(57)【要約】酵素などの治療ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質をコードする配列を細胞に挿入し、それによって、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を処置および／または予防するためのタンパク質または細胞治療薬を供給するためのヌクレアーゼおよびこれらのヌクレアーゼを使用する方法。ハーラー（またはＭＰＳ  Ｉ）病を処置および／または予防するため、ならびにハンター（ＭＰＳ  ＩＩ）症候群を処置および／または予防するための方法および組成物が本明細書に開示されている。
2019505523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）またはムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の被験体における中枢神経系（ＣＮＳ）機能障害を低減または予防する方法であって、
該被験体に、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）またはヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする導入遺伝子を含むプロモーターなしドナーベクターを投与するステップと、
内因性アルブミン遺伝子に対して標的化されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の対をコードする発現ベクターを投与するステップと
を含み、
該導入遺伝子が、肝臓細胞内の該アルブミン遺伝子に、該アルブミン遺伝子の開裂後に組み込まれ、したがって、該コードされるｈＩＤＵＡまたはｈＩＤＳが該肝臓から発現および分泌され、さらに、該肝臓から分泌された該ｈＩＤＵＡまたはｈＩＤＳが該被験体の該中枢神経系（ＣＮＳ）において見出され、したがって、該ＣＮＳ機能障害が低減または予防される、方法。
【請求項２】
前記ＣＮＳ機能障害が、認知障害を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体に、前記ドナーベクターおよび前記発現ベクターの投与の前および後に免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記導入遺伝子の発現により、前記被験体の脳内のグリコサミノグリカンのレベルがモジュレートされる、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記被験体におけるニューロンまたはグリア空胞化が低減または排除される、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記被験体におけるニューロンまたはグリア空胞化が、該被験体の脊髄における低減または排除された細胞活動である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
学習能力の喪失が、処置されていない個体と比較して低下する、請求項１から６までのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＺＦＮの対が、表１に示されているジンクフィンガータンパク質を含む、請求項１から７までのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＺＦＮ発現ベクターおよび前記ドナーベクターが、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を含む、請求項１から８までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＺＦＮ発現ベクターおよび前記ドナーベクターＡＡＶが、静脈内注射によって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体に投与される前記ＺＦＮ：ＺＦＮ：ドナー比が、１：１：８である、請求項１から１０までのいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
アルブミン遺伝子のイントロン１に組み込まれたｈＩＵＤＡまたはｈＩＤＳをコードするプロモーターなしドナーベクターを含み、該ｈＩＵＤＡまたはｈＩＤＳを発現および分泌する、Ｈｅｐ２Ｇ細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＨｅｐ２Ｇ細胞を含む細胞培養物であって、培養培地が前記ｈＩＵＤＡまたはｈＩＤＳを含む、細胞培養物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の細胞または請求項１３に記載の細胞培養物から分泌されたｈＩＵＤＡおよび／またはｈＩＤＳを含む医薬組成物。
【請求項１５】
ｈＩＵＤＡまたはｈＩＤＳタンパク質を、それを必要とする被験体に供給する方法であって、該被験体に請求項１４に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１６年１月１５日に出願した米国仮出願第６２／２７９，３９４号、２０１６年２月２６日に出願した米国仮出願第６２／３００，２７１号、および２０１６年４月２８日に出願した米国仮出願第６２／３２８，９２５号の利益を主張する。これらの出願の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、神経性疾患、特に、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）、ならびにシャイエ症候群（ＭＰＳ  ＩＳ）およびハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ  Ｈ−Ｓ）などの「軽症型」と、より急速進行性の形態であるハーラー症候群（ＭＰＳ  ＩＨ）およびハンター症候群としても公知のムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の両方を含めた、中枢神経系障害を有するリソソーム病の処置、ならびに遺伝子療法の分野に入る。
【背景技術】
【０００３】
背景
遺伝子療法には、ヒト治療薬の新時代のための巨大な可能性が秘められている。これらの方法体系により、これまでは標準の医療行為では対処できなかった状態に対する処置が可能になる。特に有望な一領域は、導入遺伝子を細胞に付加して、その細胞に、以前はその細胞において産生されていなかった産物を発現させることができることである。この技術の使用の例としては、治療タンパク質をコードする遺伝子の挿入、細胞または個体において何らかの理由で欠如しているタンパク質をコードするコード配列の挿入、およびマイクロＲＮＡなどの構造核酸をコードする配列の挿入が挙げられる。
【０００４】
導入遺伝子が細胞自身のゲノム中に組み込まれ、そこで維持されるように、導入遺伝子は、種々のやり方で細胞に送達することができる。近年、選択されたゲノム遺伝子座への標的化挿入のために部位特異的ヌクレアーゼを用いた開裂を使用する、導入遺伝子を組み込むための戦略が開発された（例えば、共有される米国特許第７，８８８，１２１号を参照されたい）。ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（工学技術で作製された（engineered）ガイドＲＮＡを利用する）などのヌクレアーゼ系は、標的化遺伝子に特異的であり、導入遺伝子構築物が、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により駆動されるプロセス中の末端捕捉によってのいずれかで挿入されるように利用することができる。例えば、米国特許第９，３９４，５３１号；同第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第９，１５０，８４７号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１９６３７３号；同第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０３３５７０８号を参照されたい。これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００５】
標的化遺伝子座としては、ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子、アルブミン遺伝子およびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６などの「セーフハーバー」遺伝子座が挙げられる。例えば、米国特許第９，３９４，５４５号；同第９，２２２，１０５号；同第９，１５０，８４７号；同第８，８９５，２６４号；同第８，７７１，９８５号；同第８，１１０，３７９号；同第７，９５１，９２５号；米国特許出願公開第２０１００２１８２６４号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１５９１７２号を参照されたい）。ヌクレアーゼ媒介性組込みでは、導入遺伝子のランダムな組込みに依拠する古典的な組込み手法と比較して、遺伝子サイレンシングまたは近くの癌遺伝子の活性化のリスクを最小にするための正確な導入遺伝子の配置が可能になり、それにより今度は、疾患の処置および／または予防のためのタンパク質の供給が可能になるので、導入遺伝子発現の改善、安全性および発現持続性の増加の見込みがもたらされる。
【０００６】
導入遺伝子の標的細胞への送達は、この技術を十分に遂行するために克服しなければならない１つの障害であるが、乗り越えなければならない別の問題は、導入遺伝子を細胞に挿入し、発現させた後、したがってコードされる遺伝子産物が必ず生物内の（with  the  organism）必要な場所に到達し、効果的であるのに十分な局所的濃度になることを保証することである。タンパク質の欠如または異常な非機能性タンパク質の存在を特徴とする疾患に対しては、野生型タンパク質をコードする導入遺伝子の送達が非常に役立ち得る。
【０００７】
リソソーム蓄積病（ＬＳＤ）は、通常、廃脂質（waste  lipid）、ムコ多糖（即ち、グリコサミノグリカン（glycosoaminoglycan）（ＧＡＧ））の分解に関与する機能的な個々のリソソームタンパク質の欠如を特徴とする希少な代謝的単一遺伝子疾患の群である。これらの疾患は、特異的酵素が機能しないことに起因してこれらの化合物を再利用のために処理できないことから、これらの化合物が細胞内に集積することを特徴とする。ＬＳＤの病態生理は、最初、ＧＡＧの単純な沈着に関係すると考えられたが、現在の研究により、これらの疾患の複雑さが認識されている。ＧＡＧ貯蔵は、細胞、組織および器官の恒常性の撹乱をもたらすようであり、また、炎症応答の活性化をもたらすサイトカインおよび炎症性モジュレーターの分泌の増加にも結び付けられている（Muenzer（２０１４年）、Mol  Gen  Metabol、１１１巻：６３〜７２頁）。
【０００８】
最も一般的な例は、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損症−遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリー病（αガラクトシダーゼＡ欠損症：ＧＬＡ）、ハンター症候群（ＭＰＳ  ＩＩ、イズロン酸−２−スルファターゼ欠損症とも称される：ＩＤＳ）、ハーラー症候群（ＭＰＳ  ＩＨ、アルファ−Ｌイズロニダーゼ欠損症とも称される：ＩＤＵＡ）、ポンペ病（アルファ−グルコシダーゼ：ＧＡＡ）およびニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損症−ＳＭＰＤ１）である。全てを合わせてグループ化した場合、集団におけるＬＳＤの発生率は７０００人の出生のうち約１人である。処置選択肢は、欠けている酵素を患者に通常は静脈内注射によって大用量で与える酵素補充療法（ＥＲＴ）を含む。そのような処置は、単に症状を処置するためのものであり、治癒的ではなく、したがって、患者は、残りの生涯にわたってこれらのタンパク質を繰り返し投薬されなければならず、潜在的に、注射されるタンパク質に対する中和抗体が発生し得る。
【０００９】
ＭＰＳ  Ｉは、ＩＤＵＡ（アルファ−Ｌイズロニダーゼ）欠損に関連し、１００，０００件の出生ごとにおよそ１回生じる。ＩＤＵＡ酵素欠損の結果、脳を含めたいくつかの器官のリソソームにＧＡＧが蓄積し、それにより、疾患の臨床的発現がもたらされる。ＧＡＧは、尿、血漿、および組織において検出することができ、疾患の進行についてのバイオマーカーとしての働きをし得る。ＧＡＧは、常染色体性劣性障害であり、正常なＩＤＵＡ遺伝子１つと変異体コピー１つとを有するヘテロ接合体の被験体では、産生される酵素の量が減少するが、野生型遺伝子から十分な酵素が産生されるので、無症候性である可能性がある。患者に関しては、ハーラー症候群の症状は、ほとんどの場合、３歳から８歳の間に現れ、それらとして、脊椎の異常な骨、鷲手、角膜の濁り、聴覚消失、成長停止、心臓弁の問題、硬直を含めた関節疾患、経時的に悪化する知的障害、および低い鼻梁を伴う厚い、粗い顔の特長が挙げられ得る。いっそう重症であるハーラー症候群を有する乳児は、出生時には正常に見え、生涯の最初の２年の間に顔の症状がより目立つようになる可能性がある。小児が年を取るにつれ、低身長を発症し（最大およそ４フィート）、多くの場合、１０歳までに閉塞性気道疾患、呼吸器感染症、または心臓の合併症により死亡する。
【００１０】
臨床的に、ＭＰＳ  Ｉは、３つのカテゴリー：該状態を最初に記載した医師にちなんで名づけられたハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、およびシャイエ症候群に分けられる。ハーラー症候群は、一般に、最も重症とみなされ、脳が影響を受ける。シャイエ症候群は、最も「軽度」［または軽症］である。多くの人は、この２つの間に入り、それが、ハーラー・シャイエと称される。
【００１１】
ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型、ＭＰＳ  ＩＩ）は、機能的なイズロン酸２−スルファターゼ酵素（ＩＤＳ）の欠如、および、その後の、影響を受けている個体におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積によって引き起こされる希少なＸ連鎖リソソーム障害である。ハンター症候群は、出生する男性１００，０００〜１５０，０００人ごとにおよそ１人を冒し、女性では非常に稀に生じ得る。ＭＰＳ  ＩＩは、多様な進行性の多系統障害であり、大多数の患者では症状が重症であり、低年齢（１０〜２０歳）で死亡が起こるが、この障害のより軽症型の患者は５０代および６０代まで生存することが報告されている（Wraithら、（２００８年）Eur  J  Pediatr、１６７巻：２６７〜２７７頁）。
臨床的に、本領域の深刻な結末（severe  end  of  the  spectrum）にある患者は、出生時には正常に見えるが、多くの場合、１８カ月齢から３６カ月齢の間に、再発性の呼吸器感染症、発育遅延、関節の硬直および股関節形成不全、再発性の臍ヘルニアおよび鼡径ヘルニア、ならびにＭＰＳ  ＩＩに関連する典型的な顔の特長（前頭部の突出、平らな鼻梁、舌の肥大および頭部の肥大）の発生という症状に基づいて診断される。疾患が進行するにつれて、臨床的発現は多系統のものになり、肺系および心臓系ならびに筋骨格系およびＣＮＳが影響を受ける。重症型と軽症型の差異は、主に神経変性および精神的欠陥の存在に起因する。
ＭＰＳ  ＩおよびＭＰＳ  ＩＩに対する標準処置は、＄１００，０００から＄５００，０００まで変動する酵素補充療法（ＥＲＴ）、または、１回におよそ＄２００，０００の費用がかかる造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、またはこの２つの組合せのいずれかである。しかし、これらの処置選択肢には、実質的な欠点がある。ＥＲＴに関しては、長期処置のいくつかの試験研究により、ＥＲＴ使用の持続時間と生活の質の悪化の統計的に有意な関連性が示されている（AronovichおよびHackett（２０１５年）Mol  Gen  Metabol、１１４巻：８３〜９３頁）。さらに、ＥＲＴは、体細胞疾患（ＣＮＳが関与しない）の好転に使用されており、また、外因的に与えられた酵素は血液脳関門を横断しないので、神経性疾患の処置のためは非効率的である（Muenzer、同上）。ＨＳＣＴに関しては、ＨＳＣＴプロセスに起因した死亡率が有意である（少なくとも１０％）（AronovichおよびHackett、同上）。したがって、ＣＮＳ機能障害を有する最も重症のＭＰＳ  ＩおよびＭＰＳ  ＩＩ患者は、現在利用可能な処置では十分なサービスを受けられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献２】米国特許第９，３９４，５３１号明細書
【特許文献３】米国特許第９，２５５，２５０号明細書
【特許文献４】米国特許第９，２００，２６６号明細書
【特許文献５】米国特許第９，０４５，７６３号明細書
【特許文献６】米国特許第９，００５，９７３号明細書
【特許文献７】米国特許第９，１５０，８４７号明細書
【特許文献８】米国特許第８，９５６，８２８号明細書
【特許文献９】米国特許第８，９４５，８６８号明細書
【特許文献１０】米国特許第８，７０３，４８９号明細書
【特許文献１１】米国特許第８，５８６，５２６号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，５３４，２６１号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，５９９，６９２号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，５０３，７１７号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，６８９，５５８号明細書
【特許文献１６】米国特許第７，０６７，３１７号明細書
【特許文献１７】米国特許第７，２６２，０５４号明細書
【特許文献１８】米国特許第７，９７２，８５４号明細書
【特許文献１９】米国特許第７，９１４，７９６号明細書
【特許文献２０】米国特許第７，９５１，９２５号明細書
【特許文献２１】米国特許第８，１１０，３７９号明細書
【特許文献２２】米国特許第８，４０９，８６１号明細書
【特許文献２３】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書
【特許文献２４】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２０１０／０２１８２６４号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書
【特許文献３２】米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書
【特許文献３３】米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書
【特許文献３４】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書
【特許文献３５】米国特許出願公開第２０１３／０１９６３７３号明細書
【特許文献３６】米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書
【特許文献３７】米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号明細書
【特許文献３８】米国特許第９，３９４，５４５号明細書
【特許文献３９】米国特許第９，２２２，１０５号明細書
【特許文献４０】米国特許第８，８９５，２６４号明細書
【特許文献４１】米国特許第８，７７１，９８５号明細書
【特許文献４２】米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７２号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Muenzer（２０１４年）Mol  Gen  Metabol、１１１巻：６３〜７２頁
【非特許文献２】Wraithら（２００８年）Eur  J  Pediatr、１６７巻：２６７〜２７７頁
【非特許文献３】AronovichおよびHackett（２０１５年）Mol  Gen  Metabol、１１４巻：８３〜９３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、例えば、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を、導入遺伝子の発現が治療的に意味のあるレベルのものになるように送達するためのゲノム編集による処置を含めた、ＭＰＳ  ＩおよびＭＰＳ  ＩＩ疾患を処置するために使用することができる方法および組成物が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
概要
ハーラー（またはＭＰＳ  Ｉ）病を処置および／または予防するため、ならびにハンター（ＭＰＳ  ＩＩ）症候群を処置および／または予防するための方法および組成物が本明細書に開示されている。本発明は、導入遺伝子配列を適切な標的細胞に挿入するための方法であって、ここで、導入遺伝子が、該疾患を処置するタンパク質（例えば、ＭＰＳ  Ｉについては全長または短縮されたＩＤＵＡタンパク質；ＭＰＳ  ＩＩについては全長または短縮されたＩＤＳタンパク質）、例えば、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩにおいて欠如または欠損しているタンパク質をコードし、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子から供給されると、それぞれＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩを処置および／または予防する、方法を記載する。本発明は、ＩＤＵＡまたはＩＤＳをコードする導入遺伝子が、その疾患を処置する（例えば、その疾患に関連する症状のうちの１つまたは複数を緩和する）タンパク質を発現するように、適切な標的細胞に発現系をトランスフェクトおよび／または形質導入する方法も記載する。ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質は標的細胞から放出され得、したがって、導入遺伝子を有さない他の細胞に影響を与えるまたはそれらによって取り込まれることが可能になる（バイスタンダー効果または交差補正（ｃｒｏｓｓ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ））。本発明は、高レベルのＩＤＵＡまたはＩＤＳを産生する細胞（例えば、成熟細胞または未分化細胞）を生成する方法であって、これらの変更された細胞の集団を患者に導入することにより、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩを処置および／または予防するために必要なタンパク質が供給される、方法も提供する。さらに、本発明は、高度に活性な形態（治療的な）のＩＤＵＡまたはＩＤＳを産生する細胞（例えば、成熟細胞または未分化細胞）を生成する方法であって、これらの変更された細胞の集団の患者への導入または患者における創出により、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を処置する（例えば、１つまたは複数の症状を低減または排除する）ために必要なタンパク質の活性が供給される、方法が提供される。
【００１６】
一つの態様では、本明細書において、ムコ多糖症Ｉ型（mucopolysaccharidosis  type  I）（ＭＰＳ  Ｉ）および／またはムコ多糖症Ｉ型（mucopolysaccharidosis  type  I）（ＭＰＳ  ＩＩ）の被験体における中枢神経系（ＣＮＳ）機能障害を低減または予防する方法であって、該被験体に、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）および／またはヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）をコードする導入遺伝子を含むプロモーターなしドナーベクターを投与するステップと、内因性アルブミン遺伝子に対して標的化されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の対をコードする発現ベクターを投与するステップとを含み、該導入遺伝子が、肝臓細胞内の該アルブミン遺伝子に、該アルブミン遺伝子の開裂（cleavage）後に組み込まれ、したがって、該コードされるｈＩＤＵＡおよび／またはｈＩＤＳが該肝臓から発現および分泌され、さらに、該肝臓から分泌された該ｈＩＤＵＡおよび／またはｈＩＤＳが該被験体の該中枢神経系（ＣＮＳ）（例えば、血液脳関門を横断する）において見出され、したがって、該ＣＮＳ機能障害が低減または予防される、方法が提供される。本明細書に記載される方法のいずれかでは、ＣＮＳ機能障害は、認知障害を含む（例えば、学習能力の喪失が処置されていない個体と比較して低下する）；導入遺伝子（複数可）により被験体の脳内のグリコサミノグリカンのレベルがモジュレートされる；ならびに／または被験体におけるニューロンもしくはグリア空胞化がＣＮＳ（脳および／もしくは脊髄）において低減もしくは排除される。方法は、被験体に免疫抑制剤をドナーベクターおよび発現ベクターの投与の前および後に投与するステップをさらに含み得る。本明細書に記載される方法のいずれかでは、ＺＦＮの対は、表１に示されているジンクフィンガータンパク質を含む。ＺＦＮ発現ベクターおよび／またはドナーベクターは、静脈内注射によるものを含めた任意の方法によって投与することができるアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）であり得る。ある特定の実施形態では、被験体に投与されるＺＦＮ：ＺＦＮ：ドナー比は、１：１：８である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の補正ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子をコードする導入遺伝子を被験体の細胞内で発現させる方法を記載する。導入遺伝子を、適切な標的細胞（例えば、血液細胞、肝細胞、脳細胞、幹細胞、前駆細胞など）のゲノム中に、その補正導入遺伝子によりコードされるＩＤＵＡまたはＩＤＳ産物が細胞のゲノム中に安定に組み込まれるように挿入することもでき、または、あるいは、導入遺伝子を、細胞中、染色体外で維持することもできる。一実施形態では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける産生のために補正ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を細胞株に挿入（安定にまたは染色体外に）し、次いで、その（任意選択で精製および／または単離した）タンパク質を、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を有する被験体を処置する（例えば、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患に関連する１つまたは複数の症状を低減および／または排除することによって）ために被験体に投与することができる。
【００１８】
別の態様では、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を有する被験体を処置する（例えば、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患に関連する１つまたは複数の症状を低減および／または排除することによって）ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ方法であって、それを必要とする被験体にＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質を提供するステップを含む方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法、例えば、本明細書に記載されるとおり細胞にＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を挿入し、したがって、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を有する被験体においてそのタンパク質を産生させるステップを含む。一部の実施形態では、活性な発現したＩＤＵＡおよび／または発現したＩＤＳは、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を有する被験体における内因性レベルに関して１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００またはそれより高いパーセントに達する。一部の実施形態では、発現した活性なＩＤＵＡまたはＩＤＳ酵素は、野生型個体において見出される酵素レベルに関して１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００またはそれより高いパーセントに達する。他の実施形態では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を含む単離された細胞は、例えば、細胞をＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を有する被験体に投与することによって、それを必要とする患者を処置するために使用することができる。他の実施形態では、補正ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子および／またはＩＤＵＡまたはＩＤＳを発現している細胞を、それを必要とする被験体に挿入し、したがって、補充タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで産生させる。一部の好ましい実施形態では、補正導入遺伝子を被験体の細胞のゲノムに挿入し、一方、他の好ましい実施形態では、補正導入遺伝子を被験体の細胞に挿入し、細胞中、染色体外で維持する。導入遺伝子は、肝臓、脳、筋肉、心臓、肺などを含めた種々の標的組織に組み込むことができる。本明細書に記載される方法のいずれかでは、発現したＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質は、細胞から放出されて（例えば、血液中への移出によって）、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子が欠如している他の細胞に作用するまたはそれらによって取り込まれ得る（例えば、マンノース受容体またはマンノース−６−リン酸受容体を介した受容体媒介性エンドサイトーシスによって）。したがって、ある特定の実施形態では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を発現している細胞（例えば、肝臓、ＨＳＰＣまたは編集されたＨＳＰＣに由来する細胞）によりＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質が分泌され、次いで、これが１つまたは複数の二次組織（例えば、脳、筋肉、骨、心臓、肺、脾臓など）に作用する。一部の例では、標的組織（ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を発現する）は肝臓である。他の例では、標的組織は脳である。他の例では、標的は血液（例えば、脈管）である。他の例では、標的は骨格筋である。さらに他の例では、標的組織（複数可）は、疾患の病態生理の追加的な態様を示す組織（例えば、心臓弁、骨、関節組織、気道組織な��）である。
