(57)【要約】  本明細書に記載の発明は、Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを複数サイクル（例えば、４〜１０サイクル）のエレクトロポレーションによって配偶子または着床前期の胚（例えば、１細胞胚もしくは接合体）に導入して遺伝的に受け継ぐことができる修飾を動物のゲノムにもたらすことによるトランスジェニック動物（例えば、非ヒト哺乳動物）作製のための高処理量方法および試薬を提供する。【選択図】図７Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子修飾非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをエレクトロポレーションによって非ヒト哺乳動物の接合体に導入して、前記非ヒト哺乳動物のゲノムを修飾することを含み、前記エレクトロポレーションが４〜１０サイクルを含む、前記方法。
【請求項２】
前記エレクトロポレーションが４〜８サイクル、または６サイクルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エレクトロポレーションの各サイクルが、独立して、２０〜４０ボルト（例えば、２５〜３５ボルト、または３０ボルト、または２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５ボルト）で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記エレクトロポレーションの各サイクルが、独立して、１〜２ｍｓ（例えば、１．０または１．５ｍｓ）のパルス幅を使用して行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記エレクトロポレーションの各サイクルが、独立して、１〜３パルス（例えば、２パルス）を使用して行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記エレクトロポレーションの各サイクルが、独立して、１００〜１０００ｍｓ（例えば、１００ｍｓ、または１２５〜１３０ｍｓ）のパルス間隔を使用して行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記エレクトロポレーションが、６サイクルからなり、前記エレクトロポレーションの各サイクルが、３０ボルト、パルス幅１．０ｍｓ、２パルス、およびパルス間隔１００ｍｓの設定を使用して行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、１５０〜３５０ｎｇ／μＬ（例えば、１５０ｎｇ／μＬ、２００ｎｇ／μＬ、２５０ｎｇ／μＬ、３００ｎｇ／μＬ、または３５０ｎｇ／μＬ）の最終濃度でエレクトロポレーションされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、前記非ヒト哺乳動物のゲノム内の標的配列とハイブリダイズする一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、前記ｓｇＲＮＡが、３００ｎｇ／μＬ（例えば、２００ｎｇ／μＬ、２５０ｎｇ／μＬ、３００ｎｇ／μＬ、３５０ｎｇ／μＬ、または４００ｎｇ／μＬ）の最終濃度でエレクトロポレーションされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ドナーポリヌクレオチドとともに前記接合体にエレクトロポレーションされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーポリヌクレオチドが、直鎖状または環状二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ヒト哺乳動物のゲノムが、１もしくは複数の塩基対の挿入もしくは欠失により、異種ＤＮＡ断片（例えば、ドナーポリヌクレオチド）の挿入により、内在性ＤＮＡ断片の欠失により、内在性ＤＮＡ断片の逆位もしくは転座により、またはそれらの組合せにより修飾される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記非ヒト哺乳動物のゲノムが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、または相同組換え（ＨＲ）により修飾される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上（例えば、１００％）のノックイン（ＫＩ）効率を達成する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％のＮＨＥＪ効率を達成する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＶＦ（ｉｎ  ｖｉｒｅｏ受精）により作製された胚において少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％以上の率で少なくとも１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ以上の内在性ゲノム領域の欠失を達成する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１７】
１つより多くの接合体が同時にエレクトロポレーションされる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００の接合体が同時にエレクトロポレーションされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
すべての接合体が、同じエレクトロポレーションキュベット内でエレクトロポレーションされる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記エレクトロポレーションが、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット内で行われる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記接合体が、エレクトロポレーションの前に透明帯を弱めるために前処置される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記接合体が、酸性タイロード液（ＡＴ）中で５〜１５秒、または１０秒間、前処置される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記接合体が、エレクトロポレーション後、保管のために凍結される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記エレクトロポレーションが、ＥＣＭ８３０方形波エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ８３０型エレクトロポレーター）を使用して行われる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
エレクトロポレーションされた接合体を偽妊娠宿主哺乳動物に移植すること、および前記エレクトロポレーションされた接合体を出生遺伝子修飾哺乳動物へと発達させることをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記非ヒト哺乳動物が、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コットンラット、ハダカデバネズミ）、ウサギ、家畜哺乳動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、ウシ、ウマ、ラクダ科動物）、ペット哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）、有袋目の哺乳動物、またはそれらの非近交系もしくは任意交配集団である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記非ヒト哺乳動物が、マウスまたはラットである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７に記載の方法のいずれか１つにより作製された遺伝子修飾非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、２０１６年１月１５日出願の米国特許仮出願第６２／２７９，０２３号の出願日の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて主張するものである。本願は、２０１４年９月２９日出願の米国特許仮出願第６２／０５６，６８７号の出願日の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて主張する、２０１５年９月２９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５２９２８号にも関連する。上述の出願の各々の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本明細書に記載の発明は、ＮＩＨ（アメリカ国立衛生研究所）の米国国立がん研究所により与えられた認可番号Ｐ３０ＣＡ０３４１９６に基づいて米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
生体物質または遺伝物質の哺乳動物接合体への送達は、通常は、遺伝子修飾動物モデルの作出などの、哺乳動物のゲノムを修飾するための、最初のステップである。これは、伝統的におよび現在、ガラス針の使用による接合体への所望の生体／遺伝物質のマイクロインジェクションにより果されている。
【０００４】
早くも１９８０年代後半には、ＤＮＡの直接マイクロインジェクションを使用して単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＴＫ遺伝子が培養哺乳動物細胞に導入された（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、２２：４７９〜４８８、１９８０年１１月）。しかし、形質転換効率は、低分子ｐＢＲ  ３２２／ＴＫ  ＤＮＡがＳＶ４０  ＤＮＡとともに同時注入されたときでさえ極めて低く、すなわち、注入された細胞１，０００個当り１５の形質転換体であった。加えて、この実験は、結果的に成熟生物を産生せず、まして表現型変化を示すことができたものを産生するどころではなかった。
【０００５】
Ｇｏｒｄｏｎら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７７：７３８０〜７３８４、１９８０年１２月）は、マウス胚へのＴＫ遺伝子（キメラＳＶ４０ウイルスベクターに組み込まれたもの）のマイクロインジェクションに成功したこと、そしてそのマイクロインジェクトした胚から発達したマウスにおいてそのようなＴＫ遺伝子が観察されたことを初めて報告した。しかし、これらのマウスは、ＴＫ遺伝子産物を発現しなかった。すなわち、これらの実験では、被験動物の表現型変化は果されなかった。Ｇｏｒｄｏｎらによって報告された結果は、ＳＶ４０ウイルスがマウス胚に導入されたときに機能的におよび遺伝的に不活性であることを以前に示したＪａｅｎｉｓｃｈらによる以前の研究（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７１：１２５０〜１２５４、１９７４）と一致しているように思われる。
【０００６】
その後、１９８１年６月に、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅは、胚への外来性遺伝物質のマイクロインジェクションによる導入に関する米国特許出願を出願した。この出願は、最終的には米国特許第４，８７３，１９１号の発行に至り、この特許は、マイクロインジェクション分野で広くライセンスされている基本特許であり、外来性遺伝物質を含有し、それを発現することができる細胞を有する哺乳動物を得るマイクロインジェクション方法を記載し、広く請求している。
【０００７】
１９８０年代初頭以降の非常に多くの改善にもかかわらず、マイクロインジェクションは、依然として、技術的要求が厳しく、多くの人手を要し、多大な時間を必要とする。マイクロインジェクションの大きな成功は、オペレーターの技術的熟練、訓練および経験といった主観的要因に依存する。それは、費用のかかるマイクロインジェクションのセットアップへの多大な先行投資、および何年も訓練し経験を積んだオペレーターを必要とするので、世界の最も優秀な、最も資金力のある学術機関でさえ、遺伝子修飾マウスモデルを作製する能力は、限定的であることが多い。
【０００８】
加えて、マイクロインジェクションは、処理量が元々少なく、１度に１つの接合体を操作する必要があり、それ故、ゲノム工学実験のサイズおよび規模を制限する。
エレクトロポレーション、または電気透過化は、外部から印加される電場によって細胞原形質膜透過性および電気伝導性を有意に増加させるプロセスである。エレクトロポレーションは、分子生物学において、細胞に何らかの物質を導入する方法、例えば、分子プローブを、細胞の機能を変化させることができる薬物を、またはＤＮＡ分子を投入する方法として使用されてきた。
【０００９】
分子生物学において、エレクトロポレーションプロセスは、細菌、酵母および植物プロトプラストの形質転換に使用されることが多い。脂質膜に加えて、細菌は、脂質膜とは異なる細胞壁も有し、この細胞壁は、ペプチドグリカンおよびその誘導体で構成されている。しかし、それらの壁は、天然に多孔質であり、過酷な環境影響から細菌を保護する堅い外殻としの機能しか果さない。細菌とプラスミドを混合した場合、プラスミドをエレクトロポレーション後に細胞に移入することができる。数ミリメートルの距離を横断する数百ボルトが概してこのプロセスに使用される。
【００１０】
この手順は、培養哺乳動物細胞などの組織培養細胞にも使用することができる。細菌の形質転換とは対照的に、外来ＤＮＡを真核細胞に導入するプロセスは、トランスフェクションとして一般に知られている。エレクトロポレーションは、エレクトロポレーションキュベットを使用して懸濁状態の細胞へのトランスフェクションに使用されてきた。
【００１１】
低い効率／処理量および技術的困難を含む、上で説明したマイクロインジェクションについての多くの障害を克服することが大いにかつ明らかに必要とされているにもかかわらず、エレクトロポレーションは、当業者には実行可能な代替手法と見られておらず、後に遺伝子修飾動物へと発達する哺乳動物胚への遺伝物質の導入へのエレクトロポレーションの使用は報告されていない。
【００１２】
具体的には、エレクトロポレーションは、これまで組織培養細胞およびマウスにおける着床後の胚において主として使用されてきた（Ｍｅｌｌｉｔｚｅｒら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．、１１８：５７〜６３（２００２）；Ａｋａｍａｔｓｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６：９８８５〜９８９０（１９９９）；Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：７１６１〜７１６５（１９８４）；ＯｓｕｍｉおよびＩｎｏｕｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：３５〜４２（２００１）；Ｆｕｋｕｃｈｉ−ＳｈｉｍｏｇｏｒｉおよびＧｒｏｖｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１０７１〜１０７４（２００１）；ならびにＴａｂａｔａおよびＮａｋａｊｉｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１０３：８６５〜８７２（２００１）を参照されたい）。
【００１３】
１つの研究では、Ｎｅｍｅｃら（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３１：２３３、１９８９）により、ネオマイシン耐性遺伝子（ｐＳＶＮＥＯ）をマウス１細胞胚（すなわち接合体）にエレクトロポレーションによって導入する試みが記載された。しかし、ネオマイシン遺伝子を含むＤＮＡは、著者によれば電流への曝露により外来性ＤＮＡと前核間の距離を減少させるために、先ず、接合体の原形質膜と透明帯の間の囲卵腔に注入され、その後、その接合体がエレクトロポレーションに付された。著者は、１つの実験において、サザンブロット分析が、偽妊娠ＩＣＲレシピエントに移植した２２６の胚から産生された５５匹の子にネオマイシン遺伝子の組込みがないことを示したことを報告した。エレクトロポレーションのパルス中に移動する総エネルギーを増加させるように設計された、高塩濃度媒体を用いる追跡実験において、著者は、生殖細胞系列伝達が成功しなかったことを予備データが示唆していることを重ねて報告した。
【００１４】
つい最近、エレクトロポレーションは、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、それをコードするＤＮＡベクター、およびモルホリノをマウスの着床前の胚に送達するために使用された（Ｇｒａｂａｒｅｋら、Ｇｅｎｅｓｉｓ、３２：２６９〜２７６（２００２）；Ｗａｎｇら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、３１８：１１２〜１２５（２００８）；およびＰｅｎｇら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、７（８）：ｅ４３７４８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３７４８（２０１２））。しかし、これらの試薬は、生殖細胞系列によって伝達され得る遺伝子修飾を引き起こすために必要とされる場合のように核で働くのではなく、サイトゾルで働く。より具体的には、これらの試薬は、それらのそれぞれの標的遺伝子の発現を、該標的遺伝子のｍＲＮＡを分解することによるか、もしくは前記ｍＲＮＡの翻訳を阻止することにより、または両方により、阻害することによって働く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、遺伝子修飾動物を作製するための外来性生体または遺伝物質の早期胚への生殖系列伝達による導入に使用するためのマイクロインジェクションの多くの欠点（例えば、低い効率）を克服することが長年必要とされているにもかかわらず、現行技術は、エレクトロポレーションなどの一見より簡単に見える手法の阻害要因を示唆しているように見える。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
本明細書に記載の発明は、生体分子を接合体および早期（すなわち、着床前）の胚に効率的に導入するための方法および試薬を提供する。このような技術は、分子生物学において広く応用される。例えば、ある特定の部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム）を、本発明の方法を使用して導入すると、正確なヌクレオチド変化、大セグメント欠失、および標的化短鎖セグメント挿入を、標的遺伝子座に高効率で導入することができる。
【００１７】
本発明の一態様は、遺伝子修飾哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）を作製する方法であって、物質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）を哺乳動物の配偶子（例えば、卵細胞の卵子）または着床前期の胚（例えば、接合体）にエレクトロポレーションによって導入して前記哺乳動物のゲノムを修飾することを含み、前記物質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｂｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含み、これらの各々が前記哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的である、方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態では、物質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含む。
【００１８】
関連態様では、本発明は、遺伝子修飾哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）を作製する方法であって、物質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）を哺乳動物の配偶子（例えば、卵細胞の卵子）または着床前期の胚（例えば、接合体）にエレクトロポレーションによって導入して前記哺乳動物のゲノムを修飾することを含み、（１）前記物質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｂｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含み、これらの各々が前記哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的であり、および（２）前記エレクトロポレーションが、１サイクルより多くのサイクル（例えば、４、５、６、７、８、９、１０サイクル、または４〜１０サイクル、好ましくは、４〜８サイクル、または６サイクル）を含む、方法を提供する。本発明の方法は、配偶子（特に、雌性配偶子、例えば、未受精卵または卵細胞）に有用であり得るが、好ましい実施形態では、前記方法は、接合体である着床前期の胚に適用される。
【００１９】
さらに別の関連態様では、本発明は、遺伝子修飾哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）を作製する方法であって、物質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）を哺乳動物の配偶子（例えば、卵細胞の卵子）または着床前期の胚（例えば、接合体）にエレクトロポレーションによって導入して前記哺乳動物のゲノムを修飾することを含み、前記エレクトロポレーションが、１サイクルより多くのサイクル（例えば、４、５、６、７、８、９、１０サイクル、または４〜１０サイクル）を含む、方法を提供する。
【００２０】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションは、４〜８サイクル、または６サイクルを含む。
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションの一部のまたはすべてのサイクルは、独立して、２０〜４０ボルト（例えば、２５〜３５ボルト、または３０ボルト、または２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５ボルト）で行われる。
【００２１】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションの一部のまたはすべてのサイクルは、独立して、１〜２ｍｓ（例えば、１．０または１．５ｍｓ）のパルス幅を使用して行われる。
【００２２】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションの一部のまたはすべてのサイクルは、独立して、１〜３パルス（例えば、２パルス）を使用して行われる。
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションの一部のまたはすべてのサイクルは、独立して、１００〜１０００ｍｓ（例えば、１００ｍｓ、または１２５〜１３０ｍｓ）のパルス間隔を使用して行われる。
【００２３】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションは６サイクルからなり、前記エレクトロポレーションの一部のまたはすべてのサイクルは、３０ボルト、パルス幅１．０ｍｓ、２パルス、およびパルス間隔１００ｍｓの設定を使用して行われる。
【００２４】
ある特定の実施形態では、物質は、配偶子に導入される。例えば、配偶子は、卵細胞または卵子などの、雌性配偶子であり得る。ある特定の実施形態では、方法は、エレクトロポレーションされた（雌性）配偶子を反対の性の配偶子（例えば、雄性配偶子）と融合させること、および出生遺伝子修飾哺乳動物へと発達させることをさらに含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、着床前期の胚は、１細胞胚（すなわち、接合体）、２細胞胚、４細胞胚、初期桑実胚、または後期桑実胚である。
ある特定の実施形態では、方法は、（エレクトロポレーションされた）着床前期の胚（例えば、接合体）を出生遺伝子修飾哺乳動物へと発達させることをさらに含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、物質は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、またはポリヌクレオチドとポリペプチドの両方を含む。例えば、エレクトロポレーションされることになる物質は、各々が哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的な、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｂｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含み得る。エレクトロポレーションされることになる物質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｂｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）についてのコード配列（例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。エレクトロポレーションされることになる物質は、哺乳動物のゲノム内の標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含み得る。物質は、ドナーポリヌクレオチドをさらに含み得る。物質は、上記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのいずれかについての組合せを含み得る。しかし、好ましい実施形態では、物質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、および各々が哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的な少なくとも１つ（例えば、１、２、３以上）のｓｇＲＮＡを含む。
【００２７】
ある特定の実施形態では、物質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むポリペプチドを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をエレクトロポレーション混合物に最終濃度２５０ｎｇ／μＬ、または最終濃度１５０ｎｇ／μＬ、２００ｎｇ／μＬ、３００ｎｇ／μＬもしくは３５０ｎｇ／μＬで添加することができる。ある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーション混合物に最終濃度３００ｎｇ／μＬ、または最終濃度２００ｎｇ／μＬ、２５０ｎｇ／μＬ、３５０ｎｇ／μＬもしくは４００ｎｇ／μＬで添加することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をエレクトロポレーション混合物に最終濃度２５０ｎｇ／μＬで添加することができ、ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーション混合物に最終濃度３００ｎｇ／μＬで添加することができる。
【００２８】
ある特定の実施形態では、物質は、ドナーポリヌクレオチドをさらに含む。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、直鎖状または環状二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子であり得る。
ある特定の好ましい実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ドナーポリヌクレオチドとともに配偶子（例えば、卵細胞の卵子）または着床前期の胚（例えば、接合体）にエレクトロポレーションされる。ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、直鎖状または環状二本鎖ＤＮＡ分子である。
【００２９】
ある特定の実施形態では、ゲノムは、１もしくは複数の塩基対の挿入もしくは欠失により、異種ＤＮＡ断片（例えば、ドナーポリヌクレオチド）の挿入により、内在性ＤＮＡ断片の欠失により、内在性ＤＮＡ断片の逆位もしくは転座により、またはそれらの組合せにより修飾される。
【００３０】
ある特定の実施形態では、ゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、または相同組換え（ＨＲ）により修飾される。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、２５０ｎｇ／μＬ）を用いるエレクトロポレーションは、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上（例えば、１００％）のノックイン（ＫＩ）効率を達成する。ある特定の実施形態では、ＫＩ効率は、１サイクルのエレクトロポレーション、または４、５、６、７、８、９もしくは１０サイクル（好ましくは、４〜１０サイクル、例えば６サイクル）のエレクトロポレーションを用いて達成される。
【００３１】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、２５０ｎｇ／μＬ）を用いるエレクトロポレーションは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％のＮＨＥＪ効率を達成する。ある特定の実施形態では、ＫＩ効率は、１サイクルのエレクトロポレーション、または４、５、６、７、８、９もしくは１０サイクル（好ましくは、４〜１０サイクル、例えば６サイクル）のエレクトロポレーションを用いて達成される。
【００３２】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、２５０ｎｇ／μＬ）を用いるエレクトロポレーションは、ＩＶＦ（ｉｎ  ｖｉｒｅｏ受精）により作製された胚において少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％以上の率で大きい標的部位ゲノム欠失（例えば、少なくとも１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ以上のゲノム領域欠失）を達成する。ある特定の実施形態では、前記率は、１サイクルのエレクトロポレーション、または４、５、６、７、８、９もしくは１０サイクルのエレクトロポレーションを用いて達成される。ある特定の実施形態では、胚は、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪなどの近交系マウス系統からのものである。
【００３３】
本発明は、Ｃａｓ９コード配列（例えば、ｍＲＮＡ）ではなくＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションによって送達したとき、胚盤胞試料の分析からの結果が、ＮＨＥＪおよびＫＩ効率が両方ともＣａｓ９コード配列のエレクトロポレーションと比較して極めて高いことを示したという驚くべき発見に、一部は基づく。
【００３４】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物のゲノム内の標的配列とハイブリダイズする、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムガイドＲＮＡを含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質とＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡのコード配列の濃度比は、少なくとも１：１、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１以上である。
