によって合成されたタンパク質に取り込まれた３５Ｓメチオニン／システインのポリアクリルアミドゲルを示す。
【図１１Ａ】図１１は、ＯＶＡ特異的抗原ＳＬ８、ＬＬＯ特異的抗原ＬＬＯ１９０およびＬＬＯ２９６で刺激された、５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。図１１Ａは、ＯＶＡ特異的抗原で刺激されたプレート上でのスポット形成コロニーを示し、図１１Ｂは、全ての３つの抗原について２×１０５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞をプロットする。
【図１１Ｂ】図１１は、ＯＶＡ特異的抗原ＳＬ８、ＬＬＯ特異的抗原ＬＬＯ１９０およびＬＬＯ２９６で刺激された、５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。図１１Ａは、ＯＶＡ特異的抗原で刺激されたプレート上でのスポット形成コロニーを示し、図１１Ｂは、全ての３つの抗原について２×１０５脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞をプロットする。
【図１２Ａ】図１２は、ＯＶＡ由来Ｔ細胞エピトープＳＬ８（１２Ａ）、ＬＬＯ特異的クラスＩＩ抗原ＬＬＯ１９０−２０１（１２Ｂ）、またはＬＬＯ特異的クラスＩ抗原ＬＬＯ２９６−３０４（１２Ｃ）で刺激された、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを示す。Ｓ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａは図面中では「ＰＣＴ」（光化学処理を表す）で印を付ける。
【図１２Ｂ】図１２は、ＯＶＡ由来Ｔ細胞エピトープＳＬ８（１２Ａ）、ＬＬＯ特異的クラスＩＩ抗原ＬＬＯ１９０−２０１（１２Ｂ）、またはＬＬＯ特異的クラスＩ抗原ＬＬＯ２９６−３０４（１２Ｃ）で刺激された、Ｓ−５９／（ＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを示す。Ｓ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａは図面中では「ＰＣＴ」（光化学処理を表す）で印を付ける。
【図１２Ｃ】図１２は、ＯＶＡ由来Ｔ細胞エピトープＳＬ８（１２Ａ）、ＬＬＯ特異的クラスＩＩ抗原ＬＬＯ１９０−２０１（１２Ｂ）、またはＬＬＯ特異的クラスＩ抗原ＬＬＯ２９６−３０４（１２Ｃ）で刺激された、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡまたはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡでワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についての細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを示す。Ｓ−５９／ＵＶＡ処理Ｌｉｓｔｅｒｉａは図面中では「ＰＣＴ」（光化学処理を表す）で印を付ける。
【図１３Ａ】図１３は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種し、ワクチン接種から３０日後に野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃したマウスからの脾臓（１３Ａ）または肝臓（１３Ｂ）当たりの単離されたコロニー形成単位の数を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（２つの方法）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種し、ワクチン接種から３０日後に野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃したマウスからの脾臓（１３Ａ）または肝臓（１３Ｂ）当たりの単離されたコロニー形成単位の数を示す。
【図１４Ａ】図１４は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはＤＰ−Ｌ４０２９ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種し（１×、３×または５×ワクチン接種）、ワクチン接種から３０日後に野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃されたマウスからの脾臓（１４Ａ）または肝臓（１４Ｂ）当たりのコロニー形成ユニットの数を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはＤＰ−Ｌ４０２９ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種し（１×、３×または５×ワクチン接種）、ワクチン接種から３０日後に野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃されたマウスからの脾臓（１４Ａ）または肝臓（１４Ｂ）当たりのコロニー形成ユニットの数を示す。
【図１５】図１５は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種された（１×、３×または５×ワクチン接種）でマウスの血清からのＬｉｓｔｅｒｉａ特異的抗体の抗体力価を示す。
