【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年2月19日(2007.2.19)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてＣＤ７０を発現する癌を処置するための組成物であって、該組成物は抗体を含む抗体−医薬複合体を含み、該抗体はＣＤ７０に結合し、かつ細胞内条件下で切断可能なリンカーにより細胞毒性剤または細胞静止剤に複合化されている、組成物。
【請求項２】
被験体において免疫学的疾患を処置するための組成物であって、該組成物は抗体を含む抗体−医薬複合体を含み、該抗体はＣＤ７０に結合し、かつ細胞内条件下で切断可能なリンカーにより細胞毒性剤または免疫抑制剤に複合化されている、組成物。
【請求項３】
抗体−医薬複合体を含む組成物であって、該抗体−医薬複合体は、ＣＤ７０に結合し、かつ細胞内条件下で切断可能なリンカーにより細胞毒性剤または免疫抑制剤に複合化されている抗体を含み、ここで該抗体−医薬複合体は：
（ａ）ＣＤ７０を発現する癌細胞株に対する細胞毒性効果もしくは細胞静止効果、または
（ｂ）ＣＤ７０を発現する免疫細胞に対する細胞毒性効果、細胞静止効果もしくは免疫抑制効果を及ぼす、
組成物。
【請求項４】
前記抗体がＣＤ７０に対する結合に関してモノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２と競合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体が以下からなる群より選択される少なくとも一つのポリペプチド領域を含む、請求項４に記載の組成物：
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ１領域；
（ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ２領域；
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ３領域；
（ｄ）配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ１領域；
（ｅ）配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ２領域；
（ｆ）配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ３領域；
（ｇ）配列番号２６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ１領域；
（ｈ）配列番号２８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ２領域；
（ｉ）配列番号３０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ３領域；
（ｊ）配列番号３６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ１領域；
（ｋ）配列番号３８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ２領域；および
（ｌ）配列番号４０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ３領域。
【請求項６】
前記抗体が、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前記Ｈ１、Ｈ２およびＨ３領域；または（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）の前記Ｈ１、Ｈ２およびＨ３領域を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の前記ポリペプチド領域が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に示すアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前記Ｈ１、Ｈ２およびＨ３領域を含む抗体が、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の前記Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域をさらに含むか；または
（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）の前記Ｈ１、Ｈ２およびＨ３領域を含む抗体が、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）の前記Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域をさらに含む、
請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号２または配列番号２２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域が、配列番号２または配列番号２２に示すアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
配列番号２または配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む前記抗体が、それぞれ配列番号１２または配列番号３２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１２または配列番号３２に示すアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体がキメラ１Ｆ６抗体もしくはヒト化１Ｆ６抗体またはキメラ２Ｆ２抗体もしくはヒト化２Ｆ２抗体である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体−医薬複合体が、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＦＰ、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＦＰ、２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦおよび２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥからなる群より選択され、ここで前記１Ｆ６抗体または２Ｆ２抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記キメラ抗体がヒト定常領域を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体が多価である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞毒性剤が、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合性物質、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカロマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイドおよびビンカアルカロイドからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞毒性剤が、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、オーリスタチンＥ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタトスタチン、カリキアミシン、メイタンシン、ＤＭ−１またはネトロプシンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞毒性剤が抗チュブリン剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗チュブリン剤が、オーリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、またはドラスタチンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗チュブリン剤が、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、オーリスタチンＥ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルシミド、エストラムスチン、セマドチン、ジスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ−１またはエロイテロビンである請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞毒性剤がＡＦＰ、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥである、請求項１９または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記切断可能なリンカーが細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ペプチドリンカーがジペプチドリンカーである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ジペプチドリンカーがｖａｌ−ｃｉｔリンカーまたはｐｈｅーｌｙｓリンカーである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記切断可能なリンカーが５．５未満のｐＨで加水分解性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記加水分解性リンカーがヒドラゾンリンカーである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記切断可能なリンカーがジスルフィドリンカーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＣＤ７０を発現するガンが、腎臓腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、胸腺癌腫、上咽頭癌腫、および脳腫瘍からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記腎臓腫瘍が腎臓細胞癌腫である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記脳腫瘍がグリオーマ、グリオブラストーマ、または髄膜腫である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記被験体がヒトである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記免疫抑制剤が、ガンシクロビル、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチル、メトトレキセート、コルチゾール、アルドステロン、デキサメタゾン、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、またはロイコトリエンレセプターアンタゴニストである、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫学的疾患がＴ細胞仲介免疫学的疾患であり、ＣＤ７０を発現する活性化Ｔ細胞を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項３６】
休止Ｔ細胞が、前記抗体−医薬複合体の投与により実質的に枯渇されない、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞仲介免疫学的疾患が、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、ハシモト甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結核または急性移植片対宿主病である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記免疫学的疾患が活性化Ｂリンパ球疾患である、請求項２に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ＣＤ７０を発現する癌細胞株が、腎臓細胞癌腫、Ｂ細胞リンパ腫、またはグリオブラストーマに由来する、請求項３に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ＣＤ７０を発現する免疫細胞が、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞または成熟樹状細胞である、請求項３に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ＣＤ７０を発現する癌または免疫学的疾患の治療用医薬組成物であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体−医薬複合体および少なくとも一つの薬学的に適合性の成分を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
凍結乾燥されている、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の抗体−医薬複合体を含む容器、および
薬学的に許容される希釈液を含む第二の容器、
を含む、医薬キット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】抗ＣＤ７０抗体−医薬結合体、ならびに癌および免疫障害の処置のためのそれらの使用
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本発明は本明細書に参考として援用される２００３年２月２０日出願の米国仮出願第６０／４４９，０５５号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
ＣＤ７０は、多様な正常および悪性の細胞種により発現される細胞膜結合−分泌分子の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーである。ＣＤ７０の一次アミノ酸（ＡＡ）配列は、そのカルボキシ末端が細胞外に曝され、そのアミノ酸末端が形質膜の細胞質ゾル側に見られるトランスメンブレンのタイプＩＩタンパク質を予測する（Ｂｏｗｍａｎら，１９９４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：１７５６−６１；Ｇｏｏｄｗｉｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７３：４４７−５６）。ヒトＣＤ７０は２０アミノ酸細胞質領域、１８アミノ酸経膜領域、および二つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を有する１５５アミノ酸細胞質外領域からなる（Ｂｏｗｍａｎら、既出；Ｇｏｏｄｗｉｎら、既出）。放射性同位元素で標識されたＣＤ７０発現細胞の抗ＣＤ７０抗体による特異的免疫沈降は２９および５０ｋＤａのそれぞれのポリペプチドを与える（Ｇｏｏｄｗｉｎら、既出；Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：１７６２−７３）。特に、構造鎖Ｃ、Ｄ、ＨおよびＩ中で、ＴＮＦ−アルファおよびＴＮＦ−ベータに対するその相同性に基づいて、三量体構造がＣＤ７０に対して予測される（Ｐｅｔｓｃｈら，１９９５，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：７６１−７２）。
【０００３】
最初の免疫組織学的研究は、ＣＤ７０が、扁桃腺、皮膚および消化器官中の胚中心Ｂ細胞と稀なＴ細胞上で発現することを明らかにした（Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９４，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：４７７−８０）。続いて、ＣＤ７０は、抗原活性化されたＴおよびＢリンパ球の細胞表面上に発現することが最近報告され、その発現は抗原刺激の除去の後に弱くなる（Ｌｅｎｓら，１９９６，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：２９６４−７１；Ｌｅｎｓら，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９０：３８−４５）。リンパ系内で、ナチュラルキラー細胞（Ｏｒｅｎｇｏら，１９９７，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０７：６０８−１３）およびマウスの成熟末梢樹状細胞（Ａｋｉｂａら，２０００，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１：３７５−８０）もＣＤ７０を発現する。非リンパ由来細胞において、ＣＤ７０は胸腺髄質上皮細胞上でも検出された（Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９４、既出；Ｈｉｓｈｉｍａら，２０００，Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２４：７４２−４６）。
【０００４】
正常細胞上での発現に加え、リンパ腫、癌腫および神経起源の腫瘍等の異なる種類のガンにおけるＣＤ７０発現が報告されている。悪性Ｂ細胞において、散在性大Ｂ細胞リンパ腫の７１％、濾胞中心リンパ腫の３３％、大脳皮質リンパ腫の２５％、およびＢ−ＣＬＬの５０％がＣＤ７０を発現することが報告された（Ｌｅｎｓら，１９９９，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １０６：４９１−５０３）。ＣＤ７０はホジキン病の悪性ホジキンとリード・ステンベルク細胞上で他のリンパ活性化マーカーとともにしばしば発現する（Ｇｒｕｓｓ  ａｎｄ  Ｋａｄｉｎ，１９９６，Ｂａｉｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ９：４１７−４６）。ある報告は、胸腺癌腫の８８％（８例のうち７例）および異型性胸腺腫の２０％（５例のうち１例）でＣＤ７０発現を示している（Ｈｉｓｈｉｍａら，２０００、既出）。ＣＤ７０が検出された第二タイプの癌腫は上咽頭癌腫である。ある研究は非分化上咽頭癌腫から得られた急速凍結腫瘍生検の８０％（２０例のうち１６例）でＣＤ７０の存在を報告している（Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕら，１９９５，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈ  １４７：１１５２−６０）。また、ＣＤ７０は脳腫瘍細胞上、特にグリオーマ細胞系、固体ヒトグリオーマおよび髄膜腫において検出されている（Ｈｅｌｄ−Ｆｅｉｎｄｔ  ａｎｄ  Ｍｅｎｔｌｅｉｎ，２００２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８：３５２−５６；Ｗｉｓｃｈｌｕｓｅｎら，２００２，Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ６２：２５９２−９９）。
【０００５】
エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）およびヒトＴ白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）等の形質転換ウイルスは、正常ならＣＤ７０を発現しない上皮細胞等の細胞上にＣＤ７０を誘導できることが提案されている（Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕら既出；Ｓｔｅｉｎら，１９８９，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．４４６）。従って、悪性Ｂ細胞上でのＣＤ７０の発現は腫瘍形成性転換の反映でありうるだろう（Ｌｅｎｓら，１９９９、既出）。また、ＣＤ７０発現は抗原接触後にＢ細胞上に誘導されるので（Ｍａｕｒｅｒら，１９９０，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：２６７９−８４；Ｌｅｎｓら，１９９６、既出）、ＣＤ７０の安定な発現は持続的な抗原刺激を反映するものだろう。これは、進行中の体細胞過度変異に基づく濾胞非ホジキンリンパ腫で起こると仮定された（Ｂａｈｌｅｒら，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：６７７０−７４；Ｂａｈｌｅｒら，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：ｓｕｐｐｌ．５５４７Ｓ−５１Ｓ）。
【０００６】
ＣＤ７０のレセプターは、約５５ｋＤａのグリコシル化されたタイプＩの膜貫通タンパク質であるＣＤ２７である（Ｇｏｏｄｗｉｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７３：４４７−５６；Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９４、既出）。ＣＤ７０はしばしばＣＤ２７Ｌとも称される。細胞表面上のホモダイマーとして存在するＣＤ２７（Ｇｒａｖｅｓｔｅｉｎら，１９９３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：９４３−５０）は、細胞外領域中で約４０アミノ酸のシステインに富む繰返し単位により定められるＴＮＦレセプター・スーパーファミリーの一員である（Ｓｍｉｔｈら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１９−２３；Ｌｏｃｋｓｌｅｙら，２００１，Ｃｅｌｌ  １０４：４８７−５０１）。ＣＤ２７は典型的には胸腺細胞、ＮＫ、ＴおよびＢ細胞により発現する（Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １５：３０７−１１；Ｌｅｎｓら，１９９８，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：４９１−９９）。休止Ｔ細胞上でＣＤ２７は構成的に発現するが、抗原誘発はさらにＣＤ２７発現を上方に調節する（ｄｅ  Ｊｏｎｇら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：２４８８−９４；Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２４２６−３５）。さらに、Ｔ細胞の、それらのＴ細胞抗原レセプター複合体のみによる誘発、またはそれとアクセサリー分子ＣＤ２８との組み合わせによる誘発は、可溶性ＣＤ２７を活性化Ｔ細胞から放出させる（Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：２９−３５）。自然のＢ細胞はＣＤ２７を発現しないが、Ｂ細胞の抗原誘発後は、その発現が誘導され、ＣＤ７０とは対照的に維持される（Ｊａｃｑｕｏｔ  Ｓら，１９９７  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：２６５２−５７；Ｋｏｂａｔａ  Ｔら，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１１２４９−５３）。
【０００７】
正常なＢ系統細胞におけるＣＤ２７とＣＤ７０の限定された発現とは著しく対照的に、ＣＤ２７とＣＤ７０の両者は多くのＢ細胞非ホジキンリンパ腫と白血病においてしばしば共発現する。これは、オートクラインループの形態のこれらの細胞上で機能的なＣＤ２７／ＣＤ７０相互作用を潜在的に導き、ＣＤ２７シグナルとＣＤ７０誘導増殖をもたらすことにより悪性細胞に生育の利点を提供する（Ｌｅｎｓら，１９９９、既出）。
【０００８】
利用可能なデータは、活性化リンパ球上のＣＤ７０によるＣＤ２７の連結反応が、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞での共刺激シグナル等のシグナルをＣＤ２７発現細胞に送るモデルを支持する（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎら、既出；Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４：２６１２−２３；Ｏｓｈｉｍａら，１９９８，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：５１７−２６；Ｓｍｉｔｈら、既出；Ｖａｎ  Ｌｉｅｒら，１９８７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９：１５８９−９６；Ｇｒａｖｅｓｔｅｉｎら，１９９５，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：５５１−７；Ｔｅｓｓｅｌａａｒら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：４９５９−６５；Ｊａｃｑｕｏｔら、既出；Ａｇｅｍａｔｓｕら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９１：１７３−８０；Ｋｏｂａｔａら、既出；Ａｇｅｍａｔｓｕら，１９９７，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：２０７３−７９；Ｓｕｇｉｔａら，１９９２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９：１１９９−１２０３；Ｏｒｅｎｇｏら，１９９７，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０７：６０８−１３を参照）。マウスおよびヒトＣＤ７０に対する抗体はそのような活性を、おそらくＣＤ７０／ＣＤ２７相互作用のブロックにより阻害することが示された（Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９４、既出；Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９５、既出；Ｏｓｈｉｍａら既出）。
【０００９】
ＣＤ７０／ＣＤ２７相互作用の際のＣＤ７０シグナル伝達、すなわち「逆シグナル伝達」による細胞機能の調節に関して限定された情報が利用できる。一部のＣＤ７０抗体は、第二の抗体に架橋または組織培養プレートに固定化されたＣＤ７０発現Ｔ細胞に提示されると、Ｔ細胞増殖を増強する能力を有する（Ｂｏｗｍａｎら，１９９４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：１７５６−６１；Ｂｒｕｇｎｏｎｉ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５５：９９−１０４）。Ｂ慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞の部分集合でのそのような「逆シグナル伝達」が記載され、ＣＤ７０は、ＰＭＡ刺激の精製Ｂ−ＣＬＬ細胞の増殖を促進するシグナルを変換するレセプターとして機能できる（Ｌｅｎｓら，１９９９、既出）。これらの観察はＣＤ２７とＣＤ７０の関与が作動的シグナルをＣＤ２７とＣＤ７０を発現する細胞に送る結果となる状況を示唆する。
【００１０】
