(57)【要約】  被験体における免疫応答を増強及び／又は惹起することができる組成物及び前記組成物を使用する方法。前記組成物は、ＩｇＡ免疫応答及び／又はＩｇＧ免疫応答を増強することができ、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を被験体に含む。前記組成物は、経口投与用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における免疫応答を増強及び／又は惹起する方法であって、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む、ＩｇＡ免疫応答及び／又はＩｇＧ免疫応答を増強することができる組成物を被験体に投与することを含み、前記組成物が、前記被験体に経口投与されることを特徴とする方法。
【請求項２】
被験体における免疫応答の増強及び／又は惹起において使用するための、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む、ＩｇＡ免疫応答及び／又はＩｇＧ免疫応答を増強することができる組成物であって、経口投与用であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
前記剤が、細胞外ＡＴＰの濃度を低減することができる請求項１に記載の方法又は請求項１に記載の通り使用するための組成物。
【請求項４】
前記剤が、ＡＴＰ加水分解活性を含む請求項１若しくは３に記載の方法又は請求項２から３のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項５】
前記剤が、ＡＴＰ加水分解酵素を含む請求項４に記載の方法又は請求項４に記載の通り使用するための組成物。
【請求項６】
前記ＡＴＰ加水分解酵素が、アピラーゼである請求項５に記載の方法又は請求項５に記載の通り使用するための組成物。
【請求項７】
前記アピラーゼが、フレキシネル菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）アピラーゼである請求項６に記載の方法又は請求項６に記載の通り使用するための組成物。
【請求項８】
前記組成物が、免疫原を更に含む請求項１若しくは３から７のいずれかに記載の方法又は請求項２から７のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項９】
前記免疫原が、消化器病原体又は全身病原体に対する免疫応答を惹起することができる請求項８に記載の方法又は請求項８に記載の通り使用するための組成物。
【請求項１０】
前記免疫原が、細菌抗原、寄生虫抗原、又はウイルス抗原である請求項８から９のいずれかに記載の方法又は請求項８から９のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項１１】
前記免疫原が、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ボイド菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレキシネル菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ソンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・ボグノリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｇｎｏｒｉ）、回虫等の蠕虫類、ランブル鞭毛虫又は赤痢アメーバ等の原生動物、ポリオウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎及びヒト免疫不全ウイルスからなる群から選択される病原体に対する免疫応答を惹起することができる請求項１０に記載の方法又は請求項１０に記載の通り使用するための組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、前記ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤をコードしている核酸を含む組み換え細菌を含む請求項１若しくは３から１１のいずれかに記載の方法又は請求項２から１１のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項１３】
前記組み換え細菌が、免疫原をコードしている核酸を更に含む請求項１２に記載の方法又は請求項１２に記載の通り使用するための組成物。
【請求項１４】
前記細菌が、大腸菌又は弱毒化サルモネラ・エンテリカである請求項１２から１３のいずれかに記載の方法又は請求項１２から１３のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、前記ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤をコードしている核酸を含むバクテリオファージを含む請求項１若しくは３から１１のいずれかに記載の方法又は請求項２から１１のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項１６】
前記バクテリオファージが、免疫原をコードしている核酸を更に含む請求項１５に記載の方法又は請求項１５に記載の通り使用するための組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、前記ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤をコードしている核酸を含むウイルスベクターを含む請求項１若しくは３から１１のいずれかに記載の方法又は請求項２から１１のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項１８】
前記ウイルスベクターが、免疫原をコードしている核酸を更に含む請求項１７に記載の方法又は請求項１７に記載の通り使用するための組成物。
【請求項１９】
前記ＩｇＡ免疫応答及び／又は前記ＩｇＧ免疫応答が、粘膜応答である請求項１若しくは３から１８のいずれかに記載の方法又は請求項２からから１８のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項２０】
前記ＩｇＡ免疫応答及び／又は前記ＩｇＧ免疫応答が、胃腸で生じる請求項１若しくは３から１９のいずれかに記載の方法又は請求項２から１９のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項２１】
感染性疾患を予防又は治療する方法であって、請求項１又は３から２０のいずれかに記載の方法を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２から２０のいずれかに記載の通り使用するための組成物であって、感染性疾患の予防又は治療において使用することを特徴とする組成物。
【請求項２３】
前記感染性疾患が、消化器病原体によって引き起こされる請求項２１に記載の方法又は請求項２２に記載の通り使用するための組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、ナノカプセルで投与するために製剤化される請求項１若しくは３から２１若しくは２３のいずれかに記載の方法又は請求項２から２０若しくは２２から２３のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、ワクチンである請求項１若しくは３から２１若しくは２３から２４のいずれかに記載の方法又は請求項２から２０若しくは２２から２４のいずれかに記載の通り使用するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物の分野である。具体的には、本発明は、ワクチンとして使用することができる免疫学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃腸は、食品の形態の多数の外来抗原の侵入口として作用する。粘膜免疫系は、食品抗原に対する不要な免疫応答を確実に回避すると同時に、任意の病原菌に対する免疫応答を確実に惹起しなければならない。更に、胃腸は、宿主と共生して生存している約１０１４の共生微生物を含む。粘膜免疫系は、共生が可能になるように制御された様式でこれら生物に対する免疫応答を確実に生じさせなければならない。したがって、粘膜免疫応答は、病原体に対して応答することができると同時に、多数の非自己抗原に対しては寛容でなければならない。
【０００３】
粘膜系にみられる抗体の主なクラスは、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）である。胃腸管内腔で分泌されるＩｇＡ抗体は、共生を可能にすると同時に、粘液に微生物を捕捉することによって粘膜を保護する。
【０００４】
前記生物が定着した胃腸は、一般的に、ワクチンとして経口的に送達される免疫原に対して非感受性であるので、経口ワクチン接種を使用して種特異的高親和性ＩｇＡ応答を誘導することは、粘膜免疫における大きな課題である。したがって、粘膜病原体に対して特異的な高力価ＩｇＡ（及びＩｇＧ抗体）を提供するために、適応粘膜系の天然不応性を克服することができる特定の組成物及び免疫付与プロトコールが当技術分野において必要とされている。
【０００５】
ヒトでの使用が認可されている経口細菌ワクチンは２種のみ、即ち、弱毒生チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ）及び死菌コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、粘膜免疫応答、具体的にはＩｇＡ及びＩｇＧ免疫応答を惹起及び／又は増強することができ、且つ経口投与することができる組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
胃腸におけるＩｇＡ応答は、抗原特異的Ｂ細胞のＩｇＡ分泌形質細胞への成熟を促進する濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞によって制御される。Ｔｆｈ細胞は、Ｂ細胞の増殖を促進し、Ｉｇクラススイッチ及び体細胞超変異を促進する活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の発現を促進する。本発明者らは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）開口イオンチャネル型Ｐ２Ｘ７受容体が、Ｔｆｈ細胞量の調節において役割を有していることを既に報告している１。細胞外ＡＴＰは、Ｐ２Ｘ７受容体に結合してＴｆｈ細胞死を誘発することが示されている。マウスにおけるＰ２Ｘ７の欠失は、腸内ＩｇＡレベルを増大させ、続いて、共生生物を枯渇させることが示されている。本発明者による新たなデータは、共生生物によって放出されるＡＴＰが、腸上皮を透過してＴｆｈ細胞活性を制限することを示す。
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む組成物が、経口投与されたときに有効な免疫応答を惹起するのに有益であることを見出した。前記組成物は、前記組成物の送達後にＩｇＡ及び／又はＩｇＧ免疫応答の増大が惹起され、それが免疫原に対して特異的であるような免疫原を更に含み得る。
【０００９】
