(57)【要約】本発明は、細胞及び／又は生物の適応実験室進化に関する。特に、本発明は、遺伝子操作を必要とせずに所望の代謝形質を生成するための細胞又は生物の適応実験室進化の方法に関する。さらに、本発明は、コンピュータプログラム要素及びコンピュータ可読媒体を提供する。さらに、本発明は、本発明の方法によって得られる細胞又は生物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は生物の所望の代謝形質を進化させる進化化学環境の適合性を評価する方法であって、代謝モデルにおける複数のフラックスの関数のうちの１つ又は幾つかのシミュレーションを含み、
前記代謝モデルが、生化学反応の化学量論的表現、並びに細胞外化合物の移入及び移出を含み、
前記代謝形質が１セットの標的を含み、
前記標的がフラックスの関数である、
方法。
【請求項２】
前記所望の代謝形質が標的化学環境において適応度の利点を与えず、前記細胞又は生物が使用されるように意図される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所望の代謝形質が前記進化化学環境において適応度の利点を与える、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
増殖と比較した１つ又は幾つかの標的のシミュレーションが行われ、
前記増殖が、バイオマス成分又はバイオマスを生成する反応（単数又は複数）を介したフラックスの関数であり、前記増殖がある固定値又は範囲内に制限されてシミュレーションが行われる、
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
制限が取り込みのいずれかについて設定されてシミュレーションが行われ、
取り込みが細胞外化合物の移入である反応を介したフラックスの関数である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
取り込みの合計がある固定値又は範囲内に制限されてシミュレーションが行われ、任意選択で、取り込みの合計が最適値に制限されてシミュレーションが行われ、及び／又は取り込みのいずれかがある固定値又は範囲内に制限されてシミュレーションが行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上方制御標的と下方制御標的が逆方向に最適化され、
前記上方制御標的は、増加が望ましい標的であり、
前記下方制御標的は、減少が望ましい標的であり、
任意選択で、上方制御標的の絶対値が最小化され、下方制御標的の絶対値が最大化され、及び／又は少なくとも１つの閾値を超える、若しくは下回る、標的の数が最適化される、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの閾値を超える、又は下回る、増殖と比較した標的の数がシミュレートされ、任意選択で、前記少なくとも１つの閾値が、参照化学環境においてフラックスの関数に対して決定される、
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シミュレーションにおいて、少なくとも１つの抑制されたフラックスが定義され、任意選択で、前記進化化学環境に含まれる抑制体又は調節性トリガーの標的である反応を介してゼロフラックスに制限することによってシミュレーションが行われる、
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記進化化学環境の数値スコアの決定を更に含み、
前記スコアが、前記化学環境における前記標的に対する最低の場合の淘汰圧の強度を示し、
前記スコアが、前記進化化学環境における前記淘汰圧による前記標的の最低の場合の適用範囲を示し、及び／又は
前記スコアが、前記進化化学環境の前記スコアを決定する際の前記進化化学環境における成分の数を考慮する、
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
増殖と比較した標的反応を介した１つ又は幾つかのフラックスの関数のシミュレーションが行われる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、
（ａ）複数の制限を課すモデルの第１の最適化を行い、それによって第１の最適化結果を決定するステップであって、
ある制限が、増殖をある固定値又は範囲に限定する条件を設定し、
ある制限が、前記モデルにおけるフラックスに対して熱力学的境界を設定し、
前記モデルの前記第１の最適化が、取り込みの合計を最適化する
ステップと、
（ｂ）前記第１の最適化結果を用いて第２の最適化を行い、それによって第２の最適化結果を決定するステップであって、
ある制限が、増殖をある固定値又は範囲に設定し、
ある制限が、取り込みの合計を前記第１の最適化結果に設定し、
前記第２の最適化結果が、前記進化化学環境の適合性を示し、
前記モデルの前記第２の最適化が、上方制御標的の合計の最適化として確認された条件を促進し、
前記モデルの前記第２の最適化が、下方制御標的の合計の最適化として確認された条件を促進する
ステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
（ｃ）前記モデルの第３の最適化を行い、それによって第３の最適化結果を決定するステップであって、
参照化学環境における上方制御標的に関して増強された上方制御標的の数が最適化され、参照化学環境における下方制御標的に関して抑制された下方制御標的の数が最適化される
ステップ
を更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記スコアがｖａｌｕｅ
【数１】
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によって与えられ、
式中、
−  ｎは、標的の数を表し、
−  ｃｏｖｅｒａｇｅは、ステップ（ｃ）で得られる標的の最小値を表し、
−  ｕは、上方制御標的の数を表し、
−  ｓｔｒｅｎｇｔｈは、ステップ（ｂ）で得られる上方制御標的の最小合計と下方制御標的の最大合計の合計を表し、
−  ｃは、前記進化化学環境における成分の数を表し、
−  Ｗｃ、Ｗｓ及びＷｍは、数学的重みを表す、
請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１４】
細胞又は生物の代謝形質を進化させる進化化学環境を決定する方法であって、
（ａ）請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法を用いて、代謝形質を進化させる少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境に属する、代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの化学環境を選択するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）において、代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％に属する化学環境が選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞又は生物の代謝形質を進化させる方法であって、
（ａ）請求項１２に記載のステップ（ａ）及び（ｂ）に従って、前記細胞又は生物の前記代謝形質を進化させる進化化学環境を決定するステップ、
（ｃ）所望の形質を進化させる進化化学環境において前記細胞又は生物を増殖させるステップ、
（ｄ）前記細胞又は生物によって少なくとも１種の所望の生成物を生成するために前記細胞又は生物を標的化学環境において増殖させるステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
微生物が酵母、好ましくはサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、より好ましくはサッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の進化化学環境の適合性を評価する方法、請求項１４又は１５に記載の進化化学環境を決定する方法、請求項１６に記載の代謝形質を進化させる方法。
【請求項１８】
前記代謝形質が少なくとも１種の芳香化合物の生成の増加である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１種の芳香化合物が、芳香族芳香化合物、若しくは分枝鎖アミノ酸由来芳香体、又はその前駆体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記芳香族芳香化合物が酢酸フェニルエチルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記代謝形質が、乳酸菌増殖を増強するアミノ酸の生成の増加である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法によって得られる細胞又は生物。
【請求項２３】
プロセッサによって実行されると、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法ステップを行うように適合されたコンピュータプログラム要素を含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項２４】
請求項１４又は１５のステップを含む、所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別するための選択化学環境を決定する方法であって、
代謝形質を進化させる化学環境の適合性が、所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別するための前記化学環境の適合性と相関する、
方法。
【請求項２５】
選択化学環境を用いて所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別する方法であって、
（ａ）請求項２４に記載の選択化学環境を決定するステップ、
（ｂ）少なくとも２種の細胞又は生物を前記選択化学環境において増殖させるステップ、
（ｃ）前記選択環境において他の細胞又は生物の１種以上よりも高い増殖を示す少なくとも１種の細胞又は生物を選択するステップ
を含み、
前記選択環境におけるより高い増殖は、前記細胞又は生物が前記所望の代謝形質を含むことを示す、
方法。
【請求項２６】
前記所望の代謝形質が前記標的化学環境において適応度の利点を与えない、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記所望の代謝形質が前記選択化学環境において適応度の利点を与える、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞及び／又は生物の適応実験室進化に関する。特に、本発明は、遺伝子操作を必要とせずに所望の代謝形質を生成するための細胞又は生物の適応実験室進化の方法に関する。さらに、本発明は、コンピュータプログラム要素及びコンピュータ可読媒体を提供する。さらに、本発明は、本発明の方法によって得られる細胞又は生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
適応実験室進化とは、特定の増殖条件下で選択中に細胞又は（微）生物の集団に蓄積する適応変化をもたらす、明確な条件下での細胞又は生物の培養を指す。
【０００３】
微生物株の設計改変は、最近、例えば、遺伝子操作が望ましくないことが多い、又は全く適用できない食品産業において、関心が次第に高まっている。さらに、遺伝子操作を適用できる場合でも、この方法は、特に複合形質の発生にやはり限定される。
【０００４】
これまで、所望の形質が適応実験室進化中にどのように発生するかを予測することは困難であった。特に、様々なパラメータ又は成分が変動する条件下で所望の形質を予測することは難題である。
【０００５】
特に、細胞の適応度を最大にしない代謝形質を確立することは困難である。自然淘汰は、適応度のより高い細胞を好むので、適応進化条件の選択は、特に、所望の代謝形質が標的条件において細胞の適応度を最大にしないときには、非直観的である。「標的条件」又は「標的生態的地位」という用語は、所望の適用例、例えば、風味化合物の製造又はワイン発酵が意図される、細胞又は生物の化学環境を指す。
【０００６】
したがって、代謝形質の改変を設計可能な、及び／又は複合代謝形質を発生可能な方法が必要である。特に、所望の代謝形質を進化させる化学環境の適合性を評価する方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、所望の代謝形質を発生させる適応進化のための化学環境を設計する方法を提供することである。
【０００８】
この目的は、独立請求項の一項に係る主題によって解決することができる。本発明の実施形態は、従属請求項中に、また、図面に関して、記述される。
【０００９】
記述される実施形態は、同様に、化学環境の適合性を評価する方法、コンピュータプログラム要素、及びコンピュータ可読媒体に関する。相乗効果が実施形態の様々な組合せから生じ得るが、それらは詳述されない場合もある。なお、本発明の状況においては、「フラックス」及び「フラックスの関数」並びに「複数のフラックス」及び「複数のフラックスの関数」という用語は、区別なく使用される。
【００１０】
さらに、方法に関する本発明のすべての実施形態は、記述されるステップの順序で行うことができるが、それでもこれが方法のステップの唯一の必須な順序である必要はないことに留意されたい。方法ステップの異なる順序及び組合せすべてがこれによって記述される。
【００１１】
本発明の第１の態様によれば、細胞又は生物の所望の代謝形質を進化させる化学環境の適合性を評価する方法が提供される。該方法は、代謝モデルにおける１つ又は幾つかのフラックスのシミュレーション、特に代謝モデルにおける１つ又は幾つかのフラックスの関数のシミュレーションを含む。それに関して、代謝モデルは、生化学反応の化学量論的表現、並びに細胞外化合物の移入及び移出を含む。代謝形質は、１セットの標的を含み、後者は、細胞又は生物において生じるフラックスの関数である。
