(57)【要約】  本出願は核酸分子の多重検出に関する。特に本出願は、標的核酸配列を検出し試料中の複数の標的核酸配列の存在を同時に検出できる方法を提供する。さらに本出願は、プローブセット、及び１つ以上の前記プローブセットを含むキットを提供し、前記プローブセット及び前記キットを使用して本発明の方法を実施できる。
2019528772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のｎ個の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
ｎは２以上の整数（例えばｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、又はそれ以上の整数）であり、前記方法は、以下の工程：
（１）検出対象の各標的核酸配列に対し少なくとも１個の上流オリゴヌクレオチド配列及び少なくとも１個のメディエータープローブを提供し、そして核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を前記上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブに接触させる工程； 
ここで、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエータープローブは５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、前記標的特異的配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の上流に位置し、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なる；
（２）メディエータープローブの切断を可能にする条件で、工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる工程；
（３）ｍ個の検出プローブを提供し、核酸のハイブリダイズを可能にする条件で工程（２）の生成物を前記ｍ個の検出プローブに接触させる工程；
ここで、ｍはｎより小さくかつ０より大きい整数であり、
各検出プローブは３’→５’方向に１個以上のメディエーター配列又はその一部に相補的な１個以上の捕捉配列及び鋳型配列を個別に含み、前記ｍ個の検出プローブはそれぞれ工程（１）で提供されたメディエータープローブのメディエーター配列又はその一部に相補的なｎ個以上の捕捉配列を含み、
各検出プローブはレポーター基及び消光基で個別に標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に各検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる；
（４）核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件で、工程（３）の生成物を核酸ポリメラーゼに接触させる工程；及び
（５）工程（４）の生成物に融解曲線解析を行い、融解曲線解析の結果に従って、各標的核酸配列が前記試料中に存在するかどうかを決定する工程；を含む、方法。
【請求項２】
ｍは、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、８以上、１０以上の整数であり（例えば、ｍは１、２、３、４、５、又は６）であり、好ましくは、ｍが２以上の場合に、前記ｍ個の検出プローブは、同一又は異なるレポーター基により個別に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）で、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上のメディエータープローブが提供され、工程（３）で、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、又は１０個以上の検出プローブが提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍ個の検出プローブは同じレポーター基を含み、工程（５）で工程（４）の生成物に融解曲線解析を行い、得られた融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って特定の標的核酸配列の存在を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍ個の検出プローブに含まれるレポーター基は互いに異なり、工程（５）で工程（４）の生成物に融解曲線解析を行う場合に、各レポーター基のシグナルをそれぞれリアルタイムに監視してレポーター基のシグナルに各々対応する融解曲線を取得し、その後にレポーター基のシグナルの種類と融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って特定の標的核酸配列の存在を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ｍは１であり、ｎは２以上の整数（例えばｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の整数）であり、
前記方法は、好ましくは、
（１）検出対象の各標的核酸配列に対し上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブを提供し、そして核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を前記上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブに接触させる工程；
ここで、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエータープローブは５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、前記標的特異的配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の上流に位置し、全てのメディエータープローブ中に含まれるメディエーター配列は互いに異なる；
（２）メディエータープローブの切断を可能にする条件で、工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる工程；
（３）核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、工程（２）の生成物を３’→５’方向にメディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列及び鋳型配列を含む検出プローブに接触させる工程；
ここで、前記検出プローブは、レポーター基及び消光基で標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に前記検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる；
（４）核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件で、工程（３）の生成物を核酸ポリメラーゼに接触させる工程；及び
（５）工程（４）の生成物に融解曲線解析を行い、融解曲線解析の結果に従って前記ｎ個の標的核酸配列が前記試料中に存在するかどうかを決定する工程；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいは核酸の混合物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び／又は前記標的核酸配列は一本鎖又は二本鎖である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料又は標的核酸配列は、原核生物、真核生物、ウイルス又はウイルス様体の供給源から得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記メディエータープローブは、以下の特徴：
（１）前記メディエータープローブは、それぞれ個別に、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むか又はそれらからなること；
（２）前記メディエータープローブの長さは、それぞれ個別に、１５〜１０００ｎｔ、例えば１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、８００〜９００ｎｔ、９００〜１０００ｎｔであること；
（３）前記メディエータープローブ中の標的特異的配列の長さは、それぞれ個別に、１０〜５００ｎｔ、例えば、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１５０ｎｔ、１５０〜２００ｎｔ、２００〜２５０ｎｔ、２５０〜３００ｎｔ、３００〜３５０ｎｔ、３５０〜４００ｎｔ、４００〜４５０ｎｔ、４５０〜５００ｎｔであること；
（４）前記メディエータープローブ中のメディエーター配列の長さは、それぞれ個別に、５〜１４０ｎｔ、例えば５〜１０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔであること；及び
（５）前記メディエータープローブは、それぞれ個別に３’−ＯＨ末端を有するか、又はその３’−末端が封鎖されていること；
の１つ以上を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記上流オリゴヌクレオチド配列は、以下の特徴：
（１）前記上流オリゴヌクレオチド配列は、それぞれ個別に、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むか又はそれらからなること；
（２）前記上流オリゴヌクレオチド配列の長さは、それぞれ個別に、１５〜１５０ｎｔ、例えば、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔ、１４０〜１５０ｎｔであること；
（３）前記上流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列とハイブリダイズする際に、それぞれ個別に前記メディエータープローブの上流から遠方に位置するか、又はメディエータープローブの上流の近傍に位置するか、あるいはメディエータープローブの前記標的特異的配列と部分的に重複する配列を有すること；及び
（４）前記上流オリゴヌクレオチド配列は、それぞれ個別に標的核酸配列に特異的なプライマー又は標的核酸配列に特異的なプローブであること；
の１つ以上を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（２）で前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、標的核酸配列とハイブリダイズした前記メディエータープローブを切断し、未処理のメディエーター配列又は前記メディエーター配列の一部（５’末端の一部）を含むメディエーター断片を放出する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性（例えば、５’エキソヌクレアーゼ活性）を有する核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）であり、
好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼは、テルムス・アクウァーティクス（Ｔａｑ）、テルムス・テルモフィルス（Ｔｔｈ）、テルムス・フィリフォルミス、テルムス・フラバス、テルモコックス・リテラリス、テルムス・アントラニルダニイ、テルムス・カルドフィルス、テルムス・クリアロフィルス、テルムス・フラバス、テルムス・イグニテェレ、テルムス・ラクテウス、テルムス・オシマイ、テルムス・ルーバー、テルムス・ルーベンス、テルムス・スコトドゥクトゥス、テルムス・シルバヌス、テルムス・テルモフラス、テルモトガ・マリチマ、テルモトガ・ネアポリターナ、テルモシフォ・アフリカヌス、テルモコックス・リトラリス、テルモコックス・バロッシ、テルモコックス・ゴルゴナリウス、テルモトガ・マリチマ、テルモトガ・ネアポリターナ、テルモシフォ・アフリカヌス、ピロコックス・ウーゼイ、ピロコックス・ホリコシイイ、ピロコックス・アビシ、ピロディクティウム・オクルトゥム、アクィフェクス・ピエロフィルス、及びアクィフェクス・アエロリエウスから選択されるバクテリアから取得され、好ましくは前記ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼであり、
好ましくは、工程（２）で５’ヌクレアーゼ活性を有する前記核酸ポリメラーゼは、前記上流オリゴヌクレオチド配列の伸長を触媒し、前記メディエータープローブの切断を誘発する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（２）で核酸ポリメラーゼは、標的核酸配列を鋳型として用いて上流オリゴヌクレオチド配列の伸長を触媒し、次いで５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、前記上流オリゴヌクレオチド配列の伸長産物に結合して前記メディエータープローブの切断を触媒する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（１）で前記上流オリゴヌクレオチド配列及び前記メディエータープローブに加えて、さらに下流オリゴヌクレオチド配列が検出対象の各標的核酸配列に対して提供され、前記下流オリゴヌクレオチド配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記下流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の下流に位置し、次いで核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を前記上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ及び下流オリゴヌクレオチド配列に接触させる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（２）で、核酸増幅を可能にする条件で工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼに接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記下流オリゴヌクレオチド配列は、以下の特徴：
（１）前記下流オリゴヌクレオチド配列は、それぞれ個別に、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むか又はそれらからなること；及び、
（２）前記下流オリゴヌクレオチド配列の長さは、それぞれ個別に１５〜１５０ｎｔ、例えば１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔ、１４０〜１５０ｎｔであること；
の１つ以上を有する、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（１）で提供される全ての上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列は、５’末端に同一のオリゴヌクレオチド配列を持ち；
好ましくは工程（１）で、前記上流オリゴヌクレオチド配列、前記メディエータープローブ及び前記下流オリゴヌクレオチド配列に加えて、さらに共通プライマーが提供され、前記共通プライマーは前記同一のオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を持ち、次いで核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を前記上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、下流オリゴヌクレオチド配列及び記共通プライマーに接触させ；
好ましくは前記共通プライマーは、以下の特徴：
（１）前記共通プライマーは、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むか又はそれらからなること；及び
（２）前記共通プライマーの長さは、８〜５０ｎｔ、例えば８〜１５ｎｔ、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、又は４０〜５０ｎｔであること；
の１つ以上を有する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出プローブは複数の捕捉配列を含み、前記複数の捕捉配列は、隣接して配置されているか、それらが連結配列によって離されるように配置されているか、又は重複して配置されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出プローブは、以下の特徴：
（１）前記検出プローブは、それぞれ個別に、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むかそれらからなること；
（２）前記検出プローブの長さは、それぞれ個別に１５〜１０００ｎｔ、例えば１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、８００〜９００ｎｔ、９００〜１０００ｎｔであること；
（３）前記検出プローブ中の各捕捉配列の長さは、個別に１０〜５００ｎｔ、例えば、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１５０ｎｔ、１５０〜２００ｎｔ、２００〜２５０ｎｔ、２５０〜３００ｎｔ、３００〜３５０ｎｔ、３５０〜４００ｎｔ、４００〜４５０ｎｔ、４５０〜５００ｎｔであること；
（４）前記検出プローブ中の鋳型配列の長さは、それぞれ個別に１〜９００ｎｔ、例えば１〜５ｎｔ、５〜１０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、８００〜９００ｎｔであること；
（５）前記検出プローブは、それぞれ個別に３’−ＯＨ末端を有するか、又はその３’−末端が封鎖されていること；
（６）前記検出プローブは、それぞれ個別に自己消光型プローブであり、例えば前記検出プローブは、その５’末端又は上流でレポーター基により標識され、かつその３’末端又は下流で消光基により標識されるか又はその３’末端又は下流でレポーター基により標識され、かつその５’末端又は上流で消光基により標識され、好ましくは前記レポーター基と前記消光基との間の距離は１０〜８０ｎｔ又はそれ以上であること；
（７）前記検出プローブ中で、レポーター基は、個別に蛍光基（例えば、ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor（登録商標） Gold 540、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar 705）であり、消光基は、蛍光を吸収／消光できる分子又は基（例えば、DABCYL、BHQ(例えば、BHQ-1又はBHQ-2)、ECLIPSE、及び／又はTAMRA）であること；
（８）前記検出プローブは、それぞれ個別にヌクレアーゼ活性（例えば５’ヌクレアーゼ活性、例えば５’→３’核酸エキソヌクレアーゼ活性）に耐性であり、例えば、前記検出プローブは、それぞれ個別にヌクレアーゼ活性に耐性のある修飾、例えば、ホスホロチオアート結合、アルキルホスファートトリエステル結合、アリールホスファートトリエステル結合、アルキルホスホナート結合、アリールホスホナート結合、水素化ホスファート結合、アルキルホスホルアミダート結合、アリールホスホルアミダート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリル修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、及び１−（４’−チオ−ＰＤ−リボフラノシル）修飾を含む主鎖を持つこと；
（９）前記検出プローブは、それぞれ個別に直鎖状であるか又はヘアピン構造を持つこと；の１つ以上を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（４）において、核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件で、前記核酸ポリメラーゼは鋳型として検出プローブを使用し、検出プローブとハイブリダイズしたメディエーター断片を伸長してそれによって二本鎖を生成し、
好ましくは、工程（２）で使用する５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼであり、かつ工程（４）で使用する核酸ポリメラーゼと同じである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（１）〜（４）は、以下の工程（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）ｍ個の検出プローブを提供し、検出対象の各標的核酸配列に対し上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、及び下流オリゴヌクレオチド配列を提供し、かつ任意に共通プライマーを提供すること；
ここで、前記下流オリゴヌクレオチド配列は請求項１５〜１７のいずれか１項に規定した通りであり、前記共通プライマーは請求項１８に規定した通りである； 
（ｂ）検出対象の試料と、提供された検出プローブ、上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、及び下流オリゴヌクレオチド配列、並びに５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）とを混合すること、及び任意に共通プライマーを添加すること；
（ｃ）核酸変性を可能にする条件で前工程の生成物をインキュベートすること；
（ｄ）核酸のアニール又はハイブリダイズを可能にする条件で前工程の生成物をインキュベートすること；
（ｅ）核酸の伸長を可能にする条件で前工程の生成物をインキュベートすること；及び
（ｆ）任意に工程（ｃ）〜（ｅ）を１回以上繰り返すこと；を含む手順によって実施される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（５）において、工程（４）の生成物を徐々に加熱又は冷却し、各検出プローブ中のレポーター基からのシグナルをリアルタイムで監視して、各レポーター基のシグナル強度が温度の変化と共に変化する曲線を取得する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
取得した曲線を微分して工程（４）の生成物の融解曲線を取得する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って、融解ピーク（融点）に対応するメディエーター断片の存在を決定し、その後にメディエーター断片中のメディエーター配列と標的核酸配列との間の対応関係に従って、前記メディエーター断片に対応する標的核酸配列の存在を決定し、
好ましくは、さらに（６）融解曲線解析の結果（特に融解曲線での融解ピークのピーク高さ）に従って、各融解ピークに対応する標的核酸配列の量を決定する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
１個の検出プローブ及び少なくとも２個のメディエータープローブを含むプローブセットであって、
前記メディエータープローブは、それぞれ個別に５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記標的特異的配列は標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸に相補的ではない配列を含み、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なり、
前記検出プローブは、３’→５’方向にメディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列及び鋳型配列を含み、前記検出プローブはレポーター基及び消光基で標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に前記検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる、プローブセット。
【請求項２７】
前記プローブセットは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、又は２０個以上のメディエータープローブを含む、請求項２６に記載のプローブセット。
【請求項２８】
全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なり、全てのメディエータープローブに含まれる標的特異的配列は互いに異なる、請求項２６又は２７に記載のプローブセット。
【請求項２９】
全てのメディエータープローブは、それぞれ異なる標的核酸配列を標的とする、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項３０】
前記メディエータープローブは請求項１０に規定した通りであり、及び／又は前記検出プローブは請求項１９又は２０に規定した通りである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれか１項に規定の１個以上のプローブセットを含むキット。
【請求項３２】
前記キットは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のプローブセットを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
キット中の全てのメディエータープローブは、異なる標的核酸配列をそれぞれ標的とする、請求項３１又は３２に記載のキット。
【請求項３４】
キット中の全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なる、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
キット中の全てのメディエータープローブに含まれる標的特異的配列は互いに異なる、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
キット中の全ての検出プローブは、同一又は異なるレポーター基で個別に標識されている、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
キットはさらに、上流オリゴヌクレオチド配列（例えば、請求項１又は１１に規定した上流オリゴヌクレオチド配列）、下流オリゴヌクレオチド配列（例えば、請求項１５又は１７に規定した下流オリゴヌクレオチド配列）、共通プライマー（例えば、請求項１８に規定した共通プライマー）、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、核酸ポリメラーゼ、又はそれらの任意の組合わせを含む、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３８】
キットはさらに、核酸ハイブリダイズ剤、メディエータープローブ切断剤、核酸伸長剤、核酸増幅剤、逆転写剤、又はそれらの任意の組合わせを含む、請求項３１〜３７のいずれか１項記載のキット。
【請求項３９】
ｍ個の検出プローブ及びｎ個のメディエータープローブを含むキットであって、
ｎは２以上の整数（例えばｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０又はそれ以上の整数）であり、ｍはｎより小さく０より大きい整数であり、
各メディエータープローブは、個別に５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記標的特異的配列は標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なり、
各検出プローブは、３’→５’方向に１個以上のメディエーター配列又はその一部に相補的な１個以上の捕捉配列及び鋳型配列を含み、前記ｍ個の検出プローブはメディエータープローブのメディエーター配列又はその一部にそれぞれ相補的である複数の（例えばｎ以上の）捕捉配列を含み、
各検出プローブは、個別にレポーター基及び消光基で標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に各検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる、キット。
【請求項４０】
試料中の前記標的核酸配列の存在又は量を検出するキットの製造における請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のプローブセットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は核酸分子の多重検出に関する。特に、本出願は試料中の複数の標的核酸配列の存在を同時に検出できる標的核酸配列の検出方法を提供する。さらに本出願は、プローブセット、ならびに１つ以上の前記プローブセットを含むキットを提供し、前記プローブセット及びキットを使用して本発明の方法を実施できる。
【背景技術】
【０００２】
リアルタイムＰＣＲは核酸を検出するための一般的な方法であり、それは簡易に操作されかつ広く使用されている。さらに、多重リアルタイムＰＣＲを使用して、１本の反応管内で複数の標的配列を同時に検出でき、これにより検出効率を改善するだけでなく、費用も削減できる。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ法では、標的配列を蛍光標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出できる。一般に、蛍光標識したプローブは、ＰＣＲ増幅用の２つのプライマー間で標的配列に特異的に結合して、プライマー二量体の非特異的増幅から生じる干渉シグナルを回避し、かつ検出結果の特定度を高める。多重リアルタイムＰＣＲのために、標的配列に特異的な複数のオリゴヌクレオチドプローブを使用する場合には、各オリゴヌクレオチドプローブを、異なる蛍光基によって標識できる。従って、各プローブが保持する固有の蛍光シグナルを検出して、各プローブによって特異的に認識される標的配列を検出できる。リアルタイムＰＣＲ法では、標的配列は、リアルタイム検出方式と増幅後の融解曲線解析（ポストＰＣＲ・ＭＣＡ方式とも呼ばれる）の２つの方式によって検出できる。リアルタイム検出方式では、標的配列の検出及びＰＣＲ増幅は、追加の工程の必要はなしに同時に実施される。従って、リアルタイム検出方式は簡易でかつ直接的である。しかしながら、その方式での一回分の検出で検出可能な標的配列の最大数は、リアルタイムＰＣＲ機器での蛍光検出チャネルの数により制限を受け、一般的には６個以下である。ＭＣＡ方式では、ＰＣＲ増幅後に追加の工程の実施が必要となり、すなわち、プローブと標的配列によって生成された二本鎖の融点を解析する必要がある。ＭＣＡ方式では、標的配列は蛍光色及び／又は融点によって認識又は識別できる。従って、ＭＣＡ方式は比較的複雑ではあるが（すなわち追加の工程が必要であるが）、一回分の検出で検出可能な標的配列の最大数は増大する。
【０００４】
しかしながら、多重リアルタイムＰＣＲにおける蛍光プローブに基づく検出にもいくつかの問題がある。まず蛍光プローブの調製は、複雑な化学修飾及び精製過程を含み、その調製費用は、非標識プローブの費用よりはるかに高い。従って、複数の蛍光プローブを使用すると検出費用が増大する。次に多重リアルタイムＰＣＲ法において、複数の蛍光プローブの共存は、反応系の蛍光のバックグラウンド値を増大させる可能性があり、それによりさらに検出感度が低下する。従って、できる限り少ない蛍光プローブを使用して、できる限り多くの標的配列を検出するために、多重リアルタイムＰＣＲ法を改良する必要性がある。
【０００５】
Faltinら(Clinical Chemistry 2012, 58(11): 1546-1556)は、「メディエータープローブ」に基づくリアルタイムＰＣＲ検出方法について述べている。従来のリアルタイムＰＣＲ検出方法では、標的配列に特異的な蛍光プローブが各標的配列に対して必要となる。しかしながら、Faltinらによって報告された方法では、各標的配列に対して２つのプローブが必要であり、それらは標的配列に特異的な非蛍光で標識したメディエータープローブ、及び標的配列に結合しない蛍光で標識した別のプローブ（蛍光プローブ）である。メディエータープローブは、３’末端の標的特異的配列と５’末端のタグ配列（メディエーター）からなり、一方の蛍光プローブは、メディエーターハイブリダイズ部位を備える３’末端での一本鎖配列と、消光基及び蛍光基を備えかつヘアピン構造を持つ５’末端での配列からなり、消光基及び蛍光基の両方ともヘアピン構造の腕部に位置しかつ互いに近接し、それにより蛍光の消光を引き起こすことができる。ＰＣＲ中に、メディエータープローブはその標的特異的配列を介して標的配列に結合し、５’末端のそのタグ配列（メディエーター）は一本鎖で遊離状態を保持し、次にメディエータープローブは、５’−ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼの存在下で酵素的に切断され、３’−ＯＨを担持するメディエーターを放出する。放出されたメディエーターは、蛍光プローブ上のメディエーターハイブリダイズ部位に結合し、ポリメラーゼによって伸長されて、消光基で標識された配列が切断又は置換され、蛍光基が消光基から分離されて、それにより蛍光強度が増大する。
【０００６】
Faltinらが述べている方法の特徴は、蛍光シグナルの発生が２つのプローブすなわちメディエータープローブ及び蛍光プローブに依存すること、このメディエータープローブは蛍光で標識されていないハイブリダイズプローブとして使用されること、また、この蛍光プローブはメディエーターに特異的に結合するが標的配列には結合しない蛍光シグナルを発生するのに使用されることである。この方法では、蛍光プローブを共通のプローブとして使用できる。例えば、単一リアルタイムＰＣＲを複数の標的配列を検出するのに使用する場合には、同一の蛍光プローブ及びそれぞれが固有の標的特異的配列を担持するが同じメディエーター配列を備える複数のメディエータープローブを使用してＰＣＲを実施できる。また、多重リアルタイムＰＣＲでは、各標的配列を認識又は識別する必要がない場合には、蛍光プローブ及び同一のメディエーター配列を持つ複数のメディエータープローブを用いて複数の標的配列の選別が可能となる。従来のリアルタイムＰＣＲ法と比較して、Faltinらの方法は、各標的配列に対し固有の蛍光プローブを合成する必要がなく共通の蛍光プローブを使用して、検出費用を著しく低減して複数の標的配列を検出できる。
【０００７】
