(57)【要約】  目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する真核生物の生産用細胞株を作製するための方法であって、ａ）前記ＰＯＩをコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）を、真核生物宿主細胞の染色体へ外因性ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座内にトランスフェクションにより組み入れて、それにより、組換え宿主細胞のレパートリーをプールとして得るステップ；ｂ）トランスフェクション後１２日以内に前記プールから単一細胞を選択するステップであって、選択することが、少なくとも、前記ＧＯＩの発現または前記発現を示すマーカーによる、ステップ；ならびにｃ）前記選択された単一細胞を単離し、増殖させ、それにより、生産用細胞株を得るステップを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する真核生物の生産用細胞株を作製するための方法であって、
ａ）前記ＰＯＩをコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）を、真核生物宿主細胞の染色体へ外因性ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座内にトランスフェクションにより組み入れて、それにより、組換え宿主細胞のレパートリーをプールとして得ること；
ｂ）トランスフェクション後１２日以内に前記プールから単一細胞を選択すること、ここで選択することは、少なくとも、前記ＧＯＩの発現または前記発現を示すマーカーによる；ならびに
ｃ）前記選択された単一細胞を単離し、増殖させ、それにより、生産用細胞株を得ること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記遺伝子座が、前記遺伝子座を含むベクター、好ましくは、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＨＡＣ、およびコスミドからなる群から選択されるベクターを介して宿主細胞へ組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ベクターが、宿主細胞の染色体へランダムに、または部位特異的組込みにより、組み込まれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
選択マーカー遺伝子が追加として宿主細胞へ組み入れられ、組換え宿主細胞のレパートリーが前記プールにおいて、対応する淘汰圧条件下で維持され、前記選択することが、少なくとも、前記トランスフェクトされたマーカー遺伝子、前記マーカー、または前記マーカーの機能のいずれかによる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記選択マーカー遺伝子が、ＰＯＩと共に選択マーカーを同時発現する、抗生物質抵抗性マーカー遺伝子または代謝機能マーカー遺伝子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
方法のステップａ）が、前記ＧＯＩを前記遺伝子座へ部位特異的組込みにより組み入れることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、哺乳類または鳥類の宿主細胞、好ましくは、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＨｕＮＳ１、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ７９３２、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｖ７９、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、ＳＰ２／０、またはＥＢ６６細胞、それらの任意の誘導体および／または子孫のいずれか一つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子座がマウスＲｏｓａ２６遺伝子座またはその哺乳類の相同体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え宿主細胞のレパートリーが、（ｉ）前記ＧＯＩのコピー数；（ｉｉ）前記ＧＯＩが組み入れられている染色体遺伝子座；（ｉｉｉ）遺伝的安定性；または（ｉｖ）エピジェネティック的安定性のうちの少なくとも１つにおいて異なる宿主細胞を網羅する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択することがさらに、細胞サイズ、細胞質顆粒性、分極率、屈折率、または細胞膜電位のいずれかによる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択することが、好ましくは前方光散乱（ＦＳＣ）および／もしくは側方光散乱（ＳＳＣ）を用いる、光学的フローサイトメトリ方法、またはマイクロ流体システムを利用する、単一細胞ソーティング技術による、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換え宿主細胞のレパートリーが、少なくとも１つの遺伝的特性において異なる、少なくとも１０，０００個の異なるクローンを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
選択される単一細胞が、少なくとも５個のＧＯＩコピー数により特徴づけられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生産用細胞株が、少なくとも０．１ｐｃｄのＰＯＩを産生する比生産性を有し、かつ前記生産用細胞株が６０日未満内に作製される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＯＩが組換えまたは異種性タンパク質、好ましくは、治療用タンパク質、免疫原性タンパク質、診断用タンパク質、または生体触媒のいずれかである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的のタンパク質（protein of interest）（ＰＯＩ）を発現する真核生物の生産用細胞株を作製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用または他の商業用の組換えタンパク質の効率的かつ高収量の生産は、安定で、高度に発現する組換え細胞株を必要とする。バイオリアクターにおいて高力価の所望のタンパク質を発現するように操作された真核細胞は、典型的には、そのような生物製剤の製造過程に使用される。この目的のために、真核細胞株が、所望のタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされる。その後、適切な単一細胞クローンが、同定され、かつ選択されなければならない。このステップは、安定して、確実に高収量の所望のタンパク質を再現性よく発現する能力がある細胞株の生成にとって重要である（Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２、１３９３〜１３９８（２００４））。最適な生産および成長プロファイルを有する細胞株の同定および選択のための現行の方法は、多数のトランスフェクト細胞のスクリーニングを含み、時間がかかり、労力を要する。
【０００３】
現在用いられている方法のほとんどは、目的の遺伝子（gene-of-interest）（ＧＯＩ）を含有する組換えＤＮＡに含まれる追加の遺伝子産物が、トランスフェクトされていない細胞に対してトランスフェクトされた細胞についての選択的優位性、例えば、抗生物質に対する抵抗性、または選択培地において成長する能力を提供する能力を利用する（例えば、Ｚｂｏｒａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３（１６）、１〜１４（２０１５））。Ｚｂｏｒａｙらは、宿主細胞染色体へ安定的に組み込まれる細菌人工染色体ベクターを使用する。クローンのタンパク質生産は、組み込まれたベクターのコピー数に正比例し、淘汰圧なしに１０週間の間、安定したままであった。単一細胞クローンは、限界希釈技術により得られた。Ｂｌａａｓらもまた、哺乳類細胞において組換えタンパク質生産を向上させるための細菌人工染色体を記載する（Ｂｌａａｓら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９、９：３）。この場合もやはり、単一細胞クローンは、希釈技術を用いて確立された。
【０００４】
ＷＯ２０１００６０８４４Ａ１は、オープンクロマチン形成および発現クロマチン構造のための制御エレメントを含有するＲｏｓａ２６遺伝子座を利用する、組換えタンパク質生産用の宿主細胞を操作するために用いられる細菌染色体ベクターを開示する。
【０００５】
抗生物質抵抗性に基づいた選択方法は、一般的に、トランスフェクト細胞に対していかなる間接的毒性も回避するようにむしろ穏やかである抗生物質濃度を用いる。結果として、トランスフェクトされた培養物は、常に全集団の５０％を超える生存率をまだなお維持しながら、トランスフェクション細胞集団のトランスフェクトされていない部分の全てが培養物から除去されるまで、抗生物質の一定の存在下で維持される。
【０００６】
培養の第１週目において、組み込まれていないＤＮＡの一過性発現が、安定細胞株の選択のための長々しいプロトコールの一因となっている。
いくつかのストラテジーにおいて、抗生物質濃度は、選択段階中、徐々に増加される。この選択条件下での培養期間は、著しい資源および時間を用い、一般的には、安定な細胞のプールの生成までトランスフェクションから約１ヶ月、かかる。さらに、長期間にわたる淘汰圧は、さらなる染色体変化または宿主細胞の発現パターンの変化の確率、および細胞ストレスを増加させる。
【０００７】
いったん安定なプールが生成されたならば、単一クローンを単離するために限界希釈が設定される。細胞は、増殖することができる単一細胞から始まるように、希釈され、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートに播種される。この技術の主な不都合は、最良のプロデューサーではない可能性がある、ある特定のクローンが、より速く分裂することができ、結果として、最良のプロデューサーが希釈されて培養物から除去されることである。したがって、限界希釈により「高プロデューサー」クローンを単離することは、選択されたプールにおいて最良のプロデューサーを同定するための、確立された検出方法、加えて、多数のクローンの退屈かつ慎重なスクリーニングを必要とする。
【０００８】
緑色蛍光タンパク質およびそれから開発された他の蛍光タンパク質の導入により、所望の組換えタンパク質の蛍光タンパク質との同時発現に基づいたトランスフェクト細胞の同定が可能になった。特に、フローサイトメトリ方法（例えば、ＦＡＣＳ）は、蛍光性共マーカー、例えば、ＧＦＰの選択、または宿主細胞の細胞膜上のマーカータンパク質を検出する蛍光標識での細胞の染色を含む、トランスフェクト細胞の異種性集団からの生産用クローンの迅速な同定および単離を利用している。このアプローチの欠点は、所望のタンパク質の発現が、実際、蛍光マーカーの高発現により損なわれ得、それゆえに、所望のタンパク質の最終的な収量が低下し得ることである。さらに、選択は、主として、所望のタンパク質の高発現と常に相関するとは限らない高レベルの蛍光マーカーに基づいている。
【０００９】
ＤｅＭａｒｉａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２００７、２３、４６５〜４７２）は、宿主細胞においてレポータータンパク質として通常は発現しない細胞表面タンパク質の発現を用いるフローサイトメトリに基づいた選択方法を記載する。レポータータンパク質および目的のタンパク質をコードする遺伝子は、ＩＲＥＳによって連結され、同じｍＲＮＡにおけるそれらの転写を可能にし、レポータータンパク質の発現は、蛍光標識抗体で検出される。
【００１０】
直接的かまたは間接的かのいずれかで標識されるレポーター遺伝子を用いることの代替のアプローチとして、所望のタンパク質の検出に基づいた方法が開発されている。例えば、ＵＳ２０１３００９２５９は、細胞膜上の所望のタンパク質の直接的標識を通して高生産用クローンを選択する、単一細胞ソーティングのためのＦＡＣＳアプローチを記載する。それの蛍光強度に基づいたクローンの選択後、選択されたクローンの遺伝的安定性、および所望のタンパク質を数世代にわたって再現性よく生産する能力を確認するためにさらなるサブクローニングステップが必要とされる。
【００１１】
Ｏｋｕｍｕｒａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２０（３）３４０〜３４６（２０１５））は、フローサイトメトリを利用する高生産性細胞についての濃縮ストラテジーを報告する。この研究において、真核細胞が、モノクローナル抗体についての発現ベクターをトランスフェクトされ、多様なモノクローナル抗体発現レベルをもつ細胞のプールを生じた。このプールにおける細胞は、分泌中の細胞表面に存在するｍＡｂと結合する蛍光標識抗体で染色され、前方光散乱（ＦＳＣ）および側方光散乱（ＳＳＣ）に基づいた細胞サイズおよび細胞内密度ゲートを設定する、フローサイトメトリによりソートされ、それにより、それらのＦＳＣおよびＳＳＣゲートに基づいて細胞画分を事前選択する。その後、これらの事前選択された細胞画分は、蛍光標識に基づいたさらなるフローサイトメトリ分析によりソートされた。
【００１２】
ＦＳＣおよびＳＳＣゲーティングはまた、蛍光強度に基づいてさらにスクリーニングされ、かつソートされる生細胞を選択するためにＳｈｉらによって利用された（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（５５）、ｅ３０１０：１〜５）。
【００１３】
マイクロ流体システムにおける標識を含まない細胞分離およびソーティングは、Ｇｏｓｓｅｔｔら（Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１０、３９７：３２４９〜３２６７）により記載されている。
【００１４】
ＷＯ２０１０１２８０３２Ａ１は、セラミド輸送タンパク質（ＣＥＲＴ）の変異体、すなわち、ＣＥＲＴ  Ｓ１３２Ａを過剰発現して、それの分泌能力を増強するためのある特定の発現カセットを含むベクター構築物を含むＣＨＯ細胞株を開示する。細胞株は、単一細胞ソーティングによりＣＥＲＴ発現の増加したレベルについて選択される。
【００１５】
ＵＳ２０１００２１９１１Ａ１は、ベクター構築物を含む生産用宿主細胞株を開示する。第１のベクター構築物はＤＨＦＲ発現カセットを含み、一方、第２のベクター構築物は、目的の遺伝子、ならびにＤＨＦＲ以外の選択および／または増幅マーカーを含む。
【００１６】
ＥＰ２７００７１３Ａ１は、トリシストロン発現カセットを用いる、真核細胞におけるタンパク質発現のためのスクリーニングおよび濃縮系を開示する。高レベルの目的のタンパク質を発現する細胞が、レポータータンパク質によって、スクリーニングされ、ソートされ、および／または濃縮される。
【００１７】
ＷＯ２０１５０９２７３５Ａ１は、目的のタンパク質を発現する真核細胞であって、内因性遺伝子Ｃ１２ｏｒｆ３５の発現産物の効果が前記細胞において損なわれる、真核細胞を開示する。
【００１８】
ＷＯ２０１２０８５９１１Ａ１は、膜結合型レポーター分子および細胞ソーティングにおけるそれらの使用を開示する。
ＷＯ２００８１４５１３３Ａ２は、組換えポリクローナルタンパク質組成物を製造するための方法であって、変異核酸配列のコレクションをトランスフェクトされた細胞のコレクションが、ポリクローナルタンパク質の発現のためにトランスフェクトされ、かつさらに培養される、方法を開示する。
【００１９】
フローサイトメトリを用いる現行の方法は、遺伝子増幅および／または安定な細胞のプールの生成のためにトランスフェクション後数週間、必要とし、その後、その安定な細胞のプールをスクリーニングすることができる。加えて、選択されたクローンは、安定な高収量生産のための最も適切なクローンを最終的に同定するために、再クローニングされ、さらに培養される必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ＰＯＩを高収量で生産する能力がある安定な生産用細胞株の最初の細胞としての資格がある単一細胞を生成し、同定し、および選択するための単純かつ速い方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
その目的は、主張されているような内容により解決される。
本発明により、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する真核生物の生産用細胞株を作製するための方法であって、
ａ）前記ＰＯＩをコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）を、真核生物宿主細胞の染色体へ外因性ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座内にトランスフェクションにより組み入れて、それにより、組換え宿主細胞のレパートリーをプールとして得ること；
ｂ）トランスフェクション後１２日以内に前記プールから単一細胞を選択すること、ここで選択することは、少なくとも、前記ＧＯＩの発現または前記発現を示すマーカーによる；ならびに
ｃ）前記選択された単一細胞を単離し、増殖させ、それにより、生産用細胞株を得ること
を含む、前記方法が提供される。
【００２２】
具体的には、選択マーカー遺伝子が、追加として、宿主細胞へ組み入れられ、組換え宿主細胞のレパートリーが、対応する淘汰圧条件下で前記プールにおいて維持され、前記選択することが、少なくとも、トランスフェクトされたマーカー遺伝子、そのマーカー、または前記マーカーの機能のいずれかによる。特定の実施形態によれば、プールは、単一細胞ソーティング前の短い時間の間だけ、例えば、トランスフェクション後１２日間以下、好ましくは、１１日間以下、１０日間以下、９日間以下、８日間以下、７日間以下、６日間以下、５日間以下、３日間以下、２日間以下、１日間以下のいずれかの間、前記淘汰圧下の格納容器内に保持される。
【００２３】
選択マーカーは、具体的には、ロバストな細胞と非ロバストな、または死んだ細胞の区別を可能にする対応する選択条件（本明細書では、「淘汰圧」または「選択圧」とも呼ばれる）下で維持または培養される時、生存および／または成長の優位性を有する細胞を提供する。いかなる事前選択もなしに、プールから直接、選択ステップｂ）を用いることは特に好ましい。したがって、レパートリーは、淘汰圧下でのプレスクリーニングなしに、単一細胞ソーティングを直接、受けることができる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ステップｂ）の後すぐに、いかなるさらなる限界希釈ステップもなしに、本明細書に記載された方法のステップｃ）による選択された単一細胞を単離し、増殖させることが続く。いくつかの実施形態において、ステップａ）の後すぐに、好ましくは、ステップａ）後最長７日以内、６日以内、５日以内、３日以内、２日以内、または１日以内のいずれかで、本明細書に記載された方法のステップｂ）による単一細胞を選択することが続く。具体的には、ＧＯＩを組み入れるための前記宿主細胞のトランスフェクション後すぐに、少しの細胞分裂もなしに、または第一もしくは第二世代において、または５世代もしくは１０世代もしくは最長１５世代内に、前記単一細胞ソーティングが行われる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法のステップｂ）による単一細胞を選択することは、好ましくは単一ステップ手順において、少なくとも１つの内因性物理的バイオマーカーだけによるソーティングによるものであり、任意で、その後に、生産性に基づいたさらなるソーティングが行われる。
【００２６】
具体的には、本明細書に記載された方法による組換え宿主細胞のレパートリーから単一細胞を選択することは、蛍光標識を用いることなしの、好ましくはいかなる標識も用いることなしの、細胞ソーティングによる。
【００２７】
したがって、好ましい実施形態によれば、生産用クローンは、ＧＯＩを宿主細胞へ安定的に組み込むとすぐに、短い時間枠内で、単一細胞ソーティングを行って、本明細書に記載されているような単一細胞から産生することができる。
【００２８】
具体的には、選択された単一細胞は、さらなる細胞の操作ステップおよび／もしくは最適化ステップならびに／または淘汰圧なしに、直ちに、生産用宿主細胞株へ進展させる状態になっている組換え宿主細胞である。特定の態様によれば、ＧＯＩは、宿主細胞染色体に、好ましくは、発現遺伝子座または発現遺伝子座の少なくとも部分を含む発現構築物（それにより、宿主細胞染色体内に作動可能なユークロマチンタンパク質発現遺伝子座を提供する）内に、安定的に組み込まれる。
【００２９】
以下、用語「発現構築物」が用いられ、それは、さらに本明細書で記載されているように、発現カセット、発現遺伝子座、またはベクターのいずれかであり得る。
具体的には、前記外因性ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座が、前記遺伝子座を含むベクター、好ましくは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、またはコスミドのいずれか一つなどの人工染色体ベクターを介して宿主細胞へ組み込まれる。そのようなベクターは、宿主細胞にトランスフェクトするのに適した技術により宿主細胞ゲノムへ組み入れることができる。
【００３０】
具体的には、前記発現構築物は、人工染色体ベクター、好ましくは、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＨＡＣ、またはコスミドのいずれか一つである。具体的には、発現構築物は、環状であるか、または最初に線状化されるかのいずれかであり、その後に、１つまたは複数の線状化された発現カセットの染色体組込みを可能にする宿主細胞のトランスフェクションが行われる。
【００３１】
特定の例によれば、遺伝子座Ｒｏｓａ２６を含むＢＡＣ、Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣ（Ｒｏｓａ２６遺伝子座は、クローンＲＰＣＩ−２４−８５Ｌ１５（ＩＤ：７６０４４８）；ＧＲＣｍ３８．ｐ３  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：Ｃｈｒ．６（ＮＣ＿００００７２．６）：１１２，９５２，７４６−１１３，１５８，５８３；供給源：ＮＣＢＩに対応する；配列番号１）を、具体的には、哺乳類宿主細胞にトランスフェクトし、それにより、組換え宿主細胞、例えば、ＣＨＯなどのハムスター細胞を作製するために、用いられる。さらに好ましいＢＡＣベクターは、例えば、遺伝子座Ｒｐｓ２１を含むＢＡＣ、Ｒｐｓ２１  ＢＡＣ（Ｒｐｓ２１遺伝子座は、クローンＲＰ２３−８８Ｄ１２（ＩＤ：６２７２７０；）に対応する、配列番号２）、遺伝子座Ａｃｔｂを含むＢＡＣ、Ａｃｔｂ  ＢＡＣ（Ａｃｔｂ遺伝子座は、クローンＲＰ２３−５Ｊ１４（ＩＤ：６０１７３８；）に対応する、配列番号３）、および遺伝子座Ｈｐｒｔを含むＢＡＣ、Ｈｐｒｔ  ＢＡＣ（Ｈｐｒｔ遺伝子座は、クローンＲＰ２３−４１２Ｊ１６（ＩＤ：７３２１２１；）に対応する、配列番号４）である（ＢＡＣ−ＰＡＣ供給源：Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＨＯＲＩ））。
【００３２】
いくつかの実施形態において、前記ベクターは、宿主細胞の染色体へランダムに、または部位特異的組込みにより、組み込まれる。具体的には、前記ＧＯＩは、ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座へランダムに、または部位特異的組込みにより、組み入れられる。具体的には、ＧＯＩは、作動可能な発現カセット内の遺伝子座へ組み入れられる。
【００３３】
具体的には、本明細書に記載された方法により宿主細胞の染色体へランダムに組み入れられる人工染色体ベクターである発現構築物を用いることができる。いくつかの実施形態において、前記発現構築物は、部位特異的組込み（例えば、相同組換え、または、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いる、部位特異的遺伝子座への標的化遺伝子組込み）により宿主細胞の染色体へ組み入れられる人工染色体である。いくつかの実施形態において、発現構築物は、部位特異的組込み（例えば、相同組換え、または、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いる、部位特異的遺伝子座への標的化遺伝子組込み）により宿主細胞の染色体へ安定的に組み入れられるプラスミドである。
【００３４】
特定の実施形態によれば、ＧＯＩの１つまたは複数のコピー、好ましくは、ＧＯＩの少なくとも５コピーもしくは５コピーより多く、または少なくとも１０コピー、または少なくとも１５コピー、または少なくとも２０コピーを宿主細胞染色体へ組み入れられる。これは、例えば、宿主細胞トランスフェクションに用いられるＧＯＩ  ＤＮＡの選択された量により達成することができる。特定の実施形態によれば、選択された単一細胞は、ＧＯＩの少なくとも５コピーもしくは５コピーより多く、または少なくとも１０コピー、または少なくとも１５コピー、または少なくとも２０コピーのＧＯＩコピー数により特徴づけられる。