【００１２】
所望の代謝形質は、細胞又は生物の所望の適用例が意図される標的環境において適応度の利点を与えない。
【００１３】
特に、所望の代謝形質は、それが適応度の利点を与える進化化学環境において進化するが、標的環境においては、所望の形質は適応度の利点を与えない。標的環境においては、所望の形質が活用される。標的環境においては、所望の形質は、少なくとも１つの所望のフラックスの増加若しくは減少を許容し、及び／又は少なくとも１つのフラックスの増加若しくは減少を回避する。特定の一実施形態においては、標的環境において、所望の形質は、少なくとも１種の所望の生成物の生成フラックスの増加を許容する。
【００１４】
当業者の理解するところによれば、進化環境と標的環境は異なり、例えば、進化環境と標的環境はそれらの組成が異なる。
【００１５】
したがって、特定の一実施形態は、細胞又は生物の所望の代謝形質を進化させる化学環境の適合性を評価する方法であって、所望の代謝形質が適応度の利点を与えない異なる化学環境で細胞又は生物が使用されることが意図される方法に関する。
【００１６】
換言すれば、一部の実施形態は、細胞又は生物の所望の代謝形質を進化させる進化化学環境の適合性を評価する方法であって、所望の代謝形質が適応度の利点を与えない標的環境において活用される方法に関する。
【００１７】
本発明に係る方法を用いて、細胞又は生物の所望の代謝形質を進化させるのに使用することができる適切な化学環境を決定することができる。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、化学量論行列が代謝モデルを表すのに使用される。あるいは、代謝モデルのグラフ表示を用意することができる。
【００１９】
本発明の状況におけるモデルにおける１つ又は幾つかのフラックスの関数のシミュレーションとは、１つ又は幾つかのフラックスの関数の最適化を指し得ることに留意されたい。
【００２０】
本発明に係る代謝形質は、細胞又は生物の対応するモデルの幾つかの標的のうちの１つ又はそれらの組合せによって構築される細胞又は生物の代謝特性である。したがって、代謝形質は、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の標的などの少なくとも１つの標的、好ましくは少なくとも２つの標的によって構築される。標的は、細胞又は生物において生じるフラックスの関数である。
【００２１】
一般に、代謝形質は、数世代の細胞又は生物にわたって進化する。それは、少なくとも２世代、例えば、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００又はそれ以上の世代、好ましくは少なくとも５０世代、より好ましくは約１００世代の細胞又は生物が、代謝形質の進化に必要であることを意味する。それは、細胞又は生物がある期間、化学環境において、特に進化化学環境において、数日、数週、数か月又は数年培養されることを意味する。
【００２２】
「代謝形質」という用語は、細胞又は生物の代謝的特徴、例えば、ある生成物をある条件下で生成する能力、あるｐＨ、あるガスレベル又はある栄養素、好ましくはあるガスレベル又はある栄養素などのある条件下で生存及び再生する能力を指す。
【００２３】
化学環境は、代謝形質を確立するのに適切である場合、代謝形質を進化させるのに適切とみなされる。すなわち、細胞又は生物の集団が化学環境中で維持される、すなわち培養されるとき、細胞又は生物の集団の一部が代謝形質を確立し、例えば、少なくとも１種の細胞又は生物が代謝形質を確立する。好ましくは、集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又はそれ以上が代謝形質を確立する。
【００２４】
「代謝形質を確立する」という用語は、代謝形質が進化化学環境及び／又は標的化学環境において２、１０、１００、１０００、５０００又はそれ以上の世代などの次世代で失われないことを意味する。特に、これは、代謝形質を有する細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％において、この形質が次世代で失われないことを意味する。
【００２５】
本発明の状況においては、上方制御標的であるモデルにおいて少なくとも１つのフラックスの関数を有することが望ましい場合もあり、上方制御標的は、化学環境への曝露による増加が望まれるフラックスの関数である。
【００２６】
細胞又は生物の特定の代謝形質を進化させる化学環境の適合性を定量的に査定／評価できることが本発明の特別な一効果である。本発明の所望の適用例とは、方法内で決定される適切な化学環境を用いた進化生態的地位における細胞又は生物の進化を指す。決定された適切な化学環境における進化は、所望の代謝形質を補強又は増強する。続いて細胞又は生物を標的生態的地位、例えば生成化学環境に移すと、細胞又は生物の補強又は増強された代謝形質は、例えば酵母によって生成される、風味化合物などの所望の生成物を生じる。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、増殖と比較した１つ又は幾つかの標的のシミュレーションが行われる。それに関して、増殖は、バイオマス成分又はバイオマスを生成する反応（単数又は複数）を介したフラックスの関数である。
【００２８】
「標的反応」又は「標的」は、方法に関連してスケールを設定又は導入するために、増殖と比較して考察される。これによって、異なる環境を互いに比較することができる。例えば、適応進化における反応に対する、すなわち所与の酵素の活性に対する、淘汰圧は、増殖の１単位当たりに必要な標的が高いほど高いと考えることができる。これは、適応進化における自然淘汰が高速／高収率増殖を好むからである。例えば、第１の環境においては、上方制御標的は、細胞中の増殖に比べて値が高い。しかし、第２の環境においては、同じ標的の値は、細胞の増殖に比べて低い。どちらの場合も、増殖最適性を想定している。高い増殖速度又は増殖収率の場合、第１の環境の場合の標的の値は、第２の場合より高くなるはずである。それぞれ２つの場合の各々における増殖と比較して、２つの化学環境を互いに定量的レベルで比較することができる。
【００２９】
一実施形態においては、少なくとも１つの上方制御標的が、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸デヒドロゲナーゼ、チロソールデヒドロゲナーゼ、チロソール分泌及び４−ヒドロキシフェニル酢酸分泌からなる群から選択され、及び／又は少なくとも１つの下方制御標的が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及び４−ヒドロキシピルビン酸分泌から選択される。
【００３０】
特定の一実施形態においては、上方制御標的が、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸デヒドロゲナーゼ、チロソールデヒドロゲナーゼ、チロソール分泌及び４−ヒドロキシフェニル酢酸分泌であり、下方制御標的が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及び４−ヒドロキシピルビン酸分泌である。
【００３１】
本発明の一実施形態によれば、シミュレーションは、増殖がある固定値又は範囲内に制限されて行われる。
【００３２】
増殖のこうした制限は、異なる化学環境の比較の可能性を更に向上させる。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、シミュレーションは、制限が細胞又は生物のモデルにおける任意の取り込みに対して設定されて行われる。それに関して、取り込みは、細胞外化合物の取り込みである反応（単数又は複数）を介したフラックス（単数又は複数）の関数である。
【００３４】
細胞外化合物の取り込みは、例えば輸送体又は小胞によって媒介される、能動的、又は細胞中への化合物の拡散による受動的であり得る。代謝フラックスに影響する細胞又は生物の受容体又は酵素と化合物の相互作用も包含される。
【００３５】
本発明の一実施形態によれば、シミュレーションは、取り込みの合計がある固定値に制限されて、又はある固定範囲内に制限されて、行われる。
【００３６】
例えば、取り込みの合計をある固定された増殖において最小限にすることによって得られる固定値に取り込みの合計を制限することができる。こうした設定は、増殖への最適又はほぼ最適な変換の状況に関係する。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、シミュレーションは、最適値に制限される取り込みの絶対値の合計で行われる（すなわち、Ｌ１ノルム）。
【００３８】
本発明の一実施形態によれば、シミュレーションは、取り込みのいずれかがある固定値に制限されて、又はある固定範囲内に制限されて、行われる。
【００３９】
本発明の一実施形態によれば、シミュレーションは、取り込みのいずれかが最適値に制限されて行われる。「最適値」という用語で極値を示すことができる。これらは、例えば、モデルにおいて定義された反応の方向に応じて最小値又は最大値とすることができる。
【００４０】
本発明の更なる一実施形態によれば、上方制御標的と下方制御標的は、逆方向に最適化される。
【００４１】
それに関して、上方制御標的は増加が望ましい標的であり、下方制御標的は減少が望ましい標的である。上方制御標的は、したがって、細胞又は生物の所望の代謝形質を増加させ得る。一方、下方制御標的は、所望の代謝形質に対して望ましくない効果、否定的な効果を有し得る、又は効果のない可能性のある、標的である。
【００４２】
特定の化学環境における細胞又は生物のシミュレーションにおいては、幾つかの可能な解決策が上方制御及び下方制御標的で生じ、形質を増強するそれらの能力が異なる場合がある。本発明の要旨は、形質を増強する最低の解決策（単数又は複数）を各環境で選択し、これらの最低の解決策（単数又は複数）を化学環境の比較に使用することである。上方制御標的（単数又は複数）を増強する、及び／又は下方制御標的（単数又は複数）を抑制する、それらの最低の能力に基づいて化学環境を比較するために、上方制御標的の絶対値を最小限にし、下方制御標的の絶対値を最大にすることができる。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、シミュレーション内で、絶対的フラックス値が検討され、シミュレーションは絶対的フラックス値を用いて行われる。
【００４４】
代謝モデルにおいては、フラックスの符号は、モデルにおいて定義されるフラックスの方向に依存する。負のフラックスは、このフラックスが、対応する正符号のフラックスと逆方向に向かうことを示す。
【００４５】
本発明の一実施形態によれば、少なくとも１つの閾値を超える、又は下回る、標的の数が最適化される。この最適化は、化学環境を改善するのに役立ち得る。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、少なくとも１つの閾値を超える、又は下回る、増殖と比較した標的の数がシミュレートされる。
【００４７】
前もって設定された閾値を超える増殖と比較した標的の数は、化学環境による標的の適用範囲についての情報を与えることができる。
【００４８】
「標的の適用範囲」という尺度は、幾つのフラックスが参照条件に比べて優れた様式で最適化されるかを示すことができる。前もって設定された閾値は、参照条件におけるフラックス（単数又は複数）の関数とすることができる。さらに、任意選択で、参照条件と比較すべき標的の値がどのくらい高い又は低いかを判定する閾値を適用する。
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、少なくとも１つの閾値が、参照化学環境においてフラックスの関数に対して決定される。
【００５０】
参照化学環境は、原則的に、任意に選択することができる。方法の一目的は、参照環境における細胞又は生物中の標的の進化よりも細胞又は生物中の標的の良好な進化を可能にする化学環境を決定することである。例えば、酵母の参照化学環境は、ワイン製造用酵母の増殖に使用されるブドウマスト培地であろう。
【００５１】
本発明の更なる一実施形態によれば、シミュレーション内で、少なくとも１つの抑制フラックスが定義される。
【００５２】
本発明の一実施形態によれば、シミュレーションは、化学環境において成分として含まれる、基質類似体などの抑制体、又は２−デオキシグルコースなどの調節性トリガーの標的である反応を介してフラックスを制限することによって行われる。
【００５３】
「調節性トリガー」という用語は、細胞又は生物において、例えば転写調節によって、経路、特に代謝経路を活性化又は抑制する化合物を指す。
【００５４】
「抑制体」という用語は、細胞又は生物、例えば基質類似体において、反応、特に代謝反応を抑制する化合物を指す。
【００５５】
その結果、本発明の更なる一実施形態によれば、シミュレーションは、これらのフラックスをゼロに制限することによって行うことができ、これらは、化学環境において成分として含まれる抑制体又は調節性トリガーの標的である。
【００５６】
一実施形態によれば、方法は、化学環境の数値スコアを決定する後続の追加のステップを含む。それに関して、スコアは、化学環境における標的に対する淘汰圧の強度を示す。さらに、スコアは、化学環境における淘汰圧による標的の適用範囲を示す。
【００５７】
数値スコアの定義及び決定の明示的一例については後述する。
【００５８】
一実施形態によれば、方法は、数値スコアの決定のステップを更に含み、スコアは、化学環境における標的に対する最低の場合の淘汰圧の強度、及び化学環境における淘汰圧による標的の最低の場合の適用範囲を示す。
【００５９】
更なる一実施形態によれば、数値スコアは、上記実施形態の１つに基づいて定義され、更に化学環境における成分の数を考慮する。
【００６０】
ことによると、化学環境における成分の数が少ないほど、環境は費用効果が高い可能性がある。さらに、異なる化合物／成分が化学環境からどのように取り入れられるかを演繹的に知ることは容易でないことが多い。これは、特に、幾つかの成分が一緒に提供される場合に該当する。多数の成分の場合、化学環境における細胞が少なくとも最適割合の近くで成分を取り入れ、使用できる可能性が低くなり得る。この状況においては、最適割合は、最適な増殖に対応する割合として理解されるべきである。
