(57)【要約】  本開示は、前立腺癌を有する患者を診断、予後予測、監視、および治療するための組成物および方法に関する。特に、本開示は、適切な治療投与を決定するための診断マーカーとしてのｎｃＲＮＡに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における低悪性度または高悪性度前立腺癌を診断するための方法であって、
ａ）ヒト患者から生物学的サンプルを得るステップ；
ｂ）インビトロアッセイにおいて前記生物学的サンプルを試薬と接触させることによって、配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルを検出するステップ；および
ｃ）前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも高い場合、対象が高悪性度前立腺癌を有すると同定し、または前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも低いかもしくは同等である場合、対象が低悪性度前立腺癌を有すると同定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルが前立腺組織および前立腺細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前立腺組織がホルマリン固定パラフィン包埋組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前立腺組織または前立腺細胞からｎｃＲＮＡを抽出するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記検出するステップが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試薬が、オリゴリボヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴリボヌクレオチドプローブ、およびオリゴヌクレオチドプローブ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｎｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、Ｃ／Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ、Ｈ／ＡＣＡ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびＩｎｃＲＮＡからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記前立腺組織サンプルが、配列番号２１、２７、３３、５５、６１、６７、７１、８６、９４、９５、１０２、１０５、１１１、１１２、１２６、１３１、１３６、１４１、１６０、１６２、１６６、１８５、１８９、１９３、および２０２からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
低悪性度または高悪性度前立腺癌について対象をスクリーニングする方法であって、
ａ）前記対象からの生物学的サンプル由来のｎｃＲＮＡを、全ゲノムｎｃＲＮＡに対するプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズさせるステップ；
ｂ）配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについてのハイブリダイゼーション生成物の相対存在量を検出するステップ；および
ｃ）前記生物学的サンプルからの前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの累積発現レベルと低悪性度前立腺癌生物学的サンプルからの前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの累積発現レベルとを比較するステップ
を含み、前記対象における前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現のレベルの増加は、さらなる治療を必要とする高悪性度前立腺癌の指標となり、および前記対象における前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現の同等かまたはそれ未満のレベルは、さらなる治療を必要としない低悪性度前立腺癌の指標となる、方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが前立腺組織および前立腺細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記前立腺組織がホルマリン固定パラフィン包埋前立腺組織である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前立腺組織または前立腺細胞からｎｃＲＮＡを抽出するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出するステップが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される方法によって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が、オリゴリボヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴリボヌクレオチドプローブ、およびオリゴヌクレオチドプローブ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ｎｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、Ｃ／Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ、Ｈ／ＡＣＡ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびＩｎｃＲＮＡからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記前立腺組織サンプルが、配列番号２１、２７、３３、５５、６１、６７、７１、８６、９４、９５、１０２、１０５、１１１、１１２、１２６、１３１、１３６、１４１、１６０、１６２、１６６、１８５、１８９、１９３、および２０２からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
対象における高悪性度前立腺癌を治療する方法であって、
ａ）ヒト患者から生物学的サンプルを得るステップ；
ｂ）インビトロアッセイにおいて前記生物学的サンプルを試薬と接触させることによって、配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルを検出するステップ；
ｃ）前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも高い場合、対象が高悪性度前立腺癌を有すると同定し、または前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも低いかもしくは同等な場合、対象が低悪性度前立腺癌を有すると同定するステップ；および
ｄ）ｉ）前立腺組織の部分的または完全な外科的除去のための手術；
ｉｉ）実効線量の放射線の投与；および
ｉｉｉ）高悪性度前立腺癌の治療のための治療有効量の薬物の投与
の１つまたは複数により高悪性度前立腺癌を治療するステップを含む方法。
【請求項１８】
前記手術が、腹腔鏡手術、腹腔鏡下根治的前立腺摘除術、前立腺摘除術、および根治的恥骨後式前立腺摘除術から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記放射線が、外照射療法、近接照射療法、３Ｄコンホメーション療法、ガンマナイフ療法、および粒子線療法から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
高悪性度前立腺癌の治療のための前記薬物が、化学療法薬および性ホルモン抑制薬から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記化学療法薬が、ドセタキセル（docetaxel）（Taxotere；タキソテール）、カバジタキセル（cabazitaxel）（Jetvana；ジェトバナ）、ゴセレリン（Goserelin）（Zoladex；ゾラデックス）、フルタミド（Flutamide）（Eulexin；ユーレキシン）、ビカルタミド（Bicalutamide）（Casodex；カソデックス）、アビラテロン（Abiraterone）（Zytiga；ジティガ）、およびニルタミド（Nilutamide）（Nilandron；ニランドロン）から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記化学療法薬が前記少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルに基づいて選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記性ホルモン抑制剤がロイプロリド（Leuprolide）（ルプロン；Lupron）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物学的サンプルが、配列番号２１、２７、３３、５５、６１、６７、７１、８６、９４、９５、１０２、１０５、１１１、１１２、１２６、１３１、１３６、１４１、１６０、１６２、１６６、１８５、１８９、１９３、および２０２からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）患者の生物学的サンプルからｎｃＲＮＡを単離するための第１の試薬溶液；および
ｂ）配列番号１〜２０９からなる群から選択される、前記第１の試薬溶液からの、少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルを検出するための第２の試薬溶液：
