(57)【要約】【課題】クロストークを遮断し、ＥＧＦＲ標的化療法の有効性を改善するために、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の両方を阻害する治療剤の必要性がある。【解決手段】  本出願は、ヒト上皮増殖因子受容体（EGFR）に結合する特異的結合メンバーに関する。特異的結合メンバーは、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの２つ以上の構造ループに位置し得るＥＧＦＲ抗原結合部位を含む。特異的結合メンバーは、ＥＧＦＲを発現しているがんの処置への適用が期待される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト上皮増殖因子受容体（EGFR）に結合する特異的結合メンバーであって、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインに位置するＥＧＦＲ抗原結合部位を含み、前記ＥＧＦＲ結合部位が、アミノ酸配列
（i）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＨＷＲＷＹＳ（配列番号３）；
（ii）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＹＷＲＷＶＫ（配列番号８）；又は
（iii）ＴＤＤＧＰ（配列番号１３）及びＳＹＷＲＷＹＫ（配列番号１４）
を含み、配列番号１又は１３に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの第１の構造ループに位置し、配列番号３、８又は１４に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの第２の構造ループに位置する、特異的結合メンバー。
【請求項２】
前記ＥＧＦＲ抗原結合部位が、
（i）前記ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列、及びＥＦループ中に、配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（ii）前記ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列、及びＥＦループ中に、配列番号８に示されるアミノ酸配列；又は
（iii）前記ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、及びＥＦループ中に、配列番号１４に示されるアミノ酸配列
を含む、請求項１に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３】
（i）配列番号１に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基１３．Ａから１８に位置し、及び／若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基９２から９８に位置するか、
（ii）配列番号１に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基１３．Ａから１８に位置し、及び／若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基９２から９８に位置するか、又は
（iii）配列番号１３に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基１４から１８に位置し、及び／若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列が前記ＣＨ３ドメインの残基９２から９８に位置し、
前記残基が、ＩＭＧＴ（ImMunoGeneTics）付番規定に従って付番される、請求項１又は２に記載の特異的結合メンバー。
【請求項４】
前記ＥＧＦＲ抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインの第３の構造ループ中にアミノ酸配列ＴＹＧ（配列番号２）をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項５】
前記ＥＧＦＲ抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の特異的結合メンバー。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列が、当該特異的結合メンバーの前記ＣＨ３ドメインの残基４４から４５．１に位置し、前記残基が、ＩＭＧＴ付番規定に従って付番される、請求項４又は５に記載の特異的結合メンバー。
【請求項７】
前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである、請求項１から６のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項８】
前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインである、請求項７に記載の特異的結合メンバー。
【請求項９】
配列番号４、９、又は１５に示されるＣＨ３ドメインを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１０】
ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１１】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメインを含む、請求項１０に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１２】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインを含む、請求項１１に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１３】
前記ＣＨ２ドメインが、配列番号１９に示される配列を有する、請求項１０に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１４】
配列番号６、１１、又は１７に示される配列を含む、請求項１から６又は９から１１のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１５】
ＣＨ２ドメインのＮ末端に、ＣＨ２ドメイン、免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１６】
前記ヒンジ領域、又はその部分が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒンジ領域、又はその部分である、請求項１５に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１７】
前記ヒンジ領域、又はその部分が、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、又はその部分である、請求項１６に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１８】
前記ヒンジ領域又はその部分が、配列番号４９に示される配列若しくは配列番号４８に示される配列又はその断片を有する、請求項１７に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１９】
第２の抗原結合部位をさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２０】
前記第２の抗原結合部位が、ＣＤＲベースの抗原結合部位である、請求項１９に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２１】
抗体分子である、請求項１９又は２０に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２２】
前記抗体分子が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子である、請求項２１に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２３】
前記抗体分子が、ヒトＩｇＧ１分子である、請求項２２に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２４】
前記第２の抗原結合部位が、腫瘍関連抗原に結合する、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２５】
前記第２の抗原結合部位が、受容体型チロシンキナーゼリガンド又は受容体型チロシンキナーゼに結合する、請求項２４に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２６】
前記受容体型チロシンキナーゼリガンドが、ＨＧＦである、請求項２５に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２７】
前記受容体型チロシンキナーゼが、ｃ−Ｍｅｔである、請求項２５に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２８】
ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を阻害する、請求項２６又は２７に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２９】
前記第２の抗原結合部位が、ＨＧＦに結合し、配列番号２１〜２６に示される抗体リロツムマブの相補性決定領域（CDR）を含む、請求項２６又は２８に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３０】
前記第２の抗原結合部位が、ＨＧＦに結合し、配列番号３１〜３６に示される抗体フィクラツズマブのＣＤＲを含む、請求項２６又は２８に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３１】
配列番号２９及び３０に示される抗体リロツムマブのＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む、請求項２９に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３２】
配列番号３９及び４０に示される抗体フィクラツズマブのＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む、請求項３０に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３３】
配列番号４１、４３、又は４５のいずれか一項に示される重鎖配列を含む、請求項２９又は３１に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３４】
配列番号２８に示される軽鎖配列をさらに含む、請求項３３に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３５】
配列番号４２、４４、又は４６のいずれか一項に示される重鎖配列を含む、請求項３０又は３２に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３６】
配列番号３８に示される軽鎖配列をさらに含む、請求項３５に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３７】
ＥＧＦＲ及び第２の抗原に同時に結合することができる、請求項１９から３６のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３８】
前記ＥＧＦＲ及び前記第２の抗原が、同じ細胞又は２つの異なる細胞上に存在するか、又は前記ＥＧＦＲが細胞上に存在し、前記第２の抗原が可溶性分子である、請求項３７に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３９】
免疫系修飾物質、細胞傷害性分子、放射性同位体、又は検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１から３８のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項４０】
前記免疫系修飾物質又は前記細胞傷害性分子が、サイトカインである、請求項３９に記載の特異的結合メンバー。
【請求項４１】
請求項１から４０のいずれか一項に記載の特異的結合メンバーをコードする核酸。
【請求項４２】
請求項４１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４３】
請求項４１に記載の核酸、又は請求項４２に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４４】
請求項４３に記載の組換え宿主細胞を、特異的結合メンバーの産生のための条件下で培養することを含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の特異的結合メンバーを産生させる方法。
【請求項４５】
前記特異的結合メンバーを単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１から４０のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４７】
患者におけるがんを処置する方法に使用するための特異的結合メンバーであって、前記がんの細胞が、ＥＧＦＲを発現する、請求項１から４０のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項４８】
前記がんが、肺がん、多形性膠芽腫、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、又は子宮内膜がんである、請求項４７に記載の使用のための特異的結合メンバー。
【請求項４９】
前記がんが、多形性膠芽腫、肺がん、又は膵臓がんである、請求項４８に記載の使用のための特異的結合メンバー。
【請求項５０】
患者における胃がんを処置する方法に使用するための特異的結合メンバーであって、前記がんの細胞が、ＥＧＦＲを発現する、請求項２６から２８、２９、３１、３３、又は３４に記載の特異的結合メンバー。
【請求項５１】
患者における非小細胞肺がんを処置する方法に使用するための特異的結合メンバーであって、前記がんの細胞が、ＥＧＦＲを発現する、請求項２６から２８、３０、３２、３５、又は３６に記載の特異的結合メンバー。
【請求項５２】
がんの細胞が、ＥＧＦＲを発現する、患者に請求項１から４０のいずれか一項に記載の特異的結合メンバーの治療有効量を投与することを含む、患者における前記がんを処置する方法。
【請求項５３】
前記がんが、皮膚がん、頭頸部がん、多形性膠芽腫、膵臓がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、肺がん、胃がん、又は子宮内膜がんである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記がんが、多形性膠芽腫、肺がん、又は膵臓がんである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
方法が、患者に請求項２６から２８、２９、３１、３３、又は３４に記載の特異的結合メンバーの治療有効量を投与することを含み、がんが、胃がんであり、前記がんの細胞がＥＧＦＲを発現する、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
がんが、患者における非小細胞肺がんであり、前記がんの細胞が、ＥＧＦＲを発現する、患者に請求項２６から２８、３０、３２、３５、又は３６に記載の特異的結合メンバーの治療有効量を投与することを含む、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本件は、その内容がその全体で参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年７月１９日に出願されたＧＢ１６１２５２０．５の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ヒト上皮増殖因子受容体（EGFR）に結合する特異的結合メンバーに関する。特異的結合メンバーは、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの２つ以上の構造ループに位置し得るＥＧＦＲ抗原結合部位を含む。本発明の特異的結合メンバーは、ＥＧＦＲを発現しているがんの処置に有用である。
【背景技術】
【０００３】
上皮増殖因子受容体（EGFR；ErbB-1及びHER1とも呼ばれる）は、上皮増殖因子ファミリー（EGFファミリー）の細胞外タンパク質リガンドのメンバーに対する細胞表面受容体である。ＥＧＦＲは、非触媒性調節領域に隣接する１回膜貫通領域及び細胞質チロシンキナーゼドメインを有する大型のモノマー性糖タンパク質である。配列分析によって、エクトドメインが、Ｌ１、ＣＲ１、Ｌ２及びＣＲ２と名付けられる４つのサブドメインを含有することが示され、その際、Ｌ及びＣＲは、それぞれｌａｒｇｅ（大型）及びＣｙｓ−ｒｉｃｈ（Cysリッチ）の頭字語である。Ｌ１及びＬ２ドメインは、それぞれドメインＩ及びＩＩＩとも呼ばれてきた。ＣＲドメインは、以前に、ドメインＩＩ及びＩＶ、又はＳ１．１〜Ｓ１．３及びＳ２．１〜Ｓ２．３と呼ばれており、その際、Ｓは、ｓｍａｌｌ（小型）についての略語である。
【０００４】
ＥＧＦＲを発現することが公知であるがんには、肺がん（例えば、非小細胞肺がん[NSCLC]）（Paoら、2010; Ammanら、2005）、多形性膠芽腫（Taylorら、2102）、皮膚がん（例えば、皮膚扁平上皮癌）（Uribeら、2011）、頭頸部がん（頭頸部扁平上皮癌[HNSCC]など）（Zimmermannら、2006; Smilekら、2012）、乳がん（Masudaら、2013）、胃がん（stomach cancer、gastric cancer）（Terashimaら、2012）、結腸直腸がん（CRC）（Spanoら、2005; Salettiら、2015）、卵巣がん（Hudsonら、2009）、膵臓がん（Troianiら、2012）、又は子宮内膜がん（Scambiaら、1994）が含まれる。
【０００５】
ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体が記載されている。これらの抗体は、ＥＧＦＲへのリガンドの結合及びその後のシグナル伝達を妨害する。
【０００６】
ｍＡｂＣ２２５（ERBITUX/セツキシマブ）は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、ＥＧＦＲへの結合をＥＧＦと競合し、それにより、下流の経路のシグナル伝達を阻害し、腫瘍細胞の増殖を遮断するキメラＩｇＧ１抗体である（Voigtら、2012）。セツキシマブは、放射線療法と組み合わせた、頭頸部がん、具体的には局所又は領域的に進行した頭頸部扁平上皮癌、白金ベースの治療法と５−ＦＵとの併用における再発性局所領域疾患又は転移性頭頸部扁平上皮癌、及び白金ベースの治療法の後に進行している再発性又は転移性頭頸部扁平上皮癌の処置のためにＦＤＡから承認されている。セツキシマブは、また、ＦＤＡから承認された試験により判定されるＫＲＡＳ変異陰性（野生型）ＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸がんの処置のために、特に、フォルフィリと併用した一次処置として、又はイリノテカンベースの化学療法に不応性の患者におけるイリノテカンとの併用で、並びにオキサリプラチンベース及びイリノテカンベースの化学療法に失敗した、若しくは単剤としてのイリノテカンに不耐容の患者の処置のために、ＦＤＡから承認されている。
【０００７】
ＡＢＸ−ＥＧＦ（VECTIBIX/パニツムマブ）は、セツキシマブのように、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、ＥＧＦＲへの結合をＥＧＦと競合し、それにより、下流の経路のシグナル伝達を阻害し、腫瘍細胞の増殖を遮断するヒトＩｇＧ２抗体である（Voigtら、2012）。パニツムマブは、ＦＤＡに承認された試験によって判定される野生型ＫＲＡＳ（コドン１２又は１３のエクソン２）転移性結腸直腸がん（mCRC）を有する患者の処置のために、フォルフォックスと併用した一次治療として、又はフルオロピリミジン、オキサリプラチン、及びイリノテカン含有化学療法を用いた前処置後の疾患進行に続く単剤療法としてのいずれかでＦＤＡによって承認されている。
【０００８】
ネシツムマブ（Portrazza）は、ＥＧＦＲに結合する別の抗体であって、転移性扁平非小細胞肺がんを有する患者の一次処置用にゲムシタビン及びシスプラチンと併用するために２０１５年にＦＤＡによって承認された。
【０００９】
ニモツズマブ（以前はh-R3として公知）は、いくつかの国で臨床試験に登録されている、ＥＧＦＲの細胞外領域に結合するヒト化ＩｇＧ１抗体である。ニモツズマブは、インド、キューバ、アルゼンチン、コロンビア、アイボリーコースト、ガボン、ウクライナ、ペルー及びスリランカにおいて頭頸部扁平上皮癌の処置のため；並びにキューバ、アルゼンチン、フィリピン及びウクライナにおいて神経膠腫（小児及び成人型）の処置のため；並びに中国において鼻咽腔がんの処置のために承認されている（Ramakrishnanら、2009）。
【００１０】
ザルツズマブ（zalutuzumab）（HuMax-EGFr）及びマツズマブ（以前はEMD 72000）を含む、ＥＧＦＲを標的化する他の抗体の臨床試験が開始されているが、これらの抗体は、規制機関の承認が与えられておらず、それ以来、開発は中止されている。
【００１１】
エルロチニブ（TARCEVA）及びゲフィチニブ（IRESSA）を含む、ＥＧＦＲのいくつかの小分子阻害剤も、がんの処置のために承認されている。
【００１２】
単剤のＥＧＦＲ標的化療法を用いてがんの処置に幾分成功があったとはいえ、多くの腫瘍が処置後に単剤療法に対する抵抗性を獲得する。これらの腫瘍が処置に抵抗性になる潜在的メカニズムとして、腫瘍細胞表面でのＥＧＦＲと他の分子との間のクロストークが同定されている。例えば、ＥＧＦＲ−ｃ−Ｍｅｔのクロストークは、神経膠芽腫、ＮＳＣＬＣ、結腸直腸がん及び胃がんを含むいくつかの腫瘍型において、腫瘍にとってのＥＧＦＲ標的化された単一の薬剤による療法に対する逃避メカニズムを生じることが見出されている。増大したＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は、ＥＧＦＲ経路の阻害効果を限定するおそれがあるので、それは、ＥＧＦＲ標的化薬物に対する獲得抵抗性と関連づけられている。両方の受容体活性が撹乱されることは、それらのシグナル伝達が高度に動的に相互接続していることを示唆している（Castoldiら、2013）。
【００１３】
ｃ−Ｍｅｔ（MET受容体、HGFR、ヒトにおけるc-MET）は、ＥＧＦＲも発現する腫瘍細胞を含む、多くの腫瘍細胞の表面に見出される受容体型チロシンキナーゼ（RTK）である。細胞分散因子（SF）としても公知の肝細胞増殖因子（HGF）は、ｃ−Ｍｅｔの唯一の公知のリガンドである。ＨＧＦは、間葉細胞によって分泌され、細胞表面にあるその受容体ｃ−Ｍｅｔを経由して主に上皮起源の細胞に対して多機能サイトカインとして作用する。これは、単一の不活性ポリペプチドとして分泌され、セリンプロテアーゼによって、ジスルフィド結合により連結した６９ｋＤａのアルファ鎖及び３４ｋＤａのベータ鎖に切断されて、ヘテロダイマー性活性分子を創出する（Naldiniら、1992）。ＨＧＦは、ｃ−Ｍｅｔに対する高親和性結合部位及びヘパリン硫酸プロテオグリカンに対する低親和性結合部位を有する。
【００１４】
ＨＧＦは、血管新生に役割を果たし、多数の細胞及び組織型において細胞増殖、生存、運動性、分散分化及び形態形成を促進する（Organら、2011）。ＨＧＦのその受容体ｃ−Ｍｅｔへの結合は、ｃ−Ｍｅｔのホモダイマー化及びチロシンリン酸化を誘導し、多くのＲＴＫに共通にその活性化及び下流のシグナル伝達を招く。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦシグナル伝達経路は、神経誘導、肝再生、創傷血管新生、成長、浸潤、形態分化及び正常な胎生学的発生に役割を果たす。ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ経路は、鍵となる発がん経路（RAS、PI3K、STAT-3及びベータカテニンを含む）の活性化を経由してがんに重要な役割も果たす。この回路を介した異常なシグナル伝達は、腫瘍形成、特に浸潤性及び転移性がん表現型の発生に関与することが示されている。ｃ−Ｍｅｔの自己分泌刺激は、神経膠腫、骨肉腫、膵臓がん及び胃がんに最も一般的に見られる（Stoneら、2014）。
【００１５】
ｃ−Ｍｅｔ及び他のＲＴＫに結合することによってｃ−Ｍｅｔ経路に影響する小分子キナーゼ阻害剤が、臨床において試験されている。コバザンチニブ（cobazantinib）及びクリゾチニブは、ＦＤＡによって承認されており、一方、臨床で試験された他の阻害剤には、チバチニブ（tivatinib）及びフォレチニブが含まれる。オナルツズマブ（MetMab）を含む、ｃ−Ｍｅｔ又はＨＧＦに結合する抗体も臨床試験を受けた。オナルツズマブは、ｃ−ＭｅｔへのＨＧＦの結合を遮断する抗ｃ−Ｍｅｔヒト化一価モノクローナル抗体である。ｃ−ＭｅｔへのＨＧＦの結合を遮断する抗ＨＧＦ抗体も、また、臨床試験において試験されており、それらには、リロツムマブ、フィクラツズマブ（ficlatuzumab）及びＨｕＬ２Ｇ７が含まれる。しかし、これらの抗体のどれも臨床使用のために承認されていない。
【００１６】
リロツムマブ（以前はAMG102として公知）は、ＨＧＦに結合してそれを中和し、それがｃ−Ｍｅｔに結合するのを遮断する完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。化学療法単独を与えられた患者と比較して、リロツムマブ併用化学療法（エピルビシン、シスプラチン及びカペシタビン（ECX））で処置された患者において、患者の死亡増が生じた有意に劣った全生存及び劣った毒性が観察された後、進行胃がんにおけるリロツムマブの臨床試験は中止された。
【００１７】
フィクラツズマブ（以前はAV-299として公知）は、ＨＧＦに結合し、リロツムマブのように、ｃ−Ｍｅｔへの結合を中和するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。再発性／転移性ＨＮＳＣＣを有する患者におけるセツキシマブと併用したフィクラツズマブを評価するための臨床試験が進行中である。加えて、以前に未処置の転移性ＥＧＦＲ変異非小細胞肺がん（NSCLC）及びＢＤＸ００４陽性標識を有する患者におけるフィクラツズマブ及びエルロチニブの処置も、検討中である。再発及び不応性急性骨髄性白血病患者における高用量シタラビンと併用したフィクラツズマブの臨床試験も進行中である。フィクラツズマブ、シスプラチン及び強度変調放射線治療（IMRT）を評価する研究は、中断されている。以前に未処置の（EGFR変異を有する又は有しない）肺腺癌を有するアジア人患者における単独の又はフィクラツズマブと併用したゲフィチニブの無作為化第２相試験は、改善された全生存又は無増悪生存を実証できなかった。
【００１８】
ＨｕＬ２Ｇ７（以前はTAK-701として公知）は、ＨＧＦを有効に中和するヒト化モノクローナル抗体であるが、進行非血液系悪性腫瘍において第１相研究での試験がなされたが、それ以上の開発に進んでいないようである。
【００１９】
抗体の定常又は可変ドメインなどの抗体ドメインの１つ又は複数の構造ループ中に操作された抗原結合部位を含む特異的結合メンバーの調製は、ＷＯ２００６／０７２６２０、ＷＯ２００９／１３２８７６、ＷＯ２００９／０００００６及びＥＰ２５４６２６８に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
上に説明したように、臨床におけるＥＧＦＲ標的化された単一の薬剤による療法の使用は、腫瘍の獲得抵抗性及びその後の再発の発生、並びにＥＧＦＲ及びＨＧＦの両方を標的化する併用療法が今のところ臨床使用のために承認されていないという事実のせいで限られている。したがって、クロストークを遮断し、ＥＧＦＲ標的化療法の有効性を改善するために、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の両方を阻害する治療剤の必要性がある。
【００２１】
