【手続補正書】
【提出日】平成19年10月24日(2007.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なるsiRNAから生物中の標的遺伝子をサイレンシングするための1以上のsiRNAを選択する方法であって、該複数の異なるsiRNA中の異なる各siRNAは標的遺伝子の転写産物中の異なる標的配列を標的化するものであり、該方法が、
(a)該転写産物中の対応する標的配列モチーフの位置塩基組成に従って該複数の異なるsiRNAを順位付けすること、その際、前記標的配列モチーフのそれぞれは、対応するsiRNAの標的配列の少なくとも一部分、及び/又は標的配列にフランキングする配列領域中の第2配列を含むものであり、並びに
(b)該順位付けしたsiRNAから１以上のsiRNAを選択すること、
を含む上記方法。
【請求項２】
前記標的配列モチーフのそれぞれが、前記対応するsiRNAの標的配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記順位付け工程を、
(a1)前記異なる各siRNAについてスコアを決定すること、その際、該スコアは位置特異的スコア行列を用いて算出され；及び
(a2)該スコアに従って複数の異なるsiRNAを順位付けすること、
によって実施する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記標的配列モチーフのそれぞれが、Lヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Lは整数であり、前記位置特異的スコア行列が{log(eij/pij)}である、
[ここで、eijは位置jにおけるヌクレオチドiの重みであり、pijはランダム配列中の位置jにおけるヌクレオチドiの重みであり、そしてi=G、C、A、U(T)であり、j=1,…,Lである]
請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記標的配列モチーフのそれぞれが、Lヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Lは整数であり、前記位置特異的スコア行列が｛log(eij/pij)｝である、
[ここで、eijは位置jにおけるヌクレオチドiの重みであり、pijはランダム配列中の位置jにおけるヌクレオチドiの重みであり、そしてi=G又はC、A、U(T)であり、j=1,…,Lである]
請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前記異なる各siRNAについてのスコアが、式：
【数１】
2007512808.tif 000001
[ここで、et及びptはそれぞれ、前記位置特異的スコア行列に従って決定された前記標的配列モチーフのそれぞれ中の、及びランダム配列中の位置tにおけるヌクレオチドの重みである]
に従って算出される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記標的配列モチーフのそれぞれが、前記対応するsiRNAの標的配列と少なくとも1つのフランキング配列とを含む、請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的配列モチーフのそれぞれが、前記対応するsiRNAの標的配列と5'フランキング配列と3'フランキング配列とを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記5'フランキング配列と前記3'フランキング配列とが、それぞれDヌクレオチドの配列であり、Dが整数である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的配列のそれぞれが19ヌクレオチドの配列であり、前記5'フランキング配列と3'フランキング配列とが、それぞれ10ヌクレオチドの配列である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的配列のそれぞれが19ヌクレオチドの配列であり、前記5'フランキング配列と3'フランキング配列とが、それぞれ50ヌクレオチドの配列である、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
サイレンシング特異性に基づいて1以上のsiRNAを選択する工程をさらに含み、サイレンシング特異性に基づいて選択する該工程が、
(i)工程(b)で2以上のsiRNAを選択した際に各siRNAについて、複数の遺伝子の中から前記選択した各siRNAの標的外（off-target）遺伝子を予測すること、その際、該標的外遺伝子が前記標的遺伝子以外の遺伝子であり、かつ前記選択した各siRNAによって直接サイレンシングされるものであり；
(ii)前記選択した各siRNAの標的外遺伝子の数に従って該2以上のsiRNAを順位付けすること；及び
(iii)所与の閾値未満の前記標的外遺伝子の数について該順位付けした2以上のsiRNAから1以上のsiRNAを選択すること、
を含む請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記予測が、
(i1)予め決定したsiRNA配列適合パターンに基づいて前記複数の遺伝子についてそれぞれの遺伝子の配列を評価すること；及び
(i2)それぞれの前記遺伝子が、前記予め決定したsiRNA配列適合パターンに基づいて前記各siRNAと適合する配列を含む場合に、それぞれの該遺伝子を標的外遺伝子として予測すること、
を含む請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記評価工程が、前記siRNAの、遺伝子中の配列とのアライメントを低ストリンジェントなFastaアライメントによって同定することを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記各siRNAが、その二本鎖領域にLヌクレオチドを有し、その際、前記予め決定したsiRNA配列適合パターンが位置適合位置特異的スコア行列（pmPSSM）によって表され、該位置適合位置特異的スコア行列が標的外転写産物中の転写産物配列位置と適合する、siRNA中の異なる位置の重み｛Pi｝
[ここで、i=1,…,Lであり、Piは位置iにおける適合の重みである]
からなる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（i1）が式：
【数２】
2007512808.tif 000002
[ここで、位置iが適合する場合は、Ei＝Piであり、位置iが適合しない場合は、Ei＝（1-Pi）/3である]
に従って位置適合スコアpmScoreを算出することを含み、前記工程(i2)が該位置適合スコアが所与の閾値より大きい場合にそれぞれの該遺伝子を標的外遺伝子として予測することを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
Lが19であり、前記pmPSSMの重みが表Iで得られる、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の遺伝子が、前記生物固有の、前記標的遺伝子以外の公知の全ての遺伝子を含む、請求項12〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記位置特異的スコア行列（PSSM）を、
(aa)19ヌクレオチドの二本鎖領域と選択した閾値を超えるサイレンシング効果とを有するsiRNAからなる複数のN siRNAを同定すること；
(bb)前記N siRNAのそれぞれについて機能的配列モチーフを同定すること、ここで、該機能的配列モチーフは、前記N siRNAのそれぞれの19ヌクレオチドの標的配列と、10ヌクレオチドの5'フランキング配列と、10ヌクレオチドの3'フランキング配列とを含むものである；
(cc)式：
【数３】
2007512808.tif 000003
[ここで、δik(j)は、kとiが等しい場合には1であり、kとiが等しくない場合には0である]
に従って、該機能的配列モチーフに基づいて頻度行列｛fij｝を算出すること、ここでi=G、C、A、U(T)であり、j=1，2,…，Lであり、そしてfijは第j番目の位置におけるiヌクレオチドの頻度である、及び