を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３４７，６００号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、前立腺癌を有する患者を診断、予後予測、監視、および治療するための組成物および方法に関する。特に、本開示は、適切な治療投与を決定するための診断マーカーとしてのｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００３】
２０１２年１１月に、米国予防サービス特別委員会は、「中程度から高い確信度でサービスに利益がないこと、および実際に害が利益を上回ること」という理由で、健常男性の前立腺癌の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングを行わないように勧告した（Moyer、2012）。特別委員会は試験が低い偽陽性率で敏感で正確であることを認めているが、彼らは「ＰＳＡ試験が命を救う証拠はほとんどなく、むしろ多くの男性が代わりに、決して致命的ではないであろう小さな腫瘍の治療に関連するインポテンス、失禁、心臓発作に苦しむ」と主張する。当然のことながら、多くの泌尿器科医は納得しておらず、多くの著名な泌尿器科腫瘍学者が強く反対意見を発表している（McNaughton-Collins&Barry、2011；Catalonaら、2012）。確かに、発生率ベースの死亡率と年間の変化率を決定するために一貫した１０年間の追跡調査を考慮に入れた、ＳＥＥＲ−ＳｔａｔとＪｏｉｎｐｏｉｎｔ回帰分析を使用した、Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓ（ＳＥＥＲ）データベースの慎重な集団ベース研究は、ＰＳＡスクリーニングによる早期発見は寿命を延ばすと結論している（Wachtelら、2013）。
【０００４】
継続的な論争を受けて、米国泌尿器科学会は２０１３年５月の年次総会で新しいガイドラインを発表し（Carterら、2013）、７５歳超の男性はもはやスクリーニングされるべきではなく、４５歳未満の男性もスクリーニングに対してカウンセリングを受けるべきであることを提唱した。この論争の中心にあるのは、ＰＳＡ試験とポジティブ針生検に基づいて前立腺癌と診断された男性１０人のうち３人が高悪性度の（aggressive；致命的な）腫瘍を治療するために決定的な治療を必要とする一方で、同じように診断された男性１０人のうち７人が低悪性度の（indolent；致死的でない）疾患を有し、決して治療を必要としないであろうという事実である。残念なことに、グリーソンスコア（Gleason Score）もＰＳＡレベルも低悪性度と高悪性度の疾患を区別しておらず、そして、そのような試験がなく、前立腺癌と診断されたほとんどすべての男性は彼らが高悪性度の疾患を持っているかのように治療されおり、不必要な治療費で推定、年間＄２．６Ｂもの費用が健康管理システムにかかっている。根治的前立腺摘除術に関連した勃起不全、失禁、鼠径ヘルニアおよび機能低下した腸機能を含む重大な病的状態は、慎重な経過観察／積極的監視（Active Surveillance；ＡＳ）と比較して総治療費の５０％を追加すると推定される（National Collaborating Centre for Cancer、2008；Ramsayら、2012）。患者およびその家族に対するこれらの副作用の非常に大きな感情的影響、および質調整生存年（Quality -Adjusted Life Years；ＱＡＬＹ）基準に対する影響を推定することはさらに困難である（Liatsikosら、2008；Mirzaら、2011）。
【０００５】
上に概説したように、前立腺癌の過剰診断および過剰治療に関連する問題は、ＰＳＡ試験自体にあるのではなく、現在、腫瘍が針生検によって確認された後に低悪性度疾患と高悪性度疾患とを区別できないということにある。この問題は、少なくとも２０年以上も前から認識されており（Partinら、1992；Coffey、1993）、今日もなお大きな問題である（Kellerら、2007；Getzenberg&Carter、2012）。その間に、倍数性、核形態学および核マトリックス構造、マイクロアレイに基づくトランスクリプトーム分析、ＤＮＡメチル化状態、ならびにＰＣＡ３およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の検出を含む、高悪性度疾患の予後マーカーを開発する多くの試みがあった（Mohlerら、1992；Partinら、1993；Rossら、1999；Leman&Getzenberg、2002；Pheら、2010；Salagierski&Schalken、2012；Bismarら、2013）。これらの方法論のいずれも前立腺腫瘍の進行の指標としてグリーソンスコアより有意に優れていることは証明されておらず、それらは低悪性度疾患を適切に識別していない（Velonasら、2013）。より良い予後指標がないため、グリーソン６腺癌（adenocarcinoma）の名称を「癌」として変更して即時かつ不必要な介入を妨げることについての議論さえあった（Carterら、2012）。しかしながら、レビュー基準の変化を考慮した最近のグリーソングレード、リードタイムバイアスおよび他の要因の再評価（Montironiら、2010）は、グリーソンスコア進行が珍しく、前立腺腫瘍進行の生物学がグリーソンスコアの変化によって捉えられていないことを示唆している（Penneyら、2013）。低悪性度腫瘍の同定におけるグリーソンスコアの価値をめぐる論争は、医師および患者に治療選択肢に関する決定の基礎となる信頼できる手段がなく、多くの男性が不必要に臨床的介入を選択する結果となった。「ゴールドスタンダード」であるグリーソンスコアそれ自体が前立腺腫瘍の進行の信頼できる指標ではないために、それもまた新しい予後ツールの開発の妨げになっている。
【０００６】
過去において、ｍＲＮＡ発現プロファイルを用いて低悪性度および高悪性度疾患を区別するように設計された試験が開発されてきたが、それぞれが重大な落とし穴および欠点を示している。第１に、１つの例外を除いて、これらのアッセイのすべてが根治的前立腺摘除術標本由来の腫瘍材料を使用しており、そしてそれ故、よくても初期の腫瘍再発の予測にすぎない。継続的な臨床上の決定に関連する術後の決定を下すためには潜在的に有用であるが、それらは手術前に低悪性度および高悪性度前立腺癌（indolent and aggressive prostate cancer）を区別することに関連する問題に対処していない。第２に、これらのゲノムアプローチのいくつかが、アンドロゲン受容体（ＡＲ）調節遺伝子発現（Heemersら、2011）、上皮間質相互作用（Chenら、2012）、および細胞周期（Cuzickら、2011、2012；Freelandら、2013；Cooperbergら、2013）を含む、前立腺癌の進行に関与する特定の経路に焦点を当てている。これらのアッセイは、すべての前立腺腫瘍が共通の経路に沿って進行するという仮定に基づいている。他の市販のバイオマーカーアッセイは、小さなサブセットの遺伝子のリアルタイムＰＣＲによって生成されたｍＲＮＡ発現プロファイルを利用する。
【０００７】
乳癌および前立腺癌を含むヒト固形腫瘍における調節不全ｍｉＲＮＡ発現に関しては、２００６年に最初に記載された（Voliniaら、2006）。移植可能なＬｕＣａＰファミリーの前立腺異種移植モデルならびにアンドロゲン受容体陽性および陰性のヒト前立腺癌細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現の比較を用いて、根治的前立腺摘除術からの良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）と前立腺癌の間で区別した３０のｍｉＲＮＡ特性を定義した（Porkkaら、2007）。これらの研究はまた、２１のｍｉＲＮＡ特性が性腺摘除抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）の出現を潜在的に予測していることを示唆した。ｍｉＲＮＡの潜在的な臨床的有用性は十分に認識されているが（deVere White、2009；Ha、2011；Casanova-Salasら、2012；Maugeri-Saccaら、2012）、今日まで、このグループからの臨床材料を使用したフォローアップ検証研究はない。
【０００８】
根治的前立腺摘除術に由来する腫瘍および腫瘍周辺の正常組織（Sivaら、2009；Carlssonら、2011；Schubertら、2013）、高グレード前立腺上皮内異常増殖および転移性疾患（Leiteら、2013）、または正常上皮組織ならびに低（グリーソン６）および高（≧グリーソン８）グレードの腫瘍（Walterら、2013）における選択されたｍｉＲＮＡの発現が、いくつかの最近の研究により調査された。
【０００９】
これらの研究は、市販のＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ、転写媒介増幅（ＴＭＡ）またはディープシークエンシング（４５４ピロ−シークエンシング）を含む様々な異なるプラットフォームを使用し、根治的前立腺摘除術からの低温保存またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織を用い、少数のｍｉＲＮＡを異なる段階の前立腺癌進行と関連づけた（Schaeferら、2010；Szczyrbaら、2010）。これらの研究はすべて根治的前立腺摘除術後の腫瘍再発のマーカーの開発に焦点を当てており、予後設定では試験されていない。
【００１０】
