(57)【要約】本発明は、新規免疫刺激ペプチド、ペプチドコンストラクトおよび組成物を提供する。さらに、本発明は、ペプチド、ペプチドコンストラクトおよび組成物を利用する治療方法を提供する。
2019528071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＧＬＳＩＬＬＮＥＥＣ（配列番号１）の配列変異体からなる、または含むペプチドであって、配列変異体は配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、かつペプチドが、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激されたＴＨＰ−１細胞またはＰＢＭＣに有効濃度で供給されると、サイトカインの分泌および／または発現を刺激する、ペプチド。
【請求項２】
Ｃ末端カルボキシル基が改変されている、好ましくはアミド化により改変されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
中性ｐＨでのペプチドの実効電荷がアミノ酸配列配列番号１を有するペプチドの実効電荷と比較して増加している、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸変化が置換、欠失、および挿入から独立して選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列変異体が、配列番号１の１５−１７位において１、２、または３アミノ酸変化を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
アミノ酸変化が残基１５および１６の１つまたは両方の欠失または残基１７の欠失などの残基１５−１７の１以上の欠失である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
配列変異体が配列番号１の４位におけるアミノ酸変化を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
４位のアミノ酸変化が置換である、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
４位におけるアミノ酸変化が、配列番号１と比較してペプチドの中性ｐＨでの電荷を増加させるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
配列番号１における４位がリジン残基で置換されている、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列変異体が配列番号１の５位におけるアミノ酸変化を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
５位のアミノ酸変化が置換である、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
５位におけるアミノ酸変化が、配列番号１と比較してペプチドの中性ｐＨでの電荷を増加させるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基での置換からのアミノ酸残基での置換である、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号１における５位がリジン残基で置換されている、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
以下の式Ｉを有する先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチド；
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｘ１Ｘ２Ｚ４Ｚ５ＧＬＳＩＬＬＮＸ３Ｘ４Ｘ５（Ｉ）（配列番号８）
ここで、
Ｚ１がＬである、または存在しない、
Ｚ２がＱである、または存在しない、
Ｚ３がＮである、または存在しない、
Ｚ４，がＧである、または存在しない、
Ｚ５がＬである、または存在しない、
Ｘ１がＲまたはＫである、または存在しない、
Ｘ２がＲまたはＫである、または存在しない、
Ｘ３がＥである、または存在しない、
Ｘ４がＥである、または存在しない、かつ
Ｘ５がＣである、または存在しない、
ただし、式Ｉは配列番号１のアミノ酸配列を有しない。
【請求項１６】
請求項１５に記載のペプチドであって、ここで
−Ｚ１が存在するならば、Ｚ２−Ｚ５、Ｘ１、およびＸ２が全て存在する；
−Ｚ２が存在するならば、Ｚ３−Ｚ５、Ｘ１、およびＸ２が全て存在する；
−Ｚ３が存在するならば、Ｚ４およびＺ５、Ｘ１、およびＸ２が全て存在する；
−Ｚ４が存在するならば、Ｚ５、Ｘ１、およびＸ２が全て存在する；
−Ｘ１が存在するならば、Ｘ２が存在する、ペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のペプチドであって、
−Ｚ１が存在しない、または
−Ｚ２が存在しない、または
−Ｚ３が存在しない、または
−Ｚ４が存在しない、または
−Ｚ５が存在しない、または
−Ｘ１が存在しない、または
−Ｘ２が存在しない、ペプチド。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のペプチドであって、
−Ｚ１が存在し、または
−Ｚ２が存在し、または
−Ｚ３が存在し、または
−Ｚ４が存在し、または
−Ｚ５が存在し、または
−Ｘ１が存在し、または
−Ｘ２が存在する、ペプチド。
【請求項１９】
請求項１５−１８のいずれか一項に記載のペプチドであって、
−Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５が全て存在する、または
−Ｘ３およびＸ４の一方のみが存在し、かつＸ５が存在し、または
−Ｘ５のみが存在し、または
−Ｘ３−Ｘ５のいずれも存在しない、ペプチド。
【請求項２０】
配列番号２−７および９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２１】
先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチドおよび少なくとも１つのさらなるペプチドを含むペプチドコンストラクトであって、前記ペプチドおよび前記少なくとも１つのさらなるペプチドが、互いに融合しているかまたはペプチドコンストラクトにおける少なくとも１つのペプチドにおける側鎖を介して共有結合している、ここで、さらなるペプチドが以下からなる群から選択される
−先行する請求項のいずれか一項に記載の同一のペプチド
−先行する請求項のいずれか一項に記載の非同一ペプチド
−先行する請求項のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも４連続アミノ酸残基のフラグメント、および
−配列（ＧＰ）ｎ、ここでｎは整数＞０であり、かつ好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される。
【請求項２２】
請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体などの多量体の形態である、請求項２１に記載のペプチドコンストラクト。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載のペプチドコンストラクトであって、ペプチドおよび少なくとも１つのさらなるペプチドが、ペプチドコンストラクトにおける少なくとも１つのペプチドにおける側鎖を介して共有結合しており、結合がジスルフィド架橋、グリシンリンカー、リジンリンカー、グリシン−リジンリンカー、システイン−リジンリンカー、Ａｒｇリンカー、およびビス−マレイミドリンカーからなる群から選択される、ペプチドコンストラクト。
【請求項２４】
請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクトを含むコンジュゲート分子であって、前記ペプチドまたはペプチドコンストラクトが異種のペプチドまたはポリペプチド、脂質、または炭水化物などの異種分子にコンジュゲートされている、コンジュゲート分子。
【請求項２５】
異種分子が：ホルモンまたはその活性フラグメント、サイトカインまたはその活性フラグメント、免疫原性タンパク質またはペプチド、免疫性担体、免疫療法薬、癌化学療法薬、走化性物質、抗体またはその特異的結合フラグメント、受容体についてのリガンド、受容体もしくはそのリガンド結合フラグメント、およびＴＣＲ−結合ペプチドからなる群から選択される、請求項２４に記載のコンジュゲート分子。
【請求項２６】
ペプチドまたはペプチドコンストラクトが、Ｎ−またはＣ末端（ポリ）ペプチド融合体を介して、リンカーを介してまたは化学的コンジュゲーションにより異種のペプチドまたはポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項２４または２５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項２７】
リンカーが請求項２３に記載されているものであり、および／または化学的コンジュゲーションがホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドなどの架橋結合剤を使用するコンジュゲーションである、請求項２６に記載のコンジュゲート分子。
【請求項２８】
請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクト、または請求項２４−２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子を含む医薬組成物であって、前記組成物が薬学的に許容可能な担体、希釈液または賦形剤をさらに含む、組成物。
【請求項２９】
免疫原、抗原、抗体、抗体フラグメント、抗体アナログ、モノクローナル抗体、化学療法剤、免疫刺激化合物、ホルモン、および免疫チェックポイント阻害剤からなる群から選択される活性成分をさらに含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
医薬としての使用のための、請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクト、請求項２４−２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、または請求項２８−２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記使用が対象における免疫原に対する特異的な適応免疫応答を高める、刺激するまたは誘発するための予防的または治療的処置方法であり、前記方法が前記予防的または治療的処置を必要とする対象に予防的または治療的に活性な量の前記ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子もしくは医薬組成物ならびに前記免疫原を同時投与することを含む、請求項３０に記載の使用のためのペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物。
【請求項３２】
ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子が免疫アジュバントとして作用する、好ましくはワクチン中で作用する、請求項３１に記載の使用のためのペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物。
【請求項３３】
前記使用が対象における癌の化学療法的または免疫療法的処置であり、前記方法が前記予防的または治療的処置を必要とする対象に治療有効量の前記ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物および化学療法剤および／または免疫療法剤を同時投与することを含む、請求項３０に記載の使用のためのペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の使用のためのペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、または医薬組成物であって、化学療法剤が
