(57)【要約】  本発明は、樹状細胞（ＤＣ）サブ集団を含む細胞調製物、そのような細胞調製物を取得する方法、並びに改善された免疫療法及び癌療法のためのそのような調製物の使用に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、炎症性疾患及び癌に対するワクチン、並びに免疫寛容原性を誘発する細胞調製物の調製に有用な実質的に純粋なヒトＤＣサブ集団の生成及び使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋なヒト単核球由来樹状細胞（ｍｄＤＣ）集団の細胞調製物であって、
ａ）それらの平均サイズ、粒度及び膜の複雑さに基づいて、それぞれ、サイズ高、粒度高、複雑さ高として特徴付けられるＤＣ−大（ＤＣ−Ｌ）；及び
ｂ）それらの平均サイズ、粒度及び膜の複雑さに基づいて、それぞれ、サイズ低、粒度低、複雑さ低として特徴付けられるＤＣ−小（ＤＣ−Ｓ）
からなる群から選択される細胞調製物。
【請求項２】
前記ヒトｍｄＤＣ集団が未成熟ｍｄＤＣの集団であるか、又は前記ヒトｍｄＤＣ集団が成熟ｍｄＤＣの集団である、請求項１に記載の細胞調製物。
【請求項３】
前記細胞が、ＣＤ１１ｃ高、ＣＤ４７高、及びＤＣＳＩＧＮ高として表面マーカーのそれらの発現レベルによってさらに特徴付けられる未成熟ＤＣ−Ｌ（ｉＤＣ−Ｌ）である、請求項２に記載の細胞調製物。
【請求項４】
前記細胞が、ＣＤ１１ｃ低、ＣＤ４７低、及びＤＣＳＩＧＮ低として表面マーカーのそれらの発現レベルによってさらに特徴付けられる未成熟ＤＣ−Ｓ（ｉＤＣ−Ｓ）である、請求項２に記載の細胞調製物。
【請求項５】
前記細胞が、リポ多糖（ＬＰＳ）、ザイモサン、ＰｇＥ２、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、又はそれらの組み合わせを含む、少なくとも１つの成熟シグナルとｉＤＣ−Ｌ集団をエクスビボでインキュベートすることによって生成される成熟ＤＣ−Ｌ（ｍＤＣ−Ｌ）である、請求項２に記載の細胞調製物。
【請求項６】
前記細胞が、ＬＰＳ、ザイモサン、ＰｇＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＴＧＦ−β、及びそれらの組み合わせを含む、少なくとも１つの成熟シグナルとｉＤＣ−Ｓ集団をエクスビボでインキュベートすることによって生成される成熟ＤＣ−Ｓ（ｍＤＣ−Ｓ）である、請求項２に記載の細胞調製物。
【請求項７】
前記細胞集団が、ａ）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＩＬ−４の存在下で単核球のエクスビボ分化によりヒトｍｄＤＣ集団を提供すること、並びにｂ）細胞選別を用いて前記細胞集団を単離すること、を含む方法によって作製されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞調製物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞調製物、及び／又は請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞調製物の存在下で活性化されるＴ細胞調製物を含む、細胞ワクチン又は免疫調節細胞組成物。
【請求項９】
前記ｍｄＤＣ集団が、少なくとも１つのターゲッター（ｔａｒｇｅｔｏｒ）、共刺激分子及び／又は抗原を発現するように遺伝子改変されている、請求項８に記載の細胞ワクチン。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのターゲッターが、少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項９に記載の細胞ワクチン。
【請求項１１】
少なくとも１つの疾患関連抗原でパルスされた請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞調製物を含み、医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含む、請求項８に記載の細胞ワクチン。
【請求項１２】
前記ヒトｍｄＤＣ集団が、少なくとも１つの疾患関連抗原及び少なくとも１つの成熟シグナルの存在下でｉＤＣ−Ｌのエクスビボインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｌの集団である、請求項１１に記載の細胞ワクチン。
【請求項１３】
前記疾患関連抗原が、癌の病因及び／若しくは病理、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生虫感染に関連する感染性疾患の病因及び／若しくは病理に関与している、請求項１２に記載の細胞ワクチン。
【請求項１４】
前記疾患関連抗原が、Ｂ７Ｈ３、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４  ｖ６／ｖ７、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥｐｈＡ２、及びＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）からなる群から選択される腫瘍関連抗原である、請求項１３に記載の細胞ワクチン。
【請求項１５】
前記疾患関連抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はインフルエンザウイルスと関連しているウイルス抗原である、請求項１３に記載の細胞ワクチン。
【請求項１６】
前記ｍｄＤＣ集団が、癌細胞上に提示される細胞表面腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている、請求項１３に記載の細胞ワクチン。
【請求項１７】
前記癌が、黒色腫、尿路癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、大腸癌、及び腸管の癌、骨悪性腫瘍、結合組織及び軟組織腫瘍、皮膚癌並びに造血器癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の細胞ワクチン。
【請求項１８】
前記癌が急性リンパ性白血病である、請求項１７に記載の細胞ワクチン。
【請求項１９】
前記細胞集団が、ＣＤ１９に特異的に結合する少なくとも１つのＣＡＲ及び／又はＣＤ２２に特異的に結合する少なくとも１つのＣＡＲを発現する、請求項１８に記載の細胞ワクチン。
【請求項２０】
自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する少なくとも１つの疾患関連抗原、並びに／又は壊死細胞又はアポトーシス細胞でパルスした、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞調製物を含み、前記細胞組成物が、さらに、医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む、請求項８に記載の免疫調節細胞組成物。
【請求項２１】
前記ヒトｍｄＤＣ集団が、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する少なくとも１つの抗原の存在下で、少なくとも１つの成熟シグナルとｉＤＣ−Ｓのエクスビボインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｓの集団である、請求項２０に記載の免疫調節細胞組成物。
【請求項２２】
前記ヒトｍｄＤＣ集団が、壊死細胞又はアポトーシス細胞の存在下で、少なくとも１つの成熟シグナルとｉＤＣ−Ｌのエクスビボインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｌの集団である、請求項２０に記載の免疫調節細胞組成物。
【請求項２３】
前記抗原が、自己免疫疾患、慢性非解決炎症性疾患、及び移植片拒絶からなる群から選択されるＴ細胞媒介性疾患の病因又は病理に関与している、請求項２０に記載の免疫調節細胞組成物。
【請求項２４】
その必要がある対象における癌若しくは感染性疾患の治療又は寛解のための方法において使用するための、請求項８〜１９のいずれか一項に記載の細胞ワクチン。
【請求項２５】
前記疾患関連抗原が、前記対象において癌を治療する方法で使用するための腫瘍関連抗原である、請求項２４に記載の使用のための細胞ワクチン。
【請求項２６】
それを必要とする対象における癌若しくは感染性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫原性反応を誘導又は増強する方法において使用するための、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の細胞ワクチン。
【請求項２７】
前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項２６に記載の使用のための細胞ワクチン。
【請求項２８】
前記腫瘍が、黒色腫、尿路癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、大腸癌、及び腸管の癌、骨悪性腫瘍、結合組織及び軟組織腫瘍、皮膚癌並びに造血器癌からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用のための細胞ワクチン。
【請求項２９】
それを必要とする対象における自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の治療又は寛解のための方法において使用するための、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の免疫調節細胞組成物。
【請求項３０】
それを必要とする対象における自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫寛容原性免疫反応を誘導する方法において使用するための、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の免疫調節細胞組成物。
【請求項３１】
前記抗原が、自己免疫疾患、慢性非寛解炎症性疾患、及び移植片拒絶反応からなる群から選択されるＴ細胞媒介疾患の病因又は病理に関与している、請求項３０に記載の使用のための免疫調節細胞組成物。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、Ｉ型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患及び自己免疫性肝炎からなる群から選択される、請求項３１に記載の使用のための免疫調節細胞組成物。
【請求項３３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞調製物を作製するためのエクスビボ方法であって、ａ）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＩＬ−４の存在下で単核球のエクスビボ分化によってヒトｍｄＤＣ集団を提供すること、及びｂ）細胞選別を用いて前記細胞集団を単離すること、を含むエクスビボ方法。
【請求項３４】
前記細胞集団が、細胞サイズ、細胞粒度、膜の複雑さ及び表面マーカー発現のレベルからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータに基づく細胞選別を含む方法によって単離される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記表面マーカーが、αＶβ５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４７、ＣＤ３６、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）、ＣＤ１１ｂ（ＣＲ３）、ＣＤ６（Ｂ７．２）、ＣＤ８５ｋ（ＩＬＴ３）、ＣＤ４０、ＣＤ３２４（Ｅカドヘリン）、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＬＲ−１、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ−３）、ＣＤ２６６（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）、ＣＤ２０６、ＤＣＳＩＧＮ、ＣＤ２００（ＯＸ２）、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２）、ＣＤ１４１、ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２７５（ＩＣＯＳ−Ｌ）、及びＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）からなる群から選択される複数のマーカーを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記表面マーカーが、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４７、及びＤＣＳＩＧＮからなる群から選択される複数のマーカーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程ａ）及びｂ）が、外因性活性化又は成熟刺激を加えることなく行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
さらに、少なくとも１つのＣＡＲを発現するように前記ｍｄＤＣ集団を遺伝子改変することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、少なくとも１つの疾患関連抗原及び少なくとも１つの成熟シグナルの存在下で前記細胞をエクスビボでインキュベートすることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの成熟シグナルが、ＬＰＳ、ザイモサン、ＰｇＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＴＧＦ−β、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、定義された樹状細胞サブ集団を含む調製物、そのような細胞調製物を取得する方法、並びに改善された免疫調節及び癌療法を提供するためのそのような調製物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
樹状細胞（ＤＣ）は、哺乳類の免疫系の抗原提示細胞である。それらの主な機能は、抗原物質を処理し、細胞表面上で抗原物質を免疫系のＴ細胞に提示することである。樹状細胞は、自然免疫系と適応免疫系の間のメッセンジャーとして機能する。外部刺激によって活性化されると、ＤＣは、構造、表現型及び機能の変化を包含する成熟過程を受け、適応免疫の最も強力なイニシエータになる。ＤＣは、両方の中央リンパ器官及び免疫周囲で、直接又は分泌メディエーターを介して、免疫系の全ての細胞と相互作用する。ＤＣは、異なる経路で成熟することができ、代替過程を介したそれらの成熟は、多様なエフェクター機能をもたらすことができる。例えば、免疫寛容原性刺激に遭遇すると、ＤＣの反応は、無反応から、アポトーシス、他の免疫細胞のうちの免疫寛容を誘導する免疫寛容原性表現型及び機能の獲得まで拡がる（Ｔｉｓｃｈら，２０１０）。ＤＣの反応は、ＤＣの移動を伴っても、又は伴わなくてもよい。
【０００３】
異なる特性及び機能を有するＤＣサブ集団は、以前に特定され、様々な役割を担うことが示されている。サブ集団は、一般的にそれらの構造的表現型に基づいて定義されている。しかしながら、この表現型は、ＤＣを理解及び使用するのにそれらの特異的機能にこそ関心があるため、単に代理物である。最近の概説において、特定のサブ集団が徹底的に調べられた（Ｌｉｕら，２０１０，Ｍｉｌｄｎｅｒら，２０１４，Ｓｃｈｌｉｔｚｅｒら，２０１４）。簡単に説明すると、脾臓及びリンパ節で見出されたマウスＤＣは、ＣＤ８＋及びＣＤ８−サブタイプに分離され、これらはさらに細分することができる。これらの器官はまた、周囲から来る遊走ＤＣを保有している。非リンパ系ＤＣの特性も、様々な組織中のＤＣについて説明されている異なる特性と共に変化し、皮膚、消化管、及び肺が最も頻繁に研究されてきた。これらの組織のＤＣは、一般に、最初にそれらのＣＤ１１ｂ発現に従って分類され、その後、組織特異的なマーカーに従って分類される。抗ウイルス反応に特化した形質細胞様ＤＣは、これらの古典的及び組織常在ＤＣとは異なる。最後に、前述したＤＣは骨髄前駆体由来であるが、単核球由来樹状細胞（ｍｄＤＣ）は単核球に由来する。
【０００４】
ヒトＤＣサブ集団の情報は、それらのマウス対応物と比較して、それほど明らかになっておらず（Ｓｃｈｌｉｔｚｅｒら，２０１４，Ｍｅｒａｄら，２０１３）、マウス単核球由来ＤＣとヒト単核球由来ＤＣに関する理解の隔たりは特に顕著である（Ｍｉｌｄｎｅｒら，２０１３）。加えて、ｍｄＤＣを含むインビボのＤＣとインビトロで作製されたＤＣの観察結果の相関の程度に関する共有理解は、マウスよりもヒトにおいてあまり十分に理解されていない（Ｃｏｌｌｉｎら，２０１３，Ｂｏｌｔｊｅｓら，２０１４）。それでも、ｍｄＤＣの可用性及び可塑性により、ｍｄＤＣはヒト研究の主な対象になっている（Ｐａｌｕｃｋａら，２０１３）。
【０００５】
いくつかの研究が、プロトコル又は生成するために使用される血清によって異なる様々な成熟ヒトＤＣについて記載している（Ｄｕｐｅｒｒｉｅｒら，２０００，Ｃｈａｎｇら，２０００，Ｘｉａら，２００２，Ｎｕｎｅｚ  Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄら，２００４）。マウスでは、ほとんどのＤＣは、定常状態で単核球から生じないと思われている（Ｌｉｕら，２００９）。実際、単核球は、炎症時にＤＣを形成すること（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎら，２００３）だけでなく、それらの消失後に、腸のＤＣの一部を再構成すること（Ｖａｒｏｌら，２００９）、及び他の研究ではＤＣとして異なる組織に組み込まれることが示されており（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎら，２００３，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら，２００９）、そのため、全てのマウスｍｄＤＣが炎症性であるという一般的概念は、疑問視されている（Ｍｉｌｄｎｅｒら，２０１４）。加えて、インビボでのヒト単核球のＤＣへの分化に関して理解するための研究は、なお進行中である（Ａｕｆｆｒａｙら，２００９，Ａｌｏｎｓｏら，２０１１）。
【０００６】
死細胞の取り込みは、ＤＣ機能に大いに関連性があり、抗原を取得し、末梢免疫寛容の永遠の過程でその環境をサンプリングするＤＣの重要な手段として役立つ（Ｈａｍｍｅｒら，２０１３）。細胞死の異なる様式は、ＤＣの活性化状態に影響するシグナルと関連している（Ｇｒｅｅｎら，２００９，Ｓａｎｃｈｏら，２００９）。マウスでは、ＣＤ８α＋サブ集団は、死細胞の取り込み及びその抗原の交差提示に特化している。表面マーカーＢＤＣＡ３（ＣＤ１４１）及びＣＬＥＣ９Ａに陽性であるヒト骨髄性ＤＣは、このサブ集団に類似している。これら及び他の研究により、細胞死の状況及びその摂取ＤＣとの相互作用は、ＤＣ自体が作用する最終的な結果に強く影響を与えることができることが示された（Ｇｒｅｅｎら，２００９）。
【０００７】
しかしながら、ｍｄＤＣ自体の死については、文献では注目されてこなかった。ＤＣは、活性化又は免疫寛容のいずれかのために、Ｔ細胞及びＢ細胞の刺激に重要な役割を有しており、それらの寿命は、この刺激の継続の重要な調節因子である。Ｔ細胞増殖用の一般的な実験プロトコルは、照射、マイトマイシンＣ処理、又は固定した抗原提示細胞（ＡＰＣ）を使用するか、あるいはさらにＡＰＣの代替物として固定した分子プラットフォームを使用する。いくつかの以前の実験では、ワクチンとして人工ＡＰＣが使用された。これらの例は、損傷したあるいは不活性のＡＰＣ及びＡＰＣ様構築物が機能的であることを示している。したがって、死んだＤＣは免疫効果を有している可能性があるので、ＤＣの死の特性研究は重要である。死の免疫細胞パターンは、Ｔ細胞の活性化誘導死によって例示するように、それらの機能の不可欠な部分である。いくつかのグループによって、死に向かう細胞は新たな免疫調節タンパク質を活発に生成できることが示された（Ｓｔｅｉｎら，２０００，Ｋｒｉｓｐｉｎら，２００６）。インビボで、ＤＣの死は、その状態及び位置に応じて異なる結果を有することができる（Ｓｔｒａｎｇｅｓら，２００７）。ＤＣ死の生物学、特に、Ｆａｓ及びｂｃｌ−２ファミリーの役割において様々な矛盾する報告がある（Ｋｕｓｈｗａｈら，２０１０に概説された）。それにもかかわらず、ＤＣの死が、その状態及び環境によって影響され、またそれらに影響を与える制御された事象であることは明らかである。
【０００８】
本発明の発明者らの何人かが記載されているＷＯ  ２０１４／０８７４０８、ＷＯ  ２００６／１１７７８６及び２００２／０６０３７６は、とりわけ、ＤＣ又は他の免疫細胞を含むアポトーシス細胞若しくは壊死細胞の調製物の生成及び／又は使用に関する。
【０００９】
ＤＣに基づく調製物及びワクチンの作製並びに／又は使用のための様々な方法は、例えば、ＷＯ  ２０１６／１４５３１７、ＷＯ  ２０１６／０３６３１９、米国特許公開第２０１０／０１０５１３５号、ＷＯ  ２００７／０８４１０５、米国特許公開第２０１７／１５１２８１号及び米国特許公開第２００４／００３８３９８に記載されている。米国特許公開第２０１４／３７７７６１号は、樹状細胞が免疫寛容原性樹状細胞サブセット又はエフェクターの樹状細胞サブセットに属しているかどうかを決定する方法、免疫療法を受けているか、かつ／又はワクチンを投与されている患者が、調節性Ｔ細胞反応又はエフェクターＴ細胞反応のいずれかに向けられる免疫反応を発達させているかどうかを決定する方法、並びに免疫療法への反応を決定する方法を開示している。
