(57)【要約】  本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、カプリル酸塩およびアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、ならびに（ｃ）スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５０ｍＭを超えるカプリル酸塩および約０．５Ｍを超えるアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記カプリル酸塩がカプリル酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記洗浄バッファーが約７５ｍＭ〜約３００ｍＭのカプリル酸塩を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記洗浄バッファーが約０．７５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記洗浄バッファーが約０．５Ｍ〜約１Ｍのリシンをさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
溶出された組換えポリペプチドが約２％未満の断片化された組換えポリペプチドを含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＣＰが哺乳動物細胞に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＣＰがホスホリパーゼＢ様２タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＣＰがカテプシンＬである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
カテプシンＬからの前記組換えポリペプチドの精製が、工程（ｃ）の溶出液中の低下したカテプシンＬ活性によって評価される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗浄バッファーのｐＨが、ｐＨ７〜ｐＨ９、またはｐＨ７．５〜ｐＨ８．５である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えポリペプチドがモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍＡｂが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記洗浄バッファーが塩化ナトリウムを含有しない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記スーパー抗原がタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、およびタンパク質Ｌからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）の後、ＨＣＰの量が約２００ｎｇ  ＨＣＰ／生成物ｍｇ未満である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ１）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５０ｍＭを超えるカプリル酸塩を含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、（ｂ２）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約０．５Ｍを超えるアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる、方法。
【請求項１８】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ１）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約０．５Ｍを超えるアルギニンアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、（ｂ２）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５０ｍＭを超えるカプリル酸塩を含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる、方法。
【請求項１９】
ホスホリパーゼＢ様２タンパク質から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１００ｍＭのカプリル酸塩および約１．１Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる、方法。
【請求項２０】
カテプシンＬから組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１５０ｍＭのカプリル酸塩および約１．１Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる、方法。
【請求項２１】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、カプリル酸塩が約２５０ｍＭを超える濃度で含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること、ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相支持体に固定化されたタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、またはタンパク質Ｌなどのスーパー抗原を用いるタンパク質精製の分野に関する。特に、本発明は、所望のタンパク質生成物の損失を最小限にしつつ洗浄工程中に宿主細胞不純物を除去するための洗浄バッファー成分およびその洗浄バッファーの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物（ＦＤＡにより「工程由来(process-related)」不純物として分類される）は、生物薬剤学的下流処理において十分に低レベルまで除去されなければならない。ＨＣＰの十分なクリアランスは、典型的な下流処理中においては、いくつかのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）生成物に関しては特に難しい場合がある。ｍＡｂ下流工程の大部分は「プラットフォーム」アプローチを使用し、典型的なｍＡｂ下流プラットフォームは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー捕捉とその後の１〜３回の非アフィニティーポリッシング工程からなる。タンパク質Ａアフィニティー捕捉工程は、プラットフォームの主力であり、ＨＣＰクリアランスの大部分を提供する。続いてのポリッシング工程は一般に、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはマルチモードクロマトグラフィーである。
【０００３】
多くのｍＡｂ生成物で、ＨＣＰ濃度は、最初のポリッシングクロマトグラフィー工程の後に十分に低いものである。しかしながら、さらなるＨＣＰを除去するために第２のポリッシングクロマトグラフィー工程が特に実施されるｍＡｂも多くあり、これは多大な工程開発努力を必要とする可能性があり、工程がますます複雑となる。従前の研究では、ｍＡｂ生成物分子との引力相互作用を有するＨＣＰ不純物の亜集団が同定されている(Levy et al., (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912; Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124)。タンパク質Ａ工程を経たクリアランスから逃れるＨＣＰの大部分は、共溶出またはタンパク質Ａリガンドもしくはベースマトリックスへの吸着よりもむしろ生成物会合によるものである。除去が困難なＨＣＰの集団は、細胞培養中に存在するＨＣＰの多様な集団に比べて比較的小さく、種々のｍＡｂ生成物では類似している。
【０００４】
困難なＨＣＰ不純物の集団は総てのｍＡｂ生成物でたいてい同一であるが、ＨＣＰ−ｍＡｂ相互作用の程度の違いがタンパク質Ａ工程による総ＨＣＰクリアランスに大きな影響を及ぼす場合があり、ｍＡｂ生成物のアミノ酸配列に対する極めて小さな変化がタンパク質Ａ工程およびポリッシング工程におけるＨＣＰ−ｍＡｂ相互作用に影響を及ぼし得る。ＨＣＰ−ｍＡｂ会合能に明らかな影響を持つタンパク質ＡカラムにロードされたＨＣＰの集団は、細胞齢、採取方法および条件によって影響を受けることがあり、異なる宿主細胞系統間で細かい違いが見られた。生成物会合の他、ほとんどのタンパク質Ａ樹脂では、ベースマトリックスに結合し、生成物と共溶出する低レベルのＨＣＰ不純物が存在する。ＣＰＧ(controlled pore glass)樹脂は、ベースマトリックスに結合した、はるかに高いレベルのＨＣＰを有する。
【０００５】
１つの特定の洗浄添加剤、カプリル酸ナトリウムは、ＨＣＰ−ｍＡｂ会合の崩壊が最も成功し、タンパク質Ａ溶出液中で低いＨＣＰ濃度が得られるものであることがこれまでに確認されている。カプリル酸ナトリウム（オクタン酸ナトリウムとしても知られる）は、臨界ミセル濃度およそ３６０ｍＭで、マウスにおいて非毒性であることが判明している８炭素飽和脂肪酸である。従前の研究では、ＨＣＰクリアランスを改善するために、５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム(Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124)、種々のＮａＣｌおよびｐＨで４０ｍＭのカプリル酸ナトリウム(Chollangi et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(11):2292-2304)、および最大８０ｍＭのカプリル酸ナトリウム(Herzer et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428)）、ならびに総ＨＣＰクリアランスとタンパク質分解性のＨＣＰ不純物の除去の両方のために、高ｐＨでＮａＣｌを伴った５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム(Bee et al., (2015) Biotechnol. Prog. 31(5):1360-1369)が使用された。これまでに、最大１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含有するタンパク質Ａ洗浄液に関する特許出願が提出されている（ＷＯ２０１４／１４１１５０；ＷＯ２０１４／１８６３５０）。加えて、カプリル酸は、タンパク質Ａ捕捉工程の前後の非クロマトグラフィー工程で宿主細胞タンパク質不純物の沈降のために使用されてきた(Brodsky et al., (2012) Biotechnol. Bioeng. 109(10): 2589-2598; Zheng et al., (2015) Biotechnol. Prog. 31(6):1515-1525; Herzer et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428)。
【０００６】
当技術分野では、宿主細胞タンパク質からタンパク質、特に、抗体を精製する改良法を提供する必要がある。
【０００７】
発明の概要
本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５０ｍＭを超えるカプリル酸塩および約０．５Ｍを超えるアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。
【０００８】
別の実施形態では、カプリル酸塩は、カプリル酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、洗浄バッファーは、約７５ｍＭ〜約３００ｍＭのカプリル酸塩を含んでなる。
【０００９】
本発明の別の側面では、洗浄バッファーは、約０．７５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンを含んでなる。
【００１０】
本発明の別の側面では、洗浄バッファーは、約０．５Ｍ〜約１Ｍのリシンをさらに含んでなる。
【００１１】
本発明の一つの実施形態では、溶出された組換えポリペプチドは、約２％未満の断片化された組換えポリペプチドを含有する。
【００１２】
本発明の一つの側面では、ＨＣＰは、哺乳動物細胞に由来し、例えば、ＨＣＰは、ホスホリパーゼＢ様２タンパク質および／またはカテプシンＬである。本発明のさらに別の側面では、カテプシンＬからの組換えポリペプチドの精製は、工程（ｃ）の溶出液中の低下したカテプシンＬ活性によって評価される。
【００１３】
一つの実施形態では、洗浄バッファーのｐＨは、ｐＨ７〜ｐＨ９；またはｐＨ７．５〜ｐＨ８．５である。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、組換えポリペプチドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えば、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ４である。
