(57)【要約】  表面を有し、分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカ体を含むナノ担体が記載されている。ナノ担体はまた、表面をコーティングする脂質二重層、及びリン脂質二重層内のカーゴ捕捉剤を含む。リン脂質二重層は、多数の空孔を安定的に密閉する。カーゴ捕捉試薬は、薬物などの所望のカーゴと相互作用するように選択され得る。
2019501198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を有し、かつ分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカナノ粒子；
前記表面をコーティングする脂質二重層；
前記多数の空孔を構成する空孔内のカーゴ捕捉剤；及び
前記空孔内で前記カーゴ捕捉剤と会合する、薬物を含むカーゴ
を含むナノ粒子薬物担体であって、
サブミクロン構造が１ミクロン未満の最大寸法を有し、前記脂質二重層が多数の空孔を安定的に密閉する、前記ナノ粒子薬物担体。
【請求項２】
前記脂質二重層がリン脂質、コレステロール（ＣＨＯＬ）、及びｍＰＥＧリン脂質を含む、請求項１に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３】
前記リン脂質が、Ｃ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する飽和脂肪酸、及び／またはＣ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する不飽和脂肪酸、及び／またはＣ１２〜Ｃ２０炭素鎖を有する脂肪酸の混合物を含む天然脂質を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジアクチルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）からなる群から選択される飽和脂肪酸を含む、請求項３に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項５】
前記リン脂質が、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、及び大豆ホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）からなる群から選択される天然脂質を含む、請求項３に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項６】
前記リン脂質が、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンからなる群から選択される不飽和脂肪酸を含む、請求項３に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項７】
前記脂質二重層が、リン脂質Ｃ１４〜Ｃ１８炭素鎖、及び約３５０Ｄａ〜５０００Ｄａの範囲のＰＥＧ分子量を有するｍＰＥＧリン脂質を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項８】
前記脂質二重層が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を含む、請求項７に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項９】
前記脂質二重層がＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧまたはＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、請求項２のナノ粒子薬物担体。
【請求項１０】
前記脂質二重層がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、請求項９に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項１１】
前記脂質二重層がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む、請求項１０に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項１２】
前記脂質二重層が、リン脂質、コレステロール、及びｍＰＥＧリン脂質を、リン脂質５０〜９０ｍｏｌ％：ＣＨＯＬ１０〜５０ｍｏｌ％：ｍＰＥＧリン脂質１〜１０ｍｏｌ％の比で含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項１３】
前記脂質二重層が、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを約３：２：０．１５のモル比で含む、請求項１０に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項１４】
前記脂質二重層が、前記ナノ粒子全体を包囲する実質的に連続的な二重層を形成している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項１５】
前記脂質二重層が、前記ナノ粒子全体を包囲する実質的に均一かつ無傷の二重層を形成している、請求項１〜１４のいずれか１項に記載ナノ粒子薬物担体。
【請求項１６】
前記シリカナノ粒子がメソ多孔性シリカナノ粒子である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項１７】
前記メソ多孔性シリカナノ粒子がコロイド的に安定している、請求項１６に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項１８】
前記メソ多孔性シリカが：
約１〜約２０ｎｍ、または約１〜約１０ｎｍ、または約２〜約８ｎｍの範囲である平均空孔サイズを有し；かつ
約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約５０〜約２００ｎｍ、または約５０〜約１５０ｎｍ、または約５０〜約１００ｎｍ、または約５０〜約８０ｎｍ、または約５０〜約７０ｎｍ、または約６０〜約７０ｎｍの範囲の平均サイズを有する、請求項１６〜１７のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項１９】
前記薬物との反応前のカーゴ捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４、アンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、及びトリエチルアンモニウム塩からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２０】
前記薬物との反応前のカーゴ捕捉剤がトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、請求項１９に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２１】
前記薬物が、前記空孔内で、ＳＯＳ８−と会合したゲル様沈澱物としてプロトン化及び捕捉されている、請求項２０に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２２】
前記薬物が、プロトン化され得る少なくとも１個の弱塩基性基を含み、前記カーゴ捕捉剤が少なくとも１個の陰イオン基を含む；及び／または
前記薬物が、７を上回り、かつ１１を下回るｐＫａを有するように選択される；及び／または
前記薬物が、第一級、第二級、及び第三級アミンを含む；及び／または
前記薬物が、約５〜約２５ｍｇ／ｍＬの水溶性指数を有するように選択される；及び／または
前記薬物が、約−３．０〜約３．０のオクタノール／水分配係数またはｌｏｇＰ値を有するように選択される；及び／または
前記薬物が、前記シリカナノ粒子の空孔の平均または中央サイズよりも小さいように選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２３】
前記カーゴが抗がん薬を含む、請求項２２に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２４】
前記カーゴがイリノテカンを含む、請求項２３に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２５】
前記カーゴが、トポイソメラーゼ阻害薬、抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、有糸分裂阻害薬、アルカロイド、アルカリ性アルキル化薬、プリンまたはピリミジン誘導体、及びプロテインキナーゼ阻害薬からなる群から独立に選択される１つまたは複数の薬物を含む、請求項２３に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２６】
前記担体が、トポテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、ビノレルビン、ＬＡＱ８２４、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビノレルビン、シクロフォスファミド、メクロレタミン、テモゾロミド、５−フルオロウラシル、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ゲムシタビン、イマチニブ、オシメルチニブ及びスニチニブパゾパニブ、エンザスタウリン、バンデタニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、及びニロチニブからなる群から選択される薬物を含む、請求項２５に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２７】
標的化部分、融合性ペプチド、及び輸送ペプチドからなる群から選択される部分にコンジュゲートしている、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２８】
がん細胞または腫瘍血管上の受容体に結合するペプチドにコンジュゲートしている、請求項２７に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項２９】
ｉＲＧＤペプチドにコンジュゲートしている、請求項２８に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３０】
表２に示されている標的化ペプチドにコンジュゲートしている、請求項２８に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３１】
トランスフェリン、及び／またはＡｐｏＥ、及び／または葉酸にコンジュゲートしている、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３２】
がんマーカーに結合する抗体を含む標的化部分にコンジュゲートしている、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３３】
表１に示されているがんマーカーに結合する抗体を含む標的化部分にコンジュゲートしている、請求項３２に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３４】
前記カーゴが、抗生物質、抗ウイルス薬、または抗真菌薬を含む、請求項２２に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３５】
前記カーゴが、シプロフロキサシン、及びレボフロキサシンからなる群から選択される抗生物質を含む；ならびに／または
前記カーゴが、テノフォビル、ジソプロキシル、及びフマラートからなる群から選択される抗ウイルス薬を含む；ならびに／または
前記カーゴが、アンホテリシンＢ、アニデュラファンギン、カスポファンギン、フルコナゾール、フルシトシン、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ミカファンギン、ポサコナゾール、及びボリコナゾールからなる群から選択される抗真菌薬を含む、請求項３４に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３６】
ｐＨ７．４を有する生物学的緩衝液中で、３７℃で、２４時間にわたって約２０％未満、または約１５％未満、または約１０％未満、または約５％未満の前記カーゴの漏出を示す、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３７】
少なくとも約８ｗ／ｗ％、または少なくとも約１０ｗ／ｗ％、または少なくとも約２０ｗ／ｗ％、または少なくとも約３０ｗ／ｗ％、または約４０ｗ／ｗ％超、または約５０ｗ／ｗ％超、または約６０ｗ／ｗ％超、または約７０ｗ／ｗ％超、または約８０ｗ／ｗ％超の薬物負荷容量を有する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３８】
少なくとも８０ｗ／ｗ％の薬物負荷容量を有する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項３９】
前記脂質二重層が疎水性薬物を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４０】
前記脂質二重層が、パクリタキセル、エリプチシン、カンプトテカン、ＳＮ−３８、及び脂質プロドラッグ（例えば、アシクロビルジホスファートジミリストイルグリセロール、ドキソルビシンがコンジュゲートしたリン脂質プロドラッグ、ヌクレオシド類似体のリン脂質誘導体、リン脂質が結合したクロラムブシルなど）からなる群から選択される疎水性薬物を含む、請求項３９に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４１】
前記脂質二重層がパクリタキセルを含む、請求項３９に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４２】
懸濁液中の前記薬物担体が、４℃で貯蔵した場合に少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月、または少なくとも４カ月、または少なくとも５カ月、または少なくとも６カ月にわたって安定している、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４３】
懸濁液中の前記薬物担体の集団が：
幅において約３０ｎｍ未満、または約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満、または約５ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満、または約２ｎｍ未満のサイズ分布範囲（半値全幅）を示す；及び／または
実質的に単峰性のサイズ分布を示す；及び／または
約０．２未満、または約０．１未満のＰＤＩを示す；及び／または
サイズにおいて約０．１未満または約０．０５未満、または約１．７／１２０未満の変動係数を示す、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４４】
前記ナノ粒子薬物担体の約３％以上が、ＩＶ注射で腫瘍部位を現像するために分布している、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４５】
前記ナノ粒子薬物担体が、凍結乾燥後の再水和で、安定な懸濁液を形成する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４６】
抗がん薬を負荷された場合に、同所ＰＤＡＣモデルにおいて、遊離薬物、または前記薬物を含有するリポソームよりも有効ながん細胞死滅をもたらす、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４７】
抗がん薬を負荷された場合に、遊離薬物及び／またはリポソーム中の薬物と比較すると、薬物毒性の低下を示す、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４８】
ｐＨ７．４を有する生理液中でコロイド安定性を有し、全身生体内分布を可能にする単分散性のままであり、かつ血管漏出（ＥＰＲ効果）またはトランスサイトーシスによって疾患部位に進入することができる、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項４９】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載の多数のナノ粒子薬物担体；及び
薬学的に許容される担体
を含む、医薬製剤前記製剤。
【請求項５０】
乳剤、分散剤、または懸濁剤である、請求項４９に記載の製剤。
【請求項５１】
前記懸濁剤、乳剤、または分散剤が、４℃で貯蔵した場合に少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月、または少なくとも４カ月、または少なくとも５カ月、または少なくとも６カ月にわたって安定している、請求項５０に記載の製剤。
【請求項５２】
前記製剤中の前記ナノスケール薬物担体が、実質的に単峰性のサイズ分布を示す；及び／または
前記懸濁剤、乳剤、または分散剤中の薬物担体が、約０．２未満、または約０．１未満のＰＤＩを示す、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５３】
静脈内投与、動脈内投与、脳内投与、髄腔内投与、経口投与、エアロゾル投与、吸入を介する投与（鼻腔内及び気管内送達を含む、カニューレを介しての頭蓋内投与、ならびに皮下または筋肉内デポー沈着からなる群から選択される経路による投与のために製剤化されている、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５４】
無菌注射用製剤である、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５５】
単位投与製剤である、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５６】
それを必要とする対象に、請求項１〜３３もしくは３６〜４８のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体、または請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の医薬製剤の有効量を投与することを含み、前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤中の薬物が抗がん薬を含む、がんを処置する方法。
【請求項５７】
前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤が、化学療法薬レジメンにおける一次治療である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤が多剤化学療法レジメンの１成分である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記多剤化学療法レジメンが、イリノテカン（ＩＲＩＮ）、オキサリプラチン（ＯＸ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及びロイコボリン（ＬＶ）からなる群から選択される少なくとも２つの薬物、または少なくとも３つの薬物、または少なくとも４つの薬物を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記がんが、膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）である、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記がんが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、カポジ肉腫、リンパ腫）、肛門癌、虫垂癌、神経膠星状細胞腫、非定型奇形様／横紋筋肉腫様腫瘍、胆管癌、肝外癌、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳幹膠腫、脳腫瘍（例えば、神経膠星状細胞腫、脳及び脊髄腫瘍、脳幹膠腫、中枢神経系非定型奇形様／横紋筋肉腫様腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系生殖細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、類癌腫（例えば、小児期、胃腸）、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、例えば（胆管、肝臓外）、腺管上皮内癌（ＤＣＩＳ）、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、食道癌、感覚神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、骨の線維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（例えば、卵巣癌、睾丸癌、頭蓋外癌、生殖腺外癌、中枢神経系）、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹癌、ヘアリーセル白血病、頭頚部癌、心臓癌、肝細胞（肝）癌、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎臓細胞、ウィルムス腫瘍、及び他の腎臓腫瘍）、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、ヘアリーセル白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌（原発性）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌（例えば、小児期、非小細胞、小細胞）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット（例えば、非ホジキンリンパ腫）、皮膚Ｔ細胞（例えば、菌状息肉症、セザリー症候群）、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系（ＣＮＳ））、マクログロブリン血症、ワルデンストローム、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、黒色腫（例えば、小児期、眼内（目））、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性扁平上皮頸部癌、正中線管癌腫、口腔癌、多発性内分泌腺腫症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口唇及び口咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵臓神経内分泌腫瘍（島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞種、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞（腎臓）癌、腎盂及び尿管、移行細胞癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（例えば、ユーイング、カポジ、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚癌（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌、基底細胞癌、非黒色腫）、小腸癌、扁平上皮細胞癌、潜在性原発を伴う扁平上皮頸部癌、胃癌、睾丸癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがんである、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ナノ粒子薬物担体がｉＲＧＤペプチドにコンジュゲートしておらず、前記ナノ粒子薬物担体をｉＲＧＤペプチドと併せて投与する、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
それを必要とする対象に、請求項１〜２２もしくは３４〜３５のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体、または請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の医薬製剤の有効量を投与することを含み、前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤中の薬物が抗微生物薬を含む、感染を処置する方法。
【請求項６４】
前記感染が、薬剤耐性細菌、ウイルス、または真菌による感染を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
前記ナノ粒子薬物担体及び／または医薬製剤を、静脈内投与、動脈内投与、脳内投与、髄腔内投与、経口投与、エアロゾル投与、吸入を介する投与（鼻腔内及び気管内送達を含む、カニューレを介しての頭蓋内投与、ならびに皮下または筋肉内デポー沈着からなる群から選択される経路によって投与する、請求項５６〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ナノ粒子薬物担体及び／または医薬製剤を、注射として、ＩＶドリップバッグから、または薬物送達カニューレを介して投与する、請求項５６〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象がヒトである、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が非ヒト哺乳類である、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
ナノ粒子薬物担体を作成する方法であって、
表面を有し、薬物分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカを含むナノ粒子を得ること；
捕捉剤を、前記多数の空孔を構成する空孔に配置すること（この際、前記捕捉剤は、前記薬物を前記空孔内に捕捉するその能力で選択される）；
前記ナノ粒子の空孔を脂質二重層でコーティングすること；及び
脂質二重層でコーティングされた前記ナノ粒子を、前記二重層を通過することができる薬物と接触させるか、またはそれで浸漬すること（この際、前記薬物が前記空孔に進入し、前記捕捉剤と反応し、前記二重層の内部に保持される）を含む、前記方法。
【請求項７０】
前記脂質二重層が、リン脂質、コレステロール（ＣＨＯＬ）、及びｍＰＥＧリン脂質を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記リン脂質が、Ｃ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する飽和脂肪酸、及び／またはＣ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する不飽和脂肪酸、及び／またはＣ１２〜Ｃ２０炭素鎖を有する脂肪酸の混合物を含む天然脂質を含む、請求項６９〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジアクチルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）からなる群から選択される飽和脂肪酸を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記リン脂質が、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、及び大豆ホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）からなる群から選択される天然脂質を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記リン脂質が、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンからなる群から選択される不飽和脂肪酸を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記脂質二重層が、リン脂質Ｃ１４〜Ｃ１８炭素鎖、及び約３５０Ｄａ〜５０００Ｄａの範囲のＰＥＧ分子量を有するｍＰＥＧリン脂質を含む、請求項６９〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記脂質二重層が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を含む、請求項７５に記載のナノ粒子薬物担体。
【請求項７７】
前記脂質二重層がＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧまたはＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
前記脂質二重層がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記脂質二重層がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記脂質二重層が、リン脂質、コレステロール、及びｍＰＥＧリン脂質を、リン脂質５０〜９０ｍｏｌ％：ＣＨＯＬ１０〜５０ｍｏｌ％：ｍＰＥＧリン脂質１〜１０ｍｏｌ％の比で含む、請求項６９〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記脂質二重層が、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを約３：２：０．１５のモル比で含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記脂質二重層を構成する脂質を、前記ナノ粒子と、前記ナノ粒子全体にわたって連続的な二重層が形成するために十分な比で組み合わせる、請求項６９〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記脂質二重層を構成する脂質を、前記ナノ粒子と、約１．０：３．０からの範囲の粒子：脂質比で組み合わせる、請求項６９〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記脂質二重層を構成する脂質を、前記ナノ粒子と、約１．０：１．１の粒子：脂質比で組み合わせる、請求項６９〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記脂質二重層が、前記ナノ粒子全体を包囲する実質的に連続的な二重層を形成する、請求項６９〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記脂質二重層が、前記ナノ粒子全体を包囲する実質的に均一かつ無傷の二重層を形成する、請求項６９〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記シリカナノ粒子がメソ多孔性シリカナノ粒子である、請求項６９〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記シリカナノ粒子がゾル−ゲル合成されたメソ多孔性シリカナノ粒子を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記メソ多孔性シリカが、約１〜約２０ｎｍ、または約１〜約１０ｎｍ、または約２〜約８ｎｍの範囲である平均空孔サイズを有する；及び／または
前記メソ多孔性シリカナノ粒子が、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約５０〜約２００ｎｍ、または約５０〜約１５０ｎｍ、または約５０〜約１００ｎｍ、または約５０〜約８０ｎｍ、または約５０〜約７０ｎｍ、または約６０〜約７０ｎｍの範囲の平均サイズを有する、請求項６９〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記薬物との反応前のカーゴ捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４、アンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、及びトリエチルアンモニウム塩からなる群から選択される、請求項６９〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記薬物との反応前のカーゴ捕捉剤がトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記薬物が、前記空孔内で、ＳＯＳ８−と会合したゲル様沈澱物としてプロトン化及び捕捉されている、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記薬物が、プロトン化され得る少なくとも１個の弱塩基性基を含み、前記カーゴ捕捉剤が少なくとも１個の陰イオン基を含む；及び／または
前記薬物が、７を上回り、かつ１１を下回るｐＫａを有するように選択される；及び／または
前記薬物が、第一級、第二級、及び第三級アミンを含む；及び／または
前記薬物が、約５〜約２５ｍｇ／ｍＬの水溶性指数を有するように選択される；及び／または
前記薬物が、約−３．０〜約３．０のオクタノール／水分配係数またはｌｏｇＰ値を有するように選択される；及び／または
前記薬物が、前記シリカナノ粒子の空孔の平均または中央サイズ未満のサイズを有する、請求項６９〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記カーゴが抗がん薬を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記カーゴがイリノテカンを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記カーゴが、トポイソメラーゼ阻害薬、抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、有糸分裂阻害薬、アルカロイド、アルカリ性アルキル化薬、プリンまたはピリミジン誘導体、プロテインキナーゼ阻害薬からなる群から独立に選択される１つまたは複数の薬物を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記担体が、トポテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、ビノレルビン、及びＬＡＱ８２４、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビノレルビン、シクロフォスファミド、メクロレタミン、テモゾロミド、５−フルオロウラシル、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ゲムシタビン、イマチニブ、オシメルチニブ及びスニチニブパゾパニブ、エンザスタウリン、バンデタニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、及びニロチニブからなる群から選択される薬物を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記薬物担体が、標的化部分、融合性ペプチド、及び輸送ペプチドからなる群から選択される部分にコンジュゲートしている、請求項６９〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載のナノ粒子薬物担体を生成する、請求項６９〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記薬物担体が、がん細胞上の受容体に結合するペプチドにコンジュゲートしている、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記薬物担体がｉＲＧＤペプチドにコンジュゲートしている、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記薬物担体が、表２に示されている標的化ペプチドにコンジュゲートしている、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記薬物担体が、トランスフェリン、及び／またはＡｐｏＥ、及び／または葉酸にコンジュゲートしている、請求項９８〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記薬物担体が、がんマーカーに結合する抗体を含む標的化部分にコンジュゲートしている、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記薬物担体が、表１に示されているがんマーカーに結合する抗体を含む標的化部分にコンジュゲートしている、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記カーゴが抗生物質を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記カーゴが、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、及びＨＩＶ抗レトロウイルス薬（例えば、テノフォビル、ジソプロキシル、フマラートなど）からなる群から選択される抗生物質を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記薬物担体が、少なくとも約３０ｗ／ｗ％、または約４０ｗ／ｗ％超、または約５０ｗ／ｗ％超、または約６０ｗ／ｗ％超、または約７０ｗ／ｗ％超、または約８０ｗ／ｗ％超の容量まで負荷されている、請求項６９〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記薬物担体が、少なくとも８０ｗ／ｗ％の容量まで負荷されている、請求項６９〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記脂質二重層が疎水性薬物を含む、請求項６９〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記脂質二重層が、パクリタキセル、エリプチシン、カンプトテカン、ＳＮ−３８、及び脂質プロドラッグ（例えば、アシクロビルジホスファートジミリストイルグリセロール、ドキソルビシンがコンジュゲートしたリン脂質プロドラッグ、ヌクレオシド類似体のリン脂質誘導体、リン脂質が結合したクロラムブシルなど）からなる群から選択される疎水性薬物を含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記脂質二重層がパクリタキセルを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
イリノテカンナノ担体を作成する方法であって、
イリノテカンをその中に収容するために適した多数の空孔を含む表面を有するシリカ体を含むナノ担体を得ること、
イリノテカンを捕捉するその能力で選択された薬剤を前記多数の空孔内に配置すること；
前記ナノ担体の空孔を、リン脂質二重層でコーティングすること（任意選択で、音波処理プロセスを使用）；及び
イリノテカンを、前記リン脂質二重層コーティングされた空孔に導入して、リン脂質二重層コーティングされたイリノテカンナノ担体を作成することを含む、前記方法。
【請求項１１４】
前記シリカ体が、ゾル−ゲル合成され、サイズ制御され、かつコロイド的に安定なシリカ体を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記イリノテカン捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ナノ担体が
（ａ）少なくとも２０ｗ／ｗ％（または３０ｗ／ｗ％または４０ｗ／ｗ％）のイリノテカン負荷容量を有する；及び／または
（ｂ）ｐＨ７．４を有する生物学的緩衝液中で、３７℃で、２４時間にわたって＜５％（または＜１０％）のイリノテカン漏出を示す、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ナノ担体が、ｐＨ７．４を有する生理液中でコロイド安定性を有し、全身生体内分布を可能にする単分散性のままであり、かつ血管漏出（ＥＰＲ効果）またはトランスサイトーシスによって疾患部位に進入することができる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記リン脂質二重層がコレステロール及び／またはパクリタキセルを含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
ナノ担体を作成する方法であって、
表面を有し、かつ分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカ体と、前記表面をコーティングするリン脂質二重層とを含む未負荷ナノ担体を得ること；
カーゴ捕捉剤を前記リン脂質二重層内に封入することを含む、前記方法。
【請求項１２０】
前記ナノ担体を、前記カーゴ捕捉剤と相互作用するように選択されたカーゴに曝露することをさらに含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記カーゴが、７を上回り、かつ１１を下回るｐＫａを有し、プロトン化され得るように選択され、前記カーゴ捕捉剤が、少なくとも１個の陰イオン基を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記カーゴがイリノテカンであり、前記カーゴ捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記カーゴが、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポテカン；１つもしくは複数の抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、ドキソルビシン及びミトキサントロン；１つもしくは複数の有糸分裂阻害薬、ビンブラスチン及びビノレルビン；または１つもしくは複数のチロシン−キナーゼ阻害薬イマチニブ、オシメルチニブ及びスニチニブである、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ナノ担体が、少なくとも３０ｗ／ｗ％の薬物負荷容量を有する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
表面を有し、かつ分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカ体；
前記表面をコーティングするリン脂質二重層；及び
前記リン脂質二重層内のカーゴ捕捉剤を含み；
サブミクロン構造が１ミクロン未満の最大寸法を有し、前記リン脂質二重層が前記多数の空孔を安定的に密閉している、ナノ担体。
【請求項１２６】
さらに、カーゴを前記リン脂質二重層内に含む、請求項１２５に記載のナノ担体。
【請求項１２７】
前記カーゴが前記カーゴ捕捉剤と会合している、請求項１２６に記載のナノ担体。
【請求項１２８】
前記カーゴが、プロトン化され得る少なくとも１個の弱塩基性基を含み、前記カーゴ捕捉剤が少なくとも１個の陰イオン基を含む；及び／または
前記カーゴが、７を上回り、かつ１１を下回るｐＫａを有するように選択される；及び／または
前記カーゴが、第一級、第二級、第三級または第四級アミンを含む；及び／または
前記カーゴが、約５〜約２５ｍｇ／ｍＬの水溶性指数を有するように選択される；及び／または
前記カーゴが、約−３．０〜約３．０のオクタノール／水分配係数またはｌｏｇＰ値を有するように選択される；及び／または
前記カーゴが、２〜８ｎｍであり、前記ナノ粒子の空孔のサイズ未満であるように選択される、請求項１２７に記載のナノ担体。
【請求項１２９】
前記カーゴがイリノテカンであり、前記カーゴ捕捉剤がトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、請求項１２６に記載のナノ担体。
【請求項１３０】
前記カーゴが、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポテカン；１つもしくは複数の抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、ドキソルビシン及びミトキサントロン；１つもしくは複数の有糸分裂阻害薬、ビンブラスチン及びビノレルビン；または１つもしくは複数のチロシン−キナーゼ阻害薬イマチニブ、オシメルチニブ及びスニチニブである、請求項１２６に記載のナノ担体。
【請求項１３１】
ｐＨ７．４を有する生物学的緩衝液中で、３７℃で、２４時間にわたって５％未満のカーゴ漏出を有する、請求項１２６に記載のナノ担体。
【請求項１３２】
少なくとも３０ｗ／ｗ％、または少なくとも８０ｗ／ｗ％の薬物負荷容量を有する、請求項１２６に記載のナノ担体。
【請求項１３３】
前記リン脂質二重層がパクリタキセルを含む、請求項１２５に記載のナノ担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月８日出願の米国特許出願第６２／２７６，６３４号の利益及びそれに対する優先権を主張し、その出願は、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の言明
本発明は、米国国立衛生研究所／米国国立がん研究所によって授与された認可番号Ｒ０１  ＣＡ１３３６９７及びＵＯｌ  ＣＡｌ９８８４６の下で、政府支援により成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）は、５年生存率が６％未満である致命的な疾患である（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．６４（１）：９−２９）。現在、化学療法での主要な処置レジメンは、単一試薬、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、または４剤レジメン、）のいずれかを含む。ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸは、ＧＥＭよりも良好な奏効率（３１．６％に対して９．４％）を、改善された生存（１１カ月に対して６．８カ月）と共に有するが、前者の組合せは、毒性がかなり高く、良好なパフォーマンスステータスを有する少数のＰＤＡＣ患者に限定される（Ｃｏｎｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６４（１９）：１８１７−１８２５）。イリノテカンが、骨髄（例えば、好中球減少症）、肝臓（例えば、壊死及び脂肪症）及び胃腸（ＧＩ）管（例えば、嘔吐、下痢）に対する重篤な影響を含む、この毒性にかなり寄与している（Ｃｏｎｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６４（１９）：１８１７−１８２５；Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９（４）：４４７−４５４；Ｌｏｕｐａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０８（１２）：２５４９−２５５６）。したがって、ＰＤＡＣでの第一選択治療のために利用可能な薬物を改善することを目的として、イリノテカン毒性を改善する処置レジメンに対する多大な要求が存在する。
【０００４】
有効性を維持しながらイリノテカン毒性を低下させるためのアプローチの１つは、全身的な薬物放出を低減しながら、がん部位へと保護送達することを伴う、ナノ担体への高用量薬物封入である。ポリマー粒子及びリポソームを含む種々の担体種が使用されており、イリノテカン送達が多少成功している（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９５（４）：４０５−４０８；Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｂｕｌｌ．２６（１）：１１６−１１９；Ｍｅｓｓｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１０（１９）：６６３８−６６４９；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７；Ｖａｌｅｎｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｎｏｍｅｄ．８（５）：６８７−６９８；Ｓａｄｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１２７（１）：９９−１０６；Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．６８（３）：６０７−６１７；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａｄｖ．Ｆｕｎｃ．Ｍａｔ．２５（５）：７８８−７９８）。しかしながら、ポリマーナノ粒子は有望なインビトロ結果、イリノテカンを負荷する限られた容量（＜１ｗ／ｗ％）及び早期薬物放出（例えば、５時間で４０％）を示す一方で、このナノ粒子は、腫瘍内薬物送達を改善しながらも、必要な毒性低下を達成することはできなかった（Ｖａｌｅｎｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｎｏｍｅｄ．８（５）：６８７−６９８）。リポソームは、硫酸アンモニウムまたはプロトン捕捉剤の使用によって、高いイリノテカン負荷容量を達成することができた（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９５（４）：４０５−４０８；Ｍｅｓｓｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１０（１９）：６６３８−６６４９；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７；Ｓａｄｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１２７（１）：９９−１０６；Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．６８（３）：６０７−６１７）、せん断及び浸透ストレス下での担体不安定性、さらには血清タンパク質による二重層の破壊は、早期薬物放出及び毒性をもたらした（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎ：Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ，１７２（１−３）：５７−６７；Ｈｅｕｒｔａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２３）：４２８３−４３００；Ｓａｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｅｕｒ．Ｐｈｙｓ．Ｊ．Ｅ．２０（４）：４０１−４０８）。
【０００５】
上記のとおり、治験または治療状況において制がん薬を送達するための多くの試みは、リポソーム（Ｍｅｓｓｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１０（１９）：６６３８−６６４９；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，６６，３２７１）またはポリマーベースの系（Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６（１）：１１６−１１９）をベースとしている。これらの担体の多くは、球形粒子であるか、または超分子が８０〜２００ｎｍの範囲のサイズに集合しており、多くの場合に、循環半減期を延長するために表面上にＰＥＧコーティングを含有し、かつ典型的には、約５ｗ／ｗ％（例えば、ポリマーベースのナノ粒子）〜約５０ｗ／ｗ％（例えば、リポソーム担体）の負荷容量を示す。前臨床レベルでは、マウスＰＤＡＣモデルを含む動物研究におけるこれらのナノ担体の潜在的な利益は、インビボ毒性の低下、抗腫瘍有効性の増強、及び生存率の改善を含むことが示されている。
【０００６】
しかしながら、少数のナノ担体しか、ＰＤＡＣ患者のための治験に進んでいない。イオノフォアを含むナノ担体（Ａ２３１８７、カリマイシンとしても公知）は、イリノテカン送達リポソーム製剤（Ｉｒｉｎｏｐｈｏｒｅ  Ｃ）及びプロトン化剤（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）イリノテカン送達リポソーム製剤（ＭＭ−３９８）（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４：７２６０−７２７１；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（６６）：３２７１−３２７７）を可能にした。Ｉｒｉｎｏｐｈｏｒｅ  Ｃ製剤（Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、イオノフォア、Ａ２３１８７、または硫酸アンモニウムを使用して、膜貫通プロトン勾配の生成による能動的イリノテカン負荷を利用するリポソーム担体である（Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．６８：６０７−６１７）。Ｉｒｉｎｏｐｈｏｒｅ  Ｃ製剤は、２０１１年に始まった臨床試験で使用されたが、試験または結果の成果についての情報は更新されていない。
【０００７】
最新の第３相治験で、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋによるイリノテカン用のリポソーム担体（ＭＭ−３９８）の開発が、第２選択処置オプションとして、ＰＤＡＣにおいて延命効果の改善を示したが、比較的高率のＧＩ管及び骨髄毒性が、重篤かつ生命を脅かす下痢及び好中球減少症についての黒枠警告を招いた（Ｖｏｎ  Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０９（４）：９２０−９２５；ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓｅｖｅｎｔｓ／ｎｅｗｓｒｏｏｍ／ｐｒｅｓｓａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ／ｕｃｍ４６８６５４．ｈｔｍ）。ＭＭ−３９８治験に参加したヒト対象も、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を含む肝臓酵素の有意な上昇を示した（例えば、ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１５／２０７７９３ＬＢ．ｐｄｆを参照されたい）。それにもかかわらず、ＭＭ−３９８は、ＧＥＭ療法に対して応答し得ない患者についてＰＤＡＣで使用するためのＦＤＡの承認を得て、Ｏｎｉｖｙｄｅ（登録商標）として販売されている（例えば、ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓｅｖｅｎｔｓ／ｎｅｗｓｒｏｏｍ／ｐｒｅｓｓａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ／ｕｃｍ４６８６５４．ｈｔｍを参照されたい）。
【０００８】