−アルキル化剤、好ましくは以下からなる群から選択される：シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、およびメルファランなどの二機能性アルキル化剤、ならびにダカルバジン（ｄｔｉｃ）、ニトロソウレア化合物、およびテモゾロミド（経口ダカルバジン）などの単機能性アルキル化剤；
−アントラサイクリン、好ましくは以下からなる群から選択される：ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン；
−細胞骨格ディスラプター（タキサン）、好ましくは以下からなる群から選択される：パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、およびタキソテール；
−エポチロン、好ましくは以下からなる群から選択される：エポチロンｂ、パツピロン、サゴピロン、イクサベピロン、およびウチデロン；
−ヒストン脱アセチル化酵素（ｄｅａｃｙｔｅｌａｓｅ）阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：ボリノスタットおよびロミデプシン；
−トポイソメラーゼＩ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：イリノテカンおよびトポテカン；
−トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：エトポシド、テニポシド、およびタフルポシド；
−キナーゼ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、およびビスモデギブ、
−ヌクレオチドまたは前駆物質アナログ、好ましくは以下からなる群から選択される：アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、およびチオグアニン；
−ペプチド抗生物質、好ましくは以下からなる群から選択される：ブレオマイシンおよびアクチノマイシン；
−白金系薬剤、好ましくは以下からなる群から選択される：カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン；
−レチノイド、好ましくは以下からなる群から選択される：トレチノイン、アリトレチノイン、およびベキサロテン；および
−ビンカアルカロイド、好ましくは以下からなる群から選択される：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン
からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項３５】
免疫療法剤が：
−ＰＤ−１阻害剤、好ましくは以下から選択される：ペンブロリズマブおよびニボルマブ；
−ＰＤ−Ｌ１阻害剤、好ましくは以下から選択される：アテゾリズマブおよびアベルマブ；および
−抗ＣＴＬＡ−４化合物、好ましくはイピリムマブからなる群から選択される、請求項３３に記載の使用のためのペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、または医薬組成物。
【請求項３６】
前記使用が対象における自然免疫応答などの免疫応答を高める、刺激するまたは誘発するための予防的または治療的処置方法であり、前記方法が前記予防的または治療的処置を必要とする対象に前記ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物を投与することを含む、請求項３０に記載の使用のためのペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物。
【請求項３７】
前記使用がウイルス、細菌、真菌、または単細胞もしくは多細胞寄生虫による感染の治療のための治療上の抗生物質処置方法であり、前記方法が前記治療的処置を必要とする対象に前記ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子もしくは医薬組成物ならびに前記抗生物質を同時投与することを含む、請求項３０に記載の使用のためのペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクト、または請求項２４−２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子をコードする核酸。
【請求項３９】
ベクター、好ましくは発現ベクターに含まれる、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
医薬としての使用のための請求項３８または３９に記載の核酸。
【請求項４１】
医薬が免疫原の免疫原性を高めるためのものである、または自然免疫などの免疫を刺激するために使用される、または癌免疫療法または癌化学療法の効果を高めるために使用される、請求項４０に記載の使用のための核酸。
【請求項４２】
疾病の予防的または治療的処置のための方法であって、前記治療が、それを必要とする対象における免疫原に対する特異的な適応免疫応答を高める、刺激するまたは誘発するために予防的または治療的に活性な量の
−請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクト、請求項２４−２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、または請求項２８−２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、ならびに
−免疫原
の同時投与を含む、方法。
【請求項４３】
免疫原に特異的に結合する抗体の製造方法であって、該方法が前記動物における前記免疫原に特異的な抗体の産生をもたらすため、免疫原性的に活性な量の以下のものを動物に同時投与することを含み
−請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクト、請求項２４−２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、または請求項２８−２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、および
−免疫原、
そしてその後前記動物から前記抗体を回収する、方法。
【請求項４４】
同時投与がペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、または医薬組成物と１つの医薬組成物の一部としてまたはペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、もしくは医薬組成物が免疫原に対する免疫応答を高めることを可能にする時間間隔内で投与される別個の組成物の一部としてのいずれかの免疫原を投与することにより達成される、請求項４２または４３に記載
【請求項４５】
ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、または医薬組成物が免疫アジュバントとして作用する、請求項４２−４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
それを必要とする対象における癌の治療的または予防的処置方法であって、該方法が治療的または予防的有効量の
−請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクト、請求項２４−２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、または請求項２８−２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、および
−化学療法剤および／または免疫療法剤を
対象に同時投与することを含む、方法。
【請求項４７】
化学療法剤が：
−アルキル化剤、好ましくは以下からなる群から選択される：シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、およびメルファランなどの二機能性アルキル化剤、ならびにダカルバジン（ｄｔｉｃ）、ニトロソウレア化合物、およびテモゾロミド（経口ダカルバジン）などの単機能性アルキル化剤；
−アントラサイクリン、好ましくは以下からなる群から選択される：ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン；
−細胞骨格ディスラプター（タキサン）、好ましくは以下からなる群から選択される：パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、およびタキソテール；
−エポチロン、好ましくは以下からなる群から選択される：エポチロンｂ、パツピロン、サゴピロン、イクサベピロン、およびウチデロン；
−ヒストン脱アセチル化酵素（ｄｅａｃｙｔｅｌａｓｅ）阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：ボリノスタットおよびロミデプシン；
−トポイソメラーゼＩ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：イリノテカンおよびトポテカン；
−トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：エトポシド、テニポシド、およびタフルポシド；
−キナーゼ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、およびビスモデギブ、
−ヌクレオチドまたは前駆物質アナログ、好ましくは以下からなる群から選択される：アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、およびチオグアニン；
−ペプチド抗生物質、好ましくは以下からなる群から選択される：ブレオマイシンおよびアクチノマイシン；
−白金系薬剤、好ましくは以下からなる群から選択される：カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン；
−レチノイド、好ましくは以下からなる群から選択される：トレチノイン、アリトレチノイン、およびベキサロテン；および
−ビンカアルカロイド、好ましくは以下からなる群から選択される：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン
からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
免疫療法剤が、
−ＰＤ−１阻害剤、好ましくは以下から選択される：ペンブロリズマブおよびニボルマブ；
−ＰＤ−Ｌ１阻害剤、好ましくは以下から選択される：アテゾリズマブおよびアベルマブ；および
−抗ＣＴＬＡ−４化合物、好ましくはイピリムマブからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
それを必要とする対象における免疫応答（自然免疫応答など）を高める、刺激するまたは誘発するための予防的または治療的処置方法であって、該方法が、治療的に活性な量の、請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクト、請求項２４−２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、または請求項２８−２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
かかる治療を必要とする対象における微生物病原体またはウイルス病原体による感染の治療方法であって、該方法が、治療的に活性な量の
−請求項１−２０のいずれか一項に記載のペプチド、請求項２１−２３のいずれか一項に記載のペプチドコンストラクト、請求項２４−２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、または請求項２８−２９のいずれか一項に記載の医薬組成物、および
−抗菌剤
を同時投与することを含む、方法。
【請求項５１】
