(57)【要約】  本発明は、側鎖にジチオ基を有する生分解性両親媒性ポリマー、及びその自己架橋ポリマーベシクル、並びに肺がん標的治療における使用を提供する。前記ポリマーは、ジチオ基含有５員環官能基を有する環状カーボネートモノマーから、活性制御可能な開環重合により得られるものであり、その分子量が制御可能であり、分子量分布が狭く、保護及び脱保護のプロセスを必要とすることがない。本発明の前記環状カーボネートモノマーの開環重合により得られるポリマーは生分解性を有し、薬物放出系の制御に有用である。作製される肺がん標的還元感受性可逆的に架橋するベシクルナノ医薬品担体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定的で長期的な循環を支持すると共に、肺がん組織において高濃化し、効率的に細胞に進入して、細胞内で速やかに解架橋し、薬物を放出し、がん細胞を効率的且つ特異的に殺し、有毒な副作用を引き起こすことなく腫瘍の増殖を効果的に阻害することができる。【選択図】図１
2019501261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学構造式は、下記構造式のいずれか１つであることを特徴とする、生分解性両親媒性ポリマー。
【化１】
2019501261.tif 000023
（式中、Ｒ１は以下の基から選択される１種であり、
【化２】
2019501261.tif 000024
Ｒ２は以下の基から選択される１種であり、
【化３】
2019501261.tif 000025
ｋは４３〜１７０、ｘは１０〜３０、ｙは４０〜２００、ｍは８６〜３４０である。）
【請求項２】
前記Ｒ１は以下の基から選択される１種であり、
【化４】
2019501261.tif 000026
前記Ｒ２は以下の基から選択される１種であり、
【化５】
2019501261.tif 000027
前記ｋは１１３〜１７０、ｘは２０〜２６、ｙは１００〜１９０、ｍは２２６〜３４０であることを特徴とする、請求項１に記載の生分解性両親媒性ポリマー。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーが標的分子に結合して得られることを特徴とする、腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマー。
【請求項４】
前記標的分子はｃＲＧＤ、ｃＮＧＱ又はｃｃ−９であることを特徴とする、請求項３に記載の肺がん標的生分解性両親媒性ポリマー。
【請求項５】
ポリマーベシクルであって、その製造方法は、
（１）請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーから製造する方法、
（２）請求項３に記載の腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーから製造する方法、
（３）請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーと、請求項３に記載の腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーとから製造する方法、
（４）請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーから製造したベシクルの表面に標的分子をカップリングさせた後に得られる方法、
のいずれか１種であることを特徴とする、ポリマーベシクル。
【請求項６】
自己架橋ポリマーベシクルであって、粒径が４０〜１８０ｎｍであることを特徴とする、請求項５に記載のポリマーベシクル。
【請求項７】
請求項５に記載のポリマーベシクルの、肺がんを治療するための医薬品の担体としての使用。
【請求項８】
前記肺がんを治療するための医薬品は、親水性抗がん剤又は疎水性抗がん剤であることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーの、肺がんを治療するためのナノ医薬品の製造のための使用。
【請求項１０】
請求項５に記載のポリマーベシクルの、肺がんを治療するためのナノ医薬品の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性ポリマー材料及びその使用に関し、具体的には、側鎖にジチオ基含有５員環官能基を有する生分解性両親媒性ポリマー、及びポリマーベシクル、並びに肺がん標的治療における使用に関し、医薬材料分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性ポリマーは非常に独特な性能を有するため、例えば手術用縫合糸、骨固定用器具、生体組織工学用足場材料、薬物徐放性担体等の生物医学の各分野に広く利用されている。合成した生分解性ポリマーとして、主に脂肪族ポリエステル（ポリグリコライドＰＧＡ、ポリラクチドＰＬＡ、ラクチド−グリコライド共重合体ＰＬＧＡ、ポリカプロラクトンＰＣＬ）、ポリカーボネート（ポリトリメチレンシクロカーボネートＰＴＭＣ）等は最もよく使用されている生分解性ポリマーであり、既に米国食品医療品局（ＦＤＡ）により許可された。
【０００３】
しかし、従来の生分解性ポリマー、例えばＰＴＭＣ、ＰＣＬ、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ等は、構造が比較的単一であり、修飾に用いられる官能基がないため、安定して循環する薬物担体又は安定した表面修飾コーティングを提供できないことが多い。ポリカーボネートの分解物は、主に二酸化炭素と中性のジオールであり、酸性の分解物は生成されない。そのうち、機能性環状カーボネートモノマーは、例えばＧＡ、ＬＡ及びε−ＣＬ等の環状エステル系モノマー、及びその他の環状カーボネートモノマーと共重合し、性能が異なる生分解性ポリマーを得ることができる。
【０００４】
また、従来技術で製造された生分解性ポリマーから得られた生分解性ナノ担体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの循環が不安定で、腫瘍細胞の取り込みが低く、細胞内の薬物濃度が低いといった問題があるため、ナノ医薬品の薬効が低いことにとどまらず、有毒な副作用もある。機能性生分解性ポリマーからミセル化ナノ粒子を製造することができ、このミセル化ナノ粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの循環は安定しているが、疎水性低分子抗がん剤のみを担持でき、透過性の強い親水性低分子抗がん剤、及び、例えばタンパク質薬物や核酸薬物等の小さい有毒な副作用を有する親水性生物高分子薬物には無力であり、薬物担体としての使用は大きく制限されている。
【０００５】
がんはヒトの健康に対する主な脅威であり、その罹患率及び死亡率は年々上昇している傾向にある。肺がんは世界範囲で、特に中国での発症率が高い一方である。手術は早期肺がん患者にのみ有益であり、中期及び末期には役立たない。肺がんの治療は、早期診断の難しさ、予後不良、転移の容易さ、薬剤耐性の生じやすさ等の特徴を有する。ナノ医薬品は、肺がんを治療するためのキーポイント及び希望となっている。しかしながら、従来技術では、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定的に循環でき、特異的に肺がんを標的とし、細胞内で速やかに薬物を放出し、有毒な副作用が小さい効果的なナノ医薬品はまだ現れておらず、特に親水性低分子抗がん剤を送達できるナノ担体はまだ現れていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、生分解性両親媒性ポリマー、それより製造されるポリマーベシクル、及び抗肺がん剤の担体としての、肺がん標的治療薬の製造のための使用を提供することにある。
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明の具体的な態様は以下のとおりである。
【０００８】
化学構造式は、
【化１】
2019501261.tif 000003
である生分解性両親媒性ポリマー。
（式中、Ｒ１は以下の基から選択される１種であり、
【化２】
2019501261.tif 000004
Ｒ２は以下の基から選択される１種であり、
【化３】
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ｋは４３〜１７０、ｘは１０〜３０、ｙは４０〜２００、ｍは８６〜３４０である。）
【０００９】
本発明に開示される生分解性両親媒性ポリマーは、疎水性ブロックにジチオ基含有５員環官能基を有する環状カーボネート単位を有し、ジブロックポリマーでもよく、
【化４】
2019501261.tif 000006
トリブロックポリマーでもよい。
【化５】
2019501261.tif 000007
好ましい態様においては、Ｒ１は以下の基から選択される１種であり、
【化６】
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Ｒ２は以下の基から選択される１種であり、
【化７】
2019501261.tif 000009
【００１０】
好ましくは、上記生分解性両親媒性ポリマーの化学構造式において、ｋは１１３〜１７０、ｘは２０〜２６、ｙは１００〜１９０、ｍは２２６〜３４０である。
【００１１】
上記生分解性両親媒性ポリマーは、側鎖にジチオ基を有するものであって、開始剤の存在下で、溶媒中でジチオ基含有５員環官能基を有する環状カーボネートモノマーと、その他の環状エステルモノマー、環状カーボネートモノマーとの開環重合により得られる。前記その他の環状カーボネートモノマーは、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、側鎖にトリメトキシベンズアルデヒドを含有する環状カーボネート（ＰＴＭＢＰＥＣ）、側鎖にジチオピリジンを含有する環状カーボネート（ＰＤＳＣ）、及びアクリレートトリメチロールエタンシクロカーボネート  （ＡＥＣ）を含む。前記その他の環状エステルモノマーは、ラクチド（ＬＡ）、グリコリド（ＧＡ）及びカプロラクトン（ＣＬ）を含む。
【００１２】
ジチオ基含有５員環官能基を有する環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）の化学構造式は以下のようである。
【化８】
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【００１３】
例えば、上記環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）は、ジクロロメタン中で、モノメトキシポリエチレングリコールを開始剤とし、ビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛を触媒として、ＴＭＣと開環共重合し、ＣＤＣとＴＭＣ単位がランダムに配列しているジブロックポリマーを形成することができる。その反応式は以下のようである。
【化９】
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【００１４】
本発明に開示される側鎖にジチオ基を含有する両親媒性ポリマーは、生分解性を有し、その疎水部分の分子量は親水部分の分子量の３倍以上であり、溶媒置換法、透析法、又は薄膜水合法などの方法により、ポリマーベシクル構造を製造することができる。製造されたポリマーベシクルはナノメートルサイズであり、粒径が４０〜１８０ｎｍであり、肺がんを治療するための薬物の担体として使用することができる。ベシクルの疎水性膜には、疎水性低分子抗肺がん薬物であるパクリタキセル、ドセタキセル等が担持され、また、ベシクルの大きな親水性空洞内に親水性抗肺がん剤、特に塩酸ドキソルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸イリノテカン、塩酸ミトキサントロンといった親水性低分子抗がん剤を担持することもできる。このように、従来の両親媒性ポリマーからなるミセル担体は、疎水性薬物しか担持できないとの欠陥、及び、従来技術において、親水性低分子抗がん剤を効率的に担持し、かつｉｎ  ｖｉｖｏで安定的に循環できる親水性低分子抗がん剤の担体がない欠陥を克服した。上記生分解性両親媒性ポリマーの親水性セグメントＰＥＧの末端に、例えばｃＲＧＤ、ｃＮＧＱ又はｃｃ−９等のポリペプチドのような腫瘍特異的標的分子を化学的にカップリングし、腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーを製造することができる。
【００１５】
