(57)【要約】  本開示は、アミリンの非凝集性バイオコンジュゲート、アミリンミメティック化合物、およびそれを含む組み合わせに関し、該バイオコンジュゲートが少なくとも１つのアシル単位を含む。製造および使用の方法がここで提供される。いくつかの態様において、本発明の非凝集性アミリンバイオコンジュゲートは、全身の臓器、例えば膵臓または脳の機能障害または不全に寄与する、アミリンの自然産生の不足および／または細胞外アミロイド線維の沈着もしくは蓄積に関連した疾患を治療するために使用することができる。
2019501963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアミリンまたはアミリン類似体の非凝集性バイオコンジュゲートであって、前記バイオコンジュゲートが少なくとも１つのアシル単位を含む、バイオコンジュゲート。
【請求項２】
前記１つのアシル単位が、配列番号１のリシン１残基に共有結合している、請求項１に記載のヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート。
【請求項３】
式Ｉ
（Ｒ１−Ｘ）ｍ−Ｒ２
［式中、Ｒ１は、アセチル、ビオチン、ユビキチン、グリカン、脂肪酸鎖および天然または合成のポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに様々な平均モル質量の官能性スペーサからなる群から選択されるアシル部分を表し、
Ｒ２は、配列番号１を表し、
Ｘは、ＮＨ、ＣＯ、またはＯを表し、
ｍは、３位、４位、５位、または６位のうちの１つ以上にアミノ酸置換を有するヒトアミリン類似体（配列番号２）を含む、配列番号１のアシル化から得られた配列番号１（Ｒ２）にコンジュゲートされたアシル基（Ｒ１）の単位数を表す］
を有する、請求項１に記載のヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート。
【請求項４】
前記アシル基が、ＰＥＧ、アセチル基、パルミトイル、およびミリストイルからなる群から選択される少なくとも１種のアシル化剤で生成される、請求項３に記載のヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート。
【請求項５】
ＰＥＧが１ｋＤａ〜４０ｋＤａである、請求項４に記載のヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート。
【請求項６】
ヒトアミリンまたはアミリン類似体の非凝集性アシル化バイオコンジュゲートを含む、組成物。
【請求項７】
インスリン、インスリン類似体、および／またはＧＬＰ−１受容体アゴニスト類似体と、薬学的に許容される担体とをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記インスリンまたはインスリン類似体が、ＮＰＨ、レギュラーインスリン、グラルギン、デテミル、デグルデク、アスパルト、リスプロ、およびグルリジンからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト類似体が、セマグルチド、エキセナチド、リキシセナチド、リラグルチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、膵臓炎、高カルシウム血症、疼痛、骨粗鬆症、慢性炎症性疾患、セリアック病、乾癬、全身の臓器の機能障害または不全をもたらすアミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される疾患または状態、ならびに血圧の上昇から生じる障害および血管疾患の治療に使用される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
全身の臓器の機能障害または不全をもたらすアミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される前記疾患または問題が、高血糖症、糖尿病、低グルコース耐性またはグルコース代謝不全、肥満、メタボリックシンドローム、中枢神経系関連または末梢関連の摂食障害、およびアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
血圧の上昇から生じる前記問題および血管疾患が、粥状動脈硬化、心筋梗塞、卒中、冠動脈心疾患、高血圧症、および心疾患からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
抗炎症薬をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の前記ヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲートと、インスリンと、薬学的に許容される担体とを混合することを含む、組成物を調製するための方法。
【請求項１５】
請求項２に記載の前記ヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲートを治療有効量で含む、医薬品。
【請求項１６】
アミリンまたはアミロイドの沈着または蓄積の不足によって引き起こされる疾患または状態を治療するための方法であって、それを必要とする患者に請求項７に記載の前記組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
前記疾患が糖尿病および／または肥満である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アミリンポリペプチド鎖のリシン１残基のアルファおよび／またはイプシロンアミン部分にアシル化剤を結合させることを含む、アミリンミメティック化合物を安定化させるための方法。
【発明の詳細な説明】
【分野】
【０００１】
[001]本明細書は、概して、新たなアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート、アミリンミメティック化合物、およびそれを含む組み合わせに関する。製造および使用の方法がここで提供される。
序論
[002]アミリンは、ＣＡＳ  ＲＮ：１０６６０２−６２−４で識別される膵島アミロイドポリペプチドとしても知られ、膵臓のランゲルハンス島のベータ細胞によって産生される３７アミノ酸ポリペプチドホルモンである。生理的条件下では、アミリンおよびインスリンは、比較的低いｐＨ環境において、同じ分泌顆粒中で産生され貯蔵される。両ホルモンは、摂食に応答してインスリン：アミリン１５：１の割合で共分泌され、アミリンは、インスリン経路から独立したグルコース恒常性において重要な生理的役割を果たす。
【０００２】
[003]食物の摂取の低減およびその後の体重減少につながる満腹感の増加、糖尿病患者における胃排出のさらなる減速、食後ピークを含むグルコース代謝プロファイルの改善、およびグルカゴンレベルの低下といった、糖尿病および肥満におけるアミリンの有益な活性が知られている（Ｈａｙら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ、ｖ．６７、ｎ．３、ｐ．５６４〜６００、２０１５）。
【０００３】
[004]１型糖尿病患者は、自然なアミリン産生を事実上有せず、長期にわたる２型糖尿病の患者は、健常な個体よりも低いレベルを有する。糖尿病患者では、食事摂取に対するアミリン応答が存在しないか、または著しく損なわれているため、アミリノミメティックおよびインスリンまたは他の抗糖尿病薬のいくつかの組み合わせは、患者の生理機能を復元する候補であり、これは糖尿病治療の主な目標である。さらに、現在のインスリンベースの薬物を用いた糖尿病患者のグルコース制御は、通常は最適以下であり、重要な副作用（例えば、体重増加および低血糖症の高いリスク）を決まって誘発する。
【０００４】
[005]この文脈におけるアミリン補充治療は、満腹感、減速した胃排出、またはより少ない食後血糖ピークの誘発を可能にし、長期的に体重減少およびグルコースレベル制御の改善をもたらし得る。しかしながら、薬学的成分として構造未修飾のアミリンを使用することは、その固有の物理化学的性質（すなわち、不十分な溶解性、アミロイド線維を形成する傾向、および低い血漿安定性）の理由で不可能である。その水溶液中での限定された溶解性は、アミノ酸２５、２７、および２８がプロリンで置き換えられた、より溶解性の高いアミリンミメティック化合物であるプラムリンチド（Ｓｙｍｌｉｎ（登録商標））の開発につながった。
【０００５】
[006]プラムリンチドの溶解性はヒトアミリンのものよりも高いが、プラムリンチドは中性ｐＨでは良好な溶解性を有さないため、製品Ｓｙｍｌｉｎ（登録商標）は酸溶液として提供されている。この製品は、アミリンの食後レベルを上昇させることを目的として、食事の直前に皮下注射として投与される必要がある。その血漿中半減期は１０〜１５分と短いため、このようなプラムリンチドの注射は血流中のアミリンの濃度を一連のピークとして上昇させ、したがって患者の生理機能を回復させなかった。科学文献において、プラムリンチドは、重度のインスリン誘発性低血糖症のリスク増加、および他の有害作用、例えば悪心、嘔吐、食欲不振、および疲労と関連付けられている。
【発明の概要】
【０００６】
[007]一側面において、ヒトアミリンまたはアミリン類似体の非凝集性バイオコンジュゲートであって、該バイオコンジュゲートが少なくとも１つのアシル単位を含むバイオコンジュゲートが、ここで提供される。一態様において、１つのアシル単位は、配列番号１のリシン１残基に共有結合している。
【０００７】
[008]別の態様では、ヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲートは、式Ｉ
（Ｒ１−Ｘ）ｍ−Ｒ２
［式中、Ｒ１は、アセチル、ビオチン、ユビキチン、グリカン、脂肪酸鎖および天然または合成のポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに様々な平均モル質量の官能性スペーサからなる群から選択されるアシル部分を表し、
Ｒ２は、配列番号１を表し、
Ｘは、ＮＨ、ＣＯ、またはＯを表し、
ｍは、３位、４位、５位、または６位のうちの１つ以上にアミノ酸置換を有するヒトアミリン類似体（配列番号２）を含む、配列番号１のアシル化から得られた配列番号１（Ｒ２）にコンジュゲートされたアシル基（Ｒ１）の単位数を表す］
によって表される。
【０００８】
[009]さらなる態様では、アシル基は、ＰＥＧ、アセチル基、パルミトイル、およびミリストイルからなる群から選択される少なくとも１種のアシル化剤で生成される。なおもさらなる態様では、ＰＥＧは１ｋＤａ〜４０ｋＤａである。
【０００９】
[010]別の側面では、本開示は、ヒトアミリンまたはアミリン類似体の非凝集性アシル化バイオコンジュゲートを含む組成物を提供する。一態様において、本組成物は、インスリン、インスリン類似体、および／またはＧＬＰ−１受容体アゴニスト類似体と、薬学的に許容される担体とをさらに含む。さらなる態様では、インスリンまたはインスリン類似体は、ＮＰＨ、レギュラーインスリン、グラルギン、デテミル、デグルデク、アスパルト、リスプロ、およびグルリジンからなる群から選択される。別のさらなる態様では、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト類似体は、セマグルチド、エキセナチド、リキシセナチド、リラグルチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドからなる群から選択される。別の態様では、本組成物は、抗炎症薬をさらに含む。
【００１０】
[011]一態様において、ヒトアミリンまたはアミリン類似体の非凝集性アシル化バイオコンジュゲートを含む組成物は、膵臓炎、高カルシウム血症、疼痛、骨粗鬆症、慢性炎症性疾患、セリアック病、乾癬、全身の臓器の機能障害または不全をもたらすアミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される疾患または状態、ならびに血圧の上昇から生じる障害および血管疾患の治療に使用される。
【００１１】
[012]さらなる態様では、全身の臓器の機能障害または不全をもたらすアミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される疾患または問題は、高血糖症、糖尿病、低グルコース耐性またはグルコース代謝不全、肥満、メタボリックシンドローム、中枢神経系関連または末梢関連の摂食障害、およびアルツハイマー病からなる群から選択される。
【００１２】
[013]さらなる態様では、血圧の上昇から生じる問題および血管疾患は、粥状動脈硬化、心筋梗塞、卒中、冠動脈心疾患、高血圧症、および心疾患からなる群から選択される。
【００１３】
[014]別の態様では、本開示は、ヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲートと、インスリンと、薬学的に許容される担体とを混合することを含む、ヒトアミリンまたはアミリン類似体の非凝集性アシル化バイオコンジュゲートを含む組成物を調製するための方法論を提供する。
【００１４】
[015]別の態様では、１つのアシル単位が配列番号１のリシン１残基に共有結合しているヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲートを治療有効量で含む医薬品が提供される。
【００１５】
[016]別の態様では、アミリンまたはアミロイドの沈着または蓄積の不足によって引き起こされる疾患または状態を治療するための方法論であって、それを必要とする患者に、組成物のインスリン、インスリン類似体、および／またはＧＬＰ−１受容体アゴニスト類似体と、薬学的に許容される担体とを投与することを含む方法論が、ここで提供される。一態様において、疾患は、糖尿病および／または肥満である。
【００１６】
[017]別の側面では、アミリンポリペプチド鎖のリシン１残基のアルファおよび／またはイプシロンアミン部分にアシル化剤を結合させることを含む、アミリンミメティック化合物を安定化させるための方法論が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】[018]図１は、ヒトアミリンとｍＰＥＧ  ５０００Ｄａの反応によって得られたモノＰＥＧ化アミリン（ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ）のクロマトグラムである。
【図２】[019]図２は、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋの特性評価を示す質量分析である。
