【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年6月6日(2007.6.6)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】多能性成体幹細胞、その起源、それを得る方法および維持する方法、それを分化させる方法、その使用法、ならびにそれ由来の細胞
【技術分野】
【０００１】
関連特許
本出願は２００１年１０月２５日提出の米国仮特許出願第６０/３４３，３８６号、２
００１年８月７日提出の米国仮特許出願第６０/３１０，６２５号、２００１年２月１５
日提出の米国仮特許出願第６０/２６９，０６２号、２００１年２月１４日提出の米国仮
特許出願第６０/２６８，７８６号の利益を主張するものであり、これらは参照により本
開示に含まれる。出願人はまた国際公開第０１/１１０１１号、第６０/１４７，３２４号
および第６０/１６４，６５０号に基づく優先権を主張し、これらの出願は参照により本
文に含まれる；その中の任意の教示を本発明の実施に用いることができる。本出願は、付
録１に添付しまた本出願の一部である、国際公開第０１/１１０１１号の一部継続出願で
ある。参照により本文に含まれる資料は先行技術とは認められない。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、哺乳類多能性成体幹細胞（MASC）に関し、より詳細には、MASCを入手
し、維持し、そして分化させる方法に関する。疾患の治療におけるMASCの使用もまた提供
される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
幹細胞からの器官および組織の作成、および続くそれらの移植は、いくつかの疾患に有
望な治療法を提供し、幹細胞を多くの分野で研究の中心としている。幹細胞技術は、数例
を挙げれば糖尿病、パーキンソン病、肝疾患、心疾患、そして自己免疫疾患に有望な新し
い治療法を提供する。しかし、器官および組織移植に付随する少なくとも二つの大きな問
題がある。
【０００４】
第一に、提供器官および組織の不足がある。米国だけで移植に必要な器官のわずか5パ
ーセントしか被提供者は入手できない（Evans, et al. 1992）。米国心臓協会によると、
１９９７年に新しい心臓を必要とした米国人４０，０００人のうち２，３００人しか心臓
を受け取っていない。米国肝臓協会は、毎年肝不全で死亡する３０，０００人近い患者に
対して提供者は３，０００人に満たないと報告する。
【０００５】
第二の大きな問題は、被提供者の免疫系と移植組織との不適合の可能性である。提供器
官または組織は宿主免疫系によって異物と認識されるため、金額的にも身体的にもかなり
のコストで免疫抑制薬を患者に与えなければならない。
【０００６】
異種移植、すなわち別の生物種からの組織または器官の移植は、ヒト器官および組織の
不足を克服する別の方法を提供できる。異種移植には先行計画という利点がある。器官を
健康なうちに採取することができ、また患者は移植手術に先立って任意の有益な前処置を
受けることができる。残念ながら、異種移植は、組織不適合の問題を克服しないばかりか
、むしろそれを悪化させる。さらに、疾病対策センターによると、有害なウイルスが種間
障壁を越えるという証拠がある。ブタは、器官および組織提供者として有力候補になって
いるが、しかしブタからヒトへの１種以上のウイルスの種間感染が記録されている。たと
えば、７０名を超えるヒトが感染し死亡した疾患であるヘンドラウイルスの発生を封じ込
めるため、１００万頭を越えるブタが近年マレーシアで屠畜された（Butler, D.1999）
。
【０００７】
幹細胞：定義および用途
移植のための器官および組織の最も期待される起源は、したがって、幹細胞技術の開発
にある。理論上、幹細胞は自己再生する細胞分裂を行って表現型および遺伝子型の同一な
娘細胞を無限回生じることができ、最終的に少なくとも一つの最終細胞型に分化すること
ができる。患者自身の幹細胞から組織または器官を作成することによって、または被提供
者の免疫系が異物と認識しないように異種細胞を遺伝子組み換えすることによって、移植
組織を作成し、感染または組織拒絶という付随する危険なしに異種移植に伴う利点を提供
することができる。
【０００８】
幹細胞はまた、遺伝子治療の結果を改善する見込みを提供する。患者自身の幹細胞をin
vitroで遺伝子組み換えし、それからin vivoで再導入して目的の遺伝子産物を産生する
ことができる。これらの遺伝子組み換え幹細胞は、体の特定の部位に埋め込むための、ま
たは全身投与のための、多数の細胞型を形成するように分化誘導される潜在力を有する。
あるいは、異種幹細胞を遺伝子組み換えして被提供者の主要組織適合複合体（MHC）抗原
を発現させるかまたはMHC抗原を全く発現させないようにすることができ、付随する拒絶
の危険なしに提供者から被提供者へ細胞を移植することが可能になる。
【０００９】
幹細胞は、広範囲な増殖可能性を有し、いくつかの細胞系統に分化して、移植時に組織
に再集合(repopulate)する細胞と定義される。典型的な幹細胞は胚性幹（ES）細胞であり
、それはこれが無限の自己再生および多能性分化可能性を有するからである（Thomson,J
. et al. 1995； Thomson, J.A. et al. 1998；Shamblott, M. et al. 1998； Williams
, R.L. et al. 1988； Orkin, S. 1998；Reubinoff, B.E., et al. 2000）。これらの細
胞は胚盤胞の内細胞塊に由来する（Thomson, J. et al. 1995；Thomson, J.A. et al. 1
998； Martin, G.R.1981）かまたは、移植後胚由来の始原生殖細胞から得ることができる
（胚性生殖細胞すなわちEG細胞）。ESおよびEG細胞はマウスから得られており、より最近
は非ヒト霊長類およびヒトからも得られている。マウス胚盤胞に導入されたとき、ES細胞
は当該マウス（動物）のすべての組織に寄与することができる（Orkin, S. 1998）。マウ
スES細胞はしたがって全能性である。出生後の動物に移植されたとき、 ESおよびEG細胞
は奇形腫を生じ、これはまたそれらの多能性を示す。ES（およびEG）細胞は、発生段階特
異的胎児性抗原（SSEA）1および4に対する抗体を用いた陽性染色法で同定することができ
る。
【００１０】
分子レベルでは、ESおよびEG細胞は、これらの未分化細胞に高度に特異的ないくつかの
転写因子を発現している。これらには、oct-4とRex1、白血病抑制因子受容体（LIF-R）が
含まれる。転写因子sox-2およびRox-1は、ESおよび非ES細胞の両方で発現している。oct-
4は原腸未形成胚、卵割初期胚、胚盤胞の内細胞塊の細胞、および胚性癌（EC）細胞で発
現している。成体動物では、oct-4は生殖細胞だけに見られる。
【００１１】
oct-4は、Rox-1と共同して、亜鉛フィンガータンパク質Rex-1の転写活性化を引き起こ
し、またESを未分化状態に維持するためにも必要である。oct-4遺伝子は、細胞がinvitr
oで分化誘導されるときダウンレギュレートされる。いくつかの研究が、oct-4がES細胞の
未分化の表現型を維持するのに必要であることと、胚発生および分化の初期段階の決定に
おいて大きな役割を果たすことを示している。Sox-2は、ES/ECの未分化状態を保ち、マウ
スES細胞を維持するのに、oct-4と共に必要であるが、ヒトES細胞の維持には必要でない
。ヒトまたはマウス始原生殖細胞は、LIFの存在を必要とする。ES細胞のもう一つの顕著
な特徴は、高濃度のテロメラーゼの存在であり、それはこれらの細胞に無限の自己再生能
力をin vitroで提供する。
【００１２】
幹細胞は大部分の器官または組織で特定されている。最もよく特徴づけられているのは
造血幹細胞（HSC）である。この中胚葉由来細胞は、細胞表面マーカーおよび機能上の特
徴に基づいて精製されている。骨髄（BM）、血液、臍帯血、胎児肝臓および卵黄嚢から単
離されたHSCは、血液細胞を生じる前駆細胞であって、すなわち続く翻訳が複数の造血系
統を再び開始し、被提供者の生命のために造血を再び開始することができる。（Fei,R.,
et al., 特許文献１；McGlave, et al, 特許文献２；Simmons,P., et al, 特許文献３
；Tsukamoto, et al, 特許文献４；Schwartz, et al, 特許文献５；DiGuisto,et al, 特
許文献６；Tsukamoto, et al,特許文献７；Hill, B., etal, 1996を参照） 致死量の放
射線を受けた動物またはヒトに移植されたとき、HSCは赤芽球、好中球-マクロファージ、
巨核球およびリンパ球造血細胞プールに新たに定着することができる。In vitroで、造血
幹細胞を少なくとも数度自己再生する細胞分裂を行うよう誘導することができ、そしてin
vivoでみられるように同一の系統に分化するよう誘導することができる。したがって、
この細胞は幹細胞の基準を満たす。造血系統の細胞を形成するようにのみ分化する幹細胞
は、しかし、他の損傷した組織、たとえば、高用量の化学療法薬物によって損傷した心臓
または肺の組織を修復するための細胞の起源を提供することはできない。
【００１３】
幅広く研究されてきたもう一つの幹細胞は神経幹細胞（NSC）である（Gage F.H.2000
；SvendsenC.N. et al, 1999； Okabe S. et al,1996）。NSCは初め胎児脳の脳室下領域
および嗅球で見出された。最近まで、成体脳は幹細胞の能力を有する細胞を含まないと信
じられていた。しかし、げっ歯類、より最近はまた非ヒト霊長類およびヒトにおけるいく
つかの研究が、幹細胞が成体脳に存在し続けることを示している。これらの幹細胞はin v
ivoで増殖でき、そして連続的に少なくとも一部の神経細胞をin vivoで再生する。exviv
oで培養したとき、NSCは増殖するように誘導することができ、またさまざまな型の神経細
胞およびグリア細胞に分化するように誘導することができる。脳に移植されたとき、NSC
は定着し神経細胞およびグリア細胞を生じることができる。したがって、この細胞も、造
血幹細胞でも、幹細胞の定義を満たす。
【００１４】
Clarke et al.は、マウス胚盤胞またはニワトリ胚に注入されたLac-Z遺伝子導入マウス
由来のNSCは、そのキメラマウスまたはニワトリ胚のいくつかの組織に寄与することを報
告した（Clarke, D. L. et al. 2000）。LacZ発現細胞は、中枢神経系だけでなく、中胚
葉派生物、また肝臓および腸の上皮細胞でさまざまな程度のモザイクで見出されたが、造
血機構を含む他の組織ではみられなかった。これらの研究はしたがって、成体NSCは以前
知られていたよりも顕著に大きな分化可能性を有しうるが、ESまたはFurcht etal. （国
際出願番号PCT/USOO/21387）およびここに記載された、成体から得られた多能性成体幹細
胞（MASC）の全能性は持たないことを示唆した。MASC、MAPCおよびMFCの用語は、成体か
ら得られた多能性成体幹細胞を記載するために交換して使用可能である。
【００１５】
変性および外傷性脳疾患の治療は、細胞置換療法を用いて大きく進歩しうる。NSC は成
体哺乳類脳の脳室下領域（SVZ）および海馬で見出されており（Ciccolini etal, 1998；
Morrison et al., 1999；Palmer et al., 1997；Reynoldsand Weiss, 1992；Vescovi et
al., 1999）、上衣および脳の他の非神経性とされる領域にもまた存在しうる（Doetsch
et al, 1999；Johansson et al, 1999；Palmer etal, 1999）。胎児または成体脳由来NS
Cは、ex vivoで増殖させ星状細胞、稀突起膠細胞および機能する神経細胞に分化するよう
誘導することができる （Ciccolini et al, 1998；Johansson et al, 1999； Palmer et
al, 1999；Reynolds et al, 1996；Ryderet al, 1990；Studer et al, 1996； Vescovi
et al, 1993）。In vivoでは、時間を変えて培養した未分化のNSCはグリア細胞、GABA性
およびドーパミン作用性神経細胞に分化する（Flax et al, 1998；Gageet al, 1995；Su
honen et al, 1996）。NSCの最も広く用いられている起源は同種異系胎児脳であり、これ
は免疫学的および倫理的問題を共に提起する。代案としては、NSCは自家脳から得ること
ができる。事前の神経病状がNSCの、培養され神経細胞およびグリア細胞にex vivoで分化
するよう誘導される能力に影響するかどうかは知られていないため、また既に疾患のある
脳における追加の手術が基礎疾患を悪化させる可能性があるため、この手法は魅力がより
低い。
【００１６】
置換戦略のための神経細胞およびグリアの理想的な起源は、成体の、容易に利用可能な
脳以外の自己組織から採取しうる細胞で、またin vitroで増殖可能でありexvivoまたはi
n vivoで患者に欠けている細胞型に分化しうるものである。近年の報告は、BM由来細胞は
in vitroでNSC条件下で培養したとき、または中枢神経系に入ったとき、神経外胚葉性細
胞の表現型の特徴を獲得することを示唆している（Sanchez-Ramos etal., 2000；Woodbu
ry et al, 2000）。この能力を有するBM細胞の表現型は知られていない。神経外胚葉性の
性質を獲得する細胞の他の細胞型への分化のための能力もまた未知である。
【００１７】
幹細胞の性質を有するもう一つの組織特異的細胞が間葉性幹細胞（MSC）で、Fridensht
ein（1982）によって最初に記載された。MSCは当初は胚性中胚葉から得られそして成体BM
から単離され、分化して筋、骨、軟骨、脂肪、骨髄間質、および腱を形成することができ
る。胚発生の間、中胚葉は肢芽中胚葉、骨、軟骨、脂肪、骨格筋そしておそらく内皮を生
じる組織に発展する。中胚葉はまた器官中胚葉に分化し、これは心筋、平滑筋、または内
皮および造血前駆細胞から成る血島を生じうる。初期中胚葉つまりMSCはしたがって、い
くつかの細胞および組織型の起源を提供しうる。いくつかのMSCが単離されている。（た
とえば、 Caplan, A., et al,特許文献８；Young, H., etal, 特許文献９；Caplan, A.,
et al, 特許文献１０；Bruder, S., et al.特許文献１１；Caplan,A., et al.,特許文
献１２；Masinovsky, B.,特許文献１３；Pittenger, M.,特許文献１４；Jaiswal,N., et
al.,1997,；Cassiede P., et al, 1996；Johnstone,B., et al, 1998；Yoo, et al, 19
98；
Gronthos, S., 1994を参照）。
【００１８】
記載されている多くのMSCのうち、すべてが、一般に間葉起源と考えられている細胞を
形成する限られた分化を示している。現在まで、報告された最も多能性のMSCはPittenger
, et alによって単離された、SH2+ SH4+ CD29+CD44+ CD71+ CD90+ CD106+ CD120a+CD12
4- CD 14- CD34-CD45- 表現型を発現する細胞である。この細胞は分化して間葉起源のい
くつかの細胞型を形成する能力があるが、明らかに、分化可能性は間葉性系統の細胞に限
られていて、この細胞を単離したチームが注目したように拡大培養中に造血細胞は決して
見つからなかった（Pittenger, et al, 1999）。
【００１９】
消化管幹細胞（Potten, C. 1998）、上皮幹細胞（Watt, F.1997）、そして円形細胞と
もいう肝幹細胞（Alison, M. et al. 1998）を含む他の組織特異的幹細胞が同定されてい
る。これらの大部分は比較してよく特徴づけられていない。
【００２０】
ES細胞に比べて、組織特異的幹細胞の有する自己再生能力はより小さく、そして複数の
系統に分化するが全能性ではない。組織特異的細胞が、ES細胞にみられると上記に記載さ
れたマーカーを発現しているかどうかを扱った研究は無い。さらに、組織特異的または系
統決定した幹細胞におけるテロメラーゼ活性の程度は、理由の一部としてこれらの細胞の
多数の高度に増幅した集団を得るのは困難であるため、十分に調べられていない。最近ま
で、組織特異的幹細胞は同一の組織の細胞にだけ分化することができると考えられていた
。いくつかの最近の文献は、成体器官特異的幹細胞にはさまざまな組織の細胞に分化する
能力がありうると示唆している。しかし、これらの型の細胞の真の性質は完全には解って
いない。いくつかの研究は、BM移植時に移植された細胞は骨格筋に分化しうることを示し
ている（Ferrari 1998；Gussoni1999）。このことは、骨髄に存在する間葉性細胞にあり
うる分化可能性の範囲内と考えることができる。Jacksonは、筋サテライト細胞は造血細
胞に分化しうると発表し、これも胚の内臓中胚葉内での表現型の転換である（Jackson19
99）。他の研究は、ある胚葉（たとえば内臓中胚葉）由来の幹細胞が、胚発生中に別の胚
葉から生じると考えられる組織に分化することができることを示している。たとえば、骨
髄移植を受けたヒトまたは動物に検出される内皮細胞またはその前駆細胞は、少なくとも
一部は骨髄提供者に由来する（Takahashi, 1999；Lin, 2000）。このように、内臓神経中
胚葉でなく内臓中胚葉に由来する、MSCのような性質の子孫が、注入される骨髄と共に移
植される。さらに驚くべきことには、げっ歯類とヒトの両方で提供者骨髄に由来する肝上
皮細胞と胆管上皮細胞が被提供者に見られることを示す報告がある（Petersen,1999；Th
eise, 2000； Theise, 2000）。同様に、NSCは造血細胞に分化しうることを３つのグルー
プが示している。最後に、Clarke et al. は、胚盤胞に注入されたとき組織キメラマウス
のすべての組織に寄与できる細胞をNSCと呼ぶことを報告している（Clarke etal, 2000
）。
【００２１】
これらの研究の大半は単一の細胞が異なる器官の組織に分化できることを決定的に示し
ていないことを指摘する必要がある。また、任意の器官から単離された幹細胞は、必ずし
も系統が決定した細胞ではない可能性がある。実際、大部分の研究者は開始細胞の表現型
を特定しなかった。例外はWeissmanとGrompeによる研究で、彼らは、肝臓に定着した細胞
はHSC中に高度に濃縮されているLin-Thy1LowSca1+骨髄細胞に存在したことを示した。同
様に、MulliganグループはHSCで高度に濃縮されている骨髄Sp細胞は筋および内皮に分化
できることを示し、またJackson et al.は筋Sp細胞が造血再構成を担うことを示した（Gu
ssoni et al., 1999）。
【００２２】
異種ES細胞から作成された組織および器官の移植には、移植拒絶から保護するため、あ
る種の細胞表面マーカーの発現を阻害するように細胞にさらに遺伝子組み換えを行うか、
または化学療法の免疫抑制剤の使用を続けるかが必要である。このように、ES細胞研究は
移植のための器官の供給が限られているという問題に有望な新しい解決法を提供するが、
異種細胞または組織の移植を維持するための免疫抑制の必要に伴う問題と危険は残る。人
口の大多数を対照とする治療法に備えて免疫学的に互換性のある細胞を提供するためには
、ES細胞の免疫学的に異なる株を推定２０株確立する必要がある。
【００２３】
自家または組織型別の一致する同種異系幹細胞の起源として、胚でなく成長した個体か
らの細胞を用いることは、移植ES細胞の使用に伴う組織不適合の問題を緩和するかまたは
克服し、またES細胞研究に伴う倫理的二律背反も解決する。自家幹細胞を組織移植に用い
ることに伴う最大の短所は、これまでのところその比較的限られた分化可能性にある。
【００２４】
成熟した生物とくにヒトからいくつかの幹細胞が単離されているが、これらの細胞は、多
能性であることが報告されているにもかかわらず、複数の細胞型に分化する可能性は限ら
れていることを示している。
【特許文献１】米国特許第５，６３５，３８７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４６０，９６４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６７７，１３６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７５０，３９７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，７５９，７９３号明細書
【特許文献６】米国特許第５，６８１，５９９号明細書
【特許文献７】米国特許第５，７１６，８２７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４８６，３５９号明細書
【特許文献９】米国特許第５，８２７，７３５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，８１１，０９４号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，７３６，３９６号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，８３７，５３９号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，８３７，６７０号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，８２７，７４０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
このように、複数の分化可能性を有する幹細胞が以前に他の研究者らおよび本発明者ら
によって単離されているとはいえ、繊維芽細胞、肝、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨
格筋、内皮、間質、平滑筋、心筋そして造血細胞を含むさまざまな系統の幅広い細胞型へ
分化する可能性を有する前駆細胞は記載されていない。細胞および組織移植と遺伝子治療
が、期待される医療の進歩を提供するなら、最大またはもっとも広範囲の分化可能性を有
する幹細胞または前駆細胞が求められる。必要なのは、ES細胞と成体において同等なもの
である。
【００２６】
BM、筋そして脳は、以前思われていたより大きな見かけの可塑性が見出された３つの組
織である。BMは、いくつかの中胚葉性（Ferrari G. et al, 1998；Gussoni E. et al, 1
999；Rafii S. et al, 1994；Asahara T. et al.,1997；Lin Y. et al, 2000；Orlic D.
et al, 2001 ；Jackson K. et al, 2001）、内胚葉性（PetersenB.E. et al, 1999；Th
eise, N.D. et al, 2000；Lagasse E. et al,2000； Krause D. et al, 2001）、そして
神経外胚葉性（Mezey D.S. et al, 2000； BrazeltonT.R., et al, 2000；Sanchez Ramo
s J. et al, 2000；Kopen G. et al, 1999）、および皮膚（Krause,D. et al, 2001）の
構造に寄与しうる細胞を含む。筋由来の細胞は造血機構に寄与しうる（Jackson K.et al
, 1999；Scale P. et al, 2000）。NSCが造血細胞 （BjornsonC. et al, 1999；Shih C.
et al., 2001）、平滑筋筋芽細胞（Tsai R.Y. etal, 2000） に分化しうること、また
マウス胚盤胞に注入されたときNSCがいくつかの細胞型を生じることの証拠もある（Clark
e, D.L. et al, 2000）。
【００２７】
本研究は、多能性成体前駆細胞の特徴を有する細胞を、複数の異なる器官すなわちBM、
筋そして脳から培養して単離することができることを示す。その細胞は同じ形態、表現型
、in vitro分化能力を有し、非常に似通った発現遺伝子プロファイルを有する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、哺乳類、好ましくはマウス、ラットまたはヒトから単離された多能性成体幹
細胞（MASC）である。当該細胞は胚以外の器官または組織に由来し、分化して中胚葉、外
胚葉そして内胚葉起源の少なくとも一つの分化細胞型を形成するよう誘導することのでき
る能力を有する。好適な一実施形態においては、MASCが単離された器官または組織は骨髄
、筋、脳、臍帯血または胎盤である。
【００２９】
MASCから得ることのできる分化細胞の例は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細
胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細
胞または稀突起膠細胞である。分化はin vivoまたはex vivoで誘導することができる。
【００３０】
本発明のMASCはまた、oct4および高濃度のテロメラーゼを構成的に発現し、CD44、MHC
クラスIおよびMHCクラスII発現は陰性である細胞と要約される。治療法としては、治療上
有効な量で患者に投与されたこの細胞である。この治療の驚くべき利点は、奇形腫がin v
ivoで形成されないことである。
【００３１】
本発明の目的は、MASCを含む正常な非ヒト動物を作成することである。好ましくは、当
該動物はキメラである。
【００３２】
本発明の別の一実施形態は、MASCの集団とそのMASCの集団を拡大させる培地を含む組成
物である。一部の場合には、培地が上皮成長因子（EOF）、血小板由来成長因子（PDGF）
および白血病抑制因子（LIF）を含むことが有益である。
【００３３】
本発明はまた、完全にまたは部分的に精製したMASCの子孫細胞の集団を含む組成物を提
供する。子孫細胞はさらに分化する能力を有していてもよく、最終分化していてもよい。
【００３４】
好ましい一実施形態においては、子孫細胞は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細
胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細
胞または稀突起膠細胞細胞型である。
【００３５】
本発明はまた、哺乳類から組織を入手し、接着細胞の集団を確立し、その集団からCD45
+細胞を除去し、CD45-細胞を回収して拡大条件下で培養して拡大した細胞集団を得ること
によって、MASCを単離し増殖させる方法を提供する。本発明の目的はしたがって、この方
法によって拡大した細胞集団を作成することである。
【００３６】
本発明の一つの態様は、MASCを単離して増殖させ、次いで増殖した細胞を目的の分化因
子の存在下で増殖させることによって、MASCをex vivoで分化させる方法である。好まし
い分化因子は、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、ジメチ
ルスルホキシド（DMSO）およびイソプロテレノール；あるいは繊維芽細胞成長因子4（FGF
4）および肝細胞成長因子（HGF）である。本発明の別の態様は分化細胞それ自体である。
【００３７】
本発明は、MASCを単離して拡大し、次いで拡大した細胞集団を哺乳類宿主に投与し、そ
こで前記細胞集団が定着しin vivoで組織特異的細胞に分化し、それによって傷害、遺伝
疾患、後天性疾患または医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機能が補強され
、再構成され、あるいは初めて提供されるように、MASCをin vivoで分化させる方法を含
む。この方法を用いて、MASCはin vivoで自己再生することができる。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの態様は、ex vivoまたはin vivo分化で得られた分化細胞であ
る。好適な一実施形態においては、分化細胞は外胚葉、中胚葉または内胚葉である。好適
な別の一実施形態においては、分化細胞は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、
骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞ま
たは稀突起膠細胞細胞型である。
【００３９】
この技術の重要な用途は、MASCまたはその子孫の治療上有効な量を投与することによっ
て患者を治療する方法である。子孫細胞はさらに分化する能力を有していてもよく、最終
分化していてもよい。この手法の予期しなかった利点は、放射線照射、化学療法、免疫抑
制剤または他の薬物または処置を用いた患者の前処置および／または後処置の必要が減少
または消滅することである。処置前または処置中の耐性の誘導もまた必要でない。
【００４０】
そのような治療法は、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変
性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症およ
び移植拒絶を含むさまざまな疾患および症状を治療することができる。
【００４１】
MASCまたはその子孫は、カテーテル投与、全身注射、非経口投与、経口投与、または胚
への子宮内注射を含む局所注射を介して投与される。投与は医薬として許容される基材と
共に行うことができ、基材は生分解性であってもよい。
【００４２】
患者に投与されたMASCまたはその子孫は、ウイルス、細菌または真菌感染に抵抗するよ
う免疫系を改変する。
【００４３】
驚くべきことに、MASCまたはその子孫が患者に投与されたとき、奇形腫は形成されない
。
【００４４】
患者に投与されたとき、MASCまたはその子孫はまた、傷害、遺伝疾患、後天性疾患また
は医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機能を補強し、再構成し、あるいは初
めて提供することもできる。器官は骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、脳、免疫系、循
環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮
膚、上皮付属器、乳房-乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣および肛門を含む粘膜のう
ち任意のものである。この方法によって治療可能な疾患の例は、癌、心血管疾患、代謝疾
患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的
欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症および移植拒絶である。
【００４５】
MASCまたはその子孫は患者の中で一またはそれ以上の器官にホーミングし、それによっ
て傷害、遺伝疾患、後天性疾患または医原性処置のために欠陥のある細胞または器官の機
能が補強され、再構成され、あるいは初めて提供されるように、そこで定着するが、これ
は驚くべきことでまた予期しなかったことである。好適な一実施形態においては、傷害は
虚血または炎症である。
【００４６】
好適な別の一実施形態においては、MASCまたはその子孫は血管新生を促進する。
【００４７】
本発明の別の態様では、MASCまたはその子孫は、治療薬、好ましくは抗血管新生剤を輸
送するように遺伝子組み換えされている。
【００４８】
本発明は、MASCが骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、脳、免疫系、骨、結合組織、筋
、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房-乳腺、脂肪組
織、および口、食道、膣および肛門を含む粘膜から成る群から選択された組織を産生する
のに有効な量で存在するMASCおよび医薬として許容される担体を含む治療用組成物を提供
する。
【００４９】
本発明はさらに、哺乳類提供者からMASCを取り出して未分化細胞の拡大集団を形成し、
拡大した細胞を患者に投与し、そこで器官、組織または細胞の機能が回復される工程を含
む、器官、組織または細胞の機能を患者に回復させるための治療法を提供する。回復され
る機能は酵素的または遺伝子的でありうる。好適な一実施形態においては、当該哺乳類提
供者は患者である。
【００５０】
本発明はMASCにex vivoで操作のためプロモーターに結合した被提供者のMHC抗原をコー
ドする核酸配列を導入し、そこでMHC抗原がMASCによって発現され、そしてMASCを患者に
移植し、そこでMHC抗原が移植されたMASCの拒絶を阻害するのに十分なレベルで発現され
る工程を含む、患者に移植された異種MASCの拒絶を阻害する方法を提供する。患者はMASC
の提供者と同一種であるかまたは別の哺乳類種である。
【００５１】
患者に移植された異種MASCの拒絶を阻害する別の方法は、遺伝子導入によってMASCにお
いてMHC抗原の発現をノックアウトし、そして遺伝子導入MASCを患者に移植することを含
む。MHC抗原はMASCによって発現されておらず、移植細胞の拒絶は阻害される。
【００５２】
本発明の一つの目的は、MASCを単離しMASCを分化させて血液または血液成分を形成させ
る過程によって、血液または個別の血液成分をex vivoで作成する方法である。好ましく
は、その個別の血液成分は赤血球、白血球または血小板である。
【００５３】
本発明の別の態様は、MASCまたはその子孫のゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、
その分析をバイオインフォマティクスおよび／またはアルゴリズムを用いたコンピュータ
分析を介して使用し、新規データを集め既知データベースと比較してこれらを比較対照す
る工程を含む薬物発見の方法である。
【００５４】
さらなる態様は、MASCまたはその子孫のゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、MASC
の分化をin vitroまたはin vivoで誘導し、分化経路の中間細胞のゲノムまたはプロテオ
ーム構成を分析し、分化経路の最終分化細胞のゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、
バイオインフォマティクスおよび／またはアルゴリズムを用いてMASCおよびその子孫のゲ
ノムまたはプロテオーム構成を特徴づけ、そして得られたデータを比較して経路の構成要
素を同定する工程を含む、分化経路の構成要素を同定する方法である。この方法を用いて
、in vitroで起こる分化とin vivoで起こる分化とを比較することができ、それによって
その二つの系の基本的な差異を特徴づけることができる。
【００５５】
本発明は、MASC中の産物を同定し、当該産物をMASCから単離することによって、治療上
、診断上または研究上の有用性を有する産物をin vitroで作成する方法を提供する。好適
な一実施形態においては、当該産物はタンパク質、脂質、複合糖質、DNAまたはRNAである
。
【００５６】
本発明には、哺乳類において、前記哺乳類に投与された抗原に対する耐性を誘導する方
法が含まれ、その方法は、続いての前記抗原を用いた感作に対する前記哺乳類の体液性免
疫反応が抑制されるように、前記抗原の投与の後またはそれと同時にMASCまたはその子孫
の有効量を前記哺乳類に投与する工程を含む。
【００５７】
血液をex vivoでMASC由来細胞と接触させることを含み、ここで前記細胞が中空の繊維
性の器具の内面を覆っている、患者の血液から毒素を除去する方法もまた含まれる。好適
な一実施形態においては、当該細胞は腎または肝細胞である。
【００５８】
本発明の一つの目的は、前記患者の血液をex vivoでMASCまたはその子孫と接触させる
ことを含み、ここで前記MASCまたはその子孫は治療薬を輸送するように遺伝子組み換えさ
れている、治療用産物を患者へ輸送するための方法である。さらなる一つの目的は、MASC
またはその子孫をex vivoで前記薬物と接触させ細胞生存を観察することを含む、薬物の
毒性を試験するための方法である。好適な一実施形態においては、当該子孫細胞は肝、内
皮、上皮および腎細胞より成る群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
下記の詳細な説明は、説明の目的で提示され、しかし本発明を記載の特定の実施例に限
定することを意図せず、本願に引用して援用する添付の図面と共に理解することができる
。
【００６０】
図１は、骨髄（BM）、筋および脳由来MASCの拡大可能性を示す図である。
【００６１】
図２は、遺伝子発現の（A）筋および脳MASCそして（B）骨髄および筋MASCにおける遺伝
子発現を示す散布図である。
【００６２】
図３は、未分化MASCおよびVEGFとともに培養したMASCのFACS分析を示す図である。プロ
ットはイソ型対照IgG染色プロファイル（細線）に対し特異的抗体染色プロファイル（太
線）を示す。図Aは未分化MASCの表現型を示す。MASCは低レベルのp2ミクログロブリン、F
lk1、Fit 1およびAC 133を発現しているが、他のどの抗内皮マーカーでも染色されない；
図Bは14日間、10ng/mLのVEGFとともに培養したMASCの表現型を示す。MASCは内皮細胞に伴
う低レベルの大部分のマーカーを発現しているが、AC 133の発現は失っている；そして図
Cは3〜9日間10ng/mLのVEGFとともに培養したMASCの表現型を示す。MASCはVEGFとともに培
養した３日目までにAC 133の発現を失い、TekおよびVE-カドヘリンの発現を３日目までに
獲得し、CD34およびHIP12を9日目までに獲得している。
【００６３】
図４はmMASCの定着とin vivo分化の顕微鏡写真である。スライドは蛍光または共焦点顕
微鏡法で検査した。図A、G、J、N、QおよびSは、mMASCを注射されていない対照NOD-SCID
動物の同一に染色された組織を示す。図A〜Fは、抗β-gal-FITC抗体および各種造血抗原
に対するPE-結合抗体で染色した、対照（A）および試験（B〜F）動物からの骨髄（BM）サ
イトスピンの顕微鏡写真を示す。A〜B:CD45、C:CD19、D:MAC1、E:GR1、F:TER119およびDA
PI；図G〜Iは、抗β-gal-FITC抗体および抗CD45-PE抗体で染色した、対照（G）および試
験動物（H、I）からの脾臓断面の顕微鏡写真を示す。提供者由来抗β-gal+細胞が塊にな
って見られる。Hは10倍でIは60倍の倍率である；図J〜Mは、抗β-gal-FITCで染色した、
対照マウス（J）および試験動物（K〜M）からの肝臓断面の顕微鏡写真を示す。J〜Lはマ
ウス抗CK-18/抗マウス-Cy5に加えてCD45-PEと、そしてMはマウス抗アルブミン/抗マウスC
y3抗体と同時染色されている。J〜K、LおよびMはそれぞれ20倍、60倍および10倍の倍率で
ある；図N〜Pは、抗β-gal-FITCに加えてマウス抗pan-CK/抗マウス-Cy5抗体（N〜P）で染
色された、対照マウスおよび試験動物（O〜P）からの腸断面の顕微鏡写真を示す。Nおよ
びPはCD45-PE抗体で同時染色した。β-gal+Pan-CK+CD45-上皮細胞が絨毛の周囲の50%を覆
っている（黒矢印、図P）。CD45について同時染色した（P）絨毛の中心のPan-CK-/β-gal
+細胞（白矢印-図O）；図Q〜Rは抗β-gal-FITCに加えてマウス抗pan-CK/抗マウス-Cy5お
よびCD45-PE抗体で染色した対照マウス（Q）および試験動物（R）からの肺断面の顕微鏡
写真を示す。いくつかのβ-gal+pan-CK+提供者細胞が被提供者動物の肺胞の内面を覆って
いるのが見られる（R）。造血起源のCD45+/pan-CK-細胞が上皮細胞から明らかに見られる
；そして図S〜Tは抗β-gal-FITC、抗vWF-PEおよびTO-PRO3で染色した対照マウス（S）お
よび試験動物で成長した移植後16週間の胸腺リンパ腫（T）の血管断面の顕微鏡写真を示
す。
【００６４】
β-gal+提供者細胞は、腫瘍細胞は抗β-Gal抗体で染色されなかったので被提供者起源
である胸腺リンパ腫内でvWF+内皮細胞に分化した。
【００６５】
図５はMASC由来内皮細胞の共焦点蛍光顕微鏡法を用いた免疫組織化学的評価を示す図で
ある。（a）VEGF中で14日間培養したMASC。接着受容体αvβ5について、および接着結合
タンパク質ZO-1、β-およびγ-カテニンについて、典型的な膜染色が見られる。目盛り棒
＝50μm。（b）VEGF処理後0日目（上図）および21日目（下図）のMASCの明視野での形態
。棒＝25μm。
【００６６】
図６はMASC由来内皮細胞の顕微鏡写真である。図AはMASC由来内皮からのvWFのヒスタミ
ン媒介放出を示す。ミオシンに対する抗体を用いた染色が、ミオシンストレスファイバー
の数の増殖、およびギャップ結合の拡大（矢印）を伴う細胞骨格の変化を示す（実験３回
の代表例）。目盛り棒＝60μm；図BはMASC由来内皮がa-LDLを取り込むのを示す。7日間後
、細胞はTie-1を発現したが、今度はa-LDLを取り込まなかった。しかし、9日目のvvWF発
現の獲得はaLDL取り込みを伴った（実験１０回の代表例）。目盛り棒＝100μｍ；そして
図CはMASC由来内皮による血管形成を示す。6時間後、典型的な血管をみることができた（
実験６回の代表例）。目盛り棒＝200μｍ。
【００６７】
図７はMASC由来内皮細胞のFACS分析を示す図である。プロットはイソ型対照IgG染色プ
ロファイル（細線）に対する特異的抗体染色プロファイル（太線）を示す（実験＞３回の
代表例）。プロットの上の数字は対照IgG染色および特異的抗体染色についての平均蛍光
強度（MFI）である。図Aはフローサイトメトリー分析で、MASC由来内皮細胞で低酸素がFl
k1およびTek発現をアップレギュレートするのを示す；図BはMASC由来内皮細胞によるVEGF
産生を低酸素がアップレギュレートするのを示す。VEGFレベルはELISAで測定し、結果は
実験６回の平均±SEMで示す；そして図CはIL-1aがクラスIIHLA抗原の発現を誘導し接着受
容体の発現を増加させることを示す。プロットはイソ型対照IgG染色プロファイル（細線
）に対する特異的抗体染色プロファイル（太線）を示す（実験３回の代表例）。プロット
の上の数字は対照IgG染色および特異的抗体染色についてのMFIを示す。
【００６８】
図８はヒトMASC由来内皮細胞の顕微鏡写真である。図C〜Fは抗ヒトβ2-ミクログロブリ
ン-FITC（図C）または抗マウス-CD31-FITC（図D）のいずれか、および両者の融合（図E）
、抗vWF-Cy3（図F）および３つの染色パターンの融合（図G）の３次元再構成図を示す。
図AおよびBは抗ヒトβ2-ミクログロブリン-FITCおよび抗vWF-Cy3、または抗マウスCD31-C
y5および抗vWF-Cy3、のいずれかで染色した一つの切片の共焦点像を示す。目盛り棒＝100
μｍ。図HはヒトMASC由来内皮細胞（上図）またはヒト包皮繊維芽細胞s（下図）を注射し
たマウスにおいて抗β2-ミクログロブリン-FITCおよび抗vWFで染色した穿孔した耳で創傷
治癒が結果として高度に血管新生した部分を生じたのを示す。目盛り棒＝20μm。C＝軟骨
。D＝真皮。図Iは腫瘍血管新生がin vivoでMASCから生じた内皮細胞に由来し、結果とし
て抗β2-ミクログロブリン-FITC、抗vWFおよびTOPRO-3で染色した腫瘍中に高度に血管申
請した部分を生じるのを示す。目盛り棒＝20μｍ。
【００６９】
図９はhMSC由来神経細胞様細胞におけるスパイク生成および発現した電位依存性ナトリ
ウム電流を表す図である。図Aはスパイク生成および発現した電位依存性ナトリウム電流
を示した培養hMSC由来神経細胞の顕微鏡写真を示す（ピペットの影が細胞を指す）。図B
はhMSC由来神経細胞から得た電流固定記録を示す図である。図Cは同じhMSC由来神経細胞
から得たリークを差し引いた電流記録を示す図である。
【００７０】
図１０は肝細胞様表現型を確認した定量的RT-PCRおよびウェスタンブロット分析を示す
図である。図AおよびBはFGF4およびHGF、またはFGF4単独と、それぞれ21および28日間Mat
rigel（商標）で培養したmMASC（A）およびhMASC（B）を示す。αFP、Cyp2b9およびCyp2
bl3については、未分化MASCでは転写物が検出されなかったため、ブロットの下の数字は
肝臓から得たmRNAとの相対比である。Li＝マウスまたはヒト肝臓mRNA；NT＝テンプレート
無し。マウス５例とヒト１例の試験の代表例として、図CはFGF4およびHGF、またはFGF4単
独と、21日間Matrigelで培養したhMASC（B）を示す。FH＝Matrigel上のFGF4およびHGF誘
導性hMASC、Huh＝対照として用いたHuh7細胞株。
【００７１】
図１１は肝細胞様細胞の顕微鏡写真を示す。FGF4によって誘導されたMASCはグリコーゲ
ンを産生する。グリコーゲン貯蔵は染色濃部の集積として見られる（試験３回の代表例）
。目盛り棒＝25μｍ。
【００７２】
定義
ここでは、以下の用語は以下の意味を持つものとする:
「拡大」は分化なしでの細胞の増殖を意味することとする。
【００７３】
「中間細胞」は、MASCの分化の間に生じる、MASCまたはその最終分化した子孫の一部の
特徴を有するがすべての特徴は有しない細胞である。中間細胞は特定の経路に決定された
前駆細胞であってもよいが、特定の細胞型に決定されていてはならない。
【００７４】
「正常」は病気、突然変異、または奇形を有しない動物、すなわち健康な動物を意味す
ることとする。
【００７５】
「自己再生」は外的刺激を加えられることなしに増殖する細胞の能力を意味することと
する。組織または器官で局所的に産生されるサイトカインまたは他の成長因子の存在は外
的刺激とならないこととする。
【００７６】
「ホーミング」は、追加の細胞が必要である部位に特異的に移動する、一部のMASCまた
はその子孫の能力を意味することとする。
【００７７】
「発現のノックアウト」は、特定の遺伝子の機能の消失を意味することとする。
【００７８】
ここでは、「ゲノムまたはプロテオーム構成」は任意の細胞の遺伝子またはタンパク質
構成要素を意味することとする。
【００７９】
「高レベルのテロメラーゼ活性」はヒト不死細胞株MCF7で観察されるレベルの２倍と関
連づけることができる。Soule et al. （1973） J. CancerInst.
51:1409-1416。
【００８０】
技術用途
MASC技術は哺乳類の体内の損傷細胞、疾患細胞、機能不全細胞または死細胞に置き換え
るのに用いることができる。さらにこれらの細胞は、自家または同種異系細胞を用いて、
天然または人工の担体、基材、または高分子とともにあるいはこれら無しで、たとえば鎌
状赤血球病、血友病または、たとえばゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ムコ多糖症など
のように処理の欠陥のために産物が体内に蓄積する「貯蔵病」といったタンパク質機能に
影響する遺伝子突然変異のように遺伝的な、失われた細胞、異常な機能または細胞または
器官を修正するために、宿主に注射することができる。瀕死細胞または死細胞の回復の例
は、黄斑変性症および他の神経変性疾患の治療におけるMASCまたはその分化した子孫の用
途となりうる。
【００８１】
これらのMASCを宿主動物の器官/組織に「ホーミング」させて組み込み増殖および分化
する能力を考えると、MASCはおそらく虚血心および心筋細胞自体にも新しい内皮細胞を提
供するのに用いることができる可能性があり、多数の他の例が存在する。
【００８２】
組織または器官の機能への一時的な利益が望ましい効果を有しうる医学的状況があり得
る。たとえば、正常な肝機能が回復できるようにするために十分なバイオ人工肝臓を接続
し、肝移植の必要を防いだ肝障害患者の例がある。これはたとえば、C型肝炎というひと
つの肝疾患だけでも、重大で満たされていない医療上の必要である。現在C型肝炎に感染
している米国人は4〜5百万人存在し、これらの人々の50%が将来肝硬変になり肝移植を必
要とするという推定がある。このことはぜひ救済を要する公衆衛生上の大問題である。自
家または同種異系MASCに由来する肝細胞は、C型肝炎または他の肝疾患において移植でき
る。そのような移植は、提供者自身の肝細胞が回復できるように一時的に肝機能を提供す
るか、または永久的に損傷肝臓に再定着し提供者細胞によって正常な肝機能が回復するよ
うにすることができる。
【００８３】
未分化のMASCがヒトまたは他の哺乳類に投与されその後被提供者の中で特定の細胞に分
化する多くの細胞療法に加えて、MASCの子孫細胞はex vivoで分化させてその後に精製し
た細胞または細胞の混合物として治療上の利益を提供するために投与することができる。
これらの未分化状態のMASCはまた、治療上の利益を有する薬物または分子を輸送する担体
または媒体として使用することができる。これは、癌、心血管疾患、炎症性疾患、免疫疾
患、感染症、などを含むがこれに限定されないいくつかの疾患のうち任意のものを治療す
るのに用いることができる。そこで例として、細胞、おそらく新規のまたは高いレベルの
血管新生分子を発現している内皮細胞を、患者に投与することができ、それは既存の血管
に組み込まれて血管新生をたとえば心臓で促進する；同様に、血管新生を抑制する分子を
産生し、血液細胞に組み込まれてそれ以上の形成をたとえば糖尿病性網膜症または新たな
血管形成が疾患の病因、蔓延および程度の鍵となる癌において抑制する内皮細胞を得るこ
とができる。
【００８４】
BMに定着して血液をex vivoで形成する能力は、影で重要な医療上の用途を有する。た
とえば、血液のex vivo産生に関して、輸血および血液製剤の注射は世界中でまだ行われ
ていて、その安全性は病原体の感染のために変わりやすい。輸血は、HIV、BおよびC型肝
炎、そして現在は狂牛病またはCJD、クロイツフェルト-ヤコブ病の差し迫った危険に繋が
ってきた。血液、特に赤血球をin vitroで産生する能力は、血液をヒトから集めることの
安全かつ信頼できる代替法を提供しうる。提供者からの採血を完全に代替することは決し
て無いと思われる。hMASCまたはその造血性の子孫を、たとえばヒツジといった動物に胎
内で注入し、ヒト造血細胞を形成しヒト血液成分または医療上の用途のあるタンパク質の
起源として使うことができる。同じことが肝細胞、膵島または多くの他の細胞型について
いえるが、ヒト細胞をin vitroで産生することの代替案を提供し、動物を細胞の工場とし
て用いる。このことは発生が予測される血液不足を補助することができる。hMASCはまた
、考えられる限りでは、いくつかの欠陥のうち任意の一つを修正するためにヒト胚に移植
することができる。
【００８５】
これらのMASCは特異的に分化した細胞のクローン集団を生じることができるため、これ
らは薬物発見の豊かな基盤である。これにはこの周辺の、遺伝子を発現させること、遺伝
子発現を分析すること、活性化の新規の遺伝子活性化パターンの発見、プロテオミクスお
よびタンパク質発現および修飾のパターンが含まれる。これはデータベースと、これらの
データを公開または自己所有のデータベースと比較したこれらのデータを分析するための
アルゴリズムとを用いて、バイオインフォマティクスで分析される。既知の薬物または物
質がどのように挙動するかの情報を、MASC、その分化した子孫、および利用可能なヒトの
集団から得られた情報と比較することができる。経路、標的、および受容体を同定するこ
とができる。新薬、抗体または他の化合物が生物学的に望ましい反応を生じるのを発見す
ることができる。同様に、MASCおよびその分化した子孫を、データベース、バイオインフ
ォマティクスおよびアルゴリズムと組み合わせて、望ましくない反応についてのモニター
として用いることができる。
【００８６】
ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳類に由来するこれらのMASCは現在までに知られた
唯一の、正常の、非-悪性の、継代の遅い細胞でさえ非常に高レベルのテロメラーゼを発
現する体細胞（非-生殖細胞）であるように見える。テロメアはMASCで伸長していて核型
的には正常である。哺乳類に注射されたMASCは、複数の器官へホーミングするので、特定
の器官に新たに到着したMASCは自己再生できる可能性がある。このように、MASCは自分自
身だけでなく、損傷したか、死亡したか、でなければ遺伝的または後天性疾患のために異
常な機能を有した細胞型である、自己再生する分化した細胞型でも、器官に再定着する可
能性を有する。
【００８７】
たとえば、I型糖尿病では膵島のインシュリン産生ベータ細胞が進行性に失われる。各
種の腎疾患では機能の進行性消失と、一部の場合では糸球体の消滅がある。もし糖尿病の
場合には、MASCまたは分化した子孫が膵臓にホーミングして、それ自身でまたは膵臓の中
で内因性細胞との相互作用によって、膵島が形成されるように誘導しうる。これは糖尿病
を改善する効果を有しうる。最終的には、MASCの自己再生する能力をin vivoで制御する
、すなわち促進または抑制し、そして分化した子孫、たとえば、膵島前駆細胞、肝細胞前
駆細胞、血球前駆細胞、神経および／または心前駆細胞への移行を制御する、すなわち促
進または抑制する、条件、物質または薬物が見出されうる。MASCを用いて、増殖し分化す
る内因性前駆細胞を器官の中で誘導しうる、経路、活性化の方法および制御を見出しうる
。
【００８８】
細胞組織または器官の区画に再定着し自己再生しそしてまた分化するこの同じ能力は、
多数の用途と、医療上の満たされていない深い必要性を満たす前例の無い効用を有しうる
。たとえば、酵素欠損症が存在するある種の遺伝疾患は、BM移植によって治療されている
。これはしばしば、疾患の後遺症が脳または骨または他の場所に残りうる疾患の合併症に
助けとなりうるが治癒はしない。MASCおよび遺伝子組み換えMASCは、多数の遺伝的および
後天性疾患を改善する希望をもたらす。これらはまた、診断上または研究上の目的および
薬物発見に有用となる。
【００８９】
本発明はまた、MASCのゲノムまたはプロテオーム構成を分析し、バイオインフォマティ
クスによるその分析、アルゴリズムによるコンピュータ分析と組み合わせて、新たなデー
タベースを収集し既知のデータベースと比較しこれらを対照することを含む；薬物発見、
ゲノミクス、プロテオミクス、および経路の同定のための方法を提供する。これによって
、治療上の利益を有する可能性のある新規化合物、抗体、タンパク質、小分子有機化合物
、または他の生物活性分子に関する標的の定義に繋がりうる、主要構成要素、経路、新規
遺伝子および／または遺伝子とタンパク質発現とタンパク質修飾の新たなパターン（プロ
テオミクス）が同定できる。
【００９０】
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、しかし本発明を限定しない。
【実施例１】
【００９１】
マウス多能性成体幹細胞（mMASC）の選択、培養および特徴づけ
細胞単離と拡大
すべての組織はミネソタ大学学内動物実験委員会からのガイドラインに従って得た。BM
単核細胞（BMMNC）はBMのフィコール・ハイパック分離によって得た。BMは5〜6週齢のROS
A26マウスまたはC57/BL6マウスから得た。あるいは、筋および脳組織を3日齢のマウス129
匹から得た。前肢および後肢の近位部からの筋を摘出しよく挽いた。その組織を0.2%コラ
ゲナーゼ（Sigma Chemical Co, St Louis, MO）を用いて1時間、37℃で処理し、次いで0.
