(57)【要約】  本発明は、コラーゲン、少なくとも１種の疎水性有機ポリマー及び少なくとも１種の活性成分をベースとする複合生体材料、その調製方法、こうした複合生体材料を含む被覆物、こうした複合生体材料を含む腹壁補強材、並びに、特に治療分野における該複合生体材料の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンと、少なくとも１種の有機ポリマーと、少なくとも１種の活性成分とを含む合成複合生体材料であって、
−  有機ポリマーは、生分解性、生体適合性、疎水性であり、ガラス転移温度が５０℃以下であり、平均モル質量が５〜１２０ｋＤａであり、
−  コラーゲンは、線条の周期が６７ｎｍである線条原線維の形態であり、
−  コラーゲン／有機ポリマーの重量比は、１０／１〜１／３であり、
−  活性成分は、抗炎症剤、抗生物質、組織修復又は創傷治癒を促進する化合物及びそれらの混合物から選択される疎水性活性成分であることを特徴とする、合成複合生体材料。
【請求項２】
複合ヒドロゲルの形態であり、複合生体材料の全重量に対して７０〜９５重量％の水を含むことを特徴とする、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
５０，０００Ｐａ〜１００，０００Ｐａの範囲の弾性を有することを特徴とする、請求項２に記載の生体材料。
【請求項４】
４０〜７５％の範囲の破断点伸びを有することを特徴とする、請求項２又は３に記載の生体材料。
【請求項５】
乾燥複合材料の形態であり、複合生体材料の総重量に対して最大で１０重量％の水を含むことを特徴とする、請求項１に記載の生体材料。
【請求項６】
有機ポリマーが、脂肪族ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリ無水物及びポリ（オルトエステル）から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項７】
有機ポリマーが、ポリグリコリド、ポリラクチド、グリコリドとラクチドの共重合体、ポリラクトン及びポリヒドロキシアルカン酸から選択される脂肪族ポリエステルであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項８】
有機ポリマーが、７００ｎｍ以下の平均サイズを有するナノドメインの形態であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項９】
少なくとも以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合生体材料の調製方法：
ｉ）線条の周期が６７ｎｍであり、ヒドロゲル中のコラーゲンの濃度が少なくとも１０ｍｇ／ｍｌである線条原線維の形態のコラーゲンのヒドロゲルを調製する工程；
ｉｉ）有機溶媒の割合が増加していく、いくつかの連続した混合溶液［有機溶媒／水性溶媒（該水性溶媒と該有機溶媒は混合可能である）］中で前記ヒドロゲルをインキュベートし、続いて前記有機溶媒の純粋な溶液中で最後のインキュベーションを行うことによって、工程ｉ）で調製したヒドロゲルを脱水する工程；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）からの脱水したヒドロゲルと、請求項１〜８のいずれか一項に定義される少なくとも１種の有機ポリマー及び少なくとも１種の活性成分を含む含浸溶液とを、含浸溶液の体積／脱水したヒドロゲルの体積の体積比を３以上として接触させる工程；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）からの含浸したヒドロゲルを有機溶媒で洗浄し、次いで水性溶媒で洗浄する工程。
【請求項１０】
工程ｉ）を、以下のサブ工程に従って実施することを特徴とする、請求項９に記載の方法：
ｉ−１）コラーゲン含量が１〜５ｍｇ／ｍｌの酸可溶性コラーゲンの溶液を調製する工程；
ｉ−２）工程ｉ−１）からの溶液を空気中で蒸発させる工程；及び、
ｉ−３）工程ｉ−２）からの溶液を塩基と接触させる工程。
【請求項１１】
工程ｉｉ）が、工程ｉ）からのヒドロゲルを、有機溶媒の含有量が２０〜３０体積％である混合有機溶媒／水性溶媒の溶液中で、次いで有機溶媒の含有量が４０〜５０体積％である混合有機溶媒／水性溶媒の溶液中で、次いで有機溶媒の含有量が６０〜７０体積％である混合有機溶媒／水性溶媒の溶液中で、次いで有機溶媒の含有量が８０〜９５体積％である混合有機溶媒／水性溶媒の溶液中で、次いで前記有機溶媒の純粋な溶液中でインキュベートすることにより、実施されることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｉｉ）における各溶液中でのインキュベーションを、３０分〜２時間持続することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
含浸溶液の有機ポリマーの濃度が、２０〜５００ｍｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、工程ｉｖ）の複合生体材料の凍結乾燥工程ｖ）を含むことを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
医療用途のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合生体材料。
【請求項１６】
慢性創傷の治療に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合生体材料。
【請求項１７】
心臓又は結腸直腸手術後の感染症の予防的処置に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合生体材料。
【請求項１８】
腹壁ヘルニア又は内臓脱出症の治療に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合生体材料。
【請求項１９】
内層と、固着剤、湿布、包帯及びそれらの混合体から選択される第２の被覆物からなる外層とを含む治療用被覆物であって、内層が請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合生体材料を含むことを特徴とする、治療用被覆物。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合生体材料を含むことを特徴とする、腹壁補強材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン、少なくとも１種の疎水性有機ポリマー及び少なくとも１種の活性成分をベースとする複合生体材料、その調製方法、こうした複合生体材料を含む被覆物、こうした複合生体材料を含む腹壁補強材、並びに、特に治療分野における該複合生体材料の使用に関する。
【０００２】
本発明は、特に慢性創傷を治療するために活性成分を送達することを可能にする生体材料の分野に適用される。
【背景技術】
【０００３】
人体全体を覆う皮膚は、外部からの攻撃から臓器や組織を保護する障壁の役割を果たす。従って、その役割は生物が正確に機能するために不可欠である。皮膚は３つの層からなる：表皮、真皮及び皮下組織又は皮下層。傷害の後、組織修復又は創傷治癒が直ちに始まる。それは４つの段階からなる：止血段階、炎症段階、増殖段階及び再形成段階。慢性創傷とは、４２日後に再閉していない皮膚創傷と定義されている。これらの創傷は、下腿潰瘍、糖尿病患者の足部潰瘍又は褥瘡の形態を取る場合がある。これらの慢性創傷は、糖尿病、血管不全又は栄養障害に罹患している患者の合併症に起因する。糖尿病患者における足の障害の有病率は毎年約２０％である。毎年、この問題は世界中の通常６５歳を超える数百万人に影響を及ぼし、従って再生医療の研究の重要課題を構成する。急性創傷と呼ばれるものとの主な相違点は、創傷治癒の過程が完全ではなく、炎症段階に留まったままであることである。慢性創傷の治療は、創傷を閉じてその治癒を得るために、炎症を阻止し、組織再生を促進することの両方をしなければならない。
【０００４】
