【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年1月31日(2007.1.31)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ＥＧＦＲインヒビター薬物に応答性の遺伝子発現マーカー
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本願は、米国仮出願番号６０／４４５，９６８（２００３年２月６日出願）の出願日の、米国特許法１１９（ｅ）の下の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、治療用ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置に対する候補である患者から得られた組織サンプルの遺伝子発現プロファイリングに関する。より具体的には、本発明は、パラフィン包埋された、固定癌組織サンプルにおける遺伝子発現の分子特徴づけに基づく方法を提供し、この方法は、患者が、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置に十分に応答性である可能性があるかどうかを医師が予測することを可能にする。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
癌専門医は、「治療の標準」として特徴付けられる化学療法剤、および特定の癌についてのラベル・クレイムを有さないが、その癌における有効性の証拠がある多数の薬物の種々の組み合わせを含む、癌に利用可能な多数の処置の選択肢を有する。良好な処置結果の最良の可能性は、患者が、最適な利用可能な癌処置に割り当てられ、そして、この割り当てが、診断後、可能な限り早くなされることを必要とする。
【０００４】
現在、臨床実務において使用される診断試験は、単一の検体であり、従って、数十の異なるマーカー間の公知の関係性の潜在的な価値を捕らえない。さらに、診断試験は、免疫組織化学に依存して、しばしば定量的ではない。この方法は、しばしば、部分的には、試薬が規準化されていないこと、そして、部分的には、解釈が主観的であり、容易に定量化され得ないことに起因して、異なる実験室において異なる結果を生じる。ＲＮＡベースの試験は、しばしば用いられるわけではない。これは、経時的なＲＮＡ分解の問題、および、分析のために、患者から新鮮な組織サンプルを得ることが困難であるという事実によるものである。固定されたパラフィン包埋組織は、より容易に利用可能である。固定された組織は、インサイチュハイブリダイゼーションによるＲＮＡの非定量的検出のために、慣用的に使用されている。しかし、近年の方法は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、固定された組織におけるＲＮＡを定量するために確立されている。この技術プラットフォームはまた、複数分析物のアッセイのための基礎を形成し得る。
【０００５】
近年、いくつかのグループが、マイクロアレイ遺伝子発現分析による、種々の癌の型の分類に関する研究を発表している（例えば、Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１−５３７（１９９９）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅ  ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１３７９０−１３７９５（２００１）；Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３１６−Ｓ３２２（２００１）；Ｒａｍａｓｗａｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１５１４９−１５１５４（２００１）を参照のこと）。遺伝子発現パターンに基づくヒト乳癌の特定の分類がまた報告されている（Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２２３２−２２３８  （２０００）；Ｗｅｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１４６２−１１４６７（２００１）；Ｓｏｒｌｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１０８６９−１０８７４（２００１）；Ｙａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８３７５−８３８０（２００１））。しかし、これらの研究のほとんどが、種々の型の癌（乳癌を含む）のすでに確立された分類を改善すること、および洗練することに焦点を当てており、そして、一般には、癌治療の臨床的結果を改善するために、この知見を治療ストラテジーにリンクさせない。
【０００６】
現代の分子生物学および生化学が、その活動が、わずかな例外を含めて、腫瘍細胞の挙動、その分化の状態および特定の治療薬に対するその感受性もしくは抵抗性に影響を及ぼす、数百の遺伝子を明らかにしているが、これらの遺伝子の状態は、薬物療法についての臨床的な決定を慣用的になすために活用されてはいない。１つの顕著な例外は、抗エストロゲン薬物（例えば、タモキシフェン）を用いる処置に対して患者を選択するための、乳癌におけるエストロゲンレセプター（ＥＲ）タンパク質発現の使用である。別の例外的な例は、Ｈｅｒ２アンタゴニスト薬物であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて患者を選択するための、乳癌におけるＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）タンパク質発現の使用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年の進歩にも関わらず、癌の処置における主要な課題は、特定の処置レジメンを、病理学的に異なる腫瘍型に標的化し、最終的には、結果を最適化するために、腫瘍の処置を個別化することに残ったままである。従って、種々の処置選択肢に対する患者の応答についての予測的な情報を同時に提供する試験に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ＥＧＦＲインヒビターを用いた処置に応答したか、または応答しなかった、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するヒト患者から得た組織サンプルにおける遺伝子発現の第ＩＩ相臨床治験の知見に基づく。
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置に対する候補である患者が、このような処置に応答する可能性を予測するための方法に関し、この方法は、患者から得た癌組織サンプルにおける１つ以上の予後のＲＮＡ転写物もしくはその発現産物の発現レベルを決定する工程を包含し、ここで、予後の転写物は、以下：
ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＷＩＳＰ１、ＣＫＡＰ４、ＦＧＦＲ１、ｃｄｃ２５Ａ、ＲＡＳＳＦ１、Ｇ−カテニン、Ｈ２ＡＦＺ、ＮＭＥ１、ＮＲＧ１、ＢＣｌ２、ＴＡＧＬＮ、ＹＢ−１、Ｓｒｃ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ４４、ＤＩＡＢＬＯ、ＴＩＭＰ２、ＡＲＥＧ、ＰＤＧＦＲａ、ＣＴＳＢ、ヘプシン、ＥｒｂＢ３、ＭＴＡ１、ＧｕｓおよびＶＥＧＦ
からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の転写物であり、ここで、（ａ）ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＷＩＳＰ１、ＣＫＡＰ４、ＦＧＦＲ１、ｃｄｃ２５Ａ、ＲＡＳＳＦ１、Ｇ−カテニン、Ｈ２ＡＦＺ、ＮＭＥ１、ＮＲＧ１、ＢＣｌ２、ＴＡＧＬＮ、ＹＢ１、Ｓｒｃ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ４４、ＤＩＡＢＬＯ、ＴＩＭＰ２、ＡＲＥＧ、ＰＤＧＦＲａおよびＣＴＳＢの１つ以上の転写物、または対応する発現産物の過剰発現は、患者が、処置に対して十分に応答性である可能性がないことを示し、そして、（ｂ）ヘプシン、ＥｒｂＢ３、ＭＴＡ、ＧｕｓおよびＶＥＧＦの１つ以上の転写物、または対応する発現産物の過剰発現は、患者が、処置に対して十分に応答性である可能性を示している。
【００１０】