【００１５】
さらに別の実施形態では、洗浄バッファーは、塩化ナトリウムを含有しない。
【００１６】
本発明の一つの側面では、スーパー抗原は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、およびタンパク質Ｌからなる群から選択される。
【００１７】
本発明の別の側面では、工程（ｃ）後、ＨＣＰの量は、約２００ｎｇ  ＨＣＰ／ｍｇ生成物未満である。
【００１８】
本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ１）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５０ｍＭを超えるカプリル酸塩を含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；（ｂ２）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約０．５Ｍを超えるアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ１）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約０．５Ｍを超えるアルギニンアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；（ｂ２）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５０ｍＭを超えるカプリル酸塩を含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、ホスホリパーゼＢ様２タンパク質から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１００ｍＭのカプリル酸塩および約１．１Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本発明は、カテプシンＬから組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１５０ｍＭのカプリル酸塩および約１．１Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。
【００２２】
一つの側面において、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、カプリル酸塩が約２５０ｍＭを超える濃度で含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。
【００２３】
別の側面では、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１５０ｍＭ〜約８５０ｍＭのカプリル酸塩を含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。
【００２４】
さらに別の側面では、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１００ｍＭ〜約８５０ｍＭのカプリル酸塩および約０．２５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】モデルとしてｍＡｂ１を用い、洗浄液中のカプリル酸ナトリウムの濃度を変えた場合のタンパク質Ａ溶出液中の収率パーセント（三角、▲）およびＨＣＰ濃度（四角、黒四角）。
【図２】洗浄バッファー中、５濃度のカプリル酸ナトリウムに関する、溶出画分、ストリップ画分、および洗浄画分中の、ロードしたｍＡｂ１のパーセント。
【図３】カプリル酸ナトリウム濃度が異なる溶液におけるＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂へのｍＡｂ１吸着に関するラングミュア等温式への当てはめ。
【図４】１００ｍＭおよび２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄バッファーを用いた場合の５種類のｍＡｂに関するタンパク質Ａ溶出液のＨＣＰ濃度。
【図５】種々のｐＨで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、ｍＡｂ２に関するタンパク質Ａ溶出液のＨＣＰ濃度。注：総ての洗浄バッファーが３００ｍＭの酢酸ナトリウムを含有する。
【図６】種々のｐＨで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、２つの異なるｍＡｂ１供給流に関するタンパク質Ａ溶出液のＨＣＰ濃度。注）総ての洗浄バッファーが３００ｍＭの酢酸ナトリウムを含有する。
【図７】種々のｐＨで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、ｍＡｂ５供給流に関するタンパク質Ａ溶出液のＰＬＢＬ２濃度。
【図８】種々のｐＨで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、ｍＡｂ５供給流に関するタンパク質Ａ溶出液のＨＣＰ濃度。
【図９】種々のｐＨで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、ｍＡｂ５供給流に関するタンパク質Ａ工程収率。
【図１０】カプリル酸ナトリウムおよびアルギニンまたはリシンを含有する洗浄液に関する、ｍＡｂ３タンパク質Ａ溶出液中のカテプシンＬ活性。
【図１１】モノクローナル抗体工程中間体に関する抗体断片化パーセント。
【図１２】カプリル酸塩単独洗浄バッファーとカプリル酸塩およびアルギニン洗浄バッファーを用いた場合のＨＣＰ濃度。
【図１３】最大１０日間、２５Ｃで保持したモノクローナル抗体原薬に関する抗体断片化パーセント。
【００２６】
詳細な説明
本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物系に限定されず、当然のことながら変更可能であることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される技術用語は特定の実施形態を記載することを目的とするに過ぎず、限定を意図しないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「1つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ポリペプチド」という場合には、２以上のポリペプチドの組合せを含むなどである。
【００２７】
用語「含んでなる(comprising)」は、「含む(including)」または「からなる(consisting)」を包含し、例えば、Ｘを「含んでなる」組成物は、排他的にＸからなる場合もあり、または何らかの付加、例えば、Ｘ＋Ｙを含む場合もある。用語「から本質的になる(consisting essentially of」は、特徴の範囲を、指定の材料または工程および特許請求される特徴の基本的特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。用語「からなる」は、いずれの付加的成分の存在も排除する。
【００２８】
「約」は、本発明で使用する場合、量および持続期間などの測定可能な値に関して、指定の値からの±５％、±１％、および±０．１％を含む、±２０％または±１０％の変動を包含することを意味し、従って、変動は、開示される方法を実施するために適当である。
【００２９】
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価のいずれの方法および材料も、本発明の試験のための実施に使用可能であるが、本明細書には好ましい材料および方法が記載される。本発明を記載および特許請求するにあたって、以下の技術用語を使用する。
【００３０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指して互換的に使用される。ポリペプチドは、天然起源の（組織由来の）、原核細胞もしくは真核細胞調製物由来の組換え発現もしくは天然発現、または合成法により化学的に生産されるものであり得る。これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。非天然残基は、科学文献および特許文献において十分に記載され、天然アミノ酸残基の模倣物として有用な少数の例示的非天然成分および指針を以下に記載する。芳香族アミノ酸の模倣物は、例えば、Ｄ−またはＬ−ナフィルアラニン(naphylalanine)；Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２チエネイルアラニン(thieneylalanine)；Ｄ−またはＬ−１、−２，３−または４−ピレネイルアラニン(pyreneylalanine)；Ｄ−またはＬ−３チエネイルアラニン(thieneylalanine)；Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン：Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン：Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−またはＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−２インドール（アルキル）アラニン；およびＤ−またはＬ−アルキルアイニン(alkylalanine)によって置換することによって作製することができ、ここで、アルキルは置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−イソチル(isotyl)、イソペンチル、または非酸性アミノ酸であり得る。非天然アミノ酸の芳香環として、例えば、チアゾイル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環が含まれる。
【００３１】
「ペプチド」は、本明細書で使用する場合、本発明において具体的に例示されるペプチドの保存的変異であるペプチドを含む。「保存的変異」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による置換を表す。保存的変異の例としては、限定されるものではないが、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、またはメチオニンなどのある疎水性残基の別の疎水性残基での置換、またはある極性残基の別の極性残基での置換、例えば、アルギニンのリシンでの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸での置換、もしくはグルタミンのアスパラギンでの置換などが含まれる。互いに置換可能である中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニンが含まれる。
【００３２】
「保存的変異」はまた、その置換ポリペプチドに対して産生された抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応を起こす限り、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を用いることも含む。そのような保存的置換は、本明細書に記載のペプチドのクラスの定義の範囲内である。
【００３３】
「カチオン性」とは、本明細書で使用する場合、ｐＨ７．４で正味の正電荷を有するいずれのペプチドも指す。ペプチドの生物活性は、当業者に公知であり、本明細書に記載される標準的な方法によって決定することができる。
【００３４】
「組換え」とは、タンパク質に関して使用する場合、そのタンパク質が異種核酸もしくはタンパク質の導入によって、または天然核酸もしくはタンパク質の変更によって修飾されていることを示す。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「治療タンパク質」は、哺乳動物に投与されて、例えば研究者または医師が求めている組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を惹起することができるいずれのタンパク質および／またはポリペプチドも指す。治療タンパク質は、２つ以上の生物学的または医学的応答を惹起する場合がある。さらに、用語「治療上有効な量」は、そのような量を受容していない対応する対象と比較して、限定されるものではないが、疾患、障害、もしくは副作用の治癒、予防、もしくは寛解、または疾患もしくは障害の進行速度の低下をもたらす、いずれの量も意味する。この用語はまた、正常な生理学的機能の向上に有効な量、ならびに第２の医薬剤の治療効果を向上または補助する患者の生理学的機能を引き起こすのに有効な量もその範囲内に含む。
【００３６】
本明細書において特定される総ての「アミノ酸」残基は、天然のＬ配置である。標準的なポリペプチド命名法に従い、アミノ酸残基に対する省略形を下表に示す。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
