(57)【要約】  ポリペプチド化合物、ポリペプチド化合物を調製する方法及びポリペプチド化合物の適用が提供される。ポリペプチド化合物の構造式は、ｎが自然数であるＡ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙであり、ここで、Ａは生物活性を有する短ペプチドフラグメントであり、Ｋは２つの活性アミノ基を含有するＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨであり、Ｙは存在しないか、又は任意の１つ又は複数のアミノ酸若しくは化学基であり、例えばｎが１である場合、ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）−Ｙであり、ｎが２である場合、その構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙであり、ｎが３である場合、その構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）３−Ｙである。提供されるポリペプチド化合物は、腫瘍成長を阻害し、免疫を改善する効果を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎが自然数である構造式Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙによって表されるポリペプチド化合物であって、
Ａは生物活性を有する短ペプチドフラグメントであり、Ｋは２つの活性アミノ基を含有するリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨであり、ｎはＫの数であり、Ｙは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、例えばｎが１である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）−Ｙであり、ｎが２である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙであり、ｎが３である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）３−Ｙであり、
Ａは、好ましくは短ペプチドフラグメントＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘであり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）ｎ−Ｙであり、ここで、ＸＡ及びＸＢは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸であり、ＸＣ及びＸＤは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Ｘは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基である、ポリペプチド化合物。
【請求項２】
ｎが２であり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、前記ポリペプチド化合物の構造式が、下記式３に示されるようなＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）２−Ｙである、請求項１に記載のポリペプチド化合物：
【化１】
2019501964.tif 000014
【請求項３】
ｎが４であり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、前記ポリペプチド化合物の構造式が、下記式４に示されるようなＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙである、請求項１に記載のポリペプチド化合物：
【化２】
2019501964.tif 000015
【請求項４】
Ｘ又はＹが存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸から構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸若しくはペプチドフラグメントを接続することができる化学基であり、Ｘ及びＹは同じであっても又は互いに異なっていてもよく、例えばＸが存在せず、かつＹをグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）とすることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項５】
ＸＡ及びＸＢがフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよい、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項６】
ＸＣ及びＸＤがフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）のいずれかから選択され、同じであっても又は異なっていてもよい、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項７】
前記ポリペプチド化合物と有機酸又は無機酸とによって形成される塩化合物を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項８】
前記ポリペプチド化合物に含まれるヒドロキシルによって形成され得るエーテル、エステル、グルコシド又はグリコシド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項９】
前記ポリペプチド化合物に含まれるスルフヒドリルによって形成され得るチオエーテル若しくはチオグリコシド化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるスルフヒドリルとシステイン若しくはシステインを含有するペプチドとによって形成され得るジスルフィド結合を含有する化合物を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１０】
前記ポリペプチド化合物に含まれるアミドによって形成され得るアシレート若しくはアルキレート化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるアミドとサッカリドとによって形成され得るグルコシド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１１】
前記ポリペプチド化合物に含まれるカルボキシル基によって形成され得るエステル又はアミド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１２】
前記ポリペプチド化合物に含まれるイミノ基によって形成され得るグルコシド、アシレート又はアルキレート化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１３】
前記ポリペプチド化合物に含まれるフェノール性ヒドロキシルによって形成され得るエステル、エーテル、グルコシド若しくはグリコシド化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるフェノール性ヒドロキシルと有機アルカリ若しくは無機アルカリとによって形成され得る塩化合物を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１４】
前記ポリペプチド化合物と金属イオンとによって形成される配位、包接又はキレート化合物を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１５】
前記ポリペプチド化合物によって形成される水和物又は溶媒を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物を含有する医薬組成物、該医薬組成物の幾何異性体、該医薬組成物の薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物、及び医薬担体又は賦形剤の形態の該医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物を作製する方法であって、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙの合成経路が式５：
【化３】
2019501964.tif 000016
に示され、
Ａは好ましくは短ペプチドフラグメントＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘであり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、前記ポリペプチド化合物の構造式はＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）ｎ−Ｙであり、ここで、ＸＡ及びＸＢは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸であり、ＸＣ及びＸＤは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Ｘは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、
初めに、Ｙを固体樹脂に固定し、Ｙ−固体樹脂を得て、該Ｙ−固体樹脂をＦｍｏｃ脱保護によって処理し、ｎ個のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを１つずつ縮合させ、Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格の調製を達成した後、該Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を側鎖アミノ基Ｄｄｅ及びＦｍｏｃの脱保護によって処理し、セグメントＡの伸長及び導入をＫｎ−Ｙ−固体樹脂の遊離アミノ基上で同時に行い、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ−固体樹脂を得て、合成の完了後にＡ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを前記固体樹脂から切り出し、粗ペプチド生成物を得て、該粗ペプチド生成物を高速液体クロマトグラフィーによって精製し、ポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る、方法。
【請求項１８】
作製に適切な樹脂がペプチド生成物のカルボキシル末端の特徴に応じて選択され、該ペプチド生成物のカルボキシル末端が遊離カルボキシル基である場合に「ＷＡＮＧ樹脂」を選択し、合成ペプチドのカルボキシル末端がアミド基である場合に「Ｒｉｎｋ樹脂」を選択し、該ペプチド生成物のカルボキシル末端がＣｙｓ、Ｐｒｏ又はＨｉｓである場合に「ＣＴＣ樹脂」を選択する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチド化合物を、以下の工程：
工程１：Ｙ−固体樹脂を調製する工程と、
ここで、Ｙが単一アミノ酸である場合、Ｙ−固体樹脂を直接購入することができ、Ｙが複数のアミノ酸を含有する短ペプチドである場合、固相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を用いる、すなわち、Ｆｍｏｃ−ａａ１−Ｗａｎｇ樹脂を出発原料として使用し、合成をカルボキシル末端（Ｃ）からアミノ末端（Ｎ）へと行い、アミノ末端のＦｍｏｃ保護基を、該アミノ末端が遊離アミノ基となるように除去した後、Ｙ−固体樹脂が得られるまで該アミノ末端を樹脂と縮合させる；
工程２：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を調製する工程と、
ここで、前記Ｙ−固体樹脂をＦｍｏｃ脱保護により処理して、遊離アミノ基を露出させ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを用いて縮合を行い（縮合方法は前記工程１のものと同じである）、ｎ個のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨが縮合するまで縮合を繰り返し（「サイクル１」と表記する）、それによりＫｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を調製する；
工程３：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂に対してアミノ脱保護を行う工程と、
ここで、Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格中の側鎖ＬｙｓのＤｄｅ及びＦｍｏｃ保護基を除去して、側鎖上の遊離アミノ基が遊離したＫｎ−Ｙ−固体樹脂を得る；
