(57)【要約】  長期間にわたって１つ以上の同じ単一細胞から少量の細胞内タンパク質及びｍＲＮＡを非破壊的且つ周期的に試料採取する方法及び装置である。特に、本明細書では、ナノストローを含むシステムによる、様々な細胞種にある細胞内タンパク質及び核酸の時間分解長期抽出及び定量的測定の非摂動的方法について記載している。
2019528782.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法であって、
ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を印加して、細胞膜のうちの、前記ナノストローの開口部を覆って延びている部分に１つ以上の細孔を開けるステップと、
前記細胞内から放出されて前記ナノストローに入った試料物質を、前記ナノストローの下の試料収集器内に捕捉するステップと、
前記細胞内の前記試料物質の１５％超が放出される前に、前記上部電極と前記下部電極との間の前記電圧印加を停止して、前記細胞膜が回復することを可能にするステップと、
を含む方法。
【請求項２】
印加する前記ステップは、１〜１００Ｖのパルス電圧を、ナノストローを通して前記上部電極と前記下部電極との間に印加するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料を捕捉する前記ステップは、前記試料物質を捕捉基板上に固定化するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記印加を停止する前記ステップは、パルス幅が約１０マイクロ秒から約５０ミリ秒である１〜１００Ｖのパルス列の印加を１〜３００秒後に停止するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記電圧を印加する前記ステップは、試料領域内で前記ナノストローと複数の追加ナノストローとを通して上部電極と下部電極との間に前記電圧を印加するステップを含み、更に、前記試料を捕捉する前記ステップは、前記ナノストロー及び前記複数の追加ナノストローの中に放出された前記試料物質を前記試料収集器内に捕捉するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノストローを通して前記上部電極と前記下部電極との間に前記電圧を再印加するステップと、試料物質を捕捉するステップと、前記電圧印加を停止するステップと、を最短回復時間後に繰り返すステップを更に含み、前記最短回復時間は１時間より長い、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記最短回復時間は６時間より長い、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉された試料物質の中の第１の時点の試料を保存するステップと、前記ナノストローを通して前記上部電極と前記下部電極との間に前記電圧を再印加する前記ステップと、試料物質を捕捉する前記ステップと、前記電圧印加を停止する前記ステップとを、各繰り返しの間の最短回復時間後に、更なる複数の繰返し回数にわたって繰り返すステップと、を更に含み、前記捕捉された試料物質の中の更なる時点の試料が各繰り返しの為に保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試料収集器内に捕捉されている前記捕捉された試料物質を検出するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料収集器内に捕捉されている前記捕捉された試料物質を定量化するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉された試料物質の中の異なる複数のバイオマーカを識別するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記捕捉された試料物質の中の異なる複数のバイオマーカを定量化するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電圧を印加する前に、前記細胞を取り巻く培地を緩衝溶液とともに交換し、前記高電圧印加の停止後に、前記細胞を取り巻く培地を交換するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
複数の時点において細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法であって、
ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に１〜１００Ｖの電圧を印加して、細胞膜のうちの、前記ナノストローの開口部を覆って延びている部分に１つ以上の細孔を開けるステップと、
前記細胞内から放出されて前記ナノストローに入った試料物質を、前記ナノストローの下の試料収集器内に捕捉するステップであって、前記試料物質を捕捉基板上に固定化するステップを含む前記捕捉するステップと、
前記細胞内の前記試料物質の１５％超が放出される前に、前記上部電極と前記下部電極との間の前記電圧印加を停止して、前記細胞膜が回復することを可能にするステップと、
前記電圧を再印加し、追加試料物質を捕捉するステップの前の少なくとも１時間の最短回復時間の間に前記細胞が回復することを可能にするステップと、
を含む方法。
【請求項１５】
複数の時点において細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法であって、
ナノストロー基板の複数の試料領域のそれぞれにおいて、少なくとも１つのナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を印加して、各ナノストローの開口部を覆って延びている細胞膜を貫通する１つ以上の細孔を開けるステップと、
前記複数の試料領域のそれぞれにおいて試料物質を捕捉するステップであって、前記試料物質は、前記ナノストローに入って前記複数の試料領域のそれぞれに対応する前記少なくとも１つのナノストローの下の複数の試料収集器に放出される、前記捕捉するステップと、
前記上部電極と前記下部電極との間の前記電圧印加を停止するステップと、
前記複数の試料領域のそれぞれにおいて、前記電圧を再印加し、追加試料物質を捕捉するステップの前の少なくとも１時間の最短回復時間の間に前記細胞が回復することを可能にするステップと、
様々な時点において、前記複数の試料領域のそれぞれに対応する別々のバイオマーカを前記捕捉された試料物質の中から識別するステップと、
を含む方法。
【請求項１６】
細胞内物質を非破壊試料採取するシステムであって、
上部領域及び下部領域を有する細胞培養チャンバと、
前記下部領域の上に位置するナノストロー基板であって、複数の試料領域を含む前記基板と、
各試料領域において前記ナノストロー基板を貫通して延びる複数のナノストローであって、各ナノストローは、外径が、細胞の細胞膜に貫入することなく前記細胞を支持するように構成されている、前記複数のナノストローと、
複数の試料物質収集器であって、各試料物質収集器は、前記複数の試料領域のうちの１つの試料領域に対応する、前記複数の試料物質収集器と、
前記上部領域にある第１の電極と、
前記下部領域にある第２の電極と、
前記第１の電極及び前記第２の電極と結合されて、パルス幅が約１０マイクロ秒から約５０ミリ秒である約１〜１００Ｖのパルス電圧を前記複数のナノストローを通して１〜３００秒の継続時間にわたって印加するように構成された制御装置と、
を含むシステム。
【請求項１７】
前記ナノストロー基板は、凹んだ試料領域のパターンを含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記ナノストロー基板は、前記細胞培養チャンバ内に取り外し可能に配置されるように構成された取り外し可能な捕捉基板を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
前記ナノストロー基板は、１つしかない向きで前記細胞培養チャンバに嵌め込まれるようにキー留めされる、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
前記ナノストロー基板はポリカーボネート膜を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２１】
前記ナノストロー基板は、前記試料領域間の前記ナノストロー基板の表面を覆うブロックコーティングを含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２２】
前記ナノストロー基板の試料領域の厚さが１０ｎｍ〜５ミクロンである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２３】
前記細胞培養チャンバの前記下部領域は複数の試料ポートを含み、各試料物質収集器は一意の試料ポートに関連付けられている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２４】
各ナノストローの外径は約２０ｎｍから約１５００ｎｍである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２５】
各ナノストローの外径は１００ｎｍを超えている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２６】
前記複数のナノストローはアルミナナノストローである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２７】
前記複数の試料物質収集器のそれぞれは、前記試料物質と結合するように構成された試料物質捕捉基板を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記複数の試料物質収集器は取り外し可能である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２９】
前記第２の電極は、前記ナノストロー基板と前記複数の試料物質収集器との間に位置する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３０】
前記複数の試料物質収集器は、前記ナノストロー基板と前記第２の電極との間に位置する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３１】
前記複数の試料採取領域は、それぞれの最大径が５〜２００μｍであるように構成されている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３２】
細胞用培地と無培地緩衝液とを自動的に切り替えるように構成された前記細胞培養チャンバに入る１つ以上のポートを更に含み、更に、前記制御装置は、前記パルス電圧を印加する前に細胞用培地と無培地緩衝液とを切り替えるように、且つ、前記パルス電圧を印加した後に無培地緩衝液と細胞用培地とを切り替えるように構成されている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３３】
細胞内物質を非破壊試料採取するシステムであって、
上部領域及び下部領域を有する細胞培養チャンバと、
前記下部領域の上に位置するナノストロー基板であって、凹んだ試料領域のパターンを含む前記基板と、
各試料領域において前記ナノストロー基板を貫通して延びる複数のナノストローであって、各ナノストローは、外径が、細胞の細胞膜に貫入することなく前記細胞を支持するように構成されており、前記外径は約２０ｎｍから約１５００ｎｍである、前記複数のナノストローと、
試料物質捕捉基板を含む、複数の取り外し可能な試料物質収集器であって、各試料物質収集器は、前記複数の試料領域のうちの１つの試料領域に対応する、前記複数の取り外し可能な試料物質収集器と、
前記上部領域にある第１の電極と、
前記下部領域にある第２の電極と、
前記第１の電極及び前記第２の電極と結合されて、パルス幅が約１０マイクロ秒から約５０ミリ秒である１〜１００Ｖのパルス電圧を前記複数のナノストローを通して１〜３００秒の継続時間にわたって印加するように構成された制御装置と、
を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１６年９月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／３９４，０８９号、件名「細胞の長期モニタリングの為の非破壊ナノストロー細胞内試料採取の方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＮＯＮ−ＤＥＳＴＲＵＣＴＩＶＥ  ＮＡＮＯＳＴＲＡＷ  ＩＮＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＳＡＭＰＬＩＮＧ  ＦＯＲ  ＬＯＮＧＩＴＵＤＩＮＡＬ  ＣＥＬＬ  ＭＯＮＩＴＯＲＩＮＧ）」の優先権を主張するものである。本特許出願は、参照によってその全内容が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
文献の引用
本明細書中において言及される全ての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が参照により具体的且つ個別に示されて組み込まれる場合と同程度に、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
連邦支援の研究に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された契約ＨＬ１３３２７２の下に、且つ、米国標準技術局によって授与された契約７０ＮＡＮＢ１５Ｈ２６８の下に、米国政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００４】
本発明は、全般的には、細胞内空間にアクセスして試料採取を行う方法に関し、特に、ナノストローシステムを使用して細胞内空間にアクセスして試料採取を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
タンパク質やｍＲＮＡなどの細胞内成分の定量分析を行うことにより、疾病病因、細胞の老化、発育、分化などに関する細胞挙動を解読する為の非常に重要な情報が得られる。ますます高感度の、単一の細胞、ｍＲＮＡ、及びタンパク質すら検出する方法が開発されており、これらは、細胞機能、表現型の不均質、細胞システム内のノイズなどの新しい洞察につながる。これらの方法は、強力ではあるが、細胞内含有物を抽出する為に細胞を溶解させなければならないことがネックになっており、過去又は未来の状態に関する情報がない単一時点のスナップショットしか得られない。このことが特に問題となるのは、単一細胞レベルでの遺伝子発現における動的変換（誘起多能性及び誘起分化を含む）又は確率的ノイズについて調査する場合である。単一細胞における表現型の不均質及び変動は、並列培養の細胞が代表的でないことが多いことを示しており、これによって、同じ細胞集団からの非破壊試料採取を時間とともに繰り返し行うことが必要であることが明らかになる。
