(57)【要約】本発明は、たとえば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）及び腸管毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）のような種々の細菌が原因で起きる下痢に対して防御を提供する精製組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）の新規の製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は有意に高い収率及び高い純度のｒＣＴＢを製造方法に関する。本発明はまたコレラ菌に対して相乗的な防御を、及びＥＴＥＣに対して交差防御を有するワクチン製剤にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）から精製した組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）を製造して新規のワクチン製剤を得る新規の方法であって、前記方法が、
−発酵させた培養物を得るためのｒＣＴＢの発酵の工程と
−回収物を得るための発酵させた培養物の熱不活化の工程と
−精製したｒＣＴＢを得るための前記回収物の精製の工程を含み、
前記方法が、工業的に拡張可能であり、費用効率が良く、高い純度で高い収量の精製ｒＣＴＢを得る、方法。
【請求項２】
前記収量が１．５〜２．５ｇｍ／リットルの範囲であり、前記純度が９５％より高い（＞９５％）請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発酵工程が以下の工程
（ａ）コレラ菌の選択された株を所定の条件で発酵槽に入れる工程と
（ｂ）所定のｐＨと温度で所定の時間、前記発酵槽を作動させて発酵させた培養物を得る工程とを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の条件が１ＭグルコースフィードのｒＣＴＢ培地への添加である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記所定のｐＨが７．２〜７．５の範囲であり、前記所定の温度が３５〜３７℃の範囲であり、前記所定の時間が１８〜２２時間の範囲である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
発酵させた培養物の前記熱不活化が６５℃±５℃の温度範囲で３０±１５分間行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ワクチン製剤が、たとえば２５％〜３０％の範囲での微細結晶セルロース、２５％〜３０％の範囲でのデンプン、０．５％〜０．７％の範囲でのステアリン酸Ｍｇ、０．５〜１％の範囲でのコロイド状二酸化珪素のような、しかし、これらには限定されない既知の賦形剤と共に、１．５ｍｌの天然のまたは組換えの不活化全細胞コレラ菌当たり１ｍｇの前記精製ｒＣＴＢを含む、請求項１に記載の新規のワクチン製剤。
【請求項８】
前記不活化コレラ菌が天然に存在するまたは組換えである請求項７に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
前記ワクチン製剤が、コレラ菌に対する早期で長期の及び相乗的な防御、且つＥＴＥＣに対する交差防御を提供することができる請求項７に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
前記製剤がＯＰＡドライ（３〜５％）で密封コーティングされ、最終的にＥＵＤＲＡＧＩＴＬ３０Ｄ５５／アクリル−ＥＺＥＩＩ（８〜１２％）で腸溶コーティングされる請求項７に記載のワクチン製剤。
【請求項１１】
前記ワクチン製剤が熱安定性であり、緩衝液投与の必要性を排除する請求項７に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たとえば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）及び腸管毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）のような種々の細菌が原因で起きる下痢に対して防御を提供する精製組換えコレラ毒素（ｒＣＴＢ）の新規の製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は有意に高い収量及び高い純度のｒＣＴＢの製造方法に関する。本発明はまた、全細胞不活化コレラ株と共に製剤化すると相乗効果を有するコレラ菌及び腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対する精製ｒＣＴＢのワクチン製剤も開示する。