感染がウイルス、細菌、真菌、または単細胞寄生虫または多細胞寄生虫による感染である、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答調節に関与する治療の分野に関する。特に、本発明は、免疫刺激効果を発揮するペプチド並びに当該ペプチドの治療的応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
レトロウイルスはＲＮＡゲノムを含有する一群のウイルスであり、感染するとＤＮＡコピーに逆転写され、次に宿主細胞のゲノムに組み込まれる。かかる感染細胞のすべての子孫はウイルスゲノム（プロウイルスと呼ばれる）を含有するだろう。すべてのレトロウイルスは、３つの遺伝子／コーディング配列：ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。
【０００３】
本発明は主にｅｎｖ遺伝子、その発現産物、そして特にＥＮＶタンパク質由来のペプチドに関する。
【０００４】
ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）はヒトのゲノムに恒久的に固定された古代のレトロウイルスのインテグレーションである。ウイルスプロテアーゼおよびエンベロープ表面タンパク質の存在を含む、ＨＥＲＶのほとんどのウイルス成分についての機能タンパク質の存在が証明されている。ＨＥＲＶ由来タンパク質は有意な生理学的可能性を示すように発展してきた可能性があり、例えば、ＨＥＲＶ由来エンベロープ糖タンパク質は胎盤組織において豊富に発現されており、その下にある細胞栄養芽層細胞層を融合することによって合胞体栄養芽層分化に関与することが提案されている。
【０００５】
一般にレトロウイルス感染症はＨＩＶ感染から知られているように有意な免疫抑制を引き起こし得る。また、いくつかのヒト内在性レトロウイルスは免疫抑制活性を示す。より正確には、ＨＥＲＶを含むいくつかのレトロウイルスのエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は免疫抑制活性を有することが示されている。
【０００６】
本出願人の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ２０１６／０５０３１６（ＷＯ２０１７／０５４８３１）には多くのＨＥＲＶ−Ｈ  Ｅｎｖ５９（「Ｅｎｖ５９」とも呼ばれる）由来のペプチドが開示されている。これらのペプチドは特に免疫抑制性であることが証明され、ペプチドおよびそれらの変異体は以前にＬＰＳ（リポ多糖）で刺激された細胞からのＩＬ−６などの炎症促進性サイトカインの分泌／発現を減少させる能力について試験されていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の対象
本発明の実施形態の目的は、疾病の治療および予防において有用な新規免疫刺激剤を提供することである。本発明の実施形態のさらなる目的は本発明の免疫刺激剤を利用する方法および組成物の提供である。
【０００８】
発明の概要
本発明者は、ＰＣＴ／ＤＫ２０１６／０５０３１６で研究されたＥｎｖ５９由来ペプチドのサブセットおよびペプチドコンストラクトが驚くべきことにＬＰＳ刺激ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）およびＬＰＳ刺激ＴＨＰ−１細胞（ヒト急性単球白血病細胞株の細胞）に対して免疫刺激効果を発揮することを発見した。この発見は、免疫アジュバント、一般的な免疫刺激剤、ワクチンアジュバントとして、またはエフェクター分子を含む免疫療法プロトコールにおいて、または癌免疫療法プロトコールにおけるアジュバントとして有用であってもよい新規免疫刺激剤を提供する可能性を開く。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、第一の態様では本発明は、アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＧＬＳＩＬＬＮＥＥＣ（配列番号１）の配列変異体を含む、またはからなるペプチドであって、配列変異体が配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を含み、かつペプチドが、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激されたＴＨＰ−１細胞またはＰＢＭＣに有効濃度で供給されると、サイトカインの分泌および／または発現を刺激する、ペプチドに関する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、本発明のペプチドおよび少なくとも１つのさらなるペプチドを含むペプチドコンストラクトであって、ペプチドおよび少なくとも１つのさらなるペプチドが、互いに融合しているかまたはペプチドコンストラクトにおける少なくとも１つのペプチドにおける側鎖を介して共有結合している、ここで、さらなるペプチドが以下からなる群から選択される
−本発明の同一のペプチド
−本発明の非同一ペプチド
−本発明のペプチドの少なくとも４連続アミノ酸残基のフラグメント、および
−配列（ＧＰ）ｎ、ここでｎは正の整数であり、かつ好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される、ペプチドコンストラクトに関する。
【００１１】
第三の態様では、本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドコンストラクトを含むコンジュゲート分子であって、前記ペプチドまたはペプチドコンストラクトが異種のペプチドまたはポリペプチド、脂質、または炭水化物などの異種分子にコンジュゲートされている、コンジュゲート分子に関する。
【００１２】
第四の態様では、本発明は、本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、またはコンジュゲート分子を含む医薬組成物であって、前記組成物が薬学的に許容可能な担体、希釈液または賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。
【００１３】
治療および／または予防に関するさらなる態様では、本発明は、多様な医学的使用のための本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子および医薬組成物に関する。これらの態様はまた、本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子および医薬組成物を利用する治療および予防方法を含む。
【００１４】
さらなる態様は、ペプチド、ペプチドコンストラクト、およびコンジュゲート分子（関連する場合）をコードする核酸、並びにこれらの核酸を含む組成物ならびにペプチド、ペプチドコンストラクトおよびコンジュゲート分子それ自体を利用する本発明の使用および方法と類似の方法での治療および予防における核酸の使用に関する。
【００１５】
最後に、本発明の態様はまた、免疫原を標的化する抗体の製造方法に関し、ここで、免疫原に対する免疫応答を高めるために本発明の多様な薬剤が使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１：ＩＬ−６タンパク質分泌の発現／分泌レベルに対するペプチドコンストラクトにより誘導された免疫調節機能。ＳＧ＃２３（図１Ａ）、ＳＧ＃２４（図１Ｂ）、ＳＧ＃２７（図１Ｃ）、ＳＧ＃２８（図１Ｄ）、ＳＧ＃４（図１Ｅ）、およびＳＧ＃２２（図１Ｆ）。
【図２】図２：多様な組成物で免疫したマウスにおける抗オボアルブミンＩｇＧ１ｐｇ／ｍｌのレベル。
【図３】図３：ＴＮＦ−アルファタンパク質分泌の発現／分泌レベルに対するペプチドコンストラクトにより誘導された免疫調節機能。ＳＧ＃４（図３Ａ）、ＳＧ＃２２（図３Ｂ）、ＳＧ＃２３（図３Ｃ）、ＳＧ＃２４（図３Ｄ）、およびＳＧ＃２８（図３Ｅ）。
【図４】図４：ＩＬ−１ベータタンパク質分泌の発現／分泌レベルに対するペプチドコンストラクトにより誘導された免疫調節機能ＳＧ＃４（図４Ａ）、ＳＧ＃２２（図４Ｂ）、ＳＧ＃２３（図４Ｃ）、ＳＧ＃２４（図４Ｄ）、およびＳＧ＃２８（図４Ｅ）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な開示
定義
以下の特定のペプチド／ペプチドコンストラクトは本明細書中の配列番号により参照される：
【表Ａ】
2019528071.tif 000003
＃）Ｅｎｖ５９からの野生型参照配列
＊）配列番号を有するペプチドの二量体として調製されたペプチド、下記参照
＊＊）配列番号を有するペプチドの二量体として調製されたペプチドペプチド、およびＣ末端においてアミド化されたペプチド、下記参照
＃＃）本発明の特定のペプチドの一般式。
【００１８】
本明細書中で使用されるように、「二量体」という表現は典型的には、本発明の２ペプチド間の末端間の融合体ペプチドまたは２つのペプチドの共有結合二量体の任意の形態のいずれかに関し、ここで、結合は２ペプチドの少なくとも１つにおける側鎖を含む。それゆえに、二量体は、「ホモ二量体」であってもよく、配列番号２の二量体および配列番号３の二量体の場合のように本発明の２つの同一のペプチドからなる；これらは本発明によれば以下の好ましい本発明の二量体について示されるようにジスルフィド架橋（すなわち２つの単量体のシステインから形成されるシスチン基）を介して好ましくは二量体化される：
【表Ｂ】
2019528071.tif 000004
【００１９】
また、二量体は、ヘテロ二量体、すなわち上述した二量体コンストラクトであるがヘテロ二量体における少なくとも１つのペプチドにおいて側鎖を含むリンカーを介して端々が融合されるまたは結合される本発明の２つの非同一ペプチドで構成されるコンストラクトであってもよい。
【００２０】
単量体がＣｙｓ残基を含有する場合、二量体、三量体および多量体の共有結合は典型的にはジスルフィド架橋を介するだろうが、本発明によれば代替物は利用可能である：例えば、リンカーは典型的にはグリシンリンカー、リジンリンカー、グリシン−リジンリンカー、システイン−リジンリンカー（典型的には１のペプチドにおける（２−オキソ−エチル）誘導体化システインおよび他のペプチドにおけるリジン間のアミド結合の形態で確立される）、Ａｒｇリンカー、およびビス−マレイミドリンカーからなる群から選択されるが、任意のリンカーが当技術分野において公知のペプチド鎖の共有結合が有用であり得る。したがって、システインが存在しない場合、本発明のペプチドは典型的には免疫刺激単量体または代わりにシステインのチオール基以外の他の官能基を介して結合している二量体、三量体および多量体としての使用を意図する。
【００２１】
二量体以外の他の多量体は本発明の実施形態であり−これらはホモ三量体またはホモ多量体などの三量体または他の多量体であってもよいが、またヘテロ三量体およびヘテロ多量体であってもよい。
【００２２】
本文脈では「ペプチド」はペプチド結合アミノ酸残基の鎖により構成される分子である。
【００２３】
本文脈では「ペプチドコンストラクト」は２以上の本発明のペプチドを含む分子または複合体である。これらは、端と端で結合（すなわち融合）していてもよいが、好ましくはペプチドコンストラクトはジスルフィドリンカーなどのリンカーを介してカップリングされる。詳細は以下を参照されたい。
【００２４】
「コンジュゲート分子」は本発明の文脈では本発明のペプチドまたはペプチドコンストラクトであり、別の異種分子にさらにカップリングしている。これらのさらなる分子に関する詳細は以下を参照されたい。
【００２５】
本発明のペプチドコンストラクトの文脈において「未改変の」という用語を使用する場合、本明細書では、考察されるペプチドは単量体であり、かつペプチド結合のみにより結合された天然に存在するアミノ酸残基により構成されることを意味する；言い換えると、未改変ペプチド（ＳＧ＃１３およびＳＧ＃２２など）は、Ｎ−またはＣ末端改変を含まず、かつ他のペプチドまたは化学エンティティに結合していない。
【００２６】
本発明の特定の実施形態
本発明の１ｓｔ態様ペプチド