しかしながら、Faltinらの方法には明らかな欠陥がある。特に、Faltinらの方法を各標的配列を識別する必要がある多重リアルタイムＰＣＲを実施するために使用する場合には、その方法では、標的特異的配列を担持するメディエータープローブ及び固有の蛍光シグナルを担持する対応する蛍光プローブを設計する必要がある。その場合に、１個のプローブが各標的配列に対して使用される従来の多重リアルタイムＰＣＲと比較して、Faltinらの方法は２倍の数のプローブを必要とする。それにより、反応系全体がより複雑になり、検出費用も高くなる。例えば、FaltinらはＨＰＶ１８及びヒトＡＣＴＢ遺伝子の同時検出のための二重ＰＣＲ法を開示していて、そこでは２個のメディエータープローブと２個の蛍光プローブが使用されるが、対照的に従来の二重リアルタイムＰＣＲ法は２個の蛍光プローブしか必要としない。同様の例は、Wadle Sら(Biotechniques 2016, 61 (3):123-8)でも見られ、これは合計で５個のメディエータープローブと５個の蛍光レポータープローブを使用する五重ＰＣＲシステムを説明している。対照的に、従来の五重リアルタイムＰＣＲ法では、５個の蛍光プローブしか必要とされない。その場合には、従来の多重リアルタイムＰＣＲと比較して、Faltinらの方法はより複雑でかつ費用がかかる。
【０００８】
米国公開特許第２０１３／０１０９５８８Ａ１号は、Faltinらの方法に類似する融解曲線解析でのリアルタイムＰＣＲ分析を開示しており、２つのプローブ（メディエータープローブに相当するＰＴＯプローブ、及び蛍光プローブに相当するＣＴＯプローブ）による標的配列の検出を達成している。それに関連して、米国公開特許第２０１３／０１０９５８８Ａ１号の方法は、Faltinらの方法と比較して類似の利点と欠点を有している。特に、この公開特許に記載される方法を用いて各標的配列を識別する必要がある多重リアルタイムＰＣＲを実施する場合に、この方法では各標的配列に対してＰＴＯプローブ及びＣＴＯプローブを設計する必要があり、すなわち２倍の数のプローブが使用される。例えばこの公開特許は、淋菌と黄色ブドウ球菌の同時検出のための二重リアルタイムＰＣＲを説明していて、２個のＰＴＯプローブ及び２個のＣＴＯプローブが使用されている。その場合に、１個のプローブが各標的配列に使用される従来の多重リアルタイムＰＣＲと比較して、米国公開特許第２０１３／０１０９５８８Ａ１号の方法はより複雑でかつ費用がかかる。
【０００９】
米国公開特許第２０１４／００５７２６４Ａ１号は、２個のプローブを用いる別のリアルタイムＰＣＲ方法を開示している。この方法では、標識したプローブの切断により蛍光シグナルが発生するので、ＭＣＡ方式ではなくリアルタイム検出方式でしか使用できない。さらに、Faltinらの方法と同様に、米国公開特許第２０１４／００５７２６４Ａ１号に記載される方法を用いて各標的配列を識別する必要がある多重リアルタイムＰＣＲを実施する場合に、その方法では、各標的配列に対し２個のプローブを設計する必要があり、反応系はより複雑でかつ費用がかかるものとなる。
【００１０】
米国公開特許第２０１５／００７２８８７Ａ１号は、融解曲線解析に有用なリアルタイムＰＣＲ分析を開示し、その標的配列の検出は３個のプローブによって達成される。しかしながら、この出願特許に記載された方法を用いて各標的配列を識別する必要がある多重リアルタイムＰＣＲを実施する場合に、この方法では各標的配列について３個のプローブを設計する必要があり、反応系はより複雑でかつ費用が掛かるものとなる。３個のプローブを使用する類似のリアルタイムＰＣＲ分析がさらに、米国公開特許第２０１５／０１６７０６０Ａ１号及び米国公開特許第２０１６／００６０６９０Ａ１号に開示されている。しかしながら、これらの方法も、米国公開特許第２０１５／００７２８８７Ａ１号に開示されている方法と類似しており、各標的配列を識別する必要がある多重リアルタイムＰＣＲを実施するために用いられる場合に、それらは従来のリアルタイムＰＣＲ法よりも複雑で費用が掛かる。
【００１１】
一般に、従来のリアルタイムＰＣＲ法と比較して、２個又は３個のプローブを使用する改良されたリアルタイムＰＣＲ法（例えば、Faltinらの方法）は、各標的配列を認識又は識別する必要がない一重リアルタイムＰＣＲ又は多重リアルタイムＰＣＲを実行する場合には顕著な利点があり、すなわち、同一のメディエーター配列であるが異なる標的特異的配列を保持する複数のメディエータープローブと共通の蛍光プローブとを使用して、検出費用を顕著に低減することができる。しかしながら、各標的配列を識別する必要がある多重リアルタイムＰＣＲを実施する場合には、これらの改良されたリアルタイムＰＣＲ法には、２倍さらに３倍の数のプローブを使用する必要があり、逆にその方法は、従来のリアルタイムＰＣＲ法より複雑でかつ費用が掛かる。
【００１２】
従って、より単純な反応系でより低い検出費用で各標的配列を識別する必要がある多重リアルタイムＰＣＲを実施するには、新規のリアルタイムＰＣＲ検出方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【００１３】
本出願において、他に特定されない限り、本明細書内で使用される科学用語及び技術用語は、当業者が一般に理解している意味を持つ。さらに、本明細書内で使用される核酸化学での実験室操作は、対応する分野で広く使用されている従来の操作である。一方、本発明の理解を深めるために、関連用語の定義及び説明を以下に示す。
【００１４】
本明細書内で使用する「標的核酸配列」、「標的核酸」及び「標的配列」という各語は、検出される対象の核酸配列を指す。本出願では、「標的核酸配列」、「標的核酸」及び「標的配列」の各語は、同じ意味を有し互換性がある。
【００１５】
本明細書内で使用する「メディエータープローブ」という語は、５’→３’方向にメディエーター配列及び標的配列（すなわち、標的特異的配列）を含む一本鎖核酸分子を指す。本出願では、メディエーター配列は標的核酸配列に相補的な配列を含まず、標的特異的配列は標的核酸配列に相補的な配列を含む。従って、核酸のハイブリダイズ、アニール又は増幅を可能にする条件下で、メディエータープローブは、標的特異的配列を経て標的核酸配列とハイブリダイズ又はアニールし（すなわち、二本鎖構造を生成し）、メディエータープローブ中のメディエーター配列は、前記標的核酸配列とハイブリダイズせずに遊離状態となる（すなわち一本鎖構造を保持している）。
【００１６】
本明細書内で使用する「標的配列」及び「標的特異的配列」という各語は、核酸のハイブリダイズ、アニール又は増幅を可能にする条件下で、標的核酸配列と選択的／特異的にハイブリダイズ又はアニールできる配列を指し、かつ標的核酸配列に相補的な配列を含む。本出願では、「標的配列」及び「標的特異的配列」の各語は、同じ意味を有し互換性がある。標的配列又は標的特異的配列は、標的核酸配列に対し特異的であると容易に理解できる。言い換えれば、核酸のハイブリダイズ、アニール又は増幅を可能にする条件で、標的配列又は標的特異的配列は、特定の標的核酸配列とのみハイブリダイズ又はアニールし、他の核酸配列とはハイブリダイズもアニールもしない。
【００１７】
本明細書内で使用する「メディエーター配列」という語は、メディエータープローブ中のオリゴヌクレオチド配列を指し、その配列は標的核酸配列に相補的ではなく、かつ標的特異的配列に対し上流（５’末端）に位置する。本出願では、各標的核酸配列に対し固有のメディエーター配列を有する固有のメディエータープローブが設計又は提供される（つまり、使用される全てのメディエータープローブ中のメディエーター配列は互いに異なっている）。すなわち、各標的核酸配列は、固有のメディエータープローブ（固有のメディエーター配列）に対応する。従って、前記固有のメディエーター配列を検出して、それに対応する標的核酸配列を検出できる。
【００１８】
本明細書内で使用される「上流オリゴヌクレオチド配列」という語は、標的核酸配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド配列を指し、その配列は、核酸のハイブリダイズ（又はアニール）又は増幅を可能にする条件で、標的核酸配列とハイブリダイズ（又はアニール）でき、かつ標的核酸配列とハイブリダイズする場合にメディエータープローブの上流に位置する。
【００１９】
本明細書内で使用する「相補的」という語は、相補的塩基対形成の原理（ワトソン・クリックの原理）に基づいて２つの核酸配列間に水素結合が形成でき、それにより二本鎖を生成できることを意味している。本出願では、「相補的」という語は、「実質的に相補的」と「完全に相補的」の両方を含んでいる。本明細書内で使用される「完全に相補的」という語は、核酸配列中の各塩基が、不整合や乖離がなく別の核酸鎖中の塩基と対合できることを意味する。本明細書内で使用される「実質的に相補的」という語は、核酸配列中の大半の塩基が別の核酸鎖中の塩基と対合できるが、不整合や乖離は許容されることを意味する（例えば１つ以上の核酸の不整合や乖離は存在してもよい）。一般に、核酸のハイブリダイズ、アニール又は増幅を可能にする条件で、２つの「相補的」（例えば、実質的に相補的又は完全に相補的）な核酸配列は、互いに選択的又は特異的にハイブリダイズ又はアニールして二本鎖を生成する。例えば、本出願では、メディエータープローブ中の上流オリゴヌクレオチド配列及び標的特異的配列は、それぞれ標的核酸配列に対して相補的（例えば、実質的に相補的又は完全に相補的）な配列を含む。従って、核酸のハイブリダイズ、アニール又は増幅を可能にする条件で、メディエータープローブ中の上流オリゴヌクレオチド配列及び標的特異的配列は、標的核酸配列と選択的／特異的にハイブリダイズ又はアニールする。それに関連して、「相補的でない」という語は、核酸のハイブリダイズ、アニール又は増幅を可能にする条件で、２つの核酸配列が互いにハイブリダイズもアニールもできず、二本鎖を生成できないことを意味する。例えば本出願では、メディエーター配列は標的核酸配列に相補的でない配列を含む。従って、核酸のハイブリダイズ、アニール又は増幅を可能にする条件で、メディエーター配列は標的核酸配列とハイブリダイズ又はアニールしないために二本鎖を生成できず、遊離状態（すなわち一本鎖構造を保持している）となる。
【００２０】
本明細書内で使用する「ハイブリダイズする／ハイブリダイズ」及び「アニールする／アニール」という各語は、相補的な一本鎖核酸分子によって二本鎖核酸を生成する過程を指す。本出願では、「ハイブリダイズする／ハイブリダイズ」及び「アニールする／アニール」は、同じ意味を有し互換性がある。一般に、２つの完全に相補的又は実質的に相補的な核酸配列は、互いにハイブリダイズ又はアニールすることができる。ハイブリダイズ又はアニールに必要な２つの核酸配列の相補性は、使用されるハイブリダイズ条件、特に温度に依存する。
【００２１】
本明細書内で使用する「核酸のハイブリダイズを可能にする条件」という表現は、当業者が一般に理解している意味を持ち、従来の方法によって決定できる。例えば、相補的配列を持つ２つの核酸分子は、適切なハイブリダイズ条件で互いにハイブリダイズできる。そのハイブリダイズ条件は、ハイブリダイズ緩衝液の温度、ｐＨ値、成分及びイオン強度などの因子に関連してもよく、かつ２つの相補的核酸分子の長さ及びＧＣ含量によって決定できる。例えば、２つの相補的な核酸分子が比較的短く及び／又は比較的低いＧＣ含量を持つ場合に、低ストリンジェントな(緊縮性)ハイブリダイズ条件を使用できる。２つの相補的核酸分子が比較的長く及び／又は比較的高いＧＣ含量を持つ場合に、高ストリンジェントなハイブリダイズ条件を使用できる。そのようなハイブリダイズ条件は当業者に周知である（例えば、Joseph SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)、及びM. L. M. AndersonのNucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y. (1999)を参照）。本出願では、「ハイブリダイズする／ハイブリダイズ」及び「アニールする／アニール」の各語は、同じ意味を持ち互換性がある。それに関連して、「核酸のハイブリダイズを可能にする条件」及び「核酸のアニールを可能にする条件」の各表現もまた、同じ意味を持ち互換性がある。
【００２２】
本明細書内で使用する「核酸の増幅を可能にする条件」という表現は、当業者が一般に理解している意味を有し、核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）が１つの核酸鎖を別の核酸鎖を合成するための鋳型として使用して二本鎖の生成を可能にする条件を指す。その条件は当業者に周知であり、ハイブリダイズ緩衝液の温度、ｐＨ値、成分、濃度及びイオン強度などの因子に関連してもよい。適切な核酸の増幅条件は、従来の方法によって決定できる（例えば、Joseph SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照）。本発明の方法では、「核酸増幅を可能にする条件」は、好ましくは核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の作用条件である。
【００２３】
本明細書内で使用する「核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件」という表現は、当業者が一般に理解している意味を有し、核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）が１つの核酸鎖を別の核酸鎖（例えばプライマー又はプローブ）を伸長するための鋳型として使用して二本鎖の生成を可能にする条件を指す。その条件は当業者に周知であり、ハイブリダイズ緩衝液の温度、ｐＨ値、成分、濃度及びイオン強度などの因子に関連してもよい。適切な核酸増幅条件は、従来の方法によって決定できる（例えば、Joseph SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照）。本発明の方法では、「核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件」は、好ましくは核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の作用条件である。本出願では、「核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件」及び「核酸伸長を可能にする条件」という表現は、同じ意味を有し互換性がある。
【００２４】
本明細書内で使用する「メディエータープローブの切断を可能にする条件」という表現は、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素が標的核酸配列にハイブリダイズしたメディエータープローブを切断し、メディエーター配列又はその一部を含む核酸断片を放出する条件を指す。本発明の方法では、メディエータープローブの切断を可能にする条件は、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素の作用条件であることが好ましい。例えば、使用される５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素が５’ヌクレアーゼ活性を持つ核酸ポリメラーゼである場合に、メディエータープローブの切断を可能にする条件は、前記核酸ポリメラーゼの作用条件であってもよい。
【００２５】
様々な酵素の作用条件は、従来の方法で当業者により決定され、一般的に緩衝液の温度、ｐＨ値、成分、濃度、及びイオン強度などの因子と関連してもよい。あるいは、酵素の製造元が推奨する条件を使用できる。
【００２６】
本明細書内で使用する「核酸変性」という語は、当業者が一般に理解している意味を有し、二本鎖の核酸分子を一本鎖に解離する過程を指す。「核酸変性を可能にする条件」という表現は、二本鎖核酸分子の一本鎖への解離を可能にする条件を指す。その条件は、当業者が旧来に沿って決定できる（例えば、Joseph SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照）。例えば、核酸変性は、加熱、アルカリ処理、尿素処理、及び酵素的方法（例えば、ヘリカーゼを使用する方法）などの従来の技術によって実施することができる。本出願では、核酸は加熱条件下で変性されるのが好ましい。例えば、核酸は、８０〜１０５℃への加熱によって変性できる。
【００２７】
本明細書内で使用する「上流」という語は、２つの核酸配列（又は２つの核酸分子）の相対位置を説明するように使用され、当業者が一般に理解している意味を有する。例えば、「１つの核酸配列が別の核酸配列の上流に位置する」という表現は、５’→３’方向に配列された場合に、後者の核酸配列と比較して前者の核酸配列が正面により近い位置（すなわち５’末端に近い位置）にあることを意味する。本明細書内で使用する場合に、「下流」という語の意味は、「上流」という語の意味と反対である。
【００２８】
本明細書内で使用する「蛍光プローブ」という語は、蛍光基を担持し、かつ蛍光シグナルを発生できるオリゴヌクレオチドを指す。本出願では、検出プローブとして蛍光プローブを使用できる。
【００２９】
本明細書内で使用する「融解曲線解析」という語は、当業者が一般に理解している意味を有し、二本鎖核酸分子の存在又は素性を二本鎖核酸分子の融解曲線によって解析する方法を指し、かつその解析を使用して二本鎖核酸分子の解離特性を評価する。融解曲線解析を実施する方法は、当業者に周知である（例えば、The Journal of Molecular Diagnostics 2009, 11 (2): 93-101を参照）。本出願では、「融解曲線解析」及び「融解解析」という各語は、同じ意味を有し互換性がある。
【００３０】
本出願のいくつかの好ましい態様において、レポーター基及び消光基で標識された検出プローブを使用して融解曲線を解析できる。要するに、検出プローブ及びその相補的配列は、周囲温度で塩基対合によって二本鎖を生成できる。この場合に、検出プローブ表面のレポーター基（例えば蛍光基）と消光基は互いに離れていて、消光基はレポーター基により生成されたシグナル（例えば蛍光シグナル）を吸収できず、そのシグナル（例えば蛍光シグナル）を検出できる。温度の上昇につれ、二本鎖の２つの鎖は解離し始め（すなわち、検出プローブはその相補的配列から徐々に解離され）、解離された検出プローブは一本鎖でランダムなコイル状になる。この場合に、解離された検出プローブ表面のレポーター基（例えば蛍光基）と消光基は互いに近接しているので、レポーター基（例えば蛍光基）によって発生したシグナル（例えば蛍光シグナル）は消光基により吸収される。従って、温度の上昇につれ、検出するシグナル（例えば蛍光シグナル）は徐々に弱まる。二本鎖の２つの鎖が完全に解離すると、全ての検出プローブは一本鎖でランダムなコイル状になる。この場合に、全ての検出プローブ表面のレポーター基（例えば蛍光基）により発生したシグナル（例えば蛍光シグナル）は消光基により吸収される。それにより、レポーター基（例えば蛍光基）によって発生したシグナル（例えば蛍光シグナル）は実質的に検出することができない。従って、加熱又は冷却中に検出プローブを含む二本鎖によって発生したシグナル（例えば蛍光シグナル）を検出して、検出プローブとその相補的配列とのハイブリダイズ及び解離過程を観察でき、シグナル強度が温度変化と共に変化する曲線が得られる。さらに得られた曲線の導出解析により、縦軸に信号強度の変化率、横軸に温度をとった曲線（二本鎖の融解曲線）を得ることができる。融解曲線のピークは融解ピークであり、ピークに対応する温度は前記二本鎖の融点（Ｔｍ値）である。一般に、検出プローブとその相補的配列との間の一致度が高いほど（例えば、より少ない塩基が不一致であり、より多くの塩基が対合している）、二本鎖のＴｍ値は高い。従って、二本鎖のＴｍ値を検出して、二本鎖中の検出プローブに相補的な配列の存在及び素性を決定できる。本明細書内で使用する「融解ピーク」、「融点」及び「Ｔｍ値」という語は、同じ意味を有し互換性がある。
検出方法
【００３１】
一態様において、本発明は、試料中の少なくとも２つの標的核酸配列の存在を検出する方法を提供する。
この方法は、以下の工程：
（１）核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を第１の上流オリゴヌクレオチド配列、第１のメディエータープローブ、第２の上流オリゴヌクレオチド配列、及び第２のメディエータープローブに接触させる工程；
ここで、
（ｉ）前記第１の上流オリゴヌクレオチド配列は第１の標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記第１のメディエータープローブは、５’→３’方向に第１のメディエーター配列と第１の標的特異的配列とを含み、前記第１のメディエーター配列は第１の標的核酸配列と相補的でない配列を含み、前記第１の標的特異的配列は第１の標的核酸配列に相補的な配列を含み、第１の上流オリゴヌクレオチド配列は、第１の標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、第１の標的特異的配列の上流に位置し、
（ii）前記第２の上流オリゴヌクレオチド配列は第２の標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記第２のメディエータープローブは、５’→３’方向に第２のメディエーター配列と第２の標的特異的配列とを含み、前記第２のメディエーター配列は第２の標的核酸配列と相補的ではない配列を含み、前記第２の標的特異的配列は第２の標的核酸配列に相補的な配列を含み、第２の上流オリゴヌクレオチド配列は、第２の標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、第２の標的特異的配列の上流に位置し、かつ
（iii）前記第１のメディエーター配列は、前記第２のメディエーター配列とは異なる；
（２）メディエータープローブの切断を可能にする条件で、工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる工程；
（３）核酸のハイブリダイズを可能にする条件下で、工程（２）の生成物を、３’→５’方向に第１のメディエーター配列又はその一部に相補的な第１の捕捉配列、第２のメディエーター配列又はその一部に相補的な第２の捕捉配列、及び鋳型配列を含む検出プローブに接触させる工程；
ここで、前記検出プローブはレポーター基及び消光基で標識され、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基により発生したシグナルを吸収又は消光でき、前記検出プローブによってその相補的配列とハイブリダイズする際に発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる；
（４）核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能とする条件で、工程（３）の生成物を核酸ポリメラーゼに接触させる工程；及び
（５）工程（４）の生成物に融解曲線解析を実施し、融解曲線解析の結果に従って、前記第１の標的核酸配列及び前記第２の標的核酸配列が前記試料中に存在するかどうかを決定する工程；を含む。
【００３２】
本発明の方法の工程（１）では、前記第１の上流オリゴヌクレオチド配列は第１の標的核酸配列に相補的な配列を含み、かつ前記第１の標的特異的配列は第１の標的核酸配列に相補的な配列を含むので、第１の標的核酸配列が存在する場合に、前記第１の上流オリゴヌクレオチド配列及び前記第１のメディエータープローブの両方とも、前記第１の標的核酸配列とハイブリダイズする。同様に、前記第２の上流オリゴヌクレオチド配列は第２の標的核酸配列に相補的な配列を含み、かつ前記第２の標的特異的配列は第２の標的核酸配列に相補的な配列を含むので、第２の標的核酸配列が存在する場合に、前記第２の上流オリゴヌクレオチド配列及び前記第２のメディエータープローブの両方とも、前記第２の標的核酸配列とハイブリダイズする。
【００３３】
本発明の方法の工程（２）では、第１の標的核酸配列が存在する場合に、前記第１の上流オリゴヌクレオチド配列及び前記第１のメディエータープローブの両方とも、前記第１の標的核酸配列とハイブリダイズする。さらに、前記第１メディエーター配列は第１の標的核酸配列と相補的ではない配列を含むので、第１のメディエータープローブ中の第１のメディエーター配列は遊離状態にあり、第１の標的核酸配列とハイブリダイズしない。この場合に、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素の存在下では、第１メディエーター配列又はその一部は、第１の上流オリゴヌクレオチド配列又はその伸長産物の存在により、第１の標的核酸配列とハイブリダイズした第１のメディエータープローブから切り離されて第１のメディエーター断片を生成する。同様に、第２の標的核酸配列が存在する場合に、前記第２の上流オリゴヌクレオチド配列及び前記第２のメディエータープローブの両方とも、前記第２の標的核酸配列とハイブリダイズし、第２のメディエータープローブ中の第２のメディエーター配列は遊離状態にあり、第２の標的核酸配列とハイブリダイズしない。この場合に、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素の存在下では、第２メディエーター配列又はその一部は、第２の上流オリゴヌクレオチド配列又はその伸長産物の存在により、第２の標的核酸配列とハイブリダイズした第２のメディエータープローブから切り離されて第２のメディエーター断片を生成する。
【００３４】
本発明の方法の工程（３）では、第１のメディエーター断片が存在する場合に、第１のメディエーター断片は第１のメディエーター配列又はその一部を含み、かつ検出プローブは第１のメディエーター配列又はその一部に相補的な第１の捕捉配列を含むので、前記第１のメディエーター断片は前記検出プローブとハイブリダイズする。同様に、第２のメディエーター断片が存在する場合に、第２のメディエーター断片は第２のメディエーター配列又はその一部を含み、かつ検出プローブは第２のメディエーター配列又はその一部に相補的な第２の捕捉配列を含むので、前記第２のメディエーター断片は前記検出プローブとハイブリダイズする。
【００３５】
本発明の方法の工程（４）では、第１のメディエーター断片が存在する場合に、前記第１のメディエーター断片は前記検出プローブとハイブリダイズし、かつ前記検出プローブは追加の配列（例えば鋳型配列）を含むので、核酸ポリメラーゼは、前記検出プローブを鋳型として使用し、第１のメディエーター断片を伸長して第１の二本鎖を生成する。同様に、第２のメディエーター断片が存在する場合に、前記第２のメディエーター断片は前記検出プローブとハイブリダイズし、かつ前記検出プローブは追加の配列（例えば鋳型配列）を含むので、核酸ポリメラーゼは鋳型として前記検出プローブを使用し、第２のメディエーター断片を伸長して第２の二本鎖を生成する。
【００３６】
本発明の方法の工程（５）では、第１の二本鎖が存在する場合に、第１の二本鎖に対応する融解ピークを検出できる。従って、第１の二本鎖に対応する融解ピークの有無を決定して、第１の標的核酸配列が前記試料中に存在か又は不存在かを決定できる。例えば、第１の二本鎖に対応する融解ピークが検出又は非検出の場合に、前記試料中に第１の標的核酸配列が存在又は不存在と決定される。同様に、第２の二本鎖に対応する融解ピークの有無を決定して、第２の標的核酸配列が前記試料中に存在か又は不存在かを決定できる。例えば、第２の二本鎖に対応する融解ピークが検出又は非検出の場合に、前記試料中に第２の標的核酸配列が存在又は不存在と決定される。
【００３７】
特に本発明の方法では、使用した第１のメディエーター配列は使用した第２のメディエーター配列と異なるために、生成された第１のメディエーター断片は、第２のメディエーター断片とは異なる配列を有し、かつ前記検出プローブに異なる位置でハイブリダイズする。従って、第１のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第１の二本鎖は、第２のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第２の二本鎖とは構造（配列）が異なる。これに対応して、第１の二本鎖は、第２の二本鎖とは異なる融点（Ｔｍ値）を持つ。それゆえに融解曲線解析では、第１の二本鎖は、第２の二本鎖とは異なる融解ピークを示す。従って、第１の二本鎖又は第２の二本鎖の融解ピークを決定して、試料中の第１の標的核酸配列又は第２の標的核酸配列の存在を決定できる。
【００３８】
また、第１のメディエーター配列、第２のメディエーター配列、及び検出プローブの配列は、既知であるか又は所定であるので、第１の二本鎖及び第２の二本鎖の融点（Ｔｍ値）は予め算出できる。従って、融解曲線解析において第１の二本鎖又は第２の二本鎖の融点（Ｔｍ値）に対応する融解ピークを決定して、試料中の第１の標的核酸配列又は第２の標的核酸配列の存在を決定できる。
【００３９】
上記と同じ原理に基づいてより多くのメディエータープローブを設計することにより、本発明の方法を使用してより多くの標的核酸配列を同時に検出することができる。いくつかの好ましい態様において、工程（１）では、第１の上流オリゴヌクレオチド配列、第１のメディエータープローブ、第２の上流オリゴヌクレオチド配列、及び第２のメディエータープローブに加えて、核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料をさらに第３の上流オリゴヌクレオチド配列及び第３のメディエータープローブに接触させ、
前記第３の上流オリゴヌクレオチド配列は、第３の標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記第３のメディエータープローブは、５’→３’方向に第３のメディエーター配列及び第３の標的特異的配列を含み、前記第３のメディエーター配列は前記第３の標的核酸配列と相補的でない配列を含み、前記第３の標的特異的配列は第３の標的核酸配列に相補的な配列を含み、かつ
第３の標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、第３の上流オリゴヌクレオチド配列は第３の標的特異的配列の上流に位置し、前記第３のメディエーター配列は前記第１及び第２のメディエーター配列とは異なり、かつ
工程（３）では、使用する検出プローブは、第３のメディエーター配列又はその一部に相補的な第３の捕捉配列をさらに含み、その捕捉配列は前記鋳型配列の下流に位置する。
【００４０】
これらの態様において、工程（１）では、第３の標的核酸配列が存在する場合に、前記第３の上流オリゴヌクレオチド配列及び前記第３のメディエータープローブは、前記第３の標的核酸配列とハイブリダイズする。さらに工程（２）では、第３の標的核酸配列が存在する場合に、第３のメディエーター配列又はその一部は、第３の上流オリゴヌクレオチド配列又はその伸長産物の存在により、第３の標的核酸配列とハイブリダイズした第３のメディエータープローブから切り離されて、第３のメディエーター断片を生成する。さらに工程（３）及び（４）では、第３のメディエーター断片が存在する場合に、前記第３のメディエーター断片は前記検出プローブとハイブリダイズし、前記核酸ポリメラーゼは、前記検出プローブを鋳型として使用し、第３のメディエーター断片を伸長して第３の二本鎖を生成する。さらに工程（５）では、第３の二本鎖に対応する融解ピークが決定されると、第３の標的核酸配列の前記試料中での有無が決定される。
【００４１】
同様に、本発明の方法では、使用した第１、第２及び第３のメディエーター配列が異なるので、生成した第１のメディエーター断片、第２のメディエーター断片及び第３のメディエーター断片は異なる配列を有し、異なる位置で前記検出プローブにハイブリダイズする。従って、第１のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第１の二本鎖、第２のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第２の二本鎖、及び第３のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第３の二本鎖は、構造（配列）が互いに異なる。それに対応して、前記の第１、第２及び第３の二本鎖は異なる融点（Ｔｍ値）を持つ。それゆえに、融解曲線解析で前記の第１、第２及び第３の二本鎖は互いに識別可能な三つの融解ピークを示す。従って、第１、第２又は第３の二本鎖の融解ピークを決定して、前記試料中の第１、第２又は第３の標的核酸配列の存在を決定できる。
【００４２】
また、第１、第２、第３のメディエーター配列と検出プローブの配列は、既知であるか所定であるので、第１、第２、第３の二本鎖の融点（Ｔｍ値）は予め算出できる。従って、融解曲線解析で第１、第２又は第３の二本鎖の融点（Ｔｍ値）に対応する融解ピークを決定して、試料中の第１、第２又は第３の標的核酸配列の存在を決定できる。
【００４３】
いくつかの好ましい態様において、工程（１）では、第１の上流オリゴヌクレオチド配列、第１のメディエータープローブ、第２の上流オリゴヌクレオチド配列、第２のメディエータープローブ、第３の上流オリゴヌクレオチド配列、及び第３のメディエータープローブに加えて、前記試料を第４の上流オリゴヌクレオチド配列及び第４のメディエータープローブにさらに接触させる。
ここで、前記第４の上流オリゴヌクレオチド配列は、第４の標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記第４のメディエータープローブは、５’→３’方向に第４のメディエーター配列及び第４の標的特異的配列を含み、前記第４のメディエーター配列は、前記第４の標的核酸配列と相補的ではない配列を含み、前記第第４の標的特異的配列は、前記第４の標的核酸配列に相補的な配列を含み、かつ
第４の標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、第４の上流オリゴヌクレオチド配列は第４の標的特異的配列の上流に位置し、前記第４のメディエーター配列は、前記の第１、第２及び第３のメディエーター配列とは異なる。
また、工程（３）では、使用する検出プローブはさらに、第４のメディエーター配列またはその一部に相補的な第４の捕捉配列を含み、この第４の捕捉配列は前記鋳型配列の下流に位置する。
【００４４】
これらの態様において、工程（１）では、第４の標的核酸配列が存在する場合に、前記第４の上流オリゴヌクレオチド配列及び前記第４のメディエータープローブは、前記第４の標的核酸配列とハイブリダイズする。さらに工程（２）では、第４の標的核酸配列が存在する場合に、第４のメディエーター配列又はその一部は、第４の上流オリゴヌクレオチド配列又はその伸長産物の存在により、第４の標的核酸配列とハイブリダイズした第４のメディエータープローブから切り離されて、第４のメディエーター断片を生成する。さらに工程（３）及び（４）では、第４のメディエーター断片が存在する場合に、前記第４のメディエーター断片は前記検出プローブとハイブリダイズし、前記核酸ポリメラーゼは、前記検出プローブを鋳型として使用し、第４のメディエーターを伸長して第４の二本鎖を生成する。さらに工程（５）では、第４の二本鎖に対応する融解ピークが検出又は非検出の場合に、前記試料中に第４の標的核酸配列が存在又は不存在と決定する。
【００４５】
同様に、本発明の方法では、使用する第１、第２、第３及び第４のメディエーター配列が異なるので、生成する第１のメディエーター断片、第２のメディエーター断片、第３のメディエーター断片、及び第４のメディエーター断片は、異なる配列を持ち、異なる位置で前記検出プローブに対しハイブリダイズする。従って、第１のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第１の二本鎖、第２のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第２の二本鎖、第３のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第３の二本鎖、及び第４のメディエーター断片と検出プローブとの伸長産物を含む第４の二本鎖は、構造（配列）が互いに異なる。それに対応して、前記第１、第２、第３及び第４の二本鎖は異なる融点（Ｔｍ値）を持つ。従って、融解曲線解析で前記の第１、第２、第３及び第４の二本鎖は互いに識別可能な４つの融解ピークを示す。それゆえに、第１、第２、第３及び第４の二本鎖の融解ピークを検出して、前記試料中の第１、第２、第３及び第４の標的核酸配列の存在を決定できる。