【背景技術】
【０００２】
下痢性疾患は公衆衛生に対する持続する世界的な脅威である。下痢の主要な原因には特定の細菌、ウイルスまたは寄生虫、食物不耐症等が挙げられる。幼児及び成人の下痢の主要な原因の１つはコレラ菌である。
【０００３】
コレラ菌は上皮組織を侵襲することなく小腸でコロニーを作り、急性の腸管コレラ感染症を引き起こすグラム陰性の細菌である。２００を超えるコレラ菌の血清型が特定されているが、コレラのほとんどの症例は２つの血清型であるＯ１及びＯ１３９が原因で生じる。汚染した食物または飲料水を介してコレラ菌が摂取されると疾患が引き起こされる。ヒトだけを冒すコレラにはコレラ毒素（ＣＴ）が介在し、それは腸管でコレラ菌によって分泌され、消化管の粘膜細胞で作用して重度の脱水やショックをもたらし得る大量の痛みのない水様性の下痢を引き起こす。治療しないままであれば、数時間以内に死亡し得る。年間症例で２８，０００〜１４２，０００の死亡率及び１４０万〜４３０万の罹患率がコレラに起因し得ると推定されている。それは天然のまたは人為的な大災害のよる流行病として発生し、多数の開発途上国では地域特有でもある。そのような大災害では、及び流行国では、きれいな飲料水及び適正な公衆衛生が得られないので、ワクチンによる治療介入が必須になる。２０１０年、ＷＨＯは流行国にて及びコレラの流行についての双方で、他の抑制対策と共に経口コレラワクチンの使用を推奨した[コレラ―概況報告書Ｎ１０７．世界保健機関．２０１２，ｐｐ．コレラ―概況報告書Ｎ１０７］。
【０００４】
現在利用できる３種のＷＨＯが事前選定した死菌経口コレラワクチンがある。
（１）全細胞成分と組換えコレラ毒素Ｂサブユニット（ｒＣＴＢ）とを含有するＤｕｋｏｒａｌ（登録商標）
（２）ｒＣＴＢを欠くが、Ｏ１血清型に加えてＯ１３９血清型のコレラ菌株を含有するＳｈａｎｃｈｏｌ（登録商標）／Ｅｕｖｉｃｈｏｌ（登録商標）
【０００５】
ｒＣＴＢを含有する死菌全細胞ワクチンの方がｒＣＴＢを含まない死菌全細胞ワクチンよりも良好な防御を提供することは周知である。熱不安定性の腸毒素（ＬＴＢ）に対する抗ＣＴＢ抗体の交差反応性のせいで、ｒＣＴＢを含有する死菌全細胞ワクチン（Ｄｕｋｏｒａｌ）は腸毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対しても有効である［Ｌｕｃａｓ，Ｍ．Ｅ，Ｄｅｅｎ，Ｊ．Ｌ，Ｖｏｎ  Ｓｅｉｄｌｅｉｎ，Ｌ，Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｙ，Ａｍｐｕｅｒｏ，Ｊ，Ｐｕｒｉ，Ｍ，Ａｌｉ，Ｍ，Ａｎｓａｒｕｚｚａｍａｎ，Ｍ，Ａｍｏｓ，Ｊ，Ｍａｃｕａｍｕｌｅ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．‘Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｍａｓｓ  ｏｒａｌ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｅｉｒａ，Ｍｏｚａｍｂｉｑｕｅ．’Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００５，３５２，７５７−７６７．］。ＳｈａｎｃｈｏｌはｒＣＴＢ成分を欠いているので、たとえば、短期のＥＴＥＣの交差防御、相乗防御効果（抗菌＋抗毒性免疫）、早期で長期の防御、等のような利益を欠く。従って、経口コレラワクチンにｒＣＴＢを含めることはさらに望ましい。
【０００６】
ｒＣＴＢは酸に不安定なので、ワクチンの投与に先立ってＤｕｋｏｒａｌワクチンは７５〜１５０ｍＬの重炭酸緩衝液と共に投与せねばならず、５歳未満の小児や成人にとってさえ投与をロジスティックに難しくしている。また、Ｄｕｋｏｒａｌでは、前記緩衝液小袋は開封されなければならず、内容物はガラス製のバイアルからのワクチンの添加と混合に続いて必要量の水に溶解されるべきである。この追加の用量調製の工程はワクチンを使用に便利で且つ煩雑にする。
【０００７】
経口コレラワクチンへのｒＣＴＢの添加はＤｕｋｏｒａｌ／Ｓｈａｎｃｈｏｌの比較からはっきりと明らかなようにワクチンのコストの上昇をもたらすことができ、その際、Ｄｕｋｏｒａｌは用量当たり＄４５を超える価格設定が為され、Ｓｈａｎｃｈｏｌは用量当たり＄５の価格設定である。ｒＣＴＢを含む経口コレラワクチンを費用効率の高いものにすることができる方法の１つはｒＣＴＢの発酵と、容易で効率の高い精製法を用いて高い培養ＯＤ及び高いｒＣＴＢ収量を与える精製とについてそのような方法を開発することによる。
【０００８】
