【手続補正書】
【提出日】平成19年3月26日(2007.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物を、真菌の無細胞抽出物およびレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または陰性対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項２】
真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物を、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する真菌細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項３】
真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する化合物の同定方法であって、
（ａ）真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む真菌細胞を化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、または該基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または陰性対照の存在下におけるシグナルと比較してより少なく検出される場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項４】
真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む真菌細胞を化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、または該基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下における発光と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項５】
真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する化合物の同定方法であって、
（ａ）真菌抽出物または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、または該基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または陰性対照の存在下におけるシグナルと比較してより少なく検出される場合に、真菌のｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項６】
真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する化合物の同定方法であって、
（ａ）真菌抽出物または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、または該基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下におけるシグナルと比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項７】
化合物が真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増強する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の構造を決定するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群の少なくとも１つのメンバーをコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が酵母細胞である、請求項２、３または４に記載の方法。
【請求項１２】
真菌抽出物が酵母抽出物である、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（Diversomer）；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；ならびに有機小分子ライブラリを含むコンビナトリアル化合物ライブラリから選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
有機小分子ライブラリが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、またはジアゼピンジオンのライブラリである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物を細胞と接触させるステップが、緩衝液および塩の組み合わせを含む水溶液中で行われる、請求項２、３または４に記載の方法。
【請求項１６】
水溶液が生理的条件に近似するまたはそれを模倣する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
水溶液がさらに界面活性剤またはサーファクタントを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
化合物の構造を質量分析、ＮＭＲ、振動分光分析、またはＸ線結晶構造解析によって決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
化合物が真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと直接結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
化合物が基質と結合する、請求項３、４、５または６に記載の方法。
【請求項２１】
化合物がｔＲＮＡイントロンと結合する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
化合物がｔＲＮＡイントロンとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を破壊する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼのサブユニット間の相互作用を破壊する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
真菌感染症またはその症状の治療、管理または寛解において使用するための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）真菌細胞抽出物または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているか、または該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップを含み、
（ｂ）において上記の状況下で、化合物の非存在下における蛍光シグナルと比較して蛍光シグナルを低減する化合物が検出される場合、
（ｃ）上記化合物を真菌細胞と接触させ、該真菌細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記真菌細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を真菌感染症の治療薬と同定する、上記方法。
【請求項２５】
真菌感染症またはその症状の治療、管理または寛解において使用するための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）真菌細胞抽出物または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、または該基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップを含み、
（ｂ）において上記の状況下で、化合物の非存在下における蛍光発光と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプターの蛍光発光を増大する化合物が検出される場合、
（ｃ）上記化合物を真菌細胞と接触させ、該真菌細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記真菌細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を真菌感染症の治療薬と同定する、上記方法。
【請求項２６】
真菌感染症またはその症状の治療、管理または寛解において使用するための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）化合物を、真菌の無細胞抽出およびレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップを含み、
（ｂ）において上記の状況下で、化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現と比較してレポーター遺伝子の発現を減少する化合物が検出される場合、
（ｃ）上記化合物を真菌細胞と接触させ、該真菌細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記真菌細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を真菌感染症の治療薬と同定する、上記方法。
【請求項２７】
真菌感染症またはその症状の治療、管理または寛解において使用するための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）化合物を、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する真菌細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップを含み、
（ｂ）において上記の状況下で、化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現と比較してレポーター遺伝子の発現を減少する化合物が検出される場合、
（ｃ）上記化合物を真菌細胞と接触させ、該真菌細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記真菌細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を真菌感染症の治療薬と同定する、上記方法。
【請求項２８】
（ｄ）上記化合物を真菌感染症の非ヒト動物モデルで試験するステップであって、該試験が、上記化合物を該非ヒト動物モデルに投与し、該化合物が該非ヒト動物モデルにおける真菌感染症の治療、管理または寛解に有効であることを検証することを含む、上記ステップをさらに含む、請求項２４、２５、２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
基質がｔＲＮＡ前駆体の成熟ドメインを含む、請求項３、４、５、６、２４または２５に記載の方法。
【請求項３０】
化合物の細胞毒性活性を測定するステップをさらに含む、請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項３１】
化合物の細胞増殖抑制活性を測定するステップをさらに含む、請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項３２】
請求項３〜７または２４〜２７のいずれか１項に記載の方法に従って同定された化合物またはその製薬上許容される塩の、真菌感染症の阻害または低減において使用するための医薬製造のための使用。
【請求項３３】
請求項３〜７または２４〜２７のいずれか１項に記載の方法に従って同定された化合物またはその製薬上許容される塩の、対象における真菌感染症またはその症状の予防、治療または寛解において使用するための医薬製造のための使用。
【請求項３４】
真菌感染症が酵母感染症である、請求項３２または３３に記載の使用。
【請求項３５】
対象がヒトである、請求項３３または３４に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を真菌細胞中に微量注入またはトランスフェクトするステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または適当な対照（例えば陰性対照、ＰＢＳなど）の存在下の蛍光発光と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗菌性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む真菌細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または適当な対照（例えば陰性対照、ＰＢＳなど）の存在下の蛍光発光と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗菌性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
一実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物の同定方法であって、（ａ）真菌の無細胞抽出物（好ましくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと、該エンドヌクレアーゼによる該基質の切断を促す条件下にて接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または適当な対照（例えば陰性対照、ＰＢＳなど）の存在下のシグナルと比較してより少なく検出される場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物が同定されるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物の同定方法であって、（ａ）真菌の無細胞抽出物（好ましくは真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと、該基質の切断を促す条件下にて接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または適当な対照（例えば陰性対照、ＰＢＳなど）の存在下の蛍光発光と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を真菌細胞中に微量注入またはトランスフェクトするステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップと、（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または適当な対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗菌性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物の同定方法であって、（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む真菌細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または適当な対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗菌性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
一実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物の同定方法であって、（ａ）真菌の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているか、あるいは前記基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または陰性対照の存在下のシグナルと比較してより少なく検出される（または検出可能ではない）場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害する抗菌性化合物が同定されるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を阻害または低減する抗菌性化合物の同定方法であって、（ａ）真菌の無細胞抽出物（好ましくはｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ抽出物）または精製された真菌のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、前記基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているか、あるいは前記基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているステップと、（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下において蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または陰性対照の存在下の蛍光発光と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗菌性化合物が同定されるステップとを含む方法を提供する。