【手続補正書】
【提出日】平成19年3月26日(2007.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼ及び第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼを含んで成り、
ただし前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在する、
オリゴ糖を分解するエンドグルカナーゼ組成物。
【請求項２】
前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、又は前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、が前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、を発現するよう組換え操作されている細菌細胞抽出物から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞抽出物が、細菌細胞から得られる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細菌細胞がエンテロバクテリアセアエ科（原語：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌細胞がエシェリヒア（原語：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）又はクレブシエラ（原語：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記細菌細胞抽出物が、ｃｅｌＺ にコードされた第一エンドグルカナーゼと、ｃｅｌＹにコードされた第二エンドグルカナーゼとを含んで成り、ただしこのときｃｅｌＺ 及びｃｅｌＹ はエルウィニア（原語：Ｅｒｗｉｎｉａ）由来である、請求項３乃至５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記第一エンドグルカナーゼがＥＧＺであり、前記第二エンドグルカナーゼがＥＧＹである、請求項１乃至６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記比が、約９：１乃至約１９：１の範囲内である、請求項１乃至７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者が、精製されている、請求項１乃至８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記分解が、約１．１乃至約２．０の範囲の因数で相乗される、請求項１乃至９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
付加的な酵素をさらに含んで成る、請求項１乃至１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記付加的な酵素が、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコ         アミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチ         ン酸リアーゼ、又はこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記付加的な酵素が真菌を由来とするグルカナーゼである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記真菌がＴ．ロンギブランキアタム（原語：Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａｎｃｈｉａｔｕｍ）である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記付加的な酵素がエタノール生成性酵素である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記エタノール生成性酵素が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第一エンドグルカナーゼ及び前記第二エンドグルカナーゼが、別々にパッケージされている、請求項１乃至１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が同時糖化発酵に用いられる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記オリゴ糖原料がセロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される、請求項１乃至１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のいずれか１項に記載のエンドグルカナーゼ組成物を用いてオリゴ糖を分解する方法であって、オリゴ糖原料を、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼと、第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼとに順次又は同時に接触させるステップを含み、このとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによるオリゴ糖分解が相乗する又は相乗が促進するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在する、