1%トリプシン（Invitrogen, Grand Island, NY）で45分間処理した。細胞をその後よく磨
砕し、70μｍフィルターを通した。細胞懸濁液を回収して、10分間、1600rpmで遠心分離
した。脳組織は切開してよく挽いた。細胞を0.1% トリプシンおよび0.1% DNAse（Sigma）
とともに30分間、37℃でインキュベートして解離させた。細胞をその後よく磨砕し、70μ
ｍフィルターを通した。細胞懸濁液を回収して、10分間、1600rpmで遠心分離した。
【００９２】
BMMNCまたは筋または脳懸濁液を、1xl05/cm2で拡大培地[2%PCS添加低グルコースDulbec
co最小必須培地（LG-DMEM）に、血小板由来成長因子（PDGF）と上皮成長因子（EGF）およ
び白血病抑制因子（LIF）を各10ng/mL]に平板播種し、5xl03/cm2で維持した。3〜4週間後
、トリプシン/EDTAで回収した細胞からCD45+/グリコフォリン（Gly）-A+細胞を磁気マイ
クロビーズを用いて除去した。結果として得られたCD45-/Gly-A-細胞を10細胞/ウェルでF
N被覆96穴プレートに再播種し、0.5〜1.5x103/cm2の間の細胞密度で拡大した。MASCの拡
大可能性は由来する組織にかかわらず同様であった（図1）。
【００９３】
MASCの特徴づけ
表現型的には、BM、筋および脳由来の、FNで培養したmMASCは、CD13+、CD44-、CD45-、
クラスIおよびクラスII組織適合抗原-、低Flk1およびcKifで、国際出願番号PCT/US00/213
87に記載されたhMASCの特徴と同一であった。細胞をIV型コラーゲン、ラミニンまたはMat
rigelで培養したときのほうが、最初の2〜3ヶ月間の細胞拡大はより大きかったが、細胞
はMSCの表現型の特徴を有した、すなわち、CD44を発現しCD13を発現しなかった。ヒト細
胞と同様に、FNで培養したmMASCはoct-4の転写物とLIF-Rとを発現した。
【００９４】
10個のCD45-/GlyA-細胞を播種したウェルの約１％から、連続的に成長する培養が得ら
れた。これは、培養MASCを開始しうる細胞が稀であっておそらくCD45-/GlyA-細胞の1/1,0
00より少ないことを示唆する。FNで培養したmMASC は直径8〜10μｍで大きい核と少ない
細胞質を有する。いくつかの集団が> 100 PDの間培養されている。細胞の形態と表現型は
培養期間を通じて変化しないままであった。
【００９５】
40および102 PDを経過したmMASCを採取し、テロメア長を評価した。テロメア長はPharm
ingen（New Jersey, USA）のテロメア長分析キットを用いて取扱説明書に従って測定した
。40 PDの間培養したmMASCの平均テロメア長（ATL）は27Kbであった。102PD後に再試験し
たとき、ATLは変化しないままであった。mMASCの核型分析には、以前に記載した通り細胞
を採取前に1:2希釈で12時間継代培養し、トリプシン-EDTAを用いて回収し、1.5時間コル
セミド処理し、続いて低張KClを用いて細胞溶解し、酸/アルコールで固定した（Verfaill
ie et al., 1992）。細胞遺伝学的分析は月単位で行い、45 PD後に高二倍体となった、試
験には使われなくなった一つの集団を除いて正常核型を示した。
【００９６】
46から>80PD後に得られたマウスMASCを、ES細胞の未分化状態を維持するのに重要な二
つの転写因子であるOct4およびRex1の発現レベルについて、定量的（Q）-RT-PCRによって
試験した。マウスMASC、神経外胚葉性に分化した子孫（bFGFの添加後1〜7日目）およびマ
ウスES細胞からRNAを抽出した。RNAを逆転写し、結果として得られたCDNAを下記の反応条
件で40回増幅した（ABI PRISM 7700, PerkinElmer/Applied Biosystems）: 2μLのDNA溶
液と、1X TaqMan SYBR Green Universal Mix PCR反応緩衝液を用いた最初の変性（95℃で
10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40サイクル。プライマーは表1
に列記する（配列番号１−１２）。
【表１】
2004529621.tif 000001
【００９７】
mRNAレベルはGAPDHをハウスキーピング遺伝子として用いて標準化し、マウスES細胞中
のレベルと比較した。oct4およびRex1 mRNAは、BM、筋および脳由来MASC中に同様のレベ
ルで存在した。Rex1 mRNAレベルはmMASCおよびmES細胞で同様であった一方、oct4mRNAレ
ベルはMASCでES細胞より約1,000倍低かった。
【００９８】
マウスBM、筋および脳由来MASCの発現遺伝子プロファイルは非常に類似している
異なる組織に由来するMASCが同様であるかどうかさらに評価するために、
BM、筋および脳由来MASCの発現遺伝子プロファイルをU74A Affimetrix遺伝子アレイを用
いて検討した。要約すると、45回細胞分裂の間培養した2〜3xl06個のBM、筋または脳由来
MASCからmRNAを抽出した。CDNAの調製、6,000個のマウス遺伝子と6,000個のESTクラスタ
ーを含むU74Aアレイとのハイブリッド形成、およびデータ取り込みは取扱説明書に従って
行った（すべてAffimetrix, Santa Clara, CAより）。データ分析はGeneChip（登録商標
）ソフトウェア（Affimetrix）を用いて行った。2.2倍の因数での発現増加または減少（I
yer V.R. et al., 1999；ScherfU. et al., 2000；AlizadehA.A. et al, 2000）を有意
とみなし、r2値を直線回帰分析を用いて決定した（図2）。
【００９９】
３種類の組織に由来するMASCの発現遺伝子プロファイルの比較は、BM由来のMASCで筋由
来と比べて遺伝子の1%未満が2.2倍より大きく異なるレベルで発現していたことを示した
。同様に、BM由来のMASCで脳由来と比べて遺伝子の1%未満だけが2.2倍より大きく異なる
レベルで発現していた。異なるMASC集団間の相関係数は>0.975であったため、異なる組織
に由来するMASCは非常に相同であり、上記の表現型および実施例5に記載の分化の特徴と
合致する。
【０１００】
マウス特異的培養条件を用いて、mMASC培養を100細胞分裂以上維持している。mMASC培
養は、-HMG-LacZについて遺伝子導入したC57B1/6マウス、ROSA26マウスおよびC57BL/6マ
ウス由来の骨髄を用いて開始した。
【実施例２】
【０１０１】
ラット多能性成体幹細胞（VMASC）の選択と培養
Sprague DawleyまたはWistarラット由来のBMおよびMNCをmMASCについてと同様の条件下
で得て播種した。21〜28日間後、細胞からCD45+細胞を除去し、結果として得られたCD45-
細胞を10細胞/ウェルで継代培養した。
【０１０２】
mMASCと同様に、rMASCは>100PDの間培養して拡大している。ラットMASC培養の拡大条
件には、EGF、PDGF-BBおよびLIFの添加と、I型コラーゲン、ラミニンまたはMatrigelでな
くFNでの培養が必要であった。rMASCはCD44、CD45およびMHCクラスIおよびIIについて陰
性で、高レベルのテロメラーゼを発現した。100細胞分裂を超えて生育する正常細胞の能
力は前例が無く、予想外で、20年以上の従来の定説に反する。
【０１０３】
42PD、72 PD、80 PD、および100 PDを経過したラット MASCを採取してテロメア長を評価
した。42 PD、72 PD、80 PD、and 100 PD後のサザンブロット分析で測定されたように、
テロメアは培養中に短縮しなかった。ラットMASCの毎月の細胞遺伝学的分析では正常核型
が見られた。
【実施例３】
【０１０４】
ヒト多能性成体幹細胞（hMASC）の選択と培養
BMは健康なボランティア提供者（2〜50歳）から、研究におけるヒト被験者の使用に関す
るミネソタ大学委員会からのガイドラインを用いたインフォームド・コンセント後に得ら
れた。BMMNCはフィコール・パック密度勾配遠心分離によって得られ、depletedof CD45+
およびグリコフォリン-A+細胞を磁気マイクロビーズ（MiltenyiiBiotec, Sunnyvale, CA
）を用いて除去した。
【０１０５】
拡大条件: 5x103個のCD45-/GlyA-細胞を200uLの拡大培地[1Xインシュリン-トランスフェ
リン-セレン（ITS）、1Xリノール酸ウシ血清アルブミン（LA-BSA）、10-8Mデキサメタゾ
ン、10-4Mアスコルビン酸-2-リン酸（すべてSigma）、100Uペニシリンおよび1,000Uスト
レプトマイシン（Gibco）を添加した58%DMEM-LG、40%MCDB-201（SigmaChemical Co, St 
Louis, MO）に、10 ng/mlのEOF（Sigma）および10ng/mlのPDGF-BB（R&DSystems, Minnea
polis, MN）を含む胎児ウシ血清（PCS）（HycloneLaboratories, Logan, UT）を0〜10%
添加]で希釈し、5ng/mlのFN（Sigma）で被覆した96穴プレートのウェルに播種した。培地
は4〜6日毎に交換した。ウェルの>40〜50%に密集成長したら、接着細胞を0.25%トリプシ
ン-EDTA（Sigma）を用いて剥離して、MASC拡大培地に1:4希釈で5ng/mlのFNで被覆したよ
り大きな培養容器に再播種し、2〜8x103細胞/cm2の間の細胞密度を維持した。
【０１０６】
未分化のMASCはCD31、CD34、CD36、CD44、CD45、CD62-E、CD62-L、CD62-P、HLA-クラス
IおよびII、cKit、Tie、Tek、αvβ3、VE-カドヘリン、血管内皮細胞接着分子（VCAM）、
細胞内接着分子（ICAM）-1を発現しなかった。MASCは低い/非常に低いレベルのβ2-ミク
ログロブリン、αvβ5、CDw90、AC133、Flk1およびFlt1、そして高レベルのCD13とCD49b
を発現した（図3）。
【実施例４】
【０１０７】
免疫表現型分析
免疫蛍光
1.培養細胞を4%パラホルムアルデヒドおよびメタノールメタノールを用いて室温で固定し
、一次抗体と、そして二次抗体とあるいは二次抗体無しで、連続して各30分間インキュベ
ートした。各工程の間に、スライドをPBS/BSAで洗浄した。細胞は蛍光顕微鏡法（ZeissA
xiovert； Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY）および共焦点蛍光顕微鏡法（共焦点1024
顕微鏡； Olympus AX70, Olympus Optical Co. LTD,Japan）によって検査した。任意の
培養中の異なる細胞型の頻度を評価するために、任意の抗体について染色陽性となった細
胞を４つの視野（視野あたり細胞50〜200個）で計数した。2.採取組織:血液およびBMのサ
イトスピン標本をアセトン（Fisher Chemicals）で10分間、室温で固定した。固形器官に
ついては、組織の5μｍ厚の新鮮凍結切片をスライドグラスに乗せ、ただちにアセトン中
で10分間、室温で固定した。イソ型血清で20分間インキュベート後、サイトスピン調製物
または組織切片を、組織特異的抗原、β-galおよび核対比染色剤（DAPIまたはTO-PRO-3）
について連続的に染色した。
【０１０８】
カバースリップはSlowfade-antifadeキット（MolecularProbes Inc., Eugene, OR, USA
）を用いて乗せた。スライドは蛍光顕微鏡法および共焦点蛍光顕微鏡法によって検査した
。
【０１０９】
3. 抗体：細胞は4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で、またはメタノールを用いて-20
℃で固定し、一次抗体、およびFITCまたはCy3結合抗マウス-または抗ウサギ-IgG抗体を用
いて連続的に各30分間インキュベートした。各工程の間にスライドをPBS＋1%BSAを用いて
洗浄した。PEまたはFITC結合抗CD45、抗CD31、抗CD62E、抗Mac1、抗Gr1、抗CD19、抗CD3
、および抗Ter119抗体はBD Pharmingenより入手した。GFAP（クローンG-A-5、1:400）、
ガラクトセレブロシド（GalC）（ポリクローナル、1:50）、MBP（ポリクローナル、1:50
）、GABA（クローンGB-69、1:100）、パルブアルブミン（クローンPARV-19、1:2000）、T
uJl（クローンSDL.3D10、1:400）、NF-68（クローンNR4、1:400）、NF-160（cloneNN18、
1:40）、そしてNF-200（クローンN52、1:400）、NSE（ポリクローナル、1:50）、MAP2-AB
（クローンAP20、1:400）、Tau（ポリクローナル、1:400）、TH（クローンTH-2、1:1000
）、DDC（クローンDDC-109、1:100）、TrH（クローンWH-3、1:1000）、セロトニン（ポリ
クローナル、1:2000）、グルタミン酸（クローンGLU-4、1:400）、速筋ミオシン（クロー
ンMY-32；1:400希釈）に対する抗体はSigmaから入手した。DAPIおよびTOPRO-3はMolecula
r Probesから入手した。vWF（ポリクローナル；1:50）、Neuro-D（ポリクローナル、1:50
）、c-ret（ポリクローナル、1:50）andNurrI（ポリクローナル、1:50）に対する抗体はS
anta Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz,CAから入手した。PSA-NCAM （ポリクロー
ナル、 1 :500）に対する抗体はPhanmingen, San Diego, CAから、そしてセロトニン輸送
体（クローンMAB1564、1:400）、DTP（ポリクローナル、1:200）、Naゲート電位チャンネ
ル（ポリクローナル、1:100）、グルタミン酸-受容体-5、-6および-7（クローン371、1:5
00）およびNMDA（ポリクローナル1:400）受容体に対する抗体はChemiconInternational,
Temecula, CAから入手した。抗ネスチン（1:400）抗体はスウェーデンのLund大学のDr.
U. Lendahlより寄贈を受けた。NSE（1:50）pan-サイトケラチン（カタログ番号C-2562；1
:100）、CK-18（C-8541；1:300）、アルブミン（A-6684；1:100）に対する抗体はすべてS
igmaから入手した。Flk1、Flt1、Tek、HNF-1pに対するポリクローナル抗体はSantaCruz 
Biotechnology Inc., Santa Cruz, CAから入手した。抗ネスチン（1:400）抗体はスウェ
ーデンのLund大学のDr. U. Lendahlより寄贈を受けた。対照-マウス、-ウサギまたは-ラ
ットIgGとFITC/PE/Cy3-およびCy5-標識二次抗体はSigmaから入手した。ウサギ抗β-gal-F
ITC抗体はRockland Immunochemicals, USAから入手した。TO-PRO-3Molecular Probes In
c.から入手し、DAPはSigmaから入手した。
【０１１０】
B. X-GAL染色；組織切片はβ-ガラクトシダーゼ酵素活性についてInvitrogenのβ-gal染
色キットを用いて染色した（pH7.4）。組織切片を10分間のかわりに5分間インキュベート
した固定工程以外は取扱説明書に従った。
【０１１１】
C. FACS:FACSについては、未分化MASCを剥離して、抗CD44、CD45、CD13、cKit、MHC-ク
ラスIおよびII、またはb2-ミクログロブリン（BD Pharmingen）および二次FITCまたはPE
結合抗体を用いて連続的に染色し、FACS-Calibur（BectonDickinson）を使用した分析ま
で2%パラホルムアルデヒドで固定した。
【実施例５】
【０１１２】
MASCからの分化系統の単一細胞起源
mMASCまたはrMASCの分化能力を、hMASCまたはES細胞の中胚葉、神経外胚葉、および内
胚葉への分化について何が記載されているかに基づいて選択した分化因子（サイトカイン
）を加えることによって試験した。分化には、EOF、PDGF-BBおよびLIFを含まないが、系
統特異的サイトカインを含む無血清培地に、l〜2x104細胞/cm2で細胞を再播種することを
要した。分化は組織特異的マーカー[遅筋ミオシンおよびMyoD（筋）、von-Willebrand因
子（vWF）およびTek（内皮）、NF200およびMAP2（神経外胚葉性）、そしてサイトケラチ
ン-18およびアルブミン（内胚葉性）]についての免疫組織化学、RT-PCR、および機能試験
によって判定した。
【０１１３】
神経外胚葉性細胞へのMASC分化
Palmer et al.は神経前駆細胞をPDGF-BBを用いて培養で拡大できること、およびPDGFの
除去と分化因子としてbFGFの添加によってその分化を誘導できることを示した。これらの
研究およびhMASCを用いて行われた研究に基づき、mMASCおよびrMASCを、PDGF-BBおよびEG
Fを含まないが100ng/mLのbFGFを含むFN被覆ウェルに播種した。神経細胞様細胞の成熟の
進行が培養期間を通じて見られた。7日間後、細胞の大多数がネスチンを発現した。14日
間後、MASCの15〜20%が星状細胞の（GFAP+）、15〜20%が稀突起膠細胞の（ガラクトセレ
ブロシド（GalC）+）、そして50〜60%が神経細胞の（神経フィラメント-200（NF-200）+
）形態的および表現型の特徴を獲得した。NF200、GFAPまたはGalCは同一の細胞には見つ
からず、神経細胞様細胞が神経細胞のマーカーを不適切に発現したhMASCまたはグリア細
胞である可能性は低いことを示唆した。神経細胞様細胞はまたTau、MAP2およびNSEも発現
した。神経細胞の約50%がガンマ-アミノ酪酸（GABA）およびパルブアルブミンを、30%が
チロシンヒドロキシラーゼおよびドーパ-デカルボキシラーゼ（DDC）を、そして20%がセ
ロトニンおよびトリプトファンヒドロキシラーゼを発現した。MASCを40PD、または90PD以
上拡大したとき、分化は同様であった。実施例1で記載の通り実施したQ-RT-PCRによって
、神経外胚葉性マーカーの発現が確認された: 2日目にMASCはotx1およびotx2mRNAを発現
し、7日間後にはネスチンmRNAが検出された。
【０１１４】
繊維芽細胞成長因子（FGF）-8bの分化因子としての効果を次に試験した。これはinviv
oで中脳の発生のために重要であり、in vitroでマウスES細胞からhMASCについてドーパミ
ン作用性およびセロトニン作用性神経細胞を誘導するのに用いられる。密集成長したhMAS
C（n＝8）を10ng/mLのFGF-8b＋EGFと培養したとき、神経細胞マーカーについて染色陽性
であるが稀突起膠細胞および星状細胞について陽性でない細胞への分化が見られた。神経
細胞はGABA性（GABA+；40±4%）、ドーパミン作用性（DOPA、TH、DCCおよびDTP+、26±5%
）そしてセロトニン作用性（TrH、セロトニンおよびセロトニン-輸送体+、34±6%）神経
細胞の特徴を有した。DOPA+神経細胞はNurr1に対する抗体で染色され、中脳DA神経細胞へ
の分化を示唆した。FGF-8b誘導性神経細胞は成熟神経細胞の電気生理学的特徴を有しなか
った。したがって、FGF-8bで支持された3週齢の細胞を、グリア芽腫細胞株であるU-87と
、FGF-8bと共にさらに2〜3週間培養した。
【０１１５】
神経細胞は細胞の大きさおよび数、長さ、および神経突起の複雑さの増大したより成熟
した形態を獲得し、そして成熟神経細胞の電気生理学的特徴（1μMテトロドトキシン（TT
X）によって可逆的に遮断される一時的な内向き電流は、一時的なタイムコースと内向き
電流の電位依存活性化とともに、成熟神経細胞にだけ見られる電位活性化ナトリウム電流
に典型的である）を獲得した。
【０１１６】
hMASC（n＝13）を10ng/mの脳由来神経分化誘導因子（BDNF）＋EOFと共に培養したとき
、分化はDOPA、TH、DCC、DTPおよびNurr1陽性神経細胞に限定された。BDNFはES細胞およ
びNSCからの神経分化を支援するが（Peault, 1996；Choi et al.1998）、DA様神経細胞
への限定的分化を示した研究は無い。
【０１１７】
同様の結果が、bFGFで誘導されたmMASCとbFGFおよびBDNFで誘導されたrMASCについて見
られた。MASC由来神経細胞についてのさらなる研究が実施例10に示されている。
【０１１８】
内皮細胞へのMASC分化 
中胚葉の例として、内皮への分化を誘導した。未分化のmMASCまたはrMASCは内皮マーカ
ーCD31、CD62E、TekまたはvWFを発現しなかったが、低レベルのFlk1を発現した。mMASCま
たはrMASCをFN被覆ウェルで10 ng/mLの内皮分化因子VEGF-Bと共に培養した。14日間のVEG
F処理後、MASCの>90%が、経過したPD数にかかわらず、内皮分化に合致してFlt1、CD31、v
WFまたはCD62を発現した。初代内皮細胞のように、MASC由来内皮細胞はMatrigelに再播種
後6時間以内に血管を形成した。
【０１１９】
同様に、hMASCはFlk1およびFlt1を発現するが、CD34、Muc18（P1H12）、PECAM、E-およ
びP-セレクチン、CD36、またはTie/Tekは発現しない。hMASCを2xl04細胞/cm2、20ng/mLの
血管内皮成長因子（VEGF）を含む無血清培地で培養したとき、細胞はCD34、VE-カドヘリ
ン、VCAMおよびMuc-18を7日目以降に発現した。14日目に、細胞はTie、Tek、Flk1およびF
lt1、PECAM、P-セレクチンおよびE-セレクチン、CD36、vWF、そしてコネキシン-40も発現
した。さらに、細胞は低比重リポタンパク質（LDL）を取り込むことができた。組織化学
染色からの結果はウェスタンブロットによって確認された。血管形成を誘導するために、
14日間VEGFと共に培養したMASCを、10ng/mLVEGF-Bを含むMatrigelに再播種して６時間経
過した。>2%PCSで培養されたhMASCを用いたときは、内皮分化は見られなかった。さらに
、PCSが分化の間に培地中に残されたとき、内皮細胞は生じなかった。
【０１２０】
hMASCを継代培養したとき少なくとも 1 000-倍の拡大が得られ、hMASCから生じた内皮
前駆細胞が顕著な増殖能力を持ち続けていることを示唆した。細胞の拡大は、PCSが７日
後に培養に添加されたときさらに大きかった。hMASC由来内皮細胞が皮下にヒト大腸癌を
移植されたNOD-SCIマウスに静脈注射で投与されたとき、ヒト内皮細胞が腫瘍で血管新生
に寄与するのが見られた。したがって、治療上の利益を得るため、すなわち、たとえば癌
において血管新生を阻害するため、または肢あるいはたとえば心臓のようなその他の器官
において血管新生を促進するために、遺伝子組み換え内皮細胞を組み込むことが可能であ
る。MASC由来内皮細胞に関するさらなる研究は実施例9に示されている。
【０１２１】
内胚葉へのMASC分化
mMASCまたはrMASCが内胚葉細胞に分化できるかどうかを試験した。分化因子であるケラ
チノサイト成長因子（KGF）、肝細胞成長因子（HGF）およびFGF-4と共に、ラミニン、コ
ラーゲン、FNまたはMatrigel被覆ウェルのいずれかでの培養を含むいくつかの異なる培養
条件を試験した。10ng/mLのFGF4＋10ng/mLのHGFを含むMatrigelに再播種したとき、MASC
の約70%が肝細胞様細胞の形態的および表現型の特徴を獲得した。細胞は類上皮細胞にな
り、細胞の約10%が二核になり、そして細胞の約70%がアルブミン、サイトケラチン（CK）
-18、およびHNF-1Pについて染色陽性となった。
【０１２２】
FGF4およびHGFを含む培養で生じた内胚葉性様細胞もまた、未分化のMASCとFGF4およびH
GF誘導性MASCの上清中の尿素レベルをSigma尿素窒素キット640を用いて取扱説明書に従っ
て測定することによって判定された、肝細胞の機能的特徴を有した。未分化のMASC培養に
おいては尿素は検出されなかった。尿素産生はFGF4およびHGFの添加１４日後に10μg/細
胞/時間であり、25日目まで同様のレベルで検出可能であった。これは単層で生育した初
代ラット肝細胞と同等である。アルブミンの存在は、尿素産生と共にMASCからinvitroの
肝細胞分化の概念を支持する。MASC由来肝細胞に関するさらなる研究は実施例11に示され
ている。
【０１２３】
内胚葉系統前駆細胞が存在する可能性が高いことを考えると、MASCは肝臓と膵臓の外分
泌および内分泌構成部分の両方、および他の内胚葉由来細胞組織系統のさまざまな細胞を
形成する細胞を生じる可能性が高い。
【０１２４】
筋または脳に由来するMASCは、BM由来MASCについて上に記載した方法を用いて、中胚葉
（内皮細胞）、神経外胚葉（星状細胞および神経細胞）および内胚葉（肝細胞様細胞）に
分化するよう誘導された。
【０１２５】
形質導入
分化した細胞が単一細胞由来でありMASCが実際に「クローン」多能性細胞であることを
示すため、MASCにレトロウイルスベクターを導入した培養細胞を作成し、そして未分化の
細胞とその子孫はゲノムの同一部位にレトロウイルス挿入配列を有することが見出された
。
【０１２６】
40から>90PDの間拡大した、二つの独立して得られたROSA26MASC、二つのC57BL/6MASCお
よび一つのrMASC集団を用いて、またeGFPを導入した「クローン」マウスおよび「クロー
ン」rMASCについて、試験を行った。eGFP導入細胞および非導入細胞の間に差異は見られ
なかった。注目すべきこととして、eGFP発現は分化したMASCで持続した。
【０１２７】
具体的には、EGF, PDGF-BBおよびLIFを含むFNで３週間培養したマウスおよびラットBMM
NCに連続２日間、eGFP腫瘍レトロウイルスベクターを導入した。その後、CD45+およびGly
A+細胞を除去し、細胞を10細胞/ウェルで継代培養した。eGFP導入ラットBMMNCを85PDの間
拡大した。または、80PDSの間拡大したマウスMASCを用いた。未分化MASCの継代培養は、7
5PDの間維持した培養から100個のMASCを播種してそれを>5xl06個に再拡大することによっ
て作成した。拡大したMASCはin vitroで内皮、神経外胚葉および内胚葉に分化するよう誘
導した。系統分化は、実施例4に記載の通り、これらの細胞型に特異的な抗体で染色する
ことによって示した。
【０１２８】
中胚葉性および神経外胚葉性子孫細胞の単一細胞起源
中胚葉性および神経外胚葉性の分化した子孫細胞が単一細胞起源であることを証明する
ため、レトロウイルスマーキングを用いた（Jordan et al, 1990；Noltaet al., 1996）
。20PD後に得たhMASCの画分にMFG-eGFPレトロウイルスを形質導入した。eGFP+hMASCを、
同一提供者由来の非導入MASCで希釈し、導入細胞の終濃度を〜5%とした。これらの混合物
を100細胞/ウェルで播種し、培養を>2xl07細胞が得られるまで拡大した。それぞれ5xl06
個のMASCを、骨格筋筋芽細胞、内皮および神経外胚葉性系統に分化するよう誘導した。分
化条件下で14日後、細胞を採取してレトロウイルス組み込み部位、およびeGFPと神経外胚
葉性、筋および内皮マーカーとの同時発現を同定するために用いた。
【０１２９】
筋芽細胞分化については、hMASCを2xl04細胞/cm2で2%PCS、EGFおよびPDGF含有拡大培地
に播種し、3μMの5-アザシチジンを用いて同じ培地中で24時間処理した。その後、細胞は
2%PCS、EGFおよびPDGF-BBを含む拡大培地中で維持した。内皮分化については、hMASCを2x
l04細胞/cm2で、EGFおよびPDGFを含まないが10ng/mlのVEGF-Bを含む無血清拡大培地で14
日間培養した。
【０１３０】
免疫蛍光評価は、培養中の細胞の5〜10%が5-アザシチジンでeGFPおよび骨格筋アクチン
について染色陽性に分化するよう誘導され、細胞の5〜10%がeGFPおよびvWFについて同時
染色される内皮に分化するよう誘導され、そして細胞の5〜10%が、eGFP、およびNF-200か
GFAPかMBPのいずれかについて同時染色される神経外胚葉に分化するよう誘導されたこと
を示した。レトロウイルス挿入部位を定義するため、MASCおよび分化した子孫の宿主ゲノ
ム隣接領域を配列決定した。別々の集団におけるレトロウイルス挿入配列の数は１から７
の間であった。表2（配列番号１３−２４）に示す通り、集団A16で染色体7にマッピング
された、筋、内皮および神経外胚葉性細胞でレトロウイルス挿入配列に隣接する、単一の
同一の配列が同定された。
【表２】
2004529621.tif 000002
【０１３１】
3'LTRに特異的なプライマーを設計し、また隣接するゲノム配列に特異的なプライマー
は表３に示す通りで、そしてリアルタイムPCRを用いて、レトロウイルス挿入部位は未分
化細胞と分化した細胞とで同一であることが確認された。これらの結果は、隣接配列とeG
FP DNA配列とが同様の量で存在することを証明した。クローンA12はそれぞれ染色体1と7
に位置する２個のレトロウイルス挿入配列を含み、両方の隣接配列をhMASCだけでなく筋
、内皮および神経外胚葉性系統にも検出することができた。これが２個のレトロウイルス
要素を有する単一細胞の子孫かまたは２個の細胞の子孫のどちらを示すのか判定するため
、リアルタイムPCRを用いて染色体1および7のeGFP隣接配列の相対量を比較した。hMASC、
筋、内皮および神経外胚葉性細胞に両方の隣接配列が同様の量存在したことが見出され、
２個のレトロウイルス挿入配列を有する単一細胞がeGFP陽性hMASCおよび分化した子孫の
元になった可能性が高いことを示唆した。3個以上のレトロウイルス挿入配列を含む他の
集団においては、我々は挿入配列が単一細胞の複数の挿入部位に由来するのかそれともeG
FP陽性画分に寄与する複数の細胞に由来するのか判定することはできなかった。にもかか
わらず、2個の集団において筋、内皮および神経外胚葉に分化した子孫細胞は単一のBM由
来前駆細胞に由来するという我々の発見は、中胚葉性系統および神経外胚葉の３つの異な
る系統の細胞において単一細胞レベルで分化するBMから原始細胞を培養することが可能で
あることを初めて決定的に証明する。
【表３】
2004529621.tif 000003
【実施例６】
【０１３２】
体内の多くの器官への哺乳類MASCのホーミングと定着
定着してin vivoで組織特異的細胞に分化する能力を有するかどうか調べるため、mMASC
を試験した。mMASCをLacZ遺伝子導入C57Black6、ROSA26マウスから実施例１に記載の通り
育成した。LacZマウス由来の106個のmMASCを、注射の４〜６時間前に250Radの全身照射あ
りまたは無しで、NOD-SCIDマウス尾静脈に静脈注射した。動物は注射後4〜24週間で頸椎
脱臼により屠殺した。
【０１３３】
組織採取
血液および骨髄: 0.5〜1mlの血液を動物の屠殺時に得た。大腿骨および脛骨を洗浄してBM
を回収した。表現型分析については、血液およびBM中の赤血球を氷冷塩酸アンモニウムを
用いて除去し（Stem Cell Technologies Inc.,Vancouver, Canada）、105個の細胞をサ
イトスピン遠心分離に用いた。連続移植については、大腿骨2本および脛骨2本からの5xl0
7個の細胞を個々の二次被提供者に尾静脈注射によって移植した。二次被提供者は7〜10週
間後に屠殺した。
【０１３４】
固形器官:肺はPBSで1:4希釈したOCT化合物（Sakura-FinetekInc, USA）の1mlで膨張させ
た。被提供者動物の脾臓、肝臓、肺、腸、骨格筋、心筋、腎臓および脳の標本を採取しOC
T中で-80℃にて、および定量的PCR用にRNA Later（Ambion Inc.,Austin, TX, USA）中で
-20℃にて低温保存した。
【０１３５】
mMASCは定着してin vivoで組織特異的細胞に分化する
β-gal/ネオマイシン（NEO）導入遺伝子含有細胞の定着（Zambrowiczet al., 1997）
は、β-galについて免疫組織化学によって、およびNEOについてQPCRによって試験された
。免疫組織化学およびQ-PCRは実施例5および1にそれぞれ記載された通り実施した。プラ
イマーは表１に列記されている。
【０１３６】
1%を超える抗β-gal細胞の検出として定義される定着が、すべての被提供者 動物の造
血組織（血液、BMおよび脾臓）ならびに肺、肝臓および腸の上皮に表4および図4に示す通
り見られた。
【表４】
2004529621.tif 000004
【０１３７】
BM（図4B〜F）および脾臓（図4H〜I）のβ-gal+細胞は、抗CD45、抗CD19、抗Mad、抗Gr
1および抗TER119抗体と同時染色された。同様の結果が末梢血について見られた。注目す
べきこととして、β-gal+CD3+T細胞はキメラマウスで見られたにもかかわらず、血液、BM
または脾臓のいずれにもβ-gal+CD3+T細胞は見られなかった。この理由は現在のところ不
明である。
【０１３８】
脾臓での定着は主に提供者細胞の塊として起こり、MASCが脾臓にホーミングするとき、
CFU-Sと同様に、MASCは局部的に増殖し分化して提供者細胞のコロニーを形成するという
仮説と合致した。mMASCの造血細胞へのin vivo分化は、mMASCにHSCが混入したことが原因
ではないと考えられる。最初に、BMMNCはmMASC培養を開始する前にカラム選択によってCD
45細胞を除去されている。次に、brachyury（Robertson et al,2000）、GATA-2およびGA
TA-1（Weiss et al., 1995）を含む初期中胚葉性または造血転写因子は、CDNAアレイ分析
によって示される通り、未分化のmMASCでは発現していない。第三に、mMASCに用いた培養
条件は、HCSについては支持的でない。第四に、hMASCを造血支持細胞とサイトカインと共
に培養することによってhMASCからin vitroで造血分化を誘導する試みはどれも成功しな
かった（Reyes et al., 2001）。
【０１３９】
顕著なレベルのmMASC定着がまた肝臓、腸および肺でも見られた。三色染色免疫組織化
学を用いて、上皮（CK+）および造血（CD45+）細胞を肝臓、腸および肺の同一組織切片に
おいて同定した。肝臓では、β-gal+提供者由来細胞は肝細胞（CK18+CD45+またはアルブ
ミン+）の束を形成し、任意の５μｍの切片の約5〜10%を占めた（図4K〜M）。被提供者起
源のいくつかのCK18+CD45+β-gal-造血細胞は上皮細胞から明瞭に同定された。Albumin+
β-gal+およびCK18+β-gal+細胞は、肝幹細胞および円形細胞からの肝再生でみられるパ
ターンで、門脈路周囲の肝細胞束に定着した（Alison et al., 1998；Petersenet al., 
1999）。このことと、切片20枚のうち5枚のみが提供者細胞を含んでいたこととは、幹細
胞は肝臓のすべての部分でなく一部分に定着し、そこで増殖して肝細胞に分化するという
概念と合致する。
【０１４０】
腸における定着もまた腸上皮幹細胞について知られていることと合致した。腸では、個
々の陰窩は4〜5個の長寿命の幹細胞を含む（Potten, 1998）。これらの幹細胞の子孫は陰
窩の中部および上部で数回の分裂を経て上皮細胞を生じ、これは上方へ、陰窩外へ出て、
隣接する絨毛へ移動する。提供者由来のβ-gal+panCK+CD45-上皮細胞がいくつかの絨毛を
完全に覆っていた（図4O〜P）。一部の絨毛では、β-gal+panCK+CD45-細胞は周囲の50%だ
けを構成し（黒矢印、図4P）、定着が両方の陰窩でなく一方であったことを示唆した。い
くつかのβ-gal+panCK-細胞が腸絨毛の中心に明瞭に見られた（白矢印、図4O）。これら
の細胞はCD45について同時染色され（図4P）、これらが提供者由来造血細胞であることを
示した。肺では、提供者細胞の大多数がβ-gal+panCK+CD45-肺胞上皮細胞を生じた一方、
大部分の造血細胞は被提供者起源であった（panCK-CD45+β-gal-）（図4R）。
【０１４１】
免疫組織化学によって検出された定着のレベルは、NEOについてQ-PCRで測定されたレベ
ルと一致した（表4）。定着レベルは、MASCの静脈注射の4〜24週間後に分析した動物で同
様であった（表4）。
【０１４２】
骨格筋または心筋には寄与は見られなかった。上皮組織および造血機構とは対照的に、
組織傷害の非存在下で骨格筋または心筋において細胞の交代はわずかであるかまたは全く
見られなかった。したがって、これらの組織への幹細胞の顕著な寄与は期待されない。し
かし、上皮細胞が迅速な交代を受ける２つの器官である皮膚および腎臓において定着は見
られなかった。胚盤胞注射実験（実施例8）において、mMASCはこれらの細胞型に分化でき
ることが示される；出生後の被提供者におけるこれらの器官で定着が見られないことの可
能な説明は、mMASCはこれらの器官へホーミングしないというもので、現在評価中の仮説
である。mMASCは神経外胚葉様細胞にex vivoで分化したが、脳においてmMASCの顕著な定
着は見られず、脳で見つかった稀な提供者細胞は神経外胚葉性マーカーで同時標識されな
かった。２つの最近の論文が、BM移植を受けた動物の脳において神経外胚葉の特徴を有す
る提供者由来細胞を検出することができることを示した。しかし、血液脳関門の破壊に伴
う条件である、移植前の完全除去の準備方法または新生動物への移植が用いられた。細胞
は、血液脳関門が完全であるかまたは最小の損傷しか受けていない、照射を受けていない
成体動物、または低用量の照射を受けた動物に注入された。このことはCNSにおいてmMASC
定着が見られなかったことを説明しうる。
【０１４３】
密集MASCはinvivoで分化しない
対照として、注射前にROSA26-MASCを注入し密集となるまで培養した。密集を形成させ
たMASCは、ex vivoで中胚葉外の細胞の中で分化する能力を失い、古典的MSCのように挙動
する（Reyes, M. et al. 2001）。106個の密集mMASCの注射によって顕著なレベルの提供
者細胞定着は生じなかった。β-gal+細胞はBM中に少数しか見られなかったが、これらの
細胞は抗CD45抗体で同時標識されず、MSCは組織に定着しうるが局所的信号に答えて組織
特異的細胞に分化することはもうできないことを示している。
【０１４４】
マウス骨髄中のMASC由来細胞は連続的に移植できる
ROSA26MASCを植え付けたマウスに由来するBMを、二次被提供者に定着する細胞を含むかど
うか試験した。mMASCの静脈注射から11週間後に一次被提供者から回収した1.5x107個のBM
細胞を、放射線照射を受けた二次NOD-SCID 被提供者に移植した（図4:動物SR-1およびSR-
2）。7および10週間後、二次被提供者を屠殺し、被提供者動物の血液、BM、脾臓、肝臓、
肺および腸を、ROSA26提供者細胞の定着に関して、NEO遺伝子について免疫組織化学およ
びQ-PCRによって分析した。一次被提供者でのように、定着の同様なパターンが二次被提
供者に見られた。BM、脾臓およびPB細胞の4〜8%がβ-gal+CD45+であった；腸上皮細胞の
６および8%がβ-gal+pan-CK+で、そして肺上皮細胞の4および5%がβ-gal+pan-CK+であっ
た。二次被提供者の肝臓における定着のレベルは一次被提供者より低かった（1および3%
に対し5および8%のβ-gal+CK18+）。これは、mMASCが一次被提供者のBM中に持続し、二次
被提供者に移植されたとき造血細胞ならびに上皮細胞に分化しうることを示唆する。
【０１４５】
MASC由来細胞はインシュリンをin vivoで産生することができる。ROSA26マウス由来MAS
Cを放射線照射したNOD-SCIDマウスに、ここに記載の通り注射した。結果として得られるM
ASC由来細胞は、ストレプトゾトシン糖尿病モデルでLacZおよびインシュリンについて同
時染色する。
【０１４６】
要約
「幹細胞可塑性」における決定的な疑問の一つは、定着し分化した提供者mMASCが機能
するかどうかである。ここに記載した結果は、老齢NOD-SCIDマウスに普通見られるように
、一個体の動物が16週間後に胸腺および脾臓にリンパ腫を生じたことを示す（Prochazka
et al., 1992）。表現型分析はこのB細胞リンパ腫が宿主由来であることを示した:CD19+
細胞はβ-gal-であった。腫瘍の脈管構造中のCD45-vWF+細胞の約40%が抗β-gal抗体で染
色され、腫瘍中の血管新生が一部は提供者mMASCに由来することを示した（図4T）。この
ことはMASCが機能する子孫をin vivoで生じることを示唆する。同様に、たとえば造血機
構および腸上皮のような放射線感受性の器官において、低用量放射線照射後にmMASC定着
および分化のレベルがより高いことは（表4、p<0.001）、mMASCが宿主組織に機能的に寄
与している可能性を示唆する。
【０１４７】
これらの結果は、哺乳類MASCを精製し、ex vivoで拡大し、そして静脈注射し、体内の
さまざまな部位にホーミングさせ、多数の器官に定着させられること、および細胞がこれ
らの各種器官中で１ヶ月またはより長期間生存することを示した。そのような提供者細胞
、未分化の子孫、および分化した子孫は、蛍光マーカーによって、BM、脾臓、肝臓および
肺を含むがこれに限定されない器官に見出される。これらの細胞は、一またはそれ以上の
区画に再定着させ、細胞または器官の機能を強化または回復するのに用いることができる
。
【実施例７】
【０１４８】
in vitro造血および赤血球産生の実証
ヒトBM由来のMASCは、単一細胞レベルで、神経外胚葉性、内胚葉性、および内皮細胞を
含む多くの中胚葉性系統に分化する。内皮および血液は個体発生において非常に密接に関
連しているため、MASCが造血細胞に分化できると仮説を立てることができる。GlyA、CD45
およびCD34陰性であるeGFP導入ヒトMASC（n＝20）を、マウス卵黄嚢中胚葉性細胞株YSM5
と、細胞凝集塊懸濁液として6日間、10ng/mLのbFGFおよびVEGFを添加した無血清培地中で
共に培養した。6日後、eGFP+細胞（すなわちMASC子孫）だけが残りYSM5細胞は死亡してい
た。
【０１４９】
残った細胞を、10%胎児ウシ血清を含む、10ng/mL骨形成タンパク質（BMP）4、VEGF、bF
GF、幹細胞因子（SCF）、Flt3L、hyperIL6、トロンボポエチン（TPO）、およびエリスロ
ポエチン（EPO）を添加したメチルセルロース培養に移し2週間培養した。これらの培養中
に、接着性eGFP+細胞、および接着性細胞に付着した多数のコロニーを形成する小さく丸
い非接着性細胞の両方が検出された。非接着性および接着性画分を別々に回収し、10ng/m
LのVEGFおよびbFGFを添加した10%FCS含有培地で7日間培養した。接着性細胞はvWFについ
て染色陽性で、ECMに播種されたとき血管を形成し、a-LDLを取り込むことができ、内皮の
性質を示した。非接着性細胞の5〜50%がヒト特異的GlyAおよびHLA-クラスIについてフロ
ーサイトメトリーによって染色陽性であった。Gly-A+/HLAクラスI+細胞をFACSによって選
択した。ライト-ギムザ染色で、これらの細胞は原始赤芽球の特徴的形態および染色パタ
ーンを示した。細胞は免疫ペルオキシダーゼでベンジジン+およびヒトH+であった。RT-PC
Rでこれらの細胞はヒト特異的Hb-eを発現したが、しかしHb-aは発現しなかった。
【０１５０】
20%FCSおよびEPOを含むメチルセルロース分析に再播種したとき、10日後に小さい赤芽
球コロニーがみられ、これらのコロニーの100%がヒト特異的GlyAおよびHbについて染色陽
性であった。MASCの選択はBMからのCD45+およびGlyA+細胞の除去に依存し、そして培養MA
SCはCD45-およびGlyA-でありFACSおよびCDNAアレイ分析の両方を用いて常に検査されてい
るため、MASCへの造血細胞の混入は非常に可能性が低い。
【実施例８】
【０１５１】
細胞の胚盤胞注射後の、複数の器官のキメラによって示されたMASCの多能性性質のinviv
oの証拠
これらの細胞の治療への応用に重要なのは、MASCの増殖して適当な細胞型にinvivoで
分化する能力である。これまで、体内で組織および器官の群全体に寄与する能力のある唯
一の細胞はES細胞である。MASCがES細胞の完全な能力を示すことができるかどうか分析す
るため、MASCを初期胚盤胞に導入してその子孫細胞の運命を観察することによって、各種
組織の形成への寄与を判定するため分析した。
【０１５２】
MASCはβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）遺伝子について遺伝子導入したROSA26マウスの
骨髄から作成し（Rafii, S., et al. 1994, Blood 84:10-13）、実施例1に記載の通り拡
大した。55〜65PD後に得られた１または10〜12個のROSA26 MASCを88および40個の3.5日目
のC57BL/6胚盤胞にそれぞれ微量注入した。胚盤胞（8個/母体）を16匹の仮母に移植し、
マウスを表5に示す通り発生および出生させた。
【表５】
2004529621.tif 000005
【０１５３】
７匹の仮母が出産し、この期間の他の研究でみられる出産率と合致した。一腹当たりの
個体数は1〜8の間で変動し、合計37匹であった。微量注入した胚盤胞から生まれた個体は
正常個体と同様の大きさで、明白な異常は示さなかった。
【０１５４】
4週間後、尾を切断して、NEOについてQ-PCRによってβ-gal/NEO導入遺伝子含有細胞の
尾への寄与を評価することで、キメラ現象について動物を評価した。キメラ現象のパーセ
ントは、試験検体中のNEOコピー数を、ROSA26マウス由来の組織中のコピー数と、取扱説
明書に従って比較することによって測定した（7700 ABI PRISMDetector Software 1.6）
。10〜12個のMASCが注入された胚盤胞由来のマウスの70%、および1個のMASCが微量注入さ
れた胚盤胞由来のマウスの50%でキメラ現象を検出することができた（図5）。キメラ現象
の程度は0.1%〜>45%の幅に分布した。6〜20週間後、動物を屠殺した。一部のマウスを液
体窒素で凍結して記載の通りに薄切片を切断した。全身マウス切片はX-Galで染色した。
その後、各切片を完全に含むデジタル画像1000組を集め、個々の全身マウス切片の合成画
像を生成した。単一のMASCが注入された胚盤胞に由来する代表的な非キメラ個体（NEOに
ついてのQ-PCRによって）では、X-Gal染色は見られなかった。対照的に、その個体は尾切
断分析によるNEOについてのR-PCRによると45%キメラであり、単一のROSA26由来MASCがす
べての体細胞組織に寄与していた。
【０１５５】
他の個体については、複数の器官を採取して、MASC由来細胞の存在に関してX-GAL染色
、抗β-gal-FITC抗体を用いた染色、およびNEOについてのQ-PCRによって分析した。NEO+
細胞を尾切断部に有した個体は、X-GAL染色および抗β-gal-FITC抗体を用いた染色によっ
て示された通り、ROSA26由来MASCが脳、網膜、肺、心筋および骨格筋、肝臓、腸、腎臓、
脾臓、BM、血液、および皮膚を含むすべての組織に寄与していた。
【０１５６】
ROSA26 MASCを微量注入された胚盤胞から生じた個体では、キメラ現象はX-GAL染色およ
び抗β-gal染色によって検出した。β-gal+細胞は、組み込まれた組織に典型的なマーカ
ーを発現した。中枢神経系でNF200およびGFAPについて、また骨格筋でジストロフィンに
ついて、β-gal+細胞は抗β-gal+FITCおよび抗NF200、またはGFAPおよびTOPRO3と同時染
色した（倍率20倍で観察）。肺組織は肺胞および気管支で抗β-gal-FITCおよびpan-CKに
ついて染色された（またTOPRO3も）（倍率20倍で観察）。骨格筋は抗β-gal-FITC、ジス
トロフィン-PEおよびTOPRO3で染色され、倍率20倍で観察された。心臓は抗β-gal-FITC、
心トロポニン-I-Cy3およびTOPRO3で染色され、倍率20倍で観察された。肝臓は抗β-gal-F
ITCおよびpan-CK-PEおよびTOPRO3で染色された（倍率40倍および10倍で観察した）。腸は
抗β-gal-FITC、pan-CK-PEおよびTOPRO3で染色され、倍率20倍で観察した。腎臓は抗β-g
al-FITCで染色され（糸球体、尿細管）、倍率20倍で観察された。骨髄染色は抗β-gal-FI
TCおよびCD45-PE、GR1-PEおよびMAC1-PEについて観察された。脾臓染色は抗β-gal-FITC
およびCD45-PE、CD3-PEおよびCD19-PEについて観察された。NEOについてQ-PCRを用いて推
定した定着のレベルはX-GALおよび抗β-gal-FITC染色によって推定されたレベルと一致し
た。
【０１５７】
要約
これらのデータは、BM由来の単一MASCが発生中のマウスに一体化し、さまざまな運命の細
胞を生じ、マウスの３つの胚葉すべての組織および器官の生成に寄与することを初めて実
証する。すべての生きた個体は、キメラ現象の程度にかかわらず、盛況な機能する期間を
有したので、これらの試験はまた、MASCはin vivoで３つの胚葉の機能する細胞に分化す
ることができることも示唆する。胚盤胞に注入されたときまたは生後に注入されたとき、
MASCが生殖細胞に寄与するかどうかは、まだ試験されていない。
【実施例９】
【０１５８】
血管内皮前駆細胞の起源
血管芽細胞と呼ばれる原始内皮前駆細胞が内皮細胞に分化し凝集して一次毛管網となる
in situ 分化である脈管形成は、胚発生中の脈管系の発達を担っている（Hirashimaet a
l, 1999）。対照的に、既存の血管から発芽する過程による新しい血管の形成と定義され
る血管新生は、発生中と出生後生活の両方に起こる（Holash et al, 1999；Yanget al.,
2001）。最近まで、出生後生活における血管形成は、既存の血管からの内皮細胞の発芽
に媒介されると考えられていた。しかし、近年の研究は、内皮「幹細胞」が成体生活まで
持続し、そこで新しい血管の形成に寄与する可能性があることを示唆していて（Peichev
et al, 2000；Lin et al, 2000；Gehling et al.,2000；Asahara et al., 1997；Shi et
al, 1998）、成体における血管新生は発生中のように少なくとも部分的に脈管形成の過
程に依存することを示唆する。内皮細胞の前駆細胞はBMおよび末梢血から単離されている
（Peichev et al., 2000；Watt et al., 1995）。これらの血管内皮前駆細胞の個体発生
は未知である。
【０１５９】
発生中に、内皮細胞は中胚葉に由来する。VEGF受容体2であるFlk1は、大動脈−生殖隆
起−中腎領域（Medvinsky et al., 1996；Fong et al.,1999；Peault, 1996）および胎
児肝臓（Fong et al., 1999）にみられる両能性の幹細胞である血管芽細胞を特徴づけ、
そして胚様体の血管芽細胞への決定はFlk1の発現を伴う（Ghoi et al.,1998；Choi, 199
8）。血管芽細胞が成体生活に持続するかどうかは不明であり、HSCおよび血管内皮前駆細
胞だけが記載されている。血管芽細胞のように、血管内皮前駆細胞はFlk1を発現し（Peic
hev et al., 2000）、一つの論文はHSCが出生後生活においてFlk1を発現することを示唆
した（Ziegler et al., 1999）。発生の間、血管芽細胞の内皮系統への決定は、VE-カド
ヘリン、CD31、そして少し後にCD34の連続的発現によって特徴づけられる（Nishikawaet
al, 1998；Yamashita et al, 2000）。出生後生活において、血管内皮前駆細胞はBMおよ
び血液から、AC133、Flk1、CD34に対する抗体、およびH1P12抗体を用いて選択されている
（Peichev et al, 2000；Lin et al, 2000；Gehlinget al, 2000）。AC133はまた、NSCs
（Uchida et al, 2000）および消化管上皮細胞（Corbeil etal, 2000）を含む他の細胞
にも見つかっている。成熟内皮への分化に当たって、AC133受容体は速やかに失われる（P
eichev et al, 2000；Gehling et al, 2000）。循環内皮細胞上にみられる別の受容体は
、ムチンであるMUC18で、H1P12抗体によって認識される（Lin et al,2000）。MUC18は血
管内皮前駆細胞の内皮への分化時に失われる。CD34は血管内皮前駆細胞ならびに造血前駆
細胞（Peichev et al., 2000； Baumhueter et al,1994）および肝円形細胞（Crosby et
al, 2001 ）で発現されている。この抗原もまた血管内皮前駆細胞の内皮への分化時に失
われる。大部分の成熟内皮細胞は、微小血管内皮細胞を除き、もうCD34を発現しない。
【０１６０】
in vivoで定着してMASCからの血管新生に寄与する多数の内皮細胞のinvitro生成は、
ここで初めて記載される。MASCは培養して>80 PDの間拡大することができ、MASCから生じ
た内皮細胞は少なくともさらに20 PD拡大することができる。MASCはしたがって臨床治療
のための内皮細胞の理想的な起源となりうる。さらに、MASCは個体発生上「血管芽細胞」
より成熟していないため、このモデルは内皮の決定および分化を特徴づけるのに有用と思
われる。
【０１６１】
hMASCは内皮の表現型の特徴を有する細胞に分化する
MASCは実施例3に記載の通り採取し培養した。内皮分化を誘導するため、MASCを2x104細
胞/cm2でFN-被覆ウェル中に、EGFおよびPDGF-BBを含まないが10ng/mLVEGFを含む無血清
拡大培地に再播種した。一部、PCSを添加した。培養は4〜5日間毎に培地交換して維持し
た。ある場合には、細胞は９日後に1:4希釈で同一の培養条件下で20＋ PDの間継代培養し
た。
【０１６２】
MASCからの内皮分化をより広範囲に定義するため、3〜18日後に細胞のFACSおよび免疫
組織化学的分析を実施した。未分化MASC上のFlk1およびFlt1の発現は低く、９日目に最大
で、18日目まで持続した。BMまたは血管内皮前駆細胞に存在するVE-カドヘリン（Peichev
et al., 2000；Nishikawa et al., 1998）は未分化MASCでは発現されておらず、しかしV
EGFを加えた培養の３日後に発現し18日目まで持続した。MASCは内皮ならびに造血前駆細
胞に見出されるAC133を低レベルで発現したが（Peichev et al.,2000；Gehling et al.,
2000）、しかし３日後にはもう検出不能であった。内皮および造血前駆細胞に存在するC
D34（Peichev et al., 2000；Asahara et al.,1997；Rafii et al., 30 1994）は、未分
化MASCには存在せず（図4A）しかし９日目から18日目まで発現された。抗体H1P12によっ
て認識されるムチンであるMUC18は、血管内皮前駆細胞を血液から生成するのに用いられ
ている（Lin et al., 2000）。MASCはH1P12では染色されなかったが、VEGFで9日間処理し
たMASCは染色陽性であり、しかし発現は18日目までに失われた。
【０１６３】
内皮特異的インテグリンであるαvβ3（Eliceiri et al, 2000）は、未分化MASCには存
在せず、一方αvβ5は非常に低いレベルで発現されていた。インテグリンの発現は分化の
間次第に増加し、14日目までに最大となった（図5）。血管新生に重要であるが内皮細胞
分化には重要でないチロシンキナーゼ受容体TieおよびTek（Partanen etal, 1999）はMA
SCでは発現していなかった。Tekの発現は3日後、Tieは7日後にみられた（図6）。MASCは
またvWFも発現していなかったが、vWFは9日目以降発現された（Rosenberget al, 1998；
Wagner et al, 1982）。CD31、CD36、CD62-Pを含む他の成熟内皮マーカー（Tedderet al
, 1995）（図7）、および接着結合タンパク質ZO-1 、p-カテニン、そしてy-カテニン（図
5）が14日後検出された（Li et al, 1990；Van Rijen etal,.1997；Petzelbauer et al,
2000）。VCAMまたはCD62-Eは、下記のように内皮がIL-1αで活性化されない限り、分化
のどの時点でも高いレベルでは発現されなかった。内皮への分化は、β2-ミクログロブリ
ンおよび、HLA-クラスIIでなく低レベルのHLA-クラスI抗原の獲得を伴った。
【０１６４】
より高い濃度のFCSは、骨芽細胞、軟骨芽細胞および脂肪細胞にだけ分化する古典的MSC
の生育を支持するため（Reyes et al, 2001； Pittenger etal, 1999）、内皮分化は、2
%PCSまたはそれ以下を用いて拡大されたMASCからだけ得られるが、10%PCSを用いて拡大し
たときには得られないことは以前に報告されている（Reyes et al, 2001）。FCSが分化の
最初の7日間に存在したとき、内皮分化は誘導することができない。非密集MASC（<lx104
細胞/cm2）が分化するよう誘導されたとき、内皮はみられなかった。MASCがVEGFへの曝露
の9日後に、10ng/mLVEGFを含む無血清培地を用いて継代培養されたとき、細胞は少なくと
もさらに12PDを経ることができた。10%FCSおよび10ng/mLのVEGFが継代培養用の培地に添
加されたとき、MASC由来内皮細胞は、MASCの経過したPDの数に関わらず、さらに20＋PDを
経ることができた。
【０１６５】
未分化のMASCと比較して、内皮細胞はより大きく、核/細胞質比はより低かった。結果
はMASCが20（n＝30）または50＋（n＝25）PDを経た培養から用いられたときと同様であっ
た。
【０１６６】
MASC由来内皮の機能的特徴
hMASCのVEGFに誘導されて分化した子孫細胞が内皮細胞の機能的特徴を有するかどうか
試験した。内皮細胞は、VEGFならびにVEGF受容体Flk1および血管新生受容体Tie-1およびT
ekの発現をアップレギュレートすることによって低酸素に応答する（Kourembanaset al,
1998）。hMASCおよびhMASC由来内皮細胞を、37℃で、20%または10%O2中で24時間インキ
ュベートした。細胞をFlk1、Flt1、Tekに対する抗体およびIgG対照を用いて染色し、2%パ
ラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した。さらに、培養上清中の
VEGF濃度をELISAキット（AP biotech, Piscataway, NJ）を用いて測定した。MASC由来内
皮細胞および未分化のMASCは低酸素条件に24時間曝露された。
【０１６７】
Flk1およびTekの発現は、低酸素に曝露されたMASC由来内皮細胞で顕著に増加した（図7
）一方、これらの受容体のレベルは未分化のMASCでは変化しなかった。さらに、低酸素内
皮培養の培養上清中のVEGFレベルは4倍に増加した（図7B）一方、低酸素に曝露されたMAS
C培養中のVEGFレベルは変化しなかった。
【０１６８】
次に、MASC由来内皮細胞がHLA-抗原および細胞接着リガンドの発現を、たとえばIL-la
のような炎症性サイトカインに応じてアップレギュレートするかどうか試験した（Meager
, 1999；Steeber et al, 2001）。106個のMASCおよびMASC由来内皮細胞を、75ng/mlのIL-
1a（R&DSystems）と共に無血清培地中で24時間インキュベートした。細胞を2%パラホルム
アルデヒドで固定し、HLA-クラスI、クラスII、β2-ミクログロブリン、vWF、CD31、VCAM
、CD62EおよびCD62Pに対する抗体、または対照抗体で染色し、FACScalibur（BectonDicki
nson）を用いて分析した。
【０１６９】
顕著に上昇したレベルのHLA-クラスIおよびII、β2-ミクログロブリン、VCAM、ECAM、C
D62E、CD62PがFACS分析によって内皮細胞で見られた（図7C）。
【０１７０】
対照的に、未分化のMASCではFlkのアップレギュレーションのみがみられた。
【０１７１】
内皮細胞の別の特徴は、LDLを取り込むことである（Steinberg et al,1985）これはVE
GFを用いて分化するよう誘導されたMASCを2, 3, 5, 7, 9, 12および15および21、LDL-dil
-acilと共にインキュベートして試験した。dil-Ac-LDL染色キットはBiomedicalTechnolo
gies（Stoughton, MA）から購入した。分析は取扱説明書のように実施した。細胞は抗Tek
、-Tie-1または-vWF抗体のいずれかを用いて同時標識した。3日後、Tekの発現が検出され
たがa-LDLの取り込みは検出されなかった。7日後、細胞はTie-1を発現したが、a-LDLの顕
著な量を取り込むことはなかった。しかし、９日目のvWFの発現の獲得はaLDLの取り込み
を伴った（図6B）。
【０１７２】
内皮細胞は、Weibel Pallade体に貯蔵され内皮が活性化されるときinvivoで放出され
るvWFを含む（Wagner et al, 1982）。これは細胞をヒスタミンで刺激することによってi
n vitroで誘導することができ（Rosenberg et al, 1998）、そのことはまた結果として細
胞の細胞内骨格の活性化を生じる（Vischer et al, 2000）。MASC由来内皮細胞をFN被覆
チャンバースライドに高密度で（104細胞/cm2）播種した。24時間後、細胞を10μMヒスタ
ミン（Sigma）を用いて無血清培地中で25分間処理し、vWFおよびミオシンに対する抗体で
染色した。未処理および処理細胞をメタノールで-20℃にて2分間固定し、vWFおよびミオ
シンに対する抗体で染色し、蛍光および／または共焦点顕微鏡法を用いて分析した。vWF
は未処理内皮細胞の細胞質全体に存在した。ヒスタミン処理した内皮細胞の細胞質は顕著
により少ない量のvWFを含み、vWFは核周囲領域でだけ検出可能であって、小胞体に存在す
るvWFを示している可能性が高かった（図6A）。ヒスタミン処理によって、ギャップ結合
の拡大と、細胞骨格のミオシンストレスファイバーの数が増加する変化が生じた（図6A）
。
【０１７３】
最後に、Matrigelまたは細胞外マトリクス（ECM）に播種されたとき「血管」を形成す
ることができるかどうか判定するため内皮細胞を試験した（Haralabopouloset al, 1997
）。ウェル当たり0.5mlの細胞外マトリクス（Sigma）を24穴プレートに加え、３時間37℃
でインキュベートした。ウェル当たり104個のMASCおよびMASC由来内皮細胞を0.5mlのVEG
F添加無血清培地に加え、37℃でインキュベートした。図6Cに示す通り、MASC由来内皮細
胞のECM上での培養の結果、6時間以内に血管形成が起こった。
【０１７４】
hMASC由来内皮細胞が腫瘍-血管新生にin vivoで寄与する
NOD-SCIDマウスの繁殖コロニーをJackson Laboratories（BarHarbor, ME）から入手し
たマウスから確立した。マウスは特定病原体フリーの条件に保ち、酸性水とオートクレー
ブ処理飼料とで維持した。水100ml当たりトリメトプリム60mgおよびスルファメトキサゾ
ール300mg（Hoffmann-La Roche Inc.,Nutley, NJ）を週二回与えた。
【０１７５】
3個のルイス肺癌球状体を肩の皮下に移植した。腫瘍の移植の3および5日後、マウスに0
.25x106個のヒトMASC由来内皮細胞またはヒト包皮繊維芽細胞を尾静脈注射によって注射
した。14日後、動物を屠殺し、腫瘍を取り出してOTC化合物（SanturaFinetek USA Inc, 
Torrance, CA）を用いて−80℃にて低温保存した。さらに、マウスを標識するために切目
を入れた耳もまた切除してOTC化合物）を用いて−80℃にて低温保存した。組織の5μｍ厚
の切片をスライドガラスに乗せ、下記の通り固定して染色した。
【０１７６】
ヒトおよびマウス内皮細胞の両方を認識する、抗ヒト-β2-ミクログロブリンまたはHLA
-クラスI抗体を、抗マウス-抗CD31抗体と抗vWFか抗Tekか抗Tie-1抗体と組み合わせて用い
、腫瘍それぞれの切片5枚について計数した分枝の長さと数のコンピュータを用いた分析
は、マウスの中のヒトMASC由来内皮細胞を受けた腫瘍は、対照マウスの腫瘍より1.45±0.