【００３５】
特定の実施形態によれば、前記発現構築物は、ＧＯＩの１つまたは複数のコピーを含み、宿主細胞にトランスフェクトするために用いられ、それにより、ＧＯＩそれぞれの１つまたは複数のコピーを含む１つまたは複数のユークロマチンタンパク質発現遺伝子座を宿主細胞の染色体内に組み入れ、または確立する。
【００３６】
さらなる特定の実施形態によれば、前記発現構築物を用いて、まず、ＧＯＩなしで宿主細胞にトランスフェクトし、それにより、宿主細胞の染色体内に１つまたは複数のユークロマチンタンパク質発現遺伝子座を組み入れ、または確立することにより宿主細胞を調製することができる。第２のステップにおいて、ＧＯＩの１つまたは複数のコピーを、宿主細胞染色体のユークロマチンタンパク質発現遺伝子座へ組み入れることができる。
【００３７】
具体的には、前記遺伝子座は、宿主細胞にとって外因性および異種性である。
特定の態様によれば、ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座のオープンクロマチン構造により特徴づけられる任意の外因性遺伝子座が用いられ得る。そのような遺伝子座は、典型的には、発現遺伝子座として構成的に活性があると理解されており、例えば、Ｒｏｓａ２６、Ｒｐｓ２１、Ａｃｔｂ、もしくはＨｐｒｔのいずれか、またはハウスキーピング遺伝子のいずれかの遺伝子座であり、宿主細胞にとって異種性または外来性である。
【００３８】
さらなる特定の態様によれば、ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座のオープンクロマチン構造により特徴づけられる任意の外因性遺伝子座が用いられ得る。外因性遺伝子座（異種性と呼ばれることもある）は、典型的には、しかし、必ずしもではないが、人工的、または宿主細胞染色体内に天然では存在せず、具体的には、異なる細胞型または種からなど、宿主細胞以外の供給源から得られる。しかしそれでも、遺伝子座と宿主細胞の両方が、哺乳類または鳥類の起源であることが特に好ましい。
【００３９】
発現構築物の１つまたは複数、好ましくは、発現構築物の少なくとも１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー、もしくは１０コピー、またはさらに１０コピーより多く、具体的には、少なくとも１５コピー、２０コピー、２５コピー、３０コピー、３５コピー、４０コピー、４５コピー、５０コピー、またはさらに少なくとも６０コピー、７０コピー、８０コピー、９０コピー、もしくは１００コピーが、染色体へ組み込まれ得る。発現構築物は、例えば宿主細胞の環状または線状化発現構築物でのトランスフェクション後、１つまたは複数の染色体遺伝子座で組み込まれ得る。
【００４０】
有害な隣接クロマチン効果を遮蔽するのに十分なＤＮＡエレメントを有する細菌人工染色体ベクターおよび他のベクターが、宿主細胞染色体内の任意の場所に組み込まれ、ベクターにコードされた遺伝子の発現を援助することができる。いくつかの実施形態において、その組込みは、宿主細胞によって大量に発現する遺伝子の染色体遺伝子座においてであり得る。
【００４１】
組換え宿主細胞のレパートリーは、具体的には、発現構築物の宿主細胞染色体への安定的組込みにより特徴づけられるクローンのプールを含有する。高プロデューサー細胞株の事前の増殖および／または濃縮なしに、組入れステップ後すぐに、選択ステップが続き得る。いくつかの実施形態において、ステップａ）後すぐに、好ましくは、本明細書に記載された方法の方法ステップａ）またはトランスフェクション後最長、１２日以内、１１日以内、１０日以内、９日以内、８日以内、７日以内、６日以内、５日以内、３日以内、２日以内、または１日以内のいずれかで、本明細書に記載された方法のステップｂ）による単一細胞の選択が行われる。
【００４２】
特定の実施形態によれば、例えば、非機能的クローン、例えば、選択圧を生き残れない非機能的クローン、または発現構築物の染色体組入れが成功しなかった場合の非機能的クローンを枯渇させるために、事前選択が実施され得る（例えば、障害性または死んだ細胞を除去すること、ネガティブ選択）。（単一細胞選択の前の）プールからの細胞の任意の事前選択は、好ましくは、ステップａ）によるトランスフェクション後、または単一細胞ソーティングの前またはその最中であるが、トランスフェクション後に単一細胞を選択するまでの時間を延ばすことなく、例えば、トランスフェクションから１２日以内に、行われる。
【００４３】
さらなる特定の実施形態によれば、さらなる選択ステップは、例えば、発現構築物の高コピー数および／またはＧＯＩの高コピー数により特徴づけられるそれらのクローンを濃縮するために、実施され得る（例えば、選択マーカーの発現により、またはＰＯＩ産生の収量により選択すること、ポジティブ選択）。そのような選択は、好ましくは、単一細胞ソーティング後、行われる。トランスフェクトされたクローンはまた、発現構築物またはＧＯＩの高コピー数を含有するクローンについて濃縮して、高プロデューサーを含む可能性が高い、クローンのポジティブ選択された画分を生じることができる。したがって、ＰＯＩ発現の高生産性の潜在能力を有する単一細胞を選択する見込みは、そのような濃縮により増加し得る。任意で、その方法は、例えば、生存率濃縮ステップ、クロマトグラフィ濃縮ステップ、またはアッセイ濃縮ステップを含む、細胞集団の選択または濃縮のさらなるステップを含み得る。
【００４４】
具体的には、本明細書に記載されているような方法は、ＰＯＩとの選択マーカーの同時発現のために、選択マーカー遺伝子を組み入れること、例えば、選択マーカー遺伝子をさらに含む発現構築物を利用することをさらに含む。選択マーカーは、例えば、マーカー遺伝子を含む発現構築物を組み入れているクローンの選択を可能にするために、発現構築物へ操作され得る。あるいは、選択マーカーは、不活性遺伝子としてのみ、発現構築物および／または宿主細胞染色体へ組み入れられ得、染色体組込みの成功で活性かつ検出可能になる。したがって、選択マーカーは、組換え宿主細胞のレパートリーにおける遺伝子の移入の成功を示す定性的読み取りとして用いることができる。
【００４５】
特定の態様によれば、選択マーカーの１つまたは複数のコピーが、ＧＯＩと共に、かつその近くに、宿主細胞染色体へ組み込むことができる。具体的には、選択マーカー遺伝子の数および発現した選択マーカーのレベルが、組換え宿主細胞の生産性を示し得る。したがって、選択マーカーは、ＰＯＩ発現の定量的指標として用いられ得る。特に、選択マーカーは、成功裏に組み込まれた、および／または機能的なコピー数の発現構築物および／またはＧＯＩを示し得る。特定の態様によれば、選択マーカー遺伝子は、ＧＯＩと作動可能に連結され、それにより、発現したＰＯＩのレベルを示す発現した選択マーカーのレベルが得られる。いくつかの実施形態において、ＧＯＩの遺伝子コピー数は、ＰＯＩについての比生産性と直接、相関し、選択マーカー遺伝子は、発現ベクターにおいてＧＯＩと共に一定比率で組み込まれる。いくつかの実施形態において、選択マーカー遺伝子のコピー数、加えて、それの発現レベルおよびその結果としてのそれの活性は、ＰＯＩ発現レベルと直接、相関する。
【００４６】
事前選択は、一般的に、マーカーを直接的に、または間接的手段により、検出することで実施される。ポジティブ事前選択方法、例えば、生存能または抵抗性マーカーの存在の事前選択方法はまた、維持または培養ステップを含んでもよく、そのステップにおいて、組換え宿主細胞のレパートリーが、選択圧下、例えば、ロバストなクローン、または発現構築物の安定な組込みにより特徴づけられ、および任意で、組み込まれた発現構築物のコピー数またはＧＯＩのコピー数を反映するクローンの生存に有利に働く条件下で、適切な培地で維持または培養され得る。いくつかの実施形態において、細胞のレパートリーは、１つまたは複数の段階においてこれらの条件下で、例えば、高い選択圧を以て、例えば、最長１２日間の間、例えば、最長、１２日間、１１日間、１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、３日間、２日間、または１日間のいずれかの間、維持または培養される。あるいは、選択圧が増加する１より多い段階が、例えば、それぞれが、少なくとも１日間、または少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、または９日間、例えば、最長１２日間の間、適用され得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、細胞のレパートリーは、最長でも、７日間以内、６日間以内、５日間以内、３日間以内、２日間以内、または１日間以内のいずれかで、本明細書に記載されているような単一細胞について選択され、特に、特定の培養ステップは行われず、選択は、例えば、トランスフェクション後すぐに、選択圧下にあり、任意で、本明細書にさらに定義されているような選択圧または高選択圧を用いるロバストな細胞の事前選択を利用する。
【００４８】
具体的には、単一細胞を選択する前に、前記組換え細胞のレパートリーは、高い選択的かつストリンジェントな条件下で、成長して、前記ＰＯＩおよび前記選択マーカーを同時発現し、抵抗性（本明細書では、「ロバストな」とも呼ばれる）細胞の画分が事前選択される。
【００４９】
特定の実施形態によれば、前記選択マーカー遺伝子は、選択マーカーをＰＯＩと共に同時発現する、抗生物質抵抗性マーカー遺伝子または代謝機能選択マーカー遺伝子である。
特定の実施形態によれば、
ａ）前記選択マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性マーカー遺伝子または代謝機能選択マーカー遺伝子であり、および
ｂ）単一細胞を選択する前に、前記組換え細胞のレパートリーが、選択的条件または高い選択的条件下で成長して、前記ＰＯＩおよび前記選択マーカーを同時発現し、抵抗性細胞の画分が事前選択される。
【００５０】
具体的には、選択マーカー遺伝子は、
ａ）代謝機能マーカー遺伝子、好ましくは、ＡＤＡ、ＤＨＦＲ、ＧＳ、ヒスチジノールＤ、ＴＫ、ＸＧＰＲＴ、もしくはＣＤＡのいずれかをコードする遺伝子；あるいは
ｂ）抗生物質抵抗性マーカー遺伝子、好ましくは、
ｉ．アミノグリコシド、好ましくは、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ジェネティシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ（フラマイセチン）、シソマイシン、アミカシン、イセパマイシン、もしくはハイグロマイシンＢのいずれか；
ｉｉ．ピューロマイシン；
ｉｉｉ．ブレオマイシン、好ましくは、ブレオマイシン、フレオマイシン、もしくはＺｅｏｃｉｎのいずれか；
ｉｖ．ブラストサイジン；または
ｖ．ミコフェノール酸
のいずれかに対する抵抗性を与える遺伝子
である。
【００５１】
具体的には、選択マーカー遺伝子およびＧＯＩは、両方とも、規定の比率で発現構築物へ組み入れられる。特に、その比率は、例えば、選択マーカー遺伝子、および事前定義された数の１つまたは複数のコピーのＧＯＩの両方を含有する発現カセットまたは発現構築物を操作することにより、事前定義され得る。特定の例によれば、１：１比と呼ばれる、同数の選択マーカー遺伝子およびＧＯＩが、発現カセットまたは発現構築物へ組み入れられる。あるいは、事前定義される比は、１：１未満、例えば、１：２（２コピーのＧＯＩあたり１個の選択マーカー遺伝子を示す）、または１：３、または１：４、または１：５、またはさらにそれ未満であり得る。ＧＯＩコピー数は、トランスフェクションのために規定量のＧＯＩを用いることにより、または、例えば、特定の数の発現カセットを用いての、もしくは遺伝子スタッキングによるその数の遺伝子の発現構築物への正確な組込みにより、増加され得る。例えば、遺伝子は、発現構築物内の部位へ、または宿主細胞染色体の選ばれた遺伝子座へ、例えば、縦列反復により、正確に、反復して付加され得る。加えて、選択可能マーカー遺伝子などの任意の追加の外来ＤＮＡエレメントを除去する方法ステップは、ＧＯＩに対するマーカー遺伝子の規定比率を低下させるために提供される。
【００５２】
具体的には、前記発現構築物は、ランダムに、または部位特異的組込みにより、組換え細胞の染色体へ組み入れられる。ランダム組込みを行ったら、組換え細胞のレパートリーは、発現率について事前選択され得、その発現率が、高い翻訳活性または発現活性の染色体遺伝子座、例えば、ＢＡＣ発現ベクターの場合のように発現ベクターによってもたらされた遺伝子座、または大量のタンパク質の染色体遺伝子座もしくは「ホットスポット」を示す。「ホットスポット」は、産物の安定で、かつ高度な発現活性、好ましくは転写活性のある産生を提供する宿主細胞の染色体における位置を意味する。ホットスポットは、典型的には、オープンクロマチン構造によって特徴づけられる。本明細書に記載されているようなユークロマチンタンパク質発現遺伝子座は、その遺伝子座内に含有される遺伝子を発現するように作動可能であるならば、ホットスポットの特定の例である。
【００５３】
ランダムな組込みは、典型的には、非相同組換えによるものであり、したがって、発現構築物の５’および３’末端配列を内因性標的染色体配列と組み換えるためのマッチする（相同性）配列を構築する必要がない。
【００５４】
部位特異的組込みは、例えば、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを利用して、組込みの標的部位を認識する挿入断片と共に発現構築物を用いることにより、実施され得る。特に、外因性発現構築物は、野生型または変異型ＦＲＴ部位またはｌｏｘ部位などの内因性組換え標的部位へ組み込むことができる。組換え標的部位がＦＲＴ部位である場合、宿主細胞は、交差または組換え事象を達成するためにＦＬＰ（ＦＬＰリコンビナーゼ）の存在および発現を必要とする。組換え標的部位がｌｏｘ部位である場合、宿主細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在および発現を必要とする。具体的には、部位特異的組込みは、部位特異的組換え媒介性カセット交換により得られうる。典型的には、発現構築物の部位特異的様式での組込みは、マッチする配列の相同組換えによる。
【００５５】
具体的には、本明細書に記載された方法の方法ステップａ）は、部位特異的組込みにより前記遺伝子座へ前記ＧＯＩを組み入れることを含む。
具体的には、前記宿主細胞は哺乳類、特に、ヒト、ハムスター、マウス、サル、イヌ、または鳥類の宿主細胞、好ましくは、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＨｕＮＳ１、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ７９３２、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｖ７９、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、ＳＰ２／０、またはＥＢ６６細胞、それらの任意の誘導体および／もしくは子孫のいずれか一つである。具体的には、パイロットスケールまたは工業スケールのタンパク質または代謝産物生産に一般的に用いられる生産用細胞株が、本明細書に記載された目的のための宿主細胞としての役割を果たし得る。例示的な宿主細胞は、ＢＨＫ、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ−ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＤＵＫＸ  Ｂ１１、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ２．２０、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ２．４１、ＣＨＯ−Ｓ、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＣＯＳ−７、Ｕ２６６、ＨｕＮＳ１、ＣＨＬ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＶＥＲＯ、またはＥＢ６６細胞である。
【００５６】
特定の例によれば、遺伝子座は、例えば、本明細書に記載された実施例に用いられているような、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座、またはそれの哺乳類相同体である。具体的には、そのような遺伝子座は、ＣＨＯ生産用宿主細胞およびそれぞれの細胞株を操作するために用いられる。
【００５７】
具体的には、前記組換え宿主細胞のレパートリーは、
ａ）前記ＧＯＩのコピー数、
ｂ）ＧＯＩが組み入れられている染色体遺伝子座、
ｃ）遺伝的安定性、または
ｄ）エピジェネティック的安定性
のうちの少なくとも１つにおいて異なる宿主細胞を網羅する。
【００５８】
発現構築物の安定な染色体組込みにより、遺伝的安定性は、たいてい高いはずであるが、それでもなお、細胞の形態学的変化のために変わり得る。細胞内因性パラメータおよび特に、細胞の物理的外観が変化し得、遺伝的および／またはエピジェネティック的不安定性を示すことが判明した。したがって、安定なプロデューサー細胞は、そのような内因性パラメータによりソートすることができる。生産用宿主細胞のマスター細胞バンクおよびワーキング細胞株を作製するための、例えば、生産用宿主細胞株を再現性よく用いるための、特に重要な発現遺伝子座の遺伝的安定性およびエピジェネティック的安定性。遺伝的およびエピジェネティック的安定性をもつ細胞株は、長期間にわたってその遺伝的性質を維持し、例えば、ＰＯＩを高発現レベル、例えば、少なくともμｇレベル（μ／ｍＬ）で、細胞培養の約１０世代または２０世代、好ましくは少なくとも３０世代、より好ましくは少なくとも４０世代、最も好ましくは少なくとも５０世代または７０世代後でさえも、効果的に生産する長期の生産期に用いることができる。細胞株の発現遺伝子座の遺伝的およびエピジェネティック的安定性は、工業スケールのタンパク質生産に用いられる場合、大きな利点である。発現遺伝子座の遺伝的およびエピジェネティック的安定性のおかげで、ＰＯＩをコードするｍＲＮＡおよびマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡについての転写レベルは、最初の１０世代または２０世代の間でのそれらのレベルを２０世代または４０世代または７０世代後のそれらのレベルと比較して有意には変化しない（例えば、＋／−５０％未満、または＋／−４０％未満、または＋／−３０％未満、または＋／−２０％未満、または＋／−１０％未満の変動）。
【００５９】
具体的には、前記プールからの単一細胞の選択はさらに、内因性物理的バイオマーカーの任意の１つまたは複数を決定することによる。具体的には、前記選択は、細胞サイズ、細胞の細胞質顆粒性、分極率、屈折率、または細胞膜電位のいずれか、または少なくとも１つによる。そのような内因性バイオマーカーのいずれも、ＰＯＩ生産とは無関係である、細胞の形、形態、外観、および／または機能に基づいて決定される。変形した、または異常な内因性物理的パラメータを理由にネガティブ選択される任意のトランスフェクト細胞は、生産用細胞株を作製するという目的には適さないとみなされる。内因性物理的特性を示す事前定義されたパラメータに従うという理由でポジティブ選択される任意の形質転換体細胞は、生産用細胞株の製造をさらに進めるためにソートされる。
【００６０】
特定の実施形態によれば、前記選択（ソーティングとも呼ばれる）は、サイズ、形状、体積、密度、弾性、流体力学的性質、分極率、光散乱、誘電泳動、および磁化率を含む細胞の性質における物理的違いによる、好ましくは前方光散乱（ＦＳＣ）および／もしくは側方光散乱（ＳＳＣ）を用いる、光学的フローサイトメトリ方法、または液滴に基づいたマイクロ流体力学もしくはラマン活性化細胞ソーティングもしくは音響放射力の適用などのマイクロ流体システムを利用する単一細胞ソーティング技術による。そのような方法は、内因性物理的バイオマーカーまたはそれぞれの細胞特性を示す事前定義された選択パラメータを測定することによりクローン集団における単一細胞のソーティングおよび単離を提供する。例えば、細胞は、特定の表現型、例えば、生存能、サイズ、形態、透過性、密度などを有する細胞を同定することによりソートされる。一実施形態において、細胞は、１つまたは複数の段階でソートされ得、例えば、最初のソーティングステップで、個々の細胞が、同じ選択パラメータ、または異なるパラメータによるさらなるソーティングの前に混合され得、または「プールされ」得、例えば、特定のサイズの細胞がまず、さらなるソーティングの前に、プールされ得る。あるいは、細胞は、例えば、単一細胞ソーティングにより、個々にソートされ得る。そのような単一細胞ソーティングは、細胞株の迅速な作製を非常に効率的に提供することができる。
【００６１】
典型的には、細胞は、ある特定の所望の表現型または物理的外観の有無に基づいて集団および亜集団へソートされる。ソーティングは、さらなるクローニングのために目的の細胞を捕捉し、かつ収集することを可能にする。いったん収集されたならば、単離された単一細胞は、例えば、ＰＯＩを高収率で生産する能力がある細胞を最終的に選択するために、およびマスター細胞バンクを調製し、任意でさらに、ワーキング細胞バンクを調製するために、増殖および培養することができる。具体的には、サブクローンもいかなる再クローニングステップも調製する必要がない。生産用細胞株は、単一クローンからすぐに確立することができ、この細胞株を用いて、マスター細胞バンクを構築することができる。マスター細胞バンクからの細胞は、増殖して、ワーキング細胞バンクを形成し、それは、ＰＯＩ製造過程に用いる前に細胞生存能および増殖について特徴づけられる。
【００６２】
単一細胞の複数の物理的特性を同時に分析するフローサイトメトリ方法は、当技術分野においてよく知られている。測定される例示的な性質には、細胞サイズ、相対的な顆粒性、または内部の複雑性が含まれる。各細胞の特性は、例えば、それの光散乱性質に基づいており、その性質は、試料内の亜集団についての情報を提供するために分析される。
【００６３】
具体的には、前記ソーティングは、前方光散乱（ＦＳＣ）および／または側方光散乱（ＳＳＣ）を用いるフローサイトメトリ方法による。
一実施形態において、前方散乱光および側方散乱光データは、ソートされた細胞に関して収集される。ＦＳＣは、細胞表面積またはサイズに比例する。ほとんどが回折した光の測定として、ＦＳＣは、それらの蛍光とは無関係に、所定のサイズより大きい粒子を検出する適切な方法を提供する。ＳＳＣは、ほとんどが屈折および反射した光の測定に基づいて、細胞顆粒性または内部の複雑性に比例する。ＦＳＣおよびＳＳＣの相関的測定は、細胞を染色または標識することの必要性なしに、異種性細胞集団における細胞型の区別を可能にする。細胞は、所望の性質に基づいてさらにソートすることができる。
【００６４】
細胞ソーティングは、典型的には蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）または免疫磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）において、好ましくはハイスループットかつ正確な様式で用いられるデバイスを用いて、実施され得る。一実施形態において、単一細胞は、別個のウェルへ直接、ソートされて、個々のクローンを生じる。
【００６５】
特定のソーティング技術は、ゲーティングを利用し、そのゲーティングは、さらなる分析のために含まれ、または排除される細胞の特性を定義するための数値的または図形的境界を設定する。例えば、ゲートは、目的の集団の周りに引くことができる。ゲートまたは領域は、分析またはソーティングのための事象を単離するように、亜集団の周りに引かれた境界である。ＦＳＣまたは細胞サイズに基づいて、ゲートは、所望のサイズおよび外観の細胞の分析だけを可能にするように、ＦＳＣ対ＳＳＣプロット上に設定することができる。一実施形態において、選択圧下での細胞の濃縮により事前選択された組換え宿主細胞が、ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングによりソートされ、それにより、遺伝的安定性および生産性の向上を示すあらかじめ決められた物理的外観または生存能特性を有するゲーティングされた亜集団が得られる。
【００６６】
具体的には、前記ソーティングステップは、蛍光標識などの標識を用いることを含まない。したがって、ソーティングステップは、組換え宿主細胞のレパートリーを染色または標識することを回避することができる。
【００６７】
ゲーティングパラメータは、細胞内因性物理的パラメータだけに基づくことができ、ゲートは、固有の集団、例えば、集団における細胞の大部分より大きい顆粒性および小さい顆粒性として同定される集団に基づいて構築することができる。具体的には、ゲーティングステップは、異なる物理的プロファイルを有する、ソートされた生存可能な組換え宿主細胞（ＦＳＣ／ＳＳＣ集団）を選択することを含む。その後、目的のソートされた細胞培養ウェルを採取し、本明細書に記載されているようにさらに処理することができる。
【００６８】
