(57)【要約】  本発明は、ガンマデルタＴ細胞を活性化する遺伝子治療および免疫療法のための方法および組成物に一般に関し、特に、種々のがんおよび感染性疾患の処置において使用され得る。一態様では、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化する方法が提供される。この方法は、ＧＤ  Ｔ細胞の存在下で、標的細胞に、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を感染させるステップを含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。
2019501661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントを含む、ウイルスベクター。
【請求項２】
前記酵素がファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントが、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記ｓｈＲＮＡが、
【化３０】
2019501661.tif 000067
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記ｓｈＲＮＡが、
【化３１】
2019501661.tif 000068
を含む、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記マイクロＲＮＡが、
【化３２】
2019501661.tif 000069
【化３３】
2019501661.tif 000070
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
前記マイクロＲＮＡが、
【化３４】
2019501661.tif 000071
を含む、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
レンチウイルスベクターである、請求項１から７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインを含む第２のコードされた遺伝エレメントをさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、インターフェロン−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７およびＩＬ−１２からなる群から選択される、請求項１０に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのケモカインが、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣＸ３ＣケモカインまたはＸＣケモカインである、請求項１０に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系であって、
ａ．請求項８に記載のレンチウイルスベクター；
ｂ．細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるための少なくとも１つのエンベローププラスミド；ならびに
ｃ．ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミド
を含み、前記レンチウイルスベクター、前記少なくとも１つのエンベローププラスミドおよび前記少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞中にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子が、前記パッケージング細胞によって産生され、前記レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染し、前記標的細胞内のメバロン酸経路に関与する酵素を阻害することが可能である、レンチウイルスベクター系。
【請求項１４】
前記ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させるための第１のヘルパープラスミドと、前記ｒｅｖ遺伝子を発現させるための第２のプラスミドとを含む、請求項１３に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項１５】
標的細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質と、請求項８に記載のレンチウイルスベクターとを含む、細胞に感染することが可能なレンチウイルス粒子。
【請求項１６】
前記エンベロープタンパク質が、標的細胞に感染するように最適化され、前記標的細胞ががん細胞である、請求項１５に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１７】
前記エンベロープタンパク質が、標的細胞に感染するように最適化され、前記標的細胞が、感染性疾患に感染する細胞である、請求項１５に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１８】
ガンマデルタＴ細胞を活性化する方法であって、前記ＧＤ  Ｔ細胞の存在下で、標的細胞に、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を感染させるステップを含み、前記少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含み、前記酵素が前記標的細胞において阻害される場合、前記標的細胞は、前記ＧＤ  Ｔ細胞を活性化する、方法。
【請求項１９】
対象においてがんを処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を投与するステップを含み、前記少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含み、前記酵素がＧＤ  Ｔ細胞の存在下でがん細胞において阻害される場合、前記がん細胞は、前記ＧＤ  Ｔ細胞を活性化して、それにより前記がんを処置する、方法。
【請求項２０】
前記酵素がファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントが、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｓｈＲＮＡが、
【化３５】
2019501661.tif 000072
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記マイクロＲＮＡが、
【化３６】
2019501661.tif 000073
【化３７】
2019501661.tif 000074
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象に治療有効量のアミノビスホスホネート薬物を投与するステップをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記アミノビスホスホネート薬物がゾレドロン酸である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１月１５日に出願され、「ガンマデルタＴ細胞の活性化のための方法および組成物」とのタイトルの米国仮特許出願第６２／２７９，４７４号に対する優先権を主張し、本明細書において参照により援用する。
【０００２】
本開示は、特に、ガンマデルタ（「ＧＤ」）Ｔ細胞の増加した活性化に関連する、遺伝子治療および免疫療法の分野に一般に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＴ細胞は、Ｔ細胞受容体構造に基づいて区別される。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットを含む主要な集団は、アルファ鎖およびベータ鎖から構成される受容体を発現する。より小さいサブセットが、ガンマ鎖およびデルタ鎖から構成されるＴ細胞受容体を発現する。ガンマデルタ（「ＧＤ」）Ｔ細胞は、３〜１０％の循環リンパ球を構成し、Ｖδ２＋サブセットは、血液中のＧＤ  Ｔ細胞の７５％を構成する。Ｖδ２＋細胞は、非ペプチドエピトープを認識し、主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）またはヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）による抗原提示を必要としない。Ｖδ２＋Ｔ細胞の大部分は、Ｖγ９鎖もまた発現し、メバリン酸および非メバリン酸ステロール／イソプレノイド合成経路中の中間体である５−炭素ピロリン酸化合物への曝露によって刺激される。イソペンテニルピロリン酸（５−炭素）に対する応答は、健康なヒトにおいて普遍的である。
【０００４】
ＧＤ  Ｔ細胞の別のサブセットであるＶδ１＋は、血液中を循環するＴ細胞のかなり小さい百分率を構成するが、Ｖδ＋１細胞は、上皮粘膜および皮膚において一般に見出される。
【０００５】
一般に、ＧＤ  Ｔ細胞は、腫瘍細胞および病原体感染細胞の死滅を含むいくつかの機能を有する。２つの糖タンパク質鎖γおよびδから構成されるそれらの独自のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）を介した刺激は、細胞傷害性、サイトカイン分泌および他のエフェクター機能の能力を改善する。ＧＤ  Ｔ細胞のＴＣＲは、独自の特異性を有し、細胞自体は高いクローン性頻度で存在し、従って、腫瘍および病原体に対する迅速な自然免疫様応答を可能にする。
【０００６】
アミノビスホスホネート薬物（「ＡＢＰ」）、およびメバロン酸経路（例については図１を参照のこと）中のイソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）の下流にあるファルネシル二リン酸シンターゼ（「ＦＤＰＳ」）の他の阻害剤は、がん、特に骨転移が関与するものを含む種々の疾患を処置するために使用されてきた。ＡＢＰには、Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＦｏｓａｍａｘ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）などの商品名が含まれる。
【０００７】
ＡＢＰは、ＧＤ  Ｔ細胞を刺激するためにも使用されてきた。これは、ＦＤＰＳが骨髄細胞において阻害され、ＩＰＰが蓄積し始め、インフラマソーム経路の活性化を抑制するＦＤＰＳの下流産物ゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）が低減されるからであり得る。ＧＧＰＰにおける低減は、カスパーゼ依存的インフラマソーム経路の阻害剤を除去し、インターロイキン−ベータおよびインターロイキン−１８を含む成熟サイトカインの分泌を可能にし、後者は、ガンマデルタＴ細胞活性化にとって特に重要である。
【０００８】
従って、ＦＤＰＳが遮断されると、増加したＩＰＰおよび減少したＧＧＰＰが組み合わさって、Ｖδ２＋Ｔ細胞を活性化する。ＩＰＰまたはＡＢＰによって活性化されたＶδ２＋細胞は、迅速に増殖し、いくつかのサイトカインおよびケモカインを発現し、腫瘍細胞または病原性微生物に感染した細胞を細胞傷害的に破壊するように機能できる。
【０００９】
しかし、ＡＢＰは、炎症および骨壊死と関連するだけでなく、それらの化学に起因して不十分なバイオアベイラビリティを有する。同様に、ＩＰＰは、非常に短い半減期を有し、合成が困難である。両方の型の化合物が、個体における全身投与を必要とする。従って、ＡＢＰ一般、および具体的にはＩＰＰは共に、治療目的のためには物足りない点が多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化する方法が提供される。この方法は、ＧＤ  Ｔ細胞の存在下で、標的細胞に、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を感染させるステップを含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。実施形態では、酵素はＦＤＰＳである。実施形態では、酵素が標的細胞において阻害される場合、この標的細胞は、引き続いて、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化する。実施形態では、標的細胞は、がん細胞または感染性因子に感染した細胞である。好ましい実施形態では、ＧＤ  Ｔ細胞の活性化は、がん細胞または感染性因子に感染した細胞を死滅させるＧＤ  Ｔ細胞を生じる。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、標的細胞は、アミノビスホスホネート薬物とも接触させる。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物はゾレドロン酸である。
【００１１】
別の態様では、対象においてがんを処置する方法が提供される。この方法は、対象に、治療有効量の、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を投与するステップを含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、酵素がＧＤ  Ｔ細胞の存在下でがん細胞において阻害される場合、がん細胞は、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化して、それによりがんを処置する。実施形態では、酵素はＦＤＰＳである。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、標的細胞は、アミノビスホスホネート薬物とも接触させる。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物はゾレドロン酸である。
【００１２】
別の態様では、対象において感染性疾患を処置する方法が提供される。この方法は、対象に、治療有効量の、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を投与するステップを含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、酵素が、ＧＤ  Ｔ細胞の存在下で、感染性因子に感染する細胞において阻害される場合、感染細胞は、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化して、それにより感染細胞および感染性疾患を処置する。実施形態では、酵素はＦＤＰＳである。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、標的細胞は、アミノビスホスホネート薬物とも接触させる。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物はゾレドロン酸である。
【００１３】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、
【化１】
2019501661.tif 000003
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡは、
【化２】
2019501661.tif 000004
を含む。
【００１４】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、
【化３】
2019501661.tif 000005
【化４】
2019501661.tif 000006
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡは、
【化５】
2019501661.tif 000007
を含む。
【００１５】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントを含むウイルスベクターが提供される。少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。実施形態では、メバロン酸経路に関与する酵素は、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）である。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【００１６】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、ｖと少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；または配列番号４を含む。
【００１７】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；または配列番号１０と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；または配列番号１０を含む。
【００１８】
実施形態では、ウイルスベクターは、低分子ＲＮＡを標的細胞中に効率的に形質導入できる任意のベクターから構成される。実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。他の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００１９】
別の態様では、ウイルスベクターは、第２のコードされた遺伝エレメントを含む。実施形態では、第２の遺伝エレメントは、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインを含む。実施形態では、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、インターフェロン−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７およびＩＬ−１２からなる群から選択される。実施形態では、少なくとも１つのケモカインは、ＣＣケモカインまたはＣＸＣケモカインである。さらなる実施形態では、少なくとも１つのケモカインは、ＲＡＮＴＥＳである。
【００２０】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が提供される。この系は、レンチウイルスベクター、細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるための少なくとも１つのエンベローププラスミド；ならびにｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。レンチウイルスベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミドおよび少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞中にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子が、パッケージング細胞によって産生される。実施形態では、レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染し、標的細胞内のメバロン酸経路に関与する酵素を阻害することが可能である。実施形態では、メバロン酸経路に関与する酵素は、ＦＤＰＳである。実施形態では、レンチウイルスベクター系は、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させるための第１のヘルパープラスミドと、ｒｅｖ遺伝子を発現させるための第２のヘルパープラスミドとを含む。実施形態では、エンベロープタンパク質は、好ましくは、標的細胞に感染するように最適化される。実施形態では、標的細胞はがん細胞である。他の実施形態では、標的細胞は、感染性因子に感染する細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ステロイドおよびイソプレノイドの生合成のためのメバロン酸経路中の主要ステップの概要を示す。
【００２２】
【図２】図２は、環状形態の例示的な３−ベクターレンチウイルスベクター系を示す。
【００２３】
【図３】図３は、環状形態の例示的な４−ベクターレンチウイルスベクター系を示す。
【００２４】
【図４】図４は、（Ａ）ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ標的化配列を発現するレンチウイルスベクターの線状マップ；および（Ｂ）ＦＤＰＳ標的化配列を有する合成マイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターの線状マップを示す。
【００２５】
【図５】図５は、本明細書に記載されるＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）を発現するレンチウイルスを有するＴＨＰ−１白血病細胞によるＶδ２＋Ｔ細胞の活性化を実証するデータを示す。
【００２６】
【図６】図６は、本明細書に記載されるＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）を発現するレンチウイルスを有するＴＨＰ−１白血病細胞によるＶδ２＋Ｔ細胞の活性化を実証するデータを示す。
【００２７】
【図７】図７は、本明細書に記載されるＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１（配列番号１）を発現するレンチウイルスを有するＰＣ３前立腺癌細胞によるＶδ２＋Ｔ細胞の活性化を実証するデータを示す。
【００２８】
【図８】図８は、本明細書に記載されるＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）を発現するレンチウイルスを有するＰＣ３前立腺癌細胞によるＶδ２＋Ｔ細胞の活性化を実証するデータを示す。
【００２９】
【図９】図９は、本明細書に記載されるＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１（配列番号１）またはＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）を発現するレンチウイルスを有するＨｅｐＧ２癌細胞によるＶδ２＋Ｔ細胞の活性化を実証するデータを示す。
【００３０】