【００４６】
また、第１、第２、第３及び第４のメディエーター配列と検出プローブの配列は、既知であるか所定であるので、第１、第２、第３及び第４の二本鎖の融点（Ｔｍ値）は予め算出できる。従って、融解曲線解析で第１、第２、第３及び第４の二本鎖の融点（Ｔｍ値）に対応する融解ピークを検出して、試料中の第１、第２、第３及び第４の標的核酸配列の存在を決定できる。
【００４７】
同様に、より多くの上流オリゴヌクレオチド配列及びより多くのメディエータープローブを使用して、本発明の方法を実施することができる。例えば、いくつかの態様では、５個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、５個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブを使用して、本発明の方法を実施することができる。
ここで、各上流オリゴヌクレオチド配列は標的核酸配列に相補的な配列を含み、
各メディエータープローブは５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記メディエーター配列は標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、前記標的特異的配列は標的核酸配列に相補的な配列を含み、それによって、特定の標的核酸配列が存在する場合に、標的核酸配列に対応する上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブは標的核酸配列とハイブリダイズでき、標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記メディエータープローブの標的特異的配列の上流に位置し、全てのメディエータープローブ内に含まれるメディエーター配列は互いに異なる。
かつ、前記検出プローブは鋳型配列及び前記鋳型配列の下流に位置し、それぞれ１個のメディエータープローブ中のメディエーター配列又はその一部に相補的である複数の配列を含む。これらの態様において、本発明の方法を用いて５個以上の標的核酸配列を同時に検出することができる。
【００４８】
いくつかの態様において、本発明の方法は、６個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、６個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブ、好ましくは７個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、７個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブ、好ましくは８個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、８個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブ、好ましくは９個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、９個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブ、好ましくは１０個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、１０個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブ、好ましくは１２個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、１２個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブ、好ましくは１５個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、１５個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブ、好ましくは２０個以上の上流オリゴヌクレオチド配列、２０個以上のメディエータープローブ及び１個の検出プローブを使用することができ、前記上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ及び検出プローブは、先に定義したのと同一の意味を持つ。これらの態様において、本発明の方法を使用して、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、又は２０個以上の標的核酸配列を同時に検出できる。
【００４９】
従って、いくつかの態様において、本発明は、試料中のｎ個の標的核酸配列の存在を検出する方法を提供し、ｎは２以上の整数（例えば、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の整数）である。この方法は、以下の工程：
（１）検出する各標的核酸配列に対して上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブを提供し、そして核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、試料を提供した上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブに接触させる工程；
ここで、前記上流オリゴヌクレオチド配列は、前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエータープローブは５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、前記標的特異的配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の上流に位置し、全てのメディエータープローブ中に含まれるメディエーター配列は互いに異なる；
（２）メディエータープローブの切断を可能にする条件で、工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に接触させる工程；
（３）核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、工程（２）の生成物を３’→５’方向に各メディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列及び鋳型配列を含む検出プローブに接触させる工程；
ここで、前記検出プローブは、レポーター基及び消光基で標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生し、かつ前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光することができ、その相補的配列とハイブリダイズする際に前記検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる；
（４）核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能とする条件下で、工程（３）の生成物を核酸ポリメラーゼに接触させる工程；及び
（５）工程（４）での生成物に融解曲線解析を実施し、融解曲線解析の結果に従って前記ｎ個の標的核酸配列が前記試料中に存在するか否かを決定する工程；を含む。
【００５０】
これらの態様の工程（１）では、特定の標的核酸配列が存在する場合に、標的核酸配列に対応する上流オリゴヌクレオチド配列（すなわち、標的核酸配列に相補的な配列を含む上流オリゴヌクレオチド配列）、及び標的核酸配列に対応するメディエータープローブ（すなわち、標的核酸配列に相補的な配列を含む標的特異的配列を含むメディエータープローブ）の両方が、標的核酸配列とハイブリダイズする。
【００５１】
さらにこれらの態様の工程（２）では、特定の標的核酸配列が存在する場合に、標的核酸配列に対応する上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブは、標的核酸配列とハイブリダイズするが、前記メディエータープローブ中のメディエーター配列は遊離状態にあり、かつ標的核酸配列とハイブリダイズしない。その場合に、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素の存在で、前記メディエータープローブ（標的核酸配列に対応するメディエータープローブ）中のメディエーター配列又はその一部は、標的核酸配列に対応する上流オリゴヌクレオチド配列（又はその伸長産物）の存在により、前記メディエータープローブから切り離されて標的核酸配列に対応するメディエーター断片を生成する。
【００５２】
さらにこれらの態様の工程（３）及び（４）では、特定の標的核酸配列に対応するメディエーター断片が存在する場合に、前記メディエーター断片は前記検出プローブとハイブリダイズし、前記核酸ポリメラーゼは前記検出プローブを鋳型として使用し、前記メディエーター断片を伸長して前記標的核酸配列に対応する二本鎖を生成する。さらにこれらの態様の工程（５）では、特定の標的核酸配列に対応する二本鎖の融解ピークが検出又は非検出の場合に、前記標的核酸配列が前記試料中に存在又は不存在と決定する。
【００５３】
特に、これらの態様において、使用する全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なるので、生成する各メディエーター断片は異なる配列を持ち、異なる位置で前記検出プローブとハイブリダイズする。従って、メディエーター断片の伸長産物と検出プローブとからなる各二本鎖は、構造（配列）が異なる。それに対応して、各二本鎖は異なる融点（Ｔｍ値）を持つ。それゆえに、融解曲線解析で各二本鎖は異なる融解ピークを示す。従って、特定の二本鎖の融解ピークを検出して、試料中の二本鎖に対応する標的核酸配列の存在を決定できる。
【００５４】
また、各メディエーター配列及び検出プローブの配列は既知であるか所定であるので、各二本鎖の融点（Ｔｍ値）は予め算出できる。従って、融解曲線解析で所定の二本鎖の融点（Ｔｍ値）に対応する融解ピークを検出して、試料中の二本鎖に対応する標的核酸配列の存在を決定できる。
【００５５】
本発明の方法の基本原理は、上記に簡潔に要約されている。本発明の方法の工程を参照して、本発明の方法を詳細に説明し例示する。
工程（１）及び（２）に関し、
【００５６】
本発明の方法では、試料中の標的核酸配列（例えば、存在する場合は第１又は第２の標的核酸配列）は、対応する上流オリゴヌクレオチド配列（例えば第１又は第２の上流オリゴヌクレオチド配列）及び対応するメディエータープローブ（例えば第１又は第２のメディエータープローブ）とまずハイブリダイズする。
【００５７】
本発明の方法では、検出する試料はいずれの試料でもよい。例えば、いくつかの好ましい態様において、試料はＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）を含むか又はＤＮＡである。いくつかの好ましい態様において、試料はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を含むか又はＲＮＡである。いくつかの好ましい態様において、試料は核酸の混合物（例えば、ＤＮＡの混合物、ＲＮＡの混合物、又はＤＮＡとＲＮＡの混合物）を含むか又は核酸の混合物である。
【００５８】
本発明の方法では、検出される標的核酸配列は、その配列又は長さに関し限定されない。例えば前記標的核酸配列は、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）分子又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）分子のいずれでもよい。さらに、検出される標的核酸配列は一本鎖又は二本鎖のいずれでもよい。
【００５９】
検出される試料又は標的核酸配列がｍＲＮＡである場合に、好ましくは、本発明の方法を実施する前に、逆転写反応を実施して前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを取得する。逆転写反応の詳細な説明に関しては、例えば、Joseph Sam-brookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照のこと。
【００６０】
検出される試料又は標的核酸配列は、任意の供給源から取得でき、供給源には限定はないが、原核生物、真核生物（例えば原生動物、寄生虫、真菌、酵母、植物、哺乳動物及びヒトを含む動物）又はウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）又はウイルス様体が挙げられる。検出される試料又は標的核酸配列はまた、任意の態様の核酸配列で、例えば、ゲノム配列、人工的に単離又は断片化した配列、合成配列などであってもよい。
【００６１】
本発明のいくつかの態様において、メディエータープローブは、天然起源のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせを含むか、又はそれらからなってもよい。いくつかの好ましい態様において、メディエータープローブは天然のヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むか又はそれらからなる。いくつかの好ましい態様において、メディエータープローブは、修飾ヌクレオチド、例えば修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、例えば５−メチルシトシン又は５−ヒドロキシメチルシトシンを含む。いくつかの好ましい態様において、メディエータープローブは、非天然ヌクレオチド、例えばデオキシヒポキサンチン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、５−ニトロインドール又はロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【００６２】
本発明の方法では、メディエータープローブの長さは限定されない。例えば、メディエータープローブの長さは、１５〜１０００ｎｔであってもよく、例えば、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、８００〜９００ｎｔ、９００〜１０００ｎｔであってもよい。例えば、メディエータープローブの長さは、１５〜１５０ｎｔであってもよく、例えば１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔ、１４０〜１５０ｎｔであってもよい。メディエータープローブ中の標的特異的配列は、その配列が標的核酸配列と特異的にハイブリダイズできるなら、いずれの長さであってもよい。例えば、メディエータープローブ中の標的特異的配列の長さは、１０〜５００ｎｔであってもよく、例えば、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１５０ｎｔ、１５０〜２００ｎｔ、２００〜２５０ｎｔ、２５０〜３００ｎｔ、３００〜３５０ｎｔ、３５０〜４００ｎｔ、４００〜４５０ｎｔ、４５０〜５００ｎｔであってもよい。例えば、メディエータープローブ中の標的特異的配列の長さは、１０〜１４０ｎｔであってもよく、例えば、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔであってもよい。メディエータープローブ中のメディエーター配列は、その配列が検出プローブと特異的にハイブリダイズし伸長できるなら、いずれの長さであってもよい。例えば、メディエータープローブ中のメディエーター配列の長さは、５〜１４０ｎｔであってもよく、例えば、５〜１０ｎｔ、８〜５０ｎｔ、８〜１５ｎｔ、１５〜２０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔであってもよい。いくつかの好ましい態様において、メディエータープローブ中の標的特異的配列の長さは、１０〜１００ｎｔ（例えば、１０〜９０ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ）であってもよく、メディエーター配列の長さは、５〜１００ｎｔ（例えば、１０〜９０ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ）であってもよい。
【００６３】
いくつかの好ましい態様において、メディエータープローブは３’−ＯＨ末端を持ち、好ましくは、そのメディエータープローブの３’末端の塩基は標的配列に相補的でなく、従ってメディエータープローブは殆ど伸長できない。いくつかの好ましい態様において、メディエータープローブの３’末端は封鎖されてその伸長を阻害する。核酸の３’末端（例えばメディエータープローブ）は様々な方法で封鎖できる。例えば、メディエータープローブは、最後のヌクレオチドの３’−ＯＨで修飾されてメディエータープローブの３’末端を封鎖できる。いくつかの態様において、メディエータープローブの最後のヌクレオチドの３’−ＯＨに化学部分（例えばビオチン又はアルキル）を付加して、メディエータープローブの３’−末端を封鎖する。いくつかの態様において、メディエータープローブの最後のヌクレオチドの３’−ＯＨを除去して、又は前記最後のヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドにより置換して、メディエータープローブの３’−末端を封鎖する。
【００６４】
本発明のいくつかの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、天然起源のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせを含むか又はそれらからなってもよい。いくつかの好ましい態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、天然のヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むか又はそれからなる。いくつかの好ましい態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、修飾ヌクレオチド、例えば修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、例えば５−メチルシトシン又は５−ヒドロキシメチルシトシンを含む。いくつかの好ましい態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、非天然ヌクレオチド、例えば、デオキシヒポキサンチン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、５−ニトロインドール又はロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【００６５】
本発明の方法では、上流オリゴヌクレオチド配列は、その配列が標的核酸配列と特異的にハイブリダイズできるなら、その長さに限定はない。例えば、上流オリゴヌクレオチド配列の長さは、１５〜１５０ｎｔであってもよく、例えば、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔ、１４０〜１５０ｎｔであってもよい。
【００６６】
本発明の方法では、核酸のハイブリダイズを可能にする条件は、当業者なら通常の方法で決定できる。例えば、検出される標的核酸配列、使用される上流オリゴヌクレオチド配列、及びメディエータープローブ中の標的特異的配列に応じて、適切なハイブリダイズ条件を決定できる。本発明のいくつかの態様において、核酸ハイブリダイズを可能にする条件は、相補的塩基対合によって、メディエータープローブ中の上流オリゴヌクレオチド配列及び標的特異的配列と対応する標的核酸配列とのハイブリダイズを可能にするようなストリンジェントな条件であり、メディエータープローブ中のメディエーター配列は、前記標的核酸配列とハイブリダイズしない。いくつかの好ましい態様において、高ストリンジェントな条件で、試料を各上流オリゴヌクレオチド配列及び各メディエータープローブに接触させる。
【００６７】
本発明の方法では、試料を各上流オリゴヌクレオチド配列及び各メディエータープローブに接触させた後に、メディエータープローブを切断してメディエーター配列又はその一部を含む断片（すなわちメディエーター断片）を放出する必要がある。共通の条件では、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用でき、標的核酸配列又はその伸長産物とハイブリダイズした上流オリゴヌクレオチド配列を使用して、標的核酸配列とハイブリダイズしたメディエータープローブの切断を誘発する。特に、工程（１）では、メディエータープローブが標的核酸配列と接触している場合に、その内部に含まれる標的特異的配列は、標的核酸配列とハイブリダイズして二本鎖構造を生成するが、メディエーター配列は標的核酸配列とハイブリダイズせずに一本鎖構造を保持している。従って、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して、二本鎖構造及び一本鎖構造を含むオリゴヌクレオチドを切断して、一本鎖構造を有する断片を放出できる。
【００６８】
本発明の方法では、核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブは標的核酸配列中の同一の鎖とハイブリダイズし、上流オリゴヌクレオチドは、メディエータープローブの切断を誘発するように、メディエータープローブの上流に位置することは容易に理解できる。本発明のいくつかの態様において、メディエータープローブの切断は、（Ａ）上流オリゴヌクレオチド配列の伸長に依存しない方式と、（Ｂ）上流オリゴヌクレオチド配列の伸長に依存する方式の２種の方式で誘発できる。特に、上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブと標的核酸配列とのハイブリダイズ後に、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素がメディエータープローブの切断を誘発できるのに十分なように上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブが近接している場合には、酵素は、伸長反応の実施の必要はなく（すなわちＡ方式）上流のオリゴヌクレオチド配列に結合しメディエータープローブを切断する。あるいは、標的核酸配列とハイブリダイズした後に、上流オリゴヌクレオチド配列がメディエータープローブから遠く離れている場合には、鋳型としての標的核酸配列とともに核酸ポリメラーゼをまず使用して、上流オリゴヌクレオチド配列の伸長を触媒し、次いで５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、上流オリゴヌクレオチド配列の伸長産物に結合しメディエータープローブを切断する（すなわちＢ方式）。
【００６９】
従って、いくつかの好ましい態様において、標的核酸配列とハイブリダイズした後に、上流オリゴヌクレオチド配列はメディエータープローブの上流に隣接している。これらの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、伸長反応の実施の必要はなく、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を直接誘発してメディエータープローブを切断する。従って、これらの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列に特異的な上流プローブであり、伸長に依存しない方式でメディエータープローブの切断を誘発する。本明細書で使用する「〜に隣接する」という語は、２つの核酸配列が互いに隣接して間隙を形成することを意味している。いくつかの好ましい態様において、２つの連続した核酸配列（例えば、上流オリゴヌクレオチド配列とメディエータープローブ）間の距離は、３０ｎｔ以下であり、例えば２０ｎｔ以下、例えば１５ｎｔ以下、例えば１０ｎｔ以下、例えば５ｎｔ以下、例えば４ｎｔ、３ｎｔ、２ｎｔ、１ｎｔである。
【００７０】
いくつかの好ましい態様において、標的核酸配列とハイブリダイズした後に、上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブの標的特異的配列は、部分的に重複する配列を持つ。これらの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、伸長反応の実施の必要はなく、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を直接誘発してメディエータープローブを切断する。従って、これらの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列に特異的な上流プローブであり、このプローブは、伸長に依存しない方式でメディエータープローブの切断を誘発する。いくつかの好ましい態様において、前記の部分的に重複する配列の長さは、１〜１０ｎｔ、例えば１〜５ｎｔ、又は１〜３ｎｔである。
【００７１】
いくつかの好ましい態様において、標的核酸配列とハイブリダイズした後に、上流オリゴヌクレオチド配列はメディエータープローブの上流から遠方に位置している。これらの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、核酸ポリメラーゼによって伸長され、次いで産生された伸長産物は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を誘発してメディエータープローブを切断する。従って、これらの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列に特異的なプライマーであり、それは伸長反応を引き起こすのに使用されて、伸長に依存する方式でメディエータープローブの切断を誘発する。本明細書内で使用する「遠方に」という語は、２つの核酸配列が互いに遠方に離れて、例えば、それらの間の距離が３０ｎｔ以上、５０ｎｔ以上、８０ｎｔ以上、１００ｎｔ以上又それ以上を意味している。
【００７２】
従って、いくつかの好ましい態様において、前記上流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列に特異的なプライマー、又は標的核酸配列に特異的なプローブである。前記プライマーは、伸長に依存する方式でメディエータープローブの切断を誘発するのに適している。前記プローブは、伸長に依存しない方式でメディエータープローブの切断を誘発するのに適している。
【００７３】
上流オリゴヌクレオチドを使用して下流オリゴヌクレオチドの切断を誘発する方法は、当業者に周知であり、本発明で使用できる。これらの方法の詳細な記述に関しては、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号及び第７，３８１，５３２号、ならびに米国公開特許第２００８／０２４１８３８号を参照のこと。
【００７４】
いくつかの態様において、メディエータープローブの切断部位は、メディエーター配列が標的特異的配列に結合する場所（すなわち、標的核酸とハイブリダイズする配列が、標的核酸とハイブリダイズしない配列と結合する場所）にある。これらの態様において、酵素によるメディエータープローブの切断は、未処理のメディエーター配列を含む断片を放出する。いくつかの態様において、メディエータープローブの切断部位は、メディエーター配列の３’末端領域内に位置する（すなわち、メディエーター配列の３’末端の上流に位置し、例えば数ヌクレオチドに位置し、例えばメディエーター配列の３’末端から１〜３ヌクレオチド離れている）。これらの態様において、酵素によるメディエータープローブの切断は、メディエーター配列の一部（５’末端部分）を含む断片を放出する。従って、本発明のいくつかの態様において、メディエーター断片は、未処理のメディエーター配列又はそのメディエーター配列の一部（５’末端部分）を含み、例えば、メディエーター配列の５’末端の５ｎｔ以上、８ｎｔ以上、１０ｎｔ以上、２０ｎｔ以上、３０ｎｔ以上、４０ｎｔ以上、５０ｎｔ以上、例えば、５〜５０ｎｔ、５〜１０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔを含む。
【００７５】
本出願では、５’ヌクレアーゼ活性を有する様々な酵素を使用して、本発明の方法を実施できる。いくつかの好ましい態様において、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素である。いくつかの好ましい態様において、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’ヌクレアーゼ活性（例えば５’エキソヌクレアーゼ活性）を有する核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）である。いくつかの態様において、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼは、標的核酸配列を鋳型として使用して上流オリゴヌクレオチド配列の伸長を触媒できるだけでなく、メディエータープローブの切断を誘発することもできるので、特に有効である。
【００７６】
いくつかの好ましい態様において、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは様々な細菌、例えば、テルムス・アクウァーティクス（Ｔａｑ、Thermus aquaticus）、テルムス・テルモフィルス（Ｔｔｈ、Thermus thermophiles）、テルムス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、テルムス・フラバス（Thermus flavus）、テルモコックス・リテラリス（Thermococcus literalis）、テルムス・アントラニルダニイ（Thermus antranildanii）、テルムス・カルドフィルス（Thermus caldophllus）、テルムス・クリアロフィルス（Thermus chliarophilus）、テルムス・フラバス（Thermus flavus）、テルムス・イグニテェレ（Thermus igniterrae）、テルムス・ラクテウス（Thermus lacteus）、テルムス・オシマイ（Thermus oshimai）、テルムス・ルーバー（Thermus ruber）、テルムス・ルーベンス（Thermus rubens）、テルムス・スコトドゥクトゥス（Thermus scotoductus）、テルムス・シルバヌス（Thermus silvanus）、テルムス・テルモフラス（Thermus thermophllus）、テルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、テルモトガ・ネアポリターナ（Thermotoga neapolitana）、テルモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、テルモコックス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、テルモコックス・バロッシ（Thermococcus barossi）、テルモコックス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）、テルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、テルモトガ・ネアポリターナ（Thermotoga neapolitana）、テルモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、ピロコックス・ウーゼイ（Pyrococcus woesei）、ピロコックス・ホリコシイイ（Pyrococcus horikoshii）、ピロコックス・アビシ（Pyrococcus abyssi）、ピロディクティウム・オクルトゥム（Pyrodictium occultum）、アクィフェクス・ピエロフィルス（Aquifexp yrophilus）、及びアクィフェクス・アエロリエウス（Aquifex aeolieus）から取得できる。好ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。
【００７７】
あるいは、工程（２）では、２つの異なる酵素、すなわち核酸ポリメラーゼ及び５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用してもよい。これらの態様において、核酸ポリメラーゼは、標的核酸配列を鋳型として用いて上流オリゴヌクレオチド配列の伸長を触媒し、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、上流オリゴヌクレオチド配列の伸長産物に結合し、メディエータープローブの切断を触媒する。
【００７８】
いくつかの好ましい態様において、工程（１）及び／又は（２）では、試料は標的核酸配列に特異的な下流オリゴヌクレオチド配列（すなわち下流プライマー）とさらに接触する。いくつかの態様において、核酸ポリメラーゼ及び下流オリゴヌクレオチド配列（すなわち下流プライマー）の使用は特に有効である。特に核酸ポリメラーゼは、プライマーとしての上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列とともに、鋳型として標的核酸配列を使用して、追加の標的核酸配列を生成して本発明の方法の感度を高めることができる。
【００７９】
従って、いくつかの好ましい態様において、工程（１）では、検出される各標的核酸配列に対し、上記で規定した上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブに加えて、下流オリゴヌクレオチド配列がさらに提供される。ここで前記下流オリゴヌクレオチド配列は、前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記下流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の下流に位置する。次に、核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、提供した上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ及び下流オリゴヌクレオチド配列と前記試料とを接触させる。
【００８０】