慢性創傷を治療するために一般的に使用されている技術は、創傷を切開し、続いてそれを圧迫することである。これは、創傷を消毒できるように、組織間に生じた壊死組織と繊維性癒着を除去することを含む。場合によっては、この技術は有効ではなく、親水コロイドやヒドロゲル等の生体材料をベースとする被覆物で創傷を覆う必要がある。被覆物の作用は、創傷が閉じることを可能にすると同時に、可能性のある感染から創傷を保護することである。カルボキシメチルセルロースの存在に関連する物理化学的性質を有する吸収性ポリマーからなる被覆物として、親水コロイドは、Ｈａｕｔｅ  Ａｕｔｏｒｉｔｅ  ｄｅ  Ｓａｎｔｅ（フランス高等保健機構）の評価報告書に定義されている。しかしながら、このタイプの被覆物は、重複感染が発生する過度に湿ったミクロ環境に関連する重複感染のリスクを生じる場合がある。ヒドロゲルは、大量の水（ヒドロゲルの総体積の約７０％）によって膨潤したポリマー鎖からなる物理的又は化学的ゲルである。アルギン酸塩又はコラーゲンをベースとするヒドロゲルを使用することが公知である。しかしながら、アルギン酸塩は、人体の酵素と接触すると急速に分解する。コラーゲンは、化学物質（アルデヒド、カルボジイミド等）を用いた架橋によって改善できる潜在的な機械特性に制限されている。しかしながら、これらの化学物質の毒性には問題がある。望ましくない副作用を引き起こす可能性があるからである。
【０００５】
被覆物は、抗生物質若しくは抗炎症剤型の少なくとも１種の活性成分又は創傷治癒を促進する分子をベースとする経口治療又は局所組成物と組み合わせて使用することができる。しかしながら、経口治療は、活性成分の制限された表皮への到達のために効果がないことを示す可能性がある。また局所組成物は、通常、頻繁な皮膚適用や、損傷と空気との間の直接接触を必要とし、感染のリスクを増大させる。
【０００６】
従って、上記で提案した解決策はどちらも効果がなく、創傷治療は非常に高価な皮膚代替物の使用を必要とするか、又は、創傷治癒の全ての段階には作用しないで、これらの解決策のいくつかの組み合わせを求める。
【０００７】
別の解決策は、規則的かつ持続的な経時的方法で前記活性成分の吸収を可能にする適切な担体を用いた活性成分の持続的放出である。可能な限り副作用が少なく、作用の持続時間が長期に亘り、薬剤が可能な限り効果的であるために、放出を制御する必要がある。さらに、純粋なコラーゲンのヒドロゲルは、活性成分の放出制御のための担体として記載されている。しかしながら、純粋なコラーゲンヒドロゲルは活性成分を十分に保持せず、不十分な機械的強度を有する［非特許文献１］。
【０００８】
さらに、コラーゲン−有機ポリマー複合材料は、薬剤の持続的放出のために提案されている。特に、非特許文献２は、コラーゲンスポンジ、乳酸・グリコール酸共重合体（Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ，ＰＬＧＡ）の微粒子及び活性成分としての抗生物質をベースとする複合材料を記載している。コラーゲン複合スポンジの形態の複合材料は以下のように調製された：抗生物質を含むＰＬＧＡの微粒子をダブルエマルジョン技術により調製した。次いで、得られた微粒子をコラーゲンと抗生物質の水溶液と混合し、得られた分散液を凍結乾燥した。非特許文献２では、ベース成分として機能する不溶性コラーゲン（ＩＣ）をｐＨ４．５の酢酸中に溶解する。このｐＨでは、最初に線維性コラーゲンはコラーゲンの三重らせんの形態で酸に溶解し、その線維形態を失う。調製プロセスは、溶液を中性のｐＨに戻さずに凍結乾燥することを基本としているので、最終物はコラーゲンの三重らせんのみから形成される。さらに、例えば非特許文献３に報告されているように、コラーゲンスポンジのコラーゲンは、線維性及び線条構造を有さないことが知られている。またさらに、コラーゲンスポンジは、化学物質によって架橋されていない場合、３７℃のゼラチン中で変性することが知られている。この結果、非特許文献２の複合材料は、活性成分の制御された（初期の急速放出を伴わない）持続的放出の特性と最適化された機械特性を有さない。
【０００９】
別の公知のコラーゲン−有機ポリマー複合材料は、コラーゲンの薄い層で覆われた前記有機ポリマーの繊維の形態である。
【００１０】
しかしながら、先行技術の複合材料は、最適化された活性成分の放出プロファイルを有さない（例えば、速すぎる及び／又は非直線的放出）。さらにそれらは、治療用被覆物において使用できる適切な機械特性、特に適切な弾性、破断点伸び及び／又は破断強度を有さない（例えば、非常に堅い物質又は緩すぎる及び／又は脆すぎる物質）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００３，５５，１６３１−１６４９
【非特許文献２】Ｒｕｓｚｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００３，５５，１６７９−１６９８
【非特許文献３】Ｖｉｇｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，９４Ａ，２，５５６−５６７
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服し、特に慢性創傷の場合の創傷治癒の過程のいくつかの段階を促進することができ、また前記創傷治癒の過程又は組織修復に関与する少なくとも１種の活性成分の制御された放出を可能にする治療用被覆物の分野での使用に適した機械特性を有する生分解性の生体適合性材料を提供することである。
【００１３】
従って、本発明の対象は、コラーゲンと、少なくとも１種の有機ポリマーと、少なくとも１種の活性成分とを含む合成複合生体材料であって、
−  有機ポリマーは、生分解性、生体適合性、疎水性であり、ガラス転移温度が５０℃以下、好ましくは約４５℃以下であり、平均モル質量が約５〜１２０ｋＤａであり、
−  コラーゲンは、線条の周期が６７ｎｍである線条原線維の形態であり、
−  コラーゲン／有機ポリマーの重量比は、約１０／１〜１／３、好ましくは約５／１〜１／２、より好ましくは約２／１〜２／３であり、
−  活性成分は、抗炎症剤、抗生物質、組織修復又は創傷治癒を促進する化合物及びそれらの混合物から選択される疎水性活性成分であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の合成複合生体材料は、生体適合性かつ生分解性であり、純粋なコラーゲンヒドロゲルに匹敵するか又はより改善された機械特性を有し、同時に、特に初期の急速放出を伴うことなく、１種以上の活性成分の制御された持続的放出を可能にする。
【００１５】
特に、本発明の複合生体材料は、少なくとも７日間、好ましくは少なくとも３週間又はさらには１ヶ月間の期間に亘り、実質的にコンスタントに活性成分を放出することができる。
【００１６】
複合生体材料のコラーゲンは、線条原線維の形態であり、コラーゲン／有機ポリマーの重量比は、約１０／１〜１／３、好ましくは約５／１〜１／２、さらに好ましくは約２／１〜２／３である。これらの特徴により、生体材料は均質であり、良好な機械特性を有する。特に、線条原繊維構造は少なくとも５０℃まで安定であり、人体の体温（すなわち約３７℃）では変性しない。さらに生体材料は、特に活性成分の初期の急速放出（「バースト放出」として広く知られている）の現象を回避しながら、制御された、持続的な、実質的にコンスタントな挙動で、１種以上の活性成分を放出することができる。
【００１７】
本発明の複合生体材料は、好ましくは有機溶媒を含まない。
【００１８】
本発明の複合生体材料は、複合ヒドロゲルの形態でもよいし、乾燥複合材料の形態でもよい。
【００１９】
複合生体材料が乾燥複合材料の形態である場合、複合生体材料の総重量に対して最大で約１０重量％、好ましくは最大で約５重量％の水を含む。本発明の好ましい実施形態によれば、乾燥複合材料は溶媒和水を含まない。
【００２０】
複合生体材料が複合ヒドロゲルの形態である場合、複合生体材料の全重量に対して約７０〜９５重量％、好ましくは約８０〜９０重量％の水を含む。
【００２１】
本発明の複合生体材料は、好ましくは、１種以上の活性成分、１種以上の有機ポリマー、コラーゲン及び任意に水又はｐＨが約７〜８の水性溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）からなる。
【００２２】