ＭＭ−３９８リポソーム製剤（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ポリアニオン系捕捉剤の援助で塩酸イリノテカンを組み込んでいる（ＥＳＭＯ  Ｇｌ  ２０１４，ｗｗｗ．ｍｅｒｒｉｍａｃｋｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ）。より具体的には、ＭＭ−３９８リポソームへのイリノテカン負荷は、多価アニオン系捕捉剤であるトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）のリポソーム内薬物封入によって達成された。この薬品は、受動的薬物封入によって達成され得る負荷の１０倍超のイリノテカンプロトン化及び捕捉をもたらす（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６（６）：３２７１−３２７７）。ＭＭ−３９８リポソームのＩＶ投与は、転移性腫瘍病巣の阻害を含めて、マウスにおける様々なＰＤＡＣ腫瘍モデルで完全な腫瘍退縮を誘導することが示されている（Ｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．（２１０２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（１２  Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ａ６３）。ＭＭ−３９８は現在、第３相治験中であり、動物及びヒト試験において、遊離イリノテカンと比較して、腫瘍阻害、薬物動態及び有効性の改善をもたらすと主張している（Ｋａｌｒａ（２０１２）ＡＡＣＲ  ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃５６２２）。これは、マウス異種移植片試験において２０ｍｇ／ｋｇの用量のＭＭ−３９８（ヒト等価用量６０〜１２０ｍｇ／ｍ２）を使用しての完全なＰＤＡＣ退縮を主張する実験データを含む（Ｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．（２１０２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（１２  Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ａ６３）。ＭＭ−３９８はまた、マウスにおいて遊離イリノテカンの最大耐量（ＭＴＤ）を８０から３２４ｍｇ／ｋｇに増加させる（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６（６）：３２７１−３２７７）。加えて、４１７人のＰＤＡＣ患者を含むＭｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによる第３相治験で（Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．ＥＳＭＯ  ＧＩ  ２０１４，ｗｗｗ．ｍｅｒｒｉｍａｃｋｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ）、ＭＭ−３９８、５−ＦＵ及びロイコボリンの組合せは、６．１か月の全生存期間（ＯＳ）をもたらしたが、これは、５−ＦＵ及びロイコボリンを与えられた対照アームよりも１．９カ月長い。しかしながら、ＭＭ−３９８リポソーム製剤へのイリノテカンの能動的負荷は受動的封入手順よりも薬物負荷容量を増強するが、この合成技術は多数のステップを必要とし、リポソーム担体は、本明細書において提供するＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームと比較して、同じコロイド安定性または同量の細胞内放出を提供することはない。それにもかかわらず、ＭＭ−３９８は、ＧＥＭ療法に対して応答し得ない患者についてＰＤＡＣで使用するためのＦＤＡの承認を得て、ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）として販売されている。リポソームへの薬物捕捉を増加させるためのポリアニオン系ポリマーの使用は、約８０ｎｍの薬物沈殿をもたらし（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）３９（１）：１３８−１４２；Ｃｏｌｂｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１２）：３０７７−３０８２）、このことが、ＬＢ−ＭＳＮＰ空孔と比較���て、ゆっくりとしたイリノテカンのリポソーム担体からの放出の理由の１つを構成している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８，９９２，９８４Ｂ１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、安全範囲の改善及び毒性の低下を伴って、イリノテカン化学療法などの化学療法を含む効率的な薬物送達を可能にするナノ担体及び送達方法がなお、満たされずに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）の５年生存率を改善するために、緊急に介入することが必要とされている。４剤レジメンであるＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（イリノテカン（ＩＲＩＮ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、オキサリプラチン（ＯＸ）、及びロイコボリン（ＬＶ）から構成される）は、より頻繁に使用されるゲムシタビン（ＧＥＭ）よりも良好な生存結果を有するが、前者の処置レジメンは、高度に毒性であり、良好なパフォーマンスステータスを有する患者における使用に制限される。イリノテカンが、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ毒性（骨髄及び胃腸管）に著しく寄与するので、本発明の具体的な目的の１つは、前者の薬物の毒性を、特注設計されたメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）プラットフォームで低下させることであり、この特注設計されたメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）プラットフォームは、コーティングされた脂質二重層（ＬＢ）を越えての高用量イリノテカン負荷のためにプロトン勾配を使用する。例えば、免疫適格性マウスにおけるＫｒａｓ由来同所ＰＤＡＣモデルにおいてリポソーム同等物と比較した場合に、ＬＢコーティングされたＭＳＮＰ（ＬＢ−ＭＳＮＰ）担体の安定性の改善は、より良好に保護されたイリノテカン送達及び腫瘍薬物濃度の上昇を可能にする。ＬＢ−ＭＳＮＰナノ担体は、腫瘍転移を処置するためにも、より効率的である。同様に重要なことに、ＬＢ−ＭＳＮＰ担体による漏出の減少及びよりゆっくりとした薬物放出速度が、リポソーム担体と比較して、骨髄、胃腸及び肝臓毒性の率を劇的に減少させる。ＬＢ−ＭＳＮＰ担体による高い有効性及び毒性の低下の組合せは、第一選択治療としてのイリノテカンの使用を促進して、ＰＤＡＣ生存を改善する。
【００１２】
概して、本発明の一態様では、表面を有し、かつ分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカ体と、表面をコーティングする脂質二重層（例えば、リン脂質二重層）と、コーティングされた脂質二重層によって空孔中に含まれるカーゴ捕捉剤とを含むナノ担体であって、サブミクロン構造が１ミクロン未満の最大寸法を有し、リン脂質二重層が多数の空孔を安定的に密閉し、かつ追加のパッケージング、標的化、イメージング、及び機能化のためのベースとして役立ち得るナノ担体を提供する。
【００１３】
本発明の重要な一態様は、改善されたカーゴ／薬剤（例えば、イリノテカンまたは本明細書に記載の化学構造を有する他の分子（複数可））ナノ担体を作成する新たな方法を含む。これらの方法は概して、分子をその中に収容するために適した多数の空孔を備えた表面を有するシリカ体を含む未負荷ナノ担体を得ることと、脂質二重層（例えば、リン脂質二重層）によってカーゴ捕捉剤、標的化剤、またはイメージング剤を空孔内に封入することとを含む。以下で詳細に論述するとおり、実施例には、これだけに限られないが、濃縮イリノテカンナノ担体を作成する新たな方法が含まれる。特定の実施形態では、これらの方法は、イリノテカンをその中に収容するために適した多数の空孔を含む表面を有するシリカ体を含むナノ担体を選択することを含む。これらの方法では、イリノテカン分子の拡散に特異的に影響を及ぼす、及び／またはそれを捕捉する能力を有する薬剤（例えば、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート）も選択し、それを多数の空孔内に配置する。ナノ担体及び空孔は、脂質二重層で完全にコーティングされる（例えば、音波処理プロセスを使用）。典型的には、シリカ体ナノ担体を乾燥させない、及び／またはこのコーティングステップの直前に洗浄する。任意選択で、特定の実施形態では、この脂質二重層は、ナノ担体機能を促進するように選択された１つまたは複数の生理活性分子を含み得る（ポリエチレングリコール、及び／または標的化リガンド、及び／またはパクリタキセル及び／または活性化イリノテカン、ＳＮ３８など）。次いで、このコーティングステップの後に、イリノテカンは、脂質二重層を越えて空孔内に移動することができ、そこで捕捉される。これは、「遠隔薬物負荷（ｒｅｍｏｔｅ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ」としても知られている。この方法で、驚くべき高い負荷容量を有するイリノテカンナノ担体（例えば、４０重量％または４０％超の薬物／ＭＳＮＰ）が形成され得る。これらの高い薬物負荷容量に加えて、これらの方法を使用して形成されるイリノテカンナノ担体は、一群の他の望ましい特性を有し、例えば、ｐＨ７．４を有する生物学的緩衝液中で、３７℃で、２４時間にわたって＜５％のイリノテカン漏出を示す。
本明細書において企図される様々な実施形態には、これらだけに限られないが、次の１つまたは複数が含まれ得る。
【００１４】
実施形態１：
表面を有し、かつ分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカナノ粒子；
表面をコーティングする脂質二重層；
前記多数の空孔を構成する空孔内のカーゴ捕捉剤；及び
前記空孔内で前記カーゴ捕捉剤と会合する、薬物を含むカーゴ
を含むナノ粒子薬物担体であって、
サブミクロン構造が１ミクロン未満の最大寸法を有し、脂質二重層が多数の空孔を安定的に密閉する、ナノ粒子薬物担体。
【００１５】
実施形態２：前記脂質二重層がリン脂質、コレステロール（ＣＨＯＬ）、及びｍＰＥＧリン脂質を含む、実施形態１のナノ粒子薬物担体。
【００１６】
実施形態３：前記リン脂質が、Ｃ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する飽和脂肪酸、及び／またはＣ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する不飽和脂肪酸、及び／またはＣ１２〜Ｃ２０炭素鎖を有する脂肪酸の混合物を含む天然脂質を含む、実施形態１〜２のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００１７】
実施形態４：前記リン脂質が、ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジアクチル（ｄｉａｃｔｙｌ）ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）からなる群から選択される飽和脂肪酸を含む、実施形態３のナノ粒子薬物担体。
【００１８】
実施形態５：前記リン脂質が、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、及び大豆ホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）からなる群から選択される天然脂質を含む、実施形態３のナノ粒子薬物担体。
【００１９】
実施形態６：前記リン脂質が、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンからなる群から選択される不飽和脂肪酸を含む、実施形態３のナノ粒子薬物担体。
【００２０】
実施形態７：前記脂質二重層が、リン脂質Ｃ１４〜Ｃ１８炭素鎖、及び約３５０Ｄａ〜５０００Ｄａの範囲のＰＥＧ分子量を有するｍＰＥＧリン脂質を含む、実施形態１〜６のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００２１】
実施形態８：前記脂質二重層が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を含む、実施形態７のナノ粒子薬物担体。
【００２２】
実施形態９：前記脂質二重層がＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧまたはＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、実施形態２のナノ粒子薬物担体。
【００２３】
実施形態１０：前記脂質二重層がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、実施形態９のナノ粒子薬物担体。
【００２４】
実施形態１１：前記脂質二重層がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む、実施形態１０のナノ粒子薬物担体。
【００２５】
実施形態１２：前記脂質二重層が、リン脂質、コレステロール、及びｍＰＥＧリン脂質を、リン脂質５０〜９０ｍｏｌ％：ＣＨＯＬ１０〜５０ｍｏｌ％：ｍＰＥＧリン脂質１〜１０ｍｏｌ％の比で含む、実施形態１〜１１のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００２６】
実施形態１３：前記脂質二重層が、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを約３：２：０．１５のモル比で含む、実施形態１０のナノ粒子薬物担体。
【００２７】
実施形態１４：前記脂質二重層が、ナノ粒子全体を包囲する実質的に連続的な二重層を形成している、実施形態１〜１３のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００２８】
実施形態１５：前記脂質二重層が、ナノ粒子全体を包囲する実質的に均一かつ無傷の二重層を形成している、実施形態１〜１４のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００２９】
実施形態１６：前記シリカナノ粒子がメソ多孔性シリカナノ粒子である、実施形態１〜１５のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００３０】
実施形態１７：前記シリカナノ粒子がゾル−ゲル合成されたメソ多孔性シリカナノ粒子を含む、実施形態１６のナノ粒子薬物担体。
【００３１】
実施形態１８：前記メソ多孔性シリカナノ粒子がサイズ制御されている、実施形態１６〜１７のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００３２】
実施形態１９：前記メソ多孔性シリカナノ粒子がコロイド的に安定している、実施形態１６〜１８のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００３３】
実施形態２０：前記メソ多孔性シリカが、約１〜約２０ｎｍ、または約１〜約１０ｎｍ、または約２〜約８ｎｍの範囲である平均空孔サイズを有する、実施形態１６〜１９のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００３４】
実施形態２１：前記メソ多孔性シリカナノ粒子が、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約５０〜約２００ｎｍ、または約５０〜約１５０ｎｍ、または約５０〜約１００ｎｍ、または約５０〜約８０ｎｍ、または約５０〜約７０ｎｍ、または約６０〜約７０ｎｍの範囲の平均サイズを有する、実施形態１〜２０のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００３５】
実施形態２２：前記薬物との反応前のカーゴ捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４、アンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、及びトリエチルアンモニウム塩からなる群から選択される、実施形態１〜２１のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００３６】
実施形態２３：前記カーゴ捕捉剤が（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む、実施形態２２のナノ粒子薬物担体。
【００３７】
実施形態２４：前記カーゴ捕捉剤が、硫酸アンモニウム；アンモニウムスクロースオクタスルファート、アンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、アンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、アンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、リン酸アンモニウム；アンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、アンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、アンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、クエン酸アンモニウム、及び酢酸アンモニウムからなる群から選択されるアンモニウム塩を含む、実施形態２２のナノ粒子薬物担体。
【００３８】
実施形態２５：前記カーゴ捕捉剤が、トリメチルアンモニウムスルファート、トリメチルアンモニウムスクロースオクタスルファート、トリメチルアンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムホスファート、トリメチルアンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムシトラート、及びトリメチルアンモニウムアセタートからなる群から選択されるトリメチルアンモニウム塩を含む、実施形態２２に記載のナノ粒子薬物担体。
【００３９】
実施形態２６：前記カーゴ捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスルファート、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート、トリエチルアンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムホスファート、トリエチルアンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムシトラート、及びトリエチルアンモニウムアセタートからなる群から選択されるトリエチルアンモニウム塩を含む、実施形態２２のナノ粒子薬物担体。
【００４０】
実施形態２７：前記薬物との反応前のカーゴ捕捉剤がトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、実施形態２２のナノ粒子薬物担体。
【００４１】
実施形態２８：前記薬物が、前記空孔内で、ＳＯＳ８−と会合したゲル様沈澱物としてプロトン化及び捕捉されている、実施形態２７のナノ粒子薬物担体。
【００４２】
実施形態２９：前記薬物が、プロトン化され得る少なくとも１個の弱塩基性基を含み、カーゴ捕捉剤が少なくとも１個の陰イオン基を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００４３】
実施形態３０：前記薬物が、７を上回り、かつ１１を下回るｐＫａを有するように選択される、実施形態１〜２９のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００４４】
実施形態３１：前記薬物が、第一級、第二級、及び第三級アミンを含む、実施形態１〜３０のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００４５】
実施形態３２：前記薬物が、約５〜約２５ｍｇ／ｍＬの水溶性指数（ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）を有するように選択される、実施形態１〜３１のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００４６】
実施形態３３：カーゴが、約−３．０〜約３．０のオクタノール／水分配係数またはｌｏｇＰ値を有するように選択される、実施形態１〜３２のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００４７】
実施形態３４：カーゴが２〜８ｎｍであり、シリカナノ粒子の空孔の平均または中央サイズ未満であるように選択される、実施形態１〜３３のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００４８】
実施形態３５：前記カーゴが抗がん薬を含む、実施形態２９〜３４のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００４９】
実施形態３６：前記カーゴがイリノテカンを含む、実施形態３５のナノ粒子薬物担体。
【００５０】
実施形態３７：前記カーゴが、トポイソメラーゼ阻害薬、抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、有糸分裂阻害薬、アルカロイド、アルカリ性アルキル化薬、プリンまたはピリミジン誘導体、及びプロテインキナーゼ阻害薬からなる群から独立に選択される１つまたは複数の薬物を含む、実施形態３５のナノ粒子薬物担体。
【００５１】
実施形態３８：前記担体が、トポテカンを含むトポイソメラーゼ阻害薬を含む、実施形態３７のナノ粒子薬物担体。
【００５２】
実施形態３９：前記担体が、トポテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、ビノレルビン、及びＬＡＱ８２４からなる群から選択されるアルカロイドを含む、実施形態３７のナノ粒子薬物担体。
【００５３】
実施形態４０：前記担体が、ドキソルビシン、及びミトキサントロンからなる群から選択される抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質を含む、実施形態３７のナノ粒子薬物担体。
【００５４】
実施形態４１：前記担体が、ビンブラスチン、及びビノレルビンからなる群から選択される有糸分裂阻害薬を含む、実施形態３７のナノ粒子薬物担体。
【００５５】
実施形態４２：前記担体が、シクロフォスファミド、メクロレタミン、及びテモゾロミドからなる群から選択されるアルカリ性アルキル化薬を含む、実施形態３７のナノ粒子薬物担体。
【００５６】
実施形態４３：前記担体が、５−フルオロウラシル、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、及びゲムシタビンからなる群から選択されるプリンまたはピリミジン誘導体を含む、実施形態３７のナノ粒子薬物担体。
【００５７】
実施形態４４：前記担体が、イマチニブ、オシメルチニブ及びスニチニブパゾパニブ、エンザスタウリン、バンデタニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、及びニロチニブからなる群から選択されるプロテインキナーゼ阻害薬を含む、実施形態３７のナノ粒子薬物担体。
【００５８】
実施形態４５：標的化部分、融合性ペプチド、及び輸送ペプチドからなる群から選択される部分にコンジュゲートしている、実施形態１〜４４のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００５９】
実施形態４６：がん細胞または腫瘍血管上の受容体に結合するペプチドにコンジュゲートしている、実施形態４５のナノ粒子薬物担体。
【００６０】
実施形態４７：ｉＲＧＤペプチドにコンジュゲートしている、実施形態４６のナノ粒子薬物担体。
【００６１】
実施形態４８：表２に示されている標的化ペプチドにコンジュゲートしている、実施形態４６のナノ粒子薬物担体。
【００６２】
実施形態４９：トランスフェリン、及び／またはＡｐｏＥ、及び／または葉酸にコンジュゲートしている、実施形態４５〜４８のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００６３】
実施形態５０：がんマーカーに結合する抗体を含む標的化部分にコンジュゲートしている、実施形態４５〜４９のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００６４】
実施形態５１：表１に示されているがんマーカーに結合する抗体を含む標的化部分にコンジュゲートしている、実施形態５０のナノ粒子薬物担体。
【００６５】
実施形態５２：前記カーゴが、抗生物質、抗ウイルス薬、または抗真菌薬を含む、実施形態２９〜３４のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００６６】
実施形態５３：前記カーゴが、シプロフロキサシン、及びレボフロキサシンからなる群から選択される抗生物質を含む、実施形態５２のナノ粒子薬物担体。
【００６７】
実施形態５４：前記カーゴがＨＩＶ抗ウイルス薬を含む、実施形態５２のナノ粒子薬物担体。
【００６８】
実施形態５５：前記カーゴが、テノフォビル、ジソプロキシル、及びフマラートからなる群から選択される抗ウイルス薬を含む、実施形態５４のナノ粒子薬物担体。
【００６９】
実施形態５６：前記カーゴが、アンホテリシンＢ、アニデュラファンギン、カスポファンギン、フルコナゾール、フルシトシン、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ミカファンギン、ポサコナゾール、及びボリコナゾールからなる群から選択される抗真菌薬を含む、実施形態５２のナノ粒子薬物担体。
【００７０】
実施形態５７：ｐＨ７．４を有する生物学的緩衝液中で、３７℃で、２４時間にわたって約２０％未満、または約１５％未満、または約１０％未満、または約５％未満のカーゴ漏出を示す、実施形態１〜５６のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００７１】
実施形態５８：少なくとも約８ｗ／ｗ％、または少なくとも約１０ｗ／ｗ％、または少なくとも約２０ｗ／ｗ％、または少なくとも約３０ｗ／ｗ％、または約４０ｗ／ｗ％超、または約５０ｗ／ｗ％超、または約６０ｗ／ｗ％超、または約７０ｗ／ｗ％超、または約８０ｗ／ｗ％超の薬物負荷容量を有する、実施形態１〜５７のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００７２】
実施形態５９：前記薬物担体が、少なくとも８０ｗ／ｗ％の薬物負荷容量を有する、実施形態１〜５７のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００７３】
実施形態６０：脂質二重層が疎水性薬物を含む、実施形態１〜５９のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００７４】
実施形態６１：脂質二重層が、パクリタキセル、エリプチシン、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、ＳＮ−３８、及び脂質プロドラッグ（例えば、アシクロビルジホスファートジミリストイルグリセロール、ドキソルビシンがコンジュゲートしたリン脂質プロドラッグ、ヌクレオシド類似体のリン脂質誘導体、リン脂質が結合したクロラムブシルなど）からなる群から選択される疎水性薬物を含む、実施形態６０のナノ粒子薬物担体。
【００７５】
実施形態６２：脂質二重層がパクリタキセルを含む、実施形態６０のナノ粒子薬物担体。
【００７６】
実施形態６３：懸濁液中の前記薬物担体が、４℃で貯蔵した場合に少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月、または少なくとも４カ月、または少なくとも５カ月、または少なくとも６カ月にわたって安定している、実施形態１〜６１のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００７７】
実施形態６４：懸濁液中の前記薬物担体の集団が、幅において約３０ｎｍ未満、または約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満、または約５ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満、または約２ｎｍ未満の、サイズ分布範囲（半値全幅）を示す、実施形態１〜６３のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００７８】
実施形態６５：懸濁液中の前記薬物担体の集団が実質的に単峰性のサイズ分布を示す、実施形態１〜６４のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００７９】
実施形態６６：懸濁液中の前記薬物担体の集団が約０．２未満、または約０．１未満のＰＤＩを示す、実施形態１〜６５のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００８０】
実施形態６７：懸濁液中の前記薬物担体の集団が、サイズにおいて約０．１未満または約０．０５未満、または約１．７／１２０未満の変動係数を示す、実施形態１〜６６のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００８１】
実施形態６８：前記ナノ粒子薬物担体の約３％以上が、ＩＶ注射で腫瘍部位を現像するために分布している、実施形態１〜６７のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００８２】
実施形態６９：凍結乾燥後の再水和で、安定な懸濁液を形成する、実施形態１〜６８のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００８３】
実施形態７０：抗がん薬を負荷された場合に、同所ＰＤＡＣモデルにおいて、遊離薬物、または前記薬物を含有するリポソームよりも有効ながん細胞死滅をもたらす、実施形態１〜６９のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００８４】
実施形態７１：抗がん薬を負荷された場合に、遊離薬物及び／またはリポソーム中の薬物と比較すると、薬物毒性の低下を示す、実施形態１〜７０のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００８５】
実施形態７２：前記ナノ粒子薬物担体が、ｐＨ７．４を有する生理液中でコロイド安定性を有し、全身生体内分布を可能にする単分散性のままであり、かつ血管漏出（ＥＰＲ効果）またはトランスサイトーシスによって疾患部位に進入することができる、実施形態１〜７１のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体。
【００８６】
実施形態７３：
実施形態１〜７２のいずれか１つによる多数のナノ粒子薬物担体；及び
薬学的に許容される担体
を含む、医薬製剤前記製剤。
【００８７】
実施形態７４：乳剤、分散剤、または懸濁剤である、実施形態７３の製剤。
【００８８】
実施形態７５：前記懸濁剤、乳剤、または分散剤が、４℃で貯蔵した場合に少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月、または少なくとも４カ月、または少なくとも５カ月、または少なくとも６カ月にわたって安定している、実施形態７４の製剤。
【００８９】
実施形態７６：前記製剤中のナノスケール薬物担体が、実質的に単峰性のサイズ分布を示す、実施形態７３〜７５のいずれか１つによる製剤。
【００９０】
実施形態７７：前記懸濁剤、乳剤、または分散剤中の薬物担体が、約０．２未満、または約０．１未満のＰＤＩを示す、実施形態７３〜７６のいずれか１つによる製剤。
【００９１】
実施形態７８：静脈内投与、動脈内投与、脳内投与、髄腔内投与、経口投与、エアロゾル投与、吸入を介する投与（鼻腔内及び気管内送達を含む、カニューレを介しての頭蓋内投与、ならびに皮下または筋肉内デポー沈着（ｄｅｐｏｔ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）からなる群から選択される経路による投与のために製剤化されている、実施形態７３〜７７のいずれか１つによる製剤。
【００９２】
実施形態７９：無菌注射用製剤である、実施形態７３〜７７のいずれか１つによる製剤。
【００９３】
実施形態８０：単位投与製剤である、実施形態７３〜７９のいずれか１つによる製剤。
【００９４】
実施形態８１：
それを必要とする対象に、実施形態１〜５１もしくは５７〜７２のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体、または実施形態７３〜８０のいずれか１つによる医薬製剤の有効量を投与することを含み、前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤中の薬物が抗がん薬を含む、がんを処置する方法。
【００９５】
実施形態８２：前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤が、化学療法薬レジメンにおける一次治療である、実施形態８１の方法。
【００９６】
実施形態８３：前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤が多剤化学療法レジメンの１成分である、実施形態８１の方法。
【００９７】
実施形態８４：前記多剤化学療法レジメンが、イリノテカン（ＩＲＩＮ）、オキサリプラチン（ＯＸ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及びロイコボリン（ＬＶ）からなる群から選択される少なくとも２つの薬物を含む、実施形態８３の方法。
【００９８】
実施形態８５：前記多剤化学療法レジメンが、イリノテカン（ＩＲＩＮ）、オキサリプラチン（ＯＸ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及びロイコボリン（ＬＶ）からなる群から選択される少なくとも３つの薬物を含む、実施形態８３の方法。
【００９９】
実施形態８６：前記多剤化学療法レジメンが、少なくともイリノテカン（ＩＲＩＮ）、オキサリプラチン（ＯＸ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及びロイコボリン（ＬＶ）を含む、実施形態８３の方法。
【０１００】
実施形態８７：前記がんが、膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）である、実施形態８１〜８６のいずれか１つによる方法。
【０１０１】
実施形態８８：前記がんが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、カポジ肉腫、リンパ腫）、肛門癌、虫垂癌、神経膠星状細胞腫、非定型奇形様／横紋筋肉腫様腫瘍、胆管癌、肝外癌、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳幹膠腫、脳腫瘍（例えば、神経膠星状細胞腫、脳及び脊髄腫瘍、脳幹膠腫、中枢神経系非定型奇形様／横紋筋肉腫様腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系生殖細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、類癌腫（例えば、小児期、胃腸）、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、例えば（胆管、肝臓外）、腺管上皮内癌（ＤＣＩＳ）、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、食道癌、感覚神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、骨の線維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（例えば、卵巣癌、睾丸癌、頭蓋外癌、生殖腺外癌、中枢神経系）、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹癌、ヘアリーセル白血病、頭頚部癌、心臓癌、肝細胞（肝）癌、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎臓細胞、ウィルムス腫瘍、及び他の腎臓腫瘍）、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、ヘアリーセル白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌（原発性）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌（例えば、小児期、非小細胞、小細胞）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット（例えば、非ホジキンリンパ腫）、皮膚Ｔ細胞（例えば、菌状息肉症、セザリー症候群）、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系（ＣＮＳ））、マクログロブリン血症、ワルデンストローム、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、黒色腫（例えば、小児期、眼内（目））、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性扁平上皮頸部癌、正中線管癌腫、口腔癌、多発性内分泌腺腫症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口唇及び口咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵臓神経内分泌腫瘍（島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞種、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞（腎臓）癌、腎盂及び尿管、移行細胞癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（例えば、ユーイング、カポジ、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚癌（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌、基底細胞癌、非黒色腫）、小腸癌、扁平上皮細胞癌、潜在性原発を伴う扁平上皮頸部癌、胃癌、睾丸癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがんである、実施形態８１〜８６のいずれか１つによる方法。
【０１０２】
実施形態８９：前記ナノ粒子薬物担体がｉＲＧＤペプチドにコンジュゲートしておらず、ナノ粒子薬物担体をｉＲＧＤペプチドと併せて投与する、実施形態８１〜８８のいずれか１つによる方法。
【０１０３】
実施形態９０：
それを必要とする対象に、実施形態１〜３４もしくは５２〜５６のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体、または実施形態７３〜８０のいずれか１つによる医薬製剤の有効量を投与することを含み、前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤中の薬物が抗微生物薬を含む、感染を処置する方法。
【０１０４】
実施形態９１：前記感染が、薬剤耐性細菌、ウイルス、または真菌による感染を含む、実施形態８１の方法。
【０１０５】
実施形態９２：前記ナノ粒子薬物担体及び／または医薬製剤を、静脈内投与、動脈内投与、脳内投与、髄腔内投与、経口投与、エアロゾル投与、吸入を介する投与（鼻腔内及び気管内送達を含む、カニューレを介しての頭蓋内投与、ならびに皮下または筋肉内デポー沈着からなる群から選択される経路によって投与する、実施形態８１〜９１のいずれか１つによる方法。
【０１０６】
実施形態９３：前記ナノ粒子薬物担体及び／または医薬製剤を、注射として、ＩＶドリップバッグから、または薬物送達カニューレを介して投与する、実施形態８１〜９１のいずれか１つによる方法。
【０１０７】
実施形態９４：前記対象がヒトである、実施形態８１〜９３のいずれか１つによる方法。
【０１０８】
実施形態９５：前記対象が非ヒト哺乳類である、実施形態８１〜９３のいずれか１つによる方法。
【０１０９】
実施形態９６：ナノ粒子薬物担体を作成する方法であって、表面を有し、薬物分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカを含むナノ粒子を得ること；捕捉剤を、前記多数の空孔を構成する空孔に配置すること（この際、前記捕捉剤は、前記薬物を前記空孔内に捕捉するその能力で選択される）；ナノ粒子の空孔を脂質二重層でコーティングすること；及び脂質二重層でコーティングされた前記ナノ粒子を、前記二重層を通過することができる薬物と接触させるか、またはそれで浸漬すること（この際、前記薬物が前記空孔に進入し、前記捕捉剤と反応し、二重層の内部に保持される）を含む方法。
【０１１０】
実施形態９７：前記脂質二重層が、リン脂質、コレステロール（ＣＨＯＬ）、及びｍＰＥＧリン脂質を含む、実施形態９６の方法。
【０１１１】
実施形態９８：前記リン脂質が、Ｃ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する飽和脂肪酸、及び／またはＣ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する不飽和脂肪酸、及び／またはＣ１２〜Ｃ２０炭素鎖を有する脂肪酸の混合物を含む天然脂質を含む、実施形態９６〜９７のいずれか１つによる方法。
【０１１２】
実施形態９９：前記リン脂質が、ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジアクチル（ｄｉａｃｔｙｌ）ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）からなる群から選択される飽和脂肪酸を含む、実施形態９８の方法。
【０１１３】
実施形態１００：前記リン脂質が、卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、及び大豆ホスファチジルコリン（大豆ＰＣ）からなる群から選択される天然脂質を含む、実施形態９８の方法。
【０１１４】
実施形態１０１：前記リン脂質が、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンからなる群から選択される不飽和脂肪酸を含む、実施形態９８の方法。
【０１１５】
実施形態１０２：前記脂質二重層が、リン脂質Ｃ１４〜Ｃ１８炭素鎖、及び約３５０Ｄａ〜５０００Ｄａの範囲のＰＥＧ分子量を有するｍＰＥＧリン脂質を含む、実施形態９６〜１０１のいずれか１つによる方法。
【０１１６】
実施形態１０３：前記脂質二重層が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を含む、実施形態１０２のナノ粒子薬物担体。
【０１１７】
実施形態１０４：前記脂質二重層がＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧまたはＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、実施形態９７の方法。
【０１１８】
実施形態１０５：前記脂質二重層がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、実施形態１０４の方法。
【０１１９】
実施形態１０６：前記脂質二重層がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む、実施形態１０５の方法。
【０１２０】
実施形態１０７：前記脂質二重層が、リン脂質、コレステロール、及びｍＰＥＧリン脂質を、リン脂質５０〜９０ｍｏｌ％：ＣＨＯＬ１０〜５０ｍｏｌ％：ｍＰＥＧリン脂質１〜１０ｍｏｌ％の比で含む、実施形態９６〜１０６のいずれか１つによる方法。
【０１２１】
実施形態１０８：前記脂質二重層が、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを約３：２：０．１５のモル比で含む、実施形態１０５の方法。
【０１２２】
実施形態１０９：前記脂質二重層を構成する脂質を、前記ナノ粒子と、ナノ粒子全体にわたって連続的な二重層が形成するために十分な比で組み合わせる、実施形態９６〜１０８のいずれか１つによる方法。
【０１２３】
実施形態１１０：前記脂質二重層を構成する脂質を、前記ナノ粒子と、約１．０：３．０からの範囲の粒子：脂質比で組み合わせる、実施形態９６〜１０９のいずれか１つによる方法。
【０１２４】
実施形態１１１：前記脂質二重層を構成する脂質を、前記ナノ粒子と、約１．０：１．１の粒子：脂質比で組み合わせる、実施形態９６〜１０９のいずれか１つによる方法。
【０１２５】
実施形態１１２：前記脂質二重層が、ナノ粒子全体を包囲する実質的に連続的な二重層を形成する、実施形態９６〜１１１のいずれか１つによる方法。
【０１２６】
実施形態１１３：前記脂質二重層が、ナノ粒子全体を包囲する実質的に均一かつ無傷の二重層を形成する、実施形態９６〜１１２のいずれか１つによる方法。
【０１２７】
実施形態１１４：前記シリカナノ粒子がメソ多孔性シリカナノ粒子である、実施形態９６〜１１３のいずれか１つによる方法。
【０１２８】
実施形態１１５：前記シリカナノ粒子がゾル−ゲル合成されたメソ多孔性シリカナノ粒子を含む、実施形態１１４の方法。
【０１２９】
実施形態１１６：前記メソ多孔性シリカナノ粒子がサイズ制御されている、実施形態９６〜１１５のいずれか１つによる方法。
【０１３０】
実施形態１１７：前記メソ多孔性シリカナノ粒子がコロイド的に安定している、実施形態９６〜１１６のいずれか１つによる方法。
【０１３１】
実施形態１１８：前記メソ多孔性シリカが、約１〜約２０ｎｍ、または約１〜約１０ｎｍ、または約２〜約８ｎｍの範囲である平均空孔サイズを有する、実施形態９６〜１１７のいずれか１つによる方法。
【０１３２】
実施形態１１９：前記メソ多孔性シリカナノ粒子が、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約５０〜約２００ｎｍ、または約５０〜約１５０ｎｍ、または約５０〜約１００ｎｍ、または約５０〜約８０ｎｍ、または約５０〜約７０ｎｍ、または約６０〜約７０ｎｍの範囲の平均サイズを有する、実施形態９６〜１１８のいずれか１つによる方法。
【０１３３】
実施形態１２０：前記薬物との反応前のカーゴ捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４、アンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、及びトリエチルアンモニウム塩からなる群から選択される、実施形態９６〜１１９のいずれか１つによる方法。
【０１３４】
実施形態１２１：前記カーゴ捕捉剤が（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む、実施形態１２０の方法。
【０１３５】
実施形態１２２：前記カーゴ捕捉剤が、硫酸アンモニウム；アンモニウムスクロースオクタスルファート、アンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、アンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、アンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、リン酸アンモニウム；アンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、アンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、アンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、クエン酸アンモニウム、及び酢酸アンモニウムからなる群から選択されるアンモニウム塩を含む、実施形態１２０の方法。
【０１３６】
実施形態１２３：前記カーゴ捕捉剤が、トリメチルアンモニウムスルファート、トリメチルアンモニウムスクロースオクタスルファート、トリメチルアンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムホスファート、トリメチルアンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムシトラート、及びトリメチルアンモニウムアセタートからなる群から選択されるトリメチルアンモニウム塩を含む、実施形態１２０の方法。
【０１３７】
実施形態１２４：前記カーゴ捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスルファート、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート、トリエチルアンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムホスファート、トリエチルアンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムシトラート、及びトリエチルアンモニウムアセタートからなる群から選択されるトリエチルアンモニウム塩を含む、実施形態１２０の方法。
【０１３８】
実施形態１２５：前記薬物との反応前のカーゴ捕捉剤がトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、実施形態１２０の方法。
【０１３９】
実施形態１２６：前記薬物が、前記空孔内で、ＳＯＳ８−と会合したゲル様沈澱物としてプロトン化及び捕捉されている、実施形態１２５の方法。
【０１４０】
実施形態１２７：前記薬物が、プロトン化され得る少なくとも１個の弱塩基性基を含み、カーゴ捕捉剤が少なくとも１個の陰イオン基を含む、実施形態９６〜１２６のいずれか１つによる方法。
【０１４１】
実施形態１２８：前記薬物が、７を上回り、かつ１１を下回るｐＫａを有するように選択される、実施形態９６〜１２７のいずれか１つによる方法。
【０１４２】
実施形態１２９：前記薬物が、第一級、第二級、第三級または第四級アミンを含む、実施形態９６〜１２８のいずれか１つによる方法。
【０１４３】
実施形態１３０：前記薬物が、約５〜約２５ｍｇ／ｍＬの水溶性指数を有するように選択される、実施形態９６〜１２９のいずれか１つによる方法。
【０１４４】
実施形態１３１：カーゴが、約−３．０〜約３．０のオクタノール／水分配係数またはｌｏｇＰ値を有するように選択される、実施形態９６〜１３０のいずれか１つによる方法。
【０１４５】
実施形態１３２：カーゴが、２〜８ｎｍであり、シリカナノ粒子の空孔の平均または中央サイズ未満であるように選択される、実施形態９６〜１３１のいずれか１つによる方法。
【０１４６】
実施形態１３３：前記カーゴが抗がん薬を含む、実施形態１２７〜１３２のいずれか１つによる方法。
【０１４７】
実施形態１３４：前記カーゴがイリノテカンを含む、実施形態１３３の方法。
【０１４８】
実施形態１３５：前記カーゴが、トポイソメラーゼ阻害薬、抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、有糸分裂阻害薬、アルカロイド、アルカリ性アルキル化薬、プリンまたはピリミジン誘導体、及びプロテインキナーゼ阻害薬からなる群から独立に選択される１つまたは複数の薬物を含む、実施形態１３３の方法。
【０１４９】
実施形態１３６：前記担体が、トポテカンを含むトポイソメラーゼ阻害薬を含む、実施形態１３５の方法。
【０１５０】
実施形態１３７：前記担体が、トポテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、ビノレルビン、及びＬＡＱ８２４からなる群から選択されるアルカロイドを含む、実施形態１３５の方法。
【０１５１】
実施形態１３８：前記担体が、ドキソルビシン、及びミトキサントロンからなる群から選択される抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質を含む、実施形態１３５の方法。
【０１５２】
実施形態１３９：前記担体が、ビンブラスチン、及びビノレルビンからなる群から選択される有糸分裂阻害薬を含む、実施形態１３５の方法。
【０１５３】
実施形態１４０：前記担体が、シクロフォスファミド、メクロレタミン、及びテモゾロミドからなる群から選択されるアルカリ性アルキル化薬を含む、実施形態１３５の方法。
【０１５４】
実施形態１４１：前記担体が、５−フルオロウラシル、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、及びゲムシタビンからなる群から選択されるプリンまたはピリミジン誘導体を含む、実施形態１３５の方法。
【０１５５】
実施形態１４２：前記担体が、イマチニブ、オシメルチニブ及びスニチニブ  パゾパニブ、エンザスタウリン、バンデタニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、及びニロチニブからなる群から選択されるプロテインキナーゼ阻害薬を含む、実施形態１３５の方法。
【０１５６】
実施形態１４３：前記薬物担体が、標的化部分、融合性ペプチド、及び輸送ペプチドからなる群から選択される部分にコンジュゲートしている、実施形態９６〜１４２のいずれか１つによる方法。
【０１５７】
実施形態１４４：実施形態１〜７２のいずれか１つによるナノ粒子薬物担体を生成する、実施形態９６〜１４３のいずれか１つによる方法。
【０１５８】
実施形態１４５：前記薬物担体が、がん細胞上の受容体に結合するペプチドにコンジュゲートしている、実施形態１４３の方法。
【０１５９】
実施形態１４６：前記薬物担体が、ｉＲＧＤペプチドにコンジュゲートしている、実施形態１４５の方法。
【０１６０】
実施形態１４７：前記薬物担体が、表２に示されている標的化ペプチドにコンジュゲートしている、実施形態１４５の方法。
【０１６１】
実施形態１４８：前記薬物担体が、トランスフェリン、及び／またはＡｐｏＥ、及び／または葉酸にコンジュゲートしている、実施形態１４３〜１４７のいずれか１つによる方法。
【０１６２】
実施形態１４９：前記薬物担体が、がんマーカーに結合する抗体を含む標的化部分にコンジュゲートしている、実施形態１４３〜１４８のいずれか１つによる方法。
【０１６３】
実施形態１５０：前記薬物担体が、表１に示されているがんマーカーに結合する抗体を含む標的化部分にコンジュゲートしている、実施形態１４９の方法。
【０１６４】
実施形態１５１：前記カーゴが抗生物質を含む、実施形態１２７〜１３２のいずれか１つによる方法。
【０１６５】
実施形態１５２：前記カーゴが、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、及びＨＩＶ抗レトロウイルス薬（例えば、テノフォビル、ジソプロキシル、フマラートなど）からなる群から選択される抗生物質を含む、実施形態１５１の方法。
【０１６６】
実施形態１５３：前記薬物担体が、少なくとも約３０ｗ／ｗ％、または約４０ｗ／ｗ％超、または約５０ｗ／ｗ％超、または約６０ｗ／ｗ％超、または約７０ｗ／ｗ％超、または約８０ｗ／ｗ％超の容量まで負荷されている、実施形態９６〜１５２のいずれか１つによる方法。
【０１６７】
実施形態１５４：前記薬物担体が、少なくとも８０ｗ／ｗ％の容量まで負荷されている、実施形態９６〜１５２のいずれか１つによる方法。
【０１６８】
実施形態１５５：脂質二重層が疎水性薬物を含む、実施形態９６〜１５４のいずれか１つによる方法。
【０１６９】
実施形態１５６：脂質二重層が、パクリタキセル、エリプチシン、カンプトテカン、ＳＮ−３８、及び脂質プロドラッグ（例えば、アシクロビルジホスファートジミリストイルグリセロール、ドキソルビシンがコンジュゲートしたリン脂質プロドラッグ、ヌクレオシド類似体のリン脂質誘導体、リン脂質が結合したクロラムブシルなど）からなる群から選択される疎水性薬物を含む、実施形態１５５の方法。
【０１７０】
実施形態１５７：脂質二重層がパクリタキセルを含む、実施形態１５５の方法。
【０１７１】
実施形態１５８：イリノテカンナノ担体を作成する方法であって、イリノテカンをその中に収容するために適した多数の空孔を含む表面を有するシリカ体を含むナノ担体を得ること、イリノテカンを捕捉するその能力で選択された薬剤を多数の空孔内に配置すること；ナノ担体の空孔を、リン脂質二重層でコーティングすること（任意選択で、音波処理プロセスを使用）；及びイリノテカンを、リン脂質二重層コーティングされた空孔に導入して、リン脂質二重層コーティングされたイリノテカンナノ担体を作成することを含む、方法。
【０１７２】
実施形態１５９：前記シリカ体が、ゾル−ゲル合成され、サイズ制御され、かつコロイド的に安定なシリカ体を含む、実施形態１５８の方法。
【０１７３】
実施形態１６０：イリノテカン捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、実施形態１５８の方法。
【０１７４】
実施形態１６１：ナノ担体が（ａ）少なくとも２０ｗ／ｗ％（または３０ｗ／ｗ％または４０ｗ／ｗ％）のイリノテカン負荷容量を有する；及び／または（ｂ）ｐＨ７．４を有する生物学的緩衝液中で、３７℃で、２４時間にわたって＜５％（または＜１０％）のイリノテカン漏出を示す、実施形態１６０の方法。
【０１７５】
実施形態１６２：ナノ担体が、ｐＨ７．４を有する生理液中でコロイド安定性を有し、全身生体内分布を可能にする単分散性のままであり、かつ血管漏出（ＥＰＲ効果）またはトランスサイトーシスによって疾患部位に進入することができる、実施形態１６１の方法。
【０１７６】
実施形態１６３：リン脂質二重層がコレステロール及び／またはパクリタキセルを含む、実施形態１６１の方法。
【０１７７】
実施形態１６４：ナノ担体を作成する方法であって、表面を有し、かつ分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカ体と、表面をコーティングするリン脂質二重層とを含む未負荷ナノ担体を得ること；カーゴ捕捉剤をリン脂質二重層内に封入することを含む、方法。
【０１７８】
実施形態１６５：ナノ担体を、カーゴ捕捉剤と相互作用するように選択されたカーゴに曝露することをさらに含む、実施形態１６４に記載の方法。
【０１７９】
実施形態１６６：カーゴが、７を上回り、かつ１１を下回るｐＫａを有し、プロトン化され得るように選択され、カーゴ捕捉剤が、少なくとも１個の陰イオン基を含む、実施形態１６５の方法。
【０１８０】
実施形態１６７：カーゴがイリノテカンであり、カーゴ捕捉剤が、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、実施形態１６５の方法。
【０１８１】
実施形態１６８：カーゴが、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポテカン；１つもしくは複数の抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、ドキソルビシン及びミトキサントロン；１つもしくは複数の有糸分裂阻害薬、ビンブラスチン及びビノレルビン；または１つもしくは複数のチロシン−キナーゼ阻害薬イマチニブ、オシメルチニブ及びスニチニブである、実施形態１６５の方法。
【０１８２】
実施形態１６９：ナノ担体が、少なくとも３０ｗ／ｗ％の薬物負荷容量を有する、実施形態１６５の方法。
【０１８３】
実施形態１７０：表面を有し、かつ分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカ体；表面をコーティングするリン脂質二重層；及びリン脂質二重層内のカーゴ捕捉剤を含み；サブミクロン構造が１ミクロン未満の最大寸法を有し、リン脂質二重層が多数の空孔を安定的に密閉している、ナノ担体。
【０１８４】
実施形態１７１：さらに、カーゴをリン脂質二重層内に含む、実施形態１７０のナノ担体。
【０１８５】
実施形態１７２：カーゴがカーゴ捕捉剤と会合している、実施形態１７１のナノ担体。
【０１８６】
実施形態１７３：カーゴが、プロトン化され得る少なくとも１個の弱塩基性基を含み、カーゴ捕捉剤が少なくとも１個の陰イオン基を含む、実施形態１７２のナノ担体。
【０１８７】
実施形態１７４：カーゴが、７を上回り、かつ１１を下回るｐＫａを有するように選択される、実施形態１７１のナノ担体。
【０１８８】
実施形態１７５：カーゴが、第一級、第二級、第三級または第四級アミンを含む、実施形態１７１のナノ担体。
【０１８９】
実施形態１７６：カーゴが、約５〜約２５ｍｇ／ｍＬの水溶性指数を有するように選択される、実施形態１７１のナノ担体。
【０１９０】
実施形態１７７：カーゴが、約−３．０〜約３．０のオクタノール／水分配係数またはｌｏｇＰ値を有するように選択される、実施形態１７１のナノ担体。
【０１９１】