細胞仲介自己免疫病におけるＣＤ７０／ＣＤ２７共刺激の役割は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のモデルで調べられた（Ｎａｋａｊｉｍａら，２０００，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １０９：１８８−９６）。特定の抗マウスＣＤ７０  ｍＡｂ（クローンＦＲ−７０）のインビボ投与は、Ｔ細胞プライミング、Ｉｇ産生またはＴＨ１／ＴＨ２細胞バランスに影響を与えることなく、抗原誘導ＴＮＦ−アルファ産生を阻害することによりＥＡＥの発症を顕著に抑制した。しかし、そのような処置は確立した病気にはほとんど有効性を持たなかった。Ｔ細胞上でのＣＤ７０発現はＴＮＦ−アルファとＩＬ−１２により増強され、ＩＬ４により下方調節されることが報告されている（Ｌｅｎｓら，１９９８、既出）。すなわち、ＣＤ７０／ＣＤ２７仲介Ｔ細胞−Ｔ細胞相互作用はＴＨ２仲介応答よりもむしろＴＨ１仲介免疫応答を増強する役割を果たしているのだろう。この仮説を支持して、抗マウスＣＤ７０  ｍＡＢ  ＦＲ−７０はＴＨ１仲介コラーゲン誘導関節炎を阻害するのにも効果的である（Ｎａｋａｊｉｍａら，２０００、既出）。対照的に、同じ抗マウスＣＤ７０  ｍＡｂは、ＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウスにおける狼瘡および感受性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける実験的森林型熱帯リーシュマニア感染（共に主にＴＨ２仲介自己免疫応答である）の調節には有効性を示さなかった（Ｎａｋａｊｉｍａら，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８，１４６６−７２；Ａｋｉｂａら，２０００，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１：３７５−３８０）。
【００１１】
ＣＤ７０の役割は、もう一つのＴＨ１仲介免疫応答である急性移植片対宿主病（ａＧＶＨＤ）においてはまだ調べられていない。ＧＶＨＤは、骨髄提供者とその移植片の受容者との組織適合性抗原の違いが存在する場合に起こる同種間骨髄移植（ＢＭＴ）療法の重篤でしばしば致死的な結果である（ｄｅｎ  Ｈａａｎら，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１４７６）。ＧＶＨＤは移植骨髄の存在する成熟Ｔ細胞や他の比較的重要でない細胞集団により引き起こされる（Ｇｉｒａｌｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｐｌｉｎ，１９９４，Ｂｌｏｏｄ  ８４：３６０３）。重篤な組合せ免疫不全患者における母性Ｔ細胞移植の場合のように、ＣＤ７０は、同種間反応により特徴付けられる条件下でＣＤ４＋細胞上にインビボで検出されたことは注目すべきことである（Ｂｒｕｇｎｏｎｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５５：９９−１０４）。ＧＶＨＤの予防は、シクロスポリン、コルチコステロイドまたはメトトレキセート等の汎Ｔ細胞免疫抑制剤により達成される。特異性の欠如に加え、これらの物質は顕著な有害な副作用にも関連する。これらの望まれない効果や正常なＴ細胞機能の破壊を限定するために、同種認識と移植拒絶に直接にかかわるＴ細胞の選択的標的化に基づく他の治療的な介在が強く求められている。
【００１２】
ＣＤ７０は抗体指示免疫治療の潜在的に有用な標的である。上記のように、ＣＤ７０は正常細胞で限定された発現パターンを有する：ＣＤ７０発現は生理学的条件下に最近に抗原活性化されたＴおよびＢリンパ球に最も限定され、その発現は抗原刺激後に下方調整される。ＣＤ７０の主要な役割は血漿細胞分化を容易にし、長期のＴ細胞記憶の発生と維持に寄与することにあると考えられている。さらに、動物モデルからの証拠は、調節されていないＣＤ７０／ＣＤ２７相互作用が免疫学的疾患に関与することを示唆し、ヒトにおいては、実験データは、慢性関節リウマチ、乾癬および多発性硬化症等のＴＨ１仲介免疫疾患におけるＣＤ７０／ＣＤ２７経路の潜在的な異常な調節を証拠立てている。ＣＤ７０が、リンパ腫Ｂ細胞、ホジキンおよびリード・ステルンベルク細胞、神経起源の悪性細胞および多くの癌腫等の多様な形質転換細胞に発現することは特に興味深い。
【００１３】
いくつかのグループが、リンパ球活性化のインビトロモデルとＴＨ１仲介応答の動物モデルの両方において抗ＣＤ７０  ｍＡｂの阻害効果を示した。治療有効性を達成するＣＤ７０／ＣＤ２７共刺激経路をブロックするための抗体の利用に焦点があてられた。しかし、そのようなアプローチの一つの大きな欠点は免疫学的疾患に関与することが知られているシグナル伝達レセプター（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ８０／ＣＤ８６共刺激経路）の数の多さである。したがって、一つの特定のシグナル伝達経路をブロックすることは病気の進展に最小の衝撃を持つのみかもしれない。これは、抗ＣＤ７０  ｍＡｂが、同種間の刺激細胞により引き起こされたインビトロＴ細胞活性化を部分的に阻害できるだけとの観察（Ｈｉｎｔｚｅｎら，１９９５、既出）および抗ＣＤ７０  ｍＡｂは、病気がいったん確立されたらＥＡＥに対して何の治療有効性を示さないとの観察により支持される（Ｎａｋａｊｉｍａら，２０００、既出）。
【００１４】
よって、ＣＤ７０／ＣＤ２７相互作用をブロックする以外の手段またはそのブロックに追加した手段によって、ガンおよび／または免疫学的病気にかかわるＣＤ７０発現細胞の成長を低下または阻害するアプローチの開発が当分野において求められている。ＣＤ７０は、成熟抗原を提示する樹状細胞、活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞の表面に発現するので、ＣＤ７０＋細胞を標的とし、該細胞を阻害または低減できる物質は、自己抗原を提示する抗原提示細胞および障害性自己反応性活性化されたＴまたはＢ細胞、ならびにＣＤ７０発現腫瘍細胞の除去に効果的であることを証明するであろう。
【００１５】
抗体の治療有効性を高めるために使用されてきたアプローチは放射標識、および化学療法との組合せである；しかし、これらのアプローチは望まれない副作用に関連するものがある。例えば、同位元素療法は脊髄抑制と関連し（Ｗｉｔｚｉｇ，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４８  （Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ９１−５）、抗体と化学療法との組合せ治療は免疫抑制と関連する。さらに、同位体標識物質は作ることが難しく、患者は、同位体標識物質での最初の治療後に再発をしばしば経験する。
【００１６】
従って、特に非ＣＤ７０発現細胞に対しては望まない効果を及ぼさずに、ＣＤ７０発現細胞に対して臨床的に有用な細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼすことのできるように構築された抗ＣＤ７０  ＡＣＤに対する必要性が存在する。そのような化合物は、ＣＤ７０を発現するガンまたはＣＤ７０発現細胞により仲介される免疫疾患に対して有用な治療剤であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の簡単な説明）
本発明は、抗体−医薬複合体（ＡＤＣ）およびＡＤＣ誘導体、ならびにＣＤ７０発現ガンおよび免疫学的疾患を治療するための該複合体の使用に関する方法を提供する。ＡＤＣ中の抗体または他の標的部分はＣＤ７０に結合する。抗体または標的部分に複合させた医薬はＣＤ７０発現細胞に対して細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼし、ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患の発生を治療またはその再発を予防する。
【００１８】
一つの側面において、被験体中のＣＤ７０を発現するガンの治療方法が提供される。該方法は通常被験体に効果的な量の抗体−医薬複合体を投与することからなる。抗体−医薬複合体は、ＣＤ７０に結合する抗体（「ＣＤ７０抗体」）を含む。抗体は細胞毒性剤または細胞静止剤である医薬に複合させる。ある実施態様において、抗体はモノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２である。
【００１９】
他の実施態様において、抗体はＣＤ７０と結合し、ＣＤ７０に対する結合に関してモノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２と競合する。そのようなＣＤ７０抗体として、（ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ１領域；（ｂ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ２領域；配列番号１０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ３領域；（ｄ）配列番号１６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ１領域；（ｅ）配列番号１８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ２領域；（ｆ）配列番号２０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ３領域；（ｇ）配列番号２６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ１領域；（ｈ）配列番号２８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ２領域；（ｉ）配列番号３０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ３領域；（ｊ）配列番号３６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ１領域；（ｋ）配列番号３８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ２領域；および（ｌ）配列番号４０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ３領域から選択される少なくとも一つのポリペプチド領域を含むことができる。
【００２０】
ある実施態様において、ＣＤ７０抗体は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）（上記）のＨ１、Ｈ２およびＨ３領域または（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）（上記）のＨ１、Ｈ２およびＨ３領域を含む。さらなる実施態様において、ＣＤ７０抗体のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域として、ポリペプチド領域がそれぞれ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
さらなる実施態様において、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３領域は、（上記の）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に対応し、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域は、（上記の）（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）にそれぞれ対応する；またはＨ１、Ｈ２およびＨ３領域は、（上記の）（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）に対応し、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域は、（上記の）（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）に対応する。さらなる実施態様において、ＣＤ７０抗体は配列番号２または配列番号２２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ＣＤ７０重鎖可変領域はまた配列番号２または配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有することもできる。
【００２２】
さらなる実施態様において、重鎖可変領域は配列番号２または配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は配列番号１２または配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。さらに、軽鎖可変領域は配列番号１２または配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有することもできる。
【００２３】
例示的な実施態様において、抗体−医薬複合体は、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＦＰ、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＦＰ、２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦおよび２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥである。
【００２４】
ＣＤ７０抗体は、例えば、キメラ、ヒト化、またはヒトの抗体であってよい。ある実施態様において、ＣＤ７０抗体はヒトの定常領域を有するキメラ抗体である。ＣＤ７０抗体は一価でも多価でもよい。
【００２５】
適当な細胞毒性剤は、例えば、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合性物質、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカロマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイドおよびビンカアルカロイドであってよい。特定の実施態様において、細胞毒性剤は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、オーリスタチンＥ、パクリタキセル、ドセタキサル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタトスタチン、カリケアミシン、メイタンシン、ＤＭ−１またはネトロプシンである。他の適当な細胞毒性剤としては、抗チュブリン物質、例えば、オーリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、またはドロスタチンである。特定の実施態様において、抗チュブリン物質は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、オーリスタチンＥ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルシミド、エストラムスチン、セマドチン、ジスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ−１またはエロイテロビンである。
【００２６】
抗体医薬複合体において、抗体は細胞毒性剤に直接またはリンカーを経て複合させることができる。適当なリンカーとしては、例えば、切断性および非切断性リンカーが挙げられる。切断性リンカーは典型的には細胞内条件において切断を受けることができる。適当な切断性リンカーとして、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ等の細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。例示的な実施態様において、リンカーはバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）またはフェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー等のジペプチドリンカーであってよい。他の適当なリンカーとしては、ヒドラゾンリンカー等の５．５未満のｐＨで加水分解可能なリンカーが挙げられる。さらなる適当な切断性リンカーとしては、ジスルフィドリンカーが挙げられる。
【００２７】
抗体−医薬複合体は、ＣＤ７０を発現する細胞、例えば、腎臓腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、胸腺癌腫、上咽頭癌腫、または脳腫瘍等の細胞を標的とすることができる。腎臓腫瘍は、例えば腎臓細胞癌腫であってよい。脳腫瘍は、例えばグリオーマ、グリオブラストーマ、または髄膜腫であってよい。抗体−医薬複合体はヒトまたは非ヒトの動物に投与することができる。
【００２８】
別の側面において、免疫学的疾患の治療方法が提供される。本方法は、一般に、ＣＤ７０に結合する抗体を含む効果的な量の抗体−医薬複合体を被験体に投与することからなる。抗体は細胞毒性剤または免疫抑制剤に複合させる。ある実施態様において、抗体はモノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２である。
【００２９】
他の実施態様において、抗体はＣＤ７０に結合し、ＣＤ７０に対する結合に関してモノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２と競合する。ＣＤ７０抗体は、（ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ１領域；（ｂ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ２領域；配列番号１０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ３領域；（ｄ）配列番号１６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ１領域；（ｅ）配列番号１８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ２領域；（ｆ）配列番号２０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ３領域；（ｇ）配列番号２６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ１領域；（ｈ）配列番号２８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ２領域；（ｉ）配列番号３０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ３領域；（ｊ）配列番号３６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ１領域；（ｋ）配列番号３８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ２領域；および（ｌ）配列番号４０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ３領域から選択される少なくとも一つのポリペプチド領域を含むことができる。
【００３０】
ある実施態様において、ＣＤ７０抗体は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）（上記）のＨ１、Ｈ２およびＨ３領域または（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）（上記）のＨ１、Ｈ２およびＨ３領域をそれぞれ含む。さらなる実施態様において、ＣＤ７０抗体のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域として、ポリペプチド領域がそれぞれ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
さらなる実施態様において、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３領域は、（上記の）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に対応し、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域は、（上記の）（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）に対応する；またはＨ１、Ｈ２およびＨ３領域は、（上記の）（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）に対応し、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域は、（上記の）（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）に対応する。さらなる実施態様において、ＣＤ７０抗体は配列番号２または配列番号２２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ＣＤ７０重鎖可変領域はさらに配列番号２または配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を持つこともできる。
【００３２】
さらなる実施態様において、重鎖可変領域は配列番号２または配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は配列番号１２または配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。さらに、軽鎖可変領域は配列番号１２または配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有することもできる。
【００３３】
例示的な実施態様において、抗体−医薬複合体は、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＦＰ、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＦＰ、２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦおよび２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥである。
【００３４】
ＣＤ７０抗体は、例えば、キメラ、ヒト化、またはヒトの抗体であってよい。ある実施態様において、ＣＤ７０抗体はヒトの定常領域を有するキメラ抗体である。ＣＤ７０抗体は一価でも多価でもよい。
【００３５】
適当な細胞毒性剤は、例えば、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合性物質、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカロマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイドおよびビンカアルカロイドであってよい。特定の実施態様において、細胞毒性剤は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、オーリスタチンＥ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタトスタチン、カリケアミシン、メイタンシン、ＤＭ−１またはネトロプシンである。他の適当な細胞毒性剤としては、抗チュブリン物質、例えば、オーリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、またはドラスタチンである。特定の実施態様において、抗チュブリン物質は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、オーリスタチンＥ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルシミド、エストラムスチン、セマドチン、ジスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ−１またはエロイテロビンである。
【００３６】
適当な免疫抑制剤として、例えば、ガンクロビル、エタネルセプト、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチル、メトトレキサート、コルチゾール、アルドステロン、デキサメタゾン、シクロオキギゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、またはロイコトリエンレセプターアンタゴニストが挙げられる。
【００３７】
抗体医薬複合体において、抗体は細胞毒性剤または免疫抑制剤に直接またはリンカーを経て複合させることができる。適当なリンカーとしては、例えば、切断性および非切断性リンカーが挙げられる。切断性リンカーは典型的には細胞内条件で切断を受けることができる。適当な切断性リンカーとして、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ等の細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。
【００３８】
例示的な実施態様において、リンカーはバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）またはフェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー等のジペプチドリンカーであってよい。他の適当なリンカーとしては、ヒドラゾンリンカー等の５．５未満のｐＨで加水分解可能なリンカーが挙げられる。さらなる適当な切断性リンカーとしては、ジスルフィドリンカーが挙げられる。
【００３９】
ＡＤＣは、例えば、Ｔｈ１仲介免疫学的疾患等の免疫学的疾患の細胞を標的とすることができる。Ｔｈ１仲介免疫学的疾患とは、例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、ハシモト甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結核または急性移植片対宿主病が挙げられる。他の免疫学的疾患としては、例えば活性化Ｂリンパ球疾患が挙げられる。被験体はヒトまたは非ヒトの動物であってよい。
【００４０】
さらに別の側面において、抗体−医薬複合体が提供される。抗体−医薬複合体はＣＤ７０に結合する抗体を有する。抗体は細胞毒性剤または免疫抑制剤と複合化する。抗体−医薬複合体はＣＤ７０を発現する癌細胞株に対して細胞毒または細胞静止効果、および／またはＣＤ７０を発現する免疫細胞に対して細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼすことができる。
【００４１】
ある実施態様において、抗体はモノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２である。他の実施態様において、抗体はＣＤ７０に結合し、ＣＤ７０に対する結合に関してモノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２と競合する。そのようなＣＤ７０抗体は、（ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ１領域；（ｂ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ２領域；配列番号１０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ３領域；（ｄ）配列番号１６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ１領域；（ｅ）配列番号１８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ２領域；（ｆ）配列番号２０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ３領域；（ｇ）配列番号２６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ１領域；（ｈ）配列番号２８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ２領域；（ｉ）配列番号３０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＨ３領域；（ｊ）配列番号３６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ１領域；（ｋ）配列番号３８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ２領域；および（ｌ）配列番号４０で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＬ３領域から選択される少なくとも一つのポリペプチドを含むことができる。
