(57)【要約】  移植に適したヒトまたはヒト化された組織および臓器が本明細書において開示される。ホスト動物の遺伝子編集は、ドナー幹細胞による失われた遺伝情報の相補のためのニッチを提供する。標的臓器の成長および／または分化に関与する遺伝子をノックアウトまたは弱体化するためにホストゲノムを編集すること、および胚段階にある動物にドナー幹細胞を注入し、臓器の成長および発生に関する失われた遺伝情報を相補すること。その結果は、相補された組織（ヒト／ヒト化された臓器）がドナーの遺伝子型および表現型に適合したキメラ動物である。かかる臓器は一世代で作製することができ、および患者自身の身体から幹細胞を採取および作製することができる。本明細書に開示されるように、相補組織のための「ニッチ」を生成する細胞または胚において複数の遺伝子を同時に編集することにより、上記を行うことが可能である。脊椎動物の細胞または胚において、複数の遺伝子を、標的化ヌクレアーゼおよび相同組み換え修復（ＨＤＲ）の鋳型を使用した編集に対する標的とすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のヒト細胞を有する非ヒト胚を備えたキメラ胚であって、１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する前記非ヒト胚の１個以上の内因性遺伝子の両アレルが破壊されており、および１個以上の対応するヒト臓器または組織の発生に関与する前記ヒト細胞の１個以上の遺伝子が、前記１個以上の破壊された内因性遺伝子の機能を相補し、それによって、前記キメラ胚から発生した動物は、少なくとも１個のヒト臓器または組織を備えており、この場合において前記内因性遺伝子は、Ｐａｘ２および／またはＰａｘ８を備え、前記ヒトの臓器または組織は、ヒト腎細胞を備えている、キメラ胚。
【請求項２】
前記非ヒト胚は、非ヒト脊椎動物胚である、請求項１に記載のキメラ胚。
【請求項３】
前記非ヒト脊椎動物胚は、偶蹄目の胚または非ヒト霊長類の胚である、請求項２に記載のキメラ胚。
【請求項４】
前記非ヒト脊椎動物胚は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、甲殻類、および魚類からなる群から選択される、請求項２に記載のキメラ胚。
【請求項５】
前記非ヒト脊椎動物胚は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、またはウサギの胚である、請求項２に記載のキメラ胚。
【請求項６】
１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する前記非ヒト胚の前記１個以上の内因性遺伝子が、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮＳ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）、ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９（Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ＺＦＮｓ）、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする分子、合成人工染色体、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合体、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、またはそれらの組み合わせにより破壊されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラ胚。
【請求項７】
前記１個以上の内因性遺伝子が、Ｃａｓ９により破壊されている、請求項６に記載のキメラ胚。
【請求項８】
前記ヒト細胞が、少なくとも１個のドナー細胞から誘導され、および前記少なくとも１個のドナー細胞が、胚性幹細胞、組織特異的幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラ胚。
【請求項９】
前記破壊が、遺伝子の編集、ノックアウト、１個以上のＤＮＡ残基の挿入、１個以上の塩基の欠失、または１個以上のＤＮＡ残基の挿入と欠失の両方を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のキメラ胚。
【請求項１０】
前記破壊が、１個以上のＤＮＡ残基の置換を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のキメラ胚。
【請求項１１】
前記破壊が、１個以上のＤＮＡ残基の置換からなる、請求項１０に記載のキメラ胚。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキメラ胚から発生した動物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラ胚から発生した動物から採取されたヒトの組織または臓器。
【請求項１４】
キメラ胚の作製方法であって、
ａ）少なくとも１個の非ヒト細胞または非ヒト胚において、１個以上の臓器または組織の発生に関与する１個以上の内因性遺伝子の両アレルを破壊すること、
ｂ）工程ａ）が非ヒト細胞で行われた場合、前記細胞をクローン化し、胚を生成すること、および
ｃ）工程ａ）または工程ｂ）の胚に、少なくとも１個のヒト細胞を導入することであって、前記ヒト細胞が、前記１個以上の臓器または組織の発生に関与する遺伝子を１個以上担持しており；それによって、キメラ胚を生成することであって、前記内因性遺伝子は、Ｐａｘ２および／またはＰａｘ８を備え、ならびに前記ヒトの臓器または組織は、ヒト腎細胞を備えていること、を含む、キメラ胚の作製方法。
【請求項１５】
前記非ヒト胚は、非ヒト脊椎動物胚である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒト脊椎動物胚は、偶蹄目の胚または非ヒト霊長類の胚である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記非ヒト脊椎動物胚は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１個のヒトドナー細胞が、胚性幹細胞、組織特異的幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記キメラ胚を動物の子宮に移植し、前記キメラ胚はヒト細胞を備えたキメラ動物へと発生する、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記キメラ動物から前記ヒト細胞を採取することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒト細胞を、その必要のあるヒト患者に移植することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１個のヒト細胞が、前記ヒト患者により提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する前記非ヒト胚の前記１個以上の内因性遺伝子が、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮＳ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）、ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９（Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ＺＦＮｓ）、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする分子、合成人工染色体、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合体、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、またはそれらの組み合わせにより破壊されている、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、Ｃａｓ９である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記内因性遺伝子のうちの１個に対する相同性を有する鋳型配列を有する相同組み換え修復（ＨＤＲ）の鋳型を導入し、前記鋳型配列は、前記内因性遺伝子配列の少なくとも一部を置き換え、前記内因性遺伝子を破壊することをさらに含む、請求項２３〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記内因性遺伝子のうちの１個に対する相同性を有する鋳型配列を各々有する複数の相同組み換え修復（ＨＤＲ）の鋳型を導入し、前記各鋳型配列は、前記内因性遺伝子配列のうちの１個の少なくとも一部を置き換え、前記内因性遺伝子を破壊することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記破壊が、前記内因性遺伝子の１個以上のＤＮＡ残基の置換を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記破壊が、前記内因性遺伝子の１個以上のＤＮＡ残基の置換からなる、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１４〜２９のいずれか１項に記載の方法を使用して作製されたキメラ胚またはキメラ動物。
【請求項３０】
非ヒトホスト動物においてヒトもしくはヒト化された臓器または組織を作製する方法であって、
ａ）非ヒト胚の少なくとも１個の細胞において、臓器または組織の発生に関与する１個以上の内因性遺伝子の両アレルを破壊すること、
ｂ）工程ａ）が前記動物ホストの細胞で行われた場合、前記細胞をクローン化し、胚を生成すること、および
ｃ）工程ａ）または工程ｂ）の胚に、少なくとも１個のヒト細胞を導入することによりキメラホスト胚を生成することであって、前記ヒト細胞が、対応するヒトの臓器または組織の発生に関与する遺伝子を１個以上担持している、生成すること、を含み、
前記キメラホスト胚から発生する動物は、ヒトもしくはヒト化された臓器または組織を備えており、それによって、非ヒトホスト動物においてヒトもしくはヒト化された臓器または組織を生成し、および前記内因性遺伝子は、Ｐａｘ２および／またはＰａｘ８を備え、前記ヒトの臓器または組織は、ヒト腎細胞を備えている、方法。
【請求項３１】
前記非ヒト胚は、非ヒト脊椎動物胚である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記非ヒト脊椎動物胚は、偶蹄目の胚または非ヒト霊長類の胚である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記非ヒト脊椎動物胚は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１個のヒト細胞が、胚性幹細胞、組織特異的幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、または人工多能性幹細胞である、請求項６４〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラ動物から前記ヒト細胞を採取することをさらに含む、請求項３０−３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒト細胞を、その必要のあるヒト患者に移植することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１個のヒト細胞が、前記ヒト患者により提供される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記内因性遺伝子のうちの１個に対する相同性を有する鋳型配列を有する相同組み換え修復（ＨＤＲ）の鋳型を導入し、前記鋳型配列は、前記内因性遺伝子配列の少なくとも一部を置き換え、前記内因性遺伝子を破壊することをさらに含む、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記内因性遺伝子のうちの１個に対する相同性を有する鋳型配列を各々有する複数の相同組み換え修復（ＨＤＲ）の鋳型を導入し、前記各鋳型配列は、前記内因性遺伝子配列のうちの１個の少なくとも一部を置き換え、前記内因性遺伝子を破壊することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記破壊が、前記内因性遺伝子の１個以上のＤＮＡ残基の置換を含む、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記破壊が、前記内因性遺伝子の１個以上のＤＮＡ残基の置換からなる、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４２】
１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する前記非ヒト胚の前記１個以上の内因性遺伝子が、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮＳ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）、ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９（Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ＺＦＮｓ）、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする分子、合成人工染色体、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合体、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、またはそれらの組み合わせにより破壊されている、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する前記非ヒト胚の前記１個以上の内因性遺伝子が、Ｃａｓ９により破壊されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の方法を使用して作製されたキメラ動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／２４７，１００号明細書の優先権を主張するものであり、当該出願の全内容は参照により本明細書に援用される。
本出願の主題は、２０１５年１１月５日に公開された国際特許出願公開ＷＯ２０１５／１６８１２５Ａ１、２０１６年９月９日に公開されたＷＯ２０１６／１４１２３４、２０１６年６月３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４０３７８、および２０１６年６月３０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４０４３１に開示された内容に関連し得る。上述の各国際特許出願の全内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府支援研究の下でなされた本発明に関する権利の主張
本発明は、国防総省に与えられた助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−１５−１−０３９３、ならびに国立衛生研究所に与えられた助成金番号１Ｒ４３ＨＬ１２４７８１−０１Ａ１および１Ｒ４３ＧＭ１１３５２５−０１の下、政府のサポートを受けて為されたものである。政府は、本発明に一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
過去１００年間において、科学者および医師は、多くの加齢性疾患および障害が始まる少なくとも人生の最後の数十年まで、人々の生存および健康の維持に大きく貢献してきた。これら疾患の治療のために、米国では毎年、１兆ドル超が費やされている。臓器移植が効果的であるが利用可能な臓器はあまりにも少なく、多くの症例で免疫不適合が問題を生じさせている。たとえば２００３年以降、臓器移植を待ちながら７，０００人を超える米国人が死亡している。
【０００４】
様々な幹細胞による動物体細胞の遺伝子相補は、治療、移植、および再生医療における使用のためのヒト化された組織および臓器の操作および生産を可能とする。現在、移植用臓器の供給源は、機械的または生物的のいずれかであり、ヒトのドナー；死体に由来するか、ごく限定された場合では、他の哺乳類種、多くの場合ブタからの異種移植となる。不幸なことに、すべての場合で、ホスト身体による拒絶を受け、および／または他の副作用を惹起し得る。
【発明の概要】
【０００５】
以下の１〜４４の連続して列挙される段落は、本発明の様々な態様および関連実施形態を記載するものである。
１．少なくとも１個のヒト細胞を有する非ヒト胚を備えたキメラ胚であって、１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する当該非ヒト胚の１個以上の内因性遺伝子の両アレルが破壊されており、および１個以上の対応するヒト臓器または組織の発生に関与する当該ヒト細胞の１個以上の遺伝子が、当該１個以上の破壊された内因性遺伝子の機能を相補し、それによって、キメラ胚から発生した動物は、少なくとも１個のヒト臓器または組織を備えており、この場合において当該内因性遺伝子は、Ｐａｘ２および／またはＰａｘ８を備え、当該ヒトの臓器または組織は、ヒト腎細胞を備えている。
２．非ヒト胚は、非ヒト脊椎動物胚である、段落１に記載のキメラ胚。
３．非ヒト脊椎動物胚は、偶蹄目の胚または非ヒト霊長類の胚である、段落２に記載のキメラ胚。
４．非ヒト脊椎動物胚は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、甲殻類、および魚類からなる群から選択される、段落２に記載のキメラ胚。
５．非ヒト脊椎動物胚は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、またはウサギの胚である、段落２に記載のキメラ胚。
６．１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する非ヒト胚の１個以上の内因性遺伝子が、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮＳ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）、ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９（Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ＺＦＮｓ）、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする分子、合成人工染色体、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合体、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、またはそれらの組み合わせにより破壊されている、段落１〜５のいずれか１つに記載のキメラ胚。
７．１個以上の内因性遺伝子が、Ｃａｓ９により破壊されている、段落６に記載のキメラ胚。
８．ヒト細胞が、少なくとも１個のドナー細胞から誘導され、および少なくとも１個のドナー細胞が、胚性幹細胞、組織特異的幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、または人工多能性幹細胞である、段落１〜７のいずれか１つに記載のキメラ胚。
９．破壊が、遺伝子の編集、ノックアウト、１個以上のＤＮＡ残基の挿入、１個以上の塩基の欠失、または１個以上のＤＮＡ残基の挿入と欠失の両方を含む、段落１〜８のいずれかに記載のキメラ胚。
１０．破壊が、１個以上のＤＮＡ残基の置換を含む、段落１〜８のいずれかに記載のキメラ胚。
１１．破壊が、１個以上のＤＮＡ残基の置換からなる、段落１０に記載のキメラ胚。
１２．段落１〜１１のいずれか１つに記載のキメラ胚から発生した動物。
１３．段落１〜１２のいずれか１つに記載のキメラ胚から発生した動物から採取されたヒトの組織または臓器。
１４．以下を含む、キメラ胚の作製方法
ａ）少なくとも１個の非ヒト細胞または非ヒト胚において、１個以上の臓器または組織の発生に関与する１個以上の内因性遺伝子の両アレルを破壊すること；
ｂ）工程ａ）が非ヒト細胞で行われた場合、細胞をクローン化し、胚を生成すること；および
ｃ）工程ａ）または工程ｂ）の胚に、少なくとも１個のヒト細胞を導入することであって、ヒト細胞が、１個以上の臓器または組織の発生に関与する遺伝子を１個以上担持しており；それによって、キメラ胚を生成することであって、内因性遺伝子は、Ｐａｘ２および／またはＰａｘ８を備え、ならびにヒトの臓器または組織は、ヒト腎細胞を備えていること。
１５．非ヒト胚は、非ヒト脊椎動物胚である、段落１４に記載の方法。
１６．非ヒト脊椎動物胚は、偶蹄目の胚または非ヒト霊長類の胚である、段落１５に記載の方法。
１７．非ヒト脊椎動物胚は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、段落１５に記載の方法。
１８．少なくとも１個のヒトドナー細胞が、胚性幹細胞、組織特異的幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、または人工多能性幹細胞である、段落１４〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．キメラ胚を動物の子宮に移植し、キメラ胚はヒト細胞を備えたキメラ動物へと発生する、段落１４〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．キメラ動物からヒト細胞を採取することをさらに含む、段落１９に記載の方法。
２１．ヒト細胞を、その必要のあるヒト患者に移植することをさらに含む、段落２０に記載の方法。
２２．少なくとも１個のヒト細胞が、ヒト患者により提供される、段落２１に記載の方法。
２３．１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する非ヒト胚の１個以上の内因性遺伝子が、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮＳ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）、ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９（Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ＺＦＮｓ）、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする分子、合成人工染色体、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合体、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、またはそれらの組み合わせにより破壊されている、段落１４〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．方法が、Ｃａｓ９である、段落２３に記載の方法。
２５．内因性遺伝子のうちの１個に対する相同性を有する鋳型配列を有する相同組み換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）の鋳型を導入し、鋳型配列は、内因性遺伝子配列の少なくとも一部を置き換え、内因性遺伝子を破壊することをさらに含む、段落２３〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．内因性遺伝子のうちの１個に対する相同性を有する鋳型配列を各々有する複数の相同組み換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）の鋳型を導入し、各鋳型配列は、内因性遺伝子配列のうちの１個の少なくとも一部を置き換え、内因性遺伝子を破壊することをさらに含む、段落２５に記載の方法。
２７．破壊が、内因性遺伝子の１個以上のＤＮＡ残基の置換を含む、段落２５または２６に記載の方法。
２８．破壊が、内因性遺伝子の１個以上のＤＮＡ残基の置換からなる、段落２５または２６に記載の方法。
２９．段落１４〜２９のいずれか１つに記載の方法を使用して作製されたキメラ胚またはキメラ動物。
３０．以下を含む、非ヒトホスト動物においてヒトもしくはヒト化された臓器または組織を作製する方法：
ａ）非ヒト胚の少なくとも１個の細胞において、臓器または組織の発生に関与する１個以上の内因性遺伝子の両アレルを破壊すること；
ｂ）工程ａ）が動物ホストの細胞で行われた場合、細胞をクローン化し、胚を生成すること；および
ｃ）工程ａ）または工程ｂ）の胚に、少なくとも１個のヒト細胞を導入することによりキメラホスト胚を生成することであって、ヒト細胞が、対応するヒトの臓器または組織の発生に関与する遺伝子を１個以上担持しており；
キメラホスト胚から発生する動物は、ヒトもしくはヒト化された臓器または組織を備えており、それによって、非ヒトホスト動物においてヒトもしくはヒト化された臓器または組織を生成し、および内因性遺伝子は、Ｐａｘ２および／またはＰａｘ８を備え、ヒトの臓器または組織は、ヒト腎細胞を備えている。
３１．非ヒト胚は、非ヒト脊椎動物胚である、段落３０に記載の方法。
３２．非ヒト脊椎動物胚は、偶蹄目の胚または非ヒト霊長類の胚である、段落３１に記載の方法。
３３．非ヒト脊椎動物胚は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、段落３１に記載の方法。
３４．少なくとも１個のヒト細胞が、胚性幹細胞、組織特異的幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、または人工多能性幹細胞である、段落６４〜８４のいずれか１つに記載の方法。
３５．キメラ動物からヒト細胞を採取することをさらに含む、段落３０−３４に記載の方法。
３６．ヒト細胞を、その必要のあるヒト患者に移植することをさらに含む、段落３５に記載の方法。
３７．少なくとも１個のヒト細胞が、ヒト患者により提供される、段落３６に記載の方法。
３８．内因性遺伝子のうちの１個に対する相同性を有する鋳型配列を有する相同組み換え修復（ＨＤＲ）の鋳型を導入し、鋳型配列は、内因性遺伝子配列の少なくとも一部を置き換え、内因性遺伝子を破壊することをさらに含む、段落３０〜３８のいずれか１つに記載の方法。
３９．内因性遺伝子のうちの１個に対する相同性を有する鋳型配列を各々有する複数の相同組み換え修復（ＨＤＲ）の鋳型を導入し、各鋳型配列は、内因性遺伝子配列のうちの１個の少なくとも一部を置き換え、内因性遺伝子を破壊することをさらに含む、段落３８に記載の方法。
４０．破壊が、内因性遺伝子の１個以上のＤＮＡ残基の置換を含む、段落３８または３９に記載の方法。
４１．破壊が、内因性遺伝子の１個以上のＤＮＡ残基の置換からなる、段落３８または３９に記載の方法。
４２．１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する非ヒト胚の１個以上の内因性遺伝子が、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮＳ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）、ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９（Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ＺＦＮｓ）、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする分子、合成人工染色体、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合体、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲｉ、またはそれらの組み合わせにより破壊されている、段落３０〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．１個以上の内因性臓器または組織の発生に関与する非ヒト胚の１個以上の内因性遺伝子が、Ｃａｓ９により破壊されている、段落４２に記載の方法。
４４．段落３０〜４３のいずれか１つに記載の方法を使用して作製されたキメラ動物。
【０００６】
本発明の上述の態様および実施形態のいずれかの特定の要素は、本発明のその他の態様および実施形態の要素と組み合わせられることができ、または置き換えられることができる。さらに、本開示のある態様および実施形態に関連した利点は、これら態様および実施形態に照らして記載されているが、他の態様および実施形態もかかる利点を示し得、また態様および実施形態のすべてが、本発明の範囲内にあるかかる利点を必ずしも示す必要はない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、組織／臓器移植の課題と、臓器移植用のヒト細胞および動物の遺伝子操作によりもたらされる解決法を図示する概略図である。