【００１９】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、補正ＩＤＵＡまたはＩＤＳ遺伝子は、機能しているＩＤＵＡまたはＩＤＳ遺伝子の野生型配列（野生型の機能性断片を含む）を含み、一方、他の実施形態では、補正ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子の配列は、例えば、生物学的活性の増強をもたらために、いくつかの様式で変更されている（例えば、ＩＤＵＡをコードする配列またはＩＤＳをコードする配列の、生物学的活性を増加させるためのコドン最適化および／または短縮化）。好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物により、活性なＩＤＵＡまたはＩＤＳ酵素が、それを必要とするＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ被験体において産生される。発現したＩＤＵＡおよび／またはＩＤＳ酵素は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を分解することができるものである。一部の実施形態では、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、筋肉および脳を含めた体の特定の組織中のＧＡＧを低減させる。好ましい実施形態では、任意の組織中のＧＡＧレベルを、無処置のＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ被験体と比較して１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、またはその間の任意の値、低下させる。
【００２０】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、ヌクレアーゼを使用してＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を標的細胞のゲノム中に挿入することができる。適切なヌクレアーゼの非限定的な例としては、細胞のゲノム中の目的の領域（例えば、疾患関連遺伝子、高度に発現した遺伝子、アルブミン遺伝子または他のまたはセーフハーバー遺伝子）内の標的部位に結合するＤＮＡ結合分子ならびに１種または複数種のヌクレアーゼドメイン（例えば、開裂ドメインおよび／または開裂ハーフドメイン）を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様タンパク質ヌクレアーゼ）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が挙げられる。開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓタンパク質（クラス１またはクラス２）および／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、アルブミン遺伝子または赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）中のグロビン遺伝子における標的部位を認識する。例えば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４００１７２１号を参照されたい。他の実施形態では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、セーフハーバー遺伝子、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶ  Ｓ１としても公知）遺伝子、アルブミン、ＨＰＲＴまたはＲｏｓａ遺伝子に結合し、かつ／またはそれを開裂させる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１４００１７２１２号を参照されたい。ヌクレアーゼ（またはその構成成分）は、本明細書に記載される１つまたは複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドとして提供することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡであり得る。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学修飾されたものであり得る（例えば、Kormannら、（２０１１年）Nature  Biotechnology、２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照されたい）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含み得る（米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドと修飾されていないヌクレオチドの混合物を含み得る（米国特許公開第２０１２０１９５９３６号を参照されたい）。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＷＰＲＥエレメントを含み得る（米国特許出願第６２／１５８，２７７号を参��されたい）。
【００２１】
別の態様では、本発明は、所望のＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を導入するために、幹細胞または前駆細胞（例えば、血液細胞前駆体、肝幹細胞など）のゲノムを開裂（編集）することが可能な、工学技術で作製されたヌクレアーゼタンパク質を供給する。一部の態様では、編集された幹細胞または前駆細胞を、次いで、拡大増殖させ、ｅｘ  ｖｉｖｏで成熟した編集された細胞に分化するように誘導することができ、次いで、細胞を患者に与える。他の態様では、編集された前駆体（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞）は、骨髄移植で与えられ、上首尾の移植後に、産生される編集された細胞が増殖し、次いでそれがｉｎ  ｖｉｖｏで分化および成熟し、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子から発現される生物剤（biologic）を含有する。他の態様では、編集された幹細胞は筋肉幹細胞であり、次いでそれが筋組織中に導入される。一部の態様では、工学技術で作製されたヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、他の態様では、ヌクレアーゼはＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、他の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する。ヌクレアーゼは、疾患に関連する遺伝子であるセーフハーバー遺伝子座に対する、または細胞において高度に発現する遺伝子に対する特異性を有するように工学技術で作製することができる。単に非限定的な例として、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１部位、ＣＣＲ５遺伝子、アルブミンまたはＨＰＲＴ遺伝子であり得、一方、疾患関連遺伝子は、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ遺伝子であり得る。
【００２２】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）は、ポリヌクレオチド形態、例えば、任意選択でプロモーターに作動可能に連結した、１種または複数種のヌクレアーゼ（またはその構成成分）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターとして供給することができる。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。別の態様では、任意選択でプロモーターに作動可能に連結した、本明細書に記載されるＩＤＵＡまたはＩＤＳをコードするポリヌクレオチドを含むＩＤＵＡまたはＩＤＳ発現ベクターが本明細書に記載される。一実施形態では、発現はウイルスベクターである。
【００２３】
別の態様では、１種または複数種のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系発現ベクターならびに／または本明細書に記載されるＩＤＵＡまたはＩＤＳ発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書に記載される。宿主細胞は、１つまたは複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系発現ベクターを用いて安定に形質転換することもでき、一過性にトランスフェクトすることもでき、これらを組み合わせることもできる。一部の実施形態では、宿主細胞は、肝細胞である。したがって、アルブミン遺伝子のイントロン１に組み込まれたｈＩＵＤＡおよび／またはｈＩＤＳをコードするプロモーターなしドナーベクターを含むＨｅｐ２Ｇ細胞であって、ｈＩＵＤＡおよび／またはｈＩＤＳを発現および分泌する、Ｈｅｐ２Ｇ細胞が本明細書で提供される。Ｈｅｐ２Ｇ細胞を含む請求項１１に記載の細胞培養物であって、培養培地がｈＩＵＤＡまたはｈＩＤＳを含む細胞培養物も、本明細書に記載される通り細胞から分泌され、かつ／または細胞の培養培地から単離されたｈＩＵＤＡおよび／またはｈＩＤＳを含む医薬組成物と同様に提供される。
【００２４】
他の実施形態では、例えば、本明細書に記載される１種または複数種のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（または前記ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするベクター）ならびにＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いた標的化された開裂後に遺伝子に挿入される「ドナー」配列またはＩＤＵＡもしくはＩＤＳ導入遺伝子を使用して、任意の標的遺伝子中のゲノム配列を本明細書に記載される治療ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子で置き換えるための方法が提供される。ドナーＩＤＵＡまたはＩＤＳ配列は、ヌクレアーゼ（またはその構成成分）を保有するベクター中に存在してもよく、別々のベクター（例えば、Ａｄ、ＡＡＶまたはＬＶベクターまたはｍＲＮＡ）中に存在してもよく、あるいは、異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入することもできる。そのような、ドナーヌクレオチド配列の標的遺伝子座（例えば、高度に発現する遺伝子、疾患関連遺伝子、他のセーフハーバー遺伝子など）への挿入により、標的遺伝子座の（例えば、アルブミン、グロビンなど）内因性遺伝子制御エレメントの制御下でＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子の発現がもたらされる。一部の態様では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子の、例えば、標的遺伝子（例えば、アルブミン）への挿入により、インタクトなＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質配列の発現および標的（例えば、アルブミン）によりコードされる任意のアミノ酸の欠如がもたらされる。他の態様では、発現する外因性ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質は、融合タンパク質であり、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子によりコードされるアミノ酸およびＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子が挿入された内因性遺伝子座によりコードされるアミノ酸（例えば、内因性標的遺伝子座、あるいは標的遺伝子座の配列をコードする導入遺伝子上の配列に由来する）を含む。標的は、任意の遺伝子、例えば、アルブミン遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子などのセーフハーバー遺伝子；ＣＣＲ５遺伝子；または、グロビン遺伝子などの、ＲＢＣにおいて高度に発現する遺伝子（例えば、ベータグロビンまたはガンマグロビン）であり得る。一部の例では、内因性配列は、外因性ＩＤＵＡタンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分上に存在し、他の例では、内因性配列は、外因性ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在する。他の場合では、内因性配列は、ＩＤＵＡ外因性タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分の両方に存在する。内因性配列は、全長の野生型内因性配列または変異体内因性配列を含んでもよく、あるいは、部分的な内因性アミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、内因性遺伝子−導入遺伝子融合物を細胞内の内因性遺伝子座に配置し、一方、他の実施形態では、内因性配列−導入遺伝子コード配列をゲノム内の別の遺伝子座に挿入する（例えば、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ−導入遺伝子配列はアルブミン、ＨＰＲＴまたはＣＣＲ５遺伝子座に挿入される）。一部の実施形態では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を、治療ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質産物が細胞（例えば、前駆細胞または成熟細胞）内に保持されるように発現させる。他の実施形態では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を膜タンパク質の細胞外ドメインと融合させ、したがって、発現すると、導入遺伝子ＩＤＵＡまたはＩＤＳ融合物により、治療タンパク質の表面局在化がもたらされる。例えば、米国特許出願公開第２０１４００１７２１２号を参照されたい。一部の態様では、編集された細胞は、細胞を特定の組織型に輸送するための膜貫通タンパク質をさらに含む。一態様では、膜貫通タンパク質は抗体であり、一方、他の態様では、膜貫通タンパク質は受容体である。ある特定の実施形態では、細胞は前駆体（例えば、ＣＤ３４＋または造血幹細胞）または成熟ＲＢＣである。一部の態様では、導入遺伝子上にコードされる治療ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質産物は、細胞から外に移出されて、導入遺伝子が欠如している細胞に影響を与えるまたはそれらによって取り込まれる。ある特定の実施形態では、細胞は肝細胞であり、治療ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質を血流中に放出して遠位の組織（例えば、脳、心臓、筋肉など）に作用させる。
【００２５】
本発明は、アロジェニック産物として患者全てに対して普遍的に使用することができる、ＭＰＳ  Ｉ疾患を処置するための、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ治療タンパク質を保有する細胞（例えば、ＲＢＣ）を生成するための方法および組成物も供給する。これらのＲＢＣキャリアは、細胞の輸送を補助する膜貫通タンパク質を含み得る。一態様では、膜貫通タンパク質は抗体であり、一方、他の態様では、膜貫通タンパク質は受容体である。
【００２６】
一実施形態では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を、アルブミン遺伝子座への挿入後にアルブミンプロモーターから発現される。次いで、導入遺伝子がｉｎ  ｖｉｖｏで肝細胞に挿入されると、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子によりコードされる生物剤を血流中に放出させることができる。一部の態様では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子をウイルスベクターに含めて静脈内注射または他の注射によってｉｎ  ｖｉｖｏで肝臓に送達する。
【００２７】
一部の実施形態では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子ドナーを、導入遺伝子をエピソームまたは染色体外で維持するために、細胞にトランスフェクトまたは形質導入する。一部の態様では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子ドナーを、導入遺伝子ドナーの発現を調節するための調節ドメインを含むベクター上に維持する。別の態様では、導入遺伝子ドナーを含むベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで適切な標的細胞に送達し、したがって、導入遺伝子ドナーベクターが肝細胞に送達されると、導入遺伝子ドナーによりコードされるＩＤＵＡまたはＩＤＳ治療タンパク質が血流中に放出される。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子が挿入された前駆細胞（造血幹細胞、筋肉幹細胞またはＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の細胞）であって、これらの前駆体に由来する成熟細胞が、導入遺伝子によりコードされるＩＤＵＡまたはＩＤＳ産物を高レベルで含有する、前駆細胞を記載する。一部の実施形態では、これらの前駆体は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてトランスジェニック動物系で使用することができる。一部の態様では、導入遺伝子がヒトＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質をコードするモデル開発にトランスジェニック動物を使用することができる。一部の例では、トランスジェニック動物は、対応する内因性遺伝子座においてノックアウトされ得、それによって、ヒトタンパク質が単離状態で研究され得るｉｎ  ｖｉｖｏ系の開発を可能にし得る。かかるトランスジェニックモデルは、小分子もしくは大きい生体分子または目的のヒトタンパク質と相互作用し得るもしくは目的のヒトタンパク質を改変し得る他の実体を同定するために、スクリーニング目的で使用され得る。一部の態様では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子は、本明細書に記載される方法のいずれかによって得られた幹細胞（例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞等）または非ヒト動物胚中に、選択された遺伝子座（例えば、高度に発現されるかまたはセーフハーバー）中に組み込まれ、次いで、胚は、生きた動物が出生するように移植される。次いで、動物は、性的成熟になるまで育てられ、子孫を生じるようになり、ここで、子孫の少なくとも一部は、組み込まれたＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を含む。
【００３０】
さらに別の態様では、核酸配列を染色体の内因性遺伝子座（例えば、疾患に関連する、高度に発現する、例えば、肝細胞におけるアルブミン遺伝子座またはＲＢＣにおけるグロビン遺伝子座）に、例えば、非ヒト胚の染色体中に部位特異的に組み込むための方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）非ヒト胚に（ｉ）組み込まれるＩＤＵＡまたはＩＤＳをコードする核酸配列に隣接する上流配列および下流配列を含む、少なくとも１つのＤＮＡベクター、ならびに（ｉｉ）標的遺伝子座中の組込み部位を認識するジンクフィンガー、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を注射するステップと、（ｂ）胚を培養して、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を発現させるステップであって、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって組込み部位に導入された二本鎖切断（break）がＤＮＡベクターとの相同組換えによって修復されて、核酸配列が染色体中に組み込まれるステップとを含む。
【００３１】
前の実施形態のいずれにおいても、本発明の方法および化合物をＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を有する被験体を処置するための他の治療剤と組み合わせることができる。一部の態様では、方法および組成物を、血液脳関門の通過を可能にするための方法および組成物と組み合わせて使用する。他の態様では、方法および組成物を、被験体の免疫応答を抑制することが公知の化合物と組み合わせて使用する。
【００３２】
本明細書に記載されるヌクレアーゼ系および／またはＩＤＵＡまたはＩＤＳドナーを含むキットも提供される。キットは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸（例えば、適切な発現ベクターに含有されるＲＮＡ分子またはＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする遺伝子）、ドナー分子、宿主細胞株に適した単一のガイドＲＮＡをコードする発現ベクター、本発明の方法を実施するための指示などを含み得る。
【００３３】
これらのおよび他の態様は、全体としての開示を踏まえて、当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、示されているマウスの群のマウスアルブミン特異的ＺＦＮおよびＩＤＵＡドナーを用いた処置後の結果を示す。図１Ａでは、グラフは、ｒＡＡＶ２／８マウスサロゲートＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーで処置したマウスの肝臓における、投薬後１カ月（左側のパネル）および４カ月（右側のパネル）のＺＦＮ活性のレベル（％インデル）を示す。ゲノムＤＮＡを個々のマウスの肝臓から単離し、ＺＦＮ活性をＺＦＮ標的部位におけるマウスアルブミン遺伝子座のディープシーケンシングによって測定した。試験群番号が列挙されており、個々の符号は、規定された時点（剖検時）における個々のマウスからのデータを表す。横線は、各群の平均±標準偏差を表す。図１Ｂでは、ＩＤＵＡ発現をウエスタンブロット分析によって測定した。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。投薬後１カ月（パネルｉ）または４カ月（パネルｉｉ）でマウスを安楽死させ、タンパク質を肝臓から抽出した。マウス肝臓におけるｈＩＤＵＡの発現を、ヒト特異的ＩＤＵＡ抗体を使用して決定した。ＧＡＰＤＨがローディング対照として示されている。
【００３５】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、検出可能なＩＤＵＡ酵素活性を示す。図２Ａは、血漿中の酵素活性を示すグラフである。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。血漿を示されている日に採取し、ＩＤＵＡ酵素活性を蛍光定量アッセイによって決定した。データは、上記時点に応じて群当たり動物４〜８匹の平均±ＳＤを示す。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、続いてダネットの多重比較検定により、ＭＰＳ  Ｉ  ＺＦＮ＋ドナー群が、雄の動物については１４日目〜１２０日目、および雌の動物については２８日目〜１２０日目に、野生型群と有意に異なったことが明らかになった。図２Ｂは、肝臓（左側のパネル）、血漿（中央のパネル）、脾臓（右側のパネル）、腎臓（右側のパネル）および肺（右側のパネル）において６０日目までに測定されたＩＤＵＡ活性を示す。肝臓、脾臓、腎臓および肺のデータを示すグラフでは、左端の棒（１）は、ＭＰＳ  Ｉヘテロ接合性マウスを表し、右側に向かって次の棒（２）は、無処置のＭＰＳ  Ｉホモ接合性マウスを表し、右側に向かって次の棒（３）は、ＩＤＵＡドナーＡＡＶのみで処置したＭＰＳ  Ｉマウスを表し、右端の棒（４）は、ドナーＡＡＶおよびアルブミン特異的ＺＦＮを含むＡＡＶで処置したＭＰＳ  Ｉマウスからのデータを表す。図２Ｃは、１カ月（パネル（ｉ））または４カ月（パネル（ｉｉ））で屠殺したマウスの様々な組織におけるＩＤＵＡ活性の量を示す２つのヒストグラムである。示されている群は、（１−左端の棒）野生型マウス、製剤緩衝液を投薬；（２−左から２番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雄、製剤緩衝液；（３−左から３番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雌、製剤緩衝液；（４−右から３番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雄、ＺＦＮ＋ドナー；（５−右から２番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雌、ＺＦＮ＋ドナー；（６−右端の棒）ＭＰＳ  Ｉ、ドナーのみ。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、検出可能なＩＤＵＡ酵素活性を示す。図２Ａは、血漿中の酵素活性を示すグラフである。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。血漿を示されている日に採取し、ＩＤＵＡ酵素活性を蛍光定量アッセイによって決定した。データは、上記時点に応じて群当たり動物４〜８匹の平均±ＳＤを示す。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、続いてダネットの多重比較検定により、ＭＰＳ  Ｉ  ＺＦＮ＋ドナー群が、雄の動物については１４日目〜１２０日目、および雌の動物については２８日目〜１２０日目に、野生型群と有意に異なったことが明らかになった。図２Ｂは、肝臓（左側のパネル）、血漿（中央のパネル）、脾臓（右側のパネル）、腎臓（右側のパネル）および肺（右側のパネル）において６０日目までに測定されたＩＤＵＡ活性を示す。肝臓、脾臓、腎臓および肺のデータを示すグラフでは、左端の棒（１）は、ＭＰＳ  Ｉヘテロ接合性マウスを表し、右側に向かって次の棒（２）は、無処置のＭＰＳ  Ｉホモ接合性マウスを表し、右側に向かって次の棒（３）は、ＩＤＵＡドナーＡＡＶのみで処置したＭＰＳ  Ｉマウスを表し、右端の棒（４）は、ドナーＡＡＶおよびアルブミン特異的ＺＦＮを含むＡＡＶで処置したＭＰＳ  Ｉマウスからのデータを表す。図２Ｃは、１カ月（パネル（ｉ））または４カ月（パネル（ｉｉ））で屠殺したマウスの様々な組織におけるＩＤＵＡ活性の量を示す２つのヒストグラムである。示されている群は、（１−左端の棒）野生型マウス、製剤緩衝液を投薬；（２−左から２番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雄、製剤緩衝液；（３−左から３番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雌、製剤緩衝液；（４−右から３番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雄、ＺＦＮ＋ドナー；（５−右から２番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雌、ＺＦＮ＋ドナー；（６−右端の棒）ＭＰＳ  Ｉ、ドナーのみ。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、検出可能なＩＤＵＡ酵素活性を示す。図２Ａは、血漿中の酵素活性を示すグラフである。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。血漿を示されている日に採取し、ＩＤＵＡ酵素活性を蛍光定量アッセイによって決定した。データは、上記時点に応じて群当たり動物４〜８匹の平均±ＳＤを示す。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、続いてダネットの多重比較検定により、ＭＰＳ  Ｉ  ＺＦＮ＋ドナー群が、雄の動物については１４日目〜１２０日目、および雌の動物については２８日目〜１２０日目に、野生型群と有意に異なったことが明らかになった。図２Ｂは、肝臓（左側のパネル）、血漿（中央のパネル）、脾臓（右側のパネル）、腎臓（右側のパネル）および肺（右側のパネル）において６０日目までに測定されたＩＤＵＡ活性を示す。肝臓、脾臓、腎臓および肺のデータを示すグラフでは、左端の棒（１）は、ＭＰＳ  Ｉヘテロ接合性マウスを表し、右側に向かって次の棒（２）は、無処置のＭＰＳ  Ｉホモ接合性マウスを表し、右側に向かって次の棒（３）は、ＩＤＵＡドナーＡＡＶのみで処置したＭＰＳ  Ｉマウスを表し、右端の棒（４）は、ドナーＡＡＶおよびアルブミン特異的ＺＦＮを含むＡＡＶで処置したＭＰＳ  Ｉマウスからのデータを表す。図２Ｃは、１カ月（パネル（ｉ））または４カ月（パネル（ｉｉ））で屠殺したマウスの様々な組織におけるＩＤＵＡ活性の量を示す２つのヒストグラムである。示されている群は、（１−左端の棒）野生型マウス、製剤緩衝液を投薬；（２−左から２番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雄、製剤緩衝液；（３−左から３番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雌、製剤緩衝液；（４−右から３番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雄、ＺＦＮ＋ドナー；（５−右から２番目の棒）ＭＰＳ  Ｉ雌、ＺＦＮ＋ドナー；（６−右端の棒）ＭＰＳ  Ｉ、ドナーのみ。
【００３６】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、処置したマウスの処置後のＧＡＧレベルの有意な低下を示すグラフである。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。尿を示されている日に収集し、ＧＡＧレベルをＢｌｙｓｃａｎ  ＧＡＧアッセイによって決定した。図３Ａは、処置後の尿中のＧＡＧの結果を示す。各群の左端の棒は無処置のＭＰＳ  Ｉ雄を示し、左から２番目の棒は無処置のＭＰＳ  Ｉ雌を示し、右から２番目の棒は処置したＭＰＳ  Ｉ雄を示し、右端の棒は処置したＭＰＳ  Ｉ雌を示す。データは、上記時点に応じて群当たり動物１〜８匹の平均±ＳＤを示す。図３Ｂは、処置の１カ月後（図３Ｂ（ｉ））または処置の４カ月後（図３Ｂ（ｉｉ））の種々の器官において検出されたＧＡＧの量を示す。示されている群は、上の図２Ｂおよび２Ｃと同じである。図３Ｃは、処置後１２０日を通して種々の群の尿において検出されたＧＡＧの量を示すグラフである。処置群は図３Ｂにおけるものと同じである。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、処置したマウスの処置後のＧＡＧレベルの有意な低下を示すグラフである。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。尿を示されている日に収集し、ＧＡＧレベルをＢｌｙｓｃａｎ  ＧＡＧアッセイによって決定した。図３Ａは、処置後の尿中のＧＡＧの結果を示す。各群の左端の棒は無処置のＭＰＳ  Ｉ雄を示し、左から２番目の棒は無処置のＭＰＳ  Ｉ雌を示し、右から２番目の棒は処置したＭＰＳ  Ｉ雄を示し、右端の棒は処置したＭＰＳ  Ｉ雌を示す。データは、上記時点に応じて群当たり動物１〜８匹の平均±ＳＤを示す。図３Ｂは、処置の１カ月後（図３Ｂ（ｉ））または処置の４カ月後（図３Ｂ（ｉｉ））の種々の器官において検出されたＧＡＧの量を示す。示されている群は、上の図２Ｂおよび２Ｃと同じである。図３Ｃは、処置後１２０日を通して種々の群の尿において検出されたＧＡＧの量を示すグラフである。処置群は図３Ｂにおけるものと同じである。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、処置したマウスの処置後のＧＡＧレベルの有意な低下を示すグラフである。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。尿を示されている日に収集し、ＧＡＧレベルをＢｌｙｓｃａｎ  ＧＡＧアッセイによって決定した。図３Ａは、処置後の尿中のＧＡＧの結果を示す。各群の左端の棒は無処置のＭＰＳ  Ｉ雄を示し、左から２番目の棒は無処置のＭＰＳ  Ｉ雌を示し、右から２番目の棒は処置したＭＰＳ  Ｉ雄を示し、右端の棒は処置したＭＰＳ  Ｉ雌を示す。データは、上記時点に応じて群当たり動物１〜８匹の平均±ＳＤを示す。図３Ｂは、処置の１カ月後（図３Ｂ（ｉ））または処置の４カ月後（図３Ｂ（ｉｉ））の種々の器官において検出されたＧＡＧの量を示す。示されている群は、上の図２Ｂおよび２Ｃと同じである。図３Ｃは、処置後１２０日を通して種々の群の尿において検出されたＧＡＧの量を示すグラフである。処置群は図３Ｂにおけるものと同じである。