実施形態１７８：カーゴが、２〜８ｎｍであり、ナノ粒子の空孔のサイズ未満であるように選択される、実施形態１７１のナノ担体。
【０１９２】
実施形態１７９：カーゴがイリノテカンであり、カーゴ捕捉剤がトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）である、実施形態１７１のナノ担体。
【０１９３】
実施形態１８０：カーゴが、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポテカン；１つもしくは複数の抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、ドキソルビシン及びミトキサントロン；１つもしくは複数の有糸分裂阻害薬、ビンブラスチン及びビノレルビン；または１つもしくは複数のチロシン−キナーゼ阻害薬イマチニブ、オシメルチニブ及びスニチニブである、実施形態１７１のナノ担体。
【０１９４】
実施形態１８１：ｐＨ７．４を有する生物学的緩衝液中で、３７℃で、２４時間にわたって５％未満のカーゴ漏出を有する、実施形態１７１のナノ担体。
【０１９５】
実施形態１８２：少なくとも３０ｗ／ｗ％の薬物負荷容量を有する、実施形態１７１のナノ担体。
【０１９６】
実施形態１８３：少なくとも８０ｗ／ｗ％の薬物負荷容量を有する、実施形態１７１のナノ担体。
【０１９７】
実施形態１８４：リン脂質二重層がパクリタキセルを含む、実施形態１７０のナノ担体。
【０１９８】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、次の詳細な説明から、当業者には明らかになるであろう。しかしながら、いくつかの本発明の実施形態を示しているが、詳細な説明及び具体例は実例として与えられており、限定ではないことは理解されるべきである。本発明の意図から逸脱することなく、本発明の範囲内で多くの変化及び変更が成されてもよく、本発明は、そのような変更すべてを含む。
【０１９９】
定義
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、互換的に使用されてよく、ヒト、さらには、非ヒト哺乳類（例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ウシ、有蹄類、ウサギなど）を指す。様々な実施形態では、対象は、院内で、外来患者として、または他の臨床状況で、医師または他の医療従事者の看護下にあるヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年期男性、青年期女性、男児、女児）であり得る。特定の実施形態では、対象は、医師または他の医療従事者の看護または処方下になくてもよい。
【０２００】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という語句は、本明細書に記載のナノ粒子薬物担体（シリカソーム（ｓｉｌｉｃａｓｏｍｅｓ））が向けられる病態に罹患しているか、またはそのリスクを有する、上記で記載したとおりの対象を指す。したがって、例えば、特定の実施形態では、対象は、がん（例えば、膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）、乳癌（例えば、薬剤耐性乳癌）、結腸癌、脳癌など）を有する対象である。特定の実施形態では、対象は、これらだけに限定されないが、薬剤耐性微生物感染を含む、微生物感染を有する対象である。
【０２０１】
「処置する」という用語は、例えば、病態または疾患を処置することに関して使用する場合、その病態もしくは疾患の１つもしくは複数の症状の緩和及び／もしくは除去、ならびに／または進行の遅延ならびに／またはその病態もしくは疾患の１つもしくは複数の症状の発症速度もしくは重症度の低減、及び／または病態もしくは疾患の予防を指す。治療する、という用語は、病態または疾患の発症の遅延または発症の予防を含む予防的処置を指し得る。
【０２０２】
「同時投与」または「〜と併せての投与」または「共処置」という用語は、第１の化合物（例えば、イリノテカンを含有するシリカソーム）及び第２の化合物（例えば、ｉＲＧＤペプチド）の同時投与に関して使用する場合、第１の化合物及び第２の化合物を投与して、それらが投与された生体内において、第１の化合物及び第２の化合物の生物学的活性の少なくとも多少の時系列的重複が存在するようにすることを示す。同時投与は、同期投与または連続投与を含み得る。連続投与では、それらの生物学的活性が重複する限り、第１の化合物と第２の化合物との投与の間に、多少の実質的な遅延（例えば、数分または数時間）が存在してもよい。特定の実施形態では、同時投与は、第１の化合物及び第２の化合物が生体に対して治療または予防効果の増強をもたらすことを可能にする時間枠を超える。特定の実施形態では、効果の増強は、相乗効果である。
【０２０３】
「ナノ担体」及び「ナノ粒子薬物担体」及び「シリカソーム」という用語は、互換的に使用され、本明細書で使用されるとおりの「多孔性ナノ粒子」という用語、及び多孔性粒子核を包む（または包囲する、または囲う）脂質二重層と互換的である多孔性粒子核を有するナノ構造を指す。特定の実施形態では、シリカナノ粒子は、多孔性シリカナノ粒子（例えば、メソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ））である。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、従来の脂質、リン脂質、コレステロール、ＰＥＧ及びリガンドの結合のための化学的官能化脂質を指す。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「脂質二重層」または「ＬＢ」という用語は、炭化水素テイルが内部に面して連続非極性相を形成している配向両親媒性脂質分子の任意の二重層を指す。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、従来定義されているとおりの、脂質二重層によって囲まれた水性コンパートメントを指す（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，ｐ．２１３を参照されたい）。
【０２０７】
シリカソームにおいて定義した脂質二重層と比較して、リポソームにおける脂質二重層は「非担持脂質二重層」と称され得て、リポソーム自体（未負荷の場合）は、「空のリポソーム」と称され得る。シリカソームの脂質二重層は、シリカソームにおける脂質二重層が多孔性粒子核上に位置し、それによって担持されているので、「担持脂質二重層」と称され得る。特定の実施形態では、脂質二重層は、約６ｎｍ〜約７ｎｍの範囲の厚さを有し得、これは、疎水性核の厚さ３〜４ｎｍ、加えて、水和親水性ヘッド基層（それぞれ約０．９ｎｍ）及びそれぞれ約０．３ｎｍの２つの部分的水和領域を含む。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、「選択的標的化」または「特異的結合」という用語は、シリカソーム（空または負荷済み）の表面上、特に、シリカソームの脂質二重層の表面上で標的化リガンドを使用することを指し、この場合、リガンドは、標的、例えば、目的の細胞表面上に発現される受容体または他の生体分子成分と特異的／選択的に相互作用する。標的化リガンドには、ペプチド、抗体、アプタマー、標的化ペプチド、多糖などの分子及び／または物質が含まれ得る。
【０２０９】
標的化リガンドを有するシリカソームは、「標的化されたシリカソーム」と称され得る。
【０２１０】
「シリカソーム」という用語は、シリカナノ粒子が脂質二重層（例えば、リン脂質二重層）で完全に被覆されている薬物含有（薬物送達）シリカナノ粒子を指す。特定の実施形態では、シリカナノ粒子は、多孔性シリカナノ粒子（例えば、メソ多孔性シリカナノ粒子）である。
【０２１１】
「約」または「およそ」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野の通常の技能を有するものが決定するような、特定の値について許容される誤差範囲内であることを指し、これは、一部では、その値が測定または決定される方法、すなわち、測定系の限界、すなわち、医薬製剤などの特定の目的に必要とされる精度に依存する。例えば、「約」は、当技術分野での実施によって、１以内または１を上回る標準偏差を意味する。別法では、「約」は、所与の値の最高２０％、好ましくは最高１０％、より好ましくは最高５％、よりさらに好ましくは最高１％の範囲を意味し得る。別法では、特に、生物系またはプロセスに関しては、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願及び請求項において記載されている場合、別段に述べない限り、特定の値について許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語が推測されるべきである。
【０２１２】
「薬物」という用語は、本明細書で使用される場合、動物及びヒトにおいて治療効果を示す、小さい、及び大きな、天然に存在するか、または合成の様々な分子サイズの化学成分を指す。薬物には、これらだけに限定されないが、有機分子（例えば、小さな有機分子）、治療用タンパク質、ペプチド、抗原、または他の生体分子、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ｃａｓ９成分をコードするコンストラクト、及び任意選択で１つまたは複数のガイドＲＮＡなどが含まれ得る。
【０２１３】
「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、標準的な薬学的に許容される担体のいずれかと定義される。本発明の医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するために公知の方法によって製剤化することができる。薬学的に許容される担体には、希釈剤、アジュバント、及びビヒクル、さらには担体、ならびに本発明の活性成分と反応しない不活性な非毒性固体または液体増量剤、希釈剤、または封入材料が含まれ得る。例には、これらだけに限定されないが、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、水、及びエマルジョン、例えば、油／水エマルジョンが含まれる。担体は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒体であってよい。処方は、当業者には周知で、かつ容易に利用可能ないくつかの情報源に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｅ  Ｗ  ［１９９５］  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄ．）は、本明細書に記載のシリカソームに関連して使用することができる処方を記載している。
【０２１４】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、標的に（例えば、標的ポリペプチドに）結合する（例えば、特異的に結合する）ことができる、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされるか、またはそれに由来する１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認められている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、さらには、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、次いでこれらが、免疫グロブリン群、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。
【０２１５】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが公知である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）及び１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端が、主に抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を画定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖及び重鎖を指す。
【０２１６】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または様々なぺプチダーゼでの消化によって生成される、いくつかのよく特徴づけられている断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂの二量体を生成し、これ自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合している軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２を穏やかな条件下で還元させると、ヒンジ領域のジスルフィド結合を分解して、それによって、（Ｆａｂ’）２二量体をＦａｂ’一量体に変換することができる。Ｆａｂ’一量体は本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体断片のより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい）。様々な抗体断片が、インタクトな抗体の消化の点において定義されているが、当業者であれば、そのようなＦａｂ’断片を新規に化学的に、または組換えＤＮＡ法を利用することによって合成することができることが分かるであろう。したがって、抗体という用語は、本明細書で使用される場合、全抗体の修飾によって生産されるか、または組換えＤＮＡ法を使用して新規に合成される抗体断片も含む。いくつかの好ましい抗体には、一本鎖抗体（単一ポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは、可変重鎖及び可変軽鎖が一緒に結合して（直接、またはペプチドリンカーを介して）連続するポリペプチドを形成している一本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）が含まれる。一本鎖Ｆｖ抗体は、直接結合しているか、ペプチド−コードリンカーによって結合しているＶＨ−及びＶＬ−コード配列を含む核酸から発現され得る、共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３。ＶＨ及びＶＬは単一ポリペプチド鎖として相互に連結しているが、ＶＨ及びＶＬドメインは、非共有結合している。繊維状ファージの表面上に発現される第１の機能性抗体分子は一本鎖Ｆｖ’ｓ（ｓｃＦｖ）であったが、しかしながら、代替の発現戦略も成功している。例えば、鎖（重鎖または軽鎖）の一方がｇ３カプシドタンパク質に融合し、相補的鎖が可溶性分子としてペリプラズムに送出するならば、Ｆａｂ分子をファージ上にディスプレイすることができる。この２つの鎖は、同じか、または異なるレプリコン上にコードされ得る；重要なポイントは、各Ｆａｂ分子の２つの抗体鎖が翻訳後に集合し、その二量体が、例えば、ｇ３ｐへの鎖の一方の連結によって、ファージ粒子へと組み込まれることである（例えば、米国特許第５７３３７４３号）。ｓｃＦｖ抗体及びいくつかの他の構造が、抗体Ｖ領域からの、天然に凝集するが、化学的に分離された軽鎖及び重鎖ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に同様の三次元構造に折り畳まれる分子に変換することは、当業者に知られている（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、及び同第４，９５６，７７８号を参照されたい）。特定の実施形態では、抗体は、ファージ上にディスプレイされているすべてを含むはずである（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びジスルフィド結合したＦｖ（例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１３２３−１３３１を参照されたい）、さらには、アフィボディ、ユニボディなど。
【０２１７】
「特異的に結合する」という用語は、本明細書で使用される場合、生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）に関する場合、分子（例えば、タンパク質及び他の生物製剤）の不均一な集団中で、ある生体分子の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定の条件（例えば、抗体の場合にはイムノアッセイ条件、または核酸の場合にはストリンジェントなハイブリッド形成条件）下で、規定のリガンドまたは抗体は、その特定の「標的」分子に結合し、そのサンプル中に存在する他の分子には、有意な量では結合しない。
【０２１８】
次に、図面を参照するが、その際、同じ参照番号は、全体を通して、対応する部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１Ａ−１】図１Ａ〜１Ｅは、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、薬物負荷のためにプロトン化剤を使用するＬＢ−ＭＳＮＰ及びリポソームイリノテカン担体の調製を示している。図１Ａは、合成方法及びＬＢ−ＭＳＮＰ及びリポソームによるイリノテカンの負荷を示す概略図を示している（図１Ａ、パネルＡ１）。ＴＥＡ８ＳＯＳをＭＳＮＰ粒子に浸漬した後に、空孔を、脂質バイオフィルムの音波処理に由来するＬＢによって密閉する（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｍａｌｌ，３：１３４１−１３４６）。図１Ａ、パネルＡ２：ＴＥＡ８ＳＯＳ浸漬された粒子をイリノテカン溶液中でインキュベートすると、ＴＥＡ８ＳＯＳによるプロトン化のために、両親媒性薬物が脂質二重層を越えて拡散することが可能になる（ＴＥＡ８ＳＯＳ←→８ＴＥＡ＋２０  ８Ｈ＋＋ＳＯＳ８−）。脂質可溶性ＴＥＡは粒子から出るが、Ｈ＋は、イリノテカンを、ＬＢを越えることができない親水性誘導体に変換する。プロトン化された薬物は、ＳＯＳ８−と相互作用して、ゲル様沈澱物を形成し、これは、空孔内に保持される。図１Ａ、パネルＡ３：同じ技術を使用して、イリノテカン捕捉のためにリポソーム同等物を生成した（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）。
【図１Ａ−２】図１Ａ−１の続きである。
【図１Ｂ】Ｉｒ−ＭＳＮＰ及びＩｒ−リポソーム担体の薬物負荷容量（ＤＬＣ）の評価。ＤＬＯ［イリノテカンの全量（ｍ０）−非封入イリノテカン（ｍ１）］／［粒子の全量（ｍＭＳＮＰまたはｍ脂質）×１００％。ＴＥＡ８ＳＯＳの包含は、粒子の流体力学的サイズ及びゼータ電位に対して無視できる作用を有した。流体力学的サイズ及びゼータ電位のデータは、表３に示されている（実施例２）。
【図１Ｃ】空の、コーティングされていないＭＳＮＰ、Ｉｒ−ＭＳＮＰ及びＩｒ−リポソーム担体のＣｒｙｏＥＭイメージ。この技術は、リポソーム中でのイリノテカン沈殿を可視化するために十分な感度を有する。
【図１Ｄ】担体安定性を、１００％血清中で、３７℃で２４時間にわたってインキュベートし、ＨＰＬＣによって薬物漏出を決定することによって評価した。
【図１Ｅ】凍結乾燥及び水再懸濁後の流体力学的直径及び薬物漏出％の変化によって決定されるとおりの担体安定性。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態によるＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ及びＩｒ−リポソームの生体内分布を示している。図２Ａ：ＫＰＣ由来同所腫瘍部位にＩＶ注射されたＮＩＲ標識担体の生体内分布を比較するための４８時間にわたるＩｎｔｅｒｖａｌ  ＩＶＩＳイメージング（ｎ＝３）。ＮＩＲ標識ＬＢ−ＭＳＮＰまたはリポソーム１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射後の、代表動物におけるＮＩＲ蛍光イメージが示されている。
【図２Ｂ】同じ実験における外植臓器のエクスビボイメージング；動物を２４時間後にと殺した。共焦点顕微鏡法によって、腫瘍部位で、リポソームと比較してＮＩＲ標識ＬＢ−ＭＳＮＰのより高い存在度が確認された。
【図２Ｃ】イリノテカン腫瘍含有率を、同所ＫＰＣ由来異種移植片モデルで決定した（ｎ＝３）。動物に、異なる薬物製剤で６０ｍｇ／ｋｇのイリノテカン用量当量のＩＶ注射を与えた。２４時間後の動物と殺の後に、腫瘍組織を、ＨＰＬＣによってイリノテカン含有率を測定するために収集した。イリノテカン含有率を、腫瘍組織１グラム当たりの全注射用量％（％ＩＤ／ｇ）として表した。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表している。
【図２Ｄ】同じ実験における血漿中イリノテカン濃度のＨＰＬＣ測定。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｅは、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、ＫＰＣ由来同所腫瘍モデルにおける遊離薬物及び封入イリノテカン担体の示差的腫瘍阻害効果を示す。図３Ａ：ＮＣＩプロトコルを使用しての、短期間用量設定試験におけるＭＴＤの評価。
【図３Ｂ】４日ごとに８回投与まで４０ｍｇ／ｋｇ遊離薬物または封入イリノテカンをＩＶ投与した後の、Ｂ６／１２９マウスにおけるＫＰＣ由来同所腫瘍の増殖阻害。Ｉｎｔｅｒｖａｌ  ＩＶＩＳイメージングを腫瘍増殖を監視するために使用したが、これは、オペレーター定義された（ｏｐｅｒａｔｏｒ−ｄｅｆｉｎｅｄ）ＲＯＩでイメージ強度によって定量的に表された。
【図３Ｃ】処置後の動物（４０〜４７日目にと殺）の原発性腫瘍部位でのアポトーシスの定量分析（切断されたカスパーゼ−３ではＩＨＣ染色を使用）。
【図３Ｄ】周囲転移に対する処置の影響を示すための、瀕死の動物（４０〜４７日目にと殺）での生物発光強度の代表的な検死結果及びエクスビボイメージング。目に見える転移性の展開を胃、小腸、肝臓、脾臓、腎臓、横隔膜、及び腹壁に見ることができた。心臓または肺の浸潤はなかった。
【図３Ｅ】（図３Ｄ）における定量エクスビボイメージングによって決定された腫瘍展開の比較分析をまとめるためのヒートマップディスプレイ。データは、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５を表している。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ対Ｉｒ−リポソームによる毒性低下の比較分析を示している。図４Ａ：図３Ｂに示されている実験からの組織を使用して、代表の瀕死動物（４０〜４７日目にと殺）から得た肝臓組織診。Ｈ＆Ｅ染色された切片での矢印は、壊死肝臓組織を指している一方で、アステリスクでマークされた部位は脂肪を示している。棒線は２００μｍである。
【図４Ｂ】６０ｍｇ／ｋｇの用量当量で異なるイリノテカン製剤を与えられ、続いて、２４時間目にと殺された動物の肝臓における切断されたカスパーゼ−３（アポトーシスマーカー、赤色）及びＦ４／８０（ＫＣマーカー、緑色）の二重ＩＨＣ染色。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青色）で染色された。棒線＝１００μｍ。
【図４Ｃ】図３Ｂで試験された同じ処置動物群における、アポトーシスの展開及び腸絨毛の鈍化を明らかにするためのＨ＆Ｅ対比染色と共に、切断されたカスパーゼ−３のためのＩＨＣ染色。棒線は１００μｍを表す。
【図４Ｄ】２日ごとに３回ＩＶ注射されるイリノテカンの４０ｍｇ／ｋｇ用量当量を使用して、胸骨骨髄に対する影響を試験した別の実験。胸骨を包埋、脱石灰化及びＨ＆Ｅ染色のために７日目に収集した。棒線は２００μｍを表す。
【図４Ｅ】肝臓におけるＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ及びＩｒ−リポソーム製剤の示差的肝毒性を説明する図。具体的な理論に結び付けられることはないが、注射されたナノ担体は初めに、ＫＣによって取り込まれ、そこで、担体の分解が、バイスタンダー肝細胞へのイリノテカン放出につながると考えられる。担体分解及び肝細胞への薬物放出のその後の速度によって、イリノテカンが代謝され、不活性になる規模を決定することができる。さらに、リポソーム担体のより高い不安定性が、より安定なＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰよりも急速な薬物放出につながっていると仮定され、このことが、アポトーシス及び壊死の違いを説明する。
【図５】図５は、本発明の１つまたは複数の実施形態による、脂質二重層コーティングされたメソ多孔性シリカナノ粒子（ＬＢ−ＭＳＮＰ）の合成手順及びＴＥＡ８ＳＯＳ媒介性イリノテカン（ＩＲＩＮ）負荷の機構を示すスキームを示している。ＭＳＮＰを、ゾル／ゲル化学を使用して合成した。ＴＥＡ８ＳＯＳ（社内で合成）を初めに、ＭＳＮＰと共にインキュベートした。これに、本発明者らのバイオフィルム技術（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）を使用して、ＬＢコートの沈積を続けた。ＴＥＡ８ＳＯＳ浸漬したＭＳＮＰを、無水脂質バイオフィルムに添加し（例えば、３：２：０．１５のモル比でのＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、続いて、音波処理で空孔を密閉した。遊離捕捉剤の除去後に、ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰをイリノテカンと共にインキュベートした。これによって、遊離の親油性イリノテカンが、粒子中に拡散してプロトン化され、空孔中に捕捉される。この反応は次のとおりに進行する：ＬＢ−ＭＳＮＰの内部に捕捉剤が存在することによって、「ＴＥＡ８ＳＯＳ←→８ＴＥＡ−Ｈ＋＋ＳＯＳ８−」の平衡が粒子インキュベーション媒体への脂質透過性トリエチルアミン（ＴＥＡ）の流出をもたらす。粒子内部へのＨ＋放出がｐＨ勾配を生み、それが、ＬＢを介して拡散する親油性イリノテカンのプロトン化をもたらす。脂質不透過性であるプロトン化ＩＲＩＮは、ＳＯＳ８−と相互作用して、沈澱物を形成し、したがって、ＬＢ−ＭＳＮＰでの効率的なＩＲＩＮ捕捉をもたらす。
【図６Ａ】図６Ａ及び６Ｂは、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、捕捉試薬を含有するイリノテカン負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰ（Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ））及び捕捉試薬を使用してイリノテカン負荷されたリポソーム（Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ））の形態及び薬物放出プロファイルを示している。図６Ａ：Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）（上のパネル）及びＩｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）（下のパネル）のＣｒｙｏＥＭイメージ（ＴＦ２０、ＦＥＴ）。ＭＳＮＰ表面上にコーティングされた脂質二重層は、透明に見え得る。上のズームインイメージは、粒子表面上に無傷の脂質コーティングを備えたＭＳＮＰを示している一方で、多孔性の内部は、ＴＥＯ８ＳＯＳとイリノテカンとの間の高密度複合体の存在を示している。同様に、リポソームイメージ（下のパネル）では、イリノテカン−捕捉剤複合体を、内部上の高密度沈澱物として見ることができる（赤い矢印でマーク）。
【図６Ｂ】ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）及びファゴリソソーム模擬流体（ＰＳＦ、ｐＨ４．５）中でのＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）及びＩｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）の薬物放出プロファイル。薬物放出測定では、ＮＰをＰＢＳまたはＰＳＦ（１ｍＬ、イリノテカン０．１ｍｇ／ｍＬ）中で調製し、続いて、３７℃で振盪した。示されている時点で、放出されたイリノテカンを遠心フィルターユニットによって、３０ｋＤのサイズカットオフで、ＮＰから分離した。濾液中のイリノテカン濃度をマイクロプレートリーダーによって３６０ｎｍのＯＤによって決定した。実験を少なくとも２回繰り返した。
【図７】図７は、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、共焦点顕微鏡によって決定されたとおりのＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）及びＩｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）の細胞取り込み及び細胞内を示している。ＬＢ−ＭＳＮＰ及びリポソームを、脂質二重層において０．１ｗ／ｗ％Ｔｅｘａｓレッド−ＤＨＰＥによって蛍光標識した。両方の粒子を２４時間にわたってＰＡＮＣ−１細胞と共にインキュベートし、次いで、ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄した後に、細胞膜をＷＧＡ４８８で、核をＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色した。スライドを、共焦点顕微鏡を使用して可視化した。
【図８】図８、パネルＡ〜Ｆは、本発明の１つまたは複数の実施形態による、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）対Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）または遊離薬物の比較細胞傷害性分析を示している。図８、パネルＡ〜Ｃ：ＰＡＮＣ−１細胞の細胞生存率を、示されている濃度の遊離ＩＲＩＮ、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）及びＩｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）で処置した後にＭＴＳアッセイによって決定した。実験をまた、種々の時間間隔（２４時間、４８時間及び７２時間）で実施した。図８、パネルＤ〜Ｆ：ＰＡＮＣ−１細胞で記載したとおりの種々の薬物濃度及び時点で遊離ＩＲＩＮ、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）及びＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）で処置した後のＢｘＰＣ−３細胞の細胞生存率。
【図９】図９は、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、骨髄の組織学的分析を示している。遊離ＩＲＩＮ、Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）及びＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）で処置した後の骨髄組織診。雄のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＩＲＩＮ、Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）またはＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）を６０ｍｇ／ｋｇの薬物用量でＩＶ注射した。２４時間後に、マウスをと殺し、胸骨を収集し、１０％ホルマリン中で固定した。切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、光学顕微鏡法によって検査した。データは、ＬＢ−ＭＳＮＰ及びリポソーム製剤の両方がイリノテカンによって誘導される骨髄枯渇を減少させたことを示している。重篤な骨髄損傷及びアポトーシスが、遊離薬物群において見られ得る。
【図１０】図１０は、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、腎臓の組織学的分析を示している。遊離ＩＲＩＮ、Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）及びＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）で処置した後の腎臓の組織学的分析。雄のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＩＲＩＮ、Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）またはＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）を６０ｍｇ／ｋｇの薬物用量でＩＶ注射した。２４時間後に、マウスをと殺し、腎臓を収集し、１０％ホルマリンで固定し、続いて、パラフィン包埋した。４μｍ厚の組織切片をガラススライド上に乗せた。切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、光学顕微鏡法によって検査した。ボーマン隙の腫脹及び浮腫（矢印でマーク）を示す代表的な組織学的イメージが、遊離ＩＲＩＮまたはＩｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）処置動物で観察された。これらの病変は、急性糸球体炎症を示している。Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）群では、有意な腎臓異常は見い出されなかった。
【図１１】図１１は、本発明の１つまたは複数の実施形態による、代表的なイリノテカン負荷ＬＢ−ＭＳＮＰの低解像度ｃｒｙｏＥＭイメージを示している。棒線は１００ｎｍを表している。約５００個の粒子の外観検査によって、＞９９％の粒子のコーティングの成功と共に、ＬＢの構造的完全性が確認された。
【図１２】図１２、パネルＡ〜Ｆは、本発明の１つまたは複数の実施形態による、Ｂ６／１２９マウスに移植してから５週間後の周辺臓器へのＫＰＣ由来腫瘍の浸潤を示すためのＨ＆Ｅ染色を示している。代表的なイメージは、膵臓（パネルＡ）、肝臓（パネルＢ）、脾臓（パネルＣ）、腎臓（パネルＤ）、小腸（パネルＥ）、及び胃（パネルＦ）の浸潤を示すために取り込まれている。棒線サイズは２００μｍである。
【図１３】図１３は、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、図２ＡのＫＰＣ由来モデルにおけるＮＩＲ標識粒子のＩＶ注射から４８時間後に取り込まれたエクスビボＩＶＩＳイメージを示している。これは、同等の粒子用量では、標識リポソームと比較して、腫瘍部位でのＬＢ−ＭＳＮＰの存在度の上昇が存在することを実証している。
【図１４】図１４は、本発明の１つまたは複数の実施形態による、ＬＢ−ＭＳＮＰ（１００ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ注射及び２４時間目での動物と殺後のＢ６／１２９マウス（ｎ＝３）におけるＫＰＣ由来同所腫瘍モデルでのＬＢ−ＭＳＮＰの生体内分布を示している。腫瘍組織及び主要臓器を収集し、誘導結合プラズマ発光分光法を使用して、Ｓｉ含有率を測定した。粒子生体内分布は、各位置について、注射された全Ｓｉ用量の％（％ＩＤ）として表される。データは、平均±ＳＤを表す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ヌードマウス（ｎ＝３）において、皮下ＰＡＮＣ−１異種移植片モデルで決定されたイリノテカン腫瘍含有率を示す。動物に、異なる薬物製剤で６０ｍｇ／ｋｇのイリノテカン用量当量のＩＶ注射を与えた。２４時間後に動物をと殺した後に、腫瘍組織を収集して、ＨＰＬＣによってイリノテカン含有率を測定した。イリノテカン含有率は、腫瘍組織１グラム当たりの全注射用量％（％ＩＤ／ｇ）として表された。データは、他の群と比較して、ＭＳＮＰでの平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表している。
【図１５Ｂ】ＮＩＲ標識ＬＢ−ＭＳＮＰ１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射から２４時間後の代表動物でのＮＩＲ蛍光イメージを示している。
【図１６】図１６は、Ｂ６／１２９マウスにおける周囲臓器でのイリノテカン含有率のＨＰＬＣ定量化を示している。動物に、異なる薬物製剤（ｎ＝３）で、６０ｍｇ／ｋｇのイリノテカン用量当量のＩＶ注射を与えた。２４時間後の動物と殺の後に、組織を収集して、ＨＰＬＣによってイリノテカン含有率を測定した。イリノテカン含有率は、組織１グラム当たりの全注射用量％（％ＩＤ／ｇ）として表された。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。
【図１７】図１７は、図３Ｂに記載の実験での各動物群（４０〜４７日目にと殺）における原発性腫瘍部位から得られた原発性腫瘍部位で、切断されたカスパーゼ−３（アポトーシスマーカー）でのＩＨＣ染色を示すための代表的なイメージを示している。アポトーシス細胞（茶色）が、赤色の矢印で示されている。棒線＝５０μｍ。
【図１８】図１８は、本発明の１つまたは複数の実施形態による、図３Ｂに記載の有効性試験の各処置群における死亡率を示している。ｘ軸上の矢印は、注射した日を示している。マウスを頻繁に監視し、自発死ではなく「瀕死基準」（Ｚｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ、１３９（１）：７３−８０）に基づきと殺した。イリノテカン負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰは、食塩水及び遊離イリノテカンと比較して、有意な（ｐ＜０．０１、ＳＰＳＳ  １９．０、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＵＳＡを使用するログランク検定によって比較）生存の改善をもたらした。Ｉｒ−リポソームと比較して、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰでは、良好な生存結果が観察された。
【図１９】図１９は、本発明の１つまたは複数の実施形態による、全血球数分析が図４Ｄに記載の実験から得られたサンプルで行われたことを示している。示差的白血球数は、遊離薬物またはＩｒ−リポソーム処置群で行われた好中球絶対数の有意な減少を示した。対照的に、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰでの処置は、好中球数の僅かな、しかし有意ではない低下を示した。データは平均±ＳＥＭ、対照と比較しての＊ｐ＜０．０５、ＬＢ−ＭＳＮＰ群と比較しての＃ｐ＜０．０５を表している。
【図２０】図２０は、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による、異なる薬物担体での肝臓におけるイリノテカン含有率のＨＰＬＣ定量化を示している。動物に、異なる薬物製剤で６０ｍｇ／ｋｇのイリノテカン用量当量のＩＶ注射を与えた（ｎ＝３）。それぞれ０．５、４、２４時間後の動物と殺の後に、肝臓組織を収集して、ＨＰＬＣによってイリノテカン含有率を測定した。イリノテカン含有率は、肝臓組織１グラム当たりの全注射用量％（％ＩＤ／ｇ）として表された。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。
【図２１Ａ】図２１Ａ及び２１Ｂは、薬物負荷のためのシリカソームの合成及び特性解析ならびに可視化を示している。図２１Ａ：上のパネルは、シリカソームを構築するための合成ステップ及び遠隔薬物負荷を示す図を提供している（実施例１及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５を参照されたい）。簡単に述べると、ＭＳＮＰ核をゾル−ゲル化学によって合成し、プロトン化剤、ＴＥＡ８ＳＯＳを含有する溶液に浸漬した。これらの粒子を、脂質バイオフィルムの存在下で音波処理手順を使用して、ＬＢでコーティングした（同書）。これに、ＴＥＡ８ＳＯＳによって提供されるプロトン勾配を越えての遠隔イリノテカン負荷を続けた。ボックス１：種々のシリカソーム成分の図。ボックス２：システイン修飾されたｉＲＧＤペプチドをＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミドに結合するためにチオール−マレイミド反応を使用する、ＬＢとのｉＲＧＤペプチドのコンジュゲーション。ボックス３：約１０ｎｍのＡｕ核の埋め込み（ＴＥＭ可視化のため）を伴う、及び伴わない裸の粒子及びシリカソームを示すＣｒｙｏ−ＥＭイメージ。合成手順は、実施例３の補足物質及び方法に記載する。棒線＝５０ｎｍ。
【図２１Ｂ】免疫適格性Ｂ６／１２９マウスにおけるＫＰＣ由来同所ＰＤＡＣモデルの検死及びＩＶＩＳイメージ。同所移植は、２×１０６のＫＰＣ−ｌｕｃ細胞を膵臓の尾部に注入するための小手術を伴う（左のパネル）。検死及び生物発光イメージングは、１〜２週間後の原発性腫瘍の増殖、続く、３〜５週間による腫瘍転移を表している。マクロ転移が矢印でマークされている。
【図２２Ａ】図２２Ａ及び２２Ｂは、同時投与されたｉＲＧＤが、ＫＰＣ由来同所モデルにおいて、ＩＶ注射されたシリカソームの腫瘍生体内分布を増強したことを示している。図２２Ａ：腫瘍担持マウスに、（ｉ）８μｍｏｌ／ｋｇ遊離ｉＲＧＤの同時投与と共に、ＩＶ５０ｍｇ／ｋｇのＮＩＲ標識シリカソームＩＶ（ｎ＝３、「シリカソーム＋ｉＲＧＤ」と称される）、（ｉｉ）５０ｍｇ／ｋｇのＮＩＲ標識された、ｉＲＧＤ−コンジュゲートしたシリカソーム（ｎ＝３、「シリカソーム−ｉＲＧＤ」と称される）、または（ｉｉｉ）ｉＲＧＤを伴わずに、５０ｍｇ／ｋｇのＮＩＲ標識シリカソームを与えた。動物を注射から２４時間後にと殺し、ＩＶＩＳを使用するエクスビボＮＩＲイメージングを続けた。
【図２２Ｂ】ＮＩＲ蛍光強度及びＳｉ含有率を使用して、同所腫瘍におけるナノ粒子含有率を定量化した。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｅは、ｉＲＧＤ同時投与がＫＰＣ由来同所モデルにおいてＩｒ−シリカソームの取り込み及び有効性を増強することを示している。図２３Ａ：ルシフェラーゼ発現ＫＰＣ由来同所腫瘍モデルにおける有効性試験のスケジュール（ｎ＝６）。選択されたＩｒ−シリカソーム用量（イリノテカン４０ｍｇ／ｋｇ；ＭＳＮＰ８０ｍｇ／ｋｇ）は、先行する有効性試験に基づく（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５）。この用量のＩｒ−シリカソームを、ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの同時投与を伴って、または伴わずにＩＶ注射した。注射を、３日毎に合計４回の投与で繰り返した。対照は、同一用量の遊離ｉＲＧＤまたはＩｒ−シリカソームのみを与えられる動物群を含んだ。
【図２３Ｂ】原発性腫瘍量及び転移を示すための、と殺前のマウスにおける生物発光強度の代表的なエクスビボイメージング。イメージは、ｉＲＧＤ同時投与がシリカソーム有効性を増強し得たことを示している。
【図２３Ｃ】図２３Ｂにおける腫瘍及び腫瘍転移阻害に対する影響をまとめたヒートマップ。
【図２３Ｄ】ｉＲＧＤ同時投与は、カプラン−マイヤー分析によって示されたとおり、Ｉｒ−シリカソームの生存影響を改善した。シリカソームのみの効果は、ＰＢＳ及び遊離ｉＲＧＤと比較して、高度に有意である（ｐ＝０．００１）。ｉＲＧＤ同時投与は、生存をさらに増強する（ｐ＝０．０２７）。
【図２３Ｅ】ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの同時投与を伴って、または伴わずにＩｒ−シリカソームの１回用量（薬物４０ｍｇ／ｋｇ）を注射してから２４時間後の腫瘍におけるイリノテカン含有率のＨＰＬＣ分析。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５を表す。
【図２４Ａ】図２４Ａ及び２４Ｃは、ｉＲＧＤ−媒介性シリカソーム取り込みが腫瘍血管系上でのＮＲＰ−１発現を必要とすることを示している。図２４Ａ：ｉＲＧＤがナノ粒子トランスサイトーシスを開始する機構を実証する図。
【図２４Ｂ】ＫＰＣ由来腫瘍切片におけるＮＲＰ−１（緑色）及びＣＤ３１（赤）の多色ＩＨＣ染色、加えて、核染色（青色）。ＩＨＣ染色法は、方法のセクションに記載する。ＮＲＰ−１は、腫瘍組織及び血管の両方の上に発現される。合成イメージは、高い程度のＣＤ３１とのＮＲＰ−１の同時局在（９４．２％）を示している；同時局在比（ＣＲ）は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによって決定した。棒線＝１００μｍ。
【図２４Ｃ】ｉＲＧＤ−媒介性シリカソーム生体内分布に対する抗ＮＲＰ−１抗体の干渉。ＮＩＲ−シリカソーム５０ｍｇ／ｋｇ＋遊離ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇのＩＶ注射の１５分前に、５０μｇの遮断抗体または対照ＩｇＧをＩＶ注射した（ｎ＝３）。２４時間後のナノ粒子生体内分布を示すエクスビボＮＩＲイメージ。ＮＩＲ強度及びＳｉ含有率を使用して、同所腫瘍部位でのナノ粒子取り込みを定量化した。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｃは、ｉＲＧＤ同時投与によって開始されるシリカソーム輸送システムの超微細構造表示を提供する。図２５Ａ：同所腫瘍を担持するマウスに、Ａｕ−シリカソーム５０ｍｇ／ｋｇを、ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの同時投与を伴って、または伴わずに注射した。腫瘍を２４時間目に採取し、ただちにＴＥＭ分析のために固定した。各群において少なくとも１０の目的の領域を表示して、血管内皮細胞において、群化した連続小胞（黄色の矢印）の存在度を定量的に表した。本発明者らは、細胞内表面積１μｍ２あたりの小胞の数を計算した（左のパネル）。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。高倍率及び低倍率での代表的なＴＥＭ写真が示されている。Ｌ＝内腔；Ｒ＝赤血球。
【図２５Ｂ】Ａｕ−シリカソーム５０ｍｇ／ｋｇを与えられ、次いで、２４時間後にと殺された腫瘍担持マウスにおけるシリカソームトランスサイトーシスのＴＥＭ表示。電子顕微鏡写真は、（ｉ）腫瘍血管の内腔（赤色の矢印）、（ｉｉ）内皮小胞の輸送（ピンク色の矢印）、及び腫瘍間質中の沈積（青色の矢印）におけるシリカソームを示している。領域「１」〜「３」の高倍率イメージが、パネルの右側に提示されている。Ｅ＝内皮細胞；Ｌ＝内腔；Ｐ＝周細胞；Ｒ＝赤血球。
【図２５Ｃ】がん細胞内部の核周囲分布におけるシリカソームの存在を示すＴＥＭイメージ。Ｎ＝核；Ｍ＝ミトコンドリア。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｂは、ＮＳＧマウスにおける、患者由来異種移植片でのｉＲＧＤ誘導シリカソーム生体内分布を示している。図２６Ａ：間質存在度は一致するが、ＮＲＰ−１発現のレベルが異なる対の腫瘍（ＸＷＲ＃８及びＸＷＲ＃１８７）を、ｉＲＧＤ同時投与の非存在及び存在下での生体内分布試験のために選択した。マッソン三色染色は、両方の腫瘍において同等レベルのコラーゲン発現を示している。多色ＩＨＣ染色（ＮＲＰ−１では緑色の蛍光抗体、ＣＤ３１では赤色の蛍光抗体）を使用して、ＮＲＰ−１発現の比存在度、及びｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して内皮細胞との重複の程度を決定した。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。
【図２６Ｂ】腫瘍担持動物に、ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの同時投与を伴って、または伴わずにＮＩＲ標識シリカソーム５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射を与えた。動物を２４時間後にと殺した（ｎ＝３）。ＮＩＲ蛍光強度及びＳｉ含有率によって決定されるとおりのシリカソームの取り込みのエクスビボ評価。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。
【図２７】図２７、パネルＡ〜Ｃは、シリカソーム上の脂質二重層にｉＲＧＤを成功裏に共有結合によってコンジュゲートさせるためのチオール−マレイミド反応の使用を示している。共有結合によるコンジュゲーションの成功を確認するために、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ博士によって提供された反応性フルオレセイン（ＦＡＭ）標識ｉＲＧＤペプチド（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６：５１０−５２０）をＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミドへの結合について使用した。詳細な方法は、実施例３の方法セクションに記載する。パネルＡ：１００μｇ／ｍＬで懸濁された初期状態及びＦＡＭ−ｉＲＧＤ−シリカソームの蛍光スペクトルを４８８ｎｍの励起波長でマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｍ５ｅ）で得、洗浄及び精製されたＦＡＭ−ｉＲＧＤ−シリカソームでの蛍光シグナルの有意な保持によって、コンジュゲーション反応の成功が確認される（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２００９，１６：５１０）。パネルＢ及びＣ：シリカソームへのｉＲＧＤコンジュゲーションの効果を、細胞取り込みに対するその影響について試験した。シリカソーム−ｉＲＧＤのバッチを、方法セクションに記載されているとおり、ＭＳＮＰフレームワークのＮＩＲ標識（ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０）と共に合成した。ＫＰＣ細胞を１００μｇ／ｍＬの粒子濃度で３７℃で２時間にわたって処理し、取り込みをフローサイトメトリー（パネルＢ）、及び共焦点顕微鏡法（パネルＣ）によって決定した。同様の標識効率を有するｉＲＧＤ遊離ＮＩＲ−シリカソームを対照として使用した。データは、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５を表す。共焦点顕微鏡法によって、結果が確認された（細胞膜は、コムギ麦芽凝集素で緑色染色され、核はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で青色染色された）。棒線＝２０μｍ。
【図２８】図２８、パネルＡ〜Ｂは、ＩＶシリカソーム生体内分布に対する非機能性ペプチド（ＣｅｎｄＲモチーフが欠如）の効果の評価を示している。パネルＡ：本発明者らは、非ＣｅｎｄＲペプチド、シクロ（ＲＧＤｆＫ）を使用して、図２２に示されている同所モデルにおいて生体内分布実験を繰り返した。簡単に述べると、腫瘍担持動物に、ＰＢＳまたは遊離シクロ（ＲＧＤｆＫ）８μｍｏｌ／ｋｇと同時投与して、ＮＩＲ標識シリカソーム５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射を与え、続いて、２４時間目に動物をと殺した（ｎ＝３）。代表的なエクスビボ臓器ＮＩＲ蛍光イメージを、ナノ粒子生体内分布を示すために得た。パネルＢ：ＮＩＲ蛍光強度分析（ＩＶＩＳソフトウェアによって）及びＳｉ含有率の決定（ＩＣＰ−ＯＥＳによる）は、非ＣｅｎｄＲペプチドが腫瘍部位でのシリカソーム取り込みを改善することはできないことを示した。データは、平均±ＳＤを表す。
【図２９】図２９、パネルＡ〜Ｂは、共焦点顕微鏡法による、腫瘍におけるシリカソーム輸送の評価を示している。パネルＡ：腫瘍切片は図２２での実験から得た。ＳＰ２−１Ｐ−ＦＣＳ、Ｌｅｉｃａ顕微鏡下で６３３ｎｍレーザーを使用して、代表的な共焦点イメージを得て、ＮＩＲ標識シリカソーム存在度の腫瘍内存在度を評価した。Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２８：１０３１−１０３５）によって記載された方法を使用して、血管の存在（ＣＤ３１は緑色）及び核の存在（ＤＡＰＩは青色で染色）を検査するために同じ切片をＩＨＣ染色することで、本発明者らは腫瘍組織におけるナノ粒子の存在及び遊走を決定することができた。棒線＝２０μｍ。パネルＢ：Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、最も近い腫瘍血管からのシリカソームの透過距離の計算値は、約１５血管と推定された。箱ひげ図（Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア）を展開して、中央値（水平線）、２５〜７５パーセンタイル（箱）、平均（中空の正方形）及びＳＤ（ひげ）を示した。＊、ｐ＜０．０５、シリカソームのみまたはシリカソーム−ｉＲＧＤと比較。
【図３０】図３０は、図２２で使用した動物から得られた臓器を使用し、ＩＣＰ−ＯＥＳ分析によって決定された肝臓（左）及び脾臓（右）におけるＳｉ含分を示している。データは、平均±ＳＤを表している。＊ｐ＜０．０５、シリカソームまたは「シリカソーム＋ｉＲＧＤ」群と比較。
【図３１】図３１は、ｉＲＧＤ同時投与を伴わずにＡｕ包埋シリカソーム５０ｍｇ／ｋｇを注射する（２４時間）前の動物からのＫＰＣ由来腫瘍の代表的なＴＥＭイメージを示している。このイメージは、内腔側の粒子沈積と共にトランスサイトーシス小胞の非存在を実証している。Ｅ＝内皮細胞、Ｌ＝内腔。
【図３２】図３２は、プロトセルとシリカソーム技術との比較結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【０２２０】
治療効力を維持する、または増加させながら、高率の毒性に対処するために、全身毒性を引き起こし得る遊離薬物の量を限定しながら標的部位（例えば、腫瘍部位、感染部位など）での薬物送達（例えば、化学療法薬、抗微生物薬など）を増強する薬物送達ナノ担体を提供する。毒性を予防し、有効性を改善するために、担体自体が安定な薬物負荷を維持することが望ましい。様々ながん細胞から確立された動物腫瘍モデルにおいて化学療法薬を送達するためのナノ担体の使用は、遊離薬物当量と比較して、薬物循環半減期を延長し、高い薬物濃度を腫瘍部位に送達して細胞傷害性死滅を改善する、さらには、全身毒性を減少させるそのようなナノ担体の能力を実証している（例えば、Ｍｅｓｓｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０（１９）：６６３８−６６４９；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６（６）：３２７１−３２７７；Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（４）：１２０８−１２１７を参照されたい）。
【０２２１】
多くのリポソーム担体がイリノテカンなどの高毒性薬物の安全性を改善することができないことを考慮して、新規のナノ粒子薬物担体を本明細書において提供するが、これは、シリカナノ粒子（例えば、メソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ））に施与された脂質二重層（ＬＢ）を使用し、それによって、担持脂質二重層を得ている。これらの脂質二重層コーティングされた多孔性シリカナノ粒子（シリカソームとしても公知）は、リポソームよりも著しく漏出性が低い薬物担体を提供する（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（２）：９９４−１００５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，５（５）：４１３１−４１４４；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（１１）：１００４８−１００６５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。薬物パッケージングのために使用することができる広い内部表面積、調節可能な空孔サイズ、担体安定性、及び制御薬物放出能によって、ＭＳＮＰは、がん治療のために多用途の多機能ナノ担体プラットフォームを構成することが実証されている（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（２）：９９４−１００５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，５（５）：４１３１−４１４４；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（１１）：１００４８−１００６５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２（３６）：１２６９０−１２６９７；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４１（７）：２５９０−２６０５；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｄｖ．Ｍａｔ．２４（１２）：１５０４−１５３４；Ｔａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４６（３）：７９２−８０１）。しかしながら、脂質−二重層コーティングされたシリカ粒子に効果的に負荷する方法は限られており、典型的には、約１０重量％から４０重量％までの範囲の負荷が得られる。
【０２２２】
様々な実施形態で、脂質−二重層コーティングされたナノ粒子薬物担体の著しく高い負荷を達成する新たな負荷方法を本明細書において提供する。一般に、新たな負荷方法は、カーゴ（例えば、目的の１つまたは複数の薬物）を、脂質二重層の内側にあるナノ粒子の空孔内に保持するカーゴ捕捉試薬を利用する。より具体的には、特定の実施形態では、この方法は、
目的のカーゴ（例えば、薬物））を収容することができる多数の空孔を含む多孔性シリカ体を含むナノ担体を得ること；
捕捉剤（カーゴ捕捉剤）を多数の空孔内に配置すること（この際、捕捉剤は、カーゴを空孔内に捕捉するその能力で選択される）；
ナノ担体の表面空孔を脂質二重層でコーティングすること；及び
