(57)【要約】  本発明は、抑制解除によって誘導可能なメチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなプロモーター又はそのバリアントを含むコマガタエラ属の酵母細胞であって、オルソロガスなプロモーターが、メチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーターである、酵母細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抑制解除によって誘導可能なメチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなプロモーター又はそのバリアントを含むコマガタエラ属の酵母細胞であって、オルソロガスなプロモーターが、メチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーターである、酵母細胞。
【請求項２】
オルソロガスなプロモーターが、メタノールで誘導可能である、請求項1に記載の酵母細胞。
【請求項３】
オルソロガスなプロモーターが、異種又は同種のポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結している、請求項1又は2に記載の酵母細胞。
【請求項４】
異種又は同種のポリペプチドが、シグナルペプチド、特に分泌シグナルペプチドを含む、請求項3に記載の酵母細胞。
【請求項５】
オルソロガスなプロモーターが、ハンゼヌラ属、カンジダ属、コマガタエラ属及びピキア属からなる群から選択されるメチロトローフ酵母細胞に由来する、請求項1から4のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項６】
メチロトローフ酵母細胞が、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、ピキア・メタノリカ、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ、コマガタエラ・ポプリ、コマガタエラ・シュードパストリス、コマガタエラ・ウルミ及びコマガタエラsp.11-1192からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項７】
オルソロガスなプロモーター及び場合により、ゲノム中の異種又は同種のポリペプチドをコードし、更に前記プロモーターに作動可能に連結した核酸分子が、ゲノム中に又は染色体外の核酸構築物として存在してもよい、請求項1から6のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項８】
オルソロガスなプロモーターが、核酸配列配列番号1又はそのバリアントを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項９】
配列番号1のバリアントが、核酸配列配列番号27:
【化１】
2019505194.tif 000052
(式中、X1はアデニン又はヌクレオチドなしであり、X2はアデニン又はグアニンであり、X3はシトシン又はチミンであり、X4はチミン又はグアニンであり、X5はアデニン又はシトシンであり、X6はグアニン又はシトシンであり、X7はアデニン又はシトシンであり、X8はグアニン又はシトシンであり、X9はアデニン、グアニン又はシトシンであり、X10はグアニン又はシトシンであり、X11はグアニン又はシトシンであり、X12はグアニン又はシトシンであり、X13はグアニン又はシトシンであり、X14はアデニン又はシトシンであり、X15はアデニン又はシトシンであり、X16はチミン又はシトシンであり、X17はグアニン又はシトシンであり、X18はグアニン又はシトシンであり、X19は、
【化２】
2019505194.tif 000053
(配列番号28)、
【化３】
2019505194.tif 000054
(配列番号29)、
【化４】
2019505194.tif 000055
(配列番号30)及び
【化５】
2019505194.tif 000056
(配列番号31)
からなる群から選択される核酸配列である)を含む、請求項8に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
配列番号1のバリアントが、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55及び配列番号56からなる群から選択される、好ましくは配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号44、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号55及び配列番号56からなる群から選択される、より好ましくは配列番号35、配列番号39、配列番号44、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号55及び配列番号56からなる群から選択される、核酸配列を含む、請求項8又は9に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
請求項1から10のいずれか一項に記載の酵母細胞を培養する工程を含む、異種ポリペプチドを製造するための方法。
【請求項１２】
培養する工程の間、抑制解除条件によって異種ポリペプチドの発現が誘導される、又はその発現率が増加する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
培養する工程の間、抑制解除条件下でメタノール又は代替の誘導物質が添加される、請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母細胞におけるオルソロガスなプロモーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品又は産業的に関連する生体触媒等の組み換えタンパク質は、最も一般的には、微生物での異種遺伝子発現によって製造される。大腸菌(Escherichia coli)、サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)及び糸状菌は、高い頻度でかつ長期間にわたって組み換えタンパク質製造に使用されてきた。過去20年の間に、メチロトローフ酵母コマガタエラ(Komagataella)(ピキア(Pichia))・パストリス(pastoris)、コマガタエラ(ピキア)・ファフィ(phaffii)(Pp)、コマガタエラ・クルツマニイ(Kurtzmanii)、オガタエア(Ogataea)(ハンゼヌラ(Hansenula))・ポリモルファ(polymorpha)(Hp)、カンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)(Cb)及びオガタエア(ピキア)・メタノリカ(methanolica)(Pm)が、効率的な代替産生株として確立されてきた。これらの株は、高い細胞密度で異種タンパク質の高発現率を実現することを可能にしている。前述の4つの酵母種のうち、異種タンパク質製造には、最も一般的にはP.パストリス(コマガタエラ・ファフィ)がこれまでのところ使用されている。
【０００３】
すべてのメチロトローフ酵母は、メタノール利用に関する遺伝子の発現制御に関与している、厳密に制御された強力なプロモーター(MUT)を有する。メタノール利用に関する遺伝子のプロモーターは、グルコース等の抑制性(repressing)炭素源では通常抑制され、炭素源としてのメタノールの存在下では大幅に上方制御される。抑制性炭素源が枯渇した場合、又は非抑制性炭素源が存在する場合、プロモーターは抑制解除によって活性化し、この作用の強さは、種間で、更には同じ生物内でさえ大幅に変わりうる。例えば、P.パストリスGS115のアルコールオキシダーゼ-1-遺伝子のプロモーター(PPpAOXl)は、メタノール誘導条件と比較して、抑制解除条件下でわずか2〜4%の活性しか有さない。それとは対照的に、H.ポリモルファにおけるオルソロガスな遺伝子(メタノールオキシダーゼ、MOX)のプロモーター(PHpMOX)は、メタノール誘導条件と比較して抑制解除(depressing)条件下で最大70%の活性を有する。また、C.ボイジニイ(アルコールオキシダーゼ1、AOD1)及びP.メタノリカ(メタノールオキシダーゼ1/2、MOD1/2)におけるオルソロガスな遺伝子のプロモーターも、同等の挙動を有する。
