(57)【要約】本明細書において提供されるのは、新規の血清型（ＢｏＮＴ／Ｘ）のクロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド、およびＢｏＮＴポリペプチドを作製する方法、および、例えば治療的適用において、使用する方法である。
2019528042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、単離されたクロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項Ａ１に記載の単離されたＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離されたクロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の単離されたＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、単離されたクロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号３に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の単離されたＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１のＣ４６１、Ｃ４６７、またはＣ１２４０に対応する位置において１つ以上の置換変異を含む、改変クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項１１】
置換変異が、配列番号１におけるＣ４６１Ｓ、Ｃ４６１Ａ、Ｃ４６７Ｓ、Ｃ４６７Ａ、Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４１６Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、またはＣ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ａに対応する、請求項１０に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号４〜１７のいずれかに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を有さない、前記ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において単置換変異を含む、改変クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項１６】
置換変異が、配列番号２におけるＣ４６１Ｓ、Ｃ４６１Ａ、Ｃ４６７Ｓ、Ｃ４６７Ａ、Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４１６Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、またはＣ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ａに対応する、請求項１５に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１８〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１８〜２１のいずれかに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列を有さない、前記ポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１８〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１５に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号２２〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、キメラクロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号２２〜２４のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のキメラＢｏＮＴポリペプチドであって、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号２２〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項２０に記載のキメラＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において単置換変異をさらに含む、請求項２０に記載のキメラＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号２５〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のキメラＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号２５〜３０のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のキメラＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２５〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項２３に記載のキメラＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２７】
細胞に侵入する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２８】
細胞中のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する、請求項２７に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２９】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、Ｙｋｔ６、およびシンタキシン１からなる群より選択される、請求項２８に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３０】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ１である、請求項２９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３１】
ＢｏＮＴが、配列番号３９のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項２６に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３２】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ２である、請求項２９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３３】
ＢｏＮＴが、配列番号４０のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項３２に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３４】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ３である、請求項２９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３５】
ＢｏＮＴが、配列番号４１のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項３４に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３６】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ４である、請求項２９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３７】
ＢｏＮＴが、配列番号４２のＫ８７およびＳ８８に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項３６に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３８】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ５である、請求項２９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３９】
ＢｏＮＴが、配列番号４３のＲ４０およびＳ４１に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項３０に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４０】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、Ｙｋｔ６である、請求項２９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４１】
ＢｏＮＴが、配列番号４４のＫ１７３およびＳ１７４に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項４０に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４２】
その対応する野生型ＢｏＮＴポリペプチドと比較して増大した安定性を有する、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４３】
細胞が、分泌細胞である、請求項２７〜４２のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４４】
細胞が、神経細胞である、請求項４３に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４５】
細胞が、免疫細胞である、請求項４３に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４６】
神経活動を抑制する、請求項４５に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４７】
弛緩性麻痺を誘導する、請求項４６に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４８】
細胞が、培養細胞である、請求項２７〜４７のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項４９】
細胞が、in vivoのものである、請求項２７〜４７のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項５０】
細胞が、哺乳動物からのものである、請求項２７〜４９のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項５１】
哺乳動物が、ヒトである、請求項５０に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項５２】
哺乳動物が、げっ歯類である、請求項５０に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項５３】
げっ歯類が、マウスである、請求項５２に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項５４】
げっ歯類が、ラットである、請求項５２に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項５５】
ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧに対する抗体と交差反応しない、請求項１〜５４のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項５６】
請求項１〜５５のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチドに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項５７】
請求項５６に記載の核酸分子を含む、核酸ベクター。
【請求項５８】
請求項５６に記載の核酸分子または請求項Ａ５７に記載の核酸ベクターを含む、細胞。
【請求項５９】
請求項１〜５５のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチドを発現する、細胞。
【請求項６０】
請求項１〜５５のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチドを生成する方法であって、前記ＢｏＮＴポリペプチドが生成される条件下において請求項５９に記載の細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項６１】
ＢｏＮＴポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
以下：
（ａ）プロテアーゼドメイン；
（ｂ）改変リンカー領域；および
（ｃ）転位置ドメイン；
ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＢｏＮＴ血清型Ｘからのものであり、およびここで、改変リンカー領域が、配列番号１のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において１つの単置換変異を含む、
を含む、改変クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項６３】
（ｄ）受容体結合ドメインをさらに含む、請求項６２に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項６４】
改変リンカー領域が、配列番号１におけるＣ４６１ＳまたはＣ４６１Ａに対応する置換変異を含む、請求項６２または請求項６３に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項６５】
改変リンカー領域が、配列番号１におけるＣ４６７ＳまたはＣ４６７Ａに対応する置換変異を含む、請求項６２または請求項６３に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項６６】
受容体結合ドメインが、ＢｏＮＴ／Ｘからのものである、請求項６３に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項６７】
受容体結合ドメインが、改変されている、請求項６６に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項６８】
受容体結合ドメインが、配列番号１におけるＣ１２４０ＳまたはＣ１２４０Ａに対応する置換変異を含む、請求項６７に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項６９】
受容体結合ドメインが、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧからなる群より選択される血清型からのものである、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７０】
細胞に侵入する、請求項６２〜６９のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７１】
細胞中のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する、請求項７０に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７２】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、Ｙｋｔ６、およびシンタキシン１からなる群より選択される、請求項７１に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７３】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ１である、請求項７２に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７４】
ＢｏＮＴが、配列番号３９のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項７３に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７５】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ２である、請求項７２に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７６】
ＢｏＮＴが、配列番号４０のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項７３に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７７】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ３である、請求項７２に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７８】
ＢｏＮＴが、配列番号４１のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項７７に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項７９】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ４である、請求項７２に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８０】
ＢｏＮＴが、配列番号４２のＫ８７およびＳ８８に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項７９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８１】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ５である、請求項７２に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８２】
ＢｏＮＴが、配列番号４３のＲ４０およびＳ４１に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項８１に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８３】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、Ｙｋｔ６である、請求項７２に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８４】
ＢｏＮＴが、配列番号４４のＫ１７３およびＳ１７４に対応するアミノ酸残基の間を切断する、請求項８３に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８５】
その対応する野生型ＢｏＮＴポリペプチドと比較して増大した安定性を有する、請求項６２〜８４のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８６】
細胞が、分泌細胞である、請求項６２〜８５のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８７】
細胞が、神経細胞である、請求項８６に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８８】
細胞が、免疫細胞である、請求項８６に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項８９】
神経活動を抑制する、請求項８８に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９０】
弛緩性麻痺を誘導する、請求項８９に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９１】
細胞が、培養細胞である、請求項７０〜９０のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９２】
細胞がin vivoのものである、請求項７０〜９０のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９３】
細胞が、哺乳動物からのものである、請求項９１または請求項９２に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９４】
哺乳動物が、ヒトである、請求項９３に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９５】
哺乳動物が、げっ歯類である、請求項９３に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９６】
げっ歯類が、マウスである、請求項９５に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９７】
げっ歯類が、ラットである、請求項９５に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９８】
改変リンカー領域が、人工リンカーを含む、請求項６２〜９７のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項９９】
人工リンカーが、プロテアーゼの切断部位を含む、請求項９８に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１００】
プロテアーゼが、トロンビン、ＴＥＶ、PreScission（３Ｃプロテアーゼ）、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、およびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群より選択される、請求項９９に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド
【請求項１０１】
リンカーが、配列番号５０〜５６のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１００に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１０２】
請求項６２〜１０１のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＢｏＮＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の核酸分子を含む、核酸ベクター。
【請求項１０４】
請求項１０２に記載の核酸分子または請求項Ｂ４２に記載の核酸ベクターを含む、細胞。
【請求項１０５】
請求項６２〜１０１のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチドを発現する、細胞。
【請求項１０６】
改変ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを生成する方法であって、前記改変ＢｏＮＴポリペプチドが生成される条件下において、請求項１０５に記載の細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項１０７】
改変ＢｏＮＴポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
配列番号１におけるＲ３６０、Ｙ３６３、Ｈ２２７、Ｅ２２８、またはＨ２３１に対応する位置において、１つ以上の置換変異を含む、改変クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項１０９】
１つ以上の置換変異が、配列番号１におけるＲ３６０Ａ／Ｙ３６３Ｆ、Ｈ２２７Ｙ、Ｅ２２８Ｑ、またはＨ２３１Ｙに対応する、請求項１０８に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１１０】
配列番号３１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０９に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１１１】
配列番号３１〜３８のいずれかに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０８に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチドであって、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有さない、前記ポリペプチド。
【請求項１１２】
配列番号３１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１１０に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１１３】
以下：
（ａ）不活性なプロテアーゼドメイン；
（ｂ）リンカー領域；および
（ｃ）転位置ドメイン
を含む、改変クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン、血清型Ｘ（ＢｏＮＴ／Ｘ）ポリペプチド。
【請求項１１４】
受容体結合ドメインをさらに含む、請求項１１３に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド。
【請求項１１５】
不活性なプロテアーゼドメインが、配列番号１のＲ３６０、Ｙ３６３、Ｈ２２７、Ｅ２２８、またはＨ２３１に対応する位置において１つ以上の置換変異を含む、請求項１１３または１１４に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド。
【請求項１１６】
１つ以上の置換変異が、配列番号１のＲ３６０Ａ／Ｙ３６３Ｆ、Ｈ２２７Ｙ、Ｅ２２８Ｑ、またはＨ２３１Ｙに対応する、請求項１１５に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド。
【請求項１１７】
細胞に侵入する、請求項１０８〜１１６のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１１８】
ＳＮＡＲＥタンパク質を切断しない、請求項１１７に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド。
【請求項１１９】
（ｂ）のリンカー領域においてさらに改変を含む、請求項１０８〜１１８のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド。
【請求項１２０】
リンカー領域における改変が、配列番号１のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において１つの単置換変異を含む、請求項１１９に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド。
【請求項１２１】
単置換変異が、配列番号１におけるＣ４６１Ａ、Ｃ４６１Ｓ、Ｃ４６７Ａ、またはＣ４６７Ｓに対応する、請求項１２０に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド。
【請求項１２２】
（ｄ）の受容体結合ドメインにおいて改変をさらに含む、請求項１１４〜１２１のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド。
【請求項１２３】
受容体結合ドメインにおける改変が、配列番号１のＣ１２４０に対応する位置において置換変異を含む、請求項１２２に記載の改変ＢｏＮＴ／Ｘ。
【請求項１２４】
請求項１０８〜１２３のいずれか一項に記載の改変ポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＢｏＮＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項１２５】
請求項１２４に記載の核酸分子を含む、核酸ベクター。
【請求項１２６】
請求項Ｃ１７に記載の核酸分子または請求項１２５に記載の核酸ベクターを含む、細胞。
【請求項１２７】
請求項１０８〜１２３のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチドを発現する、細胞。
【請求項１２８】
改変ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを生成する方法であって、請求項１２７に記載の細胞を、前記改変ＢｏＮＴポリペプチドが生成される条件下において培養するステップを含む、前記方法。
【請求項１２９】
改変ＢｏＮＴポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
治療剤を神経細胞中に送達するための送達ビヒクルとしての使用のための、請求項１０８〜１２３のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項１３１】
第２の部分に連結された第１の部分を含むキメラ分子であって、ここで、第１の部分が、請求項１０８〜１２３のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチドである、前記キメラ分子。
【請求項１３２】
第１の部分と第２の部分とが共有結合により連結している、請求項１３１に記載のキメラ分子。
【請求項１３３】
第１の部分と第２の部分とが、非共有結合的に連結している、請求項１３１に記載のキメラ分子。
【請求項１３４】
第２の部分が、低分子、核酸、短いポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される、請求項１３１〜１３３のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【請求項１３５】
第２の部分が生理活性分子である、請求項１３４に記載のキメラ分子。
【請求項１３６】
第２の部分が、非ポリペプチド薬である、請求項１３４または１３５に記載のキメラ分子。
【請求項１３７】
第２の部分が、治療用ポリペプチドである、請求項１３４または１３５に記載のキメラ分子。
【請求項１３８】
請求項１３７に記載のキメラ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１３９】
請求項１３８に記載の核酸分子を含む、核酸ベクター。
【請求項１４０】
請求項１３８に記載の核酸分子または請求項１３９に記載の核酸ベクターを含む、細胞。
【請求項１４１】
請求項１４０に記載のキメラ分子を発現する、細胞。
【請求項１４２】
キメラ分子を生成する方法であって、請求項１４１に記載の細胞を、前記キメラ分子が生成される条件下において培養するステップを含む、前記方法。
【請求項１４３】
キメラ分子を培養物から回収することをさらに含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
請求項１〜５５、６２〜１０１または１０８〜１２３のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１４５】
請求項１３１〜１３７のいずれか一項に記載のキメラ分子を含む、医薬組成物。
【請求項１４６】
薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項１４４または１４５に記載の医薬組成物。
【請求項１４７】
請求項１４４〜１４６のいずれか一項に記載の医薬組成物、および医薬組成物の治療的投与のための指示を含む、キット。
【請求項１４８】
状態を処置する方法であって、請求項１〜５５、６２〜１０１または１０８〜１２３のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド、請求項１３１〜１３７のいずれか一項に記載のキメラ分子、または請求項１４４〜１４６のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を、状態を処置するために対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４９】
状態が、過活動の神経細胞または腺に関連する、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
状態が、痙攣性発声障害、痙性斜頚（spasmodic torticollis）、喉頭ジストニア、顎口腔性発声障害、舌ジストニア、痙性斜頚（cervical dystonia）、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、限局性痙攣および他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙攣、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害、および他の筋緊張障害、および筋群の不随意運動により特徴づけられる他の障害、流涙、多汗症（hyperhydrosis）、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸管分泌、分泌障害、筋痙攣からの疼痛、頭痛、および皮膚科学的または審美的／美容的状態、肥満／食欲低下からなる群より選択される、請求項１４８または請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
状態が、望ましくない神経活動に関連しない、請求項１５０１に記載の方法。
【請求項１５２】
状態が、乾癬、アレルギー、血球貪食性リンパ組織球症、およびアルコール性膵疾患からなる群より選択される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
投与が、望ましくない神経活動が存在する場所への注射を介するものである、請求項Ｆ１〜Ｆ５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
望ましくない神経活動に関連する状態を処置することにおける使用のための、請求項１〜５５、６２〜１０１、１０８〜１２３のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド、または請求項１３１〜１３７のいずれか一項に記載のキメラ分子、または請求項１４４〜１４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５５】
医薬における使用のための、１〜５５、６２〜１０１、１０８〜１２３のいずれか一項に記載の改変ＢｏＮＴポリペプチド、または請求項１３１〜１３７のいずれか一項に記載のキメラ分子、または請求項１４４〜１４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５６】
クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを生成する方法であって、以下：
（ｉ）軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＮ）のＮ末端ドメインを含む第１のＢｏＮＴフラグメントを得ること、ここで、第１のＢｏＮＴフラグメントは、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＧ（配列番号６０）モチーフを含む；
（ｉｉ）重鎖（ＨＣ）のＣ末端ドメインを含む第２のＢｏＮＴフラグメントを得ること、ここで、第２のＢｏＮＴフラグメントは、そのＮ末端において、特異的なプロテアーゼ切断部位を含む；
（ｉｉｉ）第２のＢｏＮＴフラグメントを、特異的プロテアーゼにより切断すること、ここで、切断は、Ｎ末端において遊離のグリシン残基をもたらす；ならびに
（ｉｖ）第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとを、トランスペプチダーゼの存在下において接触させ、それにより、第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとをライゲーションして、ライゲーションされたＢｏＮＴを形成させること、
を含む、前記方法。
【請求項１５７】
第１のＢｏＮＴフラグメントが、アフィニティータグをさらに含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
アフィニティータグが、Ｎ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
アフィニティータグが、Ｃ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
アフィニティータグが、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Softag 1、Softag 3、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Xpress、Ｈａｌｏ、およびＦｃからなる群より選択される、請求項１５６〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
第２のＢｏＮＴフラグメントが、アフィニティータグをさらに含む、請求項１５６〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
アフィニティータグが、Ｎ末端において第２のＢｏＮＴフラグメントに融合している、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