【図１０】図１０は、本明細書に記載されるｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ  ＃１（配列番号５）を発現するレンチウイルスを有するＴＨＰ−１白血病細胞によるＶδ２＋Ｔ細胞の活性化を実証するデータを示す。
【００３１】
【図１１】図１１は、本明細書に記載される種々の実験条件についての特異的溶解のパーセント対Ｅ：Ｔ比を実証するデータを示す。
【００３２】
【図１２】図１２は、レンチウイルス送達された、ヒトＦＤＰＳ遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡベースのＲＮＡ干渉を実証するデータを示す。
【００３３】
【図１３】図１３は、レンチウイルス送達された、ヒトＦＤＰＳ遺伝子を標的化するｍｉＲベースのＲＮＡ干渉を実証するデータを示す。
【００３４】
【図１４】図１４は、本明細書に記載されるＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）を発現するアデノ随伴ウイルスを有するＨｅｐＧ２癌細胞によるＶδ２＋Ｔ細胞の活性化を実証するデータを示す。
【００３５】
【図１５】図１５は、ＬＶ−ｓｈＦＤＰＳで形質導入されゾレドロン酸で処理された細胞におけるＲＡＰ１プレニル化の欠如を実証するイムノブロットデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
開示の概要
本開示は、例えば図１に示すような、イソペンテニルピロリン酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＩＰＰ）をファルネシル二リン酸（ＦＤＰ）に変換するのに必要なファルネシル二リン酸シンターゼ（「ＦＤＰＳ」）の抑制を生じる、遺伝子治療構築物および細胞へのその送達に関する。実施形態では、１つまたは複数のウイルスベクターには、ＦＤＰＳを標的化するマイクロＲＮＡまたは低分子相同性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が提供され、それによりこの酵素の発現レベルを低減させる。ウイルスベクターには、レンチウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが含まれる。ＦＤＰＳの発現をモジュレートすることの結果は、ＧＤ  Ｔ細胞の増殖および分化の刺激因子であるＩＰＰの蓄積を増加させることである。従って、本明細書で提供される構築物は、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化するために使用され、がんおよび感染性疾患を処置するために使用される。
定義および解釈
【００３７】
本明細書で特に定義されない限り、本開示と併せて使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有する。さらに、文脈によって要求されない限り、単数形の用語は、複数のものを含み、複数形の用語は、単数形を含む。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションと併せて使用される命名法ならびにそれらの技術は、当該分野で周知であり一般に使用されるものである。本開示の方法および技術は一般に、当該分野で周知の、特記しない限り本明細書を通じて引用および議論される種々の一般的参考文献およびより具体的な参考文献に記載される従来の方法に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００３年）を参照のこと。任意の酵素反応または精製の技術が、当該分野で一般に達成されるまたは本明細書に記載される製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学と併せて使用される命名法、ならびにそれらの実験室手順および技術は、当該分野で周知の一般に使用されるものである。
【００３８】
明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、相互交換可能に使用され、複数形を含む意図であり、各々の意味内に入る。また、本明細書で使用する場合、「および／または」とは、列挙した項目のうち１つまたは複数のいずれかおよび全ての可能な組合せ、ならびに代替的に解釈される場合（「または」）には組合せの欠如を指し、これらを包含する。
【００３９】
全ての数的指定、例えば、範囲を含む、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、０．１の増分で変動（＋）または（−）する近似である。必ずしも明示的に述べられないものの、全ての数的指定に用語「約」が先行すると理解すべきである。用語「約」はまた、「Ｘ＋０．１」または「Ｘ−０．１」などの「Ｘ」の軽微な増分に加えて、正確な値「Ｘ」を含む。必ずしも明示的に述べられないものの、本明細書に記載される試薬は、例示に過ぎず、それらの等価物が当該分野で公知であることもまた理解すべきである。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に依存してある程度まで変動する。当業者に明らかでない用語の使用が存在する場合、それが使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００４１】
用語、活性薬剤「の投与」または活性薬剤を「投与すること」は、治療上有用な形態および治療有効量で個体の身体中に導入され得る形態で、処置を必要とする対象に活性薬剤を提供することを意味すると理解すべきである。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「含む」は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが他を排除しないことを意味する意図である。「〜から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用する場合、組成物または方法にとって任意の本質的な重要性を持つ他のエレメントを排除することを意味する。「〜からなる」は、特許請求された組成物および実質的な方法ステップのための他の成分の微量とは言えないエレメントを排除することを意味するものである。これらの推移する用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。従って、方法および組成物は、さらなるステップおよび構成要素を含み得る（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、あるいは重要性がないステップおよび組成物を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）（〜から本質的になる）、あるいは述べられた方法ステップもしくは組成物のみを意図する（〜からなる）ことが意図される。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「発現」、「発現される」または「コードする」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。発現には、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングまたは他の形態の転写後改変もしくは翻訳後改変が含まれ得る。
【００４４】
用語「ファルネシル二リン酸シンターゼ」は、本明細書でＦＤＰＳとも呼ばれ得、本明細書でファルネシルピロリン酸シンターゼまたはＦＰＰＳとも呼ばれ得る。
【００４５】
用語「ガンマデルタＴ細胞」は、本明細書でγδＴ細胞と呼ばれ得、さらにＧＤ  Ｔ細胞と呼ばれ得る。用語「ガンマデルタＴ細胞活性化」とは、活性化されているかかるＴ細胞を代表するガンマデルタＴ細胞と関連する任意の測定可能な生物学的現象を指す。かかる生物学的現象の非限定的な例には、サイトカイン産生の増加、細胞表面タンパク質の定性的もしくは定量的組成における変化、Ｔ細胞増殖における増加、および／またはＴ細胞エフェクター機能、例えば、標的細胞を死滅させること、もしくは標的細胞を死滅させるように別のエフェクター細胞を補助することにおける増加が含まれる。
【００４６】
用語「個体」、「対象」および「患者」は、本明細書で相互交換可能に使用され、任意の個々の哺乳動物対象、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマまたはヒトを指す。
【００４７】
用語「ｍｉＲＮＡ」とは、マイクロＲＮＡを指し、本明細書で「ｍｉＲ」とも呼ばれ得る。
【００４８】
用語「パッケージング細胞株」とは、レンチウイルス粒子を発現させるために使用され得る任意の細胞株を指す。
【００４９】
用語「パーセント同一性」とは、２つまたはそれよりも多くの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、以下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者に入手可能な他のアルゴリズム）のうち１つを使用してまたは目視検査によって測定したときに、比較され最大の対応を求めてアラインされたときに同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定された百分率を有する、２つまたはそれよりも多くの配列またはサブ配列を指す。適用に依存して、「パーセント同一性」は、比較されている配列のある領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得、またはあるいは、比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較のために、典型的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列が、コンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列（複数可）についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００５０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性についての検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（Ａｕｓｕｂｅｌら、以下を一般に参照のこと）によって、実施され得る。
【００５１】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを通じて公に入手可能である。
【００５２】
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重み、および１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）を使用して決定され得る。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に取り込まれたＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁（１９８９年））のアルゴリズムを使用しても決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）中に取り込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（４８巻）：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用して決定され得る。
【００５３】
本開示の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するために公的データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示で提供される核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施され得る。比較目的のためにギャップ入りアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、代表的プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」とは、合理的なベネフィット・リスク比と釣り合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症のない、理にかなった医学的判断の範囲内の、ヒトおよび動物の組織、臓器および／または体液と接触した使用のために適切な、化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、これらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６６巻：１〜１９頁を参照のこと）。
本明細書で使用する場合、用語「配列番号」は、用語「配列ＩＤ番号」と同義である。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「低分子ＲＮＡ」とは、約２００ヌクレオチド長またはそれ未満よりも一般に短い、サイレンシング機能または干渉機能を保有する、非コードＲＮＡを指す。他の実施形態では、低分子ＲＮＡは、約１７５ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約１５０ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約１２５ヌクレオチド長もしくはそれ未満、約１００ヌクレオチド長もしくはそれ未満または約７５ヌクレオチド長もしくはそれ未満である。かかるＲＮＡには、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。本開示の「低分子ＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊を生じる経路を一般に介して、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害またはノックダウンすることが可能でなければならない。
【００５７】
用語「治療有効量」とは、所与の不快、傷害、疾患または状態に罹患している患者において見られる合併症の症状を処置するのに、またはその進行もしくは発症予防するのに十分な、適切な組成物中の、および適切な剤形中の、本開示の活性薬剤の量を指す。治療有効量は、患者の状態またはその重症度、および処置される対象の年齢、体重などの状態に依存して変動する。治療有効量は、例えば、投与経路、対象の状態、ならびに当業者に理解される他の因子を含む、いくつかの因子のいずれかに依存して変動し得る。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「治療ベクター」は、限定なしに、レンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクターへの言及を含む。
【００５９】
「処置」は、疾患状態を標的化しそれと闘う、即ち、疾患状態を寛解させるまたは予防することを意図する。従って、特定の処置は、標的化される疾患状態、ならびに薬物療法および治療アプローチの現在および未来の状態に依存する。処置は毒性を伴い得る。
【００６０】
用語「処置」または「処置する」とは一般に、処置されている対象の自然経過を変更することを試みた介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程の間に実施され得る。所望の効果には、疾患の発生または再発を予防すること、症状を軽減すること、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果を抑制し、減弱させまたは阻害すること、疾患状態を寛解させるまたは緩和すること、および軽快または改善された予後を引き起こすことが含まれるがこれらに限定されない。
本開示の態様の説明
【００６１】
一態様では、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化する方法が提供される。この方法は、ＧＤ  Ｔ細胞の存在下で、標的細胞に、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を感染させるステップを含む。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。実施形態では、酵素はＦＤＰＳである。実施形態では、酵素が標的細胞において阻害される場合、標的細胞は、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化する。実施形態では、標的細胞は、がん細胞または感染性因子に感染した細胞である。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【００６２】
実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、
【化６】
2019501661.tif 000008
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれよりも高いパーセント同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡは、
【化７】
2019501661.tif 000009
を含む。
【００６３】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、
【化８】
2019501661.tif 000010
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡは、
【化９】
2019501661.tif 000011
を含む。
【００６４】
別の態様では、標的細胞は、アミノビスホスホネート薬物とも接触させる。好ましい実施形態では、アミノビスホスホネート薬物はゾレドロン酸である。
【００６５】
別の態様では、対象においてがんを処置する方法が提供される。この方法は、対象に、治療有効量の、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を投与するステップを含む。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、酵素がＧＤ  Ｔ細胞の存在下でがん細胞において阻害される場合、がん細胞は、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化して、それによりがんを処置する。実施形態では、酵素はＦＤＰＳである。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【００６６】
別の態様では、対象において感染性疾患を処置する方法が提供される。この方法は、対象に、治療有効量の、少なくとも１つの遺伝エレメントをコードするウイルス送達系を投与するステップを含む。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、酵素が、ＧＤ  Ｔ細胞の存在下で、感染性因子に感染する細胞において阻害される場合、感染細胞は、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化して、それにより感染細胞および感染性疾患を処置する。実施形態では、酵素はＦＤＰＳである。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【００６７】
実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；または配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれよりも高いパーセント同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；または配列番号４を含む。
【００６８】
他の実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；または配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；または配列番号１０を含む。
【００６９】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントを含むウイルスベクターが提供される。少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することが可能な低分子ＲＮＡを含む。実施形態では、メバロン酸経路に関与する酵素は、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）である。実施形態では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
【００７０】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；または配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれよりも高いパーセント同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；または配列番号４を含む。
【００７１】
別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝エレメントは、配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；または配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡは、配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；または配列番号１０を含む。
【００７２】
実施形態では、ウイルスベクターには、低分子ＲＮＡを効率的に形質導入できる任意のベクターが含まれる。実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。他の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００７３】
