(57)【要約】  本開示は、一般に、周囲条件下で、ＲＮＡウイルスを含有する生物学的試料を不活化および乾燥保存するための方法および装置に関する。生物学的試料からＲＮＡを採取し回収する方法およびその後のウイルスの分析方法も提供される。【選択図】図４
2019501640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡウイルスを含有する生物学的試料の不活化および乾燥保存の方法であって、
組成物が組み込まれた不溶性の乾燥固体マトリックスを提供することであって、前記組成物が少なくとも１つのタンパク質変性剤、乾燥状態でその中に含浸された少なくとも１つの酸または酸性滴定された緩衝液試薬を含む、提供することと、
前記生物学的試料と前記乾燥固体マトリックスとを接触させて、前記生物学的試料の細胞を効果的に溶解させ、無傷の状態で前記ＲＮＡを保存することと、
前記固体マトリックス上で前記生物学的試料を乾燥させることと、
周囲条件下で乾燥状態の前記固体マトリックス上に前記生物学的試料を保存することであって、前記試料が感染性ではなく、その前記ＲＮＡが無傷の状態に維持される、保存することと
を含む方法。
【請求項２】
前記酸が、酢酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、塩酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、酸化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−Ｏ−ＨＣｌ）、硫酸、硝酸、バニリン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、ＵＶ保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、キレート剤、還元剤またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物がＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、三リン酸塩、ピロリン酸塩、バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＣＲ）またはピロリン酸ナトリウムのうち少なくとも１つを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が血液である、請求項１乃至６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡウイルスが血液媒介ウイルスである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記血液媒介ウイルスが、エボラウイルス、肝炎ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスまたは関連するサブグループである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記固体マトリックスから前記ウイルスＲＮＡを回収することをさらに含む、請求項１乃至９のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスＲＮＡを回収することが、前記固体マトリックスの再水和、電気溶出またはそれらの組合せを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記再水和が、水溶液、緩衝液または有機溶液を使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡウイルスの存在について生物学的試料を試験する方法であって、
組成物が組み込まれた不溶性の乾燥固体マトリックスを提供することであって、前記組成物が少なくとも１つのタンパク質変性剤、乾燥状態でその中に含浸された少なくとも１つの酸または酸性滴定された緩衝液試薬を含む、提供することと、
前記乾燥固体マトリックスに前記生物学的試料を適用することと、
前記固体マトリックス上で前記生物学的試料を乾燥させることと、
前記乾燥固体マトリックスから生物学的試料中のＲＮＡを回収することと、
ウイルスＲＮＡの存在について前記回収されたＲＮＡを分析することと
を含む方法。
【請求項１４】
前記回収工程が、前記固体マトリックスの再水和、電気溶出、前記固体マトリックスの一部の直接的な増幅反応への添加またはそれらの組合せを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
再水和が、水溶液、緩衝溶液または有機溶液を使用する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酸が、酢酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、塩酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、酸化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−Ｏ−ＨＣｌ）、硫酸、硝酸、バニリン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸またはそれらの組合せを含む、請求項１３、１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、ＵＶ保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、キレート剤、還元剤またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１３乃至１６のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項１３乃至１７のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、三リン酸塩、ピロリン酸塩、バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＣＲ）またはピロリン酸ナトリウムのうち少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的試料が血液であり、前記ＲＮＡウイルスが、エボラウイルス、肝炎ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスまたは関連するサブグループに由来するような血液媒介ウイルスである、請求項１３乃至２０のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は配列表を含み、これはＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１５年１１月１７日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、２８３５５４−１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前がつけられ、サイズは１，６０２バイトである。
【０００２】
本発明は、ＲＮＡウイルスの採取装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡウイルス、さらに具体的にはそれらの核酸は、化学的自己加水分解および酵素媒介分解のために、安定化するのが最も困難な生体分子の１つである。試料保存温度は、ＲＮＡウイルス試料の品質にとって重要な決定因子であることが多く、したがって、ＲＮＡウイルスを含有する試料は、通常、冷蔵状態（すなわち、４℃以下）で維持され、輸送される。さらに、試料を不活化することができない場合、ウイルス感染のリスクのために、ウイルス含有試料の取り扱いには危険が伴う。
【０００４】
したがって、周囲条件下でＲＮＡなどの核酸を液体状態で保存するための現在の方法では、例えば、界面活性剤、カオトロピック化合物、還元剤、遷移金属、有機溶媒、キレート剤、プロテアーゼ、ＲＮａｓｅペプチド阻害剤および抗ＲＮａｓｅ抗体の使用によるＲＮａｓｅの失活に焦点を当てている。ＲＮＡを化学的に改変してエステル交換反応および自己加水分解を防ぐことに、さらに努力が集中している。
【０００５】
ほとんどの市販のＲＮＡ保存製品は、室温で数日または数週間、液体状態でＲＮＡを保存することができるにすぎない。乾燥形態でのＲＮＡの採取および保存が成功していると主張する技術では、通常、ＲＮＡの保存の前に、まず生物学的物質（例えば、血液、血清、組織、唾液などの生物学的試料）からＲＮＡを「事前に精製」し濃縮しなければならない。
【０００６】
したがって、生物学的試料からの核酸抽出、安定化および保存を単一プロセス内に統合する方法および装置が望ましく、必要とされている。さらに、安全な取り扱いのために、ウイルスの生物学的不活化も望ましい。このような方法および装置は、周囲条件下での核酸の長期保存を可能にし、感染性物質に関連する厄介な取り扱い要件を伴わず、その後の分析のために無傷の核酸を迅速に試験または回収することを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第９０４４７３８Ｂ２号明細書