04倍大きい血管質量を有したことを示した。これらの最初の試験は、腫瘍中の一部の血管
は、vWFかTieかTekのいずれかについて同時標識されたがマウス-CD31については標識され
ない抗ヒト-β2-ミクログロブリンHLA-クラスI陽性細胞を含んだことを示し、ヒトMASC由
来内皮細胞が腫瘍血管新生にin vivoで寄与したことを示した。
【０１７７】
寄与の程度をより良く定めるため、連続した5μｍスライドを得て、抗ヒト-β2-ミクロ
グロブリン-FITCまたは抗マウス-CD31-Cy5のいずれか、および抗vWF-Cy3を用いた別の方
法で染色した。すべてスライドを共焦点顕微鏡法で検査した。異なる図をその後集めて3
次元とし、腫瘍血管へのヒトおよびマウス内皮細胞の相対的な寄与を測定した。ヒトMASC
由来内皮細胞を注射した動物から得られた腫瘍を分析したとき、腫瘍血管の約35%が抗ヒ
ト-β2-ミクログロブリンおよびvWFについて陽性であり、一方、内皮細胞の約40%が抗マ
ウスCD31抗体について染色陽性であった（図8A-G）。内皮細胞を受けなかったかまたはヒ
ト 繊維芽細胞を受けた動物中の腫瘍は、抗β2-ミクログロブリンまたは抗HLA-クラス-I
抗体で陽性に染色される内皮細胞を含まなかった。
【０１７８】
MASC由来内皮細胞がまた創傷治癒血管新生に寄与するかどうかも分析した。マウスを標
識するために切目を入れた耳の領域をその後調べた。耳の傷における血管新生は、一部は
MASC由来内皮細胞に由来した。腫瘍中の血管と同様に、創傷の治癒した皮膚に存在するヒ
ト内皮細胞の割合は30〜45%であった（図9H）。
【０１７９】
未分化のhMASCは内皮細胞にin vivoで分化する
106個の未分化MASCを6週齢のNOD-SCIDマウスの静脈に注射した。動物は12週間飼育して
その後屠殺した。１個体において、胸腺腫瘍が検出されたが、これは老齢NOD-SCIDマウス
に普通に見られる（Prochazka et al., 1992）。胸腺を切除してOTC化合物中に-80℃にて
低温保存した。組織の10um厚の切片をスライドグラスに乗せ、下記の通り固定し染色した
。
【０１８０】
すべての造血細胞はマウスCD45について染色陽性であったがヒトCD45についてはそうで
なく、これらがマウス起源であったことを示す。腫瘍はその後抗ヒトβ2-ミクログロブリ
ン-FITC抗体とヒトおよびマウス内皮細胞の両方を認識する抗vWF-Cy3抗体とを用いて染色
した。脈管構造の約12%がhMASC由来であった（図9I）。ヒトβ2-ミクログロブリンが血管
構造の外側で検出されなかったため、この造血要素はヒト起源でないことをこれらの研究
はさらに確認した。
【０１８１】
免疫組織化学とデータ分析
in vitro 培養: 未分化のMASCまたは内皮に分化するよう2-18日間誘導されたMASCをFN
被覆chamber スライドに播種し、2% パラホルムアルデヒド （Sigma）を用いて4分間、室
温で固定した。細胞骨格染色については、チャンバースライドをメタノールを用いて2分
間、-20℃で固定した。細胞内リガンドについては、細胞を0.1 Triton-X（Sigma）を用い
て10分間透過処理し、一次抗体（抗体）、およびFITC、PEまたはCy5結合抗マウス-、ヤギ
-またはウサギ-IgG抗体と連続的に各30時間インキュベートした。それぞれの工程の間に
、スライドをPBS＋1%BSAで洗浄した。CD31、CD34、CD36、CD44、HLA-クラスIおよびII、
β2-ミクログロブリンに対する一次抗体は1:50希釈で使用した。VCAM、ICAM、VE-カドヘ
リン、セレクチン、HIP12、ZO-1、コネキシン-40、コネキシン-43、MUC18、avb3、avb5、
B-カテニンおよびy-カテニン（Chemicon）およびTek、Tie、vWF（SantaCruz）に対する
一次抗体は、1:50希釈で使用した。ストレスファイバーsはミオシンに対する抗体（軽鎖2
0kD、クローンno.MY-21；1:200）を用いて染色した。二次抗体はSigmaから購入し、下記
の希釈度で使用した:抗ヤギIgG-Cy-3（1:40）、抗ヤギIgG-FITC（1:160）、抗マウスIgG-
Cy-3（1:150）そして抗マウスIgG-FITC（1:320）、抗ウサギ-FITC（1:160）および抗ウサ
ギ-Cy-3（1:30）。TOPRO-3はSigmaから購入した。細胞は、蛍光顕微鏡法によってZeissA
xiovert顕微鏡（Carl Zeiss, Inc., Thomwood, NY）を用いて、また共焦点蛍光顕微鏡法
によって共焦点1024顕微鏡（Olympus AX70, 5 OlympusOptical Co. LTD, Japan）を用い
て検査した。
【０１８２】
腫瘍または正常組織:組織はクリオスタットを用いて5〜10μm厚の切片に切断した。切片
はアセトンを用いて10分間、室温で固定し、0.1 Triton Xで5分間透過処理した。スライ
ドをvWF、TieまたはTekについて一夜インキュベートし、次いでFITC、PEまたはCy5結合抗
マウス-、ヤギ-またはウサギ-IgG抗体を用いた二次インキュベーション、そしてマウスCD
45-PEまたはヒトCD45-FITC、ヒトβ2-ミクログロブリン-FITC、マウスCD31-FITCまたはTO
PRO-3に対する抗体を用いた連続インキュベーションを60分間行った。各工程の間に、ス
ライドをPBS＋1%BSAで洗浄した。スライドは、蛍光顕微鏡法によってZeissAxiovert顕微
鏡を用いて、また共焦点蛍光顕微鏡法によって共焦点1024顕微鏡を用いて検査した。3次
元再構成は、5μm厚のスライドからの連続0.5μm共焦点写真の、合計350枚の写真の集合
から成った。スライドはvWF-Cy3を用いて染色し、またはヒトβ2-ミクログロブリン-FITC
あるいはマウスCD31-FITCを用いて二重染色した。各スライドからの写真はMetamorphソフ
トウェア（Universal Imaging Corp）で次のスライドと並べ、3次元再構成は3DDoctorソ
フトウェア（Able software Corp）で行った。
【０１８３】
ヒト（緑）およびマウス内皮細胞（青で彩色）の3次元の血管への相対的な寄与量を各
色の立方画素として計算した。各色の面積も、寄与の正確な割合を得るため、スライドを
通じた４つの血管について平方画素として計算した。４つの異なる主要の別のスライドに
ついても各色の面積を計算した。
【０１８４】
要約
この研究の中心となる発見は、BMからMSCと共に精製される細胞は、in vitroで成熟内
皮細胞と識別できない機能上の特徴を有する内皮細胞に分化する能力を持つことである。
そのような内皮細胞は創傷治癒および腫瘍形成の状況下で血管新生にin vivoで寄与する
こと、また未分化のMASCはin vivoの局所的な信号に応答して腫瘍血管新生に寄与する内
皮細胞に分化できることも示されている。
【０１８５】
内皮に分化する同じ細胞が他の中胚葉性細胞型、また非中胚葉性起源の細胞にも分化する
ように、ここで定義される細胞は血管芽細胞に先行し、および個体発生における血管芽細
胞にさえ先行する。
【０１８６】
MASCは内皮細胞のマーカーを発現する細胞に分化することも示されているが、VEGFが内
皮細胞のようなMASC機能を誘導することが証明された。内皮細胞は動脈壁内の輸送中にリ
ポタンパク質を修飾する（Adams et al, 2000）。内皮細胞は、血流力学的な力、または
たとえばヒスタミンのような血管作用薬に曝露されると幅が広がる細胞間接着を通しての
透過障壁を維持する（Rosenberg et al, 1998； Li et al,1990；Van Rijen et al, 199
7；Vischer et al, 2000）。内皮細胞はたとえばvWF、組織因子およびプラスミノーゲン
活性化因子阻害因子といった出血を止めるための凝固前期分子を放出し（Vischer etal,
2000）、炎症に反応して接着分子の発現レベルを変化させることによって白血球が出て
行くのを調節する（Meager, 1999；Steeber et al, 2001）。内皮はまた、血管密度を増
大させることを目的にVEGFを産生しVEGF受容体を発現することによって低酸素に反応する
（Kourembanas et al, 1998）。したがって、MASCから生じた内皮細胞が、invitroで試
験したとき、これらのすべての仕事を行うことができることが実証されている。
【０１８７】
最後に、in vitroで生じたMASC由来内皮細胞が、in vivoでの創傷治癒と同様に、腫瘍
部位に移動して腫瘍血管新生に寄与することによって血管新生刺激に応答することが証明
されている。この発見は、MASCから生じた内皮細胞が成熟内皮のすべての機能上の特徴を
有することを確認する。内皮細胞が腫瘍血管新生および血管新生に寄与する程度は35〜45
%で、内皮細胞の他の起源について記載されているのと同様のレベルである（Conwayet a
l, 2001 ；Ribatti et al, 2001）。さらに、in vivoで腫瘍の微環境にもたらされた血管
新生刺激は、MASCを腫瘍床へ集め、腫瘍の脈管構造に寄与する内皮細胞への分化を誘導す
るのに十分であることがわかった。これらの試験はしたがって、骨髄に存在する細胞が、
脈管形成と類似の過程において、新しい血管形成に寄与できることを示した他のグループ
によって報告されている研究を拡張し（Peichev et al, 2000；Linet al, 2000；Gehlin
g et al, 2000；Asahara et al, 1997）、この過程を担う前駆細胞は同定されている。こ
れは、出生後BMに存在する細胞を内皮細胞のごく初期の前駆細胞と同定する、我々の知る
限り最初の報告である。
【実施例１０】
【０１８８】
神経細胞の誘導
中胚葉性細胞型の他に、機能する神経細胞、ならびに星状細胞および稀突起膠細胞にex
vivoで分化することができるかどうか判定するために、単一の成体BM由来hMASCまたはmM
ASCを試験した。前に実施例1および3にそれぞれ記載した通り、mMASCおよびhMASCを選択
し培養して拡大した。ヒト神経前駆細胞（hNPC）はClonetics（SanDiego, CA）から購入
した。hNPCを取扱説明書のように培養し分化させた。
【０１８９】
電気生理学: 標準の全細胞パッチクランプ記録を用いてMASC由来神経細胞の生理学的性質
を検討した。電位固定および電流固定記録を、Dagan3911拡張ユニットで改装したDagan3
900Aパッチクランプアンプ（Dagan Corporation,Minneapolis）を用いて得た。ホウケイ
酸ガラス製のパッチピペットをナリシゲ社ピペット製作器（型番PP-83）で引き延ばし、
ナリシゲ社マイクロフォージ（型番MF-83）を用いて研磨した。パッチピペットを、（単
位mM）142.0KF、7.0Na2S04、3.0MgS04、1.0CaCl2、5.0HEPES、ll.0EGTA、1.0グルタチオ
ン、2.0グルコース、1.0ATP（マグネシウム塩）、0.5GTP（ナトリウム塩）を含む細胞内
液で満たした。大部分の記録について、蛍光顕微鏡法を用いて全細胞パッチ記録の設定が
達成されていることを目視で確認するために、蛍光色素5,6-カルボキシフルオレセイン（
0.5mm； Eastman Kodak Chemicals）もピペット溶液に添加した。ピペット抵抗は11〜24M
Ωの幅であった。記録用標準細胞外液は以下を含む（単位mM）: 155NaCl、5.0KC1、CaCl2
、1.0MgCl2、10HEPES、グルコース。一部の実験については1μMのTTXを標準対照溶液に添
加した。記録用細胞内液および細胞外液のpHは、NaOHを用いてそれぞれ7.4と7.8に調整し
た。すべての試薬はSigmaから入手した。実験の実施とデータ回収および保存にはPClamp
8.0（Axon Instruments, Foster City）を用いた。示したデータは8.4mVの液相界面電位
について補正し、これはJPCALCソフトウェアパッケージを用いて計算した。データのオフ
ライン分析と画像表示はClamp fit 8.0（Axon Instruments,Foster City）およびPrism
（Graphpad, San Diego）を用いて構成した。
【０１９０】
形質導入:レトロウイルス上清は、オランダ、ロッテルダム大学のDr. G.Wagemakerより提
供されたMFG-eGFP含有PG13細胞を（Bierhuizen et al.,1997）MASC拡大培地と48時間イ
ンキュベートして作成し、濾過して-80℃で凍結した。MASCをレトロウイルス上清および8
μg/mlプロタミン（Sigma）と6時間インキュベートした。これを24時間後に繰り返した。
形質導入効率はFACSによって分析した。
【０１９１】
5 遺伝子マイクロアレイ分析: RNAをhMASC、bFGFまたはFGF-8b＋EGF誘導細胞からRNeasy
miniキット（Qiagene）を用いて単離し、DNase I（Promega）を用いて37℃にて1時間消化
し、RNeasyを用いて再精製した。取扱説明書に従って作成した[32P]dATP標識CDNAプロー
ブをヒトNeurobiology Atlas Array（Clonetech # 7736-1 , Clonetech Laboratories, 
Palo Alto, CA, USA）と68℃にて18〜20時間ハイブリッド形成させ、その後、2xSSC、1%S
DSで68℃にて各30分間4回、0.lxSSC、0.5%SDSで68℃にて30分間、そして１回2xSSCで室温
にて5分間洗浄した。アレイはホスホイメージャースクリーンスキャナ（MolecularDynam
ics, Storm 860）で読み取り、Atlas Image 1.0（Clontech）を用いて分析した。未分化
の細胞と分化した細胞の間の２倍より大きい差を有意とみなした。
【０１９２】
レトロウイルス挿入配列のPCR分析: PCRを用いて、ヒトゲノムDNA中のMFGベクターの3'
LTRから隣接配列3'を増幅した。106個のMASCまたは内皮か筋芽細胞か神経外胚葉に分化
した子孫からDNAを、細胞から標準法によって調製した。300ngのゲノムDNAをAscIで消化
し、splinkeretteリンカーを5'末端に結合させた（Devon R. S.et al., 1995）。splink
eretteリンカーに用いた２種のオリゴヌクレオチドは下記の通りであった:aattTAGCGGCC
GCTTGAATTtttttttgcaaaaa（配列番号３０）（ヘアピンループ形成配列は小文字で、大文
字は第二のsplinkeretteオリゴヌクレオチドの相補部分である）、およびagtgtgagtcacag
tagtctcgcgttcgAATTAAGCGGCCGCTA（配列番号３１）（下線の配列はPCRおよびRT工程で用
いたリンカー特異的プライマー（LSプライマー）の配列でもある）。eGFP遺伝子中の配列
を認識する5'-ビオチン-T7結合プライマー[ビオチン-ggc-cag-tga-att-gta-ata-cga-ctc-
act-ata-ggc-tgg-CAC-ATG-GTC-CTG-CTG-GAG-TTC-GTG-AC（配列番号３２）；下線部は効率
的なin vitro転写に必要な最小のプロモーター配列を示し、大文字はeGFP特異的配列であ
る]およびLSプライマーを用いて、隣接領域を10回、Advantage2ポリメラーゼ（Clontech
）を使用して増幅した。ビオチン標識増幅産物はストレプトアビジン-磁性ビーズ（スト
レプトアビジン磁性粒子； Roche）を用いて捕捉し、結果として生じる産物をさらにT7RN
Aポリメラーゼを用いて約1,000倍に増幅し、それからDNAase1処理した。結果として生じ
る産物をagtgtgagtcacagtagtctcgcgttc（配列番号３３）splinkeretteプライマーを用い
てsuperscriptIIの説明書（Gibco）に従って逆転写し、続いて30回のnestedPCRによって
3'LTR用のプライマー[ggc caa gaa cag atg gaa cag ctgaat atg（配列番号８９）]を用
いて増幅した。内皮、筋、および神経外胚葉に分化した細胞と未分化のMASC由来のヒトゲ
ノム中の隣接配列を配列決定した。
【０１９３】
複数の分化した子孫に同一の挿入部位が存在することを実証するため、宿主隣接ゲノム
中に特異的プライマーを作成した。リアルタイムPCR増幅（ABI PRISM 7700,Perkin Elme
r/Applied Biosystems）を、eGFP配列と比較して隣接配列を定量するために用いた。増幅
のための反応条件は下記の通りであった: 2μLのDNA溶液、1X TaqManSYBR Green Univer
sal Mix(Perkin Elmer/Applied Biosystems）PCR反応緩衝液を用いた最初の変性（95℃で
10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40サイクル。使用したプライ
マーは下記の通りであった:クローンA16:LTRプライマー＝CCA-ATA-AAC-CCT-CTT-GCA-GTT-
G（配列番号３４）；隣接配列染色体7＝TCC-TGC-CAC-CAG-AAA-TAA-CC（配列番号３５）；
クローンA12染色体7配列:LTRプライマー＝GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T（配列番号３
６）、隣接配列＝CAG-TGG-CCA-GAT-CTC-ATC-TCA-C（配列番号３７）；クローンA12染色体
1配列:LTR＝GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T（配列番号３８）；隣接配列＝GCA-GAC-GAG-
GTA-GGC-ACT-TG（配列番号３９）。隣接配列の相対量は、eGFP配列と比較して取扱説明書
に従って7700 ABI PRISM検出ソフトウェア1.6を用いて計算した。
【０１９４】
神経移植:新生（生後1日目〜3日目）雄SpragueDawleyラット（Charles River Laborator
ies）をこの試験に用いた。ラットは低温麻酔によって麻酔した。改良定位頭部固定器を
用いて頭蓋を固定し、頭皮を反転して頭蓋を露出した。hMASCは0.25%トリプシン/EDTAを
用いて採取し、2回洗浄し、PBSに再懸濁した。hMASCの生存能力は85%より大であった。リ
ン酸 緩衝液に0.7x104 細胞/μlの濃度で懸濁したhMASCの2μlの量を、Hamiltonシリンジ
に付けた先細ガラスマイクロピペットで、下記の座標を用いて定位固定的に脳室内に注入
した（ブレグマからのmm）:AP-0.6、ML0.8、DV2.1、toothbarは-1に設定した。注射後、
頭皮を縫合し仔ラットを回復させた。
【０１９５】
移植の4および12週間後、ラットを抱水クロラール（350mg/kg、i.p.）で麻酔し、断頭
して脳を摘出し、粉末ドライアイス中で凍結し、-80℃で保存した。新鮮凍結脳をクリオ
スタットを用いて切断し、染色の直前に4%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。切片
を、2%正常ロバ血清（Jackson Immuno Labs）および0.3%triton Xを含むブロッキング/
透過処理溶液を用いて１時間室温にてインキュベートした。以降の工程のために、一次お
よび二次抗体を同じブロッキング/透過処理溶液で希釈した。一次抗体（Chemicon製マウ
ス抗ヒト核（1:25）、抗ヒト角膜（1:25）および抗NeuN（1:200）；DAKO製ウサギ抗GFAP
（1:250）、Sigma製ウサギ抗NF200（1:300）を4℃にて一夜インキュベートし、各10分間3
回PBSで洗浄し、次いで二次Cy3（1:200）抗体およびFITC（1:100）抗体（すべてJackson
Immuno Labs）と2時間室温でインキュベートした。スライドはZeissAxiovert顕微鏡を用
いた蛍光顕微鏡法および共焦点1024顕微鏡を用いた共焦点蛍光顕微鏡法によって検査した
。
【０１９６】
hMASCはbFGFと共に培養したとき神経細胞、星状細胞および稀突起膠細胞表現型を獲得す
る。
神経外胚葉性分化を実施例5に記載の通りに行った。要約すると、細胞をFN被覆チャン
バースライドまたは培養平板で、60%DMEM-LG、40%MCDB-201（SigmaChemical Co, St Lou
is, MO）を含み1X ITS、1X LA-BSA、10-8Mデキサメタゾン、10-4Mアスコルビン酸-2-リン
酸（AA）（すべてSigma）、100Uペニシリンおよび1,000Uストレプトマイシン（Gibco）を
添加した無血清培地を用いて培養した。一部の培養には、我々はl00ng/mLのbFGFを添加し
た一方、別の培養には10ng/mLのEOF＋10ng/mLのFGF-8bを添加した（すべてR&DSystems）
。細胞は継代培養しなかったが、培地は3〜5日間毎に交換した。
【０１９７】
bFGFと共に再播種してから2週間後、表6に示す通り、細胞の26±4%が星状細胞（GFAP+
）、28±3%が稀突起膠細胞（MBP+）そして46±5%が神経細胞（NF200+）マーカーを発現し
た。
【表６】
2004529621.tif 000006
【０１９８】
hMASCをより高い細胞密度（2x104細胞/cm2）で再播種して分化を誘導したとき神経外胚
葉性の表現型を有する細胞は検出されず、細胞-細胞相互作用がbFGF誘導性の 神経外胚葉
性分化を阻害することを示した。
【０１９９】
20または60PDを経たhMASCを用いて分化を誘導したとき、星状細胞様、稀突起膠細胞様
および神経細胞様細胞の分布に差は無かった。しかし、20 PDの間拡大したhMASCをbFGFと
共に培養したとき、細胞の>50%が死亡した一方、>30 PD の間拡大したhMASC培養の>70%が
生存して、神経細胞様、星状細胞様または稀突起膠細胞様の表現型を獲得した。このこと
は、すべてのhMASCを神経の特徴を獲得するように誘導することはできないが、invitro
で長期間生存するhMASCの部分集団が神経細胞の分化を担っている可能性があることを示
唆する。hMASCの核型は培養期間にかかわらず正常であることが示されている（Reyeset 
al, 2001）。hMASCの神経外胚葉性様細胞への分化はしたがって、長期間の培養後のMASC
の変質が原因である可能性は低い。
【０２００】
大部分の星状細胞様および稀突起膠細胞様細胞は3週間後に死亡した。神経細胞様細胞
の漸進的な成熟が培養期間を通じてみられた。1週間後、bFGF処理hMASCはNeuroD、ネスチ
ン、ポリシアル酸付加型神経細胞接着分子（PSA-NCAM）、およびチューブリン-β-III（T
uJI）について染色陽性となった（表6）。2週間後、bFGF処理細胞はNF68、-160、および-
200、NSE、MAP2-AB、そしてTauについて染色陽性となった。bFGF誘導性神経細胞はGABA作
用性、セロトニン作用性またはドーパミン作用性神経細胞のマーカーを発現しなかったが
、グルタミン酸およびグルタミン酸受容体-5、-6および-7とN-メチル-D-アスパラギン酸
（NMDA）受容体、およびNa+ゲート電位チャンネルを発現した。
【０２０１】
神経外胚葉性分化のさらなる確認は、14日間、100ng/mLのbFGFを用いて分化を誘導され
た2つの独立したhMASC集団のCDNAアレイ分析から得られた。ネスチン、otx 1
およびotx2の発現レベルは免疫組織化学的特徴づけと一致し、mRNAの>2倍の上昇がネスチ
ン、GFAP、グルタミン酸-受容体4、5、および6、そしてグルタミン酸、およびいくつかの
ナトリウムゲート電位チャンネルについて検出されたが、しかしTHまたはTrH mRNAレベル
に上昇は見られなかった。mRNAレベルの>2倍の上昇は、脳だけに見られる転写因子である
哺乳類achaete-scute相同体1（MASH I）mRNA（Franco DelArno et al., 1993）、および
ephrin-A5 mRNA（O'Leary and Wilkinson, 1999）についても見られた。星状細胞特異的
マーカーのGFAPおよびS100A5、そして稀突起膠細胞特異的マーカーのミエリン-稀突起膠
細胞糖タンパク前駆体およびミエリンタンパク質ゼロ（PMZ）、ならびにハンチンチン、
そして主要プリオンタンパク質前駆体mRNAが、bFGFへの曝露後、>2倍高く発現された。2
倍より大きい上昇は、いくつかのグリシン受容体、GABA受容体、ヒドロキシトリプトファ
ン受容体-Aおよび神経細胞のアセチルコリン受容体、グリシン輸送体タンパク質、シナプ
トブレビンおよびシナプトソーム補助タンパク質（SNAP）25についても見られた。最後に
、bFGFはBDNFおよびグリア由来神経分化誘導因子（GDNF）の発現を誘導した。
【０２０２】
hMASCのように、mMASCはbFGFと共に培養したとき神経細胞、星状細胞および稀突起膠細胞
表現型を獲得する。
【０２０３】
他の種に由来するMASCを、同様の結果が得られるかどうか判定するために試験した。40
-90 PDの間拡大したmMASCを、104細胞/cm2でhMASCに用いたのと同一の条件で再播種した
。14日後、mMASCは星状細胞（GFAP+）、稀突起膠細胞（MBP+）および神経細胞（NF-200+
、NSE+およびTau）の形態的および表現型の特徴を獲得した。NF200とGFAPまたはMBPは同
一の細胞では決して見つからなかった。未分化のmMASCとは対照的に、bFGF処理mMASは顕
著に大きく、神経突起が>40μｍ延長した。
【０２０４】
神経細胞様細胞が神経細胞の機能的特徴を有するかどうか、そしてbFGF誘導性細胞が電
位依存性Na+電流を示すかどうか判定するため、パッチクランプを用いた。一部の細胞は
カルシウム電流を発現し、4個の細胞ではカルシウム電流に媒介されるスパイク生成の証
拠があったにもかかわらず、mMASC由来神経細胞様細胞（n＝59）のどれにも、ナトリウム
電流または速いスパイク生成は見られなかった。このように、ナトリウムゲート電位チャ
ンネルmRNAおよびタンパク質の発現にもかかわらず、bFGF誘導性細胞は機能する電位依存
性Na+電流を有しなかった。
【０２０５】
hMASCはEGFおよびFGF-8bと共に培養したとき、中脳ドーパミン作用性、セロトニン作用性
またはおよびGABA性表現型を獲得する。
中脳後脳境界および吻側前脳に発現されるFGF-8bは、中脳および前脳のドーパミン作用
性神経細胞と後脳のセロトニン作用性神経細胞の分化を誘導する（Ye et al,1998）。In
vitroでは、FGF-8bはドーパミン作用性およびセロトニン作用性神経細胞をマウスES細胞
から誘導するのに用いられている（Lee et al., 2000）。
【０２０６】
20〜60PDの間拡大したhMASC（n＝8）を2x104細胞/cm2でFNに、ITSとAAと10ng/mLのFGF-
8bおよび10ng/mLのEGFを含む無血清培地に再播種した。80%を超える細胞が3週間生存した
。FGF-8bおよびEGFは神経細胞のマーカーについて陽性染色する細胞への分化を誘導した
（図6）（7日目:PSA-NCAM、ネスチンおよびTuJI；14日目:NF-68、NF-160、NF-200；21日
目:MAP2-AB、NSE、Tau、およびNa+ゲート電位チャンネル）が、稀突起膠細胞および星状
細胞へは誘導しなかった。bFGFに誘導される分化についての我々の観察とは対照的に、10
4細胞/cm2でEGFおよびFGF-8bと共に播種した細胞は分化しなかった。2〜3週間後、細胞は
GABA性（GABA+、パルブアルブミン+）、ドーパミン作用性（TH+、DCC+、およびDTP+）お
よびセロトニン作用性（TrH+およびセロトニン+）神経細胞の特徴を有した（表6）。細胞
はまたGABA-A受容体とグルタミン酸受容体も発現した。ドーパミン作用性 表現型を有す
る細胞はまた、中脳ドーパミン作用性神経細胞でのみ発現される核転写因子Nurr1（Sauce
do-Cardenas et al., 1998）ならびに、ドーパミン作用性神経細胞で発現されるグリア細
胞系統由来の神経分化誘導因子（GDNF）受容体複合体の構成要素である膜結合受容体タン
パク質チロシンキナーゼである癌原遺伝子cRet（Trupp et al., 1996）に対する抗体につ
いて陽性に染色された。このことは、FGF-8bが中脳ドーパミン作用性神経細胞と一致する
表現型を誘導することを示唆する。
【０２０７】
ここでも、免疫組織化学的試験からの結果は、14日間FGF-8b＋EGFと共に分化を誘導さ
れたhMASCについてのCDNAアレイ分析によって確認された。免疫組織化学的特徴づけと一
致して、mRNAの>2倍の上昇がTH、TrH、グルタミン酸、いくつかのグルタミン酸受容体、
およびナトリウムゲート電位チャンネルについて検出された。パルブアルブミンとGABAは
このアレイ上に存在しないため、それらの発現はmRNA分析では確認できなかった。免疫組
織化学によってみられるほぼ限定的な神経分化と一致して、tGFAP、S100A5mRNA、あるい
は稀突起膠細胞特異的マーカーであるPMZのmRNAの発現に上昇は見られなかった。FGF-8b
＋EGFに誘導された細胞は>2倍多いチロシンキナーゼ受容体（Trk）A、BDNFとGDNF、いく
つかのグリシン-、GABA-およびヒドロキシトリプタミン-受容体、そしていくつかのシナ
プスタンパク質を発現した。
【０２０８】
グリア芽腫細胞株U87との共培養は神経細胞の成熟を促進する
使用した培養条件にかかわらず、hMASC由来神経細胞は培養中で3〜4週間を超えて生存
しない。どの培養も3週間後にグリア細胞を含まなかったため、グルタミン酸とグルタミ
ン酸受容体の両方を発現する神経細胞がグルタミン酸の毒性のために死亡した可能性があ
る（Anderson and Swanson, 2000）。あるいは、神経細胞の生存、分化、成熟に必要な、
グリア細胞によって供給される因子が培養中に存在しない可能性がある（Blondel etal.
, 2000； Daadi and Weiss, 1999； Wagner etal., 1999）。この仮説を検証するために
、3週齢のFGF-8b＋EGF培養からの細胞を、グリア芽腫細胞株U-87と、FGF-8b＋EGFを添加
した無血清培地でさらに2週間共培養した。
【０２０９】
神経膠腫細胞株U-87[American Tissue CellCollection （Rockville, MD）]はDMEM＋1
0%FCS中に維持した（Hyclone Laboratories, Logan, UT）。3週齢のFGF-8b＋EGF含有培養
からの細胞を、親油性色素PKH26（Sigma）で取扱説明書の通りに標識した。標識細胞をFN
被覆チャンバースライドにFGF-8b＋EGF含有無血清培地中に1,000個のU-87細胞と共に再播
種し、培地を3〜5日間毎に交換しながらさらに2〜3週間維持した。MASC由来細胞中に存在
するPKH26がU-87細胞株に移動しないのを確実にするため、U-87細胞をBSA含有培地および
20μlのPKH26色素で7日間培養した。神経膠腫細胞の標識は検出されなかった。
【０２１０】
これらの無血清条件下で、U-87細胞は増殖をやめたが生存した。hMASC由来細胞を蛍光顕
微鏡法で確認できるようにするため、hMASC由来神経細胞はU-87細胞との共培養前に膜色
素PKH26で標識した。U-87細胞と同じサイトカインと後3週間共培養したFGF-8b＋EGF誘導
神経細胞は、少なくともさらに2週間生存した。神経細胞は、細胞の大きさが増大し、ま
た神経突起の数、長さと複雑さが増大した、より成熟した形態を獲得した。電流注入後の
全細胞電流固定および電位固定によって、U-87細胞との共培養後の、hMASC由来のPKH26標
識神経細胞の電気生理学的特徴を評価した（図9B）。電流固定によって、FGF-8b＋EGF/U-
87培養中に存在する8個中4個のKH26標識hMASC由来細胞が、注入電流に対するスパイク生
成を示した。スパイク生成および非スパイク生成細胞の静止膜電位はそれぞれ-64.9±5.5
mVおよび29.7±12.4mVであった。試験した個々の細胞について、スパイク生成および非ス
パイク生成細胞の入力抵抗はそれぞれ194.3（37.3）および216.3（52.5）MΩであった。
図9Bにスパイク生成が観察された細胞の一つの例を示す。上図はスパイク生成細胞から対
照 条件下で得られた一群の電圧記録を示す。DC電流を最初に細胞に注入して-100〜-120
mVの範囲に保つ。電流注入手順を、中図に示す通り、次いで膜電位を異なるレベルにする
のに用いた。この例に示す通り、細胞を活動電位の閾値にするのに十分大きな脱分極電流
の段階が、単一のスパイクを引き起こす。下図は、細胞のスパイク生成が1μｍTTXでブロ
ックされうることを示し、活動電位がNaゲート電位チャンネルによって媒介されているこ
とを示唆する。同じ細胞の電位固定モードから得られた、リークを差し引いた電流記録（
図9C）は、タイムコースの中で一過性でありまた-58mVよりも正である電位で活性化され
る内向き電流、および外向き電流を示した。一過性の内向き電流は1μｍTTXで可逆的にブ
ロックされた。この薬理は、内向き電流の一過性のタイムコースおよび電位依存性の活性
化と共に、成熟神経細胞および骨格筋細胞だけにみられる電位依存性Na+電流に典型的で
ある（Sah et al., 1997；Whittemore et al., 1999）。これらの神経細胞様細胞中に骨
格筋マーカーは検出されなかった。これらの試験は、FGF-8b＋EGFでの処理と神経膠腫と
の共培養はTTX感受性電位依存性Na+電流という興奮可能な神経細胞の基本的な特徴を細胞
に与える結果になることを示唆する。
【０２１１】
ラット新生仔の脳室に移植されたhMASCは星状細胞および神経細胞のマーカーを発現する
細胞に分化する
1.4xl04個のhMASCを定位的に生後1日目〜3日目のSpragueDawleyラットの側脳室に注射
した。4および12週間後、動物を屠殺し、ヒト細胞の存在およびhMASCが神経外胚葉に分化
した証拠について分析した。ヒト核またはヒト核膜に対する抗体を用いた染色によって同
定されたヒト細胞は、SVZに、4週間後には分析した個体の側脳室から最大400μｍ離れて
観察することができ、12週間後には、ヒト細胞は、たとえば海馬中におよび脳弓に沿って
、脳実質のより深くにもみることもできた。一部のヒト細胞は典型的な星状細胞の形態を
有し抗GFAP抗体で陽性染色された一方、別の細胞は抗Neu-N抗体、NF-200および抗ヒト核
膜抗体で陽性染色された。三重染色は、ヒト核抗原陽性Neu-N陽性細胞はGFAPを同時発現
しなかったことを示した。
【０２１２】
要約
この試験の中心的な発見は、単一の出生後BMに由来するMASCを中胚葉性細胞型だけでな
く成熟神経細胞の特徴ならびに星状細胞と稀突起膠細胞の特徴を有する細胞に分化するよ
う誘導することができるということである。MASCの神経外胚葉性の性質を有する細胞への
時間依存性ならびに培養方法依存性の成熟が示された。二重染色は、神経細胞またはグリ
ア細胞は真正であり結果は不適切に発現された神経細胞のまたはグリアのマーカーが原因
でないことを決定的に実証した。これらの結果はmRNAレベルで確認された。レトロウイル
スマーキング試験を用いて、レトロウイルスベクターに隣接する宿主細胞ゲノム領域配列
はすべての系統で同一であったため、神経細胞、星状細胞および稀突起膠細胞が、筋およ
び内皮にも分化する単一のMASCに由来することが示された。hMASCは成熟神経細胞の表現
型だけでなく電気生理学的特徴すなわちTTX感受性電位依存性Na+電流も獲得した。最後に
、MASCはin vivoで神経細胞および星状細胞のマーカーを発現する細胞にも分化できるこ
とが示された。
【０２１３】
レトロウイルス挿入配列の3'-LTRに隣接するゲノム配列のPCRに基づく配列決定と組み
合わせてhMASCのレトロウイルスマーキングを用いて、神経細胞は星状細胞および稀突起
膠細胞、ならびに内皮および筋に分化するのと同一のhMASCに由来することが示された（J
ordan et al, 1990）このことはMASCが単一細胞レベルで、中胚葉性および神経外胚葉性
の系統の細胞に分化できることを決定的に示す。中胚葉性細胞型だけでなく神経外胚葉性
細胞型にも分化する能力を有する細胞である多能性成体幹細胞すなわちMASCは新たに命名
された。Sanchez-Ramos et al.（Sanchez-Ramos etal, 2000）およびWoodbury et al. 