【図３】[020]図３は、ヒトアミリンとｍＰＥＧ  ２００００Ｄａの反応によって得られたモノＰＥＧ化アミリン（ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋ）のクロマトグラムである。
【図４】[021]図４は、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋの特性評価を示す質量分析である。
【図５】[022]図５は、遊離型および精製型のモノＰＥＧ化ヒトアミリンに対するＲＡＭＰ２共受容体の結合相互作用に関するアッセイである。
【図６】図６は、遊離型および精製型のモノＰＥＧ化ヒトアミリンに対するＲＡＭＰ３共受容体の結合相互作用に関するアッセイである。
【図７】[023]図７Ａ〜Ｃは、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋのインビトロの生物学的活性を示す。
【図８】[024]図８は、アミロイド集合体に関するアッセイである。
【図９】[025]図９Ａ〜Ｃは、遊離アミリン（９Ａ−ｈＡｍｙ）およびモノＰＥＧ化ヒトアミリン（９Ｂ−ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ、９Ｃ−ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋ）の間のインビボの血漿安定性の比較である。
【図１０】[026]図１０Ａは、ヒトアミリンのアセチル化誘導体（ＡｃＯ−ｈＡｍｙ）の等電点電気泳動である。[027]図１０Ｂは、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋの等電点電気泳動である。
【図１１】[028]図１１は、ヒトアミリン（Ａ）またはｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋ（Ｂ）の集合速度に対する酸性または塩基性のｐＨの短期効果を示す。
【図１２】[029]図１２Ａは、ヒトアミリンの集合速度に対するｐＨの短期効果を示す。[030]図１２Ｂは、ＡｃＯ−ｈＡｍｙの集合速度に対するｐＨの短期効果を示す。
【図１３】[031]図１３は、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋの集合速度に対するｐＨの長期効果を示す。
【図１４】[032]図１４Ａ〜Ｄは、組換え型インスリンとのヒトアミリンまたはそのモノＰＥＧ化誘導体の短期安定性：ヒトアミリンおよびｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ（Ａ）、選択されたインスリン類似体（Ｂ）、ヒトアミリンとインスリン類似体の組み合わせ（Ｃ）、およびｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ（Ｄ）の集合動態を示す。
【図１５】[033]図１５Ａ〜Ｂは、ＴｈｔおよびＤＬＳによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびＧＬＰ−１類似体リラグルチドの組み合わせの短期安定性を示す。
【図１６】[034]図１６Ａ〜Ｂは、ＴｈｔおよびＤＬＳによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋおよびＧＬＰ−１類似体リラグルチドの組み合わせの短期安定性を示す。
【図１７】[035]図１７Ａ〜Ｂは、６か月にわたりＤＬＳによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびインスリン類似体の組み合わせの長期安定性を示す。
【図１８】[036]図１８Ａ〜Ｂは、６か月にわたりＴｈｔによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびインスリン類似体の組み合わせの長期安定性を示す。
【図１９】[037]図１９Ａ〜Ｃは、６か月にわたりＨＰＬＣによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびインスリングラルギンの組み合わせの長期安定性を示す。
【図２０】[038]図２０Ａ〜Ｃは、６か月にわたりＨＰＬＣによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびインスリンデテミルの組み合わせの長期安定性を示す。
【図２１】[039]図２１Ａ〜Ｃは、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋが健常なラットへの皮下投与後に食物摂取量および体重増加を低減させることを示す。
【図２２】[040]図２２Ａ〜Ｂは、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋおよびリラグルチドが健常なラットへの皮下共投与後に食物摂取量に対する相乗効果を有することを示す。
【図２３】[041]図２３Ａ〜Ｂは、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋが健常なラットへの皮下投与後に胃排出時間を低減させることを示す。
【図２４】[042]図２４Ａ〜Ｂは、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋが健常なラットへの皮下投与後に食後グルコースを低減させることを示す。
【詳細な説明】
【００１８】
[043]薬学的成分として構造未修飾のアミリンを使用することは、その固有の生理化学的性質、例えば、不十分な溶解性、低い血漿安定性、およびアミロイド線維を形成する傾向の理由で不可能である。以下に説明するように、本発明者らは、アミリンが薬学的成分として作用すること、ならびにアミリンを他の化合物、例えばインスリンとコンジュゲートすることを可能にする、方法、組成物などを開発した。
【００１９】
[044]本発明者らは、ヒトアミリンにアシル化剤をコンジュゲートさせると、中性ｐＨの溶液におけるアミリンペプチドの安定性が改善し、したがって、アミリンバイオコンジュゲートを他の化合物、例えばインスリンおよびＧＬＰ−１類似体と混合することが可能になるという、驚くべき発見をした。同時に、本発明者らは、アミリンペプチドの薬物動態学的な特徴を調節するためにアシル化剤を選択してもよいことを理解した。
【００２０】
[045]以下に説明するように、本発明者らは、ヒトアミリンの等電点（ｐＩ）を調節すると、アミリンペプチドが集合するｐＨ帯が結果的に変化し、それにより、アミリンを他の化合物、例えばインスリンおよびＧＬＰ−１類似体と組み合わせることが可能になると断定した。現在まで、アミリンまたはアミリン類似体を他の化合物と水溶液中で混合することは、ｐＩの不適合性のために不可能であった。例えば、ほとんどのインスリンベースの生成物およびＧＬＰ−１類似体は、生理的ｐＨに近い約ｐＨ７．２で配合されるが、ヒトアミリンおよびその類似体は、そのようなｐＨ範囲において完全に不安定である。ｐＨ４．０を有するインスリングラルギンでさえ、不適切な分子相互作用のために、アミリン類似体（すなわちプラムリンチド）と組み合わせるのに成功しなかった。例えば、米国出願公開第２００９−００１８０５３号を参照されたい。
【００２１】
[046]したがって、本開示は、ヒトアミリンまたはアミリン類似体およびアシル化剤のコンジュゲート、製造方法、ならびに、得られたバイオコンジュゲートを、アミリンオリゴマーおよびクラスターの形成に関連する毒性を誘発することなく、アミリンの生理的レベルの復元またはアミロイド集合体の細胞外形成の阻害のために使用することを考案する。
【００２２】
[047]一態様において、本開示は、ヒトアミリンまたは所定の範囲のアミリン類似体の、アシル化剤とのコンジュゲーションを提供する。
【００２３】
[048]別の態様では、本開示は、アミリンのバイオコンジュゲートの、インスリン、ＧＬＰ−１類似体、または他の化合物、例えば、限定されないが、抗糖尿病化合物および／または抗炎症性化合物との組み合わせ、それを調製する方法、ならびにその使用を提供する。いくつかの態様において、抗炎症性化合物は、ステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）から選択される。いくつかの態様において、ステロイドは、プレドニゾン、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾンから選択される。いくつかの態様において、ステロイドは、プレドニゾロン、プレドニゾン、メドロール、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、およびトリアムシノロンから選択されるコルチコステロイドである。いくつかの態様において、抗炎症性化合物は、デキサメタゾン、モメタゾン、およびトリアムシノロンから選択されるコルチコステロイドである。いくつかの態様において、ＮＳＡＩＤＳは、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、およびトルメチンから選択される。
【００２４】
[049]ここで使用される場合、アミリンとは、ＣＡＳ  ＲＮ：１０６６０２−６２−４で識別される膵島アミロイドポリペプチドを指す。アミリンは、膵臓のランゲルハンス島のベータ細胞によって産生される３７アミノ酸ポリペプチドホルモンである。別段の記載がない限り、アミリンは、天然または合成のアミリンを含め、ヒトアミリンを意味する。アミリンは、天然、合成、または生半合成の手段によって生成された、配列番号１または配列番号２のポリペプチドを包含する。
【００２５】
[050]アミリンミメティック化合物またはアミリノミメティックとは、天然起源のアミリンの機能を行うかまたはそれを模倣する薬物を指す。アミリンおよびアミリンミメティックは、天然の、合成的に、または生半合成的に生成された、ヒトアミリンと互換的に使用される。アミリンミメティックは、該アミリンミメティック化合物の活性誘導体、例えば塩、異性体、水和物、溶媒和化合物、プロドラッグ、代謝物、多形、および同配体を包含する。アミリンミメティック化合物の言及が、天然、合成、または生半合成の手段によって生成された、配列番号１または配列番号２のポリペプチドを包含することに留意することは重要である。プラムリンチドは、配列番号３に規定される配列を有する市販のアミリンミメティック化合物である。
【００２６】
[051]アシル化とは、任意のアシル剤の挿入によってアミン基の正電荷をクエンチするプロセスを指す。アシル化剤またはアシル剤は、有機無電荷ラジカル、例えばアセチル、ビオチン、ユビキチン、グリカン、脂肪酸鎖、および天然または合成のポリマーを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は例示的なアシル剤である。
【００２７】
[052]ここで使用される非凝集性とは、本発明のアミリンおよびアミリンミメティック化合物が、凝集、重合、または別様にクラスター化しないことを意味する。非凝集性アミリンとは、共有結合した少なくとも１つのアシル単位を有する本発明のアミリンを指す。
【００２８】
[053]バイオコンジュゲーションとは、少なくとも１つが生体分子である２つの分子間に安定な共有結合を形成する化学的方策である。バイオコンジュゲートは、これら２つの分子から形成された得られた生成物である。本開示全体を通じて、混合すること、結合すること、組み合わせること、カップリングすること、連結すること、コンジュゲートすることなどを含めたいくつかの用語が、バイオコンジュゲートの形成を指す。これらの用語は互換的に使用され、それぞれバイオコンジュゲーションを意味する。
【００２９】
[054]類似体（AnalogまたはAnalogue）とは、同様の物理的、化学的、生化学的、および／または薬理学的な性質を有する化合物を指す。類似体は、他の原子、基、または部分構造で置き換えられている、１個以上の原子、官能基、または部分構造において異なっていてもよい。この概念の下で、インスリンは、いくつかの類似体、例えばＮＰＨ、グラルギン、デテミル、アスパルト、リスプロ、グルリジン、またはデグルデクを有する。
【００３０】
[055]インスリンは、天然、合成、生半合成、または組換え型のインスリンを含むがこれらに限定されない、あらゆるタイプのインスリンを包含する。インスリンの非限定的な例としては、レギュラーインスリン、ＮＰＨ、グラルギン、デテミル、アスパルト、リスプロ、グルリジン、またはデグルデクが挙げられる。
【００３１】
[056]ここで使用される場合、アミリン分泌の不足もしくは妨害によって、または全身の臓器の機能障害もしくは不全をもたらすアミロイド沈着もしくは蓄積によって引き起こされる疾患または状態としては、高血糖症、糖尿病、低グルコース耐性またはグルコース代謝不全、肥満、メタボリックシンドローム、中枢神経系関連または末梢関連の摂食障害、およびアルツハイマー病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
[057]科学的および技術的な専門用語は、当該技術分野における通常かつ通例の意味を有する。薬学的調製などは、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に見出すことができる。特定の配合物、賦形剤などは、薬理学分野の慣行の範囲内で、所望の投与経路に応じて選択される。
Ａ．アミリンの修飾
[058]上記に説明したように、本発明者らは、アミリンまたはアミリンミメティックが薬学的成分として作用すること、ならびにアミリンを他の化合物、例えばアシル化剤および／またはインスリンおよびまたはＧＬＰ−１類似体と組み合わせることまたは混合することを可能にする、方法、組成物などを開発した。
【００３３】
[059]本発明者らは、ヒトアミリンにアシル化剤をコンジュゲートさせると、中性ｐＨの溶液におけるアミリンペプチドの安定性が改善し、したがって、アミリンバイオコンジュゲートを他の化合物、例えばインスリンおよびＧＬＰ−１類似体と混合することが可能になるという、驚くべき発見をした。同時に、本発明者らは、アミリンペプチドの薬物動態学的な特徴を調節するためにアシル化剤を選択してもよいことを理解した。
【００３４】
[060]この関連において、アミリンポリペプチド鎖のリシン１残基のアルファアミン部分にアシル化剤を結合させると、アミリンのｐＩの変化が達成された。Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ（１９９３）によると、ヒトアミリンのｐＩは、８．９のｐＩをもたらすように、その一次配列から容易に改変することができる。Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔら（１９９３）を参照されたい。固定化されたｐＨ勾配におけるポリペプチドの焦点位置は、それらのアミノ酸配列から予測することができる。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１４（１）、１０２３〜１０３１。