この組織サンプルは、好ましくは、固定され、パラフィン包埋された組織である。組織は、細針生検、吸引生検、気管支洗浄生検または経気管支的生検を含む種々の方法によって得られ得る。
【００１１】
特定の実施形態において、予後のＲＮＡ転写物の発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。この場合、そして、組織サンプルが、固定され、かつパラフィン包埋されている場合、ＲＴ−ＰＣＲアンプリコン（ＰＣＲプライマーにより補われるポリヌクレオチド配列として規定される）が、好ましくは、１００塩基長未満であるべきである。他の実施形態において、予後のＲＮＡ転写物の発現産物は、当該分野で公知の他の方法（例えば、免疫組織化学またはプロテオミクス技術）により決定される。予後のＲＮＡ転写物またはその発現産物を測定するためのアッセイは、キット形式で利用可能であり得る。
【００１２】
別の局面において、本発明は、固体表面上に固定された、以下の遺伝子：
ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＷＩＳＰ１、ＣＫＡＰ４、ＦＧＦＲ１、ｃｄｃ２５Ａ、ＲＡＳＳＦ１、Ｇ−カテニン、Ｈ２ＡＦＺ、ＮＭＥ１、ＮＲＧ１、ＢＣｌ２、ＴＡＧＬＮ、ＹＢ１、Ｓｒｃ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ４４、ＤＩＡＢＬＯ、ＴＩＭＰ２、ＡＲＥＧ、ＰＤＧＦｒＡ、ＣＴＳＢ、ヘプシン、ＥｒｂＢ３、ＭＴＡ、ＧｕｓおよびＶＥＧＦ
の１つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドであり得る。ｃＤＮＡは、代表的には、約５００塩基長〜５０００塩基長であり、一方で、オリゴヌクレオチドは、代表的には、約２０塩基長〜８０塩基長である。アレイは、非常に多数のｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド（例えば、約３３０，０００までのオリゴヌクレオチド）を含み得る。アレイを提示する固体表面は、たとえば、ガラスであり得る。遺伝子転写物の産物のレベルは、当該分野で公知の任意の技術（例えば、免疫組織化学またはプロテオミクスを含む）により測定され得る。
【００１３】
種々の実施形態において、アレイは、上に列挙された遺伝子のうち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、または少なくとも２７にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行なわれる。
【００１４】
本発明はさらに、患者のための個別化されたゲノムプロフィールを調製する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得た癌組織から抽出したＲＮＡを、遺伝子発現分析に供する工程；
（ｂ）ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＷＩＳＰ１、ＣＫＡＰ４、ＦＧＦｒ１、ｃｄｃ２５Ａ、ＲＡＳＳＦ１、Ｇ−カテニン、Ｈ２ＡＦＺ、ＮＭＥ１、ＮＲＧ１、ＢＣｌ２、ＴＡＧＬＮ、ＹＢ１、Ｓｒｃ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ４４、ＤＩＡＢＬＯ、ＴＩＭＰ２、ＡＲＥＧ、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＴＳＢ、ヘプシン、ＥｒｂＢ３、ＭＴＡ、ＧｕｓおよびＶＥＧＦ
からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の、組織における発現レベルを決定する工程であって、この発現レベルは、コントロール遺伝子に対して規準化され、かつ、必要に応じて、対応する癌参照組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｃ）上記遺伝子発現分析により得られたデータを要約するレポートを作製する工程。
【００１５】
本発明はさらに、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＷＩＳＰ１、ＣＫＡＰ４、ＦＧＦｒ１、ｃｄｃ２５Ａ、ＲＡＳＳＦ１、Ｇ−カテニン、Ｈ２ＡＦＺ、ＮＭＥ１、ＮＲＧ１、ＢＣｌ２、ＴＡＧＬＮ、ＹＢ１、Ｓｒｃ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ４４、ＤＩＡＢＬＯ、ＴＩＭＰ２、ＡＲＥＧ、ＰＤＧＦＲＡ、ＣＴＳＢ、ヘプシン、ＥｒｂＢ３、ＭＴＡ、ＧｕｓおよびＶＥＧＦからなる群より選択される遺伝子の、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のための方法に関し、この方法は、表３に列挙される対応するアンプリコン、および、表４に列挙される対応するプライマー−プローブセットを使用することによって、上記ＰＣＲを実施する工程を包含する。
【００１６】
本発明はさらに、表４に列挙される任意のＰＣＲプライマー−プローブセット、および表３に列挙される任意のＰＣＲアンプリコンを包含する。
【００１７】
なお別の局面において、本発明は、予後の方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得た癌細胞を含むサンプルを、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＷＩＳＰ１、ＣＫＡＰ４、ＦＧＦＲ１、ｃｄｃ２５Ａ、ＲＡＳＳＦ１、Ｇ−カテニン、Ｈ２ＡＦＺ、ＮＭＥ１、ＮＲＧ１、ＢＣｌ２、ＴＡＧＬＮ、ＹＢ１、Ｓｒｃ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ４４、ＤＩＡＢＬＯ、ＴＩＭＰ２、ＡＲＥＧ、ＰＤＧＦＲａおよびＣＴＳＢからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子のＲＮＡ転写物、またはその生成物の発現レベルの定量的分析に供する工程；ならびに
（ｂ）上記遺伝子またはその生成物の規準化された発現レベルが、規定された発現閾値を上回って上昇する場合に、患者を、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置に十分に応答する減少した可能性を有する可能性があるとして同定する工程。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は、予後の方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得た癌細胞を含むサンプルを、ヘプシン、ＥｒｂＢ３、ＭＴＡ、ＧｕｓおよびＶＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子のＲＮＡ転写物、またはその生成物の発現レベルの定量的分析に供する工程；ならびに
（ｂ）上記遺伝子またはその生成物の規準化された発現レベルが、規定された発現閾値を上回って上昇する場合に、患者を、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置に十分に応答する増加した可能性を有する可能性があるとして同定する工程。
【００１９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）は、本願において使用される用語の多くに対して、一般的なガイドを当業者に提供する。
【００２０】
当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書中に記載されるものと類似もしくは等価な多くの方法および物質を理解する。実際、本発明は、記載される方法および物質に決して限定されない。本発明の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
【００２１】
用語「マイクロアレイ」とは、ハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくは、ポリヌクレオチドプローブの、基板上の秩序化された配置をいう。
