【手続補正書】
【提出日】平成19年8月30日(2007.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出する方法であって、適当な順序において行う以下のステップ：
(ａ)サンプル中に存在する核酸フラグメントを増幅すること、
(ｂ)電気泳動ゲル中の特定位置に、部分的に融解した核酸フラグメントを固定する目的のため、ステップ(ａ)で形成した二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的融解を生ずる勾配の存在下、ゲル電気泳動の手段により核酸フラグメントを分離すること、および
(ｃ)分離核酸フラグメントを検出すること、
を含み、当該増幅ステップ(ａ)は電気泳動ゲル中または電気泳動ゲル上において行うことを特徴とする、当該方法。
【請求項２】  当該方法が更に、
(ｄ)ステップ(ｂ)の前に、当該サンプル中に存在する二本鎖核酸フラグメントを一本鎖核酸フラグメントへ完全に融解すること、およびこれらの一本鎖核酸フラグメントから二本鎖フラグメントを再形成することを含み、ここで、ホモ二量体二本鎖核酸フラグメントに加えてヘテロ二量体二本鎖核酸フラグメントを形成すること特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】  ゲル電気泳動が、キャピラリーゲル電気泳動であることを特徴とする、請求項１または２の方法。
【請求項４】  当該方法が更に：
(ｅ)少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントを再び二本鎖とするように、ステップ(ｂ)後に電気泳動条件を変え、それにより、分離核酸フラグメントが、実際には等速で電気泳動ゲル中の特定位置から移動すること、
を含むことを特徴とする、請求項１、２または３の方法。
【請求項５】  分離核酸フラグメントを、キャピラリーから排出される時に検出することを特徴とする、請求項３または４の何れかの方法。
【請求項６】  当該方法が、分離核酸フラグメントを電気泳動ゲルから単離することを更に含むことを特徴とする、請求項１−５の何れかの方法。
【請求項７】  二本鎖核酸フラグメントに少なくとも部分的な融解を生ずる電気泳動ゲル中の勾配が温度勾配であることを特徴とする、請求項１−６の何れかの方法。
【請求項８】  二本鎖核酸フラグメントに少なくとも部分的な融解を生ずる勾配が化学勾配であることを特徴とする、請求項１−６の何れかの方法。
【請求項９】  化学勾配が尿素およびホルムアミドにより形成されることを特徴とする、請求項８の方法。
【請求項１０】  当該勾配が、温度勾配および化学勾配の組合せからなることを特徴とする、請求項７、８または９の方法。
【請求項１１】  少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントが再び二本鎖核酸フラグメントを形成するように電気泳動条件を変えることに、電気泳動ゲルの温度を下げることが含まれることを特徴とする、請求項２−１０の何れかの方法。
【請求項１２】  当該サンプルが、個体由来の遺伝学的材料を含み、ここで、遺伝学的材料は、血液、精液、唾液および／または組織細胞などの核酸型で存在することを特徴とする、請求項１−１１の何れかの方法。
【請求項１３】  サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための装置であって、
電気泳動ゲルを配置した多数のキャピラリーであり、当該キャピラリー中の電気泳動ゲルの上側部および下側部は両方とも、電極を配置した液体バスと接触している当該キャピラリー、
電気泳動ゲル全体に電圧をかけるための電圧源、
電気泳動の間に電気泳動条件を変えるための手段および分離ＤＮＡフラグメントを検出するための手段、
を含み、
当該キャピラリー中のゲルの上側部が、実質的に全キャピラリー用の１つの集合液体バスに接触し、ここで電極は集合液体バス中に配置されており、そして当該キャピラリー中の各電気泳動ゲルの下側部が、別の液体バスと接触し、ここで電極はそれぞれ別の液体バス中に配置されていることを特徴とする、
当該装置。
【請求項１４】  当該キャピラリー中の電気泳動条件を変えるための手段が、当該キャピラリー中の温度を変えるための手段であることを特徴とする、請求項１３の装置。
【請求項１５】  温度を変えるための手段がペルティエ素子を含むことを特徴とする、請求項１４の装置。
【請求項１６】  温度を測定するための手段を、少なくとも１つのキャピラリー中で配置することを特徴とする、請求項１３−１５の何れかの装置。
【請求項１７】  温度を測定するための手段が、少なくとも１つのキャピラリー中で配置した白金抵抗ワイヤを含むことを特徴とする、請求項１６の装置。
【請求項１８】  当該キャピラリーが、サンプル中に存在する当該核酸フラグメントを電気泳動ゲル中で増幅するためのプライマーおよびｄＮＴＰで被覆されていることを特徴とする、請求項１３−１７の何れかの装置。
【請求項１９】  当該キャピラリーが更に、サンプル中に存在する当該核酸フラグメントを電気泳動ゲル中で増幅するためのポリメラーゼで被覆されていることを特徴とする、請求項１３−１８の装置。
【請求項２０】  当該キャピラリーがプライマーおよびｄＮＴＰで被覆されていることを特徴とする、請求項１−１２の何れかの方法および／または請求項１３−１９の何れかの装置において使用するためのキャピラリー。
【請求項２１】  当該キャピラリーがポリメラーゼで更に被覆されていることを特徴とする、請求項２０のキャピラリー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための方法および装置に関連し、ここで、当該方法は、適当な順序において行う以下のステップ：
(ａ)サンプル中に存在する核酸フラグメントを増幅すること、
(ｂ)ゲル中の特定位置に、部分的に融解した核酸フラグメントを固定する目的のため、ステップ(ａ)で形成した二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的融解を生ずる勾配の存在下、ゲル電気泳動の手段により核酸フラグメントを分離すること、および