【００３５】
[061]ここで、本発明者らは、ｌｙｓ−１の該アルファアミンにおいてヒトアミリンとアシル化剤をカップリングすると、ｐＩが９．２に近い値まで上方にシフトすることを断定した。アシル化ヒトアミリンのｐＩは約８．９〜約９．２の範囲であり得、約９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、および９．９の値を有し得る。
【００３６】
[062]したがって、一態様において、本開示は、ヒトアミリンまたはアミリン類似体およびアシル化剤のコンジュゲーション、そのようなアミリンバイオコンジュゲートを製造するための方法論、ならびに得られた該バイオコンジュゲートの使用を考案する。一態様において、例証的なアミリンバイオコンジュゲートは、アミリンオリゴマーおよびクラスターの形成に関連する毒性を誘発することなく、アミリンの生理的レベルの復元またはアミロイド集合体の細胞外形成の阻害に役立つ。
Ｂ．非凝集性アミリン：アシル化剤とアミリンのコンジュゲーション
[063]一態様において、本開示は、ヒトアミリンまたは所定の範囲のアミリン類似体をアシル化剤とコンジュゲートし、それにより非凝集性アミリンを生成することを考案する。
【００３７】
[064]第１の側面において、本開示は、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１）を有するヒトアミリン、または配列ＫＣＸAA1ＸAA2ＸAA3ＸAA4ＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号２）を有するアミリンミメティック化合物と、アシル化剤との、新規の非凝集性バイオコンジュゲートを提供する。プラムリンチドは、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ−（ＮＨ2）（配列番号３）を有する、市販されている別のアミリンミメティック化合物である。
【００３８】
[065]該バイオコンジュゲートは、例えば、アミリンポリペプチド鎖のリシン１残基のアルファまたはイプシロンアミン部分（側鎖）に存在する窒素原子に共有結合した、少なくとも１つのポリエチレングリコール単位を含んでいてもよい（したがって、モノコンジュゲートまたはポリコンジュゲート化合物が得られてもよい）。さらに、当業者であれば、アミノ酸ＸAA1、ＸAA2、ＸAA3、および／またはＸAA4を他の無電荷または正電荷のアミノ酸で置き換え、Ｌｙｓ１アシル化のみを有するものよりも高いｐＩを有するアシル化アミリン類似体を達成することもできる。
Ｃ．アミリンミメティック化合物の安定化
[066]本開示は、アミリンポリペプチド鎖のリシン１残基のアルファおよび／またはイプシロンアミン部分（側鎖）にアシル化剤を結合させることを含む、アミリンミメティック化合物を安定化させるための方法論を提供する。
【００３９】
[067]一態様において、アミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートは、式Ｉ：
（Ｒ１−ＣＯＸ）ｍ−Ｒ２
［式中、
Ｒ１は、アシル化剤を表し、
Ｒ２は、アミリン（配列番号１）またはアミリンミメティック（配列番号２）の化合物を表し、
Ｘは、ＮＨ、ＣＯ、またはＯを表し、
ｍは、一級アミンまたはヒドロキシル官能性部分の反応によるアミドまたはエステル結合を介したアミリンミメティック化合物とアシル化剤のコンジュゲーションから得られたアミリンミメティック化合物（Ｒ２）にコンジュゲートされたアシル化剤（Ｒ１）の単位数を表す］
によって表される。アミリンミメティックは、３位、４位、５位、または６位のアミノ酸が正電荷または無電荷のアミノ酸によって置換されている類似体、
および式ＩＩの化合物、
（Ｒ１−Ｘ）ｍ−Ｒ２
［式中、
Ｒ１は、アシル化剤部分および様々な平均モル質量の官能性スペーサを表し、
Ｒ２は、アミリン（配列番号１）またはアミリンミメティック（配列番号２）の化合物を表し、
Ｘは、ＮＨ、ＣＯ、またはＯを表し、
ｍは、アミリンミメティック化合物とアシル化剤のコンジュゲーションから得られたアミリンミメティック化合物（Ｒ２）にコンジュゲートされたアシル化剤（Ｒ１）の単位数を表す］
を含む。
【００４０】
[068]当然ながら、本発明のバイオコンジュゲートアミリンミメティック化合物が、該アミリンミメティック化合物の活性誘導体、例えば塩、異性体、水和物、溶媒和化合物、プロドラッグ、代謝物、多形体、および同配体を包含することは理解される。
【００４１】
[069]アミリンミメティック化合物の言及が、天然、合成、または生半合成のいずれかの、配列番号１または配列番号２のポリペプチドを包含することに留意することは重要である。
【００４２】
[070]単独でまたは別の基の一部としてここで使用される「アルキル」という用語は、１〜３５個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の脂肪族炭化水素鎖を指す。アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ブチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基は、１つ以上の好適な置換基でさらに置換されていてもよい。
【００４３】
[071]単独でまたは別の基の一部としてここで使用される「アルケニル」という用語は、２〜３５個の炭素原子を有する、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、直鎖または分枝鎖の脂肪族炭化水素基を指す。アルケニルの例としては、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソ−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基は、１つ以上の好適な置換基でさらに置換されていてもよい。
【００４４】
[072]単独でまたは別の基の一部としてここで使用される「アルキニル」という用語は、２〜３５個の炭素原子を有する、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、直鎖または分枝鎖の脂肪族炭化水素基を指す。アルキニルの例としては、エチニル、プロピニル、およびブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル基は、１つ以上の好適な置換基でさらに置換されていてもよい。
【００４５】
[073]「シクロアルキル」という用語は、定義によって別様に制限される場合を除き、単一の環状環または複数の縮合環、例えば、縮合またはスピロ系を有する、３〜２０個の炭素原子からなる（constituting of）、環状アルキル基を指す。そのようなシクロアルキル基には、例として、単環構造、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチルなど、または複数環構造、例えば、アダマンチル、およびビシクロ［２．２．１］ヘプタン、またはアリール基、ヘテロアリール基、ヘテロシクリル基、もしくは別のシクロアルキル基、例えばインダンなどが縮合している環状アルキル基が含まれる。シクロアルキル基は、１つ以上の好適な置換基でさらに置換されていてもよい。
【００４６】
[074]「シクロアルケニル」という用語は、１つ以上の二重結合を任意に含んでいてもよい、上記に定義されたようなシクロアルキル基を指す。
【００４７】
[075]「シクロアルキニル」という用語は、１つ以上の三重結合を任意に含んでいてもよい、上記に定義されたようなシクロアルキル基を指す。
【００４８】
[076]「ヘテロシクリル」という用語は、別段の記載がない限り、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＰから独立して選択される１個以上のヘテロ原子を含み、５〜１５個の炭素原子を含んでなる、完全または部分的に不飽和の、非芳香族の単環式または多環式シクロアルキル基を指す。窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよい。窒素原子は、任意に四級化されていてもよい。ヘテロシクリル基は、任意の利用可能な位置において、１つ以上の好適な置換基でさらに置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例としては、モルホリニル、オキサゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロベンゾフリル、アザビシクロヘキシル、ジヒドロインドニル、ピペリジニルまたはピペラジニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
[077]ここでの「アリール」という用語は、１つ以上の好適な置換基で任意に置換されていてもよい、５〜１５個の炭素原子を含んでなるモノまたはポリ炭素環式の芳香族基、例えばフェニルまたはナフチル環などを指す。アリール基は、シクロアルキル基、ヘテロアリール基、ヘテロシクリル基、または別のアリール基と任意に縮合していてもよい。縮合基は、１つ以上の好適な置換基でさらに置換されていてもよい。
【００５０】
[078]「ヘテロアリール」という用語は、別段の記載がない限り、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＰから独立して選択される１個以上のヘテロ原子を含み、５〜１５個の炭素原子を含んでなる、芳香族の単環式または多環式の環構造を指す。窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよい。窒素原子は、任意に四級化されていてもよい。「ヘテロアリール」は、ヘテロアリール環が、アリール環、シクロアルキル環、シクロアルケニル環、ヘテロシクリル環、および別の単環式ヘテロアリール環から独立して選択される１つまたは２つの環に縮合している、二環式または三環式環も含むが、これらに限定されない。ヘテロアリール基の例としては、オキサゾリル、イミダゾリル、ピロリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、チエニル、イソオキサゾリル、トリアジニル、フラニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン、イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン、テトラヒドロキノリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基は、任意の利用可能な位置において、１つ以上の好適な置換基でさらに置換されていてもよい。
【００５１】
[079]「ＰＥＧ」という用語は、別段の記載がない限り、ポリエチレングリコールを指し、ここで使用される場合、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を意味する。ＰＥＧという用語は、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−の構造を含み、ここでｎは、２〜１０００、または２〜５００、または２〜２５０、または２〜１２５、または２〜５０、または２〜２５、または２〜１２の範囲の整数である。一般的に使用されるＰＥＧは、ＰＥＧ末端のうち一方の端部が、比較的不活性な基、例えばアルコキシでエンドキャップされており、他方の端部が、リンカー部分によってさらに修飾されていてもよいヒドロキシル基である、エンドキャップされたＰＥＧである。使用されることの多いキャッピング基はメトキシであり、対応するエンドキャップされたＰＥＧは、ｍＰＥＧと表されることが多い。よって、ｍＰＥＧは、ＣＨ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−であり、ここで、ｎは、ＰＥＧ部分全体について示される平均分子量を与えるのに十分な２〜約１０００の整数であり、例えば、ｍＰＥＧ  Ｍｗ２，０００については、ｎはおよそ４４±１０である。
【００５２】
[080]特定のＰＥＧ形態は、分枝、直鎖状、フォーク状、ダンベル型ＰＥＧなどであり、ＰＥＧ基は、いくつかの態様では約１．０５未満の低い多分散指数を有する多分散である。所与の分子量のＰＥＧ部分は、典型的には、ある範囲のエチレングリコール（またはエチレンオキシド）モノマーからなる。例えば、分子量２０００のＰＥＧ部分は、典型的には４４±１０個のモノマーからなり、平均は約４４個のモノマーである。平均分子量（およびモノマーの数）は、典型的にはいくらかのバッチ間の変動の影響を受ける。
【００５３】
[081]他の特定のＰＥＧ形態は、同様に分枝、直鎖状、フォーク状、またはダンベル形状であり得る単分散である。単分散であるということは、ＰＥＧポリマーの長さ（または分子量）が具体的に定義されており、様々な長さ（または分子量）の混合物ではないということを意味する。
【００５４】
[082]アルコキシという用語は「アルキル−Ｏ−」を含み、ここでアルキルは上記の定義の通りである。代表的な例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、１−プロポキシおよび２−プロポキシ）、ブトキシ（例えば、１−ブトキシ、２−ブトキシ、および２−メチル−２−プロポキシ）、ペントキシ（１−ペントキシおよび２−ペントキシ）、ヘキソキシ（１−ヘキソキシおよび３−ヘキソキシ）などである。
Ｄ．例証的なアミリンミメティック化合物
[083]例証的なアミリンミメティック化合物は、リシン１のアルファおよび／またはイプシロンアミノ酸の水素が、
−Ｃ（＝Ｙ）−Ｒ1、および
−Ｃ（＝Ｙ）−Ｒ2−ＰＥＧ
（式中、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
Ｒ1、Ｒ2、およびＰＥＧは、ここで定義されている）
から選択されるアシル部分Ｑで置き換えられた、配列番号１、配列番号２、または配列番号３を有するものから選択される。
【００５５】
[084]いくつかの態様において、ＹはＯである。いくつかの態様において、ＹはＳである。
【００５６】
[085]いくつかの態様において、アミリンミメティック化合物は、リシン１のアルファまたはイプシロンアミノ酸のいずれか（しかし両方ではない）の水素原子がアシル部分Ｑで置き換えられた、配列番号１、配列番号２、または配列番号３を有するものから選択される。いくつかの態様において、アミリンミメティック化合物は、リシン１のアルファとイプシロンアミノ酸の両方の水素原子がアシル部分Ｑで置き換えられた配列番号１、配列番号２、または配列番号３を有するものから選択される。
