【手続補正書】
【提出日】平成19年1月26日(2007.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  腸炎菌を包含する重合性ミクロスフェアを含む組成物であって、腸炎菌がミクロスフェアから２相性パターンで放出され、第１相において全腸炎菌の２０％から５０％が７日から１５日の期間の初期破裂で放出され、該第１相に続く第２相において残りの腸炎菌が１０日から１５週の期間で放出されることを特徴とする組成物。
【請求項２】  ミクロスフェアが、ポリ(ラクチド)（ＰＬＡ)、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスホエステル、またはこれらの組合せを含む、請求項１の組成物。
【請求項３】  ミクロスフェアが、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマーを含む、請求項２の組成物。
【請求項４】  ラクチドのグリコリドに対する比率が、８０：２０から５０：５０である、請求項３の組成物。
【請求項５】  ラクチドのグリコリドに対する比率が、６５：３５から５０：５０である、請求項４の組成物。
【請求項６】  ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマーの分子量が、１０,０００から１１０,０００である、請求項３の組成物。
【請求項７】  ミクロスフェアが、直径０.１μｍから４００μｍを有する、請求項１の組成物。
【請求項８】  ミクロスフェアが、直径５μｍから１２０μｍを有する、請求項７の組成物。
【請求項９】  ミクロスフェアが、少なくとも１つのアジュバント、栄養物質、薬物、ペプチド、免疫調節物質、またはこれらの組合せをさらに含む、請求項１の組成物。
【請求項１０】  ポリマーに組込まれた腸炎菌の量が、ポリマーのｍｇ当り２５μｇから４００μｇである、請求項１の組成物。
【請求項１１】  十分に分配された腸炎菌を含む重合性ミクロスフェアをつくる方法であって、
（ａ）腸炎菌の水性溶液をポリマーの非水性溶液で乳化し；なお、該非水性溶液が重量：容量比１２ｍｇ／ｍｌから１５０ｍｇ／ｍｌを有し；腸炎菌のポリマーに対する重量：重量比が１：４０から１：１.５であり；水性媒体の非水性媒体に対する容量：容量比が１：８０から１：１２であり；
（ｂ）工程（ａ）から得た油中水型エマルションを第２水性溶液と混合して、水中(油中水)型二重エマルションを形成せしめ；
（ｃ）ポリマー溶媒を除去して、多孔性ミクロスフェアをつくり；
（ｄ）このミクロスフェアを濾過または遠心分離し、水洗し、乾燥する；
ことを含む方法。
【請求項１２】  ポリマーが、ポリ(ラクチド)（ＰＬＡ)、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスホエステル、またはこれらの組合せを含む、請求項１１の組成物。
【請求項１３】  ポリマー溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２、酢酸エチル、アセトン、テトラヒドロフランまたはクロロホルムを含む、請求項１１の方法。
【請求項１４】  第２水性溶液が、リン酸緩衝液または蒸留水を含む、請求項１１の方法。
【請求項１５】  第２水性溶液が、乳化剤をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】  乳化剤が、ポリビニルアルコール、スパン８０またはツイン８０を含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】  ミクロスフェアが、直径中央値０.１μｍから４００μｍを有する、請求項１１の方法。
【請求項１８】  ミクロスフェアが、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマーを含む、請求項１１の方法。
【請求項１９】  ラクチドのグリコリドに対する比率が、８０：２０から５０：５０である、請求項１８の方法。
【請求項２０】  ラクチドのグリコリドに対する比率が、６５：３５から５０：５０である、請求項１９の方法。
【請求項２１】  ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマーの分子量が、１０,０００から約１１０,０００である、請求項１８の方法。
【請求項２２】  ミクロスフェアが、少なくとも１つのアジュバント、栄養物質、薬物、ペプチド、免疫調節物質、またはこれらの組合せをさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項２３】  ポリマーに組込まれた腸炎菌の量が、ポリマーのｍｇ当り２５μｇから４００μｇである、請求項１１の方法。
【請求項２４】  腸炎菌感染から家禽を免疫する方法であって、家禽に有効量の請求項１のミクロスフェアを投与することを含む方法。
【請求項２５】  ミクロスフェアを生理的に許容される懸濁液で投与する、請求項２４の方法。
【請求項２６】  懸濁液を注射または経口により投与する、請求項２５の方法。
【請求項２７】  各家禽が単回用量０.１５ｍｇから５ｍｇを摂取する、請求項２４の方法。
【請求項２８】  家禽がミクロスフェア投与３−４週間後に効果的な腸炎菌抗体応答を発揮し、その応答が少なくとも６か月保持される、請求項２４の方法。
【請求項２９】  腸炎菌感染から家禽を免疫する方法であって、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマーを含む多孔の重合性シェル中に包含された死んだ腸炎菌を含むミクロスフェアの懸濁液の単回用量を家禽に投与することを含み；該ミクロスフェアが該腸炎菌の全量０.１５ｍｇから１５ｍｇを含み；該腸炎菌がミクロスフェアから２相性パターンで放出され、第１相において全腸炎菌の２０％から５０％が７日から１５日の期間での初期破裂で放出され、第２相において残りの腸炎菌が１０日から１５週の期間で放出される方法。
