(57)【要約】インフルエンザＡおよびＢウイルスに対する幅広い免疫応答を生成し、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する個体における複数回のワクチン接種を可能にすることにおける使用のための、複数のインフルエンザ抗原遺伝子を含む組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンを構築および生成するための方法が記載される。具体的には、上記組換えアデノウイルスベースのベクターは、初期２ｂ（Ｅ２ｂ）遺伝子において欠失を含む複製欠損アデノウイルスベクターである。
2019501945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
Ｅ２ｂ遺伝子領域において欠失を含む複製欠損アデノウイルスベクター；および
インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸配列、
を含む、組成物。
【請求項２】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、インフルエンザウイルスＡの標的抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記インフルエンザＡ標的抗原および前記インフルエンザＢ標的抗原は、インフルエンザウイルスＡおよびインフルエンザウイルスＢに共通する標的抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域において欠失をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ３領域において欠失をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域において欠失をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ３およびＥ４領域において欠失をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスの抗原を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記インフルエンザＢ標的抗原は、インフルエンザＢ／ＹａｍａｇａｔａウイルスおよびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａウイルスから選択されるウイルスの抗原を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ２、マトリクスタンパク質Ｍ２のＭ２ｅ部分、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質Ｍ１、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記インフルエンザＢ標的抗原は、ＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記欠失は、塩基対を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記欠失は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０の塩基対を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記欠失は、１５０より多い、１６０より多い、１７０より多い、１８０より多い、１９０より多い、２００より多い、２５０より多い、または３００より多い塩基対を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アデノウイルスベクターは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種のインフルエンザＡ標的抗原をコードする核酸を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アデノウイルスベクターは、複数のインフルエンザＡ標的抗原をコードする核酸を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アデノウイルスベクターは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種のインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記アデノウイルスベクターは、複数のインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記アデノウイルスベクターは、前記インフルエンザＡ標的抗原、前記インフルエンザＢ標的抗原、または両方の発現を増加させるエレメントをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記エレメントは、少なくとも１種のエレメント、少なくとも２種のエレメント、少なくとも３種のエレメント、少なくとも４種のエレメント、または少なくとも５種のエレメントを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記エレメントは、内部リボソーム結合部位を含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記エレメントは、構成的プロモーターを含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記エレメントは、誘導性プロモーターを含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記エレメントは、転写エンハンサーを含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記エレメントは、パリンドローム配列を含まない、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記アデノウイルスベクターは、前記インフルエンザＡ標的抗原、前記インフルエンザＢ標的抗原、または両方の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記アデノウイルスベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物または前記複製欠損アデノウイルスベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記共刺激分子は、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記共刺激分子は、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３の組み合わせを含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記アデノウイルスベクターは、インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸配列を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって、５×１０１１  ＶＰ以下を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって１×１０１２  ウイルス粒子ＶＰ以下を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成することを必要とする個体においてインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、該個体に請求項１〜３４のいずれかに記載の組成物を投与するステップを包含する、方法。
【請求項３６】
個体においてインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、
該個体に、
Ｅ２ｂ領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに
インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸、
を含む、第１のアデノウイルスベクターを投与するステップ；
該個体に、
（ａ）Ｅ２ｂ領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに
（ｂ）インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸、
を含む、第２のアデノウイルスベクターを投与するステップ；
を包含し、それによって、１種または複数種のインフルエンザＡおよびＢ標的抗原に対する免疫応答を生成する、方法。
【請求項３７】
個体においてインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）該個体に、
（ｉ）Ｅ２ｂ領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに
（ｉｉ）第１のインフルエンザＡ標的抗原および第１のインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸、
を含む、第１のベクターを投与するステップ；ならびに
（ｂ）その後、該個体に、第２のベクターであって、
（ｉ）  ステップ（ａ）の複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに
（ｉｉ）第２のインフルエンザＡ標的抗原および第２のインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸であって、ここで該第２のベクターの該第２のインフルエンザＡ標的抗原は、該第１のベクターの該第１のインフルエンザＡ標的抗原と同じであるかまたは異なり、該第２のベクターの該第２のインフルエンザＢ標的抗原は、該第１のベクターの該第１のインフルエンザＢ標的抗原と同じかまたは異なる、核酸、
を含む、第２のベクターを投与するステップ；
を包含し、それによって、該第１の標的抗原および該第２の標的抗原に対する免疫応答を生成する、方法。
【請求項３８】
個体においてインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、該個体に、Ｅ２ｂ領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクターならびにインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを投与するステップ；ならびに該アデノウイルスベクターを少なくとも１回該個体に再投与するステップを包含し；それによって、該インフルエンザＡおよびＢ標的抗原に対する免疫応答を生成する、方法。
【請求項３９】
ユニバーサルインフルエンザワクチンベクターを構築するための方法であって、該方法は、インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を、Ｅ２ｂ領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクターへと挿入するステップ、を包含する方法。
【請求項４０】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスの抗原を含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記インフルエンザＢ標的抗原は、インフルエンザＢ／ＹａｍａｇａｔａウイルスおよびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａウイルスから選択されるウイルスの抗原を含む、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ２、マトリクスタンパク質Ｍ２のＭ２ｅ部分、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質Ｍ１、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記インフルエンザＢ標的抗原は、ＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記個体は、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する、請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記アデノウイルスベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
第１のベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
第２のベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１のおよび第２のアデノウイルスベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない、請求項３６〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記個体は、アデノウイルス５に対して既存の免疫を有する、請求項３６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１のおよび前記第２のベクターの前記第１のおよび第２の標的抗原は、同じ感染性生物に由来する、請求項３６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１のおよび前記第２のベクターの前記第１のおよび第２の標的抗原は、異なる感染性生物に由来する、請求項３６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記インフルエンザＡ標的抗原および前記インフルエンザＢ標的抗原は、異なる標的抗原である、請求項３６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、インフルエンザウイルスＡの標的抗原である、請求項３６〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記インフルエンザＡ標的抗原および前記インフルエンザＢ標的抗原は、インフルエンザウイルスＡおよびインフルエンザウイルスＢに共通する標的抗原である、請求項３６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域において欠失をさらに含む、請求項３６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ３領域において欠失をさらに含む、請求項３６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域において欠失をさらに含む、請求項３６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ３およびＥ４領域において欠失をさらに含む、請求項３６〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記欠失は、塩基対を含む、請求項３６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記欠失は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０の塩基対を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記欠失は、１５０より多い、１６０より多い、１７０より多い、１８０より多い、１９０より多い、２００より多い、２５０より多い、または３００より多い塩基対を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記アデノウイルスベクターは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種のインフルエンザＡおよびＢ標的抗原をコードする核酸配列を含む、請求項３６〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記アデノウイルスベクターは、前記インフルエンザＡおよびインフルエンザＢ標的抗原の発現を増加させるエレメントをさらに含む、請求項３６〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記エレメントは、少なくとも１種のエレメント、少なくとも２種のエレメント、少なくとも３種のエレメント、少なくとも４種のエレメント、または少なくとも５種のエレメントを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記エレメントは、内部リボソーム結合部位を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記エレメントは、構成的プロモーターを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記エレメントは、誘導性プロモーターを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記エレメントは、転写エンハンサーを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記エレメントは、パリンドローム配列を含まない、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記アデノウイルスベクターは、前記インフルエンザＡ標的抗原、前記インフルエンザＢ標的抗原、または両方の免疫原性を増加させるポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項３６〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、Ｍを含み、前記インフルエンザＢ標的抗原は、ＢＭ２を含む、請求項３６〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記インフルエンザＡ標的抗原、前記インフルエンザＢ標的抗原、または両方は、ヘマグルチニンを含む、請求項３６〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ヘマグルチニンは、ＨＡ１ドメインを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ここで前記ヘマグルチニンは、ＨＡ２ドメインを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
ここで前記ヘマグルチニンは、ストークドメインを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記インフルエンザＡ標的抗原、前記インフルエンザＢ標的抗原、または両方は、ノイラミニダーゼを含む、請求項３６〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記インフルエンザＡ標的抗原、前記インフルエンザＢ標的抗原、または両方は、核タンパク質（ＮＰ）を含む、請求項３６〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ１を含む、請求項３６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ２を含む、請求項３６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ２ｅを含む、請求項３６〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記インフルエンザＡ標的抗原、前記インフルエンザＢ標的抗原、または両方は、ＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質Ｍ１、マトリクスタンパク質Ｍ２またはこれらの組み合わせをコードする配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項３６〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記方法は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって５×１０１１  ＶＰ以下を投与するステップを包含する、請求項３６〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記方法は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって１×１０１２  ウイルス粒子ＶＰ以下を投与するステップを包含する、請求項３６〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／２７９，２６７号および２０１６年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／２９４，８４０号の利益を請求し、その全体の内容が参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）、米国国立アレルギー・感染研究所（ＮＩＡＩＤ）によって授与された研究助成金ＲＯ１ＡＩ１１１３６４の下、政府支援によってなされた。政府は、本発明における特定の利益を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
背景
ワクチンは、有害な物質および病的な細胞を認識しかつ破壊するために免疫系を訓練することによって、身体が疾患と闘うために役立つ。ワクチンは、大きく２つのタイプ、予防ワクチンおよび処置ワクチンに分類され得る。予防ワクチンは、健康な人々に与えられて、特定の疾患の発生を防止する一方で、処置ワクチン（免疫療法ともいわれる）は、疾患を有すると診断された人に与えられて、その疾患が成長し、拡がるのを抑えるかまたは予防剤として役立つ。
【０００４】
ウイルスワクチンは、感染性疾患およびがんと闘うことに役立つように現在開発されている最中である。これらのウイルスワクチンは、宿主細胞内で疾患と関連する遺伝子の小さな画分の発現を誘導することによって機能し、それは翻って、宿主の免疫系が病的な細胞を同定しかつ破壊するよう強化する。よって、ウイルスワクチンの臨床的応答は、ワクチンが高レベルの免疫原性を得、持続した長期発現を有する能力に依存し得る。
【０００５】
感染性疾患のような複雑な疾患に対する増強された治療的応答のための方法および組成物を開発する必要が未だにある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
種々の局面において、本開示は、Ｅ２ｂ遺伝子領域において欠失を含む複製欠損アデノウイルスベクター；ならびにインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸配列を含む組成物を提供する。
【０００７】
いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、インフルエンザウイルスＡの標的抗原である。さらなる局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原および上記インフルエンザＢ標的抗原は、インフルエンザウイルスＡおよびインフルエンザウイルスＢに共通する標的抗原である。
【０００８】
いくつかの局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域において欠失をさらに含む。さらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ３領域において欠失をさらに含む。なおさらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域において欠失をさらに含む。いくつかの局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ３およびＥ４領域において欠失をさらに含む。
【０００９】
いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスの抗原を含む。他の局面において、上記インフルエンザＢ標的抗原は、インフルエンザＢ／ＹａｍａｇａｔａウイルスおよびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａウイルスから選択されるウイルスの抗原を含む。
【００１０】
他の局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ２、マトリクスタンパク質Ｍ２のＭ２ｅ部分、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質Ｍ１、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である。いくつかの局面において、上記インフルエンザＢ標的抗原は、ＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である。
【００１１】
いくつかの局面において、上記欠失は、塩基対を含む。さらなる局面において、上記欠失は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０の塩基対を含む。
【００１２】
なおさらなる局面において、上記欠失は、１５０より多い、１６０より多い、１７０より多い、１８０より多い、１９０より多い、２００より多い、２５０より多い、または３００より多い塩基対を含む。
【００１３】
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種のインフルエンザＡ標的抗原をコードする核酸を含む。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、複数のインフルエンザＡ標的抗原をコードする核酸を含む。他の局面において、上記アデノウイルスベクターは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種のインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含む。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、複数のインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含む。
【００１４】
さらなる局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザＡ標的抗原、インフルエンザＢ標的抗原、または両方の発現を増加させるエレメントをさらに含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、少なくとも１種のエレメント、少なくとも２種のエレメント、少なくとも３種のエレメント、少なくとも４種のエレメント、または少なくとも５種のエレメントを含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、内部リボソーム結合部位を含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、構成的プロモーターを含む。他の局面において、上記エレメントは、誘導性プロモーターを含む。
【００１５】
他の局面において、上記エレメントは、転写エンハンサーを含む。いくつかの局面において、上記転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーである。いくつかの局面において、上記エレメントは、パリンドローム配列を含まない。
【００１６】
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザＡ標的抗原、インフルエンザＢ標的抗原、または両方の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない。いくつかの局面において、上記組成物または複製欠損アデノウイルスベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。さらなる局面において、上記共刺激分子は、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、またはこれらの組み合わせを含む。なおさらなる局面において、上記共刺激分子は、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３の組み合わせを含む。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって５×１０１０  ＶＰ以下を含む。他の実施形態において、上記組成物は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって１×１０１２  ＶＰ以下を含む。
【００１７】
種々の局面において、本開示は、インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成することを必要とする個体においてインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、上記の組成物のうちのいずれかに従う組成物を投与するステップを包含する。
【００１８】
種々の局面において、本開示は、個体においてインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、Ｅ２ｂ領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、ならびにインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含む、第１のアデノウイルスベクターを投与するステップ；上記個体に、（ａ）Ｅ２ｂ領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、および（ｂ）インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含む、第２のアデノウイルスベクターを投与するステップを包含し；それによって、１種または複数種のインフルエンザＡおよびＢ標的抗原に対する免疫応答を生成する。
【００１９】
種々の局面において、本開示は、個体においてインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、ａ）上記個体に、（ｉ）Ｅ２ｂ領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに（ｉｉ）第１のインフルエンザＡ標的抗原および第１のインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含む、第１のベクターを投与するステップ；ならびに（ｂ）その後上記個体に、第２のベクターであって、（ｉ）ステップ（ａ）の複製欠損アデノウイルスベクター、および（ｉｉ）第２のインフルエンザＡ標的抗原および第２のインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸であって、ここで上記第２のベクターの第２のインフルエンザＡ標的抗原が、上記第１のベクターの第１のインフルエンザＡ標的抗原と同じであるかまたは異なり、上記第２のベクターの第２のインフルエンザＢ標的抗原が、上記第１のベクターの第１のインフルエンザＢ標的抗原と同じであるかまたは異なる核酸を含む、第２のベクターを投与するステップを包含し；それによって、上記第１の標的抗原および上記第２の標的抗原に対する免疫応答を生成する。
【００２０】
種々の局面において、本開示は、個体においてインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、Ｅ２ｂ領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、ならびにインフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを投与するステップ；ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも１回上記個体に再投与するステップを包含し；それによって、上記インフルエンザＡおよびＢ標的抗原に対する免疫応答を生成する。
【００２１】
種々の局面において、本開示は、ユニバーサルインフルエンザワクチンベクターを構築するための方法を提供し、上記方法は、インフルエンザＡ標的抗原およびインフルエンザＢ標的抗原をコードする核酸を複製欠損アデノウイルスベクターに挿入するステップであって、ここで上記アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ領域において欠失を有する、ステップを包含する。
【００２２】
いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスの抗原を含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザＢ標的抗原は、インフルエンザＢ／ＹａｍａｇａｔａウイルスおよびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａウイルスから選択されるウイルスの抗原を含む。
【００２３】
他の局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ２、マトリクスタンパク質Ｍ２のＭ２ｅ部分、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質Ｍ１、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である。さらに他の局面において、上記インフルエンザＢ標的抗原は、ＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である。
【００２４】
いくつかの局面において、上記個体は、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない。
【００２５】
他の局面において、第１のベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない。さらなる局面において、第２のベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない。なおさらなる局面において、上記第１のおよび第２のアデノウイルスベクターは、ｇｕｔｔｅｄベクターではない。いくつかの局面において、上記個体は、アデノウイルス５に対して既存の免疫を有する。
【００２６】
いくつかの局面において、上記第１のおよび第２のベクターの上記第１のおよび第２の標的抗原は、同じ感染性生物（infectious  organism）に由来する。他の局面において、上記第１のおよび第２のベクターの上記第１のおよび第２の標的抗原は、異なる感染性生物に由来する。いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原および上記インフルエンザＢ標的抗原は、異なる標的抗原である。
【００２７】
いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、インフルエンザウイルスＡの標的抗原である。いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原および上記インフルエンザＢ標的抗原は、インフルエンザウイルスＡおよびインフルエンザウイルスＢに共通する標的抗原である。
【００２８】
いくつかの局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域において欠失をさらに含む。さらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ３領域において欠失をさらに含む。なおさらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域において欠失をさらに含む。なおさらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ３およびＥ４領域において欠失をさらに含む。
【００２９】
いくつかの局面において、上記欠失は、塩基対を含む。さらなる局面において、上記欠失は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０の塩基対を含む。
【００３０】
なおさらなる局面において、上記欠失は、１５０より多い、１６０より多い、１７０より多い、１８０より多い、１９０より多い、２００より多い、２５０より多い、または３００より多い塩基対を含む。
【００３１】
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種または少なくとも１０種のインフルエンザＡおよびＢ標的抗原をコードする核酸配列を含む。
【００３２】
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢ標的抗原の発現を増加させるエレメントをさらに含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、少なくとも１種のエレメント、少なくとも２種のエレメント、少なくとも３種のエレメント、少なくとも４種のエレメント、または少なくとも５種のエレメントを含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、内部リボソーム結合部位を含む。他の局面において、上記エレメントは、構成的プロモーターを含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、誘導性プロモーターを含む。他の局面において、上記エレメントは、転写エンハンサーを含む。さらなる局面において、上記転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーである。いくつかの局面において、上記エレメントは、パリンドローム配列を含まない。
【００３３】
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザＡ標的抗原、インフルエンザＢ標的抗原、または両方の免疫原性を増加させるポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、Ｍを含み、上記インフルエンザＢ標的抗原は、ＢＭ２を含む。
【００３４】
他の局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原、上記インフルエンザＢ標的抗原、または両方は、ヘマグルチニンを含む。いくつかの局面において、上記ヘマグルチニンは、ＨＡ１ドメインを含む。いくつかの局面において、ここで上記ヘマグルチニンは、ＨＡ２ドメインを含む。他の局面において、ここで上記ヘマグルチニンは、ストークドメインを含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原、上記インフルエンザＢ標的抗原、または両方は、ノイラミニダーゼを含む。
【００３５】
他の局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原、上記インフルエンザＢ標的抗原、または両方は、核タンパク質（ＮＰ）を含む。さらに他の局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ１を含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ２を含む。他の局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原は、マトリクスタンパク質Ｍ２ｅを含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザＡ標的抗原、上記インフルエンザＢ標的抗原、または両方は、ＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質Ｍ１、マトリクスタンパク質Ｍ２またはこれらの任意の組み合わせをコードする配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、上記方法は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって５×１０１０  ＶＰ以下を投与するステップを包含する。他の実施形態において、上記方法は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって１×１０１２  ＶＰ以下を投与するステップを包含する。
【００３６】
本明細書で記載される方法および／または組成物との関連において考察される実施形態は、本明細書で記載される任意の他の方法または組成物に関して使用され得る。従って、１つの方法または組成物に関する実施形態は、他の方法および組成物にも同様に適用され得る。
【００３７】
他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および具体例は、特定の実施形態を示しながら、例証によって与えられるに過ぎないことは、理解されるべきである。なぜなら本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本開示の複数遺伝子構築物の模式図を図示する。
【００３９】
図１Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］への挿入のために使用される、インフルエンザＡのマトリクス１（Ｍ１）タンパク質、核タンパク質（ＮＰ）タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）、および各タンパク質遺伝子の間にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを含む三重遺伝子挿入物を図示する。
【００４０】
図１Ｂは、それぞれ、ブタテッショウウイルス−１およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスに由来する、単一の「自己切断」２Ａペプチドによって離された２種の抗原遺伝子配列を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］を図示する。
【００４１】
【図２】図２は、単一のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベースのプラットフォームにおけるインフルエンザＭ１、ＮＰ、およびＨＡ抗原のウェスタンブロット発現を図示する。
【００４２】
【図３】図３は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡワクチンの用量を段階的に増加させて免疫した後のＨＡ抗原に対する抗体応答の生成を示す（しかし、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルの空コントロールベクターでは示さない）グラフを図示する。値は、平均±ＳＥＭである。
【００４３】
【図４】図４は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡワクチンの用量を段階的に増加させて免疫した後に、Ｍ１、ＮＰ、およびＨＡ抗原に対するＩＦＮ分泌脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定される場合の細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答の生成を示す（しかし、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルの空コントロールベクターでは示されない）グラフを図示する。ＥＬＩＳｐｏｔ応答の特異性は、無関係のＳＩＶ−ＮｅｆおよびＳＩＶ−Ｖｉｆペプチドプールとの脾細胞反応性の欠如によって示された。値は、平均±ＳＥＭである。
【００４４】
【図５】図５は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡワクチンの用量を段階的に増加させて免疫した後にＭ１、ＮＰ、およびＨＡ抗原に対するグランザイムＢ分泌脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定される場合の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の生成を示す（しかし、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルの空コントロールベクターでは示さない）グラフである。ＥＬＩＳｐｏｔ応答の特異性は、無関係のＳＩＶ−ＮｅｆおよびＳＩＶ−Ｖｉｆペプチドプールとの脾細胞反応性の欠如によって示された。値は、平均±ＳＥＭである。
【００４５】
【図６】図６は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡワクチンで１回（赤色の線；群１）、２週間空けて２回（青色の線；群２）、１ヶ月空けて２回（緑色の線；群３）、または２ヶ月空けて２回（橙色の線；群４）、免疫した後のＮＰおよびＨＡ抗原に対するＩＦＮ−γ分泌脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定される場合の時間経過（縦断的）研究におけるＣＭＩ応答の生成を示すグラフを図示する。値は、平均±ＳＤである。矢印は、免疫時間を示す。
【００４６】
【図７】図７は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡワクチンで１回（赤色の線；群１）、２週間空けて２回（青色の線；群２）、１ヶ月空けて２回（緑色の線；群３）、または２ヶ月空けて２回（橙色の線；群４）、免疫した後の時間経過（縦断的）研究におけるＨＡ抗原に対する抗体（Ａｂ）応答の生成を示すグラフを図示する。値は、平均±ＳＤである。矢印は、免疫時間を示す。
【００４７】
【図８】図８は、マウスにおいてＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］インフルエンザワクチンで免疫した後に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される場合の血清中のインフルエンザＡまたはインフルエンザＢのＨＡ抗体応答の定量を図示する。