本発明はさらに、上記生分解性両親媒性ポリマー、又は上記腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマー、又は上記生分解性両親媒性ポリマーと腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーから製造することができるポリマーベシクルを開示する。例えば、上記生分解性両親媒性ポリマーと腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーを異なる配合比で混合することにより、異なる標的密度を有するポリマーベシクルを製造し（つまり、肺がん標的自己架橋ベシクルを得て）、ベシクルナノ医薬品の肺がん細胞における取込量を増やすことができる。また、生分解性両親媒性ポリマーにより製造された架橋ベシクル又は自己架橋ベシクルの外表面に腫瘍細胞特異的標的分子をカップリングすることにより、肺がん標的架橋ベシクル及び肺がん標的自己架橋ベシクルを製造し、肺がん細胞の取込量を増やし、例えばベシクルのＰＥＧ端にマイケル付加によりｃＲＧＤ、ｃＮＧＱ又はｃｃ−９を結合することもできる。
【００１６】
上記生分解性両親媒性ポリマーと腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーは、物質を一切添加しないまま自己架橋し、自己架橋ポリマーベシクル及び肺がん標的自己架橋ポリマーベシクルを得ることができる。あるいは、触媒量である、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はグルタチオン（ＧＳＨ）のような還元剤の触媒作用下で、架橋ポリマーベシクル及び肺がん標的架橋ポリマーベシクルを製造することができる。自己架橋ベシクル、肺がん標的自己架橋ベシクル、架橋ベシクル及び肺がん標的架橋ベシクルは、ベシクル疎水膜内で安定な化学架橋を形成したため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定的で長期的な循環が可能となる。一方、エンドサイトーシスによりがん細胞へ進入した後、細胞内で多数の還元物質が存在する環境下で、形成された架橋は速やかに解除（解架橋）し、薬物を速やかに放出し、肺がん細胞を効率的に殺すことができる。したがって、本発明は、上記生分解性両親媒性ポリマーの、肺がんを治療するためのナノ医薬品の製造のための使用について保護を請求する。さらに、本発明は、側鎖にジチオ基を含有する生分解性両親媒性ポリマーから製造されたポリマーベシクル、自己架橋ポリマーベシクル、及び、腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマー独自で、又は生分解性両親媒性ポリマーと共に製造された肺がん標的自己架橋ポリマーベシクル、肺がん標的架橋ポリマーベシクルの、肺がん標的治療のためのナノ医薬品の製造のための使用を含む、上記ポリマーベシクルの、肺がんを治療するためのナノ医薬品の製造のための使用を開示する。本発明のポリマーから製造された抗肺がんナノ医薬品はベシクル抗肺がんナノ医薬品である。
【００１７】
上記態様の実施により、本発明は従来技術と比べ、以下の利点を有する。
【００１８】
１．本発明は、ジチオ基含有５員環官能基を有する環状カーボネートモノマーを使用し、ポリエチレングリコールを開始剤とし、ＴＭＣ又はＬＡと活性制御可能な開環重合により共重合し、分子量が制御可能であり、分子量分布が狭い側鎖にジチオ基を含有する生分解性両親媒性ポリマーを得た。ジチオ基含有５員環基は、環状カーボネートモノマーの開環重合に影響を与えないため、重合過程では、従来の技術における保護及び脱保護のプロセスを必要とせず、操作工程を簡略化させた。
【００１９】
２．本発明に開示される側鎖にジチオ基を含有する生分解性両親媒性ポリマーは、生分解性を有するため、ポリマーベシクル及び肺がん標的ベシクルを製造し、異なる性質を有する薬物を担持することができ、物質を一切添加しないまま自己架橋し、安定した自己架橋ポリマーベシクルナノ医薬品を得ることができるため、従来技術におけるナノ医薬品はｉｎ  ｖｉｖｏでの循環が不安定で、薬物が早期に放出されやすく、有毒な副作用を引き起こすとの欠陥を克服した。
【００２０】
３．本発明に開示される自己架橋ベシクルナノ医薬品の架橋は、可逆的であり、即ちｉｎ  ｖｉｖｏでの長期的な循環を支持し、肺がん細胞内で高濃化することはできる一方、肺がん細胞へ進入した後に、速やかに解架橋し、薬物を放出し、有毒な副作用を引き起こすことなく肺がん細胞を効率的で特異的に殺すことを実現する。従来技術における架橋ナノ医薬品が安定しすぎるため、細胞内での薬物の放出が遅く、薬物耐性を引き起こすとの欠陥を克服した。
【００２１】
４．本発明に開示される生分解性ポリマーベシクル及び肺がん標的ベシクルは、物質を一切添加しないまま自己架橋ベシクルを製造することができ、製造方法が簡単であるため、従来技術では架橋ナノ医薬品の製造時に架橋剤等の物質を添加しなければならず、且つ複雑な操作や精製過程が必要となる等の欠陥を克服した。
【００２２】
５．本発明に開示される両親媒性ポリマーの自己組織化により製造された自己架橋ポリマーベシクルは、親水性低分子抗がん剤の制御放出系に有用であるため、従来の生分解性ナノミセル担体は、疎水性低分子薬物の担持しかに適用できないとの欠陥、及び、従来技術において、親水性低分子抗がん剤を効率的に担持し、かつｉｎ  ｖｉｖｏで安定的に循環できる担体がない欠陥を克服した。さらに、肺がん標的自己架橋ベシクルを製造することができ、肺がんの効率的な標的治療においてより広く利用される価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は実施例２のポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のＨ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は実施例６のポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．７ｋ−ｃｏ−ＬＡ１４．６ｋ）の核磁気共鳴スペクトルである。
【図３】図３は実施例１５の架橋ベシクルＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の、粒子径分布（Ａ）、透過型電子顕微鏡写真（Ｂ）、架橋ベシクル安定性測定（Ｃ）及び還元応答性測定（Ｄ）の図である。
【図４】図４は実施例１５のＤＯＸ・ＨＣｌ担持架橋ベシクルＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の生体外放出図である。
【図５】図５は実施例２４のＤＯＸ・ＨＣｌ担持架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の生体外放出図である。
【図６】図６は実施例２６の標的架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）のＡ５４９肺がん細胞に対する毒性結果図である。
【図７】図７は実施例２６のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクル  ｃＲＧＤ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）のＡ５４９肺がん細胞に対する毒性結果図である。
【図８】図８は実施例２８のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）のマウス体内での血液循環検討結果図である。
【図９】図９は実施例２９のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクルｃＮＧＱ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）のマウス体内での血液循環検討結果図である。
【図１０】図１０は実施例３３のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の皮下肺がん担持マウスに対する生物分布結果図である。
【図１１】図１１は実施例３４のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクルｃＮＧＱ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の皮下肺がん担持マウスに対する生物分布結果図である。
【図１２】図１２は実施例３６のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の皮下肺がん担持マウスに対する治療図であり、Ａは腫瘍増殖曲線、Ｂはマウス治療後の腫瘍画像、Ｃは体重変化、Ｄは生存曲線である。
【図１３】図１３は実施例３７のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクルｃＮＧＱ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の皮下肺がん担持マウスに対する治療図であり、Ａは腫瘍増殖曲線、Ｂは体重変化曲線、Ｃは生存曲線である。
【図１４】図１４は実施例３９のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の同所性肺がん担持マウスに対する治療図であり、Ａは腫瘍増殖曲線、Ｂは体重変化曲線、Ｃは生存曲線である。
【図１５】図１５は実施例４０のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的架橋ベシクルｃＮＧＱ／ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の同所性肺がん担持マウスに対する治療図であり、Ａは腫瘍増殖曲線、Ｂは体重変化曲線、Ｃは生存曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、実施例及び図面を参酌しながら、本発明をさらに説明する。
【００２５】
実施例１  ジチオ基含有５員環官能基を有する環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）の合成
硫化水素ナトリウム一水和物（２８．２５ｇ、３８１．７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４００ｍＬに溶解し、完全に溶解するまで５０℃で加熱し、ジブロモネオペンチルグリコール（２０ｇ、７６．４ｍｍｏｌ）を一滴ずつ滴下し、４８時間反応させた。反応物を減圧蒸留して溶媒であるＤＭＦを除去し、次に蒸留水２００ｍＬで希釈し、酢酸エチル２５０ｍＬで４回抽出し、最後に有機相を回転蒸発して黄色の粘稠状化合物Ａを得、収率は７０％であった。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４００ｍＬに溶解した化合物Ａを空気中で２４時間放置し、分子間のメルカプト基をＳ−Ｓ結合に酸化し、化合物Ｂを得、収率は＞９８％であった。窒素ガスの保護下で、化合物Ｂ（１１．７ｇ、７０．５ｍｍｏｌ）を乾燥後のＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解し、完全に溶解するまで攪拌した。続いて０℃までに冷却し、クロロギ酸エチル（１５．６５ｍＬ、１１９．８ｍｍｏｌ）を加え、次にＥｔ3Ｎ（２２．８３ｍＬ、１２０．０ｍｍｏｌ）を一滴ずつ滴下した。滴下が完了した後、該系を氷水浴条件下で４時間反応させた。反応終了後に、生成したＥｔ3Ｎ・ＨＣｌをろ過して取り除き、ろ液を回転蒸発して濃縮し、最後にジエチルエーテルで再結晶を複数回行って、黄色の結晶であるジチオ基含有５員環官能基を有する環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）を得、収率は６４％であった。
【００２６】
