(57)【要約】  本発明は、哺乳動物ＦＧＦ２１応答性レポーター細胞株、及びそれを使用して試験試料中のＦＧＦ２１活性を検出し、任意に定量する方法に関する。本発明はさらに、本発明のレポーター細胞株を使用して試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する中和抗体を検出し、任意に定量する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む哺乳動物細胞株：
（ｉ）下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第１の異種ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）キメラ転写因子をコードする第２の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が前記シス作用調節配列に結合可能である異種ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ−１のトランス活性化ドメインを含む、第２の異種ポリヌクレオチド、及び
（ｉｉｉ）チロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ及びベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが哺乳動物細胞には存在しない、請求項１に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項３】
前記異種ＤＮＡ結合ドメイン及びその同族シス作用調節配列が酵母又は細菌起源である、請求項１又は２のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項４】
前記シス作用調節配列が上流活性化配列（ＵＡＳ）であり、かつ前記異種ＤＮＡ結合ドメインが前記上流活性化配列に結合可能であるＤＮＡ結合ドメインである、請求項１から３のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項５】
前記シス作用調節配列がガラクトース応答性上流活性化配列（ＵＡＳＧ）であり、かつ前記異種ＤＮＡ結合ドメインが前記ＤＮＡ結合ドメインガラクトース応答性転写因子ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ＤＢ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項６】
前記シス作用調節配列がＬｅｘＡのＤＮＡ結合部位であり、かつ前記異種ＤＮＡ結合ドメインがリプレッサーＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、請求項１から５のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
前記細胞が、ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする下流オープンリーディングフレームに作動可能に結合するプロモーターを含む異種ポリヌクレオチドを含み、それから前記ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が発現される、請求項１から６のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項８】
ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームが、前記細胞における発現についてコドン最適化されている、請求項１から７のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
前記オープンリーディングフレームが、配列番号１に記載の配列、又は配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号１に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９７％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる、請求項１から８のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記オープンリーディングフレームが、配列番号１に記載の配列を含むか又はそれからなる、請求項１から９のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
前記第１のレポータータンパク質が酵素である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記第１のレポータータンパク質がルシフェラーゼである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
前記細胞が第２のレポータータンパク質をさらに発現する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１４】
前記第２のレポータータンパク質が構成的プロモーターから発現される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１５】
前記細胞株が、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ６５２及びＵ９３７からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれかに記載の細胞株。
【請求項１６】
前記細胞株がＨＥＫ２９３である、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞株。
【請求項１７】
試験試料中のＦＧＦ２１活性を検出し、そして任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）前記試験試料を、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞株に接触させる工程、
（ｉｉｉ）前記細胞株における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、を含む、方法。
【請求項１８】
ＦＧＦ２１活性の検出及び任意選択的な定量が、正常なヒト血清の干渉を本質的に受けない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞株が第２のレポータータンパク質を発現し、前記方法が、
（ｉｖ）前記細胞株における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）前記第１のレポータータンパク質及び前記第２のレポータータンパク質の活性の間の比を提供する工程、
をさらに含む、請求項１７から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する中和抗体を検出し、そして任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）含有試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が請求項１から１９のいずれか一項に記載の細胞株を含む、工程、
（ｉｉｉ）前記第１の細胞試料を前記試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第２の細胞試料をＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第１の細胞試料の細胞における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定し、そして前記第２の細胞試料の細胞における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１及び第２の細胞試料における前記レポーター活性の間の比を提供する工程であって、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
ＦＧＦ２１に対する中和抗体の検出及び任意選択的な定量が、正常なヒト血清の干渉を本質的に受けない、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項２０から２１のいずれかに記載の試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する抗体を検出し、そして任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）含有試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞株を含み、前記細胞株が第２のレポータータンパク質を発現する、工程、