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、一般に、乾燥固体マトリックス上に採取された生物学的標本からの核酸抽出および安定化の工程を統合し、それによってウイルスが不活化されたＲＮＡウイルスの保存を可能にする方法および装置に関する。採取された試料のＲＮＡ品質は、採取、抽出、安定化ならびに保存および／または輸送の工程中に維持される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、固体マトリックス上に周囲状態で保存されたＲＮＡに対して、その後の分析に適した無傷の形態でＲＮＡを固体マトリックスから放出させる処理を行うことができる。試料中のＲＮＡウイルスの有無を決定するための方法が記載される。また、生物学的試料から核酸を抽出して保存するための本発明の固体マトリックスを使用する方法が提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、例えば血液試料中に存在するウイルスＲＮＡである。
【００１１】
化学的に修飾された多孔質膜のこれらならびに他の特徴、態様および利点は、添付の図面を参照しつつ以下の詳細な説明を読めば、さらによく理解されよう。添付の図面では、図面の全体にわたって、類似する符号は類似する部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】エボラ標本の現場採取および輸送のための疾病管理予防センター（ＣＤＣ）のガイドラインの図を提供する（従来技術）。
【図２】乾燥固体マトリックスのための１つのタイプのフレームの図示例を提供する。図２Ａは平面図であり、図２Ｂは底面図である。
【図３】乾燥固体マトリックスおよびフレームを収容するための保存スリーブの図である。
【図４】ＲＮＡウイルスを含有する生物学的試料の不活化および乾燥保存のための方法を概説するフローチャートである。
【図５】生きたエボラウイルスをスパイクされた濾紙を接種した後のウエスタンブロットによるＥＢＯＶ  Ｇ２タンパク質の検出を示す図である。
【図６】ＲＴ−ｑＰＣＲによって乾燥血液スポット溶出液から回収され検出されたＥＢＯＶ  ＰＦＵ対平均全ウイルスＲＮＡコピーを示すグラフである。
【図７】保存されていない試料のＴｒｉｚｏｌ抽出と比較して、一晩の周囲保存後の乾燥血液スポット溶出液から回収された全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ電気泳動図データおよびＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を示す図である。
【図８】濾紙上の乾燥血液スポットからの直接的なエボラＲＮＡの無抽出（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ）ＲＴ−ｑＰＣＲ検出を示すグラフである。
【図９】ＲＳＭからの等温逆転写／増幅の組合せを示すための濾紙上の乾燥血液スポットからの直接的なエボラＲＮＡの無抽出等温増幅および検出を示す電気泳動ゲルの画像である。図９ＡのカラムＡ〜Ｃは対照反応であり、カラムＤはさらに０．５μＬのヒト全血を含有した。図９ＢのカラムＥおよびＦは対照反応であり、Ｅは鋳型を含有せず、ＦはザイールエボラウイルスＲＮＡを含有した。図９ＣのカラムＧおよびＨは、前もってヒト血液およびエボラＲＮＡをスポットした洗浄ＲＳＭの反応容積であり、カラムＨはザイールエボラウイルスの追加のコピーを有し、カラムＩはヒト血液およびエボラＲＮＡをスポットした未洗浄１  ＲＳＭである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＲＮＡウイルスは、その遺伝物質中にリボ核酸（ＲＮＡ）を含むウイルスである。レトロウイルスと呼ばれる特定のＲＮＡウイルスは、ウイルスのライフサイクル中に、ＲＮＡ遺伝物質をさらにＤＮＡに変換する場合がある。エボラ出血熱、インフルエンザ、肝炎、西ナイル熱などいくつかのＲＮＡウイルスが重篤な疾患を引き起こすことが知られている。疾患に関与する注目すべきレトロウイルスには、ＨＩＶが挙げられる。ウイルス性出血熱（ＶＨＦ）とは、ウイルスのいくつかの異なるファミリーによって引き起こされる病状のグループを指す。一般的に言えば、ＶＨＦは、血液の凝固能を妨害する多くの感染症のうちの１つを表すために使用される。ＶＨＦを引き起こすウイルスは、出血性ウイルスの４つのファミリー、アレナウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルスおよびフラビウイルスに属する。アレナウイルスには、ラッサ熱ウイルスおよびマチュポ、フニン、グアナリトならびにサビア出血熱ウイルスが挙げられる。フィロウイルスには、悪名高いエボラウイルスおよびマールブルグウイルスがある。ブニヤウイルスには、リフトバレー熱（ＲＶＦ）、クリミアコンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）およびハンタウイルスが挙げられる。黄熱病およびデング熱のウイルスはフラビウイルスである。
【００１４】
ＶＨＦはいずれも、脂肪（脂質）コーティングに覆われているか、包まれているＲＮＡウイルスである。これらのウイルスの生存能は、動物もしくは昆虫の宿主生物または宿主由来の体液に依存する。ヒトは、感染した宿主に遭遇した場合に感染する。しかし、これらのウイルスの一部では、自然宿主からの感染後、宿主由来の体液を介したヒト−ヒト感染が起こり得る。これらのウイルスによって引き起こされるヒトの出血熱の症例または大流行は、散発的および不規則に発生する。大流行の発生は容易に予測できるものではない。さらに、いくつかの例外を除いて、ＶＨＦに対する効果的な薬物治療はないため、ＶＨＦの大流行は重大な公衆衛生上のリスクと考えられている。
【００１５】
ＶＨＦの感染量は１〜１０個であり、したがって感染性が高い。早期の検出および隔離は、大流行を制御するうえで重要である。一般に、エボラウイルスなどのＶＨＦの場合、症状が発症して初めて、通常は発熱して初めて、血液中のウイルスを検出することができる。リアルタイムＰＣＲ検査などの診断試験が推奨されているが、ウイルス検査を行う施設は遠く離れていることが多いため、感染性である可能性がある試料に対して、特定の採取、取り扱いおよび輸送プロトコルが実施されている。
【００１６】
図１に、エボラ標本の採取および輸送のための疾病管理予防センター（ＣＤＣ）のガイドラインを示す。これは、現在の最新技術を代表するものである。通常、ＣＤＣのガイドラインに従うと、全血の採取量は最低でも４ｍＬが望ましく、２〜８ｏＣでの試料の輸送が推奨されている。カテゴリーＡの感染性物質の場合、吸収性材料で包まれた一次密封容器、二次容器（防水および防漏）および外部輸送パッケージからなる三重包装システムが使用される。この三重包装システムは、試料の移送中に、生きていて感染性である可能性がある生物学的液体を確実に封じ込める。
【００１７】
感染性試料を試験するためのＣＤＣガイドラインがさらに存在する。試料処理方法は、一般に、ウイルスの感染性を低減し、現場から受け取った生きた試料の処理を可能にするバイオセーフティレベル３（ＢＳＬ−３）の条件下で実施される。ウイルス不活化工程を実施した後、ＢＳＬ−２条件で試料試験を続けることが許される。あらゆる病原体の分子診断のために、不活化処理では、ウイルスの適切な同定のために核酸の完全性を保ちつつ、感染性を確実に完全に消失させる必要がある。
【００１８】
特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスのその後の診断分析のための生物学的試料の採取および保存のための装置が提供される。装置は、採取された生物学的試料を保持するための処理済み乾燥固体マトリックスと、固体マトリックスを保持するためのフレームと、試料を採取した後にフレームおよび乾燥固体マトリックスを収納するための保存スリーブとを含む。特定の実施形態では、処理済み乾燥固体マトリックスは、ウイルスＲＮＡの分析によってＲＮＡウイルスの存在を決定することができる試料からの核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組合せ）の周囲抽出および保存を可能にする。さらなる実施形態では、装置は、採取時点で採取された生物学的試料を分画することを目的として、濾過膜および処理済み乾燥固体マトリックスを保持するためのフレームを含む。
【００１９】
用語「抽出」は、試料、さらに具体的には生物学的試料から核酸を分離または単離するための任意の方法を指す。ＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸は、例えば、細胞溶解によって放出され得る。一実施形態では、核酸は、蒸発性細胞溶解（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ−ｌｙｓｉｓ）中に放出され得る。別の実施形態では、細胞は、細胞溶解試薬を含むマトリックスと接触すると溶解される。例えばＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅセルロース紙を用いて、細胞を含む生物学的試料をマトリックスに接触させると、核酸を放出する細胞溶解が生じる。明確にするために、乾燥固体基質から核酸を抽出し、採取し、保存し、回収する方法が記載される。本明細書で使用される抽出とは、細胞からの核酸の抽出（例えば、細胞溶解）または保存後のマトリックスからの回収（「マトリックス抽出」）のいずれかを指し得る。また、分析前に、採取された核酸をマトリックスから抽出する必要がない乾燥固体基質からの無抽出迅速試験の方法が記載される。
【００２０】