【００５７】
−Ｃ（＝Ｙ）−Ｒ1のタイプ
いくつかの態様において、Ｑは、アシル部分−Ｃ（＝Ｙ）−Ｒ1であり、
式中、
Ｒ1は、Ｃ1〜35アルキル、Ｃ2〜35アルケニル、Ｃ2〜35アルキニル、Ｃ3〜20シクロアルキル、Ｃ3〜20シクロアルケニル、Ｃ6〜20シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールを表し、これらはそれぞれ、任意の利用可能な位置において、Ｃ1〜12アルキル、Ｃ2〜12アルケニル、Ｃ2〜12アルキニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ3〜7シクロアルケニル、Ｃ6〜8シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、＝Ｏ、−ＣＮ、−ＣＯＣＮ、−Ｎ3、−ＮＯ2、−ＯＣＮ、−ＮＣＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯＮＨ2、−ＯＮＯ2、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨＯ、−ＣＨＳ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＳＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＮＨ2、−ＣＳＮＨＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−ＮＨ2、−ＮＨＣＯＮＨ2、−ＮＨＣＳＮＨ2、−Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2、−ＮＨＣＨＯ、−ＮＨＣＨＳ、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＳＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＨ（＝ＮＯＨ）、−ＣＨ（＝ＮＣＮ）、−ＣＯＲa、−ＣＳＲa、−ＣＯＯＲa、−ＣＳＯＲa、−ＣＯＳＲa、−ＣＯＮＲaＲb、−ＣＳＮＲaＲb、−ＣＯＣＯＲa、−ＣＯＮＲaＮＲbＲc、−ＣＳＮＲaＮＲbＲc、−ＣＳＮＲaＲb、−ＮＲaＲb、−ＮＲaＳＯ2Ｒb、−ＮＲaＣＯＮＲbＲc、−ＮＲaＣＳＮＲbＲc、−ＮＲa（Ｃ＝ＮＲb）ＮＲcＲd、−ＮＲaＮＲbＲc、−ＮＲaＣＯＲb、−ＮＲaＣＳＲb、−ＮＲaＣＯＯＲb、−ＮＲaＣＳＯＲb、＝ＮＯＲa、−ＯＲa、−ＯＣＯＲa、−ＯＣＯＯＲa、−ＯＣＯＮＲaＲb、−ＯＣＳＲa、−ＯＣＳＯＲa、−ＯＮＯ2、−ＯＣＳＮＲaＲb、−ＳＲa、−Ｓ（Ｏ）Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−ＳＯ2ＮＲaＲb、−ＣＲa（＝ＮＯＲb）、−ＣＲa（＝ＮＣＯＯＲb）、−ＣＲa（＝ＮＳＯＲb）、−ＣＲa（＝ＮＳＯ2Ｒb）、−Ｃ（＝ＮＲa）−ＮＲbＲc、−Ｃ（＝ＮＯＲa）−ＮＲbＲc、−ＣＲa（＝ＮＣＮ）、−ＮＣＲa、−Ｐ（Ｏ）ＲaＲb、−Ｐ（Ｏ）ＯＲaＯＲb、−Ｐ（Ｏ）ＲaＯＲb、−Ｐ（Ｏ）ＮＲaＯＲb、−Ｐ（Ｏ）ＮＲaＲb、−ＯＰ（Ｏ）ＲaＲb、−ＮＨＰ（Ｏ）ＲaＲbから独立して選択される１つ以上の置換基によって任意に置換されていてもよく、
Ｒa、Ｒb、Ｒc、およびＲdは、−Ｈ、Ｃ1〜12アルキル、Ｃ2〜12アルケニル、Ｃ2〜12アルキニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ3〜7シクロアルケニル、Ｃ6〜8シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、＝Ｏ、−ＣＮ、−ＣＯＣＮ、−Ｎ3、−ＮＯ2、−ＯＣＮ、−ＮＣＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−ＯＣＯＮＨ2、−ＯＮＯ2、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨＯ、−ＣＨＳ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＳＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＮＨ2、−ＣＳＮＨＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−ＮＨ2、−ＮＨＣＯＮＨ2、−ＮＨＣＳＮＨ2、−Ｎ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2、−ＮＨＣＨＯ、−ＮＨＣＨＳ、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＳＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＨ（＝ＮＯＨ）、−ＣＨ（＝ＮＣＮ）から独立して選択されるか、
あるいは、
ＲaおよびＲbは、一緒に結合して、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ3〜7シクロアルケニル、Ｃ6〜8シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールを形成するか、または、
ＲbおよびＲcは、一緒に結合して、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ3〜7シクロアルケニル、Ｃ6〜8シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールを形成するか、または、
ＲcおよびＲdは、一緒に結合して、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ3〜7シクロアルケニル、Ｃ6〜8シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールを形成する。
【００５８】
[086]いくつかの態様において、Ｒ1は、Ｃ10〜30アルキル、Ｃ10〜30アルケニル、Ｃ10〜30アルキニル、Ｃ5〜12シクロアルキル、Ｃ5〜12シクロアルケニル、Ｃ8〜16シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールを表し、これらはそれぞれ、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００５９】
[087]いくつかの態様において、Ｒ1は、Ｃ12〜18アルキル、Ｃ12〜18アルケニル、Ｃ12〜18アルキニル、Ｃ6〜10シクロアルキル、Ｃ6〜10シクロアルケニル、Ｃ10〜14シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールを表し、これらはそれぞれ、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６０】
[088]いくつかの態様において、Ｒ1は、任意の利用可能な位置において、上述のものから独立して選択された１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００６１】
[089]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1がＣ1〜6アルキルを表すアシル部分から選択され、上述のように任意に置換されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｑはアセチルであり、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６２】
[090]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1がＣ1〜35アルキル、Ｃ10〜30アルキル、およびＣ12〜18アルキルを表すアシル部分から選択され、上述のように任意に置換されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｑは、ラウリン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）10ＣＯ−）、ミリスチン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）12ＣＯ−）、パルミチン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯ−）、ステアリン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−）、およびアラキジン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）18ＣＯ−）のアシル部分から選択され、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６３】
[091]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1がＣ2〜35アルケニル、Ｃ10〜30アルケニル、およびＣ12〜18アルケニルを表すアシル部分から選択され、上述のように任意に置換されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｑは、パルミトレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ２）5ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯ−）、オレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯ−）、リノール酸（ＣＨ3（ＣＨ2）4ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯ−）、リノレン酸（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯ−）、およびアラキドン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）4（ＣＨ＝ＣＨＣＨ2）4（ＣＨ2）2ＣＯ−）のアシル部分から選択され、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６４】
[092]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1がＣ2〜35アルキニル、Ｃ10〜30アルキニル、およびＣ12〜18アルキニルを表すアシル部分から選択され、上述のように任意に置換されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1がエチニル、プロピニル、およびブチニルを表すアシル部分から選択され、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６５】
[093]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1がＣ3〜20シクロアルキル、Ｃ5〜12シクロアルキル、およびＣ6〜10シクロアルキルを表すアシル部分から選択され、上述のように任意に置換されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1が、単環構造、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチル；複数環構造、例えば、アダマンチルおよびビシクロ［２．２．１］ヘプタンを表すアシル部分から選択され、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６６】
[094]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1がＣ3〜20シクロアルケニル、Ｃ5〜12シクロアルケニル、およびＣ6〜10シクロアルケニルを表すアシル部分から選択され、上述のように任意に置換されていてもよい。いくつかの態様において、例えば、シクロアルケニルは、１つ、２つ、または３つの二重結合を有し、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６７】
[095]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1がＣ6〜20シクロアルキニル、Ｃ8〜16シクロアルキニル、およびＣ10〜14シクロアルキニルを表すアシル部分から選択され、上述のように任意に置換されていてもよい。いくつかの態様において、例えば、シクロアルキニルは、１つ、２つ、または３つの三重結合を有し、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６８】
[096]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＰから独立して選択される１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヘテロ原子を含み、５〜１５個の炭素原子または８〜１２個の炭素原子を含んでなるヘテロシクリルを表すアシル部分から選択され、ここで、窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよく、窒素原子は、任意に四級化されていてもよく、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1が、モルホリニル、オキサゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロベンゾフリル、アザビシクロヘキシル、ジヒドロインドニル、ピペリジニル、およびピペラジニルから選択されるヘテロシクリルを表すアシル部分から選択され、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００６９】
[097]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1が、５〜１５個の炭素原子または６〜１０個の炭素原子を含んでなるアリールを表すアシル部分から選択され、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1が、フェニルおよびナフチルから選択されるアリールを表すアシル部分から選択され、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００７０】
