【手続補正書】
【提出日】平成18年12月6日(2006.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法であって、該方法が以下のステップ：
(ａ)  アルファウイルス・レプリコン核酸を宿主細胞中に導入し、該レプリコン核酸は少なくともウイルス・パッケージング・シグナル及び該アルファウイルス・レプリコン核酸中で発現できる少なくとも１の異種性コード配列を含み、ここで改変宿主細胞を作り出すために該宿主細胞が少なくとも１のヘルパー機能を含み；
(ｂ)  上記少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、上記アルファウイルス・レプリコン核酸の複製及び該アルファウイルス・レプリコン核酸のパッケージングを許容する条件下で上記改変宿主細胞を培養して、ＡＲＰｓを形成し、ここで当該ＡＲＰｓがヘパリン結合性ＡＲＰｓであり；
(ｃ)  ステップ(ｂ)の後に上記改変宿主細胞を、０.２Ｍ〜５Ｍのイオン強度を有する水溶液と接触して、上記ＡＲＰｓを該水溶液中に放出させて、ＡＲＰを含む溶液を作り出し；
(ｄ)  ステップ(ｃ)のＡＲＰを含む溶液からＡＲＰｓを回収するステップ
を含む前記方法。
【請求項２】
１ｍｌあたり５×１０7〜５×１０8のステップ(ａ)に記載の宿主細胞における前記少なくとも１のヘルパー機能が、該宿主細胞のゲノム中に安定して組み込まれた核酸配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞中の前記少なくとも１のヘルパー機能が、前記アルファウイルス・レプリコン核酸を結合できるキャプシドタンパク質をコードする少なくとも１のヘルパー核酸、及び少なくとも１のアルファウイルス糖タンパク質に基いて導入され、ここで該アルファウイルス糖タンパク質が、該アルファウイルス・レプリコン核酸及び該キャプシドタンパク質と会合し、ここで該少なくとも１のヘルパー核酸分子が該アルファウイルス・レプリコン核酸と共に該宿主細胞中へと導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１のヘルパー機能が、少なくとも２個のヘルパー核酸分子によりコードされ、ここで該２個のヘルパー核酸分子の各々が、少なくとも１のウイルス・ヘルパー機能をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン強度が０.５Ｍ〜５Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１のヘルパー機能が、ＤＮＡ分子中にコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アルファウイルス・レプリコン核酸が、電気穿孔により前記宿主細胞中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、１ｍｌあたり５×１０7〜５×１０8の濃度で電気穿孔混合液中に存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、１ｍｌあたり５×１０7〜１.５×１０8の濃度で電気穿孔混合液中に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のステップ(ｃ)の前に、細胞洗浄ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルファウイルスが、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞洗浄溶液が塩を含まず、かつデオキシリボヌクレアーゼをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘルパー核酸が、キャップなしＲＮＡ分子である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１４】
アルファウイルス・レプリコンＲＮＡ及び第一ヘルパーＲＮＡ分子及び第二ＲＮＡヘルパー分子が、１：０.３：０.３〜１：２０：２０の比で電気穿孔混合液に存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記比が、１：０.５：０.５である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記比が、１：５：５である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アルファウイルス・レプリコン粒子の製造方法であって、アルファウイルス・レプリコン・ベクター及び１以上のヘルパー核酸分子を、電気穿孔を介してアルファウイルス-許容状態細胞へと導入することを含み、ここで、電気穿孔の間の培養培地中の該アルファウイルス許容状態細胞の濃度が、５×１０7〜５×１０8細胞/ｍｌであり、かつ電気穿孔前に該細胞に加えられた該アルファウイルスＲＮＡレプリコン・ベクターの濃度が、約３５μｇ/ｍｌである、前記方法。
【請求項１８】
前記電気穿孔が、電気穿孔チャンバー内で行われ、ここで電極間のギャップが０.４〜１.０ｃｍである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヘルパー機能が、全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードするシングルＤＮＡヘルパー分子内にコードされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡヘルパー分子の濃度が、少なくとも１００μｇ/ｍｌである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルファウイルス-許容状態細胞が、ベロ細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ(ｄ)の後に、イオン交換、ヘパリン・アフィニティー・クロマトグラフィー、アフィニティー又は疎水性クロマトグラフィーステップが行われる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルファウイルスが、弱毒化アルファウイルスである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルファウイルスが、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記塩洗浄ステップにおいて前記塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＮＨ4Ｃｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4、酢酸アンモニウム、及び炭酸水素アンモニウムである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
アルファウイルス・レプリコン粒子(ＡＲＰｓ)の製造方法であって、該方法が以下のステップ：
(ａ)  アルファウイルス・レプリコン核酸を宿主細胞中へ導入し、該レプリコン核酸が、少なくともウイルス・パッケージング・シグナルと該アルファウイルス・レプリコン核酸中に発現する少なくとも１の異種性コード配列を含み、ここで改変宿主細胞を作り出すために該宿主細胞が少なくとも１のヘルパー機能を含み、ここで上記レプリコン核酸が、１ｍｌあたり５×１０7〜５×１０8細胞濃度で、宿主細胞を電気穿孔することにより該宿主細胞中に導入され；
(ｂ)  上記少なくとも１のヘルパー機能の発現を許容し、上記アルファウイルス・レプリコン核酸の複製及び該アルファウイルス・レプリコン核酸のパッケージングを許容する条件下で上記改変宿主細胞を培養して、ＡＲＰｓを形成し、ここで、当該ＡＲＰｓがヘパリン結合性ＡＲＰｓであり；
(ｃ)  ステップ(ｂ)の後に上記改変宿主細胞を、０.２Ｍ〜５Ｍのイオン強度を有する水溶液と接触して、上記ＡＲＰｓを該水溶液中に放出させて、ＡＲＰを含む溶液を作り出し；
(ｄ)  ステップ(ｃ)のＡＲＰを含む溶液からＡＲＰｓを回収するステップ
を含む前記方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、１ｍｌあたり５×１０7〜１.５×１０8の濃度で、電気穿孔混合液中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルファウイルスが、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥ)である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヘルパー核酸が、キャップなしＲＮＡ分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法により製造されるアルファウイルス・レプリコン粒子調製品。