（Woodbury et al., 2000）は、ヒトまたはげっ歯類のMSC集団はinvitroで星状細胞およ
び神経細胞のマーカーを発現することができるが稀突起膠細胞のマーカーを発現すること
はできないことを示した。しかし、どちらの試験も、神経外胚葉性マーカーを獲得した同
じ細胞が中胚葉性細胞にも分化できるという証拠は提供しなかった。さらに、どちらの試
験も、神経細胞のマーカーを発現する細胞が機能する神経細胞の特徴も獲得したことは示
さなかった。このように、神経分化について示唆に富むが、これらの報告はMSCからの神
経およびグリア分化を決定的に示さなかった。
【０２１４】
ラット新生仔の脳室に移植されたhMASCは神経脳室下領域中および海馬中へ移動でき、
そこで局所的信号に応答して星状細胞および神経細胞のマーカーを発現する細胞に分化す
ることも示された。脳の非神経性領域より胚性領域に行われるほうが、また移植が成体動
物と比べて新生仔に行われるほうが、NSCの特定の神経細胞の 表現型への移動と分化はず
っと大きな程度で起こるため、このモデルが選択された（Bjorklund andLindvall, 2000
；Svendsen and Caldwell, 2000）。hMASCは多能性であり神経外胚葉の外側で細胞に分化
するにもかかわらず、hMASCは奇形腫を形成しなかった。脳室下領域の外側に移動した細
胞の数は4週間後では少なく、しかし12週間後では増加した。
【０２１５】
MASCを出生後のBMから単離し、拡大して星状細胞、稀突起膠細胞または神経細胞の細胞
型に分化するよう誘導するのが容易に可能であることによって、NSC移植における主要な
問題の一つ、すなわち適当な提供者組織の入手可能性を回避しうる。
【実施例１１】
【０２１６】
肝細胞様細胞へのMASC分化
胚発生中に、肝臓の形態形成の最初の兆候は腹側内胚葉性上皮の肥厚であり、マウスで
は胎生7.5〜8.5日目の間に起こる（Zaret K.S., 2001）。最初の内胚葉形成とそれに続く
内胚葉決定に関わるシグナルについてはあまり知られていない。原腸胚形成の初期には（
e6-e7）内胚葉は前後方向さえ決定されていない（Melton D., 1997）。しかし、近年の研
究は、ex vivoでの内胚葉のFGF4への曝露は、このとき肝マーカーを発現する能力のある
初期内胚葉を後側化することを示した（Wells J.M. et al.t 1999）。マウスで胎生8.5日
目までに、最終的な内胚葉が腸管を形成しHNF3Pを発現する（Zaret K.S.,2000）。前腸
内胚葉は、ともに隣接する心中胚葉に産生される酸性（a）FGFおよびbFGFによって肝細胞
系統に誘導され（Zaret K.S., 2001）、これらは既定の膵の運命でなく肝の運命を誘導す
るために必要である（Zaret K.S., 2001）。transversum間葉に産生される基礎形態形成
タンパク質（BMP）も、これらが内胚葉がFGFに応答する能力を高めるGATA4 転写因子のレ
ベルを上昇させるのでまた必要である（Zaret K.S., 2001）GATA4およびHNF3pが肝決定に
必要であり、またこれらは中でもアルブミンといった肝細胞特異的発現のマーカーをアッ
プレギュレートするので、肝細胞分化に繋がる下流の事象の重要なエフェクターである。
【０２１７】
大部分の場合、成熟肝細胞は数度の細胞分裂を経ることができ肝細胞置換を担っている
。結果として、肝臓幹細胞の存在および機能に関して大きな議論が存在している。化学的
傷害による広範囲の肝臓壊死の間、または肝細胞をその増殖をブロックする化学物質で処
理したとき、円形細胞と呼ばれる円形のより小さな細胞の集団が出現し増殖する（Peters
en, B.E., 2001 ）。これらの円形細胞は肝臓における「幹細胞」部分を構成する可能性
がある。円形細胞は、へリング管と呼ばれる胆道の最小単位内に存在し、そこから肝実質
へ移動する（Theise N.D., et al., 1999）。円形細胞は両能性であり、invitroおよびi
n vivoで肝細胞と胆道上皮の両方を生じる。円形細胞はいくつかの造血マーカーたとえば
Thy1.1、CD34、Flt3-受容体、およびcKitを発現し、そしてまたαFP、CK19、γ-グルタミ
ル-トランスフェラーゼ、そしてOV-6を発現する。円形細胞の起源は不明である（Peterse
n, B.E., 2001 ；Kim T.H. el al, 1997；Petersen,B.E., 2001）。
【０２１８】
最近まで、肝細胞は内胚葉性起源の細胞およびその前駆細胞からだけ得られると信じら
れていた。しかし、近年の研究は非内胚葉細胞もまた肝細胞をin vivoおよび invitroで
形成することを示唆する（Petersen, B.E., 2001；PittengerM.F. et al., 1999）。骨
髄（BM）移植後、円形細胞は提供者BMに由来する（Theise N.D., etal., 1999）。I型チ
ロシン血症の動物モデルであるFAH-/-マウスへの濃縮した造血幹細胞（HSC）の移植は、
多数の提供者LacZ+肝細胞の増殖という結果になり、動物は肝臓の生化学機能を回復した
（Lagasse E. et al., 2000）。さらに、単一HSCは造血機構に再定着するだけでなく肺、
皮膚、肝臓および腸の上皮に寄与する可能性がある（Krause D.S. et al.,2001）。in v
itroでオンコスタチンM（OSM）の存在下または非存在下でデキサメタゾン（Dex）処理し
た外分泌性膵腫瘍細胞は肝細胞表現型を獲得しうる（Shen C.N. et al.,2000）。最後に
、マウス胚性幹（ES）細胞は自発的に肝細胞表現型を獲得し、この過程はaFGF、HGF、OSM
、およびDexを用いた処理によって促進される（Hamazaki T. et al.,2001）。
【０２１９】
単一HSCはin vitroで中胚葉性および神経外胚葉性細胞に分化するだけでなく、肝細胞
の形態的、表現型および機能的特徴を有する細胞にも分化しうることが個々に実証された
。
【０２２０】
mMASC、rMASC、およびhMASCはFGF4および／またはHGFと共に培養されたとき肝細胞様表現
型を獲得する。
mMASC、rMASCおよびhMASCを記載した通りに選択し培養した。肝細胞様 細胞へのMASCの
分化のための最適条件を決定するため、さまざまな細胞外マトリクス（ECM）成分、およ
びin vivoまたはES細胞から肝細胞分化を誘導することが知られているサイトカイン（Zar
et K.S., 2001）の、mMASCまたはrMASCの肝細胞への分化に対する効果を試験した。分化
には細胞周期停止が必要であるため、細胞密度の効果もまた試験した。肝細胞様細胞への
分化を実証するため、14日後に細胞をアルブミン、CK18、およびHNF3pに対する抗体を用
いて染色した。
【０２２１】
mMASCまたはrMASCのアルブミン、CK18、およびHNF3p陽性類上皮細胞への最適分化は、
表7Aに示すようにMASCが21.5x10３細胞/cm2で10ng/mlのFGF4および20ng/mlのHGF存在下で
Matrigelに播種したときに見られた。14日後、アルブミン、CK18、およびHNF3p陽性類上
皮細胞の割合は61.4±4.7%であり、細胞の17.3%が二核であった。FNに播種したときも、
細胞の53. 1±6.3%だけが染色され二核細胞がより少なかった（10.9%）が、CK18およびHN
F3p陽性類上皮細胞への分化がみられた。
【０２２２】
FGF4またはHGFのいずれかとの培養によってアルブミン、CK18、およびHNF3p陽性類上皮
細胞が得られたが、しかし表7Aに示すようにmMASCまたはrMASCをFGF4とHGFの両方で処理
したときのほうがアルブミン、CK18、およびHNF3p陽性細胞の割合はより高かった。aFGF
、bFGF、FGF7、BMP、またはOSMの添加では肝細胞マーカーについて陽性である細胞の割合
は上昇しなかった一方、1%DMSOおよび0.1mM〜10mM酪酸ナトリウムは肝細胞マーカーにつ
いて陽性である細胞へのmMASCまたはrMASCの分化を支持しなかった。
【０２２３】
2.5〜25x10３細胞/cm2の細胞密度を試験したとき、肝細胞マーカーを有する細胞の割合
の最高値は、21.5x10３細胞/cm2で播種した細胞について見られた。細胞を<12.5x10３細
胞/cm2で播種したときは肝細胞分化は見られなかった。
【０２２４】
hMASCを3-30x10３細胞/cm2で、aFGF、bFGF、FGF7、1%DMSO、HGF、および/またはFGF4を
含む、10ng/mLFNまたは1%Matrigelに播種した。10ng/mlのFGF4単独、20ng/mlのHGF単独、
または両者の組で処理した細胞だけがアルブミン、CK18、およびHNF3pを発現する類上皮
細胞に分化した。15-30x10３細胞/cm2で播種したhMASCは類上皮細胞に分化した一方、3x1
0３細胞/cm2で播種したhMASCは死亡した。mMASCまたはrMASCのように、アルブミン、CK18
、およびHNF3p陽性類上皮細胞の割合はhMASCをMatrigel（91.3%±4.4）で培養したときの
ほうがFN（89.5%±5.4）で培養したときよりも高く、そして表7Bに示す通り、二核細胞の
割合はMatrigel（31.3%）でのほうがFN（28.7%）でよりも高かった。
【表７】
2004529621.tif 000007
【０２２５】
肝細胞様細胞へのMASC分化の表現型の特徴づけ
肝細胞分化を免疫蛍光および共焦点顕微鏡法によって肝細胞分化の初期（HNF3P、GATA4
、CK19、αFP）および後期（CK18、アルブミン、HNF1α）マーカーについて経時的に、さ
らに評価した。FGF4およびHGFを含むMatrigelに播種したmMASCまたはrMASCは、表8Aに示
す通り、直径8μmから15μmに大きくなった。21〜28日目に、細胞の約60%は類上皮細胞で
、より小さな丸型または紡錘型細胞に囲まれていた。未分化のmMASCまたはrMASCは肝臓特
異的転写因子または細胞質マーカーのどれも発現しなかった。4日後、細胞はHNF3J3、GAT
A4およびαFP、低レベルのCK19を発現し、ごく少数の細胞がHNF1α、アルブミンまたはCK
18について染色陽性であった。7日目に、その大きな類上皮細胞はHNF30、GATA4、HNF1α
について染色陽性であり、アルブミンおよびCK18について染色が強まった。少数の細胞だ
けがαFPを発現した。14、21および28日後、その大きな類上皮細胞はGATA4、HNF30、HNF1
α、CK18およびアルブミンについて染色陽性であったが、しかしαFPまたはCK19について
はそうでなかった。類上皮細胞の小塊を取り囲むより小さな細胞はCK19およびαFPについ
て染色陽性であった。
【０２２６】
FGF4およびHGF、またはFGF4単独を含むMatrigelに播種したhMASCは、21日目までに直径
10〜12μmから20〜30μmに大きくなった。7日後、細胞はHNF3p、GATA4および低レベルのC
K19を発現した一方、アルブミンまたはCK18について染色陽性の細胞は少数しかなかった
。14および21日後、類上皮細胞の>90%がGATA4、HNF3p、HNF1α、HNF4、CK18およびアルブ
ミンについて染色陽性であった一方、図10Bに示す通り、少数の細胞だけがαFPまたはCK1
9について染色陽性であった。
【表８】
2004529621.tif 000008
【０２２７】
肝細胞様細胞は神経外胚葉および内胚葉に分化したのと同じ単一hMASCに由来する
単一のmMASCまたはrMASCが内皮、神経外胚葉と、CK18およびアルブミン陽性内胚葉細胞
に分化することが示されている。単一のhMASCが中胚葉および神経外胚葉に分化すること
も示されている。同じ単一のhMASCを、肝細胞様細胞に分化することができるかどうか試
験した。MASCは記載の通りに得て培養して拡大した。分化のためには、mMASCまたはrMASC
を25x10３細胞/cm2で0.01〜10μg/mlのフィブロネクチン（FN）、0.01〜8μg/mlのコラー
ゲン（Sigma Chemical Co, St. Louis, MO）または1%Matrigel（Becton-Dickinson）に、
無血清培地[60%低グルコースDMEM（DMEM-LG； Gibco-BRL,Grand Island, NY）、40%MCDB
-201（Sigma）に、1Xインシュリン/トランスフェリン/セレン、4.7μg/mlリノール酸、1m
g/mlウシ血清アルブミン（BSA）、10-8M デキサメタゾン,lO-4Mアスコルビン酸-2-リン
酸（すべてSigma）、100U/mlペニシリン、100U/mlストレプトマイシン（Gibco）を添加]
に2% PCS（Hyclone, Logan Utah）および各10 ng/mLの上皮成長因子（EGF）（Sigma）、
白血病抑制因子（LIF； Chemicon, Temecula, CA）と血小板由来成長因子（PDGF-BB；R&
D Systems, Minneapolis, MN）を加えた中に播種した。hMASCを15-30x10３細胞/cm2で0.1
μg/ml FNまたは1% Matrigelに、LIFを含まない同じ培地中に播種した（ReyesM., 2002
）。8〜12時間後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（PBS）（Fischer）で2回洗浄し、
そして5-50ng/ml HGF、aFGF、bFGF、FGF4、FGF7、またはOSM；または10mg/mlジメチルス
ルホキシド（DMSO）、または0.1〜1mM 酪酸ナトリウムを添加した無血清培地中で培養し
た。
【０２２８】
hMASCへのeGFPの形質導入はレトロウイルス含有eGFP-CDNAを用いて行い、>5X106細胞に
拡大した。20%は筋、内皮、神経外胚葉および内胚葉に分化するよう誘導された。クロー
ンA16については単一のレトロウイルス挿入部位が未分化のMASCならびに中胚葉性と神経
外胚葉性の分化した細胞に存在し、またEGFP＋クローンA16MASCはCK18およびアルブミン
陽性細胞に分化した。同じ挿入部位が、同じ細胞集団から作成したFGF4処理MASCに存在し
（5'-TAG CGGCCGCTTGAATTCGAACGCGAGACTACTGTGACTCACACT-3'（配列番号４０）、染色体7
）、単一のhMASCが、中胚葉および神経外胚葉以外に、内胚葉に分化することを証明した
。
【０２２９】
定量的RT-PCRはFGF4およびHGFが肝細胞決定および分化を誘導することを示す。
定量的RT-PCRによって肝細胞分化は肝細胞分化の初期（HNFSp, GATA4,CK1 9, αFP）
および（CK18、アルブミン、HNF1α、シトクロムP450）マーカーについて確認された。RN
Aを3xl05個のMASCまたは肝細胞に分化するよう誘導されたMASCから抽出した。mRNAを逆転
写し、CDNAを下記の通り増幅した:ABI PRISM 7700 （PerkinElmer/Applied Biosystems
）を使用して、2μLのDNA溶液、1X TaqMan SYBR GreenUniversal Mix PCR反応緩衝液を
用いた最初の変性（95℃で10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40
サイクル。増幅に用いたプライマーは表9（配列番号４１−８８）に列記する。
【表９】
2004529621.tif 000009
【０２３０】
mRNAレベルはβ-アクチン（マウスおよびヒト）または18S（ラット）をハウスキーピン
グ遺伝子として用いて標準化し、そして新規に単離されたラットまたはマウス肝細胞、７
日間培養したラット肝細胞中のｍRNAレベル、またはClontech, PaloAlto, Californiaよ
り購入したヒト成体肝臓RNA由来のmRNAと比較した。
【０２３１】
0日目には、mMASCおよびrMASCは低レベルのアルブミン、αFP、CK18、CK19、TTR、HNF3
P、HNF1αおよびGATA4 mRNAを発現したが、CYP2B9とCYP2B13（マウス）またはCYP2B1（ラ
ット）mRNAは発現しなかった（図10）。mMASCまたはrMASCの、FGF4とHGFを用いた処理後
、HNF3J5およびGATA4 mRNAの発現は2日目に増加し、4日目までに最大となり、わずかに減
少して14日目までに一定となった。αFP、およびCK19のmRNAは2日目以降増加し、4日目ま
でに最大となり、以降は減少した。TTR mRNAは4日目以降増加し、7日目までに最大となり
一定となった。CK18、アルブミン、HNF1αおよびP450酵素mRNAは7日目以降増加し、14日
目に最大となった。14日目と21日目の間に、FGF4およびHGFに誘導されたMASCはアルブミ
ン、TTR、CK18、CYP2B9およびCYP2B13（マウス）とCYP2B1（ラット）mRNAを発現した。
【０２３２】
未分化のhMASCは低レベルのアルブミン、CK18、およびCK19、CYP1B1を発現したが、し
かしαFP（図10）とCYP2B6 mRNAは発現しなかった。アルブミン、CK18、CK19、CYP1B1mR
NAのレベルは、0日目(MASC）培養と比較して、FGF4単独とまたはFGF4およびHGFと14日間
培養したhMASCでは顕著に増加した。アルブミン、CK18およびCYP1B1 mRNAのレベルは増加
を続け、28日目にはより高かった。CYP1B1は特異的肝細胞マーカーではないが、そのアッ
プレギュレーションは肝細胞決定および成熟を示唆する。新鮮肝臓mRNAの0.5%〜1.0%であ
る低いレベルのCYP2B6を14日目と21日目に見ることができたが0日目には見られなかった
。未成熟肝細胞マーカー（CK19とαFP）のmRNAレベルは分化が進行するにつれ減少し、FG
F4単独で誘導した培養でより高かった一方、成熟肝細胞（CK18とアルブミン）のmRNAレベ
ルはFGF4とHGF誘導性hMASCでより高かった。
【０２３３】
ウェスタンブロットはFGF4＋HGFが肝細胞決定と分化を誘導することを実証する
発現 of 肝細胞特異的遺伝子の発現は、ウェスタンブロットによっても確認され、Reye
s et al.（2000）に記載された通り実施した。αFP、ヒト アルブミン、CK18に対する抗
体をブロッキング緩衝液で1:1000に希釈した。ヤギ抗β-actin（1:1000）はSantaCruzよ
り入手した。二次抗体はHRP結合ヤギ抗マウスおよびHRP結合ロバ抗ヤギであった（Amersh
am, Arlington Heights）。ECLは取扱説明書に従って実施した（Amersham）。未分化のhM
ASCはCK18、アルブミン、またはαFPタンパク質を発現しなかった（図1OB）。FGF4単独で
またはFGF4およびHGFで35日間処理後、hMASCはアルブミンとCK18を発現したが、αFPを発
現せず、組織化学的分析と一致した。
【０２３４】
mMASC、rMASCおよびhMASCは肝細胞の機能する活性を獲得する
5種類の異なる分析を用いて、肝細胞の形態的および表現型の特徴を有する細胞が肝細
胞の機能的特性も有するかどうかを判定した。
【０２３５】
肝細胞様細胞による尿素産生と分泌を分化の全期間を通じてさまざまな時点で測定した
。尿素濃度は比色分析（Sigma型番640-1）によって取扱説明書の通りに測定した。単層で
生育したラット肝細胞と、胎児マウス肝臓原基を陽性対照として、そして培地を陰性対照
として用いた。この分析法は最低10mg/mlの尿素濃度を検出できる。この分析法はアンモ
ニアも測定するため、試料はウレアーゼの添加前と後に評価した。
【０２３６】
尿素またはアンモニアは培地単独の中には検出されなかった。未分化のMASCは尿素を産
生しなかった。FGF4とHGFを用いた処理後、MASCによる尿素産生は時間依存的に増加した
。尿素産生の時間的経過はマウスとラット培養で同様であった。FGF4とHGFを用いて処理
したhMASCについては、尿素は4日目には検出されず、マウスおよびラット培養と12日目ま
で同様で、マウスおよびラット培養中の尿素を21日目に上回った。MASC由来肝細胞に産生
された尿素のレベルは、ラット初代肝細胞の単層培養でのレベルと同様であった。三つの
種すべてについて、Matrigel上で分化した細胞はFNと比較して顕著に多い尿素を産生した
。
【０２３７】
アルブミン産生を分化の全期間を通じてさまざまな時点で測定した。ラットアルブミン
濃度は以前に記載した競合的酵素結合免疫検定法（ELISA）によって測定した（Tzanakaki
s E.S., et al., 2001 ；Wells J.M et al.y2000）。ヒトおよびマウスアルブミン濃度
は、適切な場合にヒトまたはマウスアルブミンおよび抗ヒトまたは抗マウスアルブミン抗
体をラット成分と替えて、同様のELISA法を用いて測定した。ペルオキシダーゼ結合抗ヒ
トアルブミンと対照ヒトアルブミンはCappelから入手した。ペルオキシダーゼ結合アフィ
ニティ精製抗マウスアルブミンと対照マウスアルブミンはBethylLaboratories （Montgo
mery, Texas）から入手した。ELISAの特異性を確実にするため、ヒト、マウス、およびラ
ット抗体は、2時間、37℃にて3%BSAの蒸留水（dH2O）溶液中でインキュベートした。ELIS
Aは少なくとも1 ng/mlの感度を有した。
【０２３８】
未分化のMASCはアルブミンを分泌しなかった。FGF4とHGFを用いた処理後、mMASC、rMAS
CおよびhMASCはアルブミンを時間依存性に産生した。尿素産生について見られたように、
Matrigel上で分化した細胞はFN上で培養したときと比較してより多量のアルブミンを産生
した。アルブミンはヒト培養で3日目に検出されなかったにもかかわらず、マウス、ラッ
ト、およびヒト細胞は同様のレベルのアルブミンを分泌した。マウス、ラットおよびヒト
MASC由来肝細胞に産生されたアルブミンのレベルは、ラット初代肝細胞の単層培養でみら
れるレベルと同様であった。
【０２３９】
次にシトクロムP450活性を、MASC由来肝細胞の凝集塊とラット初代肝臓肝細胞の球状コ
ロニーでPROD分析を用いて評価した。mMASC-肝細胞凝集塊は、14日目のFGF4およびHGF処
理mMASCを5x10４細胞/cm2で非-組織培養プレートに播種し、これを振とう器に毎分10回転
で5時間かけて作成した。細胞凝集塊はPrimariaシャーレに移し、1mMフェノバルビタール
の存在下または非存在下で4日間緊密化させた。hMASC-肝細胞凝集塊はハンギングドロッ
プ法で作成した。要約すると、FGF4およびHGFで24日間処理したhMASCを103個、1mMフェノ
バルビタールの存在下または非存在下で100μLの液滴に入れた。4日後、凝集塊を回収し
、シトクロムP450活性をPROD分析によって評価した。ペントキシレゾルフィン（PROD）（
Molecular Probes, Eugene, Oregon）はシトクロムP450によってO-脱アルキル化され、非
蛍光化合物から蛍光化合物レゾルフィンに変化する（Tzanakakis E.S. etal., 2001 ）
。PROD代謝によって生じた蛍光強度から結果としてシトクロムP450（CYP）活性を推定す
る。insituでのレゾルフィンの測定および検出は、記載の通り共焦点顕微鏡法を用いて実
施した（Tzanakakis E.S. et al., 2001 ）。
【０２４０】
未分化のmMASCまたはhMASCの凝集塊にPROD活性はみられなかった。しかし、凝集塊を形
成するよう誘導されたmMASC（FGF4およびHGFと18日間）およびhMASC（28日間、FGF4単独
）は顕著なPROD活性を有した。MASC由来肝細胞凝集塊のPROD活性はラット初代肝細胞凝集
塊の活性と同様であった。いくつかの異なる細胞がP450活性を有するが、P450活性のフェ
ノバルビタールによるアップレギュレーションは肝細胞にだけ見られる。したがって、P4
50もまたフェノバルビタールの存在下または非存在下で試験した。フェノバルビタール無
しでは、いくつかのP450酵素が部分的にPROD代謝に加わり、上昇した蛍光値をこれらの検
体に与える。対照的に、フェノバルビタールに誘導された凝集塊では、PROD活性は、マウ
スシトクロムCyp2b9、Cyp2blO、およびCyp2bl3、ラットシトクロムCyp2bl/2（Tzanakakis
E.S. et al, 2001）、そしてヒトではCYP2B6によってほぼ完全に代謝された。したがっ
て増加した蛍光活性は、規定のシトクロムP450酵素のタンパク質発現における実際の増加
より小さい。凝集塊を96時間フェノバルビタールと共に培養したとき、PROD 活性に32%〜
39%の増加がみられ、機能する肝細胞特異的Cyp2b9、Cyp2blO、およびCyp2bl3がmMASCに、
およびCYP2B6がhMASC由来肝細胞に存在することを示唆した。
【０２４１】
MASC由来肝細胞を、FGF4処理hMASCをLDL-dil-acilとインキュベートすることによって
、LDLを取り込む能力について評価した。細胞を抗CKl8または抗Pan-CKとHNF-3pまたはGAT
A4抗体を用いて同時標識した。7日間後、a-LDLの低レベルの取り込みが検出され、増加し
て21日目に最大となった。
【０２４２】
肝細胞のもう一つの代謝機能はグリコーゲン産生または糖新生である。グリコーゲン貯
蔵のレベルは、FGF4およびHGF誘導マウスMASCとFGF誘導hMASCを3日目、7日目、14日目、2
1日目に、過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色によって分析した。PASのためには、スライドを1
%過ヨウ素酸で5分間酸化しdH2Oで３回洗浄した。その後、スライドをシッフ試薬で15分間
処理し、dH2O中で5-10分間洗浄し、Mayer'shematoxylinを用いて1分間染色してdH2O中で
洗浄した。グリコーゲン貯蔵は最初に4日目までに見られ、最大レベルは21日目以降に見
られた（図ll）。
【０２４３】
肝細胞単離と培養
肝細胞は4-6週齢雄Sprague-Dawleyラットから記載の通り採取した（SeglenP.O., 1976
）。採取後の肝細胞の生存数は90〜95%の幅であった。肝細胞は記載の通り培養した（Tza
nakakis E.S. et al., 2001 ；Tzanakakis E.S.et al, 2001）。単層を形成するために
は、肝細胞を；8μg/cm2 コラーゲン（CohesionTechnologies, Palo Alto, CA）で被覆
した35 mM Fischer平板培地（Fischer Scientific,Pittsburgh, PA）上で培養した。sph
eroidsを形成するためには、肝細胞を35-mm Primaria（商標）シャーレで培養した。（Be
cton Dickinson）。両方の条件下で、播種密度は5x10４細胞/cm2であった。最初の平板培
養の12時間後、培地を交換して死細胞および付着していない細胞を除去した。培地はその
後48時間毎に交換した。
【０２４４】
要約
出生後のマウス、ラットおよびヒトBM由来の単一のMASCはin vitroで肝細胞の表現型お
よび機能を有する内胚葉性細胞型へ分化できることが示されている。細胞分化条件下で培
養されたMASCは、原始および成熟肝細胞マーカーを時間依存性に発現し、マーカーは二重
および三重標識細胞の免疫蛍光顕微鏡法によって示された。非肝細胞マーカーは肝細胞抗
原と同時発現されなかったため、タンパク質発現プロファイルは肝細胞特異的であって擬
似的ではなかった。免疫組織化学からの結果はウェスタンブロットによって確認された。
さらに、RT-PCRは、内胚葉決定に重要であることが判っている転写因子HNF3βおよびGATA
4、および続いての肝細胞分化に必要なたとえばHNF3βといった転写因子、そしてたとえ
ばCK19、CK18、αFPおよびアルブミンといった細胞質タンパク質、のアップレギュレーシ
ョンを確認した。
【０２４５】
FGF4単独、またはFGF4およびHGFの両方が、MASCを肝細胞の形態的および表現型の特徴
を有する細胞に分化させたことが示されたが、肝細胞の機能上の特徴の獲得を示すことが
できない限り、これだけでは細胞が肝細胞に分化したことは証明されない。したがって、
機能する肝細胞を同定するため、いくつかの機能試験が組み合わせて行われた。mMASC、r
MASCまたはhMASCは尿素およびアルブミンを産生し、フェノバルビタール誘導性シトクロ
ムP450活性を含み、Dil-acil-LDLを取り込むことができ、グリコーゲン顆粒を含んだ。尿
素産生は肝細胞活性に特異的であるが、腎尿細管上皮もまた尿素を産生する（HedlundE.
et al., 2001）。対照的に、アルブミン産生は肝細胞の存在および代謝活性についての
特異的試験である（Hedlund E. et al., 2001）。シトクロムP450は、肝細胞にみられる
が、多くの他の細胞型にも存在する（Jarukamjorn K. et al.,1999）。
【０２４６】
しかし、ラットにおけるCyp2bl活性（Tzanakakis E.S. et al.,2001）、マウスにおける
Cyp2b9およびCyp2bl3（Li-Masters T. et al., 2001；ZelkoI. Et al., 2000）、そして
ヒトにおけるCYP2B6は比較的に肝細胞特異的と考えられている。P450のこれらの形の存在
はRT-PCRによって示された。P450活性がフェノバルビタールによって誘導可能な場合、示
した通り、肝細胞に関する特異性はさらに向上する（Rader D.J. et al.,2000）。
【０２４７】
LDL取り込みは肝細胞で見られるが（Oh S.H. et al., 2000）、たとえば内皮といった他
の細胞も同様の能力を有する（Avital I. et al., 2001）。最後に、肝細胞だけがグリコ
ーゲンを産生し貯蔵することができる。総合すると、これらの機能試験は、in vitroでFG
F4およびHGFを用いて処理したマウス、ラットまたはヒト由来MASCは肝細胞マーカーを発
現するだけでなく肝細胞代謝活性に合致する機能的特徴も有することを示す。
【０２４８】
いくつかの研究は、BM由来細胞は肝細胞様細胞にin vivoおよびin vitroで分化しうる
ことを示している（Petersen B.E. et al., 1999；TheiseN.D. et al.,2000；Krause D.
S. et al., 2001；Pittenger M.F. et al., 1999；WangS. et al., 2001；Lagasse E. e
t al., 2000）。しかし、大部分の研究は、肝細胞表現型を有する細胞に分化するBM細胞
の表現型について取り組んでいない。肝細胞マーカーについて染色陽性となる細胞が肝細
胞の機能的特徴を有するかどうか、および肝細胞に分化する細胞がたとえば造血細胞のよ
うな中胚葉性細胞にも分化できるかどうかはは未知である。Lagasse et al.は、マウスBM
中に存在するcKit+Thy１lowSca1+Lin+-細胞は肝細胞の表現型だけでなく肝細胞の機能を
有する細胞に分化することを示した（Lagasse E. et al., 2000）。わずか50個の細胞が
移植されたときにそのような結果を見ることができるにもかかわらず、この研究では造血
細胞に分化するのと同一の細胞が肝細胞にも分化することは証明されなかった。Krausee
t al.は単一の細胞が造血機構に再定着し稀な肝細胞を生じることができることを示した
。しかし、肝細胞の機能的評価は行われなかった（Krause D.S. etal.,2001）。Avita e
t al.は、マウスBM中のThy-1+ 細胞であるβ2m-がアルブミン、HNF4、C/EBPct、およびシ
トクロム P450 3A2 mRNAおよびタンパク質（Wilmut I., etal., 1997）、通常は肝臓で
みられる肝細胞前駆細胞の表現型を発現することを最近報告した。このように、BM中にそ
のような肝細胞前駆細胞が存在することは、最近の研究で注目されたin vivoでの骨髄の
肝細胞への分化を説明しうる（Krause D.S. et al, 2001；LagasseE. et al., 2000）。
【０２４９】
機能する肝細胞様細胞を生じる細胞が他の細胞型も生じるかどうかという疑問に対処す
るため、レトロウイルスマーキングが用いられた（Reyes M. et al.,2001；Jiang Y., 2
002）。アルブミン、GK18およびHNF1αを発現している細胞を、内皮および神経外胚葉性
の表現型を有する細胞に分化するのと同じmMASCおよびrMASCから生じうることが最近示さ
れている（Jiang Y.,2002）。hMASCについても同様の結果がみられることが確認されてい
る。中胚葉性および神経外胚葉性の表現型とsingle hMASCからの機能を有する細胞を得る
ことを示した最近発表された研究を拡張して（Reyes M., 2002）、同じsinglehMASCがま
た肝細胞の形態および表現型を有する細胞に分化することがここに示される。このように
、肝細胞マーカーを発現せず機能する肝細胞活性を有しないMASCがBM中に存在し、培養条
件に従って、これが肝細胞の表現型および肝細胞の機能的特徴、または中胚葉性および神
経外胚葉性細胞の表現型のおよび機能の特徴を獲得することが初めて示される。
【実施例１２】
【０２５０】
血友病マウスを治療するためのLacZ遺伝子導入MASCの移植
MASCはβ-gal/NEO導入遺伝子を含むROSA26マウスから得て（106細胞/マウス）、先に放
射線照射することなく血友病マウス（N＝5）に静脈注射した。動物はMASC移植後1ヶ月（N
＝2）および2ヶ月（N＝3）で屠殺した。骨髄サイトスピンおよび肝臓、脾臓、骨格筋、心
臓、肺および腸の凍結断面を、FITC-結合抗β-gal抗体とpan-サイトケラチンまたはCD45
を用いてβ-gal抗原の存在について染色した。組織はまたQ-PCRによってβ-gal遺伝子に
ついて実施例6に記載の通り分析した。
【０２５１】
予備分析では、注射後2ヶ月で分析した３個体（M3）のうち１個体が提供者細胞に由来す
る肺上皮細胞を0.1%有することが免疫組織化学およびQ-PCRによって示された。免疫組織
化学は、個体M5で脾臓、骨髄および腸に、<1%のCD45+提供者細胞が定着していることを示
した。個体M4の組織は免疫組織化学的にいくらかの提供者由来細胞を有していた；この個
体についてのPCRデータは結果待ちである。
【０２５２】
個別に参照により含まれるように、すべての公開、特許および特許出願は参照により本
開示に含まれる。前期の明細書において本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して
記載され、説明の目的で多くの詳細が示されている一方、本発明は他の実施形態を許し、
またここに記載された詳細のあるものは本発明の基本原理を離れることなく相当に変化さ
せうることは、当業者に明らかとなる。
（参考文献）
【０２５３】
2004529621.tif 000010
2004529621.tif 000011
2004529621.tif 000012
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2004529621.tif 000021
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2004529621.tif 000023
2004529621.tif 000024
2004529621.tif 000025
2004529621.tif 000026
2004529621.tif 000027
【０２５４】
（多能性成体幹細胞およびそれを単離する方法）
本発明の一部は、Morayama Reyes に対する国立保健研究所／国立アレルギー
感染病研究所からの助成（助成番号IF31-AI-Gn10291）を介して、米国政府の支
援を受けた。
【０２５５】
発明の分野
本発明は、概して、幹細胞を単離する方法、その方法によって単離された幹細
胞、およびそのような幹細胞の治療的使用に関する。さらに詳細には、本発明は
、分化して様々な細胞系統の細胞を形成する能力を有する単離骨髄由来前駆細胞
、ならびにそのような細胞を単離する方法およびそのような方法によって単離さ
れた細胞の特異的分化を誘導する方法、さらにはタンパク質および転写因子のよ
うなそれら細胞中に存在する特異的マーカーに関する。
【０２５６】
発明の背景
幹細胞からの臓器および組織の発生およびそれに続く移植は、多くの病状のた
めの有望な治療法を提供し、従って、多くの分野において幹細胞を研究の中心と
ならしめた。移植用の臓器および組織の形成のために幹細胞を用いることは、２
〜３例挙げると、糖尿病、パーキンソン病、肝疾患、心疾患、および自己免疫疾
患のための有望な代替的治療を提供する。しかしながら、臓器および組織の移植
に関連する少なくとも２つの重要な問題がある。第1に、ドナー臓器および組織
の不足がある。米国において移植のために必要とされる臓器のわずか５％がレシ
ピエントに利用可能となる（Evans, et al., J.Am.Med.Assoc.(1992) 267: 239
-146）。米国心臓病協会によると、１９９７年に新しい心臓を必要とする４０，
０００人のアメリカ人の内、わずか２，３００のみが心臓を受け取ることができ
、さらに米国肝臓病基金は、肝不全によって毎年死亡するほぼ３０，０００人の
患者のためのドナーは３，０００人より少ないことを報告している。第２の重要
な問題は、移植される組織とレシピエントの免疫系との潜在的な不適合性である
。提供臓器または組織は異物として宿主免疫系によって認識され、経済的および
身体的に−負担を強いることを承知で、拒絶反応抑制剤を患者に提供する必要が
ある。
【０２５７】
異種移植、すなわち、別の種からの組織または臓器の移植は、ヒト臓器および
組織の不足を克服するための代替的手段を提供することができる。異種移植は、
まだ健康である間に臓器を採取し、さらに移植手術の前に患者に有益な前処理を
受けさせることを可能とする移植の一歩進んだ計画を提供するであろう。残念な
がら、異種移植は、組織不適合性の問題を克服することはできず、かえって悪化
させる。さらには、疾病対策センターによると、有害なウィルスは種の壁を越え
るという証拠がある。ブタが臓器および組織のドナーの有望な候補になっている
が、ブタからヒトへの複数のウィルスの異種間感染が証明されている。例えば、
７０人を越えるヒトに感染した致死的結果をもたらす病気である、ヘンドラ(Hen
dra)ウィルスの発生を阻止するために、１００万頭を超えるブタが最近マレーシ
アで屠殺された（Butler, D., Nature (1999) 398: 549）。
【０２５８】
幹細胞：定義および使用
従って、移植のための臓器および組織の最も有望な供給源は、幹細胞技術の開
発にある。理論的に、幹細胞は自己再生細胞分裂を受けて、無期限の間、表現型
および遺伝子型において同一である娘細胞を生じさせることができ、最終的に、
少なくとも１つの確定的な細胞型に分化することができる。患者自身の幹細胞か
ら組織または臓器を発生させることによって、あるいはレシピエントの免疫系が
異物として認識しないように異種細胞を遺伝子組換えすることによって、付随す
る感染または組織拒絶の危険無しに、異種移植に関連した利点を提供するように
移植組織を作成することができる。
【０２５９】
また、幹細胞は、遺伝子治療の結果を改善する可能性をもたらす。患者自身の
幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子組換えし、ｉｎ  ｖｉｖｏで再導入して、所
望の遺伝子産物を産生させることができる。それら遺伝子操作幹細胞は、体の特
定部位での移植のためまたは全身的適用のために多数の細胞型を形成するように
分化誘導される能力を有するであろう。あるいは、レシピエントの主要組織適合
遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原を発現するように、またはＭＨＣを全く発現しない
ように、異種幹細胞を遺伝子操作して、付随の拒絶の危険無しに、レシピエント
にドナーからのそれら細胞の移植を可能とすることができる。
【０２６０】
幹細胞は、多数回に及ぶ、人によっては無限回とも云われる分裂能を有し、異
なる細胞系に分化し、移植時には組織を再生させる細胞として定義される。幹細
胞の典型は、無制限の自己再生能及び多能的分化能を有する胚性幹細胞である。
この細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得るか、あるいは移植後胚由来の始原生殖細
胞（胚性生殖細胞すなわちＥＧ細胞）より得ることが可能である。これまでＥＳ
及びＥＧ細胞はマウスから得られていたが、最近ではヒト以外の霊長類及びヒト
からも得られている。ＥＳ細胞はマウスの胚盤胞または他の動物の胚盤胞に導入
される場合、マウス（動物）のすべての組織に分化することが可能である。ＥＳ
及びＥＧ細胞は出生後の動物に移植すると奇形腫を形成するが、このこともやは
りその多能性を示すものである。ＥＳ（及びＥＧ）細胞はＳＳＥＡ１及びＳＳＥ
Ａ４抗体による陽性染色法によって特定が可能である。
【０２６１】
分子レベルでは、ＥＳ及びＥＧ細胞はこれらの未分化細胞に極めて特異的な多
くの転写因子を発現する。その例としてｏｃｔ−４やＲｅｘ−１がある。その他
にＬＩＦ−Ｒやｓｏｘ−２及びＲｏｘ−１転写因子も見られるが、後者の２つは
ＥＳ細胞以外の細胞においても発現される。ｏｃｔ−４は原腸形成前の胚、分裂
初期段階の胚、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、及び胚性腫瘍（ＥＣ）細胞において
発現される転写因子である。ｏｃｔ−４はｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞の分化を誘導
するとダウンレギュレートされ、成体の動物ではｏｃｔ−４は生殖細胞にのみ見
られる。幾つかの研究によって、ｏｃｔ−４はＥＳ細胞の未分化の表現型の維持
に必要とされ、胚形成及び分化の初期段階を決定するうえで重要な役割を担って
いることが示されている。ｏｃｔ−４はＲｏｘ−１とともにジンクフィンガータ
ンパク質であるＲｅｘ−１の転写を活性化し、ＥＳ細胞を未分化の状態に維持す
るうえでも必要とされる。同様にｓｏｘ−２はｏｃｔ−４とともにＥＳ／ＥＣ細
胞の未分化状態を維持し、マウスＥＳ細胞（ヒトでは異なる）を維持するうえで
必要とされる。ヒト及びマウス始原生殖細胞ではＬＩＦの存在が必要である。Ｅ
Ｓ細胞の別の特徴はテロメラーゼの存在であり、このためこれらの細胞はｉｎ  
ｖｉｔｒｏでの無制限の自己再生能を有するものである。
【０２６２】
幹細胞は多くの臓器組織において特定されている。最もよく調べられているも
のは造血幹細胞である。この細胞は細胞表面のマーカー及び機能的特徴に基づい
て単離された中胚葉由来の細胞である。造血細胞は骨髄、血液、臍帯血、胎児肝
臓、及び卵黄嚢より単離され、レシピエントの生涯にわたる造血作用を与え、複
数の造血細胞系を形成する（参照、Fei, R., et al., 米国特許第５，６３５，
３８７号; McGlave, et al., 米国特許第５，４６０，９６４号;Simmons, P., 
et al., 米国特許第５，６７７，１３６号; Tsukamoto, et al.,米国特許第５
，７５０，３９７号; Schwartz, et al., 米国特許第５，７５９，７９３号;Di
Guisto, et al., 米国特許第５，６８１，５９９号; Tsukamoto,et al., 米国
特許第５，７１６，８２７号; Hill, B., et al., Exp.Hematol. (1996) 24 (8
): 936-943）。造血幹細胞は致死レベルの放射線を照射した動物やヒトに移植す
ると赤血球、好中性マクロファージ、骨髄巨核球、及びリンパ様造血細胞プール
を再生させる。造血細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、少なくともある程度の自己再
生細胞分裂を行わせること、及びｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものと同じ細胞系へ
と分化させることが可能である。すなわちこの細胞は幹細胞としての基準を満た
すものである。しかしながらこの幹細胞は造血系の細胞のみに分化するため、例
えば大量の化学療法剤の投与によって損傷した心臓や肺などの他の損傷組織を修
復するための細胞の供給源とはなり得ない。
【０２６３】
よく調べられている幹細胞の第２のものは、神経幹細胞である（Gage FH: Sci
ence 287: Science 287: 1433-1438, 2000;Svendsen CN et al., Brain Path 9
: 499-513, 1999; Okabe S et al., Mech Dev59: 89-102, 1996）。神経幹細胞
は胎児脳の脳室下領域及び嗅球から最初に確認された。最近に至るまで成体の脳
には幹細胞の能力を有する細胞は既に含まれていないものと考えられていたが、
齧歯類及びより最近ではヒト以外の霊長類及びヒトにおける幾つかの研究によっ
て幹細胞が成体脳にも引き続き存在していることが示された。これらの幹細胞は
ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が可能であり、またｉｎ  ｖｉｖｏにて少なくとも一部の神
経細胞を継続的に再生することが可能である。神経幹細胞はｅｘ  ｖｉｖｏでの
培養において増殖させ、異なる種類の神経細胞及びグリア細胞に分化させること
が可能である。神経幹細胞は脳に移植すると神経細胞及びグリア細胞を生着、形
成することが可能である。したがってこの細胞もまた幹細胞の基準を満たすもの
である。
【０２６４】
間葉性幹細胞（ＭＳＣ）は胚の中胚葉より最初に誘導され、成人の骨髄より単
離されたものであるが、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄間質、及び腱へと分化する
ことが可能である。胚形成において中胚葉は、肢芽中胚葉、骨を形成する組織、
軟骨、脂肪、骨格筋、及び可能性として内皮へと発生する。中胚葉はまた、内臓
中胚葉へと分化し、内臓中胚葉は心筋、平滑筋、あるいは内皮と造血前駆細胞と
からなる血島を生ずる。したがって原始中胚葉性すなわち間葉性幹細胞は多くの
異なる細胞及び組織の発生源となり得るものである。間葉性幹細胞は幹細胞とし
て挙げられる第３の組織特異的細胞であり、フリデンシュタイン（Ｆｒｉｄｅｎ
ｓｈｔｅｉｎ）によって最初に述べられた（Fridenshtein, Arkh.Patol., 44: 
3-11, 1982）。これまでに多くの間葉性幹細胞が単離されている（参照、Caplan
, A., et al., 米国特許第５，４８６，３５９号; Young, H.,et al., 米国特
許第５，８２７，７３５号; Caplan, A., et al., 米国特許第５，８１１，０９
４号; Bruder, S., et al., 米国特許第５，７３６，３９６号;Caplan, A., et
al., 米国特許第５，８３７，５３９号; Masinovsky, B.,米国特許第５，８７
３，６７０号; Pittenger, M., 米国特許第５，８２７，７４０号;Jaiswal. N.
