(57)【要約】本発明は、酸化感受性の溶媒接触可能アミノ酸残基を含むタンパク質を含む方法及び製剤を提供し、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を使用して、タンパク質の酸化を防止する。本発明は、かかる製剤を作製するための方法及びかかる製剤を使用する方法も提供する。タンパク質製剤中のＮＡＴの分解を測定する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、前記ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを前記製剤に添加することを含み、前記ポリペプチドが、約８０Å２を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、前記方法。
【請求項２】
水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、前記ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを前記製剤に添加することを含み、前記ポリペプチドが、約３０％を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、前記方法。
【請求項３】
水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、前記ポリペプチド中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することと、少なくとも１つのトリプトファン残基が約８０Å２を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する場合に、前記ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを前記製剤に添加することと、を含む、前記方法。
【請求項４】
前記トリプトファン残基の前記ＳＡＳＡ値が、分子動力学シミュレーションによって計算される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．３ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドの前記酸化が、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記製剤が、約２℃〜約８℃で約１０９５日間にわたって安定している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記製剤中のタンパク質濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記製剤が、約４．５〜約７．０のｐＨを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記製剤が、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記製剤が、対象への投与に好適な薬学的製剤である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が、抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチド及び前記ポリペプチドの酸化を防止するためのある量のＮ−アセチルトリプトファンを含む液体製剤であって、前記ポリペプチドが、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を有する、前記液体製剤。
【請求項１７】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項１６に記載の液体製剤。
【請求項１８】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項１６または１７に記載の液体製剤。
【請求項１９】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．３ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項２０】
前記ポリペプチドの前記酸化が、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項２１】
前記製剤が、約２℃〜約８℃で約１０６５日間にわたって安定している、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項２２】
前記製剤中のタンパク質濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項２３】
前記製剤が、約４．５〜約７．０のｐＨを有する、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項２４】
前記製剤が、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項２５】
前記製剤が、対象への投与に好適な薬学的製剤である、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項２６】
前記タンパク質が、抗体である、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項２７】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である、請求項２６に記載の液体製剤。
【請求項２８】
製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、前記ポリペプチドが、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含み、前記方法が、
ある量のＮ−アセチルトリプトファンを、前記ポリペプチドを含む水性組成物に添加することと、
２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を前記組成物に添加することと、
前記ポリペプチド、前記Ｎ−アセチルトリプトファン、及び前記ＡＡＰＨを含む前記組成物を約４０℃で約１４時間インキュベートすることと、
前記ポリペプチドを前記ポリペプチド中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、
前記ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、前記ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、前記方法。
【請求項２９】
製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、
前記ポリペプチド中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することであって、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有するトリプトファン残基が酸化を受ける、前記決定することと、
ある量のＮ−アセチルトリプトファンを、前記ポリペプチドを含む水性組成物に添加することと、
２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を前記組成物に添加することと、
前記ポリペプチド、前記Ｎ−アセチルトリプトファン、及び前記ＡＡＰＨを含む前記組成物を約４０℃で約１４時間インキュベートすることと、
前記ポリペプチドを前記ポリペプチド中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、
前記ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、前記ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、前記方法。
【請求項３０】
前記トリプトファン残基の前記ＳＡＳＡ値が、分子動力学シミュレーションによって計算される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の液体製剤を含むキット。
【請求項３２】
請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の液体製剤を含む製品。
【請求項３３】
液体製剤中のポリペプチドが酸化感受性のトリプトファン残基を含むかを決定する方法であって、前記方法が、前記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて前記ポリペプチド中の各トリプトファン残基の１つ以上の分子記述子を計算することと、前記１つ以上の分子記述子を前記１つ以上の分子記述子でトレーニングされた機械学習アルゴリズムに適用して、トリプトファン酸化を予測することと、を含み、前記分子記述子が、以下、
ａ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、
ｂ）側鎖溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）、
ｃ）デルタ炭素ＳＡＳＡ、
ｄ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷、
ｅ）骨格ＳＡＳＡ、
ｆ）トリプトファン側鎖角度、
ｇ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、
ｈ）トリプトファン骨格角度、
ｉ）擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、
ｊ）骨格柔軟性、または
ｋ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷のうちの１つ以上を含む、前記方法。
【請求項３４】
前記分子記述子のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個が、前記分子シミュレーションに使用される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記分子記述子が、以下、
ａ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、
ｂ）側鎖溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）、
ｃ）デルタ炭素ＳＡＳＡ、
ｄ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷、
ｅ）骨格ＳＡＳＡ、
ｆ）トリプトファン側鎖角度、及び
ｇ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記機械学習アルゴリズムが、前記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づくポリペプチドの分子動力学シミュレーションからの分子記述子を、前記ポリペプチド中の各トリプトファン残基の実験データと一致させることによってトレーニングされたものである、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
特定の部位でのトリプトファン残基の３５％を超える酸化が、酸化に対する感受性を示す、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の分子記述子が、コンピュータを使用して計算される、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質が、抗体である、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドの酸化を低減する方法であって、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法に従って酸化感受性のトリプトファン残基を特定することと、アミノ酸置換を前記ポリペプチドに導入して、酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を、酸化を受けないアミノ酸残基で置き換えることと、を含む、前記方法。
【請求項４２】
ポリペプチドの酸化を低減する方法であって、アミノ酸置換を前記ポリペプチドに導入して、酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を置き換えることを含み、酸化感受性の前記１つ以上のトリプトファン残基が、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法によって特定されたものである、前記方法。
【請求項４３】
前記トリプトファン残基が、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に置き換えられる、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法に従って酸化感受性の前記ポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の存在を決定することと、抗酸化剤の有効量を、酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を有するポリペプチドを含む前記水性製剤に添加することと、を含む、前記方法。
【請求項４５】
水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、ある量の抗酸化剤を前記水性製剤に添加して、酸化を防止することを含み、ポリペプチドが、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法によって特定された酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を含む、前記方法。
【請求項４６】
前記抗酸化剤が、Ｎ−アセチルトリプトファンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．３ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリペプチドの前記酸化が、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記製剤が、約２℃〜約８℃で約１０９５日間にわたって安定している、請求項４４〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記製剤中のタンパク質濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記製剤が、約４．５〜約７．０のｐＨを有する、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記製剤が、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項４４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記製剤が、対象への投与に好適な薬学的製剤である、請求項４４〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記タンパク質が、抗体である、請求項４４〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ポリペプチド及び前記ポリペプチドの酸化を防止するためのある量のＮ−アセチルトリプトファンを含む液体製剤であって、前記ポリペプチドが、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法によって測定された酸化感受性の少なくとも１つのトリプトファン残基を有する、前記液体製剤。
【請求項５９】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項５８に記載の液体製剤。
【請求項６０】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項５８または６０に記載の液体製剤。
【請求項６１】
前記Ｎ−アセチルトリプトファンが、約０．３ｍＭの濃度になるように前記製剤に添加される、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６２】
前記ポリペプチドの前記酸化が、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６３】
前記製剤が、約２℃〜約８℃で約１０６５日間にわたって安定している、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６４】
前記製剤中のタンパク質濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６５】
前記製剤が、約４．５〜約７．０のｐＨを有する、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６６】
前記製剤が、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６７】
前記製剤が、対象への投与に好適な薬学的製剤である、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６８】
前記タンパク質が、抗体である、請求項５８〜６７のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６９】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である、請求項６８に記載の液体製剤。
【請求項７０】
製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、前記ポリペプチドが、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法によって特定された酸化感受性の少なくとも１つのトリプトファンを含み、前記方法が、
ある量のＮ−アセチルトリプトファンを、前記ポリペプチドを含む水性組成物に添加することと、
２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を前記組成物に添加することと、
前記ポリペプチド、前記Ｎ−アセチルトリプトファン、及び前記ＡＡＰＨを含む前記組成物を約４０℃で約１４時間インキュベートすることと、
前記ポリペプチドを前記ポリペプチド中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、
前記ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、前記ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、前記方法。
【請求項７１】
製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、
ａ）請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法によって酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を含むポリペプチドを特定することと、
ｂ）ある量のＮ−アセチルトリプトファンを、ステップａ）で特定された前記ポリペプチドを含む水性組成物に添加することと、
ｃ）２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を前記組成物に添加することと、
ｄ）前記ポリペプチド、前記Ｎ−アセチルトリプトファン、及び前記ＡＡＰＨを含む前記組成物を約４０℃で約１４時間インキュベートすることと、
ｅ）前記ポリペプチドを前記ポリペプチド中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、
前記ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、前記ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、前記方法。
【請求項７２】
請求項５８〜６９のいずれか１項に記載の液体製剤を含むキット。
【請求項７３】
請求項５８〜７２のいずれか１項に記載の液体製剤を含む製品。
【請求項７４】
Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、前記方法が、
ａ）前記組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、前記組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で平衡化された前記クロマトグラフィー材料に装填され、移動相Ａが水中酸を含み、移動相Ｂがアセトニトリル中酸を含む、前記適用することと、
ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で前記組成物を前記逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率がステップａ）と比較して増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々に前記クロマトグラフィーから溶出する、前記溶出させることと、
ｃ）前記ＮＡＴ分解物及び前記インタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、前記方法。
【請求項７５】
ステップａ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約２：９８である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、直線的に増加する、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、段階的に増加する、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記クロマトグラフィーの流速が、約１．０ｍＬ／分である、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約３０：７０に増加する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約１６分後に約３０：７０に増加する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約９０：７０にさらに増加する、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約１８．１分後に約９０：７０にさらに増加する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約２６：７４に増加する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約１４分後に約２６：７４に増加する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約９０：７０にさらに増加する、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約１６．５分後に約９０：７０にさらに増加する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
移動相Ａが、水中約０．１％酸を含む、請求項７４〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
移動相Ｂが、アセトニトリル中約０．１％酸を含む、請求項７４〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記酸がギ酸である、請求項７４〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記逆相クロマトグラフィー材料がＣ１８部分を含む、請求項７４〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記逆相クロマトグラフィー材料が固体支持体を含む、請求項７４〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記固体支持体がシリカを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記逆相クロマトグラフィー材料がカラム内に含まれる、請求項７４〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記逆相クロマトグラフィー材料が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）材料である、請求項７４〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
ＮＡＴ及びＮＡＴ分解産物が、２４０ｎｍの吸光度によって検出される、請求項７４〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
ＮＡＴ分解産物が、質量分析によって特定される、請求項７４〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記組成物中のＮＡＴの濃度が、約１０ｎＭ〜約１ｍＭである、請求項７４〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
ＮＡＴ分解産物が、Ｎ−Ａｃ−（Ｈ，１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３ａ−ヒドロキシピロロ［２，３−ｂ］−インドール−２−カルボン酸）（Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣ）、Ｎ−Ａｃ−オキシインドリルアラニン（Ｎ−Ａｃ−Ｏｉａ）、Ｎ−Ａｃ−Ｎ−ホルミル−キヌレニン（Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ）、Ｎ−Ａｃ−キヌレニン（Ｎ−Ａｃ−Ｋｙｎ）、及びＮ−Ａｃ−２ａ，８ａ−ジヒドロキシ−ＰＩＣのうちの１つ以上を含む、請求項７４〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）及びポリペプチドを含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、前記方法が、
ａ）前記組成物を約８Ｍのグアニジンで希釈することと、
ｂ）前記ポリペプチドを前記組成物から除去することと、
ｃ）前記組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、前記組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で平衡化されたクロマトグラフィー材料に装填され、移動相Ａが水中酸を含み、移動相Ｂがアセトニトリル中酸を含む、前記適用することと、
ｄ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で前記組成物を前記逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率がステップａ）と比較して増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々に前記クロマトグラフィーから溶出する、前記溶出させることと、
ｅ）前記ＮＡＴ分解物及び前記インタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、前記方法。
【請求項１００】
前記組成物中のＮＡＴの最終濃度が約０．０５ｍＭ〜約０．２ｍＭの範囲になるように、前記組成物が約８Ｍのグアニジン中で希釈される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組成物中のポリペプチドの最終濃度が約２５ｍｇ／ｍＬ以下になるように、前記組成物が約８Ｍのグアニジン中で希釈される、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ポリペプチドが、濾過によって前記組成物から除去される、請求項９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記濾過が、約３０ｋＤａｌの分子量カットオフを有する濾過膜を使用する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ステップａ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約２：９８である、請求項９９〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、直線的に増加する、請求項９９〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、段階的に増加する、請求項９９〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記クロマトグラフィーの流速が、約１．０ｍＬ／分である、請求項９９〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約３０：７０に増加する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約１６分後に約３０：７０に増加する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約９０：７０にさらに増加する、請求項１０８または１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約１８．１分後に約９０：７０にさらに増加する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約２６：７４に増加する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約１４分後に約２６：７４に増加する、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約９０：７０にさらに増加する、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が、約１６．５分後に約９０：７０にさらに増加する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
移動相Ａが、水中約０．１％酸を含む、請求項９９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
移動相Ｂが、アセトニトリル中約０．１％酸を含む、請求項９９〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記酸がギ酸である、請求項９９〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記逆相クロマトグラフィー材料がＣ１８部分を含む、請求項９９〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記逆相クロマトグラフィー材料が固体支持体を含む、請求項９９〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記固体支持体がシリカを含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記逆相クロマトグラフィー材料がカラム内に含まれる、請求項９９〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記逆相クロマトグラフィー材料が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）材料である、請求項９９〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
ＮＡＴ及びＮＡＴ分解産物が、２４０ｎｍの吸光度によって検出される、請求項９９〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
ＮＡＴ分解産物が、質量分析によって特定される、請求項９９〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記組成物中のＮＡＴの濃度が、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭである、請求項９９〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記組成物中のＮＡＴの濃度が、約０．３ｍＭである、請求項９９〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
ＮＡＴ分解産物が、Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣ、Ｎ−Ａｃ−Ｏｉａ、Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ、Ｎ−Ａｃ−Ｋｙｎ、及びＮ−Ａｃ−２ａ，８ａ−ジヒドロキシ−ＰＩＣのうちの１つ以上を含む、請求項９９〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記製剤中のタンパク質濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項９９〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記製剤が、約４．５〜約７．０のｐＨを有する、請求項９９〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記製剤が、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項９９〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記製剤が、対象への投与に好適な薬学的製剤である、請求項９９〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ポリペプチドが、抗体である、請求項９９〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
組成物中のＮＡＴの分解を監視する方法であって、請求項７４〜１３４のいずれか１項に記載の方法に従って前記組成物の試料中のＮＡＴの前記分解を測定することを含み、前記方法が１回以上繰り返される、前記方法。
【請求項１３６】
前記方法が、毎月、２ヶ月毎に、４ヶ月毎に、または６ヶ月毎に繰り返される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
薬学的組成物の品質アッセイであって、前記品質アッセイが、請求項７４〜１３４のいずれか１項に記載の方法に従って前記薬学的組成物の試料中のＮＡＴの分解を測定することを含み、前記組成物中の測定されたＮＡＴ分解物の量が、前記薬学的組成物が動物への投与に好適であるかを決定する、前記品質アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月３０日出願の米国仮出願第６２／２７３，２７３号及び２０１６年４月１２日出願の米国仮出願第６２／３２１，６３６号の利益を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、タンパク質を含み、Ｎ−アセチル−トリプトファンをさらに含む液体製剤、ならびに本液体製剤を産生及び使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アミノ酸残基の酸化的分解は、タンパク質医薬品において一般に観察される現象である。いくつかのアミノ酸残基、具体的には、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びチロシン（Ｔｙｒ）が、酸化感受性である（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４８：４９０−５００（１９９５））。酸化は、典型的には、タンパク質が、様々な加工ステップ中に、過酸化水素、光、金属イオン、またはこれらの組み合わせに曝露されたときに観察される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４８：４９０−５００（１９９５））。具体的には、光（Ｗｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７９（７）：２７９７−２８０５（２００７））、ＡＡＰＨ、またはフェントン試薬（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９８（１２）：４４８５−５００（２００９））に曝露されたタンパク質が、トリプトファン残基に対して増加したレベルの酸化を示した一方で、過酸化水素に曝露されたタンパク質は、典型的には、メチオニン酸化のみを示した（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９８（１２）：４４８５−５００（２００９））。光への曝露により、一重項酸素、過酸化水素、及び超酸化物を含む反応性酸素種（ＲＯＳ）の形成によるタンパク質酸化がもたらされ得る（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４８：４９０−５００（１９９５）、Ｗｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７９（７）：２７９７−２８０５（２００７）、Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９８（１２）：４４８５−５００（２００９）、Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ４（４）：２９８−３０６（２００５））一方で、タンパク質酸化は、典型的には、フェントン媒介反応においてヒドロキシルラジカルにより（Ｐｒｏｕｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７９（１２）：２３２５−２３３８（２００７））、かつＡＡＰＨ媒介反応においてアルコキシル過酸化物により生じる（Ｗｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  １００（８）：３３０７−１５（２０１１））。トリプトファンの酸化は、ヒドロキシトリプトファン、キヌレニン（Ｋｙｎ）、及びＮ−ホルミルキヌレニンを含む無数の酸化産物をもたらし、製剤の安全性及び効力に影響を与える可能性がある（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４８：４９０−５００（１９９５）、Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９８（１２）：４４８５−５００（２００９）、Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ４（４）：２９８−３０６（２００５））。生物学的機能の損失と相関するモノクローナル抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）における特定のトリプトファン残基の酸化が報告されている（Ｗｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７９（７）：���７９７−２８０５（２００７））。ヒスチジン配位金属イオンによって媒介されたＴｒｐ酸化が、Ｆａｂ分子について最近報告された（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２８（１０）：２５４３−５５（２０１１））。様々な過酸化物の生成をもたらすＦａｂ製剤中のポリソルベート２０の自動酸化も、同じ研究で報告されている。タンパク質中のＭｅｔ残基が内部抗酸化剤として作用することが示唆されており（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３（２６）：１５０３６−１５０４０（１９９６））、過酸化物によって容易に酸化するため、これらの過酸化物の自動酸化誘導生成も、長期保管中にタンパク質におけるメチオニン酸化をもたらし得る。タンパク質のアミノ酸残基の酸化は、その生物学的活性に影響を与える可能性がある。これは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に特に当てはまり得る。ＩｇＧ１  ｍＡｂにおけるＭｅｔ２５４及びＭｅｔ４３０でのメチオニン酸化は、トランスジェニックマウスにおける血清半減期に影響を与える可能性があり（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４８（６−７）：８６０−８６６（２０１１））、ヒトＩｇＧ１のＦｃＲｎ及びＦｃ−ガンマ受容体への結合にも影響を与える（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４６（８−９）１８７８−８２（２００９））。
【０００４】
特に液体状態でのタンパク質の安定性は、薬物製品の製造及び保管中に評価されなければならない。薬学的製剤の開発は、活性成分の酸化を防止するための抗酸化剤の添加を含むこともある。Ｌ−メチオニンの製剤への添加により、タンパク質及びペプチドにおけるメチオニン残基の酸化の低減がもたらされた（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９８（１２）：４４８５−５００（２００９）、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８６（１１）：１２５０−１２５５（１９９７））。同様に、Ｌ−トリプトファンの添加がトリプトファン残基の酸化の低減が示されている（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９８（１２）：４４８５−５００（２００９）、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２８（１０）：２５４３−５５（２０１１））。しかしながら、Ｌ−Ｔｒｐは、ＵＶ領域内で強い吸光度（２６０〜２９０ｎｍ）を有し、それを光酸化中の主要標的にする（Ｃｒｅｅｄ，Ｄ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３９（４）：５３７−５６２（１９８４））。Ｔｒｐは、チロシン（Ｂａｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２９（３）：２９６−８（１９９２））及び他のアミノ酸（Ｂｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ９７（１０）：２６１２−２６１９（１９７５））の酸素依存性光酸化を強化する内因性光増感剤と仮定されている。Ｌ−Ｔｒｐが光に曝露されたときに過酸化水素を生成することができ、ＵＶ光下のＬ−Ｔｒｐがスーパーオキシドアニオンを介して過酸化水素を産生することが実証されている（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９１（４２２６）：４６８−９（１９７６）、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（５５３６）：１８０６−１１（２００１）、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １００：３１２−３１３（１９７８））。加えて、トリプトファンが光への曝露時に一重項酸素を産生することが知られている（Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３０５（３）：７６１−７０（２００３））。ポリソルベート２０の自動酸化によって誘導されるタンパク質酸化と同様に、タンパク質酸化が、通常の取り扱い条件下でのタンパク質製剤中の他の賦形剤（例えば、Ｌ−Ｔｒｐ）によりＲＯＳ生成時に生じ得る可能性がある。
【０００５】
液体製剤中の特定のタンパク質残基の酸化の感受性は、その残基の製剤中の酸化剤（例えば、ＲＯＳ）への露出に依存し得る。溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）は、溶媒に露出する生体分子（例えば、アミノ酸残基）の表面積の尺度である。タンパク質中のアミノ酸残基のＳＡＳＡは、酸化へのその残基の利用可能性を示し得る。ＳＡＳＡは、Ｓｈｒａｋｅ−Ｒｕｐｌｅｙアルゴリズム、対重複線形結合（ＬＣＰＯ）法、及びパワーダイアグラム法を含む様々な方法を使用して計算され得る（Ｓｈｒａｋｅ，Ａ  ＆  Ｒｕｐｌｅｙ，ＪＡ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９（２）：３５１−３７１，１９７３、Ｗｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．２０（２）：２１７−２３０，１９９９、Ｋｌｅｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．３２（１２）：２６４７−２６５３，２０１１）。より最近になって、全原子分子動力学（ＭＤ）シミュレーションがアミノ酸残基のＳＡＳＡを計算するために使用されており、ＳＡＳＡ％へのバイナリ依存性及びＴｒｐ酸化の不利益が実証された（Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．１１１（５２）：１８６０１−１８６０６，２０１４）。したがって、ＳＡＳＡは、所与のタンパク質製剤中に抗酸化剤を含む好適性を決定するのに有用なパラメータであり得る。
