(57)【要約】  本発明は、強力な血管新生促進活性により特徴づけられ、虚血性疾患および虚血性傷害の治療的処置または創傷癒合において効果的である細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物に関する。本発明の組成物における使用に適する細胞外ベシクル（ＥＶ）は、血液成分に由来するか、または血管新生促進に関する力価試験により選択される。また、強力な血管新生促進活性により特徴づけられる細胞外ベシクル（ＥＶ）の医薬調製物を製造する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外ベシクル（ＥＶ）の医薬調製物を製造する方法であって、
複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地からＥＶを単離するステップと、
単離されたＥＶから、所定のＥＶ濃度の１つまたは複数のサンプルを調製するステップと、
力価試験において、各ＥＶサンプルの活性を試験するステップと、
所定の活性を超えるサンプルを、医薬調製物へのさらなる処理用に選択するステップと
を含み、
２つ以上の活性ＥＶサンプルをプールするステップを含んでもよい、方法。
【請求項２】
力価試験が請求項２から８までのいずれか１項に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＶがヒト細胞由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
血管新生促進治療による虚血性疾患もしくは虚血性傷害の処置または創傷癒合における使用のための、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ＥＶ）（ＥＶ）の組成物。
【請求項５】
血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であって、
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数１】
2019530714.tif 000005
を適用することにより、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する組成物。
【請求項６】
陽性対照が、１０％の血清を補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり１００００個のＥＶによるＨＭＥＣ細胞の刺激を含む、ＨＭＥＣ細胞ベースのＢｒｄＵ細胞増殖アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞および血清を補充されない培地を使用したＢｒｄＵ細胞増殖アッセイである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
力価試験が本明細書の例１．４．１に従い実施される、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であって、
−  細管形成アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数２】
2019530714.tif 000006
を適用することにより、細管形成アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する組成物。
【請求項９】
陽性対照が、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり５００００個のＥＶによる細胞の刺激を含む、ＨＵＶＥＣ細胞ベースのインビトロ細管形成アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞およびＶＥＧＦを補充されない培地を使用したインビトロ細管形成アッセイである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
力価試験が本明細書の例１．４．２に従い実施される、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項２から４までのいずれか１項に記載のＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと、請求項５からまで７のいずれか１項に記載の細管形成インビトロアッセイの両方を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する、請求項５から１０までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＥＶが、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ｓＥＶ）である、請求項５から１１までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
健常なドナーの供血から調製される、請求項５から１２までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＥＶが、細胞培養の馴化培地から単離された細胞外ベシクルである、請求項５から１１までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬調製物である、請求項４から１４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
処置される対象の体重１ｋｇあたり１×１０11〜５×１０12個のＥＶを含む、請求項４から１５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
血清または血漿または馴化培地に存在する全てのＥＶを捕捉しているバルク調製物である、請求項４から１６までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
ＥＶがヒト細胞由来である、請求項４から１７までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
疾患または傷害が、血管の疾患または傷害である、請求項４から１８までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
疾患または傷害が、急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性および慢性末梢動脈疾患または急性腎臓虚血である、請求項４から１８までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
培養細胞の増殖を促進するための培養培地への添加剤としての、請求項４から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に虚血性疾患、虚血性傷害の治療的処置および創傷癒合（wound healing）における、細胞外ベシクル調製物（ＥＶ）の新規な治療的応用に関する。焦点は、血管の虚血性疾患または傷害の処置、例えば急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性および慢性末梢動脈疾患または急性腎臓虚血の処置にある。
【背景技術】
【０００２】
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、末梢動脈のアテローム硬化によって生じる、広範囲にわたる状態である。外科手術または血管内介入が、依然として血流改善のための標準的治療であるが、血行再建術が成功を収めた後でさえも、大部分の患者は持続性な、または再発する症状に悩まされる。これは、ＰＡＤのための新規な治療選択肢が未だ満足のゆくものではないことを意味する。
