(57)【要約】【課題】  ＧＤＦ−８の活性を阻害する、ＧＤＦ−８タンパク質の改変され安定化されたプロペプチドを提供すること。【解決手段】  ＧＤＦ−８プロペプチドを含む改変ＧＤＦ−８プロペプチドであって、ここで、該改変ＧＤＦ−８プロペプチドは、対応する未改変ＧＤＦ−８プロペプチドと比較して増大したインビボ半減期またはインビトロ半減期を有する、改変ＧＤＦ−８プロペプチド。前記ＧＤＦ−８プロペプチドは、配列番号５に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。【選択図】  図１
2006001938.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ−８プロペプチドを含む改変ＧＤＦ−８プロペプチドであって、ここで、該改変ＧＤＦ−８プロペプチドは、対応する未改変ＧＤＦ−８プロペプチドと比較して増大したインビボ半減期またはインビトロ半減期を有する、改変ＧＤＦ−８プロペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、増殖分化因子８（ＧＤＦ−８）タンパク質のインヒビターおよびその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、ＧＤＦ−８の活性を阻害する、ＧＤＦ−８タンパク質の改変され安定化されたプロペプチドを提供する。本発明は、骨格筋組織の増加が治療上有益であるヒト障害または動物障害を予防または処置するために特に有用である。このような障害としては、筋障害または神経筋障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮症、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、悪液質）、代謝疾患または代謝障害（例えば、２型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、高血糖症、または肥満）、脂肪組織障害（例えば、肥満）、または骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
増殖および分化因子８（ＧＤＦ−８）（ミオスタチンとしても公知）は、構造的に関連する増殖因子のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーであり、このスーパーファミリーはすべて、重要な増殖調節特性および形態発生特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１３３−４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２８：２３５−７２）。ＧＤＦ−８は、骨格筋量の負のレギュレーターであり、その生物学的活性を調節する因子を同定することにかなり興味が存在する。例えば、ＧＤＦ−８は、発生中および成体の骨格筋において高度に発現される。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ−８ヌル変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成により特徴づけられる（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８３−９０）。骨格筋量における同様の増加が、ウシにおける天然に存在するＧＤＦ−８の変異において明らかである（Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４）Ｇｒｏｗｔｈ  ３８：５０１−５０７；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ（１９９４）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．３８：７５２−７５７；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２４５７−１２４６１；Ｋａｍｂａｄｕｒら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：９１０−９１５）。最近の研究はまた、ヒトＨＩＶ感染に関連する筋るいそうが、ＧＤＦ−８タンパク質発現の増加を伴うことを示した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：１４９３８−４３）。さらに、ＧＤＦ−８は、筋特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節し得、そして筋芽細胞増殖を調節し得る（ＷＯ００／４３７８１）。
【０００３】
骨格筋におけるその増殖調節特性および形態発生特性に加えて、ＧＤＦ−８はまた、多数の他の生理学的プロセス（例えば、グルコースホメオスタシス）および異常な状態（例えば、２型糖尿病および脂肪組織障害（例えば、肥満）の発症）に関与し得る。例えば、ＧＤＦ−８は、脂肪細胞へのプレ脂肪細胞の分化を調節する（Ｋｉｍら（２００１）Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．２８１：９０２−９０６）。
【０００４】
ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、およびＴＧＦ−β−３と同様に、ＧＤＦ−８タンパク質は、前駆タンパク質として合成され、この前駆タンパク質は、アミノ末端プロペプチドおよびカルボキシ末端成熟ドメイン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、１９９７（上記））、ならびにこのタンパク質を細胞外ドメインに指向しこのタンパク質から切除されるシグナル配列からなる。このプロペプチドの切断の前に、この前駆体ＧＤＦ−８タンパク質は、ホモダイマーを形成すると考えられる。その後、このアミノ末端プロペプチドは
、成熟ドメインから切断され、切断されたプロペプチドは、成熟ドメインダイマーに非共有結合したままであり得、それにより、その生物学的活性が阻害される（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６４０７−６４１５；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７６４６−７６５４；およびＢｒｏｗｎら（１９９０）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：３５−４３）。２つのＧＤＦ−８プロペプチドが、このＧＤＦ−８成熟ダイマーに結合すると考えられる（Ｔｈｉｅｓら（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１−２５９）。この不活化特性に起因して、このプロペプチドは、「潜伏関連ペプチド」（ＬＡＰ）として公知であり、成熟ドメインとプロペプチドとの複合体は、一般的に「小潜伏複合体」と呼ばれる（ＧｅｎｔｒｙおよびＮａｓｈ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：６８５１−６８５７；Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：７０１−７０５；およびＭａｓｓａｇｕｅ（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５９７−６４１）。この成熟ドメインは、このプロペプチドが除去されたときに、ホモダイマーとして活性であると考えられる。他のタンパク質もまた、ＧＤＦ−８または構造的に関連するタンパク質に結合してそれらの生物学的活性を阻害することが、公知である。このような阻害タンパク質としては、フォリスタチン（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８：２２２−２３２）およびフォリスタチン関連タンパク質が挙げられる。
【０００５】
さらに、多数のヒト障害および動物障害が、筋組織の損失または筋組織の機能的損傷に関連しており、そのような障害としては、筋ジストロフィー、筋萎縮症、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、および悪液質が挙げられる。現在までに、これらの障害について、非常にわずかしか信頼できる治療または有効な治療が存在しない。これらの障害に関連する厳しい症状は、これらの障害に罹患している患者における筋組織の量を増加する治療を使用することによって、実質的に減少され得る。このような治療は、これらの患者の生活の質を有意に改善し、そしてこれらの疾患の多くの効果を軽減し得る。したがって、これらの障害に罹患している患者における筋組織の全体の増加に寄与する新規な治療を同定する必要性が、当該分野において存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、その生物学的活性を保持しかつＧＤＦタンパク質の活性を阻害する、改変され安定化されたＧＤＦプロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドを提供することにより、この必要性を満たす。本発明の改変プロペプチドは、筋組織の増加が治療上有益であるヒト障害または動物障害を処置するために使用され得る。
【０００７】
（発明の要旨）
ＧＤＦ−８は、多くの重要な生物学的プロセスの調節に関与する。これらのプロセスにおけるそのＧＤＦ−８の重要な機能に起因して、ＧＤＦ−８は、治療介入のための望ましい標的であり得る。天然に存在するＧＤＦ−８プロペプチドは、効力および毒性の予測から、魅力的なＧＤＦ調節手段であり得るが、本発明は、天然のプロペプチドの循環半減期が、実際の治療用途または予防用途をこの分子が有するには、短すぎるかもしれないことを発見した。
【０００８】
従って、本発明は、増殖分化因子８（ＧＤＦ−８）のプロペプチドは、ＧＤＦ−８タンパク質の活性を阻害し、ＧＤＦ−８と構造が関連する他のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）タンパク質（例えば、骨形成タンパク質１１（ＢＭＰ−１１；ＧＤＦ−１１としても公知）もまた、ＧＤＦ−８プロペプチドにより阻害されるという知見に、少なくとも一部基づく。従って、本発明は、ＧＤＦタンパク質を阻害するための組成物および手段を提供し、ならびにそのようなインヒビターを同定、生成および使用するための方法を提供する。
【０００９】
上記のように、本発明はまた、天然のＧＤＦ−８プロペプチドが、比較的短いインビボ半減期を有し、これにより、実際の治療用途または予防用途を妨げ得るという知見に、一部基づく。従って、本発明は、改善した薬理動態特性（例えば、循環半減期の増加またはタンパク質分解からの防御の増加）を有する、改変ＧＤＦ−８プロペプチドおよび改変ＢＭＰ−１１プロペプチドを提供する。
【００１０】
本発明により開示されるＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドは、当該分野で公知の任意の手段により安定化され得る。例えば、１つの実施形態において、この改変プロペプチドは、ＧＤＦ−８プロペプチドと、ＩｇＧ分子のＦｃ領域とを含む、融合タンパク質である。ＧＤＦ−８プロペプチド融合タンパク質は、活性サブユニットとして、ＩｇＧ分子のＦｃ領域と融合した、ＧＤＦ−８タンパク質のプロペプチド、またはＧＤＦ−８プロペプチドの活性部分を含み得る。他の実施形態において、またはさらに、このＧＤＦ−８プロペプチドは、グリコシル化されており得るか、またはアルブミンもしくは非タンパク質様ポリマーに連結されており得る。
【００１１】
他の実施形態において、この改変プロペプチドは、ＢＭＰ−１１プロペプチドと、ＩｇＧ分子のＦｃ領域とを含む、融合タンパク質である。ＢＭＰ−１１プロペプチド融合タンパク質は、活性サブユニットとして、ＩｇＧ分子のＦｃ領域と融合した、ＢＭＰ−１１タンパク質のプロペプチド、またはＢＭＰ−１１プロペプチドの活性部分を含み得る。他の実施形態において、またはさらに、このＢＭＰ−１１プロペプチドは、グリコシル化されており得るか、またはアルブミンもしくは非タンパク質様ポリマーに連結されており得る。
【００１２】
本発明の改変ＧＤＦ−８プロペプチドまたは改変ＢＭＰ−１１プロペプチドは、ＧＤＦ−８タンパク質、成熟ＧＤＦ−８、またはＧＤＦ−８ホモダイマーまたは他の活性ＧＤＦ−８分子の、活性、発現、プロセシング、または分泌を阻害することができる。本発明の改変ＧＤＦ−８プロペプチドまたは改変ＢＭＰ−１１プロペプチドは、筋組織の増加が治療上有益である医学的状態を処置または予防するために、治療上有効な用量で患者に投与され得る。この改変ＧＤＦ−８プロペプチドまたは改変ＢＭＰ−１１プロペプチドにより処置され得る疾患および障害としては、筋障害または神経筋障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮症、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、または悪液質）、代謝疾患または代謝障害（例えば、２型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、高血糖症、または肥満）、脂肪組織障害（例えば、肥満）、および骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
（定義）
用語「ＧＤＦ−８」、「ＧＤＦ−８タンパク質」または「ＧＤＦ−８ポリペプチド」とは、配列番号１に示されるもの、ならびに現在既知であるかまたは後に記載される、その任意のホモログ（他の種のホモログを含む）を含むがこれに限らない、特定の増殖および分化因子を指す。特に好ましいのは、哺乳動物ホモログであり、最も好ましいのは、ヒトホモログである。本発明はまた、ＧＤＦ−８分子および他のすべての供給源に由来するホモログ（ウシ、イヌ、ネコ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚に由来する、ＧＤＦ−８を含むが、これらに限定されない）を包含する。種々のＧＤＦ−８分子が、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２４５７−１２４６１に記載されている。ホモログは、当該分野で周知である。相同性は、当該分野で公知あるかまたは本明細書中に記載される任意の方法によって、決定され得る。このＧＤＦ−８またはＧＤＦ−８タンパク質は、天然に存在しても、合成であってもよい。これらの用語は、このタンパク質のプロセシン
グされていない全長前駆形態（「ＧＤＦ−８前駆体タンパク質」）、ならびにそのプロペプチドの翻訳後切断から生じる成熟形態を包含する。この用語はまた、本明細書中で考察されるＧＤＦ−８タンパク質に関連する１つ以上の生物学的活性を維持する、ＧＤＦ−８タンパク質の任意のフラグメントもしくは改変体（そのアミノ酸配列に対する保存的変化または非保存的変化により改変されている配列を含む）も指す。
【００１４】
「成熟ＧＤＦ−８」とは、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質のカルボキシ末端ドメインから切断された、タンパク質またはポリペプチドを指す。ヒト形態の成熟ＧＤＦ−８タンパク質が、配列番号３に提供される。この成熟ＧＤＦ−８は、天然に存在しても合成であってもよい。成熟ＧＤＦ−８は、モノマー、ホモダイマーとして存在し得るか、またはＧＤＦ−８潜伏複合体の状態で存在し得る。インビボ条件またはインビトロ条件に依存して、成熟ＧＤＦ−８は、これらの種々の形態のいずれかまたはすべての間の平衡を確立し得る。この機構に関する限定はしないが、成熟ＧＤＦ−８は、ホモダイマーとして生物学的に活性であると考えられている。その生物学的に活性な形態で、成熟ＧＤＦ−８もまた、「活性ＧＤＦ−８」と呼ばれる。
【００１５】
句「ＧＤＦ−８活性」とは、活性ＧＤＦ−８タンパク質に関連する、生理学的増殖調節活性または形態発生活性のうちの１つ以上を指す。例えば、活性ＧＤＦ−８は、骨格筋量の負のレギュレーターである。活性ＧＤＦ−８はまた、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節し得、筋芽細胞増殖を刺激し得、そして脂肪細胞へのプレ脂肪細胞の分化を調節し得る。ＧＤＦ−８はまた、末梢組織（特に、骨格筋または脂肪細胞）におけるインスリンおよびグルコースの取り込みに対する感受性を増加させると考えられる。従って、ＧＤＦ−８の生物学的活性としては、筋肉形成の阻害、筋肉細胞増殖の阻害、筋肉発達の阻害、筋量の減少、筋肉特異的酵素の調節、筋芽細胞増殖の阻害、脂肪細胞へのプレ脂肪細胞の分化の調節、インスリンに対する感受性の増加、グルコース取込みの調節、グルコースホメオスタシス、およびニューロン細胞の発生および維持の調節が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト形態の全長ＧＤＦ−８前駆体タンパク質が、配列番号１に提供される。
【００１６】
「ＧＤＦ−８プロペプチド」とは、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質のアミノ末端ドメインから切断されるポリペプチドを指す。このＧＤＦ−８プロペプチドは、１つ以上の生物学的活性（成熟ＧＤＦ−８タンパク質またはホモダイマーに結合する能力、ＧＤＦ−８の１つ以上の生物学的活性を阻害する能力、筋肉発達を増強する能力、筋量を増強する能力、筋形成を促進する能力、および筋細胞増殖を増強する能力が挙げられるが、これらに限定されない）に関連する。このＧＤＦ−８プロペプチドは、天然に存在しても合成であってもよい。ＧＤＦ−８プロペプチドの例としては、配列番号５に提供されるヒト形態のＧＤＦ−８プロペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、このＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８のプロペプチド結合ドメインに結合することができる。別の実施形態において、このＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８の１つ以上の活性を阻害することができる。