いったん単一細胞がソートされたならば、典型的には、ソートされた細胞は、別々に、例えば、ウェルまたは他の別々の容器内で、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間で最長８週間、７週間、６週間、５週間、４週間、３週間またはそれ未満まで、例えば、最長２０日間、１９日間、１８日間、１７日間、１６日間、１５日間、１４日間、１３日間、１２日間、または１１日間までの間、成長し、単一クローンが得られる。そのような単一クローン培養は、選択圧下で、または選択圧なしで、実施され得る。その後、クローンは、最終的にそれらを生産用細胞株と定義する前に、細胞培養性能、例えば、ＰＯＩ生産性および／または選択マーカーの発現について分析され得る。一般的に、ＰＯＩを含有する上清を収集し、それを、ＰＯＩの量および／または機能性について分析することができる。
【００６９】
特定の態様によれば、前記組換え宿主細胞のレパートリーは、少なくとも１つの遺伝的特性において異なる、少なくとも１０，０００個の異なるクローン、または少なくとも１０５個、または少なくとも１０６個、または少なくとも１０７個、または少なくとも１０８個の異なるクローン、または少なくとも１０９個の異なるクローンを含む。
【００７０】
具体的には、前記組換え宿主細胞のレパートリーは、様々なコピー数の前記ＧＯＩを含み、その様々なコピー数は、１〜５００個の間の範囲である。特定の実施形態によれば、レパートリーの細胞は、平均して、少なくとも５コピー、または少なくとも１０コピー、または少なくとも１５コピー、または少なくとも２０コピーのＧＯＩを含む。具体的には、より高い平均コピー数により特徴づけられ、例えば、細胞あたり平均ＧＯＩコピー数が５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個の少なくともいずれかである、細胞の亜集団が得られうる。選択される単一細胞は、好ましくは、例えば、少なくとも５個もしくは１０個、または５個もしくは１０個より多い、あるいは１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、または１００個の少なくともいずれかである、高いＧＯＩコピー数により特徴づけられる。
【００７１】
具体的には、単一細胞は、組換え細胞のレパートリーから、合計少なくとも１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、または少なくとも１０７個の組換え細胞から少なくとも１個の選択された細胞という選択効率で、選択され、好ましくは、その選択された細胞が、静置９６ウェルプレート内での培養および生産で比生産性がすでに測定されている場合、少なくとも１ｐｃｄ、より好ましくは、少なくとも２ｐｃｄ、５ｐｃｄ、１０ｐｃｄ、１５ｐｃｄ、２５ｐｃｄ、または３５ｐｃｄの比生産性をもつ高プロデューサー細胞である。そのような高い選択効率は、細胞の大集団から形質転換体、特に、高い生産性ならびに遺伝的およびエピジェネティック的安定性の形質転換体を、最初に選択されたクローンの向上したバージョンについてさらにスクリーニングされる必要があるだろう組換え宿主細胞のさらなるレパートリーを提供するだろうサブクローンを再クローニングまたは作製する必要なしに、直接、選択するための必須条件である。その選択効率は、過度の事前選択または段階的選択なしに、特に段階希釈、および選択条件下でクローンを成長させることなしに、高度に向上することができる。
【００７２】
特定の実施形態によれば、前記生産用細胞株は、バッチ培養、フェドバッチ培養、または連続培養の条件下で、具体的には、フェドバッチ培養の生産期中、少なくとも０．１ｐｃｄ（ｐｇ／細胞／日）、好ましくは少なくとも１ｐｃｄ、５ｐｃｄ、１０ｐｃｄ、１５ｐｃｄ、２０ｐｃｄ、２５ｐｃｄ、または３０ｐｃｄのＰＯＩを生産する比生産性を有する。具体的には、培養は、バイオリアクターで実施され、バッチ期から始まり、その後、ＰＯＩの高収率での生産を可能にする生産期が続く。
【００７３】
好ましくは、前記生産用細胞株は、６０日未満以内、具体的には、５０日未満以内もしくは４０日未満以内に、または１ヶ月以内に、より具体的には、４週間以内もしくはさらに４週間未満以内に作製される。
【００７４】
具体的には、前記生産用細胞株は、少なくとも０．１ｐｃｄのＰＯＩを生産する比生産性を有し、前記生産用細胞株は、６０日未満以内に作製される。
具体的には、ＰＯＩは、組換えまたは異種性タンパク質、好ましくは、治療用タンパク質、免疫原性タンパク質、診断用タンパク質、または生体触媒のいずれかである。具体的には、ＰＯＩは、抗体またはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素、毒素融合タンパク質、糖質−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、制御タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質または粒子、プロセス酵素、細胞シグナル伝達および細胞リガンド結合性タンパク質、成長因子、ホルモンおよびサイトカイン、タンパク質抗生物質、ＰＯＩの構造タンパク質または代謝産物からなる群から選択される。具体的には、ＰＯＩは、「難発現性」ＰＯＩである。
【００７５】
本発明はさらに、本明細書に記載されているような方法により得られる、真核生物の生産用細胞株、または真核生物生産用細胞株として適格である組換え宿主細胞のレパートリーを提供し、前記生産用細胞株が、細胞の染色体へ組み入れられたＧＯＩの少なくとも１０コピー、および少なくとも０．１ｐｃｄ、好ましくは、少なくとも１ｐｃｄ、５ｐｃｄ、１０ｐｃｄ、１５ｐｃｄ、２５ｐｃｄ、または３０ｐｃｄの構成的生産性により特徴づけられる。そのようなレパートリーは、具体的には、蛍光標識により標識されない。
【００７６】
構成的生産性は、形質転換にも関わらず、組換え宿主細胞になる細胞の適応度を示す。したがって、構成的生産性の生産用細胞株は、長い生産周期にわたるＰＯＩのロバストな製造を支える。結果として、生産性は、成長する間、および／または長期にわたるフェドバッチ培養における生産期中に、安定した状態を保つ。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】商業目的の組換えタンパク質の生産のためのより高等真核細胞における安定な単一クローンの単離の向上した方法についてのストラテジーを示す図である。特に興味深いのは、産業関連の哺乳類細胞または鳥類細胞における組換えタンパク質の生産のためのこの新しいストラテジーである。トランスフェクション後１ヶ月以内に、かつ細胞のいかなる標識もなしで、高い組換えタンパク質生産性を有する安定な生産用クローンが、生成され、単離され、特徴づけられ、細胞バンキングにより保存され得る。
【図２】図２Ａは、混合集団から最良の生産用クローンを、フローサイトメトリにより光散乱  −  前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）  −  の細胞内因性パラメータにただ基づくだけで、同定およびソートするためのストラテジーを概略的に示す。図２Ｂは、２つの対照集団（ソートしようとしているそれぞれの混合細胞集団の１つの生細胞集団および１つの死細胞集団）に基づいて、フローサイトメトリにおける全細胞集団の選択のためのゲートを設定することについての例を示す。この例において、死細胞はゲート「Ｐ１」内に出現し、一方、生細胞はゲート「Ｐ２」内に出現し、さらなる培養のためにポジティブ選択することができる。
【図３】提示された方法の概念を証明する２つの例を示す図である。（ａ）上部パネルは、細胞内タンパク質についての、ＦＳＣおよびＳＳＣ特性に基づいた単一クローンの生成および単離を示す。この細胞内タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、それは、それぞれのクローンの選択および濃縮の間にすでに、そのＰＯＩの生産および細胞含有量をモニターすることを可能にする。（ｂ）下部パネルは、分泌性タンパク質についての、ＦＳＣおよびＳＳＣ特性に基づいた単一クローンの生成および単離を示す。この例における分泌性タンパク質はヒトＦＧＦ２３である。上部および下部の各パネルについて、左側において、ｙ軸にＳＳＣおよびｘ軸にＦＳＣ、加えて、生細胞についてのソートゲートを表示して、全細胞集団が示されている。中央において、ソートされた集団が示されており、この場合もやはり、ｙ軸にＳＳＣおよびｘ軸にＦＳＣが表示されている。右側において、ソートされた細胞についてのヒストグラムが示され、緑色蛍光を検出するチャネルはｘ軸に示され、それぞれのチャネルにおけるカウント数はｙ軸に示されている。「全集団」は、全細胞集団を示し、「ソートされた集団」は、９６ウェルプレートへソートされた生細胞を示し、「ＧＦＰについてのヒストグラム」は、ｘ軸に沿ってＧＦＰ蛍光の強度、およびｙ軸に細胞カウントの数を示す。
【図４】異なる方法により選択されたＧＦＰを発現する単一クローンの蛍光強度の比較を示す図である。クローンは、高い（１．０ｍｇ／ｍｌ）かまたは中位（０．５ｍｇ／ｍｌ）かのいずれかの抗生物質濃度により、およびフローサイトメトリソーティングの提示された方法を用いて選択され、またはそれらは、プールにおける選択およびその後の限界希釈により古典的に生成された。全てのクローンは、フローサイトメトリによるそれらのＧＦＰ蛍光強度により分析され、それぞれの方法により生成された単一クローンの集団についての蛍光強度の結果が、３つの一般的な統計的パラメータ「平均値」、「中央値」、および「最頻値」により示されている。
【図５】ＦＧＦ２３生産性クローンの例について、異なる方法により単離された単一クローンの比生産性（ｐｃｄ）分布の比較を示す図である。クローンは、高い抗生物質濃度により、およびフローサイトメトリソーティングの提示された方法を用いて選択され、またはそれらは、プールにおける選択およびその後の限界希釈により古典的に生成された。図５Ａにおいて、クローンについての結果は箱髭図で示され、３つ全ての統計的パラメータ、平均値、中央値、および最頻値は、試験された各方法についての単一クローンｐｃｄの分布をプロットするために用いられた。図５Ｂにおいて、比生産性が、グループ内の個々のデータ点の分布を視覚化するために散布図を用いて示されている。どちらの図においても、ｐｃｄ値は、０．０１ｐｃｄから１００ｐｃｄまでの対数目盛でｙ軸にプロットされている。
【図６】ＦＧＦ２３を生産する単一クローンについての容量収率（volumetric yield）（ｍｇ／ｌ）と比生産性（ｐｃｄ）との間の相関を示す図である。
【図７】目的の遺伝子の遺伝子コピー数とマーカー遺伝子についての遺伝子コピー数との間の相関を示す図である。本発明者らの例において、ＧＯＩはＦＧＦ２３であり、マーカー遺伝子はネオマイシン抵抗性である。
【図８】比生産性と、単一クローンの非常に高い抗生物質濃度に対する抵抗性を示す生存率との間の相関を示す図である。図８Ａにおいて、６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８濃度に対する抵抗性が評価され、図８Ｂにおいて、１０ｍｇ／ｍｌに対する抵抗性が評価された。
【図９】トランスフェクションおよびトランスフェクション後１日目から開始された１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８での選択後の示された日において決定されるＰＯＩの高生産を生じる、トランスフェクトされた生産用細胞株の割合を示す図である。図９Ａは、環状ＢＡＣを用いた場合の結果を示し、図９Ｂは線状ＢＡＣを用いた場合の結果を示す。
【図１０−１】図１０Ａ：Ｃａｇｇｓプロモーターにより駆動されるｅＧＦＰ配列、およびｅＧＦＰ開始コドンの上流すぐの最適化コザック配列を含む通常のプラスミド−ｅＧＦＰ（比較のために実施例４で用いられた）のベクターマップ。
【図１０−２】図１０Ｂ：Ｒｏｓａ２６遺伝子座においてＦＧＦ２３発現カセットを含有するＢＡＣの構築のための通常のプラスミド−ＦＧＦ２３（実施例２で用いられた）のベクターマップ（ＦＧＦ２３（Ｃ末端）ベクターマップ）。
【図１１−１】配列を示す図である。  配列番号５：組換えタグ付きヒトＦＧＦ２３（ｃｔＦＧＦ２３−Ｈｉｓ）の配列：リーダー配列、短いスペーサー、およびｈｉｓタグを含むＣ末端ｈＦｇＦ２３（１８０〜２５１）タンパク質配列；人工配列。  配列番号６：プラスミド−ｅＧＦＰの配列  配列番号１５：プラスミド−ＦＧＦ２３の配列
【図１１−２】配列を示す図である。
【図１１−３】配列を示す図である。
【図１１−４】配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
列挙された配列は以下のさらなる配列を含む：
配列番号１：Ｒｏｓａ２６遺伝子座の配列（クローンＲＰＣＩ−２４−８５Ｌ１５（ＩＤ７６０４４８）；ＧＲＣｍ３８．ｐ３  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：Ｃｈｒ．６（ＮＣ＿００００７２．６）：１１２，９５２，７４６−１１３，１５８，５８３に対応する；供給源：ＮＣＢＩ）、起源：ハツカネズミ（mus musculus）；
配列番号２：遺伝子座Ｒｐｓ２１の配列（クローンＲＰ２３−８８Ｄ１２（ＮＣＢＩクローンデータベースＩＤ：６２７２７０）に対応する）、起源：ハツカネズミ；
配列番号３：遺伝子座Ａｃｔｂの配列（クローンＲＰ２３−５Ｊ１４（ＮＣＢＩクローンデータベースＩＤ：６０１７３８）に対応する）、起源：ハツカネズミ；
配列番号４：遺伝子座Ｈｐｒｔの配列（クローンＲＰ２３−４１２Ｊ１６（ＮＣＢＩクローンデータベースＩＤ：７３２１２１；）に対応する）、起源：ハツカネズミ。
【００７９】
発明の詳細な説明
明細書を通して用いられる場合の特定の用語は、以下の意味を有する。
本明細書に用いられる場合、用語「人工染色体」は、天然染色体の性質を以て大きなＤＮＡ断片の安定な維持を可能にする、既知成分からインビトロで構築されたＤＮＡ分子を指す。人工染色体は、通常、それぞれの生物体における複製および維持を担い、かつ大きなゲノムＤＮＡ断片を安定的に維持する能力がある、染色体由来のエレメントを含有する。複製起点配列に加えて、人工染色体は、人工染色体を有する細胞の選択を可能にする選択マーカー、通常、抗生物質抵抗性マーカーを有し得る。
【００８０】
人工染色体は好ましくは、例えば、Ｆ−プラスミド由来のエレメントを有する、「ＢＡＣ」とも呼ばれる細菌人工染色体、または「ＰＡＣ」と呼ばれるＰ１−プラスミド由来のエレメントを有する人工染色体のように、細菌に由来する。人工染色体はまた、「コスミド」の場合のように、バクテリオファージ由来のエレメントを有し得る。さらに人工染色体は、「ＹＡＣ」とも呼ばれる酵母人工染色体のように酵母に由来し、「ＭＡＣ」とも呼ばれる哺乳類人工染色体のように哺乳類に由来し、例えば、ヒトに由来し、「ＨＡＣ」と呼ばれるヒト人工染色体がある。コスミド、ＢＡＣ、およびＰＡＣは、細菌由来の複製起点を有し、ＹＡＣは、酵母由来の複製起点を有し、ＭＡＣは、哺乳類細胞の複製起点を有し、ＨＡＣはヒト細胞の複製起点を有する。人工染色体は、通常、遺伝子およびそれらの制御エレメントを包含する大きなＤＮＡセグメントを組み入れるそれらの収容力として、通常、コスミドについて３０〜５０ｋｂ、ＰＡＣおよびＢＡＣについて５０〜３５０ｋｂ、ＹＡＣについて１００〜３０００ｋｂ、およびＭＡＣおよびＨＡＣについて＞１０００ｋｂの範囲である。
【００８１】
本明細書に用いられる場合、用語「細胞株」は、長期間にわたって増殖する能力を獲得している特定の細胞型の樹立したクローンを指す。用語「生産用細胞株」は、ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドにより媒介される細胞代謝産物を生産するために、内因性もしくは組換え遺伝子を発現させるために、または代謝経路の産物のために用いられる場合の細胞株を指す。生産用細胞株は一般的に、ＰＯＩなどの生産過程の生産物を得るためのバイオリアクター内での培養にすぐに使える細胞株であると理解されている。生産用細胞株は、例えば、マスター細胞バンクまたはワーキング細胞バンクとして提供され得る。
【００８２】
宿主細胞株または生産用細胞株に関しての、「発酵」とも呼ばれる、用語「培養」は、人工的、例えば、インビトロ環境における、成長、分化、または継続的生存能に有利である条件下の、細胞の活性状態または静止状態での、具体的には、産業界で知られた方法による制御バイオリアクター内での、細胞の維持を意味する。本明細書に、特に、選択ステップ後に用いられる場合、特定の培地は、無血清であり、選択条件を与えるだろう抗生物質または他の薬剤を含有しない。したがって、生じた、生産用細胞株のマスター細胞バンクは、抗生物質を含まない場合がある。しかしながら、場合によっては、製造過程を通して選択条件が維持されて、選択圧下での培地中でのマスター細胞バンクが得られる。
【００８３】
生産用細胞株の培養およびそれの生産性の決定は、バッチ、フェドバッチ、または連続方法、もしくは半連続方法（例えば、ケモスタット）において実施することができる。バッチ方法は、細胞の培養に必要な栄養分全てが、最初の培地中に含有され、発酵中さらなる栄養分の追加の供給がない培養様式であるが、フェドバッチ方法において、バッチ期後、１つまたは複数の栄養分が給送により培養物へ供給される給送期が起こる。栄養分給送の目的は、バイオマスの量を増加させて、組換えタンパク質の量もまた増加させるためである。たいていの培養方法において、給送式は必須かつ重要であるが、本発明のプロモーターを利用する本発明は、ある特定の培養様式に関して制限されない。
【００８４】
本明細書に用いられる場合、用語「増殖させること」は、１個の単一細胞に由来した生存細胞の数の増加を指す。増殖は、例えば、１回または複数の細胞周期を通して細胞を「成長させること」により、達成され得、前記細胞の少なくとも一部が分裂して、追加の細胞を生じる。
【００８５】
本明細書に用いられる場合、「同時発現」は、同じ細胞における２つ以上の核酸配列の発現を指す。２つ以上の核酸配列の発現のレベルは、同じ、または異なり得る。しかしながら、発現は、規定された比率であり得、すなわち、１つの核酸配列の高発現は、他の核酸配列の高発現を示す。したがって、２つ以上の核酸の発現は相関する。
【００８６】
例えば、ＧＯＩおよび選択マーカー遺伝子は、同じ細胞において同時に、共に、または逐次的に発現し得る。例えば、薬剤または毒素（例えば、抗生物質）に対する抵抗性により評価される、選択マーカー遺伝子の高発現は、ＧＯＩもまた高率で発現していることを示す。いくつかの実施形態において、ＧＯＩと選択マーカー遺伝子は、作動可能に連結され、それにより同時発現する。
【００８７】
用語「ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座」は、本明細書では以下のように理解される：
遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）（複数形：遺伝子座（ｌｏｃｉ））は、遺伝学分野において、染色体上の遺伝子またはＤＮＡ配列の特定の場所または位置である。遺伝子座は、遺伝子を発現するように作動可能であり得る発現配列を含む染色体セグメント内に含有され得る。本明細書に記載されているような遺伝子座は、具体的には、タンパク質発現に適した遺伝子座であり、ユークロマチン構造により特徴づけられる。
【００８８】
クロマチンは、ＤＮＡ、タンパク質、およびＲＮＡからなる、細胞に見出される高分子の複合体である。クロマチンの主な機能は、１）細胞内に適合させるようにＤＮＡをより小さい体積へまとめること、２）有糸分裂を可能にするようにＤＮＡ高分子を強化すること、３）ＤＮＡ損傷を防止すること、および４）遺伝子発現とＤＮＡ複製を調節することである。クロマチンの主なタンパク質成分は、ＤＮＡを凝縮するヒストンである。クロマチンの構造は、いくつかの因子に依存する。全体構造は、細胞周期の時期に依存する。間期の間、クロマチンは構造的にゆるく、ＤＮＡを転写し、かつ複製するＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼへのアクセスを可能にする。間期の間のクロマチンの局所的構造は、ＤＮＡに存在する遺伝子に依存する：活発に転写される（「オンにされた」）遺伝子をコードするＤＮＡは、オープンクロマチン構造内に、よりゆるくまとめられ、ＲＮＡポリメラーゼと付随して見出され（「ユークロマチン」と呼ばれる）、一方、不活性（「オフにされた」）遺伝子をコードするＤＮＡは、構造タンパク質と付随して見出され、より密接にまとめられている（ヘテロクロマチン）。
【００８９】
真核細胞における特定の遺伝子座は、ＧＯＩを導入し、または発現構築物を操作するのに特に適しており、その遺伝子座は、ユークロマチンの存在により特徴づけられ、本明細書において、ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座と呼ばれる。ユークロマチンにより特徴づけられ、本明細書に記載されている例示的な遺伝子座は、ヒト、マウス、ハムスター、イヌ、サルなどの哺乳類細胞、および鳥類細胞などの非哺乳類細胞のＲｏｓａ２６、Ｒｐｓ２１、Ａｃｔｂ、またはＨｐｒｔ、および類似体のいずれかである。
【００９０】
クロマチン構造エレメントおよびクロマチン改変エレメントはさらに下に記載されている：
「クロマチンエレメント」は、染色体上の核酸配列であって、その染色体へ組み込まれた場合、クロマチン構造を改変する性質を有する核酸配列を意味する。「シス」は、同じ核酸分子（例えば、同じベクター、プラスミド、または染色体）上の２つ以上のエレメント（例えば、クロマチンエレメント）の配置を指す。「トランス」は、２つ以上の異なる核酸分子上（例えば、２つのベクター、または２つの染色体上）の２つ以上のエレメント（例えば、クロマチンエレメント）の配置を指す。位置効果を克服できる可能性があり、かつそれゆえに安定細胞株の開発にとって興味深いクロマチン改変エレメントには、抗リプレッサー（antirepressor）、境界エレメント（ＢＥ）、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、およびユニバーサルクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）が含まれる。境界エレメント（「ＢＥ」）またはインスレーターエレメントは、多くの場合、クロマチンにおける境界を定義し、インビボで転写ドメインを定義する役割を果たし得る。ＢＥは内在性プロモーター／エンハンサー活性を欠き、むしろ、周囲クロマチンにおいて遺伝子を制御エレメントの転写影響から保護すると考えられる。境界エレメントは、ショウジョウバエ、酵母、および哺乳類細胞において、安定にトランスフェクトされたレポーター遺伝子を位置効果から保護し得ることが示されている。それらはまた、誘導性導入遺伝子発現を有するトランスジェニックマウスの割合を増加させることが示されている。遺伝子座調節領域（「ＬＣＲ」）は、遺伝子座の最初のクロマチン活性化、およびその後のそれらの天然位置における遺伝子転写に必要とされるシス制御エレメントである（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．  １９９９、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ９、１５２〜１５７）。ＬＣＲの活性化機能はまた、宿主ゲノムにおける組込みの部位に関係なく、トランスジェニックマウスにおいて適切な組織での連結した導入遺伝子の発現を可能にする。ＬＣＲは、一般的に、連結した遺伝子に組織特異的レベルの発現を与えるが、トランスジェニックマウスにおけるほとんど全ての組織での効率的発現は、切り詰め型ヒトＴ細胞受容体ＬＣＲおよびラットＬＡＰ  ＬＣＲについて報告されている。最も十分に特徴づけられたＬＣＲは、グロビン遺伝子座のそれである。広く受け入れられているモデルによる「ＭＡＲ」は、特定のＤＮＡ配列の核マトリックスへの足場を媒介し、ヘテロクロマチンコアから外側へ延びるクロマチンループドメインを生じ得る。
【００９１】
真核生物染色体のループドメイン組織化のモデルは広く受け入れられている。このモデルによれば、クロマチンは、核マトリックス（ＲＮＰおよび他の非ヒストンタンパク質で構成されるタンパク質性ネットワーク）に付着した、５０〜１００ｋｂに及ぶループに組織化される。核マトリックスに付着したＤＮＡ領域は、それぞれスキャフォールド（中期の間）またはマトリックス（間期の間）付着領域としてＳＡＲまたはＭＡＲと呼ばれる。それとして、これらの領域は、包括的なシス制御エレメントのみが、そのドメイン内の遺伝子の発現を調節するように、独立したクロマチンドメインの境界を定義し得る。しかしながら、染色体遺伝子座を近くのクロマチンエレメントから完全に遮蔽し、したがって、位置非依存的遺伝子発現を与えるそれらの能力は、安定にトランスフェクトされた細胞において観察されていない。他方、ＭＡＲ（またはＳ／ＭＡＲ）配列は、エンハンサーと相互作用して、局所的クロマチンアクセス性を増加させることが示されている。具体的には、ＭＡＲエレメントは、細胞培養株において異種性遺伝子の発現を増強することができる。
【００９２】