オリゴ糖を分解する方法又はオリゴ糖の分解を促進する方法。
【請求項２１】
第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼを得るステップ及び第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼを得るステップをさらに含んでなる請求項２０に記載のオリゴ糖の分解又はオリゴ糖の分解の増進のための方法。
【請求項２２】
前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴ糖がセロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０乃至２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記セルロースが、紙、パルプ及び植物繊維からなる群より選択される原料を由来とするセルロースである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が水溶液中で行われる、請求項２０乃至２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントと、
第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントと、
を含んで成る、オリゴ糖を分解するのに適した組換えホスト細胞。
【請求項２７】
第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、そして
第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、含んで成り、
ただしこのとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖原料の分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するように、前記第一エンドグルカナーゼ及び第二エンドグルカナーゼが発現される、
オリゴ糖原料を分解するのに適した請求項２６に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２８】
前記第一エンドグルカナーゼ又は前記第二エンドグルカナーゼ、あるいは、前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者、が分泌される、請求項２６又は２７に記載の組換えホスト細胞。
【請求項２９】
前記ホスト細胞が細菌細胞である、請求項２６乃至２８のいずれかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項３０】
前記ホスト細胞が、エンテロバクテリアセエ科から選択される、請求項２９に記載の組換えホスト細胞。
【請求項３１】
前記ホストがエシェリヒア又はクレブシエラである、請求項３０に記載の組換えホスト細胞。
【請求項３２】
前記ホスト細胞が、Ｅ．コリＢ、Ｅ．コリＤＨ５α、及びクレブシエラ−オキシトカからなる群より選択される、請求項３１に記載の組換えホスト細胞。
【請求項３３】
付加的な酵素をさらに含んで成る、請求項２６乃至３２のいずれかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項３４】
前記付加的な酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項３３に記載の組換えホスト細胞。
【請求項３５】
前記付加的な酵素がエタノール生成性酵素である、請求項３３に記載の組換えホスト細胞。
【請求項３６】
前記酵素が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択されるエタノール生成性酵素である、請求項３５に記載の組換えホスト細胞。
【請求項３７】
前記第一エンドグルカナーゼがｃｅｌＺにコードされており、そして前記第二エンドグルカナーゼがｃｅｌＹにコードされており、ただしこのときｃｅｌＺ及びｃｅｌＹはエルウィニア由来である、請求項２６乃至３６のいずれかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項３８】
第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントと、
第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントと、
を含んで成る組換え細胞であって、ただしこのとき第一エンドグルカナーゼをコードする前記第一ポリヌクレオチドセグメント又は第二エンドグルカナーゼをコードする前記第二ポリヌクレオチドセグメント、あるいは第一エンドグルカナーゼをコードする前記第一ポリヌクレオチドセグメント及び第二エンドグルカナーゼをコードする前記第二ポリヌクレオチドセグメントの両者、が、エルウィニア由来のｃｅｌＹ又はｃｅｌＺのいずれかの遺伝子産物にアミノ酸アライメントしたときに充分相同であるために多糖を分解できる機能的活性を共有している請求項２６乃至３７のいずれかに記載の、組換えホスト細胞。
【請求項３９】
前記第一エンドグルカナーゼがＥＧＺであり、そして前記第二エンドグルカナーゼがＥＧＹである、請求項２６乃至３８のいずれかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項４０】