【図２】図２Ａは、単一編集（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｄｉｔｓ）を使用した、２つのノックアウトに対しホモ接合性の動物を作製するプロセスを示す。  図２Ｂは、同時に単一編集を行うことによる、複数編集を有する動物を作製する仮説のプロセスを示す。
【図３】図３は、Ｆ０世代の創始体を確立するために使用された多重遺伝子編集を示す。
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｄは、ブタのＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒγ（またはＩＬ２Ｒｇ）の多重遺伝子編集を示す。図４Ａは、トランスフェクションの３日後の細胞群に対する、非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）、および相同組み換え修復ＨＤＲの効率を決定するためのサーベイヤー（Ｓｕｖｅｙｏｒ）解析および制限断片長多形（ＲＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析を示すグラフである。図４Ｂは、トランスフェクションの１１日後の細胞群に対する、相同組み換え修復に関するＲＦＬＰ解析を示すグラフである。図４Ｃは、ＩＬ２Ｒγ、ＲＡＧ２またはその両方でＨＤＲ陽性のコロニー割合を示すグラフである。図４Ａにおいて「Ｃ」と示される群由来の細胞が播種された。図４Ｄは、ＩＬ２ＲγおよびＲＡＧ２に対し、２μｇおよび１μｇのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮＳ）ｍＲＮＡ３０量、および１μＭのＨＤＲ鋳型を各々に対して用いてトランスフェクトされた細胞のコロニー解析を示すグラフである。コロニーの遺伝子型分布を以下に示す。本出願において、ＩＬ２ＲγとＩＬ２Ｒｇは相互交換可能に使用されている。
【図４−２】同上。
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｄは、ブタのＡＰＣおよびｐ５３の多重遺伝子編集を示す。図５Ａは、トランスフェクションの３日後の細胞群に対する、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、および相同組み換え修復（ＨＤＲ）の効率を決定するためのサーベイヤー（Ｓｕｖｅｙｏｒ）解析およびＲＦＬＰ解析を示すグラフである。図５Ｂは、トランスフェクションの１１日後の細胞群に対する、相同組み換え修復に関するＲＦＬＰ解析を示すグラフである。図５Ｃおよび図５Ｄは、ＡＰＣ、ｐ５３またはその両方でのＨＤＲに関して、示される細胞群（図５Ａにおいて、「Ｃ」および「Ｄ」と示される）に由来する陽性コロニーの割合を示すグラフである。３個以上のＨＤＲアレルを有するコロニーを以下に列記する。
【図５−２】同上。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、５‐遺伝子多重ＨＤＲ効率に対する、オリゴヌクレオチドＨＤＲ鋳型濃度の効果を示す。指定量のブタＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒγ、ｐ５３、ＡＰＣおよびＬＤＬＲ指向性ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを、２μＭ（図６Ａ）または１μＭ（図６Ｂ）の各同系ＨＤＲ鋳型とともにブタ線維芽細胞に共トランスフェクトした。ＮＨＥＪとＨＤＲの割合は、サーベイヤーアッセイおよびＲＦＬＰアッセイにより測定された。
【図７−１】図７Ａおよび図７Ｂは、５−遺伝子多重ＨＤＲ効率に対する、オリゴヌクレオチドＨＤＲ鋳型濃度の効果に関する実験データのプロットを示す、５−遺伝子多重データセットである。指定量のブタＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒγ、ｐ５３、ＡＰＣおよびＬＤＬＲ指向性ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを、２μＭまたは１μＭの各同系ＨＤＲ鋳型とともにブタ線維芽細胞に共トランスフェクトした。ＮＨＥＪとＨＤＲの割合は、サーベイヤーアッセイおよびＲＦＬＰアッセイにより測定された。５−遺伝子多重ＨＤＲからのコロニー遺伝子型：コロニー遺伝子型はＲＦＬＰ解析により評価された。図７Ａにおいて、各線は、各特定座位での１つのコロニーの遺伝子型を表している。３つの遺伝子型が特定され得た；ヘテロ接合性またはホモ接合性のＨＤＲの予測ＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片を有するもの、それに加えて、挿入または欠失（インデル）アレルの指標となる、サイズの可視偏移を有する第二のアレル。特定の座位で編集を有するコロニーの割合は、各列の下に示す。図７Ｂは、０〜５個の座位で編集されたコロニー数の集計を示す。
【図７−２】同上。
【図８−１】図８Ａおよび図８Ｂは、５−遺伝子多重ＨＤＲ効率に対する、オリゴヌクレオチドＨＤＲ鋳型濃度の効果を含む第二の実験に関する実験データのプロットを示す、別の５−遺伝子多重化データセットである。第二の５−遺伝子多重化試験のコロニー遺伝子型。図８Ａにおいて、各線は、各特定座位での１つのコロニーの遺伝子型を表している。３つの遺伝子型が特定され得た；ヘテロ接合性またはホモ接合性のＨＤＲの予測ＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片を有するもの、それに加えて、挿入または欠失（インデル）アレルの指標となる、サイズの可視偏移を有する第二のアレル。特定の座位で編集を有するコロニーの割合は、各列の下に示す。  図８Ｂは、０〜５個の座位で編集されたコロニー数の集計を示す。
【図８−２】同上。
【図９−１】図９Ａおよび図９Ｂは、コロニー遺伝子型を示す別の５−遺伝子多重化試験データセットである。図９Ａにおいて、各線は、各特定座位での１つのコロニーの遺伝子型を表している。３つの遺伝子型が特定され得た；ヘテロ接合性またはホモ接合性のＨＤＲの予測ＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片を有するもの、それに加えて、挿入または欠失（インデル）アレルの指標となる、サイズの可視偏移を有する第二のアレル。特定の座位で編集を有するコロニーの割合は、各列の下に示す。図９Ｂは、０〜５個の座位で編集されたコロニー数の集計を示す。
【図９−２】同上。
【図１０】図１０は、所望される遺伝子ノックアウトまたはアレル選択をもたらす標的化ヌクレアーゼを用いたＦ０世代キメラの作製プロセスを示す。
【図１１】図１１は、正常な表現型を有するＦ０世代動物、ならびに発育障害（ＦＴＴ：ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ）の表現型および遺伝子型を有する子孫物の確立を示す。
【図１２】図１２は、ドナー胚の遺伝的特徴を有する配偶子を用いたキメラ動物の作製プロセスを示す。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４、およびＭＥＳＰ１の３個の標的化座位での多重編集を示す。図１３Ａは、実験の概略である。図１３Ｂは、配列番号１〜３にそれぞれ列記されるＮＫＸ２−５、ＧＡＴＡ４、およびＭＥＳＰ１を用いた、遺伝子の標的化を示す。図１３Ｃは、実験に対するアッセイ結果を示す。各標的遺伝子のオリゴ配列。新規ヌクレオチドは大文字で表されている。ＰＴＣは、ボックス内の明色文字であらわされ、新規ＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＦＬＰ部位は下線が引かれている。
【図１４】図１４は、ＴＡＬＥＮｓおよびＲＧＥＮｓの組み合わせを使用した多重遺伝子編集を示す。トランスフェクトされた細胞のアッセイは両部位でのＲＦＬＰにより明らかにされるＨＤＲにより評価される。
【図１５−１】図１５Ａ〜図１５Ｅは、単為生殖ブタ胚盤胞へのヒト臍帯血幹細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の組み込みを示す画像である。図１５Ａは、胚盤胞の位相差画像である。図１５Ｂは、胚盤胞内の細胞のＤＡＰＩ画像である。図１５Ｃは、ヒト核抗原（ＨＮＡ：ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）染色である。図１５Ｄは、重ね合わせたＤＡＰＩ画像とＨｕＮｕ画像である。図１５Ｅは、重ね合わせた図１５Ａ〜図１５Ｃの画像である。図１５Ｆは、内部細胞塊（ＩＣＭ：ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）、栄養外胚葉（ＴＥ：ｔｒｏｐｈｅｃｔｏｄｅｒｍ）、または卵割腔（ＣＡ：ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌ  ｃａｖｉｔｙ）におけるＨｕＮｕ細胞の定量化を示すグラフである。図１５Ｇは、卵母細胞の活性化後、６日目、７日目、および８日目のＨＮＡ細胞の増殖を示すグラフである。６日目にｈＵＣＢＳＣが注入された。
【図１５−２】同上。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｃは、キメラのヒト‐ブタ胎仔を示す画像である。図１６Ａは、単為生殖ブタ胚盤胞にｈＵＣＢＳＣを注入後、妊娠２８日目のキメラ胎仔を示す画像である。図１６Ｂは、ヒト核抗原（ＨＮＡ）を赤で染色し、ＤＡＰＩを青で染色した免疫組織化学染色画像である。図１６Ｃは、図１６Ｂの免疫組織化学染色に対する対照であり、染色中、一次抗体が加えられていない。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ブタ遺伝子のＴＡＬＥＮ介在ノックアウトを示す。図１７Ａは、ＬＭＸＡ１、ＮＵＲＲ１、およびＰＩＴＸ３の切断部位を示す概略図である。  図１７Ｂは、二方向矢印で示されるように、ＴＡＬＥＮ切断産物を示す電気泳動画像である。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｆは、ヒト臍帯血幹細胞を用いた、ブタ胚盤胞のＰＩＴＸ３ノックアウトの相補の眼の効果を示す画像である。図１８Ａ〜図１８Ｆの画像は、妊娠６２日目の胎仔のブタの眼の肉眼的形態を示す。図１８Ａおよび図１８Ｂは、野生型ブタの眼を示す。図１８Ｃおよび図１８Ｄは、ＰＩＴＸ３ノックアウトブタの小さな眼を示す。図１８Ｅおよび図１８Ｆは、ヒト臍帯血幹細胞（ｈＵＣＢＳＣ）相補を用いたＰＩＴＸ３ノックアウトの大きな眼を示す。図１８Ａ、図１８Ｃ、および図１８Ｅの矢印は、各胎仔の眼の位置を指している。
【図１９−１】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＥＴＶ２のＴＡＬＥＮ介在ノックアウトを示す。図１９Ａは、遺伝子編集を検出するために使用された三段階ＰＣＲアッセイを示す概略図である。プライマーａ−ｄからの増幅により、欠失アレルの存在が示唆された。ヘテロ接合性クローンとホモ接合性クローンを識別するために、プライマーａ−ｂとｃ−ｄを使用して、野生型アレルを増幅した。ａ−ｄ産物が存在し、ａ−ｂ、ｃ−ｄ産物が存在しない場合のみ、そのクローンは欠失アレルに対しホモ接合性であるとみなされた。図１９Ｂは、ホモ接合性欠失の立証を示す電気泳動画像である。上述の基準を満たすクローンがグリーンボックスに囲まれている。
【図１９−２】同上。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｈは、ブタＥＴＶ２の欠失が、マウスのＥｔｖ２突然変異表現型を再現したことを示す。図２０Ａは、野生型Ｅ１８．０ブタ胚を示す。および図２０Ｂは、同じ発生段階のＥＴＶ２ノックアウト胚を示す。差し込み図は、尿膜の拡大図を示す。突然変異体の血管網形成の欠落を伴う異常な全体形状を示している（差し込み図）。図２０Ｃ〜図２０Ｈは、それぞれ、ＡおよびＢにおいて示された胚の尿膜を通る切片（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）、心臓の位置を通る切片（図２０Ｅおよび図２０Ｆ）、および胴体部分を通る切片（図２０Ｇおよび図２０Ｈ）であり、内皮マーカーであるＴｉｅ２、心臓系マーカーのＧａｔａ４、および核対比染色の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色された。野生型の尿膜は、高度に血管が発達し、Ｔｉｅ２陽性内皮膜があり、血液が満たされていた（図２０Ｃ、矢印）。一方で突然変異体はこれら一連を欠いていた（図２０Ｄ）。野生型胚（Ｅ、Ｇ）において、心内膜、主動脈（ＣＶ）、および背部大動脈（ＤＡ）ははっきりと見える。対照的に、ＥＴＶ２ヌル胚はこれら構造を完全に欠き、ただしＧａｔａ４（緑）により示される心臓前駆体と消化管は存在していた（それぞれ、ＦおよびＨ）。スケールバー：１０００μｍ（図２０ＡおよびＢ）、２００μｍ（図２０ＡとＢの差し込み図）、１００μｍ（図２０Ｃ〜図２０Ｈ）。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）を用いたＥＴＶ２突然変異ブタ胚の相補を示す免疫組織化学染色画像である。ＥＴＶ２突然変異胚盤胞はＳＣＮＴにより作製され、そして桑実胚期に１０個のｈｉＰＳＣｓが注入され、続いてホルモン同期させた未経産ブタに導入された。図２１Ａは、ヒト特異的Ａｌｕ配列を使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、ヒトＣＤ３１（図２１Ｂ）、ＨＮＡ（図２１Ｃ、赤）およびヒトｖＷＦ（図２１Ｃ、緑）に対する免疫組織化学染色画像である。四角で囲まれた領域は、下のパネルで拡大されている。矢頭は陽性細胞を指している。血管様構造の形成を示す。すべてのスケールバーは５０ミクロンを示している。ｎｔ：神経管、ｎｏｔｏ：脊索、ｓｏｍ：体節。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｄは、Ｎｋｘ２−５とＨａｎｄＩＩ（ｄＨａｎｄとしても知られている）のダブルノックアウトは、両方の心室（ｒｖとｌｖ）を欠き、１つの小さな未発達の心房（ｄｃ）を有していることを示す画像である。図２２Ａは、野生型動物を示す。図２２Ｂは、Ｎｋｘ２．５−／−動物を示す。図２２Ｃは、ｄＨａｎｄ−／−動物を示す。図２２Ｄは、ＮＫｘ２．５−／−  ｄＨａｎｄ−／−のダブルノックアウト動物を示す。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、ブタ線維芽細胞におけるＮＫＸ２−５とＨＡＮＤＩＩのダブルノックアウトを示す。図２３Ａは、示されている各遺伝子のコード配列の概略である；色が変わるところはエクソン境界を示している。青の領域（下）は、各転写因子のＤＮＡ結合ドメインを示し、三角形はＴＡＬＥＮｓ結合部位の位置を示す。図２３Ｂは、ＨＡＮＤＩＩとＮＫＸ２−５の両アレルＫＯに関する、線維芽細胞コロニーのＲＦＬＰ解析の電気泳動画像を示す。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｃは、Ｎｋｘ２−５／ＨＡＮＤＩＩ／ＴＢＸ５の三重ノックアウトブタ胚が無心症であることを示している。図２４Ａは、Ｇａｔａ４タンパク質の免疫組織化学染色の画像を示す。野生型胚（上）は陽性で染色された一方で、三重ノックアウトブタ胚（下）は心臓を欠き、Ｅ１８．０でＧａｔａ４（心臓マーカー）免疫組織化学染色が陽性の細胞は本質的に無かった（ｈ、心臓およびｆｇ、前腸）。図２４Ｂは、野生型胚（上）および三重ノックアウト胚（下）に対するＤＡＰＩ染色の画像を示す。図２４Ｃは、図２４Ａと図２４Ｂを重ね合わせた画像を示す。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｂは、Ｍｙｏｄ発現を表す画像である。Ｍｙｆ５、Ｍｙｏｄ、およびＭｒｆ４は、骨格筋の主制御因子であり、発生中および成人において骨格筋に限定されている。本明細書において、Ｍｙｏｄ−ＧＦＰトランスジェニック発現がＥ１１．５で体節、隔壁、および確立された骨格筋に限定されていることを示す（図２５Ａ）。図２５Ｂは、３５Ｓ−標識ＭｙｏＤリボプローブを使用したＥ１３．５（妊娠中期）マウス胚の傍矢状切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである。背筋、肋間筋、および四肢の筋肉群における発現を示す。
【図２６−１】図２６Ａ〜図２６Ｃは、ブタのＭＹＯＤ、ＭＹＦ５、およびＭＹＦ６の遺伝子のノックアウトを示す。図２６Ａは、それを示す概略図である。ブタのＭＹＯＤ、ＭＹＦ５、およびＭＹＦ６（ＭＲＦ４としても知られる）遺伝子に対し、ＴＡＬＥＮペアが設計された。ＴＡＬＥＮ結合部位（赤い矢頭で示されている）は、各遺伝子に対し重要な基礎（＋）ヘリックス−ループ−ヘリックス（ＨＬＨ）ドメインの上流であった。ＴＡＬＥＮ結合部位を以下に示す（赤い矢印で示される）。相同組み換え修復（ＨＤＲ）により未成熟停止コドンに対し標的化されたアミノ酸を黄色の矢印で示す。図２６Ｂは、ＲＦＬＰ解析により確認されたＨＤＲ事象を示す電気泳動画像を示す。ＨＤＲ鋳型は、未成熟停止コドンと新規制限酵素認識部位（ＨｉｎｄＩＩＩ）を導入し、ＨＤＲ事象の解析が容易になるように設計された。各遺伝子に対する対象領域をＰＣＲにより増幅し、ＲＦＬＰをトランスフェクト細胞群に対し評価した。黒矢頭は、切断されていないアレルまたは野生型アレルを示し、一方で白矢頭はＨＤＲアレルを示す。ＭＹＯＤ、ＭＹＦ５、およびＭＹＦ６に対するＨＤＲが陽性であるアレルの割合はそれぞれ１４％、３１％、および３６％であった。図２６Ｃは、三重ノックアウトを確認するための電気泳動画像と配列解析グラフを示す。これらの群は、個々のコロニーを単離するために播種された。７６８個のコロニーのうち３８個（４．９％）が、４個以上のＲＦＬＰ事象を示し、配列解析によりさらに解析された。未成熟停止コドンを組み込んだＨＤＲ、またはフレームシフトを生じさせ、その後に未成熟停止コドンを生じさせるｉｎ／ｄｅｌｓを組み込んだＨＤＲのいずれかにより、５個のコロニーが、３つすべての遺伝子に対しホモ接合性にノックアウトであることが特定された。ＭＹＯＤ／ＭＹＦ５／ＭＹＦ６の三重ノックアウトクローンのＲＦＬＰ解析および配列解析の例を示す。
【図２６−２】同上。
【図２７】図２７Ａおよび図２７Ｂは、ＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４三重ノックアウト（ＫＯ）の表現型を示す。Ｅ１８．０で、野生型（Ｗｔ）胚は輪郭が明白な体節（ｓ）、デスミン陽性（赤）の筋節（ｍ）、および発達した筋肉組織を有していた（図２７Ａ）。加えて、発達した心菅は、強いデスミンシグナル（ｈ）を示した。対照的に、ＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４  ＫＯ胚は、筋節形成の欠落を示した一方で、心臓はデスミン陽性を維持していた（図２７Ｂ）。
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｃは、ＧＦＰ標識卵割球で相補されたＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４ヌル胚の相補を示す。図２８Ａは、ＧＦＰ標識卵割球で相補されたＥ２０ブタＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４ヌル胚を示す画像である。天然ＧＦＰは、肝臓および胚の卵黄嚢で観察される。図２８Ｂは、ＧＦＰ標識卵割球で相補されたＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４ヌル胚（Ｅ２０）に由来するブタ肝臓の切片を示す画像である。天然ＧＦＰは、肝臓の類洞に見ることができる。図２８Ｃは、ＧＦＰ標識卵割球で相補されたＥ２０ブタＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４ヌル胚に由来する卵黄嚢のＰＣＲを示す棒グラフである（胚１［図２８Ａおよび図２８Ｂに示される］、３、５）。ＧＦＰ標識ブタ線維芽細胞は陽性対照であり、一方でＷＴブタの肝臓は陰性対照である。
【図２９−１】図２９Ａ〜図２９Ｅは、ＰＤＸ１−／−ブタの作製を示す。図２９Ａは、ブタＰＤＸ１座位のＴＡＬＥＮ遺伝子編集を示す概略図である。図２９Ｂは、ＲＦＬＰ解析により、非改変のヘテロ接合性ノックアウト（白矢頭）またはホモ接合性ノックアウト（黒矢頭）が特定されたことを示す電気泳動画像を提示する。クローンの４１％が、ＰＤＸ１に対しホモ接合性のノックアウトであった。図２９Ｃおよび図２９Ｄは、ＷＴ  Ｅ３０胚（図２９Ｃ）における膵臓と比較した、クローン化Ｅ３２  Ｐｄｘ１−／−  ブタ胚（図２９Ｄ）における無膵臓（△）を示す画像である。図２９Ｅは、野生型胎仔とＰＤＸ−／−突然変異体の胎仔の間の発生期β細胞の比較を示す画像である。Ｗｔ  Ｅ３０胎仔のＰ膵臓、Ｓ胃、Ｄ十二指腸。
【図２９−２】同上。
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｃは、遺伝子編集によるＨＨＥＸノックアウト（ＫＯ）の作製を示す。図３０Ａは、ＨＨＥＸ遺伝子のノックアウトの概略図である。ＨＨＥＸ遺伝子は、４個のエクソンから構成される。ＨｉｎｄＩＩＩ  ＫＯアレルを遺伝子編集によりＨＨＥＸ遺伝子のエクソン２に挿入した。図３０Ｂは、ＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＦＬＰアッセイによる、トランスフェクト群の遺伝子編集の効率測定を示す電気泳動画像を提示する。新規ＨｉｎｄＩＩＩ  ＫＯアレル（切断産物により示される、白三角）を有する染色体の割合を、ゲル上に示す。図３０Ｃは、またＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＦＬＰアッセイを使用した線維芽細胞クローンのスクリーニングを示す電気泳動画像を提示する。ホモ接合性ＫＯクローンはアスタリスクで示されている。
【図３１】図３１Ａおよび図３１Ｂは、妊娠３０日目の野生型（図３１Ａ）およびＨＨＥＸ  ＫＯブタ（図３１Ｂ）の胚における肝臓の発生を示す。図３１Ｂにおいて、ＨＨＥＸ  ＫＯ試料には肝臓の発生が無いことが記載される。同じ在胎期間の野生型対照を図３１Ａに示す。
【図３２】図３２Ａ〜図３２Ｆは、ＮＫＸ２．１のノックアウトにより、胎仔の肺の消失がもたらされることを示す。図３２Ａ〜図３２Ｃは、野生型動物において肺が発生することを示す画像である。図３２Ｄ〜図３２Ｆは、ＮＫＸ２．１ノックアウト動物において、肺が発生し損ねることを示す画像である。
【図３３】図３３は、内臓器官を示す１６．４Ｔの胎仔ブタのＭＲ画像を提示する。頭殿長がおよそ２０ｍｍのとき、ブタの在胎期間は３０日である。
【図３４】図３４は、ＰＡＸ２およびＰＡＸ８が腎臓の発生を制御することを示す概略図を提示する。
【図３５】図３５Ａ〜図３５Ｄは、ブタＰＡＸ２／ＰＡＸ８が、腎臓発生の消失を呈したことを示す画像を提示する。図３５Ａおよび図３５Ｃは、妊娠３０日目（ＧＥ）の野生型ブタの胎仔を示す。図３５Ｂおよび図３５Ｄは、妊娠３０日目のＰＡＸ２／ＰＡＸ８ヌルのブタ胎仔を示す。ＰＡＸ２／ＰＡＸ８ヌルのブタにおいて腎臓は認められなかった。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示は、たとえば心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、および骨格筋などの生きた真のヒトの臓器；ならびにたとえば神経細胞およびオリゴデンドロサイト、免疫細胞、ならびに血管生成のための内皮細胞などの生きた真のヒトの細胞を操作および作製するための方法を提供する。この目的を達成するための戦略は、特定の臓器の発生に重要な、主要遺伝子を破壊することである。特定の遺伝子をノックアウトする遺伝子編集技術を使用してこれら遺伝子を評価し、それら遺伝子が単独で、または組み合わされて、マウスおよびブタの胚盤胞でノックアウトされた場合に特定の臓器または細胞型を発生させ得るかを決定する。胚盤胞での遺伝子ノックアウトはニッチを生成することができ、その中は、望ましい臓器または細胞の発生に寄与する正常な同系幹細胞または異系幹細胞が占有することとなっている（図１）。
【０００９】
ＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲ、および合成ブタ人工染色体を使用した新規の遺伝子編集技術および遺伝子調節技術を使用して、望ましい標的遺伝子をノックアウトし、オフターゲット効果を最小化することができる他の遺伝子の機能を増強させる。ヒト幹細胞を吟味し、どのタイプの幹細胞が、特定のヒト臓器および細胞の着実な複製を生じさせ得るかを決定する。この問題は、ブタ胚盤胞の内部細胞塊、およびキメラ胎仔の発生に対する様々なヒト幹細胞の関与を評価することにより対処される。真のヒト臓器および細胞の作製を成功させるためには、これら３つの技術領域間の相互作用が重要である。
【００１０】
定義
本発明をさらに解説する前に、本明細書、実施例および添付の請求の範囲で使用される特定の用語を簡便性を目的としてここに集めている。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「ヒト化」とは、非ヒト動物から採取された臓器または組織を指し、その動物のタンパク質配列および遺伝的相補性は、当該非ヒトホストよりも、ヒトにより類似している。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「臓器」とは、普遍的機能を果たすために構造単位中で連結されている組織の集まりを指す。本明細書で使用される場合、「組織」とは、類似した細胞の集まりを指し、それらがまとまって特定の機能を実行する。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）」とは、遺伝子編集に有用な別の技術であり、大きな認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）が特徴のエンドデオキシリボヌクレアーゼである；結果として、この部位は概して、任意の所与のゲノム中で一か所のみ存在する。たとえば、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼにより認識される１８塩基対の配列が偶然に１か所存在するためには、平均してヒトゲノムの２０倍の大きさのゲノムを必要とする（しかし、一塩基の不一致を有する配列は、ヒトサイズのゲノム当たり、およそ３回発生する）。ゆえにメガヌクレアーゼは、最も特異的な天然型制限酵素とみなされている。
【００１４】
「標的遺伝子」という用語は、たとえばＴＡＬＥＮｓやＣＲＩＳＰＲなどのエンドヌクレアーゼ系の設計により、エンドヌクレアーゼの攻撃対象に選択された染色体ＤＮＡの部位を指す。
【００１５】
遺伝子編集とは、本明細書で当該用語が使用された場合、遺伝子を選択し、改変することを指す。無作為挿入、遺伝子トラッピング、およびその類似技術などは遺伝子編集ではない。標的部位での遺伝子ノックアウト、核酸付加、核酸除去、全機能の削除、アレルの遺伝子移入、発現亢進性改変（ｈｙｐｅｒｍｏｒｐｈｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、発現低下性改変（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、および１個以上のアレルの交換が遺伝子編集の例である。
【００１６】
本明細書において、「ノックアウト、不活化、および破壊された」ならびにその変化形の用語は、遺伝子発現産物が任意の手段により排除され、または大きく減少し、それによってその遺伝子発現がもはや全体として動物に対し大きな影響を与えなくなることを指すために相互交換可能に使用される。これら用語は場合により別段では、その遺伝子の役割が本質的に排除されることなく、観察可能な程度にその役割を減少させることを指すために使用される。これら用語は概して、機能性遺伝子産物の形成を阻害することを指す。遺伝子産物は、その通常の（野生型の）機能を果たす場合にのみ、機能性である。遺伝子の破壊は、当該遺伝子によりコードされた機能性因子の発現を阻害し、その遺伝子によりコードされた配列における、ならびに／または動物中でその遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーターにおける、１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む。破壊される遺伝子は、たとえば、動物ゲノムから当該遺伝子の少なくとも一部を除去すること、当該遺伝子によりコードされた機能性因子の発現を阻害するために当該遺伝子を改変すること、ＲＮＡ干渉、または外因性遺伝子によりドミナントネガティブ因子を発現させること、などにより破壊されることができる。
【００１７】
アレルの「交換」という用語は、インデルまたは一部の場合においては縮重置換を除く他の変化を伴わずに、天然アレルから外因性アレルへ変化させることを意味する。
【００１８】
「縮重置換」という用語は、コドン中の塩基が、コードされたアミノ酸を変化させずに別の塩基へと変化することを意味する。縮重置換は、エクソンまたはイントロン中であるように選択されてもよい。縮重置換の１つの用途は、遺伝子移入された配列の存在に関する検査を容易にするための制限酵素部位を作製することである。内因性アレルは本明細書において天然アレルとも呼称される。
