(57)【要約】  組織の修復、回復、再構築または再建のための標的部位に送達される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）溶液、具体的には細胞外マトリックスヒドロゲル（ＥＣＭＨ）溶液を使用して生殖粘膜組織または泌尿生殖粘膜組織の損傷を処置するための方法および組成物が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生殖粘膜組織または泌尿生殖粘膜組織の回復、再構築または修復を哺乳動物において誘導するための組成物であって、修復を必要としている、損傷または外傷を受けた生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織に効果的な量で投与される、効果的な量で投与される、ＥＣＭＨ溶液、ＥＣＭＨ無菌溶液およびＴＳ−ＥＣＭＨから選択される細胞外マトリックスヒドロゲル組成物を含み、かつ、損傷または外傷を受けた前記生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織の構成的な組織再構築または組織修復を促進させる組成物。
【請求項２】
前記細胞外マトリックスが小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞外マトリックスが膀胱粘膜（ＵＢＭ）に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞外マトリックスが組織特異的細胞外マトリックス（ＴＳ−ＥＭＣ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記粘膜組織が膣組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記粘膜組織が外性器組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記粘膜組織が子宮組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記粘膜組織が子宮頸部組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織の回復、再構築または修復を哺乳動物において誘導するための方法であって、
ＥＣＭＨ溶液、ＥＣＭＨ無菌溶液およびＴＳ−ＥＣＭＨから選択される細胞外マトリックスヒドロゲル組成物を提供すること；
修復を必要としている、損傷または外傷を受けた生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織に効果的な量の前記細胞外マトリックスヒドロゲルを投与すること；
それにより、損傷または外傷を受けた前記生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織の構成的な組織再構築または組織修復を促進させること
を含む方法。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックスが小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞外マトリックスが膀胱粘膜（ＵＢＭ）に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞外マトリックスが組織特異的細胞外マトリックス（ＴＳ−ＥＭＣ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織が膣組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織が外性器組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織が子宮組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織が子宮頸部組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織の回復、再構築または修復を哺乳動物において誘導するための方法であって、
ＥＣＭＨ溶液、ＥＣＭＨ無菌溶液およびＴＳ−ＥＣＭＨから選択される細胞外マトリックスヒドロゲル組成物を提供すること；
修復を必要としている、損傷または外傷を受けた生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織に効果的な量の前記細胞外マトリックスヒドロゲルを投与すること；
それにより、損傷または外傷を受けた前記生殖管粘膜組織または泌尿生殖路粘膜組織の構成的な組織再構築または組織修復を、瘢痕組織の制限された、または軽減された形成を伴って促進させること
を含む方法。
【請求項１８】
前記組織が外科的な切開または切除による外傷を受けている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織が、該組織において以前に形成された瘢痕組織の外科的な切開または切除による外傷を受けている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記組織が、以前に瘢痕化していない組織の外科的な切開または切除による外傷を受けている、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、罹患組織、損傷組織または欠落組織の部位における構成的再構築を具体的には粘膜組織の回復のために、より具体的には泌尿生殖粘膜組織の回復のために促進させ、それにより、罹患組織、損傷組織または欠落組織の治癒または機能的回復を生じさせるために、必要性のある患者における内側または外側の解剖学的部位に局所投与される、または埋め込まれる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）または細胞外マトリックスヒドロゲル（ＥＣＭＨ）を使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
粘膜組織に対する損傷が、疾患、化学療法もしくは放射線療法、または外傷から生じ得る。最小限に浸襲性であり、かつ、外来に基づく外科的手法に向かう現在の傾向が、誘導性かつ生物活性であり得る、または非誘導性の「代用物」であり得る注入可能な足場の開発を促してきている。精製されたコラーゲン、ゼラチン、自己脂肪、ヒアルロン酸および合成材料が、再生医療における注入可能な足場として臨床使用されている。しかしながら、過度に精製された、化学修飾された、または合成された材料は、宿主による有害な免疫応答を引き起こし、マトリックス内への細胞遊走を制限する恐れがある。
【０００３】
天然に存在する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）から構成される足場には、瘢痕組織形成を最小限に抑えながら様々な組織タイプの構成的再構築を引き起こすことが示されてきた多くの生物活性特性がある。ＥＣＭ由来の足場を、例えば、ブタまたは他の動物（例えば、反芻動物など）の膀胱（膀胱マトリックスまたはＵＢＭ）または小腸（小腸粘膜下組織またはＳＩＳ）から得ることができ、様々なＥＣＭ由来の足場が、様々な組織を修復するための使用のために記載されている。しかしながら、ほとんどの現行形態のＥＣＭは、当該ＥＣＭが得られる組織に固有の材料特性および幾何学的特性（例えば、シート状または管状の組織など）によって制限されており、注入による送達は粉末懸濁物に限定されている。
【０００４】