別の態様では、ウイルスベクターは、第２のコードされた遺伝エレメントを含む。実施形態では、第２の遺伝エレメントは、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインを含む。実施形態では、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、インターフェロン−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７およびＩＬ−１２からなる群から選択される。実施形態では、少なくとも１つのケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ｃＣＸ３ケモカイン（ｃ  ＣＸ３  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）またはＸＣケモカインである。さらなる実施形態では、少なくとも１つのケモカインは、ＣＣケモカインＲＡＮＴＥＳである。
【００７４】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が提供される。この系は、レンチウイルスベクター、細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるための少なくとも１つのエンベローププラスミド；ならびにｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。レンチウイルスベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミドおよび少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞中にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子が、パッケージング細胞によって産生される。実施形態では、レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染し、標的細胞内のメバロン酸経路に関与する酵素を阻害することが可能である。実施形態では、メバロン酸経路に関与する酵素は、ＦＤＰＳである。実施形態では、レンチウイルスベクター系は、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させるための第１のヘルパープラスミドと、ｒｅｖ遺伝子を発現させるための第２のヘルパープラスミドとを含む。実施形態では、エンベロープタンパク質は、好ましくは、標的細胞に感染するように最適化される。実施形態では、標的細胞はがん細胞である。他の実施形態では、標的細胞は、感染性疾患に感染する細胞である。
がん
【００７５】
本明細書で提供される組成物および方法は、がんを処置するために使用される。細胞、組織または標的は、がん細胞、がん性組織であり得る、がん性組織を保有し得る、あるいは疾患もしくは状態と診断されたまたは疾患もしくは状態を発症する危険性がある対象または患者であり得る。ある特定の態様では、細胞は、上皮、内皮、中皮、グリア、間質または粘膜細胞であり得る。がん細胞集団には、脳、ニューロン、血液、子宮内膜、髄膜、食道、肺、心血管、肝臓、リンパ系、乳房、骨、結合組織、脂肪、網膜、甲状腺、腺、副腎、膵、胃、腸管、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、子宮、卵巣、子宮頸部、精巣、脾、皮膚、平滑筋、心筋または横紋筋細胞が含まれ得るがこれらに限定されない。なおさらなる態様では、がんには、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、血管肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頸部の癌腫、子宮頸癌、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮癌、ユーイング肉腫、線維肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、ガストリノーマ、胃癌、肝芽腫、肝細胞癌、カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫、喉頭（ｌａｒｙｎｇｅａｌ）扁平上皮癌、喉頭（ｌａｒｙｎｘ）癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、髄芽細胞腫、中皮腫、粘液線維肉腫、骨髄性白血病、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、神経線維腫、高悪性度非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵癌、褐色細胞腫、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、シュワン細胞腫（Ｓｃｈｗａｎｏｍｍａ）、小細胞肺がん、頭頸部の扁平上皮癌、精巣腫瘍、甲状腺癌、尿路上皮癌およびウィルムス腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
【００７６】
本明細書で提供される組成物および方法は、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、小児悪性腫瘍、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされるまたは促進される子宮頸および他の腫瘍、黒色腫、バレット食道（前悪性症候群）、副腎および皮膚がんならびに自己免疫性、新生物性皮膚疾患を処置するためにも使用される。
感染性疾患
【００７７】
本明細書に開示された組成物および方法は、感染性疾患を処置するために使用され得る。用語「感染性疾患」には、感染性因子によって引き起こされる任意の疾患が含まれる。「感染性因子」には、限定なしに、細菌、真菌、ウイルス、マイコプラズマおよび寄生生物が含まれる、任意の外因性病原体が含まれる。本開示において提供される組成物で処置され得る感染性因子には、グラム陰性またはグラム陽性の球菌または桿菌である細菌などの生物、ＤＮＡウイルス、例えば、パピローマウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルス、ならびにＲＮＡウイルス、例えば、アレナウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）、パラミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルスおよびラブドウイルスが含まれるがこれらに限定されないＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる、動物において病理発生を引き起こす任意の当該分野で認識された感染性生物が含まれる。本開示の組成物および方法で処置され得る真菌の例には、例えば、白癬、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、スポロトリクム症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症およびカンジダ症などの疾患を引き起こす真菌が含まれる、カビとして成長するまたは酵母様である真菌が含まれる。本明細書で提供される組成物および方法は、体性サナダムシ、住血吸虫、組織回虫、アメーバ、ならびにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、ＬｅｉｓｈｍａｎｉａおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ種によって引き起こされる感染が含まれるがこれらに限定されない寄生生物感染を処置するために利用され得る。
ＧＤ  Ｔ細胞活性化の方法
【００７８】
個体においてＧＤ  Ｔ細胞を活性化するための組成物および方法、ならびに腫瘍および感染性疾患を処置するための方法が、本明細書で提供される。例えば、実施形態では、活性化されたＧＤ  Ｔ細胞は、腫瘍の免疫監視のための天然の機構を含むので、本明細書で提供される組成物および方法は、全ての公知のがんを処置するための方法において使用され得る（例については、Ｐａｕｚａら  ２０１４年  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５巻：６８７頁を参照のこと）。同様に、実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法は、フラビウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトレトロウイルス、マイコバクテリア、マラリア原虫ならびに種々の他のウイルス、真菌および細菌感染が含まれるがこれらに限定されない感染性疾患を処置するために使用され得る（例については、ＰａｕｚａおよびＣａｉｒｏ、２０１５年  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９６巻（１号）を参照のこと）。
【００７９】
一般に、ベクター系は、ＦＤＰＳの発現を減少させるため、および他の実施形態では、ケモカインまたはサイトカインの発現を増加させるために、開示された構築物を用いて標的細胞集団をトランスフェクトまたは形質導入するために個体に投与される。投与およびトランスフェクション／形質導入は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで生じ得、トランスフェクトされた細胞は、後のシナリオにおいて対象に後に戻し投与される。
【００８０】
開示されたベクターの投与、および対象の細胞中への開示された構築物のトランスフェクションまたは形質導入は、ＦＤＰＳの減少した発現、サイトカインまたはケモカインの増加した発現、ＩＰＰの蓄積、および多くの場合には、遺伝子改変された腫瘍細胞についての低減された成長速度を生じる。これらの特色は全て、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化し、腫瘍または感染の部位にＧＤ  Ｔ細胞を共局在させるために、一緒になって機能する。
【００８１】
開示された方法は、腫瘍細胞および／または感染細胞を認識および破壊するＮＫ細胞の能力もまた増加させ得る。ＧＤ  Ｔ細胞とＮＫ細胞との間のクロストークは、免疫応答および炎症応答を調節する重要な局面である。さらに、ＧＤ  Ｔ細胞は、樹状細胞成熟化を誘発し、Ｂ細胞およびマクロファージを動員し、種々の細胞溶解活性、例えば、インターフェロン−γおよびＴＮＦ−αの分泌に関与することが公知である。
【００８２】
実施形態では、本明細書で提供される開示された組成物および方法は、腫瘍または感染性疾患病理の部位においてＧＤ  Ｔ細胞を活性化するための遺伝子治療の一形態を構成する。一態様では、本明細書で提供される組成物および方法は、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化し、がん細胞を死滅させることまたは感染性疾患を処置することが可能な細胞溶解活性に必要な特定のサイトカインの産生を促進することによって、それらの増殖、分化および機能的能力を支持する。
【００８３】
実施形態では、遺伝子治療配列（例えば、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ）は、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスが含まれるがこれらに限定されない治療ベクターによって保有されるが、他のウイルスベクターもまた適切であり得る。遺伝子治療構築物は、プラスミド形態が含まれるがこれに限定されないＤＮＡまたはＲＮＡの形態でも送達され得る。実施形態では、開示された遺伝子治療構築物は、タンパク質−核酸複合体または脂質核酸複合体およびこれらの製剤の混合物の形態でも送達され得る。例えば、タンパク質−核酸複合体は、カチオン性ペプチド、例えば、リシンおよびアルギニンとの複合体中に、目的の核酸を含み得る。脂質−核酸複合体は、脂質エマルジョン、ミセル、リポソーム、ならびに／または中性およびカチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰおよびＤＭＲＩＥの混合物を含み得る。
【００８４】
実施形態では、治療ベクターは、単一の構築物、または少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つもしくは少なくとも５つの異なる構築物を含み得る。１つよりも多い構築物がベクター中に存在する場合、これらの構築物は、同一であり得、または異なり得る。例えば、構築物は、それらのプロモーター、組込みエレメントの存在もしくは非存在、および／またはそれらの配列に関して変動し得る。一部の実施形態では、治療ベクターは、ＦＤＰＳの発現をノックダウンすることが可能な低分子ＲＮＡをコードする少なくとも１つの構築物を含む。実施形態では、治療ベクターは、ＴＮＦ−α、インターフェロン−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはＩＬ−１２が含まれるがこれらに限定されない特定のサイトカイン（複数可）および／またはケモカイン（複数可）もまたコードする。一部の実施形態では、単一の構築物は、ＦＤＰＳの発現をノックダウンすることが可能な低分子ＲＮＡ、およびＴＮＦ−α、インターフェロン−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはＩＬ−１２が含まれるがこれらに限定されない特定のサイトカインまたはケモカインの両方をコードし得る。
【００８５】
実施形態では、ウイルスベクターは、宿主染色体中に組み込まれる核酸構築物を導入し得る。代わりに、一過的送達ベクターは、染色体組込みを防止し、遺伝子治療構築物の寿命を制限するために使用され得る。
【００８６】
実施形態では、開示された構築物およびベクターは、ＦＤＰＳおよび／またはゲラニルピロリン酸シンターゼ（「ＧＰＰＳ」）および／またはファルネシルトランスフェラーゼ（「ＦＴ」）遺伝子の発現を低減させるまたはノックダウンすることが可能な低分子相同性領域ＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）、マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）またはｓｉＲＮＡを含む。ステロイドおよびイソプレノイド合成を制御するこれらの遺伝子を下方調節することによって、イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）レベルは上昇される。ＩＰＰの上昇および蓄積は、ＧＤ  Ｔ細胞活性化を増加させるための公知の機構である。さらに、これらのピロリン酸シンターゼ遺伝子の下方調節は、インフラマソーム機能の重要な陰性調節因子を除去し、これは次にＧＤ  Ｔ細胞活性化およびエフェクター細胞機能に重要なサイトカインの増加した発現を生じる。
【００８７】
実施形態では、開示された構築物は、ＧＤ  Ｔ細胞増殖を持続させるために、インターロイキン−２および／またはインターロイキン−１５を産生することが可能な特異的プロモーターによって調節される。さらに、開示された構築物は、ＧＤ  Ｔ細胞分化および全てのエフェクター細胞機能の獲得に必要なインターロイキン−１ベータおよび／またはインターロイキン−１８および／またはインターフェロン−ガンマを産生することが可能な特異的プロモーターによって調節され得る。所望のエフェクター細胞機能には、腫瘍および／または感染細胞の直接的細胞傷害性細胞死滅、有益なサイトカインおよび／またはケモカインの分泌、がん性細胞または感染細胞を認識するために必要なＮＫ受容体の増加した発現、ならびにＧＤ  Ｔ細胞をがん性細胞標的または感染細胞標的と共局在させるために標的化抗体を結合するために必要なＦｃ受容体の増加した発現の能力が含まれる。
【００８８】
実施形態では、開示された方法は、ＧＤ  Ｔ細胞を活性化し、がん性細胞、腫瘍または感染細胞を攻撃および破壊するＮＫ細胞の能力を増加させるという間接的効果を生じる。ＮＫ細胞の活性化は、増殖および分化するように、ならびにＮＫ細胞上の４−１ＢＢ共刺激受容体と係合するために必要な４−１ＢＢＬ共刺激リガンドを発現するように刺激されるＧＤ  Ｔ細胞を必要とする。この形態のクロストークは、ＮＫ細胞を活性化するための重要な機構として公知であり、開示された方法および組成物の作用を介して本明細書で達成される。
【００８９】
別の態様では、ＧＤ  Ｔ細胞とＮＫ細胞との間のクロストークは、罹患組織に蓄積する炎症性樹状細胞を排除するための重要な機構である。単独では、ＧＤ  Ｔ細胞もＮＫ細胞も樹状細胞を破壊することは不能であるが、上述のクロストーク相互作用が起こると、ＮＫ細胞は、炎症性樹状細胞に対して細胞傷害性になるように変更される。この免疫調節機構は、ＧＤ  Ｔ細胞の強力な活性化および増殖に依存する。
【００９０】
実施形態では、ＧＤ  Ｔ細胞の活性化のための開示された方法は、アテローム動脈硬化症、腫瘍成長を刺激する慢性免疫活性化、乾癬および表皮における他の症状を含む自己免疫疾患、中枢神経系の炎症性疾患、および関節炎ならびに調節されない免疫応答の他の疾患をもたらす細胞増殖が含まれ得る病理的炎症応答を抑制するステップをさらに含む。
【００９１】
実施形態では、治療ベクターは、ガンマデルタＴ細胞の相乗的活性化を達成するために、アミノビスホスホネート（ＡＢＰ）薬物と同時発生的に投与される。相乗作用は、ＡＢＰの交互の、改変された、または低減された用量を可能にし得、急性炎症応答および慢性疾患を含む、ＡＢＰに対する有害反応を減少させ得る。
ＧＤ  Ｔ細胞活性化のための構築物
【００９２】
ＦＤＰＳの阻害は、ＩＰＰ蓄積を生じ、Ｖδ２＋ＧＤ  Ｔ細胞の活性化およびＩＬ−１８の発現を生じ、これは、ＧＤ  Ｔ細胞の活性化においても重要である。ファルネシルトランスフェラーゼの阻害は、タンパク質の減少したプレニル化を生じる。開示された構築物は、腫瘍細胞または感染細胞などの特異的標的細胞中にトランスフェクトまたは形質導入され得、この場所で、これらは、ＦＤＰＳの翻訳を阻害し、ならびに細胞傷害性サイトカインまたはケモカインをコードおよび発現するＲＮＡ配列（即ち、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）を発現し得る。
【００９３】
ＦＤＰＳおよび／またはＦＴの発現を減少させ、サイトカインの発現を増加させ、ＲＡＮＴＥＳを含むケモカインの発現を増加させるための構築物が、本明細書に開示される。例えば、一部の実施形態では、構築物は、インターフェロン−ガンマ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはＩＬ−１２をコードし得る。
【００９４】
上に列挙したものなどのサイトカインおよびケモカインの発現は、腫瘍細胞または病原性生物に感染する細胞の局在化した細胞傷害性破壊を生じる。従って、腫瘍細胞または感染細胞によるかかる構築物の発現は、それ自身の破壊を補助する望ましくない細胞を生じる。
【００９５】
同様に、開示された構築物が腫瘍細胞または感染細胞において発現される場合、ＦＤＰＳおよびＦＴの発現を減少させることは、ＧＤ  Ｔ細胞の活性化および腫瘍部位または細胞感染の部位へのＧＤ  Ｔ細胞の動員を生じる。ＲＡＮＴＥＳの発現を増加させることは、意図した組織位置へとＧＤ  Ｔ細胞をさらに誘引する。ＧＤ  Ｔ細胞は、上皮起源の広範な腫瘍ならびに多くの白血病およびリンパ腫を死滅させることができ、高レベルの抗腫瘍サイトカインＩＦＮγを産生することがさらに可能であるので、腫瘍の部位へのＧＤ  Ｔ細胞の動員は、抗腫瘍免疫を誘導する特に有効な手段であり得る。
【００９６】
ＦＤＰＳの減少した発現は、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または当該分野で公知の他の手段を介して達成され得る。例えば、配列番号１、２、３もしくは４に従うｓｈＲＮＡ、またはそれらのバリアントは、開示された構築物および方法において使用され得るが、この例は限定的ではない。ＦＤＰＳおよびＦＴの発現を減少させるためのＲＮＡのコード領域、ならびにサイトカインおよびケモカインのコード領域は、同じ構築物中または異なる構築物上にあり得る。
【００９７】
組換えポリペプチド、または低分子ＲＮＡを含む遺伝子調節分子の産生のための古典的アプローチは、安定な発現構築物の使用である。これらの構築物は、宿主細胞のゲノム中への形質導入された発現プラスミド（または少なくともその一部分）の染色体組込み、短時間プラスミドトランスフェクション、または限定的な半減期もまた有する非組込みウイルスベクターに基づく。遺伝子組込みの部位は、一般にはランダムであり、任意の特定の部位における遺伝子組込みの数および比率は、予測不能な場合が多い；同様に、非組込みプラスミドまたはウイルスベクターは、核ＤＮＡもまた生成するが、これらの種は通常、ＤＮＡの複製および持続的維持に必要な配列を欠く。従って、染色体組込みに依存する構築物は、治療間隔を超え得る組換え遺伝子の永続的な維持を生じる。
【００９８】
遺伝子発現のための安定な発現構築物に対する代替法は、一過的発現構築物である。後者の遺伝子発現構築物の発現は、非組込みプラスミドに基づいており、従って、発現は、典型的には、細胞が分裂を受ける際に、またはプラスミドベクターが内因性ヌクレアーゼによって破壊される際に失われる。
【００９９】
開示された構築物は、好ましくは、一過的に発現されるエピソーム構築物である。エピソーム構築物は、経時的に破壊または希釈され、その結果、これらは、対象のゲノムに対する永続的な変化を起こすこともなく、標的細胞の染色体中に取り込まれることもない。エピソーム複製のプロセスは、典型的には、宿主細胞複製機構およびウイルストランス作用性因子の両方を取り込む。
【０１００】
染色体組込みを回避することは、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達に対するある特定の障壁を低減させる。しかし、組込み欠損構築物でさえも組込みの背景頻度を有し得、任意のＤＮＡ分子は、宿主配列と組み換わるには相同性が低いことが見出され得る；しかし、組込みのこれらの比率は、例外的に低く、一般には臨床的に有意でない。
【０１０１】