今日までに、前立腺癌におけるｎｃＲＮＡのゲノムワイドトランスクリプトーム研究は１つだけであった（Martens-Uzunovaら、2012）。この研究では、Ｓａｎｇｅｒ  ｍｉＲＢａｓｅ  Ｖ１０．１に登録されている７２３のヒトｍｉＲＮＡを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｍｉＲＮＡ  Ｖ２マイクロアレイのＩｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａディープシーケンシングおよびマイクロアレイ分析を使用して、同じ患者からの新鮮凍結根治的前立腺摘除術サンプルおよび隣接正常組織におけるｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡ特性を比較した。これらの研究は、前立腺癌および腫瘍周囲の良性組織において発現される一揃いのｎｃＲＮＡを比較するための貴重なデータセットを提供するが、臨床的介入前に、腫瘍進行について予後的となるｎｃＲＮＡのパネルの合理的設計には役に立たない。この技術は瞬間冷凍材料を必要とするので、一般的なスクリーニング技術として不利でもある。
【００１１】
したがって、決定的な治療を、それを必要とする患者に迅速に提供することができる一方で、治療を必要としない低悪性度前立腺癌患者を特定し、それによって不必要な費用と寿命と健康の妥協を避けることができるような、高悪性度前立腺癌を有する患者を正確に識別する試験が必要とされている。さらに、例えば外科手術または放射線などの任意の治療的介入の開始前に臨床的に有用な情報を提供する試験が必要とされる。腫瘍学切片の日常的な診断評価を担う泌尿器科診療または組織病理検査室における現在の作業の流れを妨げない試験が必要とされている。最後に、何らかの治療が開始される前に結果を治療の計画に使用できるように、実行することができ、結果を泌尿器科チームと患者にタイムリーに入手できる試験が必要である。
【００１２】
本開示の一態様は、対象における低悪性度または高悪性度前立腺癌を診断するための方法であって、ａ）ヒト患者から生物学的サンプルを得るステップ；ｂ）インビトロアッセイにおいて生物学的サンプルを試薬と接触させることによって、配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルを検出するステップ；およびｃ）少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも高い場合、対象が高悪性度前立腺癌を有すると同定し、または少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも低いか同等である場合、対象が低悪性度前立腺癌を有すると同定するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは前立腺組織および前立腺細胞からなる群から選択される。他の実施形態では、組織はホルマリン固定パラフィン包埋組織である。特定の実施形態では、この方法は生物学的サンプルからｎｃＲＮＡを抽出するステップを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、検出は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態では、試薬は、オリゴリボヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴリボヌクレオチドプローブ、およびオリゴヌクレオチドプローブ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、Ｃ／Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ、Ｈ／ＡＣＡ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびＩｎｃＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１６】
本開示の別の態様は、低悪性度または高悪性度前立腺癌について対象をスクリーニングする方法であって、ａ）対象からの生物学的サンプル由来のｎｃＲＮＡを、全ゲノムｎｃＲＮＡに対するプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズさせるステップ；ｂ）配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについてのハイブリダイゼーション生成物の相対存在量を検出するステップ；およびｃ）生物学的サンプルからの少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの累積発現レベルと低悪性度前立腺癌生物学的サンプルからの少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの累積発現レベルとを比較するステップを含み、対象における少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現のレベルの増加は、さらなる治療を必要とする高悪性度前立腺癌の指標となり、および対象における少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現の同等かまたはそれ未満のレベルは、さらなる治療を必要としない低悪性度前立腺癌の指標となる、方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは前立腺組織および前立腺細胞からなる群から選択される。他の実施形態では、組織はホルマリン固定パラフィン包埋組織である。特定の実施形態では、この方法は生物学的サンプルからｎｃＲＮＡを抽出するステップを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、検出は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および核酸ハイブリダイゼーション、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態では、試薬は、オリゴリボヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴリボヌクレオチドプローブ、およびオリゴヌクレオチドプローブ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
本開示のなお別の態様は、対象における高悪性度前立腺癌を治療する方法であって、ａ）ヒト患者から生物学的サンプルを得るステップ；ｂ）インビトロアッセイにおいて生物学的サンプルを試薬と接触させることによって、配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルを検出するステップ；ｃ）少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも高い場合、対象が高悪性度前立腺癌を有すると同定し、または少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも低いかもしくは同等な場合、対象が低悪性度前立腺癌を有すると同定するステップ；およびｄ）高悪性度前立腺癌を治療するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、治療は、以下からなる群から選択される：ｉ）前立腺組織の部分的または完全な外科的除去のための手術；ｉｉ）実効線量の放射線の投与；およびｉｉｉ）高悪性度前立腺癌の治療のための治療有効量の薬物の投与。
【００２１】
ある特定の実施形態では、手術は、腹腔鏡手術、腹腔鏡下根治的前立腺摘除術、前立腺摘除術、および根治的恥骨後式前立腺摘除術から選択される。他の実施形態では、放射線は、外照射療法（external beam radiotherapy）、近接照射療法（brachy therapy）、および粒子線療法から選択される。いくつかの実施形態において、高悪性度前立腺癌の治療のための薬物療法は化学療法薬および性ホルモン抑制薬から選択される。さらに他の実施形態では、化学療法薬は、ドセタキセル（docetaxel）（Taxotere；タキソテール）、カバジタキセル（cabazitaxel）（Jetvana；ジェトバナ）、ゴセレリン（Goserelin）（Zoladex；ゾラデックス）、フルタミド（Flutamide）（Eulexin；ユーレキシン）、ビカルタミド（Bicalutamide）（Casodex；カソデックス）、アビラテロン（Abiraterone）（Zytiga；ジティガ）、およびニルタミド（Nilutamide）（Nilandron；ニランドロン）から選択される。いくつかの実施形態において、性ホルモン抑制剤は、ロイプロリド（Leuprolide）（ルプロン；Lupron）から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、高悪性度前立腺癌の治療は、少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルによって、全体としてまたは部分的に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】患者における前立腺癌の診断のための現在の臨床診療の略図を示す図である。
【図２】前立腺癌患者の予後および治療のための現在の臨床診療の略図を示す図である。
【図３】低悪性度または高悪性度前立腺癌を診断するための記載された方法の略図を示す図である。
【図４】ｍｉＲＮＡ、ＣＤ  Ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ、およびＨ／ＡＣＡ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡについてのグリーソンスコアによってクラスター化された前立腺生検におけるｎｃＲＮＡ発現のヒートマップ表示を示す図である。
【図５Ａ】患者転帰が知られているそれぞれの患者（すなわち、低悪性度または高悪性度）についての生化学的転帰を示す比較および累積ｎｃＲＮＡ発現レベルについて分析した前立腺組織生検についての進行スコアプロット図を示す図である。
【図５Ｂ】患者の転帰が未知であったそれぞれの患者（すなわち、低悪性度または高悪性度）についての生化学的転帰を示す比較および累積ｎｃＲＮＡ発現レベルについて分析した前立腺組織生検の進行スコアプロット図を示す図である。