１つの特に有用なＥＣＭが、米国特許第８，３６１，５０３号および同第８，６９１，２７６号ならびに後継出願に記載される方法によって調製することができる、細胞外マトリックスヒドロゲル（ＥＣＭＨ）として知られている可溶化されたゲル形態物である。このＥＣＭまたはＥＣＭＨは、国際公開第２０１５／１４３３１０号に記載される方法に従って調製される滅菌された可溶性ゲルであり得る。これらのゲルは好都合なことに、室温において流動性または液状であり、２５℃を超えて加熱されたとき、例えば、約３７℃である正常な体温を有する患者の身体と接触したときにはゲルを形成する。これらの特許および公開された特許出願のそれぞれがその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００５】
ＥＣＭおよびＥＣＭＨは、様々な組織の部位特異的な組織修復をもたらすために有用であり、抗菌性もまた、再生特性と同様に有することが一般には理解されている。しかしながら、ＥＣＭまたはＥＣＭＨを使用する組織の再構築または再建は多数の要因に依存しており、特定の組織を再建するためにＥＣＭまたはＥＣＭＨを使用する成功した処置は非常に予測不能である。主題発明は、これまで処置することが困難であった、または処置に対して抵抗性であった損傷粘膜組織または罹患粘膜組織を処置しなければならないという満たされていない要求に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、主題発明は、ＥＣＭまたはＥＣＭＨを使用して処置可能であることが以前には知られていない特定の状態の処置をもたらし、それにより、損傷粘膜組織または罹患粘膜組織の再構築または治癒を促進させるための医学的処置の分野における満たされていない要求を満たす方法に関する。
【０００７】
発明の概要
主題発明は、粘膜組織損傷を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を使用して処置するための方法に関連し、具体的には、損傷粘膜組織、罹患粘膜組織または欠落粘膜組織を、標的部位に送達される細胞外マトリックスヒドロゲル（ＥＣＭＨ）を使用して処置することに関する。本明細書中で使用される場合、ＥＣＭは、上皮組織の１層または複数層の細胞外マトリックスに由来する失活させられた細胞外マトリックス材料を意味する。好ましい実施形態において、ＥＣＭＨは、可溶化された均質な組成物である。別の好ましい実施形態において、ＥＣＭＨは、無菌の可溶化された均質な組成物である。明確化および区別のために、可溶化された均質な組成物は「ＥＣＭＨ溶液」として示され、無菌の可溶化された均質な組成物は「ＥＣＭＨ無菌溶液」として示される。
【０００８】
ゲルＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液を、
ｉ）ＥＣＭを粉砕すること、
ｉｉ）無傷の、非透析の、または非架橋のＥＣＭを酸性溶液における酸性プロテアーゼによる消化によって可溶化して、消化溶液を製造すること、および
ｉｉｉ）消化溶液のｐＨを７．２から７．８の間のｐＨに調節して、中和された消化溶液を製造すること
を含む方法によって調製することができる。
【０００９】
上記方法によって調製されるＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液は好都合には、室温（例えば、２５℃）において流動性溶液または液状溶液である、かつ、２５℃を超える（典型的には３０℃を超える）温度においてゲルを形成するという特性を有し得る。
【００１０】
別の実施形態において、ＥＣＭの移植片組成物または足場組成物を調製する方法はさらに、該足場を超音波処理することを含む。
【００１１】
本発明の方法を実施する際には、ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液を含む足場または移植片が、本明細書中に記載されるように調製され、その後、罹患組織または損傷組織の少なくとも一部の区域または領域に埋め込まれ、移植され、または投与され、十分な期間にわたって罹患組織または損傷組織と接触したままにされ、その結果、置換細胞が成長し、罹患細胞または損傷細胞を置き換えるようされる。十分な期間は１日から約６ヶ月までが可能である。
【００１２】
ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液は、処置されている部位への注射、注入または噴霧などによって都合よく投与することができる流動性組成物である。そのような投与は、生長可能または健康な組織の許容できる再成長または置換についてモニターする処置医によって決定されるように、数日、数週間または数ヶ月から１年までの期間にわたって１日あたり１回または複数回を含めて、所望されるように数回繰り返すことができる。
【００１３】
流動化されたＥＣＭまたはＥＣＭＨの溶液または無菌溶液の噴霧可能なゲル、溶液または懸濁物の１つの好ましい実施形態が、組成物を噴霧による投与のためにエアロゾル化するためのものである。エアロゾル化噴霧物は、流動化されたＥＣＭ組成物またはＥＣＭＨ組成物を所望の部位または場所に送達するために製造される、または改変される内視鏡において、またはそのような内視鏡とともに提供されるカニューレまたは他の導管を介して供給源リザーバーからポンプ送出することができる。
【００１４】
主題発明の方法は、効果的な量のＥＣＭ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液を、損傷または外傷を受けており、ＥＣＭ組成物により活性化される組織再建による損傷組織または外傷組織の修復からの利益を得るであろう粘膜組織の標的部位に投与することを含む。
【００１５】
外傷を受けた組織の処置は、ＥＣＭまたはＥＣＭＨが、外科的手法（例えば、組織の切除または切開）による外傷を受けた領域に塗布され、または他の方法で投与される粘膜部位または非粘膜部位を含むことができ、この場合、ＥＣＭまたは  は、組織の治癒および構成的再構築を促進させるために外科的手法の後で切除部位または切開部位に塗布することができる。好都合なことには、外傷を受けた組織に塗布されるＥＣＭまたはＥＣＭＨは、当該部位における最小限の瘢痕化または軽減された瘢痕化を伴って組織修復を促進させることができる。
【００１６】
さらに、既に形成された瘢痕組織を、例えば、医師によって行われる外科的手法によって切除することができ、または他の方法で除くことができ、そして、瘢痕組織が、ＥＣＭまたはＥＣＭＨによって促進される再構築された非瘢痕組織によって置き換えられるように、ＥＣＭまたはＥＣＭＨを新しく形成された創傷部に塗布することができ、または他の方法で投与することができる。
【００１７】
本発明によるＥＣＭＨまたはＥＣＭＨ無菌溶液を使用する主題方法から利益を得ることができる潜在的な標的粘膜組織が、口腔粘膜；眼粘膜；食道、胃および腸管を含む消化管粘膜；気道粘膜（鼻、肺および気管）；生殖管粘膜；および尿生殖路粘膜である。
【００１８】
主題発明の方法は、生検、様々なＳＴＤ、直腸膣瘻、膣脱、ホルモン不均衡、ＰＡＰ塗抹標本、性交、化学療法および放射線療法などに起因する損傷または外傷の多数の潜在的原因を考慮して、女性の生殖粘膜（例えば、子宮頸部組織）または女性の尿生殖路粘膜（例えば、膣組織）に対する損傷または外傷を処置するために特に有用である。これらの組織は日常的に検査されており、容易にアクセス可能である。ＥＣＭまたはＥＣＭＨは、妊娠、ＩＶＦまたは不妊治療のために組織において機能を修復するために、または回復するために有用であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な記述
主題発明は、罹患した、または損傷した粘膜細胞および粘膜組織をその場で置き換えることによる、あるいは、罹患した、または損傷した粘膜細胞および粘膜組織をその場で置き換えることを刺激することによる損傷粘膜組織の再構築、再建または修復に関連する。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明の方法は、損傷粘膜組織または罹患粘膜組織の処置を、内部臓器の粘膜内層に対する疾患または損傷または外傷の症状を有する、あるいは内部臓器の粘膜内層に対する疾患または損傷または外傷に苦しむ患者における罹患粘膜組織または損傷粘膜組織への幹細胞または始原体細胞の遊走を刺激することによって行うことを含む。