従って、一部の実施形態では、開示されたベクターは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１または約１２週間の期間にわたる活性遺伝子および／または低分子ＲＮＡの送達を支持する。一部の実施形態では、開示されたベクターは、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれよりも長い期間にわたる活性遺伝子および／または低分子ＲＮＡの送達を支持する。１ヶ月および１週間、または３ヶ月および２週間などの、これらの期間の任意の組合せもまた、本発明の方法において使用され得る。
【０１０２】
しかし、一部の実施形態では、構築物は、レトロウイルスインテグラーゼ遺伝子に依存する組込みエレメントを含み、その結果、この構築物は、対象の染色体中に組み込まれる。レトロ転位および転位は、可動性の遺伝エレメントが染色体中に組み込まれるまたは挿入される機構のさらなる例である。プラスミドは、組換えによって染色体中に組み込まれ得、ＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮを含む遺伝子編集テクノロジーは、ガイドＲＮＡ配列を利用し、遺伝子変換機構によって染色体遺伝子座を変更する。
【０１０３】
構築物は、ＧＤ  Ｔ細胞の維持に関与するサイトカイン（即ち、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１７およびＩＬ−１５）を発現させるための特異的プロモーターを含み得る。例えば、開示された構築物中に取り込まれ得るプロモーターには、ＴＡＴＡ−ｂｏｘプロモーター、ＣｐＧ−ｂｏｘプロモーター、ＣＣＡＡＴ−ｂｏｘプロモーター、ＴＴＧＡＣＡ−ｂｏｘプロモーター、ＢＲＥ−ｂｏｘプロモーター、ＩＮＲ−ｂｏｘプロモーター、ＡＴベースのプロモーター、ＣＧベースのプロモーター、ＡＴＣＧ−ｃｏｍｐａｃｔプロモーター、ＡＴＣＧ−ｂａｌａｎｃｅｄプロモーター、ＡＴＣＧ−ｍｉｄｄｌｅプロモーター、ＡＴＣＧ−ｌｅｓｓプロモーター、ＡＴ−ｌｅｓｓプロモーター、ＣＧ−ｌｅｓｓプロモーター、ＡＴ−ｓｐｉｋｅプロモーターおよびＣＧ−ｓｐｉｋｅプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。ＧａｇｎｉｕｃおよびＩｏｎｅｓｃｕ−Ｔｉｒｇｏｖｉｓｔｅ、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｍａｙ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｕｐ  ｔｏ  １０  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、ＢＭＣ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ  １３巻：５１２頁（２０１２年）を参照のこと。
治療ベクター
【０１０４】
構築物は、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスベクター、タンパク質および／または脂質複合体、リポソーム、ミセルなどが含まれるがこれらに限定されない公知のトランスフェクションおよび／または形質導入ベクターを介して送達され得る。
【０１０５】
ウイルスベクターは、開示された方法にとって有用な細胞型（即ち、腫瘍細胞または骨髄細胞）へと優先的に標的化され得る。ウイルスベクターは、特異的ウイルスエンベロープ−宿主細胞受容体相互作用、および遺伝子発現のためのウイルス機構のおかげで、標的細胞中に遺伝子を形質導入するために使用され得る。結果として、ウイルスベクターは、胚全体、受精卵、単離された組織試料、ｉｎ  ｓｉｔｕ組織標的および培養細胞株を含む多くの異なる細胞型中への遺伝子の移入のためのビヒクルとして使用されてきた。細胞中に外来遺伝子を導入しそれを発現させる能力は、遺伝子発現の研究、および細胞系譜の解明のため、ならびに遺伝子治療、誘導多能性幹細胞の体細胞再プログラミング、および種々の型の免疫療法などの治療的介入の可能性を提供するために、有用である。パポバウイルス科（例えば、ウシパピローマウイルス、即ちＢＰＶ）またはヘルペスウイルス科（例えば、エプスタイン・バー・ウイルス、即ちＥＢＶ）またはヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、即ちＨＢＶ）またはワクシニアを含むポックスベクターなどのウイルス由来のウイルス構成要素が、開示されたベクターにおいて使用され得る。
【０１０６】
レンチウイルスベクターは、開示された組成物および方法のためのベクターの好ましい型であるが、本開示は、レンチウイルスベクターに具体的に限定されない。レンチウイルスは、宿主細胞中に顕著な量のウイルス核酸を送達できるウイルスの属である。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染／形質導入する独自の能力を有すると特徴付けられ、形質導入後、レンチウイルスは、それらの核酸を宿主細胞の染色体中に組み込む。
【０１０７】
感染性レンチウイルスは、病原性タンパク質をコードする３つの主要な遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｔａｔおよびｒｅｖを含む２つの調節遺伝子を有する。特定の血清型およびウイルスに依存して、ウイルス核酸の調節、合成および／またはプロセシング、ならびに他の複製機能に関与するタンパク質をコードするさらなるアクセサリー遺伝子が存在し得る。
【０１０８】
さらに、レンチウイルスは、およそ６００ｎｔ長であり得る長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）領域を含む。ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域へと分節化され得る。ＬＴＲは、インテグラーゼの作用を介した宿主染色体中へのレトロウイルスＤＮＡの組込みを媒介できる。あるいは、インテグラーゼを機能させない場合、ＬＴＲは、ウイルス核酸を環状化するために使用され得る。
【０１０９】
レンチウイルス複製の初期段階に関与するウイルスタンパク質には、逆転写酵素およびインテグラーゼが含まれる。逆転写酵素は、ウイルスにコードされるＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、相補的ＤＮＡコピーの合成のための鋳型としてウイルスＲＮＡゲノムを使用する。逆転写酵素は、ＲＮＡ−鋳型の破壊のためのＲＮａｓｅＨ活性もまた有する。インテグラーゼは、逆転写酵素によって生成されたウイルスｃＤＮＡと宿主ＤＮＡとの両方を結合する。インテグラーゼは、ウイルスゲノムを宿主ＤＮＡ中に挿入する前に、ＬＴＲをプロセシングする。ｔａｔは、開始および伸長を増強するために、転写の間にトランス活性化因子として作用する。ｒｅｖ応答性エレメントは、転写後に作用して、ｍＲＮＡスプライシングおよび原形質への輸送を調節する。
【０１１０】
ウイルスベクターは、一般に、糖タンパク質を含み、種々の糖タンパク質は、特異的親和性を提供し得る。例えば、ＶＳＶＧペプチドは、骨髄細胞中へのトランスフェクションを増加させ得る。あるいは、ウイルスベクターは、それらのシェルペプチドに結合した抗体などの標的化部分もまた有し得る。標的化抗体は、例えば、ＨＥＲ−２、ＰＳＡ、ＣＥＡ、Ｍ２−ＰＫおよびＣＡ１９−９などの腫瘍上で過剰発現される抗原に対して特異的であり得る。
【０１１１】
他のウイルスベクター特異性もまた当該分野で公知であり、細胞の特定の集団を標的化するために使用され得る。例えば、ポックスウイルスベクターは、マクロファージおよび樹状細胞を標的化する。
レンチウイルスベクター系
【０１１２】
レンチウイルスビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。プロモーターに作動可能に連結した、逆転写および組込みに必要なレンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのベクターが存在する。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。プロモーターに作動可能に連結した、ウイルスカプシドを形成するために必要なレンチウイルスｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターもまた存在する。ある実施形態では、このｇａｇ核酸配列は、ｐｏｌ核酸配列の少なくとも一部とは別のベクター上にある。別の実施形態では、ｇａｇ核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌ核酸配列とは別のベクター上にある。
【０１１３】
多数の改変が、野生型復帰変異体を生じる可能性をさらに最小化するために、粒子を創出するために使用されるベクターに対してなされ得る。これらには、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔ欠失およびマトリックス（ＭＡ）欠失が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１４】
ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖベクター（複数可）は、レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれる、レンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノム由来のヌクレオチドを含まない。
【０１１５】
粒子を形成するベクター（複数可）は、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含まない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結したエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む別のベクターが使用される。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含まない。一実施形態では、ｅｎｖ核酸配列は、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする。
【０１１６】
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルス由来ではなく、異なるウイルス由来である。得られた粒子は、シュードタイプ化粒子と呼ばれる。エンベロープの適切な選択によって、事実上任意の細胞を「感染」させることができる。例えば、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（ムンプスまたは麻疹）およびオルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）のものなどの、エンドサイトーシス区画を標的化するエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用できる。好ましくは使用され得る他のエンベロープには、モロニー白血病ウイルス、例えば、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−ＡおよびＧＡＬＶに由来するものが含まれる。これらの後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合に特に好ましい。他のエンベロープタンパク質が、所望の宿主細胞に依存して選択され得る。例えば、ドーパミン受容体などの特異的受容体を標的化することが、脳送達のために使用され得る。別の標的は、血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルスエンベロープを使用して標的化され得る。例えば、エボラのＧＰは、転写後改変によってＧＰおよびＧＰ２糖タンパク質になる。別の実施形態では、シュードタイプ化エンベロープを有する異なるレンチウイルスカプシドを使用できる（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）。ＳＨＩＶシュードタイプ化ベクターは、サルなどの動物モデルにおいて容易に使用され得る。
【０１１７】
本明細書に詳述するように、レンチウイルスベクター系は、典型的には、ｇａｇ、ｐｏｌまたはｒｅｖ遺伝子のうち少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子の各々は、個々のプラスミド上で提供され得、または１つもしくは複数の遺伝子が、同じプラスミド上に一緒に提供され得る。一実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子は、同じプラスミド上に提供される（例えば、図２）。別の実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、第１のプラスミド上に提供され、ｒｅｖ遺伝子は、第２のプラスミド上に提供される（例えば、図３）。従って、３−ベクター系および４−ベクター系の両方が、実施例のセクションおよび本明細書の他の場所に記載されるように、レンチウイルスを産生するために使用され得る。治療ベクター、エンベローププラスミドおよび少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株中にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞株である。治療ベクター、エンベローププラスミドおよび少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子が最終的に産生される。
【０１１８】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が開示される。この系は、本明細書に記載されるレンチウイルスベクター；細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるためのエンベローププラスミド；ならびにｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミドおよび少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされる場合、レンチウイルス粒子が、このパッケージング細胞株によって産生され、このレンチウイルス粒子は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することまたはＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的化することが可能である。
【０１１９】
別の態様では、図２に詳述するように、本明細書で治療ベクターとも呼ばれるレンチウイルスベクターは、以下のエレメントを含み得る：ハイブリッド５’長鎖末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号１１〜１２）、プシー配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号１３）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号１４）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号１５）、Ｈ１プロモーター（配列番号１６）、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ（配列番号１、２、３、４）、マーモット転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号１７）および３’デルタＬＴＲ（配列番号１８）。別の態様では、置換、欠失、付加または変異による配列バリエーションが、本明細書の配列参照を改変するために使用され得る。
【０１２０】
別の態様では、本明細書に詳述するように、ヘルパープラスミドは、以下のエレメントを含むように設計されている：ＣＡＧプロモーター（配列番号１９）；ＨＩＶ構成要素ｇａｇ（配列番号２０）；ＨＩＶ構成要素ｐｏｌ（配列番号２１）；ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２２）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２３）；およびＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号２４）。別の態様では、ヘルパープラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させるための第１のヘルパープラスミドと、ｒｅｖ遺伝子を発現させるための第２の別のプラスミドとを含むように改変され得る。別の態様では、置換、欠失、付加または変異による配列バリエーションが、本明細書の配列参照を改変するために使用され得る。
【０１２１】
別の態様では、本明細書に詳述するように、エンベローププラスミドは、左から右に以下のエレメントを含むように設計されている：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号２５）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号２６）。別の態様では、置換、欠失、付加または変異による配列バリエーションが、本明細書の配列参照を改変するために使用され得る。
【０１２２】
別の態様では、レンチウイルスパッケージングに使用されるプラスミドは、類似のエレメントで改変され得、イントロン配列は、ベクター機能の喪失なしに潜在的に除去され得る。例えば、以下のエレメントが、パッケージング系を構成するプラスミド中の類似のエレメントを置き換え得る：伸長因子−１（ＥＦ−１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターが、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターを置き換え得る。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡを置き換え得る。ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築され得る。ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、インフルエンザＡ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）由来の膜糖タンパク質で置換され得る。
【０１２３】
注目すべきことに、レンチウイルスパッケージング系は、商業的に獲得され得（例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤのＬｅｎｔｉ−ｖｐａｋパッケージングキット）、本明細書に記載されるように設計することもできる。さらに、レンチウイルス粒子の産生効率を含む、任意の数の関連する因子を改善するために、レンチウイルスパッケージング系の性状を置換または改変することは、当業者の技術範囲内である。
用量および剤形
【０１２４】
開示されたベクターは、目的の遺伝子または配列の短期、中期または長期発現、ならびに開示されたベクターのエピソーム維持を可能にする。従って、投薬レジメンは、処置されている状態および投与の方法に基づいて変動し得る。
【０１２５】
一実施形態では、形質導入ベクターは、変動する用量で、必要とする対象に投与され得る。具体的には、対象は、約≧１０６の感染用量で投与され得る（平均で１用量が、１つの標的細胞を形質導入するために必要とされる）。より具体的には、対象は、約≧１０７、約≧１０８、約≧１０９もしくは約≧１０１０の感染用量で投与され得、またはこれらの値の中間の任意の数の用量で投与され得る。形質導入ベクター投薬の上限は、各疾患の指標について決定され、各個々の製品または製品ロットについての毒性／安全性プロファイルに依存する。
【０１２６】
さらに、本開示のベクターは、定期的に、例えば、１日１回もしくは２回、または任意の他の適切な期間、投与され得る。例えば、ベクターは、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎、９ヶ月毎、１年に１回、１８ヶ月毎、２年毎、３０ヶ月毎または３年毎に、必要とする対象に投与され得る。
【０１２７】
一実施形態では、開示されたベクターは、医薬組成物として投与される。一部の実施形態では、開示されたベクターを含む医薬組成物は、臨床適用のために、経鼻、肺、経口、外用または非経口剤形が含まれるがこれらに限定されない広範な種々の投薬形態で製剤化され得る。剤形の各々は、種々の可溶化剤、崩壊剤、界面活性剤、フィラー、増粘剤、結合剤、希釈剤、例えば、湿潤剤または他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。ベクターを含む医薬組成物は、注射、吹送法、注入または真皮内曝露のためにも製剤化され得る。例えば、注射可能な製剤は、適切なｐＨおよび浸透圧で、水性または非水性溶液中に、開示されたベクターを含み得る。
【０１２８】
開示されたベクターは、腫瘍部位中にまたは感染の部位において直接注射を介して対象に投与され得る。一部の実施形態では、ベクターは、全身投与され得る。一部の実施形態では、ベクターは、腫瘍または感染の部位を直接取り囲む組織に、ガイド付きカニューレ挿入を介して投与され得る。
【０１２９】
開示されたベクター組成物は、任意の薬学的に許容される方法を使用して投与され得る、例えば、鼻腔内、頬側、舌下、経口、直腸、眼、非経口（静脈内、真皮内、筋肉内、皮下、腹腔内）、肺、腟内、局所投与され得、外用投与され得、乱切後に外用投与され得、エアロゾルを介して、アガロースもしくはゼラチンなどの半固体媒体中で、または頬側もしくは経鼻スプレー製剤を介して粘膜投与され得る。
【０１３０】
さらに、開示されたベクター組成物は、任意の薬学的に許容される剤形、例えば、固体剤形、錠剤、丸剤、ロゼンジ剤、カプセル、液体分散物、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、経鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体剤形、溶液、エマルジョンおよび懸濁物へと製剤化され得る。さらに、組成物は、制御放出製剤、徐放性製剤、即時放出製剤、またはそれらの任意の組合せであり得る。さらに、組成物は、経皮送達系であり得る。
【０１３１】