【００１９】
「遺伝子」という用語は広義であり、機能性産物を生成するために発現される染色体ＤＮＡを指す。
【００２０】
「選択」という用語は、さらなる用途のために細胞を特定および単離する能力を指すために使用される；他の多くの方法と本プロセスを識別する非常に大きな利点である発現可能なレポーター遺伝子がそのプロセスにおいてどこにも無かった。
【００２１】
「胚盤胞」という用語は本明細書において広義に使用され、２細胞期から約３週目までの胚を指す。
【００２２】
「胚」という用語は広義に使用され、受精卵から誕生までの動物を指す。
【００２３】
「配偶子形成」という用語は、１倍体生殖細胞（卵子と精子）の生成を意味し、各々、各親の生殖系細胞から、親の遺伝的相補の半分を担持している。精子の生成は、精子形成である。受精中に精子と卵子が融合することにより、２倍体ゲノムを有する受精卵細胞が生じる。
【００２４】
「配偶子細胞」という用語は、卵子と精子の前駆細胞を指し、典型的には生殖細胞または精原細胞である。
【００２５】
「大型脊椎動物」という用語は、サル、家畜、イヌおよびネコを指す。
【００２６】
「家畜」という用語は、たとえばウシ、ヒツジ、ヤギ、鳥類（ニワトリ、七面鳥）、ブタ、水牛、および魚類など慣習的に食物用に飼育されている動物を指す。
【００２７】
「同系」という用語は、たとえば受容体とそのリガンドなど、典型的には相互作用する２つの生体分子を指す。ＨＤＲプロセスの文脈において、生体分子のうちの１つは、意図される、すなわち同系のＤＮＡ部位またはタンパク質部位に結合する配列を用いて設計されてもよい。
【００２８】
「挿入」という用語は広義に使用され、染色体への文字通りの挿入、または修復用鋳型としての外因性配列の使用のいずれかを意味する。
【００２９】
「外因性核酸」という用語は、細胞または胚に加えられる核酸を意味し、当該核酸は、自然に当該細胞中にある核酸配列と同じであっても、異なっていてもよい。「核酸断片」という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの一部を含む。細胞または胚は、たとえば非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物および魚類からなる群から選択されてもよい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結される」とは、標的核酸の転写が可能となるような方法、または促進されるような方法で核酸配列に対して制御性領域を配置することを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「アレルの交換」とは、内因性アレルの上に外因性アレルを複製する非減数分裂プロセスを指す。遺伝子はアレルを有している。特定の座位に２個の同一のアレルが存在する場合、遺伝子型はホモ接合性であり、その２個のアレルが異なっていればヘテロ接合性である。アレルは、特定の染色体上の特定の場所に位置する遺伝子の別の形態である（対のうちの１つ）。アレルは、別個の形質を決定する。アレルはそのＤＮＡ配列中の特定の位置（識別（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ）位置またはｂｐ）に塩基対（ｂｐ）の差異を有しており、それにより異なる形質が生じ、および互いに識別される。これら識別位置はアレルマーカーとして役に立つ。アレルは、識別位置で同じ塩基を有する場合、同一であるとして、一般に解説されており、および本明細書に解説される；動物は自然に、他の位置の他のｂｐで、ある変異を有している。当業者は日常的に、アレルを比較する際には自然変異を調整している。厳密に同一という用語は本明細書において、ＤＮＡアライメント中にｂｐの差異またはインデルが完全に無いことを意味するために使用される。
【００３２】
遺伝的相補
古典的に、遺伝的相補とは、２つの異なる突然変異が二倍体または異核共存体中で混合されているときの、野生型の表現型の生成を指す。しかしながらキメラ作製に関する現代技術は幹細胞相補に依ることができ、それにより現在では、２個以上の胚起源の細胞を組み合わせて１つの遺伝的に混合された動物が作製される。この場合、相補は、個々の染色体の遺伝子型における変化はいずれも含まず、むしろ遺伝子産物の混合を表している。相補は２つの細胞型が同じ胚中に存在し、各々が機能を果たし得るときに発生する。その後、各々の個別の染色体は未改変で維持される。キメラの場合、相補は、染色体の２つの異なるセットが同じ胚中で活性であるときに発生する。しかしながら、この相補から生じた子孫物は、各遺伝子型の細胞を担持し得る。胚性相補において、ホスト胚の遺伝子は、ノックアウトを生じさせるように編集され、または別の手段で非機能性遺伝子が作製されるように編集される。ヒト幹細胞が遺伝子編集された胚盤胞に注入された場合、ヒト幹細胞はホスト（編集された）ゲノムの欠落をレスキューまたは「相補」することができる。ノックアウトされた遺伝子が特定の臓器または組織の成長をサポートしていた場合、得られた相補生成組織は、非編集物、たとえば幹細胞由来の遺伝子型の成長および分化の結果であり得る。ヒト幹細胞を使用してホスト編集ゲノムを相補する場合、得られた組織または臓器は、ヒト細胞から構成され得る。この方法において、完全なヒト臓器は、相補生成臓器に対して、ホストとして他の動物を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで生成され得る。
【００３３】
任意の特定の臓器または組織の成長および分化に対し、複数の遺伝子が関与している場合があるため、複数遺伝子の編集プロセスもまた記載する。複数の遺伝子を細胞または胚で改変またはノックアウトし、それを研究用に使用してもよく、または全キメラ動物作製のために使用してもよい。これらの実施形態は、ホストニッチ（ｈｏｓｔ  ｎｉｃｈｅｓ）の選択的群減少による細胞または臓器の損失の相補を含む。本発明は、モデル、食物として役立つ動物、ならびに産業および医療のための細胞源および細胞製品として役立つ動物の迅速な作製を提供するものである。
【００３４】
図１は、ホスト動物としてブタを使用した、その必要のある対象にオーダーメイド（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ）ヒト臓器および組織を提供することに関する課題および提案方法に関する概略図を提示している。当業者であれば、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の作製を可能とする技術は、患者に、自身の幹細胞に編集遺伝子の相補をもたらすこと、およびヒトまたはヒト化された「自己の」臓器または組織の作製が可能であることを認識し得る。
【００３５】
多重遺伝子編集の使用は、相補の必要がある複数の編集遺伝子を用いたホスト動物の作製に重要である。図２Ａは、なぜたった２つの編集アレルを有する家畜を作製するために、１つの編集を使用して数年かかるかを解説するタイムラインであり、ウシに関しては、およそ６年の時間がかかっている。この文脈において、編集されたとは、遺伝子を選択し、それを改変することを指す。最初に、対象遺伝子は、培養体細胞中でたとえばノックアウト（ＫＯ）などの編集をされなければならず、その体細胞を、標的ＫＯを有するヘテロ接合性仔牛を作製するためにクローン化する。ヘテロ接合体は、交配のために成熟するまで、ウシの場合は約２才まで育てて、第一世代（Ｆ１）のオスとメスのヘテロ接合性のウシを作製し、それらを互いに交配させて、ホモ接合性のノックアウト仔牛（Ｆ２）を作製する。ウシの場合、従来的な方法を使用して複数の標的突然変異のホモ接合体を作製することは実用的ではない。さらなる編集を行うための年数と使用される動物数は、図２Ｂに図示されるように使用される特定のスキームに応じてほぼ指数関数的に増大する。脊椎動物の中では、たとえウシよりも一世代当たりより多くの子供を残し、妊娠期間が短い動物であっても、複数の編集を行うためには非常に長い時間を要するであろう。たとえばブタは、１回の交配で多くの子供を有し、妊娠期間はおよそウシの半分であるが、複数の編集を行うための時間は数年を要し得る。さらに、積極的な近親交配を行う期間を最小化するスキームは、複数編集には合理的に可能とは言えないであろう。また連続クローン化は、プロセスと結果の観点から、特に動物が家畜または実験動物として有用であるべき場合には望ましいものではない。
【００３６】
本発明により提示される好機を図３に図示している。図３は、第一世代の動物（Ｆ０）で行われる複数編集を示している。ヘテロ接合体またはホモ接合体であると独立して選択される２個以上の編集を伴う胚は、直接作製され、またはクローン化により作製され、妊娠のために代理メスに移植される。得られた動物は、Ｆ０世代の創始体である。複数の胚を作製して１匹以上の代理メスに移植し、雄雌両方の子孫を誕生させてもよく、または胚分割の公知技術を使用して複数のクローン胚を作製してもよい。たとえばブタなど、典型的には一度の出産で雌雄両方を出産する家畜を交配させ、増殖させてもよい。
【００３７】
標的化エンドヌクレアーゼまたは相同組み換え修復（ＨＤＲ）を使用して細胞または胚において、複数のアレルを破壊してもよく、または別の手段で本明細書に記載されるように編集してもよい。ある実施形態は、複数の標的染色体ＤＮＡ部位で脊椎動物の細胞または胚に遺伝子編集を行う方法であり、当該方法は、脊椎動物の細胞または胚に以下を導入することを含む：第一の標的染色体ＤＮＡ部位を指向する第一の標的化エンドヌクレアーゼ、および第一の標的部位配列に対し相同な第一の相同組み換え修復（ＨＤＲ）の鋳型；および第二の標的染色体ＤＮＡ部位を指向する第二の標的化エンドヌクレアーゼ、および第二の標的部位配列に相同な第二のＨＤＲ鋳型。当該第一のＨＤＲ鋳型配列は、第一の標的部位で天然染色体ＤＮＡ配列を置き換え、および第二のＨＤＲ鋳型配列は、第二の標的部位配列で天然染色体ＤＮＡ配列に取って代わる。
【００３８】
たとえばノックアウトまたは交換などの複数編集が達成可能であったことが判明したことは予想外であり、驚きであり、および予測不可能な結果であった。１つの理論上のメカニズムは、細胞サイクルの特定の段階にあったために複数編集が受け入れ可能であった細胞が少数存在していたというものである。エンドヌクレアーゼとＨＤＲ鋳型に暴露されたとき、それら細胞はただちに反応する。関連する動作理論は、ＨＤＲ鋳型化プロセスは、自身を複数置換させることに役立つというものであり、その理由は、１つの標的部位に対する細胞修復機構の活性化は、さらに他の部位の修復、すなわちＨＤＲ鋳型化に有利に働くためである。ＨＤＲは歴史的に低効率のプロセスであり、そのため複数ＨＤＲ編集はあまり試みられたり、観測されたり、または認識されてはいなかったようであった。
【００３９】
これまでのところ、異種相補を用いた過去の実験は、単一編集ゲノムで行われたもののみである。しかしながら、多重遺伝子編集のための本開示プラットフォームは、ヒト幹細胞によるそれら編集の相補を可能にする、複数編集された遺伝子を有するホスト胚盤胞を提供し、およびそれらから生じた臓器および組織の製造を提供する。
【００４０】
本明細書の結果は、多すぎる、または少なすぎるエンドヌクレアーゼおよび／またはＨＤＲ鋳型は、負の影響を与える可能性があることを示しており、これは本領域における過去の研究を裏切るものであり得る。事実、標的化エンドヌクレアーゼを設計し、正確に作製することはできるが、それにもかかわらず失敗したのは、この酵素の効果が高すぎるためであることが観測されている。さらに、改変が成功した細胞群は、時間とともに改善されないことが多い。細胞を改変する当業者は通常、クローン化成功、または他用途に対する安定性および健康状態の指標として、細胞および改変の寿命を予測する。しかしその予測は、本明細書の多重化プロセスにおいて多くの場合役に立たない。さらに、相同組み換え（ＨＲ）遺伝子導入の効率は、単一座位遺伝子導入と比較し、多重化法では変化しやすい。一部の座位は非常に感受性であるが、その他は効率を大きく下げてしまった。明白にエンドヌクレアーゼ間の相互干渉が存在するが、たとえばエンドヌクレアーゼは共有リソースを競合するという仮定など、単純には真の影響を説明できない。
【００４１】
多くの遺伝子を無作為に、または不正確に染色体ＤＮＡの複数の位置に挿入するための様々な公知の技術、または複数の遺伝子を破壊する多くの無作為編集を行うための様々な公知の技術が存在している。明白なことではあるが、無作為または不正確なプロセスは、複数の特異的な標的遺伝子を編集して効果を発揮させる必要がある科学者の助けにはなりそうもない。したがって本明細書に教示されるＨＤＲプロセスは、編集、および得られた生物体により容易に識別することができ、および意図された標的部位でのみ行うことができる。１つの違いは、本発明のＨＤＲ編集の実施形態は、余分な遺伝子コピーの挿入の必要がなく、および／またはエンドヌクレアーゼに標的とされた遺伝子以外の遺伝子は破壊されずに行うことができるという点である。そして特異的編集は、１つの位置で行われる。その理由は、ＨＤＲ鋳型配列は、適切な相同性が無いと部位内に複製されないからである。実施形態は、外因性アレルが、その同系アレルの部位でのみ染色体ＤＮＡ内に複製される生物体およびプロセスを含む。
【００４２】
ＨＤＲ系編集の利点は、編集を選択することができるという点である。対照的に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）プロセスによる他の試みでは、複数の位置でインデルを行うことができ、それによってフレームシフトを起こすことなくインデルは互いを相殺する。この課題は、多重化が含まれる場合に重大なものとなる。しかしＨＤＲを上手く使用することにより、所望の場合には標的遺伝子が意図されるフレームシフトを確実に有するように編集を行うことができる。さらに、アレルの交換はＨＤＲを必要とし、ＮＨＥＪ、ベクター誘導核酸挿入、トランスポゾン挿入などでは行うことができない。さらに、望ましくない編集が無い生物体の選択は、困難性がさらに高い。
【００４３】
しかしながら、家畜もしくは大型脊椎動物に関連する細胞または動物中の標的部位で、本明細書に記載される多重編集が従前に達成されたことはないと一般的に信じられている。長期継代細胞から動物をクローン化すると、非常に多くの遺伝的損傷を有する動物が作製されてしまい、実験動物モデルまたは家畜のＦ０創始体としては有用ではなくなってしまう。
【００４４】
そして遺伝子編集は、確率論的なプロセスである；結果として、編集が成功した数パーセントの細胞を特定するために、当分野は伝統的に様々なスクリーニング技術に重きを置いてきた。確率論的なプロセスであるために、当業者は、目的とする編集の数が増加するにつれ、複数の編集を行う困難性は指数関数的に増加すると予測され得た。
【００４５】
本発明の実施形態は、単一細胞もしくは胚で複数の標的遺伝子ノックアウトまたは他の編集を生成するプロセスを提供するものであり、このプロセスは本明細書において多重遺伝子ノックアウトまたは編集と呼称される。
【００４６】
アレル同一性に関する類似試験は、外因性アレルの染色体ＤＮＡを有する改変生物体の染色体ＤＮＡを、自然界で認識されるように並べることである。外因性アレルは、１個以上のアレルマーカーを有していてもよい。マーカーの上流および下流のＤＮＡアライメントは、ある距離に関し、同一であってもよい。所望される試験に応じて、その距離は、たとえば１０〜４，０００ｂｐであってもよい。ＨＤＲ鋳型は、正確に同一である配列を生成すると予測され得る一方で、鋳型領域のいずれか側の塩基はもちろん、いくつかの天然の変異を有していてもよい。当業者は日常的に、天然変異の存在にもかかわらず、アレルを識別している。当業者は、明記される境界の間のすべての範囲および値が予期されることをただちに認識することができ、以下の距離のすべてが、上限または下限として利用することができる：１５、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、４０００。
【００４７】
当業者はまた、有性生殖とは対照的な遺伝子編集の結果であるアレルに対する遺伝子編集を識別することができる。アレルが、有性生殖してアレルを混合させることができない別の種に由来する場合は自明である。そして多くの編集が、自然界ではまったく存在しない。また、アレルが１つの品種から次の品種へと移動した場合、たとえ別の品種では自然界で存在しているアレルを正確に複製する交換が行われたのだとしても、編集は容易に識別することができる。アレルは、ほとんどの場合、ＤＮＡ上に安定的に位置付けられる。しかし配偶子形成の間の減数分裂は、オスおよびメスのＤＮＡに、交差と呼ばれる事象であるアレルの交換を稀に発生させる。交差頻度と遺伝地図は、精力的に研究され、開発されている。家畜の場合、動物の血統は何世代もの間、極めて詳細に追跡されることができる。遺伝学において、センチモルガン（ｃＭ、地図単位（ｍ．ｕ．；ｍａｐ  ｕｎｉｔ）とも呼称される）は、遺伝子連鎖を測定する単位である。染色体の位置（座位またはマーカー座位）の間の距離として定義されており、これに関し、一世代における介入染色体交差の予測平均数は、０．０１である。染色体上で互いに近くにある遺伝子は、互いに離れている遺伝子と比較して交差が起こる可能性は低い。２つの遺伝子が染色体上ですぐ隣にある場合には、交差は非常に稀な事象である。単一アレルの、その隣接する２つのアレルに対する交差はほぼ起こりえないことであり、そのため、そのような事象は、遺伝子操作の産物のはずである。同品種の動物が含まれていた場合であっても、天然のアレル交換と遺伝子操作されたアレル交換は、親が判明している場合には容易に判別することができる。そして親の可能性がある個体を遺伝子型決定することにより、血統を高い精度で決定することができる。親子鑑別は、家畜群およびヒトにおいて日常的に行われている。
【００４８】
実施形態には、同時に行われる多重遺伝子編集法を含む。同時という用語は、連続ノックアウトまたは連続クローン化または動物育種の介入周期のような複数編集を達成するために複数回細胞を処置する仮想プロセスとは対照的である。同時とは、たとえば複数の標的化エンドヌクレアーゼが存在するなど、同時に有用な濃度で存在することを意味する。このプロセスを受精卵および胚に適用し、すべての細胞または本質的にすべての細胞が編集アレルまたはノックアウトを有する生物体を作製することができる。たとえばノックアウトなどの文脈において本質的にすべて細胞とは、多くの細胞の遺伝子をノックアウトし、それによって当該遺伝子の産物はその生物体の機能に対して効果が無い状態にあり、そのため当該遺伝子は実用的な目的に対して存在していない状態であることを指す。当該プロセスは、最小数の細胞分裂以上、好ましくはおよそゼロ〜およそ２分裂まで、細胞および胚の細胞を改変する。実施形態は、様々な時点にわたり発生する、または様々な細胞分裂数にわたり発生する：たとえば０〜２０回の複製（細胞分裂）、迅速プロセスまたはプロセスが予期されることを含む。当業者であれば、明示的に記載される境界の内のすべての値および範囲、たとえば約０〜２回の複製、約０〜３回の複製、約４回以下の複製、約０〜１０回の複製、１０〜１７；約７日未満、約１、約２、約３、約４、約５、または約６日未満、約０．５〜約１８日などが予期されることを直ちに認識することができる。短期継代（ｌｏｗ  ｐａｓｓａｇｅ）とは、約２０回以下の複製しか経ていない初代細胞を指す。
【００４９】
別の実施形態では、単一の胚において、母系アレル、親アレル、または両アレルは、ウシおよびブタの胚において編集され得ること、ゆえに両アレルの鋳型編集はその胚においてＨＤＲを使用して行われ得ることが示されている。これらの編集は同じ座位で行われた。姉妹染色体からの特異的遺伝子導入が検出された。Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ４３（１０９）：１７３８２−１７３８７，２０１２．
【００５０】
図４Ａ〜４Ｄを参照のこと。実施例１は、同時に２個の遺伝子をノックアウトするＨＤＲ編集の使用を試みて成功し、さらには両ノックアウトに対しホモ接合性、または各ノックアウトに対しヘテロ接合性の細胞を選択することができた実験を記載している。細胞を処置して、第一および第二の標的化エンドヌクレアーゼ（各々、ＴＡＬＥＮｓペアである）を導入し、各エンドヌクレアーゼはそれぞれ第一の遺伝子標的（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  ２、ＲＡＧ２）および第二の遺伝子標的（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ガンマ、ＩＬ２ＲｇまたはＩＬＲ２γ）に対し指向する。ＴＡＬＥＮｓは目的とされる部位を標的とするよう設計され、および適切な量で作製されなければならなかった。細胞の処置にかかる時間は５分未満であった。エレクトロポレーション法を使用したが、本明細書には他の多くの適切なタンパク質またはＤＮＡの導入方法が記載されている。次いで細胞を培養し、個々の細胞コロニーを形成させ、各コロニーは単一の処置細胞に由来している。様々なコロニーに由来する細胞を３日後または１１日後に検査した。ＲＡＧ２ノックアウト率は、ＩＬ２Ｒｇノックアウト率よりも約６倍高かった。一部の遺伝子はその他の遺伝子よりもノックアウトが困難であったことが明白であった。両方の遺伝子のノックアウト効率は高く、両ノックアウトに対しヘテロ接合性またはホモ接合性の細胞の特定に成功した。重要なことは、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＨＤＲ鋳型の用量は、特異的効果および非特異的効果を有していたことであった。ＩＬ２Ｒｇに対するＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを増加させると、ＩＬ２Ｒｇに対するＮＨＥＪおよびＨＤＲの両方が増加したが、一方でＲＡＧ２に対するＮＨＥＪ値は変化しなかった。ＩＬ２Ｒｇ  ＨＤＲ鋳型を増加させると、ＲＡＧ２座位のＨＤＲは減少したことから、オリゴヌクレオチド濃度を上昇させることによる、相同組み換え修復の非特異的阻害が示唆される。この用量感受性、特にこれら低用量での用量感受性が、多重化プロセス研究から研究者らを遠ざけたのであろう。実施例１の細胞をクローン化し、出願時、同細胞から誘導された胚で２匹の動物が妊娠していた。
【００５１】
図５Ａ〜５Ｄを参照のこと。実施例２は、多重ＨＤＲ編集に関し同じ目的であるが、異なる遺伝子を対象とした実験を記載している。第一の遺伝子標的は、Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）であった。第二の遺伝子標的は、ｐ５３（ＴＰ５３遺伝子）であった。両ノックアウトに対しホモ接合性の細胞、および両ノックアウトに対しヘテロ接合性の細胞を検出し、単離した。
【００５２】
図６〜９を参照のこと。実施例３は、２〜５個の遺伝子をノックアウトするための多重ＨＤＲ編集を記載している。３つの実験が行われ、遺伝子型決定のために検査された細胞コロニー数は、各実験に対し７２〜１９２個の範囲であった。遺伝子のＡＰＣ、ｐ５３、ＲＡＧ２、Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＤＬＲ）、ＩＬ２Ｒｇ、Ｋｉｓｓｐｅｐｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＩＳＳＲまたはＧＰＲ５４）、およびＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ４ＧＩ（ＥＩＦ４ＧＩ）の様々な組み合わせの多重ノックアウトのために細胞を処置した。遺伝子ＬＤＬＲは、他の遺伝子よりも改変に対する受容性が一貫して低かった。結果から明らかなように、ＴＡＬＥＮ特異化された相同組み換え修復（ＨＤＲ）を使用して同時に複数アレルを破壊することができた。５個のＴＡＬＥＮペアは各々、２０％を超えるＨＤＲ／部位を生じさせ、それらの同系ＨＤＲ鋳型は３つの組み合わせで同時に共トランスフェクトされた（表Ａ）。各複製からのコロニーの一部は、少なくとも４つの遺伝子でＨＤＲ事象が陽性であり、複製Ａの２つのコロニーは、５つすべての遺伝子においてＨＤＲ事象を有していた。５つの遺伝子におけるインデルの同時形成が、マウス胚性幹細胞（ＥＳまたはＥＳＣ、相互交換可能に使用される）におけるＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ刺激ＮＨＥＪにより示されたが、標的化ヌクレアーゼ刺激ＨＤＲによる５遺伝子（最大７アレル）の正確な改変は予想外かつ驚きであり、他に類を見ないものである。ＴＡＬＥＮＳの複製がＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲを交換した場合（発現のためにベクターが細胞に導入された場合）、改変レベルは検出を下回っていた（データは示さず）。しかし、他のデータは、ＲＧＥＮ多重を示していた。たとえば以下の実施例９。すべての実験で４個の遺伝子が編集されていたことが判明し、１つの実験では５個の遺伝子が編集されていた。
【００５３】
このプロセスのスピードと効率はプロセスの規模拡大に役立つものであり、それによって、プロセスの性質を変化させることなく６個以上の遺伝子の多重ノックアウトが達成可能となる。表Ａに関し、約７２〜１９２個の細胞が検証された。このプロセスは確立されており、非常に多くの細胞に対する検査数を増加させることはいまや不合理ではなく、多数の遺伝子／アレルの多重化に期待することができる。多重化遺伝子またはアレルの数は２〜２５個の範囲であってもよい。当業者はただちに、明記される境界の間のすべての範囲および値が予期されることを認識することができ、以下のすべてが、互いの組み合わせにおいて上限または下限として利用することができる：２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２５。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
明らかなことではあるが、多重ノックアウトを伴う細胞および胚は、本発明の実施形態であり、それにより作製された動物も同様である。
【００５６】
実施例４は、様々な動物の作製プロセスを多少詳細に記載しており、例示を目的として特定の遺伝子に言及している。実施例５は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計と作製の例である。
【００５７】
実施例６は、標的化ヌクレアーゼ誘導ＨＤＲプロセスを用いた多重遺伝子編集のさらなる例を提示している。ＧＡＴＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＧＡＴＡ４）；ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＫＸ２−５（ＮＫＸ２−５）、およびＭｅｓｏｄｅｒｍ  Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＭＥＳＰ１）を同時にＴＡＬＥＮｓおよびＨＤＲ鋳型を用いて標的化させ、各遺伝子内にフレームシフト突然変異と未成熟停止コドンを誘導した。目的は、相補試験における使用のための、各遺伝子に対する両アレルノックアウトを作製することであった。プロセスは約０．５％の効率であり、２個のクローンが各遺伝子で目的とされる両アレルＨＤＲを有していた。単一遺伝子での、または遺伝子の組み合わせでの所与の遺伝子のノックアウトにより、相補が行われずに遺伝子型の発育阻害が生じ、および早期の胚性致死が生じる場合がある。当業者であれば、これら遺伝子を個々にノックアウトし、ヘテロ接合体の異種交配を行い、ＦＴＴおよび相補実験のための三重ノックアウトを取得する（およそ１／６６の確率）ことは家畜において実現不可能であると認識するであろう。
【００５８】
実施例７は、ＴＡＬＥＮｓおよびＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲを組み合わせて遺伝子の多重編集を行うことができることのデータを提示している。一部の遺伝子／アレルはＴＡＬＥＮ、またはＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲによる標的化がより容易であり、これらツールを組み合わせて多重化を行わなければならない状況は起こり得る。本実施例において、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ４ＧＩ（ＥＩＦ４ＧＩ）をＴＡＬＥＮｓの標的とし、ｐ６５（ＲＥＬＡ）遺伝子をＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲの標的とした。細胞は、ＨＤＲ事象の指標であるＲＦＬＰアッセイにより解析された。ＨＤＲは両部位で明白であった。したがって、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＴＡＬＥＮｓと１、２、３  ４、５、６、７、８、９または１０個のＲＧＥＮ試薬などの任意の組み合わせをはじめとする組み合わせを多重化するために、ＴＡＬＥＮｓとＲＧＥＮｓを一緒に使用し、または別々に使用することができる。
【００５９】
キメラ
キメラはホスト胚盤胞を作製し、ドナー動物からのドナー細胞を加えることにより作製することができる。得られた動物は、ホストとドナーの両方に由来する細胞を有するキメラになり得る。一部の遺伝子は、胚がある種の細胞および細胞系統を生成するために重要である。そのような遺伝子がホスト細胞でノックアウトされた場合、その失われた遺伝子を有するドナー細胞を導入することで、それら細胞および細胞系統がホスト胚に修復され得る。修復された細胞はドナーの遺伝子型を有する。かかるプロセスは、相補プロセスと呼称される。