工程４：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂の遊離アミノ基上のセグメントＡを同時に合成する工程と、  ここで、前記工程１に記載される方法により、セグメントＡが完成し、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ−固体樹脂が得られるまでアミノ酸を１つずつ縮合させる（「サイクル２」と表記する）；
工程５：合成の完了後にＡ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを固体樹脂から切り出し、側鎖上の保護基を除去して、粗生成物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る工程と、
工程６：精製して精生成物を得る工程と、
ここで、粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製して、純度が９８％を超えるポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る；
を含む固相ポリペプチド合成法により作製する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
アミノ酸を導入及び縮合させるたびに、各アミノ酸を前記「サイクル１」と前記「サイクル２」との間で縮合させた後に、「カイザーテスト」を行って遊離アミノ基の含量を検出し、反応の縮合率が十分に高くない場合に縮合をもう一度繰り返す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト又は動物の身体内での腫瘍成長を阻害するための薬物の調製における請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物又は請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法を用いて調製されるポリペプチド化合物の適用。
【請求項２２】
前記腫瘍が、ヒトの身体内の固形腫瘍（又は外科手術後の残存腫瘍）又は非固形腫瘍である、請求項２１に記載の適用。
【請求項２３】
ヒトの身体内の前記固形腫瘍（又は外科手術後の残存腫瘍）が肉腫、肝癌、結腸癌、肺癌、胃癌、乳癌及び子宮頸癌を含むが、これらに限定されず、前記非固形腫瘍が、例えば血液系腫瘍（白血病及びリンパ腫を含む）である、請求項２２に記載の適用。
【請求項２４】
ヒト又は動物用の免疫薬又は免疫機能を改善する薬物の調製における請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物又は請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法を用いて調製されるポリペプチド化合物の適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬分野、特にポリペプチド化合物分子、ポリペプチド化合物の作製方法、並びに腫瘍成長の阻害、免疫機能の改善及び血管新生の阻害のための薬物の調製におけるポリペプチド化合物の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の遺伝的遺伝子はポリデオキシヌクレオチド鎖に保存され、生物学的機能を実行するタンパク質が遺伝的遺伝子にコードされる。生物には様々なタンパク質が存在し、これらは生命活動を維持するために種々の生物学的機能を実行する。多数のタンパク質種が存在するが、これらは基本的に自然界に存在する２０種の天然アミノ酸から構成される。タンパク質は、アミノ酸の組成及び配列のために顕著に異なる。概して、５０個以上のアミノ酸を含有する分子はタンパク質と称され、１０個以上のアミノ酸を含有するペプチド鎖はポリペプチドと称され、１０個未満のアミノ酸を含有するペプチド鎖はオリゴペプチドと称される。これまで発見されている最小の機能性小ペプチドは、僅か２個のアミノ酸を含有する。通常は、４個以上のアミノ酸から構成される機能性小ペプチドが一般に見られる。
【０００３】
ヒトゲノムプロジェクトの終了及びヒトプロテオームプロジェクトの開発により、ますます多くの機能性タンパク質セグメントが発見され、バイオ医薬分野において薬物として適用されている。機能性タンパク質セグメントは通常、特定の生物学的機能を有することが見出されている直鎖状フラグメント鎖ポリペプチドフラグメントを指す。かかる機能性タンパク質セグメントは通常、２個〜数十個のアミノ酸から構成されるペプチドセグメントである。同定及び発見されている機能性タンパク質セグメントは、人工合成アプローチにおいて調製することができる。開発され、臨床的に適用されているポリペプチド薬としては、「オキシトシン」、「サイモシンα１」及び「チモペンチン」等が挙げられる。現在利用可能なポリペプチド薬としては、天然ペプチド鎖の人工修飾により調製され、消化管の出血及び末端肥大症の治療に使用されている「オクトレオチド」、並びに抗凝血効果を有する「ヒルジンペプチド」が挙げられる。タンパク質中の機能性セグメントは多くの場合、数十個のアミノ酸又は更には僅か２個のアミノ酸を含有するポリペプチドセグメントへとスクリーニングすることができる。これらは、機能性ポリペプチドセグメントの人工合成及び適用の基礎を築く。
【０００４】
タンパク質、ポリペプチド又はオリゴペプチドにおいて、単一アミノ酸の欠失、付加又は置換、アミノ末端（Ｎ末端）又はカルボキシル末端（Ｃ末端）の閉鎖（closing）、配列中又は遊離末端への任意の化学基の付加等は、タンパク質、ポリペプチド又はオリゴペプチドの元の生物活性の変化をもたらす。新たな機能性ペプチドフラグメントの設計、スクリーニング及び発見又は効率的なペプチドフラグメントの探索は、薬物開発の重要な一環である。
【発明の概要】
【０００５】
従来技術における技術的欠陥を克服するために、一態様では、本発明は、ｎが自然数である構造式Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙによって表される多コピーポリペプチド化合物であって、
Ａは生物活性を有する短ペプチドフラグメントであり、Ｋは２つの活性アミノ基を含有するリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨであり、ｎはＫの数であり、Ｙは存在しない（null）か、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、例えばｎが１である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）−Ｙであり、ｎが２である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙであり、ｎが３である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）３−Ｙであり、
Ａは、好ましくは短ペプチドフラグメントＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘであり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）ｎ−Ｙであり、ここで、ＸＡ及びＸＢは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸であり、ＸＣ及びＸＤは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Ｘは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基である、多コピーポリペプチド化合物を提供する。
【０００６】
ｎが２であり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、ポリペプチド化合物の構造式は、下記式３に示されるようなＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）２−Ｙである：
【化１】
2019501964.tif 000002
【０００７】
ｎが４であり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、ポリペプチド化合物の構造式は、下記式４に示されるようなＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙである：
【化２】
2019501964.tif 000003
【０００８】
ここで、Ｘ又はＹは、存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸から構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸若しくはペプチドフラグメントを接続することができる化学基であり、Ｘ及びＹは同じであっても又は互いに異なっていてもよく、例えばＸが存在せず、かつＹをグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）とすることができる。
【０００９】
ＸＡ及びＸＢは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよい。
【００１０】
ＸＣ及びＸＤは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）のいずれかから選択され、同じであっても又は異なっていてもよい。
【００１１】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物と有機酸又は無機酸とによって形成される塩化合物を更に含む。
【００１２】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物に含まれるヒドロキシルによって形成され得るエーテル、エステル、グルコシド又はグリコシド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない。
【００１３】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物に含まれるスルフヒドリルによって形成され得るチオエーテル若しくはチオグリコシド化合物、又はポリペプチド化合物に含まれるスルフヒドリルとシステイン若しくはシステインを含有するペプチドとによって形成され得るジスルフィド結合を含有する化合物を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない。
【００１４】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物に含まれるアミドによって形成され得るアシレート若しくはアルキレート化合物、又はポリペプチド化合物に含まれるアミドとサッカリドとによって形成され得るグルコシド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない。
【００１５】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物に含まれるカルボキシル基によって形成され得るエステル又はアミド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない。
【００１６】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物に含まれるイミノ基によって形成され得るグルコシド、アシレート又はアルキレート化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない。
【００１７】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物に含まれるフェノール性ヒドロキシルによって形成され得るエステル、エーテル、グルコシド又はグリコシド化合物、又はポリペプチド化合物に含まれるフェノール性ヒドロキシルと有機アルカリ若しくは無機アルカリとによって形成され得る塩化合物を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない。
【００１８】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物と金属イオンとによって形成される配位、包接又はキレート化合物を更に含む。
【００１９】
ポリペプチド化合物は、ポリペプチド化合物によって形成される水和物又は溶媒を更に含む。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、上述のポリペプチド化合物を含有する医薬組成物、該医薬組成物の幾何異性体、該医薬組成物の薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物、及び医薬担体又は賦形剤の形態の該医薬組成物を提供する。