アフィニティータグが、Ｃ末端において第２のＢｏＮＴフラグメントに融合している、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
アフィニティータグが、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Softag 1、Softag 3、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Xpress、Ｈａｌｏ、およびＦｃからなる群より選択される、請求項１６１〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
プロテアーゼが、トロンビン、ＴＥＶ、PreScission（３Ｃプロテアーゼ）、エンテロキナーゼ、およびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群より選択される、請求項１６１〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
コグネイトなプロテアーゼがトロンビンである、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
第１のＢｏＮＴフラグメントが、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＸからのものである、請求項１５６〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
第１のＢｏＮＴフラグメントが、ＢｏＮＴ／Ｘからのものである、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
第２のＢｏＮＴフラグメントが、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＸからのものである、請求項１５６〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
第２のＢｏＮＴフラグメントが、ＢｏＮＴ／Ａからのものである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
第２のＢｏＮＴフラグメントが、ＢｏＮＴ／Ｂからのものである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７２】
第２のＢｏＮＴフラグメントが、ＢｏＮＴ／Ｃからのものである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７３】
第２のＢｏＮＴフラグメントが、ＢｏＮＴ／Ｘからのものである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７４】
トランスペプチダーゼが、ソルターゼである、請求項１５６〜１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
ソルターゼが、黄色ブドウ球菌からのもの（ＳｒｔＡ）である、請求項１７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１６年７月８日に出願された米国仮出願第62/360,239号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における利益を主張し、該仮出願は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により付与されたR01NS080833下において、政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）は、最も危険な潜在的なバイオテロ剤の一つであり、また、臨床的に、増加しつつあるリストの医学的状態を処置するためにも用いられる。
ＢｏＮＴの７つの血清型（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ）が今日までに知られている。近年において、ＢｏＮＴは、増加しつつあるリストの医学的状態を処置するために広く用いられてきた：微量のトキシンの局所注射により、標的領域における神経活動を減弱することができ、これは、多くの医学的状態において、ならびに美容目的のためにも、有益であり得る。ＢｏＮＴの用途が増加するにつれて、限定要因および有害効果が報告されてきている。主要な限定要因は、患者における中和抗体の産生であり、これは将来の処置を無効にする。ＢｏＮＴの使用を停止すると、しばしば、患者にとって、その疾患を処置／軽減する他の有効な方法が残らない。ＢｏＮＴの使用に関連する有害効果は、眼瞼下垂および複視などの一過性の重篤でない事象から、生命を脅かす事象、死にまで至る。ＢｏＮＴの限定要因および有害効果は、用量に大きく相関する。治療用トキシンとして新規のＢｏＮＴの型を開発することについての多大な関心が存在する。新たなＢｏＮＴの型は、過去４５年間にわたり認識されていない。
【発明の概要】
【０００４】
要旨
本開示は、少なくとも部分的に、Clostridium Botulinum菌株のゲノムデータベースを検索することから、新規のＢｏＮＴ血清型であるＢｏＮＴ／Ｘの同定に基づく。ＢｏＮＴ／Ｘは、他のＢｏＮＴと最も低い配列同一性を有し、既知のＢｏＮＴ型に対して産生された抗血清により認識されない。ＢｏＮＴ／Ｘは、他のＢｏＮＴのようにＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。しかし、ＢｏＮＴ／Ｘはまた、他のＢｏＮＴが切断できないいくつかのＳＮＡＲＥタンパク質、例えばＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、およびＹｋｔ６をも切断する。ＢｏＮＴ／Ｘを用いて疾患を処置する組成物および方法が提供される。また本明細書において提供されるのは、ＢｏＮＴ／Ｘを作製する方法である。
【０００５】
したがって、本開示のいくつかの側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、単離されたクロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを提供する。
本開示のいくつかの側面は、配列番号１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＢｏＮＴポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【０００６】
本開示のいくつかの側面は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離されたＢｏＮＴポリペプチドを提供する。本開示のいくつかの側面は、配列番号２に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＢｏＮＴポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【０００７】
本開示のいくつかの側面は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、単離されたＢｏＮＴポリペプチドを提供する。本開示のいくつかの側面は、配列番号３に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＢｏＮＴポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【０００８】
本開示のいくつかの側面は、配列番号１のＣ４６１、Ｃ４６７、およびＣ１２４０に対応する位置において１つ以上の置換変異を含む、改変ＢｏＮＴポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、置換変異は、配列番号１におけるＣ４６１Ｓ、Ｃ４６１Ａ、Ｃ４６７Ｓ、Ｃ４６７Ａ、Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４１６Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、またはＣ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ａに対応する。
【０００９】
いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれかに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有さない。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００１０】
本開示のいくつかの側面は、配列番号２のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において単置換変異を含む、改変ＢｏＮＴポリペプチドを提供する。
いくつかの態様において、置換変異は、配列番号２におけるＣ４６１Ｓ、Ｃ４６１Ａ、Ｃ４６７Ｓ、Ｃ４６７Ａ、Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４１６Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、またはＣ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ａに対応する。
【００１１】
いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号１８〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号１８〜２１のいずれかに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有しない。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号１８〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００１２】
本開示のいくつかの側面は、配列番号２２〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、キメラＢｏＮＴポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２２〜２４のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有さない。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２２〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００１３】
いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２におけるＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において、単置換変異をさらに含む。
いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２５〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２５〜３０のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２５〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００１４】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、細胞に侵入する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、細胞中のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、Ｙｋｔ６、およびシンタキシン１からなる群より選択される。
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ１である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号３９のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ２である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４０のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
【００１５】
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ３である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４１のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ４である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４２のＫ８７およびＳ８８に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ５である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４３のＲ４０およびＳ４１に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
【００１６】
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、Ｙｋｔ６である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４４のＫ１７３およびＳ１７４に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、その対応する野生型ＢｏＮＴポリペプチドと比較して増大した安定性を有する。
【００１７】
いくつかの態様において、細胞は、分泌細胞である。いくつかの態様において、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、神経活動を抑制する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、弛緩性麻痺を誘導する。いくつかの態様において、細胞は、培養細胞である。いくつかの態様において、細胞は、in vivoのものである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物からのものである。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、げっ歯類である。いくつかの態様において、げっ歯類は、マウスである。いくつかの態様において、げっ歯類は、ラットである。
いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧに対する抗体と交差反応しない。
【００１８】
本開示の他の側面は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子を提供する。かかる核酸分子を含む核酸ベクターが提供される。本明細書において記載される核酸分子または核酸ベクターを含む細胞が提供される。いくつかの態様において、かかる細胞は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドを発現する。
【００１９】
本開示のＢｏＮＴポリペプチドを生成する方法が提供される。かかる方法は、ＢｏＮＴポリペプチドを発現する細胞を、前記ＢｏＮＴポリペプチドが生成される条件下において培養するステップを含む。いくつかの態様において、方法は、ＢｏＮＴポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む。
【００２０】
本開示の他の側面は、（ａ）プロテアーゼドメイン；（ｂ）改変リンカー領域；および（ｃ）転位置ドメインを含む改変ＢｏＮＴポリペプチドを提供し、ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＢｏＮＴ血清型Ｘからのものであり、およびここで、改変リンカー領域は、配列番号１のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において１つの単置換変異を含む。
いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、（ｄ）受容体結合ドメインをさらに含む。
【００２１】
いくつかの態様において、改変リンカー領域は、配列番号１におけるＣ４６１ＳまたはＣ４６１Ａに対応する置換変異を含む。いくつかの態様において、改変リンカー領域は、配列番号１におけるＣ４６７ＳまたはＣ４６７Ａに対応する置換変異を含む。
いくつかの態様において、受容体結合ドメインは、ＢｏＮＴ／Ｘからのものである。いくつかの態様において、受容体結合ドメインは、改変されている。いくつかの態様において、受容体結合ドメインは、配列番号１におけるＣ１２４０ＳまたはＣ１２４０Ａに対応する置換変異を含む。
いくつかの態様において、受容体結合ドメインは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧからなる群より選択される血清型からのものである。
【００２２】
いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、細胞に侵入する。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、細胞中のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、Ｙｋｔ６、およびシンタキシン１からなる群より選択される。
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ１である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号３９のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ２である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４０のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
【００２３】
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ３である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４１のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ４である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４２のＫ８７およびＳ８８に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ５である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４３のＲ４０およびＳ４１に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
【００２４】
いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、Ｙｋｔ６である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴは、配列番号４４のＫ１７３およびＳ１７４に対応するアミノ酸残基の間を切断する。
いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、その対応する野生型ＢｏＮＴポリペプチドと比較して増大した安定性を有する。
【００２５】
いくつかの態様において、細胞は、分泌細胞である。いくつかの態様において、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、神経活動を抑制する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、弛緩性麻痺を誘導する。いくつかの態様において、細胞は、培養細胞である。いくつかの態様において、細胞は、in vivoのものである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物からのものである。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、げっ歯類である。いくつかの態様において、げっ歯類は、マウスである。いくつかの態様において、げっ歯類は、ラットである。
【００２６】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧに対する抗体と交差反応しない。
いくつかの態様において、改変リンカー領域は、人工リンカーを含む。いくつかの態様において、人工リンカーは、プロテアーゼの切断部位を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼは、トロンビン、ＴＥＶ、PreScission（３Ｃプロテアーゼ）、第Ｘａ因子、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、グランザイム−Ｂ、およびエンテロキナーゼからなる群より選択される。いくつかの態様において、リンカーは、配列番号５０〜６０のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本開示の他の側面は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子を提供する。かかる核酸分子を含む核酸ベクターが提供される。本明細書において記載される核酸分子または核酸ベクターを含む細胞が提供される。いくつかの態様において、かかる細胞は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドを発現する。
【００２８】
本開示のＢｏＮＴポリペプチドを生成する方法が提供される。かかる方法は、ＢｏＮＴポリペプチドを発現する細胞を、前記ＢｏＮＴポリペプチドが生成される条件下において培養するステップを含む。いくつかの態様において、方法は、ＢｏＮＴポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む。
【００２９】
本開示の他の側面は、配列番号１におけるＲ３６０、Ｙ３６３、Ｈ２２７、Ｅ２２８、またはＨ２３１に対応する位置において１つ以上の置換変異を含む、改変ＢｏＮＴポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、１つ以上の置換変異は、配列番号１におけるＲ３６０Ａ／Ｙ３６３Ｆ、Ｈ２２７Ｙ、Ｅ２２８Ｑ、またはＨ２３１Ｙに対応する。
【００３０】
いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３１〜３８のいずれかに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有さない。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００３１】
本開示の他の側面は、以下：ａ）不活性なプロテアーゼドメイン；ｂ）リンカー領域；およびｃ）転位置ドメイン、を含む、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘは、受容体結合ドメインをさらに含む。
いくつかの態様において、不活性なプロテアーゼドメインは、配列番号１のＲ３６０、Ｙ３６３、Ｈ２２７、Ｅ２２８、またはＨ２３１に対応する位置において、１つ以上の置換変異を含む。いくつかの態様において、１つ以上の置換変異は、配列番号１のＲ３６０Ａ／Ｙ３６３Ｆ、Ｈ２２７Ｙ、Ｅ２２８Ｑ、またはＨ２３１Ｙに対応する。
【００３２】
いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、細胞に侵入する。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴポリペプチドは、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断しない。
いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、（ｂ）のリンカー領域における改変をさらに含む。いくつかの態様において、リンカー領域における改変は、配列番号１のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において１つの単置換変異を含む。いくつかの態様において、単置換変異は、配列番号１におけるＣ４６１Ａ、Ｃ４６１Ｓ、Ｃ４６７Ａ、またはＣ４６７Ｓに対応する。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、（ｄ）の受容体結合ドメインにおける改変をさらに含む。
いくつかの態様において、受容体結合ドメインにおける改変は、配列番号１のＣ１２４０に対応する位置において置換変異を含む。
【００３３】
本開示の他の側面は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子を提供する。かかる核酸分子を含む核酸ベクターが提供される。本明細書において記載される核酸分子または核酸ベクターを含む細胞が提供される。いくつかの態様において、かかる細胞は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドを発現する。
【００３４】
本開示のＢｏＮＴポリペプチドを生成する方法が提供される。かかる方法は、ＢｏＮＴポリペプチドを発現する細胞を、前記ＢｏＮＴポリペプチドが生成される条件下において培養するステップを含む。いくつかの態様において、方法は、ＢｏＮＴポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む。
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書において記載される改変ＢｏＮＴポリペプチドの、治療剤を神経細胞中に送達するための送達ビヒクルとしての使用である。
【００３５】
本開示のいくつかの側面は、第２の部分に連結した第１の部分を含むキメラ分子を提供し、ここで、第１の部分は、本明細書において記載される改変ＢｏＮＴポリペプチドである。
いくつかの態様において、第１の部分と第２の部分とは、共有結合により連結している。いくつかの態様において、第１の部分と第２の部分とは、非共有結合的に連結している。
いくつかの態様において、第２の部分は、低分子、核酸、短いポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される。いくつかの態様において、第２の部分は、生理活性分子である。いくつかの態様において、第２の部分は、非ポリペプチド薬である。いくつかの態様において、第２の部分は、治療用ポリペプチドである。
【００３６】
本開示の他の側面は、本明細書において記載されるキメラＢｏＮＴポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子を提供する。かかる核酸分子を含む核酸ベクターが提供される。本明細書において記載される核酸分子または核酸ベクターを含む細胞が提供される。いくつかの態様において、かかる細胞は、本明細書において記載されるキメラＢｏＮＴポリペプチドを発現する。
【００３７】
本開示のキメラＢｏＮＴポリペプチドを生成する方法が提供される。かかる方法は、キメラＢｏＮＴポリペプチドを発現する細胞を、前記キメラＢｏＮＴポリペプチドが生成される条件下において培養するステップを含む。いくつかの態様において、方法は、キメラＢｏＮＴポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む。
本開示の他の側面は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの態様において、医薬組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。
【００３８】
かかる医薬組成物、および医薬組成物の治療的投与のための指示を含むキットもまた提供される。
本開示のいくつかの側面は、状態を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチド、キメラ分子、または医薬組成物の治療有効量を、状態を処置するために対象に投与することを含む。
【００３９】
いくつかの態様において、状態は、過活動の神経細胞または腺と関連する。いくつかの態様において、状態は、痙攣性発声障害、痙性斜頚（spasmodic torticollis）、喉頭ジストニア、顎口腔性発声障害、舌ジストニア、痙性斜頚（cervical dystonia）、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、限局性痙攣および他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス（anismus）、四肢痙攣、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害、および他の筋緊張障害、および筋群の不随意運動により特徴づけられる他の障害、流涙、多汗症（hyperhydrosis）、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸管分泌、分泌障害、筋痙攣からの疼痛、頭痛、皮膚科学的または審美的／美容的状態、および肥満／食欲低下からなる群より選択される。
【００４０】
いくつかの態様において、状態は、望ましくない神経活動に関連しない。いくつかの態様において、状態は、乾癬、アレルギー、血球貪食性リンパ組織球症、およびアルコール性膵疾患からなる群より選択される。
いくつかの態様において、投与することは、望ましくない神経活動が存在する場所への注射を介するものである。
【００４１】
本開示のさらに他の側面は、クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを生成する方法を提供し、該方法は、以下：
（ｉ）軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＮ）のＮ末端ドメインを含む第１のＢｏＮＴフラグメントを得ること、ここで、第１のＢｏＮＴフラグメントは、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＧ（配列番号６０）モチーフを含む；
（ｉｉ）重鎖（ＨＣ）のＣ末端ドメインを含む第２のＢｏＮＴフラグメントを得ること、ここで、第２のＢｏＮＴフラグメントは、そのＮ末端において、特異的なプロテアーゼ切断部位を含む；
（ｉｉｉ）第２のＢｏＮＴフラグメントを、特異的プロテアーゼにより切断すること、ここで、切断は、Ｎ末端において遊離のグリシン残基をもたらす；ならびに
（ｉｖ）第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとを、トランスペプチダーゼの存在下において接触させ、それにより、第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとをライゲーションして、ライゲーションされたＢｏＮＴを形成させること；
を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、第１のＢｏＮＴフラグメントは、アフィニティータグをさらに含む。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｎ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｃ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Softag 1、Softag 3、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Xpress、Ｈａｌｏ、およびＦｃからなる群より選択される。
【００４３】
いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、アフィニティータグをさらに含む。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｎ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｃ末端において第２のＢｏＮＴフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Softag 1、Softag 3、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Xpress、Ｈａｌｏ、およびＦｃからなる群より選択される。
【００４４】
いくつかの態様において、プロテアーゼは、以下からなる群より選択される：トロンビン、ＴＥＶ、PreScission、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、グランザイム−Ｂ、エンテロキナーゼ、およびＳＵＭＯプロテアーゼ。いくつかの態様において、コグネイトな（cognate）プロテアーゼは、トロンビンである。
いくつかの態様において、第１のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＸからのものである。いくつかの態様において、第１のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ／Ｘからのものである。いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＸからのものである。いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ／Ａからのものである。いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ／Ｂからのものである。いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ／Ｃからのものである。いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ／Ｘからのものである。
【００４５】
いくつかの態様において、トランスペプチダーゼは、ソルターゼである。いくつかの態様において、ソルターゼは、黄色ブドウ球菌からのもの（ＳｒｔＡ）である。
本開示のこれらのおよび他の側面、ならびに多様な利点および用途は、発明の詳細な説明を参照することにより明らかとなるであろう。本開示の各々の側面が多様な態様を包含し得ることは、理解されるであろうとおりである。
本願において同定される全ての文書は、それらの全体において本明細書において参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに示すために含められ、これらの側面は、これらの図面の１つ以上を、本明細書において提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせて参照することにより、よく理解することができる。特許または出願の書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面による本特許または特許出願の公開は、要請および必要な手数料の支払いの後で、特許庁により提供されるであろう。
【００４７】
【図１Ａ−Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、新たなＢｏＮＴとしてのＢｏＮＴ／Ｘの同定を示す。図１Ａは、ClustalW法により分析されたＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｆ５、ＴｅＮＴ、およびＢｏＮＴ／Ｘについてのタンパク質配列アラインメントの系統樹を示す。各々のトキシンとＢｏＮＴ／Ｘとの間の配列同一性のパーセンテージは、各々のトキシンの後に表す。ＢｏＮＴ／ＥとＢｏＮＴ／Ｆとの間、およびＢｏＮＴ／ＢとＢｏＮＴ／Ｇとの間の配列同一性のパーセンテージもまた示した。図１Ｂの上のパネルは、ＢｏＮＴ／Ｘの３つのドメインの模式図を、示されたＨＣにおけるＬＣおよびガングリオシド結合モチーフにおける保存されたプロテアーゼモチーフと共に示す。図１Ｂの下のパネルは、ＢｏＮＴ／Ｘが、全ての他の７つのＢｏＮＴおよびＴｅＮＴに対して、その配列に沿って均等に分配された低い類似性を有することを示すスライディング配列比較ウィンドウを示す。図１Ｃは、ＢｏＮＴ／Ｘ遺伝子（上のパネル）を含むｏｒｆ遺伝子クラスターの模式図であり、これは、ｏｒｆＸクラスターの２つの既知のバリアントと比較して２つのユニークな特徴を有する（中央および下のパネル）：（１）ＢｏＮＴ／Ｘ遺伝子の次に位置するさらなるｏｒｆＸ２タンパク質（ｏｒｆＸ２ｂと称される）が存在する；（２）ｏｒｆＸ遺伝子の読み枠は、ＢｏＮＴ／Ｘ遺伝子と同じ方向を有する。
【図１Ｄ−Ｅ】図１Ｄは、ＢｏＮＴ／Ｘにおいて見出されたユニークな遺伝子方向性、およびさらなるＯｒｆＸ２遺伝子を説明する模式図である。図１Ｅは、ＢｏＮＴ／Ｘ軽鎖の予備的構造を示す。暗色のドットは、活性部位の亜鉛を表す。構造は、１．９Åの解像度において示す。
【００４８】
