【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年7月26日(2007.7.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項９】
溶液中で行われるアッセイで検出される、複数の核酸ターゲットと同ターゲット中の部分配列に全体的または部分的に相補的な複数のオリゴヌクレオチドとの二重体の数の著しい減少を防止する方法であって、前記オリゴヌクレオチドは固相担体の表面に付着し、ターゲットとオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに続いてアッセイ信号を発生させ、Ｐ個のヌクレオチドから成りｎＰ個
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の電離可能な基を有するオリゴヌクレオチドの有効電荷
2007521017.tif 000002
を調節し、プローブが完全には伸長しないようにするため前記溶液中のターゲットの濃度を調節する方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項５１】
特定の生物種に由来する、関連するゲノム配列のファミリーの差異を検出する方法において、ファミリーメンバーが２つまたはそれ以上の関連する類似した部分配列を有し、同部分配列の少なくとも１つ（Ｓ１）が、いくつかのファミリーメンバーの中で、３つまたはそれ以上の連続するヌクレオチドにおいて配列が異なり、また前記関連する部分配列の少なくとも１つ（Ｓ２）が、いくつかのファミリーメンバーの中で、３つ未満の連続するヌクレオチドにおいて配列が異なるとき、
部分配列Ｓ１およびＳ２を含む関連ゲノム配列を増幅するか、または部分配列Ｓ１およびＳ２を含むｍＲＮＡ領域を逆転写して、少なくとも４つの異なったオリゴヌクレオチド集合、すなわち
（ｉ）部分配列Ｓ１に由来するオリゴヌクレオチド（配列Ｆ１Ｓ１）と部分配列Ｓ２に由来するオリゴヌクレオチド（配列Ｆ１Ｓ２）；
（ｉｉ）部分配列Ｓ１に由来するオリゴヌクレオチド（配列Ｆ２Ｓ１）と部分配列Ｓ２に由来するオリゴヌクレオチド（配列Ｆ１Ｓ２）；
（ｉｉｉ）部分配列Ｓ１に由来するオリゴヌクレオチド（配列Ｆ１Ｓ１）とオリゴヌクレオチド（配列Ｆ２Ｓ２）；
（ｉｖ）部分配列Ｓ１に由来するオリゴヌクレオチド（配列Ｆ２Ｓ１）とオリゴヌクレオチド（配列Ｆ２Ｓ２）；
を作成し、Ｆ１Ｓ１にハイブリダイズし得る第１のオリゴヌクレオチドプローブ集合と、Ｆ２Ｓ１にハイブリダイズし得る第２のオリゴヌクレオチドプローブ集合と、Ｆ１Ｓ２にハイブリダイズし得る第３のオリゴヌクレオチドプローブ集合と、Ｆ２Ｓ２にハイブリダイズし得る第４のオリゴヌクレオチドプローブ集合とを準備し、各オリゴヌクレオチド集合を相互に区別し得るように符号化した、二重アッセイ方式を用いる方法において、４つのオリゴヌクレオチド集合と４つのオリゴヌクレオチドプローブ集合とのハイブリダイゼーションの後に、Ｆ１Ｓ１またはＦ２Ｓ１を含むオリゴヌクレオチドは第１の色により標識されている故に検出可能である一方、Ｆ１Ｓ２またはＦ２Ｓ２を含むオリゴヌクレオチドは伸長反応の後に検出可能な第２の色により標識され；
前記４つのオリゴヌクレオチド集合と４つのオリゴヌクレオチドプローブ集合とを、ハイブリダイゼーションおよび伸長が可能な条件のもとで接触させることにより、Ｆ１Ｓ１またはＦ２Ｓ１を含むオリゴヌクレオチドが第１の色により標識されている故に検出可能である一方、Ｆ１Ｓ２またはＦ２Ｓ２を含むオリゴヌクレオチドは伸長反応の後に検出可能な第２の色により標識され；
第１と第２の色の存在を検出・分析してハイブリダイゼーションと伸長のパターンを解析し；
同解析に基づき４組のオリゴヌクレオチド（Ｆ１Ｓ１，  Ｆ２Ｓ１，  Ｆ１Ｓ２，  Ｆ２Ｓ２）のいずれが試料中に存在するかを決定する方法。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項５５】
２種の異なった、しかし類似した部分配列である「正常型」および「変異型」を含むゲノムＤＮＡを有する被験者群におけるｍＲＮＡの示差的発現を決定する方法であって、
（ｉ）被験者のゲノムＤＮＡの、正常型および変異型部分配列を含む領域から生成されたｍＲＮＡを逆転写して、正常型部分配列に由来する部分配列を含む第１のｃＤＮＡ鎖と、変異型部分配列に由来する部分配列を含む第２のｃＤＮＡ鎖を形成し；
（ｉｉ）第１のｃＤＮＡ鎖または第２のｃＤＮＡ鎖に対して、全体的或いは部分的に相補的なアンチセンスｃＤＮＡを生成させ、アニール条件下でアンチセンスｃＤＮＡが第１または第２のｃＤＮＡ鎖とアニールして二重鎖ｃＤＮＡを形成するようにし；
（ｉｉｉ）アンチセンスｃＤＮＡと相補的なｃＤＮＡ鎖（第１または第２のｃＤＮＡ鎖）とが二重鎖ｃＤＮＡを形成するようなアニール条件を実現し；
（ｉｖ）上記の段階（ｉｉｉ）で得られた二重鎖ｃＤＮＡの一方の鎖を消化して単鎖アンチセンスｃＤＮＡ鎖を得；
（ｖ）単鎖アンチセンスｃＤＮＡ鎖が他のｃＤＮＡ鎖（第１または第２のｃＤＮＡ鎖）とアニールするようなアニール条件を実現し；
（ｖｉ）上記の段階（ｖ）の後で残存する第１または第２のｃＤＮＡ鎖があるかどうかを決定する方法。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
先行技術において好まれる多重化発現分析の方法の一つは、ランダムに置かれた短い逆転写（ＲＴ）プライマーを用いて１組のＲＮＡを不均一なｃＤＮＡ集団に転換するか、または汎用ＲＴプライマーをｍＲＮＡのｐｏｌｙＡテールに作用させて完全な長さのｃＤＮＡを得ることである。これらの方法では配列固有のＲＴプライマーを設計する必要はないが、いずれの方法も発現の定量的追跡のためには重大な欠点を有している。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
ターゲットとプローブの立体構造の役割：
溶液中のＤＮＡは鎖のエントロピーで決まるポリマー特性を持つことが知られている（Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ａ  ｆｌｏｗ  ｆｉｅｌｄ”，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｅ  ５５：１７９４−９７（１９９７）を参照）。特に単鎖ＤＮＡ（ｓｓ）ＤＮＡは可撓性が大きく、そのことは実験的に興味のある条件のほとんどにおいて、持続長がヌクレオチド（ｎｔ）数個の程度にすぎないことに現れている。これは二本鎖ＤＮＡよりも相当に短い（Ｍａｒｋｏ  ＪＦ，Ｓｉｇｇｉａ  ＥＤ：”Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ”，２２：６２５，５０６−５０８（１９９４））。したがって固定化プローブによるｓｓＤＮＡの捕捉では分子の立体構造の自由度に著しい制約が加わることになる。同時に、もし二本鎖が形成されれば、固相法による核酸分析では、侵入するターゲットの鎖に弾性変形で対応しなければならない。ターゲットとプローブの分子のポリマーとしての立体的位置関係の適合性については、核酸分析手法の設計においてこれまで十分な注意が払われてこなかった。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
（ｉｉｉ）アッセイに関して下記の方法を確立すること：
−  メッセージ在量の広いダイナミックレンジ（全反応容積１０μｌあたり約１〜１０，０００ｆｍｏｌ）に対応するため、下記によってアッセイ信号強度のダイナミックレンジを調節すること；
−  プローブ長さとターゲットの相互作用に応じてプローブ密度を制御することで、ターゲットの捕捉に影響する「充填」制約を制御すること；
−  アレイの組成、すなわち結合部位の数を制御すること；
−  トランスクリプトの長さ、トランスクリプトの存在量、標識密度を制御すること。
−  伸長を媒介とする配列固有の信号増幅により、感度を向上させること；
−  ハイブリダイゼーションを媒介とする分析と、伸長を媒介とする分析とを組み合わせて高度に相同的な配列を検出することにより、特異性を向上させること；
−  単一の色を用いて「変異」および「正常」試料における特定遺伝子の発現レベルの差を検出できる減算法により示差発現分析を実施すること。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
検出の特異性を最適化するには、同時出願の米国特許出願Ｎｏ．１０／８９２，５１４”Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”（２００３年７月１５日出願）（以下単に出願１０／８９２，５１４ともいう）に述べられているように、プライマーとそれに対応するプローブを適切に選択することにより、多重化逆転写および検出の配列特異性を最適化する。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
これらの方法により感度と特異性を最適化すれば、指定された１組のｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、対応するオリゴヌクレオチドプローブにそれらｃＤＮＡを捕捉して検出することにより、指定された１組の遺伝子の同時定量分析を迅速に行うことができる。この分析には本明細書に述べるような単純なプロトコルを用いることが好ましく、ターゲット増幅過程の省略によってプロトコルの単純化とアッセイの所要時間の短縮を図ることが好ましい。本明細書に述べる方法、プロトコルおよび設計は、平行多重化核酸分析、特に指定された１組の遺伝子の発現パターンの定量分析に極めて有用である。ここに指定された遺伝子の組は典型的には２〜１００個、より典型的には１０〜３０個の異なるｍＲＮＡ（「メッセージ」）を含み、この方法を以下多重化発現追跡（ｍＥＭ）と呼ぶ。本明細書に述べる方法、プロトコルおよび設計は、米国特許出願Ｎｏ．１０／２０４，７９９“Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｎｄｏｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｒｒａｙｓ”（２００２年８月２３日出願）（本明細書を構成するものとして援用）に記載されたＲＥＡＤＴＭ式多重化発現追跡と組み合わせて有利に用いることができる。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
