【手続補正書】
【提出日】平成19年6月20日(2007.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の単離核酸配列。
【請求項２】
核酸配列がＤＮＡである請求項１の単離核酸配列。
【請求項３】
配列番号４の単離アミノ酸配列。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項５】
請求項１の核酸配列および単離された宿主細胞で作動できるレプリコンを含む複製クローニングベクター。
【請求項６】
請求項５の複製クローニングベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項７】
転写調節領域に作動可能に連結した請求項１の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の発現ベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項９】
請求項１の核酸を宿主に投与するステップと、骨調節が起こるか否かを評価するステップとを含む、宿主細胞において骨調節用の治療剤としての物質をテストする方法。
【請求項１０】
宿主が細胞または動物である請求項９の方法。
【請求項１１】
動物がヒト、ゲッ歯類または鳥類である請求項１０の方法。
【請求項１２】
ＨＢＭに結合する、または分子のＨＢＭへの結合を阻害する分子を同定することを含む、骨調節に関与する分子を同定する方法。
【請求項１３】
該分子がタンパク質である請求項１２の方法。
【請求項１４】
Ｚｍａｘ１遺伝子を含む第１の宿主において、ＨＢＭ遺伝子を含む第２の宿主と比較した場合に、異なる発現レベルを有するタンパク質を同定することを含む、骨調節に関与するタンパク質を同定する方法。
【請求項１５】
宿主が細胞または動物である請求項１４の方法。
【請求項１６】
高骨量表現型を有する第１の個体においてタンパク質を同定するステップと、
高骨量表現型を有しない第２の個体においてタンパク質を同定するステップと、
第１の個体のタンパク質を第２の個体のタンパク質と比較するステップと
を含み、ここで、（ｉ）第１の個体に存在するが第２の個体に存在しないタンパク質が候補タンパク質であるか、あるいは、（ｉｉ）第２の個体におけるよりも第１の個体においてより多い量で存在するタンパク質は候補タンパク質であるか、あるいは（ｉｉｉ）第２の個体におけるよりも第１の個体においてより少量で存在するタンパク質は候補タンパク質であることを特徴とする、骨調節に関与する候補タンパク質を同定する方法。
【請求項１７】
候補タンパク質に対する抗体を生産するステップをさらに含む請求項１６の方法。
【請求項１８】
高骨量表現型を有する第１の個体においてタンパク質を同定するステップと、
高骨量表現型を有しない第２の個体においてタンパク質を同定するステップと、
第１の個体のタンパク質を第２の個体のタンパク質と比較するステップと
を含み、ここで、（ｉ）第２の個体には存在するが第１の個体には存在しないタンパク質は候補タンパク質であるか、あるいは（ｉｉ）第１の個体におけるよりも第２の個体においてより多い量で存在するタンパク質は候補タンパク質であるか、あるいは（ｉｉｉ）第１の個体におけるよりも第２の個体においてより少量で存在するタンパク質は候補タンパク質であることを特徴とする、骨調節に関与する候補タンパク質を同定する方法。
【請求項１９】
候補タンパク質に対する抗体を生産するステップをさらに含む請求項１８の方法。
【請求項２０】
ＨＢＭタンパク質を固定化するステップと、タンパク質をＨＢＭタンパク質に結合させるステップと、結合の程度を測定するステップとを含む、ＨＢＭ活性につきテストする方法。
【請求項２１】
タンパク質がＡｐｏＥである請求項２０の方法。
【請求項２２】
配列番号１の核酸配列に結合するか、または配列番号１の核酸配列への分子の結合を阻害する分子を同定するステップと、
配列番号２の核酸配列に結合するか、または分子の配列番号２の核酸配列への結合を阻害する分子を同定するステップと、
各核酸配列への分子の結合の程度、または各核酸配列への分子の結合の阻害の程度を比較するステップと
を含み、ここで、多かれ少なかれ配列番号２の核酸配列若しくは配列番号１の核酸配列に結合する分子、または配列番号２の核酸配列若しくは配列番号１の核酸配列への結合を阻害する分子が候補分子であることを特徴とする、骨調節に関与する候補分子の同定方法。
【請求項２３】
候補分子がタンパク質またはｍＲＮＡである請求項２２の方法。
【請求項２４】
配列番号４のアミノ酸配列に結合する分子を同定することを含む、骨発生障害の治療用医薬を開発する方法。
【請求項２５】
分子がアミノ酸の機能を阻害または増強する請求項２４の方法。
【請求項２６】
Ｚｍａｘ１遺伝子またはＺｍａｘ１タンパク質を含有する第１の宿主を構築するステップと、
ＨＢＭ遺伝子またはＨＢＭタンパク質を含有する第２の宿主を構築するステップと、
第１の宿主および第２の宿主の間の差を分析するステップと、
