(57)【要約】  本発明は、網膜色素変性（ＲＰ）などの網膜変性疾患を治療するために構成されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む核酸ベクター、該核酸ベクターを含む医薬組成物、前記ポリヌクレオチドまたは前記核酸ベクターを含むキット、前記核酸ベクターを作製する方法、および網膜変性疾患を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒトロドプシン遺伝子（ｈＲＨＯ）プロモーターをコードする核酸；
（ｂ）ヒトホスホジエステラーゼ６Ａと称されるｃＧＭＰ特異的な桿体αサブユニット（ｈＰＤＥ６Ａ）またはそのフラグメントをコードする核酸；および
（ｃ）調節エレメントをコードする核酸
を含む導入遺伝子発現カセットを含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記調節エレメントが、（ｃ１）ヤマネズミ口内炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、好ましくは変異ＷＰＲＥ（ＷＰＲＥｍ）をコードする核酸を含み、前記ＷＰＲＥｍが、非発現型のヤマネズミ肝炎ウイルスＸタンパク質（ＷＨＸ）のオープンリーディングフレーム（ＷＨＸ  ＯＲ）を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記調節エレメントが、（ｃ２）ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、好ましくはウシ成長ホルモンｐＡ（ＢＧＨ  ｐＡ）をコードする核酸を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、前記導入遺伝子発現カセットを挟む逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をコードする核酸、好ましくは前記ｈＲＨＯプロモーターに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ（Ｌ−ＩＴＲ）と前記ｐＡに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ（Ｒ−ＩＴＲ）とをコードする核酸をさらに含み、さらに好ましくは該ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型２型由来のＩＴＲ（ＩＴＲ  ＡＡＶ２）である、先行する請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
（ａ）−（ｂ）−（ｃ）、好ましくは（ａ）−（ｂ）−（ｃ１）−（ｃ２）、さらに好ましくは（Ｌ−ＩＴＲ）−（ａ）−（ｂ）−（ｃ１）−（ｃ２）−（Ｒ−ＩＴＲ）の順で配置された構成を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
−前記ｈＲＨＯプロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列を含むこと、
および／または
−前記ｈＰＤＥ６Ａが、配列番号２のヌクレオチド配列を含むこと、
および／または
−前記ＷＰＲＥｍが、配列番号３のヌクレオチド配列を含むこと、
および／または
−前記ＢＧＨ  ｐＡが、配列番号４のヌクレオチド配列を含むこと、
および／または
−前記Ｌ−ＩＴＲが、配列番号５のヌクレオチド配列を含むこと、
および／または
−前記Ｒ−ＩＴＲが、配列番号６のヌクレオチド配列を含むこと、
をそれぞれ独立した特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む核酸ベクター。
【請求項８】
全長５，０００ｂｐ以上、好ましくは全長５，５００ｂｐ以上の骨格をさらに含む環状プラスミドである、請求項７に記載の核酸ベクター。
【請求項９】
−前記骨格に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が５個以下、好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個であること；
および／または
−前記骨格が、選択マーカー、好ましくは抗生物質耐性をコードする核酸、さらに好ましくはカナマイシン耐性をコードする核酸（ＫａｎＲ）を含み、
さらに好ましくは、前記選択マーカーの５’末端および３’末端が、前記ポリヌクレオチドから距離をおいて離れた位置に、好ましくは前記ポリヌクレオチドから距離をおいてできるだけ離れた位置に、さらに好ましくは前記ポリヌクレオチドから１，０００ｂｐ以上、さらに好ましくは１，５００ｂｐ以上、非常に好ましくは１，９００ｂｐ以上の距離をおいた位置にあること；
および／または
−前記骨格に含まれる制限酵素認識部位（ＲＥＲＳ）が１０個以下、好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個であること；
および／または
−前記骨格に含まれるプロモーターが５個以下、好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個であること；
および／または
−前記骨格が、複製開始点（ＯＲＩ）、好ましくはｐＵＣ１８  ＯＲＩを含むこと、
をそれぞれ独立した特徴とする、請求項８に記載の核酸ベクター。
【請求項１０】
前記骨格が、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、該ＡＡＶベクターのＡＡＶカプシド配列の血清型が、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の核酸ベクターと薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤。
【請求項１３】
網膜変性をもたらす遺伝子変異、遺伝子置換または遺伝子欠失を伴う疾患、好ましくは遺伝性網膜ジストロフィー、さらに好ましくは網膜色素変性（ＲＰ）、非常に好ましくはＲＰ４３型（ＲＰ４３）の治療に使用するための、請求項１２に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項７〜１１のいずれか１項に記載の核酸ベクターおよび／または請求項１２または１３に記載の医薬製剤と、
（ｂ）これらを使用するための取扱説明書と
を含むキット。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよびｈＰＤＥ６Ａをコードする核酸のいずれかをアデノ随伴ウイルスベクターに挿入することを含み、前記アデノ随伴ウイルスベクターが、好ましくは請求項７〜１１に記載の核酸ベクターである、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜色素変性（ＲＰ）などの網膜変性疾患を治療するために構成されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む核酸ベクター、該核酸ベクターを含む医薬組成物、前記ポリヌクレオチドまたは前記核酸ベクターを含むキット、前記核酸ベクターを作製する方法、および網膜変性疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜変性は、網膜の細胞が徐々に死滅することによって引き起こされる網膜の変質である。網膜変性の原因としては、動脈閉塞症、静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、Ｒ．Ｌ．Ｆ．／Ｒ．Ｏ．Ｐ．（後水晶体線維増殖症／未熟児網膜症）、疾患（通常、遺伝性疾患）等が挙げられる。網膜変性は、視力低下、夜盲、網膜剥離、光過敏、トンネル状視野、周辺視野の喪失から完全な失明までといった様々な形で現れる。