一実施形態では、生物学的試料中のＲＮＡは、試料乾燥中の蒸発性試料細胞溶解によって、または生物学的試料と接触すると細胞溶解および核酸の放出を生じる化学的に修飾された固体マトリックス（例えば、ＦＴＡ（商標）およびＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅセルロース紙）内に含浸された化合物の存在によって、乾燥固体マトリックス上に放出されてもよい。このようにして、試料（例えば、未精製の生物学的試料）からの核酸、特にＲＮＡ、さらに具体的にはウイルスＲＮＡの抽出では、処理済み固体マトリックス上に核酸が純粋でない状態で維持され、分析され得る。用語「保存（ｓｔｏｒａｇｅ）」または「保存（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」は、抽出された核酸をその後の分析および診断に適した形態に維持することに関して、本明細書では区別なく使用され得る。
【００２１】
用語「核酸」は、ＲＮＡのあらゆる形態（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ）、ならびに組換えＲＮＡ分子および組換えＤＮＡ分子またはヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を指す。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。鎖は、コード鎖または非コード鎖を含み得る。天然に存在するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸の断片は、本発明に包含され、開示された組成物および方法を用いて回収され得る。「断片」は、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の一部を指す。特定の実施形態では、標的核酸はウイルスのＲＮＡである。
【００２２】
特定の実施形態では、乾燥固体マトリックスは、限定するものではないが、セルロースベースの製品、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維またはそれらの任意の組合せを含む。本出願の固体マトリックスは多孔質であってよい。特定の実施形態では、固体マトリックスは、９０３、３１−ＥＴＦ、ＦＴＡ（商標）またはＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などのＷｈａｔｍａｎ（商標）の多孔質セルロース紙である。膜、紙、セルロース紙、固体マトリックスおよび基質という用語は、本開示を通じて区別なく使用され得る。
【００２３】
特定の実施形態では、乾燥固体マトリックスは、乾燥状態の固体マトリックスに組み込まれたタンパク質変性剤、還元剤、緩衝液および場合によりフリーラジカルトラップまたはＲＮａｓｅ阻害剤により処理される。他の実施形態では、処理済み乾燥固体マトリックスは、２０１５年５月２６日に発行され、その全体が本明細書に組み込まれた米国特許第９，０４０，６７９号に記載されたタイプのものである。１つの好ましい実施形態では、処理済み乾燥固体マトリックスは、いずれもその全体が本明細書に組み込まれた２０１５年６月２日に発行された米国特許第９，０４４，７３８号および２０１５年５月２６日に発行された米国特許第９，０４０，６７５号に記載されたタイプのものである。
【００２４】
当業者は、組成物を乾燥固体マトリックスに組み込んで処理済みマトリックスを提供するための多くのそのような方法が存在することを理解するであろう。該方法は、限定するものではないが、浸漬、スプレーコーティングまたは湿式バッチ処理を含む。組成物を乾燥固体マトリックスに組み込んだ後に、任意の適切な方法に従って、得られた処理済み固体マトリックスを乾燥させてもよい。
【００２５】
本明細書で定義されるように、「生物学的試料」は、限定するものではないが、ヒトを含むあらゆる生物から得られる血液、血清、組織、鼻粘液および唾液または培養細胞に由来する液体を含む。生物学的試料は、例えば、針を使用して血液を吸引すること、または患者の皮膚上の病変などの特定の領域をこするかぬぐうことを含む様々な技術によって、自己診断試験（例えば、血糖値モニタリング）を行う個人または訓練された医療専門家によって得られてもよい。様々な生物学的試料を採取するための方法については、当技術分野で周知である。特定の実施形態では、生物学的試料とは、ＲＮＡウイルスの存在を同定するという診断目的のための試料を指す。特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスはエボラである。
【００２６】
特定の実施形態では、タンパク質変性剤、還元剤および緩衝液を含む処理済み固体マトリックスの組成物は、本開示の乾燥固体マトリックス中に存在し、乾燥固体マトリックスは、試料の採取および抽出工程中に生物学的試料によって再水和され得る。組成物は、上記の各成分のうち１つ以上を含んでもよい。組成物は、場合により、紫外線（ＵＶ）阻害剤、フリーラジカルトラップ、ＲＮａｓｅ阻害剤、キレート剤またはそれらの任意の組合せをさらに含んでもよい。当業者は、多くのタンパク質変性剤が当該分野で周知であり、本明細書に記載の組成物および方法に使用するために経験的に選択され得ることを理解するであろう。
【００２７】
例示的なタンパク質変性剤には、限定するものではないが、チオシアン酸グアニジニウム、グアニジニウム塩酸塩、アルギニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００２８】
特定のタンパク質変性剤に限定する意図はないが、例示的なタンパク質変性剤の１つの模式図を以下に示す。
【００２９】
【化１】
2019501640.tif 000003
式中、各Ｒは、独立して、水素、ヘテロ原子含有基または炭化水素基からなる群から選択された一員であってよい。
【００３０】
ヘテロ原子含有基は、窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素およびホウ素から選択された一員を含む基である。反応性官能基を用いてグアニジン含有化合物を結合させることを目的とする。ヘテロ原子を有する典型的な反応性基には、エポキシ、アクリレート、マレイミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、アジド、シアン酸エステル、イソシアン酸塩、ハロゲン化アリール、アルデヒド、アミン、オキシム、チオール、アルコール、酸、アジリジン、アゾ、イソチオシアン酸塩、無水物、混合無水物、ラクトン、スルトンおよびケトンが挙げられる。
【００３１】
炭化水素基は、炭素と水素の両方を含む基であるが、親水性を高めるためにヘテロ原子を含んでもよい。反応性官能基を用いてグアニジン含有化合物を結合させることを目的とする。炭化水素を有する典型的な反応性基には、アリル、スチリル、ビニルおよびアルキンが挙げられる。ヘテロ原子含有炭化水素基には、２、３または４−オキシスチリル、アミノアリル、オキシアリル、オキシビニル、アミノビニルが挙げられる。Ｘは、１つ以上の形式負電荷を含む基であるアニオンである。塩化物、チオシアン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化物、亜塩素酸塩、塩素酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、酢酸塩、蟻酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩からなる群から一員が選択される。１つ以上のアニオンが使用されてもよく、様々なレベル（２価、１価、３価）の形式電荷を有するアニオンの組合せが使用されてもよいことが想定される。アニオンの分子量は、１０〜１００，０００の範囲で変化し得る。
【００３２】
特定の実施形態では、タンパク質変性剤は、第１族または第２族の金属カチオンを含む金属チオシアン酸塩である。金属チオシアン酸塩には、限定するものではないが、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸バリウムおよびチオシアン酸亜鉛が挙げられる。
【００３３】
用語「還元剤」は、別の化学種に電子を提供する化学種を指す。様々な還元剤が当該技術分野で周知であり、下記および請求項に提供される例示的な一覧は、本開示の組成物および方法に使用され得る還元剤を限定するものでは決してない。例示的な還元剤には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、ならびにトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびそれらの関連塩（例えば、ＴＣＥＰ−塩酸塩）が挙げられる。さらに、これらまたは他の還元剤の任意の組合せを用いて本発明を実施することができる。特定の実施形態では、還元剤はＴＣＥＰである。特定の実施形態では、ＴＣＥＰは、その塩酸塩、ＴＣＥＰ−ＨＣｌとして加えることができる。
【００３４】
本明細書で使用される緩衝液には、例えば、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（トリス）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）およびリン酸塩緩衝液が挙げられる。緩衝液の候補のこの一覧は、あくまで例示を目的としたものである。当業者は、本明細書に開示される組成物および方法に使用するために選択された緩衝液のｐＨが適切であることを認識するであろう。緩衝液のｐＨは、通常、３〜８の範囲内である。