「溶融温度」の計算の通常の方法と類比的に、現象論的な「直近」（“ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ”，ＮＮ）モデルを用いて、塩濃度、温度その他の与えられた実験条件のもとでのプローブ・ターゲット複合体内の隣接塩基対間の相互作用を表現し、（配列固有の）親和性定数を計算する。二重体生成の自由エネルギー（「結合エネルギー」、「凝縮エネルギー」とも呼ぶ）は次のように計算される。
ΔＧＣ＝ΔＧＮｕｃｌｅａｔｉｏｎ＋ΣｉεＮＮ−Ｐａｉｒｓ（ΔＨｉ＋ＴΔＳｉ）
ここにΔＨｉとΔＳｉはそれぞれエンタルピー、エントロピーを示す。条件ΔＧＣ＝０から、二重体の安定度を評価するのに広く用いられている「溶融温度」ＴＭが求められる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
標準的な熱力学に従い、（配列固有の）親和性定数ＫＳＳは次式から計算される。
ＫＳＳ＝Ｋ０ｅｘｐ（−ΔＧＣ／ｋＴ）
ここにＫ０は定数、ｋはＢｏｌｔｚｍａｎｎ定数である。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
この標準モデルを用いて、温度５５℃、塩濃度２Ｍで、１５ｎｔから３５ｎｔの長さの異なる１７５ｎｔのターゲットＤＮＡと７種のＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの複合体の溶融温度と親和性定数を計算した。ターゲットおよびプローブの配列は表Ｉ−１に示すとおりである。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
溶融温度と親和性定数の計算値を表Ｉ−２に示す。長いプローブに対して親和性定数が極めて大きいことは、長いプローブの方がターゲットの検出感度が高いことを予測させる。たとえば複数分子の分析のＲＥＡＤ法に従って色で符号化した直径３．２μｍの微小球（「ビード」）を用い、ビードあたりのプローブの数を［Ｐ］０＝１０５とすると、質量作用の法則により、２１量体プローブによるターゲットの検出限界が次のように計算される。
［Ｔ］ｍｉｎ＝［ＰＴ］ｍｉｎ／Ｋ［Ｐ］０＝［ＰＴ］ｍｉｎ／１．７×１０１０／Ｍ×１０５；
ここに［ＰＴ］ｍｉｎは確実に検出されるために必要なプローブ・ターゲット複合体のビード当たり最小数であり、［ＰＴ］ｍｉｎ＝１０３に対して
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が得られる。この値は細胞１個あたりコピー１個のメッセージ存在量に相当する。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
分析対象であるターゲットを固定化プローブに捕捉する際の立体構造の妨害的な作用（「立体障害」）、特に、プローブ接近性の重要性は周知である。たとえばＧｕｉｓａｎ，Ｊ．Ｍ．ｉｎ  “Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐ．２６１−２７５（１９９７）を参照されたい。このため捕捉効率を高めるための経験的な方法として、好ましい長さのスペーサーを導入してプローブの「充填」に関連する制約を軽減することが提案されている。たとえばＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（ｓｕｐｐｌ．）２１，５−９（１９９９）を参照されたい。しかし本発明の方法は既知の方法と異なり、プローブとターゲットの相互作用を最適化する系統的な設計過程の基礎として、ターゲットとプローブ層各々の性質の間に基本的な関連を確立するものである。二重体形成の際にターゲットまたはその一部のプローブ層への進入を容易にするためには、プローブ層の圧縮率を最大にする必要があることが見出された。より一般的には、本発明の設計基準は基板に固定化したプローブの長さ、グラフト密度、静電荷、ターゲットの長さと立体構造、ターゲットの５’末端に対する捕捉部分配列の位置が捕捉効率、ひいてはアッセイ信号に及ぼす影響の本性と大きさを反映している。逆に、ターゲットの存在量を正確に決定するため、プローブとターゲットの相互作用を支配する再規格化定数を決定するための方法も開示する。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
ターゲット長さの効果：
プローブとターゲットの捕捉効率に対するターゲット鎖の長さの影響を調べるため、長さ２５ｎｔ，４０ｎｔ，９０ｎｔ，１７５ｎｔで共通の部分配列を含む４つの合成ＤＮＡターゲット（表Ｉ−１参照）の末端を蛍光標識し、ＲＥＡＤ法に従って平面状アレイに配列した、色で符号化した直径３．２μｍのビード上の１９ｎｔの捕捉プローブとハイブリダイズさせた。代表的な結合曲線から、ターゲット長さＬの影響が大きいことが知られる。図３Ａに示すように、飽和以下のいずれのターゲット濃度においても、ターゲットが長いほど得られる信号強度は小さくなる。ここで信号強度は各曲線について、飽和時の値を用いて規格化されている。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
遺伝子発現分析において典型的な実験条件のもとでは、ターゲットの大きさはプローブの大きさを上回り、捕捉された各ターゲットはプローブ１個分より大きい空間を占める。したがって飽和は有限な表面積Ａ０を持つビードに対するターゲットの数の限界ＮＴＳａｔを反映する。ビード表面が捕捉されたターゲットで修飾され、ターゲットが「緩んだ」立体構造をとり、ターゲットの特性的寸法が、回転半径ＲＧ，Ｔ〜ａＬν、ここで、νは特性指数を示し、理想的な鎖に対してはν＝１／２、３次元で良好な溶媒内での自己排除的な鎖に対してはν＝３／５、で決まるものと仮定すると、より小さいＮＴＳａｔの値が得られ（ｄｅＧｅｎｎｅｓ，“Ｓｃａｌｉｎｇ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｈｙｓｉｃｓ”，Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９）、最小のターゲットに対してはＮＴＳａｔ〜Ａ０／ＲＧ，Ｔ２或いはＮＴＳａｔ〜１／Ｌである。ｐ０をビード上に捕捉されたターゲットの飽和時の数ＮＴＳａｔと同一視すれば、最小のターゲット（Ｌ＝２５ｎｔ）に対して平均分子面積はＡＴ〜４π（１．６μｍ）２／８＊１０５〜４＊１０３Å２となる。この値は（実験的）推定値
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を用いて得られるＡＴＲｅｌａｘｅｄ〜πＲＧ，Ｔ２〜６．５＊１０３Å２に近い（Ｔｉｎｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３０，５７６３（１９９７））。１７５ｎｔのターゲットについて同様の比較を行うと
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となる。これらの比較から、大きいターゲット分子の立体構造は緩んだ状態でなく、よりコンパクトな構造をとること、或いはターゲット分子が相互に孤立しておらず「重複」、所謂、相互進入していることが推測される。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４３】
一定のターゲット濃度においては、信号強度のターゲット長さＬへの依存性は１／Ｌｘの形となる（図５）。ターゲット長さがＬ＝２５ｎｔからＬ＝１７５ｎｔの範囲で、また各長さにおいてターゲット濃度が３桁（０．１ｎＭから１００ｎＭ）の範囲で変化するとき
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である。１９ｎｔのプローブにはすべてのターゲットが同じ１９ｎｔの部分配列を介してハイブリダイズし（表Ｉ−１）、したがって二重体形成の「凝縮」エネルギーは同一であるにも関わらず、ターゲットの長さが増大すると信号強度が顕著に低下する。したがって捕捉プローブの長さが与えられたとき、ターゲットが長いほど二重体形成に不利であり、有効親和性は小さくなる。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
プローブとターゲットのハイブリダイゼーションを支配する有効親和力が冪乗則に従うことは、特定のターゲット鎖の長さに従って捕捉効率を調節する手段を提供する。このことは発現分析のような分野で、配列固有の逆転写（ＲＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡの長さを制御できるため特に有用な設計基準となる。後に詳述するように、希なメッセージが短いｃＤＮＡに転換されることが、捕捉効率を最大化する上で好ましい。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
プローブ長さの効果：
図３に１９ｎｔのプローブについて示したような結合曲線を、長さ１５ｎｔ〜３５ｎｔの一群の捕捉プローブに対して作成した。図６Ａ、６Ｂには１７５ｔのターゲットに対する結合曲線を、質量作用の法則へのあてはめと共に示す。ここで上記のようにＩ〜ｎＦｃ（ｎＦは分子あたりの蛍光標識の（平均）数）と仮定している。この組から、あてはめによって親和性定数として
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が得られ、これはＮＮモデルから予測される値の約１／２０である（表Ｉ−２参照）。ターゲットの長さを２５ｎｔ，９０ｎｔ，１７５ｎｔにそれぞれ固定したときの信号強度とプローブ長さとの関係を図７Ａ〜７Ｃに示す。予想されるとおり強度プロファイルは、ＮＮモデルから予測される値よりは小さいが、短いプローブに対するほど高くなる。しかしながら４点のターゲット長さすべてに対して、プローブ長さ約３０ｎｔでプロファイルはピークに達するか、または飽和する。これはＮＮモデルでは全く予想されない効果であり、後述するように、ターゲットが固定化プローブに捕捉されるためには、接近するターゲット鎖のみならず捕捉プローブ層にも弾性変形が起こらなければならないことを示唆するものである。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
