(57)【要約】  本発明は、アリール-2,2'-タンデムビスチアゾール系化合物およびその製造方法と使用に関し、具体的に、構造が一般式Iで表されるアリール-2,2'-タンデムビスチアゾール系化合物およびその製造方法ならびにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としての抗腫瘍薬物の製造における使用に関する。
2019528308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造が一般式Iで表されるアリール-2,2'-タンデムビスチアゾール系化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩。
【化１】
2019528308.tif 000025
（ただし、
R1およびR2はそれぞれ独立にH、C1-C6アルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C3-C6シクロアルキル基、C5-C10アリール基のうちの一つであるか、あるいはR1およびR2はそれに連結した炭素原子とともに5-7員の飽和または部分飽和の環を形成する。
R3はH、C1-C6アルキル基、C3-C6シクロアルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C5-C10アリール基のうちの一つである。
R4はH、C1-C6アルキル基、C3-C6シクロアルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C5-C10アリール基のうちの一つである。
上記基は無置換のものあるいはハロゲン、C1-C6アルキル基、C1-C6ハロアルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C1-C6アルコキシ基、C1-C6ハロアルコキシ基、C3-C6シクロアルキル基、C5-C10アリール基からなる群から選ばれる一つまたは複数の基で置換されたものである。）
【請求項２】
R1およびR2はそれぞれ独立にH、C1-C6アルキル基、C6-C10アリール基であるか、あるいはR1およびR2はそれに連結した炭素原子とともに5員、6員または7員の部分飽和の環を形成することを特徴とする、請求項1に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
R3はC1-C4アルキル基、C6-C10アリール基で置換されたC1-C4アルキル基またはC3-C6シクロアルキル基であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
R4はC1-C6アルキル基であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
前記の化合物は以下の群から選ばれる、請求項1に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩：
【化２】
2019528308.tif 000026
【請求項６】
請求項1に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法であって、
【化３】
2019528308.tif 000027
（ただし、R4はHではない以外、R1、R2、R3およびR4の定義は前記と同様である。）
(1) 4-アセチル安息香酸メチルとt-ブチルスルフィンアミドを縮合反応させ、t-ブチルスルフィンイミド1を形成する工程と、
(2) t-ブチルスルフィンイミド1をグリニャール試薬と付加反応させ、t-ブチルスルフィンアミド2を形成する工程と、
(3) t-ブチルスルフィンアミド2から保護基を脱離させ、アミン3を形成する工程と、
(4) アミン3を酸4と縮合反応させ、メチルエステル5を形成する工程と、
(5) メチルエステル5を塩基加水分解反応させた後、保護基で保護されたヒドロキシアミンと置換反応させ、最後に保護基を脱離させ、一般式II-1で表される化合物を形成する工程と、
を含む、経路1で示される方法、あるいは
【化４】
2019528308.tif 000028
（ここで、R1、R2、R3の定義は前記の通りである。）
(i) 酸4と4-アミノメチル安息香酸メチルを縮合反応させ、メチルエステル8を形成する工程と、
(ii) メチルエステル8を塩基加水分解反応させた後、保護基で保護されたヒドロキシアミンと置換反応させ、最後に保護基を脱離させ、一般式II-2で表される化合物を形成する工程と、
を含む、経路2で示される方法である、
ことを特徴とする、前記方法。
【請求項７】
請求項1に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩の使用であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。
【請求項８】
請求項1に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩の使用であって、抗腫瘍薬物または腫瘍細胞を抑制する薬物の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。
【請求項９】
前記腫瘍は、多発性骨髄腫、結腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、卵巣癌、膵臓腺癌、直腸癌、胃癌、リンパ腫または白血病で、
前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、胎児肺細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓腺癌細胞、直腸癌細胞、胃癌細胞、リンパ腫細胞または白血病細胞である、
ことを特徴とする、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
治療有効量の請求項1に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩と、その薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビスチアゾール系化合物およびその製造方法と使用に関し、より具体的に、アリール-2,2'-タンデムビスチアゾール系化合物およびその製造方法ならびにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としての抗腫瘍薬物の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティクスとは、細胞核のDNA配列の変化のない場合にける、遺伝子機能の可逆的で、遺伝可能な変化に対する研究である。DNAのメチル化およびヒストンの転写後修飾は、エピゲノム調節の最も見られる二大機序で、中でも、ヒストンのアセチル化修飾が最も幅広く研究され、そしてヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）およびヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）の活性によって調節される(Clinical epigenetics 2012, 4 (1), 5)。