【０００６】
幾つかの細胞の時間分解長期モニタリング（例えば、同じ細胞集団の周期的な試料採取）は、ある程度までは細胞内蛍光測定法で可能になっているが、典型的には、これらの手法では、別の方法でマーク解除された細胞成分の継続的な試料採取が不可能である。そのような手法は、典型的には、細胞内酵素活性を非破壊追跡する為に、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質（ＦＰ）に基づくバイオセンサを必要とする。更に、生体細胞中の２〜５種のタンパク質のモニタリングが、蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）バイオセンサ及び二分子蛍光補完法（ＢｉＦＣ）により実証されているが、それでも、細胞内ターゲットの数がスペクトルの重なりによって制限される。ＦＰラベルの存在も融合タンパク質の機能に干渉する場合があり、センサの特異性の妥当性を検査することが非常に重要である。更に、ＦＰ遺伝子のトランスフェクションは、それ自体が侵入的な過程である。遺伝的に符号化されたバイオセンサ（例えば、量子ドット（ＱＤ）標識抗体や分子指標）も細胞内検出に使用されるが、これらを細胞内に送達することは困難であり、標識化方法及び標識の存在に起因する細胞の摂動も又、有意の問題である。概して、ＦＰ法が利用可能であっても、長期調査は比較的まれである。
【０００７】
ナノテクノロジは、ナノスケール寸法を活用して、センサを非破壊的に細胞内に導入したり、少量の細胞含有物を抽出したりする代替手法を提供する。例えば、ナノワイヤ「サンドイッチアッセイ」が提案されており、この場合は、抗体で官能化された、最大で１００ｎｍ径のナノワイヤが、限定された毒性で細胞に貫入して、特定の酵素を抽出の為に拘束する。アクティス等（Ａｃｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）（アクティス等（Ａｃｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）著「単一細胞ナノバイオプシにより明らかになる、生体細胞におけるコンパートメントゲノミクス（Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｎａｎｏｂｉｏｐｓｙ）」、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）、２０１４年１月２８日、８（１）：５４６−５５３頁）が「ナノバイオプシ」を実証しており、これは、細胞毒性がない方法で単一細胞の細胞質から流体（例えば、約５０ｆＬ）を抽出するものであり、成功率が７０％前後である。別のナノ試料採取手法も示されており、これは、ＡＦＭベースの試料採取プラットフォームを使用して、制御されたｐＬボリューム抽出を行い、その後に単一時点ｍＲＮＡ分析を行うものである。この手法は、ほぼ非破壊的であることが分かっており、細胞生存率が８６％であって、細胞がアポトーシスにならずに喪失しうるボリュームがほんのわずかであることが実証されている。細胞内タンパク質試料採取も可能であり、これは、ポリ−Ｌ−チロシンでコーティングされた磁化カーボンナノチューブを使用して、細胞培養から緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を抽出するものであり、細胞生存率が７０％を超える。これらの有望な結果は、単一時点での挿入と試料採取が可能であることを示している。しかしながら、これらの手法はいずれも、同じ細胞集団の発現を時間追跡する為にそれらの集団からの試料採取を繰り返しておらず、又、測定された量と実際の細胞内含有物とを比較する定量的評価を行っていない。本明細書では、上述の必要性及び問題に対処しうる方法及び装置について記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の課題を解決するためになされたものである。
【０００９】
本明細書では、長期間にわたって１つ以上の同じ単一細胞から少量の細胞内タンパク質及びｍＲＮＡを非破壊的且つ周期的に試料採取する方法及び装置について記載している。特に、本明細書では、ナノストローを含むシステムによる、様々な細胞種にある細胞内タンパク質及び核酸の時間分解長期抽出及び定量的測定の非摂動的方法について記載している。
【００１０】
ここで、本願発明者等は、様々な細胞種にある細胞内タンパク質及びｍＲＮＡの時間分解長期抽出及び定量的測定の非摂動的方法について報告する。これらの方法及び装置を用いて、５日間にわたり、同じ細胞又は細胞集団から細胞質含有物を繰り返し試料採取した。これは、中空ナノストローを組み込んだ細胞培養チャンバを用いて行われ、このナノストローは、定義された試料採取領域において、内径が、例えば、２０〜１０００ｎｍ（例えば、２０〜９００ｎｍ、２０〜８００ｎｍ、２０〜７００ｎｍ、２０〜６００ｎｍ、２０〜５００ｎｍ、２０〜４００ｎｍ、２０〜３００ｎｍ、２０〜２００ｎｍ等）であり、外径が、例えば、５０〜１５００ｎｍ（例えば、５０〜１４００ｎｍ、５０〜１３００ｎｍ、５０〜１２００ｎｍ、５０〜１１００ｎｍ、５０〜１０００ｎｍ、５０〜９００ｎｍ、５０〜８００ｎｍ、５０〜７００ｎｍ、５０〜６００ｎｍ、５０〜５００ｎｍ、５０〜４００ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０〜２００ｎｍ等）であった。本明細書に記載の手法及び装置は、細胞膜の、含有物を覆う部分に、離散的な期間だけ、細孔又は隙間を開けることが可能であり、含有物は、細胞膜と接触しているナノストローの遠位開口部において高度に集束された電気穿孔手法により抽出されてよく、これによって、ナノストローからの試料採取の為の（印加電界によって駆動されてよい）細胞内成分の拡散が可能になる。
【００１１】
抽出された細胞含有物は、従来の方法で分析されてよく、そのような方法として、蛍光、酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ｑＰＣＲ）等がある。このプロセスは、非破壊的であり、試料採取後の細胞生存率が９５％を超えており、長期の分析を可能にする。重要なこととして、細胞抽出物から測定される量は、細胞内の実際の含有物の、統計的に有意な表現を構成することが分かっている。例えば、本明細書で後述されるように、多能性幹細胞由来のヒト心筋細胞（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）の集団から分析された４８のｍＲＮＡ配列のうち、４１が正確に定量化された。本明細書に記載の方法及び装置は、大きな培養の中の選択された細胞副集団から試料採取を行うことが可能であり、これによって、心筋細胞の鼓動のような活発な活動の間でもネイティブな細胞間の接触及び通信が可能になる。これらの方法及び装置は、細胞株及び初代細胞の両方に適用可能である（それらには、本明細書に記載の例、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ、３Ｄ皮質スフェロイドにおいて抽出されたヒト星状細胞等が含まれ、これらに限定されない）。これらの方法及び装置は、同じ細胞又は細胞集団を時間とともに追跡することにより、誘導多能性や分化などのプロセスを含む細胞の動的な挙動を理解する為の新しい道筋を提供する。
【００１２】
例えば、本明細書では、細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法について記載している。これらの方法は、単一時点又は複数時点での試料採取を含んでよい。例えば、これらの方法はいずれも、ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を印加して、細胞膜のうちの、ナノストローの開口部を覆って延びている部分に１つ以上の細孔を開けるステップと、細胞内から放出されてナノストローに入った試料物質を、ナノストローの下の試料収集器内に捕捉するステップと、細胞内の試料物質の１５％超が放出される前に、上部電極と下部電極との間の電圧印加を停止して、細胞膜が回復することを可能にするステップと、を含んでよい。
【００１３】
ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を印加して、細胞膜のうちの、ナノストローの開口部を覆って延びている部分に１つ以上の細孔を開けるステップは、パルス状の（例えば、正、負、及び／又は二相の）電圧パルス、又は電流パルスを印加するステップを含んでよい。これらのパルスは、パルス幅及びパルス繰り返し数が一定又は様々であってよい。電圧は、任意の適切な継続時間にわたって印加されてよい。電圧の継続時間を含む電圧パラメータは、細胞の死滅を防ぐ為に、細胞のサイズ及び種に応じて設定されてよく、実験的に決定されてよい。本明細書において詳述されるように、（パルスパラメータを含む）印加電圧は、放出を防ぐように、拡散及び／又は電荷駆動（例えば、電気泳動）の移動度に応じて選択されてよい。例えば、印加するステップは、１〜１００Ｖのパルス電圧を、ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に印加するステップを含んでよく、このパルス電圧は、例えば、パルス幅が約１０マイクロ秒から約５０ミリ秒（例えば、１０マイクロ秒から１０ミリ秒、２０マイクロ秒から５ミリ秒、２０マイクロ秒から１ミリ秒、２０マイクロ秒から５００マイクロ秒等）であってよい。この電圧は、試料物質が細胞から出て、細胞膜の一時的な開口を通り抜けてナノストローに入ることが可能になる継続時間にわたって印加されてよく、これによって、試料物質が試料収集器に捕捉されることが可能になる。
【００１４】
典型的には、細胞膜に開口を形成する為の電圧印加は、細胞内の試料物質の２５％超（例えば、２０％超、１５％超、１４％超、１３％超、１２％超、１１％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、５％超等）が放出される前に停止される。この時点を過ぎると、細胞が死滅する可能性がより高くなる可能性がある為、電圧印加を停止すること（並びに細胞の回復を可能にすること）が有益である。例えば、電圧印加は、細胞内の試料物質の１５％超が細胞膜の開口を通り抜けて放出される前に停止されてよい。細胞から放出される試料物質の量は、印加される電界の強度（例えば、印加電圧）、細胞のサイズ、及びナノストローのサイズ（例えば、径）に依存する可能性がある。特定のタイプの試料物質が強く帯電するほど、その試料物質のサイズ及び印加電界に応じて、その試料物質が細胞内から放出される速度が高まる。更に、ナノストローの径（例えば、開口部のサイズ）が大きくなるほど、多くの試料物質が放出されうる。典型的には、細胞内の試料物質の１５％超が放出される前に、上部電極と下部電極との間の電圧印加を停止して、細胞膜が回復することを可能にするステップは、パルス幅が約１０マイクロ秒から約５０ミリ秒である１〜１００Ｖのパルス列の印加を１〜３００秒後に停止するステップを含んでよい。
【００１５】
試料は、任意の適切な様式で試料収集器内に捕捉（例えば、収集）されてよい。例えば、試料物質は、流体試料中に懸濁して残ってよく、且つ／又は、基板に拘束又は捕捉されることを含めて、基板に固定化されてよい。例えば、試料を捕捉するステップは、試料物質を捕捉基板に固定化するステップを含んでよい。
【００１６】
一般に、複数のナノストローが使用されてよく、例えば、複数の試料領域のそれぞれにおいて複数のナノストローが使用されてよく、且つ／又は、複数の試料領域にまたがって複数のナノストローが使用されてよい。例えば、電圧を印加するステップは、試料領域内で上記ナノストローと複数の追加ナノストローとを通して上部電極と下部電極との間に電圧を印加するステップを含んでよい。更に、試料を捕捉するステップは、上記ナノストロー及び複数の追加ナノストローの中に放出された試料物質を試料収集器内に捕捉するステップを含んでよい。これらのナノストローは、同一でも様々でもよい。
【００１７】
上述の各ステップ（例えば、電圧を印加するステップ、試料物質を捕捉するステップ等）は、１つ以上の同じ細胞に対して、時間とともに繰り返されてよい。例えば、これらの方法はいずれも、ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を再印加するステップと、試料物質を捕捉するステップと、電圧印加を停止するステップと、を最短回復時間後に繰り返すステップを更に含んでよく、最短回復時間は１時間より長い。典型的には、最短回復時間は数分より長くてよい（例えば、１０分超、１５分超、２０分超、３０分超、４５分超、１時間超、１．５時間超、２時間超、３時間超、４時間超、５時間超、６時間超、１２時間超、２０時間超等であってよい）。
【００１８】
請求項１に記載の方法は、捕捉された試料物質の中の第１の時点の試料を保存するステップと、ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を再印加するステップと、試料物質を捕捉するステップと、電圧印加を停止するステップとを、各繰り返しの間の最短回復時間後に、更なる複数の繰返し回数にわたって繰り返すステップと、を更に含み、捕捉された試料物質の中の更なる時点の試料が各繰り返しの為に保存される。
【００１９】
試料物質は、単一のタイプ又は種の物質（例えば、特定のタンパク質、ｍＲＮＡ等（これらは本明細書ではバイオマーカと総称される場合がある））を含んでよく、或いは試料物質は、多様な試料物質の混合物であってよい。これらの方法はいずれも、試料収集器内に捕捉されている捕捉された試料物質を検出するステップを含んでよい。例えば、これらの方法はいずれも、試料収集器内に捕捉されている捕捉された試料物質を定量化するステップを含んでよい。これらの方法はいずれも、捕捉された試料物質の中の異なる複数のバイオマーカを識別するステップを含んでよい。例えば、これらの方法はいずれも、捕捉された試料物質の中の異なる複数のバイオマーカを定量化するステップを含んでよい。
【００２０】
複数の時点において細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法が、ナノストローを通して上部電極と下部電極との間に１〜１００Ｖの電圧を印加して、細胞膜のうちの、ナノストローの開口部を覆って延びている部分に１つ以上の細孔を開けるステップと、細胞内から放出されてナノストローに入った試料物質を、ナノストローの下の試料収集器内に捕捉するステップであって、試料物質を捕捉基板上に固定化するステップを含む捕捉するステップと、細胞内の試料物質の１５％超が放出される前に、上部電極と下部電極との間の電圧印加を停止して、細胞膜が回復することを可能にするステップと、電圧を再印加し、追加試料物質を捕捉するステップの前の少なくとも１時間の最短回復時間の間に細胞が回復することを可能にするステップと、を含んでよい。