【００６０】
Ｍａｔｓｕｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １１０：４５５７−４５６２，２０１３において、ドナー由来ブタ膵臓を作製するための相補プロセスが記載されている。当該文献において、機能性膵臓の形成を阻害するよう改変されたホストブタ胚盤胞が作製された。ホスト胚盤胞は体細胞クローン化により作製された。体細胞を改変し、Ｐｄｘ１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）のプロモーターの存在下でＨｅｓ１を過剰発現させた。これは膵臓の発生を阻害することが知られていた。ホスト胚盤胞に加えられたドナー細胞はこの改変を受けていなかった。ドナー細胞は膵臓作製に必要とされる細胞系統を供給した。当該文献の筆者らは、器官形成ができないマウス胚において胚盤胞相補を行うことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで人工多能性幹細胞（ＰＳＣｓ）から機能性臓器が作製され得ることを別文献で示していた。当該文献の筆者らは、ヒト由来の多能性幹細胞（ＰＳＣｓ）を含む異種のＰＳＣｓを使用した将来的な研究について提言していた。実際に、異種移植は、４０歳を超える人々に対する、臓器／組織の不足の解決法となる可能性があるとみなされている。遺伝子をノックアウトせずに、膵臓形成を不可能にさせたという事実は重要である。
【００６１】
従来的な方法を使用し、大型脊椎動物において１つの遺伝子をノックアウトすることさえ、多量の資源投資が必要である。対照的に、細胞中で遺伝子産物を過剰発現させることは当分野に現状存在する、たとえば複数の遺伝子カセットコピーをゲノム中に配置するプラスミドまたはベクターを使用することでも容易に達成可能である。遺伝子発現を加えることは、遺伝子標的化およびノックアウトよりもさらに簡単である。遺伝子産物の過剰発現で器官形成を阻害することは、現時点では稀なことと考えられている。実際に、大型動物ゲノムの遺伝子操作に限界があることは重大であろう。とはいえ、ブタは、ヒトに対するその大きさおよび生理的な類似性、ならびにその繁殖力と成長速度により異種移植の好ましいドナー動物である。
【００６２】
図１０は、キメラに関する文脈において適用される遺伝子ノックアウトまたは他の遺伝子編集を行うために本明細書において使用される多重化プロセスを図示している。短期継代初代体細胞を、遺伝子ノックアウトを用いて作製する。ノックアウトに対し、所望されるヘテロ接合性およびホモ接合性の分布を厳密に備えた細胞を単離する。これらの細胞をクローン化で使用して胚を作製し、それをホスト胚盤胞として発生させる。ドナー胚を確立させ、それをノックアウトにより生じたニッチに投入する遺伝子を提供するドナー細胞源として使用する。ドナー細胞をホスト胚盤胞に導入し、ホスト細胞を用いて繁殖させ、ホスト細胞とドナー細胞の両方を有するキメラを形成させる。胚を代理メスに移入し、妊娠させる。キメラの子孫物は、ホスト細胞が配偶子を形成した場合にはホストの遺伝子型を有している。キメラは、自身のホスト胚盤胞により性別が決定される。
【００６３】
図１１は、発育阻害の表現型（ＦＴＴ）の相補プロセスを図示している。ＦＴＴとは、性的成熟年齢まで生存することが予測されない動物を指す。ＦＴＴの遺伝子型および表現型を有するホスト胚が提供される。たった１つの遺伝子のノックアウトにより利用可能なＦＴＴは限定的であり、いくつかの臓器と組織に関しては判明していないことから、多重化プロセスが理想的である。ドナー細胞は、ＦＴＴに失われた遺伝子を提供し、および失われた細胞型を提供する。胚は大型脊椎動物であってもよく、およびノックアウトはたとえば２〜２５個の遺伝子など多重であってもよい。さらに標的化エンドヌクレアーゼを使用してノックアウトが行われてもよい。免疫不全の実施形態において、ＩＬ２Ｒｇ−／ｙ  ＲＡＧ２−／−のノックアウトは、ホストが本質的に免疫機能を失っていることから、ＦＴＴである。しかしドナー細胞はそれら遺伝子を失っておらず、得られるキメラは、動物を発生および維持することができるという目的に対して本質的に正常な表現型を有している。しかし子孫物はＦＴＴの表現型を有している。ゆえに、動物を維持することはでき、ＦＴＴ動物を簡便に生産することができる。キメラはノックアウトに対し、ヘテロ接合性とホモ接合性の任意の組み合わせであってもよい。ゆえに、他のプロセスが追加の世代以上を必要とする場合、発育不全（ＦＴＴ）の表現型が生じるＦ０世代動物であるキメラを作製するプロセスが記載される。
【００６４】
キメラは通常、ホスト細胞に遺伝する。しかし本明細書において、ホスト細胞に遺伝するのではなく、ドナー細胞からその子孫物へと遺伝する別のキメラが開示される。遺伝的形質を切り替えることにより、なんらかの有用な機会を提供し得ることが判明した。図１２に関し、Ｇ−ホストと標識された胚が図示されている。この胚は非機能的な配偶子で作製されている。ドナーの胚盤胞が作製され、ドナー細胞源として使用されている。ドナー細胞は、ドナー配偶子を作製するために必要とされる遺伝子および細胞系を提供する。得られたキメラは、ドナー細胞の配偶子を有し、ドナー細胞の遺伝的特徴を有する子孫物を産生する。この図において、ホスト胚はオスのブラフマン（Ｂｒａｈｍａｎ）のウシである。ドナー細胞は、二重筋肉化（ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｓｃｌｅｄ）されたオスウシに由来する。キメラはブラフマンのオスウシの表現型を有していたが、その子孫物は二重筋肉化されている。ホストとドナーは、同じもしくは異なる品種に由来していてもよく、または同じもしくは異なる種に由来していてもよい。ホストは不妊であるように作製される。これは有性生殖できないことを意味する。数頭の不妊動物を使用して、たとえば運動性のない精子などの非機能性の配偶子を作製させてもよく、またはたとえば早期に配偶子形成を破壊して配偶子を全く作製させなくてもよい。ドナー細胞はたとえば野生型の細胞、望ましい形質を有する動物品種に由来する細胞、または遺伝子改変された細胞であってもよい。
【００６５】
本発明の実施形態は、たとえばキメラ家畜などの不妊キメラ動物を含み、それらは配偶子形成または精子形成が阻害された染色体へと遺伝子改変されている。染色体はＸ染色体、Ｙ染色体、または常染色体であってもよい。改変は、既存遺伝子の破壊を含み得る。破壊は、既存の染色体遺伝子を改変し、発現されなくなるようにすることで行うことができ、または遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し得る因子を遺伝子発現させることにより行うことができる。１つの実施形態は、ホストの精原幹細胞（ＳＳＣ：ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）のノックアウトである。動物は、所望される遺伝的特徴を有するドナー細胞を用いて作製されてもよく、当該動物は、ドナーの遺伝子型を有する配偶子を形成するＳＳＣ細胞を供給する。一部の遺伝子は、たとえば以下の組み合わせなどの組み合わせで破壊され、不妊を生じさせる１つ以上の効果を生み出す：Ａｃｒ／Ｈ１．１／Ｓｍｃｐ、Ａｃｒ／Ｔｎｐ２／Ｓｍｃｐ、Ｔｎｐ２／Ｈ１．１／Ｓｍｃｐ、Ａｃｒ／Ｈ１ｔ／Ｓｍｃｐ、Ｔｎｐ２／Ｈ１ｔ／Ｓｍｃｐ（Ｎａｙｅｒｎｉａ  Ｋ；Ｄｒａｂｅｎｔ  Ｂ；Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ  Ａ；Ａｄｈａｍ  ＩＭ；Ｓｃｈｗａｎｄｔ  Ｉ；Ｍｕｌｌｅｒ  Ｃ；Ｓａｎｃｋｅｎ  Ｕ；Ｋｌｅｅｎｅ  ＫＣ；Ｅｎｇｅｌ  Ｗ  Ｔｒｉｐｌｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｇｅｎｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ  ７０（４）：４０６−５  １６，２００５）。実施形態は、第一の遺伝子のノックアウトを伴う動物の第一系統と、当該系統のオスの子孫が不妊となるような第二の遺伝子のノックアウトを伴う動物の第二の系統を含む。
【００６６】
遺伝子操作された大型脊椎動物を作製するための遺伝子操作の使用は、所望される遺伝的形質を有する動物の生成を加速させることができる。伝統的な家畜の交配は費用が高く、時間もかかるプロセスであり、遺伝的形質を注意深く選択し、世代的繁殖を長く待たなければならない。注意深く形質を選択したとしても、有性生殖によるバリエーションは、所望される形質の組み合わせを育て、伝播させることにかなりの困難をもたらす。しかしドナーの形質を伝播するキメラを作製することで、動物の繁殖方法がもたらされ、それにより、所望される遺伝的形質の迅速な普及ならびに当該形質の財産的管理の保護が可能となる。実施形態は、遺伝的およびゲノム的に不妊な動物の作製を含み、それら動物は、ドナー遺伝物質のホストとして役立つことができる。ホストによる性的交配は、ドナーの遺伝物質の再生産をもたらし得る。遺伝的に不妊な動物群を使用して、１つのドナーに由来する同一遺伝子の有性生殖による拡散を行うことができ、それにより多くのドナー子孫が迅速に作製され得る。実施形態は、改変され、たった１つの性別の動物のみを産生する動物を含み、それによって、当該動物を受け取るユーザーは、当該形質を有する動物を容易には交配できないようになる。
【００６７】
実施形態は、細胞または胚に遺伝的改変を行い、配偶子形成または精子形成の活性に関し選択された遺伝子または複数の遺伝子を不活化することを含む。遺伝子改変の１つのプロセスは、たとえばＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ、または遺伝子に特異的に結合するＴＡＬＥＮペアに対するｍＲＮＡなどの標的ヌクレアーゼの導入を含む。動物を細胞または改変胚からクローン化し、代理母で直接的に誕生させる。動物は家畜動物または他の動物であってもよい。配偶子形成は早い段階で阻害されてもよい。または、不妊にとっては重要だが、その他には動物にとって重要ではない精子形成活性が破壊されてもよい。ゆえに、動物は、有性生殖ができないために不妊である。しかし、ＡＲＴｓを使用し、改変精子から子孫を誕生させてもよい。所望される遺伝的形質を有するドナー動物が（交配および／または遺伝子操作の結果として）選択される。
【００６８】
２個以上のノックアウトを備えたＦ０世代創始動物系統の迅速な確立
多重化を用いて、２個、３個、またはそれ以上の遺伝子（２〜２５個）を同時にノックアウトし、所望されるアレルの組み合わせを伴うＦ０世代を創出してもよい。すべてのノックアウトに対しホモ接合性であるとＦＴＴが生じる場合、１つの選択肢は、１個−すなわちその状況に対し最小のヘテロ接合性であればなんでもよい−をのぞき、すべてのノックアウトに対しホモ接合性の創始体を作製することである。その１つのヘテロ接合性の遺伝子によって、非ＦＴＴ表現型が可能となり得る。あるいは、多重ノックアウトは、相補を組み合わせて使用し、ＦＴＴ子孫物を有する、発育良好なキメラを作製してもよい。このプロセスは、複数ノックアウト動物作製の世代を除外することができる。
【００６９】
いずれかの場合でも、利点は大きく、多数のプロセスを現実的に達成可能とさせる。従来的な交配により２個の座位のノックアウトを伴う動物を作製することは、Ｆ２世代ではたった約６％の仔だけが所望される表現型を有することから、法外な費用がかかる（表Ｂ）。対照的に、多重化法は、Ｆ０世代で所望される遺伝子型の作製を行うことができ、従来のノックアウトと交配を超える大きな利点がある。時間と動物の節約は机上の空論ではないことを強調しなければならない。ある種の改変が可能となることは進歩であり、失敗ではなく成功が期待される。さらに、本実施例を踏まえると、１個または２個のキメラＲＧ−ＫＯ親間での交配は、ＲＧ−ＫＯの仔の産生率をそれぞれ２５％および１００％にまで大きく増加させるであろう（表Ｂ）。
【００７０】
【表２】
2019505218.tif 000003
【００７１】
免疫不全動物
実施形態のある群は、免疫不全のブタまたは他の家畜、およびそれらの作製方法に関する。これら実施形態は多重編集、たとえばホモ接合性およびヘテロ接合性のノックアウト遺伝子型の選択を管理する機会を活用するノックアウトの例である。これら実施形態は、創始系統を迅速に確立する多重化の性能を示す。またこれら実施形態は、キメラ作製を含む、本発明のさらなる態様を含む。
【００７２】
ブタは、ヒトの大きさおよび生理に類似した、最も関連性の高い非霊長類動物である。不幸なことに、完全免疫不全ブタは広く利用可能ではない。その理由は、（１）通常、単一遺伝子ノックアウト（ＫＯ）では充分ではない。（２）複数座位がヌルである動物を作製するための異種交配は非常に費用がかかり、Ｋｏｓの数に依存している可能性がある。および（３）小規模の無菌施設しかブタは利用できない。本明細書において、実施形態は、ＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒｇ（すなわち、ＲＧ−ＫＯ）の両方のノックアウトを伴う大型脊椎動物を含む。遺伝子は体細胞のノックアウトであってもよく、次いでそれら細胞をクローン化に使用し、動物全体が作製される。あるいは胚を処置して遺伝子をノックアウトしてもよく、当該動物は当該胚から直接誘導される。多重遺伝子標的化プラットフォームは、ブタにおいてＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の発生を同時に破壊することができる。したがって、かかる細胞を有さず作製された動物は、Ｆ０創始体として、本明細書の方法を用いて直接作製することができるが、その表現型はＦＴＴである。
【００７３】
多重編集に対する農業的標的
食物動物ゲノムの編集は、１度で１つではなく、同時に多くの座位を編集することで大きく加速されることができ、作製されるアレルを１つにまとめるために行われる動物の交配生殖を節約することができる。加えて、いくつかの農業的形質は複雑であり、これは、２個以上（２〜数百）の遺伝子のアレルの影響の結果として顕在化していることを意味する。たとえばＤＧＡＴ、ＡＢＣＧ２の多型、および１８番染色体上の多型はまとめて、乳牛のＮｅｔ  Ｄａｉｒｙ  Ｍｅｒｉｔにおける変異の大部分を構成する。家畜の細胞または胚に、多数遺伝子の多重編集を受けさせてもよく、遺伝子としては以下の様々な農業的標的が挙げられる：ＡＣＡＮ、ＡＭＥＬＹ、ＢＬＧ、ＢＭＰ  １Ｂ（ＦｅｃＢ）、ＤＡＺＬ、ＤＧＡＴ、Ｅｉｆ４ＧＩ、ＧＤＦ８、Ｈｏｒｎ−ｐｏｌｌ座位、ＩＧＦ２、ＣＷＣ１５、ＫｉｓｓＲ／ＧＲＰ５４、ＯＦＤ１Ｙ、ｐ６５、ＰＲＬＲ、Ｐｒｍｄ１４、ＰＲＮＰ、Ｒｏｓａ、Ｓｏｃｓ２、ＳＲＹ、ＺＦＹ、β−ラクトグロブリン、ＣＬＰＧのうちの１つ以上。
【００７４】
多重化の疾患モデル化標的：
複数遺伝子での突然変異に基づき、癌などの一部の形質が生じる（ＡＰＣ／ｐ５３を参照）。加えて、多くの疾患形質はいわゆる複雑形質（Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔｓ）とも呼称されており、２個以上の遺伝子のアレルの影響の結果として顕在化する。たとえば糖尿病、代謝、心疾患、および神経疾患は複雑形質とみなされている。実施形態は、個々のアレルに対しヘテロ接合性およびホモ接合性である動物モデル、または色々な組み合わせで他の遺伝子のアレルと組み合わせた動物モデルを含む。たとえばｍａｔｕｒｅ  ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ（ＭＯＤＹ）座位は、個々に、および以下に付加して糖尿病を引き起こす：ＭＯＤＹ  １（ＨＮＦ４α）、ＭＯＤＹ  ２（ＧＣＫ）、ＭＯＤＹ  ３（ＨＮＦ１α）、ＭＯＤＹ  ４（Ｐｄｘ１）、ＭＯＤＹ  ５（ＨＮＦ−１β）、ＭＯＤＹ  ６（ｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １）、ＭＯＤＹ  ７（ＫＬＦ１１）、ＭＯＤＹ  ８（ＣＥＬ）、ＭＯＤＹ  ９（ＰＡＸ４）、ＭＯＤＹ  １０（ＩＮＳ）、ＭＯＤＹ  １１（ＢＬＫ）。家畜の細胞または胚は、以下の様々な疾患モデル作製標的をはじめとする、動物モデル作製に対する多くの遺伝子の多重編集を受けてもよい：ＡＰＣ、ＡｐｏＥ、ＤＭＤ、ＧＨＲＨＲ、ＨＲ、ＨＳＤ１１Ｂ２、ＬＤＬＲ、ＮＦ１、ＮＰＰＡ、ＮＲ３Ｃ２、ｐ５３、ＰＫＤ１、Ｒｂｍ２０、ＳＣＮＮ１Ｇ、ｔＰ５３、ＤＡＺＬ、ＦＡＨ、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ。実施形態は、たとえばＫＯなどの編集を受けた上述の標的を１つ以上伴う細胞、胚、および動物を含む。
【００７５】
ある種の遺伝子は一貫して他種におけるオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）を有する。ヒトおよびマウスの遺伝子は一貫して、家畜、特にウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、およびウサギにおけるオルソログを有する。これらの種と魚類の間の遺伝的オルソログは多くの場合、その遺伝子の機能に応じて一致している。生物学者であれば、遺伝子オルソログの発見方法に精通しており、そのため本明細書において、他種のオルソログを列記することなく、当該種のうちの１つに関して、遺伝子が記載される場合がある。ゆえに遺伝子破壊を記載する実施形態は、他種で同じ名称または別の名称を有するオルソログの破壊を含む。全般的な遺伝子データベースならびに遺伝子オルソログの特定に特化したデータベースが存在する。さらに当業者は、遺伝子に対し普遍的に使用されている略語に精通しており、遺伝子に対し２個以上の略語がある場合に、または２個の遺伝子が同じ略語で参照されている場合に、どの遺伝子が参照されているかを特定するために当該コンテクストを使用している。
【００７６】
精原幹細胞は、家畜の遺伝的改変の第二の方法を提供する。遺伝的改変または遺伝子編集を、ドナー精巣から単離された精原幹細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。改変細胞を、レシピエントの生殖細胞枯渇精巣に移植する。移植された精原幹細胞は精子を産生し、当該精子は、人工授精を介した交配、または創始動物を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）に使用することができる遺伝的改変を担持している。
【００７７】
ホストニッチの選択的群減少による形態欠損（ｎｕｌｌｏｍｏｒｐｈｉｃ）の細胞または臓器損失の相補
多重編集を使用して、特定の胚性ニッチまたは動物ニッチから細胞または臓器を意図的に取り除き、より優れたドナー細胞の統合、増殖および分化に伝導性のある環境を創出し、胚、胎仔、または胎仔における、オルソログ性の細胞、組織または臓器の相補によりそれらの寄与を増大させることができる。ドナーの細胞と遺伝子により満たされることができる欠乏を有するよう創出されているため、空虚なニッチを伴う動物は欠乏キャリアである。具体的な例としては、配偶子形成細胞系統のレシピエント−除去とドナー−レスキューが挙げられる（ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＭＩＷＩ、ＰＩＷＩなど）。
【００７８】
別の実施形態では、多重遺伝子編集を使用して先天性脱毛症を誘導し、ドナー誘導細胞が毛髪の濾胞形成に関与する機会を提供することができる。脱毛症を引き起こす多重遺伝子編集の対象となる遺伝子としては、ＯＭＩＭおよびｔｈｒｕ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースで特定されている遺伝子；ＤＣＡＦ１７、ＶＤＲ、ＰＮＰＬＡ１、ＨＲＡＳ、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｖｅｒｔ、ＤＳＰ、ＳＮＲＰＥ、ＲＰＬ２１、ＬＡＭＡ３、ＵＲＯＤ、ＥＤＡＲ、ＯＦＤ１、ＰＥＸ７、ＣＯＬ３Ａ１、ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＨＬＣＳ、ＮＩＰＡＬ４、ＣＥＲＳ３、ＡＮＴＸＲ１、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＤＳＧ４、ＵＢＲ１、ＣＴＣ１、ＭＢＴＰＳ２  ，ＵＲＯＳ、ＡＢＨＤ５、ＮＯＰ１０、ＡＬＭＳ１、ＬＡＭＢ３、ＥＯＧＴ、ＳＡＴ１、ＲＢＰＪ、ＡＲＨＧＡＰ３１、ＡＣＶＲ１、ＩＫＢＫＧ、ＬＰＡＲ６、ＨＲ、ＡＴＲ、ＨＴＲＡ１、ＡＩＲＥ、ＢＣＳ１Ｌ、ＭＣＣＣ２、ＤＫＣ１、ＰＯＲＣＮ、ＥＢＰ、ＳＬＩＴＲＫ１、ＢＴＫ、ＤＯＣＫ６、ＡＰＣＤＤ１、ＺＩＰ４、ＣＡＳＲ、ＴＥＲＴ、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＰＶＲＬ１、ＭＧＰ、ＫＲＴ８５、ＲＡＧ２、ＲＡＧ−１、ＲＯＲ２、ＣＬＡＵＤＩＮ１、ＡＢＣＡ１２、ＳＬＡ−ＤＲＡ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＨＰ２、ＧＮＡ１１、ＷＮＴ５Ａ、ＵＳＢ１、ＬＭＮＡ、ＥＰＳ８Ｌ３、ＮＳＤＨＬ、ＴＲＰＶ３、ＫＲＡＳ、ＴＩＮＦ２、ＴＧＭ１、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＫＰ１、ＷＲＡＰ５３、ＫＤＭ５Ｃ、ＥＣＭ１、ＴＰ６３、ＫＲＴ１４、ＲＩＰＫ４が挙げられる。濾胞形成の可能性を有するドナー細胞を用いたキメラ化を使用して、ヒトの毛包を成長させることができる。ブタまたは他の脊椎動物における臓器または組織の除去、およびヒト起源の臓器または組織の成長は、医療用臓器または組織の源として特に有用である。
【００７９】
多重化のためのさらなる相補標的は、以下である：ＰＲＫＤＣ、ＢＣＬ１１ａ、ＢＭＩ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＫＫ１、ＥＴＶ２、ＦＬＩ１、ＦＬＫ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＨＥＸ、Ｃ−ＫＩＴ、ＬＭＸ１Ａ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＭＹＯＧ、ＮＫＸ２−５、ＮＲ４Ａ２、ＰＡＸ３、ＰＤＸ１、ＰＩＴＸ３、Ｒｕｎｘ１、ＲＡＧ２、ＧＧＴＡ、ＨＲ、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５。
【００８０】
実施形態は、多重化方法において、または他の方法により、上記の標的の１個、２個、またはそれ以上（２〜２５個）を標的化することを含む。
【００８１】
編集される遺伝子
特定の標的および標的化エンドヌクレアーゼに関して本明細書に記載される本方法および本発明は広く適用可能である。以下の遺伝子のすべてを用いた編集を伴うクローン化に適した初代家畜細胞が調製される。
【００８２】
【表３】
2019505218.tif 000004
2019505218.tif 000005
【００８３】
遺伝的改変動物
遺伝的に発現可能なマーカーを適所に配置して動物の異種交配を可能にする方法を使用して、またはかかるマーカーを動物内に配置しない方法のいずれかにより、染色体改変に対して単一アレルまたは両アレルの動物を作製することができる。たとえば相同組み換え修復（ＨＤＲ）の方法を使用して、動物の染色体を変化させるか、または外因性遺伝子を挿入させる。たとえばＴＡＬＥＮｓなどのツール、リコンビナーゼ融合タンパク質、ならびに従来的な方法が、本明細書の別の箇所に記載されている。本明細書に開示される遺伝的改変を支持する実験データの一部は、以下のように要約される。改変細胞の多遺伝子群からクローン化された際に、非常に優れたクローン化効率が示され、これにより、単離コロニーに対する体細胞核移植（ＳＣＮＴ：ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によるクローン化効率の変化を本方法が回避することが支持される（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかしながら加えて、ＴＡＬＥＮ介在性改変、ならびにリコンビナーゼ融合分子による改変によって、両アレル改変が一世代で達成される。たとえば、ノックアウト遺伝子に対しホモ接合性の動物は、ホモ接合体を作製するための近親交配を行うことなく、ＳＣＮＴにより作製され得る。たとえばブタおよびウシなどの家畜の妊娠期間、および繁殖年齢までの成熟は、研究と生産にとって大きな障壁である。たとえばクローン化と交配により（両方の性別の）ヘテロ接合性突然変異細胞からホモ接合性のノックアウトを作製するには、ブタおよびウシのそれぞれで、１６カ月および３０カ月が必要である。一部には、遺伝的改変とＳＣＮＴの連続周期を用いて、この負荷を減少させたとされている（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）が、これらは両方とも困難で非常に高価な技術であり、さらには、Ｆ０世代作製のための連続クローン化を回避する多くの理由が存在するが、Ｆ０世代は大型実験脊椎動物また家畜にとって実際に有用であろう。ＳＣＮＴを行う前に日常的に両アレルＫＯ細胞を作製できれば、大型動物の遺伝子操作において大きな進歩となる。両アレルノックアウトは、たとえばＺＦＮおよび希釈クローン化などの他の方法を使用した不死化細胞株で行われている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。別の研究グループで近年、市販のＺＦＮ試薬を使用したブタＧＧＴＡ１の両アレルＫＯが報告されており（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、当該報告において両アレルのヌル細胞が、ＧＧＴＡ１依存性表面エピトープの非存在に対してＦＡＣＳにより富化され得ていた。これらの研究がある有用なコンセプトを示している一方で、単一クローン化希釈（ｓｉｍｐｌｅ  ｃｌｏｎａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）は一般的に初代線維芽細胞単離物にとって実行可能ではなく（線維芽細胞は低密度で増殖しにくい）、ヌル細胞に対する生物的富化は、大部分の遺伝子にとって利用可能ではないため、動物家畜を改変することができたとは示していない。
【００８４】
標的ヌクレアーゼ誘導相同組み換えを使用して、連鎖選択マーカーの必要性を排除することができる。ＴＡＬＥＮｓを使用して、特定のアレルを家畜ゲノムに相同組み換え修復（ＨＤＲ）により正確に移入してもよい。試験的な実験において、特定の１１ｂｐ欠失（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅアレル）（Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋａｍｂａｄｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）をウシのＧＤＦ８座位に導入した（ＵＳ２０１２／０２２２１４３を参照）。単独でトランスフェクトした場合、ｂｔＧＤＦ８．１  ＴＡＬＥＮペアは、標的座位で最大１６％の染色体を切断した。１１ｂｐ欠失を保有する超らせん相同ＤＮＡ修復鋳型を用いた共トランスフェクトにより、所望される事象に対する選択を行うことなく３日目で最大５％の遺伝子転換頻度（ＨＤＲ）が得られた。遺伝子転換は、スクリーニングされた単離コロニーの１．４％で特定された。これらの結果は、ＴＡＬＥＮｓを使用することで、連鎖選択マーカーの補助なしに、効率的にＨＤＲを誘導することができることを示している。
【００８５】
相同組み換え修復（ＨＤＲ）
相同組み換え修復（ＨＤＲ）は細胞のメカニズムであり、ｓｓＤＮＡと二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の損傷を修復する。この修復メカニズムは、損傷部位に対して顕著に相同な配列を有するＨＤＲ鋳型が存在するときに細胞により行われる。特異的結合とは、生物学分野で普遍的に使用される用語であり、非標的組織と比較して、比較的高いアフィニティで標的に結合する分子を指し、概して、たとえば静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などの複数の非共有結合性相互作用が関与している。特異的ハイブリダイゼーションは、相補配列を有する核酸の間の特異的結合の形態である。たとえばＴＡＬＥＮｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、またはＧａｌ４モチーフにより、タンパク質もまたＤＮＡに特異的に結合することができる。アレルの遺伝子移入とは、鋳型−誘導プロセスを伴い内因性アレルの上に外因性アレルを複製するプロセスを指す。その内因性アレルは、一部の場合では実際に切除され、外因性核酸アレルにより交換されてもよいが、現在の理論では、このプロセスは複製メカニズムであることとなっている。アレルは遺伝子対であるため、それらの間には重要な相同性が存在する。このアレルはタンパク質をコードする遺伝子であってもよく、またはたとえば生物活性ＲＮＡ鎖をコードする、または制御タンパク質もしくはＲＮＡを受容する部位を提供するなどの他の機能を有する場合もある。
【００８６】
ＨＤＲ鋳型は、遺伝子移入されるアレルを備えた核酸である。その鋳型は、ｄｓＲＮＡであってもよく、または一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であってもよい。ｓｓＤＮＡ鋳型は、好ましくは約２０〜約５，０００残基であるが、他の長さであってもよい。当業者であれば、明示的に記載される範囲内のすべての範囲および値、たとえば５００〜１５００残基、２０〜１００残基などが予期されることを直ちに認識することができる。その鋳型は、内因性アレルまたは交換されるＤＮＡに隣接するＤＮＡに相同性を提供する隣接配列をさらに備えていてもよい。またその鋳型は、標的化ヌクレアーゼ系に結合され、したがって当該システムのＤＮＡ結合物質に対して同系結合部位である配列を備えていてもよい。