第１の宿主に添加した場合に、第１の宿主が第２の宿主の特徴を示す分子を同定するステップと
を含む、骨発生障害の治療用医薬を開発する方法。
【請求項２７】
宿主が無細胞抽出物、細胞または動物である請求項２６の方法。
【請求項２８】
差がサロゲートマーカーである請求項２６の方法。
【請求項２９】
請求項１の核酸配列を、骨発生障害に罹った動物の体細胞に導入することを含む動物において骨発生障害を治療する方法。
【請求項３０】
動物がヒトまたは鳥類である請求項２９の方法。
【請求項３１】
請求項１の核酸配列を、骨発生障害に罹った動物の生殖細胞系列に導入することを含む動物において骨発生障害を治療する方法。
【請求項３２】
動物がヒトまたは鳥類である請求項３１の方法。
【請求項３３】
請求項３のアミノ酸配列を、骨発生障害に罹った宿主の体細胞に投与することを含む宿主において骨発生を改変する方法。
【請求項３４】
宿主がヒトまたは鳥類である請求項３３の方法。
【請求項３５】
請求項３のアミノ酸配列を、骨発生障害に罹った宿主において生殖細胞系列に投与することを含む宿主において骨発生を改変する方法。
【請求項３６】
動物がヒトまたは鳥類である請求項３５の方法。
【請求項３７】
請求項３のアミノ酸配列を骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨粗鬆症を治療する方法。
【請求項３８】
患者がヒトまたは鳥類である請求項３７の方法。
【請求項３９】
請求項３のアミノ酸配列の細胞外ドメインを骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨粗鬆症を治療する方法。
【請求項４０】
患者がヒトまたは鳥類である請求項３９の方法。
【請求項４１】
請求項３のアミノ酸配列の細胞内ドメインを骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨粗鬆症を治療する方法。
【請求項４２】
患者がヒトまたは鳥類である請求項４１の方法。
【請求項４３】
請求項１の核酸配列に結合する分子を骨粗鬆症の治療が必要な患者に投与することを含む骨発生障害を治療する方法。
【請求項４４】
患者がヒトまたは鳥類である請求項４３の方法。
【請求項４５】
請求項３のアミノ酸配列に対する抗体を、骨発生障害の治療が必要な患者に投与することを含む骨発生障害を治療する方法。
【請求項４６】
ＨＢＭ又はＺｍａｘ１のゲノムまたはｃＤＮＡ核酸配列に由来するヌクレオチド配列によって患者からの試料をスクリーニングすることを含む、骨発生障害に対する遺伝的素因について診断的にスクリーニングする方法。
【請求項４７】
ＨＢＭタンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする骨発生障害についての診断アッセイ。
【請求項４８】
請求項１又は配列番号１の核酸の核酸配列を用いてハプロタイプ分析を行うことを含む、骨発生障害に対する遺伝的素因を同定するための方法。
【請求項４９】
請求項１の核酸配列に作動可能に連結した、骨組織において発現を指令するプロモーターを含む発現ベクターを構築することを含む、骨組織においてＨＢＭタンパク質を発現させる方法。
【請求項５０】
骨における発現を指令するプロモーターがオステオカルシンプロモーター、骨シアロタンパク質プロモーターまたはＡＭＬ−３プロモーターである請求項４９の方法。
【請求項５１】
配列番号５、６、７、８、９、１０または１１の核酸配列を有する細菌人工染色体。
【請求項５２】
請求項５１の細菌人工染色体を用いることを含むＺｍａｘ１遺伝子においてヌクレオチド多型を増幅する方法。
【請求項５３】
請求項５１の細菌人工染色体を用いることを含むＨＢＭ遺伝子においてヌクレオチド多型を増幅する方法。
【請求項５４】
請求項１または請求項５１の細菌人工染色体を用いることを含むＨＢＭ遺伝子の調節エレメントを同定する方法。
【請求項５５】
配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、該少なくとも１５個の連続したヌクレオチドが、配列番号２の位置５８２を含むことを特徴とする単離核酸配列。
【請求項５６】
ＤＮＡである請求項５５の単離核酸配列。
【請求項５７】
ＲＮＡである請求項５５の単離核酸配列。
【請求項５８】
請求項５５の核酸配列と宿主細胞において作動可能なレプリコンとを含む複製クローニングベクター。
【請求項５９】
請求項５８の複製クローニングベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項６０】
転写調節領域に作動可能に連結した請求項５５の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項６１】
請求項６０の発現ベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項６２】