【００３６】
ある特定の実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列の濃度は、少なくとも４０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬ、少なくとも１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも２００ｎｇ／μＬ、少なくとも３００ｎｇ／μＬ、少なくとも４００ｎｇ／μＬ、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、少なくとも６００ｎｇ／μＬ、少なくとも８００ｎｇ／μＬ、または少なくとも１０００ｎｇ／μＬ以上である。
【００３７】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的な転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のコード配列を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のコード配列を含む。
【００３８】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的なＢｕＤ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）のコード配列を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物のゲノムにランダムに組み込まれるＤＮＡを含む。
【００３９】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡベクターを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片をランダムにまたは特異的に哺乳動物のゲノムに組み込むトランスポサーゼのコード配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、トランスポサーゼを含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コットンラット、ハダカデバネズミ）、ウサギ、家畜哺乳動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、ウシ、ウマ、ラクダ科動物）、ペット哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）、動物園の哺乳動物、有袋目の哺乳動物、絶滅危惧哺乳動物、およびそれらの非近交系または任意交配集団である。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、マウスまたはラットである。
【００４１】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーション後、配偶子（反対の性の配偶子との融合後）または着床前の胚（例えば、接合体）は、胚を出産までもっていくことができる偽妊娠宿主哺乳動物に移植される。
【００４２】
ある特定の実施形態では、配偶子（反対の性の配偶子との融合後）または着床前の胚（例えば、接合体）は、エレクトロポレーションが行われる媒体から除去され、その後、偽妊娠宿主哺乳動物に移植される。
【００４３】
ある特定の実施形態では、１つより多くの、例えば、２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００以上の配偶子または着床前期の胚が、同時にエレクトロポレーションされる。
【００４４】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションされた着床前期の胚の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％以上は、胚盤胞期の胚へと発達するか、または出生トランスジェニック哺乳動物へと発達する。
【００４５】
ある特定の実施形態では、すべての配偶子および着床前期の胚は、１ｍｍエレクトロポレーションキュベットなどの、同じエレクトロポレーションキュベットにおいてエレクトロポレーションされる。
【００４６】
ある特定の実施形態では、配偶子または着床前期の胚は、エレクトロポレーションの前に、透明帯を弱めるために前処置される。
ある特定の実施形態では、配偶子または着床前期の胚は、酸性タイロード液（ＡＴ）中でｓ、例えば、５〜１５秒、または１０秒間、前処置される。
【００４７】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションは、ＥＣＭ８３０方形波エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ８３０型エレクトロポレーター）を使用して行われる。
ある特定の実施形態では、配偶子または着床前期の胚（例えば、接合体）は、エレクトロポレーション後、保管のために凍結される。凍結された配偶子または着床前期の胚は、後に、融解され、使用される。
【００４８】
ある特定の実施形態では、方法は、エレクトロポレーションされた接合体を偽妊娠宿主哺乳動物に移植すること、およびそのエレクトロポレーションされた接合体を出生遺伝子修飾哺乳動物へと発達させることをさらに含む。
【００４９】
本発明の別の態様は、本発明の方法のいずれか１つにより作製された遺伝子修飾非ヒト哺乳動物を提供する。
本明細書における上段および下段に記載のいずれの実施形態も、（参照により本明細書に組み入れられる）例にしか記載のない特定の実施形態を含む、本発明の任意の他の実施形態と組み合わせることができることを企図したものであると、理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１−１】図１Ａおよび１Ｂは、本方法を使用するマウス胚のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子破壊を示す図である。具体的には、図１Ａは、Ｔｅｔ１遺伝子座を標的とした胚の遺伝子型判定を示す。ＲＦＬＰ分析が上のパネルに示されており、シークエンシング結果が下のパネルに示されている。ＲＦＬＰ分析に使用した、標的領域における制限部位は、太字かつ下線付きである。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列は、赤色に着色されている。２つの胚からの突然変異対立遺伝子が示されており、突然変異した塩基は、青色に着色されている。図１Ｂは、Ｔｅｔ２遺伝子座を標的とした胚の遺伝子型判定を示す。
【図１−２】図１Ａおよび１Ｂは、本方法を使用するマウス胚のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子破壊を示す図である。具体的には、図１Ａは、Ｔｅｔ１遺伝子座を標的とした胚の遺伝子型判定を示す。ＲＦＬＰ分析が上のパネルに示されており、シークエンシング結果が下のパネルに示されている。ＲＦＬＰ分析に使用した、標的領域における制限部位は、太字かつ下線付きである。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列は、赤色に着色されている。２つの胚からの突然変異対立遺伝子が示されており、突然変異した塩基は、青色に着色されている。図１Ｂは、Ｔｅｔ２遺伝子座を標的とした胚の遺伝子型判定を示す。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、本方法を使用する生存マウスにおけるＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子破壊を示す図である。具体的には、図２Ａでは、Ｔｅｔ２遺伝子座を標的とし、それぞれ４００ｎｇ／μＬおよび２００ｎｇ／μＬで使用されるＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（一本鎖ガイドＲＮＡ）を、エレクトロポレーションによってマウス胚に送達した。エレクトロポレーションされた胚を、次いで、偽妊娠雌マウスに移植した。尾部生検試料を新生マウスから採取し、ＥｃｏＲＶ酵素を用いてＲＦＬＰ法を使用して遺伝子型を判定した。マウス８５Ｃ３からのＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ消化に対して抵抗性であり、マウス８５Ｃ１０からのＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ消化に対して部分抵抗性である。図２Ｂでは、Ｔｅｔ２遺伝子座を標的とするＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡをそれぞれ６００ｎｇ／μＬおよび３００ｎｇ／μＬで使用した。マウス８６Ｃ３および８６Ｃ９からのＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ消化に対して抵抗性であり、マウス８６Ｃ５、８６Ｃ７および８６Ｃ８からのＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ消化に対して部分抵抗性であった。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｄは、本方法を使用する生存マウスにおけるＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子破壊を示す図である。図２Ｃでは、マウス８５Ｃ３、８５Ｃ１０、８６Ｃ３、８６Ｃ５、８６Ｃ７、８６Ｃ８および８６Ｃ９からのＰＣＲ産物をサンガーシークエンシングにより処理し、そのクロマトグラムを野生型試料からのものと比較して示した。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｄは、本方法を使用する生存マウスにおけるＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子破壊を示す図である。図２Ｃでは、マウス８５Ｃ３、８５Ｃ１０、８６Ｃ３、８６Ｃ５、８６Ｃ７、８６Ｃ８および８６Ｃ９からのＰＣＲ産物をサンガーシークエンシングにより処理し、そのクロマトグラムを野生型試料からのものと比較して示した。
【図２−４】図２Ａ〜２Ｄは、本方法を使用する生存マウスにおけるＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子破壊を示す図である。図２Ｄ：マウス８５Ｃ３、８６Ｃ３および８６Ｃ９からのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏベクターにクローニングし、個々のクローンをシークエンシングした。挿入欠失変異が３匹のファウンダーマウスすべてからの対立遺伝子間で容易に検出された。
【図３−１】図３Ａは、実験１５からの１１匹のファウンダーマウスの遺伝子型判定の結果を示す図である。上のパネルは、ＲＦＬＰ分析なしでのＰＣＲ産物を示す。中央のパネルは、ＥｃｏＲＶを使用するＲＦＬＰ分析を示す。下のパネルは、ＥｃｏＲＩを使用するＲＦＬＰ分析を示す。
【図３−２】図３Ｂは、選択されたファウンダーマウスおよび対照マウスのサンガーシークエンシング結果を示す図である。対照マウスにおける野生型配列に対して変化した配列（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ＨＤＲで）に下線が付けられている。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｄは、ＧＦＰ  ｍＲＮＡが複数サイクルのエレクトロポレーションによってマウス胚に効率的に送達されたことを示す図である。図４Ａでは、ＧＦＰシグナルの強度を、一連のエレクトロポレーションによるマウス胚へのＧＦＰ  ｍＲＮＡの送達後に評価した。１、４、６および８サイクルのエレクトロポレーションをａ、ｂ、ｃおよびｄ群にそれぞれ使用した。図４Ｂは、４群に使用したエレクトロポレーションの設定を示す。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｄは、ＧＦＰ  ｍＲＮＡが複数サイクルのエレクトロポレーションによってマウス胚に効率的に送達されたことを示す図である。図４Ｃでは、胚生存率を、一連のエレクトロポレーション後、２細胞期または胚盤胞期の胚の計数により評価した。図４Ｄでは、ＧＦＰシグナルを、エレクトロポレーション後、２細胞期に定量した。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｃは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達がＨＤＲ効率を劇的に上昇させたことを示す図である。図５Ａは、Ａｉｃｄａ標的配列およびドナーオリゴヌクレオチドの概略図を示す。プロトスペーサー配列は、下線付きであり、ＰＡＭ配列は、緑色に着色されている。ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーにおいて変化したオリゴヌクレオチドは、大文字である。ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーにおけるＢａｍＨ１認識部位は赤色に、ＥｃｏＲＶ認識部位は青色に着色されている。図５Ｂは、エレクトロポレーション後のＡ、Ｂ、ＣおよびＤ群からの２８匹のマウスのＲＦＬＰ分析を示す。１、４、６および８サイクルのエレクトロポレーションをＡ、Ｂ、ＣおよびＤ群にそれぞれ使用した。ＥｃｏＲＶ消化またはＢａｍＨ１消化後の切断バンドが、黒矢印により指摘されている。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｃは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達がＨＤＲ効率を劇的に上昇させたことを示す図である。図５Ｃは、Ａｉｃｄａ標的領域を含有するＰＣＲ産物のシークエンシングトレースを示す。明瞭なシークエンシングトレースは、Ｂ３、Ｃ３およびＤ３に示されているように主として１個の対立遺伝子（被定義突然変異）が標的遺伝子座にある一方で、Ａ３マウスにはＷＴ対立遺伝子と突然変異対立遺伝子の両方があることを示す。ＷＴ、野生型。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの送達が、生存マウスにおいてＡｉｃｄａゲノムＫＩを作製するのに然程効率的でないことを示す図である。図６Ａは、エレクトロポレーション後のＡ、ＢおよびＣ群からのマウス組織試料のＲＦＬＰ分析を示す。１、４および６回のエレクトロポレーションをＡ、ＢおよびＣ群にそれぞれ使用した。ＥｃｏＲＶ消化後の切断バンドが、黒矢印により指摘されている。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｃは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの送達が、生存マウスにおいてＡｉｃｄａゲノムＫＩを作製するのに然程効率的でないことを示す図である。図６Ｂは、Ａｉｃｄａ標的領域を含有するＰＣＲ産物のシークエンシングトレースを示す。重複シークエンシングトレースは、Ｃ２に示されているようにこれらのマウス間の複数の対立遺伝子の存在を示す。図６Ｃでは、Ｃ２のＰＣＲ産物をクローニングし、個々のクローンをシークエンシングした。クローンＣ２−８からのシークエンシングトレースが示されている。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｃは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達が胚盤胞におけるＨＤＲ効率を劇的に上昇させたことを示す図である。図７Ａは、エレクトロポレーション後のＣａｓ９  ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質送達後の胚盤胞期の胚のＲＦＬＰ分析を示す。１、４、６および８回のエレクトロポレーションを送達のために行った。ＥｃｏＲＶまたはＢａｍＨ１消化後の切断バンドを黒矢印によって指摘した。ＷＴ：野生型。Ｔ：尾部試料。Ｂ：胚盤胞。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｃは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達が胚盤胞におけるＨＤＲ効率を劇的に上昇させたことを示す図である。図７Ｂは、Ａｉｃｄａ標的領域を含有するＰＣＲ産物のシークエンシングトレースを示す。重複シークエンシングトレースは、Ｅ５５およびＥ６７に示されているようにこれらの試料間の複数の対立遺伝子の存在を示す。図７Ｃでは、ＰＣＲ産物をクローニングし、個々のクローンをシークエンシングした。クローンＥ５５−１およびＥ６７−１からのシークエンシングトレースが示されている。ＷＴ：野生型。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｃは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達が近交系統において高いゲノム欠失効率を達成したことを示す図である。図８Ａは、Ｓｍｃ１ｂ遺伝子座からＤＮＡ断片を欠失させる戦略の概略図である。エクソン２、エクソン３およびエクソン４を含むＤＮＡセグメントを、ゲノムから欠失させた。図８Ｂは、ＤＮＡ電気泳動によるＰＣＲ産物のサイズ分析を示す。１、４および６回のエレクトロポレーションをＡ、ＢおよびＣ群にそれぞれ使用した。約５１８ｂｐ長である、Ｂ４、Ｃ１、Ｃ５およびＣ６における小さいバンドは、欠失の成功を示す。ＷＴ：野生型。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｃは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達が近交系統において高いゲノム欠失効率を達成したことを示す図である。図８Ｃ、上のパネルは、Ｓｍｃ１ｂ標的配列である。２つのｇＲＮＡの２つのプロトスペーサー配列が青色で、およびＰＡＭ配列が赤色で標識されている。下のパネル、Ｓｍｃ１ｂ標的領域を含有するＰＣＲ産物のシークエンシングトレース。ＷＴシークエンシングトレースの下の青線および赤線は、それぞれ、上流ｇＲＮＡ配列、およびＰＡＭ配列を示す。Ｂ４、Ｃ１、Ｃ５およびＣ６のシークエンシングトレースの下の２本の青線は、残存する上流および下流ｇＲＮＡを示す。明瞭なシークエンシングトレースは、Ｂ４、Ｃ１およびＣ５に示されているように主として１個の対立遺伝子が標的遺伝子座にあることを示す。ＷＴ：野生型。
【図９−１】図９Ａおよび９Ｂは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達が交雑系統において大ＤＮＡセグメント欠失について高い効率を達成したことを示す図である。図９Ａは、ＤＮＡ電気泳動によるＰＣＲ産物のサイズ分析を示す。１、４および６回のエレクトロポレーションをＡ、ＢおよびＣ群にそれぞれ使用した。約５１８ｂｐ長である、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ｂ３、Ｃ３およびＣ４における小さいバンドは、欠失の成功を示す。ＷＴ：野生型。
【図９−２】図９Ａおよび９Ｂは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達が交雑系統において大ＤＮＡセグメント欠失について高い効率を達成したことを示す図である。図９Ｂ、上のパネル、Ｓｍｃ１ｂ標的配列。２つのｇＲＮＡの２つのプロトスペーサー配列が青色で、およびＰＡＭ配列が赤色で標識されている。下のパネル、Ｓｍｃ１ｂ標的領域を含有するＰＣＲ産物のシークエンシングトレース。重複シークエンシングトレースは、Ａ５に示されているようにこれらのマウス間の複数の対立遺伝子の存在を示す。明瞭なシークエンシングトレースは、Ａ３、Ａ４、Ｃ３およびＣ４に示されているように主として１個の対立遺伝子が標的遺伝子座にあることを示す。ＷＴ：野生型。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｃは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達が標的化小ＤＮＡ断片挿入の高い効率を達成したことを示す図である。図１０Ａは、Ｒｏｓａ２６標的配列およびドナーオリゴヌクレオチドの概略図である。プロトスペーサー配列は青色に、ＰＡＭ配列は赤色に着色されている。ＤＮＡオリゴヌクレオチドにおけるＬｏｘＰ部位は、下線付きである。図１０Ｂは、ＴＩＤＥを使用するＰＣＲ産物のサイズ分析の結果を示す代表画像である。３４ｂｐ挿入における赤いバーは、ＬｏｘＰ部位の可能性のある挿入を示す。子のうちの１匹についての１回のエレクトロポレーションでの結果を示した（Ａ３）。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｃは、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達が標的化小ＤＮＡ断片挿入の高い効率を達成したことを示す図である。図１０Ｃでは、ＰＣＲ産物をクローニングし、個々のクローンをシークエンシングした。クローンＡ３−１からのシークエンシングトレースが示されている。挿入に成功したＬｏｘＰ部位は、下線付きである。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
１．大要
遺伝子修飾動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物または他の遺伝子修飾哺乳動物）を作製する状況下でマイクロインジェクションに関連する固有の制限を克服するために、本出願人は、エレクトロポレーションに基づく方法論であって、この方法を、高い生存率を有する遺伝子修飾動物の高効率、高処理量の作製に適したものにする特定の条件下で、生体物質／遺伝物質を動物の（例えば、哺乳動物の）配偶子または着床前の胚（接合体を含む）に送達するための方法論を開発した。結果として生じる遺伝子修飾は、生殖系列によって容易に伝達され得る。
【００５２】
具体的には、例示的な実施形態では、本発明の方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをマウス胚（例えば、接合体）に送達し、かくて、結果として生じる遺伝子修飾／トランスジェニックマウスのゲノムにおける標的化遺伝子修飾を果した。本明細書で最適化される実施形態またはプロトコールを含む本発明の方法は、市販のエレクトロポレーターを使用して、その上、訓練または事前の経験をほとんど必要とせずに、行うことができ、したがって、多数の胚、および複数の遺伝子標的化プロジェクトを、並行して単一ステップで処理することができる。本明細書に記載の発明の方法を使用して、様々な生体物質、遺伝物質もしくは他の物質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮを含むが、これらに限定されない）のいずれかまたはそれらの組合せを、配偶子および早期胚（例えば、接合体を含む、哺乳動物の着床前の胚）に送達することができる。したがって、本明細書に記載の技術は、前例のない容易さおよび規模を有する動物ゲノム工学を可能にする。
【００５３】
本明細書に記載の発明は、エレクトロポレーションを使用して、比較的高い（例えば、以前は毒性レベルと考えられていた）濃度の生体物質／遺伝物質を配偶子および着床前の胚（接合体を含む）に送達することができるという発見であって、前記高い濃度が、エレクトロポレーションされた配偶子および早期胚の核に関して所望の最終結果、例えば前記配偶子または胚のゲノムの遺伝子修飾、を達成するために必要とされ得る濃度であり、前記修飾が生殖系列伝達によって伝えることができるものである、発見に、一部は基づく。
【００５４】
具体的には、比較的低濃度のＣａｓ９  ｍＲＮＡ（５０もしくは１００ｎｇ／μＬ）またはｓｇＲＮＡ（２５もしくは５０ｎｇ／μＬ）が前核または細胞質マイクロインジェクション実験での使用に成功した以前のマイクロインジェクション実験に基づいて、本出願人は、報告された遺伝子をコードするプラスミド（実施例１参照）を使用して接合体へのエレクトロポレーションを試みた。驚くべきことに、エレクトロポレーションされた接合体から発達した３．５日胚において蛍光は観察されなかった。透明体を弱めるための透明体の前処置とともに、または他のレポーター、もしくはフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドとともに、他の濃度のＤＮＡを使用する同様の実験も、失敗した。実施例１で言及される実験２〜６を参照されたい。
【００５５】
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをはじめとする、エレクトロポレーション実験に使用される試薬は、より高濃度で使用されると胚に対して有毒であり得ると、広く信じられている。
【００５６】
本出願人は、比較的高濃度の生体物質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド）を使用して接合体などの早期胚にエレクトロポレーションして、胚においてまたはエレクトロポレーションされた胚から発達した動物において所望の遺伝子修飾を果すことができることを、本明細書おいて実証した。実施例２を参照されたい。
【００５７】
本明細書に記載の発明は、エレクトロポレーションされた配偶子および着床前の胚（接合体を含む）が、生理溶液または生理的媒体に放出されない限り、通常は発達遅延もしくは停止を示すか、でなければ出生動物まで生き延びないという発見に、さらに一部は基づく。例えば、前記溶液または媒体は、なかんずく、等張性である。加えて、エレクトロポレーションされた配偶子および着床前の胚（接合体を含む）を生理溶液または生理的媒体に放出することにより、通常のエレクトロポレーション媒体（例えば、ＴＥなどのポリヌクレオチドを溶解するために使用される緩衝液）が除去され、その結果、その媒体中の一切の有害物質が後続の胚の発達を遅延させることがあり得る機会がさらに減少される。
【００５８】
例えば、エレクトロポレーションに使用される緩衝液または媒体が生理溶液または生理的媒体でない場合、例えば、エレクトロポレーションされることになる物質を溶解するために使用される過剰な（例えば、４０％または５０％超えの）緩衝液を含有するものである場合、エレクトロポレーション直後にそのような緩衝液を除去することが有益であり得る。
【００５９】
ある特定の実施形態では、核酸試薬を溶解するために一般に使用されるＴＥまたは他の同様の緩衝液が、エレクトロポレーション媒体中に有意な量（例えば、＞４０％または５０％）で存在する場合、いくつかの手段を使用して、一切の潜在的有害作用を軽減することができる。例えば、一実施形態では、エレクトロポレーションされた配偶子または胚をエレクトロポレーション直後に生理溶液で洗浄することにより、配偶子または胚がＴＥ緩衝液に浸漬される時間を最小にすることができる。他の実施形態では、全モル浸透圧濃度を生理的モル浸透圧濃度に近づけるために、ＴＥ緩衝液に溶解された核酸試薬（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬）を生理溶液と適切な割合で混合することができる。さらに別の実施形態では、一切の厄介な問題を回避または最小限にするために、核酸試薬（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬）を生理溶液で直接再構成することができる。すなわち、配偶子および着床前の胚（接合体を含む）を生理溶液または生理的媒体、例えば、等張性であるものの中でエレクトロポレーションすることができる。生理溶液または生理的媒体は、塩組成および浸透圧が血漿と同様の、人工的に調製された溶液であり得る。
【００６０】
エレクトロポレーションは、本明細書に記載の条件下で生体物質を接合体に実際に導入することができるが、出生動物を作出するにはその後の発達中に接合体が生存していなければならない。エレクトロポレーションされた接合体を培養する上での初期の失敗は、所望の遺伝子修飾がエレクトロポレーションされた接合体に存在するかどうかに関係なく、接合体がエレクトロポレーションプロセスを生き延び、出生動物へと発達し続けることができないことを示唆しているように思われる。ＡＴ処置が接合体を過剰に損傷させて胚の発達を遅延させるという、およびＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡなどの、送達される試薬が接合体およびそれらのその後の発達に対して有毒であり得るという認識は、動物における生殖系列伝達可能な遺伝子修飾を恒久的に導入するための実行可能な手段としてエレクトロポレーションを使用することの阻害要因をさらに示唆している。
【００６１】
本出願人は、例えば胚盤胞期の胚への発達成功によって測定される、エレクトロポレーションされた接合体の生存率を、本発明の方法を使用して驚くほど高い（例えば、１００％に近いまたはさらには１００％に達する）レベルに劇的に向上させることができることを、本明細書において実証した。
【００６２】
本明細書に記載の発明は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｂｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの、部位特異的改変ヌクレアーゼを、エレクトロポレーション混合物に（ｍＲＮＡのコード配列などのコード配列をそれに使用するのではなく）直接使用することで、結果として生じる遺伝子編集の成功率を劇的に上昇させることができるという発見にも、一部は基づく。
【００６３】
本明細書に記載の発明は、複数ラウンド／サイクルのエレクトロポレーションを行うことで、全般的効率を有意に上昇させることができるという発見に、さらに一部は基づく。
したがって、本発明の一態様は、遺伝子修飾動物（例えば、非ヒト哺乳動物）を作製する方法であって、物質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）を前記動物（例えば、非ヒト哺乳動物）の配偶子（例えば、卵子もしくは卵細胞）または着床前期の胚（例えば、接合体）にエレクトロポレーションによって導入して前記動物（例えば、非ヒト哺乳動物）のゲノムを修飾することを含み、（１）前記物質が、前記哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的な、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、もしくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、もしくはＢｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）、もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含み、および／または（２）前記エレクトロポレーションが、１サイクルより多くのサイクル（例えば、４、５、６、７、８、９、１０サイクル、好ましくは４〜１０サイクル）を含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、物質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含み、および／またはエレクトロポレーションは、１サイクルより多くのサイクル（例えば、４〜１０サイクル、もしくは４サイクル、もしくは６サイクル）を含む。
【００６４】
関連態様では、本発明は、遺伝子修飾動物（例えば、非ヒト哺乳動物）を作製する方法であって、物質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）を前記動物（例えば、非ヒト哺乳動物）の除核卵母細胞に１サイクルより多くのサイクル（例えば、４〜１０サイクル、４〜８サイクル、または６サイクル）のエレクトロポレーションによって導入して、前記動物（例えば、非ヒト哺乳動物）のゲノムを修飾することを含み、ここで体細胞がエレクトロポレーションショックにより同時に前記除核卵母細胞と融合される、前記方法も提供する。体細胞の除核卵母細胞との融合は、ブタクローニングに使用される方法である。
