(57)【要約】  リソソーム蓄積症を治療するための組成物および方法が開示されている。内部移行エフェクター結合ドメインとリソソーム補充酵素活性とを含む生物学的治療用複合体が開示されている。生物学的治療用複合体は、細胞に入り、リソソームに集まり、該リソソームに補充酵素活性を送達することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドサイトーシスを起こす膜タンパク質に結合する抗原結合タンパク質に直接、または単一のリンカーによって連結されているリソソーム酵素を含む、組成物。
【請求項２】
前記膜タンパク質が、リソソーム膜に局在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記リソソーム酵素が、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、サポシン−Ｃ活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２活性化因子、ＧＭ３シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α−イズロニダーゼ、イズロニダーゼ−２−スルファターゼ、ヘパリンＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原結合タンパク質が、受容体融合分子、トラップ分子、受容体Ｆｃ融合分子、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂ断片、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ３ペプチド、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ、一価ナノボディ、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ：ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ重鎖ホモ二量体抗体）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインからなる群から選択される、請求項１から請求項３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記膜タンパク質が、ＣＤ６３、ＭＨＣ−Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ−１、Ｋｒｅｍｅｎ−２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ−受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質−２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、ＭＡＬ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅタンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、ＳＣＡＲＡ１−５、ＳＣＡＲＢ１−３、ＣＤ３６、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ−１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ−１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、ＵＭＯＤ（ウロモジュリン）、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ−カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ−１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ−７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−１）、ＣＡＣＮＡｌｓ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ−１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）からなる群から選択される、請求項１から請求項４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記リソソーム酵素が、前記抗原結合タンパク質に直接連結している、請求項１から請求項５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原結合タンパク質が抗体を含み、前記酵素が前記抗体の重鎖のＣ末端に共有結合している、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記リソソーム酵素が、単一のリンカーによって前記抗原結合タンパク質に連結している、請求項１から請求項５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗原結合タンパク質が半抗体を含み、前記リソソーム酵素がイムノグロブリンのＦｃドメインに共有結合し、前記酵素に共有結合した前記Ｆｃドメインが、前記抗原結合タンパク質のＦｃドメインと結合している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リンカーが開裂可能なリンカーである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リソソーム酵素がＧＡＡであるか、またはＧＡＡ活性を含み、前記膜タンパク質が、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、およびＰＲＬＲからなる群から選択される、請求項１から請求項１０のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リソソーム酵素がＧＡＡであるか、またはＧＡＡ活性を含み、前記膜タンパク質がＣＤ６３である、請求項１から請求項１１のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リソソーム酵素が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項１２のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リソソーム酵素がＧＬＡであるか、またはＧＬＡ活性を含み、前記膜タンパク質が、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、およびＰＲＬＲからなる群から選択される、請求項１から請求項１０のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記酵素がＧＬＡであるか、またはＧＬＡ活性を含み、前記膜タンパク質がＣＤ６３である、請求項１から請求項１０および請求項１４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リソソーム酵素が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項１０、請求項１４、および請求項１５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に罹患している対象を治療する方法であって、
前記対象に（ａ）酵素と（ｂ）エンドサイトーシスを起こす膜タンパク質に結合する抗原結合タンパク質とを含む生物学的治療用複合体を投与することを含み、
前記生物学的治療用複合体が、前記対象の細胞のリソソームに入って、前記リソソームに前記酵素を送達し、それが前記ＬＳＤに関連する酵素活性（「内因性酵素」）を補充する、前記方法。
【請求項１８】
前記ＬＳＤが、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖症、およびグリコーゲン蓄積症からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＬＳＤが、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、サンドホフ病、テイ・サックス病、ＧＭ２−活性化因子欠損、ＧＭ３−ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、スフィンゴ脂質活性化因子欠損、シャイエ病、ハーラー・シャイエ病、ハーラー病、ハンター病、サンフィリポＡ、サンフィリポＢ、サンフィリポＣ、サンフィリポＤ、モルキオ症候群Ａ、モルキオ症候群Ｂ、マロトー・ラミー病、スライ病、ＭＰＳ  ＩＸ、およびポンペ病からなる群から選択される、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＬＳＤがファブリー病またはポンペ病である、請求項１７から請求項１９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素が、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、サポシン−Ｃ活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２活性化因子、ＧＭ３シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α−イズロニダーゼ、イズロニダーゼ−２−スルファターゼ、ヘパリンＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素が、前記対象において免疫反応を誘導しない、請求項１７から請求項２１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記酵素がアイソザイムである、請求項１７から請求項２２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＬＳＤがポンペ病であり、前記内因性酵素がα−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）であり、前記アイソザイムが、酸性α−グルコシダーゼ、スクラーゼ・イソマルターゼ（ＳＩ）、マルターゼ・グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）、グルコシダーゼＩＩ（ＧＡＮＡＢ）、および中性α−グルコシダーゼ（Ｃ  ＧＮＡＣ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＬＳＤがファブリー病であり、前記内因性酵素がα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）であり、前記アイソザイムがＧＬＡ活性を得るように操作されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記膜タンパク質が、ＣＤ６３、ＭＨＣ−Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ−１、Ｋｒｅｍｅｎ−２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ−受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質−２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、ＭＡＬ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅタンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、ＳＣＡＲＡ１−５、ＳＣＡＲＢ１−３、ＣＤ３６、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ−１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ−１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、ＵＭＯＤ（ウロモジュリン）、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ−カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ−１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ−７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−１）、ＣＡＣＮＡｌｓ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ−１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）からなる群から選択される、請求項１７から請求項２５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記膜タンパク質がＣＤ６３である、請求項１７から請求項２６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記膜タンパク質がＡＰＬＰ２である、請求項１７から請求項２６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体断片、または他の抗原結合タンパク質である、請求項１７から請求項２８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原結合タンパク質が、前記酵素と前記膜タンパク質とに結合する二重特異性抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記酵素がイムノグロブリンのＦｃドメインに連結しており、前記抗原結合タンパク質が半抗体を含む、請求項１７から請求項２９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記酵素が、抗膜タンパク質抗体の前記重鎖のＣ末端に共有結合している、請求項１７から請求項２９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素が、抗膜タンパク質抗体の前記重鎖のＮ末端に共有結合している、請求項１７から請求項２９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記酵素がＧＬＡを含み、前記膜タンパク質がＣＤ６３であり、および前記ＬＳＤがファブリー病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記酵素がＧＡＡを含み、前記膜タンパク質がＣＤ６３であり、および前記ＬＳＤがポンペ病である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体として、リソソーム蓄積症を治療するための組成物および方法を対象とする。本出願は、特に、補充酵素を含有する標的指向化されたタンパク質複合体と、リソソーム蓄積症の治療におけるそれらの使用とを対象とする。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム蓄積症は、リソソームにおける種々の基質の分解に影響を及ぼす希少疾患の一つである。それらの基質には、スフィンゴ脂質類、ムコ多糖類、糖タンパク質類、グリコーゲン、およびオリゴ糖類が含まれ、これらが疾患を有する人の細胞に蓄積して細胞死をもたらし得る。リソソーム蓄積症によって冒される器官として、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、肺、肝臓、骨、骨格筋および心筋、ならびに細網内皮系が挙げられる。
【０００３】
リソソーム蓄積症の治療に対する選択肢として、酵素補充療法（ＥＲＴ）、基質減少療法、薬理学的シャペロン介在療法、造血幹細胞移植療法、および遺伝子療法が挙げられる。基質減少療法の例として、ゴーシェ病１型を治療するためのミグルスタットまたはエリグルスタットの使用が挙げられる。これらの薬剤は、シンターゼ活性を阻害することによって作用し、その結果、基質の産生を抑制する。造血幹細胞療法（ＨＳＣＴ）は、例えば、ＭＰＳの一部の型の患者において、中枢神経系の陰性表現型を緩和かつ低減させるのに用いられる。Ｒ．Ｍ．Ｂｏｕｓｔａｎｙ，“Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ−−ｔｈｅ  ｈｏｒｉｚｏｎ  ｅｘｐａｎｄｓ，”９（１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８３−９８，Ｏｃｔ．２０１３（非特許文献１）を参照されたい。表１には、一部のリソソーム蓄積症と、その関連酵素または他のタンパク質の一覧表を示す。
【０００４】
（表１）リソソーム蓄積症
2019505480.tif 000002
【０００５】
最もよく見られるＬＳＤには、ポンペ病とファブリー病の２種がある。ポンペ病は欠損リソソーム酵素アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）によって引き起こされ、その結果、リソソーム内のグリコーゲンのプロセシングが不十分になる。リソソーム内のグリコーゲンの蓄積が、主に骨格組織、心臓組織、および肝組織に生じる。乳児期にポンペ病を発症すると、通例２歳になる前に、心肥大、筋緊張低下、肝腫大に見舞われ、また心肺不全による死亡に見舞われることになる。成人期のポンペ病は、１０代〜５０代までに発症し、通例、骨格筋のみに関与する。
【０００６】
ファブリー病は、欠損リソソーム酵素アルファ−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）により引き起こされ、その結果、血管、ならびに他の組織および器官内にグロボトリアオシルセラミドが蓄積する。ファブリー病に付随する症状として、神経損傷および／または小血管閉塞による疼痛、腎機能不全および腎不全、高血圧および心筋症などの心合併症、被角血管腫の形成などの皮膚症状、無汗症または多汗症、ならびに渦巻き状角膜、放射状白内障、結膜異常、および網膜血管異常などの眼の疾患が挙げられる。
【０００７】