【０００３】
網膜変性疾患の中でも、網膜色素変性（ＲＰ）は極めて重要な疾患の１つである。また、ＲＰは、失明に至る様々な遺伝性眼疾患の中で最も重要な疾患の１つである。ＲＰは、臨床的な均質性は高いが、遺伝的に異質性のある疾患群であり、この疾患群は、まず桿体光受容体の細胞死が起こり、次いで錐体光受容体が失われるという特徴を有する。この疾患は網膜の中周辺部で始まり、細胞の破壊が継続的に進行して網膜の中心に達する。このような細胞破壊により、高度な円形状の視野狭窄による「トンネル状視野」が起こり、法的盲に至ることもある。その他の臨床的に重要な特徴としては、特徴的な形状の色素沈着（「骨小体様色素沈着」）と網膜血管の進行的な狭小化が挙げられる。その時間的経過は、小児期に末期状態に達する早期発症型から、高齢期までいくばくかの有効な視力が保持されうる遅発症型まで様々である。
【０００４】
ＲＰの有病率は、４，０００人に１人程度である。ＲＰは、遺伝的な異質性が極めて高く、現在５０を超えるＲＰ遺伝子が知られている。ＲＰの症例の１０〜２５％は常染色体優性遺伝形式（ａｄＲＰ）であり、６〜１８％はＸ連鎖性遺伝形式（ｘＲＰ）であり、２０〜３０％は常染色体劣性遺伝形式（ａｒＲＰ）である。症例の４０〜５０％は孤発例であり、家族歴のないａｒＲＰ症例の多くは、これに相当する可能性が高い。ＲＰのうち、ａｒＲＰは、遺伝的異質性の最も高いサブグループであり、一般に、単一遺伝子の関与の割合は、全体の中で極めて小さい。ａｒＲＰで変異が見られる遺伝子として最も多いのは、ＥＹＳ（５〜１２％）、ＵＳＨ２Ａ（５〜１５％）、ＣＲＢ１（約５％）およびＰＤＥ６Ｂ（４〜１０％）である。しかし、これらの比率は調査した集団によって大きく左右される。
【０００５】
ＰＤＥ６Ａは、桿体光受容体のｃＧＭＰホスホジエステラーゼのαサブユニットをコードしている（ＲＰ４３遺伝子座）。いわゆる「ＰＤＥ６Ａ関連ＲＰ」または「ＲＰ４３型」を引き起こすＲＰ４３遺伝子座の変異は、ａｒＲＰ症例の２〜４％で見られる。したがって、ＰＤＥ６Ａ関連ａｒＲＰの患者の絶対数は、ドイツで約９００人、ＥＵで約５，０００人ということになる。
【０００６】
ＲＰのような遺伝性網膜ジストロフィーは、遺伝子変異が原因で生じる眼疾患である。この疾患の遺伝的性質ゆえに、確立された慣用の治癒的治療法や対症的治療法はいまだ存在しない。疾患負荷が非常に大きいことから、臨床専門家は、治療法の確立が求められている疾患の中でもＲＰを最優先すべき課題としている。
【０００７】
Ｗｅｒｔら，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２（３）．ｐ．５５８−５６７（２０１３）、また２０１２年１０月２９日出版のＡｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓにおいて、細胞型特異的なマウスロドプシン（ＲＨＯ）プロモーターの制御下にマウスＰＤＥ６Ａ遺伝子を有する組換えＡＡＶ２／８ベクターであるＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ）−Ｒｈｏ−Ｐｄｅ６αが開示されている。著者らは、このベクターを用いて、ＰＤＥ６のαサブユニットをコードする遺伝子に変異（Ｐｄｅ６αｎｍｆ３６３）を有するマウスの網膜への形質導入を行ったところ、ベクターの注入により、光受容体の生存延長および網膜機能の改善が認められたと述べている。しかし、本発明者らによれば、この方法における遺伝子置換率は不十分であり、ＲＰ４３型で見られるような網膜変性を患うヒトの治療として、この方法はさほど有望でない可能性が示唆される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような背景から、本発明の目的は、これらの限界を打破し、ＲＰ、特にＲＰ４３型などの網膜変性疾患の治療の有益なツールとなるポリペプチドおよび核酸ベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、
（ａ）ヒトロドプシン遺伝子（ｈＲＨＯ）プロモーターをコードする核酸；
（ｂ）ヒトホスホジエステラーゼ６Ａと称されるｃＧＭＰ特異的な桿体αサブユニット（ｈＰＤＥ６Ａ）またはそのフラグメントをコードする核酸；および
（ｃ）調節エレメントをコードする核酸
を含む導入遺伝子発現カセットを含むポリヌクレオチドにより達成される。
【００１０】
上記により、本発明の基礎をなす課題は完全に達成される。
【００１１】
本発明者らは、本発明のポリヌクレオチドが、ヒト患者に適用可能な、ＲＰなどの網膜変性疾患の治療を可能にする遺伝子ツールの重要な構成要素を具体化したものであることを見出した。
【００１２】
本発明者らは、本発明のポリヌクレオチドをベクタープラスミドの構成要素としてＰＤＥ６Ａ欠損マウスに網膜下注射することにより、ｈＰＤＥ６Ａ導入遺伝子が桿体光受容体細胞で特異的かつ効率的に発現されることを実験により確認した。また、本発明者らは、生まれつき桿体機能を有していないこのマウスに、桿体を介する視力が付与されることも確認した。
【００１３】
この結果は驚くべきものであった。当技術分野において、本発明で提案されるような構造を有するポリヌクレオチドにより、網膜でＰＤＥ６Ａ導入遺伝子の標的発現が可能になることは予想外であった。したがって、本発明のポリヌクレオチドがこのような高い特異性と高い選択性を有すること、および視覚機能の回復において有意な生物学的有効性を有することは、当業者にとって自明な事項ではなかった。
【００１４】
本発明者らは、予備実験において、網膜に注射した本発明のポリヌクレオチドが、機能的活性を有する状態で桿体光受容体で特異的に発現されることを確認した。また、別の実験により、このポリヌクレオチドは、その場にとどまり、非標的臓器への形質導入をほとんど行わないことも確認されている。また、さらなる実験から、本発明のポリヌクレオチドを網膜に注射した後、この投与したポリヌクレオチドに対する抗薬剤抗体が誘導されないことも確認されている。これらのことから、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＰなどの網膜変性疾患の治療用医薬組成物の活性物質として好適であるという結論が導かれる。
【００１５】
本発明において、「ポリヌクレオチド」は、１３以上のヌクレオチドモノマーが共有結合で結合して鎖状に連なった構造を有する生体高分子である。好ましいポリヌクレオチドの一例は、ＤＮＡ分子である。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよいが、好ましい一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは一本鎖である。
【００１６】