【００６５】
ある特定の実施形態では、本発明のエレクトロポレーションの一部またはすべてのサイクルを独立して同一のまたは異なる条件下で行うことができる。ある特定の実施形態では、わずかに異なるエレクトロポレーション条件を使用してもよい。例えば、一部またはすべてのサイクルを、（１）２０〜４０ボルト（例えば、２５〜３５ボルト、または３０ボルト、または２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４もしくは３５ボルト）、（２）パルス幅１〜２ｍｓ（例えば、１．０または１．５ｍｓ）、（３）１〜３パルス（例えば、２パルス）、および／または（４）パルス間隔１００〜１０００ｍｓ（例えば、１００ｍｓ、または１２５〜１３０ｍｓ）の設定を使用して行ってもよい。ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションは、１ｍｍエレクトロポレーションキュベットにおいて行われる。ある特定の実施形態では、適切に調整された同様のパラメータを用いて２ｍｍキュベットを使用してもよい。
【００６６】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションは、４、５、６、７、８、９または１０サイクル（例えば、４〜１０サイクル、または６〜８サイクル、または６サイクル）で行われ、各サイクルは、３０Ｖで、パルス幅が各々１または１．５ｍｓの２パルスで行われ、パルス間隔は１００ｍｓである。
【００６７】
ある特定の実施形態では、物質は、配偶子に導入される。例えば、配偶子は、精子（例えば、成熟精子）、極体、または卵細胞もしくは卵子であり得る。成熟精子を使用する場合、精子を、先ず、脱凝集するように誘導してもよい。精子脱凝集技術は、当技術分野において公知である。例えば、Ｍａｈｉら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．、４４：２９３〜２９６（１９７５）；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら、Ｅｘｐｔｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、４０：４０２〜４１２（１９６５）；およびＷａｇｎｅｒら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ、１：３１〜４１（１９７８）を参照されたい（すべて、参照により組み入れられる）。ジスルフィド還元剤の使用による脱凝集が好ましい。卵子を使用する場合、卵子は、受精した状態であってもよく、または例えば単為生殖によって生じた活性化状態であってもよい。エレクトロポレーションされた極体を使用して、半数体卵を二倍体化してもよい。
【００６８】
配偶子を使用する場合、本発明の方法は、エレクトロポレーションされた配偶子を、反対の性の配偶子などの別の配偶子と融合させる（例えば、エレクトロポレーションされた卵子を精子と融合させる）こと、および融合した配偶子を出生遺伝子修飾動物（例えば、非ヒト哺乳動物）へと発達させることをさらに含む。例えば、精子にエレクトロポレーションする場合、遺伝子修飾がもたらされる精子細胞を、その後、接合体の形成を可能にするために卵子に入れる。また、逆もまた同じである。精子および卵子の両方に、接合体の形成前に、エレクトロポレーションすることができるだろう。
【００６９】
エレクトロポレーション後、反対の性の配偶子または着床前の胚と融合させた後の、エレクトロポレーションされた配偶子を、偽妊娠宿主動物／哺乳動物、好ましくは、同じ種または系統の偽妊娠宿主動物／哺乳動物であって、胚を出産までもっていくことができる動物（例えば、哺乳動物）に、移植することができる。ある特定の実施形態では、偽妊娠宿主動物／哺乳動物への着床は、発達の桑実胚または胚盤胞期に行われる。他の実施形態では、着床は、胚のエレクトロポレーション直後に、またはエレクトロポレーションされた配偶子を別の配偶子と融合させた直後に行われる。
【００７０】
他の実施形態では、物質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）は、着床前期の胚などの、早期胚に導入される。着床前期の胚は、１細胞胚（すなわち、接合体）、２細胞胚、４細胞胚、８細胞胚、初期桑実胚、または後期桑実胚であってもよい。胚の発達は、非対称性の分割を含むこともあり得るので、少なくとも一時的に、早期胚は、３、５、６、７細胞胚、または対称性の胚分割の結果でない他の胚である可能性がある。本発明の方法は、そのような早期胚にも適用される。しかし、好ましい実施形態では、着床前期の胚は、１細胞胚（すなわち、接合体）である。
【００７１】
ある特定の実施形態では、方法は、（エレクトロポレーションされた）着床前期の胚（例えば、接合体）を出生遺伝子修飾哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）へと発達させることをさらに含む。例えば、エレクトロポレーション後、着床前の胚を、偽妊娠宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物）、好ましくは、同じ種または系統の偽妊娠宿主動物であって、胚を出産までもっていくことができる動物（例えば、非ヒト哺乳動物）に、移植することができる。
【００７２】
ある特定の実施形態では、配偶子（反対の性の配偶子との融合後）または着床前の胚は、エレクトロポレーションが行われる媒体から先ず除去され、その後、偽妊娠宿主動物（例えば、非ヒト哺乳動物）に移植される。例えば、エレクトロポレーションされた配偶子または着床前の胚を、胚の発達に好適なまたは適合可能な媒体（例えば、等張性の生理溶液または生理的媒体）で１回または複数回洗浄することができる。そのような洗浄はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのさらなる胚の発達に有害であることも、でなければ導電性でないこともある、エレクトロポレーション媒体または緩衝液中の任意の物質を除去する。
【００７３】
この目的に好適な媒体には、Ｍ２培地もしくはＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）、または任意の他の生理溶液（適切なイオン強度およびｐＨを有するもの）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、洗浄に使用される培地または緩衝液は、任意の潜在的温度ショックを低減させるまたは最小にするために、動物（例えば、非ヒト哺乳動物）の胚の発達に最適な温度（例えば、３７℃）に予熱される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーション媒体は、等張性である。
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションされた配偶子または着床前の胚は、ポリヌクレオチドを溶解するために使用される１種または複数の緩衝液、例えば、ＴＥ緩衝液、またはＥＤＴＡなどの金属キレート剤（ｍｅｔａｌ  ｃｈｅａｔｅｒｓ）を含有する等価の緩衝液を除去するために洗浄される。
【００７５】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションされた配偶子または着床前の胚は、エレクトロポレーション媒体として使用され得る基本または低血清培地、例えば、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（ＩＮＶＴＲＯＧＥＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｓｉＰＯＲＴ（商標）（ＡＭ８９９０もしくはＡＭ８９９０Ｇ；Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、またはそれらの混合物もしくは等価物を除去するために洗浄される。
【００７６】
本発明の方法を使用して非常に多数の試薬または物質を配偶子または着床前の胚に導入して、生殖系列を通じて伝達され得る遺伝子修飾を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、物質は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または両方を含み得る。好ましい実施形態では、物質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む。例えば、エレクトロポレーションされることになる物質は、各々が哺乳動物のゲノム内の標的配列に特異的な、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｂｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含み得る。エレクトロポレーションされることになる物質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｂｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のコード配列（例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。エレクトロポレーションされることになる物質は、哺乳動物のゲノム内の標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含み得る。物質は、ドナーポリヌクレオチドをさらに含み得る。物質は、上記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのいずれかについての組合せを含み得る。
【００７７】
ある特定の実施形態では、物質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含むポリペプチドを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をエレクトロポレーション混合物に最終濃度２５０ｎｇ／μＬまたは最終濃度１５０ｎｇ／μＬ、２００ｎｇ／μＬ、３００ｎｇ／μＬもしくは３５０ｎｇ／μＬで添加することができる。ある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーション混合物に最終濃度３００ｎｇ／μＬ、または最終濃度２００ｎｇ／μＬ、２５０ｎｇ／μＬ、３５０ｎｇ／μＬもしくは４００ｎｇ／μＬで添加することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をエレクトロポレーション混合物に最終濃度２５０ｎｇ／μＬで添加することができ、ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーション混合物に最終濃度３００ｎｇ／μＬで添加することができる。
【００７８】
本明細書で使用される「最終濃度」は、Ｃａｓ９タンパク質またはｓｇＲＮＡの濃度、場合によっては、配偶子または着床前期の胚（例えば、接合体）がエレクトロポレーションキュベットの中でインキュベートされる混合物中のＣａｓ９タンパク質またはｓｇＲＮＡの濃度を意味する。
【００７９】
本発明は、Ｃａｓ９コード配列（例えば、ｍＲＮＡ）ではなくＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションによって送達したとき、胚盤胞試料の分析からの結果が、ＮＨＥＪおよびＫＩ効率が両方ともＣａｓ９コード配列のエレクトロポレーションと比較して極めて高いことを示したという驚くべき発見に、一部は基づく。
【００８０】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、２５０ｎｇ／μＬ）を用いるエレクトロポレーションは、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上（例えば、１００％）のノックイン（ＫＩ）効率を達成する。ある特定の実施形態では、ＫＩ効率は、１サイクルのエレクトロポレーション、または４、５、６、７、８、９もしくは１０サイクル（例えば、４〜１０サイクル、または４〜８サイクル、または６サイクル）のエレクトロポレーションを用いて達成される。
【００８１】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、２５０ｎｇ／μＬ）を用いるエレクトロポレーションは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％のＮＨＥＪ効率を達成する。ある特定の実施形態では、ＮＨＥＪ効率は、１サイクルのエレクトロポレーション、または４、５、６、７、８、９もしくは１０サイクル（例えば、４〜１０サイクル、もしくは４〜８サイクル、もしくは６サイクル）のエレクトロポレーションを用いて達成される。
【００８２】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、２５０ｎｇ／μＬ）を用いるエレクトロポレーションは、ＩＶＦ（体外受精）により作製された胚において少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％以上の率で大きい標的部位ゲノム欠失（例えば、少なくとも１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ以上のゲノム領域の欠失）を達成する。ある特定の実施形態では、前記率は、１サイクルのエレクトロポレーション、または４、５、６、７、８、９もしくは１０サイクル（例えば、４〜１０サイクル、もしくは４〜８サイクル、もしくは６サイクル）のエレクトロポレーションを用いて達成される。ある特定の実施形態では、胚は、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪなどの近交系マウス系統からのものである。
【００８３】
他の実施形態では、さらなる物質、例えば、ＮＨＥＪ、ＨＤＲまたはＨＲプロセスを促進または阻害するような自然界のまたは合成の化学物質も、エレクトロポレーションによって導入することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの機能を助長するまたは向上させるために、ある特定の化学試薬を含めることができる（下記参照）。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列を含む。例示的な実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質のコード配列は、ｍＲＮＡ、例えば、真核細胞での発現に好適なコドン最適化ｍＲＮＡである。
【００８５】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物のゲノム内の標的配列とハイブリダイズすることができる、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムガイドＲＮＡを含み得る。ガイドＲＮＡに必要なのは、細胞内の生理条件下でハイブリダイズすることができるような標的配列との十分な配列類似性だけである。しかし、ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列と完全に相補的（または１００％同一）である。
【００８６】
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列に融合したガイド配列であり得る。
ある特定の実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質とＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡのコード配列の濃度比は、変動し得る。例えば、好適な比は、少なくとも１：１、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１以上であり得る。
【００８７】
他の実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質とＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡのコード配列の濃度比は、最大でも１：１、最大でも１：２、最大でも１：４、最大でも１：５、最大でも１：１０以下であり得る。
【００８８】
ある特定の実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列の濃度は、少なくとも４０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬ、少なくとも１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも２００ｎｇ／μＬ、少なくとも３００ｎｇ／μＬ、少なくとも４００ｎｇ／μＬ、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、少なくとも６００ｎｇ／μＬ、少なくとも８００ｎｇ／μＬ、または少なくとも１０００ｎｇ／μＬ以上である。
【００８９】
ある特定の実施形態では、物質は、ドナーポリヌクレオチドを（例えば、ＣＲＩＳＰＲ媒介ＮＨＥＪ、ＨＤＲまたはＨＲを助長するために）さらに含む。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、直鎖状または環状二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子であり得る。そのようなドナーポリヌクレオチドは、導入されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの標的であり得る標的配列のまたはその周囲の部位特異的修飾を助長するために含めることができる。
【００９０】
本発明の方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム以外の他の物質を配偶子または着床前の胚に導入することもできる。例えば、ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、動物（例えば、哺乳動物）のゲノム内の標的配列に特異的な転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のコード配列を含み得る。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、動物（例えば、哺乳動物）のゲノム内の標的配列に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のコード配列を含み得る。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、動物（例えば、哺乳動物）のゲノム内の標的配列に特異的な、Ｂｕｄ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）、またはモジュラー塩基対塩基特異的核酸結合ドメイン（ｍｏｄｕｌａｒ  ｂａｓｅ−ｐｅｒ−ｂａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍｉｎｓ）（ＭＢＢＢＤ）由来ヌクレアーゼのコード配列を含み得る。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、動物（例えば、非ヒト哺乳動物）のゲノムにランダムに組み込まれるＤＮＡを含む。
【００９１】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、および／もしくはＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ）を含み得る。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片を哺乳動物のゲノムにランダムにまたは特異的に組み込むトランスポサーゼを含む。
【００９２】
本発明は、異型配偶子融合、すなわち配偶子細胞の結合による有性生殖、を経験する多細胞真核動物の遺伝子修飾に応用される。そのような動物の例には、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物、硬骨魚類、軟骨魚類、円口類、節足動物、昆虫、軟体動物および葉状植物が含まれる。例示的な動物としては、哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物）、鳥類および魚類が挙げられる。
【００９３】
ある特定の実施形態では、動物は、哺乳動物である（下記参照）。例えば、哺乳動物は、非ヒト霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コットンラット、ハダカデバネズミ）、ウサギ、家畜哺乳動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、ウシ、ウマ、ラクダ科動物）、ペット哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）、動物園の哺乳動物、有袋目の哺乳動物、絶滅危惧哺乳動物、またはそれらの近交系（例えば、近交系のラットまたはマウス）、非近交系もしくは任意交配集団からの個体であり得る。
【００９４】
本発明の方法を使用して、関係する動物種のゲノムに非常に多くの生殖系列伝達可能な修飾を導入することができ、そのような修飾には、これらに限定されないが、小さい挿入もしくは欠失（例えば、１塩基対以上のもの）、異種ＤＮＡ断片の挿入、内在性ＤＮＡ断片の欠失（少なくとも１、１．５、２、２．５もしくは３ｋｂの大きい欠失を含む）、内在性ＤＮＡ断片の逆位もしくは転座、またはそれらの組合せが含まれる。同様に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を含むがこれらに限定されない、非常に多くの異なる機構が、修飾を生じさせることに関与し得る。
【００９５】
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復するための細胞における機構である。この修復機構は、細胞により、主として細胞周期Ｇ２およびＳ期に、核内に相同ＤＮＡ片が存在する場合に、専ら使用され得る。
【００９６】
相同ＤＮＡ片が非存在である場合には、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と呼ばれる別のプロセスが起こり得る。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、ＤＮＡの二本鎖切断を修復するもう１つの経路である。ＮＨＥＪは、修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換えとは対照的に、相同鋳型を必要とせずに切断端が直接ライゲーションされるため、「非相同的」と言われる。ＮＨＥＪは、修復を誘導するために短い相同ＤＮＡ配列（例えば、マイクロホモロジー）を典型的に用いる。これらのマイクロホモロジーは、二本鎖切断端上の一本鎖オーバーハング内に存在することが多い。オーバーハングが完全に適合性である場合、ＮＨＥＪは、通常、正確に切断を修復する。ヌクレオチドの喪失をもたらす不正確な修復も起こり得るが、オーバーハングが適合性でない場合の方がはるかによく起こる。不適切なＮＨＥＪは、転座およびテロメア融合をもたらし得る。ＮＨＥＪは、すべての生物界にわたって進化的に保存され、哺乳動物細胞における主な二本鎖切断修復経路である。
【００９７】
ＮＨＥＪ経路が不活性化されると、二本鎖切断は、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）として公知の、より誤りがちな経路によって修復され得る。この経路では、末端切除により切断部の両側の短いマイクロホモロジーが露出され、その後、それらのマイクロホモロジーが整列して修復を誘導する。これは、ＤＳＢ末端上の一本鎖オーバーハング内の既に露出しているマイクロホモロジーを典型的に使用する古典的ＮＨＥＪと、対照をなす。したがって、ＭＭＥＪによる修復は、マイクロホモロジー間のＤＮＡ配列の欠失をもたらす。
【００９８】
相同組換えは、ヌクレオチド配列が２つの類似のまたは同一の相同ＤＮＡ分子間で交換されるタイプの遺伝子組換えである。相同組換えは、二本鎖切断（ＤＳＢ）として公知の両方のＤＮＡ鎖上で起こる有害な切断を正確に修復するために、細胞によって最も広く使用される。相同組換えは、減数分裂中にＤＮＡ配列の新たな組合せを生じさせるプロセスでもあり、このプロセスにより、真核生物は、動物の精子および卵子のような配偶子細胞を作る。相同組換えは、生物の３界すべてにわたって、およびウイルスにおいて保存される。
【００９９】
本発明の方法は、単一の配偶子または着床前の胚（例えば、接合体）に好適であり、２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００以上の配偶子または着床前期の胚（例えば、接合体）に対する多重および同時使用にも好適であり、例えば、すべてを、同じエレクトロポレーションキュベットまたは複数の同様のもしくは同一のエレクトロポレーションキュベットにおいて、同じまたは異なる条件下で、同時にエレクトロポレーションすることができる。好ましい実施形態では、エレクトロポレーションは、１ｍｍエレクトロポレーションキュベットにおいて行われる。
【０１００】
本発明の方法は、多くの点でマイクロインジェクションより優れている。マイクロインジェクションと比較して、本方法は、はるかに効率的であり、技術的要求がはるかに少なく、標準化しやすく、胚生存率も、生殖系列伝達率も、はるかに高い。例えば、マイクロインジェクションは、典型的に、注入されたマウス胚の生存率２０〜２５％を達成することができる（例えば、注入されたマウス胚の２０〜２５％が生き延びてマウス出生児をもたらす）。対照的に、エレクトロポレーションされた（またはエレクトロポレーションされ、次いで配偶子と融合された）着床前期の胚の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％以上は、胚盤胞期の胚へと、好ましくは、マッチする対照と同等の速度で、例えば、接合体についてはエレクトロポレーション後３．５日間で発達するか、または出生トランスジェニック動物へと発達する。例えば、マッチする対照は、空のベクター、スクランブルｍＲＮＡ、および／もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのためのガイド配列がエレクトロポレーションされることもあり、または緩衝液のみがエレクトロポレーションされることもある、疑似エレクトロポレーションされた配偶子または胚であり得る。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションされた（またはエレクトロポレーションされ、次いで配偶子と融合された）着床前期の胚の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％以上が、出生トランスジェニック哺乳動物へと発達する。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、指定の遺伝子修飾を含有する出生哺乳動物の百分率によって測定される、宿主ゲノムの標的化効率は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％であるか、または１００％近くである。
【０１０３】
いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、本方法の高い標的化効率は、胚が均一なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ溶液に浸漬され、エレクトロポレーションによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬に同様に曝露されることに起因し得る。これは、技術能力レベルおよび特定の実験を取り巻く要因すべてが標的化効率の比較的大きなばらつきの一因となり得る、対応するマイクロインジェクション実験とは、正反対である。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、配偶子または着床前期の胚（例えば、接合体）は、エレクトロポレーションの前に透明帯を弱めるために前処置される。例えば、配偶子または着床前期の胚をこの目的のために酸性タイロード液（ＡＴ）中で、例えば、５〜１５秒、または１０秒間、前処置することができる。
【０１０５】
タイロード液は、アメリカ人薬理学者Ｍａｕｒｉｃｅ  Ｖｅｊｕｘ  Ｔｙｒｏｄｅによって発明されたものであり、リンガー・ロック液の改良品である。タイロード液は、間質液とほぼ等張性であり、主として、生理学実験および組織培養に使用される。タイロード液は、マグネシウム、エネルギー源としての糖（通常はグルコース）を含有し、重炭酸塩および／またはＨＥＰＥＳを緩衝剤として使用する。一部の変形形態は、リン酸イオンおよび硫酸イオンも含む。タイロード液は、細胞培養用途および生理学実験に使用される場合、典型的には、９５％酸素５％二酸化炭素で気化される。
【０１０６】
酸性タイロード液は、典型的には、ＮａＣｌ、０．８ｇ；ＫＣｌ、０．０２ｇ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２４ｇ；ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；グルコース、０．１ｇ；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．４ｇを室温で１００ｍＬの水に溶解し、Ａｎａｌａｒ  ＨＣｌ（ＢＤＨ）でｐＨ２．５に調整することによって調製することができる。ＰＶＰは、粘度を増して胚の粘着性を低下させるために添加される。その溶液を滅菌濾過し、分割して−２０℃で保管することができる。ＡＴは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（例えば、１００ｍＬパッケージはＳＫＵ  Ｔ１７８８）などの供給業者から市販されている。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、配偶子または着床前の胚（例えば、接合体）は、ＡＴ中で５〜３０秒、５〜２０秒、または５〜１０秒間、前処置される。ＡＴが希釈された場合、より長い処置時間も使用され得る。好適なＡＴ処置時間は、異なる期間にわたって配偶子または着床前の胚を処置し、その後、生存能、処置後の損傷またはアポトーシス配偶子／胚の百分率、またはその後の発達中の胚の生存率を測定することによって、実験により決定することができる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションされた配偶子または胚は、エレクトロポレーションの直後に使用することができる。例えば、それぞれ、別の配偶子との融合、または偽妊娠雌への移植などである。他の実施形態では、エレクトロポレーション後、配偶子または着床前期の胚は、保管のために凍結され、その後、次のステップ、例えば、もう一方の配偶子との融合、または偽妊娠雌への移植のために、それぞれ融解される。さらに別の実施形態では、エレクトロポレーションされた配偶子または胚は、（エレクトロポレーションされた配偶子の場合、もう一方の配偶子と先ず融合させた後）、凍結保存前に、先ず、後期胚、例えば、前期もしくは後期桑実胚、または胚盤胞期胚に発達させることができる。
【０１０９】
凍結保存は、ガラス化またはプログラム可能な緩徐凍結（ｓｌｏｗ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ）（ＳＰＦ）などの、標準技術を使用して行うことができる。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションに使用される着床前の胚、接合体、または配偶子は、凍結保存から回復させて体外受精（ＩＶＦ）により得られる。
本発明の別の態様は、本発明の方法のいずれか１つにより作製された遺伝子修飾動物（例えば、非ヒト哺乳動物）を提供する。
【０１１１】
本発明を上で一般的に説明したが、下のセクションでは、この一般説明と組み合わせて、また、関連して読むべき本発明の特定の態様についてのさらなる詳細を提供する。
