【手続補正書】
【提出日】平成19年10月30日(2007.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ａ)核酸テンプレート精製の段階：
ｂ)サーモサイクリング反応の段階：および
ｃ)段階ｂ)の生成物の精製の段階
を含み、段階が微小流体ディスクで連続して行なわれることを特徴とする、一連の段階を行なう方法。
【請求項２】  微小流体ディスクを通した流体の流動をディスクの回転により行なうことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  核酸テンプレートがプラスミドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】  サーモサイクリング反応ｂ)が核酸シークエンシング反応である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】  更に：
ｄ)段階ｃ)で得られた精製産物の分離の段階；
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】  段階ａ)を核酸テンプレートを微小流体ディスクに含まれる微小構造中の精製カラムを通過させることにより行なう、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】  段階ｃ)を微小流体ディスクに含まれる微小構造中のゲル濾過カラムを通過させることにより行なう、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】  段階ｄ)がシークエンシング反応の生産物の電気泳動的分離である、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】  ａ)テンプレート核酸を含む細胞の培養を融解試薬で処理し、細胞質膜を融解させる；
ｂ)段階ａ)の融解物を微小流体ディスクの微小構造に入れ、ここで各微小構造はテンプレート核酸を精製するための手段を含む第１チャンバー、サーモサイクリング反応のための手段を含む第２チャンバー、およびサーモサイクリング反応の生成物を精製するための手段を含む第３チャンバーを含む：そして
ｃ)分析のために精製産物を回収する
ことを含む、テンプレート核酸における核酸シークエンシング反応を行なう方法。
【請求項１０】  ａ)少なくとも一つの入口；接続先
ｂ)テンプレート核酸を精製するための手段を含む第１チャンバー；接続先
ｃ)サーモサイクリング反応のための手段を含む第２チャンバー；接続先
ｄ)サーモサイクリング反応の産物を精製するための手段を含む第３チャンバー
を含むことを特徴とする、流体用の微小構造。
【請求項１１】  更に：
ｅ)第３チャンバーに接続した分離マトリックスを通した電位を適用するための手段を含む第４チャンバー
を含む、請求項１０に記載の流体用の微小構造。
【請求項１２】  テンプレート核酸のサーモサイクリング反応をを行なうための装置であり、微小流体ディスクを含み、該ディスクは請求項１０または１１に記載の流体用の複数の放射状に広がる微小構造を含む装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
次いで、プラスミド質をアガロースゲル電気泳動を用いて評価し、その量を分光光度法により決定でき、両方の技術とも当業者によく知られている。水中にまたは次段階(すなわち、ＰＣＲまたはサイクルシークエンシングのような直接シークエンシング反応)に適合できる希釈緩衝液中にプラスミドを得ることが有利である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
マイクロマシンを用いるシリコン構造上でのカオトロープ存在下でのＤＮＡの単離法が公開されている(Christel, L. A., K. Petersen, et al. (1999). “Rapid, automated nucleic acid probe assays using silicon microstructures for nucleic acid concentration.” J Biomech Eng 121(1):22-7)。米国特許第５,８８２,４９６号は、加熱反応チャンバー、電気泳動装置およびサーモニューマティック(thermopneumatic)センサー−アクチュエーター、化学前濃縮物、および濾過または制御流動装置の表面領域を増加させるための多孔性シリコン構造の製作および使用を記載している。特に、このような高表面領域または特異的孔サイズ多孔性シリコン構造は、小規模スケールでこのようなプロセスを使用する適用において、吸着、蒸発、脱着、縮合ならびに液体およびガスの流れを明白に増加させるために有用である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
回転可能な、通常、プラスティックでできたディスクから形成されるマイクロチャネルに基づく微量分析システムは、しばしば、“遠心ローター”、“チップ上の試験(lab on a chip)”または“ＣＤデバイス”としばしば呼ばれる。このようなディスクは、少量の流体の分析および分離の実行に使用できる。酵素アッセイを行なう目的でプラスティックディスクのチャネルを通して液体を移動させる原理は、例えば、Duffy, D. C., H. L. Gillis, et al. (1999). “Microfabricated centrifugal microfluidic systems: characterizatoin and multiple enzymatic assays.” Analytical Chemistry 71(20):4669-4678に記載されている。適当なプラスティックディスクの一つのタイプは、コンパクトディスクまたはＣＤと呼ばれるものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明は、テンプレート単離、サイクルシークエンシングおよびＣＤデバイスへのクリーンアップの段階の統合のための装置、およびこの装置の使用法に関する。特に、本発明は多数のサンプルの取り扱いを可能にし、したがって、自動化を非常に単純化し、試薬の消費およびしたがって全費用を削減し、必要な装置のサイズを減少させる、一つの密閉デバイスに関する。今日まで、一つの封入された構造内で、クリーン・アップされたシークエンシング反応の獲得を介した、ＤＮＡテンプレート細菌コロニーの単離を可能にする類似の統合レベルの装置の報告はない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