【００８７】
標的化エンドヌクレアーゼ系
たとえばｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮｓ）およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などのゲノム編集ツールは、生化学分野、遺伝子治療分野、および多くの生物体中の機能性ゲノム研究の分野に影響を与えている。さらに近年になり、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ：ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が、相補ＲＮＡ分子により、自身の標的部位に指向するようになった。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系はＲＥＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは別のかかるツールである。これらは標的化ヌクレアーゼ系の例である：これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在させるＤＮＡ結合物質を有している。次いで、その部位をヌクレアーゼにより切断する。ＴＡＬＥＮｓとＺＦＮｓは、ＤＮＡ結合物質に融合したヌクレアーゼを有している。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは同系であり、標的ＤＮＡ上で互いに存在している。ＤＮＡ結合物質は、染色体ＤＮＡ中で同系配列を有している。ＤＮＡ結合物質は、典型的には、意図される部位でもなく、その近くでもないところで核酸分解作用を得るために、意図される同系配列を考慮して指定される。ある実施形態は、制限なくすべてのかかる計に適用可能である；ヌクレアーゼの再切断を最小化する実施形態、意図される残基で正確にＳＮＰを覆うための実施形態、およびＤＮＡ結合部位で遺伝子移入されるアレルの配置を含む。
【００８８】
ＴＡＬＥＮＳ
本明細書において使用される場合、ＴＡＬＥＮという用語は広義であり、別のＴＡＬＥＮの補助を伴わずに、二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体ＴＡＬＥＮを含む。また、ＴＡＬＥＮという用語は、同じ部位でＤＮＡを開裂するために一緒に作用するよう操作されたＴＡＬＥＮのペアのうちの１つ、または両方の物質を指すためにも使用される。一緒に作用するＴＡＬＥＮは、左ＴＡＬＥＮと右ＴＡＬＥＮと呼称される場合もあり、ＤＮＡまたはＴＡＬＥＮペアの利き手を基準とする。
【００８９】
ＴＡＬｓに対する暗号が報告されている（ＰＣＴ公開ＷＯ  ２０１１／０７２２４６）。この場合において各ＤＮＡ結合リピートが、標的ＤＮＡ配列中の１塩基対の認識に関与する。残基は、ＤＮＡ配列を標的化するためにアセンブリされてもよい。簡潔に述べると、ＴＡＬＥＮ結合の標的部位が決定され、標的部位を認識するヌクレアーゼと一連のＲＶＤを備えた融合分子が作製される。結合すると、ヌクレアーゼはＤＮＡを切断し、それによって、細胞修復機構が作動して、切断末端で遺伝的改変が行われる。ＴＡＬＥＮという用語は、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインとヌクレアーゼドメインを備えたタンパク質を意味し、それ自身で機能性である単量体ＴＡＬＥＮ、ならびに別の単量体ＴＡＬＥＮとの二量体化を必要とするその他のＴＡＬＥＮも含む。二量体化は、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同一であればホモ二量体ＴＡＬＥＮを生じさせ得、単量体ＴＡＬＥＮが異なっていればヘテロ二量体ＴＡＬＥＮを生じさせ得る。ＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核生物のＤＮＡ修復経路である、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と相同組み換え修復の手段によって、不死化されたヒト細胞において遺伝子改変を誘導することが示されている。ＴＡＬＥＮは多くの場合ペアで使用されるが、単量体ＴＡＬＥＮも知られている。ＴＡＬＥＮ（およびその他の遺伝的ツール）により処置のための細胞としては、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、受精卵、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞が挙げられる。一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクターを使用して、その他のタンパク質ドメイン（たとえば非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を、特定のヌクレオチド配列に対して標的化してもよい。たとえば、ＴＡＬエフェクターを、限定されないが、ＤＮＡ２０相互作用酵素（たとえば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポーゼーズ、またはリガーゼなど）、転写アクチベーターもしくはリプレッサー、またはたとえばヒストンなどの他のタンパク質と相互作用するもしくは改変するタンパク質などからのタンパク質ドメインに連鎖させてもよい。かかるＴＡＬエフェクター融合の応用としては、たとえば、エピジェネティック制御因子の作製または改変、ＤＮＡにおける部位特異的挿入、欠失または修復の作製、遺伝子発現の制御、およびクロマチン構造の改変などが挙げられる。
【００９０】
ヌクレアーゼという用語は、エクソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる任意の野生型酵素または変異型酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、たとえばＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＡｌｗＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。エンドヌクレアーゼはまた、典型的には約１２〜４５塩基対（ｂｐ）の長さ、より好ましくは１４〜４５ｂｐの長さのポリヌクレオチド認識部位を有している場合に、レア切断エンドヌクレアーゼ（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を含む。レア切断エンドヌクレアーゼは、所定の座位でＤＮＡ二本鎖破壊（ＤＳＢｓ：ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ）を誘導する。レア切断エンドヌクレアーゼはたとえば標的化エンドヌクレアーゼ、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってもよく、ＺＦＮは、たとえばＦｏｋＩまたは化学エンドヌクレアーゼなどの制限酵素の触媒ドメインと、遺伝子操作ジンクフィンガードメインの融合から生成される。化学エンドヌクレアーゼにおいて、化学包丁またはペプチド包丁を、核酸ポリマーまたは特定の標的配列を認識する別のＤＮＡのいずれかに結合させ、それによって、特定配列に対し、切断活性を標的化させる。化学エンドヌクレアーゼはまた、特定のＤＮＡ配列に結合することが知られている、オルトフェナントロリン、ＤＮＡ切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ：ｔｒｉｐｌｅｘ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の合成ヌクレアーゼ様複合体を包含する。かかる化学エンドヌクレアーゼは、本発明に従う「エンドヌクレアーゼ」という用語に含有される。
【００９１】
かかるエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−  Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−  Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−  ３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００９２】
ＴＡＬＥＮｓまたは他のツールにより生成される遺伝的改変は、たとえば、挿入、欠失、外因性核酸断片の挿入、および置換からなるリストから選択されてもよい。概して、標的ＤＮＡ部位が特定され、その部位に特異的に結合することができるＴＡＬＥＮペアが作製される。ＴＡＬＥＮを、たとえばタンパク質として、ｍＲＮＡとして、または当該ＴＡＬＥＮをコードするベクターにより、細胞または胚に送達する。ＴＡＬＥＮはＤＮＡを切断し、二本鎖が破壊され、その後それが修復される。多くの場合、インデルが形成され、または付随する外因性核酸に含有される配列または多型が組み込まれ、それらは染色体内に挿入されるか、または改変配列による破壊の修復のための鋳型として供される。この鋳型誘導修復は、染色体を変化させる有用なプロセスであり、細胞染色体に有効な変化をもたらす。
【００９３】
一部の実施形態は、遺伝子改変された家畜および／または偶蹄目動物の組み立て、または作製方法を含み、当該組み立て、または作製方法は、家畜および／もしくは偶蹄目動物の細胞または胚にＴＡＬＥＮペアを導入し、そのＴＡＬＥＮペアが特異的に結合する部位で当該細胞または胚のＤＮＡに遺伝的改変を行うこと、および当該細胞から家畜動物／偶蹄目動物を作製することを含む。直接注入を細胞または胚に使用してもよく、たとえば受精卵、胚盤胞または胚に直接注入してもよい。あるいはタンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはベクターの導入のための多くの公知の技術のいずれかを使用して、ＴＡＬＥＮおよび／または他の因子を細胞に導入してもよい。遺伝的に改変された動物は、たとえば妊娠ホストへの胚移植または様々なクローン化法などの公知のプロセスに従って胚または細胞から作製されてもよい。「ＴＡＬＥＮが特異的に結合する部位で細胞のＤＮＡに遺伝的改変を行う」などの文言は、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合したときに、当該ＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼにより切断される部位で、当該遺伝的改変が行われることを意味する。当該ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮペアが結合する場所そのものを切断するのではなく、むしろ２つの結合部位の間の所定の部位で切断する。
【００９４】
一部の実施形態は、動物のクローン化に使用される細胞の組成物または処置を含む。細胞は、家畜および／または偶蹄目動物の細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、受精卵、生殖細胞、始原生殖細胞、または幹細胞であってもよい。たとえば、実施形態は、培養中の複数の初代細胞をＴＡＬＥＮタンパク質またはＴＡＬＥＮもしくはＴＡＬＥＮｓをコードする核酸に暴露することを含む、遺伝的改変を行う方法、または組み立てである。ＴＡＬＥＮｓは、たとえば、ベクターのｍＲＮＡもしくはＤＮＡの配列によりコードされる、タンパク質として、または核酸断片として導入されてもよい。
【００９５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより作製された人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインを操作して、所望されるＤＮＡ配列を標的とすることができ、およびこれによって、複雑なゲノム内の固有配列をジンクフィンガーヌクレアーゼの標的とさせることができる。内因性ＤＮＡ修復機構をうまく活用することにより、これら試薬を使用して高次生物体のゲノムを改変することができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活化させる方法で使用されてもよい。
【００９６】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約３０アミノ酸を有し、安定構造へとフォールディングされる。各フィンガーは主に、ＤＮＡ基質内のトリプレットに結合する。重要な位置のアミノ酸残基は、ＤＮＡ部位内の配列特異的相互作用のほとんどに寄与する。これらアミノ酸を、必要構造を保つための残りのアミノ酸は維持しながら変化させることができる。長いＤＮＡ配列への結合は、いくつかのドメインをタンデムに連結することにより行われる。非特異的ＦｏｋＩ切断ドメイン（Ｎ）、転写アクチベータードメイン（Ａ）、転写リプレッサードメイン（Ｒ）、およびメチラーゼ（Ｍ）のような他の機能をＺＦＰに融合させ、それぞれジンクフィンガー転写アクチベーター（ＺＦＡ）、ジンクフィンガー転写リプレッサー（ＺＦＲ）、およびジンクフィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）といったＺＦＮを形成させることもできる。遺伝子改変動物を作製するためのジンクフィンガーおよびジンクフィンガーヌクレアーゼの使用に関する材料と方法は、たとえばＵ．Ｓ．８，１０６，２５５；Ｕ．Ｓ．２０１２／０１９２２９８；Ｕ．Ｓ．２０１１／００２３１５９；およびＵ．Ｓ．２０１１／０２８１３０６に開示されている。
【００９７】
ベクターおよび核酸
ノックアウトを目的として、遺伝子の不活化を目的として、遺伝子の発現を得るために、または他の目的で、様々な核酸を細胞に導入することができる。本明細書において使用される場合、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸アナログ、ならびに二本鎖または一本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンスの一本鎖）である核酸を含む。核酸アナログは、たとえば核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または可溶性を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分で改変されていてもよい。デオキシリボースリン酸骨格を改変して、モルホリノ核酸を作製してもよく、その中の各塩基部分は６員モルホリノ環またはペプチド核酸に連結されており、その中でデオキシリン酸骨格は偽ペプチド骨格に置き換えられており、４つの塩基は維持されている。
【００９８】
標的核酸配列は、たとえばプロモーターなどの制御領域に動作可能に連結されていてもよい。制御領域は、ブタの制御領域であってもよく、または他の種由来であってもよい。
【００９９】
概して、ある種のプロモーターが、標的核酸配列に動作可能に連結されてもよい。プロモーターの例としては、限定されないが、組織特異的プロモーター、構造性プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に反応性または無反応性のプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、顕著な組織特異性または時間的特異性を伴わずに、核酸分子の発現を促進するプロモーター（すなわち、構造プロモーター）を使用してもよい。たとえばニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーターなどのベータ−アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、ｍｉｎｉＣＡＧｓプロモーター、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどのを使用してもよく、ならびにたとえば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのウイルスプロモーターを使用してもよい。一部の実施形態では、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーの融合物がプロモーターとして使用される。たとえば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５６３，２００１；ａｎｄ  Ｋｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８２１，１９９６を参照のこと。
【０１００】
核酸構築物で有用であり得る追加的制御領域としては、限定されないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（たとえば、内部リボソーム侵入部位、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンが挙げられる。かかる制御領域は必須ではないが、それらは転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率などに影響を与えることにより発現を上昇させることができる。かかる制御領域は、望ましい場合には、細胞における核酸の最適発現を得るために核酸構築物内に含まれてもよい。しかしながら、かかる追加的エレメントがなくとも充分な発現が得られる場合もある。
【０１０１】
シグナルペプチドまたは選択発現マーカーをコードする核酸構築物を使用してもよい。シグナルペプチドは、コードされるポリペプチドが特定の細胞の位置（たとえば細胞表面など）に向かうように使用されてもよい。選択マーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。かかるマーカーは、培養中の安定的形質転換体の選択に有用である。他の選択マーカーとしては、たとえば緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質などの蛍光ポリペプチドが挙げられる。
【０１０２】
一部の実施形態では、選択マーカーをコードする配列を、たとえばＣｒｅまたはＦｌｐなどのリコンビナーゼの認識配列に隣接させてもよい。たとえば、選択マーカーを、ｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼに認識される３４ｂｐの認識部位）またはＦＲＴ認識部位に隣接させ、それにより選択マーカーが構築物から切除されるようにしてもよい。Ｏｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：６８６１，１９９２，ｆｏｒ  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｒｅ／ｌｏｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ，６：７，２００４を参照のこと。選択マーカー遺伝子が割り込んだＣｒｅ−またはＦｌｐ−活性化導入遺伝子を含有するトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件付き発現を伴うトランスジェニック動物を取得してもよい。たとえばマーカー／導入遺伝子のプロモーター誘導発現は、ユビキタスまたは組織特異的のいずれかであってもよく、それらにより、Ｆ０動物（たとえばブタ）においてユビキタスな、または組織特異的なマーカーの発現が生じる。導入遺伝子の組織特異的活性化は、たとえばユビキタスにマーカー断続導入遺伝子を発現するブタを、ＣｒｅまたはＦｌｐを組織特異的に発現するブタに交配することにより行われてもよく、またはマーカー断続導入遺伝子を組織特異的に発現するブタを、ＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタに交配させることにより行われてもよい。導入遺伝子の制御発現、またはマーカーの制御切除により、導入遺伝子の発現が可能となる。
【０１０３】
一部の実施形態では、外因性核酸はポリペプチドをコードしている。ポリペプチドをコードしている核酸配列は、タグ配列を含んでいてもよく、タグ配列は、コードポリペプチドのその後の操作を容易にする（たとえば、局在または検出を容易にする）よう設計された「タグ」をコードしている。ポリペプチドをコードする核酸配列中にタグ配列を挿入してもよく、それによりコードされたタグが、そのポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端に配置される。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ社、ニューヘイブン、コネチカット州）が挙げられる。
【０１０４】
核酸構築物は、たとえば卵母細胞または卵などの生殖細胞、前駆細胞、成体幹細胞もしくは胚性幹細胞、始原生殖細胞、たとえばＰＫ−１５細胞などの腎細胞、島細胞、ベータ細胞、肝細胞、またはたとえば皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞をはじめとする任意のタイプの胚、胎仔、または成体の偶蹄目／家畜細胞へと様々な技術を使用して導入されてもよい。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系、細胞に感染可能な組み換えウイルス、もしくはリポソームの使用、またはたとえばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、もしくはリン酸カルシウム沈殿などの細胞に核酸を送達することができる他の非ウイルス系方法の使用が挙げられる。
【０１０５】
トランスポゾン系において、核酸構築物の転写単位、すなわち外因性核酸配列に動作可能に連結された制御領域は、トランスポゾンの逆位反復配列に隣接している。マウス、ヒト、およびブタの細胞をはじめとする細胞への核酸導入のために、たとえばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（Ｕ．Ｓ．６，６１３，７５２およびＵ．Ｓ．２００５／０００３５４２を参照）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３，２００３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７，２００７）；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２，２００７）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２７：４５８９，２００７）；およびＰａｓｓｐｏｒｔをはじめとする数種のトランスポゾン系が開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが特に有用である。トランスポーゼーズはタンパク質として送達されてもよく、同じ核酸構築物上で外因性核酸としてコードされていてもよく、別の核酸構築物上に導入されてもよく、またはｍＲＮＡとして提供されてもよい（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写され、キャップ化されるｍＲＮＡ）。
【０１０６】
核酸はベクター内に組み込まれてもよい。ベクターは、広義の用語であり、キャリアから標的ＤＮＡへと移動するよう設計された任意の固有ＤＮＡ断片を含んでいる。ベクターとは、発現ベクターまたはベクター系と呼称されてもよく、それらはゲノムまたは標的ＤＮＡ配列にＤＮＡを挿入させるために必要とされる構成要素のセットであり、たとえばエピソーム、プラスミド、またはウイルス／ファージＤＮＡ断片などがある。たとえばウイルスベクター（たとえばレトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、および統合ファージウイルスなど）および非ウイルスベクター（たとえばトランスポゾンなど）のベクター系が動物における遺伝子送達に使用されており、以下の２つの基礎構成要素を有している：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）から構成されるベクター、および２）トランスポーゼーズ、リコンビナーゼ、またはベクターとＤＮＡ標的配列の両方を認識し、標的ＤＮＡ配列をベクターに挿入する他のインテグラーゼ酵素。ほとんどのベクターは多くの場合、１つ以上の発現制御配列を備えた発現カセットを１つ以上含有し、この場合において、発現制御配列は、別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡそれぞれの転写および／または翻訳を制御または調節するＤＮＡ配列である。
【０１０７】
多くの様々なタイプのベクターが公知である。たとえばプラスミドおよびたとえばレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが公知である。哺乳類発現プラスミドは、典型的には、複製起源、適切なプロモーター、および任意のエンハンサーを有しており、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列もまた有している。ベクターの例としては以下が挙げられる：プラスミド（別タイプのベクターのキャリアであってもよい）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（たとえば改変ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、またはＦＩＶ）、レトロウイルス（たとえばＡＳＶ、ＡＬＶ、またはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（たとえばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ−ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、核酸という用語は、たとえばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（たとえば化学合成された）ＤＮＡ、並びに天然核酸およびたとえば合成塩基または代替骨格などの化学修飾核酸をはじめとするＲＮＡとＤＮＡの両方を指す。核酸分子は二本鎖または一本鎖（すなわち、センス一本鎖またはアンチセンス一本鎖）であってもよい。トランスジェニックという用語は本明細書において広義に使用され、遺伝的に改変された生物体、またはその遺伝物質が遺伝子操作技術により変えられている遺伝子操作された生物体を指す。ゆえにノックアウト偶蹄目動物は、外因性の遺伝子または核酸が当該動物またはその子孫物で発現されているか否かにかかわらず、トランスジェニックである。
【０１０９】
遺伝的改変動物
リコンビナーゼ融合タンパク質をはじめとするＴＡＬＥＮｓまたは他の遺伝子操作ツール、または公知の様々なベクターを使用して動物を改変してもよい。かかるツールにより行われた遺伝的改変は、遺伝子の破壊を含む場合がある。動物を遺伝的に改変するための材料と方法は、Ｕ．Ｓ．８，５１８，７０１；Ｕ．Ｓ．２０１０／０２５１３９５；およびＵ．Ｓ．２０１２／０２２２１４３に詳述されており、それらはすべての目的に対し、参照により本明細書に援用される。矛盾が生じる場合は、本出願が統制する。トランス作用（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）という用語は、別の分子から標的遺伝子に作用するプロセスを指す（すなわち分子間）。トランス作用エレメントは通常、遺伝子を含有するＤＮＡ配列である。この遺伝子は標的遺伝子の制御に使用されるタンパク質（またはｍｉｃｒｏＲＮＡもしくはその他の拡散性分子）をコードする。トランス作用遺伝子は、標的遺伝子と同じ染色体上にあってもよいが、活性は仲介タンパク質または自身がコードするＲＮＡを介している。トランス作用遺伝子の実施形態は、たとえば標的化エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子である。ドミナントネガティブを使用した遺伝子の不活化は概してトランス作用エレメントを含んでいる。シス‐制御またはシス‐作用という用語は、タンパク質またはＲＮＡのコードを伴わない作用を意味する。遺伝子不活化の文脈において、これは概して、遺伝子のコード部分の不活化、機能性遺伝子の発現に必須なプロモーターおよび／またはオペレーターの不活化を意味する。
【０１１０】