HDACの発現異常または突然変異はヒストンアセチル化の不平衡につがなり、染色質の構造が変化し、細胞の生長、分化、アポトーシスに関連する遺伝子発現が阻害され、腫瘍の化学治療に対する耐性の向上、腫瘍細胞の増殖の促進、遷移および血管新生に有利で、同時に腫瘍細胞の分化とアポトーシスが阻害されることで、腫瘍の発生につながる(ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING 2015, 23 (1), 99-126)。HDAC阻害剤はエピゲノム機能の再構築によって、腫瘍に対する標的治療を実現させることができる。
【０００３】
最新のトムソン・ロイター（Thompson Reuters Integrity）のデータによると、1000超のHDACiが薬物の研究・開発の異なる段階にあるという。中では、市販が許可されたものは5種類ある。それぞれ、2006年10月にFDAによって許可された最初のHDAC阻害剤vorinostat(SAHA、Zolinza)、Gloucester社のromidepsin(depsipeptide、FK228)、ノバルティスファーマのpanobinostat(LBH589、Farydak)、Spectrum社のBelinostatおよび深セン微芯社のチダミド(Chidamide、Epidaza)である。
発明者は（WO2012152208）でビスチアゾール化合物を公開したが、HDAC阻害剤として抗腫瘍および多発性硬化症の薬物の開発に使用することができる。中でも、化合物CFH367-C（Bisthianostat）は優れた酵素および腫瘍細胞増殖阻害の活性を示す（IC50＜400nM）。
【化１】
2019528308.tif 000003
【０００４】
また、201410136196.7でビスチアゾール系HDAC阻害剤を公開した。このような化合物はHDAC酵素に対する阻害活性がより高い(IC50=30 nM)だけでなく、多発性骨髄腫の細胞増殖に対する阻害活性もより強く(IC50は100 nMレベルに達する)、そしてEAEマウスの臨床症状に対する治療効果がCFH367-Cよりも顕著に高い。しかし、その後の研究では、当該化合物の代謝性質が劣り、代表的な化合物GCJ403の経口投与の生物学的利用能は14.7％しかない。
【化２】
2019528308.tif 000004
そのため、代謝性質が良いHDAC阻害剤の研究・開発は非常に有意義である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一つの目的は、HDAC阻害剤の製造に使用できる、新規なアリール-2,2'-タンデムビスチアゾール系化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、上記化合物の製造方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の薬物または抗腫瘍薬物の製造における上記化合物の使用を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、治療有効量の上記化合物と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の第一の側面では、構造が一般式Iで表されるアリール-2,2'-タンデムビスチアゾール系化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化３】
2019528308.tif 000005
【０００７】
（ただし、
R1およびR2はそれぞれ独立にH、C1-C6アルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C3-C6シクロアルキル基、C5-C10アリール基のうちの一つであるか、あるいはR1およびR2はそれに連結した炭素原子とともに5-7員の飽和または部分飽和の環を形成する。
R3はH、C1-C6アルキル基、C3-C6シクロアルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C5-C10アリール基のうちの一つである。
R4はH、C1-C6アルキル基、C3-C6シクロアルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C5-C10アリール基のうちの一つである。
上記基は無置換のものあるいはハロゲン、C1-C6アルキル基、C1-C6ハロアルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C1-C6アルコキシ基、C1-C6ハロアルコキシ基、C3-C6シクロアルキル基、C5-C10アリール基からなる群から選ばれる一つまたは複数の基で置換されたものである。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前記化合物は一般式II-2で表される化合物で、ここで、R1、R2、R3およびR4の定義は前記と同様である。）
【化４】
2019528308.tif 000006
【０００９】
もう一つの好適な例において、R1およびR2はそれぞれ独立にH、C1-C6アルキル基、C6-C10アリール基であるか、あるいはR1およびR2はそれに連結した炭素原子とともに5員、6員または7員の部分飽和の環を形成する。
もう一つの好適な例において、R1およびR2はそれぞれ独立にHまたはフェニル基で、前記フェニル基は無置換のものあるいはハロゲン、C1-C6アルキル基、C1-C6ハロアルキル基、C1-C6アルコキシ基、C1-C6ハロアルコキシ基、C3-C6シクロアルキル基からなる群から選ばれる一つまたは複数の基で置換されたものである。
もう一つの好適な例において、R1はフェニル基で、R2はHである。
【００１０】
もう一つの好適な例において、R3はC1-C4アルキル基、C6-C10アリール基で置換されたC1-C4アルキル基またはC3-C6シクロアルキル基である。
もう一つの好適な例において、R3はC1-C4アルキル基、ベンジル基、またはシクロプロピル基である。
もう一つの好適な例において、R3はシクロプロピル基である。
もう一つの好適な例において、R4はC1-C4アルキル基である。
もう一つの好適な例において、R4はS配置のC1-C6アルキル基である。