これらの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列の増幅のために、それぞれ上流プライマー及び下流プライマーとして作用する。それゆえに、上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列が、それぞれ２つの相補的な鎖中の異なる鎖を標的とすることは容易に理解できる。従って、標的核酸配列が二本鎖分子である場合に、上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列の異なる鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）に相補的である。標的核酸配列が一本鎖分子である場合に、上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列及びその相補的配列に相補的であり、従って標的核酸配列の増幅を達成するために使用できる。しかしながら、本願では簡潔にするために、上流オリゴヌクレオチド配列／下流オリゴヌクレオチド配列と標的核酸配列との間の関係を説明する場合には、標的核酸配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とを明確に識別することなく、又は標的核酸配列とその相補的配列とを明確に識別することなく、一般的に「標的核酸配列に相補的」と呼ぶ。しかしながら、当業者なら上流オリゴヌクレオチド配列／下流オリゴヌクレオチド配列と標的核酸配列との間の相補的関係及び位置関係を正しく理解できる。
【００８１】
例えば、本発明の方法を用いて第１及び第２の標的核酸配列を検出する場合に、第１及び第２の標的核酸配列にそれぞれ相補的な配列を含む第１及び第２の下流オリゴヌクレオチド配列を提供できる。同様に、第３の標的核酸配列において、第３の標的核酸配列に相補的な配列を含む第３の下流オリゴヌクレオチド配列が提供される。第４の標的核酸配列において、第４の標的核酸配列に相補的な配列を含む第４の下流オリゴヌクレオチド配列もまた提供できる。
【００８２】
さらに、いくつかの好ましい態様において、工程（２）では、工程（１）の生成物は核酸ポリメラーゼ（好ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ）と接触している。さらに好ましい態様において、核酸増幅を可能にする条件で、工程（１）の生成物は５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼと接触している。これらの態様において、核酸ポリメラーゼは、上流及び下流のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して標的核酸配列を増幅する。さらに、標的核酸の増幅中に、核酸ポリメラーゼは、その５’ヌクレアーゼ活性によって標的核酸配列にハイブリダイズしたメディエータープローブの切断を誘発して、メディエーター配列又はその一部を含むメディエーター断片を放出する。５’ヌクレアーゼ活性を有する様々な核酸ポリメラーゼ、特に上記に説明した核酸ポリメラーゼを、本発明の方法を実施するのに使用できる。本出願において、好ましくは、使用する核酸ポリメラーゼは、鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ（例えば鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼ）である。
【００８３】
本発明のいくつかの態様において、下流オリゴヌクレオチド配列は、天然起源のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせを含むか又はそれらからなってもよい。いくつかの好ましい態様において、下流オリゴヌクレオチド配列は、天然ヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むか又はそれらからなる。いくつかの好ましい態様において、下流オリゴヌクレオチド配列は、修飾ヌクレオチド、例えば修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、例えば５−メチルシトシン又は５−ヒドロキシメチルシトシンを含む。いくつかの好ましい態様において、下流オリゴヌクレオチド配列は、非天然ヌクレオチド、例えば、デオキシヒポキサンチン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、５−ニトロインドール又はロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【００８４】
本発明の方法では、下流のオリゴヌクレオチド配列は、その配列が標的核酸配列と特異的にハイブリダイズできるなら、その長さに限定はない。例えば、下流オリゴヌクレオチド配列の長さは、１５〜１５０ｎｔであってもよく、例えば、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔ、１４０〜１５０ｎｔであってもよい。
【００８５】
いくつかの好ましい態様において、標的核酸配列は対称的な形式で増幅される。これらの態様において、特定の標的核酸配列に対し、上流オリゴヌクレオチド配列および下流オリゴヌクレオチド配列は、増幅時に等量で使用される。いくつかの好ましい態様において、標的核酸配列は非対称的な形式で増幅される。これらの態様において、特定の標的核酸配列に対し、上流オリゴヌクレオチド配列と下流オリゴヌクレオチド配列は、増幅時に異なる量で使用される。いくつかの態様において、上流オリゴヌクレオチド配列は、下流オリゴヌクレオチド配列よりも過剰な量（例えば、１倍以上、２倍以上、５倍以上、８倍以上、１０倍以上、例えば１〜１０倍の過剰な量）で使用される。いくつかの態様において、下流オリゴヌクレオチド配列は、上流オリゴヌクレオチド配列よりも過剰な量（例えば、１倍以上、２倍以上、５倍以上、８倍以上、１０倍以上、例えば１〜１０倍の過剰な量）で使用される。
【００８６】
いくつかの好ましい態様において、標的核酸配列は三段階の方法で増幅される。これらの態様において、各回の核酸増幅は、第１の温度での核酸変性、第２の温度での核酸アニール、及び第３の温度での核酸伸長の３つの工程で実施される。いくつかの好ましい態様において、標的核酸配列は二段階の方法で増幅される。これらの態様において、各回の核酸増幅は、第１の温度での核酸変性、及び第２の温度での核酸アニールと核酸伸長の２つの工程で実施される。核酸変性、核酸アニールおよび核酸伸長を実施するのに適した温度は、従来の方法より当業者なら容易に決定できる（例えば、Joseph SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)を参照）
【００８７】
本発明の方法において、使用するメディエータープローブは、一般的に標的核酸配列と１対１で対応する。言い換えれば、検出すべき各標的核酸配列に対して固有のメディエータープローブが提供される。しかし上流オリゴヌクレオチド配列、下流オリゴヌクレオチド配列、及び標的核酸配列については、１対１対での対応は不要であることは容易に理解できる。例えば場合によっては、検出すべき試料はＤＮＡライブラリーであり、ライブラリー中の全ての断片は一方又は両方の末端に同じアダプターを含む。この状況下で、メディエータープローブの切断を誘発するために、同一の上流オリゴヌクレオチド配列を伸長に使用してもよく、又は同一の上流オリゴヌクレオチド配列及び／又は下流オリゴヌクレオチド配列を伸長に使用してもよい。従って、本発明の方法では、異なる標的核酸配列に対し、同一の上流オリゴヌクレオチド配列又は異なる上流オリゴヌクレオチド配列を使用してもよく、及び／又は同一の下流オリゴヌクレオチド配列又は異なる下流オリゴヌクレオチド配列を使用してもよい。例えば、第１、第２、第３及び第４の上流オリゴヌクレオチド配列は、同一でも異なっていてもよい。第１、第２、第３及び第４の下流オリゴヌクレオチド配列もまた同一でも異なっていてもよい。
【００８８】
さらに、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼが工程（２）で使用される場合に、ＨＡＮＤＳ手法をさらに使用して核酸増幅の効率を高めてもよい（例えば、Nucleic Acids Research, 1997, 25 (16):3235-3241参照）。例えば、いくつかの好ましい態様において、同一のオリゴヌクレオチド配列を全ての上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列の５’末端に導入してもよく、次いで同一オリゴヌクレオチド配列に相補的な共通プライマー（好ましくは、その量は一般に上流及び下流オリゴヌクレオチド配列の量よりもはるかに多い）を増幅に使用してもよい。
【００８９】
従って、いくつかの好ましい態様において、工程（１）では、提供された全ての上流オリゴヌクレオチド配列（例えば、第１、第２、第３、及び第４の上流オリゴヌクレオチド配列）及び下流オリゴヌクレオチド配列（例えば、第１、第２、第３及び第４の下流オリゴヌクレオチド配列）は、５’末端に同一のオリゴヌクレオチド配列を含み、さらに共通のプライマーが提供され、前記共通のプライマーは同一のオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を有する。次に核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を提供された上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、下流オリゴヌクレオチド配列及び共通プライマーに接触させる。いくつかの好ましい態様において、同一のオリゴヌクレオチド配列の長さは、８〜５０ｎｔであり、例えば８〜１５ｎｔ、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、又は４０〜５０ｎｔである。それに対応して、前記共通プライマーの長さは、８〜５０ｎｔであり、例えば、８〜１５ｎｔ、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、又は４０〜５０ｎｔである。その後に、いくつかの好ましい態様において、工程（２）では、工程（１）の生成物を核酸ポリメラーゼ（好ましくは５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ）に接触させる。さらに好ましい態様において、核酸増幅を可能にする条件で、工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼに接触させる。これらの態様において、核酸ポリメラーゼは、上流オリゴヌクレオチド及び下流のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、標的核酸配列を予備的に増幅して予備増幅産物を取得し、その後に共通プライマーを用いて予備増幅産物をさらに増幅する。さらに全体の増幅中に、核酸ポリメラーゼは、その５’ヌクレアーゼ活性によって、標的核酸配列又は予備増幅産物にハイブリダイズしたメディエータープローブを切断して、メディエーター配列又はその一部を含むメディエーター断片を放出する。
【００９０】
本発明のいくつかの態様において、共通プライマーは、天然起源のヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせを含むか又はそれらからなっていてもよい。いくつかの好ましい態様において、共通プライマーは天然ヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むか又はそれからなる。いくつかの好ましい態様において、共通プライマーは、修飾ヌクレオチド、例えば修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、例えば５−メチルシトシン又は５−ヒドロキシメチルシトシンを含む。いくつかの好ましい態様において、共通プライマーは、非天然ヌクレオチド、例えば、デオキシヒポキサンチン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、５−ニトロインドール又はロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【００９１】
本発明の方法において、共通プライマーは、上流及び下流オリゴヌクレオチド配列に含まれる同一のオリゴヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズできるなら、その長さに限定はない。例えば、共通プライマーの長さは、８〜５０ｎｔであってもよく、例えば８〜１５ｎｔ、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、又は４０〜５０ｎｔであってもよい。
工程（３）及び（４）に関し、
【００９２】
工程（２）では、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、標的核酸配列にハイブリダイズしたメディエータープローブを切断してメディエーター配列又はその一部を含むメディエーター断片を放出し、次いでこれを工程（３）で検出プローブとハイブリダイズさせる。本出願において、検出プローブは、３’→５’方向に各メディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列及び鋳型配列を含む。従って、工程（４）では、核酸ポリメラーゼの存在下で、検出プローブはメディエーター断片を伸長する鋳型として使用され、メディエーター断片は、伸長反応を引き起こすプライマーとして使用され、伸長反応の終了後に、メディエーター断片の伸長産物は検出プローブとハイブリダイズして核酸二本鎖を生成する。
【００９３】
本発明の方法では、検出プローブは、複数のメディエーター配列又はその一部に相補的な複数の捕捉配列（例えば、第１のメディエーター配列又はその一部に相補的な第１の捕捉配列、第２のメディエーター配列又はその一部に相補的な第２の捕捉配列、第３のメディエーター配列又はその一部に相補的な第３の捕捉配列、及び／又は第４のメディエーター配列又はその一部に相補的な第４の捕捉配列）を含む。様々な捕捉配列は任意の順序で配列できることは容易に理解できる。例えば、第１の捕捉配列は、第２の捕捉配列の上流（５’末端）又は下流（３’末端）に位置していてもよい。例えば、検出プローブは、３’→５’方向に第１の捕捉配列及び第２の捕捉配列、あるいは第２の捕捉配列及び第１の捕捉配列を含んでもよい。同様に、検出プローブはその他の捕捉配列（例えば、第１、第２、第３、第４の捕捉配列）を任意の配列順で含んでもよい。
【００９４】
さらに、様々な捕捉配列を任意の形式で配置できる。例えば、様々な捕捉配列は、隣接して配置されてもよく、又はそれらが連結配列によって離されるように配置されてもよい。例えば、第１の捕捉配列及び第２の捕捉配列は隣接して配置されてもよく、あるいは、それら捕捉配列は、連結配列（本明細書では略して「リンカー」とも呼ぶ）によって離されて配置されるか、又はそれら捕捉配列間に重複する配列が存在する。同様に、検出プローブは、その他の捕捉配列（例えば、第１、第２、第３、第４の捕捉配列）を任意の配置形式で含んでもよい。
【００９５】
場合によっては、様々な捕捉配列を重複する形の配置するのが特に有効である。これらの態様において、異なるメディエーター配列が重複する配列を含むように、複数のメディエーター配列を設計できる。例えば、第１のメディエーター配列及び第２のメディエーター配列は、第１のメディエーター配列の３’末端部分が第２のメディエーター配列の５’末端部分と同じ配列を持つように設計できる。これに対応して、検出プローブでは、第１のメディエーター配列に相補的な第１の捕捉配列の５’末端部分は、第２のメディエーター配列に相補的な第２の捕捉配列の３’末端部分と同じ配列を持つ。従って、検出プローブは、３’→５’方向に第１の捕捉配列及び第２の捕捉配列を含んでもよく、これらは重複する形で配置できる。この場合は、重複する配列は、第１及び第２の捕捉配列によって共有される配列と同じ配列又はその一部である。捕捉配列を重複して配置することで、検出プローブは、所定の長さ範囲により多くの捕捉配列を含むことができるので、より多くのメディエーター断片とハイブリダイズできる。言い換えれば、捕捉配列を重複して配置することで、単一の検出プローブをより多くのメディエータープローブと組み合わせて使用できる。
【００９６】
上記のように、本発明の方法では、単一の検出プローブと少なくとも２個（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上）のメディエータープローブとを組み合わせて使用する。従って、いくつかの好ましい態様において、単一の検出プローブの量を、単一のメディエータープローブの量よりも過剰にする（例えば、１倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上と過剰にする）。反応系全体が、放出されたメディエーター断片とハイブリダイズしメディエーター断片の伸長を媒介して二本鎖を生成するのに十分な検出プローブを含むので、これらの態様は、いくつかの場合に有効である。
【００９７】
上記のように、メディエーター断片は、未処理のメディエーター配列又はその一部を含んでもよい。メディエーター断片が未処理のメディエーター配列を含む場合に、前記検出プローブは、前記メディエーター配列に相補的な配列を含むことが好ましい。メディエーター断片がメディエーター配列の一部（５’末端部分）を含む場合に、前記検出プローブは、前記メディエーター配列の一部（５’末端部分）に相補的な配列、又は未処理のメディエーター配列に相補的な配列を含むことが好ましい。いくつかの好ましい態様において、前記検出プローブは前記メディエーター配列に相補的な配列を含む。この検出プローブは、未処理のメディエーター配列を含むメディエーター断片とハイブリダイズできるだけでなく、メディエーター配列の一部（５’末端部分）を含むメディエーター断片ともハイブリダイズできるので、この検出プローブはいくつかの場合に特に有効である。しかし当然のことであるが、前記検出プローブがメディエーター断片と安定的にハイブリダイズして伸長反応を開始できるのなら、前記検出プローブはまた、メディエーター断片の一部（例えば３’末端部分）に相補的な配列のみを含んでいてもよい。
【００９８】
さらに、捕捉配列及び鋳型配列に加えて、検出プローブはまた、３’末端（すなわち捕捉配列の下流）に追加の配列を含んでいてもよい。前記追加の配列は、一般的にメディエーター断片に相補的ではない配列を含み、メディエーター断片のハイブリダイズには関与しない。
【００９９】
本発明に従って、検出プローブ中の鋳型配列は、任意の配列を含んでもよく、各捕捉配列の上流（５’末端）に位置し、それによりメディエーター断片を伸長する鋳型として使用できる。いくつかの好ましい態様において、前記鋳型配列は、メディエータープローブ（メディエーター配列及び標的特異的配列）に相補的ではない配列を含む。これらの鋳型配列は、検出プローブとのハイブリダイズに対するメディエーター断片の特異性を高め、望まない位置でのメディエーター断片のハイブリダイズを避けて望まない二本鎖の生成を回避できるので、これらの鋳型配列はいくつかの場合に特に有効である。
【０１００】
本発明のいくつかの態様において、検出プローブは、天然起源のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸）、あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでもよく、又はそれらからなってもよい。いくつかの好ましい態様において、検出プローブは、天然のヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。いくつかの好ましい態様において、検出プローブは、修飾ヌクレオチド、例えば修飾デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、例えば５−メチルシトシン又は５−ヒドロキシメチルシトシンを含む。いくつかの好ましい態様において、検出プローブは、非天然ヌクレオチド、例えば、デオキシヒポキサンチン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、又はロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【０１０１】
本発明の方法では、検出プローブの長さに制限はない。例えば、検出プローブの長さは、１５〜１０００ｎｔであってもよく、例えば１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、８００〜９００ｎｔ、９００〜１０００ｎｔであってもよい。検出プローブ中の捕捉配列は、その配列がメディエーター断片と特異的にハイブリダイズできるのなら、任意の長さであってもよい。例えば、検出プローブ中の捕捉配列の長さは、１０〜５００ｎｔであってもよく、例えば、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１５０ｎｔ、１５０〜２００ｎｔ、２００〜２５０ｎｔ、２５０〜３００ｎｔ、３００〜３５０ｎｔ、３５０〜４００ｎｔ、４００〜４５０ｎｔ、４５０〜５００ｎｔであってもい。検出プローブ中の鋳型配列は、その配列がメディエーター断片を伸長する鋳型として使用できるのなら、任意の長さであってもよい。例えば、検出プローブ中の鋳型配列の長さは、１〜９００ｎｔであってもよく、例えば、１〜５ｎｔ、５〜１０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、８００〜９００ｎｔであってもよい。いくつかの好ましい態様において、検出プローブ中の捕捉配列の長さは、１０〜２００ｎｔ（例えば、１０〜１９０ｎｔ、１０〜１８０ｎｔ、１０〜１５０ｎｔ、１０〜１４０ｎｔ、１０〜１３０ｎｔ、１０〜１２０ｎｔ、１０〜１００ｎｔ、１０〜９０ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ）であり、鋳型配列の長さは、５〜２００ｎｔ（例えば、１０〜１９０ｎｔ、１０〜１８０ｎｔ、１０〜１５０ｎｔ、１０〜１４０ｎｔ、１０〜１３０ｎｔ、１０〜１２０ｎｔ、１０〜１００ｎｔ、１０〜９０ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ）である。
【０１０２】
いくつかの好ましい態様において、検出プローブは３’−ＯＨ末端を持つ。いくつかの好ましい態様において、検出プローブの３’末端は、その伸長を阻害するように封鎖されている。核酸（例えば検出プローブ）の３’末端は様々な方法で封鎖できる。例えば、検出プローブの終末のヌクレオチドの３’−ＯＨは、検出プローブの３’−末端を封鎖するように修飾できる。いくつかの態様において、検出プローブの３’−末端を封鎖するように、化学部分（例えばビオチン又はアルキル）を検出プローブの終末のヌクレオチドの３’−ＯＨに付加できる。いくつかの態様において、検出プローブの終末のヌクレオチドの３’−ＯＨを除去して、又は前記終末のヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドで置換して、検出プローブの３’−末端を封鎖できる。
【０１０３】
本発明の方法では、メディエーター断片は検出プローブとハイブリダイズし、それにより核酸ポリメラーゼの伸長反応を開始する。未切断のメディエータープローブはまたメディエーター配列を経て検出プローブとハイブリダイズできるが、メディエータープローブはさらに、メディエーター配列の下流に位置し検出プローブとハイブリダイズしない（すなわち遊離状態にある）標的特異的配列を含み、従って、核酸ポリメラーゼは、検出プローブとハイブリダイズした未切断のメディエータープローブを伸長できない。
【０１０４】
上述のように、検出プローブはレポーター基及び消光基で標識されており、ここで前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基により発生したシグナルを吸収又は消光できる。前記検出プローブにより、その相補的配列とハイブリダイズする場合に発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない場合に発生するシグナルとは異なる。
【０１０５】
いくつかの好ましい態様において、前記検出プローブは自己消光型のプローブである。これらの態様において、検出プローブが別の配列とハイブリダイズしない場合に、消光基はレポーター基のシグナルを吸収又は消光できる位置に配置（例えば、消光基はレポーター基の近傍に配置）されて、消光基はレポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光する。この場合に、前記検出プローブはシグナルを発生しない。さらに、前記検出プローブがその相補的配列とハイブリダイズする場合に、消光基はレポーター基のシグナルを吸収又は消光できない位置に配置（例えば、消光基はレポーター基から遠く離れた位置に配置）されて、それにより消光基はレポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光できない。この場合に、前記検出プローブはシグナルを発生する。
【０１０６】
この自己消光型の検出プローブは、当業者の能力範囲内で設計可能である。例えば、前記検出プローブは５’末端をレポーター基により標識でき、かつ３’末端を消光基により標識でき、あるいは前記検出プローブは３’末端をレポーター基で標識でき、かつ５’末端を消光基で標識できる。従って、前記検出プローブが単独で存在する場合に、前記レポーター基は前記消光基に近接して相互作用し、それにより前記レポーター基によって発生したシグナルは前記消光基によって吸収され、従って前記検出プローブはシグナルを発生しない。しかし、前記検出プローブがその相補的配列とハイブリダイズすると、前記レポーター基は前記消光基から分離され、それによりレポーター基により発生したシグナルを前記消光基は吸収できず、従って前記検出プローブはシグナルを発生する。
【０１０７】
しかしながら、当然のことであるが、検出プローブはその末端をレポーター基及び消光基で標識されていることは必須ではない。検出プローブの相補的配列とハイブリダイズする場合に前記検出プローブにより発生したシグナルが、その相補的配列とハイブリダイズしない場合に発生したシグナルと異なるのなら、検出プローブはまた、そのプローブの内部でレポーター基及び／又は消光基により標識されていてもよい。例えば、検出プローブの上流（又は下流）をレポーター基で標識し、検出プローブの下流（又は上流）を消光基で標識し、両者間の距離は十分に離れている（例えば距離は、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、又はそれ以上である）。従って、前記検出プローブが単独で存在する場合には、プローブ分子はランダムにコイル状になるか、あるいはプローブの二次構造（例えばヘアピン構造）を形成するので、前記レポーター基は前記消光基に近接して相互作用し、それにより前記レポーター基により発生したシグナルは前記消光基によって吸収され、従って前記検出プローブはシグナルを発生しない。また前記検出プローブがその相補的配列とハイブリダイズする場合に、前記レポーター基と前記消光基との間の距離は十分に離れているので、レポーター基により発生した前記シグナルを前記消光基により吸収できず、従って前記検出プローブはシグナルを発生する。いくつかの好ましい態様において、レポーター基と消光基との間の距離は、１０〜８０ｎｔ又はそれ以上であり、例えば１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔである。いくつかの好ましい態様において、レポーター基と消光基との間の距離は、８０ｎｔ以下、７０ｎｔ以下、６０ｎｔ以下、５０ｎｔ以下、４０ｎｔ以下、３０以下、又は２０ｎｔ以下である。いくつかの好ましい態様において、レポーター基と消光基との間の距離は、５ｎｔ以上、１０ｎｔ以、１５ｎｔ以上、又は２０ｎｔ以上である。
【０１０８】
従って検出プローブは、その相補的配列とハイブリダイズする場合に検出プローブによって発生したシグナルが、その相補的配列とハイブリダイズしない場合に発生したシグナルと異なるのなら、任意の適切な位置でレポーター基及び消光基により標識できる。しかしながら、いくつかの好ましい態様において、レポーター基及び消光基の少なくとも一方は、検出プローブの末端（例えば５’末端又は３’末端）に位置している。いくつかの好ましい態様において、レポーター基及び消光基の一方は、検出プローブの５’末端又は５’末端から１〜１０ｎｔに位置し、レポーター基と消光基との間に適切な距離が存在するので、検出プローブがその相補的配列とハイブリダイズする前に、消光基はレポーター基のシグナルを吸収又は消光できる。いくつかの好ましい態様において、レポーター基及び消光基のうちの一方は、検出プローブの３’末端又は３’末端から１〜１０ｎｔに位置し、レポーター基と消光基との間に適切な距離が存在するので、検出プローブがその相補的配列とハイブリダイズする前に、消光基はレポーター基のシグナルを吸収又は消光することができる。いくつかの好ましい態様において、レポーター基と消光基との間の距離は、先に規定した距離（例えば、１０〜８０ｎｔ又はそれ以上の距離）である。いくつかの好ましい態様において、レポーター基及び消光基のうちの一方は、検出プローブの５’末端に位置し、他方は３’末端に位置している。
【０１０９】
本発明の方法では、前記レポーター基及び前記消光基は、当該技術分野で公知の任意の適切な基又は分子であってもよい。これらの特定の例には、限定されないが、Cy2TM (506)、YO-PROTM-l (509)、YOYOTM-l (509)、Calcein (517)、FITC (518)、FluorXTM (519)、AlexaTM (520)、Rhodamine 110 (520)、Oregon GreenTM 500 (522)、Oregon GreenTM 488 (524)、RiboGreenTM (525)、Rhodamine GreenTM (527)、Rhodamine 123 (529)、Magnesium GreenTM (531)、Calcium GreenTM (533)、TO-PROTM-l (533)、TOTOl (533)、JOE (548)、BODIPY530/550 (550)、Dil (565)、BODIPY TMR (568)、BODIPY558/568 (568)、BODIPY564/570 (570)、Cy3TM (570)、AlexaTM 546 (570)、TRITC (572)、Magnesium OrangeTM (575)、Phycoerythrin R&B (575)、Rhodamine Phalloidin (575)、Calcium OrangeTM (576)、PyroninY (580)、Rhodamine B (580)、TAMRA (582)、Rhodamine RedTM (590)、Cy3.5TM (596)、ROX (608)、Calcium CrimsonTM (615)、AlexaTM 594 (615)、Texas Red (615)、Nile Red (628)、YO-PROTM-3 (631)、YOYOTM-3 (631)、R-phycocyanin (642)、C-Phycocyanin (648)、TO-PROTM-3 (660)、T0T03 (660)、DiD DilC (5) (665)、Cy5TM (670)、Thiadicarbocyanine (671)、Cy5.5 (694)、HEX (556)、TET (536)、Biosearch Blue (447)、CAL Fluor Gold 540 (544)、CAL Fluor Orange 560 (559)、CAL Fluor Red 590 (591)、CAL Fluor Red 610 (610)、CAL Fluor Red 635 (637)、FAM (520)、Fluorescein (520)、 Fluorescein-C3 (520)、Pulsar 650 (566)、 Quasar 570 (667)、Quasar 670 (705)、及びQuasar 705 (610)が挙げられる。ここで括弧内の数字は、最大発光波長を表示し単位はｎｍである。
【０１１０】
さらに、レポーター基と消光基の様々な適切な組み合わせは、当該技術分野において公知であり、例えば、Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971)、White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970)、Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971)、Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976)、Bishop, editor, Indicators (Peigamon Press, Oxford, 1972)、Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992)、Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949)、Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996)、米国特許第３，９９６，３４５号、及び第４，３５１，７６０号を参照のこと。
【０１１１】
いくつかの好ましい態様において、前記レポーター基は蛍光基である。これらの態様において、レポーター基によって発生したシグナルは蛍光であり、消光基は蛍光を吸収／消光可能な分子又は基である（例えば別の蛍光分子は蛍光を吸収でき、あるいは消光剤は蛍光を消光できる）。いくつかの好ましい態様において、前記蛍光基は様々な蛍光分子を含み、限定はされないが、例えば、ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor（登録商標） Gold 540、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red 635、Quasar 670、CY3、CY5,CY5.5、及びQuasar 705などが挙げられる。いくつかの好ましい態様において、前記消光基は様々な消光剤を含み、限定はされないが、例えば、DABCYL、BHQ (例えば、BHQ-1 or BHQ-2)、ECLIPSE、及び／又はTAMRAなどが挙げられる。
【０１１２】
本発明の方法では、検出プローブはまた、例えばヌクレアーゼ活性（例えば５’ヌクレアーゼ活性、例えば５’→３’核酸エキソヌクレアーゼ活性）に対する耐性を持つように修飾できる。例えば、ヌクレアーゼ活性に耐性のある修飾を検出プローブの主鎖に導入することができ、この修飾として、例えばホスホロチオアート結合、アルキルホスファートトリエステル結合、アリールホスファートトリエステル結合、アルキルホスホナート結合、アリールホスホナート結合、水素化ホスファート結合、ホスホルアミダート結合、アリールホスホルアミダート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリル修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、及び１−（４’−チオ−ＰＤ−リボフラノシル）修飾が挙げられる。
【０１１３】
本発明の方法では、検出プローブは直鎖状であってもよく、又はヘアピン構造を有していてもよい。いくつかの好ましい態様において、前記検出プローブは直鎖状である。いくつかの好ましい態様において、前記検出プローブはヘアピン構造を有する。ヘアピン構造は、天然起源か、又は人工的に導入できる。さらに、ヘアピン構造の検出プローブは、当該技術分野での従来の方法によって構成できる。例えば、２つの相補的オリゴヌクレオチド配列を検出プローブの２つの末端（５’末端及び３’末端）に付加して、検出プローブがヘアピン構造を形成できるようにする。これらの態様において、２つの相補的オリゴヌクレオチド配列は、ヘアピン構造の腕部（柄部）を形成する。ヘアピン構造の腕部は、任意の所望の長さにでき、例えば腕部の長さは、２〜１５ｎｔ、例えば３〜７ｎｔ、４〜９ｎｔ、５〜１０ｎｔ、６〜１２ｎｔであってもよい。