【図６】記載された方法の利点の略図を示す図である。
【図７】３８個の異なる患者の前立腺組織サンプルからの５６個のｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡを使用して計算された進行スコアのウォーターフォールプロット図を示す図である。
【図８】ｍｉＲＮＡおよび低分子ｎｃＲＮＡ種の両方のステムループＲＴ−ｑＰＣＲの設計の略図を示す図である。
【図９】目的の低分子ｎｃＲＮＡの限定された固有配列識別子（網掛け）を標的とし、それを他の非常に類似した低分子ｎｃＲＮＡと区別する、順方向および逆方向プライマーならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ設計の略図を示す図である。
【図１０】特定のｍｉＲＮＡ／ｓｎｃＲＮＡ配列の各々についてＣｔ曲線を示す未変換データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
対象における低悪性度または高悪性度前立腺癌を診断するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、患者由来の生物学的サンプル中の低悪性度前立腺癌と高悪性度前立腺癌とを正確に区別するための堅牢な進行スコア（Progression Score；ＰＳ）を提供する。本明細書中で使用される場合、「高悪性度な」前立腺癌は生化学的再発の証拠によって定義される。臨床的には、これは１）ＰＳＡの上昇（ＰＳＡ速度の絶対ＰＳＡレベルとして測定される）；２）転移進行の証拠；再生検におけるグリーソンスコアの変化（治療前）；またはＸ線またはＣａｔｓｃａｎにおける新しい転移の証拠を含む。本明細書中で使用される場合、「低悪性度」前立腺癌腫瘍は、高悪性度前立腺癌腫瘍の事象がないことによって定義される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、対象における低悪性度または高悪性度前立腺癌を診断する方法は、ヒト患者から生物学的サンプルを得るステップ、インビトロアッセイにおいて生物学的サンプルを試薬に接触させることによって配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルを検出するステップ；および少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルより高い場合、対象が高悪性度前立腺癌を有すると同定し、または少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌の生物学的サンプルにおける複合発現レベルより低いか同等である場合、対象が低悪性度前立腺癌を有すると同定するステップを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、前立腺組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物、および前立腺細胞からなる群から選択される。特定の実施形態では、生物学的サンプルは診断用コア針生検からのホルマリン固定パラフィン包埋組織である。他の実施形態では、生物学的サンプルは尿中エキソソームから単離されたｎｃＲＮＡである。
【００２７】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ（２０〜２４ヌクレオチド）およびｎｃＲＮＡ（最大３００ヌクレオチド）が個々の生検コアから抽出される。本明細書中で使用される場合、低分子ＲＮＡの混合物はまとめてｎｃＲＮＡと呼ばれる。そのサイズ（＜３００ヌクレオチド）のために、ｎｃＲＮＡはＦＦＰＥ組織から容易に抽出され、固定化または抽出の間に分解されず、ＦＦＰＥ組織からのｍＲＮＡの抽出に固有な問題を未然に防ぐ。生検からのｎｃＲＮＡの収量は多数の分析に十分である。５５００の小さな非コードＲＮＡ（１７３３のｍｉＲＮＡ、１６５８のｐｒｅ−ＲＮＡ、２２１６のｓｎｏ／ｓｃａ  ＲＮＡ）のプローブを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｍｉＲ  ３．０アレイを使用して、良性組織とグリーソン８腫瘍の間で差次的に発現されるｎｃＲＮＡのコホートを同定した。前立腺腫瘍の進行に関与する遺伝子オントロジーを標的とするｍｉＲＮＡ、および転移の進行に関与するいくつかのｎｃＲＮＡ（Ｃ／Ｄ  ｂｏｘおよびＨ／ＡＣＡ  ｂｏｘのｓｎｏＲＮＡ）が、この分析により同定された。いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡアレイは、アッセイのコストを大幅に低下させる新しい高感度、高含有量、高スループットプラットフォームである、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）インスツルメンテーションプラットフォーム上で作製される。
【００２８】
その相対および累積発現レベルにより低悪性度腫瘍と高悪性度腫瘍との間の区別が可能である、ｎｃＲＮＡの選択されたサブセットが同定されている。これらのｎｃＲＮＡの選択は、ＰＳＡ、グリーソンスコア、または生物学的経路分析とは無関係であり、それ自体は完全に不偏（unbiased）である。統計学的方法論によりタイプ１（偽陰性）とタイプ２のエラー（偽陽性）の両方が最小化され、進行スコア（ＰＳ）が確実に低悪性度疾患と高悪性度疾患を厳密に区別することが実証されている独立したトレーニングセットを用いてアルゴリズムを検証した。その現在の構成では、本明細書に記載の方法は、偽陰性がなく、非常に低い（＜５％）偽陽性率を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、この方法は、ｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ＣＤ／ｂｏｘおよびＨＡＣＡ／ｂｏｘ）のパネルを調べるために同じＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）技術を使用する。ある特定の実施形態では、この方法は、それぞれのｎｃＲＮＡの発現レベルおよび臨床転帰（診断試験については１２コア針生検の後に限定される腫瘍の有無ならびに予後試験については生化学的不成功および腫瘍の進行）に依存するアルゴリズムを使用する。前立腺癌の場合、この方法論は血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル、グリーソンスコア（どちらも腫瘍進行に意味のあるマーカーではない）とは無関係である。この方法論はまた、生物学的経路のいかなる分析とも無関係である。実際、本明細書に記載の方法は、前立腺組織サンプルから単離された非コードＲＮＡの分析を用いて、男性を、前立腺癌を有するもの（早期および後期の両方）とそうでないものとに階級化する。この方法論は、前立腺癌のための主要なスクリーニングアッセイとして血清ＰＳＡに取って代わることができる。
【００３０】
本明細書に記載の方法は、病理学（グリーソンスコア）、腫瘍体積またはＰＳＡとは無関係に、同じカスタマイズされたスクリーニングを使用して、低悪性度前立腺癌を高悪性度前立腺癌と区別する。いくつかの実施形態では、既知の癌転帰（すなわち、低悪性度または高悪性度）を有する患者の前立腺生検から抽出されたＲＮＡは逆転写され、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含む全ゲノムアレイ（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｍｉＲ  ３．０）に対してハイブリダイズされ、低悪性度および高悪性度前立腺腫瘍において異なって調節されているｎｃＲＮＡは同定される。他の転写物発現調節研究または試験とは対照的に、低悪性度または高悪性度前立腺癌腫瘍に見られる発現プロファイルと比較して同定されたｎｃＲＮＡ（配列番号１〜２０９）の相対および累積発現レベルは、前立腺癌の予後の驚くほど堅牢で正確な判断を提供し、そしてその結果として、適切な治療選択肢（またはその欠如）を開始することができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの相対および累積発現プロファイルを組み合わせて、低悪性度または高悪性度前立腺癌組織における同じ累積発現プロファイルと比較する。ある特定の実施形態では、低悪性度前立腺癌組織における累積発現プロファイルと比較してより高い累積発現プロファイルは、患者が高悪性度前立腺癌を有しており治療が必要であることを示す。他の実施形態では、低悪性度前立腺癌組織における累積発現プロファイルと同等かまたはそれ未満の累積発現プロファイルは、患者が高悪性度前立腺癌を有していないことおよびモニタリングを受けているが治療を必要としないであろうことを示す。
【００３２】