【００２１】
複数の時点において細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法が、 ナノストロー基板の複数の試料領域のそれぞれにおいて、少なくとも１つのナノストローを通して上部電極と下部電極との間に電圧を印加して、各ナノストローの開口部を覆って延びている細胞膜を貫通する１つ以上の細孔を開けるステップと、複数の試料領域のそれぞれにおいて試料物質を捕捉するステップであって、試料物質は、ナノストローに入って複数の試料領域のそれぞれに対応する少なくとも１つのナノストローの下の複数の試料収集器に放出される、捕捉するステップと、上部電極と下部電極との間の電圧印加を停止するステップと、複数の試料領域のそれぞれにおいて、電圧を再印加し、追加試料物質を捕捉するステップの前の少なくとも１時間の最短回復時間の間に細胞が回復することを可能にするステップと、様々な時点において、複数の試料領域のそれぞれに対応する別々のバイオマーカを捕捉された試料物質の中から識別するステップと、を含んでよい。
【００２２】
本明細書では更に、細胞内物質を非破壊試料採取する装置（システム及びデバイスを含む）について記載している。例えば、システムが、上部領域及び下部領域を有する細胞培養チャンバと、下部領域の上に位置するナノストロー基板であって、複数の試料領域を含む基板と、各試料領域においてナノストロー基板を貫通して延びる複数のナノストローであって、各ナノストローは、外径が、細胞の細胞膜に貫入することなく細胞を支持するように構成されている、複数のナノストローと、複数の試料物質収集器であって、各試料物質収集器は、複数の試料領域のうちの１つの試料領域に対応する、複数の試料物質収集器と、上部領域にある第１の電極と、下部領域にある第２の電極と、第１の電極及び第２の電極と結合されて、パルス幅が約１０マイクロ秒から約５０ミリ秒である約１〜１００Ｖのパルス電圧を複数のナノストローを通して１〜３００秒の継続時間にわたって印加するように構成された制御装置と、を含んでよい。
【００２３】
ナノストロー基板は、凹んだ試料領域のパターンを含んでよい。このパターンは、グリッド、又は他の任意のパターンであってよい。凹んだ試料領域は、一方、又は両方の側が凹んでいてよい。
【００２４】
ナノストロー基板は、細胞培養チャンバ内に取り外し可能に配置されるように構成された取り外し可能な捕捉基板を含んでよい。ナノストロー基板は、（例えば、ノッチ、カットアウト、突起等を含むか、且つ／又は、ある形状を有する）１つしかない向きで細胞培養チャンバに嵌め込まれるようにキー留めされてよく、これは、基板が、細胞培養チャンバに嵌め込まれて嵌合することが可能なように特定の構成で方向づけられることを必要とする。
【００２５】
ナノストロー基板は、任意の適切な材料で形成されてよく、例えば、基板はポリカーボネート膜を含んでよい。
【００２６】
ナノストロー基板は、試料領域間のナノストロー基板の表面を覆うブロックコーティング（例えば、ブロックポリマーコーティング）を含んでよい。従って、試料採取領域だけがナノストロー（又は「開いた」ナノストロー）を含んでよい。一般に、ナノストロー基板の試料領域の厚さは、１０ｎｍ〜５ミクロンである（例えば、５ミクロン未満、３ミクロン未満、２ミクロン未満、１ミクロン未満等である）。
【００２７】
細胞培養チャンバの下部領域は複数の試料ポートを含んでよく、各試料物質収集器は一意の試料ポートに関連付けられている。例えば、下部領域は試料物質収集器に対応してよく、変形形態によっては、試料収集器は、細胞培養チャンバの底部から切り離されてよく、且つ／又は、細胞培養チャンバに挿入されてよい。試料物質収集器が液体懸濁状態の物質を収集するように構成されている場合、物質収集器は、試料ポートに加えて、又は試料ポートの代わりに流体収容／格納領域を含んでよい。
【００２８】
ナノストローは、典型的には、細胞に貫入することなく細胞と接触する為の、任意の適切なサイズであってよい。例えば、ナノストローは、外径が約２０ｎｍから約１５００ｎｍであってよい（例えば、１００〜１５００ｎｍ、１５０〜１５００ｎｍ、１５０ｎｍ超、１６０ｎｍ超、１７０ｎｍ超、１８０ｎｍ超、１９０ｎｍ超、２００ｎｍ超等であってよい）。例えば、各ナノストローは、外径が１００ｎｍ超であってよい。
【００２９】
ナノストローは、任意の適切な材料で作られてよく、具体的には、アルミナなどの非粘着性材料で作られてよい。
【００３０】
複数の試料物質収集器のそれぞれは、試料物質と結合するように構成された試料物質捕捉基板（例えば、固相基板、結合材が付着された基板、膜（帯電膜を含む）等）を含んでよい。試料物質収集器は取り外し可能であってよい。
【００３１】
第２の電極は、ナノストロー基板と複数の試料物質収集器との間に位置してよい。代替として、複数の試料物質収集器は、ナノストロー基板と第２の電極との間に位置してよい。
【００３２】
複数の試料採取領域は、それぞれの最大径が５〜２００μｍ（例えば、５〜１５０μｍ、５〜１００μｍ等、例えば、２００μｍ未満、１５０μｍ未満、１００μｍ未満、７５μｍ未満、５０μｍ未満、３０μｍ未満、２０μｍ未満、１５μｍ未満、１０μｍ未満等）であるように構成されてよい。
【００３３】
例えば、細胞内物質を試料採取するシステムが、上部領域及び下部領域を有する細胞培養チャンバと、下部領域の上に位置するナノストロー基板であって、凹んだ試料領域のパターンを含む基板と、各試料領域においてナノストロー基板を貫通して延びる複数のナノストローであって、各ナノストローは、外径が、細胞の細胞膜に貫入することなく細胞を支持するように構成されており、外径は約２０ｎｍから約１５００ｎｍである、複数のナノストローと、試料物質捕捉基板を含む、複数の取り外し可能な試料物質収集器であって、各試料物質収集器は、複数の試料領域のうちの１つの試料領域に対応する、複数の取り外し可能な試料物質収集器と、上部領域にある第１の電極と、下部領域にある第２の電極と、第１の電極及び第２の電極と結合されて、パルス幅が約１０マイクロ秒から約５０ミリ秒である１〜１００Ｖのパルス電圧を複数のナノストローを通して１〜３００秒の継続時間にわたって印加するように構成された制御装置と、を含んでよい。
【００３４】
後述の特許請求の範囲において、本発明の新規な特徴を具体的に説明する。本発明の原理が利用される例示的実施形態を説明する後述の詳細説明と、以下の添付図面とを参照することにより、本発明の特徴及び利点がよりよく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１ａ】乃至
【図１ｆ】ナノストロー（ＮＳ）抽出試料採取装置（例えば、システム、デバイス等）の一例を示す図である。図１ａは、ポリマー膜を使用するシステムの一例を示しており、突き出ているナノストローの外径が約１５０ｎｍである。この膜は、チャンバ（例えば、５ｍｍのガラスシリンダ）の底部を抽出緩衝液につなぐ。試料採取時には、図示されるように、ＮＳウェルがインキュベータから取り外されて、電極（例えば、ＩＴＯ電極）上に配置される。電極パルス（又はパルス列）を使用して細胞膜に穴をあけて、物質がＮＳを通って抽出緩衝液（ピンク）内に拡散することを可能にすることにより、少量の細胞内含有物が試料採取される。そして、その緩衝液のアリコートが標準ピペットで吸引されてよく、従来方式で（例えば、蛍光画像化、ＥＬＩＳＡ、ｑＰＣＲ等により）分析されてよい。図１ｂは、図１ａに示された装置による活性試料採取を示す。試料採取時には、細胞内の細胞内種が、ＮＳを通って、膜の下の抽出緩衝液内へと拡散する。この例では、試料採取領域の範囲は、基板（例えば、ＮＳ膜であり、ここではポリカーボネート膜として示されている）の凹んだ部分によって定義されてよい。試料採取領域のサイズは、活性領域内で成長する細胞だけが試料採取されるように（例えば、リソグラフィによって）定義されてよい。図１ｃ及び１ｄは、図１ａ〜１ｂに示されたように構成されたシステムによる、約１５０ｎｍ径のＮＳと２００×２００μｍの活性試料採取領域との走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像の４５°傾斜したビューを示す。この例では、この窓の外側の細胞が試料採取プロセスの影響を比較的受けないことが実証された。図１ｅ及び１ｆは、（図１ｅでは）４２個の細胞を収容する５０×５０μｍの活性試料採取領域、及び（図１ｆでは）単一細胞を隔離して試料採取を行う為に使用された１５×１５μｍの試料採取領域で、それぞれ培養された細胞の例示的ＳＥＭ画像を示している。
【図２ａ】乃至
【図２ｄ】ＣＨＯ細胞の同じ副集団からＧＦＰ／ＲＦＰを長期的に試料採取する為に使用された、本明細書に記載の方法及び装置の一例を示す図である。図２ａは、２００×２００μｍのＮＳ試料採取領域（破線の正方形）における３８個の細胞の培養のＧＦＰ（緑色チャネル、上側）及びＲＦＰ（赤色チャネル、下側）の蛍光顕微鏡画像を示している。画像は、４時間おきに、本明細書に記載のナノストロー抽出法（ＮＥＸ）試料採取方法が実施される直前に取得された。ＲＦＰトランスフェクションは、８時間の時点の後に実施された。図２ｂは、蛍光顕微鏡で観察された、正規化された細胞ＧＦＰ含有量を、ＮＥＸで抽出されたＧＦＰの量と比較したものである。各時点における細胞の、抽出されたＧＦＰの相対的なレベルと、相対的な細胞内ＧＦＰ発現レベルとの間に有意な統計的差異は観察されなかった。不確かさバーが基本信号の標準偏差を反映する（両因子に関し、ｐ＞０．０５。二元配置分散分析）。図２ｃは、正規化されたＲＦＰ蛍光強度を、抽出された量と比較したものである。ＲＦＰトランスフェクションの前に小さいバックグラウンド信号が存在していたが、抽出されたＲＦＰの明確な増加は、ＲＦＰ発現の実際の増加と相関していた。エラーバーは標準偏差を示す（時点間でｐ＜０．０５。蛍光に対する抽出の場合でｐ＞０．０５。星印２つはＰ＜０．０１を示し、星印３つはＰ＜０．００１を示す。事後テューキー検定））。図２ｄは、時間（試料採取時点）に対する細胞生存率を示す。培養は、試料採取の直後には９５％を超える生存率を示し、細胞の分裂時には時間とともに１００％を超える生存率を示した。
【図３ａ】乃至
【図３ｅ】単一ＣＨＯ細胞からのＲＦＰの長期試料採取を示す図である。図３ａ〜３ｄは、１００×１００μｍの試料採取領域（破線の正方形）における単一ＲＦＰ発現細胞の蛍光顕微鏡画像を示している。ＲＦＰトランスフェクションは、２日目の試料採取時点の後に実施された。図３ｅは、蛍光による、細胞内の較正されたＲＦＰ量を、抽出された量と比較したものである。抽出されたＲＦＰの量は、細胞内のＲＦＰ発現の増加に追従していた。
【図４ａ】乃至
【図４ｄ】本明細書に記載の方法及び装置による試料採取の空間分布を示す図である。図４ａ及び４ｂでは、２００×２００μｍのＮＳ試料採取領域（白い破線の正方形）における２６個の細胞の培養のＧＦＰの蛍光顕微鏡画像が示されている。図４ａは、試料採取前のＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞を示しており、図４ｂは、試料採取直後のＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞を示している。試料採取後の細胞では、局所的に漸減するＧＦＰ強度（暗いスポット。例えば、後述の図１０を参照）が観察されており、これは、ＧＦＰが細胞から取り除かれた場所に対応する可能性が高い。スケールバーは５０μｍであり、これらのスポットをハイライトする為に輝度が高められた。図４ｃは、ＮＳを通して試料採取を行うことの有限要素モデルを示す図である。この例では、細胞は、高さが１μｍの２０×２０μｍのソースとして扱われており、様々な数の、長さが１４μｍで１５０ｎｍ径のＮＳによって抽出緩衝液につながっている。図４ｄは、図４ｃと同様にモデル化された場合の、細胞の最初のＧＦＰが抽出緩衝液内に拡散していく割合を、時間及びＮＳの数の関数として表した一例を示す図である。
【図５ａ】乃至
【図５ｃ】心筋細胞及び星状細胞に由来するヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からの長期的な試料採取の一例を示す図である。図５ａ及び５ｂは、４日間にわたる、同じｈｉＰＳＣ−ＣＭからの長期ＨＳＰ２７抽出を示している。図５ａでは、２日目の試料採取の前に、温度を３０分にわたって４４℃に上げることによって、心筋細胞が刺激された。３日目にＨＳＰ２７のアップレギュレーションが観察された（ｎ＝４。星印はP<0.05を示す。事後テューキー検定。一元配置分散分析））。ＨＳＰ２７レベルは、４日目に下降し始めた。図５ｂでは、熱ショックに曝されていないｈｉＰＳＣ−ＣＭが、４日間にわたって長期試料採取された（ｎ＝４。Ｐ＞０．０５。一元配置分散分析検定）。図５ｃは、３Ｄ培養（ｈＣＳ）においてｈｉＰＳＣから抽出され、ＮＳ上の単層で培養された星状細胞の代表的な画像を示している。星状細胞は、レンチウイルスレポータ（ｈＧＦＡＰ：ｅＧＦＰ）により蛍光標識化されており、抗ＧＦＡＰ抗体により免疫染色されている。星状細胞のモルフォロジは、２０日間にわたる、ＮＳプラットフォーム上での培養及び繰り返し試料採取の後でも維持されていた。
【図６ａ】乃至
【図６ｅ】本明細書に記載の方法によるｈｉＰＳＣ−ＣＭからの抽出におけるｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。図６ａでは、ＮＳ抽出のｍＲＮＡ発現レベル（黒色）と、溶解された細胞からのｍＲＮＡ発現レベル（灰色）とを、デルタＣｔ（ＧＡＰＤＨに対して正規化）で示している。デルタＣｔが高いほど、低いｍＲＮＡ発現が表されており、発現がないことを示すベースラインデルタＣｔは４０サイクルに設定された。検査された４８の遺伝子（例えば、分析された４８の遺伝子のサイズと名前をリストした図１６の表を参照）のうち、７つの遺伝子が、溶解対照との間に統計的差異があることが分かった（生体細胞抽出の場合はｎ＝４。細胞溶解の場合はｎ＝２。星印１つはＰ＜０．０５を示す。星印２つはＰ＜０．０１を示す。９５％信頼区間のｔ検定。プール標準偏差）。図６ｂでは、適合遺伝子と不適合遺伝子のｍＲＮＡサイズ（星印１つはＰ＜０．０を示す。ｔ検定）は、大きい遺伝子と小さい遺伝子との間の検出差がわずかであることを示した。図６ｃは、生体細胞抽出における４０の適合遺伝子と、細胞溶解におけるｍＲＮＡ発現レベルとの間のデルタＣｔの相関を示す（Ｒ＝０．８９。ｐ＜０．０００１。黒色のドットは適合遺伝子を示す。灰色のドットは不適合遺伝子を示す）。図６ｄでは、３日間にわたる１００×１００μｍのＮＳプラットフォーム上での、最大１５のｈｉＰＳＣ−ＣＭの長期ｍＲＮＡ発現レベルが示されている。１８の遺伝子のうちの１５が、一貫した遺伝子発現を示しており、これは試料採取プロセスが信頼できることを示すものである。エラーバーは、技術的複製物の標準偏差である。図６ｅでは、３日目の試料採取の後の最大１５のｈｉＰＳＣ−ＣＭの顕微鏡画像が示されている。これらの細胞は活発に鼓動していたが、それでも正常に試料採取することが可能であった。
【図７ａ】乃至