【００１７】
用語「ＧＤＦ−８インヒビター」は、ＧＤＦ−８タンパク質、成熟ＧＤＦ−８、もしくはＧＤＦ−８ホモダイマー、または他の活性ＧＤＦ−８分子の、活性、発現、プロセシング、または分泌を阻害することができる任意の分子を包含し、このようなＧＤＦ−８インヒビターとしては、改変ＧＤＦ−８プロペプチドおよび改変ＢＭＰ−１１プロペプチドが挙げられる。ＧＤＦ−８インヒビターはまた、成熟ＧＤＦ−８分子またはＧＤＦ−８ホモダイマーへのＧＤＦ−８プロペプチドの結合を増強することができる、任意の因子を包含する。このようなインヒビターとしては、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、および他の低分子が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、ＧＤＦ−８タンパ
ク質の活性が、実施例３〜６に記載される改変ＧＤＦ−８プロペプチドにより阻害される。別の実施形態において、ＧＤＦ−８タンパク質の活性が、改変ＢＭＰ−１１プロペプチドにより阻害される。
【００１８】
「ＧＤＦ−８潜伏複合体」とは、成熟ＧＤＦ−８ホモダイマーとＧＤＦ−８プロペプチドとの間に形成されるタンパク質複合体を指す。機構に関して限定はしないが、２つのＧＤＦ−８プロペプチドが、ホモダイマー中の成熟ＧＤＦ−８の２つの分子と結合して、不活性テトラマー（すなわち潜伏）複合体を形成する。この潜伏複合体は、ＧＤＦ−８プロペプチドのうちの１つ以上の代わりにかまたはそれに加えて、他のＧＤＦインヒビターを含み得る。
【００１９】
用語「改変ＧＤＦ−８プロペプチド」とは、ＧＤＦ−８プロペプチドの１つ以上の生物学的活性を保持する改変ＧＤＦ−８プロペプチド、そのフラグメントもしくは改変体を含み、さらに、本明細書中に示される安定化改変を含む、ＧＤＦ−８インヒビターを指す。ＧＤＦ−８プロペプチドの改変体形態としては、例えば、シグナルペプチドまたはプロペプチドタンパク質分解切断部位中にそれらの部位をタンパク質分解切断に対してより感受性でなくする変異（アミノ酸の挿入、欠失、および置換を含む）を含むように改変されている、ＧＤＦ−８プロペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、この改変ＧＤＦ−８プロペプチドは、対応する非改変ＧＤＦ−８プロペプチドと比較して実質的に増加した半減期を有する。非常に好ましい実施形態において、本発明の改変ＧＤＦ−８プロペプチドは、（例えば、実施例８に示される方法によって、測定された場合に）増加したインビボ半減期を有する。別の実施形態において、この改変ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８の１つ以上の活性を阻害することができる。
【００２０】
用語「ＢＭＰ−１１」、「ＢＭＰ−１１タンパク質」または「ＢＭＰ−１１ポリペプチド」とは、配列番号７に示されるもの、ならびに現在既知であるかまたは後に記載される、その任意のホモログ（他の種のホモログを含む）を含むがこれに限らない、特定の増殖および分化因子を指す。特に好ましいのは、哺乳動物ホモログであり、最も好ましいのは、ヒトホモログである。本発明はまた、ＢＭＰ−１１分子および他のすべての供給源に由来するホモログ（ウシ、イヌ、ネコ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚に由来する、ＢＭＰ−１１を含むが、これらに限定されない）を包含する。種々のＢＭＰ−１１分子が、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２４５７−１２４６１に記載されている。ホモログは、当該分野で周知である。相同性は、当該分野で公知あるかまたは本明細書中に記載される任意の方法によって、決定され得る。このＢＭＰ−１１またはＢＭＰ−１１タンパク質は、天然に存在しても、合成であってもよい。これらの用語は、このタンパク質のプロセシングされていない全長前駆形態（「ＢＭＰ−１１前駆体タンパク質」）、ならびにそのプロペプチドの翻訳後切断から生じる成熟形態を包含する。この用語はまた、本明細書中で考察されるＢＭＰ−１１タンパク質に関連する１つ以上の生物学的活性を維持する、ＢＭＰ−１１の任意のフラグメントもしくは改変体（そのアミノ酸配列に対する保存的変化または非保存的変化により改変されている配列を含む）も指す。
【００２１】
「成熟ＢＭＰ−１１」とは、ＢＭＰ−１１前駆体タンパク質のカルボキシ末端ドメインから切断された、タンパク質またはポリペプチドを指す。ヒト形態の成熟ＢＭＰ−１１タンパク質が、配列番号９に提供される。この成熟ＢＭＰ−１１は、天然に存在しても合成であってもよい。成熟ＢＭＰ−１１は、モノマー、ホモダイマーとして存在し得るか、またはＢＭＰ−１１潜伏複合体の状態で存在し得る。インビボ条件またはインビトロ条件に依存して、成熟ＢＭＰ−１１は、これらの種々の形態のいずれかまたはすべての間の平衡を確立し得る。この機構に関する限定はしないが、成熟ＢＭＰ−１１は、ホモダイマーとして生物学的に活性であると考えられている。その生物学的に活性な形態で、成熟ＢＭＰ
−１１もまた、「活性ＢＭＰ−１１」と呼ばれる。
【００２２】
「ＢＭＰ−１１プロペプチド」とは、ＢＭＰ−１１前駆体タンパク質のアミノ末端ドメインから切断されるポリペプチドをいう。このＢＭＰ−１１プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８タンパク質またはホモ二量体に結合する能力、１つ以上のＧＤＦ−８の生物学的活性を阻害する能力、筋肉の発達を増強する能力、筋肉の質量を増大させる能力、筋肉の形成を促進する能力、および筋肉細胞増殖を促進する能力を含むがこれらに限定されない、１つ以上の生物学的活性と関係する。ＢＭＰ−１１プロペプチドは、天然物でもよいし、合成物でもよい。ＢＭＰ−１１プロペプチドの例としては、配列番号１１で提供されるＢＭＰ−１１のヒト形態が挙げられるがこれに限定されない。１つの実施形態では、ＢＭＰ−１１プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８のプロペプチド結合ドメインに結合し得る。別の実施形態では、ＢＭＰ−１１プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８の１つ以上の活性を阻害し得る。
【００２３】
用語「改変ＢＭＰ−１１プロペプチド」とは、改変ＢＭＰ−１１プロペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体を含むＧＤＦ−８インヒビターをいい、これらは、ＢＭＰ−１１プロペプチドの１つ以上の生物学的活性を保持し、そして、さらに、本明細書中に示すような安定化改変を含む。ＢＭＰ−１１プロペプチドの改変体形態としては、例えば、ＢＭＰ−１１プロペプチドが挙げられるがこれに限定されない。このＢＭＰ−１１プロペプチドは、タンパク質分解切断に対して、多少感受性の部位を作製するために、シグナルペプチドまたはプロペプチドのタンパク質分解切断部位に変異（アミノ酸の挿入、欠失、および置換を含む）を含むように改変されている。好ましい実施形態では、ＢＭＰ−１１プロペプチドインヒビターは、対応する非改変ＢＭＰ−１１プロペプチドのインビボ半減期に対して、増加したインビボ半減期（実施例８の１つの実施形態において測定された）を提供するように改変される。別の実施形態では、改変ＢＭＰ−１１プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８の１つ以上の活性を阻害し得る。
【００２４】
本発明のＧＤＦ−８プロペプチドおよび本発明のＢＭＰ−１１プロペプチドは、まとめて、「ＧＤＦプロペプチド」といわれる。
【００２５】
本発明のＧＤＦ−８タンパク質および本発明のＢＭＰ−１１タンパク質は、まとめて、「ＧＤＦポリペプチド」または「ＧＤＦタンパク質」といわれる。
【００２６】
本発明の方法および組成物は、ＧＤＦインヒビターを提供し、このＧＤＦインヒビターは、インヒビターが結合しない同じＧＤＦタンパク質と比較したＧＤＦタンパク質の活性について、ＧＤＦタンパク質の活性を低下させる。特定の実施形態では、ＧＤＦタンパク質の活性は、改変ＧＤＦプロペプチドの１つ以上にが結合する場合、これらの改変プロペプチドが結合しない同じＧＤＦタンパク質に対して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％、好ましくは、少なくとも約６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、または８８％、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約９５％〜１００％減少される。１つの好ましい実施形態では、ＧＤＦインヒビターは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に共有的に連結した、改変ＧＤＦ−８プロペプチドまたは改変ＢＭＰ−１１プロペプチドである。
【００２７】
用語「安定化改変」は、タンパク質を安定化し得る、タンパク質のインビトロ半減期を増大し得る、タンパク質の循環半減期を増大し得る、および／またはタンパク質のタンパク質分解性分解を減少し得る、当該分野で公知のまたは本明細書中に示される任意の改変である。このような安定化改変としては、融合タンパク質（例えば、ＧＤＦプロペプチド
および第２のタンパク質を含む融合タンパク質）、グリコシル化部位の改変（例えば、ＧＤＦプロペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）、および糖質部分の改変（例えば、ＧＤＦプロペプチドからの糖質部分の除去を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質を含む安定化改変の場合（例えば、第２のタンパク質がＧＤＦプロペプチドに融合されるような場合）、第２のタンパク質は、「安定化部分」または「安定化タンパク質」といわれ得る。例えば、１つの実施形態では、本発明の改変ＧＤＦ−８プロペプチドは、ヒトＧＤＦ−８プロペプチド（不活化された切断部位を有する）とＩｇＧ分子（これは、ＩｇＧが、安定化タンパク質または安定化部分として作用する）の間の融合物を含む。本明細書中で用いられる場合、融合部分の第２のタンパク質を言及することに加えて、「安定化部分」はまた、糖質部分または非タンパク質ポリマーのような、非タンパク質改変を含む。
【００２８】
用語「単離された」または「精製された」とは、その天然の環境から実質的に独立している分子をいう。例えば、単離されたタンパク質は、このタンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源由来の、細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まない。句「細胞性物質を実質的に含まない」とは、単離されたタンパク質が、少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは、少なくとも８０〜８９％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは、９０〜９５％純粋、そして最も好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である、調製物をいう。
【００２９】
用語「切断部位」とは、ペプチド結合の切断を生じるタンパク質分解酵素が作用する、タンパク質またはポリペプチドのタンパク質分解部位をいう。１つの実施形態では、本発明の切断部位は、１文字アミノ酸コードで示した場合、「ＲＳＲＲ」である。
【００３０】
用語「ＩｇＧ分子のＦｃ領域」とは、当業者に周知である、アイソタイプＩｇＧの免疫グロブリンのＦｃドメインをいう。ＩｇＧ分子のＦｃ領域は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増大する原因となる、ＩｇＧ分子の部分（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）である。好ましくは、ＩｇＧ分子は、ＩｇＧ１である。
【００３１】
「インビトロ半減期」とは、生きている生物の状況の以外で測定されたタンパク質の安定性をいう。インビトロ半減期を測定するためのアッセイは、当該分野で周知であり、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、細胞ベースのアッセイ、パルスチェイス（ｐｕｌｓｅ  ｃｈａｓｅ）、ウェスタンブロット、ノーザンブロットなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのおよび他の有用なアッセイは、当該分野で周知である。
【００３２】
「インビボ半減期」とは、生物内でのタンパク質の安定性をいう。インビボ半減期は、当該分野で公知の多数の方法（インビボ血清半減期、循環半減期、および本明細書中の実施例に示すアッセイを含むがこれらに限定されない）により測定され得る。
【００３３】
「インビボ血清半減期」とは、生物の血液内を循環するタンパク質の半減期をいう。１つの実施形態では、インビボ半減期は、実施例８に示すように測定される。当該分野で公知の他の方法は、インビボ半減期を測定するために用いられ得る。
【００３４】
用語「哺乳動物」は、当該分野で公知の定義を含み、そしてまた、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ）動物および家畜（ｆａｒｍ）動物、ならびに動物園の（ｚｏｏ）動物、競技用（ｓｐｏｒｔ）動物、または愛玩（ｐｅｔ）動物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなど）を含む、哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００３５】
用語「ＴＧＦ−βスーパーファミリー」とは、構造的に関連した増殖因子のファミリー
をいい、これらの全ては、生理学的に重要な増殖調節特性および形態形成特性を有する。関連した増殖因子のこのファミリーは、当該分野で周知である（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１３３−４６；およびＨｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２８：２３５−７２）。ＴＧＦ−βスーパーファミリーとしては、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビン、ミュラー管抑制物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）、およびさらにより多くの増殖および分化因子（ＧＤＦ）（例えば、ＧＤＦ−８（ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）））が挙げられる。これらにタンパク質の多くは、ＧＤＦ−８に対する構造（例えば、ＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１としてもまた公知））および／または活性（例えば、アクチビン）に関係する。
【００３６】
用語「処置」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置を必要とする者としては、特定の医学的障害を既に有する個体、および障害を最終的に獲得し得る者（すなわち、予防手段を必要とする者）が挙げられ得る。
【００３７】
用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、宿主細胞へと外来核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を導入するための、当該分野で認識されている種々の技術をいい、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
【表１】
2006001938.tif 000003
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＧＤＦプロペプチドが、短いインビボ半減期を有し、それにより、ＧＤＦ−８活性またはＢＭＰ−１１活性の薬理的インヒビターとしてのこのプロペプチドの有効性を低下させるという発見に一部基づく。従って、１つの局面では、本発明は、改善された薬物動態学的特性（詳細には、増加した循環半減期）を有する改変および安定化されたＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１プロペプチドを特徴とする。
【００３９】
本発明は、インビトロおよびインビボでＧＤＦタンパク質（例えば、ＧＤＦ−８タンパク質およびＢＭＰ−１１タンパク質）と不活性複合体を形成する、新規の改変ＧＤＦプロ
ペプチドを提供する。本発明の改変ＧＤＦプロペプチドは、好ましくは、成熟ＧＤＦタンパク質のプロペプチド結合ドメインに結合する。従って、本発明の特定の実施形態では、改変ＧＤＦプロペプチドは、ＧＤＦプロペプチドと安定化タンパク質との間の融合タンパク質を含む。安定化タンパク質は、改変ＧＤＦプロペプチドの全体的な安定性を増大する。当業者に認識されるように、このような融合タンパク質は、必要に応じて、プロペプチドと安定化部分との間のリンカーペプチドを含む。当該分野で周知であるように、融合タンパク質は、第２のタンパク質が、第１のタンパク質とインフレームで融合されて、その結果、第１のタンパク質および第２のタンパク質の両方を含む翻訳されたタンパク質を生じるように調製される。例えば、本発明において、融合タンパク質は、ＧＤＦプロペプチドが部分が、第２のタンパク質（例えば、安定化タンパク質部分）に融合されるように調製され得る。このような融合タンパク質は、得られた翻訳されたタンパク質が、プロペプチド部分および安定化部分の両方を含むように調製される。
【００４０】