前記の付加的な酵素が分泌性酵素である、請求項３３乃至３９のいずれかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項４１】
前記分泌性酵素がｐｕｌ又はｏｕｔ遺伝子産物である、請求項４０に記載の組換えホスト細胞。
【請求項４２】
前記ホスト細胞がエタノール生産性である、請求項２６乃至４１のいずれかに記載の組換えホスト細胞。
【請求項４３】
前記ホスト細胞が、Ｅ．コリ ＫＯ４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ．コリＫＯ１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ．コリＫＯ１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）、Ｅ．コリＬＹ０１（ＡＴＣＣ １１３０３）及びＫ．オキシトカＰ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）を含んで成る群より選択される、請求項４２に記載の組換えホスト細胞。
【請求項４４】
第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、そして第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする一配列を含んで成る第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に、含んで成る請求項２７乃至４３のいずれか記載の組み換えホスト細胞に、オリゴ糖原料を接触させるステップ
を含む、オリゴ糖の分解を促進する方法であって、
ただしこのとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解が相乗し、ひいては促進されるような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一エンドグルカナーゼ及び前記第二エンドグルカナーゼが発現される、方法。
【請求項４５】
前記第一エンドグルカナーゼ又は第二エンドグルカナーゼ若しくは前記第一及び第二エンドグルカナーゼの両者が分泌される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が水溶液中で行われる、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項４４乃至４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記オリゴ糖源が、セロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項４４乃至４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
請求項２７乃至請求項４３のいずれかに記載の組み換えホスト細胞を作製する方法であって、第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に来るよう、及び；
第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする一配列を含んで成る第二異種ポリヌクレオチドセグメントを、サロゲート・プロモータの転写制御下に来るよう、
ホスト細胞に導入するステップを含み、
このとき前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解が相乗するような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一及び第二エンドグルカナーゼが発現される、方法。
【請求項５０】
ｐＬＯＩ２３５２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、
前記ベクタが安定に組み込まれたホスト細胞を特定するステップ
を含んで成る、請求項４９に記載の組換えホスト細胞を作製する方法。
【請求項５１】
ｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のポリヌクレオチド配列を含んで成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、
エンドグルカナーゼを発現しているホスト細胞を同定するステップと
を含んで成る、ホスト細胞でエンドグルカナーゼを発現させる方法を含むことを特徴とする請求項４９又は５０に記載の組み換えホスト細胞を作製する方法。
【請求項５２】
第一分解活性を有する第一エンドグルカナーゼをコードする第一異種ポリヌクレオチドセグメントをサロゲート・プロモータの転写制御下に、及び
第二分解活性を有する第二エンドグルカナーゼをコードする第二異種ポリヌクレオチドセグメントをサロゲート・プロモータの転写制御下に
含んで成る、請求項４２又は４３に記載のエタノール生産性ホスト細胞を用いて、当該エタノール生産性ホスト細胞に、オリゴ糖源を接触させるステップを含む、オリゴ糖源からエタノールを生成する方法であって、
ただし前記第一及び第二エンドグルカナーゼによる前記オリゴ糖の分解が相乗する結果、オリゴ糖が分解され、発酵してエタノールになるような比で、前記第一及び第二分解活性が存在するよう、前記第一及び第二エンドグルカナーゼが発現される、方法。
【請求項５３】
