【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含んでなり、天然のプロモータの転写制御下での前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記プロモータが前記多糖分解酵素ポリペプチドの発現増加を引き起こすものである、第一の異種のポリヌクレオチド部分；及び 
分泌ポリペプチドをコードする配列を含有する第二の異種ポリヌクレオチド部分であって、前記第一のポリヌクレオチド部分及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分が発現しない場合に於ける多糖分解酵素の産生と比べて、組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生の増加を引き起こすものである第二の異種ポリヌクレオチド部分、を含んでなる組換えホスト細胞。
【請求項２】 
前記産生の増加が前記多糖分解酵素の活性の増大、前記多糖類の量の増加又は活性の増大及び量の増加の組み合わせを含むものである、請求項１に記載の組換えホスト細胞。
【請求項３】 
前記多糖分解酵素ポリペプチドが分泌される、請求項１又は２に記載の組換えホスト細胞。
【請求項４】 
前記ホスト細胞が細菌細胞である、請求項１乃至３の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項５】 
前記ホスト細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項４に記載の組換えホスト細胞。
【請求項６】 
前記ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項５に記載の組換えホスト細胞。
【請求項７】 
前記ホスト細胞がエンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科から選択される、請求項６に記載の組換えホスト細胞。
【請求項８】 
前記ホスト細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）及びクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）から成る群より選択される、請求項７に記載の組換えホスト細胞。
【請求項９】 
前記エシェリヒアが、 Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）Ｂ、Ｅ．コリ ＤＨ５α、Ｅ．コリ Ｋ０４（ＡＴＣＣ  ５５１２３）、Ｅ．コリ Ｋ０１１（ＡＴＣＣ  ５５１２４）、Ｅ．コリ Ｋ０１２（ＡＴＣＣ  ５５１２５）及びＥ．コリ ＬＹ０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６６）、Ｋ．オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）Ｍ５Ａ１（ＡＴＣＣ  ６８５６４）、及びＫ．オキシトカ Ｐ２（ＡＴＣＣ  ５５３０７）から成る群より選択される、請求項８に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１０】 
前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、及びこれらの組合せ、から成る群より選択される、請求項１乃至９の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項１１】 
前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項１０に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１２】 
前記多糖分解酵素がｃｅｌＺ遺伝子の発現産物である、請求項１０又は１１に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１３】 
前記ｃｅｌＺ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来である、請求項１２に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１４】 
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つのｐｕｌ遺伝子又はｏｕｔ遺伝子を含んで成る、請求項１乃至１３の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項１５】 
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテリアセアエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項１乃至１４の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項１６】
前記第二の異種のポリヌクレオチドがエルウィニア−アウト遺伝子（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｏｕｔ）を含んで成る、請求項２に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１７】 
前記細菌細胞が、Ｋ．オキシトカ、Ｅ．カロトボーラ（ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｅ．カロトボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプティカ（ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）、及びＥ．クリサンセミから成る群より選択される、請求項１５に記載の組換えホスト細胞。
【請求項１８】 
前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項１乃至１６の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項１９】 
前記サロゲート・プロモータが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１若しくは２、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１７に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２０】
前記組換えホスト細胞がエタノール生成性である、請求項１乃至１８の何れかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項２１】
多糖分解酵素を外来のサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする異種のポリヌクレオチド部分を含んで成る、請求項１９に記載の組換えエタノール生成性ホスト細胞。
【請求項２２】  
前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項２０に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２３】 
前記サロゲート・プロモータが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１若しくは２、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含んで成る前記サロゲート・プロモータである、請求項２１に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２４】   
ＳＥＱ  ＩＤ：１若しくは２、又はその断片のポリヌクレオチド配列を含むサロゲート・プロモータの転写制御下に第一のポリペプチドをコードする配列を含んで成る第一の異種のポリヌクレオチド部分；及び
第二の異種ポリヌクレオチド部分が分泌ポリペプチドをコードする配列を含んでなり、前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分が発現しない場合に於ける前記第一のポリペプチドの産生と比べて、ホスト細胞による第一のポリペプチドの産生の増加を引き起こすものである、組換えエタノール生成性グラム陰性細菌ホスト細胞。
