(57)【要約】  本開示は、血餅の有無、血餅形成のタイミング（存在する場合）、および／または血餅の機械的強度（存在する場合）の１つまたは複数が活性化プロセス中のカルシウムイオンの存在または濃度によって制御される、活性化血小板生成物の生成に関する。特定の実施形態では、カルシウムイオン濃度は、活性化プロセスの一部として、パルス電界または化学的活性化剤（例えば、トロンビン）の存在下で制御される。【選択図】図１
2019501911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化生成物を生成するための方法であって、
活性化のために血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）試料を調製することであって、前記ＰＲＰ試料は、それぞれの濃度でカルシウムイオンを添加することによって調製され、前記それぞれの濃度は、血餅が前記ＰＲＰ試料を使用して生成された活性化生成物組成物中に存在するかどうか、凝固が存在する場合には、血餅形成までの時間または前記血餅の機械的強度の１つまたは複数に基づいて選択される調製することと、
前記ＰＲＰ試料を電磁刺激装置の電極（１４、１６）に対して位置決めすることと、
一組の電気パルスパラメータを指定することと、
前記ＰＲＰ試料を前記パラメータ値に従って生成された１つまたは複数の電気パルスに曝すことであって、前記ＰＲＰ試料は、前記１つまたは複数の電気パルスに曝されると、１つまたは複数の成長因子を含み、特定の凝固特性を有する活性化生成物組成物を生じる曝すこととを含む、方法。
【請求項２】
前記一組の電気パルスパラメータが、前記選択された濃度のカルシウムイオンに少なくとも部分的に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
同じ電気パルスパラメータであるが異なる濃度のカルシウムイオンが、前記活性化生成物組成物において異なる凝固特性を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、血小板の豊富な血漿試料、血小板懸濁液、または全血試料の１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の成長因子の相対レベルが、前記一組の電気パルスパラメータまたは前記添加されたカルシウムイオンの一方または両方によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記電極（１４、１６）の間に前記試料を位置決めすることが、前記電極（１４、１６）の間の導管を通して前記試料を流すことを含み、前記活性化生成物組成物が、前記導管の直径または前記導管を通る前記試料の流速の一方または両方によって少なくとも部分的に決定される前記１つまたは複数の因子の相対レベルを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
約２．５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の濃度の抗凝固剤処置されたＰＲＰ試料にＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記カルシウムイオンの濃度が、前記抗凝固剤処置されたＰＲＰ試料に添加される２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭ  ＣａＣｌ２に対応する複数の可能な濃度から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第２のカルシウムイオン濃度より低い第１のカルシウム濃度が、前記第２のカルシウムイオン濃度で観察されるより遅い初期血餅形成をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第２のカルシウムイオン濃度より低い第１のカルシウム濃度が、前記第２のカルシウムイオン濃度で観察されるより低い血餅の機械的強度をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
活性化生成物を生成するための方法であって、
活性化のために抗凝固剤処置された血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）試料を調製することと、
可能な濃度の範囲から選択されたカルシウムイオン濃度を達成するために、カルシウムイオンを前記ＰＲＰ試料に添加することであって、前記濃度は、前記ＰＲＰ試料を使用して生成された活性化生成物組成物中に存在する１つまたは複数の成長因子の目標レベルに基づいて選択される添加することと、
前記ＰＲＰ試料を電気的活性化刺激に曝すことであって、前記ＰＲＰ試料は、前記電気的活性化刺激に曝されると、前記目標レベルで前記１つまたは複数の成長因子を含む活性化生成物組成物を生じ、前記電気的活性化刺激を変化させることなく前記カルシウムイオン濃度を変化させることにより、前記１つまたは複数の成長因子の絶対または相対レベルの一方または両方が変化する曝すこととを含む、方法。
【請求項１２】
１つまたは複数の凝固特性が、前記カルシウムイオン濃度によっても決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
カルシウムイオンを前記ＰＲＰ試料に添加することが、約２．５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の濃度でＣａＣｌ２を前記ＰＲＰ試料に添加することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記カルシウムイオンの濃度が、前記ＰＲＰ試料に添加される２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭ  ＣａＣｌ２に対応する複数の可能な濃度から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
第２のカルシウムイオン濃度より低い第１のカルシウム濃度が、前記第２のカルシウムイオン濃度で観察されるより速い初期血餅形成をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
第２のカルシウムイオン濃度より低い第１のカルシウム濃度が、前記第２のカルシウムイオン濃度で観察されるより低い血餅の機械的強度をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
血小板ゲルにおける血餅の機械的強度を制御するための方法であって、
前記血小板ゲル中に生成される１つまたは複数の血餅の予想される機械的強度を決定することであって、前記予想される機械的強度は、トロンビン単独を使用して前記血小板ゲルを生成することによって観察されるものより大きい決定することと、
前記予想される機械的強度に基づいて、前記予想される機械的強度に対応するカルシウムイオン濃度を複数のカルシウムイオン濃度の中から選択することと、
前記血小板ゲルを、前記選択されたカルシウムイオン濃度でカルシウムイオンを含む血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）試料を活性化することによって生成することであって、前記ＰＲＰ試料は、電気的刺激を使用して活性化され、前記血小板ゲルは、形成されると、前記予想される機械的強度を有する血餅を含む生成することとを含む、方法。
【請求項１８】