配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む単離核酸配列であって、該少なくとも１５個の連続ヌクレオチドが配列番号２の位置５８２を含み、かつ配列番号４の位置１７１におけるバリンに対応するバリンを含むアミノ酸配列をコードし、バリンの置換が高骨重表現型に関連していることを特徴とする単離核酸配列。
【請求項６３】
ＤＮＡである請求項６２の核酸配列。
【請求項６４】
位置５８２におけるＧがＴによって置換された配列番号２の核酸配列に由来する多型部位を含む少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの単離核酸セグメント、およびその相補配列。
【請求項６５】
該相補配列が逆相補体である請求項６４の単離核酸セグメント。
【請求項６６】
該逆相補的配列がｍＲＮＡである請求項６５の単離核酸セグメント。
【請求項６７】
ＤＮＡである請求項６４の単離核酸セグメント。
【請求項６８】
ｃＤＮＡである請求項６４の単離核酸セグメント。
【請求項６９】
ＲＮＡである請求項６５の単離核酸セグメント。
【請求項７０】
ヌクレオチド６９１６９がＡによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２７４０２がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２７８４１がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド３５６００がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド４５６１９がＡによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド４６０１８がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド４６０９３がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド４６１９０がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド５０９９３がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド５１１２４がＴによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド５５４６１がＴによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド６３６４５がＡによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド６３６４６がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２４８０９がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２７８３７がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド３１４８５がＴによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド３１６８３がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド２４８０８がＧによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド３１３４０がＣによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド３２５３８がＧによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド１３２２４がＧによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド２１１１９がＡによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド３０４９７がＡによって置換された配列番号８、
ヌクレオチド２４８１１がＣによって置換された配列番号９、
ヌクレオチド６８２８０がＡによって置換された配列番号９および
その相補配列
よりなる群から選択されるエクソン配列からの単一ヌクレオチド多型部位を含む少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの単離核酸セグメント。
【請求項７１】
配列番号８の該エクソン配列のヌクレオチド２１１１９がＡによって置換された請求項７０の単離核酸セグメント。
【請求項７２】
ＤＮＡである請求項７０の単離核酸セグメント。
【請求項７３】
ＲＮＡである請求項７０の単離核酸セグメント。
【請求項７４】
プローブまたはプライマーである請求項６４または請求項７０の単離核酸セグメント。
【請求項７５】
病巣接着シグナリングに関与するタンパク質に結合する分子、または病巣接着シグナリングに関与するタンパク質への分子の結合を阻害する分子を同定することを含む骨調節に関与する分子を同定する方法。