本発明のペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列配列番号１に基づく、すなわち、それは配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む配列変異体であり、ここで当該ペプチドは、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激されたＴＨＰ−１細胞またはＰＢＭＣに有効濃度で供給されると、サイトカインの分泌および／または発現を刺激する。上述の通り、配列番号１を有するペプチドおよびそれに由来する分子が一般に免疫抑制剤であるということを考慮すると、現在開示されるペプチドが免疫刺激効果を発揮するということは非常に驚くべきことである。次に、これは、免疫応答の刺激が保証される／望ましい、臨床的状況における使用における使用のための医薬化合物またはアジュバントとして、現在開示されるペプチドを価値あるものにする。
【００２７】
本明細書中で本発明のペプチド「が、供給される場合に、サイトカインの分泌および／または発現を刺激する」と記載する場合は、ペプチドが、それが単離分子として供給される場合または本発明の二量体または多量体の一部としてＴＨＰ−１細胞またはＰＢＭＣに供給される場合のいずれかの場合にこの刺激効果を有することを意味する。言い換えると、本明細書に開示される単離ペプチドは、いくつかの場合において、例えば二量体、三量体または他の多量体の一部である場合免疫刺激機能を発揮できないように思われる場合がある。これは例えば本願において驚くべきことに実証されるようにそれ自体が免疫刺激性であるが、両方がＷＯ２０１７／０５４８３１で開示される以下の二量体コンストラクトなどの免疫抑制コンストラクトの一部である配列番号９を有するペプチドの場合である。
【表Ｃ】
2019528071.tif 000005
【００２８】
それ自体が免疫刺激性である配列番号４を有するペプチドなどの他のペプチドはまた、二量体コンストラクトＳＧ＃８およびＳＧ＃２８に存在する場合にも免疫刺激性である。
【００２９】
本発明のペプチドのすべての実施形態では、Ｃ末端カルボキシル基が改変されている、好ましくはアミド化により改変されている（すなわちＣ末端、ペプチドにおける負に荷電したカルボキシル基の除去に起因する本発明のコンストラクトの増加した安定性および正方向への電荷における変化を提供する）ことがあり得、かつ時には好ましいが、他の改変、特にペプチドの電荷をより少ない負にするまたはより多い正にするものもあり得る。一般に、本発明のペプチドの重要なサブグループの実効電荷は配列番号１を有するペプチドのものよりもより正である（より高い）と考えられ、本発明のペプチドにおいて、中性ｐＨでのペプチドの実効電荷はアミノ酸配列配列番号１を有するペプチドの実効電荷と比較して好ましくは増加することを意味する。しかしながら、本開示から明らかなように、ＳＧ＃２２ペプチド（配列番号９を有する）は配列番号１の参照ペプチドよりも低い実効電荷を有するが、それでも免疫刺激効果を提供する。
【００３０】
配列番号１を有するペプチドの実効電荷はｐＨ７で−０．１であり、ここで本明細書に具体的に開示されるペプチドおよびペプチドコンストラクトは、ｐＨ７で以下の電荷を有する：
【表Ｄ】
2019528071.tif 000006
【００３１】
そのため重要な実施形態では、配列番号１におけるアミノ酸変化は−配列番号１における位置を置換する場合に−中性ｐＨでより高い実効電荷を提供するアミノ酸残基を伴う。特に、配列番号１における各位置における好ましい置換基は、中性ｐＨで置換される残基よりもより高い実効電荷を提供するアミノ酸残基である。上記のように、負に荷電したカルボキシル基を除去するＣ末端改変の導入はこの効果に追加することができる。
【００３２】
本発明の多くの未改変の免疫刺激ペプチドのもう一つの重要な特徴は、配列番号１１（ＣＧＰＧＰＧＰ）および配列番号１２（ＧＰＧＰＧＰ）の非存在であり、典型的には水溶性を増加させるために導入され、かつ例えばＣ末端における配列番号３において見出され得る。配列番号１１／１２を含まない特定の未改変ペプチドが免疫刺激性であり、他方配列番号１１または１２を含む対応する二量体ペプチドが免疫抑制性であること−後者のペプチドコンストラクトは典型的には本明細書に開示されるように単量体形態で提示することにより免疫刺激性にされ得ることが本発明者らにより見出された。
【００３３】
本発明のペプチドのアミノ酸変化は、典型的には置換、欠失、および挿入から独立して選択される。
【００３４】
それゆえに、本発明の実施形態では、ペプチドは、配列番号１の１５−１７位において１、２、または３アミノ酸変化を有する配列変異体を含む。例えば、アミノ酸変化は、残基１５および１６の１つまたは両方の欠失、または残基１７の欠失などの残基１５−１７の１以上の欠失である。
【００３５】
また、上述のものを含む本発明のペプチドのいくつかは、配列変異体が配列番号１の４位におけるアミノ酸変化を含むものである。重要な実施形態では、４位のアミノ酸変化が置換である。当該置換アミノ酸は好ましくは−配列番号１に対する他の変化と共に−配列番号１の電荷と比較して全電荷の増加を提供するものであり、したがって４位の好ましい置換基は好ましくはＡｒｇのように正に荷電している。他の置換基はチアリジンおよびカナバニンなどの特定の非タンパク質性アミノ酸であろう。４位の好ましい置換基はリジン残基である。
【００３６】
また、上述のものを含む本発明のペプチドのいくつかは、配列変異体が配列番号１の５位におけるアミノ酸変化を含むものである。重要な実施形態では、５位のアミノ酸変化は置換である。当該置換アミノ酸は好ましくは−配列番号１に対する他の変化と共に−配列番号１の電荷と比較して全電荷の増加を提供するものであり、したがって５位の好ましい置換基は好ましくはアルギニンのように正に荷電している。他の置換基はチアリジンおよびカナバニンなどの特定の非タンパク質性アミノ酸であろう。５位の好ましい置換基はリジン残基である。また、多くのＮ末端アミノ酸は、欠失されてもよい。例えば、アミノ酸１−７は、配列番号１において欠失されてもよいがまた、アミノ酸１−６、１−５、１−４、１−３、１−２、または１は、欠失されてもよい。
【００３７】
本発明の好ましいペプチドは式Ｉを有する：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｘ１Ｘ２Ｚ４Ｚ５ＧＬＳＩＬＬＮＸ３Ｘ４Ｘ５        （Ｉ）
ここで
Ｚ１がＬである、または存在しない、
Ｚ２がＱである、または存在しない、
Ｚ３がＮである、または存在しない、
Ｚ４がＧである、または存在しない、
Ｚ５がＬである、または存在しない、
Ｘ１がＲまたはＫである、または存在しない、
Ｘ２がＲまたはＫである、または存在しない、
Ｘ３がＥである、または存在しない、
Ｘ４がＥである、または存在しない、かつ
Ｘ５がＣである、または存在しない、
ただし、式Ｉは配列番号１のアミノ酸配列を有しない。
【００３８】
本発明のペプチドのいくつかの実施形態では、式Ｉにおいて：
−Ｚ１が存在するならば、Ｚ２−Ｚ５、Ｘ１、およびＸ２が全て存在する；
−Ｚ２が存在するならば、Ｚ３−Ｚ５、Ｘ１、およびＸ２が全て存在する；
−Ｚ３が存在するならば、Ｚ４およびＺ５、Ｘ１、およびＸ２が全て存在する；
−Ｚ４が存在するならば、Ｚ５、Ｘ１、およびＸ２が全て存在する；
−Ｘ１が存在するならば、Ｘ２が存在する。
【００３９】
式Ｉのこれらの実施形態では、Ｚ１は存在していなくてもよい、またはＺ２は存在していなくてもよい、またはＺ３は存在していなくてもよい、またはＺ４は存在していなくてもよい、またはＺ５は存在していなくてもよい、またはＸ１は存在していなくてもよい、またはＸ２は存在していなくてもよい。これらの実施形態ではまた、実施形態のサブセットはＺ１が存在し、またはＺ２が存在し、またはＺ３が存在し、またはＺ４が存在し、またはＺ５が存在し、またはＸ１が存在し、またはＸ２が存在するものである。
【００４０】
上記で開示される本発明のペプチドは好ましくは式Ｉを有するものであり、ここで、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５が全て存在する、またはＸ３およびＸ４の一方のみが存在し、かつＸ５が存在する、またはＸ５のみが存在する、またはＸ３−Ｘ５のいずれも存在しない。Ｘ５の非存在がジスルフィド架橋を介する二量体化を不適当にすることが理解され、Ｘ５を欠くペプチドが単量体形態で使用されるかまたは二量体、三量体、または多量体で使用されるかのいずれかであり、システインにおけるチオール基以外の他の官能基に依存することを意味する。
【００４１】
式Ｉはまた、本明細書中で配列番号８として提供される。
【００４２】
式Ｉのペプチドのサブセットは式ＩＩにより規定される：
ＬＱＮＸ１Ｘ２ＧＬＧＬＳＩＬＬＮＸ３Ｘ４Ｘ５            （ＩＩ）
ここで
Ｘ１はＲまたはＫであり、
Ｘ２はＲまたはＫであり、
Ｘ３がＥである、または存在しない、
Ｘ４がＥである、または存在しない、かつ
Ｘ５がＣである、または存在しない、
ただし、式ＩＩが、配列番号１のアミノ酸配列を有しない。
【００４３】
本発明の特に好ましいペプチドは配列番号２−７、および９のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するものである。
【００４４】
第二の態様−本発明のペプチドコンストラクト
本発明のペプチドはそれ自体免疫刺激剤として有用であるが、いくつかはまた二量体および他の多量体として、すなわち本発明の第一の態様のペプチドおよび少なくとも１つのさらなるペプチドを含む本発明のペプチドコンストラクトとして存在し、ここで、ペプチドおよび少なくとも１つのさらなるペプチドは互いに融合しているかまたは（好ましくは）ペプチドコンストラクトにおける少なくとも１つのペプチドにおける側鎖を介して共有結合しており、ここで、さらなるペプチドが以下からなる群から選択される
−本発明の第一の態様の同一のペプチド、
−本発明の第一の態様の非同一ペプチド、
−本発明の第一の態様のペプチドの少なくとも４連続アミノ酸残基のフラグメント、および
−アミノ酸配列（ＧＰ）ｎ、ここでｎは正の整数であり、かつ好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される；この後者の第二のペプチドは典型的には本発明の第一の態様のペプチドのＮ−またはＣ末端に融合され、かつ融合パートナーとしてまたは本発明の第一の態様のペプチドへの融合パートナーとして単独で使用されてもよく、順に二量体、三量体または他の多量体の一部である；例えばコンストラクトＳＧ＃８およびＳＧ＃２８参照。
【００４５】
驚いたことに、それ自体免疫刺激性である未改変のペプチドはそれらを二量体、三量体、および他の多量体の形態で提示する場合（または上記の改変を含むことにより）それらの免疫刺激効果を保存できる；ＷＯ２０１７／０５４８３１で提示される二量体の大多数が免疫抑制性であるという事実を考えるとこれは非常に驚くべきことである。
【００４６】
ペプチドコンストラクトは、したがって、典型的には本発明の第一の態様のペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体などの多量体の形態である。ペプチドおよび少なくとも１つのさらなるペプチドは例えばペプチドコンストラクトにおける少なくとも１つのペプチドにおける側鎖を介して共有結合しており、ここで結合がジスルフィド架橋、グリシンリンカー、リジンリンカー、グリシン−リジンリンカー、システイン−リジンリンカー、Ａｒｇリンカー、およびビス−マレイミドリンカー、上記参照からなる群から選択される。コンストラクトゾルを形成するペプチドが許容する場合ジスルフィド結合を利用することが好ましい。
【００４７】
共有結合が多量体のすべてのペプチドにおいて側鎖を含まない場合、ペプチド間カップリングは従来の末端間融合であるかまたは他のペプチドの１つの側鎖および主鎖の末端間カップリングであってもよい。
【００４８】
第三の態様−本発明のコンジュゲート分子
本発明のペプチドおよびペプチドコンストラクトは、単独でまたは他の治療的活性物質との組成物における併用で免疫刺激剤としての用途を見出す。しかしながらペプチドおよびペプチドコンストラクトが他の分子とのコンジュゲートの一部を形成してもよいことは、本発明の重要な態様である；これらの他の分子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である場合、１つの便利なコンジュゲーション型は、ペプチド結合を介する融合体であるが、炭水化物および脂質などの他の分子はコンジュゲーションの他の型を必要とするだろう。