一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経口投与のために固体剤形で製剤化され得、固体剤形は、粉末、顆粒、カプセル、錠剤または丸剤であり得る。一部の実施形態では、固体剤形は、１つまたは複数の賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶セルロースまたはゼラチンを含み得る。さらに、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出形態または改変放出形態であり得る。改変放出剤形には、制御放出または持続放出、腸管放出などが含まれる。改変放出剤形において使用される賦形剤は、当業者に一般に公知である。
【０１３２】
さらなる実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、舌下または頬側剤形として製剤化され得る。かかる剤形は、舌の下で投与される舌下錠剤または溶液組成物、および頬と歯肉との間に配置される頬側錠剤を含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化され得る。本発明のかかる剤形は、経鼻送達のための溶液、懸濁物およびゲル組成物を含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経口投与のための液体剤形、例えば、懸濁物、エマルジョンまたはシロップで製剤化され得る。一部の実施形態では、液体剤形は、水および液体パラフィンなどの一般に使用される単純な希釈剤に加えて、種々の賦形剤、例えば、保水剤、甘味料、芳香剤または防腐剤を含み得る。特定の実施形態では、ベクターを含む組成物は、小児患者への投与に適切であるように製剤化され得る。
【０１３５】
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与のための剤形、例えば、無菌水性溶液、懸濁物、エマルジョン、非水性溶液または坐剤で製剤化され得る。一部の実施形態では、溶液または懸濁物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、またはオレイン酸エチルなどの注射可能なエステルを含み得る。
【０１３６】
医薬組成物の投薬量は、患者の体重、年齢、性別、投与時間および様式、排泄速度、ならびに疾患の重症度に依存して変動し得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、がんの処置は、針または血管内カニューレ挿入を使用した、腫瘍中への開示されたベクター構築物のガイドされた直接注射によって達成される。一部の実施形態では、開示されたベクターは、静脈もしくは動脈カニューレ挿入もしくは注射、真皮内送達、筋肉内送達、または疾患の部位の近傍の排出臓器中への注射によって、脳脊髄液、血液またはリンパ循環中に投与される。
【０１３８】
以下の実施例は、本発明を例示するために与えられる。しかし、本発明は、これらの実施例に記載される具体的な条件または詳細に限定されないことを理解すべきである。本明細書で言及される全ての刊行物は、参照によって具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１３９】
（実施例１）
レンチウイルスベクター系の開発
図４に要約したようなレンチウイルスベクター系を開発した（環状形態）。レンチウイルス粒子を、治療ベクター、エンベローププラスミドおよびヘルパープラスミドによるトランスフェクション後に、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入した）において産生した。機能的ウイルス粒子を産生した２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞のトランスフェクションは、プラスミドＤＮＡ取込みの効率を増加させるために、試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を使用した。プラスミドおよびＤＮＡを、最初に、３：１の比（ＰＥＩ対ＤＮＡの質量比）で、血清なしの培養培地中に別々に添加した。２〜３日後、細胞培地を収集し、レンチウイルス粒子を、高速遠心分離および／または濾過とその後のアニオン交換クロマトグラフィーとによって精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）を単位として表され得る。ＴＵの決定を、培養流体中のＨＩＶ  ｐ２４レベル（ｐ２４タンパク質は、レンチウイルス粒子中に取り込まれる）を測定し、定量的ＰＣＲによって細胞１つ当たりのウイルスＤＮＡコピーの数を測定すること、または細胞を感染させ光を使用することによって（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）、達成した。
【０１４０】
上述のように、３−ベクター系（即ち、２−ベクターレンチウイルスパッケージング系）を、レンチウイルス粒子の産生のために設計した。３−ベクター系の模式図を図２に示す。簡潔に述べると、図２を参照して、一番上のベクターは、この場合にはＲｅｖを含むヘルパープラスミドである。図２の中央に現れるベクターは、エンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書に記載される治療ベクターである。
【０１４１】
図２をより具体的に参照して、ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号２７）；ＣＡＧプロモーター（配列番号１９）；ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２８）；ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２０）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２１）；ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２２）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２３）；ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号２４）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２９）を含む。
【０１４２】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２５）；ベータグロビンイントロン（配列番号３０）；ＶＳＶ−Ｇ（配列番号２８）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３１）を含む。
【０１４３】
ヘルパー（＋Ｒｅｖ）プラスミドおよびエンベローププラスミドを含む２−ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成。
材料および方法：
【０１４４】
ヘルパープラスミドの構築：ヘルパープラスミドを、Ｇａｇ、Ｐｏｌおよびインテグラーゼ遺伝子を含むｐＮＬ４−３  ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ  Ａｉｄｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）からのＤＮＡ断片の初回ＰＣＲ増幅によって構築した。ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の同じ部位において挿入するために使用され得る、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するためのプライマーを設計した。フォワードプライマーは、
【化１０】
2019501661.tif 000012
であった。
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ断片の配列は、以下の通りであった：
【０１４５】
【化１１】
2019501661.tif 000013
【化１２】
2019501661.tif 000014
【化１３】
2019501661.tif 000015
【０１４６】
次に、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位を有する、Ｒｅｖ、ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含むＤＮＡ断片を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いで、ＤＮＡ断片を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてプラスミド中に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【０１４７】
【化１４】
2019501661.tif 000016
【化１５】
2019501661.tif 000017
【０１４８】
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターを、ＣＡＧエンハンサー／プロモーター＋ニワトリベータアクチンイントロン配列で置き換えた。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位を有する、ＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含むＤＮＡ断片を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いで、ＤＮＡ断片を、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位においてプラスミド中に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【０１４９】
【化１６】
2019501661.tif 000018
【化１７】
2019501661.tif 000019
ＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドの構築：
【０１５０】
隣接するＥｃｏＲＩ制限部位を有する水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）配列を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いで、ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ制限部位においてｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入し、正確な配向を、ＣＭＶ特異的プライマーを使用する配列決定によって決定した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【０１５１】
【化１８】
2019501661.tif 000020
【化１９】
2019501661.tif 000021
【０１５２】
４−ベクター系（即ち、３−ベクターレンチウイルスパッケージング系）もまた設計し、本明細書に記載される方法および材料を使用して産生した。４−ベクター系の模式図を図３に示す。簡潔に述べると、図３を参照して、一番上のベクターは、この場合にはＲｅｖを含まないヘルパープラスミドである。上から２番目のベクターは、別のＲｅｖプラスミドである。下から２番目のベクターは、エンベローププラスミドである。一番下のベクターは、以前に記載した治療ベクターである。
【０１５３】
一部図２を参照して、ヘルパープラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号２７）；ＣＡＧプロモーター（配列番号１９）；ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２８）；ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２０）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２１）；ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２２）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２３）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２９）を含む。
【０１５４】
Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーター（配列番号３８）；ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号３９）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２９）を含む。
【０１５５】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２５）；ベータグロビンイントロン（配列番号３０）；ＶＳＶ−Ｇ（配列番号２８）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２９）を含む。
【０１５６】
ヘルパープラスミド、Ｒｅｖプラスミドおよびエンベローププラスミドを含む３−ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成
材料および方法：
Ｒｅｖなしのヘルパープラスミドの構築：
【０１５７】
Ｒｅｖなしのヘルパープラスミドを、ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含むＤＮＡ断片を挿入することによって構築した。隣接するＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を有するこの配列を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いで、ＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてヘルパープラスミド中に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りである：
【０１５８】
【化２０】
2019501661.tif 000022
【化２１】
2019501661.tif 000023
Ｒｅｖプラスミドの構築：
【０１５９】
隣接するＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を有する、ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ配列を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって、単一のＤＮＡ断片として合成した。次いで、ＤＮＡ断片を、ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位においてｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入したが、ＣＭＶプロモーターはＲＳＶプロモーターで置き換えられる。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【０１６０】
【化２２】
2019501661.tif 000024
【化２３】
2019501661.tif 000025
【０１６１】
２−ベクターおよび３−ベクターパッケージング系のためのプラスミドは、類似のエレメントで改変でき、イントロン配列は、ベクター機能の喪失なしに潜在的に除去できた。例えば、以下のエレメントが、２−ベクターおよび３−ベクターパッケージング系中の類似のエレメントを置き換え得た：
【０１６２】
プロモーター：伸長因子−１（ＥＦ−１）（配列番号４１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号４２）およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号４３）は、ＣＭＶ（配列番号２５）またはＣＡＧプロモーター（配列番号１９）を置き換え得る。これらの配列もまた、付加、置換、欠失または変異によってさらに変動され得る。
【０１６３】
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号４４）およびｂＧＨポリＡ（配列番号４５）は、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２９）を置き換え得る。これらの配列もまた、付加、置換、欠失または変異によってさらに変動され得る。
【０１６４】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌおよびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築され得る。例えば、Ｂａｌ株由来のＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号２０）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号２１）；およびＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号２２）は、本明細書に概説されるヘルパー／ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミド中に含まれるｇａｇ、ｐｏｌおよびｉｎｔ配列と交換され得る。これらの配列もまた、付加、置換、欠失または変異によってさらに変動され得る。
【０１６５】
エンベロープ：ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号４６）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号４７）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号４８）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号４９）、インフルエンザＡ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号５０）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号５１）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号５２）またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号５３）由来の膜糖タンパク質で置換され得る。これらのエンベロープの配列は、本明細書の配列部分において同定される。さらに、これらの配列もまた、付加、置換、欠失または変異によってさらに変動され得る。
【０１６６】
まとめると、３−ベクター系対４−ベクター系は、一部以下のように比較および対比され得る。３−ベクターレンチウイルスベクター系は以下を含む：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼおよびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；ならびに３．治療ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、プシーパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥおよび３’δＬＴＲ。４−ベクターレンチウイルスベクター系は以下を含む：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌおよびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；ならびに４．治療ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、プシーパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥおよび３’デルタＬＴＲ。上記エレメントに対応する配列は、本明細書の配列表部分において同定される。
（実施例２）
ＦＤＰＳを発現するレンチウイルスベクターの開発
【０１６７】
この実施例の目的は、ＦＤＰＳレンチウイルスベクターを開発することであった。
【０１６８】
阻害性ＲＮＡの設計：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）（ＮＭ＿００２００４．３）ｍＲＮＡの配列を使用して、ヒト細胞においてＦＤＰＳレベルをノックダウンする潜在的ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補について検索した。潜在的ＲＮＡ干渉配列を、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが主催するＧＰＰ  Ｗｅｂ  Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／）またはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）などからのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムによって、選択された候補から選択した。個々の選択されたｓｈＲＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１（配列番号１６）、Ｕ６（配列番号５４）または７ＳＫ（配列番号５５）の直ぐ３’側でレンチウイルスベクター中に挿入して、ｓｈＲＮＡ発現を調節した。これらのレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物を使用して、細胞を形質導入し、特異的ｍＲＮＡレベルにおける変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを低減させるのに最も強力なｓｈＲＮＡを、マイクロＲＮＡ骨格内に個々に包埋して、ＥＦ−１アルファまたはＣＭＶ  ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にした。マイクロＲＮＡ骨格はｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇから選択した。ＲＮＡ配列を、合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても合成し、レンチウイルスベクターを使用することなく細胞中に直接導入した。