リソソーム蓄積症に対して現在行われている治療は、至適なものとは言えない。例えば、一般的には、ＥＲＴを高頻度および高用量で、例えば、隔週に最大４０ｍｇ／ｋｇまで投与しなければならない。さらに、一部の補充酵素は免疫学的に交差反応性（ＣＲＩＭ）があり、対象におけるＩｇＧの産生を刺激して、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体を介して酵素がリソソームに送達されるのを妨げる可能性がある。ＩｇＧは、補充酵素のＭ６Ｐ残基を遮蔽する可能性があり、抗原−ＩｇＧ−抗体複合体が細胞のリソソームにＦｃ受容体を介して取り込まれ、その結果、補充酵素は優先的にマクロファージの方へ送られ得る。
【０００８】
また、補充酵素の該当罹患組織への送達は非効率である（表２、およびＤｅｓｎｉｃｋ＆Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，“Ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ２０  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，”１３  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３０７−３５，２０１２（非特許文献２）を参照）。例えば、乳児型ポンペに対して長期の酵素補充療法を受けている患者が、引き続き、開鼻音、持続性筋力低下、下垂、オステオペニア、難聴、誤嚥リスク、嚥下障害、心不整脈、および嚥下障害を患う場合がある。補充酵素の用量を、毎週または隔週、経時的に最大４０ｍｇ／ｋｇまで増加させなければならないことが多い。
【０００９】
（表２）ＥＲＴの非効率な組織標的指向化
2019505480.tif 000003
【００１０】
内因性マンノース−６リン酸受容体（ＭＰＲ）は、大部分の組換え酵素のリソソームへの輸送を媒介する。ＭＰＲには、カチオン非依存性（ＣＩ−ＭＰＲ）およびカチオン依存性（ＣＤ−ＭＰＲ）の２つの相補的な形態がある。いずれの形態のノックアウトも、リソソーム酵素の輸送異常を来した。リソソーム加水分解酵素は小胞体で合成され、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）基の付加によって共有結合修飾された場合、シス−Ｇｏｌｇｉネットワークに移動する。このマーカーの構成は、以下の２つのリソソーム酵素の逐次作用によって決まる：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（Ｇ１ｃＮａｃ−ホスホトランスフェラーゼ）、およびＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスホジエステル−α−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（脱被覆酵素（ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ））。ＧｌｃＮａｃ−ホスホトランスフェラーゼは、Ｇ１ｃＮＡｃ−１−リン酸残基を、ＵＤＰ−Ｇ１ｃＮＡｃから、加水分解酵素の高マンノース型オリゴ糖における選択マンノースのＣ６位置に移動させる触媒作用を及ぼす。続いて、脱被覆酵素は末端のＧ１ｃＮＡｃを除去し、Ｍ６Ｐ認識シグナルを出すようにする。トランス−Ｇｏｌｇｉネットワークでは、このＭ６Ｐシグナルによって、リソソーム加水分解酵素がＭ６Ｐ受容体への選択的結合を介して他の全ての種のタンパク質から分離されるようになる。生成したクラスリン−被覆小胞は、トランス−Ｇｏｌｇｉネットワークから分離し、後期エンドソームと融合する。後期エンドソームの低ｐＨで、加水分解酵素はＭ６Ｐ受容体から切り離され、空の受容体はさらなる輸送を繰り返すためにＧｏｌｇｉ体へ再循環される。
【００１１】
マンノース受容体を介して送達されるβ−グルコセレブロシダーゼを除いて、組換えリソソーム酵素はＭ６Ｐ糖鎖修飾を含み、主にＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ２Ｒを介してリソソームに送達される。しかしながら、糖鎖修飾／ＣＩ−ＭＰＲ−媒介酵素補充送達は、臨床的に意義のある組織の全てに達するわけではない（表２）。酵素補充療法の改良においては、（ｉ）β２−アゴニストのクレンブテロールを用いてＣＩ−ＭＰＲの表面発現を増加させること（Ｋｏｅｂｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ，”１０３（２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１０７−１２，２０１１（非特許文献３））、（ｉｉ）酵素のＭ６Ｐ残基量を増加させること（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｔｏ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｍｉｃｅ，”２７９（４８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０３３６−４１，２００４（非特許文献４））、または（ｉｉｉ）ＩＧＦ−ＩＩドメインを酵素に融合させること（Ｍａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｍｉｃｅ，”２８８（３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４２８−３８，２０１３（非特許文献５））によって、ＣＩ−ＭＰＲ送達を改善することに焦点が絞られている。
【００１２】
数多くのリソソーム蓄積症が酵素補充療法または遺伝子療法により不適切に処置されているが、これは、主には、関連する組織または器官への補充酵素の標的指向化が不十分であることに起因する。良好な組織生体内分布および酵素のリソソーム取り込みを強化かつ促進する改良型酵素補充療法に対してのニーズが生じている。出願人らは、標的罹患組織のリソソームへの酵素のＣＩ−ＭＰＲ非依存抗体誘導送達を用いた、改良型酵素補充療法の開発を行ってきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｒ．Ｍ．Ｂｏｕｓｔａｎｙ，“Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ−−ｔｈｅ  ｈｏｒｉｚｏｎ  ｅｘｐａｎｄｓ，”９（１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８３−９８，Ｏｃｔ．２０１３
【非特許文献２】Ｄｅｓｎｉｃｋ＆Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，“Ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ２０  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，”１３  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３０７−３５，２０１２
【非特許文献３】Ｋｏｅｂｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ，”１０３（２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１０７−１２，２０１１
【非特許文献４】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｔｏ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｍｉｃｅ，”２７９（４８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０３３６−４１，２００４
【非特許文献５】Ｍａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｍｉｃｅ，”２８８（３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４２８−３８，２０１３
【発明の概要】
【００１４】
出願人らは、補充酵素を、細胞表面の標的指向化要素に結合させると、特定の標的細胞のリソソームに効果的に送達できることを見出した。この酵素と標的指向化要素との組み合わせは、生物学的治療用複合体と称される。したがって、一態様では、本発明は、組成物、すなわち酵素と抗原結合タンパク質とを含む生物学的治療用複合体を提供する。酵素はリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に関連するものであり、抗原結合タンパク質は内部移行エフェクターに結合するものである。内部移行エフェクターは、細胞の結合とリソソーム区画内への取り込みとを媒介する。
【００１５】
一部の実施形態では、酵素は、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、サポシン−Ｃ活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２活性化因子、ＧＭ３シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α−イズロニダーゼ、イズロニダーゼ−２−スルファターゼ、ヘパリンＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼのうちの任意の１つである。一部の実施形態では、酵素は、上記に列挙した酵素のうちの任意の１つ以上と同一または同様の活性を有するアイソザイムである。一部の実施形態では、α−グルコシダーゼ活性は、スクラーゼ・イソマルターゼ（ＳＩ）、マルターゼ・グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）、グルコシダーゼＩＩ（ＧＡＮＡＢ）、または中性α−グルコシダーゼ（Ｃ  ＧＮＡＣ）などのアイソザイムによって付与され得る。別の実施形態では、α−ガラクトシダーゼＡ活性は、ＧＬＡ活性を得るように操作されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼなどのアイソザイムによって付与され得る。
【００１６】
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つ以上の内部移行エフェクターに結合することができる任意のタンパク質である。さらなる特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、受容体融合分子、トラップ分子、受容体Ｆｃ融合分子、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂ断片、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ３ペプチド、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ、一価ナノボディ、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ：ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ重鎖ホモ二量体抗体）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどのうちの任意の１つ以上である。特定の一実施形態では、抗原結合タンパク質は、内部移行エフェクターと酵素とに結合する二重特異性抗体である。
【００１７】
一部の実施形態では、内部移行エフェクターは、受容体タンパク質であるか、または受容体タンパク質に結合するリガンドであり、受容体タンパク質は、細胞膜内に、細胞膜上に、または細胞膜に存在し、かつエンドサイトーシスによって取り込まれ得る。さらなる特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＣＤ６３、ＭＨＣ−Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ−１、Ｋｒｅｍｅｎ−２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ−受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質−２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、ＭＡＬ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅタンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、ＳＣＡＲＡ１−５、ＳＣＡＲＢ１−３、およびＣＤ３６のうちの任意の１つ以上である。特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ−１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ−１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）などである。他の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、Ｍ−カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ−１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ−７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ−１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである。一部の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、またはＰＲＬＲである。一部の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、マクロファージ優先インターナライザーであり、例えば、ＶＳＩＧ４（ＣＲＩＧ）、ＭＳＲ１（ＣＤ２０４）、およびＭＭＲ１（ＭＣＲ１、ＣＤ２０６）を含む。
【００１８】
生物学的治療用複合体は、いくつかのフォーマットのうちの任意の１つを有し得る。一部の実施形態では、酵素は抗原結合タンパク質に共有結合されている。特定の一実施形態では、抗原結合タンパク質は半抗体（すなわち、単一重鎖および単一軽鎖）を含み、酵素はイムノグロブリンのＦｃドメインに共有結合し、酵素に共有結合したＦｃドメインは抗原結合タンパク質のＦｃドメインと結合している。特定の別の実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体であり、酵素は抗体の重鎖（または軽鎖）のＣ末端に共有結合している。さらなる特定の別の実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体であり、酵素は抗体の重鎖（または軽鎖）のＮ末端に共有結合している。
【００１９】
他の実施形態では、酵素は抗原結合タンパク質に共有結合されていない。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、内部移行エフェクターと酵素の両方に結合する。特定の一実施形態では、抗原結合タンパク質は、内部移行エフェクターと酵素とに結合する二重特異性抗体である。
【００２０】
一部の実施形態では、酵素はＧＡＡであるか、またはＧＡＡ活性を有するアイソザイムであり、内部移行エフェクターはＣＤ９、ＩＴＧＡ７、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、またはＰＲＬＲである。他の実施形態では、酵素はＧＬＡであるか、またはＧＬＡ活性を有するアイソザイムであり、内部移行エフェクターはＣＤ９、ＩＴＧＡ７、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、またはＰＲＬＲである。
【００２１】
別の態様では、本発明は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に罹患している対象を治療する方法であって、該対象に生物学的治療用複合体（上記に記載の通り）を投与する工程を含み、該生物学的治療用複合体が、該対象の細胞のリソソームに入って、ＬＳＤに関連する酵素活性（「内因性酵素」）を補充する酵素活性（「補充酵素」）を付与する、該方法を提供する。ＬＳＤには、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖症、およびグリコーゲン蓄積症が含まれる。より具体的には、治療可能なＬＳＤは表１に列挙した疾患のうちの任意の１つ以上であり、補充酵素は表１に列挙した対応する酵素の活性を有する。特定の実施形態では、ＬＳＤはポンペ病であり、関連酵素はα−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である。特定の別の実施形態では、ＬＳＤはファブリー病であり、関連酵素はα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）である。さらなる特定の別の例では、ＬＳＤはリソソーム酸性リパーゼ欠損症（ＬＡＬ−Ｄ）であり、関連酵素はリソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）である。
【００２２】
一実施形態では、補充酵素は、対象において免疫反応を誘発するものではない。補充酵素がアイソザイムである場合もある。例えば、内因性酵素がα−グルコシダーゼである場合、アイソザイムは、α−グルコシダーゼと同一または同様の酵素活性を付与する別種のタンパク質であり、例えば、スクラーゼ・イソマルターゼ（ＳＩ）、マルターゼ・グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）、グルコシダーゼＩＩ（ＧＡＮＡＢ）、および中性α−グルコシダーゼ（Ｃ  ＧＮＡＣ）などである。内因性酵素がα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）である場合、アイソザイムは、α−ガラクトシダーゼＡと同一または同様の酵素活性を付与する別種のタンパク質であり、例えば、ＧＬＡ活性を得るように操作されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼなどである。
【００２３】