【図７ｆ】本明細書に記載の全ての装置の為の、パターン化されたナノストロー（ＮＳ）を基板の一部として形成する技術の一例を示す図である。この例では、パターン化されたＮＳ試料採取プラットフォームが製作されており、まず（図７ａにおいて）トラックエッチングされたポリカーボネート膜が用意される。この膜は、１５０ｎｍ径の細孔を有し、細孔の密度は約１×１０８個／ｃｍ２である（例えば、１×１０４〜１×１０９個／ｃｍ２の範囲を含む任意の適切な細孔径が用いられてよい）。図７ｂでは、ポリカーボネート膜の全てのナノ細孔面に１０ｎｍの酸化アルミニウム膜がコーティングされており、この例では、コーティングは、トリメチルアルミニウム及び水を前駆物質として使用する原子層堆積によって行われた。堆積にはａ−ｂ−ｃのパルス形式が用いられた。但し、ａは、前駆物質露出時間（０．０２５秒）であり、ｂは、前駆物質がＡＬＤチャンバ内にとどまる時間（３０秒）であり、ｃは、Ｎ２パージ時間（３０秒）である。図７ｃでは、ＡＬＤコーティングされたポリカーボネート膜の上面に５μｍ厚のポジ型フォトレジスト膜がスピンコーティングされており、スピンコーティングは、例えば、３５００ｒｐｍのスピン速度で６０秒間行われる。フォトレジストがコーティングされた膜は９５℃で２分間ベーキングされて、レジスト溶剤が蒸発した。図７ｄでは、フォトレジストがコーティングされた膜は、強いＵＶ光の正方形パターンに５秒間曝され、その後、現像液に６０秒浸けられて現像された。これら２つのステップによって試料採取領域が形成される。図７ｅでは、フォトリソグラフィ後に、マイクロウェルの酸化アルミニウム面がエッチング除去され、マイクロウェルの内側にはポリカーボネート面が残った。このエッチングは、例えば、高速流の組成が４０ｓｃｃｍのＢＣｌ３、３０ｓｃｃｍのＣｌ２、及び５ｓｃｃｍのＡｒであるプラズマクエスト（Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕｅｓｔ）反応性イオンエッチャ（ＲＩＥ）によって、３００ワットで、室温で行われる。ＲＩＥ中は、露出していないフォトレジストが保護層として働いた。フォトレジストはアルミナ層より格段に厚い為、マイクロウェルの内側のアルミナ層は、マイクロウェルの全体構造に影響を及ぼすことなく完全に除去可能である。図７ｆでは、３００ワットでの、３０ｓｃｃｍのＯ２による酸素ＲＩＥにより、所望の高さ（例えば、１０ｎｍから１０μｍ、２０ｎｍから３μｍ等、１０ｎｍから２μｍ、１０ｎｍから１．５μｍ等）のＮＳが得られるまで、ポリマーのエッチングが選択的に行われた。酸素ＲＩＥによるアルミナのエッチング速度はポリマーのエッチング速度に比べて遅い為、アルミナのエッチングは無視できる。フォトレジストとポリカーボネートはエッチング速度がほぼ同じなので、高さ１μｍのナノストローを作ろうとすると、１μｍのフォトレジストがエッチング除去されることにもなる。フォトレジストの厚さは、エッチング中にフォトレジストを完全には除去することなく、マイクロウェルの内側に３μｍのナノストローを製作することを可能にするのに十分であった。従って、フォトレジストは引き続き、マイクロウェルの外側の細孔を覆うブロック層として働くことが可能である。
【図８ａ】乃至
【図８ｆ】本明細書に記載の方法及び装置との組み合わせで使用可能な方法（及び較正手法）の一例を示す図である。図８ａ〜８ｆでは、等速電気泳動（ＩＴＰ）を使用して、ＧＦＰ及びＲＦＰの濃縮が１０，０００回行われている。ＩＴＰは、イオン移動度が異なる２つの電解質（先導電解質（ＬＥ）及び後続電解質（ＴＥ）を含む）の間の集束ゾーンにターゲット分子を集束させる、電気泳動の一形態である。ＩＴＰ集束ゾーンが完全に形成された後は、蛍光顕微鏡及びＣＣＤカメラで取得されたＩＴＰゾーン画像の蛍光強度を測定することにより、ＦＰの総質量の定量化が可能である。図８ａでは、３〜１０μＬのＬＥがＬＥリザーバに注入され、チャネル全体に充填された。１〜５μＬの、試料とＴＥの混合物がＴＥリザーバに注入された。図８ｂでは、ＴＥリザーバ及びＬＥリザーバに配置された２つのＰｔ電極の間に１１００ＶＤＣが印加された。図８ｃでは、ＩＴＰゾーンの形成の２分後に、ＩＴＰゾーンの蛍光強度が安定化され、全てのＧＦＰ分子がマイクロ流体チャンバ内に完全に集束されたことが示された。図８ｄでは、ＩＴＰゾーンの形成を示す時間分解画像（白い破線はチャネルエッジを示す）が、マイクロ流体チャネルにおける距離の増加とともに示されている。図８ｅでは、ＩＴＰゾーンにおけるＧＦＰ強度が時間（距離の増加）に対して示されている。各距離における蛍光強度値は、図８ｆに示されるように、ＩＴＰゾーンの強度を平均することによって抽出されており、図８ｆは、ＴＥ緩衝液で希釈されたＧＦＰ及びＲＦＰの標準物から測定された強度（ｎ＝３）に基づいて生成されたＧＦＰ及びＲＦＰの標準曲線を示している。
【図９】長期試料採取の別の例を示す図である。図９では、ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞の同じ副集団からのＧＦＰ／ＲＦＰの長期試料採取が示されている。２００×２００μｍ２のＮＳ試料採取領域（破線の正方形）における４８個の細胞の培養のＧＦＰ（緑色チャネル、上）及びＲＦＰ（赤色チャネル、下）の蛍光顕微鏡画像が示されている。画像の取得は、４時間おきに、ＮＳ試料採取プロセスの実施の直前に行われた。１２時間目の時点、リポフェクタミンによるＲＦＰトランスフェクションの４時間後に、ＲＦＰ発現の開始が観察された、
【図１０】「暗いスポット」（試料採取されている細胞内成分が、本明細書に記載の方法によって外に拡散した領域）を示す図である。図１０では、２００×２００μｍのＮＳ試料採取領域（破線の正方形）における２６個の細胞の培養のＧＦＰの蛍光顕微鏡画像が示されている。暗いスポットは、手動計数で取得されており、細胞内での位置を示すように赤色で標識化された。
【図１１ａ】乃至
【図１１ｂ】本明細書に記載の方法による、ＧＦＰ／ＲＦＰの濃度と強度との間の線形関係を示す図である。濃度が０．２５、０．１３、０．０７、０．０４、及び０．０２ｐｇ／ｍｌであるＧＦＰ溶液及びＲＦＰ溶液が、幅１０μｍ、深さ１２μｍのガラス製マイクロ流体チャンバに注入された。ＧＦＰ／ＲＦＰが充填されたマイクロ流体チャンバの顕微鏡蛍光画像が、（図１１ａでは）２００ミリ秒、（図１１ｂでは）２５ミリ秒の露出時間で取得された。ＧＦＰ／ＲＦＰ溶液の蛍光強度が測定された（ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を示す）。
【図１２ａ】乃至
【図１２ｂ】ＮＳプラットフォーム上の心臓細胞のＳＥＭ画像を示す図である。図１２ａ〜１２ｂでは、ＮＳ基板プラットフォーム上にｈｉＰＳＣ−ＣＭが広がっている。図に見られるように、ＮＳは心筋細胞の鼓動によって折れておらず、その代わりに、ナノストローが曲がることでストレスを吸収している。なお、細胞は、ＳＥＭ調製プロセスの間に脱水される為、これらの画像は、培養内の細胞モルフォロジを示すものではない。むしろ、これらの画像は、鼓動する心筋細胞による培養の後のＮＳ残存物を示している。図１２ａのスケールバーは、図１２ｂにも適用される。
【図１３ａ】乃至
【図１３ｂ】ｉＰＳＣ由来の星状細胞と、３Ｄ  ｈＣＳで生成され、ＮＳ上の単層で培養されたニューロンとに、本明細書に記載の方法及び装置を使用した様子を示す図である。図１３ａでは、星状細胞が、ｈＧＦＡＰ：：ｅＧＦＰレポータで標識化され、抗ＧＦＡＰ抗体で共免疫染色されている。図１３ｂでは、ニューロンが、抗ＭＡＰ２抗体で免疫染色されており、ｈＧＦＡＰ：：ｅＧＦＰ＋細胞と共局在化しないように示されている。スケールバーは５０μｍである。
【図１４】本明細書に記載の方法によるｍＲＮＡの共局在化をグラフィカルに示す図である。図１４では、適合ｍＲＮＡと不適合ｍＲＮＡの細胞内局在化が示されている。ｍＲＮＡの細胞内局在化は、試料採取効率に影響を及ぼす可能性がある。これを検査する為に、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡがコードするタンパク質と同じ領域に局在するものと仮定された。そして、この、タンパク質の局在化は、特定の不適合遺伝子の細胞内の１２箇所において、適合遺伝子と比較された。プラズマ膜内で見つかったタンパク質をコードするｍＲＮＡは、より多くの場合で不適合であることが統計的に示されており（Ｐ＜０．０５。ｔ検定）、これは、その特定のｍＲＮＡ配列が細胞質内で固定化されて低検出率につながる可能性がより高いことを示している。
【図１５】本明細書に記載の方法（例えば、「生体細胞」、対照の溶解された細胞、及び陰性対照（電気パルスなし））のナノストロー抽出／拡散）により試料採取された異なる４８の遺伝子の検出レベルの比較をグラフィカルに示す図である。図１５に示された熱マップは、生体細胞からの４８の遺伝子の細胞質レベルが、対照（細胞溶解）の結果とよく適合したことを示している。（ナノストロー抽出による電気穿孔がない）洗浄後に収集された陰性対照では検出される遺伝子信号は微小又は皆無であった。これは、洗浄ステップでバックグラウンド汚染が十分除去されることを示している。
【図１６】分析された４８の遺伝子のサイズ及び名称を示す表である（ハイライトされた遺伝子は不適合遺伝子を示している）。
【図１７ａ】本明細書に記載のナノストロー試料抽出方法による細胞内物質の空間的試料採取（及び／又は経時試料採取）の為に構成された装置の第１の例を示す図である。図１７ａでは、細胞内から試料採取されている物質を捕捉又は収集する為の捕捉基板／面がナノストロー基板の下に配置されている（この捕捉基板／面は様々な時点で取り替え／交換が行われてよい）。図１７ａでは、底部電極は、捕捉基板／面の裏側に配置されている。
【図１７ｂ】細胞内物質の空間的試料採取（及び／又は経時試料採取）の為に構成された装置の別の例を示す図である。この例では、捕捉基板／面は、装置の底部にあってよく（そして取り外されて交換されてよく）、底部電極は、捕捉面の上方にあってよい（例えば、ナノストローの基部に隣接してよい）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書では、全般的には、細胞内物質の非破壊試料採取の方法及び装置について記載している。これらの方法及び装置は、ナノストロー（ＮＳ）が埋め込まれた基板を使用して細胞内部から物質を拡散的に試料採取することに基づいてよい。典型的には、例えば、ナノストローを含む基板（例えば、ポリマー膜）上に関心対象細胞が培養され、これらは離散領域（例えば、定義された領域）に局在化されてよい。ナノストローは、中空であり、基板を貫通して延びており、基板の表面から突き出ている（例えば、図１ａを参照）。例えば、図１ａでは、ナノストロー基板１０１は細胞培養チャンバ１０３内に配置されており、細胞培養チャンバ１０３には上部領域（細胞培養リザーバ１０５）と、抽出緩衝液を保持する下部領域１０７とがある。ナノストロー基板１０１は、下部領域の上に位置し、１つ以上の活性試料領域を含む（例えば、図１ｂを参照）。活性試料領域１０９は、凹んでいてよい。基板は、そのような凹んだ試料領域のパターンを有してよい。このパターンは、グリッドパターン、又は他の何らかの、試料領域の配列であってよい。
【００３７】
図１ａ及び１ｂに示されるように、複数のナノストロー１１１が、各試料領域１１５においてナノストロー基板１０１を貫通して延びてよい。各ナノストローは、細胞の細胞膜に貫入することなく細胞を支持するように外径が設定されてよい（例えば、外径は約２０ｎｍから約１５００ｎｍであってよく、或いは具体的には、１４０ｎｍ超であってよく、例えば、１５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上等であってよい）。
【００３８】
一般に、図１ａ〜１ｆに示された、細胞内物質の非破壊試料採取を行うシステムのような装置は、ナノストローを通してパルス電圧を印加することによって細胞膜が開いたときに細胞から放出される試料物質を収集する複数の試料物質収集器を含んでよい。試料物質収集器１１３は、液体（例えば、試料物質が懸濁される抽出緩衝液）を収集してよく、且つ／又は、拘束された試料物質を含んでよい。例えば、試料収集器１１３は、試料物質捕捉基板を含んでよい。これらのシステムはいずれも、試料物質収集器のアレイを含んでよく、各試料物質収集器は１つの試料領域に対応し、ペアになった試料領域と試料収集器は、他の試料領域と試料収集器から隔離されてよい。
【００３９】
一般に、細胞内物質の非破壊試料採取を行うこれらのシステムはいずれも、上部領域１１７内に第１の電極、そして下部領域１１９内に第２の電極を含んでもよい。制御装置１２１が、第１の電極及び第２の電極と結合されてよく、複数のナノストローを通してパルス電圧を印加するように構成されてよい。上述のように、パルス電圧は、例えば、約１Ｖから約１００Ｖであってよく、パルス幅が約１０マイクロ秒から約５０ミリ秒であってよく、１秒から３００秒の継続時間にわたって印加されてよい。制御装置は、この範囲の値の駆動電圧を印加するように特に適応されてよく、調節可能であってよい。例えば、印加されるピーク電圧、パルス継続時間、及び／又はパルス電圧が印加される継続時間をユーザが調節してよい。制御装置は、（例えば、４時間以上に）プリセットされてよい幾らかの最短回復時間が経過するまで装置が更なる電圧を印加することを制限（例えば、阻止）してもよく、或いは、更なる印加電圧を印加することができない継続時間の値を（例えば、１時間から４８時間の間で）ユーザが選択してよい。
【００４０】
細胞が基板上で培養されている場合、細胞は基板（例えば、ポリマー膜）全体にわたって普通に成長することが可能であり、その為、試料採取領域内の細胞が周辺の細胞と相互に作用し、細胞が単離されなくなる。細胞内試料の収集は、ナノストロー（ＮＳ）を通して電位を印加して、ＮＳ先端部の近くの細胞膜に小さい穴を局所的に開けることによって行われてよい。印加されるエネルギの設定は、これらの穴が開けられてからの（例えば、典型的には２〜５分の）時間間隔の間に、最大で５〜１０％（例えば、１５％未満）のタンパク質、ｍＲＮＡ、及び小分子が、細胞外からの電荷に基づいて拡散及び／又は移動して、ＮＳを介して培養井戸の下の抽出溶液に入る（例えば、図１ｂを参照）ことが可能なように行われてよい。抽出緩衝液としては、オスモル濃度が細胞に十分適合していれば、任意の適切なものが使用されてよく、典型的には、例えば、１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が使用されてよい。この時間間隔（例えば、２〜５分の間隔）の後、細胞内から放出され、ナノストローに入り、ナノストローの下の試料収集器（例えば、抽出緩衝液及び／又は任意の固相担体）に収集された試料物質が、試料収集器から取り出されて、従来の方法（蛍光、ｍＲＮＡ検出、又はＥＬＩＳＡアッセイ等）で分析されてよい。その後、細胞培養ウェルは、新たな試料が必要になるまでインキュベータに戻されてよい。変形形態によっては、ナノストローの下の試料収集器は、取り外し及び／又は交換が可能である。
【００４１】
