【手続補正書】
【提出日】平成19年8月28日(2007.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物胚の発生を少なくとも胚盤胞の段階まで促進するインビトロの方法であって、
少なくとも二つの細胞を有するインビトロの受精胚を取得する段階と、
プロスタグランジン又はプロスタグランジン類似物を添加した培養培地において前記胚を育てることによって、結果的に生じる胚盤胞の質を効果的に向上させる段階と
を有する方法。
【請求項２】
前記向上が胚盤胞の大きさを増大させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記向上が前記胚盤胞の内細胞塊を増加させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記向上が前記胚盤胞の栄養外胚葉の大きさを増大させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記向上が、胚盤胞の大きさ、内細胞塊及び栄養外胚葉の大きさによって形成されるグループから選択される少なくとも二つの性質を増大させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プロスタグランジンがプロスタサイクリン（ＰＧＩ2）若しくはプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロスタグランジン類似物がプロスタサイクリンアゴニストを有する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アゴニストがアイロプロストを有する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プロスタグランジン類似物がプロスタグランジンＥ1（ＰＧＥ1）を有する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
インビトロの受精胚のインビボにおける着床の可能性を高める方法であって、
プロスタグランジン又はプロスタグランジン類似物を添加した培養培地においてインビトロで哺乳動物の受精卵を培養することで、結果的に生じる胚盤胞の性質の向上を効果的に促進する段階を有し、
結果的に生じる胚のインビボにおける着床の可能性が向上される方法。
【請求項１１】
前記プロスタグランジン若しくはプロスタグランジン類似物を添加した培養培地において哺乳動物の受精卵を培養することが、結果的に生じる胚が子宮に着床された時に生存可能な妊娠の確立を更に向上する請求項１０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
従来技術の説明
卵管内の環境は、精子の受精の可能性を高め、分裂する胚の発生を促進する。卵管上皮細胞と共培養された胚は、発生、孵化及び着床を向上させたことが示された[Ｘｕ、２００１年；Ｘｕ、２０００年]。プロスタサイクリン（ＰＧＩ2）は、もともと血液及び血管（ｖａｓｃｕｌａｒ）のホメオスタシスを維持する点に関与すると考えられている。しかしながら、遺伝子ノックアウトマウスにおける最近の観察結果から示唆されることは、プロスタサイクリンが他の生理的機能を有し得ることである。子宮内膜由来ＰＧＩ2の重要性が、シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)−２ノックアウトマウスにおいて行われた観察によって強調される[Ｌｉｍ、１９９７年]。ＣＯＸ−２ノックアウトマウスの子宮内膜は、正常には脱落しなかった。結果として、移入された野生型胚（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ）は、ＣＯＸ−２の欠損した雌マウスには着床できなかった。前述の異常性は、母方に外部からＰＧＩ2類似物の投与によってある程度矯正されることができた[Ｌｉｍ、１９９９年]。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
材料及び方法
試薬の出所及び制度上の承認。
別のものであると記載しない限り、試薬はシグマ社(Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．)（アメリカリ合衆国、ミズーリ、セント．ルイス）(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ)から購入されたものである。ヒトのサンプルの使用は、ヒューマンサブジェクツの保護のための委員会（ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ）(Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄと同等)によって承認された。実験動物の取扱い及び研究プロトコルは動物福祉委員会によって認定された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ウエスタンブロット解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）。
推定されるマウスＩＰのアミノ酸配列(４１７ａ．ａ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ＿ＢＡＡ０５１４４)及びヒトＩＰのアミノ酸配列(３８６ａ．ａ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ＿ＢＡＡ０６１１０)は相同性が高い[Ｋａｔｓｕｙａｍａ、１９９４年]。予備的な検討では、アフィニテイー精製ポリクローナルペプチド抗体(テキサス大学健康科学センターのケーヘルアン博士（Ｄｒ．Ｋｅ−Ｈｅ  Ｒｕａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）から提供)は、マウスＩＰと交差反応することを確認した。ウエスタンブロット解析は以前に説明したように行われた[Ｈｕａｎｇ、２００２年]。簡潔には、６０個のマウス胚盤胞由来の全細胞溶解物が、１０％アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、ニトロセルロース膜（アメリカ合衆国、ニューハンプシャーのシュレイチャ−  アンド  シュエル、インク．）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｉｎｃ．、ＮＨ、ＵＳＡ）に転写された。免疫反応タンパクが、抗体とのインキュベーション及び増強された化学発光（アメリカ合衆国、ニュージャージー、ピスカタウエイのアマ−シャム  バイオサイエンス）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）による視覚化によって検出され、またＳＴＯＲＭ８６０レーザースキャナ（アマ−シャム バイオサイエンス）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って検出された。ヒト血小板ミクロソームは、陽性のコントロールとして用いられた。抗体の特異性は、前吸収抗体を用いる平行実験で確かめられた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