大規模なスクリーニング及び親和性成熟プログラムを経て、本発明者らは、分子のＣＨ３ドメイン中にＥＧＦＲに特異的な結合部位を含む３つの特異的結合メンバーを同定することができた。これらの特異的結合メンバーを第２の腫瘍関連抗原に特異的な、ＣＤＲベースの結合部位を有する抗体分子に有利に組み込んで、強力な抗腫瘍効果を有する特異的結合メンバーを提供することができる。
【００２２】
例えば、皮疹及び病変を生じる皮膚毒性が、公知の抗ＥＧＦＲ療法で観察されている。第２の抗原、この場合ＣＴＬＡ−４又はＨＧＦに特異的なＣＤＲベースの結合部位を有する抗体分子中に組み込まれると、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバー単独で処置されたマウスで観察された皮膚毒性と比較して少ない皮膚毒性をマウスにおいて有利に誘発することが見出された（実施例１８参照）。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
したがって、第１の態様において、本発明は、ＥＧＦＲに結合し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインに位置するＥＧＦＲ抗原結合部位を含む、特異的結合メンバーを提供する。
【００２４】
ＥＧＦＲ抗原結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列
（i）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＨＷＲＷＹＳ（配列番号３）；
（ii）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＹＷＲＷＶＫ（配列番号８）；又は
（iii）ＴＤＤＧＰ（配列番号１３）及びＳＹＷＲＷＹＫ（配列番号１４）
を含む又は含有する。
【００２５】
例えば、ＥＧＦＲ抗原結合部位は、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの構造ループ領域に位置することができ、その際、構造ループ領域は、好ましくは２つ以上の構造ループを含み、ＥＧＦＲ抗原結合部位は、好ましくはアミノ酸配列
（i）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＨＷＲＷＹＳ（配列番号３）；
（ii）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＹＷＲＷＶＫ（配列番号８）；又は
（iii）ＴＤＤＧＰ（配列番号１３）及びＳＹＷＲＷＹＫ（配列番号１４）
を含む。
【００２６】
さらなる例として、ＥＧＦＲ抗原結合部位は、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの２つ以上の構造ループ内に操作することができ、その際、ＥＧＦＲ抗原結合部位は、好ましくはアミノ酸配列
（i）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＨＷＲＷＹＳ（配列番号３）；
（ii）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＹＷＲＷＶＫ（配列番号８）；又は
（iii）ＴＤＤＧＰ（配列番号１３）及びＳＹＷＲＷＹＫ（配列番号１４）
を含む。
【００２７】
配列番号１及び１３に示されるアミノ酸配列は、好ましくは特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの第１の構造ループに位置し、配列番号３、８及び１４に示されるアミノ酸配列は、好ましくはＣＨ３ドメインの第２の構造ループに位置する。
【００２８】
上述のように、ＥＧＦＲ抗原結合部位の配列は、好ましくは特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの２つ以上の構造ループに位置する。好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ抗原結合部位は、
（i）ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列、及び／若しくはＥＦループ中に、配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（ii）ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列、及び／若しくはＥＦループ中に、配列番号８に示されるアミノ酸配列；又は
（iii）ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、及び／若しくはＥＦループ中に、配列番号１４に示されるアミノ酸配列
を含有する又は含む。より好ましくは、ＥＧＦＲ抗原結合部位は、ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列、及びＥＦループ中に、配列番号３又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
ＥＧＦＲ抗原結合部位は、好ましくはアミノ酸配列ＴＹＧ（配列番号２）をさらに含む。この配列は、好ましくはＣＨ３ドメインの第３の構造ループ、より好ましくはＣＨ３ドメインのＣＤループに位置する。
【００３０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、好ましくはＣＨ３ドメインの残基（位置）１３．Ａから１８に位置し；配列番号３に示されるアミノ酸配列は、好ましくは特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの残基（位置）９２から９８に位置し；配列番号８に示されるアミノ酸配列は、好ましくは特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの残基（位置）９２から９８に位置し；配列番号１３に示されるアミノ酸配列は、好ましくはＣＨ３ドメインの残基（位置）１４から１８に位置し、配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、好ましくはＣＨ３ドメインの残基（位置）９２から９８に位置する。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、好ましくは特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの残基（位置）４４から４５．１に位置する。特異的結合メンバーの残基は、本明細書においてＩＭＧＴ（ImMunoGeneTics）付番規定に従って付番される。
【００３１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列及び配列番号３に示されるアミノ酸配列に加えて、特異的結合メンバーは、好ましくはＣＨ３ドメインの残基（位置）８８にアルギニンを含む。
【００３２】
ＥＧＦＲ抗原結合部位の配列以外の特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの配列は、特に限定されない。好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ヒト免疫グロブリンＧドメイン、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインであり、最も好ましくはヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインの配列は、当技術分野において公知である。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明による特異的結合メンバーは、配列番号４、配列番号９、又は配列番号１５のＣＨ３ドメインを含む。より好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号４又は９のＣＨ３ドメインを含む。
【００３４】
特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインをさらに含み得る。ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ分子の場合のように、好ましくは特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインのＮ末端に位置する。特異的結合メンバーのＣＨ２ドメインは、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、より好ましくはヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインである。ヒトＩｇＧドメインの配列は、当技術分野において公知である。好ましい実施形態では、特異的結合メンバーは、配列番号１９に示される配列を有するＩｇＧ  ＣＨ２ドメインを含む。
【００３５】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは配列番号６、配列番号１１、又は配列番号１７に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含む。より好ましくは、本発明の特異的結合は、配列番号６又は１１に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含む。
【００３６】
好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端に免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分を含む。免疫グロブリンヒンジ領域は、好ましくは配列番号４８に示される配列又はその断片、より好ましくは配列番号４９に示される配列を有する。
【００３７】
本発明の特異的結合メンバーは、２つのポリペプチドからなるダイマーの場合があり、その際、各ポリペプチドは、配列番号６、配列番号１１、又は配列番号１７、好ましくは配列番号６又は１１に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を有する又は含み、各ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインのＮ末端に免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分、好ましくは配列番号４９に示される免疫グロブリンヒンジ領域をさらに含む。これらの特異的結合メンバーは、本明細書においてそれぞれＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５、及びＦＳ１−６７とも呼ばれる。
【００３８】
ＣＨ３ドメイン中のＥＧＦＲ抗原結合部位に加えて、本発明の特異的結合メンバーは、二特異性又は多特異性分子を創出するために１つ又は複数の追加的な抗原結合部位をさらに含み得る。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、天然免疫グロブリン分子の可変領域中に見出され、それらの構造は、当技術分野において周知である。特異的結合メンバーがＣＤＲベースの抗原結合部位を含む場合、特異的結合メンバーは、好ましくは抗体分子である。抗体分子は特に限定されないが、但し、抗体分子は、本明細書に定義されるようなＣＨ３ドメイン及びＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。好ましい実施形態では、抗体分子は、ヒト免疫グロブリンＧ分子、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子、より好ましくはヒトＩｇＧ１分子である。ヒト免疫グロブリンＧ分子の配列は、当技術分野において公知であり、本明細書開示のＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメイン配列をそのような分子に導入することは、技術者にとって何ら困難にならない。
【００３９】
特異的結合メンバーが、１つ又は複数のＣＤＲベースの抗原結合部位を含む場合、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、好ましくは腫瘍関連抗原である分子に結合する。腫瘍関連抗原は、好ましくはＥＧＦＲを発現しているがんによって発現される腫瘍関連抗原である。好ましい実施形態では、腫瘍関連抗原は、好ましくは受容体型チロシンキナーゼに対するリガンド、又は受容体型チロシンキナーゼである。受容体型チロシンキナーゼリガンドは、好ましくはヒトｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体[HGFR]）のリガンド、最も好ましくはｃ−Ｍｅｔのリガンドである肝細胞増殖因子（HGF）である。受容体型チロシンキナーゼは、好ましくはヒトｃ−Ｍｅｔである。本発明の特異的結合メンバーが、本明細書記載の１つ又は複数のＣＤＲベースの抗原結合部位、例えばＨＧＦに結合するＣＤＲベースの抗原結合部位をさらに含む場合、この特異的結合メンバーは、（ヒト）患者に投与されたときに、この又は任意のＣＤＲベースの抗原結合部位を含まない特異的結合メンバーよりも誘発される皮疹及び病変などの皮膚毒性が少ない場合がある。
【００４０】
好ましい実施形態では、特異的結合メンバーは、ＨＧＦに特異的な第２の抗原結合部位を含み、その際、結合部位は、配列番号２１〜２６に示される抗体リロツムマブ（RI）の相補性決定領域（CDR）、又は配列番号３１〜３６に示される抗体フィクラツズマブ（FI）のＣＤＲを含む。より好ましくは、特異的結合メンバーは、配列番号２９及び３０に示される抗体リロツムマブのＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、又は配列番号３９及び４０に示される抗体フィクラツズマブのＶＨ及び／若しくはＶＬドメインを含む。そのような特異的結合メンバーは、配列番号２８の軽鎖配列、又は配列番号３８の軽鎖配列を含み得る。
【００４１】
本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２８に示されるＲＩの軽鎖配列並びに／又はそれぞれ配列番号４１、４３及び４５に示されるＲＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ／ＦＳ１−６５、若しくはＲＩ−ＦＳ１−６７  ｍＡｂ２の重鎖配列を含み得る。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号２８に示されるＲＩの軽鎖配列並びにそれぞれ配列番号４１、４３及び４５に示されるＲＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ／ＦＳ１−６５、又はＲＩ−ＦＳ１−６７  ｍＡｂ２の重鎖配列を含む。
【００４２】
本発明の特異的結合メンバーは、配列番号３８に示されるＦＩの軽鎖配列並びに／又はそれぞれ配列番号４２、４４及び４６に示されるＦＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ／ＦＳ１−６５、若しくはＦＩ−ＦＳ１−６７  ｍＡｂ２の重鎖配列を含み得る。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号３８に示されるＦＩの軽鎖配列並びにそれぞれ配列番号４２、４４及び４６に示されるＦＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ／ＦＳ１−６５、又はＦＩ−ＦＳ１−６７  ｍＡｂ２の重鎖配列を含む。
【００４３】
或いは、特異的結合メンバーが、ＨＧＦに特異的な第２の抗原結合部位を含む場合、結合部位は、米国特許第７，６３２，９２６号に記載された抗体ＨｕＬ２Ｇ７の相補性決定領域（CDR）を含み得る。このＨｕＬ２Ｇ７のＣＤＲは、配列番号６２〜６７に示される。
【００４４】
特異的結合メンバーは、免疫系修飾物質、細胞傷害性分子、放射性同位体、又は検出可能な標識にさらにコンジュゲートさせることができる。細胞傷害性分子であり得る免疫系修飾物質は、サイトカインである。
【００４５】
本発明は、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子をコードする核酸、加えてそのような核酸を含むベクターも提供する。
【００４６】
本発明の核酸又はベクターを含む組換え宿主細胞も提供される。そのような組換え宿主細胞を使用して本発明の特異的結合メンバーを産生することができる。したがって、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子を産生させる方法であって、組換え宿主細胞を特異的結合メンバー又は抗体分子の産生のための条件下で培養することを含む方法も提供される。方法は、特異的結合メンバー又は抗体分子を単離及び／又は精製する工程をさらに含み得る。
【００４７】
本発明の特異的結合メンバー及び抗体は、治療的用途への、特にがんの処置などのヒトにおける治療的用途に適用されることが期待される。したがって、本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物も提供される。
【００４８】
本発明は、患者におけるがんを処置する方法における使用のための、本発明の特異的結合メンバー又は抗体分子も提供する。患者におけるがんを処置する方法であって、患者に本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子の治療有効量を投与することを含む方法も提供される。患者におけるがんの処置のための医薬の製造における使用のための、本発明による特異的結合メンバー又は抗体分子の使用が、さらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂであるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７がＡ４３１ＮＳ（EGFRを過剰発現するヒト類上皮腺癌細胞）上のＥＧＦＲへのＥＧＦリガンドの結合を遮断することを示す図である。ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合の阻害パーセンテージをＰＢＳ対照に対して規準化するが、その際、ＰＢＳは０％阻害を生じる。
【図１Ｂ】ＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７が組換えＥＧＦＲ／ＦｃへのＴＧＦαリガンドの結合を遮断することを示す図である。ＥＧＦＲへのＴＧＦαの結合の阻害パーセンテージをＰＢＳ対照に対して規準化するが、その際、ＰＢＳは０％阻害を生じる。
【図２】フローサイトメトリーによって測定したとき、抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂであるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５、及びＦＳ１−６７がＡ４３１ＮＳ細胞上のＥＧＦＲに結合したことを示す図である。蛍光結合シグナルの幾何平均をＦｃａｂ濃度に対してプロットした。Ｆｃａｂは、Ａ４３１ＮＳ細胞に濃度依存的に結合し、一方でＷＴ  Ｆｃａｂは、結合しなかった。
【図３】４ＭＢｒ−５細胞増殖に及ぼす抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ（FS1-60、FS1-65及びFS1-67）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、ＷＴ  Ｆｃａｂ及びセツキシマブの効果を示す図である。細胞を漸増する濃度の抗ＥＧＦＲＦｃａｂ（FS1-60、FS1-65及びFS1-67）で処理したとき、ＰＢＳ対照に対して規準化された４ＭＢｒ−５細胞増殖の低下が観察された。ＷＴ  Ｆｃａｂ又はＩｇＧ１アイソタイプ対照を用いた処理は、細胞増殖にいかなる変化も引き起こさなかった。図３におけるＢｒｄＵシグナルは、Ｆｃａｂ濃度に関して規準化された平均及びＳＥＭである。図３に示されるデータから決定されたＩＣ５０は、それぞれＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５、ＦＳ１−６７、及びセツキシマブについて２７．４１、０．９９、７．５３、及び０．１３ｎＭであった。
【図４】ヒト患者由来異種移植（PDX）腫瘍を担持するマウスにおけるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５、ＦＳ１−６７、セツキシマブ及びＷＴ  Ｆｃａｂの抗腫瘍有効性を示す図である。図４に矢印で示すように、０、２、４、７、９、１１及び１４日目にマウスに投薬した。各処置に供されたマウスにおける経時的な平均絶対腫瘍体積を示す。腫瘍の測定を週２回行った。抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ及びセツキシマブで処置された全てのマウスは、完全腫瘍退縮を示した。腫瘍が再発したマウスの数をグラフの右に示す（例えば、FS1-60で処置されたマウス７匹中１匹が再発した）。
【図５】１．  マウスカッパ軽鎖バックボーンにおける９Ｄ９軽鎖（配列番号５０）２．  ９Ｄ９ｍ２ａ重鎖：マウスＩｇＧ２ａバックボーン（CH1-ヒンジ-CH2-CH3）における９Ｄ９  ＶＨ（配列番号５２）３．  ９Ｄ９ｈ１重鎖：キメラマウスＩｇＧ２ａ−ヒトＩｇＧ１バックボーン（マウスIgG2a CH1-ヒトIgG1ヒンジ-CH2-CH3）における９Ｄ９  ＶＨ（配列番号５４）４．  ９Ｄ９／ＦＳ１−６７重鎖：キメラマウスＩｇＧ２ａ−修飾ヒトＩｇＧ１バックボーンにおける９Ｄ９  ＶＨ（マウスIgG2a CH1-ヒトIgG1ヒンジ-CH2-EGFR Fcab FS1-67 CH3）（配列番号５６）の概要図である。
【図６】ＦＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２及びＲＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２がＵ８７ＭＧヒト初代神経膠芽腫細胞におけるＭｅｔ（pMet）及びシグナル伝達タンパク質ＭＡＰＫ（pMAPK）のリン酸化を阻害することを示す図である。細胞をＦＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ／ＦＳ１−６０、フィクラツズマブ（FI）、リロツムマブ（RI）、ＦＳ１−６０、フィクラツズマブとＦＳ１−６０との併用（FI＋FS1-60）、リロツムマブとＦＳ１−６０との併用（RI＋FS1-60）、又はアイソタイプ対照ＩｇＧ１カッパ（IgG）で処理した。ＨＧＦ又はＥＧＦの添加を「＋」で示し、ＨＧＦ又はＥＧＦの不在を「−」で示す。ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用した。ＨＧＦ及びＥＧＦの両方によって刺激したとき、ｍＡｂ２分子単独、及びＦＩ又はＲＩとＥＧＦＲ結合性Ｆｃａｂとの併用は、下流のシグナル伝達分子ＭＡＰＫ及びＡｋｔのリン酸化を遮断した。ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０は、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲのリン酸化を阻害することが可能である。
【図７】ｍＡｂ２  ＲＩ／ＦＳ１−６０（図７Ａ）及びｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０（図７Ｂ）が、表面プラズモン共鳴法によって測定されたときに、それらの同族抗原の両方に同時に結合できることを示す図である。ｍＡｂ２をＨＧＦ被覆チップ上に流し、続いてＨｉｓタグ付きＥＧＦＲを注入した。結合応答が示すところによると、ｍＡｂ２は、ＨＧＦ及びＨＧＦＲの両方に同時に結合することができる。
【図８】ｍＡｂ２  ＲＩ／ＦＳ１−６０及びｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０、加えてＦＳ１−６０  Ｆｃａｂが、ＥＧＦＲを過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳がん細胞上のＥＧＦＲへのＥＧＦリガンドの結合を遮断することを示す図である。ＥＧＦＲへのリガンドの結合の阻害パーセンテージをＰＢＳ対照と比較して示すが、その際、ＰＢＳは０％阻害を生じる。
【図９】ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＲＩ／ＦＳ１−６５が、異なる細胞株において抗増殖活性を有することを示す図である。図９Ａに、４日後にＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０の存在下での細胞増殖が濃度依存的に低下したが、フィクラツズマブ（FI）、リロツムマブ（RI）若しくはＦＳ１−６０単剤療法、又はＦＩ＋ＦＳ１−６０若しくはＲＩ＋ＦＳ１−６０の併用を用いた処理では低下しなかったことを示す。処理濃度を生存細胞数のパーセンテージ（PBS対照に対して規準化）に対してプロットする。図９Ｂに、ＦＩ／ＦＳ１−６５を用いた同じアッセイの繰り返しを示すが、ここでも、ｍＡｂ２は、単剤療法又はＦＩ＋ＦＳ１−６５の併用で観察されなかった細胞増殖の濃度依存性低下を示した。図９Ｃに、ＦＩ／ＦＳ１−６５、ＲＩ／ＦＳ１−６５及びＦＩ＋ＦＳ１−６５の併用が、また、ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞においてＨＧＦ及びＥＧＦによって誘導される細胞増殖を濃度依存的に阻害したが、一方でフィクラツズマブ単剤療法は阻害しなかったことを示す。処理濃度をＥＧＦ及びＨＧＦの刺激による成長の％に対してプロットする。リガンド刺激不在下の成長パーセンテージと同様に、ＥＧＦ及びＨＧＦ刺激による成長パーセンテージを点線で示す。図９Ｄに、ＦＩ／ＦＳ１−６５が、また、ＨＧＦで刺激されたＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において濃度依存的に細胞増殖を低下させ、一方でフィクラツズマブ若しくはＦＳ１−６５単剤療法、又はＦＩ＋ＦＳ１−６５の併用が低下させなかったことを示す。処理濃度を生存細胞数のパーセンテージ（HGFで刺激された細胞に対して規準化）に対してプロットする。図９Ｅに、ＦＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ／ＦＳ１−６５、ＲＩ／ＦＳ１−６５及びＦＩ＋ＦＳ１−６５の併用がＫＰ４細胞において細胞増殖を濃度依存的に低下させたことを示す。ＦＩは、細胞増殖も阻害したが、程度はより少なかった。ＦＳ１−６５、ＷＴ  Ｆｃａｂ及びＩｇＧは、非常にわずかな効果しか示さなかった。処理濃度を、生存細胞数のパーセンテージ（PBS対照に対して規準化）に対してプロットする。図９Ｆに、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞においてＦＩ／ＦＳ１−６５（３００ｎＭ）がＨＧＦによって誘導される細胞増殖を低下させ、一方で、エルロチニブ、ＦＩ又はＦＩ＋エルロチニブ処理は低下させなかったことを示す。各イメージング部位で計数された平均細胞数をプロットする。図９Ｇに、ＨＧＦの存在がＨＣＣ８２７細胞においてエルロチニブに対する抵抗性を付与することを示す。この抵抗性の効果は、エルロチニブをＦＩと併用することによって低下する可能性があったが、エルロチニブ＋ＦＩ／ＦＳ１−６５の併用は、細胞増殖を阻害するために必要な用量をさらに低下させる可能性があった。エルロチニブ処理の濃度を、各イメージング部位で計数された平均細胞数に対してプロットする。
【図１０Ａ】ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５を用いたＥＧＦＲ陽性細胞株Ａ４３１ＮＳの処理が、標識ＨＧＦの内在化を招くことを示す図である。図１０Ａに示す結果は、インキュベーション時間の増加に伴いＨＧＦの内在化が増大することを示す。ＨＧＦのみの群で時間依存的な内在化は観察されなかった。
【図１０Ｂ】ＨＧＦ自己分泌Ｕ８７ＭＧ細胞を使用する同じアッセイの繰り返しを示す図である。ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５を用いた処理は、ＨＧＦの時間依存的内在化を招いた。ｍＡｂ２処理の不在下で時間と共にＨＧＦの内在化のわずかな増加が検出されたが、ずっとゆっくりした速度であった。
【図１０Ｃ】以下の処理を用いて４日間インキュベーション後にＵ８７ＭＧ細胞から収集した培地中の遊離ＨＧＦ濃度を示す図である：ＰＢＳ対照、ヒトＩｇＧ１カッパ（IgG）、ＷＴ  Ｆｃａｂ、ＦＳ１−６５、フィクラツズマブ（FI）、リロツムマブ（RI）、ＦＩ＋ＦＳ１−６５又はＲＩ＋ＦＳ１−６５の併用、ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６５及びｍＡｂ２  ＲＩ／ＦＳ１−６５。ＦＩ、ＲＩ及びこれらのｍＡｂとＦＳ１−６５との併用は、ＰＢＳ対照と比較して培地中のＨＧＦ濃度の低下をもたらす。ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＲＩ／ＦＳ１−６５は、ＨＧＦ濃度により大きな低下を引き起こした。