【０００４】
毒性で可燃性のメタノールを用いて発現を誘導することは、操作安全性上の理由で、特に大きい工業規模において望ましくないため、強力な抑制解除プロモーターは有望な代替物となる。したがって、工業規模でのメタノール不含のタンパク質発現を可能にするために、異なる抑制解除特性を有するPPpAOX1バリアント、代替プロモーター及び新規なMUTプロモーターが近年開発された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US2015/0011407
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】W.c.Raschkeら、Gene 177(1996):163〜167
【非特許文献２】L.Rodriguezら、Yeast 12(1996):815〜822
【非特許文献３】F.S.Hartnerら、Microb.Cell Fact 5(2006):39〜59
【非特許文献４】S.Altschulら、J Mol Biol 215(1990):403〜410
【非特許文献５】Cereghinoら(Gene 519(2013):311-317)
【非特許文献６】Krainer FWら、Microbial Cell Factories 11(2012):22
【非特許文献７】T.Voglら、ACS Synth Biol.2015,DOI:10.1021/acssynbio.5b00199;2015年11月22日に発表
【非特許文献８】L.Naatsaariら(PLoS One 7(2012):e39720)
【非特許文献９】H.Songら、Biotechnol Lett 25(2003):1999〜2006
【非特許文献１０】A.M.Ledeboerら、Nucleic Acids Res 13(1985):3063〜3082)
【非特許文献１１】H.Yurimotoら、Biochim Biophys Acta 1493(2000):56〜63
【非特許文献１２】B.Leeら、Microbiology 148(2000):2697〜704
【非特許文献１３】C.K.Raymondら、Yeast 14(1998):11〜23
【非特許文献１４】T.Nakagawaら、J Biosci Bioeng 91(2001):225〜7
【非特許文献１５】T.Nakagawaら、Yeast 23(2006):15〜22
【非特許文献１６】L.Naatsaariら、BMC Genomics 15(2014):227
【非特許文献１７】F.W.Krainerら、Microb Cell Fact 11(2012):22
【非特許文献１８】R.Wiednerら、Comput Struct Biotechnol J10(2014):58〜62
【非特許文献１９】Lin-Cereghinoら(Biotechniques 38(2005):44〜48)
【非特許文献２０】Vogl Tら、ACS Synth.Biol.3(2014):188〜191
【非特許文献２１】Weis Rら、FEMS Yeast Res.5(2004):179〜89
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そのようなプロモーターの発現率は通常、メタノール誘導プロモーターと比較してはるかに低いため、本発明の目的の1つは、P.パストリス等の酵母における組み換えタンパク質の誘導可能で強力なメタノール不含の過剰発現のために、利用可能な選択の可能性を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、抑制解除によって誘導することができるメチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなプロモーター又はそのバリアントを含むコマガタエラ属の酵母細胞であって、オルソロガスなプロモーターが、メチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)又はメタノールオキシダーゼ(MOX)プロモーターである、酵母細胞を用いて達成され、このプロセスにおいて、メチロトローフ酵母細胞におけるオルソロガスなプロモーターは、抑制解除条件下でポリペプチドの発現を調節することができる。
【０００９】
この目的はまた、メチロトローフ酵母細胞のオルソロガスなギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーター及び/若しくはメタノールオキシダーゼ(MOX)プロモーター又はこれらの2つのプロモーターのバリアントを含むコマガタエラ(ピキア)属の酵母細胞であって、コマガタエラ属の酵母細胞におけるオルソロガスなプロモーターの元の制御プロファイルが保持されている、酵母細胞を用いて達成される。
【００１０】
驚くべきことに、好ましくはコマガタエラ(ピキア)属に属さない他のメチロトローフ酵母細胞において抑制解除条件下でポリペプチドの発現を調節することができるプロモーターが、コマガタエラ(ピキア)属の酵母細胞において、抑制解除条件下でポリペプチドの発現を調節する(例えば、非抑制解除条件の場合と比較して発現を増加させる)ことができ、また、同等の特性を有することが見出された。
【００１１】
更に、驚くべきことに、コマガタエラ属の酵母細胞中及び/又は同じ酵母細胞中には天然に存在しないメチロトローフ酵母細胞のギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーター及び/又はメタノールオキシダーゼ(MOX)プロモーターが、そのような細胞において特別な特性を有することが見出された。オルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーターは、コマガタエラ細胞において抑制解除条件下及びメタノール誘導条件下の両方で、すべての天然に存在するプロモーター及びメタノール利用に関する遺伝子(「MUTプロモーター」)の発現制御に関与しているこれまでに試験されているコマガタエラよりも、著しく強力である。よって、オルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーターは、抑制解除条件下で、例えばコマガタエラ細胞中に天然に存在するCAT1及びGAPプロモーターよりも著しく強力である。驚くべきことにオルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーターは、抑制解除条件下で使用されるスクリーニング条件下で、メタノール誘導性条件下で使用されるAOXプロモーターよりも、メタノール誘導条件下でコマガタエラにおいて天然に存在するAOX(AOX1及びAOX2)プロモーターとさえ全く同じくらい強力である。そのような作用は、バイオリアクター実験において調節されたC源用量のもとで通常は増強される可能性がある。オルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーターは、コマガタエラにおいて一般に使用されるAOXプロモーターに取って代わることができる。伝統的なメタノール誘導発現系を用いるが誘導剤としてメタノールを使用しない場合と比較して、本質的に同一な又は更には高いタンパク質発現収率を、この方法で達成することができる。ここで、メチロトローフ酵母細胞において(例えば、H.ポリモルファにおいて)やはり顕著に抑制解除されるこの酵母細胞の(例えば、H.ポリモルファの)ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーターは、別のメチロトローフ酵母細胞(例えば、P.パストリス)においてさえ、この制御プロファイルを保持することは驚くべきことである。それとは対照的に、より先行する研究によれば、メチロトローフ酵母間のプロモーターの移行において、外来プロモーターの制御プロファイルは移行しない(例えば、P.パストリスAOX1プロモーターは例えば、P.パストリスにおいて天然ではそ