一態様では、本発明は、酵素と、酵素を必要とする患者に酵素を効果的に補充する抗原結合タンパク質とを含有する生物学的治療用複合体を選択またはスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、生物学的治療用複合体はモデル系に投与され、該モデル系を補充酵素活性に対して評価する。一実施形態では、モデル系は、酵素の発現が不足しており、かつ抗原結合タンパク質の抗原コグネイトを発現する動物である。一実施形態では、動物モデルは、抗原結合タンパク質のヒト化コグネイトを発現し、酵素をコードする遺伝子のノックアウトを有するマウスである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、生物学的治療用複合体を概略的に示す図である。パネルＡは、二重特異性抗体（ｉｉ）と補充酵素（ｉ）とを含む生物学的治療用複合体を示す。パネルＢは、内部移行エフェクター特異的ハーフボディ（ｉｉ）と結合して、生物学的治療用複合体を形成している酵素−Ｆｃ融合ポリペプチド（ｉ）を示す。パネルＣは、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のＣ末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＤは、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のＮ末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＥは、抗内部移行エフェクター抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＦは、抗内部移行エフェクター抗体の軽鎖のＮ末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＣ、パネルＤ、パネルＥ、およびパネルＦにおける曲線はリンカーを表す。
【図２】図２は、内部移行エフェクター結合タンパク質（ＩＥ−ＢＰ）またはリソソーム蓄積症補充タンパク質（ＬＳＤ−ＲＰ）を発現するＣＨＯ細胞上清の抗ｈＦｃ非還元ウェスタンブロットを示す図である。レーン１には抗ＣＤ６３  ＩｇＧ４をロードし、レーン２にはＧＡＡ−Ｆｃノブをロードし、レーン３には抗ＣＤ６３  ＩｇＧ４  ＧＡＡをロードし、レーン４にはＧＡＡ抗ＣＤ６３  ＩｇＧ４をロードした。
【図３】図３は、蛍光基質（４−メチルウンベリフェリル−α−グルコシド）を用いて算出されたおおよそのＧＡＡ活性を表す棒グラフである。パネルＡとパネルＢのＹ軸は、タンパク質１モル当たりの毎時加水分解された基質のモル数である。Ｘ軸には、ＧＡＡ融合タンパク質の各々を列挙している。
【図４】図４は、ＨＥＫ細胞によって内部移行されたＧＡＡ構築物のおおよそのＧＡＡ活性を表す折れ線グラフである。パネルＡおよびパネルＢのＹ軸は、細胞可溶化物１ｍｇ当たりの毎時加水分解された基質のナノモル数を示す。Ｘ軸は、ＧＡＡ構築物の漸増濃度を示す。パネルＡの正方形（■）は、５ｍＭのマンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）（ＭＰＲ媒介リソソーム標的の競合物）の存在下でＨＥＫ細胞に投与された抗ＣＤ６３−ＧＡＡに相当し、丸（Ｄ）は、ＨＥＫ細胞に単独で投与された抗ＣＤ６３−ＧＡＡに相当する。パネルＢの丸（Ｄ）は、ＨＥＫ細胞に投与された抗ＣＤ６３−ＧＡＡに相当し、正方形（■）は、ＨＥＫ細胞に投与された、ＣＤ６３に結合しない抗ＣＤ６３−ＧＡＡの変異体に相当し、三角（▲）は、ＣＤ６３を発現しないＡ  ＣＤ６３  ＨＥＫ細胞に投与された抗ＣＤ６３−ＧＡＡに相当する。
【図５】図５は、ヒト筋芽細胞（パネルＡ）またはマウス筋芽細胞（パネルＢ）によって内部移行された、ＧＡＡ構築物のおおよそのＧＡＡ活性を表す折れ線グラフである。パネルＡおよびパネルＢのＹ軸は、細胞可溶化物１ｍｇ当たりの毎時加水分解された基質のナノモル数を示す。Ｘ軸は、Ｍ６Ｐの存在下または非存在下におけるＧＡＡ構築物（抗ＣＤ６３−ＧＡＡまたはｍｙｃＧＡＡのいずれか）の漸増濃度を示す。
【図６】図６は、ＧＡＡ野生型の新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）と比較した、３つのポンペ細胞株（ＧＭ２００８９、ＧＭ２００９０、およびＧＭ２００９１）のＧＡＡレベル（パネルＡ）およびグリコーゲン含有量（パネルＢ）を示す図である。パネルＡは、ポンペ細胞株における残留ＧＡＡタンパク質と、ＮＨＤＦにおけるＧＡＡタンパク質の野生型レベルとを示す抗ｈＧＡＡウェスタンブロットである。パネルＢは、細胞質内グリコーゲンを低減させるグルコース飢餓後のグリコーゲン含有量を、１００万個の細胞当たりのマイクログラムとして示す棒グラフである。
【図７】図７は、ポンペ細胞株ＧＭ２００８９（パネルＡ）、ＧＭ２００９０（パネルＢ）、およびＧＭ２００９１（パネルＣ）のグリコーゲン蓄積異常を、２００ｎＭの抗ＣＤ６３−ＧＡＡまたは２００ｎＭのｍｙｃ−ＧＡＡによって救済した結果を棒グラフの形態で示す。Ｙ軸は、１ミリグラムの細胞可溶化物当たりのグリコーゲン含有量をマイクログラム数で表す。
【図８】図８は、抗ＣＤ６３−ＧＬＡ（レーン１）、ＧＬＡ−Ｆｃノブ（レーン２）、ＧＬＡ−抗ＣＤ６３（レーン３）、抗ｍｙｃノブ（レーン４）、抗ＣＤ６３ホール（レーン５）を含有するＣＨＯ細胞抽出物上清、ならびに抗ｍｙｃノブおよび抗ＣＤ６３ホールを含有する上清の混合物（レーン６）の抗ｈＦｃ非還元ウェスタンブロットを示す。
【図９】図９は、ＧＬＡ含有融合タンパク質のＧＬＡ酵素活性（Ｙ軸は融合タンパク質１ナノモル当たりの毎時加水分解された基質のナノモル数）を棒グラフの形態で示し、Ｘ軸の左から右に、抗ＣＤ６３−ＧＬＡ（重鎖Ｃ末端構築物）、ＧＬＡ−Ｆｃ、ＧＬＡ−抗ＣＤ６３（重鎖Ｎ末端構築物）、ＧＬＡ−ｍｙｃ−ＦＬＡＧ、およびＧＬＡ  ６−ｈｉｓを挙げている。
【図１０】図１０は、ＨＥＫ細胞によって内部移行されたＧＬＡ構築物を含有するＨＥＫ細胞の抽出物に見られる、おおよそのＧＬＡ活性を表す折れ線グラフである。Ｙ軸は、ＧＬＡ活性を、細胞可溶化物１ミリグラム当たりの毎時加水分解された基質のナノモル数で示す。Ｘ軸は、ＧＡＡ構築物の漸増濃度を示す。最上部の線はＧＬＡ−抗ＣＤ６３に相当し、中間の線はＧＬＡ−ｍｙｃ＋抗ｍｙｃ／抗ＣＤ６３二重特異性抗体に相当し、最下部の線はＧＬＡ−ｍｙｃに相当する。
【図１１】図１１は、ｐＨｒｏｄｏタグ付きタンパク質が、ＨＥＫ細胞（パネルＡ）、ＰＣ−３細胞（パネルＢ）、およびＨｅｐＧ２細胞（パネル３）の低ｐＨ分画（すなわち、リソソーム分画）に取り込まれる量を表す折れ線グラフである。丸（Ｄ）はｐＨｒｏｄｏタグ付き抗ＣＤ６３抗体に相当し、正方形（■）はｐＨｒｏｄｏタグ付き抗ＡＰＬＰ２抗体に相当し、三角（▲）はｐＨｒｏｄｏタグ付きＧＬＡに相当する。
【図１２】図１２は、内部移行された抗ＣＤ６３−ＧＡＡを含有する細胞可溶化物の還元ウェスタンブロットを示す。各レーンは、タンパク質内部移行後、所定の日数で作製された細胞抽出物に相当する。パネルＡは、抗ＧＡＡ抗体でプローブされたウェスタンブロットである。１５０ｋＤａの抗ＣＤ６３−ＧＡＡは、マーカー（←ａ）の場所で観察されている。リソソーム内のＧＡＡの７６ｋＤａ活性形態は、マーカー（←ｂ）の場所で観察されている。パネルＢは、抗ｈＩｇＧ抗体でプローブされたウェスタンブロットである。１５０ｋＤａの抗ＣＤ６３−ＧＡＡは、マーカー（ｃ→）の場所で観察されている。抗体重鎖（５０ｋＤａ）は、マーカー（ｄ→）の場所で観察されている。抗体軽鎖（２３ｋＤａ）は、マーカー（ｅ→）の場所で観察されている。
【図１３】図１３は、抗ｈＧＡＡ抗体のウェスタンブロットを示す図である。７６ｋＤａのバンドは、成熟ＧＡＡに相当する。レーン１には抗ＣＤ６３−ＧＡＡを付与されたヒト化ＣＤ６３マウスからの肝臓抽出物が含まれ、レーン２には腎臓、レーン３には心臓、レーン４には腓腹筋、レーン５には四頭筋、レーン６には横隔膜の抽出物が含まれる。
【図１４】図１４は、抗ｈＣＤ６３−ＧＡＡを５０ｍｇ／ｋｇで付与されてから２４時間後の野生型（＋／＋）マウスおよびヒト化ＣＤ６３（ｈｕ／ｈｕ）マウスからの組織抽出物の抗ｈＧＡＡ抗体ウェスタンブロットを示す。リソソーム内のＧＡＡの７６ｋＤａ活性形態が観察されている。レーン１およびレーン２は、それぞれ、野生型マウスおよびヒト化マウスからの心臓抽出物に相当する。レーン３およびレーン４は、野生型マウスおよびヒト化マウスからの腓腹筋抽出物に相当する。レーン５およびレーン６は、野生型マウスおよびヒト化マウスからの横隔膜抽出物に相当する。
【図１５】図１５は、腓腹筋、四頭筋、横隔膜、心臓、肝臓、腎臓、および脾臓に存在する、抗インテグリンアルファ７抗体、抗ＣＤ９抗体、および抗ジストログリカン抗体の相対量であって、肝臓に存在するレベルに標準化された相対量を示すヒストグラムである。
【図１６】図１６は、ｐＨｒｏｄｏタグ付き抗体のリソソーム標的指向化を表すヒストグラムである。Ｙ軸は標準化された小胞の蛍光量を表す。Ｘ軸は、各抗体を示し、左から右に、抗ｍｙｃ、抗ＣＤ６３、抗ジストログリカン、抗Ｍ−カドヘリン、抗ＣＤ９、および抗インテグリンアルファ７を示す。
【図１７】図１７は、組織１ミリグラム当たりのグリコーゲンをマイクログラム数で表したグリコーゲンレベルを示すドットプロットである。組織を、Ｘ軸の左から右に、心臓、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、および三頭筋として示している。丸（●）は未処置のＧＡＡノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、正方形（■）は抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、上向き三角（▲）はｈＧＡＡで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、下向き三角（▼）は未処置の野生型マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。処置剤は、ＤＮＡ構築物の流体力学的送達によって投与された。
【図１８】図１８は、組織１ミリグラム当たりのグリコーゲンをマイクログラム数で表したグリコーゲンレベルを示すドットプロットである。組織を、Ｘ軸の左から右に、心臓、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、および三頭筋として示している。丸（●）は未処置のＧＡＡノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、正方形（■）は抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、上向き三角（▲）は抗ｈＣＤ６３−ＧＡＡで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、下向き三角（▼）は未処置の野生型マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。処置剤は、ＤＮＡ構築物の流体力学的送達によって投与された。
【図１９】図１９は、抗ｍｙｃ抗体、天然リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）、抗ｍｙｃ−ＬＩＰＡ融合タンパク質（重鎖Ｃ末端融合）、およびＬＩＰＡ−抗ｍｙｃ（重鎖Ｎ末端融合）によって毎時加水分解された基質（４−メチルウンベリフェリルオレアート）をナノモル数として表した（Ｙ軸）、リパーゼ活性を示すヒストグラムである。
【図２０】図２０は、組織１ミリグラム当たりのグリコーゲンをマイクログラム数で表したグリコーゲンレベルを示すドットプロットである。組織を、Ｘ軸の左から右に、心臓、三頭筋、四頭筋、腓腹筋、および横隔膜として示している。丸（●）は未処置のＧＡＡノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、正方形（■）は抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、上向き三角（▲）は抗ｈＣＤ６３−ＧＡＡで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおけるグリコーゲンレベルを示し、下向き三角（▼）は未処置の野生型マウスにおけるグリコーゲンレベルを示す。処置剤は、ＤＮＡ構築物の流体力学的送達（ＨＤＤ）によって投与された。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
説明
本発明は、記載された特定の実施形態、組成物、方法、および実験条件に限定されるものではないが、それはこうした実施形態、組成物、方法、および条件が異なる場合があるからである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲のみによって限定されるものである以上、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、限定することを意図するものではない。
【００２６】
本明細書に記載した方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、一部の好ましい方法および材料をこれから記述する。本明細書で引用された全ての出版物は、その記述全体が参照により本明細書に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００２７】
「リソソーム蓄積症」は、リソソームの機能不全により生じる任意の障害を含む。現在おおよそ５０種の障害が確認されており、その中で最もよく知られているものとして、テイ・サックス病、ゴーシェ病、およびニーマン・ピック病が挙げられる。これらの疾患の病因は、通常、タンパク質機能の喪失に起因して、不完全な分解産物がリソソーム内に蓄積することであると考えられている。リソソーム蓄積症は、正常な機能ではリソソーム含有物を分解するかまたは分解を調整するタンパク質における機能喪失または減弱バリアントによって引き起こされる。リソソーム蓄積症と密接に関連するタンパク質として、酵素、受容体および他の膜貫通タンパク質（例えば、ＮＰＣ１）、翻訳後修飾タンパク質（例えば、スルファターゼ）、膜輸送タンパク質、ならびに非酵素的補助因子および他の可溶性タンパク質（例えば、ＧＭ２ガングリオシド活性化因子）が挙げられる。リソソーム蓄積症には、欠損酵素それ自体によって引き起こされる前述の障害が包含されるだけでなく、任意の分子欠損によって引き起こされる任意の障害も含まれる。したがって、本明細書で使用される場合、用語「酵素」は、リソソーム蓄積症に関連する前述の他のタンパク質を包含することが意図される。
【００２８】
分子的損傷の性質が疾患の重症度に影響を及ぼすことが多く、換言すれば、完全な機能喪失は、胎児または新生児の発症に関連する傾向にあり重度の症状に関与するが、部分的な機能喪失は、（比較的）軽度の遅発型疾患に関連している。一般的に、欠損細胞における代謝障害を治すために、回復させる必要があるのは、活性のごくわずかな割合のみである。表１には、よく見られるリソソーム蓄積症の一部と、それらに関連する機能喪失タンパク質の一覧を示す。リソソーム蓄積症は、概してＤｅｓｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，２０１２に記載されている。
【００２９】
リソソーム蓄積症は、欠陥のあるリソソーム内に蓄積する産物の種類によって分類され得る。スフィンゴリピドーシスは、脂肪族アミノアルコールに結合した脂肪酸を含む脂質であるスフィンゴ脂質の代謝に影響を及ぼす疾患の一つである（Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ，“Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，”５０  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７３３−７６４，Ｊｕｌｙ  １９８１に概説されている）。スフィンゴリピドーシスの蓄積産物として、ガングリオシド（例えば、テイ・サックス病）、糖脂質（例えば、ファブリー病）、およびグルコセレブロシド（例えば、ゴーシェ病）が挙げられる。
【００３０】
ムコ多糖症は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧＳまたはムコ多糖類）の代謝に影響を及ぼす疾患の一群であり、このグリコサミノグリカンは、骨、軟骨、腱、角膜、皮膚、および結合組織の形成に役立つ二糖の反復構造を持つ非分岐長鎖である（Ｊ．Ｍｕｅｎｚｅｒ，“Ｅａｒｌｙ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，”１１１（２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．６３−７２（Ｆｅｂ．２０１４）；Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，”８（１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１８１−２３１（Ｄｅｃ．２０１４）に概説されている）。ムコ多糖症の蓄積産物として、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、コンドロイチン硫酸の種々の形態、およびヒアルロン酸が挙げられる。例えば、モルキオ症候群Ａは、リソソーム酵素のガラクトース−６−硫酸スルファターゼの欠損により生じ、リソソーム内のケラチン硫酸およびコンドロイチン６−硫酸の蓄積をもたらす。
【００３１】
グリコーゲン蓄積症（別名、糖原病）は、細胞がグリコーゲンを代謝（生成または分解）することができないことに起因する。グリコーゲン代謝は、グルコース−６−ホスファターゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、グリコーゲン分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコーストランスポーター、アルドラーゼＡ、ベータエノラーゼ、およびグリコーゲンシンターゼ含めた種々の酵素または他のタンパク質により調整される。典型的なリソソーム蓄積／グリコーゲン蓄積症はポンペ病であり、ポンペ病では、欠陥酸性アルファグルコシダーゼによりグリコーゲンがリソソーム内に蓄積されることになる。症状として、肝腫大、筋力低下、心不全、また乳児バリアントの場合には、２歳までの死亡が挙げられる（ＤｉＭａｕｒｏ  ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌ，“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉｓ，”３０（２）Ａｃｔａ  Ｍｙｏｌ．９６−１０２（Ｏｃｔ．２０１１）を参照）。
【００３２】
「生物学的治療用複合体」は、（ｉ）２つ以上の機能ドメインを含む単一タンパク質、（ｉｉ）２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質、および（ｉｉｉ）２つ以上のタンパク質または２つ以上のポリペプチドの混合物を含む。ポリペプチドという用語は、通例、ペプチド結合により結合している一本鎖アミノ酸を意味するものである。タンパク質という用語は、ポリペプチドという用語を包含するだけでなく、さらに複雑な構造をも含む。すなわち、単一ポリペプチドはタンパク質であり、タンパク質は、高次構造に結合した１つ以上のポリペプチドを含むことができる。例えば、ヘモグロビンは、４つのポリペプチド（２つのアルファグロビンポリペプチドおよび２つのベータグロビンポリペプチド）を含むタンパク質である。ミオグロビンもタンパク質であるが、これは単一のミオグロビンポリペプチドのみを含むものである。