【００２１】
第３の態様では、本発明は、上述のポリペプチド化合物を作製する方法であって、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙの合成経路が式５：
【化３】
2019501964.tif 000004
に示され、
Ａは好ましくは短ペプチドフラグメントＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘであり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、ポリペプチド化合物の構造式はＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）ｎ−Ｙであり、ここで、ＸＡ及びＸＢは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸であり、ＸＣ及びＸＤは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Ｘは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、
初めに、Ｙを固体樹脂に固定し、Ｙ−固体樹脂を得て、該Ｙ−固体樹脂をＦｍｏｃ脱保護によって処理し、ｎ個のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを１つずつ縮合させ、Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格の調製を達成した後、該Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を側鎖アミノ基Ｄｄｅ及びＦｍｏｃの脱保護によって処理し、セグメントＡの伸長及び導入をＫｎ−Ｙ−固体樹脂の遊離アミノ基上で同時に行い、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ−固体樹脂を得て、合成の完了後にＡ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを固体樹脂から切り出し、粗ペプチド生成物を得て、該粗ペプチド生成物を高速液体クロマトグラフィーによって精製し、ポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る、方法を提供する。
【００２２】
作製に適切な樹脂がペプチド生成物のカルボキシル末端の特徴に応じて選択され、該ペプチド生成物のカルボキシル末端が遊離カルボキシル基である場合に「ＷＡＮＧ樹脂」を選択し、合成ペプチドのカルボキシル末端がアミド基である場合に「Ｒｉｎｋ樹脂」を選択し、該ペプチド生成物のカルボキシル末端がＣｙｓ、Ｐｒｏ又はＨｉｓである場合に「ＣＴＣ樹脂」を選択する。
【００２３】
ポリペプチド化合物を、以下の工程を含む固相ポリペプチド合成法により作製する。
【００２４】
工程１：Ｙ−固体樹脂を調製する工程：
ここで、Ｙが単一アミノ酸である場合、Ｙ−固体樹脂を直接購入することができ、Ｙが複数のアミノ酸を含有する短ペプチドである場合、固相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を用いる、すなわち、Ｆｍｏｃ−ａａ１−Ｗａｎｇ樹脂を出発原料として使用し、合成をカルボキシル末端（Ｃ）からアミノ末端（Ｎ）へと行い、アミノ末端のＦｍｏｃ保護基を、該アミノ末端が遊離アミノ基となるように除去した後、Ｙ−固体樹脂が得られるまで該アミノ末端を樹脂と縮合させる。
【００２５】
すなわち、Ｙが単一アミノ酸ａａである場合、「ａａ１−固体樹脂」を直接購入することができる。Ｙが複数のアミノ酸を含有する短ペプチドである場合、固相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を用いる。すなわち、Ｆｍｏｃ−ａａ１−Ｗａｎｇ樹脂（置換値は０．４０ｍｍｏｌ／ｇである）を出発原料として使用し、合成をカルボキシル末端（Ｃ）からアミノ末端（Ｎ）へと行い、アミノ末端のＦｍｏｃ保護基を、アミノ末端が遊離アミノ基となるように２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ）により除去し（２回、１回当たり１０分間）、当量の３倍に相当する量のＦｍｏｃ−ａａ−ＯＨ／ＨＯＢｔ／ＤＩＣを用いて樹脂と縮合させ、反応時間を１時間とする。各々の反応工程後に樹脂をＤＭＦで６回洗浄し、反応の程度をカイザーテストによって検出し、縮合反応が不十分であることが見出された場合には縮合をもう一度繰り返す。Ｆｍｏｃ−ａａ２−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ａａ３−ＯＨ等を順次導入し、「Ｙ−固体樹脂」が完全に形成されるまで縮合反応を繰り返す。
【００２６】
工程２：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を調製する工程：
ここで、Ｙ−固体樹脂をＦｍｏｃ脱保護により処理して、遊離アミノ基を露出させ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを用いて縮合を行い（縮合方法は工程１のものと同じである）、ｎ個のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨが縮合するまで縮合を繰り返し（「サイクル１」と表記する）、それによりＫｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を調製する。
【００２７】
すなわち、Ｆｍｏｃ脱保護を行って遊離アミノ基を露出させ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを用いて縮合を行い（縮合方法は工程１に記載される）、ｎ個のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨが縮合するまで縮合を繰り返し（「サイクル１」と表記する）、それによりＫｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を調製する。
【００２８】
工程３：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂に対してアミノ脱保護を行う工程：
ここで、Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格中のＬｙｓの側鎖Ｄｄｅ及びＦｍｏｃ保護基を除去して、側鎖上の遊離アミノ基が遊離したＫｎ−Ｙ−固体樹脂を得る。
【００２９】
すなわち、「Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂」ペプチド鎖中の側鎖ＬｙｓのＤｄｅ及びＦｍｏｃ保護基を、２％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ）により除去して（２回、１回当たり１５分間）、側鎖上の遊離アミノ基が遊離したＫｎ−Ｙ−固体樹脂を得る。
【００３０】
工程４：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂の遊離アミノ基上のセグメントＡを同時に合成する工程：
ここで、工程１に記載される方法により、セグメントＡが完成し、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ−固体樹脂が得られるまでアミノ酸を１つずつ縮合させる（「サイクル２」と表記する）。
【００３１】
すなわち、Ｆｍｏｃ−ａａ１−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ａａ２−ＯＨ等を、工程１に記載される方法により、セグメントＡが完成し、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ−固体樹脂が得られるまで１つずつ縮合させる（「サイクル２」と表記する）。
【００３２】
工程５：合成の完了後にＡ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを固体樹脂から切り出し、側鎖上の保護基を除去して、粗生成物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る。
【００３３】
すなわち、合成の完了後にＡ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを９５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏにより固体樹脂から切り出し、側鎖上の保護基を除去する（３０℃で３時間の切出し）。Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを含有する溶離液を回収し、多量の冷無水エーテルを添加して、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを沈殿させた後、混合物を遠心分離する。混合物をエーテルで数回洗浄した後、乾燥させる。これにより粗生成物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹが得られる。
【００３４】
工程６：精製して精生成物を得る工程：
ここで、粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（high efficiency liquid chromatography）（ＨＰＬＣ）によって精製して、純度が９８％を超えるポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る。
【００３５】
すなわち、粗生成物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム（モデルＤａｉｓｏ  Ｃ１８、１０μｍ、１００Å、５０×２５０ｍｍ）を用いて精製する（ここで、移動相Ａは０．０５％トリフルオロ酢酸及び２％アセトニトリルを含有する水溶液であり、移動相Ｂは９０％アセトニトリル／水であり、流速は２５ｍＬ／分であり、紫外検出波長は２２０ｎｍである）。溶出ピーク溶液を回収した後、凍結乾燥によって乾燥させる。これにより、純度が９８％を超える白色の綿状ポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹが得られる。
【００３６】
工程７：保管：
ここで、凍結乾燥後に得られる白色の綿状ポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを冷暗環境に保管する。
【００３７】
アミノ酸を導入及び縮合させるたびに、各アミノ酸を「サイクル１」と「サイクル２」との間で導入及び縮合させた後に、「カイザーテスト」を行って遊離アミノ基の含量を検出し、反応の縮合率が十分に高くない場合に縮合をもう一度繰り返す。
【００３８】
第４の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体における腫瘍成長を阻害する薬物の調製における上述のポリペプチド化合物又は上述の方法を用いて調製されるポリペプチド化合物の適用を提供する。
【００３９】
腫瘍は、ヒトの身体における悪性固形腫瘍（又は医療手術後の残存腫瘍）、又は血液系腫瘍（白血病及びリンパ腫を含む）等の非固形腫瘍である。
【００４０】
腫瘍は肉腫、肝癌、結腸癌、肺癌、胃癌、乳癌及び子宮頸癌を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
第５の態様では、本発明は、ヒト又は動物用の免疫薬又は免疫機能を改善する薬物の調製における上述のポリペプチド化合物又は上述の方法を用いて調製されるポリペプチド化合物の適用を提供する。
【００４２】
本発明において開示されるポリペプチド化合物は、様々な薬物において効果的な成分となることが期待され、多くの疾患の予防及び治療のための薬物に適用可能である。特に、該ポリペプチド化合物は、免疫能の改善及び腫瘍成長の阻害のための薬物の調製に広く適用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以前に開示されている多コピー機能性セグメントペプチド分子を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを用いて調製し、得られる多コピーペプチド分子に含有される活性ペプチドセグメントのコピー数を、２ｎ（ｎ＝１、２、３等）ずつ増加させる。例えば、２コピーペプチド分子又は４コピーペプチド分子又は８コピーペプチド分子又は１６コピーペプチド分子等を含有する機能性ポリペプチド化合物分子を形成する。そのように調製されるポリペプチド化合物では、活性フラグメントのコピー数が等比級数的に増加するため、分子量も等比級数的に増加する。異なる級数で異なるペプチド分子のコピー数を有するポリペプチド化合物分子間の分子量の差が非常に大きいことから、分子量が実際の用途の最適範囲を超える場合がある。実際の用途では、実際の用途に最適なペプチド分子形態は通常、ペプチド分子のサイズと免疫原性との関係、ペプチド分子と標的分子の反応との関係、及びペプチド分子合成の投入産出比等を含む多くの要因を考慮した包括的評価により決定する必要がある。
