(57)【要約】本明細書では、連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを提供する。より詳細には、組換えポックスウイルスは、ＭＵＣ１抗原、ＣＥＡ抗原及び／またはＴＲＩＣＯＭ抗原をコードする１以上の修飾核酸を含み、組換えポックスウイルスは連続継代中に安定である。本明細書ではまた、それに関連する組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続継代中に安定な前記組換えポックスウイルスであって、前記組換えポックスウイルスは、少なくとも２つの可変Ｎ末端反復（ＶＮＴＲ）ドメインを有するＭＵＣ１ペプチドをコードする第１の核酸を含み、ａ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの配置がシャッフルされ、ｂ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインはコドン最適化され、前記組換えポックスウイルスは連続継代中に安定である、前記組換えポックスウイルス。
【請求項２】
前記第１の核酸は少なくとも３つのＶＮＴＲドメインを含む、請求項１に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３】
前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの順番は、配列番号６と比較してシャッフルされている、請求項１から請求項２のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項４】
ａ）及びｂ）の存在は、ＰＡＮＶＡＣと比較して連続継代中の安定性を向上させる、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項５】
前記第１の核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９５％、９６％、９７％または９８％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項６】
前記第１の核酸配列は配列番号２を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項７】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をコードする第２の核酸を更に含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項８】
前記第２の核酸は配列番号１３を含む、請求項７に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項９】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含み、前記少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧまたはＣヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＴヌクレオチドと定義される、請求項７に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＣヌクレオチドと更に定義される、請求項９に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１１】
前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項９から請求項１０のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１２】
前記反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項９から請求項１０のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１３】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも２、３、４、５または１０の前記反復ヌクレオチド領域に少なくとも１つの置換を含む、請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１４】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５及び／または少なくとも１９の反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む、請求項９から請求項１３のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１５】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の１９領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む、請求項９から請求項１４のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１６】
前記第２の核酸は配列番号１４を含む、請求項９から請求項１４のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１７】
前記組換えポックスウイルスはオルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスから選択される、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１８】
前記オルソポックスウイルスはワクシニアウイルスである、請求項１７に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項１９】
前記ワクシニアウイルスは改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項１８に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２０】
前記ＭＶＡはＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体である、請求項１９に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２１】
前記組換えポックスウイルスは、少なくとも継代３及び／または継代４中に安定である、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２２】
前記アビポックスウイルスは鶏痘ウイルスである、請求項１７に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２３】
前記組換えポックスウイルスは、少なくとも継代４中に、好ましくは少なくとも継代７中に安定である、請求項２２に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２４】
前記第１の核酸は、ＹＬＡＰＰＡＨＧＶ（配列番号２５）、ＹＬＤＴＲＰＡＰＶ（配列番号２６）、ＹＬＡＩＶＹＬＩＡＬ（配列番号２７）、ＹＬＩＡＬＡＶＣＱＶ（配列番号２８）、ＹＬＳＹＴＮＰＡＶ（配列番号２９）、ＳＬＦＲＳＰＹＥＫ（配列番号３０）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２５】
前記ポックスウイルスは、１以上の共刺激分子をコードする核酸を更に含む、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２６】
前記１以上の共刺激分子は、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３及びこれらの組み合わせから選択される、請求項２５に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２７】
前記Ｂ７−１核酸は、配列番号１５、１６または１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項２６に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２８】
前記Ｂ７−１核酸は配列番号１５、１６または１７を含む、請求項２６から請求項２７のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項２９】
前記Ｂ７−１核酸は配列番号１７を含む、請求項２６から請求項２８のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３０】
前記Ｂ７−１核酸は配列番号１５を含む、請求項２６から請求項２８のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３１】
前記ＩＣＡＭ−１核酸は、配列番号１８、１９または２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項２６に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３２】
前記ＩＣＡＭ−１核酸は配列番号１８、１９または２０を含む、請求項２６及び請求項３１のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３３】
前記ＩＣＡＭ−１核酸は配列番号１８を含む、請求項２６及び請求項３１から請求項３２のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３４】
前記ＩＣＡＭ−１核酸は配列番号２０を含む、請求項２６及び請求項３１から請求項３２のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３５】
前記ＬＦＡ−３核酸は、配列番号２１、２２または２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項２６に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３６】
前記ＬＦＡ−３核酸は配列番号２１、２２または２３を含む、請求項３５に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３７】
前記ＬＦＡ−３核酸は配列番号２１を含む、請求項３５から請求項３６のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３８】
前記ＬＦＡ−３核酸は配列番号２３を含む、請求項３５から請求項３６のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス。
【請求項３９】
連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するための方法であって、前記方法は、
少なくとも２つの可変Ｎ末端反復（ＶＮＴＲ）ドメインを有するＭＵＣ１タンパク質をコードする第１の核酸を提供することを含み、ａ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの配置はシャッフルされ、ｂ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインはコドン最適化され、前記組換えポックスウイルスは連続継代中に安定である、前記方法。
【請求項４０】
前記第１の核酸は少なくとも３つのＶＮＴＲドメインを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの順番は、配列番号６と比較してシャッフルされている、請求項３９から請求項４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ａ）及びｂ）の存在は、ＰＡＮＶＡＣと比較して連続継代中の安定性を向上させる、請求項３９から請求項４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１の核酸配列は、配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％または９８％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項３９から請求項４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１の核酸配列は配列番号２または配列番号３を含む、請求項３９から請求項４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をコードする第２の核酸を更に含む、請求項３９から請求項４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２の核酸は配列番号１３を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含み、前記少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧまたはＣヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＴヌクレオチドと定義される、請求項４５から請求項４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＣヌクレオチドと更に定義される、請求項４５から請求項４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項４５から請求項４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項４７から請求項４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも２、３、４、５または１０の前記反復ヌクレオチド領域に少なくとも１つの置換を含む、請求項４７から請求項５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５及び／または少なくとも１９の反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む、請求項４７から請求項５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の１９領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む、請求項４７から請求項５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の核酸は配列番号１４を含む、請求項４７から請求項５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記組換えポックスウイルスはオルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスから選択される、請求項３９から請求項５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記オルソポックスウイルスはワクシニアウイルスである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ワクシニアウイルスは改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＭＶＡはＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組換えポックスウイルスは少なくとも継代３または継代４中に安定である、請求項３９から請求項５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記アビポックスウイルスは鶏痘ウイルスである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記組換えポックスウイルスは少なくとも継代３または継代４中に安定である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の核酸は、ＹＬＡＰＰＡＨＧＶ（配列番号２５）、ＹＬＤＴＲＰＡＰＶ（配列番号２６）、ＹＬＡＩＶＹＬＩＡＬ（配列番号２７）、ＹＬＩＡＬＡＶＣＱＶ（配列番号２８）、ＹＬＳＹＴＮＰＡＶ（配列番号２９）、ＳＬＦＲＳＰＹＥＫ（配列番号３０）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項３９から請求項６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポックスウイルスは、１以上の共刺激分子をコードする核酸を更に含む、請求項３９から請求項６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記１以上の共刺激分子は、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３及びこれらの組み合わせから選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｂ７−１核酸は、配列番号１５、１６または１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｂ７−１核酸は配列番号１５、１６または１７を含む、請求項６４から請求項６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｂ７−１核酸は配列番号１７を含む、請求項６４から請求項６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｂ７−１核酸は配列番号１５を含む、請求項６４から請求項６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＩＣＡＭ−１核酸は、配列番号１８、１９または２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＩＣＡＭ−１核酸は配列番号１８、１９または２０を含む、請求項６４及び請求項６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＩＣＡＭ−１核酸は配列番号１８を含む、請求項６４及び請求項６９から請求項７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＩＣＡＭ−１核酸は配列番号２０を含む、請求項６４及び請求項６９から請求項７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＬＦＡ−３核酸は、配列番号２１、２２または２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＬＦＡ−３核酸は配列番号２１、２２または２３を含む、請求項６４及び請求項７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＬＦＡ−３核酸は配列番号２１を含む、請求項６４及び請求項７３から請求項７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＬＦＡ−３核酸は配列番号２３を含む、請求項６４及び請求項７３から請求項７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
少なくとも２つの可変Ｎ末端反復（ＶＮＴＲ）ドメインを有するＭＵＣ１ペプチドをコードする核酸であって、ａ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの配置はシャッフルされ、ｂ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインはコドン最適化され、組換えポックスウイルスの一部としての前記核酸の存在は、ａ）及びｂ）を伴わないＭＵＣ１ペプチドをコードする組換えポックスウイルスと比較して連続継代中における前記核酸及び／または前記組換えポックスウイルスの安定性を向上させる、前記核酸。
【請求項７８】
前記第１の核酸は少なくとも３つのＶＮＴＲドメインを含む、請求項７７に記載の核酸。
【請求項７９】
前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの順番は、配列番号６と比較してシャッフルされている、請求項７７から請求項７８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８０】
ＭＵＣ１ペプチドをコードする核酸であって、前記核酸は少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域にヌクレオチド置換を含み、前記反復領域は前記核酸の可変数タンデム反復（ＶＮＴＲ）ドメインの外側にあり、前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと定義され、組換えポックスウイルスの一部としての前記核酸の存在は、ヌクレオチド置換を伴わないＭＵＣ１ペプチドをコードする組換えポックスウイルスと比較して連続継代中における前記核酸及び／または前記組換えポックスウイルスの安定性を向上させる、前記核酸。
【請求項８１】
前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項８０に記載の核酸。
【請求項８２】
前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される、請求項８０から請求項８１のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８３】
前記反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項８０から請求項８２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８４】
前記ヌクレオチド置換は、前記核酸の少なくとも２、３、４または５つの反復ヌクレオチド領域にある、請求項８０から請求項８３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８５】
前記ヌクレオチド置換は、前記核酸の少なくとも１０、１５、２０または２５の反復ヌクレオチド領域内にある、請求項８０から請求項８４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８６】
前記核酸は前記ＶＮＴＲドメインに第１の修飾を更に含み、前記第１の修飾は前記ＶＮＴＲドメイン反復の順番のシャッフルを含む、請求項８０から請求項８５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８７】
前記核酸は前記ＶＮＴＲドメインに第２の修飾を更に含み、前記第２の修飾は前記ＶＮＴＲドメイン反復のコドン最適化を含む、請求項８０から請求項８６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８８】
前記ヌクレオチド置換は前記ＭＵＣ１ペプチドのアミノ酸配列を修飾しない、請求項８０から請求項８７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８９】
前記核酸は、配列番号４に対して少なくとも９５％相同である、配列番号３に対して少なくとも９５％相同である、配列番号５に対して少なくとも９５％相同である、または、配列番号２（３３６  ＭＵＣ１）に対して少なくとも９５％相同である、請求項８０から請求項８８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９０】
前記核酸は配列番号２に対して少なくとも９５％相同である、請求項８０から請求項８９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９１】