【図１１Ａ】ＨＧＦ自己分泌Ｕ８７ＭＧモデルからのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す図である。経時的な平均絶対腫瘍体積を各処置群についてプロットする。矢印は、投薬日を示す。腫瘍の測定を週２回行った。ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２は、ＥＧＦＲ又はＨＧＦのいずれかを標的化する単剤療法よりも腫瘍成長の阻害が優れていた。ＦＩ／ＦＳ１−６０は、また、ＥＧＦＲ及びＨＧＦを標的化するＦＩ＋ＦＳ１−６０併用処理よりも優れていた。
【図１１Ｂ】ＮＳＣＬＣ  Ｈ５９６モデルからのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍応答データを示す図である。経時的な平均絶対腫瘍体積を各処置群についてプロットする。矢印は、投薬日を示す。腫瘍の測定を週２回行った。ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２は、ＥＧＦＲ又はＨＧＦのいずれかを標的化する単剤療法よりも腫瘍成長の阻害が優れていた。
【図１１Ｃ】研究の経過途中のＮＳＣＬＣ  Ｈ５９６モデルからのマウスの生存率を示す図である。生存パーセンテージを各群について経時的にプロットする。２種のｍＡｂ２で処置されたマウスは、ＦＩ＋ＦＳ１−６５併用、ＦＳ１−６５の単剤療法又はビヒクル群で処置されたマウスと比較して高い生存率を有した。ＦＩ／ＦＳ１−６０で処置されたマウスの群において、全てのマウスは、研究終了時に生存していた。
【図１１Ｄ】各マウスの腫瘍サイズに対して規準化された、処置の１６日後の全てのマウスの血清から検出された遊離ＨＧＦ濃度を示す図である。ＦＩ／ＦＳ１−６０で処置されたマウスは、ビヒクル群と比較して有意に低下したレベルのＨＧＦを示した。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｖｏ研究における抗ＥＧＦＲ療法の皮膚毒性を示す図である。腫瘍植込みの１６日後に撮影された、各群からの代表的なマウスの写真を示す。マウスＩｇＧ２ａ対照（対照）、ＦＳ１−６７  Ｆｃａｂ（抗EGFR Fcab）、抗ＣＴＬＡ−４  ９Ｄ９ｍ２ａ（抗CTLA4 mAb）又は９Ｄ９−ＦＳ１−６７  ｍＡｂ２（EGFR/CTLA4 mAb2）でマウスを処置した。ＦＳ１−６７単独で処置されたマウスは、未処置のマウス、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで処置されたマウス又は抗ＥＧＦＲ／ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ２で処置されたマウスと比較してかなりの脱毛及び皮膚病変を発生した。ｍＡｂ２の二特異性は、Ｆｃａｂ処置単独と比較して低下した皮膚毒性を生じた。
【図１３】ＬＸＦＡ６７７  ＰＤＸ腫瘍を担持するマウスにおける抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２である４４２０／ＦＳ１−６０、４４２０／ＦＳ１−６５及び４４２０／ＦＳ１−６７、セツキシマブ及び４４２０対照の抗腫瘍有効性を示す図である。矢印で示すようにマウスに０、２、４、７、９、１１及び１４日目に投薬した。各処置に供されたマウスにおける経時的な平均絶対腫瘍体積を示す。腫瘍の測定を週に２回行った。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２及びセツキシマブで処置された全動物は、研究の経過中に完全腫瘍退縮を示したが、ｍＡｂ２群では再発が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、ＥＧＦＲに結合する特異的結合メンバーに関する。本発明の特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメインに位置するＥＧＦＲ抗原結合部位を含む。用語「ＥＧＦＲ」は、文脈が他のことを必要としない限り、ヒトＥＧＦＲ及び／又はネズミＥＧＦＲ（マウスEGFRなど）を表し得る。好ましくは、用語「ＥＧＦＲ」は、ヒトＥＧＦＲを表す。
【００５１】
用語「特異的結合メンバー」は、ＥＧＦＲ抗原結合部位を含む、免疫グロブリン、又は定常ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインを含むその断片のことをいう。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、その際、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ＥＧＦＲ抗原結合部位を含む。好ましい実施形態では、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端に免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分をさらに含む。そのような分子は、本明細書において抗原結合性Ｆｃ断片、又はＦｃａｂ（商標）とも呼ばれる。特異的結合メンバーは、部分的又は全体的に合成産生することができる。
【００５２】
したがって、本明細書に使用される用語「特異的結合メンバー」は、断片を含むが、但し、前記断片は、特異的結合メンバーのＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメインなどの定常ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインに位置するＥＧＦＲ抗原結合部位を含む。したがって、文脈が他のことを必要としない限り、本明細書に使用される用語「特異的結合メンバー」は、「特異的結合メンバー又はその断片」と等価である。
【００５３】
好ましい実施形態では、特異的結合メンバーは抗体分子である。用語「抗体分子」は、抗体分子の断片を包含するが、但し、そのような断片は、ＥＧＦＲ抗原結合部位を含むＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインなどの定常ドメインを含む。したがって、文脈が他のことを必要としない限り、本明細書に使用される用語「抗体分子」は、「抗体分子又はその断片」と等価である。抗体分子は、ヒト又はヒト化であり得る。抗体分子は、好ましくはモノクローナル抗体分子である。抗体分子の例は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリンアイソタイプ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプサブクラス並びにその断片である。
【００５４】
モノクローナル及び他の抗体を採用し、組換えＤＮＡ手法という技法を使用して、本来の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生させることが可能である。そのような技法は、ＣＤＲ又は可変領域を異なる免疫グロブリンに導入することを伴い得る。１つの免疫グロブリンのＣＤＲを別の免疫グロブリンに導入することは、例えばＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８Ａ又はＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されている。類似の技法を採用して、関連する定常ドメイン配列、又は構造ループ配列を導入し、異なる特異的結合メンバー中にＥＧＦＲ抗原結合部位を提供することができる。或いは、特異的結合メンバーを産生しているハイブリドーマ又は他の細胞が、遺伝的変異又は他の変化に供される場合があり、それが、産生された特異的結合メンバーの結合特異性を変化させる場合又は変化させない場合がある。
【００５５】
抗体はいくつかの方法で修飾することができるので、用語「特異的結合メンバー」は、天然でも全体又は部分合成でも、抗体断片、抗体の誘導体、機能等価物及び相同体にわたると解釈すべきである。ＣＨ３ドメインを含む抗体断片の例は、抗体のＦｃドメインである。ＣＤＲ及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体断片の例は、ＣＨ３ドメインと繋がったｓｃＦｖを含むミニボディー（minibody）である（Huら、（1996）、Cancer Res.、56（13）:3055-61）。
【００５６】
本発明の特異的結合メンバーは、ＥＧＦＲに結合する。これに関連する結合は、特異的結合を表し得る。用語「特異的」は、特異的結合メンバーが、その特異的結合パートナー以外の、本明細書ではＥＧＦＲ以外の分子へのいかなる重大な結合も示さない状況を表し得る。例えば、特異的結合メンバーは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び／又はＨＥＲ４に結合しない場合がある。用語「特異的」は、特異的結合メンバーが、いくつかの抗原が有する特異的エピトープ、例えばＥＧＦＲ上のエピトープに特異的な場合にも適用することができ、その場合、特異的結合メンバーは、当該エピトープを有する様々な抗原に結合することができる。
【００５７】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくはＥＧＦＲ抗原結合部位を含む。ＥＧＦＲ抗原結合部位は、特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４ドメインに位置する。好ましくは、ＥＧＦＲ抗原結合部位は、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインに位置する。ＥＧＦＲ結合部位は、アミノ酸配列ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＨＷＲＷＹＳ（配列番号３）を含む場合がある。或いは、ＥＧＦＲ結合部位は、アミノ酸配列ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＹＷＲＷＶＫ（配列番号８）を含む場合がある。さらなる代替形態として、ＥＧＦＲ結合部位は、アミノ酸配列ＴＤＤＧＰ（配列番号１３）及びＳＹＷＲＷＹＫ（配列番号１４）を含む場合がある。好ましくは、ＥＧＦＲ結合部位は、アミノ酸配列（i）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＨＷＲＷＹＳ（配列番号３）；又は（ii）ＬＤＥＧＧＰ（配列番号１）及びＳＹＷＲＷＶＫ（配列番号８）を含む。
【００５８】
配列番号１、３、８、１３及び１４に示されるアミノ酸配列は、好ましくは特異的結合メンバーの定常ドメインの構造ループに位置する。新しい抗原結合部位を創出するための抗体定常ドメインの構造ループ領域への配列の導入は、例えば、ＷＯ２００６／０７２６２０及びＷＯ２００９／１３２８７６に記載されている。
【００５９】
定常ドメインの構造ループには、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループが含まれる。ＣＨ３ドメインにおいて、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループは、ＣＨ３ドメインの残基１１〜１８、４３〜７８及び９２〜１０１に位置し、その際、アミノ酸残基の付番は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（IMGT）付番規定に従う。配列番号１及び１３に示されるアミノ酸配列は、好ましくは定常ドメインのＡＢループに位置する。配列番号３、８及び１４に示されるアミノ酸配列は、好ましくは定常ドメインのＥＦループに位置する。より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基１３．Ａ〜１８に位置し、配列番号１３に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基１４〜１８に位置し、及び／又は配列番号３、８及び１４に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基９２〜９８に位置し、ここでアミノ酸残基の付番は、ＩＭＧＴ付番規定に従う。
【００６０】
加えて、特異的結合メンバーは、好ましくは特異的結合メンバーの定常ドメインの構造ループ中に配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。構造ループは、好ましくはＣＤループであり、定常ドメインは、好ましくはＣＨ３ドメインである。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、好ましくはＣＨ３ドメインの残基４４〜４５．１に位置し、ここでアミノ酸残基の付番は、ＩＭＧＴ付番規定に従う。
【００６１】
本発明の特異的結合メンバーは、ＣＨ３ドメインの８８位にアルギニン残基（R）をさらに含む場合があり、ここでアミノ酸残基の付番は、ＩＭＧＴ付番規定に従う。特に、ＥＦ構造ループ中に配列番号３を含む特異的結合メンバーは、好ましくはＣＨ３ドメインの８８位にアルギニン残基（R）をさらに含む。
【００６２】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、上記構造ループ配列のうちの１つ又は複数を有する、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４由来のＣＨ３ドメイン、より好ましくはヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを含んで、ＥＧＦＲ抗原結合部位を提供する。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号４、９又は１５に示される配列を含む、有する、又はそれからなるＣＨ３ドメイン、好ましくは、配列番号４又は９に示される配列を含む、有する、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含む。
【００６４】
本発明の特異的結合メンバーは、配列番号４、９又は１５に示される配列を含む、有する、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含む場合があり、その際、ＣＨ３ドメイン配列は、配列番号４、９又は１５に示される配列のＣ末端に直接、リシン残基（K）をさらに含む。したがって、例えば、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号４に示される配列のＣ末端にリシン残基を有する、配列番号４に示される配列を含む、有する、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み得る。そのとき、そのようなＣＨ３ドメインの配列は、以下の通りとなる：
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＤＥＧＧＰＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＴＹＧＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＳＨＷＲＷＹＳＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６８）。
【００６５】
加えて、本発明の特異的結合メンバーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメインなどの免疫グロブリンＧ分子のＣＨ２ドメインを含み得る。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、配列番号１９に示される配列を有し得る。
【００６６】
特異的結合メンバーのＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどの１つ又は複数のＦｃγ受容体及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を低下又は抑止するための変異を含み得る。ヒトＩｇＧドメインのＣＨ２ドメインは、通例、Ｆｃγ受容体及び補体に結合し、本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合低下が、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）を低下させ、補体への結合低下が、特異的結合メンバーの補体依存性細胞傷害（CDC）活性を低下させると仮定する。１つ又は複数のＦｃγ受容体及び補体へのＣＨ２ドメインの結合を低下又は抑止するための変異は、公知であり、これらには、Ｂｒｕｈｎｓら（2009）及びＸｕら（2000）に記載された「ＬＡＬＡ変異」が含まれる。したがって、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含む場合があり、その際、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの４位及び５位にアラニン残基を含み、ここで付番は、ＩＭＧＴ付番規定に従う。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号６、１１、又は１７に示される配列、より好ましくは配列番号６、又は１１に示される配列を含む。
【００６８】
好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端に免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分を含む。免疫グロブリンヒンジ領域は、２つのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列を会合させ、ダイマーを形成させる。好ましくは、ヒンジ領域、又はその部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４ヒンジ領域、又はその部分である。より好ましくは、ヒンジ領域、又はその部分は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその部分である。ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の配列は、配列番号４８に示される。特異的結合メンバーの部分を形成し得る適切な短縮形ヒンジ領域を配列番号４９に示す。このヒンジ領域は、実施例において試験されたＦｃａｂ分子に存在し、一方、全長ＩｇＧ１ヒンジ領域は、ｍＡｂ２分子に存在した。したがって、特異的結合メンバーは、好ましくはＣＨ２ドメインのＮ末端に免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分を含み、その際、ヒンジ領域は、配列番号４８若しくは配列番号４９に示される配列を有するか、又はヒンジ領域は、配列番号４８若しくは４９に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。或いは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端に免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分を含む場合があり、その際、ヒンジ領域は、配列番号４８に示される配列、又はその断片を含み、その際、前記断片は、配列番号４８のアミノ酸残基のうち少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、又は少なくとも１４個を含む。
【００６９】
本発明による特異的結合メンバーは、第２の抗原結合部位、好ましくはＣＤＲベースの抗原結合部位を含み得る。用語「ＣＤＲベースの抗原結合部位」は、６つのＣＤＲ残基から構成される特異的結合メンバーの可変領域の抗原結合部位を表す。
【００７０】
第２の抗原結合部位は、好ましくは腫瘍関連抗原に結合する、又はそれに特異的である。好ましくは、腫瘍関連抗原は、受容体型チロシンキナーゼのリガンド又は受容体型チロシンキナーゼである。好ましい実施形態では、受容体型チロシンキナーゼのリガンドは、ＨＧＦであり、受容体型チロシンキナーゼは、ｃ−Ｍｅｔである。最も好ましくは、第２の抗原結合部位は、ＨＧＦに結合する。したがって、本発明による特異的結合メンバーは、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を阻害し得る。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の阻害を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、適切な方法は、Ｓｐｉｅｓｓら（2013）に記載されている。
【００７１】
腫瘍抗原などの所与の抗原に対する抗体分子、及びそのような抗体分子のＣＤＲ配列の決定は、十分に技術者の能力の範囲内であり、多数の適切な技法が、当技術分野において公知である。さらに、様々な受容体型チロシンキナーゼリガンド及び受容体型チロシンキナーゼに対する、ＣＤＲ配列を含む抗体は、当技術分野において公知である。したがって、技術者であれば、本明細書記載のＥＧＦＲ抗原結合部位に加えて、受容体型チロシンキナーゼのリガンド又は受容体型チロシンキナーゼなどの第２の抗原に対するＣＤＲベースの抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを難なく調製するであろう。
【００７２】
好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、抗体リロツムマブ又はフィクラツズマブのＨＣＤＲ３を含む。ＨＣＤＲ３は、抗体分子の特異性を決定することに役割を果たすことが公知である（Segalら、（1974）、PNAS、71:4298-4302; Amitら、（1986）、Science、233:747-753; Chothiaら、（1987）、J. Mol. Biol.、196:901-917; Chothiaら、（1989）、Nature、342:877-883; Catonら、（1990）、J. Immunol.、144:1965-1968; Sharonら、（1990a）、PNAS、87:4814-4817; Sharonら、（1990b）、J. Immunol.、144:4863-4869; Kabatら、（1991b）、J. Immunol.、147:1709-1719）。
【００７３】
特異的結合メンバーは、抗体リロツムマブ又はフィクラツズマブのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及び／又はＬＣＤＲ３をさらに含み得る。技術者であれば、それぞれ配列番号２９及び３０、並びに３９及び４０に示される抗体リロツムマブ又はフィクラツズマブのＶＨ及びＶＬドメイン配列由来のＣＤＲ配列を難なく決定するであろう。ＣＤＲ配列は、例えば、Ｋａｂａｔ（Kabat、E.A.ら、（1991））又はＩＭＧＴ付番規定に従って決定され得る。
【００７４】
Ｋａｂａｔ付番規定に従う抗体リロツムマブのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を、それぞれ配列番号２１、２２、２３、２４、２５、及び２６に記載する。
【００７５】
Ｋａｂａｔ付番規定に従う抗体フィクラツズマブのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を、それぞれ配列番号３１、３２、３３、３４、３５、及び３６に記載する。
【００７６】
抗体は、抗体リロツムマブ又はフィクラツズマブのＶＨ及び／又はＶＬドメインも含み得る。抗体リロツムマブ又はフィクラツズマブのＶＨ及びＶＬドメイン配列を、それぞれ配列番号２９及び３０、並びに３９及び４０に示す。
【００７７】
好ましい実施形態では、本発明の特異的結合メンバーは、（i）抗体リロツムマブ又はフィクラツズマブのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む、ＨＧＦに対するＣＤＲベースの抗原結合部位、並びに（ii）特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインに位置するＥＧＦＲ抗原結合部位を含み、その際、ＥＧＦＲ結合部位は、配列番号１、２及び３、配列番号１、２及び８、又は配列番号１３、２及び１４に示されるアミノ酸配列を含む。
【００７８】
より好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、（i）抗体リロツムマブ又はフィクラツズマブのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む、ＨＧＦに対するＣＤＲベースの抗原結合部位、並びに（ii）特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインに位置するＥＧＦＲ抗原結合部位を含み、その際、ＥＧＦＲ結合部位は、配列番号１、２及び３、又は配列番号１、２及び８に示されるアミノ酸配列を含む。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明の特異的結合メンバーは、それぞれ配列番号２９及び３０、又は配列番号３９及び４０に示される配列を含む、有する、又はそれからなるＶＨドメイン及びＶＬドメイン、並びに配列番号４、９、又は１５に示される配列を含む、有する、又はそれからなるＣＨ３ドメイン、好ましくは、配列番号４又は９に示される配列を含む、有する、又はそれからなるＣＨ３を含む。
【００８０】
さらなる好ましい実施形態では、特異的結合メンバーは、配列番号４１、４３、又は４５に示される配列を含む、有する、又はそれからなる重鎖並びに配列番号２８に示される配列を含む、有する、又はそれからなる軽鎖を含む。より好ましくは、特異的結合メンバーは、配列番号４１又は４３に示される配列を含む、有する、又はそれからなる重鎖並びに配列番号２８に示される配列を含む、有する、又はそれからなる軽鎖を含む。
【００８１】
代替的な好ましい実施形態では、特異的結合メンバーは、配列番号４２、４４、又は４６に示される配列を含む、有する、又はそれからなる重鎖並びに配列番号３８に示される配列を含む、有する、又はそれからなる軽鎖を含む。より好ましくは、特異的結合メンバーは、配列番号４２又は４４に示される配列を含む、有する、又はそれからなる重鎖並びに配列番号３８に示される配列を含む、有する、又はそれからなる軽鎖を含む。
【００８２】
本発明の特異的結合メンバーは、本明細書開示の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列の変種も含み得る。適切な変種は、配列変更、又は変異、及びスクリーニングの方法により得ることができる。好ましい実施形態では、１つ又は複数の変種配列を含む特異的結合メンバーは、親特異的結合メンバーの機能的特徴のうちの１つ又は複数、例えば、ＥＧＦＲ、及び／又はＨＧＦなどの第２の抗原に対する結合特異性及び／又は結合親和性を保持する。例えば、１つ又は複数の変種配列を含む特異的結合メンバーは、好ましくはＥＧＦＲ、及び／又はＨＧＦなどの第２の抗原に、（親）特異的結合メンバーと同じ親和性又はより高い親和性で結合する。親特異的結合メンバーは、変種特異的結合メンバーに組み込まれたアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない特異的結合メンバーである。
【００８３】
例えば、本発明の特異的結合メンバーは、本明細書開示の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列を含み得る。
【００８４】
好ましい実施形態では、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号４、９、又は１５、より好ましくは配列番号４又は９に示されるＣＨ３ドメイン配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を含む。
【００８５】
さらなる好ましい実施形態では、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号６、１１、又は１７、より好ましくは配列番号６又は１１に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ３及びＣＨ２ドメイン配列を含む。
【００８６】