【００３３】
生物学的治療用複合体は１つ以上のポリペプチドと、少なくとも２つの機能を含む。これらの機能のうちの一方は、リソソーム蓄積症に関連した欠陥タンパク質の活性を補充することである。これらの機能のうちの他方は、内部移行エフェクターへの結合である。したがって、リソソームタンパク質活性（例えば、酵素活性またはトランスポーター活性、別名、リソソーム病関連タンパク質（ＬＳＤ−ＲＰ）活性）と、内部移行エフェクターに結合する能力（別名、内部移行エフェクター結合タンパク質（ＩＥ−ＢＰ）活性）とを付与する単一ポリペプチドは、生物学的治療用複合体である。また、一方のタンパク質がリソソームタンパク質機能を有し、別のタンパク質が内部移行エフェクター結合活性を有するタンパク質の混合物も生物学的治療用複合体である。図１は、生物学的治療用複合体の様々な例を示す。一例（図１、パネルＡ）では、生物学的治療用複合体は、リソソーム補充タンパク質（六角形により示されるＬＳＤ−ＲＰ）と、リソソーム補充タンパク質に結合する（破線）および内部移行エフェクターに結合する（実線）二重特異性抗体（ＩＥ−ＢＰ）とを含む。ここで、二重特異性抗体の一方アームはＬＳＤ−ＲＰに非共有結合し、他方のアームは内部移行エフェクターに非共有結合し、その結果、補充タンパク質（ＬＳＤ−ＲＰ）がリソソーム内に内部移行できるようになる。別の例（パネルＢ）では、生物学的治療用複合体は、２つのポリペプチド（一方のポリペプチドはＬＳＤ−ＲＰ機能を有し、他方はＩＥ−ＢＰ機能を有する）を含む単一タンパク質を含む。ここで、ＬＳＤ−ＲＰはイムノグロブリンＦｃドメインまたは重鎖定常領域に融合され、これが、ＬＳＤ−ＲＰ半抗体のＦｃドメインと結合し、二機能性生物学的治療用複合体を形成する。パネルＢに示した実施形態は、ＬＳＤ−ＲＰが、半抗体のイムノグロブリン可変ドメインでの抗原抗体相互作用を介するのではなく半抗体の一方に共有結合で結合していることを除いて、パネルＡの実施形態と類似している。
【００３４】
他の例では、生物学的治療用複合体は、ＩＥ−ＢＰに（直接的に、またはリンカーを介して間接的に）共有結合したＬＳＤ−ＲＰからなる。一実施形態では、ＬＳＤ−ＲＰは、イムノグロブリン分子のＣ末端（例えば、重鎖または軽鎖）に結合されている。別の実施形態では、ＬＳＤ−ＲＰは、イムノグロブリン分子のＮ末端（例えば、重鎖または軽鎖）に結合されている。これらの例では、イムノグロブリン分子はＩＥ−ＢＰである。
【００３５】
「リソソーム蓄積症関連タンパク質」または「ＬＳＤ−ＲＰ」は、リソソーム蓄積症の病因または生理作用に関連した任意のタンパク質を意味する。ＬＳＤ−ＲＰには、実在の酵素、輸送タンパク質、受容体か、または、欠陥があり、かつ疾患の原因となった分子的損傷があると考えられる他のタンパク質が含まれる。ＬＳＤ−ＲＰにはまた、疾患の分子的損傷を補充もしくは回避する類似または十分な生化学的または生理学的活性を付与することができる任意のタンパク質も含まれる。例えば、「アイソザイム」はＬＳＤ−ＲＰとして用いられ得る。リソソーム蓄積症関連タンパク質の例として、表１の「関与酵素／タンパク質」に列挙されたもの、およびリソソーム蓄積症の分子欠損を回避する任意の既知のタンパク質もしくは最近発見されたタンパク質または他の分子が挙げられる。
【００３６】
分子欠損がα−グルコシダーゼ活性における欠損であるポンペ病の場合には、ＬＳＤ−ＲＰとして、ヒトアルファ−グルコシダーゼ、および「アイソザイム」が挙げられ、アイソザイムの例として、他のアルファ−グルコシダーゼ類、改変組換えアルファ−グルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ類、組換えグルコシダーゼ類、非還元末端１−４結合アルファ−グルコース残基を加水分解して単一アルファグルコース分子を放出するように改変された任意のタンパク質、任意のＥＣ  ３．２．１．２０酵素、グリコーゲンまたはデンプン用の天然または組換え低ｐＨ糖質加水分解酵素、およびグルコシル加水分解酵素（例えば、スクラーゼ・イソマルターゼ、マルターゼ・グルコアミラーゼ、グルコシダーゼＩＩ、および中性アルファ−グルコシダーゼ）などがある。
【００３７】
「内部移行エフェクター」は、細胞へ内部移行され得るタンパク質か、または逆行性膜輸送に関与もしくは寄与するタンパク質を含む。いくつかの例において、内部移行エフェクターは経細胞輸送を経るタンパク質である；すなわち、該タンパク質は細胞の一方の側で内部移行されて、細胞の他方の側へ（例えば、頂端から基底へ）輸送されるものである。多くの実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質は細胞表面発現タンパク質または可溶性細胞外タンパク質である。一方で、本発明はまた、内部移行エフェクタータンパク質がエンドソーム、小胞体、Ｇｏｌｇｉ、リソソームなどの細胞内区画内で発現する実施形態についても考慮する。例えば、逆行性膜輸送（例えば、初期／リサイクリングエンドソームからトランス−Ｇｏｌｇｉネットワークへの経路）に関与するタンパク質は、本発明の種々の実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質として作用してもよい。いずれの場合も、ＩＥ−ＢＰが内部移行エフェクタータンパク質に結合することによって、生物学的治療用複合体全体およびそれらに関連する任意の分子（例えば、ＬＳＤ−ＲＰ）も、細胞内へ内部移行されるようになる。以下で説明する通り、内部移行エフェクタータンパク質は、細胞へ直接内部移行されるタンパク質、および細胞へ間接的に内部移行されるタンパク質を含む。
【００３８】
細胞へ直接内部移行される内部移行エフェクタータンパク質は、細胞の内部移行を起こす、少なくとも１つの細胞外ドメイン（例えば、膜貫通タンパク質、ＧＰＩアンカータンパク質など）を有する膜結合性分子を含み、好ましくは細胞内分解経路および／またはリサイクリング経路を介してプロセシングされる。細胞へ直接内部移行される内部移行エフェクタータンパク質の特定の非限定例として、例えば、ＣＤ６３、ＭＨＣ−Ｉ（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７）、Ｋｒｅｍｅｎ−１、Ｋｒｅｍｅｎ−２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ−受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質−２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＭＡＬ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅタンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、およびスカベンジャー受容体（例えば、ＳＣＡＲＡ１−５、ＳＣＡＲＢ１−３、ＣＤ３６）などが挙げられる。
【００３９】
特定の実施形態において、内部移行エフェクターはプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）である。ＰＲＬＲは、特定の治療用途の標的になるだけでなく、その高速の内部移行および代謝回転によって有効な内部移行エフェクタータンパク質でもあることが見出された。内部移行エフェクタータンパク質としてのＰＲＬＲの可能性は、例えば、国際公開第２０１５／０２６９０７号に記載されており、とりわけ抗ＰＲＬＲ抗体がインビトロにてＰＲＬＲ発現細胞により効果的に内部移行されることが示されている。
【００４０】
特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ−１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ−１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）などである。他の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ−カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ−１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ−７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ−１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである。一部の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＬＰＬ２、またはＰＰＲＬＲである。
【００４１】
内部移行エフェクター（ＩＥ）を細胞に直接内部移行する実施形態において、ＩＥ−ＢＰは、例えば、ＩＥと特異的に結合する抗体もしくは抗体の抗原結合断片、またはＩＥと特異的に相互作用するリガンドもしくはリガンドの一部であり得る。例えば、ＩＥがＫｒｅｍｅｎ−１またはＫｒｅｍｅｎ−２である場合、ＩＥ−ＢＰは、Ｋｒｅｍｅｎリガンド（例えば、ＤＫＫ１）もしくはそのＫｒｅｍｅｎ結合部分を含んでいてもよいか、またはそれからなっていてもよい。別の例として、ＩＥがＡＳＧＲ１などの受容体分子である場合、ＩＥ−ＢＰは、受容体（例えば、アシアロオロソムコイド［ＡＳＯＲ］またはベータ−Ｇａ１ＮＡｃ）またはその受容体結合部分に特異的なリガンドを含んでいてもよいか、またはそれからなっていてもよい。
【００４２】
細胞へ間接的に内部移行される内部移行エフェクタータンパク質は、それら自身では内部移行しないが、細胞へ直接内部移行される第２タンパク質またはポリペプチドと結合または他の方法で結びついた後に細胞へ内部移行される、タンパク質およびポリペプチドを含む。細胞へ間接的に内部移行されるタンパク質は、例えば、内部移行細胞表面発現受容体分子と結合することができる可溶性リガンドを含む。内部移行細胞表面発現受容体分子とのその相互作用を介して細胞へ（間接的に）内部移行する、可溶性リガンドの非限定的な例としては、トランスフェリンが挙げられる。ＩＥがトランスフェリン（または別の間接的に内部移行されるタンパク質）である実施形態において、ＩＥ−ＢＰとＩＥとの結合、およびＩＥとトランスフェリン受容体（または別の内部移行細胞表面発現受容体分子）との相互作用により、ＩＥ−ＢＰ全体およびそれと関連する任意の分子（例えば、ＬＳＤ−ＲＰ）が細胞へ内部移行されるようになり、同時にＩＥとその結合パートナーの内部移行を伴う。
【００４３】
ＩＥを細胞に間接的に内部移行する実施形態において、ＩＥ−ＢＰは、例えば、ＩＥと特異的に結合する抗体もしくは抗体の抗原結合断片、または可溶性エフェクタータンパク質と特異的に相互作用する受容体もしくは受容体の一部であり得る。例えば、ＩＥがサイトカインである場合、ＩＥ−ＢＰは対応するサイトカイン受容体またはそのリガンド結合部分を含んでいてもよいか、またはそれからなっていてもよい。
【００４４】
ＩＥの典型例は、細胞膜を４回貫通する細胞表面タンパク質のテトラスパニンスーパーファミリーのメンバーであるＣＤ６３である。ＣＤ６３は、実質的に全ての組織で発現し、シグナル伝達複合体の形成および安定化に関与していると考えられている。ＣＤ６３は、細胞膜、リソソーム膜、および後期エンドソーム膜に局在化している。ＣＤ６３はインテグリンと結合することが知られており、また上皮間葉転移に関与している可能性がある。Ｈ．Ｍａｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒｓ，”１１（６）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．４２８−４２，Ｍａｙ  １９９７；ａｎｄ  Ｍ．Ｍｅｔｚｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣＤ６３  ａｎｔｉｇｅｎ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｃｌｏｎｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，”２６６  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２３９−３２４５，１９９１を参照されたい。
【００４５】
ＩＥの別の典型例は、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体様タンパク質２（「ＡＰＬＰ２」）であり、これはＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）ファミリーの遍在発現メンバーである。ＡＰＬＰ２は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子（例えば、Ｋｄ）と相互作用することが知られている膜結合タンパク質である。このタンパク質は細胞表面でＫｄに結合し、クラスリン依存的にＫｄと共に内部移行される。Ｔｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，”２８４  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４２９６  −３４３０７（２００９）を参照されたい。
【００４６】
ＩＥの別の典型例は、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）である。プロラクチン受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーであり、リガンドが結合しそれに続いて二量体化されると、「チロシンキナーゼのＪａｋ２、Ｆｙｎ、およびＴｅｃ、ホスファターゼＳＨＰ−２、グアニンヌクレオチド交換因子Ｖａｖ、ならびにシグナル伝達抑制因子ＳＯＣＳ」を活性化する（Ｃｌｅｖｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｌｉｎｅ，“Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，”１０（１０）Ｌｕｐｕｓ  ７０６−１８（２００１），摘要を参照）。プロラクチン受容体は、エンドサイトーシスリサイクリングを経て、リソソーム分画内で見出され得る。Ｇｅｎｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃＤＮＡ，”９９（２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２２１−８（１９９４）；ａｎｄ  Ｆｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ｏｎ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ，”１１５（５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １８４２−９（１９８４）を参照されたい。
【００４７】
「免疫反応」は、本明細書で使用される場合、通例、外部または「非自己」タンパク質に対する患者の免疫学的応答を意味するものである。免疫学的応答は、アレルギー反応、および補充酵素の有効性を妨げる抗体の発生を含む。一部の患者は、非機能性タンパク質のいずれをも産生することはなく、したがって補充酵素を「異種」タンパク質にする場合がある。例えば、ＧＬＡが欠乏しているファブリー病患者への組換えＧＬＡ（ｒＧＬＡ）の反復注射は、アレルギー反応を引き起こすことが多い。他の患者では、ｒＧＬＡに対する抗体の産生によって、疾患の治療において補充酵素の有効性が低減することが示されている。例えば、Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  α−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡＧＡ）ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”８５（５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５６９−５８０（２００９））を参照されたい。この文献は、修飾ＮＡＧＡを「アイソザイム」として使用して、ＧＬＡ補充することについて論じている。修飾ＮＡＧＡは、ＧＬＡとの免疫学的交差反応性を有さず、「組換えＧＬＡで繰り返し治療を受けているファブリー病患者由来の血清に対して反応しなかった」（同上文献の摘要）。
【００４８】
用語「タンパク質」は、アミド結合を介して共有結合している約２０個を超えるアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを意味する。タンパク質は、一般に当該技術分野で「ポリペプチド」として知られる１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。したがって、ポリペプチドはタンパク質であってもよく、タンパク質は複数のポリペプチドを含有して、単一機能性生体分子を形成してもよい。ジスルフィド架橋（すなわち、システイン残基間で架橋してシスチンを形成）が一部のタンパク質に含まれてもよい。これらの共有結合は、単一ポリペプチド鎖内にあっても、２つの個々のポリペプチド鎖間にあってもよい。例えば、ジスルフィド架橋は、インスリン、イムノグロブリン類、およびプロタミンなどの適切な構造と機能とに不可欠である。ジスルフィド結合形成の最近の総説として、Ｏｋａ  ａｎｄ  Ｂｕｌｌｅｉｄ，“Ｆｏｒｍｉｎｇ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，”１８３３（１１）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２４２５−９（２０１３）を参照されたい。
【００４９】