【００４８】
図８Ａは、インフルエンザＡ  ＨＡ抗体応答の定量を図示する。
【００４９】
図８Ｂは、インフルエンザＢ  ＨＡ抗体応答の定量を図示する。
【００５０】
【図９】図９は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅワクチンおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡワクチンの組み合わせで免疫したマウスに由来する再刺激脾細胞におけるＩＦＮ−γ発現エフェクターＴリンパ球の定量によって測定される場合の細胞媒介性免疫応答を図示する。
【００５１】
図９Ａは、ＩＦＮ−γ発現ＣＤ８＋脾細胞のパーセンテージを図示する。
【００５２】
図９Ｂは、ＩＦＮ−γ発現ＣＤ４＋脾細胞のパーセンテージを図示する。
【００５３】
【図１０】図１０は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅワクチンおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡワクチンの組み合わせで免疫したマウスからのサイトカイン分泌再刺激脾細胞の定量によって測定される場合の細胞媒介性免疫応答を図示する。
【００５４】
図１０Ａは、ＩＦＮ−γ分泌脾細胞の定量を図示する。
【００５５】
図１０Ｂは、ＩＬ−２分泌脾細胞の定量を図示する。
【００５６】
【図１１】図１１は、６０日間の期間にわたって、コントロール（ヌル）ワクチンと比較した、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＩｎｆＡ−ＨＡワクチンで免疫したマウスにおけるチャレンジ研究からの生存曲線を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
以下の節では、より詳細に本発明の種々の局面を記載する。本発明の各局面は、そうでないと明確に示されなければ、本発明の任意の他の1つまたは複数の局面と組み合わせられ得る。特に、好ましいまたは有利であると記載される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される任意の他の1つまたは複数の特徴（feature  of  features）と組み合わされ得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、冠詞「ａ（１つの、ある）」は、別段明示的に提供されなければ、１もしくはこれより多くを意味する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｉｇ）」などのような用語は、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、用語「または（ｏｒ）」は、接続語または離接語であり得る。
【００６１】
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わされ得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、本明細書中のいくつかの発明的実施形態は、数値範囲を企図する。種々の本発明の局面は、範囲の形式で示され得る。範囲の形式での記載は、便宜のためおよび簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきではないことは、理解されるべきである。よって、範囲の記載は、あり得る部分範囲全てならびに明示的に書き記されているかのようなその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見做されるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびにその範囲内の個々の数値（例えば、１、２、３、４、５、および６）を具体的に開示していると見做されるべきである。これは、範囲の幅とは関係なく当てはまる。範囲が存在する場合、その範囲は、範囲の端点を含む。
【００６３】
用語「アデノウイルス」または「Ａｄ」とは、アデノウイルス科のエンベロープのないＤＮＡウイルスの群をいう。ヒト宿主に加えて、これらのウイルスは、トリ、ウシ、ブタおよびイヌの種において見出され得るが、これらに限定されない。アデノウイルス科の４つの属（例えば、アビアデノウイルス属、マストアデノウイルス属、アタデノウイルス属およびシアデノウイルス属）のうちのいずれかに由来する任意のアデノウイルスの使用が、Ｅ２ｂ欠失ウイルスベクター、または本明細書で記載されるとおりの他の欠失を含むベクターの基礎として企図され得る。さらに、いくつかの血清型は、各種において見出される。Ａｄはまた、これらのウイルス血清型のうちのいずれかの遺伝的派生物（genetic  derivative）（遺伝的変異、同種または異種のＤＮＡ配列の欠失または転位が挙げられるが、これらに限定されない）に関する。
【００６４】
「ヘルパーアデノウイルス」または「ヘルパーウイルス」とは、特定の宿主細胞が供給できないウイルス機能を供給し得る（その宿主は、Ｅ１タンパク質のようなＡｄ遺伝子生成物を提供し得る）Ａｄをいう。このウイルスは、第２のウイルス、またはヘルパー依存性ウイルス（例えば、ｇｕｔｔｅｄウイルスまたはｇｕｔｌｅｓｓウイルス、またはＥ２ｂもしくは本明細書で記載されるとおりの他の領域などの特定の領域が欠失したウイルス）で欠いている機能（例えば、タンパク質）をトランスで供給するために使用される；その第１の複製能力のないウイルスは、その第２の、ヘルパー依存性ウイルスを「助ける」といわれ、それによって、細胞中でのその第２のウイルスゲノムの生成を可能にする。
【００６５】
用語「アデノウイルス５ヌル（Ａｄ５ｎｕｌｌ）」は、本明細書で使用される場合、発現のためのいかなる異種核酸配列をも含まない複製しないＡｄをいう。
【００６６】
用語「第１世代アデノウイルス」とは、本明細書で使用される場合、初期領域１（Ｅ１）が欠失したＡｄをいう。さらなる場合には、非必須初期領域３（Ｅ３）もまた、欠失され得る。
【００６７】
用語「ｇｕｔｔｅｄ」または「ｇｕｔｌｅｓｓ」とは、本明細書で使用される場合、全てのウイルスコード領域が欠失しているアデノウイルスベクターをいう。
【００６８】
用語「トランスフェクション」とは、本明細書で使用される場合、真核生物細胞へと外来核酸を導入することをいう。トランスフェクションは、当該分野で公知の種々の手段（リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、およびバイオリスティックが挙げられる）によって達成され得る。
【００６９】
用語「安定なトランスフェクション」または「安定してトランスフェクトされる」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの導入および組み込みをいう。用語「安定なトランスフェクタント」とは、ゲノムＤＮＡへと安定して組み込まれた外来ＤＮＡを有する細胞に言及する。
【００７０】
用語「レポーター遺伝子とは、レポーター分子（酵素を含む）をコードするヌクレオチド配列を示す。「レポーター分子」とは、種々の検出システム（酵素ベースの検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素ベースの組織化学アッセイ）、蛍光システム、放射活性システム、およびルミネッセントシステムが挙げられるが、これらに限定されない）のうちのいずれかにおいて検出可能である。
【００７１】
一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｔａｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）から入手可能）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．）から市販されている）、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子または当該分野で公知の他のレポーター遺伝子が、使用され得る。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「〜をコードする核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」、「〜をコードするＤＮＡ配列」、および「〜をコードするＤＮＡ」とは、デオキシリボ核酸の鎖に沿った、デオキシリボヌクレオチドの順序または配列をいう。これらデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。その核酸配列は、このようにして、アミノ酸配列をコードする。
【００７３】
用語「異種核酸配列」とは、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列であって、それが天然ではライゲートしていないか、またはそれが天然では異なる位置でライゲートしている核酸配列にライゲートしているか、またはライゲートする状態になるように操作されるヌクレオチド配列をいう。異種核酸は、それが導入される細胞の中に天然に見出されるヌクレオチド配列を含み得るか、またはその異種核酸は、天然に存在する配列に対して一部の改変を含み得る。
【００７４】
用語「導入遺伝子」とは、試験被験体の細胞またはゲノムに導入される、天然のもしくは異種の核酸配列または縮合された同種もしくは異種の核酸配列のいずれかの任意の遺伝子コード領域をいう。本発明において、導入遺伝子は、被験体の細胞に導入遺伝子を導入するために使用される任意のウイルスベクターで運ばれる。
【００７５】
用語「第２世代アデノウイルス」とは、本明細書で使用される場合、そのウイルスから、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３のＤＮＡ遺伝子配列の全てまたは一部、およびある種の実施形態では、Ｅ４のＤＮＡ遺伝子配列が欠失された（除去された）Ａｄをいう。
【００７６】
用語「被験体」とは、本明細書で使用される場合、任意の動物、例えば、哺乳動物または有袋動物をいう。被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザルまたはマカクの他のタイプ）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラットおよび任意の種類の家禽が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
ある種の局面において、インフルエンザウイルスに対して広く反応性の免疫応答を生成するために複数回のワクチン接種を可能にするアデノウイルスベクターを使用して、種々のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を生成するワクチンを生成するための方法が提供され得る。
【００７８】
一局面は、個体においていくつかのインフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、アデノウイルスベクターであって、ａ）Ｅ２ｂ領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、およびｂ）複数のインフルエンザ標的抗原をコードする核酸を含む、アデノウイルスベクターを投与するステップ；ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも１回上記個体に再投与するステップ、を包含し；それによって、上記インフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成する。
【００７９】
別の局面は、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する個体においていくつかのインフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、アデノウイルスベクターであって、ａ）Ｅ２ｂ領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、およびｂ）複数のインフルエンザ標的抗原をコードする核酸を含む、アデノウイルスベクターを投与するステップ；ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも１回上記個体に再投与するステップを包含し；それによって、上記インフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成する。
【００８０】
さらなる局面において、上記標的抗原は、インフルエンザＡおよびＢウイルスタンパク質に由来する抗原から構成される。この点において、上記インフルエンザタンパク質は、任意のインフルエンザＡおよびＢウイルスに由来し得る（Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、インフルエンザＢ／Ｙａｍａｇａｔａ、およびインフルエンザＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａが挙げられるが、これらに限定されない）。ある種の実施形態において、上記インフルエンザウイルスタンパク質は、任意のインフルエンザタンパク質であり得る（ＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質Ｍ１、およびマトリクスタンパク質Ｍ２が挙げられるが、これらに限定されない）。
【００８１】
ユニバーサルインフルエンザワクチンの開発の必要性および免疫応答の重要性
パンデミックインフルエンザ大発生は、世界的な公衆衛生に対する大きな脅威である。このような大発生は、ヒトがほとんどまたは全く免疫を持っていないウイルス株の突然の出現および爆発的な伝播の潜在性を示す。これらのウイルス株のうちの大部分は、入院を要する重度のまたは生命を脅かす病気を引き起こす。重度のインフルエンザを防止する最も効率的な方法は、感受性集団のワクチン接種である。従来のインフルエンザワクチンは、高度に可変性の表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）に対する抗体（Ａｂ）を誘導することによって機能し、そして大部分は、ウイルス感染性を低減しそして感染個体において拡がることによって作用する。このタイプのワクチンは現在、潜在的なパンデミック株が一旦同定された後に、調製して流通させるのに少なくとも６〜１２ヶ月かかってしまい、これは非常に長すぎる。これは、２０１０年４月に新たに出現したウイルスが同定されたが、大規模免疫のために十分なワクチンが１０月まで入手できなかった２００９年のＨ１Ｎ１パンデミックによって強調された。同時に、そのウイルスの拡がりおよびワクチンの必要性は明らかであった。このことは、特に、インフルエンザに対する細胞性および体液性両方の免疫応答の防御効果を誘導するワクチンを必要とする高リスク集団における使用のために、迅速に生産することができるインフルエンザワクチンの必要性を示す。
【００８２】
インフルエンザ抗原
ある種の実施形態において、インフルエンザ抗原（例えば、ヘマグルチニン、核タンパク質、およびマトリクス構成成分）は、例えば、ワクチン組成物またはアデノウイルスベクターを含む組成物において使用され得る。
【００８３】
例えば、ヘマグルチニン抗原が使用され得る。天然のインフルエンザ感染に対する防御の主要な相関物は、血清および粘膜におけるＨＡに特異的なＡｂのレベルである。季節性インフルエンザワクチンは、血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイによって測定される場合にＨＡに対する体液性応答の誘導に基づいて承認される。そのＨＡ抗原は、インフルエンザ亜型と交叉反応するステム領域において保存された抗原エピトープを含むようである（Ｎａｂｅｌ  ＧＪ  Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ｃｌｉｎ  Ｃｌｉｍａｔｏｌ  Ａｓｓｏｃ．  ２０１２；１２３：９−１５）。
【００８４】
Ｍ２タンパク質および核タンパク質（ＮＰ）はまた、ある種の局面において使用され得る。研究からは、インフルエンザＭ２タンパク質および核タンパク質（ＮＰ）がまた、実験的ワクチン（Ａｄ５ベクターを使用するものを含む）において使用される場合に広い範囲のインフルエンザ亜型非依存性防御を提供する保存された領域を含むことが示されている（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＳＬら  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００５  ２３：５４０４−１０；  Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ＳＭら  Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２００７  １３：４２６−３５；  Ｐｒｉｃｅ  ＧＥら  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１０  ５（１０）：ｅ１３１６２；  Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ  Ａ  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．  ２０１１  ３６６（１５７９）：２７６６−７３）。
【００８５】
ワクチン接種ストラテジーは、免疫応答を誘導するために抗原としてＮＰを使用してきた。なぜならＮＰは、インフルエンザウイルス亜型にわたって十分に保存されているからである（Ａｌｔｓｔｅｉｎ  ＡＤら  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００６  １５１：９２１−３１；  Ｓａｈａ  Ｓら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ２００６  ３５４：４８−５７；  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＡＧら  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１１  ６（１０）：ｅ２５９３８）。
【００８６】
さらに、Ｍ２タンパク質内の高度に保存された膜外部ドメイン（Ｍ２ｅ）は、インフルエンザＡワクチン開発の魅力的な標的として研究されてきた（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ＳＭら  Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２００７  １３：４２６−３５；  Ｎｅｉｒｙｎｃｋ  Ｓら  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １９９９  ５：１１５７−６３；  Ｒｏｏｓｅ  Ｋら  Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  ２００９  ２２：８０−９２；  Ｔｕｒｌｅｙ  ＣＢら  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２０１１  ２９：５１４５−５２）。Ｍ２ｅへの体液性応答は、Ａｂ依存性細胞媒介性細胞傷害性を潜在的に伴うおよび／または補体カスケードを誘発する機構（複数可）によって、インフルエンザ感染を阻害し得、細胞溶解を生じ得る（Ｅｌ  Ｂａｋｋｏｕｒｉ  Ｋら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１  １８６：１０２２−３１）。１つの研究グループ（Ｚｈｏｕ  Ｄら  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  １８：２１８２−９）は、タンデムで、Ｈ１Ｎ１  ＮＰに融合したインフルエンザＡウイルスの多様な株（Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ２）に由来する３種のＭ２ｅ配列を発現するＥ１欠失アデノウイルス（Ａｄ）ベクターをチンパンジー血清型Ｃ６８（ＡｄＣ６８）またはＣ６（ＡｄＣ６）から生成した。Ｍ２ｅおよびＮＰを発現するそのＡｄワクチンは、マウスにおいてロバストなＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答および３種のＭ２ｅ配列に対する中程度の抗体応答を誘起した。興味深いことに、ワクチン接種した若いマウスは、高用量の、種々のインフルエンザウイルスによるチャレンジ後の死ぬべき運命（mortality）に対して防御される。インフルエンザＢウイルスは、ゆっくりと変異し、そのＢＭ２タンパク質は、幅広いワクチン（ｂｒｏａｄ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）の理想的な候補である、インフルエンザ株Ｂ型の中で高度に保存された領域を含む（Ｈｉｅｂｅｒｔ  ＳＷ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＭＡ，  Ｌａｍｂ  ＲＡ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  １９８６  １５５：７４７−５１）。保存されたインフルエンザ構成成分（例えば、ＢＭ２、Ｍ２、ＮＰ、および異種インフルエンザウイルスに対する防御を生じるコンセンサスＨＡ）に対して体液性およびＣＭＩ両方の応答を誘導する能力は、広く反応性のインフルエンザワクチンの開発において素晴らしい潜在性を保持する。
【００８７】
新しいユニバーサルインフルエンザワクチンの開発において、全てのこれらの上記の局面は、インフルエンザＡ型およびＢ型の高度に保存されかつ交叉反応性の抗原を利用して、複数株交叉反応性インフルエンザワクチンを開発する際に利用される。
【００８８】
アデノウイルスベクター
ある種の局面において、アデノウイルスベクターは、インフルエンザ抗原の送達のための組成物および方法において使用され得る。
【００８９】
ウイルスＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）および／またはプレターミナルタンパク質（ｐＴＰ）遺伝子を除去する初期遺伝子２ｂ（Ｅ２ｂ）領域においてさらなる欠失を有する組換えＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターワクチンプラットフォームは新しく、Ｅ．Ｃ７ヒト細胞株において増殖される（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａ，  Ｂｅｇｙ  ＣＲ，  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＪＳ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９６  ９３：３３５２−６；  Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａ，  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＪＳ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９７  ４：２５８−６３；  Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８  ７２：９２６−３３；  Ｓｅｒｅｇｉｎ  ＳＳ  ａｎｄ  Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  ９：１５２１−３１）。そのベクターは、現在のＡｄ５［Ｅ１−］ベクターの７ｋｂ能力（capacity）（これは、複数の遺伝子の包含を可能にするために十分である）と比較して、最大１２ｋｂの拡大された遺伝子運搬／クローニング能力を有する（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８  ７２：９２６−３３；  Ｓｅｒｅｇｉｎ  ＳＳ  ａｎｄ  Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  ９：１５２１−３１）。Ｅ２ｂ領域のさらなる欠失は、Ａｄ５ウイルスタンパク質への免疫応答を最小限にしながら特異的抗原に対する強力な免疫応答を誘起するなどの有益なアデノウイルス免疫特性を付与する。
【００９０】
重要なことには、がんおよび感染性疾患における前臨床および臨床研究は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベースのベクターが、Ａｄ５免疫の存在下ですら、ベクター化した抗原（ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）に対して強力なＣＭＩ応答およびＡｂ応答を誘導することを示す（Ｏｓａｄａ  Ｔら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １６：６７３−８２；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００９  ２７：６３９４−８；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２００９  １２２：４４−５１；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１０  ５９：１１３１−５；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １８：３２６−３５；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１  ２９：８１０１−７；  Ｊｏｎｅｓ  ＦＲら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１  ２９：７０２０−６；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳ，  Ｊｏｎｅｓ  ＦＲ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１  Ｓ４：００１．  ｄｏｉ：１０．４１７２／２１５５−９８９９．  Ｓ４−００１；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１２  ３０：７２６５−７０；  Ｗｉｅｋｉｎｇ  ＢＧら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１２  １９：６６７−７４；  Ｍｏｒｓｅ  ＭＡら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１３  ６２：１２９３−１３０１；  Ｂａｌｉｎｔら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１５  ６４：９７７−８７；  Ｒｉｃｅ  ＡＥら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５  ２２：４５４−６２；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１５  Ｓｅｐｔ  ７  印刷前に電子出版した（ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ））。
【００９１】
進歩した組換えアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクタープラットフォームは、インフルエンザのための新規な広く交叉反応性のワクチンを開発する機会を与える。このベクターは、強力な免疫応答を誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）への規定されたインフルエンザ抗原の曝露のために、皮下注射によって直接送達され得る。重要なことには、そのＡｄ５組換えベクターは、エピソームで複製し、宿主細胞ゲノムへとゲノムを挿入せず、それによって、遺伝子組み込みおよび不可欠な細胞遺伝子機能の破壊が存在しないことを確実にする（Ｉｍｌｅｒ  ＪＬ  Ｖａｃｃｉｎｅ．  １９９５  １３：１１４３−５１；  Ｅｒｔｌ  ＨＣ，  Ｘｉａｎｇ  Ｚ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９６  １５６：３５７９−８２；  Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，  Ａ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００３  ５：３６２−６）。
【００９２】
不運なことに、現在のＡｄ５ベースのベクターが直面している大きな難題は、Ａｄ５に対する既存の免疫の存在である。大部分の人々は、Ａｄ５（ヒトワクチンに関して最も広く使用される亜型）に対する中和Ａｂを示し、人々の２／３は、Ａｄ５に対するリンパ増殖性応答を有すると調査された（Ｃｈｉｒｍｕｌｅ  Ｎら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９９  ６：１５７４−８３）。この免疫は、インフルエンザワクチンのプラットフォームとしての現在の初期遺伝子１（Ｅ１）領域欠失Ａｄ５ベクター（Ａｄ５［Ｅ１−］）の使用を妨げる。Ａｄ５免疫は、免疫すること、特に、組換えＡｄ５ベクターでの再免疫を阻害し、第２の疾患抗原に対するワクチンの免疫も同様に排除する。既存のＡｄ５ベクター免疫の問題を克服することは、熱心な調査の主題であった。しかし、他のＡｄ血清型またはさらには非ヒト形態のＡｄの使用は、重要なケモカインおよびサイトカインの産生の変化、遺伝子調節不全を直接もたらし得、有意に異なる生体分布および組織毒性を有する（Ａｐｐｌｅｄｏｒｎ  ＤＭら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００８  １５：８８５−９０１；  Ｈａｒｔｍａｎ  ＺＣら  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ２００８  １３２：１−１４）。これらのアプローチが初回免疫において成功したとしても、そのＡｄ亜型に対する免疫応答が誘導されたことに起因して、その後のワクチン接種は問題になる。Ａｄ免疫バリアを回避し、現在のＡｄ５［Ｅ１−］ベクターの有害な状態を回避することを助けるために、改善されたＡｄ５ベクタープラットフォームが、上記のように構築された。
【００９３】
さらに、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターは、現在のＡｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して、注射後最初の２４〜７２時間の間に炎症の低下を示す（Ｎａｚｉｒ  ＳＡ，  Ｍｅｔｃａｌｆ  ＪＰ  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｍｅｄ．  ２００５  ５３：２９２−３０４；  Ｓｃｈａａｃｋ  Ｊ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００４  １０１：３１２４−９；  Ｓｃｈａａｃｋ  Ｊ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５  １８：７９−８８）。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］後期遺伝子発現の欠如は、感染細胞を抗Ａｄ５活性に対してあまり脆弱にせず、その感染細胞が長期間にわたって導入遺伝子を生成および発現することを可能にする（Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳ，  Ｊｏｎｅｓ  ＦＲ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１  Ｓ４：００１．  ｄｏｉ：１０．４１７２／２１５５−９８９９．  Ｓ４−００１；  Ｈｏｄｇｅｓ  ＢＬ  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ２０００  ２：２５０−９）。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ウイルスタンパク質に対する炎症応答の低下および得られた、既存のＡｄ５免疫の回避は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］がＡＰＣ細胞に感染する能力を増大させ得、被接種者（ｉｎｏｃｕｌｅｅ）においてより高い免疫を生じ得る。さらに、他の細胞型の感染の増加は、強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のために必要とされる高レベルの抗原提示を提供し得、記憶Ｔ細胞発生をもたらす。従って、Ｅ２ｂ領域の欠失は、既存のＡｄ５免疫の存在下ですら、Ａｄ５タンパク質に対する免疫応答を最小限にしながら有利な免疫特性（例えば、特異的抗原への強力な免疫応答を誘起する）を付与することは明らかである。
【００９４】
がん（結腸直腸、乳房、およびＨＰＶ）（Ｏｓａｄａ  Ｔら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １６：６７３−８２；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１０  ５９：１１３１−５；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １８：３２６−３５；  Ｗｉｅｋｉｎｇ  ＢＧら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１２  １９：６６７−７４；  Ｒｉｃｅ  ＡＥら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５  ２２：４５４−６２；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１５  Ｓｅｐｔ  ７  ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）および感染性疾患（ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＨ１Ｎ１インフルエンザ）（Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００９  ２７：６３９４−８；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１  ２９：８１０１−７；  Ｊｏｎｅｓ  ＦＲら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１  ２９：７０２０−６；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１２  ３０：７２６５−７０）の動物モデルにおいて、強力な免疫応答が、Ａｄ５超免疫の存在下ですら発現された抗原遺伝子に対して誘導されることが報告された。進行ステージの結腸直腸がん患者における免疫療法のための新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（癌胎児性抗原）プラットフォームワクチンでの研究は、特に関連性がある。ＣＥＡ指向性ＣＭＩ応答は、既存のＡｄ５免疫にも関わらず誘導された；処置は、十分に寛容され、安全に投与され、重大な有害作用は観察されなかった（Ｍｏｒｓｅ  ＭＡら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１３  ６２：１２９３−１３０１；  Ｂａｌｉｎｔら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１５  ６４：９７７−８７）。
【００９５】
結果は、組換えＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームベースのワクチンが既存の免疫および／またはＡｄ５ベクター誘導性の免疫を克服しかつ有意な防御免疫応答を誘導する能力を示した。これらの研究は、新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターベースのワクチンが、１）現在のＡｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して、有意により高いＣＭＩ応答を誘導し得る、２）強力なＣＭＩ応答を誘導するように設計された複数回免疫レジメンのために利用され得る、３）既存のＡｄ５免疫を有する動物において有意な抗原特異的ＣＭＩ応答を誘導し得る、および４）高レベルの既存のＡｄ５免疫を有する動物において、有意な抗腫瘍応答を誘導し得るかまたは感染性疾患から防御し得る、ことを確立した。
【００９６】
ある種の実施形態において、新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］組換えプラットフォームの革新的属性は、広く交叉反応性のインフルエンザワクチンを開発するために使用され得る。これは、組換えＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームの中に、インフルエンザＡおよびＢ株のＨＡ、ＢＭ２、Ｍ２およびＮＰタンパク質に由来する保存されかつ交叉反応性の抗原を発現する複数の導入遺伝子を組み込むことによって達成され得、そして新しいユニバーサルインフルエンザワクチンとして利用されるべきである。
【００９７】
ある種の局面は、インフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法およびアデノウイルスベクターに関する。特に、ある種の局面は、１より多くの抗原性標的実体に対する複数回のワクチン接種が達成され得るように、改善されたＡｄベースのワクチンを提供し得る。重要なことには、ワクチン接種は、Ａｄに対する既存の免疫の存在下で行われ得、そして／または本明細書で記載されるとおりのアデノウイルスベクターまたは他のアデノウイルスベクターで以前に複数回免疫した被験体に投与され得る。上記アデノウイルスベクターは、種々のインフルエンザＡおよびＢ抗原に対する免疫応答（インフルエンザＡおよびＢウイルスに対する幅広い抗体および細胞媒介性免疫応答の生成が挙げられるが、これらに限定されない）を誘導するために被験体に複数回投与され得る。
【００９８】
ある種の局面は、Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクター（例えば、米国特許第６，０６３，６２２号；同第６，４５１，５９６号；同第６，０５７，１５８号：および同第６，０８３，７５０号（全てそれらの全体において本明細書に参考として援用される）に記載されるもの）の使用を提供する。’６２２特許に記載されるように、ウイルスタンパク質発現をさらに失わせるために、および同様に複製能力のあるＡｄ（ＲＣＡ）を生成する頻度を減少させるために、Ｅ２ｂ領域における欠失を含むアデノウイルスベクターは、ある種の局面において提供され得る。これらＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターの増殖は、その欠失されたＥ２ｂ遺伝子生成物を発現する細胞株を要する。
【００９９】
さらなる局面において、パッケージング細胞株；例えば、ＨＥＫ−２０３細胞株に由来するＥ．Ｃ７（以前はＣ−７と称されていた）（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６  ９３：３３５２−５６；  Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  Ａら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９７  ４：２５８−６３）が提供され得る。
【０１００】
さらに、Ｅ２ｂ遺伝子生成物、ＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質は、Ｅ．Ｃ７または類似の細胞において、Ｅ１遺伝子生成物とともに構成的に発現され得る。Ａｄゲノムから産生細胞株への遺伝子セグメントの移入は、直接的な利益を有する：（１）理論的に欠失され得るＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質の組み合わされたコード配列が、４．６ｋｂにほぼ等しいので、組換えＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質が欠失したアデノウイルスベクターの運搬能力（carrying  capacity）が増大する；ならびに（２）２またはこれより多くの非依存性組換え事象がＲＣＡを生成するために必要とされるので、ＲＣＡ生成の潜在性が減少する。
【０１０１】
従って、Ｅ１、Ａｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質を発現する細胞株は、ヘルパーウイルス混入の必要なしに、１３ｋｂにほぼ等しい運搬能力を有するアデノウイルスベクターの増殖を可能にし得る（Ｍｉｔａｎｉら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９５  ９２：３８５４；  Ｈｏｄｇｅｓら  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２０００  ２：２５０−２５９；  Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００２  ２：１１１−１３３）。
【０１０２】
さらに、ウイルスの生活環に極めて重要な遺伝子が欠失される場合（例えば、Ｅ２ｂ遺伝子）、Ａｄが他のウイルス遺伝子タンパク質を複製または発現することをさらに失うことが起こる。これは、ウイルス感染細胞の免疫認識を低下させ、外来導入遺伝子発現の長期の持続を可能にする。
【０１０３】
しかし、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、およびプレターミナルタンパク質が欠失したベクターの重要な属性としては、そのベクターがＥ１およびＥ２ｂ領域からそれぞれのタンパク質を発現できないこと、ならびにウイルス構造タンパク質のうちの大部分の発現を欠くと推定されることが挙げられる。例えば、Ａｄの主要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、Ｌ１からＬ５までの後期構造タンパク質の転写を担う（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，  Ｉｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ，  Ｔｈｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  （Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｂｏｓｔｏｎ，  １９８６）。そのＭＬＰは、Ａｄゲノム複製の前に最小限に活性であるが、高度に毒性のＡｄ後期遺伝子は、主に、ウイルスゲノム複製が起こった後にのみ、ＭＬＰから転写および翻訳される（Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｗｓ  Ｃｅｌｌ  １９８０  ２２：５２３）。後期遺伝子転写のこのシス依存性活性化は、一般に、ポリオーマおよびＳＶ−４０の増殖におけるようなＤＮＡウイルスの特徴である。上記ＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質は、Ａｄ複製に絶対的に必要とされ（Ｅ４またはタンパク質ＩＸタンパク質とは異なる）、従って、それらの欠失は、アデノウイルスベクター後期遺伝子発現およびＡＰＣなどの細胞でのその発現の毒性作用にとって極めて有害である。
【０１０４】
ある種の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域およびＥ１領域において欠失を有するが、Ａｄゲノムのいかなる他の領域は欠失していない、Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを含む。別の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域において欠失をならびにＥ１およびＥ３領域において欠失を有するが、他の領域は欠失していない、Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを含み得る。さらなる実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域において欠失を、ならびにＥ１、Ｅ３において欠失をおよびＥ４領域の部分的または完全な除去を有するが、他の欠失は有しない、アデノウイルスベクターを含み得る。
【０１０５】
別の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域において欠失を、ならびにＥ１およびＥ４領域において欠失を有するが、他の欠失は有しない、アデノウイルスベクターを含む。さらなる実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ａ、Ｅ２ｂおよびＥ４領域において欠失を有するが、他の欠失を有しない、アデノウイルスベクターを含み得る。
【０１０６】
一実施形態において、本明細書での使用のためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域およびＥ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼ機能が欠失しているが、他の欠失を有しないベクターを含む。さらなる実施形態において、本明細書での使用のためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域およびＥ２ｂ領域のプレターミナルタンパク質機能が欠失し、他は欠失していない。
【０１０７】