【００２１】
より具体的には、主題発明は、ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液を標的部位への注射または注入によって損傷粘膜組織または外傷粘膜組織に投与し、その結果、幹細胞または始原体細胞が標的部位に遊走し、それにより、新たな健康な粘膜組織による損傷粘膜組織または罹患粘膜組織の置換または再構築を刺激するように、または達成するようにすることを含む。組織の構成的再構築の促進はこの技術分野では、「組織再構築」、「組織再建」、「組織回復」、「組織修復」または「組織再生」として示され、これらの用語は、組織の治癒が、ＥＣＭ組成物またはＥＣＭＨ組成物の塗布、付着、貼り付けまたは他の従来的な投与によって促進され、かつ、治癒が自然のプロセスにより、あるいは、非ＥＣＭ系または非ＥＣＭＨ系の材料または組成物の使用により生じさせられた場合よりも効果的である、または効率的である、または非侵襲性である組織修復をもたらすプロセスを示すために交換可能に使用される。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、幹細胞または始原体細胞または活性薬物をＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液の組成物に組み込むことができ、かつ、幹細胞、始原体細胞または活性薬物を含むその溶液を、本明細書中に記載されるような組成物のために適切な送達手段によって標的粘膜組織に送達することができる。例えば、流動性のＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液を、損傷または外傷を示す標的組織に注入することができ、注射することができ、または噴霧することができる。
【００２３】
意図的ではあるが、ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液は、所定部位へのマクロファージの遊走を含めて、炎症応答を促す。ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液の特有の特徴の１つが、このマクロファージの表現型をＭ１型（炎症誘発性）からＭ２型（組織再構築促進性、これは、例えば、根底にある炎症誘発性状態を有しない人などにおいて認められるであろう）に切り替えることを促すことである。Ｍ１からＭ２へのこの表現型切り替えの重要な結果が、そうでない場合には炎症を生じさせやすい組織を健康なままにすることを可能にすることである。
【００２４】
流動化されたＥＣＭ、例えば、本発明のＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液などは、一般に用いられている流体投与プロセスまたは流体送達プロセス（例えば、注射、注入または水浸し（部位に「浴びせる」こと）など）によって、あるいは、流体またはエアロゾル化流体を、修復を必要としている損傷組織、罹患組織または欠落組織の部位に噴霧することによって投与することができる。好ましい噴霧技術が、例えば、内視鏡的に送達されるエアロゾル化ＥＣＭ流体を使用して行われる。代替として、流動化されたＥＣＭを、その塗布を容易にすることができるアプリケーターまたはデバイスを使用して塗布することができ、例えば、子宮または膣または内部臓器の修復の場合には、タンポンおよびタンポンアプリケーターなどを使用して塗布することができる。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「組成物」、用語「材料」、用語「足場」および用語「移植片」は、ＥＣＭを示すような場合、交換可能に使用することができ、特定の構成、例えば、固体形態、液状形態、流動性形態または他の形態などである特定の構成を暗示しない。例えば、「ＥＣＭ足場」は、液体またはゲルを含めて、固体または流体であることが可能である。
【００２６】
好ましくは、流動化されたＥＣＭ組成物、例えば、本明細書中に記載されるようなＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液の組成物などは、ゲルが粘性特性を有するようにゲルをその場で形成し、また、十分な粘度を有しており、その結果、組成物は、その治癒効果を１回だけの投与もしくは塗布によって、または多数回の、もしくは反復した投与もしくは塗布によってそのどちらでも果たすための十分な期間にわたって体内の所望の場所に付着する。
【００２７】
好ましい実施形態において、流動化されたＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液は、液状特性または流動性特性を塗布または投与の前に有し、塗布または投与されたときには、都合よく濃密化または高粘度化し、これにより、粘着性ゲルを投与部位または塗布部位において身体との接触時または接触直後に形成するヒドロゲルである。
【００２８】
ゲル化を、温度の上昇によって、例えば、投与後の体熱などによって開始させ、達成することができる。流動性のＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液はまた、別個の粘性剤と、例えば、十分な粘度を提供するためのヒドロゲルまたは他の一般に知られているゲル化剤などと混合することができる。代替として、流体の少なくとも一方がＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液を含有する２つの流体で、互いに接触したとき、または混合されたときにゲル化する２つの流体を投与することができる。
【００２９】
ＥＣＭ組成物は、組織の十分な血管新生が存在するときには幹細胞が所定部位にまで遊走することを引き起こすことができ、この血管により、幹細胞が所定部位に遊走するための適切な導管が提供されることが、十分に立証されている。加えて、ＥＣＭは、化学なシグナル伝達を介して隣接組織または下層組織と情報交換すると理解されており、また、隣接組織または下層組織は、ＥＣＭが使用される細胞および組織の再構築、置換または再生を最適化する「動的相互関係（ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｃｉｐｒｏｃｉｔｙ）」と呼ばれる現象によってＥＣＭと情報交換する。したがって、ＥＣＭ組成物は、配置部位、投与部位または塗布部位における新たな細胞成長および組織成長のための足場として役立ち得る。
【００３０】
１つの実施形態において、ＥＣＭは、この技術分野において一般に使用されている組織に由来することができる。例えば、ＥＣＭはこれまで、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）組織または膀胱マトリックス（ＵＢＭ）組織に由来している。代替的な実施形態において、ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液は、処置されている組織と同じ組織タイプに由来することができ、これは「組織特異的細胞外マトリックス」または「ＴＳ−ＥＣＭ」として示される。ＴＳ−ＥＣＭは、好都合な結果、例えば、動的相互関係を介して起こり得る、より効率的な、またはより応答性の再建的組織再構築などをもたらすことができる。主題発明を説明するという目的のために、主題方法による使用との関連での「ＥＣＭ」への言及は、ＥＣＭＨ溶液、ＥＣＭＨ無菌溶液、またはＴＳ−ＥＣＭを意味しており、ただし、ＴＳ−ＥＣＭはＴＳ−ＥＣＭＨ溶液またはＴＳ−ＥＣＭＨ無菌溶液のどちらかである。
【００３１】
したがって、主題発明は、疾患または外傷による損傷を受けた粘膜組織（例えば、生殖組織、外皮組織、膵臓組織、腎臓組織、循環組織、泌尿生殖組織または呼吸器組織など）の処置を、ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液あるいはＴＳ−ＥＣＭを投与することによって行うための方法および組成物を包含する。主題発明の方法は、男性または女性の泌尿生殖組織を含めて、男性または女性の組織において有用であり得る。