ジスルフィド結合形成に加えて、タンパク質は、他の翻訳後修飾を受ける場合がある。これらの修飾として、脂質修飾（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）、アルキル化（例えば、メチル化）、アシル化、アミド化、グリコシル化（例えば、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、トレオニン、チロシン、および／またはトリプトファンにおけるグリコシル基の付加）、およびリン酸化（すなわち、セリン、トレオニン、チロシン、および／またはヒスチジンへのリン酸基の付加）が挙げられる。真核生物で産生されるタンパク質の翻訳後修飾に関する最近の総説として、Ｍｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ，“Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”１５（６）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５１２−２０（２０１４）；およびＢｌｉｘｔ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄ，“Ａｒｒａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ（ＰＴＧ），”１８  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．６２−９（２０１４）を参照されたい。
【００５０】
イムノグロブリンは、複数のポリペプチド鎖と広範な翻訳後修飾とを有するタンパク質である。標準のイムノグロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＧ）は、４つのポリペプチド鎖（２つの軽鎖および２つの重鎖）を含む。各軽鎖は１つの重鎖にシスチンジスルフィド結合を介して結合し、２つの重鎖は２つのシスチンジスルフィド結合を介して相互に結合している。哺乳類系で産生されるイムノグロブリンはまた、種々の残基（例えばアスパラギン残基）で種々の多糖類によりグリコシル化され、種と種の間で異なる可能性があり、治療用抗体に対する抗原性に影響を及ぼし得る（Ｂｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｐｅａｒｍａｎ，“Ｔｈｅ  ｃｈｏｉｃｅ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，３０  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １０７−１１２（２０１４）を参照）。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」には、生物学的治療用タンパク質、研究または治療法において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のＦｃ−融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ならびにペプチドホルモンなどが含まれる。タンパク質は、組換え細胞系産生システム、例えば、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えばピキア属の種）、哺乳類系（例えば、ＣＨＯ細胞、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞などのＣＨＯ派生物）を用いて産生されてもよい。生物学的治療用タンパク質とその産生について論じている最近の総説として、Ｇｈａｄｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”２８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ  Ｒｅｖ．１４７−７５（２０１２）を参照されたい。
【００５２】
用語「抗体」には、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）を含む、イムノグロブリン分子が包含される。各重鎖は、重鎖可変領域（本発明においてＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本発明においてＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域に割り込まれている。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲによって構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略されてもよく、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略されてもよい）。用語「高親和性」抗体は、それらの標的への結合親和性が、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））または溶液親和性ＥＬＩＳＡで測定した場合に、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍ、または少なくとも１０−１２Ｍである抗体を意味する。
【００５３】
語句「二重特異性抗体」には、２以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体が含まれる。二重特異性抗体は、通例２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、（２つの異なる分子（例えば、抗原）上にある、または同一分子上（例えば、同一抗原上）にある）別々のエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１桁〜２桁、または３桁もしくは４桁低いのが一般的であり、その逆の場合もまた同様である。二重特異性抗体により認識されるエピトープは、同一の標的または異なる標的（例えば、同一のタンパク質または異なるタンパク質）にあり得る。二重特異性抗体は、例えば、同一の抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同一の抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合可能であり、こうした配列は、イムノグロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現することができる。典型的な二重特異性抗体は、２つの重鎖であって、その各々が３つの重鎖ＣＤＲ、それに続けて（Ｎ末端からＣ末端方向に）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する該重鎖と、イムノグロブリン軽鎖であって、抗原結合特異性を付与しないが各重鎖と結合可能であるか、または各重鎖と結合可能でありかつ重鎖抗原結合領域が結合するエピトープの１つ以上に結合することができるか、または各重鎖と結合可能でありかつ重鎖の一方もしくは両方をエピトープの一方もしくは両方に結合させることができる該イムノグロブリン軽鎖とを有する。
【００５４】
語句「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」には、任意の生物体由来のイムノグロブリン重鎖定常領域配列が含まれ、特別の規定がない限り、重鎖可変ドメインが含まれる。特別の規定がない限り、重鎖可変ドメインには、３つの重鎖ＣＤＲと４つのＦＲ領域とが含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲと、ＣＤＲおよびＦＲと、それらの組み合わせとが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端方向に）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片には、抗原を特異的に認識する（例えば、抗原をマイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度範囲のＫＤで認識する）ことができ、発現できかつ細胞から分泌可能であり、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。
【００５５】
語句「軽鎖」には、任意の生物体由来のイムノグロブリン軽鎖定常領域配列が含まれ、特別の規定がない限り、ヒトカッパ軽鎖およびヒトラムダ軽鎖が含まれる。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインには、特別の規定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲと４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれるのが典型的である。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメインと、軽鎖定常ドメインとが含まれる。本発明で使用可能な軽鎖には、例えば、抗原結合タンパク質が選択的に結合する第１の抗原と第２の抗原のいずれにも選択的に結合することのない軽鎖が含まれる。適切な軽鎖として、現存する抗体ライブラリー（ウエットライブラリーまたはインシリコ）で最も一般的に用いられる軽鎖をスクリーニングすることにより特定され得る軽鎖が挙げられ、該軽鎖は、抗原結合タンパク質の抗原結合ドメインの親和性および／または選択性を実質的に損なわないものである。また、適切な軽鎖として、抗原結合タンパク質の抗原結合領域が結合するエピトープの一方または両方に結合可能な軽鎖が挙げられる。
【００５６】
語句「可変ドメイン」には、次のアミノ酸領域をＮ末端からＣ末端の配列に含む（特に明記されない限り）、イムノグロブリン軽鎖または重鎖（所望通りに修飾済）のアミノ酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「可変ドメイン」には、二重ベータシート構造を有する標準ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）にフォールディング可能なアミノ酸配列が含まれ、このベータシートは第１のベータシートと第２のベータシートの残基間がジスルフィド結合により連結されている。
【００５７】
語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」には、生物体のイムノグロブリン遺伝子の核酸配列でコードされるアミノ酸配列が含まれ、該アミノ酸配列は、通常（すなわち、野生型動物では）イムノグロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域における２つのフレームワーク領域の間に見られる。ＣＤＲは、例えば生殖細胞系の配列または再構成配列もしくは非再構成配列によってコードされ、例えば、ナイーヴＢ細胞もしくは成熟Ｂ細胞またはＴ細胞によってコードされ得る。一部の状況（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によりコードされることができ、該２つ以上の配列は、隣接していない（例えば、非再構成核酸配列において）が、配列をスプライシングするかまたは連結（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ−Ｄ−Ｊ再構成）した結果として、Ｂ細胞核酸配列において隣接するものである。
【００５８】
用語「抗体断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を意味する。用語「抗体断片」に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインとＶＨドメインとからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）からなり、合成リンカーによって接続されて単一タンパク質鎖を形成し、そこでＶＬ領域とＶＨ領域が一対となって一価分子を形成しているｓｃＦｖが挙げられる。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も用語「抗体」に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）。
【００５９】
語句「Ｆｃ含有タンパク質」には、イムノグロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも機能性部分を含む、抗体、二重特異性抗体、イムノアドヘシン、および他の結合タンパク質が含まれる。「機能性部分」は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃｙＲまたはＦｃＲｎ、すなわち胎児性Ｆｃ受容体）を結合することができる、ならびに／または補体の活性化に関与することができるＣＨ２およびＣＨ３領域を意味する。ＣＨ２およびＣＨ３領域が、任意のＦｃ受容体を結合不可能にし、かつ補体の活性化を不可能にする欠失、置換、および／もしくは挿入、または他の修飾を含む場合、ＣＨ２およびＣＨ３領域は機能性ではない。
【００６０】
Ｆｃ含有タンパク質は、イムノグロブリンドメインに修飾部を含むことができ、その修飾部が結合タンパク質の１つ以上のエフェクター機能に影響を及ぼす箇所を含んでいる（例えば、ＦｃｙＲ結合、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼし、したがって半減期および／またはＣＤＣ活性に影響を及ぼす修飾部など）。こうした修飾は、以下に限定されないが、イムノグロブリン定常領域のＥＵ番号付けに準拠した次に示す修飾およびそれらの組み合わせを含む：２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、および４３９。
【００６１】
例えば、限定のためではないが、結合タンパク質はＦｃ含有タンパク質であり、血清半減期が（記載の修飾を含まない同一のＦｃ含有タンパク質と比較して）改善されており、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）での修飾；２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）での修飾；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾；または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での修飾；または２５０位および／もしくは４２８位での修飾；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾を有する。別の例では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９１（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含み得る。
【００６２】
用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、抗原（細胞特異的抗原および／または本発明の標的抗原）のエピトープを特異的に認識するポリペプチドまたはタンパク質（機能単位で複合体化した１つ以上のポリペプチド）を意味する。抗原結合タンパク質は、多特異性であってもよい。抗原結合タンパク質に関連する用語「多特異性」は、そのタンパク質が同一の抗原または異なる抗原における異なるエピトープを認識することを意味する。本発明の多特異性抗原結合タンパク質は、単一の多機能性ポリペプチドであり得るか、または相互に共有結合的または非共有結合的に結合した２つ以上のポリペプチドの多量体複合体であり得る。用語「抗原結合タンパク質」には、別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）と連結し得るかまたは共発現し得る、本発明の抗体またはその断片が含まれる。例えば、抗体またはその断片は、１つ以上の他の分子実体（タンパク質またはその断片など）に機能的に連結して（例えば、化学的共役、遺伝子融合、または非共有結合的結合などにより）、第２の結合特異性を有する二重特異性または多特異性の抗原結合分子を生成することができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、多特異性抗原結合ポリペプチドによって認識される抗原の一部分を意味する。単一抗原（抗原ポリペプチドなど）が、２つ以上のエピトープを有していてもよい。エピトープは、構造的または機能的として定義され得る。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、抗原結合ポリペプチドと抗原間の相互作用の親和性に直接寄与する残基として定義される。エピトープは、高次構造的、すなわち、非直線状アミノ酸で構成されていてもよい。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的活性表面基である決定基を含んでもよく、特定の実施形態では、特定の３次元構造特性および／または特定の荷電特性を有してもよい。連続アミノ酸から形成されたエピトープは一般に、変性溶媒への露出に際して保持されるのに対して、三次フォールディングにより形成されるエピトープは一般に、変性溶媒での処理に際して損なわれる。
【００６４】
用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を意味する。好ましくは、本発明のドメインは細胞特異的抗原または標的抗原に結合する。本明細書で使用される場合、細胞特異的抗原ドメインまたは標的抗原結合ドメインなどには、天然に存在するか、酵素的に入手可能であるか、合成か、または遺伝子操作されている任意のポリペプチドまたは糖タンパク質であって、抗原に特異的に結合する該ポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。
【００６５】
用語「ハーフボディ」または「半抗体」は、交換可能に用いられ、基本的に１つの重鎖と１つの軽鎖とを含む抗体の半分を意味する。抗体重鎖は二量体を形成することができ、したがって１つのハーフボディの重鎖は、異なる分子（例えば、別のハーフボディ）または別のＦｃ含有ポリペプチドと結合している重鎖と結合することができる。２つのわずかに異なるＦｃドメインは、二重特異性抗体、または他のヘテロ二量体、ヘテロ三量体、およびヘテロ四量体などの形成に見られるのと同様に、ヘテロ二量体化し得る。Ｖｉｎｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｉ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ，ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１４４４−１４５０（２０９１２）；ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍａｔ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”４（５）ＭＡｂｓ  ５８６−９１（２０１２）を参照されたい。
【００６６】