免疫組織化学、蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡解析。
マウス胚が４℃で３０分間、４％パラホルムアルデヒド中に固定された。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄後、胚は０．０５％のＴｗｅｅｎー２０、５％の粉末ミルク及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有トリス緩衝化生理食塩水(ｐＨ７．４)において、室温で２０分間ブロックされた。胚は、２時間ブロッキング緩衝液中でＩＰ抗体(５ｎｇ／ｍｌ)とインキュベーションされ、それから３７℃で３０分間、アレクザ（Ａｌｅｘａ）４８８(２.５μｇ／ｍｌ、アメリカ合衆国、アラバマのモレキュラー  プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＡＬ、ＵＳＡ）)と結合したヤギ抗-ラビットＩｇＧとインキュベーションされた。細胞核は、室温で２０分間、１０μｇ／ｍｌプロピデウム  イオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）によって対比染色された。胚は、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ-Ｇ（登録商標）（アメリカ合衆国、アラバマ、バーミングハムのサザン  バイオテクノロジー  アソシエイツ  インク.）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）に埋め込まれた。蛍光顕微鏡解析のために、胚盤胞は封入剤中に置かれてカバースリップが被せられた。共焦点顕微鏡解析のために、およそ５０μｍのスペーサが、スライドとカバースリップとの間に置かれて胚の３次元形態を保持した。陰性のコントロールには、胚が１０ｎｇ／ｍｌの非免疫ラビットＩｇＧとインキュベーションされた（すなわち、一次抗体濃度の２倍の濃度）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
蛍光顕微鏡解析は、適切なフィルタを備えたツアイス  アキシオプラン２（ＺｅｉｓｓＡｘｉｏＰｌａｎ  ２）顕微鏡を用いて行われた。画像は、ＣＣＤカメラを用いて捕らえられ、アキシオビジョン プログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．６）によって処理された。共焦点顕微鏡解析は、オリンパス  ＢＸ-５０顕微鏡に付属されたバイオラッド  ラジアンス  ２０００（ＢｉｏＲａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２０００）共焦点システム（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、ハーカルスのバイオラッド  ラボラトリーズ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って行われた。その画像は、イメージ  プロ  プラス  プログラム（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ+  ｐｒｏｇｒａｍ）（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、カールスバッドのメデイア−サイバーネテイックス）（Ｍｅｄｉａ−Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って処理された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
統計解析
スチュ-デントのｔ検定又はダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）検定に従った一元配置分散分析が適所に用いられた。ｐ値＜０．０５は統計的に有意とみなされた。量反応曲線の作図及びＥＤ50値(１．０に設定されるヒル勾配を有して)の計算には、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（アメリカ合衆国、カルフオル二ア、サンデイゴのグラフパッド  プリズム  ソフトウエア  インク．）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を備えた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
ＩＶＦ培養培地に胚発生又は着床を高める物質を補足することは、たいていの実験室及び非常に注意を払う培地製造業者によって採用されてきた。この懸念事項には、生殖毒物学、奇形形成、及び場合によってはこのような操作の後生的な影響を含んでいる。ヒト血清を補足された培地中で培養された羊胚由来の子羊は、より重みがあり妊娠期間がより長かった[Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９５年；Ｈｏｌｍ、１９９６年；Ｓｉｎｃｌａｉｒ、１９９９年]。過剰増殖及び新形成を含む先天性異常症、すなわちベックイス−ワインダーマン（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｎｄｅｒｍａｎｎ）症候群は生殖介助術と関係があった。[ＤｅＢａｕｎ、２００２年；Ｍａｈｅｒ、２００３年]。