(57)【要約】  ＡＴＲタンパク質キナーゼを阻害する新規化合物には、本明細書に開示する式（Ｉ）の化合物、ならびにＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物を含むリポソーム製剤が含まれる。この組成物は、がんの治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉａ）のＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物：
【化１】
2019505584.tif 000039
（式中、Ｒ′が、９．５以上のｐＫａを有する第三級アルキル置換アミンを含むアルキル−アミノ部分である）
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
化合物５の式の化合物：
【化２】
2019505584.tif 000040
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
化合物６の式の化合物：
【化３】
2019505584.tif 000041
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物、またはその薬学的に許容可能な塩をリポソームに封入して含み、実施例８に従って測定する、マウスにおいて少なくとも約５時間の血漿半減期を有する、リポソーム組成物。
【請求項５】
前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が化合物Ａである、請求項４に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が、式（Ｉ）の化合物：
【化４】
2019505584.tif 000042
（式中、Ｒが、７．０より大きい（好ましくは８．０より大きく、最も好ましくは少なくとも約９．５の）ｐＫａを有するアミンを含む部分である）
またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項４に記載のリポソーム組成物。
【請求項７】
前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が、以下からなる群：
【化５】
2019505584.tif 000043
から選択される化合物である、請求項４に記載のリポソーム組成物。
【請求項８】
前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が、以下からなる群：
【化６】
2019505584.tif 000044
から選択される化合物である、請求項４に記載のリポソーム組成物。
【請求項９】
前記リポソームが、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及びコレステロールを含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リポソームが、ＰＥＧ（２０００）−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リポソームが、約３：２：０．１５のモル比で、ＨＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＳＧを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ａ．リン脂質及びコレステロールを含むベシクル中にカプセル化したスクロースオクタ硫酸をカプセル化するリポソームを形成し；及び
ｂ．前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤を前記リポソームに充填するのに有効な条件下で、工程（ａ）の前記リポソームを前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤と接触させる工程を含むプロセスによって得られる、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポソームを前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物と接触させる前に、硫酸アンモニウムが約１．１Ｍの濃度を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が化合物Ａである、請求項４に記載のリポソーム組成物。
【請求項１５】
前記ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が化合物１である、請求項４に記載のリポソーム組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連技術
本出願は、２０１６年１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／２７７，２６２号、２０１６年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４２０，２５８号、及び２０１７年１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４４４，１７２号の優先権を主張し、これらの文献の各々は、あらゆる目的のために、その全体を参照として本出願に援用する。
【０００２】
分野
本開示は、がんの治療に有用な方法及び化合物を含む、血管拡張性失調症及びＲａｄ３関連タンパク質（ＡＴＲ）を阻害する化合物及び関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管拡張性失調症及びＲａｄ３関連（ＡＴＲ）キナーゼは、細胞ＤＮＡ損傷修復プロセス及び細胞周期シグナル伝達に関与すると考えられるセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。ＡＴＲキナーゼは、ＡＴＭ（「血管拡張性失調症変異」）キナーゼ及び他のタンパク質とともに作用し、一般的にＤＮＡ損傷応答（「ＤＤＲ」）と呼ばれるＤＮＡ損傷に対する細胞の応答を調節する。ＤＤＲは、修復のための時間を提供する細胞周期チェックポイントを活性化することによって、ＤＮＡ修復を刺激し、生存を促進し、細胞周期の進行を停止させると考えられている。ＤＤＲがなければ、細胞はＤＮＡ損傷に対してはるかに感受性があり、ＤＮＡ複製などの内在性細胞プロセス、またはがん治療に一般的に用いられる外因性ＤＮＡ傷害剤によって誘導されるＤＮＡ損傷によって容易に死滅する。
【０００４】
ＡＴＲ機能の破壊（例えば遺伝子欠損による）は、ＤＮＡ傷害剤の非存在下及び存在下の両方においてがん細胞死を促進することが示されている。ＡＴＲの変異は、胃及び子宮内膜の癌に関連し、電離放射線に対する感受性の増加及び細胞周期チェックポイントの消失につながる。ＡＴＲは体細胞の生存能力に必須であり、ＡＴＲの欠損は損傷チェックポイント応答の喪失及び細胞死をもたらすことが示されている。Ｃｏｒｔｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１７１３−１７１６（２００１）参照。ＡＴＲは脆弱な部位の安定性にも不可欠であり、Ｓｅｃｋｅｌ症候群患者においてはＡＴＲ発現の低さから、複製ストレス後の染色体破壊が増加する。Ｃａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ  ７５：６５４−６６０（２００４）参照。複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）複合体は、ＡＴＲ及びその相互作用タンパク質ＡＴＲＩＰをＤＮＡ損傷部位に動員し、ＡＴＲ自体がＣＨＫ１シグナル伝達カスケードの活性化を媒介する。Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１５４２−１５４８（２００３）参照。ＡＴＲは、関連するチェックポイントキナーゼＡＴＭと同様に、カスケード内の上流においてＲＡＤ１７をリン酸化し、これはＤＮＡ損傷細胞のチェックポイントシグナリングに重要である。Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：９６９−９７４（２００１）参照。ＡＴＲは哺乳類の初期胚において、不完全なＤＮＡ複製を感知し、分裂期細胞死を防ぐために特に必須であると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｏｒｔｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１７１３−１７１６（２００１）
【非特許文献２】Ｃａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ  ７５：６５４−６６０（２００４）
【非特許文献３】Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１５４２−１５４８（２００３）
【非特許文献４】Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：９６９−９７４（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＤＮＡ損傷化学療法剤及び電離放射線（ＩＲ）療法が、がん患者に初期の治療上の利点を提供してきた一方で、既存の療法は臨床効果を失っていた（例えば、腫瘍細胞ＤＮＡ修復応答のために）。ＡＴＲ阻害剤及びＤＮＡ傷害剤のｉｎ  ｖｉｖｏ効果は、正常な細胞に比べて、がんの選択的治療において、特にＧ１チェックポイント制御（生存のためにＡＴＲに依存する可能性がある）を欠損した腫瘍細胞の治療において、一定の可能性が示されている。
【０００７】
単剤としてまたは併用療法の一部として（例えば、化学療法及び／または放射線療法と併用して）、がんの治療のためにＡＴＲ阻害剤を送達するための強力で選択的な治療法の開発が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本発明者らは、血管拡張性失調症及びＲａｄ３関連（ＡＴＲ）キナーゼの阻害ならびにがんの治療に有用な新規化合物、ならびに所望の特性（例えば、血液循環系における半減期の延長及び腫瘍の治療における有効性）を有するＡＴＲタンパク質キナーゼの特定の阻害剤のリポソーム製剤を見出した。本発明は、ＡＴＲタンパク質キナーゼを阻害するための特定の新規化合物、ならびにＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物の特定のリポソーム製剤の延長された血漿半減期及び増強された抗腫瘍効果の発見に部分的に基づいている。
【０００９】
第一の実施形態では、式（Ｉ）の新規化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、血管拡張性失調症及びＲａｄ３関連（ＡＴＲ）キナーゼの阻害ならびにがんの治療に有用であり：
【００１０】
【化１】
2019505584.tif 000002
【００１１】
式中、Ｒは、７．０超（好ましくは８．０超、最も好ましくは少なくとも約９．５）のｐＫａを有するアミンを含む部分である。式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、Ｒにおいて、所望のＡＴＲ阻害及び／またはリポソーム形成ならびに安定性特性を提供するように選択された１つ以上の第三級アミン部分を含む。いくつかの実施例では、Ｒは、好ましくは第二の第三級置換窒素を含むアルキルアミノ部分で置換された第一の第三級置換窒素を含む複素環式部分である。特に、式（Ｉ）の化合物は、式：
【００１２】
【化２】
2019505584.tif 000003
【００１３】
の部分であり得るＲを含む。
【００１４】
式中、Ａ１は、存在しないか、またはアルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル（好ましくは−（ＣＨ２）２−）であり、Ｒ１は、低級（例えば、Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノである。一実施形態では、Ｒ１は、（Ｃ１−Ｃ４アルキル）−ＮＲａＲｂであり、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキル、例えば、Ｒ１は−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ３）である。別の実施形態では、Ｒ１はＮＲａＲｂであり、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキル、例えば、Ｒ１は−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）である。
【００１５】
式（Ｉ）の別の実施形態では、Ｒが−Ｎ（Ｈ）（Ｃ１−Ｃ４アルキル）−ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂが、それぞれ独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、またはＲが−（Ｇ）−ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂが、それぞれ独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり、ＧがＣ１−Ｃ４アルキルであり、Ｇは、Ｃ１−Ｃ４アルキルでさらに置換されていてもよい。
【００１６】
式（Ｉ）の別の実施形態では、Ｒは、式：
【００１７】
【化３】
2019505584.tif 000004
【００１８】
の部分であり得、
式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルである。
【００１９】
好ましい例として、化合物１、２、３、４、５、または６からなる群から選択される化合物を含むリポソームが挙げられる：
【００２０】
【化４】
2019505584.tif 000005
【００２１】
第二の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤化合物のリポソーム製剤は、１つ以上のリポソーム形成脂質（例えば、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））、コレステロール及びポリマー結合脂質（例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル（ＰＥＧ２０００−ＤＳＧ）から形成される単層ベシクル中に、ポリアニオン（例えば、スクロースオクタ硫酸などのポリアニオン化糖、または適切なポリアニオン化ポリオール）でカプセル化した式（Ｉ）の化合物または他のＡＴＲ阻害化合物（複数可）（例えば、比較化合物Ａ）を含み得る。リポソーム形成脂質は、好ましくは、所望の量のリポソーム膜剛性を提供し、その一方でリポソームからの式（Ｉ）の化合物の漏出量を十分に低く維持するように選択されたリン脂質（複数可）とコレステロールの比を有する、１つ以上のリン脂質を含む。ポリマー結合脂質の種類及び量は、血流中において、望ましいレベルのタンパク質結合、リポソーム安定性及び循環時間を提供するように選択することができる。いくつかの例では、リポソームベシクルは、モル比３：２のＨＳＰＣ及びコレステロールを含む。特に、リポソームは、モル比３：２：０．１５のＨＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ２０００−ＤＳＧからなるベシクルを含み得る。式（Ｉ）の化合物は、適切なポリアニオン、例えばスクロースオクタ硫酸を用いてリポソーム内に封入することができる。いくつかの例では、リポソームは、式（Ｉ）の化合物及びスクロースオクタ硫酸を、式（Ｉ）の化合物及びスクロースオクタ硫酸の化学量論比で、またはそれに近い比で封入する。
【００２２】
特定の一実施例は、モル比３：２：０．１５のＨＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ２０００−ＤＳＧから形成されるベシクルを有し、スクロースオクタ硫酸及び化合物５をカプセル化するリポソームを提供する。別の実施例は、モル比３：２：０．１５のＨＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ２０００−ＤＳＧから形成されるベシクルを有し、スクロースオクタ硫酸及び化合物５をカプセル化するリポソームを提供する。
【００２３】
別の特定の実施例は、モル比３：２：０．１５のＨＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ２０００−ＤＳＧから形成されるベシクルを有し、スクロースオクタ硫酸及び化合物６をカプセル化するリポソームを提供する。
【００２４】
別の特定の実施例は、モル比３：２：０．１５のＨＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ２０００−ＤＳＧから形成されるベシクルを有し、スクロースオクタ硫酸及び化合物Ａをカプセル化するリポソームを提供する。
【００２５】
本明細書に開示するＡＴＲ阻害剤化合物及び／またはそのリポソーム製剤は、治療及び治療方法に使用することができる。いくつかの実施形態では、治療はがんの治療である。治療として使用する場合、リポソーム組成物は、１つ以上の他の化合物または組成物を用いた（例えば、ＭＭ−３９８などのイリノテカン
【００２６】
【化５】
2019505584.tif 000006
【００２７】
リポソーム製剤と併用した）治療レジメンで使用してもよい。１つ以上の他の化合物または組成物を用いたリポソーム組成物の投与は、同時、別々または連続的であってもよい。１つ以上の他の化合物または組成物は、さらなる治療薬、例えば、さらなる抗がん剤であってもよく、または治療剤のマイナスの副作用を改善するように設計された化合物であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本明細書に開示する特定の化合物の製造に有用な第一の化学反応スキームである。