【００６１】
数値スコアを更に参照して、本発明の一実施形態においては、スコアは、淘汰圧の強度、及び淘汰圧による標的の適用範囲、並びに化学環境における成分の数の関数を含む。
【００６２】
一実施形態によれば、方法は、以下のステップを含む。第１のステップにおいては、第１のシミュレーションは、複数の制限を課し、それによって第１のシミュレーション結果を決定することによって行われる。制限の１つは、増殖をある固定値又は固定範囲に限定する条件を設定することと理解される。別の制限は、モデルのフラックスに対して熱力学的境界を設定する。第１のステップにおけるシミュレーションは、取り込みの合計を最適化することによって行われる。この最適化は、これらの成分の最適な変換を取り込み細胞又は生物の増殖に設定するために、化学環境の利用可能な成分の取り込みの合計を最小限にすることによって行われる。
【００６３】
第２の方法ステップにおいては、第２のシミュレーションが行われ、それによって第１のシミュレーション結果を使用し、又はそれに依存する。その結果、第２のシミュレーション結果が決定される。第２のシミュレーションは、細胞又は生物の増殖の制限をある固定値に設定することを含み、又は増殖をある固定範囲内に制限する。第２のシミュレーション内で設定される別の制限は、第１のシミュレーションにおいて考慮された取り込みの合計を第１のシミュレーション結果に制限する。第２のシミュレーション結果は、化学環境の適合性を示し、上方制御標的の合計の最適化として確認された条件、及び下方制御標的の合計の最適化として確認された別の条件を促進する。
【００６４】
更なる一実施形態によれば、上記方法ステップに加えて、第３のシミュレーションに関係する第３の方法ステップが含まれ、それによって第３のシミュレーション結果を決定する。この第３のシミュレーション内で、参照化学環境における参照上方制御標的に関して増強された上方制御標的の数が最適化される。同様に、参照化学環境における下方制御標的に関して抑制された下方制御標的の数も第３のシミュレーション内で最適化される。
【００６５】
本発明の更なる一実施形態においては、化学環境の数値スコアの決定は、スコアが以下のｖａｌｕｅ
【数１】
2019528498.tif 000003
によって与えられる点で定式化される。
式は、上記第１、第２及び第３のシミュレーションステップを含むシミュレーションに依拠する。上式においては、ｎは標的の数を表し、ｃｏｖｅｒａｇｅとは第３のシミュレーションステップ内で得られた標的の最適数を指し、ｕは上方制御標的の数を表し、ｓｔｒｅｎｇｔｈは、第２のシミュレーションステップにおいて得られた上方制御標的の最適化合計と下方制御標的の最適化合計の合計である。化学環境における成分の数はｃで示される。最後に、Ｗｃ、Ｗｓ及びＷｍは、数学的重みを表す。これらの重みは、使用者によって設定又は選択することができる。例えば、以下の値をＷｃ、Ｗｓ及びＷｍに選択することができる：１０００、１００、１。それによって、標的を含む形質を進化させる化学環境を評価する際に、最高の重みを標的の適用範囲に割り当て、最低の重要性を化学成分の数に割り当てる。重みに特定の値を選択して、第１、第２及び／又は第３のシミュレーションステップからの結果は、上記合計における３つの項によれば、数値ｖａｌｕｅによって定量化される数値スコアにおいてより大きい又はより小さい影響を受ける可能性がある。
【００６６】
上式は、化学環境の実際の数値スコアの決定例であり、細胞又は生物の所望の代謝形質を進化させるために使用することができる異なる化学環境の定量的比較を可能にする。実施形態の詳細な説明を参照して、明示的な簡易計算例が示される。この計算例から、上式による数値スコアの決定が明らかになる。
【００６７】
本発明の方法は、化学環境の適合性を評価するスコアを与える。このスコアを使用して、異なる化学環境を評価し、格付けすることができる。
【００６８】
更なる一実施形態によれば、化学環境の適合性を評価するスコアは、化学環境におけるｓｔｒｅｎｇｔｈ及び／又はｃｏｖｅｒａｇｅ及び／又は成分の数を含む関数を用いて計算される。当業者には、本発明の範囲を逸脱せずに、この状況を適応させることは容易であろう。
【００６９】
本発明の方法は、例えば、遺伝的アルゴリズム、シミュレーテッドアニーリングなどの最適化又は探索アルゴリズムにおける適応度スコアリングに使用することができる。遺伝的アルゴリズムが使用されるときには、化学環境は、例えば、遺伝的アルゴリズムにおける個体を表すことができ、化学環境の化合物の有無が遺伝子セット（時折、遺伝的アルゴリズムにおいて形質とも呼ばれる）を表すことができる。
【００７０】
本発明の方法を使用して、どの自然環境が所望の代謝形質を進化させるのに適切であるかを評価することもできる。したがって、化学環境を細胞又は生物の自然環境とすることができる。それは、公知である、又は当業者に既知の方法で決定される、少なくとも１つの自然環境の化合物が、化学環境の適合性の評価に使用されることを意味する。自然環境が所望の代謝形質を進化させるのに適切であると判断される場合、生物を自然環境から分離することができる。分離された生物を代謝形質の存在について分析することができる。代謝形質の分析方法は、当業者に知られており、例えば、酵素試験、代謝産物分析、生理の特性分析、フラックス分析、当業者に既知の方法（例えば、次世代シーケンシング）による、生物のプロテオーム又はゲノムの決定などが挙げられる。
【００７１】
代謝形質は、細胞又は生物の代謝的特徴、例えば、所望の生成物をある条件下で生成する能力、あるガスレベル、栄養素の有無、物質に対する抵抗性又は感受性などのある条件下で生存及び再生する能力とすることができる。好ましくは、代謝形質は、細胞又は生物が、細胞又は生物によって少なくとも１種の所望の生成物を生成できるようにする。これは、例えば、代謝形質を獲得した細胞又は生物が、本発明の方法を適用する前の細胞又は生物における所望の生成物の量に比べて、所望の生成物の生成を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％又はそれ以上増加し得ることを意味する。細胞又は生物は、代謝形質を獲得する前には化合物を生成できなかったが、代謝形質を獲得した後に所望の化合物を生成し得ることも考えられる。代謝形質は、例えば、生成物の生成の減少とすることもできる。例えば、アルコール発酵プロセスにおけるエタノールなどのアルコールの生成の減少。
【００７２】
少なくとも１種の所望の生成物は、細胞又は生物、特に微生物によって生成することができる任意の生成物、例えば、ポリマー、酸、アルコール又はエステルとすることができる。少なくとも１種の所望の生成物は、食品化合物、好ましくは芳香化合物とすることができる。芳香化合物は、例えば、アルコール、アルデヒド、エステル、脂肪酸、ケトン、ラクトン、分枝鎖アミノ酸由来芳香体（ａｒｏｍａ）若しくはその前駆体、芳香族化合物又はピラジンとすることができる。芳香化合物として用いられるアルコールは、例えば、１，２−ブタンジオール、２−ブタノール、２−３−ブタンジオール、エタノール、２−エチルブタノール、２−エチルヘキサノール、２−ヘプタノール、ヘキサノール、イソブタノール、２−メチルブタノール、３−メチルブタノール、２−メチルプロパノール、２−ノナノール、（Ｚ）−１，５−オクタジエン−３−オール、２−オクタノール、１−オクテン−３−オール、１−ペンタノール、フェニルエタノール、２−フェニルエタノール、１−ノナノールとすることができる。芳香化合物として用いられるアルデヒドの例は、アセトアルデヒド、デカナール、ヘプタナール、（Ｚ）−４−ヘプテナール、ヘキサナール、２−ヘキセナール、イソヘキサナール、２−メチルブタナール、３−メチルブタナール、２−メチルプロパナール、ノナナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ノナジエナール、（Ｚ）−２−ノネナール、（Ｅ）−２−ノネナール、オクタナール、ブタナール、ペンタナール、プロパナール、プロペナール、チオフェン−２−アルデヒドである。エステルの例は、酢酸メチル、酢酸エチル、酪酸エチル、エチルヘキソナート（ｅｔｈｙｌ  ｈｅｘｏｎａｔｅ）、エチルイソブトナート（ｅｔｈｙｌ  ｉｓｏｂｕｔｏｎａｔｅ）、オクタン酸エチル、ブタン酸エチル、ブタン酸イソブチル、酢酸２−メチル−１−ブチル、酢酸３−メチル−１−ブチル、酢酸３−オクチル、酢酸ペンチル、酢酸フェネチル、酪酸エチル、酪酸プロピル、プロピオン酸２−ヒドロキシエチル、プロピオン酸２−メチル−２−エチル−３−ヒドロキシヘキシル、ブタン酸エチル２−メチル、ブタン酸エチル３−メチルである。芳香化合物として用いられる脂肪酸の例は、アセタート、ブチラート、カプロアート、デカノアート、イソブチラート、２−メチル酪酸、３−メチル酪酸、オクタノアート、フェニルアセタート、プロピオナート、バレラートである。芳香化合物として用いられるラクトンの例は、δ−デカラクトン、γ−デカラクトン、γ−ブチロラクトン、δ−ドデカラクトン、δ−オクタラクトン、（Ｚ）−６−ドデセン−δ−ラクトンである。芳香化合物として用いられるケトンの例は、アセトフェノン、アセトン、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、２−ブタノン、３−ヒドロキシ−２−ブタノン、２−ヘプタノン、２−ヘキサノン、３−メチル−２−ブタノン、４−メチル−２−ペンタノン、２−ノナノン、２−オクタノン、１−オクテン−３−オン、２−ペンタノン、３−ペンタノン、２−トリデカノン、２−ウンデカノンである。芳香化合物として用いられる芳香族化合物は、例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、β−フェネチルアルコール、酢酸フェニルエチル又はトリメチルベンゼンである。芳香化合物として用いられるピラジンは、例えば、２，３−ジエチル−５−メチルピラジン、２−エチル−３，５−ジメチルピラジン、２−メトキシ−３−イソプロピルピラジンである。分枝鎖アミノ酸由来芳香体は、例えば、メチオノール、イソバレラート、イソブチルアセタート、イソブタノール、イソブタノアート、イソアミルアセタート、イソアミルアルコール、２−メチルブタノールである。
【００７３】
好ましい実施形態においては、芳香化合物は、酢酸フェニルエチル、又はメチオノール、イソバレラート、イソブチルアセタート、イソブタノール、イソブタノアート、イソアミルアセタート、イソアミルアルコール、２−メチルブタノールなどの分枝鎖アミノ酸由来芳香体若しくはそれらの前駆体とすることができる。
【００７４】
したがって、一実施形態は、標的化学環境において酢酸フェニルエチルの生成の増加及び／又は分枝鎖アミノ酸由来芳香体若しくはそれらの前駆体の生成の増加をもたらす所望の代謝形質を進化させる進化化学環境に関する。したがって、本発明は、標的化学環境において酢酸フェニルエチルの生成の増加及び／又は分枝鎖アミノ酸由来芳香体若しくはそれらの前駆体の生成の増加をもたらす所望の代謝形質を進化させる化学環境の適合性を評価する方法に関する。
【００７５】
好ましい実施形態においては、細胞又は生物は、産業的に関連性がある。特に企図されるのは微生物である。微生物は、細菌、酵母又はカビの群から選択することができる。産業的に関連する細菌の例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのエシェリキアである。酵母は、例えば、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセスとすることができる。カビの例は、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルスである。産業的に関連する微生物の例は、ペディオコッカス  ペントサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトコッカス  ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス  デルブリュッキ亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．）、ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などのラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、アセトバクター  ガネンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｇｈａｎｅｎｓｉｓ）、アセトバクター  ファバルム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｆａｂａｒｕｍ）などの酢酸菌種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、クルイベロミセス  マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス  ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）などのクルイベロミセス種（Ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、カザクスタニア  エキシグア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ  ｅｘｉｇｕａ）、ハンゼヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア  ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ケトミウム  サーモフィラム（Ｃｈａｒｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シェファソミセス  スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、酸塩耐性酵母（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、トルラスポラ  デルブレキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）などのトルラスポラ種（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ブレタノマイセス  ブルセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）などのブレタノマイセス種（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ザイゴサッカロミセス  ベイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、甘薯黒斑病菌（Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｆｉｍｂｒｉａｔａ）、ニューロスポラ  シトフィラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｉｔｏｐｈｉｌａ）などのニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、ザイゴサッカロミセス  ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、甘薯黒斑病菌、シイタケ（Ｌ���ｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）、ニューロスポラ  クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ファネロカエテ種（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｐ．）