本明細書に記載の方法（本明細書ではＮＥＸプロセスと称する場合がある）を用いて、１つ以上の、好ましくは多様な細胞内成分（例えば、タンパク質及び／又はｍＲＮＡの含有物）を静的且つ長期的に抽出、評価、及び分析することが可能である。これらの方法及び装置は、非破壊的であることが分かっており、細胞内含有物の、ｍＲＮＡ配列及びタンパク質に関する定量的に有用な情報を提供することが可能である。特に、本明細書に記載の方法及び装置は、細胞生存率が９５％を超えており、長期間にわたる多回リアルタイム試料採取を可能にしており、ｈｉＰＳＣ由来のヒト星状細胞が２０日を超えて十分耐えられる。同じく重要であるのが、細胞全体にわたる抽出種の試料採取プロセスであり、これによって、単一部位の抽出箇所にとどまらない、発現の全体像が得られる。本システムは、全てではない幾つかのより大きな核酸分子（＞１５，０００ｎｔ）に使用されてよく、これは、拡散がより低速であり、細胞質へのアクセス性が制限されているにもかかわらず、使用されてよい。ＮＥＸ試料採取は、単一細胞の場合であっても、このレベルで抽出される物質が少量であることで、適用可能な分析方法が限定されるにもかかわらず成功している。概して、ＮＥＸプロセスは、細胞のタンパク質及びｍＲＮＡの含有物の時間的力学を非破壊的に時間追跡する単純明快な方法であると考えられる。
【００４２】
本明細書に記載のＮＥＸプラットフォームは、複数のナノストローを含む基板（例えば、ポリカーボネート膜）をベースとしてよい。例えば、図１ｃでは、ＮＳの外径が約１５０ｎｍであり、形成された無機ＮＳがポリマーを貫通して延び、表面から１〜３ミクロン突き出ている。図１ａ及び１ｂでは、このＮＳ膜は、２〜５ｍｍ径のガラスシリンダ１０１の底面にマウントされており、ガラスシリンダ１０１は、細胞培養用の４８又は９６ウェルプレートに嵌め込まれている。ＮＳ膜の製造については図７ａ〜７ｆで図示及び説明されており、この例では、ＮＳが表面から延びる平坦なポリカーボネート膜が製造され（例えば、図１ｃを参照）、表面からの高さは容易に制御可能である。特定の細胞試料採取領域を定義することが、例えば、ＮＳ膜の残り部分を、フォトリソグラフィパターニングされたポリマーのようなブロックコーティングでブロックすることにより行われてよい（例えば、図７ａ〜７ｆを参照）。細胞培養中に、ＮＳが露出している選択された領域で成長する細胞だけが試料採取され、ブロックされた領域の細胞は作用を受けないまま残る（図１ｄ及び１ｅ）。試料採取窓の大きさは、１辺が１ミクロン未満から数ミリメートルにわたって調節されてよく、これにより、細胞間の接続性及び通信を維持したままで、単一細胞から１０万個の細胞までのスケーラブルな試料採取が可能になる（例えば、図１ｅ及び１ｆ）。
【００４３】
本明細書に記載のＮＳ状で成長した細胞は、図１ｃに示されるように、正常な細胞挙動及びｍＲＮＡ発現を示すことが分かっている。典型的には、多数の細胞タイプにおいて、径が１００ｎｍ以下のＮＳが自然発生的に細胞膜に貫入し、これによって、小分子を細胞内に送達することが可能になる。一方、より大きなＮＳ（例えば、１１０ｎｍ以上、１２０ｎｍ以上、１３０ｎｍ以上、１４０ｎｍ以上、例えば、１５０ｎｍ以上など）は、細胞膜を破裂させることなく細胞膜に飲み込まれる。但し、細胞質へのアクセスは、短い電気パルス（例えば、約１０〜３５Ｖのパルス）を印加して、ＮＳ細胞界面において細胞膜に小さい穴を一時的に開けることによっても達成可能である。印加されるエネルギは、パルスの２〜５分後に細胞膜が回復して細胞が落ち着いた状態で進化するように設定されてよい。全身性細胞質漏出を防ぐ為に、（例えば、径が約１１０〜１０００ｎｍ、例えば、約１５０ｎｍのＮＳを使用する）幾つかの例では、電気パルスの使用が、試料採取をゲート制御する「弁」によって制御されてよい。従って、本方法及び装置では、ＮＳを通して細胞から含有物が放出された時点で滴定を行い、同時に、残りの培養期間にわたって膜の保全性を維持することが可能である。
【００４４】
従って、これらの方法及び装置は、図２ａ〜２ｄに示されるように、細胞副集団及び単一細胞からの長期リアルタイム試料採取を可能にしうる。この例では、ＮＥＸ試料採取プロセスは、同じ細胞集団における細胞内タンパク質濃度の定量分析について経時的に評価されている。ＮＳで抽出された試料のＧＦＰ蛍光レベルが抽出及び測定され、これらの値が、試料採取された細胞のＧＦＰ蛍光と比較されている。ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞が、２ｍｍのガラスシリンダ上にマウントされた、２００×２００μｍの活性領域を有するＮＳ膜上で培養された。細胞は、４時間ごとに、トータルで１６時間にわたって（例えば、５つの時点で（図２ａの各列を参照））試料採取された。８時間の時点で発現の動的変化がプラスミド含有ＲＦＰによるリポフェクタミントランスフェクションによって調べられ、その発現は１２時間及び１６時間の時点で観察可能になる。各試料採取時点において、ＮＳウェルがインキュベータから取り出され、ありうる汚染物質を除去する為にＰＢＳで洗浄され、ＮＳ窓上の細胞のＧＦＰ強度及びＲＦＰ強度が蛍光顕微鏡法で測定される（図２ａ）。この例では、一連の短い電気パルスが２０秒間印加されて、ＮＳ先端部の細胞膜に小さい穴が開けられ、細胞タンパク質がＮＳ内を拡散して抽出緩衝液に入ることが１０分間可能にされる。その後、ＮＳウェルがインキュベータに戻され、抽出緩衝液内のＧＦＰ／ＲＦＰの量が等速電気泳動（ＩＴＰ）により蛍光分析されて、タンパク質が選択的に濃縮された（この手法の説明については、例えば、図８ａ〜８ｆを参照）。実験全体を通して細胞モルフォロジが正常であり、試料採取プロセス中及びプロセス後に細胞が健康であったことを示す細胞生存率が、試料採取ごとに平均で９５％を超えていた（図２ｄ）。姉妹培養についての実験（例えば、図９）では、定性的な差は見られなかった。
【００４５】
図２ｂは、活性ＮＳ領域における３８個の細胞の、顕微鏡検査による細胞のＧＦＰ蛍光と、ＮＳで抽出されたＧＦＰ／ＲＦＰ強度との定量的な比較を示している。測定値は、存在する細胞の数が異なることを考慮する為に実施ごとに最高値に対して正規化されており、標準偏差を得る為に平均化されている。試料採取された細胞の平均ＧＦＰ発現レベルは、タンパク質の安定発現の場合に予測されるように、有意な変化を示さなかった。ＮＥＸで抽出されたＧＦＰは、この傾向に明確に従っていた。ＮＥＸで測定された相対的なＧＦＰレベルは、５つの時点のいずれにおいても、細胞のＧＦＰ発現レベルとの有意な統計的差（二元配置分散分析）を示していない（時間と、抽出分と傾向の比較の両方においてｐ＞０．０５）。但し、抽出されるＧＦＰ信号は第１の時点において著しく小さく、これは、全てのＮＥＸ実験において一貫して観察されたことであり、このことは、最初の抽出の効率が低いことを示唆している。そこで、統計的偏差のレベルまで上昇しない間は、通常、最初のデータ点は破棄されるべきであるが、ここでは本願発明者等は全ての試料を示している。例えば、図２ａ〜２ｄを参照されたい。
【００４６】
本明細書に記載のＮＥＸ方法（例えば、細胞内から細胞内試料物質を非破壊試料採取する方法）は、時間的力学、即ち、細胞がトランスフェクション後にＲＦＰ蛍光タンパク質を発現し始めた場合のＲＦＰの変化に追従することも可能である（例えば、図２ｃを参照）。抽出されたＲＦＰレベルは、最初の３つの時点では背景蛍光に等しく、その後、３〜４日で急激に増加した。このことは顕微鏡検査画像と一致する（ｐ＜０．００１。二元配置分散分析）。ＮＥＸで抽出された量と蛍光画像化との間では有意な差が観察されなかった（ｐ＞０．０５。二元配置分散分析）。従って、試料採取プロセスでは、細胞発現の動的変化を経時的に測定することも可能である。
【００４７】
この３８個の細胞の副集団に関する結果を踏まえて、単一細胞の試料採取の為の活性ＮＳ領域が１００×１００μｍに縮小された（例えば、図３ａ〜３ｅを参照）。この例では、４日間にわたって１日１回、細胞の試料採取が行われ、ＲＦＰ含有物が、ＩＴＰによって分析され（図３ａ〜３ｄを参照）、蛍光顕微鏡検査画像と比較された。２日目の試料採取の後に、ＲＦＰプラスミドによる細胞のトランスフェクションが、リポフェクタミンを使用して行われた。ＮＳ活性領域内の１つの細胞が３日目に蛍光を発し、４日目に蛍光が強くなった。ＲＦＰの絶対量の測定は、例えば、顕微鏡検査とＮＥＸ測定の両方について較正曲線（図１１Ａ〜１１Ｂを参照）を使用して行われてよく、これにより、直接の定量的な比較が可能になる。図３ａ〜３ｅは、細胞のＲＦＰと単一細胞から抽出されたＲＦＰの較正された質量を示している。抽出されたＲＦＰの発現傾向と実際の細胞濃度は、それらの初期ベースラインに対して定量的に十分一致している。細胞内部のＲＦＰの総質量は、３日目及び４日目には、それぞれ、１．７ｐｇ及び２．０ｐｇであり、それらの試料採取時点における抽出されたＲＦＰの総量は１２０ｆｇ及び１５０ｆｇであった。これは、第３及び第４の試料採取時点での細胞のＲＦＰの総量に対する抽出収率がそれぞれ７％及び８％であることに対応する。
【００４８】
ＮＥＸプロセスは、非破壊的であることの為に、細胞の総含有物のうちのごくわずか（例えば、１５％以下）を抽出するように構成されており、従って、細胞内の絶対濃度を推定する為には相対的な較正が必要である。しかしながら、図２ａ〜２ｄ及び図３ａ~３ｅの反復試料採取での抽出量によれば、各試料採取イベントは高度の一貫性があり、抽出率は細胞ごとに多少ばらつきがあるものの、長期的な抽出量は厳密である。例えば、異なる２つの単一細胞の測定において、１つの細胞の抽出効率が５％で、別の細胞が１０％である場合があるが、各試料採取イベントでは、各細胞から同じパーセンテージが一貫して得られる（例えば、図３ｅ）。従って、本方法は、分析対象物の存在を検出することだけでなく、細胞質の量の経時的な定量化を確実に行うことが可能である。
【００４９】
本明細書に記載の装置及び方法は、試料採取の空間分布及び効率を考慮に入れることも可能である。ＮＥＸプロセスは、細胞全体の含有物、又は単一部位のみの試料を反映するように構成されてよい。試料採取中のＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞内のＧＦＰ強度の低下からのＮＳ抽出の空間分布が評価された。最大４０，０００個の露出ＮＳの２００×２００μｍの領域を有する、パターニングされた膜の上で、ＣＨＯ細胞の培養が夜通しで行われた（例えば、図４ａを参照）。２分間の試料採取期間の間に、ＧＦＰが細胞からＮＳを通って外に拡散し、その後は蛍光強度が低下した領域（暗いスポット）が細胞内に残り、そこでは膜が開いている（図４ｂ）。従って、「開いている」ＮＳの場所と数は、細胞内の暗いスポットにより可視化されることが可能である。試料採取中に２６個中２４個のＣＨＯ細胞がスポットを示しており、試料採取領域内のほとんどの細胞がＮＳによって貫入及び試料採取されていることが分かる。複数の貫入ＮＳ（暗いスポット）が細胞本体の全体にわたって分布していることが観察されており、細胞体領域と周辺領域との間に差はほとんどない。従って、ＮＥＸは、細胞質の全ての領域から試料採取を行うことで、細胞内含有物の全体像を提供すると考えられる。図４ａ〜４ｄを参照されたい。
【００５０】
試料採取中に細胞から抽出された総ＧＦＰは、試料採取の前と後の蛍光強度差から測定可能である。この例では、試料採取の前と後での細胞中の平均ＧＦＰは、およそ０．５０（±０．４４）ｐｇ及び０．４７（±０．３８）ｐｇであり、これは、較正されたボリュメトリックＧＦＰ強度曲線から計算された（図１１ａ〜１１ｂを参照）。これら２４個の細胞から抽出されたＧＦＰは、蛍光強度の変化から６８０ｆｇ、即ち、初期細胞濃度の６％であった。このわずかな量は、図３ａ〜３ｄの単一細胞の抽出率（７％及び８％）と同等でもある。本願発明者等は、細胞から失われた物質の量がわかったので、更に収集効率を計算した。この同じ実験の間に抽出緩衝液内で測定された、ＧＦＰの較正された量は２３０ｆｇ、即ち、細胞から失われた総量の最大３０％であった。これは、妥当な収集効率であるが、抽出及び処理における物質の喪失が限定的ではないことを示している。それとともに、これらの結果は、試料採取領域内の細胞のほとんどが抽出されたこと、複数のＮＳが一度に細胞に貫入すること、細胞の複数の領域から分子が試料採取されたこと、並びに妥当な収集効率で細胞含有物が抽出及び分析されたことを示している。
【００５１】
理論的には、抽出される物質の量は、細胞濃度、種の拡散係数、及びＮＳの幾何学的形状の関数であってよい。この抽出は、一連の、長さ１４μｍ、直径１５０ｎｍのＮＳを通して１倍ＰＢＳ抽出緩衝液に接続された、（直径２０μｍ、高さ１μｍの）細胞容積の有限要素モデル（ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（カリフォルニア州パロアルト））を使用する純粋拡散輸送プロセスとしてシミュレートされた。ＧＦＰ拡散係数が８７μｍ毎秒の場合に時間の関数として細胞から抽出される総ＧＦＰの予想パーセンテージが図４ｄに示されており、これは、実験において観察されたことと一致する。観察された細胞当たりのスポット数（図４ｂ）に近い６個のＮＳが貫入している場合、総ＧＦＰの最大９％が２分間の抽出時間にわたって抽出緩衝液内に拡散し、これは、単一細胞の実験で測定されたＧＦＰが７％及び８％であることとよく一致する。例えば、図５ａ〜５ｃを参照されたい。
【００５２】
本明細書に記載の装置及びシステムは、ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞及び星状細胞から長期的にタンパク質を試料採取することも可能にしうる。例えば、この装置は、図１ａ〜４ｄにおいて説明された装置及び方法を含み、本明細書に記載の方法の動作を示す。
【００５３】
ＮＥＸ方法は、細胞株からのみならず、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からインビトロで導出される細胞型についても、含有物を試料採取する為に用いられてよく、これは、細胞分化及び疾患モデリングに関連する将来の応用に必須である。本願発明者等は、ＥＬＩＳＡで測定された、ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）からの非蛍光熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）の長期的抽出及びオフプラットフォーム分析を評価した（図５ａ〜５ｃ）。熱ショックタンパク質は、外部ストレッサに曝されるとアップレギュレーションされる為、本明細書に記載のように、過渡プロセスの調査に適している。
【００５４】