前記方法が水溶液中で行われる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記オリゴ糖が、セロオリゴ糖、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの何らかの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記異種ポリヌクレオチドセグメントが、ｐＬＯＩ ２３５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）であるか、又は、ｐＬＯＩ ２３５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）を由来とする、請求項５２乃至５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記第一ポリヌクレオチドセグメント又は第二ポリヌクレオチドセグメント、あるいは、前記第一及び第二ポリヌクレオチドセグメントの両者、の前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリスを由来とするポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ｐＬＯＩ２３１１、ｐＬＯＩ２３１６、ｐＬＯＩ２３１７、ｐＬＯＩ２３１８、ｐＬＯＩ２３１９、ｐＬＯＩ２３２０、ｐＬＯＩ２３２３、ｐＬＯＩ２３４２、ｐＬＯＩ２３４８、ｐＬＯＩ２３４９、ｐＬＯＩ２３５０、ｐＬＯＩ２３５２、ｐＬＯＩ２３５３、ｐＬＯＩ２３５４、ｐＬＯＩ２３５５、ｐＬＯＩ２３５６、ｐＬＯＩ２３５７、ｐＬＯＩ２３５８、及びｐＬＯＩ２３５９からなる群より選択されるプラスミド又は当該プラスミド中の挿入ポリヌクレオチド断片又は当該断片を含んで成るベクター。
【請求項５８】
請求項５７に記載のプラスミド又は当該プラスミド中の挿入ポリヌクレオチド断片を含むベクターを用いて形質転換された組み換えホスト細胞を含んで成る組換えホスト細胞。
【請求項５９】
前記組み換えホスト細胞がクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６８）、クレブシエラオキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６４）、クレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６５）、及びクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６７）を含んで成る群より選択される、請求項５８に記載の組換えホスト細胞。
【請求項６０】
オリゴ糖の前記分解に、粘性の低下が伴う、請求項２０乃至２５のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記粘性の低下が、少なくとも、５センチポアズ、１０センチポアズ、２０センチポアズ、５０センチポアズ、１００センチポアズ、５００センチポアズ、及び１０００センチポアズからなる群より選択される量の粘性低下である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記オリゴ糖の分解に年度の低下が伴う請求項２６乃至４３のいずれかに記載のオリゴ糖を分解するのに適した組換えホスト細胞。
【請求項６３】
請求項６２に記載の組み換えホスト細胞を由来とする酵素抽出物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
さらに別の実施例では、前記組換え宿主は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、α−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、又はこれらの組み合わせ、などの付加的な酵素を発現する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
上記の態様の別の関連する実施例では、本ホスト細胞は、例えばＥ．コリ ＫＯ４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ．コリＫＯ１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ．コリＫＯ１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）及び Ｅ．コリＬＹ０１（ＡＴＣＣ  １１３０３）、Ｋ．オキシトカ Ｍ５Ａ１、及びＫ．オキシトカ Ｐ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）など、エタノール生産性である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
さらに別の実施例では、本ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ科、好ましくはエシェリヒア又はクレブシエラ、より好ましくはＥ．コリＫＯ４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、Ｅ．コリＫＯ１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、Ｅ．コリＫＯ１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）、ＬＹ０１（ＡＴＣＣ  １１３０３）、Ｋ．オキシトカ Ｍ５Ａ１、又はＫ．オキシトカ Ｐ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）から選択される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