【請求項３０】  免疫がミクロスフェアの投与から３−４週間で有効となる、請求項２９の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、殺腸炎菌を包含する長期間放出性、バイオ分解性、バイオ和合性、多孔性の重合性ミクロスフェアを提供する。投与に際し、腸炎菌が２相性パターンで放出される。全腸炎菌の約２０％から約５０％が約７日から約１５日の期間での初期破裂で放出され、次いで残りの腸炎菌が約１０日から約１５週の期間でゆっくりと持続的に放出される。ミクロスフェアは、水中(油中水)型エマルションの製法によりつくることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
ポリマー溶媒を次いで蒸発および/または抽出により除去すると、ポリマーが固くなり、内部水滴を包含する。この水滴は、小さいミクロスフェア中に細菌を含有し、一般的に直径中央値が約０.１から約４００μｍであり、好ましくは約５から約１２０μｍである。固化が完了すると、ミクロスフェアを濾過するか(ミクロスフェア)、遠心分離し(サブミクロンスフェア)、水洗し乾燥する。濾過は０.０２μｍから２０μｍメッシュ、好ましくは５μｍメッシュで行う。水洗は約１５ｍｌから約５０００ｍｌの水、典型的には約１００ｍｌから約５００ｍｌのリン酸緩衝液(ＰＢＳ)で行う。乾燥は、通常の技術である真空乾燥、凍結乾燥、液化床乾燥などで行うことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
腸炎菌の放出は２つの異なるメカニズムで起こり得る。腸炎菌は重合性マトリックス中の水充填経路を介する拡散により放出される。このマトリックスは内部水相またはミクロスフェア形成の際の溶媒除去によりつくられた空所または孔の結果である。ミクロスフェアの多孔はその投与時の腸炎菌の最初の飛出しで多量の放出をもたらす。ミクロスフェア孔の表面またはその近辺の腸炎菌が、ミクロスフェア孔に出入りする体液中に溶解するからである。本発明において、大略で全包含腸炎菌の約２０％から約５０％が初期破裂で放出される。この期間は典型的に約７日から１５日である。このような最初の放出速度を達成することにより、ミクロスフェア投与家禽はわずか注射後３−４週間で明らかな抗体反応を示す。これは、免疫後５０日まで明白な抗体反応をもたらさない既存の免疫方法に比して優れた利点である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
放出の第２メカニズムはポリマーの分解による腸炎菌の放出である。これは腸炎菌の初期破裂による放出に続き、ミクロスフェア中の残りの腸炎菌が徐々に放出される。典型的には、残りの腸炎菌は少なくとも約１０−約１５週間かかって徐々に放出される。分解速度は、ポリマーの水和速度に影響するポリマーの性質を変えて制御できる。その性質には、例えば、使用するモノマーの選択、ポリマーを含む種々のモノマーの比率、ポリマーの分子量などがある。この性質は、ポリマーの親水性および結晶性に影響を与えて、もってポリマーの水和速度を制御する。親水性剤、例えば、炭水化物、表面活性剤、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、低分子ポリエステルなどをポリマー中に組込んで、ポリマーの水和を増したり、侵食速度を変えたりできる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
ポリマーの性質、すなわちその組成、分子量、本質を変えることにより、拡散対分解による放出細菌の割合および全放出期間に影響を与え得る。例えば、ポリマー中のＰＬＧＡの分子量またはラクチドの量を変えると、ミクロスフェアが体内で分解する速度が変わる。ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマーのグリコリド量を増し、ポリマーの分子量を下げると、ポリマーの加水分解が高まり、ポリマー侵食からの腸炎菌放出が増加する。高い分子量のＰＬＧＡ，例えば、約７５,０００から約１１０,０００のＰＬＧＡを用いるか、少なくとも約７５：２５のラクチドのグリコリドに対する比率を用いると、初期破裂後の腸炎菌放出の期間を延長できる。しかし、望ましくは、より多量の内部水溶液を用いて、所望の最初の放出を行う多孔性ミクロスフェアを、ポリラクチドをポリグリコリドに対して高比率で含むＰＬＧＡポリマーでもつくる。また、ミクロスフェアの分解速度は、２種の異なるポリマーを組み合せて調節できる。例えば、ポリカプトラクトン(ＰＣＬ)の分解速度はＰＬＧＡよりも非常に遅い。ＰＥＧとＰＬＧＡの混合物でつくられたミクロスフェアは、非常に速い分解速度および腸炎菌の速い全放出速度を有する。ＰＥＧは放出の最初の飛出しにあまり効果がない。初期破裂における腸炎菌の放出はミクロスフェアの多孔性により制御できる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
実施例５
１０％(ｗｔ)の腸炎菌を保持するＰＬＧＡ５０：５０サブミクロスフェアの製造
４００ｍｇのポリマーＰＬＧＡ５０：５０を４ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。この溶液に０.１ｍｌの腸炎菌水性懸濁液(４００ｍｇ／ｍｌ)を加えて、音波破砕により第１エムルションをつくった。エムルションを、０.０５％ＰＶＡを含有する６ｍｌのＰＢＳに混合して、音波破砕により二重エムルションをつくった。第２エムルションを、０.５％ＰＶＡを含有する１５０ｍｌのＰＢＳ中攪拌しながら加えた。この溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２を外相に抽出するために、０.０５％ｗｔのＰＶＡを含有する２５０ｍｌのＰＢＳを２時間で加えた。得た腸炎菌含有ミクロスフェアを遠心分離し、ＰＢＳで洗い、真空乾燥した。得たミクロスフェアのサイズは約０.１から約１０μｍの範囲にあり、腸管のパイエル集腺により容易に吸収され、かつ経口投与に適していた。図２は、このミクロスフェアのサイズ分布および形態を示す。