うであるように、H.ポリモルファにおいて厳密に抑制されない;例えば、W.c.Raschkeら、Gene 177(1996):163〜167及びL.Rodriguezら、Yeast 12(1996):815〜822を参照されたい)ことが示されている。したがって、技術業界での現在の見解は、メチロトローフ酵母細胞間で異なるタイプの制御が存在するのは、プロモーター配列のためではなく、酵母細胞における異なる制御機構のためであるというものである(例えば、F.S.Hartnerら、Microb.Cell Fact 5(2006):39〜59を参照されたい)。しかしながら、驚くべきことに、メチロトローフ酵母細胞の(例えば、H.ポリモルファの)ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーターの、抑制解除による強力な活性化は、例えばコマガタエラ・ファフィ等の他のメチロトローフ酵母細胞に移行し得るどころか、AOX1遺伝子及びCAT1遺伝子のもの等の強力な同種プロモーターの技術的特性さえも超えることが見出された。
【００１２】
オルソロガスなプロモーター配列を使用することはまた、他の技術的利点も有する。例えば、それらの使用によって相同組み換えの可能性は低くなり、結果として発現株の遺伝的安定性はより高くなる。
【００１３】
「コマガタエラ属の酵母細胞」は、この属のすべての酵母細胞、例えば、コマガタエラ・クルツマニイ、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ、コマガタエラ・ポプリ(populi)、コマガタエラ・シュードパストリス(pseudopastoris)、コマガタエラ・ウルミ(ulmi)及びコマガタエラsp.11-1192等を含む。「コマガタエラ属の酵母細胞」は当然ながら、例えば、コマガタエラ・パストリスGS115、X-33、KM71、KM71H、CBS7435若しくはNRLL Y11430、CBS704、BG10、BG11及び/又はこれらの株の他の派生株等の、上記の属の特定の株の酵母細胞を含む。
【００１４】
「オルソロガスな」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる種由来の核酸又はアミノ酸分子を指し、これは少なくとも他の種の対応する核酸及びアミノ酸分子と機能的相同性を有する。「オルソログ」は、世代(generation)のために生じる異なる生物に由来し、更に共通の祖先に起源をもつ。「オルソログ」の配列は互いに大きく異なる可能性があるが、その生物学的及び/又は生化学的機能は通常、影響を受けていない(例えば、コマガタエラ・パストリスのAOXは、ハンゼヌラ・ポリモルファのMOXとオルソロガスであり、逆もまた同様であり、ハンゼヌラ・ポリモルファのFMDはコマガタエラ・パストリスのFDH1とオルソロガスであり、逆もまた同様である)。
【００１５】
「プロモーター」という用語は、本明細書において使用される場合、少なくとも1つの転写開始部位(transcription initiation start site)、核酸ポリメラーゼ複合体結合部位及びこれらの2つの要素が機能的に活性となることができ、出発細胞の元の制御プロファイルを保持しうるような、コマガタエラ属の酵母細胞におけるオルソロガスなプロモーターの更なるヌクレオチドを含む。これらの更なるヌクレオチドは、例えば転写因子結合部位を形成していてもよい。「抑制解除によって誘導可能なプロモーター」は、抑制解除条件下で活性化される(下記を参照されたい)プロモーターであり、そのため、それに作動可能に連結した核酸分子は、それらの核酸分子が異種又は同種のポリペプチドをコードするように転写される。
【００１６】
本発明によるオルソロガスなプロモーター、すなわちオルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーターは好ましくは、プロモーターを含みタンパク質/ポリペプチドをコードする対応する遺伝子の領域の、好ましくはFMD及び/又はMOXをコードし、1〜1000、好ましくは1〜900、更により好ましくは1〜800ヌクレオチドを含みうるFMD及び/又はMOX遺伝子の領域の、開始コドンの前の領域(5'末端の上流)のヌクレオチドを、50から2000の間、更により好ましくは100から1000の間、更により好ましくは150から800の間含む。オルソロガスなプロモーター、好ましくはオルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーターは、好ましくは、ポリペプチドをコードする遺伝子の領域の、好ましくはFMD及び/又はMOXをコードするFMD及び/又はMOX遺伝子の領域の5'末端の上流に、ヌクレオチドを1〜1000、好ましくは1〜900、更により好ましくは1〜800含む。
【００１７】
本発明のオルソロガスなプロモーターの、好ましくはオルソロガスなギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーター及び/又はメタノールオキシダーゼ(MOX)プロモーターの「バリアント」は、天然に存在するオルソロガスなプロモーター、好ましくはオルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーターとは1つ又は複数の(例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、50)ヌクレオチドが異なる核酸分子を含む。そのようなプロモーターバリアントは、天然に存在するプロモーターの対応する領域と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも98%同一である。
【００１８】
本発明に従って使用することができるオルソロガスなプロモーターのバリアントは、天然に存在するプロモーター、好ましくはFMD及び/又はMOXプロモーターと比較して欠失、置換及び挿入を含みうる。プロモーターのバリアントはまた、抑制解除条件下でタンパク質の発現を可能にする特性も有する。天然に存在するオルソロガスなプロモーター、好ましくはオルソロガスなFMDプロモーター及び/又はオルソロガスなMOXプロモーターを含むコマガタエラ属の酵母細胞によって発現されるであろうタンパク質の量の少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも100%、更により好ましくは少なくとも120%、更により好ましくは少なくとも150%を、抑制解除条件下で発現することができるバリアントが好ましくは使用される。
【００１９】
プロモーターバリアントを同定及び製造する方法は、十分によく知られている。通常、プロモーター中に変異を導入し、それから試験を実施し、プロモーターバリアントの特性(例えば、モデルタンパク質の発現率)が変化したかどうか、及びどのように変化したかを示す。
【００２０】