「プロモーター」とは、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡ領域を意味する。転写プロセスの一環として、ＲＮＡポリメラーゼとして知られているＲＮＡを合成する酵素は、遺伝子近傍のＤＮＡに結合する。プロモーターには、特定のＤＮＡ配列と、ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子が転写開始時に結合する部位を提供する応答エレメントとが含まれている。
【００１７】
ヒトロドプシン遺伝子（ｈＲＨＯ）プロモーターとは、ヒトロドプシンの転写を促進するＤＮＡ領域を意味する。ｈＲＨＯプロモーターのヌクレオチド配列全体は、Ａｌｌｏｃｃａら，Ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１（２００７）１１３７２−１１３８０に開示されている。一実施形態において、このプロモーターのヌクレオチド配列全体が用いられる。本発明の別の一実施形態において、ｈＰＤＥ６Ａの標的発現に必要とされる、前記プロモーターの機能的部分のみが用いられる。本発明のさらなる別の一実施形態において、前述のヌクレオチド配列と、別のプロモーターのヌクレオチド配列、イントロン配列または調節エレメント配列とを融合したものが用いられる。
【００１８】
「導入遺伝子発現カセット」または「発現カセット」は、核酸ベクターによって標的細胞に送達される複数の遺伝子配列を含む。これらの配列には、目的の遺伝子（例えば、ｈＰＤＥ６Ａ核酸）、１以上のプロモーターおよび調節エレメントが含まれる。
【００１９】
「調節エレメント」は、標的細胞において遺伝子（例えば、ｈＰＤＥ６Ａ核酸）を効果的に発現させるために必要な調節エレメントであり、よって、導入遺伝子発現カセットに含まれている必要がある。このような配列として、例えば、エンハンサー配列、プラスミドベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入を促進するポリリンカー配列、イントロンを除去するスプライシングに関わる配列、またはｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化に関わる配列が挙げられる。
【００２０】
「核酸」または「核酸分子」は、ヌクレオチドモノマーが連なった鎖状構造を有する分子であり、例えば、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）などが挙げられる。核酸は、例えば、プロモーターをコードしていてもよく、ｈＰＤＥ６Ａ遺伝子またはそのフラグメントをコードしていてもよく、調節エレメントをコードしていてもよい。核酸分子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
【００２１】
「ｈＰＤＥ６Ａをコードする核酸」とは、ヒトＰＤＥ６Ａをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を意味し、本発明の一実施形態においては、ヒトＰＤＥ６ＡのフラグメントまたはヒトＰＤＥ６Ａの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を意味する。ｈＰＤＥ６Ａの「フラグメント」とは、ｈＰＤＥ６Ａ活性を保持するｈＰＤＥ６Ａの断片または一部を意味する。ｈＰＤＥ６Ａの「機能的変異体」には、野生型ｈＰＤＥ６Ａの機能を著しく低下させたり変化させたりすることのない軽微な変更、例えば、サイレント変異、一塩基変異多型、ミスセンス突然変異およびその他の変異または欠失などを有するｈＰＤＥ６Ａ変異体が包含される。
【００２２】
本発明の「ｈＰＤＥ６Ａをコードする核酸」で少なくとも部分的にコードされているｈＰＤＥ６Ａのアミノ酸配列は、配列番号３に記載されている。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドには、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子、すなわち、当該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子が包含される。例えば、ゲノムＤＮＡに関して言えば、「単離された」という用語は、当該ゲノムＤＮＡが本来関連している染色体から分離された核酸分子を包含する。「単離された」核酸分子は、好ましくは、該核酸分子の由来生物のゲノムＤＮＡ内で該核酸分子の両側に本来存在している配列が存在していない状態の核酸分子である。
【００２４】
本発明の好ましい一実施形態において、前記調節エレメントは、ｃ１）ヤマネズミ口内炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をコードする核酸を含む。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドのこのさらなる発展形態は、光受容細胞のｈＰＤＥ６Ａの発現が著しく増大するという利点を有する。ＷＰＲＥが含まれることにより長期発現が可能になることから、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療における使用に好適である。前記ＷＰＲＥは、ヤマネズミ肝炎ウイルスＸオープンリーディングフレーム（ＷＨＸ  ＯＲＦ）遺伝子プロモーターと、その３’領域にＷＨＸの始めの６１個のＡＡをコードするオープンリーディングフレームとを含む（Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆら，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｔｅｄ  ＰＲＥ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ａｎｄ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｈｉｌｅ  ａｂｒｏｇａｔｉｎｇ  ＷＨＶ−Ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＷＡＳ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１６（５），６０５−６１９（２００９）を参照）。
【００２６】
本発明の別の一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドにおける前記ＷＰＲＥは、非発現型のＷＨＸタンパク質のＷＨＸ  ＯＲを含む変異ＷＰＲＥ（ＷＰＲＥｍ）である。
【００２７】
この場合、発現カセットからのＷＨＸタンパク質の意図しない発現が抑制されるという利点がある。
【００２８】
本発明の別の一実施形態において、前記調節エレメントは、（ｃ２）ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）をコードする核酸を含む。
【００２９】
この場合、本発明のポリヌクレオチドには、ｈＰＤＥ６ＡをコードするｍＲＮＡの核外移行、翻訳および安定性にとって重要な調節エレメントが備わっているため、発現効率が向上するという利点がある。
【００３０】
本発明のさらなる一実施形態において、前記ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ  ｐＡ）である。
【００３１】
本発明者らは、この特定のポリアデニル化シグナルと本発明のポリヌクレオチドの他の遺伝要素とを共に使用することにより、特に良好な結果が得られることを見出した。