【図１６】図１６は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いでＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢでワクチン接種した（１×、３×または５×ワクチン接種）、かつワクチン接種から３０日後に２０×ＬＤ５０または１００×ＬＤ５０野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓで攻撃したマウスのパーセント生存（攻撃後１０日）を示す。
【図１７】図１７は、抗原ＬＬＯ９１、ＡＨ１、ＡＨ１Ａ５、または細胞Ｐ８１５またはＣＴ２６細胞で刺激され、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５でワクチン接種したマウスからの脾臓細胞についてのＩＣＳアッセイの結果を示す。
【図１８Ａ】図１８は、ＡＨ１Ａ５（１８Ａ）またはＡＨ１（１８Ｂ）抗原で刺激された、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５でワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についてのスポット形成コロニーを含むプレートを示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。
【図１８Ｂ】図１８は、ＡＨ１Ａ５（１８Ａ）またはＡＨ１（１８Ｂ）抗原で刺激された、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理（ソラレンで増殖させ、次いで、ＵＶＡ処理）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０２９（ΔａｃｔＡ）−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５またはΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ  ＡＨ１Ａ５でワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞についてのスポット形成コロニーを含むプレートを示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。
【図１９Ａ】図１９は、ΔｕｖｒＡＢ突然変異を伴うまたは伴わない、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理ＤＰ−Ｌ４０２９での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６肺腫瘍を持つマウスからの肺を示す（１９Ａ）。肺転移の数を各ワクチン株につきプロットする（１９Ｂ）。残りのマウスの生存は図１９Ｃにおいてプロットする。
【図１９Ｂ】図１９は、ΔｕｖｒＡＢ突然変異を伴うまたは伴わない、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理ＤＰ−Ｌ４０２９での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６肺腫瘍を持つマウスからの肺を示す（１９Ａ）。肺転移の数を各ワクチン株につきプロットする（１９Ｂ）。残りのマウスの生存は図１９Ｃにおいてプロットする。
【図１９Ｃ】図１９は、ΔｕｖｒＡＢ突然変異を伴うまたは伴わない、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理ＤＰ−Ｌ４０２９での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６肺腫瘍を持つマウスからの肺を示す（１９Ａ）。肺転移の数を各ワクチン株につきプロットする（１９Ｂ）。残りのマウスの生存は図１９Ｃにおいてプロットする。
【図２０Ａ】図２０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡ  ＡＨ１−Ａ５、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＡＨ１−ＡＨ５およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＡＨ１−Ａ５での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスを示す。ΔｕｖｒＡＢ株は処理無し、加熱−死滅（ＨＫ）またはＳ−５９ＵＶＡ（ＰＣＴ）処理のいずれかであった。マウスのサブセットから収集された肺を、図２０Ｂにおいてプロットされた各群における肺転移の数と共に図２０Ａに示す。残りのマウスの生存は図２０Ｃ（親株）および２０Ｄ（ΔｕｖｒＡＢ株）にプロットする。
【図２０Ｂ】図２０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡ  ＡＨ１−Ａ５、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＡＨ１−ＡＨ５およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＡＨ１−Ａ５での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスを示す。ΔｕｖｒＡＢ株は処理無し、加熱−死滅（ＨＫ）またはＳ−５９ＵＶＡ（ＰＣＴ）処理のいずれかであった。マウスのサブセットから収集された肺を、図２０Ｂにおいてプロットされた各群における肺転移の数と共に図２０Ａに示す。残りのマウスの生存は図２０Ｃ（親株）および２０Ｄ（ΔｕｖｒＡＢ株）にプロットする。