【００１０】
本明細書に記載するように、いくつかの研究が、成熟ｍｄＤＣの異なる集団の存在を開示又は示唆した。しかしながら、臨床診療では、例えば、免疫療法又はワクチンの生成における様々な用途に望まれるように操作された未成熟ｍｄＤＣ（ｉ−ｍｄＤＣ）などの未成熟ＤＣを大量に取得することが特に望ましい。研究及び細胞療法に使用される現在のプロトコルによって、典型的には、反対の機能を発揮し得、それによって、有効性の低下及び潜在的に望ましくない影響をもたらす様々な割合の別々の細胞集団を含む異種ｉ−ｍｄＤＣ調製物が生成される。したがって、実質的に純粋なｉ−ｍｄＤＣサブ集団を含む均一なｉ−ｍｄＤＣ調製物の生成は、臨床目的及び研究目的に同様に非常に都合がよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要
本発明は、定義された樹状細胞（ＤＣ）サブ集団を含む細胞調製物、そのような細胞調製物を取得する方法、及び例えば、改善された免疫療法及び癌療法のためのそのような調製物の使用に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、例えば、炎症性疾患及び癌に対するワクチンの調製に有用な、又は免疫寛容を誘発若しくは増強するための特定のヒト単核球由来ＤＣ（ｍｄＤＣ）サブ集団の生成並びに使用に関する。
【００１２】
ヒトｍｄＤＣは、研究及び実験的療法に広く使用される汎用性の免疫細胞である。異なる培養条件が、成熟段階でその特性に影響を与えることが示されたが、未成熟ヒトｍｄＤＣ（ｉ−ｍｄＤＣ）の既知のサブ集団は存在しない。本発明は、エクスビボで作製されたヒトｉ−ｍｄＤＣから単離され、本明細書で小（ＤＣ−Ｓ）ｍｄＤＣ及び大（ＤＣ−Ｌ）ｍｄＤＣと命名された２つの別々のｍｄＤＣサブ集団の予想外の実験的作製に部分的に基づいている。２つの細胞集団は、それらの表現型、形態、トランスクリプトーム、貪食能、活性化、細胞死、死細胞の取り込み能力、及び死細胞取り込みへの反応において違いを示すことが見出された。これら２つの細胞集団の固有の特性及び機能を考慮して、それらが予想外に改善された治療法を提供する様々な用途に有用であることが予想外に見出された。
【００１３】
形態学的に、ＤＣ−Ｌ（本明細書ではＤＣ−大とも呼ばれる）は、ＤＣ−Ｓ（本明細書ではＤＣ−小とも呼ばれる）と比較してより大きく（サイズ高）、より細かく（粒度高）、かつより複雑な細胞膜（複雑さ高）を有することが現在見出されている。表現型では、ＤＣ−Ｌは、ＤＣ−Ｓと比較して、ワイドパネルの表面分子のより高い発現及び成熟刺激へのより強い反応を示す。トランスクリプトーム解析により、その別々のアイデンティティー及び所見が観察された表現型と一致することが明らかになった。それらは、同様のアポトーシス細胞取り込みを示すが、ＤＣ−Ｌは食作用の異なる能力を有し、より良好な抗原処理を実証し、かつＤＣ−Ｓと比較して著しくより良好な壊死細胞取り込みを有する。これらのサブ集団はまた細胞死の異なるパターンを有し、ＤＣ−Ｌは炎症性の「危険な」表現型を呈するが、ＤＣ−Ｓは、細胞死の際、それらの表面マーカーをほとんど下方制御する。加えて、アポトーシス細胞は免疫抑制表現型を誘導し、特に、リポ多糖を添加した後に、ＤＣ−Ｓと比較して、ＤＣ−Ｌ間でより顕著になる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、いくつかの実施形態において、実質的に純粋なＤＣ−Ｓ集団又はＤＣ−Ｌ集団（例えば、未成熟若しくは成熟したＤＣ−Ｓ又はＤＣ−Ｌ）を含む細胞調製物、そのような調製物を生成する方法、並びに例えば、細胞ワクチンの製造及び免疫調節療法でのそれらの使用に関する。
【発明の効果】
【００１５】
したがって、単核球（例えば、ヒト末梢血単核球）は、本発明の例示的な実施形態に従ってｍｄＤＣに分化させることができ、そこから実質的に精製されたＤＣ−Ｓ又はＤＣ−Ｌを、例えば、フローサイトメトリーによる細胞選別を用いて取得することができる。様々な実施形態によれば、実質的に精製された細胞集団は、次いで、その必要性のある対象に投与される様々な免疫調節細胞組成物の調製のために、抗原、死細胞及び／又は他の調節因子（例えば、サイトカイン又は他の成熟シグナル）などの刺激に暴露することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＤＣ−Ｌ調製物は、癌及び感染性疾患の治療又は寛解、並びにそのような障害の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫原性反応の誘導に有用な細胞ワクチンの製造に都合よく使用され得る。対照的に、ＤＣ−Ｓ調製物は、他の例示的な実施形態において、自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療又は寛解、並びにそのような疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫寛容原性免疫反応の誘導に有用な細胞組成物の製造のために都合よく使用され得る。
【００１６】
一態様によれば、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団又はＤＣ−Ｌ集団（例えば、その未成熟形態の、すなわち、それぞれｉＤＣ−Ｓ又はｉＤＣ−Ｌ）の調製物に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団又はＤＣ−Ｌ集団の調製物を作製する方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、細胞ワクチン、又は実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団若しくはＤＣ−Ｌ集団の調製物を含む免疫調節細胞組成物を調製する方法を対象とする。
【００１９】
別の態様において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団又はＤＣ−Ｌ集団の調製物を含む細胞ワクチン又は免疫調節細胞組成物を対象とする。
【００２０】
他の態様において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団又はＤＣ−Ｌ集団の調製物の存在下での活性化を含む、養子Ｔ細胞免疫療法などのＴ細胞療法、Ｔ細胞ワクチン及び免疫調節Ｔ細胞組成物を調製する方法、並びにこれらの方法によってもたらされるＴ細胞療法を対象とする。
【００２１】
さらに別の態様において、提供されるのは、癌及び感染性疾患の治療又は寛解のための方法である。
【００２２】
別の態様において、本発明は、癌及び感染性疾患の病因並びに／若しくは病理に関与する抗原に対する免疫原性反応を誘導又は増強する方法を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療又は寛解のための方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の病因並びに／若しくは病理に関与する抗原に対する免疫寛容原性免疫反応を誘導又は増強する方法を提供する。別の態様において、本発明は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の病因並びに／又は病理に関与する抗原に対するＴ細胞抑制又はアネルギーを誘導する方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、それらの形態、表現型及び／又はアポトーシス刺激に対する反応に基づいて細胞集団を区別する方法を対象とする。
【００２６】
本発明は、一態様において、（ａ）それらの平均サイズ、粒度及び膜の複雑さに基づいて、それぞれ、サイズ高、粒度高、複雑さ高として特徴付けられるＤＣ−大（ＤＣ−Ｌ）；及び（ｂ）それらの平均サイズ、粒度及び膜の複雑さに基づいて、それぞれ、サイズ低、粒度低、複雑さ低として特徴付けられるＤＣ−小（ＤＣ−Ｓ）からなる群から選択される実質的に純粋なヒト単核球由来樹状細胞（ｍｄＤＣ）集団の細胞調製物を提供する。
【００２７】
特定の実施形態において、ヒトｍｄＤＣ集団は、未成熟ｍｄＤＣ細胞の集団である。特定の実施形態において、ヒトｍｄＤＣ集団は、成熟ｍｄＤＣ細胞の集団である。
【００２８】
特定の実施形態において、該細胞は、ＣＤ１１ｃ高、ＣＤ４７高、及びＤＣＳＩＧＮ高として表面マーカーのそれらの発現レベルによってさらに特徴付けられる未成熟ＤＣ−Ｌ（ｉＤＣ−Ｌ）である。
【００２９】
特定の実施形態において、該細胞は、ＣＤ１１ｃ低、ＣＤ４７低、及びＤＣＳＩＧＮ低として表面マーカーのそれらの発現レベルによってさらに特徴付けられる未成熟ＤＣ−Ｓ（ｉＤＣ−Ｓ）である。
【００３０】
特定の実施形態において、該細胞は、少なくとも１つの成熟シグナルとｉＤＣ−Ｌ集団をエクスビボでインキュベートすることによって生成される成熟ＤＣ−Ｌ（ｍＤＣ−Ｌ）である。特定の実施形態において、該成熟シグナルは、リポ多糖（ＬＰＳ）、ザイモサン、プロスタグランジンＥ２（ＰｇＥ２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、又はそれらの組み合わせを含む。例えば、該成熟シグナルは、ＬＰＳ；ザイモサン；ＰｇＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの組み合わせ；ＴＧＦ−β；及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００３１】
特定の実施形態において、該細胞は、少なくとも１つの成熟シグナルとｉＤＣ−Ｓ集団をエクスビボでインキュベートすることによって生成される成熟ＤＣ−Ｓ（ｍＤＣ−Ｓ）である。特定の実施形態において、該成熟シグナルは、ＬＰＳ、ザイモサン、ＰｇＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＴＧＦ−β、又はそれらの組み合わせを含む。例えば、該成熟シグナルは、ＬＰＳ；ザイモサン；ＰｇＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの組み合わせ；ＴＧＦ−β；及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００３２】
特定の実施形態において、本明細書に記載のＤＣ−Ｌ及びＤＣ−Ｓからなる群から選択される細胞集団は、（ａ）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び／又はＩＬ−４の存在下で単核球のエクスビボ分化によりヒトｍｄＤＣ集団を提供すること、並びに（ｂ）細胞選別を用いて前記細胞集団を単離すること、を含む方法によって作製された。
【００３３】
特定の実施形態において、該細胞選別は、細胞サイズ、細胞粒度、膜の複雑さ及び表面マーカー発現のレベルからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータに基づく。
【００３４】
本発明は、さらに、別の態様において、ＤＣ−Ｌ及びＤＣ−Ｓからなる群から選択される実質的に純粋なヒトｍｄＤＣ集団の細胞調製物を含み、かつ／又は前記細胞調製物の存在下で活性化されるＴ細胞調製物を含む細胞ワクチン又は免疫調節細胞組成物を提供する。様々な実施形態において、該細胞調製物は、上記の細胞調製物のいずれか１つである。特定の実施態様において、該ｍｄＤＣ集団は、少なくとも１つのターゲッター（ｔａｒｇｅｔｏｒ）、共刺激分子及び／又は抗原を発現するように遺伝子改変されている。特定の実施形態において、少なくとも１つのターゲッターは、少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
【００３５】
特定の実施形態において、該細胞ワクチンは、少なくとも１つの疾患関連抗原でパルスされた上記のＤＣ−Ｌ及びＤＣ−Ｓからなる群から選択される実質的に純粋なヒトｍｄＤＣ集団の細胞調製物を含み、前記細胞ワクチンは、さらに、医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。
【００３６】
特定の実施形態において、該ヒトｍｄＤＣ集団は、少なくとも１つの疾患関連抗原及び少なくとも１つの成熟シグナルの存在下でｉＤＣ−Ｌのエクスビボインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｌの集団である。特定の実施形態において、該疾患関連抗原は、癌の病因及び／若しくは病理、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生虫感染に関連する感染性疾患の病因及び／若しくは病理に関与している。特定の実施形態において、該疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。特定の実施形態において、該腫瘍関連抗原は、Ｂ７Ｈ３、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４  ｖ６／ｖ７、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥｐｈＡ２、及びＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）からなる群から選択される。
【００３７】
特定の実施形態において、該疾患関連抗原は、ウイルス抗原である。特定の実施形態において、該ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はインフルエンザウイルス感染と関連している。
【００３８】
特定の実施態様において、前記ｍｄＤＣ集団は、癌細胞上に提示される細胞表面腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている。特定の実施形態において、該癌は、黒色腫、尿路癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、大腸癌、及び腸管の癌、骨悪性腫瘍、結合組織及び軟組織腫瘍、皮膚癌並びに造血器癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、該癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である。特定の実施形態において、該細胞集団は、ＣＤ１９に特異的に結合する少なくとも１つのＣＡＲ及び／又はＣＤ２２に特異的に結合する少なくとも１つのＣＡＲを発現する。
【００３９】
特定の実施形態において、該免疫調節細胞組成物は、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する少なくとも１つの疾患関連抗原、並びに／又は壊死細胞若しくはアポトーシス細胞でパルスした上記のＤＣ−Ｌ及びＤＣ−Ｓからなる群から選択される実質的に純粋なヒトｍｄＤＣ集団の細胞調製物を含み、前記細胞組成物は、さらに、医薬として許容される担体、賦形剤及び／若しくはアジュバントを含む。
【００４０】
特定の実施形態において、前記免疫調節細胞組成物中のヒトｍｄＤＣ集団は、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する少なくとも１つの抗原の存在下で、少なくとも１つの成熟シグナルとｉＤＣ−Ｓのエクスビボでのインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｓの集団である。
【００４１】
特定の実施形態において、前記免疫調節細胞組成物中のヒトｍｄＤＣ集団は、壊死細胞又はアポトーシス細胞の存在下で、少なくとも１つの成熟シグナルとｉＤＣ−Ｌのエクスビボでのインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｌの集団である。
【００４２】
特定の実施形態において、該抗原は、Ｔ細胞媒介性疾患（例えば、自己免疫疾患、慢性非解決炎症性疾患、及び移植片拒絶）の病因又は病理に関与している。
【００４３】
特定の実施形態において、該細胞ワクチンは、その必要がある対象における癌若しくは感染性疾患の治療又は寛解のための方法において使用するためのものである。
【００４４】
特定の実施形態において、該疾患関連抗原は、前記対象において癌を治療する方法で使用するための腫瘍関連抗原である。特定の実施形態において、該疾患関連抗原は、前記対象におけるウイルス感染を治療する方法における使用のためのウイルス抗原である。
【００４５】
特定の実施形態において、該細胞ワクチンは、それを必要とする対象における癌若しくは感染性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫原性反応を誘導又は増強する方法において使用するためのものである。特定の実施形態において、該抗原は、腫瘍関連抗原である。特定の実施形態において、該腫瘍は、黒色腫、尿路癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、大腸癌、及び腸管の癌、骨悪性腫瘍、結合組織及び軟組織腫瘍、皮膚癌並びに造血器癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、該疾患関連抗原は、ウイルス抗原である。特定の実施形態において、該ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はインフルエンザウイルス感染と関連する。
【００４６】
特定の実施形態において、該免疫調節細胞組成物は、それを必要とする対象における自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の治療又は寛解のための方法において使用するためのものである。
【００４７】
特定の実施形態において、該免疫調節細胞組成物は、それを必要とする対象における自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫寛容原性免疫反応を誘導する方法において使用するためのものである。
【００４８】
特定の実施形態において、該抗原は、自己免疫疾患、慢性非寛解炎症性疾患、及び移植片拒絶反応からなる群から選択されるＴ細胞媒介疾患の病因又は病理に関与している。特定の実施形態において、該自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、Ｉ型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患及び自己免疫性肝炎からなる群から選択される。
【００４９】
例えば、限定されるものではないが、自己免疫疾患に関連する抗原（「自己抗原」）には、糖尿病ではインスリン及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）及び膵島関連自己抗原、多発性硬化症ではミエリン塩基性タンパク質及びプロテオリピドタンパク質、重症筋無力症ではアセチルコリン受容体、並びに核及びリボソームタンパク質、並びに狼瘡ではヒストンなどの核酸タンパク質複合体が含まれる。自己抗原に含まれるのは、さらに、幹細胞に由来するもの、又はインスリノーマ、胸腺組織、Ｂリンパ芽球様細胞などの細胞株、若しくは幹細胞から作製される膵臓β細胞などの細胞からの全細胞調製物である。
【００５０】
さらなる例示的な実施形態によれば、リウマチ様動脈炎（ＲＡ）用の免疫調節組成物を調製するために使用され得る自己抗原には、ＩＩ型ウシ又はニワトリコラーゲン、ＨＣｇｐ３９、凍結乾燥した大腸菌抽出物、１５マーの合成ペプチドｄｎａＪｐ１、並びにｃｉｔ−ビメンチン、ｃｉｔ−フィブリノーゲン、及びｃｉｔ−ＩＩ型コラーゲンを含むが、これらに限定されないシトルリン化タンパク質、又はこれらのシトルリン化タンパク質に由来するペプチドが含まれるが、これらに限定されない。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に有用な抗原には、インスリン、プロインスリン、ＧＡＤ６５（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）、ＩＡ−２（膵島抗原２；チロシンホスファターゼ）、及びＺｎＴ８トランスポーター（インスリン分泌顆粒の膜上に局在化している亜鉛輸送体８）、免疫調節ペプチドＤｉａＰｅｐ２７７（ＨＳＰ６０タンパク質由来）、及び他のＨＳＰ６０由来のペプチドが含まれるが、これらに限定されない。多発性硬化症（ＭＳ）に有用な抗原には、ＭＢＰ１３−３２、ＭＢＰ８３−９９、ＭＢＰ１１１−１２９、ＭＢＰ１４６−１７０、ＭＯＧ１−２０、ＭＯＧ３５−５５、及びＰＬＰ１３９−１５４を含むミエリンペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明は、さらに、別の態様において、上記のＤＣ−Ｌ及びＤＣ−Ｓからなる群から選択される実質的に純粋なヒトｍｄＤＣ集団の細胞調製物を作製するためのエクスビボ方法であって、（ａ）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び／又はＩＬ−４の存在下で単核球のエクスビボでの分化によってヒトｍｄＤＣ集団を提供すること、並びに（ｂ）細胞選別を用いて前記細胞集団を単離すること、を含む方法を提供する。
【００５２】
特定の実施形態において、該細胞選別は、細胞サイズ、細胞粒度、膜の複雑さ及び表面マーカー発現のレベルからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータに基づく。特定の実施形態において、該細胞選別は、細胞のサイズ、細胞の粒度、膜の複雑さ及び表面マーカー発現のレベルからなる群から選択される複数のパラメータに基づき、各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。特定の実施形態において、該細胞選別は、細胞のサイズ、細胞の粒度、膜の複雑さ及び表面マーカー発現のレベルに基づく。