（ｉｉｉ）前記第１の細胞試料を前記試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第２の細胞試料をＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第１の細胞試料の細胞における前記第１及び第２のレポータータンパク質の活性を測定し、そして前記第２の細胞試料の細胞における前記第１及び第２のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）前記第１の細胞試料における前記第１及び第２のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第１の比を提供し、前記第２の細胞試料における前記第１及び第２のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第２の比を提供する工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）の第１の比及び第２の比の間の第３の比を提供する工程であって、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物ＦＧＦ２１応答性レポーター細胞株及びそれを使用して試験試料中のＦＧＦ２１活性を検出し、任意に定量する方法に関する。本発明はさらに、本発明のレポーター細胞株を使用して試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する中和抗体を検出し、任意に定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、ヒトのＦＧＦ１９及びＦＧＦ２３を含む異型線維芽細胞増殖因子のファミリーのメンバーである。ＦＧＦ２１は脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激し、またＦＧＦ２１はＨＭＧＣＳ２（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ）によって特異的に誘導されて、絶食時の炭水化物欠乏時に脂質由来のエネルギーを提供する。ＦＧＦ２１は、２型糖尿病に罹患した患者における血糖管理、並びに体重増加の管理を改善する可能性を有する（Ｗ．Ｙ．及びＬｅｕｎｇ、２０１６；Ｋｌｉｗｅｒ及びＭａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ、２０１０；Ｆｉｓｈｅｒら）。
【０００３】
ＦＧＦ２１の類似体については現在、２型糖尿病に罹患した患者について臨床試験が行なわれており、ＦＧＦ２１及び関連する類似体の両方に応答する中和抗体の効力の定量化のための高感度で特異的なアッセイが必要とされている。ＦＧＦ２１は、チロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ受容体及びベータ−Ｋｌｏｔｈｏ、即ちＦＧＦ２１シグナル伝達経路の最適な結合及び活性化に極めて重要である２つのグリコシダーゼドメインを有するシングルパス膜貫通タンパク質から構成されるヘテロ二量体細胞表面受容体を介してシグナル伝達する（Ｗａｎｇ及びＳｕｎ、２００９年）。ＦＧＦ２１が、ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ共受容体の存在下でＦＧＦＲ１ｃ受容体に結合することにより、ｒａｓ／ｒａｆ  ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードの活性化、ＥＲＫ１／２の活性化並びにＥｌｋ−１及びＳＲＦのリン酸化及び活性化がもたらされる（Ｗａｎｇら、１９９７年）。ヒト血清中に存在する多数の他の増殖因子及びサイトカインもまた、同じシグナル伝達経路を利用するので、ＦＧＦ２１に対する高感度かつ特異的なアッセイの開発を困難にしている。
【０００４】
したがって、正常なヒト血清からの干渉を最小限に抑えながら、ＦＧＦ２１活性の検出のためのＦＧＦ２１応答性レポーター遺伝子細胞株が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、上記の先行技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、哺乳動物ＦＧＦ２１応答性レポーター細胞株を提供することである。とくに、本発明の目的は、ＦＧＦ２１活性の存在に感受性を有し、ＦＧＦ２１と同じシグナル伝達経路を使用し、ＦＧＦ２１と同じシグナル伝達経路を使用するヒト血清中に存在する他の増殖因子からの干渉を受けない、哺乳動物ＦＧＦ２１応答レポーター細胞株を提供することである。
【０００６】
この問題を解決するため、本発明は、以下を含む哺乳動物細胞株を提供する：
（ｉ）下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第１の異種ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）キメラ転写因子をコードする第２の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が前記シス作用調節配列に結合可能である異種ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ−１のトランス活性化ドメインを含む、第２の異種ポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）チロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ及びベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質。
【０００７】
本発明の別の側面は、試験試料中のＦＧＦ２１活性を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）前記試験試料を本発明に従う細胞株に接触させる工程、
（ｉｉｉ）前記細胞株における第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
を含む、方法を提供する。
【０００８】
本発明の更なる側面は、試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する中和抗体を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）含有試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が本発明に従う細胞株を含む、工程、
（ｉｉｉ）前記第１の細胞試料を前記試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第２の細胞試料をＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第１の細胞試料の細胞における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定し、前記第２の細胞試料の細胞における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１及び第２の細胞試料中の前記レポーター活性の間の比を提供する工程であって、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法に関する。
【０００９】
したがって、本発明は、正常なヒト血清又はＦＧＦ２１と同じシグナル伝達経路を使用するヒト血清中に存在する他の増殖因子からの干渉を最小限に抑えながら、ＦＧＦ２１活性を検出することができる細胞株、及び種々の状況でのその使用を提供する。その更なる結果として、本発明は、その全ての側面において、信頼性のある結果を提供するために、ＦＧＦ２１と同じシグナル伝達経路を使用する他の増殖因子（ＦＧＦ２１以外）を最小限化又は除去するためのいかなる試料操作も必要としない。
【００１０】
さらに、上記の正常な血清中に存在する天然Ｅｌｋ−１等の増殖因子の存在によって引き起こされるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の非特異的な増加を減少させる手段を提供することに加えて、本発明はさらに、表１に示すように、ヒトＦＧＦ−２１の検出感度を高める。したがって、本発明に従ってトランスフェクトした細胞により、ヒトＦＧＦ−２１の検出感度が高められる。
【００１１】
したがって、一態様では、本発明は、正常なヒト血清又はＦＧＦ２１と同じシグナル伝達経路を使用するヒト血清中に存在する他の成長因子からの干渉を最小限に抑えながら、ＦＧＦ２１活性を検出することができる細胞を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、当技術分野で使用される他の細胞株と比較して、ヒトＦＧＦ−２１の検出感度が高い細胞株を提供する。
【００１３】
なお更なる態様では、本発明は、正常なヒト血清又はＦＧＦ２１と同じシグナル伝達経路を使用するヒト血清中に存在する他の成長因子からの干渉を最小限に抑えながら、ＦＧＦ２１活性を検出することができ、同時に、当技術分野で使用される他の細胞株と比較して、ヒトＦＧＦ２１の検出感度の高い細胞株を提供する。
【００１４】