【００３７】
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ〜４Ｆは、処置したマウス由来の種々の組織において検出されたＩＤＵＡ酵素活性の量を示す一連のグラフを示す。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。投薬後４カ月の時点でマウスを安楽死させ、タンパク質を肝臓および他の組織から抽出した。ＩＤＵＡ酵素活性を蛍光定量アッセイによって決定した。データは、群当たり動物８匹の平均±ＳＤを示す。＊それぞれの対照群に対してｐ＜０．０５（製剤で処置したＭＰＳ  Ｉマウス）（マン・ホイットニー検定）。図４Ａは、示されている群の肝臓におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｂは、示されている群の脾臓におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｃは、示されている群の肺におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｄは、筋肉におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｅは、示されている群の脳におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｆは、示されている群の心臓におけるＩＤＵＡ活性を示す。
【図４Ｅ−４Ｆ】図４Ａ〜４Ｆは、処置したマウス由来の種々の組織において検出されたＩＤＵＡ酵素活性の量を示す一連のグラフを示す。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。投薬後４カ月の時点でマウスを安楽死させ、タンパク質を肝臓および他の組織から抽出した。ＩＤＵＡ酵素活性を蛍光定量アッセイによって決定した。データは、群当たり動物８匹の平均±ＳＤを示す。＊それぞれの対照群に対してｐ＜０．０５（製剤で処置したＭＰＳ  Ｉマウス）（マン・ホイットニー検定）。図４Ａは、示されている群の肝臓におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｂは、示されている群の脾臓におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｃは、示されている群の肺におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｄは、筋肉におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｅは、示されている群の脳におけるＩＤＵＡ活性を示す。図４Ｆは、示されている群の心臓におけるＩＤＵＡ活性を示す。
【００３８】
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ〜５Ｆは、処置したマウスにおける処置後のＧＡＧレベルの有意な低下を示すグラフである。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。投薬後１カ月および４カ月でマウスを安楽死させ、タンパク質を肝臓および他の組織から抽出した。ＩＤＵＡ酵素活性を蛍光定量アッセイによって決定した。データは、群当たり動物８匹の平均±ＳＤを示す。＊それぞれの対照群に対してｐ＜０．０５（製剤で処置したＭＰＳ  Ｉマウス）（マン・ホイットニー検定）。図５Ａは、示されている群の肝臓におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｂは、示されている群の脾臓におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｃは、示されている群の肺におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｄは、筋肉におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｅは、示されている群の脳におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｆは、示されている群の心臓におけるＧＡＧレベルを示す。
【図５Ｅ−５Ｆ】図５Ａ〜５Ｆは、処置したマウスにおける処置後のＧＡＧレベルの有意な低下を示すグラフである。サロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーをｒＡＡＶ２／８としてパッケージングし、マウスにＩＶ注射した。投薬後１カ月および４カ月でマウスを安楽死させ、タンパク質を肝臓および他の組織から抽出した。ＩＤＵＡ酵素活性を蛍光定量アッセイによって決定した。データは、群当たり動物８匹の平均±ＳＤを示す。＊それぞれの対照群に対してｐ＜０．０５（製剤で処置したＭＰＳ  Ｉマウス）（マン・ホイットニー検定）。図５Ａは、示されている群の肝臓におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｂは、示されている群の脾臓におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｃは、示されている群の肺におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｄは、筋肉におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｅは、示されている群の脳におけるＧＡＧレベルを示す。図５Ｆは、示されている群の心臓におけるＧＡＧレベルを示す。
【００３９】
【図６Ａ−６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄは、投薬後４カ月の認知パフォーマンスを測定したバーンズ迷路を示す一連の写真の再現である。バーンズ迷路は、４０個の穴を有するプラットフォームを含む（図６Ａ）。マウスをプラットフォームに乗せ、明るい照明を用いて上から撮影した（図６Ｂ）。マウスが光を回避しようとする逃避穴（図６Ｄ）である１つ以外は全ての穴をふさいだ（図６Ｃ）。
【００４０】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、投薬後約４カ月の時点でのバーンズ迷路試験を使用した認知パフォーマンス結果を示すグラフである。データは、６日間の試験にわたる、動物が標的逃避穴を見つけるまでにかかった時間の平均±ＳＥＭ（毎日４回の試験の平均）を表す。図７Ａは、ＭＰＳ  Ｉ雄、無処置についての結果、野生型に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ＭＰＳ  Ｉ雄、ＺＦＮ＋ドナーに対して、＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１を示し、図７Ｂは、ＭＰＳ  Ｉ雌、ＺＦＮ＋ドナーについての結果、野生型に対して＊ｐ＜０．０５；ＭＰＳ  Ｉ、ドナーのみに対して＃ｐ＜０．０５を示す（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーの多重比較検定）。
【００４１】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ＭＰＳ  ＩＩのマウスモデルにおけるＩＤＳの発現を示す。図８Ａは、処置後１カ月（上のパネル）または４カ月（下のパネル）のマウス肝臓におけるヒトＩＤＳの発現を示すウエスタンブロットである。ＩＤＳに対する抗体をヒトタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＡＦ２４４９）に対して生じさせ、マウスＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｓｃｒｉｐｔからのＡ００１９１）を検出するローディング対照を用いた。図８Ｂは、処置後１２０日まで検出した血漿中のＩＤＳ酵素活性を示すグラフであり、図８Ｃは、投薬後４カ月後の様々な組織におけるＩＤＳ酵素活性を示すヒストグラムである。図８Ｃは、以下の通り各組織についての処置群の群分けを示すグラフである：（１−左端の棒）野生型、無処置のマウス；（２−左から２番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、無処置；（３−左から３番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、低用量；（４−右から３番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、中用量；（５−右から２番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、高用量；（６−右端の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ドナーによる処置のみ。群内の試料の順序は、左から右に、１〜６である。データの有意性が示されている。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、ＭＰＳ  ＩＩのマウスモデルにおけるＩＤＳの発現を示す。図８Ａは、処置後１カ月（上のパネル）または４カ月（下のパネル）のマウス肝臓におけるヒトＩＤＳの発現を示すウエスタンブロットである。ＩＤＳに対する抗体をヒトタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＡＦ２４４９）に対して生じさせ、マウスＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｓｃｒｉｐｔからのＡ００１９１）を検出するローディング対照を用いた。図８Ｂは、処置後１２０日まで検出した血漿中のＩＤＳ酵素活性を示すグラフであり、図８Ｃは、投薬後４カ月後の様々な組織におけるＩＤＳ酵素活性を示すヒストグラムである。図８Ｃは、以下の通り各組織についての処置群の群分けを示すグラフである：（１−左端の棒）野生型、無処置のマウス；（２−左から２番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、無処置；（３−左から３番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、低用量；（４−右から３番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、中用量；（５−右から２番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、高用量；（６−右端の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ドナーによる処置のみ。群内の試料の順序は、左から右に、１〜６である。データの有意性が示されている。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、ＭＰＳ  ＩＩのマウスモデルにおけるＩＤＳの発現を示す。図８Ａは、処置後１カ月（上のパネル）または４カ月（下のパネル）のマウス肝臓におけるヒトＩＤＳの発現を示すウエスタンブロットである。ＩＤＳに対する抗体をヒトタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＡＦ２４４９）に対して生じさせ、マウスＧＡＰＤＨ（ＧｅｎｓｃｒｉｐｔからのＡ００１９１）を検出するローディング対照を用いた。図８Ｂは、処置後１２０日まで検出した血漿中のＩＤＳ酵素活性を示すグラフであり、図８Ｃは、投薬後４カ月後の様々な組織におけるＩＤＳ酵素活性を示すヒストグラムである。図８Ｃは、以下の通り各組織についての処置群の群分けを示すグラフである：（１−左端の棒）野生型、無処置のマウス；（２−左から２番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、無処置；（３−左から３番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、低用量；（４−右から３番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、中用量；（５−右から２番目の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ＺＦＮ＋ドナーによる処置、高用量；（６−右端の棒）ＭＰＳ  ＩＩマウス、ドナーによる処置のみ。群内の試料の順序は、左から右に、１〜６である。データの有意性が示されている。
【００４２】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、処置の４カ月後のＭＰＳ  ＩＩマウスの示されている器官におけるＧＡＧレベルを示すヒストグラムである。図９Ａは、肝臓、脾臓、腎臓および肺におけるレベルを示し、図９Ｂは、心臓、筋肉および脳におけるレベルを示す。アスタリスクは、ＭＰＳ  ＩＩ無処置マウスと比較したデータの有意性を示す。試験した群および示されている順序は図８Ｃと同じである。
【００４３】
【図１０】図１０は、処置の４カ月後のバーンズ迷路試験を使用した認知パフォーマンス結果を示すグラフである。データは、６日間の試験にわたる、動物が標的逃避穴を見つけるまでにかかった時間の平均±ＳＥＭ（毎日４回の試験の平均）を表す。アスタリスクはＭＰＳ  ＩＩ無処置マウスとＺＦＮ＋ドナーマウスを比較したデータの有意性を示し、ハッシュタグは、ＭＰＳ  ＩＩ無処置マウスと野生型無処置マウスを比較した有意性を示す。
【００４４】
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｄは、アルブミン特異的ＺＦＮおよびＩＤＳドナーまたはＩＤＵＡドナーを用いて形質導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＩＤＳ活性またはＩＤＵＡ活性を示すグラフである。ＳＢＳ＃４７１７１、ＳＢＳ＃４７９３１およびＳＢ−ＩＤＳドナー（ＩＤＳ）、またはＳＢＳ＃４７１７１およびＳＢＳ＃４７９３１単独（ＺＦＮのみ）を用いて形質導入したＨｅｐＧ２細胞に由来する４種のサブクローンを、７２時間の上清蓄積後にｈＩＤＳ  ＥＬＩＳＡ（図１１Ａに示されている）およびＩＤＳ酵素活性（図１１Ｂに示されている）アッセイにより分析した。ＳＢＳ＃４７１７１、ＳＢＳ＃４７９３１およびＳＢ−ＩＤＵＡドナー（ＩＤＵＡ）、またはＳＢＳ＃４７１７１およびＳＢＳ＃４７９３１単独（ＺＦＮのみ）を用いて形質導入したＨｅｐＧ２細胞に由来する３種のサブクローンを、７２時間の上清蓄積後にｈＩＤＵＡ  ＥＬＩＳＡ（図１１Ｃに示されている）およびＩＤＵＡ酵素活性（図１１Ｄに示されている）アッセイによって分析した。データは、３つの独立した上清の平均±ＳＤを表す。
【図１１Ｃ−１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｄは、アルブミン特異的ＺＦＮおよびＩＤＳドナーまたはＩＤＵＡドナーを用いて形質導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＩＤＳ活性またはＩＤＵＡ活性を示すグラフである。ＳＢＳ＃４７１７１、ＳＢＳ＃４７９３１およびＳＢ−ＩＤＳドナー（ＩＤＳ）、またはＳＢＳ＃４７１７１およびＳＢＳ＃４７９３１単独（ＺＦＮのみ）を用いて形質導入したＨｅｐＧ２細胞に由来する４種のサブクローンを、７２時間の上清蓄積後にｈＩＤＳ  ＥＬＩＳＡ（図１１Ａに示されている）およびＩＤＳ酵素活性（図１１Ｂに示されている）アッセイにより分析した。ＳＢＳ＃４７１７１、ＳＢＳ＃４７９３１およびＳＢ−ＩＤＵＡドナー（ＩＤＵＡ）、またはＳＢＳ＃４７１７１およびＳＢＳ＃４７９３１単独（ＺＦＮのみ）を用いて形質導入したＨｅｐＧ２細胞に由来する３種のサブクローンを、７２時間の上清蓄積後にｈＩＤＵＡ  ＥＬＩＳＡ（図１１Ｃに示されている）およびＩＤＵＡ酵素活性（図１１Ｄに示されている）アッセイによって分析した。データは、３つの独立した上清の平均±ＳＤを表す。
【００４５】
【図１２Ａ−１２Ｄ】図１２Ａ〜図１２Ｉは、アルブミン遺伝子座に存在し得るＩＤＳドナー（「ＳＢ−ＩＤＳ」）またはＩＤＵＡ（「ＳＢ−ＩＤＵＡ」）の組込みの型、ならびに４種のＩＤＳサブクローンおよび３種のＩＤＵＡサブクローンにおいて観察された結果を示す。ＮＨＥＪ（図１２Ａ）またはＨＤＲ（図１２Ｂ）のいずれかによるヒトアルブミン遺伝子座におけるＳＢ−ＩＤＳ組込み事象がそれぞれの特異的な試薬（プライマーおよびプローブ）ならびに結合部位と共に示されている。図１２Ｃは、全てのサブクローンについてのＴａｑｍａｎ（登録商標）データの要約表である。括弧内の数字は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイにおいて、合計３回のアッセイの繰り返しのうちで、クローンが示されている組込みの様式について陽性または陰性にスコア化された回数を示す。図１２Ｄは、全てのサブクローンについてのサンガーシーケンシングデータの要約表であり、優勢な組込みの様式が示されている。Ｎ．Ａ．＝該当なし。ＮＨＥＪ（図１２Ｅおよび１２Ｈ）またはＨＤＲ（図１２Ｆ）のいずれかによるヒトアルブミン遺伝子座におけるＳＢ−ＩＤＵＡ組込み事象、ならびに、予測されるバンドサイズが示されている。図１２Ｇは、示されているサブクローンについてのＴａｑｍａｎ（登録商標）データの要約表である。図１２Ｉは、ＩＤＵＡの、クローン２１についてＨＤＲによる組込み、クローン２５についてＮＨＥＪによる組込み、およびクローン３０についてＮＨＥＪによる組込みを確認するゲルの再現である。
【図１２Ｅ−１２Ｉ】図１２Ａ〜図１２Ｉは、アルブミン遺伝子座に存在し得るＩＤＳドナー（「ＳＢ−ＩＤＳ」）またはＩＤＵＡ（「ＳＢ−ＩＤＵＡ」）の組込みの型、ならびに４種のＩＤＳサブクローンおよび３種のＩＤＵＡサブクローンにおいて観察された結果を示す。ＮＨＥＪ（図１２Ａ）またはＨＤＲ（図１２Ｂ）のいずれかによるヒトアルブミン遺伝子座におけるＳＢ−ＩＤＳ組込み事象がそれぞれの特異的な試薬（プライマーおよびプローブ）ならびに結合部位と共に示されている。図１２Ｃは、全てのサブクローンについてのＴａｑｍａｎ（登録商標）データの要約表である。括弧内の数字は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイにおいて、合計３回のアッセイの繰り返しのうちで、クローンが示されている組込みの様式について陽性または陰性にスコア化された回数を示す。図１２Ｄは、全てのサブクローンについてのサンガーシーケンシングデータの要約表であり、優勢な組込みの様式が示されている。Ｎ．Ａ．＝該当なし。ＮＨＥＪ（図１２Ｅおよび１２Ｈ）またはＨＤＲ（図１２Ｆ）のいずれかによるヒトアルブミン遺伝子座におけるＳＢ−ＩＤＵＡ組込み事象、ならびに、予測されるバンドサイズが示されている。図１２Ｇは、示されているサブクローンについてのＴａｑｍａｎ（登録商標）データの要約表である。図１２Ｉは、ＩＤＵＡの、クローン２１についてＨＤＲによる組込み、クローン２５についてＮＨＥＪによる組込み、およびクローン３０についてＮＨＥＪによる組込みを確認するゲルの再現である。
【００４６】
【図１３】図１３は、ＩＤＳが形質導入された肝臓において産生され、次いで取り込まれ、その後、プロセシングされて最終的な成熟タンパク質になるプロセスを示す概略図である。
【００４７】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａおよび１４Ｂは、初代肝細胞における、ＨｅｐＧ２サブクローンから分泌されたＩＤＳの取り込みを示す。図１４Ａは、ＩＤＳタンパク質が成熟するに従って異なるタンパク質形態を示し、また、ＨｅｐＧ２上清を初代肝細胞培養物に添加するプロセスを示す。図１４Ｂは、ＨｅｐＧ２クローン（「混合」および５５）上清およびペレットにおいて検出されたＩＤＳの形態、ならびに初代肝細胞ペレットにおいて検出された形態を示すウエスタンブロットを示し、成熟形態（４５ｋＤａ）が産生される間の全長ポリペプチド（９０ｋＤａ）のプロセシングが例示されている。上清からのＩＤＳアップデート後の初代肝細胞ペレットにおける相対的なＩＤＳ活性だけでなくハウスキーピングタンパク質（α−ＧＡＰＤＨ）であるローディング対照も示されている。
【００４８】
【図１５Ａ−１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ＨｅｐＧ２サブクローンにおいて産生されるＩＤＳまたはＩＤＵＡにおけるグリコシル化パターンに関する調査を例示する。図１５Ａは、異なる種類のグリコシル化パターンおよび脱グリコシル化に使用されるグリコシダーゼの基質特異性を示す（Leeら、（２００９年）Nat  Protoc.、４巻（４号）：５９２〜６０４頁からの改変）。図１５Ｂおよび１５Ｃは、ＨｅｐＧ２クローンにおいて産生されるＩＤＳタンパク質を調査する抗ＩＤＳ抗体を使用したウエスタンブロットであり、グリコシダーゼＰＮＧａｓｅＦおよびＥｎｄｏ  Ｈを用いた処理後の、図１５Ｂは細胞の上清中に見出されるタンパク質を示し、図１５Ｃは細胞ペレット中のタンパク質を示す。示されている通り、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いた処理により、全てのオリゴ糖鎖が除去され、それにより、「グリコシル化されていないｈＩＤＳ」がもたらされる。ＨｅｐＧ２ペレットのウエスタンブロットに関しては、ＨＳＰ９０がローディング対照として示されている。「混合」＝２つの異なるＩＤＳサブクローンからなる混合ＨｅｐＧ２  ＩＤＳ集団。「クローン５５」＝ＨｅｐＧ２  ＩＤＳサブクローン＃５５。「対照」＝陰性対照として、ＩＤＳではなくＩＤＵＡがアルブミン遺伝子座に組み込まれたＨｅｐＧ２サブクローン。「ｋＤａ」＝キロダルトン（分子量マーカー）。図１５Ｄは、産生されるｈＩＤＵＡのグリコシル化パターンを市販のｈＩＤＵＡ（Ａｌｓｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＩＤＵＡ）と比較して調査するための抗ＩＤＵＡ抗体を使用したウエスタンブロットを示す（上のパネルは暗曝露を示し、下のパネルは明曝露を示す）。前と同様に、酵素をＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｅｎｄｏ  Ｈで処理するかまたは消化しないままにした。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ＨｅｐＧ２サブクローンにおいて産生されるＩＤＳまたはＩＤＵＡにおけるグリコシル化パターンに関する調査を例示する。図１５Ａは、異なる種類のグリコシル化パターンおよび脱グリコシル化に使用されるグリコシダーゼの基質特異性を示す（Leeら、（２００９年）Nat  Protoc.、４巻（４号）：５９２〜６０４頁からの改変）。図１５Ｂおよび１５Ｃは、ＨｅｐＧ２クローンにおいて産生されるＩＤＳタンパク質を調査する抗ＩＤＳ抗体を使用したウエスタンブロットであり、グリコシダーゼＰＮＧａｓｅＦおよびＥｎｄｏ  Ｈを用いた処理後の、図１５Ｂは細胞の上清中に見出されるタンパク質を示し、図１５Ｃは細胞ペレット中のタンパク質を示す。示されている通り、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いた処理により、全てのオリゴ糖鎖が除去され、それにより、「グリコシル化されていないｈＩＤＳ」がもたらされる。ＨｅｐＧ２ペレットのウエスタンブロットに関しては、ＨＳＰ９０がローディング対照として示されている。「混合」＝２つの異なるＩＤＳサブクローンからなる混合ＨｅｐＧ２  ＩＤＳ集団。「クローン５５」＝ＨｅｐＧ２  ＩＤＳサブクローン＃５５。「対照」＝陰性対照として、ＩＤＳではなくＩＤＵＡがアルブミン遺伝子座に組み込まれたＨｅｐＧ２サブクローン。「ｋＤａ」＝キロダルトン（分子量マーカー）。図１５Ｄは、産生されるｈＩＤＵＡのグリコシル化パターンを市販のｈＩＤＵＡ（Ａｌｓｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＩＤＵＡ）と比較して調査するための抗ＩＤＵＡ抗体を使用したウエスタンブロットを示す（上のパネルは暗曝露を示し、下のパネルは明曝露を示す）。前と同様に、酵素をＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｅｎｄｏ  Ｈで処理するかまたは消化しないままにした。
【００４９】
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｄは、添加されたマンノース−６−リン酸（mannose  6-phosphase）（Ｍ６Ｐ）の、ＨｅｐＧ２細胞（図１６Ａ）またはＫ５６２細胞（図１６Ｂ）のいずれかによるＩＤＳの取り込みに対する影響およびＫ５６２細胞によって産生されたＩＤＵＡの取り込みのグラフ（図１６Ｃ）を示す。図１６Ｄは、標的細胞のマンノース−６−リン酸による処理の、取り込みに対する影響を示す概略図である。示されているデータは、Ｍ６Ｐを用いて処理したかまたは無処理のままにした細胞を例示する。図１６Ａおよび１６Ｂでは、示されている試料、それぞれ３メンバーの群は、左から右に以下の通りである：左端の棒−無処理のＨｅｐＧ２細胞に由来する馴化培地を用いた処理を含む対照；中央の棒−ＨｅｐＧ２−ＩＤＳクローン８に由来する馴化培地を用いて処理した細胞；右側の棒−ＨｅｐＧ２−ＩＤＳクローン１５に由来する馴化培地を用いて処理した細胞。各時点で、Ｍ６Ｐを用いて処理した細胞が示されている。示されている期間後、細胞をペレット化し、ＩＤＳ活性についてアッセイした。２つの条件の比較から、Ｍ６Ｐによりグリコシル化されたＩＤＳタンパク質の取り込みが阻害されたことが例示される。図１６Ｃは、無処理のＨｅｐＧ２細胞またはＩＤＵＡドナーを有するＨｅｐＧ２細胞（ＩＤＵＡクローン番号２５）から得た馴化培地で培養したＫ５６２細胞によるＩＤＵＡ取り込みを示す。図１６Ｄは、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）による細胞の処理の影響を示す概略図であり、図１６Ａ〜１６ＣにおけるＭ６Ｐによる処理によりどのように酵素の取り込みが遮断され、それにより細胞において検出可能なＩＤＵＡの量が減少するかが例示されている。
【図１６Ｃ−１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、添加されたマンノース−６−リン酸（mannose  6-phosphase）（Ｍ６Ｐ）の、ＨｅｐＧ２細胞（図１６Ａ）またはＫ５６２細胞（図１６Ｂ）のいずれかによるＩＤＳの取り込みに対する影響およびＫ５６２細胞によって産生されたＩＤＵＡの取り込みのグラフ（図１６Ｃ）を示す。図１６Ｄは、標的細胞のマンノース−６−リン酸による処理の、取り込みに対する影響を示す概略図である。示されているデータは、Ｍ６Ｐを用いて処理したかまたは無処理のままにした細胞を例示する。図１６Ａおよび１６Ｂでは、示されている試料、それぞれ３メンバーの群は、左から右に以下の通りである：左端の棒−無処理のＨｅｐＧ２細胞に由来する馴化培地を用いた処理を含む対照；中央の棒−ＨｅｐＧ２−ＩＤＳクローン８に由来する馴化培地を用いて処理した細胞；右側の棒−ＨｅｐＧ２−ＩＤＳクローン１５に由来する馴化培地を用いて処理した細胞。各時点で、Ｍ６Ｐを用いて処理した細胞が示されている。示されている期間後、細胞をペレット化し、ＩＤＳ活性についてアッセイした。２つの条件の比較から、Ｍ６Ｐによりグリコシル化されたＩＤＳタンパク質の取り込みが阻害されたことが例示される。図１６Ｃは、無処理のＨｅｐＧ２細胞またはＩＤＵＡドナーを有するＨｅｐＧ２細胞（ＩＤＵＡクローン番号２５）から得た馴化培地で培養したＫ５６２細胞によるＩＤＵＡ取り込みを示す。図１６Ｄは、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）による細胞の処理の影響を示す概略図であり、図１６Ａ〜１６ＣにおけるＭ６Ｐによる処理によりどのように酵素の取り込みが遮断され、それにより細胞において検出可能なＩＤＵＡの量が減少するかが例示されている。
【００５０】
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、処置したおよび無処置の野生型マウスならびにＭＰＳ  ＩマウスおよびＭＰＳ  ＩＩマウスの脳中のデルマタン硫酸レベル（左側のパネル）およびヘパラン硫酸レベル（右側のパネル）の分析を示す。図１７Ａは、図３Ｂ（ｉｉ）において分析したマウス、列の左端のセットに対応する。図１７Ｂは、図９Ｂにおいて分析したマウス、列の右端のセットに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を処置および／または予防するための方法および組成物が本明細書に開示されている。本発明は、ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を有する被験体では欠如しているまたは不十分に発現するタンパク質をコードする遺伝子を挿入し、したがって、該遺伝子を被験体の１種または複数種の細胞および／または組織においてｉｎ  ｖｉｖｏで発現させるための方法および組成物を提供する。例えば、遺伝子を標的組織（例えば、肝臓において）において発現させるだけでなく、標的組織から分泌させ、二次的な細胞および組織（例えば、脾臓、肺、心臓、筋肉、脳など）において機能的にさせることができる。本発明は、細胞（例えば、前駆細胞または成熟ＲＢＣ、ｉＰＳＣまたは肝細胞）を、高レベルの治療薬を産生するように変更し、これらの変更された細胞の集団を患者に導入することにより、必要なタンパク質を供給することも記載する。導入遺伝子は、それを必要とする患者において治療的に有益な所望のタンパク質または構造的ＲＮＡをコードし得る。
【００５２】
したがって、本発明の方法および組成物は、任意の遺伝子座（例えば、高度に発現するアルブミン遺伝子座）由来の導入遺伝子から治療的に有益なＭＰＳ  Ｉおよび／またはＭＰＳ  ＩＩタンパク質を発現させてＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患において欠損している酵素を補充するために使用することができる。さらに、本発明は、ＭＰＳ  Ｉおよび／またはＭＰＳ  ＩＩ疾患を、肝細胞などの細胞において高度に発現する遺伝子座に導入遺伝子配列を挿入することによって処置する（１つまたは複数の症状の緩和を含む）ための方法および組成物を提供する。
【００５３】
さらに、導入遺伝子を、最終的な移植に使用するために患者由来の細胞、例えば、患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または他の型の幹細胞（胚性幹細胞または造血幹細胞）に導入することができる。それを必要とする患者に移植のために治療導入遺伝子を造血幹細胞に挿入することが特に有用である。幹細胞が成熟細胞に分化するに従って、組織への送達のための治療タンパク質を高レベルで含有するようになる。
【００５４】
概要
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、特に示さない限り、本技術分野の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．  ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．  Ｐ．  Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．  Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。
【００５５】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合する。
