【手続補正書】
【提出日】平成19年10月2日(2007.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＦＰ改変体のβ鎖１１に対応し、そして配列番号１２、１４、１６、１８および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ＧＦＰ改変体のβ鎖１〜１０に対応し、そして配列番号４および６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載の単離されたボリペプチドを備える、キット。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号３、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、または配列番号１９の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項４または５に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８】
配列番号２１の配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１０】
配列番号２２の配列を有する、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドベクター。
【請求項１１】
蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリペプチドが、前記ベクター中の唯一のＳｐｅＩ制限酵素部位とＫｐｎＩ制限酵素部位との間でインフレームに挿入され、ここで、さらに、停止コドンが、該ＫｐｎＩ制限酵素部位の前の該タグフラグメントの３’末端にインフレームで導入され、該タグの翻訳を終結する、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
蛍光タンパク質の１と１０との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリペプチドが、前記ベクター中の唯一のＳｐｅＩ制限酵素部位とＫｐｎＩ制限酵素部位との間でインフレームに挿入され、ここで、さらに、停止コドンが、該ＫｐｎＩ制限酵素部位の前の該タグフラグメントの３’末端にインフレームで導入され、該タグの翻訳を終結する、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１３】
前記タグフラグメントが、配列番号１２、１４、１６、１８および２０からなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１４】
前記タグフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１１、１３、１５、１７および１９からなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ベクター中の唯一のＮｄｅＩ制限酵素部位とＢａｍＨＩ制限酵素部位との間にインフレームに挿入された異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１１、１２、１３または１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１０、１１、１２、１３または１４に記載のベクターを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＥ．ｃｏｌｉ細胞を含む、キット。
【請求項１８】
スプリット蛍光タンパク質システムであって、ＧＦＰ、ＧＦＰ様蛍光タンパク質、およびそれらの改変体からなる群から選択される蛍光タンパク質の少なくとも２つのフラグメントを含み、該フラグメントが：
（ａ）該蛍光タンパク質中のβ鎖の完全補完体をともに含み、
（ｂ）それら自身蛍光を発せず、そして
（ｃ）自然に自己補完性であり、該蛍光タンパク質および蛍光表現型を再構築する、スプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項１９】
２つのポリペプチドフラグメントを含む、請求項１８に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項２０】
３つのポリペプチドフラグメントを含む、請求項１８に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項２１】
前記蛍光タンパク質のポリペプチドフラグメントの一方が異種ポリペプチドに融合され、該融合ポリペプチドが、該異種ポリペプチドが可溶性であるとき、該蛍光タンパク質の他方のポリペプチドと自然に自己補完する、請求項１９に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項２２】
前記異種ポリペプチドが、ポリペプチドリンカーを介して融合される、請求項２１に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項２３】
前記蛍光タンパク質が、円順列変異体またはその改変体である、請求項１８に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項２４】
β鎖セットに対応する前記２つのポリペプチドフラグメントが、ｓ１−１０およびｓ１１；ｓ１−９およびｓ１０−１１；ｓ１−８およびｓ９−１１；ｓ１−７およびｓ８−１１；ｓ１−６およびｓ７−１１；ｓ１−５およびｓ６−１１；ｓ１−４およびｓ５−１１；ｓ１−３およびｓ４−１１；ｓ１−２およびｓ３−１１；ならびにｓ１およびｓ２−１１からなる群から選択される、請求項１９に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項２５】