【図２Ａ−Ｅ】図２Ａ〜２Ｊは、ＢｏＮＴ／ＸのＬＣ（Ｘ−ＬＣ）が、ユニークな部位においてＶＡＭＰを切断することを示す。図２Ａは、ラット脳界面活性剤抽出物（ＢＤＥ）と共にインキュベートした、ＥＤＴＡで予め処置された、または処置されていないＸ−ＬＣを示す。シンタキシン１、ＳＮＡＰ−２５、およびＶＡＭＰ２を検出するためにイムノブロット分析を行った。また、シナプトフィジン（Ｓｙｐ）を、ローディング対照として検出した。ＢｏＮＴ／ＡのＬＣ（Ａ−ＬＣ）およびＢｏＮＴ／ＢのＬＣ（Ｂ−ＬＣ）を、並行して分析した。Ｂ−ＬＣによるＶＡＭＰ２の切断は、イムノブロットシグナルの喪失をもたらすが、一方、Ａ−ＬＣによるＳＮＡＰ−２５の切断は、ＳＮＡＰ−２５のより小さなフラグメントを生じ、これは、イムノブロットにおいてなお検出することができる（アスタリスクによりマークしたもの）。Ｘ−ＬＣとのインキュベーションは、ＶＡＭＰ２のイムノブロットシグナルの喪失をもたらし、このことは、Ｘ−ＬＣがＶＡＭＰ２を切断することを示唆している。ＥＤＴＡは、Ｘ−ＬＣ、Ａ−ＬＣおよびＢ−ＬＣの活性を遮断した。図２Ｂは、Ｈｉｓ６タグ付き組み換えタンパク質として精製され、Ｘ−ＬＣと共にインキュベートされたＶＡＭＰ２（残基１−９６）を示す。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析した。Ｘ−ＬＣは、ＶＡＭＰ２（１−９６）を２つのより小さなフラグメントに変換し、このことは、Ｘ−ＬＣがＶＡＭＰ２を切断することを示している。図２Ｃ〜２Ｅは、Ｘ−ＬＣと共にインキュベートしたＶＡＭＰ２（１−９６）を示す。次いで、全タンパク質試料を、次いで、質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により分析して、切断されたフラグメントの正確な分子量を決定する。ＨＰＬＣカラムから溶離したペプチドのピークを、図２Ｃにおいて、実行時間（ＲＴ、Ｘ軸）に対してプロットした。２つの切断生成物についての質量分析データを、それぞれ図２Ｄおよび２Ｅにおいて示し、各々のシグナルについての質量対電荷比（ｍ／ｚ）を記述した。分子量は、ｍにｚを掛け、その後、ｚを減算することにより差し引いた。２つの切断生成物についてのタンパク質配列は、上から下へ配列番号６１および６２に対応し、図２Ｃにおいて示す。
【図２Ｆ−Ｊ】図２Ｆは、ＶＡＭＰ１、２、３、４、５、７、８、Ｓｅｃ２２ｂおよびＹｋｔ６の間の配列アラインメントを示し、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＸのための切断部位に下線を付し、２つのＳＮＡＲＥモチーフを箱で囲んだ。配列は、上から下へ、配列番号６３〜７１に対応する。図２Ｇは、ＨＥＫ２９３細胞において一過性導入を介して発現したＨＡタグ付きＶＡＭＰ１、３、７および８、ならびにｍｙｃタグ付きＳｅｃ２２ｂおよびＹｋｔ６を示す。細胞ライセートを、Ｘ−ＬＣと共にインキュベートし、ＨＡまたはＭｙｃタグを検出するイムノブロット分析に供した。アクチンは、ローディング対照として用いられた。Ｘ−ＬＣは、ＶＡＭＰ１、３およびＹｋｔ６を切断したが、ＶＡＭＰ７、８およびＳｅｃ２２は切断しなかった。図２Ｈは、Ｘ−ＬＣ（１００ｎＭ）と共に示された時間にわたりインキュベートされた、ＧＳＴタグ付きＹｋｔ６を示す。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析した。Ｘ−ＬＣは、Ｙｋｔ６を切断した。図２Ｉは、Ｘ−ＬＣと共に示された時間にわたりインキュベートされた、ＶＡＭＰ２（３３−８６）、ＶＡＭＰ４（１−１１５）、およびＶＡＭＰ５（１−７０）のＧＳＴタグ付き細胞質ドメインを示す。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析した。Ｘ−ＬＣは、ＶＡＭＰ４およびＶＡＭＰ５の両方を切断した。ＶＡＭＰ５の大部分を切断するために、より長いインキュベーション時間（３６０分間）が必要とされる。ＶＡＭＰ５タンパク質が、さらなるバンドを含むことに注意する。これは、分解生成物または細菌のタンパク質混入物のいずれかであり、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧにおいて、切断生成物の近くに流れる（が同一ではない）。図２Ｊは、ＶＡＭＰ４およびＳｅｃ２２ｂが検出されたことを除き、図２Ａにおいて記載されるとおりに行われた実験を示す。ローディング対照として、シナプトタグミンＩ（ＳｙｔＩ）を検出した。Ｘ−ＬＣは、ＢＤＥにおいて、ネイティブのＶＡＭＰ４を切断した。
【００４９】
【図３Ａ−Ｅ】図３Ａ〜３Ｅは、ＬＣとＨＮとの間のリンカー領域のタンパク質分解による切断による、ＢｏＮＴ／Ｘの活性化を示す。図３Ａは、７つのＢｏＮＴおよびＢｏＮＴ／ＸのＬＣとＨＮとの間のリンカー領域の配列アラインメントを示す。配列は、上から下へ、配列番号７２〜７９に対応する。ＢｏＮＴ／Ｘは、全てのＢｏＮＴの中で最長のリンカー領域を有し、これは、ＬＣにおける、およびＨＮにおける、２つの保存されたシステインに加えて、１つの余分のシステインを含む。限定されたタンパク質分解下におけるＬｙｓ−Ｃ切断部位を、質量分析アプローチにより同定した。図３Ｂは、示される濃度のＸ−ＬＣ−ＨＮに１２時間にわたり培地中で暴露された、培養ラット皮質神経細胞を示す。細胞ライセートを収集して、イムノブロット分析を行い、神経細胞におけるシンタキシン１、ＳＮＡＰ−２５、およびＶＡＭＰ２を試験した。アクチンを、ローディング対照として用いた。トリプシンにより活性化されたＢｏＮＴ／ＡのＬＣ−ＨＮ（Ａ−ＬＣ−ＨＮ）およびＢｏＮＴ／ＢのＬＣ−ＨＮ（Ｂ−ＬＣ−ＨＮ）を、並行して対照として分析した。ＶＡＭＰ２イムノブロットシグナルの喪失により証明されるとおり、Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、神経細胞に侵入し、ＶＡＭＰ２を切断した。Ｌｙｓ−Ｃにより活性化されたＸ−ＬＣ−ＨＮは、活性化されていないＸ−ＬＣ−ＨＮよりも劇的に増大した効力を示した。Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、トリプシンにより活性化されたＢ−ＬＣ−ＨＮおよびＡ−ＬＣ−ＨＮよりも強力であり、これらは、神経細胞において、同じアッセイ濃度下において、それらのＳＮＡＲＥ基質のいかなる検出可能な切断も示さなかった。図３Ｃは、示されたシステインが変異しているＸ−ＬＣ−ＨＮ変異体、ならびにＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮを、限定されたタンパク質分解により活性化して、ＤＴＴを用いてまたはこれを用いずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析したものを示す。Ｃ４２３Ｓ変異は、ＤＴＴを用いても用いなくとも、２つの５０ｋＤａのフラグメントを生じた。Ｃ４６１ＳまたはＣ４６７Ｓを含む変異体は、ＤＴＴの不在化において１００ｋＤａにおいて単一のバンドを示し、それは、ＤＴＴの存在下において２つの約５０ｋＤａのバンドに分離した。このことは、ＨＮにおけるＣ４６１およびＣ４６７はいずれも、ＬＣにおけるＣ４２３と鎖間ジスルフィド結合を形成し得ることを示している。ＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮの一部は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの最上部において凝集塊を形成した。これらの凝集塊は、ＤＴＴの存在下において消失したので、分子間ジスルフィド結合の形成に起因する。３つのシステインのうちのいずれか１つを変異させることにより、凝集塊は消失し、このことは、分子間ジスルフィド結合の形成が、リンカー領域における１つの余分のシステインの存在に起因することを示している。活性化されたＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮの大部分もまた、ＤＴＴなしで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で２つの約５０ｋＤａのバンドに分離した。このことは、図３Ｄにおいて記載されるジスルフィド結合のシャッフル（shuffling）に起因する。図３Ｄは、ＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮを限定されたタンパク質分解により活性化し、その後、示される濃度のＮＥＭと共にプレ���ンキュベーションして、ジスルフィド結合のシャッフルを遮断したものを示す。試料を、次いで、ＤＴＴの存在下または不在下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析した。ＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮの大部分は、ＤＴＴなしで、ＮＥＭ処置の後で、１００ｋＤａにおいて単一のバンドとして存在し、このことは、ＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮが主に鎖間ジスルフィド結合を含むことを示している。図３Ｅは、神経細胞をＷＴまたは示されるＸ−ＬＣ−ＨＮ変異体のいずれかに暴露したことを除き、図３Ｂにおいて記載されるとおりに行われた実験を示す。ＬＣ（Ｃ４２３）上のシステインを変異させることによりＸ−ＬＣ−ＨＮの活性が消失する一方、ＨＮ（Ｃ４６１またはＣ４６７）上の２つのシステインのうちの１つを変異させることは、神経細胞に対するＸ−ＬＣ−ＨＮの活性に影響を及ぼさない。これらの結果により、鎖間ジスルフィド結合の形成が、Ｘ−ＬＣ−ＨＮの活性にとって必須であることを確認した。
【００５０】
【図４Ａ−Ｆ】図４Ａ〜４Ｆは、全長ＢｏＮＴ／Ｘが、培養神経細胞において、およびマウスにおいてin vivoで、活性であることを示す。配列は、以下のとおりである：ＬＶＰＲ−ＧＳ（配列番号８０）、ＬＰＥＴＧＧ−Ｈｉｓ６（配列番号８１）、ＧＧ−Ｈｉｓ６（配列番号８２）およびＬＰＥＴＧＳ（配列番号５９）。図４Ａは、ソルターゼライゲーション法を用いて全長ＢｏＮＴ／Ｘの合成を説明する模式図を示す。図４Ｂは、ソルターゼライゲーション反応混合物および示された対照成分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析したことを示す。アスタリスクは、分子間ジスルフィド結合に起因する（これらの凝集塊はＤＴＴの存在下において消失するので）タンパク質の凝集塊をマークする。分子量マーカーは、レーン１（左側から出発して）におけるものである。全長ＢｏＮＴ／Ｘ（Ｘ−ＦＬ）は、ソルターゼライゲーション混合物（レーン７およびレーン１４）においてのみ現われる。図４Ｃは、同じ量（５μｌ）のソルターゼライゲーション混合物または示される対照成分に１２時間にわたり培地中で暴露された神経細胞を示す。細胞ライセートを、イムノブロットにより分析した。Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、反応混合物中でその高い濃度に起因して、単独で一部のＶＡＭＰ２を切断した。Ｘ−ＬＣ−ＨＮおよびＸ−ＨＣの両方を含むがソルターゼを含まない対照混合物は、Ｘ−ＬＣ−ＨＮ単独と比較して、ＶＡＭＰ２の切断をわずかに増強した。これは、Ｘ−ＨＣが非共有結合的相互作用を介してＸ−ＬＣ−ＨＮと会合することに起因する可能性が高い。Ｘ−ＬＣ−ＨＮとＸ−ＨＣをソルターゼによりライゲーションすることにより、ソルターゼを含まないＸ−ＬＣ−ＨＮとＸ−ＨＣとの混合物と比較して、ＶＡＭＰ２の切断が増強され、このことは、ライゲーションされたＸ−ＦＬが、神経細胞において機能的であることを示している。図４Ｄは、パネルｂ（レーン７）において記載されるとおりに調製されたソルターゼ反応混合物が、マウスにおいてＤＡＳアッセイを用いて分析した場合にin vivoで活性であることを示す。注射された肢は、弛緩性麻痺を生じ、足指は１２時間以内には広げることができなかった。左肢は、トキシンを注射されておらず、対照として用いた。図４Ｅは、ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ、モザイクトキシンＢｏＮＴ／ＤＣ、およびＢｏＮＴ／Ｘを、４つのウマ抗血清（抗ＢｏＮＴ／Ａ、抗Ｂおよび抗Ｅの三価抗血清、抗ＢｏＮＴ／Ｃ、抗ＢｏＮＴ／ＤＣおよび抗ＢｏＮＴ／Ｆ）、ならびに２種のヤギ抗血清（抗ＢｏＮＴ／Ｇおよび抗ＢｏＮＴ／Ｄ）を用いたドットブロット分析（トキシン１種あたり０．２μｇをニトロセルロース膜上にスポット）に供したことを示す。ＢｏＮＴ／Ｘは、１：１の比における精製Ｘ−ＬＣ−ＨＮおよびＸ−ＨＣからなる。これらの抗血清は、その対応する標的トキシンを認識したが、これらのいずれも、ＢｏＮＴ／Ｘを認識しなかった。図４Ｆは、ＢｏＮＴ／Ｘ（ＢｏＮＴ／ＸＲＹ）の全長の不活性な形態を、E.coliにおいてＨｉｓ６タグ付き組み換えタンパク質として精製し、ＤＴＴを用いて、またはこれを用いずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析したことを示す。
【００５１】
【図５】図５は、クロストリジウム属のニューロトキシンの分布および関係を示す系統樹である。系統樹は、Jackhmmer検索からの様々なＢｏＮＴとＴｅＮＴ配列との関係を表す。ＢｏＮＴ／Ｘを丸で囲む。
【００５２】
【図６】図６は、未変化のＶＡＭＰ２（１−９６）の質量分析の分析を示す。Ｈｉｓ６タグ付きＶＡＭＰ２（１−９６）を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析により分析した。ＨＰＬＣプロフィールを、左パネルにおいてタンパク質配列と一緒に列記した。全長ＶＡＭＰ２（１−９６）についての質量分析データを右パネルに示し、これは配列番号８３に対応し、ｍ／ｚ値を各々のシグナルについてマークした。
【００５３】
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａ〜７Ｆは、ＧＳＴ−ＶＡＭＰ２（３３−８６）上のＸ−ＬＣによる切断部位の同定を示す。図７Ａは、Ｘ−ＬＣと共に、またはこれを用いずにインキュベートした、ＧＳＴタグ付きＶＡＭＰ２（３３−８６）を示す。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析した。図７Ｂ〜７Ｃは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析により分析した、未変化のＧＳＴタグ付きＶＡＭＰ２（３３−８６）を示す。ＨＰＬＣプロフィールを、図７Ｂにおいて示した。質量分析データを、図７Ｃにおいて示し、タンパク質配列（配列番号８４）を、図７Ｃにおいて記述した。ＶＡＭＰ２（３３−６６）およびＶＡＭＰ２（６７−８６）をマークした。
【図７Ｄ−Ｆ】図７Ｄ〜７Ｅは、Ｘ−ＬＣと共にインキュベートした、ＧＳＴタグ付きＶＡＭＰ２（３３−８６）を示す。試料を、次いで、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析により分析した。ＨＰＬＣプロフィールを、図７Ｄにおいて示す。Ｘ−ＬＣにより生じたＣ末端フラグメント（配列番号８５）についての質量分析データを、図７Ｅにおいて示す。Ｎ末端フラグメント（配列番号８６）についての質量分析データを、図７Ｆにおいて示した。Ｃ末端およびＮ末端のフラグメントのタンパク質配列を、図７Ｅ〜７Ｆにおいて示し、これらは、それぞれ配列番号８５および８６に対応する。
【００５４】
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、ＸＡキメラトキシンが、神経細胞において活性であることを示す。図８Ａは、図４Ａにおいて記載されるようなＸ−ＦＬの生成と同様に、ソルターゼによりＸ−ＬＣ−ＨＮをＡ−ＨＣとライゲーションすることにより生じたＸＡキメラトキシンを示す。ソルターゼライゲーション混合物および示される対照成分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析した。Ｘ−ＬＣ−ＨＮの大部分がＸＡキメラトキシンへとライゲーションされたことから、ライゲーションは効率的である。図８Ｂは、ＸＡ混合物（５μｌ）にライゲーションされた、示された対照成分またはソルターゼに、１２時間にわたり培地中で暴露された、ラット皮質神経細胞を示す。細胞ライセートを、イムノブロットにより分析した。Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、反応混合物中でのその高い濃度に起因して、単独で一部のＶＡＭＰ２を切断した。ライゲーションされたＸＡは、神経細胞において、ＶＡＭＰ２を切断した。
【００５５】
【図９】図９は、ＨＮ中の余分のシステインおよびＨＣ中のシステインを変異させることが、ＢｏＮＴ／Ｘの活性に影響を及ぼさないことを示す。Ｘ−ＨＣ（Ｃ１２４０Ｓ）を、ソルターゼライゲーションにより、ＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮ、Ｘ−ＬＣ−ＨＮ（Ｃ４６１Ｓ）、またはＸ−ＬＣ−ＨＮ（Ｃ４６７Ｓ）とライゲーションした。神経細胞を、ソルターゼライゲーション混合物または対照成分（５μｌ）に、１２時間にわたり培地中で暴露した。細胞ライセートを、イムノブロットにより分析した。Ｃ１２４０およびＨＮ上のシステインのうちの１つ（Ｃ４６１またはＣ４６７）を変異させることは、ＢｏＮＴ／Ｘの活性に影響を及ぼさなかった。なぜならば、ライゲーションされた変異体トキシンは、神経細胞に侵入することができ、ＶＡＭＰ２を切断したからである。
【００５６】
【図１０】図１０は、ＢｏＮＴの７つの血清型に対して産生された抗血清が、神経細胞におけるそれらの標的ＢｏＮＴを中和することを示す。培養ラット皮質神経細胞を、示された抗血清とのプレインキュベーションを行うかまたはこれを行わずに、示されたＢｏＮＴに暴露した。１２時間後に細胞ライセートを採取して、イムノブロット分析に供した。全ての抗血清は、異なる血清型のＢｏＮＴの活性に影響を及ぼすことなく、それらの標的ＢｏＮＴを特異的に中和し、それによりこれらの抗血清の特異性および効力を実証した。ＢｏＮＴについての濃度は、以下のとおりであった：ＢｏＮＴ／Ａ（５０ｐＭ）、ＢｏＮＴ／Ｂ（２ｎＭ）、ＢｏＮＴ／Ｃ（１．５ｎＭ）、ＢｏＮＴ／Ｄ（１００ｐＭ）、ＢｏＮＴ／Ｅ（０．５ｎＭ）、ＢｏＮＴ／Ｆ（０．５ｎＭ）、ＢｏＮＴ／Ｇ（５ｎＭ）。ＢｏＮＴ／Ａ／Ｂ／Ｅに対する抗血清を、ウェルあたり２０μｌで用いた。全ての他の抗血清を、ウェルあたり１０μｌで用いた。ＢｏＮＴを、示された抗血清と共に３０分間にわたり３７℃でプレインキュベートし、その後、培養培地中に添加した。
【００５７】
【図１１Ａ−Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＢｏＮＴ／ＸＲＹが、神経細胞において活性でないことを示す。図１１Ａは、示された濃度におけるＢｏＮＴ／ＸＲＹに暴露された培養ラット皮質神経細胞を示す。細胞ライセートを、イムノブロットにより分析した。ＶＡＭＰ２は切断されておらず、このことは、ＢｏＮＴ／ＸＲＹが神経細胞において活性でないことを示している。図１１Ｂは、細胞ライセートおよび上清（Ｓ／Ｎ）のＢｏＮＴ／ＸＲＹの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す（４〜１２％のビスＴｒｉｓ、ＭＯＰＳバッファー）。１５０ｋＤａにおけるＢｏＮＴ／Ｘに対応するバンドは、ライセートおよび可溶性画分の両方において明白である。図１１Ｃは、高度に精製されたＢｏＮＴ／ＸＲＹの最終試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す（４〜１２％のビスＴｒｉｓ、ＭＯＰＳバッファー）。１５０ｋＤａにおけるＢｏＮＴ／Ｘに対応する単一のバンドが明白であり、約９０％の純度を示す。
【００５８】
【図１２Ａ−Ｆ】図１２Ａ〜１２Ｆは、ＢｏＮＴ／Ｘが、４つ全ての脳ガングリオシドに結合することを示す。図１２Ａ〜１２Ｄは、それぞれＧＤ１ａ（図１２Ａ）、ＧＴ１ｂ（図１２Ｂ）、ＧＤ１ｂ（図１２Ｃ）、およびＧＭ１（図１２Ｄ）に結合しているＢｏＮＴ／Ｘ（四角）、およびＡ−Ｈｃ（丸）を示す。曲線は、３回のＥＬＩＳＡアッセイの平均に対応し、Prism7（GraphPadソフトウェア）によりフィットさせた。図１２Ｅは、４つ全てのガングリオシドへのＢｏＮＴ／Ｘの結合の要旨を、図１２ＦにおけるＢｏＮＴ／Ａの全体的な結合と比較して示す。
【００５９】
【図１３Ａ−Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄは、質量分析の分析によるＹｋｔ６上のＸ−ＬＣの切断部位の同定を示す。図１３Ａ〜１３Ｄは、Ｘ−ＬＣとのプレインキュベーションを行ったかまたはこれを行っていない、１０μｇのＧＳＴタグ付きＹｋｔ６（１−１９２）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離したことを示す（図１３Ａ）。タンパク質バンドを示されるとおりに切り出し、キモトリプシンにより消化した。消化したペプチドを、脱塩して、ＥＳＩ−ＭＳと組み合わせたＣ１８カラムを介する逆相ＨＰＬＣにより分析した。Ｘ−ＬＣによる前処理なしのＧＳＴ−Ｙｋｔ６のＨＰＬＣプロフィールを、図１３Ｂにおいて示し、Ｘ−ＬＣにより前処理された試料を、図１３Ｃにおいて示した。１つのペプチドが、Ｘ−ＬＣで前処理された試料において、Ｘ−ＬＣに暴露されなかった試料におけるものよりも約１００倍高い強度であることが同定された（アスタリスクで示す）。このペプチドを、３７ｍｉｎのＲＴにおいて、ｍ／ｚ＝６１１で溶離させた（図１３Ｄ）。これは、Ｙｋｔ６におけるペプチド配列ＥＳＬＬＥＲＧＥＫＬＤＤＬＶＳＫ（配列番号８７）にのみフィットさせることができ、このことは、これが、Ｘ−ＬＣのための切断部位のＮ末端側に位置するペプチドであることを示している。したがって、切断部位は、Ｙｋｔ６におけるＫ１７３−Ｓ１７４である。
【００６０】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｅは、質量分析の分析による、ＶＡＭＰ４およびＶＡＭＰ５上のＸ−ＬＣの切断部位の同定を示す。図１４Ａ〜１４Ｅは、ＶＡＭＰ４（図１４Ｂ、１４Ｃ）およびＶＡＭＰ５（図１４Ｄ、１４Ｅ）が分析されたことを除いて、図１３において記載されるとおりに行われた実験を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＶＡＭＰ４における切断部位のＮ末端部位をマークするペプチドである。ペプチドＤＥＬＱＤＫの配列は、配列番号８８に対応する。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＶＡＭＰ４における切断部位のＣ末端部位をマークするペプチドである。ペプチドＳＥＳＬＳＤＮＡＴＡＦの配列は、配列番号８９に対応する。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＶＡＭＰ５における切断部位のＮ末端部位をマークするペプチドである。ペプチドＡＥＬＱＱＲの配列は、配列番号９０に対応する。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、ＶＡＭＰ５における切断部位のＣ末端部位をマークするペプチドである。ペプチドＳＤＱＬＬＤＭＳＳＴＦの配列は、配列番号９１に対応する。したがって、切断部位は、ＶＡＭＰ４におけるＫ８７−Ｓ８８、およびＶＡＭＰ５におけるＲ４０−Ｓ４１であると決定した。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
いくつかの態様の詳細な説明
Clostridium Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）は、クロストリジウム菌により産生される細菌のトキシンのファミリーであり、７つのよく確立された血清型（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ）を含む１〜３。それらは、最も危険な潜在的なバイオテロ剤のうちの１つであり、米国の疾病管理センター（ＣＤＣ）により「カテゴリーＡ」として選択される剤として分類される４。これらのトキシンは、単一のポリペプチドとして産生され、細菌または宿主のプロテアーゼにより、軽鎖（ＬＣ、約５０ｋＤａ）および重鎖（ＨＣ、約１００ｋＤａ）に分離され得る。２つの鎖は、鎖間ジスルフィド結合を介して連結されたままである。ＨＣは、２つのサブドメイン：エンドソーム膜を越えてのＬＣの転位置を媒介するＮ末端ＨＮドメイン、および神経細胞上の受容体への結合を媒介するＣ末端ＨＣドメインを含む。鎖間ジスルフィド結合は、ＬＣが細胞質ゾル中に転位置すると還元される５、６。放出されたＬＣは、プロテアーゼとして作用し、神経細胞のタンパク質のセットを特異的に切断する：ＢｏＮＴ／Ａ、ＣおよびＥは、ＳＮＡＰ−２５として知られるタンパク質上の別々の部位で切断する；ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＧは、小胞タンパク質ＶＡＭＰ上の異なる部位で切断する；およびＢｏＮＴ／Ｃはまた、膜貫通タンパク質シンタキシン１を切断する１〜３。これら３つのタンパク質は、ＳＮＡＲＥ複合体として知られる複合体を形成し、これは、神経伝達物質の放出のために必須である７、８。これら３つのＳＮＡＲＥタンパク質のいずれか１つの切断は、神経細胞からの神経伝達物質の放出を遮断し、それにより、筋肉を麻痺させる。
【００６２】
ＢｏＮＴは、最も強力な既知のトキシンであり、ボツリヌス症として知られるヒトおよび動物の疾患を引き起こす３。ボツリヌス症の主な形態は、ＢｏＮＴで汚染された食品を経口摂取することにより引き起こされる（食品ボツリヌス症）。乳児におけるトキシンを産生する細菌による腸でのコロニー形成に起因する乳児ボツリヌス症などの他の形態もまた存在する。ＢｏＮＴは、常に、ＮＴＮＨＡ（非毒性非ヘマグルチニンタンパク質）として知られる別の１５０ｋＤａのタンパク質と一緒に産生され、これは、ＢｏＮＴとｐＨ依存的複合体を形成し、胃腸管においてＢｏＮＴをプロテアーゼから保護する９。ＢｏＮＴおよびＮＴＮＨＡをコードする遺伝子は、２つの遺伝子クラスターの型において見出される：（１）３つの保存されたタンパク質ＨＡ１７、ＨＡ３３およびＨＡ７０の遺伝子を含むＨＡクラスター、これは、ＢｏＮＴ／ＮＴＮＨＡと複合体を形成し、腸の上皮バリアを越えてのトキシンの吸収を促進する１０〜１２。（２）機能が知られていない保存されたＯｒｆＸ１、ＯｒｆＸ２、ＯｒｆＸ３およびＰ４７タンパク質をコードするＯｒｆＸクラスター１３。
【００６３】
微量のトキシンの局所注射により、標的領域において神経活動を減弱化させることができるので、ＢｏＮＴは、筋痙攣、慢性疼痛、過活動の膀胱の問題を含む増加しつつあるリストの医学的状態を処置するために１４〜１６、ならびに美容用途のために用いられている。ＢｏＮＴのための市場は、２０１１年において既に１５億ドルを凌いでおり、２０１８年まで２９億ドルに達することが計画されている。
【００６４】
ＢｏＮＴは、伝統的にはマウスにおける中和アッセイにより分類され、これは、既知のＢｏＮＴに対する抗血清と共にまたはこれを用いずに、クロストリジウム菌の培養上清をマウスに注射することによる。最初に区別された血清型であるＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂは、１９１９年に、Georgina Burkeにより確立された１８。７つの型のうちの最後のものであるＢｏＮＴ／Ｇは、１９６９年にアルゼンチンにおける土壌試料から認識された１９。１９７０年以来、ＢｏＮＴの新たな血清型は認識されていない。この分類は、１９９０年代に各々のＢｏＮＴについてのタンパク質配列が決定された後でも、有効であった。７つのＢｏＮＴの中の任意の２つのペアの間の配列同一性は、３２％〜６５．３％の範囲である。７つ全てのＢｏＮＴが、それらの医学的使用の時代以前に、同定され、特徴づけられた。したがって、これらのトキシンのいずれかに対する特許は存在しない。任意の企業が、これら７つのＢｏＮＴのうちのいずれか１つを自由に生成して市販することができる。７つの型のうち、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂは、現在ＦＤＡによりヒトにおける使用が承認されている２つのトキシンである。１４〜１６。ＢｏＮＴ／Ａは、医学および美容の両方の用途のために用いられるドミナントな型であり、Allergan Inc.からはBotoxとして、IPSEN Inc.からはDysportとして、Merz Inc.からはXeominとして市販されている。ＢｏＮＴ／Ｂは、USWorld MedによりMyoblocとして市販されている。２つの主な理由のために、治療用トキシンとしての他のＢｏＮＴ型の開発に相当の関心が存在する。
【００６５】
（１）治療における主な限定要因は、患者におけるＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｂに対する中和抗体の産生であり、これは、同じトキシンを用いた将来的な治療を無効にする２０。この場合、患者は、異なる型のＢｏＮＴにより処置されることを必要とするであろう。これが、ＢｏＮＴ／Ｂがしばしば、処置の間にＢｏＮＴ／Ａに対する中和抗体を産生した患者を処置するために利用される理由であるが、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂの両方に対して抗体を産生した患者のために、代替的なトキシンの必要性が存在する。
【００６６】
（２）全てのＢｏＮＴは、同じ構造および機能を共有するが、それらの間にはまた、相当の差異が存在する。例えば、ＢｏＮＴ／Ａは、ＳＮＡＰ−２５を切断し、その受容体としてタンパク質ＳＶ２を用いるが、一方、ＢｏＮＴ／Ｂは、ＶＡＭＰを切断し、タンパク質シナプトタグミン（Ｓｙｔ）をその受容体として用いる２１〜２７。これらの機能的差異は、別々の型の神経細胞をターゲティングする治療効力における潜在的な差異に変換され得る。加えて、安定性および治療期間もまた、７つの型のトキシンの間で異なる。したがって、異なるトキシン型は、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂに対して優位性を有する場合がある。
【００６７】
近年におけるゲノムシークエンシングの迅速な進歩により、ＢｏＮＴの著しい多様性が明らかとなってきた２８、２９。第１に、同じ抗血清により認識され得るが、タンパク質配列に対する有意なレベルの相違（２．６％〜３１．６％の相違）を含む、複数のサブタイプが存在する２８、３０。例えば、ＢｏＮＴ／Ａは、ＢｏＮＴ／Ａ１〜Ａ８と称される８つの既知のサブタイプを含む１３。さらに、トキシン遺伝子の組み換えから誘導される可能性がある、複数のモザイクトキシンが存在する。例えば、「Ｈ型」が、２０１３年に報告されたが、それは後にキメラトキシンとして認識された。なぜならば、そのＬＣは、ＢｏＮＴ／ＦのサブタイプであるＢｏＮＴ／Ｆ５のＬＣと約８０％の同一性を共有し、そのＨＣは、ＢｏＮＴ／Ａ１のＨＣと約８４％の同一性を共有するからである３１〜３４。このことと一致して、このトキシンは、ＢｏＮＴ／Ａに対する利用可能な抗血清により、認識され中和され得る３３。
【００６８】
ＢｏＮＴをコードする遺伝子クラスターは、プラスミド、バクテリオファージまたは染色体上にあってよく、このことは、トキシン遺伝子は、可搬性であり、水平遺伝子導入に供されることを示している１３。また、クロストリジウム菌株が、２つの、または３つもの異なるトキシン遺伝子を含む場合もある３２、３５、３６。これらの場合において、一方のトキシンが、通常、他方のトキシン（小文字で表記する）よりも高いレベルで発現する（大文字で表記する）。例えば、高レベルのＢｏＮＴ／Ｂおよび低レベルのＢｏＮＴ／Ｆを発現する菌株は、ＢｏＮＴ／Ｂｆ株として知られる。また、一方のトキシンは発現されるが、他方のトキシンは発現されない場合もあり、これはサイレントトキシンとして知られる（通常（）でマークされる）。例えば、カリフォルニアにおける乳児ボツリヌス症の症例の調査は、８％の菌株がＢｏＮＴ／Ａ（Ｂ）であったことを示し、これは、これらの菌株がＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂの両方の遺伝子を含むが、検出可能なレベルではＢｏＮＴ／Ａのみを発現することを意味する３７〜３９。
【００６９】
本開示の図面および例において説明されるとおり、公開されたクロストリジウム菌のゲノム配列データベースを検索し、Clostridium Botulinum菌株１１１の染色体上でコードされる新規のＢｏＮＴ遺伝子（本明細書において以後「ＢｏＮＴ／Ｘ」と称される）を同定した。菌株１１１は、初めに、１９９６年に日本において乳児ボツリヌス症患者から単離された４０。マウスにおける菌株１１１からの毒性は、ＢｏＮＴ／Ｂ抗血清により中和することができることが示されている４０。この菌株は、プラスミド上でコードされるＢｏＮＴ／ＢのサブタイプであるＢｏＮＴ／Ｂ２を発現することが、後に確認された４１、４２。ＢｏＮＴ／Ｘの配列は、菌株１１１のゲノム配列の一部として、２０１５年の２月にPubMedデータベースに寄託された。ＢｏＮＴ／Ｘは、以前には特徴づけられていない。それが菌株１１１において発現されるか否か、およびそれが機能的なトキシンであるか否かは、未知のままである。
【００７０】
また本明細書において提供されるのは、機能的レベルにおけるＢｏＮＴ／Ｘの特徴づけである。そのＬＣは、ＶＡＭＰを、全ての他のＢｏＮＴの既知の標的部位とは別の部位において切断することを見出した。非毒性のフラグメントをソルターゼを介して共有結合的に連結することにより生成された全長トキシンは、培養神経細胞に侵入して、神経細胞中のＶＡＭＰを切断し、マウスにおいて弛緩性麻痺を誘発することを見出した。最後に、当該トキシンは、７つ全ての既知のＢｏＮＴに対して産生された抗血清によっては認識されないことを見出し、このことにより、ＢｏＮＴ／Ｘを新規のＢｏＮＴ血清型として確立した。その同定は、有効な対応策を開発するための緊急の課題を提案する。それはまた、新たな治療用トキシンへと展開される潜在能力を有し、潜在的に別々の薬理学的特性を有するキメラトキシンを作製するために用いることができる。
【００７１】
本明細書において用いられる場合、用語「クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ポリペプチド」とは、本明細書において記載されるボツリヌスニューロトキシンからの任意のポリペプチドまたはフラグメントを包含する。いくつかの態様において、用語ＢｏＮＴとは、全長ＢｏＮＴを指す。いくつかの態様において、用語ＢｏＮＴとは、ＢｏＮＴのフラグメントであって、ＢｏＮＴが神経細胞に侵入して神経伝達物質の放出を阻害する細胞の仕組み全体を遂行することができるものを指す。いくつかの態様において、用語ＢｏＮＴとは、フラグメントが任意の具体的な機能または活性を有することを必要とすることなく、単純にＢｏＮＴのフラグメントを指す。例えば、ＢｏＮＴポリペプチドとは、ＢｏＮＴ、例えばＢｏＮＴ／Ｘの、軽鎖（ＬＣ）を指す場合がある。本開示全体を通して用いられる場合がある「クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン」についての他の用語は、ＢｏＮＴ、ボツリヌストキシン、またはC. Botuliumトキシンであり得る。これらの用語は、互いに交換可能に用いられることが理解されるべきである。「ＢｏＮＴ／Ｘ」とは、本開示において記載され、特徴づけられる、新規のＢｏＮＴ血清型を指す。ＢｏＮＴ／Ｘタンパク質の配列（GenBank番号BAQ12790.1；４つのシステインに下線をして太字にする）もまた、提供される：
【００７２】
【化１】
2019528042.tif 000003
【００７３】
「改変クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）」とは、アミノ酸配列における任意の改変、例えば短縮、付加、アミノ酸置換、およびそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴを包含する。例えば、Ｃ４６１またはＣ４６７においてアミノ酸置換変異を含むＢｏＮＴ／Ｘは、改変ＢｏＮＴである。別の例において、全長ＢｏＮＴのフラグメントまたはドメイン（例えば、プロテアーゼドメイン、またはＬＣ）は、改変ＢｏＮＴであるとみなされる。いくつかの態様において、ＢｏＮＴのドメインもまた、アミノ酸置換変異を含んでもよく、例えばＢｏＮＴ／Ｘの位置Ｃ４６１またはＣ４６７において置換変異を含むプロテアーゼドメインであってもよい。
【００７４】
用語「細胞に侵入する」とは、本開示のＢｏＮＴの作用を説明するために用いられる場合、低または高アフィニティーの受容体複合体へのＢｏＮＴの結合、ＢｏＮＴのガングリオシドへの結合、トキシンの内部移行、トキシン軽鎖の細胞質中への転位置およびＢｏＮＴの基質の酵素による改変を包含する。
【００７５】
本明細書において用いられる場合、用語「クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）プロテアーゼドメイン」とは、「軽鎖（ＬＣ）」と同義である。ＢｏＮＴプロテアーゼドメインは、ＢｏＮＴの軽鎖に位置し、したがって、ＬＣとも称される。当該用語は、中毒のプロセスの酵素による標的改変ステップを実行することができるＢｏＮＴのドメインを意味する。特定のＢｏＮＴ血清型からのＬＣが参照される場合、用語「血清型−ＬＣ」が用いられる。例えば、「Ｘ−ＬＣ」とは、ＢｏＮＴ／ＸからのＬＣポリペプチドを意味する。ＢｏＮＴのプロテアーゼドメインは、C. Botulinumトキシン基質を特異的にターゲティングし、C. Botulinumトキシン基質、例えば、ＳＮＡＰ−２５基質、ＶＡＭＰ基質およびシンタキシン基質などのＳＮＡＲＥタンパク質などのタンパク質分解による切断を包含する。ＢｏＮＴ（例えば、ＢｏＮＴ／Ｘ、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃなど）において。プロテアーゼドメインまたはＬＣは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸１〜４３９付近に対応すると考えられる。ドメイン境界は、２５アミノ酸ほど異なっている場合がある。例えば、プロテアーゼドメインは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸１〜４１４または１〜４６４に対応してもよい。いくつかの態様において、プロテアーゼドメインは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸１〜４３８、１〜４３７、１〜４３６、１〜４３５、１〜４３４、１〜４３３、１〜４３２、１〜４３１、１〜４３０、１〜４２９、１〜４３９、１〜４４０、１〜４４１、１〜４４２、１〜４４３、１〜４４４、１〜４４５、１〜４４６、１〜４４７、１〜４４８、または１〜４４９に対応してもよい。
【００７６】
本明細書において用いられる場合、用語「クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）転位置ドメイン」は、「ＨＮドメイン」と同義であり、ＢｏＮＴ軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置ステップを実行することができるＢｏＮＴドメインを意味する。したがって、ＨＮは、膜を越えて細胞の細胞質中へのＢｏＮＴ軽鎖の移動を促進する。ＨＮの非限定的な例として、ＢｏＮＴ／ＡのＨＮ、ＢｏＮＴ／ＢのＨＮ、ＢｏＮＴ／ＣｌのＨＮ、ＢｏＮＴ／ＤのＨＮ、ＢｏＮＴ／ＥのＨＮ、ＢｏＮＴ／ＦのＨＮ、ＢｏＮＴ／ＧのＨＮ、およびＢｏＮＴ／ＸのＨＮが挙げられる。転位置ドメインは、重鎖（ＨＣ）のＮ末端に位置し、したがって、ＨＮとも称される。これらの用語は本明細書において交換可能に用いられることが理解されるべきである。