一例では、本願発明者等は、小細胞集団からの細胞内抽出を検出するほど高感度ではない、ＨＳＰ２７  ＥＬＩＳＡの検出限界（１０．９ｐｇ／ｍｌ、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、カリフォルニア州サンジエゴ）の為、ＮＳプラットフォーム上のｈｉＰＳＣ−ＣＭ平板培養の細胞数を１００，０００（±２５，０００）まで増やした。例えば、図１２Ａ〜１２Ｂを参照されたい。ＮＳ上の培養において７日が経過すると、ｈｉＰＳＣ−ＣＭは鼓動を開始する。連続鼓動によるストレス下でも、ＮＳは、壊れることなく、細胞から引っ張られることもなく、このアクティブに動く組織からでも試料採取を可能にした（図１３Ａ〜１３Ｂ）。細胞内抽出物は、５日間にわたり２４時間ごとに取得された。２日目に、細胞は、（３０分間、４４℃の）熱ショックに曝されることによってストレスがかけられ、これによって、ＨＳＰ２７の合成がアップレギュレーションされることが見込まれた。陰性対照として、熱ショック摂動に曝されない姉妹培養が同時点で試料採取された。
【００５５】
ＮＳプラットフォームは、ヒトＣＭにおけるＨＳＰ２７の時間的発現及びアップレギュレーションに従った。１日目は比較的低濃度で始まり、２日目には、熱ショック摂動の２時間後に、小さいが統計的に有意ではないＨＳＰ２７のレベル上昇があり、これはＨＳＰ２７の発現の遅れを示唆している。３日目にはＨＳＰ２７が１日目及び２日目の約５倍に増加し（ｎ＝４。Ｐ＜０．０５。一元配置分散分析）、４日目及び５日目には減少した。これに対し、対照のＨＳＰ２７レベルは、４日間全体にわたって比較的一定であった（ｎ＝４。Ｐ＞０．０５。一元配置分散分析検定）。第１の抽出点では両データセットとも低い抽出レベルを示しており、これは、ＧＦＰ試料採取実験に関して観察されたことと同様である。対照試料でのＨＳＰ２７のアップレギュレーションが小さいことは、試料採取に起因するストレス反応がごくわずかであることを示しており、カルセイン−ＡＭ標識化により、試料及び陰性対照の両方で細胞生存率が９０％を超えることが確認された。これらの結果は、ＮＳを使用して、鼓動しているｈｉＰＳＣ−ＣＭから非蛍光タンパク質を抽出して測定することが実現可能であることを示している。
【００５６】
ＮＳプラットフォーム上での長期培養及び反復試料採取プロセスの、神経細胞型に対する影響を評価する為に、本願発明者等は、３Ｄ皮質スフェロイド（ｈＣＳ）におけるｈｉＰＳＣ（ｈＣＳ）に由来する星状細胞の生存率を調べた。１３２日の古いｈＣＳにおいて抽出された約５０，０００個の星状細胞及びニューロンがＮＳプラットフォーム上で平板培養され（図６ｃ）、２０日間にわたり１日１回、心筋細胞の場合と同じプロトコルを使用して電気穿孔された。星状細胞は、前述のように、細胞固有レポータ（ｈＧＦＡＰ：：ｅＧＦＰ）により蛍光標識化された。試料採取期間中、毎日、細胞モルフォロジが追跡されており、ＮＳ上で培養されたヒト星状細胞は、様々な刺激及び細胞損傷に対する全体反応性が高いにもかかわらず、プラットフォーム及び毎日の試料採取ウェルに耐えており、１日目から２０日目までモルフォロジの有意な変化はなかった。
【００５７】
本明細書に記載の方法及び装置は、ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞におけるｍＲＮＡ発現レベル、例えば、特定のｍＲＮＡトランスクリプトミクスを検出及び／又は測定することにも用いられた。ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞における、識別可能なこれらのｍＲＮＡ発現レベルを測定することは、遺伝子発現、細胞表現型、及び細胞ごとの不均質性を検出する強力な方法になると考えられる。効率的な逆転写及び単一細胞配列決定の登場により、複数のｍＲＮＡ配列が、同時に、且つタンパク質より高い感度で検出されることが可能である。プライマリｈｉＰＳＣ−ＣＭから抽出されたｍＲＮＡが細胞内部の実際の濃度に統計的に関連付けられるかどうかを検定する為に、本願発明者等は、まず、ｍＲＮＡのＮＥＸ抽出を２分間実施し、これを、溶解された姉妹細胞の調製の為にｍＲＮＡ発現と比較した。ＮＥＸ抽出物は、ウェルの下からピペットで取られ、ランダムプライマを使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、単一細胞ＢｉｏＭａｒｋシステムによって配列される。この結果は、ｈｉＰＳＣ−ＣＭの姉妹培養を溶解させることによって取得された陽性対照（ｎ＝２）、並びに電気穿孔ステップがない陰性対照（ｎ＝４）と比較された。これらの対照は両方とも、ｍＲＮＡ試料と同じく増幅及び分析された。４８個の遺伝子のうち、２５個は、内向き整流性カリウムイオンチャネル（ＫＣＮＪ２）及び幾つかの内在性膜タンパク質（例えば、ＰＬＮ、ＳＣＮ５Ａ）を含む心筋関連遺伝子であり、１３個は幹細胞分化関連遺伝子であり、１０個はハウスキーピング遺伝子であった。
【００５８】
ＮＥＸ抽出物からのｍＲＮＡは、溶解対照試料と定量的に十分一致していた。ＮＥＸ抽出では、量がゼロでない、溶解された全ての遺伝子も検出されており、これは試料ごとに４４の遺伝子検出があったことに相当する。偽陽性は観察されておらず、これは、陽性対照において検出されなかった４つのｍＲＮＡが、細胞抽出物においても検出されなかった為である。抽出物中の（統計的に不適合な遺伝子を除く）各遺伝子のデルタＣｔは、陽性対照と強い相関があった（図６ｃ、Ｒ＝０．８９、Ｐ＜０．０００１）。特に、ＳＭＡＤ２（１０，４２８ｎｔ）のような大きな遺伝子であっても正常に試料採取された（図１６の表を参照）。試料採取後、ｈｉＰＳＣ−ＣＭは健康なモルフォロジを示しており、カルセインＡＭ染色された緑色蛍光は、９５％を超える細胞生存率を示した。図１４に示されるように、電界があるがＮＳがない陰性対照は、検出可能な信号を示さなかった。
【００５９】
４４の検出されたｍＲＮＡ配列の統計的ｔ検定分析では、７つの遺伝子だけが、図４ｃにおいて明るい灰色のドットで示された対照（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）と有意に異なることがわかった。７つの不成功遺伝子の検出効率が低かったことについては幾つかの原因が考えられ、例えば、サイズのせいで拡散率が低かったこと、或いは、細胞内の構造と結合したことなどが考えられる。本願発明者等は、多重検定補正を敢えて含めなかった。これは、そのような手続きが、全体第一種過誤率を維持するものの、第二種過誤の可能性（差分抽出された遺伝子が発見されない可能性）を増やす為である。図６ｂによれば、不適合ｍＲＮＡと適合ｍＲＮＡとのサイズの統計的差異はわずかであり（Ｐ＜０．０１、ｔ検定）、このことは、２〜５分の抽出期間では分子のサイズが大きいほど抽出が困難であるが、結果に大きく影響したのは１６，５６２ｎｔのＲＹＲ２であるということを示唆している。ｍＲＮＡの細胞内局在性も試料採取効率に影響しうる。これは、原形質膜内で見つかったタンパク質をコードするｍＲＮＡが、統計的に、より多くの場合に不適合だった為である（図１４、Ｐ＜０．０５、ｔ−検定）。
【００６０】
本明細書に記載の方法（例えば、ＮＥＸ試料採取）は、長期ｍＲＮＡ測定結果を得る為に、活性挙動プライマリ細胞の同じ集団に対して繰り返し実施されてよい。図６ｄ〜６ｅは、３日間にわたり１日１回測定された、最大１５個のｈｉＰＳＣ−ＣＭからの異なる１８個の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示している。これらの細胞は、試料採取された時点では活性であり、鼓動していたことに注意されたい。更なる細胞単層の存在によって細胞の厳密な計数が困難になったが、平均では、１００×１００μｍの試料採取領域において１５〜２０個の細胞が観察された。測定された発現レベルには顕著な一貫性があり、これによって、試料採取及び分析のプロセスの精度が実証された。１８個の遺伝子のうち、１５個は３日間にわたって高度の一貫性があり、このことは、ＭＹＬ７、ＴＮＮＣ１、及びＡＣＴＢの変化が有意である可能性が高く、遺伝子発現の変動を反映していると考えられることを示している。これらの変動の生物学的起源を最終的に確立するには更なる作業が必要であるが、明らかなこととして、ＮＥＸプロセスは、ｍＲＮＡ発現の変化の有無の測定を、同じ細胞集団について経時的に行うことが可能である。
【００６１】
現時点でのｍＲＮＡ配列決定システムの感度では、単一細胞からのＮＥＸ抽出物の測定は不可能であり、最大で１５〜２０個の細胞が必要である。このことは、抽出効率が最大で７％であることと合致しており、これは、試料当たりの細胞等価物が最大で１．１〜１．４個であることに相当する。単一細胞ｍＲＮＡアッセイの感度が上がれば、この制限はすぐに克服されて、長期間にわたって単一細胞からのｍＲＮＡ測定を繰り返し行うことが可能になるであろう。
【００６２】
本明細書に記載のＮＳ基板はいずれも、パターニング及び製造が可能である。ＮＳ膜のベースになるのは、１ｃｍ当たり１×１０個の細孔が開いた、１５μｍ（±１５％）厚のトラックエッチングされたポリカーボネート膜（ＧＶＳ、Ｓａｎｆｏｒｄ）であってよく、これは、水の濾過や細胞の培養によく使われている。この膜の上に１０ｎｍ厚のＡｌ２Ｏ３層が１１０℃での原子層堆積（ＡＬＤ）によって堆積されており、トラックエッチングされた細孔の内側がＮＳ壁になる。ＮＳを形成するには、Ａｌ２Ｏ３に対して、上面から、ＢＣｌ３及びＣｌ２の反応性イオンエッチングをアルゴン下で行って（３００Ｗ、４０ｓｃｃｍのＢＣｌ３、３０ｓｃｃｍのＣｌ２、５ｍＴｏｒｒ、５分）ポリマーを露出させ、その後、酸素プラズマエッチングを行ってポリマーを取り除き、無機ＮＳを露出させる。フォトリソグラフィによって定義される試料採取領域を製造する為に、５μｍ厚のポジ型フォトレジスト膜（例えば、ＭＥＧＡＰＯＳＩＴ  ＳＰＲ２２０３  ｉ−Ｌｉｎｅフォトレジスト、ダウ（Ｄｏｗ）、オースチン（Ａｕｓｔｉｎ））が、ＡＬＤコーティングされたポリカーボネート膜の表面に、３５００ｒｐｍのスピン速度で６０秒間、スピンコーティングされた。次に、フォトレジストがコーティングされた膜が９５℃で２分間ベーキングされてレジスト溶剤が蒸発し、その後、フォトレジストがコーティングされた膜が強いＵＶ光の正方形パターンに５秒間曝された。曝された後、膜は、ＭＦ−２６Ａ現像液（シップリー（Ｓｈｉｐｌｅｙ）、マールボロ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ））に６０秒間浸けられて現像された。試料採取領域の酸化アルミニウム面が反応性イオンエッチングによって除去されて、試料採取領域の内部にポリカーボネート面が残る。最後に、ポリマーが酸素反応性イオンエッチングによって除去されて、ＮＳが形成される。
【００６３】
本明細書に記載の方法及び装置のいずれにおいても、説明されたようにナノストローを通して細胞から物質を抽出する前に、細胞を掃除して老廃物質及び死滅細胞の断片を取り除くことが行われてよい。例えば、細胞は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））ですすぎ洗いされてよい。一般に、細胞用培地を使用するのではなく、１つ以上の異なる緩衝液（例えば、ＰＢＳ又はＴＥ緩衝液）に細胞を保管してよく、試料採取の前にすすぎ洗いをして培地を取り除いてよい。意外なことに、細胞用培地を使用すると、結果として、試料採取された部分（例えば、捕捉された試料物質）が明らかに汚染された。これは、細胞用培地に含まれたタンパク質及び糖に起因するものと考えられ、それらが、試料採取された含有物の中の汚染物質として現れた可能性がある。試料採取後は、細胞を培地に再度浸けてよい。従って、本明細書に記載の装置はいずれも、試料採取の合間にすすぎ洗い、及び／又は溶液の交換（例えば、細胞用培地と無培地緩衝液の切り替え）を行うように構成されてよい。従って、本装置の細胞培養チャンバは、基板上で成長する細胞を取り巻く物質の追加／除去を行う為のポートを含んでよく、本装置は、試料採取の前及び／又は後に追加及び／又は除去（並びに培地と緩衝液の切り替え）を自動的に行う為の配管及び／又はポンプを含んでよい。
【００６４】
本明細書に記載の方法及び装置のいずれにおいても、既に述べたように、ナノストローを含む基板は、異なる複数の試料領域を含んでよい。これらの試料領域は、試料採取の為に定義された（例えば、リソグラフィによって定義された）試料領域であってよく、マーキングされていてよい（即ち、可視であってよい）。試料領域は、基板の他の部分より凹んでいてよく、そこで細胞が成長している。試料採取の為に開いているナノストローが、試料領域にのみ存在してよい。
【００６５】
更に、これらの方法及び装置のいずれにおいても、負に帯電した種が細胞から出る移動性を与えられるように、（例えば、細胞内への物質の送達と比較して）電界の極性が反転されてよい。
【００６６】
それらを使用する、本明細書に記載の装置及び方法はいずれも、走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）の為の試料調製を含んでよく、例えば、約１０ｎｍのＡｕ／Ｐｄによるスパッタコーティングによって、ＳＥＭの画像化の為のＮＳ膜の調製が行われてよい。生物学的試料の準備として、試料を、０．１ＭのＮａ−カコジラート緩衝液（ｐＨ７．３）中で２％グルタルアルデヒド及び４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で少なくとも４時間固定し、次に、１％ＯｓＯ４で１０分間染色し、次に、３０％、５０％、７０％。９０％。及び１００％の一連のエタノールで脱水を行い、各溶液において室温でのインキュベーションを１０分間行った。脱水された試料は、１００％ＥｔＯＨ内で液体ＣＯ２による臨界点乾燥によって乾燥され、その後、ＳＥＭに備えて、約１０ｎｍのＡｕ／Ｐｄによるスパッタコーティングが行われた。試料の画像化は、ＦＥＩ  Ｓｉｒｉｏｎ  ＳＥＭで行われてよい。
【００６７】
説明された試料採取プロセスを実施する為に、関心対象細胞は、まず、２〜５ｍｍのガラスシリンダ内のＮＳ膜上で、適切な細胞用培地を上に載せて培養された（図１ｂ）。この培養管は、試料が必要になるまで、インキュベータの９６（又は４８）ウェルプレート内に残された。この試料採取プロセスは、５つのステップで実施された。第１に、汚染の可能性を排除する為に、細胞は１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄され、細胞用培地はＰＢＳに変更された。例えば、図１５を参照されたい。第２に、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）電極上でのＩＴＰアッセイ（後のセクションで説明される）の為に、ＮＳシリンダは、ＰＢＳからなる抽出緩衝液、又はＴＥ緩衝液の１〜１５μｌの液滴の上に置かれた（図１ａ）。白金（Ｐｔ）ワイヤが細胞培養緩衝液に浸けられた。このワイヤは対電極として働く。第３に、（ＮＳ膜を挟む）２つの電極の間に、（アノードとカソードの間が）１０〜４５Ｖの方形電気パルスが２０〜６０秒にわたって印加された（パルス継続時間は２００マイクロ秒、繰り返し率は２０Ｈｚ）。これらのパルスによって細胞膜内の細孔が一時的に開かれ、自由に拡散する細胞内のタンパク質及びｍＲＮＡが、ＮＳを通ってＮＳ膜の下面にある抽出緩衝液まで拡散することが可能になった。本願発明者等は、電界の極性が分析対象物の電荷と反対になったときに分子束が増えることに気づいた。ＩＴＯ電極は、負に帯電した分子（例えば、ｍＲＮＡ）の抽出時には正電位に保たれ、正に帯電した分子の抽出時には負電位に保たれた。第４に、電気穿孔後に、試料採取デバイスが抽出緩衝液上に更に０．５〜５分にわたって保持され、これによって、更なる細胞質含有物の拡散が可能になった。抽出プロセスは主に分子の拡散に依存する為、抽出される分子の総量は、拡散係数と濃度の両方に依存することが予想された。従って、大きな分子の抽出の場合には、それらの移動度が低いことから、拡散時間が長くなることが予想される。最後に、抽出された分子は、更なる分析の為に、抽出緩衝液からピペットで取られてＮＳ膜の下に収集された。
