(57)【要約】  本発明は、止血用組成物およびその製造方法に関し、より詳しくは、止血に用いるに適した架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む止血組成物およびこのような組成物の製造方法に関する。
2019528857.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋化されたヒアルロン酸誘導体のマトリックスを含む止血組成物。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸誘導体が１０乃至２０００μｍの大きさの粒度を有する、請求項１に記載の止血組成物。
【請求項３】
前記架橋化されたヒアルロン酸誘導体のマトリックスの複合粘度は、１Ｈｚ（２５℃）で１０Ｐａ．ｓ乃至５００，０００Ｐａ．ｓである、請求項１に記載の止血組成物。
【請求項４】
前記架橋化されたヒアルロン酸誘導体のマトリックスは、塩基性水溶液内でヒアルロン酸とエポキシド架橋剤を反応させて製造されたものである、請求項１に記載の止血組成物。
【請求項５】
傷、出血、損傷された組織、出血組織および／または骨欠損から構成された群より選択される傷害の治療に用いるためのものである、請求項１に記載の止血組成物。
【請求項６】
ｉ）塩基性水溶液に溶解されたヒアルロン酸とエポキシド架橋剤を反応させて架橋化ヒアルロン酸誘導体を製造する段階；および
ｉｉ）前記架橋化ヒアルロン酸誘導体を粉砕する段階
を含む、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の止血組成物の製造方法。
【請求項７】
前記塩基性水溶液に溶解されたヒアルロン酸の濃度は、２０乃至２００ｍｇ／ｍＬである、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記塩基性水溶液に溶解されたヒアルロン酸の濃度は、２０乃至２００ｍｇ／ｍＬであり、前記エポキシド架橋剤の投入量が０．０１乃至５０％である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ｉｉ）段階で製造されたヒアルロン酸誘導体を滅菌する段階をさらに含む、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の止血組成物および凝固誘導剤を含む希釈剤を含むことを特徴とする止血用キット。
【請求項１１】
前記凝固誘導剤は、トロンビン、ヘビ毒、血小板活性化剤、トロンビン受容体活性化ペプチド、フィブリノゲン沈澱剤、アプロチニンおよび第ＶＩＩＩ因子からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載の止血用キット。
【請求項１２】
前記凝固誘導剤を含む希釈剤は、１０乃至１０，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌのトロンビンを含むものである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記凝固誘導剤を含む希釈剤がＮａＣｌ、ＣａＣｌ２およびグリシンから構成された群より選択される物質をさらに含有するものである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
前記凝固誘導剤を含む希釈剤が３．０乃至１０．０のｐＨで緩衝液または緩衝システムを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットがプレフィルドシリンジ形態である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１６】
第１注射器に請求項１乃至５のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体を充填し、第２注射器に凝固誘導剤を含む希釈剤を充填した後、第１および第２注射器を互いにコネクタにより連結する段階；
第２注射器の凝固誘導剤を含む希釈剤をコネクタにより第１注射器内に注入してヒアルロン酸誘導体と希釈剤を混合する段階；
第１注射器内の混合物を第２注射器に再注入する段階；および
前記再注入段階を５回乃至２０回繰り返す段階を含む、請求項１３乃至１８のいずれか一項に記載の止血用キットの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、止血用組成物およびその製造方法に関し、より詳しくは、止血に用いるに適した架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む止血組成物およびこのような組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様な領域の外科的手術時、結紮（ｌｉｇａｔｕｒｅ）または一般的な手順で効果的に調節されないか調節が不可能な出血が誘発されることがある。このような出血を抑制するために止血組成物を傷に適用することができ、このような止血組成物として、傷のような人体組職に適用する時、強い付着性および適切な膨潤力を有する物質を提供することが要求される。