他の実施形態では、ＧＤＦプロペプチドは、非改変ＧＤＦプロペプチドと比較して、より長いインビボ循環半減期を有するように改変されているＧＤＦプロペプチドを含む。改変ＧＤＦプロペプチド結合の正確な機構およびタイミングは分かっていないが、本発明の改変ＧＤＦ−８プロペプチドおよび改変ＢＭＰ−１１プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８および成熟ＢＭＰ−１１に結合すると考えられている。好ましい実施形態では、本発明は、インビボまたはインビトロでのＧＤＦ−８タンパク質またはＢＭＰ−１１タンパク質と不活性複合体を形成する改変ＧＤＦプロペプチド提供する。１つの実施形態では、ＧＤＦプロペプチドは、好ましくは、成熟ＧＤＦ−８タンパク質または成熟ＢＭＰ−１１タンパク質のプロペプチド結合ドメインに結合する。このような結合は、例えば、ＧＤＦ−８活性部位およびＢＭＰ−１１活性部位でのネイティブプロペプチドの放出の後、改変ＧＤＦ−８プロペプチドおよび改変ＢＭＰ−１１プロペプチドによるネイティブプロペプチドの置換の後、および／またはＧＤＦ−８前駆体タンパク質およびＢＭＰ−１１前駆体タンパク質からのプロペプチドの切断の後に生じ得る。機構にかかわらず、改変ＧＤＦ−８プロペプチド結合および／または改変ＢＭＰ−１１プロペプチド結合は、同じ改変プロペプチドが結合しない、成熟ＧＤＦ−８タンパク質に対して、ＧＤＦ−８に関係する生物学的活性の１つ以上の低下を生じる。１つの好ましい実施形態では、改変ＧＤＦ−８プロペプチドおよびＢＭＰ−１１プロペプチドは、骨格筋質量の負の調節に関係するＧＤＦ−８活性およびＢＭＰ−１１活性を低下させる。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、本発明は、インビボまたはインビトロでＢＭＰ−１１タンパク質と不活性な複合体を形成する、改変ＧＤＦプロペプチドを提供する。１つの実施形態では、ＧＤＦプロペプチドは、好ましくは、成熟ＢＭＰ−１１タンパク質のプロペプチド結合ドメインに結合する。さらに別の実施形態では、改変ＧＤＦプロペプチドは、（安定化タンパク質として）ＧＤＦプロペプチドおよびＩｇＧ分子のＦｃ領域を含む融合タンパク質である。このようなＧＤＦインヒビターは、ＧＤＦプロペプチドの１つ以上の生物学的活性を保持する、（例えば、配列番号５または１１に示されるような）ＧＤＦプロペプチド、またはプロペプチドのフラグメントもしくは改変体を含み得る。このような改変ＧＤＦプロペプチドは、ＧＤＦタンパク質の活性を阻害し得る。本発明で用いられるＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドは、遺伝子工学の分野で周知である、任意の種々の試薬、宿主細胞および方法を用いて、合成的に生成され得るか、天然に存在する（ネイティブの）ＧＤＦ−８もしくはＢＭＰ−１１プロペプチドに由来するか、または組み換え的に産生され得る。１つの実施形態では、改変ＧＤＦ−８プロペプチドまたは改変ＢＭＰ−１１プロペプチドは、ＩｇＧ分子に共有的に連結されるヒトＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチド、またはそのフラグメントを含む。ＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に隣接して融合されるか、リンカーペプチドを介してＩｇＧのＦｃ領域に付着され得る。このようなリンカーペプチドの使用は、タンパク質生化学分野で周知である。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明の改変ＧＤＦプロペプチドが、融合タンパク質を含む場合、この融合タンパク質のＧＤＦプロペプチド部分は、好ましくは、配列番号５または１１に、少なくとも約７５〜８０％同一、より好ましくは、配列番号５または１１に、少なくとも約８１〜８５％同一、さらにより好ましくは、配列番号５または１１に、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％同一、およびさらにより好ましくは、配列番号５または１１に、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。好ましい実施形態では、ＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドは、配列番号５または１１に示す配列と同一の配列を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質のＧＤＦプロペプチド部分は、フラグメントまたは改変体がＧＤＦプロペプチドの生物学的活性の１つ以上を保持する限り、配列番号５または１１に示すＧＤＦプロペプチドの改変体のフラグメントを含み得る。別の好ましい実施形態では、改変ＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドは、配列番号５または１１の変異体バージョンを含み、ここで、この変異体は、フラグメントまたは改変体がＧＤＦプロペプチドの生物学的活性の１つ以上を保持する限り、１つ以上の変異（挿入、欠失、または置換を含む）を含むように改変される。
【００４３】
重大なことは、融合タンパク質を含む改変ＧＤＦプロペプチドを含む本発明の実施形態では、融合タンパク質は、ＧＤＦプロペプチドのネイティブのタンパク質分解部位（例えば、ＲＳＲＲ）が、得られた融合タンパク質内で、分裂、破壊、不活化または除去されるように産生または設計されることが必須である。当業者が認識するように、そうすることに失敗すると、融合タンパク質の第１のタンパク質（プロペプチド部分）から切断される融合タンパク質の第２の部分（例えば、安定化部分）を生じる。従って、本発明の重要な局面は、本発明の改変ＧＤＦプロペプチドである融合タンパク質を調製するために、このようなプロペプチドを用いる場合、ＧＤＦプロペプチドに対するネイティブの切断部位を不活化または排除することを提供する。このようなタンパク質分解切断部位を不活化する方法は、当業者に公知であり、そしてタンパク質分解切断部位のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の、変異、欠失、または挿入が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４４】
本発明のさらなる他の実施形態では、変異は、タンパク質分解切断にあまり感受性ではない部位を作製するようにＧＤＦ配列中で作製され得る。例えば、このような変異は、配列番号１のアミノ酸４５、４６、４９、５０、５２、５３、６３、６４、６５、６６、９８または９９、あるいは配列番号７のアミノ酸１２２、１２３、２８６または２８７での点変異を含み得る。別の実施形態では、このような点変異は、配列番号１１のアミノ酸において作製され得る。好ましい実施形態では、点変異は、配列番号１のアミノ酸９９での点変異である。特に好ましい実施形態では、点変異は、配列番号１のアミノ酸９９の、ＡｓｐからＡｌａへの点変異である。別の好ましい実施形態では、このような点変異は、配列番号１１のアミノ酸で作製され得る。（市販のソフトウェア（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用する）コンピューター分析もまた、タンパク質分解切断部位を同定するために用いられ得る。当業者に理解されるように、記載される任意の変異体、改変体（ｖａｒｉａｎｔ）または改変体（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、核酸レベルで代替的に作製され得る。このような技術は、当該分野で周知である。
【００４５】
（表２）
（ペプチドの切断を防止するために変異可能な例示的アミノ酸）
ＧＤＦ−８（配列番号１で参照されるアミノ酸番号）
Ａｒｇ−４５
Ｇｌｎ−４６
Ｌｙｓ−４９
Ｓｅｒ−５０
Ａｒｇ−５２
Ｉｌｅ−５３
Ｌｙｓ−６３
Ｌｅｕ−６４
Ａｒｇ−６５
Ｌｅｕ−６６
Ａｒｇ−９８
Ａｓｐ−９９
ＢＭＰ−１１（配列番号７で参照されるアミノ酸番号）
Ａｓｐ−１２２
Ａｌａ−１２３
Ｇｌｕ−２８６
Ｌｅｕ−２８７
上記のように、本発明は、ＧＤＦプロペプチドが短いインビボ半減期を有するという発見を成し遂げた。従って、治療剤または予防剤として薬学的に有用であるためには、ＧＤＦプロペプチドは、生理学的条件下で増加した寿命について、化学的または物理的に安定化されなければならない。
【００４６】
ＧＤＦプロペプチドは、改変ＧＤＦプロペプチドが、ＧＤＦタンパク質または変異体ＧＤＦタンパク質を阻害する能力を維持する限り、当該分野で公知の任意の手段により安定化または改変され得る。好ましい実施形態では、改変ＧＤＦプロペプチドは、その標的ＧＤＦタンパク質結合部位またはＧＤＦプロペプチド結合部位に結合する能力を維持する。１つの好ましい実施形態では、改変ＧＤＦプロペプチドは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に、隣接してまたはリンカーを介して融合されたＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドを含む。このＩｇＧのＦｃ領域は、対応する非改変ＧＤＦ−８プロペプチドまたは非改変ＢＭＰ−１１プロペプチドと比較した場合に、融合タンパク質の改善された薬物動態学的特性（すなわち、増加した血清半減期）において反映されるように、プロペプチドに対する保護効果または安定化効果を提供する（そして、これにより、安定化改変体として作用する）。
【００４７】
特定の実施形態では、改変ＧＤＦ−８プロペプチドは、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドまたはヒトＧＤＦ−８プロペプチドの変異体を含み、そしてＩｇＧ分子は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のＦｃ領域、またはエフェクター機能を低下させるために改変されたＩｇＧ１のＦｃ領域である。１つの実施形態では、ＩｇＧフラグメントは、ＩｇＧ１（配列番号１５）である。別の実施形態では、ＩｇＧフラグメントは、エフェクター機能を低下させるために改変されたＩｇＧ１（配列番号１６）である。エフェクター機能を低下させるために改変された分子の例としては、配列番号１６に示されるようなアミノ酸位置１４および１７にアラニン（Ａ）を含むようにヒトＩｇＧ１−Ｆｃ融合物の改変体が挙げられる。
【００４８】
改変ＧＤＰ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドは、当該分野で周知の標準的なタンパク質単離手順および精製手順に従って単離または精製され得る。
【００４９】
別の実施形態では、改変ＧＤＦプロペプチドは、ヒトＢＭＰ−１１プロペプチドまたはヒトＢＭＰ−１１プロペプチドの変異体、およびＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のＦｃ領域、またはエフェクター機能を低下させるために改変されたＩｇＧ１フラグメントであるＩｇＧ分子を含む。１つの好ましい実施形態では、安定部分は、ヒトＩｇＧ１（配列番号１５
）のＦｃ領域であるか、またはエフェクター機能を低下させるために改変されたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（配列番号１６）である。ＢＭＰ−１１プロペプチドは、本明細書中に記載されるように、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に、隣接してまたはリンカーを介して融合され得る。
【００５０】
本発明はまた、増加したインビボまたはインビトロでの半減期を有する改変ＧＤＦプロペプチドを作製する方法を提供する。１つの好ましい実施形態では、この方法は、
（１）ＧＤＦプロペプチド（例えば、ヒトＧＤＦ−８プロペプチド、配列番号５、またはヒトＢＭＰ−１１プロペプチド、配列番号１１）（これらは、タンパク質分解切断部位およびＩｇＧ分子のＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１５））を不活化するように改変される）をコードする、ｃＤＮＡ分子を調製する工程、
（２）適切な原核生物発現系または真核生物発現系において、適切な発現プラスミドおよび細胞を使用して、ｃＤＮＡを発現する工程；および
（３）改変ＧＤＦプロペプチドを含む、発現された融合タンパク質を単離および精製する工程であって、ここで、改変ＧＤＦプロペプチドは、非改変ＧＤＦプロペプチドと比較して、インビボまたはインビトロで増加した半減期を有する、工程、
により、ＧＤＦ−８／ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質またはＢＭＰ−１１／ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質を含む改変ＧＤＦプロペプチドを調製する工程を包含する。
【００５１】
本発明のこのような好ましい改変ＧＤＦプロペプチドの例は、図１１Ａに示される。
【００５２】
ｃＤＮＡ発現系は、発現されたタンパク質の単離および精製についての方法と同様に、分子生物学分野において周知である（このような実施形態の例を提供する、本明細書中の実施例２および７）。
【００５３】
代替の実施形態において、このような融合タンパク質の発現のために使用されるｃＤＮＡ構築物は、ＧＤＦプロペプチドをコードするヌクレオチドとＩｇＧ  Ｆｃ領域（または安定化部分）をコードするヌクレオチドとの間にリンカーペプチドをコードするヌクレオチドを含み得る。ＧＤＦまたはＩｇＧ  Ｆｃ領域に対するリンカーペプチドの方向は、重要ではない。リンカーペプチドは、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０またはより長いアミノ酸の長さをコードするヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、このリンカーペプチドは、グリシン−セリン−グリシン−セリン（ＧＳＧＳ）からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む。
【００５４】
別の実施形態において、発現プラスミドは、必要に応じて、発現されたタンパク質の簡便な単離および精製を可能にするタグを含み得る。このようなタグ化された発現プラスミドの使用ならびにタグ化されたタンパク質産物を単離および精製するための方法は、当該分野で周知である。
【００５５】
本発明のＧＤＦプロペプチドは、詳細には、分子のＧＤＦプロペプチド部分が特定の種由来のＧＤＦ対応配列に同一であるかまたは６０％より高く相同性であり、一方、安定化部分（例えば、ＩｇＧ分子のＦｃ領域）が、異なる種由来のＩｇＧ対応配列に同一であるかまたは６０％より高く相同性であり得る、融合タンパク質を含む。例えば、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドまたはそのフラグメントは、生じる融合タンパク質が所望の生物学的活性（すなわち、実施例３〜６に具体化されるＧＤＦ生物学的活性の阻害）を示す限り、マウスＩｇＧ分子のＦｃ領域に融合され得る（またはその逆であり得る）。本発明の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ヒトタンパク質のキメラである。当該分野で理解されるように、ヒトタンパク質のキメラタンパク質または融合タンパク質が、ヒト被験体の処置において好ましい。
【００５６】
上記のＦｃ融合タンパク質の代替としてか、または上記のＦｃ融合タンパク質に加えて、ＧＤＦプロペプチドは、周知でありかつタンパク質分野において容易に利用可能な種々の他の方法および供給源材料によって、安定化され得る。このような方法および材料としては、以下に詳細に記載されるように、例えば、グリコシル化、またはアルブミンもしくは非タンパク質ポリマーへの連結が挙げられる。改変ＧＤＦプロペプチドは、タンパク質分野において周知の標準的なタンパク質単離技術および精製技術を用いて、単離および精製され得る。
【００５７】
ＧＤＦプロペプチドまたは改変ＧＤＦプロペプチドは、種々の当該分野で公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなプロペプチドは、本明細書中に記載される方法または当該分野で公知の方法を用いて、合成され（例えば、化学的にまたは組換え的に）、単離されおよび精製され、そして成熟ＧＤＦ−８タンパク質または成熟ＢＭＰ−１１タンパク質と複合体を形成するそれらの能力について試験され得る。プロペプチドは、標準的なタンパク質化学技術を用いて合成され得る（例えば、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．（編），Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｃｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載される技術（これらの内容は，本明細書中に参考として援用される）。さらに、自動化ペプチド合成機が、市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。
【００５８】
あるいは、改変ＧＤＦプロペプチドもしくは未改変ＧＤＦプロペプチドまたはこれらのフラグメントは、当該分野で周知のように、種々の発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を用いて組換え産生され得る。例えば、ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１の発現されたプロペプチドは、例えば、Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒら（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３：５８７７−５８８２ならびにＧｅｎｔｒｙおよびＮａｓｈ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：６８５１−６８５７（これらの内容は、参考として本明細書中に援用される）に記載される方法またはペプチド精製のための当該分野で認識される任意の他の方法を用いて、精製され得る。あるいは、改変ＧＤＦプロペプチドもしくは未改変ＧＤＦプロペプチドまたはこれらのフラグメントは、タンパク質分野において確立された技術を用いる引続く精製のために、例えば、ＦＬＡＧまたは６−Ｈｉｓを用いてタグ化され得る。