脂質二重層によって、カーゴをコーティングされた空孔に導入すること（この際、カーゴは、捕捉剤と反応し、空孔内に保持される）
を含み得る。
【０２２３】
特定の実施形態では、捕捉剤は、プロトン化剤を含み、方法は、脂質二重層を通過して二重層コーティングされた多孔性ナノ粒子に至り得る１つまたは複数の薬物を得ることを含む。多孔性ナノ粒子中のプロトン化剤は、薬物を、脂質二重層を越えて逆拡散することができない親水性誘導体に変換する。
【０２２４】
実施例１に示す例示的な、ただし非限定的な実施形態では、ＭＳＮＰ核をゾル−ゲル化学によって合成し、プロトン化剤、ＴＥＡ８ＳＯＳを含有する溶液に浸漬した。これらの粒子を、二重層安定性に最適な組成の脂質バイオフィルムの存在下で音波処理手順を使用して、ＬＢでコーティングした。これに、ＴＥＡ８ＳＯＳによって与えられるプロトン勾配によって、遠隔イリノテカン負荷を続けた。イリノテカンは、ＬＢを越えて、ＭＳＮＰ内部パッケージング空間に拡散し得る弱塩基性の両親媒性分子であり、その空間で、先に捕捉されたトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）によるプロトン放出が、薬物を、ＬＢを越えて逆拡散することができない親水性誘導体に変換する。この方法を使用すると、高い負荷容量（例えば、４０重量％超、または４５重量％超、または５０重量％超、または６０重量％超、または７０重量％超、％、または８０重量％超など）が達成される。
【０２２５】
本明細書に記載の方法を使用して生成した脂質二重層ナノ粒子薬物担体（ＬＢ−ＭＳＮＰまたは「シリカソーム」）は、多数の利点をもたらす。ＬＢ−ＭＳＮＰを合成するための既存のバイオフィルムコーティング法をＴＥＡ８ＳＯＳなどのプロトン化剤と組み合わせると、リポソームを上回る多数の利点を示す微粒子担体において、イリノテカンなどの薬物の能動的及び高用量の負荷が得られる。そのような利点には、これらだけに限定されないが、合成の容易さ、薬物負荷の及び放出プロファイルの改善、安定性の改善及び生体内分布の改善が含まれる。特定の実施形態、例示的な、ただし非限定的な実施形態では、この遠隔負荷方法は、ＭＳＮＰ内でＬＢの後ろでの受動的薬物封入と比較して、イリノテカンの負荷容量の４倍以上の増加をもたらす。本明細書に記載の方法を使用すると、非封入イリノテカンは、ＬＢを介して拡散することによって、ＭＳＮＰ空孔に入り込み、その後、プロトン化が、イリノテカンを親水性にして脱出することができなくする。
【０２２６】
さらに、ナノ担体の負荷容量の増加は、がん部位への薬物送達の増加をもたらし、より少ない遊離薬物が、イリノテカンが毒性を引き起こす骨髄及び胃腸管（ＧＩＴ）などの部位で利用可能となる。一例では、ＬＢ−ＭＳＮＰは、ＭＭ−３９８の社内リポソーム同等物（負荷容量４２．５重量％）に対して、負荷容量の改善（イリノテカン負荷８３．５重量％）を示す。負荷時間、捕捉剤濃度、及び負荷のために提供されるイリノテカンの量の最適化の後に、ＬＢ−ＭＳＮＰ製剤の実施形態は、リポソーム製剤と比較して、酸性ｐＨ（４．５）で、３〜５倍高い放出容量を実証している。用量調節によって、同じ有効性を得るためにより少ない薬物用量の投与が可能になり、全身薬物毒性のさらなる低下につながる。一例では、最大耐量（ＭＴＤ）の計算において、ＬＢ−ＭＳＮＰの実施形態は、遊離薬物と比較して、耐量の５倍の改善を示した。ＭＴＤの増加は、リポソーム製剤と同様であった。骨髄組織診の分析は、イリノテカン毒性がＬＢ−ＭＳＮＰによって大きく減少したことを示した。
【０２２７】
加えて、本明細書に記載の合成／負荷方法は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２１０４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５（１１）：３５６０−３６６５）によって使用される従来のリポソームまたはポリマー−脂質技術の作成よりも容易に行うことができる。これは、非封入薬物の量を減らすことによる費用削減を含めて、ＧＭＰ製造へとスケールアップするために有利である。
【０２２８】
方法及びそれによって生成されるナノ粒子薬物担体（シリカソーム）をここではイリノテカンに関して記載したが、以下に説明するとおり、方法は、いくつかの他のカーゴ（例えば、１つまたは複数の薬物を含むカーゴ）に適用することができることは理解されるであろう。さらに、本明細書において提供する教示を考慮すると、（標的への）薬物送達の改善、及び／または毒性の低下、及び／または生体内分布の改善、及び／または放出プロファイルの改善が、多数の他の薬物で、本明細書に記載の方法及び組成物を使用して達成されるであろうと考えられる。
【０２２９】
したがって、特定の実施形態では、カーゴ捕捉剤の援助によって、カーゴの安定していて、かつ保護されている負荷を高い負荷レベルで可能にするＬＢ−ＭＳＮＰベースのナノ担体送達系を記載する。一部の実施形態では、カーゴは薬物であり得る。有効性の増強、高い薬物負荷容量及び全身毒性の低下によって、改良されたＬＢ−ＭＳＮＰ封入及び捕捉による薬物送達は、薬物封入、例えば、化学療法薬のより頻繁な使用を可能にする。ナノ担体設計の観点から、このシステムの様々な実施形態、例えば、ＬＢ−ＭＳＮＰ内のポリ陰イオン性カーゴ捕捉剤を、いくつかの異なる種類のがん及び他の疾患プロセスを処置するための広範な追加の弱塩基性分子及び薬物を送達するための有効な設計原理として使用する。
【０２３０】
一例では、有効性の増強、高い薬物負荷容量及びイリノテカンの全身毒性の低下によって、イリノテカンに関して、改良されたＬＢ−ＭＳＮＰ封入及び捕捉手順による送達は、ヒトＰＤＡＣ患者におけるイリノテカン及びＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸのより頻繁な使用を可能にする。これはまた、生存の増加を見込んで、より多くのＰＤＡＣ患者をゲムシタビンよりも効力のある治療レジメンで処置することを可能にする。最後に、ＰＤＡＣ処置のために、ＩＶ注射用の効率的で生体適合性、かつ翻訳的に競合する（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）イリノテカン製剤（ＭＭ３９８リポソームに対して）を提供する。特に、本明細書に記載の方法及び得られるナノ粒子薬物担体を考慮すると、イリノテカン及びＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ治療は、これらだけに限定されないが、結腸、直腸、肺、及び卵巣癌を含む他のがんを処置するためにも利用可能であり得る。
【０２３１】
本明細書において開示するシリカソーム送達系は、多機能プラットフォームである。メソ多孔性シリカ薬物担体は、広範なカーゴをがん細胞に、さらには動物における様々なヒトがんモデルに送達することができることが実証されている。これらには、マウスにおける異種移植片及び同所ＰＤＡＣ腫瘍へのゲムシタビン及びパクリタキシル（ｐａｃｌｉｔａｘｉｌ）同時送達が含まれる。さらに、ＭＳＮＰは、生分解性され、広範な動物検査において安全であることが実証されている（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（２）：９９４−１００５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，５（５）：４１３１−４１４４；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（１１）：１００４８−１００６５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｄｖ．Ｍａｔ．２４（１２）：１５０４−１５３４；Ｔａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４６（３）：７９２−８０１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（３８）：１５７９０−１５８０４；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｍａｌｌ，６（１６）：１７９４−１８０５）。
【０２３２】
本明細書に記載の改善された負荷、得られた薬物動態プロファイルなどを考慮すると、本明細書に記載の負荷方法、脂質二重層組成物及び得られたナノ粒子薬物担体の安定性は、以前のナノ粒子薬物担体を上回る著しい改善及び利点をもたらすと考えられる。
【０２３３】
脂質−二重層コーティングされた多孔性ナノ粒子の負荷方法。
様々な実施形態で、脂質二重層コーティングされた多孔性ナノ粒子（例えば、メソ多孔性シリカ粒子）を負荷する改善方法を、そのような方法によって作成された薬物送達ナノ粒子と共に提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、４０重量％、または４５重量％超、または５０重量％超、または６０重量％超、または７０重量％超、％、または８０重量％超など）の非常に高レベルの薬物負荷を達成する。
【０２３４】
上述のとおり、特定の実施形態では、方法は：
目的のカーゴ（例えば、薬物））を収容することができる多数の空孔を含む多孔性シリカ体を含むナノ担体を得ること；
捕捉剤（カーゴ捕捉剤）を多数の空孔内に配置すること（この際、捕捉剤は、カーゴを空孔内に捕捉するその能力で選択される）；
ナノ担体の表面空孔を脂質二重層でコーティングすること；
カーゴを、脂質二重層によってコーティングされた空孔に導入すること（この際、カーゴは捕捉剤と反応し、空孔内に保持される）を含み得る。
【０２３５】
以前にＭＳＮＰプラットフォームで使用されたことはなかったが、ポリ陰イオン性化合物、ＴＥＡ８ＳＯＳは、ＭＭ−３９８において、イリノテカンを捕捉するために使用された（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）。しかしながら、本明細書に記載の研究以前には、ＴＥＡ８ＳＯＳを、他の負荷または浸漬方法よりも著しく高いレベルで多孔性ナノ粒子の遠隔負荷を効果的に行うために使用することができるかどうかは知られていなかった。
【０２３６】
実施例に記載するとおり、ＴＥＡ８ＳＯＳは、加水分解すると８個のＨ＋イオン及び八価ＳＯＳ８−を放出するプロトン生成剤である（図１Ａ、パネルＡ２）。イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ＴＥＡ８ＳＯＳを生成し、これを、下記の方法セクションにおいて記載するとおり、ＭＳＮＰに浸漬させた（同図）。浸漬した粒子を、３：２：０．１５のモル比のＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００からなる脂質バイオフィルムでコーティングされた丸底フラスコに導入した。懸濁液の音波処理によって、捕捉剤を含有するＬＢコーティングされた粒子が得られた（図１Ａ、パネルＡ１）。これらの粒子をただちに、イリノテカン溶液中でインキュベートして、薬物が、ＳＯＳ８−と会合してゲル様沈澱物として、空孔内に移入、プロトン化、及び捕捉されることを可能にした（図１Ａ、パネルＡ１及びＡ２、図１Ｂ）。これは、本発明者らが、８０重量％以上のイリノテカン負荷容量を達成することを可能にし（図１Ｂ）、これは、以前に実証されたとおり（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）、８５０ｍ２／ｇの総表面積及び約０．７ｃｍ３／ｇの空孔体積では、多孔性担体の理論最大負荷容量（約１００重量％）に近い。
【０２３７】
方法を、薬物イリノテカン及び捕捉剤としてのＴＥＡ８ＳＯＳの使用に関して示しているが、原理の証明を実証しているので、同じ方法を、多数の他の薬物（特に、弱塩基性薬物）をシリカソームに導入するために使用することができ、多数の他の捕捉剤を同様に、例えば、本明細書に記載のとおりに利用することができることは認められるであろう。
【０２３８】
薬物負荷容量は、治療有効性及び薬物毒性の限界にも決定的な重要な製造問題であるので、ＭＳＮＰによる薬物封入の有効性を最適化するために、かなりの研究が当てられ、負荷容量の増加及び相乗的な薬物の組合せを同時送達する可能性をもたらしている。従来の浸漬方法によって、イリノテカンなどの薬物をＭＳＮＰに導入することが可能であるが、この負荷方法は、比較的非効率的であり、約１０重量％の負荷レベルを達成することが判明しており（例えば、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３１（１２）：３３３５−３３４６を参照されたい）、薬物を空孔中に保持することは困難である（例えば、Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２（３６）：１２６９０−１２６９７を参照されたい）。物理的吸着、静電付着、超分子アセンブリまたは捕捉方法の使用（例えば、ストッパー、ナノバルブまたは遮断実体）に依存した従来の薬物負荷アプローチとは異なり、多孔性ナノ粒子上に配置された無傷の脂質二重層コーティングの使用は、薬物捕捉のための急速かつ瞬間的な空孔密閉を提供する。これは、合成を簡略化し、安定した高い薬物負荷容量を提供する。本明細書に記載の方法は、多孔性粒子にカーゴを高レベルで負荷するために有効であり、脂質二重層でのこの急速かつ瞬間的な空孔密閉と適合する。
【０２３９】
バイオフィルム技術は、担持ＬＢによってゲムシタビン（ＧＥＭ）（例えば、水溶性ヌクレオシド）を急速に封入するために使用することができるＬＢコーティングされたＭＳＮＰプラットフォームのために開発されている（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。これは、ＬＢ−ＭＳＮＰが４０重量％までのＧＥＭの負荷容量を達成することを可能にするだけでなく、脂質二重層（ＬＢ）に組み込むことができる疎水性パクリタキセル（ＰＴＸ）の同時送達も可能にした（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。これは、マウスにおける同所ヒトＰＤＡＣモデルでのＰＤＡＣ処置のための相乗的及びレシオメトリック設計された担体を提供している（同書）。
【０２４０】
この担持ＬＢコーティング方法はまた、ＭＳＮＰ表面へのリポソーム付着、破断、追加のリポソーム組成物の追加によって二次的に密閉される不完全な被覆によるＭＳＮＰ表面の部分的被覆を含むいくつかのステップを伴う、ＭＳＮＰのための比較可能なリポソームコーティング技術よりもはるかに優れていることが実証されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１：７５６７−７５６９）。
【０２４１】
しかしながら、脂質二重層（ＬＢ）の存在は、以前の薬物送達ナノ粒子に改善をもたらしたが、本明細書に記載の遠隔負荷方法の利用前には、二重層はなお、さらに高い薬物負荷レベルの達成に対する障害をもたらした。
【０２４２】
上述のとおり、様々な実施形態で、ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームによる薬物負荷は、第１ステップとして、プロトン化剤を封入するためにＬＢを使用すること、続く、薬物の弱塩基性（ｐＫａ＝８．１）に依存しているイリノテカン負荷によって、さらに改善されている。本明細書の例において示すとおり、ＭＳＮＰ担体と、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）の封入の後に、非担持ＬＢがイリノテカン負荷のために使用されたリポソーム同等物（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７；Ｖｏｎ  Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０９（４）：９２０−９２５）との比較を行った。ＭＳＮＰ担体は、確固たる同所ＰＤＡＣモデルにおいて、リポソーム製剤よりも高いイリノテカンの負荷容量及び腫瘍死滅を達成しただけではなく、リポソームと比較して、担体安定性の上昇及び漏出の減少によって、薬物毒性も防いだ。したがって、ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームは、ＰＤＡＣ（または他のがん）処置のための第一選択イリノテカン担体に望ましい特性を示す。
【０２４３】
最近、ポリマー−脂質担持コーティング方法が、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によって、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて薬剤耐性乳癌腫瘍を処置するためのＭＳＮＰのイリノテカン薬物負荷のために記載された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５（１１）：３６５０−３６６５）。しかしながら、この参照文献に記載の方法は、本明細書に記載の方法及び組成物と比較すると、異なり、同じ薬物負荷容量を達成することはない。第一に、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、古典的なＬＢまたは捕捉剤を使用しておらず、本明細書で提供する担体（約８３．５ｗ／ｗ％）の１／５の負荷容量（約１５ｗ／ｗ％）しか有さない担体が生じる。
【０２４４】
第二の大きな相違は、薬物負荷手順にある。著者らは、「ＣＰＴ−１１＠ＭＳＮ」を遠心分離し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で洗浄し、次いで、真空下で室温で乾燥させる、と述べている。対照的に、本明細書に記載の方法は、保護されていないＭＳＮＰを乾燥させることを必要としない。全身薬物送達に重要な要件である水性媒体への再懸濁で、分散液を得ることが困難であるので、ＭＳＮＰの乾燥には、問題があり得る。加えて、本方法は、薬物損失を最小化し、かつ高い負荷容量（例えば、約８３．５％（ｗ／ｗ））を促進する空孔密閉の前に、薬物（例えば、イリノテカン）負荷されたＭＳＮＰの洗浄を必要としない。
【０２４５】
第三の大きな相違は、ＬＢ製剤の組成である。１つまたは複数の実施形態では、市販の脂質及びコレステロール（例えば、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の混合物を使用するが、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、社内合成したｐＨ不安定なＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１２３グラフト化ＤＯＰＥを使用する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃの使用は明らかに、薬物流出の防止剤として作用するその能力に基づくが（例えば、Ｂａｔｒａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１（１２）：２２２６−２２３３を参照されたい）、薬剤耐性乳癌を処置するためには問題である。コーティングされた二重層中にコレステロールが存在しないことで、プラットフォームの流動性及び安定性が低下する。対照的に、シリカソーム中のコレステロールの存在は、本明細書において開示するＬＢ−ＭＳＮＰの優れた安定性に寄与する（実施例を参照されたい）。さらに、提供する担体へのイリノテカン封入は、ｐＨ７．４を有する生物学的緩衝液中で、３７℃で、２４時間にわたって＜５％の漏出を示す。これは、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５：３６５０−３６６５）によって記載された早期漏出（ｐＨ７．４及び３７℃で、２４時間にわたって約１６％の漏出）よりも２．５倍低い。
【０２４６】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によって記載された薬物送達プラットフォームとの別の相違は、本発明の様々な実施形態が、バイオフィルム再水和及び空孔密閉、続く、遠心分離精製またはサイズ排除クロマトグラフィーのために、プローブ音波処理（ｐｒｏｂｅ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を使用することである。他方で、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、リポソームに関して、膜押出法を利用する。ＣＴＡＣも、ＭＳＮＰ合成のためのテンプレート剤（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として使用されるが、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．はＣＴＡＢを利用する。最後に、本発明は、ＰＤＡＣ及び他のがんのための治療の開発に取り組んでおり、主に、薬物耐性を克服するように設計されているのではないが、乳癌研究で使用するためにＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によって記載された薬物送達粒子は、そのように設計されている。すべて考慮すると、特定の理論には結び付けられないが、本明細書に記載の脂質二重層コーティングされたナノ粒子薬物担体（例えば、イリノテカン−送達ＬＢ−ＭＳＮＰ）は、薬物負荷容量、コロイド安定性、生成の容易さ、ならびに血液及び体液中での安定な薬物保持に基づき、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の担体よりも優れた独特の設計を提供すると考えられる。
【０２４７】
ナノ粒子。
様々な実施形態で、本明細書に記載のナノ粒子薬物担体は、脂質二重層でコーティングされた多孔性シリカナノ粒子（例えば、表面を有し、分子をその中に収容するために適した多数の空孔を画定するシリカ体）を含む。例えば、特定の実施形態では、シリカナノ粒子は、メソ多孔性シリカナノ粒子であってよい。ナノ粒子がシリカナノ粒子と称されるという事実は、シリカ以外の材料もシリカナノ粒子内に組み込まれることを妨げるものではない。一部の実施形態では、シリカナノ粒子は、表面に通じていて空孔へのアクセスをもたらす多数の空孔開口部を有する、実質的に球形であってよい。しかしながら、様々な実施形態では、シリカナノ粒子は、実質的に球形の形状以外の形状を有してもよい。したがって、例えば、特定の実施形態では、シリカナノ粒子は、実質的に卵形、ロッド形、実質的に正多角形、不正多角形であってよい。
【０２４８】
一般に、シリカナノ粒子は、空孔開口部間の外面、さらには、空孔内の側壁を画定するシリカ体を含む。空孔は、シリカ体を通って別の空孔開口部に延びていてもよいし、または空孔は、部分的にのみシリカ体を通じて延びていて、シリカ体によって画定される底表面を有してもよい。
【０２４９】
一部の実施形態では、シリカ体は、メソ多孔性である。他の実施形態では、シリカ体は、ミクロ多孔性である。本明細書で使用される場合、「メソ多孔性」は、約２ｎｍから約５０ｎｍの間の直径を有する空孔を有することを意味し、「ミクロ多孔性」は、約２ｎｍ未満の直径を有する空孔を有することを意味する。一般に、空孔は、任意のサイズであってよいが、典型的な実施形態では、１つまたは複数の治療用化合物をその中に含むために十分に大きい。このような実施形態では、空孔は、小分子、例えば、抗がん化合物などの治療用化合物が空孔の内表面に付着または結合し、治療目的で使用された場合には、シリカ体から放出されることを可能にする。一部の実施形態では、空孔は、実質的に円柱形である。
【０２５０】
特定の実施形態では、ナノ粒子は、直径約１ｎｍから約１０ｎｍの間、または約２ｎｍから約８ｎｍの間の空孔直径を有する空孔を含む。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約１ｎｍから約６ｎｍの間、または約２ｎｍから約５ｎｍの間の空孔直径を有する空孔を含む。他の実施形態は、２．５ｎｍ未満の空孔直径を有する粒子を含む。他の実施形態では、空孔直径は、１．５から２．５ｎｍの間である。例えば、シリカナノ粒子の調製中に異なる界面活性剤または膨潤剤を使用することによって、他の空孔サイズを有するシリカナノ粒子を調製してもよい。
【０２５１】
様々な実施形態では、ナノ粒子は、約１０００ｎｍの大きな（例えば、平均または中央直径（または他の特性寸法）の粒子を含んでよい。しかしながら、様々な実施形態では、一般に、３００ｎｍ超の粒子は、生細胞または血管開窓に進入する際にあまり有効ではないことがあるので、ナノ粒子は典型的には、５００ｎｍ未満または約３００ｎｍ未満である。特定の実施形態では、ナノ粒子は、サイズにおいて、約４０ｎｍ、または約５０ｎｍ、または約６０ｎｍから、約１００ｎｍ、または約９０ｎｍ、または約８０ｎｍ、または約７０ｎｍまでの範囲である。特定の実施形態では、ナノ粒子は、サイズにおいて、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍの範囲である。一部の実施形態は、約５０ｎｍから約１０００ｎｍの間の平均最大寸法を有するナノ粒子を含む。他の実施形態は、約５０ｎｍから約５００ｎｍの間の平均最大寸法を有するナノ粒子を含む。他の実施形態は、約５０ｎｍから約２００ｎｍの間の平均最大寸法を有するナノ粒子を含む。一部の実施形態では、平均最大寸法は、約２０ｎｍ超、約３０ｎｍ超、４０ｎｍ超、または約５０ｎｍ超である。他の実施形態は、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約ｌ００ｎｍ未満または約７５ｎｍ未満の平均最大寸法を有するナノ粒子を含む。本明細書で使用される場合、ナノ粒子のサイズは、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）または同様の可視化技術によって測定されるような、一次粒子の平均または中央サイズに関する。
【０２５２】
例示的なメソ多孔性シリカナノ粒子には、これらだけに限定されないが、ＭＣＭ−４１、ＭＣＭ−４８、及びＳＢＡ−１５が含まれる（例えば、Ｋａｔｉｙａｒｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．１１２２（１−２）：１３−２０を参照されたい）。
【０２５３】
多孔性シリカナノ粒子を作成する方法は、当業者に周知である。特定の実施形態では、メソ多孔性シリカナノ粒子を、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）をロッド状ミセルから作成されたテンプレートと反応させることによって合成する。結果は、規則的配置の空孔が多くあるナノサイズの球体またはロッドの集まりである。次いで、テンプレートを、適正なｐＨに調節された溶媒で洗浄することによって除去することができる（例えば、Ｔｒｅｗｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．１３７（１）：２３−２９を参照されたい。特定の実施形態では、メソ多孔性粒子は簡単なゾル−ゲル法を使用して合成することもできる（例えば、Ｎａｎｄｉｙａｎｔｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔ．１２０（３）：４４７−４５３などを参照されたい）。特定の実施形態では、オルトケイ酸テトラエチルを、追加のポリマーモノマー（テンプレートとして）と共に使用することができる。特定の実施形態では、３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）をＴＥＯＳの代わりに使用する。
【０２５４】
特定の実施形態では、メソ多孔性シリカナノ粒子は、Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７に記載のゾル／ゲル手順の改良によって合成された核である。ＭＳＮＰ約５００ｍｇのバッチを合成するためには、ＣＴＡＣ５０ｍＬをＨ２Ｏ１５０ｍＬと、フラスコ（例えば、５００ｍＬ円錐フラスコ）内で混合し、続いて、撹拌する（例えば、３５０ｒｐｍ、８５℃で１５分間にわたって）。これに続いて、１０％トリエタノールアミン８ｍＬを３０分間にわたって同じ温度で添加する。次いで、シリカ前駆体、ＴＥＯＳ７．５ｍＬを、ぜん動ポンプを使用して１ｍＬ／分の速度で滴下添加する。溶液を３５０ｒｐｍで８５℃で２０分間にわたって撹拌すると、約６５ｎｍの一次サイズを有する粒子の形成につながる。界面活性剤を、粒子をメタノール／ＨＣｌ（５００：１９ｖ／ｖ）の混合物で室温で２４時間にわたって洗浄することによって除去することができる。粒子を、１００００ｒｐｍで６０分間にわたって遠心分離し、メタノール中で３回洗浄することができる。
【０２５５】
本明細書に記載の負荷方法は、多孔性シリカナノ粒子（例えば、メソ多孔性シリカ）の負荷に関して実証されているが、同様の負荷方法を他の多孔性ナノ粒子で使用することができることは認められるであろう。薬物送達ナノ粒子で使用することができる多数の他のメソ多孔性物質が、当業者に知られている。例えば、特定の実施形態では、メソ多孔性炭素ナノ粒子を利用することができるであろう。メソ多孔性炭素ナノ粒子は、当業者に周知である（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃａｒｂｏｎ，１０１：１３５−１４２；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｓｉａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９（２）：８２−９１；などを参照されたい）。
【０２５６】
同様に、特定の実施形態では、メソ多孔性ポリマー粒子を利用することができる。蒸発誘導自己集合戦略による、トリブロックコポリマーと可溶性低分子量フェノール樹脂前駆体（レゾール）との有機−有機集合体からの高度規則メソ多孔性ポリマー及び炭素フレームワークの合成が、Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｈｅｍ．Ｍａｔ．６（１８）：４４４７−４４６４及びそこに引用されている参照文献によって報告されている。
【０２５７】
本明細書に記載のナノ粒子は、実例であり、非限定的である。本明細書において提供する教示を使用して、多数の他の脂質二重層薬物送達ナノ粒子を、当業者は利用することができるであろう。
【０２５８】
脂質二重層。
本明細書に記載の薬物担体ナノ粒子は、脂質二重層でコーティングされた多孔性ナノ粒子（例えば、メソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ））を含む。特定の実施形態では、急速かつ均一な粒子コーティングを得るために、コロイド及び循環安定性を得るために、及び望ましいカーゴ放出プロファイルも許容しながら有効なカーゴ保持を得るために、二重層組成物を最適化する。
【０２５９】
特定の実施形態では、脂質二重層は、リン脂質、コレステロール、及び特定の実施形態では、ペグ化脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）、または標的化部分または他の部分とのコンジュゲーションを促進するための機能化（ｆａｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ペグ化脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド）の組合せを含む。
【０２６０】
表面ＬＢコーティングを付着させるために、コーティングされる脂質フィルム手順が開発され、その際、薬物−またはＴＥＯ８ＳＯＳ浸漬されたＭＳＮＰ懸濁液を、例えば、丸底フラスコ上にコーティングされた広い脂質フィルム表面に添加する。種々の脂質二重層組成物を使用して、一連の実験を行って、急速かつ均一な粒子ラッピング、コーティング及び有効なカーゴ保持ならびに／または音波処理での放出をもたらす組成及び最適な脂質／粒子比を見い出すことができる。この脂質組成及びラッピングは、低エネルギーボルテックス条件下での粒子表面へのリポソーム融合によっては、達成することができないと考えられる。
【０２６１】
実施例１に記載のとおり、特定の実施形態では、ＭＳＮＰ５００ｍｇをＴＥＡ８ＳＯＳ２０ｍＬ（８０ｍＭ溶液）に浸漬し、これを、丸底フラスコの底にコーティングされたＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の混合物（モル比３：２：０．１５）５５０ｍｇからなる脂質バイオフィルムの上部に添加する（実施例１、及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５を参照されたい）。比を表すためにｍｏｌ％を使用するならば、「３：２：０．１５」の比は、「５８．３ｍｏｌ％：３８．８ｍｏｌ％：３．９ｍｏｌ％」に等しい。これは、約１．１：１の脂質：粒子比をもたらす。ＬＢでの粒子ラッピング及びコーティングを達成するための音波処理の後に、遊離ＴＥＡ８ＳＯＳを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたシリカソームを、薬物負荷のために、イリノテカン溶液１０ｍｇ／ｍＬ中で、６５℃の水浴内でインキュベートする。３０分後に、氷水浴内でクエンチすることによって、負荷を停止し、続いて、薬物負荷されたシリカソームを遠心分離によって３回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０２６２】
上記及び実施例１に記載の脂質二重層配合は、実例であり、非限定的である。シリカソームに負荷される薬物（複数可）及び所望の放出プロファイルに応じて、様々な実施形態では、種々の脂質二重層配合を使用することができ、最適な配合を決定することができる。
【０２６３】
したがって、特定の実施形態では、脂質二重層は、１）Ｃ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する１つまたは複数の飽和脂肪酸、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジアクチル（ｄｉａｃｔｙｌ）ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）；ならびに／または２）Ｃ１４〜Ｃ２０炭素鎖を有する１つまたは複数の不飽和脂肪酸、例えば、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ならびに／または３）Ｃ１２〜Ｃ２０炭素鎖を有する脂肪酸の混合物を含む天然脂質、例えば、卵ＰＣ、及び大豆ＰＣ、スフィンゴミエリンなどを含んでよい。これらの脂質は、実例であるが、非限定的であり、多数の他の脂質が公知であり、シリカソームの形成のために脂質二重層に組み込むことができる。
【０２６４】
特定の実施形態では、シリカソームは、脂質（例えば、リン脂質）、コレステロール、及びＰＥＧ機能化脂質（例えば、ｍＰＥＧリン脂質）を含有する。特定の実施形態では、ｍＰＥＧリン脂質は、Ｃ１４〜Ｃ１８リン脂質炭素鎖、及び３５０〜５０００のＰＥＧ分子量を含む（例えば、ＭＰＥＧ５０００、ＭＰＥＧ３０００、ＭＰＥＧ２０００、ＭＰＥＧ１０００、ＭＰＥＧ７５０、ＭＰＥＧ５５０、ＭＰＥＧ３５０など）を含む。特定の実施形態では、ｍＰＥＧリン脂質は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ７５０、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５５０、またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ３５０を含む。ＭＰＥＧは、市販されている（例えば、／／ａｖａｎｔｉｌｉｐｉｄｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ−ｃａｔｅｇｏｒｙ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｏｌｙｍｅｒｓ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ−ｌｉｐｉｄｓ／ｍｐｅｇ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ／を参照されたい）。
【０２６５】
特定の実施形態では、リン脂質：ＣＨＯＬ：ＰＥＧの比は、おおよそリン脂質（５０〜９０ｍｏｌ％）：ＣＨＯＬ（１０〜５０ｍｏｌ％）：ＰＥＧ（１〜１０ｍｏｌ％）である。
【０２６６】
上記、及び実施例で提供しているこのプロトコルは例示である。特定の実施形態では、それらの特定のカーゴ（複数可）に最適化された他のシリカソームを特定するために、捕捉剤を変更することができ、脂質組成物及びモル比を変更することができ、１つまたは複数の薬物を変更することができる。
【０２６７】
例えば、ゲムシタビン含有シリカソームのための有効な脂質配合物は、ＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを７７．５：２０：２．５のモル比で含む一方で、イリノテカン含有シリカソームのための有効な脂質配合物は、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（モル比３：２：０．１５、これは５８．３ｍｏｌ％：３８．８ｍｏｌ％：３．９ｍｏｌ％に等しい）を含むことに注意されたい。
【０２６８】
特定の実施形態では、これらの方法は、薬物負荷容量（薬物重量／担体の合計重量）を改善するために変動させることができる。特定の実施形態では、薬物負荷容量は、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも８０ｗ／ｗ％である。特定の実施形態では、薬物負荷は、４０ｗ／ｗ％超、または４５ｗ／ｗ％超、または５０ｗ／ｗ％超、または６０ｗ／ｗ％超、または７０ｗ／ｗ％、％超、または８０ｗ／ｗ％超である。
【０２６９】
本明細書に記載のプロトコルは、本明細書において提供する合成の容易さ及び改善された負荷容量及び放出プロファイルの記載によって例示されるとおり、ＭＳＮＰ表面との融合によって、リポソームコーティング方法によって作成されたナノ担体よりも優れたナノ粒子薬物担体（ナノ担体）を提供する。典型的な実施形態では、ＬＢコーティング手順を使用して、プロトン化剤、例えば、ＴＥＡ８ＳＯＳを急速に封入するが、これは後に、ＬＢを越えて拡散して入ってくる薬物をプロトン化することによってイリノテカン負荷及び捕捉をもたらす。これは、粒子空孔への高い薬物負荷をもたらす。漏出させることなく捕捉剤（例えば、ＴＥＡ８ＳＯＳ）を保持するための急速かつ有効な空孔密閉は、担体の有効性及び安定性に寄与する。
【０２７０】
カーゴ捕捉試薬。
カーゴ捕捉試薬は、所望のカーゴと相互作用するように選択することができる。一部の実施形態では、この相互作用は、イオンまたはプロトン化反応であってよいが、他の様式の相互作用が企図される。カーゴ捕捉剤は、１つまたは複数のイオン性部位を有してよく、すなわち、モノイオン性またはポリイオン性であってよい。イオン性部分は、陽イオン性、陰イオン性であってよく、または場合によっては、カーゴ捕捉剤は、陽イオン性及び陰イオン性部分の両方を含んでよい。イオン性部位は、対応する非荷電形態と平衡していてよい；例えば、陰イオン性カルボキシラート（-ＣＯＯ−）は、その対応するカルボン酸（−ＣＯＯＨ）と平衡してよいか；または別の実施例では、アミン（−ＮＨ２）は、その対応するプロトン化アンモニウム形態（−ＮＨ３＋）と平衡していてよい。これらの平衡は、局所環境のｐＨによって影響される。
【０２７１】
同様に特定の実施形態では、カーゴは、１つまたは複数のイオン性部位を含んでよい。カーゴ捕捉剤及びカーゴは、ナノ粒子（例えば、メソ多孔性シリカナノ粒子）の内側で相互作用するように選択され得る。この相互作用は、カーゴの放出が望まれるまで、カーゴをナノ粒子内に保持するために役立ち得る。一部の実施形態では、カーゴは、非イオン性形態とイオン性形態との間のｐＨ依存的平衡で存在し得る。非イオン性形態は、脂質二重層を越えて拡散し、ＭＳＮＰの空孔に進入し得る。そこで、カーゴ捕捉剤（例えば、ポリイオン性カーゴ捕捉剤）が、カーゴのイオン性形態と相互作用し、それによって、カーゴをナノ担体内に、例えば、ＭＳＮＰの空孔内に保持することができる（カーゴ及びカーゴ捕捉剤のイオン性形態が反対の電荷を有することを条件とする）。相互作用は、イオン性相互作用であってよく、沈澱物の形成を含んでよい。ナノ担体内でのカーゴの捕捉は、同様の系、例えば、カーゴ捕捉剤を省いたナノ担体、または捕捉剤を含まないリポソームと比較して、高レベルのカーゴ負荷をもたらし得る。カーゴの放出は、カーゴとカーゴ捕捉剤との間の相互作用を破壊するｐＨの適切な変化によって、例えば、カーゴを、脂質二重層を越えて容易に拡散することができるその非イオン性状態に戻すことによって達成することができる。一実施形態では、カーゴはイリノテカンであり、カーゴ捕捉剤はＴＥＡ８ＳＯＳである。
【０２７２】
カーゴ捕捉剤を、ＴＥＡ８ＳＯＳに限定する必要はない。特定の実施形態では、カーゴ捕捉は、（ＮＨ４）２ＳＯ４などの小分子を含む。他の捕捉剤には、これらだけに限定されないが、アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム、アンモニウムスクロースオクタスルファート、アンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、アンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、、アンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、アンモニウムホスファート、アンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、アンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、アンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、クエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど）、トリメチルアンモニウム塩（例えば、トリメチルアンモニウムスルファート、トリメチルアンモニウムスクロースオクタスルファート、トリメチルアンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、トリメチルアンモニウムホスファート、トリメチルアンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、トリメチルアンモニウムシトラート、トリメチルアンモニウムアセタートなど）、トリエチルアンモニウム塩（例えば、トリエチルアンモニウムスルファート、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート、トリエチルアンモニウムα−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムβ−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムγ−シクロデキストリンスルファート、トリエチルアンモニウムホスファート、トリエチルアンモニウムα−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムβ−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムγ−シクロデキストリンホスファート、トリエチルアンモニウムシトラート、トリエチルアンモニウムアセタートなど）が含まれる。
【０２７３】
ＴＥＡ８ＳＯＳに加えて、膜貫通ｐＨ勾配を、酸性緩衝剤（例えば、クエン酸塩）（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．，９５（４）：４０５−４０８；Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、４５５（１）：２６９−２７１）、プロトン生成解離塩（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）（Ｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１１５１（２）：２０１−２１５；Ｍａｕｒｅｒ−Ｓｐｕｒｅｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１４１６（１）：１−１０；Ｆｒｉｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１７５８（１０）：１６３３−１６４０）、または金属塩からのイオノフォア媒介イオン勾配（例えば、Ａ２３１８７及びＭｎＳＯ４）（Ｍｅｓｓｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０（１９）：６６３８−６６４９；Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．６８（３）：６０７−６１７；Ｆｅｎｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１４１４（１）Ｌ  １８８−２０４）によって生成することもできることも、指摘に値する。さらに、ＬＢ−ＭＳＮＰへの両親媒性弱酸負荷を改善するために酢酸カルシウム勾配を使用するなど、薬物負荷のために逆ｐＨ勾配を生成することが可能であり、これは、リポソームで利用されている戦略である（Ａｖｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５８（１）：１１９−１２９）。
【０２７４】
カーゴ／薬物。
１つまたは複数の実施形態では、カーゴは、プロトン化され得る少なくとも１個の第一級アミン基、または少なくとも１個の第二級アミン基、または少なくとも１個の第三級アミン基、または少なくとも１個の第四級アミン基、またはその任意の組合せを含む有機化合物を含む。本発明者らはまた、プロトン勾配によってＬＢ−ＭＳＮＰに負荷することができる弱塩基性薬物の包括的なリストを特定している。これらのカーゴ分子の一般的な特徴には、次の化学的特性が含まれる：
（ｉ）第一級、第二級、第三級または第四級アミン（複数可）を含む有機分子化合物；
（ｉｉ）プロトン化及びＬＢの後ろでの捕捉を可能にするｐＫａ＜１１（Ｚｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１３９（１）：７３−８０；Ｃｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１６０（２）：１４７−１５７；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．３１（１０）：２５８３−２５９２）；
（ｉｉｉ）ＬＢを越えての拡散を可能にする５〜２５ｍｇ／ｍＬの水溶性指数及び両親媒性；
（ｉｖ）−３．０〜３．０のオクタノール／水分配係数またはｌｏｇＰ値（Ｚｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１３９（１）：７３−８０；Ｃｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１６０（２）：１４７−１５７）；
（ｖ）ＭＳＮＰ空孔への進入を可能にするＭＳＮＰ空孔サイズ（２〜８ｎｍ）よりも小さい幾何学的寸法を有する適切な分子量（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４１（７）：２５９０−２６０５；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｄｖ．Ｍａｔ．２４（１２）：１５０４−１５３４；Ｔａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４６（３）：７９２−８０１）。
【０２７５】
すべてを包括するものではないが、様々な実施形態では、有望な化学療法薬のリストには、イリノテカン誘導体及び代謝産物、例えば、他のアルカロイドと共にＳＮ３８（例えば、トポテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、ビノレルビン、ＬＡＱ８２４、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ホモハリングトニン、トラベクテジン）、アンスラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、ルビドマイシン、バルルビシン、アムルビシン）、アルカリ性アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、アルカリ性アルキル化薬（例えば、シクロフォスファミド、メクロレタミン、テモゾロミド）、プリンまたはピリミジン誘導体（例えば、５−フルオロウラシル、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ゲムシタビン、カペシタビン）、及びプロテインキナーゼ阻害薬（例えば、パゾパニブ、エンザスタウリン、バンデタニブエルロチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ）が含まれ得る。
【０２７６】
上記薬剤の１つまたは組み合わせをパッケージング及び送達する能力は、結腸、乳房、肺、肝臓、膠腫、黒色腫などの追加のがん種の処置問題を含む、多機能ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームの幅広い有用性を増強する。
【０２７７】
上のリストの薬物組合せを単一の担体に同時パッケージングすることも可能である。例えば、本発明者らのＧＥＭ／ＰＴＸ同時送達プラットフォームで本発明者らが達成した成功に基づき（例えば、Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７を参照されたい）、本明細書に記載のシリカソームを使用して、相乗的及びレシオメトリック送達のために、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメンの薬物の組合せ（例えば、オキサリプラチンとイリノテカン）を検討することが可能である。さらに、本発明者らのＬＢ−ＭＳＮＰによる薬物負荷は、感染症用途のための抗生物質、例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシンまたはＨＩＶ抗レトロウイルス薬（例えば、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩）の封入などの非がん用途のために使用することができる。
【０２７８】
上述の制がん薬に加えて、薬物分子が上記のとおり塩基性である限り、捕捉試薬によって促進されるＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームは、効率的な薬物負荷及び送達に有用である。非塩基性薬物分子では、捕捉試薬は限られた援助しか提供しないであろうが、ＭＳＮＰ空孔修復のために用意された１ステップバイオフィルム技術が、さらに広いスペクトルの薬物分子、例えば、抗がん薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、及び抗生物質にさらに有効である。
【０２７９】
例えば、ＭＳＮＰを密閉するためのＬＢバイオフィルムの使用では、特定の実施形態では、効率的な薬物封入は、これらだけに限定されないが、エベロリムス、トラベクテジン、パクリタキセル、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３阻害薬、ＶＥＧＦＲ阻害薬、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害薬、オーロラキナーゼ阻害薬、ＰＩＫ−１モジュレーター、Ｂｃｌ−２阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ｃ−ＭＥＴ阻害薬、ＰＡＲＰ阻害薬、Ｃｄｋ阻害薬、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害薬、ＩＧＦＲ−ＴＫ阻害薬、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼ阻害薬、ＡＫＴ阻害薬、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害薬、チェックポイント−１または２阻害薬、接着斑キナーゼ阻害薬、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）阻害薬、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ、ニロチニブ、デカタニブ、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキセド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３１−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンジタイド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ１  ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ、ビテスパン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル（ｔａｌａｍｐａｎｅｌ）、アトラセンタン（ａｔｒａｃｅｎｔａｎ）、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ（ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ）；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］二ナトリウム塩七水和物、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル］−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕ  ｔ）６，Ａｚｇｌｙ  １０］（ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕ  ｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ２アセタートの酢酸塩［Ｃ５９Ｈ８４Ｎ１８Ｏｉ４−（Ｃ２Ｈ４Ｏ２）Ｘ、式中、ｘ＝１〜２．４］、酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、パモ酸トリプトレリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ（ｌａｐａｔａｎｉｂ）、カネルチニブ（ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、イオナファルニブ（Ｉｏｎａｆａｒｎｉｂ）、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、スベロイルアナリドヒドロキサム酸（ｓｕｂｅｒｏｙｌ  ａｎａｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリーバック（ｇｌｅｅｖａｃ）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メカプトプリン（６−ｍｅｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン（ｒａｚｏｘｉｎ）、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、ドロロキシフェン、イドキシフェン（ｉｄｏｘｙｆｅｎｅ）、スピロノラクトン、フィナステリド、シミチジン（ｃｉｍｉｔｉｄｉｎｅ）、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ  ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、ゲフィチニブ、ボルテジミブ（ｂｏｒｔｅｚｉｍｉｂ）、パクリタキセル、クレモフォール−非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチオロンＢ（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ  Ｂ）、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン（ｐｉｐｅｎｄｏｘｉｆｅｎｅ）、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン（ａｒｚｏｘｉｆｅｎｅ）、フルベストラント、アコルビフェン（ａｃｏｌｂｉｆｅｎｅ）、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００１、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ウォルトマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロナート（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ペグ化インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ａ、ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン（ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ）、アレムツズマブ、オールトランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メゲストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブ−チウキセタン（ｉｂｒｉｔｇｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、アンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エジトロナート（ｅｄｉｔｒｏｎａｔｅ）、ミトタン、シクロスポリン、リポソームダウノルビシン、Ｅｄｗｉｎａ−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント（ｃａｓｏｐｉｔａｎｔ）、ネツピタント（ｎｅｔｕｐｉｔａｎｔ）、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセトロン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポイエチン、エポエチンアルファ、及びダルベポエチンアルファ、ボセプレビル、ダクラタスビル、アスナパビル（ａｓｕｎａｐａｖｉｒ）、ＩＮＸ−１８９、ＦＶ−１００、ＮＭ２８３、ＶＸ−９５０（テラプレビル）、ＳＣＨ５０３０４、ＴＭＣ４３５、ＶＸ−５００、ＢＸ−８１３、ＳＣＨ５０３０３４、Ｒ１６２６、ＩＴＭＮ−１９１（Ｒ７２２７）、Ｒ７１２８、ＰＦ−８６８５５４、ＴＴ０３３、ＣＧＨ−７５９、ＧＩ５００５、ＭＫ−７００９、ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、Ａ−８３７０９３、ＧＳ９１９０、ＧＳ９２５６、ＧＳ９４５１、ＧＳ５８８５、ＧＳ６６２０、ＧＳ９６２０、ＧＳ９６６９、ＡＣＨ−１０９５、ＡＣＨ−２９２８、ＧＳＫ６２５４３３、ＴＧ���０４０（ＭＶＡ−ＨＣＶ）、Ａ−８３１、Ｆ３５１、ＮＳ５Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＡＮＡ５９８、Ａ−６８９、ＧＮＩ−１０４、ＩＤＸ１０２、ＡＤＸ１８４、ＡＬＳ−２２００、ＡＬＳ−２１５８、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ２０７１２７、ＢＩＴ−２２５、ＢＩＴ−８０２０、ＧＬ５９７２８、ＧＬ６０６６７、ＰＳＩ−９３８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−７８５１、ＳＣＹ−６３５、リバビリン、ペグ化インターフェロン、ＰＨＸ１７６６、ＳＰ−３０、またはその混合物を含む。