【００３２】
別の一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、前記導入遺伝子発現カセットを挟む逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をコードする核酸をさらに含み、好ましくは、前記発現カセットの第１の末端に前記ｈＲＨＯプロモーターに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ（Ｌ−ＩＴＲ）と、前記発現カセットの第１の末端の反対側に位置する第２の末端に前記ｐＡに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ（Ｒ−ＩＴＲ）とを含む。
【００３３】
この場合、製造時の効率的な複製およびパッケージングが可能になるという利点がある。「挟む」とは、ＩＴＲが導入遺伝子発現カセットの両側、すなわち、５’末端と３’末端に位置することを意味する。これにより、ＩＴＲは導入遺伝子発現カセットの外枠を構成する。
【００３４】
本発明の一実施形態において、前記ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２型由来のＩＴＲ（ＩＴＲ  ＡＡＶ２）である。
【００３５】
本発明において見出された通り、この特定のＩＴＲは、本発明のポリヌクレオチドに特に好適である。
【００３６】
本発明の別の一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）、好ましくは（ａ）−（ｂ）−（ｃ１）−（ｃ２）、さらに好ましくは（Ｌ−ＩＴＲ）−（ａ）−（ｂ）−（ｃ１）−（ｃ２）−（Ｒ−ＩＴＲ）の順で配置された構成を含む。
【００３７】
上記順序で遺伝要素が配置されていることは、本発明のポリヌクレオチドの発現効率に有益であることが確認されている。
【００３８】
本発明の別の一実施形態は、前記ｈＲＨＯプロモーターが配列番号１のヌクレオチド配列を含むこと；ｈＰＤＥ６Ａをコードする前記核酸が配列番号２のヌクレオチド配列を含むこと；ｈＰＤＥ６Ａをコードする前記核酸が配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むこと；ＷＰＲＥｍをコードする前記核酸が配列番号４のヌクレオチド配列を含むこと；ＢＧＨ  ｐＡをコードする前記核酸が配列番号５のヌクレオチド配列を含むこと；Ｌ−ＩＴＲをコードする前記核酸が配列番号６のヌクレオチド配列を含むこと；および／またはＲ−ＩＴＲをコードする前記核酸が配列番号７のヌクレオチド配列を含むこと、を特徴とする。
【００３９】
この場合、本発明のポリヌクレオチドの各遺伝要素の特定のヌクレオチド配列により、綿密な構築マニュアルが提供されるという利点がある。このようなマニュアルの提供により、本発明のポリヌクレオチドを、例えば、核酸合成装置を用いて、簡便かつ短時間で合成することが可能になる。
【００４０】
本発明の別の主題は、上記した本発明のポリヌクレオチドを含む核酸ベクターである。したがって、本発明のポリヌクレオチドの特徴、利点および特性は、本発明の核酸ベクターにも適用される。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明の核酸ベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニア／ポックスウイルスまたはヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））に由来するベクターである。最も好ましい実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである（以下を参照）。
【００４２】
本発明の一実施形態において、前記核酸ベクターは、全長５，０００ｂｐ以上、好ましくは全長５，５００ｂｐ以上の骨格をさらに含む環状プラスミドである。
【００４３】
本発明において、「骨格」という用語は、ベクター分子における、発現カセット以外の部分、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が存在する場合は、発現カセットとＩＴＲ以外の部分を表す。換言すると、前記ベクターの骨格は、発現カセットまたはＩＴＲの５’末端および３’末端に隣接し、前記ベクターの本発明のポリヌクレオチドを除いた残りの核酸部分を構成している。
【００４４】
本発明者らは、骨格を上記のような好ましいサイズにすることによって、前記発現カセットがパッケージングされず骨格が誤ってウイルス粒子にパッケージングされる（逆パッケージング）という現象が最小限に抑えられることを見出した。したがって、このような骨格を有することにより、本質的にｈＰＤＥ６Ａのみを標的細胞で確実に発現させることが可能になる。
【００４５】
本発明の別の一実施形態において、前記骨格に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、５個以下、好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個である。
【００４６】
本発明者らは、前記骨格において、選択マーカーまたは複製開始点（ＯＲＩ）が存在する場合はこれらを除外した前記骨格において、存在するＯＲＦ数を少なくし、可能であればゼロとすべきであることを見出した。この場合、万一逆パッケージングが起こった場合でも、副産物発現の可能性が最小限に抑えられるという利点がある。また、ｒＡＡＶベクターの製造時における副産物発現の可能性も最小限に抑えられる。
【００４７】
本発明の核酸ベクターのさらなる別の一実施形態において、前記骨格は、選択マーカー、好ましくは抗生物質耐性をコードする核酸、さらに好ましくはカナマイシン耐性をコードする核酸（ＫａｎＲ）を含む。
【００４８】
これにより、本発明の核酸ベクターが組み込まれた細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択するための構造的な前提条件が提供される。このような細胞を、本発明のベクターを増幅するために使用してもよい。
【００４９】
本発明の別の一実施形態において、前記核酸ベクターの骨格に含まれる前記選択マーカーは、その５’末端および３’末端が、本発明のポリヌクレオチドから距離をおいて離れた位置にあるように、好ましくは本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットから距離をおいてできるだけ離れた位置にあるように、さらに好ましくは本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットから１，０００ｂｐ以上、さらに好ましくは１，５００ｂｐ以上、非常に好ましくは１，９００ｂｐ以上の距離をおいた位置にあるように配置されている。
【００５０】
本発明者らが見出した通り、この場合、耐性をコードする核酸（ＫａｎＲ）が、前記発現カセットのＩＴＲおよび調節エレメント（例えば、プロモーター）からできるだけ距離をおいた位置に配置されているという利点がある。
【００５１】
本発明の核酸ベクターのさらなる一発展形態において、前記骨格に含まれる制限酵素認識部位（ＲＥＲＳ）は、１０個以下、好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個である。