【００３２】
１つの実施形態において、ＴＳ−ＥＣＭは、処置されている種と同じ種に由来する。例えば、ヒトにおけるＵＣの処置では、ヒト粘膜組織がＴＳ−ＥＣＭ組成物として用いられるであろう。組織移植片は、上記のように同種移植片、または異種移植片であることが可能である。
【００３３】
好都合なことには、粘膜組織に対する損傷または外傷の処置または治癒が、ＥＣＭＨ溶液、ＥＣＭＨ無菌溶液またはＴＳ−ＥＣＭの埋め込み、移植または投与を、粘膜切除または粘膜剥離の前工程を伴うことなく行うことを含む方法によって達成され得ることが意図される。したがって、組織に対する疾患または損傷が傷（例えば、組織の露出面または出血面など）を生じさせるような場合には、先立つ組織の切除が省かれることがある。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、埋め込む（こと）または埋め込み、移植する（こと）または移植、塗布する（こと）または塗布、投与する（こと）または投与、注入する（こと）または注入、注射する（こと）または注射、送達する（こと）または送達のこれらの用語はすべて、ＥＣＭＨ溶液、ＥＣＭＨ無菌溶液またはＴＳ−ＥＣＭを処置部位に与えるためのプロセスを示しており、ＥＣＭの所定部位への送達を果たすために用いられる組成物特性および手法によっては同じ意味を有することが当業者によって理解されるであろう。これらの用語は交換可能に使用することができ、いかなる点でも本発明の方法に対する限定ではない。
【００３５】
本発明によるＥＣＭＨ溶液、ＥＣＭＨ無菌溶液またはＴＳ−ＥＣＭが有用であり得る部位および適用の限定されない例には、乳腺腫瘤切除部位、腫瘍除去部位、外傷または組織／臓器の切除に起因する組織空隙部、臓器病変部、創傷部、歯槽、胸腔、腹腔、肺葉切除または肝葉切除、膣、尿道、子宮、骨盤腔、膀胱、陰茎および陰茎組織、皮下組織、鼻腔または鼻洞、血管、ならびに髄内腔が挙げられる。
【００３６】
本発明の１つの実施形態において、噴霧物が、組織再建を必要とする解剖学的部位に噴霧される上記で記載されるＥＣＭＨ溶液、ＥＣＭＨ無菌溶液またはＴＳ−ＥＣＭＨから作製される。ＥＣＭＨが、最小限に侵襲的な手法によって導入され得る送達システムに装填される。ＥＣＭＨの最終送達が、ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液が所望の部位に塗布されるようにＥＣＭＨ材料を加圧して、または物理的に、シース、シリンジまたはノズルから出すことによって達成される。噴霧の幅および面積を、シース、シリンジまたはノズルの開口部のサイズによって制御することができる。代替では、流動性のＥＣＭまたはＥＣＭＨを、タンポンアプリケーターまたはタンポンを含めてアプリケーターそれ自体を使用して、あるいは他の医療用または個人用の衛生アプリケーターデバイスを使用して所定部位に対して直接に塗布することができる。
【００３７】
好都合なことには、本発明の方法において使用されるＥＣＭＨは、所与の部位および占有空間に注入されるとき、インビボにおいて膨張し、または重合する。重合性のＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液が標的部位に投与されるとき、重合性のＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液は、組織再建というその意図された目的を果たすために所定の位置において重合し、固定されたままである。ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液は、ｐＨにおける変化（高ｐＨ側から低ｐＨ側への、または低ｐＨ側から高ｐＨ側への変化）、または温度における変化（好ましくは低温側から高温側への変化）の後で重合することができる。重合性のＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液が所望の部位に導入されると、当該部位におけるｐＨを酸または塩基の添加によって変化させることができ、これにより、ゲルが塗布部位においてインビボで重合することを可能にすることができる。重合性のＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液はまた、所望の部位への塗布の後で身体ｐＨにおいて重合することができる。
【００３８】
重合性のＥＣＭＨ溶液は、例えば、放射線（電子ビーム、ガンマ線）またはガス（エチレンオキシドまたは二酸化窒素）、あるいはこの技術分野において現在知られている他の滅菌手法（例えば、記載される超臨界ＣＯ２プロセスなど）によって滅菌することができる。
【００３９】
例
例１−ラットモデルにおける粘膜組織の置換のためのＥＣＭＨ溶液の塗布
本発明に従って、ＥＣＭＨ溶液を膣粘膜の処置のために使用することの実施可能性を動物モデルにおいてインビボで試験することができる。ラットが、女性生殖管（例えば、膣粘膜組織など）の傷についてのモデル（傷がラット膣組織において化学的に誘発され得る）として設定される場合がある。
【００４０】
誘発された傷の処置を、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）に由来し、シリンジ、カニューレ、カテーテル、内視鏡、膣鏡、タンポンもしくはタンポンアプリケーター、または他の好適な送達デバイスを使用する注入または噴霧によって当該部位に導入されるＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液を使用して実施することができる。ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液を単回の投与または塗布として、あるいは代替では複数回の投与または塗布として、例えば、必要に応じて（ｐｒｎ）、数日から約１週間に至るまでの、約１ヶ月またはそれ以上に至るまでの期間にわたって１日あたり１回または複数回、処置医または他の医療専門家によって決定されるように投与することができる。ＥＣＭＨ溶液またはＥＣＭＨ無菌溶液についての１つの好ましい投与計画として、７日間〜３０日間にわたる１日あたり１回を挙げることができる。
【００４１】
ＥＣＭからのゲルの調製方法
小腸の所与セグメントからのＳＩＳの調製が、米国特許第４，９０２，５０８号、米国特許第５，２７５，８２６号および米国特許第５，５１４，５３３号に詳述される（それらの開示は特に、参照によって本明細書中に組み込まれる）。腸の所与セグメントを最初に、縦方向の拭き取り動きを使用して掻爬して、外層（具体的には漿膜および筋層）および内層（粘膜の管腔部分）の両方を除く。
典型的には、ＳＩＳは生理食塩水ですすがれ、必要な場合には、下記で記載されるような使用まで水和状態または脱水状態で貯蔵される。
【００４２】
本発明の流動化組成物は、粘膜下組織の粉砕および／またはプロテアーゼ（例えば、トリプシンまたはペプシンなど）による消化を、前記組織を可溶化し、かつ、実質的に均質な溶液を形成するために十分な期間にわたって行うことによって腸粘膜下組織の溶液として調製される。腸粘膜下組織の出発材料は、引き裂き、切断、磨砕および剪断などによって粉砕される。粘膜下組織を凍結状態または凍結乾燥状態で磨砕することが好ましく、だが、良好な結果を、粘膜下組織の小片の懸濁物を高速（高剪断）ブレンダーでの処理に供し、必要ならば、遠心分離し、過剰な水をデカントすることにより脱水することによって同様に得ることができる。粉砕された腸粘膜下組織は、粘膜下組織の粉末を形成するために乾燥することができる。その後、粘膜下組織の粉末は水和させて、すなわち、水または緩衝化生理食塩水および必要な場合には他の薬学的に許容される賦形剤と一緒にして、粘度が２５℃で約２ｃｐｓ〜約３００，０００ｃｐｓである流体としてのＥＣＭＨ溶液を形成することができる。より高粘度の移植片組成物はゲルまたはペーストの粘稠度を有することができる。本発明の組成物は、この技術分野で認められている滅菌技術を使用して、例えば、電離放射線または滅菌ガス（例えば、超臨界ＣＯ２）への暴露などを使用して滅菌することができる。