【０２８０】
特定の実施形態では、カーゴは、抗真菌薬を含む。例示的な抗真菌薬には、これらだけに限定されないが、アンホテリシンＢ（例えば、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｓｐ．を除く多くの真菌感染などのための）、アニデュラファンギン（例えば、カンジダ血症を含むカンジダ症などのための）、カスポファンギン（例えば、アスペルギルス症、カンジダ血症を含むカンジダ症などのための）、フルコナゾール（例えば、粘膜及び全身システムカンジダ症、クリプトコックス髄膜炎、コクシジオイデス髄膜炎などのための）、フルシトシン（例えば、カンジダ症（全身）、クリプトコックス症などのための）、イサブコナゾール（例えば、アスペルギルス症、ムコール菌症などのための）、イトラコナゾール（例えば、白癬、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、スポロトリクス症などのための）、ミカファンギン（例えば、カンジダ血症を含むカンジダ症のための）、ポサコナゾール（例えば、侵襲性アスペルギルス症及びカンジダ症、口腔カンジダ症、イトラコナゾールに対して難治性の口腔カンジダ症などを予防するため）、ボリコナゾール（例えば、侵襲性アスペルギルス症、フサリウム症、スケドスポリウム症などのために）などが含まれる。
【０２８１】
二重治療用シリカソーム。
特定の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子薬物担体（シリカソーム）が２種以上の治療薬を含むことができることは認められるであろう。したがって、例えば、特定の実施形態では、シリカソーム中の空孔に、２つ、または３つ、または４つ、またはそれ以上の異なる治療薬を負荷することができる。これは、特定の実施形態では、これらの治療薬のレシオメトリック送達を可能にし得る。非限定的実例では、多数の多剤治療レジメンが、がんの処置では公知である。これらには、これらだけに限定されないが、ＣＯＭＰ（メトトレキサート、プレドニゾン）、ＬＳＡ２−Ｌ２（シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ダウノマイシン、メトトレキサート、シタラビン、チオグアニン、アスパラギナーゼ、及びカルムスチン）、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（イリノテカン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）などが含まれる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用してシリカソームに負荷される薬物に関する本明細書に記載の要求を満たす２種以上の薬剤をシリカソームに与えることができる。多剤レジメンが、本明細書に記載の負荷方法と適合し得ない薬剤を含む場合には、一部の薬剤（例えば、イリノテカン）を、忍容性の改善を得るためにシリカソームに与えることができ、処置レジメンの他の成分は、従来のモダリティによって投与することができる。
【０２８２】
特定の実施形態では、疎水性（例えば、親油性）薬物、及び他の薬剤）を、シリカソームの脂質二重層成分に与えることができる。そのような疎水性薬物には、これらだけに限定されないが、パクリタキセル、エリプチシン、カンプトテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、ＳＮ−３８などが含まれる。特定の実施形態では、シリカソームの脂質二重層成分は、１つまたは複数のリン脂質プロドラッグ（例えば、脂質にコンジュゲートした薬物）を含有してよい。例示的な脂質プロドラッグには、これらだけに限定されないが、アシクロビルジホスファートジミリストイルグリセロール（例えば、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（２４）：１１８３５−１１８３９を参照されたい）、ドキソルビシン結合型リン脂質プロドラッグ（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．，３：３２９７−３３０５を参照されたい）、ヌクレオシド類似体のリン脂質誘導体（例えば、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａ−Ｃ）の５’−ジホスファート−Ｌ−１，２−ジパルミチン誘導体、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（ａｒａ−Ａ）、ツベルシジンなど（例えば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１：２７０７−２７１３）を参照されたい）、リン脂質結合型クロラムブシル（例えば、Ｐｅｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５３：３７８２−３７９２を参照されたい）などが含まれる。
【０２８３】
上述の多剤シリカソームは、例示的及び非限定的である。本明細書において提供する教示を使用すると、本明細書に記載のシリカソーム中に（またはその上に）組み込むために多数の治療薬の組合せを、当業者は利用することができるであろう。
【０２８４】
標的化リガンド及び免疫複合体。
特定の実施形態では、ＬＢコーティングされたナノ粒子（シリカソーム）を、例えば、内皮細胞、がん細胞への特異的送達を促進するための１つまたは複数の標的化リガンドに、例えば、エンドソーム脱出を促進するための融合性リガンド、血液脳関門などを越えての輸送を増進するためのリガンドにコンジュゲートさせることができる。
【０２８５】
例示的な、ただし非限定的な一実施形態では、シリカソームを、ヒスチジンリッチＨ５ＷＹＧ（Ｈ２Ｎ−ＧＬＦＨＡＩＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧ−ＣＯＯＨ（配列番号１））などの融合性ペプチドにコンジュゲートさせる（例えば、Ｍｉｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９：２６０−２６７を参照されたい）。
【０２８６】
特定の実施形態では、シリカソームを、抗体、さらには標的化ペプチドを含む標的化リガンドにコンジュゲートさせる。標的化抗体には、これらだけに限定されないが、インタクトな免疫グロブリン、免疫グロブリン断片（例えば、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂなど）、一本鎖抗体、二重特異性抗体、アフィボディ、ユニボディ、ナノボディなどが含まれる。特定の実施形態では、がんマーカーに特異的に結合する抗体を使用する（例えば、腫瘍関連抗原）。広範囲の様々ながんマーカーが、当業者に知られている。マーカーは、がん細胞に特有である必要はないが、マーカーの発現ががん細胞で上昇する場合（正常で健康な細胞と比較して）、またはマーカーが周囲組織において匹敵するレベルで存在しない場合（特に、キメラ部分が局所送達される場合）にも、有効であり得る。
【０２８７】
例示的ながんマーカーには、例えば、ＮＤ４モノクローナル抗体によって認識される腫瘍マーカーが含まれる。このマーカーは、不十分に分化された結腸直腸癌、さらには、胃腸神経内分泌腫瘍で見い出される（例えば、Ｔｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，２２（２）：１４７−１５２を参照されたい）。がん免疫療法のための他の重要な標的は、膜結合補体調節糖タンパク質ＣＤ４６、ＣＤ５５及びＣＤ５９であり、これらは、インビボ及びインビトロで、多くの腫瘍細胞上に発現されることが見出されている。ヒトムチン（例えば、ＭＵＣ１）は、ｇｐ１００、チロシナーゼ、及びＭＡＧＥと同様に、公知の腫瘍マーカーであり、これらは、黒色腫において見出される。野生型ウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１は、多くの急性骨髄球性、急性リンパ球性、及び慢性骨髄球性白血病だけではなく、肺癌を含む様々な種類の充実性腫瘍でも高レベルで発現される。
【０２８８】
急性リンパ球性白血病は、ＴＡＡｓ  ＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、及びＣＤ２０によって特徴づけられている。急性骨髄性白血病は、ＴＡＡｓ  ＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３３、及びＣＤ３４によって特徴づけられている。乳癌は、マーカーＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、Ｔａｇ−７２によって特徴づけられている。様々な癌が、マーカーＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、及びＣＥＡによって特徴づけられている。慢性リンパ球性白血病は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５、及びＨＬＡ−ＤＲによって特徴づけられている。ヘアリーセル白血病は、マーカーＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５によって特徴づけられている。ホジキン病は、Ｌｅｕ−Ｍ１マーカーによって特徴づけられている。様々な黒色腫が、ＨＭＢ４５マーカーによって特徴づけられている。非ホジキンリンパ腫は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、及びＩａマーカーによって特徴づけられている。また、様々な前立腺癌が、ＰＳＭＡ及びＳＥ１０マーカーによって特徴づけられている。
【０２８９】
加えて、多くの種類の腫瘍細胞は、細胞種及び／またはその環境には不適切であるか、または生体の発生中にだけ存在することが正常である（例えば、胎児性抗原）、稀な抗原を表示する。そのような抗原の例には、正常には、神経細胞の外表面膜上で有意水準で発現されるだけであり、免疫系へのその曝露は、血液脳関門によって限定されるグリコスフィンゴリピド脂質ＧＤ２、ジシアロガングリオシドが含まれる。ＧＤ２は、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、黒色腫、小細胞肺癌、骨肉腫及び他の軟部組織肉腫を含む広範な腫瘍細胞の表面上で発現される。したがって、ＧＤ２は、免疫療法のための便利な腫瘍特異的標的である。
【０２９０】
他の種類の腫瘍細胞は、健康な細胞の表面では稀であるか、存在せず、腫瘍細胞の未制御の増殖及び分化を引き起こす細胞シグナル伝達経路の活性化を担う細胞表面受容体を表示する。例には、乳癌腫瘍細胞の表面で異常に高いレベルで産生される（ＥｒｂＢ２）ＨＥＲ２／ｎｅｕ、構成的活性型細胞表面受容体が含まれる。
【０２９１】
他の有用な標的には、これらだけに限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、上皮成長因子受容体などが含まれる。
【０２９２】
適切な腫瘍マーカーの例示的な、ただし限定的ではないリストを表１に提示する。これらの及び他のがんマーカーに対する抗体は、当業者に公知であり、商業的に得ることができるか、または例えば、ファージ−ディスプレイ技術を使用して容易に生成することができる。そのような抗体は、例えば、実施例３で、ｉＲＧＤペプチドをコンジュゲートさせるのと同じ手法で、本明細書に記載のシリカソームに容易にコンジュゲートさせることができる。
【０２９３】
【表１Ａ】
2019501198.tif 000003
【表１Ｂ】
2019501198.tif 000004
【表１Ｃ】
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【表１Ｄ】
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【表１Ｅ】
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【表１Ｆ】
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【０２９４】
上述のマーカーのいずれも、本明細書に記載のシリカソームコンストラクトを構成する標的化部分のための標的として使用し得る。特定の実施形態では、標的マーカーには、これらだけに限定されないが、上皮成長因子ファミリーのメンバー（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦ、ＨＥＲ４）、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、５Ｅ１０、ＣＥＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＢ  ４５、１ａ、Ｌｅｕ−Ｍ１、ＭＵＣ１、ＰＭＳＡ、ＴＡＧ−７２、ホスファチジルセリン抗原などが含まれる。
【０２９５】
上述のマーカーは、例示であって、限定ではないことが意図されている。他の腫瘍関連抗原も、当業者に公知であろう。
【０２９６】
腫瘍マーカーが細胞表面受容体である場合、その受容体に対するリガンドが、標的化部分として機能し得る。同様に、そのようなリガンドの模倣物質も、標的化部分として使用することができる。したがって、特定の実施形態では、ペプチドリガンドを、様々な抗体に加えて、またはその代わりに使用することができる。適切な標的化ペプチドの例示的な、ただし非限定的なリストを表２に示す。特定の実施形態では、これらのペプチドのいずれか１つまたは複数を、本明細書に記載のシリカソームにコンジュゲートさせることができる。
【表２】
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【０２９７】
特定の実施形態では、シリカソームを、循環における安定性を促進する、及び／またはシリカソームを細網内皮系（ＲＥＣ）から隠す、及び／またはバリア（例えば、間質障壁、血液脳関門など）を越えての、及び／または組織への輸送を促進する部分にコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、シリカソームを、血液脳関門を越えての輸送を促進するためにトランスフェリンまたはＡｐｏＥにコンジュゲートさせる。特定の実施形態では、シリカソームを、葉酸にコンジュゲートさせる。
【０２９８】
シリカソームを標的化剤（または他の薬剤）にカップリングする方法は、当業者に周知である。例には、これらだけに限定されないが、例えば、二官能性カップリング剤、例えば、グルタルアルデヒド、ジイミドエステル、芳香族及び脂肪族ジイソシアンナート、ジカルボン酸のビス−ｐ−ニトロフェニルエステル、芳香族ジスルホニルクロリド及び二官能性アリールハライド、例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン；ｐ，ｐ’−ジフルオロｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン、スルフヒドリル反応性マレイミドなどを使用する従来の化学反応によって、ビオチン及びアビジンまたはストレプトアビジンを使用すること（例えば、米国特許第４，８８５，１７２Ａ号を参照されたい）が含まれる。そのようなカップリングに適用され得る適切な反応は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９６７に記載されている。実施例３に記載の、例示的な、ただし非限定的な１つのアプローチでは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００をＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミドで置換し（実施例３の方法セクションを参照されたい）、システイン−修飾ペプチドへのチオール−マレイミドカップリングを可能にすることによって、ペプチド（この実施例ではｉＲＧＤ）をシリカソームにカップリングさせる。特定の実施形態では、標的化（及び他の）部分を、脂質二重層を含む脂質にコンジュゲートさせることができることも認められるであろう。
【０２９９】
前のコンジュゲート及びカップリング方法は、例示的及び非限定的である。本明細書において提供する教示を使用すると、多数の他の部分を、様々な方法のいずれかによって、本明細書に記載のシリカソームにコンジュゲートさせることができる。
【０３００】
医薬製剤、投与及び治療
医薬製剤。
一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子薬物担体を、単独で、または投与経路及び標準的な薬務に従って選択された生理学的に許容される担体（生理食塩水またはリン酸塩緩衝液など）との混合物で投与する。例えば、注射剤として使用する場合、シリカソームは、薬学的に許容される担体を用いて無菌懸濁剤、分散剤、または乳剤として製剤化することができる。特定の実施形態では、生理食塩水を、薬学的に許容される担体として使用することができる。他の適切な担体には、安定性の増強のための糖タンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含む、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどが含まれる。食塩水または他の塩含有担体を含む組成物では、担体を好ましくは、シリカソームの形成後に添加する。したがって、シリカソームを形成し、適切な薬物（複数可）を負荷した後に、シリカソームを、生理食塩水などの薬学的に許容される担体中で希釈することができる。これらの組成物を、従来の周知の減菌技術によって滅菌することができる。得られた水性溶液、懸濁液、分散液、エマルジョンなどを、使用のためにパッケージングするか、または無菌条件下で濾過することができる。特定の実施形態では、シリカソームを凍結乾燥し、凍結乾燥された製剤を、投与前に無菌水溶液と合わせる。組成物はまた、生理学的条件に近づけるために必要な場合には、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、張性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを含有してよい。
【０３０１】
加えて、特定の実施形態では、医薬製剤は、貯蔵時にフリーラジカル及び脂質過酸化損傷に対して脂質を保護する脂質保護剤を含んでよい。親油性フリーラジカル失活剤、例えば、アルファ−トコフェロール及び水溶性鉄特異的キレート剤、例えば、フェリオキサミン（ｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）が適している。
【０３０２】
医薬製剤中のシリカソームの濃度は、例えば、重量で約０．０５％未満、通常は、少なくとも約２〜５％から、多くは１０〜５０％まで、または４０％まで、または３０％まで広く変動してよく、選択された特定の投与様式に従って、主に流体体積、粘度などによって選択される。例えば、処置と関連した流体負荷を低下させるために、濃度を上昇させてもよい。これは特に、アテローム硬化症関連鬱血性心不全または重篤な高血圧を有する患者で望ましいことがある。別法では、投与部位での炎症を軽減するために、刺激性脂質から構成されるシリカソームを、低濃度まで希釈してもよい。投与されるシリカソームの量は、使用される特定の薬物、処置される病態及び臨床家の判断に左右されるが、一般に、体重１キログラム当たり約０．０１から約５０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１から約５ｍｇの間である。
【０３０３】
一部の実施形態では、例えば、シリカソーム中にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質を含むことが望ましい。別法では、または加えて、特定の実施形態では、ＰＥＧ−セラミド、またはガングリオシドＧＭＩ修飾脂質をシリカソームに組み込むことができる。そのような成分の添加は、シリカソームの凝集を妨げるために役立ち、循環寿命の増加及び標的組織への負荷シリカソームの送達の増加をもたらす。特定の実施形態では、シリカソーム中でのＰＥＧ修飾リン脂質、ＰＥＧ−セラミド、またはＧＭＩ修飾脂質の濃度は、約１〜１５％である。
【０３０４】
一部の実施形態では、全シリカソーム装入量は、血液からのシリカソームクリアランスにおける重要な決定因子である。装入されたシリカソームは典型的には、細網内皮系によってより急速に取り込まれ（例えば、ＲＥＳによるリポソームクリアランスを論述しているＪｕｌｉａｎｏ（１９７５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６３：６５１−６５８を参照されたい）、したがって、血流でより短い半減期を有すると考えられる。長時間の循環半減期を有するシリカソームが典型的には、治療的使用には望ましい。例えば、特定の実施形態では、８時間、または１２時間、または２４時間、またはそれ以上維持されるシリカソームが望ましい。
【０３０５】
それらの使用の別の例では、例えば、局所癌を処置するために、薬物負荷されたシリカソームを、これらだけに限定されないが、ゲル剤、油剤、乳剤などを含む幅広い範囲の局所剤形に組み込むことができる。例えば、一部の実施形態では、薬物負荷シリカソームを含有する懸濁液を、局所クリーム剤、ペースト剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤などとして製剤化し、投与する。
【０３０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシリカソームを含む医薬製剤は追加的に、緩衝剤を組み込む。緩衝剤は、任意の薬学的に許容される緩衝剤であってよい。緩衝系には、これらだけに限定されないが、クエン酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、及びリン酸塩緩衝剤が含まれる。緩衝剤の例には、これらだけに限定されないが、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム及びリン酸、アスコルビン酸ナトリウム、酒石酸、マレイン酸、グリシン、乳酸ナトリウム、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、炭酸水素ナトリウム及び炭酸、コハク酸ナトリウム及びコハク酸、ヒスチジン、及び安息香酸ナトリウム、安息香酸などが含まれる。
【０３０７】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシリカソームを含む医薬製剤は追加的に、キレート化剤を組み込む。キレート化剤は、任意の薬学的に許容されるキレート化剤であってよい。キレート化剤には、これらだけに限定されないが、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ、エデト酸、ベルセン酸、及びセキエストレンとも同意語）、及びＥＤＴＡ誘導体、例えば、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、及びエデト酸カリウムが含まれる。他のキレート化剤には、クエン酸（例えば、クエン酸一水和物）及びその誘導体が含まれる。クエン酸の誘導体には、無水クエン酸、クエン酸三ナトリウム−二水和物などが含まれる。さらに他のキレート化剤には、これらだけに限定されないが、ナイアシンアミド及びその誘導体ならびにデオキシコール酸ナトリウム及びその誘導体が含まれる。
【０３０８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシリカソームを含む医薬製剤は追加的に、抗酸化剤を含む生物活性剤を組み込む。抗酸化剤は、任意の薬学的に許容される抗酸化剤であってよい。抗酸化剤は、当業者には周知であり、それらには、これらだけに限定されないが、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウムなど）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブイル化（ｂｕｙｌａｔｅｄ）ヒドロキシトルエン、アルキルガラート、メタ硫酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、ナトリウムチオグリコール酸、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシラート、トコフェロール及びその誘導体、（ｄ−アルファトコフェロール、ｄ−アルファトコフェロールアセタート、ｄｌ−アルファトコフェロールアセタート、ｄ−アルファトコフェロールスクシナート、ベータトコフェロール、デルタトコフェロール、ガンマトコフェロール、及びｄ−アルファトコフェロールポリオキシエチレングリコール１０００スクシナート）モノチオグリセロール、亜硫酸ナトリウム及びＮ−アセチルシステインなどの物質が含まれる。特定の実施形態では、そのような物質を、存在する場合には典型的には、０．０１〜２．０％の範囲で添加する。
【０３０９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシリカソームを含む医薬製剤を、凍結保護物質と共に製剤化する。凍結保護剤は、任意の薬学的に許容される凍結保護剤であってよい。一般的な凍結保護剤には、これらだけに限定されないが、ヒスチジン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリジン、ラクトース、スクロース、マンニトール、ポリオールなどが含まれる。
【０３１０】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシリカソームを含む医薬製剤を、等張化剤と共に製剤化する。等張化剤は、任意の薬学的に許容される等張化剤であってよい。この用語は、当技術分野では、等浸透圧剤（ｉｓｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）と互換的に使用され、浸透圧を例えば、一部の実施形態では、血漿などのヒト細胞外液と等浸透性である０．９％塩化ナトリウム溶液の浸透圧まで上昇させるために、医薬製剤に添加される化合物として公知である。例示的な等張化剤には、これらだけに限定されないが、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デキストロース及びグリセロールが含まれる。
【０３１１】
特定の実施形態では、シリカソームの医薬製剤は任意選択で、防腐剤を含んでよい。一般的な防腐剤には、これらだけに限定されないが、クロロブタノール、パラベン、チメロソール、ベンジルアルコール、及びフェノールからなる群から選択されるものが含まれる。適切な防腐剤には、これらだけに限定されないが：クロロブタノール（例えば、０．３〜０．９ｗ／ｖ％）、パラベン（例えば、０．０１〜５．０％）、チメロサール（例えば、０．００４〜０．２％）、ベンジルアルコール（例えば、０．５〜５％）、フェノール（例えば、０．１〜１．０％）などが含まれる。
【０３１２】
一部の実施形態では、シリカソームを含む医薬製剤を、例えば、経口適用において快い食感をもたらすために、湿潤剤と共に製剤化する。当技術分野で公知の湿潤剤には、これらだけに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、グリセリン、ラウリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ペンタエリトリトール、及びプロピレングリコールが含まれる。
【０３１３】
一部の実施形態では、例えば、すべての添加剤、特に、ベンジルアルコールなどの疎水性成分の完全な溶解を保証するために、乳化剤が、製剤中に含まれる。多くの乳化剤が当技術分野で公知であり、例えば、ポリソルベート６０である。
【０３１４】
経口投与に関連する一部の実施形態では、薬学的に許容される香味剤及び／または甘味剤を添加することが望ましいことがある。サッカリン、グリセリン、単純なシロップ、及びソルビトールなどの化合物が、甘味剤として有用である。
【０３１５】
投与及び治療
カーゴ（例えば、薬物）負荷されたシリカソームを、様々な技術のいずれかによって対象（例えば、患者）に投与することができる。
【０３１６】
特定の実施形態では、医薬製剤を、非経口で、例えば、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内で投与する。一部の実施形態では、医薬組成物を、静脈内、動脈内、または腹腔内で大量注射によって投与する（例えば、リポソームの投与を記載している米国特許第３，９９３，７５４号；同第４，１４５，４１０号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２２４，１７９号；同第４，５２２，８０３号；及び同第４，５８８，５７８号を参照されたい）。この投与に適した特定の医薬製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）において見出される。典型的には、製剤は、許容される担体、好ましくは水性担体中に懸濁されたシリカソームの溶液を含む。上述のとおり、適切な水溶液には、これらだけに限定されないが、生理学的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理（例えば、０．９％等張性）食塩水緩衝液、及び／またはある種の乳剤製剤中が含まれる。溶液（複数可）は、配合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）、例えば、懸濁化剤、安定剤及び／または分散剤を含有してよい。特定の実施形態では、活性薬剤（複数可）を、使用前に適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質不含の水で構成するための粉末形態で提供することができる。経粘膜投与のために、かつ／または血液／脳関門通過のために、透過させる障壁に適した浸透剤を製剤において使用することができる。これらの組成物を従来の周知の滅菌技術によって滅菌してよいか、または無菌濾過してよい。得られた水溶液を、そのまま使用するためにパッケージングするか、または凍結乾燥させてよく、その際、凍結乾燥された製剤は、投与前に無菌水溶液と合わせる。組成物は、例えば、上記のとおり、生理学的条件に近づけるために必要な場合には、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレアートなどを含有してよい。
【０３１７】
他の方法では、組織に製剤を直接施与することによって、本明細書に記載のシリクサソーム（ｓｉｌｉｃｓａｓｏｍｅｓ）を含有する医薬製剤を標的組織と接触させることができる。施与を、局所によって、「オープン（ｏｐｅｎ）」または「クローズド（ｃｌｏｓｅｄ）」手順によって行ってよい。「局所」とは、皮膚、中咽頭、外耳道などの環境に曝露されている組織に医薬製剤を直接施与することを意味している。オープン手順は、患者の皮膚を切開すること、及び下にある組織を直接可視化し、そこに医薬製剤を施与することを含む手順である。これは一般に、外科手術、例えば、肺にアクセスするための開胸術、腹部内臓にアクセスするための腹式開腹術、または標的組織に対する他の直接的な外科的アプローチによって達成される。クローズド手順は、内部標的組織を直接可視化せずに、しかし、それに、皮膚の小さな創傷を通して器具を挿入することによってアクセスする侵襲性手順である。例えば、製剤を、針洗浄（ｎｅｅｄｌｅ  ｌａｖａｇｅ）によって腹膜に投与してもよい。同様に、医薬製剤を、腰椎穿刺中に、脊髄麻酔又は脊髄のメトラズアミド（ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ）イメージングのため一般に行われるような患者の適当な位置決めに続いて、注入によって髄膜又は脊髄に投与してもよい。別法では、製剤を、内視鏡検査装置によって投与してもよい。特定の実施形態では、医薬製剤を、カニューレを介して導入する。
【０３１８】
特定の実施形態では、本明細書に記載のシリカソームを含む医薬製剤を、吸入によって（例えば、エアロゾルとして）投与する。吸入は、肺及び／または脳への投与では、特に有効な送達経路であり得る。吸入による投与では、シリカソームを、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して加圧パックまたは噴霧器からエアロゾル噴霧剤の形態で好都合に送達する。加圧エアロゾルの場合には、投薬単位は、計測量を送達するためのバルブを用意することによって決定することができる。吸入器または注入器で使用するための、例えば、ゼラチン製のカプセル及びカートリッジを、化合物及びラクトースまたはデンプンなどの適切な散剤基剤の粉末混合物を含有して製剤化してもよい。
【０３１９】
特定の実施形態では、本明細書に記載のシリカソームを、経口投与のために製剤化する。経口投与では、適切な製剤を、シリカソーム（複数可）を、当技術分野で周知の経口送達に適した薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体は、本明細書に記載の活性薬剤（複数可）を、処置される患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖剤、カプレット剤、ロゼンジ剤、ジェルキャップ剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとして製剤化することを可能にする。例えば、散剤、カプセル剤及び錠剤などの経口固体製剤では、適切な添加剤には、増量剤、例えば、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトール）、セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、合成ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））、造粒剤；及び結合剤が含まれ得る。所望の場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加してもよい。所望の場合には、固体剤形を、標準的な技術を使用して糖コーティングまたは腸溶コーティングしてもよい。腸溶コーティングされた粒子の調製は、例えば、米国特許第４，７８６，５０５号及び堂第４，８５３，２３０号において開示されている。
【０３２０】
様々な実施形態では、シリカソーム（複数可）を、例えば、従来の坐剤基剤、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドを含有する坐剤または停留浣腸剤などの直腸または膣用組成物で製剤化することができる。直腸または膣送達のために活性薬剤を製剤化する方法は、当業者に周知であり（例えば、Ａｌｌｅｎ（２００７）Ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）、典型的には、活性薬剤を適切な塩基（例えば、親水性（ＰＥＧ）、親油性物質、例えば、カカオバターまたはＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｗ４５）、両新媒性物質、例えば、Ｓｕｐｐｏｃｉｒｅ  ＡＰ及びポリグリコール化グリセリドなど）と組み合わせることを含む。基剤は、所望の溶融／送達プロファイルで選択され、配合される。
【０３２１】
シリカソームの送達経路は、身体へのそれらの分布にも影響を及ぼし得る。シリカソームの受動的送達は、投与の様々な経路の使用、例えば、非経口を含むが、他の有効な投与形態、例えば、関節内注射、吸入ミスト、経口活性製剤、経皮イオン泳動、または坐剤も想起される。各経路は、シリカソームの局在において相違をもたらす。
【０３２２】
医薬品の投与計画は医師には周知であるので、哺乳類、特にヒトにおける疾患または状態を処置するために有効であるか、または治療的であるリポソーム医薬品製剤の量は、当業者には明らかであろう。本明細書における製剤の最適な量及び個々の投薬間隔は、処置される状態の性質及び規模、投与形態、経路及び部位、ならびに処置される特定の患者によって決定され、そのような最適は、従来技術によって決定することができる。当業者であれば、処置決定試験の従来の経過を使用して、最適な処置経過、例えば、規定の日数にわたって１日当たり与えられる投与回数を確認することができることも、当業者には分かるであろう。
【０３２３】
特定の実施形態では、シリカソーム及び／またはその医薬形成物は、（１）反復投与、（２）その生理活性形態での薬物の持続的送達、または（３）該当する遊離薬物と比較して、適切な有効性と共に毒性の低下を必要とする状態を含む、様々ながん、または様々な感染などを処置する際に動物（ヒトを含む）で治療用に使用することができる。様々な実施形態では、シリカソーム及び／またはその医薬形成物を、治療上有効な用量で投与する。本明細書に記載のシリカソーム及びその製剤に関する場合の「治療上有効」という用語は、シリカソームの上及び／または中に存在する生物学的活性物質が、その生物学的活性物質（治療薬）が意図されている特定の医学的効果を達成するために十分なように提供／放出されることを意味する。達成され得る望ましい医学的効果の例は、限定ではないが、化学療法、抗生物質療法、及び代謝の調節である。したがって、例えば、がん化学療法での治療上有効な用量は、がん細胞の成長及び／もしくは増殖を減速させる、ならびに／または充実性腫瘍の成長を減速、停止させる、または充実性腫瘍を縮小もしくは除去する、ならびに／または転移細胞の増殖を減速、停止させるために有効な用量（及び／または投与計画）であり得る。感染を処置するために治療上有効な用量は、病原体の成長及び／もしくは増殖を阻害する、ならびに／または病原体を死滅させる、ならびに／または病原体によって生じる１つもしくは複数の症状を軽減するために十分な用量（及び／または投与計画）であり得る。
【０３２４】
正確な投与量は、特定の治療薬及び望ましい医学的効果などの因子、さらには、年齢、性別、全身状態などの患者因子に依存して変動する。当業者は容易に、これらの因子を考慮し、過度の実験に頼ることなく、それらを、有効な治療濃度を確立するために使用することができる。
【０３２５】
疾患の治癒的、軽減的、減速的（ｒｅｔａｒｄｉｖｅ）、または予防的処置でのヒト（または非ヒト哺乳類）への投与では、処方医が、所与のヒト（または非ヒト）対象のための薬物の適切な投与量を最終的に決定し、これは、個体の年齢、体重、及び応答、さらには患者の疾患の性質及び重症度によって変動すると予測され得る。特定の実施形態では、シリカソーム（複数可）によって提供される薬物の投与量は、遊離薬物で使用される投与量とほぼ等しくてよい。しかしながら、上述のとおり、本明細書に記載のシリカソームは、投与される薬物（複数可）の毒性を著しく低下させることができ、それによって、治療ウィンドウを著しく拡大させることができる。したがって、場合によっては、遊離薬物で処方される投与量を超える投与量が利用される。
【０３２６】
特定の実施形態では、特定の時点で投与される封入薬物の用量は、約１〜約１，０００ｍｇ／ｍ２／日、または〜約８００ｍｇ／ｍ２／日、または〜約６００ｍｇ／ｍ２／日、または〜約４００ｍｇ／ｍ２／日の範囲にある。例えば、特定の実施形態では、約１〜約３５０ｍｇ／ｍ２／日、１〜約３００ｍｇ／ｍ２／日、１〜約２５０ｍｇ／ｍ２／日、１〜約２００ｍｇ／ｍ２／日、１〜約１５０ｍｇ／ｍ２／日、１〜約１００ｍｇ／ｍ２／日、約５〜約８０ｍｇ／ｍ２／日、約５〜約７０ｍｇ／ｍ２／日、約５〜約６０ｍｇ／ｍ２／日、約５〜約５０ｍｇ／ｍ２／日、約５〜約４０ｍｇ／ｍ２／日、約５〜約２０ｍｇ／ｍ２／日、約１０〜約８０ｍｇ／ｍ２／日、約１０〜約７０ｍｇ／ｍ２／日、約１０〜約６０ｍｇ／ｍ２／日、約１０〜約５０ｍｇ／ｍ２／日、約１０〜約４０ｍｇ／ｍ２／日、約１０〜約２０ｍｇ／ｍ２／日、約２０〜約４０ｍｇ／ｍ２／日、約２０〜約５０ｍｇ／ｍ２／日、約２０〜約９０ｍｇ／ｍ２／日、約３０〜約８０ｍｇ／ｍ２／日、約４０〜約９０ｍｇ／ｍ２／日、約４０〜約１００ｍｇ／ｍ２／日、約８０〜約１５０ｍｇ／ｍ２／日、約８０〜約１４０ｍｇ／ｍ２／日、約８０〜約１３５ｍｇ／ｍ２／日、約８０〜約１３０ｍｇ／ｍ２／日、約８０〜約１２０ｍｇ／ｍ２／日、約８５〜約１４０ｍｇ／ｍ２／日、約８５〜約１３５ｍｇ／ｍ２／日、約８５〜約１３５ｍｇ／ｍ２／日、約８５〜約１３０ｍｇ／ｍ２／日、または約８５〜約１２０ｍｇ／ｍ２／日の範囲を提供する投与量（投与計画）を利用する。特定の実施形態では、特定の時点で投与される用量はまた、約１３０ｍｇ／ｍ２／日、約１２０ｍｇ／ｍ２／日、約１００ｍｇ／ｍ２／日、約９０ｍｇ／ｍ２／日、約８５ｍｇ／ｍ２／日、約８０ｍｇ／ｍ２／日、約７０ｍｇ／ｍ２／日、約６０ｍｇ／ｍ２／日、約５０ｍｇ／ｍ２／日、約４０ｍｇ／ｍ２／日、約３０ｍｇ／ｍ２／日、約２０ｍｇ／ｍ２／日、約１５ｍｇ／ｍ２／日、または約１０ｍｇ／ｍ２／日であってもよい。
【０３２７】
当業者には分かるとおり、投与量を、インビボ動物モデルを使用して推定してもよい。これに関して、本明細書に記載のイリノテカン負荷されたシリカソームでは、ＫＰＣ由来同所動物モデルにおけるＩｒ−シリカソームの有効な治療量は約４０ｍｇ／ｋｇであり、これは、７０Ｋｇのヒト対象では１２０ｍｇ／ｍ２に等しいことに注意されたい（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，１０：２７０２−２７１５）。フィボナッチ分析は、この用量が、４０及び８０ｍｇ／ｍ２の開始及び中間用量によって達成され得ることを示している。
【０３２８】
投与される用量は、他の因子のなかでも、組成物の生物学的利用能、有害な副作用に対する個体の忍容性、投与様式及び上記で論述した様々な因子に応じて、本明細書に記載の用量範囲よりも高くても、または低くてもよい。治療効果を維持するために十分である、組成物の血漿中レベルを得るために、処方医の判断によって、投与量及び間隔を個々に調節してよい。当業者であれば、本明細書において提示した教示を考慮して、過度の実験を伴うことなく、有効な局所投与量を最適化することができる。
【０３２９】
本明細書に記載のとおりの組成物の複数の用量（例えば、連続またはボーラス）を、数時間、数日、数週、または数か月の経過で、それを必要とする個体に投与してもよい。例えば、これらだけに限定されないが、１、２、３、４、５、または６回を毎日、１日おき、１０日おき、毎週、毎月、週２回、週３回、月２回、月３回、月４回、月５回、１カ月おき、３カ月おき、４カ月おきなど。
【０３３０】
処置方法。
様々な実施形態で、本明細書に記載のナノ粒子薬物担体（複数可）及び／またはナノ粒子薬物担体を含む医薬製剤（複数可）を使用する処置方法を提供する。特定の実施形態では、方法（複数可）は、がんを処置する方法を含む。特定の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のとおりのナノ粒子薬物担体、及び／またはナノ粒子薬物担体を含む医薬製剤の有効量を投与することを含むことができ、前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤中の薬物は、抗がん薬を含む。特定の実施形態では、ナノ粒子薬物担体及び／または医薬製剤は、化学療法薬レジメンにおける一次治療である。特定の実施形態では、ナノ粒子薬物担体及び／または医薬製剤は、多剤化学療法薬レジメンにおける一成分である。特定の実施形態では、多剤化学療法薬レジメンは、イリノテカン（ＩＲＩＮ）、オキサリプラチン（ＯＸ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及びロイコボリン（ＬＶ）からなる群から選択される少なくとも２つの薬物を含む。特定の実施形態では、多剤化学療法薬レジメンは、イリノテカン（ＩＲＩＮ）、オキサリプラチン（ＯＸ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及びロイコボリン（ＬＶ）からなる群から選択される少なくとも３つの薬物を含む。特定の実施形態では、多剤化学療法薬レジメンは、少なくともイリノテカン（ＩＲＩＮ）、オキサリプラチン（ＯＸ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及びロイコボリン（ＬＶ）を含む。
【０３３１】
様々な実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子薬物担体（複数可）及び／またはナノ粒子薬物担体を含む医薬製剤（複数可）は、様々ながんのいずれかを処置するために有効である。特定の実施形態では、がんは、膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）である。特定の実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、カポジ肉腫、リンパ腫）、肛門癌、虫垂癌、神経膠星状細胞腫、非定型奇形様／横紋筋肉腫様腫瘍、胆管癌、肝外癌、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳幹膠腫、脳腫瘍（例えば、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、脳及び脊髄腫瘍、脳幹膠腫、中枢神経系非定型奇形様／横紋筋肉腫様腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系生殖細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、類癌腫（例えば、小児期、胃腸）、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、例えば（胆管、肝臓外）、腺管上皮内癌（ＤＣＩＳ）、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、食道癌、感覚神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、骨の線維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（例えば、卵巣癌、睾丸癌、頭蓋外癌、生殖腺外癌、中枢神経系）、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹癌、ヘアリーセル白血病、頭頚部癌、心臓癌、肝細胞（肝）癌、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎臓細胞、ウィルムス腫瘍、及び他の腎臓腫瘍）、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、ヘアリーセル白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌（原発性）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌（例えば、小児期、非小細胞、小細胞）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット（例えば、非ホジキンリンパ腫）、皮膚Ｔ細胞（例えば、菌状息肉症、セザリー症候群）、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系（ＣＮＳ））、マクログロブリン血症、ワルデンストローム、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、黒色腫（例えば、小児期、眼内（目））、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性扁平上皮頸部癌、正中線管癌腫、口腔癌、多発性内分泌腺腫症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口唇及び口咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵臓神経内分泌腫瘍（島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞種、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞（腎臓）癌、腎盂及び尿管、移行細胞癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（例えば、ユーイング、カポジ、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚癌（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌、基底細胞癌、非黒色腫）、小腸癌、扁平上皮細胞癌、潜在性原発を伴う扁平上皮頸部癌、胃癌、睾丸癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがんである。
【０３３２】
特定の実施形態では、ナノ粒子薬物担体は、ｉＲＧＤペプチドにコンジュゲートされてなく、ナノ粒子薬物担体をｉＲＧＤペプチドと併せて投与する（例えば、ナノ粒子薬物担体及びｉＲＧＤペプチドを、別々の製剤として同時投与する）。
【０３３３】
特定の実施形態では、方法（複数可）は、感染を処置する方法を含む。特定の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のとおりのナノ粒子薬物担体、及び／またはナノ粒子薬物担体を含む医薬製剤の有効量を投与することを含むことができ、その際、前記ナノ粒子薬物担体及び／または前記医薬製剤中の薬物は、抗微生物または抗ウイルス薬を含む。特定の実施形態では、感染は、院内感染を含む。特定の実施形態では、感染は、ウイルス性、細菌性、または真菌性病原体に起因する。特定の実施形態では、感染は、血流感染（ＢＳＩ）、肺炎（例えば、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ））、胃腸感染、尿路感染（ＵＴＩ）、手術部位感染（ＳＳＩ）、または皮膚感染を含む。特定の実施形態では、感染は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（例えば、血液感染）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（例えば、ＵＴＩ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（例えば、血液、ＵＴＩ、創傷）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（例えば、腎臓または呼吸器感染）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、肺）などの病原体に起因する。特定の実施形態では、感染は、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）である。
【０３３４】
特定の実施形態では、感染は、薬剤耐性病原体に起因する。例示的な薬剤耐性病原体には、これらだけに限定されないが、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（ＶＲＥ）及び多剤耐性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＤＲ−ＴＢ）、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネマーゼ産生細菌（ＫＰＣ）が含まれる。
【０３３５】
これらの処置方法の様々な実施形態では、ナノ粒子薬物担体及び／または医薬製剤を、静脈内投与、動脈内投与、脳内投与、髄腔内投与、経口投与、エアロゾル投与、吸入による投与（鼻腔内及び気管内送達を含む）、カニューレによる頭蓋内投与、ならびに皮下または筋肉内デポー沈着からなる群から選択される経路によって投与する。特定の実施形態では、ナノ粒子薬物担体及び／または医薬製剤を、注射として、ＩＶドリップバッグから、または薬物送達カニューレを介して投与する。様々な実施形態では、対象は、ヒトであり、他の実施形態では、対象は、非ヒト哺乳類である。
【０３３６】
キット。
特定の実施形態では、キットは、病態（例えば、がん、微生物感染、ウイルス感染など）を処置するための、本明細書に記載の脂質二重層コーティングされたナノ粒子薬物担体を含有している。キットは典型的には、本明細書に記載の薬物負荷されたシリカソーム及び／または本明細書に記載の薬物負荷されたシリカソームを含む免疫複合体を含む。特定の実施形態では、シリカソームは、イリノテカンを含有する。特定の実施形態では、シリカソームはｉＲＧＤペプチドに結合されているが、他の実施形態では、キットは、薬物（例えば、イリノテカン）負荷されたシリカソームまたはシリカソーム免疫複合体と同時投与するために製剤化された別のｉＲＧＤペプチドを含有する。
【０３３７】
加えて、特定の実施形態では、キットは、薬物負荷されたシリカソームまたはシリカソーム免疫複合体の使用手段（例えば、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌などのための治療薬としての）を開示する説明材料を含んでよい。
【０３３８】
加えて、キットは任意選択で、本明細書に記載のナノ粒子薬物担体を例えば、単独で、または組合せで、様々ながんを処置するために使用するための用法（例えば、プロトコル）を示すラベル及び／または説明材料を含む。説明材料はまた、推奨投与量、禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の説明（複数可）などを含んでよい。
【０３３９】
様々なキットにおける説明材料は典型的には、記載または印刷された材料を含むが、これらは、それらに限定されない。そのような説明を保存し、それらを末端使用者に伝達することができる任意の媒体が、本発明では企図されている。そのような媒体には、これらだけに限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが含まれる。そのような媒体は、そのような説明材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでもよい。
【実施例】
【０３４０】
次の実施例を、例示のために提供するが、これは、特許請求の範囲に記載の発明を限定するものではない。
【０３４１】
実施例１
脂質コーティングされたメソ多孔性シリカナノ粒子によるイリノテカン送達は、膵臓癌で、リポソームを超える有効性及び安全性の改善を示す