ある実施例では、前記ホストはクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）、クレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６）、クレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）、又はクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
第十四の態様では、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６８の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株を提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
第十五の態様では、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６４の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株を提供する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
第十六の態様では、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６５の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株を提供する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
第十七の態様では、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４６７の寄託株を代表とするクレブシエラ−オキシトカ株Ｍ５Ａ１：ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）の組換えホスト株を提供する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
別の実施例では、本組換えホストはグラム陰性細菌である。さらに別の実施例では、本組換えホストは、エンテロバクテリアセエ科のものである。例えば、言及をもってここに編入する米国特許第５，８２１，０９３号のエタノール生産性ホストが適したホストであり、具体的にはＥ．コリ株ＫＯ４（ＡＴＣＣ ５５１２３）、ＫＯ１１（ＡＴＣＣ ５５１２４）、及びＫＯ１２（ＡＴＣＣ ５５１２５）、及びクレブシエラ−オキシトカ株Ｐ２（ＡＴＣＣ ５５３０７）がこれに含まれる。あるいは、ジモモナス−モビリスなどの効率的なエタノール生産生物のエタノール生産遺伝子などを導入することにより、本発明の非エタノール生産性ホストをエタノール生産性ホスト（例えば上に言及した株など）に変換してもよい。標準的な技術を用いてこの種類の遺伝子操作を行うと、効率的に糖を発酵させてエタノールにすることのできる組換えホストが得られる。加えて、ＬＹ０１エタノール耐性株（ＡＴＣＣ  １１３０３）を公開済みのＰＣＴ国際出願ＷＯ ９８／４５４２５が解説するように利用してもよく、この公開済み出願を、言及をもってここに編入することとする（さらに例えばＹｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．ｏｆ Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．＆ Ｂｉｏ．２０：１３２−１３８も参照されたい）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
新規なベクタｐＬＯＩ２３０６の構造上の特徴を図８に概略的に示し、様々なコドン領域（即ち遺伝子ｃｅｌＺ、ｂｌａ、及びｔｅｔのコドン領域）を含めた、このベクタのヌクレオチド配列を、配列表（アミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ  ２２〜２４として開示する）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示す。ｃｅｌＺ遺伝子の下流にある（Ｅ．クリサンセミ由来の）非コドン配列であるヌクレオチド塩基対３２８２−４２８１と、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１由来の非コドン標的配列の一部である塩基対９４７６−１１５４４については、標準的技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９２）に説かれたものなど）による配列決定をまだ行っていない。例えば、これら既知の配列に対応する配列決定プライマを合成でき、この配列決定プライマを用いてｐＬＯＩ２３０６プラスミドをテンプレートとして用いた標準的な配列決定反応を行えるよう、ｐＬＯＩ２３０６プラスミドの上記の配列決定を行っていない領域のいずれかの側に来る充分なフランキング配列が開示されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、希酸で予備処理し、二種の異なる培地を補ったコメ外皮基質を用いたエタノール生産性組換えホストＥ．コリＫＯ１１の発酵率を示す。