実施例２  ジブロック側鎖にジチオ基含有５員環を有するポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下で、ＣＤＣモノマー０．１ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）及びトリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）  ０．４ｇ（３．８５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次にＣＨ3Ｏ−ＰＥＧ５０００  ０．１ｇ（０．０２ｍｍｏｌ）及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）  ０．５ｍＬを加え、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから取出し、４０℃のオイルバスで２日間反応した後、氷酢酸で反応を停止させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、最終的にろ過して真空乾燥し、ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．０ｋ）を得た。核磁気共鳴スペクトルは図１のとおりである。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：２．０８（ｔ，−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−），３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２），３．３０（ｍ、−ＯＣＨ3）、３．６５（ｔ、−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）、４．２８（ｔ，−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−），４．３１（ｍ，−ＣＣＨ2）。ＮＭＲ計算の結果、下記構造式中、ｋ＝１１４、ｘ＝２６、ｙ＝１８６であった。ＧＰＣ測定による分子量は３４．５ｋＤａ、分子量分布は１．４８であった。
【化１０】
2019501261.tif 000012
【００２７】
実施例３  ジブロック側鎖にジチオ基含有５員環を有するポリマーＭａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下で、ＣＤＣモノマー０．１ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）及びＴＭＣ  ０．４ｇ（３．８５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次にＭａｌ−ＰＥＧ６０００  ０．１２ｇ（０．０２ｍｍｏｌ）及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）０．１ｍｏｌ／Ｌを添加し、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから取出し、４０℃のオイルバスで２日間反応した後、氷酢酸で反応を停止させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、最終的にろ過して真空乾燥し、Ｍａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：２．０８（ｔ，−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−），３．０８（ｓ，−ＣＣＨ2），３．３０（ｍ、−ＯＣＨ3）、３．６５（ｔ、−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）、４．２８（ｔ，−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−），４．３１（ｍ，−ＣＣＨ2）、及び６．７０（ｓ、Ｍａｌ）。ＮＭＲ計算の結果、下記構造式中、ｋ＝１３６、ｘ＝２５、ｙ＝１８８であった。ＧＰＣ測定による分子量は３８．６ｋＤａ、分子量分布は１．４２であった。
【化１１】
2019501261.tif 000013
【００２８】
実施例４  ジブロック側鎖にジチオ基を含有するポリマーＮＨＳ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下で、ＣＤＣモノマー０．１ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）及びＴＭＣ  ０．４ｇ（３．８５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次にＮＨＳ−ＰＥＧ６５００  ０．１ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）０．５ｍＬを添加し、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから取出し、４０℃のオイルバスで２日間反応した後、氷酢酸で反応を停止させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、最終的にろ過して真空乾燥し、ＮＨＳ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：２．０８（ｔ，−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−），３．０８（ｓ，−ＣＣＨ2），３．３０（ｍ、−ＯＣＨ3）、３．６５（ｔ、−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）、４．２８（ｔ，−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−），４．３１（ｍ，−ＣＣＨ2）、及び２．３（ｓ、ＮＨＳ）。ＮＭＲ計算の結果、下記構造式中、ｋ＝１４５、ｘ＝２４．０、ｙ＝１８２。ＧＰＣ測定による分子量は３７．６ｋＤａ、分子量分布は１．３８であった。
【化１２】
2019501261.tif 000014
【００２９】
実施例５  ジブロック側鎖にジチオ基５員環を有するポリマーＰＥＧ１．９ｋ−Ｐ（ＣＤＣ１．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ４．１ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下で、ＣＤＣモノマー０．１ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）及びＴＭＣ  ０．２ｇ（１．９３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次にＣＨ3Ｏ−ＰＥＧ１９００  ０．１ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）０．５ｍＬを添加し、４０℃のオイルバスで２日間反応し、後処理は実施例２と同様であり、ＰＥＧ１．９ｋ−Ｐ（ＣＤＣ１．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ３．９ｋ）を得た。反応式及び1Ｈ  ＮＭＲ特徴ピークは実施例２と同一であった。ＮＭＲ計算の結果、構造式中、ｋ＝４６、ｘ＝１０、ｙ＝４０であった。ＧＰＣ測定による分子量は１４．５ｋＤａ、分子量分布は１．３６であった。
【００３０】
実施例６  ジブロック側鎖にジチオ基を含有するポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．７ｋ−ｃｏ−ＬＡ１４．６ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下で、ＣＤＣ  ０．０８ｇ（０．４２ｍｍｏｌ）及びラクチド（ＬＡ）０．３ｇ（２．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に０．１ｇ（０．０２ｍｍｏｌ）ＣＨ3Ｏ−ＰＥＧ５０００及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍＬ）０．１ｍｏｌ／Ｌを添加し、４０℃のオイルバスで２日間反応し、後処理は実施例２と同様であり、ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．７ｋ−ｃｏ−ＬＡ１４．６ｋ）を得た。核磁気共鳴スペクトルは図２のとおりである。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．５９（ｓ，−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−），３．０８（ｓ，−ＣＣＨ2），３．３０（ｍ、−ＯＣＨ3）、３．６５（ｔ、−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ2）、５．０７（ｓ，−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−）。ＮＭＲ計算の結果、下記構造式中、ｋ＝１１４、ｘ＝１９、ｙ＝１０１であった。ＧＰＣ測定による分子量は２４．３ｋＤａ、分子量分布は１．３２であった。
【化１３】
2019501261.tif 000015
【００３１】
実施例７  ジブロック側鎖にジチオ基を含有するポリマーＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ５．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ２８．３ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下で、ＣＤＣ  ０．１ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）及びＬＡ  ０．５ｇ（３．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次にＣＨ3Ｏ−ＰＥＧ６５００  ０．１１ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）０．５ｍＬを添加し、４０℃のオイルバスで２日間反応し、後処理は実施例２と同様であり、ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ５．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ２８．３ｋ）を得た。反応式及び1Ｈ  ＮＭＲ特徴ピークは実施例６と同一であった。ＮＭＲ計算の結果、構造式中、ｋ＝１４８、ｘ＝３０、ｙ＝２００であった。ＧＰＣ測定による分子量は４２．４ｋＤａ、分子量分布は１．４３であった。
【００３２】
実施例８  ジブロック側鎖にジチオ基を含有するポリマーＭａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ｃｏ−ＬＡ１８．６ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下で、ＣＤＣ  ０．１ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）及びＬＡ  ０．５ｇ（５．５６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン４ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次にＭａｌ−ＰＥＧ６０００  ０．１５ｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍＬ）０．１ｍｏｌ／Ｌを添加し、４０℃のオイルバスで２日間反応し、後処理は実施例２と同様であり、Ｍａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ｃｏ−ＬＡ１８．６ｋ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．５９（ｓ，−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−），３．０８（ｓ，−ＣＣＨ2），３．３０（ｍ、−ＯＣＨ3）、３．６５（ｔ、−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ2）、５．０７（ｓ，−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−）、及び６．７０（ｓ、Ｍａｌ）。ＮＭＲ計算の結果、下記構造式中、ｋ＝１３６、ｘ＝１９、ｙ＝１２９であった。ＧＰＣ測定による分子量は３２．５ｋＤａ、分子量分布は１．４４であった。
【化１４】
2019501261.tif 000016
【００３３】