したがって、本発明は、被験体における免疫応答を増強及び／又は惹起する方法であって、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む、ＩｇＡ免疫応答及び／又はＩｇＧ免疫応答を増強することができる組成物を被験体に投与することを含み、前記組成物が、前記被験体に経口投与される方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、被験体における免疫応答の増強及び／又は惹起において使用するための、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む、ＩｇＡ免疫応答及び／又はＩｇＧ免疫応答を増強することができる組成物であって、経口投与するための組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、本発明の方法を含む、感染性疾患を予防又は治療する方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、感染性疾患の予防又は治療において使用するための、本発明に従って使用するための組成物を提供する。
【００１３】
本発明の組成物
本発明の組成物は、免疫応答を増強することができる。
【００１４】
前記組成物が増強することができる免疫応答は、前記組成物によって惹起することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、前記組成物は、例えば、前記組成物が免疫原を含む場合、免疫応答を惹起することができる。一方、他の実施形態では、前記組成物は、それ自体特異的免疫応答を惹起することはできない。例えば、前記組成物は、任意で、免疫原を含んでいなくてもよい（したがって、免疫応答を惹起することはできない）が、本発明の組成物とは別々に投与された免疫原によって惹起された免疫応答を増強することはでき得る。この場合、前記組成物は、複合組成物が特異的免疫応答を惹起及び増強することができるように、使用前に免疫原を含む第２の組成物と合わせてよい。
【００１５】
代替案として、本発明の組成物は、免疫応答を惹起することができる第２の組成物と同時に又は近接する時点で被験体に投与してもよく、その結果、本発明の組成物は、第２の組成物によって惹起される免疫応答を増強することができる。
【００１６】
前記組成物が免疫原を含まない場合、単独で投与してもよく、そして、被験体内に既に存在する免疫原によって惹起される免疫応答を増強することができ得る。例えば、前記組成物は、前記組成物が投与される被験体内に既に存在する共生生物又は病原体に対する免疫応答を増強することができ得る。
【００１７】
前記組成物は、ＩｇＡ免疫応答及び／又はＩｇＧ免疫応答を増強、及び任意で惹起することができ得る。好ましくは、前記組成物は、ＩｇＡ免疫応答を増強、及び任意で惹起することができる。
【００１８】
前記組成物は、好ましくは、粘膜免疫応答の増強、及び任意で惹起において使用するためのものである。消化器、生殖器、及び呼吸器の粘膜表面は、外部環境に曝露されるので、病原体による侵入を非常に受けやすい。これら粘膜表面は、粘膜免疫応答の惹起及び増強によって保護される。前記組成物は、消化器、生殖器、又は呼吸器の粘膜表面における免疫応答の増強、及び任意で惹起において使用するためのものであり得る。好ましくは、前記組成物は、消化器の粘膜表面における免疫応答の増強、及び任意で惹起において使用するためのものである。かかる消化器の粘膜表面は、胃腸の粘膜表面を含む。胃腸は、胃、小腸、及び大腸を含む。
【００１９】
ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤
本発明の組成物は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる少なくとも１つの剤を含む。前記組成物は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる複数の剤を含んでいてもよい。例えば、前記組成物は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる２、３、又は４以上の剤を含み得る。
【００２０】
これら剤は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる。Ｔｆｈ細胞死は、通常、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合後に生じる。したがって、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減すると、Ｔｆｈ細胞死の誘発が減少する。Ｔｆｈ細胞は、Ｂ細胞のＩｇＡ分泌形質細胞への成熟を支援する。したがって、Ｔｆｈ細胞死の誘発が減少すると、Ｂ細胞の成熟及びＢ細胞のＩｇＡ分泌形質細胞への分化の増加につながることが本発明者によって示されている。
【００２１】
ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤は、Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合部位に結合することができるリガンドの形態であってよい。前記リガンドは、Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合部位に競合的に結合し得る。Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合部位に競合的に結合するリガンドは、ＡＴＰが結合するのを阻止して、下流のＴｆｈ細胞死を防ぐ。前記リガンドは、ＡＴＰアナログであってよい。
【００２２】
ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤は、Ｐ２Ｘ７受容体に結合することができる抗体の形態であってもよい。前記抗体は、Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合部位に結合し得る。
【００２３】
ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤は、Ｐ２Ｘ７受容体の発現を低減することができる剤の形態であってもよい。前記剤は、Ｐ２Ｘ７受容体をコードしている遺伝子の転写レベルを低減してよい。代替案として、前記剤が、Ｐ２Ｘ７受容体をコードしているｍＲＮＡの翻訳レベルを低減してもよい。更に代替案として、前記剤が、Ｐ２Ｘ７受容体をコードしているｍＲＮＡ前駆体のｍＲＮＡ前駆体プロセシングレベルを低減してもよい。かかる剤は、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの形態をとり得る。
【００２４】
ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤は、細胞外ＡＴＰの濃度を低下させることができ得る。具体的には、前記剤は、ＡＴＰ加水分解活性を有し得る。前記剤は、ＡＴＰ加水分解酵素であってよい。
【００２５】
前記剤は、ポリペプチドとして前記組成物中に存在してもよい。代替案として、前記剤は、核酸として前記組成物中に存在していてもよい。前記剤が核酸として前記組成物中に存在する場合、前記核酸は、ポリペプチドをコードし得る。
【００２６】
ＡＴＰ加水分解酵素
好ましくは、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤は、ＡＴＰ加水分解酵素である。
【００２７】
任意のＡＴＰ加水分解酵素を、本発明の組成物においてＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤として使用してよい。ＡＴＰ加水分解酵素とは、ＡＴＰのＡＤＰへの、ＡＴＰのＡＭＰへの、及び／又はＡＤＰのＡＭＰへの加水分解を触媒する任意の酵素を指す。かかる酵素としては、アピラーゼ、ＡＴＰａｓｅ、ＡＴＰジホスファターゼ、アデノシンジホスファターゼ、ＡＤＰａｓｅ、ＡＴＰジホスホヒドロラーゼ、及びＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＮＴＰＤ１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
好ましくは、ＡＴＰ加水分解酵素は、アピラーゼである。ＡＴＰ加水分解酵素がアピラーゼである場合、アピラーゼは、任意の生物由来のアピラーゼの配列を有し得る。好ましくは、アピラーゼは、シゲリ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌｉ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）アピラーゼである。代替案として、アピラーゼは、ソラナム・チュベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）アピラーゼであってもよい。
【００２９】
アピラーゼは、ＡＴＰ、無機リン、及びシグナル伝達分子等のエネルギー担体の比を変化させる非エネルギー結合型ＮＴＰａｓｅである。アピラーゼは、膜結合型及び分泌可溶性型の両方で全ての真核生物においてみられる。
【００３０】
アピラーゼは、任意の手段によって生成することができる。好ましくは、ＡＴＰ加水分解酵素は、組み換えによって生成される。好ましくは、ＡＴＰ加水分解酵素は、組み換えによって生成されたアピラーゼである。好ましくは、アピラーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０４５３９として提供される配列（配列番号１として本明細書に援用される）を有する組み換えによって生成されたアピラーゼである。
【００３１】
代替案として、アピラーゼは、その天然源から直接精製してもよい。アピラーゼは、植物源、動物源、又は細菌源から精製してよい。好ましくは、アピラーゼは、ジャガイモから精製される。
【００３２】
担体
上記剤は、前記組成物において担体中に存在し得る。ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤の送達及び／又は生成を可能にする任意の担体が、本発明の組成物に含まれていてよい。
【００３３】
担体は、発現ベクターであってよい。代替案として、担体は、細胞であってもよい。担体は、発現ベクターを含み、それを発現させることができる細胞であってよい。
好ましくは、前記剤は、核酸であり、発現ベクターに組み込まれている。本発明の組成物において使用することができる発現ベクターを以下に記載する。発現ベクターは、組成物に直接含まれてよい。代替案として、発現ベクターは、前記組成物中に含まれる宿主細胞に形質転換されてもよい。
【００３４】
発現ベクター
発現ベクターは、ベクターに挿入又はクローニングされている１以上の分子の発現を増強することができる。かかる発現ベクターの例としては、バクテリオファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、及びインビトロで若しくは細胞内で複製し得るか若しくは複製され得る、又は動物の細胞内の特定の位置に核酸セグメントを輸送することができる他の配列が挙げられる。本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体、エピソーム、及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド若しくはバクテリオファージ由来のベクター、並びにこれらの組合せ由来のベクター、例えば、コスミド及びファージミド、又はウイルスベースのベクター、例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスが挙げられる。