前記複数のカルシウムイオン濃度について、より高いカルシウムイオン濃度が、前記血餅のより大きい機械的強度に対応する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のカルシウムイオン濃度が、約２．５ｍＭ〜約２０ｍＭ  ＣａＣｌ２の前記ＰＲＰ試料への添加によって生成される濃度に対応する範囲内である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記カルシウムイオン濃度が、前記ＰＲＰ試料に添加される２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭ  ＣａＣｌ２に対応する前記複数の可能な濃度から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示される主題は、一般に、手術または外傷の処置などの様々な医療用途で使用される血小板治療に関する。ある特定の実施形態は、限定するものではないが、パルス電界の存在および特性ならびにカルシウムの存在および濃度を含む様々な活性化条件を変化させることによる血小板活性化および凝固の制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板ゲル（「活性化血小板の豊富な血漿」とも呼ばれる）の使用は、創傷治癒（例えば、手術後）および止血の促進を含む様々な用途のために、診療所または他の医療施設で用いられ得る新たな治療アプローチである。特に、神経損傷、腱炎、骨関節炎、心筋損傷、ならびに骨の修復および再生のような多くのタイプの損傷および症状に対して、創傷治癒処置としての血小板治療の使用への関心が存在する。さらに、患者に使用される血小板ゲルの誘導は、自己由来であり得、これは、血小板が患者自身の組織および／または体液に由来することを意味する。したがって、患者の血液試料を使用して、患者を処置するために使用される血小板ゲルを得ることができる。
【０００３】
一例として、医者は、血液を患者から採取することができる。血液はその後、血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）を生成するために遠心分離され得る。血小板活性化に際して、血液内の血小板は、創傷治癒カスケードを容易にして促進する成長因子およびタンパク質を放出する。したがって、臨床ワークフローは、血液を患者から採取し、血液を遠心分離して血小板を分離し、ウシトロンビンを使用するなどの生体外血小板活性化を行うことを伴い得る。次いで、活性化血小板または血小板ゲルは、創傷または他の処置領域に適用することができる。生体内血小板活性化が代わりに用いられる場合、医者は、血小板活性化剤を添加することなくＰＲＰを部位に適用することができる。成長因子放出および凝固を含む血小板活性化は、通常、結合組織内のコラーゲンによって誘導される。
【０００４】
トロンビン（例えば、ウシトロンビン）が血小板活性化を誘導するために使用されるそのような生体外用途では、生ずる成長因子レベルは、生物学的応答に基づいて固定され得る。これは、異なる成長因子の量および／またはそれぞれの比率もしくは割合が、トロンビンに基づく活性化の性質によって決定されることである。したがって、そのような反応において、臨床医は、異なる成長因子のそれぞれの量または割合を調整または操作することができず、その代わりに従来の活性化組成物を用いなければならない。さらに、ある特定の臨床シナリオでは、凝固しているかしていないこと、および／または凝固の存在下で血餅の機械的強度または他の特性を制御することが望ましい場合がある。
【発明の概要】
【０００５】
一実施形態では、活性化生成物を生成するための方法が提供される。この方法によれば、血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）試料が活性化のために調製される。ＰＲＰ試料は、それぞれの濃度でカルシウムイオンを添加することによって調製される。それぞれの濃度は、血餅がＰＲＰ試料を使用して生成された活性化生成物組成物中に存在するかどうか、凝固が存在する場合には、血餅形成までの時間または血餅の機械的強度の１つまたは複数に基づいて選択される。ＰＲＰ試料は、電磁刺激装置の電極に対して位置決めされる。一組の電気パルスパラメータが、指定される。ＰＲＰ試料は、パラメータ値に従って生成された１つまたは複数の電気パルスに曝される。ＰＲＰ試料は、１つまたは複数の電気パルスに曝されると、１つまたは複数の成長因子を含み、特定の凝固特性を有する活性化生成物組成物を生じる。
【０００６】
さらなる実施形態では、活性化生成物を生成するための方法が提供される。この方法によれば、抗凝固剤処置された血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）試料が活性化のために調製される。可能な濃度の範囲から選択されたカルシウムイオン濃度を達成するために、カルシウムイオンをＰＲＰ試料に添加する。濃度は、ＰＲＰ試料を使用して生成された活性化生成物組成物中に存在する１つまたは複数の成長因子の目標レベルに基づいて選択される。ＰＲＰ試料は、電気的活性化刺激に曝される。ＰＲＰ試料は、電気的活性化刺激に曝されると、目標レベルで１つまたは複数の成長因子を含む活性化生成物組成物を生じる。電気的活性化刺激を変化させることなくカルシウムイオン濃度を変化させることにより、１つまたは複数の成長因子の絶対または相対レベルの一方または両方が変化する。
【０００７】
さらなる実施形態では、血小板ゲルにおける血餅の機械的強度を制御するための方法が提供される。この方法によれば、血小板ゲル中に生成される１つまたは複数の血餅の予想される機械的強度が決定される。予想される機械的強度は、トロンビン単独を使用して血小板ゲルを生成することによって観察されるものより大きい。予想される機械的強度に基づいて、予想される機械的強度に対応するカルシウムイオン濃度は、複数のカルシウムイオン濃度の中から選択される。血小板ゲルは、選択されたカルシウムイオン濃度でカルシウムイオンを含む血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）試料を活性化することによって生成される。ＰＲＰ試料は、電気的刺激を使用して活性化される。血小板ゲルは、形成されると、予想される機械的強度を有する血餅を含む。
【０００８】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、ならびに利点は、図面を通して同様の文字が同様の部品を表している添付の図面を参照して以下の詳細な説明が読まれるときに、より良く理解されることになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本開示の態様による、パルス生成システムの概略図である。
【図２】本開示の態様による、一連の研究結果の初期血餅形成（凝固時間）までの時間を示すグラフである。
【図３】本開示の態様による、一連の研究結果の血餅動態を示すグラフである。
【図４】本開示の態様による、一連の研究結果のフィブリノゲンレベルを示すグラフである。
【図５】本開示の態様による、一連の研究結果の血餅強度を示すグラフである。
【図６】本開示の態様による、１人の研究参加者の経時的に観察された血餅の機械的強度（ＭＡ）を表す代表的なＴＥＧ追跡を示す図である。
【図７】本開示の態様による、一連の研究結果のＰＦ４レベルを示すグラフである。
【図８】本開示の態様による、一連の研究結果のＰＤＧＦレベルを示すグラフである。
【図９】本開示の態様による、一連の研究結果のＶＥＧＦレベルを示すグラフである。
【図１０】本開示の態様による、一連の研究結果のＥＧＦレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下で、本主題の１つまたは複数の具体的な実施形態を説明する。これらの実施形態に関する簡潔な説明を提供するために、実際の実施態様に関するすべての特徴について本明細書に説明するわけではない。あらゆる工学または設計プロジェクトにおけるような実際のあらゆる実施態様の開発において、数多くの実施態様に特異的な決定が、開発者の具体的な目標、例えばシステムに関連し、かつビジネスに関連する制約（ある実施態様から別の実施にまで変わり得る）の遵守を達成するようになされなければならないことが理解されるべきである。さらに、そのような開発努力は複雑であり、かつ時間がかかり得るが、それでもやはり、本開示の利益を受ける当業者にとって、設計、製作、および製造の日常的作業となるであろうことが理解されるべきである。
【００１１】
本明細書に提示される技術は、現行の技術分野を明らかに改善し、抽象的または純粋に理論的ではない物質的な対象および実体的な性質の具体的な事例を参照し適用される。
【００１２】