実施例９  トリブロックポリマーＰ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＴＭＣ１８．８ｋ）−ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＴＭＣ１８．８ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下でＴＭＣ  ０．８ｇ（７．８４ｍｍｏｌ）及びＣＤＣ  ０．１６ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン８ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ５０００  ０．１ｇ（０．０２ｍｍｏｌ）及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌ）１ｍＬを添加し、４０℃のオイルバスで２日間反応し、後処理は実施例２と同様であり、トリブロックポリマーＰ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＴＭＣ１８．８ｋ）−ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＴＭＣ１８．８ｋ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ特徴ピークは実施例２と同一であった。ＮＭＲ計算の結果、下記構造式中、ｍ＝１１４、ｘ＝２０、ｙ＝１８４であった。ＧＰＣ測定による分子量は７８．９ｋＤａ、分子量分布は１．５４であった。
【化１５】
2019501261.tif 000017
【００３４】
実施例１０  ジブロック側鎖にジチオ基を含有するポリマーＮＨＳ−ＰＥＧ７．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）の合成
窒素ガス雰囲気下で、ＣＤＣ  ０．１ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）及びＬＡ  ０．４ｇ（２．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次にＮＨＳ−ＰＥＧ７５００  ０．０１３ｍｍｏｌ及び触媒であるビス［ビス（トリメチルシリル）アミド］亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）１ｍＬを添加し、反応器を密閉し、グローブボックスから取出し、４０℃のオイルバスで２日間反応し、後処理は実施例２と同様であり、ＮＨＳ−ＰＥＧ７．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１９．０ｋ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．５９（ｓ，−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−），３．０８（ｓ，−ＣＣＨ2），３．３０（ｍ、−ＯＣＨ3）、３．６５（ｔ、−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ2）、５．０７（ｓ，−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−）及び２．３（ｓ、ＮＨＳ）。ＮＭＲ計算の結果、下記構造式中、ｋ＝１７０、ｘ＝２０、ｙ＝９６であった。ＧＰＣ測定による分子量は４２．３ｋＤａ、分子量分布は１．４５であった。
【化１６】
2019501261.tif 000018
【００３５】
実施例１１  標的ジブロックポリマーＣＣ９−ＰＥＧ７．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）の合成
環状ポリペプチドＣＳＮＩＤＡＲＡＣ（ｃｃ９）をカップリングしたポリマーＣＣ９−ＰＥＧ７．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）の合成は、２工程を備え、第１工程では、実施例１０のようにＮＨＳ−ＰＥＧ７．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）を製造し、第２工程では、アミド化反応によりＣＣ９と結合する。まず、上記ポリマーＮＨＳ−ＰＥＧ７．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）をＤＭＦに溶解し、２倍モル量のＣＣ９を添加し、３０℃で２日間反応し、透析して凍結乾燥することで、ＣＣ９−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）を得た。ＮＭＲ及びＢＣＡタンパク質キットにより計算した結果、ＣＣ９グラフト率は９１％であった。
【００３６】
実施例１２  標的ジブロックポリマーｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ｃｏ−ＬＡ１８．６ｋ）の合成
環状ポリペプチドｃ（ＲＧＤｆＣ）（ｃＲＧＤ−ＳＨ）をカップリングしたポリマーｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ｃｏ−ＬＡ１８．６ｋ）の合成は、２工程を備え、第１工程では、実施例８のようにＭａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ｃｏ−ＬＡ１８．６ｋ）を製造し、第２工程では、マイケル付加反応によりｃＲＧＤ−ＳＨのメルカプト基と結合する。まず、ポリマーＭａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ｃｏ−ＬＡ１８．６ｋ）をＤＭＦ  ０．５ｍＬに溶解し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）２ｍＬを加え、さらに１．５倍モル量のｃＲＧＤ−ＳＨを添加し、３０℃で２日間反応し、透析して凍結乾燥することで、最終生成物であるｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ｃｏ−ＬＡ１８．６ｋ）を得た。ＮＭＲ及びＢＣＡタンパク質キットにより計算した結果、ｃＲＧＤグラフト率は９４％であった。
【００３７】
実施例１３  標的ジブロックポリマーｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の合成
環状ポリペプチドｃ（ＲＧＤｆＫ）（ｃＲＧＤ）をカップリングしたポリマーｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の合成は、２工程を備え、第１工程では、実施例４のようにＮＨＳ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）を製造し、第２工程では、アミド化反応によりｃＲＧＤのアミノ基と結合する。まず、上記ポリマーＮＨＳ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）をＤＭＦに溶解し、２倍モル量のｃＲＧＤを添加し、３０℃で２日間反応した後に、透析して遊離ｃＲＧＤを除去し、凍結乾燥することで、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）を得た。ＮＭＲ及びＢＣＡタンパク質キットにより計算した結果、ｃＲＧＤグラフト率は８８％であった。
【００３８】
実施例１４  標的ジブロックポリマーｃＮＧＱ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の合成
環状ポリペプチドｃＮＧＱＧＥＱｃ（ｃＮＧＱ）をカップリングしたポリマーｃＮＧＱ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の合成は、２工程を備え、第１工程では、実施例４のようにＮＨＳ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）を製造し、第２工程では、アミド化反応によりｃＮＧＱのアミノ基と結合する。まず、上記ポリマーＮＨＳ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）をＤＭＦに溶解し、２倍モル量のｃＮＧＱを添加し、３０℃で２日間反応した後に、透析し、遊離ｃＮＧＱを除去し、凍結乾燥することで、ｃＮＧＱ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）を得た。ＮＭＲ及びＢＣＡタンパク質キットにより計算した結果、ｃＮＧＱグラフト率は９２％であった。
【００３９】
上記と同じような製造方法により、様々な、側鎖にジチオ基を含有する生分解性両親媒性ポリマーを製造することができる。原料配合比及び特性は表１に示す。
各ポリマーの製造条件、生成物のＮＭＲ及びＧＰＣによる測定結果
【表１】
2019501261.tif 000019
【００４０】
実施例１５  溶媒置換法による自己架橋ポリマーベシクルＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の製造
溶媒置換法によりポリマーベシクルを製造した。ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬをリン酸塩緩衝液（ＰＢ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）９００μＬに滴下し、３７℃で（２００ｒｍｐ）シェーカーに一晩放置し、自己架橋させ、次に、透析バッグ（ＭＷＣＯ７０００）に入れ、一晩透析し、水を５回交換した。透析溶媒はＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）であった。得られた自己架橋ベシクルのサイズを動的光散乱式粒度分布測定装置（ＤＬＳ）で測定した結果、図３Ａに示すとおり、形成したナノベシクルは１３０ｎｍであり、粒子径分布は非常に狭かった。図３Ｂから分かるように、ＴＥＭ測定の結果、ナノ粒子は中空のベシクル構造であった。自己架橋ベシクルは、高倍率での希釈、及びウシ胎児血清の存在下で変わらない粒径及び粒子径分布を維持した（図３Ｃ）が、模擬腫瘍細胞還元環境下で速やかに放出し、解架橋した（図３Ｄ）。このことから、得られたベシクルは自己架橋なものであり、かつ還元感受性の解架橋性質を有することが分かった。
【００４１】
実施例１６  透析法による自己架橋ポリマーベシクルＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の製造
透析法によりポリマーベシクルを製造した。ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを透析バッグ（ＭＷＣＯ  ７０００）に入れ、ＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で、３７℃で（２００ｒｍｐ）シェーカーに一晩放置し、自己架橋させ、次にＰＢで２４時間透析し、溶液を５回交換した。ＤＬＳ測定の結果、架橋ベシクルのサイズは８０ｎｍ程度であり、粒子径分布は０．０８であった。
【００４２】
実施例１７  薄膜水合法による自己架橋ポリマーベシクルＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の製造
薄膜水合法によりポリマーベシクルを製造した。ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）２ｍｇを、０．５ｍＬの低沸点有機溶媒、例えばジクロロメタン又はアセトニトリルに溶解し、２５ｍＬのシャープボトムフラスコ中で、回転蒸発して底部で薄膜を形成し、次に０．１ｍＢａｒの真空下でさらに２４時間真空抽出した。ＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）２ｍＬを添加し、３７℃で撹拌して薄膜を表面から剥離し、かつ攪拌粉砕し、２０分間（２００ｒｍｐ）超音波処理し、２４時間撹拌し続け、得られたベシクルは自己架橋した。ＤＬＳ測定の結果、自己架橋ベシクルのサイズは１８０ｎｍ程度であり、粒子径分布は０．２５であった。
【００４３】
実施例１８  溶媒置換法による架橋ポリマーベシクルＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の製造
実施例１５のようにポリマーベシクルを製造し、滴下終了後にＤＴＴ（濃度０．０９μＭ）を添加し、３７℃で１２時間架橋させ、次に、透析バッグ（ＭＷＣＯ７０００）に入れ、一晩透析し、溶液を５回交換した。得られた自己架橋ベシクルのサイズは１０９ｎｍ程度であり、粒子径分布は０．１３であった。
【００４４】
実施例１９  ｃＮＧＱをカップリングした標的自己架橋ポリマーベシクルｃＮＧＱ／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の製造