もう一つの好適な例において、R4はS配置のメチル基である。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記化合物は以下の群から選ばれる：
【化５】
2019528308.tif 000007
【００１２】
本発明の第二の側面では、第一の側面に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法であって、
【化６】
2019528308.tif 000008
（ただし、R4はHではない以外、R1、R2、R3およびR4の定義は前記と同様である。）
【００１３】
(1) 4-アセチル安息香酸メチルとt-ブチルスルフィンアミドを縮合反応させ、t-ブチルスルフィンイミド1を形成する工程と、
(2) t-ブチルスルフィンイミド1をグリニャール試薬と付加反応させ、t-ブチルスルフィンアミド2を形成する工程と、
(3) t-ブチルスルフィンアミド2から保護基を脱離させ、アミン3を形成する工程と、
(4) アミン3を酸4と縮合反応させ、メチルエステル5を形成する工程と、
(5) メチルエステル5を塩基加水分解反応させた後、保護基で保護されたヒドロキシアミンと置換反応させ、最後に保護基を脱離させ、一般式II-1で表される化合物を形成する工程と、
を含む、経路1で示される方法、あるいは
【００１４】
【化７】
2019528308.tif 000009
（ここで、R1、R2、R3の定義は前記の通りである。）
(i) 酸4と4-アミノメチル安息香酸メチルを縮合反応させ、メチルエステル8を形成する工程と、
(ii) メチルエステル8を塩基加水分解反応させた後、保護基で保護されたヒドロキシアミンと置換反応させ、最後に保護基を脱離させ、一般式II-2で表される化合物を形成する工程と、
を含む、経路2で示される方法である、
方法を提供する。
【００１５】
本発明の第三の側面では、第一の側面に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩の使用であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の製造における使用を提供する。
本発明の第四の側面では、第一の側面に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩の使用であって、抗腫瘍薬物または腫瘍細胞を抑制する薬物の製造における使用を提供する。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記腫瘍は、多発性骨髄腫、結腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、卵巣癌、膵臓腺癌、直腸癌、胃癌、リンパ腫、白血病である。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、胎児肺細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓腺癌細胞、直腸癌細胞、胃癌細胞、リンパ腫細胞または白血病細胞である。
もう一つの好適な例において、前記シンパ腫は、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫などである。
もう一つの好適な例において、前記T細胞シンパ腫は、皮膚T細胞リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫などである。
【００１７】
本発明の第五の側面では、治療有効量の本発明の第一の側面に記載の化合物またはその光学異性体、またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物を提供する。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1は化合物H08のヒト骨髄腫RPMI 8226 NOD/SCIDマウス移植小鼠移植腫瘍における薬物効果の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者は幅広く深く研究したところ、チアゾール環にアリール基を導入し、かつ連結部位をアルカンからフェニル基またはベンジル基に変えて得られたアリール-2,2'-タンデムビスチアゾール系化合物は、体内と体外の活性が既存の化合物（たとえばCFH367-C）よりも大幅に向上するだけでなく、経口投与における吸収特性も既存の化合物（たとえばGCJ403）よりも大幅に向上し（マウスの経口投与の生物学的利用能は34.4％に達する）、そして既存の化合物（たとえばCFH367-C）よりも優れた安全性を有するため、より良い将来性があることを見出した。これに基づき、発明者らが本発明を完成した。
【００２０】
用語
本明細書で用いられるように、「C1-C6アルキル基」とは、炭素原子を1〜6個有する直鎖または分岐鎖のアルキル基で、たとえばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、t-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの類似の基が挙げられる。
本明細書で用いられるように、「C2-C6アルケニル基」とは、炭素原子を2〜6個有する直鎖または分岐鎖のアルケニル基で、たとえばビニルル基、プロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などの類似の基が挙げられる。
本明細書で用いられるように、「C2-C6アルキニル基」とは、炭素原子を2〜6個有する直鎖または分岐鎖のアルキニル基で、たとえばエチニル基、プロパギル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などの類似の基が挙げられる。
【００２１】
本明細書で用いられるように、「C3-C6シクロアルキル基」とは、炭素原子を3〜6個有するシクロアルキル基で、たとえばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などの類似の基が挙げられる。
本明細書で用いられるように、「C5-C10アリール基」とは、炭素原子を5〜10個有するアリール基で、たとえばフェニル基、ナフチル基などの類似の基が挙げられる。
【００２２】
本明細書で用いられるように、「5-7員の飽和または部分飽和の環」とは、環原子を5〜7個含む飽和または部分飽和の環で、たとえば二重結合を1〜2個含む6員環が挙げられる。
本明細書で用いられるように、「C1-C6アルコキシ基」とは、炭素原子を1〜6個有する直鎖または分岐鎖のアルコキシ基で、たとえばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、t-ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基などの類似の基が挙げられる。