【０００３】
生体適合性の、生分解性の乾燥した安定な顆粒物質を含む止血組成物の例としては、フロシール（Ｆｌｏｓｅａｌ、登録商標）があり、これはトロンビン含有溶液中に膨潤されて流動性ペーストを形成する顆粒ゼラチンマトリックスから構成された多用途止血剤である。
【０００４】
しかし、このような製品は、止血の効能と関連した付着および膨潤力はよいが、ウシに由来するゼラチンの架橋および乾燥させた物質を含むため、ヒトの手術適用時、安全性に対する虞がある。
【０００５】
ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）は、人体構成要素の一つとして、飲料、美容、医薬品などの多様な用途で活用されている。特に、組織の再生に役立てると知られており、人体に無害であるため、癒着防止剤の成分として開発されて活用されている。最近の文献によれば、止血剤成分との組み合わせを通じて、止血組成物の可能性が提示されたが、発明者の試験結果、水和される過程で局部的にゲル化される性質により止血成分との混合が難しく、水和後の粘度と吸湿性が低く、傷部位に混合処理時に過度に高い付着性により傷部位に害を加えられることが明らかになり、自然状態のヒアルロン酸を止血剤の組成物として活用するには困難がある。
【０００６】
このような背景下で、本発明者らは、前述した従来技術の問題点を克服するために研究を重ねた結果、適切な組織付着性と癒着防止能力があるヒアルロン酸の架橋化を通じたヒアルロン酸誘導体マトリックスをなすようにし、これを適正の大きさに粉砕して、止血剤成分と混合が容易であると共に、傷部位に混合処理時、適切な接着性を有するヒアルロン酸誘導体を開発して、このような誘導体が含まれている止血組成物に卓越な止血効果を示すことを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記のような問題点を解決するための、本発明の基本的な目的は、架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む止血組成物を提供することにある。
なお、本発明の他の目的は、前記架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む止血組成物を製造する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む止血組成物は、高い水分吸収能力と活用に容易な接着力を有する。また、生体に適用した時、初期には血液流動に対する遮蔽物を形成することができる効率的な障壁を形成する。具体的に、止血組成物に含まれている架橋化ヒアルロン酸誘導体の膨潤性質は出血部位に対する組織付置力を高め、組織間癒着に対する効果的な機械的遮蔽物を作ることができる。
【０００９】
本発明の止血組成物は、従来のトロンビン液剤とは異なり、生体組織に対する付置力に優れ、一定期間後、完全な分解および生体内吸収が行われ得る。また自然ヒアルロン酸ナトリウム液に比べて適切な付着性を有する、人体に無害なヒアルロン酸誘導体を用いることによって、従来の問題点として挙げられていた外部由来物質を利用した止血組成物の副作用に対する危険性を除去した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の製造方法により製造されたヒアルロン酸誘導体を含有する止血組成物の様子を示した図面である。
【図２】実施例１ａ乃至３ａで製造したヒアルロン酸誘導体と比較例１ａ、２ａおよび比較例３ａの流変学的特性を糾明するために０．１Ｈｚ乃至１Ｈｚの振動数範囲で複合粘度（Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）およびｔａｎδ結果値を測定した結果を示したものである。
【図３】実施例１ａ乃至３ａで製造したヒアルロン酸誘導体の吸収能結果を示した図面である。
【図４】実施例１ｂ乃至３ｂで製造したヒアルロン酸誘導体含有止血組成物と比較例４ｂで製造した非架橋ヒアルロン酸含有止血組成物の液体吸水性を確認した結果を示した図面である。
【図５ａ】実施例２ｂで製造されたヒアルロン酸誘導体含有止血組成物の粒度分析結果を示す図面である。
【図５ｂ】比較例５のヒアルロン酸誘導体含有止血組成物の粒度分析結果を示す図面である。
【図６ａ】止血比較例１ａ、２ａおよび４ａ、実施例１ａ乃至３ａで製造したヒアルロン酸誘導体の付着性を確認した図面である。
【図６ｂ】止血比較例１ａ、２ａおよび４ａ、実施例１ａ乃至３ａで製造したヒアルロン酸誘導体の付着性を確認した図面である。