本明細書に記載の特定の実施形態は、どれもみな、実施例セクションのみに記載のものを含む本発明のいずれか１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせることができることを企図したものである。
【０１１２】
２．エレクトロポレーションおよびエレクトロポレーター
エレクトロポレーションは、細胞膜上の各位置での局所膜電位に依存する動的現象である。エレクトロポレーション現象が出現するためには、所与のパルス幅およびパルス波形に対し特定の膜電位閾値（例えば、０．５Ｖ〜１Ｖ）が存在する。これにより、エレクトロポレーションの電場の大きさの閾値（Ｅｔｈ）が規定されることになる。Ｅ≧Ｅｔｈであるエリア内の細胞のみがエレクトロポレーションされる。第２の閾値（Ｅｉｒ）に達するか、またはそれを超えると、エレクトロポレーションは、細胞の生存能を損なわせことになり、その結果、不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）となる。
【０１１３】
エレクトロポレーションは、疎水性二重層コアを横断して受動的に拡散することができない大きい高荷電分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の細胞への導入を可能にする。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、エレクトロポレーションの機構は、水で満たされたｎｍ規模の穴を細胞膜に作ることを含むと考えられる。エレクトロポレーション中に、膜内の脂質分子は化学変化するのではなく、単に位置を変えて細孔を広げ、その細孔が、水で満たされているので、二重層を通る導電性経路としての機能を果すと考えられる。
【０１１４】
エレクトロポレーションは、通常、いくつかの異なる段階を有する多段プロセスである。先ず、短い電気パルスを印加しなければならない。典型的なパラメータは、膜を横断して＜１ｍｓ間に３００〜４００ｍＶであろう。細胞実験に使用される電圧は、典型的にはそれよりはるかに大きい。なぜなら、それらは、バルク溶液までの長い距離にわたって印加されるため、実際の膜の内外に結果として生じる場は、印加されたバイアスのほんの一部でしかないからである。この電位の印加により、膜は、周囲の溶液からのイオンの泳動によりコンデンサーのように荷電する。臨界場に達すると、脂質形態の迅速な局部的再配列がある。結果として得られる構造は、電気伝導性ではなく、導電性細孔の生成を迅速にもたらすものであるので、「前駆細孔（ｐｒｅ−ｐｏｒｅ）」であると考えられる。そのような前駆細孔の存在の証拠は、導電性状態と絶縁状態間の移行を示唆する、細孔の「ちらつき」から主として得られる。それは、これらの前駆細孔が、小さい（約３Å）疎水性欠陥であることを示唆している。この理論が正しければ、脂質ヘッドが折り重なって親水性界面を生成する、細孔縁部での再配列によって、導電性状態への移行を説明することができるだろう。最後に、これらの導電性細孔は、回復し、閉じた二重層を再びもたらすこともあり、または拡大して最終的に破裂することもある。結果としてどうなるのかは、臨界欠陥サイズを超えるかどうかに依存し、そしてまたこの臨界欠陥サイズを超えるかどうかは、印加される場、局所機械的応力、および二重層縁部エネルギーに依存する。
【０１１５】
本発明によれば、配偶子および着床前の胚のエレクトロポレーションは、細胞溶液中で電磁場を生じさせる電気器具である、市販のエレクトロポレーターを用いて、行うことができる。例示的な、しかし非限定的な、市販のエレクトロポレーターモデルとしては、ＢＴＸ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からの、ＥＣＭ（商標）８３０方形波エレクトロポレーター、または２００１エレクトロ・セル・マニュピュレーター（ＥＣＭ  ２００１）が挙げられる。
【０１１６】
典型的な設定では、両端に２つのアルミニウム電極を有するガラスまたはプラスチックキュベットに配偶子または着床前の胚の懸濁液をピペットで移す。エレクトロポレーションの前に、配偶子または着床前の胚と、該配偶子または着床前の胚に導入すべき（生体）物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質、またはそれらの混合物）とを穏やかに混合する。この混合物は、キュベット（例えば、１ｍｍもしくは２ｍｍ幅キュベット）にピペットで移す前に作製してもよく、またはキュベットの中で作製してもよい。典型的には、総体積約２０μＬの懸濁混合物を使用するが、総体積１０〜２００μＬ、２０〜１００μＬ、２５〜７５μＬを使用することもできる。次いで、電圧およびキャパシタンスを設定し（下記参照）、キュベットをエレクトロポレーターに挿入する。エレクトロポレーション直後に、胚の生存に最適な液体媒体の所定量（例えば、全キュベット内容物と等しい容積、２０〜２００μＬ、または１００μＬ）をキュベットに添加して、エレクトロポレーションされた混合物を洗い流し、全内容物を適切な容器（例えば、組織培養皿）に回収する。
【０１１７】
エレクトロポレーションされた配偶子または着床前の胚の生存、および培養物または出生動物へのそれらの発達は、ある程度まで、エレクトロポレーション媒体が生理溶液でない場合、そのエレクトロポレーション媒体の注意深い洗浄および除去に依存する。生理溶液は、胚の発達に適切な等張性環境を提供するばかりでなく、胚の発達／生存に潜在的に有害な一切の物質を除去することもでき、そのような物質は、導電性でないこともある。
【０１１８】
好ましくは洗浄後、配偶子および着床前の胚を、偽妊娠雌に移植するか、または最適な温度および／もしくは大気条件（例えば、３７℃で、５％ＣＯ２または５％Ｏ２／５％ＣＯ２／窒素）で必要な期間インキュベートした後、３．５日胚盤胞期の胚などの発達中の胚を、臨月まで発達して生存動物として生まれるように代理母／偽妊娠雌に移植する。
【０１１９】
ＥＣＭ  ８３０またはＥＣＭ  ２００１モデルで使用することができるような、典型的なエレクトロポレーション条件は、１ｍｍエレクトロポレーションキュベットで、２０〜４０ボルト（例えば、２５〜３５ボルト、または３０ボルト、または２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ボルト）、パルス幅１〜２ｍｓ（例えば、１．０または１．５ｍｓ）、１〜３パルス（例えば、２パルス）、パルス間隔１００〜１０００ｍｓ（例えば、１００ｍｓ、または１２５〜１３０ｍｓ）の設定を使用して、エレクトロポレーションを行うことを含み得る。ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションは、４、５、６、７、８、９または１０サイクル（または６〜８サイクル）で行われ、各サイクルは、３０Ｖで、パルス幅が各々１または１．５ｍｓの２パルスで行われ、パルス間隔は１００ｍｓである。
【０１２０】
しかし、本明細書で開示される条件が説明に役立つことを目的としたものであり、限定的なものではないと、理解されたい。当業者は、例えば、導入すべき分子のサイズおよび量、配偶子または胚の型などに基づいて、パラメータを容易に調整することができる。
【０１２１】
エレクトロポレーションは、市販のベンチトップ型エレクトロポレーター、例えば、ＢＴＸからのＥＣＭ８３０もしくはＥＣＭ２００１モデル、およびＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（登録商標）デバイス（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）で行うことができる。一部のユニットは、マルチウェル細胞培養皿に適合する特別な電極集合体を用いて同時に複数の試料をエレクトロポレーションする可能性を提供する。ベンチトップ型エレクトロポレーターを多様な動作パラメータに設定することもでき、それによってオペレーターは、場の強度などの特定のパラメータを探究または最適化することができる。
【０１２２】
３．哺乳動物
上で説明したような、異型配偶子融合を経験する多細胞真核動物以外に、本発明の方法は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コットンラット、ハダカデバネズミ）、ウサギ、家畜哺乳動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、ウシ、ウマ、ラクダ科動物）、ペット哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）、動物園の哺乳動物、有袋目の哺乳動物、絶滅危惧哺乳動物、およびそれらのすべての非近交系または任意交配集団を含む、任意の哺乳動物に特に好適である。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、哺乳動物は、近交系マウスなどの、マウスである。
例示的な近交系マウス系統としては、限定ではないが、近交系のマウス系列Ｃ３Ｈ、例えば、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＦＶＢ、ＮＯＤ、ＢＡＬＢ／ｃ、１２９、Ｃ５７ＢＬ、およびＣ５７ＢＬマウスが挙げられ、Ｃ５７ＢＬマウスには、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ、Ｃ５７ＢＬ／１０などが含まれる。
【０１２４】
組換え近交系統を含む、他の近交系マウス系統としては、（限定ではないが）次のものが含まれる：１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ、１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪ、１２９Ｘ１／ＳｖＪ、１２９Ｐ３／Ｊ、Ａ／Ｊ、ＡＫＲ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＢＡＬＢ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、Ｃ５８、ＣＢＡ／ＣａＨＮ−Ｂｔｋｘｉｄ／Ｊ、ＣＢＡ／Ｊ、ＤＢＡ／１Ｊ、ＤＢＡ／１ＬａｃＪ、ＤＢＡ／２Ｊ、ＦＶＢ／ＮＪ、ＭＲＬ／ＭｐＪ、ＮＯＤ／ＬｔＪ、ＳＪＬ／Ｊ、ＳＷＲ／Ｊ、ＮＯＲ／ＬｔＪ、ＮＺＢ／ＢｌＮＪ、ＮＺＷ／ＬａｃＪ、ＲＢＦ／ＤｎＪ、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ、ＡＪＴＡＣ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃ、ＢＡＬＢ／ｃＪＢｏｍＴａｃ、ＢＡＬＢ／ｃＡＢｏｍＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｇＡｉＴａｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＴａｃ、ＣＢＡ／ＪＢｏｍＴａｃ、ＤＢＡ／１ＪＢｏｍＴａｃ、ＤＢＡ／２ＮＴａｃ、ＤＢＡ／２ＪＢｏｍＴａｃ、ＦＶＢ／ＮＴａｃ、ＮＯＤ／ＭｒｋＴａｃ、ＮＺＭ／ＡｅｇＴａｃ、ＳＪＬ／ＪｃｒＮＴａｃ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＢＲ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌＢＲ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＢＲ、ＤＢＡ／２ＮＣｒｌＢＲ、ＦＶＢ／ＮＣｒｌＢＲ、Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＣｒｌＢＲ、１２９／ＳｖＰａｓＩｃｏＣｒｌＢＲ、ＳＪＬ／ＪｏｒｌＩｃｏＣｒｌＢＲ、Ａ／ＪｏｌａＨｓｄ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＨｓｄ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＮＨｓｄ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ、ＣＢＡ／ＪＣｒＨｓｄ、ＤＢＡ／２ＮＨｓｄ、ＦＶＢ／ＮＨｓｄ、ＳＡＭＰ１／ＫａＨｓｄ、ＳＡＭＰ６／ＴａＨｓｄ、ＳＡＭＰ８／ＴａＨｓｄ、ＳＡＭＰ１０／ＴａＨｓｄ、ＳＪＬ／ＪＣｒＨｓｄ、ＡＫＲ／ＯｌａＨｓｄ、ＢｉｏｚｚｉＡＢＨ／ＲｉｊＨｓｄ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄ、ＦＶＢ／ＮｈａｎＨｓｄ、ＭＲＬ／ＭｐＯｌａＨｓｄ、ＮＺＢ／ＯｌａＨｓｄ、ＮＺＷ／ＯｌａＨｓｄ、ＳＷＲ／ＯｌａＨｓｄ、１２９Ｐ２／ＯｌａＨｓｄ、および１２９Ｓ２／ＳｖＨｓｄ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ、１２９Ｘ１／ＳｖＪ、Ｂ１０．Ａ−Ｈ２ａ  Ｈ２−Ｔ１８ａ／ＳｇＳｎＪ、Ｂ１０．Ｄ２−Ｈｃ０  Ｈ２ｄ  Ｈ２−Ｔ１８ｃ／ｏＳｎＪ、Ｂ１０．Ｄ２−Ｈｃ１  Ｈ２ｄ  Ｈ２−Ｔ１８ｃ／ｎＳｎＪ、Ｂ１０．ＲＩＩＩ−Ｈ２ｒ  Ｈ２−Ｔ１８ｂ／（７１ＮＳ）ＳｎＪ、Ｂ６（Ｃ）−Ｈ２−Ａｂ１ｂｍ１２／ＫｈＥｇＪ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｉｌ１０ｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｎｏｓ２ｔｍ１Ｌａｕ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｎｏｓ３ｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｃｄ８ａｔｍ１Ｍａｋ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈ−６ｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｉｆｎｇｔｍ１Ｔｓ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ、Ｂ６．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳｚＪ、Ｂ６．ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ、Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂ／Ｊ、ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ  ＋／＋  Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ  Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＡＰＯＡ１）���Ｒｕｂ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ、ＣＢＡ／ＣａＨＮ−Ｂｔｋｘｉｄ／Ｊ、ＣＢＡ／ＣａＪ、ＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、ＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（ＭＭＴＶｎｅｕ）２０２Ｍｕｌ／Ｊ、ＫＫ．Ｃｇ−Ａｙ／Ｊ、ＭＲＬ／ＭｐＪ、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ、ＳＪＬ／Ｊ、ＳＷＲ／Ｊ、Ｂ１０．ＰＬ−Ｈ２ｕ  Ｈ２−Ｔ１８ａ／（７３ＮＳ）ＳｎＪ、ＮＯＮｃＮＺＯ５／ＬｔＪ、ＷＲ、ＢＰＨ／２、ＢＰＬ／１、ＦＳ、Ｐ／Ｊ、Ｐ／Ａ、ならびにＰＲＯ。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、マウスには、すべての遺伝子改変された（例えば、トランスジェニック、ノックアウト、ノックイン、ノックダウン、レトロウイルス、ウイルス）または化学的に誘導された突然変異（例えば、突然変異型のアーカイブも含む、ＥＮＵ、ＥＭＳ）；放射線誘導突然変異；マウス系統において、特に、例えば、共通遺伝子系統および組換え共通遺伝子系統を含む、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、ＦＶＢ、Ｃ３Ｈ、ＮＯＤ、ＤＢＡ／２、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＤ−１に由来する突然変異体において維持される自然突然変異／修飾を有する、変異体も含まれる。具体的な例としては、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ４−Ｐｄｙｎｔｍ１Ｕｔｅ／Ｊ、Ｂ６；１２９Ｐ２−Ｐｅｍｔｔｍ１Ｊ／Ｊ、ＮＯＤ．Ｃｇ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ−Ｂ２ｍｂ／Ｄｖｓなどが挙げられる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、マウスは、混合型近交系統を含む、２つの近交系統を交配させることにより産生されたマウス交雑系統である。例示的な交雑系統としては、ＮＺＢＷＦ１／Ｊ、Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊ、Ｂ６ＳＪＬＦ１／Ｊ、ＣＢ６Ｆ１／Ｊ、ＣＢｙＢ６Ｆ１／Ｊ、ＰＬＳＪＬＦ１／Ｊ、ＷＢＢ６Ｆ１／Ｊ−ＫｉｔＷ／ＫｉｔＷ−ｖ、Ｂ６１２９ＰＦ１／Ｊ、ＣＡＦ１／Ｊ、Ｂ６１２９ＰＦ２／Ｊ、Ｂ６１２９ＳＦ１／Ｊ、Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊ、Ｂ６ＡＦ１／Ｊ、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／Ｊ、Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊ、およびＢ６ＳＪＬＦ１／Ｊが挙げられる。
【０１２７】
交雑系統のいずれにおいても、比率は、５０：５０Ｆ１から９９：１Ｆ１まで様々であり得る。
ある特定の実施形態では、マウスは、非近交系マウス、例えば、ＣＤ−１；ＩＣＲ；ブラックスイス；スイスウェブスター；ＮＩＨスイス；ＣＦ−１、およびヌードマウスである。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、ラットは、近交系ラット、例えば、ＡＣＩ、ブラウンノルウェー（ＢＮ）、ＢＣＩＸ、コペンハーゲン（ＣＯＰ）、ＭＷＦ、Ｄアグーチ（ＤＡ）、後藤・柿崎（ＧＫ）、ルイス、フィッシャー３４４（Ｆ３４４）、ウィスター・ファース（ＷＦ）、ウィスター京都（ＷＫＹ；ＷＫＹＮ１）、またはＺＤＦである。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、ラットには、すべての遺伝子改変された（例えば、トランスジェニック、ノックアウト、ノックイン、ノックダウン、レトロウイルス、ウイルス）または化学的に誘導された突然変異（例えば、突然変異型のアーカイブも含む、ＥＮＵ）；放射線誘導突然変異；共通遺伝子系統を含むラット系統において維持される自然突然変異／修飾を有する、変異体も含まれる。具体的な例としては、Ｆ３４４／ＮＴａｃ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ｂ２７）−Ｔｇ（２Ｍ）３３−３Ｔｒｇ；ＨｓｄＡｍｃ：ＴＲ−Ａｂｃｃ２；ＨｓｄＨｌｒ：ＺＵＣＫＥＲ−Ｌｅｐｒｆａ；およびＮＩＨヌードが挙げられる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、ラットは、２つの近交系統を交配させることにより産生されたラット交雑系統である。例示的な交雑系統としては、ＢＨＲ、ＦＢＮＦ１／Ｈｓｄ、およびＬＢＮＦ１／Ｈｓｄが挙げられる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、ラットは、非近交系ラット、例えば、ホルツマン、スプラーグドーリー、ロングエバンス、ウィスター、ウィスター・ハン、ＷＨ、ＷＫＹ、ツッカー、ＪＣＲ（ラッセルラット）、およびＯＦＡである。
【０１３２】
４．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮまたはＢｕｄＤを使用するゲノム修飾または編集
本明細書に記載の発明は、目的の動物のゲノムを修飾または「編集」するための強力なツールであって、前記動物の修飾または編集されたゲノムを生殖系列伝達によって伝えることができるようなツールを提供する。
【０１３３】
より具体的には、ゲノム修飾または編集を使用して、例えば異種導入遺伝子を導入することにより、または標的内在性遺伝子の発現を阻害することにより、目的の動物（例えば、哺乳動物）のゲノム配列を変化させることができる。そのような遺伝子修飾動物を使用して、例えば、特定の遺伝疾患または障害に対応する関連動物モデルを確立することができる。そのような動物モデルを使用して、疾患の機序、進行、予防および処置を探究または研究すること（例えば、薬物スクリーニングおよび前臨床試験）ができる。
【０１３４】
動物モデルで表すことができる、説明に役立つ（非限定的な）ヒト疾患または障害としては、様々な型のがん、心疾患、高血圧、代謝およびホルモン障害、糖尿病、肥満、骨粗鬆症、緑内障、皮膚色素沈着症、失明、聴覚喪失、神経変性疾患（例えば、ハンチントンまたはアルツハイマー病）、精神障害（不安およびうつ病を含む）、および先天異常（例えば、口蓋裂および無脳症）が挙げられる。
【０１３５】
現在入手できるほとんどの動物モデルは、マウスで作製され、それらは、いずれかの特定のヒト疾患の一部の態様を再現するが、すべての態様を再現することはできない。マウスモデルを使用して模倣することが困難であり得るある特定の疾患、例えば、多くの神経変性疾患（これらのほとんどが失認を含む）のために、本発明の方法を使用して、非ヒト霊長類で動物モデルを作製することができる。例えば、ハンチントン病のトランスジェニックモデルが、ヒトで起こるようなこの障害の特徴的な病態の一部を再現したアカゲザルを使用して、最近開発された（Ｙａｎｇら、２００８）。
【０１３６】
ゲノム編集は、ＺＦＮ／ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ技術などの、当技術分野で認知されている任意の技術を使用して行うことができる（Ｇａｊら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３１（７）：３９７〜４０５（２０１３）による総説を参照されたく、この文献の本文全体およびそこに引用されているすべての参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる）。好ましい実施形態では、ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して、Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを非ヒト哺乳動物の配偶子または着床前の胚（例えば、接合体）にエレクトロポレーションすることによって行われる。
【０１３７】
そのような技術により、様々な細胞型および生物の事実上あらゆる遺伝子を操作することが可能になり、特定のゲノム位置での誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を刺激するＤＮＡ二本鎖（ＤＳＢ）切断を誘導することにより広範な遺伝子修飾が可能になる。
【０１３８】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、非特異的ＤＮＡ切断ドメインに結合されたプログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合モジュールで構成されているキメラヌクレアーゼである。それらは、ジンクフィンガーまたはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと融合させることにより作製された人工制限酵素（ＲＥ）である。ジンクフィンガー（ＺＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を任意の所望の標的ＤＮＡ配列に結合するように改変し、ＲＥのＤＮＡ切断ドメインと融合させ、かくて所望の標的ＤＮＡ配列に特異的である改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）制限酵素（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）を作出することができる。ＺＦＮ／ＴＡＬＥＮを着床前の胚（例えば、接合体）の細胞などの細胞に導入すると、それを生体内原位置でのゲノム編集に使用することができる。実際、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの多用途性を、転写活性化因子および抑制因子、リコンビナーゼ、トランスポサーゼ、ＤＮＡおよびヒストンメチルトランスフェラーゼ、ならびにヒストンアセチルトランスフェラーゼなどの、ヌクレアーゼ以外のエフェクタードメインに拡大して、ゲノム構造および機能に影響を与えることができる。
【０１３９】
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメインは、真核生物に見られるＤＮＡ結合モチーフ最も一般的な型の１つであり、ヒトゲノムにおいて２番目に多くコードされているタンパク質ドメインである。個々のジンクフィンガーは、保存されたββα立体配置の約３０個のアミノ酸を有する。特異的ＤＮＡ認識のためのジンクフィンガータンパク質の利用の鍵は、ジンクフィンガードメインを３個より多く含有する非天然アレイの開発であった。この進歩は、長さ９〜１８ｂｐのＤＮＡ配列を認識する合成ジンクフィンガータンパク質の構築を可能にする高度に保存されるリンカー配列の、構造に基づいた発見によって助長された。この設計は、複雑なゲノムにおいて特異的である隣接ＤＮＡ配列を認識するジンクフィンガータンパク質を構築するための最適な戦略であることが立証された。好適なジンクフィンガーは、モジュラー構築手法により（例えば、大きいコンビナトリアルライブラリーの選択によりまたは合理的設計により作製されるジンクフィンガーモジュールの予め選択されたライブラリーを使用して）得ることができる。６４種の可能性のあるヌクレオチドトリプレットのほぼすべてを認識するジンクフィンガードメインが開発されており、予め選択されたジンクフィンガーモジュールを互いにタンデムに結合させて、一連のこれらのＤＮＡトリプレットを含有するＤＮＡ配列を標的とすることができる。あるいは、オリゴマー化プール工学（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ  ｐｏｏｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（ＯＰＥＮ）などの、選択に基づいた手法を使用して、隣接フィンガー間の状況依存的相互作用を考慮に入れる無作為化ライブラリーから新たなジンクフィンガーアレイを選択することができる。これら２つの手法の組合せも使用される。
【０１４０】
改変ジンクフィンガーは、市販されている。Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と協力して、研究者がジンクフィンガー構築および検証を完全に回避できるようにするジンクフィンガー構築用の有標プラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発したので、何千ものタンパク質が既に利用可能である。概して、ジンクフィンガータンパク質技術は、事実上あらゆる配列の標的化を可能にする。
【０１４１】
ＴＡＬエフェクターは、ＤＮＡ結合ドメインが１２番目および１３番目のアミノ酸を除いて高度に保存された３３〜３４アミノ酸の反復配列を含有する、植物病原性キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌によって分泌されるタンパク質である。これら２箇所の位置は、高可変性（反復可変二残基、またはＲＶＤ）であり、特異的ヌクレオチド認識との強い相関関係を示す。アミノ酸配列とＤＮＡ認識とのこの単純な関係は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組合せを選択することにより特定のＤＮＡ結合ドメインの改変を可能にした。ジンクフィンガーと同様に、モジュラーＴＡＬＥリピートは、隣接ＤＮＡ配列を認識するように互いに結合されている。ヌクレアーゼ、転写活性化因子および部位特異的リコンビナーゼを含む、標的化遺伝子修飾のためのＴＡＬＥリピートとの融合に利用することができる非常に多くのエフェクタードメインが、作製されてきた。カスタムＴＡＬＥアレイの迅速な構築は、「ゴールデンゲート」分子クローニング、高処理量固相構築、およびライゲーション非依存性クローニング技術を含む戦略を使用することにより、達成することができ、前記戦略はすべて、クローニングされた幹細胞のゲノム編集のために本発明で使用することができる。
【０１４２】
ＴＡＬＥリピートは、１８，７４０のヒトタンパク質コード遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリー（Ｋｉｍら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３１：２５１−２５８（２０１３））などの、当技術分野において入手できる非常に多くのツールを使用して容易に構築することができる。注文設計ＴＡＬＥアレイも、例えば、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、ＵＳＡ）、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を介して市販されている。
【０１４３】
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（または切断特異性および／もしくは切断活性を改善するように設計された突然変異を有するＦｏｋＩ切断ドメイン変異体、例えば、Ｓｈａｒｋｅｙ）などの、ＲＥの末端からの非特異的ＤＮＡ切断ドメインを使用して、酵母アッセイにおいて活性（植物細胞および動物細胞においても活性）であるハイブリッドヌクレアーゼを構築することができる。ＺＦＮ活性を改善するために、一時的低温培養条件を使用して、ヌクレアーゼ発現レベルを上昇させることができ、部位特異的ヌクレアーゼとＤＮＡ末端処理酵素の同時送達、ならびにＺＦＮ修飾細胞およびＴＡＬＥＮ修飾細胞の濃縮を可能にする蛍光代替レポーターベクターの使用も、用いることができる。ニックが入ったＤＮＡの導入が、誤りがちなＮＨＥＪ修復経路を活性化することなくＨＤＲを刺激するという発見を活用する、ジンクフィンガーニッカーゼ（ＺＦＮニッカーゼ）の使用により、ＺＦＮ媒介ゲノム編集の特異性をさらに正確にすることもできる。
【０１４４】
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との単純な関係により、設計可能なタンパク質が可能になる。公表されているソフトウェアプログラム（ＤＮＡＷｏｒｋｓ）を使用して、２ステップＰＣＲでの構築に好適なオリゴヌクレオチドを算出することができる。改変ＴＡＬＥ構築物を作製するための多数のモジュラー構築機構も報告されており、当技術分野において公知である。両方の方法が、ＤＮＡ結合ドメインを改変するための系統的手法を提供し、この手法は、ジンクフィンガーＤＮＡ認識ドメインを作製するためのモジュラー構築方法と概念的に類似している。
【０１４５】
ＴＡＬＥＮ遺伝子が構築されたら、それらは、プラスミドベクター、様々なウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を使用する、カチオン性脂質に基づいた試薬を使用するエレクトロポレーションまたはトランスフェクションなどの、当技術分野において認知されている任意の方法を使用して、ベクターで標的細胞に導入される。あるいは、ＴＡＬＥＮをｍＲＮＡとして細胞に送達することができ、これによりＴＡＬＥＮ発現タンパク質のゲノム組込みの可能性が排除される。それは、相同組換え修復（ＨＤＲ）のレベルおよび遺伝子編集中の遺伝子移入成功を劇的に増加させることもできる。最後に、精製ＺＦＮ／ＴＡＬＥＮタンパク質の細胞への直接送達も使用することができる。この手法は、挿入突然変異のリスクを伴わず、核酸からの発現に依存する送達系に比べてもたらすオフターゲット作用が少なく、したがって、インスタント幹細胞などの細胞における正確なゲノム改変を必要とする研究に最適に使用することができる。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、ＴＡＬＥＮ遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を本発明のエレクトロポレーション方法に従って配偶子および着床前の胚に導入することができる。