、ホウロクタケ種（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓｐ．）、スポロトリクム  サーモフィレ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、ビブリオ  コスティコラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｓｔｉｃｏｌａ）、リゾプス  リゾポジホルミス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｒｈｉｚｏｐｏｄｉｆｏｒｍｉｓ）、リゾプス  オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス  オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）などのリゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、リゾムコール  プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム  レストリクタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｍ）、ヤロウイア  リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ  ルゴース（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓｅ）、カンジダ  カリフォルニカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  フラビぺス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ）などのアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ペニシリウム  シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）、ペニシリウム  シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ペニシリウム  カンディダム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ペニシリウム  ブレビコンパクツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）などのペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、バチルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）などのバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）である。
【００７６】
一部の実施形態においては、本明細書に開示される方法は、酵母、好ましくはサッカロミセス  セレビシエ、より好ましくはワイン発酵、乳酸菌を用いた発酵などの発酵において望ましい分子の生成を可能にするサッカロミセス  セレビシエの所望の形質の進化に関する。
【００７７】
一般に、化学環境は、細胞又は生物の増殖培地とも呼ばれる培地である。培地は、麦汁、ブドウマストなどの複合培地、すなわち定義されていない成分及び／又はその量が定義されていない成分の混合物を含む培地とすることができる。あるいは、培地は、限定培地、すなわちすべての化合物及びそれらの量が既知である培地とすることができる。好ましくは、培地を限定培地とすることができる。一般に、化学環境は、１種以上の炭素源（例えば、グルコース、エタノール、グリセロール、フルクトース、キシロース、ラクトース、メタノール、メタン、ＣＯ２、アラビノース、ガラクトース、グルコン酸、グルクロン酸、リボース、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニン、ガラクツロン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ピルビン酸、脂肪酸）、１種以上の窒素源（例えば、ペプチド、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、バリン、フェニルアラニン、スレオニン、セリンなどのアミノ酸、アミン、（ＮＨ４）２ＳＯ４）、微量元素（例えば、ＦｅＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＮａＭｏＯ４、Ｈ３ＢＯ３、ＫＩ）及びビタミン（例えば、パントテン酸、チアミン、ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン、ビオチン、パラアミノ安息香酸）を含む。化学環境における成分は、異なるイオン状態、又は異なる水和形態、又は異なる塩形態で導入することができる。化学環境における成分は、異なる割合で導入することができる。炭素源は、生合成用炭素とエネルギー生成用炭素の両方を提供することができ、生合成とエネルギー用の別々の基質が存在してもよい。化学環境は、幾つかの炭素及び窒素源、又はどちらも炭素及び窒素源である単一若しくは多数の基質からなることもできる。化学環境は、代謝形質の進化に有用である異なる化合物を含むことができる。例示的な化学環境は、幾つかの微量元素及びビタミンに加えて、グリセロール、アルコールを主要な炭素源として、Ｌ−バリン、アミノ酸を窒素源として含むことができる。例示的な化学環境は、グルコース、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｍｇ２ＳＯ４、Ｌ−メチオニン、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、ＮａＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＫＩ及びＮａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏ、ｄ−ビオチン、パラアミノ安息香酸、ニコチン酸、パントテン酸Ｃａ、ピリドキシンＨＣＬ、チアミンＨＣｌ及びミオイノシトールを含むことができる。化学環境は、１，５−グルコノラクトン、２−デオキシグルコース、２−ホスホグリコラート、ジアミド、Ｄ−トレオース２，４−二リン酸、ヨード酢酸ナトリウム、２−ホスホグリコロヒドロキサム酸、４−クロロ水銀安息香酸、４−メチルピラゾール塩酸塩、５−ホスホアラビノナート、６−アザウラシル、６−アザウリジン、アセタゾラミド、アセトアセトン、アセトピルバート、アセトアセチル−ＣｏＡ、アロプリノール、アミノエチルピルバート、アンチマイシンＡ、アスコステロシド、エキノキャンディンＢ誘導体、エルゴコニンＡ、アスパラギン酸セミアルデヒド、オーレオバシジンＡ、バフィロマイシンＡ１、コンカナマイシンＡ、ヒグロリジン、レンカニシジン（ｌｅｎｃａｎｉｃｉｄｉｎ）、ベータ−クロロ−Ｌ−アラニン塩酸塩、カルムスチン、二硫化テトラエチルチウラム、チウラム、カスポファンギン、エキノキャンディンＣ誘導体、セルレニンＣ７５、クロトリマゾール、フェンプロピモルフ、シプロコナゾール、フルコナゾール、ツブロゾール、ボリコナゾール、ジエチレントリアミン五酢酸、エフロルニチン、エチドロナート二ナトリウム水和物、パミドロナート二ナトリウム塩水和物、フルオロウラシル、フルバスタチン、レスコール（ｌｅｓｃｏｌ）、グルコサミン、ヒドロキシカルバミド、ヨードアセトアミド、レフルノミド、メチオニンスルホキシムホスファート、メトトレキサート、メチルアミン、メチル水銀、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸、ミリオシン誘導体、ミキソチアゾールＡ、ストロビルリンＢ、ニクロサミド、ニチシノン、ニトラート、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパルタート、オキサラート、Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（Ａｐ５Ａ）、ピリドキシルアラニン、クェルセチン、ラパマイシン、シネファンギン、ソラフェンＡ、ＴＯＦＡ、スクアレスタチン、スクアレスタチン誘導体、ザラゴジン酸、テルビナフィン塩酸塩、テルビナフィン、ナフチフィン、トリアクシンＣ、トリクロサン、トリトクアリン、バルプロ酸、ビガバトリンなどの抑制体を更に含むことができる。
【００７８】
標的化学環境は、細胞又は生物を培養して、所望の代謝形質を活用するために使用される環境である。それは、標的化学環境において、細胞又は生物が、例えば所望の生成物を生成するために、培養されることを意味する。
【００７９】
一部の実施形態においては、化学環境は、細胞又は生物の代謝形質を進化させるのに使用される進化化学環境である。化学環境は、細胞又は生物を培養して、代謝形質を活用するために、例えば少なくとも１種の所望の生成物を生成するために、使用される標的化学環境とは異なる。これは、標的環境においては細胞又は生物の適応度を改善しない形質を進化させることができる。例えば、所望の代謝形質（例えば、所望の生成物の生成）のために、細胞又は生物の増殖が標的化学環境において減少する場合、代謝形質が適応度の優位点ではない標的化学環境における代謝形質の進化は、ほとんど不可能であり、又は全く不可能である。したがって、細胞又は生物は、まず、代謝形質の標的の少なくとも１つが適応度の優位点を与える進化化学環境において増殖する。この場合、本発明の方法は、代謝形質を進化させる進化化学環境の適合性の評価を目的とする。
【００８０】
本明細書では「適応度の優位点」、「適応度の利点」という用語は、特定の形質を有する細胞又は生物が、特定の形質を持たない別の細胞又は生物を上回る適応度の利点を有することを意味し、例えば、その増殖が、特定の形質を持たない別の細胞又は生物に比べて増強されることを意味する。本明細書で既に開示したように、特定の形質は、特定の形質が適応度の利点を導く進化環境において確立される。細胞又は生物が使用されることが意図される標的環境においては、特定の形質は、適応度の利点を与えない、すなわち増殖に有利ではない。標的環境においては、特定の形質が活用される。一部の実施形態においては、標的環境において、特定の形質によって、所望の分子の（増強された）生成が可能になり、及び／又は望ましくない分子の生成を回避する、若しくは減少させることが可能になる。
【００８１】
別の一実施形態においては、細胞は、腫瘍細胞、又は腫瘍細胞若しくは病原体の一群とすることができる。
【００８２】
本発明の方法を細胞又は生物の不安定化に使用することもできる。特に、腫瘍細胞又は病原体の不安定化が企図される。好ましくは、腫瘍細胞の不安定化が企図される。これは、本発明の状況においては、化学環境が、細胞又は生物、例えば腫瘍細胞又は病原体を不安定化する代謝形質の進化をもたらすことを意味する。細胞又は生物の不安定化は、例えば、増殖の減少及び／又は細胞若しくは生物の死であり得る。
【００８３】
これは、本発明の方法によって評価された化学環境が、不安定化された細胞又は生物の進化をもたらし得ることを意味する。これは、不安定化された細胞又は生物が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０又はそれ以上の世代など、細胞又は生物の少なくとも１世代後に、一般には数世代後に得られることを意味する。好ましくは、細胞を不安定化する代謝形質は、最大で１００００世代、最大で１０００世代、最大で５００世代、最大で３００世代、最大で２００世代、最大で１００世代、最大で５０世代、最大で３０世代、最大で２０世代、最大で１０世代、最大で５世代、最大で３世代後に得られる。
【００８４】
細胞の不安定化を目的とする実施形態においては、種々の化合物組成物（すなわち、化学環境）について、組成物を癌患者に投与したときに、腫瘍細胞を不安定化する代謝形質を進化させる適合性を評価することができる。したがって、本発明は、医薬品として使用するための組成物にも関する。特に、本発明は、癌の処置に使用するための組成物に関する。
【００８５】
本発明の別の一態様は、以下のステップを含む、細胞又は生物の代謝形質を進化させる化学環境を決定する方法に関する。