【００５６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１または複数のアミノ酸が、対応する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５７】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。かかる相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指す：増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
【００５８】
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合的に結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体と結合でき（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）および／または異なるタンパク質（単数もしくは複数）の１もしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、１つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【００５９】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００６０】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１または複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。これらのリピートドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも呼ぶ）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【００６１】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の工学技術での作製（１または複数のアミノ酸を変更する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「工学技術で作製され」得る。したがって、工学技術で作製されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を工学技術で作製するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然起源でないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を記憶するデータベース中の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第８，５６８，５２６号、同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６もまた参照されたい。
【００６２】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験プロセスから主に生じる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０  ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００６３】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性の修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復の間に行われる、かかる交換の特殊化された形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、かかる移入は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／もしくは標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、ならびに／または関連するプロセスに関与し得る。かかる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。
【００６４】
本開示の方法では、本明細書に記載される１または複数の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断を生じ、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが、細胞中に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易にすることが示されている。このドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはあるいは、このドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、ドナーと同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更され得、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へと変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも必要としない。
【００６５】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなるジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮタンパク質の対が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖開裂に使用され得る。
【００６６】
細胞クロマチン中の目的の領域中の配列の標的化された組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。かかる相同組換えは、切断の領域と相同な配列が存在する場合に、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。
【００６７】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含み得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列と相同なドナー配列の一部分は、置き換えられるゲノム配列に対して、約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は、例えば、１ヌクレオチドのみが１００個を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含み得る。これらの例では、非相同配列には、一般に、目的の領域中の配列と相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００よりも大きい任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、このドナー配列は、第一の配列とは非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。
【００６８】
本明細書に記載される方法のいずれかは、目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによる細胞中の１種もしくは複数種の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた提供される。
【００６９】
さらに、本明細書に記載される標的化された組込みの方法は、１種または複数種の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。外因性核酸配列は、例えば、１種もしくは複数種の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、および１種もしくは複数種の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、この外因性核酸配列は、１種または複数種のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。
【００７０】
「開裂」（cleavage）とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの個別の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。
【００７１】
「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と協同して、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」；「＋および−の開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左の開裂ハーフドメイン」は、相互交換可能に使用されて、二量体形成する開裂ハーフドメインの対を指す。
【００７２】
「工学技術で作製された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の工学技術で作製された開裂ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，８２３，６１８号を参照されたい。
【００７３】
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖状、環状または分枝状であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２ヌクレオチド長と１０，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００ヌクレオチド長と１，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２００ヌクレオチド長と５００ヌクレオチド長との間のものであり得る。
【００７４】
「疾患関連遺伝子」とは、単一遺伝子疾患においていくつかの様式で欠損している遺伝子である。単一遺伝子疾患の非限定的な例としては、重症複合免疫不全症、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積病（例えば、ゴーシェ病、ハーラー病  ハンター病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、テイ・サックス病など）、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが挙げられる。
【００７５】
「血液脳関門」とは、中枢神経系において循環血液を脳から分離する高度に選択的な透過性障壁である。血液脳関門は、血液溶質の通過を制限するＣＮＳ血管中の密着結合によって接続された脳内皮細胞によって形成される。血液脳関門は、長い間、大きな分子治療薬の取り込みを妨げ、大多数の小分子治療薬の取り込みを妨げると考えられてきた（Pardridge（２００５年）NeuroRx、２巻（１号）：３〜１４頁）。
【００７６】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、各々２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含む：リンカーＤＮＡ（生物に依存して変動する長さのもの）が、ヌクレオソームコア間に延びる。１分子のヒストンＨ１が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
【００７７】
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを構成する全ての染色体のコレクションであるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含み得る。
【００７８】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
【００７９】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。
【００８０】
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しない分子であるが、１または複数の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入され得る。「細胞中での通常の存在」は、特定の発生段階または細胞の環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して、外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能障害性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能障害性バージョンを含み得る。
【００８１】
外因性分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような小分子、または巨大分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上記分子のうちの１または複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。
【００８２】
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であり得るが、細胞が由来するのとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。
【００８３】
対照的に、「内因性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
【００８４】
「融合」分子は、２つまたはそれ超のサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。これらのサブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。融合分子の例としては、これだけに限定されないが、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと開裂ドメインとの間の融合物）、ポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）が開裂ドメインに作用的に会合した融合物および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。
【００８５】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このポリヌクレオチドは転写され、この転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生じる。トランス−スプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の他の場所に示される。
【００８６】
「遺伝子」には、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびにかかる調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接してもしなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８７】
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質もまた含まれる。
【００８８】
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活性化、ランダム変異）が、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較して、遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００８９】
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望まれる、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂および／または標的化された組換えを目的とすることができる。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささもしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００９０】
「真核生物」細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００９１】
「赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）」（ＲＢＣ）または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）は、造血幹細胞に由来する最終分化細胞である。赤血球は、ヌクレアーゼおよび大多数の細胞小器官が欠如している。ＲＢＣは、肺から末梢組織へ酸素を運搬するためのヘモグロビンを含有する。実際、個々のＲＢＣの３３％がヘモグロビンである。ＲＢＣはまた、代謝中に細胞によって産生されたＣＯ２も組織の外へ運搬し、呼気中に放出するために肺に戻る。ＲＢＣは、骨髄において血中低酸素に応答して産生され、これは、腎臓によるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の放出によって媒介される。ＥＰＯにより前赤芽球の数の増加が引き起こされ、完全なＲＢＣ成熟化に必要な時間が短縮される。ＲＢＣは核または任意の他の再生能を含有しないので、およそ１２０日後に、その細胞は肝臓、脾臓およびリンパ節におけるマクロファージの食作用活動によって（約９０％）または血漿中での溶血によって（約１０％）のいずれかで循環から取り除かれる。マクロファージ貪食後、ＲＢＣの化学構成成分は、リソソーム酵素の作用によってマクロファージの液胞中で分解される。
【００９２】
「分泌組織」とは、産物を個々の細胞から一般には上皮に由来する一部の型の管腔中に分泌する、動物内の組織である。胃腸管に局在化している分泌組織の例としては、腸、膵臓、および胆嚢を裏打ちする細胞が挙げられる。他の分泌組織としては、肝臓、眼に関連する組織および粘膜、例えば唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体および内分泌系の他のメンバーが挙げられる。さらに、分泌組織は、分泌を行うことが可能な組織型の個々の細胞を含む。
【００９３】
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結した（「ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ」または「ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ」）」は、２つまたはそれ超の構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、ここで、これらの構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの構成成分のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、このコード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合であっても、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。
【００９４】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」とは、構成成分の各々が、他の構成成分と連結して、そのように連結されていない場合にそれが果たすのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、このＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、活性化ドメインは遺伝子発現を上方調節できる場合に、作動可能な連結状態にある。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合した融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、開裂ドメインは標的部位の近位においてＤＮＡを開裂できる場合に、作動可能な連結状態にある。
【００９５】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、その全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、および／または、１もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、本技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって、決定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的および生化学的の両方の補完によって、決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００９６】
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。
【００９７】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、慣用的なアッセイにおいてである必要はないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子には、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、Ｇ４１８抵抗性、ピューロマイシン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光もしくは発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１または複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。
【００９８】
用語「被験体」および「患者」は、相互交換可能に使用され、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物を指す。したがって、「被験体」または「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の変更された細胞および／または本発明の変更された細胞によって産生されるタンパク質を投与することができる任意の哺乳動物患者または被験体を意味する。本発明の被験体は、ＬＳＤ（ＭＰＳ  Ｉ）および／またはＭＰＳ  ＩＩ障害を有する被験体を含む。
【００９９】
ヌクレアーゼ
本明細書に記載される方法では、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子の標的化導入のために１種または複数種のヌクレアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、導入遺伝子が標的化された様式でゲノム中に組み込まれるように導入遺伝子と細胞のゲノムの開裂のためのヌクレアーゼとを保有するドナー分子のｉｎ  ｖｉｖｏ開裂に有用な、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＴｔａｇｏガイドＲＮＡが挙げられる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼの１種または複数種は、天然起源である。他の実施形態では、ヌクレアーゼの１種または複数種は、非天然起源である、即ち、ＤＮＡ結合分子（ＤＮＡ結合ドメインとも称される）および／または開裂ドメインにおいて工学技術で作製されている。例えば、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る（例えば、選択された標的部位に結合するように工学技術で作製されたＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのｓｇＲＮＡ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン（例えば、異種開裂ドメインを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｔｔａｇｏ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどを含む。
【０１００】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子に結合するためおよび／または細胞のゲノム中の目的の領域に結合するために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の開裂部位を認識し、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーへと一般に分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、工学技術で作製された（非天然起源の）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを使用する。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように工学技術で作製され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼに関して変更され得（即ち、ヌクレアーゼが同族開裂ドメインを含むように）、または異種開裂ドメインに融合され得る。
【０１０２】
他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において使用される１種または複数種のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のまたは工学技術で作製された（非天然起源の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞中に２５種よりも多い異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中したドメインを含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ、ら（２００６年）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照されたい）。さらに、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ生物型（ｂｉｏｖａｒ）１株ＧＭＩ１０００および生物型４株ＲＳ１０００における、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１０３】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、これらのタンデムリピート中に見出される配列に依存する。リピートされる配列は、およそ１０２ｂｐを含み、これらのリピートは、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。これらのリピートの多型は、１２位および１３位に通常位置し、１２位および１３位における超可変二残基（ＲＶＤ）の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の連続ヌクレオチドの正体との間には、一対一の相関が存在するようである（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０１頁ならびにＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし；ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、そしてＩＮＧがＴに結合するように、決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートは、新たな配列と相互作用でき植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化できる人工の転写因子を作製するために、新たな組合せおよびリピート数を有するタンパク質へとアセンブルされている（Ｂｏｃｈら、同書）。工学技術で作製されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインに連結されて、酵母レポーターアッセイにおいて活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を生じている（プラスミドベースの標的）。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（（２０１０年）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照されたい。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎ  ｖｉｖｏ開裂および／または標的化された開裂に使用される１種または複数種のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように工学技術で作製されているという点で、非天然起源である。例えば、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【０１０５】
工学技術で作製されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。工学技術での作製方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１０６】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；およびＷＯ０１／８８１９７中に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１０７】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。例示的なリンカー配列については、米国特許第８，７７２，４５３号；同第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【０１０８】
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０  ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