総てのアミノ酸残基配列は、本明細書において、その左から右への配向が慣例的なアミノ末端からカルボキシ末端への方向である定則によって表されることに留意されたい。
【００３９】
精製方法
一つの側面において、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、カプリル酸塩およびアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を対象とする。
【００４０】
一つの側面において、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５０ｍＭを超えるカプリル酸塩および約０．５Ｍを超えるアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を対象とする。
【００４１】
一つの側面において、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、カプリル酸塩を２５０ｍＭを超える濃度で含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を対象とする。
【００４２】
一つの側面において、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１５０ｍＭ〜約８５０ｍＭのカプリル酸塩を含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を対象とする。
【００４３】
別の側面では、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ１）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、カプリル酸塩を含んでなる第１の洗浄バッファーで洗浄すること；（ｂ２）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、アルギニンを含んでなる第２の洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を対象とする。
【００４４】
別の側面では、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること；（ｂ１）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、アルギニンを含んでなる第１の洗浄バッファーで洗浄すること；（ｂ２）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、カプリル酸塩を含んでなる第２の洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を対象とする。
【００４５】
工程（ａ）で、溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用（またはロード）した後、組換えポリペプチドは、固相支持体上に固定化されているスーパー抗原に吸着される。次に、吸着された組換えポリペプチドを含有する固定化スーパー抗原を、本明細書に記載されるような洗浄バッファーと接触させることによってＨＣＰ不純物が除去され得る。
【００４６】
「スーパー抗原」は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと、これらのタンパク質の標的リガンド結合部位とは異なる部位で相互作用する一般リガンドを指す。ブドウ球菌内毒素は、Ｔ細胞受容体と相互作用するスーパー抗原の例である。抗体と結合するスーパー抗原としては、限定されるものではないが、ＩｇＧ定常領域と結合するタンパク質Ｇ(Bjorck and Kronvall (1984) J. Immunol., 133:969)；ＩｇＧ定常領域およびＶＨドメインと結合するタンパク質Ａ(Forsgren and Sjoquist, (1966) J. Immunol., 97:822)；およびＶＬドメインと結合するタンパク質Ｌ(Bjorck, (1988) J. Immunol., 140:1194)が含まれる。従って、一つの実施形態では、スーパー抗原は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、およびタンパク質Ｌからなる群から選択される。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質Ａ」は、その天然源（例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の細胞壁）から回収されたタンパク質Ａ、合成的に（例えば、ペプチド合成によってまたは組換え技術によって）生産されたタンパク質Ａ、およびＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質と結合する能力を保持するその変異体を包含する。タンパク質Ａは、例えば、ＲｅｐｌｉｇｅｎまたはＰｈａｒｍａｃｉａから商業的に購入することができる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「アフィニティークロマトグラフィー」は、クロマトグラフィー分離を達成するために、等電点、疎水性、またはサイズなどの生体分子の一般特性ではなく、生体分子間の特定の可逆的相互作用を利用するクロマトグラフィー法である。「タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー」または「タンパク質Ａクロマトグラフィー」は、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に対するタンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインの親和性を利用する特定のアフィニティークロマトグラフィー法を指す。このＦｃ部分は、ヒトもしくは動物免疫グロブリン定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３またはこれらと実質的に類似する免疫グロブリンドメインを含んでなる。実際には、タンパク質Ａクロマトグラフィーは、固相支持体に固定化されたタンパク質Ａを使用することを含む。Gagnon, Protein A Affinity Chromatography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, Validated Biosystems, (1996)参照。タンパク質Ｇおよびタンパク質Ｌもまた、アフィニティークロマトグラフィーに使用可能である。固相支持体は、タンパク質Ａが接着する非水性マトリックス（例えば、カラム、樹脂、マトリックス、ビーズ、ゲルなど）である。このような支持体としては、アガロース、セファロース、ガラス、シリカ、ポリスチレン、コロジオンチャコール、砂、ポリメタクリレート、架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、およびアガロースとデキストランとのサーフェスエクステンダーおよび任意の他の好適な材料が含まれる。このような材料は当技術分野で周知である。任意の好適な方法を、スーパー抗原を固相支持体に固定するために使用することができる。タンパク質を好適な固相支持体に固定するための方法は当技術分野で周知である。例えば、Ostrove, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, (1990) 182: 357-371参照。固定化されたタンパク質Ａまたはタンパク質Ｌを有する、および有さないこのような固相支持体は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーリンゲーム、カリフォルニア州）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ、カリフォルニア州）、ＢｉｏＲａｄ（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの部門、ウプサラ、スウェーデン）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ビルリカ、マサチューセッツ州）などの多くの商業的供給者から容易に入手可能である。
【００４９】
本明細書に記載の方法は、１以上のさらなるクロマトグラフィー工程などの１以上のさらなる精製工程を含んでなり得る。一つの実施形態では、１以上のさらなるクロマトグラフィー工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィー、特に、陰イオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される。
【００５０】
一つの実施形態では、この方法は、本明細書に記載の方法の工程（ｃ）によって生産された溶出液を濾過することをさらに含んでなる。
【００５１】
一つの実施形態では、この方法は、工程（ｃ）の後に下記の工程をさらに含んでなる：（ｄ）回収されたタンパク質を含有する溶液を３０ｍＭの酢酸、１００ｍＭのＨＣｌで約ｐＨ３．５に滴定すること；（ｅ）工程（ｄ）の溶液を約３０〜約６０分間、約ｐＨ３．５に留めること；および（ｆ）工程（ｅ）の溶液のｐＨを１Ｍのトリスで約ｐＨ７．５に調整すること。一つの実施形態では、この方法は、工程（ｆ）によって生産された溶液を濾過することをさらに含んでなる。
【００５２】
一つの実施形態では、工程（ａ）でカラムに適用される組換えタンパク質の量（すなわち、ロード比）は、３５ｍｇ／ｍｌ以下、例えば、３０ｍｇ／ｍｌ以下、２０ｍｇ／ｍｌ以下、１５ｍｇ／ｍｌ以下または１０ｍｇ／ｍｌ以下である。「ロード比」は、樹脂ミリリットル（ｍｌ）当たりのタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）のミリグラム（ｍｇ）を指すことが理解されるであろう。
【００５３】
洗浄バッファー
「バッファー」は、その酸−塩基共役成分の作用によってｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液である。「平衡バッファー」は、クロマトグラフィー用の固相を調製するために使用される溶液を指す。「ローディングバッファー」は、固相（すなわち、クロマトグラフィーマトリックス）上にタンパク質と不純物の混合物をロードするために使用される溶液を指す。平衡バッファーとローディングバッファーは同じであり得る。「洗浄バッファー」は、ローディングが完了した後に固相から不純物を除去するために使用される溶液を指す。「溶出バッファー」は、クロマトグラフィーマトリックスから目的タンパク質を取り出すために使用される。
【００５４】
「塩」は、酸および塩基の相互作用によって形成される化合物である。
【００５５】
本発明の一つの側面では、洗浄バッファーは、脂肪族カルボン酸塩を含んでなる。脂肪族カルボン酸塩は、直鎖または分岐型であり得る。特定の実施形態では、脂肪族カルボン塩は、脂肪族カルボン酸もしくはその塩であり、または脂肪族カルボン酸塩の供給源は、脂肪族カルボン酸またはその塩である。特定の実施形態では、脂肪族カルボン酸塩は直鎖であり、メタン酸（ギ酸）、エタン酸（酢酸）、プロパン酸（プロピオン酸）、ブタン酸（酪酸）、ペンタン酸（吉草酸）、ヘキサン酸（カプロン酸）、ヘプタン酸（エナント酸）、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン酸（ペラルゴン酸）、デカン酸（カプリン酸）、ウンデカン酸（ウンデシル酸）、ドデカン酸（ラウリン酸）、トリデカン酸（トリデシル酸）、テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸（マルガリン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、およびイコサン酸（アラキドン酸）またはそれらの任意の塩からなる群から選択される。よって、脂肪族カルボン酸塩は、１〜２０炭素の長さの炭素主鎖を含んでなり得る。一つの実施形態では、脂肪族カルボン酸塩は、６〜１２炭素主鎖を含んでなる。一つの実施形態では、脂肪族カルボン酸塩は、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、カプリル酸塩、デカン酸塩、およびドデカン酸塩からなる群から選択される。さらなる実施形態では、脂肪族カルボン酸塩はカプリル酸塩である。
【００５６】
一つの実施形態では、脂肪族カルボン酸塩の供給源は、脂肪族カルボン酸、脂肪族カルボン酸のナトリウム塩、脂肪族カルボン酸のカリウム塩、および脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩からなる群から選択される。一つの実施形態では、脂肪族カルボン酸塩の供給源は、脂肪族カルボン酸のナトリウム塩である。さらなる実施形態では、洗浄バッファーは、カプリル酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、またはドデカン酸ナトリウム、特に、カプリル酸ナトリウムを含んでなる。