いくつかの実施形態では、選択されたｎｃＲＮＡの累積発現プロファイルは、ｎｃＲＮＡの様々な種類の調節された発現の集合体であり得る。いくつかの実施形態では、調節された発現は、健康な前立腺組織、低悪性度前立腺癌組織、または高悪性度前立腺癌組織のような他の組織型における同じｎｃＲＮＡと比較して減少した発現であり得る。ある特定の実施形態では、調節された発現は、健康な前立腺組織、低悪性度前立腺癌組織、または高悪性度前立腺癌組織のような他の組織型における同じｎｃＲＮＡと比較して増加した発現であり得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、選択されたｎｃＲＮＡの累積発現プロファイルは、同じ組織サンプル中の特定のｎｃＲＮＡの減少した発現レベルおよび他のｎｃＲＮＡの増加した発現レベルの集合体であり得る。例えば、進行スコア、または少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの相対累積もしくは複合発現レベルは、別の組織型または同じ組織サンプル中の他のｎｃＲＮＡと比較して発現レベルが低下した１つまたは複数のｎｃＲＮＡを含み得る一方で、残りの少なくとも１０個のｎｃＲＮＡのうちの１つまたは複数が、別の組織型または同じ組織サンプル中の他のｎｃＲＮＡと比較して発現レベルの上昇を示す。少なくとも１０個の異なるように調節されたｎｃＲＮＡの累積発現レベルは、前立腺癌腫瘍が低悪性度または高悪性度であるか否かについての高度で不偏な指標を提供する。正常組織と比較して、個々の標的分子の有無、または単純な増加または減少を単に評価する他の方法とは異なり、記載の方法は、前立腺組織サンプルの真に不偏な独立した多変数分析を提供し、そのことにより前立腺癌の腫瘍が低悪性度または高悪性度であるか否かについての驚くほど正確な診断を可能にする。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルについて分析され、そして低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルにおける同じ１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号２１、２７、３３、５５、６１、６７、７１、８６、９４、９５、１０２、１０５、１１１、１１２、１２６、１３１、１３６、１４１、１６０、１６２、１６６、１８５、１８９、１９３、および２０２からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号２、６、８、１２、１４、１８、２３、４０、４４、４６、４８、８０、９０、９１、１０２、１０６、１０９、１１０、１３４、１４１、１４７、１４８、１６３、１９４、および２０１からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号９、２０、２４、２５、２７、３０、３１、３９、４１、４２、４７、５０、５４、５５、６０、６７、８３、９４、９７、１０３、１０８、１２２、１６８、１９５、および２０４からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号１７、２５、３７、４０、４８、５９、６２、７２、８０、８３、８７、１００、１０４、１２８、１４４、１４５、１５１、１５７、１５８、１６１、１６８、１８８、１９６、１９７、および２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号１１、２８、３２、３４、４３、４９、５８、６４、６６、７２、７７、１０４、１０５、１２５、１３７、１４３、１４９、１５７、１６０、１７１、１７３、１７７、１９７、２０２、および２０７からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号１３、１５、１９、３３、３７、３８、５７、６３、７１、７６、８１、８４、８５、８９、９５、１１２、１２９、１３１、１３５、１４６、１５０、１５５、１６０、２００、および２０３からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号４、２９、４０、６２、６４、６５、７２、７５、９４、９６、１０８、１２５、１３６、１３７、１４６、１５０、１６１、１６５、１６７、１７１、１８５、２０２、２０３、および２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号１５、２４、２９、３２、３８、４３、４９、５３、５７、６３、７４、８２、８５、９６、１０８、１１４、１１５、１２４、１４７、１５０、１５３、１８１、１８７、２０３、および２０８からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号７、１２、２０、２２、２３、３９、４７、５１、６０、６４、６９、８９、９０、９１、１２１、１３４、１３８、１４２、１４５、１４６、１４８、１５０、１５５、１６１、および１６７からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号６、１６、５３、６１、７４、７５、９６、１０７、１１３、１１４、１１５、１１６、１２３、１２４、１２７、１２８、１３０、１５６、１６６、１６９、１７４、１８５、１８６、１８７、および１９０からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号１〜２０９からなる群から選択される１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前立腺組織サンプルは、配列番号１〜２０９からなる群から選択される６０〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、１９１〜２００、または２０１〜２０９個のｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルを分析され、低悪性度癌を伴う前立腺組織サンプルまたは高悪性度癌を伴う前立腺組織サンプル中の同じｎｃＲＮＡについての相対および累積発現プロファイルと比較される。
【００４７】
低悪性度または高悪性度前立腺癌について対象をスクリーニングする方法もまた本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、対象由来の生物学的サンプル由来のｎｃＲＮＡを全ゲノムｎｃＲＮＡに対するプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズさせるステップ；配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡについてのハイブリダイゼーション生成物の相対存在量を検出するステップ；および生物学的サンプルからの少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの累積発現レベルを低悪性度前立腺癌生物学的サンプルからの少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの累積発現レベルと比較するステップを含み、ここで対象における少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルの増加がさらなる治療が必要である高悪性度前立腺癌の指標となり、対象における少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルと同等またはそれ未満のレベルがさらなる治療を必要としない低悪性度前立腺癌の指標となる。
【００４８】
対象における高悪性度前立腺癌を治療する方法であって、ヒト患者由来の生物学的サンプルを得るステップ；インビトロアッセイにおいて、生物学的サンプルを試薬と接触させることによって、配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルを検出するステップ；少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも高い場合、対象が高悪性度前立腺癌を有すると同定し、または少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベルが低悪性度前立腺癌生物学的サンプルにおける複合発現レベルよりも低いもしくは同等である場合、対象が低悪性度前立腺癌を有すると同定するステップ、および高悪性度前立腺癌を治療するステップを含む方法が本明細書においてさらに提供される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、治療は、ｉ）前立腺組織の部分的または完全な外科的除去のための外科手術；ｉｉ）実効線量の放射線を投与すること；ｉｉｉ）高悪性度前立腺癌の治療のために治療有効量の薬物を投与することからなる群から選択される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、インビトロアッセイにおいて生物学的サンプルを試薬と接触させることによる、配列番号１〜２０９からなる群から選択される少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルの検出がキット中に提供される。いくつかの実施形態において、キットは、患者の生物学的サンプルからｎｃＲＮＡを単離するための第１の試薬溶液を含む。いくつかの実施形態では、キットは、第１の試薬溶液から少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの発現レベルを検出するための第２の試薬溶液を含む。いくつかの実施形態では、発現レベルは、プライマー対、プローブ、マイクロアレイ、またはそれらの組み合わせを使用してアッセイされる。これに関して、当業者は、核酸の定量的発現分析のために複数の技術が存在することを容易に認識するであろう。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルを含む試薬は、遠心分離機、サーモサイクラー、およびフルオロイメージャーのような、しかしこれらに限定されない様々な機械的および分析的装置を使用して処理される。
【００５１】
ある特定の実施形態では、手術は、腹腔鏡手術、腹腔鏡下根治的前立腺摘除術、前立腺摘除術、および根治的恥骨後式前立腺摘除術から選択される。他の実施形態では、放射線は、外照射療法、近接照射療法、および粒子線療法から選択される。いくつかの実施形態では、高悪性度前立腺癌の治療のための薬物療法は化学療法薬および性ホルモン抑制薬から選択される。さらに他の実施形態では、化学療法薬は、ドセタキセル（タキソテール）、カバジタキセル（ジェトバナ）、ゴセレリン（ゾラデックス）、フルタミド（ユーレキシン）、ビカルタミド（カソデックス）、アビラテロン（ジティガ）、およびニルタミド（ニランドロン）から選択される。いくつかの実施形態において、性ホルモン抑制剤は、ロイプロリド（ルプロン）から選択される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、治療選択肢の成功または一般的な適合性の可能性は、選択され分析されたｎｃＲＮＡの複合発現レベルによって決定される。個別化医療とは、予測される反応または疾患のリスクに基づいて個々の患者に合わせた医療上の決定、慣習、介入および／または製品で、患者を異なるグループに分ける医療処置である。個別化医療、精密医療、および層別医療という用語も、コンパニオン療法のこの概念を説明している。いくつかの実施形態では、高悪性度前立腺癌の指標となる少なくとも１０個のｎｃＲＮＡの複合発現レベル分析もまた、対象がどの治療法にポジティブに反応する可能性が最も高いかを示す指標となる。