別の実施形態において、本明細書での使用のためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質機能が欠失し、そして他は欠失していない。１つの特定の実施形態において、本明細書での使用が企図されるアデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ領域の少なくとも一部、およびＥ１領域が欠失しているが、「ｇｕｔｔｅｄ」アデノウイルスベクターではない。この点において、そのベクターは、Ｅ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質機能の両方が欠失され得る。
【０１０８】
用語「Ｅ２ｂ欠失（Ｅ２ｂ  ｄｅｌｅｔｅｄ）」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのＥ２ｂ遺伝子生成物の発現および／または機能を妨げるような方法で変異される特異的ＤＮＡ配列に言及する。従って、ある種の実施形態において、「Ｅ２ｂ欠失」とは、Ａｄゲノムから欠失（除去）された特異的ＤＮＡ配列に言及する。Ｅ２ｂ欠失または「Ｅ２ｂ領域内で欠失を含む」とは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域内で少なくとも１つの塩基対の欠失に言及する。従って、ある種の実施形態において、１より多くの塩基対が欠失され、さらなる実施形態において、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０の塩基対が欠失される。別の実施形態において、その欠失は、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域内で１５０より多い、１６０より多い、１７０より多い、１８０より多い、１９０より多い、２００より多い、２５０より多い、または３００より多い塩基対の欠失である。Ｅ２ｂ欠失は、少なくとも１つのＥ２ｂ遺伝子生成物の発現および／または機能を妨げる欠失であり得、従って、Ｅ２ｂ特異的タンパク質の一部をコードするエキソン内で欠失を、ならびにプロモーターおよびリーダー配列内で欠失を含む。ある種の実施形態において、Ｅ２ｂ欠失は、Ｅ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質のうちの一方または両方の発現および／または機能を妨げる欠失である。さらなる実施形態において、「Ｅ２ｂ欠失」とは１またはこれより多くのコードされるタンパク質が非機能的であるように、Ａｄゲノムのこの領域のＤＮＡ配列における１もしくはこれより多くの点変異に言及する。このような変異は、異なる残基で置き換えられた残基を含み、非機能的タンパク質を生じるアミノ酸配列の変化をもたらす。
【０１０９】
本開示を読んで当業者によって理解されるように、Ａｄゲノムの他の領域が欠失され得る。従って、Ａｄゲノムの特定の領域で「欠失される（ｄｅｌｅｔｅｄ）」とは、本明細書で使用される場合、その領域によってコードされる少なくとも１つの遺伝子生成物の発現および／または機能を妨げるような方法で変異される特異的ＤＮＡ配列に言及する。ある種の実施形態において、特定の領域で「欠失される」とは、その領域によってコードされる発現および／または機能（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはプレターミナルタンパク質機能というＥ２ｂ機能）を妨げるような方法でＡｄゲノムから欠失（除去）される特異的ＤＮＡ配列に言及する。特定の領域内で「欠失される」または「欠失を含む」とは、Ａｄゲノムのその領域内での少なくとも１つの塩基対の欠失に言及する。従って、ある種の実施形態において、１より多くの塩基対が欠失され、さらなる実施形態において、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０の塩基対が、特定の領域から欠失される。別の実施形態において、その欠失は、Ａｄゲノムの特定の領域内での１５０より多い、１６０より多い、１７０より多い、１８０より多い、１９０より多い、２００より多い、２５０より多い、または３００より多い塩基対である。
【０１１０】
これらの欠失は、その領域によってコードされる遺伝子生成物の発現および／または機能が妨げられ得るようなものである。従って、欠失は、タンパク質の一部をコードするエキソン内での欠失、ならびにプロモーターおよびリーダー配列内での欠失を包含する。さらなる実施形態において、Ａｄゲノムの特定の領域において「欠失される」とは、１またはこれより多くのコードされるタンパク質が非機能的であるように、Ａｄゲノムのこの領域のＤＮＡ配列における１またはこれより多くの点変異に言及する。このような変異は、異なる残基で置き換えられた残基を含み、非機能的タンパク質を生じるアミノ酸配列の変化をもたらす。
【０１１１】
１またはこれより多くの欠失を含むアデノウイルスベクターは、当該分野で公知の組み換え技術を使用して生成され得る（例えば、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８  ７２：９２６−３３；  Ｈｏｄｇｅｓ，ら，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２０００  ２：２５０−５９を参照のこと）。当業者によって認識されるように、使用のためのアデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子生成物および欠失されている可能性のある必須遺伝子のうちのいずれかの生成物を構成的に発現する適切なパッケージング細胞株を使用して高力価へと成功裡に成長され得る。ある種の実施形態において、Ｅ１およびＤＮＡポリメラーゼタンパク質を構成的に発現するのみならず、Ａｄ−プレターミナルタンパク質をも発現するＨＥＫ−２９３に由来する細胞が、使用され得る。一実施形態において、Ｅ．Ｃ７細胞は、アデノウイルスベクターの高力価ストックを成功裡に成長させるために使用される（例えば、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８  ７２：９２６−３３；  Ｈｏｄｇｅｓら  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２０００  ２：２５０−５９を参照のこと）。
【０１１２】
自己増殖アデノウイルスベクターから極めて重要な遺伝子を欠失させるために、標的とされる遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｅ１タンパク質とともに、ＨＥＫ−２９３細胞または類似の細胞でまず共発現されなければならない。従って、構成的に共発現される場合に非毒性であるそれらタンパク質のみ（または誘導して発現される毒性タンパク質）が、利用され得る。Ｅ１およびＥ４遺伝子のＨＥＫ−２９３細胞における共発現は、（誘導性（構成的ではない）プロモーターを利用して）示されてきた（Ｙｅｈら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９６  ７０：５５９；  Ｗａｎｇら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９５  ２：７７５；およびＧｏｒｚｉｇｌｉａら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９６  ７０：４１７３）。Ｅ１およびタンパク質ＩＸ遺伝子（ビリオン構造タンパク質）は、共発現され（Ｃａｒａｖｏｋｙｒｉ  ａｎｄ  Ｌｅｐｐａｒｄ  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９５  ６９：６６２７）、Ｅ１、Ｅ４、およびタンパク質ＩＸ遺伝子の共発現がまた、記載されている（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９５  ６：１５７５）。Ｅ１および１００ｋ遺伝子は、Ｅ１およびプロテアーゼ遺伝子を有するので、トランス補完する（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）細胞株において成功裡に発現されている（Ｏｕａｌｉｋｅｎｅら  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００  １１  ：１３４１−５３；  Ｈｏｄｇｅｓら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ２００１  ７５：５９１３−２０）。
【０１１３】
高力価のＥ２ｂ欠失Ａｄ粒子を成長させることにおいて使用するためのＥ１およびＥ２ｂ遺伝子生成物を共発現する細胞株は、米国特許第６，０６３，６２２号に記載される。Ｅ２ｂ領域は、Ａｄゲノム複製に絶対的に必要とされるウイルス複製タンパク質をコードする（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ（前出）およびＰｒｏｎｋら  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １９９２  １０２：Ｓ３９−Ｓ４５）。有用な細胞株は、およそ１４０ｋＤａのＡｄ−ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはおよそ９０ｋＤａのプレターミナルタンパク質を構成的に発現する。特に、毒性なしに、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、およびプレターミナルタンパク質の高レベルの構成的共発現を有する細胞株（例えば、Ｅ．Ｃ７）は、複数回のワクチン接種における使用のためのＡｄを増殖させることにおける使用に望ましい。これらの細胞株は、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、およびプレターミナルタンパク質が欠失されたアデノウイルスベクターの増殖を可能にする。
【０１１４】
組換えＡｄは、当該分野で公知の技術を使用して増殖され得る。例えば、ある種の実施形態において、Ｅ．Ｃ７細胞を含む組織培養プレートは、適切なＭＯＩ（例えば、５）のアデノウイルスベクターウイルスストックで感染され、３７．０℃において４０〜９６時間インキュベートされる。その感染した細胞が採取され、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８．０）中に再懸濁され、超音波処理され、そのウイルスは、２回の塩化セシウム密度遠心分離によって精製される。ある種の技術において、そのウイルス含有バンドは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を通して脱塩され、スクロースまたはグリセロールが添加され、アリコートが−８０℃で貯蔵される。いくつかの実施形態において、そのウイルスは、その安定性を増強するようにデザインされた溶液（例えば、Ａ１９５（Ｅｖａｎｓら  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２００４  ９３：２４５８−７５））中に入れられる。そのストックの力価が測定される（例えば、ＳＤＳ溶解後のウイルスのアリコートの２６０ｎｍでの光学密度の測定によって）。別の実施形態において、組換えＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクター全体を含むプラスミドＤＮＡ（線状または環状のいずれか）は、Ｅ．Ｃ７または類似の細胞へとトランスフェクトされ得、ウイルス生成の証拠（例えば、細胞変性効果）が示されるまで３７．０℃でインキュベートされ得る。これら細胞からの馴化培地は、次いで、より多くのＥ．Ｃ７または類似の細胞を感染させて、精製前に、生成されるウイルスの量を拡大するために使用され得る。
【０１１５】
精製は、２回の塩化セシウム密度遠心分離または選択的濾過によって達成され得る。ある種の実施形態において、そのウイルスは、市販の製品（例えば、Ｐｕｒｅｓｙｎ，  Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｍ，  ＰＡ）のＡｄｅｎｏｐｕｒｅ）または特注で作ったクロマトグラフィーカラムを使用する、カラムクロマトグラフィーによって精製され得る。
【０１１６】
ある種の実施形態において、組換えＡｄは、感染させるべき細胞が、ある数のウイルスと直面することを確実にするために十分なウイルスを含み得る。従って、組換えＡｄのストック、特に、組換えＡｄのＲＣＡ非含有ストックが提供され得る。Ａｄストックの調製および分析は、当該分野で周知である。ウイルスストックは、ウイルス遺伝子型ならびにウイルスストックを調製するために使用されるプロトコルおよび細胞株に大きく依存して、力価がかなり変動する。そのウイルスストックは、少なくとも約１０６ｐｆｕ／ｍｌ、１０７ｐｆｕ／ｍｌ、または１０δｐｆｕ／ｍｌの力価を有し得、多くのそのようなストックは、高力価を有し得る（例えば、少なくとも約１０９ｐｆｕ／ｍｌ、１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、または１０１２ｐｆｕ／ｍｌ）。
【０１１７】
異種核酸
アデノウイルスベクターはまた、目的のいくつかの標的抗原、そのフラグメントもしくは融合物をコードする異種核酸配列を含み、該目的のいくつかの標的抗原、そのフラグメントもしくは融合物に対して免疫応答を生成することが望ましい。いくつかの実施形態において、そのアデノウイルスベクターは、免疫応答を調節し得るいくつかのタンパク質、その融合物もしくはそのフラグメントをコードする異種核酸配列を含む。従って、ある種の局面は、異種核酸配列を含む第２世代のＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを提供する。
【０１１８】
よって、ある種の局面は、核酸配列（本明細書において、目的のいくつかのインフルエンザ標的抗原をコードするポリヌクレオチドともいわれる）を提供する。よって、ある種の局面は、本明細書でさらに記載されるとおりの任意の供給源に由来する標的抗原をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含むベクターならびにこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞を提供する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で本質的に交換可能に使用される。また、当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドは、１本鎖（コードまたはアンチセンス）または２本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）分子またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これは、イントロンを含み、１対１の様式でＤＮＡ分子に相当する）およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含み得る。さらなるコード配列または非コード配列は、ポリヌクレオチド内に存在し得るが、その必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結され得るが、その必要はない。単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に離れていることを意味する。例えば、単離されたＤＮＡ分子は、本明細書で使用される場合、関連しないコードＤＮＡ（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域）の大きな部分を含まない。当然のことながら、これは、元々単離されているとおりのＤＮＡ分子に言及し、実験室において組換えでセグメントに後に付加される遺伝子またはコード領域を排除しない。
【０１１９】
当業者によって理解されるように、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、ゲノム外のおよびプラスミドにコードされる配列、ならびに本明細書で記載されるとおりの標的抗原、抗原のフラグメント、ペプチドなどを発現するか、または発現するように適合され得るより小さな工学技術で作製された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、天然に単離されてもよいし、または人の手による合成で改変されてもよい。
【０１２０】
ポリヌクレオチドは、天然の配列（すなわち、標的抗原ポリペプチド／タンパク質／エピトープまたはその一部をコードする内因性の配列）を含み得るか、またはこのような配列のバリアントまたは誘導体をコードする配列を含み得る。ある種の実施形態において、本明細書で示されるポリヌクレオチド配列は、本明細書で記載されるとおりの標的抗原タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチド配列またはバリアントから実質的に変化し得るが、類似のタンパク質抗原をコードし得る特定の細胞型（すなわち、ヒト細胞株）における発現のために最適化された新規な遺伝子配列を表す。
【０１２１】
他の関連する実施形態において、本明細書で記載されるとおりのタンパク質（例えば、目的の標的抗原）をコードする天然の配列と実質的同一性を有するポリヌクレオチドバリアント、例えば、本明細書で記載される方法（例えば、以下で記載されるように、標準的パラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して、ポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％配列同一性、特に、少なくとも７５％から９９％までまたはそれより高い配列同一性を含むもの、が提供され得る。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置付けなどを考慮に入れることによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の相当する同一性を決定するために適切に調節され得ることを認識する。
【０１２２】
ある種の局面において、ポリヌクレオチドバリアントは、特に、そのバリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性または異種標的タンパク質の免疫原性が、天然のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対して実質的に減少されないように、１またはこれより多くの置換、付加、欠失および／または挿入を含む。本明細書中の他の箇所で記載されるように、そのポリヌクレオチドバリアントは、標的抗原のバリアント、またはそのフラグメント（例えば、エピトープ）をコードし得、ここで抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するそのバリアントポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、エピトープ）の性質（propensity）は、天然のポリペプチドに対して実質的に減少されない。用語「バリアント」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含することは理解されるべきである。
【０１２３】
ある種の局面は、本明細書で記載されるとおりのポリペプチド（標的タンパク質抗原を含む）をコードする、少なくとも約５から１０００まで、またはそれより多くの連続ヌクレオチド、ならびにその間の全ての中間の長さのものを含むかあるいはそれからなるポリヌクレオチドを提供し得る。「中間の長さ」とは、この文脈において、引用された値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００から５００まで；５００から１，０００までなどのすべての整数を含む）を意味することは、容易に理解される。本明細書で記載されるとおりのポリヌクレオチド配列は、本明細書で記載されるとおりのポリペプチド（例えば、エピトープまたは異種標的タンパク質）をコードする天然の配列において見出されないさらなるヌクレオチドによって、一方の末端または両方の末端において伸長され得る。このさらなる配列は、その開示されるいずれかの末端において、またはその開示される配列の両方の末端において、１から２０までのヌクレオチドまたはそれより多くからなり得る。
【０１２４】
ある種の実施形態において、上記ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、コード配列自体の長さに関わらず、それらの全体的な長さがかなり変動し得るように、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、発現制御配列、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組み合わされ得る。従って、ほぼ任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが企図されるが、全体の長さは、意図された組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限され得る。例えば、全体の長さが約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（全ての中間の長さを含む）である例示的なポリヌクレオチドセグメントは、多くの実施において有用であることが企図される。
【０１２５】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、２つの配列は、以下で記載されるように、最大の一致のために整列される場合にその２つの配列中のヌクレオチドの配列が同じであれば、「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって行われ得る。「比較ウインドウ」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも約２０の連続する位置、通常は３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントをいい、ここで配列は、その２つの配列が最適に整列された後に連続する位置の同じ数の参照配列に対して比較され得る。
【０１２６】
比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅスイートの中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、デフォルトパラメーターを使用して行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアラインメントスキームを具現化する：Ｄａｙｈｏｆｆ  ＭＯ  （１９７８）  Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ  ＭＯ  （ｅｄ．）  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．  ５，  Ｓｕｐｐｌ．  ３，  ｐｐ．  ３４５−  ３５８；  Ｈｅｉｎ  Ｊ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ，  ｐｐ．  ６２６−６４５  （１９９０）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ  ＣＡＢＩＯＳ  １９８９  ５：１５１−５３；  Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ  ＣＡＢＩＯＳ  １９８８  ４：１１−１７；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＥＤ  Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ  １９７１  １１Ａ  ０５；  Ｓａｉｔｏｕ  Ｎ，  Ｎｅｉ  Ｍ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９８７  ４：４０６−２５；  Ｓｎｅａｔｈ  ＰＨＡ  ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ  ＲＲ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  −  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ  （１９７３）；  Ｗｉｌｂｕｒ  ＷＪ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８３  ８０：７２６−３０）。