【図７ａ】止血実施例２ｂ、比較例２ｂおよび４ｂで製造した止血組成物の接着性比較試験結果を示す写真である。
【図７ｂ】止血実施例２ｂ、比較例２ｂおよび４ｂで製造した止血組成物の接着性比較試験結果を試料の移動距離で示したグラフである。
【図８】止血組成物の製造時に用いられた希釈剤と実施例１ｂ乃至３ｂで製造した止血組成物のトロンビン活性を比較した結果を示した図面である。
【図９】混合回数別にヒアルロン酸含有量とトロンビン力価の変化を確認した図面である。
【図１０】ＳＤラット（ＳＤ  ｒａｔ）の肝病変で実施例３ｂの止血能を確認した結果を示した図面である。
【図１１ａ】実施例３ｂで製造した止血組成物のウサギ脾臓病変における止血効能を確認した試験結果写真である。
【図１１ｂ】実施例３ｂで製造した止血組成物のウサギ脾臓病変における止血効能を出血度で示したグラフである。
【図１２】本発明による止血組成物と非架橋ヒアルロン酸ナトリウムの止血作用模式図を比較したものであり、本発明による止血組成物の実際の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
前記のような目的を達成するための一つの様態として、本発明は、架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む止血組成物に関する。
【００１２】
本発明の止血組成物は、止血のための成分として適切な吸湿性、粘度を有する架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む。具体的な一様態として、前記架橋化されたヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＡ）またはその塩を２個以上のエポキシド基を有するエポキシド架橋剤を用いて架橋化させたものであってもよい。架橋化されたヒアルロン酸は、ヒアルロン酸本来の吸湿性を維持しながらも、ヒアルロン酸間の架橋化を通じたマトリックスをなすようになり、追加的な溶液に対する吸水性と粘度が向上し、付着性は阻害されて止血成分を含む溶液との円滑な混合が可能になる。
【００１３】
前記ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）とＮ−アセチル−Ｄ−グリコースアミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）の交互残基からなる天然のヘテロ多糖類（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）であり、エポキシド架橋剤によりヒアルロン酸誘導体マトリックスを形成するようになる。本発明ではヒアルロン酸以外にその塩が用いられてもよい。
【００１４】
前記エポキシド架橋剤は、具体的に、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ、ＥＧＤＧＥ）、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ｎｅｏｐｅｎｔｙｌ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ｄｉｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、１，２−（ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（１，２−（ｂｉｓ（２，３−ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ）ｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）またはソルビトールポリグリシジルエーテル（ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）であってもよく、より具体的に、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）であってもよい。
【００１５】
本発明の架橋化されたヒアルロン酸誘導体マトリックスの複合粘度は、１Ｈｚ（２５℃）で１０乃至５００，０００Ｐａ．ｓである（Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌｔｄ．，  ＤＨＲ−１）、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５℃）。
【００１６】
また前記架橋化されたヒアルロン酸誘導体マトリックスは、自然状態のヒアルロン酸より水分吸収能力が高く（図３）、膨潤度が大きいという長所を有する。具体的に、ゲル状態の架橋ヒアルロン酸誘導体マトリックスの膨潤度が３００％乃至１，５００％であり、乾燥粉末（１０５℃、６時間）の場合には膨潤度が３００％乃至７５，０００％である。