本発明において、用語「生分解性有機ポリマー」は、微生物（例えば、細菌、真菌、藻類）、特に酵素の作用により分解又は消化され得る有機ポリマーを意味する。ヒトにおける生分解中に関与する反応は加水分解反応、すなわち水との反応による共有結合の切断である（現行基準ＮＦＥＮ  １３  ４３２参照）。
【００２３】
本発明において、用語「生体適合性有機ポリマー」は、それらが使用される生物学的環境を阻害せず、悪化させない能力を有する有機ポリマーを意味する。特に、それらは強い炎症反応（例えば、アレルギー）を引き起こしてはならず、及び／又は、ヒトに有毒であってはならない。
【００２４】
本発明において、用語「疎水性有機ポリマー」は、接触角が約６０°〜１５０°、好ましくは約６０°〜１１０°、より好ましくは約６５°〜９０°の間で測定される有機ポリマーを意味し、例えば以下の実施例に詳述されているＷｉｌｈｅｌｍｙ測定法に従って測定される。
【００２５】
従って、本発明における有機ポリマーは生体液に不溶性である。
【００２６】
本発明の複合生体材料中の少なくとも１種の疎水性有機ポリマーの存在は、１種以上の活性成分のカプセル化と、その制御された放出を可能にする。
【００２７】
有機ポリマーは、好ましくは約４０℃以下、より好ましくは約３８℃以下のガラス転移温度を有する。
【００２８】
さらに有機ポリマーはコラーゲンと組み合わせた場合、約３７℃以下、好ましくは約３２℃以下、より好ましくは約２８℃以下のガラス転移温度を有することが有利である。
【００２９】
これは、約２８℃の温度が、皮膚上の被覆物の平衡温度に対応するためである（周囲空気と生理学的温度の境界面の温度）。コラーゲンと結合した場合、約４０℃以下の有機ポリマーのガラス転移温度は、純粋なコラーゲンに匹敵するか又はより改善された機械特性（弾性、破断点伸び及び／又は破断強度）を有する複合生体材料を得ることを可能にする。
【００３０】
有機ポリマーは、脂肪族ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリ無水物及びポリ（オルトエステル）から選択できる。
【００３１】
好ましくは、有機ポリマーは、脂肪族ポリエステル、特にポリグリコリド［すなわち、ポリ（グリコール酸）又はＰＧＡ］、ポリラクチド［すなわち、ポリ（乳酸）又はＰＬＡ］、グリコリドとラクチドの共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリラクトン（例えば、ポリ（ε−カプロラクトン））及びポリヒドロキシアルカン酸（例えば、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸））から選択される。
【００３２】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、有機ポリマーはグリコリドとラクチドの共重合体である。
【００３３】
グリコリドとラクチドの共重合体は、約５０／５０〜８５／１５、好ましくは約５０／５０〜６５／３５の範囲のラクチド／グリコリドのモル比を有することができる。
【００３４】
有機ポリマーは、約５ｋＤａ〜６０ｋＤａ、さらに好ましくは約７ｋＤａ〜２０ｋＤａの平均モル質量を有することができる。
【００３５】
複合生体材料の有機ポリマーの含有量は、複合ヒドロゲルの形態である場合、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２０〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約３０〜６０ｍｇ／ｍｌである。
【００３６】
本発明の複合生体材料の有機ポリマーは、特に約７００ｎｍ以下、好ましくは約６００ｎｍ以下、より好ましくは約１００〜５００ｎｍの平均サイズを有するナノドメインの形態である。
【００３７】
これらのナノドメインの平均サイズは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって測定される。
【００３８】
換言すると、有機ポリマーは、従来技術の複合材料の場合のように、繊維又は微粒子の形態ではない。
【００３９】
コラーゲンは、好ましくはＩ型又はＩＩＩ型コラーゲンであり、さらに好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性Ｉ型コラーゲンは、皮膚の細胞外マトリックス中に約７０重量％存在する天然タンパク質であり、それは結合組織の機械的構造に寄与し、細胞接着の基質である。
【００４０】
複合生体材料のコラーゲン含有量は、複合ヒドロゲルの形態である場合、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２０〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約３０〜６０ｍｇ／ｍｌである。
【００４１】
複合生体材料中の少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの最小コラーゲン含有量は、皮膚適用中（例えば、被覆物の形態で）の生理学的環境におけるその急速分解を回避することを可能にする。
【００４２】
本発明の材料において、通常、前記原繊維は規則的に並ばない。従って、該材料は主に又は専ら等方的ドメインを含む。
【００４３】
抗生物質型の活性成分は、ゲンタマイシン、リファマイシン又はアモキシリンであってもよい。
【００４４】
抗炎症剤型の活性成分は、デキサメタゾン又はイブプロフェン等の鎮痛剤であってもよい。
【００４５】
創傷治癒又は組織修復を促進する活性成分は、スピロノラクトンであってもよい。
【００４６】
スピロノラクトンは、ミネラロコルチコイド受容体拮抗薬であり、皮膚創傷の治療を促進することが知られている。
【００４７】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、活性成分はスピロノラクトンである。
【００４８】
本発明において、用語「疎水性活性成分」は、ｌｏｇＰ＞０、好ましくはｌｏｇＰ＞２、より好ましくはｌｏｇＰ＞３となる、オクタノール／水系における分配係数Ｐを有する活性成分を意味する。
【００４９】
分配係数Ｐは、当業者には周知である。それは、二相の溶質（活性成分）の濃度の比に等しい：Ｐ＝Ｃ’／Ｃ。Ｃ’は水で飽和した有機溶媒中の溶質の濃度に相当し、Ｃは有機溶媒で飽和した水中の溶質の濃度に相当する。
【００５０】
本発明の複合生体材料に使用される疎水性活性成分の水溶性は、通常、約５０ｍｇ／ｌ未満である。
【００５１】
複合生体材料中の活性成分の含量は、組み込むことが望まれる活性成分に依存し、従って目的とする用途に依存する。
【００５２】
特に、複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料は、約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのスピロノラクトンを含むことができる。
【００５３】
複合ヒドロゲルの形態の本発明の複合生体材料は、少なくとも約１０，０００Ｐａ、好ましくは少なくとも約４０，０００Ｐａ、より好ましくは約５０，０００〜１００，０００Ｐａの範囲の弾性（すなわち、ヤング率）を有することができる。
【００５４】
複合ヒドロゲルの形態の本発明の複合生体材料は、少なくとも約３，０００Ｐａ、好ましくは少なくとも約５０００Ｐａ、より好ましくは約１０，０００〜６０，０００Ｐａの範囲の１〜１０Ｈｚの周波数でのせん断弾性率を有することができる。
【００５５】
本発明の複合生体材料は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは約４０〜７５％の範囲の破断点伸びを有することができる。
【００５６】
本発明の複合生体材料は、少なくとも約２．５ＭＰａ、好ましくは少なくとも約３ＭＰａ、より好ましくは約３．５〜１２ＭＰａの範囲の破断強度を有することができる。
【００５７】
本発明の複合生体材料は、前記有機ポリマーから形成されたナノドメインが均一に分散している（均質な三次元網目構造）コラーゲンの線条原繊維のマトリックスの形態である。特に、前記有機ポリマーのナノドメインは、約７００ｎｍ以下、好ましくは約６００ｎｍ以下、より好ましくは約１００〜５００ｎｍの範囲の平均サイズを有する。