【０１１４】
また、本発明の方法において、工程（３）での「ハイブリダイズ」、「核酸ハイブリダイズ」及び「核酸のハイブリダイズを可能にする条件」は、先に規定したものと同じ意味を持つ。
【０１１５】
工程（３）の生成物及び酸ポリメラーゼを用いて工程（４）を実施する。工程（４）では、核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件で、核酸ポリメラーゼは、検出プローブを鋳型として使用し、検出プローブにハイブリダイズしたメディエーター断片を伸長して二本鎖を生成する。
【０１１６】
先に詳述したように、各メディエータープローブは固有のメディエーター配列を含み、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在で、固有のメディエーター配列又はその一部を含むメディエーター断片を放出する。その後に、各メディエーター断片は異なる位置で検出プローブとハイブリダイズし（すなわち対応するメディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列）、核酸ポリメラーゼによって検出プローブを備える二本鎖に伸長する。それにより各メディエータープローブに対して、その対応する標的配列が存在する場合に、メディエータープローブに対応する（１つの鎖としての）検出プローブ及び（別の鎖としての）メディエーター断片の伸長産物を含む固有の二本鎖が工程（４）で生成される。従って、工程（４）で生成した各二本鎖は、異なる構造（配列）を持ち、それゆえに異なるＴｍ値を有し、融解曲線解析で異なる融解ピークを示す。
【０１１７】
いくつかの好ましい態様において、工程（４）で使用する核酸ポリメラーゼは、鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）である。いくつかの好ましい態様において、核酸ポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは様々な細菌、例えば、テルムス・アクウァーティクス（Ｔａｑ）、テルムス・テルモフィルス（Ｔｔｈ）、テルムス・フィリフォルミス、テルムス・フラバス、テルモコックス・リテラリス、テルムス・アントラニルダニイ、テルムス・カルドフィルス、テルムス・クリアロフィルス、テルムス・フラバス、テルムス・イグニテェレ、テルムス・ラクテウス、テルムス・オシマイ、テルムス・ルーバー、テルムス・ルーベンス、テルムス・スコトドゥクトゥス、テルムス・シルバヌス、テルムス・テルモフラス、テルモトガ・マリチマ、テルモトガ・ネアポリターナ、テルモシフォ・アフリカヌス、テルモコックス・リトラリス、テルモコックス・バロッシ、テルモコックス・ゴルゴナリウス、テルモトガ・マリチマ、テルモトガ・ネアポリターナ、テルモシフォ・アフリカヌス、ピロコックス・ウーゼイ、ピロコックス・ホリコシイイ、ピロコックス・アビシ、ピロディクティウム・オクルトゥム、アクィフェクス・ピエロフィルス、及びアクィフェクス・アエロリエウスから取得できる。好ましくは、鋳型依存性の核酸ポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼである。
【０１１８】
いくつかの好ましい態様において、工程（２）で使用する５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼであり、工程（４）で使用する核酸ポリメラーゼと同じである。いくつかの好ましい態様において、工程（２）で使用する５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、工程（４）で使用する核酸ポリメラーゼとは異なる。
【０１１９】
例えばいくつかの態様において、工程（２）で第１の核酸ポリメラーゼを用いて上流オリゴヌクレオチド配列の伸長を触媒し、かつ５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いてメディエータープローブの切断を触媒し、次いで工程（４）で第２の核酸ポリメラーゼを用いてメディエーター断片の伸長を触媒する。いくつかの態様において、工程（２）で５’ヌクレアーゼ活性を有する第１の核酸ポリメラーゼを用いて上流オリゴヌクレオチド配列の伸長及びメディエータープローブの切断を触媒し、次いで工程（４）で第２の核酸ポリメラーゼを用いてメディエーター断片の伸長を触媒する。しかし、同じ酵素が工程（２）及び（４）で使用されるのが特に好ましい。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、工程（２）での上流オリゴヌクレオチド配列の伸長及びメディエータープローブの切断を触媒でき、工程（４）でのメディエーター断片の伸長を触媒できる。
【０１２０】
本発明の方法では、工程（１）〜（４）のうちの１つ以上を実用時の必要性に応じて繰り返してもよい。いくつかの好ましい態様において、工程（１）〜（２）は１回以上繰り返され、各繰り返しの前に核酸変性の工程を１回実施する。工程（１）〜（２）を繰り返してより多くのメディエーター断片を生成でき、それらを後続の工程（すなわち工程（３）〜（５））で使用することは容易に理解できる。従って、いくつかの好ましい態様おいて、本発明の方法は、工程（１）〜（２）を１回以上繰り返し、各繰り返しの前に核酸変性の工程を１回実施し、次いで工程（３）〜（５）を実施する解決手段によって実行される。
【０１２１】
いくつかの好ましい態様において、工程（１）〜（４）を１回以上繰り返し、各繰り返しの前に核酸変性の工程を１回実施する。工程（１）〜（４）を繰り返して、検出プローブとメディエーター断片の伸長産物とを含むより多くの二本鎖を生成でき、それを後続の工程（すなわち工程（５））で使用することは容易に理解できる。従って、いくつかの好ましい態様において、本発明の方法は、工程（１）〜（４）を１回以上繰り返し、各繰り返しの前に核酸変性の工程を１回実施し、次いで工程（５）を実施する解決手段によって実行される。
【０１２２】
いくつかの好ましい態様において、本発明の方法の工程（１）〜（４）は、以下の工程（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）検出プローブを提供し、検出される各標的核酸配列に対して、上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、及び下流オリゴヌクレオチド配列を提供し、かつ任意に共通プライマーを提供すること、ここで前記検出プローブ、前記メディエータープローブ、前記上流オリゴヌクレオチド配列、前記下流オリゴヌクレオチド配列、及び前記共通プライマーは、先に規定した通りである；
（ｂ）検出される試料を、提供された検出プローブ、上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、及び下流オリゴヌクレオチド配列、さらに５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）と混合すること、及び任意に共通プライマーを添加すること；
（ｃ）核酸変性を可能にする条件で、前工程の生成物をインキュベートすること；
（ｄ）核酸のアニール又はハイブリダイズを可能にする条件で、前工程の生成物をインキュベートすること；
（ｅ）核酸の伸長を可能にする条件で、前工程の生成物をインキュベートすること；及び
（ｆ）任意に工程（ｃ）〜（ｅ）を１回以上繰り返すこと；を含む手順によって実施できる。
【０１２３】
これらの態様において、工程（ｃ）では、試料中の全ての核酸分子が一本鎖に解離する。その後に、工程（ｄ）では、相補的核酸分子（例えば、上流オリゴヌクレオチド配列及び標的核酸配列又は下流オリゴヌクレオチド配列の伸長産物、下流オリゴヌクレオチド配列及び標的核酸配列又は上流オリゴヌクレオチド配列の伸長産物、メディエータープローブ及び標的核酸配列又はその増幅産物、メディエータープローブ又はメディエータープローブと検出プローブの切断から生じるメディエーター断片、共通プライマー及び上流／下流オリゴヌクレオチド配列又は上流／下流オリゴヌクレオチド配列の伸長生成物）は、アニール又はハイブリダイズして二本鎖を生成する。その後に、工程（ｅ）では、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性の核酸ポリメラーゼは、標的核酸配列にハイブリダイズした上流／下流オリゴヌクレオチド配列を伸長し、標的核酸配列にハイブリダイズしたメディエータープローブの遊離５’末端を切断し、検出プローブにハイブリダイズしたメディエーター断片を伸長し、及び上流／下流オリゴヌクレオチド配列の伸長産物にハイブリダイズした共通プライマーを伸長する。それにより、工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返して、標的核酸配列の増幅、メディエータープローブの切断、及び検出プローブとメディエーター断片の伸長産物とを含む二本鎖の生成を達成して、本発明の方法の工程（１）〜（４）を完結する。
【０１２４】
メディエータープローブの３’末端の標的特異的配列は検出プローブとハイブリダイズできずに遊離状態にあるので、核酸ポリメラーゼは検出プローブにハイブリダイズするメディエータープローブを伸長しないことは容易に理解できる。さらに好ましくは、メディエータープローブは、メディエータープローブの望まない伸長を回避するように、例えば、標的核酸配列又は検出プローブにハイブリダイズしたメディエータープローブの伸長を回避するように、３’末端で封鎖される。
【０１２５】
工程（ｃ）でのインキュベートの時間及び温度は、当業者なら通常の方法で決定できる。いくつかの好ましい態様において、工程（ｃ）で、工程（ｂ）の生成物を８０〜１０５℃（例えば８０〜８５℃、８５〜９０℃、９０〜９５℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃、１０１℃、１０２℃、１０３℃、１０４℃、又は１０５℃）の温度でインキュベートして核酸を変性する。いくつかの好ましい態様において、工程（ｃ）で、工程（ｂ）の生成物を１０秒間〜５分間、例えば１０秒間〜２０秒間、２０秒間〜４０秒間、４０秒間〜６０秒間、１〜２分間、又は２〜５分間インキュベートする。
【０１２６】
工程（ｄ）でのインキュベートの時間及び温度は、当業者なら通常の方法で決定できる。いくつかの好ましい態様において、工程（ｄ）で、工程（ｃ）の生成物を３５〜７０℃（例えば、３５〜４０℃、４０〜４５℃、４５〜５０℃、５０〜５５℃、５５〜６０℃、６０〜６５℃、又は６５〜７０℃）の温度でインキュベートして核酸をアニール又はハイブリダイズできる。いくつかの好ましい態様において、工程（ｄ）で、工程（ｃ）の生成物を１０秒〜５分間、例えば１０〜２０秒間、２０〜４０秒間、４０〜６０秒間、１〜２分間、又は２〜５分間インキュベートする。
【０１２７】
工程（ｅ）でのインキュベートの時間及び温度は、当業者なら通常の方法で決定できる。いくつかの好ましい態様において、工程（ｅ）で、工程（ｄ）の生成物は３５〜８５℃（例えば３５〜４０℃、４０〜４５℃、４５〜５０℃、５０℃〜５５℃、５５〜６０℃、６０〜６５℃、６５〜７０℃、７０〜７５℃、７５〜８０℃、８０〜８５℃）の温度でインキュベートして核酸の伸長を可能にする。いくつかの好ましい態様において、工程（ｅ）で、工程（ｄ）の生成物を１０秒〜３０分間、例えば、１０〜２０秒間、２０〜４０秒間、４０〜６０秒間、１〜２分間、２〜５分間、５〜１０分間、１０〜２０分間、又は２０〜３０分間インキュベートする。
【０１２８】
いくつかの態様において、工程（ｄ）及び（ｅ）は異なる温度で実施することができ、すなわち核酸のアニール及び伸長は異なる温度で実施する。いくつかの態様において、工程（ｄ）及び（ｅ）は同じ温度であり、すなわち核酸のアニール及び伸長は同じ温度で実施する。この場合に、工程（ｄ）及び（ｅ）は１工程として組み合わせることができる。
【０１２９】
本発明の方法では、工程（ｃ）〜（ｅ）は、１回以上、例えば２回以上、５回以上、１０回以上、２０回以上、３０回以上、４０回以上、又は５０回以上繰り返すことができる。場合によっては、標的核酸配列を増幅して検出の感度を向上できるので、工程（ｃ）〜（ｅ）を２回以上繰り返すことが有効である。しかしながら、工程（ｃ）〜（ｅ）が１回以上繰り返される場合に、各サイクルの工程（ｃ）〜（ｅ）で使用する条件は必ずしも同一ではないことは容易に理解できる。例えば、特定の条件を使用して最初の５サイクルで工程（ｃ）〜（ｅ）を実施して、次いで別の条件を使用して残りのサイクルで工程（ｃ）〜（ｅ）を実施することができる。
工程（５）に関し、
【０１３０】
本発明の方法の工程（５）では、工程（４）の生成物に融解曲線解析を実施し、この融解曲線解析の結果に従って、前記ｎ個の標的核酸配列が前記試料中に存在するかどうかを決定する。
【０１３１】
上記のように、レポーター基及び消光基で標識した検出プローブを用いて融解曲線解析を実施できる。
【０１３２】
いくつかの態様において、工程（４）の生成物を徐々に加熱し、検出プローブのレポーター基によって発生したシグナルをリアルタイムに監視して、工程（４）の生成物のシグナル強度が温度の変化と共に変化する曲線を取得する。例えば、工程（４）の生成物を４５℃以下（例えば４５℃未満、４０℃未満、３５℃未満、３０℃未満、２５℃未満）の温度から、７５℃以上（例えば、７５℃以上、８０℃以上、８５℃以上、９０℃以上、９５℃以上）の温度まで徐々に加熱し、検出プローブのレポーター基によって発生したシグナルをリアルタイムに監視して、レポーター基のシグナル強度が温度の変化と共に変化する曲線を取得する。加熱速度は、当業者なら通常の方法で決定できる。例えば加熱速度として、温度を各段階毎に０．０１〜１℃（例えば、０．０１〜０．０５℃、０．０５〜０．１℃、０．１〜０．５℃、０．５〜１℃、０．０４〜０．４℃、例えば、０．０１℃、０．０２℃、０．０３℃、０．０４℃、０．０５℃、０．０６℃、０．０７℃、０．０８℃、０．０９℃、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃、又は１．０℃）で上昇させ、かつ各段階を０．５〜１５秒間（例えば０．５〜１秒間、１〜２秒間、２〜３秒間、３〜４秒間、４〜５秒間、５〜１０秒間、１０〜１５秒間）保持し、又は、温度を毎秒０．０１〜１℃（例えば、０．０１〜０．０５℃、０．０５〜０．１℃、０．１〜０．５℃、０．５〜１℃、０．０４〜０．４℃、例えば、０．０１℃、０．０２℃、０．０３℃、０．０４℃、０．０５℃、０．０６℃、０．０７℃、０．０８℃、０．０９℃、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃、又は１．０℃）で上昇させる。
【０１３３】
いくつかの態様において、工程（４）の生成物を徐々に冷却し、検出プローブのレポーター基によって発生したシグナルをリアルタイムに監視して、工程（４）の生成物のシグナル強度が温度変化と共に変化する曲線を取得できる。例えば、工程（４）の生成物を７５℃以上の温度（例えば、７５℃以上、８０℃以上、８５℃以上、９０℃以上、９５℃）から４５℃以下（例えば４５℃未満、４０℃未満、３５℃未満、３０℃未満、２５℃未満）の温度まで徐々に冷却し、検出プローブのレポーター基によって発生したシグナルをリアルタイムに監視して、レポーター基のシグナル強度が温度の変化と共に変化する曲線を取得する。冷却速度は、当業者なら通常の方法で決定できる。例えば冷却速度として、温度を各段階毎に０．０１〜１℃（例えば、０．０１〜０．０５℃、０．０５〜０．１℃、０．１〜０．５℃、０．５〜１℃、０．０４〜０．４℃、例えば、０．０１℃、０．０２℃、０．０３℃、０．０４℃、０．０５℃、０．０６℃、０．０７℃、０．０８℃、０．０９℃、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃、又は１．０℃）で降下させ、かつ各段階を０．５〜１５秒間（例えば０．５〜１秒間、１〜２秒間、２〜３秒間、３〜４秒間、４〜５秒間、５〜１０秒間、１０〜１５秒間）保持し、又は、温度を毎秒０．０１〜１℃（例えば、０．０１〜０．０５℃、０．０５〜０．１℃、０．１〜０．５℃、０．５〜１℃、０．０４〜０．４℃、例えば、０．０１℃、０．０２℃、０．０３℃、０．０４℃、０．０５℃、０．０６℃、０．０７℃、０．０８℃、０．０９℃、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃、又は１．０℃）で降下させる。
【０１３４】
その後に、取得した曲線を微分して、工程（４）の生成物の融解曲線を取得できる。融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って、融解ピーク（融点）に対応するメディエーター断片の存在を決定できる。その後に、メディエーター断片のメディエーター配列と標的核酸配列との間の対応関係に従って、前記メディエーター断片に対応する標的核酸配列の存在を決定できる。
【０１３５】
例えば、融解曲線解析の結果が検出プローブと第１のメディエーター断片の伸長産物とを含む第１の二本鎖に対応する融解ピークの存在又は不存在を示す場合に、第１の標的核酸配列の前記試料中での存在又は不存在を決定できる。同様に、融解曲線解析の結果が検出プローブと第２のメディエーター断片の伸長産物とを含む第２の二本鎖に対応する融解ピークの存在又は不存在を示す場合に、第２の標的核酸配列の前記試料中での存在又は不存在を決定できる。融解曲線解析の結果が検出プローブと第３のメディエーター断片の伸長産物とを含む第３の二本鎖に対応する融解ピークの存在又は不存在を示す場合に、第３の標的核酸配列の前記試料中での存在又は不存在を決定できる。融解曲線解析の結果が検出プローブと第４のメディエーター断片の伸長産物とを含む第４の二本鎖に対応する融解ピークの存在又は不存在を示す場合に、第４の標的核酸配列の前記試料中での存在又は不存在を決定できる。従って、１個の検出プローブと少なくとも２個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上）のメディエータープローブを使用して、本発明の方法は、少なくとも２個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上）の標的核酸配列の同時検出（多重検出）を達成できる。
【０１３６】
理論による制約はなく、融解曲線解析の分解能又は精度は、０．５℃又はそれ以上を達成できる。言い換えれば、融解曲線解析は、融点が僅か０．５℃以下（例えば、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃）だけ互いに異なっている２つの融解ピークを識別できる。従って、本発明の方法のいくつかの態様において、任意の２つの二本鎖（例えば、第１の二本鎖と第２の二本鎖）の間の融点の差は、（例えば、第１のメディエーター配列、第２のメディエーター配列及び検出プローブの配列の設計により）少なくとも０．５℃にでき、それにより任意の２つの二本鎖（例えば第１の二本鎖及び第２の二本鎖）は融解曲線解析によって区別及び識別できる。しかしながら、簡便に互いに区別し識別するには、２つの二本鎖（例えば第１の二本鎖と第２の二本鎖）間でより大きな融点の差が在るのが条件によっては好ましい。従って、本発明の方法のいくつかの態様において、２つの二本鎖（例えば第１の二本鎖と第２の二本鎖）の間の融点の差は、融点の差が融解曲線解析によって区別され識別できるのなら、いずれの所望の値（例えば０．５℃以上、１℃以上、２℃以上、３℃以上、４℃以上、５℃以上、８℃以上、１０℃以上、１５℃以上、又は２０℃以上）であってもよい。
１個以上の検出プローブの同時使用
【０１３７】
上記の方法では、１個の検出プローブを用いて複数の標的核酸配列の多重検出を達成する。しかし本発明では使用する検出プローブの数に限定のないことは容易に理解できる。本発明の方法では、１個以上の検出プローブ（例えば、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、又はそれ以上の検出プローブ）を使用できる。さらに、上述の同一の原理に基づいて、２個以上のメディエータープローブ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の検出プローブ）を各検出プローブに対して設計できる。従って、本発明の方法は、複数の標的核酸配列の同時検出に使用でき、本発明の方法によって同時に検出できる標的核酸配列の最大数は、使用する検出プローブの数よりはるかに多く、かつ各検出プローブに対して設計されたメディエータープローブの数の合計（すなわち使用する全てのメディエータープローブの数）に等しい。さらに、１個以上のメディエータープローブが各標的核酸配列に対して設計できることは容易に理解できる。従って、本発明の方法により同時に検出できる標的核酸配列の実際の数は、使用する全てのメディエータープローブの数の同等以下であるが、依然として使用する検出プローブの数よりは多くできる。
【０１３８】
従って、いくつかの態様において、本発明は、試料中のｎ個の標的核酸配列の存在を検出する方法を提供し、ｎは２以上の整数（例えば、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、又はそれ以上の整数）であり、
この方法は、以下の工程：
（１）検出する各標的核酸配列に対し、少なくとも１つの上流オリゴヌクレオチド配列及び少なくとも１つのメディエータープローブを提供し、核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、試料を提供した上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブに接触させる工程；
ここで前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエータープローブは５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、前記標的特異的配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の上流に位置し、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なる；
（２）メディエータープローブの切断を可能にする条件で、工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる工程；
（３）ｍ個の検出プローブを提供し、核酸のハイブリダイズを可能にする条件で工程（２）の生成物を前記ｍ個の検出プローブに接触させる工程；
ここでｍはｎより小さくかつ０より大きい整数であり、各検出プローブは３’→５’方向に１つ以上のメディエーター配列又はその一部に相補的な１つ以上の捕捉配列及び鋳型配列を個別に含み、前記ｍ個の検出プローブはそれぞれ工程（１）で提供された各メディエータープローブのメディエーター配列又はその一部に相補的な複数（例えばｎ個以上）の捕捉配列を含む、そして
各検出プローブはレポーター基及び消光基で個別に標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に各検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる；
（４）核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件で、工程（３）の生成物を核酸ポリメラーゼに接触させる工程；及び
（５）工程（４）の生成物に融解曲線解析を実施して、融解曲線解析の結果に従って、各標的核酸配列が前記試料中に存在するかどうかを決定する工程；を含む。
【０１３９】
これらの態様の工程（１）で、特定の標的核酸配列が存在する場合に、その標的核酸配列に対応する上流オリゴヌクレオチド配列（すなわち標的核酸配列に相補的な配列を含む上流オリゴヌクレオチド配列）及び標的核酸配列に対応するメディエータープローブ（すなわちその標的特異的配列が標的核酸配列に相補的な配列を含むメディエータープローブ）の両方は、標的核酸配列とハイブリダイズする。
【０１４０】
さらに、これらの態様の工程（２）で、特定の標的核酸配列が存在する場合に、上流オリゴヌクレオチド配列及びその標的核酸配列に対応するメディエータープローブの両方は、標的核酸配列とハイブリダイズするが、前記メディエータープローブ中のメディエーター配列は遊離状態であり、標的核酸配列とハイブリダイズしない。この場合に、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在で、前記メディエータープローブ（標的核酸配列に対応するメディエータープローブ）中のメディエーター配列又はその一部は、（標的核酸配列に対応する）上流オリゴヌクレオチド配列又はその伸長産物の存在により、前記メディエータープローブから切断されて、標的核酸配列に対応するメディエーター断片を生成する。
【０１４１】
さらに、これらの態様の工程（３）及び（４）で、特定の標的核酸配列に対応するメディエーター断片が存在する場合に、前記メディエーター断片は相補的な検出プローブ（すなわちメディエーター断片中のメディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列を含む検出プローブ）とハイブリダイズし、前記核酸ポリメラーゼは鋳型として前記相補的検出プローブを使用し、前記メディエーター断片を伸長して前記標的核酸配列に対応する二本鎖を生成する。
【０１４２】
本発明の方法で、ｍ個の検出プローブが複数の捕捉配列を含み、前記複数の捕捉配列の集合が、工程（１）で提供された全てのメディエータープローブ中のメディエーター配列又はその一部の相補的配列を包含していることは容易に理解できる。従って、前記ｍ個の検出プローブ又は前記複数の捕捉配列は、任意のメディエータープローブから切断されたメディエーター断片を「捕捉」できる。すなわち、メディエータープローブから切断されたいずれのメディエーター断片も、少なくとも１個の検出プローブ又は少なくとも１つの捕捉配列とハイブリダイズできる。
【０１４３】
さらに、これらの態様の工程（５）で、特定の標的核酸配列に対応する二本鎖の融解ピークが検出又は非検出の場合に、前記標的核酸配列は前記試料中に存在又は不存在と決定される。
【０１４４】
いくつかの態様において、工程（１）で、検出される各標的核酸配列に対し、少なくとも１個（又はそれ以上）のメディエータープローブが提供される。従って、工程（１）で、ｎ個（又はそれ以上）のメディエータープローブが提供され、その各々が標的核酸配列に対し提供される。その後に工程（３）で、前記ｍ個の検出プローブは、ｎ個（又はそれ以上）の捕捉配列を含み、それらは工程（１）で提供されたｎ個（又はそれ以上）のメディエータープローブのメディエーター配列又はその一部にそれぞれ相補的である。従って、工程（２）で生成された任意のメディエーター断片は、（メディエーター断片中のメディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列を含む）少なくとも１つの検出プローブとハイブリダイズして二本鎖を形成することができ、その二本鎖はその後の伸長及び検出に使用される。いくつかの好ましい態様において、前記ｍ個の検出プローブはｎ個の捕捉配列を含み、これらは、ｎ個のメディエータープローブのメディエーター配列又はその一部にそれぞれ相補的である。
【０１４５】
いくつかの好ましい態様において、前記ｍ個の検出プローブは同一の捕捉配列を含まない。この場合に、各メディエータープローブに対して、メディエータープローブ由来のメディエーター断片とハイブリダイズする唯一１個の検出プローブ（メディエータープローブ中のメディエーター配列に相補的な捕捉配列を含む）が存在し、かつ伸長反応の後に、唯一１個の二本鎖が生成する。その後に、工程（５）で二本鎖の存在を検出して、前記メディエータープローブに対応する標的核酸配列の存在を決定できる。
【０１４６】
いくつかの好ましい態様において、前記ｍ個の検出プローブは同一の捕捉配列を含むことができる。この場合に、各メディエータープローブに対して、メディエータープローブ由来のメディエーター断片とハイブリダイズする１個以上の検出プローブ（メディエータープローブ中のメディエーター配列に相補的な捕捉配列を含む）が存在してもよく、かつ伸長反応の後に、１個以上の二本鎖が生成する。その後に、工程（５）で１個以上の二本鎖の存在を検出して、前記メディエータープローブに対応する標的核酸配列の存在を決定できる。
【０１４７】
これらの態様の工程（５）で、二本鎖及び／又は検出プローブのレポーター基の融点を用いて二本鎖を区別及び識別できる。いくつかの好ましい態様において、前記ｍ個の検出プローブは同一のレポーター基を含む。この場合に、工程（４）の生成物に融解曲線解析を行うことができ、融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って、特定の二本鎖の存在を決定でき、さらに二本鎖に対応する標的核酸配列の存在を決定できる。いくつかの好ましい態様において、前記ｍ個の検出プローブに含まれるレポーター基は互いに異なる。この場合に、工程（４）の生成物に融解曲線解析を行うと、各レポーター基のシグナルをリアルタイムで監視し、それにより各々が１個のレポーター基のシグナルに対応する複数の融解曲線を取得できる。その後に、レポーター基のシグナル形状及び融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って、特定の二本鎖の存在を決定でき、さらに二本鎖に対応する標的核酸配列の存在を決定できる。
【０１４８】
いくつかの典型的な態様において、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上の検出プローブ（すなわち、ｍは１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、８以上、１０以上の整数）を使用できる。いくつかの典型的な態様において、１〜１０個の検出プローブ（すなわち、ｍは１〜１０の整数であり、例えば、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である）を使用できる。さらに好ましくは、使用する検出プローブは、同一又は異なるレポーター基で個別に標識されている。
【０１４９】
例えば、いくつかの典型的な態様において、本発明の方法は、それぞれ第１のレポーター基及び第２のレポーター基で標識された第１の検出プローブ及び第２の検出プローブを使用してもよい。従って工程（５）で、第１のレポーター基及び第２のレポーター基のシグナルは、温度の変化とともにリアルタイムに監視されて、第１の融解曲線及び第２の融解曲線を取得する。その後に、第１（又は第２）の融解曲線での融解ピークに従って、第１（又は第２）の検出プローブを含む二本鎖の存在を決定でき、さらに第１（又は第２）の検出プローブとハイブリダイズしたメディエーター断片に対応する標的核酸配列の存在を決定できる。
【０１５０】
いくつかの典型的な態様において、本発明の方法は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上の検出プローブ、及び２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上のメディエータープローブを使用する。従って本発明の方法は、複数の標的核酸配列の同時検出（多重検出）を達成でき、検出可能な標的核酸配列の最大数は、使用するメディエータープローブの数に等しい。例えば本出願の実施例６で、本発明の方法は、３個の検出プローブと２０個のメディエータープローブを使用し、２０個の標的核酸配列の同時検出（二十重検出）を達成する。
【０１５１】
１個の検出プローブを使用する方法に詳述される技術的特徴は、２個以上の検出プローブを使用する方法にも応用できることは容易に理解できる。例えば、上述の検出対象の試料、標的核酸配列、メディエータープローブ、上流オリゴヌクレオチド配列、下流オリゴヌクレオチド配列、共通プライマー、検出プローブ、核酸のハイブリダイズを可能にする条件、メディエータープローブの切断を可能にする条件、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件、核酸ポリメラーゼ、融解曲線解析、工程の繰り返しなどの詳細な説明は、２個以上の検出プローブを使用する方法に応用できる。従って、いくつかの好ましい態様において、２個以上の検出プローブを使用する本発明の方法は、先に詳述した任意の１つ以上の技術的特徴、又は前記技術的特徴の任意の組合せを含むことができる。
【０１５２】
例えば、上述のように実用時の必要性に応じて、工程（１）〜（４）のうちの１つ以上の工程を繰り返してもよい。いくつかの好ましい態様において、工程（１）〜（２）を１回以上繰り返し、各繰り返しの前に核酸変性の工程を１回実施する。工程（１）〜（２）の繰り返しは、後続の工程（すなわち工程（３）〜（５））で使用するより多くのメディエーター断片を生成できることは容易に理解できる。従っていくつかの好ましい態様において、本発明の方法は、工程（１）〜（２）を１回以上繰り返し、各繰り返しの前に核酸変性の工程を１回実施し、次いで工程（３）〜（５）を実施する解決策によって実行される。
【０１５３】
いくつかの好ましい態様において、工程（１）〜（４）を１回以上繰り返し、各繰り返しの前に核酸変性の工程を１回実施する。工程（１）〜（４）の繰り返しは検出プローブとメディエーター断片の伸長産物とを含むより多くの二本鎖を生成し、それらはその後の工程（すなわち工程（５））で使用できることは容易に理解できる。従っていくつかの好ましい態様において、本発明の方法は、工程（１）〜（４）を１回以上繰り返し、各繰り返しの前に核酸変性の工程を１回実施し、次いで工程（５）を実施する解決策によって実行される。
【０１５４】
いくつかの好ましい態様において、本発明の方法の工程（１）〜（４）は、以下の工程（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）ｍ個の検出プローブを提供し、検出対象の各標的核酸配列に対し上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、及び下流オリゴヌクレオチド配列を提供し、任意に共通プライマーを提供すること、ここで、前記検出プローブ、前記メディエータープローブ、前記上流オリゴヌクレオチド配列、前記下流オリゴヌクレオチド配列、及び前記共通プライマーは、先に規定した通りである；
（ｂ）検出対象の試料を、提供された検出プローブ、上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ及び下流オリゴヌクレオチド配列、並びに５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）と混合し、任意に共通プライマーを添加すること；
（ｃ）核酸変性を可能にする条件で、前工程の生成物をインキュベートすること；
（ｄ）核酸のアニール又はハイブリダイズを可能にする条件で前工程の生成物をインキュベートすること；
（ｅ）核酸の伸長を可能にする条件で前工程の生成物をインキュベートすること；及び
（ｆ）任意に工程（ｃ）〜（ｅ）を１回以上繰り返すこと；を含む方法によって実施できる。
工程（ａ）〜（ｆ）については、上記に既に詳述した。