当分野に公知の様々な技術を使用して、遺伝子を不活化し、ノックアウト動物を作製することができ、および／または核酸構築物を動物に導入して創始動物を生み出し、動物系統を作製することができる。その中で、ノックアウトまたは核酸構築物は、ゲノム内に統合される。かかる技術としては、限定されないが、前核マイクロインジェクション（Ｕ．Ｓ．４，８７３，１９１）、生殖系統へのレトロウイルス介在遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６１４８−６１５２，１９８５）、胚性幹細胞内への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１，１９８９）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４，１９８３）、精子介在性遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３０−１４２３５，２００２；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１８：１９−２３，２００６）、およびたとえば卵丘細胞または乳腺細胞などの体細胞、または成体幹細胞、胎仔幹細胞、もしくは胚性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質転換、その後の核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−８１３，１９９７；ａｎｄ  Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３６９−３７４，１９９８）が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子介在性遺伝子導入、および体細胞核導入が特に有用な技術である。ゲノム改変された動物は、生殖系統細胞を含むその細胞のすべてが遺伝的に改変された動物である。その遺伝的改変でモザイク動物を作製する方法が使用された場合、当該動物は近交系であってもよく、およびゲノム改変された子孫が選択されてもよい。その細胞が胚盤胞状態のときに改変された場合、たとえばクローン化を使用してモザイク動物を作製してもよく、または単一細胞が改変された場合にはゲノム改変が行われてもよい。性的成熟しないように改変された動物は、使用された特定の方法に応じて、当該改変に対しホモ接合性であっても、またはヘテロ接合性であってもよい。特定の遺伝子がノックアウト改変により不活化される場合、ホモ接合性は通常、充分ではない。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉またはドミナントネガティブ戦略により不活化される場合、多くの場合、ヘテロ接合性が適切である。
【０１１１】
典型的には、前核マイクロインジェクションにおいて、核酸構築物は受精卵に導入される；１個または２個の受精卵を、精子由来の遺伝物質を含有する前核としてとして使用し、当該卵は原形質内で可視である。前核段階の受精卵は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで取得することができる（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に採取する）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精卵は以下のように作製することができる：たとえばブタの卵巣を食肉処理場で採取し、輸送の間２２〜２８℃で維持してもよい。卵巣を洗浄し、濾胞吸引のために単離してもよく、および４〜８ｍｍの濾胞を５０ｍＬのコニカル遠心管に１８ゲージの針を使用して真空下で吸引してもよい。濾胞液と吸引された卵母細胞を、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ社、ヴェローナ、ウィスコンシン州）を用いたプレフィルターを通してリンスしてもよい。コンパクトな卵丘細胞塊に囲まれた卵母細胞を選択し、３８．７℃、５％ＣＯ２の加湿された空気中、およそ２２時間、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子、１０％ブタ濾胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍＬの各妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）、およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）が補充されたＴＣＭ−１９９  ＯＯＣＹＴＥ  ＭＡＴＵＲＡＴＩＯＮ  ＭＥＤＩＵＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ社、ヴェローナ、ウィスコンシン州）に播種してもよい。続いて、卵母細胞を、ｃＡＭＰ、ＰＭＳＧ、またはｈＣＧを含まない新しいＴＣＭ−１９９成熟培地に移し、さらに２２時間インキュベートしてもよい。成熟卵母細胞を、０．１％のヒアルロニダーゼ中、１分間ボルテックスすることにより、その卵丘細胞からはぎ取ってもよい。
【０１１２】
ブタに関しては、成熟卵母細胞を、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ  ５−ウェル受精ディッシュにおいて、５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  ＭＥＤＩＵＭ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ社、ヴェローナ、ウィスコンシン州）中で受精させてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）の調製において、新たに採取された、または凍結オス精液を洗浄し、４ｘ１０５精子までＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  Ｍｅｄｉｕｍ中で再懸濁してもよい。精子の濃度は、コンピューターを使用した精液解析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ社、ヴェローナ、ウィスコンシン州）により解析してもよい。最終ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精は、オスに応じて、およそ４０個の運動性精子／卵母細胞の最終濃度で１０μｌ体積中において行われてもよい。すべての妊娠卵母細胞を３８．７℃、５．０％ＣＯ２大気中、６時間インキュベートする。受精の６時間後、推定受精卵をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同培地に移してもよい。この系により、１０〜３０％の精子過多受精率を有するほとんどのオスで日常的に２０〜３０％の胚盤胞が得られる。
【０１１３】
直線状核酸構築物を前核の１つに注入してもよい。その後、注入卵をレシピエントのメスへ移し（たとえばレシピエントメスの卵管内に）、レシピエントメスで発生させ、トランスジェニック動物を産生させる。特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚を５分間、１５，０００ｘｇで遠心させ、脂質を沈殿させることで、前核の可視化が可能となる。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴインジェクターを使用して胚を注入し、胚盤胞形成まで培養してもよい。卵割速度、ならびに胚盤胞形成および質を記録してもよい。
【０１１４】
胚は、非同期レシピエントの子宮内に外科的に移してもよい。典型的には、１００〜２００個（たとえば１５０〜２００個）の胚を、５．５インチのＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用し、卵管の膨大部−峡部のジャンクション内に配置してもよい。外科手術後、リアルタイムの妊娠超音波検査を行ってもよい。
【０１１５】
体細胞核導入において、上述の核酸構築物を含有する、たとえば胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、または顆粒膜細胞などのトランスジェニック偶蹄目動物細胞（たとえばトランスジェニックのブタ細胞またはウシ細胞）を、除核卵母細胞に導入し、混合細胞を確立させてもよい。卵母細胞を、極体近くで透明体切開（ｐａｒｔｉａｌ  ｚｏｎａ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を行い、次いで切開領域で細胞質を押し出すことにより除核してもよい。典型的には、鋭い傾斜のチップを備えた注入ピペットを使用して、トランスジェニック細胞を、第二減数分裂で停止した除核卵母細胞に注入する。一部の慣例では、第二減数分裂で停止した卵母細胞は、卵（ｅｇｇ）と名付けられている。ブタまたはウシの胚を（たとえば卵母細胞を融合および活性化することにより）作製した後、活性化の約２０〜２４時間後、胚をレシピエントのメスの卵管に移す。たとえば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２５６−１２５８，１９９８、および米国特許第６，５４８，７４１号を参照のこと。ブタに関しては、胚移植の約２０〜２１日後、レシピエントのメスを妊娠に関してチェックしてもよい。
【０１１６】
標準的な交配技術を使用して、当初のヘテロ接合性創始動物に由来する外因性核酸に対しホモ接合性の動物を作製してもよい。しかしホモ接合性が必要とされない場合もある。本明細書に記載されるトランスジェニックブタを、対象の他のブタと交配してもよい。
【０１１７】
一部の実施形態では、対象核酸と選択マーカーを別個のトランスポゾン上に置き、および等しくない量の胚または細胞のいずれかに導入してもよく、この場合において選択マーカーを含有するトランスポゾンの量は、対象核酸を含有するトランスポゾンをはるかに超えている（５〜１０倍の超過）。対象核酸を発現するトランスジェニックの細胞または動物を、選択マーカーの存在および発現に基づき単離してもよい。トランスポゾンは、正確で連鎖していない様式でゲノム内に統合されることができるため（独立転移事象）、対象核酸と選択マーカーを遺伝的に連鎖させず、標準的な交配を介した遺伝的分離により、容易に分離させることができる。ゆえに、公衆安全の視点から懸念される問題である、後継世代での選択マーカーの保持を強いられないトランスジェニック動物を作製することができる。
【０１１８】
トランスジェニック動物が作製された時点で、標準的な技術を使用して外因性核酸の発現を評価してもよい。サザンブロット解析により初期スクリーニングを行い、構築物の統合が行われたか否かを決定してもよい。サザン解析の解説に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹ．，１９８９のセクション９．３７−９．５２を参照のこと。初期スクリーニングにおいてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することもできる。ＰＣＲとは、標的核酸が増幅される手順または技術を指す。一般的に、対象領域の末端からの配列情報、または対象領域の末端の向こうの配列情報を利用して、増幅される鋳型の逆鎖と同一または類似した配列であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを使用して、総ゲノムＤＮＡまたは総細胞ＲＮＡからの配列を含む、ＤＮＡならびにＲＮＡから特定の配列を増幅することができる。典型的には、プライマーは１４〜４０ヌクレオチドの長さであるが、１０ヌクレオチドから数百ヌクレオチドの長さの範囲であってもよい。ＰＣＲは、たとえば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に解説されている。また、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、自家持続配列増幅（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、または核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）により核酸を増幅することもできる。たとえば、Ｌｅｗｉｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２：１，１９９２；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４，１９９０；ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２，１９９１を参照のこと。ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、およびスプリンケレッテＰＣＲ（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ）による解析のために、胚盤胞期で胚を個々に処理してもよい（たとえば、Ｄｕｐｕｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：４４９５，２００２を参照のこと）。
【０１１９】
トランスジェニックブタの組織におけるポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、たとえば、動物から取得した組織サンプルのノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、ウェスタン解析、たとえば酵素結合免疫吸着検査法などの免疫アッセイ、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）をはじめとする技術を使用して評価されてもよい。
【０１２０】
干渉ＲＮＡ
様々な干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が公知である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）は、相同な遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）は、ｄｓＲＮＡを、小さな２１〜２３ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）へと代謝する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡｓｅ（ｄｓＲＮａｓｅ、たとえばＤｉｃｅｒ）とｓｓＲＮａｓｅ（たとえば、Ａｒｇｏｎａｕｔ  ２またはＡｇｏ２）を含有する。ＲＩＳＣは、切断標的を発見するためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。ｓｉＲＮＡとｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方が公知である。遺伝的改変動物で遺伝子を破壊する方法は、標的の遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導し、当該標的の遺伝子および／または核酸の発現を低下させることを含む。
【０１２１】
たとえば外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導してもよい。たとえば、標的ＤＮＡに対して相同な二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、当該ＤＮＡの発現を低下させてもよい。ｓｉＲＮＡ用の構築物は、たとえば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６，１９９８；Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３，１９９２；Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３１５３，１９９６；Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３９９：１６６，１９９９；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１４５１，１９９９；およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｃｅｌｌ，９５：１０１７，１９９８に解説されるように作製することができる。ｓｈＲＮＡ用の構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１に解説されるように作製することができる。概して、ｓｈＲＮＡは、相補領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写され、これがアニーリングし、短いヘアピンを形成し得る。
【０１２２】
特定遺伝子に指向する１つの個別機能性ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを発見する可能性は高い。たとえばｓｉＲＮＡの特異的配列の予測可能性は約５０％であるが、多くの干渉ＲＮＡが優れた確実性で作製され、それらのうちの少なくとも１個が有効であり得る。
【０１２３】
実施形態は、たとえばある発生段階に対し選択的な遺伝子などの遺伝子に対するＲＮＡｉを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞、およびたとえば家畜動物などの遺伝的改変動物を含む。ＲＮＡｉはたとえば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣおよびｍｉＲＮＡからなる群から選択されてもよい。
【０１２４】
誘導系
誘導系を使用して、遺伝子発現を制御してもよい。遺伝子発現の時空間的制御が可能な様々な誘導系が公知である。いくつかは、トランスジェニック動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで機能性であることが証明されている。誘導系という用語は、昔ながらのプロモーター、および誘導性遺伝子発現エレメントを含む。誘導系の例は、テトラサイクリン（ｔｅｔ）−オンプロモーター系であり、これを使用して核酸の転写を調節することができる。この系において、変異Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を単純ヘルペスウイルスＶＰ１６のトランスアクチベータータンパク質の活性化ドメインに融合させ、ｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節されるテトラサイクリン制御転写アクチベーター（ｔＴＡ）を作製する。抗生物質の非存在下では、転写は最小限であり、一方でｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では、転写が誘導される。別の誘導系としては、エクジソン系またはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは昆虫の脱皮ホルモンであり、その産生はエクジソン受容体とｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ  遺伝子（ＵＳＰ）の産物のヘテロ二量体により制御されている。エクジソン、またはたとえばムリステロンＡ（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ  Ａ）などのエクジソンのアナログを用いた処置により発現が誘導される。誘導系を起こすために動物に投与される薬品は導入剤と呼称される。
【０１２５】
テトラサイクリン誘導系と、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構造性または誘導性のいずれか）は、より普遍的に使用されている誘導系の１つである。テトラサイクリン誘導系は、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）／リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を含む。これらｉｎ  ｖｉｖｏ系の使用方法は、２系統の遺伝的改変動物の作製に関与する。１つの動物系統は、選択プロモーターの制御下でアクチベーター（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。別セットのトランスジェニック動物は、アクセプターを発現し、その場合の対象遺伝子の発現（または改変される遺伝子の発現）は、ｔＴＡ／ｒｔＴＡトランスアクチベーターの標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列に隣接している）。２系統のマウスを交配させることで、遺伝子発現が制御される。
【０１２６】
テトラサイクリン依存性の調節系（ｔｅｔ系）は、２つの構成要素、すなわちテトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）と、ｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターに依っており、テトラサイクリン依存性の様式で下流ｃＤＮＡの発現を制御する。テトラサイクリンまたはその誘導体（たとえばドキシサイクリン）の非存在下では、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を生じさせている。しかしドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡはその標的と相互作用することができず、転写が発生しない。ｔＴＡを使用するｔｅｔ系は、ｔｅｔ−オフと名付けられている。その理由は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが、転写の下方制御をもたらしているからである。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入遺伝子発現が一次的に制御される。ｒｔＴＡはｔＴＡのバリアントであり、ドキシサイクリンの非存在下では機能せず、しかしトランス活性化のためにはそのリガンドの存在を必要とする。ゆえにこのｔｅｔ系はｔｅｔ−オンと名付けられている。たとえばレポーター遺伝子、がん遺伝子、またはシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質などをコードするいくつかの導入遺伝子の誘導発現のために、ｔｅｔ系は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用されている。
【０１２７】
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系はＣｒｅリコンビナーゼを使用する。この酵素は２つの遠く離れたＣｒｅ認識配列、すなわちｌｏｘＰ部位の間の交差による部位特異的組み換えを触媒する。２つのｌｏｘＰ配列の間に導入されたＤＮＡ配列（ｌｏｘＰ導入（ｆｌｏｘｅｄ）ＤＮＡと名付けられる）は、Ｃｒｅ介在組み換えにより切除される。トランスジェニック動物におけるＣｒｅ発現の制御は、空間制御（組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを用いる）または時間制御（誘導系を用いる）のいずれかを使用し、２つのｌｏｘＰ部位の間のＤＮＡ切除の制御を生じさせる。１つの応用は、条件付き遺伝子不活化である（条件付きノックアウト）。別の方法は、タンパク質の過剰発現であり、この場合においてｌｏｘＰ導入停止コドンは、プロモーター配列と対象ＤＮＡの間に挿入される。遺伝的改変動物はＣｒｅが発現されるまで導入遺伝子を発現せず、ｌｏｘＰ導入停止コドンの切除が導かれる。この系を組織特異的な腫瘍形成に適用し、Ｂリンパ球における抗原受容体発現を制御する。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼも開発されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼと特異的リガンド−結合ドメインを含有する融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能的活性は、融合タンパク質中のこの特異的ドメインに結合することができる外部リガンドに依存している。
【０１２８】
実施形態は、誘導系の制御下にある遺伝子を備えた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞、およびたとえば家畜などの遺伝的改変動物を含む。動物の遺伝的改変は、ゲノム改変またはモザイク改変であってもよい。誘導系は、たとえば、Ｔｅｔ−オン、Ｔｅｔ−オフ、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ、およびＨｉｆ１アルファからなる群から選択されてもよい。実施形態は、本明細書に解説される遺伝子である。
【０１２９】
ドミナントネガティブ
ゆえに、遺伝子は、除去またはＲＮＡｉ抑制による破壊されるだけではなく、当該遺伝子産物の正常機能に対して阻害効果を有するタンパク質のドミナントネガティブバリアントの産生／発現により破壊されてもよい。ドミナントネガティブ（ＤＮ）遺伝子の発現は、表現型の改変を生じさせる。これは、ａ）漸増効果；ＤＮは、受動的に、内因性遺伝子産物と、共同因子または当該内因性遺伝子の通常標的のいずれかに関し、同活性を生じさせることなく、競合する。ｂ）ポイズンピル（またはモンキーレンチ（ｍｏｎｋｅｙ  ｗｒｅｎｃｈ）効果。この場合においてドミナントネガティブ遺伝子産物は、能動的に、通常の遺伝子機能に重要なプロセスに干渉する。ｃ）フィードバック効果。この場合においてＤＮは、能動的に、遺伝子機能の負のレギュレーターを刺激する。
【０１３０】
創始動物、動物系統、形質、および繁殖
創始動物（Ｆ０世代）は、クローン化、および本明細書に記載されるその他の方法により作製されてもよい。創始動物は、受精卵または初代細胞がホモ接合性改変を受けている場合、遺伝的改変に対しホモ接合性であってもよい。同様に、ヘテロ接合性の創始動物が作製されてもよい。創始動物はゲノム改変されてもよく、これは、細胞がそのゲノムにおいて改変を受けていることを意味する。創始動物は、改変に関しモザイクであってもよく、ベクターが胚の複数の細胞のうちの１つに導入されたとき、典型的には胚盤胞期に偶然発生し得る。モザイク動物の子孫を検査し、ゲノム改変されている子孫を特定してもよい。動物系統は、有性生殖を行うことができるか、または繁殖技術の補助により繁殖することができ、ヘテロ接合性またはホモ接合性の子孫が常に改変を発現している動物のプールが作製されたときに確立される。
【０１３１】
家畜において、多くのアレルが、たとえば生産形質、体型形質、作業能力形質、および他の機能的形質などの様々な形質に連鎖していることが知られている。当業者であれば、たとえば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１２３−１３７，１９９４、米国特許第７，７０９，２０６号、Ｕ．Ｓ．２００１／００１６３１５、Ｕ．Ｓ．２０１１／００２３１４０、およびＵ．Ｓ．２００５／０１５３３１７など、これら形質のモニタリングおよび定量に順応している。動物系統は、生産形質、体型形質、作業能力形質、繁殖形質、育児形質、および疾患抵抗性形質からなる群の形質から選択される形質を含んでもよい。さらなる形質としては、組み換え遺伝子産物の発現が挙げられる。
【０１３２】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、リコンビナーゼ（たとえばＲｅｃＡタンパク質、Ｒａｄ５１など）、またはＤＮＡ組み換えに関与する他のＤＮＡ結合タンパク質を備えた標的化ヌクレアーゼ系を投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸断片を有する繊維状物質を形成し、効果としては、細胞ＤＮＡを探索し、配列に対し実質的に相同なＤＮＡ配列を発見する。たとえばリコンビナーゼはＨＤＲの鋳型として役立つ核酸配列と混合されてもよい。次いでリコンビナーゼは、ＨＤＲ鋳型と混合され、繊維状物質を形成し、細胞内に入る。リコンビナーゼ、および／またはリコンビナーゼと混合されるＨＤＲ鋳型は、タンパク質、ｍＲＮＡとして細胞または胚に入れられてもよく、またはリコンビナーゼをコードするベクターを用いて細胞または胚に入れられてもよい。Ｕ．Ｓ．２０１１／００５９１６０（米国特許出願番号１２／８６９，２３２）の開示内容は、すべての目的に対し、参照により本明細書に援用される。矛盾が生じる場合は、本出願が統制する。リコンビナーゼという用語は、細胞において、２つの比較的長いＤＮＡ鎖の間の比較的短いＤＮＡ小片の結合を酵素触媒する遺伝子組み換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、ＣｒｅおよびＦＬＰが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、Ｐ１バクテリオファージに由来するＩ型トポイソメラーゼであり、ｌｏｘＰ部位間の部位特異的なＤＮＡ組み換えを触媒する。Ｈｉｎリコンビナーゼは、サルモネラ菌に存在する、１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤのタンパク質である。ＨｉｎはＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属しており、活性部位のセリンに依存して、ＤＮＡの開裂と組み換えを開始させる。ＲＡＤ５１はヒトの遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＲＡＤ５１タンパク質ファミリーの１種であり、ＤＮＡ二本鎖の破損の修復を補助する。ＲＡＤ５１ファミリーは、細菌のＲｅｃＡと酵母のＲａｄ５１と相同である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位に隣接する特定の配列を欠失させる実験で使用される酵素である。ＦＬＰとは、  フリッパーゼ組み換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）を指し、パン酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来する。