【００５３】
特定の実施形態において、該表面マーカーには、αＶβ５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４７、ＣＤ３６、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）、ＣＤ１１ｂ（ＣＲ３）、ＣＤ６（Ｂ７．２）、ＣＤ８５ｋ（ＩＬＴ３）、ＣＤ４０、ＣＤ３２４（Ｅカドヘリン）、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＬＲ−１、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ−３）、ＣＤ２６６（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）、ＣＤ２０６、ＤＣＳＩＧＮ、ＣＤ２００（ＯＸ２）、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２）、ＣＤ１４１、ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２７５（ＩＣＯＳ−Ｌ）、及びＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）からなる群から選択される複数のマーカーが含まれる。特定の実施形態において、該表面マーカーには、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４７、及びＤＣＳＩＧＮからなる群から選択される複数のマーカーが含まれる。特定の実施形態において、該表面マーカーには、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４７、及びＤＣＳＩＧＮが含まれる。
【００５４】
特定の実施形態において、工程（ａ）及び（ｂ）は、外因性活性化又は成熟刺激を加えることなく行われる。
【００５５】
特定の実施形態において、上記のエクスビボでの方法は、さらに、少なくとも１つのＣＡＲを発現するようにｍｄＤＣ集団を遺伝子改変することを含む。
【００５６】
特定の実施形態において、上記のエクスビボでの方法は、さらに、少なくとも１つの疾患関連抗原及び少なくとも１つの成熟シグナルの存在下で細胞をエクスビボでインキュベートすることを含む。特定の実施形態において、該少なくとも１つの成熟シグナルには、ＬＰＳ、ザイモサン、ＰｇＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＴＧＦ−β、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【００５７】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明及び図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１Ａ−図１Ｃ。ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌの光散乱並びに形態。図１Ａ）フローサイトメトリーによって分析したＤＣの前方散乱対側方散乱ドットプロット。左のパネルは非ゲーティング集団を示し、右のパネルは使用したゲーティング戦略を示す。上のパネルはＦＡＣＳｃａｎで分析したｉＤＣを示し、下のパネルはＬＳＲ  ＩＩで分析したＬＰＳ成熟ＤＣを示す。ゲーティング集団は生細胞を表す（本文を参照）。図１Ｂ）ｉＤＣを、細胞遠心分離、エタノールでの固定、次いで、ヘマトキシリン及びエオシンでの染色により調製した。上のパネルにおいて、顕著なサイズの違いを有する２つのＤＣが高倍率で見られる。下のパネルにおいて、低倍率領域は、異なるサイズのＤＣの収集を示す。図１Ｃ）ｉＤＣを、材料及び方法に記載したように選別し、次いで、位相差を用いて、クリスタルバイオレットの添加後にライブで撮影した。上のパネルには、ＤＣ−Ｓの２つの例があり、下のパネルはＤＣ−Ｌの２つの例を示す。バー：１０μｍ。
【図２】未成熟ＤＣ−Ｌ対ＤＣ−Ｓ上の表面マーカーの発現。未成熟段階でのＤＣ−Ｌ対ＤＣ−Ｓの相対的表面マーカー発現が示されている。ＤＣ−Ｓの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を１００に正規化した。１００を超える値及び１００未満の値は、ＤＣ−Ｓと比較して、それぞれＤＣ−Ｌの中でより高い発現及びより低い発現を示す。＊＝ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−ＳのＭＦＩ比についてｐ＜０．０５。全てのマーカーについてｎ≧３。ＳＢ又はＰＩ陰性細胞のみを示す。エラーバー＝±ＳＥＭ。ＣＣＲ２、ＣＤ１ｅ、ＣＤ１２１ｂ（ＩＬ１Ｒ２）、ＣＤ１６３、ＨＬＡ−Ｇ、ＬＯＸ−１（ＯＬＲ１）、ＯＸ４０−Ｌ（ＣＤ２５２）、ＲＡＧＥ、ＴＩＭ−１、及びＴＳＬＰ−Ｒも試験した。しかしながら、これらの表面マーカーは、非常に低レベルで発現し、正確な定量化を妨げるか、又は全く発現せず、そのため、それらを示さない。
【図３】図３Ａ−図３Ｃ。刺激後のＤＣ−Ｌ対ＤＣ−Ｓの表面マーカー発現の変化。未成熟段階（ｉＤＣ）でのＤＣ−Ｌ対ＤＣ−Ｓの相対的マーカー発現、及びＬＰＳ、ザイモサン、サイトカインカクテル（ＣＫＣ）、又はＴＧＦ−βによるその後の刺激が示されている。ＤＣ−ＳのＭＦＩを１００に正規化した。１００を超える値及び１００未満の値は、ＤＣ−Ｓと比較して、それぞれＤＣ−Ｌの中でより高い発現及びより低い発現を示す。＊＝ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−ＳのＭＦＩ比についてｐ＜０．０５。全てのマーカーについてｎ≧３。ＳＢ又はＰＩ陰性細胞のみを示す。エラーバー＝±ＳＥＭ。
【図４】図４Ａ−図４Ｂ。ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌで差次的発現した転写産物の特徴付け。ｉＤＣをＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌに選別し、ＬＰＳを含む場合と含めない場合で２４時間再播種し、続いて、ＲＮＡ抽出した。３回の実験のプールを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを用いて分析した。４つのプールしたＲＮＡのデータセット：未成熟段階でのＤＣ−Ｓ及びＬＰＳ刺激後のＤＣ−Ｓ（それぞれ、ｉＤＣ−Ｓ及びｍＤＣ−Ｓ）、並びに未成熟段階でのＤＣ−Ｌ及びＬＰＳ刺激後のＤＣ−Ｌ（それぞれ、ｉＤＣ−Ｌ及びｍＤＣ−Ｌ）を取得した。データを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）及び４のカットオフ（ログ）を用いて前処理した。差次的発現した遺伝子のリストを取得するために、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌの発現プロファイルを互いから差し引いた。各カテゴリ（ｉＤＣ−Ｓ、ｉＤＣ−Ｌ、ｍＤＣ−Ｓ及びｍＤＣ−Ｌ）に提示した遺伝子のリストは、差次的発現し、少なくとも２倍の違いを有する転写産物として定義した遺伝子を表す。したがって、両方のサブセットにおいて同様のレベルで存在する遺伝子は、高発現していても、結果から除外される。使用したカットオフにより、倍数変化は、最小限の過剰発現を示す（違いはより大きいことはあるが、より小さいことはあり得ない）。転写のヒートマップ表示は、全ての他の試料と比較して、ＲＭＡ及びカットオフ後の絶対レベルで示されている。黒は、高発現を示す。薄い灰色は低発現を示す。値を行正規化（ｒｏｗ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）した。上から下に、最高から最低の過剰発現を示す。
【図５】図５Ａ−図５Ｅ。自然発生ＤＣ死の際の表面マーカー発現変化のパターン。ＤＣを、マーカー発現用の蛍光抗体で標識し、ＳＢで共染色した。細胞を、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌ、並びに培養中の自然発生細胞死の進行段階を示すＳＢ陰性、ＳＢ低、及びＳＢ高についてゲーティングした。図５Ａ：代表的な例の密度プロットを示す。各マーカーのＭＦＩをゲートの横に示す。全てのゲートは少なくとも５０個の事象を含む。図５Ｂ〜５Ｅ（棒グラフ）：示されているように、未成熟段階のＤＣ並びにＬＰＳ、ＣＫＣ、及びＴＧＦ−βでの刺激後のＤＣを、蛍光抗体とＳＢで共染色し、上記のようにゲーティングした。図５Ｂ−ＣＣＲ７、図５Ｃ−ＣＤ４５、図５Ｄ−ＣＤ８６、図５Ｅ−ＣＤ３３。値を、ＳＢ陰性ＤＣ−Ｓ＝１００（太線）となるように正規化した。全てのマーカーについてｎ≧３。＊＝ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−ＳのＭＦＩ比についてｐ＜０．０５。‡＝ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−ＳのＭＦＩ比の変化対ＳＢ陰性についてｐ＜０．０５（対応のあるｔ−検定）。エラーバー＝±ＳＥＭ。
【図６】ＣＤ８６及びＰＩで染色した生きたＤＣのイメージング。ｉＤＣをＣＤ８６で標識し、ＰＩで共染色し、Ａｍｎｉｓ  Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（商標）サイトメーターを用いて画像化した。該細胞を、他のフローサイトメーターで使用されるものと類似のスキームを用いて、ＤＣ−Ｓ（左列）及びＤＣ−Ｌ（右列）、並びにＰＩ陰性、ＰＩ低、及びＰＩ高にゲーティングした。全てのセットからの３つの代表的な例を示している。
【図７】図７Ａ−図７Ｃ。食作用、抗原処理、及びＤＣ−Ｓ対ＤＣ−Ｌによる死細胞の取り込み。図７Ａ）標的を、ｉＤＣに添加し、示すようにＬＰＳ、ＣＫＣ、若しくはＴＧＦ−βで事前に２４時間刺激する（「プレ」）か、又はＬＰＳで同時刺激した（「同時」）ＤＣに添加した。＊＝ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ  ＭＦＩ比についてｐ＜０．０５、ｎ≧３。ＳＢ又はＰＩ陰性細胞のみを示す。エラーバー＝±ＳＥＭ。ＤＣを、示した蛍光標的と８〜１２時間インキュベートし、次いで、フローサイトメトリーにより分析した。図７Ｂ）「Ａ」と同じであるが、蛍光色素と過剰コンジュゲートさせたオボアルブミンであり、そのため自己消光であるＤＱ−オボアルブミンを使用した。取り込み及び分解後に、得られたペプチド中の蛍光色素は、まばらであり、蛍光を発することができる。したがって、より高い蛍光は、元のタンパク質のより高い取り込み及び／又は処理を示す。図７Ｃ）ＤＣを、１：４の比でＤｉＤ標識（蛍光）アポトーシスＰＭＮと８〜１２時間インキュベートした。アポトーシス細胞を、ｉＤＣに添加するか、又は示すようにＬＰＳ若しくはＣＫＣで事前に２４時間刺激したＤＣに添加した。次いで、試料をＨＬＡ−ＤＲ又はＤＣＳＩＧＮで染色し、特異的にＤＣを特定し、フローサイトメトリーによって分析した。ＤＣ−ＳのＭＦＩを１００に正規化し、１００を超える値及び１００未満の値は、ＤＣ−Ｓと比較して、それぞれＤＣ−Ｌのうちより高い及びより低い発現を示す。＊＝ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ  ＭＦＩ比についてｐ＜０．０５。†＝成熟ＤＣ対未成熟ＤＣにおけるＤＣ−Ｌ／ＤＣ−ＳのＭＦＩ比の変化についてｐ＜０．０５（対応のあるｔ−検定）。ｎ≧３。ＳＢ又はＰＩ陰性細胞のみを示す。エラーバー＝±ＳＥＭ。
【図８】図８Ａ−図８Ｂ。アポトーシス細胞との相互作用後の表現型。ＤＣを、１：４の比でアポトーシスＰＢＭＣと２４時間混合した。示すように、ＬＰＳを、アポトーシス細胞後６時間の時点で添加した。ＳＢ又はＰＩ陰性細胞のみを示す。４回の実験の代表。図８Ａ：全てのＤＣの表面マーカーの発現の変化を、ｉＤＣについて正規化して示す（太線）。図８Ｂ：上のパネルと同じだが、全てのＤＣの結果を示す代わりに、ｉＤＣ−ＳのＭＦＩを１００に正規化する。１００を超える値及び１００未満の値は、ＤＣ−Ｓと比較して、それぞれＤＣ−Ｌの中でより高い発現及びより低い発現を示す。
【図９】ＦＳＣ対ＳＳＣ統計。ｉＤＣを、実施例１及び図１に記載の戦略に従ってゲーティングした。統計を、１０回のマッチング実験からコンパイルした。未処理のｉＤＣについては、ＤＣ−Ｓは、ｎ＝１０で、４６％〜６９％の範囲で平均５４％であり、ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの間の差についてはｐ＝０．０１８である。ＬＰＳでの成熟の誘導後、ＤＣ−Ｓの平均パーセンテージは、ｎ＝１０で、５３％〜７１％の範囲で６１％の平均値まで増加し、ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの間の差についてはｐ＜０．００１である。
【図１０】細胞死の全ての段階での抗体特異性。ｉＤＣを、同じクローンの非標識抗体の存在下（右）又は非存在下（左）で、フィコエリトリン標識抗ＣＤ９１抗体で染色した。図から分かるように、同じ大きさの観察された蛍光の低下は、細胞死の全ての段階について見られる（ＳＢ高、７６％低下；ＳＢ低、７４％低下；ＳＢ陰性、７６％低下）。同様の結果を、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１ｃについて取得した（試験した全ての抗体クローンについてｎ＝３）。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｂ。ＤＣ死の際の表面マーカー変化のパターンのまとめ。図５及び図６に詳述するように、細胞死の際にマーカー発現変化の異なるパターンのヒートマップの代表を示す。値を、ＳＢ／ＰＩ陰性ＤＣ−Ｓ＝１００になるように正規化した（白四角）。図１１Ａ：パターン１及び２、図１１Ｂ：パターン３及び４。１００を上回る値及び１００未満の値を、それぞれ斜線及び点で表す。
【図１２】図１２Ａ−図１２Ｃ。ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成。図１２Ａは、実施例７に記載の実験で使用したレンチ−第３世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲプラスミドの構造を示す。この構造を検証するためのＲＴ  ＰＣＲ試験の結果を、図１２Ｂ及び図１２Ｃに提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
発明の詳細な説明
本発明は、樹状細胞（ＤＣ）サブ集団を含む細胞調製物、そのような細胞調製物を取得する方法、並びに改善された免疫療法及び癌療法のためのそのような細胞調製物の使用に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、炎症性疾患及び癌に対するワクチンの調製、並びに免疫寛容を誘発するための細胞調製物に有用な、実質的に純粋なヒト単核球由来ＤＣサブ集団の生成並びに使用に関する。
【００６０】
いかなる理論又は機構に縛られることなく、驚くべきことに、単核球由来の細胞をエクスビボで操作すると、別々の形態の複数のＤＣ集団及び実質的に対抗する免疫機能がもたらされることを見出した。本発明の原理によれば、これらの集団は、特に、単離され、互いに分離された時に、エクスビボ及びインビボで免疫プロセスを操作する様々な方法で有用である。そのため、本発明は、癌細胞及びウイルス感染細胞などの標的細胞に対する免疫反応を増加させるか、又は免疫反応を減少させ、かつ自己抗原などの抗原に対する耐性を増加させるための新しいＤＣベースのツールを提供する。
【００６１】
形態学的には、新たに作製され、単離されたＤＣ−Ｌ細胞は、ＤＣ−Ｓと比較して、より大きく（サイズ高）、より細かく（フローサイトメトリーによって決定した場合、粒度高）、かつより複雑な細胞膜（顕微鏡によって決定した場合、複雑さ高、輝度低としても定義され得る）を有する。表現型的には、ＤＣ−Ｌは、ＤＣ−Ｓと比較して、ワイドパネルの表面分子のより高い発現及び成熟刺激に対してより強い反応を示す。これらは別々の細胞集団、並びにそれらの成熟レベルによって区別されたそれらのそれぞれのサブ集団を、トランスクリプトーム遺伝子発現、食作用の能力、抗原プロセシング、壊死細胞の取り込み、細胞死のパターン、及びアポトーシス細胞の取り込みに対する反応を含む様々な機能パラメータによってさらに区別され得る。
【００６２】
一態様によれば、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団又はＤＣ−Ｌ集団（例えば、その未成熟形態の、すなわち、それぞれｉＤＣ−Ｓ又はｉＤＣ−Ｌ）の調製物に関する。
【００６３】
別の態様において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団又はＤＣ−Ｌ集団の調製物を作製する方法を提供する。
【００６４】
別の態様において、本発明は、細胞ワクチン、又は実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団若しくはＤＣ−Ｌ集団の調製物を含む免疫調節細胞組成物を調製する方法を対象とする。
【００６５】
別の態様において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団若しくはＤＣ−Ｌ集団の調製物を含む細胞ワクチン又は免疫調節細胞組成物を対象とする。
【００６６】
他の態様において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ集団又はＤＣ−Ｌ集団の調製物の存在下での活性化を含む、養子Ｔ細胞免疫療法などのＴ細胞療法、Ｔ細胞ワクチン及び免疫調節Ｔ細胞組成物を調製する方法、並びにこれらの方法によってもたらされるＴ細胞療法を対象とする。
【００６７】
さらに別の態様において、提供されるのは、癌及び感染性疾患の治療又は寛解のための方法である。
【００６８】
別の態様において、本発明は、癌及び感染性疾患の病因並びに／又は病理に関与する抗原に対する免疫原性反応を誘導又は増強する方法を提供する。
【００６９】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療又は寛解のための方法を提供する。
【００７０】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の病因並びに／若しくは病理に関与する抗原に対する免疫寛容原性免疫反応を誘導又は増強する方法を提供する。別の態様において、本発明は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の病因並びに／若しくは病理に関与する抗原に対するＴ細胞抑制又はアネルギーを誘導する方法を提供する。
【００７１】
別の態様において、本発明は、それらの形態、表現型及び／又はアポトーシス刺激に対する反応に基づいて細胞集団を区別する方法を対象とする。
【００７２】
本発明のこれらの及び他の実施形態を、以下でさらに説明及び例示する。
【００７３】
ＤＣ調製物及びその作製法
別の実施形態において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓの調製物に関する。特定の実施形態において、本発明は、実質的に精製されたｉＤＣ−Ｓの調製物に関する。別の実施形態において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｌの調製物に関する。特定の実施形態において、本発明は、実質的に精製されたｉＤＣ−Ｌの調製物に関する。
【００７４】
本明細書で使用する「実質的に純粋な」又は「実質的に精製された」という用語は、細胞調製物内の細胞集団と関連して使用される場合、他の細胞集団の存在に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の純度レベルを表す。特に、実質的に純粋なＤＣ−Ｌ、ＤＣ−Ｓ、ｉＤＣ−Ｓ、ｉＤＣ−Ｌ、ｍＤＣ−Ｓ又はｍＤＣ−Ｌ調製物は、他のＤＣ集団を（例えば、本明細書で開示される純度レベルで）実質的に欠いている。
【００７５】
本明細書で使用する「細胞調製物」という用語は、本明細書に開示される特定の細胞型の（例えば、本明細書に開示されるエクスビボ細胞培養及び分離方法による）実験的に作製された細胞組成物を意味する。
【００７６】
ＤＣ−Ｌ及びＤＣ−Ｓという用語は、本明細書の説明及び図面に記載のヒトｍｄＤＣサブ集団を指す。ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの両方とも、ＣＤ１４を弱く及びＤＣＳＩＧＮを強く発現し、両方とも完全に分化したＤＣであることを示す。ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの両方は、低レベルのＣＣＲ７、ＣＤ８３、及びＣＤ２５を発現し、両方とも刺激の際に、これらの及び他の成熟表面マーカーを上方制御し、最初に未成熟である２つのサブ集団が存在することが裏付けられる。ＤＣ−Ｌは、粒度高、サイズ高、複雑さ高ヒトｍｄＤＣとして特徴付けられるのに対し、ＤＣ−Ｓは、粒度低、サイズ低、複雑さ低ヒトｍｄＤＣとして特徴付けられる。２つのサブ集団はまた、実質的に、本明細書に記載及び例示するように、それらの表現型、トランスクリプトーム、食作用、活性化、細胞死、死細胞の取り込み、及び／又は死細胞取り込みに対する反応に基づいて区別され得る。いくつかの実施形態によれば、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌは、例えば、実質的に以下でさらに詳細に、かつ本明細書の実施例の節でさらに例示されるＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含むが、これらに限定されないサイトカインの存在下で培養することにより得られるヒトｍｄＤＣの前述の特徴に基づいて単離され得る。