【００５２】
この場合、ＤＮＡ増幅に用いる微生物内において、本発明の核酸ベクターの安定性が大幅に向上するという利点がある。
【００５３】
本発明の核酸ベクターのさらなる一発展形態において、前記骨格に含まれるプロモーターは、５個以下、好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個である。
【００５４】
この場合、万一逆パッケージングが起こった場合でも、悪影響を及ぼし得るまたは導入遺伝子に干渉し得る副産物の発現の可能性が最小限に抑えられる。この実施形態においては、「プロモーター」は、選択マーカー（例えば、ＫａｎＲ）の発現に必要なプロモーターを除いたものとして理解される。「プロモーター」としては、適切な原核生物プロモーターとして通常示されるものが挙げられる。
【００５５】
本発明の核酸ベクターのさらなる一実施形態において、前記骨格は、複製開始点（ＯＲＩ）、好ましくはｐＵＣ１８  ＯＲＩをさらに含む。
【００５６】
この場合、本発明のベクターの複製が可能になる構造的な前提条件が提供される。
【００５７】
前記骨格は、唯一のコード配列または情報伝達配列として選択マーカーおよびＯＲＩを含むが、残りのランダム配列には、ＯＲＦ、プロモーター、ＲＥＲＳのいずれも含まないことが好ましい。
【００５８】
前記ベクター骨格に含まれるヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号８に記載されている。
【００５９】
好ましい一実施形態において、本発明の核酸ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００６０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の血清型として、現在までに複数の血清型が同定されており、これには、ヒトの１２の血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２）ならびに非ヒト霊長動物の１００を超える血清型が含まれる（Ｈｏｗａｒｔｈら，Ｕｓｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｓ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏｏｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２６：１−１０（２０１０））。前記ＡＡＶベクターの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）またはカプシド配列の血清型は、任意の公知のヒトまたは非ヒト動物のＡＡＶ血清型から選択されるものであってよい。いくつかの実施形態において、あるＩＴＲ血清型のゲノムが別の血清型のカプシドにパッケージングされるというシュードタイピング法が用いられる。例えば、Ｚｏｌｕｔｕｈｋｉｎら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  １，２，ａｎｄ  ５  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８（２）：１５８−６７（２００２）を参照されたい。
【００６１】
任意の種類のＡＡＶを用いることが可能であるが、前記ＡＡＶベクターのＡＡＶカプシド配列および／または逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の血清型が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびこれらの組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。
【００６２】
本発明者らは、ＡＡＶ２サブタイプ、ＡＡＶ５サブタイプおよびＡＡＶ８サブタイプが、本発明の核酸ベクターの作製に特に適していることを見出した。
【００６３】
本発明の組換えＡＡＶベクターの製造、精製および特性解析は、当技術分野で公知の様々な方法のうちいずれの方法を用いて行ってもよい。実験室規模の製造方法については、以下の文献を参照されたい：例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．６１ｓ：９−１５（２００２）；Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．２５．１−１６．２５．２４（２００７）；Ｇｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：１１９−１４５（２００５）；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ  ａｎｄ  Ｗｅｇｅｒ，Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｉｎ  Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｋｏｒｔｉｎｇ（Ｅｄ．），Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９７：１４３−１７０（２０１０）；およびＨｏｗａｒｔｈら（上記引用文献）。なお、後述の製造方法は、例示を目的とするものであり本発明を限定するものではない。
【００６４】
本発明の別の主題は、先に詳述したような核酸ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤に関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸ベクターの特徴、利点および特性は、本発明の医薬製剤にも適用される。
【００６５】
薬学的に許容される担体は、当技術分野で公知である。例として、Ｒｏｗｅ（Ｅｄ．）（２０１２），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓを参照する。本発明の医薬製剤は、添加剤をさらに含んでいてもよい。添加剤としては、本発明の核酸ベクターの効果に有利な任意の化合物または組成物が挙げられ、例えば、塩類、結合剤、溶媒、分散剤、補助剤および遺伝子治療法に関連して一般に用いられるその他の物質などが挙げられる。
【００６６】
本発明の医薬製剤の一実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、塩類溶液、好ましくは滅菌平衡塩類溶液を含み、任意選択で界面活性剤、好ましくは粉末ポロキサマー（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）  Ｐ  １８８  ｍｉｃｒｏ）をさらに含んでいてもよい。
【００６７】
本発明者らは、このような特定の製剤を用いることによって、薬物による悪影響および表面のｒＡＡＶ粒子の損失が最小限に抑えられることを見出した。
【００６８】
好ましい一実施形態において、本発明の医薬製剤は、網膜変性をもたらす遺伝子変異、遺伝子置換または遺伝子欠失を伴う疾患、好ましくは遺伝性網膜ジストロフィー、さらに好ましくは網膜色素変性（ＲＰ）、非常に好ましくはＲＰ４３型（ＲＰ４３）の治療に使用するために構成されたものである。