【００５９】
改変または未改変のＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドはさらに、例えば、プロテアーゼ（例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対形成（ｐａｉｒｅｄ）塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ））を用いて、天然に存在するＧＤＦ−８もしくはＢＭＰ−１１または組換え産生されたＧＤＦ−８もしくはＢＭＰ−１１の消化によって産生され得る。コンピューター分析（市販のソフトウェア、例えば、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ，Ｏｍｅｇａ，ＰＣＧｅｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を用いるコンピューター分析）は、タンパク質分解切断部位を同定するために使用され得る。あるいは、このようなＧＤＦプロペプチドは、例えば、当該分野で公知の標準的な技術（例えば、化学切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン））によって、天然に存在するＧＤＦ−８もしくはＢＭＰ−１１または組換え産生されたＧＤＦ−８もしくはＢＭＰ−１１から産生され得る。
【００６０】
改変ＧＤＦプロペプチドのタンパク質分解ＧＤＦ−８プロペプチド部分およびＢＭＰ−１１プロペプチド部分または合成ＧＤＦ−８プロペプチド部分およびＢＭＰ−１１プロペプチド部分は、標的ＧＤＦタンパク質に結合するのに必要な数のアミノ酸残基を含み得、
これによって、部分的にまたは完全に、ＧＤＦ−８活性またはＢＭＰ−１１活性を阻害する。本明細書中において、実施例４〜６は、結合アッセイおよび阻害アッセイの実施形態を例示する。特に、ＧＤＦ−８を調節または阻害する能力を維持するＧＤＦ−８プロペプチド配列および／またはＢＭＰ−１１プロペプチド配列の機能フラグメントが、本発明の範囲内に含まれる。ＧＤＦ−８プロペプチド部分は、好ましくは、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０アミノ酸；より好ましくは、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、もしくは１９０アミノ酸；そして最も好ましくは、少なくとも２００、２１０、２２０、２３０、もしくは２４０アミノ酸またはこれより多くのアミノ酸の長さを含む。好ましい実施形態において、改変ＧＤＦ−８プロペプチドのＧＤＦ−８プロペプチド部分は、２４３アミノ酸長（すなわち、配列番号５に対応する）であり；そして、ＢＭＰ−１１プロペプチドのＢＭＰ−１１プロペプチド部分は、２７４アミノ酸長（すなわち、配列番号１１に対応する）である。ヒトＧＤＦ−８のシグナル配列は、配列番号１３に示され、そして配列番号１の最初の２３アミノ酸を含む。１つの実施形態において、ＢＭＰ−１１プロペプチドの配列は、アミノ酸配列ＡＥＧＰＡＡＡで始まる。
【００６１】
ヒトＢＭＰ−１１に対するシグナル配列は、配列番号１４に示され、そして配列番号７の最初の２４アミノ酸を含む。ＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドの機能フラグメントとしての、部分ＧＤＦ−８プロペプチド配列または部分ＢＭＰ−１１プロペプチド配列の同定は、例えば、本明細書中の実施例４〜６に記載されるアッセイを用いて容易に決定され得る。
【００６２】
短縮プロペプチド配列に加えて、本明細書中のプロペプチド改変体は、詳細には、その改変体がＧＤＦプロペプチドの１つ以上の所望の生物学的活性または阻害活性を含む限り、点変異または他の改変（挿入、欠失、および置換を含む）を有するＧＤＦプロペプチドを含む。このような活性は、例えば、実施例４〜６に記載されるように、測定され得る。このような改変が分子に導入されて、ＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドの活性、循環もしくは保存半減期、または産生を増強し得る。例えば、点変異が１つ以上のタンパク質分解切断部位に導入されて、インビボにおいて改変ＧＤＦ−８プロペプチドのタンパク質分解を妨害または阻害し得る。コンピューター分析（市販のソフトウェア、例えば、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ，Ｏｍｅｇａ，ＰＣＧｅｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を用いるコンピューター分析）が、タンパク質分解切断部位を同定するために使用され得る。
【００６３】
従って、本発明のＧＤＦプロペプチドを作製する方法は、詳細には、野生型ｃＤＮＡコード配列に加えて、野生型ＧＤＦプロペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子バリエーション（アミノ酸の変化を生じ得るかまたは生じ得ない、その種の集団における天然に存在する塩基変化）に起因して野生型ＧＤＦ  ｃＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列が異なるｃＤＮＡコード配列を含む。本発明はまた、実施例４〜６に具体化されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（１つの実施形態において、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ３８７−３８９）に記載されるような条件下）で、ＧＤＦプロペプチドをコードする核酸または特定のＧＤＦタンパク質に結合する能力を有するタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズするＤＮＡ配列を意図する。点変異または誘導された改変（例えば、挿入、欠失、および置換）によって生じるｃＤＮＡ配列におけるバリエーション（これは、それらによってコードされるＧＤＦ−８プロペプチドまたはＢＭＰ−１１プロペプチドの活性、半減期、または産生を増強する）もまた、本発明に対して有用である。ＤＮＡ配列相同性の決定に有用なコンピュータープログラムが、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される。
【００６４】
ＧＤＦタンパク質と非共有結合複合体を形成する改変ＧＤＦプロペプチドの能力は、本明細書中の実施例２に記載されるように、当該分野で公知の種々の方法（サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または架橋分析）によって評価され得る。実施例２に示されるように、ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８タンパク質と非共有結合の会合を形成する。この成熟ＧＤＦ−８／ＧＤＦ−８プロペプチド複合体は、約７５ｋＤａのおおよその分子量を有する。
【００６５】
上記のように、Ｆｃ融合方法に加えて、ＧＤＦプロペプチドは、多数の他の技術によって安定化され得る。１つの実施形態において、安定化部分は、ＧＤＦプロペプチド部分に共有結合的に連結されて、融合タンパク質を生成する。例えば、ＧＤＦ−８プロペプチドは、種々の非タンパク質ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つ以上に、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される様式で、連結され得る。特定の実施形態において、ＧＤＦプロペプチドは、ポリマーへの共有結合での結合体化によって化学的に改変されて、その循環半減期を増大する。好ましいポリマー、およびこれらをペプチドに結合させるための方法もまた、米国特許第４，７７６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００６６】
別の実施形態において、ＧＤＦ−８プロペプチドは、変更されたグリコシル化パターンを有する（すなわち、野生型グリコシル化パターンから変更される）ように改変され得る。本明細書中に使用される場合、「変更された」は、１つ以上の炭水化物部分が野生型ＧＤＦプロペプチドに付加されるかまたは野生型ＧＤＦプロペプチドから欠失されることを意味する。タンパク質およびポリペプチドのグリコシル化は、代表的にＮ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、炭水化物部分のアルパラギン残基の側鎖への結合をいう。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素学的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらいずれかのトリペプチド配列の存在は、可能性のあるグリコシル化部位を生成する。Ｏ連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた、使用され得る）への糖Ｎ−アシルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの結合をいう。
【００６７】
グリコシル化部位のＧＤＦプロペプチドへの付加または欠失は、（Ｎ連結グリコシル化部位について）上記のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むかまたは排除するようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される。この変更はまた、（Ｏ連結グリコシル化部位について）野生型ＧＤＦプロペプチドの配列への１つ以上のセリン残基もしくはトレオニン残基の付加または置換によって、作製され得る。各場合について、ＧＤＦプロペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更（この技術は、当該分野で周知である）を介して変更される。
【００６８】
ＧＤＦプロペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ＧＤＦプロペプチドへのグリコシドの化学カップリングまたは酵素カップリングによる手段である。これらの手順は、Ｎ連結グリコシル化またはＯ連結グリコシル化についてのグリコシル化能力を有する宿主細胞において、ＧＤＦプロペプチドの産生を必要としないという点で、有利である。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインの遊
離スルフヒドリル基）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基）；あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日発行）、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ２５９−３０６（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００６９】
ＧＤＦプロペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、ＧＤＦプロペプチドの化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物への曝露を必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんど糖または全ての糖の切断を生じるが、アミノ酸配列はインタクトなままにする。
【００７０】
化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載される。ＧＤＦプロペプチド上の炭水化物部分の酵素学的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【００７１】
上記のように、改変ＧＤＦプロペプチドがＧＤＦプロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質である場合、ＩｇＧ分子のＦｃ領域はまた、変更されたグリコシル化パターンを有するように改変され得る。
【００７２】
別の実施形態において、ＧＤＦプロペプチドは、タンパク質アルブミンまたはアルブミンの誘導体に連結される。タンパク質またはポリペプチドをタンパク質アルブミンまたはアルブミン誘導体に連結するための方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，１１６，９４４号（Ｓｉｖａｍら）（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００７３】
特定のアミノ酸が、タンパク質の活性に有害に影響を与えることなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに置換され得ることが、当業者によって理解される。従って、本発明によって、種々の変更が、改変ＧＤＦプロペプチドもしくは未改変ＧＤＦプロペプチドのアミノ酸配列、またはこのようなプロペプチドをコードするＤＮＡ配列中に、それらの生物学的有用性または活性の測定可能な損失なしに、作製され得ることが、意図される。１つの実施形態において、このような活性は、実施例４〜６において測定されている。このような変更としては、欠失、挿入、短縮、置換、融合などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、改変ＧＤＦプロペプチド内のタンパク質分解切断部位におけるアミノ酸配列の変更は、本発明内に明確に含まれる。
【００７４】
このような変更を作製する際、アミノ酸のヒドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ
ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。タンパク質に相互作用に影響する生物学的機能の付与におけるヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野で理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴が、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのタンパク質の相互作用を規定することは、是認されている。
【００７５】
各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づくヒドロパシー指標が割当てられ
ている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、前出）；イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）が存在する。
【００７６】
このような変更を作製する際、そのヒドロパシー指標が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、ヒドロパシー指標が±１内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてヒドロパシー指標が±０．５内であるアミノ酸の置換がなおより好ましい。
【００７７】
このようなアミノ酸の置換が親水性に基づいてより効率的に作製され得ることもまた、当該分野で理解される。例えば、米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最も大きい局所的な平均親水性を記載し、そのタンパク質の生物学的特性と関連付けている。
【００７８】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。
【００７９】
このような変更を作製する際、その親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして親水性値が±０．５内であるアミノ酸の置換がなおより好ましい。
【００８０】
改変は、そのタンパク質の構造または生物学的機能がその変化によって影響されないような保存的改変であり得る。このような保存的アミノ酸改変は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づく。種々の上記の特徴を考慮に入れた例示的な保存的置換は、当業者に周知であり、そしてこれらとしては、以下が挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。改変ＧＤＦプロペプチドのアミノ酸配列は、その標的ＧＤＦタンパク質への改変ＧＤＦプロペプチドの結合が不利に影響を受けない限り、任意の数の保存的変化を有するように改変され得る。
【００８１】
相対的な配列類似性または配列同一性（配列相同性に関してタンパク質分野および分子生物学的分野においても公知である）は、好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅＴＭの「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて決定される。「Ｇａｐ」は、一致の数を最大化し、かつギャップの数を最小化する２つの配列のアラインメントを見出すために、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０）を利用する。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、２つの配列間の類似
性の最良セグメントの最適アラインメントを実行する。最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１；Ｓｍｉｔｈら、１９８３）を用いて、一致の数を最大化するためにギャップを挿入することによって見出される。
【００８２】