（ａ）本明細書に記載の方法を用いて少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）適合性の閾値を超える代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの環境を選択するステップ。
【００８６】
上述のように、一般に、細胞又は生物は、代謝形質が進化する環境（進化環境）とは異なる、異なる環境（標的環境）において使用されるように意図され、標的環境においては、代謝形質は適応度の利点を与えない。
【００８７】
本発明は、更に、以下のステップを含む、細胞又は生物の代謝形質を進化させる化学環境を決定する方法に関する。
（ａ）本明細書に記載の方法を用いて少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境に属する、代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの化学環境を選択するステップ。
【００８８】
ステップ（ｂ）においては、すべての試験化学環境のうち代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％に属する化学環境を選択することができる。当業者は、幾つかの化学環境も代謝形質の進化のために並行して選択し、使用できることを理解されたい。
【００８９】
特定の一実施形態においては、以下のステップを含む、細胞又は生物の代謝形質を進化させる化学環境を提供する方法：
（ａ）本明細書に記載の方法を用いて少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）適合性の閾値を超える代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの化学環境を選択するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の化学環境を用意するステップ。
【００９０】
別の一態様は、上記方法によって得ることができる、又は得られる、化学環境に関する。
【００９１】
適合性の閾値は、前もって設定された閾値とすることができる。適合性の閾値は、閾値を超える化学環境が、すべての試験化学環境のうち代謝形質を進化させる可能性が最も高い６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％であるように設定することができる。当業者は、環境の適合性の計算方法によっては、代謝形質を進化させる可能性のある環境が閾値未満でもよいことを理解されたい。特定の一実施形態においては、代謝形質を進化させる可能性が最も高い環境が選択される。別の特定の一実施形態においては、代謝形質を進化させる可能性が最も高い２つの環境のうち１つ、３つの環境のうち１つ、４つの環境のうち１つ、５つの環境のうち１つ、６つの環境のうち１つ、１０個の環境のうち１つ、２０個の環境のうち１つ、５０個の環境のうち１つ、１００個の環境のうち１つ、５００個の環境のうち１つ、１０００個以上の環境のうち１つが選択される。
【００９２】
さらに、本願は、以下のステップを含む、細胞又は生物の代謝形質を進化させる方法に関する。
【００９３】
本発明は、更に、以下のステップを含む、細胞又は生物の代謝形質を進化させる化学環境を決定する方法に関する。
（ａ）本明細書に記載の方法を用いて少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境に属する、代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの化学環境を選択するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された化学環境において細胞又は生物を増殖させるステップ。
【００９４】
特定の一実施形態においては、細胞又は生物の代謝形質を進化させる方法は、
（ａ）本明細書に記載の方法を用いて少なくとも２つの進化化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境に属する、代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの化学環境を選択するステップ、
（ｃ）所望の形質を進化させる選択された進化化学環境において細胞又は生物を増殖させるステップ、
（ｄ）細胞又は生物によって少なくとも１種の所望の生成物を生成するために細胞又は生物を標的化学環境において増殖させるステップ
を含む。
【００９５】
さらに、本願は、以下のステップを含む、細胞又は生物の代謝形質を進化させる方法に関する。
（ａ）本明細書に記載の方法を用いて少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）適合性の閾値を超える代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの環境を選択するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された化学環境において細胞又は生物を増殖させるステップ。
【００９６】
さらに、本願は、本明細書に記載の方法によって得られる細胞又は生物に関する。特に、本願は、以下のステップを含む方法によって得られる細胞又は生物を企図する。
（ａ）本明細書に記載の方法を用いて少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）適合性の閾値を超える代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの環境を選択するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された化学環境において細胞又は生物を増殖させるステップ。
【００９７】
特定の一実施形態においては、細胞又は生物の代謝形質を進化させる方法は、
（ａ）本明細書に記載の方法を用いて少なくとも２つの進化化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）適合性の閾値を超える代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの進化化学環境を選択するステップ、
（ｃ）所望の形質を進化させる選択された進化化学環境において細胞又は生物を増殖させるステップ、
（ｄ）細胞又は生物によって少なくとも１種の所望の生成物を生成するために細胞又は生物を標的化学環境において増殖させるステップ
を含む。
【００９８】
本発明の更なる一態様によれば、プロセッサによって実行されると、上記方法ステップのいずれか、又は任意の組合せを行うようになされたコンピュータプログラム要素が提供される。
【００９９】
本発明の別の一態様によれば、上記コンピュータプログラム要素を含むコンピュータ可読媒体が提供される。
【０１００】
細胞又は生物の所望の代謝形質を進化させる化学環境の適合性を定量化することを本発明の一要旨と見ることができる。記述した方法ステップを用いて、細胞又は生物の所望の進化を可能にする化学環境を決定するために、様々な化学環境の定量的比較を行うことができる。
【０１０１】
なお、本発明の実施形態の一部は、異なる主題に関連して記述される。特に、一部の実施形態は、方法タイプクレームに関連して記述され、別の実施形態は、装置タイプクレームに関連して記述される。しかし、当業者が以上及び以下の記述から推測するところによれば、特段の記載がない限り、１タイプの主題に属する特徴の任意の組合せに加えて、異なる主題に関する特徴の任意の組合せも本願に開示されているとみなせる。
【０１０２】
本発明の上記態様及び実施形態並びに更なる態様、実施形態、特徴及び効果は、以下に記述される実施形態の実施例から誘導することもでき、実施形態の実施例に関連して説明される。本発明は、実施形態の実施例に関連して以下により詳細に記述されるが、本発明はそれらに限定されない。
【０１０３】
本発明の更なる一態様は、
（ａ）本明細書に開示される方法を用いて、代謝形質を進化させる少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境に属する、代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの化学環境を選択するステップ
を含み、
代謝形質を進化させる化学環境の適合性が、所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別するための化学環境の適合性と相関する、
所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別するための選択化学環境を決定する方法に関する。
【０１０４】
代謝形質を進化させる化学環境の適合性と相関する所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別するための化学環境の適合性は、代謝形質を進化させるのに適切な化学環境が、所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別するのにも適切であることを意味する。
【０１０５】
更なる一実施形態は、選択化学環境を用いて所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別する方法に関する。
（ａ）上で定義した選択化学を決定するステップ、
（ｂ）少なくとも２種の細胞又は生物を選択化学環境において増殖させるステップ、
（ｃ）選択環境において他の細胞又は生物の１種以上よりも高い増殖を示す少なくとも１種の細胞又は生物を選択するステップ、
選択環境におけるより高い増殖は、細胞又は生物が所望の代謝形質を含むことを示す。
【０１０６】
所望の代謝形質は、選択環境において適応度の利点を与えるので、代謝形質を含む細胞又は生物は、所望の代謝形質を含まない別の細胞又は生物よりも高い増殖を示す。したがって、選択環境における細胞又は生物のより高い増殖は、細胞又は生物が所望の形質を含むことを示している。
【０１０７】
本発明の状況においては「より高い増殖」は、生物又は細胞の増殖が、選択環境において増殖した別の細胞又は生物に比べて５％超、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％又はそれ以上であることを意味する。当業者は、細胞又は生物の増殖を判定する方法を知っている。増殖は、例えば、細胞又は生物を含む溶液のＯＤを測定することによって判定することができる。
【０１０８】
少なくとも２種の細胞又は生物は、例えば、酵母株コレクションなどの細胞コレクション又は生物系統コレクションとすることができる。
【０１０９】
したがって、一部の実施形態においては、「細胞」という用語は「細胞系」も指し、「生物」という用語は「生物系統」を指す。
【０１１０】
したがって、一部の実施形態においては、生物系統の増殖を生物系統コレクションにおける他の生物系統の増殖と比較する。別の実施形態においては、細胞系の増殖を細胞系コレクションにおける他の細胞系の増殖と比較する。一実施形態においては、他の細胞又は生物の１種以上は、所望の代謝形質を含まないことが知られている対照細胞又は対照生物である。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】進化生態的地位（すなわち、進化化学環境）及び標的生態的地位（すなわち、標的化学環境）における簡易代謝ネットワーク及びその進化を示す図である。
【図２】細胞外化合物の交換反応のトイモデルを示す図である。
【図３】本発明の方法に依拠する遺伝的アルゴリズムを示す図である。
【図４】図４Ａは、分枝鎖アミノ酸由来芳香体の生成の増加を進化させる特定の進化生態的地位の適合性について、観察された最小スコアに対する、進化生態的地位における淘汰圧、標的ｃｏｖｅｒａｇｅ、及び成分の数のＥｖｏｌｖｅＸ計算総合スコアのヒストグラムである。図４Ｂは、酢酸フェニルエチルの生成の増加を進化させる特定の進化生態的地位の適合性について、観察された最小スコアに対する、進化生態的地位における淘汰圧、標的ｃｏｖｅｒａｇｅ、及び成分の数のＥｖｏｌｖｅＸ計算総合スコアのヒストグラムである。
【図５ａ】Ｌ−フェニルアラニン及び分枝鎖アミノ酸が、中心炭素代謝において異なる前駆体から合成されることを示す図である。
【図５ｂ】分枝鎖アミノ酸由来芳香族化合物が、親株に比べて、分枝鎖アミノ酸由来芳香体（すなわち、唯一の炭素及び窒素源としてのエタノール、グリシン、Ｌ−アルギニン）の生成の増加のためのＥｖｏｌｖｅＸ設計培地上で進化した系列から単離されたＥ株において、酢酸フェニルエチル（すなわち、グリセロール、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン）の生成の増加のためのＥｖｏｌｖｅＸ設計培地上で進化した系列から単離されたＧ株におけるよりも顕著であることを示す図である。Ｌｏｇ２倍率変化を、進化株の３つ組のワインマスト発酵について、親株の３つ組のワインマスト発酵と比較して計算する。星印のｌｏｇ２倍率変化は、有意であることが判明した（すなわち、ダネット検定、＞対照、ｐ＜０．０５）。
【図５ｃ】酢酸フェニルエチルの生成の増加が、親株に比べて、酢酸フェニルエチル（すなわち、グリセロール、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン）の生成の増加のためのＥｖｏｌｖｅＸ設計培地上で進化した系列から単離された株において認められたことを示す図である。
【図５ｄ】エールリッヒ経路が、分枝鎖及び芳香族アミノ酸由来芳香体が生成される異化経路であることを示す図である。エールリッヒ経路は、フーゼル酸を生成し、酸と更に反応（すなわち、エステル化）して発酵生成物における重要な芳香化合物であるエステルを生成することができるフーゼルアルコールをより多量に生成する。