【００７７】
本明細書において用いられる場合、用語「リンカー領域」とは、ＢｏＮＴプロテアーゼドメインと転位置ドメインとの間のアミノ酸配列を指す。リンカーは、位置４６１および４６７において２つのシステインを含み、そのうちの一方は、プロテアーゼドメイン中のシステイン、Ｃ４２３と分子間ジスルフィド結合を形成する（Ｃ４６１−Ｃ４２３ジスルフィド結合、またはＣ４６７−Ｃ４２３ジスルフィド結合）。このジスルフィド結合の形成は、ＢｏＮＴ／Ｘの活性のために必須である。
【００７８】
本明細書において用いられる場合、用語「ＬＣ−ＨＮ」とは、プロテアーゼドメイン、リンカー領域、および転位置ドメインを包含するＢｏＮＴポリペプチドを指す。特定のＢｏＮＴ血清型からのＬＣ−ＨＮが参照される場合、用語「血清型−ＬＣ−ＨＮ」が用いられる。例えば、「Ｘ−ＬＣ−ＨＮ」とは、ＢｏＮＴ／ＸからのＬＣ−ＨＮポリペプチドを意味する。ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸１〜８９２付近に対応すると考えられる。ドメイン境界は、約２５アミノ酸ほど異なっている場合がある。例えば、ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸１〜９１７または１〜８６７付近に対応してもよい。いくつかの態様において、ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸１〜８９３、１〜８９４、１〜８９５、１〜８９６、１〜８９７、１〜８９８、１〜８９９、１〜９００、１〜９０１、１〜９０２、１〜８９２、１〜８９１、１〜８９０、１〜８８９、１〜８８８、１〜８８７、１〜８８６、１〜８８５、１〜８８４、または１〜８８３に対応してもよい。
【００７９】
本明細書において用いられる場合、用語「クロストリジウム属ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）受容体結合ドメイン」とは、「Ｈｃドメイン」と同義であり、任意の天然に存在するＢｏＮＴ受容体結合ドメインであって、中毒プロセスのうちの細胞結合ステップ（例えば、ＢｏＮＴの、標的細胞の細胞膜表面上に位置するＢｏＮＴ特異的受容体系への結合を含む）を遂行することができるものを意味する。本開示のいくつかの側面は、血清型Ｘ（ＢｏＮＴ／Ｘ）からの改変ＢｏＮＴ受容体結合ドメインに関する。いくつかの態様において、「改変ＢｏＮＴ／Ｘ受容体結合ドメイン」は、ＢｏＮＴ／Ｘ（配列番号１）におけるＣ１２４０に対応する位置においてアミノ酸置換を含む。受容体結合ドメイン、またはＨＣは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸８９３〜１３０６付近に対応すると考えられる。ドメイン境界は、約２５アミノ酸ほど異なっている場合がある。例えば、受容体結合ドメインまたはＨＣは、アミノ酸８６８〜１３０６または９１８〜１３０６に対応してもよい。いくつかの態様において、受容体結合ドメインまたはＨＣは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸８９３〜１３０６、８９４〜１３０６、８９５〜１３０６、８９６〜１３０６、８９７〜１３０６、８９８〜１３０６、８９９〜１３０６、９００〜１３０６、９０１〜１３０６、９０２〜１３０６、８９２〜１３０６、８９１〜１３０６、８９０〜１３０６、８８９〜１３０６、８８８〜１３０６、８８７〜１３０６、８８６〜１３０６、８８５〜１３０６、８８４〜１３０６、または８８３〜１３０６に対応してもよい。
【００８０】
「単離された」とは、ある材料が、そのネイティブの状態において見出される場合に通常それに付随する構成成分を、様々な程度で含まないことを意味する。「単離する」とは、オリジナルのソースまたは周囲のものからの、例えば、細胞から、または隣接するＤＮＡから、または当該ＤＮＡの天然のソースからの、ある程度の分離を表す。用語「精製された」とは、調製物の他の構成成分（例えば他のポリペプチド）に関して「実質的に純粋」であるポリペプチドなどの物質を指すように用いられる。それは、他の構成成分に関して、少なくとも約５０％、６０％＞、７０％＞、または７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％純粋なポリペプチドを指してもよい。ポリペプチドに関して、用語「実質的に純粋」または「本質的に精製された」とは、約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％未満、１％または１％未満の、１つ以上の他の構成成分（例えば、他のポリペプチドまたは細胞構成成分）を含む調製物を指す。
【００８１】
用語「置換変異」とは、特定のアミノ酸への言及を伴わない場合、その位置において通常見出される野生型の残基以外の任意のアミノ酸を含み得る。かかる置換は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびプロリンなどの非極性（疎水性）アミノ酸による置き換えであってよい。置換は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンなどの極性（親水性）アミノ酸による置き換えであってよい。置換は、荷電したアミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの負に荷電したアミノ酸、ならびにリジン、アルギニンおよびヒスチジンなどのなどの正に荷電したアミノ酸による置き換えであってよい。
【００８２】
本明細書において記載される置換変異とは、典型的には、異なる天然に存在するアミノ酸残基による置き換えであるが、いくつかの場合においては、天然に存在しないアミノ酸残基もまた置換することができる。非天然のアミノ酸とは、当該用語が本明細書において用いられる場合、非タンパク質原性の（すなわち、タンパク質をコードしない）アミノ酸であって、天然に存在するか、化学合成されるものである。例として、これらに限定されないが、β−アミノ酸（β３およびβ２）、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖状コアアミノ酸、ジアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、ならびにＮ−メチルアミノ酸が挙げられる。いくつかの態様において、アミノ酸は、置換されていても非置換であってもよい。置換されたアミノ酸または置換基は、ハロゲン化された芳香族もしくは脂肪族アミノ酸、疎水性側鎖上のハロゲン化された脂肪族もしくは芳香族修飾、または脂肪族もしくは芳香族修飾であってよい。
【００８３】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のとおり改変されたKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを用いて決定される。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれる。XBLASTプログラムを用いて、スコア＝５０、ワードレングス＝３で、BLASTタンパク質検索を行って、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997において記載されるように、Gapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えば、XBLASTおよびNBLAST）を用いることができる。
【００８４】
したがって、本開示のいくつかの側面は、単離されたＢｏＮＴポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、全長ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドである。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号１に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００８５】
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、Ｘ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドである。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００８６】
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、Ｘ−ＬＣポリペプチドである。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【００８７】
Ｘ−ＬＣポリペプチドは、ＢｏＮＴ基質（例えば、ＳＮＡＲＥタンパク質）の切断が研究または治療目的のために所望される細胞中に、当該分野における外来タンパク質の発現の任意の公知の技術、例えばレンチウイルスベクターを介して細胞中への直接的なＬＣコード配列の遺伝子導入により単独で導入しても、またはＡＡＶベクターを介して、または細胞に浸透するペプチドを用いてＸ−ＬＣを融合させることにより導入してもよい。
【００８８】
いくつかの態様において、本開示のＢｏＮＴポリペプチドは、プロテアーゼドメイン（ＬＣ）、リンカー領域、転位置ドメイン（ＨＮ）、および受容体結合ドメイン（ＨＣ）を含む全長ＢｏＮＴ／Ｘであり、ここで、リンカー領域は、プロテアーゼドメインと転位置ドメインとの間に位置する。他のＢｏＮＴと同じく、ＢｏＮＴ／Ｘは、初めは単一のポリペプチドとして産生され、細菌または宿主のプロテアーゼによるＬＣとＨＮとの間のリンカー領域の切断を介して活性化される。このプロセスは「活性化」として知られ、ＢｏＮＴ／Ｘの活性のために必須である。切断の後、ＬＣとＨＮとは鎖間ジスルフィド結合を介して連結されたままであり、その後、細胞の細胞質ゾル中にＬＣが転位置し、ここで、ＬＣを細胞質ゾル中に放出するために、ジスルフィド結合が還元される。ＢｏＮＴ／Ｘは、他のＢｏＮＴと比較して保存された２つのシステイン、Ｃ４２３およびＣ４６７を含む。興味深いことに、ＢｏＮＴ／Ｘはまた、ＢｏＮＴ／Ｘにユニークな１つのさらなるシステイン（Ｃ４６１）を含む。鎖間ジスルフィド結合の形成（Ｃ４２３−Ｃ４６１またはＣ４２３−Ｃ４６７）は、ＢｏＮＴ／Ｘの活性のために必要とされる。
【００８９】
リンカー領域中のシステインに加えて、ＢｏＮＴの受容体結合ドメインは、別のシステインＣ１２４０を含み、これもまた、ＢｏＮＴ／Ｘ中の他のシステインと分子間ジスルフィド結合を形成する。これらの分子間ジスルフィド結合は、ＢｏＮＴ／Ｘを凝集させてタンパク質を不安定化させる（図４Ｂ）。ＢｏＮＴ／Ｘの活性のために必要とされないシステインを置き換えることにより、安定性が増大したＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドを生成することができる。
【００９０】
したがって、本開示のいくつかの側面は、Ｃ４６１、Ｃ４６７、またはＣ１２４０において１つ以上の置換変異を含む、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドを提供し、これは、野生型ＢｏＮＴ／Ｘよりも安定であり、匹敵する活性を有する。システインを、ジスルフィド結合の形成を消失させる任意のアミノ酸で置換してもよい。いくつかの態様において、システインを、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）で置換する。本開示の改変ＢｏＮＴにおいて存在してもよい置換変異の可能な組み合わせは、限定することなく、以下である：Ｃ４６１Ｓ、Ｃ４６１Ａ、Ｃ４６７Ｓ、Ｃ４６７Ａ、Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６１Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ａ、Ｃ４６７Ｓ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ｓ、Ｃ４６７Ｓ／Ｃ１２４０Ａ、およびＣ４６７Ａ／Ｃ１２４０Ａ。「／」は、二重変異を示す。いくつかの態様において、本開示の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列を有さない。例えば、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、配列番号１のアミノ酸配列を有さない。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つに対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列を有さない。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００９１】
いくつかの態様において、本開示の改変ＢｏＮＴポリペプチドは、本明細書において記載される置換変異を含む、改変ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドである。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、配列番号２におけるＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において、１つの単置換変異を含む。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、配列番号２におけるＣ４６１Ａ、Ｃ４６１Ｓ、Ｃ４６７Ａ、またはＣ４６７Ｓに対応する１つの単置換変異を含む。いくつかの態様において、本開示の改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号１８〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号１８〜２１のいずれか１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列を有さない。例えば、改変ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号１８〜２１のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、配列番号２のアミノ酸配列を有さない。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号１８〜２１のいずれか１つに対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列を有さない。いくつかの態様において、改変ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号１８〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００９２】
本明細書において記載される１つ以上の置換変異（例えば、Ｃ４６１、Ｃ４６７、またはＣ１２４０におけるもの）を含む改変ＢｏＮＴポリペプチドは、タンパク質の凝集を引き起こす分子間ジスルフィド結合を形成せず、したがって、それらの対応する野生型タンパク質よりも安定である。ＢｏＮＴポリペプチドの活性は、システインにおける置換変異により影響を受けない。したがって、改変ＢｏＮＴ／Ｘは、その増大した安定性に起因して、治療的使用のために野生型ＢｏＮＴ／Ｘよりも好適であり得る。
【００９３】
本開示の他の側面は、本明細書において記載されるＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮおよび異なるＢｏＮＴからの受容体結合ドメイン（ＨＣ）を含むキメラＢｏＮＴを提供する。例えば、受容体結合ドメインは、本明細書において企図されるＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、およびＢｏＮＴ／Ｇのうちのいずれか１つからのものであってもよい。したがって、キメラＢｏＮＴは、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ａ−ＨＣ、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｂ−ＨＣ、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｃ−ＨＣ、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｄ−ＨＣ、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｅ−ＨＣ、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｆ−ＨＣ、およびＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｇ−ＨＣを含む。７種の既知の血清型（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ）のうちの任意のサブタイプのＨＣドメインが、キメラトキシンのために好適であることが、理解されるべきである。ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、またはＢｏＮＴ／Ｇに言及される場合、それは全てのサブタイプを包含する。例えば、ＢｏＮＴ／Ａは、８種のサブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４、ＢｏＮＴ／Ａ５、ＢｏＮＴ／Ａ６、ＢｏＮＴ／Ａ７、またはＢｏＮＴ／Ａ８を有し、これらのＢｏＮＴ／Ａのサブタイプのうちのいずれか１つのＨｃは、本開示のキメラＢｏＮＴにおける使用のために好適である。同様に、ＢｏＮＴ／Ｂの８種のサブタイプ、すなわち、ＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ３、ＢｏＮＴ／Ｂ４、ＢｏＮＴ／Ｂ５、ＢｏＮＴ／Ｂ６、ＢｏＮＴ／Ｂ７、またはＢｏＮＴ／Ｂ８のうちのいずれか１つのＨｃは、本開示のキメラＢｏＮＴにおける使用のために好適である。
【００９４】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ａ１−ＨＣ（配列番号２２）、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｂ１−ＨＣ（配列番号２３）、およびＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｃ１−ＨＣ（配列番号２４）が提供される。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２２〜２４のいずれか１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２２〜２４のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２２〜２４のいずれか１つに対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２２〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００９５】
いくつかの態様において、本開示のキメラＢｏＮＴは、リンカー領域において、例えば配列番号２のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において、置換変異を含む、改変ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮを含む。例えば、キメラＢｏＮＴにおけるＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、配列番号２のＣ４６１Ａ、Ｃ４６７Ａ、Ｃ４６１Ｓ、またはＣ４６７Ｓに対応する置換変異を含んでもよい。例えば、本開示のキメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２５〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２５〜３０のいずれか１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２５〜３０のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２５〜３０のいずれか１つに対して、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キメラＢｏＮＴポリペプチドは、配列番号２５〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００９６】
キメラトキシン、例えばＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ａ１−ＨＣトキシンを作製するために、約１〜８９２のアミノ酸を含むＸ−ＬＣ−ＨＮフラグメント（配列番号２）を、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、およびＢｏＮＴ／Ｇのいずれか１つの受容体結合ドメインに融合させる。異なるＢｏＮＴの受容体結合ドメインは、ＢｏＮＴ／Ｂ１の約８６０〜１２９１のアミノ酸に対応する。Ｘ−ＬＣ−ＨＮフラグメントおよび／または受容体結合ドメインの境界は、１〜２５アミノ酸異なっていてもよいことが理解されるべきである。例えば、キメラトキシンのために用いることができるＸ−ＬＣ−ＨＮフラグメントは、ＢｏＮＴ／Ｘのアミノ酸１〜９１７または１〜８６７を含んでもよい。いくつかの態様において、キメラトキシンのために用いることができるＸ−ＬＣ−ＨＮフラグメントは、ＢｏＮＴ／Ｘの１〜８９３、１〜８９４、１〜８９５、１〜８９６、１〜８９７、１〜８９８、１〜８９９、１〜９００、１〜９０１、１〜９０２、１〜８９２、１〜８９１、１〜８９０、１〜８８９、１〜８８８、１〜８８７、１〜８８６、１〜８８５、１〜８８４、または１〜８８３のアミノ酸を含んでもよい。同様に、キメラトキシンのために用いてもよい受容体結合は、ＢｏＮＴ／Ｘの８８５〜１２９１または８３５〜１２９１に対応するアミノ酸を含んでもよい。いくつかの態様において、キメラトキシンのために用いてもよい受容体結合は、ＢｏＮＴ／Ｂの８６０〜１２９１、８６１〜１２９１、８６２〜１２９１、８６３〜１２９１、８６４〜１２９１、８６５〜１２９１、８６６〜１２９１、８６７〜１２９１、８６８〜１２９１、８６９〜１２９１、８７０〜１２９１、８６０〜１２９１、８５９〜１２９１、８５８〜１２９１、８５７〜１２９１、８５６〜１２９１、８５５〜１２９１、８５４〜１２９１、８５３〜１２９１、８５２〜１２９１、または８５１〜１２９１に対応するアミノ酸を含んでもよい。当業者は、タンパク質相同性におけるその知識に基づいて、配列アラインメントソフトウェアの補助により、またはこれを用いずに、本開示のキメラトキシンのために用いることができるドメインを同定することができる。フラグメントを融合させる方法は、当業者に周知の標準的な組み換え技術である。
【００９７】
本明細書においてさらに企図されるのは、改変リンカー領域を含む改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドであって、ここで、リンカー領域は、特異的なプロテアーゼ切断部位を含む。「特異的なプロテアーゼ切断部位」とは、本明細書において用いられる場合、１つより多くの非特異的なプロテアーゼにより認識され切断される配列と対立するものとして、特異的なプロテアーゼのための認識および切断の部位を指す。かかる特異的プロテアーゼとして、限定することなく、以下が挙げられる：トロンビン、ＴＥＶ、PreScission、第Ｘａ因子、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、グランザイム−Ｂ、およびエンテロキナーゼ。特異的プロテアーゼの切断部位は、リンカー領域中の既存のアミノ酸への挿入またはこれの置き換えを介して（例えば、ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドのアミノ酸４２４〜４６０を置き換える）、ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドのリンカー領域に加えることができる。特異的プロテアーゼの切断部位の配列もまた提供される：ＬＶＰＲ｜ＧＳ（トロンビン、配列番号５０）、ＥＮＬＹＦＱ｜Ｇ（ＴＥＶ、配列番号５１）、ＬＥＶＬＦＱ｜ＧＰ（PreScission、配列番号５２）、ＩＥＧＲ｜またはＩＤＧＲ｜（第Ｘａ因子、配列番号５３または５４）、ＤＤＤＤＫ｜（エンテロキナーゼ、配列番号５５）およびＡＨＲＥＱＩＧＧ｜（ＳＵＭＯプロテアーゼ、配列番号５６）。「｜」は、切断が起こる位置を示す。
【００９８】
本開示の他の側面は、ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドの機能的特徴づけを提供する。本開示のＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド、およびキメラＢｏＮＴポリペプチドは、標的細胞、例えば神経細胞に結合してこれに侵入し、その基質タンパク質、例えばＳＮＡＲＥタンパク質を切断することができる。用語「ＳＮＡＲＥタンパク質」とは、本明細書において用いられる場合、ＳＮＡＰ（Soluble NSF Attachment Protein）受容体を指し、これは、酵母および哺乳動物細胞における６０を超えるメンバーからなる大きなタンパク質スーパーファミリーである。ＳＮＡＲＥタンパク質の主な役割は、小胞融合、すなわち、小胞とそれらの標的膜結合コンパートメント（リソソームなど）との融合を媒介することである。最もよく研究されているＳＮＡＲＥタンパク質は、シナプス小胞と神経細胞におけるシナプス前膜とのドッキングを媒介するもの、例えばＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、シンタキシン１、およびＹｋｔ６である。これらのＳＮＡＲＥタンパク質のうちのいくつかは、ＢｏＮＴの基質である。例えば、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、およびシンタキシン１は、既知のＢｏＮＴ、例えばＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂにより切断されることが示されている。
【００９９】
本明細書において提供されるのは、ＢｏＮＴ／Ｘが、既知のＢｏＮＴの基質であるＳＮＡＲＥタンパク質を切断することを示すデータである。本開示の１つの驚くべき知見は、ＢｏＮＴ／Ｘが、他のＢｏＮＴが切断することができないいくつかのＳＮＡＲＥタンパク質、例えばＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、およびＹｋｔ６を切断することができるということである。ＶＡＭＰ４は、広く発現され、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）とエンドソームとの間の小胞の融合、ならびにエンドソームのホモタイプ融合を媒介することが知られている。ＢｏＮＴは、伝統的に、細胞膜に対する小胞のエキソサイトーシスを媒介するＳＮＡＲＥをターゲティングすることに限定されることが知られている。ＢｏＮＴ／Ｘは、予定として細胞膜ではない細胞内部の他の型の融合イベントを媒介するＳＮＡＲＥを切断することができる、最初のＢｏＮＴである。ＶＡＭＰ４はまた、神経細胞における非同期的なシナプス小胞エキソサイトーシス、エンラージオソーム（enlargeosome）エキソサイトーシス、および活性依存的バルクエンドサイトーシス（ＡＤＢＥ）にも寄与し得る。加えて、ＶＡＭＰ４は、免疫細胞における顆粒放出に関与していると考えられてきた。したがって、ＢｏＮＴ／Ｘは、全てのＢｏＮＴの中でも、免疫細胞における炎症性分泌を調節するユニークな潜在能力を有し得、これは、治療に活用することができる。ＶＡＭＰ５は、主に筋肉において発現し、その機能はまだ確立されていない。ＢｏＮＴ／Ｘは、ＶＡＭＰ４およびＶＡＭＰ５の機能を検討するためのユニークなツールとなるであろう。Ｙｋｔ６は、小胞体においてゴルジ輸送のために機能する。それはまた、初期／リサイクリングエンドソームからＴＧＮへの輸送においても機能する。本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドの基質としてのＹｋｔ６の同定は、ＢｏＮＴにより広範な細胞における分泌を遮断するための新たな治療的用途を開拓するので、重要である。
【０１００】
本開示の別の驚くべき知見は、ＢｏＮＴ／Ｘは、ＳＮＡＲＥタンパク質を、先には記載されていない新規の部位において切断するということである。本開示の例および図面において説明されるとおり、ＢｏＮＴ／Ｘは、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２およびＶＡＭＰ３におけるアミノ酸Ｒ６６−Ｓ６７の間を切断する。Ｒ６６−Ａ６７は、全ての他のＢｏＮＴについて確立された標的部位とは異なる、新規の切断部位である（図２Ｆ）。それはまた、先にＳＮＡＲＥモチーフとして知られていた領域内に位置する唯一のＢｏＮＴ切断部位である（図２Ｆ）。
【０１０１】
したがって、本開示のＢｏＮＴポリペプチドは、標的細胞および基質のプロフィールが拡大されている。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、細胞中のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、Ｙｋｔ６、およびシンタキシン１からなる群より選択されるＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ１（配列番号３９）を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ１を、配列番号３９のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ２（配列番号４０）を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ２を、配列番号４０のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ３（配列番号３１）を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ３を、配列番号４１のＲ６６およびＡ６７に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ４（配列番号４２）を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ４を、配列番号４２のＫ８７およびＳ８８に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ５（配列番号４３）を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、ＶＡＭＰ５を、配列番号４３のＲ４０およびＳ４１に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、Ｙｋｔ６（配列番号４４）を切断する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、Ｙｋｔ６を、配列番号４４のＫ１７３およびＳ１７４に対応するアミノ酸残基の間で切断する。
【０１０２】
いくつかの態様において、本開示のＢｏＮＴポリペプチドは、標的細胞中のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。本明細書において用いられる場合、「標的細胞」とは、天然に存在する細胞であって、ＢｏＮＴが侵入するかまたは中毒させることができる細胞を意味する。いくつかの態様において、標的細胞は、分泌細胞、例えば神経細胞または分泌型免疫細胞である。ＢｏＮＴの標的細胞となり得る神経細胞の例として、限定することなく、運動神経細胞；感覚神経細胞；自律神経細胞、例えば交感神経細胞および副交感神経細胞など；非ペプチド作動性神経細胞、例えばコリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、セロトニン作動性神経細胞、ＧＡＢＡ作動性神経細胞など；ならびにペプチド作動性神経細胞、例えばサブスタンスＰ神経細胞、カルシトニン遺伝子関連ペプチド神経細胞、血管作用性腸管ペプチド神経細胞、ニューロペプチドＹ神経細胞、コレシストキニン神経細胞などが挙げられる。
【０１０３】
本開示のＢｏＮＴポリペプチド、例えばＢｏＮＴ／Ｘまたは改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、ＶＡＭＰ４またはＹｋｔ６を切断するその能力に起因して、神経細胞以外の他の型の分泌細胞をターゲティングすることができる。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドによりターゲティングされる分泌細胞は、分泌型免疫細胞である。「分泌型免疫細胞」とは、本明細書において用いられる場合、サイトカイン、ケモカインまたは抗体を分泌する免疫細胞を指す。かかる分泌型免疫細胞は、限定することなく、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球および樹状細胞を含む、自然免疫細胞であってよい。抗体を分泌する分泌型免疫細胞（例えば白血球）もまた、本開示のＢｏＮＴポリペプチドによりターゲティングされ得る。抗体分泌細胞の非限定的な例として、限定することなく、プラズマＢ細胞、プラズマ細胞（plasmocyte）、プラズマ細胞（plasmacyte）、およびエフェクターＢ細胞が挙げられる。いくつかの態様において、標的細胞は、培養細胞、例えば培養神経細胞または培養分泌型免疫細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、in vivoのものである。いくつかの態様において、標的細胞は、哺乳動物からのものである。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。態様において、哺乳動物は、げっ歯類、例えばマウスまたはラットである。
【０１０４】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、神経活動を抑制する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、免疫応答を調節する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、弛緩性麻痺を誘導する。「弛緩性麻痺」とは、他の明らかな原因（例えば外傷）が存在しない脱力または麻痺、および低下した筋緊張により特徴づけられる臨床的徴候を指す。
【０１０５】
本開示の他の側面は、不活性なプロテアーゼドメインを含む改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドを提供する。かかるＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド（また本明細書において「不活性なＢｏＮＴ／Ｘ」としても言及される）は、標的細胞に侵入することができるが、プロテアーゼドメインの不活化に起因して、基質タンパク質（例えばＳＮＡＲＥタンパク質）を切断できない。いくつかの態様において、不活性なＢｏＮＴ／Ｘは、ａ）不活性なプロテアーゼドメイン；ｂ）リンカー領域；およびｃ）転位置ドメインを含む、Ｘ−ＬＣ−ＨＮフラグメントである。いくつかの態様において、不活性なＢｏＮＴ／Ｘは、ａ）不活性なプロテアーゼドメイン；ｂ）リンカー領域；ｃ）転位置ドメイン；およびｄ）受容体結合ドメインを含む、全長ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドである。いくつかの態様において、不活性なプロテアーゼドメインは、配列番号１のＲ３６０、Ｙ３６３、Ｈ２２７、Ｅ２２８、またはＨ２３１に対応する位置において、１つ以上の置換変異を含む。いくつかの態様において、１つ以上の置換変異は、配列番号１におけるＲ３６０Ａ／Ｙ３６３Ｆ、Ｈ２２７Ｙ、Ｅ２２８Ｑ、またはＨ２３１Ｙに対応する。不活性なＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、プロテアーゼドメインを不活化する任意の変異を含んでもよいことが、理解されるべきである。
【０１０６】
いくつかの態様において、不活性なＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号３１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、不活性なＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号３１〜３８のいずれか１つに対して、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、不活性なＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号３１〜３８のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、不活性なＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号３１〜３８のいずれか１つに対して、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、不活性なＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、配列番号３１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０１０７】