【００３５】
上記のように、処理済み固体マトリックス中に存在する組成物は、場合によりＵＶ保護剤またはフリーラジカルトラップを含んでもよい。本発明の特定の態様では、ＵＶ保護剤またはフリーラジカルは、核酸の抽出および保存のための乾燥固体マトリックス中に組み込まれた組成物に必要である。いかなる特定のＵＶ保護剤にも限定する意図はないが、例示的な薬剤には、例えば、ヒドロキノンモノメチルエーテル（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン（ＨＱ）、トルヒドロキノン（ＴＨＱ）およびアスコルビン酸またはビタミンＣが挙げられる。特定の態様では、フリーラジカルトラップはＭＥＨＱまたはＴＨＱである。用語「ＵＶ保護剤」または「フリーラジカルトラップ」は、その後の分析のために、抽出された核酸を未修飾状態に維持することに関して、本明細書では区別なく使用され得る。固体マトリックス中の組成物はまた、バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）または任意の市販のＲＮａｓｅ阻害剤（例えば、ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）などのＲＮａｓｅ阻害剤を含んでもよい。
【００３６】
特定の実施形態では、マトリックスはＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含み、ＲＮａｓｅ阻害剤は、バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）、ヌクレオチド類似体または市販のＲＮａｓｅ阻害剤（例えば、ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（商標））を含む。ＲＮＡｓｅ阻害剤は、ピロリン酸塩化合物をさらに含んでもよい。一実施形態では、ピロリン酸ナトリウム二塩基性をＲＮａｓｅ阻害剤として使用することができる。ＲＮＡｓｅ阻害剤の１つ以上の実施形態は、三リン酸ナトリウムなどの三リン酸塩をさらに含んでもよい。一例では、ピロリン酸ナトリウムを酸性滴定された緩衝液に加えると、液体状態および乾燥形態の両方でＲＮＡ安定性が増強される。
【００３７】
生物学的試料から核酸を抽出する間に再水和され得るマトリックスの実施形態は、乾燥状態の酸または酸性滴定された緩衝液試薬を含む。酸の例には、限定するものではないが、酢酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、塩酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、酸化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−Ｏ−ＨＣｌ）、硫酸、硝酸、バニリン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸またはそれらの組合せが挙げられる。このように、マトリックスは、核酸を抽出し抽出された核酸を安定化する水和時に酸性ｐＨをもたらし、水和は、試料、水または任意の他の溶液（例えば、緩衝液）を加えることによって達成され得る。マトリックスの１つ以上の実施形態は、水和時に２〜７の範囲のｐＨをもたらす。いくつかの実施形態では、マトリックスは、水和時に３〜６の範囲のｐＨをもたらす。
【００３８】
該装置は、処理済み固体マトリックスを保持するフレームを含む。特定の実施形態では、フレームは、処理済み固体マトリックスを支持することができる剛性であってよい。フレームは、マトリックスをフレームに挿入するための位置合わせ機構およびオフセットを有してもよい。特定の実施形態では、フレームは、矩形タイプの形状のコーナーを形成するように接続されて延在する４つのサイドレールを有してもよい。サイドレールのうち少なくとも１つは、固体マトリックスを受け取るのに適した大きさと位置のエッジ部分を有する。
【００３９】
他の実施形態では、フレームは、２０１５年４月６日に出願され、その全体が本明細書に組み込まれた米国特許出願第１４／７１２２９０号に記載されたものである。特定の実施形態では、フレームは、外側湾曲部および内側湾曲部を有する一体型基板である。湾曲部は、処理済み乾燥固体マトリックスならびに生物学的試料を採取し処理済み乾燥固体マトリックスに試料の一部を移すことができる第２の採取膜またはマトリックスを保持するように構成される。このように、特定の実施形態では、処理済み乾燥固体マトリックスに、生物学的試料、例えば血液スポットを直接加えてもよい。別の方法では、生物学的試料を別個のマトリックス上に採取し、処理済み乾燥固体マトリックスに移してもよい。処理済み乾燥固体マトリックスは、こうして分離膜として作用し、該用語は区別なく使用され得る。内側湾曲部は複数の第１のスロットから形成され、外側湾曲部は複数の第２のスロットから形成される。内側湾曲部は、外側湾曲部の遠位端部分の下に分離膜（処理済み固体マトリックス）の遠位端を位置合わせするように構成される。外側湾曲部および内側湾曲部は、採取膜の近位端が分離膜の遠位端との画定された重複接触領域を有するように、外側湾曲部の遠位端部分および内側湾曲部の遠位端部分の下に採取膜の近位端を位置合わせするようにさらに構成される。基板内の２つの膜の間の重複接触領域は、血液試料からの血漿の適切な分離および採取を容易にする。このように、該装置を使用して、その後の試験のために、試料の主要成分、さらに具体的にはＲＮＡを抽出または溶出してもよい。
【００４０】
図２Ａおよび図２Ｂは、血漿クリップ１００として構成されたフレームの本発明の一実施形態の代表図である。図２Ａは、内側湾曲部１０２と外側湾曲部１０４とを含むクリップ１００を示す。クリップ１００は、図２Ｂに示す複数の保持機構１０６と、複数の案内機構１０８と、複数の固定具１１０とをさらに含む。
【００４１】
特定の実施形態では、フレームは、ポリプロピレン、ナイロン（ポリアミド）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）およびポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）などのポリマー材料であってよい。特定の他の実施形態では、フレームは、円形、楕円形、矩形などの異なる形状を有してもよい。
【００４２】
該装置は、保存スリーブを含んでもよい。特定の実施形態では、保存スリーブは、固体基質上に含有された生物学的試料をある場所から別の場所に移送し、安全に取り扱うことができるように構成されてもよい。また、その後の分析のために採取された試料を貯蔵保存することもできる。特定の実施形態では、保存スリーブは、処理済み固体マトリックスを含有するフレームを受け入れるためのポケットと、スリーブ内にフレームおよびマトリックスを完全に封入するように配置され得るスリーブと連結された１つ以上のタブとを有してもよい。いくつかの実施形態では、保存スリーブは、容易に識別するために、様々な形状、サイズおよび／または色で構成されてもよい。特定の実施形態では、スリーブをマーキングすることによって試料を識別してもよく、他の実施形態では、該装置に取り付けられたＲＦＩＤチップまたはバーコードなどの識別タグを使用することによってマーキングを行ってもよい。そのような保存スリーブを利用した追跡システムは、対応する保存スリーブとの物理的接続によって、輸送中または試験中の試料の位置を容易に識別できるように、貯蔵された生物学的試料の迅速な識別を可能にすることができる。
【００４３】
本明細書に記載の装置を使用する方法がさらに提供される。一実施形態では、該方法は、ウイルスが不活化された乾燥状態でＲＮＡウイルスを保存することを可能にする。別の実施形態では、該方法は、生物学的試料からの核酸抽出および安定化の統合をさらに提供し、それによって、ＲＮＡウイルスの診断のために抽出された核酸、さらに具体的にはウイルスＲＮＡを試験する。さらなる実施形態では、該方法は、ＲＮＡウイルスおよび／または宿主トランスクリプトームの特徴付けを可能にする。
【００４４】
特定の実施形態では、該方法は、周囲温度で数日から数週間にわたり、乾燥状態のマトリックス上に抽出された核酸を保存することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は１ヶ月超にわたり保存することができる。いくつかの実施形態では、核酸は６ヶ月超にわたり保存することができる。ＲＮＡは一般に分解しやすいため、マトリックスを用いたＲＮＡの抽出および保存は有用であり、さらに様々なダウンストリームアプリケーションに使用することができる。
【００４５】
特定の実施形態では、図４のフローチャートに示すように、該方法は、ａ）固体マトリックスを提供する工程であって、少なくとも１つのタンパク質変性剤、少なくとも１つの還元剤、生物学的緩衝液および場合によりフリーラジカルトラップまたはＲＮＡｓｅ阻害剤を含む組成物が乾燥形態の固体マトリックス中に組み込まれる、提供する工程と、ｂ）装置の処理済み固体マトリックス上に、ＲＮＡウイルスについて分析される試料（例えば、生物学的試料）を適用して核酸を抽出する工程であって、マトリックスが装置のフレームに含有される、抽出する工程と、ｃ）固体マトリックスを乾燥させる工程と、ｄ）保存スリーブ内に固体マトリックスを封入する工程とを含む。特定の実施形態では、取り扱いを容易にするために、固体マトリックスはフレーム内に保持される。
【００４６】