【０１０９】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して、一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含めた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照されたい。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年．  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．  １巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸開裂の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【０１１１】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの連続的ステップで、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のためのさらなる要求、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ９を指向させる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップから構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、さらなる攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイ中への異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後の、（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性の干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関連し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾、およびその融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合的修飾が含まれるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から取得可能であり得るか、もしくは化学的に合成され得るか、またはこれらの２つの手順の組合せによって、取得可能であり得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように工学技術で作製された細胞であり得、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。一部の場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように工学技術で作製される。Ｃａｓタンパク質に加えておよび／またはその代わりに使用することができる、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（RNA  guided  nuclease）の追加的な非限定的な例としては、Ｃｐｆ１などのクラス２  ＣＲＩＳＰＲタンパク質が挙げられる。例えば、Zetscheら、（２０１５年）Cell、１６３巻：１〜１３頁を参照されたい。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはＴｔＡｇｏ系の一部である（Swartsら、同書；Shengら、同書を参照されたい）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは小さな（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合する。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、標的ＲＮＡを、低分子ＲＮＡと標的の間のワトソン・クリック塩基対合を介して認識し、標的ＲＮＡをヌクレオチド鎖切断的に開裂する（Vogel（２０１４年）Science  ３４４巻：９７２〜９７３頁）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来（多くの場合ウイルス）ＤＮＡを検出し、除去するように機能するようである（Yuanら、（２００５年）Mol.  Cell  １９巻、４０５頁；Olovnikovら（２０１３年）Mol.  Cell  ５１巻、５９４頁；Swartsら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のもの、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のもの、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが挙げられる。
【０１１４】
最もよく特徴付けられている原核生物Ａｇｏタンパク質のうちの１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のもの（ＴｔＡｇｏ；Swartsら、同書）である。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を伴う１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質−ＤＮＡ複合体と第３のＤＮＡ分子内のワトソン・クリック相補ＤＮＡ配列の結合を導くように機能する。これらのガイドＤＮＡ内の配列情報により標的ＤＮＡの同定が可能になったら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体が標的ＤＮＡを開裂する。そのような機構は、その標的ＤＮＡと結合する一方でＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（G.  Shengら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は同様の特性を有する（Olivnikovら、同書）。
【０１１５】
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡをＴｔＡｇｏタンパク質に負荷することができる（Swartsら、同書）。ＴｔＡｇｏ開裂の特異性はガイドＤＮＡによって導かれるので、したがって、外因性の研究者指定のガイドＤＮＡと形成されるＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体により、相補的な研究者指定の標的ＤＮＡへのＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ開裂が導かれる。このように、ＤＮＡにおいて標的化された二本鎖切断を生じさせることができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオルソロガスなＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用により、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化された開裂が可能になる。そのような開裂は、一本鎖のものでも二本鎖のものでもあり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡの開裂のためには、哺乳動物細胞における発現についてコドン最適化されたＴｔＡｇｏのバージョンを使用することが好ましい。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質を細胞透過性ペプチドと融合する場合には、細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で処理することが好ましい場合がある。さらに、３７摂氏温度における活性が改善されるように変異誘発によって変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。ＴｔＡｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ開裂を使用して、ＤＮＡ切断を活用するための、当技術分野における標準の技法を使用した遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子補正、標的化された遺伝子欠失を含めた転帰のひと揃い（panopoly）をもたらすことができる。
【０１１６】
したがって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望まれる任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するという点で、ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０１１７】
Ｂ．開裂ドメイン
任意の適切な開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに会合（例えば、作動可能に連結）されて、ヌクレアーゼを形成し得る。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮ−その工学技術で作製された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図した核酸標的を認識でき、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位の近くでＤＮＡが切断されるようにする、機能的実体−を生じている。例えば、Ｋｉｍら（１９９６年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３巻（３号）：１１５６〜１１６０頁を参照されたい。より最近、ＺＦＮは、種々の生物においてゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；ならびに国際公開第０７／０１４２７５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＴＡＬＥＮを生じている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。ＤＮＡに結合し、開裂ドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン）と会合して、標的化された開裂を誘導する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系も記載されている。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および同第８，９３２，８１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照されたい。
【０１１８】
上述のように、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得る、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、ｓｇＲＮＡ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ならびに／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。開裂ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年もまた参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。
【０１１９】
同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体形成を必要とする、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、開裂に必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。これら２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質についての標的部位は、好ましくは、互いに関して配置され、その結果、そのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば二量体形成によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる互いに対する空間的配向に、これらの開裂ハーフドメインを置く。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近くの端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に存在する。
【０１２０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合の部位またはその近傍でＤＮＡを開裂させることが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位においてＤＮＡを開裂させ、分離可能な結合ドメインおよび開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所において、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、工学技術で作製されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１または複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。
【０１２１】
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化された二本鎖開裂および／または標的化された置き換えのために、各々がＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。あるいは、１つのジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた、使用され得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化された開裂および標的された配列変更のためのパラメーターは、本開示の別の場所に提供される。
【０１２２】
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持するまたは多量体形成する（例えば、二量体形成する）能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。
【０１２３】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、開裂ドメインは、例えば、その全ての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７７２，４５３号；同第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号に記載されるように、ホモ二量体形成を最小化または防止する１種または複数種の工学技術で作製された開裂ハーフドメイン（二量体形成ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位および５３８位におけるアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体形成に影響を与えるための標的である。
【０１２５】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な工学技術で作製された開裂ハーフドメインには、第１の開裂ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基において変異を含み、第２の開裂ハーフドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９において変異を含む、対が含まれる。
【０１２６】
したがって、一実施形態では、４９０位における変異によりＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ、５３８位における変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ、４８６位における変異によりＧｌｎ（Ｑ）がＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられ、４９９位における変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられる。特に、本明細書に記載される工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、一方の開裂ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される工学技術で作製された開裂ハーフドメインを産生し、および別の開裂ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される工学技術で作製された開裂ハーフドメインを産生することにより調製された。本明細書に記載される工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消失される、偏性ヘテロ二量体変異体である。それらの開示が参照によりそれらの全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号を参照されたい。ある特定の実施形態では、工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える変異、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、４９０位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む（例えば、米国特許第８，７７２，４５３号を参照されたい）。他の実施形態では、工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、「シャーキー」および／または「シャーキー」変異を含む（Ｇｕｏら（２０１０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照されたい）。
【０１２７】
本明細書に記載される工学技術で作製された開裂ハーフドメインは、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号に記載されるように、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって、任意の適切な方法を使用して調製できる。
【０１２８】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「開裂酵素」（split-enzyme）技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎ  ｖｉｖｏでアセンブルされ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。かかる開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物のいずれか上に発現され得るか、または、例えば、自己開裂性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離されて、１つのオープンリーディングフレームで連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１２９】
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載される酵母ベースの染色体系における使用の前に、活性についてスクリーニングされ得る。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。
【０１３０】
Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって空間が置かれたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有する２種のＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを含む。ゲノム工学技術での作製を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３１１４３を参照されたい）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物を介して、または別々のＲＮＡとして、供給される。他の実施形態では、工学技術で作製された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されてキメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ぶ）を生じる、キメラＲＮＡが構築される（Ｊｉｎｅｋ同書およびＣｏｎｇ、同書を参照されたい）。
【０１３１】
本明細書に記載されるヌクレアーゼ（複数可）により、標的部位において１つまたは複数の二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｕｔ）および／または一本鎖切断（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｕｔ）を生じさせ得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒として不活性な開裂ドメイン（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号；同第８，７０３，４８９号およびGuillingerら、（２０１４年）Nature  Biotech.、３２巻（６号）：５７７〜５８２頁を参照されたい。触媒として不活性な開裂ドメインは、一本鎖切断を生じさせるためのニッカーゼとして作用する触媒として活性なドメインと組み合わせることができる。したがって、２つのニッカーゼを組み合わせて使用して、特定の領域において二本鎖切断を生じさせることができる。追加的なニッカーゼも当技術分野で公知である、例えば、McCafferyら、（２０１６年）Nucleic  Acids  Res.、４４巻（２号）：e11.  doi:10.1093/nar/gkv878.２０１５年１０月１９日に電子出版。
【０１３２】
標的部位
上に詳細に記載したように、ＤＮＡドメインは、遺伝子座、例えば、アルブミンまたは他のセーフハーバー遺伝子中の選択された任意の配列に結合するように工学技術で作製され得る。工学技術で作製されたＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有し得る。工学技術での作製方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計もまた実施され得る。例えば、米国公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。
【０１３３】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。
【０１３４】
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのヌクレアーゼおよび方法は、当業者に公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。
【０１３５】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。米国特許第８，５８６，５２６号もまた参照されたい。
【０１３６】
ドナー
上述のように、例えば、変異体遺伝子を補正するための、またはＭＰＳ  Ｉおよび／もしくはＭＰＳ  ＩＩ疾患において欠如もしくは欠損しているタンパク質（例えば、ＩＤＵＡもしくはＩＤＳ）をコードする遺伝子の発現を増加させるための、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも称される）の挿入が提供される。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなる。ドナー配列は、２つの相同な領域に隣接する非相同配列を含有し、目的の位置での効率的なＨＤＲを可能とする。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば、常態では目的の領域に存在しない標的化された配列を挿入するために、前記配列を、ドナー核酸分子中に存在させることができ、目的の領域中の配列に相同な領域を隣接させることができる。
【０１３７】
本明細書に記載されているのは、選択された位置内へ挿入するための、ＩＤＵＡもしくはＩＤＳタンパク質をコードする導入遺伝子の標的化された挿入の方法である。挿入に用いるポリヌクレオチドは、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子、または「導入遺伝子」とも呼ばれ得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、一本鎖および／または二本鎖であってもよく、直鎖状または環状の形態で細胞内に導入することができる。米国特許第８，７０３，４８９号および同第９，００５，９７３号を参照されたい。ドナー配列（複数可）は、ＤＮＡ  ＭＣ内に含まれ得、これは、培養中の細胞内へ環状または直鎖状の形態で導入され得る。米国特許出願公開第２０１４０３３５０６３号を参照されたい。直鎖状の形態で導入される場合、当業者に公知の方法によって、ドナー配列の末端を保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加する、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻：４９５９〜４９６３頁、Ｎｅｈｌｓら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法としては、末端アミノ基（複数可）の付加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダートやＯ−メチルリボースもしくはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間の結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターや抗生物質耐性をコードしている遺伝子などの追加的な配列を有するベクター分子の部分として、細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、ネイキッド核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの剤と複合体を形成した核酸として、導入することができ、また、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。
【０１３９】
ドナーは、一般に、組込み部位の内因性プロモーター、即ちドナーが挿入されている内因性遺伝子（例えば、高度に発現される、アルブミン、ＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴなど）の発現を駆動するプロモーターによって、発現が駆動されるように挿入される。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成性のプロモーターまたは誘導可能なもしくは組織特異的なプロモーターを含み得ることは明らかである。一部の実施形態では、遺伝子が染色体外で発現するように、ドナーを発現プラスミド中に入れて細胞中で維持する。
【０１４０】
ドナー分子は、内因性遺伝子の全てまたは一部が発現するか、またはその全てが発現しないように、内因性遺伝子中に挿入することができる。例えば、本明細書に記載される導入遺伝子を、アルブミンまたは他の遺伝子座に、例えば、ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質（複数可）をコードする導入遺伝子との融合物として、内因性アルブミン配列の一部（リソソーム酵素をコードする導入遺伝子に対してＮ末端および／またはＣ末端）が発現するか、またはその全てが発現しないように、挿入することができる。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、アルブミンに対するものなどの追加的なコード配列を伴うまたは伴わない）を任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込む。
【０１４１】
内因性配列（内因性または導入遺伝子の一部）を、導入遺伝子を用いて発現させる場合、内因性配列（例えば、アルブミンなど）は、全長配列（野生型または変異体）であっても部分配列であってもよい。内因性配列は機能的であることが好ましい。これらの全長または部分配列（例えば、アルブミン）の機能の非限定的な例としては、導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）によって発現されるポリペプチドの血清中半減期を増加させることおよび／またはキャリアとして作用することが挙げられる。
【０１４２】
さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、外因性配列（ドナー）は、目的のタンパク質と、その融合パートナーとして、融合タンパク質を細胞の表面上に配置される膜タンパク質の細胞外ドメインとの融合物を含む。これにより、導入遺伝子によりコードされるタンパク質が血清中で潜在的に作用することが可能になる。ＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患に対する処置の場合では、それぞれ導入遺伝子融合物によりコードされるＩＤＵＡまたはＩＤＳ酵素が細胞（例えば、ＲＢＣ）の表面上のその位置から血清中に蓄積する代謝産物に作用する。さらに、ＲＢＣが正常な分解の経過と同様に脾臓マクロファージによって呑み込まれると、マクロファージが細胞を呑み込むときに形成されるリソソームにより、膜に結合した融合タンパク質が、その酵素により天然に好都合なｐＨにあるリソソーム中で高濃度の代謝産物に曝露される。
【０１４４】
一部の場合では、ドナーは、改変された内因性遺伝子（ＩＤＵＡまたはＩＤＳ）であり得る。例えば、内因性遺伝子にコドン最適化を実施してドナーを生成することができる。さらに、酵素補充療法に対する抗体応答は、問題の特異的治療酵素および個々の患者に関して変動するが、野生型ＩＤＵＡまたはＩＤＳを用いた酵素補充で処置されている多くのＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患患者において有意な免疫応答が見られている。さらに、これらの抗体と処置の有効性の関連性も変動する（Katherine  Ponder、（２００８年）J  Clin  Invest、１１８巻（８号）：２６８６頁を参照されたい）。したがって、本発明の方法および組成物は、これだけに限定されないが、内因性免疫応答に対するプライミングエピトープであることが公知の部位において機能的にサイレントなアミノ酸の変化を生じさせる改変、および／または、そのようなドナーによって産生されるポリペプチドの免疫原性が低くなるような短縮を含めた、野生型ＩＤＵＡまたはＩＤＳと比較して改変された配列を有するドナーの生成を含み得る。
【０１４５】
ＭＰＳ  ＩおよびＭＰＳ  ＩＩ疾患患者は、多くの場合、脳における欠けているＩＤＵＡまたはＩＤＳ酵素の欠如に起因して神経性後遺症を有する。残念ながら、多くの場合、治療薬を、血液を介して脳に送達することは、血液脳関門の不透過性に起因して難しい。したがって、本発明の方法および組成物は、これだけに限定されないが、脳毛細血管の細胞間の密着結合の一過性の開放、例えば、高張性マンニトール溶液の頸動脈内投与の使用による一過性の浸透圧破壊、集束超音波の使用およびブラジキニン類似体の投与などを含めた、治療薬の脳への送達を増加させるための方法と併せて使用することができる。あるいは、治療薬を、脳への特異的輸送のための受容体または輸送機構を利用するように設計することができる。使用することができる特異的な受容体の例としては、トランスフェリン受容体、インスリン受容体または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１および２（ＬＲＰ−１およびＬＲＰ−２）が挙げられる。ＬＲＰは、例えばａｐｏＥ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１などの様々な分泌タンパク質と相互作用することが公知であり、したがって、ＬＲＰに対するこれらのタンパク質のうちの１つに由来する認識配列の融合により、治療タンパク質の肝臓における発現および血流中への分泌後の、酵素の脳への輸送が容易になる（Gabathuler、（２０１０年）、同上を参照されたい）。