【００６９】
本発明者らは、先に詳述した本発明のポリヌクレオチドおよび核酸ベクターにより、ＰＤＥ６Ａ関連ＲＰの原因療法を初めて可能にする治療ツールを提供する。
【００７０】
本発明の別の主題は、（ａ）本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明の核酸および／または本発明の医薬製剤と、（ｂ）これらを使用するための取扱説明書とを含むキットに関する。
【００７１】
本発明のさらなる主題は、本発明のポリヌクレオチドをアデノ随伴ウイルスベクターに挿入することを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する方法に関し、前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、好ましくは本発明の核酸ベクターである。
【００７２】
本発明の別の主題は、網膜変性をもたらす遺伝子変異、遺伝子置換または遺伝子欠失を伴う疾患を治療する方法であって、このような治療を必要とする対象に本発明の核酸ベクターおよび／または本発明の医薬製剤を投与し、それによって前記対象を治療することを含む方法である。前記疾患は、好ましくは遺伝性網膜ジストロフィーであり、さらに好ましくは網膜色素変性（ＲＰ）であり、非常に好ましくはＲＰ４３型（ＲＰ４３）である。前記ベクターは、好ましくは網膜下および／または硝子体内に投与される。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸ベクターの特徴、利点および特性は、本発明のキット、作製方法および治療方法にも適用される。
【００７４】
上述した特徴および以下に述べる特徴が、個々の事例で示した組み合わせだけでなく、本発明の範囲から逸脱しない限りは、他の組み合わせまたは単独でも使用可能であることは理解されるであろう。
【００７５】
以下に、実施形態により本発明についてさらに説明する。これにより、本発明のさらなる特徴、特性および利点が明らかになるであろう。以下の実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。特定の実施形態で述べられる特徴は、本発明の全体としての特徴であり、それぞれの特定の実施形態でのみ適用されるものではなく、本発明の任意の実施形態でも単独で適用されうるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
以下、本発明について、下記の図面および非限定的な実施例を参照することより、さらに詳細に記載し、説明する。
【図１】ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターゲノムの構造を示した図である。
【図２】ｐｈＲＨＯ．ｈＰＤＥ６Ａ．ＷＰＲＥｍシスベクタープラスミドマップの２つの実施形態を示した図である。
【図３】片眼を本発明のベクターで処置したＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異マウスの代表的なＥＲＧ測定結果である。
【図４】本発明のベクターで処置したＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異マウスにおけるｈＰＤＥ６Ａ免疫組織染色の代表的な共焦点画像である。
【実施例】
【００７７】
１．本発明の核酸ベクター
この例示的な実施形態において使用するｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターは、桿体光受容体ｃＧＭＰホスホジエステラーゼのヒトｈＰＤＥ６ＡサブユニットのｃＤＮＡを有する、ＡＡＶをベースとしたハイブリッドベクターである。ｈＰＤＥ６Ａ  ｃＤＮＡの発現は、桿体特異的なロドプシン（ｈＲＨＯ）プロモーターで制御されており、変異ヤマネズミ口内炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列により増強されている。このベクターに含まれる発現カセットは、ＡＡＶ血清型２型逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）で挟まれており、組換えゲノムは、ＡＡＶ血清型８型カプシドにパッケージングされる。この発現カセットは、以下のエレメントを含む。
−ヒトロドプシン遺伝子プロモーター：０．８ｋｂ
−桿体光受容体ｃＧＭＰホスホジエステラーゼのヒトＰＤＥ６ＡサブユニットのｃＤＮＡ：２．５８ｋｂ
−ＷＨＶ−ＸのオープンリーディングフレームのＡＴＧコドンに点突然変異を有するヤマネズミ口内炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）：０．５４ｋｂ
−ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル：０．２ｋｂ
−ＡＡＶ血清型２型逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）：０．１３ｋｂ
ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターゲノムの構造を図１に示す。
【００７８】
２．ｐｈＲＨＯ．ｈＰＤＥ６Ａ．ＷＰＲＥｍシスベクタープラスミド
例示的な一実施形態において、８０６ｂｐの桿体光受容体特異的なヒトロドプシン（ｈＲＨＯ）プロモーター［Ａｌｌｏｃｃａら，Ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１（２００７）１１３７２−１１３８０を参照］と、全長（２５７９ｂｐ）ヒトＰＤＥ６Ａ  ｃＤＮＡとを含む発現カセットを含むｐｈＲＨＯ．ｈＰＤＥ６Ａ．ＷＰＲＥｍシスベクタープラスミド骨格を用いる。またこの発現カセットは、変異ＷＸＦオープンリーディングフレームを有する５４３ｂｐのヤマネズミ肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）［Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆら，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｔｅｄ  ＰＲＥ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ａｎｄ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｈｉｌｅ  ａｂｒｏｇａｔｉｎｇ  ＷＨＶ−Ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＷＡＳ，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，１６（２００９），６０５−６１９］および２０７ｂｐのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ  ｐＡ）も含む。配列番号８で示されるヌクレオチド配列を有する５５９１ｂｐのベクター骨格にはカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）が含まれており、ＫａｎＲは、Ｌ−ＩＴＲから１９４３ｂｐ、Ｒ−ＩＴＲから２８５３ｂｐかつｐＵＣ１８  ｏｒｉから２０２４ｂｐの位置に存在する。