新たな毛細血管の形成（新血管形成）は、虚血後の組織をレスキューする際の重要なイベントである。一連の膨大な前臨床および臨床データは、幹細胞が、血管形成を改善することにより治癒プロセスに関与しうることを示している。さらに、組織の損傷部位における幹細胞の一時的な検出から、パラクリン機構が主に幹細胞の作用に関与しうることが示唆されている。かかるパラクリン機構の中には、エンドサイトーシスによりエンドソーム膜区画から導出されるベシクルである「エキソソーム」、および細胞形質膜の出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）により生成するベシクルである「エクトソーム／マイクロベシクル」が含まれる。エキソソームおよびエクトソーム／マイクロベシクルは、特徴および生物学的活性が重複するため、最近では、「細胞外ベシクル」（ＥＶ）というより包括的な用語が提案されている。ＥＶは、生理的状態でもおよび病理学的状態でも、強力な細胞間コミュニケーションに関与するビヒクルである。最近の研究では、ＥＶカーゴの輸送が受容細胞の運命を決定し得ることを示す証拠が得られている。実際、受容細胞への、核酸およびタンパク質を含むＥＶカーゴの輸送は、それらの作用の中でも最も重要な機構である。
これまで、最も研究されたＥＶは、それらの由来する細胞の効果を模倣する能力から、幹細胞により放出されるものであった。病理学的条件に応じて、標的細胞に対する様々な表現型の変化が示された。幹細胞由来のＥＶの作用機構を特徴づけるために、トランスクリプトームおよびプロテオミクス分析が行われた。特に、骨髄または脂肪組織から導出される間葉系幹細胞から回収されたＥＶにより、強い血管新生促進プロファイルが示された。これは、虚血関連疾患を含む臨床的設定におけるこれらのＥＶの潜在的なインパクトを示唆するものであった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、幹細胞由来のＥＶの使用には、かかるＥＶの単離の際、使用されるＥＶを十分な数で得るために膨大な量の幹細胞のインビトロ培養を必要とする、という欠点が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
先行技術のこれらおよび他の欠点を解決するため、本発明者らは、血液および血液画分（例えばＥＶの潜在的供給源である血清および血漿）を試験した。事実、特定の微小環境の中で放出されるＥＶは局所的に作用することができるか（パラクリン作用）、または、それらは起源の細胞から所定の距離をおいて作用することもできる（内分泌作用）。内分泌作用は、主に末梢体液中のＥＶの循環に依存する。これは、血液が、ＥＶが標的に接近する際に用いられる天然の環境でありうることを意味する。さらに、ＥＶは全ての血球により分泌され、また血流中において回収できるが、しかしながら、それらの機能の大部分は未知のままである。
後述する例において詳細に例示されるように、上記の試験により本発明者らは、力価試験において測定した結果、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を参照血管新生促進成長因子として用いた場合に、血液成分に由来するＥＶが強い血管新生促進活性を有し、それにより、血液成分に由来するＥＶが、特に虚血性疾患および虚血性傷害の治療的処置または創傷癒合において効果的であることを見出した。
【０００５】
したがって、本発明の第１の態様は、血管新生促進治療による虚血性疾患もしくは虚血性傷害の処置または創傷癒合における使用のための、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ＥＶ）組成物である。本明細書では、血液成分から単離された細胞外ベシクルを略して「ｓＥＶ」と記載する。
本発明のＥＶ組成物により処置される虚血性疾患または虚血性傷害は、好ましくは血管の疾患または傷害である。さらにより好ましくは、それは急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性および慢性末梢動脈疾患、または急性腎臓虚血からなる群から選択される。
本発明の使用のためのｓＥＶが単離される血液成分は、好ましくは血液、血清または血漿である。より好ましくは、ｓＥＶは、健常なドナーの供血から調製される。
【０００６】
上記の実施形態の全てにおいて、本発明の使用のための組成物は、本質的に血液、血清、血漿中に、またはサイズ排除に基づく馴化培地中に存在する全てのＥＶを捕捉しているバルク調製物であることが好ましい。
上記の実施形態の全てにおいて、ＥＶはヒト細胞に由来するのが好ましい。
さらに、上記の実施形態の全てにおいて、組成物は医薬調製物であってもよく、それは上記で定義されるＥＶならびに薬学的に許容される担体、ビヒクルまたは希釈剤を含む。担体、ビヒクルまたは希釈剤、ならびに所望の医薬剤形の調製物に必要とされる他のいかなる賦形剤の選択も、当業者の技量の範囲内である。
【０００７】
当業者は必要とされるＥＶの投与量を決定することも可能であり、それは主に処置される状態および患者の特徴に依存する。一般に、ＥＶの治療的有効投与量は、通常、処置される対象の体重１ｋｇあたり１×１０11〜５×１０12個のＥＶの範囲である。本発明によるＥＶ組成物は、いかなる適切な医薬剤形でも調製できる。
上記したように、本発明者らは、血液成分から単離されたＥＶが強い血管新生促進活性を有し、特に虚血性疾患および虚血性傷害の処置において、または創傷癒合においてそれらが効果的であることを見出した。
当然ながら、本発明の第１の態様に係る、血液成分から単離されたＥＶを含む組成物と同等の血管新生活性を有するＥＶを含むいかなる組成物も、それからＥＶが調製される供給源にかかわりなく、虚血性疾患および虚血性傷害の処置、また創傷癒合において同様に、または少なくとも同等に効果的である。
【０００８】
いかなる供給源由来のＥＶを含む組成物による血管新生促進活性も力価試験により定量化でき、該試験は、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより、または細管形成インビトロアッセイにより、またはＢｒｄＵ細胞増殖アッセイおよび細管形成インビトロアッセイの両方により、ＥＶ活性を試験することを含む。これらの実施形態の全てにおいて、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイおよび／または細管形成インビトロアッセイでは、陽性対照および陰性対照が使用される。両方法において、基本的な成長培地は、好ましくは内皮細胞用の基本培地である。
ＢｒｄＵアッセイは、好ましくはマトリゲルに播種されたＨＭＥＣ細胞を使用する。ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおいて、陽性対照に血清（好ましくは１０％の血清）が添加される。陰性対照は、血清を添加しないことを除き、陽性対照と同じ培地である。ＢｒｄＵアッセイは、好ましくは標的細胞当たり１００００  ＥＶの濃度に基づき行う。
【０００９】
細管形成インビトロアッセイは、好ましくはＨＵＶＥＣ細胞を使用する。細管形成インビトロアッセイにおいて、ＶＥＧＦ（好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）が陽性対照に添加される。陰性対照は、ＶＥＧＦ添加がないことを除き、陽性対照と同じ培地である。細管形成インビトロアッセイは、好ましくは標的細胞当たり５００００  ＥＶの濃度に基づき行う。
測定されたＥＶの活性が、測定された陽性対照の活性の所定のパーセンテージを超える（例えば測定された陽性対照の活性の＞５０％）場合、試験されたＥＶ調製物は活性であると考えられる。
【００１０】
本発明に係る組成物の同定において適する力価試験は、本発明者らにより実施される実験に係る後述の説明において、特に本願明細書の例のパラグラフ１．４．１および１．４．２においてさらに詳述する。