上記の配列分析ソフトウェアパッケージは、現在開示されているヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の相同性を同定するための多数の他の有用な配列分析ツールを含む。例えば、「ＢＬＡＳＴ」プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）は、特定されたデータベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）において維持されている配列データベース）において問い合わせ配列（ペプチドまたは核酸のいずれか）に対する配列類似性について検索し；「ＦａｓｔＡ」（ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ，１９８５；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８もまた参照のこと；Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０）は、問い合わせ配列と同じ型の配列の群（核酸またはタンパク質）との間の類似性についてＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの検索を実行し；「ＴｆａｓｔＡ」は、タンパク質問い合わせ配列とヌクレオチド配列の任意の群との間の類似性についてＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの検索を実行し（これは、これらのヌクレオチド配列を、比較を実行する前に、６つ全てのリーディングフレームで翻訳する）；「ＦａｓｔＸ」は、フレームシフトを考慮に入れて、ヌクレオチド問い合わせ配列とタンパク質配列の群との間の類似性についてＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの検索を実行する。「ＴｆａｓｔＸ」は、フレームシフトを考慮に入れて、タンパク質問い合わせ配列とヌクレオチド配列の任意の群との間の類似性についてＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの検索を実行する（これは、比較を実行する前に、核の配列の両方の鎖を翻訳する）。
【００８３】
当業者は、改変ＧＤＦプロペプチドまたは未改変ＧＤＦプロペプチドが、それらの生物学的特性を変更することなく、それらのアミノ酸配列に対して任意の数の置換を含み得ることを認識する。好ましい実施形態において、このような変化は、当該分野で周知の保存的アミノ酸置換である。種々の上記の特徴を考慮に入れた例示的な保存的置換は、タンパク質生物化学分野の当業者に周知であり、そしてこれらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【００８４】
本発明の特定の実施形態において、タンパク質のインビボ安定性は、多数の方法において測定され得る。１つの実施形態において、血清サンプルまたは組織サンプルは、当業者に周知の方法を用いて、静脈内もしくは腹腔内のいずれかでタンパク質を送達した後か、またはタンパク質を放射性標識した後（すなわち、ヨウ素−１２５を用いて）に、種々の時点で回収される。各血清サンプルまたは組織サンプル中に存在する放射性標識の量は、ガンマカウンターを用いて決定され得る。別の実施形態において、血清中のタンパク質の完全性／安定性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のオートラジオグラフィーまたはウエスタンブロット分析のいずれかによって評価され得る。別の実施形態において、タンパク質の生物学的活性は、多数の機能アッセイ（当該分野で公知のＥＬＩＳＡまたは細胞に基づくアッセイを含む）のうちのいずれか１つを用いて測定され得る。
【００８５】
（疾患の処置方法）
本発明のＧＤＦプロペプチドは、ヒトまたは動物における種々の医療障害を予防または処置するために有用である。ＧＤＦプロペプチドは、好ましくは、ＧＤＦタンパク質に関連する１つ以上の活性を阻害または低減させるために使用される。かなり好ましい１つの実施形態において、改変ＧＤＦプロペプチドは、同一のプロペプチドによって結合されな
い成熟ＧＤＦ−８タンパク質に関連する、成熟ＧＤＦ−８の１つ以上の活性を阻害または低減する。好ましい実施形態において、成熟ＧＤＦ−８タンパク質の活性は、１つ以上の改変ＧＤＦプロペプチドによって結合される場合、１つ以上の改変ＧＤＦプロペプチドによって結合されない成熟ＧＤＦ−８タンパク質と比較して、少なくとも５０％、好ましくは、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％または８８％、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％〜１００％阻害される。
【００８６】
改変ＧＤＦプロペプチドによって処置または予防される医療障害は、好ましくは、筋肉障害または神経筋障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋欠乏（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）または悪液質）、代謝性疾患（例えば、二型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖または肥満）、脂肪組織障害（例えば、肥満）あるいは骨変性疾患（例えば、骨粗しょう症）である。医療障害は、最も好ましくは、筋肉障害または神経筋障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮、うっ血性閉塞性肺疾患、筋るいそう症候群、筋欠乏（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）または悪液質）である。別の好ましい実施形態において、医療障害は、代謝性疾患または代謝性障害（例えば、機能不全グルコース代謝および／またはインスリン耐性（例えば、二型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病）、または高血糖もしくは肥満のような代謝性障害）である。ＧＤＦプロペプチドは、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトにおけるこのような医療障害を予防または処置するために使用される。
【００８７】
本発明のＧＤＦプロペプチドまたはプロペプチド組成物は、治療的有効量で投与される。本明細書中で使用される場合、「有効量」の改変ＧＤＦプロペプチドは、ＧＤＦタンパク質の活性を低減させて所望の生物学的成果（例えば、骨格筋質量）を達成するに十分な投薬量である。１つの実施形態において、所望の生物学的成果は、任意の治療利益（筋肉質量の増加、筋肉強度の増加、代謝改善、肥満の低減またはグルコースホメオスタシスの改善）であり得る。このような改善は、種々の方法によって測定され得る。やせたボディマスおよび肥えたボディマスを測定する方法（例えば、二重Ｘ線操作分析）、筋肉強度、血清脂質、血清レプチン、血清グルコース、糖化ヘモグロビン、ブドウ糖耐性、および糖尿病の二次的合併症の改善を測定する方法によって、測定され得る。一般に、治療有効量は、被験体の年齢、体重、身体状態および性別ならびに被験体における医療状態の重篤度で、変動し得る。投薬量は、必要ならば、観察された処置効果に適するように医師によって決定され得、そして投与され得る。一般に、組成物は、ＧＤＦプロペプチドが５０μｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の用量で与えられるように投与される。好ましくは、ＧＤＦプロペプチドは、投与後最大の期間にわたってＧＤＦプロペプチドの循環レベルを最小化するように、ボーラス用量として与えられる。連続注入はまた、ボーラス用量後に使用され得る。
【００８８】
本発明はまた、異常なグルコースホメオスタシスを生じる代謝性疾患または代謝性障害を予防または処置するための方法を提供する。正常なグルコースホメオスタシスは、とりわけ、血糖レベルでのかすかな変化に応じる膵臓β細胞によるインスリン分泌の見事に調節された統合を必要とする。インスリンの基本作用の１つは、組織（特に、筋組織および脂肪組織）への血液からのグルコースの取り込みを刺激することである。
【００８９】
従って、１つの実施形態において、本発明は、改変ＧＤＦプロペプチドまたはＧＤＦプロペプチド組成物を、疾患の徴候を改善させるに十分な量で被験体に投与することによって、糖尿病および関連障害（例えば、肥満または高血糖）を処置するための方法を提供する。二型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、特に、以下の３つによって特徴付けられる：（１）末梢組織（特に、骨格筋および脂肪細胞）におけるグルコ
ース取り込みにおけるインスリン作用に対する耐性、（２）肝臓のグルコース産生を阻害するための減損したインスリン作用、および（３）インスリン分泌調節不全（ＤｅＦｒｏｎｚｏ，（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｖ．５：１７７−２６９）。よって、二型糖尿病を罹患する被験体は、本発明に従って、細胞によるインスリンおよびグルコースの取り込みに対する感受性を増加させる改変ＧＤＦプロペプチドの投与によって処置され得る。
【００９０】
同様に、インスリン機能不全（例えば、耐性、不活性または欠損）および／または細胞への不完全なグルコース輸送によって特徴付けられる他の疾患および代謝性障害はまた、本発明に従って、改変ＧＤＦプロペプチドの投与によって処置され得、この改変ＧＤＦプロペプチドは、細胞によるインスリンおよびグルコースの取り込みに対する感受性を増加させた。
【００９１】
本発明の改変ＧＤＦプロペプチドまたは改変ＧＤＦプロペプチド組成物は、治療有効量で投与される。糖尿病および関連障害の処置に使用される場合、「有効量」の改変ＧＤＦプロペプチドは、ＧＤＦタンパク質の活性を低減させて、１つ以上の所望の治療結果（例えば、インスリン感受性または細胞によるグルコースの取り込みの増加、肥えたボディマスの低減または血清脂質、血清レプチン、血清グルコース、糖化ヘモグロビン、ブドウ糖耐性の所望の変化、または糖尿病の二次的合併症における改善）を達成するに十分な投薬量である。一般に、治療有効量は、被験体の年齢、状態および性別、ならびに被験体におけるインスリン機能不全の重篤度で変動し得る。投薬量は、必要ならば、観察された処置効果に適するように医師によって決定され得、そして投与され得る。一般に、組成物は、ＧＤＦプロペプチドが５０μｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の用量で与えられるように投与される。好ましくは、ＧＤＦプロペプチドは、投与後最大の期間にわたってＧＤＦプロペプチドの循環レベルを最小化するように、ボーラス用量として与えられる。連続注入はまた、ボーラス用量後に使用され得る。
【００９２】
本発明はまた、ＧＤＦプロペプチドのインビボでの産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上記に列挙されたような障害を有する細胞または組織に、ＧＤＦプロペプチドポリヌクレオチド配列を導入することによって、その治療効果を達成する。ＧＤＦプロペプチドポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して達成され得る。標的化されたリポソームの使用が、ＧＤＦプロペプチドポリヌクレオチド配列の治療的送達に、特に好ましい。
【００９３】
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたは、好ましくはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外因性遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多くのさらなるレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組込み得る。これらのベクターの全ては、適切なマーカーについての遺伝子を移入または組み込み得、その結果、導入された細胞は同定および生成され得る。特定の標的細胞（例えば、ベクター）上のレセプターに対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに、目的のＧＤＦプロペプチドポリヌクレオチド配列をウイルスベクターに挿入することは、現在、標的特異的である。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質の付着によって標的特異的にされ得る。好ましい標的化は、抗体を使用することによって達成される。当業者は、ＧＤＦプロペプチドポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノムに
挿入され得るかまたはウイルスエンベロープに付着され得ることを、認識する。１つの好ましい実施形態において、ベクターは、筋肉細胞または筋肉組織に標的化される。
【００９４】
組換えレトロウイルスは不完全であるので、組換えレトロウイルスは、ＬＴＲ内の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞株を必要とする。これらのプラスミドは、パッケージング機構に、カプシド化のためのＲＮＡ転写物を認識し得るようにするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞株としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、ＰＳＩ．２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２。これらの細胞は、空のビリオンを産生する。なぜなら、ゲノムが全くパッケージングされないからである。このような細胞にレトロウイルスベクターが導入される場合（ここで、パッケージングシグナルはインタクトであるが、構造遺伝子は、他の目的の遺伝子によって置換されている）、ベクターは、パッケージングされ得、そしてベクタービリオンが産生され得る。
【００９５】
あるいは、他の組織培養細胞は、慣用的なリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトされる。生じた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【００９６】
ＧＤＦプロペプチドポリヌクレオチドについての別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズおよび脂質ベース系（水中油乳濁液、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、人工膜ビヒクルであり、インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして有用である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水溶液（ａｑｕｅｏｕｓ）内部にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態において細胞に送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７，１９８１を参照のこと）。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入の方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８を参照のこと）。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組合わせであり、通常、ステロイド（特に、コレステロール）との組合わせである。他のリン脂質または他の脂質がまた、使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
【００９７】
リポソーム産生において有用な脂質の例示としては、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン）、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【００９８】
リポソームの標的化はまた、例えば、器官特異性、細胞特異性および小器官特異性に基づき得、そして当該分野において公知である。
【００９９】
改変ＧＤＦプロペプチドを用いて上記の医療状態を処置または予防する方法はまた、ＴＧＦ−β１スーパーファミリー中の他のタンパク質を阻害するために使用され得る。多くのこれらのタンパク質は、構造において、ＧＤＦ−８（例えば、ＢＭＰ−１１）に関連する。よって、別の実施形態において、本発明は、ＧＤＦ−８ではないタンパク質を阻害し得る改変ＧＤＦプロペプチドを、単独でかまたはＧＤＦ−８に対して改変ＧＤＦプロペプチドと組合わせて被験体に投与することによって上述の障害を処置する方法を提供する。
【０１００】
（改変ＧＤＦプロペプチド組成物）
本発明は、改変ＧＤＦプロペプチドを含む組成物を提供する。このような組成物は、患者に対する薬学的用途および投与に適切であり得る。組成物は、典型的には、１つ以上の本発明の改変ＧＤＦプロペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、句「薬学的に受容可能な賦形剤」としては、薬学的投与に匹敵する以下が挙げられる：溶媒、分散媒体、コーティング、抗微生物剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤など。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。例示的な薬学的に受容可能な賦形剤は、「Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」第３編、２０００、Ａｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ａ．Ｅ．Ｋｉｂｂｅ編に見出され得る。組成物はまた、補助的機能、付加的機能または増強された治療的機能を提供する他の活性化合物を含み得る。薬学的組成物はまた、投与のための指示書とともに容器、パックまたはディスペンサー中に含まれ得る。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合して処方される。投与を達成するための方法は、当業者に公知である。局所的または経口で投与され得る組成物、または粘膜を越えて透過され得る組成物を得ることもまた、可能であり得る。投与は、例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、腔内、皮下（Ｓ．Ｃ．）または経皮であり得る。好ましい実施形態としては、Ｉ．Ｖ．注入、Ｉ．Ｐ．注入、Ｉ．Ｍ．注入およびＳ．Ｃ．注入が挙げられる。１つの好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、静脈内投与される。