いくつかの態様において、不活性なＢｏＮＴ／Ｘ（例えば、不活性なＸ−ＬＣ−ＨＮまたは不活性な全長ＢｏＮＴ／Ｘ）は、リンカー領域において変異をさらに含む。いくつかの態様において、リンカー領域における改変は、配列番号１のＣ４６１またはＣ４６７に対応する位置において１つの単置換変異を含む。いくつかの態様において、単置換変異は、配列番号１におけるＣ４６１Ａ、Ｃ４６１Ｓ、Ｃ４６７Ａ、またはＣ４６７Ｓに対応する。いくつかの態様において、不活性なＢｏＮＴ／Ｘ（例えば、不活性な全長ＢｏＮＴ／Ｘ）は、受容体結合ドメインにおいて改変をさらに含む。いくつかの態様において、受容体結合ドメインにおける改変は、配列番号１のＣ１２４０に対応する位置において置換変異を含む。
【０１０８】
本明細書において記載される不活性なプロテアーゼドメインを含む改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、ヒトにおける標的細胞（例えば、神経細胞）への送達ツールとして利用することができることもまた想起される。例えば、改変ＢｏＮＴ／Ｘを、他の治療剤と、共有結合によりまたは非共有結合的に連結して、治療剤をヒトにおける標的細胞に送達するためのターゲティングビヒクルとして作用させることができる。
【０１０９】
したがって、本開示の別の側面は、第２の部分に連結された、プロテアーゼドメインを不活化する１つ以上の置換変異を含む不活性なＢｏＮＴ／Ｘである第１の部分を含むキメラポリペプチド分子に関する。分子の第２の部分は、治療剤（例えば、ポリペプチドまたは非ポリペプチド薬）などの生理活性分子であってよい。分子の第１の部分と第２の部分との連結は、共有結合によるもの（例えば融合タンパク質の形態におけるもの）であっても、非共有結合的なものであってもよい。かかる連結の方法は、当該分野において公知であり、当業者により容易に適用されることができる。キメラ分子の第２の部分がポリペプチドであって、キメラ分子がタンパク質の形態である場合、かかるキメラ分子をコードする核酸および核酸ベクターが提供される。
【０１１０】
また提供されるのは、核酸または核酸ベクターを含む細胞、およびかかるキメラ分子を発現する細胞である。融合タンパク質の形態にあるキメラ分子を、本明細書において開示される方法を用いて発現させてこれを単離してもよい。
本開示のポリペプチド（例えば、限定することなく、配列番号１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド）である第２の部分を含む、改変ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド、キメラＢｏＮＴポリペプチド、またはキメラ分子は、適切な細胞（例えばE. coliまたは昆虫細胞）において組み換え核酸からの発現により生成され、単離されるであろう。当該分野において公知の任意の方法により、本明細書において記載されるポリペプチドをコードする核酸を得て、当該核酸のヌクレオチド配列を決定することができる。
【０１１１】
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書において開示されるＢｏＮＴポリペプチドのうちのいずれかをコードする、単離された、および／または組み換えられた核酸である。本開示の単離ポリペプチドフラグメントをコードする核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ある側面において、単離ポリペプチドフラグメントをコードする対象の核酸は、本明細書において記載される改変ＢｏＮＴポリペプチドのうちのいずれかのバリアントであるポリペプチドをコードする核酸を含むものと、さらに理解される。
【０１１２】
バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントなどの、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列を含む。いくつかの態様において、本開示の単離された核酸分子は、配列番号１〜３８のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、本開示の単離された核酸分子は、配列番号１〜３８のいずれか１つに対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１１３】
いくつかの態様において、核酸は、発現ベクターなどのベクター内に含まれる。いくつかの態様において、ベクターは、核酸に作動的に連結したプロモーターを含む。
本明細書において記載されるポリペプチドの発現のために多様なプロモーターを用いることができ、これは、これらに限定されないが、以下を含む：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期（intermediate early）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲなどのウイルスＬＴＲ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、E. coliのｌａｃ  ＵＶ５プロモーター、および単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーター。制御可能プロモーターもまた用いることができる。かかる制御可能プロモーターとして、ｌａｃオペレーターを有する哺乳動物細胞プロモーターからの転写を制御するための転写調節因子としてE. coliからのｌａｃリプレッサーを用いるもの、［Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を用いるもの［Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)；Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998)；Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)］が挙げられる。
【０１１４】
他の系として、ＦＫ５０６二量体、アストラジオール（astradiol）を用いるＶＰ１６またはｐ６５、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン（diphenol murislerone）、またはラパマイシンが挙げられる。誘導可能な系は、Invitrogen、ClontechおよびAriadから入手可能である。オペロンによるリプレッサーを含む制御可能プロモーターを用いることができる。一態様において、Escherichia coliからのｌａｃリプレッサーは、転写調節因子として機能して、ｌａｃオペレーターを有する哺乳動物細胞プロモーターからの転写を制御することができる［M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)］；Gossen and Bujard (1992)［M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)］は、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を、転写活性化因子（ＶＰ１６）と組み合わせて、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）主要最初期プロモーターを由来とするｔｅｔＯを有するミニマルプロモーターを有するｔｅｔＲ−哺乳動物細胞転写活性化因子融合タンパク質、ｔＴａ（ｔｅｔＲ−ＶＰ１６）を作出し、哺乳動物細胞における遺伝子発現を制御するためのｔｅｔＲ−ｔｅｔオペレーター系を作出した。一態様において、テトラサイクリン誘導型のスイッチが用いられる（Yao et al., Human Gene Therapy; Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)；Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)）。
【０１１５】
加えて、ベクターは、例えば以下のうちのいくつかまたは全てを含んでもよい：選択可能マーカー遺伝子、例えば哺乳動物細胞における安定型または一過型の形質移入体の選択のためのネオマイシン遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセッシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳｅｓ）、万能多重クローニング部位；ならびにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのin vitro 転写のためのＴ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター。導入遺伝子を含有する好適なベクターおよびベクターを生成するための方法は、当該分野において周知であり、入手可能である。
【０１１６】
核酸を含む発現ベクターは、従来技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈降法）により宿主細胞に導入することができ、遺伝子導入された細胞を、次いで、従来技術により培養して、本明細書において記載されるポリペプチドを産生させる。いくつかの態様において、本明細書において記載されるポリペプチドの発現は、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターにより制御される。
【０１１７】
本明細書において記載される単離ポリペプチドを発現させるために用いられる宿主細胞は、Escherichia coliなどの細菌細胞、または好ましくは真核生物細胞のいずれかであってよい。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせて、免疫グロブリンのための効果的な発現系である（Foecking et al. (1986)「Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors」、Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990)「High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification」、Biotechnology 8:662-667）。本明細書において記載される単離ポリペプチドを発現させるために、多様な宿主−発現ベクター系を利用することができる。かかる宿主−発現系は、本明細書において記載される単離ポリペプチドのコード配列を産生させてその後に精製することができるビヒクルを代表するが、また、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または遺伝子導入された場合には、本明細書において記載される単離ポリペプチドをin situで発現する細胞をも代表する。これらは、限定されないが、本明細書において記載される単離ポリペプチドについてのコード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えばE. coliおよびB. subtilis）などの微生物；本明細書において記載される単離ポリペプチドをコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターを遺伝子導入された酵母（例えばSaccharomyces pichia）；本明細書において記載される単離ポリペプチドをコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；本明細書において記載される単離ポリペプチドをコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に感染した、または本明細書において記載される単離ポリペプチドをコードする配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムを由来とするプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスを由来とするプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現コンストラクトを有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ系細胞（米国特許第5,807,715号を参照）、ＰｅｒＣ．６細胞（Crucellにより開発されたヒト網膜細胞）を含む。
【０１１８】
細菌の系において、発現されているポリペプチドについての意図される用途に依存して、多数の発現ベクターを、有利に選択することができる。例えば、本明細書において記載されるポリペプチドの医薬組成物の生成のために大量のかかるタンパク質を産生させる場合、高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指揮する、容易に精製されるベクターが、望ましい場合がある。かかるベクターとして、これらに限定されないが、コード配列を、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域と共に、個々にベクター中にインフレームでライゲーションすることができるE. coli 発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruether et al. (1983)「Easy Identification Of cDNA Clones」、EMBO J. 2:1791-1794）；ｐＩＮベクター（Inouye et al. (1985)「Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli」、Nucleic Acids Res. 13:3101-3110；Van Heeke et al. (1989)「Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli」、J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターはまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために用いてもよい。一般的に、かかる融合タンパク質は、可溶性であり、溶解された細胞から、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合と、その後の遊離グルタチオンの存在下における溶離とにより、容易に精製することができる。
【０１１９】
ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子の生成物をＧＳＴ部分から放出させることができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。昆虫の系において、オートグラファカリフォルニア（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いる。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の細胞中で増殖する。コード配列は、ウイルスの非必須の領域（例えば、多核体タンパク質（polyhedrin）の遺伝子）中に個々にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多核体タンパク質プロモーター）の制御下においてもよい。
【０１２０】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素（tripartite）リーダー配列にライゲーションしてもよい。このキメラ遺伝子を、次いで、in vitroまたはin vivoでの組み換えにより、アデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須の領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染した宿主中で生存可能であり、免疫グロブリン分子を発現することができる組み換えウイルスをもたらすであろう（例えば、Loganら（1984年）「Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。特異的な開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要とされる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を保証するために、所望されるコード配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の多様な起源のものであってよい。
【０１２１】
発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含により増強することができる（Bitter et al. (1987)「Expression And Secretion Vectors For Yeast」、Methods in Enzymol. 153:516-544を参照）。加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、遺伝子生成物を所望される特定の様式において修飾およびプロセッシングするものを選択してもよい。タンパク質生成物のかかる修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要である場合がある。例えば、ある態様において、本明細書において記載されるポリペプチドは、本明細書において記載される別々のポリペプチドを形成するために、ネイティブまたは組み換えの細胞機構によるタンパク質分解による切断を必要とする、単一遺伝子生成物（例えば、単一のポリペプチド鎖として、すなわち、ポリタンパク質前駆体として）発現されてもよい。
【０１２２】
本開示は、したがって、本明細書において記載されるポリペプチドを含むポリタンパク質前駆体分子をコードする核酸配列を操作することを包含し、これは、前記ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断を指揮することができるコード配列を含む。ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断は、本明細書において記載されるポリペプチドをもたらす。本明細書において記載されるポリペプチドを含む前駆体分子の翻訳後切断は、in vivoで起きても（すなわち、宿主細胞内で、ネイティブのまたは組み換えの細胞系／機構、例えば適切な部位におけるフューリン切断による）、in vitroで起きてもよい（例えば、既知の活性のプロテアーゼまたはペプチダーゼを含む組成物中で、および／または、所望されるタンパク質分解作用を促進することが知られている条件または試薬を含む組成物中での、前記ポリペプチド鎖のインキュベーション）。
【０１２３】
組み換えタンパク質の精製および修飾は、当該分野において周知であり、したがって、ポリタンパク質前駆体の設計は、当業者により容易に理解される多数の態様を含む。記載される前駆体分子の修飾のために、当該分野において公知の任意の既知のプロテアーゼまたはペプチダーゼ、例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子（Nagaiら（1985年）「Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli」、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255、およびJennyら（2003年）「A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa」、Protein Expr. Purif. 31:1-11において概説される；これらの各々は、本明細書においてその全体において参考として援用される））、エンテロキナーゼ（Collins-Racieら（1995年）「Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA」、Biotechnology 13:982-987；本明細書によりその全体において参考として援用される））、フューリン、およびAcTEV（Parksら（1994年）「Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase」、Anal. Biochem. 216:413-417；本明細書によりその全体において参考として援用される））、ならびに口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３を用いることができる。
【０１２４】
異なる宿主細胞は、翻訳後のタンパク質および遺伝子生成物のプロセッシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機序を有する。発現された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを保証するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセッシング、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いることができる。かかる哺乳動物宿主細胞として、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられる。
【０１２５】
長期の、高収率での組み換えタンパク質の産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、本明細書において記載されるポリペプチドを安定して発現する細胞株を、設計することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、むしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択可能マーカーにより形質転換してもよい。外来ＤＮＡの導入の後で、設計された細胞を、１〜２日間にわたり富栄養培地中で増殖させて、次いで、選択培地に切り替えてもよい。組み換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体中に安定に組み込んで、コロニー（foci）を形成することを可能にし、これを次いでクローニングして、細胞株に増やすことができる。この方法は、本明細書において記載されるポリペプチドを発現する細胞株を操作するために、有利に用いることができ、このように設計された細胞株は、本明細書において記載されるポリペプチドと直接的にまたは間接的に相互作用するポリペプチドのスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０１２６】
多数の選択系を用いることができ、これは、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら（1977）「Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells」、Cell 11: 223-232）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalskaら（1992）「Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy」、Bioessays 14: 495-500）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら（1980）「Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene」、Cell 22: 817-823）を含み、遺伝子は、それぞれ、tk、hgprtまたはaprt細胞において使用することができる。また、代謝拮抗薬耐性も、以下の遺伝子についての選択の基礎として用いることができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら（1980）「Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570；O'Hareら（1981）「Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulliganら（1981）「Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076）；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Tolstoshev（1993）「Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions」、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan（1993）「The Basic Science Of Gene Therapy」、Science 260:926-932；およびMorganら（1993）「Human Gene Therapy」、Ann. Rev. Biochem. 62:191-217）ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreら（1984）「Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells」、Gene 30:147-156）。組み換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法であって用いることができるものは、Ausubelら（編）、1993年、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons, NY）；Kriegler、1990年、Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual（Stockton Press, NY）において；およびDracopoliら（編）、1994年、Current Protocols in Human Genetics（John Wiley & Sons, NY.）の第１２章および１３章；Colberre-Garapinら（1981）「A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells」、J. Mol. Biol. 150:1-14において記載される。
【０１２７】
本明細書において記載されるポリペプチドの発現レベルは、ベクターの増幅により増大させることができる（概説については、Bebbington and Hentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、第３巻（Academic Press, New York, 1987年）を参照）。本明細書において記載されるポリペプチドを発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養において存在するインヒビターのレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろう。増幅される領域は、本明細書において記載されるポリペプチドのヌクレオチド配列または本明細書において記載されるポリペプチドに関連するので、ポリペプチドの産生もまた増大するであろう（Crouseら（1983年）「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes」、Mol. Cell. Biol. 3:257-266）。
【０１２８】
本明細書において記載されるポリペプチドは、組み換えにより発現された後、ポリペプチド、ポリタンパク質または抗体の精製の分野において公知の任意の方法（例えば、抗原選択性に基づく抗体精製スキームに類似のもの）により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に特異的抗原に対するアフィニティーによるもの（任意に、ポリペプチドがＦｃドメイン（またはその部分）を含む場合にはタンパク質Ａ選択の後で）により、およびサイジングカラム（sizing column）クロマトグラフィー）、遠心分離、較差溶解度（differential solubility）により、またはポリペプチドまたは抗体の精製のための任意の他の標準的技術により、精製することができる。本開示の他の側面は、本明細書において記載される核酸または本明細書において記載されるベクターを含む細胞に関する。
【０１２９】
細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な細胞型は、本明細書において記載される。本開示の他の側面は、本明細書において記載される改変ＢｏＮＴポリペプチドを発現する細胞に関する。細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な細胞型は、本明細書において記載される。細胞は、核酸の伝播のため、または核酸の発現のため、または両方のためのものであってよい。かかる細胞として、限定することなく、好気性、微好気性、二酸化炭素志向性（capnophilic）、通性、嫌気性、グラム陰性およびグラム陽性の細菌細胞の株、例えば、限定することなくEscherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacteroides fragilis、Clostridia perfringens、Clostridia difficile、Caulobacter crescentus、Lactococcus lactis、Methylobacterium extorquens、Neisseria meningirulls、Neisseria meningitidis、Pseudomonas fluorescensおよびSalmonella typhimuriumに由来するものなど；ならびに、限定することなく、酵母株、例えばPichia pastoris、Pichia methanolica、Pichia angusta、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiaeおよびYarrowia lipolyticaに由来するものなどを含む真核生物細胞；昆虫細胞および昆虫に由来する細胞株、例えばSpodoptera frugiperda、Trichoplusia ni、Drosophila melanogasterおよびManduca sextaに由来するものなど；ならびに哺乳動物細胞および哺乳動物細胞に由来する細胞株、例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類およびヒトに由来するものなどを含む原核細胞が挙げられる。細胞株は、American Type Culture Collection、European Collection of Cell CulturesおよびGerman Collection of Microorganisms and Cell Culturesから得てもよい。適切な細胞株の選択、作製および使用のための具体的なプロトコルの非限定的例は、例えば、INSECT CELL CULTURE ENGINEERING（Mattheus F. A. Goosenら編、Marcel Dekker、1993年）；INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS（J. M. Vlakら編、Kluwer Academic Publishers、1996年）；Maureen A. Harrison & Ian F. Rae、GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE（Cambridge University Press、1997年）；CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES（Alan Doyleら編、John Wiley and Sons、1998年）；R. Ian Freshney、CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE（Wiley-Liss、第４版、2000年）；ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH（John R. W. Masters ed., Oxford University Press、第３版、2000）；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL、上記（2001年）；BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH（John M. Davis, Oxford Press、第２版、2002年）；およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、上記（2004年）において記載される。
【０１３０】
これらのプロトコルは、当業者の範囲において、および本明細書における教示から、慣用的な手順である。本開示のさらに他の側面は、本明細書において記載されるポリペプチドを生成する方法に関し、該方法は、本明細書において記載される細胞を得ること、および前記細胞において本明細書において記載される核酸を発現することを含む。いくつかの態様において、方法は、本明細書において記載されるポリペプチドを単離および精製することをさらに含む。
【０１３１】
いくつかの態様において、ボツリヌスニューロトキシンは、発酵槽においてClostridium botulinumの培養を確立してこれを増殖させ、次いで発酵させた混合物を公知の手順に従って採取および精製することにより、得られることができる。全てのボツリヌストキシン血清型は、不活性な単鎖タンパク質として最初に合成され、これは、向神経活性となるために、プロテアーゼにより切断するかまたはニックを入れなければならない。
【０１３２】
ボツリヌストキシン血清型ＡおよびＧを産生する細菌株は、内因性プロテアーゼを有し、したがって、血清型ＡおよびＧは、細菌培養物から、主にそれらの活性な形態において回収することができる。対照的に、ボツリヌストキシン血清型Ｃ、ＤおよびＥは、非タンパク質分解株により合成され、したがって、典型的には、培養物から回収された時点では不活性である。血清型ＢおよびＦは、タンパク質分解株と非タンパク質分解株との両方により産生され、したがって、活性または不活性な形態のいずれかにおいて回収することができる。例えばボツリヌストキシン血清型Ｂ型を産生するタンパク質分解株は、産生されるトキシンの一部のみを切断する場合がある。これらの菌株を用いるＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドの産生は、本明細書において企図される。
【０１３３】
ニックを入れた分子のニックがない分子に対する正確な比率は、インキュベーションの長さおよび培養の温度に依存する。したがって、例えばボツリヌストキシンＢ型トキシンの調製物のうちの一定のパーセンテージは、不活性であってもよい。一態様において、本開示のニューロトキシンは、活性な状態にある。一態様において、ニューロトキシンは、不活性な状態にある。一態様において、活性および不活性なニューロトキシンの組み合わせが企図される。
【０１３４】
本開示の一側面は、ＢｏＮＴの２つの非毒性のフラグメントをライゲーションするin vitroトランスペプチダーゼ反応を介してＢｏＮＴを生成する、新規の方法を提供する。かかる方法は、以下のステップを含む：（ｉ）軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＮ）のＮ末端ドメインを含む第１のＢｏＮＴフラグメントを得ること、ここで、第１のＢｏＮＴフラグメントは、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＧ（配列番号６０）モチーフを含む；（ｉｉ）重鎖（ＨＣ）のＣ末端ドメインを含む第２のＢｏＮＴフラグメントを得ること；ここで、第２のＢｏＮＴフラグメントは、そのＮ末端において、特異的なプロテアーゼ切断部位を含む；（ｉｉｉ）第２のＢｏＮＴフラグメントを、特異的プロテアーゼにより切断すること、ここで、切断は、Ｎ末端において遊離のグリシン残基をもたらす；ならびに（ｉｖ）第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとを、トランスペプチダーゼの存在下において接触させ、それにより、第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとをライゲーションして、ライゲーションされたＢｏＮＴを形成させること。
【０１３５】
いくつかの態様において、第１のＢｏＮＴフラグメントは、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＧ（配列番号６０）モチーフ（例えば、配列番号４５）、またはその任意のバリアントに融合した、本明細書において記載されるＸ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドを含む。いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、本明細書において記載されるＨＣポリペプチド、またはその任意のバリアント（例えば、配列番号４６）を含む。本明細書において記載される方法を用いて、任意のＢｏＮＴフラグメントまたはドメインをライゲーションすることができることが、理解されるべきである。
【０１３６】
本明細書において記載される方法はまた、キメラＢｏＮＴを作製するために用いてもよい。例えば、第１のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＸからのものであってよい。同様に、第２のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＸからのものであってよい。当業者は、作製することができる組み合わせを識別することができるであろう。いくつかの態様において、本明細書において記載されるキメラＢｏＮＴポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ａ１−ＨＣ、ＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｂ１−ＨＣ、またはＢｏＮＴ／Ｘ−ＬＣ−ＨＮ−Ｃ１−ＨＣ）は、この方法を用いて作製される。
【０１３７】
いくつかの態様において、トランスペプチダーゼは、ソルターゼである。いくつかの態様において、ソルターゼは、黄色ブドウ球菌からのものである（ＳｒｔＡ）。