【００１１】
本発明の第２の態様は、血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のためのＥＶを含む組成物であり、
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数１】
2019530714.tif 000002
を用いることにより、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、該組成物は少なくとも５０％の活性％を有する。
【００１２】
本発明のこの態様の代替の実施形態は、血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であり、
−  細管形成アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数２】
2019530714.tif 000003
を用いることにより、細管形成アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、該組成物は少なくとも５０％の活性％を有する。
【００１３】
さらなる好ましい一実施形態において、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイおよび細管形成インビトロアッセイは、陽性対照の活性に対する、所定のＥＶ組成物の活性を試験するために用いられ、該試験においては、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイおよび細管形成アッセイから得られた平均％活性値が比較される。
開示される実施形態のいずれかに係るＥＶ組成物は、ＢｒｄＵアッセイにより測定した場合の培養細胞の増殖を促進するその能力により、培養細胞の増殖を促進するための培養培地への添加剤としての使用に適する。
さらに、上記の力価試験は、複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地から単離されたＥＶのスクリーニングに、またさらなる処理に用いるための血管新生促進活性を有する調製物の同定に適する。
【００１４】
したがって、本発明の第３の態様は、細胞外ベシクル（ＥＶ）の医薬調製物を製造する方法に関し、該方法は、
複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地からＥＶを単離するステップと、
単離されたＥＶから、所定のＥＶ濃度の１つまたは複数のサンプルを調製するステップと、
力価試験において、各ＥＶサンプルの活性を試験するステップと、
所定の活性を超えるサンプルを、医薬調製物へのさらなる処理用に選択するステップと
を含み、
２つ以上の活性ＥＶサンプルをプールするステップを含んでもよい。
本願明細書の後半で例示する実験結果は、健常なドナーの血清または他の血液成分に由来するＥＶが、インビトロおよびインビボで血管新生シグナルを誘導することができ、またｓＥＶをプールした場合であってもこの効果が失われないことを示す。ｓＥＶはまた、ＰＡＤのインビボ前臨床モデルにおいて再灌流を改善する。
【００１５】
トランスクリプトーム解析およびプロテオミクス解析の結果、ＴＧＦｂ１およびアンジオスタチンは、最も関連が深いｍＲＮＡであり、血清または他の血液成分に由来するｓＥＶにより担持されるタンパク質であることが明らかとなっている。この実験による発見に基づけば、有効成分としてＴＧＦｂ１およびアンジオスタチンを含む組成物は、本発明において使用するＥＶと同じまたは同等の血管新生促進活性を発揮することが想定される。
したがって、本発明はまた、血管新生促進治療による虚血性疾患もしくは虚血性傷害の処置または創傷癒合における使用のための、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦｂ１）、ＴＧＦｂ１をコードする核酸またはＴＧＦｂ１発現誘導剤を担持する細胞外ベシクル（ＥＶ）、ならびに、アンジオスタチンまたはアンジオスタチン放出を誘導できる剤を担持する細胞外ベシクル（ＥＶ）を含む組成物に関する。
【００１６】
限定されないが、ＴＧＦｂ１の発現を誘導できる剤は例えばＴＧＦｂ、ＩＤ１、ＩＦＮＧ、ＴＨＢＳ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１またはｈｓａ−ｍｉＲ−２４であり、アンジオスタチンの放出を誘導できる剤は、例えばメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、１３ＫＤセリンプロテアーゼまたは２４ＫＤエンドペプチダーゼである。
トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦｂ１）またはＴＧＦｂ１をコードする核酸またはＴＧＦｂ１発現を誘導する剤を担持するＥＶ、ならびにアンジオスタチンまたはアンジオスタチン放出を誘導できる剤を担持するＥＶは、適切な天然供給源を用いて単離してもよく、または、活性成分の所望の組合せを含むよう設計されてもよい。
上記で定義される本発明の組成物は、好ましくは医薬組成物である。前記医薬組成物は、上記の活性成分に加えて、とりわけ、選択された医薬剤形、投与ルートおよび投与レジメン、ならびに患者の特徴および処置される疾患などを考慮し、当業者により選択される薬学的に許容される賦形剤および／または担体および／または希釈剤をさらに含む。
本発明は、後述する例により詳細に理解されるが、それは例示のみを目的として提供されるものであり、その際、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｇｕａｖａフローサイトメーターにより実施されるｓＥＶのＦＡＣＳ解析結果を示す表である。種々の細胞集団の表面抗原の発現を％値で表す。解析から、血清由来のＥＶは、種々の血球集団由来の不均一な集合体であることが示された。％値を平均値±ＳＤとして表す。
【図２Ａ】ナノサイト（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）ＬＭ１０システムにより解析されるｓＥＶ数の分布（１８人の健常者）に関する図である。健常なドナーバッグから回収したｓＥＶの平均粒子濃度は、６、１６×１０8粒子／ｍｌに対応する。
【図２Ｂ】ナノサイト解析結果を示す。ｓＥＶ直径は約２１０ｎｍであり、モード粒径は１８３ｎｍである。
【図２Ｃ】２×１０11の全粒子数から開始し、解析した全てのサンプル（ｎ＝１８）において、ｓＥＶのＲＮＡおよびタンパク質の回収量が、３００〜５００ｎｇ（ＲＮＡ）の範囲および約１μｇ（タンパク質）と同様であったことを示す図である。データを平均±ＳＤとして表す。＃および＊は、ｐ値＜０．０５。
【図３】ＢｒｄＵおよびインビトロ細管形成アッセイにより分析したときの、単一の血清由来のＥＶの血管新生促進活性を示す表である。１８のｓＥＶサンプル中の１４が、ＶＥＧＦ活性の５０％を超える値を示した。
【図４Ａ】単一およびプールされたＥＶ調製物の間のインビトロ比較を示す図である。顕著な血管新生促進活性を有するｓＥＶをプールし、それらの生物学的活性を解析した。プールされたｓＥＶは、単一のｓＥＶ調製物に匹敵する生物学的効果を示した。
【図４Ｂ】単一およびプールされたＥＶ調製物の間のインビボ比較を示す図である。インビボ実験は、インビボＳＣＩＤマウスモデルを用いて実施した。ＥＣをｓＥＶ（５×１０4個のｓＥＶ／細胞）で処置し、マトリゲルと混合し、ＳＣＩＤマウスに皮下注入した。ｓＥＶはインビボ血管新生促進活性を示す。プールされたｓＥＶを解析したとき、同様の効果が検出された。
【図５】レーザードップラー血流測定による灌流の定量分析の結果、健常者の血清に由来するＥＶ（Ｓ−ＥＶ）が、手術の７日後に対照（ＣＴＬ）と比較し、虚血後肢の灌流を顕著に促進したことを示す図である。データを平均±ＳＤとして表す。＊はｐ値＜０．０５（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック検定）。