【００４９】
従ってこの態様では、ペプチドまたはペプチドコンストラクトは例えば異種のペプチドまたはポリペプチド、脂質、または炭水化物などの異種分子にコンジュゲートされている、または内部にコンジュゲートされているが、任意の分子エンティティがコンジュゲーション／融合体について使用されてもよい；例えば、以下に議論される組成物の他の部分を形成し得る分子もまた有用なコンジュゲーションパートナーであると考えられる。
【００５０】
コンジュゲート分子が、融合体コンストラクトの一部として本発明のペプチドまたはペプチドコンストラクトを含む場合、ペプチドおよびペプチドコンストラクトはＮ−またはＣ末端融合パートナーとして配置され得るかまたはより大きい（ポリ）ペプチドの内部に挿入され得、これは本発明のペプチドまたはペプチドコンストラクトがＣ−およびＮ末端融合パートナーの両方を有することを意味する。かかる融合体コンストラクトの典型的な長さは約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０，または１００アミノ酸残基である。
【００５１】
コンジュゲート分子が異種の（ポリ）ペプチドを含む場合、これは本発明によれば、Ｃ末端アミド化を含んでもよい。一般に、本発明によればコンジュゲート分子はＣ末端アミド化され得る。
【００５２】
本発明の文脈では「異種分子」という用語は、天然の結合が存在しないためペプチドまたはペプチドコンストラクトが化学的にまたは組み換え技術によりまたは合成化学により結合（ａｔｔａｃｈｅｄ）されるべき分子を示す。「結合する（ａｔｔａｃｈｅｄ）」はまた、ペプチドまたはペプチドコンストラクトがタンパク質などの異種分子に導入されてもよいことを含む。
【００５３】
コンジュゲート分子の異種分子は典型的にはホルモンもしくはその活性フラグメント、サイトカインもしくはその活性フラグメント、免疫原性タンパク質もしくはペプチド、免疫性担体、免疫療法薬、癌化学療法薬、走化性物質、抗体もしくはその特異的結合フラグメント、受容体についてのリガンド、受容体もしくはそのリガンド結合フラグメント、ならびにＴＣＲ−結合ペプチドからなる群から選択される。「活性フラグメント」は、フラグメントが由来する全長の分子を特徴づける生物学的な活性を保持する生物学的な活性分子のフラグメントである。サイトカインの活性フラグメントは、それゆえに例えばサイトカイン活性の認識できる量を保存する。異種分子はまた、典型的にワクチン技術において使用される免疫原性担体タンパク質などの免疫原性担体、例えば破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、およびＫＬＨ、ならびにそれらの免疫原性フラグメントであり得る。
【００５４】
コンジュゲート分子が本発明のペプチドまたはペプチドコンストラクトと異種分子（すなわちペプチド結合を介しないコンジュゲーション）間の化学的コンジュゲーションにより提供される場合、コンジュゲーションは、第二の態様に関して上記詳述したリンカーを介してもよく、または化学的コンジュゲーションはホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドなどの架橋結合剤を使用するコンジュゲーションである。
【００５５】
第四の態様−本発明の医薬組成物
上記詳述した薬剤の重要な使用は、本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、またはコンジュゲート分子を含む医薬組成物の一部としてのものであり、ここで、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈液または賦形剤をさらに含む。加えて、医薬組成物は、免疫原、抗原、抗体、抗体フラグメント、抗体アナログ、モノクローナル抗体、化学療法剤、免疫刺激化合物、ホルモン、および免疫チェックポイント阻害剤からなる群から選択される活性成分を含んでもよい。
【００５６】
例えば、医薬組成物のさらなる活性成分は、以下からなる群から選択される化学療法剤であり得る；
−アルキル化剤、好ましくは以下からなる群から選択される：シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、およびメルファランなどの二機能性アルキル化剤、ならびにダカルバジン（ｄｔｉｃ）、ニトロソウレア化合物、およびテモゾロミド（経口ダカルバジン）などの単機能性アルキル化剤；
−アントラサイクリン、好ましくは以下からなる群から選択される：ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン；
−細胞骨格ディスラプター（タキサン）、好ましくは以下からなる群から選択される：パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、およびタキソテール；
−エポチロン、好ましくは以下からなる群から選択される：エポチロンｂ、パツピロン、サゴピロン、イクサベピロン、およびウチデロン；
−ヒストン脱アセチル化酵素（ｄｅａｃｙｔｅｌａｓｅ）阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：ボリノスタットおよびロミデプシン；
−トポイソメラーゼＩ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：イリノテカンおよびトポテカン；
−トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：エトポシド、テニポシド、およびタフルポシド；
−キナーゼ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、およびビスモデギブ、
−ヌクレオチドまたは前駆物質アナログ、好ましくは以下からなる群から選択される：アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、およびチオグアニン；
−ペプチド抗生物質、好ましくは以下からなる群から選択される：ブレオマイシンおよびアクチノマイシン；
−白金系薬剤、好ましくは以下からなる群から選択される：カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン；
−レチノイド、好ましくは以下からなる群から選択される：トレチノイン、アリトレチノイン、およびベキサロテン；および
−ビンカアルカロイド、好ましくは以下からなる群から選択される：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン。
【００５７】
医薬組成物のさらなる活性成分はまた、以下からなる群から選択される免疫療法剤であり得る：
−ＰＤ−１阻害剤、好ましくは以下から選択される：ペンブロリズマブおよびニボルマブ；
−ＰＤ−Ｌ１阻害剤、好ましくは以下から選択される：アテゾリズマブおよびアベルマブ；および
−抗ＣＴＬＡ−４化合物、好ましくはイピリムマブ。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、ワクチン例えば活性特異的な免疫療法を実施することにおける使用のための製品であってもよいがまた、他の製剤であってもよい。
【００５９】
医薬組成物は、上記の薬剤に加えて、薬学的に許容可能なまたは生理学的に許容可能な賦形剤、担体および／またはアジュバントなどの治療的に不活性な成分を含み、これらは当業者によく知られておりかつ、溶剤、乳化剤、湿潤剤、可塑剤、可溶化剤（例えば溶解度増強剤）着色物質、充填剤、保存料、抗酸化剤、抗菌剤、粘度調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張性調整剤、粘膜付着性物質等を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ペプチド、ペプチドコンストラクトまたはコンジュゲート分子は、アジュバントのようなさらなる免疫改変剤と共に製剤化（例えば一緒に混合）されてもよい−ワクチン成分として使用される場合にこれは特に適切なである。（さらなる）アジュバントは、酸素含有金属塩、例えば水酸化アルミニウム、キトサン、易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、重合化リポソーム、変異毒素、例えばＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２、マイクロカプセル、インターロイキン（例えばＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＮＦＧＡＭＭＡ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＤＦ誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ＭＰＬ誘導体、ホスホファゼン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ）、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｒ）、グルカン、抗原製剤、リポソーム、ＤＤＥ、ＤＨＥＡ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＯＣ／Ａｌｕｍ複合体、フロイント不完全アジュバント、ＩＳＣＯＭｓ（Ｒ）、ＬＴ  Ｏｒａｌアジュバント、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルペプチド、およびホスファチジルエタノールアミンを含むがこれらに限定されない任意の従来のアジュバントであってもよい。アジュバントのさらなる例は例えば、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．により編集；１９９５，Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎにより「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」と題されるＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ）Ｍに記載される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば皮下および／または皮内注射など注射用に製剤化されるなどの非経口投与用に製剤化されてもよい。従って、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、溶液、懸濁液、分散液、およびゲル化液を含む液体であってもよい（すなわち液体として製剤化される）。例えば、液体医薬組成物は、適した溶媒において本明細書に記載されるペプチド、ペプチドコンストラクトまたはコンジュゲート分子の粉末、顆粒または凍結乾燥物を溶解することにより形成され、そして対象に投与されてもよい。適した溶媒は、生理学的に許容可能な特性を有する任意の溶媒であってもよく、かつペプチドの組み合わせを所望の濃度で溶解できてもよい。所望の濃度は、投与される（すなわち注射される）アリコートおよび所望の単回用量に依存してもよい。注射の目的のために、アリコートは約１０から５００マイクロリッターの範囲であり、例えば５０から３００マイクロリッター以下であり、かつ所望の単回用量は１から１０００ナノモルの範囲内であることが強調される。従って、適した溶媒はペプチド、ペプチドコンストラクトまたはコンジュゲート分子について約１から１０００μＭの終濃度を達成するために任意のペプチドの組み合わせを溶解できるべきである。したがって、一実施形態では、液体組成物は、１０から８００μＭ、例えば、２０から５００μＭまたは２０から３００μＭの濃度でペプチド、ペプチドコンストラクトまたはコンジュゲート分子を含む。典型的に、溶媒は水溶液、所望により他の溶媒と混合された水溶液である。したがって、溶媒は、蒸留水など、滅菌水などの少なくとも６０％ｗ／ｗの水、例えば少なくとも６５％ｗ／ｗ、７０％ｗ／ｗ、７５％ｗ／ｗ、８０％ｗ／ｗ、８５％ｗ／ｗ、９０％ｗ／ｗまたは９５％ｗ／ｗ、９９％ｗ／ｗの水を含んでもよい。いくつかの実施形態では、溶媒は、滅菌蒸留水、例えば注射用の水である。水溶液は、水以外の他の溶媒、例えば、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、グリセロール、エタノール、アセトニトリル、植物油または合成油を含んでもよい。溶媒の水相のｐＨは、生理学的に許容される範囲、典型的にはｐＨ３から８の範囲など、ｐＨ４から８の範囲など、５から８の範囲など、６から８の範囲などの、３から９の範囲内であってもよい。したがって、液体製剤は、ｐＨコントロール剤または緩衝剤（例えばクエン酸バッファ、リン酸バッファ、酢酸バッファ）を含んでもよく、所望によりｐＨは、強塩基（例えば水酸化ナトリウムなど）の希釈液および／または強酸（例えば塩酸）の希釈液で調整されてもよい。