前記ポリペプチドフラグメントが、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＧＦＰ改変体に由来する、請求項２４に記載のスプリット蛍光タンパク質システム。
【請求項２６】
蛍光タンパク質の可溶性自己補完性フラグメント対を単離する方法であって：
（ａ）変異体のライブラリーを生成するために、第１の試験フラグメントポリペプチドをコードする核酸を変異誘発に供する工程；
（ｂ）該第１の試験フラグメントポリペプチドを宿主細胞中で発現する工程；
（ｃ）該細胞を溶解する工程；
（ｄ）該溶解物を第２の試験フラグメントポリペプチドと接触し、そして該第１の試験フラグメントポリペプチドが該第２の試験フラグメントと自己補完することを可能にする工程；
（ｅ）該溶解物中の蛍光を検出し、そして１つ以上の変異した第１の試験フラグメントポリペプチド最適物を選択する工程；
（ｆ）変異体のライブラリーを生成するために、該第２の試験フラグメントポリペプチドをコードする核酸を変異誘発に供する工程；
（ｇ）該変異体の試験フラグメントポリペプチドを宿主細胞中で発現する工程；
（ｈ）該細胞を溶解する工程；
（ｉ）該溶解物を、（ｅ）に記載されたように選択された最適物と接触し、そして該変異体の第２の試験フラグメントポリペプチドが該変異体の第１の試験フラグメントポリペプチドの最適物と自己補完することを可能にする工程；
（ｊ）該溶解物中の蛍光を検出し、そして１つ以上の変異した第２の試験フラグメントポリペプチド最適物を選択する工程；を包含し、
ここで、該変異体の第１および第２の試験フラグメントポリペプチドの最適物が単離される、方法。
【請求項２７】
蛍光タンパク質の可溶性自己補完性フラグメント対を単離する方法であって：
（ａ）変異体のライブラリーを生成するために、第１の試験フラグメントポリペプチドをコードする核酸を変異誘発に供する工程；
（ｂ）該変異体のライブラリーを発現ベクター中にクローニングする工程；
（ｃ）該発現ベクター上のライブラリーを宿主細胞中に形質転換する工程；
（ｄ）該第１のライブラリーを該宿主細胞中で一時的に発現する工程；
（ｅ）第２の試験フラグメントポリペプチドを、該宿主細胞中に、適合する発現ベクターからのトランスフェクションまたは発現によって導入する工程であって、それによって、該変異体の第１の試験フラグメントポリペプチドを該第２の試験フラグメントと自己補完することを可能にする、工程；
（ｆ）該細胞中の蛍光を検出し、そして１つ以上の変異した第１の試験フラグメントポリペプチドの最適物を選択する工程；
（ｇ）変異体のライブラリーを生成するために、該第２の試験フラグメントポリペプチドを変異誘発に供する工程；
（ｈ）該変異体のライブラリーを発現ベクター中にクローニングする工程；
（ｉ）発現ビヒクル上の該ライブラリーを宿主細胞中に形質転換する工程；
（ｊ）該変異した第２のライブラリーを該宿主細胞内で一時的に発現する工程；
（ｋ）（ｆ）で記載されたように選択された最適物を、該宿主細胞中に、適合する発現ベクターからのトランスフェクションまたは発現によって導入する工程であって、それによって、該変異体の第２の試験フラグメントポリペプチドを、該変異体の第１の試験フラグメントポリペプチドの最適物と自己補完することを可能にする、工程；
（ｌ）該細胞中の蛍光を検出し、そして１つ以上の変異した第２の試験フラグメントポリペチドの最適物を選択する工程；を包含し、
ここで、該変異体の第１および第２の試験フラグメントポリペプチドの最適物が単離される、方法。
【請求項２８】
前記第１および第２の試験フラグメントポリペプチドが、ｓ１−１０およびｓ１１；ｓ１−９およびｓ１０−１１；ｓ１−８およびｓ９−１１；ｓ１−７およびｓ８−１１；ｓ１−６およびｓ７−１１；ｓ１−５およびｓ６−１１；ｓ１−４およびｓ５−１１；ｓ１−３およびｓ４−１１；ｓ１−２およびｓ３−１１；ならびにｓ１およびｓ２−１１からなる群から選択されるＧＦＰβ鎖セットに対応する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試験フラグメントポリペプチドが、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＧＦＰ改変体に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）第１の独立に誘導可能なプロモーターの制御下で、試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質のフラグメントの自己補完対の可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）第２の独立に誘導可能なプロモーターの制御下で、レポータータンパク質のフラグメントの自己補完対の可溶性の第２のアッセイフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の該構築物の両方を含む細胞を、その中の該独立に誘導可能なプロモーターの両方の抑制を可能にするベースライン条件下で培養する工程；
（ｄ）（ａ）の該構築物によってコードされる第１のフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間の間、次に、発現された融合タンパク質が不溶性であれば凝集することを可能にするに十分な時間誘導する工程；
（ｅ）次いで、（ｂ）の該構築物によってコードされる該第２のフラグメントの発現を、該第２のアッセイフラグメント、および可溶性の第１のタグフラグメント−試験タンパク質融合物とのその自己補完性の発現を可能にするに十分な時間誘導する工程；および
