【手続補正書】
【提出日】平成19年9月26日(2007.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ. 適当な培養培地に含まれる生存細胞を、酵素産物が形成できるように予定された時間標識スフィンゴシンと接触させ、
ｂ. 工程ａ.で形成された酵素産物を分離し、そして
ｃ. 形成された酵素産物の量を測定する
工程を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性がサンプルに存在するかしないかを測定するための、または該活性の程度を測定するための、または
Ａ. 標識非リン酸化スフィンゴシンと
−所望によりスフィンゴシンキナーゼを含むサンプル、および
−ホスフェート源を、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
Ｂ. 工程Ａ.の混合物に水性緩衝液と、水と組み合わせて２相を形成できる有機溶媒を添加し、
Ｃ. 工程Ｂ.で得られた相を分離し、
Ｄ. 工程Ｃ.で得られた水性相中の酵素産物の量を測定する
工程を含む、スフィンゴシンキナーゼの活性がサンプルに存在するかしないかを測定するための、または該活性の程度を測定するための方法。
【請求項２】
ａ. 標識非リン酸化スフィンゴシンと
−ホスフェート源、および
−スフィンゴシンキナーゼを、
ａ１. 候補化合物の非存在下、および
ａ２. 候補化合物の存在下、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
ｂ. 工程ａ１および工程ａ２の混合物に水性緩衝液と、水と組み合わせて２相を形成できる有機溶媒の混合物を添加し、
ｃ. 工程ａ１.およびａ２.で形成された酵素産物を、非反応標識スフィンゴシンから、例えば請求項１、工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、
ｄ． 工程ａ１.および工程ａ２で得られた酵素産物の量を検出し、そして工程ａ１.および工程ａ２.の酵素産物の量に差があるか否かを測定し、
ｅ. 工程ｄで決定した通りにスフィンゴシンキナーゼの活性を調節する薬剤を同定する
工程を含む、スフィンゴシンキナーゼの活性を調節する薬剤を同定する方法。
【請求項３】
Ａ. 標識リン酸化スフィンゴシンと、適当な培地に含まれる生存細胞を、
Ａ１. 候補化合物の非存在下、および
Ａ２. 候補化合物の存在下、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
Ｂ. 工程Ａ１.およびＡ２.で形成された酵素産物を、非反応標識リン酸化スフィンゴシンから分離し、
Ｃ. 工程Ａ１.および工程Ａ２で得られた酵素産物の量を検出し、そして工程Ａ１.および工程Ａ２.の酵素産物の量に差があるか否かを測定し、
Ｄ. 工程Ｃで決定した通りにスフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性を調節する薬剤を選択する
工程を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性を調節する薬剤を選択する方法。
【請求項４】
α.
α１. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、所望によりスフィンゴシンキナーゼ−１−活性もしくはスフィンゴシンキナーゼ−２−活性または両方を含むか、またはスフィンゴシンキナーゼ活性を含まないサンプル、およびホスフェート源、
α２. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、定義された量のスフィンゴシンキナーゼ−１−活性を含むサンプル、およびホスフェート源、
α３. 標識非リン酸化スフィンゴシンと、定義された量のスフィンゴシンキナーゼ−２−活性を含むサンプル、およびホスフェート源、
を酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
β. 工程α１.、α２.およびα３.で形成された酵素産物を、標識スフィンゴシンの非反応化合物から、例えば請求項１、工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、そして
γ. 工程α１.、α２.およびα３におけるホスフェート変換速度を、測定し、かつ比較する
工程を含む、サンプル中にスフィンゴシンキナーゼ−１−活性またはスフィンゴシンキナーゼ−２−活性または両方があるか、またはスフィンゴシンキナーゼ活性が存在しないかを測定する方法。
【請求項５】
ｉ. 式Ｉの非リン酸化化合物とホスフェート源および
ｉ１. スフィンゴシンキナーゼ−１、
ｉ２. スフィンゴシンキナーゼ−２を、
−試験化合物の非存在下、および
−試験化合物の存在下
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
ii. 非反応の式Ｉの非リン酸化化合物を、工程ｉ１.およびｉ２.で形成された酵素産物から、例えば請求項１、工程ｂ.およびｃ.に従い分離し、そして
iii. 工程ｉ１.およびｉ２.におけるホスフェート変換速度を測定し、かつ比較する
工程を含む、試験化合物がスフィンゴシンキナーゼ−１および／またはスフィンゴシンキナーゼ−２の活性を介在できるか否かを区別する方法。
【請求項６】
主成分としての標識スフィンゴシンおよび該キットを使用するための指示書を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性の測定のためのキット。
【請求項７】
スフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を介在する薬剤の同定に使用するための、請求項６記載のキット。
【請求項８】
標識スフィンゴシンが、式
【化１】
2007507205.tif 000001
〔式中、
Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−４)アルキルであり、
Ｒ２はＨ、ＯＨまたはオキソであり、
ＸはＨまたは(ＨＯ)２ＰＯであり、
Ａ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍは、互いに独立してＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨ２−フェニル、フェニル−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＮＨ−ＣＨ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−フェニル、ＣＨ２−フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、ＳＯ２−ＮＨ、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２の基であるか、またはＡ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの中の一つの基が存在せず、
ｍは、０〜１２から選択される数字であり、
ｎは、０〜１２から選択される数字であり、
そしてｍ＋ｎは、０〜１４から選択される数字であり、
基ＤＹＥは、式Ｉの化合物において物理的手段により選択的に検出可能な基である。