【００２２】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形または複数形で使用される場合、一般に、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または、修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例えば、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドとしては、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖であっても、代表的には、二本鎖であっても、または、一本鎖領域および二本鎖領域を含んでいてもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子由来であっても、異なる分子由来であってもよい。この領域は、１つ以上の分子の全てを含み得るが、より代表的には、分子のいくつかの領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、具体的には、ｃＤＮＡを含む。この用語は、１つ以上の修飾された塩基を含む、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを包含する。従って、安定性のため、または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書中で意図される「ポリヌクレオチド」である。さらに、異常な塩基（例えば、イノシン）もしくは修飾された塩基（例えば、トリチウム化された塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で定義されるような用語「ポリヌクレオチド」の範囲内に包含される。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、未修飾のポリヌクレオチドの、あらゆる化学的、酵素的および／または代謝的に修飾された形態、ならびに、単細胞および複合細胞を含む、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００２３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチドをいい、この例としては、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖リボヌクレオチドまたは二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置を使用して、化学的な方法により合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、インビトロでの組換えＤＮＡ媒介技術、および細胞および生物体におけるＤＮＡの発現による方法を含む、種々の他の方法によって作製され得る。
【００２４】
交換可能に使用される用語「差次的に発現した遺伝子」、「差次的な遺伝子発現」およびその類義語は、その発現が、正常な被験体もしくはコントロールの被験体におけるその発現と比較して、疾患（特に、乳癌のような癌）を罹患する被験体においてより高いレベルもしくはより低いレベルまで活性化される遺伝子を指す。この用語はまた、同じ疾患の異なるステージにおいて、その発現がより高いレベルまたはより低いレベルまで活性化される遺伝子を含む。差次的に発現した遺伝子は、核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化もしくは阻害され得るか、または、異なるポリペプチド生成物を生じる選択的スプライシングに供され得る。このような差は、例えば、ｍＲＮＡレベル、表面発現、ポリペプチドの分泌または他の群分離における変化により証明され得る。差次的な遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物間の発現の比較、または、２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物間の発現率の比較、または、同じ遺伝子の２つの別個にプロセシングされた産物の比較さえも含み得、正常な被験体と疾患（特に癌）を罹患する被験体との間、または同じ疾患の種々のステージ間で異なる。差次的な発現は、例えば、正常細胞および疾患細胞の間、または、異なる疾患事象もしくは疾患ステージを経験した細胞間での、遺伝子もしくはその発現産物における、一時的なもしくは細胞の発現パターンにおける、定量的および定性的の両方の差を含む。本発明の目的について、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍の、正常な被験体および疾患を罹患した被験体における、または、疾患を罹患した被験体における疾患の発生の種々のステージにおける、所定の遺伝子の発現の間の差が存在する場合に、「差次的な遺伝子発現」が存在すると考えられる。
【００２５】
ＲＮＡ転写物に関する用語「過剰発現」は、検体もしくは特定のｍＲＮＡ参照セットにおいて測定された全ての転写物であり得る、参照ｍＲＮＡのレベルに対する規準化によって決定される転写物のレベルをいうために使用される。
【００２６】
句「遺伝子増幅」とは、複数コピーの遺伝子もしくは遺伝子フラグメントが特定の細胞または細胞株において形成されるプロセスをさす。重複する領域（増幅されたＤＮＡのストレッチ）はしばしば、「アンプリコン」と呼ばれる。通常、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量（すなわち、遺伝子の発現レベル）はまた、発現される特定の遺伝子から構成されるコピーの数の割合を増加させる。
【００２７】
用語「診断」は、本明細書において、癌に起因する死もしくは進行（非小細胞肺癌または頭頸部癌のような腫瘍性疾患の再発、転移速度および薬物耐性を含む）の可能性の予測を指すために使用される。用語「予測」は、本明細書において、患者が、薬物もしくは薬物のセットに対して有利に応答するか、不利に応答するかのいずれかである可能性、そしてまた、これらの応答の程度、または、原発性腫瘍の外科的除去および／もしくは癌の再発がない特定の期間に間の化学療法の後に、患者が生存する可能性を指すために使用される。本発明の予測方法は、任意の特定の患者に対する最も適切な処置様式を選択することによって、処置決定をなすために、臨床的に使用され得る。本発明の予測方法は、患者が、外科的介入、所定の薬物もしくは薬物の組み合わせを用いる化学療法、および／または放射線療法のような処置レジメンに有利に応答する可能性があるかどうか、あるいは、外科的手術の後および／または化学療法もしくは他の処置様式の終了後に、患者が長期生存する可能性があるかどうかを予測する際に、役立つツールである。
【００２８】
用語「長期」生存は、本明細書において、外科的手術または他の処置の後、少なくとも１年間、より好ましくは少なくとも２年間、最も好ましくは、少なくとも５年間の生存を指すために使用される。
【００２９】
特定の薬物もしくは処置の選択肢に対する用語「増加した耐性」とは、本発明に従って使用される場合、標準的な用量の薬物または標準的な処置プロトコールに対する減少した応答を意味する。
【００３０】
特定の薬物もしくは処置の選択肢に対する用語「減少した感受性」とは、本発明に従って使用される場合、標準的な用量の薬物または標準的な処置プロトコールに対する減少した応答を意味し、この減少した応答は、薬物の用量または処置の強度を増加することによって、（少なくとも部分的に）補償され得る。
【００３１】
「患者の応答」とは、患者に対する利益を示す任意のエンドポイントを用いて評価され得、このエンドポイントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）腫瘍増殖のある程度の阻害（減速および完全な増殖の停止を含む）；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの減少；（４）腫瘍細胞の隣接する末梢器官および／または組織への浸潤の阻害（すなわち、減少、減速または完全な停止）；（５）転移の阻害（すなわち、減少、減速または完全な停止）；（６）必ずしもそうでなければならないわけではないが、腫瘍の退行もしくは拒絶を生じ得る、抗腫瘍免疫応答の増強；（７）腫瘍に関連する１つ以上の症状のある程度の軽減；（８）処置後の生存の長さの増加；ならびに／あるいは（９）処置後の所定の時点における死亡率の減少。
【００３２】
用語「処置」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）措置または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指し、その目的は、標的化された病理学的状態もしくは障害を回避または減速（減少）することである。処置を必要とする個体としては、既に障害を有する個体、ならびに、障害を有する傾向がある個体、または、障害が防止されるべき個体が挙げられる。腫瘍（例えば、癌）の処置において、治療剤は、腫瘍細胞の病理を直接減少させるか、または、腫瘍細胞を、他の治療剤（例えば、照射および／または化学療法）による処置により感受性にし得る。