本明細書で用いられるように、「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである。
【００２３】
本発明の主な利点は以下の通りである。
発明者は、このようなビスチアゾール系HDAC阻害剤の構造造-効果関係を研究したところ、リンカー(Linker)を脂肪族長鎖からベンジル基に変えた後、HDACの各サブタイプのいずれも活性が異なる程度で向上したことを見出した。これに基づき、チアゾールの5-位にフェニル基を導入して置換させたら、化合物H12のHDAC1、3、6に対する阻害活性がまた数倍向上し、IC50が6〜10 nMになった。続いてベンジル基の位置にキラルなS-メチル基を導入して置換させた化合物H08は、HDAC酵素に対する阻害活性がさらに向上し、IC50が2〜3 nMに達し、Bisthianostatよりも遥かに高くなった。
【００２４】
既存の化合物（たとえばBisthianostat）と比べ、本発明によって提供される化合物はヒト多発性骨髄腫細胞RPMI 8226の増殖に対する阻害作用が顕著に増強し、たとえば化合物H08のIC50が8 nMに達し、活性が既存のHDACよりも高い。
より重要なのは、本発明によって提供される化合物は多発性骨髄腫の動物モデルにおける薬物効果が既存の化合物（たとえばBisthianostat）と比べて向上した。化合物H08を50 mg/kgで連続して3週間経口投与すると、ヒト骨髄腫RPMI 8226 NOD/SCIDマウスの移植腫瘍に治療作用があり、有効にマウスの移植腫瘍の増殖を抑制し、相対腫瘍増殖率T/Cは34.49％で、Bisthianostatを100 mg/kgで経口投与する実験群の薬物効果に相当する(T/Cは30.40％)。そして、実験の過程において、マウスの体重は基本的に変わらず、化合物H08の安全性を示した。
【００２５】
さらに、本発明によって提供される化合物は体内と体外の活性が大幅に向上し、経口投与の吸収特性もある程度改善され、初歩的な代謝実験では、化合物H08のマウスの経口投与の生物学的利用能は34.4％に達した。
このように、本発明によって提供される化合物は活性が大幅に向上し、同時に毒性がより低く、経口投与の吸収特性がより良いため、より優れた開発の将来性がある。
また、本発明の化合物は多くの固形腫瘍（たとえば乳癌、肝臓癌、肺癌、胃癌、結腸癌、リンパ腫、白血病など）にも十分に優れた抑制活性を有する。
【００２６】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、あるいはメーカーの薦めの条件で行われた。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。
【００２７】
製造実施例
下記製造実施例において、NMRはVarian製のMercury-Vx 300M装置によって測定され、NMRの測定基準は、δ H 7.26 ppm(CDCl3)、2.50 ppm(DMSO-d6)、3.31 ppm(CD3OD)で、すべての溶媒は分析純度の試薬で、一般的に処理せずにそのまま使用される。無水溶媒は標準方法によって乾燥処理されたものである。ほかの試薬は一般的にいずれも国薬グループ化学試薬有限公司、韶遠化学科技（上海）有限公司、GLバイオケム(上海)有限公司、深センマイヤー化学技術公司、Aldrich、Alfa-Aesar、Acros、Fluka、Merck、TCIまたはLancasterなどの試薬会社から購入され、少数の試薬はメーカーから購入され、特別に説明しない限り、これらの試薬はいずれも処理せずにそのまま使用された。自製の試薬は使用前に一般的にNMRによってその構造およびおおよその純度が確認された。TLC薄層クロマトグラフィーシリカゲルプレートは山東煙台会友シリカゲル開発有限公司によって生産され、型番はHSGF 254で、化合物の精製に使用された順相カラムクロマトグラフィーのシリカゲルは山東青島海洋化工社支社によって生産され、型番はzcx-11で、200〜300メッシュである。
【００２８】
製造実施例1（化合物番号H08-経路1） 
【化８】
2019528308.tif 000010
4-ホルミル安息香酸メチル(5 g, 30.5 mmol)を150 mLのジクロロメタンに溶解させ、S-t-ブチルスルフィンアミド(4.43 g, 36.6 mmol)および炭酸セシウム(12.9 g, 36.6 mmol)を入れ、18 h還流して反応させた。反応液を室温に冷却した後、珪藻土でろ過し、ろ液を濃縮させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE:アセトン=4:1）によって精製して化合物1を得た（7.4 g，91.0％、白色結晶）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.63 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.91 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 1.27 (s, 9H). ESI-MS(m/z): 290.1[M+Na] +.
【００２９】
ジメチル亜鉛(17 mL、1Mのトルエン溶液、17 mmol)を50 mLの再蒸留テトラヒドロフランに溶解させ、N2の保護において、室温でメチルマグネシウムブロミド(15 mL、1MのTHF溶液、15 mmol)を滴下し、滴下終了後室温で30 min反応させた。反応液を-78℃に冷却し、ゆっくり化合物1(2.67 g，10 mmol)のテトラヒドロフラン溶液(15 mL)を滴下し、滴下終了後-78℃で4 h反応させた。飽和塩化アンモニウム溶液で反応をクエンチングし、酢酸エチルで3回抽出し、有機相を合併して飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE:アセトン=5:1〜4:1）によって精製して化合物H08-aを得た（1.6 g，56.5％、白色結晶）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.59 (dq, J = 6.6, 3.3 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.44 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 1.52 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.23 (s, 9H). ESI-MS(m/z): 306.1[M+Na] +.