一実施形態では、ハーフボディ可変ドメインは内部移行エフェクターを特異的に認識し、ハーフボディのＦｃドメインは補充酵素（例えば、ペプチボディ）を含むＦｃ−融合タンパク質と二量体化する（同上文献の５８６ページ）。
【００６７】
「アルファ−グルコシダーゼ」（または「α−グルコシダーゼ」）、「α−グルコシダーゼ活性」、「ＧＡＡ」、および「ＧＡＡ活性」は交換可能に用いられ、グリコーゲンおよびデンプンの１，４−アルファ結合を加水分解してグルコースにすることを促進する任意のタンパク質を意味する。ＧＡＡは、特に、ＥＣ  ３．２．１．２０、マルターゼ、グルコインべルターゼ、グルコシドスクラーゼ、マルターゼ・グルコアミラーゼ、アルファ−グルコピラノシダーゼ、グルコシドインベルターゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルファ−グルコシドヒドロラーゼ、アルファ−１，４−グルコシダーゼ、およびアルファ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼとしても知られている。ＧＡＡは、リソソーム内、および小腸の刷子縁で見つけることができる。ポンペ病に罹患している患者は、機能性リソソームα−グルコシダーゼが欠乏している。Ｓ．Ｃｈｉｂａ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ，”６１（８）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３３−９（１９９７）；およびＨｅｓｓｅｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ，”１６３７（２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６４−７０（２００３）を参照されたい。
【００６８】
「アルファ−ガラクトシダーゼＡ」（または「α−ガラクトシダーゼＡ」）、「α−ガラクトシダーゼＡ活性」、「α−ガラクトシダーゼ」、「α−ガラクトシダーゼ活性」、「ＧＬＡ」、および「ＧＬＡ活性」は、交換可能に用いられ、糖脂質および糖タンパク質由来の末端α−ガラクトシル部分の加水分解を促進し、またα−Ｄ−フコシドを加水分解する任意のタンパク質を意味する。ＧＬＡはまた、特に、ＥＣ  ３．２．１．２２、メリビアーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、α−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ、α−Ｄ−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼとしても知られている。ＧＬＡは、Ｘ連鎖ＧＬＡ遺伝子によりコードされるリソソーム酵素である。ＧＬＡの欠損によりファブリー病が引き起こされ得るが、そこでは、グロボトリアオシルセラミド（別名Ｇｂ３、ＧＬ−３、またはセラミドトリヘキソシド）として知られる糖脂質が血管内に蓄積し（すなわち、隆起血管障害）、その結果、疼痛や、腎臓、心臓、皮膚、および／または脳血管組織、ならびに他の組織および器官の機能に障害をもたらす。例えば、Ｐｒａｂａｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｏｒｔｉｌｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ａ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，”７（６）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ｅ３９９７５  ｐｐ．１−９（２０１２）を参照されたい。
【００６９】
一態様では、本発明は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に罹患している患者（または対象）を、該患者に「生物学的治療用複合体」を投与することによって治療する方法を提供する。生物学的治療用複合体は、患者の細胞に入って、ＬＳＤに関連する酵素または酵素活性（すなわち「内因性酵素」）を補充する酵素または酵素活性（すなわち「補充酵素」）をリソソームに送達する。
【００７０】
ＬＳＤには、スフィンゴリピドーシス、ムコ多糖症、およびグリコーゲン蓄積症が含まれる。一部の実施形態では、ＬＳＤは、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、サンドホフ病、テイ・サックス病、ＧＭ２−活性化因子欠損、ＧＭ３−ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、スフィンゴ脂質活性化因子欠損、シャイエ病、ハーラー・シャイエ病、ハーラー病、ハンター病、サンフィリポＡ、サンフィリポＢ、サンフィリポＣ、サンフィリポＤ、モルキオ症候群Ａ、モルキオ症候群Ｂ、マロトー・ラミー病、スライ病、ＭＰＳ  ＩＸ、およびポンペ病のうちの任意の１つ以上である。特定の実施形態では、ＬＳＤはファブリー病である。別の実施形態では、ＬＳＤはポンペ病である。
【００７１】
一部の実施形態では、生物学的治療用複合体は、（ａ）補充酵素と、（ｂ）内部移行エフェクターに結合する分子実体とを含む。一部の実施形態では、補充酵素は、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、サポシン−Ｃ活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２活性化因子、ＧＭ３シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α−イズロニダーゼ、イズロニダーゼ−２−スルファターゼ、ヘパリンＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼのうちの任意の１つ以上である。
【００７２】
患者が、補充酵素を「非自己」として認識するに足るタンパク質を作製することができず、補充酵素の投与後に免疫反応が結果として生じる場合がある。これは望ましくないことである。したがって、一部の実施形態では、補充酵素は、対象における免疫反応の誘発を回避するように設計されるか、または生成される。１つの解決策は、補充酵素として「アイソザイム」を用いることである。アイソザイムは患者の「自己」タンパク質に十分類似しているが、ＬＳＤの症状を緩和するのに十分な補充酵素活性を有する。
【００７３】
ＬＳＤがポンペ病であり、内因性酵素がα−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である特定の一実施形態では、アイソザイムは、酸性α−グルコシダーゼ、スクラーゼ・イソマルターゼ（ＳＩ）、マルターゼ・グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）、グルコシダーゼＩＩ（ＧＡＮＡＢ）、および中性α−グルコシダーゼ（Ｃ  ＧＮＡＣ）のうちの任意の１つであり得る。ＬＳＤがファブリー病であり、内因性酵素がα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）である特定の別の実施形態では、アイソザイムはＧＬＡ活性を持つように操作されたα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼであり得る。
【００７４】
生物学的治療用複合体は、補充酵素の細胞内への取り込みを可能にする内部移行エフェクター結合タンパク質成分を有する。したがって、一部の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＣＤ６３、ＭＨＣ−Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ−１、Ｋｒｅｍｅｎ−２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ−受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質−２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、ＭＡＬ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅタンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、ＳＣＡＲＡ１−５、ＳＣＡＲＢ１−３、およびＣＤ３６であり得る。特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ−１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ−１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）などである。他の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ−カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ−１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ−７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ−１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである。一部の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、またはＰＲＬＲである。
【００７５】
一部の実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質は抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は、例えば、受容体融合分子、トラップ分子、受容体Ｆｃ融合分子、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂ断片、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ３ペプチド、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ、一価ナノボディ、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ：ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ重鎖ホモ二量体抗体）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインを含む。
【００７６】
一実施形態では、内部移行エフェクターに結合する分子実体は、抗体、抗体断片、または他の抗原結合タンパク質である。例えば、分子実体は二重特異性抗体である可能性があり、そこで一方のアームは内部移行エフェクター（例えば、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＰＲＬＲ、ＡＰＬＰ２）に結合し、他方のアームは補充酵素に結合する。ここで、生物学的治療用複合体は、二重特異性抗体と、補充酵素とを含む（図１Ａ）。特定の実施形態では、治療される疾患はファブリー病であり、生物学的治療用複合体は、ＧＬＡと、ＧＬＡおよびＣＤ６３に結合する二重特異性抗体とを含む。特定の別の実施形態では、治療される疾患はポンペ病であり、生物学的治療用複合体は、ＧＡＡと、ＧＡＡおよびＣＤ６３に結合する二重特異性抗体とを含む。
【００７７】
別の実施形態では、内部移行エフェクターに結合する分子実体は、半抗体と、Ｆｃドメインを含有する補充酵素（酵素−Ｆｃ融合ポリペプチド）とを含む。一実施形態では、酵素−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインが、内部移行エフェクター特異的ハーフボディのＦｃドメインと結合して、生物学的治療用複合体を形成する（図１Ｂ）。
【００７８】
他の実施形態では、補充酵素は内部移行エフェクター結合タンパク質に共有結合している。上記段落で述べた酵素−Ｆｃ融合：ハーフボディの実施形態（図１Ｂも参照のこと）はこの部類に入るが、これはそのＦｃ二量体を１つ以上のジスルフィド架橋を介して繋ぐことができるからである。酵素活性ドメインまたはポリペプチドと、内部移行−結合ドメインまたはポリペプチドとの間の共有結合的連結は、共有結合の任意の種類（すなわち、電子の共有に関与した任意の結合）であってもよい。場合によっては、共有結合は２つのアミノ酸の間のペプチド結合であり、その結果、補充酵素と内部移行エフェクター結合タンパク質とが、全体としてまたは部分的に、融合タンパク質に見られるような連続ポリペプチド鎖を形成する。補充酵素部分と内部移行エフェクター結合タンパク質とが直接連結されている場合がある。他の場合には、リンカーを用いて２つの部分を繋いでいる。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｎｋｅｒｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，”６５（１０）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．１３５７−６９（２０１３）を参照されたい。
【００７９】
特定の実施形態では、補充酵素は抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のＣ末端に（図１Ｃを参照）、または軽鎖のＣ末端に（図１Ｅ）共有結合している。特定の別の実施形態では、補充酵素は抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のＮ末端に（図１Ｄを参照）、または軽鎖のＮ末端に（図１Ｆ）共有結合している。
【００８０】
特に補充酵素がリソソーム内で通例通りにタンパク質分解的にプロセシングされない場合には、切断可能なリンカーが、抗体−酵素融合を含む生物学的治療用複合体の実施形態に加えられる。一部の実施形態では、ａ）立体的に大きい抗体を除去することによって酵素活性の保持を図ることができるように、かつｂ）酵素のリソソーム内半減期を増加できるようにするために、カテプシン切断可能リンカーを抗体と補充酵素との間に挿入し、リソソーム内での抗体の除去を容易にする。
【００８１】
別の態様では、本発明は、酵素活性と抗原結合タンパク質とを含む組成物を提供し、そこで該酵素はリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）と内部移行エフェクター結合タンパク質とに関連するものである。リソソーム蓄積症に関連する酵素（それ自体触媒性ではないタンパク質を含む）には、例えば、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、サポシン−Ｃ活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２活性化因子、ＧＭ３シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α−イズロニダーゼ、イズロニダーゼ−２−スルファターゼ、ヘパリンＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼなどが含まれる。
【００８２】
内部移行エフェクター結合タンパク質には、例えば、受容体融合分子、トラップ分子、受容体Ｆｃ融合分子、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂ断片、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ３ペプチド、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチド、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ、一価ナノボディ、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ：ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ重鎖ホモ二量体抗体）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、および他の抗原結合タンパク質などが含まれる。
【００８３】
内部移行エフェクターには、例えば、ＣＤ６３、ＭＨＣ−Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ−１、Ｋｒｅｍｅｎ−２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ−受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質−２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、ＭＡＬ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅタンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、ＳＣＡＲＡ１−５、ＳＣＡＲＢ１−３、およびＣＤ３６が含まれる。特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ−１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ−１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）などである。他の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ−カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ−１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ−７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ−１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである。一部の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＬＰＬ２、またはＰＰＲＬＲである。
【００８４】