【０１０２】
皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁物としては、典型的には、１つ以上の以下の成分が挙げられる：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗生物質（例えば、アスコルビン酸または二硫酸ナトリウム；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸）；ならびに張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。このような調製物は、ガラス性またはプラスティック性のアンプル、ディスポーサブル注射器または複数用量のバイアル中に含まれ得る。
【０１０３】
注射に適切な薬学的組成物は、滅菌した注射可能な溶液または分散物の即席調製物のための、滅菌水溶液または分散物および滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、そして容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であらねばならず、そして、微生物（例えば、細菌及び真菌）の夾雑する作用から保護されねばならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性が、例えば、コーティング（例えば、レチシン）の使用によって、分散物の場合では必要とされる粒子サイズの保持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物作用からの保護は、種々の抗微生物剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム））を組成物中に含むことが、好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび
ゼラチン）を組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１０４】
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。例えば、これらは、ゼラチンカプセル中に含まれ得るかまたは錠剤中に含まれ得る。経口治療投与の目的で、ＧＤＦプロペプチドは、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用され得る。薬学的に受容可能な結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る；バインダー（例えば、微晶質セルロース、ゴムトラガカントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、澱粉またはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）またはコーンスターチ；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅ）；滑走剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化シリコン）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは、香味剤（例えば、ペパーミント、メチルサリチレート）またはオレンジ香味剤。
【０１０５】
吸入による投与について、ＧＤＦプロペプチドは、適切な推進剤（例えば、二酸化炭素のような気体）またはネブライザーを含む、加圧された容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。
【０１０６】
全身性投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方物中に使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野において公知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーおよび坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与について、活性な化合物は、当該分野において一般に公知であるように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリーム中に処方される。
【０１０７】
ＧＤＦプロペプチドはまた、坐剤または直腸送達のための保持浣腸の形態で（例えば、慣用的な坐剤ベース（例えば、カカオバターおよび他のグリセリド）とともに）調製され得る。
【０１０８】
１つの実施形態において、改変ＧＤＦプロペプチドは、その化合物を身体からの迅速な排出から保護するキャリア（例えば、徐放性処方物（移植物および微小カプセル化送達系を含む）とともに調製される。生分解性、生体適合性のポリマー（例えば、エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ酪酸）が、使用され得る。このような処方物の調製法は、当業者に明らかである。これらの材料もまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．より商業的に得られ得る。改変ＧＤＦプロペプチドを含むリポソーム懸濁物はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って、調製され得る。
【０１０９】
投薬単位形態中に経口組成物または非経口組成物を調製することは、投与の容易性および投薬量の均一性のために特に有利である。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態は、処置されるべき被験体に対する単位投薬量として適切な物理的分散型単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同して所望の治療効果を産生するために計算された予め決められた量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の独特な特徴、および達成される特定の治療効果、そして個々の処置のためにこのような活性化合物を混合する分野において固有の制限によって示され、そして活性化合物の独特な特徴、および達成される特定の治療効果、そして個々の処置のためにこのよう
な活性化合物を混合する分野において固有の制限に直接依存する。
【０１１０】
このような化合物の毒性および治療効率は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療的に効果的な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物中の標準的な薬学的手順により決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、そしてＬＤ５０／ＥＤ５０の比として示され得る。大きな治療指数を示すＧＤＦプロペプチドが、好ましい。
【０１１１】
細胞培養アッセイおよび動物研究より得られるデータが、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を処方する際に使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんど毒性を有さないかまたは全く毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、利用される任意の投薬形態および使用される投与経路に依存する範囲内で変動し得る。本発明において使用される改変ＧＤＦプロペプチドについて、治療的に効果的な用量が、細胞培養アッセイより最初に見積もられ得る。細胞培養物中で決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の半分最大阻害（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を達成する、試験された、改変ＧＤＦプロペプチドの濃度）を含む循環血清濃度範囲を達成するために、用量は、動物モデルにおいて処方され得る。血清レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。任意の特定の投薬量の効果が、適切なバイオアッセイによってモニタリングされ得る。適切なバイオアッセイの例としては、ＤＮＡ複製アッセイ、転写ベースのアッセイ、ＧＤＦタンパク質／レセプター結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、プレ脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、脂肪細胞におけるクルコース取り込みに基づくアッセイ、および免疫学的アッセイが挙げられる。
【０１１２】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を提供する。当業者は、本発明の範囲または精神を変更することなく実施され得る多くの改変および変化を認識する。このような改変および変化は、本発明の範囲内に含まれると考えられている。実施例は、本発明の限定の目的ではない。
【０１１３】
本出願を通して引用された全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０１１４】
（実施例）
（実施例１：ＧＤＦ−８の精製）
組換えヒトＧＤＦ−８タンパク質（成熟ＧＤＦ−８＋ＧＤＦ−８プロペプチド）を発現する選択された細胞株からの馴化培地を、ｐＨ６．５に酸性化し、そして８０×５０ｍｍのＰＯＲＯＳ  ＳＰ陽イオン交換カラムと直列の８０×５０ｍｍのＰＯＲＯＳ  ＨＱ陰イオン交換カラム（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にアプライした。フォロースルーを、ｐＨ５．０に調整し、７５×２０ｍｍのＰＯＲＯＳ  ＳＰ陽イオン交換カラム（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にアプライし、ＮａＣｌ勾配で溶出した。ドデシル硫酸ナトリウムゲルポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で示されるような、ＧＤＦ−８を含む画分を、プールし、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ２〜３に酸性化し、次いで、粘度より低くするために０．１％ＴＦＡで２００ｍｌまで増やした。次いで、このプールを、６０×２１．２ｍｍガードカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が先行する２５０×２１．２ｍｍ  Ｃ５カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライし、ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配で溶出し、ＧＤＦ−８プロペプチドから成熟ＧＤＦ−８を分離した。成熟ＧＤＦ−８を含有するプールした画分を、凍結乾燥によって濃縮してアセトニトリルを除去し、２０ｍｌの０．１％  ＴＦＡを添加した。次いで、サンプルを、分離の目的で６０℃に過熱された２５０×１０ｍｍ  Ｃ５カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。これを、さらなる分離がもはや達成され得なくなるまで反復した。次いで、成熟ＧＤＦ−８を含む画分を、プールし、４０％アセトニトリルまで増やし、
そして６０×２１．２ｍｍガードカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が先行する６００×２１．２ｍｍ  ＢｉｏＳｅｐ  Ｓ−３０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。精製された成熟ＧＤＦ−８を含む画分をプールし、次の実験における使用のために濃縮した。成熟ＧＤＦ−８ダイマーの典型的な収量は、馴化培地１リットル当たり０．３３ｍｇタンパク質であった。
【０１１５】
ＧＤＦ−８プロペプチドを含むＣ５カラム画分をプールし、アセトニトリルを蒸発により除去し、２０ｍｌの０．１％ＴＦＡを加え、次いで、このサンプルを、６０℃で２５０×１０ｍｍ  Ｃ５カラム上に注入した。これを、さらなる分離がもはや達成され得なくなるまで反復した。次いで、ＧＤＦ−８プロペプチドを含む画分をプールし、４０％アセトニトリルまで増やし、そして６０×２１．２ｍｍガードカラムが先行する６００×２１．２ｍｍ  ＢｉｏＳｅｐ  Ｓ−３０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。精製されたＧＤＦ−８を含む画分をプールし、次の実験における使用のために濃縮した。ＧＤＦ−８プロペプチドの典型的な収量は、馴化培地１リットル当たり０．２４ｍｇタンパク質であった。
【０１１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、精製した成熟ＧＤＦ−８は、非還元状態で２５ｋＤａでのブロードなバンド、そして還元状態で１３ｋＤａとして移動した。類似のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルが、マウスＧＤＦ−８について報告されており（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８３−９０）、成熟タンパク質のダイマー特性を反映している。
【０１１７】
精製ＧＤＦ−８プロペプチドの見かけの分子量は、還元条件下および非還元条件下の両方で３８ｋＤａであった。このことは、ＧＤＦ−８プロペプチドが、モノマーであることを示している。ＧＤＦ−８プロペプチドの見かけの分子量と推定分子量（約２６ｋＤａ）との間の差異は、糖質の付加を反映し得る。なぜなら、そのアミノ酸配列は、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を含むからである（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２４５７−１２４６１）。従って、上記のプロセスは、精製されかつ活性な成熟ＧＤＦ−８ダイマーおよびＧＤＦ−８プロペプチドの生成をもたらす。
【０１１８】
（実施例２：精製組換えヒトＧＤＦ−８の特徴づけ）
精製成熟ＧＤＦ−８および精製ＧＤＦ−８プロペプチドの各々５０μｇを混合し、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に透析し、３００×７．８ｍｍ  ＢｉｏＳｅｐ  Ｓ−３０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に対してクロマトグラフィーにかけた。成熟ＧＤＦ−８／プロペプチド複合体の分子量は、同じカラムに対してクロマトグラフィーにかけた分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、溶出時間から決定した。
【０１１９】
精製ＧＤＦ−８プロペプチドを精製成熟ＧＤＦ−８とともに中性ｐＨでインキュベートした場合、２つのタンパク質は、サイズ排除プロフィールにより示されたように、複合体化するようであった。１２．７分にて溶出された主要なタンパク質ピークは、同じカラムに対してクロマトグラフィーにかけた分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から７８ｋＤａの予測分子量を有した。複合体のサイズは、プロペプチドの２つのモノマーと会合し、従ってテトラマー複合体を形成する、成熟ＧＤＦ−８の１つのダイマーと極めて一致する。
【０１２０】
この観察を確認するために、成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８プロペプチド両方を含む調製物を、１００ｍＭ  １−エチル  ３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ，Ｐｉｅｒｃｅ）とともに、またはこれを伴わずに、室温にて
１時間インキュベートし、ＨＣｌによりｐＨ２〜３に酸性化し、トリシン緩衝化１０％アクリルアミドゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにＭｉｃｒｏｎ−１０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。タンパク質を、クーマシーブルー染色により可視化した。約７５ｋＤの分子量に対応するバンドを、ＥＤＣを添加したサンプル中でのみ観察し、コントロールレーンにおいては観察しなかった。これにより、ＧＤＦ−８成熟／ＧＤＦ−８プロペプチド複合体の存在が確認された。このことは、このアッセイが、精製成熟ＧＤＦ−８ダイマーの活性および濃度を測定するために有用であると立証する。
【０１２１】
（実施例３：精製ＧＤＦ−８のインビトロ生物学的活性）
ＧＤＦ−８の活性を実証するために、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を、ルシフェラーゼに連結したレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２配列を用いて開発した。ＣＡＧＡ配列は、以前、ＴＧＦ−β誘導性遺伝子ＰＡＩ−１のプロモーター内のＴＧＦ−β応答性配列であると報告されている（Ｄｅｎｎｌｅｒら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：３０９１−３１００）。