本発明のオルソロガスなプロモーターの、好ましくはオルソロガスなギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーター及び/又はオルソロガスなメタノールオキシダーゼ(MOX)プロモーターの「バリアント」はまた、天然に存在するオルソロガスなプロモーターの制御要素又は上記で定義されたそのバリアント(天然に存在する配列とは1つ又は複数の、例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、50ヌクレオチドが異なる)を含むプロモーターバリアント並びに代替の最小プロモーター及び/又はコアプロモーターも含む。最小プロモーター及び/又はコアプロモーターは、転写に必要な普遍的なプロモーター要素(TATAボックス及び転写開始)だけを含むプロモーターの部分である。したがって、本発明によるオルソロガスなプロモーターのバリアントの制御要素は、開始コドンの上流(5'末端の上流)の領域のヌクレオチドを好ましくは100から1000の間、更により好ましくは150から800の間含み、転写の開始点の直前には20〜100、好ましくは25〜80、更により好ましくは30〜70ヌクレオチドを含まない。
【００２１】
「同一性」及び「同一な」はそれぞれ、2つ以上の核酸及び/又はアミノ酸配列の間での一致の程度を指し、これはその配列間の一致によって決定することができる。「同一性」のパーセンテージは、ギャップ又は他の配列の詳細を考慮した、2つ以上の配列における同一な領域のパーセンテージから導き出される(すなわち、同一性%は、同一な位置/位置の合計数×100の数字を指す)。同一性を決定するための特に好ましい方法は、米国国立生物工学情報センター(National Centre for Biotechnology Information)(NCBI)のBLASTプログラムである(特にS.Altschulら、J Mol Biol 215(1990):403〜410を参照されたい)。BLOSUM62アルゴリズムは、好ましくはパラメータ「ギャップ」「イグジステンス(existence)」:11及び「エクステンション(extension)」:1で使用する。
【００２２】
「メチロトローフ酵母細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、炭素原子1個だけを有する炭素源物質として例えばメタノールを含有する培養培地において増殖可能な酵母細胞を含む。
【００２３】
「抑制解除条件」は、本発明による酵母細胞を培養する際に使用される場合、酵母細胞がまず、抑制性炭素源(例えばグルコース)の存在下で、この炭素源がほとんど又は完全に消費されるまで培養されることを意味する。抑制性炭素源(例えばグルコース)の濃度が低減した後、細胞は、それぞれ抑制性炭素源及びグルコースに関して抑制解除条件になる。抑制作用の強さは炭素源の種類に依存しうる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態によれば、オルソロガスなFMD及び/又はオルソロガスなMOXプロモーターは、異種又は同種のポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結している。
【００２５】
オルソロガスなプロモーターは、異種(コマガタエラに由来しない)又は同種(コマガタエラに由来する)のポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結していてもよく、よってこのポリペプチドの発現に影響を及ぼす且つ/又はそれを調節することができる。得られるポリペプチドは、少なくとも5、好ましくは少なくとも10、更により好ましくは少なくとも50アミノ酸残基を含み、よってポリペプチド又はタンパク質とも称される分子を含む。
【００２６】
核酸分子は好ましくは、抗体又はその断片、酵素、構造タンパク質等のポリペプチドをコードする。
【００２７】
「作動可能に連結した」は、本明細書において使用される場合、異種又は同種のポリペプチドをコードする核酸分子が、本発明による酵母細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にするように、プロモーターに連結していることを意味する。したがって、プロモーターは、これがコーディング配列の転写に対して影響を有する場合、コーディング核酸配列に作動可能に連結している。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、異種又は同種のポリペプチドは、シグナルペプチド、特に分泌シグナルペプチドを含む。
【００２９】
酵母細胞から組み換え同種又は異種ポリペプチドを分泌するために、核酸分子によってコードされているポリペプチドはシグナルペプチドを含む。
【００３０】
「シグナルペプチド」という用語は、本明細書において使用される場合、ポリペプチドのC末端又はN末端に連結されたペプチドを指し、これはポリペプチドの分泌を調節する。本発明において使用されるシグナル配列は、小胞体(ER)の膜を介したタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドでありうる。これらのシグナル配列の核酸配列は、元の宿主細胞の天然配列に対応していてもよく、又はコドン最適化されていてもよい。シグナル配列の非限定的な例としては、MF-α(「接合因子α」シグナル配列)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)由来のCBH2タンパク質のシグナル配列、サーモマイセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)由来のキシラナーゼAのシグナル配列、Klキラートキシンシグナル、インベルターゼ分泌シグナルペプチド、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)由来のキラートキシンのシグナル配列、ピキア・アカシアエ(Pichia acaciae)由来のキラートキシンのシグナル配列、ハンセニアスポラ・ウバルム(Hanseniaspora uvarum)由来及びピキア(ハンゼヌラ)・アノマラ(anomala)由来のキラートキシンのシグナル配列又は例えばCereghinoら(Gene 519(2013):311-317)に記載されているそれらのバリアントが挙げられる。本発明の好ましいシグナル配列は、MF-α(「接合因子α」シグナル配列)である。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、オルソロガスなFMDプロモーター及び/又はオルソロガスなMOXプロモーターは、ハンゼヌラ(オガタエア)属、カンジダ属、コマガタエラ属及びピキア属からなる群から選択されるメチロトローフ酵母細胞に由来する。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、メチロトローフ酵母細胞は、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、ピキア・メタノリカ、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ、コマガタエラ・シュードパストリス、コマガタエラ・ウルミ及びコマガタエラsp.11-1192からなる群から選択される。
【００３３】
異種又は同種のポリペプチドをコードするオルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーター並びに場合により、それらに作動可能に連結した核酸分子は、ゲノム中に、自律複製配列(ARS)を有するプラスミド上の染色体外核酸構築物として、又はゲノム中に組み込まれたベクター/発現カセットとして、存在することができる。
【００３４】
オルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーター並びに場合により、それらに作動可能に連結した核酸分子は、染色体外に存在してもよく、本発明による酵母細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００３５】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、オルソロガスなプロモーターは、核酸配列配列番号1若しくは配列番号2又はそのバリアントを含む、又はこれらからなる。