【００４３】
本発明の流動化された粘膜下組織はまた、外傷誘発または疾患誘発の組織欠損を矯正するために最も典型的ではあるが、修復または増強を必要としている組織（例えば、軟組織）のための注入可能な異種移植片としての用途が見出される。
【００４４】
ＳＩＳ溶液
ＳＩＳ粉末は金網に通して篩い分けされ、どのような容器であれ、便利な容器に入れられる。粉末はその後、実質的に均質な溶液を形成するためにタンパク質分解消化に供される。１つの実施形態において、粉末は、ＨＣｌによりｐＨ２．５に調節される０．１Ｍ酢酸において、室温で４８時間の期間にわたって１ｍｇ／ｍｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）により消化される。反応媒体が、ペプシン活性を不活性化するために水酸化ナトリウムにより中和される。可溶化された粘膜下組織はその後、プロテアーゼにより可溶化された腸粘膜下組織を粉末形態で形成するために、溶液の塩析によって濃縮され、さらなる精製および／または凍結乾燥のために分離される場合がある。
【００４５】
本発明による流動化された粘膜下組織組成物の粘度を、粘膜下組織成分の濃度および水和度を制御することによって操作することができる。粘度を２５℃で約２ｃｐｓ〜約３００，０００ｃｐｓの範囲に調節することができる。低粘度の粘膜下組織組成物が関節内適用または体腔内での適用のためにより良好に適合している。より高粘度の配合物を、例えば、ゲルを、ＳＩＳ消化溶液から、そのような溶液のｐＨを約６．０〜約７．０に調節することによって調製することができる。粘膜下組織懸濁物または粘膜下組織消化溶液としての本発明の組成物のゲル形態物は典型的には、シリンジまたはカテーテルを使用する粘膜適用、皮下適用または筋肉内適用のために好ましい。
【００４６】
ＳＩＳゲルはまた、適量での０．１ＮのＮａＯＨ（消化溶液の体積の１／１０）および１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（消化溶液の体積の１／９）を４℃で混合することによってゲルになるとして記載されている。この溶液を、低温（４℃）の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して所望の体積および濃度にし、ゲル化させるために３７℃のインキュベーターに置いた。
【００４７】
このＥＣＭは溶液において４０分後にマトリックスを形成することができた。このＥＣＭ由来ゲルは２０℃未満の温度で液状であったが、温度が３７℃に上昇するときにはゲルになる。
【００４８】
ゲルをＥＣＭから調製する際には、すべての溶液が氷上に保たれたほうがよく、下記の変数を米国特許第８，３６１，５０３号に従って決定しなければならない（これは本明細書により、その全体が参照によって組み込まれる）。
Ｃｆ＝最終ゲルの濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｃｓ＝ＥＣＭ消化溶液の濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｖｆ＝実験のために必要とされる最終ゲル溶液の体積
Ｖｄ＝ＥＣＭ消化溶液から必要とされる体積（ｍｌ）
Ｖ１０Ｘ＝必要される１０×ＰＢＳの体積（ｍｌ）
Ｖ１Ｘ＝必要される１×ＰＢＳの体積（ｍｌ）
ＶＮａＯＨ＝必要とされる０．１Ｎ  ＮａＯＨの体積（ｍｌ）
【００４９】
最初に、要求されるＥＣＭゲルの最終濃度（Ｃｆ）および体積（Ｖｆ）を決定する。次に、必要されるＥＣＭの質量を乗算Ｃｆ（ｍｇ／ｍｌ）×Ｖｆ（ｍｌ）によって計算する。この値により、ＥＣＭ消化溶液から必要とされる体積（Ｖｄ）が得られるであろう（ただし、Ｖｄ＝［Ｃｆ（ｍｇ／ｍｌ）×Ｖｆ（ｍｌ）］／Ｃｓ）。
【００５０】
必要とされる１０×ＰＢＳの体積を、計算された体積Ｖｄを９で割ること（Ｖ１０Ｘ＝Ｖｄ／９）によって計算する。必要とされる０．１Ｎ  ＮａＯＨの体積を、計算された体積Ｖｄを１０で割ること（ＶＮａＯＨ＝Ｖｄ／１０）によって計算する。溶液を適切な濃度／体積にするために必要とされる１×ＰＢＳの量を下記のように計算する：Ｖ１Ｘ＝Ｖｆ−Ｖｄ−Ｖ１０Ｘ−ＶＮａＯＨ。すべての試薬を、ＥＣＭ消化物（Ｖｄ）を有しない適切な容器（通常の場合には１５ｍｌまたは５０ｍｌの遠心分離管）に加える（Ｖ１Ｘ＋Ｖｄ＋Ｖ１０Ｘ＋ＶＮａＯＨ）。溶液を氷上に置き、常に氷上に保つ。
【００５１】
ＥＣＭ消化溶液からの適量（Ｖｄ）を上記で調製されるＰＢＳ／ＮａＯＨ混合物に加え、慎重に、かつ、溶液における気泡の発生を避けながら１ｍｌのマイクロピペットにより十分に混合する。ＥＣＭ消化溶液の粘度に依存して、いくらかの有意な体積喪失が移送中に生じることがあるかもしれない。総体積をモニターし、適切な量を、最終体積が達成されるまで加える。ｐＨが約７．４でなければならないプレゲル溶液のｐＨを測定する。
【００５２】
プレゲル溶液を鋳型または適切なウェルに加える。鋳型またはウェルを少なくとも４０分間、３７℃のインキュベーターに入れる。ＣＯ２制御のインキュベーターを使用することは避ける。水の蒸発が懸念されるならば、インキュベーターに入れる前に鋳型をプラスチック製ジップロックバッグの中に入れる。ゲル化後、ゲルを鋳型から取り出し、１×ＰＢＳの上に置くことができる。ゲルが組織培養プレートで作製されたならば、１×ＰＢＳを使用までゲルの上部に置いて、水和されたゲルを維持することができる。サンプル計算：最終濃度が６ｍｇ／ｍｌである６ｍｌのゲルを１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液から作製する。
【００５３】
ＳＩＳ−ＥＣＭ投与手順
ＳＩＳ−ＥＣＭ溶液を傷誘発ラットの膣内にシリンジによって投与することができる。宿主動物の拒絶反応、感染症または異常な生理学的応答が移植片の投与後に予想されない。この溶液はまた、内視鏡検査法を介して、または腹腔鏡検査法を介して膣内に投与される場合があり、あるいは、タンポンもしくはタンポンアプリケーターまたは類似するデバイスを使用して投与される場合がある。本発明の予想外の結果が、膣粘膜の増強がＳＩＳ由来のＥＣＭＨ溶液により達成され得るような適切な組織再構築の刺激であるあろうと考えられる。
【００５４】
本発明の流動化された組成物は組織の置換および修復をもたらすことができ、さらに、粘膜組織の疾患によって引き起こされる病変部の処置または治癒をもたらすことができる。ＥＣＭＨ溶液は、天然の粘膜組織の再成長を誘導するために本方法に従って使用される。効果的な量のＥＣＭＨ溶液を欠損組織の現場に塗布することによって、バイオトロピック（ｂｉｏｔｒｏｐｉｃ）特性を、より侵襲的な外科的技術を必要とすることなく実現することができる。
【００５５】
本明細書中に記載されるものの様々な変形、改変および他の実施が、主張されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者には思いつくであろう。したがって、本発明は、前述の例示的な説明によってではなく、むしろ、下記の請求項の精神および範囲によって定義されるものとする。
【００５６】
本明細書中に提供される参考文献のそれぞれがその全体において参照によって組み込まれる。
【００５７】
例２−粘膜組織（例えば、膣粘膜など）の修復のためのゲルＥＣＭ
本発明に従って、粘膜組織の回復、再構築または修復を誘導するためにＥＣＭゲル組成物を使用することの実施可能性をウサギにおいてインビボで試験することができる。ウサギが、ヒト膣の過敏、炎症、潰瘍形成、上皮破壊および浮腫についてのモデルとして設定される。
【００５８】