任意選択工程（６）及び定量的／半定量的検出
【０１５５】
本発明の方法は、標的核酸配列の定性的検出に使用するだけでなく、標的核酸配列の定量的又は半定量的検出にも使用できる。工程（１）で試料中の特定の標的核酸配列の量が多いほど、より多くのメディエータープローブが前記標的核酸配列とハイブリダイズすること、さらに工程（２）でより多くのメディエータープローブが切断され、より多くのメディエーター断片が放出されること、さらに工程（３）及び（４）で検出プローブとハイブリダイズするメディエーター断片もより多く存在し、より多くの二本鎖が伸長反応により生成されること、さらに工程（５）でより多くの二本鎖を融解曲線解析に使用でき、結果として発生したシグナルはより強く、融解ピークの高さはより高くなることは、容易に理解できる。それにより融解ピークの相対的な高さに従って、試料中の対応する標的核酸配列の量／水準（定量的又は半定量的検出）を決定できる。従って、本発明の方法は、試料中の２つ以上の標的核酸配列の存在を検出するだけでなく、試料中の前記２つ以上の標的核酸配列の量を検出するためにも使用できる。
【０１５６】
従って、いくつかの好ましい態様において、本発明の方法はさらに、
（６）融解曲線解析の結果（特に融解曲線中の融解ピークのピーク高さ）に従って、融解ピークに対応する標的核酸配列の量を決定する工程を含む。
プローブセットとキット
【０１５７】
別の態様において、本発明は、１個の検出プローブと少なくとも２個のメディエータープローブとを含むプローブセットを提供する。ここで、
前記メディエータープローブはそれぞれ個別に、５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記標的特異的配列は標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なる。かつ、
前記検出プローブは、３’→５’方向に各メディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列及び鋳型配列を含み、前記検出プローブはレポーター基及び消光基で標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に前記検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる。
【０１５８】
いくつかの好ましい態様において、前記プローブセットは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、２０個以上のメディエータープローブを含む。好ましくは、前記メディエータープローブ（又はその内部に含まれる標的特異的配列）は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の標的核酸配列を標的とする。いくつかの好ましい態様において、前記プローブセットは、１個の検出プローブと２〜６個（例えば、２、３、４、５、又は６個）のメディエータープローブとを含む。従って、前記プローブセットは、２〜６個（例えば、２、３、４、５、又は６個）の標的核酸配列を同時に検出するのに使用できる。
【０１５９】
いくつかの好ましい態様において、全てのメディエータープローブは、それぞれ異なる標的核酸配列を標的とする。いくつかの好ましい態様において、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なり、全てのメディエータープローブに含まれる標的特異的配列は互いに異なる。
【０１６０】
このプローブセットを使用して、先に詳述したように本発明の方法を実行できることは容易に理解できる。従って、先に詳述したメディエータープローブ及び検出プローブの技術的特徴は、プローブセット内のメディエータープローブ及び検出プローブにも応用できる。従っていくつかの好ましい態様において、前記プローブセットは先に規定したメディエータープローブを含む。いくつかの好ましい態様において、前記プローブセットは先に規定した検出プローブを含む。
【０１６１】
いくつかの好ましい態様において、前記プローブセットはさらに、先に規定した上流オリゴヌクレオチド配列を含む。例えば、各標的核酸配列及び各メディエータープローブに対し上流オリゴヌクレオチド配列を提供でき、前記上流オリゴヌクレオチド配列は、前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記上流オリヌクレオチド配列は、前記メディエータープローブの標的特異的配列の上流に位置する。
【０１６２】
いくつかの好ましい態様において、前記プローブセットはさらに、先に規定した下流オリゴヌクレオチド配列を含む。例えば、下流オリゴヌクレオチド配列を各標的核酸配列及びメディエータープローブに提供でき、前記下流オリゴヌクレオチド配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記下流オリゴヌクレオチド配列は、前記メディエータープローブの標的特異的配列の下流に位置する。
【０１６３】
いくつかの好ましい実施態様において、前記プローブセットはさらに、先に規定した共通のプライマーを含む。例えば、いくつかの好ましい態様において、前記上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列は、それらの５’末端に同一のオリゴヌクレオチド配列を含む。従って、前記プローブセットはさらに、同一のオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を持つ共通プライマーを含むことができる。
【０１６４】
いくつかの好ましい実施態様において、前記プローブセットはさらに、先に規定した上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい態様において、前記プローブセットはさらに、先に規定した上流オリゴヌクレオチド配列、下流オリゴヌクレオチド配列、及び共通のプライマーを含む。
【０１６５】
別の態様において、本発明は、先に規定した１個以上のプローブセットを含むキットを提供する。
【０１６６】
いくつかの好ましい態様において、前記キットは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のプローブセットを含む。
【０１６７】
いくつかの好ましい態様において、キット中の全てのメディエーター配列はそれぞれが異なる標的核酸配列を標的とする。いくつかの好ましい態様において、キット中の全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なる。いくつかの好ましい態様において、キット中の全てのメディエータープローブに含まれる標的特異的配列は互いに異なる。
【０１６８】
いくつかの好ましい態様において、キット中の全ての検出プローブは同じレポーター基を含む。いくつかの好ましい態様において、キット中の全ての検出プローブは、同一又は異なるレポーター基により個別に標識されている。いくつかの好ましい態様において、キット中の全ての検出プローブに含まれるレポーター基は互いに異なる。
【０１６９】
いくつかの好ましい態様において、前記キットは１〜６個のプローブセットを含む。好ましくは、キット中の全ての検出プローブに含まれるレポーター基は互いに異なる。さらに好ましくは、キット中の全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なり、キット中の全てのメディエータープローブに含まれる標的特異的配列は互いに異なる。
【０１７０】
本出願はさらに、ｍ個の検出プローブ及びｎ個のメディエータープローブを含むキットを提供し、ここでｎは２以上の整数（例えばｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、又はそれ以上の整数）であり、ｍはｎより小さく０より大きい整数である。
各メディエータープローブは、５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を個別に含み、前記標的特異的配列は標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的でない配列を含み、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なる。
各検出プローブは、３’→５’方向に１個以上のメディエーター配列又はその一部に相補的な１個以上の捕捉配列及び鋳型配列を個別に含み、前記ｍ個の検出プローブは、各々が各メディエータープローブのメディエーター配列又はその一部にそれぞれ相補的である複数の（例えば少なくともｎ個の）捕捉配列を含む。かつ、
各検出プローブは、レポーター基及び消光基で個別に標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に各検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる。
【０１７１】
本発明の典型的な態様において、ｍ個の検出プローブは複数の捕捉配列を含み、前記複数の捕捉配列の集合は、キット内の全てのメディエータープローブ中のメディエーター配列の相補的な配列又はその一部を包含する。従って、前記ｍ個の検出プローブ又は前記複数の捕捉配列は、任意のメディエータープローブから切断されたメディエーター断片を「捕捉」できる。すなわち、メディエータープローブから切断されたいずれのメディエーター断片も、少なくとも１つの検出プローブ又は少なくとも１つの捕捉配列とハイブリダイズできる。
【０１７２】
いくつかの典型的な態様において、前記キットは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上の検出プローブを含む（すなわち、ｍは１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、８以上、１０以上の整数である）。いくつかの典型的な態様において、前記キットは、１〜１０個の検出プローブを含む（すなわち、ｍは１〜１０の整数であり、例えば、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である）。さらに好ましくは、前記検出プローブのそれぞれは、同一又は異なるレポーター基で標識されている。
【０１７３】
いくつかの典型的な態様において、前記キットは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上の検出プローブを含み、及び２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上のメディエータープローブを含む。従ってキットは、複数の標的核酸配列の同時検出に使用でき、検出対象の標的核酸配列の最大数は、使用するメディエータープローブの数と等しい。
【０１７４】
例えばいくつかの典型的な態様において、前記キットは、１個の検出プローブと２〜６個（例えば、２、３、４、５又は６個）のメディエータープローブを含み、それらを使用して２〜６個（例えば、２、３、４、５又は６個）の標的核酸配列を同時に検出できる。いくつかの典型的な態様において、前記キットは、２個の検出プローブと３〜１２個（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個）のメディエータープローブを含み、それらを使用して３〜１２個の標的核酸配列を同時に検出できる。いくつかの典型的な態様において、前記キットは、３個の検出プローブと４〜１８個（例えば、５〜１０個）のメディエータープローブを含み、それらを使用して４〜１８個（例えば５〜１０個）の標的核酸配列を同時に検出できる。いくつかの典型的な態様において、前記キットは、４個の検出プローブと５〜２４個（例えば、６〜１２個）のメディエータープローブを含み、それらを使用して５〜２４個（例えば６〜１２個）の標的核酸配列を同時に検出できる。いくつかの典型的な態様において、前記キットは、５個の検出プローブと６〜３０個（例えば、８〜１５個）のメディエータープローブを含み、それらを使用して６〜３０個（例えば８〜１５個）の標的核酸配列を同時に検出できる。いくつかの典型的な態様において、前記キットは、６個の検出プローブと７〜３６個（例えば、１０〜１８個）のメディエータープローブを含み、それらを使用して７〜３６個（例えば１０〜１８個）の標的核酸配列を同時に検出できる。いくつかの典型的な態様において、前記キットは、７個の検出プローブと８〜４２個（例えば、１２〜２０個）のメディエータープローブを含み、それらを使用して８〜４２個（例えば１２〜２０個、例えば１９個）の標的核酸配列を同時に検出できる。
【０１７５】
そのキットを使用して先に詳述した本発明の方法を実施できることは容易に理解できる。従って、先に詳述したメディエータープローブ及び検出プローブの技術的特徴は、キット中でのメディエータープローブ及び検出プローブにも応用できる。従ってこのキットは、本発明の方法を実施するのに必要な他の薬剤をさらに含むことができる。
【０１７６】
例えばいくつかの好ましい態様において、キットはさらに、先に規定した上流オリゴヌクレオチド配列、下流オリゴヌクレオチド配列、共通プライマー、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、核酸ポリメラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの好ましい態様において、キットはさらに、核酸ハイブリダイズ剤、メディエータープローブ切断剤、核酸伸長剤、核酸増幅剤、逆転写剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む。これらの薬剤は、当業者なら通常の方法で決定でき、かつ限定はされないが、酵素（例えば、核酸ポリメラーゼ）作動緩衝液、ｄＮＴＰ、水、イオンを含む溶液（例えば、Ｍｇ2+）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、又はそれらの任意の組合わせを含む。例えば、逆転写のための薬剤としては、限定はされないが、逆転写酵素、逆転写酵素用の作動緩衝液、オリゴｄ（Ｔ）、ｄＮＴＰ、ヌクレアーゼ非含有水、ＲＮＡ分解酵素阻害剤、又はそれらの任意の組合わせが挙げられる。
プローブセットの使用
【０１７７】
本出願はさらに、試料中の前記標的核酸配列の存在又は量を検出するキットの製造での先に規定されたプローブセットの使用に関する。
【０１７８】
前記プローブセット又はキットを使用して、先に詳述した本発明の方法を実施できることは容易に理解できる。従って、先に詳述した標的核酸配列、プローブセット、キット、及びその内部に含まれる構成要素（例えば、メディエータープローブ、検出プローブ、上流オリゴヌクレオチド配列、下流オリゴヌクレオチド配列、共通プライマー、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、核酸ポリメラーゼ、核酸ハイブリダイズ剤、メディエータープローブ切断剤、核酸伸長剤、核酸増幅剤、逆転写剤、又はそれらの任意の組合わせ）の技術的特徴を、ここでも応用できる。
【０１７９】
本明細書内に詳述された原理に基づいて、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の技術的解決策の技術的特徴を改変、置換、又は組み合わせることができる。その全ての技術的解決策及びその変形は、本出願での特許請求の範囲又はその均等物内に包含されている。
【本発明の有益な効果】
【０１８０】
先行技術と比較して、本発明の技術的解決策は、以下の有益な効果を有する。
（１）本発明の方法は、僅か１個の標識プローブ（すなわち検出プローブ）を使用して、複数の標的核酸配列の同時検出（多重検出）を達成できる。
（２）本発明の方法は、複数の標的核酸配列の同時検出（多重検出）を達成でき、同時に検出できる標的核酸配列の最大数は、使用する標識プローブ（すなわち検出プローブ）の数よりはるかに多い。
【０１８１】
従って、本発明は、単純で、高効率で、低コストの多重検出方法を提供する。本発明の方法によって検出できる標的核酸配列の最大数は、使用する標識プローブ（すなわち検出プローブ）の数に制限を受けない。すなわち本発明の方法は、相対的に限定した数の標識プローブ（すなわち検出プローブ）に基づいて、際立ってより多くの標的核酸配列の同時検出（多重検出）を達成することができ、これは特に有効な点である。
【０１８２】
本発明の態様は、図面及び実施例を参照して詳細に説明される。しかしながら、当業者であれば、以下の図面及び実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を説明することのみを意図していることを理解できる。以下の図面及び好ましい態様の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的及び有効な特徴が当業者には明白になる。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１Ａ】図１は、本発明の方法の典型的な態様を示し、本発明の方法の基本原理を説明している。  図１Ａは、１個の検出プローブと５個のメディエータープローブを使用して５個の標的核酸分子を検出する典型的な態様を示す。これらの態様において、（蛍光基及び消光基を担持する）自己消光型検出プローブを提供し、上流プライマー（上流プライマー１〜５）、下流プライマー（下流プライマー１〜５）、及びメディエータープローブ（メディエータープローブ１〜５）を各標的核酸分子（Ｔ１〜Ｔ５）に対して設計・提供し、メディエータープローブのそれぞれは、前記検出プローブとハイブリダイズできる固有のメディエーター配列（メディエーター配列１〜５）を含む。検出プローブ表面の各メディエーター配列に対するハイブリダイズ位置は固有であるが、それらの間には重複領域があってもよい。例えば、図１Ａに示すように、検出プローブ表面のメディエーター配列１のハイブリダイズ位置はメディエーター配列２のその位置と部分的に重なり、検出プローブ表面のメディエーター配列４のハイブリダイズ位置はメディエーター配列５のその位置と部分的に重なるが、検出プローブ表面のメディエーター配列３のハイブリダイズ位置はその他のメディエーター配列のその位置とは重ならない。検出中に、５個の上流プライマー、５個の下流プライマー、及び５個のメディエータープローブは、それらの対応する標的核酸分子とそれぞれハイブリダイズ（アニール）した。その後に、核酸ポリメラーゼの存在で全ての上流プライマー及び下流プライマーはそれぞれ伸長され、各上流プライマー（上流プライマー１〜５）の伸長により、対応するメディエータープローブ（メディエータープローブ１〜５）は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断され、メディエーター断片（メディエーター断片１〜５）を放出した。その後に、メディエーター断片１〜５は、それぞれ異なる位置で検出プローブとハイブリダイズし、核酸ポリメラーゼによって伸長されて５個の伸長産物を生成した。５個の伸長産物の長さは異なり、検出プローブと共に異なるＴｍ値を持つ５個の二本鎖を生成した。それにより、融解曲線解析によって特定のＴｍ値を持つ二本鎖の存在を決定でき、さらに二本鎖に対応する標的核酸分子の存在を決定できた。従って本発明の方法では、５個の標的核酸分子の検出は、１つの検出プローブと５個のメディエータープローブを使用して達成できる。
【０１８４】
【図１Ｂ】図１は、本発明の方法の典型的な態様を示し、本発明の方法の基本原理を説明している。  図１Ｂは、２個の検出プローブと１０個のメディエータープローブが使用して１０個の標的核酸分子（Ｔ１〜Ｔ１０）を検出する典型的な態様を示す。これらの態様において、２個の自己消光型検出プローブ（第１及び第２の検出プローブ）を提供し、その各々が異なる蛍光基（蛍光基１〜２）及び異なる消光基（消光基１〜２）を担持する。かつ上流プライマー（上流プライマー１〜１０）、下流プライマー（下流プライマー１〜１０）、及びメディエータープローブ（メディエータープローブ１〜１０）を各標的核酸分子（Ｔ１〜Ｔ１０）に対して設計・提供し、各メディエータープローブは固有のメディエーター配列（メディエーター配列１〜１０）を含み、メディエーター配列１〜５は第１の検出プローブとハイブリダイズでき、メディエーター配列６〜１０は第２の検出プローブとハイブリダイズできる。検出プローブ表面の各メディエーター配列のハイブリダイズ位置は固有であるが、それらの間に重複領域があってもよい。例えば、図１Ｂに示すように、第１検出プローブ表面のメディエーター配列１のハイブリダイズ位置は、メディエーター配列２のその位置と部分的に重なり、第１検出プローブ表面のメディエーター配列４のハイブリダイズ位置は、メディエーター配列５のその位置と部分的に重なり、第１の検出プローブ表面のメディエーター配列３のハイブリダイズ位置はその他のメディエーター配列のその位置と重ならない。第２の検出プローブ表面のメディエーター配列６のハイブリダイズ位置は、メディエーター配列７のその位置と部分的に重なり、第２の検出プローブ表面のメディエーター配列９のハイブリダイズ位置は、メディエーター配列１０のその位置と部分的に重なり、第２の検出プローブ表面のメディエーター配列８のハイブリダイズ位置は、その他のメディエーター配列のその位置と重ならない。検出中に、１０個の上流プライマー、１０個の下流プライマー、１０個のメディエータープローブは、それらに対応する標的核酸分子とそれぞれハイブリダイズ（アニール）した。その後に、核酸ポリメラーゼの存在で、全ての上流プライマー及び下流プライマーはそれぞれ伸長され、各上流プライマー（上流プライマー１〜１０）の伸長により、対応するメディエータープローブ（メディエータープローブ１〜１０）は５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、メディエーター断片（メディエーター断片１〜１０）を放出した。その後に、メディエーター断片１〜５は、異なる位置で第１の検出プローブとハイブリダイズし、核酸ポリメラーゼによって伸長されて５個の伸長産物を生成した。この５個の伸長産物の長さは異なり、第１の検出プローブと共に異なるＴｍ値を持つ５個の二本鎖を生成した。同様にメディエーター断片６〜１０は、異なる位置で第２の検出プローブとハイブリダイズし、核酸ポリメラーゼによって伸長されて別の５個の伸長産物を生成した。この５個の伸長産物の長さは異なり、第２の検出プローブと共に異なるＴｍ値を持つ別の５個の二本鎖を形成した。その後に、第１及び第２の検出プローブ表面の蛍光基（蛍光基１〜２）を使用してそれぞれ���融解曲線解析を実施し、特定のＴｍ値を有する二本鎖の存在を決定でき、かつ二本鎖に対応する標的核酸分子の存在を決定できた。従って、本発明の方法では、２個の検出プローブと１０個のメディエータープローブを使用して、１０個の標的核酸分子の検出を達成できる。
【０１８５】
【図２】図２は、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１と直鎖状蛍光プローブＵＰ−Ｌ２を用いた４回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示す。ここで反応Ａでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つTaq DNAポリメラーゼ及び２００ｎＭのメディエータープローブを使用し（図２Ａ）、反応Ｂでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つTaq DNAポリメラーゼ及び０ｎＭのメディエータープローブを使用し（図２Ｂ）、反応Ｃでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないKlenTaq 1DNAポリメラーゼ及び２００ｎＭメディエータープローブを使用し（図２Ｃ）、反応Ｄでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないKlenTaq 1DNAポリメラーゼ及び０ｎＭメディエータープローブを使用する（図２Ｄ）。図２Ａ〜２Ｄでは、実線は、２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１８６】
【図３】図３は、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１とヘアピン構造を持つ蛍光プローブＵＰ−ＭＢを用いた４回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示す。ここで、反応Ａでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つTaq DNAポリメラーゼ及び２００ｎＭのメディエータープローブを使用し（図３Ａ）、反応Ｂでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つTaq DNAポリメラーゼ及び０ｎＭのメディエータープローブを使用し（図３Ｂ）、反応Ｃでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないKlenTaq 1DNAポリメラーゼ及び２００ｎＭのメディエータープローブを使用し（図３Ｃ）、反応Ｄでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないKlenTaq 1DNAポリメラーゼ及び０ｎＭのメディエータープローブを使用する（図３Ｄ）。図３Ａ〜図３Ｄでは、実線は、２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１８７】
【図４】図４は、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１と蛍光プローブＵＰ−Ｌ２（図４Ａ）又はＵＰ−ＭＢ（図４Ｂ）を用いた４回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。図４Ａの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１、蛍光プローブＵＰ−Ｌ２及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図４Ｂの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１、蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用する。図４Ａ〜４Ｂの測定では、実線は、２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１８８】
【図５】図５は、メディエータープローブ（ＢＲＡＦ−ＭＰ１、ＢＲＡＦ−ＭＰ２、又はＢＲＡＦ−ＭＰ３）と直鎖状蛍光プローブＵＰ−Ｌ２を用いた３回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。ここで、図５Ａの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１、蛍光プローブＵＰ−Ｌ２及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図５Ｂの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、蛍光プローブＵＰ−Ｌ２及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図５Ｃの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ３、蛍光プローブＵＰ−Ｌ２及びポリメラーゼＴａｑを使用する。図５Ａ〜５Ｃの測定では、実線は、２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１８９】
【図６】図６は、メディエータープローブ（ＢＲＡＦ−ＭＰ１、ＢＲＡＦ−ＭＰ２、又はＢＲＡＦ−ＭＰ３）とヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢを用いた３回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。ここで、図６Ａの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１、蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図６Ｂの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図６Ｃの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ３、蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用する。図６Ａ〜６Ｃの測定では、実線は、２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１９０】
【図７】図７は、特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた５回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、及びポリメラーゼＴａｑを使用する。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１９１】
【図８】図８は、増幅を対称的に（図８Ａ）又は非対称的に（図８Ｂ）実施するリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、ポリメラーゼＴａｑ及び特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ又は１００ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを使用する。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１９２】
【図９】図９は、増幅を２段階方法（図９Ａ）又は３段階方法（図９Ｂ）によって実施するリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、ポリメラーゼＴａｑ、及び特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡ使用する。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１９３】
【図１０】図１０は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子又は変異型ＫＲＡＳ遺伝子を担持するプラスミド又は水を鋳型として用いた３回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、メディエータープローブＫＲＡＳ−ＭＰ２、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用する。黒色の実線は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子を担持するプラスミドを鋳型として用いた実験結果を示し、灰色の実線は、変異ＫＲＡＳ遺伝子を担持するプラスミドを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１９４】
【図１１】図１１は、２個のメディエータープローブと１個の蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲの増幅曲線と融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、４個のプライマー（ＢＲＡＦ−Ｆ、ＢＲＡＦ−Ｒ、ＫＲＡＳ−Ｆ、及びＫＲＡＳ−Ｒ）、２個のメディエータープローブ（ＢＲＡＦ−ＭＰ２、及びＫＲＡＳ−ＭＰ３）、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、ポリメラーゼＴａｑ及び特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを使用する。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型とした実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１９５】
【図１２】図１２は、４個のメディエータープローブと１個の蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲの融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、表４に記載の９個のプライマー、４個のメディエータープローブ及び１個の蛍光プローブ、ポリメラーゼＴａｑＨＳ、及び正常男性から取得した特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、又は１００ｐｇ）の細胞ゲノムＤＮＡを使用する。図中の実線は、ゲノムＤＮＡを鋳型とした実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を表す。
【０１９６】
【図１３】図１３は、２０個のメディエータープローブ及び６個の蛍光プローブを用いた８３回のリアルタイムＰＣＲの融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、表５に記載の４１個のプライマー、２０個のメディエータープローブ及び６個の蛍光プローブ、ポリメラーゼＴａｑＨＳ、及び正常男性から取得した細胞ゲノムＤＮＡ（合計８３試料）を使用する。図１３Ａは、ＲＯＸ検出チャネルから得られた融解曲線を示し、図１３Ｂは、ＦＡＭ検出チャネルから得られた融解曲線を示し、図１３Ｃは、Ｃｙ５検出チャネルから得られた融解曲線を示す。図中の実線は、細胞ゲノムＤＮＡ（８３試料）を鋳型とした実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０１９７】
【図１４】図１４は、二十重のＰＣＲ・ＭＣＡを用いて９２個の試料を検出して取得した代表的な実験結果を示す。黒色の実線は、鋳型としてＹ染色体上に微小欠失を有する男性からの細胞ゲノムＤＮＡを使用した実験結果を示し、灰色の実線は、正常男性の細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示す。黒色の破線は、正常女性の細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、灰色の破線は水を鋳型として使用した実験結果を示す。
【発明の詳細な説明】
【０１９８】
本発明は、説明の目的のためだけに使用する（本発明の保護範囲を限定する意図はない）以下の実施例を参照して説明される。当然なことであるが、実施例は本発明の全ての可能性を示すのではなく、本発明の原理及び技術的効果の説明にのみ使用されている。本発明は、これらの実施例に記載の材料、反応条件又はパラメーターに限定はされない。当業者は、本発明の原理に基づいて、他の類似の材料又は反応条件を用いてその他の技術的解決策を実施できる。この技術的解決策は、本発明の基本原理及び趣旨から逸脱せずに、本発明の請求範囲内に包含される。
【実施例】
【０１９９】
実施例１：メディエータープローブ及び蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ測定
【０２００】