【００３０】
化合物H08-a(1.18 g，4.16 mmol)を5 mLのジクロロメタンに溶解させ、氷浴において2 N HCl/MeOH溶液を10 mL滴下し、滴下終了後室温に自然昇温して反応させた。3 h後TLCでは完全に反応したら、濃縮後得られた残留物を飽和NaHCO3溶液に置き、ジクロロメタンで3回抽出し、有機相を合併して飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。濃縮後、化合物H08-b(700 mg、94.0％、黄色油状物)の粗製品を得たが、さらに精製する必要がなかった。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.04 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 1.24 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
【００３１】
化合物H08-cの製造方法はすでに特許WO2012152208で報告され、合成手順は詳述しない。
化合物H08-c(122 mg，0.37 mmol)を2 mLの再蒸留ジクロロメタンに溶解させ、化合物H08-b(80 mg，0.45 mmol)およびDMAP(67 mg，0.56 mmol)を入れ、10 min撹拌した。N2の保護において、0℃で反応液にEDCI(106 mg，0.56 mmol)を入れた後、室温で一晩反応させた。1 N塩酸で反応液を酸性にし、酢酸エチルで3回抽出し、有機相を合併して飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE:アセトン=6:1〜4:1）によって精製して化合物H08-dを得た（57 mg，26.1％、黄色固体）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.04 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.00 (s, 1H), 7.67 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.47 - 7.36 (m, 3H), 5.40 - 5.28 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.49 - 3.38 (m, 1H), 1.66 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.34 - 1.28 (m, 2H), 0.83 - 0.78 (m, 2H). ESI-MS(m/z): 490.1[M+H]+.
【００３２】
化合物H08-d(57 mg，0.12 mmol)を4 mLのメタノールおよび1 mLの水に溶解させ、水酸化リチウム一水和物(50 mg，1.2 mmol)を入れ、室温で一晩反応させた。1 N塩酸でpHを2〜3に調整し、白色固体が析出し、ろ過し、40℃で真空乾燥し、相応する酸を得たが、精製せずにそのまま次の反応に使用した。酸(41 mg，0.084 mmol)を2 mLの再蒸留ジクロロメタンに溶解させ、O-t-ブチルジメチルシリルヒドロキシアミン(18 mg，0.13 mmol)およびDMAP(15 mg，0.13 mmol)を入れ、10 min撹拌した。N2の保護において、0℃で反応液にEDCI(24 mg，0.13 mmol)を入れた後、室温で一晩反応させた。酢酸エチルで反応液を希釈し、そして1 N塩酸で有機相を3回洗浄し、この時TLCではTBSがすでに溶離し、さらにそれぞれ水および飽和食塩水で有機相を洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3:MeOH=25:1）によって精製し、化合物H08を得た（29 mg，70.4％、黄色固体）。(c 0.01，DMF).1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.16 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.63 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 7.80 - 7.72 (m, 4H), 7.55 - 7.39 (m, 5H), 5.25 - 5.16 (m, 1H), 3.29 - 3.20 (m, 1H), 1.56 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.31 - 1.24 (m, 2H), 0.83 - 0.77 (m, 2H).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 164.2, 160.9, 158.3, 154.0, 153.3, 147.6, 144.6, 141.2, 140.2, 131.4, 130.2, 129.4, 129.1, 126.9, 126.6, 126.2, 47.9, 21.7, 13.8, 10.1. ESI-MS(m/z): 491.2[M+H]+.
【００３３】
経路1によって以下の化合物を得た。
【表１−１】
2019528308.tif 000011
【表１−２】
2019528308.tif 000012
【００３４】
製造実施例2（化合物番号H12-経路2）
【化９】
2019528308.tif 000013
化合物H08-c(50 mg，0.15 mmol)、4-アミノメチル安息香酸メチル塩酸塩(45 mg，0.22 mmol)およびHOBt(30 mg，0.22 mmol)を2 mLのDMFに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(38 mg，0.29mmol)を入れ、0℃で10 min撹拌した後、さらにEDCI(34 mg，0.18 mmol)を入れ、自然昇温して一晩反応させた。大量の水を入れて反応液を希釈し、酢酸エチルで3回抽出し、有機相を合併してそれぞれ1 N塩酸、飽和NaHCO3溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE:アセトン=3:1）によって精製して化合物H12-aを得た（25 mg，35.2％、黄色固体）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.03 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.99 (s, 1H), 7.82 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.63 - 7.56 (m, 5H), 4.73 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.54 - 3.44 (m, 1H), 1.38 - 1.33 (m, 2H), 0.87 - 0.82 (m, 2H). ESI-MS(m/z): 476.1[M+H]+.