【０１４６】
細胞
本明細書に記載される方法によって生成される細胞を含めた、ＩＤＵＡおよび／またはＩＤＳタンパク質をコードする導入遺伝子を含む遺伝子改変された細胞、例えば、肝細胞または幹細胞も本明細書で提供される。ＩＤＵＡおよび／またはＩＤＳ導入遺伝子は、染色体外に発現させることもでき、または、１種または複数種のヌクレアーゼを使用して、標的化された様式で細胞のゲノム中に組み込むこともできる。ランダムな組込みとは異なり、ヌクレアーゼ媒介性標的化組込みでは、導入遺伝子の指定の遺伝子への組込みが確実になる。導入遺伝子は、標的遺伝子中のどこにでも組み込むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子をクレアーゼ結合部位および／または開裂部位またはその付近、例えば、開裂部位および／または結合部位の上流または下流の１〜３００塩基対（またはそれらの間の任意の数の塩基対）内、より好ましくは開裂部位および／または結合部位のいずれか側の１〜１００塩基対（またはそれらの間の任意の数の塩基対）内、さらにより好ましくは開裂部位および／または結合部位のいずれか側の１〜５０塩基対（またはそれらの間の任意の数の塩基対）内に組み込む。ある特定の実施形態では、組み込まれる配列は、いかなるベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）をも含まない。
【０１４７】
これだけに限定されないが、細胞または細胞株を含めた任意の細胞型を本明細書に記載されるように遺伝子改変して導入遺伝子を含めることができる。本明細書に記載される遺伝子改変された細胞の他の非限定的な例としては、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋など）；樹状細胞；Ｂ細胞；自己（例えば、患者由来）細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、肝細胞であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで改変されている。ある特定の実施形態では、細胞は、異種性の多能性幹細胞、全能性幹細胞または複能性幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞など）を含めた幹細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞は、患者に由来する幹細胞である。
【０１４８】
本明細書に記載される細胞は、障害を有する被験体におけるＭＰＳ  ＩまたはＭＰＳ  ＩＩ疾患を、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ療法によって処置および／または予防することにおいて有用である。例えば、ヌクレアーゼにより改変された細胞を拡大増殖させ、次いで、標準の技法を使用して患者に再導入することができる場合、ｅｘ  ｖｉｖｏ療法も提供される。例えば、Tebasら、（２０１４年）New  Eng  J  Med、３７０巻（１０号）：９０１頁を参照されたい。幹細胞の場合では、被験体への注入後、これらの前駆体の、機能的なタンパク質（挿入されたドナーに由来する）を発現する細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏ分化も起こる。
【０１４９】
本明細書に記載されている細胞を含む医薬組成物も提供される。さらに、細胞は、患者に投与する前に凍結保存することができる。
【０１５０】
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適当な手段によって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで送達してもよい。
【０１５１】
本明細書に記載されているようなヌクレアーゼの送達方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
【０１５２】
また、本明細書に記載されているようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を、１種または複数種のジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣａｓ系タンパク質（複数可）をコードする配列を含有するベクターを使用して送達してもよい。以下に限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなどを含めた任意のベクター系を使用してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、任意のこれらのベクターが、処置に求められる１種または複数種の配列を含んでもよいことは明らかである。そのため、１種または複数種のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞内に導入する際に、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドを同じベクターまたは異なるベクターに保有させてもよい。複数のベクターを使用する際には、各ベクターは、１種または複数種のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含んでもよい。
【０１５３】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞へ送達された後に、エピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのどちらかを有する。遺伝子治療手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）、ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）、ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ，  ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）、Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）、Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁（１９９５年）、ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）、Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中のＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ著（１９９５年）ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照されたい。
【０１５４】
核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で増強されたＤＮＡ取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
【０１５５】
追加的な例示の核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、マサチューセッツ州）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ、（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、ＦｅｌｇｎｅｒのＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
【０１５６】
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）、Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）、Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５巻：６４７−６５４（１９９４年）、Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）、Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）、ならびに米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
【０１５７】
追加的な送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内へのパッケージングを使用することが挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、かつ他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）、６４３頁を参照されたい）。
【０１５８】
工学技術で作製されたＺＦＰをコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、被験体に直接投与（ｉｎ  ｖｉｖｏ）することができるか、またはインビトロで細胞を処置するために使用することができ、改変された細胞は被験体に投与される（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【０１５９】
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み入れることによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高ウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に用いるパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングには十分であり、それらは、次いで、治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用されて、導入遺伝子の永続的な発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）、Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
【０１６０】
一過性発現が好適な用途では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質移入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現を得ている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。また、アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療の手順（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照されたい）に用いるために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含めた多数の刊行物に記載されている。
【０１６１】
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験の遺伝子移入に利用可能であり、それらは、形質導入薬剤を生成するために、ヘルパー細胞株内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。
【０１６２】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）、Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）、Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓでパッケージされたベクターについて、５０％またはそれ超の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）、Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１巻：１１１〜２頁（１９９７年）。）
【０１６３】
組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特長である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１巻：９１１７号  １７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。非限定的な例によれば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０、ならびに偽型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６）を含めた他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
【０１６４】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターのほとんどは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えて、その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞で増殖するように、工学技術で作製される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるものなど非分裂性の分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな保有能力を有する。臨床試験でＡｄベクターを使用する例では、筋肉内注入を用いた抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療が含められた（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子移入に用いるアデノウイルスベクターの使用の追加的な例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）、Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）、Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。
【０１６５】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生産細胞株によって生成される。これらのベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを具える。ウイルスＤＮＡは、細胞株中にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠失したヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、有意な量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、ＡＡＶよりも感受性があるアデノウイルスに対する熱処理によって低減することができる。
【０１６６】
多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、高度な特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現しているある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質をウイルスが発現する、他のウイルス−標的細胞の対にまで及び得るものである。例えば、線状ファージを工学技術で作製して、事実上いかなる選ばれた細胞受容体にも特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを工学技術で作製して、特異的な標的細胞による取り込みに好都合な特異的な取り込み配列を含有させることができる。
【０１６７】
遺伝子治療ベクターは、下記に説明するように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）や万能ドナーの造血幹細胞などの細胞に、ベクターをｅｘ  ｖｉｖｏで送達し、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択した後に、患者への細胞の再移植を行うことができる。
【０１６８】
また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触の内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかに依り、そのような経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する適当な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、そして、１つよりも多い経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供することができる。
【０１６９】
本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁、米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。
【０１７０】
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、下記に記載するように、利用可能な医薬組成物の実に様々な適当な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照されたい）。
【０１７１】
ヌクレアーゼをコードする配列とドナー構築物とを、同じまたは異なる系を使用して送達することができることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドをプラスミドによって保有することができ、一方、１種または複数種のヌクレアーゼをＡＡＶベクターによって保有することができる。さらに、これらの異なるベクターを、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって投与することができる。これらのベクターを、同時にまたは任意の順番で、送達することができる。
【０１７２】
ｅｘ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｖｏとの両方の投与に用いる製剤としては、液体中懸濁液物または乳濁液が挙げられる。多くの場合、活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤もしくは乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を高める他の試薬などの微量の補助的な物質を含有していてもよい。
【０１７３】
適用
本発明の方法は、ＭＰＳ  Ｉ疾患（例えば、リソソーム蓄積病）および／またはＭＰＳ  Ｉ疾患の処置および／または予防を企図する。処置は、必要な酵素（複数可）を発現させ、血流中に放出させるために、１種または複数種の補正疾患関連遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ、ＩＤＳなど）を細胞中のセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン）に挿入することを含み得る。導入遺伝子は、コドン最適化された導入遺伝子（例えば、ＩＤＵＡまたはＩＤＳ）；および／またはタンパク質を機能的に変更させずにエピトープを除去することができる導入遺伝子を含むタンパク質をコードするものであり得る。一部の場合では、方法は、必要な酵素を発現させ、血流中に放出させるために、補正酵素をコードする導入遺伝子を発現するエピソームを細胞中に挿入することを含む。産物を血流中に放出させるために肝細胞などの分泌細胞に挿入することが特に有用である。本発明の方法および組成物はまた、１種または複数種の治療薬をコードするＩＤＵＡまたはＩＤＳ導入遺伝子を造血幹細胞中に供給し、したがって、これらの細胞に由来する成熟細胞（例えば、ＲＢＣ）が治療薬を含有することが望まれる任意の状況で使用することができる。これらの幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで分化させることができ、また、患者全てに対して使用することができる普遍的なドナー細胞型に由来し得る。さらに、細胞は、細胞を体内で輸送するための膜貫通タンパク質を含有し得る。処置は、治療導入遺伝子を含有する患者細胞の使用も含み得、その場合、細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで発生させ、次いで、患者に導入して戻す。例えば、適切なＩＤＵＡまたはＩＤＳをコードする導入遺伝子を含有するＨＳＣを患者に骨髄移植によって挿入することができる。あるいは、ＩＤＵＡまたはＩＤＳをコードする導入遺伝子を使用して編集された筋肉幹細胞またはｉＰＳＣなどの幹細胞を筋組織に注射することもできる。
【０１７４】
したがって、この技術は、患者が、問題（例えば、発現レベルの問題または低機能性もしくは非機能性で発現するタンパク質の問題）に起因していくつかのタンパク質を欠損している状態において有用であり得る。本発明で特に有益なのは、ＭＰＳ  Ｉ疾患を有する被験体における機能性を補正するまたは回復させるための導入遺伝子の発現である。
【０１７５】
非限定的な例として、欠損しているまたは欠けているタンパク質の産生がＭＰＳ  Ｉおよび／またはＭＰＳ  ＩＩ疾患を処置するために実践され、使用された。タンパク質をコードする核酸ドナーをセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミンまたはＨＰＲＴ）に挿入し、外因性プロモーターを使用してまたはセーフハーバーに存在するプロモーターを使用してのいずれかで発現させることができる。あるいは、ドナーを使用して、欠損している遺伝子をｉｎ  ｓｉｔｕで補正することができる。所望のＩＤＵＡまたはＩＤＳをコードする導入遺伝子をＣＤ３４＋幹細胞に挿入し、骨髄移植中に患者に戻すことができる。最後に、核酸ドナーを、この細胞に由来する成熟赤血球が核酸ドナーによりコードされる生物剤を高濃度で有するように、ＣＤ３４＋幹細胞中のベータグロビン遺伝子座に挿入することができる。次いで、生物剤を含有するＲＢＣを、正しい組織に、膜貫通タンパク質（例えば、受容体または抗体）を介して標的化することができる。さらに、ＲＢＣを、ｅｘ  ｖｉｖｏで電気感作（ｅｌｅｃｔｒｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）によって感作して、エネルギー源への曝露後にそれらをより破壊されやすくすることができる（ＷＯ２００２００７７５２を参照）。
【０１７６】
一部の適用では、本発明の方法および組成物を使用することによって内因性遺伝子をノックアウトすることができる。この態様の例としては、異常な遺伝子調節因子または異常な疾患関連遺伝子をノックアウトすることが挙げられる。一部の適用では、異常な内因性遺伝子を、機能的にまたはｉｎ  ｓｉｔｕでのいずれかで、野生型バージョンの遺伝子で置き換えることができる。挿入される遺伝子は、治療ＩＤＵＡまたはＩＤＳタンパク質の発現が改善されるようにまたはその免疫原性が低下するように変更することもできる。一部の適用では、挿入されるＩＤＵＡまたはＩＤＳをコードする導入遺伝子は、脳などの選択された組織へのその輸送を増加させるための融合タンパク質である。
【０１７７】
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを含む、本開示の例示的な実施形態に関する。このことが、実例のみの目的にあること、ならびに他のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系が使用され得ること、例えば、工学技術で作製されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）が使用され得ること、および／または天然起源のもしくは工学技術で作製されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと異種由来開裂ドメインとの融合物、および／または工学技術で作製された単一ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が使われ得ることであることは理解されよう。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１）
マウスＺＦＮ試薬およびＩＤＵＡドナー鋳型の設計および構築
臨床的な候補ＺＦＮおよびヒトアルブミンドナー相同性アームについての標的配列はマウスアルブミン遺伝子座では保存されていないので、これらのマウス試験において使用するためのマウスサロゲート試薬を開発した。マウスサロゲート試薬は、マウスアルブミン遺伝子のイントロン１中の相同部位を標的とするＺＦＮ  ｒＡＡＶベクターの対（以下の表Ｉおよび表ＩＩに示す、ＳＢ−４８６４１、ＳＢ−３１５２３、米国特許出願第１４／８７２，５３７号を参照されたい）、ならびにマウス遺伝子座（ＳＢ−ｍｕ−ＩＤＵＡ）に対する相同性を有するアームが隣接するプロモーターなしヒトＩＤＵＡ導入遺伝子（ｈＩＤＵＡ）をコードするドナーを含むものであった。この試験において使用したＺＦＮ：ＺＦＮ：ドナーの比は１：１：８であった。このマウス試験に関しては、サロゲート試薬をパッケージングし血清型ｒＡＡＶ２／８を使用して送達した。なぜなら、それが、マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでｒＡＡＶ２／６ベクターよりも優れた形質導入およびより速い導入遺伝子発現を付与するからである。ｒＡＡＶ２／８ベクターを、製剤緩衝液、３５ｍＭのＮａＣｌおよび５％グリセロールを補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．１中に希釈した。
【表１】
2019505523.tif 000003
【表２】
2019505523.tif 000004
【０１７９】
マウスアルブミン特異的ＺＦＮ対は十分に活性であった。
【０１８０】
（実施例２）
マウスモデルにおけるＭＰＳ  Ｉ（ＩＤＵＡノックアウトまたはＩｄｕａ−／−）の処置
Ａ．材料および方法
この試験において使用したＭＰＳ  Ｉ（ＩＤＵＡノックアウトまたはＩｄｕａ−／−）マウスモデルは、Ｄｒ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｎｅｕｆｅｌｄ（ＵＣＬＡ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）により、ネオマイシン耐性カセットをエクソン６に挿入したＩＤＵＡ遺伝子の破壊によって作製された（Ohmiら、（２００３年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１００巻（４号）：１９０２〜１９０７頁）。次いで、マウスをＣ５７ＢＬ／６遺伝的背景で飼育し、ヘテロ接合体を選択してＩｄｕａ−／−マウスを作製した。このホモ接合性変異は、動物の生存期間の経過にわたって有意な形態学的変化、生化学的変化および神経学的変化をもたらすものであり、リソソーム病態生理を試験するための適切なモデルであることが証明された。特に、これらのＭＰＳ  Ｉマウスは、頭蓋顔面の異常、神経学的欠損、ならびに組織中および尿中のＧＡＧレベルの増加などの、ＭＰＳ  Ｉに典型的な表現型特長を示すことが示されている（Hartungら、（２００４年）、Mol  Ther.、９巻（６号）：８６６〜７５頁；Ouら、（２０１４年）、Mol  Genet  Metab.、１１１巻（２号）：１１６〜２２頁）。Ｉｄｕａ−／−マウスでは、約３〜５週齢後にこれらの症状が発生し始め、１２〜１６週齢までに、肝臓および中枢神経系（ＣＮＳ、即ち、脳、脊髄および髄膜）における広範囲にわたるＧＡＧのリソソームへの蓄積が明らかである。さらに、これらのＭＰＳ  Ｉマウスは、認知障害／機能障害を示す（Hartungら、同上；Ouら、同上）。
【０１８１】
マウスのコホートを、４〜１０週齢で同腹仔が入手可能になったらランダム化し、投薬した。同じ日に群当たり少なくとも２匹のマウスに投薬した。
【０１８２】
ｈＩＤＵＡタンパク質に対する可能性のある免疫原性応答を抑制するために、動物にシクロホスファミドを投与した。全てのマウスが、投薬の前日およびその後、第１２週まで毎週、シクロホスファミド（１２０ｍｇ／ｋｇ）２００μＬの腹腔内（ＩＰ）注射を受けた。第１２週の後、マウスは、剖検まで１２０ｍｇ／ｋｇを２週間毎に１回受けた。第１２週の後にシクロホスファミド投与の頻度を変化させた理由は、数匹のマウスで、シクロホスファミドの公知の副作用である注射部位付近の軽度の脱毛および急性の軽度の動作緩慢が観察されたからであった。以前の試験により、隔月の注射スケジュールを使用して（Aronovichら、（２００７年）、J.  Gene  Med.、９巻：４０３〜１５頁）、または必要に応じて使用して（Ouら、（２０１４年）Mol  Genet  Metabol、１１１巻（２号）：１１６頁を参照されたい）、ＭＰＳ  ＩマウスにおけるヒトＩＤＵＡ活性の喪失を減弱する効率的な免疫抑制が実証された。
【０１８３】
動物を、各性別について年齢および体重に基づいてランダム化した。１日目に単回用量の試験物またはビヒクルを投与した。ＡＡＶ注射の１カ月後に各群から３匹のマウスを安楽死させた。ＡＡＶ注射の４カ月後に各群から残りの５匹のマウスを安楽死させた。ＺＦＮ＋ドナー群に対する総ｒＡＡＶ２／８用量レベルは、マウス当たり１．５ｅ１２ｖｇであり、ドナーのみ群に対してはマウス当たり１．２ｅ１２ｖｇであった。群および受けた用量を以下の表３に示す。
【表３】
2019505523.tif 000005
【０１８４】
収集および測定：血液学的検査および臨床化学分析のための血液試料を、剖検前に（１２０日目）全ての動物から下顎出血によって収集した。動物を、血清化学のための収集（prior  to  serum  chemistry  collection）の前少なくとも８時間にわたって絶食させた。血液学的分析用の血液試料（目標体積１００〜１５０μＬ）は抗凝固剤としてカリウム（Ｋ３）ＥＤＴＡを含有するチューブに収集した。臨床化学分析用の血液試料（目標体積１００〜１５０μＬ）は抗凝固剤を伴わないチューブに収集し、血清へと処理した。
【０１８５】
ＩＤＵＡ活性の評価のために、血液試料（目標体積２００μＬ）を、７日目、１４日目、２８日目、６０日目、９０日目、１０４日目および１２０日目に全てのマウスから下顎出血によって収集して抗凝固剤としてヘパリンを含有するチューブに入れ、血漿へと処理した。
【０１８６】
尿中グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルの評価のために、尿試料（およそ１０〜１００μＬ）を、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、４２日目、６０日目、７４日目、９０日目、１０４日目および１２０日目に全てのマウスから膀胱に穏やかに圧力を加えることによって収集した。
【０１８７】