【００５７】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約５０ｍＭを超えるカプリル酸塩を含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約２００ｍＭを超えるカプリル酸塩を含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約２５０ｍＭを超えるカプリル酸塩を含んでなる。さらなる実施形態では、洗浄バッファーは、少なくとも約５０ｍＭのカプリル酸塩、例えば、少なくとも約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭまたは約３００ｍＭのカプリル酸塩を含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約８５０ｍＭ未満のカプリル酸塩、例えば、約８００ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７００ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３００ｍＭ未満のカプリル酸塩を含んでなる。別の実施形態では、洗浄バッファーは、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、または約２５０ｍＭのカプリル酸塩を含んでなる。
【００５８】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約５０ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウムを含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約２００ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウムを含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約２５０ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウムを含んでなる。さらなる実施形態では、洗浄バッファーは、少なくとも約５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム、例えば、少なくとも約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭまたは約３００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約８５０ｍＭ未満のカプリル酸ナトリウム、例えば、約８００ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７００ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３００ｍＭ未満のカプリル酸ナトリウムを含んでなる。別の実施形態では、洗浄バッファーは、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、または約２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含んでなる。
【００５９】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約５０ｍＭ〜約７５０ｍＭのカプリル酸塩；約５０ｍＭ〜約５００ｍＭのカプリル酸塩；約７５ｍＭ〜約４００ｍＭのカプリル酸塩；約７５ｍＭ〜約３５０ｍＭのカプリル酸塩；約７５ｍＭ〜約３００ｍＭのカプリル酸塩；約７５ｍＭ〜約２００ｍＭのカプリル酸塩；約２５０ｍＭ〜約７５０ｍＭを超えるカプリル酸塩；約２５０ｍＭ〜約５００ｍＭを超えるカプリル酸塩；約２５０ｍＭ〜約４００ｍＭを超えるカプリル酸塩；約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭを超えるカプリル酸塩；または約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭを超えるカプリル酸塩を含んでなる。
【００６０】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約５０ｍＭ〜約７５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約５０ｍＭ〜約５００ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約７５ｍＭ〜約４００ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約７５ｍＭ〜約３５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約７５ｍＭ〜約３００ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約７５ｍＭ〜約２００ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約２５０ｍＭ〜約７５０ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウム；約２５０ｍＭ〜約５００ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウム；約２５０ｍＭ〜約４００ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウム；約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウム；または約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウムを含んでなる。
【００６１】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、有機酸、有機酸の共役塩基のアルカリ金属またはアンモニウム塩、および有機塩基を含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、ＮａＣｌを添加せずに作製される。
【００６２】
一つの実施形態では、有機酸の共役塩基は、有機酸の共役塩基のナトリウム、カリウム、またはアンモニウム塩である。一つの実施形態では、有機酸は酢酸であり、酢酸の共役塩基は、ナトリウム塩（すなわち、酢酸ナトリウム）である。
【００６３】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの酢酸をさらに含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約４５ｍＭの酢酸を含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約１ｍＭ〜約５００ｍＭのトリス塩基をさらに含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約５５ｍＭのトリス塩基を含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの酢酸ナトリウムをさらに含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約３００ｍＭの酢酸ナトリウムを含んでなる。
【００６４】
一つの実施形態では、洗浄バッファーのｐＨは、約ｐＨ７〜約ｐＨ９、例えば、約ｐＨ７．５〜約ｐＨ８．５である。
【００６５】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約０．２５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンを含んでなる。さらなる実施形態では、洗浄バッファーは、約０．２５Ｍ〜約２Ｍのアルギニンを含んでなる。さらなる実施形態では、洗浄バッファーは、約０．５Ｍ〜約２Ｍのアルギニンを含んでなる。さらに別の実施形態では、洗浄バッファーは、約０．７５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンを含んでなる。さらなる実施形態では、洗浄バッファーは、約１Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、または約２Ｍのアルギニンを含んでなる。一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約０．５Ｍ〜約２Ｍのアルギニン、特に、約０．７５Ｍ〜約２Ｍのアルギニンを含んでなる。さらなる実施形態では、洗浄バッファーは、約１Ｍを超えるアルギニンを含んでなる。
【００６６】
「アルギニン」という場合には天然アミノ酸を指すだけでなく、アルギニン誘導体またはそれらの塩、例えば、アルギニンＨＣｌ、アセチルアルギニン、アグマチン、アルギニン酸、Ｎ−α−ブチロイル−Ｌ−アルギニン、またはＮ−α−ピバロイルアルギニンも包含すると理解される。
【００６７】
あるいは、アルギニンは、最初の洗浄バッファーに含める（すなわち、同時に使用する）こともできる。よって、一つの側面において、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＨＣＰを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１００ｍＭ〜約８５０ｍＭのカプリル酸塩および約０．２５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法を提供する。本明細書に記載の実施例に示されるように、カプリル酸塩とアルギニンの組合せを含んでなるスーパー抗原クロマトグラフィー洗浄液は、特に、除去が特に困難な２つの宿主細胞タンパク質であるＰＬＢＬ２およびカテプシンＬの除去に関して、宿主細胞タンパク質クリアランスの改良という予期しない相乗作用を示した。
【００６８】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約１００ｍＭ〜約７５０ｍＭのカプリル酸塩；約１００ｍＭ〜約５００ｍＭのカプリル酸塩；約１００ｍＭ〜約４００ｍＭのカプリル酸塩；約１００ｍＭ〜約３５０ｍＭのカプリル酸塩；もしくは約１００ｍＭ〜約３００ｍＭのカプリル酸塩；および／または約０．２５Ｍ〜約２Ｍのアルギニン、約０．５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニン；もしくは約０．５Ｍ〜約１Ｍのアルギニンを含んでなる。
【００６９】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約１００ｍＭ〜約７５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約１００ｍＭ〜約５００ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約１００ｍＭ〜約４００ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約１００ｍＭ〜約３５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム；もしくは約１００ｍＭ〜約３００ｍＭのカプリル酸ナトリウム；および／または約０．２５Ｍ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニン；もしくは約０．５Ｍ〜約１Ｍのアルギニンを含んでなる。
【００７０】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約０．５Ｍ〜約２Ｍのアルギニンおよび約５０ｍＭ〜約７５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム；約０．５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンおよび約５０ｍＭ〜約５００ｍＭのカプリル酸ナトリウム；または約０．５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンおよび約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含んでなる。
【００７１】
一つの実施形態では、洗浄バッファーは、約０．５Ｍ〜約１Ｍのリシン、例えば、約０．７５Ｍのリシンをさらに含んでなる。この実施形態では、リシンは、最初の洗浄バッファーに含まれる（すなわち、同時に使用される）。別の実施形態では、リシンは、別の洗浄バッファーに含まれる（すなわち、別個に使用される）。本明細書に提供される実施例に示されるように、リシンの添加は溶出容量を上手く低減することが示された。
【００７２】
組換えポリペプチド
一つの実施形態では、ポリペプチドは、抗原結合ポリペプチドである。一つの実施形態では、抗原結合ポリペプチドは、抗体、抗体フラグメント、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、ｍＡｂｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉鎖立体配座多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディまたは可溶性受容体からなる群から選択される。さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。組換えポリペプチド、生成分子およびｍＡｂという用語は、本明細書では互換的に使用される。抗体は、例えば、キメラ、ヒト化またはドメイン抗体であり得る。