【０００６】
Ｌ−Ｔｒｐ及びポリソルベート等の標準の賦形剤のタンパク質を安定させるよう意図されているタンパク質組成物への添加により、タンパク質のＲＯＳ誘導酸化等の予想外の望ましくない結果がもたらされ得ることが、最近の研究から明らかである。これは、酸化しやすい残基を有するタンパク質組成物の特に懸念される点である。したがって、タンパク質組成物に使用するための代替の賦形剤の特定及びかかる組成物の開発が依然として必要とされている。タンパク質製剤中でのトリプトファン誘導体の使用の例は、米国特許公開第２０１４／０３２２２０３号及び同第２０１４／０３１４７７８号によって提供される。
【０００７】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願、及び公開特許出願の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを製剤に添加することを含み、ポリペプチドが、約８０Å２を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、方法を提供する。本発明は、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを製剤に添加することを含み、ポリペプチドが、約３０％を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、方法も提供する。本発明は、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、ポリペプチド中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することと、少なくとも１つのトリプトファン残基が約８０Å２を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する場合に、ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを製剤に添加することと、を含む、方法も提供する。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡ値は、分子動力学シミュレーションによって計算される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．３ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドの酸化は、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される。いくつかの実施形態では、製剤は、約２℃〜約８℃で約１０９５日間にわたって安定している。
【００１１】
いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。
【００１３】
いくつかの態様では、本発明は、ポリペプチド及びポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを含む液体製剤であって、ポリペプチドが、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を有する、液体製剤を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．３ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの酸化は、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される。いくつかの実施形態では、製剤は、約２℃〜約８℃で約１０６５日間にわたって安定している。
【００１４】
いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。
【００１６】
いくつかの態様では、本発明は、製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、ポリペプチドが、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含み、本方法が、ある量のＮ−アセチルトリプトファンを、ポリペプチドを含む水性組成物に添加することと、２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を組成物に添加することと、ポリペプチド、Ｎ−アセチルトリプトファン、及びＡＡＰＨを含む組成物を約４０℃で約１４時間インキュベートすることと、ポリペプチドをポリペプチド中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファン及びＡＡＰＨは、約１０時間、１１時間、１２時間、１４時間、１６時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか未満にわたってインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのトリプトファン残基の約１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％のうちのいずれか以下の酸化が、ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である。
【００１７】
いくつかの態様では、本発明は、製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、ポリペプチド中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することであって、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有するトリプトファン残基が酸化を受ける、決定することと、ある量のＮ−アセチルトリプトファンを、ポリペプチドを含む水性組成物に添加することと、２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を組成物に添加することと、ポリペプチド、Ｎ−アセチルトリプトファン、及びＡＡＰＨを含む組成物を約４０℃で約１４時間インキュベートすること、ポリペプチドをポリペプチド中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、方法を提供する。
【００１８】
上記の態様のいくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡ値は、分子動力学シミュレーションによって計算される。
【００１９】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの液体製剤を含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの液体製剤を含む製品を提供する。
【００２０】
タンパク質及びＮ−アセチル−トリプトファン（ＮＡＴ）を含む製剤、ならびにその製剤を作製及び使用する方法が、本明細書に提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、液体製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、水性である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中のトリプトファンの酸化を防止する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、または抗体断片）である。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。
【００２５】
本発明は、液体製剤中のポリペプチドが酸化感受性のトリプトファン残基を含むかを決定する方法であって、本方法が、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてポリペプチド中の各トリプトファン残基の１つ以上の分子記述子を計算することと、１つ以上の分子記述子を１つ以上の分子記述子でトレーニングされた機械学習アルゴリズムに適用して、トリプトファン酸化を予測することと、を含み、分子記述子が、以下：ａ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、ｂ）側鎖溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）、ｃ）デルタ炭素ＳＡＳＡ、ｄ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷、ｅ）骨格ＳＡＳＡ、ｆ）トリプトファン側鎖角度、ｇ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、ｈ）トリプトファン骨格角度、ｉ）擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、ｊ）骨格柔軟性、またはｋ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷のうちの１つ以上を含む、方法も提供する。いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個の分子記述子が使用される。いくつかの実施形態では、分子記述子は、以下：ａ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、ｂ）側鎖溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）、ｃ）デルタ炭素ＳＡＳＡ、ｄ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷、ｅ）骨格ＳＡＳＡ、ｆ）トリプトファン側鎖角度、及びｇ）７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度を含む。いくつかの実施形態では、特定の部位でのトリプトファン残基の３５％を超える酸化は、酸化に対する感受性を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づくポリペプチドの分子動力学シミュレーションからの分子記述子を、ポリペプチド中の各トリプトファン残基の実験データと一致させることによってトレーニングされたものである。いくつかの実施形態では、１つ以上の分子記述子は、コンピュータを使用して計算される。
【００２７】
本発明は、ポリペプチドの酸化を低減する方法であって、機械学習アルゴリズムを含む上述の実施形態のうちのいずれか１つに従って酸化感受性のトリプトファン残基を特定することと、アミノ酸置換をポリペプチドに導入して、酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を、酸化を受けないアミノ酸残基で置き換えることと、を含む、方法も提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの酸化を低減する方法であって、アミノ酸置換をポリペプチドに導入して、酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を置き換えることを含み、酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基が、機械学習アルゴリズムを含む上述の実施形態のうちのいずれか１つによる方法によって特定されたものである、方法が提供される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基は、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に置き換えられる。
【００２８】
本発明は、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、コンピュータ学習アルゴリズムを含む上述の実施形態のうちのいずれか１つの方法に従って酸化感受性のポリペプチド中の１つ以上のトリプトファン残基の存在を決定することと、抗酸化剤の有効量を、酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を有するポリペプチドを含む水性製剤に添加することと、を含む、方法も提供する。いくつかの実施形態では、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、ある量の抗酸化剤を水性製剤に添加して、酸化を防止することを含み、ポリペプチドが、機械学習アルゴリズムを含む上述の実施形態のうちのいずれか１つの方法によって特定された酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗酸化剤は、Ｎ−アセチルトリプトファンである。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．３ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの酸化は、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される。いくつかの実施形態では、製剤は、約２℃〜約８℃で約１０９５日間にわたって安定している。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。
【００２９】
本発明は、ポリペプチド及びポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを含む液体製剤であって、ポリペプチドが、機械学習アルゴリズムを含む上述の実施形態のうちのいずれか１つの方法によって測定された酸化感受性の少なくとも１つのトリプトファン残基を有する、液体製剤も提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルトリプトファンは、約０．３ｍＭの濃度になるように製剤に添加される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの酸化は、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される。いくつかの実施形態では、製剤は、約２℃〜約８℃で約１０６５日間にわたって安定している。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、液体製剤を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、液体製剤を含む製品が提供される。
【００３０】
本発明は、製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、ポリペプチドが、機械学習アルゴリズムを含む上述の実施形態のうちのいずれか１つの方法によって特定された酸化感受性の少なくとも１つのトリプトファンを含み、本方法が、ある量のＮ−アセチルトリプトファンを、ポリペプチドを含む水性組成物に添加することと、２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を組成物に添加することと、ポリペプチド、Ｎ−アセチルトリプトファン、及びＡＡＰＨを含む組成物を約４０℃で約１４時間インキュベートすることと、ポリペプチドをポリペプチド中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、方法も提供する。いくつかの実施形態では、製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、ａ）機械学習アルゴリズムを含む上述の実施形態のうちのいずれか１つの方法によって酸化感受性の１つ以上のトリプトファン残基を含むポリペプチドを特定することと、ｂ）ある量のＮ−アセチルトリプトファンを、ステップａ）で特定されたポリペプチドを含む水性組成物に添加することと、ｃ）２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を組成物に添加することと、ｄ）ポリペプチド、Ｎ−アセチルトリプトファン、及びＡＡＰＨを含む組成物を約４０℃で約１４時間インキュベートすることと、ｅ）ポリペプチドをポリペプチド中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、方法が提供される。
【００３１】
いくつかの態様では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、本方法が、ａ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で平衡化されたクロマトグラフィー材料に装填され、移動相Ａが水中酸を含み、移動相Ｂがアセトニトリル中酸を含む、適用することと、ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率がステップａ）と比較して増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｃ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２：９８である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、線形に増加する。いくつかの実施形態では、ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、段階的に増加する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１６分後に約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約９０：７０にさらに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１８．１分後に約９０：７０にさらに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２６：７４に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１４分後に約２６：７４に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約９０：７０にさらに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１６．５分後に約９０：７０にさらに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中約０．１％酸を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、アセトニトリル中約０．１％酸を含む。いくつかの実施形態では、酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、Ｃ１８部分を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、シリカを含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、カラム内に含まれる。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ及びＮＡＴ分解産物は、２４０ｎｍの吸光度によって検出される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ分解産物は、質量分析によって特定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＮＡＴの濃度は、約１０ｎＭ〜約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ分解産物は、Ｎ−Ａｃ−（Ｈ，１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３ａ−ヒドロキシピロロ［２，３−ｂ］−インドール−２−カルボン酸）（Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣ）、Ｎ−Ａｃ−オキシインドリルアラニン（Ｎ−Ａｃ−Ｏｉａ）、Ｎ−Ａｃ−Ｎ−ホルミル−キヌレニン（Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ）、Ｎ−Ａｃ−キヌレニン（Ｎ−Ａｃ−Ｋｙｎ）、及びＮ−Ａｃ−２ａ，８ａ−ジヒドロキシ−ＰＩＣのうちの１つ以上を含む。
【００３２】
いくつかの態様では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）及びポリペプチドを含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、本方法が、ａ）組成物を約８Ｍのグアニジンで希釈することと、ｂ）ポリペプチドを組成物から除去することと、ｃ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で平衡化されたクロマトグラフィー材料に装填され、移動相Ａが水中酸を含み移動相Ｂがアセトニトリル中酸を含む、適用することと、ｄ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率がステップａ）と比較して増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｅ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＡＴの最終濃度が約０．０５ｍＭ〜約０．２ｍＭの範囲になるように、約８Ｍのグアニジン中で希釈される。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のポリペプチドの最終濃度が約２５ｍｇ／ｍＬ以下になるように、約８Ｍのグアニジン中で希釈される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、濾過によって組成物から除去される。いくつかの実施形態では、濾過は、約３０ｋＤａｌの分子量カットオフを有する濾過膜を使用する。いくつかの実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２：９８である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、線形に増加する。いくつかの実施形態では、ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、段階的に増加する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１６分後に約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約９０：７０にさらに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１８．１分後に約９０：７０にさらに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２６：７４に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１４分後に約２６：７４に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約９０：７０にさらに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１６．５分後に約９０：７０にさらに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中約０．１％酸を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、アセトニトリル中約０．１％酸を含む。いくつかの実施形態では、酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、Ｃ１８部分を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、シリカを含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、カラム内に含まれる。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ及びＮＡＴ分解産物は、２４０ｎｍの吸光度によって検出される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ分解産物は、質量分析によって特定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＮＡＴの濃度は、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物中のＮＡＴの濃度は、約０．３ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ分解産物は、Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣ、Ｎ−Ａｃ−Ｏｉａ、Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ、Ｎ−Ａｃ−Ｋｙｎ、及びＮ−Ａｃ−２ａ，８ａ−ジヒドロキシ−ＰＩＣのうちの１つ以上を含む。
【００３３】
上記の態様のいくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。
【００３４】
いくつかの態様では、本発明は、組成物中のＮＡＴの分解を監視する方法であって、請求項７４〜１３４のいずれか１項に記載の方法に従って組成物の試料中のＮＡＴの分解を測定することを含み、本方法が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、毎月、２ヶ月毎に、４ヶ月毎に、または６ヶ月毎に繰り返される。
【００３５】
いくつかの態様では、本発明は、薬学的組成物の品質アッセイであって、本品質アッセイが、請求項７４〜１３４のいずれか１項に記載の方法に従って薬学的組成物の試料中のＮＡＴの分解を測定することを含み、組成物中の測定されたＮＡＴ分解物の量が、薬学的組成物が動物への投与に好適であるかを決定する、品質アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、約１０ｐｐｍ未満の薬学的組成物中のＮＡＴ分解物の量は、薬学的組成物が動物への投与に好適であることを示す。
【００３６】
本明細書に記載の様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全てが組み合わせられて、本発明の他の実施形態を形成することができることを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者に明らかであろう。本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】タンパク質Ｍａｂ２、Ｍａｂ４、Ｍａｂ１、及びＭａｂ６中のＮＡＴによる様々なトリプトファン残基のＡＡＰＨストレス誘導酸化からの保護を示す。両グラフは、ｘ軸スケールが異なる同じデータを提示している。説明文は、試験した各残基のコンピュータにより計算された溶媒接触可能表面積を含む。
【図２Ａ】図２Ａ及び図２Ｂは、ＡＡＰＨによるトリプトファン酸化と側鎖ＳＡＳＡ％との間の関係を示す。図２Ａは、３８個のＩｇＧ１  ｍＡｂを含むデータセットからの結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び図２Ｂは、ＡＡＰＨによるトリプトファン酸化と側鎖ＳＡＳＡ％との間の関係を示す。図２Ｂは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、及びマウスを含む多様なフレームワークにわたる１２１個のｍＡｂを含むデータセットからの結果を示す。
【図３】トレーニング中に使用した推定器の数の関数としてのランダム決定フォレスト精度を示す。
【図４】トレーニング中に考慮した特徴量の数の関数としてのランダム決定フォレスト精度を示す。
【図５】トレーニング中に使用したツリー深度の関数としてのランダム決定フォレスト精度を示す。
【図６】最適化ランダム決定フォレストの１４個の最も関連性の高いシミュレーションに基づく分子記述子の特徴量重要度（ジニ重要度）を示す。トレーニングパラメータには、５０００個の推定器、１ノード当たり３個の考慮される特徴量、及び１０のツリー深度が含まれる。
【図７】ＮＡＴの可能性のある分解物（ｂシリーズ）に加えて、対応するＴｒｐ分解物（ａシリーズ）を示す。
【図８Ａ】異なるストレス条件に供した後の逆相クロマトグラフ０．２ｍＭ  ＮＡＴを示す。星印のピークは、ＩＣＨ光ストレス下でのみ観察されたピークを表す。
【図８Ｂ】ＡＡＰＨストレス試料中のＮＡＴ及びＮＡＴ分解物の波長にわたる蛍光及び吸光度の比較を示す。これらのプロファイルは、ＮＡＴピークが１ＡＵに設定されるように正規化されている。測定可能な蛍光（励起波長＝２４０ｎｍ、発光波長＝３４２ｎｍ）を有する唯一のＮＡＴ分解物がピーク４（このデータ及び図１５ＥのＭＳフラグメンテーションデータに基づいて、Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣとして割り当てられている）であることに留意されたい。
【図９】合成ＮＡＴ標準物のＡＡＰＨ誘導ＮＡＴ分解物との保持時間アライメントを示す。
【図１０】５ｍＭ  Ｍｅｔの共製剤の全ＮＡＴ酸化への影響を示す（ヒスチジン含有製剤及びヒスチジン不含製剤の両方）。重複注入の標準偏差が示されている。
【図１１】タンパク質のＡＡＰＨ誘導ＮＡＴ分解への影響を示す。０．３ｍＭのＮＡＴを含有するヒスチジン系緩衝液（１ｍｇ／ｍｌ（０．００６７ｍＭ）のタンパク質を有するものまたは１ｍｇ／ｍｌ（０．００６７ｍＭ）のタンパク質を有しないもの）をＡＡＰＨストレスに供した。ＮＡＴ分解物の分布及びレベルは、タンパク質の存在とは主に無関係である。重複注入の標準偏差が示されている。
【図１２】タンパク質１安定性試料及びＡＡＰＨストレスモデルにおけるＮＡＴ分解の比較を示す。挿入画は、指示された領域の拡大図を示す。
【図１３】ＮＡＴ  ＵＶ−ＨＰＬＣ応答（２４０ｎｍ）の線形性を示す。
【図１４−１】ＮＡＴ分解物がＨｉｓ緩衝液試料中のＡＡＰＨストレスＮＡＴの１〜２０倍希釈系列における線形応答を示すことを描写する。全てのピークを２４０ｎｍで検出した。
【図１４−２】ＮＡＴ分解物がＨｉｓ緩衝液試料中のＡＡＰＨストレスＮＡＴの１〜２０倍希釈系列における線形応答を示すことを描写する。全てのピークを２４０ｎｍで検出した。
【図１５Ａ−１】質量分析フラグメンテーション分析を示す（フラグメンテーションについての文献報告：Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｆｅｄｏｒｏｖａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８及びこの文献報告内の参考文献）。図１５Ａは、ピーク２及び３のＭＳデータがＮ−Ａｃ−Ｏｉａジアステレオマーとしての特定を支持することを示す。星印の断片は、Ｏｉａの特徴を示している。
【図１５Ａ−２】質量分析フラグメンテーション分析を示す（フラグメンテーションについての文献報告：Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｆｅｄｏｒｏｖａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８及びこの文献報告内の参考文献）。図１５Ａは、ピーク２及び３のＭＳデータがＮ−Ａｃ−Ｏｉａジアステレオマーとしての特定を支持することを示す。星印の断片は、Ｏｉａの特徴を示している。
【図１５Ｂ】質量分析フラグメンテーション分析を示す（フラグメンテーションについての文献報告：Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｆｅｄｏｒｏｖａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８及びこの文献報告内の参考文献）。図１５Ｂは、ピーク６のＭＳデータがＮ−Ａｃ−Ｋｙｎとしての特定を支持することを示す。星印の断片は、キヌレニン含有分子の特徴を示している。
【図１５Ｃ】質量分析フラグメンテーション分析を示す（フラグメンテーションについての文献報告：Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｆｅｄｏｒｏｖａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８及びこの文献報告内の参考文献）。図１５Ｃは、ピーク５のＭＳデータがＮ−Ａｃ−ＮＦＫとしての特定を支持することを示す。星印の断片は、キヌレニン含有分子の特徴を示している。
【図１５Ｄ】質量分析フラグメンテーション分析を示す（フラグメンテーションについての文献報告：Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｆｅｄｏｒｏｖａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８及びこの文献報告内の参考文献）。図１５Ｄは、ピーク群１及びピーク４における２６３．１イオンが同様のＭＳフラグメンテーションパターンを有し、いずれもＮ−Ａｃ−ＨＴＰではないことを示す。星印の断片は、５−ＨＴＰの特徴を示している。
【図１５Ｅ】質量分析フラグメンテーション分析を示す（フラグメンテーションについての文献報告：Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｆｅｄｏｒｏｖａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８及びこの文献報告内の参考文献）。図１５Ｅは、ピーク４におけるフラグメンテーションパターンが可能性のあるＮ−Ａｃ−ＰＩＣフラグメンテーションと一致していることを示し、文献で報告されている（Ｆａｎｇ，Ｌ．，Ｒ．Ｐａｒｔｉ，ａｎｄ  Ｐ．Ｈｕ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，２０１１．１２１８（４１）：ｐ．７３１６−２４）。暫定的な割り当てが図８Ｂに示される蛍光データに基づいて強化されている。
【図１５Ｆ】質量分析フラグメンテーション分析を示す（フラグメンテーションについての文献報告：Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｆｅｄｏｒｏｖａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８及びこの文献報告内の参考文献）。図１５Ｆは、ピーク群１における二重に酸化された種が恐らくＮ−Ａｃ−ＤｉＯｉａまたはＮ−Ａｃ−３ａ，８ａ−ジヒドロキシ−ＰＩＣであることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
いくつかの態様では、本発明は、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを製剤に添加することを含み、ポリペプチドが、約８０Å２を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを製剤に添加することを含み、ポリペプチドが、約３０％を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、水性製剤中のポリペプチドの酸化を低減する方法であって、ポリペプチド中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することと、少なくとも１つのトリプトファン残基が約８０Å２を超える溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する場合に、ポリペプチドの酸化を防止する量のＮ−アセチルトリプトファンを製剤に添加することと、を含む、方法を提供する。
【００３９】
いくつかの態様では、本発明は、製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、ポリペプチドが、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含み、ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、製剤をポリペプチドの低減した酸化についてスクリーニングするための方法であって、ポリペプチド中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することを含み、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有するトリプトファン残基が酸化を受け、ポリペプチドのトリプトファン残基の約２０％以下の酸化をもたらす量のＮ−アセチルトリプトファンを含む製剤が、ポリペプチドの低減した酸化に好適な製剤である、方法を提供する。
【００４０】
Ｉ．定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の組成物または生物学的系に限定されず、これらが言うまでもなく変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
【００４１】
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のさらなる成分を含有しない調製物を指す。かかる製剤は、滅菌である。
【００４２】
「滅菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生存微生物及びそれらの胞子を含まないか、またはそれらを本質的に含まない。
【００４３】
「安定した」製剤とは、内部のタンパク質が保管時にその物理的安定性及び／もしくは化学的安定性ならびに／または生物学的活性を本質的に保持する製剤である。好ましくは、製剤は、保管時に、その物理的及び化学的安定性、ならびにその生物学的活性を本質的に保持する。保管期間は、一般に、製剤の意図される貯蔵寿命に基づいて選択される。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技法が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された露光量及び／または温度で選択された期間にわたって測定され得る。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、濁度を測定することにより、かつ／または目視検査により）；ＲＯＳ形成の評価（例えば、光ストレスアッセイまたは２，２´−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）ストレスアッセイを使用することにより）；タンパク質の特定のアミノ酸残基の酸化（モノクローナル抗体の例えば、Ｔｒｐ残基及び／またはＭｅｔ残基）；カチオン交換クロマトグラフィー、画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動を使用した電荷不均一性の評定；アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析；質量分光分析；還元されたインタクトな抗体を比較するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ−Ｃ）分析；タンパク質の生物学的活性または標的結合機能（例えば、抗体の抗原結合機能）の評価等を含む様々な異なる方法で質的及び／または量的に評価され得る。不安定性は、凝集、脱アミド（例えば、Ａｓｎ脱アミド）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化及び／またはＴｒｐ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン（複数可）、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化差異等のうちのいずれか１つ以上を伴い得る。
【００４４】
タンパク質は、それが、色及び／もしくは透明度の目視検査時に、またはＵＶ光散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定されたときに、凝集、沈殿、断片化、及び／または変性の兆候をほとんどまたは全く示さない場合、薬学的製剤中で「その物理的安定性を保持する」。
【００４５】
タンパク質は、所与の時点での化学的安定性が、タンパク質が以下に定義されるその生物学的活性を依然として保持しているとみなされるようなものである場合、薬学的製剤中で「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、タンパク質の化学的に改変された形態を検出及び定量することによって評定され得る。化学的改変は、例えば、トリプシンペプチドマッピング、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して評価され得るタンパク質酸化を含み得る。他のタイプの化学的改変としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはｉｃＩＥＦによって評価され得るタンパク質の電荷改変が挙げられる。
【００４６】
タンパク質は、所与の時点でのタンパク質の生物学的活性が、例えば、モノクローナル抗体の抗原結合アッセイで決定される、薬学的製剤が調製された時点で呈される生物学的活性の約２０％以内（約１０％以内等）である場合（アッセイのエラー内）、薬学的製剤中で「その生物学的活性を保持する」。
【００４７】
本明細書で使用される場合、タンパク質の「生物学的活性」とは、標的に結合するタンパク質の能力、例えば、抗原に結合するモノクローナル抗体の能力を指す。これは、インビトロまたはインビボで測定され得る生物学的応答をさらに含み得る。かかる活性は、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性であり得る。
【００４８】
「酸化感受性の」タンパク質は、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びチロシン（Ｔｙｒ）等であるが、これらに限定されない、酸化しやすいことが見出されている１つ以上の残基（複数可）を含むタンパク質である。例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ部分内のトリプトファンアミノ酸またはモノクローナル抗体のＦｃ部分内のメチオニンアミノ酸が酸化感受性であり得る。
【００４９】
タンパク質の「酸化不安定な」残基は、酸化アッセイ（例えば、ＡＡＰＨ誘導または熱誘導酸化）において３５％を超える酸化を有する残基である。タンパク質中の残基の酸化パーセントは、トリプシン消化、続いて、部位特異的Ｔｒｐ酸化についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等の当該技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。
【００５０】
溶媒中の生体分子の「溶媒接触可能表面積」または「ＳＡＳＡ」とは、溶媒に露出する生体分子の表面積である。ＳＡＳＡは、測定単位（例えば、平方オングストローム）で、または溶媒に露出する表面積の割合として表され得る。例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基のＳＡＳＡは、８０Å２、または３０％であり得る。ＳＡＳＡは、Ｓｈｒａｋｅ−Ｒｕｐｌｅｙアルゴリズム、ＬＣＰＯ法、パワーダイアグラム法、または分子動力学シミュレーションを含む当該技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。
【００５１】
「等張」とは、目的とする製剤がヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有することを意味する。等張製剤は、一般に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧または氷凍結型浸透圧計を使用して測定され得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「緩衝液」とは、その酸−塩基コンジュゲート成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液を指す。本発明の緩衝液は、好ましくは、約４．５〜約８．０の範囲のｐＨを有する。例えば、酢酸ヒスチジンは、ｐＨをこの範囲内で制御する緩衝液の例である。