【００５８】
本発明の別の対象は、少なくとも以下の工程を含むことを特徴とする、本発明の第１の対象で定義される複合生体材料の調製方法である：
ｉ）線条の周期が６７ｎｍであり、ヒドロゲル中のコラーゲンの濃度が少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌである線条原線維の形態のコラーゲンのヒドロゲルを調製する工程；
ｉｉ）有機溶媒の割合が増加していく、いくつかの連続した混合溶液［有機溶媒／水性溶媒（該水性溶媒と該有機溶媒は混合可能である）］中で前記ヒドロゲルをインキュベートし、続いて前記有機溶媒の純粋な溶液中で最後のインキュベーションを行うことによって、工程ｉ）で調製したヒドロゲルを脱水する工程；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）からの脱水したヒドロゲルを、本発明の第１の対象において定義される少なくとも１種の有機ポリマー及び少なくとも１種の活性成分を含む含浸溶液と接触させる工程（含浸溶液の体積：脱水したヒドロゲル体積との体積比は約３倍以上である。）；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）からの含浸したヒドロゲルを有機溶媒で、次いで水性溶媒で洗浄する工程。
【００５９】
結果として、本発明の方法において、コラーゲンの線維性及び線条構造は保存される。当該方法は簡素で経済的であり、治療用被覆物の分野での使用に適した機械特性を有する生分解性の生体適合性材料を得ることを可能にする。特に慢性創傷の場合には、該治療用被覆物は創傷治癒の過程のいくつかの段階を促進することができ、前記創傷治癒の過程又は組織修復に関与する少なくとも１種の活性成分の制御された放出を可能にする。
【００６０】
好ましくは、工程ｉ）により得られるヒドロゲル中のコラーゲンの濃度は、約２０〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約３０〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲である。約３０〜６０ｍｇ／ｍｌの濃度は、水和及び膨潤ための大きな能力、良好な弾性並びに酵素分解に対する良好な安定性を有する複合生体材料を得るために特に適している。
【００６１】
工程ｉ）は、以下のサブ工程に従って実施することができる：
ｉ−１）コラーゲン含量が約１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ程度の酸可溶性コラーゲンの溶液を調製する工程；
ｉ−２）工程ｉ−１）からの溶液を空気中で蒸発させる工程；及び、
ｉ−３）工程ｉ−２）からの溶液を塩基と接触させる工程。
【００６２】
工程ｉ−１）は、当業者に公知の任意の手段、特にウシ、ネズミ又はブタの種からのコラーゲンの抽出によって実施することができる。
【００６３】
酸可溶性溶液は、コラーゲンを溶解できる酸性水溶液である。そのｐＨは、酸の存在下で、通常、約４未満、好ましくは約３未満であり、好ましくは、例えば約０．５Ｍの酢酸が好ましい。
【００６４】
工程ｉ−２）は、徐々に、溶液中のコラーゲンを濃縮することができる。約３日間〜２週間持続することもできる。サブ工程ｉ−２）の終了時には、コラーゲン溶液の濃度は少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２０〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約３０〜６０ｍｇ／ｍｌとなる（すなわち、コラーゲンは、本発明の複合生体材料の形成に望ましい濃度を有する）。
【００６５】
工程ｉ−３）は、濃縮したコラーゲン溶液をｐＨの上昇に供することを可能にし、コラーゲンのゲル化及びその原線維の形成をもたらす。
【００６６】
有利には、塩基性気体雰囲気、特にＮＨ３又は（ＮＨ４）２ＣＯ３の雰囲気と、工程ｉ−２）からの溶液を接触させることによって実施される。
【００６７】
工程ｉ−３）は、通常、約１２時間から２４時間持続する。
【００６８】
工程ｉ）は、塩基を除去するために、特にいくつかのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で工程ｉ−３）からのヒドロゲルを洗浄するサブ工程ｉ−４）を含むことができる。
【００６９】
また工程ｉ）は、工程ｉ−２）と工程ｉ−３）の間に、工程ｉ−２）からの溶液を型に静かに注ぎ、遠心分離機にかけるサブ工程ｉ−２’）を含むことができる。該工程ｉ−２’）は、工程ｉ−２）からのコラーゲンの濃縮（及び粘性）溶液の表面の凹凸を平坦化することができる。
【００７０】
また工程ｉ）は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１２，１１，７２４−７３３に記載の手順に従って実施することができる。
【００７１】
工程ｉｉ）は、脱水した（すなわち水を含まない）純粋なコラーゲンの材料をもたらすことを可能にする。
【００７２】
特定の実施形態において、有機溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される。
【００７３】
特定の実施形態において、水性溶媒は、水及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）から選択される。
【００７４】
工程ｉｉ）は、工程ｉ）からのヒドロゲルを、有機溶媒の含有量が約２０〜３０体積％である混合有機溶媒／水性溶媒の溶液中で、次いで有機溶媒の含有量が約４０〜５０体積％である混合有機溶媒／水性溶媒の溶液中で、次いで有機溶媒の含有量が約６０〜７０体積％である混合有機溶媒／水性溶媒の溶液中で、次いで有機溶媒の含有量が約８０〜９５体積％である混合有機溶媒／水性溶媒の溶液中で、次いで前記有機溶媒の純粋な溶液中でインキュベートすることにより、実施することができる。
【００７５】
各溶液中でのインキュベーションは、約３０分〜２時間、好ましくは約４５分〜１時間１５分、より好ましくは約１時間程度、持続することができる。
【００７６】
工程ｉｉ）は、コラーゲン中に均質な多孔性を作り出すこと及び／又は保持することを可能にする。該工程ｉｉ）は、一方では再現性のある結果を得ることを可能とし、他方では後の工程ｉｉｉ）の間にヒドロゲルの良好な含浸を得ることを可能とするので、本発明の方法において最も重要である。すなわち、良好な機械特性を保証しながら、活性成分の持続的放出の良好な特性を有する均質な複合生体材料が得られる（例えば、複合生体材料中の有機ポリマーの微視的領域の不在及びコラーゲンの線条原線維構造の保持）。
【００７７】
工程ｉｉｉ）は、工程ｉｉ）のヒドロゲルに有機ポリマー及び活性成分の溶液を含浸させることを可能にする。
【００７８】
ヒドロゲルの多孔性及び有機ポリマーの拡散に有利な媒体のために、多量の有機ポリマーをヒドロゲルに組み込むことができる。
【００７９】
工程ｉｉｉ）は、好ましくは、活性成分と有機ポリマーを含む含浸溶液を調製し、次いで含浸溶液中で工程ｉｉ）からの脱水した純粋なコラーゲンヒドロゲルをインキュベートすることによって実施される。
【００８０】
特に、含浸溶液は、活性成分を所望の濃度で有機溶媒に溶解し、次いで先の溶液に所望の濃度で有機ポリマーを添加し、最後にそれを先の溶液に溶解することによって調製される。
【００８１】
工程ｉｉｉ）は、好ましくは室温で実施される。
【００８２】
有機溶媒は、活性成分と有機ポリマーの両方を溶解できる全ての溶媒から選択できる。例として、有機溶媒はＴＨＦ又はＤＭＳＯとすることができる。
【００８３】
含浸溶液の有機ポリマーの濃度は、約２０〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約８０〜１６０ｍｇ／ｍｌの範囲とすることができる。
【００８４】
含浸溶液の活性成分の濃度は、約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００８５】
含浸溶液の体積：脱水したヒドロゲル体積との体積比は、好ましくは約３／１〜２０／１、好ましくは５／１程度である。
【００８６】