【００５３】
本明細書を通して、文脈が他に要求していない限り、用語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」または「含む（comprising）」などの変形は、記載のステップもしくは要素もしくは整数またはステップもしくは要素もしくは整数の群の包含を意味すると理解され、他のステップもしくは要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を除外するものではない。本明細書を通して、他に具体的に述べられていない限り、または文脈が他に要求していない限り、単一のステップ、物質の組成、ステップの群または物質の組成の群への言及は、１つおよび複数（すなわち１つまたは複数）のそれらのステップ、組成物、ステップの群、または物質の組成の群を含むと解釈される。
【００５４】
本明細書に記載の各実施形態は、他に具体的に述べられていない限り、他の各々すべての実施形態にも準用されるべきである。当業者は、本開示が具体的に記載されたもの以外の変形および修正を受けやすいことを理解するであろう。本開示はすべてのそのような変形および修飾を含むことを理解されたい。本開示はまた、特に明記しない限り、本明細書において参照または示される、個別的または集団的な、すべてのステップ、特徴、組成物および化合物、ならびに任意のすべての組み合わせまたは任意の２つ以上の前記ステップまたは特徴を含む。
【００５５】
本開示は、例示の目的のみを意図している、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるべきではない。本明細書に記載されるように、機能的に等価な製品、組成物および方法は明らかに本開示の範囲内である。
【００５６】
明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明されている、本開示のいくつかの特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることを理解されたい。逆に、簡潔のため、単一の実施形態の文脈で説明されている、本開示の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切な副組み合わせ（sub-combination）で提供することもできる。
【実施例】
【００５７】
本開示の実施形態の例は、以下の実施例において提供される。以下の実施例は、例示としての目的でのみ提示されるもので、本開示の使用に際し当業者を支援するために提示される。実施例は、決して開示の範囲を制限することを意図するものではない。
【００５８】
[実施例１]
前立腺癌のためのコア針生検予後プラットフォーム。
コア針生検からのｍｉＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡ（まとめてｎｃＲＮＡと呼ばれる）の抽出および特徴付けのための標準操作プロトコル。予後診断に使用された情報価値のあるｎｃＲＮＡのリスト。ウォーターフォールプロットは、比較のためのｎｃＲＮＡ発現データセットを使用し、高悪性度腫瘍と低悪性度腫瘍を区別してコア針生検から作成した。
【００５９】
[実施例２]
ＦＦＲＥコア針生検からのＲＮＡ抽出
このＳＯＰでは、それらを実験室に送った後にＲＮＡ材料を得るための、非特定化されたバーコード付きのコア針生検切片の抽出プロセスと取り扱いについて説明する。
【００６０】
標本は前立腺コア針生検材料からの１０μｍ厚のＦＦＰＥ組織の少なくとも２つの切片を含まなければならない。
【００６１】
ＲＮＡ抽出
Ａ．準備
標本を取り扱うときや運搬するときは、すべての実験室関係者が手袋を着用し、作業環境を適切な除染剤で除染するべきである。
【００６２】
ＲＮＡ材料の取り扱い時およびすべての抽出操作中は、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリーのチューブおよびフィルターチップが使用される。それらはバイオハザードビン内に適切に処分され、いかなる目的にも再利用されない。
【００６３】
サンプルチューブ、ＲＮＡ抽出カラム、および最終溶出チューブは、事前にバーコードを入れるか、またはＲＮＡ材料を得た直後にバーコードを入れる必要がある。
【００６４】
Ｂ．手順
１．  １ｍＬの脱パラフィン溶液またはヘキサデカンを加え、１０秒間激しくボルテックスする。チューブを軽く遠心してサンプルを底に移す。８４０μＬの溶媒を取り除き、５６℃で３分間インキュベートした後、室温で冷却する。（混合物が不透明に見える場合は、１ｍＬの脱パラフィン溶液またはヘキサデカンを追加して、過剰のパラフィンを溶解する。過剰の溶媒を除去して、１６０μＬの最終容量とする）。
【００６５】
２．  １５０μＬのＰＫＤ緩衝液をサンプルチューブに添加し、短時間ボルテックスして１１０００ｇで１分間遠心する。
【００６６】
３．  １０μＬのプロテイナーゼＫを下の透明な相に加える。穏やかにピペッティングして混合する。
【００６７】
４．  ５６℃で１５分間インキュベートした後、８０℃で１５分間インキュベートする。
【００６８】
５．下の透明な相を新しい２ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、氷上で３分間インキュベートする。２００００ｇで１５分間遠心する。ＱＩＡＣｕｂｅを用いたロボット精製のためには、上清を２ｍＬサンプルチューブＲＢに移し、チューブをＱＩＡＣｕｂｅに設置する。
【００６９】
６．  １６μＬのＤＮａｓｅ  Ｂｏｏｓｔｅｒ緩衝液と１０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉストック溶液を加える。チューブを逆さにして混ぜる。短時間遠心する。
【００７０】
７．室温で１５分間インキュベートした後、３２０μＬのＲＢＣ緩衝液を添加する。ピペットにより混ぜる。
【００７１】
８．サンプルに１１２０μＬの１００％ＥｔＯＨを加え、ピペッティングにより、よく混合する。
【００７２】
９．  ７００μＬのサンプルをＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅスピンカラムに移し、蓋を閉める。ｉ）スピンカラムが取り付けられている真空のスイッチを入れる；真空引きを完了させる；真空をオフにして真空マニホールドを通気する；ｉｉ）≧８０００ｇで３０秒間遠心する；フロースルーを捨てる、のいずれか。（すべてのサンプルがスピンカラムを通過するまで繰り返す）。
【００７３】
１０．スピンカラムに５００μＬのＲＰＥ緩衝液を添加し、蓋を閉める。ｉ）真空のスイッチを入れる；移送が完了するまで真空をかける；スイッチをオフにして真空マニホールドを通気する；ｉｉ）≧８０００ｇで３０秒間遠心する；フロースルーを捨てる、のいずれか。
【００７４】
１１．スピンカラムに５００μＬのＲＰＥ緩衝液を添加し、蓋を閉める。真空のスイッチを入れる。移送が完了するまで真空をかける。真空のスイッチをオフにして、真空マニホールドを換気する。≧８０００ｇで２分間遠心する。
【００７５】
１２．スピンカラムを新しい２ｍＬの回収チューブに設置する。蓋を開けた状態で、最大速度で５分間（５  ｉｎ）遠心する。
【００７６】
１３．スピンカラムをバーコードの入った新しい１．５ｍＬの回収チューブに入れる。スピンカラムメンブレンにＲＮａｓｅフリーの水２０μＬを直接加える。蓋を閉めて、最高速度で１分間遠心してＲＮＡを溶出する。
【００７７】
抽出後のＲＮＡ処理
１．ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を１．５μＬの最終溶出液に使用して、各前立腺コア針生検材料から得られた全ＲＮＡの濃度を決定する。
【００７８】
２．ＲＮＡ材料は、事前にバーコードを入れた９６ウェルＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリープレートに移して保存すべきである。電子ノートブックで使用するためにプライベートサーバーに保存された、各ウェルに対応する受託番号およびＱＣサマリーと一致させる。
【００７９】
３．すべてのサンプルは分析の準備ができるまで指定された−８０℃のフリーザーで保存されるべきである。
【００８０】
[実施例３]
ＦＦＰＥ組織からのＲＮＡ抽出のためのＱＩＡｃｕｂｅ自動化システム。
このＳＯＰは、ＦＦＰＥ組織切片からの全ＲＮＡ精製のためのＱＩＡｃｕｂｅ自動化システムを実行するためのセットアップと手順を説明している。
【００８１】
材料は、脱パラフィン処理され、プロテイナーゼＫ消化され、そして不溶性組織および材料を含まない、前立腺コア針生検材料からの１０μｍ厚のＦＦＰＥ組織の少なくとも２つの切片を含まなければならない。
【００８２】
ＲＮＡ抽出
Ａ．準備
標本を取り扱うときや運搬するときは、すべての実験室関係者が手袋を着用し、作業環境を適切な除染剤で除染するべきである。
【００８３】
Ｑｉａｃｕｂｅで作業する場合は、事前にバーコードを入れた１．５ｍＬのＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリーの回収チューブ、１０００μＬのフィルターチップ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号９９０３５２）を使用するべきである。使用後、それらはバイオハザードビン内に適切に処分され、いかなる目的にも再利用されない。
【００８４】
ＲＢＣ緩衝液、１００％エタノール、ＲＰＥ緩衝液（１００％エタノール添加）、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリーの水を含む、ＲＮＡ抽出に必要な試薬ボトルをすべて満たす。
【００８５】
開始前に装置のノズルリングを確認する。
【００８６】
Ｂ．手順