【００５３】
「保存料」とは、例えば、内部の細菌作用を本質的に低減させ、それ故に多目的製剤の生産を容易にするために製剤に任意に含まれ得る化合物である。可能性のある保存料の例としては、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他の種類の保存料としては、芳香族アルコール、例えば、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。一実施形態では、本明細書における保存料は、ベンジルアルコールである。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「界面活性剤」とは、表面活性剤、好ましくは、非イオン性界面活性剤を指す。本明細書における界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグルコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；メチルココイルタウリン酸ナトリウムまたはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレングリコール−プロピレングリコールコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８等）等が挙げられる。一実施形態では、本明細書における界面活性剤は、ポリソルベート２０である。なお別の実施形態では、本明細書における界面活性剤は、ポロキサマー１８８である。
【００５５】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」賦形剤または担体は、薬学的に許容される担体、安定剤、緩衝液、酸、塩基、糖、保存料、界面活性剤、張性剤等を含み、これらは全て当該技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２）。薬学的に許容される賦形剤の例としては、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、酢酸、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、Ｌ−トリプトファン、及びメチオニン；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；金属錯体、例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が挙げられる。「薬学的に許容される」賦形剤または担体は、対象に適度に投与されて、用いられる活性成分の有効用量を提供することができ、かつそれに曝露される対象に用いられる投薬量及び濃度で非毒性のものである。
【００５６】
製剤化されるタンパク質は、好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質である（例えば、夾雑タンパク質等を含まない）。「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を含む組成物を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて少なくとも約９９重量％のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を含む組成物を意味する。
【００５７】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で同義に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作または修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含むタンパク質、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。本明細書におけるこの定義に包含されるタンパク質の例としては、例えば、レニン等の哺乳類タンパク質；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；レプチン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；腫瘍壊死因子受容体、例えば、死受容体５及びＣＤ１２０；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｂ−リンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）；増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；血管内皮成長因子ファミリータンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＰ１ＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、及びそれらの二量体）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー、例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、及びＦＧＦ９；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子受容体、例えば、ＶＥＧＦ受容体（複数可）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３）、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４受容体）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＰＤＧＦＲ−α及びＰＤ���ＦＲ−β）、及び線維芽細胞成長因子受容体（複数可）；ＴＩＥリガンド（アンジオポイエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）アンジオポイエチン受容体、例えば、ＴＩＥ１及びＴＩＥ２；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、もしくはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−ｂ；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４；インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、及びインターフェロン−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；ミッドカイン；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分等；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭ；エフリン；Ｂｖ８；デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）；Ｄｅｌ−１；ＢＭＰ９；ＢＭＰ１０；ホリスタチン；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）；Ａｌｋ１；Ｒｏｂｏ４；ＥＳＭ１；パールカン；ＥＧＦ様ドメインマルチプル７（ＥＧＦＬ７）；ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー；トロンボスポンジン、例えば、トロンボスポンジン１及びトロンボスポンジン２；コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶ及びコラーゲンＸＶＩＩＩ；ニューロピリン、例えば、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；Ｎｏｔｃｈタンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４；セマフォリン、例えば、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、及びＳｅｍａ３Ｆ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）；イムノアドヘシン；ならびに上述のタンパク質のうちのいずれかの断片及び／または変異形、ならびに例えば、上述のタンパク質のうちのいずれかを含む１つ以上のタンパク質に結合する抗体断片を含む抗体が挙げられる。
【００５８】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を包含する。
【００５９】
「単離された」タンパク質（例えば、単離された抗体）とは、その天然環境の成分から特定及び分離され、かつ／または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、タンパク質の研究的、診断的、または治療的使用を妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。単離されたタンパク質は、組換え細胞内にインサイツでタンパク質を含むが、これは、タンパク質の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００６０】
「天然抗体」とは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。
【００６１】
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含む可変ドメインである免疫グロブリンの他方の部分と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（集合的に、ＣＨ）、ならびに軽鎖ＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含む。
【００６２】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖可変ドメインは、「ＶＨ」と称され得る。軽鎖可変ドメインは、「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
【００６３】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で大きく異なるという事実を指し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖可変ドメインは各々、ベータシート構造を接続し、かつある場合には、その一部を形成するループを形成する、３つのＨＶＲによって接続されたベータシート立体配置を主に採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接近して一緒に保持されており、他方の鎖のＨＶＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与等の様々なエフェクター機能を呈する。
【００６４】
任意の哺乳類種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
【００６５】
本明細書で使用されるＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」という用語は、それらの定常領域の化学的及び抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）が異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、γ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知であり、概して、例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００に記載されている。抗体は、抗体の１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有会合によって形成されるより大きい融合分子の一部であり得る。
【００６６】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、以下に定義される抗体断片ではない、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために本明細書で同義に使用される。これらの用語は、具体的には、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００６７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００６８】
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、ならびに名称が容易に結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ´）２断片が産出される。Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ´断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加だけＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ´−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ´の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ´）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ´断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
【００６９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、密接に非共有会合している１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造に類似している「二量体」構造で会合し得るように、柔軟性ペプチドリンカーによって共有結合し得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。
【００７０】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５，１９９４を参照されたい。
【００７１】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載されている。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００７２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な変異、例えば、自然発生変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある特定の実施形態では、かかるモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、単一の標的結合ポリペプチド配列の複数のポリペプチド配列からの選択を含む過程によって得られたものである。例えば、選択過程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプール等の複数のクローンからの特有のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列が、例えば、標的への親和性の改善、標的結合配列のヒト化、細胞培養中でのその産生の改善、インビボでのその免疫原性の低減、多重特異性抗体の作製等を行うようにさらに改変されてもよく、改変された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらには他の免疫グロブリンが典型的に夾雑していないという点で有利である。
【００７３】
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法によって抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）、Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照のこと）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全てを有するヒトまたはヒト様抗体を動物で産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３、ＷＯ１９９６／３４０９６、ＷＯ１９９６／３３７３５、ＷＯ１９９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、及び同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと）を含む様々���技法によって作製され得る。
【００７４】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、所望の生物学的活性を呈する限り、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である「キメラ」抗体、ならびにかかる抗体の断片を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照のこと）。キメラ抗体としては、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体が挙げられ、この抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルを目的とする抗原で免疫化することによって産生された抗体に由来する。
【００７５】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基に置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾を行って、抗体の性能をさらに洗練することができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）、及び米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号も参照されたい。
【００７６】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生され、かつ／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原曝露に応答してかかる抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化異種マウスに抗原を投与することによって調製され得る（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技法に関して、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法により生成されるヒト抗体に関して、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照されたい。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変であり、かつ／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。概して、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３は、これらの６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を呈し、特にＨ３が、抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際には、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＨＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）である。
【００７８】
いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の折衷案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々由来の残基が以下に記載される。
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【００７９】
ＨＶＲは、ＶＬ内の２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５、または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）のような「伸長ＨＶＲ」を含み得る。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って番号付けされる。
【００８０】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８１】
「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み得、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、抗体の配列の相同領域での「標準の」Ｋａｂａｔ番号付け配列との整列によって決定され得る。
【００８２】
Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵ指標」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）で報告されているＥＵ指標）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００８３】
「多重特異性抗体」という用語は、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つもしくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つもしくはそれ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体等）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。かかる多重特異性抗体としては、完全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディ、共有結合的または非共有結合的に連結された抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。重鎖定常領域の少なくとも一部分及び／または軽鎖定常領域の少なくとも一部分をさらに含むＶＨ／ＶＬ単位は、「ヘミマー」または「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施形態では、半抗体は、単一の重鎖可変領域の少なくとも一部分及び単一の軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含む。いくつかのかかる実施形態では、２つの半抗体を含み、かつ２つの抗原に結合する二重特異性抗体は、第１の抗原または第１のエピトープに結合するが、第２の抗原または第２のエピトープには結合しない第１の半抗体、及び第２の抗原または第２のエピトープに結合するが、第１の抗原または第１のエピトープには結合しない第２の半抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体は、５Ｍ〜０．００１ｐＭ、３Ｍ〜０．００１ｐＭ、１Ｍ〜０．００１ｐＭ、０．５Ｍ〜０．００１ｐＭ、または０．１Ｍ〜０．００１ｐＭの親和性で各抗原またはエピトープに結合するＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、ヘミマーは、分子内ジスルフィド結合が第２のヘミマーと形成されることを可能にするのに十分な重鎖可変領域の一部分を含む。いくつかの実施形態では、ヘミマーは、例えば、相補的ホール変異またはノブ変異を含む第２のヘミマーまたは半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ変異またはホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、以下でさらに論じられる。
【００８４】
「二重特異性抗体」は、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体である。二重特異性抗体は、本明細書において、「二重特異性」を有するもの、または「二重特異性」であるとも称される。別途示されない限り、二重特異性抗体によって結合される抗原が二重特異性抗体名で列記される順序は無作為である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び任意に重鎖定常領域の少なくとも一部分、ならびに単一の軽鎖可変領域及び任意に軽鎖定常領域の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、１つよりも多くの単一の重鎖可変領域を含まず、１つよりも多くの単一の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、第１の半抗体は、第１の抗原に結合し、第２の抗原には結合せず、第２の半抗体は、第２の抗原に結合し、第１の抗原には結合しない。
【００８５】
本明細書で使用される「ノブ・イントゥ・ホール」または「ＫｎＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面で一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによって、インビトロまたはインビボで一緒に対合することを誘導する技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１−７８８を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＫｎＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖を一緒に対合することが駆動される。例えば、Ｆｃ領域内にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一の可変ドメインをさらに含み得るか、または同様のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含み得る。ＫｎＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメインを一緒に、または異なる標的認識配列（例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、及び他のＦｃ融合物を含む）を含む任意の他のポリペプチド配列を対合することもできる。
【００８６】
本明細書で使用される「ノブ変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で隆起（ノブ）をポリペプチドに導入する変異を指す。いくつかの実施形態では、他方のポリペプチドは、ホール変異を有する（例えば、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，７３１，１６８、ＵＳ５，８０７，７０６、ＵＳ５，８２１，３３３、ＵＳ７，６９５，９３６、ＵＳ８，２１６，８０５を参照のこと）。
【００８７】
本明細書で使用される「ホール変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で空洞（ホール）をポリペプチドに導入する変異を指す。いくつかの実施形態では、他方のポリペプチドは、ノブ変異を有する（例えば、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，７３１，１６８、ＵＳ５，８０７，７０６、ＵＳ５，８２１，３３３、ＵＳ７，６９５，９３６、ＵＳ８，２１６，８０５を参照のこと）。
【００８８】
「直鎖状抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，８（１０）：１０５７−１０６２）に記載の抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【００８９】
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者によって決定されるそれぞれの値の許容できる誤差範囲を指し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での１実施当たり１つまたは１つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含み、それを説明する。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００９０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、任意に、２つ以上のかかる化合物の組み合わせを含むといった具合である。
【００９１】
本明細書に記載の本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００９２】
ＩＩ．タンパク質製剤及び調製
本明細書における本発明は、タンパク質及びＮ−アセチル−トリプトファン（ＮＡＴ）を含む製剤（例えば、液体製剤）に関し、ＮＡＴは、タンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及び／またはチロシンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、約８０Å２を超える。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、約３０％を超える。ＳＡＳＡは、Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．１１１（５２）：１８６０１−１８６０６，２０１４に記載のコンピュータによる全原子分子動力学（ＭＤ）シミュレーション法等の当該技術分野で既知の任意の方法を使用して計算され得る。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約４．０〜約８．５のｐＨ範囲で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約５℃〜約４０℃の範囲の温度で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約０ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲の塩濃度で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約５．０〜約７．５のｐＨ、約５℃〜約２５℃の温度、及び約０ｍＭ〜約２００ｍＭの塩濃度で測定される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、液体製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、水性製剤である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴは、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴは、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。さらなる一実施形態では、反応性酸素種は、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、アルコキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、三酸化二水素（Ｈ２Ｏ３）、ヒドロトリオキシラジカル（ＨＯ３・）、オゾン（Ｏ３）、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群から選択される。例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ部分内のトリプトファンアミノ酸及び／またはモノクローナル抗体のＦｃ部分内のメチオニンアミノ酸は、酸化感受性であり得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。製剤中の例示のタンパク質濃度としては、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ超、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。さらなる一実施形態では、ＮＡＴは、抗体のＦａｂ部分内の１つ以上のアミノ酸の酸化を防止する。別のさらなる実施形態では、ＮＡＴは、抗体のＦｃ部分内の１つ以上のアミノ酸の酸化を防止する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、製剤は、水性である。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。例えば、本発明の製剤は、モノクローナル抗体、タンパク質の酸化を防止する本明細書に提供されるＮＡＴ、及び製剤のｐＨを望ましいレベルに維持する緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製剤は、約４．５〜約９．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、ｐＨは、ｐＨ４．０〜８．５の範囲、ｐＨ４．０〜８．０の範囲、ｐＨ４．０〜７．５の範囲、ｐＨ４．０〜７．０の範囲、ｐＨ４．０〜６．５の範囲、ｐＨ４．０〜６．０の範囲、ｐＨ４．０〜５．５の範囲、ｐＨ４．０〜５．０の範囲、ｐＨ４．０〜４．５の範囲、ｐＨ４．５〜９．０の範囲、ｐＨ５．０〜９．０の範囲、ｐＨ５．５〜９．０の範囲、ｐＨ６．０〜９．０の範囲、ｐＨ６．５〜９．０の範囲、ｐＨ７．０〜９．０の範囲、ｐＨ７．５〜９．０の範囲、ｐＨ８．０〜９．０の範囲、ｐＨ８．５〜９．０の範囲、ｐＨ５．７〜６．８の範囲、ｐＨ５．８〜６．５の範囲、ｐＨ５．９〜６．５の範囲、ｐＨ６．０〜６．５の範囲、またはｐＨ６．２〜６．５の範囲である。本発明のある特定の実施形態では、製剤は、６．２または約６．２のｐＨを有する。本発明のある特定の実施形態では、製剤は、６．０または約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。本明細書で使用される場合、治療または投与目的のための「対象」または「個体」とは、哺乳動物、例えば、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等に分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００９８】
製剤中のタンパク質及び抗体は、当該技術分野で既知の方法を使用して調製され得る。製剤中の抗体（例えば、完全長抗体、抗体断片、及び多重特異性抗体）は、当該技術分野で利用可能な技法を使用して調製され得、これらの非限定的な例示の方法は、以下の節でより詳細に説明される。本明細書における方法は、ペプチド系阻害剤等の他のタンパク質を含む製剤の調製のための当業者によって適合され得る。概して十分に理解されており、かつ一般的に用いられている技法、ならびに治療用タンパク質の産生のための手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２００２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，（Ｈｏｒｓｗｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，１９８８）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０１０）を参照されたく、これらは全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、上述の製剤（例えば、液体製剤）のうちのいずれかに従って、製剤は、２つ以上のタンパク質を含む（例えば、形成（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、２つ以上のタンパク質の共製剤である）。例えば、いくつかの実施形態では、製剤は、２つ以上のタンパク質及びＮ−アセチル−トリプトファン（ＮＡＴ）を含む共製剤であり、ＮＡＴは、２つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つの酸化を防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、２つ以上のタンパク質のうちの複数の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、２つ以上のタンパク質の各々の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つは、ａ）約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有するか、ｂ）約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有するか、またはｃ）ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質のうちの複数は、ａ）約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有するか、ｂ）約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有するか、またはｃ）ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質の各々は、ａ）約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有するか、ｂ）約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有するか、またはｃ）ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つは、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質のうちの複数は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片から独立して選択された抗体である。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質の各々は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片から独立して選択された抗体である。いくつかの実施形態では、製剤の１つ以上の抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、液体製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、水性製剤である。
【０１００】
Ａ．抗体の調製
本明細書に提供される液体製剤中の抗体は、目的とする抗原に対して指向される。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与により、その哺乳動物に治療的利益がもたらされ得る。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対して指向される抗体も企図される。
【０１０１】
抗原がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子（例えば、受容体）または成長因子等のリガンドであり得る。例示の抗原としては、分子、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ＣＤ２０；ｏｘ−ＬＤＬ；ｏｘ−ＡｐｏＢ１００；レニン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子受容体、例えば、死受容体５及びＣＤ１２０；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；ホルモンまたは成長因子受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、もしくはニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、及びインターフェロン−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分等；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体；ならびに上述のポリペプチドのうちのいずれかの断片が挙げられる。
【０１０２】
（ｉ）抗原の調製
他の分子に任意にコンジュゲートされる可溶性抗原またはその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体等の膜貫通分子の場合、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。かかる細胞は、天然源（例えば、癌細胞株）に由来し得るか、または膜貫通分子を発現するように組換え技法によって形質転換された細胞であり得る。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。
【０１０３】
（ｉｉ）ある特定の抗体に基づく方法
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物に産生される。二官能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートすることが有用であり得る。
【０１０４】
動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を３体積のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、複数の部位で溶液を皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、動物は、複数の部位での皮下注射により、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５〜１／１０で追加免疫される。７〜１４日後、動物が採血され、血清が抗体力価についてアッセイされる。動物は、力価が水平状態になるまで追加免疫される。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質にコンジュゲートされた抗原及び／または異なる架橋試薬によりコンジュゲートされた抗原で追加免疫される。コンジュゲートは、タンパク質融合物として組換え細胞培養中でも作製され得る。また、ミョウバン等の凝集剤が、免疫応答を増強するために好適に使用される。
【０１０５】
目的とするモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に説明され、例えば、Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、及びヒト−ヒトハイブリドーマに関するＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）にさらに説明されるハイブリドーマ法を使用して作製され得る。さらなる方法としては、例えば、ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の産生に関する米国特許第７，１８９，８２６号に記載の方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０１０６】
様々な他のハイブリドーマ技法については、例えば、ＵＳ２００６／２５８８４１、ＵＳ２００６／１８３８８７（完全ヒト抗体）、ＵＳ２００６／０５９５７５、ＵＳ２００５／２８７１４９、ＵＳ２００５／１００５４６、ＵＳ２００５／０２６２２９、ならびに米国特許第７，０７８，４９２号及び同第７，１５３，５０７号を参照されたい。ハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を産生するための例示のプロトコルが以下に記載される。一実施形態では、マウスまたはハムスター等の他の適切な宿主動物は、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、またはその抗体を産生することができるリンパ球を誘発するように免疫化される。抗体は、目的とするポリペプチドまたはその断片、及びアジュバント、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／トレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）の複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物に産生される。目的とするポリペプチド（例えば、抗原）またはその断片は、組換え方法等の当該技術分野で周知の方法を使用して調製され得、これらの方法のうちのいくつかは、本明細書にさらに記載される。免疫化された動物由来の血清が抗抗原抗体についてアッセイされ、ブースター免疫化が任意に投与される。抗抗原抗体を産生する動物由来のリンパ球が単離される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化される。