本発明の種々の実施形態の要素を紹介する場合、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「前記（ｔｈｅ）」、および「前記（ｓａｉｄ）」は、要素が１つまたは複数であることを意味することが意図される。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であり、一覧にされた要素以外の付加的な要素があってよいことを意味することが意図される。
【００１３】
血小板活性化および／または凝集は、生体内および／または生体外の創傷を処置するのに使用され得る。生体内血小板活性化のために、活性化されていない血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）が損傷部位に適用または注入され、結合組織中に存在するコラーゲンのような体内の天然に存在する化合物によって活性化される。
【００１４】
従来の生体外プロセスの間に、採取され分離された血液中の血小板は、成長因子（例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ））の放出を誘発するトロンビンのような血小板活性化化合物に曝される。例えば、生体外血小板活性化のために、医者は、血液を患者から採取し、血液試料を遠心分離して血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）試料を生産することができる。トロンビンなどのカルシウムイオン源および血小板活性化化合物をＰＲＰ試料に添加して血小板活性化を誘発し、次いで創傷に適用される成長因子を含むゲルを形成することができる。
【００１５】
本明細書で論じるアプローチは、異なる濃度のカルシウムイオン（Ｃａ＋＋）の存在下での生体外血小板（または他の細胞）活性化および成長因子放出に関連し、活性化混合物に塩（例えば、ＣａＣｌ２）の形態で導入することができる（限定するものではないが、２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、および２５ｍＭを含む２．５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度範囲で与えられるＣａＣｌ２など）。添加されたカルシウムは、試料中のカルシウムの最終濃度と混同されるべきではない。ある特定の実施態様では、カルシウムが添加されたＰＲＰ試料は、添加されたカルシウムの量の測定を考慮に入れることができる既知の量の抗凝固剤（例えば、ＡＣＤ−Ａ）を含み得ることも理解されるべきである。さらに、活性化混合物は、１つまたは複数のカスタマイズ可能なエネルギー曝露プロトコル（例えば、１つまたは複数の電気パルス）に曝されてもよい。エネルギー曝露の有無にかかわらず、異なる濃度のカルシウムイオンの存在は、本明細書で論じるある特定の実施態様によれば、血小板活性化プロセスから生じる血餅形成を制御または変更するために使用され得、いくつかの実施形態では、凝固を完全に防止し得る。血餅形成に対するそのような制御は、活性化血小板生成物が、生成物が注入され得る（血餅が不適切である）用途に対して局所的に適用される（凝固が望ましいとされ得る）状況において有用であり得る。さらに、血餅の機械的強度を変化させることは、本明細書で論じるように、活性化混合物中のカルシウムイオン濃度またはエネルギー曝露（例えば、電気）パラメータの一方または両方を制御することによって達成され得る。例えば、本明細書で論じるように、活性化プロセスにおけるカルシウムイオンの添加により、活性化血小板生成物中に形成される血餅の生ずる機械的強度は、トロンビンに基づく活性化単独（すなわち、カルシウムイオンの添加なし）で見られるものより大きい。最後に、本明細書で論じるように、活性化混合物中のカルシウムイオン濃度またはエネルギー曝露（例えば、電気）パラメータの一方または両方を操作することで、生ずる活性化血小板生成物中の１つまたは複数の成長因子の放出または相対的な割合を制御、カスタマイズ、または最適化することができる。
【００１６】
したがって、例として、本明細書で論じる生体外血小板活性化は、ＰＲＰ試料などの血液試料、または血小板を含む任意の懸濁液（例えば、血小板懸濁液または全血）を、電気パルス（例えば、パルス電界への曝露）またはＣａ＋＋イオンの存在下で他の適切な活性化エネルギーに曝して血小板活性化を誘発することを伴い得る。ある特定の実施態様では、特定の濃度のＣａ＋＋と組み合わせて、異なるパラメータまたはパラメータの組合せと共に、異なる電気パラメータ（例えば、振幅、電圧、電界、エネルギー密度、電流、パルス幅、パルス数など）を使用して電気刺激または活性化を適用し、異なる成長因子レベルを達成し、かつ／または血餅形成の局面を制御することができる。結果として、特定の成長因子および凝固特性を有する活性化組成物が生成され得、逆に特定の成長因子および／または凝固特性を有する活性化組成物の生成は、所与の細胞組成物を活性化する際に用いられる電気パルスパラメータおよびＣａ＋＋濃度を決定することができる。
【００１７】
上述のように、活性化混合物中のＣａ＋＋濃度の制御は、本明細書で論じる様々な実施態様の基礎である。これらの実施態様のうちのある特定ものは、活性化プロトコルの一部としてパルス電界を利用することもできる。これを念頭に置いて、図１は、特定の成長因子プロファイルおよび凝固特性を有する組成物を生成するのに適したＣａ＋＋濃度を使用した生体外血小板活性化のためのパルス生成システム１０を概略的に示す。システム１０は、パルス生成回路１２と、対向する電極（または電極のアレイ）１４および１６とを含む。図示の例では、電極１４および１６は、キュベット１８の対向する側で離間されている。すなわち、キュベット１８は、電極の間に配置され、電極１４および１６は、接点２０を介してパルス生成回路に結合される。すなわち、図示の例では、導電性結合（すなわち、接触結合）が示されている。しかし、この接触結合の例は、説明を容易にし、本アプローチを説明するための有用な状況を提供するためにのみ提供され、（本明細書で論じるような）試料を活性化エネルギーに曝すための唯一の適切な機構ではないことを理解されたい。例えば、他の実施態様では、論じられたエネルギー結合を達成するために、非接触結合技術（容量性または誘導性結合技術など）を用いてもよい。したがって、本明細書で論じるように、血小板懸濁液へのエネルギー結合は、任意の適切な機構を介して、試料コンテナと導管と電極との間の接触（この例に示すように）を伴うかどうか、もしくは誘導性または容量性効果を使用したそのような接触がないことにより起こると理解されるべきである。
【００１８】
物理的または構造的な実施態様にかかわらず、パルス生成回路１２は、動作中、活性化または刺激されたときにタンパク質および／または成長因子を放出する試料２２内の血小板または他の細胞タイプを活性化するように、キュベット１８内のＣａ＋＋の存在下で血液、血液成分または血小板懸濁液試料２２を電気的に刺激または活性化する。本明細書で論じるように、これは、パルス生成回路１２が動作しているとき、電極１４および１６ならびにキュベット１８が物理的に一体化またはインターフェースされる態様にかかわらず、キュベット１８内に含まれる試料にパルス電界を適用する形態を取ることができる。システム１０は、異なる直径または幅のキュベットなどの異なるサイズのキュベットを受け入れるかまたは保持するように構成されてもよい。
【００１９】
キュベット１８は、電極１４および１６を組み込む試料ホルダ２４から使い捨ておよび／または取り外し可能であってもよい。キュベット１８を試料ホルダ２４に挿入し、電極１４および１６を接点２０に接触させることにより、パルス生成回路１２は試料２２に及ぶ電気パルスを発生することができる。理解されるように、キュベット１８は、適切な試料コンテナの一例に過ぎず、試料２２を保持し、電極１４および１６に接触し、電気パルスを伝導するように構成された他のタイプの容器は、システム１０と組み合わせて使用することができる。本明細書で論じるように、電極１４と１６との間の間隔は、適用電圧とキュベットギャップ距離との比率として定義されるパルスの電界の強度に影響し得る。例えば、幅１ｃｍのキュベットを１ｋＶのパルスに曝すと、１ｋＶ／ｃｍの電界強度が得られる。生成された電気パルスに関連する電界強度、電極分離距離、および他のパラメータは、本明細書で論じるように、活性化手順の間に成長因子レベルを互いに対して変化させるように変化または調整され得る因子である。