【００４４】
ペプチド分子における上述の問題を十分に考慮することで、本発明は、より実用的であり、任意のコピー数のペプチド分子を有し得るポリペプチド分子、及びポリペプチド分子を作製する方法を提供する。本発明において提供されるポリペプチド分子及び作製方法は、従来技術における多くの不利点を克服する、例えば、多コピーポリペプチド分子は現在、ペプチド分子のコピー数を等比級数的にのみ増加させることによって調製する必要がある。
【００４５】
本発明においては、セグメントＡの任意のコピーを含有する分岐ポリペプチド分子Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙを設計及び調製するが、ここで、Ａは特定の生物学的機能を有する活性ペプチドセグメントであり、Ｋは２つの活性アミノ基を含有するリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨであり、ｎはＫの数であり、Ｙは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基である。構造式Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙは、以下のように説明される：ポリペプチド化合物の構造式がＡ−（Ａ−Ｋ）−Ｙである、すなわち、ｎが１である場合、ポリペプチド化合物中の生物活性を有する短ペプチドフラグメントＡの総コピー数はｎ＋１＝２であり、構造式がＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙである、すなわちｎが２である場合、ポリペプチド化合物中のＡの総コピー数は３である、等である。
【００４６】
本発明においては、Ａは概して、特定の生物学的機能を有する活性ペプチドセグメントを表す。本発明の目的をより明らかに説明するために、実施形態では、ＡはＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘとして具体化される。ここで、ＸＡ及びＸＢは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよい。ＸＣ及びＸＤは、上述の脂肪族アミノ酸分子のいずれかから選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、又はＸＣ及びＸＤは、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）のいずれかを含む複素環式アミノ酸から選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、Ｘは存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸から構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸とペプチドフラグメントとを結合することができる化学基である。ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ及びＸＤの種を変化させることによって、本発明において提供されるポリペプチド化合物を、腫瘍成長の阻害及び生体の免疫応答能の改善に使用することができ、それにより、免疫機能の改善及び／又は腫瘍成長の阻害のために（ヒト又は動物への）臨床用途に使用することができる薬物を開発することができる。
【００４７】
１９６３年に、米国の科学者R. B. Merrifieldは、標的ペプチド中のアミノ酸のカルボキシル末端（Ｃ末端）を不溶性樹脂に固定し、樹脂に結合させたアミノ酸のアミノ末端（Ｎ末端）を、結合させるアミノ酸のカルボキシル末端との縮合反応を有するように制御することによってペプチド鎖を伸長させる、すなわち、アミノ酸をポリペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末端）から出発して１つずつ縮合させ、ポリペプチドセグメントのアミノ末端（Ｎ末端）に向かって連続的に伸長させる固相合成法を発明した。したがって、アミノ酸の縮合反応を実行する場合、結合させるアミノ酸のアミド基及び側鎖基は、それらの反応を回避するために保護しなければならない。現在一般に用いられている保護法としては、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護法、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護法及びヒドラジン水和物（Ｄｄｅ）保護法が挙げられる。したがって、アミノ酸を結合させるたびに脱保護−縮合サイクルを実行しなければならない（すなわち、固相担体上のアミド基を初めに脱保護した後、過剰量のアミノ酸中で結合させる次の標的アミノ酸のカルボキシル基との縮合反応を行い、ペプチド鎖を伸長させる）。各サイクル、すなわちアミノ酸の縮合→洗浄→脱保護→中和→洗浄により、必要とされる長さの標的ペプチド鎖が合成されるまで標的アミノ酸を結合させる。
【００４８】
本発明においては、２つの活性アミノ基を有するリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを初めに用いて、所望のコピー数が達成されるまで縮合反応を順次行い（縮合させるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ分子の数ｎは、所望のコピー数に１を減じたものに等しい）、それにより−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−から構成され、固体樹脂に固定されたＫｎ−Ｙ分子骨格を合成により得る。次いで、「Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂」のリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）の側鎖上のアミノ基のＤｄｅ及びＦｍｏｃ保護基を除去して、遊離アミノ基を露出させ、Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨアミノ酸縮合反応のサイクルを開始し、セグメントＡが合成されるまで行い、それにより「Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ−固体樹脂」を得る。次に、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを９５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏにより固体樹脂から切り出し、精製して、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ精製物を得る。最終的に得られるポリペプチド分子に含有される生物活性を有するセグメントのコピー数（ｎ＋１）は、数「ｎ」によって決まる。すなわち、ｎが２である場合、３コピーのセグメントＡを含有する３コピーＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙペプチド分子が得られ、ｎが４である場合、５コピーのセグメントＡを含有する５コピーＡ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙペプチド分子が得られる、等である。４コピー、６コピー又は７コピー等のセグメントＡを含有する多コピーペプチド分子を得ることができる。
【００４９】
ＷＡＮＧ樹脂を用いた合成の完了後に、ペプチド鎖をＴＦＡ法により固体樹脂から切り出し、２つのコピー、３つのコピー、４つのコピー、５つのコピー、６つのコピー、７つのコピー又は８つのコピー等を含有するＡ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ分子を得る。
【００５０】
本発明は、多コピーポリペプチド化合物分子構造及び多コピーポリペプチド化合物分子構造を作製する方法を記載するものであるが、他の方法を用いて合成される分子骨格Ａ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙを有するペプチド化合物も当然ながら本発明に含まれる。当然、構造的特徴が関連した、又はアミノ酸若しくは化学基をＡとＫとの間に挿入することによって形成される、分子骨格（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙを有する分子も本発明に含まれる。（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙは、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨをペプチド分子の末端に縮合させた後、ペプチド分子のアミノ末端のＦｍｏｃをＢｏｃ無水物で終端させ、Ｄｄｅを２％ピペリジン／ＤＭＦにより脱保護した後、セグメントＡを更に縮合及び結合させることによって形成されるため、ペプチド化合物の骨格は、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙと比較して１コピーのセグメントＡが減少し、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙの変異体である（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙとなる。
【００５１】
ｎコピーのセグメントＡ中の末端基をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨで置き換えることによって形成される分子構造も、本発明ではＡ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙの変異体である。例えば、「Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂」の末端のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨをＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨで置き換えることによって同じ生成物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙを得ることができる。
【００５２】
１つ以上のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨをＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨで置き換えることによる複数のコピーのセグメントＡを含有するＡ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙ分子の調製において、３コピーのセグメントＡを含有するＡ２Ｋ−（Ａ−Ｋ）−Ｙ分子、５コピーのセグメントＡを含有する（Ａ２Ｋ）２Ｋ−（Ａ−Ｋ）−Ｙ分子、又は９コピーのセグメントＡを含有する［（Ａ２Ｋ）２Ｋ］２Ｋ−（Ａ−Ｋ）−Ｙ分子を形成することができ、これらの変異体構造は任意のコピー数のセグメントＡの特徴を含み、また当然ながら本発明の範囲に属する。
【００５３】
以下に、本発明をより具体的に説明するために本発明を実施形態において更に詳述するが、これらの実施形態は本発明のいかなる限定も構成すると理解されるものではない。本発明の実施形態に対し、当業者によって為される本明細書の啓示に基づく任意の変更又は派生は、本発明の範囲に含まれるとみなされるものとする。
【００５４】
実施形態１：コピーペプチドフラグメントの合成
本発明において開示されるポリペプチド化合物は、それが２つのコピー、３つのコピー又は５つのコピー等を含むかにかかわらず、同じコピーペプチドセグメントＡを有し、ここで、Ａは生物活性を有する短ペプチドフラグメントＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘであり、ＸＡ及びＸＢは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよく、ＸＣ及びＸＤは、上述の脂肪族アミノ酸分子のいずれかから選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、又はＸＣ及びＸＤは、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）のいずれかを含む複素環式アミノ酸から選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、Ｋは２つの活性アミノ基を含有するリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨであり、Ｘ又はＹは存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸によって構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸とペプチドフラグメントとを結合することができる化学基であり、幾つかの考え得る組合せを表２に示すが、本発明はこれらの組合せに限定されない。