【０１０７】
その後、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞に融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を参照されたい。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、かつＨＡＴ培地等の培地に感受性を示す骨髄腫細胞が使用され得る。例示の骨髄腫細胞としては、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するマウス骨髄腫株、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生についても説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１０８】
そのように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、好適な培養培地、例えば、融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。好ましくは、例えば、Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４（３），１０５−１０８（２００６）に記載されるように、ウシ胎仔血清等の動物由来の血清の使用を低減するために、無血清ハイブリドーマ細胞培養法が使用される。
【０１０９】
ハイブリドーマ細胞培養の生産性を改善するためのツールとしてのオリゴペプチドは、Ｆｒａｎｅｋ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１１−１２２（２００５）に記載されている。具体的には、標準の培養培地は、ある特定のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）、またはタンパク質加水分解物画分で富化され、アポトーシスが３〜６つのアミノ酸残基から構成される合成オリゴペプチドによって著しく抑制され得る。これらのペプチドは、ミリモル濃度またはより高い濃度で存在する。
【０１１０】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、本明細書に記載の抗体に結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析によって決定され得る。例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）を参照されたい。
【０１１１】
所望の特異性、親和性、及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、標準の方法によって成長し得る。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ（上記参照）を参照されたい。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。タンパク質をハイブリドーマ細胞から単離する１つの手順が、ＵＳ２００５／１７６１２２及び米国特許第６，９１９，４３６号に記載されている。この方法は、結合過程で離液性塩等の最小限の塩を使用することを含み、好ましくは、溶出過程で少量の有機溶媒を使用することも含む。
【０１１２】
（ｉｉｉ）ある特定のライブラリスクリーニング方法
本明細書に記載の製剤及び組成物中の抗体は、コンビナトリアルライブラリを使用して、所望の活性または活性を有する抗体についてスクリーニングすることによって作製され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で既知である。かかる方法は、概して、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ´Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００１）に記載されている。例えば、目的とする抗体を生成する１つの方法は、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載されるように、ファージ抗体ライブラリの使用による方法である。
【０１１３】
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片をディスプレイするファージを含むファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。かかるファージライブラリは、所望の抗原に対する親和性クロマトグラフィーによってパニングされる。所望の抗原に結合することができるＦｖ断片を発現するクローンは、抗原に吸着し、それ故に、ライブラリ内の非結合クローンから分離される。その後、結合クローンは、抗原から溶出し、追加の抗原吸着／溶出サイクルによってさらに富化され得る。これらの抗体のうちのいずれも、目的とするファージクローンを選択するのに好適な抗原スクリーニング手順を設計し、続いて、目的とするファージクローン由来のＦｖ配列、及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載の好適な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して完全長抗体クローンを構築することによって得られ得る。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合ドメインは、約１１０個のアミノ酸を有する２つの可変（Ｖ）領域から形成され、各々が軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖由来であり、両方が３つの超可変ループ（ＨＶＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、ＶＨ及びＶＬが短い柔軟性ペプチドを介して共有結合される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはそれらが各々定常ドメインに融合して非共有結合的に相互作用するＦａｂ断片としてのいずれかで、ファージ上に機能的にディスプレイされ得る。本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは、集合的に「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称される。
【０１１５】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ内でランダムに組換えられ得、その後、これは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合クローンについて検索され得る。免疫化源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、高親和性抗体を免疫原に提供する。あるいは、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるように、クローニングされて、いずれの免疫化も伴うことなく、単一のヒト抗体源を広範囲の非自己抗原及び自己抗原に提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞由来の再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、かつランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによっても合成的に作製されて、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配置を達成することができる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって抗体断片をディスプレイするために、線維状ファージが使用される。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されるように、ＶＨ及びＶＬドメインが柔軟性ポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上で接続される一本鎖Ｆｖ断片として、または、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）に記載されるように、一方の鎖がｐＩＩＩに融合し、他方の鎖が細菌宿主細胞ペリプラズムに分泌され、このペリプラズムにおいて、Ｆａｂコートタンパク質構造のアセンブリが野生型コートタンパク質のうちのいくつかをディスプレイすることによってファージ表面上にディスプレイされるようになるＦａｂ断片としてディスプレイされ得る。
【０１１７】
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から収集される免疫細胞から得られる。抗抗原クローンに好意的にバイアスされたライブラリが所望される場合、対象は、抗原で免疫化されて抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／または循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、ライブラリ構築のために回収される。一実施形態では、抗抗原クローンに好意的にバイアスされたヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、抗原免疫化により抗原に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを持つ（かつ機能的内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスに抗抗原抗体応答を生じさせることによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの生成は、以下に記載されている。
【０１１８】
抗抗原反応性細胞集団のさらなる富化は、抗原特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞の単離に好適なスクリーニング手順を使用することによって、例えば、抗原親和性クロマトグラフィー、または細胞の蛍光色素標識抗原への吸着、続いて、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した細胞分離によって得られ得る。
【０１１９】
あるいは、免疫化されていないドナー由来の脾臓細胞及び／またはＢ細胞または他のＰＢＬの使用により、可能な抗体レパートリーのより良好な表示が提供され、抗原が抗原性ではない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用した抗体ライブラリの構築も可能になる。インビトロ抗体遺伝子構築を組み込むライブラリの場合、幹細胞が対象から収集されて、再配置されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。目的とする免疫細胞は、様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得られ得る。
【０１２０】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸は、目的とする細胞から回収され、増幅される。再配置されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載されるように、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをリンパ球から単離し、続いて、再配置されたＶＨ及びＶＬ遺伝子の５´末端及び３´末端と一致するプライマーでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、それにより、発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することによって得られ得る。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）及びＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）に記載されるように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５´末端のバックプライマー、及びＪ−セグメント内にあるフォワードプライマーを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅され得る。しかしながら、ｃＤＮＡから増幅するために、バックプライマーは、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：８８−８９（１９９１）に記載されるように、リーダーエクソン内にあり、フォワードプライマーは、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：５７２８−５７３２（１９８９）に記載されるように、定常領域内にあってもよい。相補性を最大限に生かすために、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）またはＳａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載されるように、縮重がプライマーに組み込まれ得る。ある特定の実施形態では、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）の方法に記載されるように、またはＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４４９１−４４９８（１９９３）の方法に記載されるように、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能なＶＨ及びＶＬ再配置を増幅するために、ライブラリ多様性が各Ｖ遺伝子ファミリーを標的とするＰＣＲプライマーを使用することによって最大化される。増幅されたＤＮＡの発現ベクターへのクローニングの場合、希少制限部位が、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載されるように、一方の端におけるタグとして、または、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるように、タグ付けされたプライマーでのさらなるＰＣＲ増幅によってＰＣＲプライマー内に導入され得る。
【０１２１】
合成的に再配置されたＶ遺伝子のレパートリーは、インビトロでＶ遺伝子セグメントから誘導され得る。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大半は、クローニング及び配列決定され（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８（１９９２）で報告されている）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３：８８−９４（１９９３）で報告されている）、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主な立体配座を含む）を使用して、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーで多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成することができる。ＶＨレパートリーは、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）に記載されるように、単一の長さの長いＨ３ループに集中する全ての配列多様性で作製することもできる。ヒトＶκ及びＶλセグメントは、クローニング及び配列決定されており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４５６−１４６１（１９９３））、それらを使用して、合成軽鎖レパートリーを作製することができる。合成Ｖ遺伝子レパートリーは、ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲ならびにＬ３及びＨ３の長さに基づいて、かなりの構造多様性を有する抗体をコードする。Ｖ遺伝子コードＤＮＡの増幅後、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントが、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）の方法に従ってインビトロで再配置され得る。
【０１２２】
抗体断片のレパートリーは、いくつかの方法でＶＨ遺伝子レパートリー及びＶＬ遺伝子レパートリーを一緒に組み合わせることによって構築され得る。各レパートリーは、異なるベクターで作製され得、これらのベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２８：１１９−１２６（１９９３）に記載されるように、インビトロで組換えられ得るか、またはコンビナトリアル感染、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載のｌｏｘＰ系によりインビボで組換えられ得る。インビボ組換えアプローチは、Ｆａｂ断片の二本鎖性質を利用して、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換効率によって課せられるライブラリサイズの制限を打開する。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーは、一方がファージミドに、他方がファージベクターに別個にクローニングされる。その後、これらの２つのライブラリは、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられ、これにより、各細胞が異なる組み合わせを含むようになり、ライブラリサイズが存在する細胞の数（約１０１２個のクローン）のみによって制限されるようになる。これらのベクターはいずれもインビボ組換えシグナルを含み、これにより、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンに組換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされるようになる。これらの巨大なライブラリは、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ−１）を有する多数の多様な抗体を提供する。
【０１２３】
あるいは、これらのレパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように、同じベクターに連続してクローニングされ得るか、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるように、ＰＣＲによって一緒にアセンブリされ、その後にクローニングされ得る。ＰＣＲアセンブリを使用して、ＶＨ及びＶＬ  ＤＮＡを、柔軟性ペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと連結して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することもできる。なお別の技法では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：３８３１−３８３７（１９９２）に記載されるように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子組み合わせ、その後、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングするために、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」が使用される。
【０１２４】
ナイーブライブラリ（天然または合成のいずれか）によって産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）を有するものであり得るが、親和性成熟は、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）（上記参照）に記載されるように、二次ライブラリを構築し、かつそれから再選択することによってインビトロで模倣され得る。例えば、変異は、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）の方法、またはＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）の方法において、エラープローンポリメラーゼを使用してインビトロでランダムに導入され得る（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５（１９８９）に報告されている）。加えて、親和性成熟は、選択された個別のＦｖクローンにおいて、１つ以上のＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、目的とするＣＤＲに及ぶランダム配列を持つプライマーでのＰＣＲを使用し、より高い親和性のクローンについてスクリーニングすることによって行われ得る。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域における変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するための方法について説明している。別の有効なアプローチは、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるように、免疫化されていないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異形のレパートリーを用いてファージディスプレイによって選択されたＶＨまたはＶＬドメインを組換え、いくつかの鎖リシャッフリングラウンドでより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技法により、約１０−９Ｍ以下の親和性を有する抗体及び抗体断片の産生が可能になる。
【０１２５】
ライブラリのスクリーニングは、当該技術分野で既知の様々な技法によって達成され得る。例えば、抗原は、吸着プレートに付着した宿主細胞で発現された吸着プレートのウェルを被覆するために使用され得るか、または細胞選別で使用され得るか、またはストレプトアビジン被覆ビーズで捕捉するためにビオチンにコンジュゲートされ得るか、またはファージディスプレイライブラリをパニングするための任意の他の方法で使用され得る。
【０１２６】
ファージライブラリ試料は、吸着剤を用いてファージ粒子の少なくとも一部分への結合に好適な条件下で固定化抗原と接触する。通常、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件は、生理学的条件を模倣するように選択される。固相に結合したファージは、洗浄され、その後、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように、酸によって、または、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されるように、アルカリによって、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）の抗原競合方法と同様の手順で、抗原競合によって溶出する。ファージは、単一の選択ラウンドで２０〜１，０００倍富化され得る。さらに、富化されたファージは、細菌培養中で成長し、さらなる選択ラウンドに供され得る。
【０１２７】
選択の効率は、洗浄中の解離速度、及び単一のファージ上の複数の抗体断片が抗原と同時に会合し得るかを含む多くの要因に依存する。速い解離速度（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短時間の洗浄、多価ファージディスプレイ、及び固相中の抗原の高被覆密度の使用によって保持され得る。高密度は、多価相互作用によりファージを安定させるのみならず、解離したファージの再結合にも有利に働く。遅い解離速度（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０に記載されるように、長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイの使用、ならびにＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるように、抗原の低被覆密度の使用によって促進され得る。
【０１２８】
わずかに異なる親和性しか有しなくとも、抗原に対して異なる親和性を有するファージ抗体間での選択が可能である。しかしながら、選択された抗体のランダム変異（例えば、いくつかの親和性成熟技法で行われる）により、大半が抗原に結合し、数個のみより高い親和性を有する多くの変異体が生み出される可能性がある。抗原を制限することにより、希少高親和性ファージが競合排除され得る。全てのより高い親和性の変異体を保持するために、ファージは、抗原に対して一定の標的モル親和性よりも低いモル濃度のビオチン化抗原ではなく、過剰ビオチン化抗原とインキュベートされ得る。その後、高親和性結合ファージは、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズによって捕捉され得る。かかる「平衡捕捉」により、わずか２倍高い親和性を有する変異体クローンのより低い親和性を有するかなりの過剰なファージからの単離を可能にする感度で、抗体がそれらの結合親和性に従って選択されることが可能になる。解離速度に基づいて区別するために、固相に結合したファージを洗浄する際に使用される条件を操作することもできる。
【０１２９】
抗抗原クローンは、活性に基づいて選択され得る。ある特定の実施形態では、本発明は、抗原を自然に発現する生細胞に結合するか、または浮遊抗原もしくは他の細胞構造に付着した抗原に結合する抗抗原抗体を提供する。かかる抗抗原抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上述のように抗抗原クローンをファージライブラリから単離し、任意に、ファージクローンの単離集団を、その集団を好適な細菌宿主で成長させることによって増幅すること、（２）それぞれ、遮断及び非遮断活性が所望される抗原及び第２のタンパク質を選択すること、（３）抗抗原ファージクローンを固定化抗原に吸着させること、（４）過剰な第２のタンパク質を使用して、第２のタンパク質の結合決定基と重複するか、またはそれと共有される抗原結合決定基を認識するいずれの望ましくないクローンも溶出すること、及び（５）ステップ（４）後に吸着したまま留まっているクローンを溶出することによって選択され得る。任意に、所望の遮断／非遮断特性を有するクローンは、本明細書に記載の選択手順を１回以上繰り返すことによってさらに富化され得る。
【０１３０】
ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体またはファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から目的とする重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって）容易に単離及び配列決定される。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター内に置かれ、その後、それらは、免疫グロブリンタンパク質を別様に産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞における所望のモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体コードＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６  （１９９３）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ，１３０：１５１（１９９２）が挙げられる。
【０１３１】
ＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／または軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列がＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）から得られ得る）と組み合わせられて、完全長または部分長重鎖及び／または軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得、かかる定常領域が任意のヒトまたは動物種から得られ得ることが理解される。ある動物（ヒト等）種の可変ドメインＤＮＡから誘導され、その後、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合して、「ハイブリッド」完全長重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成するＦｖクローンは、本明細書で使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある特定の実施形態では、ヒト可変ＤＮＡから誘導されたＦｖクローンは、ヒト定常領域ＤＮＡに融合して、完全長または部分長ヒト重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成する。
【０１３２】
ハイブリドーマに由来する抗抗原抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローンに由来する相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによっても修飾され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）の方法にあるように）。ハイブリドーマまたはＦｖクローン由来の抗体または断片をコードするＤＮＡは、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによってさらに修飾され得る。この様式で、Ｆｖクローンまたはハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１３３】
（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と称され、これらは、典型的には、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び同僚（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって行われる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体における類似の部位由来の残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１３４】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖のいずれも、抗原性を低減させるのに非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。その後、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１３５】
抗体が抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、本方法の一実施形態によれば、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析過程によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、標的抗原（複数可）に対する親和性の増加等の所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基がレシピエント及び移入配列から選択され、組み合わせられ得る。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接かつ最も実質的に関与する。
【０１３６】
本明細書に記載の製剤及び組成物中のヒト抗体は、上述のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築され得る。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって説明されている。
【０１３７】
内因性免疫グロブリン産生の不在下で免疫化時にヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが説明されている。かかる生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入により、抗原曝露時にヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）、及びＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）を参照されたい。
【０１３８】
遺伝子シャッフリングを使用して、ヒト抗体を非ヒト抗体、例えば、齧歯類抗体から誘導することもでき、ヒト抗体は、出発非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従って、本明細書に記載のファージディスプレイ技法によって得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかが、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラ集団を作り出す。抗原を用いた選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離がもたらされ、そこで、ヒト鎖が一次ファージディスプレイクローンにおける対応する非ヒト鎖の除去時に破壊された抗原結合部位を復元する、すなわち、エピトープがヒト鎖パートナーの選択を管理する（インプリントする）。残りの非ヒト鎖を置き換えるためにこのプロセスが繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３を参照のこと）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を有しない完全なヒト抗体を提供する。
【０１３９】
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化等の伝統的な手段または組換え技法によって生成され得る。ある特定の状況では、全抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片により、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４を参照されたい。
【０１４０】
抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体断片が全て、Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌され得るため、これらの断片の容易な大量産生が可能になる。抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ´−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、化学的にカップリングされて、Ｆ（ａｂ´）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ´）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離され得る。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ´）２断片が、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を産生するための他の技法は、当業者に明らかであろう。ある特定の実施形態では、抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、それ故に、それらは、インビボでの使用中の非特異的結合の低減に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質が構築されて、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでのエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（上記参照）を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、例えば、「直鎖状抗体」でもあり得る。かかる直鎖状抗体は、単一特異性または二重特異性であり得る。
【０１４１】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、これらのエピトープは、通常、異なる抗原由来である。かかる分子が通常２つの異なるエピトープのみに結合する（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）一方で、三重特異性抗体等の追加の特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合、この表現によって包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る（例えば、Ｆ（ａｂ´）２二重特異性抗体）。
【０１４２】
二重特異性抗体を作製するための方法が当該技術分野で既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の可能性のある混合物を産生し、それらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常親和性クロマトグラフィーステップによって行われる正しい分子の精製はやや厄介であり、生成物収率は低い。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に記載されている。
【０１４３】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合物のうちの少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが典型的である。免疫グロブリン重鎖融合物と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不等比が最適収率を提供する実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合の調整時に高い柔軟性が提供される。しかしながら、等比での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高収率がもたらされる場合、またはそれらの比率が特に重要ではない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１４４】
このアプローチの一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とからなる。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在により容易な分離法が提供されるため、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物の望ましくない免疫グロブリン鎖組み合わせからの分離を促進することが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１４５】
ＷＯ９６／２７０１１に記載の別のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように操作され得る。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一または同様のサイズの補償「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって第２の抗体分子の界面上に作り出される。これにより、ホモ二量体等の他の望ましくない最終生成物よりもヘテロ二量体の収率を増加させるための機構が提供される。
【０１４６】
二重特異性抗体としては、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方がアビジンにカップリングし、他方がビオチンにカップリングし得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞の望ましくない細胞への標的（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製され得る。好適な架橋際が当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１４７】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法もこの文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断されてＦ（ａｂ´）２断片を生成する手順について記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、隣接するジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。その後、生成されたＦａｂ´断片は、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。その後、Ｆａｂ´−ＴＮＢ誘導体の一方がメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ´−チオールに再変換され、等モル量の他方のＦａｂ´−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用され得る。
【０１４８】
近年の進歩により、化学的にカップリングされて二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ´−ＳＨ断片のＥ．ｃｏｌｉからの直接回収が容易になった。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ´）２分子の産生について記載している。各Ｆａｂ´断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから別個に分泌され、インビトロで直接化学的カップリングに供されて、二重特異性抗体を形成した。
【０１４９】
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養から直接作製及び単離するための様々な技法についても記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ´部分に結合した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載される「ダイアボディ」技術により、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構が提供されている。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用して二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１５０】
２より多くの原子価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｆｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１５１】
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む単一のポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照のこと）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部からなる。