例えば、天然β−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、ＦＧＦ２１について約２４ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示したが、コドン最適化β−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、ＦＧＦ−２１について約７．０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示した。これは、コドン最適化β−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子を含有する細胞の感受性が強められたことを反映している。さらに、天然β−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞は、ＦＧＦ−２１について１７２ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示した（表１）。
【００１５】
したがって、一側面では、本発明は、本発明に従ってトランスフェクトした細胞のＥＣ５０が、対応する１つ又は複数の天然遺伝子でトランスフェクトした細胞と比較して、少なくとも減少するように、より高い感度でＦＧＦ−２１を検出することができる細胞に関する。遺伝子は、例えばβ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子であるが、それ以外に他の又は更なる遺伝子を含み得る。減少は、約２倍、例えば約３倍、例えば約４倍、例えば約５倍、例えば６倍、例えば７倍、例えば約８倍、例えば９倍、例えば１０倍、例えば５０倍、例えば約１００倍、又は約１０００倍であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、キメラＥｌｋ−１−Ｇａｌ４転写因子の構造を示す。
【００１７】
【図２】図２は、ＦＧＦ２１応答性レポーター遺伝子細胞株：分子構築物を示す。
【００１８】
【図３】図３は、最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子（配列番号１）及び天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子のアラインメントを示す。
【００１９】
【図４】図４は、漸増濃度のヒトＦＧＦ２１で処理した最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の応答を示す。
【００２０】
【図５】図５は、最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子及び天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子でそれぞれトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞及びＨＥＫ２９３細胞の応答の比較を示す。
【００２１】
【図６】図６は、最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子及び天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎａｔｉｖｅ  ｂｅｔａ−Ｋｌｏｔｈｏ  ｇｅｎｅ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の応答に対する正常なヒト血清の効果を示す。
【００２２】
【図７】図７は、本発明に記載したキメラｇａｌ４−Ｅｌｋ−１転写因子又は６倍縦列反復の標準天然Ｅｌｋ−１認識配列（配列番号８、図８）のいずれかの制御下で、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に対する正常血清の効果を示す。図７に示すように、１０％正常血清を含有するＤＭＥＭ培養培地でのＨＥＫ２９３細胞の処理によって、６倍縦列反復の標準Ｅｌｋ−１認識配列の制御下におけるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性は、ＤＭＥＭ培養培地単独での細胞と比較して、約３２％増加した。対照的に、キメラｇａｌ４−Ｅｌｋ−１（Ｅｌｋ−）の制御下にてホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞については、ＤＭＥＭ培養培地単独での細胞と比較して、１０％正常血清を含有するＤＭＥＭの存在下でのホタルルシフェラーゼの活性は９．５％増加したに過ぎなかった。
【００２３】
【図８】図８は、６倍縦列反復の標準天然Ｅｌｋ−１認識配列を示す。
【００２４】
表１は、凍結、解凍及び使用のフォーマット（ｆｒｅｅｚｅ，ｔｈａｗ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｆｏｒｍａｔ）における最適化合成ベータＫｌｏｔｈｏ遺伝子及び天然ベータＫｌｏｔｈｏ遺伝子でトランスフェクトした細胞の応答の比較を示す。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明の態様の説明において、明確化のために特定の用語を使用する。しかしながら、本発明は、そのように選択した特定の用語に限定されることを意図するものではなく、各特定の用語は、同様の目的を達成するために同様に作用する全ての技術的均等物を含むと理解される。
【００２６】
本発明者らは、レポーター細胞株、及びそれを使用して試験試料中のＦＧＦ２１活性を検出／定量する方法を提供する。本発明者らはさらに、ＦＧＦ２１に対する抗体を検出／定量する方法を提供する。一方法には、ＦＧＦ２１活性を中和する抗体の能力を試験することが含まれる。
【００２７】
ＦＧＦ２１に特異的で、かつＦＧＦ２１と同じシグナル伝達経路を使用するヒト血清中に存在する他の増殖因子からの干渉を受けないレポーター遺伝子アッセイを開発するために、本発明者らは、Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１５２）及び胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３）を含むヒト細胞を、哺乳動物細胞には存在しないＤＮＡ結合ドメイン、例えばＧａｌ４の結合ドメインに融合したＥｌｋ−１のトランス活性化ドメインからなるキメラ転写因子により調節されるホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子構築物で同時トランスフェクトした。キメラ転写因子のみがレポーター遺伝子を調節する配列、例えばｇａｌ４の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するように、細胞を、キメラ転写因子をコードする発現因子で同時トランスフェクトした。天然内因性Ｅｌｋ−１は、野生型細胞におけるのと同一の様式で産生され、作用するが、専らキメラ転写因子によって調節されるＦＬレポーター遺伝子を調節するキメラプロモーターには結合することも、これを活性化することもない。さらに、細胞を、構成的プロモーターの制御下でウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子、並びにＦＧＦＲ１ｃ受容体鎖及びベータ−Ｋｌｏｔｈｏ共受容体をコードする各発現ベクターで同時トランスフェクトした。得られたレポーター遺伝子細胞株をＦＧＦ２１についての高感度かつ特異的なアッセイの確立の基礎として使用したところ、正常なヒト血清からの干渉を最小限に抑えて、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＨＥＫ２９３細胞についてＥＣ５０がそれぞれ１７０及び２４ｎｇ／ｍｌであった。ＦＧＦ２１応答性細胞は、米国特許第９１８８５８０号に記載されている凍結、解凍及び使用のフォーマットで産生される。
【００２８】
本発明者らは、レポーター細胞をさらに改善する方法をさらに調べた。とくに、本発明者らは、正常なヒト血清からの干渉を最小限に抑えながら、ＦＧＦ２１活性の検出に対する感度を高める方法を調べた。
【００２９】
定義
ベクター
「ベクター」又は「ベクター構築物」という用語は、組換え遺伝物質を宿主細胞に移入するためのビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子を指す。４つの主要な種類のベクターはプラスミド、バクテリオファージ及び他のウイルス、コスミド、並びに人工染色体である。ベクター自体は、一般的に、インサート（異種核酸配列、導入遺伝子）及びベクターの「骨格」として働くより大きな配列からなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を宿主に移入するベクターの目的は、典型的には標的細胞においてインサートを単離、増殖、又は発現させることである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞中での異種配列の発現に特異的に適合されており、一般的に、異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。本発明の態様で利用するベクターの選択は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターの具体的な用途に依存する。
【００３０】
作動可能に結合する