【００７３】
用語Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２は、それらの標準的な意味で使用される（例えば、Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)参照）。
【００７４】
「キメラ抗体」は、ドナー抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）をアクセプター抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域とともに含有する操作抗体の一種を指す。
【００７５】
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するそのＣＤＲを有し、その分子の残りの免疫グロブリン由来部分は１（または複数の）ヒト免疫グロブリンに由来する操作抗体の一種を指す。加えて、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するために変更されてよい（例えば、Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10032, Hodgson et al., (1991) Bio/Technology, 9:421参照）。好適なヒトアクセプター抗体は、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ．ＲＴＭ．データベース、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースからドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性によって選択されるものであってよい。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸に基づく）によって特徴付けられるヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適であり得る。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を供与することができる好適なアクセプター抗体は、同様にして選択することができる。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体に起源する必要はないことに留意されたい。従来技術は、このようなヒト化抗体を生産するいくつかの方法を記載している−例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１。
【００７６】
用語「ドナー抗体」は、変更された免疫グロブリンコード領域を提供してドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する変更抗体の発現を生じるために、その可変領域、ＣＤＲ、またはその他の機能的フラグメントまたはそれらの類似体のアミノ酸配列を第１の免疫グロブリン相手に供与する抗体（モノクローナル、および／または組換え）を指す。用語「アクセプター抗体」は、その重鎖および／もしくは軽鎖フレームワーク領域、ならびに／またはその重鎖および／もしくは軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の総て（またはいずれかの部分、いくつかの実施形態では、総て）を第１の免疫グロブリン相手に供与する、ドナー抗体とは異種の抗体（モノクローナルおよび／または組換え）を指す。特定の実施形態では、ヒト抗体は、アクセプター抗体である。
【００７７】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)参照。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。よって、「ＣＤＲ」は、本発明で使用する場合、３つ総ての重鎖ＣＤＲ、または３つ総ての軽鎖ＣＤＲ（または適切な場合、総ての重鎖ＣＤＲおよび総ての軽鎖ＣＤＲの両方）を指す。抗体の構造およびタンパク質折り畳みは、その他の残基が抗原結合領域の部分と考えられることを意味する可能性があり、当業者によればそのように理解されるであろう（例えば、Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883）。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「ドメイン」は、そのタンパク質の残りの部分には依存しない三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性を担い，多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの部分の機能の欠失なく、付加、除去または他のタンパク質への移動が可能である。「抗体単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる折り畳まれたポリペプチドドメインである。よって、それは完全な抗体可変ドメイン、および修飾可変ドメイン、例えば、１以上のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって置換された、あるいは末端切断された、またはＮ末端伸長またはＣ末端伸長を含んでなる抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。
【００７９】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という句は、異なるＶ領域またはドメインとは非依存的に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の領域またはドメインが単一の免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない場合（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインが付加的な可変ドメインとは非依存的に抗原に結合する場合）に、他の異なる可変領域または可変ドメインを伴う形式（例えば、ホモ多量体またはヘテロ多量体）で存在することができる。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、この用語が本明細書で使用される場合、抗原に結合し得る「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであり得るが、齧歯類（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示される通り）、テンジクザメおよびラクダ科動物ＶＨＨ  ｄＡｂ（ナノボディー）などの他の種に由来する単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科動物ＶＨＨは、自然状態で軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準的技術に従ってヒト化してもよく、このようなドメインはなお、本発明により「ドメイン抗体」であると見なされる。本明細書で使用する場合、「ＶＨはラクダ科動物ＶＨＨドメインを含む」。ＮＡＲＶは、テンジクザメを含む軟骨魚類で同定されている別の種類の免疫グロブリン単一可変ドメインである。これらのドメインはまた、新規な抗原受容体可変領域（一般にＶ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと略される）としても知られる。さらなる詳細については、Mol. Immunol. (2006) 44, 656-665およびＵＳ２００５／００４３５１９を参照。
【００８０】
用語「ｍＡｂｄＡｂ」および「ｄＡｂｍＡｂ」は、モノクローナル抗体および少なくとも１つのシングルドメイン抗体を含んでなる抗原結合タンパク質を指して本明細書で使用される。これら２つの用語は互換的に使用することができ、本発明で使用する場合、同じ意味を有するものとする。
【００８１】
多くの場合、宿主細胞タンパク質からの組換えポリペプチドの精製は、組換えポリペプチドの断片化をもたらす。出願人は、本明細書に記載の精製方法が使用される場合に、組換えポリペプチドの断片化の量が著しく低減されることを見出した。一つの実施形態では、溶出される組換えポリペプチドは、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％未満の断片化組換えポリペプチドを含有する。別の実施形態では、組換えポリペプチドは抗体であり、溶出される抗体は約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％未満の断片化された抗体を含有する。
【００８２】
宿主細胞タンパク質
「不純物」は、溶出液における、スーパー抗原クロマトグラフィー前またはスーパー抗原クロマトグラフィー後にロードサンプル中に存在するいずれの外来分子または所望でない分子も指す。「工程不純物」が存在し得る。これらは、目的タンパク質が生産される工程の結果として存在する不純物である。例えば、これらには、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＲＮＡ、およびＤＮＡが含まれる。「ＨＣＰ」は、細胞内および／または分泌タンパク質を含め、細胞培養または発酵中に宿主細胞により生産される、目的タンパク質に関連のないタンパク質を指す。宿主細胞タンパク質の一例はプロテアーゼであり、これは精製中および精製後になお存在すれば目的タンパク質に損傷を生じる可能性がある。例えば、目的タンパク質を含んでなるサンプル中にプロテアーゼが残存すれば、元は存在しなかった生成物関連物質または不純物を作り出す可能性がある。プロテアーゼの存在は、精製工程中、および／または最終的な処方物中で経時的に目的タンパク質の減衰、例えば、断片化を生じる可能性がある。
【００８３】
一つの実施形態では、宿主細胞タンパク質は、哺乳動物細胞または細菌細胞から生産される／に由来する。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒトまたは齧歯類（例えば、ハムスターまたはマウス）細胞から選択される。なおさらなる実施形態では、ヒト細胞はＨＥＫ細胞であり、ハムスター細胞はＣＨＯ細胞であり、またはマウス細胞はＮＳ０細胞である。
【００８４】
特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、およびＨＥＫ細胞からなる群から選択される（すなわち、宿主細胞タンパク質はこれらの宿主細胞に由来する）。あるいは、宿主細胞は、大腸菌(E. coli)（例えば、Ｗ３１１０、ＢＬ２１）、枯草菌(B. subtilis)および／またはその他の好適な細菌からなる群から選択される細菌細胞；糸状菌または酵母細胞など真核細胞の（例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、アスペルギルス(Aspergillus)種、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)、アカパンカビ(Neurospora crassa）であり得る。
【００８５】
「溶液」は、細胞培養培地、例えば、細胞培養供給液であり得る。供給液は、濾過されてよい。溶液は、清澄化非処理ブロス(Clarified Unprocessed Broth)（ＣＵＢ）（または清澄化発酵ブロス／上清）であり得る。ＣＵＢはまた、細胞および／または細胞残渣が清澄化により除去されている細胞培養上清としても知られる。溶液は、タンパク質を発現する細胞の溶解調製物であってもよい（例えば、溶液は細胞溶解液である）。
【００８６】
工程不純物にはまた、細胞を増殖させるためまたは目的タンパク質の発現を保証するために使用される成分、例えば、溶媒（例えば、酵母細胞を培養するために使用されるメタノール）、抗生物質、メトトレキサート（ＭＴＸ）、培地成分、凝集剤などが含まれる。また、前工程中にサンプルに浸出するスーパー抗原固相の一部である分子、例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、またはタンパク質Ｌも含まれる。
【００８７】
不純物にはまた、活性は保持するが構造が異なるタンパク質、および構造が異なるために失活したタンパク質を含む「生成物関連変異体」も含まれる。これらの生成物関連変異体には、例えば、高分子量種（ＨＭＷ）、低分子量種（ＬＭＷ）、凝集タンパク質、前駆体、分解タンパク質、折り畳みが不適切なタンパク質、低ジスルフィド結合タンパク質、断片、および脱アミド化種が含まれる。
【００８８】
洗浄工程が成功したかどうかを確認するために、溶出液におけるこれらの不純物のいずれかの１つの存在を測定することができる。例えば、本発明者らは、生成物ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇとして表されるＨＣＰレベルの減少を示した（実施例参照）。あるいは、検出されたＨＣＰは、「１００万分の１(parts per million)」または「ｐｐｍ」として表すこともでき、これはｎｇ／ｍｇに等しく、または「ｐｐｂ」「１０億分の１(parts per billion)」として表すこともでき、これはｐｇ／ｍｇに等しい。