[098]いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＰから独立して選択される１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヘテロ原子を含み、５〜１５個の炭素原子または８〜１２個の炭素原子を含んでなるヘテロアリールを表すアシル部分から選択され、ここで、窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよく、窒素原子は、任意に四級化されていてもよく、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、Ｑは、Ｒ1が、オキサゾリル、イミダゾリル、ピロリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、チエニル、イソオキサゾリル、トリアジニル、フラニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン、イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン、およびテトラヒドロキノリンから選択されるヘテロアリールを表すアシル部分から選択され、アシル部分は、上述のように任意に置換されていてもよい。
【００７１】
[099]いくつかの態様において、Ｒ1は、任意の利用可能な位置において、ヘテロシクリルから独立して選択される１つ以上の置換基によって任意に置換されていてもよい。いくつかの態様において、ヘテロシクリルは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＰから独立して選択される１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヘテロ原子を含み、５〜１５個の炭素原子または８〜１２個の炭素原子からなり（constituted of）、ここで、窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよく、窒素原子は、任意に四級化されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、ヘテロシクリルは、モルホリニル、オキサゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロベンゾフリル、アザビシクロヘキシル、ジヒドロインドニル、ピペリジニルおよびピペラジニルから選択される。
【００７２】
[100]いくつかの態様において、Ｒ1は、任意の利用可能な位置において、アリールから独立して選択される１つ以上の置換基によって任意に置換されていてもよい。いくつかの態様において、アリールは、５〜１５個の炭素原子または６〜１０個の炭素原子を含んでなる。例えば、いくつかの態様において、アリールは、フェニルおよびナフチルから選択される。
【００７３】
[101]いくつかの態様において、Ｒ1は、任意の利用可能な位置において、ヘテロアリールから独立して選択される１つ以上の置換基によって任意に置換されていてもよい。いくつかの態様において、ヘテロアリールは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、またはＰから独立して選択される１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヘテロ原子を含み、５〜１５個の炭素原子または８〜１２個の炭素原子を含んでなり、ここで、窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよく、窒素原子は、任意に四級化されていてもよい。例えば、いくつかの態様において、ヘテロアリールは、オキサゾリル、イミダゾリル、ピロリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、チエニル、イソオキサゾリル、トリアジニル、フラニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン、イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン、およびテトラヒドロキノリンから選択される。
【００７４】
[102]いくつかの態様において、部分Ｑは、Ｒ1がアセチルを表すアシル部分、ビオチン（５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタン酸）のアシル部分から選択される。
【００７５】
[103]アミリンミメティック化合物は、いくつかの態様において、娘アミリン（配列番号１、配列番号２、または配列番号３）から調製される。Ｑ部分は、例えば、Ｑ部分のＯＳｕ活性化エステルとの求核置換（アシル化）によって、リシン１のアルファ−アミノ基および／またはイプシロン−アミノ基に結合していてもよいし、あるいは、Ｑ部分は、Ｑ−アルデヒド試薬および還元剤、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用した還元的アルキル化によって、リシン１のアルファ−アミノ基および／またはイプシロン−アミノ基に結合していてもよい。
Ｅ．インスリンまたは他のペプチドとアミリンのコンジュゲーション
[104]市販のアミリンミメティック化合物であるプラムリンチドが存在するが、これはインスリンと良好に配合されない（Ｗｅｙｅｒら、２００５）。例えば、米国特許第６，４１０，５１１号は、プラムリンチドと様々なインスリンとを投与直前に同じシリンジ内で混合する試みを開示しているが、配合物の短期安定性を注記している。米国公開特許出願第２０１０／０２２２２５１号は、長時間作用型インスリンおよびアミリンペプチド、特にプラムリンチドを同じ溶液中で会合させる方策を開示している。これらの共配合物は高い集合プロファイルを示し、インスリンおよびアミリン類似体を混合することが技術的に実行不可能であることを強調した。
【００７６】
[105]物理化学的な不適合性に加えて、臨床治験は、両化合物を一緒に投与すると薬物動態が減損するため、プラムリンチドをインスリンと組み合わせるべきではないことを明らかにした。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｏｈｒｍｓ／ｄｏｃｋｅｔｓ／ａｃ／０１／ｂｒｉｅｆｉｎｇ／３７６１ｂ１＿０５＿Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ｐｄｆにおいて入手可能な、Ｓｙｍｌｉｎ（Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ−ＩＩ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓを参照されたい。
【００７７】
[106]このように、アミリンのバイオコンジュゲートとインスリンまたは他の抗糖尿病薬（例えばＧＬＰ−１類似体）および／または抗炎症性化合物との組み合わせ、その調製方法、ならびにその使用の考案に成功したのは本発明者らである。
【００７８】
[107]したがって、本開示は、アミリンまたはアミリンミメティック化合物のバイオコンジュゲートとヒトインスリン類似体との新たな非凝集性の組み合わせに関し、該バイオコンジュゲートは、アミリンポリペプチド鎖のリシン１残基に共有結合した、アシル化剤、例えば（他のいずれのものを除外することなく）ポリエチレングリコール、アセチル、パルミトイル、ミリストイル、または他の合成ポリマーの少なくとも１つの分子を含み（したがって、モノコンジュゲートまたはポリコンジュゲート化合物が得られてもよい）、インスリン類似体は、例えば、レギュラーインスリン、ＮＰＨ、グラルギン、デテミル、アスパルト、リスプロ、グルリジン、またはデグルデクである。当然ながら、他のインスリン類似体を使用してもよい。
【００７９】
[108]別の態様では、新たなアミリンまたはアミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートは、少なくとも１種のグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニスト、例えばセマグルチド、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドと組み合わされる。当然ながら、他のＧＬＰ−１受容体アゴニストを使用してもよい。
【００８０】
[109]後述するように、本開示は、１型および２型真性糖尿病の治療のための、本発明のアミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートならびに該バイオコンジュゲートおよびインスリン類似体を含む組み合わせの使用に関する。
【００８１】
[110]本発明のアミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートならびに該バイオコンジュゲートおよびＧＬＰ−１受容体アゴニストを含む組み合わせは、肥満ならびにまたは１型および２型真性糖尿病の臨床療法において使用されてもよい。
Ｆ．組成物、医薬、および使用方法
[111]本発明のアミリンおよび／またはアミリンミメティック化合物のバイオコンジュゲートは、アミロイド線維の凝集／沈着に直接的または間接的に関する種々の状態の管理において、治療的または予防的な手法として使用されてもよい。例えば、決して限定するものではないが、膵臓炎、高カルシウム血症、疼痛、変形性関節症、骨粗鬆症、炎症、セリアック病、乾癬、全身の臓器の機能障害または不全、例えば高血糖症、糖尿病、低グルコース耐性またはグルコース代謝不全、肥満、メタボリックシンドローム、中枢神経系関連または末梢関連の摂食障害、およびアルツハイマー病、また間接的に、血圧の上昇から生じる問題および血管疾患、例えば粥状動脈硬化、心筋梗塞、卒中、冠動脈心疾患、高血圧症、一般的な心疾患をもたらす、アミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される疾患または問題である（例えば、Ｙｏｕｎｇ．Ａｍｙｌｉｎ：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｇｕｌｆ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５．、Ｚｈｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、ｖ．２０、ｎ．２、ｐ．２５２〜２６２、２０１５を参照されたい）。
【００８２】
[112]このように、本発明のアミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートおよびそれを含む組み合わせは、全身の臓器の機能障害または不全をもたらすアミリン分泌の不足または妨害、アミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される疾患の予防または治療において有用な、製品、医薬品、組成物、および会合物の調製のために使用されてもよい。
【００８３】
[113]例えば、決して限定するものではないが、ここで記載される本発明のバイオコンジュゲート、特にヒトアミリンのバイオコンジュゲートは、様々な利益、例えば以下の利益を示すことを可能にする。
【００８４】
[114]（１）アミリンおよびアミリノミメティック物質、例えばプラムリンチドと比較して増加した血漿中半減期による、血流中でのより長期の持続性。
【００８５】
[115]（２）天然アミリンの効果を模倣するためのより低い用量またはより少ない回数の注射。
【００８６】
[116]（３）基底および食後の血糖、食物摂取量、胃排出、ならびに体重増加の良好な制御。
【００８７】
[117]（４）ヒトアミリンよりも高い溶解性。
【００８８】
[118]（５）増加した安定性。
【００８９】
[119]このように、本発明のヒトアミリンのバイオコンジュゲートは、膵臓ベータ細胞における凝集（文献において重合としても言及されている）、沈着、およびフィブリル化を減少させるかまたは回避し、結果として、該膵臓ベータ細胞のアポトーシスまたは破壊が人体にもたらす有害作用を回避することにより、ヒトアミリンおよびアミリンミメティック化合物によってもたらされる典型的な毒性を回避することを目的とする。
【００９０】
[120]本開示は、治療有効量の本発明のアミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートのうちの１種以上と、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、あらゆる種類の投与形態、例えば、限定されないが、経口、経腸、非経口、経舌、舌下、経鼻、皮膚、上皮、経皮、粘膜、経腟、直腸、眼などに適当である。
【００９１】
[121]さらに別の側面では、本開示は、治療有効量の本発明のアミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートのうちの１種以上と、１種以上の薬学的に許容される賦形剤と、治療有効量の１種以上のインスリンとの組み合わせを含む、低毒性薬学的組成物を考案する。そのような組成物は、あらゆる種類の投与形態、例えば、限定されないが、経口、経腸、非経口、経舌、舌下、経鼻、皮膚、上皮、経皮、粘膜、経腟、直腸、眼などに適当である。
【００９２】
[122]該組成物を調製するための方法論も考案される。特に、本発明の組成物は、任意の必要または適当な剤形、例えば溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、フォーム、ペースト、クリーム、錠剤、カプセル剤（硬式または軟式、坐薬）、ボーラス、ゲル、粉末、エアロゾル、スプレーなどで供給される。
【００９３】
[123]本発明の組成物中に用いられる薬学的に許容される賦形剤は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されているものなどが、当業者に知られている。知られているように、具体的な賦形剤は、薬理学分野の慣行の範囲内で、所望の投与経路に応じて選択される。
【００９４】
[124]本発明の薬学的組成物は、ヒトアミリンとは明確に異なる１種以上の活性成分、例えば、限定されないが、インスリン類似体、イオン（例えば亜鉛およびナトリウム）、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、抗糖尿病薬、抗生物質、抗炎症薬、降圧薬、抗レトロウイルス薬などをさらに含んでいてもよい。そのような組成物は、新たなヒトアミリンのバイオコンジュゲートの投与が他の活性成分と同時または順次である可能性も含め、即時放出性、遅延放出性、または徐放性であってもよい。
