【手続補正書】
【提出日】平成19年10月12日(2007.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質をコードするヌクレオチドを含んでなる単離された核酸。
【請求項２】  配列番号４、セリンの代わりにアスパラギンを１６３位に有する配列番号４、配列番号６、アスパラギンの代わりにセリンを１４３位に有する配列番号６、配列番号８、セリンの代わりにアスパラギンを１６１位に有する配列番号８、配列番号１０、アスパラギンの代わりにセリンを１６５位に有する配列番号１０および配列番号６の２−２４６位よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む、請求項１記載の核酸。
【請求項３】  配列番号３、５、７、９および２０よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項４】  配列番号３の３４１−１１７１位、配列番号５の７９６−１５６６位、配列番号７の８６９−１６９３位および配列番号９の４５７−１２９３位よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項５】  ストリンジェントな条件下で請求項２記載の核酸にハイブリダイズする単離された核酸。
【請求項６】  請求項１記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項７】  請求項１記載の核酸を含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項８】  単離されたヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質。
【請求項９】  配列番号４、セリンの代わりにアスパラギンを１６３位に有する配列番号４、配列番号６、アスパラギンの代わりにセリンを１４３位に有する配列番号６、配列番号８、セリンの代わりにアスパラギンを１６１位に有する配列番号８、配列番号１０、アスパラギンの代わりにセリンを１６５位に有する配列番号１０および配列番号６の２−２４６位よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１０】  単一のアミノ酸置換を含有する、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１１】  保存された位置には存在しない２以上のアミノ酸置換を含有する、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１２】  ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡにより測定した場合に請求項９記載のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド。
【請求項１３】  ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質に特異的に結合する、または保存されたコアへの結合によりβ３サブユニットファミリーのタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１４】  配列番号３、５、７、９および２０よりなる群から選ばれる配列の少なくとも１つの少なくとも１５個の連続的ヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１５】  ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルに結合する物質の同定方法であって、
（ａ）ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルを発現する細胞を準備し、
（ｂ）ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルに結合することが知られていない物質に、該細胞をさらし、
（ｃ）該細胞への該物質の結合の量を測定し、
（ｄ）工程（ｃ）における結合の量を、対照細胞（該対照細胞は、該対照細胞がヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を発現しないこと以外は、工程（ａ）の細胞と実質的に同一である）への該物質の結合の量と比較することを含んでなり、
工程（ｃ）における結合の量が対照細胞への該物質の結合の量より多い場合、該物質が、ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルに結合するものであることを特徴とする方法。
【請求項１６】  ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルに結合し従ってヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルのインヒビターまたはアクチベーターでありうる物質の同定方法であって、
（ａ）ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルを発現する細胞を準備し、
（ｂ）ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルに結合することが知られている化合物に、該細胞をさらし、
（ｃ）ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルに結合することが知られていない物質の存在下および不存在下、該細胞への該化合物の結合の量を測定することを含んでなり、
該物質の存在下の該化合物の結合の量が該物質の不存在下の場合と異なる場合、該物質が、ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルに結合しヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルのインヒビターまたはアクチベーターでありうることを特徴とする方法。
【請求項１７】  ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビターの同定方法であって、