【００２０】
理解されるように、図示のキュベットまたはコンテナベースの活性化システムは、バッチタイプの処理環境に適している。しかし、フロースルー型処理環境を代わりに用いてもよく、導管は代わりに、導管の反対側にあるか、または導管を取り囲み得る電極１４および１６を通過する。そのようなフロースルー配置により、試料を導管を通して連続的に流して活性化のためにパルス電界に曝すことができ、活性化生成物は、連続的または半連続的に収集される。電極における電気パラメータおよび／または電極１４と１６の間の幅に加えて、またはその代わりに、他のパラメータも活性化プロセスを構成するように調整されてもよい。例えば、導管を通る試料（例えば、血小板懸濁液）の流速および／または導管の直径は、活性化プロセスの因子またはパラメータとして考慮または調整されてもよい。すなわち、電極に指定された電気パラメータに加えて、流速および電極間隔の一方または両方が、活性化の間に試料が受ける電界曝露（または電界密度曝露）を決定することができる。
【００２１】
システムは、制御および入力回路を含み、専用のハウジングに実装されてもよく、またはコンピュータもしくは他のプロセッサに基づく制御システムに結合されてもよい。例えば、システム１０は、パルス生成回路１２を制御するプロセッサ２６を含むか、またはそれと通信することができる。システム１０の追加の構成要素は、プロセッサ２６によって実行される命令を記憶するメモリ２８を含むことができる。そのような命令は、パルス生成回路１２を使用して電気パルスを生成するためのプロトコルおよび／またはパラメータを含むことができる。プロセッサ２６は、例えば、汎用シングルまたはマルチチップマイクロプロセッサを含むことができる。さらに、プロセッサ２６は、用途特有のプロセッサまたは回路などの任意の従来の専用プロセッサであってもよい。メモリ２８は、ランダムアクセスメモリ、大容量記憶デバイス、ソリッドステートメモリデバイス、またはリムーバブルメモリなどの任意の適切な非一時的コンピュータ可読媒体とすることができる。さらに、ディスプレイ３０は、システム１０の動作に関連するオペレータに指示を行うことができる。システム１０は、パルス生成回路１２を作動させ、適切なパルスパラメータを選択もしくは指定し、または多数のそのようなプロファイル（異なる活性化生成物組成物または特性（例えば、成長因子プロファイル、血餅強度、凝固の有無など）に各々対応するプロファイルなど）の中から予め構成されたパルスプロファイルを選択するために、ユーザ入力デバイス３２（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、トラックボール、ＰＤＡまたはスマートフォンなどのハンドヘルドデバイス、またはそれらの任意の組合せ）を含むことができる。
【００２２】
本明細書で論じるパルス生成システム１０は、血小板または他の細胞型活性化のための単目的デバイスとして、またはエレクトロポレーション、血小板（または他の細胞型）活性化に加えて電気刺激への曝露を介した細胞増殖の促進などの他の電界曝露用途に使用され得る多目的デバイスとして実装されてもよい。さらに、システム１０は、１つまたは複数の定義されたプロトコルに従って、および／または異なる特性を有する活性化生成物を生成するために変更され得る１つまたは複数のパラメータを使用して電気パルスを生成するように構成され得る。様々な電気パルス因子またはパラメータに関して、これらの因子は、限定するものではないが、キュベット間隔（すなわち、パルスが適用されるキュベット１８の幅）、流速（フロースルー実施態様における）、電圧、電界（例えば、強度または密度）、電流、パルス幅、パルス持続時間、および適用されるパルスの数を含む。
【００２３】
プロトコルは、ユーザ入力によって生成されてもよく、および／またはリストまたはメニューからなど、ユーザによって選択されるようにメモリ２８に記憶されてもよい。パルス生成回路１２は、特定の電界強度、Ｃａ＋＋濃度、パルス長さ、合計曝露時間、流速（フロースルー実施態様における）または他の特性を使用してカスタマイズされた活性化細胞組成物を生成するプロトコルを実施するために、プロセッサ２６の制御下で動作することができる。そのようなプロトコルは、所望の臨床用途に対応するような経験的または理論的研究によって決定され得る。他の実施態様では、システム１０は、電界強度、Ｃａ＋＋濃度、パルス長さ、流速、および／または合計曝露時間の１つまたは複数に関連するユーザ入力を受信するように構成されてもよく、すなわち、ユーザは、これらの動作パラメータの１つまたは複数を変更または指定することができる。さらに、システム１０は、特定のパルス形状を生成するように、またはユーザ入力および／もしくは記憶されたプロトコル設定に従って互いに異なり得る一連のパルスを生成するように構成されてもよい。
【００２４】
一例として、システム１０によって生成されるパルスは、用途に応じて、約１ナノ秒〜約１００マイクロ秒の持続時間と、約０．１ｋＶ／ｃｍ〜約３５０ｋＶ／ｃｍの電界強度を有することができる。上述したように、パルスの電界強度は、適用電圧を電極１４と１６の間の距離で割ったものである。システム１０によって生成されるパルスは、典型的には、０．１ｋＶ／ｃｍ以上の電界強度を有するが、パルスは、典型的には、細胞を含む懸濁液の破壊電界を超えない。
【００２５】
パルス生成システム１０はまた、検知機能を含むことができる。すなわち、パルス生成システム１０は、試料２２を、細胞活性化のために使用される電気パルスの電界強度より低い電界強度を有する電気パルスであり得る検知信号に曝されるように構成され得る。パルス生成システム１０は、図１に示すように、限定するものではないが、導電率および誘電率を含む試料２２の電気的または化学的特性のいくつかを推定するために検知信号を取得および／または処理することができる電流検知回路３４を含んでもよい。実際には、そのような検知回路を使用して、Ｃａ＋＋濃度が選択されたプロトコルに一致することを確認する、および／または試料に存在する観察または測定されたＣａ＋＋濃度に基づいて動作パラメータを調整するなど、処理中の試料内のＣ１＋＋濃度を確認することができる。
【００２６】
電流検知回路３４は、検知信号の生成および処理を制御することができるプロセッサ２６に結合されてもよく、処理の一部を実行してもよい。他の実施態様では、電流検知回路３４は、検知信号の処理を制御する専用のプロセッサを含み、結果を報告するためにプロセッサ２６と通信することができる。あるいは、電流検知回路３４は、パルス生成回路１２と一体であってもよく、次の活性化電気パルスの生成に使用される入力を提供する。さらに他の実施態様では、検知信号の処理は、上述したような専用のプロセッサまたはプロセッサ２６によって実行されてもよい。
【００２７】
研究設計−ある研究では、これらのパラメータの組合せは、他の制御または活性化シナリオと組み合わせてテストされた。この研究では、濃縮された血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）が研究のために調製された。ドナーは、１８歳以上でアスピリンや他の抗血小板薬が１０日間以上投与されていない、または他のすべての非ステロイド性抗炎症薬が３日以上投与されていない場合、参加資格があった。２ｍＬの廃棄後、５人のボランティアドナーの各々からの１２０ｍＬの血液を、１／１０の容量の酸−クエン酸−デキストロース溶液Ａ（ＡＣＤ−Ａ）に収集した。ＰＲＰは、Ｈａｒｖｅｓｔ  ＳｍａｒｔＰｒｅＰ２  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｒｖｅｓｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用し、２つの６０ｍＬカートリッジを用いて製造者の推奨に従って調製した。得られたＰＲＰを、さらに処置する前にプールした。Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＮ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒで、ＡＣＤ−抗凝固処理全血および濃縮ＰＲＰについて完全な血液細胞数を測定した。