当該分野において利用可能な他のペプチドライゲーション系もまた、２つの非毒性のＢｏＮＴフラグメントをライゲーションするために用いることができる。例えば、インテインにより媒介されるタンパク質ライゲーション反応は、Ｎ末端システイン残基を有する合成ペプチドまたはタンパク質の、細菌により発現されるタンパク質のＣ末端への、ネイティブのペプチド結合を通してのライゲーションを可能にする（Evans et al., (1998) Protein Sci.7, 2256-2264；Dawson et al.,(1994) Science266, 776-779；Tam et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 12485-12489；Muir et al.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95,6705-6710；Severinov and Muir (1998) J. Biol. Chem.273, 16205-16209：これらの全内容は、本明細書において参考として援用される）。インテインにより媒介されるタンパク質ライゲーション反応のためのキットは、市販されている（例えばNew England Biolabsから）。
【０１３８】
いくつかの態様において、第１のＢｏＮＴフラグメントは、アフィニティータグをさらに含む。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｎ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｃ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。アフィニティータグが第１のＢｏＮＴフラグメントのＣ末端に融合している場合、トランスペプチダーゼは、ＬＰＸＴＧＧ（配列番号６０）モチーフにおけるＴとＧとの間を切断し、第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとをライゲーションする前に、アフィニティータグを取り除く。
【０１３９】
いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、アフィニティータグをさらに含む。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｎ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｃ末端において第２のＢｏＮＴフラグメントに融合している。アフィニティータグが第１のＢｏＮＴフラグメントのＮ末端に融合している場合、特異的プロテアーゼは、特異的プロテアーゼにおける切断部位を切断し、トランスペプチダーゼにより、第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとをライゲーションする前に、アフィニティータグを取り除く。
【０１４０】
「アフィニティータグ」とは、本明細書において用いられる場合、基質または部分に特異的に結合することができるポリペプチド配列を指す。例えば、６個のヒスチジンを含むタグは、Ｎｉ２＋に特異的に結合する。アフィニティータグは、タンパク質の単離を容易にするために、タンパク質に付加してもよい。アフィニティータグは、典型的には、当業者に公知の組み換えＤＮＡ技術を介してタンパク質に融合させる。タンパク質の単離を容易にするためのアフィニティータグの使用もまた、当該分野において周知である。本開示に従って用いることができる好適なアフィニティータグとして、限定することなく、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Softag 1、Softag 3、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Xpress、Ｈａｌｏ、およびＦｃが挙げられる。
【０１４１】
第２のＢｏＮＴフラグメントは、Ｎ末端において特異的なプロテアーゼ切断を有する。特異的プロテアーゼによる部位の切断は、第２のＢｏＮＴフラグメントのＮ末端において遊離のグリシン残基を生じる。本開示に従って用いることができる好適な特異的プロテアーゼとして、限定することなく、トロンビン、ＴＥＶ、PreScission、エンテロキナーゼ、およびＳＵＭＯプロテアーゼが挙げられる。いくつかの態様において、特異的プロテアーゼは、トロンビンであり、切断部位は、ＬＶＰＲ｜ＧＳ（配列番号５０）である。
【０１４２】
本明細書において記載されるＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドは、治療的使用のための潜在能力を提供する。例えば、ＢｏＮＴ／Ｘは、他のＢｏＮＴ血清型と比較して、より強力であり得る。ＢｏＮＴ／Ｘは、他のＢｏＮＴ血清型よりも多くの基質を切断するその能力に起因して、より多用途であり、広範な細胞においてより有効であり得る。
したがって、本開示はまた、本開示のＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドまたはキメラ分子を含む医薬組成物を企図する。本開示においてまたのちに明らかとなり得るとおり、本開示の医薬組成物は、かかる組成物が処置するように設計される特定の疾患のために好適な他の治療剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、本開示の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
【０１４３】
用語「薬学的に許容し得る担体」とは、本明細書において用いられる場合、ポリペプチドを身体の１つの部位（例えば送達部位）から別の部位（例えば、臓器、組織または身体の部分）へと運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸）、あるいは溶媒封入材料を意味する。
【０１４４】
薬学的に許容し得る担体は、処方物の他の成分と適合性であって対象の組織に対して傷害性ではない（例えば、生理学的に適合性、無菌、生理学的ｐＨなど）という意味において「許容し得る」である。薬学的に許容し得る担体として使用することができる材料のいくつかの例として、以下が挙げられる：（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよび馬鈴薯デンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末状トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤用ワックス；（９）油脂、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油。ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝化剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）嵩高剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（２３）血清構成成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２２）Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；ならびに（２３）医薬処方物において使用される他の非毒性の適合性の物質。湿潤化剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、処方物中に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」などの用語は、本明細書において交換可能に用いられる。いくつかの態様において、組成物中の本開示のＢｏＮＴポリペプチドは、注射により、カテーテルにより、坐剤により、または移植片により投与され、移植片は、多孔質、無孔質、またはゼラチン状の材料であり、これはシラスティック（Sialastic）メンブレンなどの膜または繊維を含む。
【０１４５】
典型的には、組成物を投与する場合、本開示のポリペプチドが吸収されない材料を用いる。他の態様において、本開示のＢｏＮＴポリペプチドは、徐放系において送達される。投与のためのかかる組成物および方法は、米国特許公開番号No. 2007/0020295において提供され、その内容は、本明細書において参考として援用される。一態様において、ポンプを用いてもよい（例えば、Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。別の態様において、ポリマー材料を用いることができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release（LangerおよびWise編、CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974年）；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance（SmolenおよびBall編、Wiley, New York, 1984年）；Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照。また、Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105を参照）。他の徐放系は、例えば上記のLangerにおいて議論される。
【０１４６】
本開示のＢｏＮＴポリペプチドは、結合剤の治療有効量および１つ以上の薬剤的に適合性の材料を含む医薬組成物として、投与することができる。典型的な態様において、医薬組成物は、慣用的な手順に従って、対象、例えばヒトへの静脈内または皮下投与のために適応させた医薬組成物として、処方される。
【０１４７】
典型的には、注射による投与のための組成物は、無菌の等張水性バッファー中の溶液である。必要である場合は、医薬はまた、注射の部位における疼痛を緩和するために、可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔剤を含むことができる。一般に、成分は、単位投与形態において、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ（sachette）などの気密密封容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々に、または一緒に混合して、供給される。医薬が注入により投与されるべき場合、それは、無菌の医薬グレードの水または食塩水を含有する注入ボトルにより分配される。医薬が注射により投与される場合、成分を投与の前に混合することができるように、注射用の無菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。全身投与のための医薬組成物は、液体、例えば無菌の食塩水、乳酸リンガーまたはハンクス溶液であってよい。加えて、医薬組成物は、固体の形態であってもよく、使用の直前に再溶解または懸濁されてもよい。凍結乾燥形態もまた企図される。医薬組成物は、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子または小胞中に含有されていてもよく、これもまた、非経口投与のために好適である。粒子は、組成物がその中に含有される限り、単層または複層などの任意の好適な構造のものであってよい。
【０１４８】
本開示のポリペプチドを、膜融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５〜１０ｍｏｌ％）のカチオン性脂質を含有する「安定化されたプラスミド−脂質粒子」（ＳＰＬＰ）中に封入して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングにより安定化させることができる（Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47）。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェートまたは「ＤＯＴＡＰ」などの正に荷電した脂質が、かかる粒子および小胞のために特に好ましい。かかる脂質粒子の調製は、周知である。例えば、米国特許第4,880,635号；同第4,906,477号；同第4,911,928号；同第4,917,951号；同第4,920,016号；および同第4,921,757号を参照。本開示の医薬組成物は、例えば単位用量として投与または包装してもよい。
【０１４９】
用語「単位用量」とは、本開示の医薬組成物に関して用いられる場合、対象のための単位投与量として好適な物理的に別々の単位を指し、各単位が、所望される治療効果をもたらすために計算された予め決定された量の活性材料を、必要とされる希釈剤；すなわち担体またはビヒクルと組み合わせて含有する。いくつかの態様において、本明細書において記載されるＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドを、治療用部分、例えば抗生物質と抱合させてもよい。かかる治療用部分を例えばＦｃドメインを含むポリペプチドに抱合させるための技術は、周知である；例えば、Amonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中、Reisfeldら（編）、1985年、pp. 243-56、Alan R. Liss, Inc.）；Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery（第２版）中、Robinsonら（編）、1987年、pp. 623-53、Marcel Dekker, Inc.）；Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications中、Pincheraら（編）、1985年、pp. 475-506）；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中、Baldwinら（編）、1985年、pp. 303-16、Academic Press；およびThorpeら（1982）「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」、Immunol. Rev., 62:119-158を参照。さらに、医薬組成物は、（ａ）本開示のポリペプチドを凍結乾燥形態において含有する容器、および（ｂ）注射のための薬学的に許容し得る希釈剤（例えば無菌水）を含有する第２の容器、を含む医薬キットとして提供することができる。薬学的に許容し得る希釈剤は、本開示の凍結乾燥ポリペプチドの再構成または希釈のために用いることができる。任意にかかる容器に付随するのは、医薬または生物由来物質の製造、使用または販売を規制する政府の機関により処方される形式の通知であってもよく、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する。別の側面において、上記の疾患の処置に役立つ材料を含有する製品が含まれる。いくつかの態様において、製品は、容器およびラベルを含む。
【０１５０】
好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。いくつかの態様において、容器は、本明細書において記載される疾患を処置するために有効である組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有していてもよい。例えば、容器は、皮下注射針により穿通可能な静脈内溶液バッグまたはストッパーを有するバイアルであってもよい。組成物中の活性剤は、本開示の単離ポリペプチドである。いくつかの態様において、容器に付随するラベルは、組成物が、選択される疾患を処置するために用いられることを示す。製品は、リン酸緩衝化食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容し得るバッファーを含む、第２の容器をさらに含んでもよい。それは、商業上のおよび使用者の視点から望ましい他の材料（他のバッファー、希釈剤、充填剤、針、シリンジおよび使用のための説明を含むパッケージ挿入物を含む）を、さらに含んでもよい。
【０１５１】
本開示のＢｏＮＴポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチド）、キメラ分子、および医薬組成物は、望ましくない神経細胞の活動に関連する状態の処置のために用いてもよい。したがって、本明細書においてさらに提供されるのは、望ましくない神経活動に関連する状態を処置する方法であって、該方法は、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチド、キメラ分子、または医薬組成物の治療有効量を、それにより状態を処置するために投与することを含む。いくつかの態様において、本開示のＢｏＮＴポリペプチド、キメラ分子、および医薬組成物は、望ましくない神経活動を示している１つ以上の神経細胞に接触する。
【０１５２】
典型的にニューロトキシンにより処置される状態（例えば、骨格筋の状態、平滑筋の状態、腺の状態、神経筋障害、自律神経系障害、疼痛または審美的／美容的状態）は、当業者により決定されるように、望ましくない神経活動に関連する。投与は、組成物の有効量を、望ましくない活動を示している神経細胞に接触させる経路により行われる。いくつかの態様において、状態は、過活動の神経細胞または腺に関連するものであってもよい。本明細書において議論される方法による処置について想起される具体的な状態として、限定することなく、痙攣性発声障害、痙性斜頚（spasmodic torticollis）、喉頭ジストニア、顎口腔性発声障害、舌ジストニア、痙性斜頚（cervical dystonia）、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、限局性痙攣および他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙攣、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害、および他の筋緊張障害、および筋群の不随意運動により特徴づけられる他の障害、流涙、多汗症、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸管分泌、ならびに他の分泌障害、筋痙攣からの疼痛、頭痛が挙げられる。加えて、本開示は、皮膚科学的または審美的／美容的状態を処置するために、例えば眉間のしわの軽減、皮膚の小じわの軽減のために用いることができる。
【０１５３】
本開示のＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドの１つのユニークな特性は、そのＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、およびＹｋｔ６を切断する能力である。したがって、本明細書においてさらに企図されるのは、広範な細胞における望ましくない分泌活性に関連する状態における、ＢｏＮＴ／Ｘポリペプチドの治療的使用である。いくつかの態様において、望ましくない分泌は免疫分泌である。望ましくない免疫分泌と関連する状態として、限定することなく、炎症、乾癬、アレルギー、血球貪食性リンパ組織球症、およびアルコール性膵疾患が挙げられる。
【０１５４】
本開示はまた、スポーツ外傷の処置において用いることができる。Borodic、米国特許第5,053,005号は、ボツリヌスＡ型を用いる若年性脊柱弯曲症（spinal curvature）、すなわち、脊柱側弯症（scoliosis）を処置するための方法を開示する。Borodicの開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。一態様において、Borodicにより開示されるものと実質的に類似の方法を用いて、ＢｏＮＴポリペプチドを、脊柱弯曲症を処置するために、哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。好適な態様において、ロイシンベースのモチーフと融合したボツリヌスＥ型を含むＢｏＮＴポリペプチドを投与する。さらにより好ましくは、その軽鎖のカルボキシ末端にロイシンベースのモチーフが融合したボツリヌスＡ〜Ｅ型を含むＢｏＮＴポリペプチドを、脊柱弯曲症を処置するために、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【０１５５】
加えて、ＢｏＮＴポリペプチドは、ボツリヌスＡ型により一般に行われる周知の技術を用いて、神経筋障害を処置するために、投与することができる。例えば、本開示は、疼痛、例えば、頭痛、筋痙攣からの疼痛、および多様な形態の炎症性疼痛を処置するために用いることができる。例えば、Aoki、米国特許第5,721,215号およびAoki、米国特許第6,113,915号は、疼痛を処置するためにボツリヌストキシンＡ型を用いる方法を開示する。これら２つの特許の開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０１５６】
自律神経系障害もまた、改変ニューロトキシンにより処置することができる。例えば、腺の機能不全は自律神経系障害である。腺の機能不全として、過剰発汗および過剰唾液分泌が挙げられる。呼吸器機能不全は、自律神経系障害の別の例である。呼吸器機能不全として、慢性閉塞性肺疾患および喘息が挙げられる。Sandersらは、自律神経系を処置する；例えば、過剰発汗、過剰唾液分泌、喘息などの自律神経系障害を、天然に存在するボツリヌストキシンを用いて処置するための方法を開示する。Sanderらの開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０１５７】
一態様において、上記のものなどの自律神経系障害を処置するために、ＢｏＮＴポリペプチドを用いて、Sandersらのものと実質的に類似の方法を使用することができる。例えば、ＢｏＮＴポリペプチドは、鼻腔内の粘膜の分泌を制御する自律神経系のコリン作動性神経細胞を変性させるために十分な量で、哺乳動物の鼻腔に局所的に適用することができる。改変ニューロトキシンにより処置することができる疼痛として、筋張力、または攣縮により引き起こされる疼痛、または筋肉の攣縮と関連しない疼痛が挙げられる。例えば、Binderは、米国特許第5,714,468号において、血管障害、筋張力、神経痛およびニューロパシーにより引き起こされる頭痛を、天然に存在するボツリヌストキシン、例えばボツリヌスＡ型で処置することができることを開示する。Binderの開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０１５８】
一態様において、頭痛、特に血管障害、筋張力、神経痛およびニューロパシーにより引き起こされるものを処置するために、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドを用いて、Binderのものと実質的に類似の方法を使用することができる。筋張力により引き起こされる疼痛もまた、本明細書において記載されるＢｏＮＴポリペプチドの投与により処置することができる。例えば、好ましくはボツリヌスＥ型軽鎖のカルボキシル末端においてロイシンベースのモチーフと融合したボツリヌスＥ型を、疼痛／攣縮の位置において、疼痛を軽減するために、筋肉内投与することができる。さらに、改変ニューロトキシンは、攣縮などの筋肉障害に関連しない疼痛を処置するために、哺乳動物に投与することができる。
【０１５９】
一つの広範な態様において、非攣縮関連疼痛を処置するための本開示の方法は、ＢｏＮＴポリペプチドの中枢投与または末梢投与を含む。例えば、Fosterらは、米国特許第5,989,545号において、疼痛を緩和するために、ターゲティング部分に抱合したボツリヌストキシンを中枢に（くも膜下腔内に）投与することができることを開示する。Fosterらの開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０１６０】
一態様において、疼痛を処置するために、本明細書において記載される組成物を用いて、Fosterらのものと実質的に類似の方法を使用することができる。処置されるべき疼痛は、急性疼痛であっても慢性疼痛であってもよい。筋攣縮に関連しない急性または慢性の疼痛はまた、哺乳動物における実際のまたは知覚される疼痛の位置への改変ニューロトキシンの局所的な末梢投与により軽減することができる。
【０１６１】
一態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、疼痛の位置においてまたはその近傍において、例えば切り傷においてまたはその近傍において、皮下投与される。いくつかの態様において、改変ニューロトキシンは、疼痛の位置においてまたはその近傍において、例えば哺乳動物における挫傷の位置においてまたはその近傍において、筋肉内投与される。いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、関節炎の状態により引き起こされる疼痛を処置または軽減するために、哺乳動物の関節中に直接注射される。また、頻繁に繰り返される改変ニューロトキシンの末梢の疼痛の位置への注射または注入は、本開示の範囲内である。かかる方法のための投与の経路は、当該分野において公知であり、当業者により、本明細書において記載される方法に容易に適用される（例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine（1998年）、Anthony Fauciら編、第14版、McGraw Hill発行を参照）。
【０１６２】
非限定的な例として、神経筋障害の処置は、有効量の分子を筋肉または筋群に局所投与するステップを含んでもよく、自律神経系障害の処置は、有効量の分子を腺に局所投与するステップを含んでもよく、および疼痛の処置は、有効量の分子を疼痛の部位に投与するステップを含んでもよい。加えて、疼痛の処置は、有効量の改変ニューロトキシンを脊髄に投与するステップを含んでもよい。
【０１６３】
「治療有効量」とは、本明細書において用いられる場合、本開示の各治療剤が、単独で、または１つ以上の他の治療剤と組み合わせて、対象に対して治療効果を与えるために必要とされる量を指す。有効量は、当業者により認識されるとおり、保健の実務家の知識および専門的意見の範囲内において、処置されている特定の状態、状態の重篤度、個々の対象のパラメーター（年齢、身体的状態、サイズ、性別および体重を含む）、処置の期間、併用治療の性質（ある場合は）、投与の具体的な経路などの要因に依存して変化する。これらの要因は、当業者には周知であり、慣用的な実験のみを用いて取り組むことができる。個々の構成成分またはその組み合わせの最大用量、健全な医学的判断に従った最大の安全な用量が用いられることが一般に好ましい。しかし、当業者は、対象が医学的理由、精神的理由、または実質的にあらゆる他の理由のために、より低い用量または耐容可能な用量を主張する場合があることを理解するであろう。半減期などの経験的配慮は、一般に、投与量の決定に寄与するであろう。例えば、ポリペプチドの半減期を延長するために、およびポリペプチドが宿主の免疫系により攻撃されることを防ぐために、ヒト化抗体または完全ヒト抗体からの領域を含むポリペプチドなどの、ヒト免疫系に適合可能な治療剤を用いてもよい。
【０１６４】
投与の頻度は、治療の過程にわたって決定および調整することができ、一般に、必ずしもではないが、疾患の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、ポリペプチドの持続的徐放処方物が適切である場合がある。持続的放出を達成するための多様な処方物およびデバイスは、当該分野において公知である。いくつかの態様において、投与は、毎日、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、または６日に１回である。いくつかの態様において、投与頻度は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、または１０週間に１回；または１か月に１回、２か月に１回、または３か月に１回、またはそれより長い。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。
【０１６５】
投与レジメン（用いられるポリペプチドを含む）は、経時的に変化してもよい。いくつかの態様において、正常な体重の成人の対象に対して、約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与することができる。いくつかの態様において、用量は、１〜２００ｍｇである。特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の対象およびその対象の病歴、ならびにポリペプチドの特性（ポリペプチドの半減期、および当該分野において周知の他の考慮事項など）に依存するであろう。
【０１６６】
本開示の目的のために、本明細書において記載されるような治療剤の適切な投与量は、使用される具体的な剤（またはその組成物）、処方および投与の経路、疾患の型および重篤度、ポリペプチドが予防または治療のいずれの目的のために投与されるのか、先行する治療、対象の臨床歴およびアンタゴニストに対する応答、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。典型的には、臨床医は、投与が、所望される結果を達成するに至るまで、ポリペプチドを投与するであろう。
【０１６７】
１つ以上のポリペプチドの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療または予防のいずれであるのか、および当業者に公知の他の要因に依存して、連続的であっても断続的であってもよい。ポリペプチドの投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であっても、一連の間隔を空けた用量、例えば、疾患を発症する前、その間、またはその後であってもよい。本明細書において用いられる場合、用語「処置すること」とは、ポリペプチドまたは組成物の適用または投与を指し、それを必要とする対象へのポリペプチドを含む。
【０１６８】
「それを必要とする対象」とは、疾患、疾患の症状、または疾患に向かう素因を有する個人であって、当該疾患、疾患の症状、または疾患に向かう素因を、治癒（cure）、治癒（heal）、軽減、緩和、変更、加療、寛解、改善またはこれに影響を及ぼす目的を有するものを指す。いくつかの態様において、対象は、ＣＤＩを有する。いくつかの態様において、対象は癌を有する。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象はヒトである。疾患を軽減することとは、疾患の発症または進行を遅延させること、または疾患の重篤度を低下させることを含む。疾患を軽減することとは、必ずしも治癒的な結果を必要としない。
【０１６９】
本明細書において用いられる場合、疾患の発症を「遅延させること（delaying）」とは、疾患の進行を延期すること、妨害すること、減速させる（slow）こと、遅らせる（retard）こと、安定化させること、および／または延期することを意味する。この遅延は、処置されている疾患および／または個人の病歴に依存して、異なる長さの時間であってよい。疾患の進行を「遅延させる」かまたはこれを軽減する、または疾患の発症を遅延させる方法とは、当該方法を用いない場合と比較して、所与の時間枠において、疾患の１つ以上の症状を発症する可能性を低下させるか、および／または、所与の時間枠において症状の程度を軽減する方法である。かかる比較は、典型的には、統計学的に有意な結果を得るために十分に多数の対象を用いる臨床研究に基づく。
【０１７０】
疾患の「発症」または「進行」とは、疾患の初期症状および／または後に続く進行を意味する。疾患の発症は、検出可能であり得、当該分野において周知のとおりの標準的な臨床技術を用いて評価することができる。しかし、発症はまた、検出不可能であり得る進行をも指す。本開示の目的のために、発症または進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生（occurrence）、再発（recurrence）、開始（onset）を含む。
【０１７１】
本明細書において用いられる場合、疾患の「開始」または「発生」は、最初の開始および／または再発を含む。単離ポリペプチドまたは医薬組成物を対象に投与するために、処置されるべき疾患の型または疾患の部位に依存して、医学の分野における当業者に公知の従来の方法を用いることができる。この組成物はまた、他の従来の経路を介して投与することができ、例えば経口で、非経口で、吸入スプレーにより、局所で、直腸で、鼻で、頬側で、膣で、または移植されたリザーバを介して投与することができる。
【０１７２】
用語「非経口」とは、本明細書において用いられる場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。加えて、それは、注射可能なデポー型の投与の経路を介して、例えば１、３または６か月デポー型の注射可能または生分解性の材料および方法を用いて、対象に投与することができる。
【０１７３】
本明細書において用いられる場合、「対象」とは、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜動物または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類として、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。げっ歯類として、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが挙げられる。家畜および狩猟動物として、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコの種、例えば飼いネコ、イヌの種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリの種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えばマス、ナマズおよびサケが挙げられる。患者または対象として、前述のものの任意のサブセット、例えば上のものの全てを含むが、１つ以上の群または種、例えばヒト、霊長類またはげっ歯類を除く。本明細書において記載される側面のある態様において、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。
【０１７４】
用語、「患者」および「対象」は、本明細書において交換可能に用いられる。対象は、雄性であっても雌性であってもよい。対象は、完全に発達した対象（例えば成体）であっても、発達のプロセスを経験している対象（例えば小児、乳児または胎児）であってもよい。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであってよいが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、望ましくない神経活動に関連する障害の動物モデルを表す対象として、有利に用いることができる。加えて、本明細書において記載される方法および組成物は、家畜化された動物および／またはペットを処置するために用いることができる。
【０１７５】
以下の例は、特定の態様の説明を目的とするものであって、非限定的である。本願全体にわたり引用された参考文献（学術文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全ての全内容は、本明細書により参考として明示的に援用される。
【０１７６】
例
表１  ＢｏＮＴポリペプチドの配列
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【０１７７】
新規ボツリヌスニューロトキシンおよびその誘導体
ボツリヌスニューロトキシン（ＢｏＮＴ）は、最も危険な潜在的なバイオテロ剤のうちのものであり、また、臨床的に、増大しつつあるリストの医学的状態を処置するために用いられている。今日までにＢｏＮＴの７つの血清型（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ）が知られており、過去４５年間にわたり新たな型は認識されていない。Clostridium Botulinum菌株のゲノムデータベース検索により、新規のＢｏＮＴの型が明らかとなり、これをＢｏＮＴ／Ｘと命名した。このトキシンは、他のＢｏＮＴと最も低い配列同一性を示し、既知のＢｏＮＴ型に対して産生された抗血清によっては認識されない。それは、神経細胞において、ＢｏＮＴ／Ｂ／Ｄ／Ｆ／Ｇの標的でもある小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を切断するが、ＢｏＮＴ／Ｘは、このトキシンにユニークな部位（ＶＡＭＰ２におけるＡｒｇ６６−Ａｌａ６７の間）を切断する。ＢｏＮＴ／Ｘの活性を検証するために、トランスペプチダーゼ（ソルターゼ）を用いてＢｏＮＴ／Ｘの２つの非毒性のフラグメントを共有結合により連結することにより、限定された量の全長ＢｏＮＴ／Ｘを組み立てた。組み立てたＢｏＮＴ／Ｘは、培養神経細胞に侵入してＶＡＭＰ２を切断し、マウスにおいて指外転スコア（Digit Abduction Score）アッセイにより、弛緩性麻痺を引き起こした。まとめると、これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ｘを新規のＢｏＮＴ型として確立した。その発見は、有効な対応策を開発するための緊急の課題を提案し、また、潜在的な治療的適用のための新規のツールを提示する。
【０１７８】
ゲノムデータベースの検索により新規のＢｏＮＴ遺伝子が明らかとなった
ＢｏＮＴの進化的な状況を調べることを試みて、７つのＢｏＮＴの配列をプローブとして利用して、PubMed配列データベースの反復性隠れマルコフモデル検索を行った。検索により、主要なＢｏＮＴ血清型、サブタイプおよびモザイクトキシン、ならびに関連する破傷風ニューロトキシン（ＴｅＮＴ）が首尾よく同定された（図５）。予想外のことに、それはまた、最近報告されたClostridium Botulinum菌株１１１のゲノム配列からの新規のＢｏＮＴ遺伝子（GenBank番号BAQ12790.1）を明らかにした。このトキシン遺伝子は、本明細書においてＢｏＮＴ／Ｘと称される。
【０１７９】