【００８９】
一つの実施形態では、工程（ｃ）の後に、ＨＣＰの量は、約２００ｎｇ  ＨＣＰ／生成物ｍｇ（すなわち、ｎｇ／ｍｇ）未満；約１５０ｎｇ／ｍｇ未満；約１００ｎｇ／ｍｇ未満；約５０ｎｇ／ｍｇ未満；または約２０ｎｇ／ｍｇ未満である。
【００９０】
減少は、脂肪族カルボン酸塩を用いない対照洗浄工程と比較した場合、および／または精製前の溶液（例えば、清澄化未処理ブロス）と比較した場合に示され得る。
【００９１】
一つの実施形態では、工程（ｃ）の後の、従前に公開されている１００ｍＭのカプリル酸塩洗浄（例えば、ＷＯ２０１４／１４１１５０参照）と比較したＨＣＰの相対減少倍率は、約２倍〜約５０倍である。よって、一つの実施形態では、工程（ｃ）の後の、１００ｍＭのカプリル酸塩から本質的になる洗浄バッファーと比較したＨＣＰの相対減少倍率は、約２倍〜約５０倍である。さらなる実施形態では、相対減少倍率は、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍または５０倍である。疑念を避けるため、「１００ｍＭのカプリル酸塩から本質的になる洗浄バッファー」という場合には、１００ｍＭのカプリル酸塩洗浄液の基本的特徴に実質的に影響を及ぼさない付加的成分、例えば、緩衝塩および／または酢酸ナトリウムの存在を排除しない。
【００９２】
一つの実施形態では、本発明の洗浄工程後における、溶出液からの目的タンパク質の回収率は、１００％〜５０％の範囲内のいずれの不連続の値も、またはこの範囲内の不連続の値のいずれの対によって定義されるいずれの部分範囲も含め、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７０％、６０％、５０％以下である。一つの実施形態では、溶出液からの目的タンパク質の回収率は、７０％を超える、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％  ９５％または９９％を超える。溶出液における回収率パーセント（％）は、溶出液中の目的タンパク質の量を、下式：
回収率パーセンテージ＝溶出液中の生成物の量÷カラムに適用された生成物の量×１００
に従い、カラムに適用された目的タンパク質の量のパーセンテージとして求めることによって計算される。
溶出液中に存在する不純物（すなわち、宿主細胞タンパク質）の量は、ＥＬＩＳＡ、ＯＣＴＥＴ、または上記の不純物のうち１以上のレベルを決定するための他の方法によって決定することができる。本明細書に記載の実施例では、ＥＬＩＳＡ法がサンプル中のＨＣＰのレベルを決定するために使用される。
【００９３】
一つの実施形態では、宿主細胞タンパク質は、ＰＬＢＬ２（ホスホリパーゼＢ様２タンパク質）および／またはカテプシンＬから選択される。
【００９４】
一つの実施形態では、宿主細胞タンパク質はＰＬＢＬ２である。よって、本発明の一つの側面では、ホスホリパーゼＢ様２タンパク質（ＰＬＢＬ２）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＰＬＢＬ２を含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１５０ｍＭ〜約８５０ｍＭのカプリル酸塩を含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法が提供される。
【００９５】
本発明の別の側面では、ホスホリパーゼＢ様２タンパク質（ＰＬＢＬ２）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＰＬＢＬ２を含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５５ｍＭ〜約８５０ｍＭのカプリル酸塩および約０．２５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法が提供される。
【００９６】
本発明の別の側面では、ホスホリパーゼＢ様２タンパク質（ＰＬＢＬ２）から組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびＰＬＢＬ２を含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１００ｍＭのカプリル酸塩および約１．１Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法が提供される。
【００９７】
ＰＬＢＬ２は、抗体、特に、ｍＡｂ５（実施例参照）の下流処理中に、生成物分子への明らかな結合のために除去することが困難なＨＣＰ不純物であることが見出されている。よって、一つの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＩｇＧ抗体、特に、ＩｇＧ４抗体などの抗体である。ＰＬＢＬ２量は、ＥＬＩＳＡ、例えば、本実施例に記載されている、またはＷＯ２０１５／０３８８８４に開示されているＰＬＢＬ２特異的ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で公知の方法を用いて測定することができる。
【００９８】
カテプシンＬプロテアーゼはＣＨＯ細胞培養中に生産され、それはｍＡｂ３生成物分子などの抗体を潜在的に分解し得る（実施例参照）。よって、一つの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＩｇＧ抗体、特に、ＩｇＧ１抗体などの抗体である。
【００９９】
一つの実施形態では、宿主細胞タンパク質はカテプシンＬである。この実施形態では、カテプシンＬからの組換えポリペプチドの精製は、工程（ｃ）の溶出液中のカテプシンＬ活性の減少によって測定することができる（例えば、ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ  ＰＫ−ＣＡ５７７−Ｋ１４２を用いる）。
【０１００】
本発明の一つの側面では、カテプシンＬから組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびカテプシンＬを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１５０ｍＭ〜約８５０ｍＭのカプリル酸塩を含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法が提供される。
【０１０１】
本発明の別の側面では、カテプシンＬから組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびカテプシンＬを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約５５ｍＭ〜約８５０ｍＭのカプリル酸塩および約０．２５Ｍ〜約１．５Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法が提供される。
【０１０２】
本発明の別の側面では、カテプシンＬから組換えポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）前記組換えポリペプチドおよびカテプシンＬを含んでなる溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体に適用すること、（ｂ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体を、約１５０ｍＭのカプリル酸塩および約１．１Ｍのアルギニンを含んでなる洗浄バッファーで洗浄すること；ならびに（ｃ）前記スーパー抗原クロマトグラフィー固相支持体から前記組換えポリペプチドを溶出することを含んでなる方法が提供される。
【０１０３】
本発明の一つの側面では、本明細書で定義される、精製方法のいずれか一つによって得られる精製された組換えポリペプチドが提供される。
【０１０４】
以下、本発明を以下の限定されない例を参照して説明する。
【０１０５】
ポリソルベート分解
ポリソルベート２０およびポリソルベート８０などのポリソルベートは、最終的な処方生成物中でタンパク質医薬品を安定化させるために広く使用されている非イオン性界面活性剤である。ポリソルベートは、医薬品中の残留酵素によって分解される可能性があり、これはその製品の最終的な有効期間に影響を及ぼし得る。理論に縛られるものではないが、本明細書に記載の方法は、最終生成物中の残留宿主細胞タンパク質の量を低減することによって分解されるポリソルベートを低減する。一つの実施形態では、分解されるポリソルベートの量は、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％未満である。
【実施例】
【０１０６】
例１：タンパク質Ａ洗浄液中におけるｐＨおよびカプリル酸ナトリウム濃度のスクリーニングおよび最適化
緒論
本明細書に記載の研究において、総てのｍＡｂ生成物に関して２カラム工程（タンパク質Ａの後に陰イオン交換）を用いて十分なＨＣＰ除去を達成するためにタンパク質Ａ洗浄液が最適化された。既存のプラットフォームプロセスは、多くの場合、必要とされるＨＣＰレベルを達成するために第２のポリッシング工程を必要とする。クロマトグラフィー工程を無くすことで工程が簡単になり、より迅速なプロセス開発が可能となり、設備適合リスクが軽減できる。洗浄最適化の戦略は、ＨＣＰ−ｍＡｂ相互作用を崩壊させることによってＨＣＰクリアランスを改善することであった。種々の洗浄添加剤および洗浄ｐＨをスクリーニングした後、タンパク質Ａ工程の総ＨＣＰ除去率に関して最適化を行った。
【０１０７】
材料および方法
ｎ−オクタン酸ナトリウム、氷酢酸、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ベンジルアルコールおよびトリス塩基(trizma base)は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（セントルイス，ＭＯ）から購入した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）システムを用いてさらに精製した水を用いて溶液を作製した。いずれのｐＨ調整も３Ｍトリス塩基または３Ｍ酢酸のいずれかを用いて行った。
【０１０８】
ｍＡｂ生産のためのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養
清澄化非濾過培養液(Clarified unfiltered broth)（ＣＵＢ）は、ｍＡｂ１（ＩｇＧ１、ｐＩ＝８．７、ＭＷ＝１４９ｋＤａ）、ｍＡｂ２（ＩｇＧ１、ｐＩ＝８．３、ＭＷ＝１４９ｋＤａ）、ｍＡｂ３（ＩｇＧ１、ｐＩ＝７．９、ＭＷ＝１４９ｋＤａ）、ｍＡｂ４（ＩｇＧ１、ｐＩ＝８．６、ＭＷ＝１４８ｋＤａ）、またはｍＡｂ５（ＩｇＧ４、ｐＩ＝７．１、ＭＷ＝１４５ｋＤａ）などのいくつかのＧＳＫ  ｍＡｂ生成物のうち１つを含んでいた。本試験で使用される総てのｍＡｂを生産および採取するために同様の方法を用いた。例えば、ｍＡｂ１は、２リットルの反応槽に生細胞数１．２３〜１．２４ｍＭ／ｍＬおよび生存率約９３．８％の、ｍＡｂ１発現ＤＧ４４細胞を播種することによって作製した。次に、培養物を約３４℃、ｐＨ約６．９、および６ｇ／Ｌのグルコースで１６日間維持した。振盪速度は約３００ｒｐｍで維持した。培養後、非清澄化細胞およびｍＡｂを含有する培養液に１０，０００ｇで２０分間バッチ遠心分離を行った。その後、Ｎａｌｇｅｎｅからの０．４５μＭおよび０．２μＭ  ＳＦＣＡフィルターで培養液を真空濾過した。
【０１０９】
タンパク質Ａ精製
ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）（ＭＳＳ）タンパク質Ａ樹脂を０．５ｃｍ径のカラムに最終ベッド高２５ｃｍまで充填した。樹脂は、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ  ２５を用いて２時間、４７５ｃｍ／時の線形流量で０．４ＭのＮａＣｌ中、重力沈降後に流動充填した。充填品質は、非対称を確認するための２Ｍ  ＮａＣｌ  １００μＬの注入によって評価したところ、１．０＋／−０．２および少なくとも１０００プレート／メートルであった。総てのタンパク質Ａ試験で、３５ｍｇ  ｍＡｂ／ｍＬ樹脂のロード比を用い、総てのプロセス流量は３００ｃｍ／時の線形速度に相当した。タンパク質Ａクロマトグラフィー法およびバッファーを表２に記載する。
【０１１０】
【表２】
2019530744.tif 000003
【０１１１】
洗浄の最適化