【００１７】
なお、前記架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスは、本発明特有の合成条件により架橋化することによって、ヒアルロン酸間の分子結合が増えて粘弾性が大きくなり（図２）、生体組織に対する適切な付着性を有している。また架橋化された部分は、体内のヒアルロン酸分解酵素により切断されないため、体内で向上した安定性を有しながらも、毒性に対する危険度が殆どないという特徴を有する。また止血作用を完了した以降は、患部に一定時間の間に物理的な障壁を形成することができる。
【００１８】
前述のような特徴により、本発明による組成物は、手術出血部位、外傷出血部位などを含む出血部位に止血効果を提供するために特に有用であり、医療用途、具体的には外科用手術時などのように多様な出血が発生する場合、これを止血する用途として容易かつ便利に用いられ得る。
【００１９】
また他の一つの様態として、本発明は、前記架橋化ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む止血組成物を製造する方法に関する。具体的に、前記製造方法は、ｉ）塩基性水溶液に溶解されたヒアルロン酸とエポキシド架橋剤を反応させて架橋化ヒアルロン酸誘導体を製造する段階；およびｉｉ）前記架橋化ヒアルロン酸誘導体を粉砕して適切な大きさに製造する段階を含むことができる。
【００２０】
好ましくは、本発明による前記ヒアルロン酸誘導体製造方法において、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＡ）に２個以上のエポキシ基を含むエポキシド架橋剤を反応させて得られた反応物を粉砕して製造されたヒアルロン酸誘導体を製造する。
【００２１】
本発明の製造方法には、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその塩を用いることができ、前記塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルトおよびヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムからなる群の中から選択される少なくとも一つ以上を含む。
【００２２】
前記製造方法において、ｉ）段階でヒアルロン酸の架橋反応のためのイオン化のために用いられる塩基性水溶液は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、アンモニア水溶液などが用いられてもよい。また、塩基性水溶液に溶解されたヒアルロン酸の濃度は、５０乃至２００ｍｇ／ｍＬが好ましく、このような塩基性水溶液に溶解されたヒアルロン酸の濃度によりエポキシド架橋剤（例えばＢＤＤＥ）の架橋比率が変わる。一例として、塩基性水溶液に溶解されたヒアルロン酸の濃度が２０ｍｇ／ｍＬである場合、エポキシド架橋剤としてＢＤＤＥ投入量は２％乃至５０％（ヒアルロン酸が溶解された塩基性水溶液重量に対するエポキシド架橋剤の体積比率（ｖ／ｗ））であり、塩基性水溶液に溶解されたヒアルロン酸の濃度が２００ｍｇ／ｍＬである場合、ＢＤＤＥ投入量は０．０１％乃至５％（ヒアルロン酸が溶解された塩基性水溶液重量に対するエポキシド架橋剤の体積比率（ｖ／ｗ））である。また、ｉ）段階の反応温度は４乃至８０、反応時間は１２時間乃至４８時間、そして反応圧力は０．５気圧乃至２気圧、好ましくは常圧である。
【００２３】
前記ｉ）段階のエポキシド架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ、ＥＧＤＧＥ）、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ｎｅｏｐｅｎｔｙｌ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ｄｉｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、１，２−（ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（１，２−（ｂｉｓ（２，３−ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ）ｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）またはソルビトールポリグリシジルエーテル（ｓｏｒｂｉｔｏｌｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）から選択されてもよく、より具体的には１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を用いられてもよい。
【００２４】