（ｆ）該細胞中の該レポータータンパク質の活性を検出する工程であって、それによって該可溶性の試験タンパク質を検出する工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項３１】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）該試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む哺乳動物細胞を、該試験タンパク質−タグフラグメント融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで該発現された融合タンパク質が不溶性である場合に凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該哺乳動物細胞を、該レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第２のアッセイフラグメントで化学的にトランスフェクトする工程、および
（ｄ）該細胞中で該レポータータンパク質の活性を検出し、それによって該可溶性の試験タンパク質を検出する工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項３２】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程であって、該ポリヌクレオチド構築物内で試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドが該連続β鎖の２つの間でインフレームに挿入されている、工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む哺乳動物細胞を、試験タンパク質−タグフラグメント融合タンパク質の発現を可能にするに十分な条件および時間培養し、次に、発現された融合タンパク質が不溶性である場合に凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；（ｃ）該哺乳動物細胞を、該蛍光タンパク質の自己補完対の可溶性の第２のアッセイフラグメントで化学的にトランスフェクトする工程；および
（ｄ）該細胞中の蛍光を検出し、それによって該可溶性試験タンパク質を検出する工程、
を包含するアッセイ。
【請求項３３】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程であって、該ポリヌクレオチド構築物内で試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、第１の独立に誘導可能なプロモーターの制御下に該連続β鎖の２つの間でインフレームに挿入されている、工程；
（ｂ）第２の独立に誘導可能なプロモーターの制御下で、（ａ）の構築物中に提示されない蛍光タンパク質のβ鎖に対応する可溶性の第２のアッセイフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の構築物の両方を含む細胞を、その中の該独立に誘導可能なプロモーターの両方の抑制を可能にするベースライン条件下で培養する工程；
（ｄ）（ａ）の構築物によってコードされる第１のフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間誘導し、次に、該発現された該融合タンパク質が不溶性である場合に凝集することを可能にするに十分な時間誘導する工程；
（ｅ）次いで、（ｂ）の構築物によってコードされる第２のフラグメントの発現を、第２のアッセイフラグメント、および可溶性の第１のタグフラグメント−試験タンパク質融合物とのその自己補完性の発現を可能にするに十分な時間の間誘導する工程；ならびに
（ｆ）該細胞中の蛍光を検出し、それによって該可溶性試験タンパク質を検出する工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項３４】
総試験タンパク質をインビボで定量するためのアッセイであって：
（ａ）試験タンパク質のコード配列に融合された、蛍光タンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）該蛍光タンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第２のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされる第１のフラグメント−試験タンパク質融合物、および（ｂ）の構築物によってコードされる第２のフラグメントの発現を可能にする条件下で、該タグフラグメントおよびアッセイフラグメントの自己補完性を可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｄ）総タンパク質量を決定するために蛍光を定量的に検出する工程
を包含する、アッセイ。
【請求項３５】
総試験タンパク質をインビボで定量するためのアッセイであって：
（ａ）蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程であって、該ポリヌクレオチド構築物内で試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、該連続β鎖の２つの間でインフレームに挿入されている、工程；
（ｂ）（ａ）の構築物中に提示されない蛍光タンパク質のβ鎖に対応する可溶性の第２のアッセイフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされる第１のフラグメント−試験タンパク質融合物、および（ｂ）の構築物によってコードされる第２のフラグメントの発現可能にする条件下で、該タグフラグメントおよびアッセイフラグメントの自己補完性を可能にするに十分な時間培養する工程；ならびに
（ｄ）総タンパク質量を決定するために蛍光を定量的に検出する工程
を包含する、アッセイ。