【００５５】
本実施形態は、遊離カルボキシル末端でのペプチドフラグメントの合成により例示的に説明されるが、実際の用途ではペプチド及びカルボキシル末端が、例えばアミド化等によって付加的に化学修飾されていてもよい。
【００５６】
合成は、固相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕを用いた手動合成によって行っても、又は自動ポリペプチド合成装置（モデルＡＢＩ４３３Ａ）を用いて行ってもよい。具体的な操作は、以下の通りである。
【００５７】
Ｆｍｏｃ−ａａｘ−Ｗａｎｇ樹脂（置換値は０．４０ｍｍｏｌ／ｇである）を出発原料として使用し、合成をカルボキシル末端からアミノ末端へと行い、樹脂中の初期アミノ酸のアミノ末端のＦｍｏｃ保護基を、アミノ末端が遊離アミノ基となるように２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ）により除去し（２回、１回当たり１０分間）、当量の３倍に相当する量のＦｍｏｃ−ａａＤ−ＯＨ／ＨＯＢｔ／ＤＩＣを用いて樹脂と縮合させ、反応時間を１時間とする。各々の反応工程後に樹脂をＤＭＦで６回洗浄し、縮合反応の程度をカイザーテストによって検出し、縮合反応が不十分であることが見出された場合には縮合をもう一度繰り返す。Ｆｍｏｃ−ａａＤ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ａａＣ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ａａＢ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−ａａＡ−ＯＨを、セグメントＡの配列ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘに従って順次縮合させ（Ｆｍｏｃ−ａａＤ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ａａＣ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ａａＢ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−ａａＡ−ＯＨは、アミノ基がＦｍｏｃによって保護されたアミノ酸ＸＤ、ＸＣ、ＸＢ及びＸＡを表す）、アミノ酸を縮合させるたびに、セグメントＡが完全に合成されるまで反応サイクルを繰り返す。
【００５８】
合成の完了後にセグメントＡを９５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏにより固体樹脂から切り出し、側鎖上の保護基を除去する（３０℃で３時間の切出し）。多量の冷無水エーテルを、切り出されたセグメントＡを含有する回収した液体に添加して、ペプチドを沈殿させた後、混合物を遠心分離し、上清を除去し、沈殿物をエーテルで数回洗浄した後、乾燥させる。これによりセグメントＡの粗生成物が得られる。
【００５９】
セグメントＡの粗生成物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム（モデルＤａｉｓｏ  Ｃ１８、１０μｍ、１００Å、５０×２５０ｍｍ）を用いて精製する。クロマトグラフィー操作において、移動相Ａは０．０５％トリフルオロ酢酸及び２％アセトニトリルを含有する水溶液であり、移動相Ｂは９０％アセトニトリル／水であり、流速は２５ｍＬ／分であり、紫外検出波長は２２０ｎｍである。溶出ピーク溶液を回収し、これにより純度が９８％を超えるセグメントＡペプチドの生成物が得られる。凍結乾燥後に白色の綿状セグメントＡペプチド生成物が得られ、生成物を密封包装し、冷暗環境に保管する。
【００６０】
ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ及びＸＤのアミノ酸合成のための原料Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨは市販されている。本発明に記載されるペプチド化合物のセグメントＡを調製する場合、代替的にはＸＤ−ＷＡＮＧ樹脂又はＸ−ＷＡＮＧ樹脂を直接購入してもよく、上記の方法を用いて本発明のペプチドセグメントＡコピーを得ることができる。合成によって得られる幾つかのペプチドセグメントＡコピーを表１に挙げるが、それらの分子量は質量分析によって測定される。
【００６１】
【表１】
2019501964.tif 000005
【００６２】
表１中の質量分析によって測定される各セグメントＡの分子量と分子量の理論値との検出誤差は、０．０１％の範囲内であり、セグメントＡが正確に対応する実施形態におけるセグメントＡであることが証明される。
【００６３】
本実施形態の表１にセグメントＡの幾つかの例を挙げるが、実施形態は表１に挙げられるセグメントに限定されない。合成は、以下の実施形態に記載される方法で行うことができるが、この方法に限定されない。
【００６４】
実施形態２：３コピーＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙペプチド分子及び５コピーＡ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙペプチド分子の合成
本発明においては、遊離カルボキシル末端を有するペプチド分子の調製により合成を例示的に説明する。実際の用途では、合成ペプチド分子のカルボキシル末端は、この形態に限定されず、適切な固体樹脂を必要に応じて合成に選択することができる。
【００６５】
３コピーペプチド分子Ａ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙは、３コピーのＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘを含有するポリペプチド化合物ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）２−Ｙである。構造及び合成経路を式１に示す。
【化４】
2019501964.tif 000006
【００６６】
ここで、ＸＡ及びＸＢは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよく、ＸＣ及びＸＤは、上述の脂肪族アミノ酸分子のいずれかから選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、又はＸＣ及びＸＤは、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）のいずれかを含む複素環式アミノ酸から選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、Ｋは、２つの活性アミノ基を含有するリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨであり、Ｘ又はＹは存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸によって構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸とペプチドフラグメントとを結合することができる化学基である。
【００６７】
３コピーセグメントＡペプチド分子を調製する方法は、以下の通りである：
Ｙ−固体樹脂→Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ縮合「サイクル１」の開始→２回の「サイクル１」の完了→Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｙ−固体樹脂→Ｄｄｅ及びＦｍｏｃ脱保護→Ｈ２Ｎ−Ｌｙｓ（Ｈ２Ｎ）−Ｌｙｓ（Ｈ２Ｎ）−Ｙ−固体樹脂→セグメントＡの合成  −  Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨ縮合の「サイクル２」の開始→Ａ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｙ−固体樹脂→合成の完了→Ａ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｙの粗生成物を得るための側鎖上の保護基の除去及び樹脂からのペプチドの切出し→精製→精ペプチド生成物→冷環境での保管。
【００６８】
本実施形態においては、固相ポリペプチド合成法を用いるが、具体的な操作は以下の通りである。
【００６９】
本実施形態においては、アミノ酸をポリペプチドのカルボキシル末端（Ｃ）からアミノ末端（Ｎ）へと１つずつ縮合及び伸長させた後、合成の終了後に標的ポリペプチドをＴＦＡ法により固体樹脂から切り出すことによってポリペプチドを手動合成する。
【００７０】
初めに、Ｙを固体樹脂に固定した後、２つの活性アミノ基を有する２つのリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ分子を１つずつ縮合させて、Ｋ２−Ｙ樹脂を得る。リシンは末端に活性化アミノ基を有するため、リシンと活性アミノ基を有する別のリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）とを反応させることができ、それにより伸長線状鎖を有するＫ２Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂を得ることができる。次いで、末端リシンとセグメントＡ（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ）とを活性アミノ基で反応させ、それにより伸長線状鎖を有するＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ２Ｙ−ＷＡＮＧ固体樹脂を得る。２％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ）を用いてＫ２Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂の側鎖上のリシンの保護アミノ基に対してＤｄｅ及びＦｍｏｃ脱保護を行った後、セグメントＡ（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ）を構成するアミノ酸Ｘ、ＸＤ、ＸＣ、ＸＢ及びＸＡを側鎖上の遊離アミノ基で同時に１つずつ縮合させる。これにより、３コピーのセグメントＡ  ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘを含有する化合物ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）２−Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂（又はＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂）が得られる。
【００７１】
本工程では、ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘセグメントを初めに実施形態１に記載されるように合成した後、これをＫ２−Ｙ−ＷＡＮＧ固体樹脂と縮合させるか、又はセグメントＡを構成するアミノ酸Ｘ、ＸＤ、ＸＣ、ＸＢ及びＸＡをＫ２−Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂の遊離アミノ基で同時に順次導入し、縮合させて、Ａ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂を得ることができる。最後に、Ａ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｙを９５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯによりＷＡＮＧ樹脂から切り出して、ポリペプチド化合物Ａ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｙ又はＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙの粗生成物を得る。
【００７２】
ペプチド化合物ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）２−Ｙの精製：