系統発生学的分析により、ＢｏＮＴ／Ｘが、全ての他のＢｏＮＴおよびＴｅＮＴとは明らかに区別し得ることが明らかとなった（図１Ａ）。それは、ＢｏＮＴ／ＴｅＮＴファミリー内のペアワイズ比較のうちで、あらゆる他のＢｏＮＴと最も低いタンパク質配列同一性（＜３１％）を有する（図１Ａ）。例えば、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ｂとは、３９％の配列同一性を共有し、ＢｏＮＴ／ＢとＢｏＮＴ／Ｇとは、５８％の配列同一性を有する。さらに、スライディング配列比較ウィンドウは、他の７つのＢｏＮＴおよびＴｅＮＴと比較して、ＢｏＮＴ／Ｘ配列に沿って低い類似性が均等に分布していることを示し（図１Ｂ）、このことは、それがモザイクトキシンではないことを示している。
【０１８０】
低い配列同一性にもかかわらず、全体的なドメインの配置およびＢｏＮＴのいくつかの重要な特徴は、ＢｏＮＴ／Ｘにおいて保存されると考えられ（図１Ｂ）、これらは、以下を含む：（１）保存された亜鉛依存的プロテアーゼモチーフＨＥｘｘＨ（残基２２７〜２３１、ＨＥＬＶＨ（配列番号９２））は、推定ＬＣに位置する；（２）推定ＬＣとＨＣとの間の境界に位置する２つの保存されたシステインが存在し、これらは、必須の鎖間ジスルフィド結合を形成し得る；（３）保存された受容体結合モチーフＳｘＷＹは、推定ＨＣ（残基１２７４〜１２７７、ＳＡＷＹ（配列番号９３））において存在し、これが脂質共受容体ガングリオシドを認識する４３、４４。
【０１８１】
予想されたとおり、ＢｏＮＴ／Ｘ遺伝子は、推定ＮＴＮＨＡ遺伝子により先行される（図１Ｃ）。それらは、ＯｒｆＸ遺伝子クラスター中に位置する。しかし、ＢｏＮＴ／ＸのＯｒｆＸ遺伝子クラスターは、他の２つの既知のＯｒｆＸクラスターと比較して、２つのユニークな特徴を有する（図１Ｃ）：（１）ＢｏＮＴ／Ｘ遺伝子の次に位置するさらなるＯｒｆＸ２タンパク質（ＯｒｆＸ２ｂと称される）が存在し、これは、いかなる他のＯｒｆＸクラスターについても報告されていない；（２）ＯｒｆＸ遺伝子の読み枠は、ＢｏＮＴ／Ｘ遺伝子と同じ方向を有するが、それらは、他のＯｒｆＸクラスターにおいては、通常はＢｏＮＴ遺伝子の方向とは逆である（図１Ｃ）。まとめると、これらの特徴は、ＢｏＮＴ／Ｘが、ＢｏＮＴファミリーのユニークな進化的な支系を構成し得ることを示唆する。
【０１８２】
ＢｏＮＴ／ＸのＬＣは新規の部位においてＶＡＭＰ２を切断する
ＢｏＮＴ／Ｘが機能的トキシンであるか否かを、次に検討した。第１に、ＢｏＮＴ／ＸのＬＣ（Ｘ−ＬＣ）を調べた。ＬＣの境界（残基１〜４３９）を、他のＢｏＮＴとの配列アラインメントにより決定した。ＬＣをコードするｃＤＮＡを合成して、ＬＣを、E.coliにおいてＨｉｓ６タグ付き組み換えタンパク質として産生させた。Ｘ−ＬＣを、ラット脳界面活性剤抽出物（ＢＤＥ）と共にインキュベートし、イムノブロット分析を用いて、脳における３つのドミナントなＳＮＡＲＥタンパク質であるＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ２、およびシンタキシン１が切断されたか否かを検討した。ＢｏＮＴ／ＡのＬＣ（Ａ−ＬＣ）およびＢｏＮＴ／ＢのＬＣ（Ｂ−ＬＣ）を、並行して、対照としてアッセイした。ＢｏＮＴ／ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断は、より小さな、イムノブロットにおいてなお認識され得るフラグメントを生じるが、一方、ＢｏＮＴ／ＢによるＶＡＭＰ２の切断は、ＶＡＭＰ２のイムノブロットシグナルを消失させる（図２Ａ）。シナプス小胞タンパク質であるシナプトフィジン（Ｓｙｐ）もまた、内部ローディング対照として検出した。ラット脳ＤＴＥとのＸ−ＬＣのインキュベーションは、シンタキシン１またはＳＮＡＰ−２５には影響を及ぼさなかったが、ＶＡＭＰ２シグナルを消失させた（図２Ａ）。ＢｏＮＴのＬＣは、亜鉛依存的プロテアーゼである２５。予想されたとおり、ＥＤＴＡは、Ｘ−ＬＣ、Ａ−ＬＣおよびＢ−ＬＣによるＳＮＡＲＥタンパク質の切断を防止した（図２Ａ）。Ｘ−ＬＣがＶＡＭＰ２を切断することをさらに確認するために、ＶＡＭＰ２の細胞質ドメイン（残基１〜９６）をＨｉｓ６タグ付きタンパク質として精製した。Ｘ−ＬＣとのＶＡＭＰ２（１〜９６）のインキュベーションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＶＡＭＰ２のバンドを２つのより小さな分子量のバンドに変換し（図２Ｂ）、このことにより、Ｘ−ＬＣがＶＡＭＰ２を切断することを確認した。
【０１８３】
ＶＡＭＰ２における切断部位を同定するために、Ｘ−ＬＣとのプレインキュベーションを行うかまたはこれを行わず、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、図２Ｃ〜２Ｅ、詳細については以下を参照）により、ＶＡＭＰ２（１〜９６）タンパク質を分析した。単一のドミナントなペプチドピークが、Ｘ−ＬＣとのインキュベーションの後で現れた（図２Ｃ、２Ｅおよび６）。その分子量は、３０８１．７であることが決定され、これは、ＶＡＭＰ２の残基Ａ６７〜Ｌ９６の唯一のペプチド配列にフィットする（図２Ｃ、２Ｅ）。このことと一致して、Ｈｉｓ６タグの開始点からＶＡＭＰ２の残基Ｒ６６までの他方のフラグメントもまた検出された（図２Ｄ）。この結果をさらに確認するために、異なるＶＡＭＰ２フラグメント：ＧＳＴタグ付き組み換えＶＡＭＰ２（３３〜８６）によりアッセイを繰り返した（図７）。Ｘ−ＬＣとのインキュベーションは、２０６３．１の分子量を有する単一のドミナントなピークを生じ、これは、ＶＡＭＰ２の残基Ａ６７〜Ｒ８６の唯一のペプチド配列にフィットする（図７Ｄ〜７Ｅ）。予想されたとおり、ＧＳＴタグの開始点からＶＡＭＰ２の残基Ｒ６６までの他方のフラグメントもまた検出された（図７Ｆ）。まとめると、これらの結果は、Ｘ−ＬＣが、ＶＡＭＰ２上のＲ６６とＡ６７との間で単一の切断部位を有することを示す。
【０１８４】
Ｒ６６〜Ａ６７は、全ての他のＢｏＮＴのための確立された標的部位とは区別し得る新規の切断部位である（図２Ｆ）。それはまた、ＳＮＡＲＥモチーフとして先に知られている領域内に位置する唯一のＢｏＮＴ切断部位である（図２Ｆ、網掛け領域）４５。ＶＡＭＰファミリーのタンパク質として、ＶＡＭＰ１、２、３、４、５、７、８ならびに関連するＳｅｃ２２ｂおよびＹｋｔ６が挙げられる。Ｒ６６〜Ａ６７は、ＶＡＭＰ２に対して相同性が高いＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ３において保存されるが、ＶＡＭＰ７およびＶＡＭＰ８などの他のＶＡＭＰ相同体においては保存されない。Ｘ−ＬＣの特異性を検証するために、ＨＡタグ付き全長ＶＡＭＰ１、３、７、８およびｍｙｃタグ付きＳｅｃ２２ｂおよびＹｋｔ６を、ＨＥＫ２９３細胞において、一過性遺伝子導入を介して発現させた。細胞ライセートを、Ｘ−ＬＣと共にインキュベートした（図２Ｇ）。より低い分子量へのイムノブロットシグナルのシフトにより証明されるとおり、ＶＡＭＰ１および３の両方がＸ−ＬＣにより切断されたが、一方、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８およびＳｅｃ２２Ｂは、Ｘ−ＬＣに対して耐性であった（図２Ｇ）。
【０１８５】
予想外のことに、Ｙｋｔ６が、Ｘ−ＬＣにより切断された（図２Ｇ）。この知見は、精製されたＧＳＴタグ付きＹｋｔ６フラグメントを用いて確認され、これは、Ｘ−ＬＣとのインキュベーションの後でより低い分子量のバンドにシフトした（図２Ｈ）。Ｘ−ＬＣにより切断されたＹｋｔ６に対する未変化のＹｋｔ６の質量分析により、切断部位がＫ１７３−Ｓ１７４であることを決定した（図１３Ａ）。これは、ＶＡＭＰ２における切断部位に対する相同部位であり（図２Ｆ）、このことは、切断部位の位置が、異なるＶＡＭＰにまたがって保存されていることを示している。ＶＡＭＰのメンバーのうち、ＶＡＭＰ４は、この部位において、Ｙｋｔ６と同じ一対の残基（Ｋ８７−Ｓ８８）を含む。ＶＡＭＰ４のＧＳＴタグ付き細胞質ドメインが、Ｘ−ＬＣにより効率的に切断されたことを見出した（図２Ｉ）。このことと一致して、Ｘ−ＬＣは、ＢＤＥにおいてネイティブのＶＡＭＰ４を切断した（図４Ｊ）。対照として、Ｓｅｃ２２ｂは、ＢＤＥにおいてＸ−ＬＣにより切断されなかった。加えて、ＶＡＭＰ５のＧＳＴタグ付き細胞質ドメインもまた、ＶＡＭＰ２およびＶＡＭＰ４よりも低い速度ではあったが、切断された（図２Ｉ）。切断部位は、ＶＡＭＰ４においてはＫ８７−Ｓ８８、ＶＡＭＰ５においてはＲ４０−Ｓ４１であることを、質量分析により確認した（図１４）。いずれも、ＶＡＭＰ２における切断部位に対する相同部位である（図２Ｆ）。Ｘ−ＬＣがＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５およびＹｋｔ６を切断する能力は、それらの配列はＶＡＭＰ１／２／３とは実質的に異なるので、非常に稀なものである。ＢｏＮＴ／Ｘは、古典的な標的であるＶＡＭＰ１／２／３を越えるＶＡＭＰを切断することができる最初のＢｏＮＴである６６。Ｘ−ＬＣはまた、ＢＤＥにおいてＶＡＭＰ４を切断し、その切断は、ＥＤＴＡにより遮断された（図２Ｊ）。
【０１８６】
ＢｏＮＴ／Ｘの顕著な特徴は、ＶＡＭＰ４およびＹｋｔ６を切断するそのユニークな能力である。ＶＡＭＰ４は、広く発現され、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）とエンドソームとの間の小胞融合、ならびにエンドソームのホモタイプ融合を媒介することが知られている５９、６０。Ｙｋｔ６は、膜貫通ドメインを有さない非定型的なＳＮＡＲＥである６７〜７０。それは、脂質付加を介して膜にアンカリングし、これにより、その膜との関連の動的制御が可能となる。Ｙｋｔ６は、酵母において必須のタンパク質であり、ＥＲ−ゴルジ、ゴルジ内、エンドソーム−ゴルジ−液胞、およびオートファゴソーム（autophagesome）形成を含む複数の膜融合イベントに関連付けられている。哺乳動物細胞におけるその機能は、まだ確立されていない。ＢｏＮＴは、古典的には、細胞膜に対する小胞のエキソサイトーシスを媒介するＳＮＡＲＥをターゲティングすることに限定されていると知られている。ＢｏＮＴ／Ｘは、多様な細胞内膜輸送イベントを媒介するＳＮＡＲＥを切断することができる、初めてのＢｏＮＴである。
【０１８７】
興味深いことに、ＶＡＭＰ４およびＹｋｔ６はいずれも、神経細胞において濃縮されている。最近の研究は、ＶＡＭＰ４はまた、神経細胞における非同期的なシナプス小胞エキソサイトーシス、エンラージオソームエキソサイトーシス、および活性依存的バルクエンドサイトーシス（ＡＤＢＥ）にも寄与し得ることを示唆した６１〜６３。神経細胞におけるＹｋｔ６の役割は、まだ確立されていないが、それが、パーキンソン病モデルにおいてα−シヌクレインの毒性を抑制することが示されている７１〜７２。ＢｏＮＴ／Ｘの別の基質であるＶＡＭＰ５は、主に筋肉細胞において発現し、その機能はまだ確立されていない６４。ＢｏＮＴ／Ｘは、ＶＡＭＰ４、Ｙｋｔ６、およびＶＡＭＰ５の機能および関連する膜輸送イベントを調べるための強力なツールとなるであろう。加えて、ＶＡＭＰ４は、免疫細胞における顆粒放出に関連付けられており６５、したがって、ＢｏＮＴ／Ｘは、免疫細胞における炎症性分泌を調節するという、全てのＢｏＮＴのうちでもユニークな潜在能力を有し得る。
【０１８８】
ＢｏＮＴ／Ｘのタンパク質分解的活性化
ＢｏＮＴは、初めは単一のポリペプチドとして産生される。ＬＣとＨＮとの間のリンカー領域は、「活性化」として知られるプロセスにおいて、細菌または宿主のプロテアーゼのいずれかにより切断されることを必要とし、これは、ＢｏＮＴの活性のために必須である。ＢｏＮＴのＬＣおよびＨＮは、細胞の細胞質ゾル中へのＬＣの転位置の前には、鎖間ジスルフィド結合を介して連結されたままであり、転位置の際に、ＬＣを細胞質ゾル中に放出するために、ジスルフィド結合が還元される。配列アラインメントは、ＢｏＮＴ／Ｘが、全ての他のＢｏＮＴと比較して、２つの保存されたシステインの間で最長のリンカー領域を含むことを明らかにした（Ｃ４２３〜Ｃ４６７、図３Ａ）。加えて、ＢｏＮＴ／Ｘのリンカー領域は、１つのさらなるシステイン（Ｃ４６１）を含み、これは、ＢｏＮＴ／Ｘにユニークである。
【０１８９】
ＢｏＮＴ／ＸのＬＣとＨＮとの間のリンカー領域がタンパク質分解による切断に対して感受性であるか否かを検討するために、組み換えＸ−ＬＣ−ＨＮフラグメント（残基１〜８９１）を、E.coliにおいて産生させて、リジン残基のＣ末端側で切断するエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃによる限定されたタンパク質分解に供した。限定されたタンパク質分解条件下において感受性の切断部位を同定するために、Tandem Mass Tag（ＴＭＴ）標識およびタンデム質量分析アプローチを用いて、Ｘ−ＬＣ−ＨＮを分析した。ＴＭＴは、遊離のＮ末端（およびリジン）を標識する。Ｌｙｓ−Ｃによる限定されたタンパク質分解は、未変化のＸ−ＬＣ−ＨＮ試料中には存在しないさらなる遊離のＮ末端を生じる（詳細については以下を参照）。簡単に述べると、未変化のＸ−ＬＣ−ＨＮ試料を、軽い（light）ＴＭＴで標識し、等量のＸ−ＬＣ−ＨＮ試料を、Ｌｙｓ−Ｃに暴露し、次いで、重い（heavy）ＴＭＴで標識した。両方の試料を、次いで、キモトリプシンで消化し、一緒に組み合わせて、定量的質量分析の分析に供した。同定されたペプチドのリストを、以下の表２において示す。軽いＴＭＴ：重いＴＭＴの比は、通常、各々のペプチドについて互いの２倍以内であり、例外はＮ４３９で始まる５つのペプチドであって、これは軽いＴＭＴ標識についてシグナルを示さず、このことは、これがＬｙｓ−Ｃの切断により生じる新たなＮ末端であることを示している（図３Ａ、表２）。したがって、Ｌｙｓ−Ｃは、限定されたタンパク質分解条件下において、Ｋ４３８−Ｎ４３９を優先的に切断し、このことは、リンカー領域がプロテアーゼに対して感受性であることを示している（図３Ａ）。
【０１９０】
このタンパク質分解による活性化がＢｏＮＴ／Ｘの機能にとって重要であるか否かを、次に検討した。培養神経細胞とのＢｏＮＴの高濃度のＬＣ−ＨＮのインキュベーションが、おそらくは神経細胞中への非特異的取り込みを通して、ＬＣ−ＨＮの神経細胞中への侵入をもたらしたことが、先に示されている４６、４７。このアプローチを用いて、培養ラット皮質神経細胞に対する、未変化のＸ−ＬＣ−ＨＮの効力と活性化されたＸ−ＬＣ−ＨＮの効力とを比較した。神経細胞を、培地中で１２時間にわたりＸ−ＬＣ−ＨＮに暴露した。細胞ライセートを収集して、ＳＮＡＲＥタンパク質の切断を試験するために、イムノブロット分析を行った。図３Ｂにおいて示すとおり、Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、神経細胞に侵入し、濃度依存的様式においてＶＡＭＰ２を切断した。Ｌｙｓ−Ｃにより活性化されたＸ−ＬＣ−ＨＮは、未変化のＸ−ＬＣ−ＨＮよりも劇的に高い効力を示した：１０ｎＭの活性化されたＸ−ＬＣ−ＨＮは、１５０ｎＭの未変化のＸ−ＬＣ−ＨＮと同様のレベルのＶＡＭＰ２を切断した（図３Ｂ）。未変化のＸ−ＬＣ−ＨＮは、細胞表面プロテアーゼによるタンパク質分解による切断に対して感受性である可能性が高く、このことは、神経細胞に対して高濃度においてそれがなお活性である理由であることに注意する。興味深いことに、活性化されたＸ−ＬＣ−ＨＮは、活性化されたＢｏＮＴ／ＡのＬＣ−ＨＮ（Ａ−ＬＣ−ＨＮ）およびＢｏＮＴ／ＢのＬＣ−ＨＮ（Ｂ−ＬＣ−ＨＮ）よりも強力であると考えられ、これらは、神経細胞において、同じアッセイ条件下において、それらのＳＮＡＲＥ基質の検出可能な切断を示さなかった（図３Ｂ）。
【０１９１】
表２．ＴＭＴ標識および定量的質量分析により分析した、限定されたタンパク質分解下におけるＸ−ＬＣ−ＨＮのペプチドフラグメント。
Ｈｉｓ６タグ付き組み換えＸ−ＬＣ−ＨＮを軽いＴＭＴで標識した。等量のＸ−ＬＣ−ＨＮ試料をＬｙｓ−Ｃに暴露し、次いで、重いＴＭＴで標識した。両方の試料を、次いで、キモトリプシンで消化し、一緒に組み合わせ、定量的質量分析の分析に供した。同定されたペプチドのリストを示した。軽いＴＭＴ：重いＴＭＴの比は、全てのペプチドについて互いの２倍以内であり、例外は、Ｎ４３９で始まる５つのペプチド（下線）である。これら５つのペプチドは、軽いＴＭＴ標識についてのシグナルを示さず、このことは、Ｎ４３９が、Ｌｙｓ−Ｃの切断により生じた新たなＮ末端であることを示している。表２におけるペプチド配列は、上から下へ、配列番号９４〜２２６に対応する。
【０１９２】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【０１９３】
ＢｏＮＴ／Ｘにおけるジスルフィド結合のユニークな特徴
ＢｏＮＴ／Ｘのリンカー領域は、ＢｏＮＴ／Ｘにユニークな１つのさらなるシステイン（Ｃ４６１）を含む。どのシステインがＬＣとＨＣとを連結するジスルフィド結合を形成するかを決定するために、３つのシステイン残基の各々を変異させた（Ｃ４２３Ｓ、Ｃ４６１Ｓ、およびＣ４６７Ｓ）３つのＸ−ＬＣ−ＨＮ変異体を作製した。これらの３つのシステイン変異体、ならびに野生型（ＷＴ）のＸ−ＬＣ−ＨＮを、限定されたタンパク質分解に供し、次いで、還元剤ＤＴＴを用いてまたはこれを用いずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色を介して分析した（図３Ｃ）。ＬＣにおけるシステイン（Ｃ４２３Ｓ）を変異させることにより、ＤＴＴがあってもなくても２つの約５０ｋＤａのバンドに分離されるタンパク質がもたらされることを見出した。このことは、Ｃ４２３Ｓが鎖間ジスルフィド結合を消失させたことを示している。対照的に、Ｃ４６１ＳまたはＣ４６７Ｓのいずれかを含む変異体は、ＤＴＴの不在下において１００ｋＤａにおいて単一のバンドを示し、これは、ＤＴＴの存在下において２つの約５０ｋＤａのバンドに分離し、このことは、ＨＮにおけるＣ４６１とＣ４６７とはいずれも、ＬＣにおけるＣ４２３と鎖間ジスルフィド結合を形成することができることを示唆している。また、Ｘ−ＬＣ−ＨＮ（Ｃ４２３Ｓ）変異体は、Ｌｙｓ−Ｃに対して、Ｃ４６１ＳおよびＣ４６７Ｓ変異体のいずれよりも感受性であり、さらなるタンパク質の変性をもたらすと考えられる（図３Ｃ）。この結果は、鎖間ジスルフィド結合を失うことにより、ＬＣおよびＨＮの自由度を増大させることができ、それにより、より広い表面積を暴露することができることを示唆している。さらに、ＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮの一部は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの最上部において凝集塊を形成した（図３Ｃ）。これらの凝集塊は、ＤＴＴの存在下において消失するので（図３Ｃ、＋ＤＴＴ）、分子間ジスルフィド結合の形成に起因する。Ｃ４２３、Ｃ４６１およびＣ４６７は、Ｘ−ＬＣ−ＨＮにおける唯３つのシステインである。３つのシステインのうちのいずれか１つを変異させることにより、Ｘ−ＬＣ−ＨＮの凝集塊は消失し（図３Ｃ、−ＤＴＴ）、このことは、分子間ジスルフィド結合の形成が、リンカー領域における１つの余分のシステインの存在に起因することを示している。
【０１９４】
活性化されたＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮの大部分はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＤＴＴなしで、２つの約５０ｋＤａのバンドに分離した（図３Ｃ）。一方、ＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、Ｌｙｓ−Ｃに対して、Ｃ４６１ＳおよびＣ４６７Ｓ変異体と同様に耐性であり、それは、Ｃ４２３Ｓ変異体が示したようには、さらなる変性を示さず（図３Ｃ、＋ＤＴＴ）、このことは、ＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮがＣ４２３Ｓ変異体とは異なることを示唆している。１つの可能な説明は、ＨＮ上で互いの近傍にある２つのシステイン（Ｃ４６１およびＣ４６７）の存在に起因する、ジスルフィド結合のシャッフルであり、これは、変性条件下において、ジスルフィド結合を、鎖間Ｃ４２３−Ｃ４６７またはＣ４２３−Ｃ４６７から鎖内Ｃ４６１−Ｃ４６７に再配置することができる４８、４９。この仮説を試験するために、遊離システインのスルフヒドリルと反応し、任意の遊離システインを恒久的にブロッキングするアルキル化試薬である、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を用いた。図３Ｄにおいて示すように、ＮＥＭで前処理したＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、ＤＴＴの不在下において、１００ｋＤａにおいて単一のバンドとして観察され、ＤＴＴの存在下において２つの約５０ｋＤａのバンドに分離する。これらの結果により、ネイティブのＷＴ  Ｘ−ＬＣ−ＨＮが主に鎖間ジスルフィド結合を含み、これは、リンカー領域における第３のシステインの存在に起因して、ジスルフィド結合のシャッフルに対して感受性であることを確認した。
【０１９５】
最後に、培養神経細胞に対する３つのＸ−ＬＣ−ＨＮシステイン変異体の活性を試験した。図３Ｅにおいて示すとおり、ＬＣにおけるシステイン（Ｃ４２３Ｓ）を変異させることにより、神経細胞におけるＶＡＭＰ２の切断の欠如により証明されるとおり、Ｘ−ＬＣ−ＨＮの活性が消失した。ＨＮにおける２つのシステインのうちの１つ（Ｃ４６１またはＣ４６７）を変異させることは、Ｘ−ＬＣ−ＨＮの効力に、野生型（ＷＴ）Ｘ−ＬＣ−ＨＮと比較して、著しくは影響を及ぼさなかった（図３Ｅ）。これらの結果は、鎖間ジスルフィド結合がＢｏＮＴ／Ｘの活性のために必須であることを確認し、Ｃ４２３−Ｃ４６１またはＣ４２３−Ｃ４６７のいずれかを介して、機能的な鎖間ジスルフィド結合が形成され得ることを示した。
【０１９６】
ソルターゼにより媒介されるライゲーションを介して全長ＢｏＮＴ／Ｘを作製する
ＢｏＮＴ／Ｘが機能的トキシンであるか否かを評価するためには、全長ＢｏＮＴ／Ｘを作製して試験する必要があった。しかし、ＢｏＮＴは、最も危険な潜在的なバイオテロ剤の１つである。したがって、必要な予防措置を取り、全長の活性なトキシン遺伝子は作成しなかった。代わりに、ＢｏＮＴの２つの非毒性のフラグメントの酵素によるライゲーションにより、制御された条件下において、試験管中で、限定された量の全長ＢｏＮＴを作製するアプローチを開発した。この方法は、ソルターゼとして知られるトランスペプチダーゼを利用する。ソルターゼは、特異的なペプチドモチーフを認識して、ネイティブのペプチド結合を形成することにより２つのペプチドを一緒に共有結合により連結する（図４Ａ）。このアプローチは、キメラトキシンおよび他の融合タンパク質を作製するために、先に利用されてきた５０、５１。
【０１９７】
黄色ブドウ球菌からのＳｒｔＡ*として知られる操作されたソルターゼＡを作製した５１。ＳｒｔＡ*は、ペプチドモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号５７）を認識し、Ｔ−Ｇの間を切断し、同時に、ＬＰＸＴＧ（配列番号５７）を含むタンパク質と、１つ以上のＮ末端グリシンを含む他のタンパク質／ペプチドとの間に、新たなペプチド結合を形成する（図４Ａ）。ＢｏＮＴ／Ｘの２つの非毒性のフラグメント：（１）ＬＰＥＴＧＧ（配列番号５８）モチーフ、およびＣ末端に融合したＨｉｓ６タグを有するＬＣ−ＨＮ；（２）ＧＳＴタグおよびそのＮ末端におけるトロンビン切断部位を有するＢｏＮＴ／ＸのＨＣ（Ｘ−ＨＣ）を生成した。トロンビンにより切断は、Ｎ末端に遊離のグリシンを有するＸ−ＨＣを放出する。ＳｒｔＡ*とのこれらの２つのフラグメントのインキュベーションにより、ＬＣ−ＨＮとＨＣとの間に短いリンカー（ＬＰＥＴＧＳ、配列番号５９）を含む、限定された量の約１５０ｋＤの全長ＢｏＮＴ／Ｘを生じた（図４Ａ〜４Ｂ）。
【０１９８】
Ｘ−ＨＣが、ＧＳＴタグから切断されると、未知の理由により、溶液中で凝集する強い傾向を示すことが観察された。これは、ＢｏＮＴ／Ｘについてのライゲーション効率が低い理由であり得る（図４Ｂ）。対照的に、同じアプローチを用いるＸ−ＬＣ−ＨＮのＢｏＮＴ／ＡのＨＣ（Ａ−ＨＣ）とのライゲーションは、はるかにより高い効率を達成し、Ｘ−ＬＣ−ＨＮの大部分が、ライゲーションされて全長ＸＡキメラトキシンとなった（図８Ａ）。
【０１９９】
ＢｏＮＴ／Ｘは、培養神経細胞において活性である
全長ＢｏＮＴ／Ｘの活性を分析するために、培養ラット皮質神経細胞をモデル系として用いた。神経細胞を、培地中で、ソルターゼライゲーション混合物、および多様な対照混合物に暴露した。１２時間後に細胞ライセートを収集して、ＳＮＡＲＥタンパク質の切断を試験するためにイムノブロット分析を行った。図４Ｃにおいて示すとおり、Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、反応混合物中でのその高濃度に起因して、単独でいくつかのＶＡＭＰ２を切断した。Ｘ−ＬＣ−ＨＮおよびＸ−ＨＣを含むがソルターゼを含まない対照混合物は、Ｘ−ＬＣ−ＨＮ単独と比較して、ＶＡＭＰ２の切断をわずかに増大させた。この結果は、Ｘ−ＨＣが、非共有結合的相互作用を介してＸ−ＬＣ−ＨＮと関連し得ることを示唆する。この相互作用は、Ｘ−ＬＣ−ＨＮおよびＡ−ＨＣを含む対照混合物が、Ｘ−ＬＣ−ＨＮ単独と同じレベルのＶＡＭＰ２切断を示したことから、特異的であるものと考えられる（図８Ｂ）。Ｘ−ＬＣ−ＨＮとＸ−ＨＣをソルターゼによりライゲーションすることにより、ソルターゼを含まないＸ−ＬＣ−ＨＮとＸ−ＨＣとの混合物に対して、ＶＡＭＰ２の切断が増強され（図４Ｃ）、このことは、ライゲーションされた全長ＢｏＮＴ／Ｘが、神経細胞に侵入してＶＡＭＰ２を切断することができることを示している。同様に、ライゲーションされた全長ＸＡキメラトキシンもまた、神経細胞に侵入してＶＡＭＰ２を切断した（図８Ｂ）。
【０２００】
Ｘ−ＨＣをＸ−ＬＣ−ＨＮと混合することにより、Ｘ−ＬＣ−ＨＮ単独と比較して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの最上部における凝集塊の量が増大した。これらの凝集塊は、ＤＴＴの存在下において消失し、このことは、Ｘ−ＨＣの一部が、Ｘ−ＬＣ−ＨＮと分子間ジスルフィド結合を形成したことを示唆している。ＤＴＴの存在はまた、ライゲーションされた全長ＢｏＮＴ／Ｘの量を増加させ、このことは、ＢｏＮＴ／Ｘの一部が、分子間ジスルフィド結合を介して凝集したことを示唆している（図４Ｂ）。これらの凝集塊の形成は、溶液中の有効トキシンモノマー濃度を著しく低下させ得る。これは、ＢｏＮＴ／Ｘ配列の固有の弱点であり得る。Ｘ−ＨＣは、単一のシステイン（Ｃ１２４０）を含み、このシステインを変異させることは、ライゲーションされたＢｏＮＴ／Ｘの活性に影響を及ぼさなかった（図９）。さらに、Ｃ１２４０Ｓ変異体は、Ｘ−ＬＣ−ＨＮにおいてＣ４６１ＳまたはＣ４６７Ｓ変異と組み合わせて、遊離のシステインを有さない改変ＢｏＮＴ／Ｘを作製することができる（図９）。これらの変異体トキシンは、ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｘと同じレベルの活性を維持するが、モノマーとして溶液中でＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｘよりも安定である。
【０２０１】
マウスにおいてin vivoでＢｏＮＴ／Ｘにより誘導される弛緩性麻痺
ＢｏＮＴ／Ｘがin vivoで活性であるか否かを、マウスにおいて、指外転スコア（ＤＡＳ）として知られるよく確立された非致死性アッセイを用いて試験した。このアッセイは、マウスの後肢の筋肉中へのＢｏＮＴの注射の後の局所筋麻痺を測定する５２、５３。ＢｏＮＴは、肢の筋肉の弛緩性麻痺を引き起こし、これは、驚愕応答の間に足指を広げることができないことにより検出することができる。活性化されたソルターゼ反応混合物（図４Ｂ、レーン７）を、マウスにおいて、右後肢の腓腹筋中に注射した。１２時間以内に、右肢が典型的な弛緩性麻痺を生じ、足指を広げることができなかった（図４Ｄ）。これらの結果により、ＢｏＮＴ／Ｘが、他のＢｏＮＴと同様にin vivoで弛緩性麻痺を引き起こすことができることを確認した。
【０２０２】
ＢｏＮＴ／Ｘは、全ての既知のＢｏＮＴに対して産生された抗血清により認識されなかった
ＢｏＮＴ／Ｘが血清学的にユニークなＢｏＮＴであることをさらに確認するために、７つ全ての血清型ならびに１つのモザイクトキシン（ＢｏＮＴ／ＤＣ）を含む既知のＢｏＮＴに対して産生された抗血清を用いてドットブロットアッセイを行った。４つのウマ抗血清（三価抗ＢｏＮＴ／Ａ、ＢおよびＥ、抗ＢｏＮＴ／Ｃ、抗ＢｏＮＴ／ＤＣ、ならびに抗ＢｏＮＴ／Ｆ）、ならびに２種のヤギ抗血清（抗ＢｏＮＴ／Ｇおよび抗ＢｏＮＴ／Ｄ）を利用した。これらの抗血清は、全てそれらの対応する標的ＢｏＮＴを中和することができ、神経細胞においてＳＮＡＲＥタンパク質の切断を防止し（図１０）、それにより、それらの特異性および効力を立証している。図４Ｅにおいて示すとおり、これらの抗血清は、それらの対応する標的トキシンを認識したが、これらのいずれも、ＢｏＮＴ／Ｘを認識しなかった。ＢｏＮＴ／ＤＣおよびＢｏＮＴ／Ｃに対して産生された抗血清は、それらのＨＣにおいて高い程度の類似性を共有するので、互いに交差反応することに注意する。これらの結果は、ＢｏＮＴ／Ｘを新たな血清型のＢｏＮＴとして確立した。
【０２０３】
全長の不活性なＢｏＮＴ／Ｘ
最後に、全長ＢｏＮＴ／Ｘを可溶性タンパク質として生成することができるか否かを検討した。バイオセイフティーの要件を保証するために、ＢｏＮＴ／ＸのＬＣにおいて、ＢｏＮＴ／Ｘの毒性を不活化する変異を導入した。ＢｏＮＴ／Ａにおける２つの残基Ｒ３６２Ａ／Ｙ３６５Ｆにおける変異は、in vitroでＬＣのプロテアーゼ活性を不活化して、マウスにおいてin vivoで全長ＢｏＮＴ／Ａの毒性を消失させることが示されている５４〜５６。これらの２つの残基は、ＢｏＮＴ／Ｘを含む全てのＢｏＮＴにおいて保存されている。したがって、対応する変異を、これらの２つの部位において導入した（ＢｏＮＴ／ＸにおけるＲ３６０Ａ／Ｙ３６３Ｆ）。図４Ｆにおいて示すとおり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組み換えにより、このＢｏＮＴ／Ｘの全長の不活化形態（ＢｏＮＴ／ＸＲＹ）を産生させ、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として精製した。神経細胞においてＶＡＭＰ２は切断されなかったので、それは、神経細胞に対して任意の活性を有さなかった（図１１）。
【０２０４】
ＢｏＮＴ／ＸＲＹのかなりの部分が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの最上部において凝集塊を形成した（図４Ｆ）。これは、リンカー領域における余分のシステインおよびＨＣにおけるシステインからの分子間ジスルフィド結合の形成に起因する可能性がある。なぜならば、ＤＴＴの添加は、凝集塊を単量体のＢｏＮＴ／ＸＲＹに変換したからである（図４Ｆ）。これらのシステインを変異させることは、ＢｏＮＴ／Ｘの活性に影響を及ぼさず（図９）、分子間ジスルフィド結合の形成およびＢｏＮＴ／Ｘの凝集を防止する利点を有する。
【０２０５】
ＢｏＮＴ／Ｘの不活性な形態は、治療剤を神経細胞中に送達するためのビヒクルとして利用することができる。不活化は、以下の残基のいずれか１つにおける変異またはそれらの組み合わせにより達成すことができる：Ｒ３６０、Ｙ３６３、Ｈ２２７、Ｅ２２８、またはＨ２３１、ここで後者３つの残基は、保存されたプロテアーゼモチーフを形成する。
【０２０６】
工業的規模における全長の不活性なＢｏＮＴ／Ｘの精製
全長ＢｏＮＴ／Ｘを高い程度の純度において良好な収率で精製することができるか否かは、ＢｏＮＴ／Ｘ（またはその誘導体）の治療用トキシンとしての工業的生産のために重要となるであろう。これを検討した。温度、誘導の時間およびＩＰＴＧ濃度などの、細胞増殖および発現のいくつかのパラメーターを試験した。タンパク質発現のために選択した任意のパラメーターは、細胞が指数関数的増殖に達するまで細胞を３７℃で培養し、この段階において温度を１８℃まで下げ、培地への１ｍＭのＩＰＴＧの添加により発現を誘導したことであった。細胞を、次いで、１６〜１８時間にわたり培養し、その後収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＢｏＮＴ／Ｘの存在を検証し、可溶性画分において高レベルの過剰発現を示した（図１１Ｂ）。
【０２０７】
いくつかの小規模精製試験を行って、生成プロセスを最適化した。Emulsiflex-C3（Avestin、マンハイム、ドイツ）を用いる機械的細胞溶解は、細胞内タンパク質抽出のための好ましい方法であり、超音波処理よりも効率的であると考えられた。多様なバッファー条件もまた、最適なＢｏＮＴ／Ｘの回収のための評価をしなければならなかった。精製プロセス全体にわたり還元剤を含め、望ましくない凝集に対する傾向を著しく軽減した。加えて、精製プロセスの初期段階においてグリセロールを添加剤として用い、タンパク質の安定性を改善した。
【０２０８】
ＢｏＮＴ／Ｘコンストラクトを、第１の精製ステップとしてのアフィニティークロマトグラフィーのために用いることができるＨＩＳ６タグと共に発現させた。小規模試験のために、５ｍｌのHIsTrapFFカラム（GE Healthcare、ダンデリード、スウェーデン）を用いた。最初のクロマトグラフィーから最も高い純度を達成するために、多様な濃度のイミダゾールを試験した。ＢｏＮＴ／Ｘは、１００ｍＭのイミダゾールの濃度から溶離したが、大量の混入物がトキシンと共に容易に共精製された。この混入物は、ＢｏＮＴ／Ｘと非特異的に相互作用すると考えられ、質量分析によりE. coliの宿主タンパク質（二官能性ポリミキシン耐性タンパク質ＡｒｎＡ）として同定された。この混入物の存在は、高い塩濃度（５００ｍＭのＮａＣｌ）の導入により、および精製の間に１００ｍＭのイミダゾールでのさらなる洗浄ステップを行うことにより、劇的に軽減された。このことにより、２５０ｍＭのイミダゾールでのより純度の高いＢｏＮＴ／Ｘ画分の溶離が可能となった。この後の画分を、次いで、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。
【０２０９】
適切に行えるようになったら、このプロトコルをスケールアップし、上記の条件を用いて、１２Ｌまでの培地で発現させた。加えて、ＢｏＮＴ／Ｘの回収の収率を増加させるために、１５ｍｌのProtino（登録商標）Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Macherey-Nagel、デューレン、ドイツ）からなるより大きなアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを準備した。Superdex200-16/60カラム（GE Healthcare、ダンデリード、スウェーデン）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより、最終精製ステップを行った。この方法を用いて、８５〜９０％の純度を得た（図１１Ｃ）。タンパク質を濃縮し（Vivaspin濃縮器を１００ｋＤａのカットオフで用いて（GE Healthcare、ダンデリード、スウェーデン））、これは、１０ｍｇ／ｍｌまで安定であると考えられた。タンパク質生成プロセスの完全な詳細は、以下に記載する。得られたＢｏＮＴ／Ｘの収率は、細胞培養１リットルあたり約３ｍｇであった。まとめると、これらの結果は、ＢｏＮＴ／Ｘを、工業的規模において高純度まで精製することができることを示した。
【０２１０】
精製はＬＣとＨＣとの間のジスルフィド結合を還元する還元剤の存在下において行ったので、精製されたトキシンは活性とならなかったことに注意する。しかし、システイン部位において変異（Ｃ４６１またはＣ４６７における１つの変異を、Ｃ１２４０を変異させることと組み合わせたもの）を含む設計されたＢｏＮＴ／Ｘの誘導体は、還元剤を用いずに、精製することができるであろう。ＢｏＮＴ／Ｘの不活性な形態（およびそのシステイン変異誘導体）は、治療剤を神経細胞中に送達するためのビヒクルとして利用することができることに注意する。不活化は、以下の残基のいずれか１つにおける変異またはそれらの組み合わせにより達成すことができる：Ｒ３６０、Ｙ３６３、Ｈ２２７、Ｅ２２８、またはＨ２３１（ここで後者３つの残基は、保存されたプロテアーゼモチーフを形成する）。
【０２１１】
ＢｏＮＴ／Ｘの受容体としてのガングリオシドの同定
ガングリオシドは、全てのＢｏＮＴについてよく確立された脂質共受容体であり、ガングリオシド結合モチーフは、ＢｏＮＴ／Ｘにおいてよく保存されている（図１Ｃ）。高度に精製された全長の不活性なＢｏＮＴ／Ｘを用いて、ＢｏＮＴ／Ｘがガングリオシドを介して神経細胞に結合するか否かを試験した。４つの主要な脳ガングリオシド：ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂおよびＧＭ１との相互作用について試験するために、in vitroでのＥＬＩＳＡアッセイを開発した。非特異的結合を評価するための陰性対照として、Ａ−ＬＣを用いた。ＢｏＮＴ／Ａの受容体結合ドメイン（Ａ−ＨＣ）との直接比較もまた行った。抗Ｈｉｓ６タグ抗体を用いて、タンパク質の結合を検出した。ＢｏＮＴ／Ｘが、４つ全てのガングリオシドに対して、Ａ−ＬＣの非特異的結合レベルを超えて、用量依存的結合を示したことを見出し（図１２）、このことは、ＢｏＮＴ／Ｘが、４つ全ての脳ガングリオシドを共受容体として利用することができることを示唆している。以前の報告と一致して、ＢｏＮＴ／Ａは、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂ（図１２Ｆ）、ならびにそれらの末端ＮＡｃＧａｌ−Ｇａｌ−ＮＡｃＮｅｕ部分について、同等の優先度を示した（シグモイド用量応答モデルにフィットさせた場合に、それぞれ０．７および１．０μＭの見かけのＥＣ５０値を有する）。対照的に、ＢｏＮＴ／Ｘは、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂよりもＧＤ１ｂおよびＧＭ１についてより高いアフィニティーを示した（図１２Ｅ）。このことは、ＢｏＮＴ／Ｘが、ＢｏＮＴ／ＢおよびＴｅＮＴにおいても観察される好ましいシアル酸認識パターンを有することを示唆するであろう。ＢｏＮＴ／Ｘは、他のトキシンのうちの１つと相同な位置において保存されたＳｘＷＹモチーフを有する。それが、低いアフィニティーによってではあるが、４つ全てのガングリオシドを認識することができるという事実は、複数の炭水化物結合部位の指標となり得る。
【０２１２】
考察