【０１４６】
ＴＡＬＥＮを使用して、細胞が修復機構で対応する二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによりゲノムを編集することができる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、二本鎖切断部の両側からＤＮＡをつなぎ直し、この場合、アニーリングのための配列重複が、ほとんどまたは全くない。ＰＣＲによって増幅された２つの対立遺伝子間のあらゆる差を検出する簡単なヘテロ二重鎖切断アッセイを実行することができる。切断産物を単純なアガロースゲルまたは平板ゲルシステムで可視化することができる。あるいはＤＮＡを外来性二本鎖ＤＮＡ断片の存在下でＮＨＥＪによってゲノムに導入することができる。相同組換え修復は、トランスフェクトされた二本鎖配列が修復酵素の鋳型として使用されるので、ＤＳＢ時に外来ＤＮＡを導入することもできる。ＴＡＬＥＮは、安定的に修飾されたヒト胚性幹細胞を作製するために、ならびにノックアウト線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ラットおよびゼブラフィッシュを作製するための誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）クローンを作製するために、使用されている。
【０１４７】
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、疾患の基礎原因を修正することができ、したがって、正確なゲノム修飾を用いて症状を永久に除去することができる。例えば、ＺＦＮ誘導ＨＤＲは、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、血友病Ｂ、鎌状赤血球症、α１アンチトリプシン欠損症および非常に多くの他の遺伝疾患に関連する、疾患を引き起こす突然変異を、欠損した標的遺伝子の修復または標的遺伝子のノックアウトのどちらかにより、直接修正するために使用されている。加えて、これらの部位特異的ヌクレアーゼを使用して、治療用導入遺伝子を標的動物ゲノム内の特定の「セーフハーバー」位置における対象配偶子または着床前の胚に安全に挿入することもできる。このような技術を遺伝子療法において使用して、動物の所与のゲノム内の特定の遺伝子欠陥を「修正する」ことができる。
【０１４８】
あるいは、好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、対象配偶子および着床前の胚へ標的化遺伝子変化を効率的に誘導することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムまたは「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」は、複数の短いダイレクトリピートを含有する遺伝子座であり、細菌および古細菌に対する獲得免疫をもたらす。ＣＲＩＳＰＲシステムは、侵入してくる外来ＤＮＡの配列特異的サイレンシングをｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに依存する。用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、トランス活性化キメラＲＮＡを表し、該トランス活性化キメラＲＮＡは、ｃｒＲＮＡプロセシングを促進し、Ｃａｓ９によるＲＮＡ誘導型切断の活性化に必要とされる、ノンコーディングＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ塩基は、ｔｒａｃｒＲＮＡと対合して２ＲＮＡ構造を形成し、該２ＲＮＡ構造が、切断のために相補的ＤＮＡ部位へＣａｓ９エンドヌクレアーゼを誘導する。
【０１４９】
３つの型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが存在し、ＩＩ型システムでは、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ標的認識に基づいてＤＮＡを切断するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する。細菌の場合、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断によって侵入してくる外来ＤＮＡに対する獲得免疫をもたらす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを再び標的として、ｃｒＲＮＡを設計し直すことにより事実上あらゆるＤＮＡ配列を切断することができる。実際、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現するプラスミドと必要ｃｒＲＮＡ成分を発現するプラスミドの同時送達によりヒト細胞に直接移入可能であることが証明されている。これらのプログラム可能なＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、多重遺伝子破壊能力およびｉＰＳ細胞への標的組込みを示したので、そのようなエンドヌクレアーゼを本方法においても同様に使用することができる。
【０１５０】
任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、関連Ｃａｓタンパク質およびＲＮＡガイド配列、ならびにそれらのコード配列（例えば、Ｃａｓ９のｍＲＮＡ、もしくはガイドＲＮＡのコード配列）またはそのようなコード配列を包含するベクターを含めて、本発明の方法とともに使用することができる。米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１および米国特許第８，６９７，３５９号に記載のもの（すべて参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【０１５１】
以降の説明において、ＲＮＡガイド配列は、「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」とも称され、これは、標的化配列を含み、修飾ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）とともに、標的ＤＮＡおよび／または標的ＤＮＡと会合しているポリペプチドの部位特異的修飾をもたらす。
【０１５２】
以降の説明において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおけるＣａｓ９型のタンパク質は、「部位特異的修飾ポリペプチド」とも称される。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、会合しているポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）の活性を標的ＤＮＡ内の特定の標的配列に指向させる。対象ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、第１のセグメント（本明細書では「ＤＮＡ標的化セグメント」または「ＤＮＡ標的化配列」とも称される）および第２のセグメント（本明細書では「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」とも称される）を含む。
【０１５３】
ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。対象ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）によって配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は様々であってよく、そのようなヌクレオチド配列により、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用することになる標的ＤＮＡ内の位置が決まる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列とハイブリダイズするように（例えば、遺伝子操作により）修飾することができる。
【０１５４】
ＤＮＡ標的化セグメントは、１２ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜８０ｎｔ、１２ｎｔ〜５０ｎｔ、１２ｎｔ〜４０ｎｔ、１２ｎｔ〜３０ｎｔ、１２ｎｔ〜２５ｎｔ、１２ｎｔ〜２０ｎｔ、または１２ｎｔ〜１９ｎｔの長さを有することができる。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、１９ｎｔ〜２０ｎｔ、１９ｎｔ〜２５ｎｔ、１９ｎｔ〜３０ｎｔ、１９ｎｔ〜３５ｎｔ、１９ｎｔ〜４０ｎｔ、１９ｎｔ〜４５ｎｔ、１９ｎｔ〜５０ｎｔ、１９ｎｔ〜６０ｎｔ、１９ｎｔ〜７０ｎｔ、１９ｎｔ〜８０ｎｔ、１９ｎｔ〜９０ｎｔ、１９ｎｔ〜１００ｎｔ、２０ｎｔ〜２５ｎｔ、２０ｎｔ〜３０ｎｔ、２０ｎｔ〜３５ｎｔ、２０ｎｔ〜４０ｎｔ、２０ｎｔ〜４５ｎｔ、２０ｎｔ〜５０ｎｔ、２０ｎｔ〜６０ｎｔ、２０ｎｔ〜７０ｎｔ、２０ｎｔ〜８０ｎｔ、２０ｎｔ〜９０ｎｔ、または２０ｎｔ〜１００ｎｔの長さを有することができる。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的化配列）は、少なくとも１２ｎｔの長さを有することができる。例えば、標的ＤＮＡの標的配列に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも３５ｎｔ、または少なくとも４０ｎｔの長さを有することができる。例えば、標的ＤＮＡの標的配列に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜８０ｎｔ、１２ｎｔ〜５０ｎｔ、１２ｎｔ〜４５ｎｔ、１２ｎｔ〜４０ｎｔ、１２ｎｔ〜３５ｎｔ、１２ｎｔ〜３０ｎｔ、１２ｎｔ〜２５ｎｔ、１２ｎｔ〜２０ｎｔ、１２ｎｔ〜１９ｎｔ、１９ｎｔ〜２０ｎｔ、１９ｎｔ〜２５ｎｔ、１９ｎｔ〜３０ｎｔ、１９ｎｔ〜３５ｎｔ、１９ｎｔ〜４０ｎｔ、１９ｎｔ〜４５ｎｔ、１９ｎｔ〜５０ｎｔ、１９ｎｔ〜６０ｎｔ、２０ｎｔ〜２５ｎｔ、２０ｎｔ〜３０ｎｔ、２０ｎｔ〜３５ｎｔ、２０ｎｔ〜４０ｎｔ、２０ｎｔ〜４５ｎｔ、２０ｎｔ〜５０ｎｔ、または２０ｎｔ〜６０ｎｔの長さを有することができる。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的化配列）は、少なくとも１２ｎｔの長さを有することができる。
【０１５５】
一部の実施形態では、標的ＤＮＡの標的配列に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、長さが２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ＤＮＡの標的配列に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、長さが１９ヌクレオチドである。
【０１５６】
ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の最も５’側の７個の連続するヌクレオチドに関して１００％である。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡの標的配列との相補性パーセントは、２０個の連続するヌクレオチドに関して少なくとも６０％である。一部の実施形態において、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の最も５’側の１４個の連続するヌクレオチドに関して１００％であり、残部に関しては０％ほども低い。そのような実施形態では、ＤＮＡ標的化配列は、長さが１４ヌクレオチドであると見なすことができる。一部の実施形態において、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の最も５’側の７個の連続するヌクレオチドに関して１００％であり、残部に関しては０％ほども低い。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は、長さが７ヌクレオチドであると見なすことができる。
【０１５７】
対象ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する。対象ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、結合しているポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に上述のＤＮＡ標的化セグメントによって誘導する。対象ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的である、ヌクレオチドの２つのストレッチを含む。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。
【０１５８】
対象二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む。対象二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの２つのＲＮＡ分子の各々は、互いに相補的であるヌクレオチドのストレッチを含み、その結果、２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドがハイブリダイズして、タンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成する。
【０１５９】
一部の実施形態では、活性化ＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子（例えば、参照により組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号４３１〜５６２に記載のもの）の１つまたはその相補配列と少なくとも６０％同一である。例えば、活性化ＲＮＡの二重鎖形成セグメント（または活性化ＲＮＡの二重鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）は、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号４３１〜５６２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の１つまたはその相補配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一である。
【０１６０】
一部の実施形態では、標的化ＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号５６３〜６７９（参照により組み入れられる）に記載の標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列の１つまたはその相補配列と少なくとも６０％同一である。例えば、標的化ＲＮＡの二重鎖形成セグメント（または標的化ＲＮＡの二重鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）は、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号５６３〜６７９に記載のｃｒＲＮＡ配列の１つまたはその相補配列と少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一である。
【０１６１】
２分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡを、標的化ＲＮＡと活性化ＲＮＡの制御された（すなわち、条件付きの）結合を可能にするように設計することができる。２分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、活性化ＲＮＡと標的化ＲＮＡの両方がｄＣａｓ９との機能性複合体の状態で結合していない限り機能性でないため、２分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、活性化ＲＮＡと標的化ＲＮＡとの結合を誘導性にさせることにより誘導性（例えば、薬物誘導性）になることができる。１つの非限定的な例として、ＲＮＡアプタマーを使用して、活性化ＲＮＡと標的化ＲＮＡの結合を調節（すなわち、制御）することができる。したがって、活性化ＲＮＡおよび／または標的化ＲＮＡは、ＲＮＡアプタマー配列を含むことができる。
【０１６２】
ＲＮＡアプタマーは、当技術分野において公知であり、一般に、リボスイッチの合成バージョンである。用語「ＲＮＡアプタマー」および「リボスイッチ」は、それらがその一部であるＲＮＡ分子の構造（およびしたがって、特定の配列の利用可能性）の誘導調節をもたらす合成および天然両方の核酸配列を包含するように本明細書では同義で使用される。ＲＮＡアプタマーは、特定の薬物（例えば、小分子）に特異的に結合する特定の構造（例えば、ヘアピン）に折り畳める配列を通常は含む。薬物の結合は、ＲＮＡの折り畳みの構造変化を引き起こし、これにより、アプタマーがその一部である核酸の特徴が変化する。非限定的な例として、（ｉ）アプタマーを伴う活性化ＲＮＡは、そのアプタマーに適切な薬物が結合しない限り、同族標的ＲＮＡと結合することができない可能性がある、（ｉｉ）アプタマーを伴う標的化ＲＮＡは、そのアプタマーに適切な薬物が結合しない限り、同族活性化ＲＮＡと結合することができない可能性がある、および（ｉｉｉ）異なる薬物に結合する異なるアプタマーを各々が含む、標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡは、両方の薬物が存在しない限り、互いに結合することができない可能性がある。これらの例によって説明されるように、２分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡを誘導性になるように設計することができる。
【０１６３】
アプタマーおよびリボスイッチの例は、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ、２０１２年５月、１７（５）：３４４〜３６４；Ｖａｖａｌｌｅら、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｃａｒｄｉｏｌ．、２０１２年５月、８（３）：３７１〜３８２；Ｃｉｔａｒｔａｎら、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．、２０１２年４月１５日、３４（１）：１〜１１；およびＬｉｂｅｒｍａｎら、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｒｅｖ．ＲＮＡ、２０１２年５〜６月、３（３）：３６９−３８４において見いだすことができ、これらの文献のすべては、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６４】
２分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡに含めることができるヌクレオチド配列の非限定的な例としては、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号４３１〜５６２に記載の配列、または米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号５６３〜６７９に記載の任意の配列と対合するそれらの相補配列、またはハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントを形成することができるそれらの相補配列が挙げられる。
【０１６５】
一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ヌクレオチド（標的化ＲＮＡおよび活性化ＲＮＡ）の２つのストレッチを含み、これらのストレッチは、互いに相補的であり、介在ヌクレオチド（「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」）によって共有結合しており、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するため、結果的にステムループ構造となる。標的化ＲＮＡと活性化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの３’末端と活性化ＲＮＡの５’末端を介して共有結合することもある。あるいは、標的化ＲＮＡと活性化ＲＮＡは、標的化ＲＮＡの５’末端と活性化ＲＮＡの３’末端を介して共有結合していることもある。
【０１６６】
一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡのリンカーは、３ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、リンカーは、３ヌクレオチド（ｎｔ）〜９０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）〜８０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）〜７０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）〜６０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）〜５０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）〜４０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）〜３０ｎｔ、３ヌクレオチド（ｎｔ）〜２０ｎｔ、または３ヌクレオチド（ｎｔ）〜１０ｎｔの長さを有することができる。例えば、リンカーは、３ｎｔ〜５ｎｔ、５ｎｔ〜１０ｎｔ、１０ｎｔ〜１５ｎｔ、１５ｎｔ〜２０ｎｔ、２０ｎｔ〜２５ｎｔ、２５ｎｔ〜３０ｎｔ、３０ｎｔ〜３５ｎｔ、３５ｎｔ〜４０ｎｔ、４０ｎｔ〜５０ｎｔ、５０ｎｔ〜６０ｎｔ、６０ｎｔ〜７０ｎｔ、７０ｎｔ〜８０ｎｔ、８０ｎｔ〜９０ｎｔ、または９０ｎｔ〜１００ｎｔの長さを有することができる。一部の実施形態では、一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡのリンカーは、４ｎｔである。
【０１６７】
例示的な一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドの２つの相補的ストレッチを含む。一部の実施形態では、一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（またはストレッチをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的ストレッチの一方は、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号４３１〜５６２に記載の活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つまたはその相補配列と少なくとも６０％同一である。例えば、一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（またはストレッチをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的ストレッチの一方は、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号４３１〜５６２に記載のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の１つまたはその相補配列と少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一である。
【０１６８】
一部の実施形態では、一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（またはストレッチをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的ストレッチの一方は、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、配列番号５６３〜６７９に記載の標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列の１つまたはその相補配列と少なくとも６０％同一である。例えば、一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（またはストレッチをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的ストレッチの一方は、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号５６３〜６７９に記載のｃｒＲＮＡ配列の１つまたはその相補配列と少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一である。
【０１６９】
米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号４３１〜６７９について、適切な同族対を決定する際、種名および塩基対合（タンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖について）を考慮に入れることにより、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの適切な天然に存在する同族対を通常通りに決定することができる。
【０１７０】
一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡと二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの両方に関して、天然に存在するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡと共有するものがほとんどない（概して５０％同一性）人工配列は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造が保存されない限り、Ｃａｓ９とともに機能して標的ＤＮＡを切断することができる。したがって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡの天然に存在するタンパク質結合ドメインのＲＮＡ折り畳み構造を考慮に入れて、人工タンパク質結合ドメイン（２分子または一分子バージョン）を設計することができる。非限定的な例として、機能性人工ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、天然に存在するＤＮＡ標的化のタンパク質結合セグメントの構造（例えば、ＲＮＡ二重鎖に沿って同数の塩基対を含む、および天然に存在するＲＮＡに存在するのと同じ「バルジ」領域を含む）に基づいて設計することができる。任意の種からの任意の天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対についての構造を当業者は容易に生じさせることができるので（広範な種からのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列については米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号４３１〜６７９を参照されたい）、所与の種からのＣａｓ９（または関連Ｃａｓ９）を使用する際、その種についての天然構造を模倣して人工ＤＮＡ標的化ＲＮＡを設計することができる。したがって、好適なＤＮＡ標的化ＲＮＡは、天然に存在するＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造を模倣して設計されたタンパク質結合ドメインを含む人工的に設計されたＲＮＡ（天然に存在しないもの）であり得る。（例えば、適切な同族対を決定する際には種名を考慮に入れて米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号４３１〜６７９を参照されたい）。
【０１７１】
タンパク質結合セグメントは、１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、タンパク質結合セグメントは、１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜８０ｎｔ、１５ｎｔ〜５０ｎｔ、１５ｎｔ〜４０ｎｔ、１５ｎｔ〜３０ｎｔ、または１５ｎｔ〜２５ｎｔの長さを有することができる。
【０１７２】
また、一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡと二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡの両方に関して、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、６塩基対（ｂｐ）〜５０ｂｐの長さを有することができる。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、６ｂｐ〜４０ｂｐ、６ｂｐ〜３０ｂｐ、６ｂｐ〜２５ｂｐ、６ｂｐ〜２０ｂｐ、６ｂｐ〜１５ｂｐ、８ｂｐ〜４０ｂｐ、８ｂｐ〜３０ｂｐ、８ｂｐ〜２５ｂｐ、８ｂｐ〜２０ｂｐ、または８ｂｐ〜１５ｂｐの長さを有することができる。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、８ｂｐ〜１０ｂｐ、１０ｂｐ〜１５ｂｐ、１５ｂｐ〜１８ｂｐ、１８ｂｐ〜２０ｂｐ、２０ｂｐ〜２５ｂｐ、２５ｂｐ〜３０ｂｐ、３０ｂｐ〜３５ｂｐ、３５ｂｐ〜４０ｂｐ、または４０ｂｐ〜５０ｂｐの長さを有することができる。一部の実施形態では、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、３６塩基対の長さを有する。タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するようにハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少なくとも６０％であり得る。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するようにハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり得る。一部の場合、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するようにハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、１００％である。
【０１７３】
ＤＮＡ標的化ＲＮＡと部位特異的修飾ポリペプチドは、複合体を形成する。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列と相補的であるヌクレオチド配列（上述の通り）を含むことにより、複合体に標的特異性をもたらす。複合体の部位特異的修飾ポリペプチドは、部位特異的活性をもたらす。言い換えると、部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡの少なくともタンパク質結合セグメントとのその会合のおかげでＤＮＡ配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列など）へと誘導される。
【０１７４】
部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾し（例えば、標的ＤＮＡの切断もしくはメチル化）、および／または標的ＤＮＡと会合しているポリペプチドを修飾する（例えば、ヒストンテールのメチル化もしくはアセチル化）。部位特異的修飾ポリペプチドは、本明細書では「部位特異的ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位特異的修飾ポリペプチド」とも称される。