, et al., J. Cell Biochem. (1997) 64(2): 295-312; Cassiede P., et al., 
J. Bone Miner. Res. (1996) 11 (9): 1264-1273; Johnstone, B., et al., (19
98) 238 (1): 265-272; Yoo, et al., J.Bone Joint Surg. Am. (1998) 80 (12
): 1745-1757; Gronthos, S., Blood(1994) 84 (12): 4164-4173; Makino, S.,
et al., J. Clin. Invest.(1999) 103 (5): 696-705）。これまでに記述され
ている多くの間葉性幹細胞のすべては限られた分化能を示し、一般に間葉由来の
ものと考えられる分化細胞のみに分化する。これまでに報告されている最も多能
性の高い間葉性幹細胞はピッテンジャー（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ）等によって単離
された細胞であり、この細胞の表現型はＳＨ２＋ＳＨ４＋ＣＤ２９＋ＣＤ４４＋
ＣＤ７１＋ＣＤ９０＋ＣＤ１０６＋ＣＤ１２０ａ＋ＣＤ１２４＋ＣＤ１４−ＣＤ
３４−ＣＤ４５−である。この細胞は間葉由来の多くの種類の細胞に分化するこ
とが可能であるが、当該細胞を単離した研究チームが増殖培養中に造血細胞を一
切確認しなかったと述べているように、その分化能は間葉系の細胞に限定された
ものであることは明らかである（Pittenger, et al., Science(1999) 284: 143
-147）。
【０２６５】
これまでに消化器幹細胞、表皮幹細胞、卵形細胞とも呼ばれる肝幹細胞などの
他の幹細胞が特定されている（Potten C, Philos Trans R Soc LondB Biol Sci
353: 821-30, 1998; Watt F, Philos.Trans R Soc Lond B Biol Sci 353: 831
, 1997; Alison M et al, Hepatol 29: 678-831998）。これらの細胞の多くの
ものについてはあまりよく調べられていない。
【０２６６】
ＥＳ細胞と比較すると組織特異的幹細胞の自己再生能は低く、また複数の細胞
系へと分化するが多能性は有さない。組織特異的細胞がＥＳ細胞に関して上記に
述べたようなマーカーを発現するか否かについては明らかにされていない。更に
、組織特異的幹細胞におけるテロメラーゼの活性度に関しても完全には研究し尽
くされていないが、これはこれらの細胞の高密度の集団を多数得ることが困難で
あることに一部起因するものである。
【０２６７】
最近まで、組織特異的幹細胞は同一組織の細胞にのみしか分化し得ないものと
考えられていたが、多くの最近の論文によって成人の組織特異的幹細胞が異なる
組織の細胞に分化し得る可能性が示唆されている。また多くの研究によって骨髄
移植時に移植された細胞が骨格筋に分化し得ることが示されている（Ferrari Sc
ience 279: 528-30, 1998; Gussoni Nature401: 390-4, 1999）。これは骨髄に
存在する間葉細胞の潜在的分化能の範囲内であると考えられる。ジャクソン（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ）はその論文において、筋衛星細胞が造血細胞に分化し得ることに
ついて述べているが、これもやはり臓側中胚葉内での表現型の変換の一例である
（Jackson PNAS USA 96: 14482-6, 1999）。胚の１つの層（例  臓側中胚葉）に
由来する幹細胞が、胚形成において胚の異なる層から誘導されると考えられる組
織に分化し得ることを示した研究もある。例えば、骨髄移植を行ったヒトや動物
において検出される内皮細胞またはその前駆細胞は少なくともその一部が骨髄ド
ナーに由来している（Takahashi, Nat Med 5: 434-8,1999; Lin, Clin Invest 
105: 71-7, 2000）。すなわち、ＭＳＣなどの臓側中胚葉由来ではない、内臓中
胚葉由来の細胞は移植骨髄とともに導入されたものである。更に驚くべき報告と
して、齧歯類及びヒトにおいて肝上皮細胞及び胆管上皮細胞がドナー骨髄から誘
導されることを示した報告がある（Petersen, Science 284:1168-1170, 1999; 
Theise, Hepatology 31: 235-40, 2000;Theise, Hepatology 32: 11-6, 2000）
。同様に３つの研究グループによって、神経幹細胞が造血細胞に分化し得ること
が示されている。最後になるが、クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）等によって、胚盤胞
に注入された神経幹細胞がキメラマウスのすべての組織に分化し得ることが報告
されている（Clarke, Science 288: 1660-3, 2000）。
【０２６８】
ここで、これらの研究の多くは単一の細胞が異なる臓器の組織に分化し得るこ
とを結論的に証明したものではない点を指摘しておく必要がある。実際、殆どの
研究者が始原細胞の表現型を特定していない。例外としてワイスマンとグロンペ
（Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｒｏｍｐｅ）による研究がある。この研究は肝
臓に生着した細胞が、造血幹細胞が高度に濃縮されたＬｉｎ−Ｔｈｙ１ＬｏｗＳ
ｃａ１＋骨髄細胞中に存在することを示したものである。同様にミュリガン（Ｍ
ｕｌｌｉｇａｎ）の研究グループによって、造血幹細胞が高度に濃縮された骨髄
ＳＰ細胞が筋肉及び内皮に分化し得ることが示され、またジャクソン（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ）等によって造血系の再構成は筋Ｓｐ細胞によるものであることが示され
ている（Gussoni et al., Nature 401: 390-4, 1999）。
【０２６９】
異種の胚性幹細胞から発生した組織や臓器を移植するには、細胞を更に遺伝子
改変して特定の細胞表面マーカーの発現を阻害するか、あるいは移植拒絶反応を
防ぐために化学療法的免疫抑制剤を継続使用する必要がある。したがって、胚性
幹細胞の研究によって移植用臓器の限られた供給量の問題に有望な代替策が与え
られるものの、移植された異種細胞及び組織を定着させるための免疫抑制を必要
とすることにより問題や危険をともなう。人口の大半をカバーする治療を行える
だけの免疫適合性細胞を得るためには推定で２０種類の免疫学的に異なる胚性幹
細胞の細胞系を樹立する必要がある（Wadman, M., Nature(1999) 398: 551）。
【０２７０】
胚由来ではなく、成体由来の細胞を自己由来または異種遺伝子型幹細胞の供給
源として使用することにより、移植胚性幹細胞の使用にともなう組織不適合性の
問題が解決されるばかりでなく、胚性幹細胞の研究にともなう倫理的ジレンマの
解決も図られる。これまでのところ、組織移植としての自己由来幹細胞の使用に
ともなう最大の難点は細胞の限定された分化能にある。完全に発育を遂げた生物
、特にヒトから多くの幹細胞がこれまでに単離されている。しかしながらこれら
の細胞は多能性を有するとの報告もあるものの、異なる種類の細胞への分化能は
限定されたものであった。
【０２７１】
すなわち、多分化能を有する幹細胞は本発明者及び他の研究者によってこれま
でに単離されているものの、繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格
筋、内皮、間質、平滑筋、心筋、及び造血細胞などの異なる細胞系の広範な種類
の細胞への分化能を有する前駆細胞はこれまで述べられていなかった。細胞及び
組織移植、遺伝子治療によって将来的に治療法が進歩を遂げるには、分化能が最
も高い幹細胞または前駆細胞が必要である。したがって成体における胚性幹細胞
と同等な細胞が必要とされている。
【０２７２】
発明の概要
本発明は、表面抗原ＣＤ４４、ＣＤ４５、ならびにＨＬＡクラスＩおよびII陰
性である単離多能性哺乳動物幹細胞を提供する。また、細胞は、表面抗原ＣＤ３
４、Ｍｕｃ１８、Ｓｔｒｏ−１、ＨＬＡクラスＩ陰性であり、かつｏｃｔ３／４
ｍＲＮＡ陽性あって差し支えなく、さらにｈＴＲＴ ｍＲＮＡ陽性であって差し
支えない。特に、本発明の細胞は、表面抗原ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、Ｃ
Ｄ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２ＥおよびＣＤ６２Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍ
ｕｃ１８、Ｓｔｒｏ−１、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｃ、ＣＤ４４、ＨＬＡクラス
Ｉ、ならびに２−ミクログロブリン陰性であり、かつＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ
４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１、ＥＤＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１および
ＴＧＦ−Ｒ２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａおよびＰＤＧＦ−Ｒ１ｂ陽性
であって差し支えない。本発明は、転写因子ｏｃｔ３／４、ＲＥＸ−１、および
ＲＯＸ−１を発現する、単離された、多能性で非胚性である、非生殖細胞系の細
胞を提供する。また、成長因子ＬＩＦに反応しかつＬＩＦに対する受容体を有す
る出生後の哺乳動物由来の単離多能性細胞を提供する。
【０２７３】
上記に述べた本発明の細胞は、中胚葉、外胚葉、及び内胚葉由来の少なくとも
１種類の分化細胞に分化誘導することが可能である。例えば、本発明の細胞は、
骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑
筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、造血細胞、グリア細胞、神経性細胞、
及び乏突起膠細胞の細胞タイプの細胞に少なくとも分化誘導することが可能であ
る。当該細胞としてはヒト細胞またはマウス細胞を使用することが可能である。
当該細胞は胎児、新生児、子供、または成人から得ることが可能である。当該細
胞は、骨髄、肝臓や脳などの臓器から得ることが可能である。
【０２７４】
本発明は更に、上記の多能性成体幹細胞から得られる分化細胞を提供するもの
であり、その場合の子孫細胞は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨
髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、内分泌
細胞、外分泌細胞、造血細胞、グリア細胞、神経性細胞、または乏突起膠細胞で
あり得る。分化した子孫細胞は、皮膚上皮細胞、肝上皮細胞、膵臓上皮細胞、膵
臓内分泌細胞または小島細胞、膵臓外分泌細胞、消化管上皮細胞、腎臓上皮細胞
、または表皮関連構造（毛嚢など）であり得る。分化した子孫細胞は歯の周囲の
軟部組織または歯を形成する場合もある。
【０２７５】
本発明は上記に述べたような単離形質転換多能性哺乳動物幹細胞を提供するも
のであり、その場合、当該細胞のゲノムを予め選択された単離ＤＮＡの挿入、予
め選択された単離ＤＮＡによる細胞ゲノムのセグメントの置換、または細胞ゲノ
ムの少なくとも一部の欠失あるいは不活化によって改変しておくことが可能であ
る。この改変は、ウイルスベクターの組み込みによるＤＮＡの挿入や、ＤＮＡウ
イルス、ＲＮＡウイルスやレトロウイルスベクターを使用したウイルスによる形
質導入によって行うことが可能である。また、細胞ゲノムの不活化したい部分の
配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸分子を使用して当該単離形質転換
細胞の細胞ゲノムの一部を不活化することも可能である。更に、不活化したい細
胞ゲノムの部分の配列を標的としたリボザイム配列を用いて細胞ゲノムの一部を
不活化することも可能である。改変ゲノムは、改変ゲノムを有する子孫細胞また
はその子孫と、改変していないゲノムを有する子孫細胞との区別を可能とするよ
うに発現される、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子の遺伝子
配列を有していてもよい。例えば、マーカーとしては、緑色、赤色、黄色の蛍光
タンパク質、β−ｇａｌ、Ｎｅｏ、ＤＨＦＲｍ、またはヒグロマイシンを使用す
ることが可能である。本発明の細胞は、タンパク質、酵素または他の細胞産物の
発現を調節する誘導可能なプロモーターや他の制御機構によって調節することが
可能な遺伝子を発現することが可能である。
【０２７６】
本発明は、テロメラーゼを高レベルで発現し、同じドナーから得られたリンパ
球のテロメアと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養での増殖後に長いテロメアを維
持することが可能な細胞を提供するものである。テロメアはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培
養での増殖後に約１１〜１６ＫＢの長さを有していてもよい。
【０２７７】
本発明は、ｏｃｔ３／４の発現レベルを調整する因子を含む、未分化の多能性
幹細胞の継続的増殖または分化を促進するための細胞分化溶液を提供するもので
ある。
【０２７８】
本発明は、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を単離するための方法を提供するも
のである。この方法では、骨髄単核細胞からＣＤ４５＋グリコフォリンＡ＋細胞
を枯渇させ、ＣＤ４５−グリコフォリンＡ−細胞を回収し、回収したＣＤ４５−
グリコフォリンＡ−細胞をマトリクスコーティング上に播種し、播種した細胞を
生長因子を補った培地中で培養する。枯渇工程では、モノクローナルまたはポリ
クローナル抗体を使用したネガティブ選択を行ってもよい。成長因子はＰＤＧＦ
−ＢＢ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、及びＬＩＦから選択することが可能である。最後の工
程では更に、デキサメタゾン、リノレイン酸、及び／またはアスコルビン酸を補
った培地中で培養することも可能である。
【０２７９】
本発明は、単離多能性成体幹細胞の培養方法であって、インスリン、セレニウ
ム、ウシ血清アルブミン、リノレイン酸、デキサメタゾン、及び血小板由来成長
因子を含有した無血清または低血清培地に細胞を加える工程を含む方法を提供す
るものである。無血清または低血清培地としては、ＭＣＤＢと混合した低グルコ
ースＤＭＥＭを使用することが可能である。インスリンは約１０〜約５０μｇ／
ｍｌの濃度で存在すればよい。無血清または低血清培地は、０よりも高く約１０
μｇ／ｍｌよりも低い濃度の有効量のトランスフェリンを含有することが可能で
あり、セレニウムは約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で存在すればよく、ウシ血
清アルブミンは約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で存在すればよく、リノレイン
酸は約２〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在すればよく、デキサメタゾンは約０．
００５〜約０．１５μＭの濃度で存在すればよい。無血清培地または低血清培地
は約０．０５〜０．２ｍＭのＬ−アスコルビン酸を含有することが可能である。
無血清培地または低血清培地は約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子、
約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌのインスリン
様成長因子、１０〜１０，０００ＩＵの白血病抑制因子を含有することが可能で
ある。本発明は更に、上記の方法に基づいて単離された哺乳動物の多能性成体幹
細胞の培養クローン集団を提供するものである。
【０２８０】
本発明は、ＭＡＳＣ由来細胞及び分化した子孫を永久的及び／または条件的に
不死化するための方法であって、ＭＡＳＣまたは分化した子孫にテロメラーゼを
導入する工程を含む方法を提供するものである。
【０２８１】
本発明は、完全に同種異系の多能性幹細胞、誘導した造血幹細胞、または子孫
細胞を哺乳動物に投与して、後の多能性幹細胞由来の組織移植や他の臓器移植の
ために哺乳動物に免疫寛容を誘導することにより哺乳動物の造血及び免疫系を再
構成するための方法を提供するものである。
【０２８２】
本発明は、適当な成長因子を投与し、細胞を増殖させることによって、未分化
の多能性幹細胞を分化した毛嚢へと増殖させる方法を提供するものである。
【０２８３】
本発明は上記に述べた細胞の多くの用途を提供するものである。例えば、本発
明は、単離細胞を使用するための方法であって、該細胞の集団を子宮内移植して
細胞または組織をキメラ化することにより、移植後に出生前または出生後のヒト
または動物の体内でヒト細胞を産生し、該細胞が治療効果を有する酵素、タンパ
ク質や他の産物をヒトまたは動物体内で産生して遺伝子異常を修正する方法を提
供するものである。本発明は更に、治療処置を必要とする患者の遺伝子治療にお
いて上記の細胞を使用するための方法であって、所望の遺伝子産物をコードする
予め選択した単離ＤＮＡを前記細胞に導入することによって細胞を遺伝子改変し
、培養中で該細胞を増殖させ、該細胞を前記患者の体内に導入して所望の遺伝子
産物を産生させる方法を提供するものである。
【０２８４】
本発明は、培養中で上記の単離多能性成体幹細胞を増殖させ、増殖させた該細
胞の有効量を損傷組織を修復する必要のある患者の損傷組織と接触させることに
よって、患者の組織を修復する方法を提供するものである。当該細胞は患者の体
内に局所的注入または全身的注入により導入することが可能である。当該細胞は
適当なマトリクスインプラントとともに患者の体内に導入することが可能である
。こうしたマトリクスインプラントは、更なる遺伝子物質、サイトカイン、成長
因子や当該細胞の増殖及び分化を促進する他の因子を与えるようなものであって
もよい。当該細胞は患者の体内への導入に先立ってポリマーカプセルなどにカプ
セル化することが可能である。
【０２８５】
本発明は、ヒト患者において感染因子に対する免疫応答を誘導するための方法
であって、多能性成体幹細胞を増殖させたクローン集団を培養中で遺伝子改変す
ることによって感染因子に対する防御免疫応答反応を引き起こす１以上の予め選
択した抗原分子を発現させる工程と、患者の体内に免疫応答を誘導するうえで有
効量の遺伝子改変細胞を導入する工程とを含む方法を提供するものである。この
方法は、多能性成体幹細胞を樹状細胞に分化させる工程を第２工程の前に更に含
んでいてもよい。
【０２８６】
本発明は、生理学的異常に関連した遺伝子多型を特定するためにＭＡＳＣを使
用するための方法であって、表現型データを得ることが可能な個人の統計的に有
意な集団からＭＡＳＣを単離する工程と、前記統計的に有意な個人の集団から得
たＭＡＳＣを培養増殖してＭＡＳＣ培養を樹立する工程と、前記培養ＭＡＳＣに
おいて少なくとも１つの遺伝子多型を特定する工程と、前記培養ＭＡＳＣを分化
誘導する工程と、正常な遺伝子型を有するＭＡＳＣが示す分化のパターンと特定
された遺伝子多型を有するＭＡＳＣが示す分化のパターンとを比較することによ
り前記少なくとも１つの遺伝子多型に関連した異常代謝プロセスを特徴付けする
工程とを含む方法を提供するものである。
【０２８７】
本発明は更に、哺乳動物における癌を治療するための方法であって、多能性成
体幹細胞を遺伝子改変して腫瘍障害性タンパク質、抗血管新生タンパク質、また
は腫瘍細胞表面で発現されるタンパク質を、抗原に対する免疫応答刺激に関連し
たタンパク質とともに発現させる工程と、前記哺乳動物に前記遺伝子改変多能性
成体幹細胞の有効抗癌量を導入する工程とを含む方法を提供するものである。
【０２８８】
本発明は、生物学的または生理学的因子に対する細胞応答を特徴付けるために
ＭＡＳＣを使用する方法であって、統計的に有意な個人の集団からＭＡＳＣを単
離する工程と、前記統計的に有意な個人集団から得られたＭＡＳＣを培養増殖し
て複数のＭＡＳＣ培養を樹立する工程と、前記ＭＡＳＣ培養を１以上の生物学的
または生理学的因子と接触させる工程と、前記１以上の生物学的または生理学的
因子に対する１以上の細胞応答を特定する工程と、前記統計的に有意な集団の個
人から得られた複数のＭＡＳＣ培養の前記１以上の細胞応答を比較する工程とを
含む方法を提供するものである。
【０２８９】
本発明は更に、特異的に分化した細胞を治療に使用するための方法であって、
特異的に分化した細胞をこれを必要とする患者に投与することからなる方法を提
供するものである。本発明は更に、遺伝子操作した多能性幹細胞を内在性遺伝子
または導入遺伝子を選択的に発現させるために利用する利用方法、ならびに、病
気を治療するためにｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させたＭＡＳＣを動物への移植／投与
に利用する利用方法を提供するものである。例えば、多能性幹細胞すなわちＭＡ
ＳＣから誘導した神経網膜細胞を利用して、特に黄斑変性、糖尿病性網膜疾患、
緑内障、色素性網膜炎などによって生ずる神経網膜疾患などによる失明を治療す
ることが可能である。本発明の細胞は哺乳動物の体内に細胞を定着させるために
利用することが可能であり、自家、同種異系、異種の細胞を投与して該哺乳動物
の組織特異的な代謝的、酵素的、凝固的、構造的機能などを回復または改変する
ことが可能である。本発明の細胞は哺乳動物の体内に細胞を定着させるために利
用することが可能であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞分化を誘導することが可能であ
る。本発明の細胞は哺乳動物の体内に分化した幹細胞を投与するために利用する
ことも可能である。本発明の細胞やそのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ
での子孫を利用して遺伝子疾患、変性性疾患、心臓血管疾患、代謝蓄積症、神経
疾患または癌などの病態を治療することが可能である。本発明の細胞を用いて歯
周病を治療するための歯肉様材料を作成することが可能である。本発明の細胞を
用いて皮膚移植や形成手術に利用可能な多能性幹細胞由来の皮膚上皮組織を発生
させることが可能である。本発明の細胞を用いて陰茎や心臓などの筋肉を増強す
ることが可能である。本発明の細胞を用いて治療用途の血液をｅｘ  ｖｉｖｏで
作成したり、出生前または出生後の動物の体内でヒトに用いるためのヒト造血細
胞及び／または血液を作成することが可能である。本発明の細胞は癌治療や自己
免疫疾患の治療において化学療法や放射線療法からの患者の回復を助けたり、レ
シピエントに免疫寛容を誘導するための治療手段として使用することが可能であ
る。本発明の細胞を利用してＡＩＤＳや他の感染症を治療することが可能である
。
【０２９０】
本発明の心筋細胞またはＭＡＳＣを利用して、特に心筋炎、心筋症、心不全、
心臓発作による障害、高血圧、アテローム性動脈硬化、心臓弁機能障害などの心
臓疾患を治療することが可能である。遺伝子操作を施した多能性哺乳動物由来幹
細胞または分化したその子孫を利用して中枢神経系の欠損または損傷にともなう
疾患を治療することが可能である。更に、多能性哺乳動物由来幹細胞または神経
関連細胞に分化した該細胞を利用して、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソ
ン病、ハンチントン病、ＡＩＤＳにともなう痴呆、脊椎損傷、脳や他の神経系に
影響する代謝性疾患などの神経の欠損や変性にともなう疾患を治療することが可
能である。
【０２９１】
多能性哺乳動物由来幹細胞または間質細胞などに分化したその子孫を利用して
、造血細胞、膵臓小島またはβ細胞、肝細胞などの他の細胞の分化や増殖をｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて支援することが可能である。本発明の幹
細胞または軟骨に分化したその子孫を利用して軟骨断裂、軟骨菲薄化、変形性関
節炎などの間接や軟骨の疾患を治療することが可能である。更に、本発明の幹細
胞または骨芽細胞に分化したその子孫を利用して、骨折、非治癒性骨折、変形性
関節炎や、前立腺癌、乳癌、多発性骨髄腫などの骨に転移した腫瘍によって生ず
る骨の「孔」などの、骨に悪影響を与える病態を改善することが可能である。
【０２９２】
本発明は更にヒト患者において防御的免疫応答を誘導するための免疫感作を与
えるキットを提供するものである。このキットには、骨髄吸引液から多能性成体
幹細胞を単離するための培地及び抗体、単離多能性成体幹細胞を培養するための
培地及び細胞因子、及び抗原分子を産生するように多能性成体幹細胞を遺伝子改
変するための遺伝子要素が別梱されて含まれている。当該キットには更に、多能
性成体幹細胞を組織特異的な細胞に分化させるうえで有効な培地及び細胞因子が
含まれる場合もある。遺伝子要素としてはウイルスベクターを使用することが可
能であり、このウイルスベクターは細菌またはウイルス由来の１以上の抗原をコ
ードしたヌクレオチド配列を有していてもよい。この遺伝子要素としては、細菌
、ウイルス、または寄生虫の抗原をコードしたヌクレオチド配列を有するプラス
ミドを使用することも可能である。このプラスミドにはリン酸カルシウムトラン
スフェクション用の要素が同梱される場合もある。遺伝子要素としては、癌細胞
に共通する抗原をコードしたヌクレオチド配列を有するベクターを使用すること
が可能である。更に遺伝子要素として寄生生物の抗原をコードしたヌクレオチド
配列を有するベクターを使用することも可能である。
【０２９３】
本発明は更に上記に述べたような多能性幹細胞の遺伝子プロファイリングのた
めの方法、ならびにデータバンクにおけるこの遺伝子プロファイリングの使用方
法を提供するものである。本発明は更に薬の探索を助けるためにデータベースに
おいて上記に述べたような遺伝子プロファイルされた多能性幹細胞を使用する使
用方法を提供するものである。
【０２９４】
図面の簡単な説明
図１ａおよび１ｂは、本発明の未分化ＭＡＳＣｓの写真である。ＣＤ４５の発
現及びグリコフォリンＡの発現を欠いた細胞を免疫磁気ビーズ枯渇法及びＦＡＣ
Ｓによって選別した。選別後に回収された細胞は小型の芽細胞であった（図１ａ
）。フィブロネクチンコーティングした９６穴プレートのウェル中、ＤＭＥＭ、
１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ
−ＢＢ、トランスフェリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、デキサメタゾン
、リノレイン酸、インスリン、及びアスコルビン酸からなる合成培地に５０００
個の細胞を播いた。７〜２１日後に接着細胞の小さなコロニーが形成された（図
１ｂ）。
【０２９５】
図２は、培養におけるＭＡＳＣｓの増殖速度を示すグラフである。フィブロネ
クチンコーティングした９６穴プレートのウェル中、ＤＭＥＭ、１０ｎｇ／ｍｌ
のＩＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ、トラン
スフェリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、デキサメタゾン、リノレイン酸
、インスリン、及びアスコルビン酸からなる合成培地に２％ＦＣＳを加えたもの
と加えないものとにＣＤ４５−／ＧｌｙＡ−細胞を播いた。細胞がほぼコンフル
エンスに達した時点で細胞をトリプシン処理して回収し、同じ培養条件下で１：
４の希釈率で毎週２回継代培養した。
【０２９６】
図３は、２３および３５回の細胞分裂の間、２ｘ１０３細胞／ｃｍ２の再播種
密度で培養した、年齢３５歳のドナーからのＭＡＳＣｓのテロメア長を示す。テ
ロメア長は常法により求めた。テロメア長は９ｋＢであった。これは同じドナー
から得た血中リンパ球のテロメア長よりも３ｋＢ長かった。それぞれ１０回及び
２５回の細胞分裂後にテロメア長を評価し、更に３５回の細胞分裂後にテロメア
長を評価したところ変化は見られなかった。コントロールとしてＨＬ６０細胞（
短いテロメア）及び２９３細胞（長いテロメア）を測定した。
【０２９７】
図４は、本発明のＭＡＳＣｓのために発明者が用いた培養、形質導入、分化、
および分化の確認のための一般的プロトコルを示す。図に示すように培養後にｅ
ＧＦＰを有するレトロウイルスベクターによる形質導入を行った。ほぼコンフル
エンスに達したＭＡＳＣを、１０μｇ／ｍＬのプロタミンの存在下、ＭＡＳＣ培
地（ＤＭＥＭ、２％ＦＣＳ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、トランスフェリン、セレ
ニウム、ウシ血清アルブミン、デキサメタゾン、リノレイン酸、インスリン、及
びアスコルビン酸）中で調製したＭＦＧ−ｅＧＦＰを含むＰＡ３１７上清に連続
２日間、６時間づつ曝露した。最後の形質導入の２４時間後に細胞をトリプシン
処理してＦＡＣＳによる選択を行った。３０〜７０％のＭＡＳＣがｅＧＦＰ陽性
であった。ＦＡＣＳ上でＡＣＤＵ装置を用い、ＦＮコーティングして同じ培地を
入れた９６穴プレートのウェル１個当たり１〜１００個のｅＧＦＰ陽性細胞を選
別した。これらのウェルの内、ウェル当たり１０個の細胞が入ったプレート１枚
につき約２個のウェルにおいてＭＡＳＣの子孫が生じた。ここからクローンを培
養増殖させた。増殖させた細胞の８〜１０個の継代集団が異なる分化経路に沿っ
て分化誘導された。図に示す方法によって分化を確認した。
【０２９８】
図５は、本発明のＭＡＳＣｓを分化誘導して、骨芽細胞、軟骨芽細胞(chondro
blasts)、および示されたような脂肪細胞を形成するために本発明者が用いた分
化プロトコルを示す。図中、最終分化を誘導するうえで必要なサイトカインと最
終分化の誘導を証明するための適当な試験が示してある。
【０２９９】
図６は、１０−７Ｍデキサメタゾン、β―グリセロホスフェート、および１０
ｍＭのアスコルビン酸で誘導した後、培養１５日目の骨シャロタンパク質の免疫
組織染色、ならびに７、１１、および１４日目の骨シャロタンパク質のウェスタ
ンブロット分析を示す。中央のパネルは、軟骨についてトルイジンブルー染色を
行った結果と、７、１１及び１４日目にＩＩ型コラーゲンについてウェスタンブ
ロット分析を行った結果であり、１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１を加えた無血
清培地中でＭＡＳＣをマイクロマス培養した後に軟骨細胞に分化したことを示す
ものである。一番下のパネルでは、１４日目のオイルレッド染色及びＰＰＡＲｇ
についてのウェスタンブロット分析の結果によって１０％ウマ血清によるＭＡＳ
Ｃの処理後の分化が示されている。
【０３００】
図７は、筋肉タンパク質のウェスタンブロットを示す。パネルＡはコンフルエ
ンスに達したＭＡＳＣを３μＭの５−アザシチジンと２４時間培養した結果を示
したものである。この後、培養をＭＡＳＣ増殖培地（ＤＭＥＭ、２％ＦＣＳ、Ｅ
ＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、トランスフェリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、
デキサメタゾン、リノレイン酸、インスリン、及びアスコルビン酸）中に維持し
た。分化はウェスタンブロットによって評価した。５−アザシチジンによる誘導
の５日後に、細胞の約５０％においてＭｙｆ５、Ｍｙｏ−Ｄ及びＭｙｆ６転写因
子が検出された。１４〜１８日後には、Ｍｙｏ−Ｄの発現レベルは大幅に低下し
たが、Ｍｙｆ５及びＭｙｆ６は高値に保たれた。誘導後４日目にはデスミン及び
骨格筋アクチンが検出され、骨格筋ミオシンが１４日目に検出された。免疫組織
化学法により、１４日後に７０〜８０％の細胞が成熟筋タンパク質を発現してい
ることが示された（図示せず）。５−アザシチジンまたはレチノイン酸による処
理により、培養の第１週目においてＧａｔａ４及びＧａｔａ６が発現された。更
に、２日目以降に低レベルのトロポニンＴが検出され、このことは、心筋トロポ
ニンＴが胚性骨格筋中に見出されることから、胎児筋肉が生成されたことを示し
ている。誘導２日後に平滑筋アクチンが検出され、１４日後まで高値に維持され
た。パネルＢでは無血清培地中に１４日間維持し、コンフルエンスに達したＭＡ
ＳＣに唯一のサイトカインとして１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを添加した。平滑
筋マーカーの存在をウエスタンブロットにより評価した。２日目以降には平滑筋
アクチンが、６日目以降には平滑筋ミオシンが検出された。１５日目には免疫組
織化学法によって細胞の約７０％が抗平滑筋アクチン／ミオシン抗体により陽性
染色された。４日目以降にはミオゲニンの、６日目以降にはデスミンの存在が確
認された。２〜４日後にはＭｙｆ５及びＭｙｆ６タンパク質が検出され、１５日
目まで高値を維持した。Ｍｙｏ−Ｄは検出されなかった。
【０３０１】
パネルＣでは、コンフルエンスに達したＭＡＳＣをレチノイン酸に曝露した後
、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えた無血清培地中で培養した。この後細胞を
ウェスタンブロットで分析した。２日後にはＧａｔａ４及びＧａｔａ６が発現さ
れ、１５日目まで高値を維持した。４日目以降には心筋トロポニンＴが発現され
、６日目以降には心筋トロポニンＩが発現され、１１日後にＡＮＰが検出された
（図示せず）。１５日目には免疫組織化学法によってこれらの心筋タンパク質は
７０％を越える細胞において検出された（図示せず）。２日目以降には転写因子
Ｍｙｆ６が見出された。デスミンの発現が６日目に、ミオゲニンの発現が２日目
に始まった。骨格筋アクチンも確認された。発明者等は更に、培養中で稀に自然
収縮が生じ、数ｍｍの距離を伝播するのを確認した。
【０３０２】
図８は、筋芽細胞と筋管とが融合によって多核筋管を形成した状態を示す顕微
鏡写真である。ＭＡＳＣにｅＧＦＰを形質導入した集団を５−アザシチジンで２
４時間誘導し、ＭＡＳＣ増殖培地中に維持して得られた筋芽細胞を同じドナーか
ら得られたｅＧＦＰを形質導入していないＭＡＳＣから得られた筋芽細胞と共培
養した。筋管を誘導するため、ＭＡＳＣ由来筋芽細胞（非形質転換ＭＡＳＣを５
−アザシチジンで２４時間誘導した後、ＭＡＳＣ増殖培地中に１４日間維持して
得られたもの）を１０％ウマ血清とＤＭＥＭ中で培養した。多核化細胞が形成さ
れた時点で筋管をＰＫＨ２６（赤色の膜色素）とインキュベートし、洗浄して、
１０％ウマ血清の存在下で上記に述べたように調製したｅＧＦＰを形質導入した
筋管と共培養した。２日後に細胞を蛍光顕微鏡下で調べた。顕微鏡写真にはｅＧ
ＦＰ陽性筋芽細胞がＰＫＨ２６で標識された筋管と融合した状態が示されている
。
【０３０３】
図９は、本発明のＭＡＳＣｓからの内皮細胞分化を誘導するために本発明にお
いて用いられた方法、および内皮細胞分化を検出するために用いられたマーカー
を示す。
【０３０４】
図１０は、内皮細胞分化を確認するための、フォン・ヴィレブランド因子およ
びＣＤ３４マーカーに関する免疫蛍光染色、ならびに内皮細胞表面受容体Ｔｉｅ
／Ｔｅｋに関するウェスタンブロット分析の一連の写真を示す。多能性成体幹細
胞（ＭＡＳＣ）はＦｌｋ１を発現したが、ＣＤ３４、ＰＥＣＡＭ、Ｅ−及びＰ−
セレクチン、ＣＤ３６、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ及びＦｌｔ１は発現しなかった。ＭＡＳ
Ｃを２０ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦを添加した無血清ＭＡＳＣ培地で培養した場合、１
４日目までに細胞表面にＣＤ３４が発現され、細胞がｖＷＦを発現するのを確認
した（免疫蛍光法）。更に細胞は７、１１及び１４日目にウェスタンブロット分
析により示されたようにＴｉｅ／Ｔｅｋを発現した。ＶＥＧＦによって誘導した
細胞をマトリゲルまたはＩＶ型コラーゲン上で培養すると血管形成が観察された
。
【０３０５】
図１１は、ＭＡＳＣｓをＳＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ、Ｔｐｏ、およびＥｐｏと共に
１４日間培養し、その後、造血支持フィーダーＡＦＴ０２４を用いてＳＣＦおよ
びＥＧＦ含有ＭＡＳＣ培地中において培養することによって、ＭＡＳＣｓが、ア
ストロサイト、乏突起膠細胞、及び神経性細胞に分化することを示す一連の顕微
鏡写真である。細胞は、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（アストロサ
イト）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）（乏突起膠細胞）、及びニューロフ
ィラメント−６８及び２００（ニューロン）に対する抗体によって標識した。
【０３０６】
図１２は、１００ng/mLのｂＦＧＦと共に、フィブロネクチンコートウェル中
において、低密度ＭＡＳＣｓを培養した際に、ニューロンが発生することを示す
一連の顕微鏡写真である。２０±２％の細胞がβ−チューブリンＩＩＩについて
陽性染色され、２２±３％がニューロフィラメント−６８について陽性染色され
、５０±３％がニューロフィラメント−１６０について陽性染色され、２０±２
％がニューロフィラメント−２００について陽性染色され、８２±５％がニュー
ロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）について陽性染色され、８０±２％が微小管関連
タンパク質２（ＭＡＰ２）について陽性染色された。ニューロン１個当たりの軸
索の数は分化後２、３〜４週後に３±１個〜５±１個及び７±２個に増加した。
図には示されていないが、培養２週間後には、２６±４％の細胞がＧＦＡＰ陽性
であり、２８±３％がＧａｌＣ陽性であったのに対し、４週後ではＧＦＡＰまた
はＧａｌＣ陽性細胞は減少した。
【０３０７】
図１３は、ＧＦＡＰ、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、およびニューロ
フィラメント−２００、ｘ、ｘに関するＲＴ−ＰＣＲの結果およびウェスタンブ
ロット分析、及びｂＦＧＦによるＭＡＳＣの誘導後の日数を示す。
【０３０８】
図１４は、ＭＡＳＣｓからの神経発生に対する、１００ng/mLのｂＦＧＦ、あ
るいは１０ng/mLのＦＧＦ−９、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−４、ＢＤ
ＮＦ、ＧＤＮＦ、またはＣＮＴＦの影響を示す。分化した細胞の性質はＧＦＡＰ
、ＧａｌＣ、ニューロフィラメント２００、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）
、ＧＡＢＡ及びパルブアルブミン、ならびにアセチルコリン（ＣＡＴ）に対する
抗体を用いた免疫組織化学法によって特定した。ｂＦＧＦとともに３週間培養す
ると、ＭＡＳＣはニューロン、アストロサイト、及び乏突起膠細胞に分化した。
ＧＡＢＡ、パルブアルブミン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡ−デカルボ
キシラーゼ、またはトリプトファンヒドロキシラーゼは検出されなかった。１０
ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−９及びＥＧＦとともに３週間培養すると、ＭＡＳＣはアス
トロサイト、乏突起膠細胞、及びＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロ
ンを生じた。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８及びＥＧＦとともに３週間
培養するとＧＡＢＡ作動性ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンの両方を
生じる。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−１０及びＥＧＦとともに３週間培
養するとアストロサイト及び乏突起膠細胞を生じたがニューロンは発生しなかっ
た。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−４及びＥＧＦにて３週間処理するとア
ストロサイト及び乏突起膠細胞に分化したが、ニューロンには分化しなかった。
ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ及びＥＧＦにて処理すると、チロシンヒド
ロキシラーゼ陽性細胞のみへの分化が見られた。ＧＤＮＦとともに培養するとＭ
ＡＳＣはＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロンに分化した。培養する
と３週間後にＧＡＢＡ作動性ニューロンのみへの分化が見られた。
【０３０９】
図１５は、ウィスターラットの脳において中大脳動脈の結紮によって生じさせ
た頭頂梗塞の周りへの未分化ＭＡＳＣｓの移植の効果を示す。ラットにはシクロ
スポリンを継続投与し、麻痺した四肢の機能をＭＡＳＣの注入の６週間後に調べ
た。コントロールとして動物に生理食塩水またはＭＡＳＣにより調整した培地を
注入した。ＭＡＳＣまたはコントロール溶液の移植後６週目に四肢の定位機能に
ついて検定した結果を示した。ＭＡＳＣを移植したラットにおいてのみ擬似移植
を行った動物のレベルに比肩する機能改善が見られた。
【０３１０】
図１６は、ウィスターラットの脳において中大脳動脈の結紮によって生じさせ
た頭頂梗塞の周りへの未分化ＭＡＳＣｓの移植の効果を示す。ラットにはシクロ
スポリンを継続投与し、麻痺した四肢の機能をＭＡＳＣの注入の６週間後に調べ
た。２及び６週間後に動物を殺して神経に係る表現型を決定した。ｅＧＦＰ＋細
胞の移植後の脳が自己蛍光を発することから、移植片の免疫組織化学的分析を行
う必要があった。２週目ではｅＧＦＰ＋細胞の大半が移植領域自体において検出
された。６週後ではｅＧＦＰ＋細胞は移植片の外部に移動した。２週目では抗ｅ
ＧＦＰ抗体で染色された細胞は球形状を維持し、その直径は１０〜３０μｍの範
囲であった。６週後ではｅＧＦＰ＋細胞は大幅に縮小しており、移植領域には正
常な脳組織へと延出する神経突起が見られた。ヒト特異的核抗体であるＮｕＭａ
による染色によってヒト細胞の存在が確認された（図示せず）。この抗体によれ
ば免疫蛍光抗体による２重及び３重の染色が可能であり、移植片中のヒト細胞を
特定するために将来的に利用されるであろう。
【０３１１】
本発明者等は、ヒト特異的抗ネスチン抗体を利用してＮｕＭａ陽性細胞及びＧ
ＦＰ＋細胞と同じ場所にネスチン陽性細胞の小集団を検出した。このことは神経
外胚葉の分化を示すものである。更に発明者等は、βチューブリンＩＩＩ、ニュ
ーロフィラメント−６８及び−１６０、オリゴマーカー、及びＧＦＡＰについて
陽性染色を確認した。このことは神経細胞及びグリア細胞への分化を示すもので
ある。
【０３１２】
図１７は、ＨＧＦおよびＫＧＦでＭＡＳＣｓを処理した後の、サイトケラチン
１８および１９に関する免疫組織化学分析およびウェスタンブロット分析を示す
。１４日後、サイロケラチン１８及び１９を発現する大型の上皮様細胞が見られ
た。
【０３１３】
発明の詳細な説明
ある系統にコミットした幹細胞において「クローニングプロセス」または「ト
ランス−分化」において起きるのと同様の遺伝的再プログラミングが起きるか否
かは分かっていない。本発明は、多様な臓器（例えば骨髄、肝臓、脳）に発生し
た後でさえ、それら臓器から精製し、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した場合に
残存する多能性幹細胞は、明らかな老化無しに増殖することができ、さらに、そ
の幹細胞が由来する組織とは異なる多様な細胞型に分化することができることを
示している。「可塑性」を有する様々な臓器由来の幹細胞の表現型は類似してい
る（ＣＤ４５−ＣＤ４４−ＨＬＡ−ＤＲ−ＨＬＡクラスＩ−ｏｃｔ３／４ｍＲ
ＮＡ＋およびｈＴＲＴ＋）。さらには、そのような幹細胞の特徴は、例えば、始
原生殖細胞（幹細胞がその直接の子孫であって差し支えない）の特徴に類似する
。
【０３１４】
本発明は、骨髄細胞のごく一部、ならびに脳および肝臓中の細胞が、通常、Ｅ
ＳおよびＥＧ細胞でのみ認められる遺伝子（ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１）を発現す
ることの証拠を有する。さらには、本発明は、ｏｃｔ−４／ｅＧＦＰ構成物に関
して形質転換した新生マウスの骨髄および脳においてｅＧＦＰ＋細胞を検出し、
さらに、ｏｃｔ−４発現細胞が、後胚期の生殖細胞以外の組織に存在することを
示している。従って、少数の幹細胞が成人してからもずっと残存し、多能性を有
する様々な臓器中において生存している。このことは異なる臓器に由来する幹細
胞において見られる可塑性を説明するものである。
【０３１５】
多能性幹細胞の選択及び表現型
本発明は、骨細胞、軟骨、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋、平
滑筋、心筋、内皮、上皮細胞（ケラチノサイト）、造血細胞、グリア細胞、神経
細胞、及び乏突起膠細胞の前駆細胞へと分化することが可能な、ヒトまたはマウ
ス（または他の生物種）の成体、新生児、または胎児から単離される多能性成体
幹細胞（ＭＡＳＣ）を提供するものである。これらの細胞はこれまでに述べられ
ているいずれの成体由来幹細胞よりも胚性幹細胞に近い分化表現型を示す。
【０３１６】
ここに述べられる多能性成体幹細胞は本発明者等によって開発された方法によ
って単離されたものである。発明者等はＭＡＳＣを特徴付ける多くの特異的細胞
表面マーカーを特定したものである。本発明の方法を利用することにより、ヒト
、マウスや他の生物種の成体、幼体または胎児から多能性成体幹細胞を単離する
ことが可能である。更に、マウスではこれらの細胞は脳及び肝臓から単離されて
いる。したがって、骨髄吸引液、脳または肝臓の生体組織及び場合により他の臓
器を採取し、本発明者等により特定されたような当該細胞上に発現される表面マ
ーカーに基づいて当業者に周知のポジティブまたはネガティブ選択法を用いるこ
とにより、煩瑣な実験を行うことなく当該細胞を単離することがここに至って当
業者に可能となったのである。
【０３１７】
Ａ．ヒト骨髄からの多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）の単離
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を選択するためには、当業者に周知の標準的手
法（参照、Muschler, G.F., et al., J. BoneJoint Surg. Am. (1997) 79 (11)
: 1699-709, Batinic, D., et al., BoneMarrow Transplant. (1990) 6(2): 10
3-7）によって得ることが可能な骨髄吸引液から骨髄単核細胞を得る。多能性成
体幹細胞は骨髄（または肝臓や脳などの他の臓器）に存在するが、通常の白血球
抗原ＣＤ４５や赤芽球特異的グリコフォリン−Ａ（Ｇｌｙ−Ａ）は発現しない。
この細胞の混合集団をフィコール−ハイパック分離にかける。次いで細胞を抗Ｃ
Ｄ４５及び抗Ｇｌｙ−Ａ抗体を用いたネガティブ選択にかけ、ＣＤ４５＋及びＧ
ｌｙ−Ａ＋の細胞集団を除去し、残りの約０．１％の骨髄単核細胞を回収する。
また、細胞をフィブロネクチンコーティングしたウェルに播種して、下記に述べ
る要領で２〜４週間培養した後にＣＤ４５＋及びＧｌｙ−Ａ＋細胞を除去するこ
とも可能である。あるいは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体などの、本発明者
等によって特定されたここに述べる細胞特異的マーカーの組合わせを用いたポジ
ティブ選択を行って細胞を単離する。ポジティブ及びネガティブ選択はいずれも
当業者に周知の方法であり、また、ネガティブ選択を行ううえで適当な多くのモ
ノクローナル及びポリクローナル抗体も当該技術分野において周知であって（参
照、Leukocyte Typing V, Schlossman, et al., Eds. (1995) Oxford Universit
y Press）、多くの供給元より市販されている。更に、細胞集団の混合物からの
哺乳動物細胞の分離法がシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）等による米国特許第５
，７５９，７９３号（磁気的分離）、及び、Basch, et al., J.Immunol. Metho
ds (1983)56: 269 （免疫親和性クロマトグラフィ）、ならびにWysocki and Sa
to, Proc. Natl. Acad. Sci (USA)(1978) 75: 2844) （蛍光発色細胞分析分離
法）（図１Ａ）に述べられている。回収したＣＤ４５−／ＧｌｙＡ−細胞は５〜
１１５ｎｇ／ｍｌ（好ま
しくは約７〜１０ｎｇ／ｍｌ）の血清フィブロネクチンまたは他の適当なマトリ
クスコーティングにてコーティングした培養皿に播種する。細胞は、１〜５０ｎ
ｇ／ｍｌ（好ましくは約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の血小板由来成長因子−ＢＢ（Ｐ
ＤＧＦ−ＢＢ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の上皮
成長因子（ＥＧＦ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）または１００〜１０，０００ＩＵ（好ましくは
約１０００ＩＵ）のＬＩＦを、１０−１０〜１０−８Ｍのデキサメタゾンまたは
他の適当なステロイド、２〜１０μｇ／ｍｌのリノレイン酸、及び０．０５〜０
．１５μＭのアスコルビン酸とともに補ったダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ
）または他の適当な細胞培養培地中で維持される。他の適当な培地として、ＭＣ
ＤＢ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭやＲＰＭＩなどが挙げられる。細胞は、無血清下か、１
〜２％ウシ胎児血清存在下か、あるいは１〜２％ヒトＡＢ血清または自家血清（
図１Ｂ）中に維持することができる。
【０３１８】
本発明者等は、低密度で培養された多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は白血病抑
制因子受容体（ＬＩＦ−Ｒ）を発現し、ＣＤ４４を少量発現するかあるいは発現
しないが、多能性幹細胞（ＭＳＣ）の特徴を有する細胞を高密度で培養すると、
ＬＩＦ−Ｒを発現しなくなるがＣＤ４４を発現することを示した。ＣＤ４５−Ｇ
ｌｙＡ−細胞の１〜２％がＣＤ４４−であり、ＣＤ４５−ＧｌｙＡ−細胞の内Ｌ
ＩＦ−Ｒ＋であるのは０．５％未満である。蛍光発色細胞分析分離法（ＦＡＣＳ
）により選択された細胞を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）にかけて
ｏｃｔ−４のｍＲＮＡを定量した。ｏｃｔ−４のｍＲＮＡの濃度は、選別されて
いないＣＤ４５−ＧｌｙＡ−細胞と比較して、ＣＤ４５−ＧｌｙＡ−ＣＤ４４−
細胞で５倍高く、ＣＤ４５−ＧｌｙＡ−ＬＩＦ−Ｒ＋細胞で２０倍高かった。選
別した細胞は１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＬＩＦを加えたＭ
ＡＳＣ培地に播種した。ＭＡＳＣが増殖を開始した頻度は、選別されていないＣ
Ｄ４５−ＧｌｙＡ−細胞と比較してＣＤ４５−ＧｌｙＡ−ＬＩＦ−Ｒ＋細胞で３
０倍高く、ＣＤ４５−ＧｌｙＡ−ＣＤ４４−細胞で３倍高かった。
【０３１９】
このヒト細胞を０．５ｘ１０３細胞／ｃｍ２未満の細胞密度で再播種すると、
培養はあまり増殖することなく死滅した。３日毎に１０ｘ１０３細胞／ｃｍ２を
上回る細胞密度で再播種すると、後述するように３０回の分裂を行う以前に細胞
は分裂を停止した。またこれにより分化能も失われた。３日毎に２ｘ１０３細胞
／ｃｍ２の細胞密度で再播種すると、４０回を上回る分裂が普通に見られ、分裂
回数が７０回を上回る細胞集団も見られた。細胞の倍加時間は最初の２０〜３０
回の分裂では３６〜４８時間であった。この後、細胞の倍加時間は６０〜７２時
間にまで延びた（図２）。
【０３２０】
５人のドナー（２才〜５５才）より得た多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を２ｘ
１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で２３〜２６回の分裂を行うまで培養したところ
テロメアの長さは１１〜１３ｋＢであった。これは同じドナーから得られた血中
リンパ球のテロメアの長さよりも３〜５ｋＢ長かった。２人のドナーから得た細
胞のテロメアの長さを２３回及び２５回の細胞分裂後にそれぞれ測定し、更に３
５回目の細胞分裂後に再測定したところ変化は見られなかった。これらのＭＡＳ
Ｃの核型は正常であった。（図３）
Ｂ．マウス組織からの多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）の単離
Ｃ５７／ＢＬ６マウスから骨髄を得、単核細胞またはＣＤ４５及びＧｌｙＡポ
ジティブの細胞を除去した細胞をヒトＭＡＳＣで用いたものと同じ培養条件下（
１０ｎｇ／ｍＬのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＧＦ）で播種した。骨髄単核細胞を
播種した場合には、培養開始後１４日後にＣＤ４５＋細胞を除去することにより
造血細胞を除去した。ヒトＭＡＳＣと同様、２回の細胞分裂毎に２０００細胞／
ｃｍ２の播種密度で培養に再播種した。ヒト細胞において見られたのと対照的に
、０日目にＣＤ４５＋細胞を除去した新鮮なマウス骨髄単核細胞をＭＡＳＣ培地
に播種した場合、細胞は増殖しなかった。マウス骨髄単核細胞を播種し、１４日
後に培養細胞からＣＤ４５＋細胞を除去すると、ヒトＭＡＳＣに形態及び表現型
において類似した細胞が出現した。
【０３２１】
ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＦＧのみと培養した場合、細胞の倍加は遅く（６日より
も長い）、１０回の細胞分裂を越える時間にわたって培養を維持することはでき
なかった。１００〜１００００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０００ＩＵ）のＬＩＦ
を添加することにより細胞の増殖は大幅に向上し、細胞の分裂回数は７０回を上
回った。
【０３２２】
５日齢のＦＶＢ／Ｎマウスから得た骨髄、脳、または肝臓単核細胞をフィブロ
ネクチン上、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＬＩＦとともにＭＡＳＣ培地に播種
した。１４日後にＣＤ４５＋細胞を除去し、上述したようなＭＡＳＣ培養条件下
に細胞を維持した。ＦＶＢ／Ｎマウスからの骨髄、脳、または肝細胞にて開始し
た培養中にヒトＭＡＳＣ及びマウス骨髄Ｃ５７／Ｂ１６ＭＡＳＣに形態及び表現
型において類似した細胞が増殖した。
【０３２３】
Ｃ．多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）の表現型
１．ヒトＭＡＳＣ
２２〜２５回目の細胞分裂後に得たヒト多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）に蛍光
発色細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）による免疫表現型分析を行った結果、細胞はＣ
Ｄ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、及
び−Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、ＳＴＲＯ−１、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ
は発現せず、ＣＤ４４、ＨＬＡ−クラスＩ、及びβ２マイクログロブリンを低レ
ベルで発現し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆ
ｌｋ１を発現することが示された（Ｎ＞１０）。
【０３２４】
２ｘ１０３個／ｃｍ２の細胞密度にて再播種した培養中で細胞分裂の回数が４
０回を越えると表現型はより均一となり、ＨＬＡ−クラスＩまたはＣＤ４４を発
現する細胞は見られなくなった（Ｎ＝６）。高いコンフルエンスにまで細胞が増
殖すると、Ｍｕｃ１８、ＣＤ４４、ＨＬＡ−クラスＩ及びβ２−マイクログロブ
リンを高レベルで発現するようになり、これは多能性幹細胞（ＭＳＣ）について
報告されている表現型と同様のものであった（Ｎ＝８）（Pittenger, Science(
1999) 284: 143-147）。
【０３２５】
免疫組織化学的分析により、２ｘ１０３個／ｃｍ２の播種密度にて培養された
ヒトＭＡＳＣはＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１及び−２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ
−Ｒ１ａ及び−Ｂを発現し、ＭＡＳＣの細胞集団の一部（１〜１０％）は抗ＳＳ
ＥＡ４抗体にて染色されることが示された（Kannagi R, EMBO J 2:2355-61, 19
83）。
【０３２６】
本発明者等は、２ｘ１０３個／ｃｍ２の播種密度にて２２〜２６回の細胞分裂