【００３５】
化合物H12-a(25 mg，0.052 mmol)を4 mLのメタノールおよび1 mLの水に溶解させ、水酸化リチウム一水和物(22 mg，0.52 mmol)を入れ、80℃で3 h反応させた。1 N塩酸でpHを2〜3に調整し、黄色固体が析出し、ろ過し、40℃で真空乾燥し、相応する酸を得たが、精製せずにそのまま次の反応に使用した。酸(25 mg，0.054 mmol)を2 mLの再蒸留ジクロロメタンに溶解させ、O-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)ヒドロキシアミン(19 mg，0.16 mmol)およびDMAP(10 mg，0.081 mmol)を入れ、10 min撹拌した。N2の保護において、0℃で反応液にEDCI(15 mg，0.078 mmol)を入れた後、室温で一晩反応させた。直接濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3:MeOH=30:1）によって精製し、THPで保護されたヒドロキサム酸の粗製品を得た。この粗製品を2 mLの1,4-ジオキサン(1,4-dioxane)に溶解させ、2 mLの3 N塩酸を入れ、室温で15 min撹拌し、ろ過し、化合物H12を得た(10 mg，38.9％，黄色固体)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.18 (s, 1H), 9.00 (s, 2H), 8.39 (s, 1H), 7.79 - 7.66 (m, 4H), 7.48 - 7.39 (m, 5H), 4.51 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.41 - 3.34 (m, 1H), 1.32 - 1.25 (m, 2H), 0.83 - 0.78 (m, 2H). ESI-MS(m/z): 499.1[M+Na]+.
【００３６】
生物実験実施例
実験実施例1：ヒストン脱アセチル化酵素1、3および6の阻害活性の測定実験
1．実験目的：
実施例の化合物のヒト由来ヒストン脱アセチル化酵素1、3および6（すなわちヒト由来HDAC1、HDAC3およびHDAC6）の阻害活性を測定した。
【００３７】
2．実験材料：
ちヒト由来HDAC1、HDAC3およびHDAC6は、いずれもバキュロウイルス発現システムを使用し、上海薬物研究所の李佳博士の研究チームによって精製された。
基質：HDAC1、HDAC 3：Ac-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMC、HDAC6：Boc-lys(Ac)-AMC、いずれも上海GLバイオケム有限公司から購入された。
384マイクロプレートはPerkin Elmer社の製品で、ほかの通常の化学試薬は国産の分析純度(AR)の試薬である。蛍光シグナル測定装置EnvisionTMはPerkin Elmerの製品である。
【００３８】
3．実験方法：
HDAC1、HDAC3の活性検出はAc-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMCを基質とし、HDAC6の活性検出はBoc-Lys(Ac)-AMCを基質とし、いずれも蛍光検出法を使用した。基質Ac-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMCおよびBoc-Lys(Ac)-AMCをHDACによって脱アセチル化した後、トリプターぜで加水分解させた産物AMCは蛍光シグナル測定装置EnvisionTMの355 nm励起による460 nm発光で蛍光シグナルが検出された。蛍光シグナルの経時変化を検出することによって、反応の初期速度を計算した。
被験化合物、酵素および反応緩衝液を均一に混合し、基質を入れて反応を開始させ、室温で24 hインキュベートした後、パンクレアチンを入れて1 h反応させ、最後に蛍光シグナル測定装置EnvisionTMの355 nm励起による460 nm発光で蛍光シグナルを検出した。
【００３９】
同時に、以下の対照群を設けた：
酵素を入れていないブランク対照群、
被験化合物の代わりにDMSOを入れる溶媒対照群、
Bisthianostat陽性対照群、
CFH401陽性対照群、
CFH455-C陽性対照群、
SAHA陽性対照群。
【００４０】
反応の最終体積は50 μLで、具体的な反応系は、2％ DMSO、20-200 nM HDACs(HDAC1:200 nM、HDAC3:200 nM、HDAC6:20 nM)、10 μM Ac-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMC、50 μM Boc-lys(Ac)-AMC、25 mM Hepes pH8.0、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.9 mM MgCl2、0.1％ BSA、0.156％トリプターゼである。
【００４１】
波長460 nmにおける蛍光シグナル強度を測定した後、サンプルの各濃度群の活性百分率(％Activity)を計算し、数式は以下に示す。
【数１】
2019528308.tif 000014
【００４２】
濃度の対数値を活性百分率に対してグラフを作り、さらに非線形回帰を使用して回帰曲線を算出し、ソフトGraphPad Prism 5の数式log(inhibitor) vs. response -- Variable slopeでIC50値を算出した。