工程ｉｉｉ）は、通常、約１２時間〜２４時間持続する。
【００８７】
工程ｉｖ）の有機溶媒は、ＴＨＦ又はＤＭＳＯとすることができる。
【００８８】
工程ｉｖ）の水性溶媒は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、体液をモデル化した液体（周知の血清体液若しくはＳＢＦ）、水又は細胞培養培地とすることができる。
【００８９】
工程ｉｖ）は、好ましくは、工程ｉｉｉ）からの含浸したヒドロゲルをいくつかの有機溶媒槽中で、特に約１５秒〜１分間、好ましくは約３０秒間洗浄すること；及び、工程ｉｉｉ）からの含浸したヒドロゲルをいくつかの水系溶媒槽中で、特に約１５分〜１時間、好ましくは約３０分間洗浄することによって実施される。
【００９０】
有機溶媒で洗浄することにより、コラーゲンヒドロゲルに吸収されなかった過剰のポリマーを除去することが可能になる。
【００９１】
水性溶媒で洗浄することにより、ポリマーをコラーゲンヒドロゲル中に固定することが可能になる。水性溶媒で洗浄するこの最終工程がなければ、複合生体材料は十分な機械的強度を有さず、脆くなる。
【００９２】
工程ｉｖ）の終わりには、複合生体材料は複合ヒドロゲルの形態である。
【００９３】
また当該方法は、工程ｉｖ）からの複合生体材料の凍結乾燥の工程ｖ）を含むことができる。
【００９４】
工程ｖ）の終わりには、複合生体材料は乾燥複合材料の形態である。該乾燥複合材料は、好ましくは有機溶媒又は水性溶媒を含まない。
【００９５】
そして、乾燥複合材料は長期間保存することができる。
【００９６】
また当該方法は、乾燥複合材料の水和の工程ｖｉ）を含むことができる。該工程ｖｉ）は、複合ヒドロゲルの形態の複合材料を再形成することができる。
【００９７】
工程ｖｉ）は、水、リン酸緩衝生理食塩水、体液をモデル化した液体及び細胞培養培地から選択される水溶液の存在下で実施することができる。
【００９８】
工程ｖ）及びｖｉ）は、洗浄工程ｉｖ）の終わりに得られた複合ヒドロゲル中にまだ存在している可能性のある有機溶媒を完全に除去することを可能にする。
【００９９】
本発明の第３の対象は、医療用途のための、本発明の第１の対象による複合生体材料である。
【０１００】
本発明の第４の対象は、慢性創傷の治療に使用するための、本発明の第１の対象による複合生体材料である。これらの慢性創傷は、通常、足部潰瘍、静脈性潰瘍又は褥瘡に見られる。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明による複合生体材料は、少なくとも１週間は皮膚と接触したままである。
【０１０２】
本発明の第５の対象は、心臓又は結腸直腸手術後の感染症の予防的処置に使用するための、本発明の第１の対象による複合生体材料である。
【０１０３】
本発明の第６の対象は、内層と、固着剤、湿布、包帯及びそれらの混合体から選択される第２の被覆物からなる外層を含む治療用被覆物であって、内層が本発明の第１の対象による複合生体材料を含むことを特徴とする治療用被覆物である。
【０１０４】
第２の被覆物は、特に、多孔質被覆物、滅菌ガーゼ、ポリウレタンフォーム若しくはフィルム、又は、ポリアミド／ポリエステル不織フィルムとすることができる。
【０１０５】
内層は皮膚と接触し、外層は内層を保持する。
【０１０６】
被覆物は、活性成分、特にスピロノラクトンを少なくとも１週間の間、一定の用量で放出することができる。
【０１０７】
本発明の第７の対象は、腹壁ヘルニア又は内臓脱出症の治療に使用するための、本発明の第１の対象による複合生体材料である。
【０１０８】
本発明の第８の対象は、本発明の第１の対象による複合生体材料を含む腹壁補強材である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】実施例１．２で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−Ｈの透過電子顕微鏡写真を示す（図１ａ）。また、実施例１．４で得られた本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲの顕微鏡写真を示す（図１ｂ）。
【図２】本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの直径（ｍｍ）を示し、また比較のために、実施例１．２で得られた本発明によらない純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−Ｈと、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの直径を示す。
【図３】本発明による乾燥複合材料の形態の複合生体材料Ｍ１−Ｓ、Ｍ２−Ｓ、Ｍ３−Ｓ及びＭ４−Ｓの中に存在する有機ポリマーの質量（ｍｇ）を示す。
【図４】本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの膨潤体積を示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの膨潤体積を示す（純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−Ｈの最初の量に対する％として）。
【図５】本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの破断点伸びを示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの破断点伸びを示す（試験した各材料の最初の長さに対する％として）。
【図６】本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの破壊強度（ＭＰａ）を示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの破壊強度を示す。
【図７】本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの弾性（Ｐａ）（ヤング率）を示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの弾性を示す。
【図８】本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲの異なる周波数（約１Ｈｚと１０Ｈｚ）におけるせん断弾性率（Ｐａ）を示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲのものと、実施例１．３で得られた脱水した純粋なコラーゲン材料ＭＡ−ＨＤから得られた、スピロノラクトンに含浸した（上記の実施例１．４に従って、ＴＨＦ中に約１０−２Ｍのスピロノラクトンを含む溶液に含浸させ、洗浄し、凍結乾燥し、再水和した）コラーゲンヒドロゲルＭＢ−ＨＲ（すなわち、有機ポリマーを含まない）のものとを示す。
【図９】本発明による乾燥複合材料の形態の複合生体材料Ｍ１−Ｓ（三角形による曲線）、Ｍ１−Ｓ１（菱形による曲線）、及びＭ１−Ｓ２（四角形による曲線）のスピロノラクトンの放出プロファイルを示す。
【図１０】本発明の複合生体材料Ｍ１−Ｓ（十字による曲線）、Ｍ２−Ｓ（菱形による曲線）、Ｍ３−Ｓ（四角による曲線）及びＭ４−Ｓ（三角による曲線）のスピロノラクトンの放出プロファイルを示す。
【図１１】細胞（線維芽細胞）における本発明の複合生体材料Ｍ１−Ｓの毒性を比較して示す。
【図１２】（緩衝液を毎日交換した）ＰＢＳ中での１５日間のインキュベーション後、ヒドロゲルから放出されたスピロノラクトンの生物学的活性を表す。
【図１３】本発明による乾燥複合材料の形態の複合生体材料Ｍ１−Ｓ、Ｍ２−Ｓ、Ｍ３−Ｓ、Ｍ４−Ｓ、Ｍ５−Ｓ及びＭ６−Ｓの複合生体材料１ｍｇ当たりのスピロノラクトンの重量（μｇ）を示し、また比較のために、乾燥した純粋なコラーゲン材料ＭＡ−Ｓの前記材料１ｍｇ当たりのスピロノラクトンの重量（μｇ）を示す。
【図１４】本発明による乾燥複合材料の形態の複合生体材料Ｍ７−Ｓ（図１４ａ）及びＭ８−Ｓ（図１４ｂ）のデキサメタゾンの放出プロファイルを示す。
【実施例】
【０１１０】
実施例で使用した出発物質を以下に列挙する：
−  ＰＬＧＡ  ７−１７ＫＤａ，７１９８９７−５Ｇ，Ｓｉｇｍａ，５０：５０（ラクチド：グリコリド），