【００４２】
ある実施態様において、ＣＤ７０抗体は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）（上記）のＨ１、Ｈ２およびＨ３領域；または（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）（上記）のＨ１、Ｈ２およびＨ３領域をそれぞれ含む。さらなる実施態様において、ＣＤ７０抗体のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域として、ポリペプチド領域がそれぞれ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する。
【００４３】
さらなる実施態様において、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３領域は、（上記の）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に対応し、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域は、（上記の）（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）にそれぞれ対応する；またはＨ１、Ｈ２およびＨ３領域は、（上記の）（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）に対応し、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３領域は、（上記の）（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）にそれぞれ対応する。さらなる実施態様において、ＣＤ７０抗体は配列番号２または配列番号２２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ＣＤ７０重鎖可変領域はさらに配列番号２または配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有することもできる。
【００４４】
さらなる実施態様において、重鎖可変領域は配列番号２または配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は配列番号１２または配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。さらに、軽鎖可変領域は配列番号１２または配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有することもできる。
【００４５】
例示的な実施態様において、抗体−医薬複合体は、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＦＰ、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦ、１Ｆ６−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＦＰ、２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＦおよび２Ｆ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥである。
【００４６】
ＣＤ７０抗体は、例えば、キメラ、ヒト化、またはヒトの抗体であってよい。ある実施態様において、ＣＤ７０抗体はヒトの定常領域を有するキメラ抗体である。ＣＤ７０抗体は一価でも多価でもよい。
【００４７】
適当な細胞毒性剤は、例えば、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合性物質、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカロマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイドおよびビンカアルカロイドであってよい。特定の実施態様において、細胞毒性剤は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、オーリスタチンＥ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタトスタチン、カリケアミシン、メイタンシン、ＤＭ−１またはネトロプシンである。他の適当な細胞毒性剤としては、抗チュブリン物質、例えば、オーリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、またはドラスタチンが挙げられる。特定の実施態様において、抗チュブリン物質は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、オーリスタチンＥ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルシミド、エストラムスチン、セマドチン、ジスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ−１またはエロイテロビンである。
【００４８】
適当な免疫抑制剤として、例えば、ガンクロビル、エタネルセプト、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチル、メトトレキサート、コルチゾール、アルドステロン、デキサメタゾン、シクロオキギゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、またはロイコトリエンレセプターアンタゴニストが挙げられる。
【００４９】
抗体医薬複合体において、抗体は細胞毒性剤または免疫抑制剤に直接またはリンカーを経て複合させることができる。適当なリンカーとしては、例えば、切断性および非切断性リンカーが挙げられる。適当なリンカーは典型的には細胞内条件で切断を受けることができる。適当な切断性リンカーとして、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ等の細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。
【００５０】
抗体−医薬複合体は、ＣＤ７０を発現する細胞、例えば、腎臓細胞癌腫、Ｂ細胞リンパ腫、またはグリオブラストーマを標的とすることができる。抗体−医薬複合体は、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞または成熟樹状細胞等、ＣＤ７０発現免疫細胞を標的とすることもできる。
【００５１】
さらに別の側面において、ＣＤ７０発現ガンまたは免疫学的疾患の治療用医薬組成物が提供される。医薬組成物は抗体−医薬複合体および少なくとも一つの薬学的に適合性のある成分を含む。関連する側面において、医薬キットが提供される。キットは抗体−医薬複合体を含有する容器を含む。抗体−医薬複合体は典型的には凍結乾燥されている。キットはさらに薬学的に許容される希釈液を含む第二の容器を含んでよい。
【００５２】
本発明は、下記の本発明の詳細な説明、本発明の特定の実施態様の非限定的な実施例および添付の図面によりさらに完全に理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
（発明の詳細な説明）
ＣＤ７０に結合する抗体−医薬複合体（ＡＤＣ）とＡＤＣ誘導体の利用に関する方法と組成物が提供される。抗体と複合した医薬はＣＤ７０を発現する細胞に対して細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼして、免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンを治療する。一つの側面において、本方法および組成物は、ＣＤ７０に対する結合に関して、モノクローナル抗体１Ｆ６または２Ｆ２と競合し、かつ細胞毒性剤と複合したときに、ＣＤ７０発現細胞の増殖を低下または阻害する細胞毒または細胞静止効果を及ぼす抗体およびその誘導体に関する。ここに記載の方法および組成物に従って使用することのできるＣＤ７０に対する抗体としてはモノクローナル抗体ならびにキメラ、ヒト化またはヒトの抗体（例えば、１Ｆ６または２Ｆ２のヒト化またはキメラ形）および例えば化学療法医薬等の細胞毒性剤または免疫抑制剤と複合したそれら抗体が挙げられる。
【００５４】
開示の明確化のためであって、限定するものではないが、本発明の詳細な説明を下記の小区分に分ける。
【００５５】
（Ｉ．定義と略号）
他に定義しなければ、ここで用いるすべての技術的および科学的用語は、記載の方法および組成物に関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ここで用いる下記の用語および語句は他に示されない限りそれらに帰する意味を有する。
【００５６】
ここで用いる「阻害する」または「阻害」との用語は測定可能な量だけの減少または完全に妨げることを意味する。
【００５７】
ここで用いる「物質」または「薬剤」は、例えば、医薬化合物、治療化合物または薬理学的化合物等の要素、化合物または分子的実体を意味する。物質は天然または合成またはそれらの組合せであってよい。「治療剤」とは、それのみまたは他の物質（例えば、プロドラッグと組み合わされたプロドラッグ変換酵素）との組合せでガン細胞または活性化免疫細胞に治療（例えば有益な）効果を及ぼす物質である。典型的には、ここに記載の方法および組成物に従って有用な治療剤は細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼす治療剤である。
【００５８】
物質の細胞に対する効果をいうときの「細胞毒性効果」とは、細胞を殺すことを意味する。「細胞静止効果」とは細胞増殖の阻害を意味する。「細胞毒性剤」とは、細胞に対して細胞毒または細胞静止効果を有することにより、細胞集団内の細胞の成長をそれぞれ低下または阻害する物質を意味する。
【００５９】
ＣＤ７０標的部分−医薬複合体のＣＤ７０発現細胞に対する効果の文脈において、「枯渇」とはＣＤ７０発現細胞の減少または除去をいう。
【００６０】
ここで用いる「免疫抑制剤」との用語は、免疫応答の発生または保持を阻害する物質を意味する。免疫抑制剤によるそのような阻害は、例えば、免疫細胞（例えば、ＴまたはＢリンパ球）の除去；他の細胞の機能的能力を調節（例えば、下方制御）することのできる免疫細胞の誘導または発生；免疫細胞における非応答状態の誘導（例えば、アネルギー）；または例えば免疫細胞により発現されたタンパク質のパターンを変える等の、これら細胞の活性または機能を高めるか、低下させるか、変えること（例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、転写因子、キナーゼ、共刺激分子または他の細胞表面レセプター等のある種の分子の変えられた生産および／または分泌）により行われる。典型的な実施態様において、免疫抑制剤は免疫応答を促進する免疫細胞に対して細胞毒または細胞静止効果を有する。
【００６１】
ここで用いる「免疫細胞」とは、抗原（例えば、自己抗原）に対する免疫応答の調節にかかわる造血系のあらゆる細胞を意味する。典型的な実施態様において、免疫細胞はＴリンパ球、Ｂリンパ球または樹状細胞である。
【００６２】
「ポリペプチド」との用語はアミノ酸のポリマーまたはその等価物をいい、特定の長さの生産物を意味しない；よって、「ペプチド」および「タンパク質」はポリペプチドの定義に含まれる。さらに、ここに定義される「抗体」もポリペプチドの定義に含まれる。「ポリペプチド領域」はポリペプチドのセグメントをいい、該セグメントは例えば一つ以上の領域またはモチーフを含んでもよい（例えば、抗体のポリペプチド領域は例えば一つ以上のＣＤＲを含んでもよい）。「断片」との用語は、典型的にはポリペプチドの少なくとも２０個の連続的な、または少なくとも５０個の連続的なアミノ酸を有するポリペプチドの一部をいう。「誘導体」とは第二のポリペプチドに対して保存アミノ酸置換を有するポリペプチドまたはその断片；または例えば異質ポリペプチドの結合、またはグリコシル化、アセチル化、リン酸化等により第二分子の共有結合により修飾されたポリペプチドまたはその断片を含む。さらに、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等）の一つ以上の類似体を有するポリペプチド、非置換の結合を有するポリペプチド、ならびに天然または非天然の他の公知修飾物も「ポリペプチド」の定義に含まれる。
【００６３】
ここで用いる「抗体」との用語は（ａ）免疫グロブリンポリペプチドおよび免疫グロブリンの免疫活性部分、すなわち、特定の抗原（例えば、ＣＤ７０）に免疫特異的に結合する抗原結合部位を有する免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、またはその断片、または（ｂ）抗原（例えば、ＣＤ７０）に免疫特異的に結合するそのような免疫グロブリンポリペプチドまたは断片の保存置換された誘導体をいう。抗体は、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）で一般的に記載されている。
【００６４】
上記に定義づけられた免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の文脈において、「保存置換」とは、免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の抗原に対する（例えばＫＤにより測定される）特異的結合を実質的に減少させない一つ以上のアミノ酸の置換（すなわち、標準的な結合アッセイ、例えばＥＬＩＳＡによる測定で約４０％以下、典型的には約３０％以下、さらに典型的には約２０％以下、さらに典型的には約１０％以下、または最も典型的には約５％以下だけ結合を増加させる置換、結合を顕著に変化させない置換、または結合を減少させる置換）を意味する。
【００６５】
ここで用いる「抗体誘導体」とは、例えば、異質ポリペプチドの結合によるか、または抗体に通常関連しないグリコシル化、アシル化またはリン酸化等により異質分子の共有結合により修飾された上記の抗体を意味する。
【００６６】
「モノクローナル抗体」とは、それが作られた方法にかかわらず、真核または原核細胞クローン、またはファージクローン等の単一の細胞クローンから得られる抗体を意味する。よって、ここで用いる「モノクローナル抗体」との用語はハイブリドーマ技術により作られる抗体に限定されない。
【００６７】
ポリペプチドの文脈において、「異質」との用語は、別のポリペプチドと比較して異なる起源（例えば、細胞、組織、生物または種）からのものであって、よって二つのポリペプチドは異なることを意味する。典型的には、異質ポリペプチドは異なる種からのものである。
【００６８】
ここに記載された方法に従って用いられる抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体の文脈において、ここで用いる「機能的」との用語は、抗体またはその誘導体が、（１）ＣＤ７０に結合でき、（２）細胞毒性剤と複合させたときにＣＤ７０発現細胞の増殖を低下または阻害するか、または免疫抑制剤と複合させたときに免疫細胞に対して免疫抑制効果を有することを意味する。
【００６９】
二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一」または「同一パーセント」との用語は、比較され、または最大の一致のために配列された場合に同一であるか、または特定パーセントの同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する二つ以上の配列または副配列を意味する。同一パーセントを決定するために、配列を最適な比較の目的のために配置する（例えば、第二アミノ酸または核酸配列との最適な配列のために第一アミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを次に比較する。第一配列中の位置が、第二配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、両分子は該位置において同一である。二つの配列間の同一パーセントは配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一％＝同一位置の＃／位置の全＃（例えば、重複する位置）×１００）。ある実施態様において、二つの配列は同じ長さである。
【００７０】
二つの核酸配列またはポリペプチドの文脈において、「実質的に同一」との用語は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも６５％の同一性；典型的には少なくとも７０％または少なくとも７５％の同一性；さらに典型的には少なくとも８０％または少なくとも８５％の同一性；およびさらに典型的には少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性（下記に記載の方法の一つにより測定）を有する二つ以上の配列または副配列をいう。
【００７１】
二つ以上のポリペプチド配列の文脈において、「類似性」または「類似性パーセント」とは、比較され、最大の一致のために配列されたときに、下記の方法の一つを用いて測定した場合に、同じであるか、または保存的に置換されたアミノ酸残基の特定されたパーセントを有する二つ以上の配列または副配列をいう。例えば、第一アミノ酸配列が、第一配列中に含まれるアミノ酸配列の数と同じ数のアミノ酸を比較した場合、または当業者に公知のコンピュータ類似性プログラム（下記参照）により配列されたポリペプチドの配列に比較した場合に、第二アミノ酸配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％またはさらに９５％同一であるか、または保存置換されているときに、第一アミノ酸配列は第二アミノ酸配列に対して類似すると考えることができる。
【００７２】
ポリペプチド配列の文脈において、「実質的な類似性」または「実質的な類似性」との用語は、ポリペプチド領域が、参照配列に対して少なくとも７０％、典型的には少なくとも８０％、さらに典型的には少なくとも８５％、さらにより典型的には少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列類似性を有する配列を持つことを示す。例えば、ポリペプチドは第二のポリペプチドに対して、例えばそれら二つのペプチドが一つ以上の保存置換により異なる場合、実質的に類似する。
【００７３】
抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体の文脈において、抗ＣＤ７０抗体の一つ以上の抗原結合領域（例えば、重鎖または軽鎖の可変領域、または重鎖または軽鎖のＣＤＲ）に実質的に同一または実質的に類似する一つ以上のポリペプチド領域を有するタンパク質は、当分野で公知またはここで言及する多様な標準的イムノアッセイのいずれかにより測定した場合に、抗ＣＤ７０抗体により認識されるＣＤ７０のエピトープに対する特異的結合を保持する。
【００７４】
二つの配列間の同一パーセントまたは類似性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。二つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましく、非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７において改良されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ，ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドの検査はＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施して興味のあるタンパク質をコードする核酸に相同の核酸配列を得ることができる。ＢＡＬＡＳＴタンパク質の検査はＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して興味のあるタンパク質に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載のように利用することができる。もしくは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の遠い関連を検出する反復検査を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴを利用する場合、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラム、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期値パラメーターを用いることができる。（例えば、インターネットウェブサイトアドレス：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。）配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムのもう一つの好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９年）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれる。アミノ酸配列比較のためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いることができる。配列分析のための付加的なアルゴリズムは当分野で公知であり、ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ，１９９４，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３−５に記載のＡＤＶＡＮＣＥとＡＤＡＭ；およびＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−８に記載のＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは検査の感度と速度を設定するコントロールオプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較されている二つの配列内の類似の領域が、並べられた残基のペアーを見つけることにより発見される；ｋｔｕｐ＝１の場合、一列に並べられたアミノ酸を調べる。ｋｔｕｐはタンパク配列のために２または１に、またはＤＮＡ配列のために１〜６に設定することができる。ｋｔｕｐが規定されない場合の初期値はタンパク質の場合は２であり、ＤＮＡでは���である。ＦＡＳＴＡパラメーターのさらなる説明については、例えばｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｄｏｃｓ／ｍａｎ／ｍａｎ／ｆａｓｔａ．１．ｈｔｍ１＃ｓｅｃｔ２（その内容は文献の援用により本明細書に編入する）を参照されたい。
【００７５】
もしくは、タンパク質配列アライメントは、Ｈｉｇｇｉｎｓら，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２により記載されたＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴニズムを用いて実施してよい。
【００７６】
ここで用いる「予防」、「予防する」との用語は、（ａ）ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患の発症または徴候、またはその一つ以上の臨床的または診断的症状を阻止し、（ｂ）ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患の徴候の程度を抑制し、または（ｃ）ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患の徴候の起こりやすさを低減するために、抗ＣＤ７０抗体−医薬複合体（ＡＤＣ）またはＡＤＣ誘導体を、ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患の臨床的または診断的症候の発生前に被験体に投与（例えば、ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患を得る素因または危険にある個人に対しての投与）することをいう。
【００７７】
ここで用いる「治療」または「治療する」との用語は、ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患の臨床的または診断的症状の発症後の被験体に抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体をいずれか臨床段階にて投与することにより、病気の臨床または診断的症状の低減または消去によって証拠付けられる被験体中のＣＤ７０発現ガンまたは免疫学的疾患の進行の遅延、停止または後退をいう。治療として、例えば、徴候の程度、症候の数または再発頻度の低下が挙げられる。
【００７８】
ここに用いる「薬学的に許容される」との用語は連邦の規制機関または州政府により承認されたか、または合衆国薬局方、または動物、特にヒトでの使用に関して他の一般的に認められている薬局方でリストに挙げられているものを意味する。「薬学的に適合性のある成分」とは、ＣＤ７０標的部分−医薬複合体とともに投与される薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤または基剤をいう。
【００７９】
抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の投与の文脈において、「効果的な量」との用語は、発症を阻害するか、または被験体中のＣＤ７０を発現するガンまたは免疫疾患の一つ以上の臨床または診断的症状を改善するのに十分なＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の量をいう。効果的な量の物質をここに記載の方法に従って「効果的な投薬計画」で投与する。「効果的な投薬計画」との用語は、ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患の治療または予防を達成するのに十分な物質の量と投与頻度の組合せをいう。
【００８０】
「ＡＦＰ」との略号は、ジメチルバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロイン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミンをいう（下記の式ＸＶＩを参照）。
【００８１】
「ＭＭＡＥ」との略号は、モノメチルオーリスタチンＥをいう（下記の式ＸＩを参照）。
【００８２】
「ＡＥＢ」との略号は、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸と反応させることにより作られたエステルをいう（下記の式ＸＸを参照）。
【００８３】
「ＡＥＶＢ」との略号は、オーリスタチンＥをベンゾイル吉草酸と反応させることにより作られたエステルをいう（下記の式ＸＸＩを参照）。
【００８４】
「ＭＭＡＦ」との略号は、ドバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロイン−フェニルアラニンをいう（下記の式ＩＶＩＶを参照）。
【００８５】
「ｆｋ」および「ｐｈｅ−ｌｙｓ」の略号は、リンカーフェニルアラニン−リジンをいう。
【００８６】
「ｖｃ」および「ｖａｌ−ｃｉｔ」の略号は、リンカーバリン−シトルリンをいう。
【００８７】
（ＩＩ．抗ＣＤ７０抗体およびその誘導体）