リポソーム担体はイリノテカンなどの高度に毒性な薬物の安全性を改善することに失敗し得るという問題によって、本発明者らは、メソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）に施与された担持脂質二重層（ＬＢ）を使用して、これが、より安定な担体（リポソームよりも）をもたらすかどうかを判断することに関心を持った。薬物パッケージングのために使用することができる大きな内部表面積、調節可能な空孔サイズ、担体安定性、及び薬物放出能の制御によって、ＭＳＮＰは、がん治療のための多用途で多機能のナノ担体プラットフォームを構成することが実証されている（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｍａｌｌ，３：１３４１−１３４６；Ｓｌｏｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６０：１２７８−１２８８；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２（３６）：１２６９０−１２６９７；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１２２：８３９０−８３９５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，５（５）：４１３１−４１４４；Ｈｅ  ａｎｄ  Ｓｈｉ（２０１１）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ２１：５８４５−５８５５；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，５：９７８８−９７９８；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４１：２５９０−２６０５；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｄｖ．Ｍａｔ．２４（１２）：１５０４−１５３４；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（２）：９９４−１００５；Ｔａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４６（３）：７９２−８０１；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（１１）：１００４８−１００６５；Ａｒｇｙｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２６：４３５−４５１；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。さらに、ＭＳＮＰは、生分解性であり、広範な動物試験において安全であることが判明している（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，５（５）：４１３１−４１４４；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｄｖ．Ｍａｔ．２４（１２）：１５０４−１５３４；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（２）：９９４−１００５；Ｔａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４６（３）：７９２−８０１；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（１１）：１００４８−１００６５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｍａｌｌ，６（１６）：１７９４−１８０５０。浸漬によって、イリノテカンまたはカンプトテシンをＭＳＮＰに導入することが可能であるが、この方法は比較的、非効率的であり（負荷容量＜１０重量％）（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｍａｌｌ，３：１３４１−１３４６；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１：３３３５−３３４６）、不十分な薬物保持をもたらし得る（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２（３６）：��２６９０−１２６９７）。しかしながら、本発明者らは、担持されたＬＢによって、急速ＧＥＭ封入のために使用することができるバイオフィルム技術を開発した（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。粒子表面とのリポソーム相互作用及び融合（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３１（２２）：７５６７−７５６９；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３１（４）：１３５４−１３５５）またはＥｔＯＨ分散された脂質溶液を利用する溶媒交換（Ｃａｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１０：２４８４−２４９２）を含むいくつかのＬＢコーティング手順が公開されているが、バイオフィルム技術の使用は、より再現可能で完全なコーティング、急速封入、及び担体安定性の改善をもたらす（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。これは、ＬＢ−ＭＳＮＰが最高でＧＥＭ４０重量％の負荷容量を達成することを可能にするだけでなく、ＬＢに組み込むことができるパクリタキセル（ＰＴＸ）の同時送達も可能にしている（同書）。これは、本発明者らが、マウスにおける同所ヒトＰＤＡＣモデルでのＰＤＡＣ処置のために、相乗的かつレシオメトリックに設計された担体を開発することを可能にした（同書）。最近、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．が、イリノテカンを送達するためのポリマー−脂質担持ＭＳＮＰを報告したが、薬物負荷は比較的低い（すなわち、約１６重量％）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５：３６５０−３６６５）。
【０３４２】
この実施例では、本発明者らは、特に、プロトン化剤を封入するためにＬＢを使用する、ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームのための新規の設計特徴を導入する；これは、薬物の弱塩基性特性（ｐＫａ＝８．１）を利用して、高イリノテカン薬物負荷の遠隔負荷を可能にする。さらに、担持ＬＢの能力の上昇はまた、本発明者らが、リポソーム同等物（非担持ＬＢ小胞が捕捉剤、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）によってイリノテカンを遠隔負荷するために使用された）との比較分析を行うことを可能にした（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７；Ｖｏｎ  Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０９（４）：９２０−９２５）。ＭＳＮＰ担体は、確固たる同所ＰＤＡＣモデルにおいてリポソーム製剤よりも高い負荷容量及び腫瘍死滅を達成しただけでなく、担体安定性の改善及び漏出の減少によって、イリノテカン毒性も防いだ。これは、ＬＢコーティングされた担体によって、高毒性化学療法薬の毒性を減少させるための革新的なアプローチをもたらし、これは、ＧＥＭ処置の失敗を留保するのではなく（リポソーム担体を使用するための現行のＦＤＡ改善指示）、ＰＤＡＣのための第一選択処置オプションとしてイリノテカンを使用することを可能にする。
【０３４３】
結果
コーティングされたＬＢ及びプロトン勾配を使用することによる、ＭＳＮＰへの高イリノテカン負荷。
本発明者らの最初の試みは、急速かつ均一な空孔密閉をもたらすＬＢ被覆によってイリノテカンを封入するＭＳＮＰ担体を生産することであった（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。これは、イリノテカン２２重量％（ＭＳＮＰ重量に対して）の受動的捕捉を可能にした。負荷容量をさらに改善するために、本発明者らはまた、ＬＢを越えて拡散することができる両親媒性イリノテカンを、空孔内に保持される親水性誘導体に変換するプロトン化剤の捕捉について決定した（図１Ａ、パネルＡ１）。本発明者などは、この捕捉手順を、リポソームにおいて、弱塩基性薬物、例えば、ＧＥＭ及びイリノテカンの有効で重要な封入のために使用した（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９５（４）：４０５−４０８；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（１１）：１００４８−１００６５；Ｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．１１５１：２０１−２１５）。以前にＭＳＮＰプラットフォームで使用されたことはないが、ポリ陰イオン性化合物、ＴＥＡ８ＳＯＳを、イリノテカンを捕捉するためにＭＭ−３９８で使用した（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）。ＴＥＡ８ＳＯＳは、加水分解すると８個のＨ＋イオン及び八価ＳＯＳ８−を放出するプロトン生成剤である（図１Ａ、パネルＡ２）。イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ＴＥＡ８ＳＯＳを生成し、これを、下記の方法セクションにおいて記載するとおり、ＭＳＮＰに浸漬させた（同図）。浸漬した粒子を、３：２：０．１５のモル比のＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００からなる脂質バイオフィルムでコーティングされた丸底フラスコに導入した。最適な脂質：粒子比は、１．１：１．０であると決定された。懸濁液の音波処理は、ＬＢコーティングされた粒子をもたらし、これは、捕捉剤を含有する（図１Ａ、パネルＡ１）。これらの粒子をただちに、イリノテカン溶液中でインキュベートして、薬物が、ＳＯＳ８−と会合してゲル様沈澱物として、空孔内に移入、プロトン化、及び捕捉されることを可能にした（図１Ａ、パネルＡ１及びＡ２、図１Ｂ）。これは、本発明者らが、最高８０重量％のイリノテカン負荷容量を達成することを可能にし（図１Ｂ）、これは、以前に実証されたとおり（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）、８５０ｍ２／ｇの総面積及び約０．７ｃｍ３／ｇの空孔体積では、多孔性担体の理論最大負荷容量（約１００重量％）に近い。その後の試験は、イリノテカン５０重量％を含有する粒子で行った。
【０３４４】
ＴＥＡ８ＳＯＳを使用して、イリノテカン負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰ（Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ）の有効性及び安全性をリポソーム担体と比較するために、リポソームを、ＭＭ−３９８の手順と類似の手順によってコンストラクトした（図１Ａ、パネルＡ３）（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）。これは、約４０重量％イリノテカン負荷容量を有するリポソーム（「Ｉｒ−リポソーム」と名付けられる）をもたらした；これは捕捉剤を用いないリポソーム（約５重量％）を生成するよりもかなり高い（図１Ｂ）。低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏＥＭ）は、リポソーム及びＬＢ−ＭＳＮＰでそれぞれ約７５及び約８０ｎｍの粒径を明らかにした（図１Ｃ）。高倍率ｃｒｙｏＥＭイメージによって、無傷の約７ｎｍ厚の二重層によるＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰの均一なコーティングが存在することが確認された。低倍率ｃｙｒｏＥＭイメージは、ＬＢが粒子の＞９９％で無傷であったことを示した（図１１）。これによって、１ステップ封入プロトコルの再現性が確認され、これは、ＭＳＮＰ二重層コーティングの他の方法を上回る著しい前進を有する（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。
【０３４５】
本発明者らの主な仮定は、ＬＢ−ＭＳＮＰが、リポソームと比較して担体安定性を改善できるということであるので、両方の担体を血清中でインキュベートし、凍結乾燥して、それらの薬物保持能及びイリノテカン漏出を決定した。両方の担体を、連続的かつ穏やかに振盪しながら、２４時間にわたって３７℃で１００％血清中でインキュベートした。血清タンパク質の吸着は、ｃｒｙｏＥＭ可視化を妨げるので、代わりに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を使用して、担体懸濁液中での薬物放出を決定した；これは、リポソームからの約２２％と比較して、ＬＢ−ＭＳＮＰによる＜６％早期イリノテカン放出を示した（図１Ｄ）。しかしながら、９０日間にわたる４℃での血清非含有懸濁液中での粒子貯蔵は、両方の担体が高いコロイド安定性を有することを、少量の（＜５％）早期薬物放出または流体力学的粒径の変化（＜５％）と共に示した。逆に、抗凍結（ｃｒｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）５％デキストロース溶液４０中での粒子凍結乾燥は、水中に再懸濁すると、担体安定性において著しい相違を示した（図１Ｅ）。したがって、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰは、流体力学的サイズを変化させず、２．７％の薬物放出のみをもたらした一方で、リポソームは、目に見えるほど凝集し、そのイリノテカン含分の２０．８％を放出した。これによって、ＬＢコーティングされた担体は、形態学的には同様に見えるが、ＬＢ−ＭＳＮＰは、リポソームよりも著しく安定していることが確認される。
【０３４６】
ＬＢ−ＭＳＮＰによる生体内分布、薬物動態（ＰＫ）、及びイリノテカン送達の改善を、Ｋｒａｓ由来同所ＰＤＡＣモデルにおいてリポソームと比較した
生体内分布及びＰＫ研究を、トランスジェニックＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３ＬＳＬ−Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅ（ＫＰＣ）動物における自発的ＰＤＡＣ腫瘍に由来するルシフェラーゼ発現細胞系を同所移植された免疫応答性Ｂ６／１２９マウスで行った（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，７：４６９−４８３）。ＫＰＣ由来同所モデルは、Ｋｒａｓ変異、比較的豊富な間質の発現、局所組織侵襲、及び転移の発生においてヒトＰＤＡＣを模倣する（Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６：３６８４−３６９５；Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０８：１−８；Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８：ｅ８０５８０）。原発性腫瘍が、同所移植部位で２〜３週間以内に発生し、転移が約５週間で出現し、これは、文献と一致した（図１２）（同書）。腫瘍部位へのイリノテカン担体の生体内分布を追跡するために、同所移植から３週間後に、動物に、近赤外（ＮＩＲ）標識（Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６８０）リポソームまたはＬＢ−ＭＳＮＰをＩＶ注射した（図２Ａ）。ＩＶＩＳイメージングを指示時点で、指示時点での標識ＬＢ−ＭＳＮＰまたはリポソーム１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射の前（第２欄）及び後（第３〜６欄、図２Ａ）に得た。これを、Ｄ−ルシフェリンの腹腔内（ＩＰ）注射を受けた動物における発生腫瘍でのルシフェラーゼ発現を検出するための生物発光ＩＶＩＳイメージング（図２Ａ、第１の欄）と対にした。確固たる蛍光強度が、ＬＢ−ＭＳＮＰ注射の２時間以内に腫瘍部位で観察され、その後、シグナルは少なくとも４８時間にわたって持続した。対照的に、リポソーム（同様の標識効率を有する）を注射されたマウスでは、ＮＩＲシグナル強度は、より暗く、より急速に消失した。これは、注射後２４時間後のと殺の後に動物から収集された腫瘍及び主要臓器のエクスビボイメージングによっても確認された（図２Ｂ）。エクスビボイメージングも、４８時間後に実施し、これによって、リポソーム処置動物と比較して、ＬＢ−ＭＳＮＰにおけるオペレーター規定の該当領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＲＯＩ）における、強いＮＩＲシグナル強度が確認された（図１３）。腫瘍部位での豊富な粒子取り込みに加えて、肝臓及び脾臓も、粒子分布の主要な部位であった。肺、心臓及び腎臓では、シグナル伝達はほとんど得られなかった。腫瘍組織及び主要臓器におけるケイ素（Ｓｉ）存在度を定量化する誘導結合プラズマ発光分光測定（ＩＣＰ−ＯＥＳ）は、投与された元素Ｓｉ用量全体の約３％が発生腫瘍部位に分布し得たことを実証した（図１４）。これは、ＰＤＡＣ部位への粒子分布パーセンテージが０．２〜２．４％になるリポソーム、ポリマーミセル、ゼラチン、またはＭｏＳ２／Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子と比較して、非常に良好な生体内分布を表している（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７：ｅ３９５４５；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，５：９３１−９４５；Ｃａｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：８１５−８２３；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３４：８３２３−８３３２；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１０：２０３１−２０４４）。本発明者らは、共焦点顕微鏡法によってＮＩＲ標識粒子の腫瘍内分布の可視化するための腫瘍切片も得た；これは、リポソームと比較して、ＬＢ−ＭＳＮＰでは、２４時間後に腫瘍部位でのより高い粒子存在度を実証した（図２Ｂ）。腫瘍部位でのイリノテカン含有率を評価するために、薬物６０ｍｇ／ｋｇの当量を単回用量として、遊離薬物、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（薬物６０ｍｇ／ｋｇ；粒子用量１２０ｍｇ／ｋｇ）またはＩｒ−リポソーム（薬物６０ｍｇ／ｋｇ；粒子用量１５０ｍｇ／ｋｇ）の形態で注射した。動物を、血液収集及び腫瘍採取のために０．５、４、２４、及び４８時間後にと殺した。これらの組織を、イリノテカン組織含有率を定量化するためのＨＰＬＣ分析のために使用したが、これは、２４時間目に、遊離薬物においてよりも、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ及びＩｒ−リポソームでは、５倍及び２倍高かった（図２Ｃ）。イリノテカンでの循環半減期は、血漿薬物濃度のＨＰＬＣ定量化によって、それぞれＬＢ−ＭＳＮＰ、リポソーム、及び遊離薬物で、１１、８．７、及び１．０時間と計算された（図２Ｄ）。マウスから得ることができる血液の体積のロジスティックな制約によって、本発明者らは、担体の血液滞留時間を決定することができなかった。本発明者らは、皮下ＰＡＮＣ−１異種移植片モデルにおいて生体内分布及びＰＫ研究も行い、遊離薬物を上回る、それぞれＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ及びＩｒ−リポソームで腫瘍薬物含有率の３０倍及び４倍の上昇を観察した（図１５）。本発明者らはまた、個々の臓器の薬物含有率を比較した（図１６）。これは、注射後２４時間目に、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰと比較して、Ｉｒ−リポソームでは、それぞれ肝臓、脾臓、及び腸管組織において、０．８倍、０．２倍、及び０．２倍高い薬物含有率を実証した。腎臓では、有意な差異は見られなかった。
【０３４７】
Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰは、同所ＰＤＡＣモデルにおいて、遊離薬物またはＩｒ−リポソームよりも効率的な死滅をもたらす
有効性評価のための用量探索スケジュールを開発するために、本発明者らは、米国国立がん研究所からのプロトコルを使用して、健康なマウスにおける最大耐量（ＭＴＤ）を決定した（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）。この評価は、それぞれ遊離イリノテカン、Ｉｒ−リポソーム、及びＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰで、６０、２９５、及び２９５ｍｇ／ｋｇのＭＴＤを実証した（図３Ａ）。４０ｍｇ／ｋｇの薬物用量（遊離薬物または封入薬物当量でのＭＴＤの６６．７または１３．３％に等しい）をその後の実験のために選択した。これらの用量は、それぞれＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰまたはＩｒ−リポソームでは８０または１００ｍｇ／ｋｇのナノ粒子用量に等しい。ＩＶ注射を、２×１０６ＫＰＣ細胞の同所腫瘍移植後１４日目に開始した；この時、平均原発性腫瘍サイズは、約５ｍｍであり、マクロ転移はなかった。ＩＶ注射を４日ごとに、最高８回の繰り返し反復で繰り返した（図３Ｂ）。対照群は、ＩＶ食塩水のみを与えられた動物を含んだ。同所腫瘍成長をＩＶＩＳ生物発光イメージングによって、設定された時点で監視した（図３Ｂ）。ＲＯＩにおけるイメージング強度を決定するためのＩＶＩＳソフトウェアによる腫瘍成長の量的表現は、食塩水、遊離薬物、またはＩｒ−リポソームと比較して、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ処置による著しく遅い腫瘍成長を実証した（図３Ｂ）。抗腫瘍有効性も、４０〜４７日目にと殺された動物から収集された腫瘍外植片におけるアポトーシスの率によって測定した。活性化（切断された）カスパーゼ−３を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）染色プロトコルを利用して、本発明者らは、それぞれ遊離イリノテカンまたはＩｒ−リポソームでの約６及び約１１％と比較して、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ処置されたマウスでは約２５％のアポトーシス細胞死を観察した（図３Ｃ）。
【０３４８】
代表的なＩＨＣイメージが図１７に示されている。本発明者らは、公式な生存試験を行うつもりはなかったが、調査の異なるステージでの生存動物の数を比較するために、４７日後のカプラン−マイヤーデータ表示を使用することが可能であった（図１８）。これは、リポソーム製剤よりも良好なＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰの生存率を含めて、遊離薬物を超える、両方の担体での生存の改善を実証した（図１８）。
【０３４９】
動物の検死を、局所腫瘍の広がり及び転移の出現を評価するために行った（図３Ｄ）。胃、小腸、肝臓、脾臓、腎臓、横隔膜、及び腹壁の直接的な腫瘍侵襲に加えて、多数の巨視的転移病巣を食塩水処置された動物で見ることができ、それらの動物は出血性腹水も発症していた。遊離イリノテカンは、転移に影響を及ぼすことはできなかったが、Ｉｒ−リポソームは、転移部位で生物発光強度の中等度の低下を示した（図３Ｄ）。目立って対照的に、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ処置は、強力な阻害効果を発揮し、ＩＶＩＳイメージング中に、原発性腫瘍領域外に暗い生物発光の証拠を有した（図３Ｄ）。これは、ＨＰＬＣ分析でイリノテカンのより高い、しかし著しくはない含有率を示した腎臓の領域で特に顕著であった（図１６）。図３Ｅのヒートマップは、腫瘍転移に対する処置の影響の定量的表示を示している。
【０３５０】
リポソームではなくＬＢ−ＭＳＮＰは、マウス同所モデルにおいてイリノテカン送達の安全性を改善する。
イリノテカンが、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ毒性に主に寄与するので、封入送達によって薬物毒性を減少させる可能性が、主な試験の目的である。ＭＴＤ評価は、両方の担体が急性致命的用量を遊離薬物の約５倍に増加させることができることを示した（図３Ａ）。封入薬物送達（図３Ｂ）によるイリノテカン毒性に対応するために、肝臓、胸骨骨髄、及び腸管組織を有効性試験においてと殺された動物から収集した。これらは、ＰＤＡＣ患者におけるイリノテカン毒性での主な標的臓器である（Ｃｏｎｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６４（１９）：１８１７−１８２５；Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９（４）：４４７−４５４；Ｌｏｕｐａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０８（１２）：２５４９−２５５６）。肝臓の組織学的検査は、遊離薬物で処置された動物における重篤で広範な肝細胞壊死を実証した（図４Ａ）。これは、肝細胞における核濃縮及び断片化核の存在に反映される（Ｚｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｅｗｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃｉ．１９：１２４−１２８）。肝臓損傷の重症度がＩｒ−リポソームによって多少低下したが、広範な肝壊死が観察された（図４Ａ）。対照的に、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ処置された動物は、壊死を含まず、僅かな脂肪症、可逆的薬物誘導ストレス応答のみを示した（図４Ａ）（Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ（２００１）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、６：１６２−１７６；Ｍａｏｒ  ａｎｄ  Ｍａｌｎｉｃｋ（２０１３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ａｒｔ：８１５１０５）。組織学的データは、ＩＨＣ分析によっても確認され、その際、肝臓組織が、クッパ―細胞（ＫＣ）を（ＦＩＴＣ標識抗Ｆ４／８０抗体で）染色するために使用され、アポトーシス細胞は、ＲＩＴＣ標識抗体で（切断カスパーゼ−３を認識）、細胞核は３３３４２（青色色素）で検出された（図４Ｂ）。蛍光顕微鏡下での染色切片の検査は、遊離薬物で処置された動物の肝臓全体での広範なアポトーシスを実証した。Ｉｒ−リポソームでの処置を受けた動物は、より少ないアポトーシスを実証し、これは往々にして、ＫＣまたは隣接肝組織を含んだ。対照的に、Ｉｒ−  ＬＢ−ＭＳＮＰで処置された動物の肝臓において、アポトーシスは見られなかった。
【０３５１】
ＧＩ管のＨ＆Ｅ染色は、処置群のいずれにおいても、毒性の顕微鏡証拠を明らかにしなかったが、切断されたカスパーゼ−３でのＩＨＣ染色は、遊離薬物によるアポトーシス細胞の存在及び腸絨毛の鈍化を実証した（図４Ｃ）。Ｉｒ−リポソームでの処置は絨毛を鈍化からは保護したが、ＩＨＣ染色は、先端腸細胞におけるアポトーシスの存在を明らかにした。これは、いずれのアポトーシスまたは絨毛の損傷ももたらさなかったＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰでの処置とは明らかに対照的である（図４Ｃ）。
【０３５２】
骨髄毒性を、動物に、上記のとおり４０ｍｇ／ｋｇのイリノテカン用量当量の３回の注射を与える別の実験で試験した。と殺の後に、胸骨骨髄を、Ｈ＆Ｅ染色によって骨髄毒性を評価するために収集した（図４Ｄ）（Ｉｕｓｕｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１３：４９２−５０３）。遊離薬物またはＩｒ−リポソームで処置した動物は広範な骨髄損傷を示し、骨髄腔の＜３０％が造血（ｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）細胞によって充満していることによって証拠付けられたが（Ｔｒａｖｌｏｓ（２００６）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：５６６−５９８）、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ処置された動物では、骨髄細胞性の変化はなかった（図４Ｄ）。さらに、遊離薬物またはＩｒ−リポソームによる骨髄への損傷は、末梢血好中球減少症を随伴したが、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ処置は、好中球数の無視できる低下を示した（図１９）。すべて考慮すると、これらのデータは、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰでの処置では全身及び標的臓器毒性の著しい低下を実証したが、リポソーム担体はなお、重大な臓器毒性を示す。
【０３５３】
考察
本発明者らは、高用量イリノテカン負荷及び送達のために、担持ＬＢ及びプロトン生成捕捉剤を使用して、特注設計されたメソ多孔性シリカナノ粒子プラットフォームを開発し、それを、免疫適格性マウスにおけるＫＰＣ由来膵臓癌モデルで試験した。同じ負荷手順及び捕捉剤（ＴＥＡ８ＳＯＳ）を使用して、社内合成したＭＭ−３９８リポソーム同等物と比較して、担体の安定性及び負荷容量の改善は、生体内分布、循環半減期、及びイリノテカンの薬物腫瘍含有率を改善した。Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰは、原発性腫瘍部位での腫瘍死滅の誘導においてより有効であるだけでなく、転移を処置するためにも、より活性であった。同様に重要なことに、ＬＢ−ＭＳＮＰ担体は、著しい全身毒性を誘導しなかったが、これは、骨髄、ＧＩ管、及び肝臓に対して有害な影響を有したリポソームとは際立って対照的である。本発明者らは、処置有効性の維持を伴った毒性低下を、リポソームの担体能力と比較した場合のＬＢ−ＭＳＮＰの担体能力の上昇に帰している。したがって、ＬＢ−ＭＳＮＰ担体は、ＰＤＡＣの処置にイリノテカンを導入するための革新的なアプローチを示しており、これは、現在は、最新のＦＤＡ改善リポソーム担体のための事例であるようなＧＥＭ処置に失敗した患者のための留保ではなく、第一選択の検討として、この薬物の使用を促進する可能性を含んでいる。
【０３５４】
本発明者らは、リポソーム同等物との形態学的類似点を有する、イリノテカンのための強固なＭＳＮＰ担体を開発している。しかしながら、無傷の担持ＬＢによって得られる優れた薬物封入に加えて、ＬＢ−ＭＳＮＰは、結合及び／または静電相互作用の結果として、多孔性シリカ側壁に対する密な薬物パッケージングも可能にする（Ｔａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４６（３）：７９２−８０１；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，４：４５３９−４５５０；Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，１０：３８９−３９７）。これは、本発明者らが、イリノテカン負荷容量の改善を達成することを可能にしたが、このことは、リポソームと比較して、同所腫瘍部位での優れた死滅効率をもたらす。負荷容量の改善は、担持ＬＢの安定性によってもさらに支援され、これは、血液循環及び腫瘍部位への生体内分布の間に、リポソーム二重層と比較して、カーゴ保護を改善する。本発明者らは、担持ＬＢの変動の低下が、おそらく粒子表面との強固な静電及びファンデルワールス相互作用の結果として、非担持脂質二重層（リポソーム）との血清タンパク質相互作用による脂質喪失を減少させると提唱する。担持ＬＢはまた、担体を補体媒介溶解及び血流中で生じるせん断力から守り得る（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎ：Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ，１７２（１−３）：５７−６７；Ｈｅｕｒｔａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２３）：４２８３−４３００；Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，１０：３８９−３９７；Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．２７８：５３−６２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２５：６９９７−７００５；Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１３：１１６１０−１１６４２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｍａｌｌ  １０：３９２７−３９３１）。例えば、ドキソルビシン負荷されたＤＯＰＣリポソームは、模擬血清含有生物流体環境中で、３７℃で２４時間以内に約４０％の薬物漏出を示す（Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，１０：３８９−３９７）。これは、ナノ担体として有効であるが、Ｉｒ−リポソームは、全血清中で、または粒子凍結乾燥及び再懸濁後に、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰよりも著しく安定性が低いという本発明者らの発見に従うものである（図１Ｄ及び１Ｅ）。Ｉｒ−リポソームからの高度に毒性のトポイソメラーゼ阻害薬の早期放出は、動物試験において、骨髄、肝臓、及び小腸において高率の毒性も随伴し、これは、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰの保護効果とは全く異なる。したがって、リポソームとの形態学的類似性にも関わらず、ＬＢ−ＭＳＮＰ担体は、有効性及び薬物毒性の両方の観点から、リポソームイリノテカン送達を超える明らかな利点を提供する。
【０３５５】
Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰによる骨髄及び腸管毒性の低下は、最近、ＦＤＡ承認のＭＭ−３９８リポソーム製剤、Ｏｎｉｖｙｄｅが、ＰＤＡＣ患者の処置中の重篤な好中球減少症及び下痢の可能性についての黒枠警告と共に販売されているという観点から留意すべきである（例えば、ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓｅｖｅｎｔｓ／ｎｅｗｓｒｏｏｍ／ｐｒｅｓｓａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ／ｕｃｍ４６８６５４．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１５／２０７７９３ＬＢ．ｐｄｆを参照されたい）。その警告は、致命的好中球敗血症が患者の０．８％で観察され、重篤かつ生命を脅かす好中球減少性発熱が３％で起こったことを述べている（ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１５／２０７７９３ＬＢ．ｐｄｆ）。生命を脅かす好中球減少症は、５−フルオロウラシル及びロイコボリンと組み合わせてＯｎｉｖｙｄｅを与えられた患者の２０％で観察された（同書）。同じ薬物の組合せはまた、処置された対象の１３％で重篤な下痢を引き起こした（同書）。本発明者らは、比較のためにＯｎｉｖｙｄｅを使用しなかったが、イリノテカン負荷のためにＴＥＡ８ＳＯＳを使用する社内リポソーム製剤は、遊離薬物と同様に、重大な骨髄及び腸管毒性を随伴した。同様の効果は、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームでの処置中には見られなかった。
【０３５６】
ＮＩＲ標識粒子及びＦＩＴＣ標識抗Ｆ４／８０抗体を使用して共焦点顕微鏡法によって実証されたとおり、ＭＳＮＰ及びリポソーム担体の両方が肝臓においてＫＣによって捕捉されたことは興味深い（図示せず）。直接的なインビボ実証を提供することは困難であるが、本発明者らは、ＬＢの分解及びイリノテカン放出が、ＫＣにおける酸性エンドソーム／リソソームのコンパートメントで始まると提唱する（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０−４０３４；Ｄｅｒｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．９７１：１２７−１３６；Ｋｏｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｈｏｆｆ（２０１０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８４：１７００−１７１２）。リポソームのより急速な崩壊は、なぜ、豊富なＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰの存在と比較して、まばらなＮＩＲ標識粒子のみがＩｒ−リポソームを注射された動物で観察されたかを説明し得た（図２Ｂ）。次いで、担体崩壊の割合は、バイスタンダー肝細胞への薬物放出の割合を決定し得た。これは、リポソーム担体からのイリノテカンの破裂放出が、ＣＹＰ  ３Ａ及びウリジンジホスファート−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１Ａ１）によって行われる薬物の肝代謝を圧倒し得た可能性を高めている（Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：２１８２−２１９４）。代謝の低下は、非代謝薬物のより高い保持をもたらし得、これは、図４Ａに示されているとおり、肝細胞損傷及び壊死につながる。これは、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰと比較して、Ｉｒ−リポソームで処置された動物の肝臓組織における、コンジュゲートされていないイリノテカンの著しく高い含有率、すなわち、ＩＶ注射後２４時間目での２６対１５％ＩＤ／ｇを説明し得る（図１６）。これらの所見は、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ処置動物においてアポトーシスが存在しないことと比較して、Ｉｒ−リポソームでの処置中のＫＣ及び隣接肝細胞における高い細胞死亡率を実証しているＫＣ及び活性化カスパーゼ−３のＩＨＣ染色とも適合する（図４Ｂ）。図４Ｅの図は、肝細胞アポトーシス及び壊死の規模の決定における担体安定性の役割及びＫＣからのイリノテカン放出の割合に関する本発明者らの仮説を概説している（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．，６０：３−２０）。瀕死状態の動物から得ることができた血液の量が限られたため、肝酵素を測定することは不可能であった。
【０３５７】
ＧＥＭは往々にして、ＰＤＡＣのための第一選択治療として役立ち、６．８カ月の生存結果を有する（Ｂｕｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１５：２４０３−２４１３；Ｔｅａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．７：６８−８４）。ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸは、生存を約１１カ月に改善することができるが、重篤な薬物毒性の頻繁な発生（主にイリノテカン及びオキサリプラチンによる）が、第一選択治療としてのその使用を排除する。したがって、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸは多くの場合に、良好なパフォーマンスステータスを有する患者のために留保される。残念なことに、この位置づけは、第一選択治療として認められておらず、重篤な下痢及び好中球減少症の黒枠警告を含むＯｎｉｖｙｄｅの導入で変わっていない。ＰＤＡＣ患者の約８０％が、進行した疾患段階にあるので、第一選択処置としてＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメンで薬物を使用することは有利であろう。本発明者らは、比較分析のためにＯｎｉｖｙｄｅを使用しなかったが、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームは、本発明者らの同等の社内Ｉｒ−リポソーム製剤よりも、少ない全身毒性で有効かつ生体適合性であった。したがって、本発明者らは、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームが、ＰＤＡＣにおける第一選択治療のために開発され得るであろうと提唱する。本発明者らは最近、ＰＤＡＣモデルにおけるＧＥＭ及びＰＴＸのための二重送達ＭＳＮＰ担体の実行可能性を実証している（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。各処置アプローチは、実施の前に、設計の複雑さ、経費、及び良好な製造実行に対する影響を慎重に考慮すべきである（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２８：１０３１−１０３５）。
【０３５８】
脂質コーティングされたＭＳＮＰは、カーゴ送達のためにインビトロ及び／またはインビボで有効であることが示されているが（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５：３６５０−３６６５ｌ；Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，１０：３８９−３９７；Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，６：２１７４−２１８８；Ｄｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１６８：２０９−２２４）、これは、どのようにプロトン化剤をこの担体プラットフォームの負荷効率を上昇させるために使用することができるかの最初の実証である。本発明者らはまた、プロトン勾配によってＬＢ−ＭＳＮＰに負荷することができる弱塩基性薬物の包括的なリストを特定している。これらのカーゴ分子の一般的な特徴には、次の化学的特性が含まれる：
（ｉ）第一級、第二級、第三級または第四級アミン（複数可）を含む有機分子化合物；
（ｉｉ）プロトン化及びＬＢの後ろでの捕捉を可能にするｐＫａ＜１１（Ｚｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１３９（１）：７３−８０；Ｃｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１６０（２）：１４７−１５７；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．３１（１０）：２５８３−２５９２）；
（ｉｉｉ）ＬＢを越えての拡散を可能にする５〜２５ｍｇ／ｍＬの水溶性及び両親媒性；
（ｉｖ）−３．０〜３．０のオクタノール／水分配係数またはｌｏｇＰ値；７１，７２
（ｖ）ＭＳＮＰ空孔への進入を可能にするＭＳＮＰ空孔サイズ（２〜８ｎｍ）よりも小さい幾何学的サイズを有する適切な分子量（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４１（７）：２５９０−２６０５；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｄｖ．Ｍａｔ．２４（１２）：１５０４−１５３４；Ｔａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４６（３）：７９２−８０１）。
【０３５９】
すべてを包括するものではないが、有望な化学療法薬のリストには、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポテカン；抗腫瘍アンスラサイクリン抗生物質、ドキソルビシン及びミトキサントロン；有糸分裂阻害薬、ビンブラスチン及びビノレルビン；チロシンキナーゼ阻害薬、イマチニブ、オシメルチニブ、及びスニチニブなどが含まれる。結腸、乳房、肺、肝臓、膠腫、黒色腫などの追加のがん種の処置の問題を含めて、上記薬剤の１つ、またはその組み合わせをパッケージング及び送達する能力は、本発明者らの多機能ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームの幅広い有用性を増強する。上記リストの薬物組合せを単一の担体に同時パッケージングすることも可能である。例えば、本発明者らが本発明者らのＧＥＭ／ＰＴＸ同時送達プラット―フォームで達成することができた成功に基づき（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）、相乗的及びレシオメトリック送達のために、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメン中の薬物（例えば、オキサリプラチンとイリノテカン）を組み合わせることを考慮することができる。さらに、本発明者らのＬＢ−ＭＳＮＰによる薬物負荷は、非がん用途、例えば、感染症のための抗生物質、例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、またはＨＩＶ抗レトロウイルス薬（例えば、フマル酸テノフォビルジソプロキシル）をカプセル化するために使用することができる。ＴＥＡ８ＳＯＳに加えて、膜貫通ｐＨ勾配は、酸性緩衝剤（例えば、クエン酸塩）（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．，９５（４）：４０５−４０８；Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，４５５（１）：２６９−２７１）、プロトン生成解離塩（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）（Ｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１１５１（２）：２０１−２１５；Ｍａｕｒｅｒ−Ｓｐｕｒｅｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１４１６（１）：１−１０；Ｆｒｉｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１７５８（１０）：１６３３−１６４０）、または金属塩からのイオノフォア媒介イオン勾配（例えば、Ａ２３１８７及びＭｎＳＯ４）（Ｍｅｓｓｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０（１９）：６６３８−６６４９；Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．６８（３）：６０７−６１７；Ｆｅｎｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１４１４（１）Ｌ  １８８−２０４）によって生成することもできることも、指摘に値する。さらに、ＬＢ−ＭＳＮＰへの両親媒性弱酸負荷を改善するために酢酸カルシウム勾配を使用するな���、薬物負荷のために逆ｐＨ勾配を生成することが可能であり、これは、リポソームで利用されている戦略である（Ａｖｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５８（１）：１１９−１２９）。
【０３６０】
結論
まとめると、本発明者らは、リポソームとのその形態学的類似性にも関わらず、同等のリポソーム製剤または遊離薬物よりも優れた生体親和性及び治療効力をもたらす、イリノテカンのためのＭＳＮＰ送達プラットフォームを開発した。この新たな担体を使用すると、イリノテカン送達及びＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメン中の薬物組合せを、ＰＤＡＣのための第一選択処置の地位へと進めることができるであろう。
【０３６１】
方法
物質。
オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）、トリエタノールアミン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド溶液（ＣＴＡＣ、水中２５重量％）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８樹脂、セファロースＣＬ−４Ｂ、及びＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡから購入した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）、及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡから購入した。スクロースオクタスルファート（ＳＯＳ）ナトリウム塩は、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｎａｄａから購入した。塩酸イリノテカン三水和物は、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡから購入した。ペニシリン、ストレプトマイシン、及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔから購入した。活性化（切断された）カスパーゼ−３を検出するウサギｍＡｂ抗体（カタログ番号９６６４）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。遠心濾過フィルターユニット（カットオフ：１０Ｋ及び３０Ｋ）は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。すべての薬品を、さらに精製せずに直接使用した。
【０３６２】
捕捉試薬を使用してのイリノテカン負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰの調製。
ＭＳＮＰの合成。
ＭＳＮＰ核を、本発明者らの以前のゾル／ゲル手順をやや変更することによって合成した（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。ＭＳＮＰ約５００ｍｇのバッチを合成するために、ＣＴＡＣ５０ｍＬをＨ２Ｏ１５０ｍＬと、５００ｍＬ円錐フラスコ内で混合し、続いて、３５０ｒｐｍで１５分間にわたって８５℃で撹拌した。これに、１０％トリエタノールアミン８ｍＬの添加を３０分間にわたって、同じ温度で続けた。次いで、シリカ前駆体、ＴＥＯＳ７．５ｍＬを、ぜん動ポンプを使用して１ｍＬ／分の速度で滴下添加した。溶液を３５０ｒｐｍ、８５℃で２０分間にわたって撹拌すると、約６５ｎｍの一次サイズを有する粒子が形成した。界面活性剤を、粒子をメタノール／ＨＣｌの混合物（５００：１９ｖ／ｖ）で室温で２４時間にわたって洗浄することによって除去した。粒子を１００００ｒｐｍで６０分間にわたって遠心分離し、メタノールで３回洗浄した。
【０３６３】
捕捉剤ＴＥＡ８ＳＯＳの合成。
ＴＥＡ８ＳＯＳを、市販のＳＯＳナトリウム塩からイオン交換クロマトグラフィーによって合成した（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）。簡単に述べると、その塩５００ｍｇを脱イオン（ＤＩ）水１ｍＬに溶かし、５００ｍｇ／ｍＬの水溶液を得た。溶液を、ＤＩ水で準備された８ｃｍ×１．５ｃｍ陽イオン性イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８）カラムに通した。ＳＯＳ塩をカラムに添加し、スクロースオクタスルホン（ＳＯＳ）酸に変換するために水で溶離した。酸性ＳＯＳ溶離液を、５．８の最終ｐＨに達するように、無溶媒トリエチルアミンでただちに滴定した。これは、ＴＥＡ８ＳＯＳの形成をもたらした。塩濃度を約８０ｍＭに調節し、使用前に、冷蔵庫内で４℃で貯蔵した。
【０３６４】
ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷及びＭＳＮＰへのＬＢによる捕捉。
本発明者らは、ＬＢコーティングの使用によってＴＥＡ８ＳＯＳをＭＳＮＰに捕捉するための新規の方法を使用した（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。合成を、空のＭＳＮＰ１００ｍｇを、１５／１５秒オンオフ作業サイクル及び３２．５Ｗの出力でのプローブ音波処理によって５分間にわたって水性８０ｍＭ  ＴＥＡ８ＳＯＳ４ｍＬ中に浸漬することによって開始した。粒子懸濁液をただちに、１０ｍｇ／ｍＬでクロロホルムに懸濁された１１０ｍｇのＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（モル比３：２：０．１５）の混合物を６ｃｍ丸底フラスコの底部に添加することによって得られるコーティングされた脂質バイオフィルムに添加した。これは、１．０：１．１の粒子：脂質比に等しい。室温で回転蒸発器で溶媒を蒸発させた後に、本発明者らは、約３０ｃｍ２の表面積を有するバイオフィルムを得た。バイオフィルムに粒子懸濁液を添加した後に、プローブ音波処理を、１５／１５秒オンオフ作業サイクルで、３２．５Ｗの出力で３０分間にわたって使用した。捕捉されなかったＴＥＡ８ＳＯＳを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（１．５×１５ｃｍ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＨＥＰＥＳ緩衝デキストロース溶液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％デキストロース、ｐＨ６．５）を溶離のために使用して除去した。
【０３６５】
イリノテカン負荷のための、ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰの使用。
イリノテカンを、ＨＥＰＥＳ緩衝デキストロース（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％デキストロース、ｐＨ６．５）に１０ｍｇ／ｍＬで溶解させ、これを、ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷された粒子と混合して、１：１（ｗ／ｗ）のイリノテカン／ＭＳＮＰ比を達成した。混合物を６５℃で水浴中で３０分間にわたってインキュベートし、次いで、１０分間にわたって氷水中でクエンチした。薬物負荷された粒子を洗浄し、１５０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離することによって３回精製した。洗浄した粒子を、示されているとおりに水、食塩水、またはＰＢＳに再懸濁させた。
【０３６６】
イリノテカン送達のための比較用リポソーム製剤の調製。
捕捉剤の非存在下でのＬＢ−ＭＳＮＰによるイリノテカン封入。
空のＭＳＮＰ（４０ｍｇ）を、音波処理と共に１０ｍｇ／ｍＬイリノテカン溶液（水中）４ｍＬに添加し、続いて、４時間にわたって室温で撹拌した。次いで、上記と同様の組成の脂質バイオフィルムの音波処理を使用して、薬物をＬＢによって封入した。プローブ音波処理の後に、粒子を遠心分離及び洗浄によって精製し、上記のとおり再懸濁した。
【０３６７】
ＴＥＡ８ＳＯＳを使用してのイリノテカンのリポソーム封入。
ＭＭ−３９８製剤の社内類似体を開発するために（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７；Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０９：９２０−９２５）、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を（３：２：０．０１５のモル比で）含有する脂質混合物２１２ｍｇをエタノール０．４ｍＬに６５℃で溶解した。４ミリリットルのＴＥＡ８ＳＯＳ溶液（８０ｍＭ）を同じ温度で脂質エタノール溶液と混合し、続いて、水浴内で２分間にわたって音波処理した。脂質懸濁液を６５℃で、０．１μｍ空孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して１５回押し出した。捕捉されなかったＴＥＡ８ＳＯＳを、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ）によって、ＨＥＰＥＳ−緩衝デキストロース溶液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％デキストロース、ｐＨ６．５）で溶離して除去した。ＨＥＰＥＳ緩衝デキストロース（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％デキストロース、ｐＨ６．５）中で１０ｍｇ／ｍＬで調製されたイリノテカン溶液をＴＥＡ８ＳＯＳ負荷リポソーム懸濁液（イリノテカン／脂質＝１：２．１ｗ／ｗ）と混合し、水浴内で６５℃で３０分間にわたってインキュベートした。サンプルをただちに、氷水中で１０分間にわたってクエンチした。遊離薬物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを使用して、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶離して除去した。
【０３６８】
捕捉剤の非存在下でのイリノテカンリポソーム担体の合成
本発明者らはまた、捕捉剤の代わりに受動的封入アプローチを使用して、イリノテカン送達用リポソームを合成した。簡単に述べると、脂質の混合物（脂質５３ｍｇ、３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）をエタノール０．１ｍＬに、６５℃で溶解した。１ミリリットルのイリノテカン溶液（水中１０ｍｇ／ｍＬ）を、脂質エタノール溶液と６５℃で混合し、続いて、２分間にわたって音波処理した。脂質懸濁液を６５℃で、０．１μｍ空孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して１５回押し出した。薬物負荷されたリポソームを、上記と同じ方法を使用して精製した。
【０３６９】
物理化学的特徴づけ。
この実施例で使用したすべての粒子を、形態、サイズ、サイズ分布、形状、及び表面電荷について広範に特徴づけた。ＬＢコーティングの均一性及びその無傷性をＴＥＭ（ＪＥＯＬ  １２００−ＥＸ）及びｃｒｙｏＥＭ（ＴＦ２０  ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ−Ｇ２）によって特徴づけた。粒径及びζ電位をＺＥＴＡＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって測定した。これらの測定を、１０％ＦＢＳを加えた水、ＰＢＳ、及び細胞培養培地中に１００μｇ／ｍＬの粒子濃度で懸濁させたナノ粒子で行った。
【０３７０】
各担体の薬物負荷容量を、以前に記載されたとおりに減算法によって決定した（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。簡単に述べると、精製中に検出された非封入イリノテカンの量（ｍ１）を、マイクロプレートリーダー（Ｍ５ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）でのＯＤ（３６０ｎｍ）によって、またはＨＰＬＣ（Ｒａｙｔｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって決定した。薬物負荷容量は、ＤＬＣ＝［イリノテカン全量（ｍ０）−非封入イリノテカン（ｍ１）］／［粒子全量（ｍＭＳＮＰまたはｍｌｉｐｉｄ）］×１００％と定義された。薬物保持安定性を１００％ＦＢＳ中、３７℃で２４時間にわたって試験した。簡単に述べると、薬物負荷されたＮＰ（イリノテカン：１０ｍｇ／ｍＬ）４０μＬを、連続的に振盪しながら３７℃で、血清１ｍＬに添加した。遠心濾過器分離デバイス（１０ＫのＭＷカットオフ）を使用して、混合物を設定された時間間隔で遠心分離した。放出されたイリノテカンをマイクロプレートリーダーで、またはＨＰＬＣによって定量化した。ＮＰを含まない血清濾液を対照として使用した。両方の担体の安定性も、凍結乾燥手順によって試験した。簡単に述べると、Ｉｒ−ＭＳＮＰを５％デキストロース中に懸濁させた。サンプルを−６０℃で終夜凍結乾燥させ、−８０℃フリーザー内で貯蔵した。貯蔵したサンプルを、穏やかなボルテックス処理によって水中に再懸濁させ、その後、懸濁溶液を、以前に記載したとおりにサイズ、ζ電位、及び薬物放出について特徴づけた。