粗生成物を、クロマトグラフィーカラム（モデル：Ｄａｉｓｏ  Ｃ１８、１０μｍ、１００Å、５０×２５０ｍｍ）を用いて精製する。ここで、クロマトグラフィー操作における移動相Ａは、０．０５％トリフルオロ酢酸及び２％アセトニトリルを含有する水溶液であり、移動相Ｂは９０％アセトニトリル／水であり、流速は２５ｍＬ／分であり、紫外検出波長は２２０ｎｍである。溶出ピーク溶液を回収した後、凍結乾燥させる。これにより、白色の綿状ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）２Ｙポリペプチド化合物が得られる。次いで、ポリペプチド化合物を後に使用するために密閉状態で包装し、冷蔵庫に保管する。ポリペプチド化合物の純度は、９９％超であり得る。
【００７３】
ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ及びＸＤのアミノ酸合成のための原料Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨは市販されている。本発明においてポリペプチド化合物を調製する場合、代替的にはＹ−ＷＡＮＧ樹脂原料を直接購入してもよく、上記の方法を用いて本発明に記載されるポリペプチド化合物を得ることができる。
【００７４】
３コピーのセグメントＡを含有するペプチド分子ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）２−Ｙ及び５コピーのセグメントＡを含有するペプチド分子ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙを、本実施形態において例示的な方法を用いて合成する。具体的な基の選択を、それぞれ表２及び表３に示す。
【００７５】
【表２】
2019501964.tif 000007
【００７６】
表２中の質量分析によって測定される各３コピーセグメントＡペプチド分子の分子量と分子量の理論値との検出誤差は、０．０１％の範囲内であり、３コピーセグメントＡペプチド分子が正確に対応する実施形態におけるペプチド分子であることが証明される。
【００７７】
本実施形態では、セグメントＡ及びここで形成される分子構造の形態を単に例示的に説明するものであり、列挙されるセグメントに限定されない。上記の内容は、本発明のいかなる限定もなさず、合成は、実際に以下の実施形態に記載される方法で行うことができるが、この方法に限定されない。
【００７８】
実施形態３：５コピーペプチド分子ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙの合成
本発明において提供される５コピーペプチド分子Ａ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙは、５コピーのＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘを含有するポリペプチド化合物ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙである。構造及び合成経路を式２に示す。ここで、ＸＡ及びＸＢは、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよく、ＸＣ及びＸＤは、上述の脂肪族アミノ酸分子のいずれかから選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、又はＸＣ及びＸＤは、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）のいずれかを含む複素環式アミノ酸から選択することができ、同じであっても若しくは異なっていてもよく、Ｋは、２つの活性アミノ基を含有するリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨであり、Ｘ又はＹは存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸によって構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸とペプチドフラグメントとを結合することができる化学基である。
【化５】
2019501964.tif 000008
【００７９】
５コピーセグメントＡペプチド分子を調製する方法は、以下の通りである：
Ｙ−固体樹脂→Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ縮合の「サイクル１」の開始→４回の「サイクル１」の完了→Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｙ−固体樹脂→側鎖上のアミノ基に対するＤｄｅ及びＦｍｏｃ脱保護→Ｈ２Ｎ−Ｌｙｓ（Ｈ２Ｎ）−Ｌｙｓ（Ｈ２Ｎ）−Ｌｙｓ（Ｈ２Ｎ）−Ｌｙｓ（Ｈ２Ｎ）−Ｙ−固体樹脂→セグメントＡの合成  −  Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨ縮合の「サイクル２」の開始→Ａ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｙ−固体樹脂→合成の完了→Ａ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｙの粗生成物を得るための側鎖上の保護基の除去及び樹脂からのペプチドの切出し→精製→精ペプチド生成物→冷環境での保管。
【００８０】
本実施形態においては、固相ポリペプチド合成法を用いるが、具体的な操作は以下の通りである。
【００８１】
ポリペプチド化合物ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙの合成：
本実施形態においては、アミノ酸をポリペプチドのカルボキシル末端（Ｃ）からアミノ末端（Ｎ）へと１つずつ縮合及び伸長させた後、合成の終了後に標的ポリペプチドをＴＦＡ法により固体樹脂から切り出すことによってポリペプチドを手動合成する。
【００８２】
初めに、Ｙを固体樹脂に固定した後、２つの活性アミノ基を有する４つのリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ分子を１つずつ縮合させて、Ｋ４−Ｙ樹脂を得る。リシンは末端に活性化アミノ基を有するため、リシンと活性アミノ基を有する別のリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）とを反応させ、活性アミノ基を有する第３及び第４のリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）と反応させることができ、それにより伸長線状鎖を有するＫ４Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂を得ることができる。次いで、末端リシンとセグメントＡ（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ）とを活性アミノ基で反応させ、それにより伸長線状鎖を有するＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ４−Ｙ−ＷＡＮＧ固体樹脂を得る。２％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ）を用いてＫ４Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂のリシン側鎖のアミノ基に対してＤｄｅ及びＦｍｏｃ脱保護を行った後、セグメントＡを構成するアミノ酸Ｘ、ＸＤ、ＸＣ、ＸＢ及びＸＡをＫ４Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂の遊離アミノ基で同時に導入し、縮合させる。すなわち、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）脱保護後に、セグメントＡ（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ）を遊離アミノ基と縮合させ、それにより５コピーのセグメントＡ  ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘを含有する化合物ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂（又はＡ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂）を得る。
【００８３】
最後に、ペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙを９５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯによりＷＡＮＧ樹脂から切り出して、ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４Ｙ（又はＡ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙ）の粗生成物を得る。
【００８４】
ポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙの精製：
粗生成物を、クロマトグラフィーカラム（モデル：Ｄａｉｓｏ  Ｃ１８、１０μｍ、１００Å、５０×２５０ｍｍ）を用いて精製する。ここで、クロマトグラフィー操作における移動相Ａは、０．０５％トリフルオロ酢酸及び２％アセトニトリルを含有する水溶液であり、移動相Ｂは９０％アセトニトリル／水であり、流速は２５ｍＬ／分であり、紫外検出波長は２２０ｎｍである。溶出ピーク溶液を回収した後、凍結乾燥させる。これにより、白色の綿状Ａ−（Ａ−Ｋ）４−Ｙポリペプチド化合物が得られる。次いで、ポリペプチド化合物を後に使用するために密閉状態で包装し、冷蔵庫に保管する。ポリペプチド化合物の純度は、９９％超であり得る。
【００８５】
セグメントＡの合成に使用される原料ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ及びＸＤは市販されている。本発明においてポリペプチド化合物を調製する場合、Ｙ−ＷＡＮＧ樹脂を合成の出発原料として直接購入してもよく、上述の方法を用いてアミノ酸をＹのアミノ末端に導入し、縮合させて、本発明のポリペプチド化合物を得ることができる。
【００８６】
本実施形態に記載される方法を用いて、一連の５コピーペプチド分子ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙが得られる。基の選択については表３を参照されたい。
【００８７】
【表３】
2019501964.tif 000009
【００８８】
表３中の質量分析によって測定される各５コピーセグメントＡペプチド分子の分子量と分子量の理論値との検出誤差は、０．０１％の範囲内であり、５コピーセグメントＡペプチド分子が正確に対応する実施形態におけるペプチド分子であることが証明される。
【００８９】
本実施形態では、セグメントＡ及びここで形成される分子構造の形態を単に例示的に説明するものであり、列挙されるセグメントに限定されない。上記の内容は、本発明のいかなる限定もなさず、合成は、実際に以下の実施形態に記載される方法で行うことができるが、この方法に限定されない。
【００９０】
任意のコピー数の生物活性ペプチドセグメントを含有するペプチド分子を、本発明に記載される方法を用いて調製することができる。本実施形態においては、３コピーの生物活性ペプチドセグメント（セグメントＡ）を含有する典型的なペプチド分子及び５コピーの生物活性ペプチドセグメントを含有するペプチド分子を、本発明に記載されるペプチド分子Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙの調製の実行可能性及び有効性を証明するために、特に調製及び試験する。
【００９１】
本発明は、複数のコピーの生物活性ペプチドセグメントを含有する化合物の作製に関する。分子式Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙにおいて、Ａは生物活性ペプチドセグメントを表す。例示を目的として、実施形態に用いられる幾つかの生物活性セグメントを表に挙げる。しかしながら、実際の用途では、Ａは生物活性を有する全てのペプチドフラグメントを表し、ここで関与する生物学的機能は、実施形態に例示的に記載され、限られた範囲の機能を有する活性ペプチドセグメントのもののみに限定されない。
【００９２】
実施形態に開示される生物学的に機能的なセグメントに基づく既知の活性ペプチドセグメントＡに対するアミノ酸の付加若しくは低減、アミノ酸の置換え、アミノ酸末端の修飾又はアミノ酸側鎖の修飾によって得られる全てのペプチド化合物分子、及びＡ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙペプチド分子構造に応じて調製される全ての分子が、本発明の範囲に含まれるとみなされるものとする。以下に、本発明において提供されるポリペプチド化合物の生物活性及び有効性を、具体的な実験例において説明する。