【００３５】
発現ベクターは、プラスミドであってよい。宿主において複製可能且つ生存可能である限り、任意のプラスミド発現ベクターを使用してよい。
【００３６】
発現ベクターは、ミニサークルＤＮＡであってよい。ミニサークルＤＮＡは、持続的に高レベルの核酸転写に有用である。環状ベクターは、発現サイレンシング細菌配列を有しないことを特徴とする。例えば、ミニサークルベクターは、複製開始点を有さず、且つ細菌プラスミドで一般的にみられる薬剤選択マーカー、例えば、β−ラクタマーゼ、ｔｅｒ等を有しない点で細菌プラスミドベクターとは異なる。その結果、ミニサークルＤＮＡのサイズが小さくなるので、より効率的な送達が可能になる。
【００３７】
発現ベクターは、ウイルスベクターであってよい。
【００３８】
任意のウイルスに基づく任意のウイルスベクターを前記剤のために担体として使用することができる。遺伝子治療において使用されるウイルス系の一般的に使用されるクラスは、そのゲノムが宿主細胞のクロマチンに組み込まれるか（オンコレトロウイルス及びレンチウイルス）又は主に染色体外エピソームとして細胞核に存続し続けるか（アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、及びヘルペスウイルス）に応じて２つの群に分類することができる。
【００３９】
ウイルスベクターは、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターであってよい。アデノウイルスは、２６Ｋｂｐ〜４８Ｋｂｐの線状ゲノムを有する中等度のサイズの二本鎖非エンベロープＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは、受容体媒介性結合及び内在化によって標的細胞に入り込み、非分裂細胞及び分裂細胞の両方において核に侵入する。アデノウイルスは、生存及び複製のために宿主細胞に大いに依存しており、宿主の複製機構を使用して脊椎動物細胞の核内で複製することができる。
【００４０】
ウイルスベクターは、パルボウイルス科由来であってよい。パルボウイルス科は、約５，０００ヌクレオチド長のゲノムを有する小型一本鎖非エンベロープＤＮＡウイルスの科である。本開示のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であってよい。ＡＡＶは、増殖性感染サイクルを開始させ、維持するために別のウイルス（典型的には、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）の重感染を一般的に必要とする依存性パルボウイルスである。かかるヘルパーウイルスの非存在下でも、ＡＡＶは、受容体媒介性結合及び内在化によって標的細胞に感染又は形質導入し、非分裂細胞及び分裂細胞の両方において核に侵入する能力を有する。ヘルパーウイルスの非存在下ではＡＡＶ感染から子ウイルスが生成されないので、形質導入の程度は、最初にウイルスに感染した細胞だけに限定される。レトロウイルス、アデノウイルス、及び単純ヘルペスウイルスとは異なり、ＡＡＶは、ヒト病原性及び毒性を有していないと考えられる２。
【００４１】
レトロウイルス科に由来するウイルスに基づくウイルスベクターを使用してもよい。レトロウイルスは、以下の２つの独特な機構を特徴とする一本鎖ＲＮＡ動物ウイルスを含む。第１に、レトロウイルスのゲノムは、２コピーのＲＮＡからなる二倍体である。第２に、このＲＮＡは、ビリオン結合酵素逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに転写される。この二本鎖ＤＮＡ、即ちプロウイルスは、次いで、宿主ゲノムに組み込まれ、安定的に組み込まれた宿主ゲノムの成分として親細胞から後代細胞に伝えられ得る。
【００４２】
ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってよい。
【００４３】
当業者に公知の他のウイルス又は非ウイルス系を、前記剤を送達するための担体として使用してもよい。
【００４４】
好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。代替案として、好ましくは、発現ベクターはバクテリオファージである。発現ベクターがプラスミド又はバクテリオファージである場合、発現ベクターは、細菌細胞に形質転換され得、前記細菌細胞は、本発明の組成物に含まれる。細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってよい。代替案として、細菌担体は、弱毒化サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）であってもよい。弱毒化サルモネラ・エンテリカは、血清型ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であってよい。
【００４５】
免疫原
本発明の組成物は、特異的免疫応答を誘導することができる免疫原を含み得る。本発明は、広範な疾患を治療する又は前記疾患から保護するために、広範な免疫原を使用してよい。前記免疫原は、ウイルス疾患（例えば、エンベロープ又は非エンベロープウイルスに起因）、細菌疾患（例えば、グラム陰性又はグラム陽性細菌に起因）、真菌疾患、寄生虫疾患、又は任意の他の疾患から保護する免疫応答を惹起することができる。
【００４６】
前記免疫原は、例えば、生物全体、外膜小胞、タンパク質、糖、リポ糖、（例えば、担体とヘプテンとの、又は担体と糖若しくはリポ糖との）コンジュゲート等の様々な形態をとり得る。
【００４７】
好ましい実施形態では、前記免疫原は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤をコードしている核酸を含む細菌担体の形態をとり得る。この場合、細菌担体は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７への結合レベルを低減することができる剤の担体として、及び免疫原として作用する。例えば、前記組成物は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤をコードしている核酸を含む大腸菌又は弱毒化サルモネラ・エンテリカ等の組み換え細菌を含み得る。弱毒化サルモネラ・エンテリカは、血清型ネズミチフス菌であってよい。
【００４８】
特に好ましい実施形態では、前記免疫原は、ＡＴＰ加水分解酵素、好ましくはアピラーゼをコードしている核酸を含む細菌担体の形態をとり得る。前記免疫原は、フレキシネル菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）アピラーゼをコードしている核酸を含む細菌担体の形態をとり得る。
【００４９】
代替案として、免疫原は核酸を含んでいてもよい。前記核酸は、ポリペプチド免疫原をコードし得る。前記核酸は、上記の通り担体中に存在し得る。例えば、前記核酸は、発現ベクター中に存在し得る。かかる発現ベクターは、細胞内に存在し得る。
【００５０】
免疫原とＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤とを同じ発現ベクターに組み込んでよい。代替案として、免疫原とＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤とを別々の発現ベクターに組み込んでもよい。更なる代替案として、免疫原及びＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤のうちの一方は発現ベクター中に存在していてよいが、他方は発現ベクター中に存在していない。例えば、免疫原は発現ベクター中に存在していてよいが、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤は存在していない。代替案として、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤は発現ベクター中に存在していてよいが、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合を低減することができる剤は存在していない。
【００５１】
前記免疫原は、本発明の組成物中に含まれていなくてもよい。代替案として、免疫原を本発明の組成物とは別々に投与してもよい。本発明の組成物は、使用前に免疫原を含む第２の組成物と合わせてもよく、本発明の組成物は、免疫原を含む第２の組成物と同時に又は近接する時点で投与してもよい。
【００５２】
更なる代替案として、前記免疫原は、本発明の組成物又は第２の組成物のいずれにおいても投与されなくてもよい。前記免疫原は、本発明の組成物を投与する前に被験体中に既に存在していてもよい。
【００５３】
免疫原の特異性
好ましくは、前記免疫原は、消化器病原体又は全身病原体に対する免疫応答を惹起する。好ましくは、全身病原体は、経粘膜伝達される全身病原体である。
【００５４】
前記免疫原は、任意の消化器細菌病原体に対する免疫応答を惹起し得る。消化器細菌病原体としては、腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）、ベロトキシン産生大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、チフス性及び非チフス性サルモネラ菌を含むサルモネラ菌、例えば、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌、及び豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、カンピロバクター、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ボイド菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレキシネル菌、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃｉａ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、及びリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
前記免疫原は、任意の消化器ウイルス病原体に対する免疫応答を惹起し得る。消化器ウイルス病原体としては、ポリオウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、カリシウイルス、アストロウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、Ａ型、Ｄ型、及びＥ型肝炎、トガウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