【０３７１】
細胞培養。
トランスジェニックＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋、Ｔｒｐ５３ＬＳＬ−Ｒ１７２Ｈ／＋、Ｐｄｘ１−Ｃｒｅマウスにおける自然発生腫瘍に由来する不死化細胞系を、Ｄｒ．ＵＣ  Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＡｎｄｒｅｗ  Ｌｏｗｙ博士の厚意によって得た。ＰＡＮＣ−１細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。両方の細胞種を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。ＩＶＩＳシステムでのバイオルミネセンス腫瘍イメージングを可能にするために、ＵＣＬＡベクターコア施設（ＵＣＬＡ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）において、以前に記載されたとおりに、両方の細胞に、ルシフェラーゼベースのレンチウイルスベクターを永続的にトランスフェクトした（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。単細胞クローンを選択するための限定希釈プロトコルの後に、ＫＰＣ−ｌｕｃ及びＰＡＮＣ−１−ｌｕｃ細胞集団を、ＰＤＡＣモデルを開発するために使用した。
【０３７２】
最大耐量の推定。
米国国立がん研究所のＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｂｒａｎｃｈ（ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｔｐｂ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍ）からのプロトコルを使用して、遊離及び封入イリノテカン製剤のＭＴＤを決定した（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）。２匹の健康な雄のＢＡＬＢ／ｃマウスに、遊離または封入イリノテカンの５０ｍｇ／ｋｇ（Ｃ１用量）当量をＩＶ注射した。これに、１．８の用量増加係数を続けて、最後の投与後から２４時間以内に動物死が生じるＣｎ用量を得た。用量探索の第２ラウンドはＣｎ−１用量で開始し、１．１５増加係数（ｎ＝２）を利用して、死亡または罹患の非存在と定義されるＭＴＤを発見した。ＭＴＤを、６匹のマウスに注射し、それらを罹患、死亡、または＞１５％体重減少の無いことを決定するために１５日間にわたって追跡することによって確認した。
【０３７３】
免疫適格性マウスにおけるＫＰＣ由来同所腫瘍モデルの確立。
雌のＢ６／１２９マウス（約８週）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、無病原体条件下で飼育した。すべての動物実験を、ＵＣＬＡ動物実験委員会によって承認されたプロトコルで行った。同所異種移植片を成長させるために、マウスに、イソフルランで麻酔をかけ、続いて、ケタミン５０ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン１０ｍｇ／ｋｇをＩＰ注射した。手術部位を、切開部位の周囲１ｃｍの範囲で剃毛し、ベタダイン及び７０％エタノールで洗うことによって滅菌した。マウスを外科手術のために加温パッドの上に置き、左側腹部の切開部位を、無菌ガーゼで覆った。０．５〜０．７ｃｍの外科的切開を行って、膵臓注射部位を露出させ、続いて、２７ゲージ針によって、２×１０６ＫＰＣ−ｌｕｃ細胞を含有するＤＭＥＭ／マトリゲル５０μＬ（１：１ｖ／ｖ）を膵臓尾部に注射した。腹膜層を吸収性縫合糸（ＰＤＳ  ＩＩ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）で、かつ皮膚を非吸収性縫合糸（ＰＲＯＬＥＮＥ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉じた。マウスを、麻酔から完全に回復するまで加温パッド上で保持し、次いで、清潔なケージに移した。有効性試験を腫瘍担持マウスで、移植から約２週間後に行ったが、その時点で、原発性腫瘍は、約０．５ｃｍまで成長しており、肉眼による腫瘍転移の証拠はなかった。生体内分布実験では、腫瘍担持マウスを腫瘍移植から３週間後に使用し、その時点で、原発性腫瘍は、約０．８ｃｍのサイズまで成長していた。
【０３７４】
ＩＶ注射されたＮＩＲ標識ナノ粒子の全身及び腫瘍内生体内分布。
ＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）インビボイメージングシステムを使用して、ＫＰＣ由来同所モデルにおけるＮＩＲ標識ＭＳＮＰ及びリポソームの生体内分布を試験した（ｎ＝３マウス）。ＮＩＲ標識を、０．１ｗ／ｗ％Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６８０−ＤＭＰＥを、薬物を含まないリポソーム及びＭＳＮＰ担体の両方のＬＢに組み込むことによって行った（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，９（４）：３５４０−３５５７）。腫瘍部位の生物発光イメージングのために、マウスに、Ｄ−ルシフェリン７５ｍｇ／ｋｇをＩＰ注射した。粒子注射の前に、腫瘍担持マウスでの基準蛍光イメージを捕獲した。ＮＩＲ標識粒子１００ｍｇ／ｋｇをＩＶ注射された動物で、ＮＩＲイメージを４８時間にわたって得た。動物をと殺した後に、エクスビボイメージを、切除した腫瘍及び主要臓器から得て、粒子の生体内分布を定量的に評価した。腫瘍組織の小さな切片を、ＯＣＴ試薬を用いて凍結包埋し、腫瘍切片を調製するために使用した。ＮＩＲ標識粒子の腫瘍内分布を、ＮＩＲレーザーを使用して共焦点顕微鏡法（ＳＰ２−１Ｐ−ＦＣＳ、Ｌｅｉｃａ）によって試験した。同じ切片の核染色を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素（青色）を使用することによって行った。ＬＢ−ＭＳＮＰで処理した動物では、腫瘍組織及び主要臓器も、ＩＣＰ−ＯＥＳによってＳｉ含有率を評価するために使用した。粒子生体内分布は、注射された用量全体の％（％ＩＤ）として表され、これは、個々の臓器に分散することが示され得た。腫瘍または他の正常な組織におけるイリノテカン含有率を測定するために、動物に、遊離または封入イリノテカン６０ｍｇ／ｋｇ（粒子用量、ＭＳＮＰでは１２０ｍｇ／ｋｇ及びリポソームでは１５０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、続いて、２４時間後にと殺した。ＨＰＬＣ分析を、採取した腫瘍組織、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、及び血液で行って、イリノテカン含有率を決定した。
【０３７５】
ＨＰＬＣ分析。
採取された腫瘍及び臓器サンプルを秤量し、氷上で均質化した。血漿または組織ホモジネート０．１ｍＬを酸性溶液０．４ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸／メタノール、１：４ｖ／ｖ）で抽出した後に、抽出物を１０秒間にわたって２回ボルテックス処理し、１３  ０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離した。Ｋｎａｕｅｒ  Ｓｍａｒｔｌｉｎｅニューマティクポンプ、Ｃ１８カラム、Ｋ−２６００分光光度計、及びＧｉｎａデータ収集ソフトウェアを含む系でＨＰＬＣ分析するために、イリノテカン含有上清を０．２２μｍフィルターで濾過した。１．００ｍＬ／分の流速で送達される移動相は、３％酢酸トリエチルアンモニウム水性緩衝液（ｐＨ５．５）及びアセトニトリル（７３：２７ｖ／ｖ）を含んだ（Ｎｏｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（５）：２８０１−２８０６）。２０マイクロリットルのイリノテカン含有サンプルを注射して、２５４ｎｍでの薬物吸収を測定したが、典型的には４．４分に溶離された。イリノテカン標準曲線を０．０５〜１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で作成した。イリノテカン含有率は、組織１グラム当たりの注射用量の％（％ＩＤ／ｇ）として表される。
【０３７６】
ＫＰＣ由来同所モデルを使用しての有効性の評価。
腫瘍担持Ｂ６／１２９マウスを、１群当たり８匹の動物を含む４つの群に無作為に割り付けた。マウスに、遊離または封入イリノテカンをＩＶ注射して、４日ごとに４０ｍｇ／ｋｇの用量（すなわち、ＭＳＮＰ１００または８０ｍｇ／ｋｇのリポソーム用量）を与えた。最高８回の注射を、２８日間の観察期間にわたって投与した。食塩水注射を、陰性対照として役立てた。腫瘍量をＩＶＩＳイメージングによって８日ごとに監視し、オペレーター定義されたＲＯＩで生物発光イメージング強度として定量的に表示した。群間の差異の統計的解析を、ｔ検定（Ｅｘｃｅｌソフトウェア、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して行った。すべての生存マウスを４７日目にと殺したが、その時点で、食塩水及び無薬物群の動物はすべて死亡していた。腫瘍組織及び主要臓器（ＧＩ管、肝臓、脾臓、心臓、肺、及び腎臓）を、エクスビボ生物発光イメージ強度の定量化のために採取した。
【０３７７】
種々のイリノテカン製剤の毒性可能性の比較。
有効性試験の実験中に収集された主要組織（肝臓、腎臓、脾臓、胃、及び小腸）を１０％ホルマリン中で固定し、続いて、パラフィン包埋した。組織切片を組織学的分析のためにＨ＆Ｅによって染色し、活性化（切断）カスパーゼ−３の発現のＩＨＣ分析のためにも使用した。スライドを盲検様式で、経験豊富な病理学者が読み取った。骨髄毒性を評価するための第２のアプローチは、健康なマウスにおける４０ｍｇ／ｋｇでの遊離薬物及び担体製剤の、２日空けて３回のＩＶ投与を使用した。動物を７日目にと殺し、胸骨を１０％ホルマリン中での固定、カルシウム除去、パラフィン包埋、及びＨ＆Ｅ染色のために使用した。本発明者らはまた、ＵＣＬＡ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＤＬＡＭ）の診断用臨床検査サービスによる示差的白血球計数のために血液を収集した。遊離薬物及び担体による示差的肝臓毒性の機構を理解するために、イリノテカン６０ｍｇ／ｋｇの用量当量の単回注射を受けたマウスを２４時間後にと殺した。それぞれＫＣ及び切断カスパーゼ−３を同定するためにＦＩＴＣ標識抗Ｆ４／８０抗体またはＲＩＴＣコンジュゲートした二次抗体を使用する、ＫＣ及び活性化カスパーゼ−３の発現の免疫蛍光染色のために、肝臓組織を凍結包埋した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素を使用して、同じ切片で細胞核を位置限定した。染色したスライドを共焦点顕微鏡（Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｄ１、Ｚｅｉｓｓ）下で検査した。
【０３７８】
統計的解析。
群間の差異の比較分析を、両側スチューデントｔ検定（Ｅｘｃｅｌソフトウェア、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して行った。統計的に有意な差違はｐ＜０．０５と決定された。値は、図の説明文で述べられているとおり、複数回の決定の平均±ＳＤまたはＳＥＭとして表された。
【０３７９】
実施例２
膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）は、５年生存率が５％未満である致命的な疾患である。現在、ＰＤＡＣのための第一選択の化学療法は、ゲムシタビン（ＧＥＭ）（単一薬剤療法）またはロイコボリン、５−ＦＵ、オキサリプラチン、及びイリノテカンを含むＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸとしても公知である４剤レジメンの使用による処置を含む。ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸは、ＧＥＭと比較して、ＰＤＡＣ奏功率を上昇させているが（すなわち、３１．６％対９．４％）、このレジメンは、毒性がかなり高く、したがって、良好な機能状態を有する、進行段階のＰＤＡＣ患者のうちの少数に限定される（Ｃｏｎｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６４：１８１７−１８２５）。イリノテカンが主に、骨髄（例えば、好中球減少症の発病率約６０％）、さらにはＧ．Ｉ．Ｔ．（例えば、患者の約５０％における嘔吐、下痢、悪心、食欲不振）での有害作用によって、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ毒性に寄与している（Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９（４）：４４７−４５４）。イリノテカンの毒性の低下を含む、毒性の低いＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメンを開発する必要性が満たされていない。
【０３８０】
リポソーム（Ｍｅｓｓｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１０（１９）：６６３８−６６４９；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）またはポリマーベースのナノ担体（Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｂｕｌｌ．２６（１）：１１６−１１９）によるイリノテカンの送達によって示されるとおり、イリノテカンを送達するためのナノ粒子担体の使用は、この薬物の毒性の低下に、有望な解決をもたらす。前臨床レベルでは、これらのナノ担体を使用する利点には、様々なマウスＰＤＡＣモデルの毒性低下、抗腫瘍有効性の上昇、及び生存率の増強が含まれる。現在までに、イオノフォア、Ａ２３１８７（Ｉｒｉｎｏｐｈｏｒｅ  Ｃ）またはプロトン化捕捉剤、トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）によって薬物負荷を促進するリポソーム製剤を含めて、僅かなイリノテカン担体のみが治験で試験されている。ＭＭ−３９８の治療効力は、多価陰イオン性捕捉剤、ＴＥＡ８ＳＯＳの使用による、リポソームへのイリノテカンの封入及び捕捉に依存している。ＴＥＡ８ＳＯＳは、脂質二重層を越えて拡散するイリノテカンのプロトン化をもたらし、これを、脂質二重層から出ることができない親水成分へと変換する。したがって、薬物は、リポソーム二重層による受動的封入を１０倍上回る濃度で捕捉される（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（６）：３２７１−３２７７）。ＭＭ−３９８は現在、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって第３相治験中である（ｗｗｗ．ｍｅｒｒｉｍａｃｋｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ）（Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．によるポスター・プレゼンテーション、Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１４）。このポスターは、／／ｍｅｒｒｉｍａｃｋｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＥＳＭＯＧＩ２０１４ＭＭ３９８．ｐｄｆ）で見ることができる。ＡＡＣＲ２０１２ミーティングにおいて、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ社は、「ＭＭ−３９８は、同所転移モデルを含む膵臓癌の多数のマウスモデルにおいて、腫瘍退縮を誘導した」との言明を含むアブストラクトを公開した。皮下モデルには、ＢｘＰＣ３、ＡｓＰＣ−１、Ｐａｎｃ−１及びＭｉａＰａＣａが含まれた。膵臓における同所移植は、ＢｘＰＣ３で実施された。詳細なデータは示されなかった。ＭＭ−３９８のＩＶ投与は、マウスにおいて、転移性腫瘍病巣形成の阻害を含めて、様々なＰＤＡＣ腫瘍モデルで完全な腫瘍退縮を誘導することが示されている（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（６６）：３２７１−３２７７）。ＭＭ−３９８、５−ＦＵ及びロイコボリンの組合せでの、第３相ＰＤＡＣ治験における４１７人の患者の処置は、５−ＦＵ及びロイコボリンを与えられたヒト対照における１．９カ月と比較して、全生存期間の増加（６．１カ月）を示した（Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．ＥＳＭＯ  Ｐｏｓｔｅｒ，ｗｗｗ．ｍｅｒｒｉｍａｃｋｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ）。
【０３８１】
この実施例では、本発明者らは、リポソーム同等物と比較して優れた容量を有するナノ担体によって、イリノテカンの能動的負荷、捕捉、及び封入を達成することができる新規のメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）プラットフォームを記載する。これらの粒子の合成は、担持脂質二重層ＬＢによる、粒子の多孔性内部へのＴＥＡ８ＳＯＳの急速な封入によって達成された。その後、イリノテカン溶液中で、これらの粒子をインキュベーションすることで、イリノテカンの能動的捕捉が可能となったが、イリノテカンは、二重層を越えて拡散し、次いで、ＴＥＡ８ＳＯＳによってプロトン化される。イリノテカン負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰと、社内合成したＭＭ−３９８のリポソーム同等物との比較分析を行った。この分析は、ＭＳＮＰ担体による優れた負荷容量、負荷効率、及び放出プロファイルを実証した。本発明者らはまた、社内ＭＭ−３９８リポソームと比較して、同様のインビトロ有効性及びインビボ毒性の低下を示した。本発明者らは現在、皮下及び同所ヒトＰＤＡＣ腫瘍モデルにおいてこれらの担体を比較するための動物有効性試験を行っている。
【０３８２】
本発明者らは、イリノテカンのＬＢ−ＭＳＮＰ媒介ナノ封入及び標的化送達が、骨髄及びＧＩＴにおけるイリノテカンの毒性の低下を含む毒性の低下によって、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸの臨床使用を改善すると考えている。この発見は、負荷容量及びがん部位での十分な薬物放出によってリポソーム担体よりも優れ得る、ＩＶ注射可能で、効率的で、生体適合性で、かつ商業的に競争力のあるイリノテカン製剤を可能にする。特定の実施形態では、本発明を、がん処置、さらには他の疾患の処置に使用することができる他の弱塩基性分子（ｐＫａ＞７．０）を送達するための有効な設計原理として使用することもできるであろう。
【０３８３】
次の記載では、イリノテカン負荷のための担体設計のいくつかの実施形態、さらにはＬＢ−ＭＳＮＰ担体と、ＭＭ−３９８と同様の社内合成されたリポソーム製剤との比較分析を説明する。
【０３８４】
追加の能動的負荷を達成するための捕捉剤も含む、ＬＢ−ＭＳＮＰによるイリノテカン封入。
ＬＢ−ＭＳＮＰによるイリノテカンの有効な負荷を得るために、本発明者らは、本発明者らが最近発見したバイオフィルム手順を、捕捉剤、ＴＥＡ８ＳＯＳを初めに封入することによって、薬物負荷のために適合させ、そして、この捕捉剤、ＴＥＡ８ＳＯＳが、担持ＬＢを越えて拡散する薬物をプロトン化して空孔に進入させることによって、イリノテカン移入及び保持を担う。これは、密閉されたＭＳＮＰ空孔へのイリノテカンの安定な捕捉をもたらし、平衡が達成されるまで、ＬＢを越えてのさらなる拡散のために勾配を生成する。これは実際に、多孔性内部の広い表面積及び捕捉剤媒介薬物保持の援助によって、薬物が高濃度で蓄積することを可能にする。特定の実施形態では、合成手順は、４つの部分、すなわち、ＭＳＮＰ核の合成、ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰの合成、ＴＥＡ８ＳＯＳの作用による、粒子へのイリノテカンの能動的負荷、及び最後に、担体の精製からなる。
【０３８５】
薬品：
オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ、≧９９．０％、Ｌｏｔ＃ＢＣＢＫ９５４０Ｖ）、トリエタノールアミン（≧９９．０％、Ｌｏｔ＃ＢＣＢＨ９０３６Ｖ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド溶液（ＣＴＡＣ、水中２５重量％、Ｌｏｔ＃ＳＴＢＣ７８８８Ｖ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ、≧９９．０％、Ｌｏｔ＃ＳＨＢＤ９００６Ｖ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡから購入した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、＞９９．０％、Ｌｏｔ＃１８０ＰＣ−１４７）、メトキシポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ２０００）誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、＞９９．０％、Ｌｏｔ＃１８０ＰＥＧ２ＰＥ−１２２）、及びコレステロール（Ｃｈｏｌ、＞９８．０％、Ｌｏｔ＃ＣＨ−９４）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡから購入した。スクロースオクタスルファートナトリウム塩（Ｌｏｔ＃１−ＴＭＨ−１７５−４）は、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ、Ｃａｎａｄａから購入した。塩酸イリノテカン三水和物（ＩＲＩＮ、≧９９．０％、Ｌｏｔ＃ＲＣＮ−１０４）は、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡから購入した。すべての薬品を、さらに精製せずにそのまま使用した。
【０３８６】
ＭＳＮＰのゾル−ゲル合成及びテンプレートの除去
ＭＳＮＰ核を、本発明者らのゾル／ゲル手順をわずかに変更することによって合成した。反応を５００ｍＬ円錐フラスコ内で実施した。ＣＴＡＣ（２５％）５０ｍＬを、３５０ｒｐｍで撹拌しながら１５分間にわたって８５℃で、Ｈ２Ｏ１５０ｍＬと混合した。これに、８５℃で３０分間にわたる１０％トリエタノールアミン８ｍＬの添加を続けた。シリカ前駆体、ＴＥＯＳ（７．５ｍＬ）を、ぜん動ポンプによって制御された１ｍＬ／分の速度で、混合物に滴下添加した。約６０ｎｍの一次サイズを有する粒子の合成を達成するために、溶液を３５０ｒｐｍで、８５℃で２０分間にわたって撹拌した。界面活性剤を除去するために、粒子を、室温で２４時間にわたってメントール及びＨＣｌ（５００：１９、ｖ／ｖ）によって洗浄した。粒子を１０，０００ｒｐｍで６０分間にわたって遠心分離し、メントールで３回洗浄した。高品質のＭＳＮＰ核を得るために、粒子の凝集及び汚染を監視するためのＤＬＳ測定、粒子形態を可視化するためのＴＥＭ、ならびに界面活性剤が完全に除去されたかどうかをチェックするための赤外分光法及び細胞傷害性アッセイを含む、頻繁な品質チェックを行った。
【０３８７】
捕捉剤としてＴＥＡ８ＳＯＳを使用してのイリノテカン負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰの調製
ＬＢ−ＭＳＮＰによるイリノテカン負荷のための最適な手順を確立するために、本発明者らは、バイオフィルム手順（以前に開示されている）を使用して、プロトン化剤を粒子内に捕捉し、その後、その粒子をイリノテカン溶液中でインキュベートする新規のアプローチを開発した。これは、親油性イリノテカンが、ＬＢ膜を通って拡散し、その後、空孔内でプロトン化することを可能にして、濃度勾配に対する薬物の捕捉をもたらす（図５を参照されたい）。負荷容量及び薬物放出挙動を考慮して、本発明者らは、負荷時間、捕捉剤濃度、ＬＢ−ＭＳＮＰ濃度、イリノテカン濃度、及びイリノテカン／ＬＢ−ＭＳＮＰ比を全体的に変更することによって、イリノテカン負荷手順を最適化した。これは、本発明者らが、８５％のイリノテカン負荷容量（イリノテカン／ＭＳＮＰ、ｗ／ｗ）を達成することを可能にしたが、これは、捕捉試薬の非存在下での薬物負荷容量を約４倍上回った。これは、並行して合成されたＭＭ−３９８のリポソームバージョンの負荷容量の２倍になった。さらなる考察では、本発明者らは、イリノテカン負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰを「Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）」と呼んでいる。
【０３８８】
ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰの合成
市販のスクロースオクタスルファートナトリウム塩からの捕捉剤トリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）の調製。
本発明者らは、ＴＥＡ８ＳＯＳを、その前駆体であるスクロースオクタスルファートのナトリウム塩から合成するためにイオン交換反応を使用した。簡単に述べると、前駆体塩５００ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶解させて、５００ｍｇ／ｍＬの水溶液を得た。この溶液を陽イオン性Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８樹脂イオン交換カラム（直径１５ｍｍ及び長さ８ｃｍ、Ｓｉｇｍａから購入、Ｌｏｔ＃ＭＫＢＨ８８１０Ｖ）に通過させた。脱イオン水でカラムを溶離した後に、スクロースナトリウムは、このプロセスでプロトン化オクタスルファートに変換される。収集したスクロースオクタスルホン酸をただちに、トリメチルアミン（ＴＥＡ）で５．５〜６．０の最終ｐＨに滴定すると、ＴＥＡ８ＳＯＳの形成が生じた。ＴＥＡ８ＳＯＳ濃度を、ＴＥＡの量の滴定に基づいて約８０ｍＭに調節した。多価陰イオン性ＴＥＡ８ＳＯＳを、使用前には４℃冷蔵庫で貯蔵した。
【０３８９】
ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰの調製。
本発明者らは、ＬＢコーティングのために本発明者らが以前に開示したバイオフィルム技術（その全体で参照によって組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２０８５７（ＵＣＬＡ開示２０１３−５３４−２））を、ＴＥＡ８ＳＯＳを封入するために適合させ、その後、イリノテカン負荷に進めた。簡単に述べると、空のＭＳＮＰ１００ｍｇを、１５／１５秒オンオフ作業サイクルで、３２．５Ｗの出力で３０分間にわたってプローブ音波処理を使用してＴＥＡ８ＳＯＳ水溶液４ｍＬ（４０ｍＭ）中に浸漬した。懸濁液をただちに、丸底フラスコ（直径６ｃｍ）の底部で約３０ｃｍ２の表面積を占める、コーティングされた脂質バイオフィルムの上に添加した。脂質成分の最適な混合を達成するための実験（漏出のない安定なコーティングを目的とした）に従って、本発明者らは、３：２：０．１５のモル比でＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２２８ｍｇを含有する混合物に決定した。この混合物を、クロロホルムに１０ｍｇ／ｍＬで溶解させた。室温で、真空系に接続された回転蒸発器を使用して、約１時間かけて溶媒を蒸発させることによって、バイオフィルム形成が達成された。粒子懸濁液４ｍＬをバイオフィルムに添加した後に、プローブ音波処理を、１５／１５秒オンオフ作業サイクルで、３２．５Ｗの出力で３０分間にわたって使用した。音波処理された懸濁液は、コーティングされた粒子、リポソーム、及び遊離ＴＥＡ８ＳＯＳを含有するので、ＴＥＡ８ＳＯＳ  ＬＢ−ＭＳＮＰを、セファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１５ｍｍ及び長さ１５ｃｍ、Ｓｉｇｍａから購入、Ｌｏｔ＃ＭＫＢＰ０８８５Ｖ）をＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％デキストロース、ｐＨ６．５）で溶離するクロマトグラフィー手順を使用して精製した。
【０３９０】
能動的イリノテカン負荷のための、ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰの使用。
イリノテカンを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％デキストロース、ｐＨ６．５）に溶解させた。この薬物溶液を、ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたＬＢ−ＭＳＮＰ懸濁液と１：１（ｗ／ｗ）のイリノテカン／粒子比で混合し、６０℃の水浴内で０．５時間にわたってインキュベートした。反応を、容器を氷水内に１０分間にわたって入れることによって停止させた。
【０３９１】
粒子精製
Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）を、１５，０００ｒｐｍで１０分間にわたる粒子の遠心分離、続く、食塩水または５％デキストロースへの再懸濁によって、遊離リポソーム及び遊離イリノテカンから精製した。洗浄手順を３回繰り返した。
【０３９２】
Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）粒子を使用しての、比較試験のための対照製剤の調製
Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）粒子の独特の特性を反映する比較分析を行うために、本発明者らは、浸漬されたイリノテカンをＬＢによって密閉する、捕捉剤を含まないＬＢ−ＭＳＮＰを合成した。本発明者らはまた、捕捉剤を用いて調製されたＭＭ−３９８のリポソーム同等物、さらにはイリノテカンを封入する、捕捉剤を含まない対照リポソームを調製した。
【０３９３】
捕捉剤を含有しないイリノテカンＬＢ−ＭＳＮＰの合成：
空のＭＳＮＰ（４０ｍｇ）を、５分間にわたって音波処理と共に、イリノテカン溶液４ｍＬ（水中、１０ｍｇ／ｍＬ）に入れ、次いで、さらに４時間にわたって室温で撹拌した。イリノテカン浸漬されたＭＳＮＰ懸濁液を、無水脂質膜（ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥ−ＰＥＧ２０００を３：２：０．１５のモル比で含有する脂質混合物９１ｍｇ）に添加し、続いて、１５／１５秒オンオフ作業サイクルを３２．５Ｗの出力で使用して３０分間にわたってプローブ音波処理した。１０分間にわたって１５，０００ｒｐｍでの遠心分離を使用し、続いて、上記のとおりに粒子を洗浄し、かつ再懸濁して、粒子を遊離リポソーム及び遊離薬物から精製した。本発明者らは、捕捉剤を含まない粒子を「Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（−ＳＯＳ）」と称した。
【０３９４】
商業的に開発されたリポソーム製剤、ＭＭ−３９８のリポソーム同等物の社内合成
合成を、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，６６，３２７１−３２７７）によってＭＭ−３９８のために公開された手順に従って実施した。簡単に述べると、脂質の混合物（脂質２１２ｍｇ、３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）をエタノール０．４ｍＬに６０〜６５℃で溶解させた。ＴＥＡ８ＳＯＳ溶液４ｍＬ（８０ｍＭ）を、同じ温度で脂質エタノール溶液と混合し、続いて、水浴内で２分間にわたって音波処理した。脂質懸濁液を６０〜６５℃で、０．１μｍの空孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して１５回押し出した。非捕捉ＴＥＡ８ＳＯＳを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％デキストロース、ｐＨ６．５）で溶離するＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムでのクロマトグラフィーによって除去した。イリノテカン溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、及び５％デキストロース、ｐＨ６．５を含有する１０ｍｇ／ｍＬ水溶液）を、ＴＥＡ８ＳＯＳを予め負荷されたリポソーム懸濁液（イリノテカン：脂質＝１：２．１ｗ／ｗ）と混合し、次いで、水浴内で、６５℃で０．５時間にわたってインキュベートした。反応を、混合物を氷水内に１０分間にわたって入れることによって停止した。次いで、イリノテカン負荷されたリポソームを、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１４５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）によって溶離するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（直径１５ｍｍ及び長さ１５ｃｍ、Ｓｉｇｍａ、Ｌｏｔ  ＃０１９Ｋ１０７７）で遊離イリノテカンを除去することによって精製した。本発明者らは、社内合成したリポソーム製剤を「Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）」と称する。
【０３９５】
捕捉剤を使用しない、イリノテカン封入されたリポソームの合成。
本発明者らはまた、受動的封入アプローチを使用するリポソームを合成した。簡単に述べると、脂質の混合物（脂質５３ｍｇ、３：２：０．０１５のモル比のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を、６０℃〜６５℃でエタノール０．１ｍＬに溶解させた。イリノテカン溶液１ｍＬ（水中、１０ｍｇ／ｍＬ）を６０℃〜６５℃で脂質エタノール溶液と混合し、２分間にわたる水浴音波処理を続けた。脂質懸濁液を、６０〜６５℃で、０．１ｕｍの空孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して１５回押し出した。薬物負荷されたリポソームを、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１４５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶離するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを使用して遊離イリノテカンを除去することによって精製した。本発明者らは、このリポソーム製剤を「Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（−ＳＯＳ）」と称する。
【０３９６】
Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）と対照イリノテカン製剤との比較分析。
Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）及び対照製剤の物理化学的特徴づけ。
表３は、対照製剤と比較して、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）の流体力学的サイズ、サイズ分布及び表面電荷を示している。Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）は、約０．１の多分散指数（ＰＤＩ）で、１１０〜１３０ｎｍの流体力学的サイズを有する。この粒子は、純水中で負のゼータ電位値、すなわち、−２４．７ｍＶを示した。ゼータ電位は、ＰＢＳ中では−２．９５ｍＶ、及び完全ＤＭＥＭ培養培地中では−３．２７ｍＶに変化した。これらの物理化学的パラメーターは、種々の溶液中で、Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（−ＳＯＳ）、Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）、及びＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（−ＳＯＳ）などの対照製剤と同様であった。
【表３】
2019501198.tif 000010
【０３９７】
表４は、捕捉剤の使用を伴う、及び伴わないＬＢ−ＭＳＮＰの負荷容量及び負荷効率を示している。負荷容量＝（全イリノテカン−上清中のイリノテカン）／（ＭＳＮＰまたはリポソームの質量）×１００％。負荷効率は、［（全イリノテカン−上清中のイリノテカン）／全イリノテカン］×１００％と定義される。リポソームでは、負荷容量は、８０ｍＭ捕捉試薬の非存在または存在下で、４．１２ｗ／ｗ％及び４５．２ｗ／ｗ％であった。リポソームプラットフォームにおけるイリノテカンの負荷効率は、捕捉剤の作用の結果として、８．７１％から９５．５％へ増加した。これは、合成されたＭＭ−３９８リポソームについて公開されたデータ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，６６，３２７１）と一致する。最も安定な粒子製剤を得るための実験の後に、本発明者らは、ＬＢ−ＭＳＮＰを合成するために４０ｍＭの捕捉剤を使用した。イリノテカンと共にインキュベートした後に、本発明者らは、捕捉試薬を含まないＬＢ−ＭＳＮＰでの２２．５ｗ／ｗ％の負荷容量と比較して、負荷容量８３．５ｗ／ｗ％でＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）を達成した。Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰは、少ない捕捉剤（４０ｍＭ）を使用したが、実際にこれは、８０ｍＭ捕捉剤を含有する社内ＭＭ−３９８リポソームと比較した場合に、２倍の負荷容量をもたらした。
【表４】
2019501198.tif 000011
【０３９８】
本発明者らはまた、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）の形態を可視化するためにｃｒｙｏＥＭ分析を行った。これによって、脂質二重層によるＭＳＮＰ表面の均一なコーティングが確認された（図６Ａ、上のパネル）。高倍率ｃｒｙｏＥＭイメージは、約８０ｎｍの一次粒子サイズを、二重層約７．１ｎｍ厚による完全な表面コーティングと共に実証した。ズームインイメージによって、無傷の脂質被覆の存在が確認されたが、空孔中の高密度物質の存在も実証され；この物質は、イリノテカン−ＴＥＡ８ＳＯＳ複合体を表す。本発明者らは、粒子表面に密に付着していないが、しかしながら、ＬＢ層は無傷なままであるやや大きなリポソームによって封入された粒子をたまに観察した。Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）のイメージは、単層二重層約６．５ｎｍ厚を有する約７５ｎｍのリポソーム構造を示した（図６Ａ、下のパネル）。高倍率ｃｒｙｏＥＭは、リポソーム内部の高密度ＩＲＩＮ−ＴＥＡ８ＳＯＳ沈澱物（赤色の矢印）を見るために充分な解像度を示す。
【０３９９】
各製剤の安定性を評価するために、本発明者らは、血流中でのイリノテカン安定性を推定することを意図して、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で３７℃での薬物安定性を比較した（図６Ｂ）。これは、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）がＰＢＳ中で非常に安定であり、２４時間かけて＜５％の放出をもたらすことを実証した。ＰＢＳ中で匹敵する安定性が、社内ＭＭ−３９８リポソームにおいて見出された。
【０４００】
グルコース取り込み、解糖作用、乳酸産生（ワールブルク効果）、異常な血液潅流、及び密な間質の存在によって、ＰＤＡＣのｐＨ値は酸性である（Ｗｏｊｔｋｏｗｉａｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（１６）：３９３８−３９４７；；Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３（５）：１５２４−１５３５）。したがって、本発明者らはまた、酸性ｐＨ条件での薬物放出プロファイルを観察した。腫瘍ｐＨは古典的に、約６．５に低下するが、低くは約５．５でもあり得る（Ｊａｈｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６２０９−６２１５）。粒子がＰＤＡＣ細胞によって取り込まれた場合には、ｐＨは、リソソームコンパートメントでさらに＜５に低下し得る（Ｍｉｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４：６９−８６）。したがって、本発明者らは、ファゴリソソーム模擬流体（ＰＳＦ、ｐＨ＝４．５）中で薬物放出実験を行った。ＰＳＦ中では、急速なイリノテカン放出（すなわち、４時間で２０％）をＬＢ−ＭＳＮＰにおいて見ることができた。しかしながら、社内ＭＭ−３９８製剤では、本発明者らは、ＰＳＦにおいて著しく遅い薬物放出プロファイル、すなわち、２４時間でわずか約４％の薬物放出を見い出した。
【０４０１】
培養ＰＤＡＣ細胞におけるＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）の細胞取り込み及び死滅効率
Ｔｅｘａｓレッド標識されたＬＢ−ＭＳＮＰまたはリポソームを利用した共焦点顕微鏡法は、ＰＡＮＣ−１細胞の核周囲分布での豊富な細胞取り込みを実証した（図７）。本発明者らはまた、ＭＴＳ細胞傷害性アッセイを使用して、増分イリノテカン濃度での処置の間の、ＰＡＮＣ−１及びＢｘＰＣ３細胞に対するＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）の効果を決定した。本発明者らは、これらの粒子の効果を、遊離薬物及びＩｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）対照と比較した。遊離薬物は２４時間での死滅では、より有効であるが、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）及びリポソームの両方は、両方の細胞種において、７２時間目に匹敵する死滅を示した（図８）。空のナノ粒子は４８時間にわたって、５００μｇ／ｍＬまでの濃度で、毒性を誘導しない。
【０４０２】
マウスにおけるＩｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）対Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）のインビボ毒物学的効果の比較分析。
最大耐量（ＭＴＤ）。
本発明者らは、様々なイリノテカン製剤のＭＴＤを決定することによって、インビボ毒性試験を開始した。これを、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｂｒａｎｃｈ（ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｔｐｂ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍ）からのＮＣＩプロトコルを使用して達成した。２匹の健康な雄のＢＡＬＢ／ｃマウスに、遊離または封入薬物５０ｍｇ／ｋｇ（Ｃ１用量）をＩＶ注射した。次いで、本発明者らは、１．８の用量増加係数を使用して、両方の動物（ｎ＝２）が２４時間以内に死亡するＣｎ用量を決定した。遊離または封入イリノテカンでの処置後。第２ラウンドの用量探索をＣｎ−１用量で開始し、１．１５増加係数を使用して（ｎ＝２）、死亡または重篤な罹患が存在しないＭＴＤを見い出した。ＭＴＤをさらに、５匹のマウスに注射し、それらを１５日間にわたって追跡して、罹患、死亡または＞２０％の体重減少が存在しないことを確めることによって確認した。本発明者らの結果によって、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）、Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）、及び遊離イリノテカンのＭＴＤ用量値がそれぞれ、２９５ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、及び６０ｍｇ／ｋｇであることが実証された。遊離薬物と比較して、ナノ製剤は約５倍高いＭＴＤ用量を示し、ＬＢ−ＭＳＮＰ及びリポソーム製剤の両方の使用で、毒性低下の能力を明らかに示唆している。
【０４０３】
組織学的分析。
別の実験で、健康なマウスに、ＩＶ６０ｍｇ／ｋｇの薬物用量で、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）、Ｉｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）、及び遊離イリノテカンの単回ＩＶ投与を与えた。処置から２４時間後に、マウスを、臓器採取のためにと殺した。胸骨、胃腸（ＧＩ、胃及び小腸）管、胸腺、肝臓、腎臓、脾臓、及び肺の適切なサイズ切片を１０％ホルマリン中で固定し、次いで、パラフィンに包埋した。４μｍ厚の組織切片をガラススライドに載せた。切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、光学顕微鏡法によって検査した。スライドを経験豊富な病理学者が読み取った。結果は、遊離ＩＲＩＮよりも、Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）及びＩｒ−Ｌｉｐｏ（＋ＳＯＳ）で骨髄毒性のかなりの低下を示した（図９）。本発明者らは、赤血球、巨核球または白血球前駆体に対して示差的毒性が存在するかどうかを評価するために免疫組織化学を使用して、胸骨骨髄でより詳細な試験を行っている。遊離イリノテカン及びリポソーム製剤は、腎毒性をもたらし、これは、糸球体腫脹として症状発現した。Ｉｒ−ＬＢ−ＭＳＮＰ（＋ＳＯＳ）粒子によって処置されたマウスでは、著しい腎臓異常は見い出されなかった（図１０）。
【０４０４】
結論。
このプロジェクトの目的は、有効なＰＤＡＣ死滅及び毒性低下のためにＩＶ注射用イリノテカンナノ送達プラットフォームを開発することである。高い薬物負荷容量、ナノ担体生体適合性、及び効率的な薬物封入の使用によって、ＬＢ−ＭＳＮＰプラットフォームは、ＰＤＡＣ細胞及び急性動物毒性試験において有望な結果を示している。
【０４０５】
実施例３
ｉＲＧＤ媒介トランスサイトーシスは、マウス及びヒト膵臓癌におけるシリカソームナノ担体のイリノテカン送達及び有効性を増強する
膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）はほぼ一様に致命的であるが、多少の全生存期間の改善が、イリノテカンまたはパクリタキセルを送達するナノ担体の導入で達成されている。本発明者らは、脂質二重層でコーティングされたメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）からなるイリノテカンシリカソーム担体を使用して、これらの結果を動物同所モデルにおいてさらに改善している。シリカソーム担体はまた、イリノテカンのためのリポソーム担体と比較して、大きな毒性低下をもたらす。ナノ担体は主に、腫瘍へのアクセスについて、異常な漏出性血管系（透過性及び保持効果の増強としても公知）に依存していると一般に推測されるが、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）受容体によって調節されるトランスサイトーシス輸送経路が最近、報告されている。この独特の輸送経路は、腫瘍関連インテグリンに結合する循環ｉＲＧＤペプチドによって開始され得て、その際、そのペプチドは、ＮＲＰ−１へのその後の結合のために処理される。ｉＲＧＤの同時投与は、確固たるＫｒａｓ同所ＰＤＡＣモデルにおいて、イリノテカン−シリカソームの取り込みを３〜４倍増強し、生存上の利益及び転移の著しい減少をもたらした。金−ナノ粒子核が埋め込まれているシリカソームを、インビボでのトランスサイトーシス経路の超微細構造検査のために使用したところ、ｉＲＧＤ同時投与が、血管管腔から、がん細胞の核周囲部位へと電子密度の高い担体を輸送する小胞輸送経路を誘導することが実証された。シリカソーム取り込みのｉＲＧＤ媒介増強は、患者由来異種移植片でも観察され、これは、腫瘍血管でのＮＲＰ−１発現のレベルと一致した。これらの結果によって、ＰＤＡＣ治療への有望な個人化アプローチのためのｉＲＧＤの有用性が実証されている。
【０４０６】
この実施例では、本発明者らは、確固たる膵臓管状腺癌（ＰＤＡＣ）動物モデルにおける、リポソームよりも優れたイリノテカン送達用の脂質二重層コーティングされたメソ多孔性シリカナノ担体（シリカソーム）の開発を記載する。本発明者らは、同所腫瘍部位でのシリカソーム取り込みが、ニューロピリン−１受容体のライゲーションによって新規のトランスサイトーシス経路を引き起こすｉＲＧＤペプチドの同時投与によって３〜４倍増強され得ることを実証する。ｉＲＧＤは、同じ血管受容体を発現する患者由来異種移植片へのシリカソーム取り込みも増強した。本発明者らは、小胞ベースのトランスサイトーシス経路の超微細構造証拠を提供するが、これは、腫瘍部位でのナノ担体の取り込みを説明するために一般に使用される透過性の増強及び保持効果を補足し得た。トランスサイトーシス経路は、ＰＤＡＣ患者においてイリノテカン−シリカソーム担体の利益を増強する可能性を提供する。
【０４０７】
序論
本発明者らは、薬物封入のために担持脂質二重層（ＬＢ）を使用して、高用量ＰＤＡＣ化学療法を得るために適合されている多機能メソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）プラットフォームを開発した（例えば、実施例１を参照されたい）。この担体は、担持されていないＬＢを含有する形態学的に同様のリポソーム担体と識別するために、「シリカソーム」とも呼ばれている。イリノテカン用の社内リポソーム担体を含むリポソームと比較して、本明細書に記載のシリカソームは、この薬物について著しく高い負荷容量、循環安定性の改善（担持されたＬＢの結果として）、及び薬物漏出の減少を示すことが判明している。これらの特徴は、ストリンジェントな同所Ｋｒａｓ  ＰＤＡＣモデルにおいて、リポソームに対して、シリカソームの薬物動態の改善及び処置有効性を可能にする（例えば、実施例１を参照されたい）。加えて、シリカソームは、リポソーム同等物と比較して、胃腸管、肝臓、及び骨髄において重大な毒性低下ももたらす（同書）。イリノテカンでの成功の他に、シリカソームプラットフォームを、パクリタキセル及びゲムシタビンの相乗的送達のために適合させており、同所ＰＤＡＣモデルにおいて、遊離ゲムシタビンとＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）との組合せよりも著しく（＞１０倍）優れていることを可能にしている。注目すべきことに、シリカソーム担体での上の結果は、標的化リガンドの使用に頼ることを必要とせずに、「受動的」送達によって達成され得た。
【０４０８】
この背景によって、本発明者らは、イリノテカン負荷されたシリカソーム（Ｉｒ−シリカソーム）によるＰＤＡＣ処置の有効性がトランスサイトーシスによって改善され得るかどうか、及びこれが、担体へのｉＲＧＤコンジュゲーションまたはその同時投与によって最良に達成され得るかどうかに関心を持った。この実施例で、本発明者らは、Ｋｒａｓ同所モデルにおいて担体取り込み及び処置有効性を増強するために遊離ｉＲＧＤペプチドの同時投与を使用する実行可能性を実証する。さらに、本発明者らは、血管管腔からがん細胞の核周囲部位へのＡｕ標識シリカソームの輸送を可能にする群化小胞システムの超微細構造の証拠を示す。本発明者らは、患者由来ＰＤＡＣ異種移植片において、腫瘍血管系でのＮＲＰ−１発現の比存在度が、ｉＲＧＤ同時投与の使用による、シリカソームに対する応答規模を決定することも実証する。
【０４０９】
結果
薬物負荷のためのシリカソームの合成及び特徴づけ、ならびにＰＤＡＣ腫瘍における可視化
本発明者らは、プロトン化剤に依存した遠隔負荷技術を使用しての、ＬＢコーティングされたＭＳＮＰ（シリカソームとしても公知）による高いイリノテカン負荷を実証している（例えば、図２１Ａの上のパネル、及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５を参照されたい）。イリノテカンは、ＬＢを越えてＭＳＮＰ内部パッケージングスペースへと拡散することができる弱塩基性及び両親媒性の分子であり、そのＭＳＮＰ内部パッケージングスペースで、先に捕捉されたトリエチルアンモニウムスクロースオクタスルファート（ＴＥＡ８ＳＯＳ）によるプロトン放出が、薬物を、ＬＢを越えて逆拡散することができない親水性誘導体に変換する（図２１Ａ、上のパネル）。遠隔負荷手順を、５０重量％（ｗ／ｗ、イリノテカン／ＭＳＮＰ）の薬物負荷容量を達成するＩｒ−シリカソームバッチを合成するために使用した（同書）。シリカソーム表面上へのｉＲＧＤペプチドのコンジュゲーションがＰＤＡＣ腫瘍部位への担体生体内分布に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、本発明者らはまた、ＬＢのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００成分をペプチド中のシステイン残基へのコンジュゲーションのために使用する粒子バッチを合成した。これは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の代わりにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミドを用いて、ステイン−修飾ペプチド、Ｃｙｓ−ｃ（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ）（配列番号１１）へのチオール−マレイミドカップリングを可能にすることによって達成された（方法セクションを参照されたい）（図２１Ａ、ボックス２）。コンジュゲーション反応の成功を確認するために、本発明者らは、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．によって開発されたペプチドのフルオレセイン標識バージョン（ＦＡＭ−ｉＲＧＤ）も使用して、充分な洗浄後にコンジュゲートしたシリカソームの蛍光分光法を行った（図２７、パネルＡ）（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６（６）：５１０−５２０）。これによって、蛍光ペプチドとＬＢとの安定な会合が確認された。コロイド不安定性及び担体取り込みにおける妨害を防ぐために、ｉＲＧＤコンジュゲーションの密度は、約３ｍｏｌ％（全ＬＢ成分に対して）に限定された。無傷のシリカソーム−ｉＲＧＤ担体の取り込みを、フローサイトメトリー及びＫＰＣ細胞における共焦点顕微鏡法によって確認した（図２７、パネルＢ及びＣ）。
【０４１０】
ＰＤＡＣ腫瘍におけるトランスサイトーシスプロセスのＴＥＭ可視化を行うために、本発明者らはまた、約１０ｎｍの電子密度の高いＡｕナノ粒子を含む核−シェルＭＳＮＰのバッチを合成した（図１Ａ、ボックス３）。ＣｒｙｏＥＭによって実証されたとおり、裸の粒子と同様に、核／シェル粒子を、ＬＢで効果的にコーティングすることができた（図２１Ａ、ボックス３）。このコミュニケーションで使用されたすべての担体での詳細な合成及び特徴づけ手順は、補足情報の方法セクションにおいて論述する。シリカソームの主な物理化学的特徴を下の表５にまとめる。
【０４１１】
【表５】
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【０４１２】
同所ＰＤＡＣモデルにおける、シリカソーム生体内分布に対するコンジュゲートされたｉＲＧＤペプチド対コンジュゲートされていないｉＲＧＤペプチドの効果の比較
トランスジェニックＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３ＬＳＬ−Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅ動物からの自発的ＰＤＡＣ腫瘍に由来するルシフェラーゼ発現ＫＰＣ細胞を、免疫適格性Ｂ６／１２９マウスの膵臓尾部に同所移植した（例えば、図２１Ｂの左のパネル、及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５；Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６（１４）：３６８４−３６９５を参照されたい）。このストリンジェントなＰＤＡＣ腫瘍モデルは、発がん遺伝子発現、成長特徴、転移、組織学的特徴及び形成異常間質の発生についてヒトＰＤＡＣを模倣する。図２１Ｂは、動物検死及びＩＶＩＳイメージング（図２１Ｂ）で見られたとおりの腫瘍成長特徴及び転移の詳細をまとめている（Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６（１４）：３６８４−３６９５；Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ８０５８０）。同所腫瘍部位へのシリカソーム生体内分布を、コンジュゲートされていないか（すなわち、「ＩＲＧＤ非含有」状態）、またはペプチド−コンジュゲートされている（「シリカソーム−ｉＲＧＤ」）近赤外（ＮＩＲ）標識（ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０）粒子５０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）注射によって評価した（図２２Ａ）。動物の第３の群には、遊離ペプチド８μｍｏｌ／ｋｇ及びコンジュゲートされていない粒子の同時投与が与えられた（「シリカソーム＋ｉＲＧＤ」）。当初注射から２４時間後及び動物と殺の後に行われた移植臓器のＩＶＩＳイメージングは、シリカソーム−ｉＲＧＤまたはシリカソームのみの群でのシグナル伝達強度と比較して、「シリカソーム＋ｉＲＧＤ」群では、腫瘍部位でのＮＩＲシグナル伝達強度の顕著な上昇を実証した（図２２Ａ）。イメージング強度を、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアによって定量化した。それらのインビボ効果の欠如とは対照的に、ペプチド−コンジュゲートしたシリカソームは、ＫＰＣ細胞において担体取り込みを増強することが分かり得た（図２７、パネルＢ及びＣ）。本発明者らは、これを、膜貫通取り込みを開始するには充分なＮＲＰ−１受容体密度と解釈する一方で、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．によってインビトロ／インビボ比較について以前に報告されたとおり、腫瘍血管部位での受容体存在度は、通過することができるコンジュゲートされた粒子の数で限定され得る（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６（６）：５１０−５２０；Ｔｅｅｓａｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０６（３８）：１６１５７−１６１６２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ４：５２３２）。ＮＩＲ強度（図２２Ｂ、左のパネル）が実際のＭＳＮＰ取り込みを反映していることを示すために、誘導結合プラズマ発光分光測定（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を、腫瘍のケイ素（Ｓｉ）含有率の定量化のために使用した（図２２Ｂ、右のパネル）。これによって、シリカソーム−ｉＲＧＤまたはシリカソームのみの群と比較して、「シリカソーム＋ｉ��ＧＤ」群におけるＳｉ含有率の著しい（約３倍）上昇が実証された。本発明者らはまた、対照の非ＣｅｎｄＲペプチド、シクロ（ＲＧＤｆＫ）とのシリカソーム同時投与（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２８（５９８１）：１０３１−１０３５）がシリカソーム取り込みを増強することができないことを示すために、別の実験を行うことによって、ＰＤＡＣ生体内分布のためのＣ末端（ＣｅｎｄＲ）モチーフの重要性を実証した（図２８）。この結果はまた、ＩＣＰ−ＯＥＳによって確認された（図２８）。