【００６８】
第２の電極は、ＩＴＰ電極であってよい。ＩＴＰは、幅５０μｍ、深さ２０μｍの、クロスチャネルデザインのガラス製マイクロ流体チップ内で実施された。先導電解質（ＬＥ）緩衝液及び後続電解質（ＴＥ）緩衝液は、それぞれ、２００ｍＭのトリスと１００ｍＭのＨＣｌ、及び２５ｍＭのトリスと１５０ｍＭのグリシンであった。電気浸透流（ＥＯＦ）を抑える為に、ＬＥ及びＴＥの両方に１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が追加された。試薬は全て、米国ミズーリ州のシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から調達された。ＧＦＰを予備濃縮する為に、まず、マイクロ流体チャネル及びＬＥリザーバに３〜１０μＬのＬＥが充填され、その後、１〜５μＬの、ＴＥとＧＦＰ試料溶液の混合物がＴＥリザーバに注入された。次に、ＬＥリザーバ及びＴＥリザーバに、それぞれ、アノード及びカソードが配置された。これらの電極の間に、１１００Ｖの電界（キースレー（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ）、ビーバートン（Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ））が印加された。電界の印加の直後に、ＧＦＰ  ＩＴＰ集束ゾーンが形成され、アノードに向かって電気移動した。ＧＦＰ強度は、ＩＴＰ開始後２分で安定化された。例えば、図８ａ〜８ｆを参照されたい。
【００６９】
検出可能なタンパク質信号を取得する為に、幾つかの変形形態では、小細胞集団からの細胞内抽出を検出するほど高感度ではない、ＨＳＰ２７  ＥＬＩＳＡの検出限界（１０．９ｐｇ／ｍｌ、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、サンタクララ）の為、本願発明者等は、ＮＳプラットフォーム上の細胞総数を５０，０００（±２５，０００）個に増やした。細胞内抽出は、５日間にわたって２４時間ごとに行われた。ゆるく吸着しているタンパク質を取り除く為に、各試料採取の前に細胞がＰＢＳで洗浄された。２日目に、細胞を４４℃の熱ショックに３０分曝すことにより、細胞にストレスがかけられた。これにより、ＨＳＰ２７の合成のアップレギュレーションが期待された。２日目の抽出物の収集は、熱ショックの２時間後に行われた。熱ショック摂動に曝されていない細胞も、陰性対照として試料採取された。
【００７０】
本明細書に記載の方法及び装置を用いて、ｈｉＰＳＣ−ＣＭからのＲＮＡ抽出が実施されてよい。例えば、ＮＳを使用してｍＲＮＡが抽出されてよく、その後にＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲを使用して増幅及び分析が行われてよい。少数の細胞に関連する確率的変動を平均化する為に、本願発明者等は、１００，０００（±５０，０００）個の細胞をＮＳウェルで培養することを選択した。細胞は、ＰＢＳ緩衝液ですすぎ洗いされて異物や排出物を取り除かれ、その後、試料採取が２．０分にわたって前述のように実施された。ｍＲＮＡはＲＮアーゼの存在下では急速に劣化する為、担体ＲＮＡ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））及びＲＮアーゼ抑制剤（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ））が抽出緩衝液に試料採取前に追加され、それぞれが１μｇ／ｍｌと１Ｕ／μＬである混合物が作られた。抽出緩衝液中のｍＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ））により、ｃＤＮＡに逆転写された。次に、そのｃＤＮＡが、１５サイクルにわたって予備増幅され、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＴＭ）−５（ジモリサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））により精製された。予備増幅されたｃＤＮＡは、その後、４８の遺伝子プライマにより増幅され、標準プロトコルに従う集積流体回路のフリューダイム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）チップ（フリューダイム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）、パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）））においてｑＰＣＲにより分析された。
【００７１】
抽出されたｍＲＮＡを予備増幅する為に、０．５μｌのＤＥＰＣ処理水と、０．５μｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）と、０．５μｌのｄＮＴＰ試薬とが、５μｌのｍＲＮＡ抽出物と混合された。このｍＲＮＡ溶液は、混合され、遠心分離機に短時間かけられ、その後、６５℃で５分間加熱され、氷の上で少なくとも１分間インキュベートされた。２μｌの５倍ＳＳＩＶ緩衝液と、０．５μｌのＤＴＴと、０．５μｌのＲＮアーゼ抑制剤と、０．５μｌのスーパースクリプトＩＶ  ＲＴアーゼとが、アニールされたＲＮＡ溶液に追加された。組み合わされた反応混合物が５０℃で２０分間インキュベートされ、その後、この混合物を８０℃で１０分間インキュベートすることによって、反応は不活性化された。この組み合わされた反応混合物に、１０μｌのプールされたアッセイ混合物と、２０μｌのＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐマスターミックスとが追加された。第６に、混合物は以下の条件で予備増幅された。即ち、約９５℃で１０分間保持するサイクルを約１５〜２０回、９５℃で１５秒、６０℃で４分間のサイクルを１５〜２０回繰り返した。最後に、予備増幅されたｃＤＮＡは、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＴＭ）−５により精製され、６μｌのＤＮＡ溶離緩衝液で溶離された。予備増幅されたｃＤＮＡは、遺伝子発現用フリューダイムダイナミックアレイＩＦＣ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ  ＩＦＣ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を使用して検出された。
【００７２】
本明細書に記載の方法及び装置は、ｈＣＳ由来の星状細胞のＧＦＰ抽出及び免疫細胞化学を培養及び実施するように構成されてもよい。ヒト皮質スフェロイド（ｈＣＳ）は、前述のように、ｉＰＳＣ由来であった。深部皮質層及び表面皮質層のニューロンの生成後に、ｈＣＳにおいて星状細胞産生があり、最長で１０週間後に、インビトロ皮質ニューロンに付随して非反応性星状細胞網が生成される。試料採取実験では、インビトロで１３２日目のｈＣＳは、酵素的に解離しており、デバイス当たり５００，０００〜７５０，０００個の細胞密度でＮＳ上に平板培養されている。平板培養が終了した日に、平板培養された星状細胞がウイルスレポータ（ｈＧＦＡＰ：：ｅＧＦＰ）により標識化された。ＧＦＰ試料採取では、細胞は最長で２０日間、ＮＳ上に保持され、培地は毎日交換された。短い電気パルス（４５Ｖ、パルス幅２００マイクロ秒、継続時間２０秒）が細胞に毎日印加された。免疫細胞化学の為に、ＮＳ上の細胞は、４％ＰＦＡで１０分間固定され、星状細胞を標識化する抗ＧＦＡＰ抗体、ニューロン（ＭＡＰ２）を標識化する抗ＭＡＰ２抗体、及びフィラメントを標識化する抗アクチン抗体により免疫染色された。
【００７３】
細胞内動的過程を測定し、細胞の不均質性を捕捉することは、特に単一細胞レベルでは、分子生物学及び細胞生物学において活発な研究分野になっている。試料採取のモダリティ及び感度における急速な技術的発展にもかかわらず、これらの方法は依然として、試料抽出の為には細胞を溶解させる必要があることによって制限されている。本明細書に記載の方法及び装置は、生体細胞からのタンパク質及びｍＲＮＡの長期的非破壊的抽出と定量化の為の、ＮＳベースの試料採取プラットフォームを提供する。手順自体はきわめて単純明快であって、細胞膜の、ＮＳの近くの小さな領域を局所的に穿孔し、細胞含有物が下の抽出緩衝液に拡散していくことを可能にするというものである。このプロセスは、シンプルな設備と一般的な電圧源を必要とし、ほとんどの分析室で実現可能でなければならない。
【００７４】
本明細書に記載の、受動拡散による抽出は、結果を、可能な種のうちのごくわずかに有意に偏らせるものとはされていない。タンパク質及びｍＲＮＡは、広いサイズ範囲にわたってむらなく試料採取されており、細胞含有物は、より小さな種と同様の割合で見つかっている。より小さなｍＲＮＡがわずかに優位であったが（例えば、図６ｂを参照）、これはほとんどＲＹＲ２の影響に起因するものであり、そのデータ点がなかったら、統計的差異はなかったであろう。ｍＲＮＡ配列の大部分（４１／４８）が正常に分析されたという事実は、意味のある生物学的評価を行うのに十分な数の遺伝子がモニタリング可能であることを示唆している。
【００７５】
別の重要な態様は、ＮＥＸプロセスが非摂動的だったことであり、このことは、各試料採取イベント後の細胞生存率が９５％を超えていたことから明らかである。２０日間にわたる毎日のヒト星状細胞からの試料採取の後であっても、観察されたモルフォロジの変化はごくわずかであった（モルフォロジは、摂動に対して敏速に反応することが知られている）。細胞生存率は、長期調査の為のクリティカルな指標である。例えば、試料当たりの細胞生存率が８０％であれば、細胞の死滅までに取得可能な試料数は平均で３であるが、生存率が９５％であれば、平均で１４になる。このことは特に、細胞のアポトーシスで実験が終わってしまう単一細胞の長期測定の場合に重要である。
【００７６】
ＮＥＸが細胞生物学の長期調査に適するものである為の、他の重要な特徴が幾つかある。第１に、抽出された分子は細胞培養から空間的に分離され、これにより、ピペット又はマイクロ流体デバイスによるシンプルな収集が可能になる。これにより、将来の進歩した分析技術が、試料採取プラットフォームとしてのＮＥＸプロセスと組み合わされることが可能になる。第２に、パターン化されたＮＳ試料採取領域は、細胞の発育及び分化にとって重要な、細胞同士の正常な接続性及び通信を維持しながら、スケーラブルな数の細胞が分析されることを可能にする。第３に、ＮＳプラットフォームは、細胞株（ＣＨＯ）及びｈｉＰＳＣ由来細胞（３Ｄ培養において抽出された心筋細胞又は神経細胞）を含む、検査された全細胞タイプに適合した。
【００７７】
従って、この試料採取技術は、細胞の動的な活動又は変換を調査すること、例えば、インビトロでの多能性幹細胞の分化中のシグナリング経路を追跡することや、細胞の不均質性を捕捉することに有用であることが可能である。微小流路を統合して、９６チャンバ単一細胞分析設計と同様の、幾つかの独立した細胞ウェルから一度に試料採取することにより、スループットを高めることが可能である。 そのようなシステムは、大規模集団から単一細胞に至る、細胞の生育、分化、及び疾患病状の背後にある細胞機構の理解に影響を及ぼしうる。
【００７８】
例えば、図１７ａ及び１７ｂは、図１ａ〜１ｂに示された装置と同様の装置の例を示しており、これらは、空間分解試料採取を行うように構成されている。例えば、本明細書に記載の装置の一部においては（例えば、図１７ａ）、第２の面１７０３（例えば、取り外し可能な試料物質収集器）がナノストロー膜１７３３のすぐ下に配置されてよく、これによって、細胞１７０５からナノストロー１７０７を通して抽出された分子が、試料物質がナノストロー膜１７３３の底面においてナノストロー１７０７から出たときに、第２の試料物質収集器に物理的又は化学的に拘束されることが可能である。
【００７９】
第２の面１７０３（例えば、取り外し可能な試料物質収集器）をナノストロー膜１７３３のすぐ近く（例えば、数十マイクロメートル以内）に配置することにより、抽出された分子が、横方向に拡散して遠ざかる間もなく拘束されることを可能にすることができ、これによって、ナノストロー上の細胞の２次元空間分解能が確保されうる。従って、この構成は、ナノストロー膜上の細胞の配置に対応する、抽出された分子のマップを取り外し可能な試料物質収集器の上に形成することを可能にすることができ、抽出された分子のそれぞれがどの細胞に由来するものかが分かるようになる。
【００８０】
上述のように、これらの変形形態のいずれにおいても、取り外し可能な試料物質収集器は、試料採取手順を繰り返すたびに取り外し又は交換されてよく、これによって、試料採取された細胞の時間経過が得られる。例えば、ナノストロー膜１０７３は、抽出された細胞含有物（試料物質）を捕捉する為に第２の取り外し可能な試料物質収集器（例えば、面）の上に配置されてよく、その後、同じ細胞がまだ付着していて比較的平静なナノストロー膜は、別の時点で試料物質を収集する為に別の取り外し可能な試料物質収集器まで動かされてよい。これを新しい取り外し可能な試料物質収集器で繰り返すことにより、細胞の含有物の試料は、時間に対して、単一細胞分解能を下回る空間分解能が確保されることが可能である。この時間経過の間のどの時点においても、細胞を刺激するか、他の方法で検査する為に、細胞の刺激又は摂動（例えば、加熱、物質の追加等）が加えられてよい。
【００８１】
従って、この方法及び装置は、個々の細胞の分子含有物を、大規模並列方式で（例えば、最大で数千個の細胞を一度に）経時追跡することが可能である。
【００８２】
上述のように、任意の適切な、取り外し可能な試料物質収集器が使用されてよい。例えば、取り外し可能な試料物質収集器は、捕捉される分子が中に入ったり結合したりすることが可能な透過膜であってよく、或いは、固体支持物（例えば、ガラス、金属、又はプラスチック）であってよい。捕捉された分子（試料物質）は、例えば、物理的に吸着されてよく、例えば、反対の極性に帯電されたポリマー膜に静電的に拘束されてよい。例えば、ｍＲＮＡは負であり、正に帯電したポリマー膜に静電的に拘束されてよい。取り外し可能な試料物質収集器は、固体支持物であってよく、その上に捕捉剤を有してよい。捕捉対象物（例えば、タンパク質、代謝産物、小分子）に応じて、様々な捕捉分子が、取り外し可能な試料物質収集器、及び／又は取り外し可能な試料物質収集器の様々な領域に拘束されてよい。
【００８３】