第１の態様の好ましい実施態様において、微小流体ディスクを通した流体の流れを、ディスクの回転により行なうことができる。ディスクを約２５０rpm(低速)から１５,０００rpm(高速)の範囲の種々の速度で回転(または回転)できる。方法の任意の特定の段階でのディスクを通した流体の正確な流れを達成するために必要な実際の速度は：
−微小流体ディスク上における構造の位置(すなわち、構造がディスクの中心から遠いほど、構造がディスクの中心にああるのと同じ遠心力を達成するために必要なrpmが低い)；
−液体が通過すべき構造の物理的寸法；
−液体の粘性；および
−構造における表面の化学的および物理的特性
を含む多くの因子に依存する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
図面の簡単な説明
本発明を、添付の図面の手段により実施態様の非限定的例により説明し、ここで：
図１ａは微小流体ディスクにおけるその配向を示す本発明の流体の微小構造のプランにおける模式図を示す(一部示す)；
図１ｂは、本発明の流体のための一つの微小構造のプランの模式図を示す；
図１ｃは、図１ｂのマイクロチャネルの廃棄制御構造(３４)の拡大図を示し、ここで、ａは微小流体ディスクが低速で回転した場合の液体の経路を示し、ｂは微小流体ディスクが高速で回転した場合の液体の経路を示す；
図１ｄは、図１ｂに示す微小構造のサンプル調製マイクロチャンネル構造(すなわち、(１３)−(２２)の部分)と電気泳動構造((２３)−(２８)の部分)の間の領域(３６)の拡大図を示す；
図１ｅは、微小流体ディスク上に配置された本発明の流体のための微小構造の別の態様を示す；
図２は本発明の微小流体ディスク上のウェルの二つの可能性能ある構造を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
疎水性ブレーキを、例えば、オーバーヘッドペン(パーマネント・インク)(Snowman pen, Japan)でマーキングすることにより、マイクロチャネル構造に導入できる。疎水性ブレーキの目的は、流体を望ましくない方向に誘導する毛管作用の防止である。疎水性ブレーキは、遠心力により、すなわち、ディスクを高速で回転させることにより打開できる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
図１ａはまた微小流体ディスクの外側端(４)に向かって位置決めされたウェル(１２)を示す。このウェルは、サンプルの入口(５)への添加の前にサンプル調製に使用できる。例えば、使用する核酸テンプレートが細菌コロニー由来である場合、細菌コロニーを最初に、例えば、ピペッティングロボットにより取りだし、固体液体培地の表面から、それを約１０μlの等張液に懸濁させる。懸濁液をついで微小流体ディスクのウェル(１２)に入れる。細菌細胞をついで微小流体ディスクを回転させることによりペレット化でき、上清を傾捨し得る。ペレットをついで溶液Ｉに再懸濁し、続いて回転し、溶液IIおよびIIIに連続して再懸濁する。沈殿ゲノムＤＮＡおよびタンパク質を回転によりペレット化し、プラスミド含有上清をさらに処理する(下記参照)。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
図１ｅの本発明の微小構造の他の実施態様において、チャンバー(２３)−(２５)、(２７)および(２８)として図１ｂに記載された電気泳動構造およびチャネル(２６)が無い。この態様において、サーモサイクリング反応の精製産物(すなわち、チャンバー(１６)からの溶出液)をウェル(２９)に別の電気泳動デバイスへの移動のために保持する。この態様において、生成物は約サブマイクロリットル容量で得られ、これは更なる分析のための別の構造に移動するための液体(例えば、ホルムアミドまたは水)の添加により希釈できる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
１３．反応混合物をサーモサイクリングチャンバーから、遠心力によりおよびゲル濾過チャンバーを通して排出する。ゲル濾過チャンバーは、微小構造中の深いおよび浅いセクションの間に捕捉された単分散(ふるった)Sephadex G-50 ＤＮＡグレードビーズを含む。非包含ターミネーターおよびまた塩が保持される。残りの配列ラダーは、最終“ピックアップ”ウェルに続き、必要な場合、より多くの水を添加し、液体取り扱いを助け、蒸発を減少させる。
１４．クリーン・アップ反応物を、ピペッティングロボットによりピックアップウェルから取りだし、マイクロタイタープレートに入れ、MegaBACEによる更なる処理のために５−１０μlに希釈する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  微小流体ディスクにおけるその配向を示す本発明の流体の微小構造のプランにおける模式図を示す(一部示す)；
【図１ｂ】  本発明の流体のための一つの微小構造のプランの模式図を示す；
【図１ｃ】  図１ｂのマイクロチャネルの廃棄制御構造(３４)の拡大図を示し、ここで、ａは微小流体ディスクが低速で回転した場合の液体の経路を示し、ｂは微小流体ディスクが高速で回転した場合の液体の経路を示す；
【図１ｄ】  図１ｂに示す微小構造のサンプル調製マイクロチャンネル構造(すなわち、(１３)−(２２)の部分)と電気泳動構造((２３)−(２８)の部分)の間の領域(３６)の拡大図を示す；
【図１ｅ】  微小流体ディスク上に配置された本発明の流体のための微小構造の別の態様を示す；
【図２】  本発明の微小流体ディスク上のウェルの二つの可能性能ある構造を示す。