(57)【要約】【課題】  迅速に、かつ簡便にＤＮＡハイブリダイゼーション反応をはじめとする生物、化学の反応等の検出、分析を高感度に可能とする分析用チップとこれを用いた分析方法等の新しい技術手段を提供する。【解決手段】  基板表面に垂直方向の細孔が配設されている多孔質シリコン層を有する基板において、細孔の内壁部にはプローブ分子が固定されている分子認識チップを構成し、この分子認識チップへの検体分子含有溶液の接触による検体分子とプローブ分子との反応もしくは結合の形成と、該反応もしくは結合の形成を光により検出もしくは分析する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に垂直方向の細孔が配設されている多孔質層を有する基板において、細孔の内壁部にはプローブ分子が固定されていることを特徴とする分子認識チップ。
【請求項２】
複数の細孔が、基板表面の平面位置として相互に間隔を介して規則的に配設されていることを特徴とする請求項１の分子認識チップ。
【請求項３】
複数の細孔の各々には、互いに同種もしくは異種のプローブ分子が固定されていることを特徴とする請求項１または２の分子認識チップ。
【請求項４】
複数の細孔は基板表面の平面領域として区分され、区分された領域毎に互いに異種のプローブ分子が固定されていることを特徴とするとする請求項１または２の分子認識チップ。
【請求項５】
固定されているプローブ分子がＤＮＡであって、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無の検出から塩基配列の特定を可能とするＤＮＡチップを構成していることを特徴とする請求項１から４のいずれかの分子認識チップ。
【請求項６】
細孔内壁部には、単分子膜を介してプローブＤＮＡが固定化されていることを特徴とする請求項５の分子認識チップ。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかの分子認識チップの製造方法であって、陽極酸化により多孔質層を形成し、生成された細孔の内壁部にプローブ分子を固定することを特徴とする分子認識チップの製造方法。
【請求項８】
細孔の内壁部に単分子膜を形成し、次いでこの単分子膜にプローブ分子を結合することを特徴とする請求項７の分子認識チップの製造方法。
【請求項９】
プローブ分子がＤＮＡであるＤＮＡチップを製造することを特徴とする請求項７または８の分子認識チップの製造方法。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれかの分子認識チップを用いての検体分子の分析方法であって、分子認識チップへの検体分子含有溶液の接触による検体分子とプローブ分子との反応もしくは結合の形成と、該反応もしくは結合の形成を光により検出もしくは分析することを特徴とする分子認識チップ分析方法。
【請求項１１】
請求項５または６のプローブ分子がＤＮＡであるＤＮＡチップを用いての分析方法であって、ＤＮＡチップへの検体ＤＮＡ含有溶液を接触させ、赤外分光スペクトルを測定し、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出し、塩基配列の特定を可能としていることを特徴とする分子認識チップ分析方法。
【請求項１２】
請求項１１の分析のための装置であって、少くとも、ＤＮＡチップとともに、ＤＮＡチップへの赤外線照射手段と赤外分光スペクトルの検出手段とを備えた顕微赤外測定システムとを具有することを特徴とする顕微赤外ＤＮＡ解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、医療・医学、環境、化学工業、食品等の広範囲な分野において有用な、新しい分子認識チップ、ＤＮＡチップ、それらの製造方法とこれを用いた分析方法、そしてそのための装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、医療、医学等の分野においては迅速に、かつ簡便に検体のＤＮＡや標的分子を検出、分析するための手段として、固体基板にプローブのＤＮＡや分子を固定したバイオ・化学チップが注目され、すでに実用化されてきてもいる。
【０００３】