上記のエレメント全ては、発現遺伝子座のエピジェネティック的安定性を与え、それの発現活性状態を永続化させるのに寄与する。エピジェネティックスの分子的機序は、複雑であり、ある特定の遺伝子の活性化または非活性化の改変を含む。加えて、ＤＮＡと会合したクロマチンタンパク質は、活性化され、またはサイレンスされ得る。細胞が分裂している時、それは、それのゲノムを正確に複製しなければならないだけでなく、それの遺伝子発現の前のレベルを回復しなければならない。遺伝子発現を決定する情報は、ＤＮＡに直接コードされていない場合が多く、それゆえに、「エピジェネティック」と名付けられている。エピジェネティックメモリの分子的機序は、ヒストン翻訳後修飾、転写因子、ＤＮＡメチル化、および非コードＲＮＡを含む、少なくともいくつかの機構の協働から生じる。本明細書に用いられる場合、エピジェネティック的安定性という用語は、上記で言及された機構を指す。生産用細胞株における発現遺伝子座の遺伝的およびエピジェネティック的安定性のおかげで、ＰＯＩをコードするｍＲＮＡ、およびマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡについての転写レベルが、最初の１０世代または２０世代の間のそれらのレベルを２０世代または４０世代または７０世代後のそれらのレベルと比較した場合、有意には変化しない（例えば、＋／−５０％未満、または＋／−４０％未満、または＋／−３０％未満、または＋／−２０％未満、または＋／−１０％未満の変動）。
【００９３】
したがって、クロマチンをオープンまたは活性状態に保持する上記で言及されたエレメントの組合せを含有する染色体遺伝子座は、目的の遺伝子の安定的かつ構成的発現にとって利点を提供する。そのような染色体遺伝子座は、発現ベクターを形成するように適応することができる。そのような発現ベクターのＤＮＡを増幅するために、染色体遺伝子座は、一般的に、細菌または酵母のような遺伝的生物体においてベクターＤＮＡの迅速な増幅を可能にするようにベクターエレメント（本明細書では、「バックボーン」と呼ばれる）と組み合わせられる。その後、そのような構築物は、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＨＡＣ、コスミド、またはＹＡＣと呼ばれる。
【００９４】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）は、典型的には、細菌、通常、大腸菌（E. coli）における形質転換およびクローニングに用いられる、機能的稔性プラスミド（またはＦ−プラスミド）に基づいたベクターバックボーンを有するＤＮＡ構築物である。細菌人工染色体の通常の挿入断片サイズは１５０〜３５０ｋｂｐであり、それは、例えば、マウス、ハムスター、またはヒトが起源であり得る。ＰＡＣと呼ばれる類似したクローニングベクターは、細菌Ｐ１−プラスミドから作製され得る。
【００９５】
同様に、酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、典型的には、酵母のＤＮＡに由来した、遺伝子操作された染色体である。例えば、マウス、ハムスター、またはヒトが起源であり得る１００〜１０００ｋｂの大きなＤＮＡ断片を挿入することにより、挿入された配列は、クローニングされ、物理的にマッピングされ得る。ＹＡＣのベクターバックボーンの主なコンポーネントは、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来の自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、およびテロメアである。加えて、抗生物質抵抗性マーカーおよび可視マーカーなどの選択可能マーカー遺伝子が、形質転換された酵母細胞を選択するのに利用される。
【００９６】
ＢＡＣに基づいたベクター（ならびに、とりわけＰＡＣおよびＹＡＣ）は、具体的には、本明細書に記載されているような目的のための適切な発現ベクターであり、それらが、オープンクロマチン領域または「ホットスポット」を含有する大きな真核生物のゲノムＤＮＡ挿入断片を収容できるからである。これは、ＢＡＣに基づいたベクターを、クロマチン位置効果に対して非感受性にさせ、それらに、構成的、コピー数依存的、かつ予想可能な発現を与える。ＢＡＣに基づいた発現ベクターで生成された細胞クローンは、典型的には、ＢＡＣベクターのいくつかの組み込まれたコピーを含有する。これは、後の導入遺伝子増幅のラウンドなしに、トランスフェクションおよびクローン単離後直接、目的の遺伝子の発現の上昇をもたらす。それゆえに、ＢＡＣに基づいたベクターは、導入遺伝子の高発現レベルを可能にするクロマチン領域またはホットスポットを有するべきである。例えば、Ｒｏｓａ２６、およびＨｐｒｔ遺伝子座などのハウスキーピング遺伝子が、ホットスポットであると考えられる。
【００９７】
用語「異種性」は、核酸、例えば、遺伝子、またはプロモーターなどの制御エレメントを指し、通常では見出されないかまたは天然に存在しない場所に存在し、それにより、人工ポリヌクレオチドまたは核酸が操作により生じる、核酸を指す。例えば、異種性遺伝子は、天然の野生型または変異型遺伝子であり得、かつその遺伝子と作動可能に連結されることが通常は見出されない核酸配列と連結され得る。外因性遺伝子であり、すなわち、異なる生物体または種に由来している任意の遺伝子が異種性遺伝子である。任意の外因性遺伝子座、すなわち、異なる生物体または種に由来した遺伝子座は異種性遺伝子座である。細胞から単離され、かつ発現構築物を生じるように操作された遺伝子座は、それが、同じ細胞または同じ型の細胞へ再導入される場合でさえも、人工遺伝子座として理解され、源の細胞に対して外因性である。異種性ＧＯＩによってコードされるＰＯＩは、異種性ＰＯＩとみなされると理解されている。
【００９８】
本明細書に用いられる場合、用語「作動可能に連結された」は、単一の核酸分子、例えば、発現カセットまたは構築物におけるヌクレオチドの関係であって、１つまたは複数のヌクレオチド配列の機能が、前記核酸分子に存在する少なくとも１つの他のヌクレオチド配列により影響されるような、関係を指す。例えば、プロモーターは、それが組換え遺伝子のコード配列の発現をもたらすことができる場合、そのコード配列と作動可能に連結されている。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、それが、タンパク質、例えば、成熟タンパク質のプレフォームまたはその成熟タンパク質を分泌型として発現させることができる場合、ＰＯＩをコードする核酸配列と作動可能に連結されている。具体的には、お互いに作動可能に連結されたそのような核酸は、直接的に、すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とＰＯＩをコードする核酸配列との間の中にさらなるエレメントまたは核酸配列を含まずに、連結され得る。
【００９９】
本明細書に用いられる場合、「発現カセット」は、所望のコード配列および調節配列を、これらの配列で形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞がそのコードされたタンパク質を発現することができるような作動可能な連結状態で含む、核酸配列を指す。発現カセットはしばしば、かつ好ましくは、所望のコード配列の切断および挿入に適した制限部位の取り合わせを含有する。発現ベクターは、１つまたは複数の遺伝子を発現するように作動可能な１つまたは複数の発現カセットを含有してもよい。
【０１００】
本明細書に記載されているような発現カセットは、具体的には、プロモーターの転写調節下の所望のコード配列と（またはコード配列のためのクローニング部位と）作動可能に連結された前記プロモーターを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、発現カセットは、ＧＯＩ、すなわち、ＰＯＩをコードする核酸配列を含む。具体的には、ＧＯＩは、異種性ＧＯＩである。いくつかの実施形態において、発現カセットは、選択マーカー遺伝子のコード配列を含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、ＧＯＩと選択マーカー遺伝子の両方を含み、ＧＯＩと選択マーカーを作動可能に連結している。
【０１０２】
本明細書に用いられる場合、用語「発現構築物」は、１つまたは複数の発現カセットを含む核酸分子を指す。１つより多い発現カセットを含む発現構築物は、同じもしくは異なるコード配列および／または同じもしくは異なるプロモーターを有する発現カセットを含み得る。発現構築物は、ベクター、プラスミド、または人工染色体、特に人工染色体ベクターであり得る。本明細書に用いられるような発現構築物は、宿主細胞染色体へ組み入れられ、好ましくは、非染色体の位置で、例えば、プラスミドとして、提供されない。宿主細胞の１つまたは複数の染色体への安定的な組入れは、組換え宿主細胞を遺伝的に安定にし、それは、組換え宿主細胞のレパートリーからの高プロデューサー細胞のポジティブ選択を容易にし、それにより、選択における不安定な形質転換体のパーセンテージを低下させる。
【０１０３】
例えば、制御配列、選択マーカー、および／またはＰＯＩ、それぞれをコードする、ＤＮＡ配列をライゲーションするために、ならびに組込みまたは宿主複製に必要な情報を含有する適切なベクターへそれらを挿入するために用いられる手順は、当業者によく知られており、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）に記載されている。具体的な技術は、相同組換えを利用する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、発現構築物は１つまたは複数のＧＯＩ発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、追加として、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、選択マーカー遺伝子およびＧＯＩの数を事前定義された比で含む。例えば、発現構築物は、選択マーカー遺伝子の１コピー、およびＧＯＩの少なくとも１コピー、５コピー、１０コピー、２０コピー、３０コピー、４０コピー、５０コピー、７０コピー、１００コピー、２００コピー、３００コピー、４００コピーのいずれか一つを含み得る。
【０１０５】
例として、発現構築物は、選択マーカー遺伝子の１コピーおよびＧＯＩの１０コピーを含み、したがって、選択マーカー遺伝子とＧＯＩを１対１０の事前定義された比で提供し得る。いくつかの実施形態において、発現構築物は、ＧＯＩの１コピーおよび選択マーカーの１コピーを有する１つまたは複数の発現カセットを含み、それにより、選択マーカー遺伝子とＧＯＩを１：１の固定または事前定義された比で提供する。例えば、発現構築物は、それぞれが、選択マーカー遺伝子の１コピーおよびＧＯＩの１コピーを含み、それにより、選択マーカー遺伝子対ＧＯＩの事前定義された比が１：１である、少なくとも１個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、７０個、１００個、２００個、３００個、４００個のいずれか一つの発現ベクターを含み得る。
【０１０６】
本明細書に用いられる場合、「宿主細胞」は、発現構築物の導入に、および目的のタンパク質を発現するのに適した細胞を指す。宿主細胞は、適切な栄養分および成長因子を含有する培地中での単層培養かまたは懸濁培養のいずれかに置かれた場合、成長および生存の能力がある。宿主細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞、またはハムスター、マウス、もしくはラット細胞などのげっ歯類細胞）または鳥類細胞であり得る。一般的に、宿主細胞は、ＰＯＩの組換え発現に適した任意の細胞であり得る。好ましい宿主細胞の例は、以下のいずれか一つである：
ヒト生産用細胞株：ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｕＮＳ１、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ７９３２（およびＣＨＬ誘導株）
ハムスター細胞株：ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｖ７９，それらの誘導株、好ましくは、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＤＵＫＸ  Ｂ１１、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ２．２０、ＣＨＯ／ＣＥＲＴ２．４１、ＣＨＯ−Ｓ、もしくはＢ１４ＡＦ２８−Ｇ３、または好ましくは、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ−ＴＫ−
マウス細胞株：ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、ＳＰ２／０
サル細胞株：ＣＯＳ−７
イヌ細胞株：ＭＤＣＫ
鳥類細胞株：ＥＢ６６
あるいは、前述のいずれかの誘導株／子孫。
【０１０７】
用語「内因性物理的バイオマーカー」または「内因性物理的性質」は、本明細書で交換可能に用いられ、細胞の機能を決定することなしに、例えば、発現産物またはレポーターを決定することなしに、特に、染色技術または標識の使用なしに、特に、蛍光標識を用いることなしに、細胞上または細胞内における、直接的に測定可能である内因性物理的細胞の性質を指す。広範なフルオロフォアが、典型的には、フローサイトメトリにおける標識として用いられ、具体的には、本明細書に記載されているような選択ステップに用いられない。フルオロフォアは、典型的には、細胞上または細胞内の標的を認識する抗体に付着している；それらはまた、細胞膜または別の細胞構造に対する親和性を有する化学的実体に付着している場合もある。そのような標識は、細胞標的の発現を決定するだけであり、その細胞が、（ＰＯＩ発現とは無関係に）生細胞として正常な物理的外観または機能を有するかどうかの指標を提供することはないだろう。
【０１０８】
内因性物理的性質には、細胞サイズ、細胞質顆粒性、分極率、屈折率、細胞膜電位、細胞形状、電気インピーダンス、密度、変形能、磁化率、および流体力学的性質が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０９】
本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、内因性物理的性質は、細胞質顆粒性、分極率、屈折率、および／または細胞膜電位である。
本明細書に用いられる場合、「細胞サイズ」は、細胞の体積、およびそれがどれくらいの３次元空間を占めるかを指す。細胞サイズは、例えば、フローサイトメトリにより、前方散乱パラメータを用いて測定することができる。このパラメータは、細胞の周りを通過するレーザー光の量の測定であり、細胞についての相対的サイズを与える。既知のサイズをもつビーズなどの既知の対照または標準を用いて、対照または標準のサイズに基づいた細胞の相対的サイズを測定することができる。例えば、本明細書に記載されているような選択された宿主細胞は、小型の細胞について５〜１０μｍの範囲内、または中型の細胞について１０〜２０μｍの範囲内、および大型の細胞について２０〜４０μｍの範囲内であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているような選択された宿主細胞は、対照値より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％大きいもしくは小さい細胞サイズ、または範囲内の細胞サイズを有する。対照は、選択された宿主細胞と同じ細胞分類または細胞型の、生きている、瀕死の、または死んだ細胞または細胞集団の平均値または中央値サイズであり得る。
【０１１０】
本明細書に用いられる場合、「細胞質顆粒性」は、細胞内の光学的対比／屈折率の変動の空間周波数を指す。細胞質顆粒性は、プルシアンブルーなどの色素での染色後の細胞の顕微分析により可視化され得る。それは、例えば、色素を用いることなく、フローサイトメトリにより、側方散乱パラメータによって測定することができ、その側方散乱パラメータは、細胞の内側の粒子の、跳ね返るレーザー光の量の測定値である。例えば、本明細書に記載されているような選択された宿主細胞は、対照と比較して８０％、７０％、６０％、５０％またはそれ未満である細胞質顆粒性により特徴づけられ得る。対照は、選択された宿主細胞と同じ細胞分類または細胞型の、生きている、瀕死の、または死んだ細胞または細胞集団の平均値または中央値顆粒性であり得る。細胞サイズ（ＦＳＣ）を細胞顆粒性（ＳＳＣ）で割った値の比は、生細胞について、一般的に、瀕死の、または死んだ細胞についてのＦＳＣ／ＳＳＣ値の比より１０％高く、より頻繁には、２０％、３０％、４０％、５０％、またはさらに２×、３×、４×、５×、もしくは１０×もしくはそれよりも高い。
【０１１１】
本明細書に用いられる場合、「分極率」は、外部の場に対する細胞の動力学的応答を指す。次元配向ソーターにおいて細胞を整列させるために、および／またはサイズに基づいたソーターにおいてサイズ分類された細胞を移動させるために、誘電泳動場がバイオデバイスにより適用され得る。この誘電泳動場は、それが粒子（例えば、細胞）に適用されている場合、空間的に変動し、または不均一である電場として定義することができる。正の誘電泳動は、粒子（例えば、細胞）が媒体（例えば、バッファー溶液）より分極性が高い場合に生じ、結果として、粒子がより高い電界強度の領域へ引き寄せられる。このように作動する系は、正の誘電泳動様式で作動すると言うことができる。負の誘電泳動は、粒子が媒体より分極性が低い場合に生じ、結果として、粒子がより低い電界強度の領域へ引き寄せられる。このように作動する系は、負の誘電泳動様式で作動すると言うことができる。選択されるべき細胞と同じ分類または型の生細胞（陽性対照）または死細胞（陰性対照）が、細胞が、それぞれの媒体またはバッファー条件においてどのように挙動するかを考慮に入れて系を設定するために用いられる。細胞が実験条件において分極性がより低いかまたはより高いかは、それらの状態、すなわち、生きているかまたは死んでいるかに依存する。したがって、その条件は、ポジティブ選択される細胞が、それらの分極率によって、有利な特性を有する生細胞または生細胞の亜集団のように挙動するような様式で、設定される。上記の２つの対照集団（生細胞、または瀕死および死んだ細胞）を用いて、系の設定は、第一に、死細胞の５％未満がソートされ、第二に、生細胞の５０％より多くがソートされるように、調整される。分離効率および細胞の数に依存して、瀕死または死んだ細胞を選択することについてのパーセンテージは、５％より下に低下し得、生細胞を選択することについてのパーセンテージは５０％より多くに増加し得る。
【０１１２】
細胞の「屈折率」は、どのように光または任意の他の照射が細胞を通って伝搬するかを記載する無次元数として本明細書では理解される。それは、細胞の、光を曲げる能力の測定値である。例えば、本明細書に記載されているような選択された宿主細胞について、生細胞（生細胞指数）かまたは死細胞（死細胞指数）のいずれかについての特定の屈折率が、生きているかまたは死んでいるかのいずれかである同じ分類の対照細胞に関して、実験バッファーまたは媒体条件において特徴づけられる。細胞表面の屈折率の変化により、生細胞または死細胞などの表面組成における有意な違いを有する細胞の効率的な同定および分離が可能になる。例えば、本明細書に記載されているような選択された宿主細胞は、対照（例えば、同じ分類または型の生きているまたは死んだ細胞または細胞集団の屈折率の平均値または中央値）と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％の屈折率の変化により特徴づけられ得る。
【０１１３】
用語「細胞膜電位」は、生物学的細胞の内部と外部の間の電位の差として本明細書では理解されている。細胞膜電位は、細胞の生理的状態と共にいくつかの様式で変化する。代謝エネルギーの消費が、電位を維持するために必要とされるため、傷害された、または瀕死の細胞の膜にわたる電位の大きさは減少する。より具体的には、膜電位の変化は、（細胞生存および／または細胞増殖のためにマーカー遺伝子発現を必要とする）細胞が、マーカー遺伝子発現の非存在および環境条件（例えば、抗生物質を含有し、または必須分子を欠く細胞培地条件）のせいでストレスを加えられる時に生じる。選択マーカーの非存在下での、例えば、抗生物質細胞毒性を含有する培地との細胞集団のインキュベーション前、インキュベーション後、またはインキュベーション中、生細胞集団および死細胞集団の細胞膜電位の代表的な特性が、参照特性として検出される。膜電位の変化を検出するために用いられる方法のいくつかは非破壊的であるため、そのプロセスは、細胞生存能を保存しながら、所望のマーカー遺伝子特異性を有する細胞がリッチな細胞集団を生じるための細胞ソーティングと組み合わせて用いられ得る。この検出される特性は、混合集団における個々の細胞が、生細胞か、瀕死の細胞か、または死細胞かを決定するために用いられる。例えば、本明細書に記載された、選択される宿主細胞は、細胞膜電位によって（例えば、細胞膜電位の代表的な特性によって）、有利な特性を有する生細胞または生細胞の亜集団のように挙動し得る。膜電位を測定する一つの方法は、通常の電子的細胞カウンターに利用される技術の改変を含む。これらのデバイスにおいて、食塩水に懸濁された個々の細胞は、懸濁溶液中に電流を維持する１対の電極の間に置かれたオリフィスを通過する。オリフィスを通っての細胞の通過は、溶液の伝導率を変動させ、その結果として、検出可能な電圧パルスを生じる。パルスの高さは細胞体積を示す。異なる膜電位を有する細胞の膜は、典型的には、異なるイオン伝導率を有するため、オリフィスを通過する個々の細胞の膜のイオン伝導率の変動を示す情報を含有するシグナルが、交流電流を用いて得ることができる。これらは、個々の細胞の膜電位を、例えば、波高分析器の助けを借りて、比較するために用いられ得る。細胞膜電位はさらに、例えば、パッチクランプ技術により、測定することができる。
【０１１４】
用語「細胞形状」は、細胞の輪郭または外観の空間的形を指す。例えば、本明細書に記載されているような選択された宿主細胞は、同じ分類または型の瀕死の、または死んだ細胞、または細胞集団などの対照細胞または細胞集団より、一般的に、大きいサイズおよび／またはより均一な形状を有する細胞形状により特徴づけられ得る。細胞形状は、フローサイトメトリにおいてなどのそれらの光散乱挙動のような物理的パラメータにより、またはそれらの誘電泳動力により、またはそれらの音響放射力により、決定することができる。
【０１１５】
本明細書に用いられる場合、用語「電気インピーダンス」は、中を通る電流の流れに対抗する物理的対象物の性質を指す。細胞などの生物学的物質の電気インピーダンスは、それらの状態（例えば、生細胞または死細胞）または機能に関する情報を与える。例えば、本明細書に記載されているような選択された宿主細胞は、対照とは異なる電気インピーダンスによって特徴づけられ得る。対照は、選択された宿主細胞と同じ細胞分類または型の、生きている、瀕死の、または死んだ細胞または細胞集団の電気インピーダンスの平均値または中央値であり得る。選択された宿主細胞は、対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の電気インピーダンスの差を有し得る。最初は均一の細胞集団を２つのアリコートへ分割し、一方のアリコートにおいて、細胞は生命を維持され、他方のアリコートにおいて、細胞死が誘導され、生細胞、および瀕死または死んだ細胞の電気インピーダンスの効果を、例えば、コールター型電気インピーダンス測定において、決定することができる。伝導性が低い粒子である、細胞は、伝導性マイクロチャネルの有効断面積を変化させる。これらの細胞は、周囲の液体媒体より伝導性が低いので、チャネルにわたる電気抵抗は増加し、チャネルを通過する電流を一時的に減少させ、この減少の強度が、細胞が生細胞、瀕死の細胞、または死細胞であることに相関する。電流におけるそのようなパルスをモニターすることにより、所定の体積の流体についての細胞の数が、検出され得、それらの状態が分析され得る。電流変化のサイズは、粒子のサイズに関係づけられ、粒子サイズ分布の測定を可能にし、それは、粒子の移動度、表面電荷、および濃度と相関し得る。
【０１１６】
用語「流体力学的性質」は、液体媒体において異なる運動を引き起こす、変形能、粘度、および沈降などの、細胞の水性溶媒との物理的相互作用から生じる細胞の性質を指す。流体力学的性質は、集団において生細胞を同定し、かつソートする連続的粒子分離のためのパラメータとして用いることができる。最初は均一の細胞集団を２つのアリコートへ分割し、一方のアリコートにおいて、細胞は生命を維持され、他方のアリコートにおいて、細胞死が誘導され、生きている、瀕死の、または死んだ細胞の流体力学的性質を決定し、対照値として用いることができる。一般的に、生細胞についての細胞形状は、瀕死または死んだ細胞についてより大きく、それらのサイズおよび表面外観の組合せによって、それらは、対称または非対称の液流において異なった運動をする。これは、細胞などの障害物の周りの層流の分岐を用いて、生細胞と死細胞の分離に用いることができる。例えば、本明細書に記載されているような宿主細胞は、有利な特性を有する生細胞または生細胞の亜集団の流体力学的性質を示す時、ポジティブ選択することができる。「ｐｉｎｃｈｅｄ  ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」法または「非対称ｐｉｎｃｈｅｄ  ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」法などの方法を用いて、細胞の連続的分離を達成することができる（Ｔａｋａｇｉら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ５：７７８（２００５））。ｐｉｎｃｈｅｄ  ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＰＦＦ）法は、マイクロチャネルにおける細胞の連続的サイズ分離を可能にする。この方法はまた、マイクロチャネルの内側の層流プロファイルのみを利用し、したがって、面倒な外側の場の調節を排除することができる点で有利である。より具体的に言えば、細胞有りおよび無しの液体が、ピンチ部を有するマイクロチャネルへ連続的に導入され、細胞は、流体力によって、それらのサイズに従って流れの方向に対して垂直に分離される。加えて、分離された粒子は、ピンチ部の終端に複数の分岐チャネルを作製することにより、独立して収集することができる。非対称ｐｉｎｃｈｅｄ  ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＡｓＰＦＦ）法において、マイクロチャネルが、ピンチ部の終端に非対称に配置された複数の分岐チャネルを備えている。このマイクロチャネルに関して、ピンチ部における液流は、各分岐チャネルへ非対照的に分配され、ピンチ部における１つの側壁近くでの細胞位置の差が、効果的に増幅され得る。これは、サイズが相対的に大きいピンチ部により小細胞の正確な分離を可能にする。