【０４１３】
腫瘍組織切片を、ＮＩＲ標識シリカソームの腫瘍内生体内分布の比存在度及び腫瘍血管からの移動距離を評価するために使用し、これらを、抗ＣＤ３１  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８染色によって明瞭にした（図２９）。この分析は、ｉＲＧＤ同時投与が、同所腫瘍部位でのシリカソーム取り込みを増強するための最も有効な戦略であったことを示した。対照的に、ｉＲＧＤ−コンジュゲートした担体は、本発明者らのＫＰＣ同所モデルにおいて粒子の数、さらには移動距離に対して著しい効果を発揮することはできなかった（図２９）。上記の所見によって、その後の有効性試験を行うためには、遊離ｉＲＧＤを使用することとなった。
【０４１４】
すべてのナノ担体がまた、細網内皮系（ＲＥＳ）に取り込まれるので、肝臓及び脾臓への観察可能なシリカソーム取り込みについて注釈することは重要である（肺、心臓、及び腎臓への効果はほとんど認められない）。興味深いことに、ＩＶＩＳイメージングは、ＲＥＳ臓器へのコンジュゲートした担体の生体内分布の増加の可能性を示した（図２２Ａ）。これは、ＩＣＰ−ＯＥＳの実行中の肝臓及び脾臓におけるＳｉ含有率の上昇によって確認された（図３０）。本発明者らは、この観察を正確に説明することができないが、ペプチドコンジュゲーションは直接的または間接的に、粒子オプソニン化、及びＮＲＰ−１とは無関係な、スカベンジャー受容体による取り込みの増加をもたらすことが可能である（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（２００８）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．５（４）：４９６−５０４）。
【０４１５】
ｉＲＧＤ同時投与は、シリカソームによるイリノテカン送達の有効性を増強する
Ｉｒ−シリカソームでのＰＤＡＣ処置におけるｉＲＧＤ同時投与の治療効果の可能性を実証するために、有効性実験を同じ同所腫瘍モデルにおいて行った。動物に、Ｉｒ−シリカソームのＩＶ注射を４０ｍｇ／ｋｇの薬物用量（８０ｍｇ／ｋｇの担体用量に同等）で、ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの同時投与を伴って、または伴わずに投与した。処置を、２×１０６ＫＰＣ−ｌｕｃ細胞の同所実施から１３日後に開始したが（図２３Ａ）、その時点で、原発性腫瘍のサイズは、マクロ転移の非存在下で約３〜５ｍｍであった（上記、及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５を参照されたい）。注射を、３日ごとに合計４回の投与で繰り返した（図２３Ａ）。対照群は、ＩＶ  ＰＢＳ、Ｉｒ−シリカソームのみ（同じ用量）、または遊離ｉＲＧＤのみ（同じ用量）を与えられた動物からなった。カプラン−マイヤープロットを使用して動物生存率を表し（同書）、動物検死を使用して局所腫瘍拡散及び転移の存在を評価した。多数の転移病巣を、食塩水または遊離ｉＲＧＤペプチドで処置された動物の脾臓、小腸、胃、肝臓、及び腎臓で見ることができた（図２３Ｂ）。Ｉｒ−シリカソームは、腫瘍量及び転移の数を有意に減少させたが、ｉＲＧＤ同時投与は、原発性腫瘍の縮小、さらには肝臓、胃及び小腸への拡散の阻害をさらに増強した（図２３Ｂ）。図２３Ｃのヒートマップは、転移疾患に対する、同時投与されたペプチドの影響の定量的表示を示している。ログランク検定（ＳＰＳＳ  １９．０ソフトウェア、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）も、ＰＢＳ群と比較して、ｉＲＧＤペプチドの同時投与中の５７．１％と比較した場合、Ｉｒ−シリカソームのみでの処置は生存を２８．６％改善したことを実証した（図２３Ｄ）；この相違は、統計的に有意である（ｐ＝０．０２７）。本発明者らはまた、２４時間目に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定されたとおり、ｉＲＧＤ（８μｍｏｌ／ｋｇ）ＩＶの単回投与をＩｒ−シリカソーム（薬物４０ｍｇ／ｋｇ）と一緒に与えられた動物では、イリノテカンの腫瘍内含有率の著しい（約２倍）増加が存在することを確認した（図２３Ｅ）。
【０４１６】
ｉＲＧＤ媒介シリカソーム取り込みは、腫瘍血管系でのＮＲＰ−１発現を必要とする
薬物取り込みを媒介する際のｉＲＧＤの作用機序は、がん血管上に優先的に発現されるαｖβ３またはαｖβ５インテグリンへのホーミングに依存している（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ａｎｄ  Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８２６）：４９１−４９７；Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（２０００）Ｃｅｌｌ，１００（１）：５７−７０）。インテグリンへの循環ペプチドの結合には、ペプチドのＣ末端の切断及び放出が続き、これが、ＮＲＰ−１との相互作用を媒介する（これは、Ｃ末端則としても公知）。ＮＲＰ−１結合は、薬物及びナノ粒子の輸送を援助し得る小胞の系の起動をもたらす（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６（６）：５１０−５２０；Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４９０４）。ＫＰＣ腫瘍部位でのＮＲＰ−１の発現を決定するために、ＩＨＣ染色を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗ＮＲＰ−１によって行ったが、内皮細胞及び核は、それぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識抗ＣＤ３１及びＤＡＰＩでの染色によって位置限定した。蛍光顕微鏡法及びＩｍａｇｅ  Ｊ分析を、ＣＤ３１とのＮＲＰ−１の重複％を決定するために行った；これは、９４．２％の同時局在を実証した（図２４Ｂ）。同所腫瘍部位でのシリカソーム取り込みにおけるＮＲＰ−１の役割を確かめるために、腫瘍担持マウスに、ＮＲＰ−１のｂ１ｂ２ドメインに対するアンタゴニスト抗体を予め注射した（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６（６）：５１０−５２０；Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２８（５９８１）：１０３１−１０３５）。ｉＲＧＤ及びＮＩＲ標識シリカソームのその後の投与は、遮断抗体で処置されなかった動物と比較して、担体取り込みの決定的な減少を実証した（図２４Ｃ）。同じ干渉が、対照ＩｇＧでは見られなかった（図２４Ｃ）。これらのデータによって、ｉＲＧＤ媒介シリカソーム取り込みにおけるＮＲＰ−１の役割が確認される。
【０４１７】
ＫＰＣがん部位でのトランスサイトーシス小胞による、シリカソームの輸送の超微細構造の実証
ＮＲＰ−１へのｉＲＧＤのＣ末端の結合が、がんへの栄養素送達のために重要な新規の小胞輸送機構に関係するバルクトランスサイトーシス経路を開始し得ることが実証されている（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６（６）：５１０−５２０；Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２８（５９８１）：１０３１−１０３５；Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４９０４）。本発明者らの知る限り、このトランスサイトーシス経路が、腫瘍の部位への治療用ナノ担体の輸送中に直接的に可視化されたことはない。視覚的な増強の実証をもたらし得る電子顕微鏡法（ＥＭ）を使用して、ＫＰＣモデルにおいてｉＲＧＤ媒介輸送経路の超微細構造分析を試みた。初めに、本発明者らは、ｉＲＧＤ同時投与を伴う、または伴わないシリカソームのＩＶ注射後にいろいろな間隔で採取された腫瘍部位で撮影されたＴＥＭイメージを比較した（図２５Ａ）。２４時間目に、ｉＲＧＤ同時投与が、内皮細胞を越えて、血管の管腔から半管腔側まで広がる直径１１０〜３７０ｎｍのブドウ状小胞の形成を誘導することが明らかに分かり得た（図２５Ａ、領域「３」及び「４」）。これらの特徴は、Ｄｖｏｒａｋ  ｅｔ．ａｌ（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３（５）：１９８１−１９８６）によって記載された小胞−空胞オルガネラ（ｖｅｓｉｃｕｌｏ−ｖａｃｕｏｌａｒ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）またはＶＶＯと類似する。少なくとも１０の該当領域において小胞の数をカウントし、細胞における内部表面積μｍ２当たりの小胞数を表すことによって決定される小胞密度の半定量分析は、ｉＲＧＤが、ペプチド同時投与を与えられていない動物と比較して、小胞密度を約３倍増加させ得ることを実証した（図２５Ａ、左のパネル）。
【０４１８】
可視化システムによってシリカソーム輸送を可視化することを試みる場合に、低電子密度のＭＳＮＰは、不均一で複雑なＰＤＡＣ微細環境において担体の存在を解像することが困難である。この難題に対処するために、シリカソームを、ＴＥＭによって容易に可視化することができる約１０ｎｍのＡｕ−ナノ粒子を含むように合成した（図２１Ａ）（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．９２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．７（７）：６２４４−６２５７）。同所ＫＰＣ腫瘍を発現しているマウスに、ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの非存在または存在下でＡｕ−シリカソーム５０ｍｇ／ｋｇをＩＶ注射した。腫瘍組織を、注射の２４時間後に採取し、ＴＥＭ分析を行うために固定した。１イメージで、ｉＲＧＤ同時投与を受けた動物の（ｉ）血管腔における電子密度の高いシリカソーム、（ｉｉ）内皮細胞における小胞輸送、及び（ｉｉｉ）腫瘍マトリックス中での粒子沈積を示す代表的な電子顕微鏡写真が、図２５Ｂにおいて示されている。イメージのより高い倍率の領域１〜３によって、Ａｕ含有粒子の存在が確認される。ｉＲＧＤ同時投与の間に、アポトーシスを受けている腫瘍細胞中の核周囲分布におけるシリカソームの出現を実証することも可能であった（図２５Ｃ）。この部位は、最も近い腫瘍血管から数百μｍ離れている（図２５Ｃ）。ｉＲＧＤ処置を受けていない動物の腫瘍マトリックスで、より低い粒子密度を観察することが可能であったが、本発明者らは、小胞輸送システムによって運ばれているいずれのシリカソームも位置づけることもできなかったし、静止イメージで進入のための代替機構を特定することもできなかった（図３１）。
【０４１９】
ＮＲＰ−１発現のために表現型が決定された患者由来ＰＤＡＣ腫瘍における、シリカソーム取り込みに対するｉＲＧＤ同時投与の示差的影響
ＮＲＰ−１経路が、ＫＰＣ腫瘍モデルにおいてｉＲＧＤに機能的に関連し得ることは明らかであるが、本発明者らは、そのペプチドがＮＯＤ  ＳＣＩＤ  ＩＬ２αノックアウト（ＮＳＧ）マウスにおいて成長させた患者由来異種移植片においてシリカソーム取り込みに影響を及ぼし得るかどうかを確認することに興味を持った（Ｒｕｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１７２（１）：２９−３９）。本発明者らの１人（ＴＤ）が、ＮＳＧマウスにおいて２３のヒトＰＤＡＣ腫瘍からなるリポジトリを確立している；これらの腫瘍サンプルは、ホイップル外科手術中に患者から得た。転移性腫瘍組織を、ＰＤＡＣの特徴である間質存在度ならびに発癌遺伝子及びシグナル伝達経路成分の発現を含めて、対応するヒトＰＤＡＣ腫瘍の特色を示すがんの特徴について表現型で特徴づけれた（同書）。本発明者らは、同等の間質存在度を有するが、ＩＨＣ染色によって決定されるとおり、ＮＲＰ−１発現の密度及び分布において異なる腫瘍の対を選択するために、この表現型情報を使用した。ＮＲＰ−１発現の密度、さらにはＣＤ３１及び細胞核（ＤＡＰＩ）とのその同時局在（図２６Ａ）を比較するために、ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、染色を、ＮＳＧマウスから採取した腫瘍組織で第３または第４腫瘍継代で行った。本発明者らは、同様のコラーゲン密度（三重染色）を示すが、ＮＲＰ−１発現において異なるＸＷＲ＃８及びＸＷＲ＃１８７と呼ばれる２つの患者腫瘍サンプルを特定することができた（図２６Ａ）。したがって、ＸＷＲ＃８は低いＮＲＰ−１存在度によって特徴づけられたが、ＸＷＲ＃１８７は、高いＮＲＰ−１発現レベルを有した（図２６Ａ）。ＸＷＲ＃１８７はまた、ＸＷＲ＃８（約３５％）と比較して、より多いＮＲＰ−１陽性腫瘍血管（約８０％）を示した。皮下異種移植片（ｎ＝３）をＮＳＧマウスの側腹部で確立し、その後、動物に、ＮＩＲ標識シリカソーム（５０ｍｇ／ｋｇ）をｉＲＧＤペプチド（８μｍｏｌ／ｋｇ）の同時投与を伴って、または伴わずにＩＶ注射した。２４時間後に動物をと殺した後に、移植組織のＩＶＩＳイメージングは、ｉＲＧＤを与えられたＸＷＲ＃１８７の腫瘍部位では、ＮＩＲ強度の５０％上昇を示したが；同様の増強は、ＸＷＲ＃８においては見られなかった（図２６Ｂ）。これらのデータは、ＩＣＰ−ＯＥＳを使用して腫瘍組織の元素Ｓｉ含有率を評価することによって確認された（図２６Ｂ）。すべて考慮すると、本発明者らのデータは、ＮＲＰ−１発現の密度及び分布が、インビボで、ヒト腫瘍へのシリカソーム生体内分布の程度を決定することを示している。
【０４２０】
考察
この実施例で、本発明者らは、イリノテカン−シリカソーム担体の有効性が、腫瘍取り込みを増強するために担体に結合させる必要のないコンジュゲートされていないｉＲＧＤペプチドの同時投与によって有意に改善され得ることを実証している。遊離ｉＲＧＤペプチドの同時投与は、同所ＫＰＣ腫瘍部位でのシリカソーム取り込みを３〜４倍増加させ、原発性腫瘍の死滅の増強、さらには転移阻害をもたらした。総じて、これは、動物の生存において、Ｉｒ−シリカソームのみを上回る有意な改善をもたらした。ｉＲＧＤ効果は、初めは腫瘍関連インテグリンとの相互作用、続いて、ペプチド切断及びＮＲＰ−１と結合するＣ末端の放出によって媒介される。ＮＲＰ−１の生理学的役割は、栄養上の目的でトランスサイトーシスを制御することであるが、受容体−遮断抗体の注射後の粒子輸送の減少によって実証されるとおり、小胞系も、ナノ粒子の輸送のために使用され得る。さらに、ＥＭイメージングは、ｉＲＧＤが内皮細胞において、Ａｕ標識シリカソームを血管腔から腫瘍マトリックスへと運ぶことができる群化小胞の出現を誘導し得るという超微細構造の証拠を示した。本発明者らはまた、ＮＲＰ−１が、ＮＳＧマウスに移植されたヒト膵臓腫瘍においてトランスサイトーシス経路を調節するという証拠を得た。腫瘍血管系の上で示差的ＮＲＰ−１発現を有する腫瘍対の選択によって、ｉＲＧＤ処置中の担体取り込み及びイリノテカン送達における差異が実証された。すべて考慮すると、これらのデータは、ｉＲＧＤ同時投与によってイリノテカンシリカソーム担体の有効性を増強するために、ＰＤＡＣ化学療法に対する個人化アプローチを使用することが可能であることを示している。
【０４２１】
ＰＤＡＣにおいてイリノテカン送達を増強するためのトランスサイトーシス経路の有用性は、いくつかの理由で重要である。第１の理由は、腫瘍部位での薬物耐性に、加えて、腫瘍成長及び転移の増強に寄与する異形成間質の表示である（Ｆｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８（１６）：４２６６−４２７６；Ｄｉｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．１７５８８３４０１２４４６００８）。異常な血管透過性が、ナノ粒子管外遊出の理由であり、ＥＰＲ効果と称される概念であることは多くの場合に理解されるが、本発明者らは、膵臓癌間質が血管透過性を積極的に妨害することを知っている（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．７（１１）：１００４８−１００６５；Ｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４（９）：３４６０−３４６５；Ｃａｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（１２）：８１５−８２３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９（４１）：１６６１８−１６６２３）。これは、血管内皮細胞にしっかり付着する周細胞の存在を含む（同書）。したがって、ＥＰＲ効果は、ＰＤＡＣにおいてナノ担体取り込みに寄与し得るが、この輸送、さらには血管漏出を調節する栄養輸送経路及び血管成長因子の寄与の可能性を含めて、他の血管機構が腫瘍部位でのナノ粒子取り込みに寄与し得る可能性を考慮することが重要である（Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｙｌｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．７（１１）：６５３−６６４；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８８（６）：７５９−７６８；Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ６５（１）：２７１−２８４；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（２００８）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．５（４）：４９６−５０４；Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３（５）：１９８１−１９８６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，４（１）：８１−８９）。Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、腫瘍栄養で役割を果たし、腫瘍透過性ｉＲＧＤペプチドにも治療上関係し得るエンドサイトーシス経路を記載した（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４９０４）。加えて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＴＧＦ−β及びセマフォリン３Ａなどの血管成長因子は、腫瘍血管系でαｖβ３及びαｖβ５インテグリンへの結合を可能にするＲＧＤモチーフを表示する（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６（６）：５１０−５２０；Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２８（５９８１）：１０３１−１０３５；Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４９０４）。したがって、タンパク質分解切断及びＣｅｎｄＲモチーフの放出は、成長因子受容体と関連したシグナル伝達経路及び血管透過性の役割に加えて（Ｋｏｌｏｄｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．９０（４）：７５３−７６２；Ｅｌｌｉｓ（２００６）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．５（５）：１０９９−１１０７；Ｇｌｉｎｋａ  ａｎｄ  Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ（２００８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．８４（１）：３０２−３１０）、ＮＲＰ−１媒介トランスサイトーシスを起動させることができる（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４９０４）。その結果、ＮＲＰ−１経路は、ＥＰＲ効果を含む血管漏出と共存し得るが、異なる時間反応速度を示すことが可能である。ＣｅｎｄＲモチーフに対する応答は数分以内に開始し得るが、ＥＰＲ効果は典型的には、ピークまで６〜８時間を要する（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６（６）：５１０−５２０；Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３（３）：３１９−３２８）。
【０４２２】
ｉＲＧＤ同時投与中のシリカソームトランスサイトーシスについての本発明者らのデータは、ＰＤＡＣ処置中の間質−血管障壁を克服する以前の試みを補うものである（Ｆｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８（１６）：４２６６−４２７６；Ｄｉｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．１７５８８３４０１２４４６００８；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．７（１１）：１００４８−１００６５；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．９（４）：３５４０−３５５７）。数種の血管新生薬（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｄｒｕｇ）が、ナノ担体の腫瘍アクセスを改善するために導入されている（Ｄｉｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．１７５８８３４０１２４４６００８；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，４（１）：８１−８９）。これらのうち、ＶＥＧＦは、ナノ粒子取り込みを増強するために、ＰＤＡＣ部位での潅流及び血管漏出の一時的な増加をもたらし得る（Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９３３）：１４５７−１４６１；Ｊａｃｏｂｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｇｕｔ，６２（１）：１１２−１２０）。腫瘍部位での血管透過性を促進する他の薬剤には、ブラジキニン、酸化窒素、アンジオテンシン−変換酵素阻害薬、腫瘍壊死因子α、ヘムオキシゲナーゼ−１、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼが含まれる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，４（１）：８１−８９；Ｅｉｋｅｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（１４）：４７６８−４７７３；Ｓｅｙｎｈａｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７（１９）：９４５５−９４６２；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６３（３）：１３６−１５１；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０３（３）：５３５−５４１；Ｍａｅｄａ（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１０４（７）：７７９−７８９；Ｅｉｋｅｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．９３（１）：８１−８８）。本発明者らはまた、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）経路の小分子阻害薬、ＬＹ３６４９４７を送達するナノ担体の使用は、インビボで内皮細胞への周細胞付着を急速に（＜２時間）逆転させ得ることを実証している（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．７（１１）：１００４８−１００６５）。付随する血管透過性の複数倍の上昇が、腫瘍部位でのゲムシタビン送達リポソームの出現の劇的な上昇をもたらすと実証された（１９）。ＴＧＦ−β経路の標的化によって血管透過性を増強するための他のアプローチも報告されている（Ｃａｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（１２）：８１５−８２３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９（４１）：１６６１８−１６６２３）。最後に、本発明者らの担体が、マウスにおける同所ＰＤＡＣ腫瘍の処置��にアブラキサン及び遊離ゲムシタビンの投与よりも優れ得る限りにおいて（Ｆｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．２（３）：２６０−２６９）、シリカソーム担体は、パクリタキセルとゲムシタビンとの同時送達によって間質の減少を達成することができることは述べるに値する（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．９（４）：３５４０−３５５７）。
【０４２３】
ｉＲＧＤの同時送達がＰＤＡＣ腫瘍部位でのシリカソームの取り込みを増強するという実証に基づき（図２２）、同時投与アプローチによって、ペプチドがナノ担体にコンジュゲートしている別の送達機構の主な限界が克服されるということを強調することが重要である。この差違の説明は、ＮＲＰ−１受容体の利用可能な数に基づく、担体系の輸送容量にある（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２８（５９８１）：１０３１−１０３５；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２０１２）Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２４（２８）：３７４７−３７５６；；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２０１６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１６）３００９４−１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１６．０３．００８）。したがって、コンジュゲートされたシリカソームの輸送は、血管系上の相対的に少なく有限数の標的受容体によって限定されるが、コンジュゲートされていないペプチドを別に注射することは、腫瘍部位での同伴（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）シリカソームの大量移送（より多数で）を起動させる。さらに、フィブロネクチンマトリックスへの培養腫瘍細胞の付着及び遊走に干渉することによって実証されているとおり、遊離ｉＲＧＤは、インテグリン機能の調節によって抗転移活性も有する（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１４（１）：１２０−１２８）。これは、部分的に、本発明者らの試験における腫瘍転移に対するペプチド干渉を説明し得た（図２３Ｂ及び２３Ｃ）。担体合成の経費及び複雑さを増加させるコンジュゲーション機構への依存と比較して、遊離ペプチドの使用はまた、臨床使用のために現実的かつ利用可能である。
【０４２４】
物質及び方法
物質及び実験手順のより詳細な説明を、以下の「補足的物質及び方法」に示す。
【０４２５】
シリカソームの調製
イリノテカン負荷されたシリカソームの合成：
６５ｎｍ  ＭＳＮＰ核を、上記に示したとおりのゾル−ゲル手順を使用して合成した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５も参照されたい）。以前に報告されたとおり、脂質バイオフィルムを使用して、シリカソームを生成した（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．９（４）：３５４０−３５５７；実施例１及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５を参照されたい）。簡単に述べると、ＭＳＮＰ５００ｍｇをＴＥＡ８ＳＯＳ２０ｍＬ（８０ｍＭ溶液）に浸漬し、これを、丸底フラスコの底にコーティングされたＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の混合物５５０ｍｇ（モル比３：２：０．１５）からなる脂質バイオフィルムの上部に添加する（実施例１、及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５を参照されたい）。ＬＢでの粒子コーティングを達成するための音波処理の後に、遊離ＴＥＡ８ＳＯＳを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。ＴＥＡ８ＳＯＳ負荷されたシリカソームを、薬物負荷のために、イリノテカン溶液１０ｍｇ／ｍＬ中で６５℃の水浴内でインキュベートした。３０分後に、氷水浴内でクエンチすることによって、負荷を停止し、続いて、薬物負荷されたシリカソームを遠心分離によって３回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０４２６】
ｉＲＧＤコンジュゲートしたシリカソームの合成：
ｉＲＧＤ−コンジュゲートしたシリカソームを、ＬＢに含まれるＰＥＧ鎖にペプチドを連結させることによって合成した。これは、上記のとおりの脂質のモル比を維持しながら、市販のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミドをＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の代わりに使用することによって達成された。チオール−マレイミド反応を使用し、室温で４時間にわたって実施して、過剰（０．１５ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）のシステイン−修飾ｉＲＧＤペプチドをＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミドにコンジュゲートした（Ｓｕｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１６（６）：５１０−５２０）。粒子を洗浄して、反応しなかったｉＲＧＤを除去した。コンジュゲーション反応の成功を、フルオレセイン（ＦＡＭ）標識ｉＲＧＤペプチドにコンジュゲートした粒子のバッチを調製し、続いて、十分に洗浄することによっても確認した（同書）（図２７、パネルＡ）。
【０４２７】
金の核マーカーを含むシリカソームの合成
１０ｎｍＡｕナノ粒子を、クエン酸塩含有溶液中で合成した（下記の「補足物質及び物質」を参照されたい）。金ナノ粒子核上にＭＳＮＰシェルを成長させるために、クエン酸塩封止された粒子３６ｍＬを、ＣＴＡＣ溶液１２ｍＬ（Ｈ２Ｏ中２５重量％）に急速注入した。粒子を洗浄し、３５０ｒｐｍで撹拌しながら５分間にわたって８５℃でＣＴＡＣ溶液（Ｈ２Ｏ中６．２５重量％）に再懸濁した。この混合物に、１０％（ｗ／ｖ）トリエタノールアミン０．２５６ｍＬを１０分間にわたって添加し、続いて、シリカ前駆体、ＴＥＯＳ０．３２ｍＬを滴下添加した。溶液を３５０ｒｐｍで２０分間にわたって撹拌して、約６５ｎｍの平均サイズを有するＡｕ核／ＭＳＮＰシェル粒子を作成した。粒子を、メタノール中１％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）及び純メタノールで連続洗浄することによって精製した。次いで、Ａｕ標識ＭＳＮＰを、前記したとおりにＬＢでコーティングした。
【０４２８】
ｉＲＧＤ同時投与を伴って、または伴わずにＩＶ注射されたシリカソームの生体内分布試験
ＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）イメージングを使用して、ＫＰＣ由来同所モデルにおいて（ｎ＝３マウス／群）においてＮＩＲ標識シリカソームの生体内分布を試験した（実施例１、及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５を参照されたい）。動物に、ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの同時投与を伴って、または伴わずに、５０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲートされた、及びコンジュゲートされていないシリカソームをＩＶ注射した。動物を２４時間後にと殺し、続いて、切除した腫瘍及び主要臓器をエクスビボでイメージングした。腫瘍生体内分布を、ＩＣＰ−ＯＥＳプロトコルを使用してＳｉ含有率を評価することによっても確認した（同書）。
【０４２９】
ＫＰＣ由来同所腫瘍モデルにおける、ｉＲＧＤ同時投与によるＩｒ−シリカソーム有効性の評価
腫瘍担持Ｂ６／１２９マウスを、それぞれ６匹の動物を含む４つの群に無作為に割り付けた。第１の群には、イリノテカン用量４０ｍｇ／ｋｇ（ＭＳＮＰ８０ｍｇ／ｋｇ）を含有するシリカソームを３日ごとに合計４回の投与でＩＶ注射した。第２群には、同じ用量のＩｒ−シリカソームをｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの同時投与と共に与えた。第３及び第４の群は、ＰＢＳまたはｉＲＧＤのみで処置した。マウスを、自発的な動物死の時点または瀕死状態に近づくまで毎日監視した（実施例１及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．１０（２）：２７０２−２７１５；Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９３３）：１４５７−１４６１を参照されたい）。原発性腫瘍及び転移部位の生物発光イメージングを、と殺の１０分前に動物にＤ−ルシフェリン７５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射することによって行った。腫瘍組織及び主要臓器（ＧＩ管、肝臓、脾臓、心臓、肺及び腎臓）を、生物発光イメージ強度の定量評価のために採取した。
【０４３０】
ＴＥＭ検査によるトランスサイトーシス経路の超微細構造分析
ＫＰＣ同所腫瘍マウスを、ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇの同時投与を伴って、または伴わずに、Ａｕ封入されたシリカソーム５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射によって処置した。腫瘍生検材料を２４時間後に収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、ただちに４℃で２．５％グルタルアルデヒドで固定した。さらなるサンプル調製及び切り出しは、ＵＣＬＡの電子顕微鏡検査サービスセンター（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって行われた。１％ＯｓＯ４中で固定した後に、サンプルを酸化プロピレン中で脱水し、樹脂中に包埋した。６０〜８０ｎｍ厚の組織切片を銅製のグリッド上に置き、ＪＥＯＬ１２００−ＥＸ電子顕微鏡下で検査した。
【０４３１】
患者由来ＰＤＡＣ腫瘍におけるシリカソーム生体内分布
施設内のヒト対象の許可により、ホイップル外科手術を受けた患者から２３のＰＤＡＣサンプルのリポジトリを収集し、Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｄｏｎａｈｕｅ博士の研究室でＮＳＧマウスにおいて異種移植片を確立するために使用した。表現型決定データ及びＮＲＰ−１発現についてのＩＨＣ染色の実施を利用して、２つの患者サンプル（ＸＷＲ＃８及び＃１８７）を、６週齢の雌のＮＳＧマウスの側腹部で新鮮な皮下異種移植片を成長させるために収集した（Ｒｕｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１７２（１）：２９−３９）。腫瘍サイズが約０．８ｃｍの直径まで成長したときに、上記の手順と同様に、ｉＲＧＤ同時投与を伴って、または伴わずにシリカソームを与えられた各群の３匹の動物を、腫瘍部位への生体内分布を評価するために使用した。動物を、エクスビボイメージングの実行のために２４時間後にと殺して、ＮＩＲ標識シリカソームの取り込みを決定した。イメージングデータを、ＩＣＰ−ＯＥＳによって腫瘍部位でのＳｉ含有率を評価することによっても確認した。
【０４３２】
統計的解析
群間の差異の比較分析を、両側スチューデントｔ検定（Ｅｘｃｅｌソフトウェア、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して行った。統計的に有意な差違はｐ＜０．０５と決定された。値は、図の説明文で述べられているとおり、多数回の決定の平均±ＳＤとして表された。生存データを、ＳＰＳＳソフトウェアを使用してログランク検定（マンテル−コックス）によって処理した。
【０４３３】
補足的物質及び方法
物質
テトラエチルオルトシケート（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｏｒｔｈｏｓｉｃａｔｅ；ＴＥＯＳ）、トリエタノールアミン、セチルトリメチルアンモニウムクロリド溶液（ＣＴＡＣ、水中２５重量％）、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、塩化金（ＩＩＩ）水和物、クエン酸三ナトリウム脱水物、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８樹脂、及びセファロースＣＬ−４Ｂは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ．ＵＳＡから購入した。１．２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１．２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）、１．２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ．ＵＳＡから購入した。スクロースオクタスルファート（ＳＯＳ）ナトリウム塩は、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｃａｎａｄａから購入した。塩酸イリノテカン三水和物は、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．ＵＳＡから購入した。ペニシリン、ストレプトマイシン、及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＵＳＡから購入した。ｉＲＧＤ（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ、配列番号１１）は、Ｂｉｏｍａｔｉｋ．ＵＳＡから購入した。システイン残基で修飾された反応性ｉＲＧＤ及び遮断抗ＮＰＲ−１抗体（ＮＲＰ−１の組換えｂ１ｂ２ドメインに対する）は、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ博士の厚意によって提供された。シクロ（−ＲＧＤｆＫ）（配列番号１２）は、ＡｐｅｘＢｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＵＳＡから購入した。抗ＣＤ３１抗体（カタログ＃５５３７０８）は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）．ＵＳＡから購入した。抗ＮＰＲ−１抗体（ａｂ８１３２１）は、Ａｂｃａｍ．ＵＳＡから購入した。対照の正常ヤギＩｇＧ（ｓｃ−２０２８）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＵＳＡから購入した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ａ１１００８）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４コンジュゲートしたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ａ１１００７）及びＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０  ＮＨＳエステルは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．ＵＳＡから購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｍａｔｒｉｘ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ＵＳＡから購入した。すべての薬品をさらに精製せずに、そのまま使用した。
【０４３４】
ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０を使用してのＭＳＮＰのＮＩＲ標識
ＮＩＲ蛍光色素。ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０  ＮＨＳエステルをＭＳＮＰ標識のために使用した。初めに、ＮＨＳエステルのコンジュゲーションのために、ＭＳＮＰ表面をＮＨ２基で官能化した。簡単に述べると、ＭＳＮＰ１０ｍｇをエタノール１ｍＬ中に懸濁させ、ＡＰＴＥＳ１μＬと混合した。反応を、８０℃で終夜撹拌しながら不活性Ｎ２雰囲気下で行った。続いて、混合物を遠心分離し、エタノールで３回洗浄した。ＮＨ２コンジュゲートしたＭＳＮＰをＤＭＦ１ｍＬに懸濁させ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０  ＮＨＳエステル０．０１ｍｇと混合し、室温で２時間にわたって撹拌した。標識されたＭＳＮＰを、エタノール及び脱イオン水で洗浄した。ＮＩＲ標識ＭＳＮＰを使用して、シリカソームを作成した。
【０４３５】
約１０ｎｍ金ナノ粒子の合成
約１０ｎｍの金ナノ粒子を、ＨＡｕＣｌ４５ｍＬ（１０ｍＭ）及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水４５ｍＬを、凝縮器を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに添加することによって作成した。激しく撹拌しながら沸騰温度に達した後に、クエン酸ナトリウム５．８ｍＬ（３８．８ｍＭ）を、沸騰溶液に添加した。これは、淡黄色からバーガンディ色への色変化を伴った。沸騰溶液を１６０℃で１０分間にわたって撹拌し、次いで、加熱せずにさらに１５分間にわたって撹拌した。金粒子を、本原稿の方法セクションにおいて記載したとおり、シリカソームを合成するための核として使用した。
【０４３６】
細胞系
不死化細胞系は、トランスジェニックＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３ＬＳＬ−Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅマウスでの自発腫瘍に由来した。同所移植後の成長腫瘍の生物発光腫瘍イメージングを可能にするために、ＵＣＬＡベクターコア施設（ＵＣＬＡ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、細胞にルシフェラーゼベースのレンチウイルスベクターを永続的にトランスフェクトした。限界希釈プロトコルの使用後に、代表的な細胞クローンを得た。
【０４３７】
ＫＰＣ由来細胞系を使用しての、免疫適格マウスにおける同所腫瘍の調製
すべての動物実験を、ＵＣＬＡ動物実験委員会によって承認されたプロトコルで行った。雌のＢ６／１２９マウス（約８週）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。同所異種移植片を成長させるために、マウスに、イソフルランで麻酔をかけ、続いて、ケタミン５０ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン１０ｍｇ／ｋｇをＩＰ注射した。手術部位を、切開部位の周囲１ｃｍの範囲で剃毛し、ベタダイン及び７０％エタノールで洗うことによって滅菌した。マウスを外科手術のために加温パッドの上に置き、左側腹部の切開部位を、無菌ガーゼで覆った。約０．７ｃｍの外科的切開を行って、注射部位を露出させ、続いて、２７ゲージ針によって、２×１０６ＫＰＣ−ｌｕｃ細胞を含有するＤＭＥＭ／マトリゲル５０μＬ（１：１ｖ／ｖ）を膵臓尾部に注射した。腹膜層を吸収性縫合糸（ＰＤＳ  ＩＩ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）で、かつ皮膚を非吸収性縫合糸（ＰＲＯＬＥＮＥ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉じた。マウスを、麻酔から完全に回復するまで加温パッド上で保持し、次いで、清潔なケージに移した。人工涙軟膏剤を使用して、外科手術中にマウスの目を保護した。
【０４３８】
ｉＲＧＤ効果に干渉するための抗ＮＲＰ−１遮断抗体の使用
ＫＰＣ由来同所腫瘍担持マウスにＮＩＲ標識シリカソーム５０ｍｇ／ｋｇ及び遊離ｉＲＧＤ８μｍｏｌ／ｋｇのＩＶ注射を与える１５分前に、遮断抗ＮＲＰ−１抗体または対照ＩｇＧ５０μｇを注射した。シリカソームのみを与えられた動物を対照として使用した。動物を、注射後２４時間目にと殺し、エクスビボＮＩＲイメージングを、ＮＩＲ標識シリカソームの生体内分布を試験するために使用した。エクスビボイメージングデータを、ＩＶＩＳソフトウェアを使用するＮＩＲ強度分析によって定量化し、ＩＣＰ−ＯＥＳを使用するＳｉ含有率分析を続けた。
【０４３９】
ＨＰＬＣ分析
組織中のイリノテカンのＨＰＬＣ分析のために、採取した腫瘍及び臓器サンプルを秤量し、氷上で均質化した。組織ホモジネート０．１ｍＬを酸性溶液０．４ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸／メタノール、１：４ｖ／ｖ）で抽出した後に、抽出物を１０秒間にわたって２回ボルテックス処理し、１３，０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離した。Ｋｎａｕｅｒ  Ｓｍａｒｔｌｉｎｅニューマティクポンプ、Ｃ１８カラム、Ｋ−２６００分光光度計、及びＧｉｎａデータ収集ソフトウェアを含む系でＨＰＬＣ分析するために、イリノテカン含有上清を０．２２μｍフィルターで濾過した。１．０ｍＬ／分の流速で送達される移動相は、３％酢酸トリエチルアンモニウム水性緩衝液（ｐＨ５．５）及びアセトニトリル（７３：２７ｖ／ｖ）を含んだ。２０マイクロリットルのイリノテカン含有サンプルを注射して、２５４ｎｍでの薬物吸収を測定したが、典型的には約４．４分に溶離された。イリノテカン標準曲線を０．０５〜１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で作成した。
【０４４０】
免疫蛍光染色
二重色免疫蛍光染色を使用して、ＫＰＣ腫瘍組織におけるＮＰＲ−１陽性血管を決定した。腫瘍組織を、ＯＣＴ試薬を使用して低温包埋し、腫瘍切片を調製するために使用した。切片を初めに、抗ＮＲＰ１モノクローナル抗体（１：２５０）で４℃で終夜処理した。一次抗体を除去し、ＰＢＳ中で３回洗浄した後に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体（１：５００）を添加し、１時間にわたって室温でインキュベートした。同じ切片を抗ＣＤ３１抗体でも染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−コンジュゲートした二次抗体処置を続けて、ＣＤ３１発現を同定した。ＤＡＰＩを使用して、細胞核を位置限定した。染色した切片を蛍光顕微鏡（Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｄ１、Ｚｅｉｓｓ）下で検査した。ＮＲＰ−１＋／ＣＤ３１＋血管の同時局在比を、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｊ  ソフトウェアによって決定した。
【０４４１】
実施例４
プロトセルとシリカソームとの比較分析
脂質二重層コーティングされたナノ粒子の調製に向けた１つのアプローチは、エアロゾル補助された自己集合法によって合成されたＭＳＮＰの使用を含む。ＭＳＮＰを、静電荷電リポソームの使用によってコーティングしたが、これは順に、負の電荷をもつＭＳＮＰ表面と付着し、それを壊し、次いで、それと融合する（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｍ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１：７５６７−７５６９を参照されたい）。Ｓａｎｄｉａ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  ＭｅｘｉｃｏのＢｒｉｎｋｅｒ博士のグループによって開発されたこの生成物は、「プロトセル」と呼ばれ、標題：「がん細胞に多成分カーゴを標的送達するためのプロトセル及びその使用（Ｐｒｏｔｏｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｃａｒｇｏｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）」で米国特許（米国特許第８，９９２，９８４Ｂ１号）を与えられた。その特許は特に、「プロトセルは、カーゴ成分及び多孔性粒子をリポソームまたは脂質と混合し、続いて、多孔性粒子上で脂質二重層を融合させ、カーゴ成分を多孔性粒子の１つまたは複数の空孔中に相乗的に負荷してプロトセル化合物を形成することによって形成することができる」ことを教示している。米国特許第８，９９２，９８４号の図１Ｃに示されているプロトセルの例は、「正の電荷をもつ多孔性粒子は、ＤＯＰＳ脂質二重層などの負の電荷をもつ脂質二重層と融合することができ、その際、その正の電荷をもつ多孔性粒子は、負の電荷をもつカーゴ成分（例えば、カルセインまたはＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ）を吸収することができる［正の電荷をもつ多孔性粒子］」を示している。
【０４４２】
本明細書に記載の方法及びシリカソームを開発する際に、本発明者らは、このアプローチを、いくつかの理由によって予測不可能で、かつ可能化されないとみなしたので、プロトセルで使用される手順及び成分を積極的に回避した。本発明者らは米国特許第８，９９２，９８４号に記載のリポソーム融合方法を使用して均一なＭＳＮＰコーティングを達成することができなかっただけでなく、数多くの試みで、有意な薬物負荷も達成することができなかった。このことが、本発明者らを、本明細書に記載のバイオフィルム技術、音波処理手順、及び負荷方法を開発して、プロトセルとは異なる脂質組成物からなるＬＢでの均一な粒子コーティングのための再現可能な手順を得るように促した。
【０４４３】
図３２は、「プロトセル」を生成するための本発明者らの試みの間に作成されたデータを示しており、これは、Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍａｔ．，１０：３８９−３９７によって記載されたプロトセルと同等である。簡単に述べると、２５ｍｇ／ｍＬ  ＭＳＮＰ１００μＬをリポソーム１００μＬに２．５ｍｇ／ｍＬで添加し、Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．刊行物（同書）に記載の連続ステップを続けた。最終生成物が上のパネルに示されている。この生成物を、流体力学的サイズ、サイズ分布及びコロイド安定性の評価に掛けた。左側の差し込み写真は、「コーティングされた」生成物の相分離を示しており、中央のＤＬＳパネルは、コーティングされていない粒子の小さなピーク及び凝集した粒子塊の大きなピークを示している。右側のＴＥＭイメージによって、プロトセルの粒子凝集及びシリカソームでのコロイド安定性が確認される。プロトセルにコロイド安定性が掛けていることによって、この生成物は、ＩＶ投与によって使用するには失格である。まとめると、プロトセルとは異なり、シリカソームは優れたコロイド安定性、低いＰＤＩ、及び狭いサイズ分布を示す。
【０４４４】
表６は、シリカソームとプロトセル技術との間の様々な差異を示している。
【表６Ａ】
2019501198.tif 000013
【表６Ｂ】
2019501198.tif 000014
【表６Ｃ】
2019501198.tif 000015
【０４４５】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示を目的としたものに過ぎないこと、及びそれらを考慮して様々な変更または変化が当業者に示唆され、それらは、本出願の意図及び趣旨、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれ得ることは理解される。本明細書において引用されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体で参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ−１】
2019501198.tif 000016
【図１Ａ−２】
2019501198.tif 000017
【図１Ｂ】
2019501198.tif 000018
【図１Ｃ】
2019501198.tif 000019
【図１Ｄ】
2019501198.tif 000020
【図１Ｅ】
2019501198.tif 000021
【図２Ａ】
2019501198.tif 000022
【図２Ｂ】
2019501198.tif 000023
【図２Ｃ】
2019501198.tif 000024
【図２Ｄ】
2019501198.tif 000025
【図３Ａ】
2019501198.tif 000026
【図３Ｂ】
2019501198.tif 000027
【図３Ｃ】
2019501198.tif 000028
【図３Ｄ】
2019501198.tif 000029
【図３Ｅ】
2019501198.tif 000030
【図４Ａ】
2019501198.tif 000031
【図４Ｂ】
2019501198.tif 000032
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2019501198.tif 000034
【図４Ｅ】
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【図５】
2019501198.tif 000036
【図６Ａ】
2019501198.tif 000037
【図６Ｂ】
2019501198.tif 000038
【図７】
2019501198.tif 000039
【図８】
2019501198.tif 000040
【図９】
2019501198.tif 000041
【図１０】
2019501198.tif 000042
【図１１】
2019501198.tif 000043
【図１２】
2019501198.tif 000044
【図１３】
2019501198.tif 000045
【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
2019501198.tif 000064
【図２４Ｃ】
2019501198.tif 000065
【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
2019501198.tif 000067
【図２５Ｃ】
2019501198.tif 000068
【図２６Ａ】
2019501198.tif 000069
【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2019501198.tif 000074
【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
2019501198.tif 000077
2019501198.tif 000078
2019501198.tif 000079
2019501198.tif 000080
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