【請求項２５】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が、異種のａｄｈ及びｐｄｃ遺伝子を含んで成る、請求項１９又は２３に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２６】 
前記第一のポリペプチドが分泌される、請求項２３に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項２７】 
前記組換え細菌ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項２３又は２４に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項２８】   
前記組換え細菌ホスト細胞が、エンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項２５に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項２９】 
前記組換え細菌ホスト細胞が、エシェリヒア及びクレブシエラから成る群より選択される、請求項２６に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３０】   
前記エシェリヒア及びクレブシエラが、Ｅ．コリ Ｂ、Ｅ．コリ ＤＨ５α、Ｅ．コリ Ｋ０４（ＡＴＣＣ  ５５１２３）、Ｅ．コリ Ｋ０１１（ＡＴＣＣ  ５５１２４）、Ｅ．コリ Ｋ０１２（ＡＴＣＣ  ５５１２５）、Ｅ．コリ ＬＹ０１、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１及びＫ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ  ５５３０７）から成る群より選択される、請求項２７に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３１】 
前記第一のポリペプチドが多糖分解酵素である、請求項２３乃至２８に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３２】 
前記産生増加が活性の増大を含むものである、請求項２９に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３３】   
前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α−グルコシダーゼ、エンド−１，４−α−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、から成る群より選択される、請求項２９又は３０に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３４】   
前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項３１に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３５】   
前記グルカナーゼがｃｅｌＺ遺伝子の発現産物である、請求項３２に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３６】 
前記ｃｅｌＺ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来である、請求項３３に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３７】 
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つのｐｕｌ遺伝子又はｏｕｔ遺伝子を含んで成る、請求項２３乃至３４の何れかに記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３８】 
前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテリアセエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項２３乃至３５に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項３９】
前記細菌細胞が、Ｋ．オキシトカ、Ｅ．カロトボーラ（ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｅ．カロトボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプティカ（ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）、及びＥ．クリサンセミから成る群より選択される、請求項３６に記載の組換え細菌ホスト細胞。
【請求項４０】 
オリゴ糖を提供するステップ；及び
請求項１乃至２２の何れかに記載の組換えホスト細胞に、前記オリゴ糖を接触させるステップ
を含んで成るオリゴ糖を酵素分解する方法であって、前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖が酵素分解されるよう、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成を増加させる、方法。
【請求項４１】   
前記方法が、水溶液中で行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】 
前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴ糖が、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せから成る群より選択される、請求項３８乃至４０の何れかに記載の方法。
【請求項４４】 
組換えホスト細胞中の目的遺伝子の発現を増加させることのできるサロゲート・プロモータを特定する方法であって、 一生物のゲノムポリヌクレオチドを一つ又はそれ以上の断片に断片化するステップと、 前記目的遺伝子を、少なくとも一つの断片の転写制御下に置くステップと、 前記断片及び目的遺伝子をホスト細胞内に導入するステップと、 前記目的遺伝子の発現が増加したことで、前記断片がサロゲート・プロモータであることが示されている、発現が増加した組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、方法。
【請求項４５】
多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含んで成り、その天然のプロモーターの転写制御下で前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記プロモータが前記多糖分解酵素の発現増加を引き起こすものである、第一の異種のポリヌクレオチド部分を、前記ホスト細胞に導入するステップ；及び 
分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチド部分を前記ホスト細胞に導入するステップ；
を含むものであり、
前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分の発現が、その天然のプロモータの転写制御下及び前記第二のポリヌクレオチド部分の発現の欠如に於ける前記多糖分解酵素の発現と比較して、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生が増加するものであり、
同時糖化発酵に用いることができる、請求項１乃至２２の何れかに記載の組換えホスト細胞を作製する方法 。
【請求項４６】 
ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタ。
【請求項４７】 
請求項４４に記載のベクターを含んで成る組換えホスト細胞。
【請求項４８】
ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 前記ベクタが安定に組み込まれた組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、組換えホスト細胞を作成する方法。
【請求項４９】 
ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 多糖分解酵素を発現している組換えホスト細胞を特定するステップとを含む、組換えホスト細胞で多糖分解酵素を発現させる方法。