【００７７】
例えば、ＤＣ−Ｌ及びＤＣ−Ｓは、例えば、本明細書の図２及び図３に例示するように、表面マーカーのそれらの発現レベルに基づいて、様々な実施形態において区別及び／又は単離され得る。いくつかの実施形態において、ＤＣ−Ｌは、都合の良いことに、さらに、αＶβ５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４７、ＣＤ３６、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）、ＣＤ１１ｂ（ＣＲ３）、ＣＤ６（Ｂ７．２）、ＣＤ８５ｋ（ＩＬＴ３）、ＣＤ４０、ＣＤ３２４（Ｅカドヘリン）、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＬＲ−１、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ−３）、ＣＤ２６６（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）、ＣＤ２０６、ＤＣＳＩＧＮ、ＣＤ２００（ＯＸ２）、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２）、ＣＤ１４１、ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２７５（ＩＣＯＳ−Ｌ）、及びＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）からなる群から選択される複数のマーカー（例えば、少なくとも２、３、４、５、６．．．２８又は２９）をその未成熟段階で強く（「高」）発現すると特徴付けられ得、各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、未成熟ＤＣ−Ｌ（ｉＤＣ−Ｌ）は、αＶβ５高、ＣＤ１１ｃ高、ＣＤ４７高、ＣＤ３６高、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）高、ＣＤ１１ｂ（ＣＲ３）高、ＣＤ６（Ｂ７．２）高、ＣＤ８５ｋ（ＩＬＴ３）高、ＣＤ４０高、ＣＤ４５高、ＨＬＡ−ＤＲ高、ＴＬＲ−１高、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ−３）高、ＣＤ２６６（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）高、ＣＤ２０６高、ＤＣＳＩＧＮ高、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）高、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２）高、ＣＣＲ５高、ＨＬＡ−ＡＢＣ高、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２）高、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）高、ＣＤ８０（Ｂ７．１）高、ＣＤ２７５（ＩＣＯＳ−Ｌ）高、及びＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）高として特徴付けられる。他の実施形態において、ｉＤＣ−Ｌは、ＣＤ１１ｃ高、ＣＤ４７高、及びＤＣＳＩＧＮ高として特徴付けられる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ＤＣ−Ｓは、都合の良いことに、さらに、αＶβ５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４７、ＣＤ３６、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）、ＣＤ１１ｂ（ＣＲ３）、ＣＤ６（Ｂ７．２）、ＣＤ８５ｋ（ＩＬＴ３）、ＣＤ４０、ＣＤ３２４（Ｅカドヘリン）、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＬＲ−１、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ−３）、ＣＤ２６６（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）、ＣＤ２０６、ＤＣＳＩＧＮ、ＣＤ２００（ＯＸ２）、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２）、ＣＤ１４１、ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２７５（ＩＣＯＳ−Ｌ）、及びＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）からなる群から選択される複数のマーカー（例えば、少なくとも２、３、４、５、６．．．２８又は２９）をその未成熟段階で弱く（「低」）発現すると特徴付けられ得、各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、未成熟ＤＣ−Ｓ（ｉＤＣ−Ｓ）は、αＶβ５低、ＣＤ１１ｃ低、ＣＤ４７低、ＣＤ３６低、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）低、ＣＤ１１ｂ（ＣＲ３）低、ＣＤ６（Ｂ７．２）低、ＣＤ８５ｋ（ＩＬＴ３）低、ＣＤ４０低、ＣＤ４５低、ＨＬＡ−ＤＲ低、ＴＬＲ−１低、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ−３）低、ＣＤ２６６（ＴＷＥＡＫ−Ｒ）低、ＣＤ２０６低、ＤＣＳＩＧＮ低、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）低、ＣＤ２７３（ＰＤＬ２）低、ＣＣＲ５低、ＨＬＡ−ＡＢＣ低、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２）低、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）低、ＣＤ８０（Ｂ７．１）低、ＣＤ２７５（ＩＣＯＳ−Ｌ）低、及びＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）低として特徴付けられる。他の実施形態において、ｉＤＣ−Ｓは、ＣＤ１１ｃ低、ＣＤ４７低、及びＤＣＳＩＧＮ低として特徴付けられる。
【００７９】
本明細書に記載の細胞表面マーカーのいずれかについての「陽性」若しくは「高」、「弱」若しくは「低」、又は「陰性」という用語、及び全てのそのような指定は、本明細書に記載のアッセイ及び方法の実施に有用な十分に受け入れられた用語である。細胞をそのマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、抗体が細胞に結合しているかどうかを決定するためにそのような接触した細胞のフローサイトメトリー分析を行うことなどの、当業者に公知の方法を用いて検出するのに十分な量で、その細胞表面上にマーカーを発現する場合に、細胞は、細胞表面マーカーについて「陽性」又は「高」とみなされる。細胞は、細胞表面マーカーのメッセンジャーＲＮＡを発現し得る一方で、本明細書に記載のアッセイ及び方法について陽性とみなされるためには、該細胞は、その表面上に目的の細胞表面マーカーを発現しなければならないことを理解されたい。細胞をそのマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、抗体が細胞に結合しているかどうかを決定するためにそのような接触した細胞のフローサイトメトリー分析を行うことなどの、当業者に公知の方法を用いて検出するのに十分な量で、その細胞表面上にマーカーを発現するが、より高いレベルでマーカーを発現する別の異なる細胞集団が存在し、例えば、フローサイトメトリーを用いて分析した時に、識別可能である少なくとも２つの集団が生じる場合に、細胞は、細胞表面マーカーについて「弱」又は「低」とみなされる。同様に、細胞をそのマーカーに特異的に結合する抗体と接触させ、その後、抗体が細胞に結合しているかどうかを決定するためにそのような接触した細胞のフローサイトメトリー分析を行うことなどの、当業者に公知の方法を用いて検出するのに十分な量で細胞表面上にマーカーを発現しない場合に、細胞は、細胞表面マーカーについて「陰性」とみなされる。
【００８０】
同様に、「高」及び「低」という用語は、それらの従来の科学的に受け入れられている意味に従って、大きさ及び粒度などの細胞の物理的特性に関連して本明細書で使用されている。したがって、これらの用語は、フローサイトメトリー分析などの当業者に公知の方法を用いた、前記パラメータに従う別々のサブ集団間の識別及び分化を指す。「高」及び「低」という用語は、さらに、検出方法に依存して、定性的又は定量的に検出され得る細胞の特定の属性に関連して本明細書で使用され得る。例えば、追加の検出方法は、先行する染色の有無にかかわらず、微視的評価を含み得る。
【００８１】
例えば、細胞膜の複雑さに関しては、輝度高及び輝度低の表示で使用される「輝度」という用語は、例えば、複雑さ高及び複雑さ低の表示で使用されるように、「膜の複雑さ」と互換的に使用され得る。「複雑さ低」として特定される細胞集団は、実質的に規則的、円形（２Ｄの）又は球形（３Ｄの）形状を有する膜によって特徴付けられる細胞を指す。「複雑さ高」という表示は、実質的に不規則で複雑な形状を有する膜によって特徴付けられる細胞を指す。複雑さ高及び複雑さ低のＤＣ集団の識別は、典型的に、かつ都合よく、微視的評価、例えば、光学顕微鏡、又は電子顕微鏡などを用いて当業者によって決定される。
【００８２】
加えて、粒度高／低及びサイズ高／低という表示は、さらに、微視的評価によって決定され得る。例えば、サイズ高／低は、顕微鏡によって、少なくとも１．５、例えば、２又は３倍の差の平均直径の差として決定され得る。例えば、ＤＣ−Ｌは、約１６〜３０ミクロンの平均直径を有し得、ＤＣ−Ｓは、約５〜１５ミクロンの平均直径を有し得る。本明細書に例示するように（実施例１及び図１Ｃを参照されたい）、ｉＤＣ−Ｌは、２０〜２５ミクロンの平均直径を有すると決定され、ｉＤＣ−Ｓは、光学顕微鏡によって決定されるように、１０〜１２ミクロンの平均直径を有すると決定された。
【００８３】
別の実施形態において、
ａ）それらの平均サイズ、粒度及び膜の複雑さに基づいて、それぞれサイズ高、粒度高、複雑さ高として特徴付けられるＤＣ−大（ＤＣ−Ｌ）；及び
ｂ）それらの平均サイズ、粒度及び膜の複雑さに基づいて、それぞれサイズ低、粒度低、複雑さ低として特徴付けられるＤＣ−小（ＤＣ−Ｓ）
からなる群から選択される実質的に純粋なヒト単核球由来樹状細胞（ｍｄＤＣ）集団の細胞調製物が提供される。
【００８４】
別の実施形態において、ヒトｍｄＤＣ集団は未成熟ｍｄＤＣの集団であるか、又はヒトｍｄＤＣ集団は成熟ｍｄＤＣの集団である。
【００８５】
ある特定の実施形態において、細胞の大きさは、フローサイトメトリーによって決定される。ある特定の実施形態において、細胞の粒度は、フローサイトメトリーによって決定される。ある特定の実施形態において、細胞の膜の複雑さは、光学顕微鏡によって決定される。
【００８６】
「ＤＣの成熟」は、未成熟の表現型から成熟した表現型へのＤＣの分化を指し、（１）抗原捕捉活性の減少、（２）表面ＭＨＣクラスＩＩ分子及び共刺激分子の発現の増加、（３）それらの移動を案内するケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ７）の獲得、並びに（４）Ｔ細胞分化を制御する異なるサイトカイン（例えば、インターロイキン−１２［ＩＬ−１２］）を分泌する能力を含む多様な細胞変化と関連する。
【００８７】
したがって、本明細書で使用する「未成熟ＤＣ」という用語は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を添加し、２日間培養することによって成熟が誘導された樹状細胞の能力より実質的に低い、例えば、それより１／２低い又は１／４低い抗原提示能を有する樹状細胞を指す。さらに、未成熟ＤＣは、好ましくは、抗原に対する食作用の能力を有し、より好ましくは、本明細書に記載のＴ細胞活性化のための共刺激を誘導する受容体の発現が低いか（例えば、上記のＬＰＳによって誘導される成熟ＤＣと比較して著しく低い）又は陰性発現を示す。未成熟ＤＣは、フローサイトメトリー又は免疫組織化学的染色により、そのような細胞を特定するために使用することができる表面マーカーを発現する。具体的には、表面マーカー発現を含む本発明の未成熟ＤＣ−Ｓ集団及びＤＣ−Ｌ集団の特性は、本明細書にさらに記載されている。
【００８８】
本明細書で使用する「成熟ＤＣ」という用語は、未成熟状態で樹状細胞と比較して、Ｔ細胞などのための著しく強い抗原提示能を有する細胞である。具体的には、成熟樹状細胞は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を添加し、２日間培養することによって成熟が誘導されたＤＣの抗原提示能の半分又はより強い抗原提示能、好ましくは、ＤＣの抗原提示能と同等又はより強い抗原提示能を有し得る。成熟ＤＣは、共刺激細胞表面分子の上方制御された発現を示し、様々なサイトカインを分泌する。具体的には、成熟ＤＣは、より高いレベルのＨＬＡクラスＩ抗原及びクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ）を発現し、一般的に、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６表面マーカーの発現について陽性である。表面マーカー発現を含む本発明の成熟ＤＣ−Ｓ集団及びＤＣ−Ｌ集団の特徴は、本明細書にさらに記載されている。
【００８９】
別の実施形態において、本発明は、ｉＤＣ−Ｓ、ｍＤＣ−Ｓ、ｉＤＣ−Ｌ及びｍＤＣ−Ｌからなる群から選択される実質的に精製されたｍｄＤＣサブ集団の少なくとも１つの細胞調製物を作製する方法を対象とする。別の実施形態において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｓ（例えば、ｉＤＣ−Ｓ又はｍＤＣ−Ｓ）の調製物を作製する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、実質的に精製されたＤＣ−Ｌ（例えば、ｉＤＣ−Ｌ又はｍＤＣ−Ｌ）の調製物を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本方法は、ａ）ヒトｍｄＤＣ集団を提供すること、及びｂ）細胞選別を用いて少なくとも１つのｍｄＤＣサブ集団を単離すること、を含む。
【００９０】
本明細書で使用する「細胞選別」は、典型的には、マーカー（複数可）を特異的に認識する抗体若しくは抗体断片、又は抗体若しくは抗体断片の組み合わせを用いて特異的細胞表面マーカー又はマーカーの組み合わせを有するｍｄＤＣサブセットなどの細胞種の物理的単離をもたらす陽性及び陰性選択の免疫学に基づく方法を包含する。例としては、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズ［磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）］、カラムベースの細胞選別、及び免疫パニングによる細胞選別が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
別の実施形態において、ヒトｍｄＤＣ集団を提供することは、単核球のエクスビボ分化によって行われる。別の実施形態において、ヒトｍｄＤＣ集団を提供することは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で単核球のエクスビボ分化によって行われる。典型的には、分化は、血漿又は血清補充の下で、又はＤＣ分化に適合性のある無血清培地中で行われる。特定の例示的な実施形態において、分化は、０．２〜５％の血漿、２００〜５０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、及び１００〜２５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４の存在下で行われる。他の例示的な実施形態において、分化は、１％血漿、１０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、及び５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４の存在下で行われる。特定の実施形態において、血漿は自己血漿である。特定の実施形態において、血漿は、有効量の血清と、又は当技術分野で公知の細胞増殖及び／若しくは分化を支持するための関連薬剤を補充した有効量の無血清細胞培地と置換される。
【００９２】
例えば、限定されないが、ヒトｍｄＤＣは、以下の典型的な手順によって、末梢血単核細胞から取得され得る。ＰＢＭＣは、フィコール勾配分離によって濃縮され、例えば、１時間のインキュベーション工程の後、プラスチック表面に付着する単核球を選択するために、組織培養フラスコ上に１％自己血漿を含有する培地に播種され得る。リンパ球はフラスコから洗い流され、単核球（接着性ＣＤ１４＋細胞）が単離される。あるいは、ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１４発現についての陽性選択によって（例えば、磁気ビーズ又は細胞選別の他の形態を用いて）精製され得る。次いで、得られたＣＤ１４＋単核球は、（インターロイキン（ＩＬ）−４を含む場合、又含めない場合で）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で数日間培養される。この期間中、単核球は未成熟ＤＣに分化する。５日目に、未成熟ＤＣは、収集、洗浄、及び単離される。ＤＣは、以下でさらに詳細に記載するように、成熟シグナル、例えば、１μｇ／ｍｌのＬＰＳと２４時間インキュベートすることによって、成熟するように刺激され得る。典型的には、細胞ワクチンの作製のために、成熟は、以下でさらに詳述するように、抗原負荷と同時に、又は直後（例えば、１〜数時間後）に誘導される。
【００９３】
別の実施形態において、ヒトｍｄＤＣ集団は未成熟ｍｄＤＣの集団である。別の実施形態において、少なくとも１つのｍｄＤＣサブ集団は、活性化又は成熟刺激の非存在下で（例えば、ＤＣ成熟及び／又は活性化を誘導するのに十分な量で、成熟に適する条件下でそのような外因性刺激を加えずに）未成熟ｍｄＤＣから単離される。別の実施形態において、少なくとも１つのｍｄＤＣサブ集団は、ｉＤＣ−Ｓ及びｉＤＣ−Ｌからなる群から選択され、活性化又は成熟刺激の非存在下で未成熟ｍｄＤＣから単離される。他の実施形態によれば、該細胞は、（成熟に適する条件下で）活性化又は成熟刺激の存在下でのインキュベーションにより、成熟ｍｄＤＣ集団について濃縮され得る。
【００９４】
本明細書で使用する「成熟に適する条件」という表現は、前記細胞の成熟を達成するのに適する条件下で、未成熟樹状細胞を培養することを指す。成熟に適切な条件は、当業者に周知である。成熟樹状細胞は、有効量又は有効濃度の樹状細胞成熟薬剤と未成熟樹状細胞を接触させることによって調製することができる。
【００９５】
本明細書で使用する「樹状細胞成熟薬剤」、及び「成熟薬剤」という用語は、成熟に適する条件下で樹状細胞を前記化合物とインキュベートした場合に、樹状細胞の成熟をもたらすことができる化合物を指す。樹状細胞成熟薬剤には、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、ザイモサン、ＰｇＥ２の混合物、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、及びインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＢＣＧ、ＩＦＮ−γ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、エリトラン（ＣＡＳ番号１８５９５５−３４−４）、ＴＮＦ−α及びそれらの類似体、並びにそれらの組み合わせが含まれ得る。成熟刺激には、成熟に適する条件下で使用される成熟薬剤が含まれる。
【００９６】
ＬＰＳは、ヒトＤＣを含む哺乳類のＤＣ上で発現するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−４のリガンドである。ＴＬＲ４などのＴＬＲを介したシグナル伝達によるシグナル伝達経路の活性化は、炎症性サイトカイン、ケモカイン、主要組織適合複合体を含む様々な遺伝子の誘導、及びＤＣ上の共刺激分子の上方制御につながる（すなわち、ＤＣ成熟につながる）。特定の実施形態において、ＤＣは、１μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下で成熟する。しかしながら、ＬＰＳの他の濃度も同等の結果（例えば、ＣＤ８３又は他の成熟マーカー（複数可）の発現によって決定される、例えば、ＤＣの成熟）を達成するために使用され得ることは十分に理解されたい。そのようなＬＰＳ濃度には、限定されないが、０．００１μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌなどが含まれる。加えて、ＴＬＲは、細菌生成物のリポテイコ酸、ペプチドグリカン、リポタンパク質、ＣｐＧ−ＤＮＡ、及びフラジェリン、並びにウイルス生成物の二本鎖ＲＮＡ、及び酵母生成物のザイモサン、並びにＴＬＲ４及びＴＬＲ２などの細胞外、及び／又はＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ  ９などの細胞内の両方のＴｏｌｌ様受容体を誘発する他の薬剤を認識することが示されている。