前記核酸は配列番号４に対して少なくとも９５％相同である、請求項８０から請求項９０のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９２】
前記核酸は配列番号３に対して少なくとも９５％相同である、請求項８０から請求項９１のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９３】
前記核酸は配列番号４を含む、請求項８０から請求項９２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９４】
前記核酸は配列番号３を含む、請求項８０から請求項９３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９５】
前記核酸は配列番号２を含む、請求項８０から請求項９４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９６】
ＣＥＡペプチドをコードする核酸であって、前記核酸は少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域にヌクレオチド置換を含み、前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと定義され、組換えポックスウイルスの一部としての前記核酸の存在は、前記置換を伴わないＣＥＡペプチドをコードする組換えポックスウイルスと比較して連続継代中における前記核酸及び／または前記組換えポックスウイルスの安定性を向上させる、前記核酸。
【請求項９７】
前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項９６に記載の核酸。
【請求項９８】
前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項９６から請求項９７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９９】
前記反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項９６から請求項９８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１００】
前記ヌクレオチド置換は、前記核酸の少なくとも２、３、４、５、８または１０の反復ヌクレオチド領域にある、請求項９６から請求項９９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０１】
前記ヌクレオチド置換は前記ＣＥＡペプチドのアミノ酸配列を修飾しない、請求項９６から請求項１００のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０２】
前記核酸は配列番号１４を含む、請求項９６から請求項１０１のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０３】
Ｂ７−１ペプチドをコードする核酸であって、前記核酸は少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域にヌクレオチド置換を含み、前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと定義され、組換えポックスウイルスの一部としての前記核酸の存在は、前記ヌクレオチド置換を伴わないＢ７−１ペプチドをコードする組換えポックスウイルスと比較して連続継代中における前記核酸及び／または前記組換えポックスウイルスの安定性を向上させる、前記核酸。
【請求項１０４】
前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１０３に記載の核酸。
【請求項１０５】
前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される、請求項１０３から請求項１０４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０６】
前記反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１０３から請求項１０５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０７】
前記ヌクレオチド置換は、前記核酸の少なくとも２、３、４、５、８または１０の反復ヌクレオチド領域にある、請求項１０３から請求項１０６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０８】
前記ヌクレオチド置換は前記Ｂ７−１ペプチドのアミノ酸配列を修飾しない、請求項１０３から請求項１０７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０９】
前記核酸は配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１０３から請求項１０８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１０】
前記核酸は配列番号１５を含む、請求項１０３から請求項１０９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１１】
前記核酸は配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１０３から請求項１０８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１２】
前記核酸は配列番号１７を含む、請求項１０３から請求項１０９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１３】
ＩＣＡＭ−１ペプチドをコードする核酸であって、前記核酸は少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域にヌクレオチド置換を含み、前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと定義され、組換えポックスウイルスの一部としての前記核酸の存在は、前記ヌクレオチド置換を伴わないＩＣＡＭ−１ペプチドをコードする組換えポックスウイルスと比較して連続継代中における前記核酸及び／または前記組換えポックスウイルスの安定性を向上させる、前記核酸。
【請求項１１４】
前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１１３に記載の核酸。
【請求項１１５】
前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される、請求項１１３から請求項１１４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１６】
前記反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１１３から請求項１１５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１７】
前記ヌクレオチド置換は、前記核酸の少なくとも２、３、４、５、８または１０の反復ヌクレオチド領域にある、請求項１１３から請求項１１６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１８】
前記ヌクレオチド置換は前記ＩＣＡＭ−１ペプチドのアミノ酸配列を修飾しない、請求項１１３から請求項１１７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１９】
前記核酸は配列番号１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１１３から請求項１１８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２０】
前記核酸は配列番号１８を含む、請求項１１３から請求項１１９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２１】
前記核酸は配列番号２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１１３から請求項１１８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２２】
前記核酸は配列番号２０を含む、請求項１１３から請求項１１８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２３】
ＬＦＡ−３ペプチドをコードする核酸であって、前記核酸は少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域にヌクレオチド置換を含み、前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと定義され、組換えポックスウイルスの一部としての前記核酸の存在は、前記ヌクレオチド置換を伴わないＬＦＡ−３ペプチドをコードする組換えポックスウイルスと比較して連続継代中における前記核酸及び／または前記組換えポックスウイルスの安定性を向上させる、前記核酸。
【請求項１２４】
前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１２３に記載の核酸。
【請求項１２５】
前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される、請求項１２３から請求項１２４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２６】
前記反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１２３から請求項１２５に記載の核酸。
【請求項１２７】
前記ヌクレオチド置換は、前記核酸の少なくとも２、３、４、５、８または１０の反復ヌクレオチド領域にある、請求項１２３から請求項１２６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２８】
前記ヌクレオチド置換は前記ＬＦＡ−３ペプチドのアミノ酸配列を修飾しない、請求項１２３から請求項１２７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２９】
前記核酸は配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１２３から請求項１２８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１３０】
前記核酸は配列番号２１を含む、請求項１２３から請求項１２８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１３１】
前記核酸は配列番号２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１２３から請求項１２８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１３２】
前記核酸は配列番号２３を含む、請求項１２３から請求項１２８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１３３】
プロモーター、及び前記プロモーターと機能的に連結した請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の組換え核酸を含む、発現カセット。
【請求項１３４】
請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス、請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸、または、請求項１３３に記載の発現カセットを含む、免疫原性組成物。
【請求項１３５】
請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス、請求項７６から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸、または、請求項１３３に記載の発現カセットを含む、宿主細胞。
【請求項１３６】
請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸、または、請求項１３３に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項１３７】
組換えポックスウイルスの連続継代中に安定なＭＵＣ１導入遺伝子を有する前記組換えポックスウイルスを作製するための方法であって、前記方法は、
請求項７７から請求項１３２に記載の核酸または請求項１３３に記載の発現カセットのいずれか１つを提供することと、
前記核酸または前記発現カセットを組換えポックスウイルス内に挿入することと、
を含む、前記方法。
【請求項１３８】
前記組換えポックスウイルスはオルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスから選択される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記オルソポックスウイルスはワクシニア、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ及びＭＶＡ−ＢＮの誘導体から選択される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記組換えポックスウイルスは最大４継代中に安定である、請求項１３７から請求項１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記アビポックスウイルスは鶏痘ウイルスである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４２】
前記アビポックスウイルスは少なくとも３または４継代中に安定である、または、少なくとも７継代中に安定である、請求項１３７及び請求項１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
組換えポックスウイルスの連続継代中に安定なＭＵＣ１ペプチドをコードする前記組換えポックスウイルスを作製するための方法であって、前記方法は、
ＭＵＣ１タンパク質をコードする第１の核酸を提供することであって、前記ＭＵＣ１タンパク質は少なくとも２つのＶＮＴＲドメインを含む、前記提供することと、
前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン反復の順番をシャッフルまたは再編成することと、
前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン反復のコドンを最適化することと、
前記第１の核酸配列を前記ポックスウイルス内に挿入して、連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製することと、
を含む、前記方法。
【請求項１４４】
前記置換は前記ＭＵＣ１ペプチドのアミノ酸配列を修飾しない、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記第１の核酸は、配列番号２に対して少なくとも９５％相同である、配列番号４に対して少なくとも９５％相同である、配列番号３に対して少なくとも９５％相同である、または、配列番号５に対して少なくとも９５％相同である、請求項１４３から請求項１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記核酸は配列番号２に対して少なくとも９５％相同である、請求項１４３から請求項１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記核酸は配列番号３に対して少なくとも９５％相同である、請求項１４３から請求項１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記核酸は配列番号２を含む、請求項１４３から請求項１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記核酸は配列番号５を含む、請求項１４３から請求項１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
請求項１４３から請求項１４９のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、ＣＥＡペプチドをコードする第２の核酸の反復ヌクレオチド領域内における少なくとも１つのヌクレオチドを置換することであって、前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと定義される、前記置換することと、前記第２の核酸を前記組換えポックスウイルス内に挿入することと、を更に含む、前記方法。
【請求項１５１】
前記第２の核酸の前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記第２の核酸の前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される、請求項１５０から請求項１５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記第２の核酸の前記反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１５０から請求項１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記置換は、前記第２の核酸の少なくとも２、３、４、５または１０の反復ヌクレオチド領域にある、請求項１５０から請求項１５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記第２の核酸は配列番号１４を含む、請求項１５０から請求項１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
請求項１４３から請求項１５５のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及び／またはＬＦＡ−３、ＣＥＡから選択される共刺激分子をコードする第３の核酸の反復ヌクレオチド領域内における少なくとも１つのヌクレオチドを置換することであって、前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと定義される、前記置換することと、前記第３の核酸を前記組換えポックスウイルス内に挿入することと、を更に含む、前記方法。
【請求項１５７】
前記共刺激分子反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記共刺激分子反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される、請求項１５６から請求項１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記共刺激分子反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、請求項１５６から請求項１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記置換は、前記共刺激分子核酸の少なくとも２、３、４、５または１０の反復ヌクレオチド領域にある、請求項１５６から請求項１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記共刺激分子をコードする前記核酸はＢ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１５６から請求項１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記Ｂ７．１共刺激分子をコードする前記核酸は、配列番号１５または配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１５６から請求項１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記Ｂ７．１共刺激分子をコードする前記核酸は配列番号１５または配列番号１７を含む、請求項１５６から請求項１６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記ＩＣＡＭ−１共刺激分子をコードする前記核酸は、配列番号１８または配列番号２０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１５６から請求項１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記ＩＣＡＭ−１共刺激分子をコードする前記核酸は配列番号１８または配列番号２０を含む、請求項１５６から請求項１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ＬＦＡ−３共刺激分子をコードする前記核酸は、配列番号２１または配列番号２３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である、請求項１５６から請求項１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ＬＦＡ−３共刺激分子をコードする前記核酸は配列番号２１または配列番号２３を含む、請求項１５６から請求項１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記ポックスウイルスはオルソポックスウイルスである、請求項１４３から請求項１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記オルソポックスウイルスはワクシニアウイルスである、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記ワクシニアウイルスは改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記ＭＶＡはＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記ポックスウイルスは少なくとも継代３または継代４中に安定である、請求項１６８から請求項１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記ポックスウイルスはアビポックスウイルスである、請求項１４３から請求項１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記アビポックスウイルスは鶏痘ウイルスである、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記ポックスウイルスは少なくとも継代４中に安定である、請求項１７３から請求項１７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７６】
連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するための方法における、ａ）請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸、ｂ）請求項１３３に記載の発現カセット、ｃ）請求項１３４に記載の組成物、ｄ）請求項１３５に記載の宿主細胞またはｅ）請求項１３６に記載のベクターの使用。
【請求項１７７】
前記ポックスウイルスはワクシニアウイルス、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体から選択され、前記ポックスウイルスは継代４中に安定である、請求項１７６に記載の使用。
【請求項１７８】
前記ポックスウイルスはアビポックスウイルス及び鶏痘ウイルスから選択され、前記ポックスウイルスは少なくとも継代３または継代４中に安定である、請求項１７６に記載の使用。
【請求項１７９】