【図２】本明細書に開示する特定の化合物の製造に有用な第二の化学反応スキームである。
【図３】本明細書に開示する特定の化合物の製造に有用な第三の化学反応スキームである。
【図４】本明細書に開示する特定の化合物の製造に有用な第四の化学反応スキームである。
【図５】実施例８に記載する、リポソームＡＴＲ阻害剤の血液薬物動態を示すグラフである。
【図６】実施例９Ａに記載する、子宮頸部ＭＳ７５１異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用したリポソーム化合物Ａの抗腫瘍効力を示すグラフである。
【図７】実施例９Ａに記載する、子宮頸部Ｃ３３Ａ異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用したリポソーム化合物Ａの抗腫瘍効力を示すグラフである。
【図８】実施例９Ａによる、子宮頸部Ｃ３３Ａ異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用したリポソーム化合物Ａの抗腫瘍効力を示すグラフである。
【図９】実施例９Ａによる、子宮頸部ＭＳ７５１におけるＭＭ−３９８と併用したリポソーム化合物Ａの忍容性を示すグラフである。
【図１０】実施例１０に記載するように、ＮＣＩ−Ｈ２１７０（図１０Ａ）及びＤＭＳ−１１４（図１０Ｂ）マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用したリポソーム化合物５の効力を示すグラフである。
【図１１】実施例１０に記載するように、ＮＣＩ−Ｈ２１７０（図１１Ａ）及びＤＭＳ−１１４（図１１Ｂ）マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用したリポソーム化合物５の効力を示すカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図１２】ＮＣＩ−Ｈ２１７０（図１２Ａ）及びＤＭＳ−１１４（図１２Ｂ）マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用したリポソーム化合物５の忍容性を示すグラフである。
【図１３】実施例１１に記載する、Ｃａｌｕ−６（図１３Ａ）及びＣＯＬＯ−６９９（図１３Ｂ）マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用したリポソーム化合物５の効力を示すグラフである。
【図１４Ａ】肺癌細胞株のパネル中の化合物６及び化合物５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単剤療法による細胞死滅を示すグラフである。
【図１４Ｂ】３つの化学療法剤（カルボプラチン、ゲムシタビン、化合物Ｂ）と併用した化合物５及び化合物６の効果を示すグラフである。
【図１５】Ｓｕｍ１９０ＰＴ細胞株（三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）において測定した様々な濃度の化合物Ｂの存在下及び非存在下での実施例２のＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物６のＩＣ５０シフト値を示すグラフである。
【図１６】図１６Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ＴＮＢＣ癌細胞株において測定した実施例２のＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物６の併用のＩＣ５０シフト値を示すグラフである。図１６Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ＴＮＢＣ癌細胞株において測定したＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物Ａの併用のＩＣ５０シフト値を示すグラフである。
【図１７】ゲムシタビン［１６ｎＭ］またはＡＴＲ阻害剤（化合物Ａまたは化合物５［１ｕＭ］）のいずれか単独または組合せにｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露した肺癌細胞ＤＭＳ−１１４から得られたウェスタンブロット分析結果である。
【図１８Ａ】Ｕ２ＯＳ細胞内で、化合物Ａとゲムシタビンを様々な濃度で併用して実施した細胞死及び細胞増殖アッセイである。結果を、２つの化合物を併用する場合の細胞増殖及び細胞死の予測値と比較する。
【図１８Ｂ】Ｕ２ＯＳ細胞内で、化合物Ａとゲムシタビンを様々な濃度で併用して実施した細胞死及び細胞増殖アッセイである。ＵＳＯ２細胞中の化合物Ａ（１μＭ）及びゲムシタビン（０．０４μＭ）の設定濃度で、生存細胞及びアポトーシス細胞の数も測定する。
【図１９】いくつかの肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ５２０及びＮＣＩ−Ｈ５９６）及びＵ２ＯＳ細胞において、単独で、及びＳＮ３８と併用して、設定濃度（それぞれ１μＭ及び０．２μＭ）で試験し、細胞数を経時的にモニタリングした化合物Ａを示す。
【図２０】子宮頸癌細胞株ＭＳ７５１における化合物Ａ及びＳＮ３８の併用及び単独での効果を示すグラフである。
【図２１Ａ】化合物Ａまたは化合物５とゲムシタビンとの併用効果を示す。Ｕ２ＯＳ、Ｈ３５８、及びＡ５４９細胞株における、化合物Ａまたは化合物５とゲムシタビンとの様々な濃度での併用効果を示すヒートマップである。
【図２１Ｂ】化合物Ａまたは化合物５とゲムシタビンとの併用効果を示す。細胞内での、化合物５及びゲムシタビンまたは化合物Ａ及びゲムシタビンを設定濃度で処置した細胞の顕微鏡写真を示す。
【図２１Ｃ】化合物Ａまたは化合物５とゲムシタビンとの併用効果を示す。設定濃度でのＵＳＯ２及びＨ３５８細胞の増殖アッセイも同様に示す。
【図２２】化合物Ａまたは化合物５をＳＮ３８と併用した（図２２Ａ）又は単独の（図２２Ｂ）場合のＡ５４９細胞の増殖曲線を示す。
【図２３】様々な濃度の化合物Ａまたは化合物５を含む設定濃度のゲムシタビンを用いたいくつかの細胞株におけるＩＣ５０値（μＭ）を示す。
【図２４】ゲムシタビンまたはＳＮ３８と併用した化合物Ａまたは化合物５に応答する肺癌細胞株の概要を示す。
【図２５】様々なＡＴＲ阻害剤の、ＡＴＲ（オンターゲット）及びＡＴＭ（オフターゲット）阻害能力についての試験結果を示す。阻害を、ｎＭでのＩＣ５０として報告する（図２５Ａ）。さらなる「オフターゲット」キナーゼを同様に化合物Ａまたは化合物５を用いて試験する（図２５Ｂ）。
【図２６Ａ】Ａ５４９肺癌細胞における化合物Ａまたは化合物５を用いたオンターゲットの結果を示す。ＡＴＲ阻害の読取り値であるＣＨＫ１  Ｓ３４５のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
【図２６Ｂ】Ａ５４９肺癌細胞における化合物Ａまたは化合物５を用いたオンターゲットの結果を示す。ＡＴＲ阻害の読取り値であるＣＨＫ１  Ｓ３４５のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
【図２６Ｃ】Ｈ２３肺癌細胞における化合物Ａまたは化合物５を用いたオンターゲットの結果を示す。ＡＴＲ阻害の読取り値であるＣＨＫ１  Ｓ３４５のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
【図２６Ｄ】Ｈ２３肺癌細胞における化合物Ａまたは化合物５を用いたオンターゲットの結果を示す。ＡＴＲ阻害の読取り値であるＣＨＫ１  Ｓ３４５のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
【図２６Ｅ】ＤＭＳ−１１４細胞における化合物Ａまたは化合物５を用いたオンターゲットの結果を示す。ＡＴＲ阻害の読取り値であるＣＨＫ１  Ｓ３４５のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
【図２６Ｆ】ＤＭＳ−１１４細胞における化合物Ａまたは化合物５を用いたオンターゲットの結果を示す。ＡＴＲ阻害の読取り値であるＣＨＫ１  Ｓ３４５のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
【図２７Ａ】ＨＣＣ−７０  ＴＮＢＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＴＮＢＣ、及びＤＭＳ−１１４細胞株についてのさらなるオンターゲット分析を示す。ＳＮ３８の設定濃度を、ある範囲の化合物Ａまたは化合物５濃度とともに使用する。ウェスタンブロットにより、様々なオンターゲット活性パラメータを試験し、測定する。
【図２７Ｂ】ＨＣＣ−７０  ＴＮＢＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＴＮＢＣ、及びＤＭＳ−１１４細胞株についてのさらなるオンターゲット分析を示す。ＳＮ３８の設定濃度を、ある範囲の化合物Ａまたは化合物５濃度とともに使用する。ウェスタンブロットにより、様々なオンターゲット活性パラメータを試験し、測定する。
【図２８】ＳＮ３８及び化合物Ａまたは化合物５を添加した２４時間後のＳＵＭ１４９細胞の細胞周期特性を示す。
【図２９】ＭＭ３９８と併用した場合のＬｓ化合物ＡまたはＬｓ化合物５の効果を測定するために使用するＤＭＳ−１１４肺異種移植片モデルを示す。２つの異なる用量の化合物Ａまたは化合物５（２０ｍｐｋまたは８０ｍｐｋ）とともに設定用量のＭＭ３９８（５ｍｐｋ）を使用する。ＣＨＫ１  Ｓ３４５のリン酸化のレベルを測定することにより、治療効果をアッセイする。
【図３０Ａ】ＳＵＭ−１４９細胞株におけるＭＭ３９８存在下でのＬｓ化合物Ａの効果を示す。ＲＰＡ２のリン酸化レベルを測定することによって、治療効果をアッセイする。
【図３０Ｂ】ＳＵＭ−１４９細胞株におけるＭＭ３９８存在下でのＬｓ化合物Ａの効果を示す。ＲＰＡ２、ＤＮＡＰＫ、ＣＨＫ１、及びγＨ２ＡＸのリン酸化レベルを測定することによって、治療効果をアッセイする。
【図３０Ｃ】ＳＵＭ−１４９細胞株におけるＭＭ３９８存在下でのＬｓ化合物Ａの効果を示す。ＲＰＡ２、ＤＮＡＰＫ、ＣＨＫ１、及びγＨ２ＡＸのリン酸化レベルを測定することによって、治療効果をアッセイする。Ｌｓ化合物５も、ＭＭ３９８と併用せずに試験する。
【図３１】ＳＵＭ−１４９マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物５の効力を示すグラフである。
【図３２】ＳＵＭ−１４９マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物５の忍容性を示すグラフである
【図３３】細胞株パネルに対してウェスタンブロットによって定量化したＤＮＡ損傷応答経路に関連する様々なＰＤマーカーのベースレベルである。
【図３４】動的細胞生存率アッセイにおける各ウェルについて積分スコアを計算する方法を示す模式図である。
【図３５】ＡＴＲ阻害剤化合物５及び／またはＳＮ３８に曝露した肺癌細胞株における、基底ＭＲＥ１１タンパク質発現（ウェスタンブロットによって定量化）と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
【図３６】ＡＴＲ阻害剤化合物５及び／またはＳＮ３８に曝露した肺癌細胞株における、基底ＡＴＭタンパク質発現（ウェスタンブロットによって定量化）と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
【図３７】ＡＴＲ阻害剤化合物５及び／またはＳＮ３８に曝露した肺癌細胞株における、基底ＮＢＳタンパク質発現（ウエスタンブロットによって定量化）と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
【図３８】ＡＴＲ阻害剤化合物５及び／またはＳＮ３８に曝露したｐ５３機能障害性肺癌細胞株における、基底ＮＢＳタンパク質発現（ウエスタンブロットによって定量化）と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
【図３９】ＡＴＲ阻害剤化合物５及び／またはＳＮ３８に曝露したｐ５３機能障害性肺癌細胞株における、基底ＮＢＳタンパク質発現（ウェスタンブロットによって定量化）と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
【図４０Ａ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ１２９９の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４０Ｂ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ１２９９の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４０Ｃ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ１２９９の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４０Ｄ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ１２９９の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４０Ｅ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ１２９９の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４０Ｆ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ１２９９の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４１Ａ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ４６０の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４１Ｂ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ４６０の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４１Ｃ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ４６０の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４１Ｄ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ４６０の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４１Ｅ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ４６０の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４１Ｆ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ４６０の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４２Ａ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＤＭＳ１１４の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４２Ｂ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＤＭＳ１１４の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４２Ｃ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＤＭＳ１１４の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４２Ｄ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＤＭＳ１１４の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４２Ｅ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＤＭＳ１１４の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４２Ｆ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＤＭＳ１１４の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４３Ａ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＨＣＣ７０の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４３Ｂ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＨＣＣ７０の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４３Ｃ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＨＣＣ７０の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４３Ｄ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＨＣＣ７０の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４３Ｅ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＨＣＣ７０の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４３Ｆ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＨＣＣ７０の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