一部の実施形態では、酵素は抗原結合タンパク質に共有結合されている（すなわち、電子が原子間で共有されている）。特定の一実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質はハーフボディからなるか、またはハーフボディを含み、酵素はＦｃ−融合ドメインに（例えばＣ末端で）融合されており、酵素に共有結合しているＦｃドメインは抗原結合タンパク質のＦｃドメインと結合し、その結合は１つ以上のジスルフィド架橋を含むようになっている。特定の実施形態を図１Ｂに概略的に示している。
【００８５】
特定の別の実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質（ＩＥ−ＢＰ）は、抗体または抗体断片からなるかまたはそれを含み、酵素は抗体または抗体断片に共有結合している。特定の実施形態では、ＩＥＢＰは抗体であり、酵素は、該抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端に（ペプチド結合を介して直接的にまたはリンカーを介して間接的に）共有結合している（それぞれ図１Ｃまたは図１Ｅ）。特定の別の実施形態では、ＩＥＢＰは抗体であり、酵素は、該抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に（ペプチド結合を介して直接的にまたはリンカーを介して間接的に）共有結合している（それぞれ図１Ｄまたは図１Ｆ）。
【００８６】
一部の実施形態では、酵素およびＩＥＢＰは共有結合されていないが、混合物の状態で組み合わされている。ＩＥＢＰと酵素とは、非共有結合力により結合して、複合体を形成することができる。例えば、特定の一実施形態では、ＩＥＢＰは二重特異性抗体であり、その抗体の一方のアームが内部移行エフェクターに結合し、他方のアームが酵素に結合する。この実施形態を図１Ａに概略的に示している。
【００８７】
一部の実施形態では、酵素はＧＡＡであるか、またはＧＡＡ活性を含み（例えば、ＧＡＡ活性を有するアイソザイムなど）、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤＨ１５、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、またはＰＲＬＲである。特定の実施形態では、酵素はＧＡＡであるか、またはＧＡＡ活性を含み、内部移行ドメインはＣＤ６３であり、ＩＥＢＰはＣＤ６３およびＧＡＡに対して特異性を有する二重特異性抗体である。
【００８８】
一部の実施形態では、酵素はＧＬＡであるか、またはＧＬＡ活性を含み（例えば、ＧＡＡ活性を有するアイソザイムなど）、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、またはＰＲＬＲである。特定の実施形態では、酵素はＧＬＡであるか、またはＧＬＡ活性を含み、内部移行ドメインはＣＤ６３であり、ＩＥＢＰはＣＤ６３およびＧＬＡに対して特異性を有する二重特異性抗体である。
【００８９】
別の態様では、本発明は、酵素と、酵素を必要とする患者に酵素を効果的に補充する抗原結合タンパク質とを含有する生物学的治療用複合体を選択またはスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、生物学的治療用複合体はモデル系に投与され、該モデル系を補充酵素活性について評価する。一実施形態では、モデル系は、酵素の発現が不足しており、かつ抗原結合タンパク質の抗原コグネイトを発現する動物である。一実施形態では、動物モデルは、抗原結合タンパク質のヒト化コグネイトを発現し、酵素をコードする遺伝子のノックアウトを有するマウスである。
【００９０】
一実施形態では、マウスはリソソーム酵素のノックアウトを含み、該リソソーム酵素は、α−ガラクトシダーゼＡ、セラミダーゼ、β−グルコシダーゼ、サポシン−Ｃ活性化因子、スフィンゴミエリナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡおよびＢ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−活性化因子タンパク質、ＧＭ３シンターゼ、アリールスルファターゼＡ、スフィンゴ脂質活性化因子、α−イズロニダーゼ、イズロニダーゼ−２−スルファターゼ、ヘパリンＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ；α−グルコサミドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（アリールスルファターゼＢ）、β−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、α−グルコシダーゼ２、またはリソソーム酸性リパーゼなどである。一実施形態では、ノックアウトマウスは、内部移行エフェクターのヒト型またはヒト化型（すなわち、抗原結合タンパク質のコグネイト）も発現する。ヒト内部移行エフェクターには、ＣＤ６３、ＭＨＣ−Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ−１、Ｋｒｅｍｅｎ−２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ−受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質−２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、ＭＡＬ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅタンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、ＳＣＡＲＡ１−５、ＳＣＡＲＢ１−３、ＣＤ３６、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ−１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ−１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、ＵＭＯＤ（ウロモジュリン）、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、Ｍ−カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ−１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ−７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ−６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ−１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）が含まれる。
【００９１】
ヒト受容体を発現するマウスを作製する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２００８  Ｄｅｃ；３６（１２）：２５０６−１２；および米国特許  第８，８７８，００１  Ｂ２号を参照されたい。これらの文献は、ヒト受容体を発現するトランスジェニックマウスに関して本明細書に援用される。酵素ノックアウトマウスを作製する方法も、当該技術分野で既知である。例えば、Ｋｕｅｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９９７；１９３（１０）：６６３−７１を参照されたい。この文献は、マウスのリソソーム蓄積酵素ノックアウトに関して本明細書に援用される。
【００９２】
下記の実施例は、本発明の方法をさらに説明するために提供されている。これらの実施例は、説明のためだけのものであり、本発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１  リソソームα−グルコシダーゼ融合タンパク質
ＣＩ−ＭＰＲ非依存抗体誘導送達系を、酵素をリソソームに送達するように設計した。表３には、分子構築物を列挙し、それらのＣＨＯ細胞内発現レベル（図２を参照）、蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−α−グルコシドを用いて測定されたおおよそのＧＡＡ活性（図３を参照）、ならびにリソソーム標的指向化、内部移行、および活性状態（図４および図５を参照）を示している。
【００９４】
実施例２  ＧＡＡ構築物内部移行
ＧＡＡ構築物の内部移行を、細胞可溶化物における酵素活性を測定することにより定量した。組換えＧＡＡ（配列番号１）の種々の構築物を、ＨＥＫ２９３、ヒト骨格筋芽細胞（Ｌｏｎｚａ、メリーランド州ウォーカーズビル）、または、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞に添加した。酵素構築物の添加の２４時間前に、細胞を２４ウェルプレートにプレーティングした。酵素構築物を細胞の培地に１８時間添加した。続いて、細胞を氷冷ＰＢＳ中にて十分に洗浄し、氷冷した０．５％  ＮＰ−４０のアッセイ緩衝液（０．２Ｍの酢酸ナトリウム、０．４Ｍの塩化カリウム、ｐＨ４．３）中で溶解した。溶解物を４℃にて１５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清をＧＡＡ基質である４−メチルウンベリフェリルアルファ−Ｄ−グルコシドと共に、９６ウェルプレートでアッセイ緩衝液中にて１時間インキュベートした。グリシン−炭酸緩衝液を用いてｐＨ１０．７で反応を停止した。蛍光を、励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍにおいてプレートリーダーで読み取った。溶解物のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイキットを用いて定量した。４−メチルウンベリフェロンを基質として用いた。ＧＡＡ活性を、精製タンパク質１ｍｇ当たりに毎時放出される４−メチルウンベリフェロンのｎｍｏｌ数として記録した。Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，”２３４（３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９０３−９０９（１９９５）を参照されたい。
【００９５】
ＧＡＡ活性の内部移行を、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の存在下または非存在下（図４Ａ）、およびＣＤ６３の存在下または非存在下で評価した。いくつかのリソソーム酵素は、マンノース６−リン酸受容体（ＭＰＲ）に結合している結合Ｍ６Ｐ部分を媒介として、リソソームを標的とする。したがって、抗ＣＤ６３−ＧＡＡの内部移行へのＣＩ−ＭＰＲの関与を、抗ＣＤ６３−ＧＡＡの取り込みの間に、ＭＰＲ結合を競合するＭ６Ｐ（５ｍＭ）をＨＥＫ培養培地に含めることによって評価した。Ｍ６Ｐを含めても、細胞可溶化物における４−メチルウンベリフェロンの検出で測定されたように、抗ＣＤ６３−ＧＡＡの取り込みに何ら影響を及ぼさなかった（図４Ａ）。しかしながら、抗ＣＤ６３−ＧＡＡの取り込みは、ＣＤ６３の存在に依存した（図４Ｂ）。抗ＣＤ６３・ＧＡＡは、ＣＤ６３を発現するＨＥＫ細胞によって取り込まれたが、ＣＤ６３遺伝子のノックアウトを担持するＨＥＫ細胞には取り込まれなかった（図４Ｂ）。
【００９６】
（表３）
2019505480.tif 000004
NA＝該当なし；NT＝未試験
【００９７】
実施例３  ＧＡＡ構築物の筋芽細胞による取り込み
骨格筋芽細胞（ポンペ病における検討対象の組織タイプ）が種々のＧＡＡ構築物を取り込む能力を評価した。種々の濃度（すなわち、２５ｎＭ、５０ｎＭ、および２００ｎＭ）の（１）抗ＣＤ６３−ＧＡＡ、（２）抗ＣＤ６３−ＧＡＡ＋５ｍＭ  Ｍ６Ｐ、（３）ｍｙｃ−ＧＡＡ、および（４）ｍｙｃ−ＧＡＡ＋５ｍＭ  Ｍ６Ｐの存在下、ヒト骨格筋芽細胞を培養した。ＧＡＡ構築物の内部移行を、４−メチルウンベリフェロンの蓄積によって示される細胞可溶化物で検出したＧＡＡ活性レベルから推測し、評価した。２００ｎＭのＭＰＲ非依存性抗ＣＤ６３−ＧＡＡの取り込み量は、ＭＰＲ依存性のｍｙｃ−ＧＡＡの取り込み量よりも５倍超多かった（図５Ａ）。
【００９８】
抗ＣＤ６３−ＧＡＡ構築物の細胞内局在を測定するために、ヒト骨格筋芽細胞を、抗ヒトＩｇＧ抗体（抗ＣＤ６３−ＧＡＡ構築物の抗ＣＤ６３部分の検出用）および抗ＬＡＭＰ抗体（リソソームの標識用）で染色した。ＬＡＭＰ、すなわちリソソーム膜糖タンパク質は、リソソームに特異的な内在性膜タンパク質を含む。共標識実験により抗ＣＤ６３−ＧＡＡが抗ＬＡＭＰと共局在化することがわかり、これは抗ＣＤ６３−ＧＡＡがリソソームに局在化していることを示している。
【００９９】
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞を同様に、種々の濃度（すなわち、２５ｎＭ、５０ｎＭ、および２００ｎＭ）の（１）抗ＣＤ６３−ＧＡＡ、（２）抗ＣＤ６３−ＧＡＡ＋５ｍＭ  Ｍ６Ｐ、（３）ｍｙｃ−ＧＡＡ、および（４）ｍｙｃ−ＧＡＡ＋５ｍＭ  Ｍ６Ｐと接触させた。ＧＡＡ構築物の内部移行を、４−メチルウンベリフェロンの蓄積によって示される細胞可溶化物で検出したＧＡＡ活性レベルから推測し、評価した。２００ｎＭの抗ＣＤ６３−ＧＡＡの取り込み量は、Ｍ６Ｐによって不利な影響を受けず、ｍｙｃ−ＧＡＡの取り込み量よりも約６倍〜約９倍超多かった（図５Ｂ）。
【０１００】
実施例４  抗ＣＤ６３−ＧＡＡのグリコーゲン蓄積への影響
抗ＣＤ６３−ＧＡＡが３つの異なる種類のポンペ細胞株のリソソームにおいてグリコーゲン蓄積に及ぼす影響を評価した。ポンペ細胞株は、重症の乳児型ポンペ病を発症した患者から得られた線維芽細胞由来であり、ＧＡＡ遺伝子においてノックアウト変異またはノックダウン変異を含んでいた。使用した細胞株は、ＧＭ２００８９（エクソン１８欠失）、ＧＭ２００９０（エクソン１４およびエクソン１６における複合ヘテロ接合体）、およびＧＭ２００９０（エクソン２における複合ヘテロ接合体）であった。これらの細胞株をＣｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ニュージャージー州カムデン）から得た。Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｌｅｆｔ  ｌｉｐ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ（ＧＳＤＩＩ）：ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｙ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｇｌｎ５８Ｓｔｏｐ，”８５（１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５−８（１９９９）；Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ（Ｄ６４５Ｎ，Ｇ６４８Ｓ，Ｒ６７２Ｗ，Ｒ６７２Ｑ）ａｎｄ  ｔｗｏ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ／ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，”２４４（３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９２１−７（１９９８）ａｎｄ；Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｋｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ，”１０７  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ４９０−５（２０１２）を参照されたい。新生児ヒト皮膚線維芽（ＮＨＤＦ、Ｌｏｎｚａ）を対照として用いた。全てのポンペ細胞株は、残留（＜０．１％）ＧＡＡ活性が存在する場合でも、リソソームグリコーゲン蓄積を示した（細胞質内グリコーゲンを低減させるグルコース飢餓の７２時間後）（図６、パネルＡおよびパネルＢ）。グリコーゲンをグリコーゲンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用いて測定した。
【０１０１】
細胞を、溶解前に約９６時間の間グルコース飢餓の状態にして、細胞質内グリコーゲンを除去した（Ｕｍａｐａｔｈｙｓｉｖａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｇｅ  ｏｆ  ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ，”３６１（１−２）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．１９１−８（２００５）を参照）。細胞を、抗ＣＤ６３−ＧＡＡ（２００ｎＭ）またはｍｙｃ−ＧＡＡ（２００ｎＭ）で、溶解前に７２時間処理した。全３種のポンペ細胞株に対して抗ＣＤ６３−ＧＡＡで処理した結果、リソソーム内グリコーゲン蓄積に有意な減少が見られ（図７）、これは、外因的に投与された抗ＣＤ６３−ＧＡＡがリソソームに到達し、酵素的に活性であったことを示している。
【０１０２】
実施例５  ＧＡＡに対するアイソザイム
ＧＡＡ（すなわち、交差反応免疫学的物質またはＣＲＩＭ）に対して起こり得るポンペ患者の免疫応答を回避するために、ＧＡＡ活性を救済する他のヒトグルコシダーゼを送達することを検討した。ＧＡＡ（別名は酸性α−グルコシダーゼ）に対して同様のグリコーゲン加水分解活性を有する非リソソーム酵素を調べた。これらの酵素として、スクラーゼ・イソマルターゼ（ＳＩ）、マルターゼ・グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）、グルコシダーゼＩＩ（ＧＡＮＡＢ）、および中性α−グルコシダーゼ（Ｃ  ＧＮＡＣ）が挙げられる。これらの酵素および種々の組換え実施形態が、Ｄｈｉｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｕｃｏｓａｌ  α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｗｉｔｈ  α−ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔａｒｃｈ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｓｔａｇｅ  ｔｏ  ｈａｖｅ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｓｔａｒｃｈ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｂｅｙｏｎｄ  ｇｌｕｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，”８（４）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ｅ６２５４６２０１３  Ａｐｒ  ２５（２０１３）；Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍａｌｔａｓｅ−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ：ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”３７５（３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７８２−９２（２００８）；およびＱｕｅｚａｄａ−Ｃａｌｖｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｕｍｉｎａｌ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  “ｂｒａｋｅ”ｏｎ  ｍａｌｔａｓｅ−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ，”１３８（４）Ｊ．Ｎｕｔｒ．６８５−９２（２００８）に記載されている。
