【手続補正書】
【提出日】平成19年6月1日(2007.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えハロヒドリンデハロゲナーゼ（ＨＨＤＨ）ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２の野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．のＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも１．４倍高いＨＨＤＨ活性でエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートをエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへと変換可能であり、該ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡまたはＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＣまたはＳまたはＫのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、５８位におけるＫ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＳまたはＧのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２４９位におけるＹ、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
７５位におけるＩを少なくとも含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
１５３位におけるＳを少なくとも含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
１３４位におけるＡを少なくとも含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
１８６位におけるＹを少なくとも含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号６６、配列番号６８、配列番号８０、配列番号８４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１１４、配列番号１１８、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１７０、配列番号１８０、配列番号２００、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２７０、配列番号４２２、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４７６、配列番号５２０、配列番号７０２、配列番号７２６、配列番号７２８、配列番号７３０、配列番号７３４、配列番号７３６、配列番号７３８、配列番号７４０、および配列番号７４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号６６、配列番号６８、配列番号８０、配列番号８４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１１４、配列番号１１８、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１７０、配列番号１８０、配列番号２００、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２７０、配列番号４２２、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４７６、配列番号５２０、配列番号７０２、配列番号７２６、配列番号７２８、配列番号７３０、配列番号７３２、配列番号７３４、配列番号７３６、配列番号７３８、配列番号７４０、または配列番号７４２に対応するアミノ酸配列を有し、該ポリペプチドのアミノ酸残基のうちの５％未満は、該配列番号の配列と比較した場合に保存的に変異している、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２の野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．のＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも２倍高いＨＨＤＨ活性でエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートをエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへと変換可能であり、該ポリペプチドは、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１００、配列番号７２６、配列番号７２８、配列番号７３０、配列番号７３２、配列番号７３４、配列番号７３６、配列番号７４０、および配列番号７４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２の野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．のＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも１００倍高いＨＨＤＨ活性でエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートをエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへと変換可能であり、該ポリペプチドは、配列番号１００、配列番号７２６、配列番号７３０、配列番号７３２、配列番号７３４、および配列番号７３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２の野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．のＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも５００倍高いＨＨＤＨ活性でエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートをエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへと変換可能であり、該ポリペプチドは、配列番号７２６または配列番号７３０のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号４、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号１１４、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１７０、または配列番号２７０と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１０、配列番号１４、または配列番号６８、配列番号１１８、配列番号１６４、配列番号１６６、または配列番号１８０と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１１０、配列番号１６２、配列番号２６２、配列番号４２２、配列番号４４０、または配列番号５２０と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１１６または配列番号４４８と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０、または配列番号４７６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２００と少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号４４２と少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号７０２と少なくとも８８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項２に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、核酸配列によってコードされ、該核酸配列は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号８３、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１６１、配列番号１９９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号４２１、配列番号４３９、配列番号４４１、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４７５、配列番号５１９、配列番号７０１、配列番号７２５、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、および配列番号７３７に対して相補的である別の核酸配列の実質的に全長にわたって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２に対応するアミノ酸配列を有するが、Ｓ２Ｔ；Ｔ３ＡまたはＴ３Ｐのいずれか；Ａ４Ｖ；Ｖ６Ｄ；Ｖ９ＩまたはＶ９Ｆのいずれか；Ｋ１０Ｌ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１４Ｓ；Ｍ１５Ｋ；Ｇ１６Ｃ；Ｓ１７ＴまたはＳ１７Ｒのいずれか；Ｒ２０Ｓ、Ｒ２０ＣまたはＲ２０Ｋのいずれか；Ａ２４Ｔ；Ｈ２６Ｑ；Ｖ２８Ｆ；Ａ２９Ｔ；Ｃ３０Ａ；Ｈ３１Ｌ；Ｅ３３Ｇ；Ｓ３４Ｒ；Ｆ３５Ｌ；Ｋ３６Ｎ；Ｑ３７Ｈ；Ｅ４０Ｄ；Ｆ４４Ｌ；Ａ４５Ｐ；Ｔ４７ＰまたはＴ４７Ａのいずれか；Ｋ５２Ｎ；Ｍ５４Ｖ；Ｓ５５Ｒ；Ｅ５６Ｄ；Ｅ５８Ｋ；Ｅ６１ＧまたはＥ６１Ｄのいずれか；Ｉ６３Ｖ；Ｑ７２Ｒ；Ｖ７５Ｉ；Ｌ７６Ｐ；Ｓ７８Ｃ；Ｆ８２Ｙ；Ｐ８４ＳまたはＰ８４Ｌのいずれか；Ｅ８５Ｑ；Ｋ９１Ｅ；Ａ９３Ｄ；Ｅ９５ＱまたはＥ９５Ｇ；Ｄ９６Ｎ；Ｒ１０７Ｋ；Ｖ１１２Ａ；Ａ１１４ＴまたはＡ１１４ＧまたはＡ１１４Ｓのいずれか；Ｖ１１５Ａ；Ｓ１１７Ｐ；Ｋ１２０Ｎ；Ｋ１２１Ｅ；Ｒ１２２Ｐ；Ｈ１２６Ｒ；Ｉ１３０Ｖ；Ａ１３３Ｓ；Ｔ１３４ＡまたはＴ１３４Ｖ；Ｆ１３６ＬまたはＦ１３６ＷまたはＦ１３６Ｖ；Ｗ１３９Ｈ；Ｌ１４２ＩまたはＬ１４２Ｒ；Ｔ１４４Ｓ；Ｔ１４６Ｓ；Ａ１５２Ｔ；Ｃ１５３Ｓ；Ｔ１５４ＳまたはＴ１５４Ａのいずれか；Ｉ１６８Ｖ；Ｐ１６９Ｔ；Ｙ１７７Ｆ；Ｌ１７８Ｖ；Ｓ１８０Ｉ；Ｅ１８１ＧまたはＥ１８１Ｉ；Ｐ１８４Ｋ；Ｆ１８６Ｙ；Ｔ１９４Ｉ；Ｈ１９８Ｎ；Ｖ１９９Ｍ；Ｋ２１５Ｅ；Ｖ２３６Ｇ；Ｆ２３７Ｖ；Ｗ２３８Ｌ；Ａ２４０Ｔ；Ｍ２４５ＩまたはＭ２４５ＡまたはＭ２４５Ｖのいずれか；Ｗ２４９Ｙ；Ｍ２５２ＶまたはＭ２５２Ｉ；およびＥ２５４Ｖ；からなる群より選択される１つ以上の置換を有する、ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドはさらに、生成物であるエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの存在下でＨＨＤＨ活性を維持することが可能であり、かつ該ポリペプチドはさらに、配列番号２と整列された場合に、Ａ４Ｖ、Ｆ８２Ｙ、Ｔ１３４Ｖ、Ｆ１３６Ｗ、Ｆ１３６Ｖ、Ｌ１４２Ｒ、Ｌ１７８Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｗ２４９ＹおよびＭ２５２Ｉからなる群より選択される残基変化のうちの１つ以上を有する、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜請求項２２のうちのいずれか１項に記載されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、アミノ酸位置５においてイソロイシンをコードするＡＴＴ、アミノ酸位置３６においてリジンをコードするＡＡＧ、アミノ酸位置６３においてイソロイシンをコードするＡＴＴ、アミノ酸位置９５においてグルタミン酸をコードするＧＡＧ、および、アミノ酸位置１８８においてプロリンをコードするＣＣＣからなる群より選択される１つ以上のコドンを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
プロモーターに作動可能に連結された請求項２３に記載されるポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載される発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項２７】
ＨＨＤＨポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、
（ａ）請求項２６に記載の宿主細胞を、該ＨＨＤＨポリペプチドの産生のために適切な条件下で培養する工程、および
（ｂ）該ＨＨＤＨポリペプチドを回収する工程、
を包含する、方法。