マウス組織からのゲノムＤＮＡ単離：凍結組織およそ５ｍｇをＬｙｓｉｓ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）に入れ、組織および細胞溶解液４００μＬを添加した（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）において、３ラウンド、４ｍ／ｓの４０秒／パルスによって均質化を実施した。粗溶解物を短時間遠心分離し、次いで、６５℃で３０分インキュベートし、その後、短時間遠心分離して溶解物を清澄化した。部分的に清澄化された溶解物を５分間氷上に置き、微量遠心分離チューブに移し、その後、ＭＰＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）４００μＬを添加した。混合物短時間ボルテックスし、次いで、４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離した。遠心分離後、清澄化された溶解物を新しい微量遠心分離チューブに移し、氷冷イソプロパノール１ｍＬを添加し、３０〜５０回反転させることによって混合し、−２０℃で２０分インキュベートした。混合物を４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を除去した。得られたペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、風乾した。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液１００μＬ中に再懸濁させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）を決定した。
【０１８８】
遺伝子改変分析：ＭｉＳｅｑディープシーケンシング：標的化された肝細胞におけるマウスサロゲートＺＦＮ構築物の活性を評価するために、各マウスの肝臓からゲノムＤＮＡを単離した。ＺＦＮ標的部位をＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を使用した配列解析に供した。マウスアルブミン遺伝子座内のＺＦＮ標的部位にわたる１６９塩基対（ｂｐ）断片を増幅するため（表４）および増幅の第２ラウンド用の結合配列を導入するするため（太字）のオリゴヌクレオチドプライマーの対を設計した。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の産物を精製し、アンプリコンに特異的な識別子配列（「バーコード」）が導入されるように設計されたオリゴヌクレオチド、ならびに結合する配列決定オリゴヌクレオチドプライマーに対して設計された末端領域を用いたＰＣＲの第２ラウンドに供した。次いで、バーコードアンプリコンの混合集団を、単一のアッセイチップ上で数千もの試料を並行して分析することを可能にする固相配列決定手順であるＭｉＳｅｑ分析に供した。ＭｉＳｅｑプロトコールでは、各インプットオリゴヌクレオチドに対するフォワード配列決定反応およびリバース配列決定反応の両方を逐次的に実施する。対合する配列をアラインメントし、統合し、野生型配列と比較して挿入および／または欠失（「インデル」）をマッピングした。ＺＦＮ活性が、挿入または欠失に起因して野生型とは異なる、配列決定されたアンプリコンの分率である「％インデル」として報告されている。
【表４】
2019505523.tif 000006
【０１８９】
ｈＩＤＵＡウエスタンブロット：マウス肝細胞におけるｈＩＤＵＡの発現を調査するために、肝臓タンパク質抽出物に対してウエスタンブロットを実施した。凍結組織およそ５０ｍｇをＬｙｓｉｓ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）に入れ、ＨＡＬＴ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した５００μＬ  ＲＩＰＡ緩衝液を添加した。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）において、５ラウンド、４．５ｍ／ｓの４５秒／パルスで均質化を実施した。均質化のラウンド間にチューブを氷上に置いた。次いで、粗溶解物を４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離した。遠心分離後、清澄化された溶解物を予め冷却した微量遠心分離チューブに移した。次いで、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ビシンコニン酸（ＢＣＡ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってタンパク質濃度を決定した。変性条件下で、総タンパク質３５μｇを４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）上で分離し、ニトロセルロースメンブレン上に固定化した。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を用いて室温で１時間にわたってブロッキングし、次いで、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中に希釈した一次抗体を用いて４℃で終夜プローブした。膜を、トリス緩衝食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）溶液中で５回、それぞれ５分にわたって洗浄し、次いで、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中二次抗体を用いて室温で１時間プローブした。二次標識後、膜を、ＴＢＳＴ中で５回、５分にわたって洗浄した。最後に、タンパク質負荷が一様であることを決定するために、膜を、ＧＡＰＤＨ−８００で標識した抗体を用いて室温で１時間プローブした。洗浄を上記の通り繰り返し、膜を、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナーを使用して画像処理した。
【０１９０】
ＩＤＵＡ酵素活性アッセイ：血漿および組織タンパク質抽出物中のＩＤＵＡ酵素活性を、合成基質４−メチルウンベリフェリルアルファ−Ｌ−イズロニド（４−ＭＵ−イズロニド；Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用した蛍光定量アッセイにおいて評価した。マウス組織試料をＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬと混合することによって組織タンパク質抽出物を調製した。試料を氷上で保管し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用い、スピードレベル５で５秒間均質化した。均質化を３回または固形組織粒子が見えなくなるまで繰り返した。均質化後、１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １１μＬを各試料に添加した。次いで、ホモジネートを氷上で１０分インキュベートし、その後、粗製ホモジネートを３，０００ｒｐｍで１０分遠心分離して、分析前に溶解物を澄明にした。組織抽出物のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の指示に従って使用して決定した。
【０１９１】
ＩＤＵＡ酵素活性アッセイでは、マウス組織タンパク質抽出物またはマウス血漿試料２５μＬを、ギ酸緩衝液（０．４Ｍのギ酸ナトリウム、ｐＨ３．５、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に溶解させた３６０μＭの合成基質（４−ＭＵ−イズロニド）２５μＬと混合した。反応物を３７℃で３０分インキュベートし、グリシン炭酸緩衝液（８４ｍＭのグリシン、８５ｍＭの無水炭酸ナトリウム）２００μＬを添加することによって終結させた。４−ＭＵの放出を、ＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して蛍光（Ｅｘ３６５／Ｅｍ４５０）を測定することによって決定した。４−ＭＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の希釈物を用いて標準曲線を作成した。得られたデータを線形曲線にフィッティングし、このベストフィット曲線を使用して試験試料中の４−ＭＵの濃度を算出した。酵素活性は、血漿１ｍＬまたはｍｇ組織抽出物当たりの、アッセイインキュベート時間１時間当たりに放出された４−ＭＵのｎｍｏｌ数（ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬまたはｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ）で表される。
【０１９２】
尿中およびマウス組織中のＧＡＧレベルの評価：組織中および尿中のＧＡＧレベルを、Ｂｌｙｓｃａｎ（商標）Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、Ｃａｒｒｉｃｋｆｅｒｇｕｓ、Ｃｏｕｎｔｙ  Ａｎｔｒｉｍ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を製造者の指示に従って使用して決定した。ＧＡＧアッセイの前に、上記の通り調製したマウス組織ホモジネートをプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）と１：３の比で混合し、５５℃で２４時間にわたって消化し、その後、１０分間煮沸することにより、プロテイナーゼＫの熱失活を行った。次に、組織ホモジネートを、２００単位のＤＮａｓｅおよび２μｇのＲＮａｓｅを用いて室温で２４時間にわたって振とうしながら消化した。次いで、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを１０分間煮沸することによって熱失活させ、得られた組織ホモジネートをＧＡＧアッセイに使用した。
【０１９３】
病理組織学的分析：１２０日目の剖検時に、雄（群１［ｎ＝５］、群２［ｎ＝４］、群４［ｎ＝４］、および群６［ｎ＝２］）および雌（群３［ｎ＝４］、群５［ｎ＝５］、および群６［ｎ＝２］）について最終的な体重および器官（副腎、脳、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、精巣または卵巣）の重量を収集し、また群の平均および標準偏差をＥｘｃｅｌで常套的に算出した。
【０１９４】
群１〜６からの動物を剖検し、収集した組織を固定のために１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中に入れた。以下の組織を切り取って組織学的切片を作製した：副腎、大動脈、脳、盲腸、子宮頸部、結腸、十二指腸、精巣上体、食道、眼、大腿骨脛骨関節、胆嚢、ハーダー腺、心臓、回腸、注射部位、空腸、腎臓、喉頭、肝臓、気管支を伴う肺、リンパ節（腸間膜）、視神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、下垂体、前立腺、直腸、唾液腺、坐骨神経、精嚢、骨格筋（大腿四頭筋）、皮膚、脊髄（頸部、腰部、胸部）、脾臓、骨髄を伴う胸骨、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、気管、膀胱、子宮、および膣。全ての用量群の動物からの上に列挙されている組織を常套的に処理し、パラフィンブロックに包埋した。ブロックを切片にし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した（Ｈ＆Ｅ）。スライドを、正式認可を受けた獣医病理医が顕微鏡検査により評価した。
【０１９５】
Ｂ．結果
遺伝子改変分析：アルブミン遺伝子座におけるパーセントインデル：標的化された肝細胞におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＺＦＮ構築物の活性を評価するために、剖検時に全てのマウスの肝臓からゲノムＤＮＡを単離した。マウスアルブミンイントロン１遺伝子座におけるＺＦＮ標的部位をＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を使用した配列解析に供した。次いで、ＺＦＮ活性を、ＺＦＮ活性の特質である小さな挿入および／または欠失（インデル）の存在によって決定した。サロゲートマウスＺＦＮ＋ＳＢ−ｍｕ−ＩＤＵＡを受けたマウスの全群（群４および５）においてＺＦＮ活性が検出された。１カ月の時点での肝組織におけるアルブミン遺伝子改変のレベル（％インデル）は、雄および雌の動物ついて、それぞれ４６．６７±５．７４％および３４．０５±２．０６％（平均±ＳＤ）であった。４カ月の時点での遺伝子改変のレベルは、雄および雌の動物について、それぞれ５５．６５±４．０８％および４５．６９±２．２６％であった。製剤緩衝液対照群またはドナーのみ群では、いずれの時点でもＺＦＮ切断のレベルはバックグラウンドを超えなかった。
【０１９６】
肝臓特異的プロモーターの特異性を確認するために、ＭｉＳｅｑ分析を脾臓、心臓、および筋肉に由来するゲノムＤＮＡに対しても実施した。これらの器官は、ＺＦＮ＋ドナーで処置したマウスの肝臓以外で最も高いレベルのＩＤＵＡ活性を示すので、選択した（図１Ａ参照）。これらの分析を群４および群５からのマウスに対して実施した。これは、群４および群５からのマウスが的確な組織において最も高いレベルのＺＦＮ活性を示したからである。対応する無処置の雄マウス（群２）を陰性対照として含めた。４カ月の時点で群２および群４の脾臓および心臓（非標的組織）において遺伝子改変は観察されず、これにより、肝臓特異的プロモーターの特異性が確認され、これらの組織において見出されるＩＤＵＡ活性およびＧＡＧ低下がＺＦＮ活性および肝臓以外でのドナー組込みに由来するものではないことが実証された。
【０１９７】
ｈＩＤＵＡウエスタンブロット。肝細胞におけるマウスアルブミン遺伝子座の適切な遺伝子改変を確認した後、次に、肝臓由来のタンパク質抽出物をアルブミン遺伝子座からのｈＩＤＵＡ発現について調査した。内因性マウスＩＤＵＡに由来する潜在的なバックグラウンドシグナルを回避するために、ヒトＩＤＵＡに対して生じた検出抗体を使用してウエスタンブロット分析を実施した。
【０１９８】
図１Ｂに示されている通り、ｈＩＤＵＡは、マウスサロゲートＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを受けた雄マウスおよび雌マウス全ての肝臓において１カ月および４カ月の時点で検出可能であった。発現は４カ月の時点で増加するようであった。製剤緩衝液を単独で注射した野生型対照マウスではｈＩＤＵＡシグナルは示されず、これにより、使用した抗体の種特異性が実証された。ＺＦＮの非存在下（ドナーのみ群）ではｈＩＤＵＡシグナルは観察されなかったので、ｈＩＤＵＡの発現はＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーの両方の存在に対して依存性であった。
【０１９９】
ＩＤＵＡ酵素活性。肝臓アルブミン遺伝子座から発現したｈＩＤＵＡ導入遺伝子により機能的に活性なタンパク質が産生されるかどうかを決定するために、ＩＤＵＡについての蛍光に基づく酵素活性アッセイを実施した。このアッセイを１）肝臓由来のタンパク質抽出物（発現した酵素が活性であることを確実にするため）；２）血漿（発現した酵素が肝細胞から分泌されたかどうかを決定するため）；および３）脳、心臓、肺、筋肉、および脾臓からのタンパク質抽出物（酵素が二次組織による取込みにコンピテントな形態で発現したかどうかを決定するため）に対して実施した。
【０２００】
１カ月の時点で、ＺＦＮ＋ドナーで処置したマウスの肝臓におけるＩＤＵＡ活性（雄および雌の動物について、それぞれ６５．２６±２４．６８および４０．５４±１４．５４ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ）は、野生型マウスにおいて見出された活性のレベル（４．０９±０．９９ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ）の９〜１０倍であった。ＺＦＮ＋ドナーで処置したマウスにおけるＩＤＵＡ活性も、対照ＭＰＳ  Ｉマウス（０．１１±０．０２［雄］および０．１６±０．０４［雌］ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ）およびドナーのみＭＰＳ  Ｉマウス（０．１８±０．０５ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ）の両方における活性と比較して著しく増加した。ＺＦＮの非存在下でＳＢ−ｍｕ−ＩＤＵＡドナーを受けたＭＰＳ  Ｉマウス（ドナーのみ）において見出された低レベルの活性から、ＺＦＮおよびＳＢ−ｍｕ−ＩＤＵＡドナーの両方がマウス肝細胞におけるｈＩＤＵＡの組込みおよびの発現に必要であることが実証される。
【０２０１】
ＺＦＮ＋ドナーで処置したマウスにおける肝臓ＩＤＵＡ活性は、４カ月の時点で、野生型動物における活性（８．０５±１．５５ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ）と比較してさらに増加した（雄および雌の動物について、それぞれ１４７．３２±６５．８６および６３．５９±４３．４２ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ）。
【０２０２】
図２Ａに示されている通り、ＺＦＮ＋ドナーで処置したマウスにおける血漿ＩＤＵＡ酵素活性も、１４日目に開始し、試験全体を通して、対照およびドナーのみマウスにおいて観察されたレベルと比較して増加した。平均ＩＤＵＡ活性は、１４日目から試験終了まで、野生型対照マウスにおいて観察された内因性の生理的レベルの約１．５〜１０倍に上昇したままであった。１カ月の時点と４カ月の時点で脳、心臓、肝臓、肺、筋肉および脾臓のＩＤＵＡ活性を比較し（図２Ｃ）、ＺＦＮ＋ドナー群における４カ月の時点でのＩＤＵＡ活性は、心臓、肝臓、肺、および脾臓（雄および雌）および筋肉（雄のみ）において、性別を合わせた無処置のＭＰＳ  Ｉマウスよりも有意に高い活性が示された。
【０２０３】
両方のサロゲートマウスＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを受けたＭＰＳ  Ｉマウスでは、１カ月の時点の脳以外の全ての非標的組織のＩＤＵＡ活性が野生型マウスにおける活性のレベルに近づき、これにより、肝細胞のアルブミン遺伝子座において産生されるＩＤＵＡが血漿中に分泌され、そこから二次組織によって活性な形態で取り込まれたことが実証された（図４参照）。脳においてＩＤＵＡ活性の増加が検出され、これは、野生型マウスの脳において見出されたＩＤＵＡ活性のおよそ５％に対応した（図４Ｅ参照）。
【０２０４】
尿中およびマウス組織中のＧＡＧレベルの評価：ＺＦＮ＋ドナーで処置したＭＰＳ  ＩマウスにおけるＩＤＵＡ酵素欠損で観察された補正が、疾患バイオマーカーであるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）における、時間の経過に伴うレベルの増加の防止または低下に関連するものであるかどうかを決定するために、全ての動物の尿中および組織抽出物中のＧＡＧレベルを決定した。
【０２０５】
結果から、製剤緩衝液を受けたＭＰＳ  Ｉマウスでは、試験全体を通して、疾患の進行とともに、野生型マウスにおけるレベルと比較して尿中ＧＡＧレベルが増加したことが示された。図３Ｃに示されている通り、雄および雌ＭＰＳ  ＩマウスにおけるサロゲートマウスＺＦＮおよびｈＩＤＵＡドナーの両方を用いた処置により、無処置のＭＰＳ  Ｉマウスにおいて投薬後１４日目までに見られた尿中ＧＡＧレベルの増加が妨げられた。ＧＡＧレベルはまた、製剤緩衝液で処置した雄および雌ＭＰＳ  Ｉマウスの全ての組織（脳以外）においても、野生型マウスと比較して著しく増加した（図５参照）。これらのレベルは、ＺＦＮ＋ドナーで処置したＭＰＳ  Ｉ動物では完全に正常化した。正常化は、肝臓（ＩＤＵＡがアルブミン遺伝子座から産生された場所）および二次組織（血漿からＩＤＵＡを取り込んだはずである）のどちらにおいても起こった。脳内ＧＡＧレベルは処置した動物において無処置の動物と比較して低かった（図５Ｅ参照）。
【０２０６】
このデータから、ＺＦＮ＋ドナーで処置したＭＰＳ  Ｉマウスにおいて、肝臓で産生されたｈＩＤＵＡが循環（血漿）中に入り、脾臓、心臓、肝臓、肺、および骨格筋によって取り込まれ、それにより、二次組織におけるＧＡＧレベルの低下がもたらされたことが示された。
【０２０７】
病理組織学的評価
中間および最終的な剖検、試験２８日目および１２０日目
２８日目の剖検から組織のサブセット（脳、肺、心臓、肝臓、骨格筋および脾臓）を評価した。
【０２０８】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６対照動物では、試験物に関連する病理的所見は示されなかった。雄および雌ＭＰＳ  Ｉ対照マウスでは、全身の種々の細胞型の空胞化が発生し、これは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のリソソームへの蓄積と解釈された。空胞化は、グリコサミノグリカンがうっ積したリソソームの特徴的な顕微鏡的外観である（Ohmiら、（２００３年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA、１００巻（４号）：１９０２〜１９０６頁）。２８日目の雄および雌ＭＰＳ  Ｉ対照マウスと比較して、１２０日目の動物では、ＧＡＧのリソソームへの蓄積であると考えられる典型的な全身の種々の細胞型の空胞化の発生率および／または重症度が増加した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６対照動物では、２８日目にも１２０日目にも試験物に関連する病理的な影響は示されなかった。
【０２０９】
ＣＮＳ組織評価。ＭＰＳ  Ｉ対照と比較したときに、ＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーまたはｈＩＤＵＡドナーのみで処置した動物では、脳における大きなニューロンまたはグリア空胞化の発生率および／または重症度が同様であった。しかし、脊髄では、ＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを与えた雄では、ニューロンまたはグリア空胞化の発生率および／または重症度が低下した。同様に、ＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを与えた雌でも、雌の腰髄におけるグリア空胞化以外は、ニューロンまたはグリア空胞化の発生率および／または重症度が低下した。
【０２１０】
非ＣＮＳ組織評価。大動脈空胞化（中膜）の重症度は、ＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを与えた動物ではＭＰＳ  ＩまたはｈＩＤＵＡのみの対照と比較して低下した（それぞれ最小から軽度および中程度）。ＭＰＳ  Ｉ対照と比較したときに、ＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを与えた動物（群４および５）の肺、心臓弁または間質、大動脈中膜、腎尿細管上皮、膀胱（尿路上皮および間質）、骨格筋間質細胞、脾臓マクロファージ／組織球、腸間膜リンパ節マクロファージ／組織球、胸腺間質細胞、クッパー細胞、坐骨神経、副甲状腺細胞、角膜間質／内皮細胞（デスメ膜）、胃腸管（筋層および間質［雌には事実上存在しない］）、下垂体前葉、および注射部位における空胞化の発生率および／または重症度が低下した。ＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを与えた雌（群５）では、胸骨または大腿脛骨関節軟骨細胞／骨細胞／骨膜の細胞、大腿脛骨関節滑膜の空胞化、ならびに卵巣、子宮、子宮頸部、および膣における空胞化の発生率が低下した。ＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを与えた雄では、精巣上体上皮または間質細胞の空胞化の発生率が低下した。
【０２１１】
神経行動学的評価：バーンズ迷路。剖検前の最終週の間に、バーンズ迷路試験を使用してマウスの認知パフォーマンスを試験した。ＭＰＳ  Ｉマウスは、バーンズ迷路（Belurら、（２０１５年）、American  Society  of  Gene  and  Cell  Therapy  ASGCT、５月１３〜１６日において提示された；New  Orleans、LA）および水Ｔ迷路（water  T-maze）などの他の認知能力に関する試験（Ouら、同上）のいずれにおいても学習障害（leaning  deficit）が以前から示されている。
【０２１２】
バーンズ迷路試験は、プラットフォームの中心をぐるりと囲む４０個の穴を有する円形プラットフォーム上で行われる。図６を参照されたい。穴は、マウスが穴から出入りすることができる「逃避箱」を有する１つの穴以外は全てふさがれている。明るい頭上からの照明により嫌悪刺激を生じさせ、動物が標的逃避穴を探し出し、光を回避するよう促す。迷路の周囲の壁上、すぐに見える範囲内に視覚的な手掛かりを置き、それがマウスを方向付ける空間的な手掛かりとしての機能を果たす（図６参照）。マウスを、６日間バーンズ迷路で訓練し、１日４回試験し、最大の制限時間を１回の試験当たり３分とした。各動物について、連続した試験間の間隔は１２〜１５分であった。
【０２１３】
雄および雌の動物についてそれぞれ図７Ａおよび７Ｂに示されている通り、野生型雄マウスでは、６日間の試験にわたって標的逃避穴を見つけるまでの潜伏時間が低減したことによって示されるように、経時的に改善したが、無処置のＭＰＳ  Ｉ雄マウスでは、逃避潜伏時間は経時的に改善されなかった（野生型に対してｐ＜０．０５、４日目〜６日目）。対照的に、サロゲートマウスＺＦＮ＋ｈＩＤＵＡドナーを受けた雄ＭＰＳ  Ｉマウスでは、製剤緩衝液で処置したＭＰＳ  Ｉ群と比較して、迷路パフォーマンスの改善が経時的に示され（ｐ＜０．０５、４日目〜６日目）、野生型動物と同等に良好に遂行する。試験の４日目までに、ＺＦＮ＋ドナーで処置した雄ＭＰＳ  Ｉマウスでは、学習挙動に統計的有意差が示され、標的穴を見つけるまでの６日目の平均は５３±２６（平均±ＳＥＭ）秒であったが、無処置の雄ＭＰＳ  Ｉマウスでは、標的を見つけるまでに１４９±１７秒かかった。野生型雄マウスは、６日目には５１±１５秒で標的に到達した。
【０２１４】
製剤緩衝液を受けた雌ＭＰＳ  Ｉマウスでは、野生型マウスと比較して、６日間の試験にわたってパフォーマンスに有意差は示されなかった。しかし、ＺＦＮ＋ドナーで処置した雌ＭＰＳ  Ｉマウスでは、試験の過程中、より良好な迷路パフォーマンスの傾向が示された。６日目に、処置した雌ＭＰＳ  Ｉマウスは標的穴を見つけるまでに３８±２３秒かかり、製剤緩衝液で処置した雌ＭＰＳ  Ｉマウスは標的を見つけるまでに９６±３３秒かかった。これらの結果から、ｈＩＤＵＡが、ｈＩＤＵＡタンパク質を血液脳関門の横断が容易になるように改変することなく、ＭＰＳ  ＩマウスのＣＮＳに到達し、正の神経行動学的効果を生じさせることができることが示唆される（例えば、Ouら、同上を参照されたい）。したがって、本明細書で実現される、一貫して高いＩＤＵＡの血漿中レベル（肝臓からの一定の分泌に起因する）により、血液脳関門を横断する改変されていないＩＤＵＡがもたらされた。
【０２１５】
重要なことに、ＧＡＧデータから、ＺＦＮ＋ドナーで処置したＭＰＳ  Ｉマウスにおいて発現したＩＤＵＡ活性が、尿中ＧＡＧレベルの正常化、ならびに肝臓および二次組織におけるＧＡＧレベルの低下に関連するものであったことが示された。さらに、上記処置には、ＣＮＳおよび他の標的組織における空胞化ならびにバーンズ迷路試験における認知パフォーマンスの改善（空間的記憶の改善）の傾向と関連していた。
【０２１６】
要約すると、本明細書で提示されるデータから、ＭＰＳ  Ｉ被験体に対するアルブミン遺伝子座におけるＺＦＮ媒介性遺伝子置き換えにより、疾患が処置されることが実証される。この４カ月の薬理学／毒性学試験から、サロゲートマウスＺＦＮとｈＩＤＵＡ導入遺伝子ドナーの肝臓向性ｒＡＡＶ２／８ベクターを介した共送達により、１）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＰＳ  Ｉマウス肝細胞におけるアルブミン遺伝子座の効率的な改変；２）肝臓における高レベルのｈＩＤＵＡ酵素発現および活性；３）機能的な酵素の血漿中への分泌；および４）脾臓、肺、心臓、筋肉および脳を含めた二次組織による血漿からのＩＤＵＡの取り込みがもたらされることが実証された。さらに、結果から、実現されたＩＤＵＡ活性のレベルが、非標的組織における代謝的欠陥（ＧＡＧ蓄積）を少なくとも部分的に補正するために十分なものであり、その結果、行動機能が改善されたことも実証される。
【０２１７】
（実施例３）
マウスモデルにおけるＭＰＳ  ＩＩ（ＩＤＳノックアウトまたはＩｄｓ  Ｙ／−）の処置
ＩＤＵＡ導入遺伝子を使用してＭＰＳ  Ｉの処置に関する上で行った研究と同様に、ＭＰＳ  ＩＩマウスモデル系においても補正ヒトＩＤＳ導入遺伝子を使用して実験を繰り返した。ＩＤＳ導入遺伝子を含むＡＡＶ２／８ウイルスを生成し、マウスアルブミン遺伝子のイントロン１中の相同部位を標的とするマウスＺＦＮ  ｒＡＡＶベクター（ＳＢ−４８６４１、ＳＢ−３１５２３、米国特許出願第１４／８７２，５３７号に示されている）、ならびにマウス遺伝子座（ＳＢ−ｍｕ−ＩＤＳ）に対して相同性を有するアームが隣接するプロモーターなしヒトＩＤＳ導入遺伝子（ｈＩＤＳ）をコードするドナーと共に、ＭＰＳ  ＩＩマウスを処置するために使用した。この試験において使用したＺＦＮ：ＺＦＮ：ドナーの比は１：１：８であった。このマウス試験に関しては、サロゲート試薬をパッケージングし、血清型ｒＡＡＶ２／８を使用して送達した。なぜなら、それが、マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでｒＡＡＶ２／６ベクターよりも優れた形質導入およびより速い導入遺伝子発現を付与するからである。ｒＡＡＶ２／８ベクターを、製剤緩衝液、３５ｍＭのＮａＣｌおよび５％グリセロールを補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．１中に希釈した。
【０２１８】
試験設計を以下の表５に示し、６つのマウスの群および使用した各型のＡＡＶ２／８ウイルスの量を列挙する。
【表５】
2019505523.tif 000007
【０２１９】
この試験は、基本的にＭＰＳ  Ｉ処置に関して上記の通り行った。ウエスタンブロットを上記の通り行い、発現したヒトＩＤＳタンパク質を、マウスタンパク質の検出を回避するためにヒトＩＤＳタンパク質に対して生じた抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＡＦ２４４９）を使用して検出した。結果から、ヒトＩＤＳタンパク質が、ＺＦＮおよびドナーの両方を受けた処置群（上記の群３、４、および５）において１カ月および４カ月の時点で検出可能であったことが示された。
【０２２０】
ＩＤＳ活性を、分析される組織を溶解させ、その後、ＩＤＳ活性を検出することによって検出した。従った方法体系は以下の通りである：
【０２２１】
組織溶解：マウス組織試料を食塩水（０．９％塩化ナトリウム）と混合することによって組織タンパク質抽出物を調製した。試料を氷上で保管し、Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ（登録商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｃｅ、Ａｖｅｒｉｌｌ  Ｐａｒｋ、ＮＹ）を使用して均質化した。均質化を固形組織粒子が見えなくなるまで実施した。均質化後、粗製ホモジネートを４℃、最大スピードで１５分遠心分離して、分析前に溶解物を澄明にした。組織抽出物のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の指示に従って使用して決定した。
【０２２２】
ＩＤＳ活性アッセイ：ＩＤＳ酵素活性を、合成基質４メチルウンベリフェリルαＬイドピラノシドウロン酸２硫酸（4  methylumbelliferyl  α  L  idopyranosiduronic  acid  2  sulfate）（４  ＭＵ  ＩＤＳ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した蛍光定量アッセイにおいて評価した。
【０２２３】