【請求項７６】
病巣接着シグナリングに関与する分子が、配列番号８７〜１０９よりなる群から選択されるタンパク質に結合する請求項７５の方法。
【請求項７７】
病巣接着シグナリングに関与する分子が、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９９および配列番号１０２よりなる群から選択されるタンパク質に結合する請求項７５の方法。
【請求項７８】
病巣接着シグナリングに関与する核酸またはその核酸によりコードされるポリペプチドを調節する薬剤を投与することによって被検対象において骨密度を調節する方法。
【請求項７９】
核酸が、配列番号６３〜８６よりなる群から選択される核酸を含む請求項７８の方法。
【請求項８０】
核酸が配列番号６６、配列番号７１、配列番号７７または配列番号７９を含む請求項７８の方法。
【請求項８１】
ポリペプチドが配列番号８７〜１０９よりなる群から選択される請求項７８の方法。
【請求項８２】
ポリペプチドが配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９９または配列番号１０２である請求項７８の方法。
【請求項８３】
配列番号６６、配列番号７１、配列番号７７または配列番号７９を含む核酸。
【請求項８４】
核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項８３の核酸。
【請求項８５】
請求項８３の核酸および宿主細胞で作動可能なレプリコンを含む、複製クローニングベクター。
【請求項８６】
請求項８５の複製クローニングベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項８７】
請求項８３の核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項８８】
請求項８７の発現ベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項８９】
配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９９または配列番号１０２を含むポリペプチド。
【請求項９０】
配列番号９０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９９または配列番号１０２よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９１】
病巣接着シグナリングに関与する核酸またはポリペプチドを調節する薬剤を投与するステップを含む、骨発生障害を治療する方法。
【請求項９２】
該薬剤によって調節される核酸が配列番号６３〜８６のいずれか１つから選択される請求項９１の方法。
【請求項９３】
該薬剤によって調節されるポリペプチドが配列番号８７〜１０９のいずれか１つから選択される請求項９１の方法。
【請求項９４】
Ｚｍａｘ１又はＺｍａｘ１の変異体の骨調節活性について化合物を試験する方法であって、
（ａ）Ｚｍａｘ１タンパク質、Ｚｍａｘ１変異体タンパク質、Ｚｍａｘ１タンパク質の部分、Ｚｍａｘ１変異体タンパク質の部分を、基質に固定するステップと、
（ｂ）前記Ｚｍａｘ１タンパク質若しくはその部分、又は前記Ｚｍａｘ１変異体タンパク質若しくはその部分に化合物を曝すステップと、
（ｃ）前記化合物が、Ｚｍａｘ１タンパク質又は前記Ｚｍａｘ１変異体タンパク質に結合したかどうか決定するステップと、
（ｄ）前記化合物が前記Ｚｍａｘ１タンパク質又は前記Ｚｍａｘ１変異体タンパク質に結合した場合、宿主に前記化合物を投与し、前記タンパク質の投与によって骨量が調節されたかどうか決定するステップと
を含む方法。
【請求項９５】
化合物がタンパク質である請求項９４の方法。
【請求項９６】
骨量を調節するＺｍａｘ１シグナリングに関与するタンパク質を同定するための方法であって、
（ａ）Ｚｍａｘ１又はＺｍａｘ１の生物学的に活性な部分をコードする核酸を、酵母の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結することを含む、ベイトタンパク質を準備するステップと
（ｂ）プレイタンパク質をコードする核酸を、酵母の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結することを含む、プレイタンパク質を準備するステップと、
（ｃ）ベイト酵母において前記ベイトタンパク質を発現させ、プレイ酵母において前記プレイタンパク質を発現させるステップと、
（ｄ）前記ベイト酵母と前記プレイ酵母を混ぜるステップと、
（ｅ）ベイト酵母と交配したプレイ酵母を決定し、プレイタンパク質の調節が骨量を調節するかどうか解析するステップと
を含む方法。
【請求項９７】
配列番号１又は配列番号１の生物学的に活性な断片を含む単離核酸であって、ＹＷＴＤモチーフをコードする配列番号１のヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号１の前記生物学的に活性な断片が宿主に存在すると、前記宿主において骨量の表現型の変化を引き起こす変異を起している、単離核酸。