ただし、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方は、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択される。〕
の化合物である、請求項１から５のいずれかに記載の方法または請求項６もしくは７に記載のキット。
【請求項９】
式
【化２】
2007507205.tif 000002
〔式中、
Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−４)アルキルであり、
Ｒ２はＨ、ＯＨまたはオキソ、例えばＨまたはＯＨであり、
ＸはＨまたは(ＨＯ)２ＰＯであり、
Ａ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍは、互いに独立してＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨ２−フェニル、フェニル−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＮＨ−ＣＨ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−フェニル、ＣＨ２−フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、ＳＯ２−ＮＨ、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２の基であるか、またはＡ−Ｄ、Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの中の一つの基が存在せず、
ｍは、０〜１２から選択される数字であり、
ｎは、０〜１２から選択される数字であり、
ｍ＋ｎは、０〜１４から選択される数字であり、そして
基ＤＹＥは、式Ｉの化合物において物理的手段により選択的に検出可能な基である。
ただし
−Ｅ−ＧおよびＬ−Ｍの少なくとも一方はＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、ＣＨ２−Ｏ、フェニル−Ｏ、Ｏ−ＣＯ、ＣＯ−Ｏ、ＣＯ−ＮＨ、ＮＨ−ＣＯ、ＣＯ−Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)、Ｎ(Ｃ１−４)アルキル)−ＣＯ、ＮＨ−ＳＯ２、Ｎ((Ｃ１−４)アルキル)−ＳＯ２から成る群から選択され、そして
−式
【化３】
2007507205.tif 000003
(式中、Ｘは上記で定義の通りである)
の化合物および
【化４】
2007507205.tif 000004
の化合物
を除く。〕
の化合物。
【請求項１０】
請求項９に記載の式Ｉの蛍光標識スフィンゴシンの、例えばスフィンゴ脂質経路に関与するスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素の活性を調節する薬剤を同定するための、ハイスループットアッセイにおける使用。
【請求項１１】
スフィンゴ脂質経路に包含されるスフィンゴシンキナーゼおよびホスファターゼから成る群から選択される酵素を介在できる薬剤であって、請求項２または３のいずれかに記載の方法により同定される、薬剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
基ＤＹＥは、式Ｉの化合物中で化学的に結合しており、その化学構造を物理的手段で選択的に検出し得る基を有する分子に由来する。該選択的検出性は、式Ｉの化合物において残る。例えば、蛍光基を含む分子が、式Ｉの化合物に化学的に結合し、その化学構造において蛍光基を有する分子に由来し、その蛍光基はその蛍光特性を式Ｉの化合物において保持する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
他の局面において、本発明は、
Ａ. 標識リン酸化スフィンゴシンと、適当な培地に含まれる生存細胞を、
Ａ１. 候補化合物の非存在下、および
Ａ２. 候補化合物の存在下、
酵素産物が形成できるように予定された時間接触させ、
Ｂ. 工程Ａ１.およびＡ２.で形成された酵素産物を、非反応標識リン酸化スフィンゴシンから分離し、
Ｃ. 工程Ａ１.および工程Ａ２で得られた酵素産物の量を検出し、そして工程Ａ１.および工程Ａ２.の酵素産物の量に差があるか否かを測定し、
Ｄ. 工程Ｃて決定した通りにスフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性を調節する薬剤を選択する
工程を含む、スフィンゴ脂質経路に関与するホスファターゼの活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
ホスフェート変換速度の測定および比較により、試験化合物が、例えばスフィンゴシンキナーゼ−１またはスフィンゴシンキナーゼ−２、または両方の活性のいずれかを、かつどの程度介在できるか同定することが可能となり得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
医薬的使用のために処置のための本発明の薬剤は、１種またはそれ以上の、好ましくは１種の本発明の薬剤、例えば、２種またはそれ以上の本発明の薬剤の組み合わせを含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
処置は処置および予防を含む。
このような処置のために、適当な投与量は、例えば、用いる本発明の薬剤の化学的性質および薬物動態データ、個々の宿主、投与の形態および処置する状態の性質および重症度に依存して、変化するであろう。しかしながら、一般に、大型哺乳類、例えばヒトにおいて十分な結果を得るために、指示される一日量は、約０.０１ｇから約２.０ｇの本発明の薬剤；例えば０.５ｇ〜１.０ｇであり、簡便には、例えば、１日４回までの分割投与量で投与する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
試験実施例２
試験系
蛍光標識スフィンゴシンとスフィンゴシンキナーゼの反応
ａ)リン酸化反応の実施
リン酸化反応を、本質的に下記の通り行う。ヒトＰＨＫ−１または−２を過剰発現する組み換えＨＥＫ−２９３細胞の細胞質フラクションを、総容量１００μlでＳＰ誘導体(２０μM；ＤＭＳＯ中の貯蔵溶液から添加)、１mMのＡＴＰ、および２μCi  [γ−３２Ｐ]ＡＴＰと、１５mM  ＭｇＣｌ２、０.００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０mM  ＫＣｌ、１０mM  ＮａＦおよび１.５mM  セミカルバジド含有５０mM  Ｈｅｐｅｓ緩衝液(ｐＨ７.４)中で３０°でインキュベートする。２時間までの様々な異なるインキュベーション時間の後、脂質を抽出し、ＴＬＣ−プレート(Merck)で分離する。ＴＬＣをシリカプレートで、ＢｕＯＨ／酢酸／Ｈ２Ｏ  ３：１：１またはＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ(２８ｗ／ｗ％)２００：１５０：２９：１のいずれかを移動相として使用して行う。これらの系において、スフィンゴシンおよび実施例４の化合物は同時に移動する。ピレン−標識ＳＰＰおよびスフィンゴミエリン(ＳＭ)と代謝物の同一性は、標準としての市販のトリチウム標識ＳＰＰおよびＳＭと同時の移動により確立される。