【図６】手術の７日後における、虚血後肢の腓腹筋の毛細管密度の定量分析の結果を示す。抗ＣＤ３１  ｍＡｂを使用した免疫蛍光分析は、対照（ＣＴＬ）と比較し、ＥＶが毛細管密度を顕著に増加させたことを示す図である。データを平均±ＳＤとして表す。＊はｐ値＜０．０５（ｔ検定）。
【図７】手術の７日後における、筋肉の損傷領域の定量分析の結果、および虚血後肢からのヘマトキシリン−エオシン染色された腓腹筋の筋繊維を示す図である。対照（ＣＴＬ）と比較し、ｓＥＶは筋肉の損傷を顕著に減少させる。データを平均±ＳＤとして表す。＊はｐ値＜０．０５（ｔ検定）。
【図８】リアルタイムＰＣＲ解析による比較の結果を示す図である。有効なｓＥＶは、血管新生促進性のｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ１７−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２４を富化させた（有効なｓＥＶ  対  無効なｓＥＶ、変動係数はｍｉＲ−１２６の１７％からｍｉＲ−２１の３３％の範囲）。
【図９】最初の１５の血管新生ｍＲＮＡ、およびｓＥＶにより発現したタンパク質を、ｍＲＮＡおよびタンパク質マイクロアレイ解析により同定した図である。ＴＧＦβ１およびアンジオスタチンはいずれの場合も検出された。
【図１０】ｓＥＶの転写物とタンパク質との間のクロスマッチ（以下の有意な正の相関）を示す：サイトカイン対サイトカイン相互作用（富化ＧＯスコア：３，７、ｐ値：４，６７Ｅ−０６）、血管内皮遊走の正の制御（富化ＧＯスコア：３，５、ｐ値：３，４９Ｅ−０４）、内皮細胞の遊走（富化ＧＯスコア：３，１、ｐ値：５，０３Ｅ−０５）、ＶＥＧＦシグナル伝達経路（富化ＧＯスコア：３，１、ｐ値：０，０１）、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性化および細胞外マトリックス組織化（富化ＧＯスコア：３，４、ｐ値：９，１７Ｅ−０６）。機能性アノテーション富化分析は、ＦｕｎｒｉｃｈソフトウェアおよびＣｙｔｏｓｃａｐｅのｇｅＭＡＮＩＡプラグインを用いて実行した。
【図１１】ｓＥＶがＥＣ上の６３の血管新生関連遺伝子を上方制御し、２１の遺伝子を下方制御したことを示す表である。
【図１２】ＶＥＧＦ処置により、４８の遺伝子の上方制御および３６の遺伝子の下方制御が示された表である。対照サンプルに対する増加／減少倍率として結果を表した。
【図１３】ｓＥＶおよびＶＥＧＦ処置を表すベン図である。対照サンプル（未処置のＥＣ）に対して顕著な増加倍率を示した、上方制御された転写物（変化倍率≧３）。
【図１４】ＧＯベースの機能性解析の結果、ＥＶに応答して形成された毛細管様構造から回収されたＥＣにおける、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路の関連遺伝子の富化が見られた（Ｐ＜０．０１）ことを示す表である。
【図１５】血管新生の活性化段階に関連する遺伝子の発現と、ｓＥＶ投与が相関することを示す図である。最も代表的な遺伝子のクラスターは、ＡＬＫ１シグナル伝達イベントおよび経路に関連する遺伝子からなる。
【図１６】ｓＥＶ処置およびＶＥＧＦ処置の生物学的経路を比較したヒストグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を以下の例でさらに例示するが、それは例示のみを目的として提供されるものであり、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【００１９】
１．  方法
１．１．  血清ＥＶの単離
所内の血液バンク審査委員会（Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）によるインフォームドコンセントおよび承認の後、健常な血液ドナー（ｎ＝１８）からのヒト血清が、トリノ健康科学都市（Ｃｉｔｔａ  ｄｅｌｌａ  Ｓａｌｕｔｅ  ｅ  ｄｅｌｌａ  Ｓｃｉｅｎｚａ  ｄｉ  Ｔｏｒｉｎｏ）の血液バンクにより提供された。全てのヒトおよび動物実験は、欧州ガイドライン（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）および方針に従い実施され、またチューリン大学の倫理委員会により、およびイタリア保健院（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により承認された。２０分間、３，０００ｒｐｍで血清を遠心単離して残渣を除去することにより、１１０ｍｌの血清バッグから各ドナー由来のｓＥＶを得た。上清を次に４℃で２時間、１００，０００で超遠心分離した。次にＥＶペレットを、ＤＭＳＯを１％含有するＲＰＭＩで１ｍｌの最終量で再懸濁し−８０℃で保存した。次にｓＥＶを解凍し、生物学的アッセイおよび分子的解析に用いた。
【００２０】
１．２．  Ｇｕａｖａ  ＦＡＣＳ解析
ｓＥＶ  ＦＡＣＳ解析を、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）フローサイトメーター（ミリポア社、ドイツ）により実施した。
単核細胞／マクロファージ（ＣＤ１４、ＣＤ１５）、白血球（ＣＤ４５）、接着分子（ａｌｐｈａ６、ＣＤ４４、ＣＤ２９）、内皮細胞（ＣＤ３１、ＫＤＲ）および血小板（ＣＤ４２ｂ、ＣＤ６２Ｐ、Ｐ  ＳＥＬ）に対する特異的マーカーを認識する抗体と、健常なドナーからのｓＥＶとをインキュベートした。ＦＩＴＣ、またはＰＥマウスの非免疫アイソタイプＩｇＧ（ベクトンディッキンソン社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を対照として使用した。ｓＥＶを、４℃で１時間、特異的抗体または対照アイソタイプ抗体とインキュベートし、ＦＡＣＳにより解析した。
【００２１】
１．３．  ナノ粒子のトラッキング解析
ナノサイトＬＭ１０システム（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ社、Ａｍｅｓｂｕｒｙ、英国）によりｓＥＶを解析した。簡潔には、ｓＥＶ調製物を滅菌した０．９％の生理食塩水で希釈（１：１０００）し、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＳｙｓｔｅｍおよびＮＴＡ  １．４  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えたナノサイトＬＭ１０により解析した。各患者の全ＥＶ数は、前記装置により得られた値（微小粒子／ｍｌ）を、分析のために行った希釈倍率、およびｓＥＶを再懸濁したマイクロリットル数で乗算することにより得た。
【００２２】
１．４．  ｓＥＶ力価試験
予備的試験において、ヒトの微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）に対する最良の生物学的応答を得るのに必要なｓＥＶの数を評価するため、投与量応答曲線を作成した。略語ＥＣを試験全体にわたり用いる。４つの異なるｓＥＶサンプルを用いることにより、５×１０4個ｓＥＶ／標的細胞が最も効果的なｓＥＶ投与量であることがわかった。ゆえに、５×１０4個ＥＶ／標的細胞を、インビトロ試験全体にわたり採用した。
したがって、単一のサンプル由来のｓＥＶについて、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ、またはインビトロ細管形成アッセイ、またはそれらの両方により、それらの血管新生促進活性を評価した。
【００２３】
ｓＥＶの効力（活性％として表す）を評価するため、陰性および陽性対照を用いた。ＢｒｄＵアッセイにおいて、陰性対照として無血清培地を用い、陽性対照として１０％の血清を含有する培地を用いた。インビトロ血管新生アッセイにおいて、陽性対照として１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含有する培地を、陰性対照としてＶＥＧＦ無添加の培地を用いた。