例えば、ｍＲＮＡの捕捉及び分析の場合は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールを特に拘束するポリ（ｄＴ）が、取り外し可能な試料物質収集器、又は取り外し可能な試料物質収集器の（例えば、特定の試料領域に対応する）領域の上で固定化されてよい。空間情報は、取り外し可能な試料物質収集器を、試料領域及び／又はナノストロー膜に対して１つしかない並び方でキー留めすることによって、保全されることが可能である。空間情報を保全する別の方法は、位置バーコードをＤＮＡ−ポリ（ｄＴ）捕捉分子内に追加することである。そして、ｍＲＮＡはｃＤＮＡに変換されてよく、これは標準的なバルク法で配列決定されてよい。少数のｍＲＮＡを単一分子分解能及び確保された空間分解能で検出する為に、ｓｍＦＩＳＨ又は同様の画像化方法が用いられてよい。
【００８４】
図１７ｂは、本明細書に記載の装置の別の変形形態を示す。これらの装置のいずれにおいても、図１７ｂに示されるように、電気穿孔用の底部電極１７１７が、ナノストロー膜の底部に配置されてよく、或いは、取り外し可能な試料物質収集器がイオン伝導している場合には、図１７ａに示されるように、下部電解質が捕捉用の取り外し可能な試料物質収集器の両側に広がってよく、取り外し可能な試料物質収集器の下に電極が配置されてよい。図１７Ａでは、取り外し可能な試料物質収集器１７０３’が第２の面１７０３によって支持されている。上部電極１７０９は、いずれの場合にも、ナノストロー基板１７２３の上方にある。
【００８５】
本明細書に記載の方法（ユーザインタフェースを含む）はいずれも、ソフトウェア、ハードウェア、又はファームウェアとして実装されてよく、プロセッサ（例えば、コンピュータ、タブレット、スマートフォン等）によって実行可能な一連の命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体として記載されてよく、それらの命令は、プロセッサによって実行された場合に、表示するステップ、ユーザと通信するステップ、分析するステップ、（タイミング、周波数、強度等を含む）パラメータを修正するステップ、判定するステップ、アラートするステップ、又は同様のステップを含んでこれらに限定されないステップのうちの任意のステップの実行をプロセッサに制御させる。
【００８６】
本明細書において、ある特徴又は要素が別の特徴又は要素の「上に（ｏｎ）」あると言及された場合、その特徴又は要素は、直接その別の特徴又は要素に接していてよく、或いは、介在する特徴及び／又は要素が存在してもよい。 これに対し、ある特徴又は要素が別の特徴又は要素の「直接上に（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｏｎ）」あると言及された場合、介在する特徴及び／又は要素は存在しない。又、当然のことながら、ある特徴又は要素が別の特徴又は要素に「接続されている（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、「取り付けられている（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、又は「結合されている（ｃｏｕｐｌｅｄ）」と言及された場合、その特徴又は要素は、直接その別の特徴又は要素に接続されているか、取り付けられているか、結合されていてよく、或いは、介在する特徴又は要素が存在してもよい。これに対し、ある特徴又は要素が別の特徴又は要素に、「直接接続されている（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、「直接取り付けられている（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ）」、又は「直接結合されている（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ）」と言及された場合、介在する特徴又は要素は存在しない。そのように記載又は図示された特徴及び要素は、１つの実施形態に関して記載又は図示されているが、他の実施形態にも当てはまってよい。又、当業者であれば理解されるように、ある構造又は特徴が別の特徴に「隣接して（ａｄｊａｃｅｎｔ）」配置されていて、その構造又は特徴が言及された場合、その言及は、隣接する特徴と部分的に重なり合うか、隣接する特徴の下層となる部分を有してよい。
【００８７】
本明細書において使用された術語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本開示の限定を意図したものではない。例えば、本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに矛盾する場合を除き、複数形も同様に包含するものとする。 更に、当然のことながら、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び／又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という語は、本明細書で使用された際には、述べられた特徴、手順、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を明記するものであり、１つ以上の他の特徴、手順、操作、要素、構成要素、及び／又はこれらの集まりの存在又は追加を排除するものではない。本明細書では、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、関連付けられて列挙されたアイテムのうちの１つ以上のアイテムのあらゆる組み合わせを包含するものであり、「／」と略記されてよい。
【００８８】
「下に（ｕｎｄｅｒ）」、「下方に（ｂｅｌｏｗ）」、「下方の（ｌｏｗｅｒ）」、「上方の（ｏｖｅｒ）」、「上方の（ｕｐｐｅｒ）」などのような空間的に相対的な語句は、本明細書では、図面に示されるような、１つの要素又は特徴と別の要素又は特徴との関係を説明する場合に説明を簡単にする為に使用されてよい。当然のことながら、この空間的に相対的な語句は、使用時又は操作時の器具の、図面で描かれる向きに加えて、それ以外の向きも包含するものとする。例えば、図面内の器具が反転された場合、別の要素又は特徴の「下に（ｕｎｄｅｒ）」又は「真下に（ｂｅｎｅａｔｈ）」あると記載された要素は、その別の要素又は特徴の「上に（ｏｖｅｒ）」方向づけられることになる。従って、例えば、「下に（ｕｎｄｅｒ）」という語句は、「上に（ｏｖｅｒ）」及び「下に（ｕｎｄｅｒ）」の両方の向きを包含しうる。本装置は、他の方向づけ（９０度回転又は他の方向づけ）が行われてよく、それに応じて、本明細書で使用された空間的に相対的な記述子が解釈されてよい。同様に、「上方に（ｕｐｗａｒｄｌｙ）」、「下方に（ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ）」、「垂直方向の（ｖｅｒｔｉｃａｌ）」、「水平方向の（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）」などの用語は、本明細書では、特に断らない限り、説明のみを目的として使用される。
【００８９】
「第１の」及び「第２の」という語句は、本明細書では様々な特徴／要素（ステップを含む）を説明する為に使用されてよいが、これらの特徴／要素は、文脈上矛盾する場合を除き、これらの語句によって限定されるべきではない。これらの語句は、ある特徴／要素を別の特徴／要素と区別する為に使用されてよい。従って、本発明の教示から逸脱しない限り、第１の特徴／要素が後述時に第２の特徴／要素と称されてもよく、同様に、第２の特徴／要素が後述時に第１の特徴／要素と称されてもよい。
【００９０】
本明細書及び後続の特許請求の範囲の全体を通して、別段に記述しない限りは、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という後、及びその変形である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、方法及び物品（例えば、装置（ｄｅｖｉｃｅ）及び方法を含む構成及び装置（ａｐｐａｒａｔｕｓ））において様々な構成要素が相互連帯して使用されてよいことを意味する。例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられた全ての要素又はステップの包含を意味するものであって、他のあらゆる要素又はステップの排除を意味するものではないことを理解されたい。
【００９１】
一般に、本明細書に記載の装置及び方法はいずれも、包括的であると理解されるべきであるが、構成要素及び／又はステップの全て又は一部が代替として排他的であってよく、且つ、様々な構成要素、ステップ、副構成要素、又は副ステップで「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、或いは代替として「本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」と表現されてよい。
【００９２】
実施例において使用される場合も含め、本明細書及び特許請求の範囲において使用されているように、且つ、特に断らない限り、あらゆる数値は、「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語句が前置されているものとして読まれてよく、たとえ、その語句が明示的に現れていなくても、そのように読まれてよい。「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語句は、大きさ及び／又は位置を示す場合に、記載された値及び／又は位置が、妥当な予想範囲の値及び／又は位置に収まっていることを示す為に使用されてよい。例えば、数値は、述べられた値（又は値の範囲）の±０．１％の値であってよく、述べられた値（又は値の範囲）の±１％の値であってよく、述べられた値（又は値の範囲）の±２％の値であってよく、述べられた値（又は値の範囲）の±５％の値であってよく、述べられた値（又は値の範囲）の±１０％の値であってよく、他のそのような値であってよい。本明細書で与えられるいかなる数値も、文脈上矛盾する場合を除き、その値の前後のおおよその値も包含するものと理解されたい。値「１０」が開示されている場合は、「約１０」も開示されている。本明細書に記載のいかなる数値範囲も、そこに包含される全ての副範囲を包含するものとする。又、当然のことながら、当業者であれば適正に理解されるように、ある値が開示されていれば、その値「以下の」値、その値「以上の」値、及びそれらの値の間の可能な範囲も開示されている。例えば、値「Ｘ」が開示されていれば、「Ｘ以下の」値、及び「Ｘ以上の」値（例えば、Ｘが数値の場合）も開示されている。又、本出願全体を通して、データが幾つかの異なるフォーマットで与えられていること、並びにこのデータが終点及び始点を表していて、これらのデータ点の任意の組み合わせにわたる範囲を有することも理解されたい。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点「１５」が開示されていれば、１０と１５の間の値だけでなく、１０及び１５より大きい値、１０及び１５以上の値、１０及び１５より小さい値、１０及び１５以下の値、及び１０及び１５に等しい値も開示されていると見なされる。２つの特定の単数の間の各単数も開示されていることも理解されたい。例えば、１０及び１５が開示されていれば、１１、１２、１３、及び１４も開示されている。
【００９３】
ここまで様々な例示的実施形態を説明してきたが、特許請求の範囲によって示される本発明の範囲から逸脱しない限り、様々な実施形態に対して、幾つかある変更のいずれが行われてもよい。例えば、記載された各種方法ステップが実施される順序は、代替実施形態では変更されてよい場合が多く、代替実施形態によっては、１つ以上の方法ステップがまとめてスキップされてもよい。装置及びシステムの様々な実施形態の任意選択の特徴が、実施形態によっては含まれてよく、実施形態によっては含まれなくてよい。従って、上述の説明は、主に例示を目的としたものであり、特許請求の範囲に明記されている本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００９４】
本明細書に含まれる実施例及び具体例は、本発明対象が実施されうる具体的な実施形態を、限定ではなく例示として示す。言及されたように、他の実施形態が利用されたり派生したりしてよく、本開示の範囲から逸脱しない限り、構造的な、或いは論理的な置換又は変更が行われてよい。本発明対象のそのような実施形態は、本明細書においては、個別に参照されてよく、或いは、「本発明」という言い方でまとめて参照されてよく、「本発明」という言い方で参照することは、あくまで便宜上であって、本出願の範囲を、実際には２つ以上が開示されていても、いずれか１つの発明又は発明概念に自発的に限定することを意図するものではない。従って、本明細書では特定の実施形態を図示及び説明してきたが、この、示された特定の実施形態を、同じ目的を達成するように作られた任意の構成で置き換えてよい。本開示は、様々な実施形態のあらゆる翻案又は変形を包含するものである。当業者であれば、上述の説明を精査することにより、上述の複数の実施形態の組み合わせ、及び本明細書に具体的な記載がない他の実施形態が明らかになるであろう。
【図１ａ−１ｆ】
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【図２ａ−２ｄ】
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【図３ａ−３ｅ】
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【図４ａ−４ｄ】
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【図５ａ−５ｃ】
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【図６ａ−６ｅ】
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【図７ａ−７ｆ】
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【図８ａ−８ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ−１１ｂ】
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【図１２ａ−１２ｂ】
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【図１３ａ−１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【国際調査報告】
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