１．  ２ｍＬ  ＲＢサンプルチューブに１２サンプル用のＤＮａｓｅ  Ｉインキュベーションミックス（１４５μＬのＤＮａｓｅ  Ｉミックス＋２３２μＬのＤＮａｓｅ  Ｂｏｏｓｔｅｒ緩衝液）を調製する。チューブをマイクロ遠心チューブのスロットＡに入れる。
【００８７】
２．試薬ボトルラックの２の位置にＲＢＣ緩衝液、３の位置に１００％エタノール、５の位置にＲＰＥ緩衝液、そして６の位置にＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリー水を入れる。キャップを開けてＱＩＡｃｕｂｅの上に設置する。
【００８８】
３．ＱＩＡｃｕｂｅに使い捨ての１０００μＬのフィルターチップで満たしたラックを２つ設置する。
【００８９】
４．ローターアダプターを１から１２までローターアダプターホルダーにセットし、ｉ）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）スピンカラムを１の位置に設置し、蓋を曲げてＬＩの位置に合わせる；ｉｉ）事前にバーコードを入れた１．５ｍＬの回収チューブを位置３に設置し、蓋を曲げてＬ３の位置に合わせる。
【００９０】
５．ローターアダプターをローターアダプターホルダーの番号と同じ番号になるように遠心機に設置する。
【００９１】
６．サンプルを２ｍＬ  ＲＢサンプルチューブに移し、遠心分離機の中のものおよびローターアダプターホルダーのものと同じ番号でＱＩＡｃｕｂｅに設置する。蓋を曲げてサンプルトレイ中に提供される蓋の位置に設置する。
【００９２】
７．カバーを閉じて、１〜２切片の１０μｍ  ＦＦＰＥ組織を用いたｍｉＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥ精製のランニングプロトコルを開始する。
【００９３】
抽出後のＲＮＡ取り扱いおよびＱＩＡｃｕｂｅケア
１．ＤＮａｓｅ  Ｉインキュベーションミックスを有するものおよびフィルターチップを含むすべてのサンプルチューブＲＢをゴミ箱からバイオハザードビンに移して取り除く。
【００９４】
２．試薬ボトルラックを取り外し、すべてのボトルにキャップをして保管する。
【００９５】
３．ローターアダプターを遠心機から取り外す。最終ＲＮＡ溶出液を有する回収チューブの蓋を閉め、ｓｐｅｃの準備ができるまで−８０℃で保存する。スピンカラムをバイオハザードビンに入れ、フロースルーを「グアニジンチオシアネート」とラベルされたゴミ入れの中に捨てる。ローターアダプターをバイオハザードビンに入れる。
【００９６】
４．ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を１．５μＬの最終溶出液に使用して、各前立腺コア針生検材料から得られた全ＲＮＡの濃度を決定する。
【００９７】
５．ＲＮＡ材料は、事前にバーコードを入れた９６ウェルＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリープレートに移して保存すべきである。電子ノートブックで使用するためにプライベートサーバーに保存された、各ウェルに対応する受託番号およびＱＣサマリーと一致させる。
【００９８】
６．すべてのサンプルは分析の準備ができるまで指定された−８０℃のフリーザーで保存されるべきである。
【００９９】
[実施例４]
アッセイ設計。
分子生物学における最近の進歩により、多くのヒト疾患における低分子の非コードＲＮＡの新たな役割を解き明かし、そして複数のタイプのＲＮＡの複合効果がヒト疾患の病因に寄与することが明らかになってきた。このことにより、臨床サンプル中の複数のＲＮＡ種を調べることができる新しいアッセイの開発が保証される。
【０１００】
同時検出および分析のために、２つの異なる種類のＲＮＡ種の検出および分析を単一のプラットフォームに組み合わせることが可能である（図８）。これにより、いずれのタイプのＲＮＡにおいてもデータの完全性が損なわれることなく、ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイによるデータ出力が増幅される。この技術は、臨床応用における需要に合うように、ハイスループットプラットフォームにさらに適合させることができる。しかしながら、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒによって使用されるもののような利用可能なアッセイ設計プラットフォームのいくつかは、カスタマイズされたアッセイ設計のために提供される任意の低分子ＲＮＡ配列の最後の６０ヌクレオチドのみを使用するが、これは時に特異性に欠ける。したがって、ステムループＲＴ−ｑＰＣＲを設計する際には、各々の目的の低分子ｎｃＲＮＡの固有の配列識別子を識別することによってアッセイの特異性を検証することが重要である。
【０１０１】
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）低分子ＲＮＡアッセイ設計ツールまたはｍｉＲＮＡ  Ｐｒｉｍｅｒ設計ツール（Astrid Research, Inc.）のいずれかによる、ステムループ逆転写プライマー設計のための、目的の低分子ｎｃＲＮＡ配列の３’末端の最後の６０ヌクレオチドの使用。ｃＤＮＡ合成後、ＲＴ−ｑＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ設計のために、デフォルトのパラメータ（プライマーサイズ：１８〜２７ｎｔｓ、最適２０ｎｔｓ；プライマーＴｍ：５７〜６３℃；プライマーＧＣ％：２０％〜８０％；ＰＣＲ産物のサイズ範囲：６０〜１３０ｎｔｓ）でＰｒｉｍｅｒ  ３ソフトウェア（ｖ．０．４．０．）を用いて全配列を使用する。１つの標的に対するプライマー対の特異性は、Ｐｒｉｍｅｒ−Ｂｌａｓｔを用いて検証した。目的の低分子ｎｃＲＮＡ配列が他のｎｃＲＮＡ、すなわちＣ／Ｄ  ＢｏｘおよびＨ／ＡＣＡ  Ｂｏｘ低分子核小体ＲＮＡと高い配列相同性を共有する場合、特異性を最大にするために、プライマーおよび／またはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを選択するために固有配列の領域を同定しなければならない（図９）。すべてのカスタム設計された低分子ｎｃＲＮＡアッセイは、シーケンスによって検証されている。
【０１０２】
[実施例５]
逆転写およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＯｐｅｎＡｒｒａｙマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび発現プロファイリング。
このＳＯＰは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）１２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムによるＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）プラットフォーム上で実行される、ＲＴ−ＰＣＲに基づく分析のための、非特定化されバーコードを付けたコア針生検切片から得られるＲＮＡ材料の調製および実行を記述する。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）技術は特定のハイブリダイゼーション標的を用いたカスタマイズされたアレイが可能であるが、様々なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイは予めロードされたハイブリダイゼーション標的と共に市販されている。
【０１０３】
標本は、以前に非特定化されずに上記のように処理されたコア針生検切片から得られた全ＲＮＡである。
【０１０４】
ＯＰＥＮＡＲＲＡＹプラットフォームのＲＴ−ＰＣＲ
Ａ．準備
標本を取り扱うときや運搬するときは、すべての実験室関係者が手袋を着用し、作業環境を適切な除染剤で除染するべきである。
【０１０５】
ＲＮＡ材料の取り扱い時およびすべての抽出操作中は、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリーのチューブ、プレートおよびフィルターチップが使用される。使用されたチューブおよびチップはバイオハザードビン内に適切に処分され、いかなる目的にも再利用されない。
【０１０６】
チューブおよび９６ウェルプレートに、事前にバーコードを入れ、またはサンプル材料を移した直後にバーコードを入れ、以前に割り当てられたバーコードに正しく対応させるべきである。
【０１０７】
ＰＣＲ装置で実行する準備ができるまで、すべての調製プロセスを実行し、冷却ブロックを付けて氷上で保存する必要がある。
【０１０８】
Ｂ．手順
Ｉ．ｃＤＮＡ合成
１．事前にバーコードを入れた９６ウェルプレート中で、非特定化されていない生検材料から抽出したＲＮＡをＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅフリーＨ２Ｏで５０ｎｇ／３μＬに希釈する。サンプル情報と受託番号は、将来の追跡のために各々のプレートごとにエクセル形式で協調的に記録され保存される。同じ９６ウェルプレート内のサンプルは作業バッチと見なされる。
【０１０９】
２．ｃＤＮＡ合成のためのＲＴマスターミックスを以下のように調製する（９６反応に十分）：
１反応    ９６反応（１０％増）
０．７５    ７９．２０  μＬ  カスタムＲＴプライマー（１０倍）
０．１５    １５．８４  μＬ  ｄＮＴＰｓ  含ｄＴＴＰ（１００ｍＭ）
１．５０    １５８．４  μＬ  ＭｕｌｔｉＳｃｎｂｅ（商標）逆転写酵素（５０Ｕ／μＬ）
０．７５    ７９．２０  μＬ  １０Ｘ  ＲＴ緩衝液
０．９０    ９５．０４  μＬ  ＭｇＣ１２（２５ｍＭ）
０．０９      ９．５０  μＬ  ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μＬ）
０．３６    ３８．０２  μＬ  ヌクレアーゼフリー水
【０１１０】