【００３３】
用語「腫瘍」は、本明細書中で使用される場合、悪性であれ、良性であれ、全ての腫瘍性細胞、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を指す。
【００３４】
用語「癌」および「癌性」は、代表的に未制御の細胞増殖により特徴付けられる様式の生理学的状態を指すか、または、記載する。癌の例としては、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、および脳腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３５】
癌の「病理」は、患者の福祉を含む全ての現象を含む。これとしては、異常なもしくは制御不能な細胞増殖、転移、隣接する細胞の正常な機能との干渉、サイトカインもしくは他の分泌生成物の異常なレベルでの放出、炎症性応答もしくは免疫学的応答の抑制もしくは悪化、新生物、前癌性、悪性、周囲もしくは遠隔の組織もしくは器官（例えば、リンパ節）の侵襲が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
用語「ＥＧＦＲインヒビター」は、本明細書中で使用される場合、生来の上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の生物学的機能を阻害する能力を有する分子を指す。従って、用語「インヒビター」は、ＥＧＦＲの生物学的役割の文脈において規定される。本明細書における好ましいインヒビターは、ＥＧＦＲと特異的に相互作用（例えば、結合）するが、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の他のメンバーと相互作用することによってＥＧＦＲの生物学的活性を阻害する分子はまた、この定義内に具体的に包含される。ＥＧＦＲインヒビターにより阻害される好ましいＥＧＦＲの生物学的活性は、腫瘍の発生、増殖または広がりに関連する。ＥＧＦＲインヒビターとしては、非ペプチド低分子、抗体、抗体フラグメント、アンチセンス分子およびオリゴヌクレオチドデコイが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般に、プローブの長さ、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な推測である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方で、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、その溶解温度下の環境中に相補鎖が存在する場合、変性したＤＮＡを再びアニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度がより高ければ、使用され得る相対温度がより高くなる。結果として、より高い相対温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度は、反応条件をより低いストリンジェントにする傾向がある。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。
【００３８】
本明細書中で定義される場合、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシーの条件」とは、代表的には：（１）洗浄のための低いイオン強度および高温（例えば、５０℃において、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム）を使用するか；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤（例えば、ホルムアミド）（例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％  ウシ血清アルブミン／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％  ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）＋７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）を使用するか；または、（３）４２℃において、５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄ液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳおよび１０％  デキストランサルフェートを使用し、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で洗浄し、５５℃において５０％ホルムアミドを使用し、その後、５５℃において、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣを含む高ストリンジェンシーの洗浄を行なう。
【００３９】
「中程度にストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９により記載されるように同定され得、そして、上記のものよりもストリンジェントが低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  トリクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄ溶液、１０％  デキストランサルフェートおよび２０ｍｇ／ｍｌ  変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、３７℃における一晩のインキュベーションと、その後の、約３７℃〜５０℃における１×ＳＳＣにおけるフィルターの洗浄である。当業者は、必要に応じて、プローブ長などのような因子に適応させるための、温度、イオン強度などの調節方法を理解する。本発明の文脈において、任意の特定の遺伝子セットにおいて列挙される遺伝子の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」などに対する参照は、列挙される遺伝子のいずれか１つ、もしくはいずれか、および全ての組み合わせを意味する。
【００４０】
用語「発現閾値」および「規定された発現閾値」は交換可能に使用され、遺伝子産物が、癌の再発を伴うことなく、患者の生存についての予測マーカーとして機能する、上記の当該遺伝子産物のレベルを指す。閾値は、以下の実施例に記載されるもののような、臨床治験から実験的に規定される。発現閾値は、最大感受性、または、最大選択性、または、最小誤差のいずれかについて選択され得る。任意の状況についての発現閾値の決定は、十分に当業者の知識の範囲内である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（Ｂ．詳細な説明）
他に示されない限り、本発明の実施は、当該分野の技術範囲内の、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来技術を用いる。このような技術は、例えば、以下の文献において完全に説明されている：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９８７）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）。
【００４２】
（１．遺伝子発現プロファイリング）
一般に、遺伝子発現プロファイリングの方法は、２つの大きな群：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法に分けられ得る。最も一般的に使用される、サンプルにおけるｍＲＮＡ発現の定量のための当該分野で公知の方法としては、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３（１９９９））；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２−８５４（１９９２））；および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２））が挙げられる。あるいは、特異的な二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が、使用され得る。配列決定ベースの遺伝子発現分析のための代表的な方法としては、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）および大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）が挙げられる。