【０１１７】
本明細書に記載された方法により、単一細胞が、事前定義された選択パラメータを利用して、宿主細胞の物理的内因性バイオマーカーに従ってソートされる。いくつかの実施形態において、事前定義された選択パラメータは、レベルおよび量、特に閾値である。閾値は、レパートリーの他の（選択されない）細胞またはレパートリー全体との関係で決定される閾値パーセンタイルであり得る。例えば、事前定義された選択パラメータは、標的値より上、および／またはそれより下、および／またはその周辺（すなわち、標的値に最も近い）細胞のパーセンタイルを指し得、その標的値は、例えば、細胞の亜集団（例えば、対照細胞、特に、陽性対照として生細胞、または陰性対照として死細胞）または細胞集団全体（例えば、組換え宿主細胞のレパートリー全体）の中央値または平均値である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、事前定義された選択パラメータは、最小値、最大値、平均値、または中央値を指す。いくつかの実施形態において、事前定義された選択パラメータは、対照と比較した、レベル、量、範囲、または閾値である。対照は、物理的性質（例えば、細胞サイズ、顆粒性、体積、屈折率、分極率、密度、弾性、変形能、細胞膜電位、細胞形状、流体力学的性質、光散乱、誘電泳動、または磁化率）の較正値もしくは較正曲線、最小値、最大値、平均値、または中央値であり得る。事前定義された選択パラメータは、対照、例えば、選択された宿主細胞と同じ分類または型の、生細胞もしくは死細胞、またはそれぞれの細胞集団と比較した、相対値であり得る。事前定義された選択パラメータはまた、生細胞の集団、または閾値パーセンタイル内の細胞集団（例えば、標的値、例えば、物理的性質の平均値または中央値に最も近い細胞の１０パーセンタイル）などのある特定の特性を有する細胞集団についての領域、範囲、またはゲートを指し得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、事前定義された選択パラメータは、１０パーセンタイル、２０パーセンタイル、３０パーセンタイル、４０パーセンタイル、５０パーセンタイル、６０パーセンタイル、７０パーセンタイル、８０パーセンタイル、または９０パーセンタイルスコアのいずれか一つのパーセンタイルスコアである。実例として、スコアが９０パーセンタイルにあるならば、それは、９０％のその他のスコアより高い。いくつかの実施形態において、事前定義された選択パラメータは、最良のヒットと定義される細胞のパーセンテージであり、例えば、事前定義された選択パラメータに最良にマッチする、細胞の５％もしくは１０％、または２０％の最良ヒット、またはスコアシステムにより決定された場合、３０％である。スコアは、１つまたは複数の細胞内因性物理的性質に基づき得る。いくつかの実施形態において、スコアは、細胞サイズおよび細胞顆粒性（例えば、最小、最大、または平均の細胞サイズ／細胞顆粒性）に基づいている。
【０１２０】
細胞内因性物理的性質、すなわち物理的外観を測定するためのいくつかの方法は、当技術分野において知られており、それには、マイクロスケールフィルター、流体力学的濾過、決定論的横置換、フィールドフローフラクショネーション、微細構造、慣性マイクロ流体力学、重力、生物模倣型マイクロ流体力学、磁気泳動、水性二相系、音響泳動、誘電泳動、光学、液滴に基づいたマイクロ流体力学、ラマン活性化技術、フローサイトメトリ方法が含まれるが、それらに限定されない。
【０１２１】
本明細書に記載された方法において、単一細胞は、光学的なフローサイトメトリ方法もしくはマイクロ流体システム、例えば、液滴に基づいたマイクロ流体力学もしくはラマン活性化細胞ソーティングを用いて、または音響放射力を加えて、サイズ、形状、体積、密度、弾性、流体力学的性質、分極率、光散乱、誘電泳動、および磁化率を含む細胞の性質における物理的違いに従って、ソートすることにより、選択することができる。
【０１２２】
細胞は、誘電分離方法において、例えば、別個だが局所的非対称の三角形底部微小電極の周期的アレイおよび連続的な最上部電極を利用することにより発生する３次元（３Ｄ）不均一電場で、分離することができる（Ｌｉｎｇら、Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ａｒｒａｙ；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４（１５）、ｐｐ  ６４６３〜６４７０（２０１２））。微小電極の中を通り抜けると、異種性細胞は、３Ｄ不均一な電場に応答して、電気的に分極されて、異なる強さの正の誘電泳動力を経験する。より強い正の誘電泳動を経験する細胞は、液流に対して垂直方向にさらに流れ出て、弱い正の誘電泳動を経験する細胞が残り、その細胞は、本質的には層流の流線に沿って微小電極アレイを通り抜け続ける。
【０１２３】
流体に懸濁された細胞が超音波および圧力振幅に曝された時、それらは音響放射力を経験する。この力を利用する粒子の分離は、マイクロ流体チャネルの横断面にわたって定在波を発生させることにより達成することができる（Ｇｏｓｓｅｔｔら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ：３９７：３２４９〜３２６７（２０１０））。この設定において、流体が、チャネルを通して、細胞を運ぶ間、放射力が細胞を、定在波の波節か波腹のいずれかへと押す。音響放射力の強さは、３つの異なる性質：細胞の体積、細胞と流体の相対的密度、および細胞と流体の相対的圧縮率に依存する。音響力は、異なる密度を有する細胞について反対符合を有し得る。これらの細胞は、チャネルの異なる部分：波節（高密度細胞）または波腹（低密度細胞）に引き寄せられるだろう。典型的には、絞り込まれた細胞は、中心にある出口を通って収集され、一方、他の粒子は、他の出口から出て行く。
【０１２４】
ラマン分析は、標識の必要なしに、単一細胞全体の化学的フィンガープリントを取得して、単一細胞の遺伝子型、生理的状態、および代謝産物変化などの細胞性質を迅速に同定するための非侵襲性方法である。標的とされた細胞／粒子の情報は、ラマンスペクトルにより同定および分析することができ、ラマン分光法データは、自動的に分析され得、かつ細胞をソートするためのスイッチングデバイスは、コンピュータにより制御され得る。特定の細胞は、光場、磁場、または電場を含む技術的手段を用いて制御され得、細胞は、マイクロ流体デバイスにより異なるマイクロ流体チャネルへソートされ得る。したがって、それは、瀕死の、または死んだ細胞の集団から個々の生きている細胞を単離するのによく適している。
【０１２５】
連続的マイクロ流体力学とは対照的な、マイクロ流体力学のサブカテゴリーとしての液滴に基づいたマイクロ流体力学は、低いレイノルズ数および層流型を有する不混和相において異なる体積の流体を操作する特徴を有する。微小滴は、微量体積の流体を都合よく扱う実行可能性を与え、より良い混合をもたらし、ハイスループット実験に適している。液滴に基づいたマイクロ流体力学の主要な利点の一つは、単一細胞についてのインキュベーターとして液滴を用いる能力である。１秒あたり数千個の液滴を発生させる能力があるデバイスは、特定の時点で測定される特定のマーカーもしくは内因性細胞性質に基づいて、またはタンパク質分泌もしくは酵素活性もしくは増殖などの細胞の動態学的挙動にも基づいて、細胞集団を特徴づける新しい道を切り開く。
【０１２６】
フローサイトメトリを用いる場合、細胞は、ＦＳＣおよび／またはＳＳＣプロットに基づいて、ゲートを利用してソートおよび選択され得る。当業者は、一般的なＦＡＣＳ技術を利用することができ、例えば、生細胞の集団を用い、ゲートをそれらの周囲に定義する。その時、瀕死の、または死んだ細胞の集団を用いて、それらの細胞が「生きている」ゲート内には存在しない（またはまさしく偶然にも、存在する）というゲート設定を確認することができる。したがって、分析およびソートされるべき試料において、生きている細胞は、事前定義されたゲートの中へ入り、一方、死んだ、または瀕死の細胞は、このゲートの外側にあり、捨てられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているような宿主細胞は、それが、生細胞についてのゲート内に、または有利な特性を有する生細胞集団の範囲内に入るならば、選択される。そのような特性は、細胞サイズおよび／または細胞顆粒性（ＦＳＣ／ＳＳＣ）についてのより狭い範囲を定義する、生細胞ゲート内の特定のサブゲートであり得る。生細胞ゲート内の異なる狭いサブゲートによりソートされた細胞のタンパク質生産特性を評価することは、最も生産性の高い細胞がより高い頻度で見出すことができる、特定のサブケートを同定する可能性がある。
【０１２７】
例えば、ソートされるべき細胞（目的の集団）の選択は、健康に増殖する対照集団と同じ、ＦＳＣ／ＳＳＣプロットにおけるゲート内にあり得る。餓死寸前または瀕死の細胞は、より低いＦＳＣおよびより高いＳＳＣ領域へシフトされ得、したがって、主にソートゲートの外側に見出される。宿主細胞のレパートリーについてのゲートを設定することについて、同じ型（ただし、トランスフェクトされていない、またはニセの形質転換体だけ）の宿主細胞株の２つの対照または標準集団（１つが健康、１つが瀕死）が必要とされる。（下記の本実施例に用いられているような）Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩフローサイトメーターについての典型的な設定において、電圧設定は、ＦＳＣ−Ａについて１４０Ｖ、およびＳＳＣ−Ａについて２５０Ｖである。ＦＳＣ／ＳＳＣプロット（ｘ軸にＦＳＣ−Ａ、ｙ軸にＳＳＣ−Ａ）において、非対称の生細胞ゲートは、ＦＳＣにおいて６０〜２５０単位の間、ＳＳＣにおいて１０〜１５０単位の間であり、左底部側で狭く始まって、右上部側へと広くなっていく。一般的に、ソートされるべき生細胞は、ＦＳＣ−Ａについて約１１０％またはそれよりも高い値、ＳＳＣ−Ａについてたった９０％またはそれ未満の値（細胞片を除く）を示す。
【０１２８】
本明細書に用いられる場合、用語「単離すること」は、細胞の混合物または収集物から単一細胞を放出し、かつ取得する過程として定義される。その時、単離された細胞は、それの最初の環境、例えば、細胞培養物、発現構築物をトランスフェクトされた宿主細胞のレパートリー、前記宿主細胞のレパートリーの画分（例えば、薬剤に対して抵抗性の事前選択された細胞の画分）、またはそれらの細胞内因性性質、特にそれらの物理的外観に基づいて選択された細胞のプールから分離される。本明細書に記載された単離手順は、物理的外観によるソーティングにより選択された単一細胞の単離を含み得る。
【０１２９】
本明細書に記載される場合、用語「目的の遺伝子」またはＧＯＩは、ＰＯＩをコードする核酸またはポリヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列を指す。遺伝子は、具体的には、イントロンもしくはオープンリーディングフレームを含む野生型遺伝子、またはコドン最適化もしくは変異型遺伝子であり得る。
【０１３０】
本明細書に記載される場合、用語「目的のタンパク質」またはＰＯＩは、宿主細胞において組換えテクノロジーを用いて生産されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。より具体的には、そのタンパク質は、宿主細胞において天然では存在しないポリペプチド、すなわち、異種性タンパク質か、でなければ、宿主細胞にとって本来のもの、すなわち、宿主細胞にとって同種のタンパク質であり得るが、例えば、ＧＯＩの１つもしくは複数のコピーの組換え細胞のゲノムへの組換え技術による、またはＰＯＩをコードする遺伝子の発現を調節する１つもしくは複数の制御配列、例えば、プロモーター配列の組換え改変による組込みで、生産されるかのいずれかであり得る。場合によっては、本明細書に記載される場合、ＰＯＩという用語は、組換え的に発現したタンパク質により媒介されるような、組換え細胞による任意の代謝産物も指す。
【０１３１】
ＰＯＩは、任意の真核生物、原核生物、または合成のポリペプチドであり得、特に、宿主細胞にとって異種性である。それは、好ましくは治療的、予防的、診断的、分析的、または産業的使用のための、分泌型タンパク質または細胞内タンパク質であり得る。
【０１３２】
具体的には、本明細書に記載されているようなＰＯＩは、真核生物タンパク質、好ましくは哺乳類タンパク質、具体的には、宿主細胞にとって異種性の哺乳類またはヒトタンパク質である。
【０１３３】
具体的には、ＰＯＩは、例えば、共有結合性（例えば、結合性架橋またはジスルフィド連結を介して）または非共有結合性に連結された、ポリペプチド鎖のホモマーまたはヘテロマーを含む、単一鎖または多重鎖タンパク質である。
【０１３４】
本発明の一態様によれば、ＰＯＩは、好ましくは治療用タンパク質から選択される、組換えまたは異種性タンパク質であり、それには、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、糖質−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、制御タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモンおよびサイトカイン、またはＰＯＩの代謝産物が含まれる。
【０１３５】
好ましい生産されたタンパク質の例は、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、アプロチニン、組織因子経路インヒビターもしくは他のプロテアーゼインヒビター、およびインスリンもしくはインスリン前駆体、インスリン類似体、成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、トランスフォーミング成長因子ａもしくはｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、ＧＲＰＰ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、血小板由来成長因子１、血清アルブミン、リパーゼもしくはプロテアーゼなどの酵素、または天然タンパク質と類似した機能を有する、機能的相同体、機能的等価バリアント、誘導体、および生物学的活性断片である。
【０１３６】
ＰＯＩは、天然（野生型）タンパク質であり得、または天然タンパク質と構造的に類似し得、天然タンパク質のＣ末端およびＮ末端の一方もしくは両方、または側鎖への１個または複数のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列における１つまたはいくつかの異なる部位における１個または複数のアミノ酸の置換、天然タンパク質の一方もしくは両方の末端、またはアミノ酸配列における１つもしくはいくつかの部位における１個または複数のアミノ酸の欠失、あるいは、天然アミノ酸配列における１つまたは複数の部位における１個または複数のアミノ酸の挿入により天然タンパク質から誘導され得る。そのような改変は、上記で言及されたタンパク質のいくつかについてよく知られている。
【０１３７】
ＰＯＩはまた、宿主細胞において生化学的反応を提供する基質、酵素、インヒビター、または補因子から、前記生化学的反応の生成物またはいくつかの反応のカスケードを得ること、例えば、宿主細胞の代謝産物を得ることを目的として、選択される。例示的な生成物は、リボフラビンなどのビタミン、有機酸、およびアルコールであり得、それらは、本発明による組換えタンパク質またはＰＯＩの発現後に、増加した収量で得ることができる。
【０１３８】
本発明により生産されたＰＯＩは、多量体タンパク質、好ましくは二量体または四量体であり得る。
特定のＰＯＩは、抗体またはその断片などの抗原結合性分子である。本明細書に用いられる場合、用語「抗体」は、その抗原結合性断片、またはそのような抗体のドメインを常に含むものとする。特定のＰＯＩの中では、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）もしくは免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）などの抗体、または抗原結合性断片（Ｆａｂ）、Ｆｄ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などのそれらの断片、または、例えば、Ｆｖ二量体（ダイアボディ）、Ｆｖ三量体（トリアボディ）、Ｆｖ四量体などのその操作されたバリアント、またはＶＨもしくはＶＨＨもしくはＶ−ＮＡＲのようなミニボディおよび単一ドメイン抗体である。
【０１３９】
一実施形態によれば、ＰＯＩは、「難発現性」タンパク質であり、本明細書では、「難ＰＯＩ」とも呼ばれ、それは、異種性発現系において発現するのが難しいことを意味する。そのようなタンパク質は、典型的には、そのタンパク質を機能的にするために、１つより多いポリペプチド鎖の発現、および／または宿主細胞による特異的なフォールディング、および／または翻訳後修飾、例えば、グリコシル化もしくはリン酸化を必要とする。宿主細胞において、コドン使用頻度、翻訳速度、および酸化還元電位などの因子は、そのような難ＰＯＩを発現するそれの能力に著しい影響を生じ得る。例示的な難ＰＯＩは、抗体、ウイルスエンベロープタンパク質、サイトカイン、細胞表面受容体、またはそれらの部分からなる群から選択される。
【０１４０】
本明細書に用いられる場合、用語「組換え」は、「遺伝子操作により調製されること、またはその結果」を意味するものとする。したがって、「組換え核酸」は、通常天然では見出されない形への核酸の操作によりインビトロで形成された核酸を指す。「組換えタンパク質」は、それぞれの組換え核酸を発現することにより産生される。「組換え細胞」は、具体的には、少なくとも１つの組換え核酸配列を含有するように遺伝子操作されている。「組換え宿主細胞」は、異種性核酸配列を含む宿主細胞であり、典型的には、発現構築物で形質転換されて、組換えになっている。
【０１４１】
本明細書に用いられる場合、用語「レパートリー」は、同じ発現構築物、すなわち、同じＧＯＩおよび／または選択マーカーを宿主細胞株にトランスフェクトしたことから生じ、かつ少なくとも１つの遺伝的特性において異なる、多様な宿主細胞の混合物または収集物を指す。宿主細胞のレパートリーのメンバーは、全て同一であることはなく、レパートリー内において、例えば、（ｉ）ＧＯＩおよび／または選択マーカーのコピー数、（ｉｉ）ＧＯＩおよび／または選択マーカーの染色体への組込みの部位、（ｉｉｉ）遺伝的安定性、ならび
に（ｉｖ）エピジェネティック的安定性の任意の１つ、または少なくとも１つにより、区別することができる。
【０１４２】
例えば、宿主細胞のレパートリーは、様々なコピー数、例えば、１〜５００のコピー数の範囲内で異なる、例えば、平均して、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００の発現カセットもしくは構築物を有する宿主細胞を含み得、または５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、もしくは５００の少なくともいずれか一つのコピー数を有する細胞の画分（または収集物）を含み得る。
【０１４３】
レパートリーは、例えば、１〜１００個の範囲のいくつかの異なる部位、例えば、１〜５個もしくは１〜２０個の異なる遺伝子座、例えば、平均して、１個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個の異なる遺伝子座で組み入れられた１つもしくは複数の発現カセットもしくは発現構築物を有する宿主細胞を含み得、または宿主細胞において１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個の少なくともいずれか一つの異なる染色体部位を有する細胞の画分（または収集物）を含み得る。
【０１４４】
レパートリーは、例えば、様々な遺伝的安定性を有する宿主細胞を含み得る。本明細書に用いられる場合、「遺伝的安定性」は、組換え核酸の維持、特に、細胞培養において所定の期間にわたって宿主細胞へ組み入れられた発現構築物の数の維持を指す。それゆえに、様々な遺伝的安定性を有する宿主細胞のレパートリーは、５〜７０世代の範囲内、したがって、世代時間のそれぞれの多重度を反映する期間、例えば、平均して５世代、１０世代、２０世代、３０世代、４０世代、５０世代、もしくは７０世代の間、それらの組換え核酸を維持する宿主細胞を含み、または１０世代、２０世代、３０世代、４０世代、５０世代、もしくは７０世代の少なくともいずれか一つである細胞の画分（もしくは収集物）を含み得る。
【０１４５】
本明細書に用いられる場合、用語「エピジェネティック的安定性」は、ＰＯＩをコードするｍＲＮＡおよびマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡについての転写レベルが、最初の１０世代または２０世代の間のそれらのレベルを２０世代、または４０世代、または７０世代後のそれらのレベルと比較して、有意には変化しない（例えば、＋／−５０％未満、または＋／−４０％未満、または＋／−３０％未満、または＋／−２０％未満、または＋／−１０％の変動）ことを決定する、発現遺伝子座のエピジェネティック的安定性を指すものとする。これは、ＧＯＩ転写産物についてのｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、かつそれを、Ｒｐｓ２１のようなハウスキーピング遺伝子についてのｍＲＮＡレベルに対して正規化することにより、決定することができる。
【０１４６】
宿主細胞のレパートリーは、組換え核酸のランダム組入れかまたは部位特異的組入れかのいずれか、例えば、相同組換え、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いる部位特異的遺伝子座への標的化遺伝子組込みにより得られる。本明細書に用いられる場合、宿主細胞のレパートリーは、発現構築物で成功裏にトランスフェクトされ、かつ生産用細胞株の開発におけるその細胞の使用に適している細胞の特定の有益な特徴により特徴づけられる細胞集団全体を指す。
【０１４７】
宿主細胞のレパートリーが、１つまたは複数のＧＯＩ発現カセットを含み、選択マーカー遺伝子がそのＧＯＩに作動可能に連結されている発現構築物を組み入れることにより得られる場合、発現構築物は、様々な染色体遺伝子座および／または様々なコピー数で組み入れることができる。この場合、ＧＯＩと選択マーカーの発現は、事前定義された率であり得る。したがって、選択マーカーの発現レベルは、ＧＯＩ発現レベル、およびＰＯＩ生産用宿主細胞の生産性を示し得る。
【０１４８】
宿主細胞のレパートリーが、規定数の選択マーカー発現カセット、および非依存的に１つまたは複数のＧＯＩ発現カセットを含む１つの発現構築物を組み入れることにより得られる場合、選択マーカー発現は、構築物の宿主細胞染色体への移入の成功を示し得る。選択マーカーの発現とＰＯＩの発現の比率があらかじめ定められているか、または変化するかに依存して、選択マーカーは、同様に、ＧＯＩ発現のレベルを示すことができるか、またはできないかである。
【０１４９】
宿主細胞のレパートリーが、ＧＯＩ発現カセットを含む発現構築物を組み入れ、かつ別々に、選択マーカー発現カセットを含む発現構築物を組み入れることにより得られる場合、宿主細胞のレパートリーは、様々なコピー数で、様々な染色体遺伝子座に組み入れられた、その２つの発現構築物の一方かまたは両方のいずれかを有する宿主細胞を含み得る。この例示的な場合、ＧＯＩの発現と選択マーカー遺伝子の発現は相関していない。
【０１５０】
「選択可能マーカー遺伝子」または「選択マーカー遺伝子」は、その遺伝子を発現する生物体が選択条件下で生存するのを可能にする表現型を与える遺伝子を指す。遺伝子は、具体的には、選択マーカーをコードし、イントロンを含む野生型遺伝子、またはコドン最適化もしくは変異遺伝子であり得る。
【０１５１】
細胞は、それらが、特定の因子の欠乏を克服する能力があるならば、またはそれらが、薬剤の、抵抗することができなかったなら有害な効果に抵抗することができるならば、選択条件下で増殖することができる。選択条件下で増殖する細胞（本明細書では、「選択抵抗性細胞」または単に、「抵抗性細胞」とも呼ばれる）は、代謝機能の欠損を補い、または薬剤、例えば、抗生物質の存在にも関わらず成長する性質を有し得る。例えば、選択マーカー遺伝子は、そうでなければ細胞を死滅させるであろう、薬剤の存在下で成長する能力を与える１つまたは複数の遺伝子を含み得る。さらなる例によれば、選択抵抗性細胞は、特定の栄養分の非存在下で成長する能力、例えば、欠損し、かつ形質転換されていない細胞によって産生され得ない必要な栄養分に欠けた培地で成長する能力、または欠損し、かつ形質転換されていない細胞により使用／代謝され得ない培地、例えば、エネルギー源上で成長する能力を有し得る。