【０１３３】
本明細書において、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」とは、ＲｅｃＡ様組み換えタンパク質のファミリーを指し、それらは同じ機能、特に以下の機能の本質的にすべて、または大部分を有している：（ｉ）その後のＤＮＡポリメラーゼによる伸長のために、自身の相同標的上に、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを適切に配置する能力。（ｉｉ）ＤＮＡ合成のために二本鎖核酸を調製するトポロジー的能力。および（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチドの複合体に、効率的に相補配列を発見させ、結合させる能力。最も特徴解析がなされているＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する。当該タンパク質の元々のアレル型に加えて、ＲｅｃＡ８０３など、多くの変異型ＲｅｃＡ様タンパク質が特定されている。さらに、多くの生物体がＲｅｃＡ様鎖移転タンパク質を有しており、たとえば、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳類、および植物が挙げられる。これらのタンパク質としては、たとえばＲｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２およびＤＭＣ１が挙げられる。組み換えタンパク質の実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異型ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌の源に由来するＲｅｃＡタンパク質、または別の生物体に由来する相同組み換えタンパク質であってもよい。
【０１３４】
組成物およびキット
また本発明は、たとえば部位特異的エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９、ＺＮＦｓ、ＴＡＬＥＮｓ、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合体をコードする核酸分子、同ポリペプチド、かかる核酸分子もしくはポリペプチドを含有する組成物、または遺伝子操作細胞株を含有する組成物およびキットを提供する。また、指定されるアレルの遺伝子移入に有効なＨＤＲが提供されてもよい。かかる製品は、たとえば研究ツール用に使用されてもよく、または医療用に使用されてもよい。
【実施例】
【０１３５】
別段の記載がない限り、方法は以下のとおりである。
【０１３６】
組織培養およびトランスフェクション
ブタを、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。トランスフェクションに関しては、ＮＥＯＮトランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用したトランスフェクションを介してすべてのＴＡＬＥＮｓとＨＤＲ鋳型を送達した。簡潔に述べると、１００％コンフルエンスに達した短期継代のオサボウ（Ｏｓｓａｂａｗ）ランドレース種を１：２に分割し、翌日、７０〜８０％コンフルエンスで回収した。各トランスフェクションは、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとオリゴと混合された緩衝液「Ｒ」中に再懸濁された５００，０００〜６００，０００個の細胞から構成され、１００μｌチップを使用して１００μｌのワーキング量を提供し、以下のパラメーターによりエレクトロポレーションを行った：入力電圧；１８００Ｖ；パルス幅；２０ｍｓ；およびパルス数１。典型的には、対象遺伝子に特異的な、１〜２μｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと１〜４μＭのＨＤＲ鋳型（一本鎖オリゴヌクレオチド）が各トランスフェクションが含有された。それら量からの偏差は、図および図の説明に示されている。トランスフェクション後、細胞を３日間、６ウェルディッシュのウェルに播種し、いずれも３０℃で培養した。３日後、細胞群をコロニー解析用に播種し、および／または少なくとも１０日目まで３７℃で増殖させ、編集の安定性を評価した。
【０１３７】
サーベイヤー変異検出およびＲＦＬＰ解析
目的部位に隣接するＰＣＲを、メーカーの推奨に従い１μｌの細胞溶解物を用いて、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ  ＨｉＦｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して行った。群の変異頻度は、上述のＰＣＲ産物を１０μｌ使用し、メーカーの推奨に従ってＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社）を用いて解析した。ＲＦＬＰ解析は、指定される制限酵素を使用して、上述のＰＣＲ反応物１０μｌに対し行われた。サーベイヤーとＲＦＬＰの反応物を、１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分離させ、エチジウムブロマイド染色で可視化させた。バンドの濃度測定はＩＭＡＧＥＪを使用して行われた。サーベイヤー反応の変異率は、Ｇｕｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０（１）に記載されるように算出された。相同組み換え修復（ＨＤＲ）割合は、ＲＦＬＰ断片の総濃度を、親バンド＋ＲＦＬＰ断片の総濃度で割ることにより算出された。コロニーのＲＦＬＰ解析は、ＰＣＲ産物が１Ｘ  ＭＹＴＡＱ  ＲＥＤ  ＭＩＸ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）により増幅され、２．５％アガロースゲル上で分離された点を除き、同じように行われた。
【０１３８】
希釈クローニング：
トランスフェクションの３日後、５０〜２００個の細胞を１０ｃｍディッシュ上に播種し、個々のコロニーの直系がおよそ５ｍｍに到達するまで培養した。この時点で、ＰＢＳ中で１：５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈されたＴＲＹＰＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を６ｍｌ加え、コロニーを吸引し、２４ウェルディッシュのウェルに移し、同条件下で培養した。コンフルエンスに到達したコロニーを集め、凍結保存用と遺伝子型決定用に分けた。
【０１３９】
サンプル調製：
３日目および１０日目にトランスフェクトされた細胞群を６ウェルディッシュのウェルから集め、１０〜３０％を、５０μｌの１ｘＰＣＲ相溶性溶解緩衝液：２００μｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを新たに補充した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４５％  ＴＲＹＴＯＮ  Ｘ−１００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．４５％  ＴＷＥＥＮ−２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に再懸濁した。以下のプログラムを使用したサーマルサイクラー中で溶解物を処理した：５５℃、６０分間。９５℃、１５分間。希釈クローニングからのコロニーサンプルを、２０〜３０μｌの溶解緩衝液を使用して上述のように処置した。
【０１４０】
【表４】
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2019505218.tif 000008
【０１４１】
実施例１：ブタＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒγの多重遺伝子編集
ブタＲＡＧ２とＩＬ２Ｒγを指向する６条件のＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＨＤＲ鋳型をブタの線維芽細胞に共トランスフェクトした。定量のＲＡＧ２のｍＲＮＡと鋳型を各トランスフェクションに対し使用し、一方で、ＩＬ２ＲγのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＨＤＲ鋳型の量は指定される各条件に対して変更した。ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＨＤＲ鋳型の投与量は、オンターゲット効果とオフターゲット効果の両方を有する。ＩＬ２Ｒγに対するＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを増加させると、ＩＬ２Ｒγに対するＮＨＥＪおよびＨＤＲの両方が増加したが、一方でＲＡＧ２に対するＮＨＥＪ値は変化しなかった。ＩＬ２ＲγのＨＤＲ鋳型を増加させると、ＲＡＧ２座位のＨＤＲは減少したことから、オリゴヌクレオチド濃度を上昇させることによる、相同組み換え修復の非特異的阻害が示唆される。ＲＡＧ２とＩＬ２Ｒγの両アレルＨＤＲを有するコロニーを、２条件（図４Ｃおよび図４Ｄ）から４％と２％で取得した。これは予測頻度の２％以上である。予測頻度は、独立した事象として各ＨＤＲアレルを取り扱う、３日目のＨＤＲ値の乗算により算出される。図４Ａ〜４Ｄは、ブタのＲＡＧ２  およびＩＬ２Ｒγの多重遺伝子編集である。図４Ａは、トランスフェクション後３日目の細胞群に対する、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、および相同組み換え修復（ＨＤＲ）の効率を決定するためのサーベイヤー解析およびＲＦＬＰ解析である。図４Ｂは、トランスフェクション後１１日目の細胞群に対する、相同組み換え修復に対するＲＦＬＰ解析である。図４Ｃは、ＩＬ２Ｒγ、ＲＡＧ２  またはその両方でＨＤＲ陽性のコロニー割合である。図４Ａにおいて「Ｃ」と示される群由来の細胞が播種された。コロニーの遺伝子型分布を以下に示す。図４Ｄは、ＩＬ２Ｒγ  とＲＡＧ２に対し、２μｇおよび１μｇの量のＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと、１μＭのＨＤＲ鋳型を各々に対して用いてトランスフェクトされた細胞のコロニー解析である。コロニーの遺伝子型分布を以下に示す。
【０１４２】
実施例２：ブタＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒγの多重遺伝子編集
ブタのＡＰＣとｐ５３を指向する４条件のＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＨＤＲ鋳型をブタの線維芽細胞に共トランスフェクトした。ＡＰＣ  ｍＲＮＡの量は、左から右に、連続的に減少させた（図５Ｂ）。その量の残りは、示されるように一定で維持された。ＡＰＣ  ｍＲＮＡの減少とともに、ＨＤＲ割合も直線的に減少した。ＡＰＣ  ＴＡＬＥＮｓの投与量を変化させても、ｐ５３  ＨＤＲにはほとんど影響はなかった。コロニーの遺伝子型決定により、１１日目の値と比較して、ＡＰＣとｐ５３の両方においてＨＤＲアレルを有すると予測されたコロニー単位よりも高いことが明らかとなった。図５Ｃと図５Ｄのそれぞれに対し、１３．７パーセントと７．１パーセントに対し、１８パーセントと２０パーセントであった。図５Ａ〜５Ｄは、ブタのＡＰＣ  およびｐ５３の多重遺伝子編集である。図５Ａは、トランスフェクション後３日目の細胞群に対する、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、および相同組み換え修復（ＨＤＲ）の効率を決定するためのサーベイヤー解析およびＲＦＬＰ解析である。図５Ｂは、トランスフェクション後１１日目の細胞群に対する、相同組み換え修復に対するＲＦＬＰ解析である。図５Ｃおよび図５Ｄ。ＡＰＣ、ｐ５３またはその両方でのＨＤＲに関して、示される細胞群（図５Ａにおいて、「Ｃ」および「Ｄ」と示される）に由来する陽性コロニーの割合。３個以上のＨＤＲアレルを有するコロニーを以下に列記する。
【０１４３】
実施例３：少なくとも３個の遺伝子を用いた多重化
実施例１において、高濃度のＨＤＲオリゴでＨＤＲの非特異的減少が観察された。ゆえに２＋ＨＤＲオリゴがＨＤＲ非特異的阻害を伴わずに有効であるか否かは不明であった。各標的部位に対し、１ｕＭと２ｕＭの２つの濃度を検証した。ＴＡＬＥＮ活性は２つの濃度の間で有意な変化はなかったが、ＨＤＲは各鋳型に対し、２ｕＭの濃度で有意に鈍くなった。１ｕＭ条件に由来するクローンは様々な遺伝子型を有しており、それらの一部は各遺伝子で編集を有し、最大で７アレルであった（図７Ａおよび図７Ｂ）。もし独立事象として処置された場合、７アレルの編集を伴う「ａ」と表示される遺伝子型の予測頻度は、０．００１パーセントである。本明細書において行われたように、サンプルサイズが７２で、かかる遺伝子型の２＋コロニーが同定される可能性は０．００００２６パーセント未満であると二項分布では予測された。この高い成功率は予測できるものではなく、予想外であり驚きである。この結果は、ＴＡＬＥＮｓ／ＨＤＲ鋳型の２つのさらなる組み合わせを用いて反復された（図８Ａおよび図８Ｂ、ならびに図９Ａおよび図９Ｂ）。最初の試験結果と同様に、最大で７アレルおよび最大で４遺伝子でＨＤＲ編集を有するコロニーが取得された（表Ａ）。偶然によるものと予想される頻度よりもはるかに高い頻度で、いくつかの遺伝子型が回復された。いくつかの座位で同時に二本鎖を破損させることに関する懸念は、意図しない染色体再構成が誘導されてしまうことだが、検証された試験３の細胞由来の５０核型のうち５０核型が正常であった（データは示さず）。
【０１４４】
図６Ａと図６Ｂ：５‐遺伝子多重ＨＤＲ効率に対する、オリゴヌクレオチドＨＤＲ鋳型濃度の効果。指定量のブタＲＡＧ２、ＩＬ２Ｒｇ、ｐ５３、ＡＰＣおよびＬＤＬＲ指向性ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを、２ｕＭ（図６Ａ）または１ｕＭ（図６Ｂ）の各同系ＨＤＲ鋳型とともにブタ線維芽細胞に共トランスフェクトした。ＮＨＥＪとＨＤＲの割合は、サーベイヤーアッセイおよびＲＦＬＰアッセイにより測定された。図７Ａおよび図７Ｂ：５−遺伝子多重ＨＤＲからのコロニー遺伝子型：コロニー遺伝子型はＲＦＬＰ解析により評価された。図７Ａにおいて、各線は、各特定座位での１つのコロニーの遺伝子型を表している。３つの遺伝子型が特定された；ヘテロ接合性またはホモ接合性のＨＤＲの予測ＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片を有するもの、それに加えて、挿入または欠失（インデル）アレルの指標となる、サイズの可視偏移を有する第二のアレルを有するもの。特定の座位で編集を有するコロニーの割合は、各列の下に示す。図７Ｂは、０〜５個の座位で編集されたコロニー数の集計を示す。図８Ａ〜図８Ｂ：第二の５−遺伝子多重化試験のコロニー遺伝子型。図８Ａ：各線は、各特定座位での１つのコロニーの遺伝子型を表している。３つの遺伝子型が特定された；ヘテロ接合性またはホモ接合性のＨＤＲの予測ＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片を有するもの、それに加えて、挿入または欠失（インデル）アレルの指標となる、サイズの可視偏移を有する第二のアレルを有するもの。特定の座位で編集を有するコロニーの割合は、各列の下に示す。図８Ｂ：０〜５個の座位で編集されたコロニー数の集計。図９Ａおよび図９Ｂ：第三の５−遺伝子多重化試験のコロニー遺伝子型。図９Ａ：各線は、各特定座位での１つのコロニーの遺伝子型を表している。３つの遺伝子型が特定された；ヘテロ接合性またはホモ接合性のＨＤＲの予測ＲＦＬＰ遺伝子型を有するもの、ならびにＲＦＬＰ陽性断片を有するもの、それに加えて、挿入または欠失（インデル）アレルの指標となる、サイズの可視偏移を有する第二のアレルを有するもの。特定の座位で編集を有するコロニーの割合は、各列の下に示す。図９Ｂ。０〜５個の座位で編集されたコロニー数の集計。
【０１４５】
実施例４Ａ〜４Ｄ
実施例４Ａ：多重化遺伝子編集によるＲＡＧ２／ＩＬ２Ｒｇヌル（ＲＧ−ＫＯ）ブタ線維芽細胞の開発。オスのブタ胎仔線維芽細胞に、従前に規定される方法（Ｔａｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎｍｅｉｏｔｉｃ  ａｌｌｅｌｅ  ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  ｕｓｉｎｇ  ｃｕｓｔｏｍ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＰＮＡＳ，１１０（４１）：１６５２６−１６５３１，２０１３）を使用して、ＲＡＧ２およびＩＬ２Ｒｇの破壊を目的としたＴＡＬＥＮｓとオリゴヌクレオチド鋳型をトランスフェクトさせた。ＲＧ−ＫＯ候補は、配列解析により確認された際に、たとえばＲＦＬＰにより特定される。少なくとも約５個の確認済みＲＧ−ＫＯコロニーが、クローニングとキメラ作製用のリソースとしてプールされた。
【０１４６】
実施例４Ｂ：ＲＧ−ＫＯホストの胚盤胞を使用したキメラ胚の作製
ホストのＲＧ−ＫＯ胚と、メスＥＧＦＰ標識ドナー細胞を、クロマチン導入技術を使用して作製し、その後に胚盤胞期までｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養を行った。実施例１のＲＧ−ＫＯ細胞を使用してもよい。ＥＧＦＰ胚盤胞からの７日目細胞間集塊を、６日目ＲＧ−ＫＯ胚に注入し、その後に胚を同期したメスブタに導入した。この方法を使用して、Ｎａｇａｓｈｉｍａらは、生まれた子ブタの５０パーセント超にキメラ現象を確認した（Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｘ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｉｇｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ，７０（３）：７０２−７０７，２００４）。マウスとブタの両方とも、注入キメラではオスの表現型が顕性である。ゆえに、メスドナー細胞が注入されたＸＹ  ＲＧ−ＫＯホストは、オスホストの遺伝的特徴を排他的に伝播する。妊娠チェックは、適切な時点、たとえば２５日目、５０日目、および１００日目に行われる。妊娠約１００日目の妊娠ブタを毎日４回モニタリングし、その後、約１１４日目までに帝王切開で子豚を出生させる。
【０１４７】
実施例４Ｃ：キメラではない子豚がＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を欠損しているかを決定する。
キメラではない子豚を検査し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を欠損しているかを決定する。以下のプロセスは上記を行うための１つの技術である。キメラと推定される仔豚を妊娠している各メスブタ、および野生型の仔豚を妊娠している１頭の繁殖メスブタに対し帝王切開を行う。帝王切開後、ただちに各仔豚から臍帯血を単離する。臍帯血の白血球を、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の群、ならびにドナー由来ＥＧＦＰ発現に関して評価する。さらにキメラ現象を、臍帯血、耳生検、および尾生検からＰＣＲにより評価する。この初期解析を誕生から６時間以内に完了させ、それにより非キメラ仔豚を入念にモニタリングできるようにし、感染の兆候があれば安楽死させる。非キメラ動物の一部、または免疫細胞を欠損している動物を、解剖のために安楽死させる。
【０１４８】
実施例４Ｄ：キメラブタの特定と、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の起源の決定。
キメラブタを検査し、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の起源を決定する。以下のプロセスは上記を行うための１つの技術である。キメラの仔豚を、上述の方法を使用して特定する。循環リンパ球と血清イムノグロブリンを毎週評価し、キメラ仔豚、非キメラ仔豚、および野生型仔豚の間で２カ月間にわたり比較する。ソート化されたＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の群を、ＥＧＦＰ発現に関して評価し、マイクロサテライト解析を行い、ドナー起源を確認する。サンプルの維持と、キメラブタからの精液採取は、第ＩＩ相の財源支援が利用可能となるまでＲＣＩによりサポートされる。
【０１４９】
実施例Ａ〜Ｄのサンプリング手順：
臍帯血および末梢血のＦＡＣＳ
血液リンパ球とＥＧＦＰキメラ現象の評価は、ブタ試料用に改変を行い、上述の（２）のように行われる。帝王切開分娩後ただちに各仔豚から臍帯血が採取される。将来的な同種移植治療に備えて臍帯血の一部を処理、および凍結保存し、残りはリンパ球のＦＡＣＳ解析用に使用する。末梢血サンプルは、標準的な方法により２週齢、４週齢、６週齢、および８週齢で採取される。ＲＢＣを除去し、およそ１〜２Ｅ＋５細胞をチューブに分配する。Ｔ細胞（ＣＤ４とＣＤ８）、Ｂ細胞（ＣＤ４５ＲＡとＣＤ３）、ＮＫ細胞（ＣＤ１６とＣＤ３）、および骨髄細胞（ＣＤ３）の同定用の抗ブタ抗体を用いて分注物を標識する。抗原発現は、ＬＳ  ＲＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で定量される。フルオロフォアを注意深く選択し、表面抗原とともにドナー由来ＥＧＦＰ細胞を多重的に評価できるようにする。脾臓由来の単一細胞懸濁液を同方法で解析する。
【０１５０】
検証
すべての主要臓器と組織を、適切な解剖学的発達に関して肉眼検査し、膵臓、肝臓、心臓、腎臓、肺、消化管、免疫系（末梢リンパ節および粘膜リンパ節および脾臓）、およびＣＮＳを含むすべての主要臓器と組織から、ＤＮＡ単離用の適切なサンプルを採取する。ＦＡＣＳ解析用に単一細胞懸濁液を脾臓から調製する。組織を、組織検査用に調製して、キメラ現象、キメラ状態に関連し得る何らかの変化、および何らかの基礎疾患の存在に関してさらに評価する。
【０１５１】
キメラ現象の分析
定量的ＰＣＲを、ＥＧＦＰ導入遺伝子に特異的なプライマーを使用して、臍帯血、耳生検、および尾生検に対して行い、ＥＧＦＰ細胞と野生型細胞の既知の比率を用いた標準曲線と比較する。上述のＲＦＬＰアッセイを介して、ＲＧ−ＫＯアレルに関しても試料を評価する。ＥＧＦＰ＋細胞の生着を、解剖の間に動物全体と臓器に対し、肉眼的に評価する。主要臓器の組織を、ＥＧＦＰ免疫組織化学染色用に薄片化し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて対比染色して、ドナー細胞とホスト細胞の比率を決定する。
【０１５２】
マイクロサテライト解析
研究室で日常的に使用されているものからホストの遺伝的特徴とドナーの遺伝的特徴に対して有益なマイクロサテライトに関して動物をスクリーニングする。組織と血液（ソート化されたリンパ球系統または骨髄系統、ＥＧＦＰ陽性および陰性）のサンプルを評価する。ドナー細胞とホスト細胞の相対量を、ＭＩＳＥＱ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）上で多重化アンプリコン配列解析を行うことにより評価する。
【０１５３】
動物
臍帯血および末梢血のＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を欠く非キメラブタを作製する。キメラブタは、ほぼ野生型のレベルに実質的に近いレベルを有する。さらに、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞が陽性のキメラは、実質的に正常な免疫機能を有し、標準的な条件下で飼育された場合に健康状態を維持する。
【０１５４】
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計と作製
遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列を、メーカーの方法に従いＣｈｕｒｃｈ  ｌａｂ  ｇＲＮＡ  ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社  ＩＤ：４１８２４）にクローニングした。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社  ＩＤ：４１８１５）の共トランスフェクション、またはＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９から合成されたｍＲＮＡのいずれかにより提供された。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミド（ｈＣａｓ９  ｃＤＮＡを包含する）からのＸｂａＩ−ＡｇｅＩ断片を、ＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミドにサブクローニングすることにより構築された。ｍＲＮＡの合成は、ＫｐｎＩを使用して直線化が行われた点を除き、上述のように行われた。
【０１５５】
実施例６：標的化エンドヌクレアーゼおよびＨＤＲを用いた多重遺伝子編集。
【０１５６】
図１３Ａは、多重化実験の各遺伝子の概略図であり（別の色調で示されるｃＤＮＡ−エクソンとして図示されている）、ＴＡＬＥＮＳに標的とされる部位が示されている。各遺伝子に対するＤＮＡ結合ドメインをコードする配列を以下に示す。ブタの線維芽細胞に、各遺伝子を標的とし、遺伝子型決定用の未成熟終結コドンならびに新規ＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＦＬＰ部位を挿入するよう設計された１μｇの各ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡと、０．１ｎＭｏｌの各ＨＤＲオリゴを共トランスフェクトさせた（図１３Ｂ）。遺伝子型決定用に、総数で３８４個のコロニーが単離された。ＧＡＴＡ４およびＮｋｘ２−５のＲＦＬＰアッセイが行われ（図１３Ｃ）、ＭＥＳＰ１が配列解析により評価された（データは示さず）。２個のコロニー（２／３８４、０．５２％）が、３個すべての遺伝子に対してホモ接合性のＨＤＲノックアウトであった。三重ノックアウトはアスタリスクで標識してある（図１３Ｃ）。追加の遺伝子型決定は図１３Ｃに記載されている。例として、コロニー４９はＨＤＲ編集が無い；コロニー５２と６３は、ＮＫＸ２−５に対しヘテロ接合性の編集を有している；コロニー５９は、ＮＫＸ２−５とＧＡＴＡ４の両方に対してヘテロ接合性の編集を有しているなど。
【０１５７】
実施例７：ＴＡＬＥＮｓとＲＧＥＮｓの組み合わせを使用した多重化遺伝子編集。
図１４を参照のこと。ブタの線維芽細胞を、各遺伝子に対するＴＡＬＥＮＳ（１ｕｇ  ＥＩＦ４Ｇ  １４．１  ｍＲＮＡ）＋Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ成分（２ｕｇ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ＋２ｕｇ  ｐ６５  Ｇ１ｓ  ガイドＲＮＡ）および０２  ｎＭｏｌのＨＤＲを用いて共トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、ＲＦＬＰアッセイにより評価し、両部位のＨＤＲを明らかにした。この群の細胞をコロニー単離のために播種し、両遺伝子に編集を有する単離体を特定する。
【０１５８】
実施例８：ヒト−ブタのキメラ胚盤胞。
胚盤胞相補を使用してヒト臓器／細胞をブタで作製するための重要な最初の工程は、ヒト幹細胞が、栄養外胚葉および卵割腔とは対照的に、内部細胞塊に組み込まれることができるかどうかを決定することである。ヒト幹細胞を内部細胞塊に組み込むことができるかどうかを決定するために、単為生殖胚盤胞を使用してアッセイ系を開発した。単為生殖生物は、ブタの卵母細胞を電気的活性化することにより作製され、これにより、母系前核と極体からのＤＮＡの組み合わせから二倍体細胞が形成される。その後、１個の二倍体細胞は分裂し、活性化から６日後には、ヒト幹細胞の注入に適した、充分に形成された胚盤胞となる。電気的活性化後６日目に、ｈＵＣＢＳＣを個々のブタ単為生殖胚盤胞へと注入した。次いでｈＵＣＢＳＣの分布を７日目と８日目に検証し、各時点でのヒト幹細胞数は、ヒト核抗原（ＨＮＡ）を認識する抗体を使用して個々のｈＵＣＢＳＣを可視化し、定性した。ｈＵＣＢＳＣの大部分が内部細胞塊に組み込まれていたことが判明した（図１５Ａ〜１５Ｇ、および１５Ｆ）。さらに胚盤胞への注入後２日間、ｈＵＣＢＳＣは増殖し続けていた（図１５Ｇ）。
【０１５９】
実施例９：ヒト‐ブタのキメラ胎仔。
胚盤胞相補を介したヒト臓器／細胞の作製における別の重要な工程は、ヒト幹細胞が注入されたブタの胚盤胞から、ヒト細胞を含有するブタ胎仔が生まれることを示すことである。この課題に取り組むために、ｈＵＣＢＳＣを単為生殖胚盤胞に注入し、このキメラ胚盤胞をホルモン同期させたメスブタに移植した。妊娠２８日目で胎仔を採取した（図１６Ａ）。組織切片の組織解析により、キメラ胎仔の内部臓器内のＨＮＡ陽性細胞が明らかとなった（ＦＩＧＢ）。これらの結果から、ブタ胎仔の発生を継続させるｈＵＣＢＳＣの能力が示される。