【００２８】
次いで、調製したＰＲＰを、２つのパルス電界（ＰＥＦ）、すなわちＰＥＦ  ＡまたはＰＥＦ  Ｂの１つを使用して、またはウシトロンビン（１Ｕ／ｍＬの最終濃度、Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＬＣ、Ｂｌｕｆｆｄａｌｅ、ＵＴ、ＵＳＡ）の存在下で活性化した。ＰＥＦまたはトロンビンによる活性化の前に、１／１００の容量のＣａＣｌ２（２．５ｍＭまたは２０ｍＭの最終濃度、Ｂａｃｈｅｍ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）の添加によってＰＲＰ試料を再石灰化した。合計２ｍＬの濃縮ＰＲＰを、図１に関して説明したシステムに対応するシステムで、２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）の各条件下で処置した。ＰＥＦ  Ａは、以下のようにパラメータ化した：１パルス；パルス幅は約５マイクロ秒、電圧振幅は約３．３ｋＶ、電流は３００Ａ超であった。ＰＥＦ  Ｂは、以下のようにパラメータ化した：１２０バイポーラパルス、１パルス／秒、約８００Ｖ（電圧）および約７０Ａ（電流）。対照には、高ＣａＣｌ２（すなわち、ＣａＣｌ２を添加した２０ｍＭレベル）単独の緩衝液単独（生理食塩水）および低（２．５ｍＭ）および高（２０ｍＭ）のＣａＣｌ２を添加したトロンビンで処置したＰＲＰが含まれた。
【００２９】
表１は、研究パラメータの様々な組合せをまとめたものである。
【００３０】
【表１】
2019501911.tif 000003
測定されたエンドポイントは：（１）トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）およびプロトロンビンフラグメントＦ１．２生成による血餅形成動態および強度、（２）フローサイトメトリーによって測定したアルファ顆粒（Ｐ−セレクチン）およびＴ顆粒（トール様受容体９（ＴＬＲ９）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ））マーカーの血小板表面発現、（３）血小板から上清（ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＦ４、ＰＤＩ）に放出される因子を含んだ。ＴＥＧを除くすべてのエンドポイントは、活性化の１５分後に採取した試料で測定した。
【００３１】
トロンボエラストグラフィーおよび血漿プロトロンビンの活性化−活性化生成物（すなわち、血小板ゲル）における血餅形成の分析のために、活性化ＰＲＰ３６０μＬをＴＥＧカップに移し、ＰＲＰを活性化条件に曝露した直後に記録を開始した。測定は、ＴＥＧ  ５０００  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｅｍｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。血餅動態および特性を、３０分間追跡した。
【００３２】
血漿プロトロンビンの活性トロンビンへの変換に寄与したカルシウム、ＰＥＦ、トロンビン、および対照条件の程度を決定するために、試料を遠心分離し、上清を回収し、Ｆ１．２をＰＲＰ活性化の１５分後に収集した上清中で販売業者のマニュアルに従ってＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって測定した。
【００３３】
血小板アルファ顆粒およびＴ顆粒放出−ＰＲＰの活性化後、各試料の一部を血餅へのフィブリン重合を妨げるペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（ＧＰＲＰ）と混合し、それによりフローサイトメトリーによる血小板表面マーカーのフローサイトメトリー分析を可能にした。具体的には、フローサイトメトリーを使用して、血小板表面Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）（アルファ顆粒について）ならびに血小板表面ＰＤＩおよびＴＬＲ９（Ｔ顆粒について）の変化によって測定される血小板顆粒および顆粒含量の異なる放出を評価した。フローサイトメトリーのための試料は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の等容量の２％ホルムアルデヒドの添加による活性化の１５分後に固定した。試料をＨＥＰＥＳ−生理食塩水緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡからの化学物質）中で１２倍に希釈し、次いでＦＩＴＣ結合抗ＴＬＲ９（クローン５Ｇ５、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、フィコエリトリン（ＰＥ）結合Ｐ−セレクチン（クローンＡＫ４、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＣＤ４１−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローンＨＩＰ８、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）の混合物、またはＦＩＴＣ結合抗Ｐ−セレクチン（クローンＡＫ４、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＰＥ結合ＰＤＩ（クローン１Ｄ３、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＣＤ４１−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の混合物に添加した。アイソタイプ適合ＦＩＴＣ、アイソタイプ適合ＰＥおよびＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合正常Ｉｇの混合物と反応させた試料を用いて、非特異的染色を並行して測定した。室温で３０分間染色した後、ＨＥＰＥＳ−生理食塩水緩衝液中の１％ホルムアルデヒド４００μＬを添加した。フローサイトメトリー分析は、較正されたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで行った。
【００３４】
Ｔ顆粒放出は、ＰＲＰ活性化の１５分後に収集した上清中で販売業者のマニュアルに従ってＥＬＩＳＡ（Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）によるＰＤＩの測定によってさらに評価した。
【００３５】
血小板顆粒および成長因子の異なる放出−処置されたＰＲＰの上清中の上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および血小板因子４（ＰＦ４）のレベルを、市販のＥＬＩＳＡキット（ＥＧＦおよびＰＤＧＦ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ；ＶＥＧＦ、Ｅａｇｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｓｈｕａ、ＮＨ、ＵＳＡ；ＰＦ４、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて測定した。
【００３６】
分析−観察されたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。通常分布されたデータ（Ｄ’ＡｇｏｓｔｉｎｏおよびＰｅａｒｓｏｎ  ｏｍｎｉｂｕｓ正常性試験によって判定される）は、示されているように、平均±標準偏差または平均±標準誤差として要約される。ノンパラメトリックデータは、中央値および四分位範囲または中央値および範囲として報告される。１つの方法ＡＮＯＶＡを３つ以上の群の比較に用い、個々の比較のために試験後のＴｕｋｅｙの多重比較を用いた。