【０１５２】
（ｖｉｉｉ）抗体変異形
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異形は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われて、最終構築に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特性を有することを条件とする。主題の抗体アミノ酸配列が作製された時点で、アミノ酸改変がその配列に導入されてもよい。
【０１５３】
（ｉｘ）抗体誘導体
本発明の製剤及び組成物中の抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾され得る。ある特定の実施形態では、抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、１つよりも多くのポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下である療法に使用されるか等を含むが、これらに限定されない考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
【０１５４】
（ｘ）ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
抗体は、組換え方法を使用して産生することもできる。抗抗原抗体の組換え産生について、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
（ａ）シグナル配列成分
本明細書に記載の製剤及び組成物中の抗体は、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に産生され得、これは、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識もプロセシングもしない原核宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  α−因子リーダーを含む）、もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルによって置換され得る。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１５６】
（ｂ）複製起点
発現ベクターもクローニングベクターもいずれも、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。かかる配列は、様々な細菌、酵母、及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が大半のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド由来の複製起点が酵母に好適であり、様々なウイルス複製起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）が哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０起点は、典型的には、初期プロモーターを含むという理由だけで使用され得る）。
【０１５７】
（ｃ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも命名される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質、例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子をコードする。
【０１５８】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生し、それ故に選択レジメンに耐え抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
【０１５９】
哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、抗体コード核酸、例えば、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等を取り込むための細胞成分の特定を可能にするものである。
【０１６０】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することによって特定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。内因性ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）が使用され得る。
【０１６１】
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳ阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することによって特定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅系が、上述のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用され得る。
【０１６２】
あるいは、目的とする抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及び別の選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド３´−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換または共形質転換された宿主細胞（具体的には、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８用の選択剤を含有する培地中で成長した細胞によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０１６３】
酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異菌株に対する選択マーカー、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１を提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。その後、酵母宿主細胞ゲノム中でのｔｒｐ１病変の存在により、トリプトファンの不在下での成長による形質転換の検出に有効な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２が欠損した酵母菌株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を持つ既知のプラスミドによって補完される。
【０１６４】
加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターが、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用され得る。あるいは、組換え仔牛キモシンの大規模産生のための発現系として、Ｋ．ｌａｃｔｉｓが報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定した多コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０１６５】
（ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、一般に、宿主生物によって認識され、かつ抗体をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。原核宿主との使用に好適なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用されるプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに動作可能に連結されるシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含む。
【０１６６】
真核生物のためのプロモーター配列が既知である。事実上全ての真核遺伝子が、転写が開始する部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３´末端は、コード配列の３´末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て、真核発現ベクターに好適に挿入される。
【０１６７】
酵母宿主との使用に好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。
【０１６８】
成長条件によって制御された転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に好適なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０１６９】
哺乳類宿主細胞中のベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、または異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され得るが、但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０１７０】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。
【０１７１】
（ｅ）エンハンサー要素成分
より高次の真核生物による抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在既知である。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のための増強要素について、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列の５´位または３´位でベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから５´部位に位置する。
【０１７２】
（ｆ）転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。かかる配列は、一般に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５´非翻訳領域、時折、３´非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示される発現ベクターを参照されたい。
【０１７３】
（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター中のＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、またはより高次の真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物等の真正細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ等のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等のＢａｃｉｌｌｉ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）等の他の菌株も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。
【０１７４】
完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、例えば、治療用抗体が単独で腫瘍細胞破壊に効果を示す細胞毒性薬（例えば、毒素）にコンジュゲートされる場合に、細菌中で産生され得る。完全長抗体は、血液循環におけるより優れた半減期を有する。Ｅ．ｃｏｌｉでの産生がより迅速であり、より費用効率が高い。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．）、米国特許第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）（発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列について記載する）を参照されたい。Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され得、例えば、アイソタイプに応じてタンパク質ＡまたはＧカラムにより精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行われ得る。
【０１７５】
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母等の真核微生物が、抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、より低次の真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ等；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状真菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒ等のいくつかの他の属、種、及び菌株が本明細書において一般的に利用可能であり、有用である。治療用タンパク質の産生のための酵母及び糸状真菌の使用について論じている概説については、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）を参照されたい。
【０１７６】
グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらすある特定の真菌及び酵母菌株が選択され得る。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるグリコシル化経路のヒト化について記載）、及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）を参照されたい。
【０１７７】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス菌株及び変異形、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ等の宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス菌株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異型及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５菌株が公的に利用可能であり、かかるウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明による本明細書におけるウイルスとして使用され得る。
【０１７８】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ（Ｌｅｎｉｎａｃｅａｅ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物における抗体の産生のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載）を参照されたい。
【０１７９】
脊椎動物細胞は、宿主として使用され得、培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手順になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓株（懸濁培養中での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。他の有用な哺乳類宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、ならびにＮＳ０及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２５５−２６８を参照されたい。
【０１８０】
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なものとして修飾された従来の栄養培地中で培養される。
【０１８１】
（ｈ）宿主細胞の培養
抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ´ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の培地のうちのいずれも、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬等）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度及びｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前に使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１８２】
（ｘｉ）抗体の精製
組換え技法を使用するとき、抗体は、細胞内で産生され得るか、細胞膜周辺腔内で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、微粒子残屑（宿主細胞または溶解断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたって解凍される。細胞残屑は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、最初に濃縮される。タンパク質分解を阻害するためのＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を防止するための抗生物質が含まれてもよい。
【０１８３】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィーが典型的に好ましい精製ステップのうちの１つである。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。タンパク質Ｌは、カッパ軽鎖に基づいて抗体を精製するために使用され得る（Ｎｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６４（１）：３３−４０，１９９３）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、多くの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定したマトリックスにより、アガロースで達成され得るよりも速い流速及び短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿等のタンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１８４】
一般に、研究、試験、及び臨床で使用するための抗体を調製するための様々な方法論が当該技術分野で十分に確立されており、上述の方法論と一致しており、かつ／または当業者により目的とする特定の抗体に適切であるとみなされる。
【０１８５】
Ｂ．生物学的に活性な抗体の選択
上述のように産生された抗体は、治療的観点から有益な特性を有する抗体を選択するために、１つ以上の「生物学的活性」アッセイに供され得る。抗体は、それが産生される抗原に結合するその能力についてスクリーニングされ得る。例えば、抗ＤＲ５抗体（例えば、ドロジツマブ）の場合、抗体の抗原結合特性は、死受容体５（ＤＲ５）に結合する能力を検出するアッセイで評価され得る。
【０１８６】
別の実施形態では、抗体の親和性は、例えば、飽和結合、ＥＬＩＳＡ、及び／または競合アッセイ（例えばＲＩＡ）によって決定され得る。
【０１８７】
また、抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイに供され得る。かかるアッセイは、当該技術分野で既知であり、抗体の標的抗原及び意図される使用に依存する。
【０１８８】
目的とする抗原上の特定のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、通例のクロスブロッキングアッセイ、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載の日常的な交差遮断アッセイが行われ得る。あるいは、例えば、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されるエピトープマッピングを行って、抗体が目的とするエピトープに結合するかを決定することができる。
【０１８９】
Ｃ．製剤の調製
タンパク質及び液体製剤中のタンパク質の酸化を防止するＮＡＴを含む液体製剤を調製する方法が、本明細書に提供される。液体製剤は、所望の純度を有するタンパク質を、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止するＮＡＴと混合することによって調製され得る。ある特定の実施形態では、製剤化されるタンパク質は、事前凍結乾燥に供されておらず、本明細書における目的とする製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。ある特定の実施形態では、抗体は、完全長抗体である。一実施形態では、製剤中の抗体は、Ｆ（ａｂ´）２等の抗体断片であり、この場合、完全長抗体では起こり得ない問題（抗体のＦａｂへのクリッピング等）に対処しなければならない場合がある。製剤中に存在するタンパク質の治療有効量は、例えば、所望の用量体積及び投与様式（複数可）を考慮することによって決定される。製剤中の例示のタンパク質濃度としては、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ超、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約４５ｍｇ／ｍＬ〜約５５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸のうちの１つ以上は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約５０Å２〜約２５０Å２（例えば、のうちのいずれかを超える約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２を超える（これらの値間の任意の範囲を含む））溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有するトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、約８０Å２を超える。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有するトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、約３０％を超える。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約４．０〜約８．５のｐＨ範囲で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約５℃〜約４０℃の範囲の温度で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約０ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲の塩濃度で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約５．０〜約７．５のｐＨ、約５℃〜約２５℃の温���、及び約０ｍＭ〜約５００ｍＭの塩濃度で測定される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体のＦａｂ部分及び／またはＦｃ部分内で酸化感受性である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体のＦａｂ部分内のトリプトファンアミノ酸で酸化感受性である。さらなる一実施形態では、酸化感受性のトリプトファンアミノ酸は、抗体のＣＤＲ内にある。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体のＦｃ部分内のメチオニンアミノ酸で酸化感受性である。いくつかの実施形態では、液体製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかによる少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【０１９０】
本明細書における本発明によって提供される液体製剤は、タンパク質及び液体製剤中のタンパク質の酸化を防止するＮＡＴを含む。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴは、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ超の濃度、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。ある特定の実施形態では、製剤中のＮＡＴは、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約９ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約８ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約７ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約６ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．６ｍＭ〜約１．５ｍＭ、または約０．８ｍＭ〜約１．２５ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態では、製剤中のＮＡＴは、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、トリプトファン、メチオニン、チロシン、ヒスチジン、及び／またはシステインからなる群から選択されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中のトリプトファンの酸化を防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。さらなる一実施形態では、反応性酸素種は、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、アルコキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、三酸化二水素（Ｈ２Ｏ３）、ヒドロトリオキシラジカル（ＨＯ３・）、オゾン（Ｏ３）、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群から選択される。さらなる一実施形態では、ＮＡＴは、抗体のＦａｂ部分内の１つ以上のアミノ酸の酸化を防止する。別のさらなる実施形態では、ＮＡＴは、抗体のＦｃ部分内の１つ以上のアミノ酸の酸化を防止する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本明細書における本発明によって提供される液体製剤は、タンパク質及び液体製剤中のタンパク質の酸化を防止するＮＡＴを含み、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む）低減される。
【０１９２】
タンパク質における酸化の量は、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、またはトリプシンペプチドマッピングのうちの１つ以上を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質における酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、またはトリプシンペプチドマッピングのうちの１つ以上、及び以下の式を使用して、ある割合として決定される。
2019501920.tif 000003
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本明細書における本発明によって提供される液体製剤は、タンパク質及び液体製剤中のタンパク質の酸化を防止するＮＡＴを含み、タンパク質の約４０％以下〜約０％しか酸化されない。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む）しか酸化されない。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書における本発明によって提供される液体製剤は、タンパク質及び液体製剤中のタンパク質の酸化を防止するＮＡＴを含み、タンパク質中の少なくとも１つの酸化不安定なトリプトファンの酸化は、約４０％〜約１００％低減される。いくつかの実施形態では、酸化不安定なトリプトファンの酸化は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む）低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質中の酸化不安定なトリプトファン残基の各々の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書における本発明によって提供される液体製剤は、タンパク質及び液体製剤中のタンパク質の酸化を防止するＮＡＴを含み、タンパク質中の少なくとも１つの酸化不安定なトリプトファンの約４０％以下〜約０％しか酸化されない。いくつかの実施形態では、酸化不安定なトリプトファンの約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む）しか酸化されない。いくつかの実施形態では、タンパク質中の酸化不安定なトリプトファン残基の各々の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、液体製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。本発明の液体製剤は、ｐＨ緩衝溶液中で調製される。本発明の緩衝液は、約４．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、ｐＨは、ｐＨ４．０〜８．５の範囲、ｐＨ４．０〜８．０の範囲、ｐＨ４．０〜７．５の範囲、ｐＨ４．０〜７．０の範囲、ｐＨ４．０〜６．５の範囲、ｐＨ４．０〜６．０の範囲、ｐＨ４．０〜５．５の範囲、ｐＨ４．０〜５．０の範囲、ｐＨ４．０〜４．５の範囲、ｐＨ４．５〜９．０の範囲、ｐＨ５．０〜９．０の範囲、ｐＨ５．５〜９．０の範囲、ｐＨ６．０〜９．０の範囲、ｐＨ６．５〜９．０の範囲、ｐＨ７．０〜９．０の範囲、ｐＨ７．５〜９．０の範囲、ｐＨ８．０〜９．０の範囲、ｐＨ８．５〜９．０の範囲、ｐＨ５．７〜６．８の範囲、ｐＨ５．８〜６．５の範囲、ｐＨ５．９〜６．５の範囲、ｐＨ６．０〜６．５の範囲、またはｐＨ６．２〜６．５の範囲である。本発明のある特定の実施形態では、液体製剤は、６．２または約６．２のｐＨを有する。本発明のある特定の実施形態では、液体製剤は、６．０または約６．０のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲内で制御する緩衝液の例としては、有機及び無機酸ならびにそれらの塩が挙げられる。例えば、酢酸塩（例えば、酢酸ヒスチジン、酢酸アルギニン、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ヒスチジン、コハク酸アルギニン、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、リン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、及びそれらの組み合わせ。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約６００ｍＭであり得る。ある特定の実施形態では、製剤は、ヒスチジン緩衝液（例えば、約５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度）を含む。ヒスチジン緩衝液の例としては、塩化ヒスチジン、酢酸ヒスチジン、リン酸ヒスチジン、硫酸ヒスチジン、コハク酸ヒスチジン等が挙げられる。ある特定の実施形態では、製剤は、ヒスチジン及びアルギニン（例えば、塩化ヒスチジン−塩化アルギニン、酢酸ヒスチジン−酢酸アルギニン、リン酸ヒスチジン−リン酸アルギニン、硫酸ヒスチジン−硫酸アルギニン、コハク酸ヒスチジン−コハク酸アルギニン等）を含む。ある特定の実施形態では、製剤は、約５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のヒスチジンを含み、アルギニンは、５０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度である。一実施形態では、製剤は、酢酸ヒスチジン（例えば、約２０ｍＭ）−酢酸アルギニン（例えば、約１５０ｍＭ）を含む。ある特定の実施形態では、製剤は、コハク酸ヒスチジン（例えば、約２０ｍＭ）−コハク酸アルギニン（例えば、約１５０ｍＭ）を含む。ある特定の実施形態では、製剤中のヒスチジンは、約１０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約２５ｍＭである。さらなる実施形態では、製剤中のアルギニンは、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ（例えば、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、または約２００ｍＭ）である。
【０１９７】
本発明の液体製剤は、二糖（例えば、トレハロースまたはスクロース）等の糖をさらに含み得る。本明細書で使用される「糖」は、一般組成物（ＣＨ２Ｏ）ｎ及びその誘導体、例えば、単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元糖、非還元糖等を含む。本明細書における糖の例としては、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、デキストラン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、シリトール、ルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロース等が挙げられる。
【０１９８】
界面活性剤は、任意に、液体製剤に添加される。例示の界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０号）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８等）が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、それが製剤化抗体の凝集を低減させ、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最小限に抑え、かつ／または吸着を低減させるような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１重量／体積％〜約１．０重量／体積％超の量で製剤中に存在し得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、約０．００１重量／体積％〜約１．０重量／体積％、約０．００１重量／体積％〜約０．５重量／体積％、約０．００５重量／体積％〜約０．２重量／体積％、約０．０１重量／体積％〜約０．１重量／体積％、約０．０２重量／体積％〜約０．０６重量／体積％、または約０．０３重量／体積％〜約０．０５重量／体積％の量で製剤中に存在する。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、０．０４重量／体積％または約０．０４重量／体積％の量で製剤中に存在する。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、０．０２重量／体積％または約０．０２重量／体積％の量で製剤中に存在する。一実施形態では、製剤は、界面活性剤を含まない。
【０１９９】
一実施形態では、製剤は、上で定義された薬剤（例えば、抗体、緩衝液、糖、及び／または界面活性剤）を含み、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、及びベンゼトニウムＣｌ等の１つ以上の保存料を本質的に含まない。別の実施形態では、保存料が製剤中に含まれてもよく、具体的には、製剤は、複数回投与量製剤である。保存料の濃度は、約０．１％〜約２％、好ましくは、約０．５％〜約１％の範囲であり得る。１つ以上の他の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載のものが製剤中に含まれ得るが、但し、それらが製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさないことを条件とする。本明細書における例示の薬学的に許容される賦形剤は、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示のｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２００】
製剤は、金属イオンキレート剤をさらに含み得る。金属イオンキレート剤は、当業者に周知であり、これらとしては、アミノポリカルボキシレート、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＤＤＳ（ジコハク酸エチレンジアミン）、ＰＤＴＡ（１，３−プロピレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＡＤＡ（ベータ−アラニン二酢酸）、ＭＧＣＡ（メチルグリシン二酢酸）等が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。加えて、本明細書におけるいくつかの実施形態は、ホスホン酸塩／ホスホン酸キレート剤を含む。
【０２０１】
張性剤は、組成物中の液体の張性を調整または維持するために存在する。タンパク質及び抗体等の大きい荷電生体分子とともに使用される場合、張性剤は、それらがアミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間及び分子内相互作用の可能性を低減させ得るため、「安定剤」としての役割も果たし得る。張性剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１重量％〜２５重量％、またはより好ましくは、１重量％〜５重量％の量で存在し得る。好ましい張性剤としては、多価糖アルコール、好ましくは、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
【０２０２】
本明細書における製剤は、必要に応じて、治療される特定の適応症のための１つよりも多くのタンパク質もしくは小分子薬物、好ましくは、他のタンパク質に悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含み得る。例えば、抗体が抗ＤＲ５（例えば、ドロジツマブ）である場合、それは、別の薬剤（例えば、化学療法剤及び抗腫瘍剤）と組み合わせられ得る。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、製剤は、インビボ投与のためのものである。いくつかの実施形態では、製剤は、滅菌である。製剤は、滅菌濾過膜を通す濾過によって滅菌にされ得る。本明細書における治療製剤は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈注射用溶液袋またはバイアル内に置かれる。投与経路は、好適な様式での長期間にわたる単回または複数回ボーラスまたは注入、例えば、皮下注射もしくは注入、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、関節内、または硝子体内経路、局所投与、吸入、または持続放出もしくは徐放手段等の既知の認められている方法に従うものである。
【０２０４】
本発明の液体製剤は、保管時に安定し得る。いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質は、約０〜約５℃（例えば、約１、２、３、または４℃のうちのいずれか）での少なくとも約１２ヶ月間（例えば、少なくとも約１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６ヶ月間、またはそれ以上のうちのいずれか）の保管時に安定している。いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性が評価または測定される。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、安定性及び生物学的活性を評価することができる。いくつかの実施形態では、安定性は、保管後の液体製剤中のタンパク質の酸化によって測定される。安定性は、製剤化前後、ならびに保管後の製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、及び／または生物学的活性を評価することによって試験され得る。物理的及び／または安定性は、様々な異なる方法で、例えば、凝集体形成の評価によって（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、濁度を測定することによって、及び／または目視検査によって）、カチオン交換クロマトグラフィーまたはキャピラリーゾーン電気泳動を使用して電荷不均一性を評定することによって、アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析によって、質量分光分析によって、還元されたインタクトな抗体を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ペプチドマッピング（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ−Ｃ）分析によって、抗体の生物学的活性または抗原結合機能を評価することによって、質的及び／または量的に評価され得る。不安定性は、凝集、脱アミド（例えば、Ａｓｎ脱アミド）、酸化（例えば、Ｔｒｐ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン（複数可）、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化差異等をもたらし得る。いくつかの実施形態では、タンパク質における酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、またはトリプシンペプチドマッピングのうちの１つ以上を使用して決定される。いくつかの実施形態では、抗体における酸化は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、またはトリプシンペプチドマッピングのうちの１つ以上、及び以下の式を使用して、ある割合として決定される。
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【０２０５】
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌であるべきである。これは、製剤の調製前または調製後の滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０２０６】
液体製剤を作製する方法または液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する方法であって、タンパク質の酸化を防止する量のＮＡＴを液体製剤に添加することを含む、方法も、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、液体製剤は、抗体を含む。本明細書に提供されるタンパク質の酸化を防止するＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または本明細書に開示される量のいずれかである。いくつかの実施形態では、液体製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかによる少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【０２０７】
ＩＩＩ．トリプトファン酸化を予測する方法
