【手続補正書】
【提出日】平成19年6月6日(2007.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  同じか異なっていてもよい少なくとも2つの抗体
- 第一抗体つまり
- ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質での免疫捕捉によって予備選択されたポリクローナル抗体、及び
- ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質に対する高い親和性について予備選択され、次いで精製された抗-NS1モノクローナル抗体の混合物
からなる群から選択される抗体からなるNS1糖タンパク質を捕捉するための抗体、
- 第二抗体つまり
- ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するポリクローナル抗体、及び
- ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体の混合物
からなる群から選択される明示抗体
を用いる免疫学的方法により、感染の臨床段階期間にわたって生物試料におけるフラビウイルスのNS1非構造糖タンパク質を検出することからなることを特徴とする、フラビウイルス感染の早期検出方法。
【請求項２】  フラビウイルス感染が、デング熱ウイルス感染であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】  第一抗体が適当な固体支持体に付着し、第二抗体が適当な標識に任意に複合していることを特徴とする請求項１及び２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４】  第二抗体が標識に複合していない際に、固体支持体に付着したNS1タンパク質に対するその結合が、次いで、適当な標識に複合された第三抗体で検出されることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】  第三抗体が酵素に複合していることを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】  - 第一抗体、つまり捕捉抗体は、ヘキサマー形態であるデング熱ウイルスのNS1タンパク質での免疫捕捉によって選択されるマウスのポリクローナル抗体からなり、かつ
- 第二抗体、つまり分析される生物試料でNS1の存在を検出するための抗体は、ヘキサマー形態であるデング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質で免疫化したウサギ由来のポリクローナル抗体からなり、第二抗体の付着は、ペルオキシダーゼに複合し、第二抗体に対する抗体からなる第三抗体で明示されることを特徴とする請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】  - 請求項１〜６のいずれか１つに定義される少なくとも1つの捕捉抗体及び少なくとも1つの明示抗体、
- フラビウイルス及び/又はフラビウイルスに応じた種々の血清型のヘキサマー形態であるNS1タンパク質からなる少なくとも1つの陽性対照、及び
- 正常なヒト血清からなる少なくとも1つの陰性対照
からなることを特徴とする、フラビウイルス感染の早期診断のための箱入りのセット。
【請求項８】  前記少なくとも1つの捕捉抗体及び／又は前記少なくとも1つの明示抗体が、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項7に記載の箱入りセット。
【請求項９】  NS1タンパク質が、感染した哺乳動物細胞、或いはフラビウイルスのNS1タンパク質遺伝子又はNS1タンパク質の全体又は一部分を発現できる該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイルスゲノムのフラグメントを含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた哺乳動物細胞いずれかからの培養上清から得られることを特徴とする請求項8に記載の診断のための箱入りセット。
【請求項１０】  NS1タンパク質がデング熱ウイルスのタンパク質であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載のフラビウイルス感染の早期診断のための箱入りセット。
【請求項１１】  プラスミドが、1999年6月7日付けで番号I-2220でInstitut Pasteurによって開設されているCollection Nationale de Cultures et de Microorganismes [National collection of cultures and microorganisms]に寄託されたことを特徴とする請求項９及び１０のいずれかに記載のフラビウイルス感染の早期診断のための箱入りセット。
【請求項１２】  従来技術を用いるNS1タンパク質の精製前に、沈降剤での処理及び続く遠心分離によって、NS1タンパク質の可溶型を該タンパク質の微粒子形態から分離する工程からなることを特徴とする、感染した哺乳動物細胞、或いはNS1タンパク質遺伝子又はNS1タンパク質を発現し得る該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイルスゲノムのフラグメントを含む組換えプラスミドでトランスフェクトした哺乳動物細胞のいずれかの培養上清から、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を精製する方法。
【請求項１３】  有効成分として、任意に他のタンパク質と会合したヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤との組み合わせで含むことを特徴とする、免疫原性組成物。
【請求項１４】  種々のデング熱ウイルス血清型に相当するヘキサマー形態のNS1タンパク質の少なくとも1つの混合物からなることを特徴とする請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】  インビボで抗体の産生を誘発し得る免疫原性組成物を製造するためのヘキサマー形態のNS1タンパク質又はその発現系の使用。
【請求項１６】  受動免疫を誘発し得る医薬品を製造するための、分解していないヘキサマー形態のNS1タンパク質に対する高い親和性を有する、精製され修飾された少なくとも1つのモノクローナル抗-NS1抗体の使用。
【請求項１７】  早期段階でフラビウイルスの感染を診断できる特異的な抗-NS1抗体をインビトロで選択するための、分解されていないヘキサマー形態のNS1タンパク質の使用。
【請求項１８】  - あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質の全体又は一部分を発現し得るポリヌクレオチド、
- あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質をエンコードし、該タンパク質を発現するDNAをそれが注入される宿主において発現できるプロモーターを少なくとも1つ含む発現系
からなる群から選択される有効成分を少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤との組み合わせで含むことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項１９】  プロモーターと結合した配列SEQ ID No. 1で定義されるポリヌクレオチドを適当な真核細胞で発現させることからなることを特徴とする、デング熱ウイルスのNS1タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドの発現方法。
【請求項２０】  フラビウイルスがあらゆる血清型のデング熱ウイルスであることを特徴とする、請求項１２に記載のNS1タンパク質の精製方法。
【請求項２１】  フラビウイルスがデング熱ウイルス血清型1であることを特徴とする請求項１２及び２０に記載のNS1タンパク質の精製方法。
【請求項２２】  フラビウイルス感染のインビトロでの早期検出のための、分解されていないヘキサマー形態でのNS1タンパク質に対する高い親和性を有する、精製され修飾された少なくとも１つのモノクローナル抗NS1抗体の使用。
【請求項２３】  フラビウイルス感染の診断キットを製造するための、分解されていないヘキサマー形態でのNS1タンパク質に対する高い親和性を有する、精製され修飾された少なくとも１つのモノクローナル抗NS1抗体の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
この結果、発明者らは、当該分野の従来法より良好な実際的な必要性に対応する、フラビウイルス感染の早期検出方法、つまり信頼性があり、迅速かつ安価で、そのうちに医療保護に適用できる方法を提供することを目的とした。
したがって、この発明の対象は、同じか異なっていてもよい少なくとも2つの抗体
- 第一抗体つまり
- ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質の免疫捕捉によって予備選択されたポリクローナル抗体、及び
- ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質に対する高い親和性について予備選択された抗-NS1モノクローナル抗体混合物(モノクローナル抗体は次いで精製される)
からなる群から選択される抗体からなるNS1糖タンパク質を捕捉するための抗体、
- 第二抗体つまり
- ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するポリクローナル抗体、及び
- ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体混合物
からなる群から選択される明示抗体
を用いる免疫学的方法により、感染の臨床段階期間にわたって生物試料におけるフラビウイルスのNS1非構造糖タンパク質を検出することからなることを特徴とする、フラビウイルス感染の早期検出方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
この方法の別のより有利な具体例によれば、マウスのポリクローナル抗体は、デング熱血清型1のヘキサマーNS1タンパク質での免疫捕捉によって精製される。
また、この発明の対象は、
- 上記のような少なくとも1つの捕捉抗体及び少なくとも1つの明示抗体、
- フラビウイルス及び/又はフラビウイルスに応じた種々の血清型のNS1タンパク質(タンパク質はヘキサマー形態である)からなる少なくとも1つの陽性対照、及び
- 正常なヒト血清からなる少なくとも1つの陰性対照
からなることを特徴とする、フラビウイルス感染を診断するためのキット又は箱入りのセットである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
- デング熱ウイルス血清型1に特異的なマウス抗体の精製:
上記のようにして調製した4つのデング熱ウイルス血清型に対するポリクローナル腹水の混合物中で、膜を室温で1時間インキュベートする。
膜を3回PBSで洗浄後、NS1タンパク質に付着した抗体を、 ジエチルアミン溶液pH 11.4 (100 mMジエチルアミンを含有するIscove (Gibco)で改質したダルベッコ培地)で溶出する。抗体を限外ろ過で濃縮し、1 mMアジ化ナトリウムを含むPBS緩衝液に戻す。
b- NS1タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体(明示抗体)の調製:
ウサギは、D0、D7、D21及び任意にD49で、実施例1の方法にしたがって精製したヘキサマーNS1タンパク質30μgを3回又は4回連続的に注射して免疫化し、次いでD83で出血させた。文献に記載されるか、又は上記のように製造されるモノクローナル抗体を有するSepharoseビーズでのインキュベーションによって、血清から非特異的なシグナルを奪う。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
c- 捕捉-ELISA法
c1- 標準的な曲線
ヒト血清の試験用の各捕捉-ELISAプレートについて、標準的な範囲を、ポイント1に記載される方法にしたがって精製したNS1タンパク質の溶液から調製する。その初期濃度は0.5 μg/mlであり、それを3-倍連続希釈で希釈する。
C2- 急性段階中の循環しているNS1タンパク質の検出:
上記方法にしたがって得られる精製したマウスポリクローナル抗体(捕捉抗体)をプレートに付着させ、PBS溶液に希釈し、4℃で一晩インキュベートさせる。 PBS/0.05% Tween 溶液で5分3回洗浄した後、プレートを室温で30分PBS、0.05% Tween 及び3% ミルクの混合物で浸す。PBS/0.05% Tween溶液で3回洗浄後、試験され、希釈されるか又は希釈されない血清を置き、さらに室温で1時間反応させる。1/10、1/30及び1/90の希釈物を、PBS/0.05% Tween溶液中で調製する。3回洗浄した後、NS1に特異的な第二抗体(上記のポイント3で得られる明示抗体)を加え、PBS/0.05% Tweenと3%ミルクの混合物に希釈した後、45分37℃でインキュベートする。3回洗浄後、抗-IgG抗体を第二抗体に相対させ、ペルオキシダーゼで標識する。当業者に公知の従来条件下で調製したこの抗体を加え、45分37℃でインキュベーションを行う。3回洗浄後、TMB溶液(3,3', 5,5'-テトラメチルベンジジン、Kierkegaard & Perry Lab)を用いて10分暴露を行う。比色反応は、硫酸を用いて止める。