【００３７】
結果−血餅動態および強度（ＴＥＧおよびトロンビン生成）−トロンボエラストグラフで測定した血餅動態および血餅強度に対するパルス電界（ＰＥＦ）条件およびカルシウムレベル対ウシトロンビンの比較を、表２に示す。
【００３８】
【表２】
2019501911.tif 000004
ＴＥＧ結果に関して、それぞれの研究因子についての初期血餅形成までの時間Ｒを図２にグラフで示す。具体的には、ＴＥＧ  Ｒは、凝固の酵素部分を表し、血液をＴＥＧ分析器に入れて最初のフィブリンが形成されるまでの潜時（分）である。ＴＥＧ  Ｋは、予め定められたレベルの血餅強度に到達するのに必要な時間であり、血餅動態を表す（図３にグラフで示す）。ＴＥＧ角度は、フィブリンの蓄積および架橋の迅速性に起因する経時的な振幅変化の度合いであり、フィブリノゲンレベルを表す（図４にグラフで示す）。ＴＥＧ最大振幅（ＭＡ）（図５にグラフで示す）は、ミリメートル単位の最大振幅であり、フィブリンと血小板結合の最大動的特性とフィブリン血餅の最終強度との直接的な関数である。ＴＥＧ  ＭＡは、血小板機能および／または凝集を表すと考えられる。図２〜図４の各々において、個々の結果を、平均（ＳＥＭ）の平均および標準誤差とともにプロットする。
【００３９】
表２に示す（および図２にグラフで示す）ように、初期血餅形成までの時間は、１分未満で起こるトロンビン処置した試料（実行５および６）では最短であり、逆に実行３（ＰＥＦ  Ａ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）は、約４分で凝固を開始し、実行４（ＰＥＦ  Ｂ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）は、約９分で凝固を開始し、高カルシウム単独（実行８）は、約１３分で血餅を開始した。ＴＥＧでは、実行１（ＰＥＦ  Ａ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）、実行２（ＰＥＦ  Ｂ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）、または実行７（すなわち、緩衝液（カルシウムなし）での処置）で活性化後３０分まで血餅は検出されなかったが、これは表２には示されていない。
【００４０】
これらの結果は、トロンビン生成の結果と一致し、高カルシウム単独（実行８）でインキュベートしたＰＲＰについて最高レベルのＦ１．２が観察され、Ｆ１．２は、カルシウム対照なし（実行７）ならびに実行１および２（ＰＥＦ  Ａ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２およびＰＥＦ  Ｂ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）の両方について検出できなかった。これは、ＰＥＦ  Ａ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２およびＰＥＦ  Ｂ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２（実行１および２）で３０分間処置した後、カルシウムの非存在下で検出可能な凝固を示さなかった（実行７）ＴＥＧ研究の結果と一致した。
【００４１】
したがって、これらの結果に示されるように、試験されたパルス電界はいずれも、低Ｃａ＋＋（２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）のシナリオで凝固した活性化生成物を生じなかった。他のシナリオでは、凝固時間は、約４分でのＰＥＦ  Ａおよび高Ｃａ＋＋（２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）凝固、約８分でのＰＥＦ  Ｂおよび高Ｃａ＋＋凝固、および約１分での高または低Ｃａ＋＋凝固の存在下でのトロンビンを伴う活性化アプローチに基づいて変化した。理解され得るように、この重要性は、活性化アプローチと併せてＣａ＋＋レベルを使用して凝固が少しでも起こるかどうかを制御し、凝固が起こった場合、初期血餅形成までの時間（例えば、凝固までの時間）を制御することができる点である。
【００４２】
初期血餅形成が起こるのに時間がかかるにもかかわらず、血餅強度（ＭＡ）（図５に示す）は、実行４（ＰＥＦ  Ｂ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）およびカルシウム単独対照（実行８）において最高であった。血餅強度（ＭＡ）は、実行６（トロンビン、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）および実行３（ＰＥＦ  Ａ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）で類似していたが、血餅強度は、実行３でより変動するようである。一般に、活性化プロセスにおけるカルシウムイオンの添加は、トロンビン単独を使用し、カルシウムを添加しない活性化プロセスで見られるものより大きい機械的強度を有した血餅を有する生成物を生じた。さらなる例として、図６は、ボランティアの１人について経時的に観察された血餅の機械的強度（ＭＡ）を示す代表的なＴＥＧ追跡を示す。
【００４３】
これらの結果および要約に関して、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いたＡＣＤ−抗凝固ＰＲＰの再石灰化は、（クエン酸塩とカルシウムイオンとの間の全体の結合定数に基づいて計算された）５ｍＭの推定遊離Ｃａ＋＋濃度をもたらし、かつＦ１．２産生によって証明されるようにトロンビン生成、および強度（ＴＥＧ最大振幅に由来する弾性率）がトロンビンの直接添加後に形成された血餅の強度より大きい血餅の形成をもたらした。２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いたＰＲＰの再石灰化の直後にＰＥＦ  ＡまたはＰＥＦ  Ｂ処置を添加すると、凝固開始に要する時間が短縮され、トロンビン、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２によって産出されたものより強い（ＰＥＦ  Ａ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）またはより強い（ＰＥＦ  Ｂ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）血餅を依然として生じた。したがって、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２ならびにＰＥＦ  ＡおよびＰＥＦ  Ｂで形成された血小板ゲルの強度は、材料の操作および創傷上の定位置への配置を可能にする。ＰＥＦ  ＡまたはＰＥＦ  Ｂで２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２（推定９０μＭの遊離Ｃａ＋＋）を補充したＰＲＰを刺激した場合、血餅は形成されず、これらの条件は創傷治癒のための血小板ゲルの調製に不適切であるが、放出された因子の容易な分離を可能にした。
【００４４】
これらの結果のトロンビン生成の局面に関して、低または高カルシウムのトロンビンと比較した高カルシウム単独の存在下でのＦ１．２のより高いレベルの現在の結果は、トロンビンなしのカルシウムの添加が、組織因子経路を介した可能性が高い第Ｘａ因子（プロトロンビンからのトロンビンの活性化に関与する）の生成に有利であることを示唆している。ＰＥＦ  ＡおよびＰＥＦ  Ｂは、高カルシウムの存在下では、ウシトロンビンの直接添加によって産生されるＦ１．２レベルより高いが、高カルシウム単独によって産生されるＦ１．２レベルより低いレベルを生成し、カルシウム媒介性第Ｘａ因子産生は、ＰＥＦ  ＡおよびＢの存在下ではそれほど効率的ではないが、低または高カルシウムおよびトロンビンの存在下で産生されるものより高いことを示唆している。
【００４５】
血小板アルファ顆粒およびＴ顆粒マーカーの異なる曝露−研究のこの部分の結果を、表３および表４に示す。