【００４３】
（２．逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
上記の技術のうち、最も感度が高く、かつ最も柔軟な定量方法は、ＲＴ−ＰＣＲであり、これは、薬物処置を行なったかまたは行なっていない、正常組織および腫瘍組織において、異なるサンプル集団におけるｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現のパターンを特徴付け、密接に関連するｍＲＮＡ間を区別し、そして、ＲＮＡ構造を分析するために使用され得る。
【００４４】
第１の工程は、標的サンプルからのｍＲＮＡの単離である。出発物質は代表的には、それぞれ、ヒト腫瘍もしくは腫瘍細胞株、および、対応する正常組織もしくは正常細胞株から単離した総ＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、健常なドナーに由来するプールしたＤＮＡを用いて、種々の原発性腫瘍（胸部、肺、結腸、前立腺、脳腫、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮、頭頸部などの腫瘍または腫瘍細胞株を含む）から単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が原発性腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、凍結されたかもしくは保存されたパラフィン包埋組織サンプルおよび固定された（例えば、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出され得る。
【００４５】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、当該分野で周知であり、分子生物学の標準的な教科書（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）を含む）に開示されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出する方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）ならびにＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎのような企業製の精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを使用して、製造業者の説明書に従って実施され得る。例えば、培養細胞からの総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離され得る。他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織サンプルからの総ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離され得る。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離され得る。
【００４６】
ＲＮＡは、ＰＣＲのためのテンプレートとして機能し得ないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングにおける第１の工程は、ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写と、その後の、ＰＣＲ反応におけるその指数関数的な増幅である。２つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、トリ（ａｖｉｌｏ）骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写の工程は、代表的には、環境および発現のプロファイリングの目的に依存して、特異的なプライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴ−ｄＴプライマーを使用して開始される。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、製造業者の指示に従って逆転写され得る。次いで、誘導されたｃＤＮＡは、その後のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用され得る。
【００４７】
ＰＣＲ工程は、種々の熱安定性のＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼを使用し得るが、代表的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性は有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する。従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、代表的には、ＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼの、ハイブリダイゼーションプローブを加水分解して、その標的アンプリコンに結合させる５’−ヌクレアーゼ活性を利用するが、等価な５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素が使用され得る。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応に代表的なアンプリコンを作製する。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。プローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素により伸長可能ではなく、そして、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識される。レポーター色素からの任意のレーザー励起発光は、２つの色素が、プローブ上にあるように互いに密接して位置付けられる場合に、クエンチング色素によりクエンチされる。増幅反応の間に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存性の様式でプローブを切断する。得られるプローブフラグメントは、溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルが、第２のフルオロフォアのクエンチング効果から開放される。レポーター色素の１つの分子は、合成された新しい分子の各々について遊離され、そして、クエンチされていないレポーター色素の検出は、データの定量的解釈のための基礎を提供する。
【００４８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のような市販の装置を用いて実施され得る。好ましい実施形態において、５’ヌクレアーゼ手順は、リアルタイム定量ＰＣＲデバイス（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）にて実行される。このシステムは、熱サイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータから構成される。このシステムは、サンプルを９６ウェル形式にて、熱サイクラー上で増幅する。増幅の間、９６ウェル全てについて、レーザー励起蛍光シグナルが光ファイバーケーブルを通してリアルタイムで回収され、そしてＣＣＤにおいて検出される。このシステムは、機器を実行するためおよびデータを分析するためのソフトウェアを備える。
【００４９】
５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、最初に、Ｃｔ、すなわち、閾値サイクルとして表現される。上で議論されるように、蛍光値が、各サイクルの間に記録され、そして、増幅反応におけるその点に対する、増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが最初に統計的に有意であると記録される点が閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【００５０】