そしてこれらのチップを用いた分析方法として、光学的な方法も提案されており、たとえば最も一般的に用いられるＤＮＡチップでは、検体ＤＮＡ分子に蛍光分子をラベルとして付加している（たとえば特許文献１−３参照）。
【０００４】
しかしながら、これまでのバイオ・化学チップにおいては、このような蛍光分子によるラベル化処理を省くことができないため、検出、分析の迅速化には大きな障害があり、たとえばテイラーメード医療についても、その一般への普及にとって大きな障害になっている。
【０００５】
このような状況において、本願発明者らは、生物学や医学の研究、さらには臨床検査、創薬などのために、迅速にかつ簡便にＤＮＡハイブリダイゼーション反応を検出するための手段として赤外吸収分光法を用いることを検討し、その効果について報告するとともに、この赤外分析法の適用をも考慮して、シリコン表面に自己組織化膜を作成してプローブＤＮＡを固定化することを検討してきている（非特許文献１−２）。また、赤外分光により、金基板上に固定化したプローブＤＮＡを用いてＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出することもすでに報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
ただ、これまでの検討においても、実用化を可能として迅速、高効率に、簡便に、しかも高精度、高感度での検出、分析を実現するまでには至っておらず、光分析の手段として期待されている赤外分光測定の場合にも、その感度を大幅に向上させるための手段については今後の課題とされてきた。
【特許文献１】特開２００２−１５３２９８号公報
【特許文献２】特開２００２−２１８９７４号公報
【特許文献３】特開２００４−９３３３０号公報
【非特許文献１】応用物理学関係連合講演会講演予稿集  Vol, 51, No.３，p.1431(2004.3.28)
【非特許文献２】応用物理学関係連合講演会講演予稿集  Vol. 51, No. 2, P.854(2004.3.28)
【非特許文献３】Langumuir, 18(2002), 4460-4464
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明は、上記のとおりの背景から、迅速に、かつ簡便にＤＮＡハイブリダイゼーション反応をはじめとする生物、化学の反応等の検出、分析を高感度に可能とする分析用チップとこれを用いた分析方法等の新しい技術手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明は、上記の課題を解決するものとして以下の技術手段であることを特徴としている。
【０００９】
第１：基板表面に垂直方向の細孔が配設されている多孔質層を有する基板において、細孔の内壁部にはプローブ分子が固定されている分子認識チップ。
【００１０】
第２：複数の細孔が、基板表面の平面位置として相互に間隔を介して規則的に配設されている上記の分子認識チップ。
【００１１】
第３：複数の細孔の各々には、互いに同種もしくは異種のプローブ分子が固定されている上記の分子認識チップ。
【００１２】
第４：複数の細孔は基板表面の平面領域として区分され、区分された領域毎に互いに異種のプローブ分子が固定されている上記の分子認識チップ。
【００１３】
第５：固定されているプローブ分子がＤＮＡであって、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無の検出から塩基配列の特定を可能とするＤＮＡチップを構成している上記いずれかの分子認識チップ。
【００１４】
第６：細孔内壁部には、単分子膜を介してプローブＤＮＡが固定化されている分子認識チップ。
【００１５】
第７：上記いずれかの分子認識チップの製造方法であって、陽極酸化により多孔質層を形成し、生成された細孔の内壁部にプローブ分子を固定する分子認識チップの製造方法。
【００１６】
第８：細孔の内壁部に単分子膜を形成し、次いでこの単分子膜にプローブ分子を結合する上記の分子認識チップの製造方法。
【００１７】
第９：プローブ分子がＤＮＡであるＤＮＡチップを製造することを特徴とする分子認識チップの製造方法。
【００１８】