本明細書における本発明は、液体製剤中のタンパク質の残基（トリプトファン等）の酸化に対する感受性を予測する方法も提供する。タンパク質配列情報を使用してコンピュータによる分子動力学（ＭＤ）シミュレーション（全原子ＭＤシミュレーション等）によって決定された分子記述子を使用して、酸化感受性の残基（トリプトファン残基等）を有するものとして液体製剤中のタンパク質を分類することができる。分子記述子の多様なアレイにわたって酸化感受性の残基を有するものとして液体製剤中のタンパク質を正確に予測または分類することができるコンピュータ学習アルゴリズム等のモデルを有することが望ましい。
【０２０８】
液体製剤中のタンパク質の残基（トリプトファン等）の酸化に対する感受性を予測するためのコンピュータ学習アルゴリズムを生成する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）ｉ）酸化ホットスポット残基の複数の分子記述子（例えば、隣接するアスパラギン酸側鎖酸素、側鎖ＳＡＳＡ、デルタ炭素ＳＡＳＡ、隣接する正電荷、骨格ＳＡＳＡ等）の値、及びｉｉ）酸化ホットスポット残基が酸化感受性であるか否かに関連する酸化ホットスポット残基を含むトレーニングセットを提供することと、ｂ）トレーニングセットを機械学習アルゴリズム（例えば、ランダム決定フォレスト）に適用し、それにより、機械学習アルゴリズムをトレーニングして酸化感受性を予測することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の試験残基の各々の複数の分子記述子を機械学習アルゴリズム（例えば、ランダム決定フォレスト）に適用することと、機械学習アルゴリズムの多数決を使用して、１つ以上の試験残基を酸化感受性であるか否かとして分類することと、を含む、複数の分子記述子の値を有する１つ以上の試験残基の酸化に対する感受性を予測するための機械学習アルゴリズム（例えば、ランダム決定フォレスト）を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、分子記述子は、コンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、ブートストラップ技法がランダム変数選択と組み合わせられて多重決定ツリーを成長させるランダム決定フォレストアルゴリズムである（Ｈｏ，Ｔ．Ｋ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ，１４−１６  Ａｕｇｕｓｔ  １９９５．ｐｐ．２７８−２８２、Ｈｏ，Ｔ．Ｋ．ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ．２０（８）８３２−８４４，１９９８）。これらの多重決定ツリーは、ツリーアンサンブルまたはランダム決定フォレストと称されることもある。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、少なくとも約２０個（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００個、またはそれ以上のうちのいずれか）の決定ツリー（本明細書において「推定器」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストにおける各ツリーの各枝での考慮のためにランダムに選択された変数（本明細書において「特徴量」とも称される）の数は、少なくとも約１（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストにおける各ツリーの各枝での考慮のためにランダムに選択された変数（本明細書において「ツリー深度」とも称される）の数は、約１〜約２０（例えば、約１〜１５、１〜１０、１〜５、５〜２０、５、１５、または５〜１０のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））である。変数には、ポリペプチド鎖内のアミノ酸残基の分子記述子が含まれる。いくつかの実施形態では、分子記述子は、コンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、分子記述子は、７Å以内の試験残基デルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内の試験残基デルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、試験残基側鎖角度、７Å以内の試験残基デルタ炭素の充填密度、試験残基骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内の試験残基デルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、観察プールが各ツリーの下位枝に分けられる最大回数は、少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、観察プールが各ツリーの下位枝に分けられる最大回数は、約２〜約３０（例えば、約２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、または５〜１０のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含���））である。試験残基の分子記述子についての情報は、ツリーアンサンブルに適用されて、試験残基が酸化感受性であるかの予測を得ることができる。予測は、アンサンブル中の全てのツリーの予測の多数決を採ることによって行われる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用して７Å以内の試験残基デルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数を決定するために、各分子シミュレーションの各フレームについて、試験残基の７Å以内のデルタ炭素の全ての原子が追跡され、これらの原子のうち、任意のアスパラギン酸残基の側鎖上の酸素原子である原子が計数され、最終値が、シミュレーションの持続時間にわたるこの計数の時間平均として計算される。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用して側鎖ＳＡＳＡを決定するために、各分子シミュレーションの各フレームについて、シミュレーションにおける各原子に中心がある球体の点が、各原子半径を水分子の半径と一緒に加えることによって生成され、隣接する球体の半径内にある全ての点が排除され、全ての残りの点間の面積が合計されてＳＡＳＡの値を生み出し、この記述子の最終値が、シミュレーションの持続時間にわたる試験残基側鎖原子の平均ＳＡＳＡまたはこの計算の標準偏差として計算される。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用してデルタ炭素ＳＡＳＡを決定するために、各シミュレーションの各フレームについて、試験残基デルタ炭素のＳＡＳＡが上述のようにコンピュータで計算され、この記述子の最終値が、シミュレーションの持続時間にわたる試験残基デルタ炭素の平均ＳＡＳＡまたはこの計算の標準偏差として計算される。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用して７Å以内の試験残基デルタ炭素の全正電荷を決定するために、各シミュレーションの各フレームについて、試験残基の７Å以内のデルタ炭素の荷電アミノ酸側鎖に関連する全ての原子が追跡され、これらの原子の全正電荷が一緒に加えられ、最終値が、シミュレーションの持続時間にわたるこの量の平均またはこの計算の標準偏差として計算される。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用して骨格ＳＡＳＡを決定するために、各分子シミュレーションの各フレームについて、試験残基の骨格窒素原子のＳＡＳＡが上述のようにコンピュータで計算され、この記述子の最終値が、シミュレーションの持続時間にわたる骨格窒素原子の平均ＳＡＳＡまたはこの計算の標準偏差として計算される。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用して試験残基側鎖角度を決定するために、試験残基側鎖のｃｈｉ１及びｃｈｉ２角度がシミュレーションによって追跡され、この記述子が、試験残基が酸化を最も予測する角度領域内で過ごす時間の割合として計算され、前記角度領域は、試験残基として同じアミノ酸の多くの異なる残基に対する多くの異なるシミュレーションを実行し、これらのシミュレーションにわたって全てのｃｈｉ１及びｃｈｉ２角度をグラフ化し、一般に発生する角度組み合わせをクラスタ化することによって決定される。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、７Å以内の試験残基デルタ炭素の充填密度は、試験残基デルタ炭素に中心がある半径７Å以内の球体のタンパク質原子の時間平均数としてＭＤシミュレーションを使用して計算される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、試験残基骨格角度は、シミュレーションの持続時間にわたる試験残基の骨格に関連する平均ｐｓｉ角度またはこの計算の標準偏差としてＭＤシミュレーションを使用して計算される。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用して擬似パイ軌道の占有体積を決定するために、試験残基の側鎖が、試験残基パイ軌道によって占有された空間に接近させるのに適切な高さを有する円柱の底として扱われ、シミュレーション中に円柱の体積内に含まれる全ての原子が追跡され、円柱の体積内に含まれる全てのタンパク質原子の全体積が、シミュレーションの各フレームについて計算され、最終値が、他のタンパク質原子によって占有された試験残基パイ軌道の時間平均体積として計算される。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用して骨格柔軟性を決定するために、試験残基の骨格窒素の二乗平均平方根変動が、各シミュレーションにわたって計算される。シミュレーションにおける各フレームが整列させられ、各窒素原子が移動した距離が各フレームについて計算され、各フレームのこの距離が二乗され、全てのフレームにわたるこの二乗された距離の平均が決定され、この記述子の最終値が、この二乗された距離の平均の平方根として計算される。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、ＭＤシミュレーションを使用して７Å以内の試験残基デルタ炭素の全負電荷を決定するために、各シミュレーションの各フレームについて、試験残基の７Å以内のデルタ炭素の荷電アミノ酸側鎖に関連する全ての原子が追跡され、これらの原子の全負電荷が一緒に加えられ、最終値が、シミュレーションの持続時間にわたるこの量の時間平均として計算される。
【０２２１】
例えば、いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の試験残基が酸化感受性であるかを予測するためのランダム決定フォレストを生成する方法であって、ａ）酸化ホットスポット残基を含むトレーニングセットを提供することであって、各残基が、ｉ）残基の複数の分子記述子の値、及びｉｉ）残基が酸化感受性であるかに関連する、提供することと、ｂ）トレーニングセットをランダム決定フォレストに適用し、それにより、ランダム決定フォレストをトレーニングして酸化感受性を予測することと、を含み、ランダム決定フォレストにおける個々の決定ツリーの数が、少なくとも約２０（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、またはそれ以上のうちのいずれか）であり、ランダム決定フォレストにおける各決定ツリーの各枝での考慮のためにランダムに選択された変数の最大数が、少なくとも約１（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のうちのいずれか）であり、観察プールが各ツリーの下位枝に分けられる最大回数が、少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）である、方法が提供される。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内の試験残基デルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内の試験残基デルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、試験残基側鎖角度、７Å以内の試験残基デルタ炭素の充填密度、試験残基骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内の試験残基デルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内の試験残基デルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内の試験残基デルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、及び試験残基側鎖角度を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、分子記述子は、タンパク質が抗体である場合にＦｖ領域等の試験残基を含むタンパク質のアミノ酸配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、分子記述子は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、試験残基及び酸化ホットスポット残基は、同じアミノ酸の残基である（例えば、それらは全てトリプトファン残基である）。いくつかの実施形態では、試験残基及び酸化ホットスポット残基は、トリプトファン残基である。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の試験残基が酸化感受性であるかを予測する方法であって、ａ）試験残基の複数の分子記述子の値を決定することと、ｂ）試験残基の複数の分子記述子を、複数の分子記述子でトレーニングされたランダム決定フォレストに適用して酸化感受性を予測することと、を含み、ランダム決定フォレストの多数決が、試験残基を酸化感受性であるか否かとして分類する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、酸化ホットスポット残基を含むトレーニングセットを提供することであって、各残基が、ｉ）残基の複数の分子記述子の値、及びｉｉ）残基が酸化感受性であるかに関連する、提供することと、トレーニングセットをランダム決定フォレスト適用し、それにより、ランダム決定フォレストをトレーニングして酸化感受性を予測することと、によってトレーニングされたものであり、ランダム決定フォレストにおける個々の決定ツリーの数は、少なくとも約２０（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、またはそれ以上のうちのいずれか）であり、ランダム決定フォレストにおける各決定ツリーの各枝での考慮のためにランダムに選択された変数の最大数は、少なくとも約１（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のうちのいずれか）であり、観察プールが各ツリーの下位枝に分けられる最大回数は、少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内の試験残基デルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内の試験残基デルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、試験残基側鎖角度、７Å以内の試験残基デルタ炭素の充填密度、試験残基骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内の試験残基デルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内の試験残基デルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内の試験残基デルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、及び試験残基側鎖角度を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、分子記述子は、タンパク質が抗体である場合にＦｖ領域等の試験残基を含むタンパク質のアミノ酸配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、分子記述子の値は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、試験残基及び酸化ホットスポット残基は、同じアミノ酸の残基である（例えば、それらは全てトリプトファン残基である）。いくつかの実施形態では、試験残基及び酸化ホットスポット残基は、トリプトファン残基である。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の試験トリプトファン残基が酸化感受性であるかを予測する方法であって、ａ）試験トリプトファン残基の複数の分子記述子の値を決定することと、ｂ）試験トリプトファン残基の複数の分子記述子を、複数の分子記述子でトレーニングされたランダム決定フォレストに適用して酸化感受性を予測することと、を含み、ランダム決定フォレストの多数決が、試験トリプトファン残基を酸化感受性であるか否かとして分類する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、トリプトファン酸化ホットスポット残基を含むトレーニングセットを提供することであって、各残基が、ｉ）残基の複数の分子記述子の値、及びｉｉ）残基が酸化感受性であるかに関連する、提供することと、トレーニングセットをランダム決定フォレストに適用して、それにより、ランダム決定フォレストをトレーニングしてトリプトファン酸化感受性を予測することと、によってトレーニングされたものであり、ランダム決定フォレストにおける個々の決定ツリーの数は、少なくとも約２０（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、またはそれ以上のうちのいずれか）であり、ランダム決定フォレストにおける各決定ツリーの各枝での考慮のためにランダムに選択された変数の最大数は、少なくとも約１（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のうちのいずれか）であり、観察プールが各ツリーの下位枝に分けられる最大回数は、少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、トリプトファン側鎖角度、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、トリプトファン骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、及びトリプトファン側鎖角度を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、分子記述子は、タンパク質が抗体である場合にＦｖ領域等の試験トリプトファンを含むタンパク質のアミノ酸配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、分子記述子の値は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質が酸化感受性のトリプトファン残基を含むかを決定する方法であって、ａ）タンパク質中の各トリプトファン残基の複数の分子記述子の値を決定することと、ｂ）複数の分子記述子を、複数の分子記述子でトレーニングされたランダム決定フォレストに適用して酸化感受性を予測することと、を含み、各トリプトファン残基のランダム決定フォレストの多数決が、残基を酸化感受性であるか否かとして分類し、ランダム決定フォレストが少なくとも１つのトリプトファン残基を酸化感受性として分類した場合、タンパク質が酸化感受性のトリプトファン残基を含むと決定される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、トリプトファン酸化ホットスポット残基を含むトレーニングセットを提供することであって、各残基が、ｉ）残基の複数の分子記述子の値、及びｉｉ）残基が酸化感受性であるかに関連する、提供することと、トレーニングセットをランダム決定フォレストに適用して、それにより、ランダム決定フォレストをトレーニングしてトリプトファン酸化感受性を予測することと、によってトレーニングされたものであり、ランダム決定フォレストにおける個々の決定ツリーの数は、少なくとも約２０（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、またはそれ以上のうちのいずれか）であり、ランダム決定フォレストにおける各決定ツリーの各枝での考慮のためにランダムに選択された変数の最大数は、少なくとも約１（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のうちのいずれか）であり、観察プールが各ツリーの下位枝に分けられる最大回数は、少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、トリプトファン側鎖角度、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、トリプトファン骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、及びトリプトファン側鎖角度を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、各トリプトファン残基の分子記述子は、タンパク質が抗体である場合にＦｖ領域等のトリプトファン残基を含むタンパク質のアミノ酸配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、分子記述子の値は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。
【０２２５】
ＩＶ．酸化を低減する方法
本明細書における本発明は、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、液体製剤中のタンパク質の酸化を防止する量のＮＡＴを添加することを含む、方法も提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及び／またはチロシンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、約８０Å２を超える。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、約３０％を超える。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約４．０〜約８．５のｐＨ範囲で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約５℃〜約４０℃の範囲の温度で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約０ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲の塩濃度で測定される。いくつかの実施形態では、トリプトファン残基のＳＡＳＡは、約５．０〜約７．５のｐＨ、約５℃〜約２５℃の温度、及び約０ｍＭ〜約２００ｍＭの塩濃度で測定される。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。さらなる一実施形態では、反応性酸素種は、一重項酸素、超酸化物（Ｏ２−）、アルコキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、三酸化二水素（Ｈ２Ｏ３）、ヒドロトリオキシラジカル（ＨＯ３・）、オゾン（Ｏ３）、ヒドロキシルラジカル、及びアルキル過酸化物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。例えば、本発明の製剤は、モノクローナル抗体、タンパク質の酸化を防止する本明細書に提供されるＮＡＴ、及び製剤のｐＨを望ましいレベルに維持する緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、水性である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかによる少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む（例えば、製剤は、２つ以上のタンパク質を含む共製剤である）。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、タンパク質の酸化を防止する量のＮＡＴを製剤に添加することを含み、タンパク質が、約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））ＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、タンパク質中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することと、少なくとも１つのトリプトファン残基が約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））ＳＡＳＡを有する場合に、タンパク質の酸化を防止する量のＮＡＴを製剤に添加することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約８０Å２を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、タンパク質中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することと、約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））ＳＡＳＡを有するトリプトファン残基の数に基づいてある量のＮＡＴを製剤に添加することと、を含み、製剤に添加されるある量のＮＡＴが、タンパク質の酸化を防止する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））である。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、８５Å２を超える（または３０％を超える）ＳＡＳＡを有する１つよりも多くのトリプトファン残基を有し、各トリプトファン残基の酸化を防止するのに十分な量のＮＡＴが添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、タンパク質の酸化を防止する量のＮＡＴを製剤に添加することを含み、タンパク質が、約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％）のうちのいずれかを超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約３０％を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、タンパク質中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することと、少なくとも１つのトリプトファン残基が約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有する場合に、タンパク質の酸化を防止する量のＮＡＴを製剤に添加することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約３０％を超えるＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、タンパク質中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することと、約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有するトリプトファン残基の数に基づいてある量のＮＡＴを製剤に添加することと、を含み、製剤に添加されるある量のＮＡＴが、タンパク質の酸化を防止する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））である。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。
【０２３２】
ＳＡＳＡは、Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に記載されており、以下の実施例にさらに詳細に記載されるコンピュータによる全原子分子動力学シミュレーション法を使用して計算され得る。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、タンパク質の酸化を防止する量の抗酸化剤を製剤に添加することを含み、タンパク質が、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗酸化剤は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）である。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、上述のランダム決定フォレストのうちのいずれかによるランダム決定フォレストである。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、少なくとも約２０個（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００個、またはそれ以上のうちのいずれか）の推定器、少なくとも約１個（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のうちのいずれか）の特徴量、及び少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）のツリー深度でトレーニングされたものである。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、トリプトファン側鎖角度、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、トリプトファン骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、トリプトファン分子記述子の値は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、タンパク質の酸化を防止する量のＮＡＴを製剤に添加することを含み、タンパク質が、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、上述のランダム決定フォレストのうちのいずれかによるランダム決定フォレストである。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、少なくとも約２０個（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００個、またはそれ以上のうちのいずれか）の推定器、少なくとも約１個（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のうちのいずれか）の特徴量、及び少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）のツリー深度でトレーニングされたものである。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、トリプトファン側鎖角度、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、トリプトファン骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、トリプトファン分子記述子の値は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測されたトリプトファン残基の数に基づいてある量のＮＡＴを製剤に添加することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））、またはＮＡＴが製剤中で可溶性である最高濃度までである。いくつかの実施形態では、製剤に添加されるＮＡＴの量は、約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、タンパク質中の１つ以上のトリプトファンアミノ酸の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、ＮＡＴは、反応性酸素種（ＲＯＳ）によるタンパク質の酸化を防止する。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、上述のランダム決定フォレストのうちのいずれかによるランダム決定フォレストである。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、少なくとも約２０個（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００個、またはそれ以上のうちのいずれか）の推定器、少なくとも約１個（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のうちのいずれか）の特徴量、及び少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）のツリー深度でトレーニングされたものである。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、トリプトファン側鎖角度、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、トリプトファン骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、トリプトファン分子記述子の値は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の酸化を低減する方法であって、アミノ酸置換をタンパク質に導入して、酸化感受性であると予測された１つ以上のトリプトファン残基を、酸化を受けないアミノ酸残基で置き換えることを含み、予測が、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによるものである、方法が提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上のトリプトファン残基は各々、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、及びバリンからなる群から独立して選択される残基に置き換えられる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに従う少なくとも１つの追加のタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、上述のランダム決定フォレストのうちのいずれかによるランダム決定フォレストである。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、少なくとも約２０個（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００個、またはそれ以上のうちのいずれか）の推定器、少なくとも約１個（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のうちのいずれか）の特徴量、及び少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）のツリー深度でトレーニングされたものである。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、トリプトファン側鎖角度、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、トリプトファン骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、トリプトファン分子記述子の値は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。
【０２３７】
Ｖ．スクリーニング方法
本明細書における本発明は、液体製剤をタンパク質の低減した酸化についてスクリーニングする方法も提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及び／またはチロシンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質中のトリプトファンは、酸化感受性である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、約８０Å２を超える。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、約３０％を超える。いくつかの実施形態では、タンパク質中のトリプトファンは、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測される。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、タンパク質の約４０％以下〜約０％（例えば、約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、または０％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））しか酸化されない。いくつかの実施形態では、製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、タンパク質の低減した酸化について液体製剤をスクリーニングする方法であって、タンパク質が、ｉ）約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））ＳＡＳＡ、またはｉｉ）約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有する少なくとも１つのトリプトファン残基を含み、本方法が、ａ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））のＮ−アセチル−トリプトファン（ＮＡＴ）を、タンパク質を含む液体製剤に添加することと、ｂ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））の２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を液体製剤に添加することと、ｃ）タンパク質、ＮＡＴ、及びＡＡＰＨを含む液体製剤を、約３５℃〜約４５℃（例えば、約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５℃のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））で、約１０時間〜約２０時間（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））インキュベートすることと、ｄ）タンパク質をタンパク質中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、タンパク質中のトリプトファン残基の約２０％以下（例えば、約２０、１５、１０、５、４、３、２、または１％のうちのいずれか以下（これらの値間の任意の範囲を含む））の酸化をもたらす量のＮＡＴを含む液体製剤が、タンパク質の低減した酸化に好適な製剤である、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。実施形態のうちのいくつかでは、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤���ある。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、液体製剤をタンパク質の低減した酸化についてスクリーニングする方法であって、ａ）タンパク質中のトリプトファン残基のＳＡＳＡ値を決定することと、ｂ）ｉ）約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））ＳＡＳＡ、またはｉｉ）約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有するトリプトファン残基の数に基づいて、ある量のＮＡＴを液体製剤に添加することと、ｃ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））の２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を液体製剤に添加することと、ｄ）タンパク質、Ｎ−アセチル−トリプトファン、及びＡＡＰＨを含む液体製剤を、約３５℃〜約４５℃（例えば、約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５℃のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））で、約１０時間〜約２０時間（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））インキュベートすることと、ｅ）タンパク質をタンパク質中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、タンパク質中のトリプトファン残基の約２０％以下（例えば、約２０、１５、１０、５、４、３、２、または１％のうちのいずれか以下（これらの値間の任意の範囲を含む））の酸化をもたらす量のＮＡＴを含む液体製剤が、タンパク質の低減した酸化に好適な製剤である、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＳＡＳＡは、コンピュータによる全原子分子動力学シミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。実施形態のうちのいくつかでは、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、液体製剤をタンパク質の低減した酸化についてスクリーニングする方法であって、タンパク質が、ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含み、本方法が、ａ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））のＮ−アセチル−トリプトファン（ＮＡＴ）を、タンパク質を含む液体製剤に添加することと、ｂ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））の２，２´−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を液体製剤に添加することと、ｃ）タンパク質、ＮＡＴ、及びＡＡＰＨを含む液体製剤を、約３５℃〜約４５℃（例えば、約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５℃のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））で、約１０時間〜約２０時間（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））インキュベートすることと、ｄ）タンパク質をタンパク質中のトリプトファン残基の酸化について測定することと、を含み、タンパク質中のトリプトファン残基の約２０％以下（例えば、約２０、１５、１０、５、４、３、２、または１％のうちのいずれか以下（これらの値間の任意の範囲を含む））の酸化をもたらす量のＮＡＴを含む液体製剤が、タンパク質の低減した酸化に好適な製剤である、方法が提供される。いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質（例えば、抗体）濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。実施形態のうちのいくつかでは、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムは、上述のランダム決定フォレストのうちのいずれかによるランダム決定フォレストである。いくつかの実施形態では、ランダム決定フォレストは、少なくとも約２０個（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００���５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００個、またはそれ以上のうちのいずれか）の推定器、少なくとも約１個（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のうちのいずれか）の特徴量、及び少なくとも約２（例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のうちのいずれか）のツリー深度でトレーニングされたものである。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、トリプトファン側鎖角度、７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度、トリプトファン骨格角度（標準偏差）、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、骨格柔軟性、及び７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷を含む。いくつかの実施形態では、複数の分子記述子は、２〜１１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか）の分子記述子を含む。いくつかの実施形態では、トリプトファン分子記述子の値は、液体製剤中のタンパク質のパラメータを使用したコンピュータによるＭＤシミュレーションによって決定される。いくつかの実施形態では、酸化アッセイにおける残基の少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか）の酸化は、酸化に対する感受性を示す。