【００７９】
ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターは、このシスベクタープラスミドとトランスｐＤＰ８−ＫａｎＲヘルパ−プラスミドの両方をヒト胎児腎臓細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）に一過的にトランスフェクションすることにより作製される。細胞溶解液を低速で遠心分離して清澄化し、次いで、塩化セシウム勾配超遠心分離を連続して２回行うことによりベクターを精製し、タンジェンシャルフローろ過工程に供して、濃縮およびバッファー交換を行う。次いで、得られたｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクター懸濁液を滅菌ろ過し、製剤としてバイアルに充填する。
【００８０】
ｐｈＲＨＯ．ｈＰＤＥ６Ａ．ＷＰＲＥｍシスベクタープラスミドマップの２つの実施形態を図２Ａおよび図２Ｂに示す。
【００８１】
３．ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａによりもたらされる生物活性および導入遺伝子発現
本発明者らは、２週齢ＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異マウス［Ｓａｋａｍｏｔｏら，Ｎｅｗ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｄｅ６ａ  ｇｅｎｅ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１８（２００９）１７８−１９２を参照］の網膜下腔にｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターを送達し、生物活性および導入遺伝子発現の有無を確認した。送達方法は、Ｍｉｃｈａｌａｋｉｓら，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｅ  ｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＧＡ３−／−  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｃｏｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８  ２０５７−２０６３（２０１０）に記載の方法と同様である。マウスの処置眼（ＴＥ）には網膜下注射を行い、他方の非処置眼（ＵＥ）を対照とした。ベクターの有効性は、注射３週間後に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける客観的な機能評価法である網膜電図検査（ＥＲＧ）により評価した。ＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異マウスは、正常な桿体光受容機能を喪失している。桿体に続いて、影響を受けていなかった錐体光受容体も変性し、病末期には錐体機能まで失われる。したがって、桿体機能および錐体機能の評価に特化したＥＲＧプロトコールは、ＰＤＥ６Ａ機能の間接的指標として、またｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターの生物活性（ＢＡＡ）を評価する上でも好適である。
【００８２】
代表的な結果については、図３を参照されたい。処置眼と非処置眼との間で特定のＥＲＧ成分の振幅において明確な左右差が見られたことから、ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターで処置することにより、処置眼で明らかに治療効果が得られたことが分かる。ＥＲＧ測定終了後、マウスを屠殺し、両眼を摘出してｈＰＤＥ６Ａ導入遺伝子の発現を免疫組織学的に解析（導入遺伝子発現アッセイ、ＴＥＡ）するための処理を行った。この処理として、摘出した組織を固定して凍結包埋した。垂直凍結切片を、ヒトＰＤＥ６Ａタンパク質のウサギポリクローナル抗体（抗ＰＤＥ６Ａ、＃ＮＢＰ１−８７３１２、Ｎｏｖｕｓ社、リトルトン、コロラド州）で染色した。免疫シグナルを、Ａｌｅｘａ  ４８８標識ロバ抗ウサギＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。免疫染色した凍結切片の共焦点画像を、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８  ＳＭＤ共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて収集した。この抗ＰＤＥ６Ａ抗体により、マウスＰｄｅ６ａタンパク質も検出されるため、野生型マウスの網膜の桿体光受容体外節では特異的なシグナルが認められるが、Ｐｄｅ６ａ欠損（ＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異）の網膜ではシグナルは認められない。ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターで処置した後、処置眼の桿体光受容体では、ＰＤＥ６Ａに対する明確で特異的なシグナルが認められたが、非処置眼では認められなかった（図４を参照）。また、網膜の凍結切片を核染色色素であるＨｏｅｃｈｓｔ  ３４４２で染色した結果から、処置眼では、非処置眼と比べて、網膜の外顆粒層が実質的に保存されており、網膜変性に対して上記処置を行うことは、有益な効果があることが明らかになった。
【００８３】
代表的な結果については、図４に示すｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターで処置したＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異マウスにおけるｈＰＤＥ６Ａの免疫組織染色（薄灰色）の代表的な共焦点画像を参照されたい。この抗体（抗ＰＤＥ６Ａ、作業希釈率はすべての実験において１：５００）により、マウスＰＤＥ６Ａタンパク質も検出されるため、野生型マウスの網膜（Ａ、上段パネル）の桿体光受容体外節（写真上部の強く染色されている構造）では特異的なシグナルが認められるが、非処置のＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異マウスの網膜（Ｂ、下段パネル）では特異的なシグナルは認められない。Ｂの上段パネルにおいて、ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６ＡベクターでコードされるｈＰＤＥ６Ａタンパク質に対する特異的なシグナルが認められる。Ａの下段パネルは、二次抗体のみで染色した対照染色の結果である。網膜の横断切片をＨｏｅｃｈｓｔ  ３４４２色素でも染色し、網膜の細胞核（灰色シグナル）を可視化した。ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６ＡによるｈＰＤＥ６Ａの発現により、ＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異網膜における桿体光受容体の変性の進行が明らかに抑制されている。Ｂの上段（処置眼）と下段（非処置眼）との外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを比較されたい。