【図４４Ａ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＭＤＡＭＢ４６８の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４４Ｂ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＭＤＡＭＢ４６８の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４４Ｃ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＭＤＡＭＢ４６８の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４４Ｄ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＭＤＡＭＢ４６８の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４４Ｅ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＭＤＡＭＢ４６８の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４４Ｆ】ＡＴＲ阻害及び／またはＳＮ３８に曝露した後のがん細胞株ＭＤＡＭＢ４６８の薬力学的マーカーの倍率変化である。
【図４５】ＡＴＲ阻害及び／またはゲムシタビンに６または１８時間曝露した後のがん細胞株Ａ５４９における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
【図４６】ＡＴＲ阻害及び／またはゲムシタビンに６または１８時間曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ２３における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
【図４７】ＡＴＲ阻害及び／またはゲムシタビンに６または１８時間曝露した後のがん細胞株ＤＭＳ１１４における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
【図４８】ＡＴＲ阻害及び／またはゲムシタビンに６または１８時間曝露した後のがん細胞株Ｕ２０Ｓにおける薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
【図４９】ＡＴＲ阻害及び／またはゲムシタビンに６または１８時間曝露した後のがん細胞株ＮＣＩＨ４６０における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
【図５０】ＡＴＲ阻害及び／またはゲムシタビンに６または１８時間曝露した後のがん細胞株ＨＣＣ８２７における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
【図５１】化合物５及び／またはＳＮ３８に１８時間曝露した後の結腸直腸癌細胞株パネルにおける薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
【図５２】化合物５及び／またはＳＮ３８に１８時間曝露した後の結腸直腸癌細胞株パネルにおける、リン酸化Ｃｈｋ１レベルの正規化した定量結果である（各細胞株のシグナルを、ＳＮ３８単独の存在下でシグナルに対して正規化する）。
【図５３】化合物５及び／またはＳＮ３８に１８時間曝露した後の結腸直腸癌細胞株パネルにおける、リン酸化ＲＰＡ２レベルの正規化した定量結果である（各細胞株のシグナルをＳＮ３８単独の存在下でシグナルに対して正規化する）。
【図５４】化合物５及び／またはＳＮ３８に１８時間曝露した後の結腸直腸癌細胞株パネルにおける、γＨ２ＡＸレベルの正規化した定量結果である（各細胞株のシグナルを、ＳＮ３８単独の存在下でシグナルに対して正規化する）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
ＡＴＲタンパク質キナーゼを阻害するための新規化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、式（Ｉ）：
【００３０】
【化６】
2019505584.tif 000007
【００３１】
によって記載し、式中、Ｒは、マウスにおいて少なくとも約５時間の血漿半減期を提供するように選択された、７．０より大きい（好ましくは８．０より大きい、そして最も好ましくは少なくとも約９．５の）ｐＫａを有するアミンを含む部分である（実施例７に従って得られる）。好ましくは、Ｒは４〜１２個の炭素原子を有するアミン置換アルキル部分を含む。Ｒは、三置換アミン及び水素化アルキル基の組合せのみを含むように選択することができる。Ｒは、好ましくは少なくとも７、しかし最も好ましくは少なくとも約９．５のｐＫａ（例えば、約９．５〜１０．５のｐＫａ）を有する第三級アルキル置換アミンをさらに含む。式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の例として、化合物１〜６が挙げられる（実施例１〜６参照）：
【００３２】
【化７】
2019505584.tif 000008
【００３３】
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、Ｒに、所望のＡＴＲ阻害及び／またはリポソーム形成及び安定性特性を提供するように選択された１つ以上の第三級アミン部分を含む。いくつかの例では、Ｒは、好ましくは第二の三級置換窒素を含むアルキルアミノ部分で置換された第一の第三級置換窒素を含む複素環式部分である。特に、式（Ｉ）の化合物は、式：
【００３４】
【化８】
2019505584.tif 000009
【００３５】
の部分であるＲを含みことができ、式中、Ａ１は、存在しないか、またはアルキル（例えばＣ１−Ｃ４アルキル（好ましくは−（ＣＨ２）２−）であり、Ｒ１は、低級（例えばＣ１−Ｃ４）アルキルアミノである。一実施形態では、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ４アルキル）−ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり、例えばＲ１は−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ３）である。別の実施形態では、Ｒ１はＮＲａＲｂであり、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり、例えばＲ１は−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）である。
【００３６】
式（Ｉ）の別の実施形態では、Ｒが−Ｎ（Ｈ）（Ｃ１−Ｃ４アルキル）−ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂがそれぞれ独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、またはＲが−（Ｇ）−ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂがそれぞれ独立してＣ１−Ｃ４アルキルであり、式中、ＧがＣ１−Ｃ４アルキルであり、式中、Ｇを、Ｃ１−Ｃ４アルキルでさらに置換することができる。
【００３７】
式（Ｉ）の別の実施形態では、Ｒは、式：
【００３８】
【化９】
2019505584.tif 000010
【００３９】
の部分であることができ、式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立してＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００４０】
好ましい実施例として、上記の化合物１、２、３、４、５、または６からなる群から選択される化合物を含むリポソームが挙げられる。いくつかの実施例では、化合物は化合物５または化合物６である。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）、またはその薬学的に許容可能な塩の化学構造を有することができ、式中、Ｒ′は、約９．５以上のｐＫａを有する第三級アルキル置換アミンである：
【００４２】
【化１０】
2019505584.tif 000011
【００４３】
式（Ｉａ）の化合物の実施例として、本明細書に開示する化合物５（例えば、実施例１）が挙げられる。式（Ｉａ）の一実施形態では、Ｒ′はＮＲａＲｂであり、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立してＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００４４】
ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物のリポソーム製剤（例えば、実施例７に記載の）は、実施例８に記載するマウスモデルにおいて５時間以上の血漿半減期の向上などの望ましい薬物動態学的特性を提供することができる。リポソームは、通常、水性の内部を取り囲む１つ以上の脂質二重層を有するベシクルを備える。リポソーム組成物は、多くの場合、媒体、例えば、リポソーム外部の水性流体の中にリポソームを含む。リポソーム脂質は、水性媒質と接触する際に自発的に二層膜、例えばリン脂質、例えばホスファチジルコリンを形成する両親媒性脂質成分を含むことができる。リポソームはまた、膜硬化性成分、例えば、ステロール、例えば、コレステロールを含み得る。いくつかの場合には、リポソームはまた、親水性ポリマーに結合した脂質、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質誘導体も含み、これは、リポソームの凝集傾向を低下させる場合があり、他の有益な効果も有し得る。
【００４５】
リポソーム製剤は、１つ以上のリポソーム形成脂質（例えば、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））、コレステロール及びポリマー結合脂質（例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル（ＰＥＧ２０００−ＤＳＧ）から形成される単層ベシクル中に、ポリアニオン（例えば、ポリアニオン化糖、例えば、スクロースオクタ硫酸、または適切なポリアニオン化ポリオール）でカプセル化した式（Ｉ）の化合物を含む。リポソーム形成脂質は、好ましくは、所望の量のリポソーム膜剛性を提供し、その一方でリポソームからの式（Ｉ）の化合物の漏出量を十分に低く維持するように選択されたリン脂質（複数可）とコレステロールの比を有する、１つ以上のリン脂質を含む。
【００４６】
リポソームは、通常、ミクロンまたはサブミクロンの範囲のサイズを有し、イリノテカンなどの抗がん剤を含む医薬物質を保持し、様々な有益な方法でそれらの医薬特性を変化させる能力について十分に認識されている。医薬用リポソーム組成物を調製し、特徴付ける方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ  Ｄ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９９３；Ｇ．Ｇｒｅｒｏｒｉａｄｉｓ（ｅｄ．），Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１−３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，２００６；Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ｐａｔ．８，１４７，８６７を参照されたく、前記文献は、あらゆる目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する）。
【００４７】
いくつかの実施例（例えば、実施例７）では、ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤組成物は、ポリ硫酸化糖（例えば、スクロースオクタ硫酸）などのポリアニオンとともにリポソームに封入されたＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物を含むリポソームを含み得る。スクロースの完全置換型硫酸エステルであるスクロソフェートは、完全にプロトン化された形態において以下の構造を有する：
【化１１】
2019505584.tif 000012
スクロソフェートは、スクロースオクタ硫酸またはスクロオクタ硫酸（ＳＯＳ）とも呼ばれる。様々な塩、例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩の形態でのスクロソフェートの調製方法は、当該分野において周知である（例えば、ＵＳ  Ｐａｔ．４，９９０，６１０であり、前記文献は、その全体を参照として本明細書に援用する）。
【００４８】
ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤リポソームは、ＴＥＡを含有するリポソームを形成し、続いてＴＥＡがリポソームを離れるにつれて、ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物（例えば、化合物Ａまたは式（Ｉ）の化合物）をリポソームに充填することを含む、複数の工程で調製することができる。例えば、ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤リポソームは、（ａ）トリエチルアミン（ＴＥＡ）をスクロソフェートのトリエチルアンモニウム塩（ＴＥＡ−ＳＯＳ）として含有するリポソームを調製し、（ｂ）続いて、イリノテカンがリポソームに入り、対応する量のＴＥＡがリポソームを離れることを可能にする（それによって、生じるリポソームにおけるＴＥＡの濃度勾配を消耗または減少させる）のに効果的な条件下で、ＴＥＡ−ＳＯＳリポソームをイリノテカンと接触させる工程を含むプロセスによって調製することができる。
【００４９】
第一の工程は、ＴＥＡスクロソフェートの溶液中にリポソーム脂質を水和及び分散させることによって、ＴＥＡ−スクロソフェートを含有するリポソームを形成することを含み得る。これは、例えば、ＨＳＰＣ及びコレステロールを含む脂質を加熱したエタノール中に溶解させ、溶解及び加熱した脂質溶液を、リポソーム脂質の転移温度（Ｔｍ）を超える温度、例えば６０℃以上でＴＥＡ−スクロソフェート水溶液中に分散させることによって行うことができる。脂質分散液は、規定の細孔サイズ、例えば１００ｎｍを有するトラックエッチングされたポリカーボネート膜を通した押し出しによって、７５〜１２５ｎｍ（例えば、８０〜１２０ｎｍ、またはいくつかの実施形態では、９０〜１１５ｎｍ）の平均サイズを有するリポソームに形成することができる。ＴＥＡ−スクロソフェートは、各モル当量のスクロソフェートに対して少なくとも８モル当量のＴＥＡを含み、約０．４０〜０．５０Ｎの濃度、ならびに分散及び押し出し工程の間にリポソームリン脂質の許容不能な分解を防止するように選択されたｐＨ（例えば、約６．５）（例えば、これらの工程の間にリポソームリン脂質の分解を最小限に抑えるように選択されたｐＨ）を有する溶液を得ることができる。次いで、捕捉されなかったＴＥＡ−ＳＯＳを、薬物のカプセル化の前に、例えば、透析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換または限外濾過によって、リポソーム分散液から除去することができる。得られるリポソームは、ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤スクロソフェートを含有することができる。これらのＡＴＲ阻害剤リポソームは、得られるリポソーム組成物中のＴＥＡの量を、４℃で１８０日後に所定の最大レベル未満、または約４℃、より一般的には５±３℃で、例えばｍｇ／ｍＬ／月、または、単位時間、例えば、ｍｏｌ％リゾＰＣ／月にわたるＰＣからリゾＰＣへの変換率（％）で測定する冷蔵庫中での保存中のリポソーム組成物中の所定の最大レベルのリゾＰＣ蓄積速度未満のリゾＰＣ形成を生じるレベルまで低下させるのに十分な薬物をリポソームに充填することによって安定化され得る。次に、充填プロセスの間にリポソームから外部媒体に交換されるＴＥＡを、通常、任意の適切な公知の方法（複数可）によって（例えば、ゲルクロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション、イオン交換または限外濾過によって）、任意の未捕捉のＡＴＲ阻害剤とともに、リポソームから除去する。リポソーム外部媒体は、所望のｐＨで緩衝された注射可能な等張液（例えば、塩化ナトリウムの等張溶液）と交換することができる。
【００５０】
リポソームカプセル化ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物を含む様々なリポソーム製剤の抗腫瘍効果を、ヒト子宮頸癌細胞株（例えば、実施例９に示す、ＭＳ７５１、Ｃ３３Ａ及びＳｉＨａ細胞株）、ならびに肺扁平上皮癌細胞株（例えば、実施例１０のＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞株）、小細胞肺癌細胞株（例えば、実施例１０のＤＭＳ−１１４細胞株）、ならびにヒトＣａｌｕ−６及びＣＯＬＯ−６９９細胞株（実施例１１）を含む、様々な肺癌細胞株で試験した。
【００５１】