【０２４１】
ＶＩ．タンパク質製剤の投与
液体製剤は、ボーラスとしての静脈内投与、またはある期間にわたる連続注入による投与、筋肉内、腹腔内、脳室内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、吸入、または硝子体内経路による投与等の既知の方法に従って、タンパク質（例えば、抗体）での治療を必要とする哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与される。一実施形態では、液体製剤は、静脈内投与により哺乳動物に投与される。かかる目的のために、製剤は、例えば、シリンジを使用して、または静脈ラインを介して注射され得る。一実施形態では、液体製剤は、皮下投与により哺乳動物に投与される。なお別の実施形態では、液体製剤は、硝子体内投与により投与される。
【０２４２】
タンパク質の適切な投薬量（「治療有効量」）は、例えば、治療される状態、状態の重症度及び経過、タンパク質が予防目的または治療目的のために投与されるか、以前の療法、患者の病歴及びタンパク質への応答、使用されるタンパク質の種類、ならびに主治医の裁量に依存する。タンパク質は、一度にまたは一連の治療にわたって患者に好適に投与され、診断時から任意の時点で患者に投与され得る。タンパク質は、単一治療として、または問題になっている状態の治療に有用な他の薬物もしくは療法とともに投与され得る。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、治療的処置及び予防的手段または予防手段の両方を指す。治療を必要とする者としては、障害を既に有する者、ならびに障害が予防されるべき者が挙げられる。本明細書で使用される場合、「障害」とは、哺乳動物を問題になっている障害にかかりやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性障害または疾患を含むが、これらに限定されない、治療から利益を享受するであろう任意の状態である。
【０２４３】
薬理学的な意味で、本発明との関連で、タンパク質（例えば、抗体）の「治療有効量」とは、抗体が有効である治療のための障害の予防または治療に有効な量を指す。いくつかの実施形態では、投与されるタンパク質の治療有効量は、１回以上の投与によるかにかかわらず、約０．１〜約５０ｍｇ／患者体重ｋｇ（例えば、約０．３〜約２０ｍｇ／患者体重ｋｇ、または約０．３〜約１５ｍｇ／患者体重ｋｇ）の範囲であろう。いくつかの実施形態では、タンパク質の治療有効量は、１日用量として、または複数回の１日用量として投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質の治療有効量は、週１回または月１回等の１日１回よりも低い頻度で投与される。例えば、タンパク質は、１週間以上毎（例えば、１、２、３、もしくは４週間毎、もしくはそれ以上、または１、２、３、４、５、もしくは６ヶ月毎、もしくはそれ以上）に約１００〜約４００ｍｇ（例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００ｍｇのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））の用量で投与され得るか、または１週間以上毎（例えば、１、２、３、もしくは４週間毎、もしくはそれ以上、または１、２、３、４、５、もしくは６ヶ月毎、もしくそれ以上）に約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１５．０、もしくは２０．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。用量は、注入物等の、単回用量として、または複数回用量（例えば、２、３、４回、またはそれ以上の用量）として投与され得る。この療法の進展は、従来の技法によって容易に監視される。
【０２４４】
ＶＩＩ．ＮＡＴの分解を測定する方法
本明細書における本発明は、液体製剤をタンパク質の低減した酸化についてスクリーニングする方法も提供する。製剤中のタンパク質を有効に保護するために、製剤中のＮＡＴは、影響を受けやすいＴｒｐ残基よりも犠牲的に酸化されなければならず、したがって、ＮＡＴ分解物がＮＡＴを含む薬物製品の取り扱い及び保管中に生じることが予期され得る。薬物製品中に存在する分解したＮＡＴ種が治療用タンパク質とともに患者に投与されるため、ＮＡＴの比率及び分解経路の理解が重要である。文献におけるＮＡＴ分解についての単一報告は、高温での長期保管後に、多重反応監視ＬＣ−ＭＳ法とともに、濃縮ＨＳＡ溶液中で観察された２つのＮＡＴ分解物（Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣ、２ｂ、及びＮ−Ａｃ−３ａ，８ａ−ジヒドロキシ−ＰＩＣ、３ｂ）を特定及び定量するための二次元サイズ排除クロマトグラフィー捕捉法を使用した（Ｆａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，２０１１，１２１８（４１）：７３１６−２４）。Ｔｒｐ自体の分解がより包括的に研究されており（Ｊｉ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，２００９，９８（１２）：４４８５−５００、Ｓｉｍａｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈ．Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，１９９８，４６（２）：４９０−４９８）、ＰＩＣ（２ａ）、オキシインドリルアラニン（Ｏｉａ、４ａ）、ジオキシインドリルアラニン（ＤｉＯｉａ、５ａ）、キヌレニン（Ｋｙｎ、６ａ）、Ｎ−ホルミル−キヌレニン（ＮＦＫ、７ａ）、及び５−ヒドロキシ−Ｔｒｐ（５−ＯＨ−Ｔｒｐ、８ａ）を含むより大きい基の分解物が報告されている。
【０２４５】
いくつかの態様では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、ａ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で平衡化されたクロマトグラフィー材料に装填され、移動相Ａが水中酸を含み、移動相Ｂが有機溶媒中酸を含む、適用することと、ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率がステップａ）と比較して増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｃ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。複数の実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１：９９、２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、または１０：９０のうちのいずれかである。複数の実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２：９８である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、直線的に増加する。他の実施形態では、ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、段階的に増加する。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルである。
【０２４６】
いくつかの態様では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、ａ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で平衡化されたクロマトグラフィー材料に装填され、移動相Ａが水中酸を含み、移動相Ｂがアセトニトリル中酸を含む、適用することと、ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率がステップａ）と比較して増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｃ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。複数の実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約１：９９、２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、６：９４、７：９３、８：９２、９：９１、または１０：９０のうちのいずれかである。複数の実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２：９８である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、直線的に増加する。他の実施形態では、ステップｂ）における移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、段階的に増加する。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．２５ｍＬ／分、０．５ｍＬ／分、０．７５ｍＬ／分、１．０ｍＬ／分、１．２５ｍＬ／分、１．５ｍＬ／分、１．７５ｍＬ／分、２．０ｍＬ／分、または２．５ｍＬ／分のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．０ｍＬ／分のうちのいずれかである。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２５：７５、２８：７２、３０：７０、３２：６８、または３５：６５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１４、１５、１６、１７、または１８分後のうちのいずれかに、約２５：７５、２８：７２、３０：７０、３２：６８、または３５：６５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１６分後に、約２５：７５、２８：７２、３０：７０、３２：６８、または３５：６５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１６分間後に約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、流速は、約１ｍＬ／分である。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約８５：１５、９０：１０、または９５：５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１６、１７、１８、１９、または２０分後のうちのいずれかに、約８５：１５、９０：１０、または９５：５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１８．１分後に、約８５：１５、９０：１０、または９５：５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約９０：１０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１８．１分後に約９０：１０に増加する。いくつかの実施形態では、流速は、約１ｍＬ／分である。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２４：７６、２５：７５、２６：７０、２７：７３、または２８：７１のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２６：７４に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１２、１３、１４、１５または１６分後のうちのいずれかに、約２４：７６、２５：７５、２６：７０、２７：７３、または２８：７１のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１４分後に、約２４：７６、２５：７５、２６：７０、２７：７３、または２８：７１のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約２６：７４に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１４分後に約２６：７４に増加する。いくつかの実施形態では、流速は、約１ｍＬ／分である。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約８５：１５、９０：１０、または９５：５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約３０：７０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、または１８．５分後のうちのいずれかに、約８５：１５、９０：１０、または９５：５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１６．５分後に、約８５：１５、９０：１０、または９５：５のうちのいずれかに増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、約９０：１０に増加する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１６．５分後に約９０：１０に増加する。いくつかの実施形態では、流速は、約１ｍＬ／分である。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、または１．０ｖ／ｖ％酸のうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中約０．１％酸を含む。いくつかの実施形態では、酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中約０．１％ギ酸を含む。いくつかの実施形態では、移動相５は、アセトニトリル中約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、または１．０ｖ／ｖ％酸のうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、アセトニトリル中約０．１％酸を含む。いくつかの実施形態では、酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、アセトニトリル中約０．１％ギ酸を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中約０．１％ギ酸を含み、移動相Ｂは、アセトニトリル中約０．１％ギ酸を含む。
【０２５３】
いくつかの態様では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、ａ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で平衡化されたクロマトグラフィー材料に装填され、２：９８の移動相Ｂの移動相Ａに対する比率で、移動相Ａが水中０．１ｖ／ｖ％ギ酸を含み、移動相Ｂが有機溶媒中０．１ｖ／ｖ％ギ酸を含む、適用することと、ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が約７０：３０、その後、約９０：１０に増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｃ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、流速は、約１．０ｍＬ／分であり、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１６分後に約７０：３０に増加し、その後、クロマトグラフィーの開始から約１８分後に約９０：１０に増加する。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルである。
【０２５４】
いくつかの態様では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、ａ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で平衡化されたクロマトグラフィー材料に装填され、２：９８の移動相Ｂの移動相Ａに対する比率で、移動相Ａが水中０．１ｖ／ｖ％ギ酸を含み、移動相Ｂがアセトニトリル中０．１ｖ／ｖ％ギ酸を含む、適用することと、ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が約７０：３０、その後、約９０：１０に増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｃ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、流速は、約１．０ｍＬ／分であり、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１６分後に約７０：３０に増加し、その後、クロマトグラフィーの開始から約１８分後に約９０：１０に増加する。
【０２５５】
いくつかの態様では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、ａ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中のクロマトグラフィー材料に装填され、２：９８の移動相Ｂの移動相Ａに対する比率で、移動相Ａが水中０．１ｖ／ｖ％ギ酸を含み、移動相Ｂがアセトニトリル中０．１ｖ／ｖ％ギ酸を含む、適用することと、ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率が約７４：２６、その後、約９０：１０に増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｃ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、流速は、約１．０ｍＬ／分であり、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率は、クロマトグラフィーの開始から約１４分後に約７４：２６に増加し、その後、クロマトグラフィーの開始から約１６．５分後に約９０：１０に増加する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、Ｃ８部分またはＣ１８部分を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、Ｃ１８部分を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、シリカを含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、カラム内に含まれる。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ−Ｃ１８クロマトグラフィーカラムである。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ−Ｃ１８  ３．５μｍ、４．６×７５ｍｍクロマトグラフィーカラムである。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、約０℃〜約３０℃の範囲の温度で行われる。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、約０℃、５℃、２０℃、または３０℃のうちのいずれかで行われる。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、室温で行われる。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、約５℃で行われる。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、５℃±３℃で行われる。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、ＮＡＴ及びＮＡＴ分解産物は、２４０ｎｍの吸光度によって検出される。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ分解産物は、質量分析によって特定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＮＡＴの濃度は、約１０ｎＭ〜約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物中のＮＡＴの濃度は、約１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、７．５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、７５０μＭ、または１ｍＭのうちのいずれか未満である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮＡＴの濃度は、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約５００μＭ、または約５００μＭ〜約１ｍＭの範囲である。
【０２５９】
上記の方法のいくつかの実施形態では、ＮＡＴ分解産物は、Ｎ−Ａｃ−（Ｈ，１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３ａ−ヒドロキシピロロ［２，３−ｂ］−インドール−２−カルボン酸）（Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣ）、Ｎ−Ａｃ−オキシインドリルアラニン（Ｎ−Ａｃ−Ｏｉａ）、Ｎ−Ａｃ−Ｎ−ホルミル−キヌレニン（Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ）、Ｎ−Ａｃ−キヌレニン（Ｎ−Ａｃ−Ｋｙｎ）、及びＮ−Ａｃ−２ａ，８ａ−ジヒドロキシ−ＰＩＣのうちの１つ以上を含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）及びポリペプチドを含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、ａ）ポリペプチドを変性させることと、ｂ）ポリペプチドを組成物から除去することと、ｃ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中のクロマトグラフィー材料に装填され、移動相Ａが水中酸を含み、移動相Ｂがアセトニトリル中酸を含む、適用することと、ｄ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率がステップａ）と比較して増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｅ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、グアニジンでの処理によって変性する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、グアニジンで変性し、グアニジンは、組成物に添加されて、約７Ｍ〜約９Ｍの最終濃度になる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、グアニジンで変性し、グアニジンは、組成物に添加されて、約８Ｍの最終濃度になる。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）及びポリペプチドを含む組成物中のＮ−アセチルトリプトファン分解を測定するための方法であって、ａ）組成物を約８Ｍのグアニジンで希釈することと、ｂ）ポリペプチドを組成物から除去することと、ｃ）組成物を逆相クロマトグラフィー材料に適用することであって、組成物が移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中のクロマトグラフィー材料に装填され、移動相Ａが水中酸を含み、移動相Ｂがアセトニトリル中酸を含む、適用することと、ｄ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で組成物を逆相クロマトグラフィー材料から溶出させることであって、移動相Ｂの移動相Ａに対する比率がステップａ）と比較して増加し、ＮＡＴ分解物がインタクトなＮＡＴとは別々にクロマトグラフィーから溶出する、溶出させることと、ｅ）ＮＡＴ分解物及びインタクトなＮＡＴを定量することと、を含む、方法を提供する。
【０２６２】
上記の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＡＴの最終濃度が約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭの範囲になるように、約８Ｍのグアニジン中で希釈される。上記の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＡＴの最終濃度が約０．０５ｍＭ〜約０．２ｍＭの範囲になるように、約８Ｍのグアニジン中で希釈される。上記の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＡＴの最終濃度が、約０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１０ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１８ｍＭ、または約０．２ｍＭのうちのいずれか未満になるように、約８Ｍのグアニジン中で希釈される。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のポリペプチドの最終濃度が、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか以下になるように、約８Ｍのグアニジン中で希釈される。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のポリペプチドの最終濃度が、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約３５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約４５ｍｇ／ｍＬ、約１４５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬになるように、約８Ｍのグアニジン中で希釈される。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、濾過によって組成物から除去される。いくつかの実施形態では、濾過は、約３０ｋＤａｌの分子量カットオフを有する濾過膜を使用する。
【０２６４】
上記の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、製剤は、約３．５〜約７．０のｐＨを有する。上記の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、約３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、７．０、７．５、または８．０のうちのいずれかのｐＨを有する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、本発明は、組成物中のＮＡＴの分解を監視する方法であって、上述の方法に従って組成物の試料中のＮＡＴの分解を測定することを含み、本方法が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも約２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回のうちのいずれかの回数繰り返される。いくつかの実施形態では、本方法は、１日１回、週１回、もしくは月１回、またはそれらの任意の組み合わせの回数繰り返される。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも約毎月、２ヶ月毎に、３ヶ月毎に、４ヶ月毎に、５ヶ月毎に、６ヶ月毎に、９ヶ月毎に、または少なくとも約年１回繰り返される。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的組成物の品質アッセイであって、本品質アッセイが、上述の方法に従って薬学的組成物の試料中のＮＡＴの分解を測定することを含み、組成物中の測定されたＮＡＴ分解物の量が、薬学的組成物が動物への投与に好適であるかを決定する、品質アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、約１ｐｐｍ、２ｐｐｍ、３ｐｐｍ、４ｐｐｍ、５ｐｐｍ、６ｐｐｍ、７ｐｐｍ、８ｐｐｍ、９ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、６０ｐｐｍ、７０ｐｐｍ、８０ｐｐｍ、９０ｐｐｍ、または１００ｐｐｍのうちのいずれか未満の薬学的組成物中のＮＡＴ分解物の量は、薬学的組成物が動物への投与に好適であることを示す。いくつかの実施形態では、約１０ｐｐｍ未満の薬学的組成物中のＮＡＴ分解物の量は、薬学的組成物が動物への投与に好適であることを示す。
【０２６９】
ＶＩＩＩ．製品
本発明の別の実施形態では、本発明の液体製剤を保持し、かつ任意にその使用に関する指示を提供する容器を含む製品が提供される。いくつかの実施形態では、液体製剤は、タンパク質（例えば、抗体）及びＮ−アセチル−トリプトファン（ＮＡＴ）を含み、タンパク質は、ａ）約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））ＳＡＳＡを有するか、ｂ）約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有するか、またはｃ）ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤中のＮＡＴの量は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭのうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））である。いくつかの実施形態では、タンパク質の酸化は、約４０％〜約１００％（例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））低減される。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約０℃〜約５℃（例えば、約０、１、２、３、４、または５℃のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））で、少なくとも約１２ヶ月（例えば、少なくとも約１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ヶ月のうちのいずれか（これらの値間の任意の範囲を含む））にわたって安定している。いくつかの実施形態では、液体製剤中のタンパク質の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体配列に由来する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約４．５〜約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。
【０２７０】
好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、及びシリンジが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。例示の容器には、２〜２０ｃｃの単回使用ガラスバイアルがある。あるいは、複数回投与量製剤の場合、容器は、２〜１００ｃｃのガラスバイアルであり得る。容器は、製剤を保持し、容器上のラベルまたは容器に関連するラベルは、使用に関する指示を示し得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用に関する指示を有する添付文書を含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０２７１】
添付文書とは、適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌に関する情報、及び／またはかかる治療薬の使用に関する警告を含む、治療薬の商業パッケージ内に習慣的に含まれる指示を指す。
【０２７２】
任意に製品と組み合わせて、様々な目的、例えば、液体製剤中のタンパク質の酸化の低減、または液体製剤のタンパク質の低減した酸化についてのスクリーニングに有用なキットも提供される。本発明のキットは、ａ）約５０Å２〜約２５０Å２を超える（例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、または２５０Å２のうちのいずれかを超える（これらの値間の任意の範囲を含む））ＳＡＳＡを有するか、ｂ）約１５％〜約４５％を超える（例えば、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５％のうちのいずれかを超える）ＳＡＳＡを有するか、またはｃ）ＭＤシミュレーションに基づいてトリプトファン残基の酸化感受性とトリプトファン残基の複数の分子記述子との関連性についてトレーニングされた機械学習アルゴリズムによって酸化感受性であると予測された少なくとも１つのトリプトファン残基を含むタンパク質（例えば、抗体）を含む１つ以上の容器、ＮＡＴ、ＡＡＰＨ、及び／または本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従う使用に関する指示を含む。本発明のキット内に供給される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット内に含まれる紙シート）上の文書による指示であるが、機械可読指示（例えば、磁気または光学記憶ディスク上で配信される指示）も許容される。
【０２７３】
本明細書は、当業者が本発明を実践することを可能にするのに十分なものであるとみなされる。本明細書に示され、かつ記載される修正に加えて、本発明の様々な修正が前述の記述から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２７４】
本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態が例証のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０２７５】
実施例１．酸化からのＮＡＴ保護の評定
ＳＡＳＡ計算
示されるタンパク質残基のＳＡＳＡを、Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に記載のコンピュータによる全原子分子動力学モデル化法を使用して計算した。簡潔には、タンパク質の構造を、必要に応じてイオン及び明示的溶媒分子を添加した、３Ｄ結晶構造または相同モデルのいずれかから得た。ＳＡＳＡを、相互情報計算をローカルで実施するＧＲＯＭＡＣＳのｇ＿ｓａｓを使用して計算した（Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１６（３）：２７３−２８４，１９９５、Ｌａｎｇｅ  Ｏ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７０（４）：１２９４−１３１２，２００８）。二乗平均平方根変動、水素結合、及び二次構造を、それぞれ、ＧＲＯＭＡＣＳのｓｔａｔｕｓｇ＿ｒｓｍｆ、ｇ＿ｈｂｏｎｄ、及びｄｓｓｐを使用して計算した。シャノンエントロピー及び相互情報を、以前に公開された方法（Ｋｏｒｔｋｈｏｎｊｉａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ５（２）：３０６−３２２，２０１３）を使用して計算した。ＭＤシミュレーションを、Ａｍｂｅｒ  １１（ＦＦ９９ＳＢ固定電荷力場）を使用して行い、ＳＡＳＡを、ａｒｅａｉｍｏｌ（Ｂａｉｌｅｙ  Ｓ、Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５０（Ｐｔ  ５）：７６０−７６３，１９９４）を使用して計算し、１００ナノ秒軌道を、それらが利用可能なコンピュータで計算する能力内の十分なデータ提供したときに使用した。
【０２７６】
ＡＡＰＨストレス
タンパク質Ｍａｂ１、Ｍａｂ２、及びＭａｂ３／Ｍａｂ４を酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５））中で透析し、Ｍａｂ５／Ｍａｂ６をヒスチジン系緩衝液（２０ｍＭヒスチジン塩酸塩（ｐＨ５．５））中で透析した。タンパク質溶液を、対応する緩衝液中１ｍｇ／ｍＬタンパク質の最終濃度にし、１ｍＭの２，２´−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を添加した。Ｎ−アセチル−Ｔｒｐ（ＮＡＴ）を濃縮ストック溶液から各タンパク質溶液に０〜５ｍＭの濃度で添加した。試料を４０℃で１６時間インキュベートし、続いて、メチオニンでクエンチし、緩衝液交換して、最初の透析緩衝液＋１００ｍＭのスクロースにした。
【０２７７】
ＬＣ−ＭＳトリプシンペプチドマッピング
Ｍａｂ２、Ｍａｂ１、及びＭａｂ３／Ｍａｂ４のＡＡＰＨストレス試料の部位特異的修飾を、マイクロスケールトリプシンペプチド消化、続いて、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用して監視した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｖ．２０，２０１４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ）。３０μＬ（２５０μｇ）の各ストレス試料を１９０μＬの還元カルボキシメチル化緩衝液（６ＭグアニジンＨＣＬ、３６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．６）で希釈して、タンパク質を変性させた。変性後、４μＬの１Ｍ  ＤＴＴを各混合物に添加し、還元反応物を３７℃で１時間インキュベートした。その後、試料を１０．４μＬのヨード酢酸の添加によりカルボキシメチル化し、室温の暗所で１５分間保管した。アルキル化反応を２μＬの１Ｍ  ＤＴＴの添加によりクエンチした。還元及びアルキル化試料をＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で緩衝液交換して、トリプシン消化緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．２）中に入れた。その後、試料を、１：５０の酵素：タンパク質重量比でシークエンシンググレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによって消化した。消化反応物を３７℃で４時間インキュベートし、その後、１００％ギ酸（ＦＡ）を試料に添加して３．０ｖ／ｖ％の最終ＦＡ濃度にすることによってクエンチした。
【０２７８】
各消化した試料のペプチドマッピングを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ高分解能質量分析システム（ＨＲＭＳ）に連結されたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＨＰＬＣ上で行った。消化した試料の１０μｇ注入物の分離を、０．３ｍＬ／分の流速で泳動し、かつカラム温度を７７℃で制御したＣＳＨ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、粒径１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）上で行った。溶媒Ａは、水中０．１％ＦＡからなり、溶媒Ｂは、アセトニトリル中０．１％ＦＡからなった。勾配を表１に示す。カラム流出物を２１４ｎｍで監視した。全ＭＳ−ＳＩＭデータを、２００〜２０００ｍ／ｚの走査範囲にわたって１７，５００の分解能で収集した。陽イオンモードでの電子スプレーイオン化を、３．５０ｋＶの針スプレー電圧を使用することによって達成した。目的とする酸化しやすい部位を、同じマイクロスケールトリプシン消化、続いて、ＰＴＭの残基特異的局在化のために使用したＭＳ／ＭＳフラグメンテーションでのＬＣ／ＭＳ−ＭＳを使用して各ｍＡｂについて事前に特徴付けした。各部位の酸化レベルを、Ｔｈｅｒｍｏ  ＸＣａｌｉｂｕｒ生物薬剤学的特徴付けソフトウェアを使用して抽出イオンクロマトグラフィー（ＥＩＣ）によって決定した。酸化の相対的割合を、酸化ペプチド種のピーク面積を天然ペプチドのピーク面積と酸化ペプチドのピーク面積の合計で除することによって計算した。トリプトファン部位について報告した全酸化値は、Ｗｏｘ１（＋１６）とＮＦＫ／Ｗｏｘ２（＋３２）のみの合計である。ペプチドマッピングのさらなる詳細については、Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ＵＨＰＬＣ−ＨＲＭＳ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．，２０１４を参照されたい。
表１
2019501920.tif 000005
【０２７９】
酸化からのＮＡＴ保護
以下の酸化しやすいトリプトファン残基、Ｍａｂ２  Ｗ５３及びＷ１０６、Ｍａｂ４  Ｗ５２、Ｍａｂ１  Ｗ１０３、ならびにＭａｂ６  Ｗ１０３／１０４を、ＡＡＰＨ誘導酸化からのＮＡＴ保護について評定した。各タンパク質を、１ｍＭのＡＡＰＨを使用して上述のようにＡＡＰＨストレスに供した。ＮＡＴを、Ｍａｂ２、Ｍａｂ４、及びＭａｂ１の場合、０、０．０５、０．１、及び０．３ｍＭで添加し、Ｍａｂ６の場合、０、０．１、及び１ｍＭで添加した。図１ならびに表２及び３に示されるように、ＮＡＴは、各試験残基をＡＡＰＨストレスに起因する酸化から保護することができた。
表２．トリプトファン残基の酸化
2019501920.tif 000006
表３．タンパク質の保護
2019501920.tif 000007
１：として計算した（０ｍＭ  ＮＡＴでのΔ酸化−０．１ｍＭ  ＮＡＴでのΔ酸化）／０ｍＭ  ＮＡＴでのΔ酸化
【０２８０】
トリプトファン酸化感受性の予測
図２Ａに示されるように、トリプトファン残基ＳＡＳＡの関数としてのＡＡＰＨによる酸化％を、３８個のＩｇＧ１  ｍＡｂからのデータを使用してプロットした。３０％ＳＡＳＡのカットオフを使用して、試験残基の８７％が３５％を超える酸化レベルを有した。トリプトファン残基の単一の分子記述子であるＳＡＳＡ％は、この抗体集団における酸化に対する感受性の予測に高度に正確であった。しかしながら、図２Ｂに示されるように、データセットが多様なフレームワーク（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、マウス）を有する１２１個のｍＡｂ由来のトリプトファン残基を含むように拡大することにより、ＳＡＳＡ％のみに基づく酸化感受性の予測がより不正確になった。
【０２８１】
実施例２．トリプトファン酸化感受性の予測のための機械学習
ＳＡＳＡ等の単一のシミュレーションに基づく分子記述子を使用して、特定のＩｇＧサブクラス等のある特定の条件下でトリプトファン酸化感受性の高度に正確な予測をもたらすことができる。しかしながら、多様なフレームワークにわたる残基のトリプトファン酸化感受性を予測する場合、正確度は、複数の分子記述子を使用することによって改善され得る。我々は、一組のＭＤシミュレーションに基づく分子記述子をトリプトファン酸化感受性と相関させるための機械学習を使用し、酸化感受性に関するいずれの実験データも利用可能ではない試験トリプトファン残基の安定性を正確に予測するために使用することができるモデルを得て、候補分子の選択のためのより迅速なパイプラインを可能にした。さらに、潜在的に安定性を駆動する基礎となる機構を指し示すこのモデルにおける分子記述子の相対的重要度を決定した。
【０２８２】
分子記述子