以下の式を適用した：
【数３】
2019530714.tif 000004
ＶＥＧＦ（すなわち陽性対照）による血管新生能力の５０％超の値は、効果的なｓＥＶと考えられた。
異なる２つのｓＥＶサンプル（１：１）を混合することにより、ｓＥＶのプールを得た。プールされたｓＥＶをまた、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイおよびインビトロ血管新生アッセイにより評価した。
実施したＢｒｄＵ細胞増殖アッセイおよびインビトロ血管新生アッセイの詳細を以下に示す。
【００２４】
１．４．１  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ
ＨＭＥＣ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ３２４３）を、ＥＢＭ（ＬＯＮＺＡ）＋１０％のＦＢＳ培地３００μｌ中、９６ウェル（ウェル当たり３０００個の細胞）に播種した。２４時間後に、ＨＭＥＣ細胞を、３時間、ＦＢＳフリーのＤＭＥＭで飢餓状態にし、次にＦＢＳフリーのＤＭＥＭ中、ウェル当たり３０×１０6個のＥＶ（標的細胞当たり１００００個のＥＶ）と共に再懸濁して刺激した。ＦＢＳフリーＤＭＥＭおよびＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを、陰性および陽性対照として用いた。４時間のＥＶ刺激の後、１０μｌのＢｒｄＵ（ＢｒｄＵ最終濃度１０μＭ）を各ウェルに添加し、ＨＭＥＣ細胞を１８時間インキュベートした。
【００２５】
刺激およびＢｒｄＵとのインキュベートの後、ＢｒｄＵの標識を、ＢｒｄＵ標識および検出キット（ＲＯＣＨＥ社）により検出した。簡潔には、９６ウェルプレートを２５０μｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで３回洗浄し、細胞を３０分、−２０℃にて、２００μｌの冷却済み固定剤（７０％エタノール＋０．５Ｍ  ＨＣｌ）で固定し、次に２５０μｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで再度３回洗浄した。プレートを、３７℃で３０分間、１００μｌのヌクレアーゼ溶液と共にインキュベートし、２５０μｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで３回洗浄し、次に３７℃で３０分間、１００μｌの抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ  Ｆａｂフラグメントと共にインキュベートした。プレートを１００μｌのパーオキシダーゼ基質で満たして室温で２〜３０分間置き、プレートを４９０ｎｍの参照波長を用いてマイクロタイタープレートリーダーにおいて４０５ｎｍで読み取った。
効果の％を算出するため、ＥＶ刺激されたサンプルに由来するＯＤを、以下のように測定した。すなわち、陰性対照（ＦＢＳ無しＤＭＥＭ）のＯＤを効果０％として設定し、陽性対照（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）のＯＤを効果１００％として設定し、ＥＶ刺激されたサンプルのＯＤを、以下の式により効果の％として換算した：
（サンプルＯＤ−陰性対照ＯＤ）／（陽性対照ＯＤ−陰性対照ＯＤ）×１００
【００２６】
１．４．２  インビトロ細管形成アッセイ
２４ウェルプレートを、成長因子を減らしたマトリゲルの薄層で被覆し、３７℃で１時間静置した。１．２５×１０9個のＥＶ（標的細胞当たり５００００個ＥＶ）を再懸濁させたＦＢＳフリーの５００μｌのＥＢＭ（内皮基本培地）（ＬＯＮＺＡ社）と共に、マトリゲル被覆ウェルにＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７３０）を播種（１ウェルあたり２５０００細胞）した。陰性および陽性対照として、ＦＢＳ無しＥＢＭおよびＦＢＳ無しＥＢＭ＋１０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ（Ａｂｃａｍ社）を使用した。２４時間後に、各ウェル５枚の顕微鏡写真を撮影し、毛細管様構造をＩｍａｇｅＪソフトウェアによりカウントし、ＥＶサンプルの視野当たりの毛細管様構造の平均カウント数を算出した。
【００２７】
効果の％を算出するため、毛細管様構造の平均カウントを、以下のように測定した。すなわち、陰性対照（ＦＢＳ無しＥＢＭ）の毛細管様構造のカウント（ＣＬＳＣ）を０％とし、陽性対照（ＦＢＳ無しＥＢＭ＋１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）のＣＬＳＣを１００％とし、サンプルのＣＬＳＣを以下の式により効果の％として換算した：
（サンプルＣＬＳＣ−陰性対照ＣＬＳＣ）／（陽性対照ＣＬＳＣ−陰性対照ＣＬＳＣ）×１００。
ｓＥＶの力価は、全体的効果パーセンテージに関して表される、ＢｒｄＵおよびインビトロ細管形成試験の効果のパーセンテージの算術平均として算出した。
【００２８】
１．５  動物試験
動物試験は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従い実施した。前述のように、皮下組織から基底膜の固体ゲルへの血管成長を測定することにより、血管新生を評価した（Lopatina T, Bruno S, Tetta C, Kalinina N, Porta M, Camussi G. Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential. Cell Commun Signal. 2014;12(1):26. doi:10.1186/1478-811X-12-26）。最初に、ＥＣ（１×１０6細胞／注入）を、ｓＥＶ（ＥＣ  １×１０6個当たり、５×１０10個ＥＶ）と共に一晩インキュベートした。次に、オスの重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（６週齢）の皮下に、事前に刺激したＥＣと混合した、０．５ｍｌの氷冷済ＢＤマトリゲルマトリックス・成長因子減少タイプ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を注入した。非刺激の同数のＥＣを陰性対照として用いた。マトリゲルプラグを１０日後に切除し、４時間４％パラホルムアルデヒドで固定した。マトリゲル含有パラフィン切片（５〜８μｍ厚）をトリクローム染色法により染色した。血管のルーメン領域は、前述のように測定した（Lopatina T, Bruno S, Tetta C, Kalinina N, Porta M, Camussi G. Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential. Cell Commun Signal. 2014;12(1):26. doi:10.1186/1478-811X-12-26）。
【００２９】
１．５．１  後肢虚血のマウスモデル
ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）（７〜８週齢および１８〜２２ｇの体重）に、ゾラゼパムを８０ｍｇ／Ｋｇでｉ．ｍ．注射し麻酔した。手術後に動物を慎重にモニターし、必要に応じケトロラク（Ｋｅｔｏｒｏｌａｃ、５ｍｇ／Ｋｇ）を投与し痛覚を消失させた。