ｒＣＴＢの製造及び精製に関する多数の特許及び非特許の開示がある。論文「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ａｓ  ａ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，ＰＮＡＳ，１９８９，Ｖｏｌ．８６，Ｐｇ．４８１−４８５における非特許の開示は、アフィニティクロマトグラフィカラムを用いることによって得られる最良の収量は、製造の観点から費用効率の全く良くない７５μｇ／ｍＬであったことを開示している。「Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂ：  Ｏｎｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｗｉｔｈ  Ｍａｎｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｔｏｘｉｎｓ、２０１５，７，９７４−９９６」と題する別の非特許は、今日までｒＣＴＢの製造で使用されている発現系の様式の完璧なリスト及び使用されている精製法を開示した。このデータはｒＣＴＢの１ｇｍ／Ｌｔを超える収量は今までに達成されていないことを示している。
【０００９】
上記従来技術を考慮して、この分野における現実的な寄与は、高い純度と共にさらに有意に高い収量を生じる組換えコレラ毒素Ｂについての製造及び精製についての方法を開発することである。また、熱安定性であり、緩衝液投与の必要性を排除する、且つワクチンの送達を容易にする製剤及び剤形を開発するニーズもある。
【００１０】
本発明の目的
本発明の主要な目的は精製された組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）の新規の製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、有意に高い収量と高い純度を伴った精製された組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）を得るための発酵及び精製の方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、単純で効率的な方法によって非常に短時間で望ましくない不純物を排除しながら、精製された組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）を得るためのｒＣＴＢの発酵及び精製の方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、精製された組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）の製造のための拡張可能な、時間のかからない、費用効率が高い、環境に優しい且つ手頃な価格の方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、コレラ菌に対する新規のワクチン製剤で使用することができる精製された組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、コレラ菌に対する早期で長期間の相乗的な防御及びＥＴＥＣに対する交差防御を提供する経口コレラワクチンで使用することができる新規のワクチン製剤を提供することである。
【発明の概要】
【００１６】
従って、本発明は、有意に高い収量と高い純度を伴った精製された組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）の製造のための新規の方法を提供する。ｒＣＴＢの製造のための本方法は、細菌株が発酵槽の中で不活化されるために環境を汚染する可能性を最少化するので、拡張可能であり、時間がかからず、且つ環境に優しい。
【００１７】
本発明はまた、死菌全細胞コレラ菌を伴ったｒＣＴＢのワクチン製剤及び患者のコンプライアンスに好適な熱安定性の剤形における前記製剤の提示に関する。
【００１８】
本発明の方法は非限定例として以下で開示されている。
【００１９】
構成的にまたは誘導性にｒＣＴＢを過剰発現する組換えＯ１コレラ菌株はＳｗｅｄｅｎのＧｏｔｈｅｎｂｅｒｇ大学のＪａｎ  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ教授の研究室で作製されたが、事前に定義された培地にて主細胞バンク及び作業細胞バンクを調製するのに使用される。
【００２０】