【００４６】
【表３】
2019501911.tif 000005
研究の血小板アルファ顆粒およびＴ顆粒マーカー部分において、表３に示すように、血小板の８０％以上が、実行５および６（２．５ｍＭまたは２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を有するトロンビン）ならびに実行１および３（すなわち、ＰＥＦ  Ａ、２．５ｍＭまたはＰＥＦ  Ａ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）中の血小板アルファ顆粒膜タンパク質であるＰ−セレクチンに対して陽性であり、血小板の低い割合（５３．５±３３、平均±ＳＤ）が、実行４（ＰＥＦ  Ｂ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）においてＰ−セレクチン陽性であった。高カルシウム単独（実行８）は、実行２（ＰＥＦ  Ｂ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）およびカルシウム対照なし（実行７）と比較して、Ｐ−セレクチン陽性血小板の割合を適度に増加させた。ＰＥＦ処置による粒子あたりのＰ−セレクチンの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、トロンビンおよび低または高ＣａＣｌ２で見られるものより低かった。
【００４７】
血小板表面のトール様受容体９（ＴＬＲ９）は、実行５（トロンビン、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）において最も高かった。実行４（ＰＥＦ  Ｂ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）については、ＴＬＲ９の低下およびＴＬＲ９の高度に変化するレベルが観察され、実行１および３（ＰＥＦ  Ａ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２およびＰＥＦ  Ａ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）、実行２（ＰＥＦ  Ｂ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）、ならびにカルシウムなしおよび高カルシウムのみの対照（実行７および８）については、無視できる程度のＴＬＲ９発現が観察された。全体的に、ＴＬＲ９のレベルは、Ｐ−セレクチンより低かったが、ＴＬＲ９発現のパターンは、Ｐ−セレクチンで見られたパターンとは明らかに異なっていなかった。対照的に、ＰＤＩ発現のパターンは、実行５（トロンビン、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）の代わりに実行６（トロンビン、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）で最高レベルが見られた点で独特であった。
【００４８】
表４を参照すると、Ｔ顆粒放出はまた、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、処置されたＰＲＰ試料の上清中へのＰＤＩの放出によっても評価された。ＰＤＩレベルは、ＰＥＦ  Ａおよび２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２で活性化されたＰＲＰを用いて、実行１の上清中で最大であり、レベルは、トロンビンで処理した試料についてのアッセイの検出限界に近いかまたはそれ未満であった（実行５および６）。これは、フローサイトメトリーによって測定された血小板表面ＰＤＩと対照的であり、実行６（トロンビン、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）において最高であった。したがって、遊離対表面結合ＰＤＩの活性化条件の間に差異があるようである。興味深いことに、可溶性ＰＤＩレベルは、放出されたＥＧＦレベルと最もよく相関していた（ｒ＝０．５６６、ｐ＝０．０００１）。
【００４９】
【表４】
2019501911.tif 000006
血小板顆粒および成長因子の異なる曝露−研究のこの部分の結果を、表５および表６に示す。
【００５０】
【表５】
2019501911.tif 000007
各処置条件によって放出される成長因子の量は大きく変動したが、処置によって放出された血小板因子４（ＰＦ４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の全体的なパターンは、同様であった。
【００５１】
具体的には、ＰＲＰの上清中のＰＦ４、ＰＤＧＦ、およびＶＥＧＦの量を増加させる処置条件の相対的な能力は、ほとんどのものから最も少ないものまでで：実行６（トロンビン、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）≒実行５（トロンビン、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）＞実行４（ＰＥＦ  Ｂ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）≒実行１（ＰＥＦ  Ａ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）＞実行２（ＰＥＦ  Ａ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）＞実行８（２０ｍＭ  ＣａＣｌ２単独）＞実行２（ＰＥＦ  Ｂ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）≒カルシウムなしであった。これらの相対的な関係を、図７、図８、および図９にグラフで示す。図７、図８および図９（ならびに後述の図１０）の各々において、個々の結果が平均およびＳＥＭと共にプロットされている。アッセイの検出限界未満の結果を、検出の下限値でプロットする。
【００５２】
対照的に、ＥＧＦのほとんどの放出から最も少ない放出を生じさせる条件は：実行１（ＰＥＦ  Ａ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）＞＞実行３（ＰＥＦ  Ａ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）＞＞実行６（トロンビン、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）＞＞実行５（トロンビン、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）≒実行４（ＰＥＦ  Ｂ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）≒実行８（高カルシウム単独）＞実行２（ＰＥＦ  Ｂ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）≒実行７（カルシウムなし）であった。これらの結果を、図１０にグラフで示す。その結果、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、およびＶＥＧＦのレベルは、互いに高度に相関していたが、ＥＧＦレベルは、対応する係数（ｒ）（上の数字）および関連する確率（ｐ値）（下の数字）を有する成長因子相関マトリックスとして表６に示すように、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、およびＶＥＧＦと相関しなかった。
【００５３】
【表６】
2019501911.tif 000008