薬剤、好ましくはワクチンの調製における、ａ）請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス、ｂ）請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸、ｂ）請求項１３３に記載の発現カセット、ｃ）請求項１３４に記載の組成物、ｄ）請求項１３５に記載の宿主細胞またはｅ）請求項１３６に記載のベクターの使用。
【請求項１８０】
薬剤、好ましくはワクチンとして使用するための、請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス、ｂ）請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸、ｂ）請求項１３３に記載の発現カセット、ｃ）請求項１３４に記載の組成物、ｄ）請求項１３５に記載の宿主細胞またはｅ）請求項１３６に記載のベクター。
【請求項１８１】
ワクチンの異種プライムブースト投与レジメンに使用するための、請求項１から請求項３８及び請求項１８０のいずれか１項に記載の組換えポックスウイルス、ｂ）請求項１３４に記載の組成物またはｃ）請求項１３６に記載のベクター。
【請求項１８２】
前記異種プライムブースト投与レジメンは、
ａ）１回または複数回の初回投与量のワクシニアウイルスであって、前記ワクシニアウイルスは請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸を含む、前記ワクシニアウイルスと、
ｂ）請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸を含む１回または複数回のブースト投与量の鶏痘ウイルスと、
を含む、請求項１８１に使用するための組換えポックスウイルス、組成物またはベクター。
【請求項１８３】
前記ワクシニアウイルスは改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ＭＶＡ−ＢＮ及びＭＶＡ−ＢＮの誘導体から選択される、請求項１８２に使用するための組換えポックスウイルス、組成物またはベクター。
【請求項１８４】
連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するのに使用するための、請求項７７から請求項１３２のいずれか１項に記載の核酸、ｂ）請求項１３３に記載の発現カセット、ｃ）請求項１３４に記載の組成物、ｄ）請求項１３５に記載の宿主細胞またはｅ）請求項１３６に記載のベクター。
【請求項１８５】
連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するための方法であって、前記方法は、
ａ）少なくとも２つの可変Ｎ末端反復（ＶＮＴＲ）ドメインを有するＭＵＣ１ペプチドをコードする第１の核酸を提供することであって、前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの配置はシャッフルされ、ｂ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインはコドン最適化される、前記提供することと、
ｂ）ＣＥＡペプチドをコードする第２の核酸を提供することであって、前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含み、前記少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧまたはＣヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＴヌクレオチドと定義される、前記提供することと、
を含む、前記方法。
【請求項１８６】
前記第１の核酸は少なくとも３つのＶＮＴＲドメインを含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの順番は、配列番号６と比較してシャッフルされている、請求項１８５から請求項１８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記第１の核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９５％、９６％、９７％または９８％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１８５から請求項１８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記第１の核酸配列は配列番号２を含む、請求項１８５から請求項１８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を更に含み、前記少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧまたはＣヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＴヌクレオチドと定義される、請求項１８５から請求項１８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも２、３、４、５または１０の前記反復ヌクレオチド領域に少なくとも１つの置換を含む、請求項１８５から請求項１９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記第２の核酸は、前記第２の核酸の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５及び／または少なくとも１９の反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む、請求項１８５から請求項１９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記第２の核酸は配列番号１４を含む、請求項１８５から請求項１９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記組換えポックスウイルスはワクシニアウイルス、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ及びＭＶＡ−ＢＮの誘導体から選択され、少なくとも継代３または継代４中に安定である、請求項１８５から請求項１９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９５】
前記組換えポックスウイルスはアビポックスウイルス及び鶏痘ウイルスから選択され、少なくとも継代３または継代４中に安定である、請求項１８５から請求項１９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９６】
前記組換えポックスウイルスはアビポックスウイルス及び鶏痘ウイルスから選択され、少なくとも継代７中に安定である、請求項１８５から請求項１９３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾ムチン１細胞表面結合（ＭＵＣ１）導入遺伝子、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）導入遺伝子、及び／または、１以上の共刺激分子を含む、組換えポックスウイルス及びその組成物に関する。少なくとも１つの態様では、修飾ＭＵＣ１、ＣＥＡ及び／または共刺激分子の導入遺伝子は、組換えポックスウイルスの連続継代中におけるポックスウイルスの安定性を向上させる。追加の態様では、本発明は、ワクチン及び医薬品組成物に使用するための組換えポックスウイルス及びその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えポックスウイルスは、感染性微生物に対して、またより最近では、腫瘍に対する免疫療法用ワクチンに利用されている（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０５（８）：１０３１−１０３４）。これらポックスウイルス群のうちの２種である、アビポックスウイルス及びオルソポックスウイルスは腫瘍との闘いに有効であることが示されており、潜在的ながん治療薬に関係している（同文献）。
【０００３】
１つの例示的なアビポックスウイルス種である鶏痘は、鶏痘ウイルスが哺乳動物細胞に侵入してタンパク質を発現させるが複製不全となることから、ヒトに投与するための安全な媒体であることが示されている（Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００５  Ｆｅｂ；４（１）：６３−７６）。加えて、鶏痘ウイルスの発現用媒体としての使用については、がん、マラリア、結核及びＡＩＤＳに対するワクチンに関する多数の臨床試験で評価されている（同文献）。
【０００４】
最もよく知られたオルソポックスウイルスであるワクシニアは全世界的な天然痘の根絶に利用されており、ベクター及び／またはワクチンとしての有用性が示されている。組換えワクシニアベクターは、ｐ９７、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｐ５３及びＥＴＡなどいくつかの腫瘍関連遺伝子を含む幅広い挿入遺伝子を発現するように遺伝子操作されている（Ｐａｏｌｅｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【０００５】
感染症及びがんに対する免疫療法用ワクチンとして有用であることが判明している１種のポックスウイルス株は改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞ワクシニアアンカラ株ウイルス（ＣＶＡ）を５１６回連続継代することにより作製された（概説は、Ｍａｙｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４（１９７５）を参照のこと）。これら長期的な継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムはそのゲノム配列の約３１キロベースを欠失しており、そのため、トリ細胞における複製には極めて制限された宿主細胞であると記載された（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８（１９９１））。様々な動物モデルにおいて、得られたＭＶＡが極めて弱毒性であることが示された（Ｍａｙｒ，Ａ．＆  Ｄａｎｎｅｒ，Ｋ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−３４（１９７８））。
【０００６】
より安全な製品、例えば、ワクチンまたは医薬品などを開発するための、高い安全性プロファイルを有するＭＶＡの株が記載されている。国際ＰＣＴ公開ＷＯ２００２０４２４８０を参照されたい（例えば、米国特許番号６，７６１，８９３及び６，９１３，７５２も参照されたい）（それら全ては参照により本明細書に組み込まれる）。そのような変異体は、非ヒト細胞内及び細胞株、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）内において増殖複製可能であるが、ヒト細胞株（特にＨｅＬａ、ＨａＣａｔ及び１４３Ｂ細胞株を含む）内では複製不能である。そのような株はまた、インビボ、例えば、極度の免疫不全状態であり複製ウイルスに感染しやすいトランスジェニックマウスモデルＡＧＲ  １２９など特定のマウス株内において増殖複製不能である。米国特許番号６，７６１，８９３を参照されたい。「ＭＶＡ−ＢＮ」と呼ばれるそのようなＭＶＡ変異体及びその誘導体（組換え体を含む）が記載されている。国際ＰＣＴ公開ＷＯ２００２０４２４８０を参照されたい（例えば、米国特許番号６，７６１，８９３及び６，９１３，７５２も参照されたい）。がん免疫療法用ワクチンの開発では、組換えポックスウイルスにより発現される際に、腫瘍抗原ＭＵＣ１が様々ながんに対する患者の免疫応答を誘導及び増強することが示されている。例えば、Ｍｅｈｅｂｔａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖ  １５；１７（２２）：７１６４−７３を参照されたい。
【０００７】
ＭＵＣ１（ＭＵＣ−１、ムチン１、細胞表面結合）（ＣＤ２２７としても周知）は、肺、胃、腸、眼及びいくつかのその他器官の上皮細胞、ならびに、造血細胞及び活性化Ｔ細胞など一部の少数の非上皮細胞の頂端面を裏打ちする糖タンパク質である。健常上皮におけるその主な機能は、潤滑及び、化学物質及び微生物物質に対する物理的障壁を提供することである（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ  ＭＡ，Ｓｗａｎｓｏｎ  ＢＪ（Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４）．“Ｍｕｃｉｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４（１）：４５−６０）。
【０００８】
ＭＵＣ１は膜貫通ドメインにより頂端面に固定される（Ｈａｔｔｒｕｐ  ＣＬ，Ｇｅｎｄｌｅｒ，ＳＪ（２００８）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ（Ｔｅｔｈｅｒｅｄ）Ｍｕｃｉｎｓ”．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０：４３１−４５７）。ＭＵＣ１の細胞外ドメインは、通常は大量にグリコシル化された２０アミノ酸の可変数タンデム反復（ＶＮＴＲ）ドメインを含む（様々な個体において反復数は２０〜１２０の範囲で変動する）（Ｂｒａｙｍａｎ  Ｍ，Ｔｈａｔｈｉａｈ  Ａ，Ｃａｒｓｏｎ  ＤＤ（Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４）．”ＭＵＣ１：ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ”．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２：４）。
【０００９】
多くのヒト癌（卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌及び前立腺癌など）及び血液悪性腫瘍（多発性骨髄腫及びいくつかのＢ細胞性非ホジキンリンパ腫）がＭＵＣ１を異常に過剰発現していることが示されている（Ｐｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  Ｊｕｌ−Ａｕｇ．２１：２５９１−２５９６）。正常組織におけるその集中発現とは対照的に、ＭＵＣ１は腫瘍細胞の全面にわたり均一に分布している（Ｃｏｒｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊａｎ  ２００３；１０８（１）：３２−４１）。その上、ＭＵＣ１は通常、腫瘍内において過少グリコシル化され、タンパク質コアの新規及び潜在的に抗原性のエピトープを免疫系に曝露する（Ｒｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８  Ａｕｇ  ２１；７９（４）：４０２−１０）。
【００１０】
ヒトがんとのＭＵＣ１の関連を考慮し、従来技術では、タンパク質の免疫原性を高めるためにＭＵＣ１の修飾を試みている。例えば、Ｈａｍｂｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．によるＵＳ２００６／０１４７４５８では、天然ＭＵＣ１と比較して低い相同性を有するのに加えて７ＸＶＮＴＲセグメントを有するＭＵＣ１配列を設計するために「コドン利用率」を利用した。Ｈａｍｂｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．によるＵＳ２００６／０１４７４５８では、免疫原性を高めるためにＨＳＰ−７０−ＭＵＣ１融合タンパク質を作製した。Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許番号５，７４４，１４４では、２つの２０アミノ酸タンデム反復を付加することによりＭＵＣ１タンパク質を修飾した。
【００１１】
ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、結腸腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍及び膵臓腫瘍の大部分（１）、乳癌の約５０％（２）、及び肺癌の７０％（３）で発現する１８０ｋＤの糖タンパク質である。ＣＥＡはまた胎児消化管組織内で発現しており、比較的程度は低いが正常結腸上皮で発現している。いくつかの研究が患者内における抗ＣＥＡ抗体の存在を報告している（４〜７）一方で、他の研究では報告されていない（８〜１０）ために、ＣＥＡの免疫原性は不明瞭である。ＣＥＡは、１９６５年に、ヒト消化管の腺癌内におけるがん特異的胎児性抗原として最初に記載された（Ｇｏｌｄ，Ｐ．ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓ．Ｏ．（１９６５）Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２１：４３９−４６２）。それ以来、ＣＥＡは、ヒト消化管のほぼ全ての固形がんにおいて過剰に産生される細胞表面抗原として特徴づけられている。ヒトＣＥＡタンパク質の遺伝子がクローニングされている（Ｏｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．１４２：５１１−５１８、欧州出願番号ＥＰ０３４６７１０）。
【００１２】
がん治療薬を改良することに対する、かなりのアンメットメディカルニーズが存在している。ＭＵＣ１抗原及びＣＥＡ抗原のがんに対する免疫応答を誘導する効果を考慮すると、がん患者に抗原を効果的に導入できる改良されたワクチンに対するニーズが存在している。
【００１３】
加えて、規制認可を求めることにおける困難を成功裏に克服することができるがん治療薬を提供するというニーズが上昇している。特に、大規模製造、不純物などに関わる問題は、治療薬の規制認可を得てそれら治療薬を患者に対する利益とする上で大きなハードルとなり得る。少なくとも１つの態様では、本発明の様々な実施形態の開発で、大規模製造、不純物に関わる困難及びその他の問題が成功裏に克服されている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明では、１つ以上の反復ヌクレオチド領域内のＭＵＣ１、ＣＥＡ及び／またはＴＲＩＣＯＭコード核酸における様々な置換が、組換えポックスウイルス内におけるＭＵＣ１導入遺伝子、ＣＥＡ導入遺伝子及び／またはＴＲＩＣＯＭ導入遺伝子の安定性を向上させることが明らかとなった。
【００１５】
それゆえ、一実施形態において、本発明は連続継代中に安定な組換えポックスウイルスに関する。組換えポックスウイルスは、少なくとも２つの可変Ｎ末端反復（ＶＮＴＲ）ドメインを有するＭＵＣ１ペプチドをコードする第１の核酸を含み、ａ）少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの配置がシャッフルされ、ｂ）少なくとも２つのＶＮＴＲドメインがコドン最適化され、組換えポックスウイルスは連続継代中に安定である。
【００１６】
１つ以上の好ましい実施形態では、組換えポックスウイルスは、配列番号２（３３６  ＭＵＣ）に対して少なくとも９５％相同、配列番号３（３７３  ＭＵＣ）に対して少なくとも９５％相同、配列番号４（３９９／４００  ＭＵＣ１）に対して少なくとも９５％相同、または、配列番号５（４２０  ＭＵＣ１）に対して少なくとも９５％相同な、第１の核酸を含む。より好ましい実施形態では、組換えポックスウイルスは、配列番号２（３３６  ＭＵＣ１）に対して少なくとも９５％相同な核酸を含む。別のより好ましい実施形態では、組換えポックスウイルスは、配列番号３（３７３  ＭＵＣ）に対して少なくとも９５％相同な核酸を含む。
【００１７】
更に別の好ましい実施形態では、組換えポックスウイルスは、配列番号１３または１４（ＣＥＡ）に対して少なくとも９９％相同な核酸を更に含む。好ましい実施形態では、組換えポックスウイルスは配列番号１３または１４を含む。
【００１８】
組換えポックスウイルスは任意の種類のポックスウイルスであり得ることが企図される。ある特定の実施形態では、ポックスウイルスはオルソポックスウイルスまたはアビポックスウイルスである。好ましい実施形態では、オルソポックスウイルスはワクシニアウイルス、ＭＶＡウイルス、ＭＶＡ−ＢＮ及びＭＶＡ−ＢＮの誘導体から選択される。その他のより好ましい実施形態では、オルソポックスウイルスはＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体である。その他の好ましい実施形態では、アビポックスウイルスは鶏痘ウイルスである。
【００１９】
その他の実施形態では、本発明の組換えポックスウイルスは、本明細書に記載のＭＵＣ１核酸及び／またはＣＥＡ核酸に加え、ＴＲＩＣＯＭ（ＴＲＩａｄ  ｏｆ  ＣＯｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（三つ組み共刺激分子））をコードする１以上の核酸を含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、本発明の組換えポックスウイルス及び／または核酸を異種プライムブースト投与レジメンに使用することができる。好ましい実施形態では、レジメンは、ａ）１回または複数回の初回投与量のＭＶＡウイルス（ＭＶＡウイルスは、本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸のうちの１以上を含む）、及びｂ）本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸のうちの１以上を含む１回または複数回のブースト投与量の鶏痘ウイルス、を含む。
【００２１】
本明細書に記載の組換えポックスウイルス、核酸、方法、ワクチン及び組成物は、キットとして具体化できることが企図される。それゆえ、好ましい実施形態では、本発明は、組換えオルソポックスウイルス、限定するわけではないが例えば、ＭＶＡ、本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸のうちの１以上を含む組換えオルソポックスウイルス；及び組換えアビポックスウイルス、限定するわけではないが例えば、本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸のうちの１以上を含む鶏痘を含む、組成物、ワクチン、キット、またはその使用に関する。
【００２２】
他の実施形態では、本発明は、本開示の１以上の導入遺伝子をコードする、連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するための１つ以上の方法に関する。
【００２３】
一実施形態では、ＭＵＣ１導入遺伝子を有する、連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するための方法が存在し、その方法は、ａ）本開示の核酸または発現カセットのいずれか１つを提供すること、及びｂ）核酸または発現カセットを組換えポックスウイルス内に挿入すること、を含む。
【００２４】
別の実施形態では、ａ）少なくとも２つの可変Ｎ末端反復（ＶＮＴＲ）ドメインを有するＭＵＣ１ペプチドをコードする第１の核酸配列を提供すること（少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの配置がシャッフルされ、少なくとも２つのＶＮＴＲドメインがコドン最適化される）、及びｂ）ＣＥＡペプチドをコードする第２の核酸を提供すること（第２の核酸は、第２の核酸の少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含み、少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧまたはＣヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＴヌクレオチドと定義される）、を含む、連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するための方法が存在し、組換えポックスウイルスは連続継代中に安定である。