図６〜９及び実施例９に示すように、マウス異種移植片モデル（実施例９Ａ）において、３種のヒト子宮頸癌細胞株に対して、単独で、及びイリノテカンリポソーム製剤ＭＭ３９８（実施例９Ｂ）と併用して、ＡＴＲ阻害剤化合物Ａのリポソーム製剤（実施例７）を試験した。３種の子宮頸癌細胞株（ＭＳ５７１及びＣ３３Ａ）のうちの２種の対照実験と比較して、実施例７のリポソーム化合物Ａ製剤について、経時的により大きな腫瘍体積が観察された。しかしながら、イリノテカンリポソームＭＭ３９８（実施例９Ｂ）を、化合物Ａリポソーム製剤（実施例７）と併用して投与すると、ＭＭ３９８単独またはリポソーム化合物Ａ単独の投与に比べて、３種の子宮頸癌細胞株の腫瘍体積を大幅に抑制した。
【００５２】
図１０Ａ〜１０Ｂ及び図１１Ａ〜１１Ｂに示すように、式（Ｉ）及び式（Ｉａ）のＡＴＲ阻害剤化合物５（実施例７に記載するように、リポソームとして製剤化した実施例１の化合物）のリポソーム製剤を、マウス異種移植片モデルの２種の肺癌細胞株（実施例１０）に対して、単独で、及びイリノテカンリポソーム製剤ＭＭ３９８（実施例９Ｂ）と併用して試験した。図１０Ａ及び図１０Ｂに示すように、化合物５のリポソーム製剤の投与は、実施例１０の対照実験に比べて試験した各細胞株において腫瘍体積を減少させ、ＭＭ３９８と実施例７の化合物５リポソーム組成物との併用は、マウスモデルにおいて、いずれかの化合物を他の化合物とは独立して投与した場合よりも腫瘍体積を大幅に減少させた。同様に、実施例１０（図１１Ａ及び図１１Ｂ）に示すカプラン−マイヤー生存曲線は、２つの異なる細胞株を用いて、実施例９ＢのイリノテカンリポソームＭＭ３９８と実施例７の化合物５リポソーム製剤とを併用投与した場合に、マウス肺癌異種移植試験における生存率の増加を示す。
【００５３】
図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、ＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物の様々なリポソーム製剤の忍容性を実施例１０において評価した。図１２Ａに示すように、ＮＣＩ−Ｈ２１７０マウス異種移植片モデルで試験したマウス体重の減少は、化合物５のリポソーム製剤（実施例７）において、イリノテカンリポソームＭＭ３９８（実施例９Ｂ）、対照、または化合物５とＭＭ３９８を組み合わせたリポソーム製剤の併用に比べて、経時的に最も低かった。図１２Ｂに示すように、ＤＭＳ−１１４マウス異種移植片モデルで試験したマウス体重の減少は、化合物５とＭＭ３９８を組み合わせたリポソーム製剤の併用において、化合物５のリポソーム製剤（実施例７）、または独立して投与したイリノテカンリポソームＭＭ３９８（実施例９Ｂ）に比べて、経時的に最も低かった。
【００５４】
図１３Ａ及び図１３Ｂに示すように、イリノテカンリポソームＭＭ３９８（実施例９Ｂ）とＡＴＲタンパク質キナーゼ阻害剤化合物５のリポソーム製剤を併用して投与すると、対照、ＭＭ３９８イリノテカンリポソーム単独投与、化合物Ａリポソーム製剤（実施例７）の投与またはＭＭ３９８イリノテカンリポソーム（実施例９Ｂ）と化合物Ａリポソーム製剤（実施例７）との併用に比べて、マウス異種移植片モデルのＣａｌｕ−６細胞株及びＣＯＬＯ６９９細胞株の両方において腫瘍体積が最も大きく減少した。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示す。以下の実施例及び調製物は、本発明のこれらの及び他の実施形態を当業者がより明確に理解し実施できるようにするために提供する。これらは、本発明の範囲を限定するものではなく、単に例示的で代表的なものであるとみなされるべきである。
【００５６】
ＡＴＲペプチドは、文献において公知の様々な方法を用いて発現させ、及び単離することができる（例えば、Ｕｎｓａｌ−Ｋａｃｍａｚ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ９９：１０，ｐｐ６６７３−６６７８，Ｍａｙ  １４，２００２参照；Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １２４，ｐｐ９４３−９５５，Ｍａｒ．１０，２００６；Ｕｎｓａｌ−Ｋａｃｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４，ｐ１２９２−１３００；及びＨａｌｌ−Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９９，１８，６７０７−６７１３も参照）。
【００５７】
化合物Ａは、化合物ＩＩ−Ａ−７の合成及び使用に関連する部分を参照として本明細書に援用する、ＷＯ２０１０／０７１８２７Ａ１（２０１０年６月２４日公開）に開示されている方法によって得ることができる。化合物Ａの構造は以下の通りである：
【００５８】
【化１２】
2019505584.tif 000013
【００５９】
式（Ｉ）の様々な化合物を、本明細書に記載するように調製し、これらを以下の表に要約する。
【００６０】
【表１】
2019505584.tif 000014
【００６１】
実施例１、２、３及び６は、図１のスキーム１に示す、ｉｎ−ｓｉｔｕ生成されたボロン酸エステルを用いたワンポットスズキクロスカップリング法で調製した。図１に示すように、中間体３：１−ブロモ−４−（２−ブロモエチルスルホニル）ベンゼンの合成は、以下のようにして得ることができる。
【００６２】
【化１３】
2019505584.tif 000015
【００６３】
ＤＣＭ（４００ｍＬ）中の中間体２（３５ｇ、１３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＢｒ３（４０ｇ、１４６ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。次いで、混合物を室温で一晩攪拌した。水（１５ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。次いで、得られたものを水（１２０ｍＬ）及びブライン（１２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を濃縮して２０ｇの３の粗製物を黄色油状物として取得し、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
【００６４】
図１に示すように、中間体２の合成は以下のように実施することができる：
【００６５】
【化１４】
2019505584.tif 000016
【００６６】
ＤＣＭ（５００ｍｌ）中の中間体１（４５ｇ、１９４ｍｍｏｌ）の溶液に、数回のバッチでｍ−ＣＰＢＡ（１３４ｇ、７７６ｍｍｏｌ）を室温で加えた。次いで、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、ＤＣＭ（５００ｍｌ）を添加して固体を洗浄した。濾液をＮａＯＨ（１Ｍ、３００ｍＬ×３）及びブライン（３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を濃縮乾固して３６ｇの２（７０％）を白色固体として得た。
【００６７】
図１に示すように、中間体１の合成は以下のように実施することができる。
【００６８】
【化１５】
2019505584.tif 000017
【００６９】
ＭｅＣＮ（６００ｍｌ）中の４−ブロモベンゼンチオール（４５ｇ、２３８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（６０ｇ、４７６ｍｍｏｌ）及びＮａＩ（３６ｇ、２３８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１０分間攪拌した。次に２−ブロモエタノールを滴下した。添加後、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムで精製して、４５ｇの１（８１％）を淡黄色の油状物として得た。
【００７０】
ブロックＢは、図２のスキーム２に従って調製することができる。図２に示すように、ブロックＢの合成は以下のようにして行うことができる。
【００７１】
【化１６】
2019505584.tif 000018
【００７２】
ＤＭＳＯ（３０ｍＬ）中の中間体６（６．０ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＤＩ（８．９ｇ、５４．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（３．８ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１７ｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で４時間攪拌した。アニリン（２．５ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩攪拌した。水を加え、形成した固体を濾過により回収した。粗生成物をシリカゲルカラムで精製して、２．５ｇのブロックＢ（３１％）を黄色固体として得た。
【００７３】
ＬＣ−ＭＳ （Ｍ＋１）： ２９３．２；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ１０．２８ （ｓ， １Ｈ）， ８．４２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．７４ （ｓ， ２Ｈ）， ７．３６ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）。
【００７４】
再び図２に示すように、中間体６の合成は以下のようにして行うことができる。
【００７５】
【化１７】
2019505584.tif 000019
【００７６】
ＭｅＯＨ（７０ｍＬ）中の３−アミノ−６−ブロモピラジン−２−カルボン酸メチル（１０．０ｇ、４３．１ｍｍｏｌ）の溶液に、水（７０ｍＬ）中のＬｉＯＨ（９．０ｇ、２１５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を９０℃で３時間攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、ＨＣｌ（２Ｍ）でｐＨ＝４〜５に酸性化した。混合物を濾過して７．４ｇの６（７９％）を黄色固体として得た。
【００７７】
ＬＣ−ＭＳ （Ｍ＋１）： ２１８．０；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ ８．３９ （ｓ， １Ｈ）， ７．５９ （ｂｒ， ２Ｈ）。
【００７８】
実施例１：化合物５（３−アミノ−６−（４−（（２−（４−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ピペリジン−１−イル）エチル）スルホニル）フェニル）−Ｎ−フェニルピラジン−２−カルボキサミド）の合成
【００７９】
【化１８】
2019505584.tif 000020
【００８０】
正確な質量：５３６．２６；分子量：５３６．７０；化合物５；より塩基性；１４３ｍｇ；収率８．２％；ｐＫａ  １０．００。
【００８１】
無水ジオキサン（３ｍｌ）中の２−（１−（２−（（４−ブロモフェニル）スルホニル）エチル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１−アミン（ブロックＡ１）（２６１ｍｇ、０．６４８ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸カリウム（１９１ｍｇ、１．９４４ｍｍｏｌ）及びビス（ピナコラト）ジボラン（２４６ｍｇ、０．９７１ｍｍｏｌ）を添加し、反応容器を真空／窒素サイクルを繰り返して脱気し、次いでＰｄ（ｄｐｐｆ）２Ｃｌ２を加えた。ＣＨ２Ｃｌ２（５３ｍｇ、０．０６４８ｍｍｏｌ）を再び脱気し、反応物を窒素下で９０℃、２時間加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、３−アミノ−６−ブロモ−Ｎ−フェニルピラジン−２−カルボキサミド（ブロックＢ）、２ＭのＫ２ＣＯ３（１ｍｌ）を添加し、脱気し、窒素でパージした。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（７５ｍｇ、０．０６４８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１００℃で４時間加熱した。反応物を室温に冷却し、酢酸エチルで希釈し、ブラインで３回洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去すると、暗色油の残留粗生成物が得られ、溶出液としてジクロロメタン中０〜１５％メタノールを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ  Ｆｌａｓｈ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）で精製した。所望の生成物を黄色固体として得た（１４９ｍｇ、収率４３％）。ＭＳ （Ｍ＋Ｈ）＋ ５３７；１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １０．４５ （ｓ， １Ｈ）， ９．０３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４９ （ｄ， ２Ｈ， ６．８Ｈｚ）， ７．９５ （ｄ， ２Ｈ， ６．８Ｈｚ）， ７．８８ （ｓ， ｂｒ， ２Ｈ）， ７．８１ （ｄ， ２Ｈ， ８．８Ｈｚ）， ７．４０ （ｔ， ２Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ７．１８（ ｔ， １Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ３．５３ （ｔ， ２Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ２．６４ （ｄ， ２Ｈ， １１．６ Ｈｚ）， ２．５５ （ｔ， ２Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ２．０５ （ｍ， ２Ｈ）， １．９８ （ｓ， ６Ｈ）， １．１７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４２ （ｄ， ２Ｈ， １２．０Ｈｚ）， １．１８ （ｍ， ３Ｈ）， ０．７８ （ｍ， ２Ｈ）。
【００８２】
高分解能質量（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ハイブリッド四重極型Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計）：計算値Ｃ２８Ｈ３６Ｎ６Ｏ３Ｓ＋プロトン（１．００７２８）＝５３７．２６４２；単一荷電イオンのｍ／ｚ理論値：５３７．２６４２；実測値：５３７．２６３６。
【００８３】
実施例２：化合物６（３−アミノ−６−（４−（（２−（４−（ジエチルアミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）スルホニル）フェニル）−Ｎ−フェニルピラジン−２−カルボキサミド）の合成
【００８４】
【化１９】
2019505584.tif 000021
【００８５】
正確な質量：５３６．２６；分子量：５３６．７０；化合物６；より塩基性；５３ｍｇ；収率１１．１％；ｐＫａ  ９．８１。
【００８６】
ブロックＡ２（１−（２−（（４−ブロモフェニル）スルホニル）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチルピペリジン−４−アミンを用いて同様の様式で実施例２を調製し、黄色固体を得た（５２ｍｇ、収率２４％）。ＭＳ （Ｍ＋Ｈ）＋ ５３７；１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １０．４５ （ｓ， １Ｈ）， ９．０５ （ｓ， １Ｈ）， ８．５１ （ｄ， ２Ｈ， ８．４Ｈｚ）， ７．９４ （ｄ， ２Ｈ， ８．８Ｈｚ）， ７．８７ （ｓ， ｂｒ， ２Ｈ）， ７．７９ （ｄ， ２Ｈ， ８．８Ｈｚ）， ７．４２ （ｔ， ２Ｈ， ８．４Ｈｚ）， ７．１８（ ｔ， １Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ３．５４ （ｔ， ２Ｈ， ６．４Ｈｚ）， ２．６５ （ｄ， ２Ｈ， １１．２ Ｈｚ）， ２．５６ （ｔ， ２Ｈ， ６．４Ｈｚ）， ２．２０ （ｑ， ４Ｈ， ６．８ Ｈｚ）， １．７１ （ｔ， ２， １０．４ Ｈｚ）， １．３３ （ｄ， ２Ｈ， １２．４Ｈｚ）， ０．８５ （ｑｄ， ２Ｈ， １２．４ Ｈｚ）， ０．７４（ｔ， ６Ｈ， ７．２ Ｈｚ）。
【００８７】
１−（２−（（４−ブロモフェニル）スルホニル）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチルピペリジン−４−アミン（ブロックＡ２）を、対応する４−ジエチルアミノピペリジンを用いて同様の方法で調製した。無色の油状物が得られた（６６１ｍｇ、収率４７％）、ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋ ４０３， ４０５。
【００８８】
実施例３：化合物２（３−アミノ−６−（４−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）スルホニル）フェニル）−Ｎ−フェニルピラジン−２−カルボキサミド）の合成
【００８９】
【化２０】
2019505584.tif 000022
【００９０】
正確な質量：４５３．１８；分子量：４５３．５６；化合物２；より塩基性でない；９８ｍｇ；収率７．７％；ｐＫａ  ７．４６。
【００９１】