実施例１４で得られた標的ポリマーｃＮＧＱ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）と実施例２で得られたＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）を混合してＤＭＦに溶解し、実施例１５のようにｃＮＧＱをカップリングした標的自己架橋ポリマーベシクルを製造した。標的ポリマーのＰＥＧ分子量は非標的ＰＥＧ分子量よりも大きく、標的分子がよりよく表面から露出することを保証する。両者を異なる配合比で混合することにより、表面に異なる標的分子を有する自己架橋ベシクルを製造することができる。好ましくは、前者の含有量が５〜３０ｗｔ．％である。ＤＬＳ測定により、そのサイズは９０〜１２０ｎｍ程度であり、粒子径分布は０．０５〜０．１５であった。
【００４５】
実施例２０  ｃＲＧＤをカップリングした標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の製造
薄膜水合法によりｃＲＧＤをカップリングした標的自己架橋ポリマーベシクルを製造した。実施例２で得られたＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１．６ｍｇ及び実施例１３で得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）０．４ｍｇを０．５ｍＬの低沸点有機溶媒、例えばジクロロメタン又はアセトニトリルに溶解し、実施例１７のように製造する自己架橋ベシクルのサイズは、８８ｎｍ程度であり、粒子径分布は０．０８であった。両者を異なる配合比で混合することにより、表面に異なる標的分子を有する自己架橋ベシクルを製造することができる。好ましくは、前者の含有量が５〜３０ｗｔ．％である。
【００４６】
実施例２１  ＣＣ９をカップリングした標的自己架橋ベシクルＣＣ９／Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＬＡ１８．８ｋ）−ＰＥＧ４ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＬＡ１８．８ｋ）の製造
実施例８で製造されたＭａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ＬＡ１８．６ｋ）及びＰ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＬＡ１８．８ｋ）−ＰＥＧ４ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＬＡ１８．８ｋ）を混合し、実施例１６に記載の透析方法に従ってベシクルを製造した。次に４Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍＬを添加し、溶液をｐＨ７．５〜８．０に調整し、さらにＭａｌモル量の１．５倍でＣＣ９を加え、マイケル付加反応により結合し、３０℃で２日間反応した後に、透析した。ＤＬＳ測定の結果、そのサイズは１１０ｎｍであり、粒子径分布は０．１６であった。ＮＭＲ及びＢＣＡタンパク質キットにより計算した結果、ポリペプチドのグラフト率は９０％であった。２種のポリマーを異なる配合比で混合することにより、表面に異なる標的分子を有する自己架橋ベシクルを製造することができる。好ましくは、前者の含有量が５〜３０ｗｔ．％である。
【００４７】
上記と同じような製造方法により、様々な自己架橋ポリマーベシクル及び標的自己架橋ポリマーベシクルを製造することができる。原料配合比及び特性は表２に示す。
自己架橋ポリマーベシクル及び標的自己架橋ポリマーベシクルの製造及び特性
【表２】
2019501261.tif 000020
【００４８】
実施例２２  自己架橋ポリマーベシクルＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の薬物担持及び生体外放出
溶媒置換法によりポリマーベシクルを製造し、ＤＯＸ・ＨＣｌの担持はｐＨ勾配法により行い、ベシクル内外のｐＨ差により、親水性薬物ＤＯＸ・ＨＣｌを封入した。ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬをクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）９００μＬに滴下し、３７℃で（２００ｒｍｐ）シェーカーに５時間放置し、次にＰＢ（４Ｍ、ｐＨ８．１）０．０５ｍＬを添加してｐＨ勾配を確立し、その後、ＤＯＸ・ＨＣｌを直ちに加え、シェーカーに５〜１０時間放置することで薬物がベシクルへ進入するとともに、自己架橋することができた。最後に透析バッグ（ＭＷＣＯ  ７０００）に入れて一晩透析し、水を５回交換した。透析溶媒はＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）であった。異なる比率（１０％〜３０％）の薬物を担持した自己架橋ベシクルの粒径は１０５〜１２４ｎｍ、粒子径分布は０．１０〜０．１５であった。蛍光分光光度計により測定したＤＯＸ・ＨＣｌの封入効率は６３％〜７７％であった。ＤＯＸ・ＨＣｌの生体外放出実験は、３７℃の恒温シェーカーで振とう（２００ｒｐｍ）しながら行われ、１組につき３つの並列サンプルがある。第１組は、ＤＯＸ・ＨＣｌ担持自己架橋ベシクルがＧＳＨ  １０ｍＭを加えた模擬細胞内還元環境ＰＢ（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で、第２組は、ＤＯＸ・ＨＣｌ担持自己架橋ベシクルがＰＢ（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）中である。薬物担持自己架橋ベシクルの濃度が３０ｍｇ／Ｌであり、０．６ｍＬを取って透析バッグ（ＭＷＣＯ：１２０００）に入れ、各チューブに対応の透析溶媒２５ｍＬを加え、所定の時間間隔で測定用として５．０ｍＬ透析バッグ外部媒体を取って、それに応じてチューブに対応の媒体を５．０ｍＬ追加した。蛍光計により溶液に含まれる薬物の濃度を測定した。図４はＤＯＸ・ＨＣｌの累積放出量と時間との関係であり、図から分かるように、腫瘍細胞内の還元環境を模擬するためのＧＳＨを添加した後、ＧＳＨを添加していないサンプルより明らかに速く放出された。このことから、薬物担持自己架橋ベシクルは、１０ｍＭのＧＳＨの存在下で効果的に薬物を放出できることが分かった。
【００４９】
実施例２３  標的自己架橋ベシクルＡｌｌｙ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ２．９ｋ−ＣＬ１４．２ｋ）の疎水性薬物ＰＴＸの担持及び放出
溶媒置換法によりポリマーベシクルを製造した。パクリタキセルＰＴＸのＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ及びＡｌｌｙ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ２．９ｋ−ＣＬ１４．２ｋ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）９０μＬを混合し、次に、リン酸塩緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＰＢ）９００μＬに滴下し、３７℃で（２００ｒｍｐ）シェーカーに一晩放置し、自己架橋させ、次に、透析バッグ（ＭＷＣＯ７０００）に入れ、一晩透析し、水を５回交換した。透析溶媒はＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）であった。ＰＴＸの含有量は０〜２０ｗｔ．％であった。得られた自己架橋ベシクルのサイズは１３０〜１７０ｎｍ、粒子径分布は０．１〜０．２であった。ＴＥＭ測定の結果、ベシクル構造であり、還元感受性の解架橋性質を有する。ＰＴＸの封入効率は５０％〜７０％であった。生体外放出実験の設計は実施例２２と同一であり、ＧＳＨ添加後の疎水性薬物は、ＧＳＨ未添加のサンプルより明らかに速く放出された。
【００５０】
実施例２４  標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の薬物の担持及放出
薄膜水合法によりポリマーベシクルを製造し、ｐＨ勾配法によりＤＯＸ・ＨＣｌを担持した。ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）１．６ｍｇ及びｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）０．４ｍｇを０．５ｍＬの低沸点有機溶媒、例えばジクロロメタン又はアセトニトリルに溶解し、２５ｍＬのシャープボトムフラスコ中で、回転蒸発して底部で薄膜を形成し、次に０．１ｍＢａｒの真空下でさらに２４時間真空抽出した。クエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）２ｍＬを添加し、３７℃で撹拌して薄膜を表面から剥離し、かつ攪拌粉砕し、２０分間（２００ｒｍｐ）超音波処理し、２４時間撹拌し続け、自己架橋した。ＤＬＳ測定の結果、架橋ベシクルのサイズは９０ｎｍ程度であり、粒子径分布は０．１０であった。上記ベシクル溶液にＰＢ（４Ｍ、ｐＨ８．１）０．０５ｍＬを添加し、ｐＨ勾配を確立し、その後、ＤＯＸ・ＨＣｌを直ちに加え、シェーカーに５〜１０時間放置した。次に透析バッグ（ＭＷＣＯ  ７０００）に入れてＰＢを一晩透析し、溶液を５回交換した。異なる比率（１０％〜３０％）の薬物を担持した後、粒径は１１２〜１２１ｎｍであり、粒子径分布は０．１０〜０．１５であり、ＤＯＸ・ＨＣｌの封入効率は６１％〜７７％であった。生体外放出実験の設計は実施例２２と同一であり、図５から分かるように、ＧＳＨ  １０ｍＭ添加後に薬物が効果的に放出され、その速度はＧＳＨ未添加のサンプルより明らかに速かった。
【００５１】
実施例２５  標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ２０／ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の薬物の担持及放出
透析法によりベシクルを製造し、ｐＨ勾配法によりエピルビシン塩酸塩（Ｅｐｉ・ＨＣｌ）を担持した。ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）８０μＬ及びｃＮＧＱ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを均一に混合した後に、直接的に透析バッグ（ＭＷＣＯ  ７０００）に入れ、クエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）中で、３７℃でシェーカーに４時間放置し、自己架橋させ、その後に同じ媒体に対して１２時間透析し、溶液を５回交換した。ＤＬＳ測定の結果、自己架橋ベシクルのサイズは９６ｎｍであり、粒子径分布は０．１８であった。上記ベシクル溶液にＰＢ（４Ｍ、ｐＨ８．５）０．０５ｍＬを添加してｐＨ勾配を確立し、その後、Ｅｐｉ・ＨＣｌを直ちに加え、シェーカーに５〜１０時間放置した。次に透析バッグ（ＭＷＣＯ  ７０００）に入れてＰＢを一晩透析し、溶液を５回交換した。異なる比率（１０％〜３０％）の薬物を担持し、粒径は９８〜１１８ｎｍであり、粒子径分布は０．１０〜０．１５であり、Ｅｐｉ・ＨＣｌの封入効率は６４％−７９％であった。Ｅｐｉ・ＨＣｌ生体外放出実験の設計は実施例２２と同一であった。
【００５２】
表３に示すように、上記と同じような製造方法により、様々な自己架橋ポリマーベシクル及び標的自己架橋ポリマーベシクルの、例えばドキソルビシン塩酸塩（ＤＯＸ・ＨＣｌ）、エピルビシン塩酸塩（Ｅｐｉ・ＨＣｌ）、イリノテカン塩酸塩（ＣＰＴ・ＨＣｌ）及びミトキサントロン二塩酸塩（ＭＴＯ・ＨＣｌ）、並びに疎水性抗がん剤であるパクリタキセル、ドセタキセル等の様々な親水抗がん低分子薬物に対する薬物担持量及び封入率を検討することができる。
親水性薬物を担持した自己架橋ポリマーベシクル及び標的自己架橋ポリマーベシクルの薬物担持量、封入率
【表３】
2019501261.tif 000021
【００５３】
実施例２６  ＭＴＴ法による中空自己架橋ベシクル及び中空標的自己架橋ベシクルのＡ５４９細胞に対する毒性の測定