たとえばターゲット濃度１．１３ｎＭに対してはＩ１５０ｎｔ／Ｉ１０００ｎｔ〜３である。移行濃度（図１０Ａに見られる屈曲点を参照）付近などで見られる約３倍の感度増加は、トランスクリプトの長さＬを縮小したときに予想される強化効果と一致している。すなわちＬを１０００ｎｔから１５０ｎｔに減少させたときの感度増加はおよそ（１０００／１５０）ｘ（３／１５）である。第１の因子はモデルターゲットについてＩ．２．１項に述べた（そこでは
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であった）長さの縮小に対応し、第２の因子は、選ばれた線形標識密度において１５０量体のｎＦ（１５０ｎｔ）〜３であり、ｎＦ（１０００ｎｔ）〜１５であることを反映している。ｘ＝３／２とするとこの強化効果は〜３．５となり、実験値と一致する。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
図１１はｃ＊とトランスクリプトの長さとの関係ｃ〜１／Ｌｙを示す。限られたものではあるが利用できるデータから
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と推定される。この曲線は希釈領域（線より下）と濃縮領域（線より上）との境界を表している。一般に、希なメッセージの捕捉効率、したがって検出感度を高めるには、大きい有効親和性定数を利用するため希釈領域で作業するのが有利である。この利点はターゲットが長いときは特に著しい。ターゲットは検出を容易にするため複数個の箇所に、たとえば本明細書に示すように逆転写中に標識ｄＮＴＰを導入することにより、標識を施すことが望ましい。反対に、実験的に記録された信号強度の解析に際しては、長さの異なるｃＤＮＡは存在量が等しくても一般に大きく異なった信号強度を生ずる可能性があることを考慮しなければならない。すなわちメッセージの存在量の決定の信頼性を確保するには、有効親和性定数を用いて溶液濃度を評価しなければならない。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
Ｉ．２．２Ｂ  捕捉プローブ位置の効果：末端捕捉配列：
本明細書にはまた、捕捉部分配列を長いトランスクリプトの５’末端付近に置くことによって、捕捉効率、したがってアッセイ信号および感度を支配する有効親和性が増大することを開示する。このことは１２００ｎｔのカナマイシンｍＲＮＡについて、逆転写プライマーならびに内部および末端プローブのアラインメントを示す図１２Ａに表されている。図１２Ｂは５００ｎｔのトランスクリプトを２つの異なった（組の）１９量体プローブに捕捉した場合のタイトレーションの結果を比較したもので、プローブの一方はトランスクリプトの５’末端付近の部分配列に、他方はトランスクリプト内部の部分配列にそれぞれ適合するものである。「末端」捕捉プローブを用いたときは「内部」プローブに比べて約１．５倍のアッセイ信号強度が記録されている。これらの結果を吸着等温線の形に変換すれば（図１３）、捕捉部分配列をトランスクリプトの５’末端付近にとることが、長さを縮小した場合と類似の効果を持つことがわかる。このことは、末端部分配列を捕捉する際にはプローブ層もターゲットも立体構造の変化が少なくてすみ、したがって後述のように鎖のエントロピーに由来される反発効果が少ない点で、短いターゲットを使用するのと等価であるとの見方を支持するものである。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７１】
多価電解質ブラシ：
一つの見方として、ここに示すモデルは変形可能な基板への多価電解質の吸着過程に類似するものである。この基板は多価電解質「ブラシ」、或いはある条件のもとでは末端グラフトされたポリマー「ブラシ」の特徴を持つ（図１４、Ｐｉｎｃｕｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２４，２９１２−２９１９（１９９１）（本明細書を構成するものとして援用）、またＦｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｃ．４  ｉｎ：”Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｔ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ”，Ｃｈａｐｍａｎ  Ｈａｌｌ，１９９３を参照）。面密度σの末端グラフトされたプローブ層において、隣接プローブ間の特性距離ｄ（σ〜ｄ−２）と、各プローブの緩んだ、或いは拡張した（「マッシュルーム型」）構造の特性寸法ξ⊥とは相互に関係づけられ、ξ⊥＜＜ｄである限りは各マッシュルームの立体構造は隣接するマッシュルームの影響を受けないが、プローブ鎖が重なるようになると「マッシュルーム」構造は拘束を受け、プローブは、次第に「伸長」構造を採用し、これによって、プローブ層は鎖の末端が自由表面を向いた「ブラシ」状の形をとる（Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｍｉｌｎｅｒ，Ｗｉｔｔｅｎ＆Ｃａｔｅｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２１，２６１０−２６１９（１９８８））。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７３】
たとえば溶液反応
2007521017.tif 000010
の解離度をｋとすると、αＢｕｌｋ：＝［Ａ−］／［ＡＨ］をｋと［Ｈ＋］で表してαＢｕｌｋ＝１／｛１＋［Ｈ＋］／ｋ｝と書ける。一般に［Ｈ＋］＞［Ｈ＋］Ｂｕｌｋ，α＜αＢｕｌｋであり、ｆ＝ｆ（α）、より正確にはｆ＝ｆ（ｋ，ＣＢｕｌｋＳ）である。バルク溶液中の塩濃度ＣＢｕｌｋＳが低いときは、電気的中性を保つために対イオンがブラシ内部に保持され、そのため混合エントロピーが減少する。対応して働く浸透圧のため、鎖はグラフト密度の如何に関わらず完全に伸びると考えられる。逆にバルクの塩濃度が十分高ければ過剰な可動共イオンおよび対イオンがブラシに進入し、ブラシ内の静電的相互作用を遮蔽する。また捕捉された対イオンに対する浸透圧が低下するため鎖の緩んだ立体構造の出現（およびそれに対応する層の厚さの減少）が予想される。通常のハイブリダイゼーション実験でしばしば現れる高い塩濃度（約１００ｍＭ〜２Ｍ）のもとでは、立体構造が崩壊し、対イオンが層全体に分布せず固定化されたプローブ鎖（またはプローブ・ターゲット二重体）に結合した状態となる。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７６】
ＩＩ．１．１  プローブ層の変形とターゲットの拘束：親和性定数の再規格化
末端グラフトされたプローブの層にターゲット（の一部）が進入すると、局所的にセグメント濃度が増加し、それに応じて浸透圧が発生する。さらにターゲットの進入によって層の弾性変形が生ずるが、これは図１４に示すように鎖の伸長（「伸縮」）によって媒介される。浸透圧と鎖の伸長による弾性的エネルギーは進入するターゲットに対する反発力として働き、二重体生成の自由エネルギーに反発力の項ＧＰを生じさせる。コロイド懸濁液のエントロピー的安定化に寄与するのはこの反発自由エネルギーであるが、グラフト層の最適な立体構造はそれに接触するコロイド粒子の上で鎖の相互浸透を最小にするようなものであり、ここで目的とする捕捉プローブ層の立体構造の最適化はターゲット鎖の層内への進入を容易にすることである。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
グラフト密度が極めて低い場合、たとえばｄ〜σ−１／２＞＞ＲＧ，Ｔの極限では、孤立したプローブが緩んだ立体構造（マッシュルーム型）をとっており、その大きさはＲＧ，Ｐ〜ａＰν，ν＝３／５であり、ターゲットの捕捉が進行する際に鎖の局所的な「充填」による制約を受けることはない。しかし捕捉されるターゲットの最大数は少なく、したがってアッセイ信号は弱い。反対にグラフト密度が高くｄ〜σ−１／２＜ξＴ＜＜ＲＧ，Ｔであれば、特に鎖が完全に伸長する条件のもとでは、利用し得る捕捉プローブの数は多くなるが、層の横方向の圧縮率は低く、ターゲットは十分に捕捉されずアッセイ信号は弱くなる。ここにξＴは部分的に伸長したターゲットの特性を示す「液滴」の大きさである。したがって固定化プローブ層によるターゲットの捕捉を最適化するには、圧縮率を実質的に減少させない限りで単位面積あたりのプローブ数を最大にする必要がある。たとえば与えられたターゲットの大きさＴの部分が二重体形成に関与するものとすれば、大きさＴの合成ターゲットを用い、外部条件を一定として、捕捉されたターゲットの分率を反映するアッセイ信号をグラフト密度の関数として求め、得られた曲線でピークまたはプラトーの出現位置を決めれば、最適のグラフト密度が求められる。例えば、可撓性の「バックボーン」に「間接的に」プローブを付着させ、これを更に固相に付着させる間接固定法も拘束を緩和するのに利用できる。米国特許出願Ｎｏ．１０／９４７，０９５“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｂｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”（２００４年９月２２日出願）（本明細書を構成するものとして援用）を参照されたい。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７８】
ターゲットまたはターゲットの一部は、捕捉配列との接触のため、プローブ層または既に形成されているプローブ・ターゲット複合層の局所的立体構造に適合しなければならない（図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１５参照）。これによるターゲット鎖への拘束、およびそれに対応する配置エントロピーの減少（希釈領域でも起こる）は二重体生成の自由エネルギーに反発力の項ＧＴを生じさせる。ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡに加えられる拘束の程度は、溶液中の条件のもとでこれらの多価電解質がとる拘束のない（緩んだ）立体構造に依存し、配列固有の相互作用（折り畳み）を考慮しないとしてもなお複雑な挙動が予想される（たとえばＳｃｈｉｅｓｓｅｌ＆Ｐｉｎｃｕｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３１，７９５３−７９５９（１９９８）を参照）。具体例を挙げれば、ターゲットの長さＴ、大きさＲＧ，Ｔ〜ａＴν，ν＝３／５（ガウス的コイル構造を仮定）の部分が局所的グラフト密度σのプローブ層に進入する場合、ターゲットの変形の弾性エネルギーＧＴ〜（ＲＧ，Ｔ／σ−１／２）２〜ａ２Ｔ２ν／σが必要である。すなわちターゲットのうちプローブ層に進入する部分の長さが隣接プローブ間の特性距離ｄ〜σ−１／２に比べて大きいほど、それに必要なターゲットの変形が困難になる。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７９】