配列番号1(FMDプロモーター):
【００３６】
【化１】
2019505194.tif 000002
【００３７】
配列番号2(MOXプロモーター)
【００３８】
【化２】
2019505194.tif 000003
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、配列番号1のバリアントは、配列番号27を含む、又はこれからなる。配列番号27は以下の核酸配列を有する:
【００４０】
【化３】
2019505194.tif 000004
【００４１】
(式中、
X1はアデニン又はヌクレオチドなしであり、X2はアデニン又はグアニンであり、X3はシトシン又はチミンであり、X4はチミン又はグアニンであり、X5はアデニン又はシトシンであり、X6はグアニン又はシトシンであり、X7はアデニン又はシトシンであり、X8はグアニン又はシトシンであり、X9はアデニン、グアニン又はシトシンであり、X10はグアニン又はシトシンであり、X11はグアニン又はシトシンであり、X12はグアニン又はシトシンであり、X13はグアニン又はシトシンであり、X14はアデニン又はシトシンであり、X15はアデニン又はシトシンであり、X16はチミン又はシトシンであり、X17はグアニン又はシトシンであり、X18はグアニン又はシトシンであり、X19は、オルソロガスなプロモーターの、好ましくはFMD及び/又はMOXプロモーターのコアプロモーターであり、特に好ましいのは、
【００４２】
【化４】
2019505194.tif 000005
【００４３】
(配列番号28)、
【００４４】
【化５】
2019505194.tif 000006
【００４５】
(配列番号29)、
【００４６】
【化６】
2019505194.tif 000007
【００４７】
(配列番号30)、
【００４８】
【化７】
2019505194.tif 000008
【００４９】
(配列番号31)、
【００５０】
【化８】
2019505194.tif 000009
【００５１】
(配列番号32)、
【００５２】
【化９】
2019505194.tif 000010
【００５３】
(配列番号33)及び
【００５４】
【化１０】
2019505194.tif 000011
【００５５】
(配列番号34)からなる群から選択される核酸配列、特に配列番号28、配列番号29、配列番号30及び配列番号31、特に配列番号28である。配列番号27中の少なくとも1つのヌクレオチドは配列番号1の対応する位置で異なっており、よって結果として配列番号1のバリアントを生じる。
【００５６】
驚くべきことに、配列番号1中の少なくとも1個の、好ましくは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の点変異(挿入及び/又は置換)(配列番号27を参照されたい)により、配列番号1からなる、又はそれを含むプロモーター領域と比較して優れた作用を示すプロモーターバリアントが得られることが判明した。ポリペプチドをコードしている核酸分子に作動可能に連結したそのようなプロモーターを含む酵母細胞は、配列番号1からなるプロモーターを保有する酵母細胞と比較して、少なくとも培養の最初の24時間以内に少なくとも同じ又は更には増加した発現率を示す。したがって、その対応する核酸配列配列番号27中のX1〜X18及びX1〜X19として示される位置のうちの1つ又は複数で、配列番号1を改変することが特に好ましい。
【００５７】
配列番号1とは異なるヌクレオチド配列を生じる、配列番号27のヌクレオチドX1、X3、X4、X5、X9、X16及びX17のうちの1つ又は複数(2、3、4、5、6又は7個)の変異は、そのようなプロモーターはまた、抑制解除条件下での培養48時間後にも、配列番号1を使用する場合と比較してポリペプチド及びタンパク質発現の増加を示すことから、好ましい。
【００５８】
配列番号1とは異なるヌクレオチド配列を生じる、配列番号27のヌクレオチドX1、X4、X9、X16及びX17のうちの1つ又は複数(2、3、4又は5個)の変異は、そのようなプロモーターはまた、炭素源として例えばメタノールを使用した培養の72時間後にも、配列番号1を使用する場合と比較してポリペプチド及びタンパク質発現の増加を示すため、特に好ましい。
【００５９】
上述のように、配列番号27のX19は、配列番号1中に天然に存在するコアプロモーター(すなわちTATAAATACCGCCTCCTTGCGCTCTCTGCCTTCATCAATCAAATC(配列番号28))又は代替コアプロモーターでありうる。特に好ましいコアプロモーターは、配列番号29、配列番号30及び配列番号31を含む、又はこれらからなる。すべてのこれらのコアプロモーターは、抑制解除条件下で、配列番号1又は配列番号27(天然に存在するコアプロモーターが、配列番号27の位置X19で、これらの代替コアプロモーターのうちの1つで置換されている)と組み合わせて、配列番号1によってコードされているプロモーターと比較して顕著に増強されたポリペプチド発現率を示す。
【００６０】
配列番号1の特に好ましいバリアントは、以下の核酸配列からなる群から選択される:
配列番号35(v1;実施例2を参照):
【００６１】
【化１１】
2019505194.tif 000012
【００６２】
配列番号36(v2):
【００６３】
【化１２】
2019505194.tif 000013
【００６４】
配列番号37(v3):
【００６５】
【化１３】
2019505194.tif 000014
【００６６】
配列番号38(v4):
【００６７】
【化１４】
2019505194.tif 000015
【００６８】
配列番号39(v5):
【００６９】
【化１５】
2019505194.tif 000016
【００７０】
配列番号40(v6):
【００７１】
【化１６】
2019505194.tif 000017
【００７２】
配列番号41(v7)
【００７３】
【化１７】
2019505194.tif 000018
【００７４】
配列番号42(v8):
【００７５】
【化１８】
2019505194.tif 000019
【００７６】
配列番号43(v9):
【００７７】
【化１９】
2019505194.tif 000020
【００７８】
配列番号44(v10)
【００７９】
【化２０】
2019505194.tif 000021
【００８０】
配列番号45(v11):
【００８１】
【化２１】
2019505194.tif 000022
【００８２】
配列番号46(v12):
【００８３】
【化２２】
2019505194.tif 000023
【００８４】
配列番号47(v13)
【００８５】
【化２３】
2019505194.tif 000024
【００８６】
配列番号48(v14):
【００８７】
【化２４】
2019505194.tif 000025
【００８８】
配列番号49(v15):
【００８９】
【化２５】
2019505194.tif 000026
【００９０】
配列番号50(v16):
【００９１】
【化２６】
2019505194.tif 000027
【００９２】
配列番号51(v17):
【００９３】
【化２７】
2019505194.tif 000028
【００９４】
配列番号52(v18):
【００９５】
【化２８】
2019505194.tif 000029
【００９６】
配列番号53(v19):
【００９７】
【化２９】
2019505194.tif 000030
【００９８】
配列番号54(v20):
【００９９】
【化３０】
2019505194.tif 000031
【０１００】
配列番号55(v21):
【０１０１】
【化３１】
2019505194.tif 000032
【０１０２】
配列番号56(v22):
【０１０３】
【化３２】
2019505194.tif 000033
【０１０４】