ＭＴＴ法により中空ベシクルの細胞毒性を測定し、Ａ５４９ヒト肺がん細胞を使用した。５×１０4個／ｍＬでＡ５４９細胞を９６ウェルプレートに１ウェルにつき１００μＬで播種し、２４時間後に細胞の密集度が７０％になるまで培養した。次に、実験群の各ウェルにそれぞれ濃度の異なる（０．０００１〜１．５ｍｇ／ｍＬ）ベシクルサンプル（実施例１５の中空自己架橋ベシクル及び実施例１９の中空標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）を例として）を加え、また、細胞ブランク対照ウェル及び培地ブランクウェル（重複４ウェル）を別途設置した。２４時間培養後、各ウェルにＭＴＴ（５．０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、続いて４時間培養した後、各ウェルにＤＭＳＯ  １５０μＬが溶解して生成した結晶子を加え、マイクロプレートリーダーにより４９２ｎｍにおいて吸光度（Ａ）を測定し、培地ブランクウェルをゼロにし、細胞生存率を計算した。図６は自己架橋ベシクルの細胞毒性結果であり、架橋ベシクルの濃度が０．７５から１．５ｍｇ／ｍＬまでに増えた時に、Ａ５４９の生存率が依然として９０％より高かったため、該架橋ベシクルは良好な生体適合性を有することが分かった。
【００５４】
実施例２７  ＭＴＴ法による薬物担持自己架橋ベシクル及び薬物担持標的自己架橋ベシクルのＡ５４９肺がん細胞に対する毒性の測定
ＭＴＴ法によりベシクルのＡ５４９細胞に対する毒性を測定した。細胞の培養は、実験群の各ウェルにサンプルを加える際に、薬物担持架橋ベシクル及び薬物担持標的自己架橋ベシクル、実施例２２のＤＯＸ・ＨＣｌ担持自己架橋ベシクル、実施例２４のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）及び実施例２５のＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ／ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）をそれぞれ対応するウェルに加え、ＤＯＸ・ＨＣｌの濃度範囲を０．０１、０．１、０．５、１、５、１０、２０及び４０μｇ／ｍＬとし、標的分子含有量が１０％、２０％から３０％であり、非標的薬物担持自己架橋ベシクル群、及び遊離ＤＯＸ・ＨＣｌ群を対照群とした以外は、実施例２６と同一であった。共同で４時間培養した後に、サンプルを吸引し、新鮮な培地に交換し、続いて４４時間インキュベートした。その後のＭＴＴ添加、処理及び吸光度の測定は実施例２６と同一であった。図７は薬物担持自己架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）のＡ５４９細胞に対する毒性測定である。ＤＯＸ・ＨＣｌ担持の３０％ｃＲＧＤ標的自己架橋ベシクルのＡ５４９細胞に対する半数致死濃度（ＩＣ50）が２．１３μｇ／ｍＬであり、非標的対照ベシクルよりも顕著に低く、遊離薬物（４．８９μｇ／ｍＬ）よりも低いことから、本発明の薬物担持標的自己架橋ベシクルは、効果的に肺がん細胞を標的とし、細胞内で薬物を放出し、最終的にがん細胞を殺すことができると分かった。
【００５５】
実施例２８  ＭＴＴ法による薬物担持自己架橋ベシクル及び薬物担持標的自己架橋ベシクルのＨ４６０細胞に対する毒性の測定
ＭＴＴ法によりベシクルのＨ４６０ヒト肺がん細胞に対する毒性を測定した。細胞の培養は、実験群の各ウェルにサンプルを加える際に、異なるｃｃ−９含有量、異なる薬物担持量の薬物担持標的架橋ベシクルを、対応するウェルに加え、例えば、ＣＰＴ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルＣＣ９／Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＬＡ１８．８ｋ）−ＰＥＧ４ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ＬＡ１８．８ｋ）を例として、ＣＰＴ・ＨＣｌの濃度範囲が０．０１、０．１、０．５、１、５、１０、２０及び４０μｇ／ｍＬであり、また、標的分子含有量が１０％、２０％から３０％であり、非標的薬物担持架橋ベシクル及遊離ＣＰＴ・ＨＣｌ群を対照群とした以外は、実施例２６と同一であった。共同で４時間培養した後に、サンプルを吸引し、新鮮な培地に交換し、続いて４４時間インキュベートした。その後のＭＴＴ添加、処理及び吸光度の測定は実施例２６と同一であった。その結果、非標的薬物担持自己架橋ベシクルのＨ４６０細胞に対するＩＣ50は４．８５μｇ／ｍＬであり、特にＤＯＸ・ＨＣｌ担持の３０％ＣＣ９標的架橋ベシクルのＨ４６０細胞に対するＩＣ50は２．１７μｇ／ｍＬであり、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム注射液ＤＯＸ−ＬＰｓ（Ｌｉｂｏｄ  ＤＯＸ−ＬＰｓ、３５．２μｇ／ｍＬ）よりも顕著に低く、遊離薬物（３．０９μｇ／ｍＬ）よりも低いことから、本発明の薬物担持標的架橋ベシクルは、効果的に肺がん細胞を標的とし、細胞内で薬物を放出し、最終的にがん細胞を殺すことができると分かった。
【００５６】
上記と同じような方法により様々な薬物担持自己架橋ポリマーベシクル及び標的自己架橋ポリマーベシクルの肺がん細胞に対する毒性を検討した。上記薬物は、親水抗がん低分子薬物であるドキソルビシン塩酸塩（ＤＯＸ・ＨＣｌ）、エピルビシン塩酸塩（Ｅｐｉ・ＨＣｌ）、イリノテカン塩酸塩（ＣＰＴ・ＨＣｌ）及びミトキサントロン二塩酸塩（ＭＴＯ・ＨＣｌ）、並びに疎水性抗がん剤であるパクリタキセル、ドセタキセルである。結果を表４に示す。
【００５７】
実施例２９  薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓ及び薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓの血液循環
すべての動物実験は、蘇州大学動物実験センターの規定に準じている。実験では体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃヌードマウスを使用した。ベシクルは、ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）、及び異なる配合比で混合されたｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）とＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）からなり、ｃＲＧＤの割合が２０％であるときに、粒径が１００ｎｍ、粒子径分布が０．１０であり、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓと命名され、薬物はＤＯＸ・ＨＣｌであった。ＤＯＸ・ＨＣｌ担持した、非標的ベシクルＣＬＰｓ、標的ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、非架橋標的ベシクルｃＲＧＤ２０／ＰＥＧ−ＰＴＭＣ及びＤＯＸ・ＨＣｌを、尾静脈を介してマウス体内に注射し（ＤＯＸ薬物量が１０ｍｇ／ｋｇ）、０、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２及び２４時間に約１０μＬ定時採血し、差量法により血液重量を正確に計算し、さらに、血液に濃度１％のトリトン１００μＬ及びＤＭＦ５００μＬを添加して抽出した（なお、２０ｍＭのＤＴＴ、１ＭのＨＣｌを含有する）。次に遠心分離（２００００回転／分、２０分間）した後、上澄みを取り、蛍光により各時点でのＤＯＸ・ＨＣｌ量を測定した。図８は横軸が時間であり、縦軸が、血液１ｇあたりの、ＤＯＸ・ＨＣｌ量のＤＯＸ全注射量に占める割合（ＩＤ％／ｇ）である。図から分かるように、ＤＯＸ・ＨＣｌの循環時間は非常に短く、２時間でＤＯＸがすでに検出困難となるが、架橋ベシクルは２４時間後に依然として８ＩＤ％／ｇであった。計算すれば、標的薬物担持自己架橋ベシクル、薬物担持自己架橋ベシクル及び非架橋標的ベシクルのマウス体内での半減期はそれぞれ４．４９、４．２６及び１．４５時間であったが、ＤＯＸ・ＨＣｌのほうはわずか０．２７であった。したがって、標的薬物担持自己架橋ベシクルはマウス体内で安定しており、より長い循環時間を有すると分かった。その他の薬物担持標的自己架橋ベシクル、薬物担持自己架橋ベシクルの血液循環実験の操作及び計算方法は同じである。その結果を表４に示す。
【００５８】
実施例３０  薬物担持的自己架橋ベシクルＣＬＰｓ及び薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓの血液循環
実施例２５のように、ｃＮＧＱ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）からなる標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ、及び非標的自己架橋ベシクルＣＬＰにＤＯＸ・ＨＣｌを担持した後に、尾静脈を介してＢａｌｂ／Ｃヌードマウスに注射し、実施例２９と同じようにその血液循環を検討し、ＤＯＸ・ＨＣｌ及びドキソルビシン塩酸塩リポソームＤＯＸ−ＬＰｓを対照群とした。その結果、図９に示すとおり、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ及びＣＬＰｓは４８時間後に依然として５．０ＩＤ％／ｇであった。計算すれば、標的自己架橋ベシクル及び自己架橋ベシクルのマウス体内での半減期はそれぞれ４．９９及び４．７９時間であったため、マウス体内で安定しており、より長い循環時間を有すると分かった。結果を表４に示す。
【００５９】
実施例３１  自己架橋ベシクル及び標的自己架橋ベシクルのＡ５４９肺がん担持マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験では、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃヌードマウスを使用し、５×１０6個のＡ５４９ヒト肺がん細胞を皮下注射し、約３〜４週間後に、腫瘍の大きさが１００〜２００ｍｍ3となった時から実験を開始した。ｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）から製造された自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ及び非標的自己架橋ベシクルＣＬＰｓを例とした。蛍光物質ｃｙ−７で標識されたｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ及び非標的ＣＬＰｓを尾静脈を介してマウス体内に注射し、次に異なる時間点である１、２、４、６、８、１２、２４、４８時間に小動物生体内イメージャーによりベシクルの所在を追跡した。実験結果から分かるように、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓが腫瘍部位に速やかに蓄積し、かつ４８時間後にも蛍光が依然として強かった。ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓは腫瘍部位に自発的に標的化及び濃縮化することができると分かった。その他の標的自己架橋ベシクル、自己架橋ベシクルのｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験の操作及び計算方法は同じである。結果を表４に示す。
【００６０】
実施例３２  薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓ及び薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓのＡ５４９肺がん担持マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験では、腫瘍の接種及び尾静脈による投与は実施例３１と同一であった。実施例２５と同じように製造された、Ｅｐｉ・ＨＣｌを担持し且つｃｙ−７で標識されたＣＬＰｓ及びｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓは、両者とも腫瘍部位に速やかに蓄積し、ＣＬＰｓが４〜６時間で消失したが、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓが４８時間後にも腫瘍部位の蛍光が依然として強かったことから、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓは腫瘍部位に自発的に標的化及び濃縮化することができると分かった。結果を表４に示す。
【００６１】