【００６２】
典型的には、液体製剤は等張性であり、かつ所望により無菌である。従って、いくつかの実施形態では、製剤は、等張生理食塩水などの生理食塩水を含む。当該液体は別の溶媒、溶解度増強剤（例えばポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、イオン性および非イオン性乳化剤（例えばポロクサマー（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）））、分散剤、増粘剤、保存料、抗菌剤、および／または抗酸化剤などのさらなる賦形剤を含有してもよい。溶媒の非限定的な例示的な例は、水、生理食塩水、ＤＭＳＯ、グリセロール、エタノール、アセトニトリル、植物油または合成油を含む。
【００６３】
いくつかのペプチドは長期間水にさらされると酸化し易いかまたは不安定であることが知られている。従って貯蔵安定な組成物を達成するために、医薬組成物は、制限された量の水または水溶液のみを含有するよう製剤化されてもよく、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５％ｗ／ｗ未満の水または水溶液などの１０％ｗ／ｗ未満の水または水溶液を含有する。制限されたレベルの水を有する医薬組成物の例は、顆粒、粉末、例えば、凍結乾燥物、すなわち凍結乾燥粉末を含んでもよい。典型的には、凍結乾燥組成物は、例えば、水性溶液、所望により無菌の溶液、例えば、３から８の範囲のｐＨなど、４から８の範囲のｐＨなど３−９の範囲のｐＨを有する溶液に使用前に溶解されてもよい。凍結乾燥物はさらなる成分、例えば増量剤および凍結乾燥防止剤（例えばショ糖、ラクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、ラフィノース、グリシン、ヒスチジンまたはそれらの混合物）、緩衝剤（例えばクエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム、水酸化ナトリウム、Ｔｒｉｓ塩基、Ｔｒｉｓ酢酸、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌまたはそれらの混合物）、抗酸化剤、抗菌剤、可溶化剤（例えばポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０））を含有してもよい。
【００６４】
凍結乾燥組成物はまた、例えば、口腔粘膜によるなどの経口経路により投与される固形剤形に製剤化される。したがって、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口投与、例えば、舌下投与のために製剤化されてもよい。従って、医薬組成物は、凍結乾燥固形剤形などの固形剤形、典型的には錠剤、カプセルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔ）であってもよく、所望により迅速な崩壊のために製剤化されてもよい。本発明の組成物、方法および使用に適切な医薬製剤および送達系は当技術分野で知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２００３）  ２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，ＮＪ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ  ａｄ  Ｓｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ；ａｎｄ  Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３−３１５参照）。
【００６５】
言及したように、医薬組成物は、投与の特定の経路に適合するように製剤化され得る。したがって、医薬組成物は、多様な経路により投与に適した担体、希釈液、または賦形剤を含んでもよい。組成物が所望により製剤化され得る接触または生体内での送達のための投与の例示的な経路は、吸入、鼻腔内、経口、口腔内、舌下、皮下、皮内、皮膚上、直腸、経皮、またはリンパ内を含む。
【００６６】
経口、口腔内または舌下投与について、組成物は例えば、錠剤またはカプセルの形態をとってもよく、所望により速崩壊性（ｆａｓｔ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）錠剤／カプセルまたは持続放出錠剤／カプセルとして製剤化される。いくつかの実施形態では、錠剤は凍結乾燥されており、所望により舌下で投与されるのに適した速崩壊性（ｆａｓｔ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）錠剤またはカプセルである。
【００６７】
医薬組成物はまた、「単位剤形」に製剤化され、本明細書で使用される単位剤形は物理的に別個の単位を指し、ここで、各単位は１以上の用量で投与される場合に、所望の効果を生み出し得る医薬担体（賦形剤、希釈液、ビヒクルまたは充填剤）と所望により関連して所定量のペプチド、ペプチドコンストラクトまたはコンジュゲート分子を含有する。単位剤形はまた、例えば、凍結乾燥または凍結乾燥状態で組成物（凍結乾燥物）または無菌液体担体を含んでもよいアンプルおよびバイアルを含み、例えば、それは生体内での投与または送達前に加えられ得る。単位剤形は、例えば、アンプルおよびバイアルとその中に配置された液体組成物をさらに含む。
【００６８】
ペプチドは酸素にさらされると、たとえば空気または空気を含有する溶媒にさらされると分解しやすい場合がある。従って、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、不活性ガス、例えばアルゴンまたは窒素を含む。
【００６９】
治療態様
本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、または医薬組成物は治療における用途を見出す。
【００７０】
それらの免疫刺激効果に起因して、本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、または医薬組成物は免疫系を刺激するために治療的または予防的設定において「そのまま」使用されてもよい。そのような状況でO。
【００７１】
本発明によれば、ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物は、使用が対象における免疫原に対する特異的な適応免疫応答を高める、刺激するまたは誘発するための予防的または治療的処置方法であることを見出し、ここで、該方法は、前記予防的または治療的処置を必要とする対象に予防的または治療的に活性な量の前記ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子もしくは医薬組成物ならびに前記免疫原を同時投与することを含む。
【００７２】
「同時投与」という用語は、本発明のペプチド／ペプチドコンストラクト／コンジュゲート分子／組成物と同一投与の一部（例えば同一の組成物において）としてのまたはいくつかの別個の投与（あるいは異なるときに）としてのいずれかの、さらなる活性成分の同時投与を表示し、ここで、しかしながら、本発明のペプチド／ペプチドコンストラクト／コンジュゲート分子／組成物の免疫刺激効果はさらなる活性成分の効果を高めることができ、この場合免疫原に対する免疫応答を増加させる。言い換えると、ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子が免疫アジュバントとして作用する、好ましくはワクチン中で作用することが好ましい。
【００７３】
ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物はまた対象における癌の化学療法的または免疫療法的処置における使用を見出し、ここで該方法は、前記予防的または治療的処置を必要とする対象に治療有効量の前記ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子もしくは医薬組成物ならびに化学療法剤および／または免疫療法剤を同時投与することを含む。
【００７４】
化学療法剤は典型的には以下からなる群から選択される：
−アルキル化剤、好ましくは以下からなる群から選択される：シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、およびメルファランなどの二機能性アルキル化剤、ならびにダカルバジン（ｄｔｉｃ）、ニトロソウレア化合物、およびテモゾロミド（経口ダカルバジン）などの単機能性アルキル化剤；
−アントラサイクリン、好ましくは以下からなる群から選択される：ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン；
−細胞骨格ディスラプター（タキサン）、好ましくは以下からなる群から選択される：パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、およびタキソテール；
−エポチロン、好ましくは以下からなる群から選択される：エポチロンｂ、パツピロン、サゴピロン、イクサベピロン、およびウチデロン；
−ヒストン脱アセチル化酵素（ｄｅａｃｙｔｅｌａｓｅ）阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：ボリノスタットおよびロミデプシン；
−トポイソメラーゼＩ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：イリノテカンおよびトポテカン；
−トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：エトポシド、テニポシド、およびタフルポシド；
−キナーゼ阻害剤、好ましくは以下からなる群から選択される：ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、およびビスモデギブ、
−ヌクレオチドまたは前駆物質アナログ、好ましくは以下からなる群から選択される：アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、およびチオグアニン；
−ペプチド抗生物質、好ましくは以下からなる群から選択される：ブレオマイシンおよびアクチノマイシン；
−白金系薬剤、好ましくは以下からなる群から選択される：カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン；
−レチノイド、好ましくは以下からなる群から選択される：トレチノイン、アリトレチノイン、およびベキサロテン；および
−ビンカアルカロイド、好ましくは以下からなる群から選択される：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、
ならびに免疫療法剤は典型的には以下からなる群から選択される：
−ＰＤ−１阻害剤、好ましくは以下から選択される：ペンブロリズマブおよびニボルマブ；
−ＰＤ−Ｌ１阻害剤、好ましくは以下から選択される：アテゾリズマブおよびアベルマブ；および
−抗ＣＴＬＡ−４化合物、好ましくはイピリムマブ。
【００７５】