追加的な一様態として、前記ｉ）段階で製造されたヒアルロン酸誘導体は、ｉｉ）段階に導入される前に生理食塩水などを用いて洗浄されてもよい。前記ｉ）段階で製造されたヒアルロン酸誘導体は、洗浄方法以外にも、当業界における公知の方法、例えば蒸留（大気圧または減圧下）、再結晶、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、相分離、溶媒抽出または透析により分離および／または精製されてもよい。
【００２５】
なお、前記ｉｉ）段階は、ｉ）段階で製造された架橋されたヒアルロン酸誘導体を粉砕してゲル形態に製造する段階である。粉砕方法は、通常の粉砕法、例えばブレード粉砕または圧縮粉砕方法により粉砕されてもよく、均質な粒子のために最小３回以上行うが、これに限定されるのではない。
【００２６】
特に、前記ヒアルロン酸誘導体の大きさおよび形態は特に制限されず、医学的に適用される範囲によりその大きさおよび形態を多様化することができ、前記ｉｉ）段階で粉砕されたヒドロゲルの大きさは、１０乃至２０００μｍ、より具体的には２００μｍ乃至８００μｍが好ましいが、必要に応じて他の大きさに粉砕して用いることもできる。
【００２７】
前記ｉ）およびｉｉ）段階を経て製造されたヒアルロン酸誘導体は、高温高圧条件で滅菌して用いることができる。したがって、追加的な一様態として、本発明による前記製造方法は、ｉｉ）段階で製造されたヒアルロン酸誘導体を滅菌する段階をさらに含むことができる。
【００２８】
本発明のヒアルロン酸誘導体製造方法により製造されたヒドロゲルの複合粘度は、１Ｈｚ（２５℃）で１０乃至５００，０００Ｐａ．ｓであり、膨潤度は２００％乃至１，５００％である。また前記ヒアルロン酸誘導体が粉末状態である場合には膨潤度が７５，０００％に達する。
【００２９】
また他の様態として、本発明は、前記本発明による止血用組成物および薬学的に許容される希釈剤を含む止血用キットに関する。
【００３０】
具体的に、本発明による止血用キットは、前記ヒアルロン酸誘導体を含む止血用組成物と共に凝固誘導剤を含む希釈剤を含むことができる。好ましくは、前記止血用キットには前記ヒアルロン酸誘導体を含む止血用組成物：凝固誘導剤を含む希釈剤が２：８乃至９：１の重量比率で含まれてもよい。
【００３１】
本発明によるキットに用いられる希釈剤に含まれる凝固誘導剤は、血液の凝固を誘導する物質であり、例えば、トロンビン、ヘビ毒、血小板活性化剤、トロンビン受容体活性化ペプチド、フィブリノゲン沈澱剤、アプロチニンおよび第ＶＩＩＩ因子からなる群より選択される一つ以上のものであってもよいが、これに制限されるのではない。好ましくはトロンビンである。トロンビンは、ヒトに用いるに適した（つまり、製薬上許容される）任意のトロンビン製剤から誘導されてもよい。トロンビンの適した供給源は、ヒトおよびウシの血、血漿または血清（免疫拒否反応が予想されない場合、他の動物供給源のトロンビンが適用され得る）を含み、組換え起源のトロンビン（例えば、組換えヒトトロンビン）および自己組織由来のヒトトロンビンがいくつかの適用では好ましいこともあり、これは他の凝固誘導剤の場合にも同様に適用される。
【００３２】
製薬上許容される希釈剤は、使用−準備された組成物で好ましい最終−濃度を成就できる量で用いられる。このような凝固誘導剤を含む希釈剤は、前述の凝固誘導剤以外にも、その他有用な成分、例えばイオン、緩衝液、賦形剤、安定化剤などを含有することができる。好ましい塩は、ＮａＣｌおよび／またはＣａＣｌ２であり、好ましい安定化剤は、グリシンであり、全てトロンビンをはじめとする凝固誘導剤のために適用される一般的な量および濃度で用いられる（例えば、０．５乃至１．５％ＮａＣｌ（例えば、０．９％）および／または２０乃至８０ｍＭのＣａＣｌ２（例えば、４０ｍＭ））。追加の実施態様において、希釈剤はまた、再構成された乾燥組成物のｐＨ、好ましくは３．０乃至１０．０のｐＨで、より好ましくは６．５乃至８．５のｐＨで緩衝するように緩衝液または緩衝システムを含むことができる。例えば、前記希釈剤は、注射用水、および−互いに独立に−１００乃至１０，０００ＩＵ／バイアルトロンビン（好ましくは１，０００乃至５，０００ＩＵ／バイアル）、５０乃至２００ｍＭのＮａＣｌ（好ましくは１００乃至２００ｍＭ）、１０乃至８０ｍＭのＣａＣｌ２（好ましくは３０乃至５０ｍＭ）および５乃至１００ｍｇ／ｍＬグリシン（好ましくは５乃至２０ｍｇ／ｍＬ）を含むことができる。具体的な一様態として、前記凝固誘導剤を含む希釈剤は、水溶液と凝固誘導剤、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、アルブミンおよびグリシンから構成された群より選択された物質が別途に分離されて（例えば凍結乾燥されてバイアルに含まれている形態）キットに含まれてもよく、使用時に水溶液で凝固誘導剤、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、アルブミンおよびグリシンから構成された群より選択された物質を溶解して用いてもよい。