特定の実施形態では、該方法は、装置（図４、工程ｅ）を保存すること、周囲条件下で乾燥状態の固体マトリックス上に核酸を含有させることのうち少なくとも１つをさらに含む。次いで、周囲条件下での試験のために、該装置を遠隔地に移送してもよい。このように、ウイルスは不活性であるが、適切な分析を可能にするためにＲＮＡは無傷の状態で保存される。
【００４７】
特定の実施形態では、図４に示す工程ｄおよび工程ｅを逆にして、試料を保存スリーブに密封した後に乾燥させてもよい。例えば、乾燥剤をスリーブに加えて、試料を乾燥させるか、試料の乾燥を完了させてもよい。
【００４８】
特定の態様では、固体マトリックスは、市販の９０３、３１−ＥＴＦまたはＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（商標）などの多孔質のセルロースベースの紙である。この方法の性能は、周囲温度下で乾燥形態（例えば固体マトリックス上）で、核酸、特に不安定な生体分子であることが広く知られているＲＮＡを保存することを可能にする。この方法に利用される試料には、限定するものではないが、ヒトを含む任意の生物から得られた血液、血清、組織、鼻粘液および唾液または培養細胞に由来する液体などの生物学的試料が挙げられる。
【００４９】
上に描写された方法は、場合により、その後の分析のために固体マトリックスから核酸を回収する工程を含み得る。
【００５０】
このように、本発明のさらなる態様では、図４で上述したような保存後の試料をさらに処理するための方法が含まれる。該方法は、保存された試料から核酸を抽出するか、マトリックスから直接試料を分析するワークフローを適用する追加の工程を含む。
【００５１】
特定の実施形態では、固体マトリックスは乾燥試薬の固定された組成物を含み、これにより、水和時にＲＮＡなどの生物学的試料から核酸を効率的に抽出してから、周囲温度で、抽出されたＲＮＡを安定化させることが可能になる。このように、特定の実施形態では、マトリックスは、生物学的試料からの抽出の後に所望のレベルでＲＮＡの安定性および完全性を維持する。一実施形態では、マトリックスに核酸安定化試薬を含浸させる。これらの安定化試薬は、ＲＮＡｓｅ阻害剤、酸性滴定された緩衝液またはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含んでもよい。組成物は、紫外線（ＵＶ）阻害剤またはフリーラジカルスカベンジャーをさらに含んでもよい。
【００５２】
したがって、特定の実施形態では、水溶液、上記の緩衝溶液または有機溶液中で固体マトリックス（例えば、セルロース紙）を再水和することによって、ＲＮＡを回収してもよい。マトリックスからの抽出後、ウイルス起源の決定などの診断目的のために、回収されたＲＮＡを分析してもよい。さらに具体的には、ＲＮＡはＲＮＡウイルスと会合している。
【００５３】
あるいは、電気溶出によって固体マトリックスからＲＮＡを回収してもよい。当業者は、固体マトリックスからＲＮＡを回収することができる任意の方法を使用して、開示された方法を実施してもよいことを理解するであろう。
【００５４】
このように、特定の実施形態では、ＲＮＡ抽出マトリックスは固相抽出マトリックスである。固相抽出法が使用されるマトリックスは、本明細書では固相抽出マトリックスと呼ばれる。固相抽出（ＳＰＥ）技術を利用して、シークエンシングおよび他のアプリケーションのための高純度核酸の抽出時間を短縮することができる。固相抽出とは、固相および液相を使用して、材料から同じタイプまたは異なるタイプの１つ以上の分子を単離する抽出方法である。固相抽出マトリックスを使用して、例えば、クロマトグラフィーまたは他の分析方法のアップストリームで試料を精製する。この方法の一例は、固相抽出マトリックス上に試料（例えば生物学的試料）を充填することと、周囲温度でマトリックスを保存して実質的に乾燥状態にすることと、適切な緩衝液によってマトリックスを再水和してマトリックスからＲＮＡを特異的に抽出することとを含む。
【００５５】
本発明のさらなる態様では、図４で上述したような保存後の試料をさらに処理するための方法が含まれる。該方法は、マトリックスから核酸を抽出する追加の工程を含む。したがって、精製された核酸をさらに処理または分析することができる。あるいは、マトリックスから直接核酸を処理または分析することができる。この実施形態では、核酸を含有するマトリックスをワークフローに直接加えてもよい。特定の実施形態では、核酸画分をさらに精製することなく、試料を分析または処理してもよい。
【００５６】
該方法の特定の態様では、固体マトリックスは、市販の９０３、３１−ＥＴＦまたはＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（商標）などの多孔質のセルロースベースの紙である。この方法の性能は、周囲温度下で乾燥形態（例えば固体マトリックス上）で、核酸、特に不安定な生体分子であることが広く知られているＲＮＡを保存することを可能にする。この方法に利用される試料には、限定するものではないが、ヒトを含む任意の生物から得られた血液、血清、組織、鼻粘液および唾液などの生物学的試料が挙げられる。
【００５７】
該方法の特定の態様では、別個の抽出工程またはＲＮＡ回収工程を伴わず、固体マトリックスを分析してもよい。例えば、検出目的のために、乾燥した生物学的試料を含有する固体マトリックスの一部を酵素反応に直接加えてもよい。好適な酵素反応には、逆転写反応が挙げられる。さらなる実施形態では、逆転写反応と、ＰＣＲまたはｑＰＣＲなどのＤＮＡ増幅反応とを組み合わせてもよい。なおさらなる実施形態では、ＤＮＡ増幅反応は、等温ＤＮＡポリメラーゼを用いた等温反応である。一実施形態では、固体マトリックスは、ＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などのＷｈａｔｍａｎ（商標）の多孔質セルロース紙である。いくつかの実施形態では、２０１４年５月１５日公開の国際公開２０１４０７２３５４Ａ１号パンフレットに記載されているように、非溶出固体マトリックスを分析してもよい。
【００５８】
実施例
以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定するためのものではない。
【実施例１】
【００５９】
エボラウイルスの不活化および検出
ＡＴＣＣからベロ細胞を入手し、供給元によって提供された仕様に基づいた標準的な組織培養技術を用いてＴ−７５フラスコにルーチンに継代した。アッセイの前日に、細胞を１：２に分割して、細胞が感染時に指数増殖期にあることを確認した。血球計およびトリパンブルー排除を用いて、全細胞数および生存率の決定を行った。このアッセイに利用される細胞では、細胞生存率は９５％超でなければならない。
【００６０】
このアッセイに用いたウイルスは、ザイールエボラウイルス１９９５１０６２１株であった。各アッセイでは、ウイルスの予め滴定されたアリコートをフリーザー（−８０℃）から取り出し、ＢＳＬ−４実験室の生物学的安全キャビネット内で室温までゆっくりと解凍させた。組織培養培地またはマウスの全血でウイルスを希釈して、実験に必要な接種材料を得た。
【００６１】
濾紙溶出液がベロ細胞に対して直接的に細胞変性であるかどうかを決定するために、１ｍＬの細胞培養培地に、各濾紙（Ｔ、Ｒ、Ｅ）から得られた１ｍｍまたは２〜７ｍｍのパンチを加えた。濾紙の組成を以下の表１に示す。
【００６２】
３０分後、室温で、高速で１分間試料をボルテックスし、未処理の細胞培養培地を用いて希釈系列（１：１０、１：５０、１：１００）を作製した。次いで、Ｔ−２５フラスコ内のＶｅｒｏ細胞のコンフルエントな単層に、１ｍＬの溶出液の原液または希釈溶出液を２連で加えた。１時間後、３７℃で、４ｍＬの追加の未処理の細胞培養培地をフラスコに加え、７日間モニターした。標準的なスケール（０〜４＋ＣＰＥ）を用いて、明らかな細胞変性効果（ＣＰＥ）を記録した。濾紙溶出液から得られた細胞変性効果の概要を以下の表１に示す。
【００６３】
【表１】
2019501640.tif 000004
濾紙が生きたＥＢＯＶを不活化するかどうかを決定するために、細胞培養由来のウイルス（１．７×１０５および１×１０３ＰＦＵ／２５μＬ）を各濾紙の複製試料に加え、室温で乾燥させた。ウイルスを含有しない細胞培養培地を陰性対照として含めた。少量のウイルスが存在する場合、本発明者らの方法が確実に効率的にＥＢＯＶを増殖し検出することを実証するために、１０ＰＦＵのウイルスを含有する陽性対照を用いて単層の細胞（濾紙にはスポットしない）を感染させた。乾燥後、７ｍｍのパンチを１ｍＬの細胞培養培地に加え、続いて室温で３０分間インキュベートし、激しく混合して、細胞培養溶出液中に活性ウイルス粒子を確実に放出させた。次いで、この一次溶出液の１：１０希釈液をＶｅｒｏ細胞のコンフルエントな単層に移した。１時間の感染工程の後、追加の細胞培養培地をフラスコに加え、７日間にわたり細胞変性効果（ＣＰＥ）について細胞を観察した。感染後７日目に、各フラスコから上清を採取し、Ｖｅｒｏ細胞の新しいコンフルエントな単層に移し、さらに７日間このフラスコのＣＰＥを観察した。この第２のインキュベーション（合計１４日）後、各フラスコから上清を採取し、プラークアッセイおよびウエスタンブロットによってＥＢＯＶ抗原について分析した。ウイルス不活化試験の結果の概要を以下の表２に示す。
【００６４】
【表２】
2019501640.tif 000005