【０１７５】
一部の実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、天然に存在する修飾ポリペプチドである。他の場合、部位特異的修飾ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドではない（例えば、下で論じるようなキメラポリペプチド、または修飾（例えば、突然変異、欠失、挿入）されている天然に存在するポリペプチド）。
【０１７６】
例示的な天然に存在する部位特異的修飾ポリペプチドは、天然に存在するＣａｓ９／Ｃｓｎ１エンドヌクレアーゼの非限定的かつ非包括的リストとして米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号１〜２５５（参照により組み込まれる）に記載されている。本明細書で開示の、これらの天然に存在するポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡに結合し、そしてその結果、標的ＤＮＡ内の特定の配列に指向され、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生じさせる。
【０１７７】
部位特異的修飾ポリペプチドは、ＲＮＡ結合部分と活性部分という２つの部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分であって、前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが標的ＤＮＡ内の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ結合部分と、（ｉｉ）部位特異的酵素活性（例えば、ＤＮＡメチル化の活性、ＤＮＡ切断の活性、ヒストンメチル化の活性、ヒストンアセチル化の活性など）を示す活性部位であって、前記酵素活性の部位が、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決まる、活性部位とを含む。
【０１７８】
他の実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分であって、前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡが標的ＤＮＡ内の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ結合部分と、（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の転写を（例えば、転写を増加または減少させるように）調節する活性部分であって、前記標的ＤＮＡ内の調節される転写部位がＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決まる、活性部分とを含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する。
【０１８０】
他の場合、対象部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡと会合しているポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する。
【０１８１】
例示的な部位特異的修飾ポリペプチドを下でさらに提供する。
具体的には、一部の実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の図３に示されているＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６もしくは７３１〜１００３と、または米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号Ａ１の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として記載のアミノ酸配列のいずれかにおける対応する部分と（すべて参照により組み入れられる）、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、核酸（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）は、新たなまたは向上した特徴（例えば、改善された安定性）を該核酸に備えさせるための１つまたは複数の修飾、例えば、塩基修飾、骨格修飾などを含む。当技術分野において公知であるように、ヌクレオシドは、塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合しているリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、リン酸基が、その糖の２’ ヒドロキシル部分に結合していることもあり、３’ ヒドロキシル部分に結合していることもあり、または５’ヒドロキシル部分に結合していることもある。オリゴヌクレオチドを形成する場合、リン酸基が隣接ヌクレオシドを互いに共有結合させて直鎖状高分子化合物を形成する。そしてまた、この直鎖状高分子化合物のそれぞれの末端をさらに連結させて環状化合物を形成することができるが、直鎖状化合物が一般には好ましい。加えて、直鎖状化合物は、分子内ヌクレオチド塩基相補性を有することもあり、したがって、完全にまたは部分的に二本鎖の化合物を生成するような様式で折り畳めることもある。オリゴヌクレオチド内のリン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の骨格を形成すると言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’−５’ホスホジエステル結合である。
【０１８３】
修飾を含有する好適な核酸の例としては、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有する核酸が挙げられる。核酸（修飾された骨格を有する核酸）は、骨格内にリン原子を保持するもの、および骨格内にリン原子を有さないものを含む。
【０１８４】
リン原子を骨格内に含有する好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、正常３’−５’結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含む）、ホスホロジアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’、または２’−２’結合である、逆の方向性を有するものを含む。逆の方向性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合を含む、すなわち、塩基性であり得る（核酸塩基が欠けているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の反転ヌクレオチド残基を含む。様々な塩（例えば、カリウムまたはナトリウムなど）、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【０１８５】
一部の実施形態では、対象核酸は、１つまたは複数のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、ネイティブホスホジエステルヌクレオシド間結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−と表される）を含む。ＭＭＩ型ヌクレオシド間結合は、上述の米国特許第５，４８９，６７７号において開示されている。好適なアミドヌクレオシド間結合は、米国特許第５，６０２，２４０号において開示されている。両方とも参照により組み入れられる。
【０１８６】
例えば米国特許第５，０３４，５０６号（参照により組み入れられる）に記載されているようなモルホリノ骨格構造を有する核酸も好適である。例えば、一部の実施形態では、対象核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。これらの実施形態の一部では、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホロジエステルヌクレオシド間結合で、ホスホジエステル結合が置換されている。
【０１８７】
リン原子を骨格内に含まない好適な修飾されたポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの混合型のヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子性もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、次のものを有するものを含む：モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮとＯとＳとＣＨ２の混合成分部分を有する他のもの。
【０１８８】
対象核酸はまた、核酸模倣物であり得る。ポリヌクレオチドに適用される場合の用語「模倣物」は、フラノース環のみまたはフラノース環とヌクレオチド間結合の両方が非フラノース基で置換されているポリヌクレオチドを含むことを意図したものであり、フラノース環のみを置換したものは、当技術分野では代用糖であるとも言われる。複素環式塩基部分または修飾された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのような核酸である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが証明されているポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物における骨格は、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える、２つ以上の結合しているアミノエチルグリシンユニットである。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製が記載されている代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。すべて参照により組み入れられる。
【０１８９】
研究されてきたポリヌクレオチド模倣物のもう１つのクラスは、モルホリノ環に結合された複素環式塩基を有する結合モルホリノユニット（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸中のモルホリノ単量体ユニットを結合させる多数の結合基が報告されている。結合基の１つのクラスは、非イオン性オリゴマー化合物を得るために選択されてきた。非イオン性モルホリノ系オリゴマー化合物は、細胞のタンパク質と望ましくない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、細胞のタンパク質と望ましくない相互作用を形成する可能性が低いオリゴヌクレオチドの非イオン性模倣物である（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ、ＢｒａａｓｃｈおよびＤａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１（１４）：４５０３〜４５１０（２００２））。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号（参照により組み入れられる）において開示されている。単量体サブユニットを連結する様々な異なる結合基を有する、ポリヌクレオチドのモルホリノクラスの中の様々な化合物が、調製された。
【０１９０】
ポリヌクレオチド模倣物のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環が、シクロヘキセニル環で置換されている。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホロアミダイト単量体が調製され、古典的ホスホロアミダイト化学に従うオリゴマー化合物の合成に使用されている。特定の位置がＣｅＮＡで修飾された完全修飾ＣｅＮＡオリゴマー化合物およびオリゴヌクレオチドが調製され、研究された（参照により組み入れられるＷａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：８５９５〜８６０２（２０００）を参照されたい）。一般に、ＣｅＮＡモノマーのＤＮＡ鎖への組込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのその安定性を増大させる。ＣｅＮＡオリゴアデニル酸塩は、ＲＮＡおよびＤＮＡ相補配列と複合体を形成し、該複合体は、ネイティブ複合体と同様の安定性を有した。天然核酸構造にＣｅＮＡ構造を組み込む研究は、ＮＭＲおよび円偏光二色性によって、容易に立体配座を適合させることにより進むことが証明された。
【０１９１】
さらなる修飾としては、２’ヒドロキシル基を糖環の４’炭素原子に結合することによって２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、その結果、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。結合は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋する基であるメチレン（−ＣＨ２−）であり得、ここでのｎは、１または２である（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、４：４５５〜４５６（１９９８））。ＬＮＡおよびＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡに関して非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な溶解特性を示す。ＬＮＡを含有する強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（参照により組み入れられる、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９７：５６３３〜５６３８（２０００））。
【０１９２】
ＬＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシルの合成および調製とともにそれらのオリゴマー化および核酸認識特性が記載されている（参照により組み入れられる、Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５４：３６０７〜３６３０（１９９８））。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６にも記載されており、両方とも参照により組み入れられる。
【０１９３】
核酸は、１つまたは複数の置換糖部分構造も含み得る。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含み、ここでのアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜１０アルキルまたはＣ２〜１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２は、特に好適であり、ここでのｎおよびｍは、１〜１０である。他の好適なポリヌクレオチドは、次のものから選択される糖置換基を含む：Ｃ１〜１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。好適な修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、７８：４８６〜５０４（１９９５））、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらなる好適な修飾としては、本明細書における下記実施例に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても公知）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
【０１９４】
他の好適な糖置換基としては、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２’−糖置換基は、アラビノ（上向き）位であってもよく、またはリボ（下向き）位であってもよい。好適な２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。オリゴマー化合物上の他の位置で、特に、３’末端ヌクレオシド上のまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位で、および５’末端ヌクレオチドの５’位で、同様の修飾を行うこともできる。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分構造などの糖模倣物を有することもある。
【０１９５】
対象核酸は、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基としては、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体；６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン；５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，’：４，５）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。
【０１９６】
複素環式塩基部分構造として、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置換されているもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンも挙げることができる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号（参照により組み入れられる）で開示されたもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０で開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、国際版、１９９１、３０：６１３により開示されたもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３により開示されたものが挙げられる。これらの核酸塩基の一部は、オリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが証明されており（Ｓａｎｇｈｖｉら編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９３、２７６〜２７８頁）、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせたとき、好適な塩基置換である。
【０１９７】
対象核酸の別の可能な修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを向上させる１つまたは複数の部分構造またはコンジュゲートをポリヌクレオチドに化学結合させることを含む。これらの部分構造またはコンジュゲートは、第一級または第二級ヒドロキシル基などの官能基と共有結合しているコンジュゲート基を含み得る。コンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を向上させる基、およびオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基が挙げられるが、これらに限定されない。好適なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられるが、これらに限定されない。薬力学的特性を向上させる基は、取込みを改善する、分解に対する抵抗性を増強する、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態特性を向上させる基は、対象核酸の取込み、分布、代謝または排泄を改善する基を含む。
【０１９８】
コンジュゲート部分構造としては、脂質部分構造、例えば、コレステロール部分構造（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：６５５３〜６５５６（１９８９））；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、４：１０５３〜１０６０（１９９４））；チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６０：３０６〜３０９（１９９２））；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、３：２７６５〜２７７０（１９９３））；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：５３３〜５３８（１９９２））；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：１１１１〜１１１８（１９９１））；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２５９：３２７〜３３０（１９９０））；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、７５：４９〜５４（１９９３））；リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３６：３６５１〜３６５４（１９９５））；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：３７７７〜３７８３（１９９０））；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１４：９６９〜９７３（１９９５））；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３６：３６５１〜３６５４（１９９５））；パルミチル部分構造（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２６４：２２９〜２３７（１９９５））；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分構造（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２７７：９２３〜９３７（１９９６））が挙げられるが、これらに限定されず、すべてが参照により組み入れられる。
【０１９９】
コンジュゲートは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜または小胞膜の横断を助長するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物または有機もしくは無機化合物を意味し得る、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞膜透過性ペプチド−としても公知）を含み得る。小さい極性分子から大きい高分子および／またはナノ粒子まで様々であり得る別の分子に結合しているＰＤＴは、分子の細胞膜横断、例えば、細胞外空間から細胞内空間への移行、またはサイトゾルからオルガネラ内への移行を助長する。一部の実施形態では、ＰＴＤは、外来性ポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）のアミノ末端に共有結合している。一部の実施形態では、ＰＴＤは、外来性ポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）のカルボキシル末端に共有結合している。一部の実施形態では、ＰＴＤは、核酸（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなど）に共有結合している。例示的なＰＴＤとしては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞への侵入を指示するのに十分な数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、９（６）：４８９〜４９６（２００２））；ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５２（７）：１７３２〜１７３７（２００３））；短縮ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：１２４８〜１２５６（２００４））；ポリリシン（Ｗｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：１３００３〜１３００８（２０００））；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ：およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されず、例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、次のもののいずれかが挙げられるが、これらに限定されない：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＫＫＲＲＱＲＲ、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ、およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ。一部の実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能ＣＰＰ（ＡＣＰＰ）（Ａｇｕｉｌｅｒａら、Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．（Ｃａｍｂ）、１（５−６）：３７１〜３８１（２００９年６月）である。ＡＣＰＰは、正味電荷をほぼゼロに低下させることによって接着および細胞への取込みを阻害する、適合するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に切断可能なリンカーを介して接続されているポリカチオン性ＣＰＰ（例えばＡｒｇ９または「Ｒ９」）を含む。リンカーの切断により、ポリアニオンは放出され、その結果、ポリアルギニンおよびその固有の接着性が局所的に曝露され、かくて、膜を横断するＡＣＰＰが「活性化」される。
【０２００】
例示的なＤＮＡ標的化ＲＮＡを下でさらに説明する。
一部の実施形態では、好適なＤＮＡ標的化ＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む。２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子の第１のもの（活性化ＲＮＡ）は、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、配列番号４３１〜５６２に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つまたはその相補配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子の第２のもの（標的化ＲＮＡ）は、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号の配列番号５６３〜６７９に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つまたはその相補配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０２０１】
一部の実施形態では、好適なＤＮＡ標的化ＲＮＡは、単一のＲＮＡポリヌクレオチドであり、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号の配列番号４３１〜５６２に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する第１のヌクレオチド配列と、少なくとも８個の連続するヌクレオチドのストレッチに関して、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号の配列番号４６３〜６７９に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する第２のヌクレオチド配列とを含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、その標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡと相補的であるヌクレオチドのストレッチにその５’末端が結合している配列５’ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３’を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、二分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、その活性化ＲＮＡは、配列５’ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’を含む。
【０２０３】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡであり、標的ＤＮＡと相補的であるヌクレオチドのストレッチにその５’末端が結合している配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−リンカー−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’（ここで、「リンカー」は、任意のヌクレオチド配列を含むことができる任意のリンカーヌクレオチド配列を示す）を含む。他の例示的一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号（参照により組み入れられる）の配列番号６８０〜６８２に記載のものを含む。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）を、マウスまたはラットなどの、目的の動物において導入遺伝子として構成的にまたは条件付きで（例えば、組織もしくは細胞型特異的にまたは誘導性に）発現させることができ、したがって、機能性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを配偶子または着床前の胚に備えさせるのに、そのような動物から得られる配偶子または着床前の胚にＤＮＡ標的化ＲＮＡまたはガイド配列を導入するだけでよい。例えば、ゲノム編集成功がニューロン、免疫細胞および内皮細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介、レンチウイルス媒介または粒子媒介送達方法により送達されるガイドＲＮＡを使用して実証された、Ｐｌａｔｔら、ＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、Ｃｅｌｌ  ｈｔｔｐ：／／ｄｘ  ｄｏｔ  ｄｏｉ  ｄｏｔ  ｏｒｇ  ｓｌａｓｈ  １０．１０１６  ｓｌａｓｈ  ｊ  ｄｏｔ  ｃｅｌｌ  ｄｏｔ  ２０１４．０９．０１４（参照により組み入れられる）に記載のＣｒｅ依存性Ｃａｓ９ノックインマウスを参照されたい。Ｃａｓ９型の導入遺伝子は、例えばユビキタスプロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーター）によって駆動することができ、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム（例えば、細胞型もしくは組織特異的Ｃｒｅドライバーとともに）を使用することによってまたは当技術分野において周知のその等価物もしくは変異型を使用することによって誘導性にさせることができる。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９発現動物は、繁殖力があり、正常な同腹子サイズを有し、形態異常を提示せず、および／または品種改良してホモ接合体にすることができる。