【００２５】
本発明の追加の目的及び利点については続く説明において部分的に記載されており、その説明により部分的に明らかとなる、または、本発明を実施することにより知ることができる。本発明の目的及び利点は、特に添付の特許請求の範囲が示す要素及び組み合わせにより、理解及び達成されるであろう。
【００２６】
本明細書に組み込まれ本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明の１つ以上の実施形態を示すものであり、その記載と共に、本発明の原理の説明に役割を果たす。
【００２７】
図面に示す全てのペアワイズアライメントは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／において利用可能なＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ配列アライメントツールを使用して実施した。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＰＡＮＶＡＣ（ＭＵＣ１及びＣＥＡ）の導入遺伝子の不安定性を示すＰＣＲ解析を示す図である。示しているのは、ＭＵＣ１及びＣＥＡをＴＢＣ−ＦＰＶゲノムに統合するために使用した部位（ＩＧＲ６１／６２）のＰＣＲアンプリコンの結果である。強調表示しているのは、想定ＰＣＲ断片及び潜在的なｗｔ断片のピークである。より小さなサイズのいくつかの欠失断片を検出することができ、３４℃または３７℃のいずれかにおける反復継代中に富化される。ＰＡＮＶＡ−Ｆの継代０〜７における結果を示す。
【図２Ａ】Ａ及びＢは、本発明の様々な実施形態によるＭＵＣ１のアミノ酸配列及びＶＮＴＲドメイン反復のシャッフルを示す図である。ＡはＰＡＮＶＡＣ内に存在するＭＵＣ１アミノ酸（配列番号６）である。示しているのは、ＰＡＮＶＡＣ  ＭＵＣ１内に存在する６つのＶＮＴＲである。ＢはｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０内に存在するＭＵＣ１アミノ酸（配列番号３０）である。示しているのは、ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０  ＭＵＣ１内に存在する３つのＶＮＴＲである。下線を付したアミノ酸は、ＷＯ２０１３／１０３６５８のアゴニストエピトープを形成するように修飾されたアミノ酸を表している。
【図２Ｂ】Ａ及びＢは、本発明の様々な実施形態によるＭＵＣ１のアミノ酸配列及びＶＮＴＲドメイン反復のシャッフルを示す図である。ＡはＰＡＮＶＡＣ内に存在するＭＵＣ１アミノ酸（配列番号６）である。示しているのは、ＰＡＮＶＡＣ  ＭＵＣ１内に存在する６つのＶＮＴＲである。ＢはｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０内に存在するＭＵＣ１アミノ酸（配列番号３０）である。示しているのは、ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０  ＭＵＣ１内に存在する３つのＶＮＴＲである。下線を付したアミノ酸は、ＷＯ２０１３／１０３６５８のアゴニストエピトープを形成するように修飾されたアミノ酸を表している。
【図３】Ａ〜Ｃは、本発明の様々な実施形態によるＭＵＣ１  ＶＮＴＲドメイン反復のペアワイズアライメント及び例示的なコドン最適化を示す図である。ＡはＰＡＮＶＡＣ  ＶＮＴＲ  ＃２（配列番号７）とｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３、ｍＢＮ４２０  ＶＮＴＲ  ＃１（配列番号８）のアライメントであり、ＢはＰＡＮＶＡＣ  ＶＮＴＲ  ＃１（配列番号９）とｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３、ｍＢＮ４２０  ＶＮＴＲ  ＃２（配列番号１０）のアライメントであり、ＣはＰＡＮＶＡＣ  ＶＮＴＲ  ＃３（配列番号１１）とｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３、ｍＢＮ４２０  ＶＮＴＲ  ＃３（配列番号１２）のアライメントである。下線を付したヌクレオチドは、ＷＯ２０１３／１０３６５８のアゴニストエピトープを形成するように修飾されたヌクレオチド領域を表している。
【図４Ａ】本発明による組換えポックスウイルスベース構築物に使用した、ＰＡＮＶＡＣと比較したＭＵＣ１コード配列のペアワイズアライメントを示す図である。ＭＵＣ１  ＰＡＮＶＡＣ（配列番号１）対ＭＵＣ１  ｍＢＮ３３６（配列番号２）のペアワイズアライメントである。１つ以上の置換を含む例示的な反復領域には下線を付している。
【図４Ｂ】本発明による組換えポックスウイルスベース構築物に使用した、ＰＡＮＶＡＣと比較したＭＵＣ１コード配列のペアワイズアライメントを示す図である。ＭＵＣ１  ＰＡＮＶＡＣ（配列番号１）対ＭＵＣ１  ｍＢＮ３７３（配列番号３）のペアワイズアライメントである。１つ以上の置換を含む例示的な反復領域には下線を付している。
【図４Ｃ】本発明による組換えポックスウイルスベース構築物に使用した、ＰＡＮＶＡＣと比較したＭＵＣ１コード配列のペアワイズアライメントを示す図である。ＭＵＣ１  ＰＡＮＶＡＣ（配列番号１）対ＭＵＣ１  ｍＢＮ４２０（配列番号５）のペアワイズアライメントである。１つ以上の置換を含む例示的な反復領域には下線を付している。
【図５】本発明による組換えポックスウイルスベース構築物に使用した、ＰＡＮＶＡＣのＣＥＡ（配列番号１３）と比較したｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０のＣＥＡコード配列（配列番号１４）のペアワイズアライメントを示す図である。１つ以上の置換を含む例示的な反復領域には下線を付している。
【図６】本発明による組換えポックスウイルスベース構築物に使用した、ＰＡＮＶＡＣのＢ７−１（配列番号１６）と比較した、ＰＡＮＶＡＣと比較した、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０のＢ７−１コード配列（配列番号１５）のペアワイズアライメントを示す図である。例示的な反復領域は示した置換（アライメントの非＊領域）により示されている。
【図７】本発明による組換えポックスウイルスベース構築物に使用した、ＰＡＮＶＡＣ（配列番号１９）と比較した、ＰＡＮＶＡＣと比較した、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０のＩＣＡＭ−１コード配列（配列番号１８）のペアワイズアライメントを示す図である。例示的な反復領域は示した置換（アライメントの非＊領域）により示されている。
【図８】本発明による組換えポックスウイルスベース構築物に使用した、ＰＡＮＶＡＣ（配列番号２２）と比較した、ＰＡＮＶＡＣと比較した、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０のＬＦＡ−３コード配列（配列番号２１）のペアワイズアライメントを示す図である。例示的な反復領域は示した置換（アライメントの非＊領域）により示されている。
【図９】Ａ及びＢは、ｍＢＮ３３６内におけるＭＵＣ１導入遺伝子の安定性を解析する実験を示す図である。Ａは治験薬（ＣＴＭ）／ＧＭＰ原料の作製中及びそれ以降における継代を代表する７継代にわたるＣＥＡの安定性に関するＰＣＲ結果である。ＢはＣＴＭ／ＧＭＰ原料の作製中及びそれ以降における継代を代表する７継代にわたるＭＵＣ１の安定性に関するＰＣＲ結果である。ＣはＣＴＭ／ＧＭＰ原料の作製中及びそれ以降における継代を代表する７継代にわたるＴＲＩＣＯＭの安定性に関するＰＣＲ結果である。ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６Ｂの作製に使用した組換えプラスミドを陽性対照として使用し、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を陰性対照（空のベクター骨格）として使用し、またＨ２ＯをＰＣＲ反応の対照として使用した。
【図１０】Ａ及びＢは、ｍＢＮ３３６の継代５、６及び７の解析を示す図である。Ａはシークエンシングによる解析のために送付した継代７試料のＰＣＲ増幅である。個々のＰＣＲ増幅を、それぞれ個々の導入遺伝子、ＣＥＡ、ＭＵＣ１及びＴＲＩＣＯＭに対して実施した。Ｂはフレームシフトをもたらす検出された点変異を含有する遺伝子座を示すＭＵＣ１ヌクレオチド配列の電気泳動図（継代５に開始）である。
【図１１】Ａ及びＢは、ｍＢＮ３７３内におけるＭＵＣ１導入遺伝子の安定性を解析する実験を示す図である。Ａはそれぞれの継代における挿入導入遺伝子のＰＣＲ解析である。ＦＰＶ−ｍＢＮ３７３Ｂの作製に使用した組換えプラスミドを陽性対照として使用し、ＦＰＶ（株ＴＢＣ−ＦＰＶ）を陰性対照として使用した。Ｂは挿入導入遺伝子及びそれぞれの挿入隣接領域を包含する５５６６ｂｐ（ＰＣＲ１）及び５２６４ｂｐ（ＰＣＲ２）の想定バンドサイズが得られた継代７におけるＦＰＶ−ｍＢＮ３７３ＢのＰＣＲ解析である。配列解析により、ＣＴＭ／ＧＭＰ原料の作製中及びそれ以降における継代を代表する７継代後における組換え体の遺伝的安定性が確認された。
【図１２】ｍＢＮ４２０内におけるＭＵＣ１導入遺伝子、ＣＥＡ導入遺伝子及びＴＲＩＣＯＭ導入遺伝子の安定性を解析するＰＣＲ解析を示す図である。示しているのは、５つの導入遺伝子全てをＭＶＡ−ＢＮゲノムに統合するために使用した部位（ＩＧＲ８８／８９）のＰＣＲアンプリコンの結果である。強調表示しているのは、想定ＰＣＲ断片及び潜在的なｗｔ断片のピークである。より小さなサイズのいくつかの欠失断片を検出することができ、３０℃における反復継代中に富化される。ｍＢＮ４２０の継代０〜７における結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
上記の発明の概要と以下の発明を実施するための形態の両方は例示及び説明のために過ぎず、請求項に記載の本発明を限定するものではないということを理解すべきである。
【００３０】
ＰＡＮＶＡＣは、それぞれが導入遺伝子ＭＵＣ１、ＣＥＡ及びＴＲＩＣＯＭを発現するワクシニア（ＰＡＮＶＡＣ−Ｖ）及び鶏痘（ＰＡＮＶＡＣ−Ｆ）の組換えポックスウイルスを使用した異種プライムブースト戦略を採用している。ＰＡＮＶＡＣはがんの治療に有効であることが示されており、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌及び膀胱癌を含む様々ながんの臨床試験が現在行われている。ＭＶＡ−ＣＶ３０１は、臨床試験実施中の別の異種ワクチン混合物である（例えば、Ｇｕｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；ｖｏｌ．１４：１０，Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；ｖｏｌ．１１を参照のこと）。ＭＶＡ−ＣＶ３０１は、それぞれが導入遺伝子ＭＵＣ１、ＣＥＡ及びＴＲＩＣＯＭを発現するＭＶＡ及び鶏痘を使用した異種プライムブースト戦略を採用している。
【００３１】
ＰＡＮＶＡＣ及びＭＶＡ−ＣＶ３０１はがんの治療に有効ではあるが、ＰＡＮＶＡＣ組換えポックスウイルスの導入遺伝子の安定性は、連続継代中及びウイルス産生中により低下することになる。表１及び表２に示すが、ＰＡＮＶＡＣ−Ｖ及びＰＡＮＶＡＣ−Ｆの連続継代後において、ＭＵＣ１及びＣＥＡを発現するウイルスのパーセンテージは徐々に低下している。
【００３２】
【表１】
2019528755.tif 000002
【００３３】
【表２】
2019528755.tif 000003
【００３４】
少なくとも１つの態様では、ＭＵＣ１及び／またはＣＥＡの発現低下は、ＭＵＣ１導入遺伝子及び／またはＣＥＡ導入遺伝子が少なくとも部分的に低下した結果であると考えられる。図１は、ＰＡＮＶＡＣのＭＵＣ及びＣＥＡ遺伝子組換え配列の低下を示している。図１において、組換えＰＡＮＶＡＣ−Ｆ産物は４４４５ｂｐであると想定された。しかしながら、図示されているように、実験は、ＭＵＣ１及びＣＥＡの断片化配列であることが確認された複数のより小さなサイズの断片の存在を示した（データは省略）。ＭＵＣ１導入遺伝子及び従来の組換えポックスウイルスにおける発現の低下及び不安定性は、ＣＶ３０１組換えポックスウイルスの産生及び純度を妨げる。
【００３５】
本発明の様々な核酸及び組換えポックスウイルスの作製に先立って、導入遺伝子を安定化させるために、本発明者らは、ＰＡＮＶＡＣの組換えワクシニアウイルス、組換えＭＶＡウイルス及び組換え鶏痘ウイルス、ならびにＭＶＡ−ＣＶ３０１をカスタマイズ及び／または修飾する複数の試みを実施した。表３及び表４に示すが、導入遺伝子及び／または組換えワクシニアウイルス、組換えＭＶＡウイルス及び組換え鶏痘ウイルスに対する修飾は、（ｉ）導入遺伝子を挿入する遺伝子間領域（ＩＧＲ）を変えるまたは修飾すること、（ｉｉ）１つ以上の導入遺伝子のコドンを最適化すること、（ｉｉｉ）導入遺伝子プロモーターを変更すること、及び、（ｉｖ）ＭＵＣ１導入遺伝子内のＶＮＴＲ領域の数及び配置を改変すること、を含んでいた。表に記載されているように、構築物の多くは、導入遺伝子発現の低下をもたらす機能低下変異または断片欠失のいずれかにより、安定的な作製に失敗した。
【００３６】
【表３】
2019528755.tif 000004
【００３７】
【表４】
2019528755.tif 000005
【００３８】
これら複数の試みの後、ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６を構築した。本明細書に記載しているが、ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６は、修飾ＭＵＣ１導入遺伝子、ＣＥＡ導入遺伝子及び修飾ＴＲＩＣＯＭ導入遺伝子を含むＭＶＡ−ＣＶ３０１組換えポックスウイルスである。図９及び図１０に示すように、ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６は、ＰＡＮＶＡＣ（図１及び表１を参照のこと）と比較して導入遺伝子の安定性を示した。図１０に示すように、ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６は、継代４中において、導入遺伝子ＭＵＣ１、ＣＥＡ及びＴＲＩＣＯＭの全てにおける安定性を示した。継代５に開始して、解析原料の小さな集団内にフレームシフト変異が検出された。継代４中に示された安定性は、ＰＡＮＶＡＣに伴う安定性問題を克服するＭＶＡ−ｍＢＮ３３６の能力、及び、ＭＵＣ１を含む安定ポックスウイルスを作製するためのその他の試みを示している。ＭＶＡベースワクチンの製造及びより大規模な製造が通常、継代３または継代４のＭＶＡから得られるので、ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６の安定性は更なる利点である。このように、ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６が継代４中に安定であることから、大規模製造を開始することが可能となり、安定性に関する大きな規制の困難を克服することが可能となる。
【００３９】
不安定性の問題に対処して是正するために、本発明の核酸を合成し、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＣＥＡ導入遺伝子及びＴＲＩＣＯＭ導入遺伝子をコードする１以上の核酸を提供した。本開示によって示すように、本発明のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及びＴＲＩＣＯＭ核酸は、組換えポックスウイルスの連続継代中における、組換えポックスウイルス及びそれら核酸内に含まれる導入遺伝子の遺伝的安定性を向上させることにつながる。
【００４０】
それゆえ、様々な実施形態では、本発明は、ＭＵＣ１抗原、ＣＥＡ抗原及び／またはＴＲＩＣＯＭ抗原をコードする１以上の新規核酸を有する組換えポックスウイルスを提供する。本明細書でより詳細に提供するように、少なくとも１つの態様では、組換えポックスウイルスの一部に組み込まれる場合、１以上の修飾ＭＵＣ１、ＣＥＡ及び／またはＴＲＩＣＯＭコード核酸配列は、組換えポックスウイルス内における導入遺伝子の安定性及び存在を向上させる。
【００４１】
定義
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。それゆえ、例えば、「ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（核酸）」への言及は核酸のうちの１以上を含み、また「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ（方法）」への言及は、本明細書に記載の方法に変更または置き換え可能な当業者に周知の同等のステップ及び方法への言及を含む。
【００４２】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の要素における全ての要素それぞれを意味するものと理解されたい。本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を、当業者は理解し、または、通常の実験を行うだけで確認することが可能であろう。そのような等価物が本発明に包含されることが企図される。
【００４３】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体にわたり、文脈上特に必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載した完全体もしくはステップ、または完全体の群を包含するが、いかなる他の完全体もしくはステップまたは完全体もしくはステップの群をも除外しないことを意味するものと理解されたい。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で、あるいは本明細書で使用する場合に時として、「有する」という用語で置き換えることができる。上記の用語（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する）のうちのいずれも、本発明の態様または実施形態の文脈において本明細書で使用する際にはいつも、あまり好ましくはないが、「からなる」という用語で置き換えることができる。本明細書で使用する場合、「からなる」は、クレーム要素に明記されていない任意の要素、工程または成分を除外する。本明細書で使用する場合、「から本質的になる」は、クレームの基本的な特徴及び新規特徴に対して実質的な影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。
【００４４】
本明細書で使用する場合、複数の列挙要素間にある接続詞的な「及び／または」という用語は、個々の選択肢と組み合わせた選択肢の両方を包含するものと理解される。例えば、２つの要素が「及び／または」で等位接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素を伴わずに第１の要素を適用することを意味する。第２の選択肢は、第１の要素を伴わずに第２の要素を適用することを意味する。第３の選択肢は、第１の要素及び第２の要素を共に適用することを意味する。これら選択肢のうちのいずれか１つがその意味の中に含まれると理解され、したがって本明細書で使用する場合、「及び／または」という用語の要件が満たされる。２つ以上の選択肢の同時適用もその意味の中に含まれ、したがって「及び／または」という用語の要件が満たされる。
【００４５】
本明細書に記載の「変異」は、本明細書において、核酸に対する修飾、例えば、欠失、付加、挿入及び／または置換などのいずれかと定義される。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「共刺激分子」とは、それらのリガンドに結合する際に、Ｔ細胞が活性となることができるように第２のシグナルを伝達する分子のことである。Ｔ細胞上の最もよく知られた共刺激分子はＣＤ２８であり、Ｂ７−１（Ｂ７．１またはＣＤ８０とも呼ばれる）またはＢ７−２（ＣＤ８６としても周知）のいずれかに結合する。追加の共刺激分子はＢ７−３である。Ｔ細胞活性化のための第２のシグナルも提供する補助分子は、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−２）、白血球機能関連抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２及びＬＦＡ−３）を含む。インテグリン及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーメンバーも共刺激分子として機能し得る。
【００４７】
組換えポックスウイルス、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、ＴＲＩＣＯＭ及びその他の導入遺伝子と関連して本明細書で使用する場合、組換えポックスウイルスの「遺伝的安定性」、「安定性」、「発現の安定性」、「連続継代中に安定」、「連続継代中の安定性」または「連続継代中における発現の安定性」とは、組換えポックスウイルスの遺伝子組換えヌクレオチド配列が、組換えポックスウイルスの連続継代中に物質的にインタクト及び／または物質的に変化しない状態を少なくとも継代３または継代４となるまで維持することを意味するものと理解される。少なくとも継代３または継代４中における安定性を有する組換えポックスウイルスは、大規模製造により作製される最終作製物として特に重要であり、ポックスウイルスの作製は通常、継代３または継代４である。「物質的にインタクト及び／または物質的に変化しない」とは、継代の数が増加するにつれて導入遺伝子発現の一定の低下を引き起こす単一変異または断片変異（例えば、置換、欠失などを含む）が存在しないことを意味する。例えば、表１及び表２に示すように、ＰＡＮＶＡＣにおける様々な導入遺伝子の発現レベルは継代の数が増加するにつれて低下した。本出願の実施例２〜実施例４に記載のアッセイを含むがこれらに限定されない、遺伝的安定性または導入遺伝子の安定性を解析できる周知の様々な方法が当技術分野において存在する。安定性を測定するための当該技術分野において周知の追加の方法としては、ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、ＦＡＣＳによる導入遺伝子共発現の測定などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」とは、外来分子、ウイルスまたは微生物の開発及び／または産生を目的として、外来分子、ウイルスまたは微生物を導入された細胞のことである。本明細書に記載の１つの非限定例では、細胞培養に好適な細胞、例えば、ＣＥＦ細胞を、ポックスウイルスに感染させてもよく、またはその他の代替実施形態では、外来遺伝子または異種遺伝子を含むプラスミドベクターに感染させてもよい。それゆえ、好適な細胞培養物は、ポックスウイルス及び／または外来遺伝子もしくは異種遺伝子の宿主として機能する。
【００４９】
本明細書に記載の核酸配列に関する「パーセント（％）配列相同性またはパーセント（％）配列同一性」は、必要に応じ、最大パーセント配列同一性を得るために配列をアラインしてギャップを導入した後における、参照配列（すなわち、そこから候補配列が由来する核酸配列）内のヌクレオチドと同一な候補配列内のヌクレオチドのパーセンテージと定義される（いかなる保存的置換も配列同一性の一部としては考慮しない）。当業者に周知の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、パーセントヌクレオチド配列同一性またはパーセントヌクレオチド配列相同性を測定することを目的としたアライメントを実施することができる。当業者は、比較する配列の全長にわたる最大アライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００５０】