従前の研究で、除去が困難な多くのＨＣＰ不純物はｍＡｂと直接会合していることが示された(Levy et al., (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912; Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124)；ＨＣＰ−ｍＡｂ相互作用を崩壊させる溶液条件は、タンパク質Ａ洗浄工程の際に改善されたＨＣＰクリアランスを提供する可能性があり、この研究では、種々の洗浄溶液をスクリーニングし、この目的で最適化した。具体的には、異なる濃度のカプリル酸ナトリウムを種々のｐＨで含有する洗浄溶液を、サンプルロード後、溶出前に、タンパク質Ａに吸着されたｍＡｂからＨＣＰを除去するために使用した。各洗浄液のＨＣＰ除去の有効性を評価および定量するために、以下のＥＬＩＳＡ法の節に記載したように、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡを所内で開発した。カプリル酸ナトリウムをタンパク質Ａ洗浄液中に使用した場合に、ロバストなＨＣＰクリアランスを提供することが従前に見出されている。しかしながら、従前の研究では、１００ｍＭ未満のカプリル酸ナトリウム濃度およびｐＨ７．５に限定され、初期のスコーピング試験の後に濃度およびｐＨの範囲にわたるカプリル酸ナトリウムタンパク質Ａ洗浄液の挙動の特徴評価を行うための曲面中心複合計画試験(spherical central composite design study)が行われた。これらの計画は、以下の表３および４に示される。統計モデリングは以下の統計分析法の節に従って完成させた。
【０１１２】
分析
タンパク質Ａ収率
タンパク質Ａ収率は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて溶出液中のｍＡｂ濃度を測定することによって決定した。３つの溶出液サンプルのＮａｎｏｄｒｏｐの読み取り値の平均を取ってタンパク質濃度を決定し、タンパク質Ａ溶出液中の総ｍＡｂ含量を、ｍＡｂ濃度に溶出液容量（クロマトグラムから決定）を掛けることによって計算した。ロード中のｍＡｂ濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣにてＰＯＲＯＳ（商標）Ａ  ２０μＭカラムを用いて決定した。分析用タンパク質Ａでの各ＣＵＢサンプルの生データを各ｍＡｂについて既知濃度を有する標品と比較して力価を決定した。総ロード容量に測定された力価を掛けてロードされたｍＡｂの総量を計算し、溶出液中の総ｍＡｂをロード中の総ｍＡｂで割ることによって収率を計算した。
【０１１３】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度の測定：ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ
ＣＨＯ由来生成物サンプル中の免疫原性ＨＣＰの総量を定量するために、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡを用いた宿主細胞タンパク質分析法を所内で開発した(Mihara et al., (2015) J. Pharm. Sci. 104: 3991-3996)。このＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、特注のヤギ抗ＣＨＯ  ＨＣＰポリクローナル抗体と、ＣＨＯ由来生成物にわたる多製品用の所内生産したＨＣＰ参照標品を用いて開発した。
【０１１４】
統計分析
ＨＣＰクリアランスおよび収率に関して洗浄性能を分析するために、スコーピング実験および中心複合計画試験を行った。これらの因子は両方とも−１，１単位スケールとし、これらのデータに一般線形モデルを当てはめた。各応答に別のモデルを当てはめた。最終的なモデルが選択されたところで、残差に対するモデル仮定を評価し、適当であれば変換を行った。全モデル項を５％有意水準に対して評価し、総ての二次因子項を含む全モデルで始めて、変数減少法(backwards elimination)を実施した。
【０１１５】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅの平衡等温線測定
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂をＤＩ水にバッファー交換して約５０％スラリーを作製した。このスラリーをＲｅｓｉＱｕｏｔに適用し、家庭用真空ラインで乾燥させ、２０．８μＬの樹脂プラグを９６ディープウェルプレートに分配した。別の９６ウェルプレートで、１００、２５０および５００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含む０〜１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を作製した。各溶液に関してタンパク質濃度を測定した後、各樹脂プラグに１ｍＬを加えた。この樹脂−タンパク質混合物を振盪しながら一晩平衡化した。樹脂を濾過により直接ＵＶ９６ウェルプレート中に取り出し、終濃度を測定した。吸着されたタンパク質濃度ｑは下式を用いて計算した。
【０１１６】
【数１】
2019530744.tif 000004
【０１１７】
結果および考察
本節に示される結果は、高濃度のカプリル酸ナトリウム（＞１００ｍＭ）は、タンパク質Ａクロマトグラフィー中に、従前に公開されているカプリル酸ナトリウムベースのタンパク質Ａ洗浄バッファーよりも有意に多い宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去することを実証する。このことは、モデルとして、比較的高いＨＣＰレベルを有するいくつかのｍＡｂを用いて実証され、統計的実験計画によって確認され、試験したｍＡｂに関するＣＵＢ（タンパク質Ａロード）は、１０６および１０７ｎｇ／ｍｇのＨＣＰ濃度を有した。
【０１１８】
本試験の主要な目的は、タンパク質Ａクロマトグラフィー工程のＨＣＰクリアランスに及ぼす洗浄バッファーのカプリル酸ナトリウム濃度およびｐＨの影響を評価することであった。主要な目的は二要素であった。第一には、カプリル酸ナトリウム濃度およびｐＨの全試験範囲でＨＣＰに及ぼす影響を理解することであった。両パラメーターの全範囲を探究するためにスコーピング計画を用い（表３）、最大カプリル酸ナトリウム濃度は１Ｍであり、ｐＨ範囲は７〜９であった。第二の目的は、許容可能な工程収率を維持しながらＨＣＰクリアランスに関してカプリル酸ナトリウム濃度およびｐＨを最適化することであった。この最適化のために曲面中心複合計画(spherical Central Composite Design)（ＣＣＤ、表４）を用いた。スコーピングおよびＣＣＤの両試験では、モデルｍＡｂとしてｍＡｂ１を使用した。これらの初期試験からの所見をさらなるｍＡｂに関して検討した。スコーピングおよびＣＣＤの両方からの結果を以下に示す。
【０１１９】
【表３】
2019530744.tif 000005
【０１２０】
【表４】
2019530744.tif 000006
【０１２１】
ＣＣＤ試験から得られた結果を表５に示す。全体的に見れば、タンパク質Ａ洗浄バッファーのｐＨがＨＣＰクリアランスに及ぼす影響は最小であった。５００ｍＭまたは７５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液は、試験した全ｐＨ範囲でほぼ同一のＨＣＰレベルを有した。統計分析は方法の節に記載のとおりに行った。簡単に述べれば、各応答（収率およびＨＣＰ）に別のモデルを当てはめ、モデル項を、Ｆ検定を用いて５％有意水準に対して評価した。Ｆ検定により、洗浄ｐＨがＨＣＰ濃度に対して統計的に有意な効果を持たなかったことが確認された。また、同様の統計分析によってｐＨが収率％に関して有意な因子ではないことも確認された。
【０１２２】
【表５】
2019530744.tif 000007
【０１２３】
ＣＣＤ結果の統計分析により、カプリル酸ナトリウム濃度は、ＨＣＰクリアランスおよび収率％の両方に関して、線形項および二次項の両方を有する有意な因子であることが確認された。ＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍｇ）は、カプリル酸ナトリウム濃度が０から１Ｍに殖えると２桁減少した（図１−収率％（三角、▲）およびＨＣＰ濃度（四角、黒四角））。しかしながら、カプリル酸ナトリウム濃度が２５０ｍＭを超えると、収率は９０％超から７０％に低下する（図１）。カプリル酸ナトリウムの濃度が２５０ｍＭを超える場合のこの工程収率の大きな低下は、カプリル酸塩ミセルの形成による可能性がある。タンパク質Ａ洗浄バッファーにおけるカプリル酸塩の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、実験的に３４０ｍＭであると決定された。カプリル酸ナトリウムの濃度が２５０ｍＭから５００ｍＭに引き上げられた場合、収率には１５％の低下が見られ、ＨＣＰには２．８％の低減が見られるにすぎなかった。このことは、遊離型のカプリル酸ナトリウムがＨＣＰ除去のために活性な形態であるが、ＣＭＣを超える濃度は、カプリル酸塩ミセルが収率低下をもたらすために減収を示すことを示し得る。
【０１２４】
例２：収率低下および可能性のある軽減戦略の検討
ＣＭＣを超える場合の収率％の低下は、遊離型のカプリル酸塩ではなくカプリル酸塩ミセルがタンパク質Ａ工程の収率を低下し得ることを示唆する。この収率低下の性質を決定するために、種々のカプリル酸ナトリウム洗浄液を用い、タンパク質Ａプロセスの溶出液、ストリップ、および洗浄画分においてｍＡｂ濃度を測定した（図２）。この結果は、高いカプリル酸ナトリウム濃度での収率低下が洗浄工程中の脱着によるものであったことを実証する。
【０１２５】
高カプリル酸ナトリウム洗浄中の収率低下をさらに特徴付けるために、高カプリル酸ナトリウム濃度でのｍＡｂ能の低下を調べる目的で平衡結合等温線を測定した（図３）。従前に公開されている、１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含有するカプリル酸塩洗浄液は、ラングミュア等温式に当てはめた場合、最大結合能５７ｇ／Ｌを有した。２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムでは、吸着等温式は同様であったが、５００ｍＭのカプリル酸ナトリウムでは、ラングミュア等温式の適合は不十分であった。この結果により、高濃度のカプリル酸ナトリウム洗浄液はタンパク質Ａ樹脂の結合能を低下させ、収率低下を招くことが確認された。
【０１２６】
収率低下の原因を決定した後、収率低下を軽減する方法を検討した。検討した２つの戦略は、洗浄容量の引き下げとロード比の引き下げであった。２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄液を４、６、および８ＣＶで試験した。洗浄長を８ＣＶから４ＣＶに短縮すると、わずか２％の収率増大を示し（表６）、ＨＣＰ濃度は３１．０ｎｇ／ｍｇから３５．８ｎｇ／ｍｇに増加するにすぎなかった。このことは、高カプリル酸ナトリウム洗浄液が初期のスコーピング試験およびＣＣＤ試験で試験されたものよりも少容量で許容可能なＨＣＰレベルを達成できることを示し、また、洗浄容量を少なくしても高カプリル酸ナトリウム濃度による結合の低下を補償しないことも示された。
【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
タンパク質Ａ捕捉中のロード比の低下もまた、高濃度カプリル酸ナトリウム洗浄中の収率低下の軽減策として検討した（表７）。ロード比を３０ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌに引き下げると、収率は、２５０ｍＭおよび５００ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄液に関してそれぞれ４．７％および７．７％増大した。ロード比がタンパク質Ａ溶出液中のＨＣＰ濃度に及ぼす影響は最小であった。
【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
例３：さらなるｍＡｂを用いた場合の改良された洗浄の性能
先行するタンパク質Ａ洗浄最適化試験は、モデル生成物としてｍＡｂ１のみを用いて行った。ＣＣＤ試験により、ｐＨはＨＣＰ除去に関して有意な因子ではないことが確認された。統計分析およびその後の収率検討で、４００ｍＭまでのカプリル酸ナトリウム濃度が最適であることが示された。２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄液のＨＣＰ除去がこれまでに開発された１００ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄液よりも改良されていることを確認するために、この節ではさらなるｍＡｂを試験した。５種類のｍＡｂに関してタンパク質Ａ溶出液中のＨＣＰ濃度を、１００ｍＭまたは２５０ｍＭのいずれかのカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液で比較した（図４）。１つのｍＡｂ（ｍＡｂ３）は、より高レベルのＨＣＰを伴う高細胞密度法と他の供試分子に匹敵する標準法の２つの別個の上流工程を起源とした。
【０１３１】
ｍＡｂ２を除き、ここで試験した総てのｍＡｂが、２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄液を用いた場合にタンパク質Ａ溶出液中に１００ｎｇ／ｍｇ未満を有した。ほとんどの場合、ＨＣＰ濃度は、単に洗浄液中のカプリル酸ナトリウム濃度を高めることによっておよそ一桁改善した。加えて、これらのｍＡｂは、カプリル酸ナトリウム濃度が上昇しても、許容可能な工程収率と生成物品質を有した。
【０１３２】
例４：カプリル酸ナトリウムベースのタンパク質Ａ洗浄液に対するアルギニンの添加