ここに記載の方法と組成物は、抗体またはその誘導体を、（ａ）ＣＤ７０に特異的に結合し、および（ｂ）治療剤と複合したときに、治療剤がＣＤ７０を発現するガン細胞または活性化免疫細胞に細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼすＡＤＣとして使用することを含む。抗ＣＤ７０抗体の文脈において、ここで用いる「誘導体」との用語は、（ｉ）抗ＣＤ７０抗体の抗原結合領域、または（例えば、保存置換により）それに由来する領域、および抗ＣＤ７０抗体に異質な少なくとも一つのポリペプチド領域または他の部分を有し、かつ（ｉｉ）抗原結合領域またはそれに由来する領域を経てＣＤ７０に特異的に結合する分子をいう。特定の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体はｍＡｂ  １Ｆ６または２Ｆ２またはその誘導体である。ある側面において、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は、ＣＤ７０に対する結合に関して、モノクローナル抗体ＩＦ６または２Ｆ２と競合する。
【００８８】
典型的な実施態様において、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は細胞毒性剤と複合すると、ＣＤ７０発現ガン細胞に対して細胞毒または細胞静止効果を及ぼし、細胞毒または免疫抑制剤と複合すると、ＣＤ７０発現ガンまたは免疫学的疾患それぞれの治療に関して、活性化リンパ球または樹状細胞に対して細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼす。
【００８９】
本発明組成物と方法に従う使用に適当な抗ＡＤ７０抗体は典型的にはモノクローナルであり、例えば、キメラ（例えば、ヒト定常領域またはマウス可変領域を有するもの）、ヒト化またはヒトの抗体；単鎖抗体等を挙げることができる。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってよい。
【００９０】
ある実施態様において、抗体は抗原結合性抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ鎖、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルヒド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨのいずれかの領域からなる断片、またはＦａｂ発現ライブラリーにより作られる断片、または上記の抗体のいずれかのＣＤ７０結合断片等である。単鎖抗体等の抗原結合性抗体断片は可変領域のみからなるか、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬ領域の全体またはその一部と組み合わせてなる。また、抗原結合性抗体断片は、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬ領域とのいかなる組合せからなってよい。典型的には、抗体はヒト、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリのものである。ここで用いる「ヒトの」抗体としては、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が挙げられ、以下に記載のように、および例えば米国特許第５，９３９，５９８号および６，１１１，１６６号に記載のように、ヒトの免疫グロブリンライブラリーから、ヒトＢ細胞から、または一つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックである動物から単離された抗体が挙げられる。
【００９１】
抗体は単特異的、二重特異的、三重特異的であるか、またはそれ以上の多重特異性を有してよい。多重特異的抗体はＣＤ７０の異なるエピトープに対して特異的であってよいし、またＣＤ７０および不均一タンパク質の両方に特異的であってよい（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら，１９９１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：６０−６９；米国特許第４，４７４，８９３号、同上第４，７１４，６８１号、同上第４，９２５，６４８号、同上第５，５７３，９２０号および同上第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，１９９２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７−１５５３を参照。）ここに記載の方法を実施するために有用な二重特異的および三重特異的抗体等の多重特異的抗体は、（ＣＤＲおよび／またはモノクローナル抗体２Ｆ２および１Ｆ６の重鎖を有する抗体等の、しかしこれに限定されない）ＣＤ７０および第二の細胞表面レセプターまたはレセプター複合体、例えば免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、主要組織適合性タンパク質、レクチン（Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプ）、または補体調節タンパク質に免疫特異的に結合する抗体である。典型的な実施態様において、多重特異的抗体部の第二細胞表面分子またはレセプター複合体への結合は抗ＣＤ７０抗体−医薬複合体の細胞毒または細胞静止効果を向上させる。
【００９２】
ある特定の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体はＣＤ７０に対して作動性、非作動性または拮抗性である。別の特定の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体はＣＤ７０リガンドのＣＤ７０への結合をブロックしない。さらに別の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体はブロッキング抗体（すなわち、ＣＤ２７のＣＤ７０への結合をブロックする抗体）である。
【００９３】
一つの側面において、抗ＣＤ７０抗体はモノクローナル抗体１Ｆ６の一つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）に実質的に同一または実質的に類似する一つ以上のＣＤＲを含む（表１を参照）。例えば、抗体は、ｍＡｂ  １Ｆ６の対応する重鎖ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２またはＨ３領域）または対応する軽鎖ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２またはＬ３領域）（それぞれ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０）に実質的に同一または実質的に類似の重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲを含むことができる。典型的な実施態様において、抗ＣＤ７０抗体は、ｍＡｂ  １Ｆ６の対応する重鎖および／または軽鎖ＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似する二つまたは三つの重鎖ＣＤＲおよび／または二つまたは三つの軽鎖ＣＤＲを有する。特定の実施態様において、１Ｆ６の重鎖または軽鎖ＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似するＣＤＲは配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０に示すアミノ酸配列を有する。
【００９４】
例えば、抗ＣＤ７０抗体がｍＡｂ  １Ｆ６の重鎖ＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似する少なくとも一つの重鎖ＣＤＲを有するある実施態様において、抗体またはその誘導体は、さらに、ｍＡｂ  １Ｆ６の軽鎖に実質的に同一または実質的に類似する少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００９５】
ある典型的な実施態様において、抗ＣＤ７０抗体は重鎖または軽鎖の可変領域を含み、該可変領域は、（ａ）ｍＡｂ  １Ｆ６の対応するＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似する一組の三つのＣＤＲ、および（ｂ）一組の四つのフレームワーク領域を有する。例えば、抗ＣＤ７０抗体は重鎖または軽鎖の可変領域を含むことができ、該可変領域は、（ａ）ＣＤＲの組がモノクローナル抗体１Ｆ６に由来する一組の三つのＣＤＲ、および（ｂ）フレームワーク領域の組がｍＡｂ  １Ｆ６のフレームワーク領域の組とは同一または異なる一組の四つのフレームワーク領域を有する。
【００９６】
特定の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体は、ｍＡｂ  １Ｆ６の重鎖可変領域に実質的に同一または実質的に類似する（すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列に実質的に同一または実質的に類似する（表１を参照））重鎖可変領域および／またはｍＡｂ  １Ｆ６の軽鎖可変領域に実質的に同一または実質的に類似する（すなわち、配列番号１２に示すアミノ酸配列に実質的に同一または実質的に類似する（表１を参照））軽鎖可変領域を有する。例えば、抗体は配列番号２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むことができ、任意にさらに配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる。一つの例示的実施態様において、抗ＣＤ７０抗体はｍＡｂ  １Ｆ６である。
【００９７】
もう一つの側面において、抗ＣＤ７０抗体はモノクローナル抗体２Ｆ２の一つ以上のＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似する一つ以上のＣＤＲを含む（表１を参照）。例えば、抗体は、ｍＡｂ  ２Ｆ２の対応する重鎖ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２またはＨ３領域）または対応する軽鎖ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２またはＬ３領域）（それぞれ配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０）に実質的に同一または実質的に類似の重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲを含むことができる。典型的な実施態様において、抗ＣＤ７０抗体は、ｍＡｂ  ２Ｆ２の対応する重鎖および／または軽鎖ＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似する二つまたは三つの重鎖ＣＤＲおよび／または二つまたは三つの軽鎖ＣＤＲを有する。特定の実施態様において、２Ｆ２の重鎖または軽鎖ＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似するＣＤＲは配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０に示すアミノ酸配列を有する。
【００９８】
例えば、抗ＣＤ７０抗体がｍＡｂ  ２Ｆ２の重鎖ＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似する少なくとも一つの重鎖ＣＤＲを有するある実施態様において、抗体またはその誘導体は、さらに、ｍＡｂ  ２Ｆ２の軽鎖に実質的に同一または実質的に類似する少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００９９】
ある典型的な実施態様において、抗ＣＤ７０抗体は重鎖または軽鎖の可変領域を含み、該可変領域は、（ａ）ｍＡｂ  ２Ｆ２の対応するＣＤＲに実質的に同一または実質的に類似する一組の三つのＣＤＲ、および（ｂ）一組の四つの骨格領域を有する。例えば、抗ＣＤ７０抗体は重鎖または軽鎖の可変領域を含み、該可変領域は、（ａ）ＣＤＲの組がモノクローナル抗体２Ｆ２に由来する一組の三つのＣＤＲ、および（ｂ）骨格領域の組がｍＡｂ  ２Ｆ２の骨格領域の組とは同一または異なる一組の四つの骨格領域を有する。
【０１００】
特定の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体は、ｍＡｂ  ２Ｆ２の重鎖可変領域に実質的に同一または実質的に類似する（すなわち、配列番号２２に示すアミノ酸配列に実質的に同一または実質的に類似する（表１を参照））重鎖可変領域および／またはｍＡｂ  ２Ｆ２の軽鎖可変領域に実質的に同一または実質的に類似する（すなわち、配列番号３２に示すアミノ酸配列に実質的に同一または実質的に類似する（表１を参照））軽鎖可変領域を含む。例えば、抗体は配列番号２２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むことができ、任意にさらに配列番号３２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる。一つの例示的実施態様において、抗ＣＤ７０抗体はｍＡｂ  ２Ｆ２である。
【０１０１】
各配列番号が対応する１Ｆ６または２Ｆ２の領域を示す表を以下に示す。
【０１０２】
【表１】
2006518753.tif 000001
2006518753.tif 000002
2006518753.tif 000003
ここに示される方法に有用な抗ＣＤ７０抗体はＣＤ７０に対する結合親和性で記載または特定してもよい。典型的な結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものである。
【０１０３】
免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンの治療に用いてよい抗体は当分野で公知のあらゆる適当な方法により作ることができる。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術またはそれらの組合せ使用等、多様な技術を用いて調製することができる。ハイブリドーマ技術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）；およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら，Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，ｐｐ．５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）で一般的に議論されている。抗ＣＤ７０抗体を作るために用いることのできるファージディスプレイ技術としては、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎら，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０；Ａｍｅｓら，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，１９９４，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃら，１９９７，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎら，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１  １３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号、同上第５，２２３，４０９号、同上第５，４０３，４８４号、同上第５，５８０，７１７号、同上第５，４２７，９０８号、同上第５，７５０，７５３号、同上第５，８２１，０４７号、同上第５，５７１，６９８号、同上第５，４２７，９０８号、同上第５，５１６，６３７号、同上第５，７８０，２２５号、同上第５，６５８，７２７号、同上第５，７３３，７４３号および同上第５，９６９，１０８号（これらの開示は本明細書に参考として援用される）に開示されたものが挙げられる。
【０１０４】
特定のエピトープを認識する抗体断片を作る技術も当分野において一般的に知られている。例えば、ＦａｂとＦ（ａｂ’）２断片は、（Ｆａｂ断片を作るために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２断片を作るために）ペプシン等の酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により作ることができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１領域を含む。また、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９；およびＳａｗａｉら，１９９５，ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４；およびＢｅｔｔｅｒら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（これらの開示は本明細書に参考として援用される）に記載の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え生産する技術も用いることができる。
【０１０５】
単鎖Ｆｖおよび抗体を作るために用いることのできる技術の具体例として、米国特許第４，９４６，７７８号および同上第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８；Ｓｈｕら，１９９３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：７９９５−７９９９；およびＳｋｅｒｒａら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０が挙げられる。
【０１０６】
ある実施態様において、抗ＣＤ７０抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を作る方法は当分野で公知である。（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２９：１２０２；Ｏｉら，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓらら，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号、同４，８１６，５６７第号および同上第４，８１６，３９７号を参照。）抗ＣＤ７０抗体はヒト化抗体であってよい。ヒト化抗体は、所望の抗原に結合し、非ヒト種に由来する一つ以上のＣＤＲと、ヒト免疫グロブリン分子に由来する骨格と定常領域を有する抗体分子である。ヒトの骨格領域中の骨格残基は、抗原結合を変更、好ましくは向上するようにＣＤＲドナー抗体からの対応する残基によってしばしば置換されている。これらの骨格置換物は、当分野でよく知られた方法により、例えば、特定の位置の稀な骨格残基を同定するための抗原結合と配列の比較に重要な骨格残基を同定するために、ＣＤＲと骨格残基の相互作用のモデル化により同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎら，米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３を参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト化（ＥＰ  ０  ２３９  ４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号、同上第５，５３０，１０１号および同上第５，５８５，０８９号）、張り合わせまたは新表面の付与（ＥＰ  ０  ５９２  １０６；ＥＰ  ０  ５１９  ５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら，１９９４，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３）およびチェインシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２）（これらの開示は本明細書に参考として援用される）などの公知の多様な技術を用いてヒト化することができる。
【０１０７】
さらに別の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から得られる抗体ライブラリーを用いて、例えばファージディスプレイ法（上記を参照）等の多様な公知の方法により作ることができる。例えば、米国特許第４，４４４，８８７号および同上第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５，ＷＯ９８／５０４３３，ＷＯ９８／２４８９３，ＷＯ９８／１６６５４，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１も参照されたい。さらに、選択されたエピトープを認識するヒト抗体は、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて同じエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択を導く「誘導選択」と称される技術を用いて作ることができる（例えば、Ｊｅｓｐｅｒｓら，１９９４，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３を参照）。ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを用いて作ることもできる。抗原に向けられたモノクローナル抗体は、免疫化されたトランスジェニックマウスから慣用のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。ヒト抗体を作るためのこの技術の概略について、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３を参照されたい。ヒト抗体とヒトモノクローナル抗体を作るためのこの技術とそのような抗体を作るためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０  ５９８，８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号、同上第５，６２５，１２６号、同５，６３３，４２５第号、同上第５，５６９，８２５号、同上第５，６６１，０１６号、同上第５，５４５，８０６号、同上第５，８１４，３１８号、同上第５，８８５，７９３号、同上第５，９１６，７７１号および同上第５，９３９，５９８号を参照されたい。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａ）やＭｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）等の会社は上記の技術と同様な技術を用いて、選択された抗原に向けられたヒト抗体を提供することに携わることができる。
【０１０８】
上記のように、抗ＣＤ７０抗体の誘導体も本方法の実施に用いることができる。一般的に、抗ＣＤ７０抗体誘導体は抗ＣＤ７０抗体（抗原結合断片または保存置換されたポリペプチドを含む）および抗ＣＤ７０抗体に異質な少なくとも一つのポリペプチド領域または他の部分からなる。例えば、抗ＣＤ７０抗体は、例えば、どんなタイプの分子の共有結合によっても、抗体誘導体が抗原結合領域またはそれに由来する領域を経てＣＤ７０に特異的に結合するようなことがないように、または複合医薬が（ａ）ＣＤ７０を発現するガン細胞に細胞静止または細胞毒性効果または（ｂ）活性化リンパ球に対して細胞静止、細胞毒または免疫抑制効果を及ぼすことのないように共有結合させることで修飾することができる。典型的な修飾としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグリル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合等が挙げられる。多くの化学修飾のいずれかを、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等の、しかしこれらに限定されない公知の技術により行ってよい。さらに、誘導体は一つ以上の非古典的アミノ酸を含んでよい。
【０１０９】
ある実施態様において、抗体誘導体は、一つ以上のモノマーからなる例えば二量体等の多量体であり、ここで各モノマーは、抗体誘導体がＣＤ７０に特異的に結合する多量体（例えば、ホモダイマー）を形成するように、（ｉ）抗ＣＤ７０抗体の抗原結合部位、またはそれに由来するポリペプチド領域（例えば、一つ以上のアミノ酸の保存置換によるもの）、および（ｉｉ）多量体化（例えば二量体化）ポリペプチド領域を有する。典型的な実施態様において、抗ＣＤ７０抗体の抗原結合領域、またはそれに由来するポリペプチド領域は、二量体化または多量体化領域を有する異質タンパク質に対して組換えにより、または化学的に融合する。免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンを治療または予防する目的で抗体誘導体を被験体に投与する前に、誘導体をホモダイマーまたはヘテロダイマーの形成を可能とする条件に供する。ここで用いるヘテロダイマーは同一の二量体化領域を有するが、異なるＣＤ７０抗原結合領域を有するか、同一のＣＤ７０抗原結合領域を有するが、異なる二量体化領域を有するか、または異なるＣＤ７０抗原結合領域と異なる二量体化領域を有してよい。
【０１１０】
典型的な二量体化領域は、転写因子に由来するものである。一つの実施態様において、二量体化領域は塩基領域ロイシンジッパー（「ｂＺＩＰ」）の二量体化領域である（例えば、Ｃ．Ｖｉｎｓｏｎら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：９１１−９１６を参照）。有用なロイシンジッパー領域は、例えば、酵母転写因子ＧＣＮ４、哺乳類転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合プロテインＣ／ＥＢＰ、およびガン遺伝子生産物ＦｏｓとＪｕｎ中の核形質転換のロイシンジッパー領域が挙げられる。（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９−１７６４；ＢａｘｅｖａｎｉｓおよびＶｉｎｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖｅｌ．３：２７８−２８５；Ｏ’Ｓｈｅａら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：５３８−５４２を参照。）もう一つの実施態様において、二量体化領域は塩基性領域ヘリックス−ループ−ヘリックス（「ｂＨＬＨ」）タンパク質のものである。（例えば、Ｍｕｒｒｅら，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：７７７−７８３を参照。また、Ｄａｖｉｓら，１９９０，Ｃｅｌｌ  ６０：７３３−７４６；ＶｏｒｏｎｏｖａおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９９０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：４７２２−４７２６を参照。）特に有用なｈＨＬＨタンパク質はｍｙｃ、ｍａｘおよびｍａｃである。
【０１１１】
さらに別の実施態様において、二量体化領域は、例えば、重鎖定常領域またはその領域等の免疫グロブリン定常領域である（例えば、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域）。（例えば、米国特許第５，１５５，０２７号、同上第５，３３６，６０３号、同上第５，３５９，０４６号および同上第５，３４９，０５３号；ＥＰ  ０  ３６７  １６６；ＷＯ９６／０４３８８を参照。）