にわたって培養したヒトＭＡＳＣの発現遺伝子プロファイルをクロンテック社（
Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）製ｃＤＮＡアレイを用いて評価し、以下のプロファイルを
得た。
【０３２７】
Ａ．多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ６２Ｅ、Ｃ
Ｄ６２Ｐ、ＣＤ４４−Ｈ、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ；ＩＬＩ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１
１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、Ｆｌｔ３−Ｌ、またはＣＮＴＦの受容
体のｍＲＮＡを発現せず、ＨＬＡ−クラスＩ、ＣＤ４４−Ｅ及びＭｕｃ１８のｍ
ＲＮＡを低レベルで発現する。
【０３２８】
Ｂ．ＭＡＳＣは、サイトカインであるＢＭＰ１、ＢＭＰ５、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ
、ＫＧＦ、ＭＣＰ１；サイトカイン受容体であるＦｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧ
Ｆ−Ｒ１α、ｇｐ１３０、ＬＩＦ−Ｒ、アクチビンＲ１及び−Ｒ２、ＴＧＦＲ−
２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ；接着受容体であるＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９及び
ＣＤ１０のｍＲＮＡを発現する。
【０３２９】
Ｃ．ＭＡＳＣは、ｈＴＲＴ及びＴＲＦ１；ＰＯＵ−ドメイン転写因子ｏｃｔ−
４  ｃ  ｓｏｘ−２（ＥＳ／ＥＣの未分化状態を維持するうえでｏｃｔ−４とと
もに必要とされる。Uwanogho D, Mech Dev 49: 23-36,1995）、ｓｏｘ−１１（
神経発生）、ｓｏｘ−９（軟骨形成、Lefebvre V, Matrix Biol16: 529-40, 19
98）；ホメオドメイン転写因子であるＨｏｘａ４及び−ａ５（頚部及び胸部骨格
の指定；気道の臓器形成、Packer AI, Dev Dyn 17: 62-74,2000）、Ｈｏｘ−ａ
９（骨髄造血、Lawrence H, Blood 89: 1922, 1997）、Ｄｌｘ４（前脳及び頭部
周辺構造の指定、Akimenko MA, J Neurosci 14:3475-86, 1994）、ＭＳＸ１（
胚中胚葉、成人心臓及び筋肉、軟骨及び骨形成、Foerst-Potts L, DevDyn 209:
70-84, 1997）、ＰＤＸ１（膵臓、Offield MF,Development 122: 983-95, 199
6）のｍＲＮＡを発現する。
【０３３０】
Ｄ．ｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、及びｈＴＲＴのｍＲＮＡの存在がＲＴ−ＰＣＲ
により確認された。
【０３３１】
Ｅ．更にＲＴ−ＰＣＲにより、Ｒｅｘ−１のｍＲＮＡ（ＥＳの未分化状態を維
持するうえでｏｃｔ−４とともに必要とされる。Rosfjord E, BiochemBiophys 
Res Common 203: 1795-802, 1997）及びＲｏｘ−１のｍＲＮＡ（Ｒｅｘ−１の転
写にｏｃｔ−４とともに必要とされる。Ben-Shushan E, Cell Biol18: 1866-78
, 1998）がＭＡＳＣにおいて発現されていることが示された。
【０３３２】
ｏｃｔ−４は原腸形成前の胚、分裂初期段階の胚、胚盤胞の内部細胞塊の細胞
、及び胎児性（ＥＣ）癌細胞内において発現される転写因子であり（Nichols J,
et al Cell 95: 379-91, 1998）、細胞が分化誘導されるとダウンレギュレート
される。ｏｃｔ−４の発現は胚形成及び分化の初期段階を決定するうえで重要な
役割を担っている。ｏｃｔ−４はＲｏｘ−１とともに、ＥＳを未分化に維持する
うえでやはり必要とされるジンクフィンガータンパク質であるＲｅｘ−１の転写
を活性化させる（Rosfjord E, Rizzino A. BiochemBiophys Res Commun 203: 1
795-802, 1997; Ben-Shushan E, et al., MolCell Biol 18: 1866-78, 1998）
。更に、ＥＳ／ＥＣ及び他のより分化の進んだ細胞において発現されるｓｏｘ−
２は、ＥＳ／ＥＣの未分化状態を維持するうえでｏｃｔ−４とともに必要とされ
る（Uwanogho D, Rex M, Cartwright EJ, PearlG, Healy C, Scotting PJ, Sha
rpe PT: Embryonic expression of the chickenSox2, Sox3 and Sox11 genes s
uggests an interactive role in neuronaldevelopment.  Mech Dev 49: 23-36
, 1995）。マウスＥＳ細胞及び始原生殖細胞の維持にはＬＩＦの存在が必要であ
るが、ヒト及びヒト以外の霊長類のＥＳ細胞についてはこの条件はさほど明確で
はない。
【０３３３】
本発明者等は、ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、及びＲｏｘ−１がヒト及びマウス骨
髄由来の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）及びマウス肝臓及び脳由来のＭＡＳＣ中
で発現されていることを観察した。ヒトＭＡＳＣは白血病抑制因子受容体（ＬＩ
Ｆ−Ｒ）を発現し、ＳＳＥＡ−４にて陽性染色される。ヒトＭＡＳＣの増殖がＬ
ＩＦによって影響されるかは依然明らかではないがヒトＭＡＳＣはＬＩＦ−Ｒ＋
細胞を選別することによって濃縮されることが初期の実験によって示されている
。これに対してマウスＭＡＳＣの増殖はＬＩＦによって助長される。最後にｏｃ
ｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、Ｒｅｘ−１及びＲｏｘ−１のｍＲＮＡレベルはヒトＭＡＳ
Ｃの培養において３０回目の細胞分裂以降に高くなり、表現型がより均一な細胞
を生ずる。これに対して高密度で培養されたＭＡＳＣではこれらのマーカーは発
現しなくなる。このことは４０回の細胞分裂以前の老化及び細胞が軟骨芽細胞、
骨芽細胞、及び脂肪細胞以外への分化能を失うことに関連している。したがって
ｏｃｔ−４の存在は、Ｒｅｘ−１、Ｒｏｘ−１、ｓｏｘ−２、及びＬＩＦ−Ｒと
ともにＭＡＳＣ培養中の最も原始的細胞の存在を示すマーカーとなる。
【０３３４】
本発明者等はｏｃｔ−４のプロモーターであるｅＧＦＰ遺伝子に関してマウス
の形質転換体を調べた。これらの動物では始原生殖細胞ならびに生後の生殖細胞
中にｅＧＦＰの発現が見られる。本発明者等はＭＡＳＣがｏｃｔ−４を発現する
際に生後のこれらの動物の骨髄、脳、及び肝臓にｅＧＦＰポジティブな細胞が見
られるか否かについて試験を行った。生後５日目のマウスの骨髄、脳、及び肝臓
からｅＧＦＰ＋細胞（最も明るかった細胞１％）を選別した。蛍光顕微鏡検査法
による評価を行ったところ、脳及び骨髄から選別された細胞の内、ｅＧＦＰ＋で
あったのは１％未満であった。選別した細胞集団においてＱ−ＲＴ−ＰＣＲによ
りｏｃｔ−４のｍＲＮＡが検出された。選別した細胞をマウスＭＡＳＣを支持可
能な条件下（ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＬＩＦを補い、フィブロネクチンでコーティン
グしたウェル）で播種した。細胞は生存したが増殖は見られなかった。マウス胚
性繊維芽細胞に移したところ細胞の増殖が見られた。ＭＡＳＣ支持条件下に再び
播種したところ、ＭＡＳＣの形態及び表現型を備えた細胞が検出された。
【０３３５】
２．マウスＭＡＳＣ
ヒト細胞におけるのと同様、Ｃ５７／ＢＬ６ＭＡＳＣを、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−
ＢＢ及びＬＩＦを添加して培養した場合、ＣＤ４４及びＨＬＡ−クラスＩネガテ
ィブとなり、ＳＳＥＡ−４にて陽性染色され、ｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、ＲＯＸ
−１及びｓｏｘ−２の転写産物を発現した。同様にＦＶＢ／Ｎの骨髄、脳、及び
肝臓から得たＭＡＳＣはｏｃｔ３／４のｍＲＮＡを発現した。
【０３３６】
多能性成体幹細胞の培養
本明細書中に述べるような単離多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は本発明の方法
を用いて培養することが可能である。簡単に述べれば、低血清もしくは無血清培
地中での培養が細胞を未分化状態に維持するうえで好ましい。ここに述べられる
ような、当該細胞の培養に用いられる無血清培地は表Ｉに示されるように補った
ものである。
【０３３７】
【表１】
2004529621.tif 000028
ＭＡＳＣはＬＩＦ−Ｒを発現し、また一部の細胞はｏｃｔ−４を発現すること
により、ＬＩＦを添加することによって培養が向上するか否かについて試験を行
った。ヒトＭＡＳＣに１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦを添加した場合、短期間の細胞増
殖に影響は見られなかった（２５回の細胞分裂までの細胞倍加時間、ｏｃｔ−４
の発現レベルが同じ）。ヒト細胞における場合と比較して、０日目にＣＤ４５＋
細胞を除去した新鮮なマウス骨髄単核細胞をＭＡＳＣ培養に播種した場合、細胞
の増殖は見られなかった。マウス骨髄単核細胞を播種し、培養細胞から１４日後
にＣＤ４５＋細胞を除去した場合、ヒトＭＡＳＣに形態及び表現型において類似
した細胞が出現した。このことは、マウスＭＡＳＣの初期の増殖には造血細胞に
よって分泌される因子が必要であることを示している。ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＦＥ
Ｇのみを加えて培養した場合、細胞の倍加時間は遅く（６日よりも長い）、１０
回の細胞分裂を越える時間にわたって培養を維持することはできなかった。１０
ｎｇ／ｍＬのＬＩＦの添加により細胞の増殖は大幅に向上した。
【０３３８】
培養中で樹立された細胞は、４０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを加えたＤＭＥ
Ｍを用い、凍結して凍結ストックとして保存することが可能である。培養細胞の
凍結ストックを調製するための他の方法も当業者に周知である。
【０３３９】
単分化能前駆細胞及び組織特異的細胞型へのＭＡＳＣの分化誘導
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、適当な成長因子、ケモカイン、及
びサイトカインを用い、例えば、中胚葉由来の各種細胞、神経外胚葉由来の細胞
（グリア細胞、乏突起膠細胞、及びニューロン）や内胚葉由来の細胞などの多く
の細胞系を形成するように分化誘導することが可能である。
【０３４０】
Ａ．臓側中胚葉
１．骨芽細胞：  コンフルエンスに達した多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を１
０−６〜１０−８Ｍ（好ましくは約１０−７Ｍ）のデキサメタゾン、β−グリセ
ロフォスフェート及び５〜２０ｍＭ（好ましくは１０ｍＭ）のアスコルビン酸と
ともに培養した。骨芽細胞の存在を証明するため、ＶｏｎＫｏｓｓａ染色法（Ｃ
ａＰＯ４の銀還元反応）、または骨シャロタンパク質、オステオネクチン、オス
テオカルシンに対する抗体（免疫組織化学／ウエスタン）を使用した。培養１４
日から２１日後には細胞の８０％を上回るものがこれらの抗体によって陽性に染
色された（図５、６）。
【０３４１】
２．軟骨芽細胞：  多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）をトリプシン処理し、５０
〜１００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のＴＧＦ−β１を補った無
血清ＤＭＥＭ中、マイクロマス懸濁培養として培養した。試験管の底に微小な軟
骨凝集体が形成され、トルイジンブルーにて陽性に染色された。初期にはマイク
ロマス全体にわたってＩ型コラーゲンが検出された（５日目）が、１４日後では
繊維状軟骨の外層においてのみ検出された。５日後にはＩＩ型コラーゲンが検出
されるようになり、１４日後にはマイクロマスは強く染色された。骨シャロタン
パク質についての染色は繊維状軟骨の外層において陰性もしくは微弱な陽性であ
った。オステオネクチン、オステオカルシン、及びオステオポンチンについては
異なる染色強度が得られた。ＩＩ型コラーゲンの存在はウエスタンブロット及び
ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。更に、５日後に回収された細胞にＲＴ−ＰＣＲを
行ったところ、軟骨に特異的な転写因子であるＣＡＲＴ１及びＣＤ−ＲＡＰ１の
存在が示された（図５、６）。
【０３４２】
３．脂肪細胞：  脂肪細胞の分化を誘導するには、約１０−7〜約１０−６Ｍ
（好ましくは約１０−7Ｍ）のデキサメタゾン、約５０〜約２００μｇ／ｍｌ（
好ましくは約１００μｇ／ｍｌ）のインスリン、または約２０％のウマ血清を補
った培地を使用することが可能である。脂肪細胞の分化は、光学顕微鏡による観
察、オイル・レッドによる染色、あるいはリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、
脂肪細胞の脂質結合タンパク質（ａＰ２）、またはペルオキシソーム増殖剤応答
性受容体（ＰＰＡＲ）の検出によって検出される。細胞マーカー及び産物の検出
方法は当業者には公知のものであり、ＰＰＡＲγに結合するトログリタゾン（Ｔ
ＲＯ）及びロシグリタゾン（ＲＳＧ）などの特定のリガンドを用いた検出法など
が挙げられる。
【０３４３】
４．軟骨及び骨の発現遺伝子プロファイル  本発明者等は、骨芽細胞及び軟骨
芽細胞への分化に際して発現される遺伝子を調べた。詳細には、ＭＡＳＣ（ｎ＝
３）及び２日間にわたって骨芽細胞及び軟骨芽細胞培養条件に切り換えたＭＡＳ
Ｃの発現遺伝子プロファイルを調べてこれら２つの特定の細胞系列への均一な相
対的転換が見られるか否かを、クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）社及びイン
ビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社のｃＤＮＡアレイを用いて判定した。検
出された変化の一部を表２に列記した。これは決して、ＭＡＳＣ、骨芽細胞、及
び軟骨芽細胞の発現遺伝子プロファイルの決定的評価たりうるものではない。し
かしながらこの結果は、ＭＡＳＣの骨及び軟骨への分化が発現遺伝子プロファイ
ルに著明かつ多様な変化をもたらすことを示すものであり、培養中の細胞の多く
が所定の経路に沿って分化誘導可能であるという所見と符合するものである。
【０３４４】
【表２】
2004529621.tif 000029
５．サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションによる骨の発現遺伝子プロフ
ァイル：  本発明者等はサブトラクション法を用いて未分化の多能性成体幹細胞
（ＭＡＳＣ）と単分化能の子孫細胞との間の遺伝子の相違を調べた。ポリアデニ
ル化ｍＲＮＡを未分化ＭＡＳＣから抽出し、２日間にわたり細胞を骨芽細胞系へ
と分化誘導した。改変を行うことなく製造者の推奨するところにしたがって、ク
ロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）社の販売するＰＣＲ−選択キットを使用して
発現レベルの異なるｃＤＮＡのサブトラクション及び増幅を行った。未分化のＭ
ＡＳＣではなく、２日目の骨芽細胞培養中で発現した遺伝子から配列の分析を開
始した。
【０３４５】
１）本発明者等は、発現レベルの異なる８６個のｃＤＮＡ配列の配列を決定し
た。発明者等はノーザンブロッティングによりｍＲＮＡがＭＡＳＣではなく、２
日目の子孫骨芽細胞において実際に特異的に発現していることを確認した。得ら
れた配列は以下のデータベースと（ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて）比較した
。すなわち、SwissProt, GenBank protein andnucleotide collections, ESTs,
murine and human EST contigsである。
【０３４６】
２）配列は相同性によって分類した。８個が転写因子、２０個が細胞の代謝に
関与、５個が染色体の修復に関与、４個がアポトーシス経路に関与、８個がミト
コンドリアの機能に関与、１４個が接着受容体／ＥＣＭ要素、１９個が機能が不
明な既知のＥＳＴ配列、８個が新規な配列であった。
【０３４７】
３）本発明者等は、３人の個別のドナーより得られた多能性成体幹細胞（ＭＡ
ＳＣ）を１２ｈ、２４ｈ、２ｄ、４ｄ、７ｄ、及び１４ｄにわたって骨に分化誘
導したものを用い、新規配列の内の２個についてＱ−ＲＴ−ＰＣＲを行った。２
個の遺伝子はそれぞれ分化誘導の最初の２日間及び４日間において発現し、その
後はダウンレギュレートされた。
【０３４８】
４）本発明者は更に未分化のＭＡＳＣに存在するが２日目の骨芽細胞には存在
しない遺伝子について分析を行った。この結果、発現レベルの異なる３０個の遺
伝子が配列決定され、その内の５個はＥＳＴ配列または未知の配列であった。
【０３４９】
Ｂ．筋肉
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を任意の筋肉の表現型を有する細胞に分化させ
るには、分化誘導に先立ってＭＡＳＣがコンフルエンスに達していることが必要
である。
【０３５０】
１．骨格筋：骨格筋分化を誘導するには、コンフルエンスに達した多能性成体
幹細胞（ＭＡＳＣ）を、ＭＡＳＣ増殖培地中、約１〜約３μＭ（好ましくは約３
μＭ）の５−アザシチジンにて２４時間処理する。次いで培養をＭＡＳＣ培地中
で維持する。分化はウェスタンブロット及び免疫組織化学法にて評価する。ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの骨格筋への分化は当業者には周知の標準的方法及び市販の抗体
を用いたウェスタンブロットまたは免疫組織化学法のいずれかによって、Ｍｙｆ
−５、Ｍｙｏ−Ｄ、Ｍｙｆ−６、ミオゲニン、デスミン、骨格筋アクチン及び骨
格筋ミオシンの一連の活性化を検出することによって証明することが可能である
。５−アザシチジンによる誘導の５日後にはＭｙｆ５、Ｍｙｏ−Ｄ、及びＭｙｆ
６転写因子が細胞の約５０％に検出される。１４〜１８日後では、Ｍｙｏ−Ｄの
発現レベルは大幅に低下したのに対し、Ｍｙｆ５及びＭｙｆ６の発現レベルは高
値を維持した。デスミン及び骨格筋アクチンは誘導後４日目と早期に検出され、
骨格筋ミオシンは１４日目に検出された。免疫組織化学法により１４日目には細
胞の７０〜８０％が成熟筋タンパク質を発現していることが確認された。５−シ
チジンによる処理によって培養の第１週目にＧａｔａ４及びＧａｔａ６が発現し
た。更に２日後には低レベルのトロポニン−Ｔが検出された。誘導の２日後には
平滑筋アクチンが検出され１４日間にわたり高値を維持した。２０％のウマ血清
を添加すると筋原細胞の多核化筋管への融合が見られた（図７）。発明者等は２
重蛍光標識を用い、系統変換した筋原細胞を分化経路の異なる筋細胞と融合させ
ることが可能であることを示した（図８）。
【０３５１】
２．平滑筋：成長因子は添加せず、高濃度（約５０〜約２００ｎｇ／ｍｌ、好
ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ）の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を補った無血
清培地中で多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を培養することにより平滑筋細胞を誘
導することが更に可能である。細胞は分化の開始時点でコンフルエンスに達して
いることが好ましい。最終分化した平滑筋細胞は、当業者に周知の標準的方法に
よってデスミン、平滑筋特異的アクチン、及び平滑筋特異的ミオシンの発現を検
出することによって同定が可能である。平滑筋アクチンは２日後から、平滑筋ミ
オシンは１４日後から検出された。細胞の約７０％が抗平滑筋アクチン抗体及び
抗平滑筋ミオシン抗体によって陽性染色された。４日後からミオゲニンの存在が
確認され、６日後からデスミンが確認された。２〜４日後に更にＭｙｆ５及びＭ
ｙｆ６タンパク質が検出され、１５日目まで高値を維持した。Ｍｙｏ−Ｄは検出
されなかった（図７）。
【０３５２】
３．心筋：心筋分化は、前記に述べたように約５〜約２００ｎｇ／ｍｌ（好ま
しくは約１００ｎｇ／ｍｌ）の塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を、成長
因子を添加しない標準無血清培地に添加することによって可能である。コンフル
エンスに達したＭＡＳＣをμＭ（好ましくは約３μＭ）の５−アザシチジン、次
いで１０−5〜１０−７Ｍの（好ましくは１０−６Ｍ）のレチノイン酸に露曝し
た後、ＭＡＳＣ増殖培地中で培養した。または、ＭＡＳＣをこれらの誘導因子の
いずれか一方または両者の組合わせとともに培養した後、５０〜２００ｎｇ／ｍ
ｌ（好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ２、または５〜２０ｎｇ／ｍｌ（好
ましくは１０ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−４と１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２の組合わ
せを添加した無血清培地中で培養してもよい。発明者等は心筋細胞と一致するタ
ンパク質の発現を確認した。Ｇａｔａ４及びＧａｔａ６が早くも２日目に発現さ
れ、１５日まで高値を維持した。心筋トロポニンＴが４日目以降に発現され、心
筋トロポニンＩが６日目以降に発現された。ＡＮＰは１１日目以降に検出された
。免疫組織化学法により１５日目にこれらの心筋タンパク質が７０％を上回る細
胞で検出された。転写因子Ｍｙｆ６は２日目以降に確認された。デスミンの発現
が６日目に、ミオゲニンの発現が２日目に始まった。骨格筋アクチンも確認され
た。培養を３週間以上維持すると細胞はシンシチウムを形成した。発明者等は更
に、培養中で稀に自然収縮が生じ、数ｍｍの距離を伝播するのを確認した（図７
）。
【０３５３】
Ｃ．内皮細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）はＦｌｋ１を発現したが、ＣＤ３４、ＰＥＣＡ
Ｍ、Ｅ−及びＰ−セレクチン、ＣＤ３６、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ及びＦｌｔ１は発現し
なかった。ＭＡＳＣを２０ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦを添加した無血清ＭＡＳＣ培地で
培養した場合、１４日目までに細胞表面にＣＤ３４が発現され、細胞がｖＷＦを
発現するのを確認した（免疫蛍光法）（図９、１０）。更に細胞は、Ｔｉｅ、Ｔ
ｅｋ、Ｆｌｋ１及びＦｌｔ１、ＰＥＣＡＭ、Ｐ−セレクチン及びＥ−セレクチン
、ならびにＣＤ３６を発現した。組織化学染色の結果をウェスタンブロットによ
り確認した。ＶＥＧＦによって誘導した細胞をマトリゲルまたはＩＶ型コラーゲ
ン上で培養すると血管形成が観察された（図９、１０）。
【０３５４】
Ｄ．造血細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）がＣＤ３４＋の内皮細胞へと分化すること、ま
た最近の研究によってＣＤ３４−ＦＬＫ＋細胞を内皮細胞及び造血細胞に分化誘
導することが可能であることが示されたことから、ＭＡＳＣの造血前駆細胞への
分化誘導が可能か否かを調べた。ｅｘ  ｖｉｖｏでマウス及びヒト再生幹細胞を
支持可能な胎児肝臓由来の間葉細胞系であるＡＦＴ０２４フィーダーによって調
整し、５％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを添加したＰＤＧＦ−ＢＢ及び
ＥＧＦ含有ＭＡＳＣ培地中、ＩＶ型コラーゲン上にＭＡＳＣを再播種した。これ
らの培養から回収した細胞は、ｃＫｉｔ、ｃＭｙｂ、Ｇａｔａ２、及びＧ−ＣＳ
Ｆ−Ｒを発現したが、ＣＤ３４は発現しなかった（ＲＴ−ＰＣＲ）。造血作用が
胚性内臓内胚葉が放出する因子によって誘発されることから、発明者等はヒトＳ
ＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ，Ｔｐｏ、及びＥｐｏの存在下でβＧａｌ＋のマウスＥＢと
ヒトＭＡＳＣとを共培養した。２つの別々の実験において、ヒトＣＤ４５を発現
するβＧａｌ−細胞の小集団が検出された。
【０３５５】
Ｅ．間質細胞：
発明者等は、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）をＩＬ−１α、ＦＣＳ、及びウマ
血清とともに培養することにより「間質細胞」分化を誘導した。これらの細胞が
造血支持能を有することを証明するため、フィーダーを２，０００ｃＧｙにて放
射線照射し、ＣＤ３４＋臍帯血細胞をフィーダーと接触させて播種した。１、２
、及び５週間後にメチルセルロースアッセイにおいて子孫細胞を再播種してコロ
ニー形成細胞（ＣＦＣ）の数を求めた。２週間後にＣＦＣは３〜５倍に増加し、
５週後においてＣＦＣは維持された。これはマウス胎児肝臓由来のフィーダー細
胞であるＡＦＴ０２４と接触させてＣＤ３４＋細胞を培養した場合と類似してい
た。
【０３５６】
Ｆ．神経性細胞
驚くべきことに、造血作用支持フィーダーであるＡＦＴ０２４によって調整し
たＥＧＦ含有ＭＡＳＣ培地中で、ＶＥＧＦ、造血性サイトカインＳＣＦ、Ｆｌｔ
−Ｌ、Ｔｐｏ及びＥｐｏにて誘導した多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、グリア
繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性アストロサイト、ガラクトセレブロシド
（ＧａｌＣ）陽性乏突起膠細胞、及びニューロフィラメント陽性ニューロンに分
化した（図１１）。そこで発明者等は、ＡＦＴ０２４フィーダーによるＦＧＦ２
の産生ならびに培養へのＥＧＦの添加がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの神経系細胞への分
化を誘導したものであるとの仮説を立てた。
【０３５７】
そこで発明者等は、神経発生ならびに神経前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養にお
いて重要な役割を担っていることが知られているＦＧＦ２がＭＡＳＣ由来の神経
発生に与える影響について調べた。ＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＢＢを加えて培養した
ヒト骨髄由来ＭＡＳＣ（ｎ＝７）の、コンフルエンスが５０％に満たない培養を
５０〜５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ２を含有する
培地に切り換えると、２〜４週間後にアストロサイト、乏突起膠細胞、及びニュ
ーロンの表現型を有する細胞への分化が確認された（図１１）。培養２週間後に
おいて、細胞の２６±４％がＧＦＡＰ陽性であり、２８±３％がＧａｌＣ陽性で
あり、４６±５％がニューロフィラメント−２００陽性であった。３週後に再び
調べたところ、ＧＦＡＰまたはＧａｌＣ陽性細胞の数は減少していたが、２０±
２％の細胞がβ−チューブリンＩＩＩについて陽性染色され、２２±３％がニュ
ーロフィラメント−６８について陽性染色され、５０±３％がニューロフィラメ
ント−１６０について陽性染色され、２０±２％がニューロフィラメント−２０
０について陽性染色され、８２±５％がニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）に
ついて陽性染色され、８０±２％が微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）につい
て陽性染色された（図１２）。ＧＡＢＡ、パルブアルブミン、チロシンヒドロキ
シラーゼ、ＤＯＰＡ−デカルボキシラーゼ、及びトリプトファンヒドロキシラー
ゼは検出されなかった。ニューロン１個当たりの軸索の数は分化後２、３〜４週
後に３±１個〜５±１個及び７±２個に増加した。アストロサイト、乏突起膠細
胞、及びニューロンの特徴を有する細胞への分化は、ウェスタンブロット及びＲ
Ｔ−ＰＣＲ分析によって、ＧＦＡＰ、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及び
ニューロフィラメント−２００がＦＧＦ２処理細胞には存在するが、ＭＡＳＣに
は存在しないことを証明して確認した。
【０３５８】
ＦＧＦ−９はグリア芽細胞腫細胞系列から最初に単離され、培養中でグリア細
胞の分裂を誘導する。ＦＧＦ−９は、大脳皮質、海馬、黒質、脳幹の運動核、プ
ルキンエ細胞層のニューロンにおいてｉｎ  ｖｉｖｏに見られる。ＭＡＳＣに５
〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ−９及びＥＧＦを添加
して３週間培養すると、アストロサイト、乏突起膠細胞、ＧＡＢＡ作動性ニュー
ロン、及びドーパミン作動性ニューロンを生じた。中枢神経系の発生過程では、
中／後脳境界において前脳により発現されるＦＧＦ−８が、ソニックヘッジホッ
グとともに中脳及び前脳のドーパミン作動性ニューロンの分化を誘導する。ＭＡ
ＳＣに５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ−８及びＥＧ
Ｆを添加して３週間培養するとＧＡＢＡ作動性ニューロン及びドーパミン作動性
ニューロンの両方を生じることが分かっている。ＦＧＦ−１０は極微量が脳に見
出され、その発現は海馬、視床、中脳、及び脳幹に限定され、ニューロン内で選
択的に発現し、グリア細胞では発現しない。ＭＡＳＣを５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好
ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ−１０及びＥＧＦ中で３週間培養するとアス
トロサイト及び乏突起膠細胞を生じたが、ニューロンは生じなかった。ＦＧＦ−
４は脊索において発現し、中脳の領域化に必要とされる。ＭＡＳＣを５〜５０ｎ
ｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ−４及びＥＧＦにて３週間処理
するとアストロサイト及び乏突起膠細胞に分化したが、ニューロンには分化しな
かった。
【０３５９】
脳において特異的に発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経発生
に影響する他の成長因子としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細
胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）など
がある。ＢＤＮＦは、ＮＳＣ、ヒト上衣下細胞、及び神経系前駆細胞のニューロ
ンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化を促進し、海馬由来神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏで
の軸索生成を促進する神経成長因子ファミリーに属する。黒質のドーパミン作動
性ニューロンの生存を支持するというＢＤＮＦの既知の機能と符合するものであ
るが、ＭＡＳＣを５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＢＤＮＦ
及びＥＧＦにて処理すると、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのみへの
分化が見られた。ＧＤＮＦはＴＧＦスーパーファミリーに属する。神経発生の初
期にはＧＤＮＦは前神経外胚葉で発現し、神経発生におけるＧＤＮＦの重要な役
割を示すものである。ＧＤＮＦは末梢神経及び筋肉の運動ニューロンの生存を促
し、神経栄養因子活性及び分化促進能を有する。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましく
は１０ｎｇ／ｍＬ）のＧＤＮＦによりＭＡＳＣのＧＡＢＡ作動性及びドーパミン
作動性ニューロンへの分化が誘導されることが分かっている。ＣＮＴＦは毛様体
神経節から最初に単離され、サイトカインのｇｐ１３０ファミリーに属する。Ｃ
ＮＴＦは発生初期の神経の生存を促す。ＣＮＴＦにより、ラット胎児の海馬神経
細胞の培養においてＧＡＢＡ作動性及びコリン作動性ニューロンの数が増加する
。更にＣＮＴＦはＧＡＢＡ作動性ニューロンの細胞死を防止するとともにＧＡＢ
Ａの取込みを促進する。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＣ
ＮＴＦはＭＡＳＣに対し同様のＧＡＢＡ作動性誘導効果を示し、ＭＡＳＣはＣＮ
ＴＦへの曝露の３週後にＧＡＢＡ作動性ニューロンのみに分化した。
【０３６０】
ラットの脳に移植されたＭＡＳＣの運命についても調べた。５０，０００個の
ｅＧＦＰ＋のＭＡＳＣを、シクロスポリンを継続投与したＷｉｓｔｅｒ系ラット
に誘発させた頭頂部梗塞の周囲に定位的に移植した。生理食塩水、ＭＡＳＣ調整
培地、またはＭＡＳＣの移植後６週目に四肢の定位機能について検定した。ＭＡ
ＳＣを移植したラットにおいてのみ擬似移植を行った動物のレベルに比肩する機
能改善が見られた（図１５）。
【０３６１】
２及び６週間後に動物を殺して神経に係る表現型を決定した。ｅＧＦＰ＋細胞
の移植後の脳が自己蛍光を発することから、移植片の免疫組織化学的分析を行っ
た。２週目ではｅＧＦＰ＋細胞の大半が移植領域自体において検出された（図１
６）。５週後ではｅＧＦＰ＋細胞は移植片の外部に移動した。２週目では抗ｅＧ
ＦＰ抗体で染色された細胞は球形状を維持し、その直径は１０〜３０μｍの範囲
であった。６週後では抗ｅＧＦＰ抗体で染色された細胞は大幅に縮小しており、
移植領域には正常な脳組織へと延出する樹状突起が見られた。ヒト特異的核抗体
であるＮｕＭａによる染色によってヒト細胞の存在が確認された。この抗体を利
用すれば免疫蛍光抗体による２重及び３重の染色が可能であり、移植片中のヒト
細胞を特定することが可能である。
【０３６２】
本発明者等は、ヒト特異的抗ネスチン抗体を利用してＮｕＭａ陽性細胞及びＧ
ＦＰ＋細胞と同じ場所にネスチン陽性細胞の小集団を検出した。このことは神経
外胚葉の分化を示すものである。更に発明者等は、チューブリンＩＩＩ、ニュー
ロフィラメント−６８及び−１６０、オリゴマーカー、及びＧＦＡＰについて陽
性染色を確認した。このことは神経細胞及びグリア細胞への分化を示すものであ
る（図に示されていない）。
【０３６３】
Ｇ．上皮細胞
発明者等はコンフルエンスに達した多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）（ｎ＝４）
を１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）単独かまたはケラチノサイト成長
因子（ＫＧＦ）との組合わせにて処理した。１４日後にＨＧＦ受容体、サイトケ
ラチン８、１８及び１９を発現する大型の類上皮細胞を確認した。サイトケラチ
ン１９の存在は胆管上皮細胞への分化が起きている可能性を示すものである。基
質をフィブロネクチンからコラーゲンゲルまたはマトリゲルに変更することによ
って上皮細胞の形態を有するサイトケラチン１８発現細胞の発生率が向上した（
図１７）。
【０３６４】
分化した複数細胞系列の単一細胞起源
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）同士が互いにクローンであるかどうかを確認す
るため、発明者等はＦＡＣＳ１により選別を行い、ＭＦＧ−ｅＧＦＰにより形質
導入したｅＧＦＰ＋細胞をウェル１個当たり１０個播種し、１０８個の細胞にま
で培養した。形質導入は以下のように行った。２４時間前に再播種したＭＡＳＣ
を６時間づつ連続２日間にわたってＰＧ１３細胞系にパッケージングされたＭＦ
Ｇ−ｅＧＦＰまたはＭＳＣＶ−ｅＧＦＰ及び１０μｇ／ｍＬのプロタミンに曝露
した。ＭＡＳＣの４０〜７０％に形質導入された。ｅＧＦＰの発現はｅｘ  ｖｉ
ｖｏにて少なくとも３ヶ月間維持され、分化後も多くの細胞において発現が維持
された。１個の細胞を選別した場合、１，０００個を上回るウェルにおいて増殖
はまったく見られなかったが、ウェル当たり１０個の細胞を播種した場合にはウ
ェルの３％において細胞の増殖が見られた。ウェルの０．３％のみに１０７個を
越える細胞への更なる増殖が見られた。次いでこれらの細胞を中胚葉由来のすべ
ての種類の細胞に分化誘導した（骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞、骨格筋及び
平滑筋細胞、及び内皮）。ここでもやはり免疫組織化学法及びウエスタンブロッ
ティングによって分化を確認した。細胞を更にｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲにかけて挿
入されたウイルスＤＮＡを挟み込んだヒトＤＮＡの配列が類似していることを証
明した。発明者等はレトロウイルス遺伝子がＭＡＳＣ及び分化した子孫の別々の
３つのクローンのヒトゲノムの同じ部位に挿入されていることを確認した。
【０３６５】
ＭＡＳＣの生着
発明者等は多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）が生着し、ｉｎ  ｖｉｖｏにて維持
されるかを調べるため研究を行った。
【０３６６】
１．発明者等はｅＧＦＰ＋のＭＡＳＣをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに筋肉内注射
した。４週間後に動物を殺し、筋肉を調べてヒトＥＳ細胞に関し上記に述べたよ
うに奇形腫が発生しているかを判定した。５頭中５頭の動物に奇形腫の発生は見
られなかった。ｅＧＦＰ陽性の細胞は検出された。
【０３６７】
２．発明者等はｅＧＦＰ＋のＭＡＳＣをＳＣＩＤマウス胎児に子宮内ＩＶ注入
した。出生直後に動物を調べた。ＰＣＲ分析により心臓、肺、肝臓、脾臓、及び
骨髄にｅＧＦＰ＋細胞の存在が確認された。
【０３６８】
３．発明者等は無傷または梗塞を発生したラットの脳にＭＡＳＣを定位的に移
植した。ＭＡＳＣは神経細胞の表現型を獲得し、少なくとも６週間にわたって維
持された。
【０３６９】
ＭＡＳＣの応用例
１．骨芽細胞
骨細胞に分化誘導された本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、細胞治療
として、または骨粗鬆症における組織再生、ページェット病、骨折、骨髄炎、骨
壊死、軟骨形成不全症、骨形成不全症、遺伝性多発性外骨腫、多発性骨端異形成
症、マルファン症候群、ムコ多糖症、神経繊維腫症、または脊柱側彎症、限局性
奇形、二分脊椎、半側椎骨、融合椎骨、肢奇形の再建術、腫瘍により損傷した組
織の再建、中耳炎などの感染症後の再建に使用することが可能である。
【０３７０】
２．軟骨細胞
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を分化誘導して形成される軟骨細胞は
、細胞治療または、年齢関連疾患及び損傷、スポーツ関連損傷、あるいは、慢性
関節リウマチ、関節症性乾癬、ライター関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、強
直性脊椎炎、変形性関節炎などの特定の疾患における組織再生、外耳再建術、鼻
再建術、及び輪状軟骨の再建術に利用することが可能である。
【０３７１】
３．脂肪細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）より得られた脂肪細胞は、再建手術や美容整形
手術における再形成及びＩＩ型糖尿病の治療に利用することができる。再建手術
においては、本発明の方法により分化させた脂肪細胞を、例えば乳房切除術後の
乳房再建や、顔面や手からの腫瘍除去などの他の外科手術による欠損組織の再形
成に利用することが可能である。美容整形手術では、本発明の方法によって本発
明の細胞から得られた脂肪細胞を、乳房拡大や老化した皮膚の皺取りなど様々な
方法において使用することが可能である。更にこのようにして得られた脂肪細胞
によって脂肪の制限の研究に有効なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルシステムが与えられ
る。
【０３７２】
４．繊維芽細胞
ＭＡＳＣから誘導される繊維芽細胞は、細胞治療や組織の修復に利用して外傷
の治癒を促したり、美容整形手術用の土台などの連結組織の支持要素を与えるこ
とが可能である。
【０３７３】
５．骨格筋
ＭＡＳＣを分化誘導して得られる骨格筋細胞は、デュシャンヌ型筋ジストロフ
ィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、骨格筋ミオパシ
ーの治療における細胞療法や組織修復、及び骨格筋損傷を修復するための再建術
に利用することが可能である。
【０３７４】
６．平滑筋
ＭＡＳＣを分化誘導して得られる平滑筋細胞は、細胞治療や、食道閉鎖、腸閉
鎖、腸重積症などの消化器系の発生異常の治療における組織修復、及び腸梗塞手
術や結腸結腸吻合術後の組織の置換に利用することが可能である。
【０３７５】
本発明のＭＡＳＣから形成された平滑筋細胞は更に、膀胱や子宮の再建、新生
血管形成、例えばアテローム性動脈硬化症や動脈瘤などによって損傷した血管の
修復に利用することが可能である。平滑筋前駆細胞（メサンギウム細胞）を糸球
体の疾患や細胞治療のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして、または糖尿病性ニューロ
パシーにおける組織再生に利用することが可能である。平滑筋前駆細胞は更に、
血圧の調節において重要な遠位曲尿細管や傍糸球体組織の緻密斑の修復に利用す
ることが可能である。
【０３７６】
７．心筋細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）から誘導される心筋細胞は、弁置換術、先天性
心異常あるいは心筋症や心内膜炎によるうっ血性心不全や、心筋梗塞により損傷
した心組織を治療するための細胞治療や組織修復に有用である。細胞は特に注射
により局所的に投与することによって高い効果を得ることが可能である。ＭＡＳ
Ｃから分化した小膠細胞は、脊髄損傷、及びハンチントン病、パーキンソン病、
多発性硬化症やアルツハイマー病などの神経変性性疾患の治療、ならびに中枢神
経系を冒す感染症によって損傷した組織の修復に使用することが可能である。サ
イトカインを産生するよう遺伝子改変された小膠細胞は、血液脳関門のためにア
クセスが困難な中枢神経系の感染症を治療するための移植に利用することも可能
である。グリア細胞は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症や脳腫瘍による発作
後の神経組織を再生するため、及び脊髄損傷後に神経組織を再生するための成長
因子または成長因子阻害物質を産生するために利用することも可能である。
【０３７７】
８．間質細胞
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）から誘導される間質細胞は、化学療法
後の骨髄置換のため、また骨髄移植のための移植細胞として使用することができ
る。乳癌では強力な化学療法レジメンを行う前に患者から例えば骨髄吸引液を採
取する。こうした化学療法は組織、特に骨髄に損傷を与える。患者の骨髄から単
離したＭＡＳＣを培養して増殖させ、骨髄細胞の再定着に充分な自己細胞を得る
ことが可能である。これらの細胞は異なる組織に分化することが可能であるので
局所的または全身的に導入された細胞が他の損傷組織に移動し、その組織環境に
存在する細胞因子によってこれらの細胞の分化が誘導されて増殖するという利点
が得られる。
【０３７８】
９．内皮細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を前記に述べた方法により内皮細胞に分化させ
、この内皮細胞を第ＶＩＩＩ因子欠損症の治療、及び新生血管形成のための血管
新生因子の産生に利用することが可能である。この内皮細胞は更に血管新生阻害
剤を使用した腫瘍抑制のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル、ならびに脈管炎、過敏
症、及び凝固疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを与えるものである。こうした培養
内皮細胞と当業者に周知の高速スクリーニング法を用いることにより、治療効果
を有する可能性のある数千もの有用化合物をより速やかにかつ高いコスト効率で
スクリーニングすることが可能である。
【０３７９】
１０．造血細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は造血細胞に分化することが可能である。した
がって本発明の細胞を利用して高投与量の化学療法後に骨髄を再生することが可
能である。化学療法を行う前に患者から骨髄吸引液を採取する。本発明の方法に
より幹細胞を単離し、培養、分化誘導する。この後、分化細胞と未分化細胞の混
合物を患者の骨髄腔に再導入する。現在この目的で造血幹細胞を用いた臨床試験
が行われているが、本発明の幹細胞は骨髄ばかりでなく他の組織の化学療法によ
って損傷した細胞をも置換することが可能な細胞に更に分化可能であるという更
なる利点を有するものである。本発明のＭＡＳＣから誘導される造血細胞を血液
細胞に更に分化させて血液バンクで保管することにより、輸血用血液が不足する
問題を解消することが可能となる。
【０３８０】
１１．神経外胚葉細胞
ＭＡＳＣから分化した小膠細胞は、脊髄損傷、及びハンチントン病、パーキン
ソン病、多発性硬化症やアルツハイマー病などの神経変性性疾患の治療、ならび
に中枢神経系を冒す感染症によって損傷した組織の修復に使用することが可能で
ある。サイトカインを産生するよう遺伝子改変された小膠細胞は、血液脳関門の
ためにアクセスが困難な中枢神経系の感染症を治療するための移植に利用するこ
とも可能である。グリア細胞は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症や脳腫瘍に
よる発作後の神経組織を再生するため、及び脊髄損傷後に神経組織を再生するた
めの成長因子または成長因子阻害物質を産生するために利用することも可能であ
る。乏突起膠細胞及びアストロサイトに分化させたＭＡＳＣを例えば、脱髄組織
、特に脊髄に移植し、脱髄組織中でＭＡＳＣに周囲の神経組織にミエリン鞘を形
成させることが可能である。この方法は、乏突起膠細胞及びアストロサイト前駆
細胞の供給源として胚性幹細胞を使用した場合に有効であることがマウスにおい
て証明されている（Brustle, O., et al., Science(1999) 285: 754-756）。本
発明のＭＡＳＣは胚性幹細胞の幅広い分化特性を有するばかりでなく移植用の自
己細胞を与えるという更なる利点を有する。
【０３８１】
本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、例えばムコ
多糖症、白質ジストロフィー（グロボイド細胞性白質ジストロフィー、キャナヴ
ァン病）、フコシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ニーマン−ピック病
、サンフィリポ症候群、ウォルマン病、及びテイ−サックス病などの先天性神経
変性性疾患や蓄積症を治療することが可能である。また本発明のＭＡＳＣは、脳
卒中、中枢神経系出血、中枢神経系外傷などの外傷性疾患、脊髄損傷や脊髄空洞
症などの末梢神経系疾患、網膜剥離、黄斑変性や他の変性網膜疾患及び糖尿病性
網膜疾患などの網膜疾患の治療に使用することが可能である。
【０３８２】
１２．外胚葉性上皮細胞
更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、脱
毛症などの皮膚疾患、火傷の傷や白子症などの皮膚欠陥を治療もしくはその症状
を緩和することが可能である。
【０３８３】
１３．内胚葉性上皮細胞
本発明のＭＡＳＣから誘導される上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子
治療に使用して、複数の臓器疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能
である。この細胞を使用して、例えば、ムコ多糖症、白質ジストロフィー、ＧＭ
２ガングリオシドーシスなどの蓄積症、クリグラー−ナジャー症候群などの高ビ
リルビン疾患、例えばオルニチンデカルボキシラーゼ欠損症、シトルリン血症、
及びアルギニノコハク酸尿症といった尿素回路の先天異常などのアンモニア疾患
、フェニルケトン尿症、先天性高チロシン血症、及びα１−アンチトリプシン欠
損症などのアミノ酸及び有機酸異常、ならびに第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子欠損症な
どの凝固疾患といった先天性の肝疾患を治療もしくは緩和することが可能である
。この細胞はまたウイルス感染による後天性肝疾患を治療するために使用するこ
とも可能である。本発明の細胞は更に、人口肝臓（腎臓透析に類似）の製造、凝
固因子の生成、及び、肝上皮細胞が産生するタンパク質や酵素の生成などのｅｘ
ｖｉｖｏでの応用例に使用することも可能である。
【０３８４】
更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、胆
汁性肝硬変や胆道閉鎖症などの胆道疾患を治療もしくはその症状を緩和すること
も可能である。
【０３８５】
更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、膵
臓閉塞症、膵臓炎、及びα１−アンチトリプシン欠損症などの膵臓疾患を治療も
しくはその症状を緩和することが可能である。更に、本発明の細胞から膵臓上皮
細胞が得られ、また神経細胞が得られることより、β細胞を生成することが可能
である。これらの細胞を糖尿病の治療に用いることも可能である（皮下移植、膵
臓内または肝臓内移植）。更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺
伝子治療に使用して、腸閉塞、炎症性腸疾患、腸梗塞、及び腸切除などの腸上皮
組織の疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。
【０３８６】
１４．非最適培養条件下での不老性を与えるためのＭＡＳＣの改変
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は長いテロメア（１２ｋｂ）を有し、このテロ
メア長は異なる年齢のドナーから得られた細胞で異ならない。ＭＡＳＣをｅｘ  
ｖｉｖｏ培養するとテロメアはｅｘ  ｖｉｖｏ培養中において４ヶ月以上の長期
にわたって（３５回の細胞倍加より長い期間）短くならない。これはより長期に
及ぶこともある。すべての年齢の人から得られるＭＡＳＣ中にテロメラーゼが存
在する。ＭＡＳＣをコンフルエンスに達した状態で培養すると老化が始まりテロ
メアは短くなりはじめる。生産、商業上の理由などにより比較的高密度の培養中
で長期に及ぶ増殖を行うことが好ましいことから、ＭＡＳＣをテロメアーゼを含
む構築体により形質導入／トランスフェクトして、これにより細胞の老化を防止
することが可能である。これらの細胞はｉｎ  ｖｉｖｏ移植に使用することが可
能であるが、移植に先立って細胞からテロメラーゼを除去することが好ましい。
これはテロメラーゼが２個のＬｏｘＰ部位の間に位置するように構築体を構築す
ることによって行うことが可能である。これによりＣｒｅリコンビナーゼによっ
てテロメラーゼを切り出すことが可能となる。Ｃｒｅは、第２のベクター／プラ
スミドを用いるかまたはテロメラーゼ含有構築体の一部として標的細胞に形質導
入／トランスフェクトすることが可能である。Ｃｒｅは、構成的活性型として、
または、例えば天然エストロゲン受容体（ＥＲ）リガンドでは誘導されないが４
−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）により誘導可能なヒトエストロゲン受容
体（ＥＲ）の１以上の突然変異リガンド結合ドメインを当該タンパク質に融合す
るか、またはテトラサイクリンやラパマシン誘導などの薬剤誘導系を用いること
により、誘導可能な酵素として導入することが可能である。
【０３８７】
１５．免疫拒絶反応を防止するための移植アプローチ
ａ．万能ドナー細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を遺伝子操作して細胞及び遺伝子治療のための
万能ドナー細胞とし、遺伝病などの疾患の治療や酵素の置換を行うことが可能で
ある。未分化のＭＡＳＣは、ＨＬＡ−Ｉ型、ＨＬＡ−ＩＩ型抗原やβ２マイクロ
グロブリンを発現しないが、分化した子孫の一部には少なくともＩ型ＨＬＡ抗原
を発現するものがある。ＭＡＳＣは、ＨＬＡ−Ｉ型及びＨＬＡ−ＩＩ型抗原を欠
損させ、場合によりレシピエントとなる患者由来のＨＬＡ抗原を導入することに
より万能ドナー細胞に改変することが可能であり、これにより細胞が容易にＮＫ
細胞の媒介する細胞障害の標的となることを防止し、細胞での無制限のウイルス
増殖や細胞の悪性転換を防止することが可能となる。ＨＬＡ抗原は、相同組換え
、またはプロモーター領域への点突然変異の導入、または抗原の最初のエクソン
への点突然変異の導入により、キメラ細胞の場合におけるように停止コドンを導
入することによって欠損させることが可能である。ホストのＨＬＡ抗原は、レト
ロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルスなどのウイルスによる形質導
入やトランスフェクトによってＨＬＡ抗原のｃＤＮＡを標的細胞に導入すること
によって移入することが可能である。ＭＡＳＣを利用して特定のタンパク質を体
内または血中で所定範囲の量すなわち濃度となるよう調整することが可能である
。
【０３８８】
ｂ．免疫系による認識を回避するための子宮内移植
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を子宮内移植生着に使用して遺伝子の異常を修
正したり、ホストの免疫系の発達以前にホストの免疫系に認識されなくなるよう
に細胞を導入することが可能である。これは動物の体内で血液などのヒト細胞を
大量に生産するための方法を与えるものであり、また正常なタンパク質または酵
素を産生する細胞を移植することによってヒト胎児の遺伝的欠陥を修正する方法
として利用することも可能である。
【０３８９】
１６．遺伝子治療
現在にいたるまで遺伝子治療に使用されるヒト細胞は、骨髄及び皮膚細胞に基
本的に限られていた。これは、他の種類の細胞は、体内から抽出し、培養中で増
殖させ、遺伝子改変し、組織が由来する患者に首尾良く再移植することが困難で
あることによる（Anderson, W. F., Nature(1998) 392: 30; Anderson, W. F.,
Scientific American (1995)273: 1-5; Anderson, W. F., Science (1992) 25
6: 808-813）。本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、体内から抽出、単離
し、培養中で未分化状態にてまたは分化誘導して増殖させ、様々な方法、殊にウ
イルスによる形質導入を用いて遺伝子改変することが可能である。遺伝物質の取
込み及び発現は証明することが可能であり、外来ＤＮＡの発現は発生過程の全体
を通じて安定的である。幹細胞に外来ＤＮＡを挿入するためのレトロウイルスな
どのベクターは当業者には周知のものである（Mochizuki, H., et al.,J. Viro
l (1998) 72(11): 8873-8883; Robbins, P., et al., J. Virol. (1997) 71 (1
2): 9466-9474; Bierhuizen, M., et al., Blood(1997) 90 (9): 3304-3315; D
ouglas, J., et al., Hum. Gene Ther.(1999) 10 (6): 935-945; Zhang, G., e
t al., Biochem. Biophys. Res. Commun.(1996) 227 (3): 707-711）。レトロ
ウイルスを用いて形質導入が行われると、緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発
現が最終分化した筋細胞、内皮細胞、及び単離ＭＡＳＣに由来するｃ−Ｋｉｔ陽
性細胞において持続する。これはＭＡＳＣに導入されたレトロウイルスベクター
の発現が分化の全体を通じて持続することを示すものである。予めレトロウイル
スベクターにより形質導入し、最初のＭＡＳＣ培養期間の数週目に選別した１０
個のｅＧＦＰ＋細胞にて開始した培養から最終分化が誘導された。
【０３９０】
造血幹細胞は、その分化能は限定されたものであるが、遺伝子治療において有
用であることが示されている（参照、Kohn, D. B., Curr.Opin. Pediatr. (199
5) 7: 56-63）。本発明の細胞は、レトロウイルスベクターが未分化の幹細胞に
導入されたにも関わらず、最終分化した筋細胞、内皮細胞及びｃ−Ｋｉｔ陽性細
胞において緑色蛍光タンパク質の発現が持続することによって証明されるように
、最終分化した時点で形質導入またはトランスフェクトされたＤＮＡを維持可能