配列同一性は、通例、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCG package、Accelerys Inc、San Diego USA）を参照して定義される。ＧＡＰは、マッチの数を最大限にし、ギャップの数を最小限にする、２つの完全配列を整列させるためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用する。一般的に、ギャップ生成ペナルティー＝１２及びギャップ伸長ペナルティー＝４でデフォルトのパラメーターが使用される。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ（Altschulら（1990）J. MoI. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson及びLipman（1988）PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Smith及びWaterman（1981）J. Mol Biol. 147: 195-197）、又はＡｌｔｓｃｈｕｌら（1990）、上記のＴＢＬＡＳＴＮプログラムが、一般的にデフォルトのパラメーターを採用して使用される場合がある。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Nucl. Acids Res.（1997）25 3389-3402）が使用される場合がある。
【００８７】
本発明の特異的結合メンバーは、本明細書開示の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有する構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列も含み得る。特に、変更は、特異的結合メンバーの１つ又は複数のフレームワーク領域に行われ得る。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号４、９、又は１５、より好ましくは配列番号４又は９に示されるＣＨ３ドメイン配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有するＣＨ３ドメイン配列を含み得る。
【００８９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明の特異的結合メンバーは、配列番号６、１１、又は１７、より好ましくは配列番号６又は１１に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有するＣＨ３及びＣＨ２ドメイン配列を含む。
【００９０】
ＥＧＦＲへの結合を本発明の特異的結合メンバーと競合する、又はＥＧＦＲ上の本発明の特異的結合メンバーと同じエピトープに結合する特異的結合メンバーも考えられており、その際、特異的結合メンバーは、好ましくは特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインに位置するＥＧＦＲ抗原結合部位を含む。２つの特異的結合メンバーによる抗原の競合を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、表面プラズモン共鳴法、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して、２つの特異的結合メンバーによる抗原への結合の競合を決定することができる。抗体により結合されるエピトープをマッピングするための方法は、当技術分野において同様に公知であり、本発明の特異的結合メンバーによって結合される１つ又は複数のエピトープをマッピングするために採用することができる。
【００９１】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは親和性（KD）４．５ｎＭ又はより大きい親和性を有するＥＧＦＲに結合する。例えば、本発明の特異的結合メンバーは、親和性（KD）４．５ｎＭ、４ｎＭ、３．６ｎＭ、３．５ｎＭ、２．６ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．８ｎＭ、１．６ｎＭ、１．５ｎＭ、１．３ｎＭ、１ｎＭ、０．７ｎＭ、又はより大きい親和性でＥＧＦＲに結合し得る。
【００９２】
ＥＧＦＲなどの同族抗原に対する特異的結合メンバーの結合親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴法（SPR）によって決定することができる。細胞表面に発現されたＥＧＦＲなどの同族抗原に対する特異的結合メンバーの結合親和性は、フローサイトメトリーによって決定することができる。
【００９３】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは細胞表面に発現されたＥＧＦＲに結合することができる。細胞は、好ましくは、がん細胞である。
【００９４】
特異的結合メンバーが第２の抗原に特異的なＣＤＲベースの抗原結合部位などの第２の抗原結合部位を含む場合、特異的結合メンバーは、好ましくはＥＧＦＲ及び第２の抗原に同時に結合することができる。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＥＧＦＲ及び第２の抗原に同時に結合することができる。
【００９５】
本発明の特異的結合メンバーは、ヒトＥＧＦＲ及び／又はネズミＥＧＦＲ（マウスEGFRなど）に結合し得る。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、ヒトＥＧＦＲに結合する。
【００９６】
本発明の特異的結合メンバーは、治療剤又は検出可能な標識にコンジュゲートされている場合がある。この場合、特異的結合メンバーは、コンジュゲートと呼ばれる場合がある。例えば、特異的結合メンバーは、免疫系修飾物質、細胞傷害性分子、放射性同位体、又は検出可能な標識にコンジュゲートされている場合がある。免疫系修飾物質又は細胞傷害性分子は、サイトカインであり得る。検出可能な標識は、放射性同位体、例えば、非治療用放射性同位体であり得る。
【００９７】
特異的結合メンバーは、ペプチド結合又はリンカーにより治療剤又は検出可能な標識にコンジュゲートされている場合があり、すなわち、前記治療剤又は検出可能な標識及び特異的結合メンバー又はそのポリペプチド鎖成分を含む融合ポリペプチド内にあり得る。コンジュゲーションのための他の手段には、化学コンジュゲーション、特に二官能性試薬を使用する（例えば、DOUBLE-REAGENTS（商標）Cross-linking Reagents Selection Guide、Pierceを採用する）架橋が含まれる。
【００９８】
したがって、特異的結合メンバー及び治療剤又は検出可能な標識は、例えば任意の適切な化学結合を経由して又はリンカー、例えばペプチドリンカーを経由して相互に直接接続され得る。
【００９９】
ペプチドリンカーは、短いもの（２〜２０残基、好ましくは２〜１５残基のアミノ酸ストレッチ）であり得る。ペプチドリンカー配列の適切な例は、当技術分野において公知である。１つ又は複数の異なるリンカーが使用され得る。リンカーは、約５アミノ酸長であり得る。
【０１００】
化学結合は、例えば、共有結合又はイオン結合であり得る。共有結合の例には、ペプチド結合（アミド結合）及びジスルフィド結合が含まれる。例えば、特異的結合メンバー及び治療剤又は診断剤は、例えばペプチド結合（アミド結合）によって共有結合的に連結している場合がある。したがって、特異的結合メンバー及び治療剤又は診断剤は、一本鎖ポリペプチドとして産生（分泌）させることができる。
【０１０１】
本発明は、本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸も提供する。技術者は、当技術分野において周知の方法を使用してそのような核酸を難なく調製するであろう。単離された核酸は、例えば、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞における発現により、本発明の特異的結合メンバーを発現させるために使用され得る。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ又はＮＳ０細胞などの哺乳動物細胞である。核酸は、一般に、発現のために組換えベクターの形態で提供される。
【０１０２】
単離された核酸は、例えば、配列番号５、７、１０、１２、１６、又は１８に示される配列を含み得る。
【０１０３】
そのような核酸及びベクターを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ宿主細胞は、本発明の特異的結合メンバーを発現させるためのそれらの使用と同様に、本発明の一部であり、続いてこの宿主細胞を細胞培養物から精製し、任意選択により医薬組成物に製剤化することができる。したがって、本発明は、本発明の特異的結合メンバーを産生させる方法であって、本発明の組換え宿主細胞を特異的結合メンバーの産生のための条件下で培養することを含む方法をさらに提供する。上述のように適切な宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野において周知である。方法は、特異的結合メンバーを単離及び／又は精製することをさらに含み得る。方法は、任意選択により下記のような薬学的に許容される賦形剤又は他の物質を用いて、特異的結合メンバーを医薬組成物に製剤化することも含み得る。
【０１０４】
上述のように、多くのがんは、その細胞表面にＥＧＦＲを発現することが示されている。本発明者らは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中にＥＧＦＲ抗原結合部位、すなわちＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含む特異的結合メンバーが、ＥＧＦＲへの上皮増殖因子（EFG）の結合であって、細胞成長、増殖及び分化を刺激することが公知である結合を遮断する能力を含む抗腫瘍特性を有することを示した。公知の抗腫瘍効果を有する抗体へのＥＧＦＲ抗原結合部位の組込みの結果、親抗体よりも強力な腫瘍細胞増殖阻害を含む、より強力な抗腫瘍特性を有する特異的結合メンバーが生じた。加えて、ＣＨ３ドメイン中にＥＧＦＲ抗原結合部位を含む特異的結合メンバーは、腫瘍細胞によって内在化されることが示された。腫瘍細胞による特異的結合メンバーの内在化は、いくつかの利点を提供し得る。例えば、ＥＧＦＲは、特異的結合メンバーと一緒に内在化されたと考えられる。理論に縛られることを望むわけではないが、ＥＧＦＲの内在化は、ＥＧＦＲの分解をもたらし、それにより、そのリガンドが、もはや受容体に結合することができないので、受容体の活性化を減少させると考えられる。加えて、特異的結合メンバーにコンジュゲートした任意の抗腫瘍分子は、特異的結合メンバーと一緒に内在化され、それは、例えば抗腫瘍分子の非特異的毒性を低下させると期待される。さらにＨＧＦなどの特異的結合メンバーの第２のＣＤＲベースの抗原結合部位に結合した任意の可溶性リガンドも、特異的結合メンバーと一緒に内在化され、その結果として環境から隔離されると期待される。特異的結合メンバーの迅速な内在化は、処置に対するより迅速な初期応答も招くことができ、それにより、患者が処置に応答するかどうかを初期段階で判定可能にする。
【０１０５】
したがって、本発明は、患者におけるがんを処置する方法に使用するための、本発明の特異的結合メンバーを提供し、その際、前記がんの細胞は、ＥＧＦＲを発現する。患者におけるがんを処置するための医薬の製造における本発明の特異的結合メンバーの使用であって、前記がんの細胞がＥＧＦＲを発現する、使用、及び患者におけるがんを処置する方法であって、前記がんの細胞がＥＧＦＲを発現し、本発明の特異的結合メンバーの治療有効量を患者に投与することを含む、方法も提供される。
【０１０６】
特異的結合メンバーが、ＨＧＦ又はｃ−Ｍｅｔに結合する第２の抗原結合部位を含む場合、特異的結合メンバーで処置されるべきがんの細胞は、好ましくはＨＧＦをさらに分泌し、及び／又はｃ−Ｍｅｔを発現する。
【０１０７】
患者は、好ましくはヒト患者である。
【０１０８】
本発明の特異的結合メンバーを使用して処置されるべきがんの細胞は、例えばその細胞表面にＥＧＦＲを発現する。一実施形態では、処置されるべきがんの細胞は、例えばその細胞表面にＥＧＦＲを発現すると判定されていてもよい。細胞表面での抗原の発現を判定するための方法は、当技術分野において公知であり、例えばフローサイトメトリーを含む。
【０１０９】
本発明の特異的結合メンバーを使用して処置されるべきがんは、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、多形性膠芽腫、膵臓がん、皮膚がん（例えば皮膚扁平上皮癌）、頭頸部がん（例えば頭頸部扁平上皮癌）、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、及び子宮内膜がんからなる群から選択され得る。本明細書において称される胃がんには、胃食道がんなどの食道がんが含まれる。
【０１１０】
上述のがんの全ては、ＥＧＦＲを発現することが示されている。ＥＧＦＲを発現しているがんは、ＥＧＦＲ陽性（EGFR+）又はＥＧＦＲ過剰発現と称される場合がある。したがって、本明細書において称されるがんは、ＥＧＦＲ陽性であり得る。追加的又は代替的に、本明細書において称されるがんは、ＥＧＦＲを過剰発現し得る。がんが、ＥＧＦＲ陽性又はＥＧＦＲを過剰発現するかは、例えば、免疫組織化学法（IHC）を使用して判定され得る。
【０１１１】
好ましくは、がんは、肺がん、多形性膠芽腫、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、胃がん、又は乳がんである。
【０１１２】
より好ましくは、がんは、肺がん、多形性膠芽腫、膵臓がん、頭頸部がん、又は胃がんである。
【０１１３】
最も好ましくは、がんは、肺がん、多形性膠芽腫、又は膵臓がんである。
【０１１４】
特異的結合メンバーが、ＨＧＦに特異的な第２の抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであり、前記結合部位が、配列番号２１〜２６に示される、抗体リロツムマブの相補性決定領域（CDR）を含む場合、がんは、好ましくは胃がんであり、その際、前記がんの細胞は、ＥＧＦＲを発現する。リロツムマブは、臨床における胃がんの処置のために試験されている。
【０１１５】
特異的結合メンバーが、ＨＧＦに特異的な第２の抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであり、前記結合部位が配列番号３１〜３６に示される抗体フィクラツズマブの相補性決定領域（CDR）を含む場合、がんは、好ましくは肺がん、最も好ましくは非小細胞肺がんであり、その際、前記がんの細胞はＥＧＦＲを発現する。フィクラツズマブは、臨床における肺がん、特に非小細胞肺がんの処置に適切であることが示されている。
【０１１６】
適用が、肺がんなどの特定の種類のがんを表す場合、これは、関連組織、この場合は肺組織の悪性形質転換を表す。異なる組織、例えば乳房組織の悪性形質転換に由来するがんは、身体の別の位置、例えば肺に転移性病変を生じる場合があるが、それにより、当該がんは、本明細書において称されるような肺がんではなく、乳がんである。
【０１１７】
がんは、原発がん又は二次がんであり得る。したがって、本発明の特異的結合メンバーは、患者におけるがんを処置する方法に使用するための場合があり、その際、がんは、原発腫瘍及び／又は腫瘍転移である。
【０１１８】
本発明の特異的結合メンバーは、患者、好ましくはヒト患者の処置方法に使用するために設計されている。特異的結合メンバーは、通常、特異的結合メンバーに加えて、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。例えば、本発明の医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤又は当業者に周知の他の物質を含み得る。そのような物質は、無毒であるべきであり、活性成分の有効性を妨害すべきでない。担体又は他の物質の正確な性質は、注射、例えば静脈内又は皮下注射の場合がある投与経路に依存する。特異的結合メンバーは、静脈内又は皮下に投与され得る。
【０１１９】
液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物若しくは植物油、鉱物油又は合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。
【０１２０】
静脈内注射、又は患部注射のために、特異的結合メンバー、又は特異的結合メンバーを含む医薬組成物は、好ましくは、発熱物質不含で、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態である。関連する当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製することができる。保存剤、安定化剤、緩衝液、抗酸化剤及び／又は他の添加剤が適宜採用され得る。医薬品製剤を調製するための多くの方法は、当業者に公知である。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１２１】
本発明による特異的結合メンバーを含む組成物は、処置されるべき状態に応じて、単独で又は他の処置と併用して同時に若しくは順次に、又は別の治療剤若しくは薬剤との合剤として投与される場合がある。例えば、本発明の特異的結合メンバーは、処置されるべき疾患、例えば上述のがんのための既存の治療剤と併用して投与される場合がある。例えば、本発明の特異的結合メンバーは、化学療法、放射線治療、免疫療法、又はホルモン療法などの第２の抗がん療法と併用して患者に投与される場合がある。特に、本発明の特異的結合メンバーは、エルロチニブ又はセツキシマブ、好ましくはエルロチニブなどのＥＧＦＲ阻害剤と併用して患者に投与される場合がある、又は併用した投与のためであり得る。或いは、本発明の特異的結合メンバーは、フィクラツズマブ又はリロツムマブなどの、ＨＧＦに結合する抗体分子と併用して患者に投与される場合がある、又は併用した投与のためであり得る。
【０１２２】
したがって、患者におけるがんを処置する方法は、化学療法剤、放射性核種、免疫療法剤、又はホルモン療法用の薬剤と併用して本発明による特異的結合メンバーの治療有効量を患者に投与することを含み得る。化学療法剤、放射性核種、免疫療法剤、又はホルモン療法用の薬剤は、好ましくは、問題のがんのための化学療法剤、放射性核種、免疫療法剤、又はホルモン療法用の薬剤、すなわち、問題のがんの処置に有効であると示された化学療法剤、放射性核種、免疫療法剤、又はホルモン療法用の薬剤である。問題のがんに有効であることが示された適切な化学療法剤、放射性核種、免疫療法剤、又はホルモン療法用の薬剤の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１２３】
投与は、「治療有効量」であり得、これは、患者に利益を示すために十分である。そのような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも回復であり得る。したがって、特定の疾患の「処置」は、少なくとも１つの症状の回復を表す。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置されているものの性質及び重症度、処置されている特定の患者、個別の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、特異的結合メンバーの種類、投与方法、投与計画並びに医者に公知の他の要因に依存する。処置の処方、例えば投薬量などの決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置されている疾患の進行に依存し得る。特異的結合メンバーの適切な用量は、当技術分野において周知である（Ledermannら（1991）Int. J. Cancer 47: 659-664;及びBagshaweら（1991）Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922）。投与される特異的結合メンバーに見合った、本明細書又はＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（2003）に示された特定の投薬量を使用することができる。特異的結合メンバーの治療有効量又は適切な用量は、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性及びｉｎ  ｖｉｖｏ活性を動物モデルにおいて比較することによって決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投薬量をヒトに外挿するための方法は、公知である。正確な用量は、処置される区域のサイズ及び位置並びに特異的結合メンバーの正確な性質を含む、いくつかの要因に依存する。処置は、内科医の判断により毎日、週２回、毎週又は毎月の間隔で繰り返される場合がある。処置は、外科手術の前及び／又は後に与えられる場合があり、外科処置の解剖学的部位に直接投与又は適用され得る。
【０１２４】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、以下の実験的例証を含む本開示を与えられた当業者に明らかであろう。
【０１２５】
本明細書において言及された全ての文書は、その全体で参照により本明細書に込まれている。
【０１２６】
本明細書に使用される「及び／又は」は、２つの特定の構成又は構成要素のそれぞれを他方と共に又は他方なしに具体的に開示することと捉えるべきである。例えば「Ａ及び／又はＢ」は、ちょうどそれぞれが本明細書において個別に示されているかのように、（i）Ａ、（ii）Ｂ並びに（iii）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として捉えるべきである。
【０１２７】
文脈が他のことを定めない限り、上述の構成の説明及び定義は、本発明のいかなる特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく当てはまる。
【０１２８】
ここで本発明のある特定の態様及び実施形態を、一例として、上記の図面を参照しながら例証する。
【実施例】
【０１２９】
実施例１−抗ＥＧＦＲ抗原結合性Ｆｃ（Fcab）の調製
下記のように、酵母ディスプレイＦｃａｂライブラリーから蛍光標示式細胞分取法（FACS）により及びファージディスプレイＦｃａｂライブラリーから磁気ビーズ捕捉により、ＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂを選択した。
【０１３０】
ＦＡＣＳを使用する酵母ライブラリーからの抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂのナイーブ選択
ＦＡＣＳにより酵母ディスプレイＦｃａｂライブラリーから抗原特異的Ｆｃａｂを選択するために使用される方法は、ＷＯ２００９／１３２８７６に記載されている。酵母細胞表面にＦｃａｂクローンを発現しているライブラリーを３００ｎＭビオチン化ＥＧＦＲ細胞外ドメインと共にインキュベートした。次に、高速セルソーター（BD Bioscience、FACSAria）を使用する蛍光シグナルによる抗原結合性酵母細胞の単離のために、細胞をストレプトアビジン−アロフィコシアニン（APC）（BD Bioscience、349024）で染色した。この選択手順を数回繰り返して、十分に純粋な抗原結合性酵母細胞集団を富化した。非特異的選択を避けるために、染色のためにストレプトアビジン−ＡＰＣ及び抗ビオチン−ＡＰＣ（Miltenyi Biotec、130-090-856）を交互のラウンドで使用した。富化された集団からの個別のクローンを、抗原結合性についてスクリーニングし、供給業者のプロトコール（Invitrogen、K1740-01）に従う可溶性タンパク質の発現及び特徴付けのために、最も有望なクローンをピキア（Pichia）発現ベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＡ中にクローニングした。
【０１３１】
ファージディスプレイＦｃａｂライブラリーからの抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂのナイーブ選択
ファージディスプレイＦｃａｂライブラリーからのＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂを磁気ビーズ上に捕捉することにより選択した。ファージおよそ１×１０１０個及びストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Invitrogen、Dynabeads）２００μｌを含有するファージディスプレイライブラリーを２％乳汁／ＰＢＳＴを有する１．５ｍｌチューブに入れ、室温（RT）で１時間回転させながら別々にブロッキングした。結合性の選択のために、ブロッキング後のファージディスプレイライブラリーを２％乳汁／ＰＢＳＴ中１〜１００ｎＭのビオチン化ＥＧＦＲと共にＲＴで１時間インキュベートした。磁気ラック（DynaMag、Invitrogen）に１．５ｍｌチューブを立てることによって、上清を除去しながらブロッキング後のストレプトアビジン被覆磁気ビーズを捕捉し、続いてビオチン化ＥＧＦＲ／ファージ混合物中に再懸濁し、５分間インキュベートした。ビーズ／ＥＧＦＲ／ファージ化合物を磁石によって捕捉し、１ｍｇ／ｍｌトリプシンを使用して１０分間溶出させた。溶出したファージを使用して大腸菌ＴＧ１コンピテント細胞（Lucigen）に感染させ、これを３７℃で３０分間インキュベートした。ファージに感染したＴＧ１細胞を２×ＹＴ寒天に蒔き、次に、増幅させるために２×ＹＴ培地１００ｍｌ中、３７℃で一晩成長させた。ＴＧ１細胞を遠心分離により除去後に、培地の上清をＰＥＧ／ＮａＣｌと４：１の比で混合し、氷上で１時間インキュベートして、富化したファージを沈殿させた。ファージを４４００ｒｐｍで４℃、３０分間の遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁した。選択プロセスを数回繰り返すことによって、ファージディスプレイされたＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂクローンのこの富化集団をさらなる富化のために使用した。個別のクローンをＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ＥＧＦＲに対して強い結合性を有するクローンをピキアにクローニングし、上記のように発現させた。
【０１３２】
選択されたＦｃａｂの親和性成熟
親和性成熟のために、酵母及びファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｃａｂに、ループシャッフリングによって配列多様性を導入した。プライマー１及び２を使用してＡＢ＿ＣＤループ領域をＰＣＲにより増幅させプライマー３及び４を使用してＣＤ＿ＥＦループ領域を増幅させた。下の表１にプライマー配列を記載する。
【０１３３】
【表１】
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【０１３４】
ＡＢ＿ＣＤ及びＣＤ＿ＥＦループ領域を混合し、プルスルー（pull-through）ＰＣＲにより集合させて、新しい配列組合せを作製した。シャッフルされたＰＣＲ産物をファージディスプレイベクターＦｄＭｙｃにライゲートし、エレクトロポレーション法によってＴＢ１大腸菌細胞にトランスフォームした。このループシャッフルされたライブラリーを上記のファージ選択のために使用して、改善されたバインダーについてスクリーニングした。続く選択及びスクリーニング戦略では、１００ｎＭから１０及び１ｎＭに抗原濃度を減少させることを使用して、高親和性バインダーを同定した。
【０１３５】
特徴付けのために、改善した結合親和性を有する個別の親和性成熟ＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂをピキア及びＨＥＫ細胞に発現させた。この選択戦略を使用して同定されたＦｃａｂには、ＦＳ１−６０（配列番号６）、ＦＳ１−６５（配列番号１１）及びＦＳ１−６７（配列番号１７）が含まれた。これらのＦｃａｂは、それぞれ配列番号６、１１及び１７に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、並びにＣＨ２ドメインのＮ末端の、配列番号４９に示される短縮形ヒンジ領域を含んでいた。
【０１３６】
実施例２−ＥＧＦＲに特異的に結合するＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂ
酵素結合性免疫吸着検定法（ELISA）を使用して、抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂであるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７がＨＥＲ受容体ファミリーのＥＧＦＲに特異的に結合するかどうかを判定した。
【０１３７】
Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（商標）ビオチンキット（Innova Biosciences、704-0030）を供給業者のプロトコールに従って使用して、ＥＧＦＲ（社内製）、ＨＥＲ２  Ｈｉｓタグ（Sino Biological、10004-H08H）、ＨＥＲ３  Ｈｉｓタグ（Sino Biological、10201-H08H）及びＨＥＲ４  Ｈｉｓタグ（Sino Biological、10363-H08H）を含む抗原をビオチン化した。ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Nunc）の異なるウェルにＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのビオチン化抗原を４℃で一晩被覆し、過剰の未結合抗原をＰＢＳで洗浄した。抗原被覆プレートをＰＢＳ中１ｔｗｅｅｎ％（PBST）で、室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴを除去した後、０．１％ＰＢＳＴ中の抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ（１μＭ）並びに関連する陽性及びＩｇＧ陰性抗体対照（１μＭ）を１時間インキュベートして、被覆抗原に結合させ、続いて洗浄した。結合したＦｃａｂ又は抗体を、プロテインＡ−ＨＲＰ（ThermoFisher 101023）又はＨＥＲ４陽性対照について抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）（Sigma A9044）によって検出した。比色検出用のＨＲＰ酵素と相互作用させるための基質としてテトラメチルベンジジン（TMB）（eBioscience 00-4201-56）を使用した。１Ｍ硫酸を添加して、酵素−基質反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍの吸光度からバックグラウンドとしての６３０ｎｍの吸光度を差し引いたものとして読み取った。
【０１３８】
ＨＥＲ２に対する陽性対照トラスツズマブ（Roche）及びペルツズマブ（Genentech）、ＨＥＲ３に対する抗体ＭＭ１２１（Merrimack）及びＨＥＲ４に対する抗ＨＥＲ４抗体（R&D Systems、MAB11311）は、それぞれの対応する抗原に結合した。抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂであるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７は、ＥＧＦＲへの結合性を示したが、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４への結合性は示さず、ＥＧＦＲへのそれらの特異性を実証していた。
【０１３９】
実施例３−ＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂは、ＥＧＦＲ上の、セツキシマブと異なるエピトープに結合する
表面プラズモン共鳴法（SPR）を使用して、ＥＧＦＲ特異的ＦｃａｂであるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７が公知の抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（Merck）と、ＥＧＦＲへの結合を競合するかどうかを判定した。
【０１４０】
ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（GE healthcare）を使用して、ＥＧＦＲ特異的ＦｃａｂであるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７が、セツキシマブ（CX）で飽和したヒトＥＧＦＲ被覆チップに結合することができるかどうか、及びその逆を判定した。
【０１４１】
ストレプトアビジンチップ（SAチップ）（GE Healthcare BR-1000-32）にビオチン化ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ECD）、２００ＲＵを被覆した。流速２０μｌ／分のＨＢＳ−Ｐ緩衝液（GE Healthcare）を使用して実験を実施し、５０ｍＭ  ＮａＯＨを５０μｌ／分で１２秒間３回流すことによってＥＧＦＲ表面を再生した。第１のＥＧＦＲ結合性化合物（EGFR特異的Fcab又はセツキシマブ）を２０μｌ／分で４分間注入し、次に第２のＥＧＦＲ結合性化合物（セツキシマブ又はEGFR特異的Fcab）を４分間注入し（第２の注入の間の第１の化合物の解離を排除するために、第２の注入は、第１の化合物と混合して行った）、続いてＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で解離させた。第１及び第２の注入を同じ化合物（セツキシマブに続いてセツキシマブ）を使用して行った場合、第２の注入でほとんど又は全く追加的な応答が観察されなかったが、これは、ＥＧＦＲ結合表面が飽和したことを示している。
【０１４２】
【表２】
2019528048.tif 000003
【０１４３】
表２に、裸のＥＧＦＲ表面へのＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂの結合応答（３６．３〜５４．２ＲＵ）と比較して、セツキシマブで飽和したＥＧＦＲ被覆チップ上のＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂの結合応答（２２．２〜２７．４ＲＵ）に小さな低下があったことを示し、これは、ＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂが、セツキシマブエピトープと異なるが部分的に重複するＥＧＦＲ上のエピトープに結合することを示している。注入系列を逆にした場合にも同じ効果が観察され、Ｆｃａｂ飽和表面に対するセツキシマブの結合応答（３１．０〜３５．４ＲＵ）は、裸のＥＧＦＲ表面に結合するセツキシマブの結合応答（３９．０〜４０．５ＲＵ）と比較してわずかに低下した。
【０１４４】
実施例４−ヒト及びマウスＥＧＦＲへのＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂの結合親和性
ヒト及びマウスＥＧＦＲへのＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂの結合親和性を、ＳＰＲを使用して決定した。親和性の測定のために、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器（GE healthcare）を使用し、ＳＡチップに２００又は１０００ＲＵのビオチン化ヒト（社内）又はマウス（Sino Biological）ＥＧＦＲ細胞外ドメインを被覆した。一連の濃度のＦｃａｂ（１〜１０００ｎＭ）をＨＢＳ−Ｐ緩衝液（GE Healthcare）中に２０μｌ／分で２．５分間注入して、結合速度を測定した。次に、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１５分間注入して解離速度を決定した。５０ｍＭ  ＮａＯＨを５０μｌ／分で１０秒間２回使用してＥＧＦＲ表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２  ＲＣ１（GE Healthcare）を使用して１：１（Langmuir）適合モデルから結合親和性（KD）を得た。結果により、ＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂが、０．７〜６．０ｎＭの間の結合親和性でヒト及びマウスＥＧＦＲに結合することが示された（表３参照）。
【０１４５】
【表３】
2019528048.tif 000004
【０１４６】
実施例５−抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂのリガンド遮断活性
抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂであるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７を、ＥＧＦＲ発現ヒト類上皮腺癌細胞株Ａ４３１ＮＳ（ATCC CRL-2592）へのリガンドＥＧＦの結合を遮断する能力について試験した。
【０１４７】
Ａ４３１ＮＳ細胞をＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（GIBCO、13151-014）で２０分間解離させて、細胞表面ＥＧＦＲ受容体への損傷を回避した。２％ウシ胎仔血清（FBS）（Life Technologies、10270）を有するＰＢＳ（流動緩衝液）中に細胞を懸濁した。細胞２×１０５個を９６ウェルプレート中の１００μｌに蒔き、次に、陰性対照としてのＰＢＳを使用して様々な濃度（０．００２〜２５ｎＭ）のＦｃａｂと共に１５分間インキュベートした。次に、これらの細胞を４０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＥＧＦ（Invitrogen、EB477）と共に４℃で１時間インキュベートし、ＥＧＦＲへの結合をＦｃａｂと競合させた。未結合のＦｃａｂ又はビオチン化ＥＧＦを流動緩衝液で細胞から洗浄除去した。細胞に結合したビオチン化ＥＧＦを、氷上で４５分間インキュベーション後にストレプトアビジン−ＰＥ（Invitrogen、SA10041）により検出し、シグナルをフローサイトメーター（BD Accuri C6）で読み取った。図１Ａに、ＰＢＳ対照に対して規準化されたＥＧＦＲへのＥＧＦの結合の阻害パーセンテージを示すが、その際、ＰＢＳは０％阻害を招く。結果は、抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂがＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を０．４６から０．６１ｎＭの範囲のＩＣ５０で遮断したことを実証している（表４参照）。したがって、これらの結果は、ＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７が細胞表面ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断することを実証している。
【０１４８】
組換えＥＧＦＲ／Ｆｃ（Sino Biological）へのリガンドＴＧＦαの結合を遮断する能力についても、ＥＬＩＳＡによって抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂであるＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７を試験した。
【０１４９】
重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．２中のＴＧＦαをＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Nunc）上に４又は３７℃で一晩固定化し、過剰のＴＧＦαをＰＢＳで洗浄除去した。ＴＧＦα被覆プレートをＰＢＳ中１％ｔｗｅｅｎ（PBST）中の１％ＢＳＡを用いて室温で２時間ブロッキングし、その後、Ｆｃａｂ（０．１〜１００ｎＭ）及びＥＧＦＲ／Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ）混合物（１時間予備混合）と共に３７℃で１時間インキュベートした。Ｆｃａｂに結合したＥＧＦＲ／Ｆｃを洗浄除去したのに対して、ＴＧＦαに結合したＥＧＦＲ／Ｆｃを抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Sigma）で検出した。比色検出のためにＨＲＰ酵素と相互作用するための基質としてＴＭＢ（eBioscience）を使用し、反応を１Ｍ硫酸で停止させた。図１Ｂに、０％遮断としてのＦｃａｂなしのＥＧＦＲ／ＦｃへのＴＧＦαの結合に対して規準化した、抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂによるＥＧＦＲ／ＦｃへのＴＧＦαの結合の遮断パーセンテージを示す。結果は、抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂが３．７〜４．０ｎＭの範囲のＩＣ５０でＥＧＦＲ／ＦｃへのＴＧＦαの結合を遮断したことを示している（表４）。
【０１５０】
【表４】
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【０１５１】
実施例６−抗原結合を評価するためのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーによりＡ４３１ＮＳ細胞上の細胞表面ＥＧＦＲへの結合について抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂを試験した。Ａ４３１ＮＳ細胞を流動緩衝液中の抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂと共に氷上で１時間インキュベートすることによって、ＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７の結合を評価した。野生型（WT）Ｆｃａｂ（配列番号４７）を対照として使用した。細胞を洗浄し、暗所の氷上で４５分間インキュベートしたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Invitrogen #A21445）を用いてＦｃａｂの結合を検出した。過剰の二次抗体を洗浄除去し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用するフローサイトメトリーによってシグナルを分析した。幾何平均蛍光シグナルをＦｃａｂ濃度に対してプロットして、各ＦｃａｂについてＥＣ５０を決定した（図２）。全部で３つの抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂがＡ４３１ＮＳ細胞に濃度依存的に結合し、一方、ＷＴ  Ｆｃａｂは結合せず、ＥＧＦＲへのこれらのＦｃａｂの特異性を実証していた。抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂの結合親和性を表５に要約する。
【０１５２】
【表５】
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【０１５３】
実施例７−抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ介在性抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）
標的に結合した抗体又はＦｃａｂのＦｃエフェクター部分がエフェクター細胞の細胞表面のＦｃγＲＩＩＩａ受容体に同時に結合した場合、それは、２つの細胞の架橋を引き起こし、それにより、ＡＤＣＣ経路を活性化し、活性化Ｔ細胞核内因子（NFAT）経路の活性化及び最終的に標的化細胞の制御細胞死をもたらす。
【０１５４】
ＳＰＲを使用して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体への結合について抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂを試験した。ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器（GE healthcare）を使用し、ＣＭ５チップにＦｃγＲＩＩＩａ（Sino Biological）２０００ＲＵを被覆した。会合のためにＨＢＳ−Ｐ緩衝液（GE Healthcare）中、一連の濃度のＦｃａｂ（６２〜１０００ｎＭ）を２０μｌ／分で３分間注入し、続いてＨＢＳ−Ｐ緩衝液を流して５分間解離させた。１０ｍＭ  ＮａＯＨを２０μｌ／分で１５秒間使用してＦｃγＲＩＩＩａ被覆チップを再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２  ＲＣ１（GE Healthcare）を使用して結合親和性（KD）を定常状態の適合から得た。結果により、抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂが２７７〜２８９ｎＭの間の結合親和性でＦｃγＲＩＩＩａに結合することが示された（表６参照）。
【０１５５】
抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂがＡＤＣＣを誘発するかどうか判定するために、ＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙ（Promega、G7018）を行った。ＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙは、エフェクター細胞として、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体及びルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定発現している操作Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用する。ＮＦＡＴ活性化の結果としてのルシフェラーゼの産生によってＡＤＣＣ活性を定量した。製造業者の説明書に従ってアッセイを実施した。簡潔には、ＥＧＦＲを発現しているＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ATCC、HTB-132）を漸増する濃度の抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂと共にインキュベートした。続いて、ＡＤＣＣバイオアッセイ用エフェクター細胞を添加し、５％ＣＯ２中、３７℃で６時間インキュベートした。最終的に、ルシフェラーゼ試薬を添加し、相対発光を定量した。結果により、ｎＭ範囲にＥＣ５０値を有する抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ介在性ＡＤＣＣ活性が示され（表６）、これは、ＡＤＣＣがこれらのＦｃａｂが抗腫瘍活性を発揮する作用機序の１つである可能性があることを示唆している。
【０１５６】
【表６】
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【０１５７】
実施例８−サイズ排除クロマトグラフィーによる抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂの生物物理的特徴付け
ＷＴ  Ｆｃａｂと比較して、ＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７は、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループに標的結合を可能にする変異を有する。これらの変異がＦｃａｂ構造に及ぼす影響を評価するために、抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂの生物物理的特徴付けを行った。Ｚｏｒｂｅｘ  ＧＦ−２５０  ９．４ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍカラム（Agilent）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣシステムで２つ組のＦｃａｂ試料をサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）によって分析した。１ｍｇ／ｍｌ試料のアリコート８０μｌを注入し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭ  ｌ−アルギニン、ｐＨ６．０中、１ｍｌ／分で１５分間運転した。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Agilent）を使用して可溶性凝集物レベルを分析した。Ｆｃａｂは、ＷＴ  Ｆｃａｂと類似のカラム保持時間で対称性の単一ピークＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示した（表７）。これらの結果によって、ＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７における変異がＦｃａｂ構造に最小限の影響を有したこと、並びにこれらのＦｃａｂがモノマー性であり、可溶性凝集物を形成しないことが実証された。
【０１５８】
【表７】
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【０１５９】
実施例９−細胞増殖に対する抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂの効果
ＥＧＦＲを発現するアカゲザル肺上皮細胞株４ＭＢｒ−５（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２０８）を採用して、細胞増殖に対するＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６７の効果を検討した。製造業者の説明書（バージョンNovember 2004）に従って行ったＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ＢｒｄＵ（比色）イムノアッセイ（Roche、11647229001）を使用して細胞増殖を定量した。１％熱不活性化ウシ胎仔血清（FBS）（ThermoFisher、10270）及び１ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子（EGF）（R&D Systems、236-EG）を含有するＨａｍのＦ−１２Ｋ培地（ThermoFisher 21127022）中においてＢｒｄＵの存在下で４ＭＢｒ−５細胞を様々な濃度の抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂと共に３７℃で３日間インキュベートした。ＰＢＳのみ、ＷＴ  Ｆｃａｂ、ＩｇＧアイソタイプ対照、及びセツキシマブ（Merck）を対照として算入した。３日のインキュベーション期間中に、ＤＮＡ合成の間にＢｒｄＵを細胞に組み込んだ。細胞増殖によるＤＮＡの合成レベルを、ＥＬＩＳＡアッセイにおける抗ＢｒｄＵ−ペルオキシダーゼによって検出した。結果を図３に示す。図３に、漸増する濃度の抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ又はセツキシマブで細胞が処理されたときに、減少したＢｒｄＵが検出されたことを示す。結果をＰＢＳ対照に対して規準化した。ＷＴ  Ｆｃａｂ又はＩｇＧ１アイソタイプ対照（２０００ｎＭ）を用いた細胞の処理は、ＰＢＳ対照と比較してＢｒｄＵの組込みにいかなる変化も招かなかった。抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ及びセツキシマブに対するＩＣ５０を表８に示す。これらのデータは、４ＭＢｒ−５細胞を漸増する濃度の抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂで処理したときに低下した細胞増殖が観察されたことを実証している。
【０１６０】
【表８】
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【０１６１】
実施例１０−ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究：ＥＧＦＲによって駆動されるヒト患者由来肺腺癌異種移植モデルＬＸＦＡ６７７における抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ処置
ヒト患者由来異種移植（PDX）腫瘍を担持するマウスを使用して抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を評価した。約５〜７週齢の免疫欠損ＮＭＲＩヌードマウス（Charles River）に腫瘍を植え込んだ。ＥＧＦＲを発現しているＬＸＦＡ  ６７７  ＰＤＸ（Oncotest）は、６２歳男性患者の原発性肺腺癌に由来した。マウスの側腹部に片側又は両側皮下植込みするために腫瘍断片（稜の長さ３〜４ｍｍ）を使用した。０日目に、担腫瘍動物を実験群に無作為に割り付けて、投薬計画の開始時に平均群腫瘍体積１００〜１２０ｍｍ３を与えた。
【０１６２】
マウス７匹の群を以下：ＦＳ１−６０、ＦＳ１−６５、ＦＳ１−６７、ＷＴ  Ｆｃａｂ、セツキシマブ、又はＰＢＳ（ビヒクル対照として）で処置した。Ｆｃａｂ及びセツキシマブを２０ｍｇ／ｋｇで投薬し、ビヒクルを１０ｍｌ／ｋｇで投薬した。各処置を２週間かけて７回静脈内投与した。腫瘍を二次元的に（直径×高さ）測定するために、ノギスを使用して８７日目まで腫瘍体積を週に２回監視した。次式により腫瘍体積を計算した：（直径×高さ２）×０．５。腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えたならば、動物を屠殺した。
【０１６３】
全部で３つの抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ及びセツキシマブは、処置された全てのマウスに完全腫瘍寛解を引き起こし、一方でＷＴ  Ｆｃａｂは、全く抗腫瘍有効性を示さなかった（図４）。全ての抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ及びセツキシマブによる腫瘍阻害は、ビヒクル対照及び／又はＷＴ  Ｆｃａｂ処置群と比べて統計的に有意であった（Kruskal-Wallis/Dunn）（表９）。最終投薬の４週間後に、抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂで処置された全てではなく一部の動物に腫瘍の再成長が観察された（７匹中１匹がFS1-60で処置後に再発し、７匹中４匹がFS1-67で処置後に再発し、７匹中５匹がFS1-65で処置後に再発した）。再成長しなかった腫瘍について、測定を続け、完全寛解は８７日目の研究終了まで継続した。ビヒクル対照群及びＷＴ  Ｆｃａｂ処置群と比べて全てのＦｃａｂ処置について、腫瘍成長における４００％という統計的に有意な遅れが観察された（Kaplan-Meier）。結論として、耐容性良好な用量レベルで、全部で３つのＦｃａｂは、ＥＧＦＲ依存性ＰＤＸモデル、ＬＸＦＡ  ６７７において完全寛解を引き起こした。
【０１６４】
【表９】
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【０１６５】
実施例１１−ｍＡｂ２分子の調製
ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２の調製
モノクローナル抗体リロツムマブ（RI）及びフィクラツズマブ（FI）のＣＨ３ドメインをそれぞれＥＧＦＲ特異的Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６０及びＦＳ１−６５のＣＨ３ドメインと置換することによって、ｍＡｂ２分子ＲＩ／ＦＳ１−６０（重鎖：配列番号４１；軽鎖：配列番号２８）、ＦＩ／ＦＳ１−６０（重鎖：配列番号４２；軽鎖：配列番号３８）、ＲＩ／ＦＳ１−６５（重鎖：配列番号４３；軽鎖：配列番号２８）及びＦＩ／ＦＳ１−６５（重鎖：配列番号４４；軽鎖：配列番号３８）を調製した。ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体ＦＩについて、抗体のＣＨ３ドメイン全体をコードするＤＮＡ配列をＦＳ１−６０又はＦＳ１−６５  ＦｃａｂのＣＨ３ドメインにより置換した。ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体ＲＩについて、同じ方法を使用した。
【０１６６】