プローブ・ターゲット複合体の形成を促進する、配列に固有の「凝縮」エネルギーＧＣは、自由エネルギーのこれらの反発項Ｇｅｌ＝ＧＰ＋ＧＴにつり合わなければならない。すなわちプローブ・ターゲット複合体の形成を支配する自由エネルギーはＧ〜Ｇｅｌ−ＧＣの形をとる。自由エネルギーのこの形の直接的な帰結の一つは配列に依存する親和性定数ＫＳＳの、有効親和性定数Ｋ＊＜ＫＳＳへの「再規格化」である。Ｇｅｌ＜ＧＣである限り凝縮は起こるが、自由エネルギーの実増加量は少なく、−ΔＧ＊Ｃ＝−ΔＧＣ＋Ｇｅｌ、＞−ΔＧＣであり、それに対応して有効凝縮エネルギーが小さいことから有効親和性定数も小さくなる。
Ｋ＊〜ｅｘｐ（−ΔＧ＊Ｃ／ＲＴ）＜ＫＳＳ〜ｅｘｐ（−ΔＧＣ／ＲＴ）
また「溶融温度」も低下し、Ｔ＊Ｍ＜ＴＭとなる。ここにＴ＊Ｍは条件ΔＧ（Ｔ＊Ｍ）＝ΔＧ＊Ｃ（Ｔ＊Ｍ）＝０から定まり、ＴＭは条件ΔＧＣ（ＴＭ）＝０から定まる。このように配列固有の値には大きな補正を見込む必要があり、実際、弾性効果によって二重体形成が完全に抑止されることもある。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８０】
有効親和性定数を評価する方法の一つはここに述べる経験的方法であり、立体構造が既知のプローブ層と、長さＴの興味ある部分のみから成る合成ターゲットおよび長さＴの部分配列が全長Ｌ＞Ｔの配列中に埋め込まれている別のターゲットとを使用して等温線の測定を行う。排除容積効果を無視すれば、与えられた長さＰのプローブの層の立体構造は、グラフト密度σと有効電荷線密度ｆ（０＜ｆ＜１）で決まり、後者は実験条件、特にバルク溶液内の塩、ｐＨ、温度を反映する。これらの等温線測定から、種々のターゲット濃度領域における有効親和性定数を容易に求めることができる。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８２】
ＩＩ．１．２  設計に関する考察
プローブ層の立体構造：優先グラフト密度：
与えられたグラフト密度σに対して、プローブ鎖の横方向の変位ｓ⊥がｄと同程度に、すなわち、
2007521017.tif 000011
（Ｐはプローブ長さ、ａはモノマーまたはセグメントの大きさ）となると、「マッシュルーム型」構造における隣接する鎖の重なりが生ずるようになる。ν＝１／２のときこの条件はａ２Ｐ〜ｄ２〜１／σ、したがってＰ〜１／σａ２となる。対象の捕捉プローブに対して好ましい長さＰが与えられると、これ故にグラフティング密度は、好ましくはσ＜１／ａ２Ｐのように最適化される。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８３】
プローブグラフト密度における増加に相当する方法におけるセグメント密度を増加するターゲット進入を考察することは、この規則の修正を示唆する。捕捉プローブの優先長さＰが与えられたとき、ターゲットの一部が進入して少なくともプローブと同程度のフットプリントを占めることを見越して、σｅｆｆ＝ｇσ＜ｇ／ａ２Ｐ、１／２＜ｇ＜１となるようにグラフト密度を選ぶ。たとえばｇ＝１／２すなわちＴ＝Ｐ（末端捕捉の場合十分良い近似で成立する状況、図１２Ａ，１２Ｂ，１３参照）のときは、予想されるターゲットの進入に対応するためにはσｅｆｆ＜１／２ａ２Ｐとする。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８４】
プローブ層の自由エネルギー：浸透圧と弾性変形：
ターゲット鎖またはその一部が末端グラフトされたプローブのブラシに進入すると、局所的セグメント密度φが増大する。面積Ａ０、厚さＤ＝Ｄ（σ）のブラシがｎｐ本の鎖を含んでいる場合、φ〜Ｓ／Ａ０Ｄ（σ）〜（ｎｐ／Ａ０）Ｐ／Ｄ（σ）（Ｐは鎖１本あたりセグメント数）、したがってφ〜σＰ／Ｄ（σ）である。φが増加すれば浸透圧Π〜φｗ（ｗは特性指数）が増大し、層の圧縮率
2007521017.tif 000012
が減少する。セグメントが加わればその度に弾性変形が起こる。たとえば「小球」の連なりから成るブラシ（図１４）では弾性変形により小球の「特性」寸法ξＰが減少し、同時に鎖セグメントの伸長とそれに伴うブラシの厚さＤ＝Ｄ（σ）の減少による自由エネルギー増加分も減少する。各小球がＰＢ個のセグメントを含むとすれば、
2007521017.tif 000013
したがって
2007521017.tif 000014
である。各プローブ鎖の長さがＰでブラシの厚さにわたってＰ／ＰＢ個の小球を含むとすれば、
2007521017.tif 000015
であり、ξＰ〜σ−１／２とすればＤ〜ａＰσ１／３となる。すなわちグラフト密度を増加させると鎖の伸長により層の厚さが増加する。このようなスケール関係は、鎖の弾性における反発力（排除容積効果、静電的相互作用など）と吸引力とのバランスから全く一般的に生ずるものである。
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８６】
典型的な値である
2007521017.tif 000016
における最大捕捉効率の実験値から、鎖１本あたりの特性的フットプリントξＰが推定される。（直径３．２μｍの）ビード１個が対応できるターゲット（長さＬ＝２５ｎｔ）の最大数の推定値として
2007521017.tif 000017
（図６Ｂ）を用い、各ターゲットが大きさの等しいプローブに捕捉されてハイブリダイズすると仮定すると、ターゲット捕捉後の平均分子面積はＡｐ〜π（１．６μｍ）２／２＊６＊１０５〜０．６５＊１０３Å２と推定され、これはプローブのグラフト密度
2007521017.tif 000018
に対応する捕捉前の値の２倍に相当する。このことから、グラフトの過程は「自己限定的」であって、少なくともここで引用する実験に用いられている固相担体の形成の条件では、末端グラフトされたプローブの立体構造は緩んだ状態ではなく、部分的に伸長した構造であると考えられる。部分的伸長は特性半径
2007521017.tif 000019
の「小球」の伸長した列の構造（Ｔｉｎｌａｎｄ  ｅｔ．ａｌ．，ｏｐ．ｃｉｔ．）と適合する。ここにＲＧ，Ｐは溶液中で拘束を受けないプローブ鎖の回転半径を表す。すなわち自己限定的過程で形成されたブラシにおいては
2007521017.tif 000020
である。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９０】
小さいターゲットの極限では、捕捉の主な効果は前述のとおりプローブ層内でのセグメント密度の増大であり、移行はプローブ層、或いはより一般的には特性寸法がξ＾Ｐ＜ξＰで既に特性寸法がξ＾Ｔ＜ξＴであるターゲットを捕捉している捕捉プローブが形成する層が、圧縮率の低い領域に移行することを表している。すなわち移行が生ずるのは、ｎＴ＊ξ＾Ｔ２＋ｎＰ＊ξ＾Ｐ２〜η＊Ａ０、すなわちη＊〜（ｎＰ＊／Ａ０）ξ＾Ｐ２＋（ｎＴ＊／Ａ０）ξ＾Ｔ２〜ｐ０ξ＾Ｐ２＋ｃ＊ξ＾Ｔ２、したがってｃ＊〜（η＊−ｐ０ξ＾Ｐ２）／ξ＾Ｔ２のときである。特別な場合として
2007521017.tif 000021
ならばｃ＊＋ｐ０〜η＊／ξ＾２、或いは
2007521017.tif 000022
と仮定すればｃ＊＋ｐ０〜η＊／Ｌｙである。さらに特別な場合としてｎＰ＊＝ｎＴ＊＝ｎ＊ならばη＊〜（ｎ＊／Ａ０）ξ＾ＰＴ２或いはｃ＊＝（ｎ＊／Ａ０）〜η＊／ξ＾ＰＴ２である。ここにξ＾ＰＴ２はプローブ・ターゲット二重体のフットプリントを表し、前と同じく
2007521017.tif 000023
である。この限界値は短いターゲットを用いるか（実際上は得られないことが多い）、指定のターゲット配列をターゲットの５’末端付近に置くことによって達成することができる。本明細書には後者の可能性を図１５に関連して例示する。
【誤訳訂正３４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９１】
これと対照的に大きいターゲットの極限では、「自己限定的」グラフト過程によるグラフトプローブ層の形成の場合と全く同様に、移行点は（全体としての）大きさＬ、特性的「フットプリント」ξ＾Ｔ２の捕捉されたターゲットの層においてターゲット鎖の重なり（クラウディング）が始まる点を反映している。ターゲットの重なりは
2007521017.tif 000024
のとき、すなわちｃ＊〜ｎＴ＊／Ａ０〜η＊／ξ＾Ｔ２〜１／Ｌのときに起こる。ここに、η＊Ａ０は捕捉されたターゲットで被覆され得る面積の分率を示す。
【誤訳訂正３５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９３】
「グラフト密度はｃ＊〜η＊／Ｌ＋ｐ０（または更に一般的な
2007521017.tif 000025
の場合に対する類似の条件）が最大になるように調節する。たとえば好ましい実施態様においては、ｃＤＮＡの場合について述べたようにＲＴプライマーを適用するなどの方法で具体的なターゲット長さＬを選択し、ついでσを調節する」
【誤訳訂正３６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９４】
２つの限界値は、移行がプローブ・ターゲット複合層の弾性的応答における変化を反映する一般的な場合に対する特殊な場合を表すものである。プローブ・ターゲット複合層の弾性変形と、二重体形成に必要な拘束された立体構造をとるターゲットの弾性変形との組み合わせは、全長Ｌが増大する配列に埋め込まれた同一の捕捉部分配列Ｔを含むモデルターゲットに対する吸着等温線において、ターゲット捕捉効率が
2007521017.tif 000026
に依存することを説明するためにも用いられる。したがって有限容積を「占める」有限の部分配列が容積ＲＧ，Ｔ３〜Ｌ３νの「コイル」内に見出される確率は〜１／Ｌ３ν，ν＝３／５に従って変化する。