（ａ）ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質または突然変異ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を宿主細胞内で組換え的に発現させ、それにより、その組換え的に発現したヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質に、他のカルシウム感受性カリウムチャンネルサブユニットタンパク質とのヘテロマーを形成させることにより、カルシウム感受性カリウムチャンネルを形成させ、
（ｂ）ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在下、工程（ａ）で形成したカルシウム感受性カリウムチャンネルの生物活性を測定することを含んでなり、
該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下の、工程（ａ）で形成したカルシウム感受性カリウムチャンネルの生物活性の変化が、該物質が、ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットタンパク質を含有するカルシウム感受性カリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビターであることを示すことを特徴とする方法。
【請求項１８】  遺伝子の転写を促進、増強または抑制するβ３遺伝子内のＤＮＡ配列の同定方法であって、
（ａ）レポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子のコード化ｃＤＮＡ配列に該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）の断片が先行するように、プロモーター−レポーターベクターを構築し、
（ｂ）該ベクターを細胞内にトランスフェクトし、該ベクターにコードされるレポータータンパク質の存在量を測定し、
（ｃ）工程（ｂ）の細胞内のレポータータンパク質の存在量を、該β３遺伝子のプロモーター領域の断片を有さないベクターでトランスフェクトされた細胞内のレポータータンパク質の存在量と比較することを含んでなり、
β３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットを内因的に発現する細胞内でのみ、他のプロモーター要素の不存在下、該レポータータンパク質の存在量を増加させるβ３遺伝子のプロモーター領域の断片が、プロモーター要素であり；β３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットを内因的に発現しない細胞内で、無関係な構成的プロモーター要素の存在下、レポータータンパク質の存在量を減少させる配列が、リプレッサー要素であり；β３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットを内因的に発現させる細胞内で、無関係な構成的プロモーター要素の存在下、該レポータータンパク質の存在量を増加させる配列が、エンハンサー要素であることを特徴とする方法。
【請求項１９】  該ベクターが、該β３遺伝子のプロモーター領域の断片から独立して機能するプロモーターまたはエンハンサー配列要素を含有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】  該レポータータンパク質の存在量をトランスフェクト化細胞の割合に関して正規化する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】  遺伝子の転写を促進、増強または抑制するβ３遺伝子内のＤＮＡ配列の同定方法であって、
（ａ）該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの放射能標識断片を、細胞からの核抽出物と共にインキュベートし、
（ｂ）該インキュベーション物をゲル上で分離することを含んでなり、
細胞からの核抽出物と共にインキュベートした後にゲル内で異なって移動する（「シフトを受ける」）β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片が、β３遺伝子の発現を促進、増強または抑制する核因子に結合するＤＮＡ配列であることを特徴とする方法。
【請求項２２】  該β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片を、請求項１８記載の方法により同定する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】  該細胞がβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットを発現する、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】  該細胞がβ３ａ、β３ｂ、β３ｃまたはβ３ｄサブユニットを発現しない、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】  β３遺伝子の転写調節に関与する核因子の同定方法であって、
（ａ）該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの放射能標識断片を、クローニングまたは精製された転写因子と共にインキュベートし、該インキュベーション物をゲル上で分離することを含んでなり、
β３遺伝子のプロモーター配列要素に結合する因子が、該放射能標識ＤＮＡ断片の移動におけるシフトを誘導し、該β３遺伝子の転写調節に関与することを特徴とする方法。
【請求項２６】  該β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片を、請求項１８または２１記載の方法により同定する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】  β３遺伝子の転写調節に関与する転写因子の同定方法であって、
（ａ）該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの放射能標識断片を、細胞からの核抽出物と共にインキュベートし、該インキュベーション物をゲル上で分離すること、
（ｂ）単一の転写因子または転写因子のファミリーを特異的に認識する抗体を工程（ａ）のインキュベーション物に加え、ついで該インキュベーション物をゲル上で分離することを含んでなり、
工程（ａ）と比較した場合の工程（ｂ）の二本鎖ＤＮＡの移動度におけるスーパーシフトが、該抗体により認識される転写因子が該二本鎖ＤＮＡに結合することを示すことを特徴とする方法。