【図６】図６Ａは、乳酸菌（ＬＡＢ：ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）増殖の支援を増強するＳ．セレビシエを進化させる特定の進化生態的地位の適合性について、観察された最小スコアに対する、進化生態的地位における淘汰圧、標的ｃｏｖｅｒａｇｅ、及び成分の数のＥｖｏｌｖｅＸ計算総合スコアのヒストグラムである。図６Ｂは、進化株が乳酸菌増殖の増強を改善することを示す図である。馴化培地の収集時に対応する酵母株のＯＤ６００によって規準化された、親Ｓ．セレビシエ株（Ｔ８）及び進化Ｓ．セレビシエ株（Ａ１１、Ａ１２、Ｂ１１）から馴化培地に播種されたＬ．ラクチス（ＩＬ１４０３）及びＬ．プランタルム（ＷＣＳＦ１）の４日間の増殖（初期ＯＤ６００  ０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
幾つかの図における類似又は関連成分を同じ参照番号で示す。図は、模式的なものであり、スケールが不完全である。
【０１１３】
以下、本発明の方法に基づくアルゴリズムの単純なトイモデルの例を示す。トイモデルは、単純でわかりやすい例を示すものである。本発明も上記実施形態の１つも、トイモデルに関して記述される単純なシナリオに限定されない。
【０１１４】
図１の説明は、簡易代謝ネットワークによって、進化生態的地位と標的生態的地位の区別を記述するものであり、生態的地位は化学環境であり、それによって標的生態的地位において適応度の利点を与えない代謝形質の進化である。
【０１１５】
図１の説明に用いられる簡易代謝ネットワークは、次いで、本発明の方法ステップに基づく計算の一例を示すのにここで使用されることが考えられるトイモデルである代謝モデルに展開される。図２においては、代謝ネットワークは、細胞外化合物の交換反応で増大し、細胞外化合物の移入及び移出を示す。さらに、フラックス及び代謝産物を図２における識別子で示す。
【０１１６】
図２に示す反応から、モデルの以下の化学量論行列Ｓを推論することができ、以下のベクトル−物質収支ベクトル（ｂベクトル）、下界及び上界ベクトル（ｌｂ及びｕｂベクトル）、並びに生物学的目的ベクトル（ｃベクトル）が導入される。
Ｓ行列（化学量論行列）＝
【０１１７】
【表１】
2019528498.tif 000004
【０１１８】
トイモデルの以下のｌｂ及びｕｂベクトルは、それぞれのフラックスベクトル成分に対する熱力学的又は容量制約に対応するフラックス下界及び上界を規定する。−１０００及び１０００の値は、この計算例においては、無制限のフラックス境界を示す。
【０１１９】
【表２】
2019528498.tif 000005
【０１２０】
トイモデルの以下のｃベクトルは、モデルの生物学的目的をコードする：
【０１２１】
【表３】
2019528498.tif 000006
【０１２２】
言うまでもなく、上記ｃベクトルの唯一の非ゼロ成分は交換反応Ｇｅｘｔに関連したフラックスベクトル成分ｖ１７を指し（図２参照）、ここで考えられるトイモデルの生物学的目的は、細胞外化合物Ｇｅｘｔを生成する増殖である。
【０１２３】
トイモデルの以下のｂベクトルは、代謝産物物質収支、すなわち、トイモデルで考えられる１４種の代謝産物の収支を規定する。ここでの仮定は定常状態であり、ｂベクトルの成分はゼロに設定される：
【０１２４】
【表４】
2019528498.tif 000007
【０１２５】
上で導入されたトイモデルのｌｂベクトルは、トイモデルの可能なフラックスベクトルの各成分の下界を規定することに留意されたい。同様に、上で規定されるトイモデルのｕｂベクトルは、トイモデルの可能なフラックスベクトルの各成分に対して上界を導入する。ここで考えるトイモデルよりも入念なシナリオにおいては、可能なフラックスベクトルの成分の下界及び上界の値は、実験的に決定することができ、又は熱力学的制約から決定することができる。
【０１２６】
生物学的目的に上で関連したｃベクトルに関して、この目的は、モデルが異なると変わることがある。例えば、より大きいモデルにおいては、生物学的目的は、必ずしも増殖でなくてもよく、例えば、ＡＴＰ産生の極大化でもよい。
【０１２７】
最後に、上記トイモデルの場合に示したように、すべての成分がゼロに設定されたｂベクトルが採用される定常状態のシミュレーションは、化学環境において細胞又は生物の進化をシミュレートする簡便な一方法であり、それによってシステムが上記物質収支を特徴とする定常状態にあることを想定する。
【０１２８】
本発明の一実施形態に係る化学環境の適合性の定量は、参照状況の知識、及びその後の参照状況との比較に基づく。本発明の状況においては、参照シナリオとの比較は、化学環境の適合性又は可能性を定量的に評価するために意図される。特に、本発明に係る最低の場合の適用範囲の考察に関して、参照状態フラックス範囲をそれぞれのモデルにおいて考慮し、フラックスと比較することができる。したがって、トイモデル計算においては、本発明に係る最低の場合の適用範囲の考察の状況において参照状態フラックスが必要とされる。
【０１２９】
最低の場合の適用範囲及びそれに関連する計算については後で考察する。ここで、トイモデル計算の参照状態は、基質Ａ及びＢ上の増殖の状態であると定義され、図２を比較されたい。
【０１３０】
参照状態は、以下のように、フラックスの各々の最小値及び最大値によって記述される。
【０１３１】
【表５】
2019528498.tif 000008
【０１３２】
この準備後、本発明の実施形態に係る方法ステップをここでトイモデルに関連して説明する。このために、反応ｖ３を介してフラックスを上方制御する（すなわち、ｖ３は上方制御標的である）基質Ｃ及びＤを含む化学環境の適合性又は可能性を評価すべきである。
【０１３３】
状況を単純化するために、トイモデル内で抑制が考慮されないことに留意されたい。
【０１３４】
第１のステップにおいては、増殖最適条件は、以下のように線形最適化によって設定される。
【数２】
2019528498.tif 000009
ただし、以下の制限を条件とする。
【数３】
2019528498.tif 000010
ここで、νｕｐｔａｋｅは、特定の化学環境において利用可能な成分の取り込み反応のフラックスを表し、Ｓは、種のゲノムスケール代謝トイモデルの化学量論行列を表し、νはフラックスベクトルを表し、νμは増殖速度（すなわち、フラックス）であり、νｉｎｈｉｂｉｔｅｄは、特定の化学環境中に存在する抑制体によって抑制される反応を介したフラックスであり、νｌｂ及びνｕｂはそれぞれフラックス下界及び上界である。
【０１３５】
なお、大部分のモデルにおいては取り込みフラックスは負に定義され、これらの状況においては上記極小化が−νｕｐｔａｋｅに対して行われる。当業者には、本発明の範囲を逸脱せずに、この状況を適応させることは容易であろう。
【０１３６】
式（１）〜（５）において与えられる上記規定は、
以下の制限を条件として、
Ａｅｑ・ｘ＝ｂｅｑ、  （ＩＩ）
ｌｂｉ≦ｘｉ≦ｕｂｉ  （ＩＩＩ）
以下の形に実行される。
ｍａｘｆ’ｘ  （Ｉ）
ここで、上記導入量Ａｅｑ、ｌｂ、ｕｂ、ｆ及びｂｅｑは、以下のように与えられる。
【０１３７】
行列Ａｅｑは、化学環境の成分の可能な分泌を表す２つの列が追加されたトイモデルのＳ行列によって与えられる。これは、上記式２における制限を表す。したがって、Ａｅｑは、以下で与えられる。
【０１３８】
【表６】
2019528498.tif 000011
【０１３９】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において導入されたベクトルｌｂ、ｕｂ及びｆは、以下で与えられる。
【０１４０】
【表７】
2019528498.tif 000012
【０１４１】
最後の３つの行ｌｂ、ｕｂ及びｆは、式３における制限を表す、化学環境の成分の可能な分泌の制限である。
【０１４２】
上記ベクトルｆにおける値１は、式１における制限に対応する、目的における化学環境の成分の取り込みを表す。
【０１４３】
ｌｂ及びｕｐの最後から５及び６番目の行は、許容される化学環境の成分の３つの取り込みを表す。
【０１４４】
以下のベクトルｂｅｑは、式２における制限に対応する、トイモデルのｂベクトルである。
【０１４５】
【表８】
2019528498.tif 000013
【０１４６】
上記連立方程式は、例えば、ＣＰＬＥＸ  ＬＰ解法又はＧＬＰＫ解法で解かれる。解法は、目的関数の最適値に対応する変数の値を返す。ｘは実際には一意的でない可能性もあることに留意する価値がある。しかし、目的関数（すなわち、ｆ’ｘ）の最適値は一意的である。ここで考えるトイモデルにおいては、ｘの成分に対して以下の、この場合は一意的な、値が得られる。
【０１４７】
【表９】
2019528498.tif 000014
【０１４８】
トイモデル計算における次の方法ステップにおいては、増殖最適制限下の標的反応に対する最低の場合の淘汰圧のシミュレーションを、次式に従って考えることができる。
【数４】
2019528498.tif 000015
ただし、以下の制限を条件とする。
【数５】
2019528498.tif 000016
ここで、νｕｐ及びνｄｏｗｎは、それぞれ上方及び下方制御標的反応を介したフラックスである。
【０１４９】
ここで考えるトイモデルの特定の例においては、標的フラックスは、可逆的でない。したがって、ここで変数及び制限を追加して、混合整数線形計画問題としてフラックスの絶対値の最適化を行う必要はない。しかし、より入念なシナリオの場合、これは必要かもしれない。
【０１５０】
上記制限は、以下の形になる。
Ａｅｑ・ｘ＝ｂｅｑ、  （Ｖ）
Ａ・ｘ≦ｂ、  （ＶＩ）
ｌｂｉ≦ｘｉ≦ｕｂｉ  （ＶＩＩ）
を条件として、以下の形になる。
ｍａｘｆ’ｘ  （ＩＶ）
【０１５１】
式（ＩＶ）における行列Ａｅｑは、フラックス変数の２つの列が化学環境の成分の可能な分泌を記述するために追加されたモデルのＳ行列によって与えられる。これは、上記式７における制限に対応する。したがって、行列Ａｅｑは以下の通り解釈される。
【０１５２】
【表１０】
2019528498.tif 000017
【０１５３】
式（ＶＩ）における量Ａを示す式８及び式１１によって導入される制限は、以下のように記述することができる。
【０１５４】
【表１１】
2019528498.tif 000018
【０１５５】
ここで、第１の行は、式８からの制限を示し、第２の行は式１１からの制限を示す。
【０１５６】
さらに、以下のベクトルｌｂ、ｕｐ及びｆが、トイモデル内のこの方法ステップにおいて生じる。
【０１５７】
【表１２】
2019528498.tif 000019
【０１５８】
式７における制限から、以下のｂベクトルｂｅｑが生じる。
【０１５９】
【表１３】
2019528498.tif 000020
【０１６０】
最後に、式（ＶＩ）の形で変換される式８及び１１からの制限は、式（ＶＩ）においてｂの以下の値を生じる。
【０１６１】
【表１４】
2019528498.tif 000021
【０１６２】
やはり、問題は、標的に関与する可逆的フラックス（すなわち、下界が０より小さいフラックス、ｌｂ＜０）が存在するかどうかに応じて、例えば、ＣＰＬＥＸ  ＬＰ又はＣＰＬＥＸ  ＭＩＬＰ解法によって解かれる。トイモデルの場合、解法は、目的関数の最適値に対応するｘ（すなわち、変数の値）として以下のベクトルｘを返す。
【０１６３】
【表１５】
2019528498.tif 000022
【０１６４】
ｘは実際には一意的でない可能性もあり、目的関数（すなわち、ｆ’ｘ）の最適値のみが一意的であることにも留意されたい。
【０１６５】
上記結果によれば、特定の化学環境によってもたらされる淘汰圧の強度のスコアに関係する目的関数（すなわち、ｆ’ｘ）の最適値は、ここで考えるトイモデルの例において１０で与えられる。
【０１６６】
次に、増殖最適性制限及び最低の場合の淘汰圧制限下の最低の場合の標的反応適用範囲のシミュレーションを、以下のようにトイモデル内で行うことができる。
【数６】
2019528498.tif 000023
ただし、以下の制限を条件とする。
【数７】
2019528498.tif 000024
ここで、ｂｔａｒｇｅｔｓは、標的反応を介した絶対的フラックスが参照条件（すなわち、ｗｌｂ、ｗｕｂ）下で絶対的フラックス範囲から規定される対応する閾値を超えるかどうかを規定する２値変数である。トイモデル計算の参照条件を含む参照シナリオの例を上で考察したが、このシナリオで得られた値を今度はトイモデル計算に使用する。
【０１６７】
上記式（１９）及び（２０）のパラメータδは、淘汰圧に曝露される（すなわち、淘汰圧が適用される）対応する標的反応を考えるために、増殖と比較してフラックスが特定の化学環境においてどのくらい低い又は高いべきかを示す閾値パラメータである。したがって、式（１９）及び（２０）によって、トイシナリオにおける標的反応の適用範囲の定量の例がもたらされる。式（１８）からの制限と一緒に、最低の場合の適用範囲シナリオは、したがって、式（１２）〜（２１）のセットによって考慮される。
【０１６８】
明示的な計算の場合、上記制限は、
Ａｅｑ・ｘ＝ｂｅｑ、  （ＩＸ）
Ａ・ｘ≦ｂ、  （Ｘ）
ｌｂｉ≦ｘｉ≦ｕｂｉ、  （ＸＩ）
ｘ＝［ｘｂ，ｘｃ］、  （ＸＩＩ）
ｘｂ∈｛０，１｝  （ＸＩＩＩ）
を条件として、以下の形になり、
ｍａｘｆ’ｘ  （ＶＩＩＩ）
ｘは、連続変数と整数変数の両方を含むことができる。
【０１６９】
上記式（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩＩＩ）における量は、以下の式によって与えられる。
【０１７０】
Ａｅｑは、モデルのＳ行列であり、再度２つの列が化学環境の成分の可能な分泌を記述するために追加され、更に１列が式１３における制限を反映する標的反応の適用範囲変数のために追加される。したがって、式（ＩＸ）におけるＡｅｑは、以下の通り解釈される。
【０１７１】
【表１６】
2019528498.tif 000025
【０１７２】
上記式（Ｘ）における量Ａは、式１４、１７及び１９における制限をコードし、したがって、
【０１７３】
【表１７】
2019528498.tif 000026
【０１７４】
によって与えられる。
ベクトルｌｂ、ｕｂ及びｆは、以下の式によって与えられる。
【０１７５】
【表１８】
2019528498.tif 000027
【０１７６】
さらに、この計算ステップにおけるフラックスベクトルの成分の以下の変数タイプ（Ｃ＝連続、Ｂ＝２値）は、以下のように定義される。
【０１７７】
【表１９】
2019528498.tif 000028
【０１７８】
式１３からの制限は、以下のベクトルｂｅｑによって表される。
【０１７９】