【誤訳訂正３７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９５】
低い（バルク）イオン強度の条件下でのターゲットの捕捉：多価電解質ブラシ：
本発明の好ましい実施態様に関連して本明細書に述べるグラフト密度の典型的な値、すなわち３．２μｍのビード１個あたり約１０６（または約３＊１０１２／ｃｍ２）は、層内の空間電荷密度ｚＣＰの大きい値に対応する。たとえば長さＰ＝２０のオリゴヌクレオチドに対して、対応するプローブ層の厚さＤ〜５０Ａとすると、プローブ鎖の濃度は
2007521017.tif 000027
である。したがってバックボーンの（完全解離した）燐酸基に関係する電荷の局所的濃度はｆＣＰ〜２００ｍＭ（ｆ＝２０）となる。
【誤訳訂正３８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９６】
電気化学的平衡状態においては、プローブ層内およびバルク溶液内に存在するカチオンと（ポリ）アニオンの濃度は条件Ｃ＋Ｃ−＝ＣＢｕｌｋ＋ＣＢｕｌｋ−によって関係づけられる。電気的中性の要求から、プローブ層内ではＣ−＋ｆＣＰ＝Ｃ＋，バルク溶液内ではＣＢｕｌｋ＋＝ＣＢｕｌｋ−＝ＣＢｕｌｋである。したがって与えられた負電荷ｆＣＰに対して、層内のカチオン濃度はバルク溶液内のカチオン濃度よりかなり大きくなる。
2007521017.tif 000028
【誤訳訂正３９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９８】
これに対応するＤｅｂｙｅ遮蔽長さξＥ〜１／κは鎖あたりのバックボーン電荷ｆＣＰに関係し、式κ２＝４πｌＢｆＣＰで求められる。ここにｌＢ＝ｅ２／εＴはＢｊｅｒｒｕｍ長さ、ＣＰ＝Ｐ／ｄ２Ｄである。ブラシ内に細くされた対イオンに起因する浸透圧Π＝ｆＣＰＴによる反発力と、鎖の弾性ｆＣＰＴ＝κＤ／ｄ２（κ＝Ｔ／ａ２Ｐは弾性率）との釣り合いから、グラフト密度に関係なく
2007521017.tif 000029
が得られ、したがって
2007521017.tif 000030
となる。このスケールは鎖の間の平均距離ｄ、したがってグラフト密度によって決まる。
2007521017.tif 000031
の極限では任意の電荷ｆ＞０に対して鎖が伸長し、グラフト密度に関わりなくブラシ厚さが最大となる。グラフト密度が十分小さく、ターゲットの進入に対応できるなら、そのような層への捕捉は「剣山型」の立体構造で、プローブ層の著しい弾性変形なく進行する。「小球」型の立体構造に従う鎖の伸長への復帰は、遊離の共イオンおよび対イオンを添加し、それらのイオンに関連するＤｅｂｙｅ遮蔽長さκＦｒｅｅ−１がξＥと同程度、したがって
2007521017.tif 000032
となるようにその濃度を選ぶことで実現される。そのように遮蔽されたブラシでは、内部の立体構造は定性的には「小球」の連鎖から成る半希釈ポリマーブラシに類似するが、電気化学的平衡を維持するためバルク溶液の条件に応答する。
【誤訳訂正４０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０１】
2007521017.tif 000033
2007521017.tif 000034
2007521017.tif 000035
2007521017.tif 000036
2007521017.tif 000037
【誤訳訂正４１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０３】
ＩＩＩ．１  信号強度の調整
核酸分析においては、分析対象のターゲットの濃度が広範囲にわたって変化することがある。従って、多重化発現追跡においては、対象とするメッセージの存在量は細胞１個あたりｍＲＮＡコピー１〜２個に対応する低濃度から１０４個以上に対応する高濃度にまでわたることが多い。最弱から最強に至るトランスクリプトの信号を同時に検出するために必要な４桁のダイナミックレンジは多くのカメラや記録装置の能力を超える。プローブとターゲットの親和性を変化させること、およびアレイの組成に関するいくつかの方法によって、既知の、或いは予想されるメッセージ存在量に対応して信号強度を調整することが可能である。
【誤訳訂正４２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１１】
図１１に関連してｃ＊は希釈領域から濃縮領域への移行が起こる濃度、Ｌ＊はこれに対応するトランスクリプトの長さ（Ｌ＊：＝Ｌ（ｃ＊））を示す。
【誤訳訂正４３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１２】
これに対応する設計手順は、ＩＩ．２  章にアッセイ設計の最適化の一部として示した次の関数である。
ＳｅｌｅｃｔＦｉｎａｌＴａｒｇｅｔＡｂｕｎｄａｎｃｅ（Ｌ，Ｌ＊，Ｃ）
ＳｅｌｅｃｔＴａｒｇｅｔＬｅｎｇｔｈ（Ｃ，Ｃ＊，ＳＰ）
ＳｅｌｅｃｔＣａｐｔｕｒｅＳｅｑｕｅｎｃｅ（ＰｒｏｂｅＳｅｑ）
【誤訳訂正４４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
これに関連する方法として、Ｅｋｉｎｓ（ＵＳ５，８０７，７５５）は受容体・リガンド結合アッセイを行うため受容体のスポットアレイを設計する方法を論じている。この方法では受容体の濃度がリガンドの濃度よりもかなり低くなければならない。後述するように、これは［Ｐ］０とビードの数ＮＢが共に小さい場合に対する下記の理論的記述に対応する。しかしＥｋｉｎｓは受容体濃度が高い領域についても、本発明に述べるようなダイナミックレンジの圧縮方法についても何ら考察しておらず、また受容体・リガンド相互作用の分析にランダムに符号化した微小球アレイを使用することについても、望ましいアッセイ条件を達成するために異なった種類のビードないしプローブの相対存在量を変化させることについても触れていない。
【誤訳訂正４５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１５】
問題の反応は、溶液中のターゲット分子（たとえばリガンドＴを含む）と、固体担体（たとえば色で符号化したビード）上に付着した受容体分子Ｐ（たとえばプローブ）とが可逆的に複合体Ｐ・Ｔを形成する反応である。この反応は質量作用の法則と親和性係数Ｋに支配され、１つの受容体が１つのリガンドに結合する場合には
Ｋ
Ｐ＋Ｔ←−→ＰＴ
と書かれる。質量作用の法則は、その基本形においてはビード上の複合体分子の数［ＰＴ］、ビード上の未複合受容体部位の数［Ｐ］、反応に関与し得る遊離リガンド分子の総数［Ｔ］の関係を表し、数学的には下記の形である。
Ｋ＝［ＰＴ］／［Ｐ］［Ｔ］
ビード上の受容体分子Ｐは濃度［ｐ］０（ｐ０）でビードに固定化されており、分析対象におけるリガンド分子Ｔの初期濃度は［Ｔ］０（ｔ０）ｍｏｌ／ｌ（Ｍ）である。
【誤訳訂正４６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１６】
任意の瞬間において表面上の複合体分子の濃度は［ＰＴ］（ｃ）分子／ビードであり、未複合の受容体部位の数、［Ｔ］（ｔ）はｐ０−ｃで与えられる。任意の瞬間において、反応に関与し得るリガンド分子の数は、初期の分子数と既に複合化された分子の数との差である。ＮＢ個のすべて受容体分子Ｐを持つビードＮＢ個のアレイにおいては、形成された複合体の数はｃＮＢに等しい。したがって分析対象の容積Ｖの溶液において、反応し得るリガンド分子の数はＶＮＡｔ０−ＮＢｃとなる。ここにＮＡはＡｖｏｇａｄｒｏ数である。これらを用いて質量作用の法則は
Ｋ＝ｃ／（（ｐ０−ｃ）（ｔ０−ＮＢｃ／ＶＮＡ））
と書ける。複合体の数ｃは各ビードに対する蛍光信号強度に正比例する。
【誤訳訂正４７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１８】
ｔ０＞＞ＮＢｐ０／ＶＮＡ
分析対象内のリガンド分子の総数が受容体部位の総数より遥かに多い場合は、平衡にある系に数個のビードを加えても各ビード上の複合体分子の数はほとんど変化しない。すなわち複合体分子の数、したがってそのような複合体を持つビードからの信号強度はビードの数と無関係であると見なせる。
【誤訳訂正４８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１９】
ｔ０＞＞ＮＢＰ０／ＶＮＡ
反応に関与し得る受容体部位の数がリガンド分子より遥かに多い場合は、平衡にある系に数個のビードを加えると、平衡を維持するためには複合化したリガンド分子のあるものが解離して新しいビード上に再分布しなければならない。実際、極限状態ではｃ＝ｔ０ＶＮＡ／ＮＢである。したがってリガンド分子の濃度が与えられたときビードあたりの複合体分子の数、したがってそれに対応する蛍光信号強度はビード数に反比例する。
2007521017.tif 000038
【誤訳訂正４９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２０】
無次元変数Ｙ＝ｃ／ｐ０、Ｘ＝Ｋｔ０、Ｃ＝Ｋｐ０ＮＢ／ＮＡ／Ｖを導入すると、Ｋの式はＹ／（１−Ｙ）＝（Ｘ−ＣＹ）と書かれる。占有率ＹとＣ（ビード数に比例）およびＸ（無次元化したリガンド濃度）の関係を図１７に示す。ビード数が少ないときはＹはＣに依存しない。これは上記（ａ）の状態に対応する。無次元変数で示せばＸ＞＞ＣのときＹ→Ｘ／（１＋Ｘ）であってＣとは無関係である。更にＸ＞＞１ならばＹ→１、すなわちリガンド濃度が高く親和性係数が大きければビードは完全に占有される。Ｃが大きくなるとＹはＣと共に単調に減少し、上記の（ｂ）の状態ではＹ＝Ｘ／Ｃである。
【誤訳訂正５０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２９】
「各タイプのビード上の蛍光発色団または複合化分子の望ましい数ｃｉｄを選択する。
１．ｐ０，ｉの既知の、または予想される値に基づいて受容体・リガンドの対の各々についてＹｉｄを設定する。
２．分析対象物質の濃度と親和性係数の積としてＸｉを計算する。
３．受容体・リガンドの対の各々についてＣｉｄ＝Ｘｉ／Ｙｉｄ−１／（１−Ｙｉｄ）を計算する。
４．各タイプのビードの望ましい数をＮＢ，ｉｄ＝ＣｉｄＶＮＡ／ｐ０，ｉＫｉとして計算する。
【誤訳訂正５１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３０】
実験的証明：