【０１５２】
したがって、選択マーカー遺伝子には、薬剤、例えば、抗生物質に対する抵抗性を与える１つまたは複数の遺伝子（以下、「抗生物質抵抗性マーカー遺伝子」と呼ばれる）、および代謝機能を与えるマーカー遺伝子（以下、「代謝機能マーカー遺伝子」と呼ばれる）が含まれる。
【０１５３】
抗生物質抵抗性マーカー遺伝子の場合、この遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされている細胞のみが、対応する抗生物質の存在下で成長することができ、それゆえに、選択される。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの発現した抗生物質抵抗性遺伝子の存在について選択するために、好ましくは、抗生物質ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）が培地添加物として用いられる。
【０１５４】
真核細胞についての遺伝子マーカーとして用いることができる例示的な抗生物質抵抗性マーカー遺伝子には、（ｉ）ネオマイシン（Ｇ４１８）、ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ（フラミセチン）、シソマイシン、アミカシン、およびイセパマイシン、およびハイグロマイシンＢに対する抵抗性を与える遺伝子などの任意のアミノグリコシド抵抗性マーカー遺伝子；（ｉｉ）ピューロマイシンに対する抵抗性を与える遺伝子；（ｉｉｉ）ブレオマイシン、好ましくはブレオマイシン、フィレオマイシン、もしくはＺｅｏｃｉｎに対する抵抗性を与える遺伝子；（ｉｖ）ブラストサイジン；または（ｖ）ミコフェノール酸が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５５】
本明細書に記載された方法によれば、選択条件は、対応する選択マーカー遺伝子産物を宿主細胞へ導入するための発現構築物でのトランスフェクション後の、細胞培地への抗生物質の添加で得られる。組換え宿主細胞への遺伝子移入の成功を示す抗生物質抵抗性についてのそのような選択の方法は、当技術分野においてよく知られており、標準実験マニュアルに十分記載されている。本明細書に記載されているような宿主細胞のレパートリーは、選択マーカー遺伝子およびＧＯＩを発現する選択条件下で、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、または最長１２日間までの少なくともいずれか一つの間、成長する（例えば、抗生物質の存在下で）。あるいは、本明細書に記載された宿主細胞のレパートリーは、最長で７日間、６日間、５日間、３日間、２日間、または１日間のいずれか一つの間、培養または維持条件下（例えば、抗生物質の存在下で抗生物質選択マーカー遺伝子およびＧＯＩを発現する選択条件下）に置かれる。
【０１５６】
特定の実施形態によれば、宿主細胞のレパートリーが最初、調製され、その後、そのプールにおいて、例えば、プール内の細胞の７０％、８０％、または９０％より多くが死滅するような抗生物質をプール培地に加えることにより、抗生物質選択圧下に置かれる。その後、抗生物質選択圧は、例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、または６日間の抗生物質選択圧後、プール培地を交換または希釈することにより、除去される。その後、単一細胞ソーティングが、低い抗生物質選択圧下で、または抗生物質選択圧なしで、実施される。
【０１５７】
以下において、抗生物質抵抗性遺伝子を有する細胞についての様々な抗生物質および選択条件が記載されている。
アミノグリコシド系抗生物質は、グリコシド結合を介して、その分子の他の半分に連結された少なくとも１つのアミノ−ピラノースまたはアミノ−フラノース部分を含む。それらの抗菌効果は、タンパク質合成の阻害に基づいている。アミノグリコシド抵抗性遺伝子は、真核細胞の分子生物学において一般的に利用され、多くの標準テキストブックおよび実験マニュアルに記載されている。アミノグリコシド抵抗性遺伝子産物は、それのアミノグリコシド分解活性を考慮して、機能性遺伝子産物であると報告されている。したがって、アミノグリコシド抵抗性マーカー遺伝子はさらに、既知のアミノグリコシド抵抗性遺伝子の機能的バリアント、すなわち、アミノグリコシド分解活性を有するバリアント型抵抗性マーカー遺伝子の遺伝子産物を含む。
【０１５８】
アミノグリコシドは、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度、最も好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｍｌの濃度で利用することができる。さらなる特に好ましい実施形態において、アミノグリコシドは、１０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの濃度、好ましくは１〜４ｍｇ／ｍｌの濃度で利用される。ハイグロマイシンＢは、アミノグリコシド系抗生物質であり、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの濃度で利用される。
【０１５９】
ピューロマイシンは、抗生物質であり、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で利用される。ブレオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、およびフレオマイシンは、グリコペプチド系抗生物質であり、以下のように利用される：ブレオマイシンは、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で利用される。Ｚｅｏｃｉｎは、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で利用される。フレオマイシンは、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの濃度で利用される。ブラストサイジンは、少なくとも２μｇ／ｍｌ、好ましくは２μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で利用されるヌクレオシド系抗生物質である。ミコフェノール酸は、少なくとも２５μｇ／ｍｌの濃度で利用される。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、Ｔｎ５由来のｎｅｏはアミノグリコシダーゼ３’−ホスホトランスフェラーゼ、ＡＴＰ  ３’ＩＩをコードする）、ＫａｎＭＸ（アシュビア・ゴシッピー（Ashbya gossipii）由来のＴＥＦプロモーターの調節下での細菌アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼからなるハイブリッド遺伝子）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ブレオマイシン抵抗性遺伝子、ストレプトベルティシリウム種（Streptoverticillum sp）由来のｂｌｓ（アセチルトランスフェラーゼ）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）由来のｂｓｒ（ブラストサイジン−Ｓデアミナーゼ）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のＢＳＤ（別のデアミナーゼ）、およびストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス（Streptoalloteichus hindustanus）（ＳＨ）ｂｌｅ遺伝子、または上記に列挙された遺伝子の機能性バリアントである。
【０１６１】
好ましくは、本発明による抵抗性遺伝子産物は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（「Ｎｅｏｒ」として一般的に知られる抵抗性遺伝子）である。Ｇ４１８（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｂｓｔｒａｃｔｓ登録番号４９８６３−４７−０により定義されているような、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ）またはネオマイシンでの選択が、ネオマイシン抵抗性遺伝子産物を発現する細胞を選択するために用いられ得る。
【０１６２】
例示的な代謝機能マーカー遺伝子には、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ヒスチジノールＤ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、およびシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡ）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１６３】
代謝機能マーカー遺伝子は、顕性または潜性マーカー遺伝子であり得る。潜性マーカー遺伝子は、選択下の活性が欠損している特定の宿主を必要とする。顕性マーカー遺伝子は、宿主には依存せずに機能する。
【０１６４】
いくつかの潜性代謝機能マーカー遺伝子は、サルベージ経路ピリミジンまたはプリン生合成に関与する。ピリミジンまたはプリンのデノボ生合成が阻害される時、細胞は、ヌクレオシド前駆体のそれぞれのヌクレオチドへの変換に必要なそれぞれの酵素（例えば、チミジンキナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはアデノシンキナーゼ）を用いるサルベージ経路を利用することができる。これらのサルベージ経路は、プリンおよびピリミジンのデノボ生合成が機能しうる時、細胞成長に必要とされない。サルベージ経路酵素が欠損した細胞は、正常な成長条件下で生存できるが、プリンまたはピリミジンのデノボ生合成を阻害する薬剤の添加により、サルベージ経路が必須になるため、欠損した細胞の死が生じる。
【０１６５】
例えば、チミジンキナーゼ陰性細胞には、チミジンキナーゼ選択マーカー遺伝子をトランスフェクトすることができる。これらの細胞を選択条件下、例えば、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼを阻害し、したがって、チミジン一リン酸のデノボ合成をブロックする、メトトレキサートまたはアミノプテリンを含有する培地中で成長させた場合、成功裏にトランスフェクトされている、すなわち、チミジンキナーゼマーカー遺伝子を含有する細胞が生存し、それを選択することができる。チミジンキナーゼについての選択条件を提供する一般的に用いられる培地はＨＡＴ培地であり、それは、ヒポキサンチンアミノプテリンおよびチミジンを含有する。チミジンキナーゼについてのそのような選択培地は、通常、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン、および３μＭグリシンを追加した完全培地である。
【０１６６】
大腸菌ＸＧＰＲＴを産生する細胞は、キサンチンからキサンチン一リン酸（ＸＭＰ）を経由してグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）を合成することができる。ＸＧＰＲＴ選択マーカーでのトランスフェクション後、ＸＧＰＲＴを産生する生存細胞は、プリンヌクレオチドデノボ合成をブロックするインヒビター（アミノプテリンおよびミコフェノール酸）を含有する培地においてグアニンヌクレオチド形成についての唯一の前駆体としてのキサンチンを用いて選択的に成長することができる。そのような選択培地は、一般的に、透析されたウシ胎仔血清、２５０μｇ／ｍｌキサンチン、１５μｇ／ｍｌヒポキサンチン、１０μｇ／ｍｌチミジン、２μｇ／ｍｌアミノプテリン、２５μｇ／ｍｌミコフェノール酸、および１５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミンを含有する。
【０１６７】
シトシンデアミナーゼは、非哺乳類酵素であり、シトシンおよび５−フルオロシトシンの脱アミノを触媒して、それぞれ、ウラシルおよび５−フルオロウラシルを形成する。ピリミジンデノボ合成経路の阻害は、細胞が、ピリミジン追加物のウラシルへのシトシンデアミナーゼによる変換に依存する条件を生み出す。したがって、シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現する細胞のみが、通常１ｍＭ  Ｎ−（ホスホンアセチル（phosphonacetyl））−Ｌ−アスパラギン酸、１ｍｇ／ｍｌイノシン、および１ｍＭシトシンを含有するそれぞれの選択培地において救出され得る。
【０１６８】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は、セリンからグリシンの生合成、デオキシウリジン一リン酸からチミジン一リン酸の生合成、およびプリンの生合成に必要とされる。ＤＨＦＲ欠損細胞は、チミジン、グリシン、およびヒポキサンチンの添加を必要とし、それらが機能性ＤＨＦＲ遺伝子を獲得しない限り、添加されるヌクレオシドの非存在下で成長しない。葉酸類似体である、メトトレキサート（ＭＴＸ）、は、ジヒドロ葉酸レダクターゼと結合して、それを阻害し、したがって、曝露された細胞の細胞死を引き起こす。増加したレベルのＤＨＦＲを含有することを生存細胞に要求する、増加性または高いＭＴＸ濃度（例えば、０．０１〜３００μＭ  ＭＴＸ）を用いて、細胞は成長について選択される。
【０１６９】
グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）は、グルタメートおよびアンモニアからのグルタミンの生合成に関与する酵素である。この酵素反応は、哺乳類細胞においてグルタミン形成のための唯一の経路を提供する。成長培地におけるグルタミンの非存在下で、ＧＳ酵素は、培養中の哺乳類細胞の生存に必須である。マウスミエローマ株などのいくつかの哺乳類細胞株は、添加されるグルタミンなしで生存するのに十分なＧＳを発現しない。これらの細胞株に関して、トランスフェクトされたＧＳ遺伝子は、グルタミンを含まない培地において成長を可能にすることにより、選択マーカーとして機能することができる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株などの他の細胞株は、外因性グルタミンなしで生存するのに十分なＧＳを発現する。これらの場合、ＧＳインヒビター、例えば、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸは、１０μＭ〜７０μＭの間の濃度で用いられる）が、追加のＧＳ活性を有するトランスフェクタントのみが生存することができるように、内因性ＧＳ活性を阻害するために用いることができる。したがって、ＧＳは、（ｉ）遺伝子が天然で欠損している、もしくは遺伝子の除去による、ＧＳ欠損宿主細胞においてか、または（ｉｉ）ＧＳ機能を有する細胞およびＧＳインヒビターにおいてかのいずれかで、グルタミンなしの培地を用いて、選択マーカーとして用いることができる。
【０１７０】
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）は、事実上全ての哺乳類細胞において存在し、細胞成長のための必須酵素ではない。ＡＤＡは、細胞毒性アデノシンヌクレオシドのそれらのそれぞれの無毒性イノシン類似体への不可逆的変換を触媒する。アデノシン、または９−Ｄ−キシロフラノシルアデニン（ＸｙｌＡ）などの細胞毒性アデノシン類似体の細胞毒性濃度の存在下で増殖する細胞は、ＡＤＡにその細胞毒性物質を解毒することを要求する。ＡＤＡの密着結合遷移状態類似インヒビターである、２’−デオキシコホルマイシン（ｄＣＦ）を、ＡＤＡ遺伝子の増幅について選択するために、０．０１〜０．３μＭ  ｄＣＦの濃度を用いて、使用することができる。ＡＤＡについての選択培地として、１０μｇ／ｍｌチミジン、１５μｇ／ｍｌヒポキサンチン、４μＭ  ９−β−Ｄ−キシロフラノシルアデニンを含有する培地を用いることができる。
【０１７１】
サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）遺伝子ｈｉｓＤは、ヒスチジノールのアミノ酸ヒスチジンへの変換を触媒するタンパク質ヒスチジノールデヒドロゲナーゼをコードする。ヒスチジノールは、哺乳類細胞に対して毒性であるが、一方、ヒスチジンは哺乳類必須アミノ酸である。それゆえに、ヒスチジンの代わりにヒスチジノールを含有する培地での培養における成長選択は、ヒスチジン飢餓とヒスチジノール中毒の両方によって起こる。典型的な選択条件は、１ｍＭ  Ｎ−（ホスホンアセチル（phosphonacetyl））−Ｌ−アスパラギン酸、１ｍｇ／ｍｌイノシン、および１ｍＭシトシンを含有する培地により提供される。
【０１７２】
選択条件はまた、用いられる選択可能マーカー遺伝子が増幅可能な選択可能マーカー遺伝子である場合には、選択可能マーカー遺伝子の増幅を引き起こし得る。例えば、メトトレキサートは、ＤＨＦＲ遺伝子を増幅するのに適する選択培地である。２’−デオキシコホルマイシン（ｄＣＦ）は、ＡＤＡ遺伝子を増幅するのに用いることができる。
【０１７３】
用語「高い選択圧」は、高ストリンジェント性下、例えば、培地における非常に高い抗生物質濃度（例えば、１ｍｌの培地あたり少なくとも１ｍｇ  Ｇ４１８）下での選択を意味する。高ストリンジェント性は、トランスフェクションを受けている細胞の９０％より多く、好ましくは９９％より多く、さらにより好ましくは９９．９％より多く、最も好ましくは９９．９９％より多くを除去し、死滅させ、区別可能にし、または選択可能にする淘汰圧を意味し、その結果、その残りの少量の画分が、最も高い発現レベルを有する成功裏にトランスフェクトされたクローンを表す。最も好ましくは、生存細胞またはロバストな細胞のレパートリーを得るために３日未満内に、淘汰圧が、トランスフェクト細胞に用いられる。いくつかの実施形態において、細胞のレパートリーは、トランスフェクタントを高い選択圧に曝した後すぐに、単一細胞について選択され、その単一細胞ソーティングに続いて、低い選択圧下または選択圧なしで、ソートされた細胞の培養が行われ、すなわち、ソートされた細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも３０％、または少なくとも２０％、または少なくとも１０％、または少なくとも１％が、選択圧の下で生き残る。
【０１７４】
「形質転換」および「トランスフェクション」は、ＤＮＡを細胞へ導入する過程を指すために交換可能に用いられる。
本明細書に記載された方法によれば、発現構築物は、宿主細胞の染色体へ組み入れられ、それにより、宿主細胞のレパートリーが得られる。発現構築物は、それにより、ランダムに組み入れられ得るか、または特定の部位に組み込まれ得るかのいずれかである。
【０１７５】
用語「ランダムに組み入れられる」は、染色体の不特定の部位での、すなわち、特定部位での方向づけられた組込みなしでの、核酸の組込みを指す。
本明細書に用いられる場合、用語「部位特異的組込み」は、染色体の具体的に選ばれた部位での核酸の、方向づけられた組入れを指す。例えば、部位特異的組込みは、相同組換えにより、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、達成することができる。具体的な例は、当技術分野においてよく知られた部位特異的組換えシステムを利用する。Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えは最も広く用いられる部位特異的組換えシステムであるが、Ｆｌｐ−ＦＲＴ組換えシステム、Ｄｒｅ−ｒｏｘ組換えシステム、ＰｈｉＣ３１−ａｔｔＰ／ａｔｔＢまたは別のファージインテグラーゼなどの他のシステムが用いられ得る。
【０１７６】
本明細書に用いられる場合、用語「相同組換え」は、染色体またはゲノム上の特定の遺伝子を人工的に改変する遺伝子ターゲティング手段を指す。染色体上の標的配列と相同な部分を有するゲノム断片が細胞へ導入された場合、その用語は、導入されたゲノム断片と、染色体上のそれに対応する遺伝子座との間のヌクレオチド配列相同性に基づいて起こる組換えを指す。
【０１７７】
本明細書に用いられる場合、「遺伝子座」は、染色体上の特定の位置またはＤＮＡ配列を指す。遺伝子座は、タンパク質の発現を支援する内因性制御配列により特徴づけることができる。
【０１７８】
好ましい遺伝子座は、Ｒｏｓａ２６、Ｈｐｒｔ、ｂ−アクチン、およびＲｐｓ２１、または一般的に、部位特異的組込みで発現レベルが高い、ハウスキーピング遺伝子を有する遺伝子座である。そのような遺伝子座、または遺伝子発現のためにオープンクロマチン部位を安定化させる任意の他の形のクロマチン修飾因子を含有するＢＡＣなどの人工染色体を用いるランダム組込みには、ベクターＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込みを可能にする任意の部位、特に、任意のユークロマチン含有部位が適している。
【０１７９】
用語「選択効率」は、事前定義されたパラメータに基づいて細胞のレパートリーから選択される所望の細胞の数を指す。それは、レパートリーにおける少なくともｙ個の数の細胞からｘ個の選択された細胞（「ヒット」とも呼ばれる）として表される。より高い選択効率に関して、より大きい細胞のレパートリーが、最良のヒットを同定するようにスクリーニングされ得る。トランスフェクトされた、および／または組換え宿主細胞のレパートリーから選択されたヒットは特に、生産用宿主細胞のそれぞれの目的のタンパク質についての高生産性により特徴づけられる。
【０１８０】
細胞ソーティングのためにフローサイトメトリまたは類似したシステムを用いて、１時間あたり１千万個のトランスフェクト細胞が分析され得、１千万個から最良の１００個の細胞が、この方法により選択され、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートなどの細胞培養プレートへソートされ得る。これは、１千万個未満の細胞もまた分析され得、かつ単一の最良の細胞だけがソートされ得ること、またはソートされた細胞が、最良の０．０１％に、または最良の０．１％もしくは最良の１％まで、または最良の１０％までに調整され得る。１千万個より多いトランスフェクト細胞が入手可能である場合には、ソーティング手順が細胞死の増加を引き起こしてそれにより選択基準に干渉するということがないという条件で、最大１億個まで、またはそれよりも多くの細胞もまたソートされ得る。単離および培養のために取り扱うことができる細胞の数に従って、最良細胞のパーセンテージの限界を設定することにより、任意の数の細胞を収集することができる。
【０１８１】
トランスフェクト細胞のプールから、任意の数をまた、限界希釈でプレーティングすることができる。しかしながら、プールからの選択された細胞は、さらなる品質基準なしにプレーティングされる。したがって、同定される高プロデューサーの確率の増加を得るために、多数の細胞がプレーティングおよびスクリーニングされる必要がある。典型的には、細胞は、３８４または９６ウェルプレートに播種され、５つより多いプレートを用いて、およびしばしば、ロボットシステムを用いて、それらの増殖および生産の性質についてスクリーニングされる。細胞を限界希釈によってプレーティングする場合、プレーティングされる正確な数の付近の、高い不確実性でプレーティングされる細胞の平均数があるだけであるため、追加の別の欠点がある。例えば、細胞濃度が１ミリリットルあたり１０個の細胞に調整され、ウェルあたり１００μｌがプレーティングされた時、ウェルあたり平均１個の細胞がプレーティングされる。これは、しばしば、統計学によれば、ウェルあたり２個の細胞が見出され、または細胞が全く見出されないことを含む。したがって、高い確実性で単一クローンを得るために、第二の細胞クローニングステップが必要とされる。したがって、限界希釈は、高生産性単一クローンを得るために、相当な時間および人および物質資源を必要とする。
【０１８２】
記載された実施例において、プールおよびその後の限界希釈溶液を作製するために、または安定なクローンの迅速な生成およびフローサイトメトリによって最良の９６個のクローンをソーティングするために、百万個の細胞をそれぞれ、トランスフェクトした。長期の抗生物質選択を受けた安定なプールを生成し、その後、いかなるさらなる選択基準もなしに、限界希釈により９６ウェルプレートにプレーティングしたか、または宿主細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションから１日もしくは２日後、短い期間、高い抗生物質濃度下で選択し、続いて、百万個のトランスフェクタントから最良の９６個のクローンを単離するためにフローサイトメトリにより単一細胞をソーティングしたかのいずれかであり、それにより、少なくとも１０４個の細胞から１個のクローンの選択効率を達成した。
【０１８３】