ヘテロダイマーは、ＦｏｓとＪｕｎとの間（Ｂｏｈｍａｎｎら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１３８６−１３９２）、ＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリーのメンバー間（Ｈａｉら，１９８９，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：２０８３−２０９０）、Ｃ／ＥＢＰファミリーのメンバー間（Ｃａｏら，１９９１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１５３８−１５５２；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１５５３−１５６７；Ｒｏｍａｎら，１９９０，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：１４０４−１４１５）、およびＡＴＦ／ＣＲＥＢとＦｏｓ／Ｊｕｎファミリーのメンバー間（ＨａｉおよびＣｕｒｒａｎ，１９９１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：３７２０−３７２４）に形成することが知られている。従って、ＣＤ７０結合タンパク質−医薬複合体が、異なる二量体化領域を含むヘテロダイマーとして被験体に投与される場合、前記のいかなる組合せも用いてよい。
【０１１２】
他の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体誘導体は、第二抗体に複合化した抗ＣＤ７０抗体（「抗体ヘテロ複合体」）である（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照）。本方法を実施するために有用なヘテロ複合体は、ＣＤ７０に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体２Ｆ２または１Ｆ６のＣＤＲおよび／または重鎖を有する抗体）および免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、主要組織適合性タンパク質、レクチン（Ｃタイプ、Ｓタイプ、またはＩタイプ）または補体コントロールタンパク質等の、表面レセプターまたはレセプタータンパク質に結合する抗体からなる。
【０１１３】
ある実施態様において、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は、競合結合の決定のために当分野で知られている方法（例えば、ここに記載のイムノアッセイ等）により決定されるように、ｍＡｂ  １Ｆ６または２Ｆ２のＣＤ７０への結合を競合的に阻害する。典型的な実施態様において、抗体は１Ｆ６または２Ｆ２のＣＤ７０への結合を、少なくとも５０％、より典型的には少なくとも６０％、さらにより典型的には少なくとも７０％および最も典型的には少なくとも７５％だけ競合的に阻害する。他の実施態様において、抗体はＩＦ６または２Ｆ２のＣＤ７０への結合を少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％だけ競合的に阻害する。
【０１１４】
抗体は、多様な公知の方法のいずれかによりＣＤ７０への特異的な結合について検定することができる。使用することのできるイムノアッセイとしては、数例を挙げると、例えば、ウエスタンブロット等の技術を用いる競合または非競合アッセイ系、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイが挙げられる。このようなアッセイは当分野で決まった仕事であって、よく知られている。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，編，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第４版．１９９９）；Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９）を参照。）
さらに、抗体のＣＤ７０への結合親和性および抗体ＣＤ７０相互作用の解離速度は競合結合アッセイにより決定することができる。競合結合アッセイの一つの例は、標識されたＣＤ７０（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）を、興味のある抗体とともに、増加させた量の非標識ＣＤ７０の存在下にインキュベートし、標識されたＣＤ７０に結合した抗体を検出することからなるラジオイムノアッセイである。次に、そのデータから、抗体のＣＤ７０に対する親和性および結合解離速度をＳｃａｔｃｈａｒｄプロット分析により決定することができる。また、第二抗体（例えば、ｍＡｂ  １Ｆ６または２Ｆ２）との競合を、ラジオイムノアッセイを用いて決定することができる。この場合、ＣＤ７０を、標識された化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と複合化させた興味のある抗体とともに、増加させた量の非標識第二抗体の存在下にインキュベートする。もしくは、抗体のＣＤ７０への結合親和性および抗体−ＣＤ７０相互作用の結合速度と解離速度を表面プラスモン共鳴により決定することができる。
【０１１５】
ここに記載の方法に従って、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は治療剤に複合させたときに、ＣＤ７０発現細胞内で吸収され、蓄積し、該細胞内で治療剤は効果（例えば、細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果）を及ぼす。さらなる実施態様において、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は治療剤に複合させたときに、ＣＤ発現細胞の膜を標的とし、膜上に蓄積し、ここで治療剤は効果（例えば、細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果）を及ぼす。さらに別の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は治療剤と複合させたときに、細胞内の生物学的分子（例えば、炎症作因）を標的とし、該生物学的分子を分泌またはそれに結合する細胞またはその隣接する細胞に蓄積し、ここで治療剤は効果（例えば、細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果）を及ぼす。
【０１１６】
一定の抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体を治療剤に複合させた場合、それがＣＤ７０発現細胞に結合した際に対応する治療効果を及ぼすかどうかは、例えば、（１）ＣＤ７０発現細胞を独立して抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体とインキュベートすることにより、（２）該細胞を、治療剤に複合させかつ抗体またはその誘導体に特異的に結合する第二試薬とインキュベートし、そして（３）その対応する治療効果について該細胞を検定することによって容易に決定することができる。複数の抗体または抗体誘導体は、各抗体またはその誘導体（例えば、抗Ｉｇ抗体）が持つポリペプチド領域に特異的に結合する第二試薬を用いるそれらアッセイにより容易に評価することができる。例えば、ＣＤ７０に結合し、かつ細胞毒性剤（例えば、ＡＦＰ、ＭＭＡＦまたはＭＭＡＥ等のオーリスタチン）に複合させたときに細胞毒性効果を及ぼす抗ＣＤ７０  ｍＡｂは、例えばＣｈｕｎら，２００３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．９で記載されているような間接免疫毒性アッセイにより同定することができる。簡単に説明すると、細胞毒性剤を第二抗体（例えば、マウスのｍＡｂの場合、ポリクローナル抗マウスＩｇＧ）と複合させる；ＣＤ７０発現細胞を第一抗体と細胞毒性剤複合化第二抗体とともに（例えば、第一抗体のためにハイブリドーマ上清を用いた９６ウエルプレート中で）インキュベートする；そして第一抗体依存性細胞毒性を標準的な細胞毒性アッセイ（例えば、ＭＴＴ細胞生存度アッセイ）で評価する。（同上参照。）
本方法に有用な抗ＣＤ７０抗体およびその誘導体はタンパク質合成に当分野で公知の方法、典型的には例えば組換え体発現技術により作ることができる。ＣＤ７０に結合し、ＣＤ７０発現細胞の増殖を低下または阻害する抗体またはその誘導体の組換え体発現は、該抗体またはその誘導体をコードする核酸を含む発現ベクターの構築を必要とする。そのようなタンパク質をコードする核酸がいったん得られたら、そのタンパク質分子の生産用ベクターを当分野でよく知られた技術を用いる組換えＤＮＡ技術により作ってよい。標準的な技術、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，第３版，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，第２版，１９８９）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第４版，１９９９）；およびＧｌｉｃｋ  ＆  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  （ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，第２版，１９９８）に記載された標準的な技術を、組換え核酸法、核酸合成、細胞培養、トランスジーン取り込みおよび組換えタンパク質発現のために用いることができる。
【０１１７】
例えば、抗ＣＤ７０抗体の組換え発現に関して、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に結合させたその重鎖または軽鎖、または重鎖または軽鎖の可変領域をコードしてよい。発現ベクターとしては、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照）を含んでよく、抗体の可変領域は全重鎖または軽鎖の発現用ベクターにクローン化してよい。発現ベクターは宿主細胞に慣用の技術により移入し、こうしてトランスフェクションを受けた細胞は次に慣用の技術により培養され、抗ＣＤ７０抗体を産生する。二本鎖抗体の発現の典型的な実施態様において、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、全免疫グロブリン分子の発現用宿主細胞中で共発現させることができる。
【０１１８】
多様な前核および真核宿主−発現ベクターシステムを利用して抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体を発現させることができる。典型的には、特に全組換え抗ＣＤ７０抗体分子のために、真核細胞が組換えタンパク質の発現に用いられる。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター要素等のベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳類細胞は抗ＣＤ７０抗体およびその誘導体の産生の効果的な発現システムである（例えば、Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｃｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２を参照）。
【０１１９】
他の宿主−発現システムとしては、例えば、細菌細胞におけるプラスミド系の発現システム（例えば、Ｒｕｔｈｅｒら，１９８３，ＥＭＢＯ  １，２：１７９１；Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９を参照）；Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）発現ベクターのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞における使用等の昆虫システム；アデノウイルス系のシステム等の哺乳類細胞におけるウイルス系の発現システム（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９；Ｂｉｔｔｎｅｒら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４を参照）が挙げられる。
【０１２０】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定の形式で修飾しプロセシングする宿主細胞株を選ぶことができる。発現すべき外来タンパク質の適切な修飾およびプロセシング（例えば、グリコシル化、リン酸化および切断）を確実にすべく適当な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物と遺伝子産物の適当なプロセシングの細胞装置を有する真核宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳類宿主細胞としては、例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷ１３８が挙げられる。
【０１２１】
安定した発現系は、組換え抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体の長期で高収率の生産に典型的に用いられる。例えば、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体を安定して発現する細胞系は、適当な発現調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位）と選択マーカーにより調節されるＤＮＡにより宿主細胞を形質転換し、次に形質細胞を選択培地で成長させることにより操作することができる。選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞がＤＮＡをそれらの染色体に安定して組み込むことを可能とさせ、増殖して細胞増殖巣を形成し、次にこれをクローン化し、細胞系へと発達させることができる。例えば、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞にそれぞれを用いることのできる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子等の多くの選択系を用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性は、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ、およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏといった遺伝子の選択の基準として用いることができる。所望の組換えクローンを選択するために、組換えＤＮＡ技術の分野で通常知られる方法を日常的に利用することができ、そうした方法は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９０）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９４，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３）；およびＣｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されている。
【０１２２】
抗体または誘導体の発現量はベクター増幅により高めることができる。（一般的に、例えば、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照。）抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体を発現するベクターシステムにおけるマーカーが増幅できる場合、宿主細胞培養培地に存在する阻害剤の量を増加させることで、該阻害剤に対する耐性を付与するマーカー遺伝子の増加したコピー数を有する宿主細胞が選択されるだろう。関連抗体遺伝子のコピー数も増加し、それにより抗体またはその誘導体の発現を高めるだろう（Ｃｒｏｕｓｅら，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７を参照。）
抗ＣＤ７０抗体が重鎖および軽鎖の両方またはその誘導体を含む場合、宿主細胞は重鎖タンパク質をコードする第一ベクターと軽鎖タンパク質をコードする第二ベクターとの二つの発現ベクターで共トランスフェクトしてよい。二つのベクターは重鎖と軽鎖タンパク質の等しい発現を可能とする同一の選択マーカーを含んでよい。もしくは、重鎖と軽鎖タンパク質の両方をコードし、発現することができる単一のベクターを用いてもよい。そのような場合、典型的には、過剰の毒性のない重鎖を避けるために、軽鎖は重鎖の前に置く（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２；Ｋｏｈｌｅｒ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７を参照）。重鎖と軽鎖のコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからなってよい。
【０１２３】
（例えば、動物、化学合成または組換え体発現により）抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体がいったん作られたら、それをタンパク質精製の適当な方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィー（例えば、そのままのＦｃ領域を有する抗体の精製のためにプロテインＡクロマトグラフィー等））、遠心、示差溶解度によるか、またはタンパク質精製の他の標準的技術により精製することができる。抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は、例えば、ペプチド等のマーカー配列と融合して、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にすることができる。適当なマーカーアミノ酸配列として、例えば、６ヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクターに提供されるｔａｇ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）およびインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）および「ｆｌａｇ」タグ等が挙げられる。
【０１２４】
抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体がいったん作られたら、（細胞毒性剤に複合させた場合）ＣＤ７０発現ガン細胞に対する細胞静止または細胞毒性効果または（免疫抑制剤に複合させた場合）ＣＤ７０発現免疫細胞に対する免疫抑制効果を及ぼす能力を下記または当分野で公知の方法により決定する。
【０１２５】
（ＩＩＩ．抗ＣＤ７０抗体−医薬複合体）
ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患の治療に有用な組成物は抗ＣＤ７０抗体−医薬複合体（ＡＤＣ）または抗ＣＤ７０  ＡＤＣ誘導体を含む。ここで用いる「抗ＣＤ７０  ＡＤＣ」とは、（上記セクションＩＩで説明したように）治療剤に複合させた抗ＣＤ７０抗体をいう。ここで用いる「抗ＣＤ７０誘導体」とは、（上記セクションＩＩで説明したように）治療剤と複合させた抗ＣＤ７０抗体の誘導体をいう。ある実施態様において、ＡＤＣは抗ＣＤ７０抗体（例えば、ｍＡｂ  １Ｆ６または２Ｆ２またはその断片または誘導体、例えばそのキメラまたはヒト化形等）を含む。ここに記載のＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は、ＣＤ７０を発現するガンまたは免疫学的疾患を有する被験体に投与した場合、典型的には単独または他の治療剤と組み合わせて投与された場合にＣＤ７０発現細胞に対して臨床的に有益な効果を生む。
【０１２６】
典型的な実施態様において、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が細胞により吸収されるか、内在化された場合にＣＤ７０発現細胞に対して細胞毒または細胞静止効果、または免疫細胞（例えば、活性化リンパ球または樹状細胞）に対して細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼすように細胞毒または免疫抑制剤と複合させる。抗体または抗体誘導体に複合させるために特に適当な部分は化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体または化合物、またはトキシンである。例えば、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体は、化学療法剤（下記を参照）またはトキシン（例えば、細胞静止または殺細胞剤、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシンまたはジフテリアトキシン）等の細胞毒性剤に複合させることができる。抗ＣＤ７０分子に複合させるために有用なさらなる物質の具体例は下記に示す。
【０１２７】
他の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体をプロドラッグ変換酵素と複合させる。プロドラッグ変換酵素は公知の方法を用いて抗体またはその誘導体に組換え融合するか、または化学的に複合させる。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、ベータ−グルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１２８】
治療剤をタンパク質、特に抗体に複合させる技術はよく知られている。（例えば、Ａｒｎｏｎら，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，」ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，第２版．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，」ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｉｎｃｈｅｒａら編，１９８５；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，」ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｂａｌｄｗｉｎら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；およびＴｈｏｒｐｅら，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８を参照。またＰＣＴ公開ＷＯ８９／１２６２４も参照。）
ここに記載の方法に従って、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体をＣＤ７０発現細胞内に吸収、蓄積させ、該細胞内でＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は治療効果（例えば、細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果）を及ぼす。蓄積および蓄積速度の決定方法は、本明細書に参考として援用される２００２年７月３１日出願の米国仮出願第６０／４００，４０４号に見られる。
【０１２９】
典型的には、治療剤（例えば、医薬またはプロドラッグ変換酵素）に複合させた抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体を用いる場合、その治療剤は治療すべきガンの細胞により、または活性化免疫細胞（例えば、活性化リンパ球または樹状細胞）により吸収されたときに活性があるのが好ましい。他の実施態様において、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が吸収されず、医薬が細胞膜に結合することによりＣＤ７０発現細胞を低減または抑制するのに効果的である。さらに他の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体のＡＤＣまたはそのＡＤＣ抗体は細胞内の生物学的分子（例えば、炎症作因）を標的とし、該生物学的分子を分泌またはそれに結合する細胞またはその隣接する細胞で蓄積し、ここで治療剤は効果（例えば、細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果）を及ぼす。
【０１３０】
活性化免疫細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞外において治療剤の活性を最小化するために、治療剤が活性化免疫細胞またはＣＤ７０を発現するガン細胞の細胞表面に濃縮されるように、細胞膜結合ＣＤ７０に特異的に結合するが、可溶性ＣＤ７０には結合しない抗体を用いことができる。もしくは、さらに典型的な実施態様において、治療剤は、（例えば加水分解または分解剤により）抗体から切断されない場合はその活性を減ずるように複合させる。そのような実施態様において、活性化免疫細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞の細胞内環境での切断に対して感受性があるが、細胞外環境に対しては実質的に感受性のない切断性リンカーにより、治療剤を抗体またはその誘導体に結合させることで、複合体は活性化免疫細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞（例えば、エンドソーム内、または例えばｐＨ感受性またはプロテアーゼ感受性のためにリソソーム環境内またはカベオラ内）に吸収されたときに抗体またはその誘導体から切断される。（下記のセクションＩＩＩ（Ａ）を参照。）
さらに、ある実施態様において、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は、形質膜に対して荷電されている治療物質を含み、細胞によりいったん内在化された該物質の形質膜を横断する能力をその荷電によりさらに最小化させる。ここで用いる「荷電された物質」とは、（ａ）物質の一領域が形質膜に対して電荷を有するように分極しているか、または（ｂ）形質膜に対して正味荷電を有する物質を意味する。
【０１３１】
典型的には、抗ＣＤ７０抗体−医薬複合体（ＡＤＣ）またはＡＤＣ誘導体は実質的に精製されている（例えば、その効果を限定するか、または所望でない副作用を作る物質を実質的に含まない）。ある特定の実施態様において、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は４０％純粋、さらに典型的には約５０％純粋、最も典型的には約６０％純粋である。他の特定の実施態様において、抗ＣＤ７０  ＡＣＤまたはＡＤＣ誘導体は少なくとも約６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、または９５〜９８％純粋である。もう一つの特定の実施態様において、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は約９９％純粋である。
【０１３２】
（Ａ．リンカー）
典型的には、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は、治療剤と抗体ＣＤ７０抗体またはその誘導体との間にリンカー領域を含む。上記のように、典型的な実施態様において、リンカーは細胞内環境において切断可能であるために、リンカーの切断は細胞内環境において治療剤を抗体から解放する。
【０１３３】