【０１０３】
以下のアイソザイム構築物を作製し、ＣＨＯ細胞内で発現させた：（１）抗ＣＤ６３、（２）抗ＣＤ６３−ＮｔＭＧＡＭ（すなわち、抗ＣＤ６３抗体重鎖のＣ末端に連結されたマルターゼ・グルコアミラーゼのＮ末端サブユニット）、および（３）抗ＣＤ６３−ＣｔＭＧＡＭ。Ｄｈｉｔａｌ，２０１３を参照されたい。マウスマルターゼ・グルコアミラーゼ（抗ｍＣＤ６３−ｍｃｔＭＧＡＭ）のＣ末端サブユニットに融合した抗マウスＣＤ６３重鎖を発現する別の構築物も、マウスモデルで使用するために改変された（実施例１１を参照）。
【０１０４】
実施例６  リソソームα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）融合タンパク質
ヒトＧＬＡ（配列番号２）を含む種々の融合タンパク質を構築し、ＣＨＯ細胞内で発現させた。これらの構築物には、（ｉ）抗ＣＤ６３重鎖のＣ末端に融合したＧＬＡ（抗ＣＤ６３−ＧＬＡ）、（ｉｉ）イムノグロブリンＦｃに融合したＧＬＡ（例えば、Ｆｃ「ノブ」）、（ｉｉｉ）ＧＬＡ−抗ＣＤ６３（すなわち、抗ＣＤ６３重鎖のＮ末端に融合したＧＬＡ）、および（ｉｖ）ＧＬＡ−ｍｙｃ融合を含めた（図８）。また、ＧＬＡ部分のない内部移行エフェクター結合タンパク質（ＩＥＢＰ）を、改変かつ発現させた。一例では、ＩＥＢＰは、ＣＤ６３に対する結合特異性を持つ一方の半分と、ｍｙｃに対する結合特異性を持つ他方の半分を備えた二重特異性抗体であった。ＧＬＡ酵素活性（すなわち、４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトピラノシドの加水分解）を各ＧＬＡ融合タンパク質に対して評価し、その結果を図９に示す。全構築物は、Ｃ末端抗ＣＤ６３−ＧＬＡ融合を除外して、α−ガラクトシダーゼ活性を示した（図９）。Ｆｃノブについては、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，“‘Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ’  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，”９（７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．６１７−６２１（１９９６）に記載されている。
【０１０５】
各構築物（またはＩＥＢＰとＧＬＡ−ｍｙｃの組み合わせ）のＨＥＫ細胞への内部移行を、４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトピラノシドの酵素触媒加水分解から形成されるメチルウンベリフェロンを測定することにより定量した。種々の構築物をＨＥＫ２９３細胞に添加し、続いてインキュベートしてエンドサイトーシスさせた後、洗浄し、ｐＨ４で溶解した。ＧＬＡ基質を各細胞可溶化物に加え、α−ガラクトシダーゼの反応を進行させた。その結果を図９に示し、図９では、ＧＬＡ−抗ＣＤ６３融合タンパク質がＨＥＫ細胞に内部移行されたことが示されている。ＧＬＡ−ｍｙｃ単独では、すなわち、ＩＥＢＰ要素の非存在下では、ＨＥＫ細胞によって取り込まれなかった。しかしながら、ＣＤ６３に結合し、かつｍｙｃエピトープに結合した二重特異性抗体の存在下では取り込まれた（図１０）。
【０１０６】
実施例７  内部移行エフェクター結合タンパク質の取り込み
抗ＣＤ６３抗体または抗ＡＰＬＰ２抗体の低ｐＨ細胞分画への内部移行を、高Ｍ６Ｐ含有量を有している、組換えヒトＧＬＡ（ｒｈＧＬＡ）の低ｐＨ分画への内部移行と比較した。ＧＬＡ、抗ＣＤ６３、および抗ＡＰＬＰ２の各々を、低ｐＨ感受性色素ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）で標識した。ＨＥＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞（肝癌）、およびＰＣ−３細胞（前立腺癌）をｐＨｒｏｄｏ（登録商標）で標識したタンパク質と接触させ、一晩または約１６時間インキュベートした。続いて、細胞をイメージングし、蛍光小胞をカウントした。各タンパク質の標識度合いに応じて蛍光出力を標準化した。ＨＥＫ細胞、ＰＣ−３細胞、およびＨｅｐＧ２細胞は、ｒｈＧＬＡに比べて抗ＣＤ６３と抗ＡＰＬＰ２の取り込み量がより多くなることを示した（図１１）。
【０１０７】
実施例８  リソソーム内での融合タンパク質のプロセシング
抗ＣＤ６３−ＧＡＡ構築物がリソソーム内でタンパク質分解的にプロセシングされるか否かを、ポンペ細胞可溶化物のウェスタンブロット分析により評価した。ＧＭ２００８９ポンペ細胞を抗ＣＤ６３−ＧＡＡの存在下で培養し、生じた細胞可溶化物を、抗ＧＡＡ抗体（図１２、パネルＡ）または抗ｈＩｇＧ抗体（図１２、パネルＢ）を用いて還元ウェスタンブロット分析した。
【０１０８】
Ｃｏｒｉｅｌｌから入手したＧＭ２００８９ポンペ病線維芽細胞株を６ウェルプレートにプレーティングし、抗ＣＤ６３−ＧＡＡと共に１８時間インキュベートした後、培養液で十分に洗浄した。ウェル内容物を、様々な時点（すなわち、抗ＣＤ６３−ＧＡＡの除去０時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後）でＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。抗ヒトＧＡＡ抗体（ａｂ１１３０２１、Ａｂｃａｍ  ＬＴＤ、英国ケンブリッジ）を用いたウェスタンブロットにより、溶解物についてＧＡＡの定量を行った（図１２）。完全な抗ＣＤ６３−ＧＡＡと小形の中間体とを早期の時点で検出し、ＧＡＡの成熟リソソーム７６ｋＤａ型を抗ＣＤ６３−ＧＡＡを添加した後の全時点で検出した。これは、抗ＣＤ６３−ＧＡＡが患者細胞内に内部移行し、ＧＡＡの成熟リソソーム型に正常にプロセシングされていることを示している。さらに、細胞内での７６ｋＤａ型の半減期がＧＡＡ内部移行の他の研究と符合している（Ｍａｇａ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｉｄ  α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８８，１４２８−１４３８（２０１３））。
【０１０９】
実施例９  抗ＣＤ６３−ＧＡＡの組織分布とプロセシング
ＣＤ６３部位でヒト化されたマウス（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”２１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６５２  −  ６５９（２００３）を参照）に抗ＣＤ６３−ＧＡＡを投与した。組織サンプルを採取し、ＧＡＡをウェスタンブロット分析により評価した。ＧＡＡは、肝臓、横隔膜、腎臓、心臓、ならびに四頭筋および腓腹筋で検出された（図１３）。
【０１１０】
簡潔に述べると、ヒトＣＤ６３部位をマウスＣＤ６３部位に入れることによって、ヒト化ＣＤ６３マウスを作製した。抗ＣＤ６３−ＧＡＡまたは抗ＣＤ６３を、２月齢のヒト化ＣＤ６３マウスまたはヒトＣＤ６３を持たない野生型マウスに、５０ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射により投与した。様々な時点（例えば、注射の０時間後、６時間後、２４時間後）で尾出血させた。抗ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡを行い、抗ＣＤ６３−ＧＡＡの血清濃度を算出した。抗ＣＤ６３−ＧＡＡは血清から速やかに排除され、親抗ＣＤ６３抗体よりも高速であった。また、注射されたマウスを様々な時点で屠殺し、組織を解剖し、液体窒素で急速凍結した。組織をＲＩＰＡ緩衝液中に溶解し、ウェスタンブロットによりＧＡＡの定量を行った。７６ｋＤａ成熟リソソーム型が、定量した組織の多くに存在していたが、これは抗ＣＤ６３−ＧＡＡが組織内の細胞に内部移行していることを示している（図１３）。ヒト化ＣＤ６３マウスは抗ＣＤ６３−ＧＡＡを骨格筋（心臓、腓腹筋、四頭筋）に内部移行したが、野生型マウスはいかなる取り込みも示さなかった。これは、抗ＣＤ６３−ＧＡＡがＣＤ６３により媒介されて骨格筋細胞に内部移行したことを示している。
【０１１１】
ＣＤ６３ヒト化マウス（ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ）と対照マウス（ＣＤ６３＋／＋）とに、抗ＣＤ６３−ＧＡＡを尾静脈注射により５０ｍｇ／ｋｇで投与した。２４時間時点で組織を抽出し、溶解物の２００μｇをレーン毎にロードした。ウェスタンブロットを、抗ｈＧＡＡ抗体と、ローディング対照として抗ＧＡＰＤＨとを用いてプローブした。図１４はウェスタンブロットを示し、ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕにおいて、ＣＤ６３が抗ｈＣＤ６３−ＧＡＡの筋組織への取り込みを媒介したが、野生型ＣＤ６３＋／＋マウスにおいては媒介しなかったことを明らかにしている。抗ｈＣＤ６３−ＧＡＡが、成熟７６ｋＤａ  ｈＧＡＡにプロセシングされた。
【０１１２】
実施例１０  筋特異的内部移行エフェクター
筋特異的抗原（抗インテグリンアルファ７、抗ＣＤ９、および抗ジストログリカン）に対するビオチン化抗体をＧＡＡノックアウトマウスに投与した。これらの抗体の組織分布をウェスタンブロット分析により測定した。図１５には、骨格筋（腓腹筋、四頭筋、および横隔膜）、心筋、肝臓（標準化用のベースラインとして機能する）、腎臓、および脾臓内で見られた抗体レベルのヒストグラムを示す。抗インテグリンアルファ７抗体は、骨格筋および心臓で（肝臓で見られたレベルを上回るレベルで）見られた。抗ＣＤ９抗体は骨格筋および心臓で（肝臓で見られたレベルを上回るレベルで）見られ、また腎臓および脾臓でも同様に見られた（図１５）。
【０１１３】
これらの選択された筋特異的抗体がリソソームを標的にできるか否かを判定するために、抗体をｐＨｒｏｄｏ−赤色で標識し、続いて１０μｇ／ｍＬでマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞と共に一晩インキュベートした。小胞蛍光を定量し、蛍光体の抗体への標識度合いに応じて標準化した。結果を図１６に示し、図１６では、抗ＣＤ６３、抗ジストログリカン、抗Ｍ−カドヘリン、抗ＣＤ９、および抗インテグリンアルファ７がＣ２Ｃ１２筋芽細胞の低ｐＨリソソーム分画を標的にしたことが示されている。
【０１１４】
実施例１１  筋グリコーゲンレベルの回復
天然マウスＣＤ６３発現を有する２〜３月齢のＧＡＡノックアウト（ＫＯ）マウスに、完全長ヒトα−グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）、抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡ（抗マウスＣＤ６３）およびその関連軽鎖、または抗ｈＣＤ６３−ＧＡＡ（抗ヒトＣＤ６３）およびその関連軽鎖をコードするプラスミド構築物を流体力学的送達（ＨＤＤ）した。全ての構築物は、ユビキチンプロモーターとＳＶ４０ｐｏｌｙＡテールとからなる同一のプラスミドバックボーンを用いた。簡単に述べると、各プラスミドの４０μｇ（すなわち、重鎖と軽鎖の４０μｇまたはｈＧＡＡのみの４０μｇ）を滅菌生理食塩水２ｍＬ〜３ｍＬで希釈し、ＧＡＡ  ＫＯマウスの尾静脈にすばやく注射した。３日毎の尾出血により、約１０日間のｈＧＡＡ構築物または抗体ＧＡＡ構築物の血清レベルを明らかにした。マウスをＨＤＤの３週間後に屠殺し、組織を液体窒素で急速凍結した。組織を蒸留水で均質化し、煮沸、遠心沈殿した。蛍光グリコーゲンアッセイキット（ＭＡＫ０１６、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用いて上清についてグリコーゲンの定量を行った。
【０１１５】
心臓、横隔膜、ならびに三頭筋、腓腹筋、および四頭筋を含めた骨格筋におけるグリコーゲンレベルを、野生型マウス、ＧＡＡ  ＫＯマウス、および流体力学的に送達かつ発現したｈＧＡＡまたは抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおいて測定した。その結果を図１７に示し、図１７には、グリコーゲンが、抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡ処置マウスにおいてほぼ野生型レベルまで回復していることが示されている。グリコーゲン回復の効果は抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡでより顕著に見られ、抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡは、ＧＡＡ  ＫＯマウスの骨格筋または横隔膜においてわずか約１０％〜３５％のグリコーゲンレベルの低減を示したｈＧＡＡ単独に比べて、野生型の筋グリコーゲンレベルのほぼ１００％回復を示した（図１７を参照）。
【０１１６】
心臓、横隔膜、ならびに三頭筋、腓腹筋、および四頭筋を含めた骨格筋におけるグリコーゲンレベルを、野生型マウス、ＧＡＡ  ＫＯマウス、および流体力学的に送達（ＨＤＤ）かつ発現した抗ｈＣＤ６３−ＧＡＡ、抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡまたは抗ｍＣＤ６３−ｍｃｔＭＧＡＭで処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおいて測定した。図１８に示した結果には、グリコーゲンが、抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡ処置マウスにおいてほぼ野生型レベルまで回復していることが示されている。グリコーゲン回復の効果は抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡでより顕著に見られ、抗ｍＣＤ６３−ＧＡＡは、ＧＡＡ  ＫＯマウスの骨格筋または横隔膜においてわずか約２０％のグリコーゲンレベルの低減を示した抗ｈＣＤ６３−ＧＡＡ単独に比べて、野生型レベルの２０％未満の範囲に筋グリコーゲンレベルを回復させた（図１８を参照）。この結果は、リソソームに送達されたＧＡＡの作用が、種特異的なＣＤ６３内部移行によって増強されることをさらに裏付けるものである。対照（未処置）ＧＡＡ  ＫＯマウスと比較した、ＧＡＡ  ＫＯマウスにおけるＨＤＤを介した抗ｍＣＤ６３−ｍｃｔＭＧＡＭ処置を、ＨＤＤの７日後または１２日後に試験した（図２０を参照）。未処置である他は同一の条件下の野生型マウスにはグリコーゲン蓄積に変化が見られないのに対し、マウス特異的抗ｍＣＤ６３−ｍｃｔＭＧＡＭのＨＤＤ構築物で処置したＧＡＡ  ＫＯマウスにおいて、両方の時点でグリコーゲンがインビボで低減された（図２０）。
【０１１７】
実施例１２  リソソーム酸性リパーゼ
リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬまたはＬＩＰＡ）は、コレステリルエステルおよびトリグリセリドをリソソーム内で分解する酵素である。ＬＩＰＡにおける欠損（例えば、ＬＡＬ−Ｄまたはウォルマン病）は、肝臓、脾臓、および他の器官で脂肪質の蓄積をもたらす。ＬＡＬ−Ｄの有病率は、世界で４０，０００人に１人〜３００，０００人に１人である。ＬＩＰＡ欠損を持つ乳児は、処置されなければ、多臓器不全のために６か月〜１２か月で死亡する。より年長の子供は診断未確定のまま、心臓発作、脳卒中、または肝不全で死亡する可能性がある。
【０１１８】
ＬＩＰＡに繋留する抗体が内因性リパーゼ活性に及ぼす影響を評価するために、２種のＬＩＰＡ抗体構築物である重鎖Ｃ末端融合体（抗ｍｙｃ−ＬＩＰＡ）と重鎖Ｎ末端融合体（ＬＩＰＡ−抗ｍｙｃ）とを作製した。ヒトリソソーム酸性リパーゼ酵素（配列番号３）のアミノ酸２４〜３９９のｃＤＮＡを、抗体重鎖プラスミドのＮ末端またはＣ末端にクローニングした。カテプシン切断可能配列を重鎖と酵素間にリンカーとして用いた。対応する軽鎖に付随した構築物をＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞上清をトランスフェクトした５日後に採取し、細菌濾過した。上清をウェスタンブロット分析し、抗ＬＩＰＡ抗体と抗ｈＩｇＧ抗体とでプローブした。ＣＨＯ細胞におけるＬＩＰＡ、抗ｍｙｃ−ＬＩＰＡ、およびＬＩＰＡ−抗ｍｙｃの発現を確認した。
【０１１９】
上清のアッセイ緩衝液（０．２Ｍの酢酸ナトリウム、０．４Ｍの塩化カリウム、ｐＨ４．３）希釈液をＬＩＰＡ基質である４−メチルウンベリフェリルオレアートで１時間インキュベートした。グリシン−炭酸緩衝液を用いてｐＨ１０．７で反応を停止した。蛍光を、励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍにおいてプレートリーダーで読み取った。抗ｍｙｃ−ＬＩＰＡ構築物とＬＩＰＡ−抗ｍｙｃ構築物の両方が、天然ＬＩＰＡ対照と比較して有意なリパーゼ活性を示した（図１９）。
【０１２０】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際には、本明細書に記載されたものに加えて本発明の種々の変更が、上記の記述から当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付される特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2019505480.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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