例えば、核酸配列用の適切なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９の局所相同性アルゴリズムにより提供されている。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡが開発してＧｒｉｂｓｋｏｖ（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３が正規化したスコアリングマトリックスを使用することにより、このアルゴリズムをアミノ酸配列に適用することができる。配列のパーセント同一性を測定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）により提供されている。この方法のデフォルトパラメータについては、ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に記載されている。本発明の文脈におけるパーセント同一性を確認するための好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ  Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋが開発しＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）が販売するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージスイートから、スコアリングテーブルにデフォルトパラメータ（例えば、１２のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、及び６のギャップ）を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを採用してもよい。「整合」値から作製したデータは「配列同一性」を表している。配列間におけるパーセント同一性またはパーセント類似性を算出するためのその他の好適なプログラムは通常、当該技術分野において周知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、以下のデフォルトパラメータ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用して、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを使用してもよい。これらプログラムの詳細については、以下のインターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／において見出���ことができる。
【００５１】
「プライムブーストワクチン接種」または「プライムブーストレジメン」という用語は、特定の抗原を標的とするワクチンの第１のプライム注射の後に間隔をあけた同一ワクチンの１回または複数回のブースト注射を使用した、ワクチン接種戦略またはワクチン接種レジメンのことを意味する。プライムブーストワクチン接種は同種または異種であってもよい。同種プライムブーストワクチン接種では、プライム注射と１回または複数回のブースト注射の両方用に同一の抗原及びベクターを含むワクチンを使用する。異種プライムブーストワクチン接種では、プライム注射と１回または複数回のブースト注射の両方用に同一の抗原を含むが、プライム注射及び１回または複数回のブースト注射用に異なるベクターを含む、ワクチンを使用する。例えば、同種プライムブーストワクチン接種では、プライム注射用に１以上の抗原を発現する核酸を含む組換えポックスウイルス、及び、１回または複数回のブースト注射用に１以上の抗原を発現する同一の組換えポックスウイルスを使用してもよい。それに対し異種プライムブーストワクチン接種では、プライム注射用に１以上の抗原を発現する核酸を含む組換えポックスウイルス、及び、１回または複数回のブースト注射用に１以上の抗原を発現する異なる組換えポックスウイルスを使用してもよい。
【００５２】
「組換え体」という用語は、自然には発生しないか、または、天然に認められない配置で別のポリヌクレオチドに結合するかのいずれかである、半合成または合成由来のポリヌクレオチドのことを意味する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「連続継代」は、細胞継代を使用した組換えウイルスの作製に関する。単なる例ではあるが、初期継代において宿主細胞をウイルスまたは組換えウイルスに感染させる。初期継代においてウイルスを複製して作製する。宿主細胞の感染及び培養後、宿主細胞からウイルスを採取して細胞／ウイルス懸濁液内に回収する。通常、この手順は続く細胞継代において複数回繰り返され、それぞれの継代ではより多くの組換えウイルスを作製及び複製する。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」または「異種」遺伝子は、野生型ポックスウイルスゲノム（例えば、ワクシニア、鶏痘またはＭＶＡ）には存在しない核酸またはアミノ酸配列と理解される。組換えポックスウイルスが宿主細胞へと投与された後に、対応する異種遺伝子産物、すなわち、「異種抗原」及び／または「異種タンパク質」として発現されるように、「導入遺伝子」または「異種遺伝子」（ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス内に存在する場合）がポックスウイルスゲノム内に組み込まれることを、当業者は理解している。発現は通常、ポックスウイルス感染細胞内における発現を可能とする調節因子と異種遺伝子を機能的に連結させることにより達成される。調節因子が天然または合成のポックスウイルスプロモーターを含んでいることが好ましい。
【００５５】
「ＴＲＩＣＯＭ」、Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  ＣＯｓｔｉｍｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（三つ組み共刺激分子）（ＴＲＩＣＯＭとしても周知）としては、Ｂ７−１（Ｂ７．１またはＣＤ８０としても周知）、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１、ＣＤ５４としても周知）及びリンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３、ＣＤ５８としても周知）を含み、一般的には、抗原特異的免疫応答を亢進させるために特定の抗原を発現する組換えウイルスベクター（例えば、ポックスウイルスベクター）内に含まれる。ＴＲＩＣＯＭの個々の構成要素は、同一または異なるプロモーターの制御下にあってもよく、また特定の抗原を含む同一ベクター上または別々のベクター上に提供されてもよい。例示的なベクターについては、例えば、Ｈｏｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ  ｔｏ  Ａｍｐｌｉｆｙ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５８００−５８０７（１９９９）及び米国特許番号７，２１１，４３２Ｂ２に開示されている（それらの両方は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５６】
「ベクター」とは、異種ポリヌクレオチドを含み得るＤＮＡプラスミドもしくはＲＮＡプラスミドまたはウイルスのことを意味する。異種ポリヌクレオチドは、予防または治療を目的とした目的の配列を含んでいてもよく、任意選択的に、発現カセットの形態であってもよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、最終的な標的細胞または標的対象内において複製可能である必要はない。この用語はクローニングベクター及びウイルスベクターを含む。
【００５７】
新規ＭＵＣ１核酸配列
本発明の開発において、本発明者らは、組換えポックスウイルス、特に、オルソポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ）及びアビポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルス）の継代過程にわたり、ＭＵＣ１、ＣＥＡ及び／またはＴＲＩＣＯＭをコードする核酸における１つ以上の領域が変異（例えば、欠失、置換など）し、それにより組換えポックスウイルス及びそこに含まれる導入遺伝子に不安定性がもたらされることを明らかにした。
【００５８】
ＶＮＴＲ領域の修飾
上記のとおり、ＶＮＴＲ領域は、２０アミノ酸の可変数タンデム反復（ＶＮＴＲ）ドメイン（異なる個体において反復数は２０〜１２０の範囲で変動する）を含むＭＵＣ１の細胞外ドメインである。Ｂｒａｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。ＶＮＴＲドメインのアミノ酸配列が通常同一である（例えば、図２Ａを参照のこと）一方で、ＶＮＴＲのヌクレオチド配列は互いに異なり得る。図２Ａに示すように、ＰＡＮＶＡＣの一部であるＭＵＣ１が６つのＶＮＴＲを有するように合成された。
【００５９】
一態様では、本発明の開発過程にわたり、ＭＵＣ１  ＶＮＴＲ領域をコードする核酸に対する１つ以上の修飾が、組換えポックスウイルス内におけるＭＵＣ１導入遺伝子の安定性を向上させたことが明らかとなった。より詳細には、本発明者らは、ＶＮＴＲをコードする核酸をシャッフルすることにより、ＰＡＮＶＡＣ  ＭＵＣ１と比較してＭＵＣ１導入遺伝子の安定性が更に向上することを明らかにした。本明細書で使用する場合、ＶＮＴＲを「シャッフルする」は、ＶＮＴＲドメイン反復をコードする核酸の順番を再編成することと定義される。図２Ａ及び図２Ｂの記載は、ＶＮＴＲのシャッフルの非限定例である。図２Ａにおいて、ＰＡＮＶＡＣ  ＶＮＴＲドメインの順番はＶＮＴＲ＃１〜６で示されている。図２Ｂを見ると、ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３、ｍＢＮ４２０のＶＮＴＲ＃１をコードする核酸は、ＰＡＮＶＡＣのＶＮＴＲ＃をコードする核酸に対応している。ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３、ｍＢＮ４２０のＶＮＴＲ＃２は、ＰＡＮＶＡＣのＶＮＴＲ＃１に対応している。その結果、ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３、ｍＢＮ４２０のＭＵＣ１を合成する上で、ＰＡＮＶＡＣ  ＶＮＴＲ＃１及び＃２の順番はシャッフルされた。
【００６０】
本発明により、図２Ａ及び図２Ｂに示すＶＮＴＲドメインはＭＵＣ１  ＶＮＴＲドメインの単なる代表例であり、ＶＮＴＲドメインの数及びＶＮＴＲがシャッフルされる配置の数は様々であり得るということが理解される。
【００６１】
ＶＮＴＲのシャッフルに加えて、ＶＮＴＲドメインのコドンを最適化することにより、ＭＵＣ１導入遺伝子の安定性が更に向上することが明らかとなった。本明細書で使用する場合、「コドンを最適化する」は、反復ヌクレオチド配列の相同性によりＶＮＴＲのヌクレオチド配列に対する変異及び／または欠失の可能性を最小限とするために、ＶＮＴＲの１つ以上のヌクレオチドを置換することと定義される。
【００６２】
図３Ａ〜図３Ｂのアライメントに示す、更に具体的な実施形態では、本発明の核酸のうちの１以上はＶＮＴＲドメイン内に様々な置換を含む。図３Ａに示すように、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０（以下、ｍＢＮ３７３／４２０）のＶＮＴＲ１は、ＷＯ２０１３／１０３６５８に記載のアゴニストエピトープをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（下線で示す領域）に加えて、説明したコドン最適化置換を含む。図３Ｂ及び図３Ｃに示すように、ｍＢＮ３７３／４２０修飾のＶＮＴＲ２及び３は、説明したコドン最適化置換を含む。
【００６３】
本発明により、図３Ａ〜図３Ｃに示すＶＮＴＲドメインに対する説明したコドン最適化修飾はＭＵＣ１  ＶＮＴＲドメインコドン最適化の単なる代表例であるということが理解される。単なる例ではあるが、本発明では、ＶＮＴＲドメイン内の特定の修飾位置において代替ヌクレオチドを置換してもよいことが企図される。ＶＮＴＲドメイン内の特定の修飾位置は、修飾がサイレント修飾となるように様々であり得ることが更に企図される。本明細書で使用する場合、サイレント修飾とは、修飾がＭＵＣ１抗原のアミノ酸配列に影響を及ぼさないことを意味する。
【００６４】
それゆえ、一実施形態では、本発明のＭＵＣ１核酸は、１）シャッフルされて２）コドン最適化された１つ以上のＶＮＴＲドメイン領域を含む。
【００６５】
ＭＵＣ１の非ＶＮＴＲ領域に対する修飾
本発明の別の態様では、ＶＮＴＲドメインの外側の領域に対して１以上の修飾を行った。本発明の開発過程にわたる更に特定の態様では、ＭＵＣ１  ＶＮＴＲ領域の外側（非ＶＮＴＲ領域）のそれらヌクレオチド領域内における１つ以上の修飾が、ＭＵＣ１導入遺伝子の安定性を向上させたことが明らかとなった。それら領域（下線を付したヌクレオチド）の代表的なサンプルを以下に示す。ＶＮＴＲ領域は灰色で網掛けしている。
【００６６】
【表５】
2019528755.tif 000006
【００６７】
ウイルスの連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するために、本発明の１つ以上の核酸を合成した。より詳細には、図２Ａ〜図２Ｃに記載しているが、示すとおり、ＰＡＮＶＡＣ  ＭＵＣ１（配列番号１）のＶＮＴＲ領域の外側の下線領域のうちの１つまたは複数に対して１つ以上の置換を行った。
【００６８】
それにより、本発明の一実施形態では、ＭＵＣ１核酸のＶＮＴＲ領域の外側の反復ヌクレオチド領域のうちの少なくとも１つに置換を含む新規ＭＵＣ１核酸が存在する。少なくとも１つの態様では、反復領域のうちの１つ以上は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと定義される。更に特定の態様では、反復ヌクレオチド領域のうちの１つ以上は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される。あるその他の更に特定の態様では、連続反復したヌクレオチドは、（ｉ）連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）連続したＴヌクレオチドと定義される。
【００６９】
図２Ａ〜図２Ｃに示すように、新規ＭＵＣ１核酸は、ＭＵＣ１核酸のＶＮＴＲ領域の外側の少なくとも２、３、４または５つの反復ヌクレオチド領域内に置換を含み得る。更なる態様では、新規ＭＵＣ１核酸は、ＶＮＴＲ領域の外側の少なくとも１０、１５、２０または２５の反復ヌクレオチド領域内に置換を含み得る。
【００７０】
なおも追加の態様では、新規ＭＵＣ１核酸は、組換えポックスウイルスの連続継代中により変異する傾向のあるＶＮＴＲ領域の外側の領域内に少なくとも１つの置換を含み得る。例示的な態様では、新規ＭＵＣ１核酸は、表５に示すＰＡＮＶＡＣ  ＭＵＣ１（配列番号１）のヌクレオチド領域及び／またはこれらの組み合わせから選択されるＶＮＴＲ領域の外側のＭＵＣ１ヌクレオチド反復領域のうちの１つまたは複数内に少なくとも１つの置換を含み得る。
【００７１】
【表６】
2019528755.tif 000007
【００７２】
より好ましくは、新規ＭＵＣ１核酸は、表６に示すＰＡＮＶＡＣ  ＭＵＣ１（配列番号１）のヌクレオチド領域及び／またはこれらの組み合わせから選択されるＶＮＴＲ領域の外側のそれらＭＵＣ１ヌクレオチド反復領域内に少なくとも１つの置換を含み得る。
【００７３】
【表７】
2019528755.tif 000008
【００７４】
本発明により、表５及び表６に列挙したヌクレオチド位置は、ＭＵＣ１の非ＶＮＴＲ領域内に存在するＭＵＣ１核酸反復領域の単なる代表例であるということが理解される。それゆえ、本明細書に記載の反復領域は配列番号１内における特定の位置（例えば、２４０〜２５３）を有しているが、その特定の領域は別のＭＵＣ１核酸内における別のヌクレオチド位置に対応していてもよい。
【００７５】
追加の実施形態では、ＶＮＴＲの外側の反復領域に対する修飾及び／またはＶＮＴＲ領域内の修飾はサイレント修飾であり、修飾がＭＵＣ１抗原のアミノ酸配列に影響を及ぼさないことを意味する。少なくとも１つの態様では、１つ以上の反復領域を修飾することによりＭＵＣ１導入遺伝子の安定性を向上させることは、ある特定のヌクレオチド及び／または反復領域のみがＭＵＣ１のアミノ酸配列に影響を及ぼさずに修飾され得るという点で困難であった。
【００７６】
前述したことを考慮して、１つ以上の実施形態では、本発明は、１）ＶＮＴＲドメイン反復にａ）シャッフル及びｂ）コドン最適化から選択される１つ以上の修飾、及び２）ＶＮＴＲの外側の反復領域に１つ以上の修飾を含む、１以上のＭＵＣ１核酸を含む。
【００７７】
別の態様では、本発明のＭＵＣ１核酸は、対象内におけるＭＵＣ１導入遺伝子の免疫原性を高めるように構成された１つ以上の修飾を含み得る。１つの非限定例では、ＭＵＣ１核酸は、ＷＯ２０１３／１０３６５８に記載のアゴニストエピトープ（それらは参照により本明細書に組み込まれる）のうちの１つまたは複数を含むように修飾され得る。
【００７８】
【表８】
2019528755.tif 000009
【００７９】
好ましい実施形態では、ＭＵＣ１核酸は、配列番号２（３３６  ＭＵＣ）、配列番号３（３７３  ＭＵＣ）、配列番号４（３９９／４００  ＭＵＣ１）または配列番号５（４２０  ＭＵＣ１）に対して少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列を含む。なおも追加の好ましい実施形態では、ＭＵＣ１核酸は、配列番号２（３３６  ＭＵＣ）、配列番号３（３７３  ＭＵＣ）、配列番号４（３９９／４００  ＭＵＣ１）または配列番号５（４２０  ＭＵＣ１）に対して少なくとも９６％、９７％または９８％相同なヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態では、ＭＵＣ１核酸は、配列番号２（３３６  ＭＵＣ）、配列番号３（３７３  ＭＵＣ）、配列番号４（３９９／４００  ＭＵＣ１）または配列番号５（４２０  ＭＵＣ１）から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００８０】
なおもその他の好ましい実施形態では、ＭＵＣ１核酸は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４に対して少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列を含む。なおも追加の好ましい実施形態では、ＭＵＣ１核酸は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４に対して少なくとも９６％、９７％または９８％相同なヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態では、ＭＵＣ１核酸は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
新規ＣＥＡ核酸配列
本発明の別の態様では、ＣＥＡ核酸の反復領域内における１つ以上の修飾が、ＣＥＡ導入遺伝子の安定性を向上させることが明らかとなった。それら領域の代表的なサンプルを、図５のペアワイズアライメントで示す。それら例示的な反復領域は示した置換（アライメントの非＊領域）により示されている。
【００８２】
少なくとも１つの態様では、置換は組換えポックスウイルスの安定性を更に向上させた。このことは、図９及び図１０に示すｍＢＮ３３６の安定性データにより少なくとも部分的に示されている。上記のとおり、ｍＢＮ３３６はＭＵＣ１、ＣＥＡ及びＴＲＩＣＯＭを含む。ｍＢＮ３３６が修飾ＭＵＣ１核酸を含む一方で、ｍＢＮ３３６はＣＥＡに対する任意の追加の修飾を含まず、ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子に対する中間段階の修飾のみを含む。その結果、本明細書で開示するＭＵＣ１に対する修飾が組換えポックスウイルスの安定性を向上させた一方で、継代５に開始する不安定性は維持された。一旦修飾ＣＥＡがｍＢＮ３７３内の鶏痘ウイルスの一部に含まれると、継代５の後から継代７において導入遺伝子及び鶏痘ウイルスの安定性が示された（例えば、図１１を参照のこと）。
【００８３】
それゆえ、様々な実施形態では、本発明は、ＣＥＡ核酸の少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含むＣＥＡペプチドをコードする核酸（ＣＥＡ核酸）を含み、少なくとも１つの反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧまたはＣヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＴヌクレオチドと定義される．追加の実施形態では、反復ヌクレオチド領域は、ａ）３以上の連続反復したＧヌクレオチド及び／またはｂ）３以上の連続反復したＣヌクレオチドと更に定義される。
【００８４】
好ましい実施形態では、ＣＥＡ核酸の反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと定義される。追加の好ましい実施形態では、反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される。
【００８５】
１つ以上の実施形態では、ＣＥＡ核酸は、第２の核酸の少なくとも２、３、４、５または１０の反復ヌクレオチド領域に少なくとも１つの置換を含む。好ましい実施形態では、ＣＥＡ核酸は、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５及び／または少なくとも１９の反復ヌクレオチド領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。より好ましい実施形態では、ＣＥＡ核酸は、第２の核酸の１９領域内に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。
【００８６】
より好ましい実施形態では、ＣＥＡ核酸は配列番号１４（ｍＢＮ３７３／４２０  ＣＥＡ）を含む。
【００８７】
新規ＴＲＩＣＯＭ核酸配列
本発明の別の態様では、ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子をコードする１以上の核酸に対して１超の修飾を行った。更に特定の態様では、本発明の開発過程にわたり、ＴＲＩＣＯＭ核酸の反復領域内における１つ以上の修飾が、ＴＲＩＣＯＭ導入遺伝子の安定性を向上させることが明らかとなった。それら領域の代表的なサンプルを、図６〜図８のペアワイズアライメントで示す。それら例示的な反復領域は示した置換（アライメントの非＊領域）により示されている。
【００８８】
少なくとも１つの態様では、１つ以上の置換は、組換えポックスウイルスの安定性を更に向上させた。このことは、図９及び図１０に示すｍＢＮ３３６の安定性データにより少なくとも部分的に示されている。上記のとおり、ｍＢＮ３３６は修飾ＭＵＣ１を含む。しかしながら、ｍＢＮ３３６はＣＥＡに対する任意の追加の修飾を含まず、ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子に対する中間段階の修飾のみを含む。その結果、本明細書で開示するＭＵＣ１に対する修飾がｍＢＮ３３６の安定性を向上させた一方で、継代５の後における不安定性は維持された。一旦修飾導入遺伝子が鶏痘ウイルスの一部に含まれると、継代５の後から継代７において導入遺伝子及びポックスウイルスの安定性が示された（例えば、図１１を参照のこと）。
【００８９】
一実施形態では、新規ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子は、配列番号１５または１７（Ｂ７−１）に対して少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列、配列番号１８または２０（ＩＣＡＭ−１）に対して少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列、及び配列番号２１または２３（ＬＦＡ−３）に対して少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列、を含む。なおも追加の好ましい実施形態では、ＴＲＩＣＯＭ核酸は、配列番号１５または１７（Ｂ７−１）、配列番号１８または２０（ＩＣＡＭ−１）、及び／または配列番号２１または２３（ＬＦＡ−３）に対して少なくとも８５％、９０％または９５％相同なヌクレオチド配列を含む。なおもより好ましい実施形態では、ＴＲＩＣＯＭ核酸は、配列番号１７（Ｂ７−１）、配列番号２０（ＩＣＡＭ−１）及び／または配列番号２３（ＬＦＡ−３）に対して少なくとも８５％、９０％または９５％相同なヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