これらの結果および要約に関して、ＰＥＦ  Ａ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２が血餅を生じないにもかかわらず、Ｐ−セレクチン陽性血小板の割合の著しい増加、ならびにＰＤＩ、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、およびすべての休止状態の放出されたＥＧＦの最高レベルの著しい増加をもたらした。対照的に、ＰＥＦ  Ｂ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２は、Ｐ−セレクチン、ＴＬＲ９、ＰＤＩ、またはいずれかの成長因子の緩衝液と比較して有意な増加をもたらさなかった。２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を補充したＰＲＰでは、ＰＥＦ  ＡとＰＥＦ  Ｂの両方とも、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２単独より大きい程度に、かつトロンビン、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２より少ない程度に、アルファ顆粒マーカー、Ｐ−セレクチンの曝露を増加させた。ＰＦ４、ＰＤＧＦ、およびＶＥＧＦのレベルは、血小板表面のＰ−セレクチン発現（ＭＦＩ）および血小板表面ＴＬＲ９によって示されるＴ顆粒放出で示されるように、ＥＧＦではなく血小板アルファ顆粒放出と相関したが、ＥＧＦレベルは、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、またはＶＥＧＦではなく、活性化後の上清中に存在するＰＤＩのレベルと相関した。したがって、ＥＧＦ放出のパターンは、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、およびＶＥＧＦのパターンとは異なり、血小板内のＥＧＦの分布もこれらの他の因子の分布とは異なることを示唆している。放出された可溶性ＰＤＩと可溶性ＥＧＦとの相関についての潜在的な説明は、選択された血小板顆粒における共局在化または放出が類似の刺激によって誘発される別個の顆粒における局在化を含む。ＰＥＦ  ＡによるＥＧＦの増強された放出は、ＥＧＦが創傷治癒の上皮化段階にとって重要であることを考えると、臨床状況において潜在的に有用である。
【００５４】
前述を念頭において、存在する成長因子およびそれらの相対的な割合だけでなく、凝固の有無および／または血餅形成のタイミングに関してもカスタマイズされた活性化血小板生成物を生成することが可能である。すなわち、本明細書に記載の凝固結果を考慮すると、凝固の存在または血餅形成開始の時間は、成長因子の放出と併せて最適化することができることが理解され得る。例えば、高Ｃａ＋＋（２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）と併せてＰＥＦ  ＡおよびＰＥＦ  Ｂは、異なる相対的な割合ではあるが、対照上で試験したすべての成長因子の放出をもたらす。さらに、上記の結果に見られるように、低Ｃａ＋＋（２．５  ＣａＣｌ２）と併せてＰＥＦ  Ａは、凝固しないが試験されたすべての成長因子が放出される活性化生成物を生じる。逆に、低Ｃａ＋＋と併せてＰＥＦ  Ｂは、凝固しないが試験された成長因子が明らかに放出されない活性化生成物を生じる。したがって、放出された成長因子のレベルおよび凝固時間を制御および／または調節するために、電気刺激と添加されたＣａとの適切な組合せを使用してもよく、凝固が望まれない場合には、所望のレベル−高放出または低放出で成長因子を放出させるために、電気刺激と添加されたＣａとの適切な組合せを使用してもよい。
【００５５】
凝固および追加のＣａおよび電気的条件の結果−前述の考察および結果のさらなる支持において、観察された凝固時間、凝固強度、成長因子放出および溶血と共に、電気的条件およびカルシウムイオン濃度の範囲を示すさらなるデータセットを、表７に示す。この追加の例に示されるように、カルシウムイオン濃度および電気パラメータは、異なる関心軸（例えば、凝固時間、血餅強度、放出のための成長因子（複数の独立して操作可能な成長因子）、溶血など）に沿った一連の応答を得るために共に変化させることができる。このようにして、カルシウムイオン濃度および／または１つまたは複数の電気パルスパラメータの一方または両方を適切に選択することによって、活性化生成物の複数の属性を構成することができる。
【００５６】
表７の例として、試料２、３、４および５は、同じタイプの電気刺激を有するが、添加されたカルシウムのレベルは異なる。凝固時間は、添加されたＣａの関数として、１０．２分から１７．４分まで変化し得、１つのＣａ濃度について凝固はない。これは、単純にＣａ濃度を調製することによって、凝固／凝固なしを制御し、さらにこれらの試料の実際の凝固時間を制御する手段を提供する。添加されたＣａのレベルが増加するにつれて、これらの試料−２、３、４および５の放出されたＥＧＦのレベルが増加し、この場合、同じタイプの電気刺激を維持しながら、Ｃａレベルを調整することによって放出された成長因子を調節する手段を提供する。同様の方法で、溶血のレベルを調節することができる。
【００５７】
【表７】
2019501911.tif 000009
2019501911.tif 000010
したがって、表７に示すように、様々な異なる電気的特性およびパルスパラメータをカルシウムイオン濃度と共に変化させて様々な異なる凝固時間および強度を達成しながら、成長因子放出および溶血の個々のレベルをなお制御することができる。
【００５８】
本発明の技術的効果は、血餅の有無、血餅形成のタイミング（存在する場合）、および／または血餅の機械的強度（存在する場合）の１つまたは複数が活性化プロセス中のカルシウムイオンの存在または濃度によって制御される、活性化血小板生成物の生成を含む。カルシウムイオン濃度は、活性化プロセスの一部として、パルス電界または化学的活性化剤（例えば、トロンビン）の存在下で制御または特定される。
【００５９】
本明細書は、本発明を最良の態様を含めて開示するとともに、あらゆるデバイスまたはシステムの製作および使用ならびにあらゆる関連の方法の実行を含む本発明の実施を当業者にとって可能にするために、実施例を用いている。本発明の特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者が想到する他の実施例を含むことができる。このような他の実施例は、特許請求の範囲の文言との差がない構造要素を有する場合、または特許請求の範囲の文言との実質的な差がない等価の構造要素を含む場合、特許請求の範囲の技術的範囲に包含される。
【００６０】
本明細書の末尾に添付された請求項が「関数を実行するための手段」または「関数を実行するためのステップ」として指定された１つまたは複数の要素を含む場合、そのような要素は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２（ｆ）に基づいて解釈されることを意図している。しかし、他の方法で指定された要素を含む請求項については、そのような要素は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２（ｆ）に基づいて解釈されることを意図していない。
【符号の説明】
【００６１】
１０  パルス生成システム
１２  パルス生成回路
１４  電極
１６  電極
１８  キュベット
２０  接点
２２  試料
２４  試料ホルダ
２６  プロセッサ
２８  メモリ
３０  ディスプレイ
３２  ユーザ入力デバイス
３４  電流検知回路
【図１】
2019501911.tif 000011
【図２】
2019501911.tif 000012
【図３】
2019501911.tif 000013
【図４】
2019501911.tif 000014
【図５】
2019501911.tif 000015
【図６】
2019501911.tif 000016
【図７】
2019501911.tif 000017
【図８】
2019501911.tif 000018
【図９】
2019501911.tif 000019
【図１０】
2019501911.tif 000020
【国際調査報告】
2019501911.tif 000021
2019501911.tif 000022
2019501911.tif 000023
2019501911.tif 000024
2019501911.tif 000025