【請求項３６】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされるタグフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を可能にする条件下で、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで、発現された該融合タンパク質が不溶性である場合に凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該細胞を溶解する工程；
（ｄ）該溶解物を、該レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの第２の補完性アッセイフラグメントと接触させる工程；ならびに
（ｅ）該レポータータンパク質の活性を検出する工程
を包含し、
ここで、検出可能なレポーター活性の存在が、該試験タンパク質が可溶性であることの指標を提供する、アッセイ。
【請求項３７】
不溶性試験タンパク質をインビトロで検出するためのアッセイであって：
（ａ）該試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされるタグフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を可能にする条件下で、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで、発現された該融合タンパク質が不溶性である場合凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該細胞を溶解し、そしてそれから不溶性フラクションを単離する工程；
（ｄ）該不溶性フラクションを化学的変性によって可溶化する工程；
（ｅ）可溶化された変性不溶性タンパク質フラクションを、該レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの第２の補完性アッセイフラグメントを含む適切な希釈剤中、自己補完を可能にするに十分な条件および時間の間再生する工程；および
（ｆ）該不溶性タンパク質の量を決定するために蛍光を定量的に検出する工程
を包含する、アッセイ。
【請求項３８】
総試験タンパク質をインビトロで検出するためのアッセイであって：
（ａ）該試験タンパク質のコード配列に融合された、レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの可溶性の第１のタグフラグメントのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされるタグフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を可能にする条件下で、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで、発現された該融合タンパク質が不溶性である場合凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｃ）該細胞を溶解する工程；
（ｄ）化学的変性によって該溶解物中の総タンパク質を可溶化する工程；
（ｅ）該溶解物中の可溶化されたタンパク質を、該レポータータンパク質の自己補完対のフラグメントの第２の補完性アッセイフラグメントを含む適切な希釈剤中、自己補完を可能にするに十分な条件および時間の間再生する工程；および
（ｆ）総タンパク質の量を決定するために蛍光を定量的に検出する工程
を包含する、アッセイ。
【請求項３９】
可溶性試験タンパク質をインビボで検出するためのアッセイであって：
（ａ）蛍光タンパク質の１と３との間の連続β鎖に対応するタグフラグメントをコードするポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する工程であって、該ポリヌクレオチド構築物内で試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、該連続β鎖の２つの間でインフレームに挿入されている、工程；
（ｂ）（ａ）の構築物を含む細胞を、（ａ）の構築物によってコードされるタグフラグメント−試験タンパク質融合物の発現を可能にする条件下で、該融合タンパク質の発現を可能にするに十分な時間培養し、次いで、発現された該融合タンパク質が不溶性である場合凝集することを可能にするに十分な時間の間培養する工程；
（ｆ）該細胞を溶解する工程；
（ｇ）該溶解物を、（ａ）の構築物中で提示されない蛍光タンパク質のβ鎖に対応する第２の補完性アッセイフラグメントポリペプチドと接触する工程；および
（ｈ）該レポータータンパク質の活性を検出する工程
を包含し、
ここで、検出可能なレポーター活性の存在が、該試験タンパク質が可溶性である指標を提供する、アッセイ。
【請求項４０】
前記試験タンパク質が、レポータータンパク質の前記自己補完対のフラグメントのタグフラグメントのＮ末端に、リンカーポリペプチドを経由して融合される、請求項３０、３１、３４、３６または３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１のタグフラグメントが、配列番号１２、１４および１６からなる群から選択され、前記第２のアッセイフラグメントが、配列番号４および６からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１のタグフラグメントがβ鎖１０−１１に対応し、そして前記第２のアッセイフラグメントがβ鎖１−９に対応する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のタグフラグメントが配列番号３４の配列を有し、前記第２のアッセイフラグメントが配列番号３６の配列を有する、請求項４３に記載の方法。