これは、Voznyiら、（（２００１年）、J.  Inherit  Metab  Dis、２４巻（６号）：６７５〜８０頁）に記載されている２段階アッセイである。第１のステップにおいて、４  ＭＵ  ＩＤＳを試験試料と一緒にインキュベートする；ＩＤＳが存在すれば、それは、基質からの硫酸基の除去を触媒する。得られる化合物、４メチルウンベリフェリルαＬイズロニド（４  ＭＵ  イズロニド）は、第２の酵素、αＬイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の基質である。第１のステップを固定時間にわたってインキュベートした後、ＩＤＳ活性をクエンチし、過剰な組換えＩＤＵＡを添加して４  ＭＵ  イズロニド開裂を駆動し、蛍光化合物４メチルウンベリフェロン（４  ＭＵ）を得る。簡単に述べると、希釈した試料１０μＬを、基質緩衝液（０．１Ｍの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０、１０ｍＭの酢酸Ｐｂ（ＩＩ））に溶解させた１．２５ｍＭの４  ＭＵ  ＩＤＳ  ２０μＬと混合した。次いで、反応物を３７℃でインキュベートした。
【０２２４】
ＩＤＳ活性を停止させ、あらゆる硫酸化基質を４  ＭＵに変換するために、２×濃縮したマッキルベイン緩衝液（０．２Ｍのシトレート、０．４Ｍのホスフェート、ｐＨ４．５）２０μＬを各試料に添加し、その後、１μｇ／ｍＬの組換えＩＤＵＡ  １０μＬを添加した。ＩＤＵＡ反応物を３７℃で終夜インキュベートし、次いで、停止液（０．５ＭのＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．７、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）２００μＬを添加することによって終結させた。４  ＭＵの放出を、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＭＸマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で蛍光（Ｅｘ３６５／Ｅｍ４５０）を測定することによって決定した。
【０２２５】
４  ＭＵ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いて標準曲線を作成した。得られたデータをプロットし、対数曲線（log  log  curve）をデータにフィッティングし、このベストフィット曲線を使用して試験試料中の４−ＭＵの濃度を算出した。酵素活性を、血漿１ｍＬまたはタンパク質溶解物１ｍｇ当たりの、アッセイインキュベート時間（第１の反応ステップのみ）１時間当たりに放出された４  ＭＵのｎｍｏｌ数（ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬまたはｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ）として表した。
【０２２６】
処置の１カ月後および４カ月後に動物の肝臓中のＩＤＳタンパク質を測定した（図８Ａ）。データから、ドナーおよびＺＦＮの両方を受けた全群においてタンパク質が検出可能であることが実証された。さらに、処置群の血漿における活性を経時的に測定し、ＺＦＮおよびドナーを受けた群由来の全ての試料において活性が検出された。高用量群で最も高い活性が検出された（図８Ｂ）。４カ月の屠殺時点でも、ＺＦＮおよびドナーを受けた動物由来の全ての組織においてＩＤＳ活性が検出された。本試験では動物のいくつもの器官においても活性が測定され（図８Ｃ）、脳を含めた試験した全ての組織において、高用量処置群で無処置のＭＰＳ  ＩＩマウスと比較して有意に多くのＩＤＳ活性が示される。
【０２２７】
組織中ＧＡＧレベルを実施例２に記載の通り測定し、結果から、高用量動物からの分析した全ての組織（脳以外）においてＧＡＧの有意な減少が示された（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０２２８】
処置の４カ月後にバーンズ迷路試験を使用して処置群の認知パフォーマンスを試験した（図１０）。データは、６日間の試験にわたって、動物が標的を見つけるまでにかかった時間の平均±ＳＥＭ（毎日４回の試験の平均）を表す。個々のマウスそれぞれについてのデータを以下の表６に示す（各試験日における各マウスについての、穴に到達するまでの秒単位の時間として表されている）。個々のマウスについてのデータを表中に水平方向にわたって示し（各マウスに１〜１０の番号を付し、各データポイントは、試験日ごとに行った４回の実行の平均である）、各試験（試験日１〜６）を垂直方向に示す。高処置用量では、処置を受けた動物と無処置のＭＰＳ  ＩＩ動物との間に有意差があった。
【表６−１】
2019505523.tif 000008
【表６−２】
2019505523.tif 000009
【０２２９】
示されているように、高処置用量では、処置を受けた動物とＭＰＳ  ＩＩ動物との間に有意差があった。
【０２３０】
（実施例４）
ヒト細胞において産生されたＩＤＳおよびＩＤＵＡタンパク質の特徴付け
Ａ．ＨｅｐＧ２細胞（プール）およびＨｅｐＧ２サブクローンの生成および特徴付け
ＨｅｐＧ２細胞に、基本的にＷＯ２０１５／０８９０７７に記載されている通りｈＡＬＢ  ＺＦＮ  ＳＢＳ＃４７１７１およびＳＢＳ＃４７９３１を用いて形質導入し、形質導入の３日後にＩＤＳドナーまたはＩＤＵＡドナーの組込みをＭｉＳｅｑ分析によって評価し、アルブミン遺伝子座において５９．２７％インデル（ｈＩＤＳ）および６２．２７％インデル（ｈＩＤＵＡ）が示された。この高レベルの改変に基づいて、これらの細胞をサブクローニングのために選択し、次いで、４種のｈＩＤＳサブクローン（番号４、８、１５および５５）および３種のｈＩＤＵＡサブクローン（番号２１、２５および３０）を２４ウェルプレート中に播種し、上清をｈＩＤＳまたはｈＩＤＵＡ分泌についてＩＤＳまたはＩＤＵＡ酵素活性アッセイおよびＥＬＩＳＡの両方によって分析した（図１１）。ＳＢ  ４７１７１  ＺＦＮベクターおよびＳＢ  ４７９３１  ＺＦＮベクターを単独で用いて形質導入したＨｅｐＧ２細胞を陰性対照として使用した（図１１の「ＺＦＮのみ」）。
【０２３１】
４種のＩＤＳサブクローンで機能的なＩＤＳの分泌が示され、これらのサブクローンの上清における活性レベルは、４０８〜１，８５５ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬにわたった。全てのサブクローンで元のＨｅｐＧ２プール（図１１Ａおよび１１Ｂの「ＩＤＳ−プール」）の数倍のｈＩＤＳ活性が示された。
【０２３２】
３種のＩＤＵＡサブクローンで機能的なＩＤＵＡの分泌が示され、これらのサブクローンの上清における活性レベルは、９２〜４７５ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬにわたった（図１１Ｃおよび１１Ｄ）。
【０２３３】
これらの結果は、ｈＩＤＳまたはｈＩＤＵＡ  ＥＬＩＳＡによって実証された。ｈＩＤＳについても、４種のサブクローン全てで、細胞培養上清へのｈＩＤＳ分泌が１５６〜４３８ｎｇ／ｍＬにわたるレベルで示され、これは、元のＨｅｐＧ２プールの数倍であった。どちらのアッセイにおいても、ＺＦＮのみを用いて形質導入したＨｅｐＧ２プールではバックグラウンドは見られなかったが、これにより、ＨｅｐＧ２細胞が内因性ｈＩＤＳをこれらのアッセイによって検出可能なレベルで分泌しないことが示される。同様に、ｈＩＤＵＡについても、３種全てのサブクローンで細胞培養上清へのｈＩＤＵＡ分泌が４０．６〜２０９．８ｎｇ／ｍＬにわたるレベルで示された。どちらのアッセイでも、無処理のＨｅｐＧ２細胞またはＺＦＮのみを用いて形質導入したＨｅｐＧ２サブクローンではバックグラウンドが見られなかったが、これにより、ＨｅｐＧ２細胞が内因性ｈＩＤＵＡをこれらのアッセイによって検出可能なレベルで分泌しないことが示される。
【０２３４】
Ｂ．ＨｅｐＧ２サブクローンのアルブミン遺伝子座におけるＳＢ  ＩＤＳ組込みのＴａｑｍａｎ（登録商標）による特徴付け
ＨｅｐＧ２サブクローン４、８、１５および５５を、ゲノムのアルブミン遺伝子座における改変に関してさらに特徴付けた。第１に、ＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかによるＩＤＳ（「ＳＢ−ＩＤＳ」）ドナーの組込みの様式を決定するために、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイを導入遺伝子の５’末端における組込みの各方法に特異的なプライマーおよびプローブを用いて開発した（図１２）。ＮＨＥＪによる組込み後、ＡＡＶ  ＩＴＲ（および相同性アーム）はなお存在し、ＮＨＥＪに特異的なプローブによって認識され、それにより、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイにおいて陽性シグナルがもたらされる（図１２Ａ）。対照的に、ＳＢ−ＩＤＳドナーをＨＤＲによって組み込む場合、ＩＴＲは欠け、それにより、これらの試薬を用いると陰性シグナルがもたらされる。ＨＤＲによって組み込まれたＳＢ−ＩＤＳドナーを検出する試薬は、４２９ｂｐの産物に対して最適化されたＰＣＲプライマーおよびアルブミンのエクソン１に結合するプローブからなる（図１２Ｂ）。これらのＨＤＲ試薬をＮＨＥＪによって組み込まれたＳＢ−ＩＤＳドナーに対して使用する場合、得られる９７９ｂｐのＰＣＲ産物は、付加的なサイズに起因して非効率的に増幅され、それにより、陰性シグナルがもたらされる。
【０２３５】
結果から、分析した、ＺＦＮ＋ドナーで処理したサブクローン４種全てでＮＨＥＪまたはＨＤＲに特異的な試薬によるシグナルが示され、これにより、これらのサブクローンのアルブミン遺伝子座におけるＳＢ−ＩＤＳ導入遺伝子の５’組込み事象が確認されることが示された。サブクローン１５および５５についての結果から、ＨＤＲがＳＢ−ＩＤＳの組込みのための機構として明白に示された（図１２Ｃ）。サブクローン４および８は、３回全てのＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイにおいてＮＨＥＪ組込み事象に関して一貫して陽性にスコア化された。しかし、サブクローン４および８はまた、ＨＤＲによる組込みに関しても、３回のＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイの繰り返しのうち１回で陽性にスコア化された。他の２回の繰り返しでは、これらのサブクローンは、ＨＤＲによる組込みに関して陰性であったか、またはアッセイでの反復の間に大きな量の変動があり、それにより組込みの方法を決定するのが困難であった。したがって、これらの試料は、ＨＤＲに関して陰性とみなした。第２のアルブミン対立遺伝子のインデル分析に基づいて、本発明者らは、サブクローン４および８はそれぞれ８８％および８３％がクローンであり、低く相反するＨＤＲシグナルは、これらのサブクローンにＳＢ−ＩＤＳのＨＤＲに基づく組込みを伴うマイナーなＨｅｐＧ２集団の存在に起因し得ることが示唆されると結論づけた。
【０２３６】
Ｃ．ＨｅｐＧ２サブクローンのアルブミン遺伝子座におけるＳＢ−ＩＤＵＡ組込みのＴａｑｍａｎ（登録商標）による特徴付け
ＨｅｐＧ２  ＩＤＵＡサブクローン２１、２５および３０を、ゲノムのアルブミン遺伝子座における改変に関してさらに特徴付けた。第１に、ＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかによるＩＤＵＡ（「ＳＢ−ＩＤＵＡ」）ドナーの組込みの様式を決定するために、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイを導入遺伝子の５’末端における組込みの各方法に特異的なプライマーおよびプローブを用いて開発した（図１２）。ＮＨＥＪによる組込み後、ＡＡＶ  ＩＴＲ（および相同性アーム）はなお存在し、ＮＨＥＪに特異的なプローブによって認識され、それにより、Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて陽性シグナルがもたらされる（図１２Ｅ）。対照的に、ＳＢ−ＩＤＵＡドナーをＨＤＲによって組み込む場合、ＩＴＲは欠け、それにより、これらの試薬を用いると陰性シグナルがもたらされる。ＨＤＲによって組み込まれたＳＢ−ＩＤＵＡドナーを検出する試薬は、４２９ｂｐの産物に対して最適化されたＰＣＲプライマーおよびアルブミンのエクソン１に結合するプローブからなる（図１２Ｆ）。これらのＨＤＲ試薬をＮＨＥＪによって組み込まれたＳＢ−ＩＤＵＡドナーに対して使用する場合、得られる９７９ｂｐのＰＣＲ産物は、付加的なサイズに起因して非効率的に増幅され、それにより、陰性シグナルがもたらされる。
【０２３７】
結果から、分析した、ＺＦＮ＋ドナーで処理したサブクローン３種全てでＮＨＥＪまたはＨＤＲに特異的な試薬によるシグナルが示され、これにより、これらのサブクローンのアルブミン遺伝子座におけるＳＢ−ＩＤＵＡ導入遺伝子の５’組込み事象が確認されることが示された。サブクローン２１についての結果からはＨＤＲによるｈＩＤＵＡ組込みが明白に示されたが、サブクローン２５および３０についての組込みの機構は不明であった。したがって３種のサブクローン全てに対して、代替的な遺伝子型決定方法を行った。この遺伝子型決定のために、サブクローン２１、２５および３０由来のゲノムＤＮＡを放射標識ＰＣＲアッセイに供して、アルブミン遺伝子座内のＺＦＮ標的部位における５’導入遺伝子組込み事象の存在を評価した（図１２Ｈ）。得られたゲルから、クローン２１についてＨＤＲによる組込み、クローン２５についてＮＨＥＪによる組込みおよびクローン３０についてＮＨＥＪによる組込みが確認された（図１２Ｉ）。矢印は、ＮＨＥＪ（上の矢印）またはＨＤＲ（下の矢印）による挿入に特徴的なバンド領域を示す。
【０２３８】
Ｄ．ＨｅｐＧ２  ＩＤＳサブクローンのアルブミン遺伝子座から産生されたｈＩＤＳポリペプチドの特徴付け
肝臓におけるＩＤＳのｉｎ  ｖｉｖｏ発現およびその後の標的組織による部分配列の取り込みは、ＩＤＳタンパク質のグリコシル化パターンに依存する（図１３）。アルブミン遺伝子座から産生されたｈＩＤＳタンパク質をさらに特徴付けるために、ＨｅｐＧ２  ＩＤＳおよび対照ＨｅｐＧ２クローンから生成した上清に対してウエスタンブロッティングを実施した。２セットのｈＩＤＳ発現ＨｅｐＧ２細胞をこの分析のために使用した。第１のセットは、上で分析したＨｅｐＧ２  ＩＤＳクローンと同じ様式で生成された高ＩＤＳ発現混合クローンである。アルブミン遺伝子座におけるＭｉＳｅｑ分析から、この「混合クローン」は、６９．９％の改変されていないＨｅｐＧ２細胞、２１．４％の、ＩＤＳが挿入されていないアルブミン対立遺伝子における５ｂｐの欠失を含有するＨｅｐＧ２  ＩＤＳサブクローン、および、合わせて総集団の６．８％を占める、小さな欠失を含有する３種の他のサブクローンからなることが示された（図１４において「混合」と記した）。
【０２３９】
使用した第２のＨｅｐＧ２  ＩＤＳクローンは、上で特徴付けた低発現ＩＤＳクローンであるクローン＃５５であった。ＨｅｐＧ２  ＩＤＵＡクローンは、これらのＨｅｐＧ２  ＩＤＳクローンと同じ様式で生成されたが、アルブミンにおいてＩＤＳではなくＩＤＵＡ（ＭＰＳ  Ｉにおいて遺伝子欠損している）が組み込まれたものであるので、これを陰性対照として使用した（図１４の「Ｃｔｒｌ」）。
【０２４０】
ヒトＩＤＳは、最初、シグナルペプチドおよびプロペプチドの両方を含有する５５０アミノ酸の未成熟前駆体形態として内因的に発現する。２５アミノ酸のシグナルペプチドおよび８アミノ酸のプロペプチドの両方がｈＩＤＳタンパク質の翻訳後修飾および成熟化の間に開裂される（Wilsonら、（１９９０年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA.、８７巻（２１号）８５３１〜５頁）。得られた７３〜７８ｋＤａのポリペプチドは、ゴルジ装置においてリン酸化およびグリコシル化されて９０ｋＤａの前駆体になり、その後、リソソームにおいて開裂されて５５ｋＤａの中間体になり、最終的に４５ｋＤａの成熟ｈＩＤＳタンパク質になり、１８ｋＤａのポリペプチドが放出される（Froissartら、（１９９５年）Biochem.  J.、３０９巻（Ｐｔ２号）：４２５〜３０頁）。
【０２４１】
ｈＩＤＳのこれらの形態のいずれがｈＩＤＳ組込み後にアルブミン遺伝子座から産生されるかを決定するために、ＨｅｐＧ２細胞ペレット、ＨｅｐＧ２細胞培養上清（細胞からのｈＩＤＳ分泌後）、およびこのＨｅｐＧ２細胞培養上清と一緒にインキュベートした後の改変されていない初代肝細胞ペレット（二次組織による取り込みを模倣する）に対してウエスタンブロットを実施した。
【０２４２】
図１４に示されている通り、アルブミンからｈＩＤＳを産生するＨｅｐＧ２ペレット（「ＨｅｐＧ２ペレット」）では全長ＩＤＳおよび全ての中間体および成熟ポリペプチドの形態が見出された。全長形態のＩＤＳは、スメアのバンドとして見られ、これは、これらの産生細胞において新しく合成されたＩＤＳの進行中の翻訳後修飾（グリコシル化）に起因する可能性があった。これにより、ヘパトーマＨｅｐＧ２細胞において、アルブミン遺伝子座から産生されたｈＩＤＳタンパク質が、天然起源のポリペプチドと同様に翻訳後修飾され、分泌されることが実証された。産生されたおよそ９０ｋＤａの酵素の移動は、線維芽細胞（Froissartら、同上）およびＣＨＯ細胞（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標）およびＧＲＥＥＮ  ＣＲＯＳＳ組換えＩＤＳ；米国特許出願公開第２０１３０２３６４４２号を参照されたい）において産生された組換えＩＤＳの移動と一致した。
【０２４３】
第２に、これらのＨｅｐＧ２サブクローン由来の馴化上清の分析により、全長ｈＩＤＳが細胞から分泌されるＩＤＳの最初の形態であり、１８ｋＤａのバンドについてのごく弱いバンドのみもまた検出されたことが示された（「ＨｅｐＧ２上清」）。この馴化細胞培養上清をナイーブな改変されていない初代肝細胞と一緒にインキュベートすると、これらの肝細胞により、上清からｈＩＤＳが効率的に取り込まれる（「初代肝細胞ペレット」）。これらのペレットでは全長ｈＩＤＳが検出可能であったが、５５ｋＤａ、４５ｋＤａ、および１８ｋＤａのポリペプチドが全てこれらのペレットに存在していたので、ｈＩＤＳが成熟形態のタンパク質にも容易にプロセシングされ得ることが明らかであった。最後に、ｈＩＤＳを分泌するＨｅｐＧ２細胞由来の上清と一緒にインキュベートした初代肝細胞におけるｈＩＤＳ活性が６．５〜１０．３倍に増加していたので、上清から取り込まれたｈＩＤＳは活性である。
【０２４４】
まとめると、これらのデータから、アルブミンから産生されるｈＩＤＳが、元の細胞においてその成熟形態に正常にプロセシングされ、全長形態が細胞から分泌され、この全長ｈＩＤＳが二次的な細胞により取り込まれ、効率的にプロセシングされてその成熟および活性形態になることが実証される。
【０２４５】
Ｅ．ＨｅｐＧ２サブクローンのアルブミン遺伝子座から産生されたｈＩＤＳおよびｈＩＤＵＡのグリコシル化の特徴付け
肝細胞、ニューロンおよびグリア細胞のようないくつかの細胞型における効率的な細胞による取り込みおよび適切なリソソーム標的化には、ＩＤＳまたはＩＤＵＡ酵素におけるマンノース６リン酸修飾が必要であることが示唆／実証されている（Danieleら、（２００２年）Biochim  Biophys  Acta.、１５８８巻（３号）：２０３〜９頁）。したがって、アルブミン遺伝子座から産生され、分泌されたｈＩＤＳおよびｈＩＤＵＡのグリコシル化パターンを特徴付けるために、ＨｅｐＧ２  ＩＤＳまたはＩＤＵＡサブクローンの上清に対してウエスタンブロッティングを実施した。ＩＤＳは、８カ所の潜在的なＮグリコシル化部位を含有し、これらは、高マンノースオリゴ糖鎖、ハイブリッドオリゴ糖鎖、および複合オリゴ糖鎖の組合せによって占有される（Froissartら、同上）。これらの型のグリコシル化は、特異的なグリコシダーゼを使用して区別することができる：ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）は、糖タンパク質から、オリゴ糖の３つの型全てを開裂することができるが、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）は、Ｎ連結糖タンパク質から高マンノースオリゴ糖および一部のハイブリッドオリゴ糖のみを開裂することができ、複合オリゴ糖は開裂することができない（図１５Ａ）。
【０２４６】
アルブミン遺伝子座から産生され、分泌されたｈＩＤＳにいずれの種のグリコシル化が存在しているかを決定するために、２つの異なるＨｅｐＧ２  ＩＤＳ集団（混合およびクローン５５；上記）から細胞培養上清を採取し、対照上清をアルブミンにＩＤＵＡが組み込まれたＨｅｐＧ２サブクローンから採取した（対照）。上清を消化せずにおいたか（Ｕ）またはＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｐ）もしくはＥｎｄｏ  Ｈ（Ｅ）のいずれかを用いた消化に供した。図１５Ｂは、いずれかのＨｅｐＧ２  ＩＤＳ集団由来の上清のＰＮＧａｓｅ  Ｆによる消化（Ｐ）により、およそ６０ｋＤａの単一のバンドへの完全なシフトがもたらされたことを示し、これにより、タンパク質から全てのオリゴ糖鎖が除去されたこと（＝グリコシル化されていないｈＩＤＳ）が示される。対照的に、Ｅｎｄｏ  Ｈによる消化（Ｅ）により、中間の移動性のスメアのバンドがもたらされた。対照上清ではいかなるｈＩＤＳ発現も示されず、これにより、無処理の細胞からのｈＩＤＳの分泌はわずかであったまたは分泌がなかったことが示された。
【０２４７】
同様に、ＨｅｐＧ２ペレットに由来するタンパク質溶解物に対して同じセットのグリコシダーゼ消化を実施したときに（図１５Ｃ）、３種の主要な大きなＩＤＳ形態が見られ（全長約７３〜７８ｋＤａ；中間体約５５ｋＤａ；および成熟約４５ｋＤａ）、全てで同じ見かけの分子量のシフトが示された。全長バンドおよび中間体バンドのどちらでもＰＮＧａｓｅ  Ｆによる消化（Ｐ）で完全なシフトが示され、Ｅｎｄｏ  Ｈによる消化（Ｅ）では部分的なシフトが示された。成熟４５ｋＤａバンドでは、この同じシフトのセットが示されたが、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる消化後には二重線としてよりはっきりと見え、これは、公開された文献（Froissartら、同上）と一致した。
【０２４８】
ＨｅｐＧ２−ＩＤＵＡクローンを同様に使用して、産生されるＩＤＵＡのグリコシル化パターンを分析した。図１５Ｄは、ＰＮＧａｓｅ  ＦおよびＥｎｄｏＨにより、ＨｅｐＧ２−ＩＤＵＡ細胞の上清において、市販のＩＤＵＡ酵素Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｒＩＤＵＡと同様のパターンが生じることを示す。
【０２４９】
まとめると、これらのデータから、アルブミン遺伝子座から産生され、分泌されたｈＩＤＳおよびＩＤＵＡタンパク質が高マンノース／ハイブリッドグリコシル化（Ｅｎｄｏ−Ｈ感受性）および複合グリコシル化（Ｅｎｄｏ−Ｈ非感受性／ＰＮＧａｓｅ  Ｆ感受性）の混合物を含有したことが実証される。
【０２５０】
Ｆ．マンノース−６−リン酸による細胞のＩＤＳ取り込みの競合
対照ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１０７４１；「ＨｅｐＧ２」）細胞またはＨｅｐＧ２−ＩＤＳクローン＃８または＃１５を、１０％ＦＢＳおよび１×ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養することによって馴化培地を作製した。細胞を７２時間培養して細胞培養上清中にＩＤＳを蓄積させ、次いで、上清を収集し、０．２μｍ濾過し、使用するまで−８０℃で凍結させた。
【０２５１】
改変されていないＨｅｐＧ２またはＫ５６２細胞１００，０００個を２４ウェルプレートのウェルごとに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間成長させた。次いで、培地を、５ｍＭのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下または非存在下のＨｅｐＧ２またはＨｅｐＧ２−ＩＤＳ馴化培地（上記の通り生成）に変えた。細胞を馴化培地±５ｍＭのＭ６Ｐで６時間または２４時間インキュベートした。馴化培地中で６時間インキュベートした細胞を、また通常の細胞成長培地に切り換えて１８時間置き、この２４時間の最後に全ての条件からの細胞ペレットを収集した。細胞培養上清を除去した後、細胞ペレットをＰＢＳ  １ｍＬで１回洗浄してあらゆる残留する馴化培地を除去した後に、ＩＤＳ活性についてアッセイした。細胞ペレットを、ＴＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１５０μＬ中、超音波処理によって溶解させ、ＩＤＳ活性についてアッセイした。
【０２５２】
結果（図１６Ａおよび１６Ｂ）から、ＨｅｐＧ２細胞およびＫ５６２細胞のどちらにおいても５ｍＭのＭ６Ｐの存在下ではＩＤＳの取り込みが低減したことが実証される。
【０２５３】
Ｇ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアルブミン遺伝子座から産生されたＩＤＵＡは二次的な細胞によってマンノース−６−リン酸依存性に取り込まれた。図１６Ｄは、Ｋ５６２細胞のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）での処理がどのようにＩＤＵＡ酵素の取り込みを妨げるかを例示する概略図である。
対照ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１０７４１；「ＨｅｐＧ２」）細胞またはＨｅｐＧ２−ＩＤＵＡクローン＃２５を、１０％ＦＢＳおよび１×ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養することによって培地を生成した。細胞を７２時間培養して細胞培養上清中にＩＤＵＡを蓄積させ、次いで、上清を収集し、０．２μｍで濾過し、使用するまで−８０℃で凍結させた。
【０２５４】
ＩＤＵＡ取り込みを以下の通り決定した。改変されていないＫ５６２細胞１００，０００個を、２４ウェルプレートのウェルごとに、５ｍＭのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下または非存在下のＨｅｐＧ２馴化培地（上記の通り生成）に播種した。細胞を馴化培地±５ｍＭのＭ６Ｐで２４時間インキュベートした。細胞培養上清を除去した後、細胞ペレットをＰＢＳ  １ｍＬで２回洗浄してあらゆる残留する馴化培地を除去した後に、ＩＤＵＡ活性について蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−イズロニド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してアッセイした。
【０２５５】
図１６Ｃに示されている通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアルブミン遺伝子座から産生されたものは、二次的な細胞によってマンノース−６−リン酸依存性に取り込まれる。
【０２５６】
（実施例５）
脳へのドナーの取り込み
ＩＤＵＡおよびＩＤＳ酵素の基質であるグリコサミノグリカンであるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸のレベルに関する脳組織ホモジネートの質量分析をＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）において実施した。簡単に述べると、実施例２に記載のＭＰＳ  Ｉマウス（無処置およびＺＦＮおよびＩＤＵＡドナーで処置した）の組織を２００ｍＭの酢酸アンモニウム、２０ｍＭの酢酸カルシウム、４ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．０中で均質化した。タンパク質濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定し、試料を１ｍｇ／ｍＬに標準化した。ヘパラン硫酸試料をヘパリナーゼＩおよびＩＩＩで消化し、２種の主要な二糖（Δ−ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ［ＩＶ−Ａ］およびΔ−ＵＡ−ＧｌｃＮＳ［ＩＶ−Ｓ］）を得た。デルマタン硫酸試料をコンドロイチナーゼＢで消化し、３種の主要な二糖（ΔＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）［ｄｉ−４Ｓ］、ΔＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）［Δｄｉ−６Ｓ］およびΔＵＡ−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ、６Ｓ）［Δｄｉ−４Ｓ，６Ｓ］）を得た。消化後、内部標準をスパイクし、１０，０００ＮＭＷＬのスピンフィルターまたはフィルタープレートを通して遠心分離することによって大きな分子を除去し、試料を逆相ＨＰＬＣに供した。分析物および内部標準を、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより、特定の多重反応モニタリング方法をネガティブモードで使用して検出した。各分析物およびＩＳのピーク面積をそれらのそれぞれのＭＳ−クロマトグラムにおいて積分し、ピーク面積の比を定量のために使用している。未知の試料中のそれぞれの二糖の濃度を公知の濃度の標準物質の較正曲線から補間し、μｇ／ｍＬで報告した。各二糖について定量下限（ＬＬＯＱ）は０．００５μｇ／ｍＬであった。各試料について二糖濃度を合計し、ホモジネート投入量に対してプロットした。
【０２５７】
図１７Ａに示されている通り、ＭＰＳ  Ｉマウス由来の脳組織ホモジネートをデルマタン硫酸レベルおよびヘパラン硫酸レベルについて質量分析によって特異的に測定したところ、注入の４カ月後に、ＺＦＮ＋ドナーで処置した雄マウスにおいてそれらの性別を合わせた対照と比較してデルマタン硫酸レベルが有意に低下した。処置した雌マウスでも、デルマタン硫酸レベルが低下する傾向が示された。同様に、ＺＦＮ＋ドナーで処置したＭＰＳ  ＩＩマウスでも、脳中デルマタン硫酸レベルが低下する傾向が示され、最も高いＺＦＮ＋ドナー用量で統計的有意性に達した（図１７Ｂ）。しかし、ヘパラン硫酸についてはＭＰＳ  ＩマウスモデルまたはＭＰＳ  ＩＩマウスモデルのいずれにおいても低下は観察されなかった。
【０２５８】
本明細書にて言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５９】
開示は、理解を明確にする目的で、説明および実施例によっていくらか詳細に提供されているが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変形および改変が実践され得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、前出の記載および実施例は、限定として解釈されるべきものではない。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図４Ｅ−４Ｆ】
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【図５Ａ−５Ｄ】
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【図５Ｅ−５Ｆ】
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【図６Ａ−６Ｄ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ−１１Ｄ】
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【図１２Ａ−１２Ｄ】
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【図１２Ｅ−１２Ｉ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５Ａ−１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
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【図１６Ｃ−１６Ｄ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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