【００９７】
他の実施形態において、ＴＬＲ活性化を誘導しない他の成熟刺激は、典型的には、組み合わせて、例えば、サイトカインカクテルの形態で使用される。例えば、本発明の実施形態は、ＰｇＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、又はＴＧＦ−βの組み合わせの使用を用いる。
【００９８】
本明細書に例示するように、成熟は、２〜５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ、１〜２５μｇ／ｍＬのザイモサン、０．２〜５μｇ／ｍＬのＰｇＥ２、２〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α及び１０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βからなるＣＫＣ、又は５〜１２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βとのインキュベーションによって達成され得る。特定の例示的な実施形態において、成熟は、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ、５μｇ／ｍＬのザイモサン、１μｇ／ｍＬのＰｇＥ２、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βからなるＣＫＣ、又は２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βとのインキュベーションによって達成され得る。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００９９】
細胞ワクチン及び免疫調節細胞組成物
他の実施形態において、本発明は、癌若しくは感染性疾患の治療又は寛解、並びに／又は癌若しくは感染性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫原性反応の誘導に有用な細胞ワクチンに関する。いくつかの実施形態において、該ワクチンは、本明細書に記載の実質的に純粋なｍｄＤＣサブ集団を含むＤＣワクチンである。他の実施形態において、該ワクチンは、本明細書に記載の実質的に純粋なｍｄＤＣサブ集団を用いて調製されたＴ細胞ワクチン又は養子Ｔ細胞療法である。
【０１００】
樹状細胞ワクチン接種は、ＤＣを用いた耐久性のある完全な反応をもたらすことができる癌特異的Ｔ細胞依存性抗腫瘍免疫などのＴ細胞依存性免疫を誘導するように設計された免疫療法の形態である。ＤＣワクチン接種における重要なステップは、Ｔ細胞への疾患特異的抗原の効率的な提示である。ＤＣは、Ｔ細胞に対する抗原を捕捉、処理、及び提示する能力を介するワクチン接種の必須成分である。活性化された（成熟した）抗原負荷ＤＣは、特有の機能及びサイトカインプロファイルを示すエフェクターＴ細胞への抗原特異的Ｔ細胞の分化を開始する。「ＤＣ成熟」は、さらに、未成熟表現型から成熟した表現型へのＤＣの分化を指し、（１）抗原捕捉活性の減少、（２）表面ＭＨＣクラスＩＩ分子及び共刺激分子の発現の増加、（３）それらの移動を案内するケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ７）の獲得、並びに（４）Ｔ細胞分化を制御する異なるサイトカイン（例えば、インターロイキン−１２［ＩＬ−１２］）を分泌する能力を含む多様な細胞変化と関連する。いくつかの実施形態によれば、該細胞は、治療すべき疾患の病因及び／又は病理に関連する抗原でパルス又は負荷される。
【０１０１】
そのため、いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗原パルスヒトｍｄＤＣ集団を含むＤＣワクチンに関する。本発明のＤＣワクチンは、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの疾患関連抗原でパルスされた本発明の細胞調製物を含み、前記ワクチンは、さらに、医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。
【０１０２】
本明細書で使用する、抗原又は複数の抗原（例えば、腫瘍細胞溶解物などの腫瘍関連抗原）でＤＣに負荷を与える文脈における「抗原負荷」又は「抗原パルス」という用語は、ＤＣが抗原（複数可）を取り込み（例えば、貪食し）、かつ／又は抗原（複数可）若しくはＤＣ細胞表面上のＭＨＣ分子の文脈における抗原（複数可）由来のペプチドを発現するのを可能にするのに十分な条件下で抗原（複数可）とＤＣを接触させることを意味する。
【０１０３】
本明細書で使用する「抗原の食作用及び／又は発現を可能にするのに十分な条件」という表現は、免疫原の捕捉並びに前記免疫原の免疫系の他の細胞へのプロセシング及び提示を可能にするのに適する媒体中で、十分な時間、樹状細胞をインキュベートすることを指す。
【０１０４】
本明細書で使用する「抗原」という用語は、体内に導入された場合、免疫系によって特異的免疫反応（すなわち、体液性又は細胞性）を誘導する任意の分子を指す。
【０１０５】
様々な実施形態において、本発明の細胞ワクチンによって治療又は寛解される癌及び感染性疾患は、典型的には、Ｔ細胞エピトープを含む特徴的な抗原によって明らかにされる様々な腫瘍及び感染症（例えば、ウイルス）を含み得る。例えば、限定されないが、該癌は、黒色腫、尿路癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、大腸癌及び他の腸管の癌、骨悪性腫瘍、結合組織及び軟組織腫瘍、並びに皮膚癌であり得る。別の実施形態において、該癌は、黒色腫、尿路癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、大腸癌、及び腸管の癌、骨悪性腫瘍、結合組織及び軟組織腫瘍、皮膚癌並びに造血器癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、該癌は、急性リンパ性白血病である。他の実施形態において、該感染性疾患は、様々なウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染と関連し得る。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。例示的な抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＣＡＩＸ、ＣＤ４４  ｖ６／ｖ７、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥｐｈＡ２、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、並びにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）並びに疾患関連抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
都合のよいことに、本発明の実施形態に係る細胞ワクチンは、ａ）実質的に精製されたＤＣ−Ｌ、例えば、少なくとも１つの疾患関連抗原、並びに適切な量のサイトカイン及び／又は他の成熟シグナル（例えば、ＬＰＳ）の存在下でのｉＤＣ−Ｌのエクスビボでのインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｌの少なくとも１つの調製物；並びにｂ）医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。
【０１０７】
他の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の治療又は寛解、及び／又は自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫寛容原性免疫反応の誘導に有用な細胞組成物に関する。いくつかの実施形態において、該組成物は、本明細書に記載の実質的に純粋なｍｄＤＣサブ集団を含むＤＣ組成物である。他の実施形態において、該組成物は、本明細書に記載の実質的に純粋なｍｄＤＣサブ集団を用いて調製されるＴ細胞組成物（例えば、養子移入療法）である。そのような細胞組成物は、さらに、本明細書では、本発明の免疫寛容原性組成物と呼ばれる。
【０１０８】
そのため、本発明は、いくつかの実施形態において、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する少なくとも１つの疾患関連抗原、並びに／又は壊死細胞若しくはアポトーシス細胞でパルスされた本発明の細胞調製物を含む免疫調節組成物であって、前記細胞組成物が、さらに、医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む免疫調節組成物に関する。
【０１０９】
様々な実施形態によれば、本発明の免疫寛容原性組成物によって治療又は寛解されるべき自己免疫疾患及び炎症性疾患は、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、Ｉ型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）並びに自己免疫性肝炎）を含むが、これらに限定されないＴ細胞介在性疾患であり得る。他の実施形態において、該疾患は、炎症性疾患、特に、慢性非解決疾患であり得る。特定の実施形態によれば、該炎症性疾患は、例えば、喘息（特に、アレルギー性喘息）、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、遅延型過敏症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（例えば、特発性肺線維症、又は関節リウマチに関連するＩＬＤ又は他の炎症性疾患）であり得る。別の実施形態において、該疾患は、移植片拒絶反応、例えば、同種移植片拒絶及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であり得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態に係る免疫寛容原性細胞組成物は、ａ）実質的に精製されたＤＣ−Ｓ、例えば、少なくとも１つの疾患関連抗原、並びに適切な量のサイトカイン及び／又は他の成熟シグナル（例えば、ＬＰＳ）の存在下でのｉＤＣ−Ｓのエクスビボでのインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｓの少なくとも１つの調製物；並びにｂ）医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。別の実施形態において、前記抗原は、Ｔ細胞媒介性疾患の病因又は病理に関与している。別の実施形態において、前記抗原は、例えば、自己免疫疾患、慢性非寛解炎症性疾患、又は移植拒絶と関連する抗原、例えば、ＩＩ型ウシ又はニワトリコラーゲン、ＨＣｇｐ３９、凍結乾燥した大腸菌抽出物、１５マーの合成ペプチドｄｎａＪｐ１、並びにｃｉｔ−ビメンチン、ｃｉｔ−フィブリノーゲン、ｃｉｔ−フィブリノーゲン、及びｃｉｔ−ＩＩ型コラーゲンを含むが、これらに限定されないシトルリン化タンパク質、又はこれらのシトルリン化タンパク質に由来するペプチド、インスリン、プロインスリン、ＧＡＤ６５（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）、ＩＡ−２（膵島抗原２；チロシンホスファターゼ）、ＺｎＴ８トランスポーター、ＤｉａＰｅｐ２７７及び他のＨＳＰ６０由来のペプチド、ＭＢＰ１３−３２、ＭＢＰ８３−９９、ＭＢＰ１１１−１２９、ＭＢＰ１４６−１７０、ＭＯＧ１−２０、ＭＯＧ３５−５５、及びＰＬＰ１３９−１５４を含むミエリンペプチドを含むが、これらに限定されない自己免疫抗原を含有し得る。
【０１１１】
他の実施形態において、該細胞は、該対象に投与される前に壊死細胞又はアポトーシス細胞とインキュベートされる。単一の理論又は作用機序に束縛されるものではないが、そのようなインキュベーションは、細胞に免疫寛容原性機能を誘導し得るため、自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療並びに寛解に有用であり得る。そのため、いくつかの実施形態によれば、本発明の実施形態に係る免疫寛容原性組成物は、ａ）実質的に精製されたＤＣ−Ｌ、例えば、壊死細胞又はアポトーシス細胞、必要に応じて少なくとも１つの疾患関連抗原、並びに適切な量のサイトカイン及び／又は他の成熟シグナル（例えば、ＬＰＳ）の存在下でのｉＤＣ−Ｌのエクスビボでのインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｌの少なくとも１つの調製物；並びにｂ）医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。他の実施形態において、本発明の実施形態に係る免疫寛容原性組成物は、ａ）実質的に精製されたＤＣ−Ｓ、例えば、壊死細胞又はアポトーシス細胞、必要に応じて少なくとも１つの疾患関連抗原、並びに適切な量のサイトカイン及び／又は他の成熟シグナル（例えば、ＬＰＳ）の存在下でのｉＤＣ−Ｓのエクスビボでのインキュベーションによって得られる成熟ＤＣ−Ｓの少なくとも１つの調製物；並びにｂ）医薬として許容される担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。
【０１１２】
別の実施形態において、該細胞組成物は、Ｔ細胞組成物、典型的には、抗原特異的Ｔ細胞を含む養子Ｔ細胞組成物である。
【０１１３】
本明細書で使用する「抗原特異的Ｔ細胞」という用語は、本発明の抗原負荷ＤＣへの暴露時に増殖し、かつそれらの表面上に特定の抗原を有する細胞を攻撃する能力を発達させるＴ細胞を指す。そのようなＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、いくつかの方法によって、例えば、標的細胞の表面上のグランザイム及びパーフォリンなどの有毒な酵素を放出すること、又は標的細胞内部へのこれらの溶菌酵素の侵入に影響を与えることによって標的細胞を溶解する。一般的に、細胞傷害性Ｔ細胞は、それらの細胞表面上にＣＤ８を発現する。一般に「ヘルパー」Ｔ細胞として知られている抗原ＣＤ４を発現するＴ細胞はまた、特異的細胞傷害活性を促進することができ、また、本発明の抗原負荷ＤＣによって活性化され得る。
【０１１４】
本発明の養子Ｔ細胞療法には、Ｔ細胞が、（例えば、抗原負荷され、かつ／又はアポトーシス細胞若しくは壊死細胞とインキュベートされた）本発明のＤＣ調製物の存在下で、エクスビボで増殖し、活性化された状態で患者の静脈内に大量に戻されるＴ細胞療法が含まれる。いくつかの実施形態において、該Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）又はＣＴＬ（ＣＤ８＋）であり得る。パルスＤＣによって提示された抗原に特異的な増殖Ｔ細胞は、次いで、単離され、必要に応じて、さらに増殖され、かつ／又は患者への投与前に適切なサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）によってエクスビボで刺激され得る。いくつかの実施形態において、該Ｔ細胞はＤＣと組織適合性がある。しかしながら、他の実施形態（例えば、ＣＡＲ由来細胞が使用される場合）において、該細胞は、それらのＭＨＣ−ＩＩ発現に関して該対象と適合し得ない。
【０１１５】
該細胞集団及び組成物は、ヒトの治療に使用するための任意の便利な方法で投与用に製剤化することができる。ヒトへのインビボ投与のために、本明細書に開示される細胞及び組成物は、医薬として有用な組成物を調製するために使用される公知の方法に従って製剤化することができる。該ＤＣは、単独の活性物質として、又は医薬として適切な希釈剤（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント及び／又は担体と共に他の公知の活性物質（例えば、１以上の化学療法剤）と混合して組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、該細胞は、非経口経路による投与用に製剤化される。「非経口」という用語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、脳槽注射、又は注入技術が含まれる。腫瘍内注入、及び直接の器官内注射（例えば、脾臓内又は肝臓内注射）も含まれる。注射又は注入技術のために、該ＤＣは、限定されないが、ＰＢＳ又は抗凝固剤を含有するＰＢＳなどの任意の適切な注射緩衝液中に懸濁され得る。
【０１１６】
本発明の医薬調製物を含む有効量の細胞、組成物は、部分的に又は完全に、所望の治療効果、予防効果、及び／又は生物学的効果を達成する用量を含む。特定の実施形態において、腫瘍を有する患者に投与される有効量の樹状細胞は、サイズを小さくするか、又は患者における腫瘍の増殖を阻害するのに有効である。特定の用途に有効な実際の量は、治療される状態及び投与経路に依存する。ヒトにおける使用のための有効量は、動物モデルから決定することができる。例えば、ヒトについての用量は、動物において有効であることが見出された循環及び／又は胃腸濃度を達成するように製剤化することができる。
【０１１７】
本明細書に記載の細胞集団及び組成物は、典型的には、単独で、又は有効量の任意の他の活性物質、例えば、化学療法剤と組み合わせて有効量のＤＣを含有する。該組成物中に含有されるＤＣの有効量、又は投与量、及び所望の濃度は、使用目的、患者の体重及び年齢、並びに投与経路を含む多くの要因に依存して変化し得る。
【０１１８】
遺伝子改変された細胞
他の実施形態において、本発明の組成物中の細胞は、例えば、様々なターゲッター（例えば、目的の細胞、腫瘍若しくは組織に対する）、共刺激分子及び／又は抗原を発現するように遺伝子改変され得る。例えば、樹状細胞療法及び他の免疫療法は、Ｔ細胞依存性免疫反応を活性化するためにＴ細胞に刺激シグナルを提供するように作用する共刺激分子を促進し、かつ／又はそれから恩恵を受けることができる。リンパ球の活性化時には、共刺激は、多くの場合、効果的な免疫反応の発達に不可欠である。共刺激は、それらの抗原受容体からの抗原特異的シグナルに加えて必要とされる。共刺激分子の非限定的な例としては、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ（ヒトにおいてＨＬＡ−ＤＲなどのＨＬＡとも呼ばれる）、共刺激分子のＢ７ファミリーのメンバー、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ３０、ＣＤ３０リガンド、４−ＩＢＢ受容体、４−ＩＢＢリガンド、ＣＤ２７、ＦＡＳ受容体、ＦＡＳリガンド、ＴＲＡＩＬ受容体、及びＴＲＡＩＬリガンドが挙げられる。本明細書に記載の様々な態様のいくつかの実施形態において、１以上の共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＭＨＣクラスＩＩ又はＨＬＡ−ＤＲから選択される。共刺激分子の測定又は検出は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【０１１９】
他の実施形態において、本発明の組成物において使用される細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され得る。ＣＡＲは、標的とされる抗原に強く付着する分子の結合部位（すなわち、「結合部分」）は、リンパ球の活性化につながるシグナル伝達の開始に関与する従来の免疫受容体の細胞質ドメイン（「シグナル伝達部分」）と組み合わされる。最も一般的には、使用される結合部分は、標的とされる抗原に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦａｂ（抗原結合）断片の構造に由来する。Ｆａｂは２つの遺伝子の生成物であるので、対応する配列は、通常、重鎖が軽鎖由来のペプチドをそれらの天然形状に折り畳み、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）領域を作製するのを可能にする短いリンカー断片を介して組み合わされる。多くが、Ｔ細胞に抗体断片を付着させる元のＣＡＲシステムとして知られているので、それらはまた、「Ｔボディ」とも呼ばれた。他の可能な抗原結合部分には、ホルモン又はサイトカイン分子のシグナル伝達部分、ライブラリーのスクリーニング（例えば、ファージディスプレイ）由来の膜受容体及びペプチドの細胞外ドメインが含まれる。本発明の組成物に使用されるＣＡＲに適する抗原標的は、本明細書に開示される疾患特異的抗原である。
【０１２０】
特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣは、内因性のＴＣＲからのシグナルの主要伝達者であるＣＤ３ζ鎖からの細胞内ドメインを有する、「第一世代」のＣＡＲを含む。特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣは、さらに、細胞へ追加のシグナルを提供するために、細胞質テイル内の様々な共刺激タンパク質受容体（複数可）からの細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）を含む「第二世代」のＣＡＲを含む。特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣは、効力を増強するために、複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせた「第三世代」のＣＡＲを含む。
【０１２１】