第１０：上記いずれかの分子認識チップを用いての検体分子の分析方法であって、分子認識チップへの検体分子含有溶液の接触による検体分子とプローブ分子との反応もしくは結合の形成と、該反応もしくは結合の形成を光により検出もしくは分析する分子認識チップ分析方法。
【００１９】
第１１：プローブ分子がＤＮＡであるＤＮＡチップを用いての分析方法であって、ＤＮＡチップへの検体ＤＮＡ含有溶液を接触させ、赤外分光スペクトルを測定し、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出し、塩基配列の特定を可能としている分子認識チップ分析方法。
【００２０】
第１２：第１１の発明の分析のための装置であって、少くとも、ＤＮＡチップとともに、ＤＮＡチップへの赤外線照射手段と赤外分光スペクトルの検出手段とを備えた顕微赤外測定システムとを具有することを特徴とする顕微赤外ＤＮＡ解析装置。
【発明の効果】
【００２１】
上記のとおりの本願発明によれば、平板状表面の場合に比べて、多孔質化により表面積を増大させ、固定化するプローブ分子数を顕著に増大させることができること、そして赤外分光検出を用いる場合には検体分子にラベルを付加する必要がないため、迅速に、かつ簡便にＤＮＡハイブリダイゼーション反応をはじめとする生物、化学の反応等の検出、分析を高感度に可能とすることができる。また、分析用チップとしての製造も容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本願発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが以下にその実施の形態について説明する。
【００２３】
本願発明の分子認識チップは、たとえば図１にその概要を拡大して例示したように、基板（１）の表面に垂直方向の細孔（２）が配設されている多孔質層（１１）を有し、細孔（２）の内壁部（２１）には、たとえばシリコンの多孔質層でプローブＤＮＡの場合を説明している図２のようにプローブ分子が固定されている。
【００２４】
なお、ここで、細孔（２）の方向が垂直方向であるとのことは、幾何学的に厳密に垂直であることに限定されているものではない。細孔（２）に傾斜や湾曲があったとしても、細孔（２）が基板（１）の表面や横方向平面に対して実質的に垂直、縦方向に配設されていればよい。
【００２５】
多孔質層（１１）における細孔（２）は、その内径（Ｄ）や深さについて特に限定的ではないが、製造やチップとしての分析への使用等の観点からは、内径（Ｄ）が２ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲とすることが好適に考慮される。このような多孔質層（１１）の形成には、公知の陽極酸化法が典型的な好ましい方法として考慮される。
【００２６】
たとえば陽極酸化法により多孔質層（１１）を形成するための基体については基板（１）の１部を構成しているものであってもよいし、基板（１）とは同種または異種の別体であってもよい。別体の場合には、形成された多孔質層（１１）が基板（１）に積層一体化されたものとすることができる。
【００２７】
基体、そしてこの基体にその表面に垂直方向の細孔（２）を有する多孔質層（１１）としては、プローブ分子を細孔（２）の内壁部に固定化できるものであれば各種のものでよく、さらに好適には、たとえば陽極酸化法等により簡便に細孔（２）形成が可能であるもの、プローブ分子と検体分子との反応や結合を検知する手段によって、たとえば後述する赤外線等の光検知の手段によって容易に検知、分析可能であるものが考慮される。
【００２８】
代表的な例としては、シリコンを示すことができ、さらにはアルミニウム、ＩｎＰ（インジウム・リン）、Ｎｂ（ニオブ）等を陽極酸化も可能な例として示すことができる。
【００２９】
多孔質層（１１）における細孔（２）の大きさ、つまり内径（Ｄ）や深さについては、たとえば陽極酸化法の条件の選択によって適宜に制御することができる。細孔（２）の配置位置についても同様である。
【００３０】