中間体ブロックＡ３の２−（（４−ブロモフェニル）スルホニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチルエタン−１−アミンを用いて同様の方法で、実施例３の化合物を調製し、黄色の固体を得た（９８ｍｇ、収率  １１％）。ＭＳ （Ｍ＋Ｈ）＋ ４５４；１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １０．４６ （ｓ， １Ｈ）， ９．０５ （ｓ， １Ｈ）， ８．５１ （ｄ， ２Ｈ， ６．８Ｈｚ）， ７．９８ （ｄ， ２Ｈ， ６．８Ｈｚ）， ７．８８ （ｓ， ｂｒ， ２Ｈ）， ７．８１ （ｄ， ２Ｈ， ８．８Ｈｚ）， ７．４１ （ｔ， ２Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ７．１７（ ｔ， １Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ３．４８ （ｄｄ， ２Ｈ， ６．８Ｈｚ）， ２．７３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３３ （ｑ， ４Ｈ， ６．８Ｈｚ）， ０．８１ （ｔ， ６Ｈ， ６．８Ｈｚ）。
【００９２】
ブロックＡ３（２−（（４−ブロモフェニル）スルホニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチルエタン−１−アミン）を、対応する４−ジエチルアミンを用いて同様の方法で調製した。無色の油状物が得られた（１．４２ｇ、収率７３％）、ＭＳ （Ｍ＋Ｈ）＋ ３２０， ３２２。
【００９３】
実施例４：化合物４（３−アミノ−６−（４−（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）−λ２−アザニル）スルホニル）フェニル）−Ｎ−フェニルピラジン−２−カルボキサミド）の合成
【００９４】
【化２１】
2019505584.tif 000023
【００９５】
正確な質量：４３９．１６；分子量：４３９．５１；化合物４；ｐＫａ  ８．３６。
【００９６】
化合物４は、図３のスキーム３に示すように調製することができる。トルエン／エタノール／水（２ｍＬ／２ｍＬ／２ｍＬ）中のブロックＢ（１５０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）、ブロックＦ（１５３ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）及びＮａ２ＣＯ３（２１６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）にＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（３０ｍｇ）を添加した。混合物をアルゴン雰囲気下、７５℃で４時間攪拌した。反応混合物を濃縮乾固した。残渣を分取ＨＰＬＣにより精製して、１００ｍｇのＴＭ４（４５％）を白色固体として得た。
【００９７】
ＬＣ−ＭＳ （Ｍ＋１）： ４４１．４；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ８．８８ （ｓ， １Ｈ）， ８．３３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．００ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．１０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４６ （ｓ， ６Ｈ）。
【００９８】
再び、図３のスキーム３に示すように、ブロックＦの合成は以下のように行うことができる。
【００９９】
【化２２】
2019505584.tif 000024
【０１００】
ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の中間体７（１０．０ｇ、３２．６ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、−７８℃でＢ（ｉ−Ｐｒ）３（３０．６ｇ、１６３ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ｎ−ＢｕＬｉ（２．５Ｍ、６５ｍＬ）を滴下した。混合物を−７８℃で２時間、次に室温でさらに１６時間攪拌した。水を加えて反応を停止させた。混合物を濃縮乾固した。残渣を分取ＨＰＬＣで精製して、５．２ｇのブロックＦ（５９％）を白色固体として得た。
【０１０１】
ＬＣ−ＭＳ （Ｍ＋１）： ２７３．４；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６） δ ７．９０−７．４５ （ｍ， ４Ｈ）， ２．９１ （ｓ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０３ （ｓ， ６Ｈ）。
【０１０２】
再び、図３のスキーム３に示すように、中間体７の合成は以下のように行うことができる。
【０１０３】
【化２３】
2019505584.tif 000025
【０１０４】
０℃のＤＣＭ（３００ｍＬ）中の４−ブロモベンゼン−１−スルホニルクロライド（２０ｇ、７８．３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（２２ｍＬ、１５８ｍｍｏｌ）、続いてＮ，Ｎ′−ジメチルエタン−１，２−ジアミン（８．３ｇ、９４．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間攪拌し、次いでＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈した。溶液を水（２００ｍＬ）及びブライン（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムで精製して１７．０ｇの７（７１％）をオフホワイトの固体として得た。
【０１０５】
実施例５：化合物３（３−アミノ−６−（４−（（２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル）スルホニル）フェニル）−Ｎ−フェニルピラジン−２−カルボキサミド）の合成
【０１０６】
【化２４】
2019505584.tif 000026
【０１０７】
正確な質量：４８０．１９；分子量：４８０．５９；化合物３；ｐＫａ  ７．７３。
【０１０８】
実施例５の化合物は、図４に示すスキーム４により得ることができる。スキーム４の中間体５は、下記のようにして得ることができる。
【化２５】
2019505584.tif 000027
【０１０９】
アルゴン雰囲気下、−７８℃のＴＨＦ（３０ｍＬ）中の中間体４（１．７ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の溶液にＢ（ｉ−Ｐｒ）３（４．７ｇ、２５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ｎ−ＢｕＬｉ（２．５Ｍ、１０ｍＬ）を滴下した。混合物を−７８℃で２時間、次に室温でさらに１６時間攪拌した。水を加えて反応をクエンチした。混合物を濃縮乾固した。残渣を分取ＨＰＬＣで精製して、３００ｍｇの５（１９％）を白色固体として得た。
【０１１０】
再び図４に示すように、スキーム４の中間体４は以下のようにして得ることができる。
【０１１１】
【化２６】
2019505584.tif 000028
【０１１２】
ＭｅＣＮ（３００ｍＬ）中の中間体３（２０ｇ、６０ｍｍｏｌ）の溶液に、１−メチルピペラジン（９．０ｇ、９０ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１６．６ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムで精製して１５ｇの４（７１％）を淡色固体として得た。
【０１１３】
実施例６：化合物１（３−アミノ−６−（４−（（１−（ジメチルアミノ）プロパン−２−イル）スルホニル）フェニル）−Ｎ−フェニルピラジン−２−カルボキサミド）の合成
【０１１４】
【化２７】
2019505584.tif 000029
【０１１５】
正確な質量：４３９．１７；分子量：４３９．５３；化合物１；より塩基性でない；４２７ｍｇ；収率１２．９％；ｐＫａ  ７．０４。
【０１１６】
１−ブロモ−４−（２−ブロモエチルスルホニル）ベンゼンを使用する以外は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１１，５４，２３２０（補足資料）に記載の化合物１の調製手順に従って、実施例６の化合物を調製した。黄色の固体が得られた（４２７ｍｇ、収率１１％）。ＭＳ （Ｍ＋Ｈ）＋ ４４０；１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： δ １０．４６ （ｓ， １Ｈ）， ９．０５ （ｓ， １Ｈ）， ８．５２ （ｄ， ２Ｈ， ６．８Ｈｚ）， ７．９３ （ｄ， ２Ｈ， ６．８Ｈｚ）， ７．８９ （ｓ， ｂｒ， ２Ｈ）， ７．８２ （ｄ， ２Ｈ， ８．０Ｈｚ）， ７．４０ （ｔ， ２Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ７．１８（ ｔ， １Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ３．５３ （ｔ， ２Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ２．６４ （ｄ， ２Ｈ， １１．６ Ｈｚ）， ２．５５ （ｔ， ２Ｈ， ７．２Ｈｚ）， ２．０５ （ｍ， ２Ｈ）， １．９８ （ｓ， ６Ｈ）， １．１７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４２ （ｄ， ２Ｈ， １２．０Ｈｚ）， １．１８ （ｍ， ３Ｈ）， ０．７８ （ｍ， ２Ｈ）。
【０１１７】
実施例７：封入トリエチルアンモニウムＳＯＳ塩を有するリポソームの調製及びリポソームへのＡＴＲｉの充填
スクロースオクタ硫酸（当量１４４．８）は、すべてのヒドロキシル基が硫酸エステルを形成しているスクロース誘導体のナトリウム塩である。６０ｇのスクロースオクタ硫酸（ＳＯＳ）ナトリウム塩を１５０ｍｌの脱イオン水に溶解し、５０℃の水浴を振とう（旋回）させながら加熱した。この溶液を、スルホン化ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマー陽イオン交換樹脂ビーズ（Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ８−１００−２００メッシュ、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を充填したカラムに通した。このカラムを３〜３．６ＭのＨＣｌ水溶液で予め平衡化して樹脂を水素形態にし、流出量が導電率＜１μＳ／ｃｍを示すまで、脱イオン水で洗浄した。導電率検出器を用いて溶離液をモニタリングした。導電率ピークに対応してＳＯＳ画分を集め、すぐに純粋なトリエチルアミン（ＴＥＡ）溶液でｐＨ６〜６．５に滴定した。この溶液に対し、ナトリウム感受性電極を用いた電位差測定によって残留ナトリウムを、及び屈折計を用いてＳＯＳ濃度を分析した。０．２５％未満の残留ナトリウムを有する溶液を脱イオン水で希釈して、ＳＯＳの終濃度１．１Ｍとし、次いでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉ−Ｔｏｐフィルターを用いて滅菌濾過した。
【０１１８】
コレステロール（Ｃｈｏｌ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ、ＵＳＡから購入した。水素化ダイズホスホコリン（ＨＳＰＣ）及びメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリル（ＰＥＧ２０００−ＤＳＧ）は、Ｌｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。
【０１１９】
Ｃｈｏｌ、ＨＳＰＣ及びＰＥＧ２０００−ＤＳＧを、６５℃で３：２：０．１５のモル比で１００％エタノール（２００プルーフ、Ｓｉｇｍａカタログ番号：４５９８２８）に同時溶解させた。ＴＥＡ−ＳＯＳの溶液（添加したエタノールの体積の１０倍）を脂質溶液と６０〜６５℃で混合し、この温度で、多層ベシクルの均一な乳状懸濁液が形成されるまで攪拌した。この懸濁液を、６０〜６５℃で、アルゴン加圧押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を用いて１００ｎｍの孔径を有する５つの積層ポリカーボネートトラックエッチングフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に３回押し出し、得られた単層リポソームを氷中で急速に冷却し、使用前に４〜６℃で保存した。リン脂質の濃度をリン酸アッセイによって測定し、粒径をＭａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｚｅｒで記録した。
【０１２０】
薬剤充填前に、ゲルクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて過剰の未捕捉ＴＥＡ−ＳＯＳを除去することにより、ＴＥＡ−ＳＯＳ勾配を作製した。５０％デキストロース溶液を用いてリポソームの浸透圧を平衡化した。デキストロースの終濃度は１５％であった。
【０１２１】
ＡＴＲ阻害剤を、１Ｍ  ＨＣｌでの滴定及び４５℃での加熱によって、脱イオン水中の１５％デキストロース溶液に溶解し、次いで、０．２μｍ  ＮＡＬＧＥＮＥ  １３ｍｍシリンジフィルターで濾過した。溶液中の薬物濃度をＨＰＬＣで検出した。９〜１０ｍｇ／ｍＬの薬物を含有するＡＴＲ阻害剤のストック溶液を、薬物／脂質比８００ｍｇ／ｍｍｏｌリン脂質となるようにリポソームに添加し、ｐＨを１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液及び０．１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整した。
【０１２２】
リポソーム−薬物混合物を、時々攪拌しながら６５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション混合物を迅速に冷却し、０℃で１０分間インキュベートし、次いで周囲温度に到達させた。ＨＢＳ−６．５緩衝液（５ｍＭの２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジノ）−エチルスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１４４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶離するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのゲルクロマトグラフィーにより、捕捉されなかった薬物を除去した。空隙容量で溶出されたリポソーム画分を合わせ、０．２μｍの濾過で滅菌し、使用前に４〜６℃で保存した。リポソームを、脂質濃度、薬物濃度、及び粒子サイズによって特徴付けた（表２）。４００ｇ／ｍｏｌより高い薬物／脂質比において凝集を形成し、沈殿した化合物１を除いて、すべてのＡＴＲ阻害剤が良好な充填効力を示した。
【０１２３】
【表２】
2019505584.tif 000030
【０１２４】
実施例８：リポソームＡＴＲｉのＰＫ試験の一般的説明
図５は、リポソームＡＴＲ阻害剤の血液薬物動態を示すグラフである。ＡＴＲ阻害剤のリポソーム製剤を実施例７に記載したように調製した。リポソームを、３匹の７〜９週齢の雌ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（体重約２５ｇ）に２０ｍｇ薬物／ｋｇの用量で静脈内投与した。０．０８、１．５、４、８及び２４時間の時点で、伏在静脈からの出血により、血液試料をリチウムヘパリン管に収集した。１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって、血漿を細胞画分から分離した。メタノール中の１％酸性酸（１％Ａｃ／ＭｅＯＨ）２００μｌの存在下で、血漿試料を少なくとも２時間、−８０℃でインキュベーションすることにより、薬物を抽出した。血漿タンパク質を、１５０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によってスピンダウンさせた。７５μｌの上清をＨＰＬＣバイアル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ４０１１−ＬＶ１）に移し、さらに７５μｌの１％Ａｃ／ＭｅＯＨを加えた。薬物含量をＨＰＬＣで分析し、各試料を２回測定した。データは、注入後の時間に対してプロットした注入用量（％）として表した。図５に示すように、化合物１、化合物３及び化合物２のリポソーム製剤は、循環器系において不安定であり、リポソーム化合物１及び化合物３は２４時間時点でのＨＰＬＣ分析で検出不能であり、リポソーム化合物２は８時間時点ですでに検出不能であった。２つのリポソーム製剤化合物６及び化合物５は、２４時間後において初期注入用量の１６％を上回っており、循環器系での良好な寿命を有する。以下の表２は、血液ＰＫ曲線をまとめたものである。リポソーム化合物６及び化合物５は、他のリポソームの実施例に比べて最も高い血漿半減期を示す。
【０１２５】
【表３】
2019505584.tif 000031
【０１２６】
実施例９Ａ：マウスの子宮頸癌異種移植片に対するＴＥＡ．ＳＯＳを用いて調製したＬＳ化合物Ａのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効力及び忍容性
図６は、実施例９Ａに記載する、子宮頸部ＭＳ５７１異種移植片モデルにおける、ＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物Ａの抗腫瘍効力を示すグラフである。
【０１２７】
図７は、実施例９Ａに記載する、子宮頸部Ｃ３３Ａ異種移植片モデルにおける、ＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物Ａの抗腫瘍効力を示すグラフである。
【０１２８】