「抗体」という用語は、完全な分子と抗原結合部位を含むその断片の両方を含むことを意味する。本発明に開示される抗体はまた、完全に合成であり得、該抗体のポリペプチド鎖は合成され、おそらく、受容体として本明細書に開示されるポリペプチドとの結合のために最適化されている。そのような抗体は、キメラ又はヒト化抗体であり得、構造は完全に四量体であり得るか、又は二量体であり得、かつ単一の重鎖及び単一の軽鎖のみを含み得る。
【０１２２】
細胞質ドメインに関しては、ＣＡＲは、共刺激分子のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６及び／又はＣＤ４０及び／又はＣＤ８３のシグナル伝達ドメインを単独で、又はＣＡＲに関して有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて含むように設計することができる。本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、インビボで複製することができ、持続腫瘍制御をもたらすことができる長期持続をもたらす。例示的な一実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、所望のＣＡＲ、例えば、抗ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含むレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを該細胞に導入することによって作製することができる。あるいは、そのゲノムに組み込まれずに、Ｔ細胞内に安定して維持されるベクターが使用される。別の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、そのようなＣＡＲ分子をコードする遺伝子の細胞への形質導入又はトランスフェクションによって作製することができる。特定の例示的な実施形態において、該ＣＡＲは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに連結された抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖを含む。他の例示的な実施形態において、該ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに連結された抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖを含み得る。
【０１２３】
本発明は、いくつかの実施形態において、典型的には第２世代のキメラ抗原受容体（又はヒト化）、それだけでなく進んだ世代のキメラ抗原受容体（ヒト化、複数の共刺激細胞内ドメイン、添加したサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２など）及び抗阻害分子）などでの樹状細胞の遺伝子工学処理に関する。
【０１２４】
本発明は、腫瘍試料とのＣＡＲ改変ＤＣのインビトロ相互作用と罹患者へのさらなる注射、並びに／又は成長因子及び他の物質によるＣＡＲ改変ＤＣ集団のインビボ濃縮と、事前に腫瘍に暴露されていない（しかし、腫瘍に特異的なＣＡＲを担持する）ＣＡＲ改変ＤＣのインビボ注射の両方に関する。インビボには、Ｉ．Ｖ．、皮内、皮下、結節内、腫瘍内、及び脳室内（頭部腫瘍）、並びにＣＳＦ内が含まれる。
【０１２５】
いくつかの実施形態によれば、本発明に係るＤＣ集団は、それによって改変されて、追加の抗原をさらに処理してＴ細胞に提示するために、腫瘍を死滅させること及び提示のために消化することの両方を実施し得る。これは、いくつかの実施形態において、腫瘍の再発を防止し、これまでＣＡＲ治療にはあまり影響を受けないと見なされていた腫瘍（すなわち、リンパ腫、ＣＬＬ、固形腫瘍）における有効なＣＡＲ治療を提供することを可能にし得る。
【０１２６】
特定の実施形態において、ＣＡＲ−ＤＣは、１以上の異なる種類のＣＡＲ分子を含むことによって、１以上の癌関連抗原を標的とし、具体的には、関連する癌関連抗原を対象とする。特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、特異的にＣＤ１９を対象とするＣＡＲを含む。特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、特異的にＣＤ２２を対象とするＣＡＲを含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、特異的にＣＤ１９を対象とするＣＡＲと特異的にＣＤ２２を対象とするＣＡＲを含む。特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、特異的にＣＤ１９を対象とするＣＡＲと特異的にＣＤ２２を対象とする異なるＣＡＲを含む。特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、ＣＤ１９及びＣＤ２２を対象とする二重特異性ＣＡＲを含む。特定の実施形態において、本発明のＣＡＲ−ＤＣ細胞は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞によって提示されるＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を標的とする。特定の実施形態において、該ＣＡＲ分子は、ヒト由来及び非ヒト由来の配列を含むキメラＣＡＲ分子である。特定の実施形態において、該ＣＡＲ分子はヒト化ＣＡＲ分子であり、実質的にヒト由来の配列を含む。特定の実施形態において、該ＣＡＲ分子はヒトＣＡＲ分子であり、ヒト由来の配列からなる。養子Ｔ細胞療法には、Ｔ細胞がインビトロで増殖され（例えば、インターロイキン−２の免疫調節作用に依存する細胞培養法を用いて）、活性化状態で大量に患者の静脈内に戻されるＴ細胞療法が含まれる。養子Ｔ細胞療法はまた、対象の又は患者自身のＴ細胞を遺伝子改変し、それらの表面上で組み換え受容体（ＣＡＲ）を生成することを含むことができる。
【０１２７】
所望の遺伝子生成物を送達及び発現させるために使用される発現構築物又はベクターの調製は、当技術分野で公知である。単離された核酸配列は、全（すなわち、完全）遺伝子、又はその一部として、その天然の供給源から取得することができる。核酸分子はまた、組み換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）又は化学合成（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，２及び４章を参照されたい）を用いて生成することができる。
【０１２８】
該構築物はまた、当技術分野で公知の他の調節配列又は選択マーカーを含み得る。該核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも呼ばれる）は、このベクターを、原核生物、真核生物、又は必要に応じてその両方（例えば、シャトルベクター）での複製及び組み込みに適するようにさせる追加配列を含み得る。加えて、典型的なクローニングベクターはまた、転写開始配列及び翻訳開始配列、転写終結コドン及び翻訳終止コドン、並びにポリアデニル化シグナルを含有し得る。
【０１２９】
既に記載した要素に加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローニングされた核酸の発現レベルを増加させること、又は組み換えＤＮＡを保有する細胞の特定を容易にすることが意図された他の特殊な要素を含有し得る。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを担持するプラスミドは、適切な因子がプラスミド上に保有されるか、又は宿主細胞のゲノムと共に運ばれる遺伝子によって提供される限り、エピソーム複製される。
【０１３０】
該ベクターは、真核生物レプリコンを含んでも、又は含まなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、該ベクターは、適切な選択マーカーを用いて真核細胞内で増幅可能である。該ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は可能ではない。その代わり、該組み換えＤＮＡは改変細胞のゲノムに組み込まれるが、プロモーターは所望の核酸の発現を指示する。
【０１３１】
哺乳類発現ベクターの例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、及びｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能であるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能であるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ及びｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能であるｐＴＲＥＳ、並びにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、本明細書に記載の実施形態において有用な構築物のためのベクター骨格として役立ち得る。
【０１３２】
レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターも使用することができる。ＳＶ４０ベクターには、例えば、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルス由来のベクターにはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バーウイルス由来のベクターにはｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。これらは、本発明の構築物についてベクター骨格として役立ち得る。
【０１３３】
上記のように、ウイルスは、多くの場合、宿主防御機構を逃れるように進化してきた非常に特殊化した感染性病原体である。典型的には、ウイルスは、特定の細胞型に感染し、増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、所定の細胞型を特異的に標的化し、それによって感染細胞に組み換え遺伝子を導入するために、その天然の特異性を利用する。そのため、本発明で使用されるベクターの種類は、形質転換された細胞型に依存する。形質転換された細胞型に応じて適切なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのようなものとして、選択の考慮の一般的な説明は、本明細書に提供されていない。
【０１３４】
組み換えウイルスベクターは、水平感染及び標的特異性などの利点を提供するので、本発明の遺伝子のインビボ発現に有用である。水平感染は、例えば、レトロウイルスのライフサイクルに固有であり、単一の感染細胞が、出芽し、隣接細胞に感染する多くの子孫ビリオンを生成するプロセスである。その結果、細胞の大面積が急速に感染し、その大部分は最初に元のウイルス粒子に感染していなかった。これは、感染性病原体が娘子孫を介して唯一拡散する垂直感染とは対照的である。水平方向に広がることができないウイルスベクターも生成することができる。所望の目的が局在数の標的細胞のみに特定の遺伝子を導入することである場合に、この特徴は有用であり得る。
【０１３５】
レトロウイルス由来のベクターには、例えば、レンチウイルスベクターが含まれる。「レンチウイルスベクター」及び「組み換えレンチウイルスベクター」は、レンチウイルスとして知られるレトロウイルスベクターのサブセットに由来する。レンチウイルスベクターは、目的の核酸分子を保有し、特定の実施態様において、目的の核酸分子の発現を指示できる核酸構築物を指す。レンチウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は遺伝子座規定要素（複数可）、又は選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、メッセンジャーの翻訳後修飾、若しくはタンパク質の転写後修飾などの他の手段によって遺伝子発現を制御する他の要素が含まれる。そのようなベクター構築物はまた、使用されるレンチウイルスベクターに適切なパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、並びにポジティブ鎖及びネガティブ鎖のプライマー結合部位（これらは既にレトロウイルスベクター中に存在しない場合）を含んでいなければならない。必要に応じて、該組み換えレンチウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指示するシグナル、ネオマイシン、ＴＫ、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、又はＤＨＦＲなどの選択マーカー、並びに１以上の制限部位及び翻訳終結配列を含み得る。一例として、そのようなベクターは、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。
【０１３６】
「レンチウイルスベクター粒子」は、本発明の範囲内で利用され得、目的の少なくとも１つの遺伝子を保有するレンチウイルスを指す。該レトロウイルスはまた、選択マーカーを含有し得る。該組み換えレンチウイルスは、その遺伝物質（ＲＮＡ）をＤＮＡに逆転写し、感染の際に宿主細胞のＤＮＡにこの遺伝物質を組み込むことが可能である。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ（例えば、アンホトロピック又はＶＳＶ−Ｇエンベロープ）、又はキメラエンベロープを有し得る。
【０１３７】
本発明の原理に係る遺伝物質、具体的にはＤＮＡを生細胞、具体的には樹状細胞に挿入するための、当技術分野で公知の任意の非破壊的方法は、ＣＡＲ遺伝子を標的樹状細胞に送達するのに適用可能であると考えられていることを理解されたい。例えば、トランスフェクション、形質導入、感染及び電気泳動が関連すると考えられている。
【０１３８】
治療的使用
別の実施形態において、本発明は、その必要がある対象における癌若しくは感染性疾患の治療又は寛解のための方法における使用のための、本発明の細胞ワクチンに関する。別の実施形態において、前記疾患関連抗原は、前記対象における癌を治療する方法で使用するための腫瘍関連抗原である。別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における癌若しくは感染性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫原性反応を誘導又は増強する方法における使用のための、本発明の細胞ワクチンに関する。別の実施形態において、前記抗原は、腫瘍関連抗原である。様々な実施形態において、前記腫瘍は、黒色腫、尿路癌、婦人科癌、頭頸部癌、原発性脳腫瘍、膀胱癌、肝癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、大腸癌、及び腸管の癌、骨悪性腫瘍、結合組織及び軟組織腫瘍、皮膚癌並びに造血器癌からなる群から選択され、各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１３９】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の治療又は寛解のための方法における使用のための、本発明の免疫調節細胞組成物に関する。別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫寛容原性免疫反応を誘導する方法における使用のための、本発明の免疫調節細胞組成物に関する。別の実施形態において、前記抗原は、自己免疫疾患、慢性非寛解炎症性疾患、及び移植片拒絶反応からなる群から選択されるＴ細胞媒介性疾患の病因又は病理に関与する。他の実施形態において、前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、Ｉ型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患及び自己免疫性肝炎からなる群から選択され、各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１４０】
本発明に係る細胞ワクチン及び免疫調節細胞組成物は、個別に有益であると決定される本発明に係る成熟ＤＣ、本発明に係る未成熟ＤＣ、及びそれらの任意の組み合わせを含み得ることを理解されたい。
【０１４１】
本発明に係る細胞調製物の存在下で活性化されるＴ細胞調製物は、本発明に係る成熟ＤＣ、本発明に係る未成熟ＤＣ、及びそれらの任意の組み合わせによって活性化され得ることを理解されたい。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、状態、障害若しくは病態の「治療すること」又は「治療」という用語は、（１）状態、障害若しくは病態に罹患するか、又はそれにかかりやすい可能性があるが、状態、障害若しくは病態の臨床症状又は亜臨床症状を経験していないか、又は呈していない哺乳類における状態、障害若しくは病態の臨床症状又は亜臨床症状の出現を予防又は遅延させること；かつ／又は（２）状態、障害若しくは病態を阻害すること、すなわち、疾患若しくはその再発又はその少なくとも１つの臨床症状若しくは亜臨床症状の発症を阻止、低下又は遅らせること；かつ／又は（３）疾患を軽減すること、すなわち、状態、障害若しくは病態又はその臨床症状若しくは亜臨床症状の少なくとも１つの退行を引き起こすこと、を含む。
【０１４３】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における癌若しくは感染性疾患の治療又は寛解の方法であって、該対象に有効量の本発明の細胞ワクチンを投与することを含む方法を提供する。
【０１４４】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における癌若しくは感染性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫原性反応を誘導又は増強する方法であって、該対象に有効量の本発明の細胞ワクチンを投与することを含む方法を提供する。
【０１４５】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の治療又は寛解のための方法であって、該対象に有効量の本発明の免疫寛容原性組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１４６】
別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の病因及び／又は病理に関与する抗原に対する免疫寛容原性免疫反応を誘導する方法であって、該対象に有効量の本発明の免疫寛容原性組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１４７】
典型的には、本発明の細胞ワクチン及び免疫寛容原性組成物において使用される細胞調製物は、実質的に生存可能である。生存可能なＤＣは、いくつかの実施形態において、疾患部位又は疾患組織に遊走する能力を保持しているので好ましい。しかしながら、いくつかの実施形態において、例えば、ＤＣ−Ｌ調製物を含む細胞ワクチンの中でアポトーシスプロセスを開始した細胞の使用が企図される。
【０１４８】
別の実施形態において、本発明の方法で対象に投与される細胞は、自己由来である。別の実施形態において、本発明の方法で対象に投与される細胞は同種異系である。本発明の方法の特定の実施形態によれば、該細胞組成物は、該対象と組織適合性がある（例えば、自己細胞又はＭＨＣ  ＩＩ適合同種細胞）。本発明の方法の他の特定の実施形態によれば（例えば、ＣＡＲ由来細胞を使用する場合）、該細胞組成物は、該対象と組織適合性はない。
【０１４９】
別の実施形態において、細胞ワクチン又は免疫寛容原性組成物の調製のためのキットであって、単離細胞集団及び／又は本明細書に記載のそれらの調製の手段を含むキットが提供される。
【０１５０】
本明細書に開示された細胞組成物及び製剤の投与量は、疾患、患者の病歴、投与の頻度、投与の様式、及び宿主からの細胞の排除などの性質に応じて変化し得る。初期用量はより多いが、その後はより少ない維持用量になり得る。該用量は、有効な投与レベルを維持するために、毎週若しくは隔週程度の低い頻度で投与されるか、又はより少ない用量に分割し、毎日、週２回、隔週、年４回などで投与され得る。予備的な用量は、動物試験に従って決定することができ、ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当技術分野で認められた慣行に従って行うことができる。特定の実施形態において、対象は、本明細書に記載のＤＣベースの組成物の１つの用量、２つの用量、３つの用量、４つの用量、５つの用量、６つの用量又はそれ以上で投与され得る。
【０１５１】
患者への投与用のＤＣの典型的な投与量（有効量）は、多かれ少なかれ細胞が使用され得るが、用量当たり１×１０３〜１×１０８細胞の範囲であり得る。特定の実施形態において、樹状細胞の数は、１×１０４〜１×１０８、特定の実施形態において、１×１０５〜１×１０８、なお特定の実施形態において、１×１０６〜１×１０８、かつ特定の実施形態において、１×１０６〜１×１０７の範囲である。しかしながら、他の範囲は、治療に対する患者の反応に応じて可能である。さらに、初期用量は、その後のＤＣの投与用量と同じ、又はより低い若しくはより多くなり得る。
【０１５２】