【０１２２】
１２のＣＡＧＡボックスを含むレポーターベクターを、基本的なレポータープラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｅ１７５１）を使用して作製した。アデノウイルス主要後期プロモーターからのＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位（−３５／＋１０）を、ＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。ＣＡＧＡボックス（ＡＧＣＣＡＧＡＣＡ）の１２の反復を含むオリゴヌクレオチドをアニールして、ＸｈｏＩ部位にクローニングした。ヒト横紋筋肉腫細胞株Ａ２０４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２）を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ、カタログ番号１８１４４４３）を使用して、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を、２ｍＭ  グルタミン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌペニシリンおよび１０％ウシ胎仔血清を補充したマッコイ５Ａ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ、カタログ番号２１５００−０７９）中で４８ウェルプレートにて１６時間培養した。次いで、細胞を、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリンおよび１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有するマッコイ５Ａ培地中、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１またはアクチビンを用いて、３７℃にて６時間処理した。ルシフェラーゼをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｅ１４８３）を用いて処理細胞中で定量した。アッセイ結果を、図１に例示する。ＧＤＦ−８については、結果を、３つの別々の実験についての平均±Ｓ．Ｅ．として表した。ＢＭＰ−１１およびアクチビンについては、結果は、２つの別々の実験の代表である。
【０１２３】
結果は、ＧＤＦ−８が、最大でレポーター構築物を１０倍活性化した（１０ｎｇ／ｍｌ
ＧＤＦ−８のＥＤ５０）ことを示す。このことは、精製組換えＧＤＦ−８が生物学的に活性であったことを示す。ＢＭＰ−１１（これは、アミノ酸レベルでＧＤＦ−８に９０％同一である（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８：２２２−２３２およびＮａｋａｓｈｉｍａら（１９９９）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８０：１８５−１８９））およびアクチビンは、類似の生物学的応答を誘発した。このことは、レポーター遺伝子アッセイが、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１またはアクチビンのインビボでの生物学的活性を検出するに適切なアッセイであることを示す。
【０１２４】
（実施例４：精製ＧＤＦ−８の結合特性）
ＧＤＦ−８潜在性複合体（ｌａｔｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を、２０モルのＥＺ−結合スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ、カタログ番号２１２１７）  対  １モルのＧＤＦ−８複合体の比にて、２時間氷上で
ビオチン化して、０．５％  ＴＦＡで不活性化し、Ｃ４  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ２５０×４．６ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に対してクロマトグラフィーに供して、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離した。ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配で溶出したビオチン化成熟ＧＤＦ−８画分をプールし、濃縮し、ＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ、カタログ番号２３２３５）により定量した。
【０１２５】
組換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ、カタログ番号３３９−ＲＢ／ＣＦ）を９６ウェル平底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ，カタログ番号３５９０）に、０．２Ｍ  炭酸ナトリウム緩衝液中に１μｇ／ｍｌで、一晩４℃にてコーティングした。次いで、プレートを、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンでブロックし、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従って洗浄した。種々の濃度のビオチン化ＧＤＦ−８のアリコート１００μｌを、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間インキュベートし、洗浄し、結合したＧＤＦ−８の量を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ、カタログ番号１３０４７Ｅ）、続いて、ＴＭＢ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，カタログ番号５０−７６−０４）の添加により検出した。比色測定を、４５０ｎＭにて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーで行った。
【０１２６】
図２に示されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ（１２ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０を有する推定ＧＤＦ−８ＩＩ型レセプター）に結合したビオチン化ＧＤＦ−８は、ＡｃｔＲＩＩ結合アッセイがＧＤＦ−８についてのインビトロ結合アッセイにおいて感受性であることを示す。
【０１２７】
（実施例５：ＧＤＦ−８プロペプチドによるＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１の阻害）
ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドと室温にて１時間予めインキュベートした場合、ＧＤＦ−８の生物学的活性が減少した。図３は、ＧＤＦ−８プロペプチドの存在下で、ＧＤＦ−８についてのＥＤ５０（１０ｎｇ／ｍｌ）でのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター活性の誘導を示す。ＧＤＦ−８プロペプチドは、用量依存性様式にてＧＤＦ−８誘導を減少させた（２５ｎｇ／ｍｌ（０．６ｎＭ）のＩＣ５０）。ＧＤＦ−８プロペプチドはまた、同程度までＢＭＰ−１１の生物学的活性を阻害した。対照的に、このアッセイにおけるアクチビンの活性は、おそらく、ＧＤＦ−８とアクチビンとの間の比較的低い相同性に起因して、ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１と比較して、ＧＤＦ−８プロペプチドにより影響を受けなかった。
【０１２８】
同様に、図４は、ＧＤＦ−８プロペプチドと５ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＧＤＦ−８とを予めインキュベートしたことにより、実施例４に記載されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＢへのＧＤＦ−８結合が阻害された（０．３ｎＭのＩＣ５０）ことを示す。結論として、本発明のＧＤＦ−８プロペプチドは、レポーター遺伝子アッセイおよびＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおいて測定されるように、インビトロでのＧＤＦ−８活性およびＢＭＰ−１１活性の強力なｎＭ未満で有効な（ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ）インヒビターである。従って、このアッセイは、ＧＤＦ−８プロペプチドが活性でありかつこのアッセイにおけるＧＤＦ−８活性の強力なインヒビターであることを示す。
【０１２９】
（実施例６：ＧＤＦ−８プロペプチドによるＧＤＦ−８−レセプター結合の阻害）
ＧＤＦ−８を、１００〜２００μＣｉ／μｇの比活性へとＦｒｏｌｉｋら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０９９５−１０９９９により記載されるようにクロラミンＴでヨウ化した。ヨウ化ＧＤＦ−８は、実施例３に記載される（ＣＡＧＡ）１２レポーターアッセイにおいて非標識ＧＤＦ−８と匹敵する生物学的活性を示した。１２５Ｉ標識ＧＤＦ−８を筋芽細胞株Ｌ６に対する特異的結合について評価した。
【０１３０】
Ｌ６筋芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４５８）を、ゼラチン化２４ウェルプレートにてダルベッコ改変イーグル培地（１０％熱非働化ウシ胎仔血清を補充）中でコンフルエントになるまで増殖させた。平衡結合をＳｏｎｇら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１３６：４２９３−４２９７（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように行った。１ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ  ＧＤＦ−８（非標識ＧＤＦ−８ありまたはなし）をコンフルエントなＬ６細胞と４℃にて４時間インキュベートした。細胞を洗浄した後、結合した［１２５Ｉ］ＧＤＦ−８を抽出し、γカウンターで定量した。結果を三連の測定の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、３つの別個の実験の代表である。
【０１３１】
図５に示されるように、１２５Ｉ−ＧＤＦ−８は、Ｌ６細胞に高親和性で結合した。注意すべきことは、ＴＧＦ−β１ではなくＢＭＰ−１１が１２５Ｉ  ＧＤＦ−８結合に取って代わり、このことは、ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１（ＴＧＦ−β１ではない）がこれらの細胞上の共通のレセプターを共有することを示す（データは示さず）。ＧＤＦ−８結合のスキャッチャード分析から、Ｋｄが１４０ｐＭであると予測した。さらに、１ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ−ＧＤＦ−８を、ＧＤＦ−８プロペプチドと室温にて１時間予めインキュベートした場合、Ｌ６細胞への特異的ＧＤＦ−８結合は、漸増濃度の非標識ＧＤＦ−８プロペプチドにより阻害され得た（図６）。結果を、三連の測定の平均±Ｓ．Ｅ．として表し、２つの別個の実験の代表である。１ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８のＩＣ５０は、１４０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−８プロペプチドであった。これらのデータにより立証されるように、ＧＤＦ−８プロペプチドは、ＧＤＦ−８レセプター結合をブロックすることによりＧＤＦ−８生物学的活性を阻害する。
【０１３２】
（実施例７：ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質によるＧＤＦ−８活性の阻害）
以下の実施例８に示されるように、マウスＧＤＦ−８プロペプチドは、インビボにて比較的短い半減期を有する。ＧＤＦ−８プロペプチドのバイオアベイラビリティーを増大させるために、ＧＤＦ−８プロペプチドとマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域との間の融合物を、標準的な遺伝子操作技術を使用して構築した。
【０１３３】
Ｓｔｅｕｒｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１６５−１１７４に記載のように、４つの変異をＦｃ領域に導入して、エフェクター機能を減少させた。標準的なＰＣＲ方法論を使用して、２つの融合構築物を、マウスＧＤＦ−８プロペプチド（アミノ酸１〜２６７）をコードするｃＤＮＡをマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域に融合することにより調製した（図７）。融合物１（図７Ａ）は、ヒンジ部分の最初のアミノ酸にて開始するマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域の２３３アミノ酸にインフレームにて融合されたマウスＧＤＦ−８プロペプチド（２４アミノ酸の分泌リーダーを含む）の最初の２６５アミノ酸をコードする。融合物２（図７Ｂ）は、短いグリシン−セリン−グリシン−セリン（ＧＳＧＳ）リンカーがＧＤＦ−８プロペプチドをマウスＦｃ領域から分離することを除いて、融合物１に類似の様式で構築される。
【０１３４】
２つのキメラを、真核生物発現ベクターｐＥＤ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０）に導入し、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，カタログ番号１１６６８−０１９）を使用して、ＣＯＳ−１  Ｍ６細胞（Ｈｏｒｏｗｉｔｚら（１９８３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１４７−１５９）において一過性に発現させた。２４時間インキュベートした後、Ｒ１ＣＤ１（改変ＤＭＥＭ／Ｆ１２無血清培養培地）を添加した。馴化培地（ＣＭ）をプールし、新たなＲ１ＣＤ１と交換し、ＣＭを６
０時間後に再び採取した。次いで、馴化培地をプールし、１／１０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０を添加した後に、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＨＰ７  ９ＮＡ，Ｅｎｇｌａｎｄ，カタログ番号１７−０７０８０−０１）に通して精製した。精製タンパク質を、０．１Ｍ  酢酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌにて溶出し、１／２０容量の３Ｍ
Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０で直ぐに中和した。タンパク質を、標準的なマウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡプロトコルを使用して定量し、実施例５に記載されるように、精製ヒトＧＤＦ−８プロペプチドを伴ったＡｃｔＲＩＩＢ競合ＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。結果を図８に示す。ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合物のＩＣ５０は、低いナノモル範囲にあり、融合物１と融合物２との間には差異はない。融合物１（ＧＤＦ−８プロペプチドとマウスＩｇＧ２ａとの間にリンカーなし）を、安定なＣＨＯ細胞株を作製する際に使用するために選択し、ＲＧＡアッセイにおいてＧＤＦ−８の阻害を試験した。
【０１３５】
ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ  ｃＤＮＡを、Ｔｈｉｅｓら（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１−２５９（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、ＣＨＯ発現プラスミドｐＨＴｏｐにサブクローニングし、ＣＨＯ／Ａ２細胞にトランスフェクトした。安定な細胞株（ＰＦ−４／０．０２）を、０．０２Ｍ  メトトレキセート中で細胞を選択することにより樹立した。選択された株由来のＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を含む馴化培地を採取し、１０％  ｖ／ｖ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を添加することによりそのｐＨを合わせ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で予め平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＨＰ７  ９ＮＡ，Ｅｎｇｌａｎｄ，カタログ番号１７−１２７９−０２）に通して精製した。画分を、１００ｍＭ