(ｃ)分離核酸フラグメントを検出すること、
を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
特に適当な好ましい、本発明による方法の態様では、当該方法は、以下のステップ：
(ｄ)ステップ(ｂ)の前に、当該サンプル中に存在する二本鎖核酸フラグメントを一本鎖核酸フラグメントへ完全に融解すること、およびこれらの一本鎖核酸フラグメントから二本鎖フラグメントを再形成することを含み、ここで、ホモ二量体二本鎖核酸フラグメントに加えてヘテロ二量体二本鎖核酸フラグメントを形成する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ホモ二量体二本鎖核酸フラグメント(以下、ホモ二量体フラグメントと称する)は、２つの「通常の」(すなわち、変異のない)一本鎖核酸フラグメントまたは２つの変異一本鎖核酸フラグメントが対となり二本鎖核酸フラグメントを形成するとき、生ずる。ヘテロ二量体二本鎖核酸フラグメント(以下、ヘテロ二量体フラグメントと称する)は、通常の一本鎖核酸フラグメントが変異一本鎖核酸フラグメントと対となるときに、形成される(図２)。次いで、両鎖は、厳密には相補的でないため、ヘテロ二量体フラグメントはホモ二量体フラグメントよりも低い結合エネルギーを有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
二本鎖核酸フラグメントを一本鎖フラグメントに完全に融解すること、およびこれらの一本鎖フラグメントから二本鎖核酸フラグメントを再形成することは、例えば、当該サンプルを加熱し、それによって、二本鎖フラグメントが融解し、次いで当該サンプルを再び冷却し、それによって、一本鎖フラグメントが再び二本鎖核酸フラグメントを形成し、次いで、ゲル電気泳動を用い互いから分離することにより、行われ得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
上記のように、次いで、異なる核酸フラグメントは、当該フラグメントの部分的融解を生ずる勾配中の結合エネルギーの相違に基づき相互に分離される。当該ヘテロ二量体フラグメントは、ホモ二量体フラグメントより低い結合エネルギーを有し、そのため、部分的に融解し、ゲル中に直ぐに固定化する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ヘテロ接合性変異が存在するとき、４種の二本鎖核酸フラグメントが形成され、２つのホモ二量体フラグメントおよび２つのヘテロ二量体フラグメントを、図２に示すように形成する。ヘテロ二量体フラグメントは、少なくとも１塩基が対とならず、すなわち、反対塩基と結合し得ないという事実により特徴付けられる。２つのヘテロ二量体フラグメントはより低い結合エネルギーを有し、そのため、ホモ二量体フラグメントよりも直ぐに部分的に融解し、ゲル中の異なる特定位置で固定化される。塩基対は隣接塩基対(すぐに隣接する塩基対はより強く、それより離れた塩基対ではより弱く)の結合エネルギーに影響を与えるため、２種のヘテロ二量体フラグメントは異なる結合エネルギーを有する。２つのヘテロ二量体フラグメントの結合エネルギーの相対的な相違により、これらは、ゲル中の異なる位置(すなわち、例えば、異なる温度)で融解し、そのため、異なる位置で固定化する。この手法で、異なる対立遺伝子は、例えば、互いから分離され得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明による当該方法で行った電気泳動は、好ましくはキャピラリー電気泳動である。この技術は、ゲルの配置に基づき、例えば、キャピラリー中のポリアクリルアミドに基づく。当該サンプルは、キャピラリー中に配置され、次いで、電圧は、キャピラリー全体にかけられる。当該サンプル中に存在する分子は、特に大きさおよび／または荷電に基づき異なるスピードでキャピラリー中のゲルを通って移動し、そのため、互いから分離される。キャピラリー電気泳動の利点は、核酸フラグメントの場合、キャピラリー中のゲル全体により高い電圧をかけることが出来るため、分子が当該キャピラリー中をより早く移動し得るという事実である。そのため、電気泳動ステップは、相当短時間で行うことができる。これは、キャピラリーが非常に細く、それにより、キャピラリー中のゲルの耐性が高いという事実の結果である。ゲル全体に高い電圧がかかるとき、電流、およびそれより生ずる熱は、低いままである。キャピラリーの体積に対する表面領域の割合は、より高く、そのため、生ずる熱は、より迅速により早く放出され得る。非常に低粘度(実質的には液体)のゲルがまたキャピラリー中に配置され得る。そのため、低密度で固体性のゲルマトリクスを選択し得る。更なる利点は、非常に少量のサンプルを分析し得ることであり、それは、僅かな材料を利用するときに特に重要となる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明は更に、添付の図を参照することにより説明され、ここで、
図１は、部分的に融解したＤＮＡフラグメントの概要図を示しており(本発明の方法のステップｂ)、
図２は、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成を概略的に示しており(本発明の方法のステップｄ)、
図３は、本発明の装置の好ましい態様の概要図(部分的に断面図)を示しており、
図４は、図３の詳細を示しており、そして
図５は、本発明の装置の他の適当な好ましい態様の概要図(部分的に断面図)を示している。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、部分的に融解したＤＮＡフラグメントの概要図を示す。
【図２】  図２は、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成を概略的に示す。
【図３】  図３は、本発明の装置の好ましい態様の概要図を示す。
【図４】  図４は、図３の詳細を示す。
【図５】  図５は、本発明の装置の他の適当な好ましい態様の概要図を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2004512850.tif 000001