(dd)式：
【数４】
2007512808.tif 000004
に従ってeijを算出することでPSSMを決定すること、
を含む方法によって取得する、請求項10に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数のN siRNAが、細胞中の異なる転写産物量を示す複数の異なる遺伝子を標的化する、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記順位付け工程を、前記異なる各siRNAについてスコアを決定することによって実施し、前記工程(b)を、最大スコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施する、請求項3〜11及び15〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記順位付け工程を、前記異なる各siRNAについてスコアを決定することによって実施し、前記工程(b)を、規定の値に最も近似する前記スコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施し、その際、該規定の値が複数のsiRNA配列モチーフの最大中央値サイレンシング効果に対応するスコア値である、請求項3〜11及び15〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数のsiRNA配列モチーフが、細胞当たり約3〜5コピー未満の存在レベルを有する転写産物中の配列モチーフである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記順位付け工程を、前記異なる各siRNAについてスコアを決定することによって実施し、前記工程(b)を、規定の範囲内の前記スコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施し、該規定の範囲は所与のレベルのサイレンシング効果をそれぞれが有する複数のsiRNA配列モチーフに対応するスコア範囲である、請求項3〜11及び15〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記サイレンシング効果が約100nMのsiRNA濃度で50％、75％又は90％を超える、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数のsiRNA配列モチーフが、細胞当たり約3〜5コピー未満の存在レベルを有する転写産物中の配列モチーフである、請求項24又は25に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数のN siRNAが少なくとも10、50、100、200又は500個の異なるsiRNAを含む、請求項19〜26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記位置特異的スコア行列（PSSM）を、
(aa)該PSSMをランダムな重みで初期化すること；
(bb)(aa)で得た重みwijをランダムに選択すること；
(cc)選択した前記重みの値を変えて、改変値を有する前記選択した重みを含む試験psPSSMを作成すること；
(dd)式：
【数５】
2007512808.tif 000005
[ここで、wk及びpkはそれぞれ、前記機能的配列モチーフ中の及びランダム配列中の、位置におけるヌクレオチドの重みである]
に従って、該試験psPSSMを用いて、複数のsiRNA機能的配列モチーフ中のそれぞれのsiRNA機能的配列モチーフについてスコアを算出すること；
(ee)該複数のsiRNA機能的配列モチーフ間で、該試験スコアとsiRNAの特徴の測定基準との相関関係を算出すること；
(ff)選択した重みの異なる複数の値について所与の範囲で工程(cc)〜(ee)を繰り返し、選択した該重みの最大の相関に対応する値を保持すること；及び
(gg)工程（bb）〜（ff）を選択した回数繰り返して、該PSSMを決定すること
を含む方法によって取得する、請求項3〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
(i)前記測定基準において異なる値を有するsiRNAからなる複数のsiRNAを同定すること；
(ii)それぞれが該複数のsiRNA中の1つのsiRNAに対応する、複数のsiRNA機能的配列モチーフを同定すること;及び
を含む方法によって、該複数のsiRNA機能的配列モチーフを選択することをさらに含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記特徴がサイレンシング効果である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数のsiRNAが、細胞中の異なる転写産物量を示す複数の異なる遺伝子を標的化する、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記工程(b)を最大スコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施する、請求項29〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程(b)を、規定の値に最も近似するスコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施し、その際、該規定の値が複数のsiRNA配列モチーフの最大中央値サイレンシング効果に相当するスコア値である、請求項29〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数のsiRNA機能的配列モチーフが、細胞当たり約3〜5コピー未満の存在レベルを有する転写産物中の配列モチーフである、請求項29〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
前記工程(b)を、規定の範囲内のスコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施し、該規定の範囲は所与のレベルのサイレンシング効果をそれぞれが有する複数のsiRNA配列モチーフに対応するスコア範囲である、請求項29〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
前記サイレンシング効果が約100nMのsiRNA濃度で50％、75％または90％を超える、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数のsiRNA機能的配列モチーフが、細胞当たり約3〜5コピー未満の存在レベルを有する転写産物中の配列モチーフである、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数のsiRNAが少なくとも10、50、100、200又は500個の異なるsiRNAを含む、請求項30〜37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
前記位置特異的スコア行列（PSSM）がwkを含み、k=1,…,Lであり、wkは第1型のsiRNA及び第2型のsiRNA間の、配列位置kでヌクレオチドG又はCを発見する確率の差異であり、前記スコアが式：
【数６】
2007512808.tif 000006
に従って算出される、請求項28に記載の方法。
【請求項４０】
前記第1型のsiRNAが第1の閾値以上のサイレンシング効果を有する1以上のsiRNAからなり、第2型のsiRNAが第2の閾値未満のサイレンシング効果を有する1以上のsiRNAからなる、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記確率の差異がガウス曲線の和によって記述され、該ガウス曲線はそれぞれ、各配列位置でG又はCを発見する確率の差異を表す、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記第1及び第2の閾値が100nMのsiRNA濃度でいずれも75％である、請求項41に記載の方法。