な広範な種類の分化細胞を提供するものである。
【０３９１】
本発明のＭＡＳＣは、遺伝子治療用の造血幹細胞と比較して他の利点も有する
。本発明の幹細胞は局所麻酔下で得られる骨髄吸引液から単離し、培養中で増殖
させ、外来遺伝子をトランスフェクトすることが比較的容易に可能である。同様
な目的で用いる相応な数の造血幹細胞は、少なくとも１Ｌの骨髄から単離しなく
てはならず、また細胞を培養中で増殖させることも困難である（参照、Prockop,
D. J., Science (1997) 276:71-74）。
【０３９２】
遺伝子治療用の候補遺伝子の例としては、アポリポタンパク質Ｅ（アルツハイ
マー病や心血管疾患のリスクとの相関が示されている）、ＭＴＨＦＲ（高ホモシ
ステイン値及び脳卒中と変異体との相関が示されている）、第Ｖ因子（血栓のリ
スクと相関を有する）、ＡＣＥ（心疾患のリスクと変異体との相関が示されてい
る）、ＣＫＲ−５（ＨＩＶに対する耐性との相関が示されている）、ＨＰＲＴ（
ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、欠損によりレッ
シュ−ナイハン病を発症）、ＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、欠損
により重篤な免疫不全疾患につながる）、ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ、欠
損により重篤な複合免疫不全疾患につながる）、ｐ２１（毛細管拡張性運動失調
の治療用候補遺伝子として提唱されている）、ｐ４７（欠損と、慢性肉芽腫症の
患者の好中球のオキシダーゼ活性の欠落との相関が示されている）、ジェンバン
ク受託番号Ｍ５５０６７及びＭ３８７５５）Ｒｂ（腫瘍形成に関連する網膜芽腫
感受性遺伝子、ジェンバンク受託番号Ｍ１５４００）、ＫＶＬＱＴ１（カリウム
チャンネルタンパク質、異常型と心不整脈との相関が示されている。ジェンバン
ク受託番号Ｕ４０９９０）、ジストロフィン遺伝子（デュシェンヌ型筋ジストロ
フィーに関連、ジェンバンク受託番号Ｍ１８５３３、Ｍ１７１５４、及びＭ１８
０２６）、ＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症に関連する膜内外伝導度レギュレータ、ジェ
ンバンク受託番号Ｍ２８６６８）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（
毛細管拡張性運動失調に関連、ジェンバンク受託番号Ｕ２６４５５）、及びＶＨ
Ｌ（このタンパク質の欠損または突然変異はフォンヒッペル−リンダウ病との関
連が示されている）をコードする遺伝子が挙げられる（Latif, F., et al.,Sci
ence (1993) 260: 1317-1320）。これらの遺伝子改変細胞の使用により効果的に
治療可能な他の疾患としては、第ＩＶ因子欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損
症（重篤な複合免疫不全疾患すなわちＳＣＩＤに関連）や糖尿病、及びグルコセ
レブロシダーゼ、α−イヅロニダーゼの血書運症が挙げられる。
【０３９３】
これらの新規な遺伝子は、酵素レベルが調整可能であるように誘導性プロモー
ターにより発現調節することが可能である。これらの誘導性プロモーター系は産
生させるタンパク質に結合させたヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）の突然変異リ
ガンド結合ドメインを有していてもよい。そのためには患者はタンパク質を発現
させるためにタモキシフェンを摂取する必要がある。あるいは、テトラサイクリ
ン−ｏｎ／ｏｆｆ系、ＲＵ４８６やラパマイシン誘導系を使用することも可能で
ある。相対的選択発現を行う更なる方法は組織特異的プロモーターを使用するこ
とである。例えば脳では、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター（Ａｄ−Ｎ
ＳＥ）やグリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターにより発現調節
される導入遺伝子を導入することが可能であり、これにより脳組織においてほぼ
当該遺伝子のみの発現が実現される。同様にＴｅｃプロモーターやＶＥ−カドヘ
リンプロモーターを使用することにより内皮細胞のみにおける発現を得ることも
可能である。
【０３９４】
遺伝子改変されたＭＡＳＣは局所的に導入するか全身的に注入することが可能
である。より限定された分化能を有するこうしたヒト幹細胞は、第ＩＸ因子の遺
伝子をトランスフェクトした場合、ＳＣＩＤマウスへの全身注入後少なくとも８
週間にわたってタンパク質を分泌する（Keating, A., et al., Blood(1996) 88
: 3921）。本発明のＭＡＳＣは、これまでに報告されているいかなる非胚性幹細
胞よりも幅広い分化能を有し、異なる組織に移動してそこでサイトカイン、成長
因子などの因子によって細胞分化が誘導されることから、全身的または局所的投
与において更なる利点を与えるものである。分化した細胞は周囲の組織の一部と
なるが、誘導された遺伝子のタンパク質産物を産生する能力は維持したままとな
る。
【０３９５】
例えばパーキンソン病では、ヒト胎児の死体から得られた中脳性ドーパミンニ
ューロンがパーキンソン病の患者の脳内で生存、機能できることが臨床試験によ
り示されている。ＰＥＴ走査により、［１８Ｆ］フルオロドーパの細胞移植片周
囲の領域での取込み量が移植後に増加し、患者によっては少なくとも６週間はそ
の状態に維持されることが示されている（参照、Dunnett, S and A.Bjorklund,
Nature (1999) 399 (Suppl.)A32-A39; Lindvall. O., Nature Biotech. (1999
) 17: 635-636; Wagner, J., et al., NatureBiotech. (1999) 17: 653-659）
。胚性細胞と異なり、本発明が述べるところの単離ＭＡＳＣは、移植用の細胞の
速やかな供給を可能とする一方で、胚性細胞移植を病気の治療の有望な代替策と
ならしめている分化能を維持している。
【０３９６】
ＡＩＤＳの治療においては、本発明のＭＡＳＣを遺伝子操作して、ＨＩＶ感染
細胞内で産生される野生型Ｒｅｖの機能を阻害するＲｅｖのトランスドミナント
・ネガティブな突然変異体であるＲｅｖ１０を産生させることが可能である（Be
vec, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1992) 89: 9870-9874; Ranga, 
U., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1998) 95 (3): 1201-1206）。ＭＡ
ＳＣは、造血系列の細胞に分化誘導されて患者の体内に導入されると、欠乏した
ＨＩＶ感染患者のＴ細胞の供給を回復させる。遺伝子改変されたこれらの細胞は
突然変異体であるＲｅｖＭ１０を有するために多くのＨＩＶ株による感染の致死
的影響に対して耐性を獲得する。
【０３９７】
遺伝子改変されたＭＡＳＣを不活担体中にカプセル化して細胞をホストの免疫
系から保護する一方で分泌タンパク質を産生することが可能である。細胞のマイ
クロカプセル化の技術は当業者に周知のものである（参照、Chang, P., etal.,
Trends in Biotech. (1999)17(2): 78-83）。細胞のマイクロカプセル化の材
料としては例えば、ポリマーカプセル、アルギネート−ポリ−Ｌ−リシン−アル
ギネートマイクロカプセル、ポリ−Ｌ−リシン−アルギン酸バリウムカプセル、
アルギン酸バリウムカプセル、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ
／ＰＶＣ）製中空繊維、及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）製中空繊維などが
挙げられる。例えば米国特許第５，６３９，２７５号（ビージ，Ｅ．等）（Ｂａ
ｅｔｇｅ，Ｅ．）には、遺伝子操作した細胞が封入された生体適合性カプセルを
用いた生物学的活性分子の長期かつ安定的な発現のための装置及び方法が開示さ
れている。このような生体適合性免疫隔離性カプセルは、本発明のMASCとともに
、例えば糖尿病やパーキンソン病などの多くの生理的疾患を治療するための方法
を与えるものである。
【０３９８】
例えば糖尿病の患者では、生理学的に治療効果を奏するレベルでインスリンを
産生するように遺伝子改変した異種幹細胞を患者の組織内に送達すべくカプセル
化することが可能である。あるいは、患者自身の骨髄吸引液から得られた自家幹
細胞に上記に述べたようにレトロウイルスにて形質導入することも可能である。
これらの細胞は、生理学的に治療効果を奏するレベルのインスリンを産生するよ
うに遺伝子改変した後、チャン（Ｃｈａｎｇ）やビージ（Ｂａｅｔｇｅ）により
述べられるようにカプセル化して患者の組織内に導入することが可能であり、こ
れにより細胞は組織中に滞留して長期にわたってインスリンを産生する。
【０３９９】
本発明の細胞のマイクロカプセル化の別の利点は、マイクロカプセル内に生物
学的治療効果を奏する分子を産生する各種細胞を封入できる点である。本発明の
ＭＡＳＣは、それぞれ治療上有効なレベルの生物学的活性分子を産生するように
遺伝子改変可能な、複数の異なる細胞系列に分化誘導することが可能である。異
なる遺伝子要素を有するＭＡＳＣを共にカプセル化して異なる生物学的活性分子
を産生することが可能である。
【０４００】
本発明のＭＡＳＣはｅｘ  ｖｉｖｏにて遺伝子改変することにより、遺伝子治
療における最も困難な障壁を克服することが可能である。例えば、患者の骨髄吸
引液を採取し、この吸引液からＭＡＳＣを単離する。このＭＡＳＣを１以上の所
望の遺伝子産物を発現するように遺伝子改変する。このＭＡＳＣをｅｘ  ｖｉｖ
ｏにてスクリーニングもしくは選択して首尾良く改変された細胞を特定し、この
細胞を局所的あるいは全身的に患者に再導入することが可能である。あるいは、
ＭＡＳＣを遺伝子改変して培養により分化誘導し、移植用の特定の細胞系を得る
ことも可能である。いずれの場合にも、移植されたＭＡＳＣによって所望の遺伝
子産物を発現可能な安定的にトランスフェクトされた細胞の供給源が与えられる
。特に患者自身の骨髄吸引液がＭＡＳＣの供給源である場合、本方法により移植
細胞を産生するための免疫学的に安全な方法が与えられる。
【０４０１】
この方法を、その幾つかを数えあげるだけでも、糖尿病、心筋症、神経変性性
疾患、及びアデノシンデアミナーゼ欠損症の治療に用いることが可能である。例
えば糖尿病では、ＭＡＳＣを単離し、インスリンを産生するように遺伝子改変し
、病気を罹患した患者に移植することが可能である。疾患が自己免疫に関連した
ものである場合、ＭＡＳＣを、免疫監視機構を免れるように改変ＭＨＣを発現す
るかもしくはＭＨＣを発現しないように遺伝子改変することが可能である。ウイ
ルスゲノムのＥ３領域を発現するアデノウイルスベクターを利用することにより
、移植された膵臓小島細胞においてＭＨＣの発現が抑制された。発明者等が証明
したように、本発明の細胞は安定的にトランスフェクトまたは形質導入すること
が可能であり、したがって糖尿病患者に移植するためのインスリンのより恒久的
な供給源を与えるものである。
【０４０２】
特にＭＨＣの発現を変化させるように遺伝子改変したドナーＭＡＳＣ、及び特
に所望のヘモグロビン遺伝子産物を発現するように遺伝子改変した自家ＭＡＳＣ
は、鎌状赤血球貧血症及びサラセミアの治療のための細胞療法に特に有効である
。
【０４０３】
ＭＡＳＣを遺伝子改変する方法
本明細書中に述べられる方法によって単離される細胞は、当業者に周知の様々
な方法により細胞内にＤＮＡやＲＮＡを導入することによって遺伝子改変するこ
とが可能である。これらの方法は大まかに４つの大きなカテゴリーに分類される
。すなわち、（１）例えばレトロウイルス（レンチウイルスなど）、シミアンウ
イルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、シンドビスウイルス、及びウシパピ
ローマウイルスなどのＤＮＡまたはＲＮＡウイルスの使用を含むウイルスによる
導入法、（２）リン酸カルシウムトランスフェクション及びＤＥＡＥデキストラ
ントランスフェクション法などの化学的導入法、（３）例えば、リポソーム、赤
血球ゴースト、及びプロトプラストなどの、ＤＮＡを充填した膜小胞を用いた膜
融合導入法、（４）マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、また
は直接的な「裸」のＤＮＡの導入などの物理的導入法である。多能性成体幹細胞
（ＭＡＳＣ）は、予め選択した単離ＤＮＡの挿入、予め選択した単離ＤＮＡによ
る細胞ゲノムのセグメントの置換、または、細胞のゲノムの少なくとも一部の欠
失または不活化によって遺伝子改変することが可能である。細胞ゲノムの少なく
とも一部の欠失及び不活化は、例えば、遺伝子組換え、アンチセンス法（ペプチ
ド核酸すなわちＰＮＡの使用を含む）、リボザイム法などの様々な方法によって
行うことが可能である。１以上の予め選択されたＤＮＡ配列の挿入は相同組換え
やホスト細胞のゲノムへのウイルスによる挿入によって行うことが可能である。
プラスミド発現ベクターや核局在化配列を用いて所望の遺伝子配列を細胞内、特
に細胞核内に導入することも可能である。ポリヌクレオチドを核に誘導する方法
は当該技術分野にあっては周知のものである。遺伝物質は、対象遺伝子を特定の
化学物質／薬剤の使用によりポジティブまたはネガティブに誘導するか、特定の
薬剤／化学物質の投与後に消失させるか、化学物質（タモキシフェン応答性突然
変異エストロゲン受容体など）による誘導または特定の細胞区画（細胞膜など）
中における発現を可能とするように標識可能であるプロモーターを利用して導入
することが可能である。
【０４０４】
相同組換え
リン酸カルシウムトランスフェクションは、プラスミドＤＮＡ／カルシウムイ
オンの沈殿物を利用したものであり、標的遺伝子またはポリヌクレオチドを組み
込んだプラスミドＤＮＡを単離または培養ＭＡＳＣに導入するために用いること
できる。簡略に述べると、プラスミドＤＮＡを塩化カルシウムの溶液に混合した
後、リン酸緩衝した溶液に加える。沈殿物が形成された時点でこの溶液を培養細
胞に直接加える。ＤＭＳＯまたはグリセロールによる処理を利用してトランスフ
ェクション効率を向上させることが可能であり、ビス−ヒドロキシエチルアミノ
エタンスルホネート（ＢＥＳ）を使用して安定的トランスフェクタントのレベル
を高めることが可能である。リン酸カルシウムトランスフェクションシステムは
一般に市販されている（例、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ（登録商標）、プロメガ社（
Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）、ウィスコンシン州マディソン）。
【０４０５】
ＤＥＭＥデキストラントランスフェクション法はやはり当業者に周知の方法で
あり、一過性のトランスフェクションが望ましい場合には、しばしばより効率が
高いことからリン酸カルシウムトランスフェクション法よりも好ましい。
【０４０６】
本発明の細胞は単離細胞であるため、細胞内に遺伝物質を導入するにはマイク
ロインジェクションが特に効果的である。
【０４０７】
簡略に述べると、細胞をまず光学顕微鏡のステージに乗せる。顕微鏡による拡
大像を見ながらガラス製のマイクロピペットを核に穿刺してＤＮＡまたはＲＮＡ
を注入する。この方法は所望の遺伝物質を直接核に導入することが可能であり、
注入されたポリヌクレオチドの細胞質やリソゾームにおける分解が避けられるた
めに有利である。この方法は形質転換動物の生殖細胞の改変に効果的に用いられ
てきた。
【０４０８】
本発明の細胞はエレクトロポレーションによって遺伝子改変することができる
。まず標的ＤＮＡまたはＲＮＡを培養細胞の懸濁液に加える。このＤＮＡ／ＲＮ
Ａ−細胞懸濁液を２個の電極間に置き、電気パルスを加えると、細胞の外膜に小
孔が開くことによって膜に一時的に透過性が生じる。この膜に開いた小孔から細
胞内に標的ポリヌクレオチドが入り込み、電場を中断すると小孔は約１〜３０分
で閉鎖する。細胞を遺伝子改変するためのＤＮＡやＲＮＡのリポソームによる導
入は、ポリヌクレオチドと安定的な複合体を形成するカチオン性リポソームを利
用して行うことができる。リポソーム複合体を安定化させるためにジオレイルフ
ォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレイルフォスファチジ
ルコリン（ＤＯＰＣ）を添加することが可能である。リポソーム導入法用に推奨
される試薬は一般に市販されているＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ライフ
・テクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））である
。例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）は、カチオン性脂質であるＮ−［１
−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニ
アクロリドとＤＯＰＥとの混合物である。線形ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡやＲＮ
Ａの導入は、リポソーム導入法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで
行うことが可能である。リポソームは大きなＤＮＡ片を包含することが可能であ
り、ポリヌクレオチドを分解から保護し、特定の細胞または組織を狙って投与す
ることが可能であることからリポソーム導入法は好ましい方法である。リポソー
ム法に依拠した他の導入システムが数多く市販されており、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ
（商標）（キアジェン社（Ｑｉａｇｅｎ））、ＤＯＴＡＰ（ロシュ・モレキュラ
ーバイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ））、ＦｕＧｅｎｅ６（商標）（ロシュ・モレキュラーバイオケミカルズ
社）、及びＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ
））などがある。カチオン性脂質による遺伝子導入効率は、アベ等の方法（Abe,
A., et al. (J.Virol. (1998)72: 6159-6163)）におけるように、水泡性口内
炎ウイルスエンベロープの精製Ｇ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）などの精製したウ
イルスまたは細胞エンベロープ成分を使用することによって高めることが可能で
ある。
【０４０９】
リポポリアミンコーティングしたＤＮＡを用いた始原及び樹立された哺乳動物
細胞系へのＤＮＡの導入において有効であることが示されている遺伝子導入法を
用いてＭＡＳＣに標的ＤＮＡを導入することが可能である。この方法はＬｏｅｆ
ｆｌｅｒ，Ｊ．及びＢｅｈｒ，Ｊ．により一般的に述べられている（Loeffler, 
J. and Behr, J. Methods in Enzymology(1993) 217: 599-618）。
【０４１０】
裸のプラスミドＤＮＡは単離ＭＡＳＣから分化した細胞からなる組織マス中に
直接注入することが可能である。この方法はプラスミドＤＮＡを骨格筋組織に導
入するうえで有効であることが示されており、マウス骨格筋内での発現が１回の
筋内注入後１９ヶ月以上にわたって観察されている。活発に分裂中の細胞はより
効率的に裸のプラスミドＤＮＡを取り込む。このため、プラスミドＤＮＡによる
処理に先立って細胞分裂を刺激しておくことが有利である。
【０４１１】
マイクロプロジェクタイルによる遺伝子導入を利用してｉｎ  ｖｉｖｏまたは
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＭＡＳＣに遺伝子を導入することも可能である。マイクロ
プロジェクタイル遺伝子導入法の基本的な手順についてはＪ．Ｗｏｌｆｆにより
Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （１９９４）の１９５頁に述べられてい
る。簡略に述べると、標的遺伝子をコードしたプラスミドＤＮＡで、通常１〜３
ミクロンの粒径を有する金またはタングステン粒子である微小なビーズをコーテ
ィングする。コーティングした粒子は発射室の上方に挿入されたキャリアシート
上に置く。キャリアシートは発射後保持スクリーンに向かって加速される。保持
スクリーンはキャリアシートの更なる運動を阻止するバリアとして機能し、その
際、ポリヌクレオチドコーティングされた粒子は、分化ＭＡＳＣからなる組織マ
スなどの標的表面に向けて通常ヘリウムガスの流れによって推進される。微粒子
注入法は既に述べられているものであり、こうした方法は当業者に周知のもので
ある（参照、Johnston, S.A., et al., Genet.Eng. (NY) (1993) 15: 225-236;
Williams, R.S., et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 2726-2730
; Yang, N.S., et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA (1990) 87: 9568-9572）
。
【０４１２】
Ｓｅｖｅｓｔｙｅｎ等（Nature Biotech. (1998) 16: 80-85）によって述べら
れているように、プラスミドＤＮＡにシグナルペプチドを結合させてこのＤＮＡ
を細胞核に取り込ませることでより効率的な発現を図ることが可能である。
【０４１３】
ウイルスベクターを利用して本発明のＭＡＳＣ及びその子孫を遺伝子改変する
ことが可能である。先に述べた物理的方法と同様、ウイルスベクターを利用して
例えば１以上の標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子やリボザイム
配列を細胞内に導入する。ウイルスベクター及びそれらを利用して細胞にＤＮＡ
を導入する方法は当業者に周知のものである。本発明の細胞を遺伝子改変するう
えで使用可能なウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデ
ノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターな
ど）、アルファウイルスベクター（例、シンドビスベクター）、及びヘルペスウ
イルスベクターなどが挙げられる。
【０４１４】
多くのレトロウイルスベクターが分裂していない細胞に効果的にＤＮＡを導入
するために開発されているが、レトロウイルスベクターは活発に分裂中の細胞に
形質導入するうえで有効である（Mochizuki, H., et al., J.Virol. (1998) 72
: 8873-8883）。レトロウイルス用のパッケージング細胞系は当業者には周知の
ものである。パッケージング細胞系はウイルスベクターのカプシドの生成及びウ
イルス粒子の成熟に必要なウイルスタンパク質を与えるものである。一般にこう
したウイルスタンパク質としては、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖといったレトロ
ウイルスの遺伝子によりコードされるタンパク質が含まれる。エコトロピック、
ゼノトロピック、またはアンフォトロピックのレトロウイルスベクターを生成す
るうえで好適なパッケージング細胞系を既知の細胞系から選択することにより、
レトロウイルスベクター系に一定の特異性を与えるものである。
【０４１５】
一般にレトロウイルスＤＮＡベクターはパッケージング細胞系とともに細胞内
で所望の標的配列／ベクターの組合わせを産生するために用いられる。簡略に述
べると、レトロウイルスＤＮＡベクターは、マルチクローニング部位とＳＶ４０
プロモーターの近くに２個のレトロウイルスＬＴＲ配列を有するプラスミドＤＮ
Ａである。第１のＬＴＲは、マルチクローニング部位にクローニングされた標的
遺伝子の配列に機能的に連関しているＳＶ４０プロモーターの５’側に位置し、
マルチクローニング部位の後に３’側の第２のＬＴＲが位置する。レトロウイル
スＤＮＡベクターはその形成後、上述したようなリン酸カルシウムトランスフェ
クションによってパッケージング細胞系内に導入される。約４８時間のウイルス
産生後に、標的遺伝子配列を含むウイルスベクターを収穫する。
【０４１６】
レトロウイルスベクターにより特定の種類の細胞に遺伝子導入する方法はＭａ
ｒｔｉｎ等（J. Virol. (1999) 73: 6923-6929）によって示されている。この方
法では、アンフォトロピックなマウス白血病ウイルスのエンベロープに融合させ
た表面糖タンパクである高分子量メラノーマ関連抗原に対する一本鎖可変フラグ
メント抗体を利用して、ベクターによりメラノーマ細胞に狙いを絞って標的遺伝
子を導入している。例えば、分化細胞を遺伝子改変する場合などのように、標的
細胞に狙いを定めた遺伝子導入が望ましい場合には、本発明のＭＡＳＣから分化
した各細胞系列が発現する特異的マーカーに対する抗体フラグメントに融合させ
たレトロウイルスベクターを使用してこれらの細胞に狙いを絞って遺伝子を導入
することが可能である。
【０４１７】
レンチウイルスベクターを利用して本発明の細胞を遺伝子改変することも可能
である。多くのこうしたベクターが文献に述べられており、当業者に周知である
（Salmons, B. and Gunzburg, W.H.,"Targeting of Retroviral Vectors for G
ene Therapy," Hum. Gene. Therapy(1993) 4: 129-141）。これらのベクターは
ヒト造血幹細胞を遺伝子改変するうえで有効であることが示されている（Sutton
, R., et al., J. Virol. (1998) 72:9683-9697）。レンチウイルスのパッケー
ジング細胞系については既に述べられている（参照、Kafri, T., et al., J.Vi
rol. (1999)73: 576-584; Dull, T., et al., J. Virol. (1998) 72: 9683-969
7）。
【０４１８】
Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）などの組換えヘルペスウイルスを利
用して、エリスロポエチン受容体を発現している細胞に狙いを絞ってＤＮＡを導
入する試みが成功している（Laquerre, S., et al., J.Virol. (1998) 72: 968
3-9697）。これらのベクターを利用して本発明の細胞を遺伝子改変することも可
能であり、ウイルスベクターにより本発明の細胞が安定的に形質転換されたこと
を発明者等は証明している。
【０４１９】
アデノウイルスベクターは形質転換効率が高く、最大で８ＫｂのＤＮＡフラグ
メントの導入が可能であり、分裂中細胞及び分化細胞のいずれにも感染すること
ができる。多くのアデノウイルスベクターが文献に述べられており、当業者に周
知である（参照、Davidson, B.L., et al., NatureGenetics (1993) 3: 219-22
3; Wagner, E., et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA (1992) 89: 6099-6103）
。標的ＤＮＡをアデノウイルスベクターに挿入する方法は、組換えアデノウイル
スベクターを利用して標的ＤＮＡを特定の種類の細胞に導入するための方法と同
様、遺伝子治療の技術分野における当業者にとって周知のものである（参照、Wo
ld, W., Adenovirus Methods and Protocols,Humana Methods in Molecular Me
dicine (1998), Blackwell Science, Ltd.）。特定の種類の細胞に対する結合親
和性がウイルスベクター繊維の配列の改変によって証明されている。遺伝子導入
においてタンパク質の発現を調節するためのアデノウイルスベクター系がこれま
でに述べられている（Molin, M., et al., J. Virol.(1998) 72: 8358-8361）
。特定種類の細胞に狙いを絞った形質転換を可能とすべく遺伝子改変された受容
体特異性を有するアデノウイルスベクターを伝播させるための系もこれまでに述
べられている（Douglas, J., et al., NatureBiotech. (1999) 17: 470-475）
。最近の報告に見られるヒツジアデノウイルスベクターは、予め存在する体液性
免疫による遺伝子導入の際の障害の可能性を解消するものである（Hofmann, C.,
et al., J. Virol. (1999) 73:6930-6936）。
【０４２０】
更に、分子接合体ベクターを利用して特定細胞を標的とした遺伝子導入及び安
定的遺伝子発現を可能とするアデノウイルスベクターが入手可能である。このベ
クターは標的遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをポリリシンとともに濃縮して構
築される。このポリリシンは分裂能を失ったアデノウイルスに結合させてある（
Schwarzenberger, P., et al., J. Virol.(1997) 71） 8563-8571）。
【０４２１】
本発明の細胞を形質転換するためのアルファウイルスベクター、特にシンドビ
スウイルスベクターも入手可能である。これらのベクターは市販されており（イ
ンビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）、例として米国特許第
５，８４３，７２３号、Ｘｉａｎｇ，Ｃ．等（Science (1989) 243: 1188-1191
）、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．等（J. Virol. (1993) 67: 6439-6446）及
びＦｒｏｌｏｖ，Ｉ．等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 11371-1137
7）などに述べられている。
【０４２２】
発明者等は、Ｒｏｂｂｉｎｓ等（J. Virol. (1997) 71 (12): 9466-9474）に
より述べられるｅＧＦＰ−ＭＮＤレンチウイルスベクター及びｅＧＦＰ−ＭＧＦ
ベクターを用いた場合にＭＡＳＣが良好な形質転換能を有することを示した。こ
の方法を用いると、ＰＡ３−１７パッケージング細胞（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．
及びＣ．Ｂｕｔｔｉｍｏｒｅにより述べられる（Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 2
895-2902）ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞から誘導されるアンフォトロピックなパッケ
ージング細胞系）とプロタミン（８ｍｇ／ｍｌ）の組合わせ中で調製された上清
を含む緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ベクターに４．６時間と短時間の露曝後
に３０〜５０％のＭＡＳＣを形質転換することが可能である。未分化のＭＡＳＣ
の培養期間全体を通じてｅＧＦＰの発現が見られる。更に、リポフェクタミンを
用いたトランスフェクションによって導入遺伝子がＭＡＳＣに首尾良く導入され
ている。
【０４２３】
標的細胞へのトランスフェクションまたは形質導入は当業者に周知の方法にお
いて遺伝子マーカーを用いて証明することが可能である。例えばＡｅｑｕｏｒｅ
ａ  ｖｉｃｔｏｒｉａの緑色蛍光タンパク質は遺伝子改変された造血細胞の特定
及び追跡において有効なマーカーであることが示されている（Persons, D., et
al., Nature Medicine (1998) 4:1201-1205）。別の選択可能なマーカーとして
は、β−Ｇａｌ遺伝子、ｔｒｕｎｃａｔｅｄ神経成長因子受容体、薬物選択マー
カー（ＮＥＯ、ＭＴＸ、ヒグロマイシンなど）などが挙げられる。
【０４２４】
１７．ＭＡＳＣは組織の修復に有用である
本発明の幹細胞は組織修復に用いることも可能である。発明者等は、本発明の
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）が、繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞
、骨格筋、内皮、間質細胞、平滑筋、心筋、及び造血細胞などの多くの種類の細
胞に分化することを証明した。例えば、本明細書にて先に述べた方法により骨芽
細胞へと分化誘導したＭＡＳＣを骨に移植することにより、修復プロセスを促進
し、弱くなった骨を強化し、関節表面を再形成することが可能である。先に述べ
た方法により軟骨細胞へと分化誘導したＭＡＳＣを関節に注入して関節軟骨の表
面を再形成することが可能である。Ｃａｐｌａｎ等（米国特許第５，８５５，６
１９号）は、間葉幹細胞を含む収縮ゲルマトリクスからなる生体マトリクスイン
プラントについて述べている。このインプラントは、特に腱、靱帯、半月板や筋
肉といった組織の欠損を修復するように設計されたものである。例えばコラーゲ
ン、合成ポリグリコール酸繊維、または合成ポリ乳酸繊維などから形成される多
孔質の立体的足場に接するように軟骨細胞を加えることによって例えば軟骨を形
成することが可能である。発明者等は、本発明のＭＡＳＣを例えば軟骨細胞に分
化させ、これをコラーゲン、合成ポリグリコール酸や合成ポリ乳酸などの足場材
料の内部もしくは周囲に蓄積することによって組織修復を促すインプラントが得
られることを示した。
【０４２５】
更に、マトリクスにより本発明の細胞を特定の解剖学的部位に導入し、ここで
マトリクスに含まれるか、または細胞に取り込まれるようにマトリクスに含ませ
たプラスミドにコードされた特定の成長因子によって初期の細胞集団の成長を方
向付けることが可能である。例えば、特定のポリマーマトリクスを形成する際の
発泡工程においてマトリクスの孔内にＤＮＡを取り込ませることが可能である。
発泡工程において使用されるポリマーが膨張すると孔内にＤＮＡが閉じ込められ
、これによりプラスミドＤＮＡの放出を制御し、ＤＮＡを徐放することが可能と
なる。こうしたマトリクスの調製方法はＳｈｅａ等（NatureBiotechnology (19
99) 17: 551-554）によって述べられている。
【０４２６】
Ｂｏｎａｄｉｏ，Ｊ．等（Nature Medicine (1999) 5: 753-759）に述べられ
るように、サイトカイン、成長因子やホルモンをコードするプラスミドＤＮＡを
遺伝子活性化ポリマーマトリクス担体に閉じ込めることが可能である。この生分
解性ポリマーを例えば折れた骨の近傍に移植し、そこにＭＡＳＣを移植するとＭ
ＡＳＣがＤＮＡを取込んでサイトカイン、成長因子やホルモンを産生して局所濃
度が高くなり、これにより損傷組織の治癒が早められる。
【０４２７】
本発明の提供する細胞すなわち本発明の方法によって単離されるＭＡＳＣを利
用して移植用の組織または臓器を製造することが可能である。Ｏｂｅｒｐｅｎｎ
ｉｎｇ等（Nature Biotechnology (1999) 17: 149-155）によれば、イヌの膀胱
の外面より得た筋細胞とイヌ膀胱の内面より得たライニング細胞を培養し、この
培養から組織のシートを調製し、小型のポリマー製球体の外側を筋細胞で、内側
をライニング細胞でコーティングすることによって機能する膀胱を形成し得たこ
とが報告されている。この球体をイヌの尿路系に挿入すると、球体は膀胱として
の機能を開始した。Ｎｉｃｋｌａｓｏｎ等（Science (1999) 284: 489-493）に
よれば、培養した平滑筋及び内皮細胞より所定長の血管グラフト材料を製造し得
たことが報告されている。培養細胞から組織層を形成するための他の方法も当業
者に周知である（参照、Vacanti, et al., 米国特許第５，８５５，６１０号）
。これらの方法は、これまでに述べられているいずれの非胚性幹細胞と比較して
もより幅広い分化能を有する本発明の細胞と組み合わせて使用した場合に特に有
効である。
【０４２８】
本発明のＭＡＳＣは組織損傷領域に直接注入するかまたは全身的に注入するこ
とにより心筋細胞を復元することが可能であり、これにより細胞が心組織に生着
する。この方法は血管形成と組み合わせた場合に特に有効である。注入方法及び
血管形成の促進方法はいずれも当業者に周知のものである。本発明のＭＡＳＣは
、これらの方法を利用した心または他の組織修復のためのより多様な細胞の供給
源を与える幅広い分化能を有するものである。
【０４２９】
本発明のＭＡＳＣは、例えば高投与量の化学療法後の骨髄を再生する目的で有
用である。化学療法を行う前に患者から骨髄吸引液を採取する。本発明の方法に
より幹細胞を単離し、培養、分化誘導する。この後、分化細胞と未分化細胞の混
合物を患者の骨髄腔に再導入する。現在この目的で造血幹細胞を用いた臨床試験
が行われているが、本発明のＭＡＳＣは骨髄ばかりでなく他の組織の化学療法に
よって損傷した細胞をも置換することが可能な細胞に更に分化可能であるという
更なる利点を有するものである。
【０４３０】
また、Ｌａｗｍａｎ等（国際特許出願公開公報第ＷＯ９８／４２８３８号）に
より述べられる方法を用いて同種異系ドナー由来の幹細胞の組織適合性抗原を変
化させることも可能である。この方法を用いることにより、凍結ストックを調製
し、これを保存して、例えば白血病患者の場合のように、自身の骨髄を再形成で
きない患者に投与するために利用可能な移植骨髄のパネルを形成することが可能
である。
【０４３１】
患者の免疫系細胞や血液細胞は、例えば、患者から自家幹細胞を単離し、この
細胞を培養して細胞集団を増殖させた後、患者に細胞を再導入することによりそ
の数を復元することが可能である。この方法は、例えば多発性骨髄腫、非ホジキ
ン型リンパ腫、自己免疫疾患や充実性腫瘍を診断された患者のように、治療目的
で放射線照射及び／または化学療法によって免疫系や骨髄細胞を減少させる必要
がある場合に特に有効である。
【０４３２】
白血病、自己免疫疾患、鎌状赤血球貧血症やサラセミアなどの遺伝病を治療す
る目的での、本発明の、もしくは本発明の方法により単離された、同種異系の細
胞による患者の血液や免疫系細胞の復元は、特にＬａｗｍａｎ等（国際特許出願
公開公報第ＷＯ９８／４２８３８号）により述べられる方法によって組織適合性
抗原が変化させられている場合に行うことが可能である。
【０４３３】
本明細書中に述べられる目的の実現のため、本発明の自己由来または同種異系
ＭＡＳＣを、分化または未分化の状態で、遺伝子を改変するかまたは改変するこ
となく、組織部位への直接注入、全身注入、許容されるマトリクスの表面上もし
くはその近傍に、または薬学的に許容される担体との組合わせとして、患者に投
与することが可能である。
【０４３４】
１９．ＭＡＳＣによって分化経路を研究するためのモデル系が与えられる
本発明の細胞は更に発生過程の更なる研究を行ううえでも有用である。例えば
、Ｒｕｌｅｙ等（国際特許出願公開公報第ＷＯ９８／４０４６８号）は特定の遺
伝子の発現を阻害するとともに、阻害された遺伝子のＤＮＡ配列を得るためのベ
クター及び方法について述べている。本発明の細胞をＲｕｌｅｙにより述べられ
るようなベクターで処理し、これによりＤＮＡ配列解析によって特定可能な遺伝
子の発現を阻害することが可能である。この細胞を分化誘導し、改変された遺伝
子型／表現型の影響を調べることが可能である。
【０４３５】
例えばＨａｈｎ等（Nature (1999) 400: 464-468）は、正常なヒト上皮繊維芽
細胞に以前より癌との相関が示されている遺伝子の特定の組合わせを導入すると
細胞が癌化するように分化誘導することが可能であることを証明した。
【０４３６】
誘導可能な発現エレメントを有するベクターを利用した遺伝子発現の制御によ
って、特定の遺伝子産物が細胞分化に与える影響を調べるための方法が与えられ
る。誘導発現系は当業者に周知のものである。このような系の一つにＮｏ，Ｄ．
等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 3346-3351）によって述べられる
エクジソン誘導系がある。
【０４３７】
ＭＡＳＣを利用して、特定の遺伝子変化、毒物、化学療法薬や他の薬剤が発生
経路に与える影響を調べることが可能である。当業者には周知の組織培養法によ
れば、異なる個人から得られた数十万もの細胞試料の大量培養が可能となるため
、例えば催奇形性または突然変異誘発性が疑われる化合物の高速スクリーニング
を行うことが可能となる。
【０４３８】
発生経路を研究する目的で、催奇形性が疑われる化合物を含む、特定の成長因
子、サイトカインなどの薬剤にてＭＡＳＣを処理することが可能である。ＭＡＳ
Ｃはこれまでに述べられている方法及びベクターによって遺伝子改変することも
可能である。更に、ＭＡＳＣをアンチセンス技術や細胞に導入されるタンパク質
による処理によって改変して天然遺伝子配列の発現を改変することが可能である
。例えばシグナルペプチド配列を利用して所望のペプチドやポリペプチドを細胞
内に導入することが可能である。ポリペプチド及びタンパク質を細胞内に導入す
るうえで特に効果的な方法の一つがＲｏｊａｓ等（NatureBiotechnology (1998
) 16: 370-375）により述べられている。この方法によれば、培地に導入するこ
とにより細胞膜を通過して細胞の内部へと移動するポリペプチドまたはタンパク
質産物が得られる。任意の数のタンパク質をこのように使用して細胞の分化に対
する標的タンパク質の影響を調べることが可能である。また、Ｐｈｅｌａｎ等（
Nature Biotech. (1998) 16: 440-443）によって述べられる方法を用いてヘルペ
スウイルスタンパク質であるＶＰ２２を機能性タンパク質に結合させて細胞内に
輸送することも可能である。
【０４３９】
本発明の細胞は、外来遺伝子の導入またはゲノムＤＮＡの発現の抑制またはＤ
ＮＡの切り出しによって遺伝子操作することにより、化学療法剤や遺伝子治療ベ
クターとしての潜在的有効性を試験するための欠陥表現型を有する分化細胞を作
出することが可能である。
【０４４０】
２０．ＭＡＳＣは高スループットスクリーニング用の多様な種類の分化及び未
分化培養細胞を与える
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、例えば９６穴などの多穴培養プレ
ートで培養することにより、例えば、標的サイトカイン、ケモカイン、生長因子
、または薬理ゲノミクスや薬理遺伝学における薬理組成物について高スループッ
トスクリーニングを行うための系を得ることが可能である。本発明のＭＡＳＣは
、細胞を同一個体由来の特定の細胞系に分化させることができるという唯一の系
を与えるものである。多くの１次培養と異なり、これらの細胞は培養中で維持し
て長期にわたって観察することができる。同一個体及び異なる複数の個体に由来
する細胞の複数の培養を対象となる因子にて処理してその細胞因子が同じ遺伝子
組成の異なる種類の分化細胞に与える影響、または遺伝子組成の異なる個体に由
来する類似した種類の細胞に与える影響に差異が認められるかを判定することが
可能である。したがって、例えばサイトカイン、ケモカイン、薬理組成物、及び
成長因子を速やかかつ高いコスト効率にてスクリーニングし、その効果をより明
らかに解明することが可能である。大きな個体集団から単離し、遺伝子多型、特
に一塩基多型の有無に関して特徴付けられた細胞を細胞培養バンクで保管して各
種のスクリーニング法に供することが可能である。例えば、当業者には周知の方
法によって決定することが可能な統計的に有意な個体集団から得た多能性成体幹
細胞によって、広範な物質に対する陽性または陰性の応答の増強に関連した多型
を特定するための高スループットスクリーニング用の理想的な系が与えられる。
このような物質の例としては、薬理組成物、ワクチン調製物、細胞障害性物質、
突然変異誘発物質、サイトカイン、ケモカイン、生長因子、ホルモン、阻害物質
、化学療法剤、及びその他の化合物または因子のホストが挙げられる。こうした
研究から得られる情報は、感染症、癌、ならびに多くの代謝性疾患の治療におい
て幅広い応用が考えられる。
【０４４１】
生物学的、または薬学的物質、またはこうした物質のコンビナトリアルライブ
ラリーに対する細胞応答を特徴付けるためにＭＡＳＣを利用する方法では、ＭＡ
ＳＣを統計的に有意な個体集団から単離し、培養を増殖させ、１以上の生物学的
または薬学的物質に接触させる。ＭＡＳＣは、分化細胞が特定の生物学的または
薬学的物質の所望の標的である場合に、培養の増殖の前もしくは後に分化誘導す
ることが可能である。統計的に有意な個体集団の複数の個体から得られたＭＡＳ
Ｃ培養間で１以上の細胞応答を比較することにより、当該生物学的または薬学的
物質の効果を判定することが可能である。また、遺伝子組成が同一のＭＡＳＣま
たはこの細胞から分化した細胞を利用して、コンビナトリアルライブラリーの化
合物などの異なる化合物をスクリーニングすることも可能である。細胞に基づい
た高スループットスクリーニングと組み合わせて用いられる遺伝子発現系につい
てはこれまでに述べられている（参照、Jayawickreme, C. andKost, T., Curr.
Opin. Biotechnol. (1997) 8: 629-634）。内皮細胞活性化の阻害物質を同定す
るために用いられる高容量スクリーニング法についてはＲｉｃｅ等によって述べ
られるものがあり、始原ヒト臍静脈内皮細胞についての細胞培養系を利用したも
のである（Rice, et al., Anal. Biochem.(1996) 241: 254-259）。本発明の細
胞によれば、標的とする多数の生物学的及び薬学的物質を同定するうえで用いら
れる高スループットスクリーニング法のための、最終分化及び未分化の各種の細
胞が与えられる。最も重要な点としては、本発明の細胞によって、生物学的及び
薬学的物質に対する応答が異なる多様な遺伝子を有する個体群から培養細胞の供
給源が与えられることである。
【０４４２】
ＭＡＳＣは単独または予めパッケージングされた培地及び培養用の補足物質と
ともに凍結ストックとして提供され、更には、別個にパッケージングされた、特
定の種類の細胞を分化誘導するための有効濃度の適当な因子とともに提供される
。また、ＭＡＳＣは、当業者に周知の方法によって調製され、上記に述べた方法
により分化誘導された細胞を含む凍結ストックとして提供することも可能である
。
【０４４３】
２１．ＭＡＳＣと遺伝子プロファイル
遺伝子の変異は疾病に対する感受性に対して直接、間接の影響を与える。直接
的なケースでは、一塩基多型（ＳＮＰ）を生ずる１個のヌクレオチドの変化によ
っても、タンパク質のアミノ酸配列は変化し、疾病や疾病に対する感受性に直接
影響する。生じたタンパク質の機能的変化はしばしばｉｎ  ｖｉｔｒｏにて検出
することが可能である。例えば、ある種のＡＰＯリポタンパク質Ｅの遺伝子型は
特定の患者においてアルツハイマー病の発症及び進行との関連が示されている。
【０４４４】
ＤＮＡ配列の異常は、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、ＤＮＡ
チップ技術、及び当業者に周知の他の方法によって検出することが可能である。
ヒトのゲノムにおけるタンパク質のコード領域は約３％程度でしかないと推定さ
れており、コード領域には恐らく２００，０００〜４００，０００個の共通のＳ
ＮＰが存在するものと推定されている。
【０４４５】
ＳＮＰ関連遺伝子解析を用いたこれまでの研究方法では、表現型の特徴付けを
行うことが可能な多数の個体から遺伝子解析用の試料を得ていた。残念なことに
こうした方法で得られた遺伝的相関は、容易に特定可能な表現型に関連した特定
の多型の同定に限定されており、疾患の原因に関する更なる情報を与えるもので
はなかった。
【０４４６】
本発明のＭＡＳＣは、特定の疾患に関連した遺伝子要素の特定と、その疾患を
有する患者に見られる最終的な表現型との間に橋渡しをするうえで必要な要素を
与えるものである。簡略に述べると、まず、表現型に関するデータを得ることが
可能な統計的に有意な個体集団からＭＡＳＣを単離する（参照、Collins, et al
., Genome Research (1998) 8:1229-1231）。次いで得られたＭＡＳＣ試料を培
養して増殖させ、細胞の２次培養を凍結ストックとして保存する。この凍結スト
ックは後の発生実験で使用する培養を得るために使用することが可能である。増
殖させた細胞集団について複数の遺伝子解析を行って遺伝子多型を特定すること
が可能である。例えば、当業者に周知のＤＮＡチップ技術などの現時点で可能な
方法を用いて、大きな標本集団において比較的短時間で一塩基多型を特定するこ
とが可能である（Wang, D., et al., Science(1998) 280: 1077-1082; Chee, M
., et al., Science (1996) 274:610-614; Cargill, M., et al., Nature Gene
tics (1999)22: 231-238; Gilles, P., et al., Nature Biotechnology (1999)
17: 365-370; Zhao, L.P., et al., Am.J. Human Genet. (1998) 63: 225-240
）。ＳＮＰ解析のための方法についてもＳｙｖａｎｅｎ、Ｘｉｏｎｇ、Ｇｕ、Ｃ
ｏｌｌｉｎｓ、Ｈｏｗｅｌｌ、Ｂｕｅｔｏｗ、及びＨｏｏｇｅｎｄｏｏｒｎによ
ってこれまでに述べられている（Syvanen, A., Hum. Mut.(1999) 13: 1-10）、
（Xiong, M. and L. Jin, Am. J. Hum.Genet. (1999) 64: 629-640）、（Gu, Z
., et al., Human Mutation (1998) 12:221-225）、（Collins, F., et al., S
cience(1997) 278: 1580-1581）、（Howell, W., et al., Nature Biotechnolo
gy (1999)17: 87-88）、（Buetow, K., et al., Nature Genetics (1999) 21: 
323-325）、（Hoogendoorn, B., et al., Hum.Genet. (1999) 104: 89-93）。
【０４４７】
特定の多型が特定の疾患の表現型に関連している場合、その多型のキャリアで
あることが特定された個体から得た細胞を、非キャリア個体から得た細胞をコン
トロールとして用いて、発生異常について調べることが可能である。本発明のＭ
ＡＳＣは、本明細書中に述べられた所定の方法及び当業者に周知の他の所定の方
法を用いて特定の種類の細胞に分化誘導することが可能であることより、特定の
遺伝子疾患に関連した発生異常を研究するための実験系を与えるものである。例
えば、特定のＳＮＰが特定の神経変性性疾患と関連している場合、未分化のＭＡ
ＳＣ及びニューロン前駆細胞、グリア細胞などの神経由来の細胞に分化したＭＡ
ＳＣの両方を利用して、その多型の細胞への影響を調べることが可能である。特
定の多型を示す細胞を分化の過程で追跡することにより、薬物感受性、ケモカイ
ン及びサイトカイン応答性、成長因子、ホルモン、及び阻害物質に対する応答性
、ならびに受容体の発現及び／または機能の変化に対する応答性に影響を与える
遺伝子要素を特定することが可能である。この情報は遺伝子を原因とする疾患や
遺伝的素因が認められる疾患の治療方法を模索するうえで極めて有用である。
【０４４８】
ＭＡＳＣを用いた、生理学的異常に関連した遺伝子多型を特定するための本方
法においては、表現型に関するデータを得ることが可能な統計的に有意な個体集
団からＭＡＳＣを単離し（統計的に有意な集団とは、少なくとも１個の遺伝子多
型を有する要素が含まれる充分なサイズの集団として当業者により定義される）
、培養を増殖させてＭＡＳＣ培養を樹立する。次いで培養細胞から得たＤＮＡを
用いて集団から得られた培養ＭＡＳＣにおける遺伝子多型を特定し、細胞を分化
誘導する。正常な遺伝子型を有するＭＡＳＣが示す分化のパターンと特定された
遺伝子多型を有するかまたは候補薬に対する応答を示すＭＡＳＣが示す分化のパ
ターンとを比較することにより特定の遺伝子多型に関連した異常代謝プロセスを
同定、特徴付けることが可能である。
【０４４９】
２２．ＭＡＳＣによって安全なワクチン投与が可能となる
本発明のＭＡＳＣを抗原性タンパク質を産生するように遺伝子改変することに
より抗原提示細胞として利用することも可能である。例えば複数の遺伝子改変を
行った自家または同種異系の前駆細胞を用い、対象細胞をトランスフェクトすべ
く徐放されるように生分解性マトリクス中に包埋したプラスミドと本発明の前駆
細胞とを組み合わせることにより、１乃至複数の抗原に対する免疫応答を刺激す
ることが可能であり、抗原提示細胞が徐放されることによって免疫応答の最大効
果が高められる可能性がある。ある種の抗原を長期にわたって複数回投与すると
最終抗原チャレンジにおいて免疫応答が高まることが当業者に知られている。ま
た、Ｚｈａｎｇ等（Nature Biology (1998) 1: 1045-1049）の方法においてＭＡ
ＳＣを抗原提示細胞として利用して特定の抗原に対するＴ細胞の寛容を誘導する
ことも可能である。
【０４５０】
現在使用されている多くのワクチン製剤には添加化学物質や他の物質が用いら
れている。その例として、抗生物質（ワクチン培養中での細菌の増殖を抑える）
、アルミニウム（補助剤）、ホルムアルデヒド（細菌産物をトキソイドワクチン
に対して不活化）、グルタミン酸１ナトリウム（安定剤）、卵タンパク質（発育
鶏卵を利用して製造されるワクチンの成分）、亜硫酸塩（安定剤）、及びチメロ
サール（保存剤）などが挙げられる。一部これらの添加成分のため、現在のとこ
ろワクチン製剤の安全性に関し社会的関心が広く高まっている。例えばチメロサ
ールは水銀を含有し、塩化エチル水銀、チオサリチル酸、水酸化ナトリウム、及
びエタノールの組合わせからなる。更に、決定的なものではないが、ある種のワ
クチン成分と、自己免疫に一般に関連付けられている疾患などの潜在的合併症と
の関係を示唆する研究もある。したがって、より効果的なワクチン療法が求めら
れており、またワクチン接種の方法の快適度が高まるならばワクチン研究に対す
る社会的協力が容易に得られるであろう。
【０４５１】
本発明のＭＡＳＣは、樹状細胞へと分化させることが可能であり、この樹状細
胞がＴ細胞に抗原を提示することによりＴ細胞が活性化されて異物に対する応答
を生ずる。こうした樹状細胞は、先に述べられた方法を用いて外来抗原を発現す
るように遺伝子改変することが可能である。こうしたワクチン投与方法の利点は
、１個の遺伝子改変細胞によって複数の抗原を提示することが可能な点である。
【０４５２】
異種由来の分化または未分化ＭＡＳＣワクチンベクターは、外来細胞表面のマ
ーカーによって免疫系が刺激されるという更なる利点を与えるものである。ワク
チンの設計実験において、複数の抗原による免疫応答の刺激により、ワクチン製
剤中の特定の抗原に対する免疫応答が高められることが示されている。
【０４５３】
例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、水痘、ポリオ、ジフテリア、百日咳、破傷風、
ライム病、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、Ｂ型インフルエンザ（Ｈｉｂ）、ＢＣ
Ｇ、日本脳炎、黄熱病、及びロタウイルスについて免疫学的に有効な抗原が特定
されている。
【０４５４】
本発明のＭＡＳＣを利用してヒト被験者において感染因子に対する免疫応答を
誘導する方法は、培養中で多能性成体幹細胞のクローン集団を増殖させ、１以上
の所定の抗原性分子を発現するよう、増殖した細胞を遺伝子改変して感染因子に
対する防御免疫応答を刺激し、免疫応答を誘導するうえで有効量の遺伝子改変細
胞を被験者に導入することによって行うことが可能である。遺伝子改変細胞の投
与方法は当業者に周知のものである。免疫応答を誘導するうえで有効量の遺伝子
改変細胞とは、当業者に周知の方法により測定可能な抗体反応を生ずるのに充分
な量の所望の抗原を発現する細胞の量のことである。好ましくは、抗体反応とは
、適当な感染因子によるチャレンジを行った場合の病気に対する耐性によって検
出することが可能な防御抗体反応のことである。
【０４５５】
２３．ＭＡＳＣと癌治療
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、癌治療のための新規なビヒクルを
与えるものである。例えば、ＭＡＳＣを内皮細胞、または局所的、全身的に投与
した場合に内皮組織に生着する前駆細胞に分化誘導することが可能である。この
細胞は、新生腫瘍に血液供給する血管形成（血管新生）に用いられ、ひいては内
皮組織内で分裂、増殖する。外部から導入される因子の刺激によって細胞死する
ようにこの細胞を遺伝子操作することにより、血管新生を阻害して腫瘍への血流
を遮断することが可能である。外部から導入される因子の一例としては抗生物質
であるテトラサイクリンがあり、その場合、テトラサイクリン応答性因子の制御
下で細胞死を誘発するＣａｓｐａｓｅやＢＡＤなどの遺伝子で細胞をトランスフ
ェクトまたは形質導入する。テトラサイクリン応答性因子についてはこれまでに
文献に述べられており（Gossen, M. & Bujard, H.,Proc. Natl. Acad. Sci. US
A (1992) 89: 5547-5551）、内皮細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏでの導入遺伝子の
発現制御を可能とするものであり（Sarao, R. & Dumont, D.,Transgenic Res. 