【図２】図２は、混合廃棄事務用紙を用いた、エタノール生産性組換えホスト株Ｋ．オキシトカＰ２の同時糖化発酵（ＳＳＦ）率を示す。ＳＳＦで出た不溶性の残渣は、セルラーゼ酵素及び基質が結合した供給源として次の発酵時でリサイクルした。
【図３】図３は、低コピー数のプロモータプローブベクタであるプラスミドｐＬＯＩ２１７１の構造を示し、選択のためのカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）、プラスミドのエピソーム維持のための温度感受性ｐＳＣ１０１レプリコン（Ｒｅｐ（ｔｓ））、及び、ホスホ−ベータ−グルコシダーゼ（ＥＧＺ）をコードする、プロモータのないポリサッカラーゼ遺伝子ｃｅｌＺ、の方向を示す。
【図４】図４は、形質転換した細菌コロニで測定したＣＭＣ指示プレート上の浄化領域の大きさ（ｘ軸）と、発現したグルカナーゼ活性量（ｙ軸）との間の高い対応を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐＬＯＩ２１８３プラスミド内でサロゲート・プロモータとして機能するＺ．モビリスＤＮＡ断片の部分的なヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。その完全な配列は、ジェンバンク受託番号ＡＦ１０９２４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を付与されている。二つの転写開始部位（＃）、−３５及び−１０領域、シャイン−ダルガルノ部位（太字）、ベクタ及びｃｅｌＺの部分的な配列（小文字）、及びｃｅｌＺ開始コドン（太字で示したａｔｇ）を示してある。
【図６】図６は、僅かなレベル（ｐＵＣ１９；パネルＡ）、中程度のレベル（ｐＬＯＩ２１６４；パネルＢ）及び高レベル（ｐＬＯＩ２３０７；パネルＣ）のグルカナーゼを発現している様々なプラスミドを、外側の細胞壁と内側の膜（ｉｍ）との間に位置したペリプラスム封入体（ｐｉｂ）の形で持つＥ．コリＤＨ５α細胞の電子顕微鏡写真である。図示の棒は０．１μｍを表す。
【図７】図７は、組換えホストのゲノムに導入させ、そのホストに安定なグルカナーゼ発現活性をもたらすことのできる遺伝子作成物であるｃｅｌＺ組み込みベクタｐＬＯＩ２３０６を作成するのに用いるクローニング戦略の概略詳細図である。
【図８】図８は、Ｚ．モビリス由来のサロゲート・プロモータ、Ｅ．クリサンセミ由来のｃｅｌＺ遺伝子、耐性マーカ（ｂｌａ及びｔｅｔ）及びＫ．オキシトカ標的配列の位置を示した、ｃｅｌＺ組み込みベクタｐＬＯＩ２３０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）の概略図である。
【図９】図９は、ＥＧＹ及びＥＧＺの相乗作用の図解である。両酵素をＣＭＡａｓｅ活性が等しく（１．５ＩＵ／ｍｌ）なるまで希釈し、計算上の相乗作用を括弧内に示した。パネルＡは、酵素の比率が相乗作用に及ぼす作用を示したグラフである。個々の酵素の寄与度に基づき、予想上の活性が一定（１．５ＩＵ／ｍｌ）になるようにしながら、様々な量のＥＧＹ及びＥＧＺを組み合わせた。検定はＣＭＣと一緒に１時間、３５℃でインキュベートし、沸騰させて反応を停止させた。Ｘ軸上の数字は、ＥＧＺ及びＥＧＹ間の比率を示す。相乗作用を各棒線の上方に示す。パネルＢは、単独及び組み合わせたとき（９部ＥＧＺ ＋ １部ＥＧＹ）のＥＧＺ及びＥＧＹによるＣＭＣの加水分解を示したグラフである。検定はすべて、個々のＥＧＹ活性及びＥＧＺ活性の合計に基づき、同等の総活性 （０．１５ ＩＵ／ｍｌ）を含んでいた。相乗作用を、両酵素の組合せについて各点上方に示す。パネルＣは、単独及び組み合わせたときのＥＧＺ及びＥＧＹによる酸膨潤セルロースの加水分解を示したグラフである。組合せの酵素反応については、ＥＧＺ 対ＥＧＹ を９対１の比で用いた。検定はすべて、個々のＥＧＹ及びＥＧＺ活性の合計に基づいて１．５ ＩＵ／ｍｌを含んでいた。相乗作用を、両酵素の組合せについて各点上方に示す。
【図１０】図１０は、酸膨潤セルロース及びアビセル（Ｒ）という二種の複合糖からの加水分解生成物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を示す。約１．５ ＩＵ 及び２５ ＩＵ のＣＭＣａｓｅ をそれぞれ酸膨潤セルロース及びアビセル（Ｒ）の反応に用いた。Ｙ軸の略字は；Ｇ１はグルコース；Ｇ２はセロビオース；Ｇ３はセロトリオース；Ｇ４はセロテトラオース；及びＧ５はセロペンタオースを表す。レーンでは、Ｓは混合セロオリゴ糖の標準；Ｃは酵素なしのコントロール；ＺはＥＧＺ；ＹはＥＧＹ、そして Ｚ ＋ Ｙは ＥＧＺ ＋ ＥＧＹを表す。パネルＡは酸膨潤セルロースをＣＭＣａｓｅ（１μｌ添加量）と一緒に６時間インキュベートした結果を示す。パネルＢは、酸膨潤セルロースをＣＭＣａｓｅ（２μｌ添加量）と一緒に６時間インキュベートした結果を示す。パネルＣは、アビセル（Ｒ）を ＣＭＣａｓｅ （１０μｌの添加量）と一緒に４８時間インキュベートした結果を示す。
【図１１】図１１は、ＥＧＺ及びＥＧＹによるセロオリゴ糖の加水分解を示したＴＬＣ分析を示す。各テストは、１ｍｌ当たり約０．０７ ＩＵ の ＣＭＣａｓｅ（２時間のインキュベーション、３５℃）を含んでいた。略字は；Ｓは混合セロオリゴ糖の標準；Ｇ１はグルコース；Ｇ２はセロビオース；Ｇ３はセロトリオース；Ｇ４はセロテトラオース；及びＧ５はセロペンタオースを表す。パネルＡは、加水分解前の基質を示し、パネルＢはＥＧＹと一緒にインキュベートした後の基質を示し、パネルＣはＥＧＺと一緒にインキュベートした後の基質を示し、そしてパネルＤは、様々な時間（０、５、１０、及び２５）のインキュベーション後のセロペンタオースのＥＧＺ加水分解を示す。