サンプル毎のバリエーションの誤差および効果を最小限にするために、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を使用して実施される。同一の内部標準は、異なる組織の間で、比較的一定のレベルで発現され、そして、実験的な処理により影響を受けない。遺伝子の発現パターンを規準化するために頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセロアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンについてのｍＲＮＡである。
【００５１】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近のバリエーションは、リアルタイム定量的ＰＣＲであり、これは、二重標識された蛍光プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合物が規準化のために使用される定量的競合的ＰＣＲ、および、サンプル内に含まれる規準化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的競合的ＰＣＲの両方と適合性である。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照のこと。
【００５２】
固定され、パラフィン包埋された組織をＲＮＡ供給源として使用して、遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコールの工程（ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む）は、種々の刊行された学術文献に示される｛例えば：Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１［２０００］；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９［２００１］｝。簡単に述べると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルを約１０μｍ厚の切片に薄切することから開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、そして、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後、必要に応じてＲＮＡの修復および／または増幅工程が含められてもよく、そして、ＲＮＡが、遺伝子特異的なプロモーターを使用して逆転写されて、その後に、ＲＴ−ＰＣＲが続く。
【００５３】
（３．マイクロアレイ）
差次的な遺伝子発現はまた、マイクロアレイ技術を用いて同定または確認され得る。従って、乳癌関連遺伝子の発現プロフィールは、マイクロアレイ技術を用いて、新鮮な腫瘍組織またはパラフィン包埋された腫瘍組織のいずれかにおいて測定され得る。この方法において、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）が、マイクロチップ基板上にプレーティングされるか、または並べられる。並べられた配列は、次いで、目的の細胞もしくは組織に由来する特定のＤＮＡプローブとハイブリダイズされる。ＲＴ−ＰＣＲ法とまさに同じように、ｍＲＮＡの供給源は、代表的には、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常組織または正常細胞株から単離された総ＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、種々の原発性腫瘍または腫瘍細胞株から単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が原発性腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、凍結されたか、保存されたパラフィン包埋組織サンプルおよび固定（例えば、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出され得、これらのサンプルは、毎日の臨床実務において慣用的に調製および保存されている。
【００５４】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅したインサートは、高密度なアレイ内の基板に貼り付けられる。好ましくは、少なくとも１０，０００のヌクレオチド配列が基板に貼り付けられる。１０，０００要素ごとにマイクロチップ上に固定化された、マイクロアレイ化遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適切である。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、目的の組織から抽出したＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの取込みによって作製され得る。チップに貼り付けられた標識されたｃＤＮＡプローブは、このアレイのＤＮＡの各スポットに対して特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄を行い、非特異的に結合したプローブを取り除いた後、チップは、共焦点レーザー顕微鏡またはＣＣＤカメラのような別の検出方法により走査される。並べられた要素の各々のハイブリダイゼーションの定量は、対応するｍＲＮＡの量の評価を可能にする。二色蛍光を用いると、２つのＲＮＡ供給源から作製された、別個に標識されたｃＤＮＡプローブが、アレイに対してペアを成してハイブリダイズする。特定の遺伝子の各々に対応する２つの供給源に由来する転写物の相対量は、こうして、同時に決定される。ハイブリダイゼーションの小型スケールは、多数の遺伝子についての発現パターンの簡便かつ迅速な評価を可能にする。このような方法は、１細胞あたり数コピーで発現される希な転写物を検出するため、そして、発現レベルの少なくともおよそ２倍差で再現可能に検出するために、必要とされる感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析は、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ技術またはＡｇｉｌｅｎｔ”ｓマイクロアレイ技術を使用することによって、製造業者のプロトコールに従って、市販の機器によって実施され得る。
【００５５】
遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発は、分子マーカーを体系的に検索し、種々の腫瘍型における予測を得ることを可能にする。
【００５６】
（４．遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ））
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）は、各転写物についての個々のハイブリダイズプローブを提供する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時かつ定量的な分析を可能にする方法である。第１に、転写物を固有に同定するための十分な情報を含む短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）が作製されるが、このタグは、各転写物内の固有の位置から得られる。次いで、多くの転写物が互いに連結されて、長い連続した分子を形成し、これを配列決定して、複数のタグのアイデンティティを同時に明らかにし得る。任意の集団の転写物の発現パターンは、個々のタグの量を決定し、そして、各タグに対応する遺伝子を同定することによって、定量的に評価され得る。さらなる詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７（１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−５１（１９９７）を参照のこと。
【００５７】
（５．大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析）
Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：６３０−６３４（２０００）により記載されるこの方法は、非ゲルベースのシグネチャー配列決定と、別個の直径５μｍのマイクロビーズ上の数百のテンプレートのインビトロクローニングとを組合せる配列決定アプローチである。第１に、ＤＮＡテンプレートのマイクロビーズライブラリーは、インビトロクローニングにより実施される。この次に、フロー・セル内の高密度（代表的には、３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２以上）のテンプレート含有マイクロビーズの平面アレイのアセンブリが続く。各マイクロビーズ上のクローニングしたテンプレートの自由端は、ＤＮＡフラグメントの分離を必要としない蛍光ベースのシグネチャー配列決定法を使用して、同時に分析される。この方法は、一回の操作で、酵母ｃＤＮＡライブラリーから数十万の遺伝子シグネチャー配列を同時かつ正確に提供することが示されている。
【００５８】
（６．免疫組織化学）
免疫組織化学法がまた、本発明の予後のマーカーの発現レベルを検出するために適切である。従って、抗体または抗血清、好ましくは、ポリクローナル抗血清、そして最も好ましくは、各マーカーに特異的なモノクローナル抗体が、発現を検出するために使用される。抗体は、例えば、放射標識、蛍光標識、ハプテン標識（例えば、ビオチン）または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）を使用する、抗体自体の直接標識によって検出され得る。あるいは、未標識の一次抗体は、抗血清、ポリクローナル抗血清または一次抗体に特異的なモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体と組合せて使用される。免疫組織化学のプロトコールおよびキットは、当該分野で周知であり、かつ、市販されている。
【００５９】
（７．プロテオミクス）
用語「プロテオーム」は、特定の時点における、サンプル（例えば、組織、生物または細胞培養物）中に存在するタンパク質の全体として規定される。プロテオミクスとしては、とりわけ、サンプル内のタンパク質発現の全体的な変化の研究（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）が挙げられる。プロテオミクスは、代表的には、以下の工程を包含する：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）による、サンプル内の個々のタンパク質の分離；（２）例えば、質量分析またはＮ末端配列決定による、ゲルから回収された個々のタンパク質の同定、および（３）バイオインフォマティクスを使用する、データの分析。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対する価値ある捕捉であり、本発明の予後のマーカーの生成を検出するために、単独でか、または他の方法と組合せて使用され得る。
【００６０】
（８．ＥＧＦＲインヒビター）
上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）ファミリー（ＥＧＦＲ、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３およびｅｒｂ−Ｂ４を含む）は、上皮の悪性腫瘍においてしばしば活性化されている増殖因子レセプターのファミリーである。従って、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、例えば、卵巣癌、膵臓癌、非小細胞肺癌｛ＮＳＣＬＣ｝、乳癌および頭頸部癌を含む、いくつかの腫瘍型において活性であることが知られている。いくつかのＥＧＦＲインヒビター（例えば、ＺＤ１８３９（ゲフィニチブまたはＩｒｅｓｓａとしても公知）；およびＯＳＩ７７４（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ，ＴａｒｃｅｖａＴＭ））は、癌の処置のための有望な薬物候補である。
【００６１】
小さな合成キナゾリンであるＩｒｅｓｓａは、ＥＧＦＲのＡＴＰ結合部位、増殖促進レセプターチロシンキナーゼを完全に阻害し、非小細胞肺癌の処置についての第ＩＩＩ相臨床治験中である。別のＥＧＦＲインヒビターである［ａｇｒ］シアノ−［ｂｇｒ］メチル−Ｎ−［（トリフルオロメトキシ）フェニル］−プロペンアミド（ＬＦＭ−Ａ１２）は、ヒト乳癌細胞の増殖および侵襲性を阻害することが示されている。
【００６２】
Ｃｅｔｕｘｉｍａｂは、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ依存性の細胞増殖をブロックするモノクローナル抗体である。これは、現在、第ＩＩＩ相臨床治験において試験されている。
【００６３】
ＴａｒｃｅｖａＴＭは、進行した卵巣癌および非小細胞肺癌および頭頸部癌を有する患者における抗癌活性の有望な指標を示す。
【００６４】
本発明は、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置の候補である患者が、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置に応答する可能性があるかどうかを予測する、価値ある分子マーカーを提供する。
【００６５】
ＥＧＦＲインヒビターの列挙される例は、薬物の有機低分子と抗ＥＧＦＲ抗体分類の両方を表す。本発明の知見は、アンチセンス分子、小さなペプチドなどを含むがこれらに限定されない他のＥＧＦＲインヒビターにも同等に適用可能である。
【００６６】
（９．ｍＲＮＡの単離、精製および増幅の一般的な説明）
ＲＮＡ供給源として、固定され、パラフィン包埋された組織を使用して、遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコールの工程（ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む）は、種々の刊行された学術文献に示される｛例えば：Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１［２０００］；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９［２００１］｝。簡単に述べると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルを約１０μｍ厚の切片に薄切することから開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、そして、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後、必要に応じてＲＮＡの修復および／または増幅工程が含められてもよく、そして、ＲＮＡが、遺伝子特異的なプロモーターを使用して逆転写されて、その後に、ＲＴ−ＰＣＲが続く。最終的に、データは、試験される腫瘍サンプルにおいて同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて、患者に利用可能な最良な処置選択肢を同定するために分析される。
【００６７】
（１０．癌遺伝子セット、アッセイされた遺伝子下位配列、および、遺伝子発現データの臨床への応用）
本発明の重要な局面は、癌（例えば、肺癌）組織による特定の遺伝子の測定された発現を使用して、予後の情報を提供することである。この目的のために、アッセイされるＲＮＡの量の差と、使用されるＲＮＡの量の可変性の両方を補正する（規準化する）ことが必要である。従って、アッセイは、代表的には、特定の規準化遺伝子（ＧＡＰＤＨおよびＣｙｐ１のような周知のハウスキーピング遺伝子を含む）の発現を測定し、そして組み込む。あるいは、規準化は、アッセイされる遺伝子の全てまたはその大きなサブセット（全体的な規準化アプローチ）の平均またはメジアンシグナル（Ｃｔ）に基づき得る。遺伝子ごとの観点から、患者の腫瘍ｍＲＮＡの、測定され、かつ規準化された量は、癌組織の参照セットにおいて見出される量と比較される。この参照セットにおける癌組織の数（Ｎ）は、異なる参照セットが（概して）、本質的に同じように挙動することを確証するのに十分に多い。この条件が適合する場合、個々のセットに存在する個々の癌組織の同定は、アッセイされる遺伝子の相対量に対して有意な効果を有さない。通常、癌組織参照セットは、少なくとも約３０、好ましくは、少なくとも約４０の異なるＦＰＥ癌組織生検から構成される。他に記されない限り、各ｍＲＮＡ／試験された腫瘍／患者についての規準化された発現レベルは、参照セットにおいて測定された発現レベルの百分率として表わされる。より具体的には、十分に多い数（例えば、４０）の腫瘍の参照セットは、各ｍＲＮＡ種の規準化されたレベルの分布を生じる。分析されるべき特定の腫瘍サンプルにおいて測定されるレベルは、この範囲内のある百分率に入り、この範囲は、当該分野で周知の方法により決定され得る。以下に、他に記されない限り、遺伝子の発現レベルに対する参照は、参照セットに対する規準化された発現を想定するが、このことは、常に明白に述べられているわけではない。