最後の主要なＢｏＮＴ血清型が同定された後４５年間以上かけて、ＢｏＮＴの第８の血清型が同定された。ＢｏＮＴ／Ｘは、このトキシンのファミリーのうちで、全ての他のＢｏＮＴおよびＴｅＮＴに対して最も低いタンパク質配列同一性を有し、この低レベルの同一性は、トキシン配列に沿って均等に分布している。予想されたとおり、ＢｏＮＴ／Ｘは、既知のＢｏＮＴに対して産生されたいかなる抗血清によっても認識されなかった。それは、ユニークかつ区別し得るトキシンファミリーの進化的支系を明らかに代表する。
【０２１３】
ＢｏＮＴ／Ｘは、Clostridium Botulinum菌株のゲノム配列を検索することにより明らかとなり、それは、ゲノムシークエンシングおよびバイオインフォマティクスアプローチにより同定された最初の主要なトキシン型を代表する。ＢｏＮＴ／Ｘ遺伝子を含む菌株１１１は、初めに、１９９０年代に乳児ボツリヌス症患者から同定された。古典的な中和アッセイを用いる以前の特徴づけは、ＢｏＮＴ／Ｂ２を、この菌株の主要なトキシンとして確立した。ＢｏＮＴ／Ｘは、サイレントトキシン遺伝子であるか、または研究室における培養条件下においては検出可能な毒性レベルにおいては発現されなかった可能性がある。したがって、それは、菌株１１１をシークエンシングすることによってのみ同定することができる。このことは、微生物の病原性因子を理解するためのゲノムシークエンシングおよびバイオインフォマティクスアプローチの重要性を説明する。
【０２１４】
サイレントＢｏＮＴ遺伝子は、先にも、多様なClostridium Botulinum菌株においてしばしば見出されてきた。これらの細菌がサイレントトキシン遺伝子を保有している理由は不明である。それは、進化の間に変性した遺伝子であり得る。サイレントトキシン遺伝子が、未熟な停止コード変異を含む場合には、明らかにそうである。しかし、サイレント遺伝子が全長ＢｏＮＴをコードしている場合もある。これらのサイレントな全長ＢｏＮＴが、特定の環境条件下において発現されて毒性を示すことができるか否かは、興味深い問題のままである。
【０２１５】
ＢｏＮＴの一般的な３ドメイン構造および機能は、ＢｏＮＴ／Ｘにおいてよく保存されているが、それはまた、いくつかのユニークな特徴もまた有する：（１）それは、神経細胞におけるその標的として、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＧとＶＡＭＰを共有するが、それは、ＶＡＭＰを、このトキシンにユニークな新規の部位（ＶＡＭＰ２におけるＲ６６−Ａ６７）において切断する。このことは、ＶＡＭＰを異なる部位において切断するために用いることができるトキシンのレパートリーをさらに拡大する
。（２）ＬＣとＨＮとを連結する鎖間ジスルフィド結合は、ＢｏＮＴ／Ｘにおいて保存されているが、それはまた、リンカー領域においてユニークなさらなるシステインを含み、これは、ジスルフィド結合のシャッフルをもたらし得る。ＨＮにおける余分のシステインは、ＬＣ−ＨＮの活性のためには必須ではなく（図３Ｄ）、それを変異させることは、分子間ジスルフィド結合の形成を防止するという利点を有する（図３Ｄ、４Ｂ）。
【０２１６】
Ｈｉｓ６タグ付きＸ−ＬＣ−ＨＮフラグメントは、組み換えタンパク質としてバッファー中で安定である。それは、神経細胞に対して、Ａ−ＬＣ−ＨＮおよびＢ−ＬＣ−ＨＮのいずれよりも高いレベルの活性を示し（図３Ｂ）、このことは、その膜での転位置および／またはプロテアーゼ活性が、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂにおける対応するフラグメントよりも効率的であり得ることを示唆している。Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、その侵入が神経細胞には限定されない場合があるので、広範な細胞型および組織においてＶＡＭＰ１／２／３をターゲティングするために有用な試薬であり得る。例えば、それは、感覚神経細胞および炎症性シグナルを分泌する他の細胞の両方をターゲティングすることにより、局所領域における疼痛を軽減するために、潜在的に利用することができる。それはまた、ＸＡなどのキメラトキシンを作製するために用いることもできる（図８）。
【０２１７】
Ｘ−ＨＣは、その存在が神経細胞においてＶＡＭＰ２の切断をＬＣ−ＨＮ単独よりも増強したので、機能的である（図４Ｃ）。しかし、Ｘ−ＨＣは、さらに評価されるべきままとなっている、いくつかの好ましくない特徴を有し得る。例えば、十分なレベルの可溶性Ｘ−ＨＣは、それが、タンパク質の折りたたみ／溶解度を促進することが知られているＧＳＴに融合された場合にのみ生成されるが、Ｈｉｓ６タグを用いる場合はそうではない。ＧＳＴタグから放出された後、Ｘ−ＨＣは、凝集しやすくなる。加えて、Ｘ−ＨＣにおけるシステインもまた、分子間ジスルフィド結合を形成し得る（図４Ｂ）。全長の不活性なＢｏＮＴ／Ｘは、可溶性タンパク質として精製されて存在することができ、このことは、Ｘ−ＨＣについての溶解度の問題が、少なくとも部分的に、Ｘ−ＬＣ−ＨＮからのこのドメインの分離に起因し得ることを示唆している。例えば、Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、Ｘ−ＨＣと相互作用し得、全長の文脈においてその潜在的な疎水性セグメントをカバーし、これは、多ドメインタンパク質については珍しくない
【０２１８】
ガングリオシドは、ずっと以前に、全てのＢｏＮＴサブタイプについて神経細胞受容体として、確立されている。ＢｏＮＴ／Ｘが、４つ全ての最も豊富なガングリオシド：ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂおよびＧＭ１に結合することができることを示している。加えて、ＢｏＮＴ／Ｘが、ＢｏＮＴ／Ａと比較した場合に、著しいアフィニティーおよび特異性の相違によりこれを行う。他のＢｏＮＴは、ガングリオシドのサブグループに対して多様な程度の優先度を有すると考えられるので、このことは固有の特性である。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｅ、ＦおよびＧは、ＧＤ１ａおよびＧＴ１ｂを優先する。ＢｏＮＴ／Ｘは、他のＢｏＮＴと比較して、潜在的により広い範囲の神経細胞型を認識し得る。
【０２１９】
ＢｏＮＴ／Ｘがin vivoで低い毒性を有する可能性はあり、これは、菌株１１１についての元の研究においてＢｏＮＴ／Ｘ活性が検出されなかった理由を説明し得る。そうである場合、低下した毒性は、そのＨＣドメインに起因する可能性がある。なぜならば、Ｘ−ＬＣ−ＨＮは、Ａ−ＬＣ−ＨＮおよびＢ−ＬＣ−ＨＮのいずれよりも活性が高いと考えられるからである。分子間ジスルフィド結合の形成はまた、有効トキシン濃度を減少させ得る。in vivoでのその効力を決定するためには、全長のネイティブのＢｏＮＴ／Ｘを生成することが必要となるであろうが、全長トキシンを生成する前に、ＢｏＮＴ／Ｘの非毒性のフラグメントを用いて中和抗血清を作製することが重要となるであろう。
【０２２０】
全長の活性トキシン遺伝子を任意の発現系／生物中に導入することは、常に、重要なバイオセイフティーの懸念であり、生物学的トキシンの構造−機能研究の手強い障害となっている。これはＢｏＮＴにとって特に重要な配慮である。なぜならば、それらは６つのカテゴリーＡの潜在的バイオテロ剤のうちの１つであるからである４。ここで、２つの相補的かつ非毒性のフラグメントから限定された量の全長トキシンを生化学的に組み立てる方法を開発した。各々のフラグメントを、個別に発現させて精製し、次いで、ソルターゼを用いて試験管中で一緒にライゲーションする。２つのタンパク質フラグメントをタンパク質のトランススプライシングを通して融合させるスプリットインテイン（split intein）系などの他のタンパク質ライゲーション法もまた、利用することができる５７。反応中の前駆体フラグメントの量を制御することにより、ライゲーションされた全長トキシンの量を、厳密に制御することができる。この「半合成」アプローチは、多ドメインの生物学的トキシンおよび他の毒性タンパク質を制御された条件下において生成するために用いることができる。それはまた、２つのＢｏＮＴのＨＣを交換すること、ＢｏＮＴのＨＣを他のターゲティングタンパク質で置き換えること、またはさらなる積荷をトキシンに付加することなどの、融合およびキメラトキシンを作製するための多用途のプラットフォームを提供する。これまでに作製された全長トキシンｃＤＮＡは存在せず、細菌または任意の他の生物におけるトキシンの発現も存在しないので、このアプローチは、野生型および変異体トキシンの生成に関連するバイオセイフティーの懸念を著しく軽減し、生物学的トキシンおよび毒性タンパク質の構造−機能研究を著しく促進にするであろう。
【０２２１】
材料および方法
材料：シンタキシン１（ＨＰＣ−１）、ＳＮＡＰ−２５（Ｃ１７１．２）、およびＶＡＭＰ２（Ｃ１６９．１）についてのマウスモノクローナル抗体は、E. Chapman（マディソン、ＷＩ）により寛大にも贈与されたものであり、Synaptic Systems（ゲッティンゲン、ドイツ）から入手可能である。アクチンについてのマウスモノクローナル抗体は、Sigmaから購入した（ＡＣ−１５）。ＢｏＮＴ／Ａ／Ｂ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／Ｆに対するウマポリクローナル抗血清、およびＢｏＮＴ／Ｇに対するヤギポリクローナル抗血清は、ＦＤＡから得た。ＢｏＮＴ／Ｄに対するヤギポリクローナル抗体は、Fisher Scientificから購入した（ＮＢ１００６２４６９）。ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、およびＢｏＮＴ／Ｇは、Metabiologicsから購入した（マディソン、ＷＩ）。ＢｏＮＴ／Ｄは、E. Johnson（マディソン、ＷＩ）により寛大にも贈与されたものである。
【０２２２】
ｃＤＮＡおよびコンストラクト：Ｘ−ＬＣ（残基１〜４３９）およびＸ−ＨＣ（残基８９３−１３０６）をコードするｃＤＮＡを合成した。Ｘ−ＨＮをコードするｃＤＮＡは、研究室内で、ギブソン・アセンブリー法を用いて作成した。Ａ−ＬＣ（残基１〜４２５、Ｍ３０１９６）およびＢ−ＬＣ（残基１〜４３９、ＡＢ２３２９２７）をコードするｃＤＮＡは、GenScript（ニューブランズウィック、ＮＪ）により合成された。これらのＬＣを、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質としての発現のために、ｐＥＴ２８ベクター中にクローニングした。Ｘ−ＨＣを、ｐＧＥＸ４Ｔ中にクローニングして、ＧＳＴタグ付きタンパク質として発現させた。Ｘ−ＬＣ−ＨＮ、Ａ−ＬＣ−ＨＮ、およびＢ−ＬＣ−ＨＮを、それらのＣ末端に融合したペプチド配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号５８）と共に、ｐＥＴ２８ベクター中にサブクローニングし、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として精製した。ＢｏＮＴ／Ｘの全長の不活性な形態は、研究室内で、変異させたＸ−ＬＣ（Ｒ３６０Ａ／Ｙ３６３Ｆ）、Ｘ−ＨＮおよびＸ−ＨＣから構築した。それを、ＢｏＮＴ／ＸのＣ末端に融合したＨｉｓ６タグと共に、ｐＥＴ２８ベクター中にクローニングした、ラットＶＡＭＰ２をコードするｃＤＮＡは、E. Chapman（マディソン、ＷＩ）により寛大にも贈与された。ＶＡＭＰ２（１〜９６）は、ｐＥＴ２８ベクター中にクローニングして、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として発現させた。ＶＡＭＰ２（３３−８６）は、ｐＧＥＸ４Ｔベクター中にクローニングして、ＧＳＴタグ付きタンパク質として発現させた。マウスＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ３、ラットＶＡＭＰ７およびＶＡＭＰ８をコードするｃＤＮＡは、C. Hu（ルイビル、ＫＹ）により寛大にも贈与された。それらを、それらのＣ末端に融合したＨＡタグと共に、改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター中にクローニングした。Ｈｉｓ６タグ付きソルターゼ（ＳｒｔＡ*）をコードするコンストラクトは、B. Pentelute（ボストン、ＭＡ）により寛大にも贈与されたものであり、先に記載されている５１。
【０２２３】
バイオインフォマティクス：Uniprotデータベースを、Ａ型ＢｏＮＴの配列（Uniprotアクセッション番号A5HZZ9）を用いて、HMMERウェブサーバーにおいてjackhmmerで収束まで検索した。返された配列を、Clustal OmegaおよびSplitsTree4で推定されたNeighborNet系統発生ネットワークとアラインメントした。
【０２２４】
タンパク質精製：タンパク質発現のために、E.coli BL21（DE3）を利用した。発現の誘導は、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて２２℃で一晩行った。細菌のペレットを、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で超音波処理により破壊し、２００００ｇで３０分間にわたる４℃での遠心分離の後で、上清を回収した。タンパク質精製は、AKTA Prime FPLC系（GE）を用いて行い、精製されたタンパク質を、PD-10カラム（GE、17-0851-01）でさらに脱塩した。特に、全長の不活性なＢｏＮＴ／Ｘ（ＢｏＮＴ／ＸＲＹ）を、ｐＥＴ２２ｂベクター中にクローニングした。対応するプラスミドで、E. coli BL21（DE3）コンピテントセルを形質転換した。生じたコロニーを用いて、２５０ｍｌの振盪フラスコ中で、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に播種し、一晩、３７℃で増殖させた。発現のための培養物を、初めに、LEX Bioreactor（Epiphyte3、オンタリオ、カナダ）を用いて、３７℃で、１．５ＬのＴＢ培地中でＯＤ６００が０．８に達するまで増殖させた。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを用いる発現の誘導のために、温度を１８℃まで低下させ、１６〜１７時間にわたり増殖させた。細胞を収集して、氷上で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール、５％のグリセロール、２ｍＭのＴＣＥＰ中で再懸濁し、Emulsiflex-C3（Avestin、マンハイム、ドイツ）で２０，０００ｐｓｉにおいて細胞を溶解させた。ライセートを、２００，０００ｇで４５分間にわたり４℃で超遠心した。上清を、１５ｍｌのProtino（登録商標）Ni-NTAアガロース（Macherey-Nagen、デューレン、ドイツ）カラム上にロードし、これを次いで、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのイミダゾール、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰで洗浄した。溶離は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰを用いて行った。溶離液を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、０．５ｍＭのＴＣＥＰ中で、４℃で一晩透析した。透析液を、Vivaspin濃縮器（100kDaのカットオフ、GE Healthcare、ダンデリード、スェーデン）を用いて濃縮し、その後、透析のために使用したものと同じバッファーで事前に平衡化したSuperdex200-16/60カラム（GE Healthcare、ダンデリード、スウェーデン）上にロードした。ＢｏＮＴ／Ｘに対応する溶離ピークを回収し、最終試料が１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように濃縮した。試料を、等分して、液体窒素中にて−８０℃で瞬間凍結した。
【０２２５】
ガングリオシド結合アッセイ：精製されたガングリオシドＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂおよびＧＭ１（Carbosynth、コンプトン、ＵＫ）を、ＤＭＳＯ中で溶解し、２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に達するまでメタノール中で希釈した；１００μＬを、９６ウェルのＰＶＣアッセイプレート（カタログ番号2595、Corning；Corning、ＮＹ）の各ウェルに適用した。２１℃での溶媒蒸発の後で、ウェルを、２００μＬのＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで洗浄した。非特異的な結合部位を、２．５時間にわたる４℃での２００μＬのＰＢＳ／２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中でのインキュベーションによりブロッキングした。結合アッセイは、１ウェルあたり１００μＬのＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で、１時間にわたり４℃で行い、これは、試料（三つ組み）を、６μＭ〜０．０５μＭ（連続２倍希釈において）の範囲の濃度で含んだ。インキュベーションの後で、ウェルをＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで３回洗浄し、ＨＲＰ共役抗６ｘＨｉｓモノクローナル抗体（１：２０００、ThermoFisher）と共に１時間にわたり４℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡによる３回の洗浄ステップの後で、Ultra-TMB（１００μＬ／ウェル、ThermoFisher）を基質として用いて、結合した試料を検出した。１５分後、１００μＬの０．２ＭのＨ２ＳＯ４の添加により、反応を停止させ、Infinite M200PROプレートリーダー（Tecan、メンネドルフ、スイス）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。データを、Prism7（GraphPadソフトウェア）で分析した。
【０２２６】
ラット脳界面活性剤抽出物（ＢＤＥ）におけるＳＮＡＲＥタンパク質の切断：先に記載されるとおり、新たに解剖された成体ラット脳から、ラットＢＤＥを調製した５８。簡単に述べると、ラット脳を、１５ｍｌの３２０ｍＭのスクロースバッファー中でホモジェナイズし、その後、５０００ｒｐｍで２分間にわたり４℃で遠心分離した。上清を回収し、１１，０００ｒｐｍで１２分間遠心分離した。ペレットを回収して、１５ｍｌのＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ：２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に２％のTriton X-100およびプロテアーゼインヒビターのカクテル（Roche、ＣＡ）を添加したものの中で、３０分間にわたり可溶化した。試料を、その後、１７，０００ｒｐｍで２０分にわたり遠心分離して、不溶性の材料を取り除いた。ＢＤＥの最終タンパク質濃度は、約２ｍｇ／ｍｌであった。ＢＤＥ（６０μｌ）を、それぞれ、１時間にわたり３７℃でＸ−ＬＣ（０．５μＭ）、Ａ−ＬＣ（１μＭ）、またはＢ−ＬＣ（１μＭ）と共にインキュベートし、次いで、増強した化学発光（ＥＣＬ）法（Pierce）を用いるイムノブロットにより分析した。対照として、ＬＣを、２０ｍＭのＥＤＴＡと共に２０分間にわたり室温（ＲＴ）でプレインキュベートして、ＢＤＥ中に添加する前にそれらの活性を脱活性（de-active）した。
【０２２７】
Ｘ−ＬＣによる組み換えＶＡＭＰの切断：ＶＡＭＰ２（１−９６）は、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として発現させて精製し、ＶＡＭＰ２（３３−８６）は、ＧＳＴタグ付きタンパク質として発現させて精製した。これらのタンパク質（０．６ｍｇ／ｍｌ）を、０．１μＭのＸ−ＬＣと共に、ＴＢＳバッファー中で１時間にわたり３７℃でインキュベートした。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクマシーブルー染色、または質量分析の分析に供することのいずれかにより分析した。
【０２２８】
細胞ライセートにおけるＶＡＭＰの切断：全長のＨＡタグ付きＶＡＭＰ１、３、７および８を、PolyJet遺伝子導入試薬（SignaGen、ＭＤ）を製造者の指示に従って用いて、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入した。４８時間後に、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１０ｃｍディッシュ１枚あたり４００μｌ）にプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma-Aldrich）を加えたものの中で、細胞ライセートを収集した。細胞ライセート（２５０μｌ）を、Ｘ−ＬＣ（０．５μＭ）と共に１時間にわたり３７℃でインキュベートした。試料を、次いで、イムノブロットにより分析した。
【０２２９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる全タンパク質分析：Harvard Medical SchoolにおけるTaplin Biological Mass Spectrometry Core Facilityにおいて、試料を分析した。簡単に述べると、全タンパク質試料を、３ｃｍのビーズをオフラインで圧力セルを用いて充填した１００μｍの内径のＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム上にロードした。カラムを、Accela 600ポンプ（Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、ＭＡ）に再取り付けした。漸加するアセトニトリルの迅速勾配を用いて、タンパク質／ペプチドをＨＰＬＣカラムから溶離させた。ペプチドは、溶離するにつれて、エレクトロスプレーイオン化に供され、次いで、LTQ Orbitrap Velos Proイオントラップ質量分析計（Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、ＭＡ）中に入って、６００００の解像度において高解像度ＦＴＭＳスキャンを得、イオントラップにおいて低い解像度において第２のスキャンを得、最終スキャンを得てデータ依存的ＭＳ／ＭＳを行う。電荷の状態のエンベロープに対して、デコンヴォルーションを手動で行い、可能な場合にはタンパク質についてのモノアイソトピック質量を得るか、平均質量を得た。ソフトウェアプログラム、Sequest（Thermo Fisher Scientific）により、タンパク質データベースを得られた断片化パターンとマッチングさせることにより、ペプチドおよびタンパク質のアイデンティティーを決定した。全データベースは、全ての配列の逆向きのバージョンを含み、データに、１〜２％のペプチド偽発見率までフィルタをかけた。
【０２３０】
ＬＣとＨＮとの間のプロテアーゼ切断部位の同定：Ｈｉｓ６タグ付き組み換えＸ−ＬＣ−ＨＮフラグメント（残基１〜８９１）を、E.coliにおいて精製し、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃによる限定されたタンパク質分解に供した（Sigma P2289、１００：１（トキシン：Ｌｙｓ−Ｃ）のモル比、室温において２５分間）。Tandem Mass Tag（ＴＭＴ）標識およびタンデム質量分析アプローチにより切断部位を決定した。簡単に述べると、未変化のＸ−ＬＣ−ＨＮ試料を、軽いＴＭＴで標識して、等量のＸ−ＬＣ−ＨＮ試料を、Ｌｙｓ−Ｃに暴露し、次いで、重いＴＭＴで標識した。両方の試料を、次いで、キモトリプシンで消化して、一緒に組み合わせて、定量的質量分析の分析に供した。
【０２３１】
ＮＥＭによるシステインのアルキル化：Ｌｙｓ−Ｃにより活性化されたＸ−ＬＣ−ＨＮフラグメントを、リン酸ナトリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）中で、示された濃度（２０、１０および５ｍＭ）におけるＮＥＭを用いてまたはこれを用いずに０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度で希釈し、１０分間ＲＴでインキュベートした。ＮＥＭは、リン酸ナトリウムバッファー中で新たに調製した。試料を、３×の中性のローディング色素（２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、３０％のグリセロール、６％のドデシル硫酸リチウム、１０ｍＭのＮＥＭおよび０．０６％のＢＰＢ）と混合した。ＮＥＭを含まない試料については、ＮＥＭを含まない同じ３×のＳＤＳローディング色素を用いた。試料を、ローディング色素と共にＲＴで１０分間さらにインキュベートして、５５℃で１０分間加熱して、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析した。
【０２３２】
神経細胞の培養およびイムノブロット分析：初代ラット皮質神経細胞を、Ｅ１８〜１９胚から、先に記載されるようにパパイン解離キット（Worthington Biochemical、ＮＪ）を用いて調製した５８。実験は、ＤＩＶ１４〜１６において行った。神経細胞を、培地中で、ＢｏＮＴ／Ｘフラグメントまたはソルターゼライゲーション混合物に１２時間にわたり暴露した。細胞を、次いで洗浄して、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）にプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma-Aldrich）を加えたもので溶解した。ライセートを、１０分間、微量遠心機を用いて最大速度で４℃にて遠心分離した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧおよびイムノブロット分析に供した。
【０２３３】
ドットブロット：ＢｏＮＴ（１μｌ中０．２μｇ）をニトロセルロース膜上にスポットし、乾燥させた（１０分間室温で）。膜を、ＴＢＳＴ（ＴＢＳに０．０５％のTween20を加えたもの）中５％のミルクで３０分間ブロッキングして、次いで、示された抗血清（１：５００希釈）と共に３０分間インキュベートした。膜を、次いで、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）共役二次抗体と共に３０分間インキュベートし、ＴＢＳＴでさらに３回洗浄して、ＥＣＬ法（Pierce）で分析した。本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ｘ試料が、１：１の比の精製されたＸ−ＬＣ−ＨＮおよびＸ−ＨＣからなったことを注記する。
【０２３４】
ソルターゼにより媒介されるライゲーション：ＧＳＴ−Ｘ−ＨＣを、トロンビンにより一晩４℃で切断し、その後、タンパク質の混合物中に添加した。ライゲーション反応は、Ｘ−ＬＣ−ＨＮ（８μＭ）、トロンビンで切断したＧＳＴ−Ｘ−ＨＣ（２５μＭ）、Ｃａ２＋（１０ｍＭ）、およびソルターゼ（１０μＭ）を添加した５０μｌのＴＢＳバッファー中で、４０分間ＲＴでセットアップした。図４Ｃにおいて、神経細胞を、培地中の５μｌの混合物に１２時間にわたり暴露した。図４Ｄにおいて記載するＤＡＳアッセイにおいて、２５μｌの混合物を、マウスの後肢中に注射した。
【０２３５】
ＤＡＳアッセイ：ソルターゼライゲーション混合物を、初めに、トリプシンを用いる限定されたタンパク質分解により活性化した（６０：１のモル比（タンパク質の合計量：トリプシン）、３０分間、ＲＴで）。本発明者らは、トリプシンインヒビター（ダイズトリプシンインヒビター、１：１０の比（トリプシン：トリプシンインヒビター）を添加することによりタンパク質分解を停止させることができるので、ここでＬｙｓ−Ｃの代わりにトリプシンを選択した。マウス（ＣＤ−１系統、２１〜２５ｇ、ｎ＝６）をイソフルラン（３〜４％）で麻酔し、滅菌Hamilton注射器に取り付けた３０ゲージの針を用いて、ソルターゼライゲーション混合物を、右後肢の腓腹筋中に注射した。ＢｏＮＴは、驚愕応答において、後足の麻痺をもたらす。筋麻痺は、先に記載されたとおり５２、５３、注射後１２時間以内に観察された。
【０２３６】
参考文献
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【０２３７】
他の態様
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせることができる。本明細書において開示される各々の特徴は、同じ、同等、または類似の目的に役立つ代替的特徴により置き換えることができる。したがって、別段に明示的に記述されない限り、開示される各々の特徴は、一連の一般的な同等または類似の特徴の単なる例である。
【０２３８】
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本開示を多様な用途および条件に適応させるために、本開示の多様な変更および改変を行うことができる。したがって、他の態様もまた、請求の範囲内である。
【０２３９】
均等物および範囲
本明細書において、いくつかの本発明の態様を記載および説明してきたが、一方、当業者は、機能を発揮するため、ならびに／または本明細書において記載される結果および／もしくは利点の１つ以上を得るために、多様な他の手段および／または構造を容易に想起するであろう。そして、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内であるものとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料、および配置は、例示的であることを意図され、実際のパラメーター、寸法、材料および／または配置は、本発明の教示が用いられる特定の用途に依存するであろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、またはこれを確認することができるであろう。したがって、前述の態様は、単に例として提示されるものであって、添付の請求の範囲およびそれに対する均等物の範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載および請求されるものとは別段に実施することができることが、理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書において記載される各々の特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法に対して向けられる。加えて、２つ以上のかかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０２４０】
全ての定義は、本明細書において定義され用いられる場合、辞書による定義、参考として援用される文献における定義、および／または定義される用語の通常の意味に優先することが理解されるべきである。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々がそれについて引用される事項に関して参考として援用され、これは、一部の場合においては、文献の全体を包含する場合がある。
【０２４１】
不定冠詞「a」および「an」は、ここで明細書および請求の範囲において用いられる場合、明らかに逆であることが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
句「および／または」とは、ここで明細書および請求の範囲において用いられる場合、そのように結合された要素のうちの「いずれかまたは両方」、すなわち、一部の場合においては接続的に存在し、他の場合においては離接的に存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」により列記される複数の要素は、同じ様式において、すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」として解釈されるべきである。「および／または」節により特に同定される要素以外に、他の要素が任意に存在してもよく、これは、特に同定された要素と関係していてもこれと無関係であってもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンド的語法で接続されて用いられる場合、一態様において、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を指し；別の態様においては、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を指し；さらに別の態様においては、ＡとＢとの両方（任意に他の要素を含む）を指す、など。
【０２４２】
ここで明細書および請求の範囲において用いられる場合、「または」は、上で定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リストにおいて項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的であるもの、すなわち、多数の要素または要素のリスト、および任意にリストに入っていないさらなる項目のうちの、少なくとも１つの包含であるが、１つより多くをもまた含むものとして解釈されるべきである。「〜のうちの１つのみ」または「〜のうちの正確に１つ」などの、明らかに逆を示す用語のみ、または、請求の範囲において用いられる場合は、「〜からなる」は、多数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの包含を指す。一般的に、用語「または」とは、本明細書において用いられる場合、「〜のいずれか」、「〜のうちの一方」、または「〜のうちの正確に１つ」などの排他性の用語により先行される場合には、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるべきである。「〜から本質的になる」とは、請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられるようなその通常の意味を有するべきである。
【０２４３】
ここで明細書および請求の範囲において用いられる場合、句「少なくとも１つ」とは、１つ以上の要素のリストに関して、要素のリスト中の要素のうちの任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきであるが、これは、必ずしも、当該要素のリスト中に特に列記される各々および全ての要素のうちの少なくとも１つを含まず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、句「少なくとも１つ」が指す要素のリストにおいて特に同定される要素以外に、要素が任意に存在してもよいことを可能にし、これは、特に同定される要素と関係していてもこれと無関係であってもよい。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、同等に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一態様において、任意に１つより多くを含む、少なくとも１つのＡを指し、ここでＢは存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様においては、任意に１つより多くを含む、少なくとも１つのＢを指し、ここでＡは存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様においては、任意に１つより多くを含む、少なくとも１つのＡ、および任意に１つより多くを含む、少なくとも１つのＢを指す（および任意に他の要素を含む）など。
【０２４４】
また、明らかに逆が示されない限り、本明細書において請求される任意の方法であって１つより多くのステップまたは動作を含むものにおいて、当該方法のステップまたは動作の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは動作が列記される順序に限定されないことも、理解されるべきである。
【０２４５】
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「運搬する（carrying）」、「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、「保有する（holding）」、「〜からなる（composed of）」および類似のものなどの全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、それを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。移行句「〜からなる（consisting of）」および「〜から本質的になる（essentially consisiting of）」のみが、それぞれクローズまたはセミクローズの移行句であるべきであり、このことは、米国特許庁特許審査便覧（Manual of Patent Examining Procedures）、セクション2111.03において記載されるとおりである。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｅ】
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【図２Ａ−Ｅ】
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【図２Ｆ−Ｊ】
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【図３Ａ−Ｅ】
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【図４Ａ−Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ−Ｆ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｃ】
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【図１２Ａ−Ｆ】
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【図１３Ａ−Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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