【０１２７】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ  １９８１  ２：４８２の局所的同一性アルゴリズム（local  identity  algorithm）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９７０  ４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８８  ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）（５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視によって、行われ得る。
【０１２８】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９７７  ２５：３３８９−３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０  ２１５：４０３−１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、ポリヌクレオチドに関するパーセント配列同一性を決定するために、例えば、本明細書で記載されるパラメーターとともに使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。１つの例証的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターＭ（マッチする残基の対の報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算され得る。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大の達成される値から量Ｘだけ低下するか；１またはこれより大きな負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロまたはそれより小さくなるか；あるいはいずれかの配列の末端に達する場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーター、Ｗ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８９  ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の差の比較を使用する。
【０１２９】
ある種の局面において、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここでその比較ウインドウの中のポリヌクレオチド配列の部分は、その２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセントまたはこれより小さい（通常は、５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセント）の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。そのパーセンテージは、同一の核酸塩基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、そのマッチした位置の数を、参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【０１３０】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書で記載されるとおりの目的の特異的抗原またはそのフラグメントをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者によって理解される。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかが、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。にもかかわらず、コドン使用法における差異に起因して変動するポリヌクレオチドは、ある種の局面において具体的に企図される。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子もまた、企図される。対立遺伝子は、１またはこれより多くの変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。その得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデーターベース配列比較）を使用して同定され得る。
【０１３１】
従って、別の実施形態において、変異誘発アプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）は、本明細書で記載されるとおりの標的抗原配列またはそのフラグメントのバリアントおよび／または誘導体の調製のために使用される。このアプローチによって、ポリペプチド配列中の特異的改変が、ポリペプチドをコードする基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を介して行われ得る。これらの技術は、例えば、１またはこれより多くのヌクレオチド配列変化をそのポリヌクレオチドの中に導入することにより、前述の考慮事項のうちの１またはこれより多くを組み込む、配列バリアントを調製して試験するための簡単なアプローチを提供する。
【０１３２】
部位特異的変異誘発は、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供して、横断する欠失接合点の両側で安定な二重鎖を形成するために、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列の使用による変異体ならびに隣接するヌクレオチドの十分な数の生成を可能にする。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、低下させるか、改変するか、もしくは別の方法で変化させる、および／またはそのコードされるポリペプチドの特性、活性、組成物、安定性、もしくは一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０１３３】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、例えば、自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して一般に実施されるように、化学的手段によってそのフラグメントを直接合成することによって容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、選択された配列を組換え生成のための組換えベクターに導入することによって、および分子生物学分野の当業者に一般に公知の他の組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  ＮＹ参照のこと）によって、得られ得る。
【０１３４】
本明細書で記載されるように所望の標的抗原ポリペプチドもしくはそのフラグメント、または上記のうちのいずれかを含む融合タンパク質を発現するために、そのポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列は、当該分野で公知の組換え技術を使用する、本明細書の他の箇所で記載されるとおりの適切なＡｄに挿入される。適切なアデノウイルスベクターは、その挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントならびに任意の所望のリンカーを含む。当業者に周知の方法は、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含むこれらアデノウイルスベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが挙げられる。このような技術は、例えば、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８  ７２：９２６−３３；  Ｈｏｄｇｅｓら  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２０００  ２：２５０−２５９；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎ．Ｙ．，  およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら  （１９８９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  Ｎ．Ｙに記載される。
【０１３５】
種々のベクター／宿主システムは、ポリヌクレオチド配列を含みおよび生成するために利用され得る。これらとしては、微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡベクターで形質転換された細菌；酵母ベクターで形質転換された酵母；ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞システム；ウイルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞システム；あるいは動物細胞システムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
アデノウイルスベクターに存在する「制御エレメント」または「調節配列」とは、ベクターのそれらの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域（これらは、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う）である。このようなエレメントは、それらの強度および特異性において変動し得る。利用されるベクターシステムおよび宿主に依存して、任意の数の適切な転写および翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からなるＡｄ転写／翻訳複合体へとライゲートされ得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入は、感染した宿主細胞におけるポリペプチドを発現し得る生存可能なウイルスを得るために使用され得る（Ｌｏｇａｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ  Ｔ  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  １９８４  ８７：３６５５−５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）は、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるために使用され得る。
【０１３７】
特異的開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。そのポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる転写または翻訳制御シグナルは、全く必要とされないこともある。しかし、コード配列またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、その開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレーム中にあるべきである。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源のもの（天然および合成の両方）であり得る。発現の効率は、使用される特定の細胞システム（例えば、文献中に記載されるもの）に適したエンハンサーの包含によって増強され得る（Ｓｃｈａｒｆ  Ｄ．ら  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．  １９９４  ２０：１２５−６２）。特異的終結配列（specific  termination  sequence）（転写または翻訳いずれかのため）はまた、その選り抜きのポリペプチドをコードする配列の効率的な翻訳を達成するために組み込まれ得る。
【０１３８】
ポリヌクレオチドコード生成物（例えば、目的の標的抗原）の発現を、その生成物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの干渉しないエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルベースのイムノアッセイは、いくつかの適用のために使用され得るが、競合的結合アッセイもまた、使用され得る。これらおよび他のアッセイは、とりわけ、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒら（１９９０；  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓｔ  Ｐａｕｌ．  Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ  ＤＥら  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８３  ７５８：１２１１−１６）に記載される。アデノウイルスベクターは、目的のいくつかのインフルエンザ抗原をコードする核酸配列を含み得る。
【０１３９】
ある種の実施形態において、所望の標的抗原の発現を増加させるエレメントは、本明細書で記載されるアデノウイルスベクターの核酸配列へと組み込まれる。このようなエレメントとしては、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ；  Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５  ２０３：９９；  Ｅｈｒｅｎｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｓｅｍｌｅｒ  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９５  ２０３：６５；  Ｒｅｅｓら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６  ２０：１０２；  Ｓｕｇｉｍｏｔｏら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９４  ２：６９４）が挙げられる。ＩＲＥＳは、翻訳効率を増加させる。同様に、他の配列も発現を増強し得る。いくつかの遺伝子に関しては、特に５’末端にある配列は、転写および／または翻訳を阻害する。これらの配列は通常、ヘアピン構造を形成し得るパリンドロームである。送達されるべき核酸の中の任意のこのような配列は、欠失されてもよいし、欠失されなくてもよい。
【０１４０】
転写または翻訳生成物の発現レベルは、どの配列が発現に影響を及ぼすかを確認または確かめるためにアッセイされ得る。転写レベルは、任意の公知の方法（ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプローブ保護などが挙げられる）によってアッセイされ得る。タンパク質レベルは、任意の公知の方法（ＥＬＩＳＡが挙げられる）によってアッセイされ得る。当業者によって認識されるように、異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターは、当該分野で公知の組換え技術（例えば、Ｍａｉｏｎｅら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１  ９８：５９８６−９１；  Ｍａｉｏｎｅら  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００  １：８５９−６８；  Ｓａｎｄｉｇら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２０００  ９７：１００２−０７；  Ｈａｒｕｉら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００４  １１：１６１７−２６；  Ｐａｒｋｓら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６  ９３：１３５６５−５７０；  ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２  ９９：１２９７９−９８４；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  ＮＹに記載されるもの）を使用して生成され得る。
【０１４１】
上記で注記されるように、アデノウイルスベクターは、目的のいくつかのインフルエンザ標的タンパク質または抗原をコードする核酸配列を含む。この点において、そのベクターは、目的の１〜４種またはこれより多くの異なる標的抗原をコードする核酸を含み得る。その標的抗原は、全長タンパク質であってもよいし、そのフラグメント（例えば、エピトープ）であってもよい。そのアデノウイルスベクターは、目的の１種の標的タンパク質に由来する複数のフラグメントまたはエピトープをコードする核酸配列を含んでいてもよいし、目的の多くの異なる標的インフルエンザ抗原タンパク質に由来する１またはこれより多くのフラグメントまたはエピトープを含んでいてもよい。
【０１４２】
ある種の実施形態において、免疫原性フラグメントは、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩｌ分子に結合する。本明細書で使用される場合、免疫原性フラグメントは、このような結合が、当該分野で公知の任意のアッセイを使用して検出される場合に、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩｌ分子「に結合する」といわれる。例えば、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩに結合する能力は、ＭＨＣクラスｌ／β２ｍ／ペプチドヘテロ三量体複合体への１２５Ｉ標識β２−ミクログロブリン（β２ｍ）の組み込みを促進する能力をモニタリングすることによって、間接的に評価され得る（Ｐａｒｋｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７５２：１６３，  １９９４を参照のこと）。あるいは、当該分野で公知の機能的ペプチド競合アッセイが、使用され得る。ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、一般に、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第３版，  ２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３）およびその中で引用される参考文献中にまとめられるもの）を使用して同定され得る。免疫原性フラグメントを同定するための代表的技術としては、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力に関してポリペプチドをスクリーニングすることが挙げられる。特定の標的ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、全長標的ポリペプチドの反応性より実質的に低くないレベルで（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）このような抗血清および／またはＴ細胞と反応するフラグメントである。言い換えると、免疫原性フラグメントは、全長ポリペプチドの反応性に類似するかまたはこれより高い反応性のレベルでこのようなアッセイ内で反応し得る。このようなスクリーニングは、一般に、当業者に周知の方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８に記載されるもの）を使用して行われ得る。
【０１４３】
標的抗原としては、インフルエンザＡおよびＢウイルスのうちのいずれかに由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。標的抗原は、本明細書で記載される感染性インフルエンザウイルスのうちのいずれかによって生成されるタンパク質（例えば、ウイルス抗原タンパク質、すなわち、インフルエンザＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、マトリクスタンパク質Ｍ１、マトリクスタンパク質Ｍ２、核タンパク質、およびノイラミニダーゼが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。本明細書で使用される場合、「感染性因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）」とは、宿主に感染し得る任意の生きている生物である。感染性因子としては、例えば、インフルエンザＡおよびＢウイルスの任意の変種が挙げられる。
【０１４４】
アデノウイルスベクターはまた、標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列を含み得る。この点において、このようなタンパク質を含むアデノウイルスベクターで免疫した後に生成されるタンパク質は、目的の標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質に融合された目的の標的抗原を含む融合タンパク質であり得る。
【０１４５】
使用方法
アデノウイルスベクターは、本明細書で記載されるとおりの１種もしくは複数種の標的抗原に対する免疫応答を生成するための多くのワクチンの状況において使用され得る。アデノウイルスベクターは、これらがＡｄに対して既存の免疫を有する被験体において免疫応答を生成するために使用され得、アデノウイルスベクターを使用する複数回の免疫を含むワクチン接種レジメン（前の世代のアデノウイルスベクターを使用することが不可能であるレジメン）において使用され得るという予測外の知見が原因で特に重要である。