実施例では、ＢＲＡＦ遺伝子を検出対象の典型的な標的配列として使用して、メディエータープローブ及び蛍光プローブを使用したリアルタイムＰＣＲ分析を実行し、前記リアルタイムＰＣＲ測定で直鎖状蛍光プローブ及びヘアピン状蛍光プローブ（すなわちヘアピン構造を有する蛍光プローブ）を使用する影響を評価した。使用した蛍光プローブ（直鎖状又はヘアピン状）は自己消光型蛍光プローブであり、その一方の末端は蛍光基（例えばＲＯＸ）で標識され、他方の末端は消光基（例えばＢＨＱ２）で標識されていた。
【０２０１】
簡潔に言うと、２５μＬのＰＣＲ反応系を使用してリアルタイムＰＣＲを実施し、前記ＰＣＲ反応系は、１×緩衝液Ａ（６７ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１６．６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、６．７μＭのＥＤＴＡ、及び０．０８５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）、３．０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２．０ＵのポリメラーゼＴａｑ（Linglan Biotechnology Co.,Ltd.,Ｓhanghai）又はＫｌｅｎＴａｑ１（AB Bioscience,UK）、４００ｎＭの上流プライマー及び４００ｎＭの下流プライマー、０又は２００ｎＭのメディエータープローブ、２００ｎＭの蛍光プローブ（直鎖状又はヘアピン状）、０．１μＬの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、及び５μＬの２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを含んだ。リアルタイムＰＣＲの反応条件は、９５℃に５分、５０サイクル（９５℃に２０秒と６１℃に１分）であり、６１℃で蛍光を採取した。使用した実験装置は、Bio-Rad CFX96リアルタイムＰＣＲ装置（Bio-Rad,USA）であった。使用したプライマー及びプローブは、Shanghai Sangon Co.,Ltd.により合成された。使用したプライマー及びプローブの配列を表１に示した。
【表１】
2019528772.tif 000003
【０２０２】
実験結果を図２〜図３に示す。図２は、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１と直鎖状蛍光プローブＵＰ−Ｌ２を用いた４回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示す。反応Ａでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つTaq DNAポリメラーゼ及び２００ｎＭのメディエータープローブを使用し（図２Ａ）、反応Ｂでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つTaq DNAポリメラーゼ及び０ｎＭのメディエータープローブを使用し（図２Ｂ）、反応Ｃでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないKlenTaq 1DNAポリメラーゼ及び２００ｎＭのメディエータープローブを使用し（図２Ｃ）、反応Ｄでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないKlenTaq 1DNAポリメラーゼ及び０ｎＭメディエータープローブを使用する（図２Ｄ）。図２Ａ〜２Ｄでは、実線は、２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２０３】
図２の結果は、リアルタイムＰＣＲ蛍光シグナルが反応Ａでのみ発生し、反応Ｂ、Ｃ又はＤでは蛍光シグナルが発生しなかったことを示す。これらの結果は、５’→３エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼを（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）使用した場合に、メディエータープローブ及び直鎖状蛍光プローブをリアルタイムＰＣＲに使用できたことを示している。
【０２０４】
図３は、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１とヘアピン構造を持つ蛍光プローブＵＰ−ＭＢを用いた４回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示す。反応Ａでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つTaq DNAポリメラーゼ及び２００ｎＭのメディエータープローブを使用し（図３Ａ）、反応Ｂでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つTaq DNAポリメラーゼ及び０ｎＭのメディエータープローブを使用し（図３Ｂ）、反応Ｃでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないKlenTaq 1DNAポリメラーゼ及び２００ｎＭのメディエータープローブを使用し（図３Ｃ）、反応Ｄでは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないKlenTaq 1DNAポリメラーゼ及び０ｎＭのメディエータープローブを使用する（図３Ｄ）。図３Ａ〜図３Ｄでは、実線は、２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２０５】
図３の結果は、リアルタイムＰＣＲ蛍光シグナルが反応Ａでのみ発生し、反応Ｂ、Ｃ又はＤでは蛍光シグナルが発生しなかったことを示す。これらの結果は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を使用した場合に、メディエータープローブ及びヘアピン構造を持つ蛍光プローブをリアルタイムＰＣＲに使用できたことを示している。
実施例２：メディエータープローブ及び蛍光プローブを用いたＰＣＲ後ＭＣＡ測定
【０２０６】
実施例では、検出対象の典型的な標的配列としてＢＲＡＦ遺伝子を使用して、ＰＣＲ後ＭＣＡ方法で直鎖状蛍光プローブ及びヘアピン状蛍光プローブを使用する影響を評価した。
【０２０７】
実施例１に記載したように、２５μＬのＰＣＲ反応系を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。使用したＰＣＲ反応系は実施例１で使用した系と同じであった。使用したＰＣＲ反応条件は、９５℃に５分、５０サイクル（９５℃に２０秒、及び６１℃に１分）、３５℃に１０分であり、６１℃で蛍光を採取した。ＰＣＲが終了した後に、以下の手順に従って融解曲線解析を実施した。その手順として、９５℃に２分、４５℃に２分、その後反応系の温度を４５℃から９５℃に０．５℃／段階（各段階の持続時間は５秒であった）の加熱速度で上昇させ、その間に蛍光シグナルを採取した。実験結果を図４に示した。
【０２０８】
図４は、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１と蛍光プローブＵＰ−Ｌ２（図４Ａ）又はＵＰ−ＭＢ（図４Ｂ）を用いた４回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。図４Ａの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１、蛍光プローブＵＰ−Ｌ２及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図４Ｂの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１、蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用する。図４Ａ〜４Ｂの測定では、実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２０９】
図４の結果は、メディエータープローブ及び蛍光プローブ（直鎖状又はヘアピン状）を含む反応系を用いてリアルタイムＰＣＲ及びそれに続くＭＣＡを実施した場合に、この実験群では標的ピークは約７８℃に検出できた。これらの結果は、メディエータープローブ及び蛍光プローブ（直鎖状又はヘアピン状）を使用してＰＣＲ後ＭＣＡ測定を実施できたことを示している。さらに、図４の結果はまた、直鎖状蛍光プローブを用いてＭＣＡ分析を実施した場合に、非特異的ピークが約６０℃に検出できたことを示している（これはメディエータープローブと直鎖状蛍光プローブによって生成される二本鎖を表す）。対照的に、ヘアピン状蛍光プローブを用いてＭＣＡ測定を実施した場合には、非特異的ピークは著しく弱くなった。これらの結果は、ヘアピン状蛍光プローブに直鎖状蛍光プローブよりも優れた特異性が存在したことを示している。従って、状況によっては、ヘアピン状蛍光プローブが好ましい場合がある。
実施例３：メディエーター配列の長さの選択
【０２１０】
この実施例では、異なる長さのメディエーター配列を持つ複数のメディエータープローブを設計・合成し、実施例２に記載の方法を使用して、ＰＣＲ後ＭＣＡ測定に対するメディエーター配列の長さの影響を評価した。
【０２１１】
簡潔に言うと、３個のメディエータープローブが設計・合成され、その内部に含まれるメディエーター配列の長さは、それぞれ１９、１５及び１３塩基であった。３つのメディエータープローブの特定の配列を表２に示した。
【表２】
2019528772.tif 000004
【０２１２】
実施例２に記載するように、２５μＬのＰＣＲ反応系を使用してリアルタイムＰＣＲ及びその後のＭＣＡ測定を実施した。使用したメディエータープローブを除いて、使用したＰＣＲ反応系、ＰＣＲ反応条件及びＭＣＡ測定条件は、実施例２で使用した条件と同じであった。実験結果を図５〜６に示した。
【０２１３】
図５は、メディエータープローブ（ＢＲＡＦ−ＭＰ１、ＢＲＡＦ−ＭＰ２、又はＢＲＡＦ−ＭＰ３）と直鎖状蛍光プローブＵＰ−Ｌ２を用いた３回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。図５Ａの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１、蛍光プローブＵＰ−Ｌ２及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図５Ｂの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、蛍光プローブＵＰ−Ｌ２及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図５Ｃの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ３、蛍光プローブＵＰ−Ｌ２及びポリメラーゼＴａｑを使用する。図５Ａ〜５Ｃの測定では、実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２１４】
図６は、メディエータープローブ（ＢＲＡＦ−ＭＰ１、ＢＲＡＦ−ＭＰ２、又はＢＲＡＦ−ＭＰ３）とヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢを用いた３回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。図６Ａの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ１、蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図６Ｂの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用し、図６Ｃの測定では、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ３、蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びポリメラーゼＴａｑを使用する。図６Ａ〜６Ｃの測定では、実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２１５】
図５〜６の結果は、蛍光プローブ（直鎖状又はヘアピン状）と共に長さの異なるメディエーター配列を有する３個のメディエータープローブを用いて、ＰＣＲ後ＭＣＡ測定を実施できたことを示している。従ってこれらの結果は、実用時の必要性に従って、ＰＣＲ後ＭＣＡ測定を実施するために適切な長さのメディエータープローブを選択できたことを示している。さらに図５〜６の結果はまた、メディエータープローブのメディエーター長さの減少につれ、非特異的ピークのＴｍ値は徐々に下がり、シグナル強度が連続的に減少したことを示している。従って、実用時の必要性に応じて、メディエータープローブのメディエーター長さを適切に最適化して、非特異的ピークの干渉を低減できる。
【０２１６】
さらに図５〜６の結果はまた、直鎖状蛍光プローブを用いてＭＣＡ測定を実施した場合に、非特異的ピーク（メディエータープローブと直鎖状蛍光プローブによって生成した二本鎖を表す）を検出できたことを示している。対照的に、ヘアピン状蛍光プローブを用いてＭＣＡ測定を実施した場合に、非特異的ピークのシグナルは顕著に減少したか、まったく検出されなかった。これらの結果は、ヘアピン状蛍光プローブが直鎖状蛍光プローブよりも優れた特異性を持ち、メディエータープローブと蛍光プローブとの間のハイブリダイズから生じる非特異的ピークの干渉をより良好に克服できたことを示している。従って、状況によっては、ヘアピン状蛍光プローブが好ましい場合がある。
実施例４：メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定の感度
【０２１７】
この実施例では、メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定の感度を調べた。簡潔に言うと、実施例２に記載されるように、２５μＬのＰＣＲ反応系を使用してリアルタイムＰＣＲ及びその後のＭＣＡ測定を実施した。使用したメディエータープローブはＢＲＡＦ−ＭＰ２であり、使用した蛍光プローブはＵＰ−ＭＢであり、使用したポリメラーゼはＴａｑであり、使用した鋳型は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡであった（その量は１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇであり、測定は各量に対し３回繰り返した）。ゲノムＤＮＡの量を除いて、使用したＰＣＲ反応系、ＰＣＲ反応条件及びＭＣＡ測定条件は、実施例２と同じである。結果を図７に示した。
【０２１８】
図７は、特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた５回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。このリアルタイムＰＣＲでは、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、及びポリメラーゼＴａｑを使用する。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２１９】
図７の結果は、１０ｐｇ程度の少量のゲノムＤＮＡを鋳型として使用した場合に、特定の標的ピークがメディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定によって依然として検出できたことを示している。これは、前記ＰＣＲ後ＭＣＡ測定が非常に高い感度を有し、かつ１個のヒトゲノムを検出するのにも使用できたことを示している。
実施例５：ＰＣＲ増幅条件の選択
【０２２０】
この実施例では、メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定に対するＰＣＲ増幅条件の影響を評価した。
（１）対称的増幅及び非対称的増幅
【０２２１】
簡潔に言うと、実施例４に記載されるように、２５μＬのＰＣＲ反応系を使用してリアルタイムＰＣＲ及びその後のＭＣＡ測定を実施した。使用したメディエータープローブはＢＲＡＦ−ＭＰ２であり、使用した蛍光プローブはＵＰ−ＭＢであり、使用したポリメラーゼはＴａｑであり、使用した鋳型は特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ又は１００ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡであった。プライマーの濃度を除いて、使用したＰＣＲ反応系、ＰＣＲ反応条件及びＭＣＡ測定条件は実施例４で使用したものと同じであった。対称的ＰＣＲでは、使用したプライマーは４００ｎＭの上流プライマー及び４００ｎＭの下流プライマーであった。非対称的ＰＣＲでは、使用したプライマーは８００ｎＭの上流プライマー（プライマーとプローブとは逆方向で、すなわちプローブに結合したそれらの伸長産物）及び８０ｎＭの下流プライマーであった。実験結果を図８に示した。
【０２２２】
図８は、増幅が対称的（図８Ａ）又は非対称的（図８Ｂ）に実施されるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、ポリメラーゼＴａｑ及び特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ又は１００ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを使用する。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２２３】
図８の結果は、対称的増幅又は非対称的増幅の条件で、メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定が特定の標的ピークを検出できたことを示し、２つの条件にＰＣＲのＣｑ値とＭＣＡ測定で発生した特異的ピークに有意差はなかった。従って、前記ＰＣＲ後のМＣＡ測定では、ＰＣＲ増幅は対称的又は非対称的に実施できた。
（２）２段階ＰＣＲ及び３段階ＰＣＲ
【０２２４】
簡潔に言うと、実施例４に記載されるように、２５μＬのＰＣＲ反応システムを使用してリアルタイムＰＣＲ及びその後のＭＣＡ測定を実施した。使用したメディエータープローブはＢＲＡＦ−ＭＰ２であり、使用した蛍光プローブはＵＰ−ＭＢであり、使用したポリメラーゼはＴａｑであり、使用した鋳型は特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡであった。ＰＣＲ反応条件を除いて、使用したＰＣＲ反応系及びＭＣＡ測定条件は実施例４で使用したものと同じであった。２段階ＰＣＲで使用した増幅条件は、９５℃に５分、その後に５０サイクル（９５℃に２０秒、及び６１℃に１分）であった。３段階ＰＣＲで使用した増幅条件は、９５℃に５分、その後に５０サイクル（９５℃に２０秒、６１℃に４０秒、及び７２℃に２０秒）であった。実験結果を図９に示した。
【０２２５】
図９は、２段階法（図９Ａ）又は３段階法（図９Ｂ）によって増幅が実施されるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、メディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、ポリメラーゼＴａｑ、及び特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを使用する。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２２６】
図９の結果は、２段階ＰＣＲ又は３段階ＰＣＲの条件で、メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定で特定の標的ピークを検出できたことを示している。さらに図９の結果はまた、２段階ＰＣＲの条件で前記ＰＣＲ後ＭＣＡ測定を使用して１０ｐｇ程度の低い濃度でゲノムＤＮＡを検出でき、３段階ＰＣＲの条件で前記ＰＣＲ後ＭＣＡ測定を使用して１００ｐｇ程度の低い濃度でゲノムＤＮＡを検出できたことを示している。これらの結果は、前記ＰＣＲ後ＭＣＡ測定で、ＰＣＲ増幅を２段階方式又は３段階方式で実施でき、２段階法を使用してＰＣＲ増幅を実施した場合に、前記ＰＣＲ後ＭＣＡ測定はより高い感度を有する。
【０２２７】
実施例６：メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定に対する標的配列変動の影響
【０２２８】
メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定の１つの特徴は、検出された融点がメディエーター配列及び蛍光プローブに依存し、かつ標的配列に関与しないことである。従って、検出対象の標的配列に変動があった（結果として、標的配列はメディエータープローブ中の標的特異的配列と完全には一致しなかった（例えば、１つ以上の不一致の塩基があった））としても、リアルタイムＰＣＲのアニール／伸長中にメディエータープローブが標的配列に結合できるのなら、前記ＰＣＲ後ＭＣＡ測定で特異的ピークを検出でき、特異的ピークの融点は変化のないままであった。この特徴を検証するために、この実施例では、メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定に対する標的配列の変化／変異の影響について評価した。
【０２２９】
簡潔に言うと、２５μＬのＰＣＲ反応系を使用してリアルタイムＰＣＲを実施し、前記ＰＣＲ反応系は、１×緩衝液Ａ（６７ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１６．６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、６．７μＭのＥＤＴＡ、及び０．０８５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）、３．０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２．０ＵのポリメラーゼＴａｑ、４００ｎＭの上流プライマー及び４００ｎＭの下流プライマー、２００ｎＭのメディエータープローブＫＲＡＳ−ＭＰ２、２００ｎＭの蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、０．１μＬの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、及び野生型ＫＲＡＳ遺伝子又は変異型ＫＲＡＳ遺伝子を担持する（鋳型としての）５μＬのプラスミドを含んだ。使用したプライマー及びプローブの配列を表３に示した。
【表３】
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【０２３０】
野生型ＫＲＡＳ遺伝子と対比して、変異型ＫＲＡＳ遺伝子は、エクソン２中にＧ→Ａ塩基変異を持ち、標的配列の変異を模倣するために使用された。使用したメディエータープローブ中の標的特異的配列は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子の配列と完全に一致したが、変異型ＫＲＡＳ遺伝子とは１つの不一致を持っていた。
【０２３１】
リアルタイムＰＣＲの反応条件は、９５℃に５分、５０サイクル（９５℃に２０秒、及び６１℃に１分）、３５℃に１０分であり、６１℃で蛍光を採取した。ＰＣＲが終了した後に、以下の手順に従って融解曲線解析を実施した。その手順として、９５℃に２分、４５℃に２分、その後反応系の温度を４５℃から９５℃に０．５℃／段階（各段階の持続時間は５秒）の加熱速度で上昇させ、その間にＲＯＸ蛍光シグナルを採取した。使用した実験装置は、Bio-Rad CFX96リアルタイムＰＣＲ装置（Bio-Rad, USA）であった。実験結果を図１０に示した。
【０２３２】
図１０は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子又は変異型ＫＲＡＳ遺伝子を担持するプラスミド又は水を鋳型として用いた３回のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線及び融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、メディエータープローブＫＲＡＳ−ＭＰ２、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、及びポリメラーゼＴａｑを使用する。黒色の実線は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子を担持するプラスミドを鋳型として用いた実験結果を示し、灰色の実線は、変異型ＫＲＡＳ遺伝子を担持するプラスミドを鋳型として用いた実験結果を表し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２３３】
図１０の結果は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子又は変異型ＫＲＡＳ遺伝子を担持するプラスミドを鋳型として使用した場合に、メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定で特異的な標的ピークを検出でき、上記２つの条件下で検出した特定の標的ピークは同じ融点を有したことを示している。これらの実験結果は、メディエータープローブとヘアピン状蛍光プローブに基づくＰＣＲ後ＭＣＡ測定が、特定の標的配列の変化又は変異に耐えることができ、リアルタイムＰＣＲのアニール又は伸長中に、標的配列の変化又は変異が、変化又は変異した標的配列へのメディエータープローブの結合に影響を及ぼさないのなら、前記ＰＣＲ後ＭＣＡ測定は依然として変化又は変異した標的配列を検出するために使用でき、検出された特異的ピークの融点は変化しないままであったことを示している。
実施例７：二重検出
【０２３４】
この実施例では、２個のメディエータープローブと１個の蛍光プローブが１回のＰＣＲ後ＭＣＡ測定に使用されて、２個の標的配列の同時検出及び識別（すなわち二重検出）を達成した。この実験では、検出対象の典型的な標的配列としてＢＲＡＦ遺伝子とＫＲＡＳ遺伝子を使用し、検出対象の試料として特定量の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを使用した。
【０２３５】
簡潔に言うと、２５μＬのＰＣＲ反応系を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。前記ＰＣＲ反応系は、１×緩衝液Ａ（６７ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１６．６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、６．７μＭのＥＤＴＡ、及び０．０８５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）、３．０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２．０ＵのポリメラーゼＴａｑ、４００ｎＭのプライマーＢＲＡＦ−Ｆ（配列番号１）、ＢＲＡＦ−Ｒ（配列番号２）、ＫＲＡＳ−Ｆ（配列番号８）及びＫＲＡＳ−Ｒ（配列番号９）、１００ｎＭメディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２（配列番号６、ＢＲＡＦ遺伝子に特異的な標的特異的配列を含む）、２００ｎＭメディエータープローブＫＲＡＳ−ＭＰ３（５’−ＣＴＣＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣ−Ｃ7ＮＨ2−３’（配列番号１１）、ＫＲＡＳ遺伝子に特異的な標的特異的配列を含む）、２００ｎＭの蛍光プローブＵＰ−ＭＢ（配列番号５）、０．１μＬの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、及び特定量の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇ、各量に対して測定を３回繰り返した）を含んだ。使用したＰＣＲ反応条件及びＭＣＡ測定条件は、実施例６で使用したものと同じであった。結果を図１１に示した。
【０２３６】
図１１は、２個のメディエータープローブと１個の蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲの増幅曲線と融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、４個のプライマー（ＢＲＡＦ−Ｆ、ＢＲＡＦ−Ｒ、ＫＲＡＳ−Ｆ、及びＫＲＡＳ−Ｒ）、２個のメディエータープローブ（ＢＲＡＦ−ＭＰ２、及びＫＲＡＳ−ＭＰ３）、ヘアピン状蛍光プローブＵＰ−ＭＢ、ポリメラーゼＴａｑ、及び特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ又は１０ｐｇ）の２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを使用する。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２３７】
図１１の結果は、融解曲線中に２個の識別可能な特異的ピーク（ＢＲＡＦのピークとして印付けし、ＫＲＡＳのピークとして印付けしている）が見られ、その融点は蛍光プローブＵＰ−ＭＢ及びメディエータープローブＢＲＡＦ−ＭＰ２及びＫＲＡＳ−ＭＰ３中のメディエーター配列の伸長産物によって生成された二本鎖に対応したことを示している。この結果は、２個のメディエータープローブと1個の蛍光プローブを使用して、１回のＰＣＲ後ＭＣＡ測定で、２つの標的配列の同時検出及び識別（すなわち二重検出）を達成できることを示している。さらに図１１の結果はまた、前記二重ＰＣＲ後ＭＣＡ測定の感度が非常に高く（検出限界は１０ｐｇのゲノムＤＮＡ程度と低くできた）、１個のヒトゲノムの検出にも使用できたことを示している。
実施例８：四重検出
【０２３８】
この実施例では、４個のメディエータープローブと１個の蛍光プローブを使用して、１回のＰＣＲ後ＭＣＡ測定で４つの標的配列の同時検出及び識別（すなわち四重鎖検出）が達成された。この実験では、Ｙ染色体上の３つの検出部位（ｓＹ８２、ｓＹ８６、及びｓＹ２４２）及び内部参照遺伝子（ＺＦＸ／Ｙ遺伝子）を検出対象の典型的な標的配列として使用し、正常男性から取得した特定量の細胞ゲノムＤＮＡを検出対象の試料として使用した。
【０２３９】
簡潔に言うと、２５μＬのＰＣＲ反応系を使用してリアルタイムＰＣＲを実施した。前記ＰＣＲ反応系は、１×緩衝液Ａ（６７ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１６．６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、６．７μＭのＥＤＴＡ及び０．０８５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）、１１．０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．７ｍＭのｄＮＴＰ、５．０ＵのポリメラーゼＴａｑＨＳ（TaKaRa,Dalian）、表４に示すプライマー（８個のプライマー及び１個の共通増幅プライマー）及びプローブ（４個のメディエータープローブ及び１個の蛍光プローブ）を含み、並びに正常男性から取得した特定量の細胞ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、又は１００ｐｇ、測定を各量につき３回繰り返した）を含んだ。
【０２４０】
使用したＰＣＲ反応条件は、９５℃に５分、４サイクル（９５℃に２０秒及び６１℃に１分）、４６サイクル（９５℃に２０秒及び６２℃に１分）、及び３５℃に３０分であった。ＰＣＲが終了した後に、以下の手順に従って融解曲線解析を行った。その手順として、９５℃に２分、４０℃に２分、その後０．４℃／段階（各段の保持時間は５秒）の加熱速度で反応系の温度を４０℃から９５℃まで上昇させ、その間にＲＯＸ蛍光シグナルを採取した。使用した実験装置は、Bio-Rad CFX96リアルタイムＰＣＲ装置（Bio-Rad,USA）であった。結果を図１２に示した。
【０２４１】
図１２は、４個のメディエータープローブと１個の蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲの融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、表４に記載の９個のプライマー、４個のメディエータープローブ及び１個の蛍光プローブ、ポリメラーゼＴａｑＨＳ、及び正常男性から取得した特定量（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、又は１００ｐｇ）の細胞ゲノムＤＮＡを使用した。図中の実線は２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２４２】
図１２の結果は、融解曲線中に４個の識別可能な特異的ピーク（すなわち、それぞれ２４２、ＺＦ、８２及び８６の４つのピークとして印付けした）が見られ、その融点は、前記蛍光プローブとメディエータープローブ２４２−ＭＰ、ＺＦ−ＭＰ、８２−ＭＰ及び８６−ＭＰ中のメディエーター配列の伸長産物により生成された二本鎖に対応したことを示している。この結果は、４個のメディエータープローブ及び1個の蛍光プローブを使用して、４つの標的配列の同時検出及び識別（すなわち四重検出）が１回のＰＣＲ後ＭＣＡ測定で達成できたことを示している。さらに、図１２の結果はまた、前記四重ＰＣＲ後ＭＣＡ測定の感度が高かったことを示している（検出限界を１００ｐｇゲノムＤＮＡ程度と低くできた）。
実施例９：二十重検出
【０２４３】
この実施例では、２０個のメディエータープローブと６個の蛍光プローブを使用して、１回のＰＣＲ後ＭＣＡ測定で２０個の標的配列の同時検出及び識別（すなわち二十重検出）を達成した。この実験では、１８個の検出部位（ｓＹ２４２、ｓＹ８２、ｓＹ８６、ｓＹ１５２、ｓＹ１４５、ｓＹ８４、ｓＹ１２４、ｓＹ１２７、ｓＹ１２８、ｓＹ１３３、ｓＹ１４３、ｓＹ１３４、ｓＹ１５５、ｓＹ１５４、ｓＹ１５７、ｓＹ２５４、ｓＹ２３９、及びｓｙ２５５）及び２個の内部参照遺伝子（ＳＲＹ遺伝子及びＺＦＸ／Ｙ遺伝子）を検出対象の典型的な標的配列として使用し、検出対象の試料として８３人の正常男性から取得した細胞ゲノムＤＮＡを使用した。
【０２４４】
簡潔に言うと、２５μＬのＰＣＲ反応系を使用してリアルタイムＰＣＲを実施した。前記ＰＣＲ反応系は、１×緩衝液Ａ（６７ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１６．６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、６．７μＭのＥＤＴＡ及び０．０８５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）、１１．０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．７ｍＭのｄＮＴＰ、５．０ＵのポリメラーゼＴａｑＨＳ（TaKaRa,Dalian）、表５に示すプライマー（４０個のプライマー及び１個の共通増幅プライマー）及びプローブ（２０個のメディエータープローブ及び６個の蛍光プローブ）を含み、並びに５μＬの細胞ゲノムＤＮＡを含んだ。