無菌条件下、各マウスの左の後肢の中央部の皮膚を小切開した。左の大腿動脈の近位端部および伏在動脈の遠位部を結紮し、解体し、切除した。覆っている皮膚を、滅菌済みの６−０絹糸で縫合した。予備実験において、種々のｓＥＶ数およびｓＥＶ投与ルートを評価した。後者については、静脈内（ｉｖ）もしくは筋肉内（ｉ．ｍ．）単独で、または様々な組合せを含めた。動物の苦痛および処置に対する反応を考慮し、最良の投与経路が以下の通りと判断した：Ｔ０（１×１０10  ｉｖ）、Ｔ１およびＴ２（０．５×１０10  ｉ．ｍ．）。組織学的解析のため、動物を７日目に安楽死させた。
【００３０】
１．５．２  後肢血流のモニタリング
麻酔後、脱毛クリームを使用して両足から毛髪を除去し、次にマウスを３分間、３７℃でヒートプレートに配置し、温度差を最小化した。Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ（ＬＤＢＦ）アナライザ（ＰｅｒｉＳｃａｎ  ＰＩＭ  ３  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｉｍｅｄ社、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して後肢血流を測定した。手術の直前、および手術後０、３、７日目に、ＬＤＢＦ分析を後肢および足に対し実施した。種々のカラー画素を使用し、レーザー周波数の変化として血流を示した。スキャン後、保存したイメージを分析し、血流を定量化した。環境中の照明および温度により生じるデータ変動を排除するため、後肢血流を、左（虚血性）と右（非虚血性）のＬＤＢＦの比として表した。
【００３１】
１．５．３  毛細管密度の評価
腓腹筋の中の毛細管密度を、免疫蛍光分析により定量化した。筋肉サンプルをＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ社）に包埋し、液体窒素中で瞬間凍結した。組織切片（５μｍ厚）を調製し、マウスＣＤ３１に対するモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いる免疫蛍光法により毛細管内皮細胞を同定した。各組織塊の３つの異なる断面からの１５のランダムに選ばれた顕微鏡視野を基に、マウス試料ごとの毛細管内皮細胞をカウントした。毛細管密度を、高倍率（ｘ４００）１視野あたりのＣＤ−３１陽性箇所の数として表した。
【００３２】
１．５．４  組織学
虚血および非虚血の肢の腓腹筋を、手術後７日目に切除し、８時間、４％パラホルムアルデヒドで直ちに固定し、さらにパラフィン包埋した。組織切片をヘマトキシリン−エオジンで染色した。光学顕微鏡を用い、×２００の倍率でスライドを観察した。全筋繊維を、ならびに再生プロセスを表す小さい直径および複数の中心核を有する繊維をカウントするため、虚血性の肢部の全ての傷害領域からイメージを得た。全ての非虚血性の肢部から得たランダムなイメージを対照とした。
【００３３】
１．６  タンパク質アレイ
種々のｓＥＶ由来のタンパク質を、ＮＰ４０溶解バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、１％のＮＰ４０）により抽出した。２つの非オーバーラップアレイの組合せを含み、６０のヒト血管新生タンパク質の発現を定量的に測定する、Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓアレイ１０００（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用し、血管新生タンパク質のプロファイリングを実施した。サンプル毎にタンパク質２５μｇをロードした。データからバックグラウンドを減算し、タンパク質濃度をアレイの種々の標準曲線から得た。機能性アノテーション富化分析は、ＦｕｎｒｉｃｈソフトウェアおよびＣｙｔｏｓｃａｐｅのｇｅＭＡＮＩＡプラグインを用いて実行した。
【００３４】
１．７  ｍＲＮＡ血管新生マイクロアレイ・プロファイル
ｓＥＶの全ＲＮＡを、オールインワン（Ａｌｌ  ｉｎ  Ｏｎｅ）（Ｎｏｒｇｅｎ社、Ｔｈｏｒｏｌｄ、ＯＮ、カナダ）抽出法を使用して単離した。ＲＮＡ濃度および純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計により検出した。２６０〜２８０ｎｍの吸光度が１．８〜２．０のサンプルを採用した。
製造業者の指示に従い、ＲＴ2  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄキット（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いｃＤＮＡを合成した。ｓＥＶサンプルごとにｃＤＮＡを２００ｎｇローディングし、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＴ2  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（ＰＡＨＳ  ０２４、ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた遺伝子発現プロファイリングを実施した。血管新生における８４の主要な遺伝子の発現プロファイルを分析した（ウェブサイト：http://www.sabiosciences.comに利用可能な遺伝子のリスト）。ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ（登録商標）システム（ＡＢ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。遺伝子発現の相対値を、ΔΔＣT法を用いて測定した。ｓＥＶ投与により形成される細管様構造に対しても、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＴ2  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙを行った。ＥＣを回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製し、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＴ2  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙを使用しｃＤＮＡに逆転写し、処理した。ＰＣＲアレイに存在する５つの内因性制御遺伝子：β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ０（ＲＰＬＰ０）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびｂ−アクチン（ＡＣＴＢ）を用いて正規化した。各処置サンプルの、対照サンプルに対する変化倍率は、２−ΔΔＣｔに対応した。ＥＣの処置の有無による遺伝子発現の変化を、増加／減少倍率として示した。Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＳｕｉｔｅおよびＦｕｎｒｉｃｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用し、データをさらに分析した。
【００３５】
２．  結果
２．１  ｓＥＶの特徴解析
ｓＥＶ中の種々の細胞集団（血小板、内皮、単核細胞、白血球および接着分子標識）の表面抗原を、Ｇｕａｖａ  ＦＡＣＳ解析により試験した。解析から、血清由来のＥＶは種々の血球集団から来ている不均一な集合体であることが示された（図１）。
ナノサイト分析においては、健常なドナー間でのｓＥＶの数およびサイズの顕著な違いに留意しなかった。１１０ｍｌのバッグから回収したｓＥＶの平均粒子濃度は約６．１６×１０8粒子／ｍｌであり（図２Ａ）、ｓＥＶの直径は約２１０ｎｍ、１８３ｎｍのモード粒径であった（図２Ｂ）。２×１０11個の全粒子から、ｓＥＶのＲＮＡおよびタンパク質の回収量は、分析した全サンプル（ｎ＝１８）において、３００〜５００ｎｇ（ＲＮＡ）および約１μｇ（タンパク質）と同等であった（図２Ｃ）。