酢酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．５で溶出し、５％  ｖ／ｖ  ３Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０を添加することにより直ぐ中和した。ピーク画分をプールし、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＨＰ７  ９ＮＡ，Ｅｎｇｌａｎｄ，カタログ番号１７−１０６９−０１））にロードした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０を画分に添加して、凝集を防止した。画分を、Ｎｏｖｅｘ  １０％  トリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ，カタログ番号ＥＣ６６７５５）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。
【０１３６】
プールした画分を、分光光度計により定量し、実施例４に記載されるＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイ、およびレポーター遺伝子アッセイにおいて活性についてアッセイした（図９）。精製ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合物のＩＣ５０は、１．３ｎＭであった。このデータは、ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を含む本発明の改変ＧＤＦ−８プロペプチドが、ＧＤＦ−８プロペプチドと比較して、強力な阻害性（中和）活性を保持していることを示す。
【０１３７】
（実施例８：薬物動態）
ＧＤＦ−８プロペプチド（本明細書中「ＧＤＦ８−Ｐｒｏ」といわれる）およびＧＤＦ−８プロペプチド−ＦＣ融合タンパク質（本明細書中「ＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃ」といわれる）の薬物動態（ＰＫ）を、１回の静脈内投与の後に、０．２μｇ／マウス（ＧＤＦ８−Ｐｒｏ）または２μｇ／マウス（ＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃ）の用量にて、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいて評価した。動物に、非標識ＧＤＦ８−Ｐｒｏおよび１２５Ｉ標識ＧＤＦ８−Ｐｒｏの混合物または非標識ＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃおよび１２５Ｉ標識ＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃの混合物を上記の用量にて与え、血清中の１２５Ｉ放射活性および注射用量の比活性に基づいて、血清濃度を決定した。図１０は、ＧＤＦ８−ＰｒｏおよびＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃ両方についての血清濃度  対  時間曲線を示す。表１は、１回の静脈内注射（２μ
ｇ／マウス）の後にＧＤＦ８−ＰｒｏおよびＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃについてのＰＫパラメーターを示す。ＧＤＦ８−Ｐｒｏについての血清濃度およびＰＫパラメーターを、比較目的のために、２μｇ／マウスの用量に対して正規化した。
【０１３８】
【表２】
2006001938.tif 000004
Ｔ１／２：終期排泄相の間の半減期
Ｃｍａｘ：ピーク血清濃度
ＭＲＴ：平均残留時間
Ｖ１：分布の開始容量
Ｖｓｓ：定常状態の分布の容量
註：ＧＤＦ−８−Ｐｒｏ  ＰＫパラメーターは、２μｇ／マウスの容量に対して正規化した。
【０１３９】
図１０に認められ得るように、ＧＤＦ８−Ｐｒｏと比較してＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃは、クリアランスが４００倍遅く、半減期が１００倍長かった。分布の開始容量および定常状態の分布の容量の両方は、ＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃと比較して、ＧＤＦ８−Ｐｒｏが約３倍大きかった。このことは、ＧＤＦ８−Ｐｒｏが、ＧＤＦ８−ＰｒｏＦｃと比較して、血管空間の外側により大きな程度まで分布することを示す。
【０１４０】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域のＧＤＦプロペプチドに対する安定化効果は、マウスＧＤＦプロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、両方の成分がマウス由来）を使用して例示されるが、本発明の方法は、特定の前駆体タンパク質にもＩｇＧ成分が由来する動物種にも関係なく、融合タンパク質が適切に構築されて、（すなわち、本明細書中に記載されるように）活性を保持するのであれば、ＧＤＦプロペプチドおよびＩｇＧ成分の任意の組み合わせに適用され得る。
【０１４１】
（実施例９：２つのヒトＧＤＦ−８プロペプチドＦｃ融合物の誘導および活性）
２つのＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合構築物を、標準的なＰＣＲ方法論を使用して、治療可能性の評価のために調製した。ヒトＧＤＦ−８プロペプチド（配列番号５）をコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１５；図１１Ａ）またはエフェクター機能の減少のために改変したヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（配列番号１６；図１１Ｂ）に融合した。
【０１４２】
１．ヒトＧＤＦ−８プロペプチド−ＩｇＧ１  ｗｔ  Ｆｃ融合タンパク質（図１１Ａ）：
ヒトＧＤＦ−８プロペプチド（配列番号５のアミノ酸１〜２４１および配列番号１３に示される２３アミノ酸のシグナルペプチドを含む）の最初の２６４アミノ酸を、ヒンジ領域の最初のアミノ酸にて開始する、ヒトＩｇＧ１定常領域の２３２アミノ酸（配列番号１５）とインフレームで融合した。
【０１４３】
２．ヒトＧＤＦ−８プロペプチド−ＩｇＧ１変異体（図１１Ｂ）：
上記のように、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドの最初の２６４アミノ酸を、変異したヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の２２７アミノ酸（配列番号１６）とインフレームで融合した。２つの変異（配列番号１６に示されるアラニン残基（Ａｌａ−１４およびＡｌａ−１７））を、Ｌｕｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−３２４に記載されるように、エフェクター機能を減少させるために導入した。
【０１４４】
２つの融合タンパク質を、真核生物発現ベクターｐＥＤ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０）に導入し、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，カタログ番号１１６６８−０１９）を使用して、ＣＯＳ−１  Ｍ６細胞（Ｈｏｒｏｗｉｔｚら（１９８３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１４７−１５９）において一過性に発現させた。２４時間インキュベートした後、Ｒ１ＣＤ１（改変ＤＭＥＭ／Ｆ１２無血清培養培地）を添加した。馴化培地（ＣＭ）をプールし、新たなＲ１ＣＤ１と交換し、ＣＭを６０時間後に再び採取した。次いで、馴化培地をプールし、１／１０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を添加した後に、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＨＰ７  ９ＮＡ，Ｅｎｇｌａｎｄ，カタログ番号１７−０７０８０−０１）に通して精製した。精製タンパク質を、０．１Ｍ  酢酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌにて溶出し、１／２０容量の３Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０で直ぐに中和した。タンパク質を、標準的なヒトＩｇＧ
ＥＬＩＳＡプロトコルを使用して定量し、実施例５に記載されるように、精製ヒトＧＤＦ−８プロペプチドを伴ったＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおいてアッセイした。結果を図１２に示す。結論として、両方のヒトプロペプチドＦｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢへのＧＤＦ−８結合の強力なインヒビターである。
【０１４５】
（実施例１０：ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ試験）
マウスＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質（実施例９から）を、成体マウスにおいて試験した。７〜９週齡の成体雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを体重に関して無作為化し、７つの群にした（処置なし群は、６匹のマウスであることを除く）。マウスを５週間にわたり、動物１匹あたり、１０μｇ、１００μｇ、または１０００μｇの１週間の総量を伴って、Ｉ．Ｐ．注射により１週間に２回投薬した。コントロール注射は、高用量のプロペプチド−Ｆｃに対して等モル量のマウスＩｇＧ２ａ−Ｆｃとした。この研究の終わりに、腓腹筋、四頭筋、精巣上体脂肪パッド、腎臓、および肝臓を取り出し、秤量した。図１３は、平均組織質量（エラーバーは、平均の標準誤差を示す）を示す。アスタリスク（＊）は、コントロールタンパク質ＩｇＧ２ａＦｃを用いて処置したマウスと比較した場合の、統計的有意差（ｐ＜０．０１（ステューデントＴ検定を使用））を示す。ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質のＩ．Ｐ．注射（１ｍｇ／週）（処置マウス）によるインビボでのＧＤＦ−８活性のブロッキングは、ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を与えなかったコントロールマウスと比較して、腓腹筋質量において６．２％の増加、および四頭筋質量において１１．３％の増加を生じた。さらに、ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質のＩ．Ｐ．注射（１００μｇ／週）（処置マウス）によるインビボでのＧＤＦ−８活性のブロッキングは、脂肪パッド質量において２３．０％の増加を生じた。高用量（１ｍｇ／週）の処置はまた、脂肪パッド質量の減少をもたらしたが、脂肪パッド質量の変動性に起因して、統計学的有意差はあまりなかった（ｐ＝０．０４７）。試験した他の組織（肝臓および腎臓を含む）の質量に対する処置の効果はなかった。まとめると、改変ＧＤＦ−８プロペプチドは、インビボでＧＤＦ−８活性をブロックし、筋肉質量の増加および脂肪質量の減少をもたらす。まとめると、ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆ
ｃ融合タンパク質のＩ．Ｐ．注射（処置マウス）によるインビボでのＧＤＦ−８活性のブロッキングは、ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を与えなかったコントロールマウスと比較して、腓腹筋および四頭筋の質量の増加を生じた。
【０１４６】
（等価物）
当業者は、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、慣用的な実験法のみを使用して認識しまたは確認し得る。このような等価物は、特許請求の範囲により含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、レポーター遺伝子アッセイにおける、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、およびアクチビンの相対的生物学的活性を示す。
【図２】図２は、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイにおける、精製ビオチニル化ヒトＧＤＦ−８の結合特性を示す。
【図３】図３は、ＧＤＦ−８プロペプチドの存在下での、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、およびアクチビンについてＥＤ５０でのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター活性の誘導を示す。
【図４】図４は、ＧＤＦ−８プロペプチドによる、ＡｃｔＲＩＩＢへのビオチニル化ＧＤＦ−８結合の用量依存性阻害を示す。
【図５】図５は、Ｌ６細胞へのＧＤＦ−８の結合を示す。
【図６】図６は、ＧＤＦ−８プロペプチドによる、Ｌ６細胞へのＧＤＦ−８特異的結合の用量依存性阻害を示す。
【図７】図７Ａは、成熟ＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。図７Ｂは、Ｆｃ領域からＧＤＦ−８プロペプチドを隔てる短いグリシン−セリン−グリシン−セリン（ＧＳＧＳ）リンカーを備えた、マウスＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を示す。
【図８】図８Ａは、ＡｃｔＲＩＩＢ競合ＥＬＩＳＡにおけるＧＤＦ−８結合に対する、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドおよび２つのマウスＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質の効果を示す。図８Ｂは、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドと２つのマウスＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質のＩＣ５０を比較する表である。
【図９】図９は、レポーター遺伝子アッセイにおける、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドおよびマウスＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質の相対的生物学的活性を示す。
【図１０】図１０は、それぞれ、０．２μｇ／マウスまたは２μｇ／マウスの単回静脈投与後の、ヨウ化ＧＤＦ−８プロペプチドおよびＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質の薬理動態を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ヒトＧＤＦ−８プロペプチド−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、エフェクター機能の減少のために改変した、ヒトＧＤＦ−８プロペプチド−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＧＤＦ−８プロペプチドおよび２つのヒトＧＤＦ−８プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質による、ＡｃｔＲＩＩＢ競合ＥＬＩＳＡにおけるＧＤＦ−８結合の用量依存性阻害を示す。
【図１３】図１３は、インビボで投与した改変ＧＤＦ−８プロペプチドが、未処理マウスまたはコントロールタンパク質ＩｇＧ２ａＦｃ処理マウスと比較して、腓腹四頭筋量を増加させ、脂肪量を減少させるが、腎臓量にも肝臓量にも影響しないことを示す、グラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｆ】図１４Ｆは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｇ】図１４Ｇは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｈ】図１４Ｈは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｉ】図１４Ｉは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｊ】図１４Ｊは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｋ】図１４Ｋは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｌ】図１４Ｌは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｍ】図１４Ｍは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｎ】図１４Ｎは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｏ】図１４Ｏは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１４Ｐ】図１４Ｐは、配列番号１〜１６に対応するアミノ酸配列および核酸配列、ならびにその注釈を示す。
【図１】
2006001938.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
2006001938.tif 000029
【図１４Ｌ】
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【図１４Ｍ】
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【図１４Ｎ】
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【図１４Ｏ】
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【図１４Ｐ】
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【配列表】
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