【請求項９８】
請求項９７の核酸を含む複製クローニングベクター。
【請求項９９】
請求項９８の複製クローニングベクターにより形質転換された単離された宿主細胞。
【請求項１００】
変異したＺｍａｘ１を発現するトランスジェニック動物であって、前記変異したＺｍａｘ１はトランスジェニック動物に発現されたときに骨量が変化することを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項１０１】
骨発生障害に罹患した動物の体細胞に、配列番号１を含む核酸を導入するステップを含む、動物の骨発生障害を治療するための方法。
【請求項１０２】
骨発生障害に罹患した動物の生殖細胞系列の細胞に、配列番号１を含む核酸を導入するステップを含む、動物の骨発生障害を治療するための方法。
【請求項１０３】
骨発生障害に罹患した宿主の体細胞に、配列番号３を含むアミノ酸配列又は生物学的に活性なその断片を投与するステップを含む、宿主の骨発生障害を調節する方法。
【請求項１０４】
（ａ）配列番号２を有する核酸、
（ｂ）配列番号４のポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号２の核酸又は配列番号４のポリペプチドをコードする核酸内の遺伝子座にハイブリダイズするプライマーを用いて、哺乳動物のライブラリーから増幅された核酸、
（ｄ）配列番号２の核酸にハイブリダイズする核酸、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の核酸に相補的な核酸、及び
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のポリヌクレオチドに由来する配列番号２の位置５８２を含む少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸
からなる群から選択される核酸を含み、被検対象に投与されたときに骨量を調節するタンパク質又はポリペプチドをコードする、単離された高骨量（ＨＢＭ）ポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
核酸が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリヌクレオチドに由来する少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含む請求項１０４のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
配列番号１を含む核酸を宿主に投与するステップと、骨量の調節が前記宿主に起こるかどうか評価するステップとを含む、宿主の骨量に関する治療剤としての物質を試験する方法。
【請求項１０７】
配列番号１を含む核酸又は配列番号１の生物学的に活性な断片をコードする核酸に作動可能に連結した、骨組織における発現を指示するプロモーターを含む発現ベクターを構築するステップを含む、骨組織においてＺｍａｚ１タンパク質を発現させる方法。
【請求項１０８】
プロモーターが、オステオカルシンプロモーター、ＡＭＬ−３プロモーターの骨シアロタンパク質プロモーターである、請求項１０７の方法。
【請求項１０９】
プロモーターがオステオカルシンプロモーターであり、骨組織が骨芽細胞である請求項１０８の方法。
【請求項１１０】
配列番号１に対して又は配列番号１の部分に対してアンチセンスである、骨量を調節する量の核酸を投与するステップを含む、動物の骨量を調節する方法。
【請求項１１１】
Ｚｍａｘ１を発現するトランスジェニック動物を準備するステップと、前記Ｚｍａｘ１を調整するステップと、前記動物における骨発生における前記Ｚｍａｘ１調節の影響を決定するステップとを含む、骨障害を研究する方法。
【請求項１１２】
変異したＺｍａｘ１を発現するトランスジェニック動物であって、前記変異したＺｍａｘ１は前記動物中で発現したとき骨量を変化させることを特徴とする動物。
【請求項１１３】
請求項１１２のトランスジェニック動物に化合物を投与するステップと、前記化合物が前記トランスジェニック動物の骨量を調節したかどうか決定するステップとにより、化合物を骨調節化合物として試験する方法。
【請求項１１４】
核酸は（ａ）又は（ｂ）又はそれらに相補的な核酸である、請求項１０４の単離された高骨量（ＨＢＭ）ポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
前記１５個の連続したヌクレオチドは、配列番号２の位置５８１、５８２及び５８３を含む、請求項５５の単離核酸配列。
【請求項１１６】
配列番号２の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む単離核酸配列であって、前記少なくとも１５個の連続したヌクレオチドは、配列番号４の位置１７１におけるアミノ酸置換をコードするヌクレオチドを含み、前記置換は高骨量表現型に関連することを特徴とする単離核酸配列。