【表２０】
2019528498.tif 000029
【０１８０】
最後に、式１４、１７及び１９における制限を表す式（Ｘ）における量ｂは、以下で与えられる。
【０１８１】
【表２１】
2019528498.tif 000030
【０１８２】
式（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩＩＩ）によって与えられる問題は、次いで、例えば、ＣＰＬＥＸ  ＭＩＬＰ解法によって解かれる。
【０１８３】
トイモデルの場合、解法は、目的関数の最適値に対応するｘ（すなわち、変数の値）として以下のベクトルを返す。
【０１８４】
【表２２】
2019528498.tif 000031
【０１８５】
したがって、特定の化学環境によってもたらされる淘汰圧による標的の適用範囲のスコアに対応する目的関数（すなわち、ｆ’ｘ）の最適値は１である（上記ベクトルの最後の成分における値）。この値は、この場合の唯一の標的が最低の場合においても適用されることを意味する。
【０１８６】
したがって、トイモデルの場合、Ｃ及びＤを含む化学環境は、標的フラックスの増加に対して参照化学環境よりも強力な淘汰圧をもたらすと予想される。
【０１８７】
総合数値スコアは、特定の化学環境における最低の場合の淘汰圧、最低の場合の適用範囲、及び成分の数から誘導することができる。
【数８】
2019528498.tif 000032
ｖａｌｕｅは総合スコアであり（すなわち、値が低いほど、特定の化学環境が形質を進化させるのに良好である）、ｎは標的反応の数であり、ｃｏｖｅｒａｇｅは最低の場合の適用範囲であり（すなわち、
【数９】
2019528498.tif 000033
）、ｕは上方制御標的反応の数であり、ｓｔｒｅｎｇｔｈは、最低の場合の淘汰圧強度であり（すなわち、
【数１０】
2019528498.tif 000034
）、ｃは、特定の化学環境における成分の数であり、Ｗｃ、Ｗｓ、Ｗｍは、それぞれ化学環境の適用範囲、強度、及び複雑性に割り当てられる重みである。
【０１８８】
トイモデルの場合、重みをＷｃ＝１０００、Ｗｓ＝１及びＷｍ＝１に設定すると、化合物Ｃ及びＤを含む化学環境の総合スコアは９９２と得られる。
【０１８９】
幾つかの化学環境が評価される場合、このスコアは、考慮された化学環境のセットのうち適切な化学環境を選択するために、他の化学環境のスコアと比較される。一般に、スコアが低いほど、特定の化学環境が特定の所望の代謝形質を進化させるのに適している。当業者は、本発明の範囲を逸脱せずに、例えば、スコアが高いほど適合性が良好であるように、スコア化の式を適応させることは容易であろう。
【０１９０】
化学環境の設計は、例えば、遺伝的アルゴリズムにおける適応度関数として本発明に係る方法を用いて、１セットの可能な成分からの成分の組合せを最適化することによって行うこともできる。
【０１９１】
図３に関して、遺伝的アルゴリズムに関連して本発明に係る方法の適用の例を示す。アルゴリズムは、代謝形質の適応進化に最適な化学環境の設計に適している。遺伝的アルゴリズムにおける集団の個体は、化合物の組合せを表すバイナリーベクトルとして定義される特定の化学環境である。適応度スコアリングは、代謝形質の適応進化に対する個々の化学環境の良好性を評価する。再生相は、交差、変異及びエリート主義（ｅｌｉｔｉｓｍ）によって新世代の個体を生成する。
【０１９２】
ＥｖｏｌｖｅＸ事例研究１．ワイン芳香体の生成の改善
本事例研究は、サッカロミセス  セレビシエを進化させて、ワインマストの標的生態的地位における２つの所望の代謝形質、すなわち、１）酢酸フェニルエチル（すなわち、バラとハチミツの香り及びキイチゴのような風味を有するフェニルエチルアルコールとアセタートのエステル）の生成の増加、及び２）分枝鎖アミノ酸由来芳香体又はそれらの前駆体の生成の増加を得ることを目的とする。これらの形質を初期表現型に関する上方及び下方制御標的フラックスに関して更に規定した。それらは、最小値において（すなわち、最小数のフラックスに含まれる）閾値を超えて変化して所望の形質を得ることが必要であるフラックスとしてＳ．セレビシエのゲノムスケール代謝モデルを用いて同定された。初期の代謝表現型として、（ワインマスト中の窒素源の複雑な混合物の代わりに）アンモニウムを窒素源として過剰のグルコースで増殖する際のＳ．セレビシエフラックス分布を使用して、アミノ酸由来芳香体の新規生成を増強する標的も同定した。自然淘汰によるこれら所望の形質（すなわち、標的フラックスの特定の上方及び下方制御）の適応進化を可能にするために、進化生態的地位は、細胞が進化生態的地位で増殖するときに、所望の形質が増殖を増強する（すなわち、適応度に有利である）ように設計される必要があった。したがって、進化生態的地位に長時間曝露されると、細胞集団は、標的生態的地位において所望の形質を可能にする、又は強化する、変異が多くなる。
【０１９３】
次いで、ＥｖｏｌｖｅＸアルゴリズムを用いて、標的生態的地位のための所望の形質の適応進化のための進化生態的地位としての特定の化学環境の適合性を評価した。Ｓ．セレビシエのゲノムスケール代謝モデルを使用して、その化学組成によって規定される所与の進化生態的地位の下で標的反応フラックスに対する淘汰圧の相対強度を予測した。ＥｖｏｌｖｅＸは、生物が利用することができる炭素及び窒素源を含めた幾つかの異なる分子（すなわち、モデルにおいて記述された取り込み及び利用）、及び特定の代謝反応に対するその効果をモデル化することができる抑制体（例えば、基質類似体）又は調節性トリガー（例えば、２−デオキシグルコース）で構成される生態的地位を考慮することができる。参照生態的地位が定義されると（例えば、一般的増殖条件）、ＥｖｏｌｖｅＸは、参照条件下よりも強力な淘汰圧による標的反応の適用範囲も計算する。さらに、ＥｖｏｌｖｅＸは、標的フラックスに対する淘汰圧からの特定の進化生態的地位、参照条件下よりも強力な淘汰圧によるそれらの適用範囲、及び生態的地位における化学成分の数の総合スコアを導く。ここで、ＥｖｏｌｖｅＸを実行して、Ｓ．セレビシエのゲノムスケール代謝モデルにおいて定義される一般的炭素及び窒素源のうち３つの、更にグルコナートを含めた、全組合せとして形成される化学環境をスコア化した。参照条件として、グルコース最少実験室培地を使用した。スコアが良好（すなわち、低いほど総合スコアが良好）な環境を手作業で検査して、実験適応進化のための進化生態的地位を選択した。酢酸フェニルエチルの生成の増加を進化させるために、以下の培地、すなわち、グリセロール、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニンを選択し、分枝鎖アミノ酸由来芳香体の生成の増加を進化させるために、以下の培地、すなわち、エタノール、グリシン、Ｌ−アルギニンを選択した。化合物のこれらの組合せは、適応進化実験において唯一の炭素及び窒素源として役立った。選択されたエタノール、グリシン、Ｌ−アルギニンの組合せは、ヒストグラム（図４Ａ）を見て分かるように、分枝鎖芳香族酸由来エステルの生成の増加を進化させるための適合性について良好なスコアであり（観察された最小スコアに対して１．０４）、スコアのより低いものに優先して選択された。というのは、炭素源としてのエタノールは速い増殖を支援することができ、したがって実験を容易にするからである。グリセロール、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−スレオニンは、酢酸フェニルエチルの生成の増加を進化させるための適合性について比較的良好なスコアである（観察された最小スコアに対して１．０６）（図４Ｂ）。この組合せは、スコアがより良好なものに優先して選択された。というのは、初期の実験によれば、Ｄ−リボース及びグルコナートは、炭素源として増殖を維持せず、炭素及び窒素源としてのアミノ酸の唯一の寄与も増殖を維持しないと予想されたからである。
【０１９４】
実験適応進化を小規模液体培養で行った。約８０世代にわたる３つの複製系列における選択された進化生態的地位における連続移行後、９種の単一株を系列の最終集団から単離した。進化生態的地位培地上の最終集団の能力に対するそれらの能力に基づいて、選択された株（酢酸フェニルエチルの生成の増加について進化した系列の各々から１つの株、及び分枝鎖アミノ酸由来芳香体の生成の増加について進化した系列のうち２つから１つの株）を標的生態的地位において、すなわち３つ組のワインマスト上の培養を模倣したワイン発酵において、特徴づけた。ＧＣ−ＭＳを用いた揮発性芳香体プロファイリングのために試料を回収した。標的化合物の生成は、対応するＥｖｏｌｖｅＸ設計培地中で進化した集団由来の株において増加することがわかった。図３は、親株に対する進化単離株における標的化合物の生成：ｂ）分枝鎖アミノ酸由来芳香体、ｃ）酢酸フェニルエチルを示す。図５は更にａ）Ｓ．セレビシエの代謝における標的芳香化合物の起源及び前駆体、並びにｄ）更に反応してエステルを生成し得る芳香族フーゼルアルコールと酸を生成するエールリッヒ経路を示す。
【０１９５】
ＥｖｏｌｖｅＸ事例研究２：乳酸菌（ＬＡＢ：ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）増殖の支援を増強するＳ．セレビシエのＥｖｏｌｖｅＸ設計適応進化。
第２の事例研究は、改変エクソメタボローム（すなわち、分泌代謝産物）のためにＳ．セレビシエを適応進化させて、ＬＡＢの増殖支援に影響を及ぼすことを目的とした。本発明者らは、Ｓ．セレビシエが必須アミノ酸のない培地上でＬＡＢの増殖を可能にすることを以前に認めた。窒素に富むが、Ｎ源の性質が不安定である培地において、Ｓ．セレビシエが窒素含有化合物、特にアミノ酸を分泌することが見いだされた。ここで、本発明者らは、ＥｖｏｌｖｅＸを使用して、Ｓ．セレビシエが適応進化して改変エクソメタボロームを分泌してＬＡＢ増殖を増強する条件を設計することを目的とした。Ｓ．セレビシエのゲノムスケール代謝モデルを、アミノ酸生合成の調節を反映した追加の制限と一緒に使用した。具体的には、１）Ｌ−チロシンが培地中で供給されるが、すべての芳香族アミノ酸が利用可能なわけではない場合でも、Ｌ−チロシン合成が活性であるように制限された、２）Ｌ−イソロイシン又はＬ−スレオニンが培地中に存在しても、ホモセリン（Ｌ−スレオニン前駆体）合成が活性であるように制限された。さらに、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−チロシンの自由な取り込みがモデルにおいて許容された。ＥｖｏｌｖｅＸの標的フラックスを以下のように設定した：上方制御：Ｌ−スレオニンアルドラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸デヒドロゲナーゼ、チロソールデヒドロゲナーゼ、チロソール分泌及び４−ヒドロキシフェニル酢酸分泌、並びに下方制御：ピルビン酸デカルボキシラーゼ及び４−ヒドロキシピルビン酸分泌。次いで、ＥｖｏｌｖｅＸアルゴリズムを使用して、Ｓ．セレビシエのゲノムスケール代謝モデルにおいて定義される一般的炭素及び窒素源のうち３つの、更にグルコナートを含めた、全組合せとして形成される化学環境をスコア化した。参照化学環境として、硫酸アンモニウムをＮ源として含むグルコース最少培地を使用した。スコアが良好（すなわち、低いほど総合スコアが良好）な環境を手作業で検査して、実験適応進化のための進化生態的地位を選択した。これらから、本発明者らは、１）ピルバートと２）Ｌ−スレオニンの組合せを選択した（進化生態的地位のスコアヒストグラムでは、観察された最小スコアに対して１．０１のスコア、図６Ａ参照）。
【０１９６】
増殖プレートにおいて１）ピルバート、２）Ｌ−スレオニン、３）Ｌ−イソロイシン、４）Ｌ−ロイシン、５）Ｌ−バリン及び６）Ｌ−チロシンを唯一のＣ及びＮ源として緩衝ＹＮＢ（Ｎ源なし、ＮａＯＨ＋コハク酸、ｐＨ５．８）中で約１００世代の適応実験室進化を行い、その間にピンニングによる新しいプレートへの移行を３日ごとに行った。進化生態的地位において実質的な増殖向上を示す集団から、単一の増殖の速い株を単離した。単離株をＬＡＢ（ラクトコッカス  ラクチス、ラクトバチルス  プランタルム）に対するそれらの増殖支援について親株と比べて試験した。ＬＡＢに対する増殖支援を試験する馴化培地を、それ自体ではＬＡＢを増殖させることができないＣＤＭ３５グルコース培地（アンモニウム及びアミノ酸：Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンを含む；Ｐｏｎｏｍａｒｏｖａら、準備中の原稿）上で酵母株を増殖させることによって調製した。１６又は２０時間（すなわち、０．０１の初期ＯＤ６００から）の３０℃（振盪なし）でのインキュベーション後、酵母細胞をペレット化し、廃棄した。上清を更に０．２２μｍ無菌ＰＶＤＦフィルターに通した。次いで、ＬＡＢを０．０１の初期ＯＤ６００で９６ウェルプレート中で酵母馴化及び非馴化培地に播種した。ＬＡＢを振盪せずに３０℃でインキュベートし、それらの増殖を４日後に評価した。３種の進化株は、Ｌ．ラクチス（ＩＬ１４０３）及びＬ．プランタルム（ＷＣＳＦ１）に対する増殖支援が向上した（図６Ｂ）。
【０１９７】
本願は、以下の実施形態も含む。
【０１９８】
実施形態１：細胞又は生物の所望の代謝形質を進化させる化学環境の適合性を評価する方法であって、代謝モデルにおける複数のフラックスの関数のうちの１つ又は幾つかのシミュレーションを含み、
代謝モデルが生化学反応の化学量論的表現並びに細胞外化合物の移入及び移出を含み、
代謝形質が１セットの標的を含み、
標的がフラックスの関数である、
方法。
【０１９９】
実施形態２：実施形態１に係る方法であって、増殖と比較した１つ又は幾つかの標的のシミュレーションが行われ、
増殖が、バイオマス成分又はバイオマスを生成する反応（単数又は複数）を介したフラックスの関数である、
方法。
【０２００】
実施形態３：実施形態２に係る方法であって、
増殖がある固定値又は範囲内に制限されてシミュレーションが行われる、
方法。
【０２０１】
実施形態４：実施形態３に係る方法であって、
増殖がその最適値に制限されてシミュレーションが行われる、
方法。
【０２０２】
実施形態５：実施形態３又は４に係る方法であって、制限が取り込みのいずれかについて設定されてシミュレーションが行われ、
取り込みが、細胞外化合物の移入である反応を介したフラックスの関数である、