【０１４６】
一般に、免疫応答の生成は、体液性応答および／または細胞媒介性応答の誘導を含む。ある種の実施形態において、目的の標的抗原に対する免疫応答を増大させることは、望ましい。よって、「免疫応答を生成することまたは「免疫応答を誘導すること」とは、任意の統計的に有意な変化、例えば、１種もしくは複数種の免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、好中球など）の数の増加またはこれら免疫細胞のうちの１種もしくは複数種の活性（ＣＴＬ活性、ＨＴＬ活性、サイトカイン分泌、サイトカイン分泌のプロフィールの変化など）の増加を含む。
【０１４７】
当業者は、免疫応答の変化が起こったかどうかを確立するための多くの方法が利用可能であることを容易に認識する。免疫応答（例えば、細胞数、サイトカイン発現、細胞活性）の変化を検出するための種々の方法は、当該分野で公知であり、本発明との関連において有用である。例示的方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  編者：  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａｄａ  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅｔｈａｎ  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  （２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  ＮＹ）、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｉｎｃ．  ＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  ＮＹ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第二版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ）；  Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ）および他の箇所に記載される。この状況において有用な例示的方法としては、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖アッセイ、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ（クロム放出もしくは等価なアッセイが挙げられる）、および任意の数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくはＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイを使用する遺伝子発現分析が挙げられる。
【０１４８】
ある種の実施形態において、免疫応答の生成は、コントロールと比較して、アデノウイルスベクターを投与される被験体において、約１．５〜２０倍またはこれより大きな倍数（少なくとも、約、または多くて１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、またはそこから得られる任意の範囲もしくは数）の標的抗原特異的ＣＴＬ活性の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、コントロールと比較してアデノウイルスベクターを投与される被験体において約１．５〜２０倍、またはこれより多くの倍数の標的特異的ＣＴＬ活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、サイトカイン分泌（例えば、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、グランザイム、または他のサイトカイン）を測定するＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定される場合に、コントロールと比較して約１．５〜２０倍、またはこれより多くの倍数の標的抗原特異的細胞媒介性免疫活性の増加を含む。
【０１４９】
さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、適切なコントロールと比較して、アデノウイルスベクターを投与した被験体において、１．５〜５倍の間の標的特異的抗体生成の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、コントロールと比較してアデノウイルスベクターを投与した被験体において、約１．５〜２０倍、またはこれより多くの倍数の標的特異的抗体生成の増加を含む。
【０１５０】
従って、ある種の局面は、目的のインフルエンザウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し得、上記方法は、ａ）Ｅ２ｂ領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、およびｂ）標的抗原をコードする核酸を含む、アデノウイルスベクターを上記個体に投与するステップ；ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも１回上記個体に再投与するステップを包含し；それによって、上記標的抗原に対する免疫応答を生成する。ある種の実施形態において、投与される上記ベクターがｇｕｔｔｅｄベクターではない方法が提供され得る。
【０１５１】
さらなる実施形態において、ａ）Ｅ２ｂ領域において欠失を有する複数欠損アデノウイルスベクター、およびｂ）インフルエンザウイルス標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを、Ａｄに対して既存の免疫を有する個体に投与するステップ；ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも１回上記個体に再投与するステップによって、該個体においてインフルエンザウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法が提供され得；それによって、インフルエンザウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する。
【０１５２】
Ａｄに対する既存の免疫に関して、これは、当該分野で公知の方法（例えば、Ａｄ抗体の存在に関して試験するための抗体ベースのアッセイ）を使用して決定され得る。さらに、ある種の実施形態において、上記方法は、先ず、個体がＡｄに対して既存の免疫を有することを決定するステップ、次いで、本明細書で記載されるとおりのＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを投与するステップを包含し得る。
【０１５３】
ある種の局面において、インフルエンザ標的抗原（例えば、本明細書の他の箇所で記載されるもの）に対する免疫応答を生成するための方法が提供され得る。
【０１５４】
特定の局面において、インフルエンザＡおよびＢウイルス（例えば、本明細書の他の箇所で記載されるもの）に対する免疫応答を生成するための方法が提供され得る。
【０１５５】
本明細書の他の箇所で注記されるように、アデノウイルスベクターは、感染性因子であって、それに対して免疫応答が生成されるべき感染性因子のうちのいずれか１種または複数種に由来する目的の１種または複数種の標的抗原をコードする核酸配列を含む。例えば、標的抗原としては、ウイルス抗原タンパク質、すなわち、インフルエンザＢＭ２タンパク質、ヘマグルチニン、マトリクスタンパク質Ｍ１、マトリクスタンパク質Ｍ２、核タンパク質、およびノイラミニダーゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１５６】
投与のために、アデノウイルスベクターストックは、適切な緩衝液、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤などと組み合わせられ得る。ある種の実施形態において、適切な数のアデノウイルスベクター粒子は、適切な緩衝液（例えば、滅菌ＰＢＳ）中で投与される。
【０１５７】
ある種の環境において、本明細書で開示されるアデノウイルスベクター組成物を、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらに腹腔内に送達することが、望ましい場合がある。ある種の実施形態において、遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩としてのその活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水で調製され得る。分散液剤（dispersion）はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物で、ならびに油で調製され得る。他の実施形態において、Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターは、丸剤形態で送達され得るか、嚥下によってまたは坐剤によって送達され得る。
【０１５８】
注射用途に適した例示的な薬学的形態としては、滅菌水性液剤または分散液剤、および滅菌注射用液剤または分散液剤の即座の調製のための滅菌散剤・粉剤（sterile  powder）が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、滅菌されていなければならず、そしてその製剤が容易に引き抜かれかつシリンジを通して押し出される程度までの、流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、汚染する微生物（例えば、細菌、糸状菌および真菌）の活動に対して保護されていなければならない。そのキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および／または植物性油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散液剤の場合には必要とされる粒径の維持によっておよび／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって促進され得る。多くの場合、それは、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含み得る。注射用組成物の長期吸収は、組成物中で吸収を遅延させる剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。
【０１５９】
一実施形態において、水性液剤での非経口投与のために、その液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、その液体希釈剤は、まず十分な塩類またはグルコースで等張性にされるべきである。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この点について、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示に鑑みて、当業者に公知である。例えば、１投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入液に添加されるか、または提唱される注入部位に注射されるかのいずれかであり得る（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」  第１５版，  第１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投与量におけるいくらかのバリエーションは、処置されている被験体の状態に依存して必然的に起こる。さらに、ヒト投与のために、調製物は、ＦＤＡ当局の生物学基準によって要求されるとおりの無菌、発熱原性、および一般的な安全性および純度基準を満たすことを必要とし得る。
【０１６０】
そのキャリアは、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファ、キャリア溶液、懸濁液（suspension）、およびコロイドなどをさらに含み得る。薬学的に活性な物質のこのような媒体および剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または剤が活性成分と不適合である範囲を除いて、治療用組成物におけるその使用は、企図される。補助活性成分はまた、その組成物に組み込まれ得る。語句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与された場合に、アレルギー反応または類似の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物に言及する。
【０１６１】
本明細書で記載される治療用組成物の投与経路および投与頻度、ならびに投与量は、個体毎で、疾患毎で変動し、標準的技術を使用して容易に確立され得る。一般に、薬学的組成物およびワクチンは、注射によって（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻内に（例えば、吸引によって）、丸剤形態で（例えば、嚥下、膣または直腸送達様の坐剤）、投与され得る。ある種の実施形態において、１〜３用量の間が、６週間の期間にわたって投与され得、さらなるブースターワクチン接種が、その後周期的に与えられ得る。
【０１６２】
適切な用量は、上記で記載されるように投与される場合に、本明細書の他の箇所で記載されるとおりの標的抗原免疫応答を促進し得るアデノウイルスベクターの量である。ある種の実施形態において、その免疫応答は、基底（すなわち、非処置）レベルを少なくとも１０〜５０％上回る。このような応答は、患者における標的抗原の抗体（target  antigen  antibody）を測定することによって、またはインフルエンザ感染細胞をインビトロで殺滅し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性生成によって、または免疫応答をモニタリングするための当該分野で公知の他の方法によって、モニターされ得る。
【０１６３】
一般に、適切な投与量および処置レジメンは、予防上の利益を提供するために十分な量のアデノウイルスベクターを提供する。防御的免疫応答は、標準的な増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを使用して一般に評価され得、これらのアッセイは、免疫（ワクチン接種）の前および後に、患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０１６４】
１つの利点は、特に、Ａｄに対して既存の免疫を有する個体において、同じアデノウイルスベクターで複数回のワクチン接種を施すことができる一方で、そのアデノウイルスワクチンはまた、初回抗原刺激レジメンおよび追加免疫レジメンの一部として投与され得る。プライミングおよびブースター接種スキームの混合モダリティーは、免疫応答の増強を生じ得る。
【０１６５】
従って、一局面は、プラスミドワクチン（例えば、目的の標的抗原を含むプラスミドベクター）で被験体をプライミングするための方法であり、上記方法は、そのプラスミドワクチンを少なくとも１回投与し、所定の時間の長さを経過させるステップ、次いで、そのアデノウイルスベクターを投与することによって追加免疫するステップによるものである。複数回のプライミング（例えば、１〜３回）が使用され得るが、より多くが使用されてもよい。プライミングと追加免疫の間の時間の長さは、約６ヶ月から１年まで変動し得るが、他の時間枠が使用されてもよい。
【０１６６】
ある種の実施形態において、上記組成物または複製欠損ウイルスベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。ある種の実施形態において、上記共刺激分子は、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、上記共刺激分子は、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３の組み合わせを含む。ある種の局面において、上記組成物は、同じ複製欠損ウイルスベクター中に配置された複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。ある種の局面において、上記組成物は、別個の複製欠損ウイルスベクター中に配置された複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。
【０１６７】
特定の局面において、上記組成物は、本明細書で記載されるとおりのインフルエンザウイルス標的抗原をコードする核酸配列を含み、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、またはこれらの組み合わせをコードする１種または複数種の核酸配列をさらに含む複製欠損ウイルスベクターを含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１×１０８  ウイルス粒子（ＶＰ）であって１×１０１０  ＶＰ以下の用量で、標的抗原を含む複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。他の実施形態において、本開示は、少なくとも１×１０８  ＶＰであって５×１０１１  ＶＰ以下の用量で、標的抗原を含む複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１×１０８  ＶＰであって１×１０１２  ＶＰ以下の用量で、標的抗原を含む複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、本開示は、少なくとも１×１０８  ＶＰであって１×１０１０  ＶＰ以下の用量で、複製欠損アデノウイルスベクターを投与するための方法を提供する。他の実施形態において、本開示は、少なくとも１×１０８  ＶＰであって５×１０１１  ＶＰ以下の用量で、複製欠損アデノウイルスベクターを投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１×１０８  ＶＰであって１×１０１２  ＶＰ以下の用量で、複製欠損アデノウイルスベクターを投与するための方法を提供する。
【０１６９】
さらなる実施形態において、本明細書で記載されるワクチンまたは薬学的組成物は、少なくとも、約、または多くて、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８  、１０１９、１０２０のウイルス粒子、またはそこから導き出せる任意の数もしくは範囲を含み得る。特定の実施形態において、本明細書で記載されるワクチンまたは薬学的組成物は、少なくとも、約、または多くて、１０９、１０１０、１０１１のウイルス粒子またはそこから導き出せる任意の数もしくは範囲を含み得る。
【０１７０】
ある種の実施形態において、本明細書で記載されるワクチンまたは薬学的組成物は、１時間ごと、１日ごと、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、１ヶ月ごと、２ヶ月ごと、３ヶ月ごと、四半期ごと、６ヶ月ごと、９ヶ月ごと、１年ごと、または１０年ごと、またはそこから導き出せる任意の間隔もしくは範囲の所定の間隔で、例えば、少なくとも、約、または多くて、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、３０回、４０回、５０回、１００回、１２０回、１３０回、１４０回、１５０回、投与され得る。
【０１７１】
上記で記載される種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本明細書中で言及される、および／または出願データシート中に列挙される米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されたのと同程度まで、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【０１７２】
上記実施形態の局面は、なおさらなる実施形態を提供するために種々の特許、出願および刊行物の概念を使用することが必要であれば、改変され得る。
【０１７３】
これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明に鑑みて上記実施形態に対して行われ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、請求項を、本明細書および特許請求の範囲において開示されるその具体的実施形態へと限定すると解釈されるべきではなく、このような特許請求項の範囲が権利を与えられるその均等物の全範囲とともに、全ての考えられる実施形態を含むと解釈されるべきである。よって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【実施例】
【０１７４】
本発明はさらに、以下の実験例への参照によって詳細に記載される。これらの例は、例証目的で提供されるに過ぎず、別段特定されなければ、限定であるとは意図されない。従って、本発明は、以下の実施例に限定されるとは決して解釈されるべきではなく、むしろ本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全てのバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
【０１７５】
実施例１
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターへの挿入のための複数のインフルエンザ抗原遺伝子の構築
この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターへの挿入のための複数のインフルエンザ抗原遺伝子の構築を記載する。複数のインフルエンザ抗原を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］を生成するために、その個々のインフルエンザ抗原遺伝子配列を、それぞれ、ブタテッショウウイルス−１およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスに由来する「自己切断」２Ａペプチドによって離す（図１Ａを参照のこと）（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  Ｐ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ  Ｍ  Ｔｒａｆｆｉｃ  ２００４  ５（８），  ６１６-２６；  Ｈｏｌｓｔ  Ｊら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８  ９：６５８-６６；  Ｋｉｍ  ＪＨら  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，  ２０１１  ６（４），  ｅ１８５５６．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８５５６）。２Ａペプチドは、リボソーム上で翻訳されるので、その２Ａペプチドの最後の２残基の間のペプチド結合は決して形成されず、１回のリボソーム通過（one  ribosomal  pass）に別個に発現されるタンパク質を生じる。３種の遺伝子を離す２つの２Ａペプチド配列の使用は、その３種のタンパク質のほぼ化学量論的発現を生じる。同様に、ブタテッショウウイルス−１およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスにそれぞれ由来する単一の「自己切断」２Aペプチドによって離される、２種の抗原遺伝子配列を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］が構築され得る（図１Ｂ）。