膣粘膜の過敏、炎症、潰瘍形成、上皮破壊および浮腫を、殺菌剤（例えば、塩化ベンザルコニウム（ＢＺＫ）など）、酸溶液、液体窒素または化学療法剤を膣粘膜表面に直接塗布することによってウサギにおいて誘発することができる。
【００５９】
損傷を受けた膣粘膜組織の処置を、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）に由来し、シリンジ、カニューレ、カテーテル、内視鏡、膣鏡、タンポン、アプリケータースティックまたは他の好適な送達デバイスを使用する注入または噴霧によって膣粘膜表面に導入されるゲル細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を使用して実施することができる。ゲルＥＣＭを、少なくとも１週間から約１ヶ月に至るまでの期間にわたって１日あたり１回または複数回投与することができる。ゲルＥＣＭについての好ましい投与計画が、１日間〜５日間にわたる１日あたり１回である。
【００６０】
ＥＣＭからのゲルの調製方法
ＳＩＳからのゲルＥＣＭの調製は例１に記載される。ゲルＥＣＭ溶液は２５℃未満の温度では粘性であろうし、しかし、３７℃では１０分〜３０分のうちに、好ましくは２０分以内にゲル化するであろう。
【００６１】
ゲルＥＣＭを膣粘膜組織損傷のウサギモデルにおいて使用するインビボ研究
膣の過敏、炎症、潰瘍形成、上皮破壊および浮腫を処置するための１つの取り組みが、刺激物、微生物または炎症性細胞応答に対する物理的バリアを提供することができ、かつ、膣粘膜バリア機能の迅速な置換のための足場を、粘膜上皮構造を回復し、内因性の粘膜治癒プロセスを組織化することによって提供することができるＥＣＭ組成物を提供することである。本研究では、損傷を受けた膣粘膜組織を処置するための哺乳動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭＨ）のヒドロゲル形態物の局所送達の効力が明らかにされるであろう。臨床症候学、炎症および上皮バリア機能に対するＥＣＭＨの影響が、多数の評価項目によって評価されるであろう。
【００６２】
本例において示される研究では、ＥＣＭから構成されるヒドロゲルが膣粘膜組織過敏のウサギモデルを効果的に処置し得ることが示されるであろう。効果的な治療が、ＥＣＭＨ処置によって積極的に導かれ得る下記の２つの本質的な生理学的プロセスに従って決定される：１）宿主を炎症促進性の管腔内容物および管腔微生物の容赦のない連続攻撃から保護する膣上皮バリア機能の回復、および２）損傷を受けた膣粘膜組織が、非処置の場合よりも迅速に、かつ少ない瘢痕形成を伴って治癒すること。本研究では、上皮バリア機能を回復し、かつ、粘膜組織の修復および再生のための環境を確立することによるＥＣＭＨを用いた膣粘膜組織損傷の効果的な処置を実証することができる。
【００６３】
方法
実験設計
ＥＣＭＨの効力を膣組織過敏（ＲＶＩ）のウサギモデルにおいて明らかにするために、粘膜組織損傷を、２％塩化ベンザルコニウム（ＢＺＫ）の１ｍＬの溶液を膣内に５インチ〜６インチ挿入されるシリンジおよびカニューレにより１０日間連続して膣に直接塗布することによって雌ウサギにおいて誘発することができる（Ｆｉｅｌｄｓ他、２０１４）。ＥＣＭＨは、例１に記載されるように調製される場合がある。処理残留物を含むＥＣＭＨ希釈剤を模倣する１ｍＬのＥＣＭＨ溶液またはコントロール溶液のどちらかが、５日間にわたって１日に１回、膣内に５インチ〜６インチ設置されるシリンジおよびカニューレにより塗布されるであろう。動物は、時間的応答を評価するためにＢＺＫ塗布後７日および１４日で屠殺されるであろう（ｎ＝１４／時点／処置）。ＢＺＫまたは処置を何ら受けなかった健康なウサギが、７日および１４日の両方での比較のために含められるであろう（ｎ＝６／時点）。研究の主要評価項目には、臨床応答、組織学的スコア、炎症応答およびバリア機能が含まれることがある。
【００６４】
すべてのインビボ研究では、６ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの、好ましくは８ｍｇ／ｍＬのＥＣＭＨ濃度が使用されるであろう。すべてのインビトロ研究では、４００μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬの、好ましくは５００μｇ／ｍＬのＥＣＭＨ濃度が使用されるであろう。ＥＣＭＨの膣粘膜組織への結合を可視化する研究のために、ＦＩＴＣ標識されたＥＣＭＨを、タンパク質標識キットを製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  ＰｉｅｒｃｅＮｅｔ；＃５３０２７）に従って用いて調製することができる。
【００６５】
動物および管理
すべての手順および動物実験が、研究用動物の管理および試験に関するすべての該当する規制に従って承認され、実施されるであろう。雌ウサギ（２０週齢〜２８週齢）が得られ、個別に収容され、７日間〜１０日間にわたって環境順応させられるであろう。動物は、２１℃〜２３℃の温度および１２時間の明暗サイクルによる標準的条件のもとで収容されるであろう。ウサギは、食物および水の自由な摂取が研究期間中を通して許されるであろう。
【００６６】
目視検査
ウサギは膣分泌物または浮腫の徴候について毎日検査されるであろう。
【００６７】
膣組織の外植およびスコア化
動物は前記のような所定の時点で屠殺されるであろう。安楽死が米国獣医学会（ＡＶＭＡ）に従ってＣＯ２吸入およびそれに続く頸椎脱臼によって達成されるであろう。安楽死後、膣組織サンプルが、子宮頸部、膣中央部および膣尾部から得られるであろう。
【００６８】
組織切片が、組織学およびミエロペルオキシダーゼ測定のために使用されるであろう。切片はパラフィン包埋されるであろう。切片（５μｍ）が、子宮頸部、膣中央部および膣尾部から得られ、代表的な組織学的スコア化のためのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色されるであろう。切片が、白血球浸潤、上皮の潰瘍形成および破壊、ならびに浮腫についてスコア化されるであろう。
【００６９】
付着性およびバリア機能についてのＥＣＭＨのインビトロ試験
ＥＣＭＨ付着試験
ＥＣＭＨの粘膜付着を、改変された剥離力測定を使用して測定することができる。１０Ｎの負荷セルを備える一軸引張試験機（ＭＴＳ  Ｉｎｓｉｇｈｔ；ＭＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）が、すべての引張り強さ測定のために使用されるであろう。２つのウサギ膣組織切片を、粘膜を外側に向けて、また、１つのワッシャーが２４ウェルプレート（直径：１５．６ｍｍ）の底部に接着されるスチール製ワッシャー（直径：１２．７ｍｍ）に接着することができる。ＥＣＭＨを、１／１０の体積の０．１Ｍ  ＮａＯＨにより中和し、その後、１／９の体積の１０×ＰＢＳを加えることによって調製することができる。その後、０．５ｍＬのＥＣＭＨを底部ワッシャーおよび上部ワッシャーの両方の上に加え、３７℃での１時間のインキュベーションの前に所定の深さにまでゲル内に浸透させることができる。インキュベーション後、粘膜を、破壊が表面間に生じるまで５ｍｍ／分の一定速度でゆっくり上方に引くことができる。（Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇ＆Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ（１９９５）；（Ｋａｍｍｅｒ、１９８３）。
【００７０】
ＦＩＴＣを用いたＥＣＭＨ保持研究