−  ＰＬＧＡ  ２４−３８ＫＤａ，７１９８７０−５Ｇ，Ｓｉｇｍａ，５０：５０（ラクチド：グリコリド），
−  ＰＬＧＡ  ３０−６０ＫＤａ，Ｐ２１９１−５Ｇ，Ｓｉｇｍａ，５０：５０（ラクチド：グリコリド），
−  ＰＬＡ  １０ＫＤａ，７６４６２０−５Ｇ，Ｓｉｇｍａ，
−  ＰＬＡ  ３０ＫＤａ，７６７３４４−５Ｇ，Ｓｉｇｍａ，
−  ＰＣＬ  １４ＫＤａ，４４０７５２−５Ｇ，Ｓｉｇｍａ，
−ラット尾腱，Ｇｉｂｃｏ  Ａ１０４８３０１，
−スピロノラクトン，Ｓ３３７８−１Ｇ，Ｓｉｇｍａ，
−デキサメタゾン，Ｄ４９０２−１Ｇ，Ｓｉｇｍａ，及び
−アルドステロン，Ａ９４７７−２５ＭＧ，Ｓｉｇｍａ．
【０１１１】
別段の指示がない限り、全ての材料は製造業者から受け取ったまま使用した。
【０１１２】
調製した材料又は市販の材料を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、ヒドロキシプロリンアッセイ、接触角の測定、破断点伸びの測定、破断強度の測定、弾性の測定、毒性の測定、ＵＶ分光法を用いた活性成分の放出をモニターするための測定及びスピロノラクトンの生物学的活性の測定により特性評価した。
【０１１３】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による分析は、Ｔｅｃｈｎａｉ  Ｓｐｉｒｉｔ  Ｇ２の商品名でＦＥＩが販売する装置を用いて行った。
【０１１４】
接触角は、ＤＳＡ３０の商品名でＫＲＵＳＳが販売する張力計を用いて測定した。この測定は、以下のＷｉｌｈｅｌｍｙ法に従って行った：テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に約１６０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した有機ポリマーの溶液を、汚れのない乾燥したスライドガラス上に沈着させる。乾燥を行い、スライドガラスの表面に有機ポリマーの膜を形成する。有機ポリマーで覆われたスライドガラス上に水滴を沈着させる。この操作は約２５℃で行われる。張力計で、水と有機ポリマーで覆われたスライドガラスとの間の表面張力を測定し、水との接触角を算出する。接触角が大きいほど有機ポリマーは疎水性である。
【０１１５】
弾性は、Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ  ３２２０の商品名でＢｏｓｅが販売する装置を用いて２５℃で測定した。
【０１１６】
せん断弾性率は、ＭＣＲ  ３０１の商品名でＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒが販売する装置を用いて２５℃で測定した。
【０１１７】
破断点伸びは、Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ  ３２２０の商品名でＢｏｓｅが販売する装置を用いて２５℃で測定した。
【０１１８】
破壊強度は、Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ  ３２２０の商品名でＢｏｓｅが販売する装置を用いて２５℃で測定した。
【０１１９】
ヒドロキシプロリンアッセイは、様々な溶液又は物質中のコラーゲン濃度の測定を可能にする。ヒドロキシプロリンは、コラーゲンポリペプチド鎖に多量に存在するアミノ酸である。このアッセイは以下の方法で行った：試験するコラーゲン溶液を約１０８℃で酸性（ＨＣｌ  ６Ｍ）条件下で加水分解した。このようにヒドロキシプロリンを解放し、次いで得られた混合物を乾燥した。ヒドロキシプロリンをクロラミンＴで酸化し、次いでジメチルアミノ−４−ベンズアルデヒド（ＤＭＢＡ）との複合体を形成し、着色生成物を得た。濃度は、較正範囲との比較により、５５７ｎｍでの分光光度測定によって決定した。
【０１２０】
材料の毒性を以下のように測定した：初代ヒト真皮線維芽細胞を培養プレート上に播種した。次いで、線維芽細胞と共に複合ヒドロゲルを１日間又は６日間インキュベートした。細胞生存率を代謝試験（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ  Ａｓｓａｙ（商標））によって測定し、対照の線維芽細胞（複合ヒドロゲルを添加していない）のそれと比較した。
【０１２１】
活性成分の放出のモニタリングは、Ｕｖｉｋｏｎ  ＸＬの商品名でＮｏｒｔｈＳｔａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが販売する装置を用いて、ＵＶ分光法によって測定した。
【０１２２】
スピロノラクトンの生物学的活性を、以下の方法で測定した：Ｈ９Ｃ２細胞は、アルドステロンとその受容体の複合体に結合する配列を有するプロモーターの下流にルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を組み込むことによって遺伝子改変された筋芽細胞である。アルドステロンを添加すると、ルシフェラーゼが発現し、生物発光によって検出された。試験したヒドロゲルによって放出されたスピロノラクトンが活性である場合は、Ｈ９Ｃ２とのそのインキュベーションはアルドステロンを阻害し、生物発光シグナルがゼロになる。この阻害は、アルドステロンと共にインキュベートしたＨ９Ｃ２上のスピロノラクトンの生物活性をレポートする。スピロノラクトン活性は、試験した様々なタイプのヒドロゲルに由来するスピロノラクトンが放出する液体で直接測定した。
【０１２３】
実施例１：本発明の第１の対象による合成複合生体材料の調製
１．１  コラーゲンの抽出
コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンが非常に豊富であることが知られているラット尾腱から抽出した。この目的のために、ラット腱をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、溶液が細胞や血液を含まず透明になるまで、約４℃で、３０００Ｇで約５分間遠心分離した（Ｇは遠心分離速度の測定単位であり、重力による加速度に相当する）。それらを約４ＭのＮａＣｌ溶液で洗浄し、残りの細胞を全て破壊した。さらにＰＢＳ中で洗浄して微量のＮａＣｌを除去した後、洗浄した腱と約０．５Ｍの酢酸溶液を約２４時間混合し、次いで、得られた混合物を約３０００Ｇで約２０分間遠心分離した。その後、得られた混合物は、別のタンパク質の存在下でコラーゲンＩの三重らせんを構成した。約４ＭのＮａＣｌ溶液を得られた溶液に滴下して添加し、コラーゲンＩを選択的に沈殿させ、０．７Ｍの最終ＮａＣｌ濃度を得た。次いで、得られた混合物を３０００Ｇで遠心分離し、得られた沈殿物を０．５Ｍ酢酸に溶解し、実質的にコラーゲンＩを含む溶液を形成した。該溶液を同じ溶媒に対して透析してＮａＣｌを完全に除去し（約２４時間、４槽）、約２１０００Ｇで約３時間遠心分離し、最終的なコロイド凝集物を除去した。
【０１２４】
このようにして調製したコラーゲン溶液を、その三重らせん構造を維持するために約４℃で保存した。この溶液におけるヒドロキシプロリンアッセイは、約５ｍｇ／ｍｌであるそのコラーゲン濃度の測定を可能にした。
【０１２５】
１．２  濃縮したコラーゲンＩヒドロゲルの調製
上記で調製した約５ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を約０．５Ｍの酢酸溶液に溶解した。約４０ｍｇ／ｍｌの最終コラーゲン濃度に達するまで、滅菌ドラフト下で該溶液を空気中で蒸発させた。溶媒の蒸発は計量することによりモニターした。次いで、溶液の最終濃度をヒドロキシプロリンアッセイにより確認した。
【０１２６】
このようにして得られた約４０ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を型に入れ、次いで、型／コラーゲン溶液のアセンブリを遠心分離して凹凸を平坦化した。その後、得られた型をアンモニア蒸気下に約１２時間置いて、コラーゲンＩのゲル化と原線維形成を可能にした。得られたヒドロゲルを滅菌ＰＢＳ槽（すなわち、オートクレーブ中で湿潤滅菌したもの）内で数回洗浄し、アンモニアを除去し、ｐＨを７にした。各洗浄の前にｐＨをモニターした。得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルをＭＡ−Ｈと表示する。