本発明では、前記選択された株を事前に定義された条件で維持されている発酵槽における発酵に供する。発酵培地はグルコースフィード及び他の既知の製造培地成分を含む。所定のｐＨ及び温度を維持しながら、発酵槽を１８〜２２時間作動させる。得られた発酵させた培養物を所定の温度範囲に加熱することによって不活化に供して不活化した細胞、変性させたタンパク質及びｒＣＴＢで構成する回収物を得る。室温にて所定のｒｐｍで回収物を遠心分離する。得られた上清を酸沈殿及び限外濾過に供して精製されたｒＣＴＢを得る。そのようにして得られた濾液をさらに透析濾過に供し、その後無菌濾過して精製し、無菌化したｒＣＴＢを得る。
【００２１】
得られた精製され、無菌化されたｒＣＴＢを性状分析及び定量に供する。ＨＰＬＣによって所望の純度を、ならびにＧＭ１ＥＬＩＳＡ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって収量を確認した後、所望の剤形で製剤化するのに精製され、無菌化されたｒＣＴＢを使用する。
【００２２】
ｒＣＴＢを精製するのに使用される本発明の方法は、たとえば、さらに高い純度と共に有意にさらに高い収量を提供することのような、従来技術を超える多数の利点を示す。それはまた、ｒＣＴＢを製造し、精製する頑健で迅速な方法も提供する。単位操作の数を減らし、ｒＣＴＢを精製するための高価なカラムクロマトグラフィノン使用を回避するので、その方法は費用効率が高い。追加の利点はそれが工業的に拡張可能であることである。ｒＣＴＢの存在のせいで、前記ワクチン製剤はコレラ菌に対して相乗的な防御も提供する。ｒＣＴＢが全細胞不活化コレラ株と共に製剤化される場合、ワクチン製剤はＥＴＥＣに対する交差防御を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】発酵の間での株ＭＳ１０１２の増殖曲線を示す図である。
【図２】ｒＣＴＢの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を示す図である。
【図３】精製したｒＣＴＢのＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図４】精製の様々な段階での煮沸ｒＣＴＢ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図５】（Ａ）ｒＣＴＢの煮沸及び非煮沸の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。（Ｂ）ｒＣＴＢのウエスタンブロットを示す図である。
【図６】ｒＣＴＢの定量のために行った濃度測定の結果を示す図である。
【図７】ｒＣＴＢの発酵及び精製のバッチの一貫性の泳動試料についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図８】発酵及び精製についての模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
従って、本発明はｒＣＴＢの＞９５％純度と共に１．５〜２．５ｇｍ／リットルの範囲での高い収量を与える組換えコレラ毒素Ｂの製造のための方法に関する。ｒＣＴＢを過剰発現する組換えコレラ菌株ＭＳ１０１２はＧｏｔｏｖａｘ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎによって開発された。前記株は、Ｇｏｔｏｖａｘ  ＡＢ，ＳｗｅｄｅｎとＭＳＤ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｈｉｌｌｅｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．との間での共同研究の一環としてＨｉｌｌｅｍａｎ  Ｌａｂｓによって受け取られた。前記株に由来するｒＣＴＢの方法開発、精製、定量及び性状分析はＨｉｌｌｅｍａｎ  Ｌａｂｓにて実施されている。
【００２５】
本発明の好まれる実施形態が記載される前に、本発明は、記載されている特定の材料が変化してもよいので、それらに限定されないことが理解される。本明細書で使用されている専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであって、本発明の範囲を限定するようには決して意図されないことも理解される。本明細書で使用されるとき、文脈が明瞭に指示しない限り、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の参照を含むことが言及されなければならない。
【００２６】
ｒＣＴＢを過剰発現する選択された組換えコレラ菌株ＭＳ１０１２は事前に定義された培地で培養され、事前に定義された条件で一晩インキュベートされる。前記選択された株を次いで、７．２〜７．５の範囲でｐＨを維持しながら１８〜２２時間の発酵に供し、温度はグルコースフィードの存在下で３５℃〜３７℃の範囲であり、その後、発酵させた培養物を６０℃〜７０℃の範囲での高温に３０分間加熱する。