【００３３】
また他の実施態様において、凝固誘導剤を含む希釈剤は、酢酸ナトリウムを少量、具体的に１乃至５０ｍＭ、好ましくは１０乃至３０ｍＭを含有することができる。また前記凝固誘導剤を含む希釈剤は、１００ｇ／ｌ未満のマンニトール、好ましくは５０ｇ／ｌ未満を含有することができ、２００ｇ／ｌ未満の乳糖、好ましくは１００ｇ／ｌ未満を含有することができる。好ましくは、前記凝固誘導剤を含む希釈剤は、酢酸ナトリウム、マンニトールおよび乳糖を必須に含有しなくてもよい。具体的に、前述のような範囲のグリシンを含むことによって、グリシンだけでも、酢酸ナトリウム、マンニトールおよび乳糖を含むことなく、トロンビンをはじめとする凝固誘導剤が凍結乾燥ケーク形態を維持できると共に、凝固誘導剤の力価も安定化され得る。
【００３４】
好ましい実施様態によれば、前記希釈剤が凝固誘導剤としてトロンビンを含む場合、好ましくは１０乃至１０，０００Ｉ．Ｕ．トロンビン／ｍｌ、特に２５０乃至５，０００Ｉ．Ｕ．トロンビン／ｍｌを含む。好ましくは、このような使用準備された形態の止血用キットは、１０乃至１００，０００国際単位（Ｉ．Ｕ．）のトロンビン、より好ましくは５００乃至２０，０００Ｉ．Ｕ．、特に１，０００乃至１０，０００Ｉ．Ｕ．を含有する。好ましい一様態において、本発明による止血用キットは、プレフィルドシリンジ形態であってもよい。前記用語「プレフィルドシリンジ」とは、注射用製剤をそのままシリンジ（注射器）に一定量充填して製造されたもので、使用準備、つまり、使用時に薬物の秤量および注射器内充填などが不要で、即時に使用可能なことを意味する。
【００３５】
具体的な一実施様態において、本発明による止血用キットは、これに制限されるのではないが、本発明によるヒアルロン酸誘導体を含む止血組成物で充填されたプレフィルドシリンジをコネクタで連結し、凝固誘導剤が含まれている希釈剤が充填された注射器を前記コネクタの他の末端に連結してこれを注入することによって架橋ヒアルロン酸誘導体マトリックスを含む止血組成物を水和させて製造され得る。均質な生成物収得のためにヒアルロン酸誘導体−凝固誘導剤含有希釈剤注射器間に互いに往復注入を繰り返すことができ、好ましくは５回以上、より好ましくは１０回程度往復して製造することができる。
【００３６】
このような本発明による止血用キットは、前記ヒアルロン酸誘導体を含む止血組成物と凝固誘導剤としてトロンビンを含む希釈剤を共に組み合わせて含むことによって、トロンビンを単独で使用したり、従来膨潤性および付着性を付加するためにゼラチンマトリックスをトロンビン−含有溶液と共に用いたフロシールなどに比べて卓越な止血効果を示す（図１０など参照）。
【発明の実施のための形態】
【００３７】
以下、下記の実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。しかし、下記の実施例に対する説明は本発明の具体的な実施態様を特定して説明するものに過ぎず、本発明の権利範囲をこれらに記載された内容に限定したり制限解釈しようとする意図ではない。
【００３８】
実施例１−３．止血組成物のためのヒアルロン酸誘導体の製造
【００３９】
Ａ．架橋ヒアルロン酸誘導体マトリックスの製造
１ｇのヒアルロン酸ナトリウムをそれぞれ３個の反応器に準備した後、０．２５ＮのＮａＯＨ溶液を利用して最終重量が１０．０ｇ（実施例１ａ）、８．３ｇ（実施例２ａ）、７．１ｇ（実施例３ａ）になるように投入した。完全に溶解された前記溶液に１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を７０ｕＬ（実施例１ａ）、６０ｕＬ（実施例２ａ）、５０ｕＬ（実施例３ａ）を投入した後、混合した。混合液を恒温水槽に入れて３０℃で１８時間反応させた後、緩衝溶液で洗浄して未反応物を除去した。製造されたゲルを圧縮方式で３回以上粉砕して粒子の大きさを調節した後、１２１℃で１５分間滅菌した。製造されたヒアルロン酸誘導体３．０ｇを５ｍｌ注射器に無菌称量した後、１２７℃、２分間事後滅菌してヒアルロン酸誘導体プレフィルドシリンジを製造した（実施例１ａ、２ａ、３ａ）。
【００４０】
Ｂ．希釈剤の製造
１バイアル当たりトロンビン５，０００ＩＵ、グリシン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム原料を投入した後、適量の注射用水を入れて溶解した。溶かした溶液を無菌フィルターしてバイアルに充填した後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥粉末は出血部位に用いる直前に０．９％生理食塩注射液で完全に溶解して用いる。
【００４１】
Ｃ．架橋ヒアルロン酸誘導体マトリックスが含まれている止血組成物の製造