方法。
【０２０３】
実施形態６：実施形態５に係る方法であって、取り込みの合計がある固定値又は範囲内に制限されてシミュレーションが行われる、方法。
【０２０４】
実施形態７：実施形態６に係る方法であって、
取り込みの合計が最適値に制限されてシミュレーションが行われる、
方法。
【０２０５】
実施形態８：実施形態７に係る方法であって、
取り込みのいずれかがある固定値又は範囲内に制限されてシミュレーションが行われる、
方法。
【０２０６】
実施形態９：実施形態８に係る方法であって、
取り込みのいずれかが最適値に制限されてシミュレーションが行われる、
方法。
【０２０７】
実施形態１０：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、上方制御標的と下方制御標的が逆方向に最適化され、
上方制御標的は、増加が望ましい標的であり、
下方制御標的は、減少が望ましい標的である、
方法。
【０２０８】
実施形態１１：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、
絶対的フラックス値のシミュレーションが行われる、
方法。
【０２０９】
実施形態１２：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、
上方制御標的の絶対値が最小化され、下方制御標的の絶対値が最大化される、
方法。
【０２１０】
実施形態１３：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、
少なくとも１つの閾値を超える、又は下回る、標的の数が最適化される、
方法。
【０２１１】
実施形態１４：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、
少なくとも１つの閾値を超える、又は下回る、増殖と比較した標的の数がシミュレートされる、
方法。
【０２１２】
実施形態１５：実施形態１３又は１４に係る方法であって、
少なくとも１つの閾値が、参照化学環境においてフラックスの関数に対して決定される、
方法。
【０２１３】
実施形態１６：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、
シミュレーションにおいて、少なくとも１つの抑制されたフラックスが定義される、
方法。
【０２１４】
実施形態１７：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、
化学環境に含まれる抑制体又は調節性トリガーの標的である反応を介してフラックスを制限することによってシミュレーションが行われる、
方法。
【０２１５】
実施形態１８：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、
化学環境に含まれる抑制体又は調節性トリガーの標的である反応を介してゼロフラックスに制限することによってシミュレーションが行われる、
方法。
【０２１６】
実施形態１９：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、
代謝モデルの化学量論行列が使用される、
方法。
【０２１７】
実施形態２０：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、化学環境の数値スコアの決定を更に含み、
スコアが、化学環境における標的に対する淘汰圧の強度を示し、及び／又は
スコアが、化学環境における淘汰圧による標的の適用範囲を示す、
方法。
【０２１８】
実施形態２１：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、化学環境の数値スコアの決定を更に含み、
スコアが、化学環境における標的に対する最低の場合の淘汰圧の強度を示し、
スコアが、化学環境における淘汰圧による標的の最低の場合の適用範囲を示す、
方法。
【０２１９】
実施形態２２：実施形態２０又は２１に係る方法であって、
スコアが、化学環境のスコアを決定する際の化学環境における成分の数を考慮する、
方法。
【０２２０】
実施形態２３：実施形態２２に係る方法であって、
スコアが、淘汰圧の強度、及び淘汰圧による標的の適用範囲、及び化学環境における成分の数の関数を含む、
方法。
【０２２１】
実施形態２４：前述の実施形態のいずれかに係る方法であって、増殖と比較した標的反応を介した１つ又は幾つかのフラックスの関数のシミュレーションが行われ、
該方法が、
（ａ）複数の制限を課すモデルの第１の最適化を行い、それによって第１の最適化結果を決定するステップであって、
ある制限が、増殖をある固定値又は範囲に限定する条件を設定し、
ある制限が、モデルにおけるフラックスに対して熱力学的境界を設定し、
モデルの第１の最適化が、取り込みの合計を最適化する
ステップと、
（ｂ）第１の最適化結果を用いて第２の最適化を行い、それによって第２の最適化結果を決定するステップであって、
ある制限が、増殖をある固定値又は範囲に設定し、
ある制限が、取り込みの合計を第１の最適化結果に設定し、
第２の最適化結果が、化学環境の適合性を示し、
モデルの第２の最適化が、上方制御標的の合計の最適化として確認された条件を促進し、
モデルの第２の最適化が、下方制御標的の合計の最適化として確認された条件を促進する
ステップと
を含む、方法。
【０２２２】
実施形態２５：前述の実施形態に係る方法であって、
（ｃ）モデルの第３の最適化を行い、それによって第３の最適化結果を決定するステップであって、
参照化学環境における上方制御標的に関して増強された上方制御標的の数が最適化され、参照化学環境における下方制御標的に関して抑制された下方制御標的の数が最適化される
ステップを更に含む、
方法。
【０２２３】
実施形態２６：実施形態２４及び２５に係る方法であって、
スコアがｖａｌｕｅ
【数１１】
2019528498.tif 000035
によって与えられ、
式中、
−  ｎは、標的の数を表し、
−  ｃｏｖｅｒａｇｅは、ステップ（ｃ）で得られる標的の最小値を表し、
−  ｕは、上方制御標的の数を表し、
−  ｓｔｒｅｎｇｔｈは、ステップ（ｂ）で得られる上方制御標的の最小合計と下方制御標的の最大合計の合計を表し、
−  ｃは、化学環境における成分の数を表し、
−  Ｗｃ、Ｗｓ及びＷｍは、数学的重みを表す、
方法。
【０２２４】
実施形態２７：前述の実施形態のいずれか一つに係る方法であって、
該方法が、遺伝的アルゴリズムにおける適応度スコアリングに使用される、
方法。
【０２２５】
実施形態２８：実施形態２７に係る方法であって、
化学環境が、遺伝的アルゴリズムにおける個体を表し、化学環境の化合物が、遺伝的アルゴリズムにおける個体の性質又は遺伝子を表す、
方法。
【０２２６】
実施形態２９：前述の実施形態のいずれか一つに係る方法であって、
化学環境が細胞又は生物の自然環境である、
方法。
【０２２７】
実施形態３０：実施形態２９に係る株を単離するサイトを選択する方法であって、
該方法が、代謝形質を有する細胞又は生物の単離をもたらす、
方法。
【０２２８】
実施形態３１：前述の実施形態のいずれか一つに係る方法であって、
代謝形質が、細胞又は生物による少なくとも１種の所望の生成物の生成をもたらす、
方法。
【０２２９】
実施形態３２：実施形態３１に係る方法であって、
少なくとも１種の所望の生成物が食品化合物、好ましくは芳香化合物である、
方法。
【０２３０】
実施形態３３：実施形態３２に係る方法であって、
少なくとも１種の所望の生成物がポリマー、酸、アルコール又はエステルである、
方法。
【０２３１】
実施形態３４：前述の実施形態のいずれか一つに係る方法であって、
細胞又は生物が産業的に関連性がある、
方法。
【０２３２】
実施形態３５：前述の実施形態のいずれか一つに係る方法であって、
細胞又は生物が細菌、酵母又はカビの群から選択される微生物である、
方法。
【０２３３】
実施形態３６：実施形態３５に係る方法であって、
酵母がサッカロミセス  セレビシエである、
方法。
【０２３４】
実施形態３７：前述の実施形態のいずれか一つに係る方法であって、
化学環境が細胞又は生物用の培地である、
方法。
【０２３５】
実施形態３８：実施形態１から３７に係る方法であって、
化学環境が、細胞又は生物の代謝形質を進化させるのに使用される進化化学環境であり、細胞又は生物を培養して少なくとも１種の所望の生成物を生成するために使用される標的化学環境とは異なる、
方法。
【０２３６】
実施形態３９：実施形態１から３７に係る方法であって、
細胞が腫瘍細胞である、
方法。
【０２３７】
実施形態４０：実施形態１から３７に係る方法であって、
生物が病原体である、
方法。
【０２３８】
実施形態４１：実施形態３９又は４０に係る方法であって、
代謝形質が細胞又は生物の不安定化をもたらす、
方法。
【０２３９】
実施形態４２：実施形態４１に係る方法であって、
細胞又は生物の不安定化が、増殖の減少及び／又は細胞若しくは生物の死を引き起こす、
方法。
【０２４０】
実施形態４３：細胞又は生物の代謝形質を進化させる化学環境を決定する方法であって、
（ａ）前述の実施形態のいずれか一つに係る方法を用いて、少なくとも２つの化学環境の代謝形質を進化させる適合性を評価するステップ、
（ｂ）代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境に属する、代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの化学環境を選択するステップ
を含む、方法。
【０２４１】
実施形態４４：実施形態４３に係る方法であって、ステップ（ｂ）において、代謝形質を進化させる可能性が最も高い化学環境の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％に属する化学環境が選択される、
方法。
【０２４２】
実施形態４５：細胞又は生物の代謝形質を進化させる化学環境を決定する方法であって、
（ａ）前述の実施形態のいずれか一つに係る方法を用いて、少なくとも２つの化学環境の適合性を評価するステップ、
（ｂ）適合性の前もって設定された閾値を超える代謝形質を進化させる適合性を有する少なくとも１つの化学環境を選択するステップ
を含む、方法。
【０２４３】
実施形態４６：細胞又は生物の代謝形質を進化させる方法であって、実施形態４３から４５のステップを含み、
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された化学環境において細胞又は生物を増殖させるステップ
を更に含む、方法。
【０２４４】
実施形態４７：実施形態４６の方法によって得られる細胞又は生物。
【０２４５】
実施形態４８：実施形態４４の細胞又は生物の代謝形質を進化させる方法であって、
（ａ）実施形態４３のステップ（ａ）及び（ｂ）に従って、細胞又は生物の代謝形質を進化させる進化化学環境を決定するステップ、
（ｃ）所望の形質を進化させる進化化学環境において細胞又は生物を増殖させるステップ、
（ｄ）細胞又は生物によって少なくとも１種の所望の生成物を生成するために細胞又は生物を標的化学環境において増殖させるステップ
を含む、方法。
【０２４６】
実施形態４９：実施形態１から４６及び４８に係る方法であって、代謝形質が少なくとも１種の芳香化合物の生成の増加である、方法。
【０２４７】
実施形態５０：実施形態４９に係る方法であって、少なくとも１種の芳香化合物が、芳香族芳香化合物、若しくは分枝鎖アミノ酸由来芳香体、又はその前駆体である、方法。
【０２４８】
実施形態５１：実施形態５０に係る方法であって、芳香族芳香化合物が酢酸フェニルエチルである、方法。
【０２４９】
実施形態５２：実施形態１から４６及び４８に係る方法であって、代謝形質が、乳酸菌増殖を増強するアミノ酸の生成の増加である、方法。
【０２５０】
実施形態５３：プロセッサによって実行されると、実施形態１から４４のいずれかに係る方法ステップを行うようになされたコンピュータプログラム要素。
【０２５１】
実施形態５４：実施形態５３に係るコンピュータプログラム要素を含むコンピュータ可読媒体。
【０２５２】
実施形態５５：実施形態４３又は４４のステップを含む、所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別するための選択化学環境を決定する方法であって、
代謝形質を進化させる化学環境の適合性が、所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別するための化学環境の適合性と相関する、
方法。
【０２５３】
実施形態５６：選択化学環境を用いて所望の代謝形質を有する細胞又は生物を選別する方法であって、
（ａ）実施形態５５に係る選択化学環境を決定するステップ、
（ｂ）少なくとも２種の細胞又は生物を選択化学環境において増殖させるステップ、
（ｃ）選択環境において他の細胞又は生物の１種以上よりも高い増殖を示す少なくとも１種の細胞又は生物を選択するステップ、
選択環境におけるより高い増殖は、細胞又は生物が所望の代謝形質を含むことを示す、
方法。
【０２５４】
実施形態５７：実施形態５５又は５６に係る方法であって、所望の代謝形質が標的化学環境において適応度の利点を与えない、方法。
【０２５５】
実施形態５８：実施形態５５から５７に係る方法であって、所望の代謝形質が選択化学環境において適応度の利点を与える、方法。
【図１】
2019528498.tif 000037
【図２】
2019528498.tif 000038
【図３】
2019528498.tif 000039
【図４】
2019528498.tif 000040
【図５ａ】
2019528498.tif 000041
【図５ｂ】
2019528498.tif 000042
【図５ｃ】
2019528498.tif 000043
【図５ｄ】
2019528498.tif 000044
【図６】
2019528498.tif 000045
【国際調査報告】
2019528498.tif 000046
2019528498.tif 000047
2019528498.tif 000048
2019528498.tif 000049
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