前記免疫原は、任意の消化器原生動物病原体に対する免疫応答を惹起し得る。消化器原生動物病原体としては、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｌｉａ）、小形クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、戦争イソスポーラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｂｅｌｌｉ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｃｏｌｉ）、小形アメーバ（Ｅｎｄｏｌｉｍａｘ  ｎａｎａ）、ヨードアメーバ（Ｉｏｄａｍｏｅｂａ  ｂｕｔｓｃｈｌｉｉ）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｆｒａｇｌｉｓ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、及び腸トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
前記免疫原は、任意の消化器蠕虫病原体に対する免疫応答を惹起し得る。消化器蠕虫病原体としては、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、フィリピン毛頭虫（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ）、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、広節裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｌａｔｕｍ）、小型条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａ）、縮小条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）、肥大吸虫（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ  ｂｕｓｋｉ）、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ  ｙｏｋｏｇａｗｉ）、エジプト吸虫（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ）、ヒト胃盤虫（Ｇａｓｔｒｏｄｉｓｃｏｉｄｅｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、及び鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
前記免疫原は、任意の経粘膜伝達全身病原体、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を惹起し得る。
【００５９】
前記免疫原は、任意の動物において免疫応答を惹起し得る。動物は、脊椎動物又は非脊椎動物であってよい。脊椎動物は、哺乳類であってよい。脊椎哺乳類は、ヒトであってよい。哺乳類の例としては、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、霊長類等が挙げられるが、これらに限定されない。動物は、霊長類であってよい。好ましくは、動物はヒトである。前記免疫原は、動物に感染することができる任意の病原体に対する免疫応答を惹起し得る。特定の動物又は動物群に感染することができる病原体に対する免疫応答を惹起することができる免疫原を使用する場合、前記免疫原を含む組成物が、前記特定の動物又は動物群に投与するのに好適である。
【００６０】
医薬組成物
本明細書に開示される組成物は、上記剤及び免疫原以外の追加成分を含んでいてもよい。例えば、典型的には、１以上の薬学的に許容し得る成分を含む。かかる成分の総論は、参照文献３において入手可能である。
【００６１】
組成物は、チオメルサール又は２−フェノキシエタノール等の保存剤を含んでいてよい。
【００６２】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくは、パイロジェンフリーであり、例えば、１用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）、好ましくは１用量当たり＜０．１ＥＵしか含有しない。組成物は、好ましくはグルテンフリーである。
【００６３】
本発明の組成物は、ワクチンであってよい。
【００６４】
キット
また、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む第１の区画を含むキットも本明細書に開示される。
【００６５】
前記キットは、免疫原を含む第２の区画を更に含んでいてもよい。
【００６６】
治療及び免疫原性組成物の投与の方法
本発明の組成物は、動物被験体に投与することを意図する。したがって、本発明は、被験体における免疫応答を増強及び／又は惹起する方法であって、前記被験体に本発明の組成物を投与する工程を含む方法を提供する。動物被験体は、任意の動物であってよい。動物は、脊椎動物又は非脊椎動物であってよい。脊椎動物は、哺乳類であってよい。脊椎哺乳類は、ヒトであってよい。哺乳類の例としては、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、霊長類等が挙げられるが、これらに限定されない。動物は、霊長類であってよい。好ましくは、動物はヒトである。本発明の方法は、本発明の組成物を投与することを含む、動物における感染性疾患を予防又は治療する方法を含む。
【００６７】
被験体における免疫応答を増強及び／又は惹起する方法は、本発明の組成物で前記被験体を免疫することを含み得る。したがって、本発明は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む組成物で被験体を免疫する方法を提供する。
【００６８】
また、本発明は、例えば被験体における免疫応答の増強及び／又は惹起に使用するための医薬としての、本発明の組成物又はキットの使用を提供する。本発明は、被験体における免疫応答を増強及び／又は惹起する方法において使用するための、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む組成物を提供する。更に、本発明は、感染性疾患の予防又は治療において使用するための、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む組成物を提供する。また、本発明は、被験体における免疫応答を増強するための医薬の製造における、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤の使用を提供する。更に、本発明は、感染性疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤の使用を提供する。また、前記医薬は、免疫原を含んでいてもよい。代替案として、前記医薬は、免疫原と組み合わせて投与するためのものであってもよい。
【００６９】
本発明は、被験体を免疫する方法において使用するための、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む組成物を提供する。また、本発明は、被験体を免疫するための医薬の製造における、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤の使用を提供する。本発明の方法及び組成物によって予防又は治療され得る感染性疾患は、病原体によって引き起こされる任意の疾患であってよい。病原体は、消化器病原体又は全身病原体であってよい。全身病原体は、経粘膜伝達全身病原体であってよい。前記疾患は、細菌、ウイルス、原生動物、又は蠕虫病原体によって引き起こされ得る。
【００７０】
消化器細菌病原体としては、腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）、ベロトキシン産生大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、チフス性及び非チフス性サルモネラ菌を含むサルモネラ菌、例えば、腸チフス菌、腸炎菌、パラチフス菌、ネズミチフス菌、及び豚コレラ菌、カンピロバクター、コレラ菌、ボイド菌、赤痢菌、フレキシネル菌、ディフィシル菌、ウェルシュ菌、ボツリヌス菌、セレウス菌、腸炎ビブリオ菌、エンテロコリチカ菌、ピロリ菌、黄色ブドウ球菌、及びリステリア菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
消化器ウイルス病原体としては、ポリオウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、カリシウイルス、アストロウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、Ａ型、Ｄ型、及びＥ型肝炎、トガウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
消化器原生動物病原体としては、ランブル鞭毛虫、小形クリプトスポリジウム、戦争イソスポーラ、赤痢アメーバ、大腸アメーバ、小形アメーバ、ヨードアメーバ、二核アメーバ、大腸バランチジウム、及び腸トリコモナスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
消化器蠕虫病原体としては、回虫、ズビニ鉤虫、アメリカ鉤虫、糞線虫、無鉤条虫、旋毛虫、フィリピン毛頭虫、有鉤条虫、広節裂頭条虫、小型条虫、縮小条虫、肥大吸虫、横川吸虫、エジプト吸虫、ヒト胃盤虫、蟯虫、及び鞭虫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
経粘膜伝達全身病原体としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が挙げられる。
【００７５】
本発明の組成物は、腸炎を予防又は治療するために使用することができる。
【００７６】
本発明の組成物は、アジュバントとして使用してもよい。代替案として、本発明の組成物は、ワクチンとして使用してもよい。
【００７７】
本発明の方法、組成物、及び使用は、一般的に、被験体における抗体応答、好ましくはＩｇＡ免疫応答及び／又はＩｇＧ免疫応答を生じさせるために使用される。
【００７８】
本発明の方法、組成物、及び使用は、好ましくは、被験体における免疫保護応答、好ましくは、免疫保護ＩｇＡ応答を提供する。
【００７９】
本発明の方法、組成物、及び使用は、好ましくは、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる剤を含む組成物の非存在下で免疫原によって提供される免疫応答と比べて改善された免疫応答を提供する。好ましくは、本発明の方法、組成物、及び使用は、ＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体レベルへの結合を低減することができる剤を含む組成物の非存在下で免疫原によって提供されるＩｇＡ免疫応答と比べて改善されたＩｇＡ免疫応答を提供する。
【００８０】
本発明の組成物は、様々な方法で投与することができる。通常の免疫経路は、経口投与によるが、他の利用可能な経路としては、鼻腔内、頬側、舌下等が挙げられる。したがって、好ましくは、前記組成物は経口投与用に製剤化される。
【００８１】
前記組成物を経口投与用に製剤化する場合、前記組成物は、錠剤、カプセル剤、サシェ剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤、ロゼンジ、再構成用粉末、液状製剤、又は坐剤の形態であってよい。
【００８２】
経口投与の場合、本発明の組成物は、錠剤又はカプセル剤の形態で、又は液剤、乳剤、又は懸濁剤として提供され得る。
【００８３】