ヒドロゲル保持時間を求めるために、９羽のウサギに、ＦＩＴＣ標識されたＥＣＭＨがＢＺＫによる組織損傷誘発の後で投与されるであろう。ウサギは、浣腸後２時間、１２時間および２４時間で屠殺されるであろう（ｎ＝３／時点）。ＦＩＴＣ−ＥＣＭＨ処置ウサギからの外植された膣組織が、光学的に透明であり、その結果、管腔内容物が蛍光画像化によって視認されるように処理される。屠殺直後に、すべてのサンプルが、ＦＩＴＣ結合物の光退色を防止するために光から保護されるだろう。組織の光学的透明化をＤｅｎｔ固定液（１：４のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：アセトン）における２時間のインキュベーションによって開始することができる。その後、膣組織は透過処理し、Ｄｅｎｔ漂白剤（１：４：１のＤＭＳＯ：アセトン：Ｈ２Ｏ２）において１時間漂白することができる。その後、光学的に透明化された組織が画像化されるであろう。露光時間がＦＩＴＣ−ＥＣＭＨのコントロールサンプルに対して設定され、すべての後続画像については一定に保たれるであろう。
【００７１】
ＴＲＩＴＣ−デキストラン透過性アッセイ
膣粘膜上皮の透過性がＴＲＩＴＣ−デキストラン（分子量、４．４ｋＤａ；Ｓｉｇｍａ）の膣内投与によって評価されるだろう。ウサギに、ＴＲＩＴＣ−デキストラン（１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）が屠殺の４時間前に投与されるであろう。心臓接合部からの全血が屠殺時に得られ、血清チューブに集められるであろう。ＴＲＩＴＣ−デキストラン測定が、標準曲線として使用されるＴＲＩＴＣ−デキストランの連続希釈物とともに、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で三連で行われるであろう。
【００７２】
膣上皮細胞（ＶＥＣ）培養
インビトロでのバリア機能アッセイのために、ＶＥＣ（ＶＫ２／Ｅ６Ｅ７、ＡＴＣＣ）が、非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび２０％のＦＢＳを含有するＭＥＭにおいて約８０％のコンフルエンスにまで培養されるであろう。ＥＣＭＨに対するＶＥＣの機能的応答が、迅速分化システム（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ  ＨＴＳ）を製造者の説明書に従って使用して評価されるであろう。コンフルエントであり、かつ、分化した細胞単層が１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによる２時間の攻撃誘発に供され、その後、ＥＣＭＨによる４８時間の処置に供されるであろう。ＶＥＣの機能的応答が、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）および上皮カドヘリン（Ｅ−カドヘリン）細胞接着タンパク質の存在によって測定されるであろう。
【００７３】
全体として、試験結果から、ＥＣＭＨが膣粘膜に付着すること、ＥＣＭＨが、膣粘膜を被覆することによって物理的バリアを提供し、上皮バリア機能を回復させ、かつ、組織修復のプロセスのための足場として作用することが明らかにされ得る。本発明の流動化された組成物は組織置換および組織修復をもたらす場合があり、さらに、粘膜組織の疾患によって引き起こされる病変部の処置または治癒をもたらす場合がある。ＥＣＭＨ溶液を、天然の粘膜組織の再成長を誘導するために本方法に従って使用することができる。効果的な量のＥＣＭＨ溶液を欠損組織の現場に塗布することによって、バイオトロピック特性を、より侵襲的な技術または全身的薬学的処置を必要とすることなく実現することができる。
【００７４】
例３−粘膜組織（例えば、膣粘膜など）の修復のためのゲルＥＣＭ
本発明に従って、粘膜組織の回復、再構築または修復を誘導するためにＥＣＭゲル組成物を使用することの実施可能性をモルモットにおいてインビボで試験することができる。  モルモットが、ヒト膣の過敏、炎症、潰瘍形成、上皮破壊および浮腫についてのモデルとして設定される。
【００７５】
膣粘膜の過敏、炎症、潰瘍形成、上皮破壊および浮腫を、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）による感染によってモルモットにおいて誘発することができる（ＭａｙｏおよびＨｓｉｕｎｇ、１９８４）。
【００７６】
損傷を受けた膣粘膜組織の処置を、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）に由来し、シリンジ、カニューレ、カテーテル、内視鏡、膣鏡、タンポン、アプリケータースティックまたは他の好適な送達デバイスを使用する注入または噴霧によって膣粘膜表面に導入されるゲル細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を使用して実施することができる。ゲルＥＣＭを、少なくとも１週間から約１ヶ月に至るまでの期間にわたって１日あたり１回または複数回投与することができる。ゲルＥＣＭについての好ましい投与計画が、１日間〜５日間にわたる１日あたり１回である。
【００７７】
ＥＣＭからのゲルの調製方法
ＳＩＳからのゲルＥＣＭの調製は例１に記載される。ゲルＥＣＭ溶液は２５℃未満の温度では粘性であろうし、しかし、３７℃では１０分〜３０分のうちに、好ましくは２０分以内にゲル化するであろう。
【００７８】
ゲルＥＣＭを膣粘膜組織損傷のモルモットＨＳＶ２モデルにおいて使用するインビボ研究
膣の過敏、炎症、潰瘍形成、上皮破壊および浮腫を処置するための１つの取り組みが、刺激物、微生物または炎症性細胞応答に対する物理的バリアを提供することができ、かつ、膣粘膜バリア機能の迅速な置換のための足場を、粘膜上皮構造を回復し、内因性の粘膜治癒プロセスを組織化することによって提供することができるＥＣＭ組成物を提供することである。本研究では、損傷を受けた膣粘膜組織を処置するための哺乳動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭＨ）のヒドロゲル形態物の局所送達の効力が明らかにされるであろう。臨床症候学、炎症および上皮バリア機能に対するＥＣＭＨの影響が、多数の評価項目によって評価されるであろう。
【００７９】
本例において示される研究では、ＥＣＭから構成されるヒドロゲルが膣粘膜組織過敏のモルモットモデルを効果的に処置し得ることが示されるであろう。効果的な治療が、ＥＣＭＨ処置によって積極的に導かれ得る下記の２つの本質的な生理学的プロセスに従って決定される：１）宿主を炎症促進性の管腔内容物および管腔微生物の容赦のない連続攻撃から保護する膣上皮バリア機能の回復、および２）損傷を受けた膣粘膜組織が、非処置の場合よりも迅速に、かつ少ない瘢痕形成を伴って治癒すること。本研究では、上皮バリア機能を回復し、かつ、粘膜組織の修復および再生のための環境を確立することによるＥＣＭＨを用いた膣粘膜組織損傷の効果的な処置を実証することができる。
【００８０】
方法
実験設計
ＥＣＭＨの効力をモルモットＨＳＶ２モデルにおいて明らかにするために、粘膜組織損傷を、１０４．５〜１０５の粒子形成単位のＨＳＶ２を含有する１ｍＬの接種物がニードルを伴わないツベルクリン用シリンジにより膣に直接に置かれ、その後、膣が手術用パッドで塞がれることにより雌モルモットにおいて誘発することができる。ＥＣＭＨは、例１に記載されるように調製される場合がある。処理残留物を含むＥＣＭＨ希釈剤を模倣する１ｍＬのＥＣＭＨ溶液またはコントロール溶液のどちらかが、ウイルス接種後２４時間〜７２時間から始まって５日間にわたって１日に１回、膣内および外陰部に設置されるシリンジおよびカニューレを用いて塗布されるであろう。動物は、時間的応答を評価するために処置後３日、７日および１４日で屠殺されるであろう（ｎ＝１４／時点／処置）。ウイルスまたは処置を何ら受けなかった健康なモルモットが、７日および１４日の両方での比較のために含められるであろう（ｎ＝６／時点）。研究の主要評価項目には、臨床応答、組織学的スコア、炎症応答およびバリア機能が含まれることがある。
【００８１】