【００９３】
実験例１：鳥類及び家禽（ニワトリ）における本発明において提供されるポリペプチド化合物の免疫効果の実験
ヒト又は動物の身体内の赤血球は、ヘマグルチニン（ＨＡ）を含有するウイルスによって凝集することがあり、この現象は赤血球凝集現象と称される。かかる赤血球凝集現象は、特定の免疫血清又は特異的抗体によって阻害することができ、阻害試験は「赤血球凝集阻害試験」（ＨＩ）と称される。
【００９４】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、ニワトリ赤血球の凝集現象を引き起こし得る。ニワトリをニューカッスル病ウイルスワクチンで免疫化した後、ニワトリ血清を試験する赤血球凝集阻害試験（ＨＩ）によって抗体のレベルを判定することができる。試験に対する抗血清の最大希釈倍率は、抗体の力価である。試験抗体の力価が高いほど、免疫効果がより良好になる。
【００９５】
ＨＩ法は以下の利点を有する：
１．  高い感度：ＨＩ法では、微量の抗体を検出することができ、結果は比較的正確であり、反応は高感度な血清学的検出反応の１つである；
２．  高い特異性：赤血球の凝集を引き起こすウイルスは、特異的抗体によってのみ阻害することができる；
３．  高い検出速度：ＨＩ試験では結果を判定するのに約２時間しか必要とされない；
４．  ＨＩ試験は高い環境要件を何ら有さず、操作は単純かつ迅速であり、１回の試験で多量のサンプルを検出することができる。
【００９６】
本実験例では、表２中の種々の３コピーセグメントを用いて、生体内での抗体の生成に対するワクチンと組み合わせて使用される多コピー生物活性ペプチド分子の影響を調査する。
【００９７】
実験方法は、以下の通りである：１０日齢の特定病原体除去ニワトリ（ＳＰＦニワトリと略記）を選ぶ。ＳＰＦニワトリを、各群１０匹のニワトリで１２群に分ける。皮下ワクチン接種を、以下の群の各ＳＰＦニワトリの翼の腋窩部に行う。各群のＳＰＦニワトリをアイソレーター内で飼育する。約１ｍｌの静脈血を接種後１０日目に翼下から採取し、血清を血液から分離し、ＨＩ試験によって試験する。試験結果を表４に示す（一部のポリペプチド化合物の試験結果のみを挙げる）。操作の詳細については、２００７年に中国農業大学出版社により出版されたXin Guo著の「動物免疫学の実験過程（Experiment Course of Animal Immunology）」を参照されたい。
ブランク群：０．３ｍｌの通常生理食塩水を注射する；
対照群：０．３ｍｌのニューカッスル病生ワクチン（「ワクチン」と略記、ＣＳ２株、Chengdu Tecbond Biological Products Co., Ltd.製）を接種する；
実験群：本発明において提供されるポリペプチド化合物０．２μｇと混合した０．３ｍｌのワクチンを接種する。
【００９８】
ＳＰＦニワトリ群は通常、実験時に同じ給餌及び管理条件下で飼育する。群内のＳＰＦニワトリの食餌活動は正常であり、有害反応は見られず、いずれのＳＰＦニワトリも死亡しない。これにより、本発明において提供されるポリペプチド化合物の使用が安全であることが示される。
【００９９】
表４中の結果から、ＨＩの平均抗体力価が、本発明に記載されるポリペプチド化合物をニワトリワクチンに添加した後に、ブランク群及び対照群（ワクチン単独）の値と比較して改善することが示される。これにより、本発明において提供されるポリペプチド化合物が、ワクチンと組み合わせて使用した場合に良好な免疫改善効果を達成することが証明される。
【０１００】
【表４】
2019501964.tif 000010
【０１０１】
実験例２：免疫効果に対する種々のコピー数の生物活性セグメントを含有するペプチド分子の影響の比較実験
生物活性ペプチド分子、３コピー活性ペプチド分子及び５コピー活性ペプチド分子を実験例１において無作為に選択し、免疫効果に対する種々のコピー数の活性ペプチドセグメントを含有する活性ペプチド分子の影響を試験する。試験結果を表５に示す。
【０１０２】
群分け：
ブランク群：０．３ｍｌの通常生理食塩水を注射する；
対照群：０．３ｍｌのニューカッスル病生ワクチン（「ワクチン」と略記、ＣＳ２株）を、ワクチン製造業者により提供される仕様書に従って各ニワトリに接種する；
実験群：０．２μｇのペプチドと混合した０．３ｍｌのワクチンを、ワクチン製造業者により提供される仕様書に従って各ニワトリに接種する；
【０１０３】
【表５】
2019501964.tif 000011
【０１０４】
郡内のＳＰＦニワトリの食餌活動は実験時に正常であり、有害反応は見られず、いずれのＳＰＦニワトリも死亡しない。これにより、本発明において提供されるポリペプチド化合物の使用が安全であることが示される。表５中の結果により、ペプチドフラグメントのコピー数が増大するにつれ、免疫改善効果が更に増大することが示される。これは、生物学的効果とペプチドフラグメントのコピー数との間に正の相関があることを意味する。
【０１０５】
実験例３：種々のコピー数のペプチドセグメントを含有するペプチド化合物の固形腫瘍阻害効果についての実験
実験の目的：マウスにおける固形腫瘍に対する種々のコピー数のペプチドセグメントを含有する合成ペプチドサンプルの阻害効果を試験する。
試験サンプル：合成ペプチドサンプル＃６−１、＃６−３及び＃６−５、全て５ｍｇ／バイアル規格の凍結乾燥サンプル、純度９８．５％超、冷蔵庫内に−２０℃で保管；サンプルをその場で注射用水により２ｍｇ／ｍｌに希釈し、マウスの首筋に皮下注射により注射する；各注射後の残りのサンプルは捨てる。
陽性対照サンプル：５−フルオロウラシル（５−ＦＵと略記）、Tianjin Kingyork Amino Acids Co., Ltd.製、２５０ｍｇ／１０ｍＬ／バイアル規格、ロット番号：１６００１０８；薬物をマウスの腹部に注射し、各注射後の残りの薬物は捨てる。
試験動物：ハツカネズミ（Mus Musculus）Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウス、６週〜８週齢、体重２３±２ｇ。試験動物は、Beijing Huabukang Biological Technology Co., Ltdから得られる。
マウスを温度２２±３℃及び相対湿度４０％〜８０％のＳＰＦレベル恒温恒湿層流家禽小屋内で、各ケージに５匹のマウスを収容して飼育する。マウスにクリーングレードのマウス飼料ブロック及び濾過滅菌水を自由に摂取させ、家禽小屋についてのマウス飼育規則に従って管理する。
試験方法：ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した対数増殖期の肝細胞癌２２（Ｈ２２）腫瘍細胞を接種に使用し、懸濁腫瘍細胞をＰＢＳ緩衝液で１×１０６個／０．１ｍｌの濃度に希釈した後、皮下注射によりマウスの右肩甲骨に接種する。マウスにおける腫瘍成長状態を綿密に観察し、マウスの皮膚下の腫瘍が約５０ｍｍ３〜８０ｍｍ３に成長した時点で薬物を群内のマウスに投与する。
実験の終了：群内のマウスにおける腫瘍体積を、腫瘍の最大径及び最小径を２日おきにバーニヤで測定することによって測定する。対照群の平均腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達した時点で全ての実験動物を頸椎脱臼（neck dislocation）によって屠殺し、腫瘍組織を剥離し、秤量し、各腫瘍の重量及び各群の平均腫瘍重量を記録する。腫瘍阻害率を各群の平均腫瘍重量に従って算出する。すなわち、腫瘍阻害率（％）＝（１−サンプル群の平均腫瘍重量／ブランク群の平均腫瘍重量）×１００％。一元配置ＡＮＯＶＡ検証を、ＳＰＳＳ  ｖ１３．０統計ソフトウェアを用いて行う。結果を表６に示す。
【０１０６】
【表６】
2019501964.tif 000012
【０１０７】
結果の分析：
サンプル群の平均腫瘍重量とブランク群の平均腫瘍重量との比較により、腫瘍阻害効果が活性ペプチドのコピー数の増大とともに改善することが見出される。
【０１０８】
実験例４：５コピーのペプチドセグメントを含有する生物活性ペプチド化合物の腫瘍阻害効果についての実験
実験の目的：５コピーのペプチドセグメントを含有する３つの生物活性ペプチド化合物を無作為に選択し、肝細胞癌２２（Ｈ２２）固形腫瘍に対するそれらの阻害効果を試験する。
試験サンプル：合成ペプチドサンプル＃４−５、＃９−５及び＃１４−５、全て５ｍｇ／バイアル規格の凍結乾燥サンプル、純度９８．５％超、冷蔵庫内に−２０℃で保管；サンプルをその場で注射用水により２ｍｇ／ｍｌに希釈し、マウスの首筋に皮下注射により注射する；各注射後の残りのサンプルは捨てる。
陽性対照サンプル：５−フルオロウラシル（５−ＦＵと略記）、Tianjin Kingyork Amino Acids Co., Ltd.製、２５０ｍｇ／１０ｍＬ／バイアル規格、ロット番号：１６００１０８；薬物をマウスの腹部に注射し、各注射後の残りの薬物は捨てる。
試験動物：ハツカネズミＢａｌｂ／ｃ雌性マウス、６週〜８週齢、体重２３±１ｇ。試験動物は、Beijing HFK Bioscience Co., Ltdから得られる。
マウスを温度２２±３℃及び相対湿度４０％〜８０％のＳＰＦレベル恒温恒湿層流家禽小屋内で、各ケージに５匹のマウスを収容して飼育する。マウスにクリーングレードのマウス飼料ブロック及び濾過滅菌水を自由に摂取させ、家禽小屋についてのマウス飼育規則に従って管理する。
試験方法：ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した対数増殖期の肝細胞癌２２（Ｈ２２）腫瘍細胞を接種に使用し、懸濁腫瘍細胞をＰＢＳ緩衝液で１×１０６個／０．１ｍｌの濃度に希釈した後、皮下注射によりマウスの右肩甲骨に接種する。マウスにおける腫瘍成長状態を綿密に観察し、マウスの皮膚下の腫瘍が約５０ｍｍ３〜８０ｍｍ３に成長した時点で薬物を群内のマウスに投与する。
実験の終了：群内のマウスにおける腫瘍体積を、腫瘍の最大径及び最小径を２日おきにバーニヤで測定することによって測定する。対照群の平均腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達した時点で全ての実験動物を頸椎脱臼によって屠殺し、腫瘍組織を剥離し、秤量し、各腫瘍の重量及び各群の平均腫瘍重量を記録する。腫瘍阻害率を各群の平均腫瘍重量に従って算出する。すなわち、腫瘍阻害率（％）＝（１−サンプル群の平均腫瘍重量／ブランク群の平均腫瘍重量）×１００％。一元配置ＡＮＯＶＡ検証を、ＳＰＳＳ  ｖ１３．０統計ソフトウェアを用いて行う。結果を表７に示す。
【０１０９】
【表７】
2019501964.tif 000013
【０１１０】
結果の分析：
サンプル群の平均腫瘍重量とブランク群の平均腫瘍重量との比較及び統計分析により、結果はＰ＜０．０５を示し、実施例＃４−５、＃９−５及び＃１４−５において肝細胞癌２２（Ｈ２２）腫瘍阻害効果に有意な差があることが証明される。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明において提供されるポリペプチド化合物は、様々な薬物の効果的な成分となることが期待され、多くの疾患の予防及び治療のための薬物に適用可能である。特に、ポリペプチド化合物は、免疫能を増強する薬物の調製に使用することができ、産業用途に好適である。
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月13日(2018.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎが１より大きい自然数である構造式Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙによって表されるポリペプチド化合物であって、
Ａは生物活性を有する短ペプチドフラグメントであり、Ｋは２つの活性アミノ基を含有するリシンＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨであり、ｎはＫの数であり、Ｙは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、ｎが２である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）２−Ｙであり、ｎが３である場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＡ−（Ａ−Ｋ）３−Ｙであり、
Ａは、好ましくは短ペプチドフラグメントＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘであり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、該ポリペプチド化合物の構造式はＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）ｎ−Ｙであり、ここで、ＸＡ及びＸＢは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸であり、ＸＣ及びＸＤは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Ｘは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基である、ポリペプチド化合物。