対象へ細胞を投与するための様々な手段は、当業者に公知である。そのような方法は、全身注射、例えば、ｉ．ｖ．注射、又は対象の標的部位への細胞の移植を含むことができる。細胞は、対象への注射又は移植による導入を容易にする送達装置に挿入することができる。そのような送達装置は、レシピエント対象の体内に細胞及び液体を注入するためのチューブ、例えば、カテーテルを含むことができる。いくつかの実施形態において、該チューブは、さらに、例えば、細胞を所望の位置で該対象に導入することができる針を有する。該細胞は、様々な異なる形態での送達用に調製することができる。例えば、該細胞は、溶液若しくはゲルに懸濁するか、又はそのような送達装置に含有される場合には、支持マトリックスに包埋することができる。細胞は、細胞が生存可能なままでいる医薬として許容される担体又は希釈剤と混合することができる。
【０１５３】
医薬として許容される担体及び希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒及び／又は分散媒体が含まれる。そのような担体及び希釈剤の使用は、当技術分野で公知である。溶液は、好ましくは、無菌であり、流体である。好ましくは、本明細書に記載の細胞の導入前に、該溶液は、製造及び貯蔵の条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどの使用によって細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。
【０１５４】
細胞投与のための直接注入技術はまた、脈管構造全体を通って、又は、例えば、肝臓、若しくは腎臓又は任意の他の器官などの特定の器官の脈管構造への細胞の遊出を刺激するために使用することができる。これには、脈管構造の非特異的標的化が含まれる。１つは、特定の注入部位、例えば、肝臓の門脈を選択することによって任意の器官を標的化することができる。あるいは、注入は、体内の任意の静脈内に全身的に行うことができる。所望であれば、哺乳類又は対象は、薬剤で前処理することができ、例えば、組織標的細胞を増強するために投与される薬剤（例えば、ホーミング因子）を、所望の組織を標的とすることを細胞に促すためにその部位に配置することができる。例えば、組織へのホーミング因子の直接注入は、細胞の全身送達前に行うことができる。
【０１５５】
別の実施形態において、本発明は、細胞のサブ集団間を区別する方法であって、ａ）細胞調製物を提供すること、ｂ）該調製物を少なくとも１つのアポトーシス刺激に供すること、及びｃ）少なくとも１つのアポトーシス刺激後に、それらの形態、表現型及び／又は機能における別々の変化に基づいて、調製物中の別々の細胞サブ集団を特定すること、を含む方法を対象とする。
【０１５６】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、それらは、決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１５７】
実施例
材料及び方法
培地＆試薬
細胞培地は、１％Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からなっていた。蛍光アネキシンＶは、ＭＢＬ社（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。Ｓｙｔｏｘブルー（カタログ番号Ｓ１１３４８）、ＤｉＤ（カタログ番号Ｄ３０７）、蛍光デキストラン（分子量１０，０００、カタログ番号Ｄ２２９１０）、可溶性アレクサフルオロ４８８ヒドラジド（カタログ番号Ａ１０４３６）、ＤＱ−オボアルブミン（カタログＤ８２０５３）、蛍光大腸菌（カタログ番号Ｅ１３２３１）蛍光ザイモサン（カタログ番号Ｚ２３３７３）、及びＣＦＤＡ−ＳＥ（「ＣＦＳＥ」、カタログ番号Ｃ１１５７）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から入手した。蛍光ラテックスビーズ（カタログ番号Ｌ５４０５）、ＤｉＯＣ６（３）（カタログ番号３１８４２６）、カルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（「ＣＣＣＰ」、カタログ番号Ｃ２７５９）、ＰｇＥ２（カタログ番号Ｐ０４０９）、ザイモサン（カタログ番号Ｚ４２５０）、ヘマトキシリン（カタログ番号ＧＨ５１１６）、エオシン（カタログ番号Ｈ４０２１６）、クリスタルバイオレット（カタログ番号Ｃ０７７５）、及び大腸菌からのリポ多糖（カタログ番号Ｌ６５２９）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ヨウ化プロピジウムは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの両方から入手した。ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−１βは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。一次抗体は、Ｄａｋｏ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及びＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ−ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）から入手した。二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手した。マウス及びヤギＩｇはＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから入手した。
【０１５８】
ＰＭＮ及び単核球の単離
白血球を取得するための２つの選択肢は、１）健康なドナーのバフィーコート、又は２）健常ボランティアの末梢血）であった。ＰＭＮの単離のために、ＲＢＣを０．９％ＮａＣｌ溶液中６％ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｅｐ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を添加することによって沈殿させ、最大４０分間、室温に保った。次いで、懸濁液の白血球に富む上層を回収し、フィコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる密度勾配上で遠心分離した。残留赤血球を低張性溶解により除去した。単核球の単離のために、ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配を用いて調製した。次に、ＣＤ１４磁性ビーズを用いた陽性選択を、製造業者の説明書に従って行った（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。ＰＭＮ及び単核球の両方について、純度は、９５％を超え、かつＰＩも９５％超が排除された。
【０１５９】
単核球由来樹状細胞の作製
未成熟ｍｄＤＣを、前述のＰＢＭＣのＣＤ１４＋選択画分から作製した。簡単に説明すると、単核球を１％自己血漿、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）、及びＩＬ−４（５００Ｕ／ｍＬ）の存在下で、１．２５×１０６個／１．５ｍＬ培地の濃度で、１２ウェルプレートの中央のウェルに播種した。隔日で、０．１５ｍＬを培地から除去し、血漿、ＩＬ−４、及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地０．２５ｍＬを添加した。ｉＤＣを６日目に取得した。成熟ＤＣを取得するために、６日目に、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ、５μｇ／ｍＬのザイモサン、又は１μｇ／ｍＬのＰｇＥ２、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βからなるサイトカインカクテル（ＣＫＣ）と共に、新鮮な培地及びサイトカインをｉＤＣに与えた。あるいは、ＴＧＦ−βを、２５ｎｇ／ｍＬで添加した。
【０１６０】
細胞死の誘導及び検出
前述のように、生存能力アッセイを行った。簡単に説明すると、染色緩衝液は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、０．７５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳからなっていた。アネキシンＶ、ＤｉＯＣ６（３）、ＰＩ及びＳＢを滴定し、最適なシグナル・ノイズ比を取得した。アネキシンＶ及びカルシウムを、細胞の分析の１０分前に添加した。カルシウムを、１．５ｍＭに達するまで添加した。ＤｉＯＣ６（３）を、培養物からの細胞抽出の３０分前に添加した。ＤｉＯＣ６（３）を滴定し、ＣＣＣＰを用いた陽性対照を用いて確認した。ＰＢＭＣ中のアポトーシスを誘導するために、それらを、白血球フェレーシスにより採取し、凍結した。使用の日に、それらを解凍し、メチルプレドニゾロン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に暴露し、その後、それらは初期アポトーシスの表現型（６０％超のアネキシンＶ＋、５％未満のＰＩ＋）を獲得した。ＰＭＮにおいてアポトーシスを誘導するために、それらを、１４±２時間、２４ウェルプレート中の１ｍＬのＲＰＭＩ中、４×１０６個／ｍＬでインキュベートした。壊死ＰＭＮについては、８０％超がトリパンブルー陽性になるまで、細胞を５６℃でインキュベートした。取り込みアッセイのために、製造業者の説明書に従ってＰＭＮをＤｉＤで染色し、その後、上記のように、細胞死を誘導した。
【０１６１】
食作用及び相互作用の研究
食作用の標的を８〜１２時間、ＤＣに添加した。以下の濃度を使用した：可溶性アレクサフルオロ４８８ヒドラジド、蛍光デキストラン、及びＤＱ−オボアルブミン、１ｍｇ／ｍＬ；蛍光大腸菌、ＤＣ当たり１０個の粒子；蛍光ザイモサン、ＤＣ当たり３個の粒子；蛍光ラテックスビーズ、ＤＣ当たり１５又は５０個のビーズ。試料の調製を検査するために、対照標的を３０分間、氷上でインキュベートした。ＤｉＤ標識アポトーシス又は壊死ＰＭＮを、洗浄工程の後に、ＤＣ当たり４個の細胞で添加した。８〜１２時間の標識細胞とのインキュベーション後に、ＤＣの特異的特定のために、試料をＨＬＡ−ＤＲ又はＤＣＳＩＧＮのいずれかで染色し、次いで、フローサイトメトリーを用いて分析した。相互作用の研究のために、アポトーシス細胞又は壊死細胞を洗浄し、ＤＣ当たり４個の細胞でＤＣに添加し、その後、分析前に２４時間インキュベートした。示した場合には、ＬＰＳを、アポトーシス細胞の添加後６時間の時点で添加した。死細胞との相互作用後にＤＣの表現型を決定するために、少なくとも１種類の標識が高度に発現したＤＣ特異的マーカーであるように抗体カクテルを設計し、散乱ゲートに入った遊離アポトーシス細胞を排除した。
【０１６２】
サイトメトリー
ＦＡＣＳｃａｎ（商標）、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターを使用し、主にＬＳＲ  ＩＩ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、及びＩｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（商標）１００（Ａｍｎｉｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用した。補償をソフトウェアで行った。顕微鏡観察のために、Ｍｉｃｒｏｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  ３．３  ＲＴＶ  ＣＣＤカラーカメラ（Ｑ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を搭載したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００顕微鏡を使用した。細胞を、細胞遠心分離により調製し、次いで、９５％エタノールで固定し、標準ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色プロトコルに従った。あるいは、細胞にクリスタルバイオレットの１ｍｇ／ｍＬ溶液の１０％を添加した後、ライブで撮影した。結果の信頼性を確認するために、いくつかの手段をとった。１）抗体競合研究を行い、研究した細胞死の段階で、抗体結合が特異的であることを確認した。２）パルス面積対高さのダブレット識別を使用して、測定値を偏らせ得る細胞対を排除した。３）アイソタイプ対照を広く使用して、非特異的結合を評価及び特定した。異常に高いアイソタイプ結合によって特定される悪い試料を排除した。残りの試料については、（自己蛍光を含む）アイソタイプの寄与を、計算から数学的に差し引いた。４）直接コンジュゲートした抗体を優先的に使用した。５）抗体標識を、７５μｇ／ｍＬのマウスＩｇの存在下で行った。あるいは、二次染色を、７５μｇ／ｍＬのヤギＩｇの存在下でヤギ抗マウス抗体を用いて行う場合には、精製抗体を用いた。６）染色緩衝液は、ＨＥＰＥＳ及び１％ウシ胎児血清（全てＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから）を補充し、カルシウムを含まないＰＢＳからなっていた。７）図１Ａに示すように、末期アポトーシス細胞及び断片を、ＤＣクラスターからうまくゲーティングして除外した。
【０１６３】
細胞選別
選別はＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて行った。ｉＤＣを６日目で採取し、ＣＤ４７、ＣＤ１１ｃ、及びＤＣＳＩＧＮ、並びにＳＢで染色した。次いで、それらを、全３種類のマーカーを最低レベルで発現する細胞としてＤＣ−Ｓを、及び最高レベルで発現する細胞としてＤＣ−Ｌを選択する階層ゲーティングを作成することによって選別した。単核球については、ＰＢＭＣを、ＣＤ１４及びＣＤ１６、並びにＳＢで染色した。次いで、それらを、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−及びＣＤ１４弱ＣＤ１６＋集団に選別し、ＤＣへの分化のために、上記のように６日間培養した。
【０１６４】
ＲＮＡ＆マイクロアレイ
選別後、ＤＣを再播種し、自己血漿、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ４の存在下で２４時間インキュベートした。成熟が誘導されたときに、ＬＰＳを１０ｎｇ／ｍＬで添加した。次いで、ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｕｉａｇｅｎ社（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＲＮｅａｓｙキットを用いて抽出した。３人のドナーからのＲＮＡをプールし、次いで、処理して、ヒト遺伝子１．０  ＳＴマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、発明者らの施設の遺伝子治療Ｇｏｌｄｙｎｅ  Ｓａｖａｄ研究所の中の遺伝子治療のためのイスラエル国家戦略センターのマイクロアレイ施設で分析した。マイクロアレイデータの前処理は、ＲＭＡを用いて行った。プローブセットの強度をｓ対数スケールに変換し、４のカットオフを使用した。プローブセットは、それらが２以上の線形倍率変化を示した場合、差次的発現であると考えられた。ｒｅｆｓｅｑアイデンティティーを欠くプローブを排除し、同一の遺伝子に対応する複数のプローブの場合を一緒に照合した。
【０１６５】
データ分析
フローサイトメトリーデータのソフトウェア分析を、ソフトウェア補償を含むＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて行った。細胞死の際の表現型を研究する際、関連するアイソタイプを使用して、表面マーカーの他の部分として測定し、以下に詳述するように、ＳＢ又はＰＩが高い、低い若しくは陰性としてゲーティングした。次に、データをまとめる際に、（自己蛍光を含む）アイソタイプＭＦＩを、マーカーＭＦＩから差し引いた。ヒートマップを、「ヒートマップビルダー（Ｈｅａｔ−ｍａｐ  Ｂｕｉｌｄｅｒ）」（スタンフォード大学医学部）を用いて作成した。統計解析を、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。有意性カットオフについて０．０５のｐ値を用いる統計分析のためのスチューデント両側ｔ−検定を用いた。該当する場合、図の凡例に示すように、対応のあるｔ−検定を用いた。
【０１６６】
実施例１．前方散乱及び側方散乱分析が、形態学的に異なる２つのＤＣサブセットであるＤＣ−小及びＤＣ−大を明らかにする
「ＤＣ−小（ＤＣ−Ｓ）」及び「ＤＣ−大（ＤＣ−Ｌ）」と呼ばれる細胞の２つのクラスターを、フローサイトメトリー光散乱プロットにて特定した（図１Ａ）。これらの２つの集団は、機械の集光光学系の違いに応じて様々な程度に分割されるが、使用した全てのフローサイトメーターに現れた。未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）のうち、ｉＤＣ−Ｓは、平均して、全細胞の約５４％を含み（図９）、ｉＤＣ−Ｌは、平均して、全細胞の約４７％を含む。ＬＰＳでの成熟の誘導後、ＤＣ−Ｓの平均パーセンテージは約６１％の平均値に増加する一方で、ＤＣ−Ｌの平均パーセンテージは約３９％の平均値まで減少する（図９）。
【０１６７】
細胞死は、一般的に光散乱特性の変化を伴っていることを考慮して、これら２つの集団が異なる生存率の状態を表しているかどうかを検討した。全体として、計算上ＤＣの５％未満がトリパンブルー陽性であり、ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの両方は、アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、及びＳｙｔｏｘブルー（ＳＢ）によってアッセイした場合、大部分が生細胞であった。これらの知見を、ミトコンドリア膜電位感受性色素のＤｉＯＣ６（３）を用いて確認した。そのため、細胞生存率は、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌの違いを考慮していない。
【０１６８】
前方散乱は、細胞サイズの有用な近似である。ＤＣは、撮像されたときにサイズが著しく異種であることが示され、より小さい細胞及びより大きい細胞が存在するという事実を支持した（図１Ｂ）。選別の際、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌにおける形態学的差異は、別々の集団で再現される（図１Ｃ）。ＤＣ−Ｌはより大きく、それらは、より大きな膜の複雑さを示し、かつより細かい。図１Ｃに見られるように、ｉＤＣ−Ｌは、顕微鏡評価により、約２０〜２５ミクロンの平均直径を有すると決定され、ｉＤＣ−Ｓは、約１０〜１２ミクロンの平均直径を有すると決定された。
【０１６９】
ヒト単核球は、ＣＤ１６＋及びＣＤ１６−の２つの主な集団で構成されるので、それらがＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌの発達に関与するかどうかを調べた。そのために、末梢血単核球を、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−集団及びＣＤ１４弱ＣＤ１６＋集団に選別し、同じプロトコルを使用して、それらをＤＣに分化させた。両方の単核球サブ集団がＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌを生じたため、細胞の新しいクラスターは、「古典的な」ＣＤ１６クラスター集団と重複しないことが示唆された。
【０１７０】
実施例２．ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌは、異なるレベルの表面マーカーを発現し、成熟刺激に対して異なる反応をする
次に、表面マーカーの発現を、抗体の大規模パネルを用いてこれら２つの集団において特徴付けた。ＤＣが未成熟である場合（培養６日目）、表面マーカーの相対発現は、それらの相対的分布の広いスペクトルを示し、ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ比は９４〜１３５に及んだ（図２）。ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの両方は、ＣＤ１４を弱く、ＤＣＳＩＧＮを強く発現し、両方とも完全に分化したＤＣであることが示される。ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの両方は、低レベルのＣＣＲ７、ＣＤ８３、及びＣＤ２５を発現し、刺激時に、両方ともこれら及び他の成熟表面マーカーを上方制御する。これにより、異なる成熟段階で、ＤＣの１集団よりむしろ最初は未成熟である２つのサブ集団が存在することが確認される。
【０１７１】
ＰｇＥ２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β；ＬＰＳ；ザイモサン；又はＴＧＦ−βのサイトカインカクテル（ＣＫＣ）による刺激後に、ＤＣを試験した場合、顕著な多様性が認められ、場合によって、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌの反応パターンの相違でさえ認められた（図３、異なる表面マーカーが図３Ａ及び図３Ｂに提示されている）。
【０１７２】
全ての成熟ＤＣを見ると（すなわち、別々にＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌを分析する前）、ＬＰＳ及びＣＫＣに特異的な反応が見られ、公知の文献と一致している。別々にサブ集団を分析した場合でも、ＣＫＣ及びＬＰＳの両方について、図３Ｂに見られるように、サブセット特異的変化が観察された。ＤＣ−Ｌは、ＣＫＣ若しくはＬＰＳ刺激後に、それぞれ刺激表面マーカーＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＣＤ２５、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、及びＣＤ５４のより高い発現を示す。