実施例３３  薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓ及び薬物担持標的自己架橋ベシクルＣＣ９／ＣＬＰｓのＨ４６０肺がん担持マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験では、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃヌードマウスを使用し、５×１０6個のＨ４６０ヒト肺がん細胞を皮下注射し、約３〜４週間後に、腫瘍の大きさが１００〜２００ｍｍ3となった時から実験を開始した。ＣＣ９−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．７ｋ−ｃｏ−ＬＡ１４．６ｋ）から製造された標的自己架橋ベシクルＣＣ９／ＣＬＰｓ及び薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓをｃｙ−５で標識し、疎水性薬物であるドセタキセルＤＴＸを担持し、実施例３２と同じように操作し、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを検討した。実験結果から分かるように、ＤＴＸ担持ＣＣ９／ＣＬＰｓが腫瘍部位に速やかに蓄積し、かつ４８時間後にも腫瘍部位の蛍光が依然として強かった。ＣＣ９／ＣＬＰｓは腫瘍部位に自発的に標的化及び濃縮化することができるが、薬物担持非標的自己架橋ベシクルは腫瘍に進入してから２時間後にすぐに代謝し、かつ強度が低かったことが分かった。結果を表４に示す。
【００６２】
実施例３４  薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓ及び薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓのＡ５４９肺がん担持マウスでの体内生物分布
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験では、腫瘍の接種及び尾静脈による投与は実施例３１と同一であった。ｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）から製造されたＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ及び非標的自己架橋ベシクルＣＬＰｓを、尾静脈を介してマウス体内に注射し（ＤＯＸ・ＨＣｌ：１０ｍｇ／ｋｇ）、１２時間後にマウスを殺し、腫瘍及び心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓組織を取り出し、洗浄して重量を量った後、１％のトリトン５００μＬを加え、ホモジナイザーにより粉砕し、更にＤＭＦ９００μＬを加えて抽出した（２０ｍＭのＤＴＴ、１ＭのＨＣｌを含有する）。遠心分離（２００００回転／分、２０分間）した後、上澄みを取り、蛍光により各時点でのＤＯＸ・ＨＣｌ量を測定した。図１０では、横軸が器官組織であり、縦軸が腫瘍又は組織１ｇあたりのＤＯＸ・ＨＣｌの、ＤＯＸ・ＨＣｌ全注射量に占める割合（ＩＤ％／ｇ）である。ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ及びＤＯＸ・ＨＣｌを１２時間注射し、腫瘍での蓄積量がそれぞれ６．５４、２．５３及び１．０２ＩＤ％／ｇであり、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓはＣＬＰｓ及びＤＯＸ・ＨＣｌの３及び６倍であり、薬物担持ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓは自発的な標的化により腫瘍部位でより多く蓄積したことが分かった。結果を表４に示す。
【００６３】
実施例３５  薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓ及び薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ／ＣＬＰｓのＡ５４９肺がん担持マウスでの体内生物分布
腫瘍の接種、尾静脈による投与及び動物の操作は実施例３４と同一であった。ＤＯＸ・ＨＣｌ担持ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ、非標的ＣＬＰｓ及びドキソルビシン塩酸塩リポソームＤＯＸ−ＬＰｓを尾静脈を介してマウス体内に注射した（ＤＯＸ・ＨＣｌ：１０ｍｇ／ｋｇ）。６時間後に、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ及びＤＯＸ−ＬＰが腫瘍で蓄積したＤＯＸ・ＨＣｌ量がそれぞれ８．６３、３．５２及び１．８２ＩＤ％／ｇであった。ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓは後者の２倍及び５倍であり、薬物担持ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓは自発的な標的化により腫瘍部位でより多く蓄積したことが分かった。結果を図１１に示す。
【００６４】
実施例３６  薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓ及び薬物担持標的自己架橋ベシクルＣＣ９／ＣＬＰｓのＨ４６０肺がん担持マウスでの体内生物分布
Ｈ４６０肺がん担持マウスのモデル構築は実施例３３と同一であり、尾静脈による投与及び動物の操作は実施例３４と同一であった。ＤＴＸ担持ＣＣ９／ＣＬＰｓ、非標的ＣＬＰｓ及びＤＯＸ−ＬＰｓを尾静脈を介して投与した。６時間後にＣＣ９／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ及びＤＯＸ−ＬＰｓが腫瘍で蓄積したＤＴＸ量がそれぞれ９．０２、２．４２及び１．８２ＩＤ％／ｇであった。ＣＣ９／ＣＬＰｓはＣＬＰｓ及びＤＯＸ−ＬＰｓの４及び５倍であり、薬物担持ＣＣ９／ＣＬＰｓは自発的な標的化により腫瘍部位で蓄積したことが分かった。結果を表４に示す。
【００６５】
実施例３７  薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ及び薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓのＡ５４９皮下肺がん担持マウスでの腫瘍抑制効果、体重変化及び生存率
実験では、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃヌードマウスを使用し、５×１０6個のＡ５４９ヒト肺がん細胞を皮下注射し、約２週間後に、腫瘍の大きさが３０〜５０ｍｍ3となった時から実験を開始した。ｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）を１：５で混合して製造したＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ、遊離ＤＯＸ・ＨＣｌ及びＰＢＳをそれぞれ０、４、８及び１２日に尾静脈を介してマウス体内に注射した（ＤＯＸ薬物量が１０ｍｇ／ｋｇ）。０〜１８日目の期間で、２日毎にマウスの体重を量り、ノギスにより腫瘍体積を測定した。腫瘍体積の計算方法はＶ＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）／２（式中、Ｌは腫瘍の長さであり、Ｗは腫瘍の幅であり、Ｈは腫瘍の厚さである。）である。マウスの生存を４５日間観察し続けた。図１２から分かるように、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ治療群は１８日目に腫瘍を顕著に阻害したが、薬物担持ＣＬＰｓ群は腫瘍がある程度増殖した。遊離ＤＯＸ・ＨＣｌも腫瘍の増殖を抑制できたが、そのマウスの体重が１２日目に２１％低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。これに対して、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ及びＣＬＰｓ群のマウスは体重がほぼ変わらなかったことから、薬物担持自己架橋ベシクルはマウスに有毒な副作用を有しないことが分かった。ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ治療群は６０日間後に全部生存していたが、ＤＯＸ・ＨＣｌ群は４２日目に全部死亡し、ＰＢＳ群も４３日目に全部死亡した。したがって、本発明の標的自己架橋ベシクルは、薬物を担持した後に、腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、マウスへの有毒な副作用がなく、さらに腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすこともできると分かった。
【００６６】
実施例３８  薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ／ＣＬＰｓ及び薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓのＡ５４９皮下肺がん担持マウスでの腫瘍抑制効果、体重変化及び生存率
皮下Ａ５４９腫瘍のモデル構築、尾静脈による投与方法及びデータ収集は実施例３７と同一であった。ｃＮＧＱ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）を１：５で混合して製造したＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ、非標的ＣＬＰｓ、ＤＯＸ−ＬＰｓ及びＰＢＳを尾静脈を介して注射した。図１３から分かるように、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ治療群は１８日目に、腫瘍の増殖を効果的に阻害できたが、薬物担持ＣＬＰｓ群は腫瘍が増殖し、マウス体重がほぼ変わらなかった。ＤＯＸ−ＬＰｓも腫瘍の増殖を抑制できたが、ＤＯＸ−ＬＰｓ群のマウスの体重が１２日目に１８％低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ治療群は６８日間後に全部生存していたが、ＤＯＸ・ＨＣｌ群は３２日目に全部死亡し、ＰＢＳ群も４２日目に全部死亡した。したがって、薬物担持標的自己架橋ベシクルは、腫瘍を効果的に抑制でき、マウスへの有毒な副作用がなく、腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができると分かった。
【００６７】
実施例３９  薬物担持標的自己架橋ベシクルＣＣ９／ＣＬＰｓ及び薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓのＨ４６０皮下肺がん担持マウスでの腫瘍抑制効果、体重変化及び生存率
皮下Ｈ４６０腫瘍のモデル構築は実施例３３と同一であり、尾静脈による投与方法及びデータ収集は実施例３７と同一であった。腫瘍の大きさが３０〜５０ｍｍ3となった時から実験を開始し、ＣＣ９−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．７ｋ−ｃｏ−ＬＡ１４．６ｋ）を１：５で混合して製造したＣＰＴ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルＣＣ９／ＣＬＰｓ、非標的ＣＬＰｓ、遊離ＣＰＴ・ＨＣｌを尾静脈を介して注射した。その結果、ＣＣ９／ＣＬＰｓ治療の１８日目に、腫瘍の増殖を効果的に阻害できたが、薬物担持ＣＬＰｓ群は腫瘍が少々増え、マウス体重がほぼ変わらなかった。ＣＰＴ・ＨＣｌとＰＢＳも腫瘍の増殖を抑制できたが、ＣＰＴ・ＨＣｌ群のマウスの体重が１０日目に１８％低減した。ＣＣ９／ＣＬＰｓ治療群は７２日間後に全部生存していたが、ＣＰＴ・ＨＣｌ群は２８日目に全部死亡し、ＰＢＳ群も３７日目に全部死亡した。
【００６８】
実施例４０  薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ及び薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓのＡ５４９同所性肺がん担持マウスでの腫瘍抑制効果、体重変化及び生存率