３．  ４．５μＬのＲＴマスターミックスを、事前にバーコードを入れたＰＣＲグレード（ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、Ｐｙｒｏｇｅｎ、ＤＮＡおよびＲＮＡフリー）の９６ウェルプレートにロードする。各ウェルに３μＬの希釈した全ＲＮＡを加え、ピペッティングで静かに混合する。ＰＣＲグレードおよび滅菌した接着ホイルを使用してプレートを密封し、そして短時間スピンさせる。
【０１１１】
４．ＰＣＲ装置にロードする前に、反応プレートを氷上で５分間インキュベートして、以下の表に示すように逆転写反応を行う。
【０１１２】
【表１】
2019528758.tif 000002
【０１１３】
ＩＩ．前増幅（Pre-Amplification）
１．以下のように前増幅サイクル用のＰｒｅＡｍｐマスターミックスを調製する（９６サンプルに十分）：
１反応    ９６反応（１０％増）
１２．５  １３２０μＬ  カスタムＰｒｅＡｍｐプライマー（１０倍）
２．５    ２６４μＬ  ＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐマスターミックス（２倍）
７．５    ７９２μＬ  ヌクレアーゼフリーＨ２０
【０１１４】
２．  ２２．５μＬのＰｒｅＡｍｐマスターミックス（mast mix）を事前にバーコードを入れたＰＣＲグレード（ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、Ｐｙｒｏｇｅｎ、ＤＮＡおよびＲＮＡフリー）９６ウェルプレートにロードする。各ウェルに２．５μＬのｃＤＮＡを加える。プレートをＰＣＲグレードおよび滅菌した接着ホイルで密封し、プレートを６回反転させることによって混合する。短時間スピンする。
【０１１５】
３．ＰＣＲ装置にロードする前に、反応プレートを氷上で５分間インキュベートして、以下に示すように前増幅サイクルを実行する。
【０１１６】
【表２】
2019528758.tif 000003
【０１１７】
ＩＩＩ．ＯｐｅｎＡｒｒａｙ
１．ＰＣＲグレード９６ウェルプレートに１５２μＬの０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液を添加する。１：２０希釈を行うために、８μＬの前増幅産物を各ウェルに移す。
【０１１８】
２．  ９６ウェルプレートをＰＣＲグレードおよび滅菌したホイルで密封し、プレートを６回反転させて混合する。プレートを短時間遠心する。
【０１１９】
３．ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレートを室温に３０分間温め、説明書に従ってＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレートを１枚ずつロードする。キャリアトレイにロードされ、シールされた４枚のＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）プレートを取り付けて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘシステムに挿入してリアルタイムＰＣＲ段階を実行する。
【０１２０】
４．生データを収集し、ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｉｔｅソフトウェアで分析して相対発現レベルを得る。将来の分析のために、結果を安全なｍｉＲ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃクラウドにアップロードする。
【０１２１】
ＩＶ．ＲＴ−ＰＣＲ実行後のサンプル処理
指定の−８０℃で、適切なＱＲコードを有するすべての初期ＲＮＡ材料ならびにｃＤＮＡ合成、前増幅および希釈した前増幅サイクルからのすべての作業バッチ９６ウェルプレートを保存する。
【０１２２】
[実施例６]
Ｑｕａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘにおいてカスタム設計された５６  ｍｉＲＮＡ  Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙを使用したｍｉＲＮＡの調査。
実施例６では、５６個のセンチネル（Sentinel）ｍｉＲＮＡ用のプローブをカスタマイズされたＯｐｅｎ  Ａｒｒａｙプレートに予めロードし、５６個の特定のｍｉＲＮＡを調査するように設計された４８個の同一のサンプルウェルを提供した。
【０１２３】
ｓｎＲＮＡは前述の患者サンプルから調製した。ｃＤＮＡを上述のように合成し、そして各ｃＤＮＡから５００ｎｇを個々のウェルにロードした。
【０１２４】
これらの記載された実験において、使用されたプローブは５’末端でＦＡＭを用いて標識され、そしてそれぞれのレポーター／クエンチャーは３’末端のＴＡＭＲＡであった。
【０１２５】
デジタルＰＣＲを４０サイクルに設定した。
【０１２６】
各サイクルの間に、ｃＤＮＡの増幅が成功すると、プローブ置換および特異的ウェル中の各標的コピーからの切断が起こり、蛍光の増加がもたらされた。カメラ／検出器は各ウェルの各サイクルの終わりに蛍光の総量を報告する。
【０１２７】
生データはプローブとサイクル数に依存する。生の蛍光データの読み取り値は、各々のサイクルについて、そして各々の生物学的サンプルについて、各々のウェルから検索される（表１参照）。
【０１２８】
前のサイクルに対する蛍光の変化が与えられ（ΔＲｎ）、これを、各サイクルに対する蛍光の相対変化が得られるようにトランスポーズした。この例では、データはその後、臨床記述子、すなわち患者番号（ｐａｔｉｅｎｔ  ｎｕｍｂｅｒ）およびコア番号（ｃｏｒｅ  ｎｕｍｂｅｒ）によって分類される。
【０１２９】
[実施例７]
Ｑｕａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘの３８４ウェルブロックを使用した混合ｍｉＲＮＡとｓｎｏＲＮＡの調査。
６つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ１５ｂ、ｍｉＲ２０ａ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ３２０ｃおよびｍｉＲ１２７５）および６つのｓｎｃＲＮＡ（４つのＨ／ＡＣＡ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ（ＡＣＡ２０、ＡＣＡ３４、ＡＣＡ４２、ＡＣＡ５４）ならびに２つのＣ／Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡ（Ｕ３５ＡおよびＵ７４））の試験セットを使用して、ミックスｍｉＲＮＡおよび低分子ｎｃＲＮＡを効率的に調べるアッセイの能力を検証した。これらのＲＮＡ種のｃＤＮＡは、本明細書に記載の遺伝子特異的プライマーを用い、単一のＲＴミックス中で、本明細書の実施例に記載のように逆転写および増幅された。同じ逆転写ｃＤＮＡ産物を使用し、それら自身の特異的ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ混合液を用いて個々の各ｍｉＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを首尾よく検出した。シグナル取得は実施例６に記載の通りであった。図１０のプロットは、各々の特異的ｍｉＲＮＡ  ｓｎｃＲＮＡ配列についてのＣｔ曲線を示す未変換データを示す。イベントまでの時間を決定するためのデータの変換は、わずかに異なるハイブリダイゼーション速度を有するプローブについてのＣｔの決定に関連する問題を排除する。
【０１３０】
実験について、ＴａｑＭａｎプローブは、ＦＡＭ発蛍光団およびクエンチャーとしてＴＡＭＲＡを含む。ＴＡＭＲＡは、アッセイの特異性および感度を増強するためにＭＧＢ（副溝結合剤）によって置換され得る。
【０１３１】
発蛍光団およびクエンチャーの選択は、使用されるプラットフォームにわずかに依存する。発蛍光団の選択は、利用可能な励起レーザーおよび発光波長に対する検出システムカメラの感度に依存して拡張することができる。
【０１３２】
[実施例８]
ｎｃＲＮＡ配列。
【０１３３】
【表３−１】
2019528758.tif 000004
【０１３４】
【表３−２】
2019528758.tif 000005
【０１３５】
【表３−３】
2019528758.tif 000006
【０１３６】
【表３−４】
2019528758.tif 000007
【０１３７】
【表３−５】
2019528758.tif 000008
【０１３８】
【表３−６】
2019528758.tif 000009
【０１３９】
【表３−７】
2019528758.tif 000010
【０１４０】
【表３−８】
2019528758.tif 000011
【０１４１】
【表３−９】
2019528758.tif 000012
【０１４２】
【表３−１０】
2019528758.tif 000013
【０１４３】
【表３−１１】
2019528758.tif 000014
【０１４４】
【表３−１２】
2019528758.tif 000015
【０１４５】
【表３−１３】
2019528758.tif 000016
【０１４６】
【表３−１４】
2019528758.tif 000017
【０１４７】
【表３−１５】
2019528758.tif 000018
【図１】
2019528758.tif 000019
【図２】
2019528758.tif 000020
【図３】
2019528758.tif 000021
【図４】
2019528758.tif 000022
【図５Ａ】
2019528758.tif 000023
【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019528758.tif 000027
【図９】
2019528758.tif 000028
【図１０−１】
2019528758.tif 000029
【図１０−２】
2019528758.tif 000030
【図１０−３】
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【国際調査報告】
2019528758.tif 000032