例えば、ある実施態様において、リンカーは細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断物質により切断可能である。リンカーは、例えばリソソームまたはエンドソームプロテアーゼ等の、しかしこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素により切断されるペプチジルリンカーであってよい。典型的には、ペプチジルリンカーは少なくとも二アミノ酸の長さまたは少なくとも三アミノ酸の長さである。切断物質としてカテプシンＢおよびＤおよびプラスミン等が挙げられ、これらのすべてがジペプチド医薬誘導体を加水分解して標的細胞内で活性医薬の放出をもたらすことが知られている（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３を参照）。最も典型的なものは、ＣＤ７０発現細胞に存在する酵素により切断可能なペプチジルリンカーである。例えば、ガン組織で高度に発現するチオール依存性プロテアーゼカテプシンＢにより切断可能なペプチジルリンカーを用いることができる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー）。他のリンカーは例えば米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。特定の実施態様において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーはＶａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカー（例えば、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーを用いるドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照）である。治療剤の細胞内タンパク質分解放出を用いる一つの利点は、治療剤は複合しているときは典型的に減弱化されており、複合体の血清安定性が典型的に高いということである。
【０１３４】
他の実施態様において、切断性リンカーはｐＨ感受性、すなわち、あるｐＨ値で加水分解に感受性のあるものである。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性のある酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニチンアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等）を用いることができる。（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号、同上第第５，８２４，８０５号、同上５，６２２，９２９号；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｈｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅら，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１を参照。）そのようなリンカーは、血液中の条件のように中性ｐＨ条件下では比較的安定であるが、リソソームのおおよそのｐＨ（ｐＨ５．５または５．０以下）で不安定である。ある実施態様において、加水分解性リンカーはチオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合により治療剤に結合させたチオエーテル等）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照））。
【０１３５】
さらに別の実施態様において、リンカーは還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。多様なジスルフィドリンカー、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを用いて形成するこができるジスルフィドリンカーが当分野において知られている（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら，Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７を参照。また、米国特許第４，８８０，９３５号を参照。）
さらに別の特定の実施態様において、リンカーはマロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕら，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０１３６】
典型的には、リンカーは細胞外環境に実質的に感受性がない。ここで用いる「細胞外環境に実質的に感受性がない」とは、リンカーの文脈において、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の試料において、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が細胞外環境に存在する場合（例えば血漿中）、約２０％以下、典型的には約１５％以下、さらに典型的には約１０％以下およびさらにより典型的には約５％以下、約３％以下、また約１％以下のリンカーが切断されることを意味する。リンカーが細胞外環境に実質的に感受性がないかどうかは、例えば血漿とともに、（ａ）ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体（「ＡＤＣ試料」）および（ｂ）等モル量の非複合抗体または治療剤（「対照試料」）の両方を一定時間（例えば、２、４、８、１６または２４時間）独立してインキュベートし、次に、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定されたＡＤＣ試料に存在する非複合抗体または治療剤の量と対照試料に存在するものの量とを比較することにより決定することができる。
【０１３７】
互いに排他的ではない他の実施態様において、リンカーは細胞吸収を促進する。ある実施態様において、リンカーは治療剤に複合させたときに（すなわち、ここに記載のＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体のリンカー−治療剤部分の環境で）細胞吸収を促進する。さらに別の実施態様において、リンカーは治療剤と抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体の両方に複合させたときに（すなわち、ここに記載のＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の環境で）細胞吸収を促進する。
【０１３８】
本組成物と方法に用いることのできる多様なリンカーは、「Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ａｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｒ  ａｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題される２００３年７月３１日出願のＷＯ２００４０１０９５７および「Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，ａｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｒ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ」と題される２００２年７月３１日出願の米国仮出願第６０／４００，４０３号（これらの開示は本明細書に参考として援用される）に記載されている。
【０１３９】
ある実施態様において、リンカー単位は下記の一般式を有する。
【０１４０】
【化１】
2006518753.tif 000004
式中、
−Ｔ−はストレッチャー単位であり；
ａは０または１であり；
各−Ｗ−は独立してアミノ酸単位であり；
ｗは独立して２〜１２の範囲の整数であり；
−Ｙ−はスペーサー単位であり；そして
ｙは０、１または２である。
【０１４１】
（１．ストレッチャー単位）
ストレッチャー単位（−Ｔ−）は、それが存在する場合、抗ＣＤ７０抗体単位をアミノ酸単位（−Ｗ−）に結合させる。天然または化学操作による、抗ＣＤ７０抗体上に存在しうる有用な官能基としては、スルヒドリル、アミノ、ヒドロキシ、炭水化物のアノマー性水酸基、およびカルボキシルが挙げられるが、これらに限定されない。適当な官能基はスルヒドリルおよびアミノである。スルヒドリル基は抗ＣＤ７０抗体の分子内ジスルヒド結合の還元により作ることができる。もしくは、抗ＣＤ７０抗体のリジン部分のアミノ基を２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）または他のスルヒドリル生成試薬と反応させることによりスルヒドリル基を作ることができる。特定の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体は組換え抗体であり、一つ以上のリジンを有するように設計される。他の実施態様において、組換えＣＤ７０抗体を、さらなるスルヒドリル基、例えば付加的なシステインを有するように設計する。
【０１４２】
ある特定の実施態様において、ストレッチャー単位は抗ＣＤ７０抗体単位のイオウ原子と結合を形成する。このイオウ原子は、還元ＣＤ７０抗体（Ａ）のスルヒドリル（−ＳＨ）基に由来するものであってよい。これらの実施態様の代表的ストレッチャー単位は式（Ｉａ）と（Ｉｂ；下記参照）の角括弧内に示されている。式中、Ａ−、Ｗ−、−Ｙ−、Ｄ、ｗおよびｙは上記の通りであり、Ｒ１は−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、−Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）−、−アリーレン−、−Ｃ１−１０アルキレン−アリーレン、−アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−、（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン、−Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−から選択される；およびｒは１〜１０の範囲の整数である。
【０１４３】
【化２】
2006518753.tif 000005
【０１４４】
【化３】
2006518753.tif 000006
例示的なストレッチャー単位はＲ１が（ＣＨ２）５−である次式（Ｉａ）のものである。
【０１４５】
【化４】
2006518753.tif 000007
別の例示的なストレッチャー単位は、Ｒ１が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、かつｒが２である次式（Ｉａ）の単位である。
【０１４６】
【化５】
2006518753.tif 000008
さらに別の例示的なストレッチャー単位は、Ｒ１が−（ＣＨ２）５−である次式（Ｉｂ）の単位である。
【０１４７】
【化６】
2006518753.tif 000009
他の特定の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体単位のイオウ原子とストレッチャー単位のイオウ原子との間のジスルヒド結合によってストレッチャー単位を抗ＣＤ７０抗体単位（Ａ）に連結する。この実施態様の代表的なストレッチャー単位は式（ＩＩ）の角括弧内に示されている。式中、Ｒ１、Ａ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記の通りである。
【０１４８】
【化７】
2006518753.tif 000010
他の特定の実施態様において、ストレッチャーの反応基は、抗ＣＤ７０抗体のアミノ基に反応性のある反応部位を有する。このアミノ基はアルギニンまたはリジンのアミノ基であってよい。適当なアミン反応部位としては、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネート等の活性化エステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
これらの実施態様の代表的ストレッチャー単位は式（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）の角括弧内に示される。式中、Ｒ１、Ａ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記の通りである。
【０１５０】
【化８】
2006518753.tif 000011
さらに別の側面において、ストレッチャーの反応性官能基は、抗ＣＤ７０抗体上に存在しうる修飾炭水化物基に反応性のある反応部位を含む。特定の実施態様において、抗ＣＤ７０抗体は酵素によりグリコシル化されて炭水化物部分を提供する。この炭水化物は過ヨード酸ナトリウム等の試薬により温和に酸化してよく、酸化された炭水化物の得られたカルボキシル単位を、ヒドラジン、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバジド、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジド等の官能基を有するストレッチャー、例えばＫａｎｅｋｏら，１９９１，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２：１３３−４１に記載されたストレッチャーと縮合することができる。この実施態様の代表的なストレッチャー単位は式（ＩＶａ）〜（ＩＶｃ）の角括弧内に示される。式中、Ｒ１、Ａ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは上記の通りである。
【０１５１】
【化９】
2006518753.tif 000012
【０１５２】
【化１０】
2006518753.tif 000013
（２．アミノ酸単位）
アミノ酸単位（−Ｗ−）は、スペーサー単位が存在する場合、ストレッチャー単位（−Ｔ−）をスペーサー単位（−Ｙ−）に連結し、スペーサー単位がない場合、ストレッチャー単位を細胞毒性剤または細胞静止剤（医薬単位；Ｄ）に連結する。
【０１５３】
−Ｗｗ−はジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位である。各−Ｗ−単位は独立して下に角括弧中に示される式を有し、ｗは２〜１２の範囲の整数である。
【０１５４】
【化１１】
2006518753.tif 000014
式中、Ｒ２は水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、
【０１５５】
【化１２】
2006518753.tif 000015
である。
【０１５６】
リンカー単位のアミノ酸単位は、腫瘍関連プロテアーゼ等の、しかしこれに限定されない酵素により酵素的に切断されて、医薬単位（−Ｄ）を放出し、これは放出の際に生体中でプロトン化されて細胞毒医薬（Ｄ）を提供する。
【０１５７】
例示的なＷｗ単位は次式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）により表わされる。
【０１５８】
【化１３】
2006518753.tif 000016
式中、Ｒ３およびＲ４は次の通りである：
【０１５９】
【化１４】
2006518753.tif 000017
式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は次の通りである：
【０１６０】
【化１５】
2006518753.tif 000018
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は次の通りである：
【０１６１】
【化１６】
2006518753.tif 000019
適当なアミノ酸単位として、式（Ｖ）の単位が挙げられるが、これらに限定されない。式中、Ｒ３はベンジルであり、Ｒ４は−（ＣＨ２）４ＮＨ２である；Ｒ３はイソプロピルであり、Ｒ４は−（ＣＨ２）４ＮＨ２である；またはＲ３はイソプロピルであり、Ｒ４は−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２である。もう一つの適当なアミノ酸単位は、Ｒ３がベンジルであり、Ｒ４がベンジルであり、Ｒ５が−（ＣＨ２）４ＮＨ２である場合の式（ＶＩ）の単位である。
【０１６２】
−Ｗｗ−単位は特定の腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断の選択性について設計し、最適化することができる。適当な−Ｗｗ−単位はその切断がプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、およびプラスミンにより触媒される単位である。
【０１６３】
一実施態様において、−Ｗｗ−はジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチド単位である。
【０１６４】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６が水素以外である場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６が結合する炭素原子はキラルである。
【０１６５】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６が結合する各炭素原子は独立して（Ｓ）または（Ｒ）立体配置を有する。
【０１６６】
ある実施態様において、アミノ酸単位はフェニルアラニン−リジンジペプチド（Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＦＫリンカー）である。もう一つの実施態様において、アミノ酸単位はバリン−シトルリンジペプチド（Ｖａｌ−ＣｉｔまたはＶＣリンカー）である。
【０１６７】
（３．スペーサー単位）
スペーサー単位（−Ｙ−）は、それが存在する場合、アミノ酸単位を医薬単位に結合させる。スペーサー単位は、自己破壊および非自己破壊の二つの一般的なタイプがある。非自己破壊スペーサー単位は、抗ＣＤ７０抗体−リンカー−医薬複合体または医薬−リンカー化合物からのアミノ酸単位の酵素的切断後にスペーサー単位の一部またはすべてが医薬単位に結合したままのスペーサー単位である。非自己破壊スペーサー単位の例としては、（グリシン−グリシン）スペーサー単位とグリシンスペーサー単位（両方ともにスキーム１に示す）が挙げられるが、これらに限定されない。グリシン−グリシンスペーサー単位またはグリシンスペーサー単位を含む抗ＣＤ７０抗体−リンカー−医薬複合体が腫瘍細胞関連プロテアーゼ、ガン細胞関連プロテアーゼまたはリンパ球関連プロテアーゼによる酵素的切断を受ける場合、グリシン−グリシン−医薬部分またはグリシン−医薬部分がＡ−Ｔ−Ｗｗ−から切断される。医薬を放出するために、独立した加水分解反応が標的細胞内で起こってグリシン−医薬単位結合を切断しなければならない。
【０１６８】
典型的な実施態様において、−Ｙｙ−はＱｍによって置換可能なｐ−アミノベンジルエーテルであり、ここでＱは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノである；ｍは０〜４の範囲の整数である。
【０１６９】
（スキーム１）
ある実施態様において、非自己破壊スペーサー単位（−Ｙ−）は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−である。
【０１７０】
【化１７】
2006518753.tif 000020
もう一つの実施態様において、非自己破壊スペーサー単位（−Ｙ−）は−Ｇｌｙ−である。
【０１７１】
一実施態様において、医薬−リンカー化合物または抗ＣＤ７０抗体−リンカー−医薬複合体はスペーサー単位を欠く（ｙ＝０）。
【０１７２】
もしくは、自己破壊スペーサー単位を含有する抗ＣＤ７０抗体−リンカー−医薬複合体は別個の加水分解工程を必要とせずに医薬（Ｄ）を放出することができる。これらの実施態様において、−Ｙ−は、ＰＡＢ基の窒素原子により−Ｗｗ−に結合させ、かつカルボネート、カルバメートまたはエーテル基により直接−Ｄに結合させたｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位である（スキーム２およびスキーム３）。
【０１７３】
（スキーム２）
【０１７４】
【化１８】
2006518753.tif 000021
式中、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノである；ｍは０〜４の範囲の整数である；ｐは１〜２０の範囲の整数である。
【０１７５】
（スキーム３）
【０１７６】
【化１９】
2006518753.tif 000022
式中、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノである；ｍは０〜４の範囲の整数である；ｐは１〜２０の範囲の整数である。
【０１７７】
自己破壊スペーサーの他の例としては、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体等、ＰＡＢ基に電気的に等価な芳香族化合物（例えば、Ｈａｙら，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７を参照）およびオルトまたはパラアミノベンジルアセタル類が上げられるがこれらに限定されない。アミド結合加水分解の際に容易な環状化を受けるスペーサー、例えば置換および非置換の４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら，１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２２３）、適当に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環状システム（Ｓｔｏｒｍら，１９７２，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）および２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙら，１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７）を用いることができる。グリシンのα位で置換されているアミノ含有医薬の脱離（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ら，１９８４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）も、抗ＣＤ７０抗体−リンカー−医薬複合体に利用できる自己破壊スペーサー法の例である。
【０１７８】
別の実施態様において、スペーサー単位は、付加的な医薬を取り込むために用いることのできる分鎖のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位（スキーム４）である。
【０１７９】
（スキーム４）
【０１８０】
【化２０】
2006518753.tif 000023
式中、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノである；ｍは０〜４の範囲の整数である；ｎは０または１である；ｐは１〜２０の範囲の整数である。
【０１８１】
一実施態様において、二つの−Ｄ部分は同一である。
【０１８２】
別の実施態様において、二つの−Ｄ部分は異なる。
【０１８３】
典型的なスペーサー単位（−Ｙｙ−）は次式（ＶＩＩＩ）〜（Ｘ）により表わされる。
【０１８４】
【化２１】
2006518753.tif 000024
式中、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、ハロゲン、ニトロまたはシアノである；ｍは０〜４の範囲の整数である。
【０１８５】
【化２２】
2006518753.tif 000025
（Ｂ．治療剤）
ここに記載の方法に従って、ガン細胞または活性化免疫細胞に治療効果を及ぼす物質は、抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体に複合させる治療剤として用いることができる。（例えば、ＷＯ  ２００４／０１０９５７、「Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ａｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｒ  ａｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」（既出）および米国仮出願第６０／４００，４０３号（既出）を参照）。典型的には、治療剤は細胞毒性剤または免疫抑制剤である。
【０１８６】
有用な種類の細胞毒性剤または免疫抑制剤としては、例えば抗チュブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、モノ（プラチナ）、ビス（プラチナ）および三核プラチナ複合体およびカルボプラチン等のプラチナ複合体）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノホア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、前形成化合物（ｐｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、照射増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等が挙げられる。
【０１８７】
個々の細胞毒性剤または免疫抑制剤としては、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロランブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトチャラシンＢ、デカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エステロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、ミトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカミシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ−１６およびＶＭ−２６が挙げられる。
【０１８８】
いくつかの特定の実施態様において、治療剤は細胞毒性剤である。適当な細胞毒性剤としては、例えば、ドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、エネジインおよびレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ジスコデルモリド、エロイテロビン、およびミトキサントロンが挙げられる。
【０１８９】
ある実施態様において、細胞毒性剤は慣用の化学療法剤であり、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、ミトマイシンＣまたはエトポシドである。さらに、強力な物質、例えばＣＣ−１０６５類似体、カリケミアミシン、メイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシンおよびパリトキシンを抗ＣＤ７０抗体またはその誘導体に結合させることができる。
【０１９０】
特定の実施態様において、細胞毒性剤または細胞静止剤はオーリスタチンＥ（当分野ではドラスタチン−１０としても知られる）またはその誘導体である。典型的には、オーリスタチンＥ誘導体は、例えばオーリスタチンＥとケト酸との間で形成されたエステルである。例えば、オーリスタチンＥはパラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させてＡＥＢとＡＥＶＢをそれぞれ作ることができる。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、およびＭＭＡＥが挙げられる。オーリスタチンＥおよびその誘導体の合成と構造は、米国特許出願第０９／８４５，７８６（米国特許出願公開第２００３００８３２６３号）および同上第１０／００１，１９１号；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／２４２０９号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３４３５号、および米国特許第６，３２３，３１５号、同上第６，２３９，１０４号、同上第６，０３４，０６５号、同上第５，７８０，５８８号、同上第５，６６５，８６０号、同上第５，６６３，１４９号、同上第５，６３５，４８３号、同上第５，５９９，９０２号、同上第５，５５４，７２５号、同上第５，５３０，０９７号、同上第５，５２１，２８４号、同上第５，５０４，１９１号、同上第５，４１０，０２４号、同上第５，１３８，０３６号、同上第５，０７６，９７３号、同上第４，９８６，９８８号、同上第４，９７８，７４４号、同上第４，８７９，２７８号、同上第４，８１６，４４４号および同上第４，４８６，４１４号に記載されている。