(1998) 7: 421-427）、一般に市販されている（CLONETECHLaboratories, Palo 
Alto, CA）。
【０４５６】
また、未分化のＭＡＳＣまたは組織特異的細胞系に分化させたＭＡＳＣを、腫
瘍細胞を障害するか血管形成を阻害するような所定の産物（Ｄａｗｓｏｎ等によ
り述べられる色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）など（Dawson, et al., Science(1
999) 285: 245-248））を産生するように遺伝子改変して、これを細胞外環境へ
と輸送させることも可能である。例えばＫｏｉｖｕｎｅｎ等は、ＭＭＰ−２及び
ＭＭＰ−９（腫瘍形成への関連が示されているマトリクスメタロプロテアーゼ）
を選択的に阻害する所定のアミノ酸配列を有する環状ペプチドについて述べてい
る。この環状ペプチドは動物モデルにおいて腫瘍の成長及び浸潤を阻止し、ｉｎ
ｖｉｖｏにて新生血管を特異的に標的とすることが示されている（Koivunen, 
E., Nat. Biotech. (1999) 17: 768-774）。細胞を腫瘍部位に送達し、腫瘍阻害
産物を産生させ、この後破壊することが望ましい場合には、誘導プロモーターの
制御下で細胞死を促進する細胞死促進タンパク質を有するように更に細胞を遺伝
子改変することが可能である。
【０４５７】
ＭＡＳＣは、患者から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏにて培養し、特に適当な抗原に
対する高い免疫応答反応に関連が示されてる受容体との組み合わせにおいて該抗
原を発現するようにｅｘ  ｖｉｖｏにて遺伝子改変し、被験者に再導入して腫瘍
細胞が発現するタンパク質に対する免疫応答を引き起こすことが可能であること
から、癌ワクチンの投与用のベクターを更に与えるものである。
【０４５８】
２４．ＭＡＳＣ、またはＭＡＳＣ単離及び培養用の要素の入ったキット
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、適当な梱包材料とともにキットと
して提供される。例えば、ＭＡＳＣは、本明細書中に述べられるような別梱され
た未分化状態での培養用の適当な因子及び培地とともに凍結ストックの形で提供
される。更に上記に述べたような別梱の分化誘導用の因子を提供することも可能
である。
【０４５９】
本発明によれば、患者の幹細胞を単離、培養するうえで有効量の適当な因子を
含むキットも提供される。臨床技師は、患者から骨髄吸引液を採取したならば、
抗ＣＤ４５及び抗グリコフォリンＡはキットに入っているので、あとは本明細書
中に述べられる方法で幹細胞を選択し、キットに入っている培地を使用して本発
明の方法に則って細胞を培養するだけでよい。基本培地の組成については上記に
述べられている。
【０４６０】
本発明の一態様は、臨床的状況下でヒト被験者からＭＡＳＣを単離するための
キットの調製である。同梱されたキットの要素を使用することで、単純な骨髄吸
引液からＭＡＳＣを単離することが可能である。分化因子、培地、及び培養中で
ＭＡＳＣを分化誘導するための説明書が入った更なるキット要素を使用すること
で、患者自身の骨髄サンプルから抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団を得ることが臨
床技師にとって可能となる。キットに入れられる更なる材料として、分化したＡ
ＰＣによって発現、提示される適当な抗原をコードしたポリヌクレオチド投与用
ベクターを提供することも可能である。例えばＢ型肝炎の表面抗原、Ａ型肝炎、
アデノウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍや他の感染因子
の防御抗原の遺伝子配列を有するプラスミドを例えば提供することが可能である
。これらのプラスミドは、例えばキットに入っているリン酸カルシウムトランス
フェクション用の材料及び使用説明書を使用することで培養ＡＰＣに導入するこ
とが可能である。遺伝子改変されたＡＰＣを患者の体内に再注入するための更な
る材料を提供することも可能であり、これにより自家ワクチン投与システムが与
えられる。
【０４６１】
本発明を以下の詳細な実施例にもとづいて更に説明する。
【０４６２】
実施例
実施例１．骨髄単核細胞からのＭＡＳＣｓの単離
８０人を越えるボランティアの後部腸骨稜から吸引した骨髄から骨髄単核細胞
を得た。
【０４６３】
表３に示されるように、各被験者から１０〜１００ｃｍ３の骨髄を得た。表３
に、各被験者から単離された単核細胞のおおよその数を示した。単核細胞（ＭＮ
Ｃ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配（シグマケミカル社、ミズーリ州セン
トルイス）（Sigma Chemical Co, St Louis, MO）上で骨髄を遠心分離して得た
。骨髄ＭＮＣはＣＤ４５及びグリコフォリンＡマイクロビーズ（ミルテニーバイ
オテック社、カリフォルニア州サニーヴェイル）（Miltenyi Biotec,Sunnyvale
, CA）とともに１５分インキュベートし、この試料をＳｕｐｅｒＭＡＣＳ磁石の
前方に置くことでＣＤ４５＋／Ｇｌｙ−Ａ＋細胞を除去した。抽出された細胞は
９９．５％がＣＤ４５−／Ｇｌｙ−Ａ−であった。
【０４６４】
表３に示されるように、ＣＤ４５＋／ＧｌｙＡ＋細胞の除去によって全骨髄単
核細胞の約０．０５〜０．１０％を構成するＣＤ４５−／ＧｌｙＡ−細胞が回収
された。
【０４６５】
【表３】
2004529621.tif 000030
一般的な白血球抗原であるＣＤ４５、または赤血球前駆細胞のマーカーである
グリコフォリン−Ａ（ＧｌｙＡ）を発現していない細胞を選択した。ＣＤ４５−
／ＧｌｙＡ−細胞は骨髄単核細胞の１／１０３を構成する。ＣＤ４５−／Ｇｌｙ
Ａ−細胞を、フィブロネクチンにてコーティングし、２％ＦＣＳ、ＥＧＦ、ＰＤ
ＧＦ−ＢＢ、デキサメタゾン、インスリン、リノレイン酸及びアスコルビン酸を
添加したウェルに播種した。７〜２１日後に接着細胞の小集団が形成された。我
々は限界希釈アッセイを用いて接着細胞集団を生ずる細胞の頻度を求めたところ
５ｘ１０３個のＣＤ４５−／ＧｌｙＡ−細胞につき１個の割合であった。
【０４６６】
コロニー（約１０３個の細胞）が出現した時点で細胞をトリプシン処理により
回収し、同様の培養条件下で３〜５日毎に１：４の希釈率で再播種した。細胞密
度は２〜８ｘ１０３細胞／ｃｍ２に保った。細胞の倍加時間は４８〜６０時間で
あった。１０〜１２回の細胞分裂後に蛍光発色細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）によ
る免疫表現型分析を行った結果、細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３
８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ及びＣＤ６２−Ｐ、Ｍｕｃ１８、ｃＫｉｔ
、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ、及びＣＤ４４を発現していなかった。細胞はＨＬＡ−ＤＲま
たはＨＬＡ−クラスＩをまったく発現しておらず、β２マイクログロブリンを低
レベルで発現していた。細胞はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、
ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１に対する抗体によって強度に陽性染色された。このＭＡＳ
Ｃの表現型は細胞分裂が３０回を越えるまで変化が見られなかった（ｎ＝１５）
。２〜５０才のドナーの内、８５％を上回るドナーから３０回以上の細胞分裂が
可能で、すべての中胚葉性細胞（下記参照）に分化可能な細胞を含むＭＡＳＣ培
養が樹立された。１０人のドナーについて細胞分裂が５０回を越えるまでＭＡＳ
Ｃを増殖させた。細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦを補った無血清培地で培養した
ところ、細胞の倍加時間は長くなったが（＞６０時間）細胞分裂は４０回を上回
った。ＩＧＦを含まず２％ＦＣＳを加えた培地で培養した細胞で見られたのと同
様、無血清培地で培養した細胞はＨＬＡ−クラスＩ及びＣＤ４４について陰性で
あり、下記に述べるようにすべての中胚葉性表現型に分化可能であった。
【０４６７】
フィブロネクチンの代わりにＩ型コラーゲンまたはラミニン上に細胞を播種す
ると、細胞はＣＤ４４及びＨＬＡ−ＤＲを発現したが、細胞分裂が３０回を越え
るまで増殖させることはできなかった。ＥＧＦまたはＰＤＧＦを省くと細胞は分
裂せずに死滅したのに対し、これらのサイトカインを高濃度で添加するとＭＡＳ
Ｃは初期には増殖したが細胞分裂が２０〜３０回を越えると分裂は停止した。高
濃度のデキサメタゾンを添加した場合にも細胞分裂は３０回を越えなかった。細
胞を２％を越えるＦＣＳを添加した培地で培養するとＣＤ４４、ＨＬＡ−ＤＲ、
及びＨＬＡ−クラスＩを発現した。同様に高密度の培養（８ｘ１０３細胞／ｃｍ
２）においてもＣＤ４４、ＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−クラスＩ、ならびにＭｕｃ
−１８が獲得されたが、これはＭＡＳＣについて述べられている表現型に類似し
ている。高密度培養または高濃度のＦＣＳを添加しての培養では増殖能が失われ
、細胞分裂は２５〜３０回を越えると停止した。
【０４６８】
我々は培養が樹立された段階で１細胞／ウェルとなるようにＭＡＳＣを再播種
してＭＡＳＣのクローン化を試みた。３人のドナーから得た２０００個以上の細
胞を、ＦＮコーティングを施し、同じ培地を入れた９６穴プレートに１個ずつ播
種した。どのウェルについても細胞の増殖は見られなかった。注目に値するのは
、細胞を１０細胞／ウェルで播種したところ約４％のウェルにおいて細胞の増殖
が見られたことである。これらのウェルの内の５％の子孫は細胞数が１０７個を
越えるまで増殖させることができた。
【０４６９】
５人のドナー（２〜５０才）から得たＭＡＳＣを１５回の細胞分裂にわたって
培養したところ、そのテロメアの長さは１１〜１６ｋＢであった。３人のドナー
においてこれは同じドナーから得た血中リンパ球のテロメア長よりも３ｋＢ長か
った。１人のドナーから得た細胞のテロメア長について、１５回、３０回、及び
４５回の細胞分裂後にテロメア長を測定したところ変化は見られなかった。３０
回の細胞分裂後に回収したＭＡＳＣに細胞遺伝学的分析を行ったところ、正常な
核型を示した。
【０４７０】
実施例２．ＭＡＳＣｓの分化
骨芽細胞分化を誘導するために、無血清培地に１０−７Ｍのデキサメタゾン、
１０ｍＭのアスコルビン酸、および１０ｍＭのグリセロホスフェートを補足した
。骨芽細胞分化は、骨発生に比較的特異的である、カルシウムの無機物化、アル
カリホスファターゼ発現、ならびに骨シアリルタンパク質、オステオポンチン、
オステオカルシンおよびオステオネクチンの産生の検出によって確認した（図７
を参照）。
【０４７１】
軟骨分化を誘導するために、以前記載したように、無血清培地に、１００ng/m
lのＴＧＦ−１（Ｐ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）を補足した。細胞はフィブ
ロネクチンに接着している状態で、もしくは懸濁培養において分化誘導し、いず
れの方法においても分化軟骨細胞が形成された。軟骨細胞を形成する分化は、II
型コラーゲン、ならびにグリコサミノグリカンアグリカンの検出によって確認し
た（図７を参照）。
【０４７２】
脂肪細胞分化を誘導するために、１０−７Ｍデキサメタゾンおよび１００μg/
mlインシュリンを培地に添加した。また、無血清培地を２０％ウマ血清含有培地
に置き換えることによって、脂肪細胞分化を誘導した。脂肪細胞分化は、ＬＰＬ
およびａＰ２の検出によって検出した。
【０４７３】
骨格筋細胞分化を誘導するため、コンフルエンスが８０％を越えたＭＡＳＣを
３μＭの５−アザシチジンで２４時間処理した後、ＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＢＢを
加えたＭＡＳＣ培地中で維持したところ、培養条件を変化させてから５日目には
筋特異的タンパク質の発現が見られた。誘導２日目に、Ｍｙｆ５、Ｍｙｏ−Ｄ、
及びＭｙｆ６転写因子を検出した。１４〜１８日後にはＭｙｏ−Ｄの発現レベル
は大幅に低下したが、Ｍｙｆ５及びＭｙｆ６は高値に保たれた。誘導後４日目に
はデスミン及びサルコメアアクチンを検出し、１４日目には速収縮性ミオシン及
び遅収縮性ミオシンを検出した（図７）。免疫組織化学法により、１４日後には
７０〜８０％の細胞が成熟筋タンパク質を発現していることが確認された。我々
は２０％ウマ血清を添加して筋原細胞が多核化された筋管へと融合することを示
した（図７）。注目に値する点として、５−アザシチジン処理によって更に、培
養の第１週目にＧａｔａ４及びＧａｔａ６の発現が、１４日後には心筋トロポニ
ンＴの発現が誘導された。更に誘導２日後に平滑筋アクチンが検出され、１４日
目まで高値を保った。
【０４７４】
無血清ＭＡＳＣ培地中に１４日間維持してコンフルエンスに達したＭＡＳＣに
１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを唯一のサイトカインとして添加したところ平滑筋
細胞への分化が観察された。これらの細胞は平滑筋のマーカーを発現していた。
４日目にミオゲニンの存在が、６日後にデスミンの存在が確認された。２日目以
降に平滑筋アクチンが検出され、１４日後に平滑筋ミオシンが検出された。１４
日後では、約７０％の細胞が抗平滑筋アクチン及びミオシン抗体により陽性染色
された。更に２〜４日後にＭｙｆ５及びＭｙｆ６タンパク質を検出し、これらは
１５日目まで高値に保たれたがＭｙｏ−Ｄは検出されなかった（図７）。
【０４７５】
心筋分化は本明細書中で先に述べた標準無血清培地に１００ｎｇ／ｍｌの塩基
性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加することによって誘導した。ｂＦＧＦ
処理の開始時点で細胞はコンフルエンスに達していた。心組織の更なる発生を誘
導するため、１００ｎｇ／ｍｌの５−アザシチジン、１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧ
Ｆ、及び２５ｎｇ／ｍｌの骨形態形成タンパク質２及び４（ＢＭＰ−２及びＢＭ
Ｐ−４）を培地に添加した。心組織分化誘導の処理の開始時点で細胞は８０％を
越えるコンフルエンスに達していた。Ｇａｔａ４及びＧａｔａ６の発現が２日目
には見られ、１５日目まで高値を維持した。２日目以降にＭｙｆ６及びデスミン
の発現が見られ、６日目以降にミオゲニンの発現が見られた。４日目以降に心筋
トロポニンＴの発現が見られ、１１日目以降に心筋トロポニンＩ及びＡＮＰの発
現が見られた。１５日目には免疫組織化学法により７０％を越える細胞において
これらの成熟心筋タンパク質が検出された。培養を３週間以上継続すると細胞は
シンシチウムを形成した。我々は更に、培養中で稀に自然収縮が生じ、数ｍｍの
距離を伝播するのを確認した（図７）。ここでもやはり６日目以降にＭｙｆ５、
Ｍｙｆ６及び平滑筋アクチンを検出した。
【０４７６】
１５〜２０日目までにｅｘ  ｖｉｖｏで内皮細胞の分化を誘導するため、血管
内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を２０ｎｇ／ｍｌの濃度で他の成長因子を含まない無
血清培地に添加した。内皮細胞の分化は、内皮細胞分化に関連した細胞タンパク
質及び受容体を検出するための免疫蛍光染色によって確認した。結果を図７に示
す。
【０４７７】
造血細胞の分化は、ｅｘ  ｖｉｖｏでマウス及びヒト再生幹細胞を支持する胎
児肝臓由来の間葉細胞系であるＡＦＴ０２４フィーダーにて調整した、５％ＦＣ
Ｓ及び１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを添加したＰＤＦＦ−ＢＢ及びＥＧＦ含有ＭＡ
ＳＣ培地が入れられるとともにＩＶ型コラーゲンでコーティングされたウェルで
ＭＡＳＣを培養することによって誘導した。これらの培養から回収した細胞は、
ｃＫｉｔ、ｃＭｙｂ、Ｇａｔａ２、及びＧ−ＣＳＦ−Ｒを発現したが、ＣＤ３４
は発現しなかった（ＲＴ−ＰＣＲ）。造血作用が胚性内臓内胚葉が放出する因子
によって誘発されることから、発明者等はヒトＳＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ，Ｔｐｏ、
及びＥｐｏの存在下でβＧａｌ＋のマウスＥＢとヒトＭＡＳＣとを共培養した。
２つの別々の実験において、ヒトＣＤ４５を発現するβＧａｌ−細胞の小集団が
検出された。
【０４７８】
「間質細胞」の分化はＭＡＳＣをＩＬ−１α、ＦＣＳ、及びウマ血清とともに
培養することにより誘導した。これらの細胞が造血支持能を有することを証明す
るため、フィーダーを２，０００ｃＧｙにて放射線照射し、ＣＤ３４＋臍帯血細
胞をフィーダーと接触させて播種した。２週間後にメチルセルロースアッセイに
おいて子孫細胞を再播種してコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の数を求めた。ＣＦＣ
は３〜５倍に増殖していた。
【０４７９】
コンフルエンスに達したＭＡＳＣ培養を肝細胞成長因子（ＨＦＧ）及びＫＧＦ
にて処理した。１４日後、細胞は、肝上皮細胞の発生に関連が示されているＭＥ
Ｔ（ＨＧＦ受容体）、サイトケラチン１８及び１９を発現した。
【０４８０】
実施例４．  成人骨髄由来ＭＡＳＣへの形質導入
約３〜１０代の継代培養後にＭＡＳＣ培養が樹立された後、連続２日間にわた
りレトロウイルスによってＭＡＳＣに緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）保有ベク
ターを形質導入した。使用したレトロウイルスはＭＦＧ−ｅＧＦＰまたはＭＮＤ
−ｅＧＦＰ−ＳＮ構築体であり、Ｄｏｎａｌｄ  Ｋｏｈｎ氏の好意により提供さ
れたものである（Donald Kohn, M.D., LA ChildrensHospital, Los Angeles, C
A）。いずれのベクターもアンフォトロピックな細胞系であるＰＡ３１７かテナ
ガザル白血病パッケージング細胞系であるＰＧ１３にパッケージングした。この
プロデューサーフィーダー細胞をＭＡＳＣ増殖培地で４８時間培養してレトロウ
イルス上清を調製した。上清は濾過して使用時まで−８０℃に凍結した。ほぼコ
ンフルエンスに達したＭＡＳＣをＭＡＳＣ増殖培地中で継代培養した。２４時間
後、８ｇ／ｍＬプロタミン（シグマ社）（Sigma）を加えたレトロウイルス含有
上清にて培地を置換し、５時間培養した。２４時間後にこれを繰り返した。最後
の形質導入の２〜３日後、コンソートコンピュータを用いＦＡＣＳスタープラス
フローサイトメーター上で（いずれもベクトン・ディキンソン社製）（Becton D
ickinson Inc.）、５ｎｇ／ｍＬのＦＮにてコーティングした９６穴プレート上
のウェル当たりの細胞数１０個にてｅＧＦＰ＋細胞を選択した。接着細胞の４０
〜８５％にｅＧＦＰの発現が見られた。蛍光活動化セルソータ上で自動細胞載置
ユニット（ＡＣＤＵ）を用い、フィブロネクチンコーティングした９６穴プレー
トにウェル当たり１０個のｅＧＦＰ＋細胞を選別した。細胞はＭＡＳＣ増殖培地
中で１〜７ヶ月間培養した。３〜４週間後、３〜４％のウェルにおいて接着細胞
がコンフルエンスに達した。この細胞を再び培養して増殖させた。１０７個以上
の細胞に増殖した子孫を生じたウェルはプレート当たり１個に満たなかった（更
に４８時間細胞分裂させた）。したがって、更なる増殖能を有するのは骨髄細胞
の１／１０７〜１／１０８ということになる。
【０４８１】
増殖させたクローン細胞集団を５〜１０個の集団に分割した。細胞の一部は未
分化の状態で低温保存し、一部を骨芽細胞、軟骨細胞、間質細胞、骨格筋及び平
滑筋細胞、ならびに内皮細胞に分化誘導した。所定の経路に沿って分化が起きて
いることを証明し、組織の種類を同定するため、細胞を免疫組織化学法及び／ま
たはウェスタンブロットによって分化後の細胞中に存在することが知られている
タンパク質について調べた。
【０４８２】
細胞集団が１個の細胞から発生したことを示すため、単個細胞選別法またはリ
ングクローニング法を用いたが、ＭＡＳＣが接着細胞であることから、ＦＡＣＳ
やリングクローニングによって１個ではなく２個の細胞が選択されている可能性
がある。レトロウイルスの組込みがランダムに起きることを利用してすべての分
化細胞クローンの起源を調べた。ランダムなウイルス組込みのためにレトロウイ
ルスのＬＴＲの両側に位置するホスト細胞のＤＮＡは細胞特異的である。細胞分
裂によって生ずるすべての娘細胞は、ホスト細胞のゲノムの同じ位置にレトロウ
イルスが存在することに基づいて特定が可能である。
【０４８３】
Ｉｎｖｅｒｓｅポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、挿入されたレトロ
ウイルスの３’側及び５’側のＬＴＲの両側のフランキングホストＤＮＡを増幅
した。ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲは、Ｊａｎ  Ｎｏｌｔａ氏の好意により提供された
プロトコルに則って行った（Jan Nolta, Ph.D., LA ChildrenHospital, Los An
geles, CA）。簡略に述べると、ＤＮＡを未分化のＭＡＳＣ及び分化した子孫か
ら抽出し、Ｔａｑ１（インビトロジェン社）（Invitrogen）にて切断し、フラグ
メントをライゲートしてＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行うことで５’側のフランキン
グホスト細胞ＤＮＡの配列を得た。こうしたｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲまたはサザン
ブロット分析を重点的に造血幹細胞に用いることにより分化したすべての細胞系
が１個の細胞から誘導されたことを証明した。フランキングＤＮＡを増幅した後
、２００〜３００塩基の配列を決定し、フランキングＤＮＡを特異的に認識する
プライマーを設計した。次いで未分化細胞及び分化した細胞に、フランキングＤ
ＮＡに特異的なプライマーと５’側のｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａ
ｔ（ＬＴＲ）を認識するプライマーとを使用したＰＣＲを行って分化した子孫か
らＤＮＡを増幅した。検討した３つの試料のそれぞれにおいて、５’側ＬＴＲの
フランキング配列として１個の細胞に特異的な配列が特定された。この配列は未
分化細胞と分化細胞とで同じであった。このことは、「中胚葉性」の起源を有す
る細胞のすべてが１個の細胞に由来することを証明するものである。
【０４８４】
この方法を利用して、本研究では、骨前駆細胞が骨髄に存在し、この細胞が骨
芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、及び骨髄間質細胞へと分化し得るこ
とを確認した。本発明者等は更に、１個の骨髄由来細胞が内臓及び臓側中胚葉か
らの細胞を生じうることを証明した。更に、９ヶ月以上にわたって培養した細胞
の核型が正常であり、その旺盛な増殖能は細胞の幹細胞としての性質によるもの
であって、腫瘍形成や不死化によるものではないことも証明した。
【０４８５】
実施例５．  生体骨髄間葉幹細胞からのグリア細胞及び神経細胞の発生
分化したニューロンは分裂が終了しており、ｉｎ  ｖｉｖｏではニューロンの
再生はほとんどあるいはまったく観察されていない。分裂能を有する新たな神経
幹細胞（ＮＳＣ）を脳の欠損領域に導入することによって欠損組織の機能を回復
させることができるのであれば、脳の神経変性性及び外傷性疾患の治療における
大きな進歩となる。すべての中胚葉性細胞に分化する生後骨髄から選ばれたＭＡ
ＳＣは、ニューロン、乏突起膠細胞、及びアストロサイトにも分化し得ることが
これまでに発見されている。
【０４８６】
ＭＡＳＣの培養を実施例１に述べた要領で樹立した。神経発生を以下のように
誘導した。ニューロン、アストロサイト、及び乏突起膠細胞を神経分化用培地か
らなる培地中で発生させた。この培地は以下を含む。１０〜９５％ＤＭＥＭ−Ｌ
Ｇ（好ましくは約６０％）、５〜９０％ＭＣＤＢ−２０１（好ましくは約４０％
）、１ｘＩＴＳ、１ｘＬＡ−ＢＳＡ、１０−７〜１０−９Ｍのデキサメタゾン（
好ましくは１０−８Ｍ）、１０−３〜１０−５Ｍのアスコルビン酸２−リン酸（
好ましくは約１０−４Ｍ）、及び０．５〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（好ましく
は約１０ｎｇ／ｍＬ）。この培地は、特定の種類の細胞に分化誘導するため、更
に以下のサイトカインの１以上のものを含有していてもよい。
【０４８７】
５〜５０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬ）−アストロ
サイト、乏突起膠細胞、ニューロン（タイプ不明）。
【０４８８】
５〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−９（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−アストロ
サイト、乏突起膠細胞、ＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロン。
【０４８９】
５〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−ドーパミ
ン作動性、セロトニン作動性、及びＧＡＢＡ作動性ニューロン、グリア細胞への
誘導なし。
【０４９０】
５〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−１０（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−アスト
ロサイト、乏突起膠細胞、ニューロンへの誘導なし。
【０４９１】
５〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−４（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−アストロ
サイト、乏突起膠細胞、ニューロンへの誘導なし。
【０４９２】
５〜５０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−ドーパミン
作動性ニューロンのみ。
【０４９３】
５〜５０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−ＧＡＢＡ作
動性及びドーパミン作動性ニューロン。
【０４９４】
５〜５０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−ＧＡＢＡ作
動性ニューロンのみ。
【０４９５】
ＭＡＳＣを神経性細胞に分化誘導するための生長因子は、神経系の胚発生にお
ける知見、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＳＣ分化を評価した研究から得られた
知見に基づき選択した。すべての培地は無血清で、強力な外胚葉誘導因子である
ＥＧＦを補った。ＦＧＦは神経系の発生において重要な役割を担っている。ヒト
生後骨髄由来ＭＡＳＣを１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬのＥＧ
Ｆの存在下で培養すると、アストロサイト、乏突起膠細胞、及びニューロンへの
分化が観察された。アストロサイトは、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ−ｆｉｂｒｉｌａ
ｒ−ａｃｉｄｉｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性細胞として同定され、乏突起膠細胞は
グルコセレブロシド陽性（ＧａｌＣ）として同定され、ニューロンはＮｅｕｒｏ
Ｄ、チューブリンＩＩＩＢ（Ｔｕｊｉ）、シナプトフィジン、及びニューロフィ
ラメント６８，１６０、及び２００を順次発現する細胞として同定される。これ
らの細胞は、ＧＡＧＡ作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性ニューロン
のマーカーは発現しない。
【０４９６】
ＦＧＦ−９はグリア芽細胞腫細胞系列から最初に単離され、培養中でグリア細
胞の分裂を誘導する。ＦＧＦ−９は、大脳皮質、海馬、黒質、脳幹の運動核、プ
ルキンエ細胞層のニューロンにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで見られる。ＭＡＳＣに１
０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−９及びＥＧＦを添加して３週間培養すると、アストロサ
イト、乏突起膠細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、及びドーパミン作動性ニュー
ロンを生じた。中枢神経系の発生過程では、中／後脳境界において前脳により発
現されるＦＧＦ−８が、ソニックヘッジホッグとともに中脳及び前脳のドーパミ
ン作動性ニューロンの分化を誘導する。ＭＡＳＣに１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８
及びＥＧＦを添加して３週間培養するとＧＡＢＡ作動性ニューロン及びドーパミ
ン作動性ニューロンの両方を生じることが分かっている。ＦＧＦ−１０は極微量
が脳に見出され、その発現は海馬、視床、中脳、及び脳幹に限定され、ニューロ
ン内で選択的に発現し、グリア細胞では発現しない。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬ
のＦＧＦ−１０及びＥＧＦ中で３週間培養するとアストロサイト及び乏突起膠細
胞を生じたが、ニューロンは生じなかった。ＦＧＦ−４は脊索において発現し、
中脳の領域化に必要とされる。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−４及びＥＧ
Ｆにて３週間処理するとアストロサイト及び乏突起膠細胞に分化したが、ニュー
ロンには分化しなかった。
【０４９７】
脳において特異的に発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経発生
に影響する他の成長因子としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細
胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）など
がある。ＢＤＮＦは、ＮＳＣ、ヒト上衣下細胞、及び神経系前駆細胞のニューロ
ンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化を促進し、海馬由来神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏで
の軸索生成を促進する神経成長因子ファミリーに属する。黒質のドーパミン作動
性ニューロンの生存を支持するというＢＤＮＦの既知の機能と符合するものであ
るが、ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ及びＥＧＦにて処理すると、チロシ
ンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのみへの分化が見られた。ＧＤＮＦはＴＧＦ
スーパーファミリーに属する。神経発生の初期にはＧＤＮＦは前神経外胚葉で発
現し、神経発生におけるＧＤＮＦの重要な役割を示すものである。ＧＤＮＦは末
梢神経及び筋肉の運動ニューロンの生存を促し、神経栄養因子活性及び分化促進
能を有する。ＧＤＮＦがＭＡＳＣのＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニュー
ロンへの分化を誘導することが分かっている。ＣＮＴＦは毛様体神経節から最初
に単離され、サイトカインのｇｐ１３０ファミリーに属する。ＣＮＴＦは発生初
期の神経の生存を促す。ＣＮＴＦにより、ラット胎児の海馬神経細胞の培養にお
いてＧＡＢＡ作動性及びコリン作動性ニューロンの数が増加する。更にＣＮＴＦ
はＧＡＢＡ作動性ニューロンの細胞死を防止するとともにＧＡＢＡの取込みを促
進する。ＣＮＴＦはＭＡＳＣに対し同様のＧＡＢＡ作動性誘導効果を示し、ＭＡ
ＳＣはＣＮＴＦへの曝露の３週後にＧＡＢＡ作動性ニューロンのみに分化した。
【０４９８】
上記に述べたように、ＩＬ−１１やＬＩＦなど造血サイトカインのあるものは
ＮＳＣの栄養因子であることが示されている。更に、神経前駆細胞のｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏでの研究により、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＳＣＦ、及
びＳＣＦ−１が神経性細胞の分化の初期段階で作用するのに対して、ＩＬ５，Ｉ
Ｌ７，ＩＬ９及びＩＬ１１は後の神経の成熟段階において作用することが示され
ている。初期作用性サイトカイン（１０ｎｇ／ｍＬトロンボポエチン（アムジェ
ン社の好意による）（Amgen Inc., Thousand Oaks, CA））、１０ｎｇ／ｍＬの
顆粒細胞コロニー刺激因子（Ａｍｇｅｎ）、３Ｕのエリスロポエチン（Ａｍｇｅ
ｎ）、及び１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン３（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）の組
合わせの後、１４ｎｇ／ｍＬの胎児肝臓チロシンキナーゼ３リガンド（イミュネ
ックス社の好意による）（Immunex Inc, Seattle, WA）及び１５ｎｇ／ｍＬのＳ
ＣＦ（アムジェン社の好意による）を補ったマウス胎児肝臓フィーダー層ＡＦＴ
０２４（Ｄｒ．Ｉｈｏｒ  Ｌｅｍｉｓｈｋａの好意による）（Dr. IhorLemichk
a, Princeton University, NJ）により調整した培地中で１ヶ月培養することに
よってＭＡＳＣを誘導した。このような条件下で生成したニューロンはニューロ
フィラメント６８を発現しているがニューロフィラメント２００は発現しておら
ず、未成熟である。
【０４９９】
一部の培養において、レトロウイルスを用いｅＧＦＰ保有ベクターにてＭＡＳ
Ｃに形質導入した（上記の実施例４に述べた）。分化したグリア及び神経性細胞
では引き続きｅＧＦＰの発現が見られた。このことは、これらの細胞はその分化
を妨害することなく遺伝子改変が可能であることを示すものである。したがって
、未分化のＭＡＳＣは、後にアストロサイト、乏突起膠細胞、及びニューロンを
生ずる神経幹細胞を生成することが可能である。
【０５００】
ＭＡＳＣは生後骨髄から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、ｉｎ  ｖｉｔｒ
ｏでグリア細胞や特定の神経性細胞に分化誘導することが容易であることから、
ＮＳＣの移植における主要な問題の１つ、すなわち好適なドナー組織が入手しに
くいという問題が解決される。
【０５０１】
本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、例えばムコ
多糖症、白質ジストロフィー（グロボイド細胞性白質ジストロフィー、キャナヴ
ァン病）、フコシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ニーマン−ピック病
、サンフィリポ症候群、ウォルマン病、及びテイ−サックス病などの先天性神経
変性性疾患や蓄積症を治療またはその症状を緩和することが可能である。また本
発明のＭＡＳＣは、ハンチントン病、多発性硬化症やアルツハイマー病などの後
天性の神経変性性疾患を治療またはその症状を緩和することが可能である。更に
本発明のＭＡＳＣは、脳卒中、中枢神経系出血、中枢神経系外傷などの外傷性疾
患、脊髄損傷や脊髄空洞症などの末梢神経系疾患、網膜剥離、黄斑変性や他の変
性網膜疾患及び糖尿病性網膜疾患などの網膜疾患の治療に使用することが可能で
ある。
【０５０２】
実施例６  造血細胞の発生
造血幹細胞（ＨＳＣ）は中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは卵黄嚢中胚葉に由
来するものと長い間考えられていた。原始赤血球系細胞が卵黄嚢に由来している
ことについては充分な証拠が存在する。完成造血細胞がやはり卵黄嚢の細胞に由
来しているか否かについては明らかとなっていない。ニワトリ胚、マウス及びヒ
ト胎児における最近の一連の研究によって、完成造血細胞は固有胚、すなわちＡ
ＧＭ領域に存在する中胚葉性細胞に由来していることが示された。ヒトでは２２
〜３５日目に背側大動脈においてＦｌｋ１＋細胞の小集団が発生し、ＣＤ３４＋
の内皮または造血細胞に分化する。これらは胎児肝臓に定着する細胞であると考
えられている。造血能を有する細胞は背側大動脈に由来するが、これらの細胞が
成熟造血細胞に分化及びコミットするためには、内皮環境が造血細胞の発生にと
って有利な肝臓に細胞が移動する必要がある。これに対し、ＡＧＭ領域に残留す
る細胞が造血細胞に発生することはない。
【０５０３】
本発明のＭＡＳＣ培養中のクローンの中には造血能を持ったものがある。この
ＭＡＳＣは内皮細胞に分化して胚様体らしきものを形成する。この細胞集合体が
造血細胞へと分化する。この微小な懸濁集合体をトリプシン処理し、ＦＮ、ＩＶ
型コラーゲンまたはＥＣＭ上に再播種する。培地は、０．５〜１０００ｎｇ／ｍ
ＬのＰＤＧＦ−ＢＢ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）及び０．５〜１０００ｎｇ
／ｍＬのＥＧＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）を含有したＭＡＳＣ培地に５〜
１０００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬ）を補ったものか、
ＩＬ３、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＳＣＦ（２〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ま
しくは約１０〜２０ｎｇ／ｍＬ）の組合わせからなるものを使用した。または、
０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）
及び０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）を含
有したＭＡＳＣ培地に５％ＦＣＳと１〜１０００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（好ましく
は約１００ｎｇ／ｍＬ）を補ってＡＦＴ０２４細胞にて調整したものを使用した
。これらの培養のいずれから回収された細胞においてもｃＫｉｔ、ｃＭｙｂ、Ｇ
ａｔａ２及びＧ−ＣＳＦ−Ｒの発現が見られ（ＲＴ−ＰＣＲ／免疫組織化学法）
、造血細胞への分化が可能であることが示された。
【０５０４】
実施例７  上皮組織の発生
出願人等は更に上皮組織の発生を証明した。簡略に述べると、まず血管を１〜
１００ｎｇ／ｍＬのフィブロネクチンと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのラミニン、Ｉ
Ｖ型コラーゲンやマトリゲルなどの他のＥＣＭ産物とにてコーティングした。使
用した培地は以下からなる。１０〜９５％のＤＭＥＭ−ＬＧ、５〜９０％のＭＣ
ＤＢ−２０１、１ｘＩＴＳ、１ｘＬＡ−ＢＳＡ、１０−７〜１０−９Ｍのデキサ
メタゾン（好ましくは１０−８Ｍ）、１０−３〜１０−５Ｍのアスコルビン酸２
リン酸（好ましくは１０−４Ｍ）。この培地には以下のサイトカインの内の１以
上のものを加えてもよい。
【０５０５】
０．５〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）。
【０５０６】
０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ
）。
【０５０７】
０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（肝細胞成長因子）（好ましくは約１０
ｎｇ／ｍＬ）。
【０５０８】
０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ（ケラチノサイト成長因子）（好ましく
は約１０ｎｇ／ｍＬ）。
【０５０９】
細胞の中には、汎サイトケラチン陽性、ならびにサイトケラチン１８及び１９
陽性のものが見られ、これらの細胞が内胚葉由来であることが示された（肝上皮
細胞、胆管上皮細胞、膵腺房細胞や消化管上皮細胞）。一部の細胞では、肝上皮
細胞及び腎臓上皮細胞に特異的なＨ−Ｍｅｔすなわち肝細胞成長因子受容体の存
在が示された。また、皮膚上皮細胞の特徴であるケラチンの存在が示された細胞
もあった。
【０５１０】
本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、複数の臓器
疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。この細胞を使用して
、例えば、ムコ多糖症、白質ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシドーシスなど
の蓄積症、クリグラー−ナジャー症候群などの高ビリルビン疾患、例えばオルニ
チンデカルボキシラーゼ欠損症、シトルリン血症、及びアルギニノコハク酸尿症
といった尿素回路の先天異常などのアンモニア疾患、フェニルケトン尿症、先天
性高チロシン血症、及びα１−アンチトリプシン欠損症などのアミノ酸及び有機
酸異常、ならびに第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子欠損症などの凝固疾患といった先天性
の肝疾患を治療もしくは緩和することが可能である。この細胞はまたウイルス感
染による後天性肝疾患を治療するために使用することも可能である。本発明の細
胞は更に、人口肝臓（腎臓透析に類似）の製造、凝固因子の生成、及び、肝上皮
細胞が産生するタンパク質や酵素の生成などのｅｘ  ｖｉｖｏでの応用例に使用
することも可能である。
【０５１１】
更に本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、胆汁性
肝硬変や胆道閉鎖症などの胆道疾患を治療もしくはその症状を緩和することも可
能である。
【０５１２】
更に本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、膵臓閉
塞症、膵臓炎、及びα１−アンチトリプシン欠損症などの膵臓疾患を治療もしく
はその症状を緩和することが可能である。更に、本発明の細胞から膵臓上皮細胞
が得られ、また神経細胞が得られることより、β細胞を生成することが可能であ
る。これらの細胞を糖尿病の治療に用いることも可能である（皮下移植、膵臓内
または肝臓内移植）。
【０５１３】
更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、腸
閉塞、炎症性腸疾患、腸梗塞、及び腸切除などの腸上皮組織の疾患を治療もしく
はその症状を緩和することが可能である。
【０５１４】
更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、脱
毛症などの皮膚疾患、火傷の傷や白子症などの皮膚欠陥を治療もしくはその症状
を緩和することが可能である。
【０５１５】
実施例８  ＭＡＳＣ、軟骨及び骨の発現遺伝子プロファイル
本発明者等は、２ｘ１０３個／ｃｍ２の播種密度にて２２〜２６回の細胞分裂
にわたって培養したヒトＭＡＳＣの発現遺伝子プロファイルをクロンテック社（
Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）及びインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製ｃＤ
ＮＡアレイを用いて評価し、以下のプロファイルを得た。更に発明者等はＭＡＳ
Ｃを２日間にわたって軟骨及び骨に分化誘導した際の遺伝子発現の変化を評価し
た。
【０５１６】
−多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ
６２Ｐ、ＣＤ４４−Ｈ、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ、ＩＬＩ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１
、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、Ｆｌｔ３−Ｌ、またはＣＮＴＦの受容体
のｍＲＮＡを発現せず、ＨＬＡ−クラスＩ、ＣＤ４４−Ｅ及びＭｕｃ１８のｍＲ
ＮＡを低レベルで発現する。
【０５１７】
−ＭＡＳＣは、サイトカインであるＢＭＰ１、ＢＭＰ５、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、
ＫＧＦ、ＭＣＰ１；サイトカイン受容体であるＦｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ
−Ｒ１α、ｇｐ１３０、ＬＩＦ−Ｒ、アクチビンＲ１及び−Ｒ２、ＴＧＦＲ−２
、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ；接着受容体であるＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９及びＣ
Ｄ１０のｍＲＮＡを発現する。
【０５１８】
−ＭＡＳＣは、ｈＴＲＴ、ｏｃｔ−４、ｓｏｘ−２、ｓｏｘ−１１、ｓｏｘ−
９、ｈｏｘａ４、−５、−９、Ｄｌｘ４、ＭＳＸ１、ＰＤＸ１のｍＲＮＡを発現
する。
【０５１９】
−軟骨及び骨のいずれにおいても、ｏｃｔ−４、ｓｏｘ−２、Ｈｏｘａ４、５
、９；Ｄｌｘ４、ＰＤＸ１、ｈＴＲＴ、ＴＲＦ１、サイクリン、ｃｄｋ、シンデ
カン−４、ジストログリカン、インテグリンα２、α３、β１、ＦＬＫ１、ＬＩ
Ｆ−Ｒ、ＲＡＲ−α、ＲＡＲγ、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａ及び−Ｂ、ＴＧ
Ｆ−Ｒ１及び−２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＢＭＰ１及び４、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＭＣＰ
１の発現は失われるかもしくは低下した。
【０５２０】
−骨芽細胞の分化は、ＨＯｘ７、ｈｏｘ１１、ｓｏｘ２２、ｃｄｋｉ、シンデ
カン−４、デコリン、ルミカン、フィブロネクチン、骨シャロタンパク質、ＴＩ
ＭＰ−１、ＣＤ４４、β８、β５インテグリン、ＰＴＨｒ−Ｐ、レプチン−Ｒ、
ＶｉｔＤ３−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ３、ＦＧＦ−Ｒ２、エストロゲン−Ｒ、ｗｎｔ−７
ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＢＭＰ２の獲得／及び発現の増加に関連していた。
【０５２１】
−軟骨の分化はＳｏｘ−９、ＦＲＥＡＣ、ｈｏｘ−１１、ｈｏｘ７、ＣＡＲＴ
１、Ｎｏｔｃｈ３、ｃｄｋｉ、ＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、デコリン
、軟骨糖タンパク、軟骨オリゴマー基質タンパク質、ＭＭＰ及びＴＩＭＰ、Ｎ−
カドヘリン、ＣＤ４４、α１及びα６インテグリン、ＶｉｔＤ３−Ｒ、ＢＭＰ２
、ＢＭＰ７の獲得に関連していた。
【０５２２】
実施例９  ＭＡＳＣと骨芽細胞とで発現レベルが異なる遺伝子のサブトラクティ
ブハイブリダイゼーションによる特徴付け
本発明者等は、未分化のＭＡＳＣとコミットした子孫との間の遺伝子の差異を
特定するためサブトラクション的手法を用いた。ポリアデニル化ｍＲＮＡを未分
化のＭＡＳＣから抽出し、細胞を２日間にわたり骨芽細胞系に分化誘導した。ク
ロンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）より入手されるＰＣＲ選択キットを使用し
、製造者の推奨するところに何ら変更を行うことなく基づいて、発現レベルの異
なるｃＤＮＡのサブトラクション及び増幅を行った。２日目の骨芽細胞培養中で
発現される遺伝子配列を分析したが未分化のＭＡＳＣ中で発現される遺伝子配列
については分析を行わなかった。
【０５２３】
発現レベルの異なる８６個のｃＤＮＡ配列の配列を決定した。ＭＡＳＣにおい
てｍＲＮＡの発現は見られず、２日目の骨芽細胞の子孫において実際にｍＲＮＡ
が特異的に発現していることをノーザンブロッティング法により確認した。これ
らの配列を（ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって）次のデータベースと比較した。
すなわち、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質及びヌクレオチドコ
レクション、ＥＳＴｓ、マウス及びヒトＥＳＴｃｏｎｔｉｇｓである。
【０５２４】
配列は相同性によって分類した。８個が転写因子であり、２０個が細胞の代謝
に関与しており、５個がクロマチンの修復に関与しており、４個がアポトーシス
経路に関与しており、８個がミトコンドリアの機能に関与しており、１４個が接
着受容体／ＥＣＭ成分であり、１９個が機能不明な公知のＥＳＴ配列であり、８
個が新規な配列であった。
【０５２５】
新規配列の内２個について、３人のドナーから得たＭＡＳＣを骨に分化誘導し
たものに１２時間、２４時間、２日、４日、７日及び１４日間にわたってＱ−Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを行った。遺伝子はそれぞれ分化の最初の２及び４日間に発現され、
その後ダウンレギュレートされた。
【０５２６】
未分化のＭＡＳＣに存在するが２日目の骨芽細胞には存在しない遺伝子につい
て分析した。発現レベルの異なる３０個の遺伝子の配列が決定され、この内の５
個はＥＳＴ配列または既知配列であった。これらの遺伝子がＭＡＳＣには存在す
るが２日目の骨芽細胞には存在しないことをノーザンブロッティングによって確
認した。
【０５２７】
実施例１０  ＭＡＳＣの定着
ＭＡＳＣがｉｎ  ｖｉｖｏにて定着、生存するかを調べるため研究を行った。
【０５２８】
ｅＧＦＰ＋ＭＡＳＣをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに筋内注入した。４週後にマウ
スを殺し、ヒトＥＳ細胞について報告されているように筋肉に奇形腫が生じるか
否かを調べた。５頭中５頭において奇形腫は見られなかった。ｅＧＦＰ陽性細胞
が検出された。更にｅＧＦＰ＋ＭＡＳＣＩＶをＳＣＩＤマウス胎児に子宮内注入
した。出生直後に動物の評価を行った。ＰＣＲ解析により、心臓、肺、肝臓、脾
臓、及び骨髄にｅＧＦＰ＋細胞の存在が示された。
【０５２９】
ラットの正常な脳または梗塞を発症した脳にＭＡＳＣを定位的に移植したとこ
ろ、細胞は神経細胞に見られる表現型を獲得し、この表現型は少なくとも６週間
にわたって維持された。これらの研究によりヒトＭＡＳＣはｉｎ  ｖｉｖｏで定
着し、奇形腫へと発生することなく臓器特異的に分化することが示された。
【０５３０】
更にこれらの研究によってＭＡＳＣが胚性幹細胞や生殖細胞とは大きく異なる
ことが示された。ＭＡＳＣは成人及び子供の異なる臓器から得ることが可能な新
たなクラスの多能性幹細胞である。
【０５３１】
実施例１１  マウス由来ＭＡＳＣの選択、増殖、及び特徴付けの実例
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）はマウスの骨髄から得ることが可能であり、ま
た骨髄以外の臓器にも存在し得る。
【０５３２】
１．マウス骨髄のＭＡＳＣの特定
本研究者等はマウス骨髄からＭＡＳＣを選択した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスから
骨髄を得て、単核細胞またはＣＤ４５及びＧｌｙＡ陽性細胞を枯渇させた細胞（
ｎ＝６）をヒトＭＡＳＣで使用したのと同じ条件下（１０ｎｇ／ｍＬのヒトＰＤ
ＧＦ−ＢＢ及びＥＧＦ）で播種した。骨髄単核細胞を播種した場合には、培養開
始後１４日後にＣＤ４５＋細胞を枯渇させて造血細胞を除去した。ヒトＭＡＳＣ
におけるのと同様、細胞分裂２回毎に培養を２０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で
再播種した。
【０５３３】
ヒト細胞における観察とは対照的に、０日目にＣＤ４５＋細胞を枯渇させた新
鮮なマウス単核細胞をＭＡＳＣ培地に播種した場合には増殖は見られなかった。
マウス骨髄単核細胞を播種し、１４日後に培養細胞のＣＤ４５＋細胞を枯渇させ
ると、ヒトＭＡＳＣに類似の形態及び表現型を有する細胞が出現した。このこと
は造血幹細胞が分泌する因子がマウスＭＡＳＣの初期の増殖に必要とされる可能
性を示している。ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＦＧのみと培養した場合には、細胞倍加
時間は長く（６日より長い）、１０回の細胞分裂を越えて培養を維持することは
できなかった。１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦを添加することにより細胞の増殖率が高
められ、７０回を越える細胞分裂が可能であった。ラミニン、ＩＶ型コラーゲン
、またはマトリゲル上で培養した場合、細胞の増殖は見られたが細胞はＣＤ４４
＋かつＨＬＡ−クラスＩ陽性であった。ヒト細胞におけるのと同様、フィブロネ
クチンコーティングした皿上でＬＩＦを加えて培養したＣ５７／ＢＬ６ＭＡＳＣ
はＣＤ４４及びＨＬＡ−クラスＩ陰性であり、ＳＳＥＡ−４により陽性染色され
、ｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、及びｓｏｘ−２の転写因子を発現した。
【０５３４】
マウス骨髄から得たＭＡＳＣは、ヒトＭＡＳＣの分化誘導にも用いられる方法
によって心筋細胞、内皮及び神経外胚葉細胞に分化誘導することが可能である。
したがってＣ５７Ｂ１６マウス由来ＭＡＳＣはヒト骨髄由来のＭＡＳＣに相当す
るものであるといえる。
【０５３５】
２．ＭＡＳＣは骨髄以外の組織にも存在する
発明者等は肝臓や脳などの他の組織にもＭＡＳＣが存在するかについて調べた
。コラゲナーゼ及びトリプシンで処理した生後５日目のＦＶＢ／Ｎマウスから得
た骨髄、脳及び肝臓単核細胞をフィブロネクチン上でＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、
及びＬＩＦを添加したＭＡＳＣ培地に播種した。１４日後にＣＤ４５＋細胞を除
去して細胞を上記に述べたようなＭＡＳＣの培養条件下に維持した。骨髄、脳、
または肝細胞にて開始した培養中で、ヒトＭＡＳＣ及びＣ５７／Ｂ１６マウスの
骨髄から得られたマウスＭＡＳＣに類似した形態を有する細胞が増殖した。これ
らの細胞はｏｃｔ−４のｍＲＮＡを発現していた。
【０５３６】
発明者等は更にｏｃｔ−４のプロモーターであるｅＧＦＰ遺伝子について形質
転換したマウスを調べた。これらの動物では生後の生殖細胞と同様、始原生殖細
胞においてもｅＧＦＰの発現が見られた。ＭＡＳＣはｏｃｔ−４を発現すること
から、我々はｅＧＦＰ陽性細胞が生後のこれらの動物の骨髄、脳、及び肝臓に見
られるかについて試験を行った。生後５日目のマウスの骨髄、脳及び肝臓からｅ
ＧＦＰ＋細胞を選別した（最も明るい１％の細胞）。蛍光顕微鏡法によって調べ
たところ、脳及び骨髄から選別した細胞の内１％に満たないものがｅＧＦＰ＋で
あった。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより、選別した集団においてｏｃｔ−４のｍＲＮＡ
が検出された。選別した細胞をＭＡＳＣの支持条件下（フィブロネクチンコーテ
ィングし、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＬＩＦを加えたウェル）に播種した。細胞は生存
したものの増殖はしなかった。マウス胚性繊維芽細胞に移したところ細胞の増殖
が見られた。更にＭＡＳＣ培地に移したところ、ヒト骨髄またはＣ５７／Ｂ１６
またはＦＶＢ／Ｎマウスの骨髄から古典的なＭＡＳＣ選択及び培養法によって得
たＭＡＳＣに類似した形態及び表現型を有する細胞が得られた。
【０５３７】
本発明を特定かつ好適な異なる実施形態及び方法について述べたが、発明の範
囲を逸脱することなく多くの変更ならびに改変を加えることが可能である点は了
承されよう。参照文献、特許及び特許文献はそのすべてが恰も個々に援用されて
いるかのように援用されるものである。
【０５３８】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【図面の簡単な説明】
【０５３９】
【図１】図１は、骨髄（BM）、筋および脳由来MASCの拡大可能性を示す図である。
【図２】図２は、遺伝子発現の（A）筋および脳MASCそして（B）骨髄および筋MASCにおける遺伝子発現を示す散布図である。
【図３】図３は、未分化MASCおよびVEGFとともに培養したMASCのFACS分析を示す図である。
【図４】図４は、mMASCの定着とin vivo分化の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、MASC由来内皮細胞の共焦点蛍光顕微鏡法を用いた免疫組織化学的評価を示す図である。
【図６】図６は、MASC由来内皮細胞の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、MASC由来内皮細胞のFACS分析を示す図である。
【図８】図８は、ヒトMASC由来内皮細胞の顕微鏡写真である。
【図９】図９は、hMSC由来神経細胞様細胞におけるスパイク生成および発現した電位依存性ナトリウム電流を表す図である。
【図１０】図１０は、肝細胞様表現型を確認した定量的RT-PCRおよびウェスタンブロット分析を示す図である。
【図１１】図１１は、肝細胞様細胞の顕微鏡写真を示す。