図８は、実施例９Ａによる、子宮頸部Ｃ３３Ａ異種移植片モデルにおける、ＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物Ａの抗腫瘍効力を示すグラフである。
【０１２９】
図９は、実施例９Ａによる、子宮頸部ＭＳ７５１における、ＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物Ａの忍容性を示すグラフである。
【０１３０】
ＭＭ−３９８（リポソームイリノテカン）と併用したＡＴＲ阻害剤化合物Ａ（Ｌｓ化合物Ａ）を充填したリポソームの抗腫瘍効力を、ヒト子宮頸部ＭＳ７５１、Ｃ３３Ａ及びＳｉＨａ細胞株のモデルにおいて試験した。細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、供給元の推奨に従って、１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩を添加したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で増殖させた。ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合性無胸腺雄ヌードマウス（４〜５週齢、少なくとも１６ｇの体重）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスに対し、３０％マトリゲルを添加したＰＢＳ中に懸濁した５×１０６細胞を含有する０．１ｍＬの懸濁液を、右脇腹に皮下接種した。腫瘍が１５０ｍｍ３〜３５０ｍｍ３の大きさに達した時点で、動物を以下の方法に従って処置群に割り当てた。動物を腫瘍サイズによってランク付けし、縮小腫瘍サイズの６つのカテゴリーに分けた。各サイズカテゴリーから１匹の動物を無作為に選択することにより、１０匹の動物／群からなる４つの処置群を形成し、それにより、各処置群においてすべての腫瘍サイズを同等に表現した。
【０１３１】
以下の調製物の４つの尾静脈注射を、７日間の間隔で動物に与えた：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回につき２または５ｍｇ／ｋｇの用量のＭＭ−３９８；３）注射１回につき２０または６０ｍｇ／ｋｇのリポソーム化合物Ａ；４）ＭＭ−３９８、続いて２４時間間隔のリポソーム化合物Ａの注射。注射用リポソームを実施例７に記載したように調製した。動物の体重及び腫瘍サイズを週２回モニタリングした。腫瘍の進行を、最大（長さ）及び最小（幅）軸に沿った腫瘍の触診及びキャリパー測定によって週２回モニタリングした。腫瘍サイズは、式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９７２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）：
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２
を用いて、キャリパー測定により、週２回測定した。
【０１３２】
処置に関連する毒性を評価するために、動物の体重を週２回、測定した。腫瘍接種後、動物を６０日間観察した。群内の腫瘍がマウス体重の１０％に達した時点で、群内の動物を安楽死させた。群全体にわたる平均腫瘍体積を一緒にプロットし、経時的に比較した。図６、７、及び８に示すように、リポソームＡＴＲ阻害剤化合物ＡとＭＭ−３９８の併用は、３つの異種移植片モデルすべてにおいて、ＭＭ−３９８及びリポソーム化合物Ａ単独に比べて、有意に強力な抗腫瘍効果を有する。処置に関連する毒性を、動物の体重の動態によって評価した（図９）。いずれの群も有意な毒性を示さなかった。すべての処置群における動物の体重は対照群と同等であり、一貫して増加していた。したがって、ＡＴＲ阻害剤化合物Ａのリポソーム製剤は、試験した腫瘍モデルにおいて、毒性を顕著に増加させることなく抗腫瘍活性の増加を示した。
【０１３３】
実施例９Ｂ：ＭＭ−３９８イリノテカンリポソームの製造
実施例９Ａ及び本明細書の他の箇所で使用するＭＭ３９８は、多工程プロセスで調製可能なイリノテカンリポソームである。まず、脂質を加熱エタノールに溶解する。脂質は、３：２：０．０１５のモル比で混合したＤＳＰＣ、コレステロール及びＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥを含み得る。好ましくは、リポソームは、３：２：０．０１５のモル比で混合したＤＳＰＣ、コレステロール及びＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥからなるベシクルにイリノテカンスクロースオクタ硫酸（ＳＯＳ）を封入してカプセル化することができる。得られるエタノール−脂質溶液を、溶解した脂質から形成されるベシクル中にカプセル化した置換アミン（アンモニウム型）及びポリアニオンを含有する適切なサイズ（例えば８０〜１２０ｎｍ）の本質的に単層リポソームを形成するのに有効な条件下で、置換アミン及びポリアニオンを含む水性媒体中に分散させる。分散は、例えば、置換アミン及びポリアニオンを含有する水溶液とエタノール脂質溶液とを脂質転移温度、例えば６０〜７０℃を超える温度で混合し、得られる水和脂質懸濁液（多層リポソーム）を１つ以上のトラックエッチングされた、例えばポリカーボネート製の、例えば、５０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍ、または２００ｎｍの規定された孔径を有する膜フィルターを介して圧力下で押し出しすることによって実施することができる。置換アミンは、トリエチルアミン（ＴＥＡ）であることができ、ポリアニオンは、約０．４〜０．５Ｎの濃度で、化学量論比（例えば、ＴＥＡ８ＳＯＳ）で混合したスクロースオクタ硫酸（ＳＯＳ）であることができる。次いで、すべての、または実質的にすべての捕捉されなかったＴＥＡまたはＳＯＳを除去し（例えば、ゲル濾過、透析または限外濾過によって）、その後、リポソームに残留するＴＥＡとの交換でイリノテカンをリポソームに封入可能とするのに有効な条件下でリポソームをイリノテカンと接触させる。この条件は：捕捉されたＴＥＡ−ＳＯＳ溶液の浸透圧を平衡させ、及び／または、充填時の浸透圧によるリポソームの破裂を防止するための浸透圧剤（例えば、５％デキストロース）のリポソーム外部媒体への添加、充填工程中の薬物及び／または脂質の分解を低減するためのｐＨの調整及び／または選択（例えば、６．５への）、ならびにＴＥＡとイリノテカンとの膜間交換を促進するためのリポソーム脂質の転移温度を超える温度への上昇（例えば６０〜７０℃まで）からなる群から選択される１つ以上の条件を含み得る。リポソームを隔てたＴＥＡとの交換によるイリノテカンの充填は、好ましくは、すべての、または実質的にすべてのＴＥＡがリポソームから除去され、それによってリポソームを隔てたその濃度勾配が枯渇するまで続く。好ましくは、イリノテカン対スクロオクタ硫酸のグラム当量比が、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、０．９８、０．９９もしくは１．０（または約０．９〜１．０、０．９５〜１．０、０．９８〜１．０もしくは０．９９〜１．０の範囲）である限り、イリノテカンのリポソーム充填プロセスを継続する。好ましくは、ＴＥＡが、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上がリポソーム内部から除去されるまで、イリノテカンのリポソーム充填プロセスを継続する。イリノテカンは、例えば、イリノテカンとスクロースオクタ硫酸を約８：１のモル比で、リポソーム内にイリノテカンスクロソフェートを形成することができる。次に、ゲル（サイズ排除）クロマトグラフィー、透析、イオン交換、または限外濾過法を用いて、残存するリポソーム外イリノテカン及びＴＥＡを除去して、イリノテカンリポソームを得る。リポソーム外部媒体を、注射可能な薬理学的に許容可能な流体、例えば緩衝化等張性生理食塩水で置換する。最後に、リポソーム組成物を、例えば０．２μｍの濾過によって滅菌し、投与バイアルに分注し、使用時まで、標識し、例えば２〜８℃の冷蔵庫に保存する。リポソーム外部媒体は、残存するリポソーム外イリノテカン及びＴＥＡの除去と同時に、薬理学的に許容可能な流体で置換することができる。組成物のリポソーム外ｐＨは、例えば、約６．５〜８．０のｐＨ、またはその間の任意の適切なｐＨ値（例えば、７．０〜８．０、及び７．２５を含む）で組成物を調製することによって、所望の貯蔵安定性（例えば、４℃での１８０日超の保存中にリポソーム内のリゾＰＣの形成を減少させる）を提供するように調整または選択することができる。
【０１３４】
ＤＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及びＰＥＧ−ＤＳＰＥをそれぞれ３：２：０．０１５のモル比に対応する量（例えば、１２６４ｍｇ／４１２．５ｍｇ／２２．４４ｍｇ）で秤量した。脂質をクロロホルム／メタノール（４／１  ｖ／ｖ）に溶解し、完全に混合し、４つのアリコート（Ａ〜Ｄ）に分割した。回転蒸発器を用いて６０℃で各試料を蒸発乾固させた。減圧下（１８０μトル）、室温で１２時間静置することにより、残留クロロホルムを脂質から除去した。乾燥した脂質を６０℃のエタノールに溶解し、最終アルコール含量が１０％（ｖ／ｖ）になるように、適切な濃度の予熱したＴＥＡ８ＳＯＳを添加した。脂質濃度は７５ｍＭであった。脂質分散液を、Ｌｉｐｅｘ  ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ｃａｎａｄａ）を使用して約６５℃で、２積層０．１μｍポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）に１０回押し出し、一般的な平均直径９５〜１１５ｎｍ（準弾性光散乱によって測定）を有するリポソームを製造した。押し出されたリポソームのｐＨを必要に応じて１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整した。イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの併用により、リポソームを精製した。最初に、ＤＯＷＥＸ  ＩＲＡ９１０樹脂を１Ｎ  ＮａＯＨで処理し、続いて脱イオン水で３回洗浄した後、３Ｎ  ＨＣｌで３回洗浄した後、水で複数回洗浄した。調製した樹脂にリポソームを通し、フローセル導電率計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｓａｌｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて溶出画分の導電率を測定した。導電率が１５μＳ／ｃｍ未満である場合、この画分は、さらなる精製を許容可能であると考えられた。次に、脱イオン水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにリポソーム溶出液をアプライし、回収したリポソーム画分の導電率を測定した（通常１μＳ／ｃｍ未満）。４０％デキストロース溶液を終濃度が５％（ｗ／ｗ）になるように添加し、緩衝液（Ｈｅｐｅｓ）をストック溶液（０．５Ｍ、ｐＨ６．５）から最終濃度１０ｍＭになるように添加することにより、膜間の等張性を達成した。
【０１３５】
各バッチの分析証明書から得られた含水量及び不純物レベルを考慮して、脱イオン水中のイリノテカン・ＨＣｌ三水和物粉末を、１５ｍｇ／ｍＬの無水イリノテカン−ＨＣｌに溶解し、イリノテカンのストック溶液を調製した。薬物充填は、５００ｇ／ｍｏｌのリポソームリン脂質にイリノテカンを添加し、湯浴中で３０分間、６０±０．１℃まで加熱することによって開始した。湯浴から取り出す際に氷冷水に浸すことにより、溶液を急速に冷却した。Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で平衡化及び溶出したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによってリポソーム外の薬物を除去した。Ｂａｒｔｌｅｔｔ法（リン酸塩測定法参照）により、ＨＰＬＣ及びリン酸塩によってイリノテカンに関して、試料を分析した。
【０１３６】
本明細書に記載する貯蔵安定性イリノテカンリポソームの好ましい一実施例は、ＯＮＩＶＹＤＥ（イリノテカンリポソーム注射剤）として市販される製品である。ＯＮＩＶＹＤＥは、静脈内使用のために、イリノテカン塩酸塩三水和物をリポソーム分散液に製剤化したトポイソメラーゼ阻害剤である。ＯＮＩＶＹＤＥは、ゲムシタビンに基づく治療後の、疾患進行後の膵臓の転移性腺癌の治療の必要性を示した。
【０１３７】
ＯＮＩＶＹＤＥは、約７．２５のｐＨを有する貯蔵安定化リポソームである。ＯＮＩＶＹＤＥ製品は、イリノテカン塩酸塩三水和物出発物質から得られたイリノテカンスクロソフェートをリポソームに封入して含有する。イリノテカンの化学名は、（Ｓ）−４，１１−ジエチル−３，４，１２，１４−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−３，１４−ジオキソ１Ｈ−ピラノ［３′，４′：６，７］−インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−９−イル−［１，４′−ビピペリジン］−１′−カルボキシレートである。ＯＮＩＶＹＤＥの用量は、イリノテカンリポソームを調製するために使用するイリノテカン塩酸塩三水和物出発物質の当量に基づいて、またはリポソーム中のイリノテカンの量に基づいて計算することができる。イリノテカン塩酸塩三水和物１グラム当たり約８６６ｍｇのイリノテカンが存在する。例えば、イリノテカン塩酸塩三水和物出発材料の量に基づく８０ｍｇのＯＮＩＶＹＤＥ用量は、最終産物中に実際に約０．８６６×（８０ｍｇ）のイリノテカンを含有する（すなわち、イリノテカン塩酸塩出発物質の重量に基づいて８０ｍｇ／ｍ２の用量のＯＮＩＶＹＤＥは、最終産物中の約７０ｍｇ／ｍ２のイリノテカンと同等である）。ＯＮＩＶＹＤＥは、滅菌された、白色〜わずかに黄色の不透明な等張性リポソーム分散液である。各１０ｍＬの単回用量バイアルは、４３ｍｇのイリノテカン遊離塩基を４．３ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する。リポソームは、直径およそ１１０ｎｍの単層脂質二重層ベシクルであり、イリノテカンを含有する水性空間をスクロースオクタ硫酸塩としてゲル化または沈殿状態で封入する。ベシクルは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）６．８１ｍｇ／ｍＬ、コレステロール２．２２ｍｇ／ｍＬ、及びメトキシ末端ポリエチレングリコール（分子量２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）０．１２ｍｇ／ｍＬからなる。各ｍＬにつき、緩衝液として４．０５ｍｇ／ｍＬの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を、及び等張性試薬として８．４２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムも含有する。ＯＮＩＶＹＤＥの各バイアルは、単回用量バイアル中に、白色〜わずかに黄色の不透明なリポソーム分散液として４３ｍｇ／１０ｍＬのイリノテカン遊離塩基を含有する。
【０１３８】
本発明の一例では、ＯＮＩＶＹＤＥ単位剤形は、リポソームにカプセル化されたある量のイリノテカンを含む医薬組成物であり、８０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン塩酸塩三水和物に等しい量のイリノテカンを提供する総量約７０ｍｇ／ｍ２のイリノテカン、及び約２０％未満のリゾＰＣを提供する。単位剤形は、約５００ｍＬの総容量を有する静脈内製剤であり得る。ＯＮＩＶＹＤＥは、以下のようにバイアルからの等張性リポソーム分散液を希釈することによって投与用に調製される：算出した量のＯＮＩＶＹＤＥをバイアルから回収する。ＯＮＩＶＹＤＥを５００ｍＬの５％デキストロース注射液、ＵＳＰまたは０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰで希釈し、穏やかな転倒混和により希釈溶液を混合し；希釈溶液を光から保護し、室温保存の場合は調製後４時間以内に、または冷蔵条件［２℃〜８℃（３６°Ｆ〜４６°Ｆ）］での保存の場合は調製後２４時間以内に、希釈溶液を投与する。
【０１３９】
ゲムシタビンに基づく治療の後に進行する膵臓の転移性腺癌患者の治療のための、５−フルオロウラシル及びロイコボリンとの併用によるＯＮＩＶＹＤＥ（イリノテカンリポソーム注射）の必要性が示される。ロイコボリンとフルオロウラシルの投与前にＯＮＩＶＹＤＥを投与する。ＯＮＩＶＹＤＥの推奨用量は、２週間ごとに９０分間にわたる静脈内注入によって投与するイリノテカン７０ｍｇ／ｍ２である。ＵＧＴ１Ａ１＊２８対立遺伝子について同型接合であることが既知の患者におけるＯＮＩＶＹＤＥの推奨開始用量は、９０分間にわたる静脈内注入によって投与する５０ｍｇ／ｍ２のイリノテカンである。ＯＮＩＶＹＤＥの用量は、その後のサイクルで許容されるように７０ｍｇ／ｍ２に増加させることができる。血清ビリルビン値が正常値の上限を超えている患者に対しては、ＯＮＩＶＹＤＥの推奨用量は存在しない。ＯＮＩＶＹＤＥを希釈溶液として９０分間にわたって静脈内に注入する。
【０１４０】
適切な治療レジメンとして、ＯＮＩＶＹＤＥ  ７０ｍｇ／ｍ２を、（１＋ｄラセミ体の）ロイコボリン４００ｍｇ／ｍ２（または２００ｍｇ／ｍ２のロイコボリン活性型ｌ）及びフルオロウラシル２，４００ｍｇ／ｍ２とともに、２週ごとに４６時間にわたって（ＯＮＩＶＹＤＥ／５−ＦＵ／ＬＶ；ｎ＝１１７）、ＯＮＩＶＹＤＥ  １００ｍｇ／ｍ２を３週ごとに（ｎ＝１４７）、またはロイコボリン２００ｍｇ／ｍ２及びフルオロウラシル２０００ｍｇ／ｍ２を、１週ごとに２４時間にわたって合計４週間とその後の２週間の休薬期間にわたって（５−ＦＵ／ＬＶ；ｎ＝１３４）が挙げられる。
【０１４１】