【００９５】
[125]さらに別の側面は、全身の臓器の機能障害または不全をもたらすアミリン分泌の不足または妨害、アミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される疾患の予防または治療における、ヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲートのアジュバントとしての使用に関する。
【００９６】
[126]さらに別の側面は、１種以上のヒトアミリンのバイオコンジュゲートを治療有効量で含むという事実を特徴とする医薬品に関する。
【００９７】
[127]さらに別の側面は、内科的療法に使用されることを特徴とする、ヒトアミリンのバイオコンジュゲート、ならびにそれらを含む製品、医薬品、組成物、および会合物に関する。
【００９８】
[128]さらに別の側面は、アミリンミメティック化合物、特にヒトアミリンの、１種以上のバイオコンジュゲートを治療有効量で患者に投与することを含むことを特徴とする、アミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される疾患の治療または予防の方法に関する。
【００９９】
[129]別の側面では、本開示は、１型および２型真性糖尿病の治療のための、本発明のアミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートならびに該バイオコンジュゲートおよびインスリン類似体を含む組み合わせの使用に関する。糖尿病の言及は、アミロイド線維の凝集／沈着に直接的または間接的に関連する他の疾患および機能障害も包含する。
【０１００】
[130]別の側面では、本開示は、肥満の臨床療法における、本発明のアミリンミメティック化合物の非凝集性バイオコンジュゲートならびに該バイオコンジュゲートおよびＧＬＰ−１受容体アゴニストを含む組み合わせの使用に関する。
【０１０１】
［実施例］
[131]以下の例は、特定の態様に関するものであり、本開示の範囲または趣旨をいかようにも限定するものではない。当業者であれば、本開示および例を使用して、明示的に記載されてはいないが同一または同様の機能を行って同一または同様の結果を達成し、したがって本開示の範囲および趣旨に包含される、均等な態様をもたらすことができる。
【０１０２】
例１：様々なアシル化コンジュゲートの調製
[132]１０ｍＭのＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液）（ｐＨ７．４）の存在下での、５ｍｇ／ｍＬのヒトアミリン溶液と、ヒトアミリン１に対して５モル過剰量のｍＰＥＧ  ５０００Ｄａまたは２００００Ｄａとの、２５℃における２時間の反応。
【０１０３】
[133]この反応を等量の３０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（水溶液）の添加によりクエンチし、次いで、Ｃ１８  Ｋｒｏｍａｓｉｌ逆相カラムで４ｍＬ／分にて、２２０ｎｍに設定した検出器でクロマトグラフを行う。（Ｋｒｏｍａｓｉｌは、スウェーデンのＡｋｚｏＮｏｂｅｌ社の一部門であるＳｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓグループによって商業化された製品ラインである）。ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋおよびｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋのクロマトグラムは、それぞれ図１および図３に示されている。ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋのクロマトグラムは、１２分におけるモノＰＥＧ化アミリンのピークを示す。一方、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋのピークは約１３分である。
【０１０４】
[134]マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を行って、モノＰＥＧ化ヒトアミリンを特性評価した。図２は、９ＫＤａにおけるｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋのピークを示し、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋのｍ／ｚ比は、図４に示されている。
【０１０５】
例２：ヒトアミリンおよびモノＰＥＧ化ヒトアミリンの受容体結合アッセイ
[135]精製したモノＰＥＧ化ヒトアミリンを、ＲＡＭＰ２およびＲＡＭＰ３共受容体の結合相互作用についてアッセイした。
【０１０６】
[136]ＲＡＭＰ（受容体活性修飾タンパク質）をＰＢＳ（ウシ胎仔血清）ｐＨ７．４において４℃で１時間にわたりフルオレセインイソチオシアネートで標識し、同じ緩衝液を使用したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｇ２５（米国企業ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより提供されているアガロースベースのクロマトグラフィー媒体）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。Ａ２８０およびＡ４９０におけるＵＶ吸光度測定によって標識を確認し、約０．５個のフルオレセイン／ＲＡＭＰ分子に依拠したカップリング効率の推定を可能にした。ＲＡＭＰ−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）の蛍光異方性を、遊離マウスアミリン、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋの関数として測定することにより、また、非特異的結合のための対照として無関係のタンパク質であるニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）を使用することにより、結合を行った。
【０１０７】
[137]図５および６によると、結合アッセイは、遊離型と精製型の両方のｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋで同様な共受容体ＲＡＭＰ２およびＲＡＭＰ３に対する見かけの結合親和性を、二連アッセイ（モノＰＥＧ化ヒトアミリンＣ＃１およびＣ＃２、ならびに遊離アミリン＃１および＃２）において示し、ＰＥＧ部分が共受容体親和性に干渉しないことを示している。ＨＥＷＬを使用した対照アッセイは、いずれの共受容体に対しても非特異的な結合を示す。
【０１０８】
例３：ヒトアミリンおよびモノＰＥＧ化ヒトアミリンの生物学的活性アッセイ
[138]ヒトアミリン受容体を自然に発現するＭＣＦ−７細胞を使用した環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）産生アッセイによって、ヒトアミリンおよびそのＰＥＧ化類似体の生物学的活性を判定した。このアッセイは、９６ウェルの半面積プレートにおいて、２０μｌ／ウェルの全反応体積で行った。簡潔に述べると、１ウェル当たり４０００個の細胞（解凍したて）を、アミリン（参照化合物）、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋ、または対照（無処置）の存在下にて、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１％のＢＳＡ、および５００μＭのＩＢＭＸ（ホスホジエステラーゼ阻害剤）を補充したＨＢＳＳの懸濁液中で、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。
【０１０９】
[139]インキュベーション後、細胞を溶解させ、蛍光アクセプター（Ｄ２標識ｃＡＭＰ）およびドナー（ユーロピウムクリプテートで標識した抗ｃＡＭＰ抗体）を添加した。アミリンまたはクライアント化合物での刺激後に細胞によって産生されたｃＡＭＰは、標識ｃＡＭＰと競合し、したがって、それぞれ、標識ｃＡＭＰおよび抗体上のＤ２とクリプテートとの間のＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を減少させた。室温で６０分間のインキュベーションの後、蛍光を測定し（３３７ｎｍにおける励起、６２０対６６５ｎｍにおける発光）、６６５ｎｍにおけるシグナルを６２０ｎｍにおけるシグナルで除すことにより、ｃＡＭＰ濃度を判定した。結果は、ヒトアミリンの最大効果に対する対照応答のパーセントとして表した。標準参照のアゴニストはヒトアミリンであり、これを各実験においていくつかの濃度で試験して濃度応答曲線を生成し、この濃度応答曲線からそのＥＣ５０値を計算した。
【０１１０】
[140]図７は、アミリン（ＥＣ５０＝４１ｎＭ、図７Ａ）またはそのＰＥＧ化誘導体のｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ（ＥＣ５０＝１３０ｎＭ、図７Ｂ）のいずれかおよびｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋ（ＥＣ５０＝４．９μＭ、図７Ｃ）がｃＡＭＰ産生を著しく増加させることを示し、アミリン類似体の生物学的活性プロファイルを裏付けている。
【０１１１】
例４：ヒトアミリンの集合プロファイルに対するＰＥＧ化の効果
[141]例１の精製したモノＰＥＧ化ヒトアミリンをＤＭＳＯに再懸濁させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈し、３７℃でインキュベートした。アミロイド発色プローブであるチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を使用することにより、アミロイド集合体に関して試料を評価した。アミロイドフィブリル形成を測定するためのＴｈＴ結合プロトコルの利用は、当該技術分野において既に確立されている（例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，１９９９を参照されたい）。アミリン（５０μＭの遊離型またはｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋ）の集合の動態解析は、１０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４）中のタンパク質を２５℃でインキュベートすることによって行った。集合の後に、４０μＬのＴｈＴ  １００μＭを含む１６０μＬの試料を添加し、４５０ｎｍで励起させ、４８２ｎｍで発光を２４時間測定することによって蛍光を監視することにより、アミロイドフィブリルへのチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の結合を行った。
【０１１２】
[142]図８はその結果を示す。遊離ヒトアミリンは極めて速く集合する。３日間で、ほとんど全ての遊離ヒトアミリンがアミロイド形態で集合した。ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋは、７日目において依然として集合の徴候を示していない。このアッセイは、ＰＥＧ化プロセスがヒトアミリンの凝集を阻害することができたことを証明する。
【０１１３】
例５：ＰＥＧ化ヒトアミリン生成物の薬物動態
[143]ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋおよびｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋの薬物動態を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雄ラットにおいてインビボで特性評価した。１２時間の明暗サイクルの温度制御室に動物を収容した。水および食物は不断で与えた。対照（遊離ヒトアミリン、非ＰＥＧ化）、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋ、およびｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋの３つの群を作った。動物には、遊離ヒトアミリンまたは精製したモノＰＥＧ化ヒトアミリン誘導体のいずれかのヒトアミリンペプチドを１００μｇ含む生理食塩水５００μＬを与えた。ラット（各時間間隔につきｎ＝３のラット）の後眼窩から血液を収集し、血漿を製造元（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＺＨＡ−５２Ｋ）によって提供されたヒトアミリンに関するＥＬＩＳＡアッセイに供した。
【０１１４】
[144]図９Ａは、遊離アミリンの急速な血漿中での崩壊を示し、一方で、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋ（図９Ｂ）およびｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋ（図９Ｃ）は、血漿中でのより長い安定性の持続期間を示す。このアッセイは、ヒトアミリンのＰＥＧ化のプロセスに、その半減期を調節する能力があることを証明する。
【０１１５】
例６：ヒトアミリンのｐＩに対する様々なアシル化剤の効果
[145]６０マイクログラムのアセチル化ヒトアミリン（ＡｃＯ−ｈＡｍｙ）またはｈＡｍｙＰＥＧ５ｋを、８Ｍの尿素、２％のＣＨＡＰＳ、および０．００２％のブロモフェノールブルー緩衝液に溶解させ、１２５μＬの最終体積にした。等電点電気泳動（ＩＥＦ）の前に、７ｃｍのｐＨ３−１０線形固定化ｐＨ勾配ストリップに試料を含ませ、一晩インキュベートした。ＩＥＦは、２００Ｖ（１分）、３５００Ｖ（９０分）および３５００Ｖ（６０分）へのランピングの条件に従い、ＭｕｌｔｉＰｈｏｒ  ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のデバイスで２０℃にて行った。最後に、０．２０％のグルタルアルデヒド（３０％エタノール、０．２Ｍ酢酸ナトリウム中）でストリップを室温にて６０分間固定し、次いで、ペプチドの特定のためにクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（４０％メタノール、７％酢酸中で０．０２５％）によって３０分間染色した。バックグラウンドが視覚化されなくなるまで、過剰量のクーマシーを０．１％酢酸とのインキュベーションによって除去した。ＩＥＦは、ストリップにおける変位とｐＨとの間の関係から容易に計算することができる。図１０に示されるように、ＡｃＯ−ｈＡｍｙに存在する（図１０Ａ）Ｌｙｓ１のアセチル化およびｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋに存在する同じ部位でのＰＥＧ化（図１０Ｂ）は、ヒトアミリンのｐＩをおよそ９．２に増加させる同様の効果をもたらす。