ＧＳベクター（Lonza）へのサブクローニング用にそれぞれ５’及び３’末端に制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを有する、モノクローナル抗体ＲＩ及びＦＩの重鎖及び親軽鎖の修飾ＣＨ３ドメインをコードする遺伝子配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Life Technologies）により合成した。可溶性タンパク質の発現（Lonza）のために、構築物を哺乳動物細胞（CHOK1SV GS-KO細胞）にトランスフェクトした。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞をトランスフェクトし、最大１２日間成長させ、最適な一過性タンパク質発現及び分泌を可能にした。ＣＨＯ  ＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Lonza）を使用して安定プールも作製した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞によって発現及び分泌されたｍＡｂ２を細胞上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１６７】
ＦＩ、ＲＩ又はＨｕＬ２Ｇ７（Galaxy Biotech、EP2016162B1参照）などのヒト抗体のＣＨ３ドメイン配列を所望のＦｃａｂのＣＨ３ドメイン配列により同様に置換することによって他のｍＡｂ２分子を調製することができる。適切なＦｃａｂには、ＦＳ１−６０及びＦＳ１−６５に加えて、ＦＳ１−６７が含まれる。
【０１６８】
ＥＧＦＲ／ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ２の調製（実施例１８に使用）
重鎖（VH）及び軽鎖（VL）の抗マウスＣＴＬＡ４抗体９Ｄ９の可変領域は、特許出願番号ＵＳ２０１１／００４４９５３Ａ１に公表された９Ｄ９  ｓｃＦｖ配列（配列番号４８）に由来した。以下のｍＡｂ及びｍＡｂ２分子をこれらの可変領域ベースで設計し、図５に模式的に示す。
【０１６９】
ｐＴＴ５（NRCC）発現ベクターへのクローニング用にそれぞれ５’及び３’末端に制限部位ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを有する、９Ｄ９軽鎖（配列番号５０）、９Ｄ９ｍ２ａ重鎖（配列番号５２）、及び９Ｄ９／ＦＳ１−６７重鎖（配列番号５６）をコードする遺伝子配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Life Technologies）により合成した。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするＤＮＡ配列の間にＸｈｏＩ部位を含むように９Ｄ９ｈ１重鎖遺伝子配列（配列番号５４）を設計して、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ消化及びＤＮＡライゲーションによる異なるＣＨ３ドメインのサブクローニングを可能にした。可溶性タンパク質の一過性発現のために構築物を哺乳動物細胞（293-6E細胞、NRCC）にトランスフェクトした（社内）。２９３−６Ｅ細胞にトランスフェクトし、最大５日間成長させて、最適なタンパク質発現及び分泌を可能にした。２９３−６Ｅ細胞により発現及び分泌された、コードされたｍＡｂ２をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって細胞上清から精製した。ＣＨＯ  ＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Lonza）を使用して安定なプールも作製した。
【０１７０】
イピリムマブ（軽鎖は配列番号５８及び重鎖は配列番号６０）などのヒト抗体のＣＨ３ドメイン配列を、所望の抗原結合性Ｆｃ（Fcab）のＣＨ３ドメイン配列により同様に置換することによって他のｍＡｂ２分子を調製することができる。適切なＦｃａｂには、ＦＳ１−６７、ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６０が含まれる。
【０１７１】
実施例１２−抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２によるＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ及びシグナル伝達タンパク質のリン酸化の遮断
ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲのリン酸化を、続いてＨＧＦ及びＥＧＦによって刺激される二次メッセンジャーであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）及びＡｋｔのリン酸化を遮断する能力について抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０を試験した。
【０１７２】
細胞溶解物の調製
１０％  ＦＢＳを有する培地から０．１％  ＦＢＳを有する低血清培地に、神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（ATCC HTB-14）の一晩培養物を移して、リガンド刺激に対する感受性を最適化した。細胞を一晩インキュベートした。翌日、終濃度２００ｎＭ（又は２００＋２００ｎＭの併用）のＦＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ、ＲＩ、ＦＳ１−６０、ＩｇＧ１カッパ、ＦＩ＋ＦＳ１−６０併用及びＲＩ＋ＦＳ１−６０併用を含む処理を細胞に加え、刺激のために０．６ｎＭ  ＨＧＦ（PeproTech、100-39）及び１．６ｎＭ  ＥＧＦ（R&D Sytems、236-EG）の存在下で、３７℃で２０分間インキュベートした。増殖因子刺激を行う及び行わない、抗体処理なしの対照を含めた。１：１００プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem、539131）及び１：１００ホスファターゼ阻害剤カクテル（Calbiochem、524625）及び分析のために収集した溶解物を含む溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を使用して、処理後の細胞を溶解させた。
【０１７３】
ウェスタンブロッティング
４〜１２％ビストリスタンパク質ゲル（ThermoFisher、NP0322BOX）を使用して、溶解物試料を標準的なウェスタンブロッティング分析に供し、ニトロセルロースメンブレン（ThermoFisher、IB301001）に移した。メンブレンを５％Ｍａｒｖｅｌ乳汁／ＴＢＳＴでブロッキングし、次に、Ｔｙｒ１２３４／１２３５でリン酸化されたｃ−Ｍｅｔに特異的なウサギモノクローナル抗体（Cell Signaling、3077）を使用してホスホ−ｃ−Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１０６８でリン酸化されたＥＧＦＲに特異的なマウスモノクローナル抗体（Cell Signaling、2236）を使用してホスホ−ＥＧＦＲ、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４でリン酸化されたｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ERK1/2）に特異的なマウスモノクローナル抗体（Cell Signaling、9106）を使用してホスホ−ＭＡＰＫ、及びＳｅｒ４７３でリン酸化されたＡｋｔに特異的なウサギモノクローナル抗体（Cell Signaling、9271）を使用してホスホ−Ａｋｔについて探索した。メンブレンを洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体（抗マウス、Jackson ImmunoResearch、又は抗ウサギ、Jackson ImmunoResearch）を添加し、その後、シグナル検出のために強化化学発光基質（ThermoFisher、34076）と反応させた。マウスモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（Sigma-Aldrich、G8795）を使用して負荷対照と同じメンブレン上でＧＡＰＤＨを探索した。
【０１７４】
結果を図６に示すが、結果は、ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔのリン酸化並びにその後のＭＡＰＫ及びＡｋｔのリン酸化を刺激することを実証している。ＥＧＦは、ＥＧＦＲのリン酸化並びにその後のＭＡＰＫ及びＡｋｔのリン酸化も刺激する。ＦＩ及びＲＩのように、ｍＡｂ２分子は、ＨＧＦによるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を遮断することができた。ホスホ−ｃ−Ｍｅｔの遮断は、ホスホ−ＭＡＰＫ及びホスホ−Ａｋｔの遮断をもたらす。しかし、これをＥＧＦによるＥＧＦＲの刺激により克服し、ＭＡＰＫ及びＡｋｔのリン酸化を招くことができる。したがって、ＦＩ及びＲＩは、ＥＧＦの存在下でＭＡＰＫ及びＡｋｔのリン酸化を遮断することができない。同様に、ＦＳ１−６０単独はＨＧＦの存在下でＭＡＰＫ及びＡｋｔのリン酸化を遮断することができない。ＨＧＦ及びＥＧＦの両方によって刺激されると、ｍＡｂ２分子のみ、及びＦＩ又はＲＩとＦＳ１−６０との併用は、下流のシグナル伝達分子ＭＡＰＫ及びＡｋｔのリン酸化を遮断することができた。これらの結果により、ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０がｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲのリン酸化を、及びしたがって下流のシグナル伝達も、ＦＩ、ＲＩ又はＦＳ１−６０単独よりも効率的に阻害することができることが実証された。これらの受容体型チロシンキナーゼの活性化の遮断は、細胞増殖、細胞移動及び細胞生存を阻害すると期待することができよう。
【０１７５】
実施例１３−ｍＡｂ２分子の同時二特異性結合
ｍＡｂ２分子がその２つの同族抗原に同時に結合する能力を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器（GE healthcare）を使用するＳＰＲによって測定した。
【０１７６】
標準的なアミンカップリングを使用して、ＣＭ５チップに１２００ＲＵのＨＧＦを被覆した。第１の注入工程において、ＲＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２又はＦＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２（５００ｎＭ）を２０μｌ／分で５分間注入し、チップ上に被覆されたＨＧＦに結合飽和させた。第２の注入工程において、２０μｇ／ｍｌ  Ｈｉｓタグ付きＥＧＦＲを２０μｌ／分で５分間注入し、続いてＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で解離させた。４０ｍＭ  ＮａＯＨを４５μｌ／分で１７秒間３回繰り返して使用してＨＧＦ表面を再生させた。飽和ＨＧＦチップ上の第２の注入工程におけるＥＧＦＲの結合応答により、ＲＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２がＨＧＦ及びＥＧＦＲに同時に結合できることが示された（図７）。
【０１７７】
実施例１４−抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２によるＥＧＦＲへのＥＧＦの結合の遮断
ＥＧＦＲ発現ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞へのリガンドＥＧＦの結合を遮断する能力について、抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０を試験した。実施例５に記載したものと同じ方法を使用したが、Ａ４３１ＮＳ細胞の代わりにＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を採用した。様々な濃度（２５〜０．００２ｎＭ）のｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０、ｍＡｂ２  ＲＩ／ＦＳ１−６０、ＦＳ１−６０  Ｆｃａｂ、ヒトＩｇＧ１（IgG1）、又はＷＴ  Ｆｃａｂを対照としてのＰＢＳと共に試験した。図８に、ＰＢＳ対照に対して規準化された、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合の阻害パーセンテージを示すが、その際、ＰＢＳは、０％の阻害活性を有する。
【０１７８】
結果は、ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０がＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を０．４５から０．７１ｎＭの間のＩＣ５０で遮断したことを実証している（表１０）。これは、ＦＳ１−６０  ＦｃａｂのＩＣ５０と匹敵する。これらのデータは、抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂのＥＧＦ遮断活性が、それをｍＡｂ２形式に挿入することによって影響されなかったことを示している。
【０１７９】
【表１０】
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【０１８０】
実施例１５−がん細胞株の細胞増殖に及ぼす抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２の効果
４つのがん細胞株を採用して、細胞増殖に及ぼす抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２の効果を試験した。
【０１８１】
Ｕ８７ＭＧ細胞
神経膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞（HGFの自己分泌産生）を様々な濃度のＦＩ、ＦＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ＋ＦＳ１−６０（１：１の併用）、ＲＩ、ＲＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ＋ＦＳ１−６０（１：１の併用）、ＦＳ１−６０、ヒトＩｇＧ１カッパ（IgG）、又はＰＢＳと共に３７℃で４日間インキュベートした。異なる処置の抗増殖効果を決定するために生存細胞数を使用した。４日後に、それぞれ総細胞数及び死細胞について核を染色するために、１μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Invitrogen、H3570）及び２．５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（PI）（Sigma、P4864）を細胞に添加し、細胞を暗所の室温で２５分間インキュベートした。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（IXM）顕微鏡（Molecular Devices）を倍率４×で使用して生存細胞数を決定した。
【０１８２】
細胞増殖の濃度依存性低下がｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０の存在下で観察された（図９Ａ）。ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０は、ＦＩ、ＲＩ又はＦＳ１−６０  Ｆｃａｂを用いた単剤療法と比較して優れた有効性を有した。ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２は、ＦＩ＋ＦＳ１−６０又はＲＩ＋ＦＳ１−６０を用いた処置よりも優れていた。別のｍＡｂ２であるＦＩ／ＦＳ１−６５を用いてアッセイを繰り返し、結果は、ＦＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２で観察された結果を反映していた（図９Ｂ）。これらのデータにより、ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５がＨＧＦ自己分泌Ｕ８７ＭＧ細胞において抗増殖活性を有することが示された。
【０１８３】
ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞
ＮＣＩ−Ｈ５９６（ATCC HTB-178）は、ＥＧＦシグナル伝達経路及びＨＧＦシグナル伝達経路の両方に関与する肺腺扁平上皮がん細胞株であり、これを使用して、ｍＡｂ２分子が増殖を遮断する能力を検討した。ＥＧＦ及びＨＧＦリガンドの両方でＮＣＩ−Ｈ５９６細胞を刺激したことを除き、上記Ｕ８７ＭＧアッセイと同じ方法を使用した。処理の１日前に、培地中に使用したＦＢＳのレベルを１０％から１％に低下させた。翌日、２ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（R&D systems、236-EG）及び１２ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（PeproTech、100-39）の存在下で様々な濃度（１０〜１０００ｎＭ）で処理を加え、３７℃で３日間インキュベートした。ＨＧＦ＋ＥＧＦの対照である、ＥＧＦのみ、ＨＧＦのみ及びリガンド刺激なしも含めた。結果は、ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＲＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２が、ＨＧＦ及びＥＧＦによって誘導される細胞増殖を濃度依存的に阻害することを示している（図９Ｃ）。１０００ｎＭでＦＩ／ＦＳ１−６５、ＲＩ／ＦＳ１−６５及びＦＩ＋ＦＳ１−６５併用は、リガンド刺激によって誘導される細胞増殖を完全に遮断した。逆に、ＦＳ１−６５又はＦＩ単独を用いた単剤療法は、両方のリガンドが存在したときに刺激を遮断できなかった。これらのデータは、二特異性抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＲＩ／ＦＳ１−６５がＥＧＦ及びＨＧＦによって誘導される増殖を阻害することに効果的であったことを実証している。
【０１８４】
ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞
ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ATCC CRL-5908）は、構成的活性型変異ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ及びＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍを発現する非小細胞肺がん（NSCLC）細胞株である（Kobayashiら、2005）。これらの変異は、ＮＳＣＬＣ患者においてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）療法に対する抵抗性を付与することが公知の獲得二次変異である。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株は、ｃ−Ｍｅｔも発現する。この細胞株を使用して、ｍＡｂ２分子がＨＧＦによって刺激される増殖を遮断する能力を検討した。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞をＨＧＦで刺激したことを除き、上記Ｕ８７ＭＧアッセイと同じ方法を使用した。処理の１日前に、使用する培地を１０％ＦＢＳ含有から血清不含に変更した。８０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦの存在下で様々な濃度（０．００３〜３００ｎＭ）の処理を加え、３７℃で３日間インキュベートした。結果は、ＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２を用いた処理が、ＨＧＦによって誘導される細胞増殖を濃度依存的に低下させたことを示している（図９Ｄ）。試験した他の処理で効果は観察されなかった。これらのデータにより、二特異性ＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２が、ＥＧＦＲ活性化変異を有するＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において細胞増殖を阻害することに効果的であったことが実証された。
【０１８５】
ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株を使用して、ＥＧＦＲ  ＴＫＩエルロチニブと併用したＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２が増殖を遮断する能力も検討した。エルロチニブ（２μＭ）の存在下及び不在下で３００ｎＭのＦＩ及びＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２を添加した。結果は、ＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２処理がＨＧＦにより誘導される細胞増殖を低下させる能力（図９Ｆ）が、エルロチニブの存在によって影響されなかったことを示している。エルロチニブ、ＦＩ又はＦＩ＋エルロチニブ処理で効果は観察されなかった。これらのデータにより、二特異性ＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２が、ＥＧＦＲ活性化変異を有するＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において細胞増殖を阻害することに効果的であり、エルロチニブよりも優れていたことが実証された。
【０１８６】
ＫＰ４細胞
ＫＰ４（Riken RCB1005）は、ＨＧＦの自己分泌産生する膵管細胞癌である。この細胞を、供給業者によって推奨される条件で、様々な濃度（０．００３〜３００ｎＭ）のＦＩ、ＦＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ／ＦＳ１−６５、ＲＩ／ＦＳ１−６５、ＦＩ＋ＦＳ１−６５（１：１の併用）、ＦＳ１−６５、ヒトＩｇＧ１カッパ（IgG）又はＷＴ  Ｆｃａｂと共に図９Ｅに示すように３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Roche）を使用して細胞を分析して、製造業者のプロトコールに記載のように生存細胞数を決定した。生存細胞におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの解糖産生により安定テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１は可溶性ホルマザンに開裂する。形成したホルマザン色素の量を吸光度４５０ｎｍ及び６３０ｎｍで定量する。
【０１８７】
細胞増殖における濃度依存性低下が、漸増する濃度のｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ／ＦＳ１−６５、ＲＩ／ＦＳ１−６５、ＦＩ＋ＦＳ１−６５の併用及びＦＩで観察された（図９Ｅ）。３つのｍＡｂ２は、ＦＩ又はＦＳ１−６５の単剤療法と比較して優れた有効性を有した。ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＲＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２は、また、ＦＩ＋ＦＳ１−６５を用いた処理よりも優れていた。これらのデータにより、ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＲＩ／ＦＳ１−６５がＨＧＦ自己分泌ＫＰ４細胞において抗増殖活性を有することが示された。
【０１８８】
ＨＣＣ８２７細胞
ＨＣＣ８２７（ATCC CRL-2868）は、活性化ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失を発現し、ＥＧＦＲコピー数増幅を有する肺腺癌細胞株である（Furugakiら、2014）。細胞株は、ＭＥＴ増幅を介してＥＧＦＲ  ＴＫＩ抵抗性を獲得することが示されている（Shienら、2015）。この細胞株を使用して、ｍＡｂ２及びエルロチニブが、ＨＧＦによって刺激される増殖を遮断する能力を検討した。細胞を１０％ＦＢＳ中で培養した。処理の１日前に、ＦＢＳを１％に低下させた。４０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦの存在下で、細胞にエルロチニブ（０．１％  ＤＭＳＯ中）を様々な濃度（１０μＭから０．０２５６ｎＭ）で添加し、細胞を３７℃で３日間インキュベートした。いくつかの試験では、３００ｎＭのＦＩ又はＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２をエルロチニブと併用して添加した。ビヒクル対照として、０．１％  ＤＭＳＯを使用した。結果は、ＨＧＦの存在がエルロチニブに対する抵抗性を付与することを示している（図９Ｇ）。この抵抗性の効果は、エルロチニブをＦＩと併用することによって取り消すことができたが、エルロチニブ＋ＦＩ／ＦＳ１−６５の併用処理は、細胞増殖を阻害するために必要なエルロチニブの用量をさらに低下させた。これらの結果は、エルロチニブ処理をＦＩとではなく、ＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２と併用することが、処理に必要なエルロチニブの用量を低下させ、したがって、潜在毒性を低下させることができたことを示唆している。
【０１８９】
実施例１６−抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２処理によって誘導される培養培地中のＨＧＦ内在化及びＨＧＦレベルの減少
ＨＧＦの内在化は、抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２がｃ−Ｍｅｔ活性化を低下させ、細胞増殖を阻害するメカニズムであるかどうかを検討するために、Ａ４３１ＮＳ及びＵ８７ＭＧ細胞を使用してＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２によって誘導されるＨＧＦの内在化を試験した。
【０１９０】
製造業者の説明書に従ってＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｒａｐｉｄ  ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８（Innova Biosciences、322-0010）で標識されたＨＧＦをフローサイトメトリーによって検出した。６．５ｎＭ標識ＨＧＦを３３．３ｎＭ  ＦＩ／ＦＳ１−６０又はＦＩ／ＦＳ１−６５と共に室温で１時間予備インキュベートした。ｍＡｂ２を有しないＨＧＦを対照として使用した。混合物をＡ４３１ＮＳ細胞と共に１時間インキュベートして結合させ、インキュベーションを氷上で行って、あらゆる内在化活性を減速させた。１％ＢＳＡ（Sigma、A7906）を含有する氷冷ＰＢＳ（Lonza、BE17-516F）で細胞を２回洗浄することによって、あらゆる未結合のＨＧＦ及びｍＡｂ２を除去した。細胞を氷冷培地中に再懸濁し、３７℃に移行させて、１８０、１２０、６０、３０又は１０分間の期間内在化を加速させ、対照として１セットを全体にわたり氷上に残した。インキュベーション期間の終わりに、１％ＢＳＡを含有する氷冷ＤＰＢＳ（ThermoFisher、14040-133）中の０．０５％ＮａＮ３（Sigma、S2002）で細胞を２回洗浄することによってさらなる内在化を阻害した。細胞を２００ｎＭ抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ＩｇＧ（ThermoFisher、A-11094）と共に氷上で１時間インキュベートすることによって、細胞表面に結合した標識ＨＧＦをクエンチした。内在化した標識ＨＧＦは、細胞表面によりこのクエンチングから保護されたので、検出されたあらゆる標識ＨＧＦは内在化したＨＧＦであった。製造業者のプロトコールに従って、ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）Ｆｉｘｅｄ  Ｃｅｌｌ  ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標）試薬（ThermoFisher、R37606）で細胞を染色し、その後フローサイトメトリーにより分析した。