【００６８】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例から明らかである。
【実施例】
【００６９】
（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）における遺伝子発現の第ＩＩ相研究）
遺伝子発現研究は、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置に応答したか、または応答しなかったＮＳＣＬＣ患者の、パラフィン包埋された、固定組織サンプルにおける遺伝子発現を分子的に特徴付けるという主な目的を以って、設計および実施した。この結果は、１つのＥＧＦＲインヒビターの使用に基づく。
【００７０】
（研究設計）
分子アッセイを、ＮＳＣＬＣと診断された２９人の個々の患者から得た、パラフィン包埋した、ホルマリン固定腫瘍組織について行なった。患者は、材料および方法の節において記載されたように実施した組織病理学的評価が、腫瘍組織の適切な量を示した場合に限り、研究に含めた。全ての患者が、ＮＳＣＬＣについての以前の処置歴を有し、前処置の性質は多様であった。
【００７１】
（材料および方法）
代表的な腫瘍ブロックの各々を、診断、腫瘍の量および腫瘍のグレードの半定量的な評価のための標準的な組織病理学により特徴付けた。合計６つの切片（各々１０ミクロン厚）を調製し、２つのＣｏｓｔａｒ  Ｂｒａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅチューブ（ポリプロピレン，１．７ｍＬチューブ、透明；各チューブに３つの切片）に入れた。腫瘍が全生検面積の３０％未満を構成した場合、サンプルは解剖学者により切開され得、腫瘍組織を直接Ｃｏｓｔａｒチューブに入れた。
【００７２】
１つ以上の腫瘍ブロックが外科手順の一部として得られた場合、最も代表的な病理のブロックを分析に用いた。
【００７３】
（遺伝子発現分析）
ｍＲＮＡを、固定され、パラフィン包埋された組織サンプルから抽出および精製し、そして、上記のような遺伝子発現分析のために調製した。
【００７４】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、定量的な遺伝子発現の分子アッセイを、ＲＴ−ＰＣＲにより実施した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＴＭは、熱サイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータから構成される。このシステムは、サンプルを３８４ウェル形式にて、熱サイクラー上で増幅する。増幅の間、３８４ウェル全てについて、レーザー励起蛍光シグナルが光ファイバーケーブルを通してリアルタイムで回収され、そしてＣＣＤにおいて検出される。このシステムは、機器を実行するためおよびデータを分析するためのソフトウェアを備える。
【００７５】
（分析および結果）
腫瘍組織を、１８５の癌関連遺伝子および７の参照遺伝子について分析した。各患者についての閾値サイクル（ＣＴ）値を、その特定の患者についての全ての遺伝子の平均に基づいて基準化した。臨床的結果のデータは、全ての患者について利用可能であった。
【００７６】
結果を、２つの方法（各々、応答に関して、２つの群に患者を分けた）で評価した。
【００７７】
１つの分析は、完全もしくは部分的な応答［ＲＥＳ］を１つの群として、そして、安定な疾患（３ヶ月のｍｉｎ）または進行性の疾患を１つの群［ＮＲ］として分類した。第２の分析は、臨床上の利益の観点から患者をグループ分けし、ここでは、臨床上の利益は、部分的な応答、完全な応答、または３ヶ月における安定な疾患として定義される。
【００７８】
応答（部分的な応答および完全な応答）を、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ基準）により決定した。安定な疾患を、３ヶ月以上にわたる、進行性の疾患の不在として命名した。
【００７９】
（ｔ検定による１７人の患者の分析）
分析を、１７人の処置された患者全てについて行い、規準化された遺伝子発現と、ＲＥＳ（応答）またはＮＲ（非応答）の二成分の結果との間の関係性を決定した。ＲＥＳもしくはＮＲとして分類された患者群についてｔ検定を実施し、各遺伝子についての群間の差についてのｐ値を算出した。以下の表は、群間の差についてのｐ値が＜０．１０であった、２３の遺伝子を列挙する。この場合、応答は、部分的な応答または完全な応答として定義され、前者は、腫瘍の＞５０％縮小であり、後者は、腫瘍の消失である。示されるように、応答は、２人の患者において同定した。
【００８０】
【表１】
2006521793.tif 000001
上記の表１において、より低い平均発現Ｃｔ値は、より低い発現を示し、逆に、より高い平均発現値は、特定の遺伝子のより高い発現を示す。従って、例えば、ＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂ遺伝子の発現は、ＥＧＦＲインヒビター処置に応答しなかった患者において、この処置に応答した患者よりもより高かった。従って、ＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂの上昇した発現は、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置の乏しい結果の指標である。言い換えると、ＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂ遺伝子が、ＮＳＣＬＣ患者の癌から得た組織サンプルにおいて過剰発現する場合、ＥＧＦＲインヒビターを用いる処置は、機能する可能性がなく、従って、医師は、代替的な処置選択肢を探すことが賢明である。
【００８１】
従って、腫瘍におけるＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＷＩＳＰ１、ＣＫＡＰ４、ＦＧＦＲ１、ｃｄｃ２５ＡまたはＲＡＳＳＦ１の上昇した発現は、ＥＧＦＲインヒビターを用いた処置に十分応答する可能性がないことの指標である。一方で、ＥｒｂＢ３の上昇した発現は、患者が、ＥＧＦＲインヒビター処置に応答する可能性があることの指標である。
【００８２】
以下の表２において、二成分の分析を、部分的な応答、完全な応答または安定な疾患のいずれかとして定義される、臨床上の利益に関して実施した。示されるように、５人の患者は、臨床上の利益についてのこれらの基準を満たした。
【００８３】
【表２】
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上記の表２に示されるように、６つの遺伝子が、ｐ＜０．１で臨床上の利益と相関した。Ｇ−カテニン，Ｈ２ＡＦＺおよびＮＭＥ１の発現は、抗ＥＧＦＲ処置に応答しなかった患者においてより高かった。従って、これらの遺伝子のより高い発現は、患者が抗ＥＧＦＲ処置から利益を受ける可能性がないことの指標である。逆に、ヘプシン，ＥｒｂＢ３およびＭＴＡの発現は、抗ＥＧＦＲ処置に応答した患者においてより高かった。これらの遺伝子のより高い発現は、患者が抗ＥＧＦＲ処置から利益を受ける可能性があることの指標である。
【００８４】
表３は、同定された遺伝子のＰＣＲ増幅の間に使用される、登録番号およびアンプリコンの配列を示す。
【００８５】
表４は、同定された遺伝子のＰＣＲ増幅の間に使用される、プライマー／プローブセットの登録番号および配列を示す。各遺伝子について、フォワードプライマー配列番号をｆ２と同定し、プローブ配列をｐ２と同定し、そして、リバースプライマー配列をｒ２と同定する。
【００８６】
本明細書中に示されるデータは、ＮＳＣＬＣ由来の組織サンプルを使用して得られたが、これらの組織発現プロフィールから引き出される結果は、例えば、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌および頭頸部癌のような他の癌にも同等に適用可能であることが強調される。
【００８７】
本明細書を全体で引用される全ての参考文献は、本明細書により参考として援用される。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
【表４−１】
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【００９０】
【表４−２】
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