抑制解除下で低減した発現率を示す、配列番号1からなる又はそれを含むFMDプロモーターのバリアントは、以下の配列を含む、又はこれらからなる:
配列番号57(v23):
【０１０５】
【化３３】
2019505194.tif 000034
【０１０６】
配列番号58(v24)
【０１０７】
【化３４】
2019505194.tif 000035
【０１０８】
配列番号59(v25):
【０１０９】
【化３５】
2019505194.tif 000036
【０１１０】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、配列番号1のバリアントは、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号44、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号55及び配列番号56からなる群から選択される。
【０１１１】
本発明の別の態様は、本発明による酵母細胞を培養する工程を含む、異種ポリペプチドを製造するための方法に関する。
【０１１２】
オルソロガスなFMD及び/又はMOXプロモーターを含む本発明による酵母細胞は、同種又は異種ポリペプチドの過剰発現に特に適している。優れた特性のために、本発明による酵母細胞を用いて、抑制解除条件下で並びにメタノール誘導条件又は適した代替の誘導性条件下でポリペプチド及び/又はタンパク質を発現すること、並びに場合により細胞からそれを分泌することが可能である。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、培養中、抑制解除条件下で異種ポリペプチドの発現は誘導される、又はその発現率は増加する。
【０１１４】
プロモーター抑制解除は、抑制性炭素源(C源:例えば、グルコース、グリセロール)の供給速度を低減することによって又は非抑制性C源(例えば、ソルビトール)を使用することによって、実現することができる。抑制性C源は、直接的な抑制によって又はC源の代謝産物の抑制性によって、その特性を実現することができる。極端な例では、抑制性C源の供給速度はゼロに近づくことがある。脂肪酸、ホルムアルデヒド又はギ酸等の他の化合物に起因する更なる誘導作用もまた起こり得る。
【０１１５】
培養中及び/又はその発現中のタンパク質収率を増加させるために、抑制解除条件下での培養中、好ましくはメタノールが添加される。
【０１１６】
当業者は、温度、培地等の一般的な培養条件に十分に精通している(例えば、Krainer FWら、Microbial Cell Factories 11(2012):22を参照されたい)。
【０１１７】
以下の図及び実施例に基づいて本発明をより詳細に規定するが、本発明はこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】緑色蛍光タンパク質をコードする核酸がオルソロガスな内在性プロモーターに作動可能に連結している、コマガタエラ属の酵母細胞の培養における緑色蛍光レポータータンパク質(緑色蛍光タンパク質(GFP)の改良されたバリアント)の蛍光強度を示す図である。オルソロガスなプロモーター(及び参照としてP.パストリスの内在性プロモーター)をGFPレポーター遺伝子に作動可能に連結し、P.パストリスにおいてベクターとして形質転換した。この株を、96ディープウェルを有するマイクロタイタープレート(ディープウェルプレート(DWP))中で最小培地(BMD1)において60時間培養し、続いてメタノールで誘導した。レポータータンパク質の蛍光及びOD600(生物量の指標として)を、グルコースで抑制された条件下(16h)、抑制解除条件下(60h)で測定し、メタノール誘導後の様々な時点で測定した。蛍光測定値をOD600値に対して正規化した。4つの形質転換体それぞれの平均及び標準偏差を図に示す。
【図２Ａ】経時的なタンパク質発現の測定値の曲線を示す。図1から選択された株を振とうフラスコで培養した。タンパク質蛍光(RFU/OD600比;RFU=相対蛍光単位)を経時的に測定した。測定開始時のグルコース濃度は55.5mM(10g/L)であった。3つの形質転換体それぞれの平均(MV)及び標準偏差を示す。
【図２Ｂ】経時的なタンパク質発現の測定値の曲線を示す。図1から選択された株を振とうフラスコで培養した。OD600を経時的に測定した。測定開始時のグルコース濃度は55.5mM(10g/L)であった。3つの形質転換体それぞれの平均(MV)及び標準偏差を示す。
【図２Ｃ】経時的なタンパク質発現の測定値の曲線を示す。図1から選択された株を振とうフラスコで培養した。グルコースの量を経時的に測定した。測定開始時のグルコース濃度は55.5mM(10g/L)であった。3つの形質転換体それぞれの平均(MV)及び標準偏差を示す。
【図３】図3A〜図3Cは、オルソロガスなHpFMDプロモーターが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)(図3A)、カンジダ・アンタークチカ(antarctica)由来のリパーゼB(CalB)(図3B)及びマニホット・エスクレンタ(manihot esculenta)由来のヒドロキシニトリルリアーゼ(MeHNL)(図3C)等の他のレポータータンパク質の発現も上方制御できることを示す図である。これらの株を、DWP中で最小培地において60h後のグルコース枯渇点まで培養し、続いてメタノールで更に誘導した。HRP及びCalB酵素活性を培養上清で測定した。MeHNLの活性は消化された細胞を使用して測定した。4つの形質転換体それぞれの平均及び標準偏差を示す。
【図４】試験したHpFMDプロモーター(P_FMD)及びAOX1プロモーター(P_A0X1)野生型配列プロモーターのレポータータンパク質蛍光を示す図である。株の遺伝的背景はP.パストリスBg11 KU70である。培養はディープウェルプレート(DWP)中で行った。レポータータンパク質蛍光及びOD600を、グルコース抑制解除下(24及び48h)及びメタノール誘導の2つの異なる時点(72及び96h)で測定した。FMDプロモーターを有する株を、様々なプロモーターバリアントを試験するための参照株として使用した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１１９】
(実施例1)
材料及び方法
プロモーターのクローニング
オルソロガスなプロモーターをPCRで増幅し、GFPレポーター遺伝子の前にクローニングした。そうするために、レポータープラスミドpPpT4mutZeoMlyI-intARG4-eGFP-BmrIstuffer(T.Voglら、ACS Synth Biol.2015,DOI:10.1021/acssynbio.5b00199;2015年11月22日に発表)。
【０１２０】
このプラスミドは、L.Naatsaariら(PLoS One 7(2012):e39720)によって記載されたpPpT4ベクターに基づいている。天然のコンテクストを得るために、プロモーターをシームレスに(すなわち、プロモーターと開始コドンとの間に制限酵素切断部位もリンカー配列もなく)クローニングした。文献参照に基づいてプライマーを設計した(HpFMDプロモーター(H.Songら、Biotechnol Lett 25(2003):1999〜2006;A.M.Ledeboerら、Nucleic Acids Res 13(1985):3063〜3082)、CbAOD1プロモーター(H.Yurimotoら、Biochim Biophys Acta 1493(2000):56〜63)、CbFLD1プロモーター(B.Leeら、Microbiology 148(2000):2697〜704)、Pm MOD1及びMOD2プロモーター(C.K.Raymondら、Yeast 14(1998):11〜23;T.Nakagawaら、J Biosci Bioeng 91(2001):225〜7;T.Nakagawaら、Yeast 23(2006):15〜22)。使用したプライマー配列をTable A(表1)に示す。