【０１９１】
特定の実施態様において、細胞毒性剤はＤＮＡ副溝結合剤である。（例えば、米国特許第６，１３０，２３７号を参照。）例えば、ある実施態様において、副溝結合剤はＣＢＩ化合物である。他の実施態様において、副溝結合剤はエネジイン（例えば、カリケアミシン）である。
【０１９２】
ある実施態様において、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は抗チュブリン剤を含有する。抗チュブリン剤の例として、タキサン類（例えばタキソール（商標登録）（パクリタキセル）、タキソテレ（商標登録）（ドセタキセル））、Ｔ６７（チュラリク）、ビンカアルキロイド類（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、およびドラスタチン類（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗チュブリンとしては、例えばバッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ジスコデルモリド、およびエロイテロビンが挙げられる。
【０１９３】
ある実施態様において、細胞毒性剤は抗チュブリン剤の別のグループであるメイタンシノイドである。例えば、特定の実施態様において、メイタンシノイドはメイタンシンまたはＤＭ−１である（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ社；Ｃｈａｒｉら，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１も参照）。
【０１９４】
ある実施態様において、治療剤は放射同位体元素ではない。
【０１９５】
ある実施態様において、細胞毒性剤または免疫抑制剤は代謝拮抗物質である。代謝拮抗物は、例えばプリンアンタゴニスト（例えば、アゾチオプリンまたはマイコフェノレートモフェチル）、デヒドロフォレートリダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキセート）、アシクロビル、ガングシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカーネットまたはトリフルリジンであってよい。
【０１９６】
他の実施態様において、細胞毒性剤または免疫抑制剤はタクロリムス、シクロスポリンまたはラパマイシンである。さらなる実施態様において、細胞毒性剤はアルデスロイキン、アレンツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、ベキサロテン、ベキサロテン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、クラドリビン、ダーベポエチンアルファ、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エキセメスタン、フィルグラスチン、フロキシウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲンシタビン、ゲンツズマブオゾガミシン、ゴセレリン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブメシレート、インターフェロンアルファ−２ａ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、メクロレタミンまたはナイトロジェンマスタード、メゲストロール、メスナ、メトトレキセート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ナンドロロンフェンプロピオネート、オプレルベキン、オキサリプラチン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチン、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、トレミフェン、トシツモマブ、トラツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンおよびゾレドロネートである。
【０１９７】
さらなる実施態様において、医薬はヒト化された抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）；ＯＶＡＲＥＸ（ＡｌｔａＲｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）；ＰＡＮＯＲＥＸ（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，ＮＣ；マウスＩｇＧ２ａ抗体）；セツキシマブエルビタクス（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ；抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧキメラ抗体）；ビタキシン（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．ＭＤ；キャンパスＩ／Ｈ（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ，ＭＡ；ヒト化ＩｇＧ１抗体）；スマートＭＩ９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；ヒト化抗ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体；リンホサイド（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ；ヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ抗体）；スマートＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；ヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）；オンコリン（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；放射能標識マウス抗ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体）；アロミュン（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，ＣＡ；ヒト化抗ＣＤ２  ｍＡｂ）；アバスチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；抗ＶＥＧＦヒト化抗体）；エプラツザマブ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ  ａｎｄ  Ａｍｇｅｎ，ＣＡ；抗ＣＤ２２抗体）；およびＣＥＡサイド（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，ＮＪ；ヒト化抗ＣＥＡ抗体）である。
【０１９８】
他の適当な抗体としては、下記の抗原に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｌ６、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、アルファフェトタンパク質、ＣＡ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異的抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、抗トランスフェリンレセプター、ｐ９７、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、前立腺特異的抗原、ＩＬ−２レセプター、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、およびＮｅｕガン遺伝子産物。
【０１９９】
ある実施態様において、治療剤は免疫抑制剤である。免疫抑制剤は、例えばガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチルまたはメトトレキセートであってよい。もしくは、免疫抑制剤は、例えばグルココルチコイド（例えば、コルチゾールまたはアルドステロン）またはグルココルチコイド類似体（例えば、プレドニゾンまたはデキサメタゾン）であってよい。
【０２００】
ある典型的な実施態様において、免疫抑制剤は、アリールカルボン酸誘導体、ピラゾール含有誘導体、オキシカン誘導体およびニコチン酸誘導体等の抗炎症剤である。抗炎症剤の種類としては、例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、およびロイコトリエンレセプターアンタゴニストが挙げられる。
【０２０１】
適当なシクロオキシゲナーゼ阻害剤としては、メクロフェナミン酸、メフェナミン酸、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニザル、フェンブフェン、フノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダク、テノキシカン、トルメチンおよびアセチルサリチル酸が挙げられる。
【０２０２】
適当なリポキシゲナーゼ阻害剤としては、レドックス阻害剤（例えば、カテコールブタン誘導体、ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、マソプロコール、フェニドン、イアノパレン、インダゾリノン、ナファザトローム、ベンゾフラノール、アルキルヒドロキシルアミン）、および非レドックス阻害剤（例えば、ヒドロキチアゾール、メトキシアルキルチアゾール、ベンゾピランおよびその誘導体、メトキシテトラヒドロピラン、ボスウェリン酸およびボスウェリン酸のアセチル化誘導体、およびシクロアルキル基で置換されたキノリンメトキシフェニル酢酸）およびレドックス阻害剤の前駆体が挙げられる。
【０２０３】
他の適当なリポゲナーゼ阻害剤としては、酸化防止剤（例えば、フェノール、没食子酸プロピル、フラボノイドおよび／またはフラボノイドを含有する天然の基質、フラボンのヒドロキシル化誘導体、フラボノール、ジヒドロクエルセチン、ルテオリン、ガランギン、オロボール、カルコンの誘導体、４，２’，４’−トリヒドロキシカルコン、オルト−アミノフェノール、Ｎ−ヒドロキシウレア、ベンゾフラノール、エブセレンおよび還元セレノ酵素の活性を増加させる種）、イオンキレート剤（例えば、ヒドロキサム酸およびその誘導体、Ｎ−ヒドロキシウレア、２−ベンジル−１−ナフトール、カテコール、ヒドロキシルアミン、カルノソールトロロクスＣ、カテコール、ナフトール、スルファサラジン、ジロイトン、５−ヒドロキシアントラニル酸および４−（オメガ−アリールアルキル）フェニルアルカン酸）、イミダゾール含有化合物（例えば、ケトコナゾールおよびイトラコナゾール）、フェノチアジン、およびベンゾピラン誘導体が挙げられる。
【０２０４】
さらに他の適当なリポシキゲナーゼ阻害剤としては、エイコサノイドの阻害剤（例えば、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサヘキサエン酸およびドコサヘキサエン酸およびそれらのエステル、ＰＧＥ１（プロスタグラジンＥ１）、ＰＧＡ２（プロスタグランジンＡ２）、ビプロストール、１５−モノヒドロキシエイコサテトラエン酸、１５−モノヒドロキシ−エイコサトリエン酸および１５−モノヒドロキシエイコサペンタエン酸、およびロイコトリエンＢ５、Ｃ５およびＤ５）、カルシウム流に干渉する化合物、フェノチアジン、ジフェニルブチルアミン、ベラパミル、フスコシド、クルクミン、クロロゲン酸、カフェー酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（ＥＴＹＡ）、ヒドロキシフェニルレチナミド、イオナパレン、エスクリン、ジエチルカルバマジン、フェナントロリン、バイカレイン、プロキシクロミル、チオエーテル、ジアリルスルフィドおよびジ−（１−プロペニル）スルヒドが挙げられる。
【０２０５】
ロイコトリエンレセプターアンタゴニストとしては、カルシトリオール、オンタゾラスト、Ｂａｙｅｒ  Ｂａｙ−ｘ−１００５、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＣＧＳ−２５０１９Ｃ、ｅｂｓｅｌｅｎ、Ｌｅｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  ＥＴＨ−６１５、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ−２９３１１１、Ｏｎｏ  ＯＮＯ−４０５７、Ｔｅｒｕｍｏ  ＴＭＫ−６８８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ  ＢＩ−ＲＭ−２７０、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２１３０２４、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２６４０８６、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２９２７２８、Ｏｎｏ  ＯＮＯ  ＬＢ４５７、Ｐｆｉｚｅｒ  １０５６９６、Ｐｅｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＰＦ  １００４２、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６６１５３、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０１１４６、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０１９９３、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０９２４７、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５３２２８、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  ＳＭ  １５１７８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＷＡＹ  １２１００６、Ｂａｙｅｒ  Ｂａｙ−ｏ−８２７６、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  ＣＩ−９８７、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  ＣＩ−９８７ＢＰＣ−１５ＬＹ  ２２３９８２、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２３３５６９、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ−２５５２８３、ＭａｃｒｏＮｅｘ  ＭＮＸ−１６０、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．ＭＫ−５９１、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．ＭＫ−８８６、Ｏｎｅ  ＯＮＯ−ＬＢ−４４８、Ｐｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＰＦ−５９０１、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＧ  １４８９３、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６６３６４、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６９６９８、Ｓｉｏｎｏｏｇｉ  Ｓ−２４７４、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−４１９３０、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５０５０５、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５１１４６、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５２７９８、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＫ＆Ｆ−１０４４９３、Ｌｅｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  ＳＲ−２５６６、Ｔａｎａｂｅ  Ｔ−７５７およびＴｅｉｊｉｎ  ＴＥＩ−１３３８が挙げられる。
【０２０６】
（１．ドラスタチン医薬）
ある実施態様において、細胞毒性剤または細胞静止剤はドラスタチンである。さらに特定の実施態様において、ドラスタチンはオーリスタチンクラスである。ここで用いるドラスタチンとは天然のオーリスタチンまたは非天然の誘導体、例えばＭＭＡＥを包含する。よって、特定の実施態様において、細胞毒性剤または細胞静止剤はＭＭＡＥ（式ＸＩ）である。もう一つの特定の実施態様において、細胞毒性剤または細胞静止剤はＡＦＰ（式ＸＶＩ）である。
【０２０７】
【化２３】
2006518753.tif 000026
ある実施態様において、細胞毒性剤または細胞静止剤は次式ＸＩＩ−ＸＸＩのドラスタチンである。
【０２０８】
【化２４】
2006518753.tif 000027
【０２０９】
【化２５】
2006518753.tif 000028
【０２１０】
【化２６】
2006518753.tif 000029
（Ｃ．抗ＣＤ７０  ＡＤＣとＡＤＣ誘導体の形成）
抗ＣＤ７０  ＡＤＣおよびＡＤＣ誘導体の生成は当業者に公知の技術によって達成してよい。簡単に説明すると、抗ＣＤ７０  ＡＤＣは抗ＣＤ７０抗体、医薬および任意に、医薬と抗体を結合させるリンカーからなる。多くの異なる反応が医薬を抗体に共有結合するために利用できる。これは、リジンのアミノ基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルヒドリル基および芳香族アミノ酸の多様な部分等の抗体分子のアミノ酸残基の反応によりしばしば達成される。共有結合の最も普通に用いられる非特異的な方法の一つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を抗体のアミノ（またはカルボキシ）基に結合させるカルボジイミド反応である。さらに、ジアルデヒドまたはイミドエステル等の二官能性物質が化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に結合させるために用いられている。また、シッフ塩基反応が医薬の抗体への結合に利用できる。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する医薬の過ヨウ素酸塩酸化によりアルデヒドを形成し、これを次に抗体分子と反応させることからなる。結合は抗体分子のアミノ基とのシッフ塩基の形成により起こる。イソチオシアネート類も医薬を抗体に共有結合させるカップリング剤として用いることができる。他の技術が当業者に知られており、それらは本発明の範囲内にある。そのような技術の限定するものではない実例は、例えば、文献の援用によりすべての内容が本明細書に編入される米国特許第５，６６５，３５８号、５，６４３，５７３号および５，５５６，６２３号に記載されている。
【０２１１】
ある実施態様において、リンカーの前駆体である中間体を適当な条件下で医薬と反応させる。ある実施態様において、医薬および／または中間体の反応基を使用する。続いて、医薬と中間体との反応生成物、または誘導体化医薬を抗ＣＤ７０抗体と適当な条件下で反応させる。
【０２１２】
（ＩＶ．他のＣＤ７０標的部分とタンパク質−医薬複合体）
上記のように、他の実施態様において、ＣＤ７０標的部分はここに記載の方法に従って有用な抗体である必要はない。従って、ＣＤ７０標的部分は、ＣＤ７０に結合し、かつ細胞毒性剤に複合させたときにＣＤ７０発現細胞の増殖を低下または阻害する抗体、またはＣＤ７０に結合し、かつ免疫抑制剤に複合させたときに免疫抑制効果を及ぼす抗体からの一つ以上のＣＤＲを含むことができる。典型的には、タンパク質は多量体、最も典型的には二量体である。
【０２１３】
さらに、ここに提供される方法に従って有用なＣＤ７０結合タンパク質として、融合タンパク質、すなわち、（典型的には少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または少なくとも約１００アミノ酸の）異質タンパク質に組換え融合または化学的に複合させた（共有および非共有の両方の複合を含む）タンパク質が挙げられる。融合は必ずしも直接的である必要性はなく、リンカー配列を経て起こってもよい。
【０２１４】
例えば、本方法に有用なＣＤ７０標的部分は、枠組み内の抗ＣＤ７０抗体の一つ以上のＣＤＲのコード領域を、異質タンパク質をコードする配列に融合させることによる組換えにより作ることができる。異質タンパク質は、加えられた治療的な利益；安定な発現の促進；高収率の組換え発現を容易にする手段の提供；および／または多量体領域の提供といった一つ以上の特徴を提供するだろう。
【０２１５】
他の側面において、ＣＤ７０標的部分としては、ＣＤ２７、およびＣＤ７０に結合するその変異体または断片が挙げられる。ＣＤ７０標的部分としては、さらにＣＤ７０に特異的に結合するペプチド、リガンドおよび他の分子を挙げることができる。
【０２１６】
ここに記載の方法に有用なＣＤ７０標的部分は、タンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニングに適当な方法を用いて同定することができる。典型的には、まず、タンパク質を、ＣＤ７０に特異的に結合する能力によって同定し、次に細胞毒性剤または細胞静止剤に複合させたときに、活性化リンパ球またはＣＤ７０発現ガン細胞に対して細胞静止または細胞毒性効果、または免疫抑制剤に複合させたときに免疫細胞に対して免疫抑制効果を及ぼす能力によって同定する。使用することのできる伝統的な方法の中には、？ｇｔ１１ライブラリーの抗体検査の技術に類似する方法で、標識ＣＤ７０による発現ライブラリーの検査を伴う「相互作用クローニング」技術がある。例示のためで限定するものではないが、これは以下のように達成することができる：ＣＤ７０（またはその１Ｆ６または２Ｆ２結合領域）をコードするｃＤＮＡクローンの末端を心臓筋肉キナーゼ（ＨＭＫ）用のリン酸化部位に挿入することにより修飾する（例えば、Ｂｌａｎａｒ  ａｎｄ  Ｒｕｔｔｅｒ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１０１４−１０１８を参照）。組換えタンパク質は大腸菌で発現し、ＧＤＰアフィニティーカラムで均一になるまで精製し（Ｅｄｅｒｙら，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７４：５１７−５２５）、？３２Ｐ−ＡＴＰおよびウシ心臓筋肉キナーゼ（シグマ）を用いて、１×１０８ｃｐｍ／μｇの比活性まで標識し、これを用いて「極西アッセイ」（ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ  ａｓｓａｙ）（Ｂｌａｎａｒ  ａｎｄ  Ｒｕｔｔｅｒ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１０１４−１０１８）によりヒト胎盤？ｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。ＣＤ７０プローブと相互作用するプラークを単離する。陽性？プラークのｃＤＮＡ挿入物を遊離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等、配列決定に適するベクターにサブクローニングする。
【０２１７】
タンパク質相互作用を生体内で検出する方法である二ハイブリッドシステムを詳細に説明するが、例示の目的のみに示されるのであって、限定のためではない。このシステムの一つのバージョンが記載されており（Ｃｈｉｅｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から市販、利用できる。
【０２１８】
いったんＣＤ７０結合タンパク質が同定されたら、（細胞毒性剤に複合させた場合に）ＣＤ７０発現ガン細胞に対する細胞静止または細胞毒性効果、または（免疫抑制剤に複合させた場合に）ＣＤ７０発現免疫細胞に対する免疫抑制効果を及ぼす（それのみ、または多量体化させた場合か、二量体化または多量体化領域に融合させた場合の）能力を下記の方法により測定する。
【０２１９】
（Ｖ．細胞毒、細胞静止および免疫抑制活性のアッセイ）
ここに記載の方法に従って、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体はＣＤ７０発現ガン細胞に対して細胞毒または細胞静止効果を及ぼし、または活性化ＣＤ７０発現免疫細胞（例えば、活性化リンパ球または樹状細胞）に対して細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼす。抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果についてアッセイ可能な活性化リンパ球は、培養された細胞系（例えば、ＣＥＳＳ（ＡＴＣＣから利用可能である）；またはＫＭＨ２およびＬ４２８（その両方がＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ社から利用可能である）であってよく、または新鮮な血液試料または他の起源から調製されたリンパ球からのものであってよい。リンパ球は抗体およびサイトカインの適当な混合物によって活性化することができる。例えば、Ｔリンパ球は同種の刺激細胞または抗原をパルスした同原抗原提示細胞を用いて活性化でき、Ｔ細胞クローンは下記実施例９に記載のように供給細胞の存在下にＰＨＡおよびサイトカインにより活性化することができる。細胞毒または細胞毒性効果についてアッセイすることのできるＣＤ７０発現ガン細胞は、下記実施例７に記載のように培養細胞系であってよく、または被験体から調製されたＣＤ７０発現ガン細胞からのものであってよい。
【０２２０】
いったん抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が、ＣＤ７０発現ガン細胞に対して細胞毒または細胞静止効果を及ぼし、または活性化免疫細胞に対して細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼすことが確認されたら、その治療価値を動物モデルで証明することができる。免疫学的疾患またはＣＤ７０発現ガンの例示的な動物モデルは下記のセクションＶＩで説明する。
【０２２１】
物質が細胞に対して細胞静止または細胞毒性効果を及ぼすかどうかを決定する方法は公知である。そのような方法の具体例は以降に説明する。
【０２２２】
抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が活性化免疫細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞に対して細胞静止効果を及ぼすかどうかを決定するために、チミジン取り込みアッセイを用いてよい。例えば、９６ウエルプレート上の５，０００細胞／ウエルの密度の活性化免疫細胞（例えば、活性化リンパ球）またはＣＤ７０発現ガン細胞を７２時間培養し、この７２時間の最後の８時間、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンに曝して、３Ｈ−チミジンの培養細胞への取り込みをＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の存在下または非存在下に測定する。
【０２２３】