【０１７３】
対照的に、刺激は、ｉＤＣで見られるＣＤ１３５又はαＶβ３インテグリン発現のＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ比を変えない。ＣＣＲ５、Ｅ−カドヘリン、又はＣＤ２０６については、ｉＤＣのＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ比は、使用される刺激の比から大きく異なる。
【０１７４】
ＤＣＳＩＧＮ又はＣＤ１１ｂなどの他の場合では、ＴＧＦ−βの比はｉＤＣについて見られる比（ＤＣ−Ｌ＞ＤＣ−Ｓ）と同様であり、ＬＰＳ、ザイモサン、及びＣＫＣは、これらのマーカーのＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ比を１００に向かって移動させる。他の場合もあり、例えば、ＣＤ１４では、反応が単一刺激、この場合はザイモサンについて顕著に異なる。
【０１７５】
それらが未成熟の間は、ｉＤＣ−ＳとｉＤＣ−Ｌの両方は、ＣＤ１４１（ＢＤＣＡ−３）を強く発現するが、ＤＮＧＲ１のレベルは低い（図２）。ＬＰＳによる刺激後に、ＣＤ１４１及びＤＮＧＲ１それぞれについて、全体的な発現レベルは５０％及び１００％増加するが、ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ比は、１２０及び９５で不変のままである（図２）。
【０１７６】
まとめると、負荷の際、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌは、表面マーカー特異的かつ刺激特異的であり得る異なる反応を示す。重要なことに、本明細書で使用されるＤＣがランダムなヒトドナーのうちの１０人からのもので、その初代細胞は、分化及び刺激中に、最長で培養８日を過ぎているという事実にもかかわらず、これらの結果が一貫していることである。
【０１７７】
実施例３．ＲＮＡマイクロアレイは、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌ上で差次的発現をする多様な遺伝子を明らかにする
ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌ間の差異の本質をよりよく理解するために、それらの転写プロファイルを分析した。図４に、検討した４つの試料：未成熟段階でのＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌ（ｉＤＣ−ＳとｉＤＣ−Ｌ、それぞれ）及び成熟段階でのＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌ（ｍＤＣ−ＳとｍＤＣ−Ｌ、それぞれ）のヒートマップ表現が示されている。図４は、４つの全ての試料と比較して、目的の遺伝子の絶対発現レベルを示す。未成熟ＤＣ−Ｓ試料において、いくつかの免疫学的に関連する遺伝子生成物は、ｉＤＣ間で未成熟ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ表現型発現規模の最後から１／３にあることを見出した。これは、トランスクリプトームと観察された表現型の間の重要な相関性を提供する。いくつかの他の免疫学的に関連する遺伝子も、ｉＤＣ−Ｓ試料中に存在する。ｉＤＣ−Ｌ試料はまた、重要な免疫遺伝子、及び機能はまだ完全には理解されていない多数の遺伝子を有していた。
【０１７８】
ＬＰＳ成熟段階でのＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌを比較すると、遺伝子の繰り返しが観察され、そのトランスクリプトームの安定性を示し、その明確な、安定したアイデンティティーのさらなる証拠を提供する。成熟ＤＣ−Ｓ試料において、多くの遺伝子は、未成熟段階で存在しないことが見出された。成熟ＤＣ−Ｌ試料において、相当数の免疫学的に関連する遺伝子、並びに豊富なアポトーシス関連遺伝子及び死細胞の取り込みに関連する遺伝子が存在する。
【０１７９】
実施例４．細胞死の際の表面マーカー発現はＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌについて異なる
生存可能なＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌは表面マーカー発現のレベルが異なるので、細胞死の際にも、違いがあるかどうかを検討した。この疑問を調べるために、全ての試料をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、及び／又はＳｙｔｏｘブルー（ＳＢ）で共染色した。ＰＩの蛍光強度、並びに他の膜排除された核酸特異的蛍光色素の強度が、細胞死の進行と相関していることが示された。ＳＢとＰＩの両方を滴定及び試験し、ＰＩ＋ＳＢ二重染色を含めて、両方の色素について結果は等しかった。次いで、これらの細胞を、ＳＢ若しくはＰＩのそれらの取り込みに応じて陰性、低い、又は高いとして分類し、各状態について目的の表面マーカーの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を測定した（図５）。驚くべきことに、一貫性のあるパターンが観察され、死亡時にＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの表現型の間に有意差が示された。見られるように、細胞が死のプロセスに進む場合、異なるマーカーの発現レベルは変化する。ＣＣＲ７については、ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの両方は、細胞死が進むにつれて、それらの発現を増加させる。この場合、ＣＣＲ７の最も高い発現を有し、最も明確な可視化を可能にするので、ＣＫＣ処理細胞を示す。ＣＤ４５の場合には、対照的に、ＤＣ−Ｌは、細胞死が進むにつれて、なおも発現レベルを増加させるが、ＤＣ−Ｓについては実際に減少する。３つの一般的な発現パターンを特定し、図５の棒グラフに示している：パターン１、細胞死が進行するにつれて、表面マーカー発現は、ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの両方について増加する（図５Ｂ、ＣＣＲ７）；パターン２、ＤＣ−Ｌについては、表面マーカー発現は増加するが、細胞死が進行するにつれて、ＤＣ−Ｓについては減少する（図５Ｃ、ＣＤ４５）；パターン３、表面マーカー発現は、細胞死が進行するにつれて、使用した刺激に応じた挙動と共に、混合パターンを示す（図５Ｄ、ＣＤ８６）か、又は表面マーカー発現は、細胞死が進むにつれて単調に変化しない（図５Ｅ、ＣＤ３３）。注目すべきは、ほとんどの場合、混合パターン（パターン３）は、パターン２と同様であった。図１１は、これらの結果がヒートマップ表現の中で試験した全マーカーについて集計したものであることを示す。
【０１８０】
示した細胞は、自然発生細胞死を受けるＤＣを表す。非特異的抗体結合は、死細胞での結果に影響を与える可能性がある。研究したプログラム細胞死（ＰＣＤ）の段階で、非特異的結合を最小化するプロトコル（材料及び方法を参照されたい）を用いて、抗体は特異的に結合する（図１０）。細胞がより進んだ細胞死の段階に入ると、それらの光散乱特性が変化し、分析ゲートから出る（図１）。ＰＩ及びＳＢは、アネキシンＶ陽性となった直後に、初期アポトーシス段階で細胞への侵入を開始する。次いで、それらは、細胞死の過程が進むにつれて、次第により多くのＰＩ又はＳＢを獲得する。これは、進行している細胞死のマーカーとしてＰＩ又はＳＢ強度の使用（単なる陽性対陰性とは対照的に）の背後にある根拠である。注目すべきは、アネキシンＶ及びＰＩ又はＳＢと一緒に表面マーカーの染色を行った実験から、アネキシンＶ単一陽性段階からＰＩ又はＳＢの低い段階へ進む時に、表面マーカー発現のレベルは非常に小さな違いしかないことが示された。したがって、簡略化のために、細胞死の間のマーカー発現変化を研究する時に、ＰＩ又はＳＢのみを用いてさらなる実験を行った。
【０１８１】
まとめると、表面マーカーの発現は、ＤＣ細胞死の際に変化する。これは、均一ではないが、異種プロセスであり、異なるマーカー及び異なる刺激は、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌについて差次的な変化の方向並びに大きさに影響を与える。
【０１８２】
ＳＢ低段階又はＰＩ低段階及びＳＢ高段階又はＰＩ高段階でのＤＣ状態をさらに評価するために、細胞をＣＤ８６及びＰＩで染色し、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（商標）サイトメーター（Ａｍｎｉｓ，ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を用いてライブで分析した。図６に見られるように、サイズ、形状、並びに細胞内及び膜の複雑さにおけるＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの間の形態学的差異が観察された。細胞はＰＩ低段階に進むと、観察される形態学的変化はない。これは、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ分析ソフトウェアによって提供される一連の定量的形態学的測定によって確認された。これにより、ＰＩ低段階が実際にアポトーシスの初期段階に対応することが確認される。ＰＩ高段階でのみ、ＤＣ−Ｓのわずかな収縮及び膜の損失及びＤＣ−Ｌの細胞質の複雑さなどの形態学的変化が観察される。ＰＩは核内で強く蛍光を発し、屈折する。それにもかかわらず、これらの「ＰＩ高細胞」でさえ、小疱のない無傷の核を有する完全細胞である。
【０１８３】
まとめると、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌは、細胞死の過程に入ると表現型の異なる変化を示す。表現型の変化は、成熟状態及び刺激の影響を受ける。これらの変化は、細胞死の形態学的証拠の収集の前及び初期段階で起きる。
【０１８４】
実施例５．ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌは別々の食作用能を有するが、ＤＣ−Ｌは抗原処理及び死細胞の取り込みに優れている
ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの間の機能の違いを模索し続けるために、それらに未成熟段階、ＬＰＳ、ＣＫＣ、又はＴＧＦ−βで刺激した後、又はＬＰＳと同時に様々な蛍光標的を与えた。使用される全ての蛍光色素は、エンドソーム酸性化の影響を受けない。図７Ａに見られるように、ＤＣ−Ｓ及びＤＣ−Ｌは、デキストラン食作用又は可溶性染料の飲作用についてそれらの能力に有意差はない。ＤＣ−Ｓは、大腸菌のより良好な食作用に向かう傾向を示し、ＣＫＣでの成熟後に有意になる。ＤＣ−Ｓはまた、ラテックスビーズの食作用の著しく良好な能力を示し（ＴＧＦ−β処理したＤＣを除く）、ビーズのより高い負荷でより顕著になる。ＤＣ−Ｌ細胞は、対照的に、ザイモサン粒子の取り込みのより良好な能力を示し、同時に与えたＬＰＳでの成熟後に顕著になる。これらの結果は、明らかに、細胞サイズが全ての細胞機能を決定しないことを示している。「より大きい」は、必ずしも、「より多く」ではない。図７Ｂは、ＤＣ−Ｌが、抗原の取り込み及びプロセシングのためのアッセイであるＤＱ（商標）−オボアルブミン（タンパク質分解の際に、明るい緑色蛍光を示すオボアルブミンの自己クエンチコンジュゲート）を提供した後に、より強いシグナルを示すことを実証する。両方のサブセットは、同様に飲作用を行い（図７Ａ）、（オボアルブミンの受容体である）ＣＤ２０６の発現の差は著しくより低い程度であるので（図３）、これより、ＤＣ−Ｌが抗原プロセシングに特に優れていることが示唆される。
【０１８５】
次に、ＤＣに、未成熟段階で又はＬＰＳ若しくはＣＫＣでの成熟後のいずれかで、蛍光標識アポトーシス多形核（ＰＭＮ）細胞を与えた。図７Ｃは、差異が大きくなくても、ＤＣ−Ｌは、未成熟段階及びＣＫＣでの成熟後にアポトーシスＰＭＮの取り込みに優れているが、ＤＣ−Ｓは、ＬＰＳでの成熟後のアポトーシスＰＭＮ取り込みに優れていることを示している。ＤＣに壊死ＰＭＮも提供すると、驚くべきことに、ＤＣ−Ｌによる取り込みは、アポトーシス細胞の取り込みを上回り、ＤＣ−Ｓについて観察された速度よりもはるかに効率的であった（図７Ｃ）。
【０１８６】
実施例６．ＤＣ−Ｌは、アポトーシス細胞の取り込み後に免疫寛容原性表現型を獲得する
次いで、アポトーシス細胞との相互作用後のＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌの違いをアッセイした。６時間後にＬＰＳを添加する場合と添加しない場合で、アポトーシス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を４：１の比でｉＤＣに２４時間添加した。図８Ａに示すように、ＤＣの両方のセットについてのデータ解析により、未成熟段階での免疫寛容原性表現型の誘導及びＬＰＳに対する反応の阻害（ＣＤ４０を除く）により、アポトーシス細胞からの強力な免疫調節効果が明らかになる。
【０１８７】
ＤＣ−Ｓ対ＤＣ−Ｌの分析（図８Ｂ）から、アポトーシス細胞とｉＤＣの相互作用後に、ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ発現比がＣＤ４０及びＣＤ８６について減少し、ＤＣ−Ｓに対してＤＣ−Ｌ発現が減少したことが示される。同時に、ＤＣ−Ｌ／ＤＣ−Ｓ比は、ＣＤ９１、ＣＤ２７５、及び、特にＨＬＡ−ＤＲについて増加した。このパターンは、アポトーシス細胞を受けとったＤＣにＬＰＳを添加したときに再現されたが、この時は程度がさらに増した。これらの結果を確認するために、ＰＢＭＣの代わりにアポトーシスＰＭＮを用いてこれらの実験を繰り返し、同様の結果が得られた。注目すべきことに、これらの結果は、アポトーシス細胞を含めないでそれらを刺激した時に見られる反応と比較した場合、ＬＰＳに対するＤＣ−Ｓ対ＤＣ−Ｌの反応が反対であることを示す（図３）。
【０１８８】
まとめると、アポトーシス細胞は、ＬＰＳの添加後でさえ、ＤＣ−ＳとＤＣ−Ｌ間で、免疫抑制表現型を誘導する。さらに、アポトーシス細胞との相互作用後、ＤＣ−Ｌは、ＨＬＡ−ＤＲの相対的な発現を増加させながら優先的に共刺激分子を抑制し、その傾向は、実際、アポトーシス細胞にＬＰＳを添加した後に増加した。
【０１８９】
実施例７．抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成
単核細胞（ＭＮＣ）をバフィーコートから収集し、ＤＬＩのような方法により凍結した。解凍時に、ＭＮＣを、４８時間、それぞれ、１：３の細胞対ビーズ比で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ）により活性化した。ビリオンを、レンチ−第３世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲプラスミド（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ；図１２Ａ）及びｐＨｅｌｐ１−３パッケージングプラスミドでトランスフェクトしたレンチ−Ｘ  ２９３細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ−Ｔａｋａｒａ）から生成した。ＣＡＲは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに連結された抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖを含む。活性化細胞を、０．７ｍｌのウイルス上清及び２μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の添加によって感染させ、遠心分離した（５００ｇ、４５分間、３２℃）。次いで、細胞を１００ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下でインキュベートした。トランスフェクションの成功の検出のために、ＲＴ  ＰＣＲを用いた（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。
【０１９０】
実施例８．抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−ＤＣの生成及び細胞毒性アッセイ
ＤＣ−Ｌ及びＤＣ−Ｓ集団を、基本的には、実施例７に記載のとおりに、レンチ−第３世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲプラスミドでトランスフェクトする。標的細胞（白血病／リンパ腫）及び対照細胞を、懸濁液中同数で混合し、各々を異なる色（ＣＦＳＥ又はＣＭＴＭＲのいずれか）で予め標識した。次いで、ＣＡＲ−ＤＣ細胞を添加し、培養物を４時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を７ＡＡＤ（生死判別マーカー、ＰＩとよく相関する）で染色し、細胞をＦＡＣＳによって分析する。ゲーティングを、７ＡＡＤ陰性（生存）細胞上にて行い、ＣＡＲ−ＤＣ細胞の％細胞毒性を推定するために計算する。
【０１９１】
実施例９．二重特異性ＣＡＲ−ＤＣの生成
ＤＣ細胞の遺伝子操作は、任意の腫瘍関連抗原に対する抗腫瘍ＤＣ細胞を迅速に作製するための手段を提供する。このアプローチを用いて、外因性ＣＡＲを有する本発明に係る未成熟ＤＣ−Ｌ（ｉＤＣ−Ｌ）、成熟ＤＣ−Ｌ（ｍＤＣ−Ｌ）、未成熟ＤＣ−Ｓ（ｉＤＣ−Ｓ）及び成熟ＤＣ−Ｓ（ｍＤＣ−Ｓ）を生成し、これらの細胞集団は、特異的癌関連細胞を標的化する。
【０１９２】
そのようなＣＡＲ−ＤＣ細胞を取得するために、本発明に係る成熟若しくは未成熟のＤＣ−Ｌ細胞又はＤＣ−Ｓ細胞を、当技術分野で周知のプロトコルに従って、腫瘍関連抗原認識ＣＡＲをコードする遺伝子を保有するプラスミドでトランスフェクトする。その後、これらの細胞を処理して、ＣＡＲ、例えば、実施例７などに記載のＣＤ１９に結合するＣＡＲを安定に発現する安定クローンを生成する。
【０１９３】
ＣＡＲ−ＤＣ細胞によって与えられる選択圧は、抗原エスケープ変異体をもたらし得るので、これらの細胞を、必要に応じてさらにトランスフェクトし、その結果、それらは複数（２、３など）の異なるＣＡＲを安定的に発現し、その結果、それらの癌細胞への標的化はより特異的になり、抗原エスケープ変異体を形成しにくくなる。例えば、二重標的化ＣＡＲ−ＤＣは、ＣＤ１９に結合するＣＡＲとＣＤ２２に結合するＣＡＲの両方を発現し得る。ＣＤ１９−ＣＡＲ−ＤＣ細胞を用いた細胞毒性実験において、エフェクター／標的比の関数として、ヒトＣＤ１９を発現する標的細胞のみを溶解する。この実験において、ＣＤ１９及びＣＤ２０の両方を担持するヒトＢ細胞リンパ腫由来であり、懸濁液中で成長するので、Ｒａｊｉ細胞を標的細胞集団として使用する。Ｒａｊｉ細胞の特異的細胞死滅を模倣するために、キメラ抗ヒトＣＤ２０薬物であるリツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ，Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用する。陰性対照標的細胞として、また懸濁液中で成長し、ＣＤ１９又はＣＤ２０を担持しないＴＨＰ−１細胞を使用する。
【０１９４】
実施例１０．急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療におけるＣＡＲ−ＤＣの使用
急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者から得られた癌細胞を、細胞外マーカー発現プロファイルについて試験する。このプロファイルから、１以上の癌関連抗原を特定する。次いで、例えば、実施例７に記載の方法などによって生成されるＣＡＲ−ＤＣ細胞を生成し、これらのＣＡＲ（複数可）は、癌関連抗原、例えば、ＣＤ１９及びＣＤ２２を特異的に認識する。
【０１９５】
次に、１種類のＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ２２）を発現する各細胞、又は特定した多数の癌関連抗原に結合するように適合されたＣＡＲのアレイ（例えば、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２）を発現する特定の細胞のいずれかの本発明に係るＣＡＲ−ＤＣ細胞で患者を治療する。投薬及び投与レジメンは、ケースバイケースで決定され得る。
【表１】
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【０１９６】
特定の実施形態の上記の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、現在の知識を適用することにより、過度の実験を行うことなく、かつ一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態の様々な適用のために容易に改変及び／又は適合させることができ、したがって、そのような適合及び改変は、開示される実施形態の意味及びその均等物の範囲内で理解されることが意図されるべきである。本明細書で用いられる表現又は専門用語は、説明の目的のためであり、限定するものではないことを理解されたい。様々な開示される機能を行うための手段、材料、及び工程は、本発明から逸脱することなく、別の様々な形態をとることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【国際調査報告】
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