【００２７】
得られた発酵培養物を次いで遠心分離に供して不活化された細胞及び変性させたタンパク質を取り除く。
【００２８】
得られた上清を次いで限外濾過に供する。そのように得られた濾液を５００Ｋｄａの限外濾過膜を用いて限外濾過する。濃縮液を捨て、透過液を回収する。そのように得られた透過液をヘキサメタリン酸ナトリウムの存在下で酸沈殿に供する。得られた沈殿物を遠心分離に供する。上清を捨て、そのように形成されたペレットを回収し、緩衝溶液、好ましくはｐＨ７．４のリン酸緩衝液に溶解する。得られたペレット緩衝液溶液をさらに、１０Ｋｄａの膜を用いた限外濾過に供し、培地成分を取り除く。濃縮液を回収し、０．２２μｍの膜によってフィルター滅菌する。得られた精製し、無菌化したｒＣＴＢをｒＣＴＢの性状分析及び定量に供する。
【００２９】
ＨＰＬＣ及びＮｏｖｅｘトリス／グリシンゲル１４％におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによってｒＣＴＢの純度を確認する。ＨＰＬＣのプロファイル（図３）は９５％を超える純度を裏付ける。
【００３０】
ｒＣＴＢのさらなる性状分析はＬＴ３９モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによって実施する。ｒＣＴＢの定量はＧＭ１  ＥＬＩＳＡによって実施する。ＥＬＩＳＡ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる濃度測定は双方とも互いの裏付けを生じる。ｒＣＴＢの全体的な収量は１．５〜２．５ｇｍ／リットルである。
【００３１】
所望の純度及び収量を達成した後、精製し、フィルターで無菌化したｒＣＴＢを製剤化工程に供する。
【００３２】
Ｏｇａｗａ、Ｉｎａｂａの血清型のいずれかと共に自然に単離されたＯ１コレラ菌株、またはＯｇａｗａ及びＩｎａｂａを同時発現する組換えで作出したＨｉｋｏｊｉｍａ株の不活化全細胞に精製したｒＣＴＢを混合し、１．５ｍＬの不活化コレラ菌の細菌浮遊液当たり１ｍｇのｒＣＴＢを得る。得られた浮遊液をスクロースの存在下でバイアルまたはトレイにて凍結乾燥する。凍結乾燥サイクルは２８時間である。同時に圧力制御を維持しながら、棚温度を３０℃〜５０℃の範囲で維持する。凍結乾燥した物質を窒素チャンバーにてトレイから気密容器に移し、使用まで４℃で保存する。
【００３３】
得られた凍結乾燥した物質を所望の剤形、さらに好ましくは錠剤に製剤化することができる。ｒＣＴＢを死菌全細胞コレラ菌と組み合わせて、具体的には消化管のあまり酸性でない領域（小腸）でｒＣＴＢと不活化全細胞コレラ菌を溶解し、遊離する保護的酸耐性ポリマーで腸溶コーティングした錠剤として製剤化する。腸溶コーティングは、摂食状態または絶食状態にかかわらず、胃酸環境から保護しながら小腸でのｒＣＴＢの遊離を可能にする。製剤は、コレラが風土病である地域またはコレラ流行地域における５歳を超える旅行者または対象のためにブリスター包装／ストリップ包装での固形剤形で設計され、包装され、市場に出される。
【００３４】
従って、本発明は高い純度と共に有意に高い収量を提供する。方法は、総時間を減らし、ｒＣＴＢを精製するのに必要とされた高価なクロマトグラフィのマトリクスの使用を回避するので費用効率が良い。本発明はまた、ＥＴＥＣに対する交差防御及びコレラ菌に対する相乗効果を提供する剤形で、好ましくは固形剤形、さらに好ましくは錠剤の形態で新規のワクチン製剤も提供する。発酵及び精製のための模式図は図８で示されるようなものである。
【００３５】
方法の上記の詳細な記載は非限定の実施例によって説明される。
【実施例】
【００３６】
実施例１：組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）の発酵及び精製
ＭＳ１０１２株は、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔｉｎｉ、ＭＳ培地（カザミノ酸、２０ｇｍ；スクロース、２．５ｇｍ；Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、６．２７ｇｍ；Ｋ２ＨＰＯ４、５ｇｍ；ＮＨ４Ｃｌ、１ｇｍ；Ｎａ２ＳＯ４、０．０８９ｇｍ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、４２ｍｇ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、４ｍｇ；ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ、５ｍｇ）、ＶＣＧ培地（カザミノ酸、３０ｇｍ；酵母抽出物、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇｍ；Ｌ−トリプトファン、０．