【０１７６】
実施例２
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡでの細胞感染後のインフルエンザタンパク質の発現
この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡでの細胞感染後の、インフルエンザタンパク質の発現を記載する。Ａ５４９細胞を、マトリクス１（Ｍ１）タンパク質、核タンパク質（ＮＰ）、およびヘマグルチニン（ＨＡ）を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ］ベクターに感染させた。Ｍ１、ＮＰ、およびＨＡの発現を、ウェスタンブロットによって確認した。図２に示されるように、インフルエンザＡに由来する遺伝子挿入物の、ヘマグルチニン（ＨＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、およびマトリクス１（Ｍ１）タンパク質、３種（３）全てを含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベースのプラットフォーム（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡ）を、構築し、生成した。実施例３および実施例４に示されるように、このワクチンは、マウスにおいて免疫原性であり、ＨＡ、ＮＰ、およびＭ１指向性の免疫応答を誘導した。
【０１７７】
実施例３
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡ免疫に対する抗体応答
この実施例は、Ｍ１タンパク質、ＮＰタンパク質、およびＨＡタンパク質を含む  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターでの複数回の免疫後の、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）抗原に対する抗体応答を記載する。各５匹のマウスの群を、１×１０８、１×１０９、または１×１０１０  ウイルス粒子（ＶＰ）Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡの用量で毎週の間隔で皮下に２回免疫した。コントロールマウスに、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）を同じ用量で注射した。最後の免疫（ワクチン接種）の２週間後に血清を個々のマウスから得、定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して抗ＨＡ抗体の存在について評価した（Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １８：３２６−３５）。図３に示されるように、抗ＨＡ抗体応答は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡ免疫マウスにおいて用量依存性様式で生成されたが、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）を注射したコントロールマウスでは生成されなかった。
【０１７８】
実施例４
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡ免疫に対する細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答
この実施例は、Ｍ１タンパク質、ＮＰタンパク質、およびＨＡタンパク質を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターで複数回免疫した後のインフルエンザ抗原に対する細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を記載する。各々５匹のマウスの群に、１×１０８、１×１０９、または１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡの用量を毎週の間隔で２回、皮下に免疫した。コントロールマウスに、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）を同じ用量で注射した。最後の免疫（ワクチン接種）の２（２）週間後に個々のマウスから脾臓を得、ＩＦＮ−γ分泌脾細胞に関してＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用してＣＭＩについて評価した（Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１０  ５９：１１３１−３５；  Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １８：３２６−３５；  Ｊｏｎｅｓ  ＦＲら  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１  ２９：７０２０−２６）。図４に示されるように、ＣＭＩ応答は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡ免疫マウスにおいて生成されたが、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）を注射したコントロールマウスでは生成されなかった。
【０１７９】
実施例５
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡ免疫に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答
この実施例は、Ｍ１タンパク質、ＮＰタンパク質、およびＨＡタンパク質を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターでの複数回免疫した後の、インフルエンザ抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を記載する。ＣＴＬ応答を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでグランザイムＢ分泌を測定することによって定量した。
【０１８０】
各々５匹のマウスの群に、１×１０８、１×１０９、または１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡの用量で毎週の間隔で２回、皮下に免疫した。コントロールマウスに、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）を同じ用量で注射した。最後の免疫（ワクチン接種）の２（２）週間後に個々のマウスから脾臓を得、グランザイムＢ分泌脾細胞に関してＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性について評価した。図５に示されるように、ＣＴＬ応答は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡ免疫マウスにおいて生成されたが、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）を注射したコントロールマウスでは生成されなかった。
【０１８１】
実施例６
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡ免疫に対するＣＭＩ応答の時間経過評価
この実施例は、Ｍ１タンパク質、ＮＰタンパク質、およびＨＡタンパク質を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターでの複数回免疫した後の種々の時点でのインフルエンザ抗原に対する細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を記載する。各マウス群を、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡで１回（群１）、２週間空けて２回（群２）、１ヶ月空けて２回（群３）および２ヶ月空けて２回（群４）、免疫した。免疫（ワクチン接種）後の種々の時点で個々のマウスから脾臓を得、ＩＦＮ−γ分泌脾細胞に関するＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用することによって、ＮＰおよびＨＡに対するＣＭＩ応答に関して評価した。図６に示されるように、ＣＭＩ応答は、最後の免疫の１週間後で概して最大であり、次いで、その後低下していった。
【０１８２】
実施例７
ｍ１タンパク質、ＮＰタンパク質、およびヘマグルチニンを含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターの投与
この実施例は、種々の時点でｍ１タンパク質、ｎｐタンパク質、およびヘマグルチニンを含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターを注射して、インフルエンザヘマグルチニン抗原に対する抗体応答が生成することを記載する。各マウス群を、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＨＡで１回（群１）、２週間空けて２回（群２）、１ヶ月空けて２回（群３）および２ヶ月空けて２回（群４）、免疫した。免疫（ワクチン接種）後の種々の時点で個々のマウスから血清を得、抗ＨＡ抗体の存在に関して定量的ＥＬＩＳＡ技術によって評価した。図７に示されるように、抗ＨＡ抗体応答は、免疫後の５８〜８５日にピークに達し、その後、抗体応答は僅かに低くなることが観察された。
【０１８３】
実施例８
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡを組み合わせた免疫に対する抗体応答
この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅワクチンおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡワクチンの組み合わせでの免疫後の、インフルエンザＡ（ＩｎｆＡ）およびインフルエンザＢ（ＩｎｆＢ）抗原に対する抗体応答を記載する。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅを、１×１０１０  ウイルス粒子（ＶＰ）の用量で投与し、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡワクチンを、１×１０１０  ＶＰの用量で投与した。
【０１８４】
５匹のマウスの群を、２週間間隔を空けて２回、陰性コントロールとしての１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（空のベクター）、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−インフルエンザＡ（ＩｎｆＡ）−ヘマグルチニン（ＨＡ）／マトリクス２ｅ（Ｍ２ｅ）、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡ、または１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅおよび１×１０１０  ＶＰｓ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−インフルエンザＢ（ＩｎｆＢ）−ＨＡを含むワクチン混合物で免疫した。２回目の免疫の２週間後、個々のマウスの血清を、以前に記載される（Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １８：３２６−３５）ように定量的ＥＬＩＳＡを使用して、インフルエンザＡ−ＨＡまたはインフルエンザＢ−ＨＡに対する抗体の存在に関して分析した。
【０１８５】
図８は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］インフルエンザワクチンでのマウスの免疫後に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される場合の血清中のインフルエンザＡまたはインフルエンザＢ  ＨＡ抗体応答の定量を図示する。図８Ａは、インフルエンザＡ  ＨＡ抗体応答の定量を図示する。図８Ｂは、インフルエンザＢ  ＨＡ抗体応答の定量を図示する。
【０１８６】
インフルエンザＡおよびＢの両方に対する抗体は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡの混合物でワクチン接種したマウスにおいて検出されたが、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを注射したコントロールマウスでは検出されなかった。これらの応答は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅ単独で免疫したマウスがインフルエンザＢ−ＨＡに対する抗体を生成せず、かつＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ単独で免疫したマウスがインフルエンザＡ−ＨＡに対する抗体を生成しなかったので、特異的であった。
【０１８７】
実施例９
再刺激した脾細胞における細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答のフローサイトメトリー分析
この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅワクチンおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡワクチンの組み合わせで免疫したマウスに由来する脾細胞を、インフルエンザＨＡペプチド、インフルエンザＭ２ペプチド、インフルエンザＢ  ＨＡペプチドで、エキソビボで再刺激した後の細胞媒介性免疫応答のフローサイトメトリー分析を記載する。
【０１８８】
５匹のマウスの群を、２週間の間隔で２回、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（空のベクター）、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−インフルエンザＡ（ＩｎｆＡ）−ヘマグルチニン（ＨＡ）／マトリクス２ｅ（Ｍ２ｅ）、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡ、または１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅおよび１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−インフルエンザＢ（ＩｎｆＢ）−ＨＡを含むワクチン混合物で免疫した。２回目の免疫の２週間後、個々のマウスの脾臓を、特異的ペプチドプールへの曝露後に、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）発現ＣＤ８＋（Ａ）および／またはＣＤ４＋（Ｂ）  Ｔ細胞によって明らかにされるように、ＣＭＩ活性に関してフローサイトメトリーによって分析した。
【０１８９】
図９は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅワクチンおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡワクチンの組み合わせで免疫したマウス由来の再刺激脾細胞におけるＩＦＮ−γ発現エフェクターＴリンパ球の定量によって測定される場合の細胞媒介性免疫応答を図示する。図９Ａは、ＩＦＮ−γ発現ＣＤ８＋脾細胞のパーセンテージを図示する。図９Ｂは、ＩＦＮ−γ発現ＣＤ４＋脾細胞のパーセンテージを図示する。
【０１９０】
インフルエンザＡおよびＢ両方に対するＣＭＩ応答は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡの混合物でワクチン接種したマウスにおいて検出されたが、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを注射したコントロールマウスでは検出されなかった。インフルエンザＨＡ抗原に対してバックグラウンド応答が観察されたが、有意に（Ｐ＜０．０５  マンホイットニー検定）より高いＣＭＩ応答が、免疫したマウスにおいて観察された。これらの応答は、ワクチン免疫したマウスのＴ細胞が培地または無関係の抗原（ＳＩＶ−ｎｅｆ）ペプチドプールへの曝露後にＣＭＩ応答を生成しなかったので、特異的であった。
【０１９１】
実施例１０
再刺激脾細胞における細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答のＥＬＩＳｐｏｔ分析
この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅワクチンおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡワクチンの組み合わせで免疫したマウスに由来する脾細胞をインフルエンザＨＡペプチド、インフルエンザＭ２ペプチド、インフルエンザＢ  ＨＡペプチドで、エキソビボで再刺激した後の細胞媒介性免疫応答のＥＬＩＳｐｏｔ分析を記載する。
【０１９２】
５匹のマウスの群を、２週間の間隔で２回、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（空のベクター）、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−インフルエンザＡ（ＩｎｆＡ）−ヘマグルチニン（ＨＡ）／マトリクス２ｅ（Ｍ２ｅ）、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡ、または１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅおよび１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−インフルエンザＢ（ＩｎｆＢ）−ＨＡを含むワクチン混合物で免疫した。２回目の免疫の２週間後、個々のマウスの脾臓を、特異的ペプチドプールへの曝露後にインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）（Ａ）またはＩＬ−２（Ｂ）を分泌するスポット形成細胞（ＳＦＣ）に関するＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、ＣＭＩ活性に関して分析した。
【０１９３】
図１０は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅワクチンおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡワクチンの組み合わせで免疫したマウスのサイトカイン分泌再刺激脾細胞の定量によって測定される場合の細胞媒介性免疫応答を図示する。図１０Ａは、ＩＦＮ−γ分泌脾細胞の定量を図示する。図１０Ｂは、ＩＬ−２分泌脾細胞の定量を図示する。
【０１９４】
インフルエンザＡおよびＢ両方に対するＣＭＩ応答は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＡ−ＨＡ／Ｍ２ｅおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＩｎｆＢ−ＨＡの混合物でワクチン接種したマウスにおいて検出されたが、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを注射したコントロールマウスにおいて検出されなかった。これらの応答は、ワクチン免疫したマウスの脾臓細胞が無関係の抗原（ＳＩＶ−Ｎｅｆ）ペプチドプールへの曝露後にＣＭＩ応答を生成しなかったので、特異的であった。
【０１９５】
実施例１１
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベースのインフルエンザワクチンでのチャレンジ研究
この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベースのインフルエンザワクチンでのチャレンジ研究を記載する。１０匹のマウスの群を、２週間の間隔で２回、１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（空のベクター）または本願の図１Ｂで構築されるとおりの１×１０１０  ＶＰ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＩｎｆＡ−ＨＡを含むワクチンで免疫した。２回目の免疫の３０日後に、マウスをインフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１株（インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９株）でチャレンジし、チャレンジ後に生存に関して評価した。
【０１９６】
図１１は、６０日の期間にわたって、コントロール（ヌル）ワクチンと比較して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｍ１／ＮＰ／ＩｎｆＡ−ＨＡワクチンで免疫したマウスにおけるチャレンジ研究からの生存曲線を図示する。
【０１９７】
ワクチン接種したマウスは、僅か２０％生存を経験したＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを注射したコントロールマウスと比較して、ウイルスチャレンジから完全な防御が付与され、この差異は有意であった（ログランク  マンテル−コックス検定，  Ｐ＝０．０００３）。
【０１９８】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示されかつ記載されてきたその一方で、このような実施形態が例示によって提供されるに過ぎないことは、当業者に明らかである。多くのバリエーション、変化、および置換は、今や本発明から逸脱することなく当業者に想起されよう。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する種々の変更は、本発明を実施するにあたって使用され得ることは、理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義し、本特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が、それによって網羅されることは、意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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