【０２０６】
本発明の高効率、高処理量エレクトロポレーション方法と合わせて、そのような部位特異的修飾ポリペプチド発現動物（例えば、マウスまたはラット）を、ｉｎ  ｖｉｖｏ高処理量遺伝子スクリーニングにおいて使用して、多くの重要な生物学的プロセスのいずれか、例えば腫瘍抑制、幹細胞再生、に関与する遺伝子、ウイルス複製の宿主決定因子、および発がん性増殖の調節因子を同定することができ、ならびにゲノムワイドなまたは標的を定めたｓｇＲＮＡライブラリーと直接組み合わせて新たな生物学的知見を得ることができる。
【実施例】
【０２０７】
本明細書に記載の実施例は、単に説明に役立つことを目的としたものに過ぎず、限定的なものではない。しかし、本実施例に記載の条件は、一般的適用性があるものであり得、また本明細書に記載の発明のいずれか１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせることができることを企図したものである本明細書に記載の発明の特定の実施形態の構成要素であり得る。
【０２０８】
遺伝子修飾マウスは、遺伝子機能およびヒト疾患を研究するための重要なモデルとして役立つものであり、主として、従来の遺伝子標的化またはトランスジェニック技術を使用して作出された。典型的な従来の遺伝子標的化実験では、所望の遺伝子修飾を先ずマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に相同組換えによって導入し、所期の突然変異を有する、クローニングにより得られたＥＳ細胞クローンを単離する（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、２００５）。その後、標的ＥＳ細胞を野生型胚盤胞に注入する。標的ＥＳ細胞の一部は、結果として得られるキメラ動物の生殖細胞系列に寄与することができ、標的化遺伝子修飾を有するマウスを作製する（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、２００５）。
【０２０９】
有効だが、遺伝子標的化は、費用がかかり、時間がかかり、生殖細胞系列コンピテントＥＳ細胞株の入手可能性および性能に大きく依存する。
生殖細胞系列コンピテントＥＳ細胞株の必要を回避するために、１細胞胚に直接注入して特定の遺伝子が破壊された動物を作製することができる、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｕｒｎｏｖら、２０１０）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（ＢｏｇｄａｎｏｖｅおよびＶｏｙｔａｓ、２０１１）を含む、部位特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用する代替方法論が開発された（Ｃａｒｂｅｒｙら、２０１０；Ｇｅｕｒｔｓら、２００９；Ｓｕｎｇら、２０１３；Ｔｅｓｓｏｎら、２０１１）。二本鎖切断部位（ＤＳＢ）に隣接する、相同性を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはプラスミドを備えさせると、被定義修飾を相同組換え（ＨＲ）によりゲノムに導入することができる（Ｂｒｏｗｎら、２０１３；Ｃｕｉら、２０１１；Ｍｅｙｅｒら、２０１０）。
【０２１０】
最近、ＲＮＡ誘導型の、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム（Ｈｓｕら、２０１４年）を使用して、単一または複数の遺伝子の突然変異を有するマウス、ならびにレポーターおよび条件付き対立遺伝子を有するマウスを１ステップで作製する方法（Ｗａｎｇら、２０１３；Ｙａｎｇら、２０１３）が確立された。
【０２１１】
同様の手法を使用して、遺伝子修飾動物が様々な種から作製された（Ｃｈａｎｇら、２０１３；Ｈａｉら、２０１４；Ｈｗａｎｇら、２０１３；Ｌｉら、２０１３ａ；Ｌｉら、２０１３ｂ；Ｎｉｕら、２０１４）。トランスジェニックマウスを作製する旧来の手法と同様、これらの研究はすべて、ヌクレアーゼ成分を１細胞接合体に送達するためにマイクロインジェクションを用いる。
【０２１２】
本明細書に記載の方法論は、エレクトロポレーションを使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの生体／遺伝物質を哺乳動物（例えば、マウス）接合体に送達し、標的化遺伝子修飾を有する生存トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することに成功する。
【０２１３】
実施例１
レポーターをコードするポリヌクレオチドのマウス接合体および推定接合体へのエレクトロポレーション
この実験は、レポーター遺伝子をコードするプラスミドのマウス接合体または推定接合体（略して「接合体」）へのエレクトロポレーションの結果を記載するものである。
【０２１４】
ＣＭＶプロモーターと遍在的発現を支持するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとを有するｐＭＡＸＧＦＰベクター（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）をこの実験に選択した。Ｂ６Ｄ２Ｆ２マウス胚を採取し、酸性タイロード液（ＡＴ）（Ｐ／Ｎ  Ｔ１７８８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中で５秒間処置し、ＫＯＳＭａａ／ＢＳＡ（Ｐ／Ｎ  Ｚｅｋｓ−０５０、Ｚｅｎｉｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で２回洗浄し、２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｐ／Ｎ  ３１９８５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に入れた。次いで、２５μＬ中の胚を、４０ｎｇ／μＬの最終ＤＮＡ濃度に達するように、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中８０ｎｇ／μＬの同量（２５μＬ）のｐＭＡＸＧＦＰと混合し、その混合物を１ｍｍエレクトロポレーションキュベットに投入し、３０ボルト、パルス幅１ｍｓ、２パルス、パルス間隔１００ｍｓの設定を使用してエレクトロポレーションした（ＥＣＭ８３０、ＢＴＸ）。
【０２１５】
エレクトロポレーション後、１００μＬの事前に平衡させたＫＯＳＭａａ／ＢＳＡを用いて胚を回復させ、その後、３．５日間、組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）において培養した。培養状態で３．５日後に、胚を蛍光顕微鏡下でＧＦＰ発現について観察した。蛍光は、検査した３つの胚の中では観察されなかった（実験１）。
【０２１６】
透明帯層は、接合体へのプラスミド侵入にとって物理的障害となり得るので、実験２および３では、本出願人は、透明帯に穴を開けることにより、透明帯を除去することにより、または胚をＡＴ中で１０秒間、さらに同時にｐＭＡＸＧＦＰの濃度を２０ｎｇ／μＬから４０ｎｇ／μＬへ、それから１００ｎｇ／μＬへと変化させて処置することにより、透明帯層を弱めるか、または破断しようとした。この場合もやはり、検査した胚の中で蛍光は観察されなかった。
【０２１７】
６−フルオレセインアミダイト（６−ＦＡＭ）（４０、１００および５００ｎｇ／μＬ）で標識したオリゴヌクレオチド、Ｔｕｒｂｏ  ＧＦＰ  ｍＲＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ（２５ｎｇ／μＬ）またはｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（４０および１００ｎｇ／μＬ）を含む、他のレポーターシステムは、試験した胚の中で蛍光を観察しなかった（実験４、５および６）。ＧＦＰシグナルを有した唯一の胚が１つの事例で観察されたが、この胚は、死滅または発達遅延した。
【０２１８】
実施例２
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのマウス接合体および推定接合体へのエレクトロポレーション
この実験は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介標的化遺伝子破壊のためのマウス接合体または推定接合体（略して「接合体」）への、本発明の方法を使用する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達を実証するものである。
【０２１９】
このために、Ｔｅｔ１エクソン４およびＴｅｔ２エクソン３を標的として選択して、以前に記載されたガイドＲＮＡ（参照により本明細書に組み入れられる、Ｗａｎｇら、２０１３）を使用した。Ｔｅｔ１およびＴｅｔ２システムの利便性は、Ｓａｃ１（Ｔｅｔ１）またはＥｃｏＲＶ（Ｔｅｔ２）制限部位がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）近位配列と重複することである。したがって、標的部位を包含する胚から増幅されたＰＣＲ産物を使用して、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を使用して突然変異対立遺伝子を検出することができる（Ｗａｎｇら、２０１３）。
【０２２０】
実験６では、マウスＢ６Ｄ２Ｆ２接合体を先ずＡＴで１０秒間処置し、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ／Ｔｅｔ１  ｓｇＲＮＡと４０／２０ｎｇ／μＬまたは１００／５０ｎｇ／μＬで混合し、説明したようにエレクトロポレーションした。次いで、胚を３．５日間、それらが胚盤胞に発達するまで培養した。次いで、胚を全ゲノム増幅およびＰＣＲ分析のために回収した。
【０２２１】
Ｓａｃ１制限酵素を使用して、ＲＦＬＰにより、標的部位を包含するＰＣＲ産物を分析した。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）とＴｅｔ１  ｓｇＲＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）の混合物を使用したとき、エレクトロポレーションされた接合体から発達した胚の中で突然変異は検出されなかった。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）とＴｅｔ１  ｓｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）の混合物を使用したとき、ＡＴ処置した胚１６個のうちの３個、およびＡＴ処理なしの胚１６個のうちの１個は、ＲＦＬＰ分析に基づいてＴｅｔ１遺伝子座に突然変異対立遺伝子を有することが判明した（図１Ａ）。これらの突然変異をサンガーシークエンシングによりさらに確認した（図１Ａ）。
【０２２２】
次に、実験７では、さらに高濃度のＣａｓ９  ｍＲＮＡ（４００ｎｇ／μＬ）＋Ｔｅｔ２  ｓｇＲＮＡ（２００ｎｇ／μＬ）をマウス接合体にエレクトロポレーションし、ＡＴ処置した胚９個のうちの４個は、Ｔｅｔ２遺伝子座に二対立遺伝子突然変異を有することが判明した（図１Ｂ）。
【０２２３】
したがって、Ｔｅｔ１遺伝子とＴｅｔ２遺伝子は両方とも、マウス接合体において、エレクトロポレーション送達ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ＋ｓｇＲＮＡ）を使用して効率的に標的化することができる。
【０２２４】
その一方で、異なるプラスミド濃度、すなわち、２００ｎｇ／μＬ、４００ｎｇ／μＬ、および８００ｎｇ／μＬのプラスミドＤＮＡを使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをコードするプラスミドのエレクトロポレーションを（Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの形態でのＣＲＩＳＰＲ試薬の送達の代替案として）試みた。２００ｎｇ／μＬ群では、スクリーニングした合計１２個のうち１個の突然変異胚が同定された。したがって、接合体へのＤＮＡのエレクトロポレーションも達成することができたが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの場合、ｍＲＮＡ／ガイドＲＮＡの組合せの方がＤＮＡより効率的であるように見えた。
【０２２５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用するこの実験および他の実験では、下記の手順を使用してＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを生成した。
簡単に述べると、野生型Ｃａｓ９遺伝子を有するｐｘ３３０プラスミド（Ｃｏｎｇら、２０１３）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＣａｓ９コード配列の増幅用のＤＮＡ鋳型としての役割を果した。Ｔ７プロモーター配列をフォワードプライマーに付加させ、Ｃａｓ９野生型遺伝子のコード配列に隣接するリバースプライマーと対合させた。Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を行った。ｓｇＲＮＡ合成については、Ｔ７プロモーター配列をｓｇＲＮＡ鋳型／フォワードプライマーに付加させ、ＩＶＴ鋳型をＰＣＲ増幅により作製した。Ｔ７−ｓｇＲＮＡ  ＰＣＲ産物をカラム精製し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＩＶＴ用の鋳型として使用した。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡは両方とも、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製し、このキットに備えられている溶出緩衝液で溶出した。ＩＶＴ反応からの分割量をアガロースゲルで分離して、反応からの品質を評価した。
【０２２６】
サーベイヤーアッセイを記載された通りに行った（Ｇｕｓｃｈｉｎら、２０１０）。マウスまたは胚からゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子特異的プライマーを使用して次の条件下でＰＣＲを行った：５分間９５℃；３５×（３０秒間９５℃、３０秒間６０℃、４０秒間６８℃）；２分間６８℃；４℃で保持。次いで、ＰＣＲ産物を変性させ、アニールし、サーベイヤーヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）で処置した。次いで、産物を１０％アクリルアミドＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＢＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）で分離し、臭化エチジウムで染色し、可視化した。ＲＦＬＰ分析については、１０μｌのＴｅｔ１またはＴｅｔ２  ＰＣＲ産物をＳａｃ１（Ｔｅｔ１）またはＥｃｏＲＶ（Ｔｅｔ２）で消化し、ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）染色アガロースゲル（２％）で分離した。シークエンシングについては、ＰＣＲ産物を直接シークエンシングするか、またはＴｏｐｏクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、個々のクローンをサンガーシークエンシングによりシークエンシングした。
【０２２７】
実施例３
エレクトロポレーションされたマウス接合体の発達
接合体のＩｎ  ｖｉｔｒｏ培養および分析は重要な手法であり、この手法に基づいて、遺伝子編集技術に関する多数のパラメータを迅速な所要時間および好ましくはより低い動作費用で試験し、分析することがきる。しかし、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養システムを使用して、エレクトロポレーションされた接合体を培養した場合、その後の胚の発達は遅延または中止されるようであった。多くの場合、例えば５０／２５ｎｇ／μＬ〜１０００／５００ｎｇ／μＬの、多様な濃度範囲でのＣａｓ９  ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡのエレクトロポレーション後、胚は、３．５日の培養期間終了時に異なる発達段階に進み、１細胞、２細胞または４細胞期、桑実胚期、および時には胚盤胞期のものを含んだ（実験８）。対照的に、エレクトロポレーションされていない対照胚は、ＡＴで前処置されていようと、いまいと、同じ期間の終了時に胚盤胞期に達した。一部の実験（実験１０および１１）では、実験におけるすべての群の中の胚が、胚盤胞期に達することができなかった。
【０２２８】
エレクトロポレーションされた接合体を培養する上でのそのような初期の失敗は、所望の遺伝子修飾が、エレクトロポレーションされた接合体に存在するかどうかに関係なく、接合体がエレクトロポレーションプロセスを生き延び、出生動物へと発達し続けることができないことを示唆しているように思われる。ＡＴ処置が接合体を過剰に損傷させて胚の発達を遅延させるという、およびＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡなどの、送達される試薬が接合体およびそれらのその後の発達に対して有毒であり得るという認識は、動物における生殖系列伝達可能な遺伝子修飾を恒久的に導入するための実行可能な手段としてエレクトロポレーションを使用することについて、さらに疑念を投げかける。
【０２２９】
エレクトロポレーションされた接合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発達不良問題を解決しようとして、驚くべきことに、本出願人は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件（表１）を変えることによる、より具体的には、ポリヌクレオチド緩衝液（例えば、ＴＥ緩衝液）および低血清培地（例えば、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地）を典型的に含むエレクトロポレーション媒体での一切の潜在的に有害な物質の洗浄除去による、解決策を特定した。エレクトロポレーションされた接合体の生存および発達に関する、この劇的な効果を、ここに記載する実験で実証する。
【０２３０】
詳細には、Ｂ６Ｄ２Ｆ１／Ｊドナー雌マウスを過排卵させて、胚収率を最大にした。各ドナー雌に５ＩＵ（ｉ．ｐ．注射）の妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を投与し、４７時間後、続いて５ＩＵ（ｉ．ｐ．注射）のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与した。
【０２３１】
ｈＣＧの投与直後に、雌をＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｊ繁殖用雄と１：１交配させた。約２４時間後、雌を交尾プラグの存在について点検した。交尾プラグを示す雌を安楽死させ、それらの卵管を切除し、Ｍ２培地に入れた。次いで、ヒアルロニダーゼを０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で添加したＭ２培地に卵管を入れた。膨大部を溶解し、ヒアルロニダーゼを含有するＭ２培地中で卵丘細胞が剥がれるまでインキュベートしておくことにより、卵母細胞クラッチ（ｏｏｃｙｔｅ  ｃｌｕｔｃｈ）を除去した。接合体を回収し、新鮮なＭ２培地の２回の洗浄に付した後、ＣＯＯＫ  ＭＩＮＣベンチトップ型インキュベーターで２４時間、油のもとで平衡させたＲＣＶＬ培地の微小液滴に入れた。
【０２３２】
酸性タイロード液を融解し、処置すべき接合体５０個ごとに１滴である１００μＬの液滴をペトリ皿に入れた。ＥＰ（エレクトロポレーション）用に同定された接合体をＲＣＶＬ培地から除去し、（予温した）Ｍ２培地の液滴１００μＬに入れた。５０の群における接合体を酸性タイロード液に１０秒間入れ、その後、取り出し、予温したＭ２培地の液滴１００μＬによって３回洗浄した。次いで、処置された接合体を、エレクトロポレーションの準備ができたＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地の液滴５〜１０μＬに入れた。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地液滴に対する接合体の数および液滴の数は、行う実験のパラメータによって異なった。
【０２３３】
実験１４および１５両方に、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ／Ｔｅｔ２  ｓｇＲＮＡを２００／１００、４００／２００、および６００／３００ｎｇ／μＬで含有するＣＲＩＳＰＲ混合物を使用した。加えて、実施例１５については、ＥｃｏＲＶ部位（ＧＡＴＡＴＣ）をＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）に変換する突然変異を有するドナーオリゴヌクレオチドも２００、４００、または２００ｎｇ／μＬで供給した。混合物を実験群ごとにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で合計１０μＬに合せ、１０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中の胚に添加した。次いで、２０μＬの全内容物を１ｍｍキュベットに投入し、エレクトロポレーションを行った（３０ボルト、パルス幅１ｍｓ、２パルス、パルス間隔１００〜１０００ｍｓ）。
【０２３４】
エレクトロポレーションの完了時、エレクトロポレーションされた配偶子または着床前の胚を次のステップ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養および／または偽妊娠雌への移植）の前に洗浄することが望ましい場合、胚をキュベットから１００μＬの予温したＫＳＯＭａａ／ＢＳＡ培地に回収し、予温したＭ２培地の液滴１００μＬに連続的に３回通して一切の残存エレクトロポレーション溶液（１：１のＴＥ緩衝液とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地）を洗浄除去した。次いで、接合体を生存能について評価した。健常であると判断したものを、特定病原体除去（ＳＰＦ）手術室に輸送するために９５０μＬの予温したＭ２培地が入っているクライオバイアルに移した。
【０２３５】
ＳＰＦ施設において、ｐ１０００ピペットを使用してクライオバイアルから接合体を取り出し、ＣＯＯＫ  ＭＩＮＣベンチトップ型インキュベーターで２４時間、油のもとで平衡させたＲＣＶＬ培地の培養液滴に入れた。移植時に、ＲＣＶＬ微小液滴から胚を除去し、予温した１００μＬのＭ２培地液滴に入れ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＡＨ（実験動物健康管理）日常手順９４−０９などの標準的プロトコールに従ってＣＢＹＢ６Ｆ１／Ｊ偽妊娠雌に移植した。
【０２３６】
マウスのサブセットを出生時に分析した。これらのマウスについては、マウスが生まれたときに尾部生検試料を採取し、ＥｃｏＲＶ消化を用いてＲＦＬＰにより分析した（図２Ａおよび２Ｂ）。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ４００ｎｇ／μＬおよびｓｇＲＮＡ  ２００ｎｇ／μＬの群からスクリーニングしたマウス１３匹のうちの２匹からのＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ消化に対して抵抗性（ファウンダー８５Ｃ３）または部分抵抗性（８５Ｃ１０）であった（図２、パネルＡ）。
【０２３７】
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを、それぞれ６００ｎｇ／μＬおよび３００ｎｇ／μＬの、より高い濃度で使用したとき、マウス５匹（ファウンダー８６Ｃ３、８６Ｃ５、８６Ｃ７、８６Ｃ８および８６Ｃ９）は、ＲＦＬＰアッセイにより分析して陽性であり、そのうちの２匹（８６Ｃ３および８６Ｃ９）は、ＥｃｏＲＶ消化に対して完全抵抗性であったが、３匹（８６Ｃ５、８６Ｃ７および８６Ｃ８）は部分抵抗性であった。ＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングにより、マウス７匹のうちの６匹について突然変異対立遺伝子の存在が確認された（図２Ｃ、８５Ｃ３、８５Ｃ１０、８６Ｃ３、８６Ｃ７、８６Ｃ８および８６Ｃ９）、そして１匹は、低い存在量の突然変異対立遺伝子を有することができた（８６Ｃ５）。さらに、ファウンダー８５Ｃ３、８６Ｃ３および８６Ｃ９からのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏベクターにクローニングし、個々のクローンをシークエンシングしたとき、予想通り、Ｔｅｔ２標的遺伝子のＰＡＭ近位領域に正確に位置する挿入欠失変異が検出された（図２Ｄ）。
【０２３８】
これら２つの実験からの残りのマウスは、１週齢になったときに分析した。尾部生検試料を採取し、ＲＦＬＰによって前に説明した通りに分析し、これらのマウスから増幅したＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングにより結果を確認した。表１に要約する通り、これら２つの実験間のファウンダー効率（ｆｏｕｎｄｅｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）に濃度依存性改善が観察された。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを２００ｎｇ／μＬでおよびｓｇＲＮＡを１００ｎｇ／μＬで使用したとき、スクリーニングした３４匹の中で１匹のファウンダーが同定された（３．２％）。濃度をＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ４００ｎｇ／μＬおよびｓｇＲＮＡ  ２００ｎｇ／μＬに上昇させたとき、ファウンダー効率は、４８．３％に上昇した（スクリーニングした２９匹中ファウンダーマウス１４匹）。濃度をさらにＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ６００ｎｇ／μＬおよびｓｇＲＮＡ  ３００ｎｇ／μＬに上昇させたとき、効率は、４５．５％であった（スクリーニングした３３匹中ファウンダーマウス１５匹）。注目すべきことに、実験１５については、１００％ファウンダー効率を達成し、スクリーニングしたマウス１１匹すべてが突然変異対立遺伝子を有することが判明した（図３）。
【０２３９】
ドナーオリゴヌクレオチドを実験計画に組み込んだ実験１５においてＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＤＲも試験した。
具体的には、接合体にエレクトロポレーションし、マウスが生まれ、その遺伝子型を同定した。４６６ｂｐのＰＣＲ産物を増幅し、この増幅産物は標的部位を包含するものであり、それをＥｃｏＲＶ消化に付してＮＨＥＪ突然変異を有する対立遺伝子を検出し、およびＥｃｏＲＩ消化に付してＨＤＲ対立遺伝子を検出した。成功したＨＤＲ対立遺伝子は他の実験群の中では検出されなかったが、ＥｃｏＲＩにより切断された対立遺伝子を有する２匹のファウンダーマウス（図３、パネルＡ、８６ＥＰ１１および８６ＥＰ１４）が検出され、２匹のファウンダーマウスは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを４００ｎｇ／μＬで、Ｔｅｔ２遺伝子座の３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡを２００ｎｇ／μＬで、およびｓｓＤＮＡドナーを４００ｎｇ／μＬで用いてエレクトロポレーションした群から得た。この群の中の１１匹のマウスすべてが、ＥｃｏＲＶ消化に対して抵抗性である対立遺伝子を有した。ファウンダー８６ＥＰ１１〜８６ＥＰ１５は、ＥｃｏＲＶによって切断することができた対立遺伝子の検出可能なレベルを有さないようであり、これは、１１匹のファウンダーマウスすべてからのＮＨＥＪ突然変異の存在を示唆する。１１試料をＥｃｏＲ１に曝露したとき、試料８６ＥＰ１１および８６ＥＰ１４からの対立遺伝子の一部は、ＥｃｏＲＩにより部分的に消化されたことを示し、これは、これら２つの試料からのＨＤＲ対立遺伝子の存在を示唆する。
【０２４０】
それ故、ファウンダー８６ＥＰ１１および８６ＥＰ１４からのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、個々のクローンをシーケンシングした。図３、パネルＢに示されているように、試料８６ＥＰ１１−４および８６ＥＰ１４−４はＥｃｏＲＩ部位を有し、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより媒介されるドナーｓｓＤＮＡからのこの部位の組込み成功を示唆する。
【０２４１】
様々な異なるエレクトロポレーション設定パラメータを一連の実験でさらに試験し、それらの結果を下に要約した：
１．２０Ｖ、２パルス、間隔１００ｍｓ、洗浄０回
ａ．Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ２００ｎｇ／ｕＬ＋Ｔｅｔ２  ｓｇＲＮＡ  １００ｎｇ／μＬ
ｂ．結果：１２％胚盤胞期到達（２／１７）、観察された遺伝子標的化なし
２．２０Ｖ、２パルス、間隔１００ｍｓ、洗浄３回
ａ．Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：５００／２５０、４００／２００、２００／１００ｎｇ／μＬ
ｂ．結果：平均で９１％胚盤胞（５０／５５）
３．２０Ｖ、２パルス、間隔１ｓ、洗浄３回
ａ．Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：８００、６００、４００、３００、２００、１００ｎｇ／μＬ
ｂ．２００ｎｇ／μＬでの結果（バッチ１）：１００％ブラスト（blast）（１６／１６）、１４．３％標的化（１／７）
ｃ．２００、３００、４００ｎｇ／μＬでの結果（バッチ２）：９５．８％ブラスト（４６／４８）、結果未決定
ｄ．結果（バッチ３）、複数回の洗浄、偽妊娠雌マウスに移植された胚、出生未決定
４．２０Ｖ、３パルス、間隔１ｓ、洗浄１回
ａ．Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：４００、２００ｎｇ／μＬ
ｂ．２００ｎｇ／μＬでの結果（バッチ１）：８２．３％ブラスト（１４／１７）、標的化なし
ｃ．４００および２００ｎｇ／μＬでの結果（バッチ２）：９３．８％ブラスト（３０／３２）、結果未決定
５．２０Ｖ、３パルス、間隔１ｓ、洗浄３回
ａ．Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：２００ｎｇ／μＬ
ｂ．結果：８８．９％ブラスト（１６／１８）、標的化なし
６．３０Ｖ、２パルス、間隔１ｓ、洗浄３回
ａ．Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：４００、３００、２００ｎｇ／μＬ
ｂ．２００ｎｇ／μＬでの結果：９４％ブラスト（１５／１８）、標的化なし
ｃ．３００ｎｇ／μＬでの結果：８４％ブラスト（１６／１９）、１６％標的化（３／１９）、４００ｎｇ／μＬでは標的化なし
要約すると、結果は、エレクトロポレーションされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する遺伝子修飾成功が、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬の濃度に依存することを示唆している。旧来のマイクロインジェクション実験と比較して、エレクトロポレーション実験では、試薬濃度は制限因子にはならず、より濃度の高い試薬（例えば、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡについては４００ｎｇ／μＬ超、およびｓｇＲＮＡについては２００ｎｇ／μＬ超）の使用によって遺伝子編集されたマウスが生じることが判明した。