０５ｇｍ；ＫＨ２ＰＯ４、０．１３ｇｍ；Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、０．８７ｇｍ；スクロース、３．４ｇｍ）、ｒＣＴＢ生産培地（カザミノ酸、３０ｇｍ；スクロース、２．５ｇｍ；Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、６．２７ｇｍ；Ｋ２ＨＰＯ４、５ｇｍ；ＮＨ４Ｃｌ、１ｇｍ；Ｎａ２ＳＯ４、０．０８９ｇｍ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、４２ｍｇ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、４ｍｇ；ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ、５ｍｇ）等のような培地の１．５％寒天プレート上の常用種ロットから復活させ、３７℃で一晩インキュベートした。
【００３７】
このプレートから３つのコロニーをＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔｉｎｉ、ＭＳ培地、ＶＣＧ培地、ｒＣＴＢ生産培地等のような培地３５ｍＬに移し、振盪しながら（１８０ｒｐｍ）３７℃にて培養物を０．９〜１．５／ｍＬまたは対数中期増殖期に由来するＣＤ６００まで増殖させた。この培養物３５ｍＬを用いて、５リットルの発酵槽にてカザミノ酸、３０ｇｍ；スクロース、２．５ｇｍ；Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、６．２７ｇｍ；Ｋ２ＨＰＯ４、５ｇｍ；ＮＨ４Ｃｌ、１ｇｍ；Ｎａ２ＳＯ４、０．０８９ｇｍ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、４２ｍｇ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、４ｍｇ；ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ、５ｍｇを含有するｒＣＴＢ生産培地２．５リットルに植菌した。６００ｒｐｍで振盪しながら、発酵槽のｐＨを７．２±１〜７．４±１の範囲で維持し、３７℃での温度、２反応容器容量／分の通気を維持し、１Ｍのグルコース及びｒＣＴＢ生産培地を含有するフィードをｐＯ２が３０％未満低下する発酵の５時間後に０．３ｍＬ／分の供給速度で与えた。株ＭＳ１０１２の発酵培養物は１０〜１２時間で８〜１０のＯＤ６００に達した（図１）。水で３０％に希釈した消泡剤２０４（Ｓｉｇｍａ）を使用して発泡を制御した。２０時間後に培養を中止し、発酵槽の温度を３０分間６５℃に上昇させて望ましくない細菌タンパク質を沈殿させた。ｒＣＴＢは７４℃まで熱変性に耐性なので沈殿しない（ＤＳＣ、図２）。熱処理し、発酵させた培養物を室温にて８０００ｒｐｍで９０分間遠心分離した。残渣を捨て、上清を回収し、次いでそれを５００Ｋｄａの接線流濾過（ＴＦＦ）に供し、濃縮液を捨て、透過液を回収した。２．５ｇｍ／ｌｔの濃度でのヘキサメタリン酸ナトリウムの存在下でｐＨが４．５に達するまで、６ＭのＨＣｌとその後３ＭのＨＣｌを用いた酸沈殿に透過液を供するした。この酸処理した５００Ｋｄａの透過液を２〜８℃にて８０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５００〜６００ｍｌの２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶解し、次いでそれを５×１０ＫｄａのＴＦＦに供してヘキサメタリン酸ナトリウム及び培地成分をペレットから取り除いた。濃縮液を回収し、濾過し、０．２２ミクロンのフィルターで無菌化した。
【００３８】
これが精製し、無菌化したｒＣＴＢである。発酵及び精製の過程は上記で与えられたような模式図で示すように実施された。ｒＣＴＢの発酵及び精製についての３つの一貫性の泳動試料は上述の過程によって行われた。
【００３９】
実施例２：組換えコレラ毒素Ｂの純度、性状分析及び定量