各実験を3回ずつ繰り返し、各実験は重複ウェルを3個超設けた。3回の実験の平均IC50値を化合物の阻害能力の最終指標として求めた。
【００４３】
4．一部の化合物の実験結果：
【表２】
2019528308.tif 000015
【００４４】
表1の実験結果から、本発明によって提供される化合物は、HDAC1、3、6のいずれにも良い阻害活性を有し、本発明では、リンカー(Linker)をBisthianostatの脂肪族長鎖からベンジル基に変えただけで、HDACの各サブタイプのいずれも活性がBisthianostatよりも2〜3倍向上したことがわかる。これに基づき、チアゾールの5-位にフェニル基を導入して置換させたら、化合物H12のHDAC1、3、6に対する阻害活性が以前報告された（WO2012152208）的化合物CFH401と比べて4〜5倍向上し、IC50が約6〜10 nMになったことがわかる。続いてベンジル基の位置にキラルなS-メチル基を導入して置換させた化合物H08は、HDAC酵素に対する阻害活性がさらに向上し、IC50が2〜3 nMと低下し、活性がBisthianostatよりも遥かに高くなったことがわかる。
【００４５】
【表３】
2019528308.tif 000016
【００４６】
実験実施例2：細胞レベルの抗腫瘍活性の測定実験
1．実験目的：
実施例の化合物の抗腫瘍活性の測定を行い、化合物のヒト由来多発性骨髄腫細胞株8266の生長に対する阻害活性を測定することによって化合物の体外抗腫瘍活性を評価した。
【００４７】
2．実験材料：
CCK8キット(カタログ番号：CK04)は東仁化学科技有限公司から購入された。
96ウェル細胞培養プレート(カタログ番号：3599)はCorning社から購入された。
マイクロプレートリーダー(absorbance microplate reader molecular devices)はMD社から購入された。
RPMI 8226細胞株は上海長征医院の侯健教授から得られ、培養条件はRPMI-1640+10％ FBSで、37℃、5％CO2の飽和湿度のインキュベーター(Forma Scientific, Inc.)で通常の培養を行った。
【００４８】
3．実験方法：
細胞の生長速度に合わせ、対数生長期の多発性骨髄腫細胞を100 μL/ウェルで96ウェル培養プレートに接種し、さらに試薬を1 μL/ウェル入れ、各濃度に重複ウェルを3つ設け、そして相応する濃度のDMSO溶媒対照を設けた。多発性骨髄腫細胞を37℃、5％CO2の条件で72 h培養した。RPMI 8226細胞の接種密度は5000/ウェルである。
CCK-8染色法：薬物作用終了後、各ウェルにCCK-8溶液10 μLを入れ、37℃で3 hインキュベートし、マイクロプレートリーダーによって450 nmおよび690 nmにおけるOD値を測定した。
【００４９】
4．データ処理と統計分析：
以下の数式で被験物の多発性骨髄腫細胞の増殖に対する阻害率(％ Inhibiton)および活性（％ Activity）を計算したが、ここで、ODSampleは薬物投与ウェルで測定された吸光値(OD450 - OD690)を表す。ODDMSOはDMSO対照ウェルの吸光値(OD450 - OD690)を表す。
【数２】
2019528308.tif 000017
【数３】
2019528308.tif 000018
濃度の対数値を活性百分率(％ Activity)に対してグラフを作り、非線形回帰を使用して回帰曲線を算出し、GraphPad Prism 5ソフトのlog(inhibitor) vs. response -- Variable slopeのパラメーター設定でIC50値を算出した。各群の実験は独立に3回繰り返し、毎回各濃度に重複ウェルを3つ設けた。
【００５０】
5．一部の化合物の実験結果：
【表４】
2019528308.tif 000019
【００５１】
表2から、本発明によって提供される化合物はいずれも良い腫瘍細胞増殖の阻害活性を示し、Bisthianostatと比べ、細胞レベルで活性が異なる程度で向上し、中でも、化合物H08およびH12の活性は百倍近く向上し(IC50はいずれも8 nM程度)、この結果は酵素レベルの活性測定の結果と一致する。
【００５２】
実験実施例3：細胞レベルの抗腫瘍活性の測定実験
1．実験目的：
実施例の化合物の抗腫瘍活性の測定を行い、化合物の数株のヒト腫瘍細胞株の生長に対する阻害活性を測定することによって化合物の体外抗腫瘍活性を評価した。
【００５３】
2．実験材料：
CCK8キット(カタログ番号：CK04)は東仁化学科技有限公司から購入された。
タンパク質染色法のスルホローダミンB(sulforhodamine B、SRB)はsigma社から購入された。
96ウェル細胞培養プレート(カタログ番号：3599)はCorning社から購入された。
マイクロプレートリーダー(absorbance microplate reader molecular devices)はMD社から購入された。
【００５４】
細胞株の由来：
【表５】
2019528308.tif 000020
腫瘍細胞（MDA-MB-231を除く）は37℃、5％CO2条件で通常の培養を行った。
【００５５】
3．実験方法：