別の実施形態では、ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子は、配列番号１５または１７（Ｂ７−１）、配列番号１８または２０（ＩＣＡＭ−１）、及び／または配列番号２１または２３（ＬＦＡ−３）を含む。
【００９１】
更に別の実施形態では、ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子は、配列番号１７（Ｂ７−１）、配列番号２０（ＩＣＡＭ−１）及び／または配列番号２３（ＬＦＡ−３）を含む。
【００９２】
１つの好ましい実施形態では、新規ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子は、配列番号１５（Ｂ７−１）に対して少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列、配列番号１８（ＩＣＡＭ−１）に対して少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列、及び配列番号２１（ＬＦＡ−３）に対して少なくとも８０％相同なヌクレオチド配列、を含む。なおも追加の好ましい実施形態では、ＴＲＩＣＯＭ核酸は、配列番号１５（Ｂ７−１）、配列番号１８（ＩＣＡＭ−１）及び／または配列番号２１（ＬＦＡ−３）に対して少なくとも８５％、９０％または９５％相同なヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
別の好ましい実施形態では、新規ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子は、配列番号１７（Ｂ７−１）に対して少なくとも８０％、９０％または９５％相同なヌクレオチド配列、配列番号２０（ＩＣＡＭ−１）に対して少なくとも８０％、９０％または９５％相同なヌクレオチド配列、及び配列番号２３（ＬＦＡ−３）に対して少なくとも８０％、９０％または９５％相同なヌクレオチド配列、を含む。
【００９４】
別の実施形態では、ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子は、配列番号１５（Ｂ７−１）、配列番号１８（ＩＣＡＭ−１）及び／または配列番号２１（ＬＦＡ−３）を含む。
【００９５】
別の実施形態では、ＴＲＩＣＯＭ共刺激分子は、配列番号１７（Ｂ７−１）、配列番号２０（ＩＣＡＭ−１）及び／または配列番号２３（ＬＦＡ−３）を含む。
【００９６】
本開示は、本明細書で提供する新規核酸配列に対して相補的な核酸配列を組み入れることを企図する。
【００９７】
組換えポックスウイルス
１つ以上の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＭＵＣ１核酸のうちの１以上を含む組換えポックスウイルスを含む。より好ましい実施形態では、組換えポックスウイルスは、本明細書に記載のＭＵＣ１核酸配列及びＣＥＡ核酸配列を含む。
【００９８】
好ましい実施形態では、ＭＵＣ１核酸は、配列番号２、配列番号３（３７３  ＭＵＣ）、配列番号５（４２０  ＭＵＣ１）または配列番号４（３９９／４００  ＭＵＣ１）に対して少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列、及び配列番号１３または１４を含むＣＥＡ核酸配列を含む。
【００９９】
なおも追加の実施形態では、本開示の組換えポックスウイルスは１以上の共刺激分子、限定するわけではないが例えば、本明細書に記載の共刺激分子を含む。１つの好ましい実施形態では、共刺激分子はＴＲＩＣＯＭ（Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３）を含む。より好ましい実施形態では、Ｂ７−１共刺激分子は、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７を含む核酸配列から選択される。より好ましい実施形態では、ＩＣＡＭ−１共刺激分子は、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０を含む核酸配列から選択される。より好ましい実施形態では、ＬＦＡ−３共刺激分子は、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３を含む核酸配列から選択される。より好ましい実施形態では、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３は、それぞれ、配列番号１５、配列番号１８及び配列番号２１を含む核酸配列から選択される。別のより好ましい実施形態では、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３は、それぞれ、配列番号１７、配列番号２０及び配列番号２３を含む核酸配列から選択される。
【０１００】
本開示の様々な実施形態では、組換えポックスウイルスは、オルソポックスウイルス、限定するわけではないが例えば、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体であることが好ましい。
【０１０１】
ワクシニアウイルス株の例は、Ｔｅｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｈｅａｖｅｎ株、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、Ｐａｒｉｓ株、Ｂｕｄａｐｅｓｔ株、Ｄａｉｒｅｎ株、Ｇａｍ株、ＭＲＩＶＰ株、Ｐｅｒ株、Ｔａｓｈｋｅｎｔ株、ＴＢＫ株、Ｔｏｍ株、Ｂｅｒｎ株、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ株、ＢＩＥＭ株、Ｂ−１５株、Ｌｉｓｔｅｒ株、ＥＭ−６３株、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ株、Ｅｌｓｔｒｅｅ株、Ｉｋｅｄａ株及びＷＲ株である。好ましいワクシニアウイルス（ＶＶ）株はＷｙｅｔｈ（ＤＲＹＶＡＸ）株（米国特許７，４１０，６４４）である。
【０１０２】
別の好ましいＶＶ株は改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．［１９９４］，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０）である。本発明の実施に有用でありブダペスト条約の要件に従い寄託されているＭＶＡウイルス株の例は、１９９４年１月２７日、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍに寄託番号ＥＣＡＣＣ  ９４０１２７０７で寄託された株ＭＶＡ  ５７２、２０００年１２月７日、ＥＣＡＣＣ  ００１２０７０７で寄託されたＭＶＡ  ５７５株、２０００年８月３０日、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８で寄託されたＭＶＡ−ＢＮ株であり、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体は追加の例示的な株である。
【０１０３】
ＭＶＡ−ＢＮの「誘導体」とは、本明細書に記載のＭＶＡ−ＢＮと本質的に同一の複製特性を示すが、それらゲノムの１つ以上の部位に差異を示すウイルスのことを意味する。ＭＶＡ−ＢＮ、ならびにその誘導体は、複製不能であり、インビボ及びインビトロにおいて増殖複製不全であることを意味する。インビトロにおいてより具体的には、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）内において増殖複製可能だが、ヒト角化細胞株ＨａＣａｔ内（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ（１９８８），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６：７６１−７７１）、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ寄託番号９１１１２５０２）、ヒト胎児腎臓細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ寄託番号８５１２０６０２）及びヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）においては増殖複製不可能であると記載されている。加えて、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａｔ細胞株内のＭＶＡ−５７５と比較して、少なくとも２倍より少ない、より好ましくは３倍より少ない、ウイルス増殖比率を有している。ＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体のこれら特性に対する検査及びアッセイについては、ＷＯ０２／４２４８０（米国特許出願番号２００３／０２０６９２６）及びＷＯ０３／０４８１８４（米国特許出願番号２００６／０１５９６９９）に記載されている。
【０１０４】
これまでの段落に記載の、インビトロのヒト細胞株内における「増殖複製不可能」または「増殖複製不能」については、例えば、ＷＯ０２／４２４８０（上に記載した所望の特性を有するＭＶＡを得るための方法についても教示している）に記載されている。この用語は、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許番号６，７６１，８９３に記載のアッセイを使用した、感染後４日のインビトロにおいて１未満のウイルス増殖比率を有するウイルスに適用される。
【０１０５】
「増殖複製不全」という用語は、これまでの段落に記載の感染後４日のインビトロのヒト細胞株内において１未満のウイルス増殖比率を有するウイルスを指す。ＷＯ０２／４２４８０または米国特許番号６，７６１，８９３に記載のアッセイは、ウイルス増殖比率の決定に適用可能である。
【０１０６】
これまでの段落に記載のインビトロのヒト細胞株内におけるウイルスの増幅または複製は通常、感染細胞から作製されたウイルス（出力）の、細胞を感染させるために元々使用された量（入力）に対する比率で表され、「増殖比率」と呼ばれる。「１」の増殖比率は、感染細胞から作製されたウイルスの量が細胞を感染させるために最初に使用された量と同一である増殖状態のことを定義し、感染細胞がウイルス感染及びウイルス増殖を許容することを意味する。それに対し１未満の増殖比率、すなわち、入力レベルと比較した出力の低下は、増殖複製が欠如すること、したがってウイルスが弱毒化していることを示す。
【０１０７】
別の実施形態では、本明細書で開示するＭＵＣ１核酸及び／またはその他の核酸を含む組換えポックスウイルスはアビポックスウイルス、限定するわけではないが例えば、鶏痘ウイルスである。
【０１０８】
「アビポックスウイルス」という用語は、任意のアビポックスウイルス、例えば、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、ジュンコ痘ウイルス、マイナ痘ウイルス、鳩痘ウイルス、オウム痘ウイルス、ウズラ痘ウイルス、クジャク痘ウイルス、ペンギン痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス及び七面鳥痘ウイルスなどのことを意味する。好ましいアビポックスウイルスはカナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスである。
【０１０９】
鶏痘ウイルスの例は、ＦＰ−１株、ＦＰ−５株、ＴＲＯＶＡＣ株（米国特許番号５，７６６，５９８）、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ株（米国特許７，４１０，６４４）、ＴＢＣ−ＦＰＶ株（Ｔｈｅｒｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ−ＦＰＶ）であり、ＦＰ−１株は、１日齢のニワトリにワクチンとして使用するために改変されたデュベット（Ｄｕｖｅｔｔｅ）株である。この株は、Ｏ  ＤＣＥＰ  ２５／ＣＥＰ６７／２３０９  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８０と呼ばれＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から市販されている鶏痘ウイルスワクチン株である。ＦＰ−５は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ｎｏ．１６５，ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．３０３２１から入手可能な市販のニワトリ胚由来鶏痘ウイルスワクチン株である。
【０１１０】
特定の好ましい実施形態では、組換えオルソポックスウイルス、例えば、配列番号５（４２０  ＭＵＣ１）、配列番号４（３９９／４００  ＭＵＣ１）、配列番号３（３７３  ＭＵＣ１）または配列番号２（３３６  ＭＵＣ１）から選択されるＭＵＣ１核酸配列を含むワクシニア、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体などが存在する。ある特定のより好ましい実施形態では、組換えオルソポックスウイルスは、配列番号２（４２０  ＭＵＣ１）から選択されるＭＵＣ１核酸配列、配列番号１３または１４から選択されるＣＥＡ核酸、及びＴＲＩＣＯＭを含む、ＭＶＡウイルスである。最も好ましい実施形態では、配列番号２（３３６  ＭＵＣ１）を含むＭＵＣ１核酸配列、配列番号１３を含むＣＥＡ核酸、及びＴＲＩＣＯＭを含む、組換えＭＶＡが存在する。別の最も好ましい実施形態では、ＴＲＩＣＯＭは、配列番号１７（Ｂ７−１）、配列番号２０（ＩＣＡＭ−１）及び配列番号２３（ＬＦＡ−３）を含む１つ以上の核酸を含む。
【０１１１】
ある特定の他の好ましい実施形態では、組換えアビポックスウイルス、例えば、配列番号３（３７３  ＭＵＣ１）を含むＭＵＣ１核酸配列を含む鶏痘ウイルスなどが存在する。ある特定のより好ましい実施形態では、組換えアビポックスウイルスは、配列番号３（３７３）を含むＭＵＣ１核酸、配列番号１３または１４から選択されるＣＥＡ核酸、及びＴＲＩＣＯＭを含む、鶏痘ウイルスである。最も好ましい実施形態では、配列番号３（３７３  ＭＵＣ１）を含むＭＵＣ１核酸配列、配列番号１４を含むＣＥＡ核酸、及びＴＲＩＣＯＭを含む、組換え鶏痘ウイルスが存在する。別の最も好ましい実施形態では、ＴＲＩＣＯＭは、配列番号１５（Ｂ７−１）、配列番号１８（ＩＣＡＭ−１）及び配列番号２１（ＬＦＡ−３）を含む１つ以上の核酸を含む。
【０１１２】
発現カセット／制御配列
様々な態様では、本明細書に記載の１つ以上の核酸は、１つ以上の核酸が発現制御配列と機能的に連結している１つ以上の発現カセット内に組み入れられる。「機能的に連結する」とは、記載した構成要素同士がそれらの意図した様式で機能するような関係にあることを意味し、例えば、プロモーターが発現される核酸を転写するなどである。コード配列と機能的に連結している発現制御配列は、コード配列の発現が発現制御配列と適合する条件下で達成されるように結合している。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コードオープンリーディングフレームの先頭にある開始コドン、イントロン用のスプライシングシグナル、及びインフレーム終止コドンが挙げられるがこれらに限定されない。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ前初期Ｉプロモーター、ならびに、以下のワクシニアウイルスまたはＭＶＡ由来プロモーター及びＦＰＶ由来プロモーター、３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、Ｐｒ１３．５長プロモーター、４０Ｋプロモーター、ＭＶＡ−４０Ｋプロモーター、ＦＰＶ  ４０Ｋプロモーター、３０ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター及びＰｒＬＥ１プロモーターを含むがこれらに限定されない様々なポックスウイルスプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。追加のプロモーターについては、ＷＯ２０１０／０６０６３２、ＷＯ２０１０／１０２８２２、ＷＯ２０１３／１８９６１１及びＷＯ２０１４／０６３８３２に更に記載されている（それらは全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１３】
追加の発現制御配列としては、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び所望の宿主系内における所望の組換えタンパク質（例えば、ＭＵＣ１、ＣＥＡ及び／またはＴＲＩＣＯＭ）をコードする核酸配列の適切な転写及びそれに続く翻訳に必要な任意のその他の配列が挙げられるがこれらに限定されない。ポックスウイルスベクターはまた、所望の宿主系内における核酸配列を含有する発現ベクターの導入及びそれに続く複製に必要な追加の要素を含有していてもよい。そのようなベクターは従来の方法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ｉｎ“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を使用して容易に構築され、市販品として入手可能であることを、当業者は更に理解するであろう。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本開示の組換えオルソポックスウイルス及び／または組換えアビポックスウイルスは、１つ以上のサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γなど、１つ以上の増殖因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦなど、１つ以上の共刺激分子、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２など、またはその他のＢ７関連分子を含み、１つ以上の分子、例えば、ＯＸ−４０Ｌもしくは４１  ＢＢＬなどまたはこれら分子の組み合わせを生物学的アジュバントとして使用することができる（例えば、Ｓａｌｇａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６８（２）：１２２−３８；Ｌｏｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．６（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ６１−６；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６（Ｓｕｐｐｌ  １）：２５１−６０；Ｋｕｉｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５：３８１−９０を参照のこと）。これらの分子を宿主へと全身的に（または局所的に）投与することができる。いくつかの例では、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ、４１  ＢＢＬ及びＩＣＡＭ−１を投与する。
【０１１５】
導入遺伝子を含む組換えポックスウイルスの作製
当該技術分野において周知の通常の方法を用いて本明細書で提供する組換えポックスウイルスを作製することができる。組換えポックスウイルスを得るための方法または外来コード配列をポックスウイルスゲノム内に挿入するための方法は当業者に周知である。例えば、標準的な分子生物学的手法、例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡ及びＲＮＡの単離、ウェスタンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＰＣＲ増幅手法などの方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．）［Ｊ．Ｓａｍｂ  ｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されており、ウイルスの取り扱い法及び処理法については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ［Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）］に記載されている。同様に、ＭＶＡの取り扱い、処理及び遺伝子操作のための技術及びノウハウについては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ［Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ  ＆  Ｒ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔｔ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ９：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓを参照のこと）］及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＶ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒを参照のこと）］に記載されている。
【０１１６】
本明細書で開示する様々な組換えポックスウイルスを作製するために、異なる方法を適用してもよい。ウイルスに挿入するＤＮＡ配列を、ポックスウイルスのＤＮＡのセクションに相同なＤＮＡを挿入したＥ．ｃｏｌｉプラスミド構築物内に配置してもよい。別に、挿入するＤＮＡ配列をプロモーターにライゲートしてもよい。プロモーター−遺伝子連結部を、非必須遺伝子座を含有するポックスウイルスＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列に相同なＤＮＡがプロモーター−遺伝子連結部の両隣に隣接するように、プラスミド構築物内に配置してもよい。得られたプラスミド構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌内で増殖させることにより増幅してから単離してもよい。挿入するＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドを細胞培養物、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に形質移入し、同時にその培養物をポックスウイルスに感染させてもよい。プラスミド内の相同ポックスウイルスＤＮＡ間の組換え及びウイルスゲノム間の組換えのそれぞれにより、外来ＤＮＡ配列の存在により改変されたポックスウイルスを作製することが可能となる。
【０１１７】