【０１２１】
【表１】
2019505194.tif 000037
【０１２２】
Hp(ハンゼヌラ・ポリモルファ(polymorphs))DSM 70277株、Cb(カンジダ・ボイジニイ)DSM 70026株及びPm(ピキア・メタノリカ)DSM 2147株のゲノムDNAを単離し、PCR反応のための鋳型として使用した。PCR産物を、ベクターpPpT4mutZeoMlyI-intARG4-eGFP-BmrIstufferにおいてTAクローニングによってクローニングした(US2015/0011407及びT.Voglら(ACS Synth Biol.2015,DOI:10.1021/acssynbio.5b00199;2015年11月22日に発表)もまた参照されたい)。P.パストリス内在性プロモーターAOX1、CAT1及びGAPのための対照ベクターは、US2015/0011407から得る。
【０１２３】
対応するプロモーターの下流にHRP(イソ酵素A2A;L.Naatsaariら、BMC Genomics 15(2014):227)、CalB及びMeHNLを含む代替のレポーターベクターを、US2015/0011407から得たか、又は上記のeGFPベクターから切断(制限酵素NheI及びNotI)されたeGFPレポーター遺伝子を組み込むことによって作出し、HRP、CalB及びMeHNLのPCR産物を組み換えクローニングによってシームレスに組み込んだ。Table B(表2)に示すプライマーをPCR増幅に使用した。
【０１２４】
【表２】
2019505194.tif 000038
【０１２５】
したがって、文献中で言及されているHRP及びCalBベクターをPCR鋳型として使用した(US2015/0011407及びT.Voglら(ACS Synth Biol.2015,DOI:10.1021/acssynbio.5b00199;2015年11月22日に発表))。MeHNL配列を、P.パストリスのコドンに最適化し、AOX1プロモーター及びターミネーターに対するオーバーハングを有する合成二本鎖DNA断片として設計した(Table B(表2)を参照)。この断片をPCRの鋳型として使用した。以下の配列を使用した。
【０１２６】
【化３６】
2019505194.tif 000039
【０１２７】
(配列番号22)
【０１２８】
ここでのタンパク質コーディング配列は大きく、開始及び終止コドンは太字フォントで示されており、一方、組み換えクローニング用のベクターに対するオーバーハングは小文字で記載されており、pPpT4ベクターファミリーでのクローニングのために典型的に使用される切断部位であるEcoRI及びNotIは下線を付けている。
【０１２９】
HRP及びCalB遺伝子はMFαシグナル配列に融合されているため、同じフォワードプライマー(pHpFMD-MFα-Gib)をこの2つの遺伝子のPCR増幅にも使用した。ベクターにおいてクローニングした遺伝子を、AOX1ターミネーター及びそれぞれのプロモーターに結合するプライマー(HpFMDプロモーターにはseq-pHpHMD-149..126fwd)を使用してシーケンシングした。
【０１３０】
菌株、材料、蛍光測定及び酵素アッセイ
酵素HRP及びCalB活性は、Krainer FW(Microb Cell Fact 11(2012):22)のプロトコールに従って、基質2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及び酪酸p-ニトロフェニル(p-NPB)を用いて決定した。
【０１３１】
GFPを用いて比較するすべてのプロモーターの形質転換に、CBS7435野生型株を使用した。HRP及びCalBプラスミドはより高度にタンパク質を発現するため(F.W.Krainerら、Microb Cell Fact 11(2012):22)、これをmutS株に形質転換した(L.Naatsaariら(PLoS One(2012);7:e39720))。MeHNL活性測定のために、製造業者の使用説明書に従って(Thermo Fisher Scientific、Y-PER(商標)Yeast Protein Extraction Reagent)、Y-PER消化によって細胞を溶解し、R.Wiednerら、Comput Struct Biotechnol J10(2014):58〜62に記載されているように「マンデロニトリルシアノゲナーゼアッセイ」を使用して活性を測定した(最終的なマンデロニトリル濃度15mM)。
【０１３２】
結果
HpFMD、HpMOX、CbFLDl、CbAODl、PmMODl及びPmMOD2遺伝子という6個の異種プロモーターをP.パストリスにおいて試験した。プロモーターを、P.パストリスにおいてメタノール誘導可能なAOX1プロモーター、構成的GAPプロモーター及び抑制解除/メタノール誘導可能なCAT1プロモーターと比較した。すなわちオルソロガスなプロモーターをゲノムDNA PCRによって増幅し、レポーター遺伝子としてGFPを有するベクター中でクローニングした。以下のプロモーター配列を使用した。
HpFMD(配列番号1):
【０１３３】
【化３７】
2019505194.tif 000040
【０１３４】
HpMOX(配列番号2):
【０１３５】
【化３８】
2019505194.tif 000041
【０１３６】
CbFLD1(配列番号23):
【０１３７】
【化３９】
2019505194.tif 000042
【０１３８】
CbAOD1(配列番号24):
【０１３９】
【化４０】
2019505194.tif 000043
【０１４０】
PmMOD1(配列番号25)
【０１４１】
【化４１】
2019505194.tif 000044
【０１４２】
PmMOD2(配列番号26):
【０１４３】
【化４２】
2019505194.tif 000045
【０１４４】
CbAODl、PmMODl及びPmMOD2プロモーターを含むプラスミドを含むP.パストリス形質転換体は、レポータータンパク質蛍光を有さなかった(図1)。CbFLDlプロモーターは、グルコースで抑制を示し、メタノールでPpAOXlプロモーターの約10%、わずかに誘導された。驚くべきことに、試験したH.ポリモルファプロモーターは両方ともH.ポリモルファ由来のそれらの天然の制御プロファイルを保持し、ピキア・パストリスにおいて抑制、抑制解除及びメタノール誘導も保持した(図1及び図2)。HpFMDプロモーターは驚くべきことに、抑制解除条件下で構成的PpGAPプロモーターを上回り、また、更なる炭素源を供給しなくてもメタノール誘導PpAOXlプロモーターの約75%を達成した。HpFMDプロモーターの抑制解除された発現は、P.パストリス由来の最も強力な内因性MUTプロモーター(PpCATl)レポータータンパク質蛍光のものを約3.5倍上回った。メタノール誘導後、HpFMDプロモーターはPpAOXlプロモーターを約2倍上回った。小規模でのこれらの結果(図1)は、振とうフラスコにおける実験によって裏付けられ(図2)、ここでは、グルコース測定値もまた抑制解除された制御プロファイルを明らかに示している。HpFMDプロモーターの技術的利点の更なる向上は、バイオリアクターにおける供給速度の最適化によって達成することができる。
【０１４５】
HpFMDレポーターの予想外に強力な発現が、GFPに加えて他のタンパク質でも再現できるかどうかを調べるために、他のタンパク質:分泌タンパク質ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)及びカンジダ・アンタークチカリパーゼB(CalB)及びマニホット・エスクレンタ由来の細胞内ヒドロキシニトリルリアーゼ(キャッサバ、MeHNL)のコーディング配列の上流にHpFMDプロモーターをクローニングした(図3A〜図3C)。
【０１４６】