【０１６０】
相補されたＰＩＴＸ３ノックアウト胚盤胞から誘導されたヒト‐ブタキメラ胎仔。ブタ−ブタキメラのブタ黒質ドーパミン神経細胞も作製し、特徴解析する；およびヒト‐ブタキメラのヒト黒質ドーパミン神経細胞も作製し、特徴解析する。ＮＵＲＲ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＰＩＴＸ３のノックアウト胚盤胞は、線維芽細胞でＴＡＬＥＮ技術を使用して作製され、クローン化される。ノックアウト胚盤胞が、相補を基礎とした黒質ドーパミン神経細胞の生成を行うことができるかどうかを、幹細胞源として標識ブタ卵割球を使用することにより決定する。この方法は、異種ブタ−ブタ膵臓を作製するために従前に使用されたことがある（Ｍａｔｓｕｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。胎仔の頭殿長が約１７ｍｍに達する３４〜３５日胎齢で、胎仔ブタを安楽死させる。この発生段階で、ＶＭおよび他の脳構造は、Ｅ１５日の胎仔ラット、および中間妊娠初期のヒト胎仔のサイズと同等であり、細胞移植に使用する。ＮＵＲＲ１、ＬＭＸ１Ａ、またはＰＩＴＸ３の胚盤胞のいずれか由来の胎仔ＶＭにおけるブタ−ブタ異種ドーパミン神経細胞の確認がマイルストーンであり、それにより、ヒト‐ブタキメラの作製を進めることができる。
【０１６１】
ブタ線維芽細胞におけるＬＭＸ１Ａ、ＰＩＴＸ３、およびＮＵＲＲ１のＴＡＬＥＮノックアウト。ＬＭＸＡ１、ＰＩＴＸ３、およびまたドーパミン神経細胞の発生に主要な役割を果たすもう１つの遺伝子であるＮＵＲＲ１に対する、それぞれエクソン１、２および３を切断するようＴＡＬＥＮｓを開発した（図１７Ａを参照、黒三角）。新規停止コドン、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、および新規停止コドン後にフレームシフトが導入されるよう設計された相同組み換え修復の鋳型とともに、ＴＡＬＥＮｓを共トランスフェクトし、確実に標的アレルを破壊した。トランスフェクト細胞群を、ＰＣＲ−制限酵素断片長多型アッセイにより産生されたＨｉｎｄＩＩＩ依存性切断に対して分析した（図１７Ｂ）。新規ＨｉｎｄＩＩＩ−ノックアウトアレル（切断産物により示される、白三角）を有する染色体の割合を、ゲル上に示す。この群に各クローンは由来しており、ＲＦＬＰと配列解析により両アレルノックアウトと立証されたクローンを相補実験用に凍結保存した。
【０１６２】
実施例１０：ヒト幹細胞を用いたＰＩＴＸ３ノックアウトブタ胚盤胞の相補は、眼の表現型をレスキューする。
ヒト幹細胞がブタにおいてＰＩＴＸ３欠失を相補することができるかを決定するために、ｈＵＣＢＳＣをＰＩＴＸ３ノックアウトブタの胚盤胞に注入し、胚盤胞をホルモン同期させた未経産ブタに移植した。キメラ胎仔を妊娠６２日目に採取し、まぶたの状態を検証した（図１８Ａ、図１８Ｃ、および図１８Ｅ）。キメラ胎仔の一部は、野生型ブタ胎仔と同様に眼瞼開裂を示していたが、その他は眼瞼閉鎖を示した。これらの結果から、ブタ胚盤胞のＰＩＴＸ３ノックアウトは、外胚葉性系統に対するヒト幹細胞の寄与の研究に適したモデルであることが示唆される。
【０１６３】
実施例１１：ＥＴＶ２  ノックアウトブタ胚
Ｅｔｖ２は、血管系統および造血系統の主要な制御遺伝子であり、遺伝子編集実験の理想的な候補である。いくつかの理由によって、Ｅｔｖ２遺伝子の座位に突然変異を誘導し、血管および造血系欠損ブタ胚を作製した。第一に、Ｅｔｖ２がマウスにおいて血管および造血系の発生の主要な制御遺伝子であることが包括的に示されている（Ｆｅｒｄｏｕｓ  ２００９，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ２０１１，Ｋｏｙａｎｏ−Ｎａｋａｇａｗａ  ２０１２，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ２０１２，Ｃｈａｎ  ２０１３，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ２０１３，Ｂｅｈｒｅｎｓ  ２０１４，Ｓｈｉ  ２０１４）。遺伝系統の追跡戦略を使用して、Ｅｔｖ２発現細胞が血管／内皮細胞系統および造血系統を生じさせることが示されている（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ２０１１，Ｋｏｙａｎｏ−Ｎａｋａｇａｗａ  ２０１２，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ２０１２）。第二に、包括的遺伝子欠失戦略が行われ、Ｅｔｖ２変異マウス胚が、血管系統および造血系統を欠くために生存できなかったことが示されている（Ｆｅｒｄｏｕｓ  ２００９，Ｋｏｙａｎｏ−Ｎａｋａｇａｗａ  ２０１２，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ２０１２，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ２０１３）。トランスクリプトーム解析を使用し、Ｅｔｖ２の非存在下ではＴｉｅ２が大幅に下方制御されていることが測定されている（Ｆｅｒｄｏｕｓ  ２００９，Ｋｏｙａｎｏ−Ｎａｋａｇａｗａ  ２０１２）。さらにトランスジェニック技術と分子生物技術を使用して（転写アッセイ、ＥＭＳＡ、ＣｈＩＰ、および突然変異誘導）、Ｓｐｉ１、Ｔｉｅ２  、およびＬｍｏ２  がＥｔｖ２の直接的な下流標的であったことが実証されている（Ｆｅｒｄｏｕｓ  ２００９，Ｋｏｙａｎｏ−  Ｎａｋａｇａｗａ  ２０１２，Ｓｈｉ  ２０１４）。第三に、ＥＳ／ＥＢ系の分化において、強制的にＥｔｖ２を過剰発現させると、内皮細胞系統および造血系統の群が大幅に増加することから、Ｅｔｖ２は、両系統を含む分子カスケードを統治する能力を有する単一要素であることが示される（Ｋｏｙａｎｏ−Ｎａｋａｇａｗａ  ２０１２）。
【０１６４】
実施例１２：ＥＴＶ２ノックアウトのブタ胚は血管系統と造血系統を欠いている。
従前の研究から、Ｅｔｖ２を欠く胚は血管系と血液が存在せず、およそＥ９．５で死に至ることから、マウスにおいて脈管形成と造血にＥｔｖ２が重要であることが示されている（Ｆｅｒｄｏｕｓ  ２００９，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ２０１１，Ｋｏｙａｎｏ−Ｎａｋａｇａｗａ  ２０１２）。いずれの学説にも拘束されることは意図していないが、ＥＴＶ２は哺乳類において血管系および血液の重要な制御因子であり、ゆえにブタでＥＴＶ２をノックアウトすることで、マウスの表現型が模写されると仮定される。ブタにおけるＥＴＶ２の役割を検証するために、ブタ線維芽細胞において、当該遺伝子に隣接する２つのＴＡＬＥＮペアを使用し、全ＥＴＶ２コード配列を除去した（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。このプロセスにより、１５％の効率で完全な遺伝子除去が行われた；遺伝子型決定されたクローン５２８個のうち７９個が、ＥＴＶ２遺伝子の欠失に関してホモ接合性であった。ＥＴＶ２ホモ接合性のノックアウト線維芽細胞クローンを、核クローニングに使用し（体細胞核導入：ＳＣＮＴ：Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、ＥＴＶ２ヌル胚を作製し、それを代理メスブタに移植した。クローン化効率は２９％であり、これは平均成功率の２０％よりも高かった。
【０１６５】
Ｅ１８．０で胚を採取し、解析した（図２０Ａ〜図２０Ｈ）。Ｅ１８．０で、野生型（Ｗｔ）の胚は血管が形成され、尿膜で血管網がよく発達しており（図２０Ａ）、血液発生の証拠があった（図２０Ｃ）。対照的に、ＥＴＶ２  ＫＯ胚は、明白な発育障害を示していた。両方の胚ともに２４体節期にあったが、Ｗｔ胚と比較して、ＥＴＶ２  ＫＯは成長が遅れており（図２０Ｂ）、血液と血管系統の両方とも欠失していた（図２０Ｃ〜図２０Ｈ）。ＥＴＶ２  ＫＯの胚は、主静脈、背部大動脈、および心内膜を欠いており、一方でＷｔの胚では明白に発達していた（図２０Ｅ〜図２０Ｈ）。これらの結果は、類似表現型を示しており、ＥＴＶ２の機能はマウスとブタの間で保存されていることが示唆される。さらにこれらのデータは、複数変異をブタゲノムに誘導し、２個以上の細胞型でヒト化されたキメラ臓器の成長をサポートすることができるという仮説を強く支持するものである。
【０１６６】
実施例１３：ヒトｉＰＳＣｓを用いたＥＴＶ２ノックアウトブタ胚盤胞の相補
ｈｉＰＳＣｓがブタにおいてＥＴＶ２欠失を相補することができるかを決定するためにさらなる実験が行われた。ｈｉＰＳＣｓをＥＴＶ２ノックアウトブタの胚盤胞に注入し、これら胚盤胞をホルモン同期させた未経産ブタに移植した。キメラ胎仔を妊娠１８日で採取し、ｈｉＰＳＣｓの状態に関し、免疫組織化学染色で検証した（図２１Ａ〜図２１Ｃ）。ヒト細胞を、Ａｌｕ反復配列に対するプローブを使用したゲノムｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ならびにヒト核抗原（ＨＮＡ）に対する染色により特定した。ヒトＣＤ３１とヒトｖＷＦ（血管／内皮マーカー）を発現するヒト細胞の存在が観察されたことから、ブタ胚盤胞におけるＥＴＶ２ノックアウトは、血管系統および造血系統に対するヒト幹細胞の寄与の研究の優れたモデルであるという見解が支持される。
【０１６７】
実施例１４：心臓発生の重要な制御因子としてのＮｋｘ２−５およびＨａｎｄＩＩ。
心臓発生は、電気的に結合されるようになり、最終的には機能的合胞体を形成する心臓前駆体の専門化、増殖、移動、および分化を含む複雑で高度に統合された事象である。これら心臓発生段階は、遺伝子破壊技術を使用して心臓形成と活性に重要であることが示されている転写ネットワークにより統制されている（Ｌｙｏｎｓ  １９９５，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  １９９７，Ｔａｎａｋａ  １９９９，Ｂｒｕｎｅａｕ  ２００１，Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ２００１，Ｇａｒｒｙ  ２００６，Ｆｅｒｄｏｕｓ  ２００９，Ｃａｐｒｉｏｌｉ  ２０１１）（表１）。Ｎｋｘ２−５は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオドメインタンパク質のティンマン（Ｔｉｎｍａｎ）（Ｃｓｘ）の脊椎動物ホモログである。ティンマンの変異は、ハエにおいて心臓形成の欠落を生じさせる（Ｂｏｄｍｅｒ  １９９３）。Ｎｋｘ２−５は、心臓系統で発現される早期転写因子の１つである。Ｎｋｘ２−５の標的破壊により、無秩序な心臓の形態形成、重度の成長遅延、およびおよそＥ９．５で胚死亡が生じる（Ｌｙｏｎｓ  １９９５，Ｔａｎａｋａ  １９９９）。ＨａｎｄＩＩ（ｄＨａｎｄ）は、心臓の形態形成にも重要であることが示されているｂＨＬＨ転写因子である。ＨａｎｄＩＩ  変異胚は、早期胚形成の間に死に至り、重度の右心室形成不全と大動脈弓の欠落を有する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  １９９７）。さらに、Ｎｋｘ２−５とＨａｎｄＩＩの両方を欠いているマウスは、心室の発育不全を示し、たった１つの心房しか有していない（図２２Ａ〜図２２Ｄ）（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ２００１）。マウスモデルにおける、これらの遺伝子破壊実験は、ブタモデルにおける遺伝子編集戦略使用の有効性を示している。
【０１６８】
実施例１５：ブタＮＫＸ２−５とＨＡＮＤＩＩ遺伝子の多重ノックアウト。
ＮＫＸ２−５／ＨＡＮＤＩＩ変異ブタ線維芽細胞を作製するために、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲの組み合わせを使用した。保存された転写因子／ＤＮＡ結合ドメインの内、またはすぐ前のいずれかで、各遺伝子を標的化した（図２３Ａ）。下流のＡＵＧでの開始により機能性ペプチドが産生されてしまう可能性を低くするためには、転写開始部位の近くの遺伝子を標的化するよりもこの戦略のほうが好ましい。ＮＫＸ２−５に関しては、新規のインフレーム停止コドン、ＲＦＬＰスクリーニング用の制限酵素部位、および機能性リードスルータンパク質を予防するための停止コドン後の追加の５塩基の挿入、を生成するために相同鋳型が提供された。二重変異体が特定された（図２３Ｂ）。単発で二重ヌルのブタ線維芽細胞細胞株を確実に生成する能力はユニークであり、相補に重要な革新技術である。
【０１６９】
実施例１６：三重ノックアウトブタ胚における無秩序な心臓形成。
予備実験は多くの重要な転写因子（すなわち、ＭＥＳＰ１、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤＩＩ、ＴＢＸ５など）を標的としており、無秩序な心臓形成を生じさせ、先天性心疾患の研究と有望な治療法のための新規の重要なブタの実験モデルを提供するであろう。本明細書において、概念実証としての標的化の成功と、ＮＫＸ２−５／ＨＡＮＤＩＩ／ＴＢＸ５  遺伝子の欠失に関しホモ接合性のクローンの作製が示された。三重ノックアウト線維芽細胞クローンを、核クローニング（ＳＣＮＴ）に使用し、ＮＫＸ２−５／ＨＡＮＤＩＩ／ＴＢＸ５  ヌルブタ胚を作製し、それを代理メスブタに移植した。Ｅ１８で胚を採取し、解析した。Ｅ１８はマウスのＥ１１と等しい。Ｅ１８で三重ノックアウトブタ胚は、血管構造、骨格筋、および血液を有しているが、野生型の対照ブタ胚と比較して本質的に心臓を欠いていた（ＧＡＴＡ４免疫組織化学染色陽性の心筋細胞は最小限）（図２４Ａ〜図２４Ｃ）。これらのデータは、他の系統（すなわち、ＴＢＸ５ＫＯの神経系統）の関与を限定し、より反映的な先天性心疾患モデルである（すなわち、形成不全の右心および左心の欠損）、ＮＫＸ２−５／ＨＡＮＤＩＩ二重ノックアウトブタモデル利用の論理的根拠と実現可能性を支持するものである。この方法は、ブタモデルにおけるヒト化二心室心臓の遺伝子操作をもたらす。
【０１７０】
実施例１７：筋形成の重要な調節因子としてのＭｙｆ５、Ｍｙｏｄ、およびＭｒｆ４。
Ｍｙｏｄ、Ｍｙｆ５、Ｍｒｆ４、およびＭｙｏｇを含むＭｙｏｄファミリーの発見は、骨格筋の筋形成の制御メカニズム理解に対する基盤的プラットフォームをもたらした（図２５Ａおよび２５Ｂ）。
【０１７１】
たとえばトランスクリプトーム解析、プロモーター解析およびＣｈＩＰ−ｓｅｑなどの複数の戦略を活用し、筋形成が為される間のＭｙｏｄファミリーの制御ネットワークが研究されている。Ｍｙｏｄファミリーのメンバーは主要な筋原性調節因子であり、筋特異的遺伝子、転写因子、細胞サイクル遺伝子などをはじめとする広汎な遺伝子ファミリーをトランス活性化し、筋原細胞の運命を促す。従前の遺伝子破壊実験によって、Ｍｙｆ５／Ｍｙｏｄ／ＭＲＦ４を欠くマウスは骨格筋を欠損し、誕生後早期に死に至ることが示されており、これはおそらく呼吸ができないことが原因であると推測されている（横隔膜の非存在が原因）。マウスモデルにおける、これら遺伝子の破壊実験は、ブタモデルにおける遺伝子編集戦略使用の有効性を示している。
【０１７２】
ＭＹＯＤ、ＭＹＦ５、およびＭＲＦ４をノックアウトするためのＴＡＬＥＮｓおよび相同組み換え修復（ＨＤＲ）の利用。ブタにおけるＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４（別名、ＭＹＦ６）の役割を検証するために、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲを使用して各コード配列を破壊した（図２６Ａ〜図２６Ｃ）。
【０１７３】
ＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４  ノックアウトブタ胚は、骨格筋系統を欠損している。Ｅ１８．０で胚を採取し、解析した（図２７Ａおよび図２７Ｂ）。マウスおよびブタにおける結果は、類似した表現型を示しており、ＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４  の機能は、変異胚が骨格筋を欠損していることから、マウスとブタの間で保存されているという見解が支持される。さらにこれらのデータは、複数変異をブタゲノムに誘導し、２個以上の細胞型でヒト化されたキメラ臓器の成長をサポートすることができるという仮説を強く支持するものである。
【０１７４】
実施例１８：ＧＦＰ  ＷＴブタ卵割球を用いたＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４  ノックアウト表現型の相補。
ブタのＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４  ヌル胚盤胞をＳＣＮＴを使用して作製し、ＧＦＰ標識ブタ卵割球を注入した（認証されたブタＥＳ細胞は入手不可能であったため、卵割球を本実験に利用した）。得られたキメラを、偽妊娠メスブタに移植し、Ｅ２０で検証した。肝臓および卵黄嚢がＧＦＰ陽性であったことから、相補の実現可能性が示された。さらに、ブタＭＹＦ５／ＭＹＯＤ／ＭＲＦ４  ヌル胚盤胞のおよそ１０％がＧＦＰ標識されていたと推定された（図２８Ａ〜図２８Ｃ）。これらのデータは、このブタ変異ホストにおける、ブタ；ブタの相補を支持するものである。これらのデータはさらに、ブタモデルにおいて、骨格筋を欠き、最終的には相補組織形成のためのニッチを生成する三重ノックアウトを作製することを支持している。ブタにおいてヒト化骨格筋を作製するためのこれら実験の全体を通じて、このデータが使用される。
【０１７５】
実施例１９：ＰＤＸ１  のノックアウトは、無膵胎仔ブタをもたらした。
Ｐｄｘ１−／−マウスは膵臓が無く、成熟臓器へと発達する膵芽の不能が原因で、誕生後すぐに死亡する（Ｏｆｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。胚盤胞相補によるマウスのＰｄｘ１−／−表現型のレスキューは、野生型マウスまたはラットのｉＰＳＣｓをＰｄｘ１−／−マウスの胚盤胞に注入し、ドナー細胞に由来する正常に機能する膵臓を有するマウスを作製することにより示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。Ｐｄｘ１欠失の胚盤胞相補もブタで最近報告されており、標識ＷＴ卵割球細胞を、ドミナントＰｄｘ１：ｈｅｓ１  導入遺伝子を発現するブタ胚盤胞に注入した後、トランスジェニック無膵ブタで機能性膵臓が作製されている（Ｍａｔｓｕｎａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。クローン化されたＰｄｘ１ノックアウトブタは、導入遺伝子を使用した際にみられる位置効果または発現レベルの予想外の性質に影響を受けることはなく、無膵臓ブタの作製のための、より一貫性の高いプラットフォームを提供する。ＴＡＬＥＮ技術を広汎に使用して、ブタ線維芽細胞におけるＰＤＸ１遺伝子の両アレル性ノックアウトを行い（図２９Ａ）、これには、ＰＤＸ１遺伝子の重要なホメオボックスドメインを標的とするＴＡＬＥＮペアと、停止コドン、フレームシフト、および新規制限酵素部位を導入するためのＨＤＲ構築物が使用されている。ホモ接合性のＰＤＸ１ノックアウトは、４１％の割合で取得された（７６／１８４クローン）（図２９Ｂ）。これらのＰＤＸ１−／−線維芽細胞とクロマチン導入クローニング技術を使用して、ＰＤＸ１−／−胚盤胞が作製され、Ｅ３０で採取されるＰＤＸ１−／−ブタ胚における無膵臓が示されている（図２９Ｃおよび図２９Ｄ）。Ｅ３２で採取された野生型の胚のブタ膵臓中には、Ｐｄｘ１とインスリンを発現する発生期のβ細胞が存在している（図２９Ｅ）。
【０１７６】
実施例２０：ＨＨＥＸ  ノックアウトにより、胎仔ブタに肝臓の欠失が生じる
ＨＨＥＸ  ＫＯクローンの作製。いずれの学説にも拘束されることは意図していないが、ＨＨＥＸは肝臓の発生を制御していると仮説が立てられている（図７０）。初期実験において、ＨＨＥＸＫＯクローンを作製し、この遺伝子編集法の有効性を検証した。ＤＮＡ結合に重要なホメオドメイン様領域のＮ末端内でＨＨＥＸ遺伝子のエクソン２を切断する構築物が開発された（図３０Ａ、黒三角を参照のこと）。新規停止コドン、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、および新規指定コドン後にフレームシフト変異が導入されるよう設計された相同組み換え修復の鋳型とベクター構築物を線維芽細胞にトランスフェクトし、確実に標的アレルを破壊した。５０％を超えるトランスフェクト群が、ＰＣＲ−制限酵素断片長多型アッセイによるとＨｉｎｄＩＩＩＫＯアレルに対し陽性であり（図３０Ｂ）、および当該群由来のいくつかの各クローンが、当該ＫＯアレルに対しヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれかであった（図３０Ｃ）。ＫＯアレルが立証された配列を有する総計で２２個のクローンが凍結保存された。同じベクター構築物を使用して、ＨＨＥＸ  およびＵｂｃ  の両方のＫＯ胚盤胞を作製する。
【０１７７】
ＨＨＥＸ  ＫＯはブタにおいて胚性致死である。ブタにおけるＨＨＥＸ  ＫＯの効果を決定するために、ＨＨＥＸ−／−線維芽細胞をクローン化ＳＣＮＴを行い、同期されたレシピエントに移植された。妊娠３０〜３２日目に、胚を採取し、肝臓の発生に関して評価した。すべての胚を遺伝子型決定し、ＨＨＥＸのノックアウトを確認した。すべての試料が、肝臓の明白な欠失を伴う発達遅延を示した（図３１Ｂ）。各試料からサンプルを採取し、たとえばＥＴＶ２などの他の標的遺伝子の編集とこのノックアウトを組み合わせ、ヒト血管系を有するヒト肝臓を作製する将来的な実験用のＨＨＥＸノックアウト細胞の源として、線維芽細胞を増殖させた。
【０１７８】
実施例２１：ブタ遺伝子ノックアウトと、胎仔ブタにおけるヒト幹細胞の組込に対する予備実験に関する要約。
予備実験から、眼、心臓、肺、肝臓、骨格筋、膵臓、血管系、造血細胞、およびドーパミン神経細胞の発生を破壊する、ブタにおける標的遺伝子ノックアウト能力が示された。また、ブタの桑実胚／胚盤胞に注入されたヒト幹細胞が、内部細胞塊内で自身の統合を生じさせることができること、および胎仔ブタの発生に関与することができることが示された。重要なことは、胚盤胞相補を背景として、胎仔ブタにおけるヒト幹細胞の関与も観察されたことであった。これらの結果は、ブタの中で、ヒトの臓器と細胞を操作することの実現可能性に関する強い証左を提供するものである。
【０１７９】
実施例２２：１６．４Ｔでの胎仔ブタ臓器のＭＲ画像解析
胚盤胞相補を介してブタで作製された臓器の画像解析は、強磁場ＭＲＩを使用することで促進される。ＵＭＮ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの１６．４Ｔ磁石が、現在世界で最も強力な画像解析用磁石である。図３３は、妊娠３０日の胎仔を示しており（２０ｍｍの頭殿長）、内部臓器のすべてを非常に詳細に見ることができる。この図で使用されたパルスシーケンスは、肝臓の可視化に最適化された。３Ｄ形態分析に加え、たとえば臓器体積などのパラメーターの定量用に、他の臓器に対するコントラストを最適化するための他のパルスシーケンスも開発され、相補された臓器の解剖学的特性に関する重要な情報が提供される。これにより、特定の臓器を作製するための標的遺伝子のノックアウト後の相補の成功を測定するための迅速な定量方法が提供される。
【０１８０】
実施例２３：腎機能を回復させるための腎臓の操作
６００，０００人を超える米国人が、末期の腎疾患（ＥＳＲＤ：ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）を有しており、生命を維持するために透析を必要としている。腎移植により生存期間が長くなり、生活の質も向上し、透析よりもコストは低くなるが、ドナー臓器の不足による限界がある。胚盤胞相補は、ＥＳＲＤ治療用ヒト腎臓作製の有望な方法を提示している。発表された研究において、胚盤胞相補を使用して、Ｓａｌ１変異無腎マウスに腎臓を生成させ得たことが示されている（Ｕｓｕｉ，ｅｔ  ａｌ，２０１２）。しかしながら、得られた腎臓はキメラであり、レシピエントに由来する集合管と血管系が含有されていた。さらに、腎機能の改善は何も記載されていなかった。Ｐａｘ  ２／８は、中間中胚葉の形成に重要である（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，ｅｔ  ａｌ，２００２，図３４）。機能性のマウス腎臓を、Ｐａｘ２／８の二重変異胚の細胞相補を介して操作している（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，ｅｔ  ａｌ，２００２）。これらの変異体は通常、腎臓のすべての細胞型を含む、すべての中間中胚葉派生物を欠いている。野生型のマウス胚細胞またはｉＰＳ細胞を用いたＰａｘ２／８変異マウスの相補により、すべてがドナー細胞から構成された機能性腎臓の形成が生じる。Ｐａｘ２／８変異ブタを作製し、それらブタが腎臓を欠いているか否かを決定する。野生型のブタ幹細胞を用いた胚盤胞相補を使用して、機能性腎臓を作製する。ヒト幹細胞を用いた種間胚盤胞相補を使用して、ブタホストにおいてヒトの腎臓を作製する。
【０１８１】
Ｐａｘ２  とＰａｘ８複合ヘテロ接合体を、異系交配させ、二重変異マウスを作製する。二重変異体は、機能性腎臓を欠いているために誕生後すぐに死亡する。腎臓の機能と発生の欠失は、ウォルフ管と腎原性間葉／細管のマーカーを用いたハイブリダイゼーションを行うことで確認される。相補実験に関し、Ｐａｘ２／８変異胚盤胞に、ユビキタスレポーター遺伝子としてＧＦＰを発現するマウスに由来するｉＰＳＣｓまたはＥＳＣｓをマイクロインジェクションする。Ｅ１９またはＰ２１で、腎臓の組織分析および機能分析のためにキメラを安楽死させる。成熟糸球体、細管、間質、および血管のマーカーを用いて染色し、およびＧＦＰに対する抗体を用いて共染色し、各細胞型の源（ドナー対ホスト）を特定し、胚盤胞相補によって、ドナーＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞に完全に由来する機能性腎臓が作製され得ることの決定的な証拠を提供する。腎機能を、血清クレアチニン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、オスモル濃度／電解質、ナトリウムバランス、クレアチニンクリアランス、および血液ガスを測定することにより評価する。血圧を、テールカフおよびラジオテレメトリーにより測定する。Ｐａｘ２／８ノックアウトブタの胚盤胞は、ＴＡＬＥＮ技術を使用して作製する。二重変異ブタ胎仔は、カーネギーステージ１０（Ｅ１５）、２０（Ｅ３０．５）、および満期胎仔（Ｅ１１０）を分析すること、およびＬｈｘ１、Ｗｔ１およびＰａｘ２に対する染色を行うことにより中間中胚葉／腎臓を形成しないことが実証される。Ｐａｘ２／８変異ブタが腎臓を形成しないことを実証した後、ブタとヒトの両方の胚細胞、および人工多能性幹細胞を利用して胚盤胞相補を実行してもよい。Ｐａｘ２／８変異胚盤胞に、野生型のＧＦＰ標識ブタＥＳ細胞、またはヒトｉＰＳ細胞、ナイーブｉＰＳ細胞、ＵＢＳ、およびＭＡＰ細胞を注入する。腎臓の発生は、ＭＲＩと組織／マーカー分析を使用して、レシピエント胚でモニタリングされる。腎臓機能は、血清クレアチニンと尿クレアチニン、電解質、およびオスモル濃度を測定することにより評価される。
【０１８２】
使用されるホスト細胞とドナー細胞の遺伝子型決定は、以下を含む：Ｐａｘ２−／−／Ｐａｘ８−／−；Ｐａｘ８−／−；Ｐａｘ２−／−。
【０１８３】
いずれの学説にも拘束されることは意図していないが、ＰＡＸ２  と  ＰＡＸ８は、腎臓の発生を制御していると推測されている（図３４）。腎臓発生に対するＰＡＸ２とＰＡＸ８の機能を調査するために、ブタのＰＡＸ２／ＰＡＸ８ノックアウトブタを作製した。ＰＡＸ２／ＰＡＸ８変異マウスは、腎臓のすべての細胞型を含む、すべての中間中胚葉派生物を欠いている（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，ｅｔ  ａｌ，２００２）。同様に、予備実験において、ブタＰＡＸ２／ＰＡＸ８変異ブタは、腎臓を含む、すべての中間中胚葉派生物を欠いていることが示された（図３５Ａ〜図３５Ｄ）。ゆえに、機能性腎臓を、Ｐａｘ２／８の二重変異胚の細胞相補を介して操作する。野生型の胚細胞またはｉＰＳ細胞を用いたＰＡＸ２／ＰＡＸ８変異の相補により、尿細管、集合管、および血管系を含むすべてがドナー細胞から構成された機能性腎臓の形成が生じる。ヒト幹細胞を用いた種間胚盤胞相補を使用して、ブタホストにおいてヒトの腎臓を作製する。
【０１８４】
表Ｅは、編集されたキャリア（ホスト）の遺伝子型、動物を相補（レスキュー）するために使用されたドナーの遺伝子型のリストを提示する。
【０１８５】
【表５】
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【０１８６】
さらなる開示
本明細書に置いて言及される特許、特許出願、公表文献、および記事は、参照により本明細書に援用される。矛盾が生じる場合は、本出願が統制する。実施形態は様々な特性を有している。これら特性は、機能的実施形態を作製する必要性によりガイドとして組み合わされてもよく、および適合されてもよい。表題、および副表題は、簡便性のために提供されているが、実質的ではなく、記載される範囲を限定するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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