【００８４】
以上より、ｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａベクターは、ＰＤＥ６Ａ  Ｄ６７０Ｇ変異マウスの桿体光受容体において効率的かつ特異的にｈＰＤＥ６Ａ導入遺伝子を発現し、それによって処置領域における光受容体の変性の進行を実質的に抑制すると結論付けることができる。重要なことに、この桿体の生存延長により、「バイスタンダー効果」、すなわち桿体が失われた領域全体で原疾患とは無関係な錐体まで失われるような現象が回避される。また、生物活性データから、このマウスにおいて錐体を介する視力が長期に保持されていることが分かる。この結果は、各種形態のヒト網膜色素変性に上記処置を適用する上で特に重要である。
【００８５】
４．非ヒト霊長動物における網膜下注射後のＡＡＶ８の体内分布および排出
別の試験として、２１匹のカニクイザルを３群に分けて、網膜下注射（高用量：１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）、低用量：１×１０１１ｖｇおよび溶媒のみ）を行った。臨床グレードの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を非ヒト霊長動物の網膜下に単回投与した後のウイルスの分布と排出を調べた。この検討事項は、本発明の遺伝子治療法の環境リスク評価にとって重要である。
【００８６】
剖検時（９１日後）に、処置眼、流入領域リンパ節、唾液腺および脾臓、視神経、脳および脊髄、心臓、肺、肝臓、副腎および生殖腺からそれぞれ組織サンプルを採取した。また、ベクター投与前、ベクター投与から１日後、２日後、３日後、１週間後、４週間後および１３週間後に各動物から血液、尿、涙液および鼻腔液を綿棒で採取し、ＤＮＡ抽出およびｑＰＣＲによるベクターゲノムの定量を行った。
【００８７】
処置した網膜において、ｒＡＡＶ  ＤＮＡが用量依存的に検出された。また、低用量群の２匹の動物および高用量群の３匹の動物の視神経で、定量可能レベルのｒＡＡＶ  ＤＮＡが検出された。さらに、鼻腔液、涙液および尿において、ｒＡＡＶ  ＤＮＡの一過性の排出が認められた。生殖細胞系の組織では、ｒＡＡＶ  ＤＮＡは検出されず、ごく少数の個体のリンパ節および脾臓で散発的なシグナルが検出されたものの、その他の組織では、不検出または定量下限未満レベルであった。血液サンプルでは、すべての測定時点で不検出または定量下限未満レベルであった。
【００８８】
これらのデータは、本発明の臨床実施に関わるデータである。臨床実施に関わる被験者、治験責任医師および規制当局関係者は皆一様に、遺伝子組換え生物の使用に伴う環境リスクを確認することに関心を持っている。体液へのウイルス排出は、用量依存的に生じるようだが、標的外臓器への形質導入はごくわずかであると思われる。
【００８９】
５．非ヒト霊長動物の網膜下に投与したＡＡＶ８に対する体液性免疫反応
臨床グレードの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を非ヒト霊長動物の網膜下に単回投与した際の体液性免疫反応について情報を得ることは、本発明による網膜の遺伝子治療の安全かつ効率的な臨床試験プロトコールの開発において重要な要素である。このため、本発明者らは、ｒＡＡＶ８シュードタイピングウイルスを非ヒト霊長動物（Ｍａｃａｃｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の網膜下に単回投与し、該動物における抗薬物抗体（ＡＤＡ）の力価を調べた。
【００９０】
２１匹のサルを３群に分けて、網膜下注射（高用量：１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）、低用量：１×１０１１ｖｇおよび溶媒のみ）を行い、これと併用して臨床試験シナリオと同等の免疫抑制療法も行った。ベースラインサンプルと、ベクター投与から１日後、２日後、３日後、１週間後、４週間後および１３週間後に採取したサンプルとを比較した。
【００９１】
この試験により、ｈＰＤＥ６Ａ導入遺伝子の網膜下送達にｒＡＡＶ８の使用を想定している本発明の臨床適用に関わるデータが得られる。臨床グレードベクターおよび外科手術と、免疫抑制療法とを併用する臨床シナリオの模擬実施において、非ヒト霊長動物における抗薬物抗体の誘導は確認されなかった。
【００９２】
６．毒性
毒性の評価は、臨床所見、体重、眼底検査、スリットランプ（ＳＬＯ）検査、肉眼検査、眼底撮影、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）−（インドシアニングリーン血管造影および蛍光血管造影（ＦＡ）を含む）、眼圧（ＩＯＰ）、網膜電図検査（ＥＲＧ）ならびに臓器重量の評価、ならびに肉眼的評価および微視的評価に基づいて行った。
【００９３】
試験製剤に関連する死亡や臨床所見はいずれも認められなかった。
【００９４】
また、体重、ＥＣＧ、血圧、臨床病理、尿検査、免疫グロブリン評価のいずれにおいても有害所見や試験製剤に関連する所見は認められなかった。
【００９５】
眼に関連する評価を行った際に、試験製剤に関連する変化は認められなかった。ＩＯＰ（一過性の上昇）、ＥＲＧ（潜時の延長）、ＯＣＴ（光受容体外節の短縮）、ＳＬＯ（網膜色素上皮（ＲＰＥ）の凝集、ＲＰＥまたは脈絡膜の萎縮、ＦＬＡにおける滲出）ならびに眼底検査（色素増加および色素脱失）の所見は、対照群のサルにも認められたことから、試験方法に関連するものであると考えられる。
【００９６】
網膜外層（光受容体外節（ＰＯＳ））において、試験方法に関連する（すなわち、網膜下注射が原因の）軽微な構造的変化が認められた。この変化は、リサイクル／再生（１日あたり１０％）が常時行われている構造体であるＰＯＳの短縮であった。ＰＯＳは、網膜下手術により、術後最長で６ヶ月間短縮した状態になることが知られている（Ｓｃｈａｆｆｅｒら、１９９３）。
【００９７】
臓器重量および肉眼的観察に関する所見は認められなかった。
【００９８】
以上より、網膜下投与したｒＡＡＶ．ｈＰＤＥ６Ａは、雄性および雌性のカニクイザルにおいて、最大の試験用量である１×１０１２ｖｇまで良好な忍容性を示すと結論付けることができる。試験製剤に関連する唯一の変化は、網膜に生じた一過性の軽微な血管周囲炎であったが、これはｒＡＡＶベクターに関連している可能性が高いと考えられる。対照群を含むすべての群において、ＲＰＥで軽微な障害が認められたが、これは、試験方法に関連するものであると考えられる。
【００９９】
７．核酸配列
以下のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は添付の配列表に記載されている。
ｈＲＨＯプロモーターヌクレオチド配列：配列番号１
ｈＰＤＥ６Ａヌクレオチド配列：配列番号２
ｈＰＤＥ６Ａアミノ酸配列：配列番号３
ＷＰＲＥｍヌクレオチド配列：配列番号４
ＢＧＨ  ｐＡヌクレオチド配列：配列番号５
Ｌ−ＩＴＲヌクレオチド配列：配列番号６
Ｒ−ＩＴＲヌクレオチド配列：配列番号７
ｐＧＬ２．ＫａｎＲベクター骨格ヌクレオチド配列：配列番号８
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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