ｒＣＴＢの純度をＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。ＴＳＫゲルＰＷＸＬガードカラム（６．０×４０ｍｍ、ＴＯＳＯＨ）と直列のＴＳＫゲル５０００ＰＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、粒度７μｍ、ＴＯＳＯＨ）及びＴＳＫゲル４０００ＰＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、粒度７μｍ、ＴＯＳＯＨ）におけるＨＰＬＣ−ＳＥＣによって試料を分析した。定組成様式で３０分間、１．０ｍｌ／分の流速で移動相は０．１ＭのＮａＮＯ３、ｐＨ７．２であった。空隙容量及び全カラム容量はそれぞれデキストランＭＷ５０，００，０００−４００，００，０００（ＨＩＭＥＤＩＡ）及び酸化重水素（Ｄ２Ｏ，Ｍｅｒｃｋ）によって決定した。タンパク質のピークは２８０ｎｍで検出した。ＨＰＬＣのプロファイル（図３）はこの精製方法が我々に＞９５％純粋なｒＣＴＢを与えることを示した。
【００４０】
精製したｒＣＴＢをＮｏｖｅｘトリス／グリシンゲル１４％上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってもチェックし、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  Ｉｍａｇｅｒを用いてバンドの検出を行った（図５Ａ及び５Ｂ）。ゲルは１２Ｋｄａにてたった１つの主バンドの存在を明瞭に示した（図５Ｂ）。ｒＣＴＢの純度の結果は、ｒＣＴＢについて以下の表１で示すようなＥＭＥＡの明細に完全に一致した。
【００４１】
【表１】
2019501874.tif 000002
【００４２】
１：１００希釈の希釈でのＬＴ３９モノクローナル抗体と１：２０００の希釈でのヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いたウエスタンブロットによってｒＣＴＢの性状分析を行った。ウエスタンブロットについては、煮沸した試料と煮沸しなかった試料の双方をＳＤＳ−ＰＡＧＥで流した。煮沸は６０Ｋｄａの５量体ｒＣＴＢを１２Ｋｄａの単量体に切断した。ウエスタンブロットの抗体は５量体のみを認識するので、ウエスタンブロットでは６０Ｋｄａでの５量体についてのバンドしか観察されず、単量体についてのバンドはなかった（図５Ｂ）。
【００４３】
ｒＣＴＢの定量は前に記載された［Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ａ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＧＭ１−ＥＬＩＳＡ）ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．１９７８；１：１９−２３］ようにＧＭ１  ＥＬＩＳＡによって行った。手短には、０．３ナノモル／ｍｌのＧＭ１をＥＬＩＳＡプレートに被覆した。３倍希釈の試料を作った。０．５μｇ／ｍｌの濃度での精製ＣＴＢを参照として使用した。ＬＴ３９モノクローナル抗体を１：１００希釈の希釈で一次抗体として使用した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを１：４０００の希釈で二次抗体として使用した。ｒＣＴＢの定量もデンシトメトリーによって行い、その結果を図６に示した。ＥＬＩＳＡ及びデンシトメトリーの結果は双方とも互いを裏付ける。ｒＣＴＢの全体的な収量は１．５〜２．５ｇｍ／リットルであった。３つの一貫性の泳動試料では、ｒＣＴＢの収量は２ｇｍ／Ｌ、１．７ｇｍ／Ｌ及び２．２５ｇｍ／Ｌであった（図７）。
【００４４】
実施例３：製剤及び標的生成物のプロファイル（ＴＰＰ）
ホルマリンによる死菌全細胞コレラ菌とｒＣＴＢ（１．５ｍｌのホルマリンによる死菌全細胞コレラ菌当たり１ｍｇ）の製剤をスクロース（２．５ｍｇ／ｍｌ）の存在下で凍結乾燥した。凍結乾燥サイクルは２８時間であった。棚温度は４０℃に設定し、圧力制御は９２２ミリバールに設定した。凍結乾燥物質を窒素チャンバーにてトレイから気密容器に移し、使用まで４℃で保存した。この製剤のＴＰＰは錠剤である。１錠のワクチンはコレラ菌の熱死菌全細胞とｒＣＴＢの活性医薬化合物（錠剤当たり１００〜１５０ｍｇ）を含有した。錠剤で使用した賦形剤は微細結晶セルロース（２５〜３０％）、デンプン（２５〜３０％）、ステアリン酸Ｍｇ（０．５〜０．７％）、コロイド状二酸化珪素（０．５〜１％）である。成分すべての混合物を打錠機にて直接圧縮した。錠剤をＯＰＡドライ（３〜５％）で密封コーティングし、最終的にＥＵＤＲＡＧＩＴＬ３０Ｄ５５／アクリル−ＥＺＥＩＩ（８〜１２％）で腸溶コーティングした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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