【０１６９】
ベクター構築：ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡについて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチド配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温までの冷却の間にアニールさせた。レンチウイルスベクターを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて３７℃で１時間消化した。消化されたレンチウイルスベクターを、アガロースゲル電気泳動によって精製し、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクター対オリゴ（３：１比）を混合し、アニールさせ、ライゲーションした。ライゲーション反応を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて室温で３０分間実施した。２．５マイクロリットルのライゲーションミックスを、２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。４２℃でのヒートショック後に形質転換が達成された。細菌細胞を、アンピシリンを含む寒天プレート上に広げ、薬物耐性コロニー（アンピシリン耐性プラスミドの存在を示す）を回収し、ＬＢブロスにおいて拡大増殖させた。オリゴ配列の挿入についてチェックするために、プラスミドＤＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐキットを用いて、回収した細菌培養物から抽出した。レンチウイルスベクターにおけるｓｈＲＮＡ配列の挿入を、ｓｈＲＮＡ発現を調節するために使用したプロモーターに特異的なプライマーを使用するＤＮＡ配列決定によって検証した。以下の標的配列を使用して、ＦＤＰＳをノックダウンする例示的なｓｈＲＮＡ配列を決定した：
【化２４】
2019501661.tif 000026
【０１７０】
次いで、ｓｈＲＮＡ配列を、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下の、合成マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）へとアセンブルした。簡潔に述べると、ｍｉＲヘアピン配列、例えば、以下に詳述するｍｉＲ３０、ｍｉＲ２１またはｍｉＲ１８５は、ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇから得た。１９〜２２マーのｓｈＲＮＡ標的配列を使用して、合成ｍｉＲ配列を構築した。ｍｉＲ配列を、アンチセンス−標的配列−ヘアピンループ配列（各マイクロＲＮＡに特異的）−センス標的配列として整列させた。
以下のｍｉＲ配列を開発した：
【化２５】
2019501661.tif 000027
【化２６】
2019501661.tif 000028
（実施例３）
ｓｈＲＮＡ  ＃４によるＴＨＰ１単球性白血病における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウン
【０１７１】
この実施例は、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４発現レンチウイルス（ＬＶ）によるＴＨＰ１単球性白血病細胞におけるＦＤＰＳのノックダウンが、図５に示すように、ガンマデルタＴ細胞においてＴＮＦ−α発現を刺激することを示している。
【０１７２】
ＴＨＰ１細胞（１×１０５細胞）を、ＬＶ−対照またはＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４で３日間形質導入した。形質導入の２日後、細胞を、１μＭゾレドロン酸で処理したまたは処理しなかった。２４時間後、形質導入されたＴＨＰ−１細胞を、５×１０５のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ−２と共に丸底９６ウェルプレート中で４時間にわたって共培養した。ＰＢＭＣ細胞を、ゾレドロン酸およびＩＬ−２で１１日間事前刺激して、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を拡大増殖させた。フルオロフォアコンジュゲート抗ＴＣＲ−Ｖδ２および抗ＴＮＦ−α抗体を使用したＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ−αについての染色後、細胞を、フローサイトメトリーを介して分析した。生細胞にゲートをかけ、Ｖδ２＋かつＴＮＦ−α＋の細胞を、ドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は、フローサイトグラムの右上象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の３．１％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４は、５％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の７．２％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４は、５６．２％を刺激した。
（実施例４）
ｓｈＲＮＡ  ＃４によるＴＨＰ１白血病細胞における１４日間にわたるＦＤＰＳのノックダウン
【０１７３】
この実施例は、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４発現レンチウイルス（ＬＶ）によるＴＨＰ１白血病細胞における１４日間にわたるＦＤＰＳのノックダウンが、図６に示すように、ＧＤ  Ｔ細胞においてＴＮＦ−α発現を刺激することを示している。
【０１７４】
ＴＨＰ１細胞（１×１０５細胞）を、ＬＶ−対照またはＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４で１４日間形質導入した。形質導入の２日後、細胞を、１ｕＭゾレドロン酸で処理したまたは処理しなかった。２４時間後、形質導入されたＴＨＰ−１細胞を、５×１０５のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ−２と共に丸底９６ウェルプレート中で４時間にわたって共培養した。ＰＢＭＣ細胞を、ゾレドロン酸およびＩＬ−２で１１日間事前刺激して、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を拡大増殖させた。フルオロフォアコンジュゲート抗ＴＣＲ−Ｖδ２および抗ＴＮＦ−α抗体を使用したＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ−αについての染色後、細胞を、フローサイトメトリーを介して分析した。生細胞にゲートをかけ、Ｖδ２＋かつＴＮＦ−α＋の細胞を、ドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は、フローサイトグラムの右上象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の０．９％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）は、１５．９％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の４．７％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）は、７６．２％を刺激した。
（実施例５）
ｓｈＲＮＡ  ＃１によるＰＣ３前立腺癌細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウン
【０１７５】
この実施例は、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１発現レンチウイルス（ＬＶ）によるＰＣ３前立腺癌細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウンが、図７に示すように、ＧＤ  Ｔ細胞においてＴＮＦ−α発現を刺激することを示している。
【０１７６】
ＰＣ３細胞を、ＬＶ−対照またはＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１（配列番号１）で３日間形質導入した。形質導入の２日後、細胞を、１ｕＭゾレドロン酸で処理したまたは処理しなかった。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を、５×１０５のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ−２と共に丸底９６ウェルプレート中で４時間にわたって共培養した。ＰＢＭＣ細胞を、ゾレドロン酸およびＩＬ−２で１１日間事前刺激して、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を拡大増殖させた。フルオロフォアコンジュゲート抗ＴＣＲ−Ｖδ２および抗ＴＮＦ−α抗体を使用したＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ−αについての染色後、細胞を、フローサイトメトリーを介して分析した。生細胞にゲートをかけ、Ｖδ２＋かつＴＮＦ−α＋の細胞を、ドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は、フローサイトグラムの右上象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の０．２％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１は、０．５％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の１．７％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１（配列番号１）は、３２．２％を刺激した。
（実施例６）
ｓｈＲＮＡ  ＃４によるＰＣ３前立腺癌細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウン
【０１７７】
この実施例は、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４発現レンチウイルス（ＬＶ）によるＰＣ３前立腺癌細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウンが、図８に示すように、ＧＤ  Ｔ細胞においてＴＮＦ−α発現を刺激することを示している。
【０１７８】
ＰＣ３細胞を、ＬＶ−対照またはＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）で３日間形質導入した。形質導入の２日後、細胞を、１ｕＭゾレドロン酸で処理したまたは処理しなかった。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を、５×１０５のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ−２と共に丸底９６ウェルプレート中で４時間にわたって共培養した。ＰＢＭＣ細胞を、ゾレドロン酸およびＩＬ−２で１１日間事前刺激して、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を拡大増殖させた。フルオロフォアコンジュゲート抗ＴＣＲ−Ｖδ２および抗ＴＮＦ−α抗体を使用したＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ−αについての染色後、細胞を、フローサイトメトリーを介して分析した。生細胞にゲートをかけ、Ｖδ２＋かつＴＮＦ−α＋の細胞を、ドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は、フローサイトグラムの右上象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の０．５％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）は、１．９％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の２．１％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４は、２８．７％を刺激した。
（実施例７）
ｓｈＲＮＡ  ＃１および＃４によるＨｅｐＧ２肝臓癌細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウン
【０１７９】
この実施例は、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１（配列番号１）発現レンチウイルス（ＬＶ）およびｓｈＲＮＡ＃４（配列番号４）発現レンチウイルス（ＬＶ）によるＨｅｐＧ２肝臓癌細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウンが、図９に示すように、ＧＤ  Ｔ細胞においてＴＮＦ−α発現を刺激することを示している。
【０１８０】
ＨｅｐＧ２細胞を、ＬＶ−対照、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１（配列番号１）またはＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）で３日間形質導入した。形質導入の２日後、細胞を、１ｕＭゾレドロン酸で処理したまたは処理しなかった。２４時間後、形質導入されたＨｅｐＧ２細胞を、５×１０５のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ−２と共に丸底９６ウェルプレート中で４時間にわたって共培養した。ＰＢＭＣ細胞を、ゾレドロン酸およびＩＬ−２で１１日間事前刺激して、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を拡大増殖させた。フルオロフォアコンジュゲート抗ＴＣＲ−Ｖδ２および抗ＴＮＦ−α抗体を使用したＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ−αについての染色後、細胞を、フローサイトメトリーを介して分析した。生細胞にゲートをかけ、Ｖδ２＋かつＴＮＦ−α＋の細胞を、ドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は、フローサイトグラムの右上象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の０．４％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１（配列番号１）および＃４（配列番号４）は、それぞれ０．７％および０．９％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の６．９％を刺激し、ＬＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃１および＃４は、それぞれ７．６％および２１．１％を刺激した。
（実施例８）
マイクロＲＮＡ−３０によるＴＨＰ１白血病における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウン
【０１８１】
この実施例は、ＦＤＰＳ標的化合成マイクロＲＮＡ−３０発現レンチウイルス（ＬＶ）によるＴＨＰ１白血病細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウンが、図１０に示すように、ガンマデルタＴ細胞においてＴＮＦ−α発現を刺激することを示している。
【０１８２】
ＴＨＰ１細胞（１×１０５細胞）を、ＬＶ−対照またはＬＶ−ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ  ＃１（配列番号５）で３日間形質導入した。形質導入の２日後、細胞を、１ｕＭゾレドロン酸で処理したまたは処理しなかった。２４時間後、形質導入されたＴＨＰ−１細胞を、５×１０５のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ−２と共に丸底９６ウェルプレート中で４時間にわたって共培養した。ＰＢＭＣ細胞を、ゾレドロン酸およびＩＬ−２で１１日間事前刺激して、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を拡大増殖させた。フルオロフォアコンジュゲート抗ＴＣＲ−Ｖδ２および抗ＴＮＦ−α抗体を使用したＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ−αについての染色後、細胞を、フローサイトメトリーを介して分析した。生細胞にゲートをかけ、Ｖδ２＋かつＴＮＦ−α＋の細胞を、ドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は、フローサイトグラムの右上象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の０．２％を刺激し、ＬＶ−ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳは、８．１％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ−対照は、ＴＮＦ−α発現Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の５．３％を刺激し、ＬＶ−ｍｉＲ３０  ＦＤＰＳ  ＃１（配列番号５）は６７．３％を刺激した。
（実施例９）
ＴＨＰ−１細胞、培養ヒトＧＤ  Ｔ細胞および／またはＺｏｍｅｔａ（Ｚｏｌ）の混合物から得られるＥ：Ｔ比
【０１８３】
この実施例は、図１１に示すように、処理されたＴＨＰ−１単球様腫瘍細胞を培養ヒトＧＤ  Ｔ細胞と混合することから生じる結果を実証している。
【０１８４】
単球様細胞株ＴＨＰ−１を、対照レンチウイルスベクター（ＬＶ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子発現を抑制するＬＶ（ＬＶ−ＦＤＰＳ）、ゾレドロン酸（Ｚｏｌ）または組合せで処理した。図１１に示す説明文は以下の通りであった：レンチウイルス対照ベクター（ＬＶ−対照）、ＦＤＰＳを下方調節するマイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＦＰＰＳ）、Ｚｏｍｅｔａ（Ｚｏｌ）、Ｚｏｍｅｔａ＋レンチウイルス対照（Ｚｏｌ＋ＬＶ−対照）、またはＺｏｍｅｔａ＋ＦＰＰＳを下方調節するマイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター（Ｚｏｌ＋ＬＶ−ＦＰＰＳ）。
【０１８５】
匿名のドナー由来のヒトＧＤ  Ｔ細胞を培養し、処理したＴＨＰ−１細胞に、４：１、２：１または１：１の比（ＧＤ  Ｔ：ＴＨＰ−１）で４時間添加した。細胞死滅を蛍光アッセイによって測定した。ＴＨＰ−１細胞を、ＬＶ−ＦＤＰＳおよびＺｏｌの組合せで処理した場合、ＧＤ  Ｔ細胞による細胞傷害性Ｔ細胞死滅は、いずれかの処理単独と比較して、大きく増加した。ＬＶ−ＦＤＰＳ処理単独をＺｏｌ処理単独と比較した場合、ＬＶ−ＦＤＰＳは、より大きい死滅をもたらすが、組合せ処理後の腫瘍細胞死滅を＞３倍下回った。組み合わせたＬＶ−ＦＤＰＳ＋Ｚｏｌ処理は、４：１の比でほぼ７０％の腫瘍細胞死滅を引き起こした；これは、２番目に良い処理（ＬＶ−ＦＤＰＳ単独）よりも、３倍よりも大きく高かった。
（実施例１０）
レンチウイルス送達された、ヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡベースのＲＮＡ干渉
【０１８６】
図１２に示すように、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞に、Ｈ１プロモーターおよび非標的化または４つの異なるＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列のいずれかを含むレンチウイルスベクターを感染させた。４８時間後、ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。ＦＤＰＳ  ｃＤＮＡの発現を、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎおよびＦＤＰＳプライマーを使用する定量的ＰＣＲによって決定した。ＦＤＰＳ発現を、各試料についてアクチンレベルに対して標準化した。
Ｈ１プロモーターおよび非標的化配列
【化２７】
2019501661.tif 000029
のうち１つのいずれかを含むＦＤＰＳ標的化レンチウイルスベクターを、２９３  Ｔ細胞において産生した。
【０１８７】