表２の結果では、乾燥および回収中の未処理セルロース（Ｔ）上のウイルスの顕著な消失が示されるが、処理セルロース（Ｒ、Ｅ）では、ＥＢＯＶの完全な不活化が認められる。感染個体ではエボラのピーク力価は約１０６ＰＦＵ／ｍＬに達するため、ＲＳＭ（Ｒ）およびＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（Ｅ）上の約１０５の感染粒子の観察された不活化は臨床的に有意である。ＲＳＭとは、上記の米国特許第９，０４４，７３８号に記載されているマトリックスの一実施形態であるＲＮＡ安定化マトリックスを指す。
【００６５】
また、ウエスタンブロットによって、プラークアッセイ（上記の表２）によって評価された同じ試料を評価して、感染１４日後にＥＢＯＶ  Ｇ２タンパク質を検出した。図５に示す結果から、表２に示す結果が、ウエスタンブロットによって、処理セルロース（Ｒ、Ｅ）ではなく未処理セルロース（Ｔ）からＥＢＯＶ  Ｇ２タンパク質が検出されたことを示すことが確認される。濾紙の組成を表１にさらに記載した。
【００６６】
乾燥血液スポットの抽出後に濾紙からＥＢＯＶのＲＮＡを定量的に検出可能であるかどうかを決定するために、既知量のＥＢＯＶ（１０５、１０４、１０２および１０１ＰＦＵ）をマウスの全血にスパイクした。試料（５０μＬ）を濾紙上にスポットし、次いでＢＳＣ内で３０分間乾燥させ、次いで乾燥剤パックを含有するジップロックマイラーバッグに移して室温で保存した。２４時間後、２つの７ｍｍのパンチを取り出し、１５μＬのプロテイナーゼＫ溶液（４ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ＋０．５％ＳＤＳ）によって１０分間再水和させた。ＴＲＩｚｏｌを含有するチューブにパンチを移し、ボルテックスし、３００ｒｐｍで６０分間チューブを振盪することによって室温でインキュベートした。希釈系列のアリコートを濾紙上にスポットせず、回収の比較のためにＴＲＩｚｏｌに直接加えた。次いで、全ＲＮＡを抽出し、製造業者の推奨に従って精製した。次いで、２４時間の乾燥保存後に濾紙から回収されたウイルスＲＮＡの量および品質を評価した。Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いて各ＲＮＡ溶出液の試料を分析して、２４時間の乾燥保存後に回収された全ＲＮＡの品質を評価した。製造業者の推奨に従ってＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔを追跡した。定量的逆転写酵素ＰＣＲを用いて、濾紙溶出液中に存在する無傷のウイルスゲノムの数を推定した。使用されたアッセイは、以前に公開され、ＥＢＯＶの核タンパク質遺伝子を検出するように設計された（Ｗｅｉｄｍａｎｎら、２００４．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０：９４−９９）。ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ：ザイールエボラウイルス、Ｍａｙｉｎｇａ、ＮＲ−３１８０６のＲＮＡ）から得たＲＮＡを用いて、ＥＢＯＶのＲＮＡコピー数を決定した。各濾紙溶出液中に検出されたＥＢＯＶのＲＮＡコピー数を、濾紙に曝露されていない（同じＥＢＯＶ接種材料の）対をなす試料から検出されたＥＢＯＶのＲＮＡの総コピー数で除算することによって、回収率を計算した。この比率に１００％を乗算して回収率を求めた。
【００６７】
図６は、感染粒子（ＰＦＵ）の関数としての抽出された乾燥血液スポットからのＥＢＯＶ核タンパク質遺伝子のワンステップＲＴ−ｑＰＣＲ検出の結果を示す。その小さなサイズの結果としてＲＮＡ分解に対して比較的感受性でない約１００ｂｐのアンプリコンを用いて、すべての添加された（ｄｏｓｅｄ）濾紙標本からＥＢＯＶ核タンパク質遺伝子を検出するのに成功した。しかし、全ＲＮＡのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析から、Ｔｒｉｚｏｌ標準技法と同様にＲＳＭ濾紙（Ｒ）のみがＲＮＡ完全性（ＲＩＮ＞５）を首尾よく保存したことが明らかにされた（図７）。総括すると、表３のこれらの実験の比較は、試験した最も高いウイルス用量でのエボラ不活化および全ＲＮＡ完全性の決定を要約する。
【００６８】
【表３】
2019501640.tif 000006
表３の結果は、ＲＳＭ濾紙は標準的なＴｒｉｚｏｌ除染と同様に機能するが、Ｔｒｉｚｏｌとは異なり、乾式処理および周囲条件での安定化を可能にすることを実証する。したがって、ＲＳＭの性能は、核酸の完全性を保ちながら感染性の完全な消失が観察されるという点で、病原体の分子診断のためのＣＤＣガイドラインに準拠する。
【実施例２】
【００６９】
濾紙からのエボラの無抽出ＲＴ−ＰＣＲ検出
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）にエボラ特異的プライマーを発注した。配列番号１および配列番号２を脱塩により精製した。ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ：ザイールエボラウイルス、Ｍａｙｉｎｇａ、ＮＲ−３１８０６のＲＮＡよりエボラＲＮＡを得た。このウイルスストックは、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞ＲＮＡのバックグラウンドに４．５×１０８のゲノムＲＮＡコピー／μＬを含有していた。最終エボラゲノム当量が１０７〜１０９／ｍＬになるように、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース溶液を用いて安定化させたヒト全血を、エボラＲＮＡと同時に、３１−ＥＴＦ、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ、ＲＳＭ濾紙上にスポットした（別個に充填したピペットを使用して濾紙の同じ領域に排出した）。これらのエボラ濃度（ＲＮＡコピー数／ｍＬ）は、ヒトの発熱の約３日後の疾患の負担を模倣したものである。スパイクされた血液試料（約２５μＬ）を濾紙上で乾燥させ、デシケータキャビネット内で周囲温度で一晩保存して遅延処理を模倣した。
【００７０】
エボラの無抽出検出のために、Ｈａｒｒｉｓ  Ｍｉｃｒｏ−ｐｕｎｃｈを用いて各乾燥血液スポットの中心から単一の１．２ｍｍのパンチを得、２０μＬのｃＤＮＡ合成反応に直接排出した。容積吸収により、各パンチが元の試料の約１μＬを含有すると推定されたことから、エボラＲＮＡの鋳型投入範囲はパンチあたり１０４〜１０６コピーであると予測された。その結果、対照目的のために、ストックエボラＲＮＡの等量の投入（１０４または１０６コピー）を、濾紙試料とともにＲＴ−ｑＰＣＲによって試験した。ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ランダムプライマーを用いて各エボラＲＮＡ対照および１．２ｍｍの乾燥血液スポットからｃＤＮＡを生成した。エボラＲＮＡ対照または１．２ｍｍの乾燥血液スポットを含有するが、逆転写酵素を欠く並列反応（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を作成して、ゲノムＤＮＡからのバックグラウンドシグナルを評価した。すべてのｃＤＮＡ反応物を２５℃で５分間インキュベートし、続いて４２℃で４５分間インキュベートし、次いで９５℃で５分間不活化した。得られたｃＤＮＡをエボラ特異的プライマーを含有するｑＰＣＲ反応に適用して、ＡＢＩ  ７５００装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてエボラシグナルをリアルタイムで検出した。要約すると、各試料について、５μＬのｃＤＮＡを、１２．５μＬの２Ｘ  ＳｅｎｓｉＭｉｘ  ＳＹＢＲ  Ｍａｓｔｅｒ混合物（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１μＬの１０μＭプライマー混合物および６．５μＬのヌクレアーゼフリー水と混合して、２５μＬリアルタイムｑＰＣＲ反応を作成した。これらの反応物を９５℃で１０分間インキュベートし、次いで９５℃で５秒間および６０℃で３１秒間を合計４０サイクルさせた。各サイクルでＳＹＢＲ蛍光を読み取り、プロットしてエボラが検出可能なＣＴ閾値を算出した。
【００７１】
図８は、上記の無抽出プロトコルを用いた様々な濾紙パンチからのエボラＲＮＡのツーステップＲＴ−ｑＰＣＲ検出の結果を示す。エボラＲＮＡは、スパイクされた範囲（１０７〜１０９ＲＮＡコピー／ｍＬ）にわたって、ＦＴＡ  ＥｌｕｔｅおよびＲＳＭ濾紙上の乾燥血液スポットから直接首尾よく検出された。対照反応により、これらの濾紙パンチが、１μＬあたり約１０４〜１０６ＲＮＡコピーを含有することが確認された。逆転写酵素を欠く対照反応では検出されず、ゲノムＤＮＡではなくｃＤＮＡに対するプライマー特異性が実証された。重要なことに、未処理の濾紙試料（３１−ＥＴＦ）からの検出は成功せず、従来のｃＤＮＡ合成工程では、図７に示すように３１−ＥＴＦ濾紙から血液が浸出したことが認められた。対照的に、ＦＴＡ  ＥｌｕｔｅおよびＲＳＭの両試料は、濾紙マトリックス上に血液成分を保持した。したがって、この無抽出アプローチを用いたエボラ検出の成功は、パンチインｃＤＮＡ合成およびその後のダウンストリームのｑＰＣＲ検出工程の間に、濾紙採取マトリックスが血液阻害剤をいかに良好に保持するかによって決まる。
【実施例３】
【００７２】
濾紙からのエボラの無抽出等温増幅および検出
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）にエボラ特異的プライマーを発注した。配列番号３および配列番号４を脱塩により精製し、配列番号５および配列番号６をＨＰＬＣにより精製した。ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の認識部位に下線を引き、ニック部位にキャレットを記す。