経口錠剤は、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、着色剤、及び保存剤等の薬学的に許容し得る賦形剤と混合された本発明に係る組成物を含み得る。好適な不活性充填剤としては、炭酸ナトリウム及びカルシウム、リン酸ナトリウム及びカルシウム、ラクトース、デンプン、糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。例示的な液体経口賦形剤としては、エタノール、グリセロール、水等が挙げられる。デンプン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デンプングリコール酸ナトリウム、微結晶性セルロース、及びアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤は、デンプン及びゼラチンを含み得る。滑沢剤は、存在する場合、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクであってよい。必要に応じて、錠剤は、消化管における吸収を遅らせるためにモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の物質でコーティングされてもよく、腸溶性コーティングでコーティングされてもよい。
【００８４】
経口投与用のカプセルとしては、硬質及び軟質のゼラチンカプセルが挙げられる。硬質ゼラチンカプセルを調製するために、本発明の化合物を固体、半固体、又は液体の希釈剤と混合してもよい。軟質ゼラチンカプセルは、水、落花生油又はオリーブ油等の油、流動パラフィン、短鎖脂肪酸のモノグリセリドとジグリセリドとの混合物、ポリエチレングリコール４００、又はプロピレングリコールを本発明の化合物と混合することによって調製することができる。
【００８５】
経口投与用の液体は、懸濁剤、液剤、乳剤、若しくはシロップ剤の形態であってもよく、使用前に水又は他の好適なビヒクルで再構成するための乾燥製品として凍結乾燥又は提示されてもよい。かかる液体組成物は、任意で、薬学的に許容し得る賦形剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトール、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル等）；非水性ビヒクル、例えば油（例えば、アーモンド油又は分画ヤシ油）、プロピレングリコール、エチルアルコール、又は水；保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはプロピル、又はソルビン酸）；湿潤剤、例えば、レシチン；及び必要に応じて着香剤又は着色剤を含有していてもよい。
【００８６】
本発明に従って調製された組成物は、小児及び成人の両方を治療するためのワクチンとして使用してよい。被験体は、１歳未満、１歳〜５歳、５歳〜１５歳、１５歳〜５５歳、又は少なくとも５５歳であってよい。ワクチンを投与する被験体は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、好ましくは６５歳以上）、若年層（例えば、５歳以下）、入院している被験体、医療従事者、軍人、妊婦、慢性病を患っている免疫不全患者、海外渡航者等であってよい。
【００８７】
治療は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールによって行ってよい。複数回投与は、一次免疫スケジュール及び／又は追加免疫スケジュールにおいて使用してよい。複数回投与スケジュールでは、様々な用量を同一の又は異なる経路によって投与してよく、例えば、初回刺激は非経口経路で、追加刺激は粘膜経路で行う、初回刺激は粘膜経路で、追加刺激は非経口経路で行う等である。免疫学的にナイーブな被験体では、１回超（典型的には、２回）投与することが特に有用である。複数回投与は、典型的には、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間等）間隔で投与される。
【００８８】
概論
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｄｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよく、追加成分を含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００８９】
数値ｘに関連する用語「約」は、任意であり、例えばｘ±１０％を意味する。
【００９０】
特に指定しない限り、２以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、特定の順序で混合することを必要としない。したがって、成分を任意の順序で混合してよい。３成分が存在する場合、２成分を互いに組み合わせ、次いで、組合せ物を第３の成分と組み合わせてよい。
【００９１】
細胞の培養において動物（特にウシ）材料を使用する場合、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない起源から入手しなければならない。全体的に、動物由来の材料の完全な非存在下で細胞を培養することが好ましい。
【００９２】
化合物を組成物の一部として身体に投与する場合、その化合物を代わりに好適なプロドラッグに置換してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１ａ】細菌起源の腸内ＡＴＰ。ＳＰＦ及び無菌マウス（ＧＦ）由来の回腸の内腔、胆汁、尿、及び血清におけるＡＴＰ濃度。
【図１ｂ】細菌起源の腸内ＡＴＰ。小腸から単離された指定の細菌種の培養培地中のＡＴＰ濃度（棒グラフ）及び細胞増殖（ＯＤ６００）。
【図１ｃ】細菌起源の腸内ＡＴＰ。（左から右へ）門静脈、頸静脈、及び下大静脈、並びに心臓由来の血清中のＡＴＰ濃度。
【図１ｄ】細菌起源の腸内ＡＴＰ。膜損傷（ＤＩＢＡＣ＋細胞、上のドットプロット）、細胞死（ＳｙｂｒＧｒｅｎ＋ＤＡＰＩ＋細胞、下のドットプロット）についての、未処理（ＬＢ）又はＶＡＭで処理された（ＶＡＭ）回腸細菌のＦＡＣＳ分析。
【図１ｅ】細菌起源の腸内ＡＴＰ。未処理（ＬＢ）培養物及びＶＡＭ処理培養物におけるＡＴＰ濃度（上図）及び回腸細菌の増殖（下図）。
【図１ｆ】細菌起源の腸内ＡＴＰ。ＰＢＳ（左バー）又はＶＡＭ（右バー）を経管栄養したマウス由来の回腸ＡＴＰ濃度。
【図１ｇ】細菌起源の腸内ＡＴＰ。未処理（左バー）又はＶＡＭを経口経管栄養した（右バー）ＷＴ及びｐ２ｒｘ７−／−マウスのＰＰ由来のＴｆｈ細胞内のアネキシンＶ＋細胞のＦＡＣＳによる分析。
【図２ａ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。大腸菌によるＡＴＰ分泌の概略図（ＯＭ、外膜、ＰＳ、細胞膜周辺腔、ＩＭ、内膜、Ｃｙｔ、サイトゾル）。ｐＢＡＤ２８組み換え体についての経時的な培養培地中のＡＴＰ濃度（棒グラフ）及び細菌増殖（ＯＤ６００）。
【図２ｂ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。アピラーゼの影響の概略図。ｐＨＮＤ１０形質転換体についての経時的な培養培地中のＡＴＰ濃度（棒グラフ）及び細菌増殖（ＯＤ６００）。
【図２ｃ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。ｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０形質転換体で免疫したマウス由来の腸洗浄液中の抗大腸菌ＩｇＡについてのＦＡＣＳ分析。
【図２ｄ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。ｐＢＡＤ２８をトランスフェクトした大腸菌で免疫し、それぞれの細菌株で試験したマウスにおける腸内抗大腸菌ＩｇＡの定量。
【図２ｅ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。ｐＨＮＤ１０をトランスフェクトした大腸菌で免疫し、相互の細菌株で試験したマウスにおける腸内抗大腸菌ＩｇＡの定量。
【図２ｆ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。細菌の経管栄養前及び後（１２時間）にＣＡ（右バー）又はＰＳＶ（左バー）で処理したマウスにおける回腸ＡＴＰの増加倍数。
【図２ｇ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。ｐＢＡＤ２８形質転換体に応答する抗大腸菌ＩｇＡの定量。
【図２ｈ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。ｐＨＮＤ１０形質転換体に応答する抗大腸菌ＩｇＡの定量（ｙ軸の目盛が異なる）。
【図２ｉ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。指定の細菌種におけるｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０をトランスフェクトした大腸菌を経管栄養したマウスの腸液中のＩｇＡについてのＦＡＣＳ分析。
【図３ａｂ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。（ａ）腸洗浄液の連続希釈液中のＩｇＡによる大腸菌染色。（ｂ）この表は、腸内ＩｇＡ濃度及び大腸菌特異的抗体の幾何平均を示す。
【図３ｃ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。合計腸内ＩｇＡ濃度に対してプロットしたＦＡＣＳによる抗大腸菌ＩｇＡの幾何平均及びフィッティング曲線の相対関数。
【図３ｄ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。様々な抗生物質群の存在下における大腸菌の経管栄養及びＡＴＰ測定の時点を示す図。
【図３ｅ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。ＣＡの存在下における、非免疫マウス（Ｕｎｉｍ；左バー）における又はｐＢＡＤ２８（右バー）及びｐＨＮＤ１０（中央バー）形質転換体に応答する抗大腸菌ＩｇＡの定量。
【図３ｆ】アピラーゼによる分泌抗大腸菌ＩｇＡ応答の効率的な誘導。ＰＳＶの存在下における、非免疫マウス（Ｕｎｉｍ；左バー）における又はｐＢＡＤ２８（右バー）及びｐＨＮＤ１０（中央バー）形質転換体に応答する抗大腸菌ＩｇＡの定量。
【図４】ｐＢＡＤ２８保有大腸菌（中央バー）、ｐＨＮＤ１０保有大腸菌（右バー）、及び対照無菌マウス（ＧＦ；左バー）が単独定着した（ｍｏｎｏｃｏｌｏｎｉｚｅｄ）無菌マウスにおける腔内ＡＴＰレベル。
【図５】ｐＢＡＤ２８保有大腸菌（中央バー）、ｐＨＮＤ１０保有大腸菌（右バー）、及び対照無菌マウス（ＧＦ；左バー）が単独定着した動物におけるＴｆｈ細胞数（左のグラフ）及び胚中心細胞数（右のグラフ）の分析。
【図６】ｐＢＡＤ２８保有大腸菌が単独定着した無菌マウス、ｐＨＮＤ１０保有大腸菌が定着した無菌マウス、及び対照無菌マウス（ＧＦ）由来の合計腸内ＩｇＡ濃度に対してプロットした、ＦＡＣＳによる腸液中の抗大腸菌ＩｇＡの幾何平均。
【図７Ａ】ｐＢＡＤ２８保有非毒性ネズミチフス菌についての経時的な培養培地中のＡＴＰ濃度（棒グラフ）及び細菌増殖（ＯＤ６００）。
【図７Ｂ】ｐＨＮＤ１０保有非毒性ネズミチフス菌についての経時的な培養培地中のＡＴＰ濃度（棒グラフ）及び細菌増殖（ＯＤ６００）。