【０１１６】
例７：時間およびｐＨ依存性の設定におけるヒトアミリンの集合プロファイルに対する様々なアシル化剤の効果
[146]第１の設定では、遊離ヒトアミリン、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ、およびＡｃＯ−ｈＡｍｙを、ＴｈＴの存在下で様々なｐＨ（３．０〜１０．０）の水性緩衝溶液中でインキュベートした。アミロイド線維へのＴｈＴ結合から誘導された蛍光発光を２５℃で２４時間監視した。遊離ヒトアミリンの集合動態は、当該技術分野において入手可能な知識と同様であった（図１１Ａ〜Ｂおよび１２Ａ）。しかしながら、ヒトアミリンのＰＥＧ化とアセチル化誘導体の両方が、水溶液中での安定性の改善およびアミロイド線維形成の低下または非存在のパターンを示した（それぞれ、図１１Ｃ〜Ｄおよび１２Ｂ）。これらの所見は、ヒトアミリンのアシル化誘導体が、水溶液中、特に生理的ｐＨ範囲内で、上昇した安定性を有するという仮説を支持する。
【０１１７】
[147]別の実験設定では、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋの安定性に対するｐＨの影響も、より長い期間（最長１６日間）およびより高いエネルギー環境（３７℃）で試験した。図１３は、２５℃で７日、その後３７℃でもう９日（すなわち、合計１６日）の後の、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋに対するｐＨ効果の結果を示す。このアッセイは、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋが、様々なｐＨで数日おいた後に、高温に供された場合でも集合していない状態を保つ証拠を提供する。
【０１１８】
例８：ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋおよびインスリン類似体を組み合わせた際の短期安定性
[148]インスリンＲ、インスリンデテミル、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、またはＧＬＰ−１類似体リラグルチドと組み合わせた際の、ヒトアミリンまたはそのＰＥＧ化誘導体（ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋまたはｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋ）の集合速度を、ＴｈＴ結合アッセイによって試験した。これらの組み合わせ（１０μＭの各化合物）を、１０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４）と共に、また１０μＭのＴｈＴの存在下において、２５℃で２４時間インキュベートした。４５０ｎｍで励起させ、４８２ｎｍで発光を測定することにより、アミロイド線維の形成を示す蛍光の変動を監視した。
【０１１９】
[149]図１４Ａは、ｈＡｍｙは集合するが、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋは集合しないことを示す。
【０１２０】
[150]図１４Ｂは、インスリンＲ、グラルギン、およびデテミルが、無視できる集合性を有することを示す。
【０１２１】
[151]図１４Ｃは、インスリンと組み合わせたヒトアミリンが集合することを示すが、図１４Ｄは、インスリンと組み合わせたｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋが集合しないことを示す。
【０１２２】
[152]図１５は、リラグルチド溶液に添加されたヒトアミリンはアミロイド集合を誘発するが、リラグルチドと共にｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋを含む溶液は、アミロイド集合の痕跡を明らかに有さなかったことを示す。
【０１２３】
[153]図１６は、リラグルチド溶液に添加されたヒトアミリンはアミロイド集合を誘発するが、リラグルチドと共にｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋを含む溶液は、アミロイド集合の痕跡を明らかに有さなかったことを示す。
【０１２４】
[154]加えて、このアッセイは、様々なインスリン類似体またはＧＬＰ−１類似体とｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋの組み合わせが２４時間にわたって安定状態を保つことを証明する。
【０１２５】
例９：モノＰＥＧ−ｈＡｍｙ５ｋおよびインスリン類似体を組み合わせた際の長期安定性
[155]これらの実験設定では、選択した各インスリンベースの製品（グラルギンおよびデテミル）の元の配合物に、ＰＥＧ化ヒトアミリン（０．２ｍｇ／ｍＬまたは１．０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、インスリンレギュラービヒクルにおける主要な干渉を回避した。これらの組み合わせは無菌環境下で操作し、６か月間にわたって冷蔵条件下（４℃）に保った。ＴｈＴ−結合アッセイ、動的光散乱、および透過型電子顕微鏡法により、溶液の安定性を測定した。活性構成成分の完全性を確認するために、高性能液体クロマトグラフィーによる試料の分析も行った。
【０１２６】
[156]図１７は、動的光散乱によるｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋおよびインスリン（グラルギンおよびデテミル）の長期安定性の結果を示す。このアッセイは、この組み合わせが６か月にわたって安定状態を保つことを証明する。
【０１２７】
[157]図１８は、チオフラビンＴ結合によるｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋおよびインスリン（グラルギンおよびデテミル）の長期安定性の結果を示す。このアッセイは、この組み合わせが６か月間に集合しないことを示し、したがって、この組み合わせが６か月にわたって安定状態を保つことを証明する。
【０１２８】
[158]図１９は、ＨＰＬＣによるｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋおよびインスリン（グラルギン）の長期安定性の結果を示す。このアッセイは、インスリンが６か月にわたって安定状態を保つことを示す。
【０１２９】
[159]図２０は、ＨＰＬＣによるｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋおよびインスリン（デテミル）の長期安定性の結果を示す。このアッセイは、インスリンが６か月にわたって安定状態を保つことを示す。
【０１３０】
例９．１：ＴｈＴ結合アッセイ
[160]インスリンレベミルまたはインスリングラルギンと組み合わせた際のヒトアミリンまたはそのＰＥＧ化誘導体の集合速度も、４℃におけるインキュベーション後の第０週、第１週、第２週、第３週、第４週、第８週、第１２週、および第２４週に試験した。これらの組み合わせを、１０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４）と共に、また１０μＭのＴｈＴの存在下において、２５℃で２４時間インキュベートした。４５０ｎｍで励起させ、４８２ｎｍで発光を測定することにより、アミロイド線維の形成を示す蛍光の変動を監視した。
【０１３１】
例９．２：動的光散乱分析
[161]単独のまたは混合した、ヒトインスリングラルギン（９０Ｕ／ｍＬ）およびｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ（０．２乃至１．０ｍｇ／ｍＬの濃度）の粒径分布を、ＤｙｎａＰｒｏ  ＮａｎｏＳｔａｒ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）での動的光散乱によって評価した。６５８ｎｍのレーザー波長を使用して、９０°の固定角で後方散乱光を検出した。セルホルダーは、実験全体を通して２５℃に維持した。データは、０、１、２、３、４、８、１２、および２４週間のインキュベーション後に収集した。最終的なデータは、３つの独立した測定値の平均からなった。粒径は、製造元のソフトウェアによって計算した。
【０１３２】
例９．３：高性能液体クロマトグラフィー
[162]組み合わせたインスリングラルギンおよびｈＡｍｙＰＥＧ５ｋの遊離画分を、Ｊａｓｃｏ  ＬＣ−２０００  ＨＰＬＣ（Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）において、４ｍＬ／分の流量でＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃ１８カラム（ＯＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ、２５０×４．６ｍｍ、ＳＮ  ０５９３２８６Ｍロット９４１８、粒径５ｕｍ）を使用した、Ｃ１８逆相高性能液体クロマトグラフィー（Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって評価した。４℃における０、３、および６か月のインキュベーション後に試料を分析した。各試料およそ２０ｕＬを、２０ｕＬのステンレス鋼注入管ループでの注入の前に、５０％  Ｈ2Ｏ、５０％  ＣＨ3ＣＮ、０．１％  ＴＦＡ溶液８０ｕＬと混合した。精製勾配は次のように行った。０．１％のＴＦＡを含む５０％ＣＨ3ＣＮ水溶液の５分間の均一濃度流、０．１％のＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ水溶液の５０％から８０％に漸増する１５分間の線形勾配、続いて１００％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡの１０分間の均一濃度流。２２０ｎｍにおける吸光度を追跡することによって試料溶出を監視した。遊離画分の量を曲線下面積によって計算した。出発濃度から最終的なペプチド不含の量を減じることにより、集合体を推定した。
【０１３３】
例１０：健常なラットの食物摂取量（ＦＩ：food intake）に対するＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ｋの効果
[163]このアッセイは、Ｈａｎｓｅｎら（２０１４）によって説明されているように行った。簡潔に述べると、処置前のＦＩおよび体重によってランダム化した健常なラットを、ＭＡＮＩ−ｆｅｅｄｗｉｎシステムの（ＦＩ、水摂取量、および自発運動活性を考慮した）登録のために移動させ、１週間にわたって順化させた。次いで、これらの動物に、ビヒクル、ＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ｋ（１．０ｍｇ／Ｋｇ、２．０ｍｇ／Ｋｇ、または４．０ｍｇ／Ｋｇ）、または陽性対照（リラグルチド０．２ｍｇ／Ｋｇ）を研究開始の３０分前に皮下投与した。その後、食物および水の摂取量、体重、ならびに自発運動活性を最長１２０時間にわたって監視および記録した。その結果が図２１に示されている。
【０１３４】
[164]予想通り、陽性対照は処置直後にＦＩを著しく低減させ、最長４８時間にわたって持続した。同じ時間枠において、ＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ｋ（１〜４ｍｇ／Ｋｇ）は、累積的（図２１Ａ）と全ＦＩ（図２１Ｂ）の両方を、無処置の対照ラットと比較して最大３８％（ｐ＜０，０５）用量依存的に低減させた。ＦＩの減少に従い、ＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ｋは、体重増加率も用量依存的様式で低下させた。図２１Ｃは、４ｍｇ／Ｋｇで投与した動物は５日間にわたって顕著な陽性効果を経験したが、２ｍｇ／Ｋｇで処置したものは試験開始後２４時間以内のみにおいて体重増加が有意に低かったことを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊または＋＋＋ｐ＜０．００１、全ての事例においてビヒクルとの比較）。
【０１３５】
[165]別の設定では、健常なラットをビヒクルおよび低用量のＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ｋ（１．０ｍｇ／ｋｇ）リラグルチド（０．１ｍｇ／ｋｇ）で別々または同時に処置し、ＦＩを２４時間にわたって監視した。ここでも、処置と陽性対照の両方が、投薬後２４時間にわたって累積的（図２２Ａ）および全食物摂取量（図２２Ｂ）を明らかに低減させた。さらに、共処置は、健常なラットの食物摂取量に対する著しい相加効果を明らかにした（＊＊＊はビヒクル／ビヒクルと比較してｐ＜０．００１、＃＃＃はリラグルチド０．１ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．００１、＄＄＄はＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ｋと比較してｐ＜０．００１）。
【０１３６】
[166]この実験は、ＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ＫがＦＩに対するヒトアミリンの効果をインビボで維持することを実証し、したがって、糖尿病および／または肥満を治療するためのその適用を支持する。さらに、低用量のＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０Ｋおよびリラグルチドの共処置は、組み合わせの薬理学的利点を強調する顕著な相乗作用をもたらした。
【０１３７】
例１１：健常なラットの胃排出時間に対するＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ｋの効果