【０１２７】
１．３  濃縮したコラーゲンＩヒドロゲルの脱水
上記で得られたコラーゲンＩヒドロゲルを、いくつかの連続した混合ＴＨＦ／水の槽内のインキュベーションによって徐々に脱水した：３０体積％のＴＨＦ濃度を有するＴＨＦ／水の槽、５０体積％のＴＨＦ濃度を有するＴＨＦ／水の槽、７０体積％のＴＨＦ濃度を有するＴＨＦ／水の槽、９５体積％のＴＨＦ濃度を有するＴＨＦ／水の槽、及び最後に純粋なＴＨＦの槽を用いて実施した。各槽内でのインキュベーションは約１時間持続した。
【０１２８】
脱水工程の後、脱水した純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＤを得た。
【０１２９】
脱水した純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＤをＰＢＳで洗浄し、凍結乾燥して乾燥した純粋なコラーゲン材料ＭＡ−Ｓを得ることができる。その後、ＭＡ−ＳをＰＢＳで再水和してＭＡ−ＨＲと表示する純粋なコラーゲンヒドロゲルを再形成することができる。
【０１３０】
１．４  合成複合生体材料Ｍ１の調製
スピロノラクトンをＴＨＦに溶解し、次いでＰＬＧＡを前術の混合物に溶解することにより、１６０ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ  ３０−６０ｋＤａと、１０−２Ｍ（すなわち４．１６ｍｇ／ｍｌ）のスピロノラクトンを含む溶液を調製した。
【０１３１】
上記で調製した脱水した純粋コラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＤを、ＰＬＧＡとスピロノラクトンを含む溶液で約１２時間含浸した。溶液の体積は脱水した純粋コラーゲンヒドロゲルの体積の少なくとも５倍であった。
【０１３２】
含浸後、得られた複合ヒドロゲルを純粋なＴＨＦで約３０秒間３回洗浄し、過剰のＰＬＧＡを除去した。次いで滅菌ＰＢＳで約３０分間３回洗浄し、ポリマーを線維性コラーゲンのネットワーク内に固定し、そして複合ヒドロゲルの形態の本発明の複合生体材料Ｍ１−Ｈを形成した。
【０１３３】
また乾燥形態の前記複合生体材料も得た。この目的のために、複合生体材料Ｍ１−Ｈを約１０分間液体窒素中に浸漬し、氷結晶の形成を回避した。次いで、約２４時間凍結乾燥し（−４０℃未満の温度、１００μバールの真空）、乾燥複合材料の形態の本発明の複合生体材料Ｍ１−Ｓを形成した。
【０１３４】
次に、乾燥複合材料を、リン酸緩衝生理食塩水の添加により再水和させ、複合ヒドロゲルの形態の材料Ｍ１−ＨＲを形成した。
【０１３５】
前記生体複合材料のコラーゲン／有機ポリマーの重量比は１／１であった。
【０１３６】
図１は、実施例１．２で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−Ｈの透過電子顕微鏡写真を示す（図１ａ）。これは本発明の一部を形成しない。また、実施例１．４で得られた本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲの顕微鏡写真を示す（図１ｂ）。
【０１３７】
図１は、コラーゲンの線維性及び線条構造が保存された均質な複合生体材料を示す。さらに、ＰＬＧＡポリマーの微視的領域は識別できない。これは、ポリマーがコラーゲン内に均一に分布していることを意味する。
【０１３８】
下記表に、実施例１及び以下の実施例で使用される様々な有機ポリマーの接触角の値を要約した：
【０１３９】
【表１】
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【０１４０】
実施例２：本発明の第１の対象による別の合成複合生体材料の調製
上記の実施例１．３で得られた脱水した純粋コラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＤを以下の各含浸溶液を用いて含浸することにより、複合生体材料Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲを調製した：
−  約１０−２Ｍのスピロノラクトンと約１６０ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ  ７−１７ｋＤａを含む溶液、
−  約１０−２Ｍのスピロノラクトンと約１６０ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ  ２４−３８ｋＤａを含む溶液、及び
−  約１０−２Ｍのスピロノラクトンと約１６０ｍｇ／ｍｌのＰＣＬ  １４ｋＤａを含む溶液。
【０１４１】
含浸、洗浄、凍結乾燥及び再水和の工程は、上記の実施例１．４に記載したものと同一である。
【０１４２】
図２は、本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの直径（ｍｍ）を示し、また比較のために、実施例１．２で得られた本発明によらない純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−Ｈと、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの直径を示す。
【０１４３】
図２は、本発明で定義される活性成分及び疎水性有機ポリマーのヒドロゲル中での存在が、得られるヒドロゲルの直径にほとんど影響しないか、又は全く影響しないことを示す。従って、複合ヒドロゲルは、純粋なコラーゲンに近い水和に良好な能力を有し、収縮しない。
【０１４４】
図３は、本発明による乾燥複合材料の形態の複合生体材料Ｍ１−Ｓ、Ｍ２−Ｓ、Ｍ３−Ｓ及びＭ４−Ｓの中に存在する有機ポリマーの質量（ｍｇ）を示す。
【０１４５】
図３は、ＰＬＧＡ  ７−１７ｋＤａが使用される場合（Ｍ２−Ｓ）、本発明の複合生体材料はより多くの量の有機ポリマーを組み込めることを示す。それでもなお、試験された有機ポリマーが組み込まれる量は適切であり、２５ｍｇ程度のコラーゲンの質量に対して、約１５ｍｇより多く、好ましくは約２０〜３１ｍｇの範囲である。
【０１４６】
図４は、本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの膨潤体積を示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの膨潤体積を示す（純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−Ｈの最初の量に対する％として）。
【０１４７】
図４は、本発明による複合ヒドロゲルの膨潤についての良好な能力（約５５％〜８０％）を示し、さらにＰＬＧＡ  ７−１７ｋＤａを使用した場合は純粋なコラーゲンヒドロゲルのものと同様である。
【０１４８】
図５は、本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの破断点伸びを示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの破断点伸びを示す（試験した各材料の最初の長さに対する％として）。
【０１４９】
図６は、本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの破壊強度（ＭＰａ）を示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの破壊強度を示す。
【０１５０】
図７は、本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲ、Ｍ２−ＨＲ、Ｍ３−ＨＲ及びＭ４−ＨＲの弾性（Ｐａ）（ヤング率）を示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲの弾性を示す。
【０１５１】