ヒアルロン酸誘導体で充填されたプレフィルドシリンジ（実施例１ａ、２ａ、３ａ）をコネクタで連結し、トロンビンが含まれている希釈剤を利用してヒアルロン酸誘導体を水和させた。均質な生成物収得のためにヒアルロン酸誘導体−トロンビン含有希釈剤注射器間にシリンダーを往復しながら少なくとも往復１０回混合を行って止血組成物を製造した（実施例１ｂ、２ｂ、３ｂ）。調製されたヒアルロン酸誘導体を含有する止血組成物の様子を図１に示す。
【００４２】
実施例４．ヒアルロン酸誘導体の流変学的特性
実施例１ａ乃至３ａで製造したヒアルロン酸誘導体と市販されているヒアルロン酸含有Ｂ社の癒着防止剤（比較例１ａ）、そしてＧ社の架橋ヒアルロン酸フィラー（比較例２ａ）およびＬ社の架橋ヒアルロン酸フィラー（比較例３ａ）の流変学的特性を糾明するために回転型レオメーター（Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を実施した。０．１Ｈｚ乃至１Ｈｚの振動数範囲で複合粘度（Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）およびｔａｎδ結果値を図２に示した。
図２および表１を通じて、実施例１ａ乃至３ａは比較例１ａ乃至３ａに比べて高い複合粘度値を示す。これによって本発明のヒアルロン酸誘導体（実施例１ａ乃至３ａ）が比較例１ａ乃至３ａより優れた粘度を有し、構造的に安定性の高い構造で形成されていることが分かる。
【表１】
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【００４３】
実施例５．ヒアルロン酸誘導体の膨潤度
実施例１ａ乃至３ａで製造したヒアルロン酸誘導体３．０ｍＬに生理食塩水を１００ｍｌを添加した後、１０分間攪拌した。３７℃で１時間放置した後、吸収されない生理食塩水を除去した後、ヒアルロン酸誘導体に吸収された溶液の体積を確認した。
図３は、実施例１ａ乃至３ａで製造したヒアルロン酸誘導体の膨潤度結果であり、実施例１ａの膨潤度は７０６％、実施例２ａの膨潤度は６０７％、実施例３ａの膨潤度は４０９％である。本発明のヒアルロン酸誘導体（実施例１ａ乃至３ａ）は、自己の体積の４乃至７倍以上に達する水分を吸収する吸収能を示した。
【００４４】
実施例６．ヒアルロン酸誘導体含有止血組成物と非架橋ヒアルロン酸含有止血組成物との吸収能比較
比較例４：１，０００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウムを緩衝溶液に２０重量％濃度に溶解した後、この液３．０ｇを５ｍｌ注射器に称量して１２７℃、２分間事後滅菌した（比較例４ａ）。希釈剤を利用した止血組成物の製造過程は実施例１ｂ乃至３ｂと同一に実施して最終組成物を製造した（比較例４ｂ）。
図４は、実施例１ｂ乃至３ｂで製造したヒアルロン酸誘導体含有止血組成物と比較例４ｂで製造した組成物の液体吸水性を確認した結果である。吸水性を確認するために試験物品５．０ｇをｄｉｓｈに塗布した後、色素が添加された生理食塩水を試験物品の上に１．０ｍＬ撒いて液体が吸収される様子を観察した。
図４を通じて、ヒアルロン酸誘導体が含まれている止血組成物である実施例１ｂ乃至３ｂは比較例４ｂに比べて液体が粒子の間に急速に吸収される現像が描写される。
【００４５】
実施例７．ヒアルロン酸誘導体が含まれている止血組成物の粒度分析
実施例２ｂのヒアルロン酸誘導体が含まれている止血組成物の粒子の大きさと分布度を確認するために各試料３ｇを蒸溜水１５ｍＬで希釈してＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒを利用して０．３７５ｕｍで２０００ｕｍ間の粒子を計数した。その結果を図５ａに示した。図５ｂは、顆粒形態の止血剤であるフロシール（Ｆｌｏｓｅａｌ、登録商標）（比較例５）の粒度分析結果である。
図５ａおよびｂを通じて、実施例２ｂの平均粒子の大きさは６３８．５ｕｍ、比較例５の平均粒子の大きさは４６２．８ｕｍであり、実施例２ｂの止血組成物は比較例５と比較した時、粒子分布度が均一に示されることを確認した。
【００４６】
実施例８．ヒアルロン酸誘導体の付着性確認試験
タック（ｔａｃｋ）値を測定するために比較例１ａ、比較例２ａ、比較例４ａ、実施例１ａ乃至３ａの各試料をレオメーターのＰｌａｔｅにローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）した後、１０秒間０．１の剪断速度（Ｓｈｅａｒ  ｒａｔｅ）に回転をさせ、０．１ｍｍ／ｓの速度でＧｅｏｍｅｔｒｙが分離される時の垂直抗力（Ｎｏｒｍａｌ  Ｆｏｒｃｅ）値を測定した。
図６ａおよびｂは、各試料別ＧＡＰ（ｍｍ）による垂直抗力（Ｎ）値を示したものであり、この図面に示された最大垂直抗力（Ｎ）を比較すると、本発明の実施例１ａ乃至３ａが比較例１ａ（Ｂ社の癒着防止剤）、比較例２ａ（Ｇ社の架橋ヒアルロン酸フィラー製品）および比較例４ａ（非架橋ヒアルロン酸液）より高い垂直抗力値を示した。つまり、本発明の実施例が比較例より高い付着性を示した。