以下の分子記述子を、上述のコンピュータによる全原子分子動力学モデル化法を使用して計算した。６つのＭＤシミュレーションを、以下のパラメータ：Ｆｖ領域のみ、１シミュレーション当たり１００ナノ秒のスナップショット、明示的水、定圧、３つのシミュレーションにプロトン化ＨＩＳ、３つのシミュレーションに脱プロトン化ＨＩＳ（「ｐＨ」）、及び３フェムト秒の刻み幅を使用して、各トリプトファン残基に行った。ＭＤ誘導分子記述子は、局所化学的環境：電荷、疎水性、水素結合、ならびに骨格及びアミノ酸側鎖の局所構造の環状フィンガープリンティングを含んだ。
【０２８３】
７Å以内のトリプトファンデルタ炭素のアスパラギン酸側鎖酸素の数
各分子シミュレーションの各フレームについて、各トリプトファンの７Å以内のデルタ炭素の全ての原子を追跡した。これらの原子のうち、任意のアスパラギン酸残基の側鎖上の酸素原子であった原子を計数した。最終値は、シミュレーションの持続時間にわたるこの計数の時間平均を表す。
【０２８４】
側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）
各分子シミュレーションの各フレームについて、各トリプトファン側鎖の溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）をコンピュータで計算した。簡潔には、シミュレーションにおける各原子に中心がある球体の点を、各原子半径を水分子の半径と一緒に加えることによって生成した。隣接する球体の半径内にあった全ての点を排除し、全ての残りの点間の面積を合計してＳＡＳＡの値を生み出した。この記述子の最終値は、シミュレーションの持続時間にわたるトリプトファン側鎖原子のＳＡＳＡの標準偏差を表す。
【０２８５】
デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）
各シミュレーションの各フレームについて、各トリプトファンデルタ炭素の溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）を前述のようにコンピュータで計算した。この記述子の値は、シミュレーションの持続時間にわたるトリプトファンデルタ炭素のＳＡＳＡの標準偏差を表す。
【０２８６】
７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全正電荷（標準偏差）
各シミュレーションの各フレームについて、各トリプトファンの７Å以内のデルタ炭素の荷電アミノ酸側鎖に関連する全ての原子を追跡した。これらの原子の全正電荷を一緒に加えた。最終値は、シミュレーションの持続時間にわたるこの量の標準偏差を表す。
【０２８７】
骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）
各分子シミュレーションの各フレームについて、各トリプトファンの骨格窒素原子の溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）をコンピュータで計算した。この記述子は、シミュレーションの持続時間にわたる骨格窒素原子のＳＡＳＡの標準偏差である。
【０２８８】
トリプトファン側鎖角度
トリプトファン側鎖のｃｈｉ１及びｃｈｉ２角度を、シミュレーションを通じて追跡した。多くの異なるトリプトファン残基及びシミュレーションにわたって全てのｃｈｉ１及びｃｈｉ２角度をグラフ化したときに、一般に発生する角度組み合わせのクラスタが明らかになった。Ｋ平均クラスタ化を使用して、１２の領域の各々の中心を定義した。
【０２８９】
トリプトファン酸化を最も予測した角度領域は、Ｃｈｉ１＝７６度及びＣｈｉ２＝９８度に中心がある「クラスタ５」であった。各個々のトリプトファン残基について、それがクラスタ５で過ごした時間の割合をシミュレーションにわたって追跡し、記述子としてランダム決定フォレストに追加した。
【０２９０】
７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の充填密度
充填密度を、トリプトファンデルタ炭素に中心がある半径７Å以内の球体のタンパク質原子の時間平均数として計算した。
【０２９１】
トリプトファン骨格角度（標準偏差）
この記述子を、シミュレーションの持続時間にわたる各トリプトファン残基の骨格に関連するｐｓｉ角度の標準偏差を測定することによって計算した。
【０２９２】
擬似パイ軌道の占有体積
各トリプトファン残基の側鎖を、トリプトファンパイ軌道によって占有された空間に接近させるために９Åの高さを有する円柱の底として扱った。シミュレーション中に円柱の体積内に含まれる全ての原子を追跡した。円柱の体積内に含まれる全てのタンパク質原子の全体積を、シミュレーションの各フレームについて計算した。最終値は、他のタンパク質原子によって占有されたトリプトファンパイ軌道の時間平均体積を表す。
【０２９３】
骨格柔軟性
各トリプトファン残基の骨格窒素の二乗平均平方根変動を各シミュレーションにわたって計算した。簡潔には、シミュレーションにおける各フレームを整列させた。各窒素原子が移動した距離を各フレームについて計算した。各フレームのこの距離を二乗し、全てのフレームにわたるこの二乗した距離の平均を取った。最後に、この二乗した距離の平均の平方根を取って、トリプトファンの骨格窒素の二乗平均平方根変動を生み出した。
【０２９４】
７Å以内のトリプトファンデルタ炭素の全負電荷
各シミュレーションの各フレームについて、各トリプトファンの７Å以内のデルタ炭素の荷電アミノ酸側鎖に関連する全ての原子を追跡した。これらの原子の全負電荷を一緒に加えた。最終値は、シミュレーションの持続時間にわたるこの量の時間平均を表す。
【０２９５】
ランダム決定フォレストの生成
実験的に決定された酸化レベルを有する６８個の分子中の１２１個のトリプトファン残基の一組の分子記述子の値を、上述のように計算した。３５％を超える酸化を有するトリプトファン残基を「不安定」に分類し、３５％未満の酸化を有するトリプトファン残基を「安定」に分類した。ＩｇＧ型、ＩｇＧフレームワーク情報、トリプトファン残基のＣＤＲ位置、ＣＤＲ長さ、配列内の以前の残基及びその後の残基、ならびに他の酸化ホットスポットの数を含む一般的な分子記述子を、トリプトファン残基の各々とも関連付けた。
【０２９６】
実験データ（安定しているトリプトファン残基または不安定なトリプトファン残基）とトリプトファン分子記述子（シミュレーションデータ）との組み合わせを使用して、どのシミュレーションに基づく出力がトリプトファン安定性に対応するかを学習するようにランダム決定フォレストをトレーニングした。ランダム決定フォレストの正確度を一連のパラメータにわたって評価して、トレーニングに最適な条件を特定し、トリプトファン酸化の予測に最も重要な記述子を、最適化パラメータを使用して生成されたランダム決定フォレストを使用してランク付けした。
【０２９７】
ランダム決定フォレストの正確度を、２つの方法を使用して評価した。一方の方法では、「アウトオブバッグ」エラーを計算した。アウトオブバッグエラーは、機械学習文献において予測モデル正確度の信頼できる推定値であることが証明されている（Ｊａｍｅｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｐｐ  ３１６−３２１，２０１３）。簡潔には、ブートストラップ凝集を、トレーニングセットＸ＝ｘ１、…、ｘｎに適用し、各トレーニング試料ｘｉの平均予測誤差を、それらのブートストラップ試料においてｘｉを有しなかったツリーのみを使用して計算した。他方の方法では、データセットを、ランダム決定フォレストをトレーニングするために使用したトレーニングセット（データの８０％）及び結果として得られたランダム決定フォレストに適用した試験セット（データの残りの２０％）に分けた。試験セットの予測誤差を使用して、モデルの正確度を計算した。
【０２９８】
ランダム決定フォレストに最適なトレーニング条件を決定するために、以下のパラメータ：ランダム決定フォレストに含まれた個々の決定ツリー（または推定器）の数、ランダム決定フォレストにおける各ツリーの各枝での考慮のためにランダムに選択された変数（または特徴量）の数、及び観察プールが下位枝に分けられた最大回数（またはツリー深度）を変化させ、モデルの正確度を評価した。トリプトファン酸化モデルの正確度に最適な数は、２００以上であった（図３を参照のこと）。８５％を超える正確度がわずか３０個の推定器で依然として達成された。最適な特徴量の数は、１〜４の範囲であった（図４を参照のこと）。最適なツリー深度は、５以上であった（図５を参照のこと）。正確なモデルがわずか２のツリー深度で依然として達成された。これらの結果に基づいて、以下の最適化パラメータ：５０００個の推定器、１ノード当たり３個の考慮される特徴量、及び１０のツリー深度を使用して、ランダム決定フォレストを生成した。結果として得られた最適化ランダム決定フォレストのアウトオブバッグエラー計算により、８９．２％の正確度がもたらされた。このデータをトレーニングセットと試験セットに分けて、最適化ランダム決定フォレストの正確度が８８％であることが見出され、８０％の感度及び８９％の特異性であった（表４を参照のこと）。
表４：ランダム決定フォレスト精度
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【０２９９】
最適化ランダム決定フォレストにおけるシミュレーションに基づく分子記述子の相対的重要度を、ジニ重要度を使用して評定し、上位１４個の分子記述子について図６に示す。最も重要な記述子は、隣接するアスパラギン酸側鎖酸素であり、ランク順に、側鎖ＳＡＳＡ（標準偏差）、デルタ炭素ＳＡＳＡ（標準偏差）、隣接する正電荷（標準偏差）、骨格ＳＡＳＡ（標準偏差）、ｐＨ７でのトリプトファン側鎖角度、ｐＨ７での充填密度、骨格角度（標準偏差）、骨格変動、擬似パイ軌道のＳＡＳＡ、ｐＨ５での充填密度、ｐＨ５でのトリプトファン側鎖角度、ｐＨ５での隣接する負電荷、及びｐＨ７での隣接する負電荷が続いた。
【０３００】
実施例３．異なるストレス条件及び製剤でのＮＡＴ分解の特徴付け
ＮＡＴ安定性を系統的に評定するために、我々は、ＵＶ検出と組み合わせた逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー法を開発して、ＮＡＴ分解を定量化した。ＮＡＴをタンパク質製剤の典型である緩衝液系に添加し、典型的な製造及び保管条件下で組換えタンパク質が供され得るストレスを模倣するように設計されたもの：アルキル過酸化物、フェントン化学反応、ＵＶ光、及び熱ストレスに供した（Ｇｒｅｗａｌ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１４．１１（４）：１２５９−７２、Ｊｉ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，２００９．９８（１２）：４４８５−５００、Ｔｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２０１４．３１（３）：５４１−５３）。我々の研究では、１０を超える異なるＮＡＴ分解物が観察され、及び主な種が特定された。
【０３０１】
化学物質
明記される場合を除いて、化学物質をＳｉｇｍａから購入した。使用した全ての化学物質は、分析純度グレードのものであった。タンパク質治療試料をチャイニーズハムスター卵巣細胞またはＥ．ｃｏｌｉ中で産生し、親和性クロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーを含む一連のクロマトグラフィーステップによって精製した。主なＮＡＴ分解物の合成（ＮＡＴ分解物の構造については図７を参照のこと）を、以下に記載の文献の方法を適応させることによって達成した。
【０３０２】
一般合成手順
可能な場合、無水溶媒を使用した。分取逆相クロマトグラフィーを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ  １０μ  Ｃ１８  １１０Å  １００ｍｍ×３０ｍｍ分取ＨＰＬＣ  カラムを使用してＷａｔｅｒｓ  ２５２５  ＨＰＬＣシステム上で行った。移動相Ａ＝Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏ、０．１％ギ酸。移動相Ｂ＝アセトニトリル、勾配＝０〜２０％Ｂ（０〜１２分）、画分収集を２５４ｎｍのＵＶシグナル閾値（１０−１Ａｕ）によって誘発した。画分をＬＣ／ＭＳによって所望の生成物の存在について分析した。全ての分取分離について、純度を改善するために、所望のピークのフロンティング部分及びテーリング部分を含む画分をプールした画分に含めなかった。
【０３０３】
最終生成物のＬＣ／ＭＳ試料分析を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計とともにＷａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ及び本明細書に記載のクロマトグラフィー条件を使用して行った。全走査精密質量データを、５０〜８００ｍ／ｚの範囲にわたって陽イオンモードで１５，０００の分解能で収集した。ＭＳ２を、ダイナミックエクスクルージョンを無効にして上位３つのイオン上で行った。
【０３０４】
ＮＭＲ分析を過重水素化ＤＭＦ中で行った。
【０３０５】
トリプトファン誘導体のアセチル化の一般手順
トリプトファン誘導体をアセトニトリル（無水、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）（最終濃度２００ｍＭ）に添加した。ジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、５当量）を添加し、その直後に、１．１当量の無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）を添加した。反応物を室温で１６時間撹拌した。混合物を濾過して未反応の出発材料を除去し、溶媒を真空内で除去した。この材料をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、所望の生成物を分取ＲＰＬＣによって精製した。
【０３０６】
Ｎ−Ａｃ−Ｋｙｎ（Ｎ−Ａｃ−ＤＬ−キヌレニン）６ｂ
ＤＬ−キヌレニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、上記の一般手順によってアセチル化した。ＤＬ−キヌレニン（８００ｍｇ、３．８４ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのアセトニトリルに添加して、薄黄色の懸濁液を形成した。ＤＩＰＥＡ（５当量）及びＡｃ２Ｏ（１．１当量）を添加した。室温で１６時間撹拌した後、懸濁固体の大部分を溶解し、溶液が暗黄色／橙色になった。分取クロマトグラフィーによる分離及び単離画分材料の一部分の凍結乾燥により、４２８ｍｇのふわふわした淡黄色の固体を得た。得られた生成物（ＲＰ−ＵＰＬＣによる純度９９％、収率４４％）を、ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ＝２５１．１０３）及びＮＭＲによって特徴付けた。
【０３０７】
ＵＶによるＴＬＣ分析及びニンヒドリン染色により、出発材料の不在が確認された。
【０３０８】
Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ（Ｎα−アセチル−Ｎ´−ホルミル−キヌレニン）７ｂ
Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫを、Ｃ．Ｅ．Ｄａｌｇｌｉｅｓｈ  ｉｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５２，１３７−１４１によって報告された文献プロトコルを適応させることによって合成した。ギ酸（Ｓｉｇｍａ、９８〜１００％、３６０μＬ）と無水酢酸（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、無水９９％、１０５μＬ）との混合物を３０分間撹拌し、その後、１００ｍｇのＮ−アセチル−ＤＬ−キヌレニンを添加した。２時間反応させた後、ＬＣ／ＭＳ分析は、出発材料の存在を依然として示し、この時点で、ギ酸（１２０μＬ）及び無水酢酸（３５μＬ）の第２の添加を行って、反応を完了させた。第２の添加の１時間後のＬＣ／ＭＳ分析により、出発材料の不在及び所望の生成物形成が示された。反応混合物を１５ｍＬの水に室温で添加し、冷蔵した。淡茶色の結晶が一晩で生じた。これらを濾過し、氷冷水で洗浄し、湿潤残渣を凍結乾燥させて、ふわふわした淡茶色の固体として１０ｍｇの所望の生成物を得た。得られた生成物（ＲＰ−ＵＰＬＣによる純度９０％、収率９．０％）を、ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ＝２７９．０９８）及びＮＭＲによって特徴付けた。
【０３０９】
Ｏｉａ（オキシンドイル（ｏｘｉｎｄｏｙｌ）−ＤＬ−アラニン）ジアステレオマー４ａ
Ｏｉａを、Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．，Ｋａｗａｋｉｓｈｉ，Ｓ．ｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９４，７，１８５−１９０によって報告された文献プロトコルを適応させることによって合成した。ＤＭＳＯ（９００μＬ）及びフェノール（１００ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を５ｍＬの３７％ＨＣｌと周囲温度で予混合した。ＤＬ−Ｔｒｐ（１．０ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの氷酢酸中に懸濁させ、混合物に添加した。反応物を周囲温度で撹拌した。進行をＬＣ−ＭＳによって周期的に確認した。４時間後、ＬＣ／ＭＳにより、出発材料の喪失及び所望の生成物塊での２つの密接に溶出するピークの形成が確認された（ｍ／ｚ＝２２１）。真空下での溶媒の除去により、暗茶色のシロップを得た。この物質を４ｍＬのＤＭＦ中に溶解した。ジアステレオマーの分離を試みることなく、分取−ＲＰＬＣを使用して所望のジアステレオマー生成物の精製を行った。所望の画分を合わせ、凍結乾燥させて、３０５ｍｇのふわふわした白色の固体を得た。得られた生成物（収率２８％）を、ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ＝２２１）によって特徴付けた。
【０３１０】
Ｎ−Ａｃ−Ｏｉａ（Ｎ−アセチル−オキシ−インドイル（ｉｎｄｏｙｌ）アラニン）ジアステレオマー４ｂ
オキシ−インドイル（ｉｎｄｏｙｌ）−ＤＬ−アラニンジアステレオマー４ａ（１００ｍｇ）を上記の一般手順に従ってアセチル化した。１６時間後、ＬＣ／ＭＳにより、反応が完了したことが確認された。溶媒を真空内で除去した。分取クロマトグラフィー及び凍結乾燥により、５６ｍｇのふわふわした白色の粉末を得た。ジアステレオマーの分離を試みなかった。得られたジアステレオマー生成物（ＲＰ−ＵＰＬＣによる純度８９％、収率４７％）を、ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ＝２６３．１０２）及びＮＭＲによって特徴付けた。ＵＶによるＴＬＣ分析及びニンヒドリン染色により、出発材料の不在が確認された。
【０３１１】
Ｎ−Ａｃ−５−ＨＴＰ（Ｎ−アセチル−５−ヒドロキシ−トリプトファン）８ｂ
５−ＨＴＰ  ８ａ（１５０ｍｇ）を上記の一般手順に従ってアセチル化した。１６時間後、ＬＣ／ＭＳにより、反応が完了したことが確認された。溶媒を真空内で除去した。分取クロマトグラフィー及び凍結乾燥により、５８ｍｇのふわふわした白色の粉末を得た。得られた生成物（収率３２％）を、ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ＝２６３．１）及びＮＭＲによって特徴付けた。ＵＶによるＴＬＣ分析及びニンヒドリン染色により、出発材料の不在が確認された。
【０３１２】
２，２´−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）酸化ストレス
ＡＡＰＨ（Ｃａｌｂｉｏ  Ｃｈｅｍ、９９．８％）を使用して、アルキル過酸化物による酸化的分解をモデル化した。０．３ｍＭのＮＡＴ±５ｍＭのＬ−Ｍｅｔ（ｐＨ５．５）を含むヒスチジン緩衝液及び非ヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．５）をＡＡＰＨ水溶液で処理して、最終濃度１．０ｍＭのＡＡＰＨにした。等体積のＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏを対照試料に添加した。試料を４０℃で１６時間インキュベートした。酸化をＬ−Ｍｅｔの添加によってクエンチして、最終濃度２０ｍＭにした。クエンチ溶液の添加後、最終ＮＡＴ濃度は０．２ｍＭであった。
【０３１３】
フェントンストレス
ＦｅＣｌ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、純度９８％）及びＨ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ２Ｏ中３０ｗ／ｗ％）を、０．３ｍＭのＮＡＴ±５ｍＭのＬ−Ｍｅｔ（ｐＨ５．５）を有するヒスチジン含有緩衝液（ｐＨ５．５）に添加して、それぞれ、最終濃度０．２ｍＭ及び１０ｐｐｍにした。Ｈ２Ｏ２の添加時、バイアルを短時間ボルテックスし、４０℃で３時間インキュベートした。酸化をＬ−Ｍｅｔの添加によってクエンチして、最終濃度１００ｍＭにした。クエンチ溶液の添加後、最終ＮＡＴ濃度は０．２ｍＭであった。
【０３１４】
光ストレス
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＩＣＨ）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐによって推奨されている原薬／製品光安定性試験を行うように設計された光ボックス［Ａｔｌａｓ  ＳｕｎＴＥＳＴ  ＣＰＳ＋Ｘｅｎｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｂｏｘ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）］を利用して、光ストレスをＮＡＴ含有試料に供した。ＩＣＨ光安定性試験を、１２０万ｌｕｘ時間の白色光及び２００Ｗ時間／ｍ２のＵＶ光と定義し、光ボックスを、２４時間の期間にわたってストレスを供するようにプログラムした。０．３ｍＭのＮＡＴ±５ｍＭのＬ−Ｍｅｔを含有するヒスチジン緩衝液及び非ヒスチジン緩衝液を滅菌ガラスバイアルにアリコートした（１ｍＬ／バイアル）。バイアルに蓋をし、それらを横にして光ボックス内に置いて、光源への曝露を最大限にした。各緩衝液条件の対照試料をホイルで覆い、曝露持続時間にわたって光ボックス内に置いた。他のストレスモデルとの一貫性を保つために、ＨＰＬＣ分析前に、緩衝溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏで希釈して、最終ＮＡＴ濃度０．２ｍＭにした。
【０３１５】
熱ストレス
１．０ｍＭのＮＡＴを含有するヒスチジン緩衝液及び非ヒスチジン緩衝液を滅菌ガラスバイアルにアリコートした（５ｍＬ／バイアル、１つの緩衝液当たり６つのバイアル）。ストレス中にバイアルを指示された温度で暗ボックス内に保管し、分析まで保管のために−７０℃に移した（時点を５ヶ月間にわたって月１回取った）。各緩衝溶液の初期時点の試料を−７０℃に即座に移した。分析前に、試料を解凍し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏで希釈して、最終ＮＡＴ濃度０．２ｍＭにした。
【０３１６】
ＨＰＬＣ分析
ＮＡＴ及びＮＡＴ分解物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８  ３．５μｍ、４．６×７５ｍｍ逆相カラムを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣまたはＷａｔｅｒｓ  Ｈ  Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ上で分離した。カラム温度を、サーモスタットコントローラーによって３０±０．８℃で保持した。ＨＰＬＣ及びＵＰＬＣに使用した勾配を、それぞれ、表５及び表６に列記する（注：ＵＰＬＣ上のより短い勾配は、より初期の保持時間に順応するように設計されており、１．０ｍＬ／分の流速でのより広い範囲のシステム圧力のため、カラム再平衡化期間が延長された）。ＮＡＴ分解産物を２４０ｎｍで検出した。標準帯域幅設定（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣでは８ｎｍ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｈ−クラスでは４．８ｎｍ）を各機器での分析に使用した。オートサンプラーを５±３℃で維持した。１０ｎｍｏｌのＮＡＴ及び／またはＮＡＴ分解物（大半の試料では５０μＬ）を分析のためにカラムに注入した。クロマトグラムを、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを使用して処理した。
表５．Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣでの勾配
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表６．Ｗａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣでの勾配
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【０３１７】
ＬＣ／ＭＳによる試料の分析
ＬＣ／ＭＳ試料分析を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計とともにＷａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣ及び上述のクロマトグラフィー条件を使用して行った。全走査精密質量データを、５０〜８００ｍ／ｚの範囲にわたって陽イオンモードで１５，０００の分解能で収集した。ＭＳ２を、ダイナミックエクスクルージョンを無効にして上位３つのイオン上で行った。
【０３１８】
結果
ストレス試料のパネル設計
ＮＡＴ安定性を、４つの異なる代表的なストレス：１）医薬品生産中のステンレス鋼との接触に起因する鉄浸出によって引き起こされる潜在的な酸化を模倣するフェントン化学反応（Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ２＋）、２）ポリソルベート洗剤の分解によって産生されるアルキル過酸化物を模倣するＡＡＰＨストレス、３）光安定性を評定するために医薬業界で使用される強烈な光ストレスであるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＩＣＨ）光ストレス（１２０万ｌｕｘ時間、２００ｗ時間／ｍ２）、及び４）バイオ医薬品の長期分解をシミュレートするための加速熱ストレスへの曝露後に評定した。異なるストレスモデルによってもたらされる変化間の比較を行うことができるように、各ストレスの強度を、典型的な貯蔵寿命及び製造と比較して強烈であり、かつ互いに同様の分解強度であるように選択した。これらの研究を、ｍＡｂに典型的に使用される製剤と一致する製剤で行った。ヒスチジンが酸化的に活性であるため、適切な場合、ヒスチジン含有緩衝液及び非ヒスチジン含有緩衝液の両方を用いた。
【０３１９】
方法開発
Ｃ１８カラムを使用した逆相クロマトグラフィーを使用して、ＮＡＴ分解を監視した。勾配条件を、ＮＡＴ及びＮＡＴ分解物の好適な分解能を確保するように選択した（図８Ａ）。溶出物を２４０ｎｍで監視し、波長を、低レベル種の適切な感度を確保するように選択した［いくつかの種はより高い波長（例えば、２８０ｎｍ）及びシグナルでは検出されず、ノイズがより低い波長（例えば、２１４ｎｍ）で下がった。図８Ｂを参照のこと］。最終クロマトグラフィー条件により、関連範囲にわたる線形応答がもたらされた：０．０１〜１．０ｍＭのＮＡＴ（図１３）及びＡＡＰＨ−ストレスＮＡＴ試料中１〜２０倍希釈の分解物（図１４）。ＮＡＴ及び主な分解物のオートサンプラー安定性を５℃で最大１２時間確立した（データ示さず）。
【０３２０】
タンパク質含有試料をグアニジン中で希釈し、タンパク質を限外濾過（３０ｋＤａの分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎスピンフィルター）により除去した。不完全な回収がいくつかのｍＡｂにおいてカオトロープの不在下で観察され、ＮＡＴとタンパク質との間の非共有相互作用が生じ得ることを示唆した。ＮＡＴがヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）に結合することが以前に実証されている（Ａｎｒａｋｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２００４．１７０２（１）：ｐ．９−１７）が、現在に至るまでｍＡｂに結合することは報告されていない。最終試料調製条件を使用して、ＮＡＴの回収率は、３つの試験した抗体／抗体誘導体では９４〜９９％であり、ＮＡＴ分解物の回収率は、９８〜１００％であった（データ示さず）。
【０３２１】
ストレス試料パネルの分析
６つの新たな主ピーク及び複数の微小ピークによって表される複数のＮＡＴ分解物が全てのストレス条件で観察された（図８Ａ、ＮＡＴ分解物構造については図７を参照のこと）。各試料の全ＮＡＴ分解を、ＮＡＴピーク面積を各ストレスモデルの対照試料と比較することによって計算した（表７）。ＮＡＴ分解は、３％（熱ストレス、非Ｈｉｓ緩衝液）〜８３％（ＩＣＨ光ストレス、Ｈｉｓ緩衝液）の範囲であった。
表７．モデルストレス条件及び対応するＮＡＴ分解
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＊星印のピークは、ＩＣＨ光ストレス下で観察されたピークのみを表す。
【０３２２】
フェントンストレス及びＡＡＰＨストレスについておよそ３０〜４０％のＮＡＴ分解が全ての試験された条件下で観察され、分解物のレベル及び分布は、概して、緩衝液中のヒスチジンの存在とは無関係であった（図８Ａ、ＮＡＴ分解物構造については図７を参照のこと）。ＩＣＨ光ストレス下にある間、ＮＡＴは、より高い緩衝液感度を受けた（すなわち、ヒスチジン製剤と非ヒスチジン製剤との間の差異）（図８Ａ）。光ストレス下での非ヒスチジン緩衝液中のＮＡＴの安定性がＡＡＰＨストレス及びフェントンストレスと量的に同様のＮＡＴ分解をもたらした（２８％対３３〜４１％損失）一方で、分解物の分布が変化し、新たなピークが観察された（図８Ａの「＊」で指示されたピークを参照のこと）。著しくより高いレベルの分解（８０％超）が光ストレス下のヒスチジン緩衝液で観察され、新たなピークとともに、上昇レベルの以前に観察されたＮＡＴ分解物をもたらした（図８Ａ）。
【０３２３】
全体的に、ＩＣＨ光ストレス条件下で観察された微小ピーク（図８Ａの「＊」で指示されたピーク）を除いて、分解試料パネルにおけるプロファイル間の特筆すべき一貫性が観察された。これは、過酸化水素／ヒドロキシルラジカル（フェントンストレス）及びアルキル過酸化物（ＡＡＰＨ）が共通の経路によりＮＡＴを分解し得る一方で、ＵＶ光によって誘導された反応性酸素種（ＲＯＳ）（Ｈ２Ｏ２、一重項酸素、超酸化物）が追加の分解経路を提示し得ることを示唆する。ヒスチジンの存在がＩＣＨ光条件下でのＮＡＴ分解を増大させたという観察は、ヒスチジン自体が光反応性であり、それ故に、ＲＯＳレベル及び種類を増加させることができるという報告と一致する（Ｓｔｒｏｏｐ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，２０１１．１００（１２）：ｐ．５１４２−５５）。試験したこれらの多様なストレス条件下で観察された共通のＮＡＴ分解プロファイルを考慮して、薬物製品におけるいずれのＮＡＴ分解もこれらの同じ種の生産をもたらす可能性がある。
【０３２４】
分解物の特定
次に、分解したＮＡＴ分解物種の同一性を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して調査した。主ピークの分子イオンを表８に列記する（ＬＣ／ＭＳにより適切なシグナル強度を呈した全てのピークの完全なリストは表９に含まれている）。主ピーク２、３、及び４は、２６３．１（ＮＡＴ＋１６）のｍ／ｚを有し、ＮＡＴの単一酸化事象と一致した。主ピーク２及び３が監視した全てのストレス及び吸光度波長にわたって同様のＭＳ１及びＭＳ２スペクトル（図１５Ａ）及び一貫した比率を有したため（図８Ｂ）、これらのピークをＮ−Ａｃ−Ｏｉａ  ４ｂの相互変換ジアステレオマーとして暫定的に割り当てた（構造については図７を参照のこと）。トリプトファンの過酸化水素処理後の類似Ｔｒｐ種が報告されている（Ｓｉｍａｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈ．Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，１９９８．４６（２）：ｐ．４９０−４９８）。この割り当ては、オキシインドリルアラニン（Ｏｉａ）含有ペプチドを示すとして以前に報告された１３０．１でのＭＳ２イオンの観察によってさらに支持される（Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８．）（図１５Ａ）。
表８．ＮＡＴ分解物の特定
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表９．ＮＡＴ分解物種の同一性
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【０３２５】
主ピーク５及び６は、それぞれ、２７９．１０（ＮＡＴ＋３２）及び２５１．１０（ＮＡＴ＋４）のｍ／ｚを有し、２８０ｎｍで吸光度を有しなかったか、または弱い吸光度しか有しなかった（図８Ｂ）。インドール環の損失を示唆するこれらの特性は、主な既知の生理学的分解物Ｔｒｐ、ＮＦＫ（７ａ、Ｔｒｐ＋３２）、及びＫｙｎ（６ａ、Ｔｒｐ＋４）のうちの２つと一致する（Ｄｒｅａｄｅｎ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２．７（７）：ｐ．ｅ４２２２０）（構造については図７を参照のこと）。これらの種が対応するＮ−アセチル化バージョンＮ−Ａｃ−ＮＦＫ  ７ｂ及びＮ−Ａｃ−Ｋｙｎ  ６ｂ（構造については図７を参照のこと）を表したかを評定するために、衝突誘起解離を使用して、両種のＭＳ２スペクトルを生成した。各々、キヌレニンの特徴として以前に報告された（Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８）強いシグナルをｍ／ｚ＝１７４．１で示した（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）。この情報に基づいて、これらの種を、それぞれ、Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ  ７ｂ及びＮ−Ａｃ−Ｋｙｎ  ６ｂとして暫定的に割り当てた（構造については図７を参照のこと）。
【０３２６】
これらの種の同一性を確認するために、真正標準物Ｎ−Ａｃ−Ｏｉａ  ４ｂ、Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ  ７ｂ、及びＮ−Ａｃ−Ｋｙｎ  ６ｂを、上述の合成手順を使用して合成した。ストレスＮＡＴ試料におけるピークのクロマトグラフィープロファイルもＭＳ２プロファイルもいずれも真正試料（図９及び図１５Ａ〜１５Ｃ）のピークと整列し、これらのピークの特定をさらに支持した。
【０３２７】
５−ＯＨ−Ｔｒｐ  ８ａがＴｒｐの主な生理学的異化産物であることを考慮して、合成標準物Ｎ−Ａｃ−５−ＯＨ−Ｔｒｐ  ８ｂ（構造については図７を参照のこと）も調製して、この種がＮＡＴの主な分解経路に沿っているかを評定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる真正Ｎ−Ａｃ−５−ＯＨ−Ｔｒｐ  ８ｂ標準物の分析により、保持時間も質量分析データも観察されたＮＡＴ分解物と一致しなかったため、この化合物がストレスＮＡＴ試料のうちのいずれか中に任意の有意な量で存在しなかったことが示された（図９及び図１５Ｄ）。インドール環のベンゼン部分で酸化されたＴｒｐ誘導体に由来するＭＳ２断片イオン１４６．１（Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１．４６（１０）：ｐ．１０３０−８）は、わずかに酸化されたＮＡＴ分解物種のうちのいずれにも観察されず、最小レベルのヒドロキシル化しかＮＡＴ酸化中にインドール環の４、５、６、または７位で生じなかったことを示唆した（図１５Ａ及び図１５Ｄ）。
【０３２８】
ピーク群１及びピーク４におけるわずかに酸化されたＮＡＴ種をＮ−Ａｃ−ＰＩＣ  ２ｂの立体異性体（構造については図７を参照のこと）として暫定的に特定し、ピーク群１における二重に酸化されたＮＡＴ種を、同様に、それぞれ、Ｎ−Ａｃ−３ａ、８ａ−ジヒドロキシＰＩＣ  ３ｂの立体異性体として暫定的に割り当てた。これらの分子は、ＮＡＴ含有ＨＳＡ製剤の長期熱ストレス（２５℃で３年間）時に報告された唯一のＮＡＴ分解物であり（Ｆａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，２０１１．１２１８（４１）：ｐ．７３１６−２４）、我々の研究で観察されたＭＳ２フラグメンテーションパターンは、その報告と一致した（図１５Ｅ及び図１５Ｆ）。さらに、ピーク４は、Ｈ，１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３ａ−ヒドロキシピロロ［２，３−ｂ］−インドール−２−カルボン酸（ＰＩＣ）２ａが蛍光性の唯一の共通のＴｒｐ分解物のうちの１つであるという報告（Ｓｉｍａｔ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，１９９８．４６（２）：４９０−４９８）と一致する、これらの研究で蛍光検出を使用して観察された唯一のＮＡＴ分解物であった（図８Ｂ）。これらの種の合成標準物を調製した場合、これらの特定を確定的に決定することができず、二重に酸化されたＮ−Ａｃ−ジオキシインドリルアラニン（Ｎ−Ａｃ−ＤｉＯｉａ）も不完全に分解されたピーク群１に存在することが可能なままである。ピーク割り当てを表８に要約する。
【０３２９】
これらの研究で観察されたＮＡＴ分解物（Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣ、Ｎ−Ａｃ−Ｏｉａ、Ｎ−Ａｃ−ＮＦＫ、Ｎ−Ａｃ−Ｋｙｎ、及びＮ−Ａｃ−２ａ，８ａ，−ジヒドロキシ−ＰＩＣ）は、過酸化水素での処理によって酸化された遊離トリプトファンについてＳｉｍａｔらによって報告されたもの（ＰＩＣ、Ｏｉａ、ＮＦＫ、Ｋｙｎ、ＤｉＯｉａ、及び５−ＯＨ−Ｔｒｐ）と大いに一致した。（Ｓｉｍａｔ，Ｔ．Ｊ．Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，１９９８．４６（２）：ｐ．４９０−４９８）。ペプチド及びタンパク質中のトリプトファン分解物の決定的な特定が限定されている（多くのトリプトファン誘導体の等圧性質がペプチド及びタンパク質レベルでの分解物の特定を複雑にし、個々の残基の単離が分解をもたらし得るため）が、ペプチド／タンパク質の文献は、ＮＡＴ研究と同様に一致する（Ｓｉｍａｔ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，１９９８．４６（２）：ｐ．４９０−４９８、Ｆｅｄｏｒｏｖａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１０．１０（１４）：ｐ．２６９２−７００、Ｌｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２０１４．８６（１４）：ｐ．６８５０−７、Ｒｏｎｓｅｉｎ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２００９．２０（２）：ｐ．１８８−９７）。注目すべき１つの不一致は、５−ＯＨ−Ｔｒｐであり、これは、インビボでのＴｒｐの主な分解物（トリプトファンヒドロキシラーゼ経路を介する）であり、遊離ＴｒｐについてのＳｉｍａｔらによる研究で観察されたが、同じ過酸化水素条件下でのトリペプチドＡｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａの酸化時に微量レベルでしか観察されず、調査されたペプチド及びタンパク質の文献では明確に特定されず、ＮＡＴについての我々の研究では観察されなかった。
【０３３０】
総合すれば、これは、（ＮＡＴ及びペプチド／タンパク質にあるような）アミド化Ｎ末端を含むＴｒｐ誘導体の酸化感受性が非酵素的条件下で遊離Ｔｒｐと比較して５位でより低いことを示唆する。
【０３３１】
他の賦形剤及びタンパク質のＮＡＴ分解への影響
次に、他の賦形剤のＮＡＴ分解への影響を評定した。特に興味深いのは、抗酸化剤として薬物製品製剤に一般に添加される別の抗酸化剤であるＭｅｔの存在である。概して、緩衝液製剤への５ｍＭのＭｅｔの包含により、全ＮＡＴ酸化の全体的な減少がもたらされ（表７、図１０）、これは、Ｍｅｔにおけるチオエーテル部分が酸化シンクとしての役割を果たすことができるという仮説と一致する。ＭｅｔのＮＡＴ安定性への影響は、酸化モデル間で異なり、Ｍｅｔは、ＡＡＰＨモデルにおいてＮＡＴ安定性に適度の改善（緩衝液に応じて、４〜８％の全ＮＡＴ損失）をもたらし、ＩＣＨ光ストレス条件下でわずかにより良好な改善（１０〜１６％）をもたらし、フェントンモデルにおいて著しい改善（２５％）をもたらした（表８）。フェントン条件下でのＭｅｔで製剤化された際のＮＡＴ酸化の著しい減少は、過酸化水素をクエンチするＭｅｔに起因し得る（Ｊｉ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，２００９．９８（１２）：ｐ．４４８５−５００）。Ｍｅｔ製剤化ストレス試料で観察された主な種の分布がＭｅｔで製剤化されていないものと変わらなかったため、Ｍｅｔの添加がモデル系の各々における酸化機構を変化させたようには見えない（データ示さず）。
【０３３２】
低濃度のタンパク質のＡＡＰＨ誘導ＮＡＴ分解への影響も分析した。２つの抗体（タンパク質１及びタンパク質２）を緩衝液中で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．３ｍＭのＮＡＴで製剤化した（約４５：１モル比のＮＡＴ：タンパク質）。ＡＡＰＨストレス時、ＮＡＴ分解のレベルは、酸化体種の分布のように、タンパク質含有溶液とタンパク質不含溶液との間で大いに一致した（ＮＡＴピーク面積の約４０％損失）（図１１）。これらの結果は、低レベルのタンパク質の存在が試験した酸化的（アルキル過酸化物誘導）ストレス条件下でＮＡＴ分解レベル／経路に本質的に影響を与えないことを示唆する。
【０３３３】
薬物製品製剤中のＮＡＴのリアルタイム安定性
次に、このモデル経験をもとに、ｍＡｂの製造及び保管時に生じると予期されるＮＡＴ酸化の量を調査した。図１２は、ＡＡＰＨモデルストレス系と、ＮＡＴ、Ｍｅｔ、及びｍＡｂ製剤に典型的な他の賦形剤と共製剤化された抗体１５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＭ）との比較を図解する。初期時点、−２０℃及び５℃で６ヶ月間（典型的な保管条件を代表するもの）、及び２５℃で６ヶ月間（速安定性条件を代表する）の結果を示す。酸化レベルは、製造直後かつ試験した典型的な保管条件下でわずかであった。２５℃で６ヶ月後、いくらかの分解が観察された（全ＮＡＴ損失＝１６．８％）。興味深いことに、対応するビヒクルは、著しくより低いＮＡＴ分解を示し、タンパク質含有試料が２５℃で３ヶ月後に７．５％のＮＡＴ損失を有した一方で、対応するビヒクルは、１％のＮＡＴ損失しか示さなかった。より高い温度でさえも（図１２）、ビヒクルは、最小限のＮＡＴ分解しか示さず、高濃度のタンパク質の存在が、ある場合には、加速熱条件下でＮＡＴ分解を低減させることができることを示唆した。加速安定性試料中に存在する５つの主な種は、ストレスモデルで特定された主な種（図１２）と一致し、これらのモデルが薬物製品試料におけるＮＡＴ分解経路を忠実に再現することを示唆した。
【０３３４】
要約すると、酸化的ストレスに対する保護をタンパク質治療薬中のＴｒｐ残基に提供することで既知の抗酸化剤であるＮ−Ａｃ−トリプトファンの安定性を評定するためのクロマトグラフィー法を使用して、ＮＡＴが、多様なストレス条件下及び異なるモデル製剤におけるストレスの種類とは大いに無関係であるＮ−Ａｃ−Ｏｉａ、Ｎ−Ａｃ−ＰＩＣ、Ｎ−Ａｃ−Ｋｙｎ、及びＮ−Ａｃ−ＮＦＫ（構造については図７を参照のこと）を含む一組の共通の分解物に分解することが示され、これは、以前に報告されていない所見である。これらの分解物は、概して、研究したストレスモデルにおけるＮＡＴ分解が最も一般的な生理学的Ｔｒｐ分解物である５−ヒドロキシトリプトファンのＮ−アセチル化バージョンの産生をもたらさなかったことを除いて、Ｔｒｐ酸化についての文献と一致する。理論に拘束されることなく、これは、非酵素的条件下で、ＮＡＴ（及び恐らく、拡大解釈すれば、タンパク質中のＴｒｐ残基）がＴｒｐ異化と同じ中間体を介して分解しないことを示唆する。実際には、理論に拘束されることなく、このデータは、ＮＡＴの酸化がインドール環の２位及び３位で主に生じることを示唆する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【国際調査報告】
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