次いで、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞に、レンチウイルスベクターを感染させて、ＦＤＰＳノックダウンの有効性を決定した。４８時間後、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡに変換した。ＦＤＰＳ  ｃＤＮＡの発現を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲミックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＦＤＰＳプライマー（フォワードプライマー：５’−ＡＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＧＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号６１）およびリバースプライマー：５’−ＣＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＡＴＣＡ−３’（配列番号６２））を使用する、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅ  ｑＰＣＲ装置での定量的ＰＣＲによって決定した。ＦＤＰＳ発現を、アクチンプライマー（フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号６３）およびリバースプライマー：５’−ＧＧＣＧＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴ−３’（配列番号６４））を使用して、各試料についてアクチンレベルに対して標準化した。ｓｈＣｏｎ試料の相対的ＦＤＰＳ  ＲＮＡ発現を１００％に設定する。ＦＤＰＳ発現における８５％（ＦＤＰＳ配列＃１）、８９％（ＦＤＰＳ配列＃２）、４６％（ＦＤＰＳ配列＃３）および９８％（ＦＤＰＳ配列＃４）の減少があった。
（実施例１１）
レンチウイルス送達された、ヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）遺伝子を標的化するｍｉＲベースのＲＮＡ干渉
【０１８８】
図１３に示すように、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞に、Ｈ１プロモーター（配列番号１６）、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）配列またはＥＦ−１αプロモーター（配列番号４１）のいずれかおよびｍｉＲ３０ベースのＦＤＰＳ配列を含むレンチウイルスベクターを感染させた。４８時間後、細胞を溶解し、イムノブロットを、抗ＦＤＰＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）抗体をタンパク質ローディング対照として使用して実施した。
【０１８９】
より具体的には、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞に、Ｈ１プロモーター（配列番号１６）およびＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列
【化２８】
2019501661.tif 000030
またはＥＦ−１アルファプロモーター（配列番号４１）およびｍｉＲ３０ベースのＦＤＰＳ配列
【化２９】
2019501661.tif 000031
のいずれかを含むレンチウイルスベクターを感染させた。
【０１９０】
４８時間後、細胞をＮＰ−４０溶解緩衝液で溶解し、タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を用いて定量した。５０マイクログラムのタンパク質試料を、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。イムノブロットを、抗ＦＤＰＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）抗体をタンパク質ローディング対照として使用して実施した。抗体を、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体と結合させ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＬｉｃｏｒ  ｃ−ＤｉＧｉｔ  Ｂｌｏｔスキャナーを用いて検出した。イムノブロットバンドの濃度測定を、ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて定量した。ＥＦ−１プロモーターを有するＬＶ対照を１００％に設定した。ＦＤＰＳタンパク質発現の６８％（ＬＶ−ｓｈＦＤＰＳ  ＃４）、４３％（ＬＶ−ｍｉＲ  ＦＤＰＳ  ＃１）および３８％（ＬＶ−ｍｉＲ  ＦＤＰＳ  ＃３）の低減があった。
（実施例１２）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４によるＨｅｐＧ２肝臓癌細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウン
【０１９１】
この実施例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号４）によるＨｅｐＧ２肝臓癌細胞における３日間にわたるＦＤＰＳのノックダウンが、ＧＤ  Ｔ細胞においてＴＮＦ−α発現を刺激することを示している（図１４、パネルＢ）。
【０１９２】
ＨｅｐＧ２細胞を、対照またはＡＡＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ  ＃４（配列番号８）で３日間形質導入した。形質導入の２日後、細胞を、１ｕＭゾレドロン酸で処理したまたは処理しなかった。２４時間後、形質導入されたＨｅｐＧ２細胞を、５×１０５のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ−２と共に丸底９６ウェルプレート中で４時間にわたって共培養した。ＰＢＭＣ細胞を、ゾレドロン酸およびＩＬ−２で１１日間事前刺激して、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を拡大増殖させた。フルオロフォアコンジュゲート抗ＴＣＲ−Ｖδ２および抗ＴＮＦ−α抗体を使用したＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ−αについての染色後、細胞を、フローサイトメトリーを介して分析した。生細胞にゲートをかけ、Ｖδ２＋かつＴＮＦ−α＋の細胞を、ドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は、フローサイトグラムの右上象限に現れた（図１４、パネルＢ）。
【０１９３】
ＡＡＶベクター構築。ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列＃４（配列番号４）を、ｐＡＡＶプラスミド（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中に挿入した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含むＦＤＰＳオリゴヌクレオチド配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温までの冷却の間にアニールさせた。ｐＡＡＶを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて３７℃で１時間消化した。消化されたｐＡＡＶプラスミドを、アガロースゲル電気泳動によって精製し、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクター対オリゴ（３：１比）を混合し、アニールさせ、ライゲーションした。ライゲーション反応を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて室温で３０分間実施した。２．５マイクロリットルのライゲーションミックスを、２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。４２℃でのヒートショック後に形質転換が達成された。細菌細胞を、アンピシリンを含む寒天プレート上に広げ、薬物耐性コロニー（アンピシリン耐性プラスミドの存在を示す）を回収し、ＬＢブロスにおいて拡大増殖させた。オリゴ配列の挿入についてチェックするために、プラスミドＤＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐキットを用いて、回収した細菌培養物から抽出した。ｐＡＡＶプラスミドにおけるｓｈＲＮＡ配列の挿入を、ｓｈＲＮＡ発現を調節するために使用したプロモーターに特異的なプライマーを使用するＤＮＡ配列決定によって検証した。Ｈ１プロモーター（配列番号１６）、ｓｈＦＤＰＳ配列（例えば、配列番号４）、左末端逆位配列（左ＩＴＲ；配列番号６５）および右末端逆位配列（右ＩＴＲ；配列番号６６）を有する例示的なＡＡＶベクターは、図１４、パネルＡに見出すことができる。
【０１９４】
ＡＡＶ粒子の産生。ＡＡＶ−ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡプラスミドを、プラスミドｐＡＡＶ−ＲＣ２（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびｐＨｅｌｐｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と組み合わせた。ｐＡＡＶ−ＲＣ２プラスミドは、ＲｅｐおよびＡＡＶ２カプシド遺伝子を含み、ｐＨｅｌｐｅｒは、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子を含む。ＡＡＶ粒子を産生するために、これらのプラスミドを、１：１：１（ｐＡＡＶ−ｓｈＦＤＰＳ：ｐＡＡＶ−ＲＣ２：ｐＨｅｌｐｅｒ）の比で２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。１５０ｍｍディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）中での細胞のトランスフェクションのために、１０マイクログラムの各プラスミドを、１ｍｌのＤＭＥＭ中に一緒に添加した。別のチューブ中で、６０マイクロリットルのトランスフェクション試薬ＰＥＩ（１マイクログラム／ｍｌ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１ｍｌのＤＭＥＭに添加した。２つのチューブを一緒に混合し、１５分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、細胞を３日後に収集した。細胞を、ドライアイス／イソプロパノール中での凍結／解凍溶解によって溶解した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を、細胞溶解物に３７℃で３０分間添加した。次いで、細胞デブリを、４℃で１５分間の１２，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレット化した。上清を収集し、次いで、標的細胞に添加した。
（実施例１３）
ＬＶ−ｓｈＦＤＰＳで形質導入されゾレドロン酸で処理された細胞における減少したＲＡＰ１プレニル化
【０１９５】
この実施例は、レンチウイルス送達された、ヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＤＰＳ）遺伝子を標的化するｓｈＲＮＡとゾレドロン酸とが、ファルネシル二リン酸産生を阻害するように相乗作用することを示している。
【０１９６】
ＦＤＰＳは、ファルネシル二リン酸の産生を触媒する、イソプレノイド合成経路中の酵素である。ゾレドロン酸によるＦＤＰＳの酵素活性の阻害またはｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンによる低減されたタンパク質発現は、低減されたファルネシル二リン酸レベルを生じる。細胞タンパク質のファルネシル化は、ファルネシル二リン酸を必要とする。ＲＡＰ１Ａは、細胞ファルネシル二リン酸のレベルについてのバイオマーカーとして使用され得る、ファルネシル化によって改変されるタンパク質である。低減されたＲＡＰ１Ａファルネシル化を特異的に認識する抗体を使用して、ＬＶ−ｓｈＦＤＰＳ単独によるまたはゾレドロン酸と組み合わせた形質導入後にＦＤＰＳ活性を測定した。ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞に、ＦＤＰＳ  ｓｈＲＮＡ配列＃４を含むレンチウイルスベクターを感染させた。ゾレドロン酸処理細胞について、ゾレドロン酸（Ｓｉｇｍａ）を、最後の２４時間にわたって添加した。４８時間後、細胞をＮＰ−４０溶解緩衝液で溶解し、タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を用いて定量した。５０マイクログラムのタンパク質試料を、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。イムノブロットを、抗ＦＤＰＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ＲＡＰ１Ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）抗体をタンパク質ローディング対照として使用して実施した。抗体を、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体と結合させ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＬｉｃｏｒ  ｃ−ＤｉＧｉｔ  Ｂｌｏｔスキャナーを用いて検出した。ＲＡＰ１Ａバンド強度における増加は、減少したファルネシル化と相関する。ＲＡＰ１Ａ脱ファルネシル化は、ＬＶ−ｓｈＦＤＰＳで形質導入されゾレドロン酸で処理された細胞のみにおいて生じた。
（実施例１４）
がんを有する対象の処置
ＬＶ−ＦＤＰＳは、後期の切除不可能な肝細胞癌の部位への局所投与を介してレンチウイルスベクターによって送達される遺伝子薬である。
【０１９７】
第Ｉ相臨床試験は、併用の放射線療法も化学療法も伴わない、患者の肝臓の超音波ガイドされるカニューレ挿入を使用して肝細胞癌（ＨＣＣ）の部位にＬＶ−ＦＤＰＳを送達することの安全性および実現可能性を試験する。この研究は、ＨＣＣの首尾よい処置を生じることが理性的に予測される。この研究は、ステージＩＩＩ／ＩＶの切除不可能なＨＣＣを有する１８歳またはそれよりも年長の患者におけるＬＶ−ＦＤＰＳの最大耐用量を同定するための非盲検の４×３用量漸増（４つの用量範囲、１用量当たり最大で３人の対象）である。
【０１９８】
ＬＶ−ＦＤＰＳは、腫瘍細胞における酵素ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を低減させるために設計された遺伝子治療である。実験的研究は、ＬＶ−ＦＤＰＳによって改変された腫瘍細胞が、細胞傷害による腫瘍死滅の能力を含む、ヒトガンマデルタＴ細胞の抗腫瘍活性を誘導することを示している。
【０１９９】
最長直径≧１ｃｍ（ヘリカルＣＴによって測定する）および≦４．９ｃｍの最大直径を有する標的病変を有し、以下に詳述する組み入れ基準および除外基準を満たす対象を、次の利用可能な投薬カテゴリーに登録する。最大で３人の対象を、各投薬量群に採用する。用量は、２５ｍＬを超えない容量を有する単一ボーラスで肝内カニューレ挿入を介して送達される、製品リリース基準に記載されるＬＶ−ＦＤＰＳのいくつかの形質導入単位である。最小用量は１×１０９形質導入単位であり、漸増は、１×１０１０形質導入単位の次の用量まで１０倍であり、次の用量は、１×１０１１形質導入単位であり、ＨＣＣに対する組換えアデノウイルス治療を用いた報告された経験に基づいて、１×１０１２形質導入単位の最大用量である（Ｓａｎｇｒｏら、Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２０１０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７巻：８３７〜４３頁）。対象を登録し、処置し、３ヶ月にわたって評価する。全ての安全性評価を、次のより高い用量レベルで対象を登録および処置する前に、各群について完了する。登録および用量漸増は、最大耐用量が達成されるまでまたは研究が完了するまで継続する。
【０２００】
カニューレ挿入は、カテーテルの先端が適切な肝動脈接合部に来るまでの、左鎖骨下動脈を介したものである。カニューレ挿入は、記載されるように、超音波検査によってガイドされる（Ｌｉｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ，  ｌｅｕｃｏｖｏｒ  ａｎｄ  ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｆｏｒ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２００４年、Ｊ．  Ｃｈｉｎ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ６７巻：６０２〜１０頁）。
一次評価項目
【０２０１】
安全性：全身および局所領域的有害事象は、ＣＴＣＡＳに従ってグレード分けされ、ＭｅｄＲＡに従ってコード化される。単一の用量範囲における全ての対象についての有害事象データは、用量漸増前に評価する。最終安全性評価は、全ての用量範囲からのデータを取り込む。
二次評価項目
【０２０２】
・局所領域的投与後の病変分布およびＬＶ−ＦＤＰＳの保持、ならびに組織を取得するための引き続く生検または剖検。
・処置後３ヶ月の間の、標的における奏効率（ＯＲＲ）、および物理的分析、医学的画像化または生検による測定可能な非局所病変（存在する場合）。
・局所注射後１０分、３０分、１時間および１日の間の血流中のＬＶ−ＦＤＰＳのレベル。
・処置後３ヶ月の間の、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＡＴ、総ビリルビンおよびＧＧＴを含む肝機能マーカーにおける変化。
・ａｄ  ｈｏｃ分析における歴史的対照（ＬＶ−ＦＤＰＳなし）患者を超える無病生存期間。
組み入れ基準
【０２０３】
・１８歳よりも年長、男性および女性の両方を含む。
・組織学もしくは細胞学によって、またはスクリーニングの時点で、切除、移植もしくは他の潜在的に根治的な療法に適していない実質細胞起源の肝細胞癌の現在受容されている臨床標準に基づいて確認された診断。
・病変が局所領域的標的化送達に適している、と担当医が決定する。
・標的病変が、コンピュータ断層撮影によって≧１．０ｃｍの一次元最長直径を有する測定可能な疾患を示さなければならない；最大最長直径は≦５．０ｃｍである。
・カルノフスキー・パフォーマンス・スコア、ＥＣＯＧ値の６０〜８０％。
・平均余命≧１２週間。
・造血機能：ＷＢＣ≧２，５００／ｍｍ３；ＡＮＣ≧１０００／ｍｍ３；ヘモグロビン≧８ｇ／ｄＬ；血小板数≧５０，０００／ｍｍ３；凝固ＩＮＲ≦１．３。
・ＡＳＴおよびＡＬＴ＜ＵＬＮの５倍；ＡＬＰＳ＜ＵＬＮの５倍。ビリルビン≦ＵＬＶの１．５倍；クレアチン≦ＵＬＮの１．５倍およびｅＧＦＲ≧５０。
・甲状腺機能：総Ｔ３または遊離Ｔ３、総Ｔ４または遊離Ｔ４およびＴＨＣ≦ＣＴＣＡＥグレード２の異常。
・主治医の意見で適切な、腎、心血管および呼吸機能。
・免疫学的機能：循環Ｖガンマ９Ｖデルタ２＋Ｔ細胞≧３０／ｍｍ３；免疫不全疾患なし。
・血清学およびウイルスＲＮＡ試験によってＨＩＶ陰性。
・書面によるインフォームドコンセント。
除外基準
【０２０４】
・血管と隣接する、血管を包囲する、または血管に浸潤する標的病変。
・切除、移植または他の潜在的に根治的な療法に適した原発性ＨＣＣ。
・過去４ヶ月以内の肝臓手術または化学塞栓療法。
・過去４ヶ月以内の肝臓放射線照射または全身放射線療法。
・４週間以内の化学療法、またはニトロソウレア、マイトマイシンＣもしくはシスプラチンの任意の使用。
・アミノビスホスホネート治療の現在のまたは過去４週間以内の受け入れ。
・４週間以内または＜５薬物半減期の治験薬剤。
・糖尿病に起因する創傷治癒の障害。
・顕著な精神病、アルコール依存または違法薬物使用。
・研究プロトコールおよび報告要求に従おうとしない。
・過去４ヶ月以内のアミノビスホスホネート処置。
・臨床的に有意な心血管、脳血管（脳卒中）、免疫学的（Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルス感染、ウイルス性肝炎または硬変を除く）、内分泌または中枢神経系の障害の存在；現在の脳症；過去４ヶ月以内の入院または輸血を必要とする静脈瘤出血。
・ＨＩＶまたは後天性免疫不全症候群の履歴。
・抗レトロウイルス薬物療法による現在のまたは以前の処置。
・試験区間および追跡区間を通じた、妊娠、授乳、またはバリア型もしくは化学的避妊具の使用を取り入れることの拒絶。
【０２０５】
ＬＶ−ＦＤＰＳは、後期の切除不可能な肝細胞癌の部位への局所投与を介してレンチウイルスベクターによって送達される遺伝子薬である−アミノビスホスホネートの補助投与
【０２０６】
第Ｉ相臨床試験は、併用アミノビスホスホネート化学療法を伴う、患者の肝臓の超音波ガイドされるカニューレ挿入を使用して肝細胞癌（ＨＣＣ）の部位にＬＶ−ＦＤＰＳを送達することの安全性および実現可能性を試験する。この研究は、ＨＣＣの首尾よい処置を生じることが理性的に予測される。この研究は、ステージＩＩＩ／ＩＶの切除不可能なＨＣＣを有する１８歳またはそれよりも年長の患者におけるＬＶ−ＦＤＰＳの最大耐用量を同定するための非盲検の４×３用量漸増（４つの用量範囲、１用量当たり最大で３人の対象）である。
【０２０７】
ＬＶ−ＦＤＰＳは、腫瘍細胞における酵素ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を低減させるために設計された遺伝子治療である。実験的研究は、ＬＶ−ＦＤＰＳによって改変された腫瘍細胞が、細胞傷害による腫瘍死滅の能力を含む、ヒトガンマデルタＴ細胞の抗腫瘍活性を誘導することを示している。以前の実験的研究は、ＬＶ−ＦＤＰＳと、原発性または転移性疾患において処方され得る特定のアミノビスホスホネート薬物との正の相互作用の可能性もまた示している。この研究のために、対象は、医師のアドバイスおよび対象の好みに従って、Ａｒｅｄｉａ（登録商標）（パミドロネート）、Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロン酸）またはＡｃｔｏｎｅｌ（登録商標）（リセドロネート）による持続的な標準治療投薬と共に、用量漸増量のＬＶ−ＦＤＰＳを受ける。
【０２０８】