「作動可能に結合する」という用語は、遺伝子又はオープンリーディングフレーム等の機能単位の一部である各要素の結合を指す。したがって、プロモーターを、ポリペプチドをコードする核酸配列（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）に作動可能に結合することによって、２つの要素は機能単位の一部−遺伝子となる。核酸配列への発現制御配列（プロモーター）の結合により、プロモーターによって導かれる核酸配列の転写が可能になる。ポリペプチドをコードする２つの異種核酸配列を作動可能に結合させることによって、その配列は、機能単位の一部−異種核酸配列によってコードされる（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームとなる。２つのアミノ酸配列を作動可能に結合させることにより、その配列は，同じ機能単位の一部−ポリペプチドとなる。２つの異種アミノ酸配列を作動可能に結合することにより、ハイブリッド（融合）ポリペプチドが生成される。
【００３１】
本発明の第１の側面は、以下を含む哺乳動物細胞株に関する：
（ｉ）下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第１の異種ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）キメラ転写因子をコードする第２の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が、前記シス作用調節配列に結合可能である異種ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ−１のトランス活性化ドメインを含む、第２の異種ポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）チロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ及びベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質。
【００３２】
本発明の哺乳動物細胞株（レポーター細胞株とも呼ばれる）は、試験試料中のＦＧＦ２１活性の存在についてアッセイするのに有用である。レポーター細胞株はさらに、ＦＧＦ２１の類似体の活性及び効力を試験（スクリーニング又は確認等）するのに使用することができる。同様に、本発明の哺乳動物細胞株は、ＦＧＦ２１の活性を中和する抗体についてその能力（及び効力）を試験（スクリーニング又は確認等）するのに使用することができる。
【００３３】
哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子のバックグラウンド活性を最小限化するために、本発明者らは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメイン及び同族シス作用調節配列を使用するが、それはレポーター系の宿主として使用される哺乳動物細胞の遺伝的バックグラウンドには存在しない。有用なＤＮＡ結合ドメイン／シス作用調節配列は、典型的には、酵母又は細菌等の、哺乳動物とは遠く離れた関係の生物に見られる。したがって、本発明の一態様では、異種ＤＮＡ結合ドメイン及びその同族シス作用調節配列は酵母又は細菌起源（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ）のものである。
【００３４】
異種ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ−１のトランス活性化ドメインを含み、かつ第１のレポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を導くプロモーターの上流の同族シス作用調節配列に結合するキメラ転写因子のリクルートメントにより、プロモーターの転写複合体の形成が刺激され、これにより第１のレポータータンパク質が発現される。レポーターの刺激による発現は、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路によって媒介される。
【００３５】
好ましい態様では、シス作用調節配列は上流活性化配列（ＵＡＳ）であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインは前記上流活性化配列に結合可能であるＤＮＡ結合ドメインである。
【００３６】
さらにより好ましい態様では、シス作用性調節配列はガラクトース応答性上流活性化配列（ＵＡＳＧ）であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ結合ドメインガラクトース応答性転写因子ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ＤＢ）である。
【００３７】
別の態様では、シス作用調節配列はＬｅｘＡのＤＮＡ結合部位であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインはリプレッサーＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメインである。
【００３８】
他の有用な系には、ＴｅｔＲ／ＴｅｔＯ系及びＣｕｍａｔｅ／ＣｕＯ系が含まれる。
【００３９】
本発明のレポーター細胞株を樹立化するための宿主として使用される細胞はベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を内因的に発現し、該タンパク質はチロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ及びベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質の一部を形成することができる。
【００４０】
しかしながら、好ましい態様では、ベータＫｌｏｔｈｏタンパク質をコードし、それを発現するように適合された発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入する。したがって、一態様では、細胞には、ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする下流オープンリーディングフレームに作動可能に結合するプロモーターを含む異種ポリヌクレオチドが含まれ、そこから前記ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が発現する。異種ポリヌクレオチドは典型的に発現ベクターである。ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする下流オープンリーディングフレームに作動可能に結合するプロモーターは、典型的には、細胞株においてベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質の構成的発現を提供するプロモーターである。細胞株においてベータＫｌｏｔｈｏタンパク質の発現を導くのに有用なプロモーターの例には、非限定的に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトβ−アクチン（ｈＡＣＴＢ）、ヒト伸長因子−１α（ｈＥＦ−１α）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター及びサイトメガロウイルス初期エンハンサー／チキンβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターからなるリストから選択される構成的に活性なプロモーターが含まれる。
【００４１】
本発明者らは、天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を含む発現構築物と比較して、コード配列（ＯＲＦ）が哺乳動物宿主細胞での発現について最適化された、ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする発現構築物を導入することによって、レポーター系のＥＣ５０が有意に改善されることを見出した。
【００４２】
したがって、本発明の一態様では、ベータＫｌｏｔｈｏタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、前記細胞での発現についてコドン最適化された。特定の態様では、オープンリーディングフレームは、配列番号１に記載の配列、又は配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列、例えば配列番号１に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号１に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９７％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる。
【００４３】
好ましい態様では、哺乳動物細胞は、ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする下流オープンリーディングフレームに作動可能に結合するプロモーターを含む異種ポリヌクレオチドを含み、そこから前記ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が発現するが、ここで前記オープンリーディングフレームの配列は、配列番号１に記載の配列を含むか又はそれからなる。
【００４４】
レポーター系では、用途に適した任意のレポーター遺伝子を使用することができる。通常、該系には、試験ラボでの樹立化が容易で、感受性が強いレポーターを使用する。典型的には、レポーター遺伝子は、レポータータンパク質をコードし、これは酵素又は蛍光タンパク質である。