血管新生促進活性によりｓＥＶを選択するため、内部対照としてＶＥＧＦを使用した「力価試験」を実施した。ＥＣの増殖および管状構造の形成を誘導する能力の解析において、ＶＥＧＦの血管新生促進効果の約５０％を示すときに、効果的なｓＥＶであるものとした。図３に示すように、１８のうちの１４のｓＥＶサンプルが、ＶＥＧＦ活性の５０％超の値を示した。さらにこれらの結果を評価するため、顕著な血管新生促進活性を有するｓＥＶを選択してプールし、それらの生物学的活性を解析した。注目すべきは、これらのプールされたｓＥＶが、個別的なｓＥＶ調製物に匹敵する生物学的効果を示すことが立証されたことである（図４Ａ）。これは、プールされたときでもｓＥＶ生物活性が失われなかったことを示す。
【００３６】
２．２  ｓＥＶはインビボ血管新生を誘導する
本発明者らの力価試験を確認するため、インビボＳＣＩＤマウスモデルを使用しインビボ実験を実施した。その際、ＥＣをｓＥＶ（５×１０4個ｓＥＶ／細胞）で処置し、マトリゲルと混合し、ＳＣＩＤマウスに皮下注入した。１週後に、丘疹を除去し、解析した。図４Ｂに示すように、インビボで解析した場合もｓＥＶは血管新生促進活性を示す。プールされたｓＥＶを解析したときも、同様の効果が検出された（図４Ｂ）。
【００３７】
２．３  ｓＥＶは、ＰＡＤのマウスモデルにおいて再灌流の回復を改善する
ヒトのＰＡＤを模倣する虚血後肢マウスモデルにおいて、ｓＥＶの血管新生効果を評価した。全量で２×１０10個のｓＥＶを、手術後毎日（介入の直後（Ｔ０）に１ｘ１０10、１日目（Ｔ１）および２日目（Ｔ２）に０．５×１０10）投与した。投与方法の違いが血管新生の効果に影響するか否かを評価するため、ｓＥＶを以下のいずれかで投与した
ｉ）Ｔ０、Ｔ１およびＴ２に尾静脈内に静注により投与（データ示さず）、
ｉｉ）Ｔ０、Ｔ１およびＴ２に虚血性後肢の筋肉内に直接投与（データ示さず）、および
ｉｉｉ）Ｔ０に静注により、Ｔ１およびＴ２に筋肉内に投与。介入の直後にｓＥＶを静注し、続いて筋内投与することが最良の応答を誘導することがわかった。虚血後肢の血液灌流を、Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎイメージングを使用して評価した。手術直後、虚血性および非虚血性の後肢の比率が、ＣＴＬ群では０．１３±０．０６、およびｓＥＶ群（ｎ＝１０／群）では０．１２±０．０４に減少した。ｓＥＶ処置群において、後肢灌流の比率は、ＣＴＬ群と比較し、手術後７日目に顕著に増加した（０．８９±０．２６  対  ０．６±０．１８（ｐ＜０．０５））（図５）。虚血後肢の毛細管密度は、一貫して、対照群と比較し、ｓＥＶ処置マウスにおいて顕著に増加した（２２．４±５．５  対  １１．２±１．８（ｐ＜０．０５））（図６）。
組織の損傷（腓腹筋）の解析から、ｓＥＶ処置マウスの筋肉では、筋肉の損傷領域が減少し（図７）、また血管密度が増加することがわかった。ゆえに、本発明者らのモデルでは、ｓＥＶは虚血により誘導される損傷からの保護を提供すると考えられる。
【００３８】
２．４  ｓＥＶ−カーゴ分析
上記の結果を踏まえ、ｓＥＶにより担持される血管新生関連ｍｉＲ、ｍＲＮＡおよびタンパク質の、かかる機能効果を発揮する際の寄与を解析した。その際、第一に、新血管形成に関与することが公知のｍｉＲ（Caporali A, Emanueli C. MicroRNAs in postischemic vascular repair. Cardiol Res Pract. 2012;1(1). doi:10.1155/2012/486702）を評価した。
図８において示されるリアルタイムＰＣＲ解析は、有効なｓＥＶが、無効なｓＥＶと比較し、周知の血管新生促進ｍｉＲであるｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ１７−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２４を顕著に富化したことを立証するものである（有効なｓＥＶ  対  無効なｓＥＶの変動係数ＣＶは、ｍｉＲ−１２６の１７％からｍｉＲ−２１の３３％にわたる）。
ｍＲＮＡおよびタンパク質マイクロアレイ分析に基づき、第一の１５の血管新生ｍＲＮＡおよびｓＥＶにより発現されるタンパク質を選択した（図９）。ＴＧＦｂ１およびアンジオスタチンがｍＲＮＡおよびタンパク質において共通に検出されることが観察された（ＴＧＦｂ１：２８．８のｍＲＮＡ平均Ｃｔ値および６．３ｎｇ／ｍｌのタンパク質量、アンジオスタチン：２８．２のｍＲＮＡ平均Ｃｔ値および１１．５ｎｇ／ｍｌのタンパク質量）。
【００３９】
ｓＥＶの転写物とタンパク質との間のクロスマッチから、以下の有意な正の相関が示された：マトリックスメタロプロテイナーゼの活性化および細胞外マトリックス組織化（富化ＧＯスコア：３．４、ｐ値：９．１７Ｅ−０６）、サイトカイン対サイトカイン相互作用（富化ＧＯスコア：３．７、ｐ値：４．６７Ｅ−０６）、内皮細胞の遊走（富化ＧＯスコア：３．１、ｐ値：５．０３Ｅ−０５）、血管内皮遊走の正の制御（富化ＧＯスコア：３．５、ｐ値：３．４９Ｅ−０４）、ＶＥＧＦシグナル伝達経路（富化ＧＯスコア：３．１、ｐ値：０．０１）（図１０）。
【００４０】
２．５  インビトロでのｓＥＶ処置による遺伝子パターン調節
血管新生促進のきっかけを誘導する際のｓＥＶカーゴの生物学的関連性を確認するため、ｓＥＶまたはＶＥＧＦ（陽性対照）に応答して形成される毛細管様構造から回収されたＥＣに対するｍＲＮＡ−血管新生マイクロアレイ解析を行い、未処置のＥＣ（内部対照）と比較した。
ｓＥＶおよびＶＥＧＦにより発揮される血管新生促進効果がほぼ同等であったにもかかわらず、異なる遺伝子発現のパターンが検出され、すなわち、ｓＥＶ処置（４つのサンプルを解析）により、６３の血管新生関連遺伝子が上方制御され、２１の遺伝子が下方制御され（図１１〜１２）、一方、ＶＥＧＦ処置により、４８の遺伝子が上方制御され、３６の遺伝子が下方制御された（図１２）。各処置において、対照サンプル（未処置のＥＣ）と比較し≧３の増加倍率で上方制御された転写物について、さらなる試験に供した。これに基づき、以下の１０種の最も高発現する遺伝子を選択した。ｓＥＶ処置については、ＰＴＧＳ１、ＩＤ１、ＴＨＢＳ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＦＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＥＲＢＢ２、ＴＩＥ１、ＩＦＮＧおよびＣＸＣＬ９であり、ＶＥＧＦ処置については、ＩＬ６、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＣ、ＰＴＧＳ１、ＰＧＦ、ＴＩＥ１、ＰＥＣＡＭ１、ＩＤ１、ＪＡＧ１およびＮＯＳ３である（図１３）。また、図１３において示されるベン図は、ＰＴＧＳ１、ＩＤ１およびＴＩＥ１遺伝子が、両方の処置で共通することを示す。
【００４１】
ｓＥＶ処置と関連する分子事象を詳細に吟味するため、種々のＧｅｎｅオントロジー（ＧＯ）データベースを参照した。ＧＯベースの機能解析では、ｓＥＶに応答して形成された毛細管様構造から回収されたＥＣにおいて、ＴＧＦｂ１シグナル伝達経路に関連する遺伝子の富化が観察された（Ｐ＜０．００１）（図１４）。留意すべきは、さらに詳細なＧＯ解析の結果、ｓＥＶ投与が、ＴＧＦｂ／ＡＬＫ１媒介血管新生の活性化段階に関係する遺伝子の発現と相関することがわかったことである（図１５）。実際、最も代表的な遺伝子クラスターは、ＡＬＫ１シグナル伝達イベントおよび経路（図１５）に関係する遺伝子からなるものであった。後者の結果は、最も高発現する遺伝子の１つとしてＩＤ１（図１１または図１３）を同定したトランスクリプトーム解析をさらに裏付けるものである。図１６（ｓＥＶおよびＶＥＧＦにより媒介される生物学的経路間の比較を示す）は、ｓＥＶの作用機構中、ＡＬＫ１カスケードが最も関連性が深いことをさらに裏付けるものである。