【図２０Ｃ】図２０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡ  ＡＨ１−Ａ５、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＡＨ１−ＡＨ５およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＡＨ１−Ａ５での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスを示す。ΔｕｖｒＡＢ株は処理無し、加熱−死滅（ＨＫ）またはＳ−５９ＵＶＡ（ＰＣＴ）処理のいずれかであった。マウスのサブセットから収集された肺を、図２０Ｂにおいてプロットされた各群における肺転移の数と共に図２０Ａに示す。残りのマウスの生存は図２０Ｃ（親株）および２０Ｄ（ΔｕｖｒＡＢ株）にプロットする。
【図２０Ｄ】図２０は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ΔａｃｔＡ、ΔａｃｔＡ  ＡＨ１−Ａ５、ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ  ＡＨ１−ＡＨ５およびΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ  ＡＨ１−Ａ５での治療ワクチン接種を与えた確立されたＣＴ２６腫瘍を持つマウスを示す。ΔｕｖｒＡＢ株は処理無し、加熱−死滅（ＨＫ）またはＳ−５９ＵＶＡ（ＰＣＴ）処理のいずれかであった。マウスのサブセットから収集された肺を、図２０Ｂにおいてプロットされた各群における肺転移の数と共に図２０Ａに示す。残りのマウスの生存は図２０Ｃ（親株）および２０Ｄ（ΔｕｖｒＡＢ株）にプロットする。
【図２１Ａ】図２１Ａは、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理されている野生型Ｌｉｓｔｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｕｖｒＡＢ突然変異体によって感染されたＤＣ２．４細胞の蛍光顕微鏡イメージを示し、融合させたイメージ（Ｌｉｓｔｅｒｉａおよびアクチン陽性双方）およびローダミンイメージ（アクチン陽性のみ）を示す。図２１Ｂは、ＬＬＯ−と比較した、野生型およびΔｕｖｒＡＢ株（生、加熱、死滅またはＳ−５９ＵＶＡ処理）についての細胞質に存在するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのパーセンテージのプロットである。
【図２１Ｂ】図２１Ａは、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理されている野生型Ｌｉｓｔｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｕｖｒＡＢ突然変異体によって感染されたＤＣ２．４細胞の蛍光顕微鏡イメージを示し、融合させたイメージ（Ｌｉｓｔｅｒｉａおよびアクチン陽性双方）およびローダミンイメージ（アクチン陽性のみ）を示す。図２１Ｂは、ＬＬＯ−と比較した、野生型およびΔｕｖｒＡＢ株（生、加熱、死滅またはＳ−５９ＵＶＡ処理）についての細胞質に存在するＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのパーセンテージのプロットである。
【図２２】図２２は、グラム染色Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ野生型、およびＳ−５９／ＵＶＡ処理されているΔｕｖｒＡＢ株の陰性イメージ顕微鏡写真を示す。
【図２３Ａ】図２３は、示されたＬｉｓｔｅｒｉａ株またはビヒクルコントロールでワクチン接種されたマウスへの注射に続いての標的細胞集団を示す。非特異的標的細胞に対する抗原特異的標的細胞の低下したレベルは、ワクチン接種に応答するＴ細胞のインビボ細胞傷害性を示す。図２３Ａは、０日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理株については１および２日も）におけるワクチン接種でのＡＨ１−ＡＨ５発現ワクチンについての結果を示す（図２３Ａおよび２３Ｂにおける頂部列は、ＡＨ１標的細胞に対する示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す。底部列は、ＡＨ１−Ａ５標的細胞についての示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す）。図２３Ｂは、１４日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理については１５および１６日）における反復ワクチン接種を有し、図２３Ｃは、ＯＶＡ特異的応答において観察される。
【図２３Ｂ】図２３は、示されたＬｉｓｔｅｒｉａ株またはビヒクルコントロールでワクチン接種されたマウスへの注射に続いての標的細胞集団を示す。非特異的標的細胞に対する抗原特異的標的細胞の低下したレベルは、ワクチン接種に応答するＴ細胞のインビボ細胞傷害性を示す。図２３Ａは、０日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理株については１および２日も）におけるワクチン接種でのＡＨ１−ＡＨ５発現ワクチンについての結果を示す（図２３Ａおよび２３Ｂにおける頂部列は、ＡＨ１標的細胞に対する示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す。底部列は、ＡＨ１−Ａ５標的細胞についての示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す）。図２３Ｂは、１４日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理については１５および１６日）における反復ワクチン接種を有し、図２３Ｃは、ＯＶＡ特異的応答において観察される。