【図８】対照マウス（左バー）、ｐＨＮＤ１０保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウス（中央バー）、及びｐＢＡＤ２８保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウス（右バー）由来の合計腸内ＩｇＡ濃度に対してプロットした、ＦＡＣＳによる腸液中の抗ネズミチフス菌ＩｇＡの幾何平均。
【図９】対照非免疫マウス（左バー）、ｐＨＮＤ１０保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウス（中央バー）、及びｐＢＡＤ２８保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウス（右バー）におけるＰＰ、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、脾臓、及び肝臓からの毒性サルモネラ菌の回収。ＣＦＵ、コロニー形成単位；ＣＴＲＬ、非免疫マウス。
【図１０ａ】対照未処理マウスと比較した、ｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０を保有する弱毒化サルモネラ菌で免疫し、次いで、毒性サルモネラ菌でチャレンジしたマウスにおける脾臓サイズ。
【図１０ｂ】対照未処理マウス（左バー）、ｐＨＮＤ１０を保有する弱毒化サルモネラ菌で免疫し、次いで、毒性サルモネラ菌でチャレンジしたマウス（中央バー）、及びｐＢＡＤ２８を保有する弱毒化サルモネラ菌で免疫し、次いで、毒性サルモネラ菌でチャレンジしたマウス（右バー）の脾臓重量。ＣＴＲＬ、未処理マウス。
【図１１ａ】ｐＢＡＤ２８を保有する弱毒化サルモネラ菌又はｐＨＮＤ１０を保有する弱毒サルモネラ菌で免疫し、次いで、毒性サルモネラ菌でチャレンジしたマウス及び対照未処理マウスにおける肝臓組織の画像。
【図１１ｂ】ｐＢＡＤ２８を保有する弱毒化サルモネラ菌（右バー）又はｐＨＮＤ１０を保有する弱毒化サルモネラ菌（中央バー）で免疫し、次いで、毒性サルモネラ菌でチャレンジしたマウスにおける肝臓の組織学的スコア。左バーは、対照未処理マウスにおける肝臓の組織学的スコアを示す。
【図１２】毒性ネズミチフス菌を感染させた後に、ｐＨＮＤ１０保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウス（中央バー）、非免疫マウス（ＣＴＲＬ；左バー）、及びｐＢＡＤ２８保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウス（右バー）におけるデキストラン量。
【図１３】毒性サルモネラ菌でチャレンジした４８時間後における、リコンビナーゼ活性化遺伝子−１（Ｒａｇ−１）欠損マウス由来の腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、肝臓、及び脾臓に回収された毒性サルモネラ菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数。非免疫マウス（ＣＴＲＬ）は左バーによって表され、ｐＢＡＤ２８を保有する弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウスは右バーによって表され、ｐＨＮＤ１０を保有する弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウスは中央バーによって表される。
【図１４】未処理マウス（左バー、三角形によって表される）、ｐＢＡＤ２８保有大腸菌由来の周辺質タンパク質で処理したマウス（中央バー、菱形によって表される）、及びｐＨＮＤ１０保有大腸菌由来の周辺質タンパク質で処理したマウスにおける糞便ＩｇＡ濃度。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
マウス及び抗生物質の投与
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びｐ２ｒｘ７−／−（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｐ２ｒｘ７ｔｍ１Ｇａｂ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）マウスをＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｌｌｉｎｚｏｎａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）における特定病原体除去（ｓｐｆ）施設で飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ無菌マウスをＣｌｅａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）における可撓性フィルム隔離飼育器で維持した。抗生物質処理のために、飲用水中で以下の抗生物質群を４週間マウスに与えた：１ｇ／Ｌアンピシリン及び０．５ｇ／Ｌクロラムフェニコール（内因性叢に対しては活性であるが、ｐＢＡＤ２８で形質転換された大腸菌に対しては活性でない殺菌剤群）、又は１ｇ／Ｌストレプトマイシン、１ｇ／Ｌペニシリン、及び０．５ｇ／Ｌバンコマイシン（内因性及びｐＢＡＤ２８で形質転換された細菌の両方に対して殺菌性である）。
【００９５】
ＡＴＰの定量
回腸ＡＴＰを定量するため、腸洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ダイズトリプシン阻害剤、ＰＭＳＦ）１０ｍＬにより洗浄することによって腸内容物を回収し、滅菌チューブ内にて１４’０００ｒｐｍでスピンし、濾過（０．２２μｍ）して、任意の細菌サイズの夾雑物を除去し、直ちにドライアイスで凍結させた。腸洗浄液中のＡＴＰ濃度に希釈係数を乗じて、真の腔内ＡＴＰ濃度を得た。３４Ｇ針による穿刺を通じて胆嚢及び膀胱から胆汁及び尿を回収した。培養下の共生細菌によって分泌されるＡＴＰを定量するために、腸内容物をＢＨＩアガーにプレーティングし、３７℃で１６時間培養した。シングルコロニーをピックし、ＢＨＩブロスで培養した。シングルコロニーの１６時間培養物から得られた培地を遠心分離し（１５，０００×ｇ）、上清を回収し、濾過（０．２２μｍ）した。循環部分におけるＡＴＰを定量するため、下大静脈、頸動脈、及び門静脈、並びに心臓を露出させ、３４Ｇ針による穿刺を通じて血液を回収した。血液を１，０００×ｇで遠心分離し、血清を回収し、１，０００×ｇで２回目の遠心分離を行った。溶血血清は廃棄した。製造業者のプロトコールに従って組み換えホタルルシフェラーゼ及びその基質であるＤ−ルシフェリンを用いた生物発光アッセイによって細胞外ＡＴＰ濃度を評価した。
【００９６】
抗生物質による細菌培養物の処理
アンピシリン（２．５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（１μｇ／ｍＬ）、メトロニダゾール（１μｇ／ｍＬ）を、０．５ＯＤの腸内細菌培養物に添加した。抗生物質を添加した３時間後、４時間後、及び５時間後に細菌培養物から上清を回収し、滅菌チューブ内にて１４’０００ｒｐｍでスピンし、濾過（０．２２μｍ）した。生物発光アッセイによってＡＴＰ濃度を評価した（上記を参照）。
【００９７】
抗体及びフローサイトメトリー
以下のｍＡｂはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した：ビオチンをコンジュゲートした抗ＣＸＣＲ５（クローン２Ｇ８、カタログ番号５５１９６０）及びフィコエリトリン（ＰＥ）をコンジュゲートした抗ＩＣＯＳ（クローン７Ｅ．１７Ｇ９、カタログ番号５５２１４６）から購入した。ＰＥ−Ｃｙ７をコンジュゲートした抗ＣＤ４（Ｃｌｏｎｅ：ＧＫ１．５、カタログ番号１００４２２）及びＡＰＣをコンジュゲートしたストレプトアビジン（カタログ番号４０５２０７）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ。Ｐｅｒｃｐ−ｅＦｌｕｏｒ７１０をコンジュゲートした抗ＣＤ３（クローン：１７Ａ２、カタログ番号４６−００３２−８０）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。アネキシンＶ染色は、製造業者のプロトコールに従ってＢｉｏｌｅｇｅｎｄアネキシンＶ結合バッファ（カタログ番号４２２２０１）（１×１０６細胞／ｍＬ）中で実施した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）又はＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを解析した。
【００９８】
プラスミド
フレキシネル菌の完全長ｐｈｏＮ２：：ＨＡ融合物を、ＰＢＡＤ  Ｌ−アラビノース誘導性プロモータの制御下にあるプラスミドｐＢＡＤ２８（ＡＴＣＣ８７３９３８７４０２）のポリリンカー部位にクローニングして、プラスミドｐＨＮＤ１０（参照文献８）を作製した。
【００９９】
大腸菌による経口免疫及び抗大腸菌ＩｇＡを検出するためのフローサイトメトリー
ｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０で形質転換した大腸菌を、アラビノース（０．３％）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地に無菌的に接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。遠心分離によって細胞を収集し、滅菌ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中２×１０１０ＣＦＵ／ｍＬの密度に濃縮した。細菌懸濁液（３００μＬ中１０１０ＣＦＵ）を胃に経管栄養した。３日間毎に３週間手順を繰り返し、２８日目にマウスを屠殺した。腸洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ダイズトリプシン阻害剤、ＰＭＳＦ）５ｍＬで洗浄することによって腸内容物を回収し、滅菌チューブ内にて１４’０００ｒｐｍでスピンし、濾過（０．２２μｍ）して、任意の細菌サイズの夾雑物を除去した４。抗大腸菌ＩｇＡをフローサイトメトリー分析するために、ＬＢブロス３ｍＬにシングルコロニーを接種し、３７℃で一晩培養した。次いで、培養物を遠心分離し（７，０００ｒｐｍで３分間）、滅菌濾過したＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．００５％ＮａＮ３で３回洗浄し、約１０７細菌／ｍＬの密度で再懸濁させた。次いで、腸内容物及び細菌を混合し、４℃で１時間インキュベートした。細菌を２回洗浄した後、モノクローナルＦＩＴＣ抗マウスＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０４０−０２、作業希釈１：２００）に再懸濁させた。１時間インキュベートした後、細菌を２回洗浄し、対数モードのＦＳＣ及びＳＳＣパラメータを用いてＦＡＣＳＣａｎｔｏで取得するためにＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドに再懸濁させた。分析した各動物について、ＥＬＩＳＡを用いて、大腸菌の表面染色用に用いられる同じ腸洗浄サンプルの未希釈アリコート中の合計ＩｇＡ濃度を求めた。この値を用いて、大腸菌のフローサイトメトリー用に用いられる腸洗浄液の各希釈物における合計ＩｇＡ濃度を計算し、フローサイトメトリーで得られた幾何平均蛍光に対してプロットした。