【０１９１】
Ｕ８７ＭＧ細胞を用いて対応する実験を行った。
【０１９２】
結果は、ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５の存在下で標識ＨＧＦのシグナルが、インキュベーション時間と共に増加したことを示している（図１０Ａ及び１０Ｂ）。ＨＧＦのインキュベーション単独は、時間にかかわらず検出されたシグナルを変化させなかった。全体を通して氷上でインキュベートされた対照細胞は、ＨＧＦシグナルの増加を示さなかった。これらのデータにより、ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５が、おそらくｍＡｂ２の内在化を介してＡ４３１ＮＳ及びＵ８７ＭＧ細胞へのＨＧＦの内在化を促進したことが示された。
【０１９３】
さらに、抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２と共のインキュベーションは、Ｕ８７ＭＧ細胞の増殖阻害にＨＧＦ標的化ｍＡｂ＋ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂの併用よりも強力であった（実施例１５）。抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２によるＨＧＦの内在化がシステム中のＨＧＦのレベル低下をもたらすという仮説を立てた。この仮説を試験するために、抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２と共のインキュベーションによって引き起こされる遊離ＨＧＦのレベル変化を、ＨＧＦを分泌するＵ８７ＭＧ細胞において調査した。Ｕ８７ＭＧ培養物を３０ｎＭでの異なる処理と共に３７℃で４日間インキュベートした。処理は、ＦＩ／ＦＳ１−６５、ＲＩ／ＦＳ１−６５、ＦＩ、ＲＩ、ＦＳ１−６５、ＦＩ＋ＦＳ１−６５併用、ＲＩ＋ＦＳ１−６５併用、ＷＴ  Ｆｃａｂ、ヒトＩｇＧ１カッパ、及びＰＢＳ対照であった。４日目に、各細胞培養物からの培地をＨＧＦレベル分析のために収集した。ＨＧＦヒトＥＬＩＳＡキット（ThermoFisher、KAC2211）を製造業者のプロトコールに従って使用してＨＧＦ濃度を測定した。モノクローナル抗ＨＧＦ抗体を使用して、培地中の遊離のＨＧＦを検出した（遊離ＨＧＦを、検出抗体によって結合された、培地中のＨＧＦと定義した）。
【０１９４】
結果は、ＦＩ及びＲＩの両方並びにそれらとＦＳ１−６５との併用が、おそらくＨＧＦを隔離することによって、ＰＢＳ、ＩｇＧ、ＷＴ  Ｆｃａｂ及びＦＳ１−６５対照と比較して培地中の遊離ＨＧＦ濃度の有意な減少を引き起こしたことを示している（図１０Ｃ）。ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＲＩ／ＦＳ１−６５で処理された細胞培養物で、遊離ＨＧＦレベルにおけるより大きな低下が観察された。この有意な低下は、ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＲＩ／ＦＳ１−６５が、ＥＧＦＲの結合を介してＨＧＦを細胞内に内在化させること、及びＨＧＦを隔離することの両方によって、培地からＨＧＦを除去するという理論と一致する。遊離ＨＧＦレベルにおけるこの低下は、ｍＡｂ２による細胞増殖の阻害に、併用処理で観察されるよりも強力な効果をもたらすと期待される。
【０１９５】
実施例１７−ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究：神経膠芽腫ＨＧＦ自己分泌Ｕ８７ＭＧ及びＮＳＣＬＣ  Ｈ５９６異種移植モデルの抗ＥＧＦＲ／ＨＧＦ  ｍＡｂ２処置
神経膠芽腫
ＨＧＦ自己分泌Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞株を移植されたマウスを使用して、ＥＧＦＲ及びＨＧＦを標的化する二特異性ｍＡｂ２のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を評価した。およそ８〜１２週齢の雌性無胸腺ヌードマウス（CRL:NU（NCr）-Foxn1nu、Charles River）に腫瘍を植え込んだ。雌性ヌードマウスに連続生着させることによりＵ８７ＭＧ神経膠芽腫を維持した。腫瘍の成長を開始するために、各試験動物の右側腹部の皮下に１ｍｍ３片を植え込んだ。ノギスを用いて腫瘍のサイズを２方向で測定し、次式を使用して平均体積を計算した：（幅×長さ）×０．５。研究期間中、腫瘍を週２回測定した。０日目に、個別の腫瘍体積が７５から１４４ｍｍ３の動物をそれぞれ動物８匹の６群に無作為に割り付け、群の平均腫瘍体積は１０２ｍｍ３であった。１日目から、全てのマウスの静脈内に週２回最大８週間投薬した。６群の処置は、ＰＢＳビヒクル（２４．９ｍｌ／ｋｇ）、ＦＳ１−６０、ＦＩ、ＦＩ＋ＦＳ１−６０併用、ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０であり、全ての用量は６０ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍の体積が２０００ｍｍ３を超えたならば、動物を安楽死させた。
【０１９６】
ＥＧＦＲのみを標的化するＦＳ１−６０で処置されたマウスを除く全ての処置は、ビヒクルと比較して腫瘍の寛解を示した。ＦＩとＦＩ＋ＦＳ１−６０併用との間に差は観察されなかった。ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２処置群においてビヒクル、ＦＳ１−６０及びＦＩよりも優れた抗腫瘍活性が観察された。ＦＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２は、また、ＦＩ＋ＦＳ１−６０の併用処置よりも優れていた。ログランク（Mantel-Cox）検定及びＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して、２群の全生存経験（生存曲線）の間の差の有意性を判定した。結果を表１１にまとめる。各群の経時的な平均腫瘍体積を図１１Ａに示す。
【０１９７】
【表１１】
2019528048.tif 000012
【０１９８】
結論として、ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＲＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２は、ＥＧＦＲ又はＨＧＦのいずれかを標的化する単剤療法よりも腫瘍成長の阻害が優れていた。ＦＩ／ＦＳ１−６０は、また、ＥＧＦＲ及びＨＧＦを標的化するＦＩ＋ＦＳ１−６０の併用処置よりも優れていた。
【０１９９】
処置期間中、異なる処置を受けているマウスにおいて血清試料を採取して、異種移植片から分泌された遊離ヒトＨＧＦを決定した。実施例１６に記載のようにＨＧＦヒトＥＬＩＳＡキット（ThermorFisher、KAC2211）を製造業者のプロトコールに従って使用して分析するために、１６日目に、全ての生存動物からの血清試料を収集した。検出されたＨＧＦ濃度を対応するマウスの腫瘍サイズに対して規準化した。
【０２００】
結果は、ＦＩ／ＦＳ１−６０がビヒクル群と比較して血清中の遊離ＨＧＦ濃度に有意な減少を引き起こしたことを示している（図１１Ｄ）。ビヒクル群と比較してＦＩ＋ＦＳ１−６０併用及びＲＩ／ＦＳ１−６０で処置された群において、統計的に有意ではなかったものの大きな低下も観察された。これらの観察は、ＦＩ／ＦＳ１−６０がＨＧＦを内在化及び隔離し、細胞増殖の阻害により強力な効果をもたらすという考えと一致する。
【０２０１】
ＮＳＣＬＣ
変更されたＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達を担持するヒトのがんをマウスモデルで研究する難題の１つは、マウスＨＧＦがヒトＭｅｔに対して低親和性を示し、したがって、そのようなヒト腫瘍が成長する理想的な環境を提供しないという事実であった。ヒトＨＧＦを発現しているトランスジェニックマウスｈＨＧＦｔｇ−ＳＣＩＤ（Van Andel Institute）は、腫瘍環境にとって種適合性のＨＧＦ（ヒト）を提供する（Zhangら、2005）。
【０２０２】
ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ５９６は、ＥＧＦＲ及びＨＧＦシグナル伝達経路の両方に関与するが、ＨＧＦを自己分泌しない。ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２を用いた処置のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をＨ５９６モデルにおいて評価するために、ＮＳＣＬＣ細胞をトランスジェニックｈＨＧＦｔｇ−ＳＣＩＤマウスに移植してＨＧＦ刺激環境を与えた。全てのｈＨＧＦｔｇ−ＳＣＩＤ雌性マウスの右側腹部に細胞１×１０６個を植え込んだ。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達したときに、動物を各群８匹の６群に無作為化した。腫瘍を週２回測定し、次式を使用して腫瘍体積を計算した：（長さ×幅）／深さ。０日目から、６群の植込み後のマウスに以下の処置を腹腔内に週２回最大７週間投薬した：全て用量６０ｍｇ／ｋｇでＰＢＳビヒクル（２４ｍｌ／ｋｇ）、ＦＳ１−６５、ＦＩ、ＦＩ＋ＦＳ１−６５、ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５。腫瘍の体積が２５００ｍｍ３を超えたならば、動物を安楽死させた。
【０２０３】
全ての処置は、ビヒクルと比較して腫瘍寛解を示した。ＦＩ＋ＦＳ１−６５の併用処置は、ＦＳ１−６５又はＦＩの単剤療法と比較して全生存に改善を示さなかった。ＦＩ／ＦＳ１−６０  ｍＡｂ２処置は、他の処置と比較して全生存の改善に優れていた。ログランク（Mantel-Cox）及びＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して、２群の全生存経験（生存曲線）の間の差の有意性を判定した。結果を表１２にまとめる。各群の経時的な平均腫瘍体積を図１１Ｂに示す。ＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２処置群における動物８匹中２匹は、腫瘍の完全寛解を示した。各群のマウスの経時的な生存を図１１Ｃに示す。２つのｍＡｂ２で処置されたマウスは、ＦＩ＋ＦＳ１−６５の併用で処置されたマウスと比較して高い生存率を有した。ＦＩ／ＦＳ１−６０で処置されたマウスの群では、全てのマウスが研究終了時に生存していた。
【０２０４】
結論として、ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２は、ＥＧＦＲ又はＨＧＦのいずれかを標的化する単剤療法よりも腫瘍成長の阻害に優れていた。ＦＩ／ＦＳ１−６０は、また、ＥＧＦＲ及びＨＧＦを標的化するＦＩ＋ＦＳ１−６０の併用処置よりも優れていた。
【０２０５】
【表１２】
2019528048.tif 000013
【０２０６】
実施例１８−抗ＥＧＦＲ含有ｍＡｂ２で処置されたマウスにおける低下した皮膚毒性
公知の抗ＥＧＦＲ療法で、皮疹、病変などを生じる皮膚毒性が観察されている。抗ＥＧＦＲ  Ｆｃを含有する抗ＥＧＦＲ  Ｆｃａｂ及びｍＡｂ２の毒性を決定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行った。抗ＥＧＦＲ／ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ２  ９Ｄ９／ＦＳ１−６７及び対照（実施例１１）を、Ｋｒａｍａｎ  Ｍら（2010）に記載されているような同系マウス腫瘍モデルＬＬ２．ｏｖａにおける腫瘍成長の制御へのそれらの有効性について試験した。腫瘍細胞（５×１０５個）を６〜８週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ６（Charles River）マウスの側腹部の皮下に植え込み、マウスをそれぞれマウス８匹のコホート４つに無作為に割り付けた。腫瘍植込みの３、６及び１０日後に、マウスに以下の処置の２５０μｇ（２５ｇ／マウスと仮定して１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した：マウスＩｇＧ２ａ対照、ＦＳ１−６７  Ｆｃａｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ９Ｄ９ｍ２ａ及び９Ｄ９／ＦＳ１−６７  ｍＡｂ２。１０、１２、１４、１７、１９、２０及び２１日目に腫瘍体積を電子ノギスで測定した。１６日目にマウスの写真を撮影して、観察された皮膚毒性を図示した。
【０２０７】
観察された皮膚毒性は、ＦＳ１−６７単剤療法で処置されたマウスにおいて最も顕著であった。マウスのうち４匹にかなりの脱毛があり、マウスの２匹が、腫瘍植込み部位ではないにしろ病変を示した。９Ｄ９／ＦＳ１−６７  ｍＡｂ２で処置されたマウスのうち２匹も幾分脱毛を示したが、ＦＳ１−６７単剤療法で処置されたマウスほど明白ではなかった。結果を図１２に示す。表１３に、この試みで観察された皮膚毒性をまとめる。理論に限定されることを望むわけではなく、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇにおける高レベルのＣＴＬＡ４発現が、腫瘍にｍＡｂ２を濃縮し、皮膚に対するＥＧＦＲ  Ｆｃａｂの効果を限定することができ、それでｍＡｂ２で観察された低下した皮膚毒性を説明していると考えられる。９Ｄ９／ＦＳ１−６７  ｍＡｂ２は、腫瘍成長の最高レベルの制御も示した。
【０２０８】
【表１３】
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【０２０９】
Ｈ５９６のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究においても、抗ＥＧＦＲベースのｍＡｂ２を用いたときに低下した皮膚毒性が観察された。ＦＳ１−６５群及びＦＩ＋ＦＳ１−６５併用群のマウスは、脱毛を示した。しかし、ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５  ｍＡｂ２処置群において、脱毛は著しく低下した。この観察は、ｍＡｂ２における第２の標的が第２の標的の高発現レベルの部位に二特異性分子を方向づけ、皮膚に対する抗ＥＧＦＲドメインの効果を制限しているという理論と一致する。したがって、行われたｉｎ  ｖｉｖｏ研究は両方とも、抗ＥＧＦＲベースのｍＡｂ２が低下した皮膚毒性をもたらしたことを示した。
【０２１０】
実施例１９−サイズ排除クロマトグラフィーによる抗ＥＧＦＲベースのｍＡｂ２の生物物理的特徴付け
モノクローナル抗体ＲＩ及びＦＩのＣＨ３ドメインを抗ＥＧＦＲ  ＦｃａｂのＣＨ３ドメインにより置換することによってｍＡｂ２  ＲＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ／ＦＳ１−６５、ＦＩ／ＦＳ１−６０及びＦＩ／ＦＳ１−６５を調製した。このＣＨ３ドメイン交換の影響を評価するために、抗ＥＧＦＲベースのｍＡｂ２の生物物理的特徴付けを行った。Ｚｏｒｂｅｘ  ＧＦ−２５０  ９．４ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍカラム（Agilent）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣシステム上でサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）によりｍＡｂ２及びｍＡｂ試料を分析した。１ｍｇ／ｍｌ試料のアリコート８０μｌを注入し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭ  ｌ−アルギニン、ｐＨ６．０、１ｍｌ／分で１５分間運転した。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Agilent）を使用して可溶性凝集物レベルを分析した。ｍＡｂ２は、対応する親ｍＡｂと類似のカラム保持時間で対称性の単一ピークのＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示した（表１４）。これらの結果によって、ＣＨ３ドメインの交換が親ｍＡｂの構造に最小限の影響を有したこと、並びにこれらのｍＡｂ２がモノマー性であり、可溶性凝集物を形成しないことが実証された。
【０２１１】
【表１４】
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【０２１２】
実施例２０−ＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２の結合
細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５（詳細については実施例１５参照）及びＨＣＣ８２７（ATCC CRL-2868、EGFRチロシンキナーゼドメインに獲得欠失[E746-A750]を有する肺腺癌）の細胞表面ＥＧＦＲへの結合性について、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２及びＦｃａｂをフローサイトメトリーによって試験した。ＲＩ／ＦＳ１−６５、ＦＩ／ＦＳ１−６５及びＦＳ１−６５  Ｆｃａｂの結合性を、細胞株をｍＡｂ２又はＦｃａｂと流動緩衝液中、氷上で１時間インキュベートすることによって評価した。野生型（WT）Ｆｃａｂ及びＩｇＧを対照として使用した。細胞を洗浄し、ｍＡｂ２又はＦｃａｂの結合をＲ−フィコエリトリン−コンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Jackson、#109-116-098）で検出し、暗所の氷上で４５分間インキュベートした。過剰の二次抗体を洗浄除去し、フローサイトメーター（FACSCantoII、BD Biosciences）を使用するフローサイトメトリーによってシグナルを分析した。幾何平均蛍光シグナルをｍＡｂ２又はＦｃａｂ濃度に対してプロットし、ＥＣ５０を決定した（表１５）。全ての抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２及びＦｃａｂは、ＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＨＣＣ８２７細胞株に濃度依存的に結合したが、一方でＷＴ  Ｆｃａｂ及びＩｇＧは結合せず、これは、ＥＧＦＲへのこれらのｍＡｂ２及びＦｃａｂの特異性を実証していた。
【０２１３】
【表１５】
2019528048.tif 000016
【０２１４】
Ｈｉｓタグ付きヒトＥＧＦＲ（Sino Biological）に対する抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２の結合親和性を、ＳＰＲを使用して決定した。親和性の測定のために、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（GE healthcare）及び６１２０〜８５２０ＲＵの抗ヒトＦａｂ抗体（GE healthcare、28-9583-25）で被覆されたＣＭ５チップを使用した。抗Ｆａｂ被覆ＣＭ５チップ上に捕捉するために、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（GE Healthcare）中の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２（５μｇ／ｍｌ）を１０μｌ／分で５分間注入した。一連の濃度のヒトＥＧＦＲ（０．２７〜１３９ｎＭ）を３０μｌ／分で１０分間注入して結合速度を測定した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液を１０分間注入して解離速度を決定した。ｍＡｂ２捕捉工程なしにフローセルにＥＧＦＲ抗原を注入することによって参照の減算を行った。１０ｍＭグリシンを３０μｌ／分で６０秒間、２回使用して抗Ｆａｂ表面を再生した。１：１（Langmuir）適合モデルからＢＩＡｃｏａｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０（GE Healthcare）を使用して結合親和性（KD）を得た。結果により、抗ＥＧＦＲベースのｍＡｂ２がヒトＥＧＦＲに１．６〜３．６ｎＭの間の親和性で結合することが示された（表１６参照）。
【０２１５】
【表１６】
2019528048.tif 000017
【０２１６】
実施例２１−ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究：ＥＧＦＲによって駆動されるヒト患者由来肺腺癌異種移植モデルＬＸＦＡ６７７の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２処置
ヒト患者由来異種移植（PDX）腫瘍を担持するマウスを使用してＥＧＦＲ標的化模擬ｍＡｂ２のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を評価した。実施例１０に記載されたのと同じ方法を使用した。
【０２１７】
マウス７匹の群を以下で処置した：模擬ｍＡｂ２  ４４２０／ＦＳ１−６０、４４２０／ＦＳ１−６５、４４２０／ＦＳ１−６７、セツキシマブ、対照４４２０  ｍＡｂ、又はビヒクル対照としてのＰＢＳ。ｍＡｂ２又は対照ｍＡｂ試料を２０ｍｇ／ｋｇで投薬し、ビヒクルを１０ｍｌ／ｋｇで投薬した。２週間かけて７回の処置を静脈内投与した。腫瘍体積を週２回８８日目まで監視した。
【０２１８】
抗ＥＧＦＲ模擬ｍＡｂ２  ４４２０／ＦＳ１−６０、４４２０／ＦＳ１−６５及び４４２０／ＦＳ１−６７を用いた処置は、全体的完全腫瘍寛解をもたらしたが、全３群において個別の腫瘍は単に部分的な寛解を受けただけであった。４４２０対照ｍＡｂは、いかなる抗腫瘍有効性も示さなかった（図１３）。最終投薬の１から５週間後に、４４２０／ＦＳ１−６５を投薬されたマウス１匹を除き、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２で処置された全ての動物で腫瘍の再成長が観察された。ビヒクル対照群及び４４２０対照群と比べて全てのｍＡｂ２で、腫瘍成長における４００％までの統計的に有意な遅れが観察された（Kaplan-Meier）（表１７）。結論として、耐容性良好な用量レベルで、全部で３つのｍＡｂ２は、ＥＧＦＲ依存性ＰＤＸモデル、ＬＸＦＡ  ６７７において完全寛解をもたらした。
【０２１９】
試験された３つのｍＡｂ２は、マウスＥＧＦＲと交差反応性であり、したがって、ヒトＥＧＦＲ特異的セツキシマブと比較してシンク効果をもたらすおそれがあろうことは、公知である。シンク効果を代償するための抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２のさらなる投薬は、連続腫瘍寛解をもたらすと仮定されている。或いは、処置の開始前の負荷用量が、この影響を回避することもできるであろう。
【０２２０】
【表１７】
2019528048.tif 000018
【０２２１】
配列表
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６０  ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
FS1-60 ABループ - LDEGGP（配列番号１）
FS1-60 CDループ - TYG（配列番号２）
FS1-60 EFループ - SHWRWYS（配列番号３）
【０２２２】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６０  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）
GQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVSHWRWYSGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２２３】
Ｃ末端リシンを含むＦｃａｂ  ＦＳ１−６０  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）
GQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVSHWRWYSGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号６８）
【０２２４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６０  ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号５）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTTGGATGAGGGGGGTCCTGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCACTTATGGGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGTCTCATTGGAGGTGGTACTCTGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
【０２２５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６０のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVSHWRWYSGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２２６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６０のＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）
GCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCTAGCAGGGACGAGCTGGATGAAGGCGGACCTGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCACCTACGGCCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTTCTGTACTCCCGCCTGACCGTGTCCCACTGGCGGTGGTACTCTGGCAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC
【０２２７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６５  ＣＨ３ドメインの構造ループのアミノ酸配列
FS1-65 ABループ - LDEGGP（配列番号１）
FS1-65 CDループ - TYG（配列番号２）
FS1-65 EFループ - SYWRWVK（配列番号８）
【０２２８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９）
GQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWVKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２２９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６５  ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTTGGATGAGGGGGGTCCTGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCACTTATGGGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTCTTACTGGAGGTGGGTTAAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
【０２３０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６５のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWVKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２３１】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６５のＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）
GCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTTGGATGAGGGGGGTCCTGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCACTTATGGGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTCTTACTGGAGGTGGGTTAAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
【０２３２】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６７のＣＨ３構造ループのアミノ酸配列
FS1-67 ABループ - TDDGP（配列番号１３）
FS1-67 CDループ - TYG（配列番号２）
FS1-67 EFループ - SYWRWYK（配列番号１４）
【０２３３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６７のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１５）
GQPREPQVYTLPPSRDETDDGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWYKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２３４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６７のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGACTGACGACGGTCCGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCACTTATGGGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTCTTACTGGAGGTGGTACAAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
【０２３５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６７のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDETDDGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWYKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２３６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６７のＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）
GCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGACTGACGACGGTCCGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCACTTATGGGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGTCTTACTGGAGGTGGTACAAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
【０２３７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６０、Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６５、及びＦｃａｂ  ＦＳ１−６７のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１９）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
【０２３８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６０、Ｆｃａｂ  ＦＳ１−６５、及びＦｃａｂ  ＦＳ１−６７のＣＨ２ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号２０）
GCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAG
【０２３９】
リロツムマブ（RI）ＣＤＲのアミノ酸配列
RI CDR1 VH - IYYWS（配列番号２１）
RI CDR2 VH - YVYYSGSTNYNPSLKS（配列番号２２）
RI CDR3 VH - GGYDFWSGYFDY（配列番号２３）
RI CDR1 VL - RASQSVDSNLA（配列番号２４）
RI CDR2 VL - GASTRAT（配列番号２５）
RI CDR3 VL - QQYINWPPIT（配列番号２６）
【０２４０】
リロツムマブ（RI）重鎖のアミノ酸配列（配列番号２７）
斜体字＝リロツムマブＶＨ（CDRに下線）；太字＝ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１；太字及び下線＝ヒトＩｇＧ２ヒンジ；太字及び斜体字＝ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２；太字、斜体字及び下線＝ヒトＩｇＧ２  ＣＨ３
【０２４１】
【表１８】
2019528048.tif 000019
【０２４２】
リロツムマブ（RI）及びＲＩ／ＦＳ１−６０、ＲＩ／ＦＳ１−６５、及びＲＩ／ＦＳ１−６７軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２８）
斜体字＝リロツムマブＶＬ（CDRに下線）；太字＝ヒトＩｇＧカッパ定常領域
【０２４３】
【表１９】
2019528048.tif 000020
【０２４４】
リロツムマブ（RI）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２９）
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYVYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGGYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSS
【０２４５】
リロツムマブ（RI）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３０）
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVDSNLAWYRQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYINWPPITFGQGTRLEIKR
【０２４６】
フィクラツズマブ（FI）のＣＤＲのアミノ酸配列
FI CDR1 VH - TYWMH（配列番号３１）
FI CDR2 VH - EINPTNGHTNYNQKFQG（配列番号３２）
FI CDR3 VH - NYVGSIFDY（配列番号３３）
FI CDR1 VL - KASENVVSYVS（配列番号３４）
FI CDR2 VL - GASNRES（配列番号３５）
FI CDR3 VL - GQSYNYPYT（配列番号３６）
【０２４７】
フィクラツズマブ（FI）重鎖のアミノ酸配列（配列番号３７）
斜体字＝フィクラツズマブＶＨ（CDRに下線）；太字＝ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１；太字及び下線＝ヒトＩｇＧ１ヒンジ；太字及び斜体字＝ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２；太字、斜体字及び下線＝ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３
【０２４８】
【表２０】
2019528048.tif 000021
【０２４９】
フィクラツズマブ（FI）及びＦＩ／ＦＳ１−６０、ＦＩ／ＦＳ１−６５、及びＦＩ／ＦＳ１−６７軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３８）
斜体字＝フィクラツズマブＶＬ（CDRに下線）；太字＝ヒトＩｇＧカッパ定常領域
【０２５０】
【表２１】
2019528048.tif 000022
【０２５１】
フィクラツズマブ（FI）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）
QVQLVQPGAEVKKPGTSVKLSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPTNGHTNYNQKFQGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYVGSIFDYWGQGTLLTVSS
【０２５２】
フィクラツズマブ（FI）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４０）
DIVMTQSPDSLAMSLGERVTLNCKASENVVSYVSWYQQKPGQSPKLLIYGASNRESGVPDRFSGSGSATDFTLTISSVQAEDVADYHCGQSYNYPYTFGQGTKLEIKR
【０２５３】
ｍＡｂ２  ＲＩ／ＦＳ１−６０重鎖のアミノ酸配列（配列番号４１）
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYVYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGGYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVSHWRWYSGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２５４】
ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６０重鎖のアミノ酸配列（配列番号４２）
QVQLVQPGAEVKKPGTSVKLSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPTNGHTNYNQKFQGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYVGSIFDYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVSHWRWYSGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２５５】
ｍＡｂ２  ＲＩ／ＦＳ１−６５重鎖のアミノ酸配列（配列番号４３）
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYVYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGGYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWVKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２５６】
ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６５重鎖のアミノ酸配列（配列番号４４）
QVQLVQPGAEVKKPGTSVKLSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPTNGHTNYNQKFQGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYVGSIFDYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELDEGGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWVKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２５７】
ｍＡｂ２  ＲＩ／ＦＳ１−６７重鎖のアミノ酸配列（配列番号４５）
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYVYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGGYDFWSGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRDETDDGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWYKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２５８】
ｍＡｂ２  ＦＩ／ＦＳ１−６７重鎖のアミノ酸配列（配列番号４６）
QVQLVQPGAEVKKPGTSVKLSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPTNGHTNYNQKFQGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYVGSIFDYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDETDDGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWYKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２５９】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片（野生型[WT]Fcab）のアミノ酸配列（配列番号４７）
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２６０】
ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号４８）
EPKSCDKTHTCPPCP
【０２６１】
短縮形ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号４９）
TCPPCP
【０２６２】
９Ｄ９軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５０）
DIVMTQTTLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
【０２６３】
９Ｄ９軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）
GACATCGTGATGACCCAGACCACCCTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGACCAGGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAGCCGACGCCGCCCCCACCGTGAGCATCTTCCCCCCCAGCAGCGAGCAGCTGACCAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAACGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACAGCTGGACCGACCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGAGACACAACAGCTACACCTGCGAGGCCACCCACAAGACCAGCACCAGCCCCATCGTGAAGAGCTTCAACAGAAACGAGTGC
【０２６４】
９Ｄ９ｍ２ａ重鎖のアミノ酸配列（配列番号５２）
EIQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSTAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
【０２６５】
９Ｄ９ｍ２ａ重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号５３）
GAGATCCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGTGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAGTGGATCGGCGTGATCAACCCCTACAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGGCAGCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTGAGCACCGCCAAGACCACCGCCCCCAGCGTGTACCCCCTGGCCCCCGTGTGCGGCGACACCACCGGCAGCAGCGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCCGTGACCCTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCAGCGTGACCGTGACCAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGAGCATCACCTGCAACGTGGCCCACCCCGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAGATCGAGCCCAGAGGCCCCACCATCAAGCCCTGCCCCCCCTGCAAGTGCCCCGCCCCCAACCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCAGCCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCGAGGACGACCCCGACGTGCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAGGTGCACACCGCCCAGACCCAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGAGCGCCCTGCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGCGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACAAGGACCTGCCCGCCCCCATCGAGAGAACCATCAGCAAGCCCAAGGGCAGCGTGAGAGCCCCCCAGGTGTACGTGCTGCCCCCCCCCGAGGAGGAGATGACCAAGAAGCAGGTGACCCTGACCTGCATGGTGACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAGTGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAGAAGAAGAACTGGGTGGAGAGAAACAGCTACAGCTGCAGCGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCAGAACCCCCGGCAAG
【０２６６】
９Ｄ９ｈ１重鎖のアミノ酸配列（配列番号５４）
EIQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSTAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２６７】
９Ｄ９ｈ１重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号５５）
GAGATCCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGTGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAGTGGATCGGCGTGATCAACCCCTACAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGGCAGCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTGAGCACCGCCAAGACCACCGCCCCCAGCGTGTACCCCCTGGCCCCCGTGTGCGGCGACACCACCGGCAGCAGCGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCCGTGACCCTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCAGCGTGACCGTGACCAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGAGCATCACCTGCAACGTGGCCCACCCCGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAGATCGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
【０２６８】
９Ｄ９／ＦＳ１−６７重鎖のアミノ酸配列（配列番号５６）
EIQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSTAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDETDDGPVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESTYGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSYWRWYKGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２６９】
９Ｄ９／ＦＳ１−６７重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号５７）
GAGATCCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGTGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAGTGGATCGGCGTGATCAACCCCTACAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGGCAGCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTGAGCACCGCCAAGACCACCGCCCCCAGCGTGTACCCCCTGGCCCCCGTGTGCGGCGACACCACCGGCAGCAGCGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCCGTGACCCTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCAGCGTGACCGTGACCAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGAGCATCACCTGCAACGTGGCCCACCCCGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAGATCGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGAGACGAGACCGACGACGGCCCCGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCACCTACGGCCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGAGCTACTGGAGATGGTACAAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGC
【０２７０】
イピリムマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５８）
DIQMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２７１】
イピリムマブ軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号５９）
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGGGCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGGCGCCTTCAGCAGAGCCACCGGCATCCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGACTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCAGCAGCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGCGAGTGC
【０２７２】
イピリムマブ重鎖のアミノ酸配列（配列番号６０）
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０２７３】
イピリムマブ重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号６１）
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGCACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACCTTCATCAGCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGAACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGAGAAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCCCCGTGGCCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
【０２７４】
ＨｕＬ２Ｇ７  ＣＤＲのアミノ酸配列
HuL2G7 CDR1 VH - GNWIE（配列番号６２）
HuL2G7 CDR2 VH - EILPGSNTNYNEFKFKG（配列番号６３）
HuL2G7 CDR3 VH - GGHYYGSSWDY（配列番号６４）
HuL2G7 CDR1 VL - KASENVVTYVS（配列番号６５）
HuL2G7 CDR2 VL - GASNRYT（配列番号６６）
HuL2G7 CDR3 VL - GQGYSYPYT（配列番号６７）
【０２７５】
参考文献
All documents mentioned in this specification are incorporated herein by reference in their entirety.
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【図１】
2019528048.tif 000023
【図２】
2019528048.tif 000024
【図３】
2019528048.tif 000025
【図４】
2019528048.tif 000026
【図５】
2019528048.tif 000027
【図６】
2019528048.tif 000028
【図７】
2019528048.tif 000029
【図８】
2019528048.tif 000030
【図９−１】
2019528048.tif 000031
【図９−２】
2019528048.tif 000032
【図９−３】
2019528048.tif 000033
【図９−４】
2019528048.tif 000034
【図１０−１】
2019528048.tif 000035
【図１０−２】
2019528048.tif 000036
【図１１−１】
2019528048.tif 000037
【図１１−２】
2019528048.tif 000038
【図１２】
2019528048.tif 000039
【図１３】
2019528048.tif 000040
【配列表】
2019528048000001.app
【国際調査報告】
2019528048.tif 000041
2019528048.tif 000042