【図２３Ｃ】図２３は、示されたＬｉｓｔｅｒｉａ株またはビヒクルコントロールでワクチン接種されたマウスへの注射に続いての標的細胞集団を示す。非特異的標的細胞に対する抗原特異的標的細胞の低下したレベルは、ワクチン接種に応答するＴ細胞のインビボ細胞傷害性を示す。図２３Ａは、０日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理株については１および２日も）におけるワクチン接種でのＡＨ１−ＡＨ５発現ワクチンについての結果を示す（図２３Ａおよび２３Ｂにおける頂部列は、ＡＨ１標的細胞に対する示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す。底部列は、ＡＨ１−Ａ５標的細胞についての示されたワクチンでワクチン接種されたマウスについての結果を示す）。図２３Ｂは、１４日（Ｓ−５９  ＵＶＡ処理については１５および１６日）における反復ワクチン接種を有し、図２３Ｃは、ＯＶＡ特異的応答において観察される。
【図２４】図２４は、ｕｖｒＡＢの欠失を伴うおよび伴わない、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅ株の減弱化を示す。ｌｏｇ力価は、増殖およびＵＶＡ照射（６Ｊ／ｃｍ２）の間に存在するソラレンＳ−５９のｎＭ濃度に対してプロットされる。
【図２５】図２５は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ−がＳ−５９／ＵＶＡ光不活化に対してより感受性であることを示す。Ｌｉｓｔｅｒｉａは中期ｌｏｇ相まで増殖させ、ＰＢＳ中で洗浄し、種々の濃度のＳ−５９と共に５分間インキュベートし、２．１Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ光で照射した。Ｌｉｓｔｅｒｉａの変動性はＢＨＩ寒天プレート上での増殖によって評価した。（Ａ）１００ｎＭ  Ｓ−５９で処理したＬｉｓｔｅｒｉａの代表的なＢＨＩ寒天プレート。加熱死滅させたＬｉｓｔｅｒｉａをコントロールとして供した；（Ｂ）ＢＨＩ寒天プレート上でコロニーを形成するための種々の濃度のＳ−５９で処理されたＬｉｓｔｅｒｉａの変動性。
【図２６】図２６は、Ｓ−５９／ＵＶＡ処理された活力の無いＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢがその代謝活性およびそのゲノムレパートリーの発現を保持することを示す。（Ａ）Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢのＭＴＴアッセイで測定された代謝活性。生きたおよび加熱死滅させたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢをコントロールとして供した；（Ｂ）ＭＴＴアッセイで測定された不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ株の代謝活性の定量。
【図２７】図２７は、ＤＣを感染し、ファゴリソソームから逃れるその能力を、十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ株が保持することを示す。カバーグラス上で増殖させたネズミＤＣ系ＤＣ２．４を３７℃にて３０分間、１のＭＯＩにて感染させた。細胞外細菌を何回かの洗浄によって注意深く除去し、感染した細胞を、ゲンタマイシンの存在下で３７℃にて５時間インキュベートして、細胞外細菌の増殖を妨げた。ＤＣ２．４細胞を３．５％ホルムアルデヒドで固定し、次いで、ウサギ抗−Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体で染色し、ヤギ−抗−ウサギＦＩＴＣ二次抗体で検出した。アクチンはファロイジン−ローダミンで検出し、ＤＡＰＩを用いて核を可視化した。
【図２８】図２８は、十分に不活化されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢが、ネズミ骨髄−由来のＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）のＭＨＣクラスＩ経路へ効果的に抗原を負荷することを示す。第５日に、ＢＭ−ＤＣを、１００のＭＯＩにて３７℃にて３０分間感染させた。細胞外細菌を何回かの洗浄によって除去した。感染されたＢＭ−ＤＣをＢ３Ｚと共に一晩共インキュベートし、発色性物質ＣＰＲＧの加水分解によって活性を測定した（吸光度）。
【図２９Ａ】図２９は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染ヒト未成熟単球−由来ＤＣが、活性化（２９Ａ）および成熟化マーカー（２９Ｂ）をアップレギュレートし、ならびにプロ炎症サイトカインを分泌する（２９Ｃ）ことを示す。ＤＣを、種々のＭＯＩにてＬｉｓｔｅｒｉａで１時間感染させた。感染したＤＣを、ゲンタマイシンの存在下でさらに２４時間培養して、細胞外細菌の増殖を妨げた。表現型の変化は、フローサイトメトリーによって測定した。サイトカインのレベルは、サイトメータービーズアレイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、細胞上清から測定した。