好ましい実施形態では、細胞培養物として好適な細胞、例えば、ＣＥＦ細胞をポックスウイルスに感染させてもよい。それに続いて、本開示で提供するＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸のうちの１以上などの外来遺伝子（単数または複数）または異種遺伝子（単数または複数）を含む第１のプラスミドを、好ましくは、ポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下で、感染細胞に形質移入してもよい。上で説明したように、プラスミドはまた、外来配列の挿入をポックスウイルスゲノムの選択部位に誘導可能な配列を含む。任意選択的に、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスプロモーターと機能的に連結したマーカー遺伝子及び／または選択遺伝子を含むカセットを含有する。好適なマーカー遺伝子または選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼまたはその他のマーカーをコードする遺伝子である。選択カセットまたはマーカーカセットを使用することにより、作製した組換えポックスウイルスの同定及び単離が簡略化される。しかしながら、組換えポックスウイルスはまた、ＰＣＲ技術により同定することが可能である。その後、更なる細胞を上で得た組換えポックスウイルスに感染させて、第２の外来遺伝子（単数または複数）または異種遺伝子（単数または複数）を含む第２のベクターを形質移入してもよい。この遺伝子がポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入されるような場合、第２のベクターはまた、第２の外来遺伝子（単数または複数）のポックスウイルスゲノムへの統合を誘導するポックスウイルス相同配列において異なっている。相同組換えが生じた後に、２種以上の外来遺伝子または異種遺伝子を含む組換えウイルスを単離してもよい。追加の外来遺伝子を組換えウイルスに導入するために、上のステップで感染用に単離した組換えウイルスを使用することにより、また形質移入用の更なる外来遺伝子（単数または複数）を含む更なるベクターを使用することにより、感染及び形質移入のステップを繰り返してもよい。
【０１１８】
代替的に、上に記載した感染及び形質移入のステップは入れ替え可能であり、すなわち、外来遺伝子を含むプラスミドを好適な細胞に最初に形質移入してからポックスウイルスに感染させてもよい。更なる代替法として、それぞれの外来遺伝子を異なるウイルスに導入して、得られた組換えウイルスの全てで細胞を共感染させてから、全ての外来遺伝子を含む組換え体でスクリーニングすることも可能である。第３の代替法は、インビトロでのＤＮＡゲノムと外来配列のライゲーション、及びヘルパーウイルスを使用した組換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムの再構成である。第４の代替法は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは別の菌種を用いた、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングしたポックスウイルスゲノムと、ワクシニアウイルスゲノム内における所望の導入部位に隣接する配列に相同なＤＮＡ配列に隣接する直鎖状外来配列の間の相同組換えである。
【０１１９】
本開示の１つ以上の核酸をポックスウイルスの任意の好適な部位に挿入してもよい。好ましい態様では、本発明に使用するポックスウイルスはＭＶＡ及び／または鶏痘ウイルスを含む。ＭＶＡ及び鶏痘ウイルスの好適な部位は、ＭＶＡ及び鶏痘ゲノムの非必須部位である。
【０１２０】
ＭＶＡについて、ＭＶＡゲノムの非必須部位は、ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域または既知の欠失部位１〜６であってもよい。代替的にまたは追加的に、組換えＭＶＡの非必須部位は、ウイルスの増殖に非必須であるＭＶＡゲノムのコード領域であってもよい。しかしながら、少なくとも１つの細胞培養系、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）などの中で増幅及び増殖可能な組換え体を得ることが可能である限り、本発明の核酸（例えば、ＭＵＣ１、ＣＥＡ及びＴＲＩＣＯＭ）及び本明細書に記載の任意の付随するプロモーターがウイルスゲノム内の任意の場所に挿入され得ることが本発明の範囲内であるため、挿入部位はＭＶＡゲノム内におけるこれらの好ましい挿入部位に限定されない。
【０１２１】
本発明の核酸は、ＭＶＡ及び／または鶏痘ウイルスの１つ以上の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入し得ることが好ましい。「遺伝子間領域」という用語は、ＭＶＡ及び／または鶏痘ウイルスの２つの隣接したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間、好ましくは、ＭＶＡ及び／または鶏痘ウイルスゲノムの２つの必須ＯＲＦ間に位置するウイルスゲノムのそれら部位を指すことが好ましい。ＭＶＡについて、ある特定の実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ  ０７／０８、ＩＧＲ  ４４／４５、ＩＧＲ  ６４／６５、ＩＧＲ  ８８／８９、ＩＧＲ  １３６／１３７、及びＩＧＲ  １４８／１４９から選択される。鶏痘ウイルスについて、ＩＧＲはＢａｍＨ１から選択される。
【０１２２】
ＭＶＡウイルスについて、追加的にまたは代替的に、ヌクレオチド配列は、既知の欠失部位、すなわち、ＭＶＡゲノムの欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのうちの１つまたは複数に挿入されてもよい。「既知の欠失部位」という用語は、そこからＭＶＡが誘導される親ウイルスのゲノム、特に、例えば、Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８８：３２４９−３２５９に記載の親漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）のゲノムに対して、２０継代５１６を特徴としたＣＥＦ細胞における連続継代中に欠失したＭＶＡゲノムの部位のことを意味する。
【０１２３】
ワクチン
ある特定の実施形態では、本開示の組換えポックスウイルスは、ワクチンの一部として製剤化することができる。ワクチンを調製するために、ポックスウイルスを生理学的に許容される形態に変換してもよい。ある特定の実施形態では、そのような調製は、天然痘に対するワクチン接種に使用されるポックスウイルスワクチンの調製に関する知見（例えば、Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２（１９７４）に記載されている）に基づいている。
【０１２４】
例示的な調製は以下のとおりである。１０ｍＭ  トリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中、５×１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で配合した精製ウイルスを−８０℃で保管する。ワクチン注射を調製するために、例えば、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で、２％ペプトン及び１％ヒトアルブミンの存在下、１０２〜１０８粒子のウイルスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥させてもよい。代替的に、製剤中のウイルスを段階的に凍結乾燥させることによりワクチン注射を調製してもよい。ある特定の実施形態では、製剤は、追加の添加剤、例えば、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドンなど、または、インビボ投与に好適な酸化防止剤または不活性ガス、安定化剤または組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含むがこれらに限定されないその他の添加剤などを含有する。それから、アンプルを密封して適切な温度、例えば、４℃から室温の間で数ヶ月間保管してもよい。しかしながら、必要性のない限り、−２０℃未満の温度でアンプルを保管することが好ましい。
【０１２５】
ワクチン接種または治療を伴う様々な実施形態では、０．１〜０．５ｍｌの水溶液、好ましくは、生理食塩水またはトリス緩衝液中に凍結乾燥物を溶解させて、全身的にまたは局所的に、すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮膚内、または当業者に周知の任意のその他投与経路のいずれかで投与する。投与方法、投与量及び投与回数の最適化は、当業者の技能及び知識の範囲内である。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、弱毒ワクシニアウイルス株は、免疫不全動物、例えば、ＳＩＶに感染させたサル（血中ＣＤ４＜４００／μｌ）、または免疫不全ヒトにおける免疫応答を誘導するのに有用である。「免疫不全」という用語は、不完全な免疫応答のみを示すまたは病原体に対する防御能の低い個体の免疫系の状態を記述する。
【０１２７】
キット、組成物、及び使用方法
様々な実施形態の１つでは、本発明は、本明細書に記載の核酸を含む組換えポックスウイルスを含むキット及び／または組成物を包含する。組成物は医薬組成物または免疫原性組成物であることが好ましい。
【０１２８】
一実施形態では、それぞれの組換えポックスウイルスが本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸を含む、２種以上の組換えポックスウイルスの混合物を含むキット及び／または組成物が存在する。混合物は、ａ）オルソポックスウイルス、例えば、本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸を含むワクシニア、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体など、及びｂ）アビポックスウイルス、例えば、本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸を含む鶏痘などを含む。オルソポックスウイルスと鶏痘ウイルスの混合物は同種または異種プライムブーストレジメンで投与できることが企図される。
【０１２９】
別の実施形態では、２種以上の組換えポックスウイルスの混合物を含むキット及び／または組成物は、ａ）本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸を含むＭＶＡウイルス、及びｂ）アビポックスウイルス、例えば、本開示のＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸を含む鶏痘などを含む。ＭＶＡウイルスと鶏痘ウイルスの混合物は同種または異種プライムブーストレジメンで投与できることが企図される。
【０１３０】
追加の実施形態では、１つ以上の組換えポックスウイルスのそれぞれは、本開示の共刺激分子のうちの１つ以上を更に含む。好ましい実施形態では、１つ以上の共刺激分子は、本開示のＴＲＩＣＯＭ分子のうちの１つ以上である。
【０１３１】
キット及び／または組成物は、組換えポックスウイルスの投与のための取扱説明書と共に、本開示の組換えポックスウイルスの１つ以上の容器またはバイアル瓶を含み得ることが企図される。
【０１３２】
本明細書で提供するキット及び／または組成物は通常、１つ以上の薬学的に許容される及び／または承認された担体、添加剤、抗生物質、防腐剤、補助物質、希釈剤及び／または安定化剤を含んでいてもよい。そのような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであってもよい。好適な担体は通常、大きく徐々に代謝される分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体などである。
【０１３３】
組成物（例えば、医薬組成物及び／または免疫原性組成物）を調製するために、本明細書で提供する組換えポックスウイルスを生理学的に許容される形態に変換してもよい。このことは、Ｈ．Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９：２３８６−２３９２（１９７４）に記載されている、天然痘に対するワクチン接種に使用するポックスウイルスワクチンの調製における知見に基づいて実施可能である。
【０１３４】
例えば、約１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中、５×１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で配合した精製ウイルスを−８０℃で保管してもよい。ワクチン注射を調製するために、例えば、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で、２％ペプトン及び１％ヒトアルブミンの存在下、１０２〜１０８または１０２〜１０９粒子のウイルスを１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥させてもよい。代替的に、製剤中のウイルスを段階的に凍結乾燥させることによりワクチン注射を作製してもよい。この製剤は、追加の添加剤、例えば、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドンなど、または、インビボ投与に好適なその他の助剤、例えば、酸化防止剤または不活性ガス、安定化剤または組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）などを含有していてもよい。凍結乾燥に適した標準的なウイルス含有製剤は、１０ｍＭのトリス緩衝液、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１８．９ｇ／ｌのデキストラン（分子量３６，０００〜４０，０００）、４５ｇ／ｌのスクロース、０．１０８ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸一カリウム塩一水和物、ｐＨ７．４を含む。それから、ガラスアンプルを密封して４℃から室温の間で数ヶ月間保管してもよい。しかしながら、必要性のない限り、−２０℃以下の温度でアンプルを保管することが好ましい。
【０１３５】
ワクチン接種または治療において、水溶液（例えば、０．１〜０．５ｍｌ）、好ましくは、注射用蒸留水、生理食塩水またはトリス緩衝液中に凍結乾燥物を溶解させて、全身的にまたは局所的に、すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または当業者に周知の任意のその他投与経路のいずれかで投与してもよい。投与方法、投与量及び投与回数については、当業者が周知の方法を用いて最適化してもよい。
【０１３６】
様々なその他の実施形態では、組換えポックスウイルスの連続継代中における組換えポックスウイルス及び／またはその中の導入遺伝子の安定性を生む及び／または向上させることに関係する１つ以上の方法が存在する。更に特定の実施形態では、組換えポックスウイルスは少なくとも３または４継代中に安定である。
【０１３７】
複数の継代中に安定な組換えポックスウイルスを有することは多くの理由から特に重要であり、それらのいくつかの理由としては、組換えウイルスの大規模製造及び薬剤としてのその使用、ならびに多数の継代中におけるワクチン安定性の政府方針が挙げられる。本発明の組換えポックスウイルスについて、少なくとも３または４継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製することは、ＰＡＮＶＡＣ−Ｖ及びＰＡＮＶＡＣ−Ｆが継代１あたりで不安定性及び／または導入遺伝子生存能の低下を示し始めた（例えば、表１及び表２、ならびに図１Ａ及び図１Ｂを参照のこと）ことから重要である。
【０１３８】
一実施形態では、組換えポックスウイルスの連続継代中に安定なＭＵＣ１導入遺伝子を有するポックスウイルスを作製するための方法が存在し、その方法は、ａ）本開示の核酸または発現カセットのいずれか１つを提供すること、及びｂ）核酸または発現カセットを組換えポックスウイルス内に挿入すること、を含み、組換えポックスウイルスは連続継代中に安定である。
【０１３９】
本開示による例示的な方法
１．別の実施形態では、組換えポックスウイルスの連続継代中に安定な前記組換えポックスウイルスを作製するための方法が存在し、前記方法は、
ａ）少なくとも２つの可変Ｎ末端反復（ＶＮＴＲ）ドメインを有するＭＵＣ１ペプチドをコードする第１の核酸を提供することを含み、ａ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインの配置はシャッフルされ、ｂ）前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメインはコドン最適化され、前記組換えポックスウイルスは前記組換えポックスウイルスの連続継代中に安定である、前記方法。
【０１４０】
２．別の実施形態では、組換えポックスウイルスの連続継代中に安定な安定性組換えポックスウイルスを作製するための方法が存在し、前記方法は、ＭＵＣ１タンパク質をコードする第１の核酸を提供することであって、前記ＭＵＣ１タンパク質は少なくとも２つのＶＮＴＲドメインを含む、前記提供することと、前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン反復の順番をシャッフルまたは再編成することと、前記少なくとも２つのＶＮＴＲドメイン反復のコドンを最適化することと、前記第１の核酸配列を前記ポックスウイルス内に挿入して、組換えポックスウイルスの連続継代中に安定な前記組換えポックスウイルスを作製することと、を含む。
【０１４１】
３．前記第１の核酸は、配列番号２に対して少なくとも９５％相同である、配列番号４に対して少なくとも９５％相同である、配列番号３に対して少なくとも９５％相同である、または、配列番号５に対して少なくとも９５％相同である、１及び２のいずれか１項に記載の方法。
【０１４２】
４．前記核酸は配列番号２に対して少なくとも９５％相同である、１から３のいずれか１項に記載の方法。
【０１４３】
５．前記核酸は配列番号３に対して少なくとも９５％相同である、１から４のいずれか１項に記載の方法。
【０１４４】
６．前記核酸は配列番号２を含む、１から５のいずれか１項に記載の方法。
【０１４５】
７．前記核酸は配列番号５を含む、１から６のいずれか１項に記載の方法。
【０１４６】
８．１から７のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、ＣＥＡペプチドをコードする第２の核酸の反復ヌクレオチド領域内における少なくとも１つのヌクレオチドを置換することであって、前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと定義される、前記置換することと、前記第２の核酸を前記組換えポックスウイルス内に挿入することと、を更に含む、前記方法。
【０１４７】
９．前記第２の核酸の前記反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される、８に記載の方法。
【０１４８】
１０．前記第２の核酸の前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される、８及び９のいずれか１項に記載の方法。
【０１４９】
１１．１から１０の方法の一態様では、前記ＣＥＡヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される。
【０１５０】
１２．１から１１の方法の一態様では、前記ＣＥＡ反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される。
【０１５１】
１３．１から１２の方法の一態様では、前記置換は、前記ＣＥＡ核酸の少なくとも２、３、４、５または１０の反復ヌクレオチド領域にある。
【０１５２】
１４．１から１３に記載の方法の一態様では、前記ＣＥＡ核酸は配列番号１４を含む。
【０１５３】
１５．１から１４の方法の一態様では、前記方法は、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１及び／またはＬＦＡ−３、ＣＥＡから選択される共刺激分子をコードする核酸の反復ヌクレオチド領域内における少なくとも１つのヌクレオチドを置換することであって、前記反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）３以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと定義される、前記置換することと、共刺激分子をコードする前記核酸を前記組換えポックスウイルス内に挿入することと、を更に含む。
【０１５４】
１６．１から１５の方法の一態様では、前記共刺激分子反復領域は、（ｉ）３以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）３以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）３以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される。
【０１５５】
１７．１から１６の方法の一態様では、前記共刺激分子反復ヌクレオチド領域は、（ｉ）４以上の連続反復したヌクレオチド、（ｉｉ）４の以上連続したＧまたはＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴまたはＣヌクレオチドと更に定義される。
【０１５６】
１８．１から１７の方法の一態様では、前記共刺激分子反復領域は、（ｉ）４以上の連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）４以上の連続したＣヌクレオチド及び／または（ｉｉｉ）４以上の連続したＴヌクレオチドと更に定義される。
【０１５７】
１９．１から１８に記載の方法の一態様では、前記置換は、前記共刺激分子核酸の少なくとも２、３、４、５または１０の反復ヌクレオチド領域にある。
【０１５８】
２０．１から１９の方法の一態様では、前記共刺激分子をコードする前記核酸はＢ７−１（配列番号１５〜１７）、ＩＣＡＭ−１（配列番号１８〜２０）及びＬＦＡ−３（配列番号２１〜２３）から選択される。
【０１５９】
２１．１から２０の方法の一態様では、前記共刺激分子をコードする前記核酸は、Ｂ７−１（配列番号１５）、ＩＣＡＭ−１（配列番号１８）及びＬＦＡ−３（配列番号２１）のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である。
【０１６０】
２２．１から２１の方法の一態様では、前記共刺激分子をコードする前記核酸は、Ｂ７−１（配列番号１７）、ＩＣＡＭ−１（配列番号２０）及びＬＦＡ−３（配列番号２３）のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同である。
【０１６１】
２３．１から２２の方法の一態様では、前記共刺激分子をコードする前記核酸は、Ｂ７−１（配列番号１７）、ＩＣＡＭ−１（配列番号２０）及びＬＦＡ−３（配列番号２３）のうちの少なくとも１つを含む。
【０１６２】
２４．１から２３の方法の一態様では、前記共刺激分子をコードする前記核酸は、Ｂ７−１（配列番号１５）、ＩＣＡＭ−１（配列番号１８）及びＬＦＡ−３（配列番号２１）を含む。
【０１６３】
２５．１から２４に記載の方法の一態様では、前記ＭＵＣ１をコードする前記第１の核酸は配列番号３１、３２、３３及び３４から選択される。
【０１６４】
２６．本開示により提供されるように、１から２６に記載の方法の組換えポックスウイルスは、オルソポックスウイルスまたはアビポックスウイルスから選択することができる。好ましい実施形態では、オルソポックスウイルスはワクシニアウイルス、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ及びＭＶＡ−ＢＮの誘導体から選択される。より好ましい実施形態では、オルソポックスウイルスは、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体のいずれかである。なおも別のより好ましい実施形態では、アビポックスウイルスは鶏痘ウイルスである。
【０１６５】
他の実施形態では、ポックスウイルスの連続継代中に安定な組換えポックスウイルスを作製するための方法における、本開示のａ）核酸、ｂ）発現カセット、ｃ）組成物、ｄ）宿主細胞またはｅ）ベクターの使用が存在する。
【０１６６】