【０１００】
弱毒化ネズミチフス菌による経口免疫及び抗ネズミチフス菌ＩｇＡを検出するためのフローサイトメトリー
ｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０で形質転換した無毒ｇｙｒＡ１８１６Δｃｙａ１Δｃｒｐ１ネズミチフス菌（ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子に変異を有し、機能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰ受容体タンパク質を産生することができない）（ＡＴＣＣ（登録商標）５３６４８（商標））を、アラビノース（０．０５％）及びクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地に無菌的に接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。遠心分離によって細胞を収集し、滅菌ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中５×１０１０ＣＦＵ／ｍＬの密度に濃縮した。細菌懸濁液（１００μＬ中５×１０９ＣＦＵ）を、３日間毎に３回、正常に定着したＣ５７ＢＬ／６マウスの胃に経管栄養した。ｐＨＮＤ１０形質転換体によりアピラーゼを確実に最大限発現させるために、アラビノース０．０５％を飲用水に添加した。最後の免疫の１ヶ月間後、大腸菌が定着したマウスについて上記した通り、抗サルモネラ菌分泌型ＩｇＡについてマウスを試験した。
【０１０１】
実施例１−正常に定着したマウスにおける大腸菌
共生生物によって産生される細胞外ＡＴＰレベルの検出
細胞外ＡＴＰは、マウス糞便に由来するインビトロで培養された腸内共生生物の上清中で既に検出されている５、６。共生生物の代謝活性が腸内ＡＴＰのレベルに寄与しているかどうかを調べるために、特定病原体除去施設のマウス及び完全無菌マウスにおいて小腸内のＡＴＰレベルを観察した。特定病原体除去マウスではマイクロモル濃度のＡＴＰが検出されたが、完全無菌マウスではＡＴＰがほぼ検出不可能であった。尿、胆汁、及び無菌（又はほぼ無菌）の上皮又は内皮器官由来の血清等の流体は、実質的な量の腔内ＡＴＰを示さないことが見出された（図１（ａ）を参照）。この知見は、共生生物による粘膜定着が細胞外ＡＴＰレベルの増大において役割を果たしていることを示す。
【０１０２】
小腸に存在する細菌がＡＴＰを放出するかどうかを試験するために、マウス回腸から単離された好気性及び嫌気性のコロニーの培養物を培地中のＡＴＰについて試験し、細胞増殖と比較した。図１（ｂ）は、培地中のＡＴＰが細菌増殖に比例して増加することが見出されたことを示す。したがって、これらデータは、小腸に存在する細菌が腔内ＡＴＰの生成に寄与することを示す。
【０１０３】
また、本発明者らは、細菌の細胞死の結果、細胞溶解中のＡＴＰ放出に起因して細胞外ＡＴＰが更に増加するかどうかについても調べた。回腸細菌細胞培養物を、バンコマイシン、アンピシリン、及びメトロニダゾール（ＶＡＭＡ）で処理した。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を用いて細胞死をモニタリングし、参照文献７に記載の通りフローサイトメトリーにおいてＤＩＢＡＣ（ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）トリメチンオキソノール）を用いて膜損傷をモニタリングした。図１（ｄ）〜（ｆ）は、細菌の細胞死及び膜透過性が顕著なＡＴＰ放出に関連していたことを示す。また、ＶＡＭのインビボ経口投与の結果、野生型マウスのパイエル板由来のＴｆｈ細胞におけるホスファチジルセリン露出（細胞死のシグナル）の増加に伴って、図１ｇに示す通り腔内ＡＴＰが急激に且つ著しく増加したが、Ｐ２ｒｘ７−／−マウスでは増加しなかった。これは、殺菌死によるＡＴＰの放出がＰ２Ｘ７を介してＴｆｈ細胞の存在量に影響を与えることを示す。
【０１０４】
ＡＴＰの上皮透過性
小腸におけるＡＴＰの上皮透過性を評価するために、毎日ＡＴＰγＳ（ＡＴＰの非加水分解性アナログ）をマウスに経管栄養した。Ｔｆｈ細胞はＰ２Ｘ７を介して細胞外ＡＴＰに感受性であるので、本発明者らは、処理の２週間後のパイエル板におけるＴｆｈ細胞の回復を分析した。ＡＴＰγＳを投与した結果、野生型マウスではＴｆｈ細胞が著しく減少したが、Ｐ２ｒｘ７−／−マウスでは減少しなかった。この知見は、内腔ＡＴＰがパイエル板を透過することができ、Ｐ２Ｘ７を介してＴｆｈ細胞の存在量に影響を与える得ることを示唆する。
【０１０５】
門静脈又は頸静脈、大静脈及び心臓から回収した血液中のＡＴＰ濃度の分析によって、他のサンプルと比べて門静脈由来の血液中のＡＴＰ濃度が３０倍〜５０倍増加することが明らかになった（図１（ｃ）を参照）。これは、ＡＴＰが小腸に容易に吸収されることを示す。
【０１０６】
アピラーゼを用いる腔内ＡＴＰレベルの低下
本発明者らは、フレキシネル菌９由来のｐＨＮＤ１０（周辺質アピラーゼ（ＡＴＰジホスホヒドロラーゼ）をコードしているｐｈｏＮ２：：ＨＡ融合物８を保有しているｐＢＡＤ２８ベースの組み換えプラスミド）を発現している組み換え大腸菌Ｋ−１２株を用いた。
【０１０７】
大腸菌の増殖に付随して放出される細胞外ＡＴＰは、図２（ａ）及び（ｂ）に示す通り、ｐＨＮＤ１０を保有する細菌において検出不可能であった。これは、アピラーゼがＡＴＰ分泌を効率的に抑制したことを示す。
【０１０８】
ｐＨＮＤ１０を発現している大腸菌がマウスに定着した結果、ＶＡＭ投与後に小腸におけるＡＴＰ濃度が著しく低下した。これは、細菌の細胞死後のＰｈｏＮ２（アピラーゼ）の放出が、腔内ＡＴＰを効率的に加水分解したことを示す。
【０１０９】
抗原特異的免疫応答の増強
ＰｈｏＮ２を用いる抗大腸菌ＩｇＡ応答の増強が、本発明者らによって立証された。ｐＨＮＤ１０プラスミド及びｐＢＡＤ２８プラスミド（アピラーゼＰｈｏＮ２をコードしていない）を保有する大腸菌をＣ５７ＢＩ／６マウスに経管栄養した。ｐＨＮＤ１０（アピラーゼをコードしている）をトランスフェクトした細菌を経管栄養したマウスで、大腸菌特異的ＩｇＡのレベルが著しく増大した。したがって、細菌によるＡＴＰ放出は高親和性ＩｇＡ応答の発現を制限し、立証されている通り、アピラーゼの発現によるＡＴＰレベルの低下は、図２（ｃ）及び３に示すような高親和性ＩｇＡ応答を生じさせる。アピラーゼを発現している細菌によって惹起される抗大腸菌ＩｇＡは、ｐＢＡＤ２８含有細菌及びｐＨＮＤ１０含有細菌の両方に対して等しく反応性であった。これは、アピラーゼが「アピラーゼ特異的」ＩｇＡ応答を促進しなかったことを示す（図２（ｄ）及び（ｅ）を参照）。
【０１１０】
本発明者らは、クロラムフェニコール及びアンピシリン（ＣＡ；内因性叢に対しては活性であるが、ｐＢＡＤ２８で形質転換された大腸菌に対しては活性ではない）又はペニシリン／ストレプトマイシン／バンコマイシン（ＰＳＶ；内因性及びｐＢＡＤ２８で形質転換された細菌の両方に対して殺菌性である）の経口投与後に腔内ＡＴＰ及び抗大腸菌ＩｇＡを測定することによって、高親和性ＩｇＡ応答のためのアジュバントとしてのアピラーゼの役割について調べた。ｐＢＡＤ２８で形質転換された細菌を経管栄養したマウスにおける抗大腸菌ＩｇＡは、腔内ＡＴＰの増加に付随して、ＰＳＶ投与によって減少したが、ＣＡ投与では減少しなかった。腔内ＡＴＰも抗大腸菌ＩｇＡ応答も、ｐＨＮＤ１０を保有する細菌が定着したマウスではＣＡ又はＰＳＶによる影響を受けなかった（図２（ｆ）〜（ｈ）を参照）。
【０１１１】
上に説明した知見は、アピラーゼが送達される、細菌に特異的であることが見出され、即ち、他の細菌種に特異的な大腸菌ＩｇＡ抗体について試験したところ、図２（ｉ）に示す通りｐＢＡＤ２８を保有する大腸菌を投与したときと比べて、ｐＨＮＤ１０を保有する大腸菌をマウスに投与したときに増加は記録されなかった。
【０１１２】
したがって、本明細書に提供されるデータは、アピラーゼ、又はＡＴＰのＰ２Ｘ７受容体への結合レベルを低減することができる別の剤を含む組成物が、前記組成物に含まれる免疫原に対する特異的ＩｇＡ応答を増加させることができることを示す。したがって、本発明の組成物は、ワクチンとして有用であり得る。
【０１１３】
実施例２−無菌単独定着マウスにおける大腸菌
本発明者らは、細胞外ＡＴＰとは別に胃腸内に同量の細菌刺激が存在する制御された環境設定における、腔内ＡＴＰレベル、Ｔｆｈ及び胚中心細胞の数、並びに抗大腸菌ＩｇＡレベルに対するアピラーゼの効果を立証するために、無菌マウスに単独定着させた。
【０１１４】
単独定着マウスにおけるアピラーゼの存在下の腔内ＡＴＰの減少
ｐＨＮＤ１０又はｐＢＡＤ２８で形質転換された大腸菌を無菌マウスに単独定着させた。図４は、ｐＨＮＤ１０保有大腸菌が単独定着したマウスが、ｐＢＡＤ２８保有大腸菌が単独定着したマウス及び対照マウスと比べて、腸内の腔内ＡＴＰ濃度の著しい低下を示したことを示す。大腸菌が定着していない無菌マウスを対照として用いた。
【０１１５】
Ｔｆｈ細胞及び胚中心Ｂ細胞の数は、単独定着マウスにおいてアピラーゼの存在下で増加する
パイエル板における合計細胞数を数え、ＦＡＣＳにおける頻度によってＴｆｈ細胞及びＧＣ  Ｂ細胞の相対存在量を推定することによって、ｐＨＮＤ１０又はｐＢＡＤ２８のいずれかで形質転換された大腸菌が単独定着した無菌マウスを、Ｔｆｈ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋）の数及び胚中心Ｂ細胞（ＣＤ１９＋Ｆａｓ＋ＰＮＡ＋）の数について試験した。図５は、ｐＢＡＤ２８保有大腸菌が単独定着しているマウス又は対照マウスと比べて、ｐＨＮＤ１０保有大腸菌が単独定着しているマウスでは，Ｔｆｈ細胞及び胚中心Ｂ細胞の数が増加したことを示す。
【０１１６】
この知見は、小腸のパイエル板におけるＴｆｈ細胞及び胚中心Ｂ細胞の制御において腔内ＡＴＰが役割を有することと一致している。ｐＨＮＤ１０保有大腸菌で発現したアピラーゼの存在が腔内ＡＴＰのレベルを低下させ、これによってＡＴＰがＴｆｈ細胞及び胚中心細胞の数を減少させるのが阻止される。
【０１１７】
抗大腸菌ＩｇＡは、単独定着マウスにおいてアピラーゼの存在下で増加する
ｐＨＮＤ１０又はｐＢＡＤ２８のいずれかで形質転換された大腸菌が単独定着している無菌マウスを、上記の通り抗大腸菌ＩｇＡについて試験した。図６は、ｐＢＡＤ２８が単独定着しているマウス又は対照マウスと比べて、ｐＨＮＤ１０が単独定着しているマウスにおいて大腸菌特異的ＩｇＡのレベルが著しく増加したことを示す。
【０１１８】
この知見は、アピラーゼの存在の結果として産生されるＩｇＡが、アピラーゼと同時に投与された免疫原に特異的であることを確認する。
【０１１９】
実施例３−正常に定着したマウスにおける弱毒化ネズミチフス菌
アピラーゼを発現するネズミチフス菌の作製
肝臓弱毒化ネズミチフス菌におけるアピラーゼ発現が特異的ＩｇＡ応答を増加させ、毒性株による感染からの保護を増強し得るかどうかを調べるために、本発明者らは、モデルワクチンとして無毒ｇｙｒＡ１８１６Δｃｙａ１Δｃｒｐ１ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ（登録商標）５３６４８（商標））（ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子に変異を含み、機能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰ受容体タンパク質を産生することができない）を用いた。本発明者らは、上記の通り、ｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０のいずれかでネズミチフス菌を形質転換した。大腸菌で観察される通り、図７は、ｐＨＮＤ１０を保有する（したがって、アピラーゼを発現する）ネズミチフス菌の培養培地ではＡＴＰが検出不可能であった（図７ｂを参照）が、ｐＢＡＤ２８を保有する（したがって、アピラーゼを発現しない）ネズミチフス菌では細菌細胞密度と相関して増加する量で検出された（図７ａを参照）ことを示す。