図８は、本発明による複合ヒドロゲルの形態の複合生体材料Ｍ１−ＨＲの異なる周波数（約１Ｈｚと１０Ｈｚ）におけるせん断弾性率（Ｐａ）を示し、また比較のために、実施例１．３で得られた純粋なコラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＲのものと、実施例１．３で得られた脱水した純粋なコラーゲン材料ＭＡ−ＨＤから得られた、スピロノラクトンに含浸した（上記の実施例１．４に従って、ＴＨＦ中に約１０−２Ｍのスピロノラクトンを含む溶液に含浸させ、洗浄し、凍結乾燥し、再水和した）コラーゲンヒドロゲルＭＢ−ＨＲ（すなわち、有機ポリマーを含まない）のものとを示す。結果として、純粋なコラーゲンヒドロゲル又はスピロノラクトンを含む純粋なコラーゲンヒドロゲルと比較して、本発明の複合生体材料の機械的強度の有意な改善が観察される。
【０１５２】
図９は、本発明による乾燥複合材料の形態の複合生体材料Ｍ１−Ｓ（三角形による曲線）、Ｍ１−Ｓ１（菱形による曲線）、及びＭ１−Ｓ２（四角形による曲線）のスピロノラクトンの放出プロファイルを示す。別々の曲線は、放出されたスピロノラクトンの累積量（ｎｍｏｌ）を時間（時間）の関数として示す。
【０１５３】
この実験で最初に使用された生体材料が乾燥複合材料の形態であることは特筆に価する。しかしながら、それらは、活性成分の放出をモニターするために、測定中に直ちに再水和される。後述のように、生体材料の毒性や、スピロノラクトンの生物学的活性の測定についても同様である。
【０１５４】
複合生体材料Ｍ１−Ｓ１及びＭ１−Ｓ２は、（Ｍ１−Ｓについて約１６０ｍｇ／ｍｌとした代わりに）含浸溶液中のＰＬＧＡの濃度に関して、Ｍ１−Ｓ１については約４０ｍｇ／ｍｌとし、Ｍ１−Ｓ２については約８０ｍｇ／ｍｌとした以外は、実施例１と同様に調製した。
【０１５５】
経時的に一定量のスピロノラクトンを放出することを促進し、スピロノラクトンの放出をより良好に制御するためには、約１６０ｍｇ／ｍｌの濃度が好ましいことが観察される。本発明による３種の複合生体材料は、４００時間（約２週間）で約３０〜６０％のスピロノラクトンのみを放出することは特筆に価する。
【０１５６】
図１０は、本発明の複合生体材料Ｍ１−Ｓ（十字による曲線）、Ｍ２−Ｓ（菱形による曲線）、Ｍ３−Ｓ（四角による曲線）及びＭ４−Ｓ（三角による曲線）のスピロノラクトンの放出プロファイルを示す。別々の曲線は、放出されたスピロノラクトンの１日量（１日当たりのナノモル）を時間（日数）の関数として示す。
【０１５７】
図１１は、細胞（線維芽細胞）における本発明の複合生体材料Ｍ１−Ｓの毒性を比較して示す：
−  実施例１．３で得られた脱水した純粋コラーゲン材料ＭＡ−ＨＤから得られた、スピロノラクトンに含浸した（上記の実施例１．４に従って、ＴＨＦ中に約１０−２Ｍのスピロノラクトンを含む溶液に含浸させ、洗浄し、凍結乾燥した）乾燥コラーゲン材料ＭＢ−Ｓの毒性；
−  実施例１．３で得られた脱水した純粋コラーゲン材料ＭＡ−ＨＤから得られた、ＰＬＧＡに含浸した（上記の実施例１．４に従って、ＴＨＦ中に約１６０ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ  ３０〜６０ｋＤａを含む溶液に含浸させ、洗浄し、凍結乾燥した）乾燥コラーゲン材料ＭＣ−Ｓの毒性；及び、
−  実施例１．３で得られた乾燥した純粋なコラーゲン材料ＭＡ−Ｓの毒性。
【０１５８】
さらに、Ｃは陰性対照（ヒドロゲルを含まず細胞のみを含むウエル）を表す。別々のチャートは、陰性対照Ｃと比較した、１日目及び６日目の、上記で定義した物質Ｍ１−Ｓ、ＭＢ−Ｓ、ＭＣ−Ｓ及びＭＡ−Ｓの細胞生存率（％）を示す。
【０１５９】
６日目には、細胞が増殖して調査が累積しているので、全ての点が１００％を超える。２つの三角形が対照（円）のわずかに下にあるので、スピロノラクトンは細胞に対してわずかな毒性効果を有することが観察される。実際、最初の日には、細胞の７４％しか生存しなかった。しかしながら、これは細胞増殖を妨げない（直線が増加している）。また図１１では、四角は対照（丸）と同じレベルにあるので、疎水性有機ポリマーＰＬＧＡに関して非毒性が示される。
【０１６０】
図１２は、下記を使用したときの、（緩衝液を毎日交換した）ＰＢＳ中での１５日間のインキュベーション後、ヒドロゲルから放出されたスピロノラクトンの生物学的活性を表す。：
（１）本発明による複合生体材料Ｍ１−Ｓと、約１０−８Ｍのアルドステロンとの混合物；及び、比較のために、
（２）材料ＭＢ−Ｓと、約１０−８Ｍのアルドステロンとの混合物；
（３）材料ＭＣ−Ｓと、約１０−８Ｍのアルドステロンとの混合物；
（４）材料ＭＡ−Ｓと、約１０−８Ｍのアルドステロンとの混合物；
（５）陰性対照（アルドステロンを含まない培地を含むウェル）；
（６）約１０−８Ｍのアルドステロン；及び、
（７）約１０−８Ｍのアルドステロンと約１０−６Ｍのスピロノラクトンとの混合物。
【０１６１】
図１２は、使用した培地の種類に依存したルシフェラーゼの産生を示す（相対光単位又はＲＬＵ）。ルシフェラーゼ活性は、条件（５）よりも条件（６）の方が大きく、アルドステロンがミネラルコルチコイド受容体に実際に結合し、強い転写を引き起こすことが観察される。約１０−６Ｍのスピロノラクトン（条件（７））を添加すると、アルドステロンの効果が阻害され、受容体は活性化されない。本発明による複合生体材料Ｍ１−Ｓを使用した条件（１）は、条件（７）で得られたものと同等の活性を示し、スピロノラクトンが複合生体材料Ｍ１−Ｓによって実際に放出され、同時にその活性を維持していることを表す。ＰＬＧＡが存在しない場合（条件（２））、コラーゲンはスピロノラクトンを維持せず、残量のスピロノラクトンは不活性であるか、アルドステロンに対して作用する濃度が比較的低い。最後に、２つの最終条件（３）及び（４）は、スピロノラクトンを含まない対象に対応し、約１０−８Ｍのアルドステロンのみを含む条件（６）のものと同じ高さである。このように、コラーゲンヒドロゲル又はＰＬＧＡを含むコラーゲンヒドロゲルの効果はない。
【０１６２】
実施例３：本発明の第１の対象による別の合成複合生体材料の調製
上記の実施例１．３で得られた脱水した純粋コラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＤを以下の各含浸溶液を用いて含浸することにより、複合生体材料Ｍ５−ＨＲ及びＭ６ＨＲを調製した：
−  約１０−２Ｍのスピロノラクトンと約１６０ｍｇ／ｍｌのＰＬＡ  １０ｋＤａを含む溶液、及び、
−  約１０−２Ｍのスピロノラクトンと約１６０ｍｇ／ｍｌのＰＬＡ  ３０ｋＤａを含む溶液。
【０１６３】
含浸、洗浄、凍結乾燥及び再水和の工程は、上記の実施例１．４に記載したものと同一である。
【０１６４】
図１３は、本発明による乾燥複合材料の形態の複合生体材料Ｍ１−Ｓ、Ｍ２−Ｓ、Ｍ３−Ｓ、Ｍ４−Ｓ、Ｍ５−Ｓ及びＭ６−Ｓの複合生体材料１ｍｇ当たりのスピロノラクトンの重量（μｇ）を示し、また比較のために、乾燥した純粋なコラーゲン材料ＭＡ−Ｓの前記材料１ｍｇ当たりのスピロノラクトンの重量（μｇ）を示す。
【０１６５】
上記の実施例１．３で得られた脱水した純粋コラーゲンヒドロゲルＭＡ−ＨＤを以下の各含浸溶液を用いて含浸することにより、別の複合生体材料Ｍ７−ＨＲ及びＭ８ＨＲを調製した：
−  約５．３×１０−２Ｍ（すなわち、２１ｍｇ／ｍｌ）のデキサメタゾン及び約１６０ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ  ７−１７ｋＤａを含む溶液、及び、
−  約３．２×１０−２Ｍ（すなわち、１２．６ｍｇ／ｍｌ）のデキサメタゾン及び約１６０ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ  ７−１７ｋＤａを含む溶液。
【０１６６】
含浸、洗浄、凍結乾燥及び再水和の工程は、上記の実施例１．４に記載したものと同一である。
【０１６７】
図１４は、本発明による乾燥複合材料の形態の複合生体材料Ｍ７−Ｓ（図１４ａ）及びＭ８−Ｓ（図１４ｂ）のデキサメタゾンの放出プロファイルを示す。別々の曲線は、放出されたデキサメタゾンの累積量（μｇ）を時間（日数）の関数として示す。
【図１ａ）】
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【図１ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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