振とうフラスコ実験における培養上清中の活性タンパク質の最終的な収率に関して、HpFMDプロモーターによるすべてのタンパク質の抑制解除された発現は、GAPプロモーターによる構成的発現と等しく、CAT1プロモーターによる抑制解除された発現を明らかに上回っていた。HpFMDプロモーターのメタノールに誘導された酵素活性は、AOX1プロモーター活性を2.5倍上回った。
【０１４７】
HpFMDプロモーターの強力な発現はまた、4つの異なる分泌レポータータンパク質並びに細胞内レポータータンパク質(eGFP、HRP、CalB、MeHNL)でも観察することができた。オルソロガスなHpFMDプロモーターは、P.パストリスにおける内在性プロモーターさえも上回った。
【０１４８】
興味深いことに、オルソロガスなプロモーターはピキア中のプロモーターとの配列同一性が非常に低いか、又は同一性がない。HpFMDプロモーターのBLAST検索では、ピキア・パストリスゲノムにおいて有意なヒットはなく、HpFMDプロモーターとPpFDHlプロモーターとの直接のアライメントでも、有意な類似性は見られなかった(BLASTN 2.2.32+、Blast 2 sequences、「somewhat similar sequences(blastn)」に設定;分子タイプ:核酸)。
【０１４９】
これらの外来配列はピキアのゲノム中の同一配列と組み換わることがなく、したがって、例えばゲノム中にすでに存在する類似配列との相同組み換え現象のために、失われることがないため、そのような低い配列同一性はプロモーターの望ましい特性である。
【０１５０】
驚くべきことに、オルソロガスなプロモーターは、HpFMDプロモーターによる2.5倍もの高い活性により実証されるように、タンパク質発現のための極めて有用なツールである可能性がある。予期しないことに、HpFMDプロモーターはまた、H.ポリモルファ由来のその抑制解除制御プロファイルをP.パストリスにおいても保持し、よってP.パストリスにおいて最も強力な抑制解除プロモーターとなる。そのため、毒性で高引火性(inflammatory)のメタノールを含まない高効率の製造プロセスを可能にすることができる。
【０１５１】
(実施例2)
FMDプロモーターバリアント
1.プロモーターのクローニング
配列番号1を有するFMDプロモーターを含むpPpT4mutZeoMlyI-intArg4-EGFP-P_FMD1を、プロモーターバリアントvOl〜v22のPCR増幅のための鋳型とした。点変異、挿入又は様々なコアプロモーターをFMDプロモーター配列に導入するように、プライマーを設計した。プロモーターバリアントを2つの部分に分けて増幅し、次いで、制限エンドヌクレアーゼSailで事前に切断したpPpT4mutZeoMlyI-intArg4-eGFP-P_FMDベクターの骨格とアセンブルした。プロモーターバリアントv23〜v25を作製するために、一方の部分だけをPCR増幅し、他方の部分は合成DNAとして注文した。この場合、この2つのDNA断片を、制限エンドヌクレアーゼNheIで事前に切断したpPpT4mutZeoMlyI-intArg4-eGFP-P_FMDベクターの骨格とアセンブルした。DNA断片とベクター骨格とのアセンブリのために、配列相同性に基づくアセンブリクローニングを使用し、プロモーターからレポーター遺伝子eGFPへシームレスに移行させた。
【０１５２】
2.P.パストリス形質転換及びスクリーニング
異なるプロモーターバリアントvOl〜v25を有するベクターを酵母中に形質転換するために、P.パストリスBg11ΔKU70株を使用した。野生型株と比較して、この株は2つの遺伝子ノックアウトを有する:1つ目は、非相同末端結合機構に関与するタンパク質をコードしているKU70遺伝子。この遺伝子をノックアウトすることによって、相同組み換え現象がP.パストリスにおいて起こる可能性はより高くなる。このことにより、ゲノム中の異なる組み込み遺伝子座による予期しない作用を避けるために、ベクターを規定の遺伝子座、この場合はARG4遺伝子座に標的化することが容易になる。2つ目のノックアウト遺伝子は、AOXl遺伝子(mutS/Bg11株)である。このノックアウト株を使用することによって、メタノール誘導可能なプロモーターの支配下で異種発現タンパク質のより高い収率を達成することができる(Krainer FWら、Microb.Cell Fact.ll(2012)p.22)。
【０１５３】
Lin-Cereghinoら(Biotechniques 38(2005):44〜48)の短縮されたプロトコールに従って、P.パストリスBg11ΔKU70をBglII線状プラスミドで形質転換した。スクリーニングのための参照株を得るために、プロモーターバリアントと同じ(ただし代わりに配列番号1の非改変FMDプロモーター及びAOX1プロモーターを有する)ベクターを同様に形質転換した。多コピー組み込みを回避するために、比較的少量である約500ngのDNAを形質転換させた。例えば、1μgの線状pPpT4_Sベクターを使用することにより、典型的には単一コピー形質転換体だけが生じる(Vogl Tら、ACS Synth.Biol.3(2014):188〜191)。
【０１５４】
発現ランドスケープの均一性を示すために、9個の構築物について42個の形質転換体をスクリーニングした。それらの試験した構築物のすべてに関するランドスケープが均一であることが分かったため、構築物1個当たり形質転換体16個だけを選び、2回目のスクリーニングにおいて2つの異なるディープウェルプレート(DWP)で培養した。DWP培養は、Weisら(Weis Rら、FEMS Yeast Res.5(2004):179〜89)によって報告されているプロトコールを適合させた。単一コロニーを選び、使用してBMD(250μl)を96ウェルDWP中に接種し、48時間培養した。その後、BMM2(250μl)を添加して1回目として細胞を誘導した。DWP中での培養の60、72及び84時間後にBMM10(50μl)で更に3回、細胞を誘導した。48、72及び96時間後に試料を採取し、測定した。試料は以下の通り採取した:10μlの細胞培養物を、マイクロタイタープレート(Nuncマイクロウェル96ウェルオプティカルボトムプレート(ポリマー底)、黒色;Thermo Fisher Scientific)中で190μlの脱イオン水と混合した。FLUOstar(登録商標)Omegaプレートリーダー(BMG LABTECH GmbH、Ortenberg、ドイツ)を使用して、eGFP蛍光測定を実施した。488/507nm(励起/発光)で蛍光を測定し、データ評価のために、得られた相対蛍光単位(RFU)をOD600に対して正規化した。
【０１５５】
【表３Ａ】
2019505194.tif 000046
【０１５６】
【表３Ｂ】
2019505194.tif 000047
【０１５７】
【表３Ｃ】
2019505194.tif 000048
【０１５８】
3.結果
試験したHpFMDプロモーター(P_FMD)及びAOX1プロモーター(P_AOX1)野生型配列プロモーターのレポータータンパク質蛍光の結果を、図4に示す。
【０１５９】
a)FMDプロモーターバリアント-点変異及び単一ヌクレオチド挿入
【０１６０】
【表４Ａ】
2019505194.tif 000049
【０１６１】
【表４Ｂ】
2019505194.tif 000050
【０１６２】
b)FMDプロモーターバリアント-コアプロモーター交換
【０１６３】
【表５】
2019505194.tif 000051
【図１】
2019505194.tif 000057
【図２Ａ】
2019505194.tif 000058
【図２Ｂ】
2019505194.tif 000059
【図２Ｃ】
2019505194.tif 000060
【図３】
2019505194.tif 000061
【図４】
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【配列表】
2019505194000001.app
【国際調査報告】
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