実施例１０：ＴＥＡ．ＳＯＳを用いて調製したＬｓ化合物５のマウス肺癌異種移植片に対するｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効力及び忍容性
図１０Ａ及び図１０Ｂは、実施例１０に記載するように、ＮＣＩ−Ｈ２１７０（図１０Ａ）またはＤＭＳ−１１４（図１０Ｂ）マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物５の効力を示すグラフである。
【０１４２】
図１１Ａ及び図１１Ｂは、実施例１０に記載するように、ＮＣＩ−Ｈ２１７０（図１１Ａ）及びＤＭＳ−１１４（図１１Ｂ）マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物５の効力を示すカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。
【０１４３】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２１７０（図１２Ａ）またはＤＭＳ−１１４（図１２Ｂ）マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物５の忍容性を示すグラフである。
【０１４４】
ＡＴＲ阻害剤化合物５とＭＭ−３９８（リポソームイリノテカン）の組合せを充填したリポソームの抗腫瘍効力を、ヒトＮＣＩ−Ｈ２１７０（肺扁平上皮細胞癌）及びＤＭＳ−１１４（小細胞肺癌）肺細胞株のモデルにおいて試験した。
【０１４５】
細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、供給元が推奨するように、１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩を添加したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で増殖させた。ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合性無胸腺雄ヌードマウス（４〜５週齢、少なくとも１６ｇの体重）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスに対し、３０％マトリゲルを添加したＰＢＳ中に懸濁した５×１０６細胞を含有する０．１ｍＬの懸濁液を、右脇腹に皮下接種した。腫瘍が１５０ｍｍ３〜３５０ｍｍ３の大きさに達した時点で、動物を以下の方法に従って処置群に割り当てた。動物を腫瘍サイズによってランク付けし、縮小腫瘍サイズの６つのカテゴリーに分けた。各サイズカテゴリーから１匹の動物を無作為に選択することにより、１０匹の動物／群からなる４つの処置群を形成し、それにより、各処置群においてすべての腫瘍サイズを同等に表現した。以下の調製物の４つの尾静脈注射を、７日間の間隔で動物に与えた：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回につき５ｍｇ／ｋｇの用量のＭＭ−３９８；３）注射１回につき８０ｍｇ／ｋｇのリポソーム化合物５；４）ＭＭ−３９８、続いて２４時間間隔のリポソーム化合物５の注射。注射用リポソームを実施例７に記載したように調製した。ＭＭ−３９８は実施例９Ｂに記載されている。
【０１４６】
動物の体重及び腫瘍サイズを週２回モニタリングした。腫瘍の進行を、最大（長さ）及び最小（幅）軸に沿った腫瘍の触診及びキャリパー測定によって週２回モニタリングした。腫瘍サイズは、式：
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２
を用いて、キャリパー測定により、週２回測定した。
【０１４７】
処置に関連する毒性を評価するために、動物の体重を週２回、測定した。群内の腫瘍がマウス体重の１０％に達した時点で、群内の動物を安楽死させた。群全体にわたる平均腫瘍体積を一緒にプロットし、経時的に比較した。
【０１４８】
図１０Ａ及び１０Ｂ、ならびに図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、両方の肺異種移植片モデルにおいて、リポソームＡＴＲ阻害剤化合物５は、ＭＭ−３９８の抗腫瘍効力を有意に向上させた。リポソームＡＴＲ阻害剤化合物５とＭＭ−３９８の併用処置は、動物の体重に影響を及ぼさなかった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。
【０１４９】
実施例１１：ＭＭ−３９８と併用したリポソーム阻害剤Ｌｓ化合物５及びＬＳ化合物Ａのマウス肺癌異種移植片に対するｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効力の比較
図１３Ａ及び１３Ｂは、Ｃａｌｕ−６（図１３Ａ）またはＣＯＬＯ−６９９（図１３Ｂ）マウス異種移植片モデルにおけるＭＭ−３９８と併用した場合のリポソーム化合物５の効力を示すグラフである。例えば、図１３Ａ及び図１３Ｂ中のデータは、リポソームＡＴＲ阻害剤化合物５が両方のモデルにおいてＭＭ−３９８の抗腫瘍効力を有意に向上させたが、リポソーム中に製剤化した化合物Ａは、ＣＯＬＯ−６９９異種移植片モデルにおいてのみ活性であったことを示している。
【０１５０】
ＡＴＲ阻害剤化合物５とＭＭ−３９８（リポソームイリノテカン）の組合せを充填したリポソームの抗腫瘍効果を、ヒトＣａｌｕ−６及びＣＯＬＯ−６９９肺細胞株の異種移植片モデルにおける化合物Ａのリポソーム製剤と比較した。
【０１５１】
細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、供給元の推奨に従って、１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩を添加したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で増殖させた。ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合性無胸腺雄ヌードマウス（４〜５週齢、少なくとも１６ｇの体重）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスに対し、３０％マトリゲルを添加したＰＢＳ中に懸濁した５×１０６細胞を含有する０．１ｍＬの懸濁液を、右脇腹に皮下接種した。腫瘍が１５０ｍｍ３〜３５０ｍｍ３の大きさに達した時点で、動物を以下の方法に従って処置群に割り当てた。動物を腫瘍サイズによってランク付けし、縮小腫瘍サイズの６つのカテゴリーに分けた。各サイズカテゴリーから１匹の動物を無作為に選択することにより、１０匹の動物／群からなる４つの処置群を形成し、それにより、各処置群においてすべての腫瘍サイズを同等に表現した。以下の調製物の４つの尾静脈注射を、７日間の間隔で動物に与えた：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回につき１０または２０ｍｇ／ｋｇの用量のＭＭ−３９８；３）注射１回につき８０ｍｇ／ｋｇのリポソーム化合物５；４）注射１回につき８０ｍｇ／ｋｇのリポソーム化合物Ａ；５）ＭＭ−３９８、続いて２４時間間隔のリポソーム化合物５の注射。６）ＭＭ−３９８、続いて２４時間間隔のリポソーム化合物Ａの注射。注射用リポソームを実施例７に記載したように調製した。
【０１５２】
動物の体重及び腫瘍サイズを週２回モニタリングした。腫瘍の進行を、最大（長さ）及び最小（幅）軸に沿った腫瘍の触診及びキャリパー測定によって週２回モニタリングした。腫瘍サイズは、式：
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２
を用いて、キャリパー測定により、週２回測定した。
【０１５３】
処置に関連する毒性を評価するために、動物の体重を週２回、測定した。群内の腫瘍がマウス体重の１０％に達した時点で、群内の動物を安楽死させた。群全体にわたる平均腫瘍体積を一緒にプロットし、経時的に比較した。
【０１５４】
実施例１２：遊離型薬物併用スクリーニング試験
図１４Ａは、肺癌細胞株のパネル中の化合物６及び化合物５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単剤療法による細胞殺傷度を示すグラフである。化合物５は、化合物６よりも効力が高く、ＩＣ５０が約３（＝１００．５）倍低い。図１４Ｂは、３つの化学療法剤（カルボプラチン、ゲムシタビン、化合物Ｂ）と併用した場合の、化合物５と化合物６の効果を示すグラフである。この図は、化学療法剤と１μｇ／  ｍｌの化合物６または化合物５との組合せのＩＣ５０をｌｏｇ（μＭ）で比較する。試験したすべての細胞傷害剤及び１つを除くすべての細胞株において、化学療法剤への化合物５の添加は、化合物６よりも強力（より低いＩＣ５０）であった。
【０１５５】
図１５は、Ｓｕｍ１９０ＰＴ細胞株（ＴＮＢＣ）における併用（実施例２＋化合物Ｂ）のＩＣ５０シフトを示すグラフである。
【０１５６】
図１６Ａ及び図１６Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株（ＴＮＢＣ）における実施例２の化合物と化合物Ｂ、それに対して化合物Ａと化合物Ｂの併用のＩＣ５０シフトの比較を示すグラフである。
【０１５７】
培養／治療条件
ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＣｏｒｎｉｎｇカタログ番号３７０７  ３８４ウェル  Ｗｈｉｔｅ  Ｃｌｅａｒ底プレートと共に使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性試験を行った。細胞を３８４ウェルフォーマットでプレーティングし（１０００細胞／ウェル）、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間の時点で単剤治療薬を添加し、次いで３７℃で２４時間インキュベートした。４８時間の時点で、培地中の薬物を除去し、ＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地を添加した。次いで、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。併用試験については、細胞をカルボプラチンまたは化合物Ｂまたはゲムシタビンに２４時間曝露した後、化学療法剤を除去し、細胞を第二の化合物（ＡＴＲ阻害剤）に２４時間曝露した。細胞を新鮮な培地でさらに４８時間培養した。
【化２８】
2019505584.tif 000032
１２０時間の時点で、培地を除去し、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（ＣＴＧ）試薬を添加した（ＰＢＳと１：１の比）。照度計（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｒｅａｄｅｒ）を用いてプレートを読み取った。
【０１５８】
データ分析：
Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ  ＭＡ）を使用して開発された社内アルゴリズムを使用してデータを分析した。要約すると、４つの複製ウェルについて平均ＣＴＧ発光値を計算した。外れ値検出は、変動係数（ＣＶ＞２０％）を計算することにより行い、外れ値は平均値から除外した。対照未処理ウェルに基づいてＣＴＧ値を正規化した。マイクロモル濃度（μＭ）中の薬物濃度を対数変換し、４パラメータのロジスティック曲線にフィッティングした。
【０１５９】
【数１】
2019505584.tif 000033
【０１６０】
（式中、C:薬物濃度、y:正規化したCTG値、a:上部漸近線（最大細胞殺傷度を表す）、b：下部漸近線（0.8〜1.2に限定される）、IC50,slope：ロジスティック曲線勾配。）
【０１６１】
データ品質管理を行い、以下のルールに従って濃度範囲が最適であることを保証した：（１）最低濃度で細胞の７０％超を殺傷する場合、その濃度範囲はあまりにも強力すぎると考えられる（２）最高濃度で細胞の３０％未満しか殺傷しない場合、濃度範囲が低いか、またはその細胞株の耐性が高すぎると考えられる。さらに、Ｒ２を用いて適合度の好適性を評価し、Ｒ２＜０．９の場合、不適合とフラグ付けする。
【０１６２】
ＪＭＰ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、ＮＣ）を用いて統計分析を行い、ｐ＜０．０５ならば有意であるとみなした。
【０１６３】
実施例１３：ＡＴＲ活性測定
基質としてＧＳＴ標識完全長ｐ５３を用いたＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ  ＨＴＲＦアッセイにおける線形の酵素濃度を用いて、キナーゼＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ（ｈ）に対する供給された化合物セットについてＥＣ５０測定を実施した。
【０１６４】
Ｋｍ値１５μＭ以内のＡＴＰ濃度でのＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ（ｈ）の活性を、１０μＭからの片対数希釈による９種類の濃度の化合物で測定した。Ｓｅｒ１５上でのｐ５３のＡＴＲ／ＡＴＲＩＰリン酸化を、ユーロピウム標識抗ホスホＳｅｒ１５  ｐ５３抗体及び抗ＧＳＴ−ｄ２抗体からなるエネルギー移動複合体の形成を介して測定した。すべてのデータ点を、ＤＭＳＯ対照及びＥＤＴＡブランクを用いて二連で実施した。
【０１６５】
ＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ（ｈ）を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、０．０１％のＢｒｉｊ−３５、１％グリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中に予め希釈し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、０．０１％のＢｒｉｊ−３５、１％グリセロール、１０ｍＭのＭｎＣｌ２中で、３０ｎＭのＧＳＴ、ｃＭｙｃ  ｐ５３−（ｈｕ，ＦＬ）を基質として用いてアッセイした。反応は、ＡＴＰを１０μＭの終濃度に到達するまで添加して開始した。
【０１６６】
個々のレプリケートを、ＤＭＳＯ陽性対照活性に対する割合（％）で表した。各阻害剤濃度の平均活性（％対照）を阻害剤濃度に対してプロットし、ＥＣ５０値をＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭを用いて測定した。
【０１６７】
％対照活性として表したデータを阻害剤濃度に対してプロットし、ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭを用いて４パラメータのロジスティックスにフィッティングした。各化合物のグラフを、付随するＥｘｃｅｌレポートのデータとともに示す。化合物の効力の要約を以下に示す。
【０１６８】
【表４】
2019505584.tif 000034
【０１６９】
実施例１４：ＡＴＭ活性の決定
推定されるＩＣ５０値は以下の通りである（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  ＫＩＮＡＳＥＰＲＯＦＩＬＥＲを用いて得られる）：
【０１７０】
【表５】
2019505584.tif 000035
【０１７１】
実施例１５：ウェスタンブロット分析による全ＡＴＲ及びホスホＡＴＲの検出
図１７に示すように：肺癌細胞ＤＭＳ−１１４を、ゲムシタビン［１６ｎＭ］またはＡＴＲ阻害剤（化合物Ａまたは化合物５［１μＭ］）のいずれか単独または組合せにｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露した。１、３、６及び２４時間後に、２％ＳＤＳ含有細胞溶解緩衝液を用いて全細胞タンパク質溶解物を生成し、ウェスタンブロット分析のために全試料を回収し、同時に実行するまでの間、−８０℃で保存した。関心対象の以下のタンパク質及びリンタンパク質を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（以下の方法及び材料の部を参照）から購入した抗体によって検出した：全ＡＴＲ及びリン酸化ＡＴＲ（Ｓ４２８）、ホスホＣＨＫ１（Ｓ３１７及びＳ３４５）、γＨ２ＡＸ、βアクチン。
【０１７２】
図１７の結果：全ＡＴＲ及びホスホＡＴＲシグナルが、２つのＡＴＲ阻害剤（化合物Ａ及び化合物５）のいずれかの添加により強力に低下し、対照またはゲムシタビン単独治療では低下しない（例えば、２４時間でのレーン１、２を、３、４または５、６と比較されたい）。ゲムシタビンに応答して、ホスホＣＨＫ１（Ｓ３１７及びＳ３４５）シグナル伝達は、２４時間にわたって有意に増加する。使用するＡＴＲ阻害剤（化合物Ａまたは化合物５）のいずれかの添加は、ＣＨＫ１のリン酸化シグナルを無効化する。両阻害剤によるＡＴＲタンパク質及び下流ＣＨＫ１シグナル伝達の減少から、両分子の特定のオンターゲット効果が確認される。さらに重要な点として、本発明者らの仮説は、細胞周期の停止及びＤＮＡ損傷の修復につながるはずのＣＨＫ１リン酸化シグナリングによって引き起こされる細胞周期チェックポイントの喪失が、ＤＮＡ損傷の蓄積による細胞死を誘導するということである。ｙＨ２ＡＸシグナルの増加は、毒性の増大及びＤＮＡ損傷の蓄積を測定するための代用として見なすことができる。
【０１７３】
細胞培養
Ｕ２ＯＳ及び他のすべての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を添加した（ＲＰＭＩ）で増殖させた。イメージング及び低速度撮影に適合するＮｕｃＬｉｇｈｔ赤血球株を、Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．によって推奨されるように、レンチウイルス粒子、感染及びピューロマイシン選択プロトコールを使用して生成した。
【０１７４】
抗体及びウェスタンブロット