【請求項２８】  β３遺伝子の転写調節に関与する核因子をコードするクローンをクローニングにより同定する方法であって、
（ａ）該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの放射能標識断片で、発現ライブラリーをスクリーニングし、
（ｂ）該ライブラリーのいずれのクローンが二本鎖ＤＮＡの放射能標識断片に結合するのかを判定し、
（ｃ）工程（ｂ）のクローンを増幅し、配列決定することを含んでなる方法。
【請求項２９】  該β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片を、請求項１８または２１記載の方法により同定する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】  β３遺伝子の転写調節に関与する核因子をクローニングにより同定する方法であって、
（ａ）該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片を安定なマトリックスに結合させ、
（ｂ）ｃＤＮＡにコードされる融合タンパク質を表面に発現するファージを該マトリックスと共にインキュベートし、
（ｃ）該マトリックスに結合しないファージを洗浄により除去し、
（ｄ）該β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの過剰の断片で、該マトリックスに結合したファージを溶出することを含んでなり、
工程（ｄ）で溶出されたファージが、β３遺伝子の転写調節に関与する核因子をコードすることを特徴とする方法。
【請求項３１】  該β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応するＤＮＡを、請求項１８または２１記載の方法により同定する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】  工程（ｄ）で溶出されたファージを増幅し、配列決定する、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】  β３遺伝子の転写調節に関与する核因子の同定方法であって、
（ａ）該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片を安定なマトリックスに結合させ、
（ｂ）細胞からの核抽出物を該マトリックスと共にインキュベートし、
（ｃ）該核抽出物からの非結合タンパク質を該マトリックスから洗浄し、
（ｄ）該β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応する過剰の二本鎖ＤＮＡで、結合タンパク質を該マトリックスから溶出することを含んでなり、
工程（ｄ）からの溶出されたタンパク質が、β３遺伝子の転写調節に関与する核因子であることを特徴とする方法。
【請求項３４】  工程（ｄ）からの溶出されたタンパク質をゲル上で分離し、該ゲルを染色して、該溶出タンパク質の純度を試験することを更に含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】  該ゲル上で分離されたタンパク質を配列決定することを更に含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】  ウエスタンブロットまたは免疫沈降により、該溶出タンパク質を同定するために、該ゲル上で分離されたタンパク質を公知転写因子に対する抗体で免疫学的に分析することを更に含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】  該β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片を、請求項１８または２１記載の方法により同定する、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】  β３遺伝子の転写調節に関与する核因子をクローニングにより同定する方法であって、
（ａ）該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片の少数ないしは幾つかのコピーをレポータータンパク質コード化ｃＤＮＡに先行して含有する酵母株を構築し、
（ｂ）該挿入ｃＤＮＡおよび転写活性化ドメインにコードされる融合タンパク質の形成を可能にするベクター中、細胞からのｃＤＮＡライブラリーを構築し、
（ｃ）（ｂ）のライブラリーを（ａ）の酵母株内に形質転換し、該レポータータンパク質の発現を示す酵母のコロニーを単離することを含んでなる方法。
【請求項３９】  該β３遺伝子のプロモーター領域内に見出される配列に対応する二本鎖ＤＮＡの断片を、請求項１８または２１記載の方法により同定する、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】  単離されたコロニーからベクターを精製し、該ベクター内のｃＤＮＡを配列決定することを更に含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】  該β３遺伝子の転写速度を増強または抑制する物質の同定方法であって、
（ａ）レポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子のコード化ｃＤＮＡ配列に該β３遺伝子のプロモーター領域（配列番号２０のヌクレオチド１−１７，４３６）の断片が先行するように、プロモーター−レポーターベクターを構築し、
（ｂ）該ベクターを細胞内にトランスフェクトし、化合物の存在下および不存在下、該ベクターにコードされるレポータータンパク質の存在量を測定することを含んでなり、
（１）該化合物の存在が該レポータータンパク質の存在量を減少させる場合には、該化合物が、該β３遺伝子の転写速度を抑制する物質であり、（２）該化合物の存在が該レポータータンパク質の存在量を増加させる場合には、該化合物が、該β３遺伝子の転写速度を増強する物質であることを特徴とする方法。
【請求項４２】  該方法が、対照細胞内の該レポータータンパク質の存在量に対する該化合物の効果が測定される対照を更に含み、該対照細胞が、該β３遺伝子のプロモーター領域の断片を欠くベクターで該対照細胞がトランスフェクトされている以外は工程（ｂ）の細胞と実質的に同じ細胞である、請求項４１記載の方法。