【０２４２】
データは、透明帯を例えばＡＴ処置により弱めることが、接合体エレクトロポレーションにとって有益であり得ることも示唆している。しかし、長期処置を避けるべきである。
最後に、しかし他と等しく重要なこととして、本方法を使用するＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子標的化をうまく行うことができ、実験設定でパラメータにある一定の変化を加えて行うことができた。エレクトロポレーションされた接合体の発達成功を確実にするために、エレクトロポレーション完了時に、エレクトロポレーションされた接合体を胚の発達に最適な生理溶液または生理的媒体で１回または複数回（例えば、２、３、４回）すすぐこと必要があり得る。例えば、エレクトロポレーションされた接合体を、予温したＭ２培地の液滴（１００μＬ）に連続的に通して、一切の残存エレクトロポレーション溶液（例えば、１：１のＴＥ緩衝液とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標））を洗浄除去し、その後、接合体を培養に移すか、または子宮環境に移植する。
【０２４３】
【表１】
2019501659.tif 000003
【０２４４】
本発明の方法の詳細な説明に役立つ（しかし非限定的）実施形態をここで下に提供する：
１．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｐ／Ｎ  Ａ２１５３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した１００μＬ  ＫＳＯＭａａ  Ｅｖｏｌｖｅ（Ｐ／Ｎ  Ｚｅｋｓ−０５０、Ｚｅｎｉｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の分割量を９６ウェル平底組織培養プレート上に置き、ＨｅｒａＣｅｌｌインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で平衡させた後、１細胞接合体を加えた。
【０２４５】
２．Ｂ６Ｄ２Ｆ１雌マウスに５国際単位（ＩＵ）の妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、Ｐ／Ｎ  ＨＯＲ−２７２、ＰｒｏＳｐｅｃ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、Ｐ／Ｎ  ＨＯＲ−２５０、ＰｒｏＳｐｅｃ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）のｉ．ｐ．注射を行った。次いで、雌マウスをＢ６Ｄ２Ｆ１雄マウスと交配させた。交尾プラグについて陽性であったものを頸椎脱臼（ＣＤ）により安楽死させた。受精した胚を、切除した生殖器管からフラッシュした。
【０２４６】
３．Ｂ６Ｄ２Ｆ２マウスから１細胞接合体を採取し、１０秒間、酸性タイロード液（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ１７８８；または等価物、例えばＥＭＢＲＹＯＭＡＸ（登録商標）Ｐ／Ｎ  ＭＲ−００４−Ｄ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で処置し、ＫＳＯＭａａ  Ｅｖｏｌｖｅで２回洗浄し、組織培養皿またはプレート（３５ｍｍ、Ｐ６０、９６ウェル）内の予温したＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｐ／Ｎ  ３１９８５、Ｇｉｂｃｏ）の液滴１０μＬに入れた。
【０２４７】
４．「生体物質」（ＣＲＩＳＰＲについては、これは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと、ｓｇＲＮＡと、任意選択でドナーオリゴヌクレオチド、または代替物としてそれをコードするＤＮＡ、とから本質的になる）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡで再構成して体積１０μＬにし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中の接合体の液滴１０μＬに添加した。
【０２４８】
５．「生体物質」に浸漬された接合体を取り出し、ＢＴＸ  Ｍｏｄｅｌ  ６１０（Ｐ／Ｎ  ４５０１２４、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）用の２ｍｍキュベットのチャンバに入れた。ポリヌクレオチド／接合体溶液または懸濁液がキュベットの２つの導体間に確実に行くようにキュベットをタッピングし、混合物中に気泡が生じないようにタッピングする。
【０２４９】
６．キュベットをＢＴＸキュベットチャンバ（ＥＣＭ  ８３０）に入れ、次の設定（またはその変型、例えば本明細書に開示のもの）を使用してエレクトロポレーションする：
ａ．電圧：３０Ｖ
ｂ．パルス間隔：１２５〜１３０ｍｓ
ｃ．パルス幅：１ｍｓ
ｄ．パルス数：２
７．キュベットパッケージから付属のプラスチックピペットを使用して、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルから８０〜１００μＬの予温した培地（例えば、ＫＳＯＭａａ／ＢＳＡ培地）を除去し、その培地をキュベットに穏やかに添加する。キュベットからすべての内容物を除去し、その混合物をウェルに排出する。
【０２５０】
８．エレクトロポレーションされた接合体を、予温したＭ２培地の液滴１００μＬに連続的に２〜３回通して、一切の残存エレクトロポレーション溶液を洗浄除去する。
９．洗浄された接合体を有する９６ウェルプレートを直ちにインキュベーターに戻す。
【０２５１】
１０．発達の胚盤胞期に達するように３７℃／５％ＣＯ２で３．５日間、胚を培養し、その後、分析のために回収した。
１１．ＧＥＮＯＭＥＰＬＥＸ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＮ  ＧＡ４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、胚のゲノムを増幅した。次いで、増幅されたゲノムを、標的部位を包含するプライマー対を用いるＰＣＲ反応（ＡＣＣＵＰＲＩＭＥ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐ／Ｎ  １２３３９−０１６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；またはＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ、Ｐ／Ｎ  Ｒ０５０Ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を清浄化し、サンガーシークエンシングによりヌクレオチド配列を分析した。
【０２５２】
１２．Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよび任意選択のＤＮＡドナーを合成し、注入混合物を以前に記載された（Ｗａｎｇら、２０１３；Ｙａｎｇら、２０１３）ように調製した。
【０２５３】
実施例４
マウス接合体の改善されたマルチサイクルエレクトロポレーション
上の実施例に記載の方法は、異なる標的遺伝子についてばらつきを示すこともある。例えば、ＡｉｃｄａおよびＲｏｓａ２６遺伝子座における一部の試験では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が比較的低い効率（それぞれ、約０％および１７％）で起こる（データを示さない）。マイクロインジェクションとエレクトロポレーション間の別の並行比較研究では、上記実施例に基づく方法は、Ｓｍｃｌｂ遺伝子座における大セグメント欠失を生じさせないようであり、一方、マイクロインジェクションは、高い効率を有した（データを示さない）。このような観察が遺伝子座特異的効果に起因するのかは、完全には明らかでない。
【０２５４】
しかし、これらのゲノム遺伝子座を標的として使用して、この実施例は、本明細書に記載の改善された方法を使用してゲノム編集効率上昇を達成することができることを実証する。加えて、これらの改善された方法は、正確なヌクレオチド変化、大セグメント欠失および標的化短鎖セグメント挿入を含む、種々の遺伝子修飾を標的遺伝子座に導入することもできる。
【０２５５】
１つの改善は、上で説明したようなたった１ラウンド／サイクルのエレクトロポレーションではなく、一連の（例えば、複数のサイクル）のエレクトロポレーションを使用することである。最適なシリーズのエレクトロポレーションサイクルを決定するために、前に使用した設定（例えば、３０Ｖ、２パルス、パルス幅１または１．５ｍｓ、間隔１００ｍｓ）と同じまたは同様の設定で１、４、６および８シリーズのエレクトロポレーションサイクルを使用し、２細胞および胚盤胞期のエレクトロポレーションされた胚について観察された生存率を比較した。
【０２５６】
生存率は、エレクトロポレーションの回数増加とともに低下したが、６サイクルのエレクトロポレーションは、胚盤胞の妥当なｉｎ  ｖｉｔｒｏ発達率をもたらした（図４Ｃ）。重要なこととして、マーカー−ＧＦＰ  ｍＲＮＡ−の送達効率は、より多くのエレクトロポレーションサイクルを適用したとき有意に上昇した（図４Ｄ）。
【０２５７】
次に、Ａｉｃｄａを標的として使用して、複数サイクルのエレクトロポレーションの適用が標的化効率を向上させるかどうか試験した。新鮮な卵管をフラッシュすることによりＢ６Ｄ２Ｆ２／Ｊ胚を用意した。受精した胚を先ずＡＴ（酸性タイロード）で１０秒間処置し、その後、エレクトロポレーション前によく洗浄した。マウス接合体を１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに投入し、次いで１０μＬのＣａｓ９  ｍＲＮＡ（６００ｎｇ／μＬ）、Ａｉｃｄａを標的とするｓｇＲＮＡ（３００ｎｇ／μＬ）、ＤＮＡオリゴ（６００ｎｇ／μＬ）と混合した。ＤＮＡオリゴは、標的領域に隣接するＤＮＡ配列と、原標的配列（ｇａｇａｃｃｇａｔａｔｇｇ）を、ＢａｍＨ１部位（ＧＧＡＴＣＣ）およびＥｃｏＲＶ部位（ＧＡＴＡＴＣ）を含む配列に変換する、少数のヌクレオチド変化とを含有する（図５Ａ）。次いで、キュベットにおいて１、４、６または８シリーズ／サイクルのエレクトロポレーションにわたって上記と同じ設定で接合体にエレクトロポレーションした（図４Ｂ）。エレクトロポレーション後、直ちに胚を偽妊娠マウスに移植した。子が生まれた２週間後に組織試料を遺伝子型判定のために採取した。
【０２５８】
標的部位を包含するＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで独立して消化し、シークエンシングした。図６Ａ〜６Ｃおよび直ぐ下の表に示すように、６回／サイクルのエレクトロポレーション後にマウス４匹のうち１匹は、ＫＩ（ノックイン）を有した。その一方で、すべての他の群は、ＫＩを有さなかった。
【０２５９】
Ａｉｃｄａゲノムノックイン（ＫＩ）を生じさせるためのＣａｓ９  ｍＲＮＡ（自社製）の使用
【０２６０】
【表２】
2019501659.tif 000004
【０２６１】
次いで、市販のＣａｓ９  ｍＲＮＡを同じ設定でのエレクトロポレーションに使用した。より良好な出生率が複数サイクルのエレクトロポレーション時に観察された。直ぐ下の表に示すように、ほとんどの群についてＫＩは成功しなかったが、マウス１１匹のうちの３匹は、８シリーズのエレクトロポレーション後にＫＩを有した。
【０２６２】
Ａｉｃｄａゲノムノックイン（ＫＩ）を生じさせるためのＣａｓ９  ｍＲＮＡ（市販）の使用
【０２６３】
【表３】
2019501659.tif 000005
【０２６４】
これらのデータは、複数回／サイクルのエレクトロポレーションは効率を上昇させることができるが、その効率は、ある特定のゲノム遺伝子座に対するマイクロインジェクションのものより依然として低いことを示唆している。
【０２６５】
効率をさらに改善するために、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡに使用したのと同じ設定で、Ｃａｓ９タンパク質を他のＣＲＩＳＰＲ成分とともに送達した。一部の実験では、２５０ｎｇ／μＬのＣａｓ９タンパク質を実験群すべてに使用した。ある特定のエレクトロポレーションされた胚は、エレクトロポレーション後、直ちに偽妊娠マウスに移植し、生存マウスを得た。ある特定の他のエレクトロポレーションされた胚は、培養して胚盤胞期にし、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）およびＤＮＡシークエンシングを使用する遺伝子型判定のために回収した。
【０２６６】
驚くべきことに、胚盤胞試料の分析から得た結果は、エレクトロポレーションにＣａｓ９タンパク質を使用した後、ＮＨＥＪおよびＫＩ効率が両方とも極めて高いことが認められることを示した。注目すべきことに、Ｃａｓ９タンパク質の使用は、１サイクルのエレクトロポレーションでも約７０％ＫＩ効率を達成した（図７Ａ〜７Ｃ、および直ぐ下の表）。
【０２６７】
エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達は胚盤胞におけるＡｉｃｄａのＨＤＲ効率を劇的に上昇させた
【０２６８】
【表４】
2019501659.tif 000006
【０２６９】
正しいＫＩを確認するために、試料の一部を無作為にＴＯＰＯクローニングおよびＤＮＡシークエンシングに選択した（図７Ｃ）。図５Ｂに示されているように、この結果を出生マウスの遺伝子型判定結果により確認した。１ラウンドのエレクトロポレーションを使用して、６０．００％（６／１０）のＫＩ効率を達成した。エレクトロポレーションの数／サイクルを４回に増加させことで、７１．４３％（５／７）という非常に類似した高い効率を達成した。エレクトロポレーション数を６回／サイクルおよび８回／サイクルへとさらに増加させることで、ＫＩ効率８１．３３％（５／６）および１００％（５／５）をそれぞれ得た（図５Ａ〜５Ｃ、および表１）
【０２７０】
【表５】
2019501659.tif 000007
【０２７１】
上の実施例に記載の方法は、Ｓｍｃ１ｂ遺伝子座において２．２ｋｂの欠失を生じさせる点で最適未満の効率を有した（データを示さない）。この実施例で説明するような一連のエレクトロポレーションにＣａｓ９タンパク質を直接使用することが、以前には困難であった遺伝子座において大ＤＮＡセグメント欠失を生じさせるには効率的であることを実証するために、Ｃａｓ９タンパク質、およびＳｍｃ１ｂ遺伝子座の異なる領域を標的とする２つのｓｇＲＮＡを、共エレクトロポレーションした（図８Ａ）。
【０２７２】
簡単に述べると、Ｂ６Ｄ２Ｆ２／Ｊ胚をＩＶＦ（体外受精）により作製し、その際、ＧＳＨ（グルタチオン）を使用して透明帯を弱めた。受精した胚を採点し、選択し、洗浄した。次いで、Ｃａｓ９タンパク質（２５０ｎｇ／μＬ）と２つのｓｇＲＮＡ（３００ｎｇ／μＬ）の混合物を用いて胚に１、４または６回／サイクル、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた胚を偽妊娠マウスに移植した。組織試料を子から採取し、ゲノムＤＮＡの精製およびＰＣＲに使用した。ＰＣＲ産物をＤＮＡ電気泳動およびシークエンシングによって分析した。
【０２７３】
図９Ａに示すように、３／９匹のマウスは、たった１回／サイクルのエレクトロポレーションで理想的な欠失を有した。ＤＮＡセグメント約２２００ｂｐがＳｍｃ１ｂ遺伝子座から欠失された。４および６シリーズのエレクトロポレーションにより、それぞれ、欠失効率２０％（１／５）および３３．３４％（２／６）を得た（図９Ａおよび９Ｂ、ならびに直ぐ下の表）。正しい欠失をサンガーシークエンシングにより確認した。
【０２７４】
ＩＶＦにより作製された胚内へのＣａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるＳｍｃ１ｂのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介大セグメント欠失
【０２７５】
【表６】
2019501659.tif 000008
【０２７６】
ＢＴＸ８３０エレクトロポレーターを用いてＢ６Ｄ２Ｆ２胚にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、胚を洗浄し、偽妊娠（ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｇｎｅｎｔ）マウスに移植した。出生マウスごとに、ＰＣＲ産物をゲノムＤＮＡから増幅し、ＤＮＡ電気泳動およびサンガーシークエンシングによって分析した。
【０２７７】
近交系統を用いる改良プロトコールを評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ系統からのＩＶＦ由来マウス胚を単離し、胚ドナーとして使用した。上記のＢ６Ｄ２Ｆ２交雑胚と同じプロトコールを使用してエレクトロポレーションを行った。２種の移入を群ごとに行った。
【０２７８】
ＰＣＲ産物サイズ分析からの遺伝子型判定結果は、４回のエレクトロポレーションからマウス７匹のうちの１匹、６回のエレクトロポレーションからマウス１０匹のうちの３匹が大セグメント欠失を有することを示した（図８Ｂ、表２）。１サイクルエレクトロポレーションは、高効率で確かにＮＨＥＪ変異を生じさせたが、大セグメント欠失の作製には役に立たなかった（表２）。加えて、一連のエレクトロポレーションは、近交系統の出生率に有意な影響を与えなかった。
【０２７９】
【表７】
2019501659.tif 000009
【０２８０】
全体的に見れば、上の結果は、一連のエレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質送達が、マウスゲノムにおける大ＤＮＡセグメント欠失の作製の点で非常に効率的であることを実証した。
【０２８１】
条件付きＫＯ（ノックアウト）マウスモデルを作製するための、またはタンパク質もしくはＲＮＡ標的にタグを付けるための、小ＤＮＡセグメントの標的化ゲノム挿入は、マウスモデル作製に広く使用されている。一連のエレクトロポレーションを用いるＣａｓ９タンパク質の送達が、小ＤＮＡ断片のゲノム挿入を生じさせるのに十分なものであるかどうかを試験するために、ＩＶＦ胚をＣ５７ＢＬ／６ＮＪ系統から用意し、Ｃａｓ９タンパク質（２５０ｎｇ／μＬ）と、Ｒｏｓａ２６遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ（３００ｎｇ／μＬ）とＬｏｘＰ部位を有するＤＮＡオリゴ（１０００ｎｇ／μＬ）との混合物を用いてエレクトロポレーションを行った（図１０Ａ）。次いで、胚を移植し、生存マウスを回収した。組織試料を子から採取し、ゲノムＤＮＡの精製およびＰＣＲ分析に使用した。
【０２８２】
標的部位を包含するＰＣＲ産物のＴＩＤＥ（分解による挿入欠失の追跡（Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  ＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ））分析は、１、４および６シリーズのエレクトロポレーションにより、それぞれ、１０匹のうち４匹、５匹のうち０匹、および３匹のうち２匹の、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に正しいＬｏｘＰ部位を有する可能性のあるマウスを得たことを示した（表３）。これらの試料をＴＯＰＯクローニングおよびサンガーシークエンシングに選択し、使用した。シークエンシング結果は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座への正しいＬｏｘＰ部位の挿入を確証した。図１０Ａ〜１０Ｃにおける代表画像は、１回のエレクトロポレーションを用いた試料の１つについてのＴＩＤＥ分析およびサンガーシークエンシングの結果を示したものである。
【０２８３】
【表８】
2019501659.tif 000010
【０２８４】
これらの結果は、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ近交系統マウスにおけるものを含む、Ｃａｓ９タンパク質を使用するエレクトロポレーションにより、標的領域に小ＤＮＡ断片を効率的に挿入することができることを実証する。
【０２８５】
実施例で提示したデータは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよびドナーオリゴを使用する一連のエレクトロポレーションの適用することにより上記実施例に記載の方法の効率と比べて効率を向上させることができるが、改善された効率が例えばマイクロインジェクションと比較して依然として相対的に低かったことを明示する。
【０２８６】
この方法論をさらに改善するために、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡではなくＣａｓ９タンパク質を使用してエレクトロポレーションを行い、驚くべきことに、ＫＩ効率が劇的に改善された。１回のエレクトロポレーションを使用するＣａｓ９タンパク質の送達はゲノムＫＩに対して効率的に機能したが、６シリーズのエレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の送達は、近交系統においてでさえゲノム修飾（例えば、大ＤＮＡセグメント欠失）のはるかに高い効率を妥当な出生率とともに達成した。３箇所のゲノム遺伝子座すべてにおける様々な遺伝子修飾（正確なヌクレオチド変化、標的化短鎖セグメント挿入、および大セグメント欠失）について、本明細書に記載の改善された方法は、マイクロインジェクション同等に良好にまたはそれより良好に機能した。
【０２８７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、様々な動物モデルを作製するために広く使用されている（Ｃｈａｐｍａｎら、２０１５；Ｃｈｅｎら、２０１５；Ｍａら、２０１４；Ｎｉｕら、２０１４；Ｒｕａｎら、２０１５；Ｙｉｎら、２０１４；Ｚｏｕら、２０１５）。マイクロインジェクションは、ほとんどの動物種についてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を胚に送達するために今までに使用された、依然として主な方法である。マイクロインジェクションと比較して、開発し本明細書に記載したこの改善された方法は、初心者が行っても、熟練作業者が行うマイクロインジェクションより良好でなかったとしても、それと少なくとも同様に効率的である。マイクロインジェクションは、技術的要求が厳しく、処理量が少ない。加えて、マイクロインジェクションは、設備への有意な出資、ならびに何年も訓練および経験を積んだオペレーターを必要とする。比較して、本明細書に記載の改善された方法には、高効率、高処理量、ならびにセットアップおよび操作の容易さをはじめとする、明らかな利点がある。それ故、この方法を使用して、最も好適な種における遺伝子編集動物モデルを高効率で容易に作製することができる。
【０２８８】
実施例４の実験を行う際に下記の一般的方法およびある特定の試薬を使用したが、これらは、単に例証を目的としたものであり、限定的なものではない。  エレクトロポレーションのための試薬の調製
ｐｘ３３０プラスミドを鋳型として使用して、Ｃａｓ９コード配列を増幅した。Ｔ７プロモーター配列をフォワードプライマーに付加させた。ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行った。
【０２８９】
ｓｇＲＮＡ合成のために、２つのユニバーサルプライマー（下記参照）と、様々なｇＲＮＡ配列を有する１つのプライマー（下記参照）とを使用してＰＣＲ増幅によりＴ７プロモーター配列をｓｇＲＮＡ配列に付加させた。
【０２９０】
すべてのｓｇＲＮＡのためのＩＶＴ  ＤＮＡ鋳型を調製するために使用した２つのユニバーサルプライマー
【０２９１】
【表９】
2019501659.tif 000011
【０２９２】
ｓｇＲＮＡの合成のためのＩＶＴ  ＤＮＡ鋳型を調製するために使用したフォワードプライマー
【０２９３】
【表１０】
2019501659.tif 000012
【０２９４】
Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ産物精製キットを使用してＴ７−ｓｇＲＮＡ  ＰＣＲ産物を精製し、ＩＶＴのための鋳型として使用した。ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｓｇＲＮＡを合成し、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製した。
【０２９５】
一本鎖ＤＮＡオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からＵｌｔｒａｍｅｒ  ＤＮＡオリゴとして取り寄せた。ＤＮＡオリゴ配列を下に列挙した。
【０２９６】
ＨＤＲ媒介ＫＩのためのＤＮＡドナーとして使用したＤＮＡオリゴヌクレオチド
【０２９７】
【表１１】
2019501659.tif 000013
【０２９８】
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋから取り寄せた（Ｌ−６１２５）。Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＮから取り寄せた（ＣＰ０１−５０）か、またはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取り寄せた（Ｂ２５６４１）。
【０２９９】
エレクトロポレーションのための試薬を調製するために、必要濃度のすべての成分を混合し、総体積がエレクトロポレーションの最終体積より大きかった場合は凍結乾燥させた。その混合物を２０，０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、上ずみを、ヌクレアーゼが入っていない新たなチューブに移した。最終溶液の体積を調整して必要体積にした。
【０３００】
Ｃａｓ９  ＲＮＰ（ｓｇＲＮＡと複合体を形成している組換えＣａｓ９タンパク質）を調製するために、Ｃａｓ９タンパク質と、ＤＮＡオリゴを伴うまたは伴わないｓｇＲＮＡとを含むエレクトロポレーション溶液を、３７℃で１５分間インキュベートした。試料を氷の上に置き、直ちにエレクトロポレーションに使用した。
【０３０１】
接合体単離、培養および移入
すべての動物研究は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認され、ＮＩＨにより示された実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）の基準を順守した。
【０３０２】
自然交配により胚を作製する際、マウス胚を単離し、以前に記載された（Ｑｉｎら、２０１５）ように培養した。ＩＶＦは、いくつかの小さい変更を加えた標準プロトコール（Ｂｙｅｒｓら、２００６）に従って行った。簡単に述べれば、Ｃｏｏｋ  ＲＶＦ培地を受精用培地として使用した。受精率を向上させるためおよび透明帯を弱めるために、卵丘卵母細胞塊を１．０ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）中で３０分間プレインキュベーションした。胚を受精および生存能について採点し、ＣＯＯＫ  ＭＩＮＣベンチトップ型インキュベーター内のＫ−ＲＶＣＬ−５０培地の事前に平衡させた微小液滴に入れた。ＰＭＳＧは、ＰｒｏｓｐｅｃｔまたはＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから得た。ｈＣＧは、ＰｒｏｓｐｅｃｔまたはＳｉｇｍａから得た。
【０３０３】
接合体エレクトロポレーション
エレクトロポレーションは、以前に記載された（参照により組み入れられる、Ｑｉｎら、２０１５）ように行った。簡単に述べると、接合体を酸性タイロード液（Ｔ１７８８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０秒間処置し、予温したＭ２培地でよく洗浄した。ＩＶＦにより産生された胚は、酸性タイロード液で処置しなかった。改良ＩＶＦプロトコールでの受精前に、透明帯を弱めるために透明帯を前もってＧＳＨで処置した。
【０３０４】
次いで、接合体をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｐ／Ｎ  ３１９８５、Ｇｉｂｃｏ）の液滴１０μＬに入れた。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ／ドナーを含む溶液１０μＬを、胚を有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ液滴と混合し、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｐ／Ｎ  ４５−０１２４、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に入れた。
【０３０５】
エレクトロポレーションは、ＥＣＭ８３０方形波エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）で行った。各サイクルのエレクトロポレーション設定は、すべての実験について同じであり、３０Ｖで、パルス幅１ｍｓ、およびパルス間隔１００ｍｓで２パルスを使用する。エレクトロポレーション後、胚を回収するために、Ｍ２培地の予温した１００μＬの分割量を滅菌プラスチックピペットでキュベットに入れた。接合体をキュベットから取り出し、予温したＭ２培地で洗浄した。その後、胚をＭＩＮＣベンチトップ型インキュベーター（ＣＯＯＫ；３７℃、５％ＣＯ２および５％Ｏ２／窒素）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して胚盤胞にするか、または偽妊娠雌マウス（ＣＢｙＢ６Ｆ１／Ｊ）に移植した。ＩＶＦ胚については、それらを培養して２細胞期にし、その後、移植した。
【０３０６】
ＲＦＬＰ分析およびサンガーシークエンシング
前に記載された（Ｑｉｎら、２０１５）ようにアルカリ溶解を使用して組織または胚からのゲノムＤＮＡを抽出した。特定のプライマーを用いてＰＣＲを次の条件下で行った：５分間９８℃；３４×（３０秒間９８℃、３０秒間５８℃（または他のアニーリング温度）、３０秒間６８℃）；２分間６８℃；４℃で保持。約４μＬのＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を用いてアガロースゲル（１．０％）上で分離した。ＰＣＲ産物をシークエンシングし、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＣＲ４平滑末端ベクターにクローニングして、正しいシグナルクローンを同定した。個々のクローンの配列をサンガーシークエンシングによって決定した。
【０３０７】
参考文献
【０３０８】
【表１２−１】
2019501659.tif 000014
【０３０９】
【表１２−２】
2019501659.tif 000015
【０３１０】
【表１２−３】
2019501659.tif 000016
【０３１１】
【表１２−４】
2019501659.tif 000017
【０３１２】
【表１２−５】
2019501659.tif 000018
【０３１３】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、参照により本明細書中に組込まれる。
【図１−１】
2019501659.tif 000019
【図１−２】
2019501659.tif 000020
【図２−１】
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【図２−２】
2019501659.tif 000022
【図２−３】
2019501659.tif 000023
【図２−４】
2019501659.tif 000024
【図３−１】
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【図３−２】
2019501659.tif 000026
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【国際調査報告】
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2019501659.tif 000044
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