最長直径≧１ｃｍ（ヘリカルＣＴによって測定する）および≦４．９ｃｍの最大直径を有する標的病変を有し、以下に詳述する組み入れ基準および除外基準を満たす対象を登録し、アミノビスホスホネート治療を始める。標的病変の３０日後のサイズを再評価して、対象がＬＶ−ＦＤＰＳの開始基準をなおも満たすことを確実にする。アミノビスホスホネートに対する客観的臨床応答を有さない対象を、次の利用可能なＬＶ−ＦＤＰＳ投薬カテゴリーに登録する。最大で３人の対象を各投薬量群に採用し、全てが、主治医によって他にアドバイスされない限り、研究持続時間にわたってアミノビスホスホネートを継続する。ＬＶ−ＦＤＰＳ用量は、２５ｍＬを超えない容量を有する単一ボーラスで肝内カニューレ挿入を介して送達される、製品リリース基準に記載されるＬＶ−ＦＤＰＳのいくつかの形質導入単位である。最小用量は１×１０９形質導入単位であり、漸増は、１×１０１０形質導入単位の次の用量まで１０倍であり、次の用量は、１×１０１１形質導入単位であり、ＨＣＣに対する組換えアデノウイルス治療を用いた報告された経験に基づいて、１×１０１２形質導入単位の最大用量である（Ｓａｎｇｒｏら、Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２０１０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７巻：８３７〜４３頁）。対象を登録し、処置し、３ヶ月にわたって評価する。全ての安全性評価を、次のより高い用量レベルで対象を登録および処置する前に、各群について完了する。登録および用量漸増は、最大耐用量が達成されるまでまたは研究が完了するまで継続する。
【０２０９】
カニューレ挿入は、カテーテルの先端が適切な肝動脈接合部に来るまでの、左鎖骨下動脈を介したものである。カニューレ挿入は、記載されるように、超音波検査によってガイドされる（Ｌｉｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ，  ｌｅｕｃｏｖｏｒ  ａｎｄ  ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｆｏｒ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２００４年、Ｊ．  Ｃｈｉｎ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ６７巻：６０２〜１０頁）。
一次評価項目
【０２１０】
安全性：全身および局所領域的有害事象は、ＣＴＣＡＳに従ってグレード分けされ、ＭｅｄＲＡに従ってコード化される。単一の用量範囲における全ての対象についての有害事象データは、用量漸増前に評価する。最終安全性評価は、全ての用量範囲からのデータを取り込む。
二次評価項目
【０２１１】
・局所領域的投与後の病変分布およびＬＶ−ＦＤＰＳの保持、ならびに組織を取得するための引き続く生検または剖検。
・処置後３ヶ月の間の、標的における奏効率（ＯＲＲ）、および物理的分析、医学的画像化または生検による測定可能な非局所病変（存在する場合）。
・局所注射後１０分、３０分、１時間および１日の間の血流中のＬＶ−ＦＤＰＳのレベル。
・処置後３ヶ月の間の、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＡＴ、総ビリルビンおよびＧＧＴを含む肝機能マーカーにおける変化。
・ａｄ  ｈｏｃ分析における歴史的対照（ＬＶ−ＦＤＰＳなし）患者を超える無病生存期間。
組み入れ基準
【０２１２】
・１８歳よりも年長、男性および女性の両方を含む。
・組織学もしくは細胞学によって、またはスクリーニングの時点で、切除、移植もしくは他の潜在的に根治的な療法に適していない実質細胞起源の肝細胞癌の現在受容されている臨床標準に基づいて確認された診断。
・病変が局所領域的標的化送達に適している、と担当医が決定する。
・標的病変が、コンピュータ断層撮影によって≧１．０ｃｍの一次元最長直径を有する測定可能な疾患を示さなければならない；最大最長直径は≦５．０ｃｍである。
・カルノフスキー・パフォーマンス・スコア、ＥＣＯＧ値の６０〜８０％。
・平均余命≧１２週間。
・造血機能：ＷＢＣ≧２，５００／ｍｍ３；ＡＮＣ≧１０００／ｍｍ３；ヘモグロビン≧８ｇ／ｄＬ；血小板数≧５０，０００／ｍｍ３；凝固ＩＮＲ≦１．３。
・ＡＳＴおよびＡＬＴ＜ＵＬＮの５倍；ＡＬＰＳ＜ＵＬＮの５倍。ビリルビン≦ＵＬＶの１．５倍；クレアチン≦ＵＬＮの１．５倍およびｅＧＦＲ≧５０。
・甲状腺機能：総Ｔ３または遊離Ｔ３、総Ｔ４または遊離Ｔ４およびＴＨＣ≦ＣＴＣＡＥグレード２の異常。
・主治医の意見で適切な、腎、心血管および呼吸機能。
・免疫学的機能：循環Ｖガンマ９Ｖデルタ２＋Ｔ細胞≧３０／ｍｍ３；免疫不全疾患なし。
・血清学およびウイルスＲＮＡ試験によってＨＩＶ陰性。
・書面によるインフォームドコンセント。
除外基準
【０２１３】
・アミノビスホスホネート補助治療に対して不耐性、またはアミノビスホスホネート補助治療を継続しようとしない。
・アミノビスホスホネート治療後の客観的臨床応答。
・血管と隣接する、血管を包囲する、または血管に浸潤する標的病変。
・切除、移植または他の潜在的に根治的な療法に適した原発性ＨＣＣ。
・過去４ヶ月以内の肝臓手術または化学塞栓療法。
・過去４ヶ月以内の肝臓放射線照射または全身放射線療法。
・４週間以内の、アミノビスホスホネートを除く化学療法、またはニトロソウレア、マイトマイシンＣもしくはシスプラチンの任意の使用。
・４週間以内または＜５薬物半減期の治験薬剤。
・糖尿病に起因する創傷治癒の障害。
・顕著な精神病、アルコール依存または違法薬物使用。
・研究プロトコールおよび報告要求に従おうとしない。
・臨床的に有意な心血管、脳血管（脳卒中）、免疫学的（Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルス感染、ウイルス性肝炎または硬変を除く）、内分泌または中枢神経系の障害の存在；現在の脳症；過去４ヶ月以内の入院または輸血を必要とする静脈瘤出血。
・ＨＩＶまたは後天性免疫不全症候群の履歴。
・抗レトロウイルス薬物療法による現在のまたは以前の処置。
・試験区間および追跡区間を通じた、妊娠、授乳、またはバリア型もしくは化学的避妊具の使用を取り入れることの拒絶。
（実施例１５）
肝臓の慢性ウイルス疾患（複数可）を有する対象の処置
ＬＶ−ＦＤＰＳは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶまたは肝臓の他のウイルス感染の処置のために肝臓への局所投与を介してレンチウイルスベクターによって送達される遺伝子薬である
【０２１４】
第Ｉ相臨床試験は、超音波ガイドされるカニューレ挿入を使用してウイルス感染肝臓にＬＶ−ＦＤＰＳを送達することの安全性および実現可能性を試験する。この研究は、肝臓の感染の首尾よい処置を生じることが理性的に予測される。この研究は、化学療法に対して耐性の肝臓の慢性ウイルス疾患を有する１８歳またはそれよりも年長の患者におけるＬＶ−ＦＤＰＳの最大耐用量を同定するための非盲検の４×３用量漸増（４つの用量範囲、１用量当たり最大で３人の対象）である。
【０２１５】
ＬＶ−ＦＤＰＳは、腫瘍細胞における酵素ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を低減させるために設計された遺伝子治療である。実験的研究は、ＬＶ−ＦＤＰＳによって改変された腫瘍細胞が、ウイルス感染細胞に対する細胞傷害性の能力を含む、ヒトガンマデルタＴ細胞を誘導することを示している。
【０２１６】
Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶまたは他のウイルスを含む、肝臓の確認されたウイルス感染を有する対象を、次の利用可能なＬＶ−ＦＤＰＳ投薬カテゴリーに登録する。最大で３人の対象を、各投薬量群に採用する。ＬＶ−ＦＤＰＳ用量は、２５ｍＬを超えない容量を有する単一ボーラスで肝内カニューレ挿入を介して送達される、製品リリース基準に記載されるＬＶ−ＦＤＰＳのいくつかの形質導入単位である。最小用量は１×１０９形質導入単位であり、漸増は、１×１０１０形質導入単位の次の用量まで１０倍であり、次の用量は、１×１０１１形質導入単位であり、ＨＣＣに対する組換えアデノウイルス治療を用いた報告された経験に基づいて、１×１０１２形質導入単位の最大用量である（Ｓａｎｇｒｏら、Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２０１０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７巻：８３７〜４３頁）。対象を登録し、処置し、３ヶ月にわたって評価する。全ての安全性評価を、次のより高い用量レベルで対象を登録および処置する前に、各群について完了する。登録および用量漸増は、最大耐用量が達成されるまでまたは研究が完了するまで継続する。
【０２１７】
カニューレ挿入は、カテーテルの先端が適切な肝動脈接合部に来るまでの、左鎖骨下動脈を介したものである。カニューレ挿入は、記載されるように、超音波検査によってガイドされる（Ｌｉｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ，  ｌｅｕｃｏｖｏｒ  ａｎｄ  ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｆｏｒ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２００４年、Ｊ．  Ｃｈｉｎ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ６７巻：６０２〜１０頁）。
一次評価項目
【０２１８】
安全性：全身および局所領域的有害事象は、ＣＴＣＡＳに従ってグレード分けされ、ＭｅｄＲＡに従ってコード化される。単一の用量範囲における全ての対象についての有害事象データは、用量漸増前に評価する。最終安全性評価は、全ての用量範囲からのデータを取り込む。
二次評価項目
【０２１９】
・局所領域的投与後の病変分布およびＬＶ−ＦＤＰＳの保持、ならびに組織を取得するための引き続く生検または剖検。
・処置後３ヶ月の間の、臓器内または全身性の持続性ウイルス応答（ＳＶＲ）として測定される奏効率（ＯＲＲ）。
・局所注射後１０分、３０分、１時間および１日の間の血流中のＬＶ−ＦＤＰＳのレベル。
・処置後３ヶ月の間の、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＡＴ、総ビリルビンおよびＧＧＴを含む肝機能マーカーにおける変化。
・ａｄ  ｈｏｃ分析における歴史的対照（ＬＶ−ＦＤＰＳなし）患者を超える無病生存期間。
組み入れ基準
【０２２０】
・１８歳よりも年長、男性および女性の両方を含む。
・組織学もしくは細胞学によって、またはスクリーニングの時点で、切除、移植もしくは他の潜在的に根治的な療法に適していない肝臓の慢性ウイルス感染の現在受容されている臨床標準に基づいて確認された診断。
・病変が局所領域的標的化送達に適している、と担当医が決定する。
・カルノフスキー・パフォーマンス・スコア、ＥＣＯＧ値の６０〜８０％。
・平均余命≧１２週間。
・造血機能：ＷＢＣ≧２，５００／ｍｍ３；ＡＮＣ≧１０００／ｍｍ３；ヘモグロビン≧８ｇ／ｄＬ；血小板数≧５０，０００／ｍｍ３；凝固ＩＮＲ≦１．３。
・ＡＳＴおよびＡＬＴ＜ＵＬＮの５倍；ＡＬＰＳ＜ＵＬＮの５倍。ビリルビン≦ＵＬＶの１．５倍；クレアチン≦ＵＬＮの１．５倍およびｅＧＦＲ≧５０。
・甲状腺機能：総Ｔ３または遊離Ｔ３、総Ｔ４または遊離Ｔ４およびＴＨＣ≦ＣＴＣＡＥグレード２の異常。
・主治医の意見で適切な、腎、心血管および呼吸機能。
・免疫学的機能：循環Ｖガンマ９Ｖデルタ２＋Ｔ細胞≧３０／ｍｍ３；免疫不全疾患なし。
・血清学およびウイルスＲＮＡ試験によってＨＩＶ陰性。
・書面によるインフォームドコンセント。
除外基準
【０２２１】
・切除、移植または他の潜在的に根治的な療法に適した慢性ウイルス疾患。
・過去４ヶ月以内の肝臓手術または化学塞栓療法。
・過去４ヶ月以内の肝臓放射線照射または全身放射線療法。
・４週間以内または＜５薬物半減期の治験薬剤。
・アミノビスホスホネート治療の現在の（過去４週間以内の）または進行中の受け入れ。
・糖尿病に起因する創傷治癒の障害。
・顕著な精神病、アルコール依存または違法薬物使用。
・研究プロトコールおよび報告要求に従おうとしない。
・臨床的に有意な心血管、脳血管（脳卒中）、免疫学的（ウイルス感染、ウイルス性肝炎または硬変を除く）、内分泌または中枢神経系の障害の存在；現在の脳症；過去４ヶ月以内の入院または輸血を必要とする静脈瘤出血。
・試験区間および追跡区間を通じた、妊娠、授乳、またはバリア型もしくは化学的避妊具の使用を取り入れることの拒絶。
【０２２２】
ＬＶ−ＦＤＰＳは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶまたは肝臓の他のウイルス感染の処置のために肝臓への局所投与を介してレンチウイルスベクターによって送達される遺伝子薬である−併用補助アミノビスホスホネート治療
【０２２３】
第Ｉ相臨床試験は、超音波ガイドされるカニューレ挿入を使用してウイルス感染肝臓にＬＶ−ＦＤＰＳを送達することの安全性および実現可能性を試験する。この研究は、肝臓の感染の首尾よい処置を生じることが理性的に予測される。この研究は、化学療法に対して耐性の肝臓の慢性ウイルス疾患を有する１８歳またはそれよりも年長の患者におけるＬＶ−ＦＤＰＳの最大耐用量を同定するための非盲検の４×３用量漸増（４つの用量範囲、１用量当たり最大で３人の対象）である。
【０２２４】
ＬＶ−ＦＤＰＳは、腫瘍細胞における酵素ファルネシル二リン酸シンターゼの発現を低減させるために設計された遺伝子治療である。実験的研究は、ＬＶ−ＦＤＰＳによって改変された腫瘍細胞が、ウイルス感染細胞に対する細胞傷害性の能力を含む、ヒトガンマデルタＴ細胞を誘導することを示している。以前の実験的研究は、ＬＶ−ＦＤＰＳと、感染性疾患の間に処方され得る特定のアミノビスホスホネート薬物との正の相互作用の可能性もまた示している。この研究のために、対象は、医師のアドバイスおよび対象の好みに従って、Ａｒｅｄｉａ（登録商標）（パミドロネート）、Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）（ゾレドロン酸）またはＡｃｔｏｎｅｌ（登録商標）（リセドロネート）による持続的な標準治療投薬と共に、用量漸増量のＬＶ−ＦＤＰＳを受ける。
【０２２５】
Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶまたは他のウイルスを含む、肝臓の確認されたウイルス感染を有する対象は、感染性疾患のＬＶ−ＦＤＰＳ処置のための登録基準を満たすように、再スクリーニング前の４５日間にわたるアミノビスホスホネート治療を開始する。適格な対象を、次の利用可能なＬＶ−ＦＤＰＳ投薬カテゴリーに登録する。最大で３人の対象を、各投薬量群に採用する。ＬＶ−ＦＤＰＳ用量は、２５ｍＬを超えない容量を有する単一ボーラスで肝内カニューレ挿入を介して送達される、製品リリース基準に記載されるＬＶ−ＦＤＰＳのいくつかの形質導入単位である。最小用量は１×１０９形質導入単位であり、漸増は、１×１０１０形質導入単位の次の用量まで１０倍であり、次の用量は、１×１０１１形質導入単位であり、ＨＣＣに対する組換えアデノウイルス治療を用いた報告された経験に基づいて、１×１０１２形質導入単位の最大用量である（Ｓａｎｇｒｏら、Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２０１０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７巻：８３７〜４３頁）。対象を登録し、処置し、３ヶ月にわたって評価する。全ての安全性評価を、次のより高い用量レベルで対象を登録および処置する前に、各群について完了する。登録および用量漸増は、最大耐用量が達成されるまでまたは研究が完了するまで継続する。
【０２２６】
カニューレ挿入は、カテーテルの先端が適切な肝動脈接合部に来るまでの、左鎖骨下動脈を介したものである。カニューレ挿入は、記載されるように、超音波検査によってガイドされる（Ｌｉｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ，  ｌｅｕｃｏｖｏｒ  ａｎｄ  ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｆｏｒ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２００４年、Ｊ．  Ｃｈｉｎ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ６７巻：６０２〜１０頁）。
一次評価項目
【０２２７】
安全性：全身および局所領域的有害事象は、ＣＴＣＡＳに従ってグレード分けされ、ＭｅｄＲＡに従ってコード化される。単一の用量範囲における全ての対象についての有害事象データは、用量漸増前に評価する。最終安全性評価は、全ての用量範囲からのデータを取り込む。
二次評価項目
【０２２８】
・局所領域的投与後の病変分布およびＬＶ−ＦＤＰＳの保持、ならびに組織を取得するための引き続く生検または剖検。
・処置後３ヶ月の間の、臓器内または全身性の持続性ウイルス応答（ＳＶＲ）として測定される奏効率（ＯＲＲ）。
・局所注射後１０分、３０分、１時間および１日の間の血流中のＬＶ−ＦＤＰＳのレベル。
・処置後３ヶ月の間の、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＡＴ、総ビリルビンおよびＧＧＴを含む肝機能マーカーにおける変化。
・ａｄ  ｈｏｃ分析における歴史的対照（ＬＶ−ＦＤＰＳなし）患者を超える無病生存期間。
組み入れ基準
【０２２９】
・１８歳よりも年長、男性および女性の両方を含む。
・組織学もしくは細胞学によって、またはスクリーニングの時点で、切除、移植もしくは他の潜在的に根治的な療法に適していない肝臓の慢性ウイルス感染の現在受容されている臨床標準に基づいて確認された診断。
・病変が局所領域的標的化送達に適している、と担当医が決定する。
・カルノフスキー・パフォーマンス・スコア、ＥＣＯＧ値の６０〜８０％。
・平均余命≧１２週間。
・造血機能：ＷＢＣ≧２，５００／ｍｍ３；ＡＮＣ≧１０００／ｍｍ３；ヘモグロビン≧８ｇ／ｄＬ；血小板数≧５０，０００／ｍｍ３；凝固ＩＮＲ≦１．３。
・ＡＳＴおよびＡＬＴ＜ＵＬＮの５倍；ＡＬＰＳ＜ＵＬＮの５倍。ビリルビン≦ＵＬＶの１．５倍；クレアチン≦ＵＬＮの１．５倍およびｅＧＦＲ≧５０。
・甲状腺機能：総Ｔ３または遊離Ｔ３、総Ｔ４または遊離Ｔ４およびＴＨＣ≦ＣＴＣＡＥグレード２の異常。
・主治医の意見で適切な、腎、心血管および呼吸機能。
・免疫学的機能：循環Ｖガンマ９Ｖデルタ２＋Ｔ細胞≧３０／ｍｍ３；免疫不全疾患なし。
・血清学およびウイルスＲＮＡ試験によってＨＩＶ陰性。
・書面によるインフォームドコンセント。
除外基準
【０２３０】
・切除、移植または他の潜在的に根治的な療法に適した慢性ウイルス疾患。
・過去４ヶ月以内の肝臓手術または化学塞栓療法。
・過去４ヶ月以内の肝臓放射線照射または全身放射線療法。
・４週間以内または＜５薬物半減期の治験薬剤。
・糖尿病に起因する創傷治癒の障害。
・顕著な精神病、アルコール依存または違法薬物使用。
・研究プロトコールおよび報告要求に従おうとしない。
・臨床的に有意な心血管、脳血管（脳卒中）、免疫学的（ウイルス感染、ウイルス性肝炎または硬変を除く）、内分泌または中枢神経系の障害の存在；現在の脳症；過去４ヶ月以内の入院または輸血を必要とする静脈瘤出血。
・試験区間および追跡区間を通じた、妊娠、授乳、またはバリア型もしくは化学的避妊具の使用を取り入れることの拒絶。
配列
以下の配列が本明細書で言及される：
【表１−１】
2019501661.tif 000032
【表１−２】
2019501661.tif 000033
【表１−３】
2019501661.tif 000034
【表１−４】
2019501661.tif 000035
【表１−５】
2019501661.tif 000036
【表１−６】
2019501661.tif 000037
【表１−７】
2019501661.tif 000038
【表１−８】
2019501661.tif 000039
【表１−９】
2019501661.tif 000040
【表１−１０】
2019501661.tif 000041
【表１−１１】
2019501661.tif 000042
【表１−１２】
2019501661.tif 000043
【表１−１３】
2019501661.tif 000044
【表１−１４】
2019501661.tif 000045
【表１−１５】
2019501661.tif 000046
【表１−１６】
2019501661.tif 000047
【表１−１７】
2019501661.tif 000048
【表１−１８】
2019501661.tif 000049
【表１−１９】
2019501661.tif 000050
【表１−２０】
2019501661.tif 000051
【表１−２１】
2019501661.tif 000052
【表１−２２】
2019501661.tif 000053
【表１−２３】
2019501661.tif 000054
【表１−２４】
2019501661.tif 000055
【表１−２５】
2019501661.tif 000056
【表１−２６】
2019501661.tif 000057
【表１−２７】
2019501661.tif 000058
【表１−２８】
2019501661.tif 000059
【表１−２９】
2019501661.tif 000060
【表１−３０】
2019501661.tif 000061
【表１−３１】
2019501661.tif 000062
【表１−３２】
2019501661.tif 000063
【表１−３３】
2019501661.tif 000064
【表１−３４】
2019501661.tif 000065
【表１−３５】
2019501661.tif 000066
【０２３１】
本発明の好ましい実施形態の特定のものが上に記載され、具体的に列挙されてきたが、本発明がかかる実施形態に限定されることは意図しない。種々の改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに、本発明に対してなされ得る。
【図１】
2019501661.tif 000075
【図２】
2019501661.tif 000076
【図３】
2019501661.tif 000077
【図４】
2019501661.tif 000078
【図５】
2019501661.tif 000079
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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