【０２４５】
前記６個の蛍光プローブでは、蛍光プローブＵＰ１とＵＰ２をＲＯＸとＢＨＱ２で標識し、それらの蛍光シグナルをＲＯＸチャネルにより検出し、蛍光プローブＵＰ３とＵＰ４をＦＡＭとＢＨＱ１で標識し、それらの蛍光シグナルをＦＡＭチャネルで検出し、蛍光プローブＵＰ５とＵＰ６をＣｙ５とＢＨＱ２で標識し、それらの蛍光シグナルをＣｙ５チャネルで検出した。メディエータープローブ８２−ＭＰ、８６−ＭＰ、２４２−ＭＰ、ＺＦ−ＭＰ中のメディエーター配列は、蛍光プローブＵＰ１に結合でき、それぞれ標的配列ｓＹ８２、ｓＹ８６、ｓＹ２４２、及びＺＦＸ／Ｙの検出に使用した。メディエータープローブ１５２−ＭＰ、１４５−ＭＰ、８４−ＭＰ、及びＳＲＹ−ＭＰ中のメディエーター配列は、蛍光プローブＵＰ２に結合でき、それぞれ標的配列ｓＹ１５２、ｓＹ１４５、ｓＹ８４、ＳＲＹの検出に使用した。メディエータープローブ１２４−ＭＰ、１２７−ＭＰ、１２８−ＭＰ中のメディエーター配列は蛍光プローブＵＰ３に結合でき、それぞれ標的配列ｓＹ１２４、ｓＹ１２７、及びｓＹ１２８の検出に使用された。メディエータープローブ１３３−ＭＰ、１４３−ＭＰ、及び１３４−ＭＰのメディエーター配列は、蛍光プローブＵＰ４に結合でき、標的配列ｓＹ１３３、ｓＹ１４３、及びｓＹ１３４の検出に使用した。メディエータープローブ１５５−ＭＰ、１５４−ＭＰ、及び１５７−ＭＰ中のメディエーター配列は、蛍光プローブＵＰ５に結合でき、標的配列ｓＹ１５５、ｓＹ１５４、及びｓＹ１５７の検出に使用した。メディエータープローブ２５４−ＭＰ、２３９−ＭＰ、及び２５５−ＭＰのメディエーター配列は、蛍光プローブＵＰ６に結合でき、標的配列ｓＹ２５４、ｓＹ２３９、及びｓＹ２５５の検出に使用した。
【０２４６】
この実験では、８３人の正常男性からの細胞ゲノムＤＮＡを試験対象の試料（合計８３個の試料）として使用し、８３回のリアルタイムＰＣＲを実施した。使用したＰＣＲ反応条件は、９５℃に５分、４サイクル（９５℃に２０秒及び６１℃に１分）、４６サイクル（９５℃に２０秒及び６２℃に１分）、及び３５℃に３０分であった。ＰＣＲが終了した後に、以下の手順に従って融解曲線解析を実施した。その手順として、０．１℃／段階（各段階の持続時間は５秒）の加熱速度で反応系の温度を４５℃から９８℃に上昇させ、続いて４５℃に２分間保持し、その後に０．０４℃／段階（各段階の持続時間は５秒）の加熱速度で反応系の温度を４５℃から９８℃に上昇させた。ＭＣＡ測定の全工程中に、３個の検出チャネル（ＲＯＸ、ＦＡＭ、及びＣｙ５）から蛍光シグナルを採取した。使用した実験装置は、Bio-Rad CFX96リアルタイムＰＣＲ装置（Bio-Rad,USA）であった。結果を図１３に示した。
【０２４７】
図１３は、２０個のメディエータープローブと６個の蛍光プローブを用いた８３回のリアルタイムＰＣＲの融解曲線を示す。前記リアルタイムＰＣＲでは、表５に記載の４１個のプライマー、２０個のメディエータープローブ及び６個の蛍光プローブ、ポリメラーゼＴａｑＨＳ、及び正常男性から取得した細胞ゲノムＤＮＡ（合計８３試料）を使用した。図１３Ａは、ＲＯＸ検出チャネルから得られた融解曲線を示す。図１３Ｂは、ＦＡＭ検出チャネルから得られた融解曲線を示す。図１３Ｃは、Ｃｙ５検出チャネルから得られた融解曲線を示す。図中の実線は、細胞ゲノムＤＮＡ（８３試料）を鋳型として用いた実験結果を示し、破線は水を鋳型として用いた実験結果（負の対照）を示す。
【０２４８】
図１３は結果として、ＲＯＸ検出チャネルから得られた融解曲線では、８個の特定の識別可能なピークが見られ（８個のピーク、すなわちそれぞれ２４２、ＺＦ、８２、８６、１５２、１４５、ＳＲＹ、及び８４として印付けされている）、その融点は蛍光プローブＵＰ１又はＵＰ２とメディエータープローブ２４２−ＭＰ、ＺＦ−ＭＰ、８２−ＭＰ、８６−ＭＰ、１５２−ＭＰ、１４５−ＭＰ、ＳＲＹ−ＭＰ、及び８４−ＭＰ中のメディエーター配列の伸長産物とによって生成された二本鎖に対応し、ＦＡＭ検出チャネルから得られた融解曲線では、６個の特定の識別可能なピークが見られ（６個のピーク、すなわちそれぞれ１２４、１２７、１２８、１３３、１４３、及び１３４として印付けされている）、その融点は蛍光プローブＵＰ３又はＵＰ４とメディエータープローブ１２４−ＭＰ、１２７−ＭＰ、１２８−ＭＰ、１３３−ＭＰ、１４３−ＭＰ、及び１３４−ＭＰ中のそれぞれのメディエーター配列の伸長産物とによって形成された二本鎖に対応し、並びにＣｙ５検出チャネルから得られた融解曲線では、６個の特定の識別可能なピークが見られ（６個のピーク、すなわちそれぞれ１５５、１５４、１５７、２５４、２３９、及び２５５と印付けされている）、その融点は蛍光プローブＵＰ５又はＵＰ６とメディエータープローブ１５５−ＭＰ、１５４−ＭＰ、１５７−ＭＰ、２５４−ＭＰ、２３９−ＭＰ、及び２５５−ＭＰ中のそれぞれのメディエーター配列の伸長産物とによって生成された二本鎖に対応したことを示している。これらの実験結果は、２０個のメディエータープローブ及び６個の蛍光プローブを使用して、２０個の標的配列の同時検出及び識別（すなわち二十重検出）が１回のＰＣＲ後ＭＣＡ測定で達成できたことを示している。
【０２４９】
さらに図１３の結果はまた、検出した８３個の試料に対し取得した８３個の融解曲線の形状は実質的に同じであり、これらの融解曲線で２０個の特定ピークのＴｍ値は実質的に同じであった（ＣＶ＜０．５％）。これにより、前記二十重のＰＣＲ後ＭＣＡ測定には非常に優れた再現性及び信頼性が高かったことを示している。
【０２５０】
前記方法の信頼性をさらに確認するために、別の９２個の試料を前記方法を用いて盲検試験を行った。前記９２個の試料のうち、３３個の試料は異なる正常男性から取得した細胞ゲノムＤＮＡであり、５８個の試料はＹ染色体上に微小欠失を持つ異なる男性から取得した細胞ゲノムＤＮＡであり、１個の試料は正常女性から取得した細胞ゲノムＤＮＡであった。前記二十重のＰＣＲ後ＭＣＡ測定を使用して９２個の試料を検出した。
【０２５１】
その後に、従来のＰＣＲ−アガロースゲル電気泳動も使用して９２個の試料を検出した。その結果は、二十重のＰＣＲ後ＭＣＡ測定の検出結果がＰＣＲ‐アガロースゲル電気泳動の検出結果と完全に一致したことを示している。これはまた、本発明の二十重のＰＣＲ後ＭＣＡ測定に非常に優れた信頼性が有ったことを示している。前記二十重のＰＣＲ後ＭＣＡ測定のいくつかの典型的な検出結果を図１４に示した。
【０２５２】
図１４は、二十重のＰＣＲ後ＭＣＡ測定を用いて９２個の試料を検出して得られた代表的な実験結果を示す。黒色の実線は、Ｙ染色体上に微小欠失を持つ男性からの細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した実験結果を示し、灰色の実線は、正常男性からの細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示す。黒色の破線は、正常女性からの細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた実験結果を示し、灰色の破線は水を鋳型として使用した実験結果を示す。これらの実験結果はまた、２０個のメディエータープローブと６個の蛍光プローブを使用して、１回のＰＣＲ後ＭＣＡ測定で２０個の標的配列の同時検出及び識別（すなわち二十重検出）を達成できることを示している。
【０２５３】
本発明の特定の態様を詳細に説明してきたが、開示された全ての教示に基づいて、細部に対して様々な改変及び変更を加えることができ、それらの改変及び変更は本発明の適用範囲内にあることを当業者なら理解できる。本発明の適用範囲は、特許請求の範囲及びその任意の均等範囲により定められる。
【表４】
2019528772.tif 000006
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月4日(2019.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のｎ個の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
ｎは２以上の整数であり、前記方法は、以下の工程：
（１）検出対象の各標的核酸配列に対し少なくとも１個の上流オリゴヌクレオチド配列及び少なくとも１個のメディエータープローブを提供し、そして核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を前記上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブに接触させる工程； 
ここで、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエータープローブは５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、前記標的特異的配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の上流に位置し、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なる；
（２）メディエータープローブの切断を可能にする条件で、工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる工程；
（３）ｍ個の検出プローブを提供し、核酸のハイブリダイズを可能にする条件で工程（２）の生成物を前記ｍ個の検出プローブに接触させる工程；
ここで、ｍはｎより小さくかつ０より大きい整数であり、
各検出プローブは３’→５’方向に１個以上のメディエーター配列又はその一部に相補的な１個以上の捕捉配列及び鋳型配列を個別に含み、前記ｍ個の検出プローブはそれぞれ工程（１）で提供されたメディエータープローブのメディエーター配列又はその一部に相補的なｎ個以上の捕捉配列を含み、
各検出プローブはレポーター基及び消光基で個別に標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に各検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる；
（４）核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件で、工程（３）の生成物を核酸ポリメラーゼに接触させる工程；及び
（５）工程（４）の生成物に融解曲線解析を行い、融解曲線解析の結果に従って、各標的核酸配列が前記試料中に存在するかどうかを決定する工程；を含み、
場合により、前記方法は、さらに、以下の工程：（６）融解曲線解析の結果に従って、各融解ピークに対応する標的核酸配列の量を決定する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記方法は、以下の特徴：
（ａ）ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、又はそれ以上の整数である；
（ｂ）ｍは、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、８以上、１０以上の整数である；
（ｃ）ｍが２以上の場合に、前記ｍ個の検出プローブは、同一又は異なるレポーター基により個別に標識されている；
（ｄ）前記試料は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいは核酸の混合物を含む；
（ｅ）前記標的核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡである；
（ｆ）前記標的核酸配列は一本鎖又は二本鎖である；（ｇ）前記試料又は標的核酸配列は、原核生物、真核生物、ウイルス又はウイルス様体の供給源から得られる；
（ｈ）工程（２）で前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼであり；場合により、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼは、工程（４）で使用される核酸ポリメラーゼと同一である；
（ｉ）前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである；
（ｊ）前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、テルムス・アクウァーティクス（Ｔａｑ）、テルムス・テルモフィルス（Ｔｔｈ）、テルムス・フィリフォルミス、テルムス・フラバス、テルモコックス・リテラリス、テルムス・アントラニルダニイ、テルムス・カルドフィルス、テルムス・クリアロフィルス、テルムス・フラバス、テルムス・イグニテェレ、テルムス・ラクテウス、テルムス・オシマイ、テルムス・ルーバー、テルムス・ルーベンス、テルムス・スコトドゥクトゥス、テルムス・シルバヌス、テルムス・テルモフラス、テルモトガ・マリチマ、テルモトガ・ネアポリターナ、テルモシフォ・アフリカヌス、テルモコックス・リトラリス、テルモコックス・バロッシ、テルモコックス・ゴルゴナリウス、テルモトガ・マリチマ、テルモトガ・ネアポリターナ、テルモシフォ・アフリカヌス、ピロコックス・ウーゼイ、ピロコックス・ホリコシイイ、ピロコックス・アビシ、ピロディクティウム・オクルトゥム、アクィフェクス・ピエロフィルス、及びアクィフェクス・アエロリエウスから選択されるバクテリアに由来するＤＮＡポリメラーゼである；
（ｋ）前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、Ｔａｑポリメラーゼである；
（ｌ）工程（１）で、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上のメディエータープローブが提供され、工程（３）で、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、又は１０個以上の検出プローブが提供される；
の１つ以上を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記ｍ個の検出プローブは同じレポーター基を含み、工程（５）で工程（４）の生成物に融解曲線解析を行い、得られた融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って特定の標的核酸配列の存在を決定する；または、
（ｂ）前記ｍ個の検出プローブに含まれるレポーター基は互いに異なり、工程（５）で工程（４）の生成物に融解曲線解析を行う場合に、各レポーター基のシグナルをそれぞれリアルタイムに監視してレポーター基のシグナルに各々対応する融解曲線を取得し、その後にレポーター基のシグナルの種類と融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って特定の標的核酸配列の存在を決定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｍは１であり、ｎは２以上の整数であり、そして、
前記方法は、以下の工程：
（１）検出対象の各標的核酸配列に対し上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブを提供し、そして核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を前記上流オリゴヌクレオチド配列及びメディエータープローブに接触させる工程；
ここで、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエータープローブは５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、前記標的特異的配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記上流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の上流に位置し、全てのメディエータープローブ中に含まれるメディエーター配列は互いに異なる；
（２）メディエータープローブの切断を可能にする条件で、工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる工程；
（３）核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、工程（２）の生成物を３’→５’方向にメディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列及び鋳型配列を含む検出プローブに接触させる工程；
ここで、前記検出プローブは、レポーター基及び消光基で標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に前記検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる；
（４）核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件で、工程（３）の生成物を核酸ポリメラーゼに接触させる工程；及び
（５）工程（４）の生成物に融解曲線解析を行い、融解曲線解析の結果に従って前記ｎ個の標的核酸配列が前記試料中に存在するかどうかを決定する工程；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記メディエータープローブは、以下の特徴：
（ａ）前記メディエータープローブは、それぞれ個別に、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むか又はそれらからなること；
（ｂ）前記メディエータープローブの長さは、それぞれ個別に、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、８００〜９００ｎｔ、又は９００〜１０００ｎｔであること；
（ｃ）前記メディエータープローブ中の標的特異的配列の長さは、それぞれ個別に、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１５０ｎｔ、１５０〜２００ｎｔ、２００〜２５０ｎｔ、２５０〜３００ｎｔ、３００〜３５０ｎｔ、３５０〜４００ｎｔ、４００〜４５０ｎｔ、又は４５０〜５００ｎｔであること；
（ｄ）前記メディエータープローブ中のメディエーター配列の長さは、それぞれ個別に、５〜１０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、又は１３０〜１４０ｎｔであること；及び
（ｅ）前記メディエータープローブは、それぞれ個別に３’−ＯＨ末端を有するか、又はその３’−末端が封鎖されていること；
の１つ以上を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記上流オリゴヌクレオチド配列は、以下の特徴：
（ａ）前記上流オリゴヌクレオチド配列は、それぞれ個別に、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むか又はそれらからなること；
（ｂ）前記上流オリゴヌクレオチド配列の長さは、それぞれ個別に、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔ、又は１４０〜１５０ｎｔであること；
（ｃ）前記上流オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列とハイブリダイズする際に、それぞれ個別に前記メディエータープローブの上流から遠方に位置するか、又はメディエータープローブの上流の近傍に位置するか、あるいはメディエータープローブの前記標的特異的配列と部分的に重複する配列を有すること；及び
（ｄ）前記上流オリゴヌクレオチド配列は、それぞれ個別に標的核酸配列に特異的なプライマー又は標的核酸配列に特異的なプローブであること；
の１つ以上を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、以下の特徴：
（ａ）工程（１）で前記上流オリゴヌクレオチド配列及び前記メディエータープローブに加えて、さらに下流オリゴヌクレオチド配列が検出対象の各標的核酸配列に対して提供され、前記下流オリゴヌクレオチド配列は前記標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、前記下流オリゴヌクレオチド配列は前記標的特異的配列の下流に位置し、次いで核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を前記上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ及び下流オリゴヌクレオチド配列に接触させる、
（ｂ）工程（２）で
（ｉ）前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、標的核酸配列とハイブリダイズした前記メディエータープローブを切断し、未処理のメディエーター配列又は前記メディエーター配列の一部（５’末端の一部）を含むメディエーター断片を放出する；又は、
（ｉｉ）前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼであり、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記核酸ポリメラーゼは、前記上流オリゴヌクレオチド配列の伸長を触媒し、前記メディエータープローブの切断を誘発し；場合により、工程（２）で、核酸増幅を可能にする条件で工程（１）の生成物を５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼに接触させる；又は、
（ｉｉｉ）核酸ポリメラーゼは、標的核酸配列を鋳型として用いて上流オリゴヌクレオチド配列の伸長を触媒し、次いで５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、前記上流オリゴヌクレオチド配列の伸長産物に結合して前記メディエータープローブの切断を触媒する；
（ｃ）工程（４）において、核酸ポリメラーゼの伸長反応を可能にする条件で、前記核酸ポリメラーゼは鋳型として検出プローブを使用し、検出プローブとハイブリダイズしたメディエーター断片を伸長してそれによって二本鎖を生成する；
（ｄ）工程（５）において、工程（４）の生成物を徐々に加熱又は冷却し、各検出プローブ中のレポーター基からのシグナルをリアルタイムで監視して、各レポーター基のシグナル強度が温度の変化と共に変化する曲線を取得し；その後、取得した曲線を微分して工程（４）の生成物の融解曲線を取得し；その後、融解曲線中の融解ピーク（融点）に従って、融解ピーク（融点）に対応するメディエーター断片の存在を決定し、その後にメディエーター断片中のメディエーター配列と標的核酸配列との間の対応関係に従って、前記メディエーター断片に対応する標的核酸配列の存在を決定する；
の１つ以上を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記下流オリゴヌクレオチド配列は、以下の特徴：
（ａ）前記下流オリゴヌクレオチド配列は、それぞれ個別に、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むか又はそれらからなること；及び、
（ｂ）前記下流オリゴヌクレオチド配列の長さは、それぞれ個別に１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１１０ｎｔ、１１０〜１２０ｎｔ、１２０〜１３０ｎｔ、１３０〜１４０ｎｔ、又は１４０〜１５０ｎｔであること；
の１つ以上を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（１）で提供される全ての上流オリゴヌクレオチド配列及び下流オリゴヌクレオチド配列は、５’末端に同一のオリゴヌクレオチド配列を持ち；
場合により、工程（１）で、前記上流オリゴヌクレオチド配列、前記メディエータープローブ及び前記下流オリゴヌクレオチド配列に加えて、さらに共通プライマーが提供され、前記共通プライマーは前記同一のオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を持ち、次いで核酸のハイブリダイズを可能にする条件で、前記試料を前記上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、下流オリゴヌクレオチド配列及び記共通プライマーに接触させ；
場合により、前記共通プライマーは、以下の特徴：
（ａ）前記共通プライマーは、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むか又はそれらからなること；及び
（ｂ）前記共通プライマーの長さは、８〜１５ｎｔ、１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、又は４０〜５０ｎｔであること；
の１つ以上を有する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出プローブは、以下の特徴：
（ａ）前記検出プローブは、それぞれ個別に、天然起源のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合わせを含むかそれらからなること；
（ｂ）前記検出プローブの長さは、それぞれ個別に１５〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、８００〜９００ｎｔ、又は９００〜１０００ｎｔであること；
（ｃ）前記検出プローブ中の各捕捉配列の長さは、個別に１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜１５０ｎｔ、１５０〜２００ｎｔ、２００〜２５０ｎｔ、２５０〜３００ｎｔ、３００〜３５０ｎｔ、３５０〜４００ｎｔ、４００〜４５０ｎｔ、又は４５０〜５００ｎｔであること；
（ｄ）前記検出プローブ中の鋳型配列の長さは、それぞれ個別に１〜５ｎｔ、５〜１０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、４０〜５０ｎｔ、５０〜６０ｎｔ、６０〜７０ｎｔ、７０〜８０ｎｔ、８０〜９０ｎｔ、９０〜１００ｎｔ、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔ、３００〜４００ｎｔ、４００〜５００ｎｔ、５００〜６００ｎｔ、６００〜７００ｎｔ、７００〜８００ｎｔ、又は８００〜９００ｎｔであること；
（ｅ）前記検出プローブは、それぞれ個別に３’−ＯＨ末端を有するか、又はその３’−末端が封鎖されていること；
（ｆ）前記検出プローブは、それぞれ個別に自己消光型プローブであること；
（ｇ）前記検出プローブ中で、レポーター基は、個別に蛍光基であり、消光基は、蛍光を吸収／消光できる分子又は基であること；
（ｈ）前記検出プローブは、それぞれ個別にヌクレアーゼ活性に耐性であること；
（ｉ）前記検出プローブは、それぞれ個別に直鎖状であるか又はヘアピン構造を持つこと；並びに、
（ｊ）前記検出プローブは複数の捕捉配列を含み、前記複数の捕捉配列は、隣接して配置されているか、それらが連結配列によって離されるように配置されているか、又は重複して配置されていること；
の１つ以上を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出プローブは、以下の特徴：
（ａ）前記検出プローブは、その５’末端又は上流でレポーター基により標識され、かつその３’末端又は下流で消光基により標識されるか又はその３’末端又は下流でレポーター基により標識され、かつその５’末端又は上流で消光基により標識される；
（ｂ）前記レポーター基と前記消光基との間の距離は１０〜８０ｎｔ又はそれ以上であること；
（ｃ）前記レポーター基は、ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor（登録商標） Gold 540、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5、及びQuasar 705からなる群から選択される；
（ｄ）前記消光基は、DABCYL、BHQ、ECLIPSE、及びTAMRAからなる群から選択される；
（ｅ）前記検出プローブは、それぞれ個別に５’ヌクレアーゼ活性に耐性である；
（ｆ）前記検出プローブは、それぞれ個別にヌクレアーゼ活性に耐性のある修飾を含む主鎖を持つこと；並びに
（ｇ）前記検出プローブは、それぞれ個別に、ホスホロチオアート結合、アルキルホスファートトリエステル結合、アリールホスファートトリエステル結合、アルキルホスホナート結合、アリールホスホナート結合、水素化ホスファート結合、アルキルホスホルアミダート結合、アリールホスホルアミダート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリル修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、及び／又は１−（４’−チオ−ＰＤ−リボフラノシル）修飾を含む主鎖を持つこと；
の１つ以上を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（１）〜（４）は、以下の工程（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）ｍ個の検出プローブを提供し、検出対象の各標的核酸配列に対し上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、及び下流オリゴヌクレオチド配列を提供し、かつ任意に共通プライマーを提供すること；
ここで、前記下流オリゴヌクレオチド配列は請求項７又は８に規定した通りであり、前記共通プライマーは請求項９に規定した通りである； 
（ｂ）検出対象の試料と、提供された検出プローブ、上流オリゴヌクレオチド配列、メディエータープローブ、及び下流オリゴヌクレオチド配列、並びに５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存性の核酸ポリメラーゼとを混合すること、及び任意に共通プライマーを添加すること；
（ｃ）核酸変性を可能にする条件で前工程の生成物をインキュベートすること；
（ｄ）核酸のアニール又はハイブリダイズを可能にする条件で前工程の生成物をインキュベートすること；
（ｅ）核酸の伸長を可能にする条件で前工程の生成物をインキュベートすること；及び
（ｆ）任意に工程（ｃ）〜（ｅ）を１回以上繰り返すこと；を含む手順によって実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
１個の検出プローブ及び少なくとも２個のメディエータープローブを含むプローブセットであって、
前記メディエータープローブは、それぞれ個別に５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記標的特異的配列は標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸に相補的ではない配列を含み、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なり、そして
前記検出プローブは、３’→５’方向にメディエーター配列又はその一部に相補的な捕捉配列及び鋳型配列を含み、前記検出プローブはレポーター基及び消光基で標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に前記検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なり、
場合により、前記プローブセットは、以下の特徴：
（ｉ）前記プローブセットは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、又は２０個以上のメディエータープローブを含む；
（ｉｉ）全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なり、全てのメディエータープローブに含まれる標的特異的配列は互いに異なる；
（ｉｉｉ）全てのメディエータープローブは、それぞれ異なる標的核酸配列を標的とする；
（ｉｖ）前記メディエータープローブは請求項５に規定した通りである；及び
（ｖ）前記検出プローブは請求項１０又は１１に規定した通りである；
の１つ以上を有する、前記プローブセット。
【請求項１４】
請求項１３に規定の１個以上のプローブセットを含むキットであって、
場合により、前記キットは、以下の特徴：
（ｉ）前記キットは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上のプローブセットを含む；
（ｉｉ）キット中の全てのメディエータープローブは、異なる標的核酸配列をそれぞれ標的とする；
（ｉｉｉ）キット中の全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なる；
（ｉｖ）キット中の全てのメディエータープローブに含まれる標的特異的配列は互いに異なる；
（ｖ）キット中の全ての検出プローブは、同一又は異なるレポーター基で個別に標識されている；
（ｖｉ）キットはさらに、上流オリゴヌクレオチド配列、下流オリゴヌクレオチド配列、共通プライマー、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、核酸ポリメラーゼ、又はそれらの任意の組合わせを含む；並びに、
（ｖｉｉ）キットはさらに、核酸ハイブリダイズ剤、メディエータープローブ切断剤、核酸伸長剤、核酸増幅剤、逆転写剤、又はそれらの任意の組合わせを含む；
の１つ以上を有する、前記キット。
【請求項１５】
上流オリゴヌクレオチド配列は請求項１又は６に規定した通りである；及び／又は、下流オリゴヌクレオチド配列は請求項７又は８に規定した通りである；及び／又は、共通プライマー請求項９に規定した通りである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ｍ個の検出プローブ及びｎ個のメディエータープローブを含むキットであって、
ｎは２以上の整数であり、ｍはｎより小さく０より大きい整数であり、
各メディエータープローブは、個別に５’→３’方向にメディエーター配列及び標的特異的配列を含み、前記標的特異的配列は標的核酸配列に相補的な配列を含み、前記メディエーター配列は前記標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、全てのメディエータープローブに含まれるメディエーター配列は互いに異なり、
各検出プローブは、３’→５’方向に１個以上のメディエーター配列又はその一部に相補的な１個以上の捕捉配列及び鋳型配列を含み、前記ｍ個の検出プローブはメディエータープローブのメディエーター配列又はその一部にそれぞれ相補的である複数の捕捉配列を含み、
各検出プローブは、個別にレポーター基及び消光基で標識されており、前記レポーター基はシグナルを発生でき、前記消光基は前記レポーター基によって発生したシグナルを吸収又は消光でき、その相補的配列とハイブリダイズする際に各検出プローブによって発生するシグナルは、その相補的配列とハイブリダイズしない際に発生するシグナルとは異なる、キット。
【請求項１７】
試料中の前記標的核酸配列の存在又は量を検出するキットの製造における請求項１３に記載のプローブセットの使用。
【国際調査報告】
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