【図２９Ｂ】図２９は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染ヒト未成熟単球−由来ＤＣが、活性化（２９Ａ）および成熟化マーカー（２９Ｂ）をアップレギュレートし、ならびにプロ炎症サイトカインを分泌する（２９Ｃ）ことを示す。ＤＣを、種々のＭＯＩにてＬｉｓｔｅｒｉａで１時間感染させた。感染したＤＣを、ゲンタマイシンの存在下でさらに２４時間培養して、細胞外細菌の増殖を妨げた。表現型の変化は、フローサイトメトリーによって測定した。サイトカインのレベルは、サイトメータービーズアレイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、細胞上清から測定した。
【図２９Ｃ】図２９は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染ヒト未成熟単球−由来ＤＣが、活性化（２９Ａ）および成熟化マーカー（２９Ｂ）をアップレギュレートし、ならびにプロ炎症サイトカインを分泌する（２９Ｃ）ことを示す。ＤＣを、種々のＭＯＩにてＬｉｓｔｅｒｉａで１時間感染させた。感染したＤＣを、ゲンタマイシンの存在下でさらに２４時間培養して、細胞外細菌の増殖を妨げた。表現型の変化は、フローサイトメトリーによって測定した。サイトカインのレベルは、サイトメータービーズアレイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、細胞上清から測定した。
【図３０】図３０は、Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡがインビボにてＯＶＡ−特異的免疫を誘導することを示す。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０８ＣＦＵのＳ−５９／ＵＶＡ不活化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｕｖｒＡＢ  ＯＶＡを静脈内投与した。Ｓ−５９／ＵＶＡ不活化親Ｌｉｓｔｅｒｉａ株および加熱死滅させたＬｉｓｔｅｒｉａをコントロールとして供した。７日後に、脾臓を収集し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによってＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価した。（Ａ）代表的なＥＬＩＳＰＯＴウェルを示す；（Ｂ）ＥＬＩＳＰＯＴによって評価したＯＶＡ−特異的免疫。ワクチン接種したマウスの脾臓細胞を、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドと共に、またはそれなくしてインキュベートした。
【図３１】図３１は、異種抗原ＬＬＯ−ＯＶＡ／ＰＲ３の一次アミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。該図面はＯＶＡ  Ｈ−２Ｋｂエピトープ（配列番号：４９）およびＰＲ３  ＨＬＡ  Ａ−２制限クラスＩエピトープ（ａ．ｋ．ａ．ＰＲ１）（配列番号：５０）も示す。
【図３２】図３２は、化合物４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５‘，８−トリメチルソラレン（Ｓ−５９）を示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2006521376.tif 000057
【図２】
2006521376.tif 000058
【図３】
2006521376.tif 000059
【図４】
2006521376.tif 000060
【図５】
2006521376.tif 000061
【図６Ａ】
2006521376.tif 000062
【図６Ｂ】
2006521376.tif 000063
【図７】
2006521376.tif 000064
【図８Ａ】
2006521376.tif 000065
【図８Ｂ】
2006521376.tif 000066
【図９ＡＢ】
2006521376.tif 000067
【図９ＣＤ】
2006521376.tif 000068
【図１０】
2006521376.tif 000069
【図１１Ａ】
2006521376.tif 000070
【図１１Ｂ】
2006521376.tif 000071
【図１２Ａ】
2006521376.tif 000072
【図１２Ｂ】
2006521376.tif 000073
【図１２Ｃ】
2006521376.tif 000074
【図１３Ａ】
2006521376.tif 000075
【図１３Ｂ】
2006521376.tif 000076
【図１４Ａ】
2006521376.tif 000077
【図１４Ｂ】
2006521376.tif 000078
【図１５】
2006521376.tif 000079
【図１６】
2006521376.tif 000080
【図１７】
2006521376.tif 000081
【図１８Ａ】
2006521376.tif 000082
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
2006521376.tif 000084
【図１９Ｂ】
2006521376.tif 000085
【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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