実験では、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃヌードマウスを使用し、肺に５×１０6個の生物発光Ａ５４９ヒト肺がん細胞（Ａ５４９−Ｌｕｃ）を直接的に注射し、約１０日間後に、小動物ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステムによる観察において、マウスの肺に蛍光が発見され、Ａ５４９同所性肺がんモデルの構築が成功した。次に、実施例２０のように、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）を１：５で混合して製造したＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ、ＤＯＸ・ＨＣｌ及びＰＢＳをそれぞれ、０、４、８及び１２日目に尾静脈を介してマウス体内に注射した（ＤＯＸ・ＨＣｌ：１０ｍｇ／ｋｇ）。０〜１６日目の期間で、４日毎にマウスの体重を量り、小動物生体内イメージャーにより、マウス肺における腫瘍の生物発光の強さをモニタニングし、マウスの生存を４５日間観察した。図１４に示すとおり、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ治療群では、１６日間以内に、肺における腫瘍の生物発光の強度が低減し続けた一方、薬物担持ＣＬＰｓ群では、肺における腫瘍の生物発光の強度がある程度増加した。なお、両方とも体重がほぼ変わらなかった。ＤＯＸ・ＨＣｌも腫瘍の増殖を抑制できたが、ＤＯＸ・ＨＣｌ群のマウスの体重が４日目に２１％低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ治療群は４５日間後に全部生存していたが、ＤＯＸ・ＨＣｌ群は３０日目に全部死亡し、ＰＢＳ群も２０日目に全部死亡した。したがって、薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓは、同所性肺がん腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、マウスへの有毒な副作用がなく、腫瘍担持マウスの生存時間を効果的に延ばすことができると分かった。
【００６９】
実施例４１  薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ及び薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓのＡ５４９同所性肺がん担持マウスでの腫瘍抑制効果、体重変化及び生存率
Ａ５４９同所性肺がんのマウスモデル構築、投与方法及び測定方法は実施例４０と同一であった。ｃＮＧＱ−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）を１：５で混合して製造したＤＯＸ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ、非標的ＣＬＰｓ、ＤＯＸ−ＬＰｓ及びＰＢＳを尾静脈を介して注射した。その結果は図１５に示すとおり、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ治療群では、１６日間以内に、腫瘍の生物発光の強度が低減し続けたが、薬物担持ＣＬＰ群では、腫瘍の生物発光の強度がある程度増加し、マウスの体重がほぼ変わらなかった。ＤＯＸ−ＬＰｓも腫瘍の増殖を抑制できたが、ＤＯＸ−ＬＰｓのマウスの体重が４日目に２１％低減した。ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ治療群は４５日間後に全部生存していたが、ＤＯＸ−ＬＰｓ群は３２日目に全部死亡し、ＰＢＳ群も２３日目に全部死亡した。したがって、薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓは同様に、同所性肺がん腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、マウスへの有毒な副作用がなく、さらに腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができると分かった。
【００７０】
実施例４２  薬物担持標的自己架橋ベシクルＣＣ９／ＣＬＰｓ及び薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓのＡ５４９同所性肺がん担持マウスでの腫瘍抑制効果、体重変化及び生存率
Ａ５４９同所性肺がんのマウスモデル構築、投与方法及び測定方法は実施例４０と同一であった。ｃｃ９−ＰＥＧ６．５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＬＡ１３．８ｋ）及びＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．７ｋ−ｃｏ−ＬＡ１４．６ｋ）を１：５で混合して製造したＣＰＴ・ＨＣｌ担持標的自己架橋ベシクルＣＣ９／ＣＬＰ、非標的ＣＬＰｓ、ＣＰＴ・ＨＣｌ及びＰＢＳをマウスに注射した。ＣＣ９／ＣＬＰｓ治療群では、１６日目に、腫瘍の生物発光の強度が低減したが、薬物担持ＣＬＰｓ群では、腫瘍の生物発光の強度がある程度増加し、マウスの体重がほぼ変わらなかった。ＣＰＴ・ＨＣｌも腫瘍の増殖を抑制できたが、ＣＰＴ・ＨＣｌ群のマウスの体重が３日目に２１％低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。ＣＣ９／ＣＬＰｓ治療群は４０日間後に全部生存していたが、ＣＰＴ・ＨＣｌ群は３４日目に全部死亡し、ＰＢＳ群は２１日目に全部死亡した。したがって、薬物担持標的自己架橋ベシクルＣＣ９／ＣＬＰｓは同所性肺がん腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、有毒な副作用がなく、さらに腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができると分かった。
【００７１】
実施例４３  薬物担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＣＬＰｓ及び薬物担持自己架橋ベシクルＣＬＰｓのＡ５４９担持同所性肺がんマウスでの腫瘍抑制効果、体重変化及び生存率
ＡＡ−ＰＥＧ３ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．９ｋ−ＰＤＳＣ４．８ｋ）及びＰＥＧ１．９ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．６ｋ−ＰＤＳＣ４．６ｋ）を１：５で混合してＰＴＸ担持自己架橋ベシクルを製造した。次に、実施例２１のように、ベシクル表面におけるアクリレート（ＡＡ）及びｃＲＧＤｆＣのメルカプト基のマイケル付加反応によりＰＴＸ担持標的自己架橋ベシクルｃＲＧＤ／ＣＬＰを製造した。ＤＬＳ測定の結果、８５ｎｍであり、粒子径分布は０．１０であった。ＮＭＲ及びＢＣＡタンパク質キット計算の結果、ポリペプチドのグラフト率は９２％であった。
【００７２】
Ａ５４９同所性肺がんのマウスモデル構築、投与方法及び測定方法は実施例４０と同一であった。ＰＴＸ担持ｃＲＧＤ／ＣＬＰｓ、非標的自己架橋ベシクルＣＬＰｓ、Ｔａｘｏｌ及びＰＢＳをそれぞれマウスに注射した。ＰＴＸ担持ｃＲＧＤ／ＣＬＰｓ治療群では、１６日間以内に、腫瘍の生物発光の強度が低減し続けたが、非標的ＣＬＰｓ群では、腫瘍の生物発光の強度が増加し、両方ともマウスの体重がほぼ変わらなかった。ＰＴＸも腫瘍の増殖を抑制できたが、ＰＴＸ群のマウスの体重が１２日目に１０％低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。ＰＴＸ担持ｃＲＧＤ／ＣＬＰｓ治療群は４１日目に依然として生存していたが、ＰＴＸ群のマウスは２９日目に全部死亡し、ＰＢＳ群も３２日目に全部死亡した。したがって、ＰＴＸ担持ｃＲＧＤ／ＣＬＰｓは同所性肺がん腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、有毒な副作用がなく、さらに腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができると分かった。
【００７３】
上記と同じような実験方法により異なる薬物を担持した様々な自己架橋ポリマーベシクル及び標的自己架橋ポリマーベシクルの肺がん担持マウスへの影響を検討し、その結果を表４に示す。
薬物担持自己架橋ポリマーベシクル及び薬物担持標的自己架橋ポリマーベシクルの肺がんに対する体内外抗腫瘍結果
【表４】
2019501261.tif 000022
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019501261.tif 000033
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019501261.tif 000037
【図１１】
2019501261.tif 000038
【図１２】
2019501261.tif 000039
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月27日(2018.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学構造式は、下記構造式のいずれか１つであることを特徴とする、生分解性両親媒性ポリマー。
【化１】
2019501261.tif 000043
（式中、Ｒ１は以下の基から選択される１種であり、
【化２】
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Ｒ２は以下の基から選択される１種であり、
【化３】
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ｋは４３〜１７０、ｘは１０〜３０、ｙは４０〜２００、ｍは８６〜３４０である。）
【請求項２】
前記Ｒ１は以下の基から選択される１種であり、
【化４】
2019501261.tif 000046
前記Ｒ２は以下の基から選択される１種であり、
【化５】
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前記ｋは１１３〜１７０、ｘは２０〜２６、ｙは１００〜１９０、ｍは２２６〜３４０であることを特徴とする、請求項１に記載の生分解性両親媒性ポリマー。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーが標的分子に結合して得られることを特徴とする、腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマー。
【請求項４】
前記腫瘍は肺癌であることを特徴とする、請求項３に記載の腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマー。
【請求項５】
前記標的分子はｃＲＧＤ、ｃＮＧＱ又はｃｃ−９であることを特徴とする、請求項４に記載の腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマー。
【請求項６】
ポリマーベシクルであって、その製造方法は、
（１）請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーから製造する方法、
（２）請求項３に記載の腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーから製造する方法、
（３）請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーと、請求項３に記載の腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーとから製造する方法、
（４）請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーから製造したベシクルの表面に標的分子をカップリングさせた後に得られる方法、
のいずれか１種であることを特徴とする、ポリマーベシクル。
【請求項７】
自己架橋ポリマーベシクルであって、粒径が４０〜１８０ｎｍであることを特徴とする、請求項６に記載のポリマーベシクル。
【請求項８】
請求項６に記載のポリマーベシクルの、肺がんを治療するための医薬品の担体としての使用。
【請求項９】
前記肺がんを治療するための医薬品は、親水性抗がん剤又は疎水性抗がん剤であることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の生分解性両親媒性ポリマーの、肺がんを治療するためのナノ医薬品の製造のための使用。
【請求項１１】
請求項６に記載のポリマーベシクルの、肺がんを治療するためのナノ医薬品の製造のための使用。
【国際調査報告】
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