【図１】
2019530714.tif 000007
【図２Ａ】
2019530714.tif 000008
【図２Ｂ】
2019530714.tif 000009
【図２Ｃ】
2019530714.tif 000010
【図３】
2019530714.tif 000011
【図４Ａ】
2019530714.tif 000012
【図４Ｂ】
2019530714.tif 000013
【図５】
2019530714.tif 000014
【図６】
2019530714.tif 000015
【図７】
2019530714.tif 000016
【図８】
2019530714.tif 000017
【図９】
2019530714.tif 000018
【図１０】
2019530714.tif 000019
【図１１】
2019530714.tif 000020
【図１２】
2019530714.tif 000021
【図１３】
2019530714.tif 000022
【図１４】
2019530714.tif 000023
【図１５】
2019530714.tif 000024
【図１６】
2019530714.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月13日(2019.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外ベシクル（ＥＶ）の医薬調製物を製造する方法であって、
複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地からＥＶを単離するステップと、
単離されたＥＶから、所定のＥＶ濃度の１つまたは複数のサンプルを調製するステップと、
力価試験において、各ＥＶサンプルの活性を試験するステップと、
所定の活性を超えるサンプルを、医薬調製物へのさらなる処理用に選択するステップと
を含み、
２つ以上の活性ＥＶサンプルをプールするステップを含んでもよい、方法。
【請求項２】
ＥＶがヒト細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管新生促進治療による虚血性疾患もしくは虚血性傷害の処置または創傷癒合における使用のための、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ＥＶ）（ＥＶ）の組成物。
【請求項４】
血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であって、
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数１】
2019530714.tif 000026
を適用することにより、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する組成物。
【請求項５】
陽性対照が、１０％の血清を補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり１００００個のＥＶによるＨＭＥＣ細胞の刺激を含む、ＨＭＥＣ細胞ベースのＢｒｄＵ細胞増殖アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞および血清を補充されない培地を使用したＢｒｄＵ細胞増殖アッセイである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
力価試験が本明細書の例１．４．１に従い実施される、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であって、
−  細管形成アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数２】
2019530714.tif 000027
を適用することにより、細管形成アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する組成物。
【請求項８】
陽性対照が、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり５００００個のＥＶによる細胞の刺激を含む、ＨＵＶＥＣ細胞ベースのインビトロ細管形成アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞およびＶＥＧＦを補充されない培地を使用したインビトロ細管形成アッセイである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
力価試験が本明細書の例１．４．２に従い実施される、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
力価試験が請求項７から９のいずれか１項に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項２、３又は１０のいずれか１項に記載のＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと、請求項４から６のいずれか１項に記載の細管形成インビトロアッセイの両方を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する、請求項４から９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＥＶが、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ｓＥＶ）である、請求項４から９及び１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
健常なドナーの供血から調製される、請求項４から９、１１及び１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＥＶが、細胞培養の馴化培地から単離された細胞外ベシクルである、請求項４から９及び１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬調製物である、請求項３から９及び１１から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
処置される対象の体重１ｋｇあたり１×１０11〜５×１０12個のＥＶを含む、請求項３から９及び１１から１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
血清または血漿または馴化培地に存在する全てのＥＶを捕捉しているバルク調製物である、請求項３から９及び１１から１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
ＥＶがヒト細胞由来である、請求項３から９及び１１から１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
疾患または傷害が、血管の疾患または傷害である、請求項３から９及び１１から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
疾患または傷害が、急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性および慢性末梢動脈疾患または急性腎臓虚血である、請求項３から９及び１１から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
培養細胞の増殖を促進するための培養培地への添加剤としての、請求項３から９及び１１から１８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
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