細孔（２）の配置については、基板表面の平面位置として複数の細孔（２）が相互に間隔を置いて配置されていてよく、この配置は、所定のパターンに従うものとして規則的であってもよい。そして、複数の細孔（２）の各々には、互いに同種もしくは異種のプローブ分子が固定されていてよく、複数の細孔（２）は基板表面の平面領域として区分され、区分された領域毎に互いに異種のプローブ分子が固定されていてもよい。
【００３１】
多孔質層（１１）を支持する基板（１）は各種であってよい。たとえば前記のシリコン等でもよいし、形成した多孔質層（１１）を載置するようにした樹脂やガラス、セラミックス、金属等の各種のものであってよい。
【００３２】
実際の製造方法としては上記のとおりの陽極酸化による方法が好適である。すなわち、陽極酸化により多孔質層を形成する。次いで細孔の内壁部にはプローブ分子を固定する。
【００３３】
プローブ分子の固定については、細孔の内壁部に単分子膜を形成し、次いでこの単分子膜にプローブ分子を結合することも考慮される。
【００３４】
これは、多孔質層（１１）の細孔（２）の内壁面へのプローブ分子の固定を容易とするためである。たとえばシリコンの場合、この際には、陽極酸化により形成した細孔（２）の内壁面は水素で終端されているため疎水性であることから、単分子膜の形成のためには親水性表面とすることが望まれる。このためには、たとえば紫外線（ＵＶ）照射により内壁面を酸化して親水化することが考慮される。単分子膜の形成については、たとえば、自己組織化膜（ＳＡＭ）法によることができる。
【００３５】
プローブ分子は各種であってよく、標的分子との反応に対応して選択することができる。たとえばその代表例は、プローブ分子がＤＮＡであるＤＮＡチップを構成することである。
【００３６】
プローブ分子については、たとえばプローブＤＮＡの場合、後述の実施例に示したＳＨ基を付加したものだけでなく、ＮＨ2基を付加したものなど、用いる固定化の方法によって多様なバリエーションが可能である。また、プローブ分子には、検体分子と共役結合やイオン結合、錯結合等を形成する各種の分子が用いられてよい。
【００３７】
本願発明においては、以上のような分子認識チップを用いての検体分子の分析方法であって、分子認識チップへの検体分子含有溶液の接触による検体分子とプローブ分子との反応もしくは結合の形成と、該反応もしくは結合の形成を光により検出もしくは分析することを特徴とする分析方法が実現される。
【００３８】
たとえば、プローブ分子がＤＮＡであるＤＮＡチップを用いての分析方法であって、ＤＮＡチップへの検体ＤＮＡ含有溶液を接触させ、赤外分光スペクトルを測定し、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出し、塩基配列の特定を可能とする。
【００３９】
この赤外分光法については本願発明者がこれまでにも様々に提案してきている方法や装置、そしてそれらのバリエーションが採用されてよい。
【００４０】
赤外分光法によれば従来のような蛍光物質のラベル化は全く必要がないという特徴もある。
【００４１】
そして、この分析のための装置であって、たとえば図３のように、少くとも、ＤＮＡチップとともに、ＤＮＡチップへの赤外線照射手段と赤外分光スペクトルの検出手段とを備えた顕微赤外測定システムとを具有する顕微赤外ＤＮＡ解析装置が提供される。この例においては透過型のシステムが示されているが、基板や多孔質層の材質、形状等の選択によって反射型のシステムとしてもよい。
【００４２】
そこで以下により具体的に実施例を示し、さらに詳しく本願発明について説明する。
【実施例】
【００４３】
＜Ａ＞Au(金)電極上にn+型シリコン基板（面方位は100）を載置し、フッ化水素（濃度50％）とエタノール（濃度99.5％）の1対1の混合溶液を用いて、電流密度を38.5 mA/cm2に保ち裏面より30Wの白色光を当てながらシリコンを陽極酸化した。その後、フッ化水素（濃度50％）とエタノール（濃度99.5％）の1対6の混合溶液を用いて、一定の電流密度128.5 mA/cm2で裏面より30Wの白色光を当てながら電界研磨を行ない、多孔質シリコン層を剥離し、剥離した多孔質シリコン層をアクリル板上に固定した。
【００４４】
多孔質シリコン層の厚みは、30μｍであり、細孔の大きさは、平均で、内径50ｎｍである。
【００４５】