本明細書で述べるように、有効親和性定数は長さに依存して大きく変化することがある。たとえばカナマイシンの場合、濃縮領域においてＫｅｆｆ（Ｌ＝５０ｎｔ）／Ｋｅｆｆ（Ｌ＝１０００ｎｔ）〜１０である。トランスクリプトの長さの選択とビードの重複数との相乗効果が極めて劇的である例を図１８に示す。これは実施例Ｖのプロトコルに従い、反応容積２０μｌ中に１０，０００ｆｍｏｌ存在するカナマイシンｃＤＮＡの検出に約３０００個のビードを、反応容積２０μｌ中に２ｆｍｏｌ存在するＩＬ−８のｃＤＮＡの検出に約１００個のビードをそれぞれ用いて作成した図である。
【誤訳訂正５２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３１】
図１８に示すように、左から５番目と７番目の比の対には５０ｎｔと１０００ｎｔのカナマイシンのトランスクリプトがいずれも１０００ｆｍｏｌ存在するにも関わらず、それぞれの信号強度の測定値は１桁以上異なっている。更にまた図１８に示すように、カナマイシンｃＤＮＡの存在量はＩＬ−８ｃＤＮＡの約５０００倍であるのに対して信号強度は約２０倍にすぎず、ダイナミックレンジ圧縮を端的に示している。
【誤訳訂正５３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４２】
ＩＩＩ．２  伸長に媒介される配列固有の信号の増幅
感度と特異性：
短い標識ｃＤＮＡを生成させるアッセイ設計を用いて今日までに得られた結果によれば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの増幅を用いず新規な増幅方法を使用して、長さ５０〜７０ｎｔのカナマイシンｃＤＮＡの標識断片を反応容積１０μｌ中１ｆｍｏｌのレベルで検出するのに十分な感度が得られている（図１９）。
【誤訳訂正５４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４６】
まずカナマイシンｍＲＮＡ（ここでは濃度範囲１〜３２ｆｍｏｌ／２０μｌ）を、たとえば逆転写反応中にＣｙ３標識ｄＣＴＰをｃＤＮＡに導入することにより標識する。実施例ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖおよび図９に示すようにこの標識ｃＤＮＡを固定化捕捉プローブで捕捉する。捕捉されたターゲットによる信号を増強するため、ビオチニル化ｄＣＴＰ（Ｂｉｏ−１４−ｄＣＴＰ）を用いてｉｎ−ｓｉｔｕ（「オンチップ」）でプローブ伸長反応を行わせる。ついで得られたビオチニル化伸長生成物をストレプトアビジン・フィコエリスリン複合体に接触させて、フィコエリスリンのタグに由来する顕著に強化された蛍光を発生させる（実施例ＩＩ参照）。
【誤訳訂正５５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４８】
本明細書の実施例に述べるアッセイプロトコルとＲＥＡＤ方式の実施態様において、５０〜７０ｎｔのトランスクリプトの捕捉によって発生した信号は、ターゲット増幅を行わずに（ただし上記の信号増幅を行って）、試料のｃＤＮＡ濃度約０．１ｆｍｏｌｅ／１０μｌの検出が可能であった（信号と未補正バックグラウンドの強度比２：１のレベルで）。これは細胞１個あたりコピー１０〜３０個の頻度で存在するｍＲＮＡを検出するのに十分な感度である（標準プロトコル（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｏｎｇ，Ｈ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｇａｌｌｏ，Ｍ．Ｖ．，Ｃｈｅｅ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６７５−１６８０（１９９６））と同様、ｍＲＮＡは１０７個／ｍｌの末梢血単核球から採取するものとする）。
【誤訳訂正５６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５１】
したがって交差反応を最小限にするため、配列固有の逆転写プライマーをｍＲＮＡの３’末端付近に置くことにより短いトランスクリプトを生成させることが好ましい。これは本明細書に述べるエントロピー効果に対処するアッセイ設計としても好ましい方法である。このようなアッセイ設計は、配列固有の逆転写プライマーの選択および配列固有の検出プローブを、好ましくは同時出願のＮｏ．６０／４８７４５１（前記）の方法によって最適化することにより実施される。
【誤訳訂正５７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５６】
最も単純な例は、配列の著しく異なる領域（塩基３個が追加された部分）が１つ、ＳＮＰを１箇所持つ領域が１つあるような遺伝子ファミリーである。上記の方式によれば、４個のビードと２つの異なったトランスクリプト標識を使用する。図２５Ｂに示したように、１つのビードにはプローブｈＰ１を結合させ（３つの追加塩基を持つ領域Ｐ１へのハイブリダイゼーション）、他の符号化ビードの１つにはプローブｈＰ２を結合させる（３つの追加塩基を持たない領域Ｐ２へのハイブリダイゼーション）。第３のビードにはプローブｅＰ１を結合させ（通常の対立遺伝子を持つ領域ｅＰ１とのハイブリダイゼーション）、第４のビードにはプローブｅＰ２を結合させる（対立遺伝子の変異形を持つ領域ｅＰ２とのハイブリダイゼーション）。各トランスクリプトの５’末端は、適当な標識を持つプライマーを用いて逆転写反応中に第１の色（「赤」）で標識する。ｅＰ１またはｅＰ２プローブとハイブリダイズしたトランスクリプトを伸長させたときは、第２の色（「緑」）で標識した伸長ヌクレオチド（ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰ）を用いて伸長生成物を標識する。
【誤訳訂正５８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５７】
試料のハイブリダイゼーションに続いてアレイを分析する。ビードｈＰ１またはｈＰ２に赤が出現すれば、トランスクリプト中にそれぞれＰ１またはＰ２が存在することが示される。ｅＰ１ビード上のトランスクリプトが伸長すれば（緑の標識により識別される）、ｅＰ１の通常の（「野生型」）対立遺伝子が捕捉されたことが、またｅＰ２ビードが緑色を示せばｅＰ２の変異対立遺伝子が捕捉されたことが示される。このようにして、１回の伸長反応のみを用い、ハイブリダイゼーションと伸長のパターンを分析することにより、両領域を持つトランスクリプトの存在が容易に検出できる。より複雑な差異のパターンを持つｍＲＮＡのファミリーも、適切な数の符号化ビードとハイブリダイゼーションおよび伸長反応を利用して、同様に分析することができる。
【誤訳訂正５９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６３】
ＩＩＩ．３．２Ｂ  高度に相同的な配列の識別：トウモロコシの近交系
ここに詳述するような応用においては、問題とするターゲットと実質的に相同な配列を持つ数百数千のターゲットの集合の中から特定のターゲットを検出する必要がある。このような状況では、要求される配列の選択性はハイブリダイゼーションで実現できる限界を超える。適当なプライマーとプローブの組の選択については同時出願のＮｏ．６０／４８７，４５１（前記）に詳論されている。ここでは逆転写または増幅の少なくともいずれかによる配列固有の転換、およびハイブリダイゼーション（ｈＭＡＰ）または伸長（ｅＭＡＰ）による多重化検出の組み合わせを要する、具体的なアレイ設計およびアッセイプロトコルをいくつか開示する。これらのアッセイ設計および本発明の方法論の例として、いくつかの具体例を以下に述べる。
【誤訳訂正６０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７０】
プローブで官能化された符号化微小球（ビード）：
プローブを付着させる粒子の材質としては、たとえばプラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル、黒鉛、二酸化チタン、ラテックス、セファロースなどの架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、テフロンなどが可能である（たとえばＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ発行の“Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ”を参照）。粒子は必ずしも球形である必要はなく、また多孔質であってもよい。粒子の寸法はｎｍ級（たとえば１００ｎｍ）からｍｍ級（たとえば１ｍｍ）まで可能であるが、約０．２ミクロン〜約２００ミクロンが好ましく、約０．５ミクロン〜約５ミクロンが更に好ましい。
【誤訳訂正６１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７２】
プローブ：
アッセイにおいては配列固有のプローブ、いわゆる「捕捉プローブセット」を使用する。捕捉プローブセットの各メンバーは、好ましくは同時出願のＮｏ．１０／８４７，０４６“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ｈＭＡＰ）”（２００４年５月１７日出願）に記載の方法により、１つの「対応」ｃＤＮＡターゲット分子に相補的な固有の領域を持つように設計される。前述のとおり捕捉プローブセットの各メンバーの相補的領域の長さは、結合の親和力を調節するために異なる場合がある。
【誤訳訂正６２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７３】
これらのオリゴヌクレオチドプローブは５’末端に、ニュートラアビジンの付着によって官能化された微小粒子との結合のためにビオチニル化ＴＥＧスペーサーを、或いはカルボキシル化ビードとＥＤＡＣ反応を用いた官能化微粒子表面との共有結合のためにアミノ化ＴＥＧスペーサー（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ  ＴＸ）を、それぞれ含むように合成することができる。
【誤訳訂正６３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７５】
アレイの構成法：
