【手続補正書】
【提出日】平成19年7月30日(2007.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
一過的な形質転換
形質転換のための様々なプロトコール（Schaefer et al. 1991; Reutter and Reski 1996, Schaefer 2001）が、Physcomitrella patensについて記載されている。本明細書中に示した試験に対しては、前記方法の修飾/組合せを用いた:
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
遺伝子構造＆保存
すでに強調したように、Ｐｐｔｕｂ１〜４は、ＥＳＴデータベースにおいて最も多く示される。さらに、それらの対応する大多数のＥＳＴを、完全長cＤＮＡライブラリィーから生じた。この２つの事実は、インシリコ（in silico）でＰｐｔｕｂ１〜４の転写開始部位(ＴＳＳ)を決定するために役立った。対応する上流ゲノム領域に対して５'ＥＳＴの複数アラインメントは、Ｐｐｔｕｂ１〜３が正確な転写開始を有することを示した：Ｐｐｔｕｂ１については５'ＥＳＴの２７のうち２０が、Ｐｐｔｕｂ２については５'ＥＳＴの２０のうち１６およびＰｐｔｕｂ３については５'ＥＳＴの１４のうち９は、＋１(図３-６)でマークした最も上流の同じ位置で開始する。さらに、全ての３つのＴＳＳは、コンセンサス配列によって囲まれる(下記を参照)。Ｐｐｔｕｂ４の場合では、２３の５'ＥＳＴは、１００bp内で複数のＴＳＳを示した。最も上流の５'ＥＳＴの開始部位を、＋１として定義した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
Ｐｐｔｕｂ-構築体の一覧(配列表も参照されたい)
【表６】
2007501619.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
【表７】
2007501619.tif 000002
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
同じ方法を用いて、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７遺伝子中に含有された５'ＵＴＲイントロンのプロモーター活性に対する影響を調べた。欠失された５'イントロンの構築体を分析し、Ｐｐａｃｔ１の場合と同様の結果を得た、即ち、達成されたタンパク質量は、Ｐｐａｃｔ５の場合の３５Ｓプロモーターの場合とほぼ同じで、Ｐｐａｃｔ７の場合ではわずかに低く、５'ＵＴＲ中のイントロンの存在が、プロモーターの有効な活性に重要であることを示す。また、形質転換がＡＴＧまでの５'転写領域のみを含有する構築体によって実施された場合に、いくつか残っている促進活性を観察した。さらに、これらの２つの遺伝子の場合では、５’ＵＴＲ下流３５Ｓプロモーターの融合により、３５Ｓプロモーター単独(図１０、１１)と比較した場合、ＶＥＧＦタンパク質の発現が高効率（２〜７倍)となった。同様の結果がＰｐａｃｔ３の場合に観察され、５'ＵＴＲ単独または融合された下流ＣａＭＶ３５Ｓは、３５Ｓと比較して(図１２) 各々約２および３倍産生した。これらの指標により、それらが様々なプロモーター下に位置づけられる場合であっても、これら３つの遺伝子についての５'転写領域においてエンハンサー活性の存在を示唆した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
Ｐｐａｃｔ３のプロモーター領域の欠失構築体の分析から、いくつかの興味深い特徴を明らかになった。記載したとおりに、このプロモーターは、他のアクチン遺伝子プロモーターと比べて低い活性を示し、ＣａＭＶ ３５Ｓと関連するが、それはわずかに活性が高かった。この場合に、次の５'非転写領域について試験した：−２２１０bp、−９９５bp、−８２１bp、−５２３bp、−３２３bp、−１８２bpおよび−８１bp。驚くべきことに、プロモーターの活性は、プロモーター領域の−８２１bpまでを含有する構築体についてはＣａＭＶ ３５Ｓとほぼ同じであった。しかし、bp−５２３および転写開始に対してより短い領域を含有する構築体は、組換えタンパク質の２倍以上の量を産生した。これは、一過的形質転換アッセイ(図１５)中にこの遺伝子の転写を下方調節する−５２３bp領域上流に位置づけられるcis-作用領域を示しているのであろう。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