【００４７】
実施例９．ヒアルロン酸誘導体の接着性確認試験
止血組成物の接着性を確認するために比較例２の試料３ｇを実施例２ｂと同一に希釈剤を利用して調製した（比較例２ｂ）。
平らなガラス板と３０度傾斜のガラス板を準備した後、それぞれのガラス板上に比較例４ｂ、比較例２ｂおよび実施例２ｂの試料約０．５ｍＬを落として５分間放置した後、各試料の長さを測定した。各試料の移動距離は３０度傾斜ガラス板上の試料長さと平らなガラス板上の試料長さとの差で求めた。
図７ａおよびｂは、比較例４ｂ、比較例２ｂおよび実施例２ｂ試料を平らなガラス板上にローディングした様子を描写し、実施例２ｂは比較例２ｂと比較例４ｂに比べて高い接着性を示した。
【００４８】
実施例１０．ヒアルロン酸誘導体がトロンビン活性に与える影響
トロンビン活性測定試験は、大韓民国薬典第１１改正のトロンビン定量法により試験した。詳しい操作法は下記のとおりである。
トロンビン標準品を生理食塩注射液に溶かしてこの液１ｍＬ中の４．０、５．０、６．２および７．５単位を含有する４種の標準液を作った後、それぞれ０．１０ｍＬを試験管に入れる。予め同じ温度に維持したフィブリノゲン溶液０．９０ｍＬをピペットを用いて入れ、同時にタイマーを作動させて静かに振って混合しながら最初にフィブリンの凝固が起こる時までの時間を測定する。４種の標準液をもってそれぞれ５回ずつ測定し、その平均値を求めた。
試験物品に対する測定は、前記と同じ温度で同様な方法で行う。試験物品を生理食塩注射液に溶かして１ｍＬ中の５単位を含有する溶液を作ってその０．１０ｍＬを用いて以前の操作を５回繰り返して凝固時間を測定し、平均値を求める。両対数グラフの横軸に単位、縦軸に凝固時間にして４種の標準液による凝固時間の平均値をグラフ上に取って検量線を作成する。この検量線を用いて検液の凝固時間の平均値から単位数Ｕを読む。
図８は、止血組成物の製造時に用いられた希釈剤と実施例１ｂ乃至３ｂで製造した止血組成物のトロンビン活性を比較した結果である。ヒアルロン酸誘導体が含まれていない希釈剤のトロンビン力価とヒアルロン酸誘導体が含まれている止血組成物のトロンビン力価が類似している。この結果から、ヒアルロン酸誘導体がトロンビンの活性には影響を与えないことを確認した。
【００４９】
実施例１１．ヒアルロン酸誘導体がトロンビン活性に与える影響
止血組成物を製造する過程で混合回数別のヒアルロン酸含有量とトロンビン力価変化を確認するために実施例２ａで製造したヒアルロン酸誘導体をプレフィルドシリンジに３．０ｇ充填した後、１，０００ＩＵ／ｍＬトロンビンが含まれている希釈剤を利用してヒアルロン酸誘導体を水和させた。水和過程をそれぞれ片道５回、７回、１０回、２０回行った試料のトロンビン力価とヒアルロン酸含有量試験結果は図９に示す。
図９を通じて、ヒアルロン酸誘導体と希釈剤の間の混合は少なくとも１０回以上行われてこそ均質な止血組成物を収得することができることを確認した。
【００５０】
実施例１２．ラットにおける止血効力の確認
ＳＤラット（ＳＤ  ｒａｔ）の肝病変での止血効能に対して実施例２ｂの製剤を試験した。動物モデルはラットの中心線開腹を行った後、露出された肝にメスを利用してほぼ横１ｃｍ、縦１ｃｍ、深さ０．２ｃｍにコア組織を除去する。適用装置チップを利用して出血傷にほぼ１．０ｍＬの割り当てられた試験物品が病変に局所的に適用される。試験物品を適用した後２分に塗布した試験物品を除去し、１、２、５および１０分に出血程度を観察した。結果は図１０に描写される。
図１０は、ＳＤラット肝病変で実施例２ｂの止血能を確認した結果である。実施例２ｂで製造した止血組成物が時間経過により血液を吸収することが観察される。２分経過後、止血剤を湿潤ガーゼで除去した時、傷組織で止血された様子が観察される。
【００５１】
実施例１３．ウサギにおける止血効力の確認
ウサギの脾臓病変における止血効能を確認するためにウサギの脾臓に４ｍｍ穿孔を行って出血を誘導する。傷にほぼ１．０ｍＬの割り当てられた試験物品を病変に局所適用した後、試験物品が適用部位への近接を助けるために湿潤ガーゼで５秒間指圧迫を行う。湿潤ガーゼは２分後に除去し、試験物品は５分に生理食塩水を利用して洗浄した。出血程度は２、５および１０分ごとに観察し、その結果は図１１ａおよびｂに図示される。
図１１ａおよびｂを通じて、実施例２ｂで製造した止血組成物の優れた組織付置力と血液吸収力を確認した。２分経過時に出血組織の血液で飽和された実施例２ｂが観察され、製品外部に出血なしに止血された。また生理食塩水を利用して止血剤を除去した後にも再出血がなかったし、血塊が形成された様子が観察される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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