【０１２０】
抗ネズミチフス菌ＩｇＡはアピラーゼの存在下で増加する
ｐＨＮＤ１０又はｐＢＡＤ２８のいずれかで形質転換した無毒ネズミチフス菌５×１０９個を３日間毎に３回経管栄養することによって、正常に定着したマウスを免疫した。動物の飲用水にアラビノース０．０５％を添加して、免疫中にｐＨＮＤ１０形質転換体によってアピラーゼを確実に最大限発現させた。最後の免疫の１ヶ月間後、大腸菌が定着したマウスについて上記した通り、抗サルモネラ菌分泌型ＩｇＡについてマウスを試験した。図８は、ｐＢＡＤ２８を保有する弱毒化ネズミチフス菌又は対照マウスと比べて、ｐＨＮＤ１０を保有する弱毒化ネズミチフス菌で経口免疫したマウスにおいて、サルモネラ菌特異的ＩｇＡ応答が著しく増加したことを示す。
【０１２１】
この知見は、アピラーゼの存在の結果として産生されるＩｇＡが、アピラーゼと同時に投与された免疫原に特異的であることを確認する。
【０１２２】
アピラーゼを保有する弱毒化ネズミチフス菌による免疫は、毒性ネズミチフス菌に対する保護を提供する
共生細菌叢による定着抵抗性は、毒性ネズミチフス菌の感染を制限する。対照的に、ストレプトマイシンでマウスを前処理すると、腸炎及腸チフスを効率的に発現させる。最後の免疫の１ヶ月間後にストレプトマイシンを投与した際に５×１０７個の毒性サルモネラ菌（Ｓ．Ｔｍｗｔ：ストレプトマイシンに対して抵抗性のＳＢ３００サルモネラ・エンテリカ血清型Ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＬ１３４４（野生型）、参照文献１０に開示）による感染から保護する能力について、ｐＨＮＤ１０又はｐＢＡＤ２８のいずれかで形質転換された弱毒化ネズミチフス菌によるマウスの免疫を試験した。ｐＨＮＤ１０を保有する無毒サルモネラ菌で既に免疫されているマウスに感染させた結果、感染の４８時間後にｐＢＡＤ２８形質転換体で免疫したマウス又は対照非免疫マウスと比較したとき、パイエル板からの毒性サルモネラ菌の回収が著しく減少し、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、脾臓、及び肝臓において毒性サルモネラ菌がほぼ検出不可能なレベルになった（図９を参照）。
【０１２３】
これは、ｐＢＡＤ２８含有ネズミチフス菌で免疫したマウス又は非免疫マウスと比べて、ｐＨＮＤ１０含有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウスにおいて感染後の病態生理学的変化の減少が観察されたことと一致している。図１０は、未処理マウスの対照脾臓と比べて、ｐＢＡＤ２８保有ネズミチフス菌で免疫した感染マウスでは脾臓のサイズ及び重量が大きく増大したが、ｐＨＮＤ１０保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫した感染マウスでは増大しなかったことを示す。図１１は、未処理マウスの対照肝臓と比べて、ｐＢＡＤ２８保有ネズミチフス菌で免疫した感染マウスでは肝臓の組織診断が悪化したが、ｐＨＮＤ１０保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫した感染マウスでは悪化しなかったことを示す。
【０１２４】
ｐＨＮＤ１０含有弱毒化ネズミチフス菌で免疫した結果毒性サルモネラ菌から保護されることを本発明者らが立証した更なる方法は、毒性サルモネラ菌による感染が胃腸内皮バリアの漏出を引き起こす程度をモニタリングすることによるものであった。この漏出は、経管栄養によってマウスに投与されたデキストランに対する胃腸の透過性を分析することによってモニタリングした。この目的のために、無毒サルモネラ菌で免疫したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５×１０７個の毒性サルモネラ菌を経口感染させ、７０ｋＤａ  ＦＩＴＣ−デキストラン５ｍｇを経管栄養した。４時間後、末梢血を回収し、血清中のフルオロフォアの存在について試験した。各値から、未処理マウスから回収された血清のバックグラウンド蛍光値を減じた。
【０１２５】
毒性サルモネラ菌感染の作用から有効に保護されたマウスは、デキストランの胃腸の透過性を示さず、したがって、かかるマウス由来の血清は、デキストランをそれほど含有しておらず、マウスは毒性サルモネラ菌感染の作用を受けた（即ち、それほど効率的に保護されなかった）。
【０１２６】
図１２は、対照非免疫マウス及びｐＢＡＤ２８保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウスと比べて、毒性ネズミチフス菌に感染させた後にｐＨＮＤ１０保有弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウス由来の血清が含有するデキストランの量が著しく減少したことを示す。これら結果は、アピラーゼ発現細菌による免疫によって提供されたＩｇＡ応答が、サルモネラ菌の全身伝播からの保護を付与することを示す。
【０１２７】
適応ＩｇＡはアピラーゼの存在下で観察された保護に関与している
本発明者らは、下記免疫が成熟Ｂ又はＴリンパ球を産生することができないマウスに対して有する効果を観察するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて上記した通り、ｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０のいずれかを保有する弱毒化ネズミチフス菌でリコンビナーゼ活性化遺伝子−１（Ｒａｇ−１）欠損マウスを免疫した。（ｐＨＮＤ１０を保有する弱毒化ネズミチフス菌で免疫したマウスにおける）対照非免疫マウス又は毒性サルモネラ菌によるチャレンジの４８時間後にｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０を保有するネズミチフス菌で免疫したマウスに由来する腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、肝臓、及び脾臓に回収された毒性サルモネラ菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数が同等であることによって図１３に示されているように、アピラーゼの存在の結果、毒性サルモネラ菌による感染からの保護は増強されなかった。これら結果は、リンパ球（例えば、適応ＩｇＡ）が野生型マウスにおいて観察された免疫による保護に関与していることを示す。
【０１２８】
本発明は、一例として説明しただけであり、本発明の範囲及び趣旨の範囲内で変更を行い得ることが理解される。
【０１２９】
実施例４−細菌担体の形態の免疫原の非存在下におけるアピラーゼ組成物によるマウスの処理
周辺質タンパク質の抽出
ｐＢＡＤ２８又はｐＨＮＤ１０で形質転換された大腸菌を、アラビノース（０．３％）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地に無菌的に接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。細菌（１０１１個）を４℃で２０分間６，０００ｒｐｍでスピンし、ＰＢＳで２回洗浄し、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０％スクロース、及び０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム１ｍＬに再懸濁させ、３０℃で３分間インキュベートし、次いで、最終濃度１０ｍＭになるようにＭｇＣｌ２を添加し、３０℃で１時間細菌をインキュベートした。細菌懸濁液を４℃で１０分間１０’０００ｒｐｍで遠心分離し、上清（即ち、周辺質タンパク質）１００μＬをＣ５７ＢＬ／６マウスに経管栄養によって投与した。
【０１３０】
アピラーゼを保有する大腸菌由来の周辺質タンパク質で処理したマウスにおいて糞便ＩｇＡが増加した
未処理マウス又はアラビノース誘導性のｐＢＡＤ２８（空ベクター）若しくはｐＨＮＤ１０（アピラーゼ保有ベクター）大腸菌形質転換体由来の周辺質タンパク質を１５日間毎日経管栄養したマウスにおいて、糞便ＩｇＡ濃度を測定した。
【０１３１】
図１４は、未処理マウス又は非アピラーゼ含有組成物で処理したマウスと比較して、アピラーゼ含有組成物で処理したマウスの糞便ＩｇＡが増加したことを示す。これらデータは、アピラーゼが、（ｐＢＡＤ２８形質転換体由来の周辺質タンパク質によってＩｇＡ濃度が変化しないことによって示される通り）胃腸内及び細菌担体の形態の免疫原の非存在下で、免疫学的に不活性な組成物内でＩｇＡ免疫応答を提供できることを示す。
【０１３２】
参照文献
［１］  Ｐｒｏｉｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１，７８９−８０１
［２］  Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ．４２４：２５１    
［３］  Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２．
［４］  Ｈａｐｆｅｌｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）
［５］  Ａｔａｒａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５５，８０８−８１２
［６］  Ｉｗａｓｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８，１９４９−１９５１
［７］  Ｍａｕｒｉｃｅ，Ｃ．Ｆ．  ＆  Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｐ．Ｊ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５３１，９１−１０７
［８］  Ｓｃｒｉｂａｎｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ９，ｅ９０２３０
［９］  Ｓａｎｔａｐａｏｌａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８８，１６２０−１６２７
［１０］  Ｈｏｉｓｅｔｈ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｂ．Ａ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９１：２３８−２３９
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図２ｉ】
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【図３ａｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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