【００４５】
一態様では、レポーター遺伝子（第１のレポーター遺伝子）は酵素をコードする。好ましい態様では、レポーター（第１のレポーター）は、ホタルルシフェラーゼ又はウミシイタケルシフェラーゼ等のルシフェラーゼである。
【００４６】
別の態様では、レポーター遺伝子（第１のレポーター遺伝子）は蛍光タンパク質をコードし、第１のレポータータンパク質は蛍光タンパク質である。有用な蛍光タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び関連蛍光タンパク質、例えば増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及び異なる励起／発光スペクトルを示すそれらのバリアントが含まれる。
【００４７】
本発明者らは、本発明のレポーター細胞株（哺乳動物細胞）に第２のレポーター遺伝子を導入するのが有用であることを見出した。第２のレポーター遺伝子は、典型的には、第２のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合するプロモーターを含むポリヌクレオチドの形態で導入される。第２のレポーターの発現を導くプロモーターは、典型的には、本発明のレポーター細胞株を樹立化するのに使用される哺乳動物宿主細胞において構成的に活性である。有用な構成的に活性なプロモーターには、非限定的に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトβアクチン（ｈＡＣＴＢ）、ヒト伸長因子−１α（ｈＥＦ−１α）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター及びサイトメガロウイルス初期エンハンサー／チキンβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターが含まれる。
【００４８】
哺乳動物細胞における第２のレポータータンパク質の導入により、試料間変動が減少する。第２のレポータータンパク質の適用により、細胞の欠失（ｌｏｓｓ）又は播種された細胞数の変動による細胞密度の試料間変動を補償するための手段がもたらされる。
【００４９】
任意のルシフェラーゼの構成的発現を使用する利点は、結果がレポーター遺伝子細胞の欠失によって影響されず、また結果が血清マトリックス効果によって影響されず、そして一定の容易に検出可能なレベルのルシフェラーゼ活性が得られることである。これら全ては、他の（第２の）ルシフェラーゼの構成的発現の測定の使用によって得られる正規化により補償することができる。このような正規化を使用しない単一のレポーター遺伝子手順の使用では、これらの利点のいずれも得ることができない。
【００５０】
第１及び第２のレポータータンパク質が存在する場合、レポーターは典型的には同じ検出手段を使用するように選択される。例えば、第１のレポーターが増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）等の蛍光タンパク質である場合、第２のレポータータンパク質は典型的にはこのクラスの別の種の蛍光タンパク質であり、異なる励起／発光スペクトルを示す。
【００５１】
好ましい態様では、第１のレポータータンパク質がルシフェラーゼであり、第２のレポーター（構成的に発現される）もルシフェラーゼであるが、但し各ルシフェラーゼは同一ではない。この場合、両方のルシフェラーゼの活性は容易に検出可能であり、アッセイプレートの同じウェル中で連続的に読み取ることができる。例えば、レポーター遺伝子構築物がホタルルシフェラーゼ（第１のレポータータンパク質）を産生する場合、構成的に産生されるのは第２のルシフェラーゼ（第２のレポータータンパク質）、例えばウミシイタケルシフェラーゼであり得る。第２のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第１のルシフェラーゼの活性は、ＵＳ２０１１／０１８９６５８に記載されている。アッセイを行う場合、第１のレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後で、次に試薬を加えてその特定のルシフェラーゼをクエンチし、これにより、次の読み取りで構成的構築物からのルシフェラーゼのみを読み取り、次にこれを正規化の目的のために使用する。これを実施例１でより詳細に説明する。
【００５２】
任意のルシフェラーゼの構成的発現を使用する利点は、結果がレポーター遺伝子細胞の欠失によって影響されず、また結果が血清マトリックス効果によって影響されず、そして一定の容易に検出可能なレベルのルシフェラーゼ活性が得られることである。これら全ては、他の（第２の）ルシフェラーゼの構成的発現の測定の使用によって得られる正規化により補償することができる。このような正規化を使用しない単一のレポーター遺伝子手順の使用では、これらの利点のいずれも得ることができない。
【００５３】
樹立化のための宿主として使用する細胞株は、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）ＦＧＦ２１シグナル伝達経路を含む任意の哺乳動物細胞株であり得、したがって、ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ共受容体の存在下でのＦＧＦ２１のＦＧＦＲ１ｃ受容体への結合により、ｒａｓ／ｒａｆ  ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードの活性化、ＥＲＫ１／２の活性化並びにＥｌｋ−１及びＳＲＦのリン酸化及び活性化がもたらされる。あるいは、受容体が存在せず、シグナル伝達経路が根本的に欠如している場合、例えばベータ−Ｋｌｏｔｈｏ共受容体の異種発現によって、シグナル伝達経路を回復することが可能でなければならない。好ましくは、本発明の哺乳動物細胞は、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路が無傷である場合の哺乳動物宿主細胞に基づく。
【００５４】
本発明の一態様では、細胞株は、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ６５２及びＵ９３７からなる群から選択される。好ましい態様では、細胞株はＨＥＫ２９３である。
【００５５】
本発明は、正常なヒト血清からの干渉を最小限に抑えながら、感度を向上させるために、ＦＧＦ２１応答性細胞について先に適用した米国特許第９１８８５８０号に記載されている凍結、解凍及び使用のフォーマットを実質的に改善する。本明細書で実施例１に開示したように、改善された感度自体は、ＥＣ５０における実質的な改善、並びにＥＣ５０及びＬＬＯＱ（より低い定量下限値）における実質的な改善おいて現れる。
【００５６】
これらの特徴は、本発明によって得られるが、本発明では、ＨＥＫ２９３細胞を、先に使用したのと同じレポーター遺伝子構築物、キメラＥｌｋ−１転写因子、及びＦＧＦＲ１ｃ受容体鎖、しかし天然の遺伝子に対して７９％の相同性を有する最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子、並びに構成的プロモーターの制御下でのウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子で同時トランスフェクトした。合成ベータＫｌｏｔｈｏ遺伝子は、翻訳を最適化ために統計的に最も頻繁に利用されるコドンを使用し、それによってベータＫｌｏｔｈｏ共受容体がＦＧＦ２１のその受容体への結合及びシグナル伝達経路の活性化を促進する効率を高めるように設計された。得られた細胞株は、同じクローニング方法を使用するが、天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子を利用して先に樹立化したＦＧＦ２１応答性Ｊｕｒｋａｔ又はＨＥＫ２９３細胞株よりも著しく感受性が強い。
【００５７】
本明細書中で考察されるように、本発明の哺乳動物細胞株は、試験試料中のＦＧＦ２１活性の存在をアッセイするのに有用である。別の側面では、本発明のレポーター細胞株は、ＦＧＦ２１の類似体の活性及び効力を試験（例えばスクリーニング又は確認等）するのに使用される。同様に、本発明のレポーター細胞株は、ＦＧＦ２１の活性を中和する能力（及び効力）について抗体を試験（スクリーニング又は確認等）するのに使用することができる。
【００５８】
したがって、本発明の一側面は、試験試料中のＦＧＦ２１活性を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）前記試験試料を特許請求の範囲の先行する請求項（ｔｈｅ  ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｃｌａｉｍｓ）のいずれか一項に記載の細胞株に接触させる工程、
（ｉｉｉ）前記細胞株における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
を含む、方法を提供する。
【００５９】
前記方法は、ＦＧＦ２１活性又はＦＧＦ２１の類似体の活性／効力を検出／定量するのに使用することができる。
【００６０】
好ましい態様では、前記方法は、第２のレポータータンパク質を、例えば試料間の変動を補償する手段として使用する。
【００６１】
したがって、一態様では、細胞株は第２のレポータータンパク質を発現し、前記方法は、