【図１２】図１２は、Ｅ．クリサンセミによる非晶質セルロースの資化を示すモデルである。三種類のグルコシダーゼを、非晶質セルロースの異化に用いる。これらのうちの二つ、即ちＥＧＹ及びＥＧＺは、共に相乗的に働く細胞外エンドグルカナーゼである。ＥＧＹ は大型の基質分子を要し、これらをより短い不溶性のフラグメントに加水分解する。ＥＧＹ は可溶性のセロオリゴ糖（２乃至５グルコシル残基）を加水分解しない。ＥＧＺは可溶性のセロオリゴ糖 （セロペンタオース及びセロテトラオース）及び中間の長さの非晶質フラグメントを簡単に加水分解して、セロビオース及びセロトリオースを生成する。セロビオース及びセロトリオースは、ホスホエノールピルビン酸依存的ホスホトランスフェラーゼ系による細胞取り込みの際にリン酸化する。加水分解は、第三の酵素であるホスホ−β−グルコシダーゼにより細胞内で完了する。その結果生ずる単量体の生成物（グルコース及びグルコース−６−リン酸）は、解糖により代謝される。
【図１３】図１３は、ｃｅｌＹのためのプロモータ−プローブ・ベクタの構築の概略図である。Ｚ．モビリス染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ 断片をｐＬＯＩ２３１７のＢａｍＨＩ 部位に連結して、ｃｅｌＹコーディング領域（太線部分）のための強力なサロゲート・プロモータを作った。Ｚ．モビリスＤＮＡ断片（プロモータ１及びプロモータ２）を、白抜き部分として示す。レプリコン及び抗生物質耐性遺伝子を点彩した。他のベクタＤＮＡは、細い接続線で示す。矢印は転写の方向を表す。
【図１４】図１４は、ＤＨ５α（ｐＬＯＩ２３２３）における転写開始部位とｃｅｌＹプロモータの推定プロモータ領域を示す。ｃｅｌＹの転写開始はプライマー伸長解析により同定される。４個のプロモータ（それぞれ出現の順番に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ  １８〜２１）が同定された。Ｅ．コリの３５領域及び１０領域と類似するこれらのプロモータの上流配列を下線で示す。ＲＮＡ開始部位を太字で示す。推定プロモータの強い方から降順に開始部位の隣の括弧内に番号を付ける。強度の差は小さく、２倍以内である。
【図１５】図１５は、ｃｅｌＹ及びｃｅｌＺをエタノール生産性Ｋ．オキシトカＰ２の染色体に機能的に組み込むためのｐＬＯＩ２３５２の構築の概略図を示す。ｃｅｌＹ 及び ｃｅｌＺのコーディング領域を太線部分で示す。プロモータとして働くＺ．モビリスＤＮＡ断片（ｐｒｏｍ１及びｐｒｏｍ２）を白抜き部分で示す。レプリコン及び抗生物質耐性遺伝子を点彩した。他のベクタＤＮＡは、細い接続線で示す。各部分の上の矢印は転写の方向を表す。小さな白抜きの矢印は、ｆｌｐリコンビナーゼが認識するＦＲＴ部位を表す。ＦＲＴ配列は非対称であり、染色体組み込み後にプラスミドＤＮＡ（レプリコン及び選択マーカ）の欠失が可能なよう、配置されている。
【図１６】図１６は、二重相同組換えによりｃｅｌＺを不活化させるためのｐＬＯＩ２３５７の構築の概略図である。ｃｅｌＹ のコーディング領域を太線部分で示す。プロモータとして働くＺ．モビリスＤＮＡ断片（ｐｒｏｍ１）を、白抜き部分として示す。レプリコン及び抗生物質耐性遺伝子を点彩した。他のベクタＤＮＡは、細い接続線で示す。各部分の上の矢印は転写の方向を表す。小さな白抜きの矢印は、ｆｌｐリコンビナーゼが認識するＦＲＴ部位を表す。
【図１７】図１７は、セロビオシドの資化を示す、発酵ブロスの薄層クロマトグラムのデジタル画像を示す。左側パネル（Ａ）は、Ｅ．クリサンセミエンドグルカナーゼを欠く親株である株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）を表し、右側パネル（Ｂ）は、高レベルのＣｅｌＹ及びＣｅｌＺエンドグルカナーゼを分泌する組換え株である株ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）を表す。約４μＬのブロスを、各レーンにスポットし、Ｇ１乃至 Ｇ６というラベルは、隣のスポットのグルコシル残基の数を表す。両パネル（Ａ及びＢ）のレーンは、左から右に向かって、：１は当初（０時間目）；２は発酵から１０時間後；そして３は３６時間後、を表す。
【図１８】図１８は、Ｋ．オキシトカＭ５Ａ１のエタノール生産性類縁体による非晶質セルロースからのエタノール生産量のグラフを示す。 上側及び中央のパネル（Ａ及びＢ）に示した結果には、三回の重複測定から採った標準偏差が含まれる。下側のパネル（Ｃ）に示した結果は、一回の発酵を表す。上側のパネル（Ａ）は、 ６．８５ ｇ／Ｌ の非晶質セルロースの発酵結果を示し、中央のパネル（Ｂ）は、１５．３３ ｇ／Ｌ の非晶質セルロースの発酵結果を示し、下側のパネル（Ｃ）は、２８．９６ ｇ／Ｌの非晶質セルロースの発酵結果を示す。株Ｐ２（ｐＣＰＰ２００６）は、親株であり、Ｅ．クリサンセミエンドグルカナーゼ遺伝子はない。株ＳＺ６（ｐＣＰＰ２００６）はＣｅｌＺエンドグルカナーゼを分泌し、株ＳＺ２１（ｐＣＰＰ２００６）はＣｅｌＹ及びＣｅｌＺエンドグルカナーゼを分泌し、株ＳＺ２２（ｐＣＰＰ２００６）はＣｅｌＹエンドグルカナーゼを分泌する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2004501636000001.app
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2004501636.tif 000001
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2004501636.tif 000002