すべてのインビボ試験では、６ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの、好ましくは８ｍｇ／ｍＬのＥＣＭＨ濃度が使用されるであろう。ＥＣＭＨの膣粘膜組織への結合を可視化する研究のために、ＦＩＴＣ標識されたＥＣＭＨを、タンパク質標識キットを製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  ＰｉｅｒｃｅＮｅｔ；＃５３０２７）に従って用いて調製することができる。
【００８２】
動物および管理
すべての手順および動物実験が、研究用動物の管理および試験に関するすべての該当する規制に従って承認され、実施されるであろう。若い成体雌Ｈａｒｌｅｙモルモットが得られ、個別に収容され、７日間〜１０日間にわたって環境順応させられるであろう。動物は、２１℃〜２３℃の温度および１２時間の明暗サイクルによる標準的条件のもとで収容されるであろう。モルモットは、食物および水の自由な摂取が研究期間中を通して許されるであろう。
【００８３】
目視検査
モルモットは膣分泌物または浮腫の徴候について毎日検査されるであろう。
【００８４】
膣組織の外植およびスコア化
動物は前記のような所定の時点で屠殺されるであろう。安楽死が米国獣医学会（ＡＶＭＡ）に従ってＣＯ２吸入およびそれに続く頸椎脱臼によって達成されるであろう。安楽死後、膣組織サンプルが、子宮頸部、膣中央部、膣尾部および外陰部から得られるであろう。
【００８５】
組織切片が、組織学およびミエロペルオキシダーゼ測定のために使用されるであろう。切片はパラフィン包埋されるであろう。切片（５μｍ）が、子宮頸部、膣中央部、膣尾部および外陰部から得られ、代表的な組織学的スコア化のためのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色されるであろう。切片が、白血球浸潤、上皮の潰瘍形成および破壊、ならびに浮腫についてスコア化されるであろう。
【００８６】
膣スワブからのウイルス定量
ウイルスの排出が、それぞれのモルモットの膣を綿で覆われる予め湿らせたスワブで処置開始後３日目、７日目および１０日目に拭き取るか、または、子宮頸部膣洗浄液を処置開始後３日目、７日目および１０日目に得るかのどちらかによって測定されるであろう。  分泌物におけるＨＳＶ２の量がリアルタイムＰＣＲによって測定されるであろう。
【００８７】
付着性およびバリア機能についてのＥＣＭＨのインビトロ試験
方法
ＥＣＭＨ付着試験
ＥＣＭＨの粘膜付着を、改変された剥離力測定を使用して測定することができる。１０Ｎの負荷セルを備える一軸引張試験機（ＭＴＳ  Ｉｎｓｉｇｈｔ；ＭＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）が、すべての引張り強さ測定のために使用されるであろう。２つのモルモット膣組織切片を、粘膜を外側に向けて、また、１つのワッシャーが２４ウェルプレート（直径１５．６ｍｍ）の底部に接着されるスチール製ワッシャー（直径：１２．７ｍｍ）に接着することができる。ＥＣＭＨを、１／１０の体積の０．１Ｍ  ＮａＯＨにより中和し、その後、１／９の体積の１０×ＰＢＳを加えることによって調製することができる。その後、０．５ｍＬのＥＣＭＨを底部ワッシャーおよび上部ワッシャーの両方の上に加え、３７℃での１時間のインキュベーションの前に所定の深さにまでゲル内に浸透させることができる。インキュベーション後、粘膜を、破壊が表面間に生じるまで５ｍｍ／分の一定速度でゆっくり上方に引くことができる。（Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇ＆Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ（１９９５）；（Ｋａｍｍｅｒ、１９８３）。
【００８８】
ＦＩＴＣを用いたＥＣＭＨ保持研究
ヒドロゲル保持時間を求めるために、９匹のモルモットに、ＦＩＴＣ標識されたＥＣＭＨがウイルス接種の３日後〜５日後に投与されるであろう。モルモットは、ＥＣＭＨ塗布後２時間、１２時間および２４時間で屠殺されるであろう（ｎ＝３／時点）。ＦＩＴＣ−ＥＣＭＨ処置モルモットからの外植された膣組織が、光学的に透明であり、その結果、管腔内容物が蛍光画像化によって視認されるように処理される。屠殺直後に、すべてのサンプルが、ＦＩＴＣ結合物の光退色を防止するために光から保護されるだろう。組織の光学的透明化をＤｅｎｔ固定液（１：４のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：アセトン）における２時間のインキュベーションによって開始することができる。その後、膣組織は透過処理し、Ｄｅｎｔ漂白剤（１：４：１のＤＭＳＯ：アセトン：Ｈ２Ｏ２）において１時間漂白することができる。その後、光学的に透明化された組織が画像化されるであろう。露光時間がＦＩＴＣ−ＥＣＭＨのコントロールサンプルに対して設定され、すべての後続画像については一定に保たれるであろう。
【００８９】
ＴＲＩＴＣ−デキストラン透過性アッセイ
膣粘膜上皮の透過性がＴＲＩＴＣ−デキストラン（分子量、４．４ｋＤａ；Ｓｉｇｍａ）の膣内投与によって評価されるだろう。モルモットに、ＴＲＩＴＣ−デキストラン（１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）が屠殺の４時間前に投与されるであろう。心臓接合部からの全血が屠殺時に得られ、血清チューブに集められるであろう。ＴＲＩＴＣ−デキストラン測定が、標準曲線として使用されるＴＲＩＴＣ−デキストランの連続希釈物とともに、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で三連で行われるであろう。
【００９０】
全体として、試験結果から、ＥＣＭＨが膣粘膜に付着すること、ＥＣＭＨが、膣粘膜を被覆することによって物理的バリアを提供し、上皮バリア機能を回復させ、かつ、組織修復のプロセスのための足場として作用することが明らかにされ得る。本発明の流動化された組成物は組織置換および組織修復をもたらす場合があり、さらに、粘膜組織の疾患によって引き起こされる病変部の処置または治癒をもたらす場合がある。ＥＣＭＨ溶液を、天然の粘膜組織の再成長を誘導するために本方法に従って使用することができる。効果的な量のＥＣＭＨ溶液を欠損組織の現場に塗布することによって、バイオトロピック特性を、より侵襲的な技術または全身的薬学的処置を必要とすることなく実現することができる。
【００９１】
例４−瘢痕形成防止使用
以前の外傷または外科的手法から生じた瘢痕を呈する患者がＥＣＭまたはＥＣＭＨにより処置され得る。内科医または外科医により、瘢痕組織と、どのような周縁部であれ、その周縁部とが、内科医または外科医によって適切であると判断されるように切除される。  ＥＣＭまたはＥＣＭＨが、切除された瘢痕組織を取り囲む組織縁に塗布される。瘢痕および周囲組織の切除によって形成される創傷の閉鎖が、従来的または標準的な創傷閉鎖手法（例えば、縫合または接着剤）によって行われる。ＥＣＭまたはＥＣＭＨを代替として、またはさらに、閉じられた創傷組織に塗布することができる。ＥＣＭまたはＥＣＭＨのさらなる塗布または反復した塗布を、瘢痕形成を伴うことなく、または軽減された瘢痕形成を伴って、組織の構成的再構築を促進させるために決定されるように行うことができる。
【００９２】
代替として、外科的手法が、手術部位に瘢痕組織が既に形成されていない患者に対して行われる。ＥＣＭまたはＥＣＭＨを手法直後に、また、手術部位を縫合または接着剤によって閉じる前に切開部位または切除部位に塗布することができる。さらなるＥＣＭ材料またはＥＣＭＨ材料を、組織の構成的再構築を促進させ、かつ、瘢痕組織形成の防止または軽減をもたらすために手術部位に塗布することができる。
本明細書中に記載される主題発明は、提供される説明または例によって限定されず、当業者が、記載されるような本発明の範囲および精神に含まれる発明を実施することを可能にする実施態様を包含することが意図される。
【国際調査報告】
2019528314.tif 000002