（ｉｖ）前記細胞株における第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１のレポータータンパク質及び第２のレポータータンパク質の活性の間の比を提供する工程、
をさらに含む。
【００６２】
更なる側面は、試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する中和抗体を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）含有（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が特許請求の範囲の先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞株を含む、工程、
（ｉｉｉ）第１の細胞試料を試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）第２の細胞試料をＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）第１の細胞試料の細胞における第１のレポータータンパク質の活性を測定し、そして第２の細胞試料の細胞における第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１及び第２の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供する工程であって、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法に関する。
【００６３】
好ましい態様では、前記方法は、第２のレポータータンパク質を、例えば試料間の変動を補償する手段として使用する。
【００６４】
したがって、一態様では、試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する抗体を検出し、任意に定量する方法は、
（ｉ）含有試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が特許請求の範囲の先行する請求項のいずれか一項に記載の細胞株を含み、前記細胞株が第２のレポータータンパク質を発現する、工程、
（ｉｉｉ）第１の細胞試料を、試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）第２の細胞試料を、ＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）第１の細胞試料の細胞における第１及び第２のレポータータンパク質の活性を測定し、そして第２の細胞試料の細胞における第１及び第２のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１の細胞試料における第１及び第２のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第１の比を提供し、第２の細胞試料における第１及び第２のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第２の比を提供する工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）の第１の比及び第２の比の間の第３の比を提供する工程であって、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む。
【００６５】
本発明の態様を説明する場合、全ての可能な態様の組み合わせ及び変さらについては、明確に説明はしていない。それにもかかわらず、特定の手段が互いに異なる従属項に列記されているか又は異なる態様に記載されているという単なる事実によっては、これらの手段の組み合わせを有利に使用できないことは示されない。本発明は、記載された態様の全ての可能な組み合わせ及び変更を想定している。
【００６６】
本明細書における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、あらゆる場合において、それぞれ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）  ｏｆ）」という用語で任意に置換可能であることを意図している。本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。全ての引用文献は参照により本明細書に援用される。
【００６７】
以下の非限定的な事項によって、以下に本発明を説明する。
【００６８】
項目１．  以下を含む哺乳動物細胞株：
（ｉ）下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第１の異種ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）キメラ転写因子をコードする第２の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が前記シス作用調節配列に結合可能である異種ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ−１のトランス活性化ドメインを含む、第２の異種ポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）チロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ及びベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質。
【００６９】
項目２．  前記異種ＤＮＡ結合ドメイン及びその同族シス作用調節配列が、酵母又は細菌起源である、項目（ｃｌａｉｍ）１に記載の哺乳動物細胞。
【００７０】
項目３．  前記シス作用調節配列が上流活性化配列（ＵＡＳ）であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインが前記上流活性化配列に結合可能であるＤＮＡ結合ドメインである、項目１又は２に記載の哺乳動物細胞。
【００７１】
項目４．  前記シス作用調節配列がガラクトース応答性上流活性化配列（ＵＡＳＧ）であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ結合ドメインガラクトース応答性転写因子ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ＤＢ）である、先行する項目のいずれか一つに記載の哺乳動物細胞。
【００７２】
項目５．  前記シス作用調節配列がＬｅｘＡのＤＮＡ結合部位であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインがリプレッサーＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、先行する項目のいずれか一つに記載の哺乳動物細胞。
【００７３】
項目６．  前記細胞が、ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする下流オープンリーディングフレームに作動可能に結合するプロモーターを含む異種ポリヌクレオチドを含み、それから前記ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が発現する、先行する項目のいずれか一つに記載の哺乳動物細胞。
【００７４】
項目７．  ベータＫｌｏｔｈｏタンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームが、前記細胞における発現についてコドン最適化されている、項目６に記載の哺乳動物細胞。
【００７５】
項目８．  前記オープンリーディングフレームが、配列番号１に記載の配列、又は配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号１に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９５％の配列同一性、例えば９７配列番号１に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９９％の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる、項目６又は７のいずれか一つに記載の哺乳動物細胞。
【００７６】
項目９．  前記第１のレポータータンパク質がルシフェラーゼ等の酵素である、先行する項目のいずれか一つに記載の哺乳動物細胞。
【００７７】
項目１０．  前記第１のレポータータンパク質が蛍光タンパク質である、先行する項目のいずれか一つに記載の哺乳動物細胞。
【００７８】
項目１１．  前記細胞が第２のレポータータンパク質をさらに発現する、先行する項目のいずれか一つに記載の哺乳動物細胞。
【００７９】
項目１２．  前記第２のレポータータンパク質が構成的プロモーターから発現される、先行する項目のいずれか一つに記載の哺乳動物細胞。
【００８０】
項目１３．  前記細胞株が、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ６５２及びＵ９３７からなる群から選択される、先行する項目のいずれか一つに記載の細胞株。
【００８１】
