【手続補正書】
【提出日】平成19年4月13日(2007.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ヒトのＧＡＢＡBレセプター１プロモーターＰ１ａまたはＧＡＢＡBレセプター１プロモーターＰ１ｂを含み、そのヌクレオチド配列が以下から成る群から選ばれる核酸分子：
(ａ) 配列番号：１と少なくとも９５％相同性のあるヌクレオチド配列；および
(ｂ) 配列番号：２と少なくとも９５％相同性のあるヌクレオチド配列；および
(ｃ) （ａ）または（ｂ）で定義した配列に対して相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列。
【請求項２】  請求項１（ａ）に記載のヌクレオチド配列を、請求項１（ｂ）に記載のヌクレオチド配列と併せて含む核酸分子。
【請求項３】  請求項１または２に記載の核酸分子で形質転換されたベクター。
【請求項４】  請求項３に記載のベクターを保持する培養細胞ホスト。
【請求項５】  請求項１または２に記載の核酸分子およびレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子の発現をプロモーター配列が制御するようにプロモーターおよびレポーターが位置している、発現系。
【請求項６】  レポーター遺伝子が以下から選ばれる請求項５に記載の発現系：
(ａ) ホタルのルシフェラーゼ遺伝子；
(ｂ) 細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子；
(ｃ) β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）遺伝子；および
(ｄ) 緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子。
【請求項７】  核酸分子がベクター内で形質転換される請求項５または６に記載の発現系。
【請求項８】  ベクターが複製起点および／または優性選別マーカーを含む請求項７に記載の発現系。
【請求項９】  請求項５〜８のいずれかに記載の発現系でトランスフェクトされたホスト細胞。
【請求項１０】  請求項９に記載のホスト細胞を使用することを含むＧＡＢＡBレセプタープロモーターの活性をアッセイする方法。
【請求項１１】  以下の工程を含む、ＧＡＢＡBレセプター１転写の調節物質である化合物をスクリーニングする方法：
(ａ)  請求項５〜８のいずれかに記載の適当な発現系で細胞ホストをトランスフェクト
し；
(ｂ) 被検化合物を前記細胞と接触させ；そして、
(ｃ) 前記被検化合物が前記レポーター遺伝子の発現レベルを調節するか否かを決定する。
【請求項１２】  ホスト細胞が内因的にＧＡＢＡBレセプター１を発現する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】  ホスト細胞が、さらに１つまたは２つ以上の固有の転写因子をコードする核酸分子を含む適当な発現系でトランスフェクトされる請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】  転写因子が以下を含む群から選ばれる請求項１３に記載の方法：ＣＲＥＢ−１、ＣＲＥＢ−２、ＣＲＥＭ−１、ＡＴＦ−１、ＡＴＦ−２、ＡＴＦ−３、ＡＴＦ−４、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、ＡＰ−１およびＡＰ−２。
【請求項１５】 ヒト以外のトランスジェニック動物であって、そのゲノムが、レポーター遺伝子に結合させた、ＧＡＢＡBレセプタープロモーターＰ１ａおよび／またはＰ１ｂを構成する核酸分子、または機能的に同等なその改変形またはその活性なフラグメントを含む発現系を含む該トランスジェニック動物。
【請求項１６】  ヒト以外のトランスジェニック動物であって、そのゲノムが請求項５〜８のいずれかに記載の発現系を含む該トランスジェニック動物。
【請求項１７】  請求項１５または１６に記載のヒト以外のトランスジェニック動物を使用することを含む、ＧＡＢＡBレセプター１転写の調節物質である化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１８】  請求項１５または１６に記載のヒト以外のトランスジェニック動物から単離された組織または細胞を使用することを含む、ＧＡＢＡBレセプター１転写の調節物質である化合物をスクリーニングする方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
前記発現系はさらにレポーター遺伝子を含んでいてもよく、前記プロモーターおよびレポーター遺伝子は、前記レポーター遺伝子の発現がＧＡＢＡBレセプター１プロモーターＰ１ａおよび／またはＰ１ｂによって調節可能なように配置されている。本発明の適当な発現系は、例えば細菌性プラスミドまたは酵母プラスミド、プラスミドおよびファージまたはウイルスＤＮＡの組み合わせに由来する広宿主域プラスミドおよびベクターである。さらにまた、本発明のベクターは複製起点および／または優性選択マーカーを含むことができる。本発明の発現系の構築に用いることができる適当なレポーター遺伝子は、例えばホタルのルシフェラーゼ遺伝子、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）遺伝子および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
実施例２
ＧＡＢＡBＲ１プロモーターＰ１ａおよびＰ１ｂの活性の測定
Ｐ１ａおよびＰ１ｂが本当にプロモーターとして作用するのか否かを実験的に決定するために、これらの領域をホタルのルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡと融合させ、トランスフェクトした細胞でプロモーター活性のレポーターとして用いた。
Ｒ１ａおよびＲ１ｂプロモーターフラグメントを含むレポーター構築物を、鋳型として前記プロモーター領域をカバーするゲノム配列を含むプラスミドｐＡＭ３６４を用いＰＣＲによって作製した。ＰＣＲ反応は標準的な手順（Perkin-Elmer）によって実施した。簡単に記せば、９５℃４分の最初の変性の後で９５℃１分の変性、６０℃１分のアニーリング、７２℃１分の伸長を３５サイクル、さらに最終的に７２℃７分の伸長を実施した。プロモーターフラグメントを作製するために用いたプライマーのための配列（詳細については下記表１を参照されたい）では、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄIIIエンドヌクレアーゼ制限酵素部位をそれぞれ５’および３’プライマーに導入して、ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII消化ｐＧＬ３ベーシックルシフェラーゼレポーターベクター（Promega）にサブクローニングできるようにした。したがって、完全なプロモーターレポーター構築物（ｐＡＭ４４０、ｐＡＭ４３８およびｐＡＭ４３６）は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したＲ１ａおよびＲ１ｂプロモーターフラグメントを含んでいる（表示サイズについては表を参照のこと）。プラスミドＤＮＡはキアゲンチップ（Qiagen tip)−１００カラムを供給元の指示にしたがって使用して精製した。フラグメントの正しい挿入はＤＮＡ配列決定によって確認された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
実施例５
ＧＡＢＡBＲ１プロモーターＰ１ａおよびＰ１ｂフラグメントの活性
Ｐ１ａおよびＰ１ｂプロモーターフラグメントを含むレポーター構築物を実施例２で述べたようにＰＣＲによって作製し、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子と融合させた。作製した構築物は図４に示されている。
仮定的転写開始部位はＰ１ａについては配列番号：１の３２０７位で、Ｐ１ｂについては配列番号：２の４４０５位で特定された。図４に示したプロモーター領域内の位置は、転写開始部位を＋１位として設定して計算した。