したがって、本発明は、安定かつ高プロデューサーの生産用細胞株を生成するために単一細胞を同定および選択するための新規な方法に基づいている。その方法は、基本的に、内因性物理的バイオマーカーに基づいた、組換え宿主細胞のレパートリーの単一細胞ソーティングを利用する。例によれば、安定な生産用細胞株を生成するための単一細胞クローンは、トランスフェクション後１週間以内に単離することができる。特に、単一細胞クローンを、安定的にトランスフェクトされた細胞のプールから、細胞サイズの指標として前方散乱（ＦＳＣ）および細胞の顆粒性の指標として側方散乱（ＳＳＣ）を利用する基礎的な細胞性質を測定することにより、同定した。
【０１８４】
本明細書に記載されているような方法は、生産用クローンの単離および安定かつ効率的な生産用細胞株の生成のために既存の技術を凌ぐ以下のいくつかの利点を提供する：
１．時間に関して、（安定な細胞プールを用いて、限界希釈段階希釈および／または最初の選択でのクローンの再クローニングを実施する通常の方法と比較して）少なくとも４ヶ月間、削減する
２．トランスフェクトされた細胞とトランスフェクトされていない細胞を区別するために細胞サイズおよび顆粒性などの基礎的な細胞性質を用いる
３．選択中、抗生物質抵抗性選択マーカーおよび高い抗生物質濃度を用いる場合、
ａ．トランスフェクション後の初期段階の間のいかなる増殖優位も回避することができる；
ｂ．高い抗生物質における増殖の制限により、単離された単一クローン間の変動性がより高く、結果として、「高プロデューサー」を単離するより高い見込みを提供する
ｃ．組換えＤＮＡのコピー数対タンパク質生産の線形相関が示され得る。逆に、選択条件下で高い組込み事象を有するそれらの細胞のみの生存が予想される
ｄ．潜在的な高プロデューサーを同定するためのツールとして抗生物質抵抗性を利用する一般的なプレスクリーニングが好ましい。
【０１８５】
前述の記載は、以下の実施例を参照して、より完全に理解されるだろう。しかしながら、そのような実施例は、単に、本発明の１つまたは複数の実施形態を実践する方法を代表するに過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして読まれるべきではない。
【実施例】
【０１８６】
実施例１
組換え細胞内タンパク質ｅＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）を発現する単一クローンの生成
ＢＡＣ−ｅＧＦＰの構築
ＢＡＣ−ｅＧＦＰ構築物について、５μｇのプラスミド−ｅＧＦＰ  ＤＮＡ（配列ＩＤＸＸ、図１０におけるベクターマップ）を、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素ＳｆａＡＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ２０９４）およびＰａｃＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ２２０４）（各５Ｕ）で、３７℃で３０分間、消化した。その後、その断片を、１％アガロース（ａｇｒａｒｏｓｅ）−ＴＡＥゲル上で分離した。よりゆっくり移動する断片は、目的の遺伝子およびＢＡＣ組換えのための相同アームを含有した。この断片をゲルから切り出し、Ｓｉｇｍａゲル抽出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｅｒｃｋの一部；ＮＡ１１１１−１Ｋ）により、製造会社の使用説明書に従って精製した。その後、ＤＮＡ断片の濃度を、ＵＶ分光光度計を２６０ｎｍで用いて、測定した。１５０ｎｇの精製されたＳｆａＡＩ／ＰａｃＩ断片を、組換え酵素について誘導され（材料はＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇから入手することができ、手順は、Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓによるｐＲｅｄ／ＥＴマニュアルに従う）、かつＲｏｓａ２６ＢＡＣ（ＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＨＯＲＩ）、Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡから入手することができる、クローン名ＲＰ２４−８５Ｌ１５）（Ｒｏｓａ２６遺伝子座の配列（配列番号１）を含むＢＡＣ）を含有する大腸菌ＤＨ１０ｂエレクトロコンピテント細胞へ、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーターを２０００Ｖ／２オームで用いて、エレクトロポレーションした。形質転換体を、３７℃で７０分間、回復させた。１００μＬの形質転換液を、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ；Ｃ１９１９−５Ｇ）および１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。その後、プレートを、３７℃で一晩、インキュベートした。１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培養においてＢＡＣ  ＤＮＡ単離を実施するために、陽性コロニーを採取した。培養物を４０００ｒｐｍで５分間、遠沈することにより、ＤＮＡ単離を行った。細胞ペレットを、ＲＮアーゼＡを含有するＰ１バッファー（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット；１２１６３）の３００μＬ中に再懸濁し、続いて、３００μＬのＰ２バッファー中に再懸濁した。チューブを、室温で優しく５回、反転させた。すぐ後に、３００μＬのバッファーＰ３を加え、混合するために５回、反転させ、氷上で１０分間、インキュベートした。６００μＬのイソプロパノールを加え、−２０℃で２０分間、インキュベートした。その後、その混合物を、室温、１４０００ｒｐｍで３０分間、遠沈した。ペレットをかき乱すことなしに、注意深く上清を捨て、ペレットを、５００μＬの７０％エタノールで１回、洗浄した。回転を、１４０００ｒｐｍで１５分間、繰り返した。ペレットをかき乱すことなしに、注意深く上清を捨てた。ペレットを５分間、乾燥させ、その後、３０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッフ��ー［ｐＨ  ８．０］中に可溶化した。特徴的なＢＡＣ断片化分析として、線状断片のＲｏｓａ２６  ＢＡＣへの組込みを、単離されたＤＮＡのＥｃｏＲＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号ＥＲ０２７１）による消化により、検証した。２０μＬのＢＡＣ  ＤＮＡを、１ＵのＥｃｏＲＩで３０分間、消化し、１％アガロース−ＴＡＥゲル上にその反応の生成物を分離させた。さらに、組込みをまた、（ａ）ＢＡＣにおける組込み部位の上流に結合するフォワードプライマー（ＡＢ１１）および目的の遺伝子（この場合、ｅＧＦＰ）を含有する移入ＤＮＡ断片の５’領域において結合するリバースプライマー（ＡＢ１２）を用いて、５’相同アーム挿入部位、（ｂ）フォワードプライマー（ＡＢ０９）およびリバースプライマー（ＡＢ４０）を用いて、ｅＧＦＰ遺伝子が存在することを保証するためにｅＧＦＰ断片に特異的である、目的の遺伝子プライマー、ならびに（ｃ）移入ＤＮＡ断片の３’領域において結合するフォワードプライマー（ＡＢ１３）およびＢＡＣにおける組込み部位の下流の領域にアニールするリバースプライマー（ＡＢ１４）を用いて３’相同アーム挿入部位について、ＰＣＲ分析により検証した。トランスフェクションのためのＢＡＣ  ＤＮＡを単離するために、確認された改変型Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣを含有するＤＨ１０ｂコロニーを、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５００ｍＬ  ＬＢ培地へ接種した。その後、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  ＢＡＣ単離キット（Ｍａｃｈａｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ；７４０４３６．２５）を用いてＢＡＣ  ＤＮＡを単離し、その濃度を、ＵＶ分光光度計を２６０ｎｍで用いて、測定した。６μｇのＢＡＣ  ＤＮＡを、１０μＬの最終体積において一晩、ＢＡＣを線状化するように、０．５ＵのＰＩ−ＳｃｅＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｒ０６９６Ｌ）を用いて、線状化した。
【０１８７】
【表１】
2019501658.tif 000002
【０１８８】
哺乳類細胞のトランスフェクション
細胞内ＧＦＰ発現のために、１×１０６個の細胞に、５μｇのＧＦＰ−ＢＡＣ  ＤＮＡをトランスフェクトした。ＧＦＰの発現を、プロトコールを確立するために、およびトランスフェクション中の異なる時期を追跡するために用いた。トランスフェクション後２日目において、細胞を、０．２５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｒｏｔｈ）の存在下で２日間、培養した。２日後、Ｇ４１８濃度を０．５ｍｇ／ｍＬへ増加させ、さらに２日間、選択状態に保った。抗生物質選択の開始後４日目において、培養物を二等分に分けた。一方の半分について、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬに保持し、他方の半分について、Ｇ４１８濃度を１．０ｍｇ／ｍＬへ増加させた。単一細胞が９６ウェルプレートへソートされ得る時を決定するために、以下の基準が満たされるまで死細胞についてのマーカーとしてヨウ化プロピジウム染色を用いるＦＡＣＳ分析により、細胞のアリコートを、抗生物質処理中、定期的に分析した：
・宿主細胞集団の大部分が、高い抗生物質濃度での毒性により細胞死の兆候を示す
・トランスフェクト細胞の小さい生存可能亜集団（全体の＜５％）が、類似した条件下で抵抗性である
・生きている集団および死んでいる集団についてのＦＳＣ−ＳＳＣ特性の違いが、明らかに目に見える（図２）
トランスフェクションから１０日後、すなわち、Ｇ４１８の存在下でトランスフェクトされた細胞を培養および選択した後、細胞を１００μｍ細胞ストレーナーに通過させて、いかなる凝集塊も除去することによりソーティングのために調製し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩによるＦＳＣ−Ａについて１４０ＶおよびＳＳＣ−Ａについて２５０Ｖの電圧設定でのＦＳＣおよびＳＳＣだけに基づいてソートした。ＦＳＣ／ＳＳＣプロット（ｘ軸にＦＳＣ−Ａ、ｙ軸にＳＳＣ−Ａ）において、非対称の生細胞ゲートは、ＦＳＣにおいて６０〜２５０単位の間、かつＳＳＣにおいて１０〜１５０単位の間であり、左下部側の狭い部分から始まって、右上部側へだんだん広くなっていく（図３上部パネル）。ＧＦＰ発現を、ソーティングのための基準（criterium）として用いなかったが、ＧＦＰ発現を、ソートされた生細胞について緑色蛍光チャネルにおいて記録した（図３、ヒストグラム）。致死性抗生物質濃度の非存在下での培地含有９６ウェルプレートへ単一細胞をソートした。トランスフェクトされた１０６個の細胞から最良の９６個の細胞をソートし、その結果として、１０４個中約１個の選択効率を生じた。単一細胞を、まず、１ｍＭグルタミン（Ｌｏｎｚａ）、０．２％抗凝集試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．００１％フェノールレッド（Ｓｉｇｍａ）を追加した５０μＬのＣＤ−ＣＨＯ培地を含有する９６ウェル丸底プレートにおいて適切に増殖させた。約１７回の分裂後、細胞は、クローンを特徴づけ、タンパク質生産について分析し、かつ冷凍用ストックを調製するのに十分な数であった。
【０１８９】
約１０回の細胞分裂（１０２４個の細胞に等しい）後、個々のクローンを、再懸濁し、５００μＬの補足ＣＤ−ＣＨＯ培地を含有する２４ウェルプレートへ移した。さらに５回の分裂後、細胞を、死細胞についてのマーカーとしてＰＩの存在下で、ＦＡＣＳ分析によりそれらのＧＦＰ発現について分析した。各クローンについて、平均値、中央値、および最頻値などのＧＦＰ蛍光強度パラメータを定量化し、それぞれの統計的パラメータの分析のために箱髭図を作成した（図４）。その結果は、フローサイトメトリにより本発明者らの記載された方法に従ってソートされたクローンの中では、より高い発現レベルを有する個々のクローン（２５％の最良クローン）が選択されており、これらのクローンは、限界希釈により生成したクローンの中には見出されなかったことを示している。したがって、生産用細胞のこの最良２５％について、選択効率は、１０５個のトランスフェクタントあたり２．５個の細胞であった。
【０１９０】
比較上の例において、限界希釈などの通常の技術を用いて、そこでそのような高プロデューサークローンを同定するために（いくらかが生成され、または細胞プールから残っているならば）、１００個より多いクローンをスクリーニングする必要があるだろう。
【０１９１】
示された本実験において、そのような高プロデューサークローンは、限界希釈により見出されなかったが、直接的単一細胞ソーティングに関しては見出された。さらに、選択されたクローンの蛍光強度についての平均値は、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８、それぞれにおいて選択されたクローンの平均値間の比較からわかるように、初期の選択相の間、Ｇ４１８濃度の増加と共に増加した。
【０１９２】
実施例２
ＦＧＦ２３のＣ末端断片の分泌性発現のためのＦＧＦ２３発現カセットを有するＢＡＣの構築
ＦＧＦ２３−ＢＡＣの構築について、ヒトＦＧＦ２３のＣ末端断片のコード配列に加えて、必要な遺伝因子の全てを含有するベクターを用いた（図１０Ｂ、配列番号１５）。手短に言えば、ＦＧＦ２３遺伝子を、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターの調節下に置き、その後、ポリアデニル化シグナルが続いた。そのカセットは、ネオマイシン／カナマイシン抵抗性遺伝子を含有する。そのカセットは、ＲＯＳＡ  ２６遺伝子座を含有する細菌人工染色体への組換えのために３’−相同配列および５’−相同配列に囲まれている。
【０１９３】
上記のようなプラスミド構築物からのＢＡＣ−ＦＧＦ２３構築について、５μｇのＤＮＡを、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素ＳｆａＡＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ２０９４）およびＰａｃＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ２２０４）（各５Ｕ）により、３７℃で３０分間、消化した。その後、その断片を、１％アガロース−ＴＡＥゲル上で分離した。よりゆっくり移動する断片は、目的の遺伝子およびＢＡＣ組換えのための相同アームを含有した。この断片を、ゲルから切り出し、Ｓｉｇｍａゲル抽出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｅｒｃｋの一部；ＮＡ１１１１−１Ｋ）により、製造会社の使用説明書に従って精製した。その後、ＤＮＡ断片の濃度を、ＵＶ分光光度計を２６０ｎｍで用いて、測定した。１５０ｎｇの精製されたＳｆａＡＩ／ＰａｃＩ断片を、組換え酵素について誘導され（材料はＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇから入手することができ、手順は、Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓによるｐＲｅｄ／ＥＴマニュアルに従う）、かつＲｏｓａ２６ＢＡＣ（Ｒｏｓａ２６ＢＡＣはＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＨＯＲＩ）、Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡから入手することができる、クローン名ＲＰ２４−８５Ｌ１５）（Ｒｏｓａ２６遺伝子座の配列（配列番号１）を含むＢＡＣ）を含有する大腸菌ＤＨ１０ｂエレクトロコンピテント細胞へ、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーターを２０００Ｖ／２オームで用いて、エレクトロポレーションした。形質転換体を、３７℃で７０分間、回復させた。１００μＬの形質転換液を、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ；Ｃ１９１９−５Ｇ）および１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。その後、プレートを、３７℃で一晩、インキュベートした。１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培養においてＢＡＣ  ＤＮＡ単離を実施するために、陽性コロニーを採取した。培養物を４０００ｒｐｍで５分間、遠沈することにより、ＤＮＡ単離を行った。細胞ペレットを、ＲＮアーゼＡを含有するＰ１バッファー（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット；１２１６３）の３００μＬ中に再懸濁し、続いて、３００μＬのＰ２バッファー中に再懸濁した。チューブを、室温で優しく５回、反転させた。すぐ後に、３００μＬのバッファーＰ３を加え、混合するために５回、反転させ、氷上で１０分間、インキュベートした。６００μＬのイソプロパノールを加え、−２０℃で２０分間、インキュベートした。その後、その混合物を、室温、１４０００ｒｐｍで３０分間、遠沈した。ペレットをかき乱すことなしに、注意深く上清を捨て、ペレットを、５００μＬの７０％エタノールで１回、洗浄した。回転を、１４０００ｒｐｍで１５分間、繰り返した。ペレットをかき乱すことなしに、注意深く上清を捨てた。ペレットを５分間、乾燥させ、その後、３０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー［ｐＨ  ８．０］中に可溶��した。特徴的なＢＡＣ断片化分析として、線状断片のＲｏｓａ２６  ＢＡＣへの組込みを、単離されたＤＮＡのＥｃｏＲＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号ＥＲ０２７１）による消化により検証した。２０μＬのＢＡＣ  ＤＮＡを、１ＵのＥｃｏＲＩで３０分間、消化し、１％アガロース−ＴＡＥゲル上にその反応の生成物を分離させた。さらに、組込みをまた、（ａ）ＢＡＣにおける組込み部位の上流に結合するフォワードプライマー（ＡＢ１１）および目的の遺伝子（この場合、ＦＧＦ２３）を含有する移入ＤＮＡ断片の５’領域において結合するリバースプライマー（ＡＢ１２）を用いて、５’相同アーム挿入部位、（ｂ）フォワードプライマー（ＡＢ０９）およびリバースプライマー（ＡＢ８８）を用いて、ＦＧＦ２３遺伝子が存在することを保証するためにＦＧＦ２３断片に特異的である、目的の遺伝子プライマー、ならびに（ｃ）移入ＤＮＡ断片の３’領域において結合するフォワードプライマー（ＡＢ１３）およびＢＡＣにおける組込み部位の下流の領域にアニールするリバースプライマー（ＡＢ１４）を用いて３’相同アーム挿入部位について、ＰＣＲ分析により検証した。トランスフェクションのためのＢＡＣ  ＤＮＡを単離するために、確認された改変型Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣを含有するＤＨ１０ｂコロニーを、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５００ｍＬ  ＬＢ培地へ接種した。その後、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  ＢＡＣ単離キット（Ｍａｃｈａｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ；７４０４３６．２５）を用いてＢＡＣ  ＤＮＡを単離し、その濃度を、ＵＶ分光光度計を２６０ｎｍで用いて、測定した。６μｇのＢＡＣ  ＤＮＡを、０．５ＵのＰＩ−ＳｃｅＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｒ０６９６Ｌ）を用いて線状化し、そのＢＡＣを一晩、線状化して、１０μＬの最終体積になった。
【０１９４】
哺乳類細胞へのトランスフェクション
分泌性ＦＧＦ２３の発現のために、１×１０６個の細胞に、５μｇのＦＧＦ２３−ＢＡＣ  ＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後２日目において、細胞を、０．２５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｒｏｔｈ）の存在下で２日間、培養した。２日後、Ｇ４１８濃度を０．５ｍｇ／ｍＬへ増加させ、さらに２日間、選択状態に保った。抗生物質選択の開始後４日目において、培養物を二等分に分けた。一方の半分について、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬに保持し、他方の半分について、Ｇ４１８濃度を１．０ｍｇ／ｍＬへ増加させた。トランスフェクションから１０日後（その間、トランスフェクト細胞をＧ４１８の存在下で培養した）、細胞を１００μｍ細胞ストレーナーに通過させて、いかなる凝集塊も除去することにより、ソーティングのために調製し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩによるＦＳＣ−Ａについて１４０ＶおよびＳＳＣ−Ａについて２５０Ｖの電圧設定でのＦＳＣおよびＳＳＣだけに基づいてソートした。ＦＳＣ／ＳＳＣプロット（ｘ軸にＦＳＣ−Ａ、ｙ軸にＳＳＣ−Ａ）において、非対称の生細胞ゲートは、ＦＳＣにおいて６０〜２５０単位の間、かつＳＳＣにおいて１０〜１５０単位の間であり、左下部側の狭い部分から始まって、右上部側へだんだん広くなっていく（図３下部パネル）。致死性抗生物質濃度の非存在下での培地含有９６ウェルプレートへ単一細胞をソートした。この例における選択効率は、この場合もやはり、１０６個の全トランスフェクタントのうち９６個の細胞であり、結果として、１０４個のうち約１個を生じた。単一細胞を、まず、１ｍＭグルタミン（Ｌｏｎｚａ）、０．２％抗凝集試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．００１％フェノールレッド（Ｓｉｇｍａ）を追加した５０μＬのＣＤ−ＣＨＯ培地を含有する９６ウェル丸底プレートにおいて適切に増殖させた。約１７回の分裂後、細胞は、クローンを特徴づけ、タンパク質生産について分析し、かつ冷凍用ストックを調製するのに十分な数であった。
【０１９５】
約１０回の細胞分裂（１０２４個の細胞に等しい）後、個々のクローンを、再懸濁し、５００μＬの補足ＣＤ−ＣＨＯ培地を含有する２４ウェルプレートへ移した。
単一クローンを、９６ウェルプレートにおいて、フェドバッチ条件下で、生産について分析した。生産について、細胞を、１００μＬの生産用培地（上記の補足ＣＤ−ＣＨＯを、１５％  Ｆｅｅｄ  Ｂ  ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および３．３％  ＦｕｎｃｔｉｏｎＭＡＸ力価増強剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した）中、９６ウェルプレートにおいて１×１０５個の細胞／ウェルで播種した。そのプレートを、振盪せずにインキュベートした。２日ごとに、フィード補足を培養に加えた（１０％培養体積の濃度でのＦｅｅｄ  Ｂ  ＣＤ−ＣＨＯおよび３．３％培養体積の濃度でのＦｕｎｃｔｉｏｎＭＡＸ力価増強剤）。培養物を、８日間の終わりに遠沈し、ＥＬＩＳＡによる分泌性タンパク質の分析のために上清を収集した。ＧＦＰ分析と同様に、比較のために限界希釈によるＦＧＦ２３について、同じ様な設定を実施した。両方の方法についての比生産性を、ＦＧＦ２３  ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、Ａｕｓｔｒｉａ）により製造会社の使用説明書に従って分析した。それぞれの群の個々のクローンについてのｐｃｄ値を統計的に分析し、それぞれ、箱髭図および散布図によりプロットした（図５Ａおよび５Ｂ）。各クローンについての体積収量を計算し、これらのクローンのｐｃｄ値と体積収量の相関を分析した（図６）。その結果は、フローサイトメトリによりソートされたクローンの比生産性についての平均値が、限界希釈によりソートされたそれらのクローンの平均値より約１０倍（１ｌｏｇ）であったことを示している。この場合もやはり、これは、高プロデューサーを同定するスクリーニング効率が大きく向上していることを実証している。
【０１９６】
個々のクローンについてのＧＯＩの遺伝子コピー数は、ＰＯＩの比生産性とよく相関する。したがって、ＧＯＩの遺伝子コピー数とマーカー遺伝子の遺伝子コピー数との間の相関は、興味深い。これは、それぞれの遺伝子についての特異的なプライマーでのリアルタイムＰＣＲを用いて試験することができる。ＲＴ−ＰＣＲからの結果は、図７によりこれらの２つの遺伝子の間の相関を示している。
【０１９７】