項目１４．  試験試料中のＦＧＦ２１活性を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）前記試験試料を、先行する項目のいずれか一つに記載の細胞株に接触させる工程、
（ｉｉｉ）前記細胞株における第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
を含む、方法。
【００８２】
項目１５．  前記細胞株が第２のレポータータンパク質を発現し、前記方法が、
（ｉｖ）前記細胞株における第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１のレポータータンパク質及び第２のレポータータンパク質の活性の間の比を提供する工程、
をさらに含む、項目１４に記載の方法。
【００８３】
項目１６．  試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する中和抗体を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）含有試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が、先行する項目のいずれか一つに記載の細胞株を含む、工程、
（ｉｉｉ）第１の細胞試料を、試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）第２の細胞試料をＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）第１の細胞試料の細胞における第１のレポータータンパク質の活性を測定し、そして第２の細胞試料の細胞における第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１及び第２の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供し、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法。
【００８４】
項目１７．  試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する抗体を検出し、任意に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）含有試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が先行する項目のいずれか一つに記載の細胞株を含み、前記細胞株が第２のレポータータンパク質を発現する、工程、
（ｉｉｉ）第１の細胞試料を、試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）第２の細胞試料をＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）第１の細胞試料の細胞における第１及び第２のレポータータンパク質の活性を測定し、そして第２の細胞試料の細胞における第１及び第２のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１の細胞試料における第１と第２のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第１の比を提供し、第２の細胞試料における第１と第２のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第２の比を提供する工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）の第１の比及び第２の比の間の第３の比を提供し、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる工程、
を含む、方法。
【００８５】
配列番号２から８に記載の配列は、本発明の哺乳動物細胞株の調製に有用な種々のポリヌクレオチドに関する。
【実施例】
【００８６】
例１
ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３）を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、図１に示すように、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ｎｔ１からｎｔ３９０）に融合したＥｌｋ−１のトランス活性化ドメイン（ｎｔ９１９からｎｔ１２７５）からなるキメラ転写因子によって調節されるホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子構築物を用いて連続的に同時トランスフェクトした。Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインは哺乳動物細胞には存在しないので、キメラ転写因子のみが、ＦＬレポーター遺伝子の転写を調節するｇａｌ４の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合する。細胞をさらに、ＦＧＦ２１誘導性ＦＬ活性を正規化するのに使用される構成的プロモーターの制御下で、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子、並びに最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子及びＦＧＦＲ１ｃ受容体鎖で同時トランスフェクトした（図２）。最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、天然の遺伝子と７９％の相同性を示す（図３）。最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。安定なクローンを単離し、漸増濃度のヒトＦＧＦ２１の存在下でＦＧＦ２１応答性について特性決定し、次にサブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特性決定し、そして増殖させた。これにより、天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子でトランスフェクトした細胞株と比較して、感受性が強められたＦＧＦ２１応答性細胞株が得られた。したがって、得られたレポーター遺伝子細胞株は、漸増濃度のヒトＦＧＦ２１で処理した場合に、約３．０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０であり、感受性が強いことが見出された（図４）。正常なドナーからのヒト血清は、１／１０の最終希釈で、漸増濃度のヒトＦＧＦ２１を用いた処理に対する細胞の応答に有意に影響しなかった（図４）。
【００８７】
最適化合成ベータＫｌｏｔｈｏ遺伝子を有するＦＧＦ２１応答性ＨＥＫ２９３細胞株を米国特許第９１８８５８０号に記載されている凍結、解凍、及び使用のフォーマットで使用し、漸増濃度のヒトＦＧＦ２１で処理した場合、ホタルルシフェラーゼ活性のＲＬＵとして表される細胞の応答は、天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子でランスフェクトしたＦＧＦ２１応答性Ｊｕｒｋａｔ細胞株で観察されたものより明らかに優れていた（図５）。米国特許第９１８８５８０号に記載されている凍結、解凍、及び使用のフォーマットで使用した最適化合成ベータＫｌｏｔｈｏ遺伝子を有するＦＧＦ２１応答性ＨＥＫ２９３細胞株は、米国特許第９１８８５８０号に記載されている凍結、融解、及び使用フォーマットで使用した天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子でそれぞれトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及びＪｕｒｌａｔ細胞の約２４ｎｇ／ｍｌ及び１７０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０と比較して、約７．０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示した（表１）。米国特許第９１８８５８０号に記載されている凍結、融解及び使用フォーマットで使用した最適化合成ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子を有するＨＥＫ２９３細胞株は、正常なヒト血清からの有意な干渉を示さなかった（図６）。
【００８８】
参考文献
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Ｗａｎｇ  Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１７５０−１７５７、１９９７
【図１】
2019528794.tif 000002
【図２】
2019528794.tif 000003
【図３−１】
2019528794.tif 000004
【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
2019528794.tif 000009
【図４】
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【図５】
2019528794.tif 000011
【図６】