本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物は対象における免疫応答（例えば自然免疫応答）を高める、刺激するまたは誘発するための予防的または治療的処置方法においてさらに有用であり、ここで、該方法は、前記予防的または治療的処置を必要とする対象に前記ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物を投与することを含む。この実施形態では、ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物はしたがって、別個の医薬剤として作用する。
【００７６】
また、本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物はウイルス、細菌、真菌、または単細胞寄生虫もしくは多細胞寄生虫による感染の治療のための治療上の抗生物質処置方法における使用を見出し、ここで該方法は、前記治療的処置を必要とする対象に前記ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子もしくは医薬組成物ならびに前記抗生物質を同時投与することを含む。任意の抗生物質治療は本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または医薬組成物により誘導された免疫学的認識の増大から利益を得ることができ、これは任意の利用可能な抗生物質剤（ペニシリン、セファロスポリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アミノグリコシド、ポリミキシン、抗マイコバクテリア薬、スルホンアミド、トリメトプリム、抗真菌剤、および抗ウイルス剤）との組み合わせ治療を意味する。
【００７７】
本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子または組成物の投与レジメンおよび正確な投与量に関して、これらは治療される正確な条件ならびに治療されるべき対象の年齢、性別、体重、および全身状態に応じて当業者によって容易に決定されるだろう。ヒト対象を治療することが好ましいことが本開示から理解されるだろうが、本発明はまた、獣医学における使用を見出す。
【００７８】
抗体産生に関する態様
ペプチド、ペプチドコンジュゲート、およびコンジュゲート分子が免疫アジュバントとしての使用を見出すため、それらは免疫原に特異的に結合する抗体の製造における使用を見出す。かかる方法は、前記動物における前記免疫原に特異的な抗体の産生をもたらすため、免疫原性的に活性な量の以下のものを動物に同時投与することを含み
−本明細書に開示されるペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、または（医薬品の）組成物、および
−免疫原、
そしてその後前記動物から前記抗体を回収する。
【００７９】
同時投与は、ペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、または医薬組成物と１つの医薬組成物の一部としてまたはペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、もしくは医薬組成物が免疫原に対する免疫応答を高めることを可能にする時間間隔内で投与される別個の組成物の一部としてのいずれかの免疫原を投与することにより達成される、すなわち同時投与はワクチン投与に関連するのと同じ方法で使用される。
【００８０】
抗体産生はそれ自体知られた方法を介してモノクローナル抗体を調製するさらなる工程を必要としてもよい。
【００８１】
本発明の核酸に関する態様
免疫刺激効果を誘導するためにペプチド、ペプチドコンストラクト、コンジュゲート分子、およびこれらを含む組成物を投与する代わりに、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの核酸から細胞により発現され得るそれらのペプチド、ペプチドコンストラクトおよびコンジュゲート分子の体細胞による発現をもたらすことも可能である。この目的のために、コードする核酸は適した細胞への核酸の注射後に免疫原の一過性の発現を達成できる核酸ワクチンと同等の方法で使用される。
【００８２】
例えば、核酸が投与された対象において免疫原ならびにペプチド、ペプチドコンストラクト、もしくはコンジュゲート分子の両方の発現を引き起こすベクターを投与し、それにより同時免疫化およびアジュバント効果を得ることは本発明の範囲内である。
【００８３】
それゆえに、ペプチド、ペプチドコンストラクト、またはコンジュゲートが実際に核酸によりコードされ得、かつ（ヒト）細胞により発現され得るならば、本発明はまた、本発明のペプチド、ペプチドコンストラクト、またはコンジュゲートをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を提供する。それゆえに、核酸は典型的には部分ベクター、好ましくは裸のＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソーム中で製剤化されたＤＮＡまたはＲＮＡ、ウイルス（弱毒化）または細菌（弱毒化）などの発現ベクターである。
【００８４】
それゆえに本発明の核酸は免疫原の免疫原性を高める、（先天的などの）免疫を刺激する、または癌免疫療法または癌化学療法の効果を高めるために使用され得る。
【実施例】
【００８５】
実施例の前文
実施例２、４、および５において使用されるＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１ベータＥＬＩＳＡ定量についての手順
以下の通りＥＬＩＳＡアッセイを製造者のプロトコールに従って行った：
プレートを振盪しないＣａｐｔｕｒｅ抗体との一晩のインキュベーションを除き、各インキュベーション工程後に、密封し、１５０−２００ｒｐｍで回転テーブルで振盪した。ＥＬＩＳＡを実行する１日前に、９６穴アッセイプレートをＣａｐｔｕｒｅ抗体、ここでは１ｘコーティングバッファ（ｄｄＨ２Ｏで希釈した５ｘコーティングバッファ）で１：２００に希釈したＣａｐｔｕｒｅ  ＩＬ−６抗体またはＣａｐｔｕｒｅ  ＴＮＦ−アルファ抗体またはＣａｐｔｕｒｅ  ＩＬ−１ベータ抗体で覆った。これらのＣａｐｔｕｒｅ抗体溶液の各１００μＬをすべてのウェルに加え、密封し一晩（１６−１８時間）４℃でインキュベートした。翌日、セットからすべての試薬を使用前に室温（ＲＴ）にした。プレートを１ウェルあたり最小３００μＬ  Ｗａｓｈバッファ（１ｘＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。次の洗浄で残留しているバッファはプレートを吸収紙で吸い取り除去した。次に２００μｌの１ｘアッセイ希釈液Ａ（ＰＢＳ  ｐＨ＝７．４で希釈した５ｘアッセイ希釈液Ａ）を１時間加え、非特異的結合をブロックした。プレートがブロックされている間に、すべての試料および標準（各プレート必須）を調製した。標準および試料は３回ずつ実行した。ＩＬ−６について、１ｍＬの最高標準濃度（２５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−６定量）をＩＬ−６ストック溶液から１ｘアッセイ希釈液Ａ（１ｘＡＤ）で調製した。ヒトＩＬ−６で、２５０ｐｇ／ｍｌの最高標準の６つの２倍の段階希釈を行った、標準濃度：２５０ｐｇ／ｍｌ、１２５ｐｇ／ｍｌ、６２．５ｐｇ／ｍｌ、３１．２ｐｇ／ｍｌ、１５．６ｐｇ／ｍｌおよび７．８ｐｇ／ｍｌ。ＴＮＦ−アルファについて、１ｍＬの最高標準濃度（５００ｐｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−アルファ定量）をＴＮＦ−アルファストック溶液から１ｘアッセイ希釈液Ａ（１ｘＡＤ）で調製した。ヒトＴＮＦ−アルファで５００ｐｇ／ｍｌ最高標準の６つの２倍の段階希釈を行った、標準濃度：５００ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、１２５ｐｇ／ｍｌ、６２．５ｐｇ／ｍｌ、３１．２ｐｇ／ｍｌ、１５．６ｐｇ／ｍｌおよび７．８ｐｇ／ｍｌ。ＩＬ−１ベータについて、１ｍＬの最高標準濃度（２５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−１ベータ定量）をＩＬ−１ベータストック溶液から１ｘアッセイ希釈液Ａ（１ｘＡＤ）で調製した。ヒトＩＬ−１ベータで２５０ｐｇ／ｍｌ最高標準の６つの２倍の段階希釈を行った、標準濃度：２５０ｐｇ／ｍｌ、１２５ｐｇ／ｍｌ、６２．５ｐｇ／ｍｌ、３１．２ｐｇ／ｍｌ、１５．６ｐｇ／ｍｌおよび７．８ｐｇ／ｍｌ。１ｘＡＤはすべての実施例、ここでは実施例１、実施例２および実施例３についてゼロ標準（０ｐｇ／ｍｌ）としての役割を果たす。プレートをブロッキングした後、洗浄を行い、１００μＬ標準および試料を３連でアッセイし、ＲＴで２時間インキュベートした。試料はＩＬ−６解析については希釈せず、ＴＮＦ−アルファ解析については５倍希釈し、またはＩＬ−１ベータ解析については３倍希釈した。洗浄後、１００μｌのＩＬ−６またはＴＮＦ−アルファまたはＩＬ−１ベータ検出抗体を各ウェルに適用し、１ｘＡＤで１：２００に希釈し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄しその後１ｘＡＤで１：１０００に希釈した���ウェルあたり１００μｌのアビジン−ＨＲＰ溶液で３０分インキュベーションした。最後の洗浄はバックグラウンドを減少させるために、洗浄の間に少なくとも３０秒の間隔をあけて５回行った。次に１００μｌの新鮮な混合したＴＭＢ基質溶液（プレートあたり１０ｍＬ、セットにおいて提供される基質各５ｍＬ）を適用し１５分間暗所に放置した。シグナル飽和を防ぐために観察する必要があり、ポジティブウェルは青色に変わった。暗所でインキュベートした後、反応をウェル当たり１００μＬの２ＮＨ２ＳＯ４で停止した。ポジティブウェルは黄色に変わった。３０分以内に吸光度を４５０ｎｍおよび５７０ｎｍ（バックグラウンド）で測定した。データをマイクロソフトエクセル２０１０プログラムで解析した。統計学的な解析をマイクロソフトエクセル２０１０プログラムを使用して行った。
【００８６】
実施例１
ＳＧ＃４、ＳＧ＃８、ＳＧ＃１３、およびＳＧ＃１４（配列番号２−５由来）により誘導された免疫調節機能。
ペプチドＳＧ＃４、ＳＧ＃８、ＳＧ＃１３、およびＳＧ＃１４（配列番号２−５）での細胞の前処置はＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、およびＩＬ−８などの炎症促進性サイトカインを含むサイトカインの放出を促進する。
【００８７】
ヒト急性単球白血病細胞株ＴＨＰ−１におけるＩＬ−６の発現レベルに対するペプチドＳＧ＃４、ＳＧ＃８、ＳＧ＃１３、およびＳＧ＃１４の調節機能を調べた。ＴＨＰ−１細胞を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０で５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。ＴＨＰ−１細胞はリポ多糖（ＬＰＳ）治療に応答してＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１０およびＩＬ−８ｍＲＮＡおよびタンパク質を誘導することが知られている。ＴＨＰ−１細胞は未処置のままにされ、または各ペプチドの０ｕＭ、７．５μＭ、１５μＭ、３０μＭ、６０μＭまたは１００μＭでインキュベートし、かつ至適用量およびインキュベーション時間を見つける以前の解析に基づいて６時間１μｇ／μｌ  ＬＰＳで刺激した。
表１：ヒト急性単球白血病細胞株ＴＨＰ−１におけるＩＬ−６の発現レベルに対するペプチドＳＧ＃４、ＳＧ＃８、ＳＧ＃１３、およびＳＧ＃１４の調節機能。
（−）阻害はＬＰＳのみの処理試料と比較した場合の阻害の割合（％）（任意に１００％に設定）を示す。例えば３０μＭでのＳＧ＃１３についての（−）５．２８６０９は、ＬＰＳのみの処理細胞と比較して、５．３８６０９％のＩＬ−６分泌が阻害された（または言い換えれば、ＬＰＳのみの処理細胞から観察されたＩＬ−６分泌の９５％未満が処理細胞において観察された）ことを示す。従って１００μＭでのＳＧ＃１３についての（＋）３６．９８２８％は、分泌サイトカインのレベルがＬＰＳのみの処理試料（１００％）から３６．９８２８％超えてまたはコントロールの１３６．９８２８５％であることを示す。