【００７３】
配列番号１：５′−ｄ［ＴＣＴ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＡＴＣ］−３′
配列番号２：５′−ｄ［ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＴＣ］−３′
配列番号３：５′−ｄ［ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  Ｔ］−３′
配列番号４：５′−ｄ［ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＣＡＣ］−３′
配列番号５：５′−ｄ［ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＾  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  Ｃ］−３′
配列番号６：５′−ｄ［ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＾  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＣＧＡ  ＡＣ］−３′
ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ：ザイールエボラウイルス、Ｍａｙｉｎｇａ、ＮＲ−３１８０６のＲＮＡにより以下の試薬を得た。このウイルスストックは、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞ＲＮＡのバックグラウンドに４．５Ｅ＋０８のゲノムＲＮＡコピー／μＬを含有し、ＲＮａｓｅフリーＴＥＴ緩衝液（０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１０ｍＭトリス、ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で１：１０，０００に希釈した（この時点で４５，０００エボラゲノム当量／μＬ）。希釈したＲＮＡを−８０℃で１００μＬのアリコート中に保存した。公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ１４２９６０）から、ザイールエボラウイルス、Ｍａｙｉｎｇａ  ＲＮＡ（配列番号１〜４）のプライマーを設計した。
【００７４】
１０μＬの等温逆転写／増幅反応（ＲＴ−ｉＳＤＡ）の組合せに、以下の成分を含めた：５０ｎＭの配列番号３、５０ｎＭの配列番号４、０．５μＭの配列番号５、０．２５μＭの配列番号６、２００μＭのｄＡＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２００μＭのｄＣＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２００μＭのｄＧＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２００μＭのｄＴＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、５ｍＭの硫酸マグネシウム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、４０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、１０ｕｎｉｔｓのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｕｎｉｔｓのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ）、８ｕｎｉｔｓのＢｓｔ  ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）および３．２ｕｎｉｔｓのＮｔ．ＢｂｖＣＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）容積反応の増加、例えば５０μＬまたは７５μＬを比例的に測定した。示されたコピー数で、またはＲＮＡ安定化マトリックス（ＲＳＭ）の１．２ｍｍのパンチ（Ｈａｒｒｉｓ  ＭＩＣＲＯ−ＰＵＮＣＨ（登録商標））の一部としてもしくはそれと併用して、エボラＲＮＡ鋳型を溶液中に加えた。すべての反応物を５０℃で２０分間インキュベートし、７０℃で１５％ＴＢＥ−尿素ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、電気泳動によって各回からのアリコートを分析した。電気泳動の直前に、反応物から２μＬと、６μＬのＧｅｌ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを混合し、９５℃で２分間変性させ、直ちに氷上で急冷した。各変性試料から５μＬを直ちにゲルのウェルに充填した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の２Ｘ溶液中で電気泳動後にゲルを１５分間染色し、製造業者の指示に従って希釈し、Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）ＦＬＡ９５００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）可変モードレーザースキャナーを用いて視覚化した。
【００７５】
承認されたＩＲＢプロトコル＃１３０９５を使用して、ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｎｉｓｋａｙｕｎａ、ＮＹ）からヒト血液を得た。１つのピペットチップに８μＬの血液および別のピペットチップに４５，０００コピー／μＬで８μＬのザイールエボラウイルスＲＮＡを吸引し、濾紙の同じ領域に同時にそれらを吐出させることによって、ヒト血液およびウイルスＲＮＡを含有するＲＳＭを調製した。スポットの中心が濾紙の端から約０．７ｃｍになるように血液とＲＮＡとを混合した。スポットを空気乾燥させ、保存した濾紙を室温で乾燥させた。乾燥後、いくつかのＲＳＭ試料をストリップに切断し、血液ＲＮＡスポットが底になるようにし、ＴＥＴ緩衝液およびＣＦ７紙（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の芯を用いて側方流動によってストリップを洗浄した。洗浄後、使用前にストリップを空気乾燥させ、等温増幅に１．２ｍｍのパンチを使用した。他の場合では、側方流動によってＲＳＭ試料を洗浄せず、７５μＬの等温増幅反応に乾燥血液スポットからの１．２ｍｍのパンチを直接放出した。
【００７６】
図９Ａ〜９Ｃは、反応前に１．２ｍｍのパンチを洗浄したまたはしないＲＳＭからの等温逆転写／増幅の組合せを示す。矢印は、予測された逆転写増幅産物（完全にニックが入った８１塩基アンプリコンおよび部分的にニックが入った１０２塩基アンプリコン）を示す。図９Ａは対照反応Ａ、ＢおよびＣを示し、各反応は５０μＬの容積を有した。反応Ａは鋳型を含有せず、ＢおよびＣはそれぞれザイールエボラウイルスＲＮＡを４５，０００コピー含有した。反応Ｄはさらに０．５μＬのヒト全血を含有した。図９Ｂは対照反応を示し、ＥおよびＦはそれぞれ１０μＬの反応容積であった。反応Ｅは鋳型を含有せず、ＦはザイールエボラウイルスＲＮＡを４５，０００コピー含有した。図９Ｃは、前もってヒト血液およびエボラＲＮＡをスポットした洗浄ＲＳＭの１．２ｍｍのパンチを含有する１０μＬの各反応容積であった反応ＧおよびＨを示す。反応Ｈは、ＲＳＭの洗浄されたパンチに加えて、反応に別個に加えられたザイールエボラウイルスＲＮＡの追加の４５，０００コピーを有した。反応Ｉは、ヒト血液および４５，０００コピーのエボラＲＮＡをスポットした未洗浄ＲＳＭの１．２ｍｍのパンチを含有する７５μＬの反応容積であった。等温増幅中にＲＳＭ濾紙から浸出する血液成分は観察されなかった。
［実施態様１］
ＲＮＡウイルスを含有する生物学的試料の不活化および乾燥保存の方法であって、
組成物が組み込まれた不溶性の乾燥固体マトリックスを提供することであって、前記組成物が少なくとも１つのタンパク質変性剤、乾燥状態でその中に含浸された少なくとも１つの酸または酸性滴定された緩衝液試薬を含む、提供することと、
前記生物学的試料と前記乾燥固体マトリックスとを接触させて、前記生物学的試料の細胞を効果的に溶解させ、無傷の状態で前記ＲＮＡを保存することと、
前記固体マトリックス上で前記生物学的試料を乾燥させることと、
周囲条件下で乾燥状態の前記固体マトリックス上に前記生物学的試料を保存することであって、前記試料が感染性ではなく、その前記ＲＮＡが無傷の状態に維持される、保存することと
を含む方法。
［実施態様２］
前記酸が、酢酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、塩酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、酸化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−Ｏ−ＨＣｌ）、硫酸、硝酸、バニリン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸またはそれらの組合せを含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記組成物が、ＵＶ保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、キレート剤、還元剤またはそれらの組合せをさらに含む、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様４］