Ｆｈａｃｔ５b 以外について、ＡＴＧスタートコドンの５'配列上流を、iＰＣＲによって単離し、配列決定した。Ｆｈａｃｔ１の場合には １８２４ bp、Ｆｈａｃｔ４.４については１３３３ bpおよびＦｈａｃｔ５については３２８９ bp が利用できる。様々な５'ＵＴＲの長さを、Gene Racer Kit (Invitrogen)を用いる５'レースによって決定した。イントロン−エキソン構造を、cＤＮＡ配列とiＰＣＲによって得られたゲノム配列との比較によって、そしてPhyscomitrella 遺伝子と比較することによって決定した。Physcomitrellaアクチン遺伝子の場合では、同定したFunariaアクチン遺伝子は、ｃＤＮＡの位置−１４に位置する大きな５'イントロン、Ｆｈａｃｔ１、Ｆｈａｃｔ４.４ および Ｆｈａｃｔ５各々に対して、９２８ bp、１０１５ bp および６５６ bpの長さを含有する。現在までに、５'プロモーター配列に関して、Ｆｈａｃｔ１については ７００ bp、Ｆｈａｃｔ４.４については１４５ bp およびＦｈａｃｔ５については ２５１５ bpを単離し、配列決定した。Ｆｈａｃｔ１については、３'領域の４１９ bpを単離した。Funaria アクチン遺伝子の５'領域または３'領域を、Funaria hygrometrica 由来のゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって、Ｆｈａｃｔ１の５'領域についてはプライマー９０８および９０９を用いることによって、Ｆｈａｃｔ１の３'領域については９８３および９８４、Ｆｈａｃｔ４.４の５'領域については１０００および１００１および、Ｆｈａｃｔ５の５'領域については６１１および６１２を用いて、増幅した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
両ケースに対して、単離した５'プロモーター配列は、高いホモロジーを示した。図１９Ａは、Ｐｐａｃｔ１およびＦｈａｃｔ１の単離したプロモーター領域の概略図の比較を示す。転写開始は、位置１であるといわれ、５'プロモーター領域の最初のntは−１であるといわれる。Ｆｈａｃｔ１の５'プロモーター領域の単離した２６７bpは、Ｐｐａｃｔ１ ５'プロモーター領域の最初の２６７ bpと全体にわたり５８％のホモロジーを示す。この配列内では、種々な観察し得る相同な区分がある。−２６７と−１２９の間の配列が、５１％のホモロジーを示す。次の２９bpは、６２％ 同一性を示し、位置−１００および−１内のホモロジーは、ほぼ７０％であった。Ｐｐａｃｔ１からＦｈａｃｔ１ イントロンおよびプロモーター配列間のこれらの高い配列同一性に関して、これらの２つのコケ植物における相同な遺伝子としてこれらの２つの遺伝子を推定することは妥当である。別の興味深い態様は、様々なＰｐａｃｔ１:ｖｅｇｆ欠失構築体間で観察された発現低下である(図１５)。発現の劇的な低下は、−２３７〜−８２欠失構築体に存在することが判った。これは、Ｐｐａｃｔ１のプロモーター領域の配列として、-１２９〜−１の間の５'プロモーター領域の重要な機能について論じるものであり、Ｆｈａｃｔ１は、説明したように高度に保存されており、−８２欠失構築体は高度に保存された配列の全てを含有するわけではないが、−２３７欠失構築体は含んでいる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
−２２７０〜−１８７６の間のＰｐａｃｔ３の配列は、−２３２５〜−１９４８の間に位置するＦｈａｃｔ５の同じ配列領域に対して、２９％の低いホモロジーを示すのみでる。次いで、約１１００ ntの伸張領域は、８２％の非常に高いホモロジーを示す。次のＰｐａｃｔ３の１４０ nt およびＦｈａｃｔ５プロモーターの１５２ntは、「ただ」５３％のホモロジーを示すだけである。−６４１〜−４６３に位置するＰｐａｃｔ３の配列は、Ｆｈａｃｔ５の−７０５および−５２８の間の領域に対して７６％の高い保存性を示す。次の約１８０ntは、５３％の低いホモロジーを示す。次いで、Ｐｐａｃｔ３プロモーター配列の最後の２８８bpは、Ｆｈａｃｔ５の次の２８０bpと７３％を有するホモログである。２つの相同な遺伝子間の様々なホモロジーの程度を有するこれらの領域は、５'プロモーター領域内の調節性活性要素の存在を示すものである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
実施例３： Physcomitrella patens およびFunaria hygrometrica ユビキチン遺伝子のクローニングおよび分析、およびそれらの発現促進領域
Physcomitrellaのポリユビキチン遺伝子に対応するいくつかのＥＳＴ配列の存在を利用して、特異的なオリゴを設計して、データベースにおけるユビキチン遺伝子相同配列の最も豊富に存在するＥＳＴの対応するゲノム配列を単離し、これをＰｐｕｂｑ１と呼ぶ。Ｐｐｕｂｑ１の５'領域の２１４６bpはiＰＣＲによって同定され得る。１２９bpの転写された５'リーダーは、ＯＲＦの開始前に存在し、５'レースによって決定した。Ｐｐｕｂｑ１の５’領域は、プライマー７７７および６０２を用いて、Physcomitrella patens由来のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲによって増幅した。