細胞の生長速度に合わせ、対数生長期の腫瘍細胞を90 μL/ウェルで96ウェル培養プレートに接種し、付着生長24 h後さらに試薬を10 μL/ウェル入れ、各濃度に重複ウェルを3つ設け、そして相応する濃度のDMSO溶媒対照および無細胞零点校正ウェルを設けた。腫瘍細胞（MDA-MB-231を除く）を37℃、5％CO2条件で72 h培養した（MDA-MB-231細胞は37℃で、CO2を含有しない条件で培養した）。薬物作用終了後、Ramos、HL-60、Molt-4、Raji、CCRF-CEM、SU-DHL-6腫瘍細胞株の試験では、各ウェルにCCK-8溶液10μLを入れ、37℃で2 h程度インキュベートし、マイクロプレートリーダーによって450 nmにおけるOD値を測定した。BEL-7402、BEL-7404、A549、NCI-H1975、EBC-1、MCF-7、MDA-MB-231、T47D、NCI-N87、MKN-74、HT-29、MRC-5腫瘍細胞株の試験では、培養プレートにおける細胞培養液を捨て、10％(w/v)トリクロロ酢酸(100μL/ウェル)を入れて4℃で1 h固定し、さらに蒸留水で5回洗浄した。逆さでオーブンで乾燥した後、培養プレートを取り出して各ウェルに100μLのSRB溶液(4mg/mL SRB粉末を1％氷酢酸に溶解させたもの)を入れ、室温で15min置いた後、1％氷酢酸で5回洗浄してプレートの底のタンパク質と結合しなかったSRBを十分に除去した。逆さでオーブンで乾燥した後、各ウェルに10 mM Tris溶液を150 μL入れ、マイクロプレートリーダーによって560nmにおけるOD値を測定した。
【００５６】
4．データ処理と統計分析：
以下の数式で被験物の腫瘍細胞の増殖に対する阻害率を計算し、半数阻害量IC50値はLogit法によって計算した：阻害率=（対照群OD値−投与群OD値）/対照群OD値×100％。各群の実験は独立に3回繰り返し、毎回各濃度に重複ウェルを3つ設けた。
【００５７】
【表６】
2019528308.tif 000021
【００５８】
実験実施例3：化合物H08のヒト骨髄腫RPMI 8226のNOD/SCIDマウス移植腫瘍動物モデルにおける薬物効果実験
1．実験目的：
化合物H08のヒト多発性骨髄腫の動物モデルにおける薬物効果を考察した。
【００５９】
2．投与プラン
【表７】
2019528308.tif 000022
【００６０】
PS341: ボルテゾミブは、プロテアソーム阻害剤で、多発性骨髄腫の治療に使用され、構造は以下に示す。
【化１０】
2019528308.tif 000023
【００６１】
3．実験材料：
NOD/SCIDマウスは雌で、5〜6週齢で、体重20±3 gで、上海霊暢生物科技有限公司から提供され、生産合格証番号：SCXK(滬)2013-0018である。各群の動物数は6匹である。IACUC号は2013-0007(南模)である。
ヒト骨髄腫RPMI 8226細胞株は上海薬物研究所の李佳研究チームによって保存された。当該細胞株でNOD/SCIDマウスの右側の脇下の皮下に接種し、細胞接種量は1×107/匹で、移植腫瘍が形成した後、NOD/SCIDマウスの体内で2回継代した後使用した。
【００６２】
4．実験方法：
生長期の腫瘍組織を1.5 mm3程度に切り、無菌条件で、NOD/SCIDマウスの右側の脇下の皮下に接種した。NOD/SCIDマウスの皮下移植腫瘍は、ノギスで直径を測定し、腫瘍が100〜300 mm3に生長した時点で動物を無作為に群分けした。群分けの仕方は表5に示すように、溶媒対照群では等量のブランク溶媒を投与した。実験の全過程において、毎週2回移植腫瘍の直径を測定し、同時にマウスの体重を測った。腫瘍体積（tumor volume、TV）の計算式は、TV=1/2×a×b2で、ここで、a、bはそれぞれ長さと幅を表す。測定の結果から相対腫瘍体積（relative tumor volume、RTV)を計算し、計算式は、RTV=Vt/V0である。ここで、V0は分けて投与する時点（即ちd0）で測定された腫瘍体積で、Vtは毎回の測定の時の腫瘍体積である。
【００６３】
抗腫瘍活性の評価指標は以下の通りである：1）相対腫瘍増殖率T/C（％）、計算式：T/C(％)=(TRTV/CRTV)×100％、TRTV：治療群のRTV、CRTV：陰性対照群のRTV；2）腫瘍体積増加抑制率GI％、計算式：GI％=[1-(TVt-TV0)/(CVt-CT0)]×100％、TVt：治療群の毎回の測定の腫瘍体積、TV0：治療群の分けて投与する時点で測定された腫瘍体積、CVt：対照群の毎回の測定の腫瘍体積、CT0：対照群の分けて投与する時点で測定された腫瘍体積；3）腫瘍重量抑制率、計算式：腫瘍重量抑制率％=(Wc-WT)/Wc×100％、Wc：対照群の腫瘍重量、WT：治療群の腫瘍重量。
【００６４】
5．実験結果： 
図1は化合物H08のヒト骨髄腫RPMI 8226 NOD/SCIDマウス移植小鼠移植腫瘍における薬物効果の結果を示す。
【表８】
2019528308.tif 000024
【００６５】
図1および表6から、化合物H08を50 mg/kgで連続して3週間経口投与すると、ヒト骨髄腫RPMI 8226 NOD/SCIDマウスの移植腫瘍にある程度の治療作用があり、有効にマウスの移植腫瘍の増殖を抑制し、相対腫瘍増殖率T/Cは34.49％で、Bisthianostatを100 mg/kgで経口投与する実験群の薬物効果に相当し(T/Cは30.40％)、いずれも陽性化合物PS341よりも優れたことがわかる。
【００６６】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
2019528308.tif 000029
【国際調査報告】
2019528308.tif 000030
2019528308.tif 000031
2019528308.tif 000032
2019528308.tif 000033