作成した多孔質シリコン層の細孔の内壁部の表面は、水素で終端されているため、疎水性となり、以後の自己組織化膜の作成が難しいことから、185nmと254nmを含む低圧水銀灯を用いた紫外線照射により表面を酸化して、親水性表面に変換した。
【００４６】
この親水化処理が実際に進んでいることは、図４（ａ）（ｂ）に示した赤外分光測定の結果から確認される。紫外線照射にともなって、Si-H振動に帰属される吸収ピークが減少して、Si-OHに帰属されるピークが増大していることがわかる。なお、親水化処理は、濃硫酸と過酸化水素水との混合液に浸漬させる方法等によってもよい。
【００４７】
そこで、親水化処理を行った後、次式に示したように、体積比2%でMPTMSを脱水メタノールに溶かした溶液に、窒素雰囲気中で12時間反応させ自己組織化膜を作成した。
【００４８】
【化１】
2006105879.tif 000002
MPTMS分子が表面に付着していることは、図５に示したように、赤外測定で、所定の官能基の振動ピークが観測されることから確認された。
【００４９】
最後に、末端をSH基に修飾したプローブＤＮＡ分子（アデニン20量体）の重水溶液（濃度96μM）中に、作成した多孔質シリコン層を24時間浸漬して次式に従ってプローブDNAを固定化した。
【００５０】
【化２】
2006105879.tif 000003
プローブDNAが固定化されていることは、図6の赤外測定から確認した。
【００５１】
また、固定化されたDNAを24時間重水に浸漬したところ、表面にはDNA検出に十分な量のプローブDNAが残存していることを確認した。
【００５２】
この保持時間は実用上十分なものである。
【００５３】
＜B＞固定化したプローブDNAに相補的な配列を持つDNAを加えて、実際に、作成した多孔質DNAチップをハイブリダイゼーションが検出出来ることを以下のように確認した。
【００５４】
すなわち、アデニンの20量体のプローブDNAを多孔質チップに固定化した後、相補的な塩基対であるチミンの20量体を含む重水溶液(濃度約500μM)に24時間浸したときの波数2000〜1250cm-1に注目したときの顕微赤外分光測定の結果が図7である。2M NaCl重水溶液でリンスしたあとに、アデニンとチミンのハイブリダイゼーションによる赤外ピークが明瞭に測定されている。同様の実験を多孔質化していない平板のSi基板を用いて行うと、プローブDNAならびに検体DNAのいずれの赤外スペクトルも全く得ることは出来なかった。このことは、多孔質化することが赤外検出に不可欠であることを示している。
【００５５】
また、参照実験として、SH基を付けたアデニン20量体を基板に固定する前に、チミン20量体をハイブリダイゼーションさせた後に、基板に固定化した場合の実験を行った（図8）リンス後のスペクトルは、図7の実証実験で得られたスペクトルと良く対応していることから、実証実験において確かにハイブリダイゼーションが観測されていることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本願発明の分子認識チップの概要を示した斜視図と一部拡大断面図である。
【図２】細胞内壁部へのプローブＤＮＡの固定化の例を示した概要図である。
【図３】顕微赤外ＤＮＡ解析装置の概要を示した図である。
【図４】親水化処理について示した赤外分光測定の結果を例示した図である。
【図５】ＭＰＴＭＳ分子の付着について赤外分光測定の結果として例示した図である。
【図６】プローブＤＮＡの固定化を赤外分光の結果として例示した図である。
【図７】ＤＮＡハイブリダイゼーションについて赤外分光の結果として示した図である。
【図８】参照実験を赤外分光測定の結果として示した図である。
【符号の説明】
【００５７】
１  基板
１１  多孔質層
２  細孔
２１  内壁部
【図１】
2006105879.tif 000004
【図２】
2006105879.tif 000005
【図３】
2006105879.tif 000006
【図４】
2006105879.tif 000007
【図５】
2006105879.tif 000008
【図６】
2006105879.tif 000009
【図７】
2006105879.tif 000010
【図８】
2006105879.tif 000011