【請求項１１７】
（ａ）配列番号２を有する核酸、
（ｂ）配列番号４のポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に相補的な核酸、及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリヌクレオチドに由来する配列番号２の位置５８２を含む少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸
からなる群から選択される核酸を含む、単離された高骨量（ＨＢＭ）ポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
また、本発明は、Ｚｍａｘ１遺伝子領域のヌクレオチド配列、ならびにＨＢＭ遺伝子領域のヌクレオチド配列に関する。さらに詳しくは、好ましい実施形態はＺｍａｘ１遺伝子領域Ｂ２００Ｅ２１−ＨおよびＢ５２７Ｄ１２−Ｈのセグメントを含有するＢＡＣクローンである。好ましい実施形態は配列番号５〜１１よりなるＢＡＣクローンのヌクレオチド配列である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
ＨＢＭクローニングのために配列番号１、３および５〜１１に記載した核酸から選択された核酸はポリメラーゼ反応鎖（ＰＣＲ）によって調製した。ＨＢＭヌクレオチド配列の５’および３’末端に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーは設計し、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。（配列の５’末端に特異的な）全ての順方向プライマーは、５’末端にＮｃｏＩクローニング部位を含むように設計した。これらのプライマーは、ＮｃｏＩ部位内にコードされたメチオニン残基、続いての、バリン残基およびＨＢＭ ＤＮＡ配列によってコードされたタンパク質におけるタンパク質翻訳の開始を可能とするように設計した。（配列の３’末端に特異的な）全ての逆方向プライマーは、ＨＢＭ配列のｐＥＴ−２８ｂのリーディングフレームへのクローニングを可能とするために５’末端にＥｃｏＲＩ部位を含んだ。ｐＥＴ−２８ｂベクターは、ヒスチジン親和性タグを含む（Ｃ−末端における）６つのヒスチジン残基を含むさらなる２０カルボキシル末端アミノ酸をコードする配列を供した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１５】
実施例２
本発明は、これらのクローンの組立体である、以下の表７で明らかな、ＨＢＭ遺伝子領域からの２つのＢＡＣクローンに由来するＤＮＡ配列を記載する。クローンｂ２００ｅ２１−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８６２８；配列番号１０〜１１）を１９９７年１２月３０日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９ Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した。クローンｂ５２７ｄ１２−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８９０７：配列番号５〜９）は１９９８年１０月２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９ Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した。これらの配列は、Ｚｍａｘ１遺伝子についてのＤＮＡプローブ、該遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー、Ｚｍａｘ１遺伝子におけるヌクレオチド多型、またはＺｍａｘ１遺伝子の調節エレメントを同定するのに当業者が用いることができるユニークな試薬である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１６】
【表７】
2004515209.tif 000001
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ及び１Ｂ】
図１は、遺伝子連鎖実験で用いた個体の系図を示す。各個体の下にＩＤ番号があり、脊髄ＢＭＤおよび対立遺伝子についてのｚ−スコアは染色体１１上に臨界的マーカーを要求する。実線の記号は「罹患した」個体を表す。「Ｎ」を含む記号は「未罹患」個体である。３７個体からのＤＮＡを遺伝子型分けした。クエスチョンマークは未知の遺伝子型または遺伝子型を特定されなかった個体を示す。
【図２Ａ及び２Ｂ】