【表１】
2019528071.tif 000007
【００８８】
実施例２
ＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、ＳＧ＃２７、およびＳＧ＃２８により誘導された免疫調節機能。
ペプチドコンストラクトＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、ＳＧ＃２７、およびＳＧ＃２８のいずれかによる細胞の治療は炎症促進性サイトカインＩＬ−６の放出に影響する。
【００８９】
ここでは、我々はヒト急性単球白血病細胞株ＴＨＰ−１におけるＩＬ−６タンパク質のレベルに対するペプチド、ペプチドＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、ＳＧ＃２７、およびＳＧ＃２８の調節機能を調べた。ＴＨＰ−１細胞を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０で５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。ＴＨＰ−１細胞はリポ多糖（ＬＰＳ）治療に応答してＩＬ−６タンパク質を誘導することが知られている。ＴＨＰ−１細胞は未処置のままにされ、または各ペプチドコンストラクトＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、ＳＧ＃２７、およびＳＧ＃２８の０ｕＭ、１５μＭ、３０μＭ、６０μＭでインキュベートし、かつ至適用量およびインキュベーション時間を見つける以前の解析に基づいて２４時間１μｇ／μｌ  ＬＰＳで刺激した。
【００９０】
ＩＬ−６ＥＬＩＳＡ定量
実施例の前文に記載のようにＥＬＩＳＡアッセイを行った。結果は図１および表２に示される。
表２：ヒト急性単球白血病細胞株におけるＩＬ−６の分泌レベルに対するペプチドコンストラクトＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、ＳＧ＃２７、およびＳＧ＃２８のアクチベーター機能。例えば１５μＭでのＳＧ＃２３についての（＋）３５．００３３割合（％）は、分泌サイトカインのレベルがＬＰＳのみの処理試料（１００％）を３５．００３３割合（％）超え、ベースライン値の１３５．００３３％であることを示す。
【表２】
2019528071.tif 000008
【００９１】
実施例３
ペプチドコンストラクトＳＧ＃４によるマウスの生体内での免疫化後の免疫応答活性化
ニワトリオボアルブミンは免疫学研究においてＴ細胞活性化を引き起こすために使用されてきた。オボアルブミン免疫化マウスは複数のマウスモデルにおける組織特異的なエフェクター機能を媒介する主にＩｇＧ１およびＩｇＥアイソタイプの抗ＯＶＡ抗体を産生する。したがって、ＴＨ２媒介免疫応答の免疫化／誘導の有効性を決定するために血漿または血清における抗ＯＶＡ抗体レベルを測定することがしばしば望ましい。ここでは、我々は雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴＨ２媒介免疫応答を誘導することにおけるＳＧ＃４ペプチドの有効性を試験した。試験薬はオボアルブミン単独、ペプチドコンストラクトＳＧ＃４単独、またはＳＧ＃４と組み合わせたオボアルブミンを含有した。
【００９２】
当該研究は各５マウス（５雌ＢＡＬＢ／ｃマウス）の４群から構成された。動物を標準的な投与経路および表３に記載された以下の投与量を使用して１日および１４日目に免疫化した。
表３．動物の免疫化のためのスケジュール
【表３】
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表４．研究に含まれる群、名称、用量レベル、用量容積、治療および動物の数
【表４】
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【００９３】
抗オボアルブミンＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ定量のための手順
以下の通りＥＬＩＳＡアッセイは製造者のプロトコールに従って行った。ＥＬＩＳＡで供給されるマイクロウェルプレートの各ウェルをオボアルブミンで覆った。オボアルブミンに特異的な抗体は、生物学的な液体、ここでは各マウスからの５μｌの血清に存在するならば、固定化オボアルブミンに結合するだろう。マウスＩｇＧ１を認識する検出抗体をウェルに添加した。このヤギ抗マウスＩｇＧ１をＨＲＰで標識し、自己抗体の定量を可能にした。ＨＲＰ基質３，３’，５，５’− テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、次いで停止溶液を添加すると、分光光度的に測定された黄色の産物が生じた。色の強度は結合したヤギ抗マウスのＩｇＧ１／ＨＲＰの量に正比例し、それは抗オボアルブミン抗体の濃度に比例する。１ｍＬの最高標準濃度（２５０ｐｇ／ｍｌ抗オボアルブミンＩｇＧ１定量）を抗オボアルブミンＩｇＧ１ストック溶液から１ｘアッセイ希釈液Ａ（１ｘＡＤ）で調製した。ヒト抗オボアルブミンＩｇＧ１で２５０ｐｇ／ｍｌ最高標準の６つの２倍の段階希釈を行った、標準濃度：２５０ｐｇ／ｍｌ、１２５ｐｇ／ｍｌ、６２．５ｐｇ／ｍｌ、３１．２ｐｇ／ｍｌ、１５．６ｐｇ／ｍｌ、７．８ｐｇ／ｍｌおよび３．９ｐｇ／ｍｌ。１ｘＡＤはゼロ標準（０ｐｇ／ｍｌ）としての役割を果たす。検量線をプロットすることにより計算を行い、試料濃度を決定した。コンピュータリダクションソフトウェアを使用して、標準に対する吸光度（線形ｙ軸）  対  濃度（線形ｘ軸）をプロットし、かつデータを二次方程式に適合させる。当該直線の式を使用して、各血清試料における抗オボアルブミンＩｇＧ１の濃度を計算した。結果について図２参照。
【００９４】
図２から明らかなように、第二のブーストの後、ＳＧ＃４およびオボアルブミンの両方で免疫した群はオボアルブミン単独で免疫した動物と比較して有意に高い免疫応答の誘導を示した。抗ＯＶＡ  ＩｇＧ１の測定はペプチド、ペプチドＳＧ＃４により媒介されるＴＨ２免疫応答の大きさを評価する方法として使用した。
【００９５】
実施例４
ＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８により誘導された免疫調節機能。
ＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８の任意のペプチドによる細胞の治療は、炎症促進性サイトカインＴＮＦ−アルファの放出に影響する。
【００９６】
ここでは、我々は、ヒト急性単球白血病細胞株ＴＨＰ−１におけるＴＮＦ−アルファタンパク質のレベルに対するペプチド、ペプチドＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８の調節機能を調べた。ＴＨＰ−１細胞を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０で５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。ＴＨＰ−１細胞はリポ多糖（ＬＰＳ）治療に応答してＴＮＦ−アルファタンパク質を誘導することが知られている。
【００９７】
ＴＨＰ−１細胞は未処置のままにされ、または各ペプチドコンストラクトＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８の０ｕＭ、１５μＭ、３０μＭでインキュベートし、かつ至適用量およびインキュベーション時間を見つける以前の解析に基づいて２４時間１μｇ／μｌ  ＬＰＳで刺激した。
【００９８】
ＴＮＦ−アルファＥＬＩＳＡ定量
実施例の前文に記載のようにＥＬＩＳＡアッセイを行った。結果は図３および表５に示される。
表５：ヒト急性単球白血病細胞株におけるＴＮＦ−アルファの分泌レベルに対するペプチド、ペプチドＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８のアクチベーター機能。例えば１５μＭでのＳＧ＃４について（＋）８３．６４割合（％）は、分泌サイトカインの中央値レベルがＬＰＳのみの処理試料（１００％）を８３．６４割合（％）超えるまたは１８３．６４であることを示す。
【表５】
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【００９９】
実施例５
ＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８により誘導された免疫調節機能。
ペプチドコンストラクトＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８のいずれかによる細胞の治療は炎症促進性サイトカインＩＬ−１ベータの放出に影響する。
【０１００】
ここでは、我々は、ヒト急性単球白血病細胞株ＴＨＰ−１におけるＩＬ−１ベータタンパク質のレベルに対するペプチドコンストラクトＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８の調節機能を調べた。ＴＨＰ−１細胞を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ  １６４０で５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。ＴＨＰ−１細胞はリポ多糖（ＬＰＳ）治療に応答してＩＬ−１ベータタンパク質を誘導することが知られている。ＴＨＰ−１細胞は未処置のままにされ、または各ペプチドコンストラクトＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８の０ｕＭ、１５μＭ、３０μＭでインキュベートし、かつ至適用量およびインキュベーション時間を見つける以前の解析に基づいて２４時間１μｇ／μｌ  ＬＰＳで刺激した。
【０１０１】
ＩＬ−１ベータＥＬＩＳＡ定量
実施例の前文に記載のようにＥＬＩＳＡアッセイを行った。結果は図４および表６に示される。
表６：ヒト急性単球白血病細胞株におけるＩＬ−１ベータの分泌レベルに対するペプチド、ペプチドＳＧ＃４、ＳＧ＃２２、ＳＧ＃２３、ＳＧ＃２４、およびＳＧ＃２８のアクチベーター機能。例えば１５μＭでのＳＧ＃４についての（＋）４４．４４割合（％）は、分泌サイトカインの中央値レベルがＬＰＳのみの処理試料（１００％）より４４．４４割合（％）超えてまたは１４４．４４であることを示す。
【表６】
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【図１−ＡＢ】
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【図１−ＣＤ】
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【図１−ＥＦ】
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【図２】
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【図３−ＡＢ】
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【図３−ＣＤ】
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【図３−Ｅ】
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【図４−ＡＢ】
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【図４−ＣＤ】
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【図４−Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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