なおもその他の実施形態では、薬剤、好ましくはワクチンの調製における、本開示のａ）組換えポックスウイルス、ｂ）核酸、ｃ）発現カセット、ｄ）組成物、ｄ）宿主細胞またはｅ）ベクターの使用が存在する。
【０１６７】
なおも更なる実施形態では、薬剤、好ましくはワクチンとして使用するための、本開示の組換えポックスウイルス、ｂ）核酸、ｂ）発現カセット、ｃ）組成物、ｄ）宿主細胞またはｅ）ベクターが存在する。
【０１６８】
更に追加の実施形態では、コード配列を標的細胞に導入するための方法に使用するための、本開示の組換えポックスウイルス、ｂ）核酸、ｂ）発現カセット、ｃ）組成物、ｄ）宿主細胞またはｅ）ベクターが存在する。
【実施例】
【０１６９】
以下の実施例は本発明を説明するものではあるが、当然、決してクレームの範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１７０】
実施例１：組換えポックスウイルスの構築
ＣＥＦ培養物の同時の感染及び形質移入により、指定のＭＵＣ１核酸配列及びＣＥＡ核酸配列をそれらのプロモーターと共に挿入してから、ウイルスゲノムと組換えプラスミドｐＢＮ１４６の間で相同組換えさせることにより、ＭＵＣ１（例えば、ｍＢＮ３９９、ｍＢＮ４００、ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ３７３及びｍＢＮ４２０）をコードするポックスウイルスの作製を実施した。挿入を有するウイルスを単離して特徴づけしてから、ウイルスストックを作製した。
【０１７１】
ｍＢＮ３９８及びｍＢＮ４００を構築するために、ワクシニアウイルスのＩＧＲ８８／８９にも存在する相同配列を含有するＭＶＡ組換えプラスミドを使用した。ＭＵＣ１ヌクレオチド配列及びＣＥＡヌクレオチド配列をワクシニアウイルス配列のＩＧＲ  ８８／８９間に挿入して、ワクシニアウイルスゲノム内への組換えを可能とした。それゆえ、ポックスウイルスプロモーターの下流にＭＵＣ１ヌクレオチド配列及びＣＥＡヌクレオチド配列を含有するプラスミドを構築した。ｍＢＮ３９８及びｍＢＮ４００用に配列番号１（ＭＵＣ１）及び配列番号１３（ＣＥＡ）を使用した。ｍＢＮ３９８内におけるＭＵＣ１及びＣＥＡ用のプロモーターはそれぞれ、ＰｒＳプロモーター（ＭＵＣ１）及び４０ｋ−ＭＶＡ１プロモーター（ＣＥＡ）であった。ｍＢＮ４００内におけるＭＵＣ１及びＣＥＡ用のプロモーターはそれぞれ、Ｐｒ１３．５長プロモーター（ＭＵＣ１）及びＰｒＳ５Ｅプロモーター（ＣＥＡ）であった。ＴＲＩＣＯＭの共刺激分子をｍＢＮ３９８及びｍＢＮ４００の一部として組み込んだ。これらの配列はＢ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３を含み、それぞれ、配列番号１６、１９及び２１を含んでいた。
【０１７２】
ｍＢＮ３３６を構築するために、ＭＶＡ（ＩＧＲ８８／８９（ＭＵＣ１）、ＩＧＲ４４／４５（ＣＥＡ）、ＩＧＲ１４８／１４９（ＴＲＩＣＯＭ）にも存在する挿入配列である３種類の導入遺伝子ｐＢＮ３７４（ＴＲＩＣＯＭ）、ｐＢＮ５１５（ＣＥＡ、配列番号１３）、ｐＢＮ５２５（ＭＵＣ１、配列番号２）用に、３種類の組換えプラスミドを使用した。ＭＵＣ１ヌクレオチド配列及びＣＥＡヌクレオチド配列をＭＶＡウイルス配列間に挿入して、ＭＶＡウイルスゲノム内への組換えを可能とした。それゆえ、ポックスウイルスプロモーターの下流にＭＵＣ１ヌクレオチド配列及びＣＥＡヌクレオチド配列を含有するプラスミドを構築した。ｍＢＮ３３６用に配列番号２（ＭＵＣ１）及び配列番号１３（ＣＥＡ）を使用した。プロモーターはＰｒＳプロモーター（ＭＵＣ１）及び４０ｋプロモーター（ＣＥＡ）であった。ＴＲＩＣＯＭの共刺激分子をｍＢＮ３３６の一部として組み込んだ。これらの配列はＢ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３を含み、それぞれ、配列番号１７、２０及び２３を含んでいた。ｐＢＮ６３２は、ＭＶＡ（ＩＧＲ  ８８／８９内）にも存在する配列を含有している。ＭＵＣ１ヌクレオチド配列及びＣＥＡヌクレオチド配列をＭＶＡウイルス配列間に挿入して、ＭＶＡウイルスゲノム内への組換えを可能とした。それゆえ、ポックスウイルスプロモーターの下流にＭＵＣ１ヌクレオチド配列及びＣＥＡヌクレオチド配列を含有するプラスミドを構築した。ｍＢＮ４２０用に配列番号５（ＭＵＣ１）及び配列番号１４（ＣＥＡ）を使用した。ＭＵＣ１及びＣＥＡ用のプロモーターはそれぞれ、Ｐｒ１３．５プロモーター（米国特許公開２０１５／０２９９２６７を参照のこと）（ＭＵＣ１）及び４０ｋ  ＭＶＡ１プロモーター（ＣＥＡ）であった。ＴＲＩＣＯＭの共刺激分子をｍＢＮ４２０の一部として組み込み、ＩＧＲ  ８８／８９内に導入した。これらの配列はＢ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３を含み、それぞれ、配列番号１５、１８及び２１を含んでいた。
【０１７３】
ｍＢＮ３７３を構築するための組換えプラスミドｐＢＮ５６３は、鶏痘ウイルスにも存在する配列を含有している。ＭＵＣ１ヌクレオチド配列及びＣＥＡヌクレオチド配列を鶏痘ウイルス配列のＢａｍＨ１領域間に挿入して、鶏痘ウイルスゲノム内への組換えを可能とした。それゆえ、ポックスウイルスプロモーターの下流にＭＵＣ１ヌクレオチド配列及びＣＥＡヌクレオチド配列を含有するプラスミドを構築した。ｍＢＮ３７３用に配列番号３（ＭＵＣ１）及び配列番号１４（ＣＥＡ）を使用した。ＭＵＣ１及びＣＥＡ用のプロモーターはそれぞれ、４０Ｋ  ＦＰＶ−１  ＰｒＳプロモーター（ＭＵＣ１）及び４０ｋ−ＭＶＡ１プロモーター（ＣＥＡ）であった。ＴＲＩＣＯＭの共刺激分子をｍＢＮ３７３の一部として組み込んだ。これらの配列はＢ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３を含み、それぞれ、配列番号１５、１８及び２１を含んでいた。
【０１７４】
上記の組換えプラスミドはまた、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｐｓ）、薬剤耐性遺伝子ＧＰＴ、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）、ならびに、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、及び、単量体赤色蛍光タンパク質と結合した薬剤耐性遺伝子グアニン−キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）を含む選択カセットを含有していた。全ての選択遺伝子（ＧＦＰ、ＮＰＴＩＩ及びｍＲＦＰ１）は単一のバイシストロン性転写産物がコードしていた。
【０１７５】
ｍＢＮ３９９／４００用のワクシニアウイルスで、ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ４２０用のＭＶＡ−ＢＮで、または、ｍＢＮ３７３用のＦＰＶで、ＣＥＦ培養物を接種し、更にプラスミドＤＮＡをそれぞれのＣＥＦ培養物に形質移入した。次いで、これら細胞培養物に由来する試料を、選択薬剤を含有する培地内のＣＥＦ培養物に接種し、プラーク精製によりＥＧＦＰ発現ウイルスクローンを単離した。選択薬剤及び発現ＥＧＦＰの存在下で増殖させたウイルスストックを、以下、ｍＢＮ３９９、ｍＢＮ４００（ワクシニアウイルス）、ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ４２０（ＭＶＡウイルス）及びｍＢＮ３７３（鶏痘）のうちの１つと称した。組換えウイルスの作製及びウイルスストックの作製には、１（１）〜５（５）回のプラーク精製を含む５〜１２回の連続継代を要した。
【０１７６】
選択薬剤の不在下、ＣＥＦ細胞培養物を用いて組換えポックスウイルスを継代した。選択薬剤が存在しないことにより、挿入配列に由来する選択遺伝子、ｇｐｔ及びＥＧＦＰ、ならびに関連プロモーター（選択カセット）をコードする領域が失われた。選択カセットの喪失をもたらす組換えは、Ｆ１  Ｉ４Ｌ領域及びこの領域のサブセクションであるＦ１反復（Ｆ１  ｒｐｔ）（それぞれの構築物のプラスミド内における選択カセットに隣接している）が関与している。本明細書に記載の構築物における説明した遺伝子間領域内に挿入されたＭＵＣ１配列及びＣＥＡ配列だけを残しつつ、選択カセットの喪失をもたらす組換えに関与するようにこれらの複製配列を組み込んだ。
【０１７７】
選択カセットを欠くプラーク精製ウイルスを作製した。そのような作製には、５（５）回のプラーク精製を含む１５（１５）回の継代を要した。
【０１７８】
ｍＢＮ３３６、ｍＢＮ４２０及びｍＢＮ３７３ストック内におけるＭＵＣ１配列及びＣＥＡ配列の存在ならびに親ＭＶＡ−ＢＮウイルスの不存在をＰＣＲ解析で確認し、ネステッドＰＣＲを使用して選択カセット（ｇｐｔ及びＥＧＦＰ遺伝子／ＮＰＴＩＩ及びｍＲＦＰ１）の不存在を確認した。
【０１７９】
インビトロでＭＶＡ−ＢＮ−ＭＵＣ１−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭを播種した細胞内におけるＭＵＣ１タンパク質及びＣＥＡタンパク質の発現が示された。
【０１８０】
実施例２：ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６継代１〜７のＰＣＲ解析
７継代の培養によりＭＶＡ−ｍＢＮ３３６Ｂの遺伝的安定性を評価した。ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６Ｂ（ヒトムチン１（ＭＵＣ−１）及びヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をこのワクチン候補の標的抗原とする）は、５種類のヒト導入遺伝子、ならびに、強力で直接的な免疫応答を誘導するための補助としてのヒト免疫共刺激分子（ＴＲＩａｄ  ｏｆ  ＣＯｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（三つ組み共刺激分子）またはＴＲＩＣＯＭと呼ばれる）をコードする３種類の遺伝子、白血球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）及びＢ７−１、をコードする。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の３つの遺伝子間領域（ＩＧＲ）、ＣＥＡ遺伝子を含有するＩＧＲ  ４４／４５、ｈＭＵＣ１遺伝子を含有するＩＧＲ  ８８／８９及びＴＲＩＣＯＭ遺伝子を含有するＩＧＲ  １４８／１４９に、導入遺伝子を挿入した。ポックスウイルスプロモーター、４０ｋ−ＭＶＡ１、３０ｋ、Ｉ３Ｌ及びＰｒＳで導入遺伝子発現を駆動した。
【０１８１】
初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を調製して、ＶＰ−ＳＦＭ培地を入れたローラーボトル（ＲＢ）内に播種（７×１０７個の細胞）してから、４日間３７℃で培養した。ＶＰ−ＳＦＭ培地を１００ｍｌのＲＰＭＩ培地に交換し、約．３〜００．１のＭＯＩ（１×１０８個の細胞／ＲＢの細胞数を指す）で細胞を感染させてから、３日間３０℃で培養した。培養後、−２０℃で少なくとも１６時間ＲＢを凍結させることによりウイルス試料を回収してから、ＲＢを解凍して細胞ウイルス懸濁液を回収した。細胞懸濁液の正確な体積を測定し、ウイルス試料を超音波処理し、それに続きアリコートしてから８０℃で保管した。この手順を６回繰り返して７継代とした。
【０１８２】
３０℃の培養後、それぞれの継代に対して挿入導入遺伝子のＰＣＲ解析を実施した。図９Ａは、７継代にわたるＣＥＡの安定性に関するＰＣＲ結果を示している。図９Ｂは、７継代にわたるＭＵＣ１の安定性に関するＰＣＲ結果を示している。図９Ｃは、７継代にわたるＴＲＩＣＯＭの安定性に関するＰＣＲ結果を示している。ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６Ｂの作製に使用した組換えプラスミドを陽性対照として使用し、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を陰性対照（空のベクター骨格）として使用し、またＨ２ＯをＰＣＲ反応の対照として使用した。
【０１８３】
図１０Ａ及び図１０Ｂは継代７試料の解析を示している。図１０Ａはシークエンシングによる解析のために送付した継代７試料のＰＣＲ増幅である。それぞれ個々の導入遺伝子、ＣＥＡ、ＭＵＣ１及びＴＲＩＣＯＭに対して、個々のＰＣＲ増幅を実施した。Ｂはフレームシフトをもたらす検出された点変異を含有する遺伝子座を示すＭＵＣ１ヌクレオチド配列の電気泳動図である。フレームシフトをもたらす検出された点変異を含有する遺伝子座を示すＭＵＣ１ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅及び電気泳動図で、継代５に初めて点変異が検出された。継代５に初めて検出された点変異は、継代５、６及び７に生じる変異を解析する電気泳動図である。
【０１８４】
図９及び図１０に示すように、ｍＢＮ３３６内におけるＭＵＣ１、ＣＥＡ及びＴＲＩＣＯＭ混合物は、ＰＡＮＶＡＣ−Ｖ及びＰＡＮＶＡＣ−Ｆ内におけるＭＵＣ１導入遺伝子、ＣＥＡ導入遺伝子及びＴＲＩＣＯＭ導入遺伝子と比較して向上及び上昇した安定性を示した（例えば、図１ならびに表１及び表２を図３及び図４と比較のこと）。継代５に開始して、解析原料の小さな集団内にフレームシフト変異が検出された。
【０１８５】
継代４中に示された安定性は、ＰＡＮＶＡＣに関連する安定性問題を克服するＭＶＡ−ｍＢＮ３３６の機能、及び、ＭＵＣ１を含む安定ポックスウイルスを作製するためのその他の試みを示している。ＭＶＡベースワクチンの製造及びより大規模な製造が通常、継代３または継代４のＭＶＡから得られるために、ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６の安定性は更なる利点である。このように、ＭＶＡ−ｍＢＮ３３６が継代４中に安定であることから、大規模製造を開始することが可能となり、安定性に関する大きな規制困難を克服することが可能となる。
【０１８６】
実施例３：ＦＰＶ−ｍＢＮ３７３の向上した安定性
ＦＰＶ−ｍＢＮ３７３Ｂの遺伝的安定性を７継代にわたり評価した。治験薬の作製に使用する大規模製造中に利用したローラーボトル（ＲＢ）内で培養を行った。それぞれの継代について、ウイルス力価をフローサイトメトリーアッセイで、また導入遺伝子インサートの正確なサイズをＰＣＲで解析した。加えて、導入遺伝子のシークエンシングにより最終継代（Ｐ７）を解析した。
【０１８７】
初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を調製して、ＶＰ−ＳＦＭ培地を入れたＲＢ内に播種（７×１０７個の細胞／ＲＢ）してから、３日間３７℃で培養した。ＶＰ−ＳＦＭ培地を１００ｍｌのＲＰＭＩ培地に交換し、０．１のＭＯＩ（１×１０８個／ＲＢの細胞数を意味する）で細胞を感染させてから、４日間３７℃で培養した。培養後、−２０℃で少なくとも１６時間ＲＢを凍結させることによりウイルス試料を回収してから、ＲＢを解凍して細胞ウイルス懸濁液を回収した。細胞懸濁液の正確な体積を測定し、ウイルス試料を超音波処理し、それに続きアリコートしてから８０℃で保管した。ウイルス力価をモニターして所定のＭＯＩでの次の継代の感染を可能とするために、それぞれの継代後の感染性ウイルス力価を測定した。この手順を６回繰り返して７継代とした。
【０１８８】
図１１Ａに示すように、３７℃の培養後、それぞれの継代に対して挿入導入遺伝子のＰＣＲ解析を実施した。ＦＰＶ−ｍＢＮ３７３Ｂの作製に使用した組換えプラスミドを陽性対照として使用し、ＦＰＶを陰性対照（空のベクター骨格）として使用し、またＨ２ＯをＰＣＲ反応の対照として使用した。
【０１８９】
図１１Ｂに示すように、導入遺伝子及びそれぞれの隣接領域の少なくとも６００ｂｐを含有するＢａｍＨＩ  Ｊ部位を増幅させた後に、７回目の継代のシークエンシングを実施した。継代７（３７℃）において解析したＦＰＶ−ｍＢＮ３７３ＢのＰＣＲアンプリコンにおいて、挿入導入遺伝子及びそれぞれの隣接領域の少なくとも６００ｂｐをカバーする５５６６ｂｐ（ＰＣＲ１）及び５２６４ｂｐ（ＰＣＲ２）の想定バンドサイズが得られた。この結果は理論配列と比較したアセンブル配列の１００％同一性を示し、３７℃の７継代におけるＦＰＶ−ｍＢＮ３７３Ｂの遺伝的安定性が確認された。
【０１９０】
少なくとも１つの態様では、ｍＢＮ３７３内におけるＭＵＣ１導入遺伝子（配列番号３）の得られた安定性は、配列番号３を含むｍＢＮ３７３とｍＢＮ３３６の両方において驚くべきものであった。そのため、配列番号３のＭＵＣ１がｍＢＮ３３６（ＭＶＡウイルス）の継代５に不安定性を示し始めるが、同一の配列番号３はｍＢＮ３７３（鶏痘ウイルス）の少なくとも継代７まで安定である。
【０１９１】
実施例４：ＭＶＡ−ｍＢＮ４２０の安定性
ＭＶＡ−ｍＢＮ４２０の遺伝的安定性を７継代にわたり評価した。治験薬の作製に使用する大規模製造中に利用したローラーボトル（ＲＢ）内で培養を行った。約０．０５〜０．１のＭＯＩ及び４日間のウイルス培養期間を使用して３０℃及び３４℃で試験を実施した（これらの条件は、治験薬の作製に使用する通常の大規模製造における代表的なものである）。それぞれの継代について、ウイルス力価をフローサイトメトリーアッセイで、また導入遺伝子インサートの正確なサイズをＰＣＲで解析した。
【０１９２】
初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を調製して、ＶＰ−ＳＦＭ培地を入れたＲＢ内に播種（７×１０７個の細胞／ＲＢ）してから、３日間３７℃で培養した。ＶＰ−ＳＦＭ培地を１００ｍｌのＲＰＭＩ培地に交換し、０．０５〜０．１のＭＯＩ（１×１０８個／ＲＢの細胞数を指す）で細胞を感染させてから、４日間３０℃及び３４℃で培養した。培養後、−２０℃で少なくとも１６時間ＲＢを凍結させることによりウイルス試料を回収してから、ＲＢを解凍して細胞ウイルス懸濁液を回収した。ウイルス試料を超音波処理し、それに続きアリコートしてから８０℃で保管した。ウイルス力価をモニターして所定のＭＯＩでの次の継代の感染を可能とするために、それぞれの継代後の感染性ウイルス力価を測定した。この手順を６回繰り返して７継代とした。
【０１９３】
３０℃及び４の培養後、それぞれの継代に対して挿入導入遺伝子のＰＣＲ解析を実施した。３０℃で行った継代の結果を図１２に示す。ｍＢＮ４２０の作製に使用した組換えプラスミドを陽性対照として使用し、ＭＶＡ−ＢＮを陰性対照（空のベクター骨格）として使用し、またＨ２ＯをＰＣＲ反応の対照として使用した。
【０１９４】
図１２に示すように、ｍＢＮ４２０内におけるＭＶＡの安定性は、ｍＢＮ３３６内におけるＭＶＡ及びｍＢＮ３７３内における鶏痘ウイルスと比較して低下した。
【０１９５】
実施例５：ＭＵＣ１及びＣＥＡをコードする追加の組換えＭＶＡウイルス及び組換え鶏痘ウイルスの向上した安定性
本発明の追加の組換えＭＶＡウイルス及び組換え鶏痘ウイルスの作製は、実施例１に記載のように行う。配列番号３１、３２、３３または３４（ＭＵＣ１）及び配列番号１３または１４（ＣＥＡ）を含むＭＵＣ１導入遺伝子、ＣＥＡ導入遺伝子及びＴＲＩＣＯＭ導入遺伝子をコードする核酸を、実施例１に記載のようにＭＶＡ−ＢＮに挿入する。加えて、実施例１に記載のように、ＴＲＩＣＯＭをＭＶＡに挿入し、配列番号１５または１７（Ｂ７．１）、配列番号１８または２０（ＩＣＡＭ−１）及び配列番号２１または２３（ＬＦＡ−３）を含むＴＲＩＣＯＭ配列をＭＶＡに挿入する。
【０１９６】
加えて、配列番号３１、３２、３３または３４（ＭＵＣ１）及び配列番号１３または１４（ＣＥＡ）を含むＭＵＣ１導入遺伝子及びＣＥＡ導入遺伝子をコードする核酸を、実施例１に記載のようにＭＶＡ−ＢＮに挿入する。加えて、実施例１に記載のように、ＴＲＩＣＯＭを鶏痘ウイルスに挿入し、配列番号１５または１７（Ｂ７．１）、配列番号１８または２０（ＩＣＡＭ−１）及び配列番号２１または２３（ＬＦＡ−３）を含むＴＲＩＣＯＭ配列を鶏痘に挿入する。
【０１９７】
配列番号３１、３２、３３または３４はそれぞれ、配列番号３５を含むＭＵＣ１ペプチドをコードする。
【０１９８】
配列番号３１、３２、３３及び３４の新規ＭＵＣ１核酸はそれぞれ、ＷＯ２０１３／１０３６５８に記載のアゴニストエピトープを含まない本発明の核酸の変異体をコードする。いくつかの態様では、アゴニストエピトープの置換及び／または除去は、アゴニストエピトープの存在が安定性または不安定性ではなくＭＵＣ１の免疫原性を高めるように機能することから、本発明の組換えポックスウイルスの安定性に影響を及ぼさない。
【０１９９】
実施例１に記載のように、インビトロでＭＶＡ−ＢＮ−ＭＵＣ１−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭを播種した細胞内におけるＭＵＣ１タンパク質、ＣＥＡタンパク質及びＴＲＩＣＯＭタンパク質の発現が示される。
【０２００】
ＭＶＡウイルス及び／または鶏痘ウイルス内における導入遺伝子の向上した遺伝的安定性を７継代にわたり評価する。治験薬の作製に使用する大規模製造中に利用したローラーボトル（ＲＢ）内で培養を行う。約００．０５〜００．１のＭＯＩ及び２、３、４、５、６または７日間のウイルス培養期間を使用して３０℃、３４℃または３７℃（使用するベクター系による）で試験を実施する（これらの条件は、治験薬の作製に使用する通常の大規模製造における代表的なものである）。それぞれの継代について、ウイルス力価をフローサイトメトリーアッセイで、また導入遺伝子インサートの正確なサイズをＰＣＲで解析する。加えて、導入遺伝子のシークエンシングにより最終継代（Ｐ７）を解析する。
【０２０１】
初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を調製して、ＶＰ−ＳＦＭ培地を入れたＲＢ内に播種（７×１０７個の細胞／ＲＢ）してから、３日間３７℃で培養する。ＶＰ−ＳＦＭ培地を１００ｍｌのＲＰＭＩ培地に交換し、０．００５〜０．１のＭＯＩで細胞を感染させてから、４日間３０℃、３４℃または３７℃で（使用するベクター系による）培養する。培養後、−２０℃で少なくとも１６時間ＲＢを凍結させることによりウイルス試料を回収してから、ＲＢを解凍して細胞ウイルス懸濁液を回収する。ウイルス試料を超音波処理し、それに続きアリコートしてから８０℃で保管する。ウイルス力価をモニターして所定のＭＯＩでの次の継代の感染を可能とするために、それぞれの継代後の感染性ウイルス力価を測定する。この手順を６回繰り返して７継代とする。
【０２０２】
３０℃、３４℃または３７℃（ベクター系による）の培養後、それぞれの継代に対して挿入導入遺伝子のＰＣＲ解析を実施する。それぞれの対応するポックスウイルス（例えば、ＭＶＡ−ＢＮウイルスまたは鶏痘ウイルス）の作製に使用した組換えプラスミドを陽性対照として使用し、ＭＶＡ−ＢＮウイルスまたは鶏痘ウイルスを陰性対照（空のベクター骨格）として使用し、またＨ２ＯをＰＣＲ反応の対照として使用する。
【０２０３】
導入遺伝子及びそれぞれの隣接領域の少なくとも６００ｂｐを含有するＩＧＲ部位を増幅させた後に、７回目の継代のシークエンシングを実施する。それぞれの構築物のＰＣＲアンプリコンを継代７で解析する。ＭＶＡウイルス及び／または鶏痘ウイルスが導入遺伝子間で安定であることを確認するために、ＭＵＣ１核酸、ＣＥＡ核酸及び／またはＴＲＩＣＯＭ核酸のシークエンシング結果を実施する。
【０２０４】
本明細書に記載の方法または組成物の正確な詳細が本発明に記載の趣旨を逸脱することなく変化または変更可能であることは明らかであろう。本発明者らは、以下のクレームの範囲及び趣旨に含まれる全てのそのような変更及び変化を請求する。
【図１】
2019528755.tif 000010
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−１】
2019528755.tif 000016
【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図５−１】
2019528755.tif 000022
【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７−１】
2019528755.tif 000027
【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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