図２は１１ｑ１３．３におけるＨＢＭ領域のＢＡＣ／ＳＴＳ内容物理的マップを示す。遺伝子、ＥＳＴ、マイクロサテライト、ランダム配列、およびＢＡＣ端部配列に由来するＳＴＳマーカーを長い水平方向の線上方に示す。ＧＤＢに存在するマーカーでは、同一の命名法が用いられた。遺伝子座の名称（Ｄ１１Ｓ＃＃＃＃）は、もし利用可能であれば主要名称後に括弧に入れて掲げる。ＢＡＣ端部配列に由来するＳＴＳを、最初のＢＡＣ名称、続いての、各々、クローンの左および右端部についてのＬまたはＲと共に掲げる。２つの大きな矢印は、ＨＢＭ臨界的領域を否定する遺伝子マーカーを示す。ＳＴＳ下方の水平線は、９倍網羅ＢＡＣライブラリーのＰＣＲ−ベースのスクリーニングによって同定されたＢＡＣクローンを示す。塗り潰ぶしていない丸は、マーカーがライブラリースクリーニングの間に対応するＢＡＣライブラリーアドレスを増幅しなかったことを示す。クローンの名称は以下の約束を用いる。ＢＡＣについてのＢ、プレート、列および行アドレス、続いての、ＨＢＭプロジェクトを示す−Ｈ（すなわち、Ｂ３６Ｆ１６−Ｈ）。
【図３Ａ〜３Ｆ】
図３Ａ〜３Ｆは、フランキングイントロン配列と共にＺｍａｘ１のゲノム構造を示す。翻訳は、エクソン１中の下線を施した「ＡＴＧ」によって開始される。ＨＢＭ遺伝子における多型の部位はエクソン３であり、下線を施した「Ｇ」によって表され、それにより、このヌクレオチドはＨＢＭ遺伝子中の「Ｔ」である。ｍＲＮＡの３’非翻訳領域はエクソン２３（エクソン１、配列番号４０；エクソン２、配列番号４１；エクソン３、配列番号４２；エクソン４、配列番号４３；エクソン５、配列番号４４；エクソン６、配列番号４５；エクソン７、配列番号４６；エクソン８、配列番号４７；エクソン９、配列番号４８；エクソン１０、配列番号４９；エクソン１１、配列番号５０；エクソン１２、配列番号５１；エクソン１３、配列番号５２；エクソン１４、配列番号５３；エクソン１５、配列番号５４；エクソン１６、配列番号５５；エクソン１７、配列番号５６；エクソン１８、配列番号５７；エクソン１９、配列番号５８；エクソン２０、配列番号５９；エクソン２１、配列番号６０；エクソン２２、配列番号６１；エクソン２３、配列番号６２）内で下線を施す。
【図４】
図４は、ＹＷＴＤスペーサー、細胞外付着部位、ＬＤＬおよびカルシウム用の結合部位、システインに富んだ長因子反復、膜貫通領域、ＣＫ−ＩＩリン酸化部位を持つ理想的ＰＥＳＴ領域およびインターナライゼーションドメインを含むＺｍａｘ１のドメイン組織化を示す。また、図４は、ＨＢＭタンパク質で起こるグリシンからバリンへの変化の部位を示す。シグナルペプチドはアミノ酸１〜２２に位置し、細胞外ドメインはアミノ酸２３〜１３８５に位置し、膜貫通ドメインセグメントはアミノ酸１３８６〜１４１３に位置し、および細胞質ドメインはアミノ酸１４１４〜１６１５に位置する。
【図５】
図５は、ＨＢＭ遺伝子に関連するＢＡＣ ｃｏｎｔｉｇＢ５２７Ｄ１２およびＢ２００Ｅ２１の模式図である。
【図６Ａ〜６Ｊ】
図６Ａ〜６Ｅは、野生型遺伝子Ｅｍａｘ１のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列である。ヌクレオチド５８２におけるグアニンからチミンへの塩基対置換についての位置は、下線を施す。この対立遺伝子変種はＨＢＭ遺伝子である。該ＨＢＭ遺伝子は、１７１位におけるグリシンからバリンへのアミノ酸置換を持つタンパク質をコードする。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は塩基１ないし７０の境界であり、３’ＵＴＲは塩基４９１６〜５１２０の境界である。
【図７Ａおよび７Ｂ】
図７Ａおよび７Ｂは、種々の組織におけるＺｍａｘ１の発現を示すノザンブロット分析である。
【図８】
図８は、ＰＣＲ産物分析である。
【図９】
図９は、Ｚｍａｘ１エクソン３突然変異の特異的オリゴヌクレオチド検出である。
【図１０】
図１０は、センスおよびアンチセンスプローブを用いる１００×倍率におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリタイゼーションによるマウスＺｍａｘ１の細胞位置である。
【図１１】
図１１は、センスおよびアンチセンスプローブを用いる４００×倍率におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリタイゼーションによるマウスＺｍａｘ１の細胞位置である。
【図１２】
図１２は、センスおよびアンチセンスプローブを用いる４００×倍率における骨内膜中での骨芽細胞のｉｎ ｓｉｔｕハイブリタイゼーションによるマウスＺｍａｘ１の細胞位置である。
【図１３】
図１３は、ＭＣ−３Ｔ３細胞におけるＺｍａｘ１発現のアンチセンス阻害である。
【図１４】
図１４は、野生型Ｚｍａｘ１対立遺伝子（左側パネル、Ｇ特異的オリゴ；５５℃洗浄）と比較したＨＢＭ１対立遺伝子（右側パネル；Ｔ特異的オリゴ；５８℃洗浄）の稀性を示すＺｍａｘ１エクソン３対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）アッセイを示す。右側パネルに出現する陽性スポットはポジティブコントロールであった。
【図１５】
図１５は、病巣接着シグナリングにおけるＺｍａｘ１の潜在的役割を表すモデルを示す。