特定のプローブの組み合わせを含むアレイを作成するには、符号化しプローブで修飾したビードをプールしてアレイに構成する。アレイの構成法には多くの方法があるが、その一つにＬＥＡＰＳＴＭ（Ｌｉｇｈｔ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｎｅａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ）と呼ばれるものがあり、米国特許Ｎｏ．６，２５１，６９１（本明細書を構成するものとして援用）に記述されている。この方法ではまず平面電極と、それに実質的に平行な第２の平面電極のサイドイッチ構造を作成し、両電極間のギャップに電解質溶液のような分極性液体を満たす。第２の平面電極の内表面には低インピーダンスの部分が得られるようなパターンを設ける。次にビードをギャップに入れ、ギャップに交流電圧を印加すると、ビードは第２の平面電極上でパターンに従ってランダムに符号化されたアレイを形成する。或いは第２の平面電極上の照明パターンを利用することもできる。この方法で得られるアレイは、その特徴の密度を極めて高くとることができる。粒子アレイを構成する別の方法は米国特許出願Ｎｏ．１０／１９２，３５２“Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”（２００２年７月９日出願）に記載されている。
【誤訳訂正６４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８４】
プローブは当業者に周知の方法により、符号化したトシル化微粒子にＥＤＡＣ反応によって共有的に結合させた。予め計算した量の合成ターゲットの各々を脱塩水中１０μＭの原液から採取し、１ｘＴＭＡＣ（４．５Ｍ  テトラエチル塩化アンモニウム、７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５％  ＳＤＳ）で所定の最終濃度まで希釈した。表Ｉ−１に示すプローブの１種以上を蛍光微粒子で官能化した後、シリコン基板上に平面アレイを構成した。合成ターゲット２０ｍｌを基板表面に加え、基板を５５℃のヒーターに入れ、２０分後に取り出してターゲット溶液を吸引した。基板を１ｘＴＭＡＣで室温で３回洗浄し、ついで１０μｌの１ｘＴＭＡＣを基板上においてカバーグラスで覆い、アレイの蛍光強度を記録した。以上のハイブリダイゼーション実験の結果を図３，５，６，７に示した。
【誤訳訂正６５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８５】
実施例ＩＩ：粒子１個あたりの蛍光発色団の絶対数の決定
市販のＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥＴＭ  ＰＥ  フィコエリスリン蛍光定量キット（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ製）を用いた実験を行った。このキットは６．６μｍのポリマービードの表面に既知量のフィコエリスリン（ＰＥ）分子を結合させたものである。ビードに由来する蛍光強度の定量測定のため、ビードのランダム平面アレイをシリコンウェハー表面に構成し、適当な蛍光フィルターとＣＣＤカメラを備えた蛍光顕微鏡を用いて、粒子表面のＰＥの蛍光発色団からの蛍光の強度を表面に付着したＰＥ発色団の数（データは製造者による）の関数として追跡した。この実験では測定に１５０Ｗのキセノンアークランプを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ−６００ＦＮエピ蛍光顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ  ２０ｘ  ０．７５  ＮＡ対物鏡、Ｒ＆Ｂ  ＰＥフィルターキューブ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｂａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）を用いた。イメージは冷却した１６ビットＣＣＤカメラ（Ａｐｏｇｅｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）により記録した。この実験における露出／積分時間は５００ｍｓであった。イメージの取得と解析にはパソコン上のＭＡＴＬＡＢＴＭを用いて開発したユーザーインターフェイス付きプログラムを使用した。結果を図４に示す。これにより粒子１個あたり約１００個（すなわち１ＰＥ分子／μｍ２）のＰＥ分子がこの方法で検出できることがわかる。
【誤訳訂正６６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８８】
すなわちＰＥ分子１個はＣｙ３分子約６０個、或いはＣｙ５分子約２０個と等価である。したがってＣｙ３分子約６０個／μｍ２、Ｃｙ５分子約２０個／μｍ２の検出感度が予想される。２μｍの球の表面積は約１２．５μｍ２であるから、検出されるためには１個あたりＣｙ３分子７５０個、またはＣｙ５分子２５０個が必要である。３ミクロンの球ならば対応する値はそれぞれＣｙ３分子１７００個、Ｃｙ５分子６００個となる。したがって（２〜３ミクロン粒子の球に対して）Ｃｙ色素を用いた場合の検出感度の安全な予測は粒子１個あたり蛍光発色団約１０００個となる。
【誤訳訂正６７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８９】
同様に、前述のとおり曲線の勾配を、記録された生の強度データから１μｍ２あたり分子数を求めるための（ＰＥ以外の色素を用いた場合に）近似的な換算係数として利用することもでき、さらにビードの大きさが既知ならばビード１個あたりの蛍光発色団の数を知ることができる。
【誤訳訂正６８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９２】
段階２：
ｍＲＮＡを含む溶液を６５℃で、典型的には５分間加熱し、プライマーのアニーリングによるｍＲＮＡの変性を容易にする。ついで溶液を室温まで、典型的には２℃／ｍｉｎの速度で徐冷し、逆転写酵素（たとえばＣｏｎｔｅｃｈ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）と蛍光標識ｄＮＴＰ（典型的には標識と非標識ｄＣＴＰのモル比１：８）を添加して逆転写反応を開始する。標識ｃＤＮＡの合成の後、ＲＮアーゼを用いてＲＮＡテンプレートを消化する。
【誤訳訂正６９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２０２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２０２】
アッセイプロトコルの最適化：
アッセイの感度とダイナミックレンジを更に改善するため、アッセイ条件の最適化を行った。具体的には、カナマイシンｍＲＮＡのタイトレーションにおける逆転写プライマー濃度を１／２５にし（５０μＭから２μＭへ）、ハイブリダイゼーション時間を半分に短縮した（５０℃で３０分から１５分へ）。
【誤訳訂正７０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２０４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２０４】
実施例Ｖ：モデルｍＲＮＡの逆転写の最適化
実施例ＩＩＩに示したｍｐｍｐ逆転写法アッセイの性能を更に向上させるため、最高の成績を収めた５０ｎｔのカナマイシントランスクリプトに対して、逆転写反応温度を厳格に制御するようプロトコルを最適化した。サーモサイクラーの温度プロファイルをプログラム化し、逆転写プライマーのアニーリング・転写の条件をより厳密に制御することにより、蛍光信号強度を２〜３倍に増強することができた（図１９）。具体的にはサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、下記の温度プロファイルで実施例ＩＩＩの逆転写反応を実施した。
ＲＮＡ変性：６５℃、５分
アニーリング：４５℃、３０分
アニーリング：３８℃、２０分
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩの熱不活化：８５℃、５分
保持：４℃
【誤訳訂正７１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２０５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２０５】
ハイブリダイゼーション条件は、１ｘＴＭＡＣ中５０℃で１５分インキュベーション、同緩衝液で３回洗浄、各回でビードに接触している２０μｌを交換、とした。
【誤訳訂正７２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２０８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２０８】
濃度約１２．５ｎＭ〜５０ｐＭのカナマイシンｍＲＮＡの一定量を、１００ｎｇ／μｌ（濃度約３００ｎＭに相当）に希釈したヒト胎盤全ＲＮＡ溶液中にスパイクした。すなわち特異的ｍＲＮＡと非特異的ｍＲＮＡのモル比は１：２４〜１：６２００の範囲であった。８種の比（ターゲットなしの対照を含め）においてそれぞれ別個に、最適化したアッセイ条件で逆転写反応を行った。
【誤訳訂正７３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２１３】
白血病：
たとえば国際出願Ｎｏ．ＷＯ０３／００８５５２には、遺伝子発現プロファイルによる混合系統白血病（ＭＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の診断方法が記載されている。これらのアッセイ方法は他の遺伝子の発現プロファイルの分析、たとえばＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ投与に先立つＨｅｒ−２の分析にも用いられる。遺伝子発現プロファイルはまた臓器移植の決定や感染性病原体の診断にも有用である。医薬の標的への効果も発現プロファイルに基づいて解析することができる。サイトカインに数種の多形が存在することは、疾病への感受性或いは移植拒絶反応の出現を示すことがあり、これも本明細書に示した方式により解析することが可能である。本発明の方法のその他の応用例としては、特定の遺伝子の発現パターンの変化に現れる感染／病原体への曝露に対する宿主の応答の解析がある。