ＰＯＩ生産とマーカー遺伝子機能との間の機能的相関を試験するために、決定されたｐｃｄ値を有する組換えＦＧＦ２３を生産する選択されたクローンを、高い抗生物質濃度下でのそれらの生存について分析した。これについて、１×１０５個の細胞／ウェルを、９６ウェルプレートにおける１００μＬのＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｌ−グルタミンおよび抗凝集試薬が追加されている）中に播種した。細胞を、６ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬのＧ４１８で３日間、処理した。対照として、細胞を、抗生物質なしの同じ様な設定で培養した。細胞生存率を、Ａｂｃａｍ細胞毒性アッセイキットを用いて、製造会社の使用説明書通りに測定した。２０μＬの細胞毒性試薬を各ウェルに加え、３７℃で３時間、インキュベートした。６０５ｎｍでの吸光度の同時的減少と連動した５７０ｎｍでの吸光度の増加は、生細胞の存在を示す。抗生物質処理された試料において観察された生細胞集団の、各クローンについての処理されていない対照に対する比率は、細胞がどれくらいの量の抗生物質に耐え得るかについての洞察を提供する（図８）。増加した生産性と高い抗生物質濃度に対する抵抗性との間の相関が観察された。そのデータは、高い抗生物質濃度に対する抵抗性に基づいた遺伝的スクリーニング方法が、さらなる試験のために、大きい試料サイズを相対的に小さい数へプレスクリーニングするために用いられ得ることを実証している。
【０１９８】
実施例３
組換え細胞内タンパク質を発現する単一クローンの生成についての早い時点の同定
細胞内ＧＦＰ発現のために、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを用いて、１×１０５個または１×１０６個の細胞のいくつかのアリコートにそれぞれ、５μｇまたは２５μｇのＧＦＰ−Ｒｏｓａ２６−ＢＡＣ  ＤＮＡ（環状か、またはＳｃｅＩでＢＡＣバックボーンにおいて線状化されているかのいずれか）をトランスフェクトした。ＧＦＰの発現を、トランスフェクションおよび選択条件を向上させるためにプロトコールを評価するために、ならびにトランスフェクション中の異なる時期を追跡するために用いた。トランスフェクション後１日目において、１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｒｏｔｈ）を培地へ加え、細胞を、１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で培養し続けた。細胞のアリコートを、３日目から、トランスフェクション後９日目までＦＡＣＳ分析によりモニターし、前方散乱および側方散乱特性に加えて、ヨウ化プロピジウム染色を、死細胞についてのマーカーとして用いた。
【０１９９】
生細胞集団のみをゲーティングし、ゲーティングされた細胞をさらに、３つのカテゴリー：ＧＦＰ発現なしのＣＨＯ細胞の陰性対照と等価のＧＦＰ発現なし（＜１００任意単位の蛍光シグナル強度）、低いＧＦＰ発現（１００〜１０，０００任意単位の蛍光シグナル強度）、および高いＧＦＰ発現（＞１０，０００任意単位の蛍光シグナル強度）へ分けた。上記の各カテゴリーについてのＧＦＰシグナル強度を、３日目から９日目までモニターし、各カテゴリーについての％を、カテゴリー内の細胞の数を３つ全てのカテゴリー内の細胞数の合計で割ることにより計算した。ＤＮＡに対する細胞の比率の比較は、５μｇまたは２５μｇのＤＮＡをトランスフェクションに用いることができ、細胞数は、１×１０５〜１×１０８個の細胞の間を変動し得ることを示した。１×１０５個の細胞について５μｇ  Ｒｏｓａ２６−ＢＡＣ  ＤＮＡの使用は、この実験において、１×１０６個の細胞について２５μｇ  ＤＮＡを用いることより高いトランスフェクション効率を示した。１×１０５個の細胞に、５μｇの線状または環状ＤＮＡのいずれかをトランスフェクトし、トランスフェクション後１日目から１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で選択した場合、トランスフェクション後６〜９日目（選択の開始後５〜８日目に対応する）が、残存する生存細胞のフローサイトメトリソーティングについての良い時点であると観察された（図９Ａは環状ＢＡＣでのトランスフェクションについて、図９Ｂは線状ＢＡＣでのトランスフェクションについて）。トランスフェクション後６日目からずっと、生存細胞の少なくとも５０％が高い発現細胞に属した。生存細胞集団におけるこの高発現細胞の割合は、線状化ＢＡＣについて約８０％まで、環状ＢＡＣについて１００％まで増加していた。環状ＢＡＣの場合、これは、６〜８日目において、１０４個の細胞のうち１〜３個の細胞が目的の細胞であることを意味する。線状化ＢＡＣについて、１０４個の細胞のうち４２７〜３３２個の細胞が、本発明者らの目的のタンパク質について高発現を示す、目的の細胞である。
【０２００】
【表２】
2019501658.tif 000003
【０２０１】
材料および方法：
宿主細胞株のトランスフェクション（ヌクレオフェクション）：哺乳類宿主細胞、具体的にはＣＨＯ−Ｋ１を、トランスフェクションの当日まで、適切な市販の細胞培地（ＣＤ−ＣＨＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。トランスフェクションの当日、対数的に成長する細胞をカウントし、１×１０６個の細胞を、１００μＬのＡｍａｘａヌクレオポレーションバッファー（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁させた。再懸濁した細胞を、ヌクレオポレーションキュベット（キットと共に提供された）へ移した。ＧＦＰまたはＦＧＦ２３（配列番号５）についての配列を、プラスミド、または遺伝子座Ｒｏｓａ２６（配列番号１）を含むＢＡＣベクターへ導入した（Ｚｂｏｒａｙら参照）。５μｇまたは２５μｇのプラスミドＤＮＡまたはＢＡＣ−ＤＮＡを、細胞を含有するエレクトロポレーションキュベットへピペッティングし、細胞を、製造会社のプロトコールに従ってエレクトロポレーションした。トランスフェクト細胞をすぐに、２ｍＬの新鮮な予熱された培地を含有する６ウェルプレートへ移した。トランスフェクションから１日または２日後、抗生物質を致死濃度で加えた。
【０２０２】
宿主細胞株のトランスフェクション（リポフェクション）：哺乳類宿主細胞、具体的にはＣＨＯ−Ｋ１を、トランスフェクションの当日まで、適切な細胞培地（ＣＤ−ＣＨＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。１５μＬのリポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、複合体形成のために、５μｇのＤＮＡと室温で３０分間、インキュベートした。その後、リポフェクチン−ＤＮＡ複合体を、２．５ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地を含有する６ウェルプレートにおける４×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞上へゆっくりオーバーレイした。全てのステップは、製造会社の使用説明書に従った。細胞を培養し、致死性抗生物質濃度の添加前に、３７℃で１日または２日間、回復させた。
【０２０３】
生産用クローン単離のための限界希釈：細胞プールからの生産用クローンの限界希釈について、４×１０５個の細胞に、上記のようなリポフェクチン／５μｇ  ＢＡＣ  ＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に０．２５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｒｏｔｈ）から開始し、０．７５ｍｇ／ｍｌまで徐々に増加させて、選択を行った。トランスフェクションから１６日以内に安定なプールが生成された。細胞を、０．５個の細胞／ウェルへ希釈し、Ｌ−Ｇｌｎ、フェノールレッド、抗凝集試薬、および０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を追加したＣＤ−ＣＨＯの１００μＬを含有する９６ウェル丸底プレート内に播種した。前述のように、細胞を増殖させ、分泌性タンパク質の場合、比生産性（ｐｃｄ）について、または緑色蛍光タンパク質の細胞内発現の場合、蛍光強度について、分析した。
【０２０４】
実施例４
それぞれ、トランスフェクション後早期の、および長期培養後の、細胞集団および細胞プールの個々の哺乳類細胞における組換えタンパク質発現のための通常のプラスミドおよびＢＡＣの比較
ａ）プラスミド−ｅＧＦＰ
哺乳類細胞においてｅＧＦＰを発現することができるプラスミドを構築した。プラスミドは、Ｃａｇｇｓプロモーターにより駆動されるｅＧＦＰ配列、およびｅＧＦＰ開始コドンのすぐ上流の最適化コザック配列を含む。ベクターマップは図１０に示されている。
【０２０５】
ｂ）ＢＡＣ−ｅＧＦＰ構築
上記のようなプラスミド−ｅＧＦＰ構築物からのＢＡＣ−ｅＧＦＰ構築について、５μｇのＤＮＡを、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素ＳｆａＡＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ２０９４）およびＰａｃＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ２２０４）（各５Ｕ）で、３７℃で３０分間、消化した。その後、その断片を、１％アガロース−ＴＡＥゲル上で分離した。よりゆっくり移動する断片は、目的の遺伝子およびＢＡＣ組換えのための相同アームを含有した。この断片をゲルから切り出し、Ｓｉｇｍａゲル抽出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｅｒｃｋの一部；ＮＡ１１１１−１Ｋ）により、製造会社の使用説明書に従って精製した。その後、ＤＮＡ断片の濃度を、ＵＶ分光光度計を２６０ｎｍで用いて、測定した。１５０ｎｇの精製されたＳｆａＡＩ／ＰａｃＩ断片を、組換え酵素について誘導され（材料はＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇから入手することができ、手順は、Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓによるｐＲｅｄ／ＥＴマニュアルに従う）、かつＲｏｓａ２６ＢＡＣ（ＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＨＯＲＩ）、Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡから入手することができる、クローン名ＲＰ２４−８５Ｌ１５）（Ｒｏｓａ２６遺伝子座の配列（配列番号１）を含むＢＡＣ）を含有する大腸菌ＤＨ１０ｂエレクトロコンピテント細胞へ、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーターを２０００Ｖ／２オームで用いて、エレクトロポレーションした。形質転換体を、３７℃で７０分間、回復させた。１００μＬの形質転換液を、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ；Ｃ１９１９−５Ｇ）および１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。その後、プレートを、３７℃で一晩、インキュベートした。１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培養においてＢＡＣ  ＤＮＡ単離を実施するために、陽性コロニーを採取した。培養物を４０００ｒｐｍで５分間、遠沈することにより、ＤＮＡ単離を行った。細胞ペレットを、ＲＮアーゼＡを含有するＰ１バッファー（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット；１２１６３）の３００μＬ中に再懸濁し、続いて、３００μＬのＰ２バッファー中に再懸濁した。チューブを、室温で優しく５回、反転させた。すぐ後に、３００μＬのバッファーＰ３を加え、混合するために５回、反転させ、氷上で１０分間、インキュベートした。６００μＬのイソプロパノールを加え、−２０℃で２０分間、インキュベートした。その後、その混合物を、室温、１４０００ｒｐｍで３０分間、遠沈した。ペレットをかき乱すことなしに、注意深く上清を捨て、ペレットを、５００μＬの７０％エタノールで１回、洗浄した。回転を、１４０００ｒｐｍで１５分間、繰り返した。ペレットをかき乱すことなしに、注意深く上清を捨てた。ペレットを５分間、乾燥させ、その後、３０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー［ｐＨ  ８．０］中に可溶化した。特徴的なＢ��Ｃ断片化分析として、線状断片のＲｏｓａ２６  ＢＡＣへの組込みを、単離されたＤＮＡのＥｃｏＲＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号ＥＲ０２７１）による消化により、検証した。２０μＬのＢＡＣ  ＤＮＡを、１ＵのＥｃｏＲＩで３０分間、消化し、１％アガロース−ＴＡＥゲル上にその反応の生成物を分離させた。さらに、組込みをまた、（ａ）ＢＡＣにおける組込み部位の上流に結合するフォワードプライマー（ＡＢ１１）および目的の遺伝子（この場合、ｅＧＦＰ）を含有する移入ＤＮＡ断片の５’領域において結合するリバースプライマー（ＡＢ１２）を用いて、５’相同アーム挿入部位、（ｂ）フォワードプライマー（ＡＢ０９）およびリバースプライマー（ＡＢ４０）を用いて、ｅＧＦＰ遺伝子が存在することを保証するためにｅＧＦＰ断片に特異的である、目的の遺伝子プライマー、ならびに（ｃ）移入ＤＮＡ断片の３’領域において結合するフォワードプライマー（ＡＢ１３）およびＢＡＣにおける組込み部位の下流の領域にアニールするリバースプライマー（ＡＢ１４）を用いて３’相同アーム挿入部位について、ＰＣＲ分析により検証した。トランスフェクションのためのＢＡＣ  ＤＮＡを単離するために、確認された改変型Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣを含有するＤＨ１０ｂコロニーを、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５００ｍＬ  ＬＢ培地へ接種した。その後、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  ＢＡＣ単離キット（Ｍａｃｈａｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ；７４０４３６．２５）を用いてＢＡＣ  ＤＮＡを単離し、その濃度を、ＵＶ分光光度計を２６０ｎｍで用いて、測定した。６μｇのＢＡＣ  ＤＮＡを、１０μＬの最終体積において一晩、ＢＡＣを線状化するように、０．５ＵのＰＩ−ＳｃｅＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｒ０６９６Ｌ）を用いて、線状化した。
【０２０６】
ｃ）哺乳類細胞へのトランスフェクション
以前に記載されているように（Ｚｂｏｒａｙら、２０１５）、６００，０００個のＣＨＯ  Ｋ１細胞（ＣＨＯ−Ｋ１−ＡＣ−ｆｒｅｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、カタログ番号１３０８０８０１）に、Ｇ４１８選択マーカーも含有する５μｇのプラスミド−ｅＧＦＰかまたはＢＡＣ−ｅＧＦＰのいずれかをトランスフェクトした：
線状化ＢＡＣ−ｅＧＦＰプラスミドおよびプラスミド−ｅＧＦＰ、それぞれのトランスフェクションを、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｖキット（Ｌｏｎｚａ；ＶＣＡ１００３）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞において実施した。成長相における細胞を、まず、ＣＡＳＹカウンターを用いてカウントした。６００，０００個の細胞を、１２００ｒｐｍで５分間、遠沈した。上清を捨て、細胞を、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １を含有するヌクレオフェクションキットＶの１００μＬ中に再懸濁させた。線状化ＢＡＣ−ｅＧＦＰまたはｅＧＦＰ−プラスミドの８．５μＬを、再懸濁した細胞に加え、チューブを軽くはじくことにより優しく混合した。その後、その内容物をヌクレオフェクションキュベットへ移し、プログラムＵ−０２３を用いてヌクレオポレーションした。ヌクレオフェクション後すぐに、５００μＬの予熱されたストックＣＤ−ＣＨＯ培地を細胞に加え、パスツールピペット（製造会社により提供された）を用いて、１．５ｍｌ  ＣＤ−ＣＨＯ培地を含有する６ウェルコーニングプレートへ移した。ストックＣＤ−ＣＨＯ培地は、１Ｌの既知組成のＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ；１０７４３−０２９）、４０ｍＬの１００ｍＭ  ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ１７−６０５Ｅ／Ｕ１）、２ｍＬの抗凝集剤（Ｇｉｂｃｏ、０１−００５７ＤＧ）、および２ｍＬのフェノールレッド（Ｓｉｇｍａ、Ｐ０２９０）を混合することにより調製されている。
【０２０７】
ｄ）発現の決定
トランスフェクション後２日目（ｄａｙ  ２  ｐ．ｔ．）において、ｅＧＦＰ発現を追跡するために培養物をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ  ＩＩ、ＢＤ）により分析し、２つのアリコートへ分割した。
【０２０８】
細胞プール分析（アリコート１）：ｄａｙ  ２  ｐ．ｔ．からずっと、０．７５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を培養に加えた。ＦＡＣＳにより、生存率およびｅＧＦＰ発現を、トランスフェクション後のｄａｙ  ９  ｐ．ｔ．およびトランスフェクション後２１日目（ｄａｙ  ２１  ｐ．ｔ．）に記録した。ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ、加えて、ｅＧＦＰ陽性細胞のＭＦＩ（平均蛍光強度）を決定した。
【０２０９】
細胞クローン分析（アリコート２）：トランスフェクト細胞を、それらを１００μｍ細胞ストレーナーに通過させて、いかなる凝集塊も除去することによりソーティングのために調製し、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩＩにおいて、蛍光ゲートの下限を任意蛍光単位１００００に設定することにより（ＦＳＣ／ＳＳＣによる）生細胞ゲートにおける細胞のｅＧＦＰ発現に基づいてソートした。ＦＳＣ−Ａについて１４０ＶおよびＳＳＣ−Ａについて２５０Ｖの電圧設定を有するＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩＩでの生細胞ゲートは、６０〜２５０単位の間のＦＳＣおよび１０〜１５０単位の間のＳＳＣで、左下部側の狭い部分から始まって右上部側へだんだん広くなる形で、非対称に設定された。各プールの９６個の細胞を、抗生物質の非存在下での９６ウェルプレートの培地含有単一ウェルへソートした。いかなる抗生物質選択もなしで、単一細胞を、まず、上記のｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含有するＣＤ−ＣＨＯ培地の１００μＬを含有する９６ウェルプレートにおいて適切に増殖させ、その後、５００μｌの同じ培地を含有する２４ウェルプレートへ移した。トランスフェクション後２１日目（ｄａｙ  ２１  ｐ．ｔ．）において、回収され、かつ増殖することができるそれらのクローンを、再び、ＦＡＣＳによりｅＧＦＰ発現について分析した。６０００より小さいＭＦＩを有するクローンを、ｅＧＦＰ発現なし、または低いｅＧＦＰ発現として分類し、６０００〜６００００の間のＭＦＩを有するクローンは中間のｅＧＦＰ発現体であり、６００００より高いＭＦＩを有するクローンは高いｅＧＦＰ発現体であった。
【０２１０】
ｅ）結果および結論
通常のプラスミドにおける発現カセットか、または大きなユークロマチン遺伝子座を有するＢＡＣにおける発現カセットのいずれか、それぞれをトランスフェクトされた細胞のプールの分析：
表２は、通常のプラスミド上のｅＧＦＰ発現カセットか、またはＢＡＣ上の外因性ユークロマチン遺伝子座であるＲｏｓａ２６遺伝子座内にあるｅＧＦＰ発現カセットのいずれかをトランスフェクトされたトランスフェクト細胞のプールの比較を示す。プールは、抗生物質淘汰圧下で培養される。抗生物質抵抗性遺伝子マーカーは、ｅＧＦＰ発現カセットと共に提供される。
【０２１１】
トランスフェクション後２日目（ｄａｙ  ２  ｐ．ｔ．）、ｅＧＦＰ陽性の細胞のパーセンテージは、ＢＡＣをトランスフェクトされた培養物において、プラスミドをトランスフェクトされた培養物と比較して低い（０．５％対２％）が、どちらのトランスフェクト細胞プールも、類似した蛍光を示す（それぞれ、ＭＦＩ約６，２００および６，６００）。これはすでに、ＢＡＣをトランスフェクトされた細胞が、プールにおけるプラスミドをトランスフェクトされた細胞と比較して、ｅＧＦＰのより高い特異的発現を生じることを示している。
【０２１２】
トランスフェクション後９日目、両方の細胞プールにおける生存率は類似しているが（３％対４％）、ｅＧＦＰを発現するクローンの数は、プラスミドのトランスフェクション（２０％）で、ＢＡＣトランスフェクション（３．３％）と比較して、ずっと高い。これは、通常のプラスミドトランスフェクションで、ｅＧＦＰ陽性細胞の大部分が、淘汰圧のせいですでに死んでいることを示している。
【０２１３】
ＢＡＣ−ｅＧＦＰをトランスフェクトされた培養物は、生細胞（４％）とｅＧＦＰ陽性細胞（３．３％）の類似した数を示し、ｅＧＦＰを生産する細胞の全てが生きていることを示している。さらに、このＢＡＣをトランスフェクトされた細胞プールにより生じた、１８４，０００の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、プラスミドをトランスフェクトされたプールのＭＦＩ（７８，０００）より有意に高い。
【０２１４】
プールのこれらの結果は明らかに、９日以内に安定的かつ高度に生産するクローンを見出す確率が、通常のプラスミドの形質転換で極めて低いことを示している。同時に、それは、大きなユークロマチン遺伝子座において目的の遺伝子を有する発現カセットを含有する構築物でのトランスフェクションから９日以内に高度に生産するクローンを見出す高い確率があることを示している。そのような有利な結果が、トランスフェクション後１２日以内に見出される可能性も高いが、そのような１２日間の期間後は、プール内の単一細胞クローンの望まれていない増殖のリスクがより高く、結果として、個々のクローンについてのより大きいスクリーニングおよび特徴づけの努力が生じる。
【０２１５】
通常のプラスミドにおける発現カセットか、または大きなユークロマチン遺伝子座を有するＢＡＣにおける発現カセットのいずれか、それぞれをトランスフェクトされた単一細胞の分析
表３は、トランスフェクション後２日目、ＢＡＣトランスフェクションが、プラスミド−ｅＧＦＰトランスフェクション（２％）と比較してｅＧＦＰ陽性クローンの有意により低い割合（０．５％）を生じたことを示す。しかしながら、各トランスフェクションからの９６個の高度に生産するｅＧＦＰ陽性クローンのランダムソーティング後、トランスフェクション後２１日目におけるそのクローンのｅＧＦＰ発現レベルの有意な差を観察することができる。回収されたクローンのレベルは類似しているが（９６個のうち３５個、対９６個のうち４１個）、クローンの発現レベルは有意に異なる：プラスミド−ｅＧＦＰクローンは、大部分（４１個のうち３７個、すなわち９０％）、低い発現レベル（ＭＦＩ＜６，０００）を示した。たった１０％（４１個のうち４個）が、中位の発現レベルを示す。これはよく知られており、安定なクローンのために遺伝子増幅および長期培養を行うことがなぜ、ほとんどの場合、必要であるかの理由である。
【０２１６】
ＢＡＣ−ｅＧＦＰトランスフェクションは、驚くべきことに、著しいレベル（３５個のうち１５個、すなわち４３％）の非常に高度に生産するクローン（ＭＦＩ＞６０，０００）および著しいレベル（３５個のうち１９個、すなわち５４％）の中位に生産するクローン（６，０００〜６０，０００の間のＭＦＩ）を示す。
【０２１７】
まとめて考えると、単純なプラスミドトランスフェクションについて見られることと同様の、トランスフェクション後の発現レベルの低下をＢＡＣトランスフェクションに関して予想しただろうから、これは、驚くべき所見である。ユークロマチンタンパク質発現遺伝子座における目的の遺伝子でのトランスフェクションにおいて明らかに安定かつ高度に発現するクローンが生じることにより、これらのクローンについて、トランスフェクション後すぐに非常にストリンジェントな方法で（例えば、抗生物質淘汰圧により、および／または発現レベルによるソーティングにより）、濃縮することが可能である。
【０２１８】
【表３】
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【０２１９】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【国際調査報告】
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