アミノ酸であるアルギニンは、脂肪酸であるカプリル酸ナトリウムに比べて、極めて異なる物理的および化学的特性を有する。これらの２つの添加物間の構造的な違いが次元の異なるＨＣＰ除去機構をもたらし得る、すなわち、アルギニンとカプリル酸塩の混合物が単一成分だけを含有する洗浄液よりも良好なＨＣＰ除去を示し得るとの仮説を立てた。カプリル酸塩／アルギニン混合物に関して総ＨＣＰ除去および特定のＨＣＰ除去の両方を評価するために以下の試験を行った。
【０１３３】
カプリル酸塩／アルギニンタンパク質Ａ洗浄バッファーを用いた場合の総ＨＣＰクリアランス
カプリル酸ナトリウムとアルギニンの組合せを含有するタンパク質Ａ洗浄バッファーを、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２を用いて試験した。ｍＡｂ２に関する結果を図５に示す。１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムまたは７５０ｍＭのアルギニン単独を含有するタンパク質Ａ洗浄バッファーでは、７００〜１３００ｎｇ／ｍｇのＨＣＰ濃度となった。カプリル酸ナトリウム濃度を２５０ｍＭに引き上げると、ＨＣＰクリアランスに、上述の「高カプリル酸ナトリウム」結果と一致する大きな改善がもたらされた。２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含有するｐＨ８．５の洗浄液では、タンパク質Ａ溶出液中に２７３ｎｇ／ｍｇＨＣＰという結果になった。カプリル酸塩ベースのタンパク質Ａ洗浄液にアルギニンを添加すると、ＨＣＰ除去がさらに改善され、ｐＨ７．５または８．５のいずれかの、７５０ｍＭアルギニンを含む２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムは、それぞれ２０９および１４４ｎｇ／ｍｇのＨＣＰ濃度という結果となった。
【０１３４】
同様のカプリル酸塩／アルギニン試験を、ｍＡｂ１を用いて行った。ｍＡｂ１は、「標準的」流加バイオリアクターと高細胞密度法の２つの別個の上流プロセスを起源とした。高細胞密度法は、より高い生成物力価およびＨＣＰ濃度をもたらした。これは「最悪の場合」の供給材料として本試験に含められた。結果を図６に示す。
【０１３５】
全体的に見れば、ｍＡｂ１の結果は、図５に示されたｍＡｂ２所見と同様である。標準的ｍＡｂ１供給流および高密度材料の両方に関して、カプリル酸ナトリウムを１００ｍＭから２５０ｍＭに引き上げることによりＨＣＰクリアランスの改善が見られた。加えて、５００ｍＭのアルギニンは、いずれかのカプリル酸ナトリウム単独洗浄液よりも良好なＨＣＰクリアランスを示した。しかしながら、混合物としてまたは逐次的洗浄を適用することによる、カプリル酸ナトリウムおよびアルギニンの両方による洗浄は、個々のいずれかの成分を超えるＨＣＰクリアランスの改善を示した。最高性能は、２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムと７５０ｍＭのアルギニンを含有するｐＨ８．５の洗浄液であった。高カプリル酸ナトリウムとアルギニンのこの組合せは、高密度および標準ｍＡｂ１に関してそれぞれ１１３および６７ｎｇ／ｍｇのタンパク質Ａ溶出液をもたらした。
【０１３６】
例５：ＰＬＢＬ２を除去するためのカプリル酸塩／アルギニンタンパク質Ａ洗浄液する
ＰＬＢＬ２は、生成物分子への明らかな結合のために、ＩｇＧ４であるｍＡｂ５の下流処理では除去が困難な特定のＨＣＰ不純物である。この特定のＨＣＰ不純物は、下流処理中にＩｇＧ４生成物と結合することが従前に判明している。ＰＬＢＬ２はまた、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ分析中に「希釈性の非線形性」を生じる。高カプリル酸ナトリウム濃度および／またはアルギニンを含有するタンパク質Ａ洗浄液を、ｍＡｂ５に対して、タンパク質Ａ工程中のＰＬＢＬ２除去に関して試験した。
【０１３７】
洗浄液は、ｐＨ７．５〜８．５にて７５０ｍＭまでのカプリル酸ナトリウム濃度および１Ｍまでのアルギニン濃度で試験した。各タンパク質Ａ洗浄試験に関して、総ＰＬＢＬ２濃度（図７、ＰＬＢＬ２特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定）を、総ＨＣＰ（図８）、および工程収率（図９）とともに報告した。
【０１３８】
ＰＬＢＬ２濃度は、種々の試験洗浄液に関してほぼ１〜６００ｎｇ／ｍｇと変動があった。アルギニン不含で１００ｍＭ未満のカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液の性能は最悪であり、およそ６００ｎｇ／ｍｇ  ＰＬＢＬ２を含むタンパク質Ａ溶出液をもたらした。カプリル酸ナトリウム濃度を２５０ｍＭに引き上げると、ＰＬＢＬ２は約１００ｎｇ／ｍｇに低減され、２５０ｍＭを超えるカプリル酸ナトリウム濃度は、ＰＬＢＬ２を約５０ｎｇ／ｍｇまで低減し続けただけでなく、収率の低下ももたらした。総ＨＣＰもまた、カプリル酸ナトリウムの増大に伴って一般に低下した。
【０１３９】
アルギニンを含有するタンパク質Ａ洗浄液は、ＰＬＢＬ２クリアランスという点で最も成功し、それらはまた総ＨＣＰの良好な除去も示した。カプリル酸ナトリウム不含の１０００ｍＭのアルギニンは、約１０ｎｇ／ｍｇのＰＬＢＬ２および６２ｎｇ／ｍｇのＨＣＰをもたらした。高濃度のアルギニンは有意な収率低下を招かなかった。
【０１４０】
カプリル酸ナトリウムとアルギニンの組合せは、ｍＡｂ５に関して、最も有効な洗浄液であった。具体的には、１Ｍのアルギニンを含む２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム、ｐＨ７．５または８．５は、約９０％の工程収率を維持しながら、２〜３ｎｇ／ｍｇのＰＬＢＬ２および約２０〜３０ｎｇ／ｍｇのＨＣＰをもたらした。１Ｍのアルギニンおよび１００ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液もまた成功したが、やや高いＰＬＢＬ２およびＨＣＰ濃度をもたらした。
【０１４１】
例６：カテプシンＬ活性の低減のためのカプリル酸塩／アルギニン洗浄液
カプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有するタンパク質Ａ洗浄液を、ｍＡｂ３を用い、カテプシンＬクリアランス能に関して試験した。カテプシンＬプロテアーゼは、ＣＨＯ細胞培養中に生産され、ｍＡｂ３生成物分子を分解する可能性がある。カテプシンＬはタンパク質Ａ工程中にｍＡｂ３から除去されないことが示されている。１００ｍＭのカプリル酸ナトリウム、２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム、１０００ｍＭのアルギニンを伴う１００ｍＭのカプリル酸ナトリウム、および７５０ｍＭのリシンを伴う１００ｍＭの  カプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液を試験した。
【０１４２】
この特定の生成物に対する、２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液は、予期しないタンパク質Ａ溶出挙動をもたらし、通常、約２カラム容量で行われる低ｐＨ溶出が、１０カラム容量にわたって拡大された。加えて、２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄液を試験した場合、ｍＡｂ３タンパク質Ａ溶出液は、極めて高い凝集物を含んでいた（ＳＥＣにより測定）。この挙動は、高カプリル酸ナトリウム洗浄液を用いて試験した他のいずれの生成物にも見られなかった。
【０１４３】
アルギニンまたはリシンを含有するタンパク質Ａ洗浄液は、２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウム単独を用いた場合に見られた拡大溶出挙動を示さなかった。３種類の異なる洗浄液（１００ｍＭのカプリル酸塩（「プラットフォームｍｓｓｓ溶出液」）；２５０ｍＭのカプリル酸塩、１Ｍのアルギニン（「ｃａｐ／ａｒｇ  ｍｓｓｓ溶出液」）；２５０ｍＭのカプリル酸塩、７５０ｍＭのリシン（「ｃａｐ／ｌｙｓ  ｍｓｓｓ溶出液」））に関して、タンパク質Ａ溶出液中で測定されたカテプシンＬ活性を図１０に報告し、タンパク質Ａ溶出容量を表８に示す。測定された活性は、１００ｍＭのカプリル酸ナトリウム、１０００ｍＭのアルギニン洗浄液を用いた場合に有意に低減され、続いての安定性試験で、１００ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄液に比べてこの洗浄液を用いて調製された材料では、断片化が減少したことが示された。アルギニンよりもむしろ７５０ｍＭのリシンの添加が大きな溶出容量を首尾良く低減したが、カテプシンＬ活性は有意に低減しなかった。カプリル酸ナトリウムと１０００ｍＭのアルギニンの組合せは、妥当な溶出容量および許容可能な生成物品質属性を維持しながらカテプシンＬおよび総ＨＣＰクリアランスの改善をもたらす。
【０１４４】
【表８】
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【０１４５】
例７：ＨＣＰを除去するためのカプリル酸塩／アルギニンタンパク質Ａ洗浄液
カプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有するタンパク質Ａ洗浄液を、ｍＡｂ３を用い、ＨＣＰクリアランス能に関して試験した。洗浄バッファー濃度および結果として得られたＨＣＰ濃度の概略を下表９に示す。アルギニン／カプリル酸塩洗浄液は、ｍＡｂ３に関してカプリル酸塩単独洗浄液に匹敵した。
【０１４６】
１５０ｍＭのカプリル酸塩洗浄液は、１００ｍＭのカプリル酸塩洗浄液よりも有意に高いＨＣＰクリアランスをもたらす。１．１Ｍのアルギニンと１５０ｍＭのカプリル酸塩の組合せは、有意な因子によってＨＣＰクリアランスをさらに改善する。タンパク質Ａ工程中のＨＣＰクリアランスの改善は、カプリル酸塩単独工程において必要とされた最終ポリッシングクロマトグラフィー工程の除去を可能にした。
【０１４７】
【表９】
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【０１４８】
例８：ｍＡｂ３の断片化の低減
カプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有する洗浄液を用いたｍＡｂ３のタンパク質Ａ精製を、精製中の抗体の断片化に関して試験した。１００ｍＭのカプリル酸塩洗浄液を含有する３バッチの洗浄バッファー、および１５０Ｍのカプリル酸塩と１．１Ｍのアルギニンを含有する２バッチの洗浄バッファーを含めてデータを取得した（図１１〜１３）。
【０１４９】
図１１は、全下流工程中の抗体の断片化パーセント（ＳＥＣ  ＨＰＬＣを用いて測定）を示す。図１２は、工程中のＨＣＰ濃度を示す。カプリル酸塩／アルギニンバッチは、工程中に有意な抗体断片化の生成を示さないが、カプリル酸塩単独バッチは、第３のポリッシング工程（カプリル酸塩／アルギニン洗浄液では不要）後に有意な抗体断片化の生成を示す。
【０１５０】
加えて、両工程（カプリル酸塩単独およびカプリル酸塩＋アルギニン）によって生産された原薬の安定性を比較した。カプリル酸塩＋アルギニン工程から得られた原薬は、摂氏２５度にて１０日以内に抗体の断片化を生じず、カプリル酸塩単独工程から得られた原薬は、摂氏２５度にて１０日で有意な抗体の断片化を生じる（図１３）。
【０１５１】
洗浄バッファーにおけるカプリル酸塩とアルギニンの組合せは、カテプシンＬのクリアランスを改善するため、下流工程で抗体の断片化の生成を有意に低減する。
【０１５２】
結論
タンパク質Ａ工程中のＨＣＰクリアランスは、ＨＣＰ−ｍＡｂ相互作用を最小化するために洗浄バッファーを修正することによって最適化された。初期スクリーニング試験では、タンパク質Ａ洗浄バッファーのｐＨ（７〜９で変動）は、ＨＣＰクリアランスまたは工程収率に有意に影響を及ぼさないと結論付けられた。カプリル酸ナトリウム濃度は、工程収率およびＨＣＰ除去の両方に強い効果を有する。極めて高いカプリル酸ナトリウム濃度（ＣＭＣを超える）では、ＨＣＰクリアランスは最適であるが、工程収率は極めて低い。この試験では、２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムを含有するタンパク質Ａ洗浄液の使用が、許容可能な工程収率を維持しながら、これまでに使用された１００ｍＭのカプリル酸ナトリウム洗浄液に比べてＨＣＰクリアランスの大きな改善をもたらすことが見出された。この試験ではまた、２５０ｍＭのカプリル酸ナトリウムと５００〜１０００ｍＭのアルギニンの組合せを含有するタンパク質Ａ洗浄液が、カプリル酸ナトリウム単独を含有する洗浄液に比べて高いＨＣＰクリアランスを有することが見出された。カプリル酸ナトリウムおよびアルギニンを含有するタンパク質Ａ洗浄液は、それぞれｍＡｂ３およびｍＡｂ５からカテプシンＬおよびＰＬＢＬ２（２つは特に除去が困難な不純物である）を首尾良く除去することが見出された。
【０１５３】
本明細書に記載された実施形態は、本発明の総ての側面に適用可能であると理解される。さらに、限定されるものではないが、特許および特許出願を含め、本明細書に引用されている総ての刊行物は、全内容が示されている場合と同じく、引用することにより本明細書の一部とされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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