すべての標的及びリン特異的抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ及び／またはＥｐｉｔｏｍｉｃｓから購入し、１：１０００希釈で使用した。すべての抗体のリストを表６に示す。標準的な抗体に基づくウェスタンブロット及び免疫組織化学プロトコールを使用した。簡潔に述べると、２％ＳＤＳに基づく細胞溶解緩衝液を使用して、ウェスタンブロッティング用の全細胞溶解物を回収した。ＬｉＣｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及び／またはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに関して、二次抗体及び染色プロトコールを購入及びそれに従った。
【０１７５】
【表６】
2019505584.tif 000036
【０１７６】
全細胞溶解プロトコール
細胞を増殖させ、６ｃｍディッシュスケールで処置した。細胞を採取するために、培地を除去し、迅速に氷冷ＰＢＳで置換した。次いでＰＢＳを２５０μＬの２％ＳＤＳ溶解緩衝液に交換した。インキュベーションの５分後、溶解した細胞をこすり落とし、細胞溶解物ホモジナイザー微量遠心分離スピンカラム（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ、Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９６５６）に充填した。次いで、濾液を０．２μｍの遠心フィルターカラム（Ｎａｎｏｓｅｐ  ＭＦ  ０．２＿ｍ、Ｐａｌｌ、カタログ番号ＯＤＭ０２Ｃ３４）上に充填した。次いで、溶解物を−８０℃で保存した。
【０１７７】
２％ＳＤＳを含有する溶解緩衝液（表７）を、Ｓｔｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ，”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，ｎｏ．１２（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００４）：１３９０−１３９６に従って改質した。
【０１７８】
【表７】
2019505584.tif 000037
【０１７９】
実施例１６：広範なキナーゼパネルスクリーニング（３５９）
３５９個のうち、主にヒットしたものは：ＡＬＫ、ＡＲＫ、ｃ−ＭＥＲ、ＣＬＫ１、ＤＹＲＫ、ＧＳＫ３ａ、ＧＳＫ３ｂ、ＦＬＴ２、ＦＬＴ３、ＭＬＫ１、ＳＩＫ２、ＴＮＩＫ、及びＹＳＫ４であった。
【０１８０】
【表８】
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【０１８１】
本発明を、その特定の実施形態に関連して記載しているが、さらなる変更が可能であり、本出願は、一般的に、本発明の原則に従い、本発明の属する技術分野における公知のまたは慣習的な実施の範囲内にあり、本明細書に記載する本質的な特徴に適用し得る本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または適応を包含することを意図していることを理解されたい。
【０１８２】
実施例１７：化合物Ａを比較物質として用いたデータ
様々な濃度の化合物Ａ及びゲムシタビンを併用して、Ｕ２ＯＳ細胞中で細胞死及び増殖アッセイを実施した。その結果を、２つの化合物の併用による細胞増殖及び細胞死の予測と比較した（図１８Ａ）。生存細胞及びアポトーシス細胞の数もまた、ＵＳＯ２細胞中の化合物Ａ（１μＭ）及びゲムシタビン（０．０４μＭ）の設定濃度で測定した（図１８Ｂ）。結果は、化合物Ａとゲムシタビンとの併用が、いずれかの化合物単独よりも細胞死の促進において優れていることを示している。
【０１８３】
化合物Ａはまた、いくつかの肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ５２０及びＮＣＩ−Ｈ５９６）及びＵ２ＯＳ細胞において、それぞれ単独で及びＳＮ３８と併用して、設定濃度（それぞれ１μＭ及び０．２μＭ）で試験し、細胞数を経時的にモニタリングした。この結果は、化合物ＡまたはＳＮ３８のいずれか単独よりも、併用のほうが、細胞数を経時的に維持または減少させるのにより効果的であることを示している（図１９）。
【０１８４】
子宮頸癌細胞株ＭＳ−７５１において、化合物Ａ及びＳＮ３８を併用して、及び単独で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイも実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、いずれかの化合物単独に比べて、併用により、経時的な細胞数の減少を示す（図２０）。
【０１８５】
実施例１８：ゲムシタビンまたはＳＮ３８と併用した化合物Ａ及び化合物５の比較
Ｕ２ＯＳ、Ｈ３５８、及びＡ５４９細胞株内で、化合物Ａまたは化合物５とゲムシタビンとを様々な濃度で組み合わせ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死及び増殖アッセイを実施した。結果は、細胞死を誘発するのに必要とされる各化合物及びゲムシタビンの濃度を示す（図２１Ａ）。化合物５とゲムシタビンまたは化合物Ａとゲムシタビンの設定濃度をＵＳＯ２及びＨ３５８細胞においても同様に試験した。すべての場合において、相対的な細胞増殖は、薬物単独に比べて併用によって低下する（図２１Ｂ〜Ｃ）。
【０１８６】
Ａ５４９細胞内で、化合物Ａまたは化合物５をＳＮ３８と併用した。細胞増殖を、経時的及びある範囲の濃度で測定した。最適化合物／  ＳＮ３８濃度での増殖曲線を強調表示している（図２２Ａ）。化合物Ａ単独または化合物５単独のいずれかをある濃度範囲で用いて、Ａ５４９細胞の相対的な増殖を測定した（図２２Ｂ）。
【０１８７】
様々な濃度の化合物Ａまたは化合物５とともに、設定濃度のゲムシタビンを用いて、いくつかの細胞株においてＩＣ５０値を測定した（図２３）。
【０１８８】
ゲムシタビンまたはＳＮ３８と併用した化合物Ａまたは化合物５に応答する肺癌細胞株の概要を図２４に示す。
【０１８９】
実施例１９：化合物Ａと化合物５のオンターゲット及びオフターゲットでの比較。
様々なＡＴＲ阻害剤を、ＡＴＲ（オンターゲット）及びＡＴＭ（オフターゲット）を阻害する能力について試験した。阻害は、ｎＭにおけるＩＣ５０として報告される（図２５Ａ）。さらなる「オフターゲット」キナーゼを化合物Ａまたは化合物５を用いて同様に試験した（図２５Ｂ）。
【０１９０】
Ａ５４９肺癌細胞（図２６Ａ〜Ｂ）、Ｈ２３肺癌細胞（図２６Ｃ〜Ｄ）、及びＤＭＳ−１１４細胞（図２６Ｅ〜Ｆ）における化合物Ａまたは化合物５を用いて、オンターゲットでの試験を行った。ＡＴＲ阻害の読取り値であるＣＨＫ１  Ｓ３４５リン酸化をウェスタンブロットにより測定した。各化合物は、一定濃度のゲムシタビンとともに同様に用いた。
【０１９１】
ＨＣＣ−７０  ＴＮＢＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  ＴＮＢＣ、及びＤＭＳ−１１４細胞株に対し、さらなるオンターゲット試験を行った。ある範囲の化合物Ａまたは化合物５濃度とともにＳＮ３８の設定濃度を使用した。様々なオンターゲット活性パラメータをウェスタンブロットにより試験し、測定した（図２７Ａ〜Ｂ）。
【０１９２】
ＳＮ３８及び化合物Ａまたは化合物５の添加の２４時間後に、ＳＵＭ１４９細胞の細胞周期特性を決定した（図２８）。薬物を併用して与えた場合、対照に比べてより多くの割合の細胞がＧ２期で停止する。
【０１９３】
実施例２０：ＭＭ３９８と併用した化合物Ａ及び化合物５のリポソーム製剤の比較
ＤＭＳ−１１４肺異種移植片モデルを使用して、ＭＭ３９８と併用したＬｓ化合物ＡまたはＬｓ化合物５の効果を測定した。２つの異なる用量の化合物Ａまたは化合物５（２０ｍｐｋまたは８０ｍｐｋ）とともに設定用量のＭＭ３９８（５ｍｐｋ）を使用した。ＣＨＫ１  Ｓ３４５リン酸化のレベルを測定することによって、治療効果をアッセイした（図２９）。
【０１９４】
ＭＭ３９８存在下でのＬｓ化合物Ａの効果もＳＵＭ−１４９細胞株において試験した。ＲＰＡ２、ＤＮＡＰＫ、ＣＨＫ１、及びγＨ２ＡＸのリン酸化レベルを測定することによって、治療効果をアッセイした。Ｌｓ化合物５はまた、ＭＭ３９８と併用しない場合も試験した（図３０Ａ〜Ｃ）。
【０１９５】
実施例２１：マウスにおける三種陰性乳癌異種移植片に対するＴＥＡ．ＳＯＳを用いて調製したＬｓ化合物５のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効力及び忍容性
ＭＭ−３９８（リポソームイリノテカン）と併用したＡＴＲ阻害剤化合物５を充填したリポソームの抗腫瘍効力を、ヒトＳＵＭ−１４９（三種陰性乳癌）細胞株のモデルにおいて試験した。
【０１９６】
細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、供給元の推奨に従って、１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩を添加したＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で増殖させた。ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕホモ接合性無胸腺雄ヌードマウス（４〜５週齢、少なくとも１６ｇの体重）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。マウスに対し、３０％マトリゲルを添加したＰＢＳ中に懸濁した１０７細胞を含有する０．１ｍＬの懸濁液を、右脇腹に皮下接種した。腫瘍が１５０ｍｍ３〜３５０ｍｍ３の大きさに達した時点で、動物を以下の方法に従って処置群に割り当てた。動物を腫瘍サイズによってランク付けし、縮小腫瘍サイズの６つのカテゴリーに分けた。各サイズカテゴリーから１匹の動物を無作為に選択することにより、１０匹の動物／群からなる４つの処置群を形成し、それにより、各処置群においてすべての腫瘍サイズを同等に表現した。以下の調製物の５つの尾静脈注射を、７日間の間隔で動物に与えた：１）対照（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水ｐＨ６．５）；２）注射１回につき５ｍｇ／ｋｇの用量のＭＭ−３９８；３）注射１回につき８０ｍｇ／ｋｇのリポソーム化合物５；４）ＭＭ−３９８、続いて２４時間間隔のリポソーム化合物５の注射；５））ＭＭ−３９８、続いてカプセル化していない遊離のＡＴＲ阻害剤化合物Ａの注射。注射用リポソームを実施例１０に記載したように調製した。
【０１９７】
動物の体重及び腫瘍サイズを週２回モニタリングした。腫瘍の進行を、最大（長さ）及び最小（幅）軸に沿った腫瘍の触診及びキャリパー測定によって週２回モニタリングした。腫瘍サイズは、式：
腫瘍体積＝［（長さ）×（幅）２］／２
を用いて、キャリパー測定により、週２回測定した。
【０１９８】
処置に関連する毒性を評価するために、動物の体重を週２回、測定した。群内の腫瘍がマウス体重の１０％に達した時点で、群内の動物を安楽死させた。群全体にわたる平均腫瘍体積を一緒にプロットし、経時的に比較した。
【０１９９】
図３１に示すように、リポソームＡＴＲ阻害剤化合物５は、異種移植片モデルにおいて、ＭＭ−３９８の抗腫瘍効力を有意に向上させた。リポソーム化合物ＡとＭＭ−３９８の併用治療は、動物の体重に影響を及ぼさなかった（図３２）。
【０２００】
実施例２２：細胞株特性及びＩｎｃｕｃｙｔｅデータとの比較
ＤＮＡ損傷経路に関与する様々なタンパク質について、蛍光標識した細胞株パネルを特性決定した。がん細胞の親株に、ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄレンチウイルスで形質導入し、ピューロマイシンで選択した。基底タンパク質レベルを測定し、ウェスタンブロット分析によって定量化した。定量化を実施した際、ＰＤマーカーシグナルをβアクチンシグナルに対して正規化した。タンパク質レベルは、化合物５に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞応答及び化学療法併用処置の尺度である細胞株の「積分スコア」と相関していた。積分スコアは以下のように計算することができる：
【０２０１】
図３３及び３４に示すように、９６ウェルプレートに細胞株を播種し、各ウェルを化合物５の投与マトリックス及び化学療法に４日間曝露した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイを用いて動的細胞生存率を測定した。用量マトリックス中の各薬剤の組合せについて、用量組合せ特異的積分スコアを、正規化した細胞増殖曲線下面積を合計することによって計算した。用量マトリックス上の４つの最大スコアを平均することによって、細胞株特異的積分スコアを計算した。
【０２０２】
図３５及び３６に示すように、化合物５及びＳＮ３８に曝露した肺癌細胞株において、基底ＭＲＥ１１タンパク質レベル及び基底ＡＴＭレベルの両方が、細胞株の積分スコアと有意に相関していることが観察された。ｐ５３機能障害性バックグラウンドを有し、化合物５及びＳＮ３８に曝露した肺癌細胞において、積分スコアは、ＮＢＳ、ＭＲＥ１１及びＲＡＤ５０タンパク質レベルと相関する。「機能障害性ｐ５３」細胞は、ゼロではない基底ｐ５３タンパク質レベルを有する細胞である（ほとんどの細胞において、ｐ５３レベルは、処置後にウェスタンブロットでのみ見ることができる）。（図３７、図３８及び図３９参照）。
【０２０３】
実施例２３：シグナル伝達実験：ＳＮ３８と併用した、化合物５対化合物Ａ：６つの異なるＰＤマーカー
図４０〜４４に示すように：ＳＮ３８と併用した様々な用量の化合物５または化合物Ａにがん細胞株を曝露した後、ウェスタンブロットによって薬力学的マーカーｐＣｈｋ１、ｐＲＰＡ２、ｐＡＴＲ、ｐＤＮＡＰＫ、ｐＣｈｋ２及びγＨ２ＡＸを定量化した。ＨＣＣ７０、ＤＭＳ１１４、ＭＤＡＭＢ４６８、ＮＣＩＨ１２９９及びＮＣＩＨ４６０細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした後、ＳＮ３８及び／またはＡＴＲ阻害剤に曝露した。薬物曝露の２４時間後、細胞をウェスタンブロッティング用に溶解した。定量化を行った際、ＰＤマーカーシグナルをβアクチンシグナルに対して正規化した。
【０２０４】
実施例２４：シグナル伝達実験：ゲムシタビンと併用した、化合物５対化合物Ａ：３つの異なるＰＤマーカー
図４５〜５０に示すように：ＡＴＲ阻害剤及び／またはゲムシタビンに曝露した後のＤＮＡ損傷経路に関与する様々なタンパク質について、６つの蛍光標識した細胞株を特性決定した。がん細胞の親株に、ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄレンチウイルスで形質導入し、ピューロマイシンで選択した。１６ｎＭのゲムシタビンと併用した様々な用量の化合物５または化合物Ａにがん細胞株を曝露した後、薬力学的マーカーｐＣｈｋ１、ｐＡＴＲ及びγＨ２ＡＸをウェスタンブロットによって定量化した。Ａ５４９、ＮＣＩＨ２３、ＤＭＳ１１４、Ｕ２０Ｓ、ＨＣＣ８２７及びＮＣＩＨ４６０細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした後、ＳＮ３８及び／またはＡＴＲ阻害剤に曝露した。薬物曝露の６時間または１８時間後、細胞をウェスタンブロッティング用に溶解した。定量化を行った際、ＰＤマーカーシグナルをβアクチンシグナルに対して正規化した。
【図１】
2019505584.tif 000045
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019505584.tif 000049
【図６】
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【図７】
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【図８】
2019505584.tif 000052
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019505584.tif 000057
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2019505584.tif 000062
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
2019505584.tif 000074
【図２６Ｂ】
2019505584.tif 000075
【図２６Ｃ】
2019505584.tif 000076
【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
2019505584.tif 000078
【図２６Ｆ】
2019505584.tif 000079
【図２７Ａ】
2019505584.tif 000080
【図２７Ｂ】
2019505584.tif 000081
【図２８】
2019505584.tif 000082
【図２９】
2019505584.tif 000083
【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
2019505584.tif 000097
【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４１Ｅ】
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【図４１Ｆ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４２Ｆ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４３Ｆ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４４Ｆ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【国際調査報告】
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