【請求項５０】
前記組換えホスト細胞がエタノール生成性である、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項５１】 
請求項１９乃至２２の何れかに記載のエタノール生成性組換えホスト細胞に前記オリゴ糖源を接触させるステップを含み、
前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖源が酵素分解されて発酵してエタノールになるよう、前記エタノール生成性組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成が増加するものである、
オリゴ糖源からエタノールを生成する方法。
【請求項５２】
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が異種のａｄｈ及びｐｄｃ遺伝子を含んで成る、請求項４８又は４９に記載の方法
【請求項５３】 
前記エタノール生産性組換えホスト細胞が第二の異種のポリヌクレオチド部分として、少なくとも一つのｐｕｌ遺伝子又はｏｕｔ遺伝子を含んで成る、組換えホスト細胞を用いる請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】 
前記方法が水溶液中で行われる、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５５】 
前記オリゴ糖がリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せから成る群より選択される、請求項４９乃至５１の何れかに記載の方法。
【請求項５６】 
前記第一の異種のポリヌクレオチド部分が、ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）であるか、又は、ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）由来である、請求項４９乃至５２の何れかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
別の実施例では、前記ホスト細胞は細菌細胞であり、好ましくはグラム陰性通性嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科である。別の関連する実施例では、組換えホスト細胞は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属又はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のものであり、好ましくは株E. コリ（ｃｏｌｉ）Ｂ（ＡＴＣＣ  １１３０３）、Ｅ． コリＤＨ５α、 Ｅ．コリＫ０４（ＡＴＣＣ  ５５１２３）、Ｅ．コリＫ０１１（ＡＴＣＣ  ５５１２４）、Ｅ．コリＫ０１２（ＡＴＣＣ  ５５１２５）、Ｅ．コリＬＹ０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６６）、K. オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）Ｍ５Ａ１（ＡＴＣＣ  ６８５６４）、Ｋ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ  ５５３０７）である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
一実施例では、前記ホスト細胞は細菌細胞であり、好ましくはグラム陰性通性嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ科由来である。関連する実施例では、前記組換えエタノール生成性ホスト細胞は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属又はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のものであり、好ましくは株Ｅ．コリＢ（ＡＴＣＣ  １１３０３）、Ｅ．コリＤＨ５α、Ｅ．コリＫ０４（ＡＴＣＣ  ５５１２３）、Ｅ．コリＫ０１１（ＡＴＣＣ  ５５１２４）、Ｅ．コリＫ０１２（ＡＴＣＣ  ５５１２５）、Ｅ．コリＬＹ０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６６）、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１（ＡＴＣＣ  ６８５６４）、Ｋ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ  ５５３０７）である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
三番目の態様では、本発明は、第一のポリペプチドをコードする配列を含有する第一の異種のポリヌクレオチド部分と、分泌ポリペプチドをコードする配列を含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分と、を含有する組換えエタノール生成性グラム陰性細菌ホスト細胞を特徴とし、前記第一の異種のポリヌクレオチドは、サロゲート・プロモータの転写制御下にあり、このホスト細胞による前記第一のポリペプチドの産生が増加させられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
別の実施例では、前記組換えホスト細胞は通性嫌気性細菌細胞である。関連する実施例では、前記ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ科由来、好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属又はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のものであり、より好ましくは株Ｅ．コリＢ（ＡＴＣＣ  １１３０３）、Ｅ．コリＤＨ５α、Ｅ．コリＫ０４（ＡＴＣＣ  ５５１２３）、Ｅ．コリＫ０１１（ＡＴＣＣ  ５５１２４）、Ｅ．コリＫ０１２（ＡＴＣＣ  ５５１２５）、又はＥ．コリＬＹ０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６６）、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１（ＡＴＣＣ  ６８５６４）、Ｋ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ  ５５３０７）である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
好適な実施例では、本発明は、エタノール生成性でもある組換えホストを利用するものである。実施例の一つでは、この組換えホストはグラム陰性細菌である。別の実施例では、この組換えホストはエンテロバクテリアセエ科由来である。例えば、言及をもってここに編入する米国特許第５，８２１，０９３号のエタノール生成性ホストが適したホストであり、具体的には、Ｅ．コリ株Ｋ０４（ＡＴＣＣ  ５５１２３）、Ｋ０１１（ＡＴＣＣ  ５５１２４）、及びＫ０１２（ＡＴＣＣ  ５５１２５）、及びクレブシエラ−オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）株Ｍ５Ａ１がある。その代わりに、例えば、ジモモナス−モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）など、効率的なエタノール生成生物由来のエタノール生成遺伝子を導入することで、本発明の非エタノール生成性ホスト（例えば上記の株など）をエタノール生成性ホストに変換してもよい。標準的な技術を用いたこの種類の遺伝子操作の結果、糖をエタノールに効率的に発酵させることのできる組換えホストが得られる。加えて、ＬＹ０１エタノール耐性株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６６）を公開済みＰＣＴ国際出願ＷＯ９８／４５４２５号に説かれたように利用してもよく、この公開済み出願を言及をもってここに編入することとする（また、例えばＹｏｍａｎｏら（１９９８）Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．＆Ｂｉｏ．２０：１３２−１３８を参照されたい）。