2019528794.tif 000012
【図７】
2019528794.tif 000013
【図８】
2019528794.tif 000014
【配列表】
2019528794000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月22日(2019.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む哺乳動物細胞株：
（ｉ）下流プロモーター配列に作動可能に結合する異種シス作用調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合する、第１の異種ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）キメラ転写因子をコードする第２の異種ポリヌクレオチドであって、前記キメラ転写因子が前記シス作用調節配列に結合可能である異種ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ−１のトランス活性化ドメインを含む、第２の異種ポリヌクレオチド、及び
（ｉｉｉ）チロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ及びベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質、
前記細胞がベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする下流オープンリーディングフレームに作動可能に結合するプロモーターを含む異種ポリヌクレオチドを含み、そこから前記ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が発現され、かつ
前記オープンリーディングフレームが配列番号１に記載の配列を含むか又はそれからなる。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが哺乳動物細胞には存在しない、請求項１に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項３】
異種ＤＮＡ結合ドメイン及びその同族シス作用調節配列が酵母又は細菌起源である、請求項１又は２のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項４】
シス作用調節配列が上流活性化配列（ＵＡＳ）であり、かつ前記異種ＤＮＡ結合ドメインが前記上流活性化配列に結合可能であるＤＮＡ結合ドメインである、請求項１〜３のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項５】
シス作用調節配列がガラクトース応答性上流活性化配列（ＵＡＳＧ）であり、かつ前記異種ＤＮＡ結合ドメインが前記ＤＮＡ結合ドメインガラクトース応答性転写因子ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ＤＢ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項６】
シス作用調節配列がＬｅｘＡのＤＮＡ結合部位であり、かつ前記異種ＤＮＡ結合ドメインがリプレッサーＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、請求項１〜５のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
ベータ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームが、前記細胞における発現についてコドン最適化されている、請求項１〜６のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項８】
第１のレポータータンパク質が酵素である、請求項１〜７のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
第１のレポータータンパク質がルシフェラーゼである、請求項１〜８のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
細胞が第２のレポータータンパク質を更に発現する、請求項１〜９のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
第２のレポータータンパク質が構成的プロモーターから発現される、請求項１〜１０のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
細胞株が、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ６５２及びＵ９３７からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞株。
【請求項１３】
細胞株がＨＥＫ２９３である、請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞株。
【請求項１４】
試験試料中のＦＧＦ２１活性を検出し、そして任意選択的に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）前記試験試料を、請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞株に接触させる工程、
（ｉｉｉ）前記細胞株における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、を含む、方法。
【請求項１５】
ＦＧＦ２１活性の検出及び任意の定量が、正常なヒト血清の干渉を本質的に受けない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞株が第２のレポータータンパク質を発現し、前記方法が、
（ｉｖ）前記細胞株における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）前記第１のレポータータンパク質及び前記第２のレポータータンパク質の活性の間の比を提供する工程、
を更に含む、請求項１４〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する中和抗体を検出し、そして任意選択的に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）含有試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞株を含む、工程、
（ｉｉｉ）前記第１の細胞試料を前記試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第２の細胞試料をＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第１の細胞試料の細胞における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定し、そして前記第２の細胞試料の細胞における前記第１のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）第１及び第２の細胞試料における前記レポーター活性の間の比を提供する工程であって、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法。
【請求項１８】
ＦＧＦ２１に対する中和抗体の検出及び任意の定量が、正常なヒト血清の干渉を本質的に受けない、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７〜１８のいずれかに記載の試験試料中に存在するＦＧＦ２１に対する抗体を検出し、そして任意選択的に定量する方法であって、前記方法が、
（ｉ）含有試験試料を提供する工程、
（ｉｉ）第１及び第２の細胞試料を提供する工程であって、前記細胞試料が請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞株を含み、前記細胞株が第２のレポータータンパク質を発現する、工程、
（ｉｉｉ）前記第１の細胞試料を前記試験試料に、続いてＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第２の細胞試料をＦＧＦ２１に接触させる工程、
（ｉｖ）前記第１の細胞試料の細胞における前記第１及び第２のレポータータンパク質の活性を測定し、そして前記第２の細胞試料の細胞における前記第１及び第２のレポータータンパク質の活性を測定する工程、
（ｖ）前記第１の細胞試料における前記第１及び第２のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第１の比を提供し、前記第２の細胞試料における前記第１及び第２のレポータータンパク質のレポーター活性の間の第２の比を提供する工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）の第１の比及び第２の比の間の第３の比を提供する工程であって、１未満の比（第１／第２）が前記試料中のＦＧＦ２１に対する抗体の存在の指標となる、工程、
を含む、方法。
【国際調査報告】
2019528794.tif 000015
2019528794.tif 000016
2019528794.tif 000017