【誤訳訂正７４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２１８】
サイトカイン７種（ＩＬ−２，−４，−６，−８，−１０，ＴＮＦ−α，ＩＦＮ−γ）および内生的対照２種（ＧＡＰＤＨ，ユビキチン）の完全なｃＤＮＡのクローンのキャラクタリゼーションを配列決定により行い、ｐＣＭＶ６ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＤ）中の特定サイトカインｃＤＮＡインサートを含むプラスミドＤＮＡの形で回収した。ターゲット固有のＰＣＲ増幅のコストを避けるため、標準プライマー対によってすべてのｃＤＮＡを増幅するように、クローニングベクター配列に対するＰＣＲプライマーを設計した。順方向ＰＣＲプライマーをＴ７プロモーター配列（サイトカインの各インサート（ｃＤＮＡ）のクローニング部位に隣接して存在）の上流に置くことにより、ターゲットの５’末端に位置する特定のｃＤＮＡ配列のみのＴ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が行われる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ，Ａｍｂｉｏｎ）に続いて、アガロースゲル中でのＳｙｂｒＧｒｅｅｎ染色によりテンプレートのキャラクタリゼーションを行い、２００倍に希釈し、吸光度を測定してＤＮＡ濃度を決定した。
【誤訳訂正７５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２２４】
表ＩＩＩ−１：多重化分析に用いた９種のヒトサイトカインｃＤＮＡクローン：逆転写プライマー及び捕捉プローブの設計
2007521017.tif 000039
2007521017.tif 000040
【誤訳訂正７６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３３】
【図１】図１は多重化発現追跡を実施する過程を示す。
【図２】図２は図１の過程に関連する典型的なワークフローを示す。
【図３Ａ】図３Ａは表Ｉ−１に示したモデルプローブおよびターゲットに対するタイトレーション曲線（結合曲線）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは図３Ａの曲線を質量作用の法則によって回帰分析した結果から抜粋した、同曲線に対する微粒子１個あたりの親和性定数Ｋとプローブ部位の数Ｐ０を示す。
【図４】図４は強度と微粒子表面の蛍光発色団濃度との換算のための較正曲線を示す。
【図５】図５は表Ｉ−１に示したプローブとターゲットの複合体の形成の程度とターゲット長さとの関係、および冪乗法則によるデータの回帰分析の結果から抜粋した指数の値を示す。
【図６Ａ】図６Ａは表Ｉ−１に示した１７５  ｎｔのモデルターゲットと種々の長さのプローブとの複合体の形成に関する吸着等温線を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは図６Ａの曲線を質量作用の法則によって回帰分析した結果から抜粋した、同曲線に対する微粒子１個あたりの親和性定数Ｋとプローブ部位の数Ｐ０を示す。
【図７Ａ】図７Ａは表Ｉ−１に挙げられたそれぞれ長さ１７５ｎｔ，９０ｎｔ，２５ｎｔのターゲットと種々の長さのプローブとの複合体形成の程度とプローブ長さとの関係を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは表Ｉ−１に挙げられたそれぞれ長さ１７５ｎｔ，９０ｎｔ，２５ｎｔのターゲットと種々の長さのプローブとの複合体形成の程度とプローブ長さとの関係を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは表Ｉ−１に挙げられたそれぞれ長さ１７５ｎｔ，９０ｎｔ，２５ｎｔのターゲットと種々の長さのプローブとの複合体形成の程度とプローブ長さとの関係を示す。
【図８Ａ】図８Ａは１５０ｎｔのｃＤＮＡの生成を例に複数プライマー・複数プローブ（ｍｐｍｐ）設計を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは１２００ｎｔのカナマイシンのｍＲＮＡにそのようなｍｐｍｐ設計を適用して作成した１５０ｎｔおよび１０００ｎｔのｃＤＮＡのタイトレーション曲線を示す。
【図９】図９はランダム符号化アレイ検出（Ｒａｎｄｏｍ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＲＥＡＤＴＭ）による、ハイブリダイゼーションに媒介された発現追跡の作業手順を模式的に示す。
【図１０Ａ】図１０ＡはカナマイシンのｍＲＮＡの逆転写で得られた３つの異なる長さのｃＤＮＡについて図８のタイトレーション曲線を変換して得られた直線化タイトレーション曲線（等温線）を示す。等温線の屈曲点は吸着に「希釈」領域と「濃縮」領域があることを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは濃縮領域で固定化プローブに捕捉されたターゲット鎖の「フットプリント」を模式的に示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは希釈領域で固定化プローブに捕捉されたターゲット鎖の「フットプリント」を模式的に示す。
【図１１】図１１は図１０の等温線の濃縮領域から希釈領域への移行を特徴づけるｃ＊の値とターゲット鎖長さとの関係を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは５００ｎｔのｃＤＮＡの生成を例に複数プライマー・複数プローブ（ｍｐｍｐ）設計を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは５００ｎｔのｃＤＮＡについて、ｃＤＮＡ内部の部分配列とｃＤＮＡの５’末端付近の部分配列にそれぞれに適合するプローブへの捕捉によって得られたタイトレーション曲線の比較を示す。
【図１３】図１３は図１２の５００ｎｔのｃＤＮＡに対するタイトレーション曲線の変換によって得られた直線化タイトレーション曲線を示す。
【図１４】図１４は末端グラフトされたポリマー鎖が、グラフト密度によって異なる配列をとることを模式的に示す。
【図１５】図１５は末端グラフトされたポリマーにターゲット鎖が捕捉される際の鎖の拘束を模式的に示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは二官能性ポリマー修飾剤を用いることにより微粒子表面におけるポリマーのグラフト密度を制御する方法を模式的に示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂはプローブとポリマーの相互作用を拡大して示す。
【図１７】図１７は（規格化）占有率（縦軸）と、アレイ中の微粒子（ビード）の数および（無次元）ターゲット濃度に正比例する量（横軸）との関係を示す。
【図１８】図１８は、微粒子の重複数の最適化によるダイナミックレンジ圧縮の効果により、レンジに５０００倍の差がある濃度で存在する５０  ｎｔのカナマイシンｃＤＮＡと７０  ｎｔのＩＬ  ８  ｃＤＮＡに対してそれぞれ生ずる信号の強度の差が２０倍程度に抑えられることを示す。
【図１９Ａ】図１９ＡはｍＲＮＡターゲットに対するプローブとプライマーの位置を示す。
【図１９Ｂ】図１９ＢはＩＬ−８  ｍＲＮＡの逆転写で得られた短いｃＤＮＡの希釈系列の表であり、１ｆｍｏｌのｍＲＮＡが検出限界であることを示している。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは図１９Ｂの表から作成したプロットを示す。
【図２０Ａ】図２０ＡはｍＲＮＡターゲットに対するプローブとプライマーの位置を示す。
【図２０Ｂ】図２０ＢはカナマイシンｍＲＮＡの逆転写で得られた５０  ｎｔのｃＤＮＡの、本明細書に示すいくつかのプロトコルによって作成した希釈系列を示す。８種のサイトカインｍＲＮＡの混合物（バックグラウンド）およびヒト胎盤ＲＮＡ混合物へのｃＤＮＡのスパイキングを示す希釈系列も含まれている。
【図２１】図２１は図１９の希釈系列の変換によって得られた直線化吸着等温線を示す。
【図２２】図２２は酵素によって触媒されるプローブの伸長およびそれに続く修飾による信号増幅法を模式的に示す。
【図２３】図２３は図１９の信号増幅法を適用することによる感度の向上を示す。下側の曲線は標識したカナマイシンｃＤＮＡの信号（第１のカラーチャンネルで記録）を、上側の曲線は同じカナマイシンにプローブ伸長および修飾を施した後の信号（第２のカラーチャンネルで記録）を示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは７個のサイトカイン遺伝子および２個の「ハウスキーピング遺伝子」から成るパネルに対して行った多重化発現分析の代表的な結果を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは図２４Ａに示した結果のヒストグラムを示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは多型解析の二段階プロセスを適用することにより、相同性の高い配列を区別し得る設計における、ターゲットとプローブの位置を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは異なったプローブを付着させた４つの符号化ビードを示す。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは図２５Ａおよび図２５Ｂのプローブを用いたアッセイの結果を示す。
【図２６】図２６はＡＵリッチなｍＲＮＡの配列の濃度の定量測定と特定のクラスの同定を同時に行う方法を示す。
【図２７】図２７はトウモロコシのゼイン遺伝子ファミリー（ａｚｓ  ２２）から得られた７つのトウモロコシ遺伝子の配列アラインメントを示す。
【図２８】図２８はトウモロコシのゼイン遺伝子ファミリー（ａｚ２  ２２）内の相同性の高い配列を検出できる、ハイブリダイゼーションと伸長を組み合わせた設計を示す。
【図２９】図２９は図２８における相同性の高い遺伝子１６および３１を検出できる、ハイブリダイゼーションと伸長を組み合わせた設計を示す。
【図３０】図３０は１つの検出色を用いる減算法示差発現分析の手順を示す。