[167]このアッセイは、Ｄａｌｂｏｇｅら（２０１５）によって説明されているように行った。簡潔に述べると、８週齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雄ラット３０匹を５日間にわたって順化させた。半絶食したラットに、ビヒクル、ＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ｋ（０．５ｍｇ／Ｋｇ、１．０ｍｇ／Ｋｇ、２．０ｍｇ／Ｋｇ、または４．０ｍｇ／Ｋｇ）、または陽性対照（リラグルチド０．２ｍｇ／Ｋｇ）を研究開始の６０分前に皮下投与した。アセトアミノフェンおよびグルコースを含む溶液の経口投与により、胃排出およびグルコース恒常性を評価した。血漿中の血糖とアセトアミノフェン両方の出現を、−６０分および０分（グルコースのみ）、ならびに１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、および１８０分（グルコースおよびアセトアミノフェン）で収集した血液試料から測定した。その結果が図２４に示されている。
【０１３８】
[168]図２３ＡおよびＢに示されるように、アセトアミノフェンの経口吸収という点から測定した胃排出は、ＧＬＰ−１類似体リラグルチドによってかなり低減されている。さらに、ｈＡｍｙ−ＰＥＧ２０ｋは、血漿中のアセトアミノフェンの出現の量（全ての用量において）と速度（１〜４ｍｇ／Ｋｇにおいて）の両方を著しく低減させた（＊、＋、＄、＃、＾はビヒクルと比較してｐ＜０．０５、＊＊＊はビヒクルと比較してｐ＜０．００１）。さらに、図２４（ＡおよびＢ）は、試験化合物は経口グルコース投与後に血糖に対して有意だが軽度の干渉を有したが、陽性対照はより明白な効果を有したことを示す（＊、＋、＄、＃、＾はビヒクルと比較してｐ＜０．０５、＊＊はビヒクルと比較してｐ＜０．０１）。
【０１３９】
[169]この実験は、ＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ＫがＧＥに対するヒトアミリンの効果をインビボで維持することを実証し、したがって、糖尿病および／または肥満関連障害を治療するためのその適用を支持する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ）】
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【図１０Ｂ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2019501963.tif 000020
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月17日(2018.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】[018]図１は、ヒトアミリンとｍＰＥＧ  ５０００Ｄａの反応によって得られたモノＰＥＧ化アミリン（ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ）のクロマトグラムである。
【図２】[019]図２は、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋの特性評価を示す質量分析である。
【図３】[020]図３は、ヒトアミリンとｍＰＥＧ  ２００００Ｄａの反応によって得られたモノＰＥＧ化アミリン（ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋ）のクロマトグラムである。
【図４】[021]図４は、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋの特性評価を示す質量分析である。
【図５】[022]図５は、遊離型および精製型のモノＰＥＧ化ヒトアミリンに対するＲＡＭＰ２共受容体の結合相互作用に関するアッセイである。
【図６】図６は、遊離型および精製型のモノＰＥＧ化ヒトアミリンに対するＲＡＭＰ３共受容体の結合相互作用に関するアッセイである。
【図７】[023]図７Ａ〜Ｃは、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋのインビトロの生物学的活性を示す。
【図８】[024]図８は、アミロイド集合体に関するアッセイである。
【図９】[025]図９Ａ〜Ｃは、遊離アミリン（９Ａ−ｈＡｍｙ）およびモノＰＥＧ化ヒトアミリン（９Ｂ−ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ、９Ｃ−ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋ）の間のインビボの血漿安定性の比較である。
【図１０】[026]図１０Ａは、ヒトアミリンのアセチル化誘導体（ＡｃＯ−ｈＡｍｙ）の等電点電気泳動である。[027]図１０Ｂは、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋの等電点電気泳動である。
【図１１】[028]図１１は、ヒトアミリン（Ａ）またはｈＡｍｙ−ＰＥＧ５ｋ（Ｂ）の集合速度に対する酸性または塩基性のｐＨの短期効果を示す。
【図１２】[029]図１２Ａは、ヒトアミリンの集合速度に対するｐＨの短期効果を示す。[030]図１２Ｂは、ＡｃＯ−ｈＡｍｙの集合速度に対するｐＨの短期効果を示す。
【図１３】[031]図１３は、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋの集合速度に対するｐＨの長期効果を示す。
【図１４】[032]図１４Ａ〜Ｄは、組換え型インスリンとのヒトアミリンまたはそのモノＰＥＧ化誘導体の短期安定性：ヒトアミリンおよびｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ（Ａ）、選択されたインスリン類似体（Ｂ）、ヒトアミリンとインスリン類似体の組み合わせ（Ｃ）、およびｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ（Ｄ）の集合動態を示す。
【図１５】[033]図１５は、ＴｈｔおよびＤＬＳによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびＧＬＰ−１類似体リラグルチドの組み合わせの短期安定性を示す。
【図１６】[034]図１６は、ＴｈｔおよびＤＬＳによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋおよびＧＬＰ−１類似体リラグルチドの組み合わせの短期安定性を示す。
【図１７】[035]図１７Ａ〜Ｂは、６か月にわたりＤＬＳによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびインスリン類似体の組み合わせの長期安定性を示す。
【図１８】[036]図１８Ａ〜Ｂは、６か月にわたりＴｈｔによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびインスリン類似体の組み合わせの長期安定性を示す。
【図１９】[037]図１９Ａ〜Ｃは、６か月にわたりＨＰＬＣによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびインスリングラルギンの組み合わせの長期安定性を示す。
【図２０】[038]図２０Ａ〜Ｃは、６か月にわたりＨＰＬＣによって測定した、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋおよびインスリンデテミルの組み合わせの長期安定性を示す。
【図２１】[039]図２１Ａ〜Ｃは、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋが健常なラットへの皮下投与後に食物摂取量および体重増加を低減させることを示す。
【図２２】[040]図２２Ａ〜Ｂは、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋおよびリラグルチドが健常なラットへの皮下共投与後に食物摂取量に対する相乗効果を有することを示す。
【図２３】[041]図２３Ａ〜Ｂは、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋが健常なラットへの皮下投与後に胃排出時間を低減させることを示す。
【図２４】[042]図２４Ａ〜Ｂは、ｈＡｍｙＰＥＧ２０ｋが健常なラットへの皮下投与後に食後グルコースを低減させることを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
例７：時間およびｐＨ依存性の設定におけるヒトアミリンの集合プロファイルに対する様々なアシル化剤の効果
[146]第１の設定では、遊離ヒトアミリン、ｈＡｍｙＰＥＧ５ｋ、およびＡｃＯ−ｈＡｍｙを、ＴｈＴの存在下で様々なｐＨ（３．０〜１０．０）の水性緩衝溶液中でインキュベートした。アミロイド線維へのＴｈＴ結合から誘導された蛍光発光を２５℃で２４時間監視した。遊離ヒトアミリンの集合動態は、当該技術分野において入手可能な知識と同様であった（図１１Ａおよび１２Ａ）。しかしながら、ヒトアミリンのＰＥＧ化とアセチル化誘導体の両方が、水溶液中での安定性の改善およびアミロイド線維形成の低下または非存在のパターンを示した（それぞれ、図１１Ｂおよび１２Ｂ）。これらの所見は、ヒトアミリンのアシル化誘導体が、水溶液中、特に生理的ｐＨ範囲内で、上昇した安定性を有するという仮説を支持する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
[169]この実験は、ＰＥＧ−ｈＡｍｙ２０ＫがＧＥに対するヒトアミリンの効果をインビボで維持することを実証し、したがって、糖尿病および／または肥満関連障害を治療するためのその適用を支持する。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  ヒトアミリンまたはアミリン類似体の非凝集性バイオコンジュゲートであって、前記バイオコンジュゲートが少なくとも１つのアシル単位を含む、バイオコンジュゲート。
［２］  前記１つのアシル単位が、配列番号１のリシン１残基に共有結合している、［１］に記載のヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート。
［３］  式Ｉ
（Ｒ１−Ｘ）ｍ−Ｒ２
［式中、Ｒ１は、アセチル、ビオチン、ユビキチン、グリカン、脂肪酸鎖および天然または合成のポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに様々な平均モル質量の官能性スペーサからなる群から選択されるアシル部分を表し、
Ｒ２は、配列番号１を表し、
Ｘは、ＮＨ、ＣＯ、またはＯを表し、
ｍは、３位、４位、５位、または６位のうちの１つ以上にアミノ酸置換を有するヒトアミリン類似体（配列番号２）を含む、配列番号１のアシル化から得られた配列番号１（Ｒ２）にコンジュゲートされたアシル基（Ｒ１）の単位数を表す］
を有する、［１］に記載のヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート。
［４］  前記アシル基が、ＰＥＧ、アセチル基、パルミトイル、およびミリストイルからなる群から選択される少なくとも１種のアシル化剤で生成される、［３］に記載のヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート。
［５］  ＰＥＧが１ｋＤａ〜４０ｋＤａである、［４］に記載のヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲート。
［６］  ヒトアミリンまたはアミリン類似体の非凝集性アシル化バイオコンジュゲートを含む、組成物。
［７］  インスリン、インスリン類似体、および／またはＧＬＰ−１受容体アゴニスト類似体と、薬学的に許容される担体とをさらに含む、［６］に記載の組成物。
［８］  前記インスリンまたはインスリン類似体が、ＮＰＨ、レギュラーインスリン、グラルギン、デテミル、デグルデク、アスパルト、リスプロ、およびグルリジンからなる群から選択される、［７］に記載の組成物。
［９］  前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト類似体が、セマグルチド、エキセナチド、リキシセナチド、リラグルチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドからなる群から選択される、［７］に記載の組成物。
［１０］  前記組成物が、膵臓炎、高カルシウム血症、疼痛、骨粗鬆症、慢性炎症性疾患、セリアック病、乾癬、全身の臓器の機能障害または不全をもたらすアミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される疾患または状態、ならびに血圧の上昇から生じる障害および血管疾患の治療に使用される、［６］に記載の組成物。
［１１］  全身の臓器の機能障害または不全をもたらすアミロイド沈着または蓄積によって引き起こされるかまたは助長される前記疾患または問題が、高血糖症、糖尿病、低グルコース耐性またはグルコース代謝不全、肥満、メタボリックシンドローム、中枢神経系関連または末梢関連の摂食障害、およびアルツハイマー病からなる群から選択される、［１０］に記載の組成物。
［１２］  血圧の上昇から生じる前記問題および血管疾患が、粥状動脈硬化、心筋梗塞、卒中、冠動脈心疾患、高血圧症、および心疾患からなる群から選択される、［１０］に記載の組成物。
［１３］  抗炎症薬をさらに含む、［６］に記載の組成物。
［１４］  ［１］に記載の前記ヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲートと、インスリンと、薬学的に許容される担体とを混合することを含む、組成物を調製するための方法。
［１５］  ［２］に記載の前記ヒトアミリンの非凝集性バイオコンジュゲートを治療有効量で含む、医薬品。
［１６］  アミリンまたはアミロイドの沈着または蓄積の不足によって引き起こされる疾患または状態を治療するための方法であって、それを必要とする患者に［７］に記載の前記組成物を投与することを含む、方法。
［１７］  前記疾患が糖尿病および／または肥満である、［１６］に記載の方法。
［１８］  アミリンポリペプチド鎖のリシン１残基のアルファおよび／またはイプシロンアミン部分にアシル化剤を結合させることを含む、アミリンミメティック化合物を安定化させるための方法。
【国際調査報告】
2019501963.tif 000028
2019501963.tif 000029
2019501963.tif 000030
2019501963.tif 000031
2019501963.tif 000032
2019501963.tif 000033
2019501963.tif 000034