前記組成物がＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、実施態様１、２または３に記載の方法。
［実施態様５］
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、三リン酸塩、ピロリン酸塩、バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＣＲ）またはピロリン酸ナトリウムのうち少なくとも１つを含む、実施態様４に記載の方法。
［実施態様６］
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施態様３に記載の方法。
［実施態様７］
前記生物学的試料が血液である、実施態様１乃至６のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
［実施態様８］
前記ＲＮＡウイルスが血液媒介ウイルスである、実施態様１乃至７のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
［実施態様９］
前記血液媒介ウイルスが、エボラウイルス、肝炎ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスまたは関連するサブグループである、実施態様８に記載の方法。
［実施態様１０］
前記方法が、前記固体マトリックスから前記ウイルスＲＮＡを回収することをさらに含む、実施態様１乃至９のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
［実施態様１１］
前記ウイルスＲＮＡを回収することが、前記固体マトリックスの再水和、電気溶出またはそれらの組合せを含む、実施態様１０に記載の方法。
［実施態様１２］
前記再水和が、水溶液、緩衝液または有機溶液を使用する、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１３］
ＲＮＡウイルスの存在について生物学的試料を試験する方法であって、
組成物が組み込まれた不溶性の乾燥固体マトリックスを提供することであって、前記組成物が少なくとも１つのタンパク質変性剤、乾燥状態でその中に含浸された少なくとも１つの酸または酸性滴定された緩衝液試薬を含む、提供することと、
前記乾燥固体マトリックスに前記生物学的試料を適用することと、
前記固体マトリックス上で前記生物学的試料を乾燥させることと、
前記乾燥固体マトリックスから生物学的試料中のＲＮＡを回収することと、
ウイルスＲＮＡの存在について前記回収されたＲＮＡを分析することと
を含む方法。
［実施態様１４］
前記回収工程が、前記固体マトリックスの再水和、電気溶出、前記固体マトリックスの一部の直接的な増幅反応への添加またはそれらの組合せを含む、実施態様１３に記載の方法。
［実施態様１５］
再水和が、水溶液、緩衝溶液または有機溶液を使用する、実施態様１４に記載の方法。
［実施態様１６］
前記酸が、酢酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、塩酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、酸化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−Ｏ−ＨＣｌ）、硫酸、硝酸、バニリン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸またはそれらの組合せを含む、実施態様１３、１４または１５に記載の方法。
［実施態様１７］
前記組成物が、ＵＶ保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、キレート剤、還元剤またはそれらの組合せをさらに含む、実施態様１３乃至１６のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
［実施態様１８］
前記組成物が、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、実施態様１３乃至１７のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
［実施態様１９］
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、三リン酸塩、ピロリン酸塩、バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＣＲ）またはピロリン酸ナトリウムのうち少なくとも１つを含む、実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２０］
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様２１］
前記生物学的試料が血液である、実施態様１３乃至２１のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
［実施態様２２］
前記ＲＮＡウイルスが血液媒介ウイルスである、実施態様１３乃至２２のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
［実施態様２３］
前記血液媒介ウイルスが、エボラウイルス、肝炎ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスまたは関連するサブグループである、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
前記方法が、周囲条件下で乾燥形態で無傷のＲＮＡの長期保存を可能にし、前記試料中に存在するあらゆるウイルスが不活化される、実施態様１３乃至２３のいずれか１項または複数の項に記載の方法。
［実施態様２５］
ウイルスＲＮＡの分解を伴わずにＲＮＡウイルスを含有する生物学的試料を不活化および乾燥保存するための採取装置であって、
組成物が組み込まれた不溶性の乾燥固体マトリックスを提供することであって、前記組成物が少なくとも１つのタンパク質変性剤、乾燥状態でその中に含浸された少なくとも１つの酸または酸性滴定された緩衝液試薬を含む、提供することと、
前記乾燥固体マトリックスを保持するためのフレームと、
前記試料を採取した後に前記フレームおよび乾燥固体マトリックスを収容することができる保存スリーブと
を含む採取装置。
［実施態様２６］
前記酸が、酢酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、塩酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）、酸化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−塩酸（ＴＣＥＰ−Ｏ−ＨＣｌ）、硫酸、硝酸、バニリン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸またはそれらの組合せを含む、実施態様２５に記載の装置。
［実施態様２７］
前記組成物が、ＵＶ保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、キレート剤、還元剤またはそれらの組合せをさらに含む、実施態様２５または２６に記載の装置。
［実施態様２８］
前記組成物がＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、実施態様２７に記載の装置。
［実施態様２９］
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、三リン酸塩、ピロリン酸塩、バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＣＲ）またはピロリン酸ナトリウムのうち少なくとも１つを含む、実施態様２８に記載の装置。
［実施態様３０］
前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施態様２７、２８または２９に記載の装置。
【符号の説明】
【００７７】
１００  血漿クリップ
１０２  内側湾曲部
１０４  外側湾曲部
１０６  保持機構
１０８  案内機構
１１０  固定具
【図１】
2019501640.tif 000007
【図２】
2019501640.tif 000008
【図３】
2019501640.tif 000009
【図４】
2019501640.tif 000010
【図５】
2019501640.tif 000011
【図６】
2019501640.tif 000012
【図７】
2019501640.tif 000013
【図８】
2019501640.tif 000014
【図９】
2019501640.tif 000015
【配列表】
2019501640000001.app
【国際調査報告】
2019501640.tif 000016
2019501640.tif 000017
2019501640.tif 000018
2019501640.tif 000019