【請求項２】
ｎが２であり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、前記ポリペプチド化合物の構造式が、下記式３に示されるようなＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）２−Ｙである、請求項１に記載のポリペプチド化合物：
【化１】
2019501964.tif 000017
【請求項３】
ｎが４であり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、前記ポリペプチド化合物の構造式が、下記式４に示されるようなＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）４−Ｙである、請求項１に記載のポリペプチド化合物：
【化２】
2019501964.tif 000018
【請求項４】
Ｘ又はＹが存在しないか、又は任意のアミノ酸、若しくは任意の数のアミノ酸から構成されるペプチドフラグメント、若しくはアミノ酸若しくはペプチドフラグメントを接続することができる化学基であり、Ｘ及びＹは同じであっても又は互いに異なっていてもよく、例えばＸが存在せず、かつＹをグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）とすることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項５】
ＸＡ及びＸＢがフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）のいずれかを含む脂肪族アミノ酸分子であり、同じであっても又は異なっていてもよい、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項６】
ＸＣ及びＸＤがフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）のいずれかから選択され、同じであっても又は異なっていてもよい、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項７】
前記ポリペプチド化合物と有機酸又は無機酸とによって形成される塩化合物を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項８】
前記ポリペプチド化合物に含まれるヒドロキシルによって形成され得るエーテル、エステル、グルコシド又はグリコシド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項９】
前記ポリペプチド化合物に含まれるスルフヒドリルによって形成され得るチオエーテル若しくはチオグリコシド化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるスルフヒドリルとシステイン若しくはシステインを含有するペプチドとによって形成され得るジスルフィド結合を含有する化合物を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１０】
前記ポリペプチド化合物に含まれるアミドによって形成され得るアシレート若しくはアルキレート化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるアミドとサッカリドとによって形成され得るグルコシド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１１】
前記ポリペプチド化合物に含まれるカルボキシル基によって形成され得るエステル又はアミド化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１２】
前記ポリペプチド化合物に含まれるイミノ基によって形成され得るグルコシド、アシレート又はアルキレート化合物等を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１３】
前記ポリペプチド化合物に含まれるフェノール性ヒドロキシルによって形成され得るエステル、エーテル、グルコシド若しくはグリコシド化合物、又は前記ポリペプチド化合物に含まれるフェノール性ヒドロキシルと有機アルカリ若しくは無機アルカリとによって形成され得る塩化合物を更に含むが、そのように形成される化合物に限定されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１４】
前記ポリペプチド化合物と金属イオンとによって形成される配位、包接又はキレート化合物を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１５】
前記ポリペプチド化合物によって形成される水和物又は溶媒を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物を含有する医薬組成物、該医薬組成物の幾何異性体、該医薬組成物の薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物、及び医薬担体又は賦形剤の形態の該医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物を作製する方法であって、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎ−Ｙの合成経路が式５：
【化３】
2019501964.tif 000019
に示され、
Ａは好ましくは短ペプチドフラグメントＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘであり、ＡがＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘである場合、前記ポリペプチド化合物の構造式はＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−（ＸＡＸＢＸＣＸＤ−Ｘ−Ｋ）ｎ−Ｙであり、ここで、ＸＡ及びＸＢは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸であり、ＸＣ及びＸＤは１つ又は２つの脂肪族アミノ酸及び芳香族複素環式アミノ酸から選択され、Ｘは存在しないか、又は任意の１つ以上のアミノ酸若しくは化学基であり、
初めに、Ｙを固体樹脂に固定し、Ｙ−固体樹脂を得て、該Ｙ−固体樹脂をＦｍｏｃ脱保護によって処理し、ｎ個のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを１つずつ縮合させ、Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格の調製を達成した後、該Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を側鎖アミノ基Ｄｄｅ及びＦｍｏｃの脱保護によって処理し、セグメントＡの伸長及び導入をＫｎ−Ｙ−固体樹脂の遊離アミノ基上で同時に行い、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ−固体樹脂を得て、合成の完了後にＡ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを前記固体樹脂から切り出し、粗ペプチド生成物を得て、該粗ペプチド生成物を高速液体クロマトグラフィーによって精製し、ポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る、方法。
【請求項１８】
作製に適切な樹脂がペプチド生成物のカルボキシル末端の特徴に応じて選択され、該ペプチド生成物のカルボキシル末端が遊離カルボキシル基である場合に「ＷＡＮＧ樹脂」を選択し、合成ペプチドのカルボキシル末端がアミド基である場合に「Ｒｉｎｋ樹脂」を選択し、該ペプチド生成物のカルボキシル末端がＣｙｓ、Ｐｒｏ又はＨｉｓである場合に「ＣＴＣ樹脂」を選択する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチド化合物を、以下の工程：
工程１：Ｙ−固体樹脂を調製する工程と、
ここで、Ｙが単一アミノ酸である場合、Ｙ−固体樹脂を直接購入することができ、Ｙが複数のアミノ酸を含有する短ペプチドである場合、固相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を用いる、すなわち、Ｆｍｏｃ−ａａ１−Ｗａｎｇ樹脂を出発原料として使用し、合成をカルボキシル末端（Ｃ）からアミノ末端（Ｎ）へと行い、アミノ末端のＦｍｏｃ保護基を、該アミノ末端が遊離アミノ基となるように除去した後、Ｙ−固体樹脂が得られるまで該アミノ末端を樹脂と縮合させる；
工程２：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を調製する工程と、
ここで、前記Ｙ−固体樹脂をＦｍｏｃ脱保護により処理して、遊離アミノ基を露出させ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを用いて縮合を行い（縮合方法は前記工程１のものと同じである）、ｎ個のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨが縮合するまで縮合を繰り返し（「サイクル１」と表記する）、それによりＫｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格を調製する；
工程３：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂に対してアミノ脱保護を行う工程と、
ここで、Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂ペプチド骨格中の側鎖ＬｙｓのＤｄｅ及びＦｍｏｃ保護基を除去して、側鎖上の遊離アミノ基が遊離したＫｎ−Ｙ−固体樹脂を得る；
工程４：Ｋｎ−Ｙ−固体樹脂の遊離アミノ基上のセグメントＡを同時に合成する工程と、  ここで、前記工程１に記載される方法により、セグメントＡが完成し、Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹ−固体樹脂が得られるまでアミノ酸を１つずつ縮合させる（「サイクル２」と表記する）；
工程５：合成の完了後にＡ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを固体樹脂から切り出し、側鎖上の保護基を除去して、粗生成物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る工程と、
工程６：精製して精生成物を得る工程と、
ここで、粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製して、純度が９８％を超えるポリペプチド化合物Ａ−（Ａ−Ｋ）ｎＹを得る；
を含む固相ポリペプチド合成法により作製する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
アミノ酸を導入及び縮合させるたびに、各アミノ酸を前記「サイクル１」と前記「サイクル２」との間で縮合させた後に、「カイザーテスト」を行って遊離アミノ基の含量を検出し、反応の縮合率が十分に高くない場合に縮合をもう一度繰り返す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト又は動物の身体内での腫瘍成長を阻害するための薬物の調製における請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物又は請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法を用いて調製されるポリペプチド化合物の適用。
【請求項２２】
前記腫瘍が、ヒトの身体内の固形腫瘍（又は外科手術後の残存腫瘍）又は非固形腫瘍である、請求項２１に記載の適用。
【請求項２３】
ヒトの身体内の前記固形腫瘍（又は外科手術後の残存腫瘍）が肉腫、肝癌、結腸癌、肺癌、胃癌、乳癌及び子宮頸癌を含むが、これらに限定されず、前記非固形腫瘍が、例えば血液系腫瘍（白血病及びリンパ腫を含む）である、請求項２２に記載の適用。
【請求項２４】
ヒト又は動物用の免疫薬又は免疫機能を改善する薬物の調製における請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物又は請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法を用いて調製されるポリペプチド化合物の適用。
【国際調査報告】
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