細胞毒性を測定するために、壊死または細胞死（計画化された細胞死）を測定することができる。壊死は典型的には形質膜の増加浸透性、細胞の膨潤、および形質膜の破裂を伴う。細胞死は典型的には膜の水泡化、細胞質の凝縮、および内因性エンドヌクレアーゼの活性化によって特徴付けられる。活性化免疫細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞に対するこれらの効果のいずれかの決定は、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が免疫学的疾患およびＣＤ７０発現ガンの治療または予防に有用であることを示す。
【０２２４】
細胞生存度は、細胞中のニュートラルレッド、トリパンブルー、またはＡＬＡＭＡＲ（商標登録）ブルー等の染料の取り込みを決定することにより測定することができる（例えば、Ｐａｇｅら，１９９３，Ｉｎｔｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３：４７３−４７６を参照）。そのようなアッセイにおいて、染料を含有する培地で細胞をインキュベートし、細胞を洗浄し、染料の細胞取り込みを反映する残留染料を分光光度法で測定する。また、タンパク質結合染料であるスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）を用いて細胞毒性を測定することができる（Ｓｋｅｈａｎら，１９９０，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１２）。
【０２２５】
もしくは、生きていて死んでいない細胞を検出することにより哺乳類細胞の生存と増殖に関する定量的比色アッセイにＭＴＴ等のテトラゾリウム塩を用いる（例えば、Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５−６３を参照）。
【０２２６】
細胞死は、例えば、ＤＮＡ断片化を測定することにより定量することができる。ＤＮＡ断片化の定量的インビトロ測定用の市販光度測定法が利用可能である。ＴＵＮＥＬ（断片化ＤＮＡ中の標識ヌクレオチドの取り込みを検出する）およびＥＬＩＳＡ系アッセイ等のそれらアッセイの具体例が、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，１９９９，ｎｏ．２，ｐｐ．３４−３７（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に記載されている。
【０２２７】
細胞死は細胞の形態学的変化を測定することにより決定することもできる。例えば、壊死の場合のように、形質膜の保全の損失が、ある種の染料（例えば、アクリジンオレンジまたは臭化エチジウム等の蛍光染料）の取り込みの測定により決定することができる。細胞死の細胞数を測定する方法は、Ｄｕｋｅ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら，ｅｄｓ．，１９９２，ｐｐ．３．１７．１−３．１７．１６）に既に記載されている。また、細胞をＤＮＡ染料（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、またはヨウ化プロピジウム）により標識し、クロマチン凝縮と内核膜に沿ったふちの形成に関して細胞を観察する。細胞死を決定するために測定することのできる他の形態学的変化としては、例えば細胞質凝縮、増加した膜のブレブ形成および細胞収縮が挙げられる。
【０２２８】
細胞死の存在は、培養物の付着区画および「浮遊」区画の両方において測定することができる。例えば、両区画は、上清を除去し、付着細胞をトリプシン処理し、遠心洗浄工程（例えば、１０分、２０００ｒｐｍ）後に調製物を一緒にし、細胞死を検出する（例えば、ＤＮＡ断片化を測定する）ことにより集めることができる。（例えば、Ｐｉａｚｚａら，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：３１１０−１６を参照）。
【０２２９】
免疫抑制効果は、例えば、免疫応答の促進にかかわる活性化免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞毒Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、または成熟樹状細胞）に対する細胞毒または細胞静止効果についてのアッセイを（上記のように）行うことにより測定することができる。さらに、または別法として、（例えば、フローサイトメトリーを用いて）特定の免疫細胞集団の存在または非存在、例えば、免疫応答の抑制にかかわるＴ調節細胞の存在の検査；例えば、細胞毒性Ｔ細胞の細胞分解能力等の免疫細胞の機能的能力の測定；細胞のサイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体または他の分泌分子または細胞表面分子の測定（例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）；または免疫細胞の活性化の生化学的マーカーまたは免疫細胞内のシグナル経路の測定（例えば、チロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化、ポリペプチド切断、およびタンパク質複合体の形成および解離のウエスタンブロットおよび免疫沈降分析；タンパク質アレイ分析；ＤＮＡアレイまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いるＤＮＡ転写のプロファイリング）により免疫抑制効果を決定することができる。
【０２３０】
（ＶＩ．免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンの動物モデル）
抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は、免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンの動物モデルにおいて検査または証明できる。免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンの多くの確立された動物モデルが当業者に知られており、そのいずれもＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の効能を検定するために用いることができる。そのようなモデルの非限定的な例を以下に述べる。
【０２３１】
糖尿病、狼瘡、全身性硬化症、シェーグレン症候群、実験的自己免疫脳脊髄炎（多発性硬化症）、甲状腺炎、重症筋無力症、関節炎、ぶどう膜炎、炎症性腸疾患等の全身性および器官特異的な自己免疫病の動物モデルの幾つかの例が、Ｂｉｇａｚｚｉ，「Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ，」  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｒｏｓｅ  ＆  Ｍａｃｋａｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８）  ａｎｄ  ｉｎ  「Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，」  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｏｌｉｇａｎら，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９７）に記載されている。
【０２３２】
アレルギー性症状、例えば喘息や皮膚炎も、げっ歯類においてモデルとすることができる。気道過敏症はオボアルブミンにより（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２−５８００）またはＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ卵抗原（Ｔｅｓｃｉｕｂａら，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１９９６−２００３）によってマウス中に誘導することができる。マウスのＮｃ／Ｎｇａ系は血清ＩｇＥの顕著な増加を示し、同時にアトピー性皮膚炎様病変を発達させる（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄら，２０００，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ６：２０９−２１０；Ｗａｔａｎａｂｅら，１９９７，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４６１−４６６；Ｓａｓｋａｗａら，２００１，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：２３９−２４７）。
【０２３３】
免疫適格提供者のリンパ球の致死照射組織非適合宿主への注射はマウスで急性ＧＶＨＤを誘導する古典的なアプローチである。もしくは、親Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスモデルは急性および慢性ＧＶＨＤを誘導するシステムを提供する。このモデルにおいて、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／２マウスの親系統間交配のＦ１子孫である。ＤＢＡ／２リンパ系細胞の非照射Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスへの移入は慢性ＧＶＨＤを引き起こす一方で、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／１０またはＢ１０．Ｄ２リンパ系細胞の移入は急性ＧＶＨＤを引き起こす（Ｓｌａｙｂａｃｋら，２０００，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌ．２６：９３１−９３８；Ｋａｔａｏｋａら，２００１，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３：３１０−３１８）
さらに、ヒト造血幹細胞および成熟末梢血液リンパ系細胞の両者がＳＣＩＤマウスに植え付けることができ、これらのヒトリンパ−造血細胞はＳＣＩＤマウス中で機能を持ち続ける（ＭｃＣｕｎｅら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６３２−１６３９；Ｋａｍｅｌ−Ｒｅｉｄ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１７０６−１７０９；Ｍｏｓｉｅｒら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：２５６−２５９）。これは、ヒトリンパ系細胞に対する潜在的な治療剤を直接に調べる小動物モデルシステムを提供する（例えば、Ｔｏｕｒｎｏｙら，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６９８２−６９９１を参照）。
【０２３４】
さらに、ＣＤ７０を発現するヒト腫瘍細胞系を、適当な免疫欠損げっ歯類系、例えばアシミックヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスに移植することにより、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体のインビボ有効性を調べる小動物モデルを作ることができる。ＣＤ７０を発現するヒトリンパ腫細胞系の例としては、例えばＤａｕｄｉ（Ｇｈｅｔｉｅら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１３２９−３６；Ｇｈｅｔｉｅら，１９９０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：４８１−５；ｄｅ  Ｍｏｎｔら，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：７６５４−５９），Ｒａｍｏｓ  （Ｍａら，２００２，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １６：６０−６；Ｐｒｅｓｓら，２００１，Ｂｌｏｏｄ  ９８：２５３５−４３），ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ  （Ｃａｔｔａｎ  ＆  Ｍａｕｎｇ，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３８：５４８−５２；Ｃａｔｔａｎ  ａｎｄ  Ｄｏｕｇｌａｓ，１９９４，Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  １８：５１３−２２），Ｒａｊｉ  （Ｏｃｈａｋｏｖｓｋａｙａら，２００１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：１５０５−１０；Ｂｒｅｉｓｔｏら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：２９４４−４９），ａｎｄ  ＣＡ４６  （Ｋｒｅｉｔｍａｎら，１９９９，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８１：１４８−５５）が挙げられる。ＣＤ７０を発現するホジキンリンパ腫系の非限定的な例はＬ５４０ｃｙである（Ｂａｒｔｈら，２０００，Ｂｌｏｏｄ  ９５：３９０９−１４；Ｗａｈｌら，２００２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：３７３６−４２）。ＣＤ７０を発現するヒト腎臓細胞癌腫細胞系の非限定的な例としては、７８６−Ｏ（Ａｎａｎｔｈら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：２２１０−６；Ｄａｔｔａら，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：１７６８−７５）、ＡＣＨＮ（Ｈａｒａら，２００１，Ｊ  Ｕｒｏｌ．１６６：２４９１−４；Ｍｉｙａｋｅら，２００２，Ｊ  Ｕｒｏｌ．１６７：２２０３−８）、Ｃａｋｉ−１（Ｐｒｅｗｅｔｔら，１９９８，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：２９５７−６６；Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓｉｅｍａｎｎ，２００２，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：１１９−２６）およびＣａｋｉ−２（Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒら，２００１，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ３：３６０−７）が挙げられる。ＣＤ７０を発現する上咽頭癌腫細胞系の非限定的な例としては、Ｃ１５とＣ１７（Ｂｕｓｓｏｎら，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４２：５９９−６０６；Ｂｅｒｎｈｅｉｍら，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．６６：１１−５）が挙げられる。ＣＤ７０を発現するヒトグリオーマ細胞系の非限定的な例としては、Ｕ３７３（Ｐａｌｍａら，２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８２：４８０−７）およびＵ８７ＭＧ（Ｊｏｈｎｓら，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９８：３９８−４０８）が挙げられる。これらの腫瘍細胞系は皮下注射により固体腫瘍または静脈内注射により散在性腫瘍のいずれかとして免疫欠損げっ歯動物宿主中で確立することができる。宿主内でいったん確立されたら、これらの腫瘍モデルは、インビボ腫瘍成長の調節に対して、ここに記載の抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の治療有効性を評価するために利用できる。
【０２３５】
（ＸＩＩ．免疫疾患およびＣＤ７０発現ガン）
ここに記載の抗ＣＤ７０  ＡＤＣおよびＡＤＣ誘導体は、免疫細胞（例えば、リンパ球または樹状細胞）の不適切な活性化により特長付けられる免疫学的疾患を治療または予防するために有用である。ここに記載の方法による免疫学的疾患の治療または予防は、効果的な量の抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体をその治療または予防を必要とする被験体に投与することで、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は（ｉ）ＣＤ７０を発現し、かつその病状に関連する活性化免疫細胞に結合し、（ｉｉ）該活性化免疫細胞に対して細胞毒性効果、細胞静止効果または免疫抑制効果を及ぼすことにより達成される。
【０２３６】
免疫細胞の不適切な活性化により特長付けられ、ここに記載の方法により治療または予防することのできる免疫学的病気は、例えば、その疾患の背後にある過敏性反応のタイプにより分類することができる。これらの反応は、典型的にはアナフィラキシー反応、細胞毒（細胞分解）反応、免疫複合体反応、または細胞仲介免疫（ＣＭＩ）反応（遅延タイプの過敏性（ＤＴＨ）反応ともいう）の四種類に分類される。（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｐａｕｌ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ  ｅｄ．１９９３）を参照。）
そのような免疫学的疾患の具体的な例としては、慢性関節リウマチ、自己免疫脱髄疾病（例えば、多発性硬化症、アレルギー性脳髄膜炎）、内分泌眼病、ぶどう膜網膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、グレーブス病、糸球体腎炎、自己免疫肝臓病，炎症性腸疾患（例えば、クローン病）、アナフィラキシー、アレルギー性反応、シェーグレン症候群、タイプＩ糖尿病、原発性胆汁肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、繊維筋肉痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌不全、シュミッツ症候群、自己免疫ぶどう膜炎、アジソン病、副腎炎、甲状腺炎、ハシモト甲状腺炎、自己免疫甲状腺病、悪性貧血、胃萎縮症、慢性肝炎、狼瘡性肝炎、アテローム性動脈硬化、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレッスラー症候群、自己免疫血小板減少症、突発性血小板減少紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、ペンフィゴイド、強皮症、進行性全身性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰症、レイノー現象、食道不良運動、手指硬化および末梢血管拡張症）、男女の自己免疫不妊症、強着性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、混合結合組織病、多発関節炎ネドーサ、全身性壊死化脈管炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、チャガス病、サルコイドーシス、リューマチ熱、喘息、再発性流産、抗リン脂質症候群、ファーマーズラング（農夫肺）、多形紅斑、心臓切開後症候群、カッシング症候群、自己免疫慢性活性肝炎、バードファンシアーズラング（愛鳥家肺）、毒性上皮性壊死溶解、アルポート症候群、歯槽炎、アレルギー性肺胞炎、繊維化性肺胞炎、間質性肺病、紅斑ノドースン、壊疽性膿皮症、輸血反応、タカヤス動脈炎、リュウマチ性多筋肉痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨大細胞動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、スタンパー症候群、湿疹、リンパ肉芽腫症、ベーチェット病、キャプラン症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心筋内繊維症、眼内炎、エリテーマ・エレバタン・エト・ジウチナン（ｅｒｙｔｈｅｍａ  ｅｌｅｖａｔｕｍ  ｅｔ  ｄｉｕｔｉｎｕｍ）、乾癬、胎児赤芽球症、好酸性ファシイティス（ｆａｃｉｉｔｉｓ）、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、フックの毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノック・ショーンレイン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶、心筋症、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、低温性グロブリン血症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、エバンス症候群、および自己免疫生殖腺不全が挙げられる。
【０２３７】
従って、ここに記載の方法は、Ｂリンパ球の疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、リュウマチ性関節炎、およびタイプＩ糖尿病）、Ｔｈ１リンパ球の疾患（例えば、リュウマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、ハシモト甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結核または急性移植片対宿主病）、またはＴｈ２リンパ球の疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症、または慢性移植片対宿主病）の治療を包含する。
【０２３８】
ある実施態様において、免疫学的疾患はＴ細胞仲介免疫学的疾患、例えば該疾患に関連する活性化Ｔ細胞がＣＤ７０を発現するＴ細胞疾患である。ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体はそのようなＣＤ７０発現活性化Ｔ細胞を低減させるために投与することができる。特定の実施態様において、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の投与はＣＤ７０を発現する活性化Ｔ細胞を低減させる一方で、休止Ｔ細胞はＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体により実質的に低減することはない。この文脈において、「実質的に低減されない」とは約６０％未満、または約７０％未満、または約８０％未満の休止Ｔ細胞が低減されないことを意味する。
【０２３９】
ここに記載の抗ＣＤ７０  ＡＤＣおよびＡＤＣ誘導体はＣＤ７０を発現するガンを治療または予防するためにも有用である。ＣＤ７０を発現するガンのここに記載の方法による治療または予防は、効果的な量の抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体をその治療または予防を必要とする被験体に投与することで、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は（ｉ）ＣＤ７０を発現するガン細胞に結合し、（ｉｉ）ＣＤ７０を発現するガン細胞の増殖を低減または阻害する細胞毒または細胞静止効果を及ぼすことにより達成される。
【０２４０】
ここに記載の方法により治療または予防できるＣＤ７０発現ガンとしては、例えば、異なるサブタイプの無痛性非ホジキンリンパ腫（無痛性ＮＨＬ）（例えば、小胞ＮＨＬ、小リンパ球リンパ腫、リンパ形質細胞ＮＨＬまたは周辺領域ＮＨＬ）；Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫および慢性リンパ球白血病等のＢ細胞系のガン；腎臓細胞癌腫；上咽頭癌腫；胸腺癌腫；グリオーマ；髄膜腫；および結腸、胃および直腸の癌腫が挙げられる。
【０２４１】
（ＶＩＩＩ．抗ＣＤ７０  ＡＤＣおよびＡＤＣ誘導体を含む医薬組成物およびその投与）
本発明の方法に従って、ここに記載の抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体を含む組成物を免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンを有するか、またはその危険性のある被験体に投与する。ここで用いる「被験体」との用語は、例えばヒトおよび非ヒト哺乳類、例えば霊長類、げっ歯類およびイヌ等の、ＣＤ７０結合タンパク質−医薬複合体を投与してよい哺乳類被験体を意味する。ここに記載の方法を用いる治療が具体的に意図される被験体はヒトを含む。ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は免疫学的疾患またはＣＤを発現するガンの予防または治療において、単独または他の組成物と組み合わせて投与することができる。
【０２４２】
多様な供給システムが知られており、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体を投与するために用いることができる。導入方法としては、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下内、鼻内、硬膜外および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は、点滴または丸薬投与、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口粘膜、直腸または腸粘膜等）による吸収により投与することができ、化学療法剤等の生物活性物質とともに投与することができる。投与は全身または局所であってよい。
【０２４３】
特定の実施態様において、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体組成物は注射により、カテーテルにより、座薬により、または移植物により投与され、該移植物は多孔性、非多孔性、またはゼラチン状物質、例えばシアラスト（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜等の膜、または繊維等である。典型的には、組成物を投与する場合、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体を吸収しない材料が用いられる。
【０２４４】
他の実施態様において、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は調節除放システムで供給される。一実施態様において、ポンプを用いてよい（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照。）別の実施態様において、高分子物質を用いることができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ  ＆  Ｗｉｓｅ  ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ  ＆  Ｂａｌｌ編，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ＆  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照。Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい。）他の調節除放システムが、例えば上記のＬａｎｇｅｒで議論されている。
【０２４５】
抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は、治療有効量のＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体および一つ以上の薬学的に適合性のある成分を含有する医薬組成物として投与される。例えば、医薬組成物は典型的には一つ以上の医薬キャリヤー（例えば、石油、動物、植物または合成を起源とする滅菌液体、例えば水や油で、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等）を含む。医薬組成物を静脈内投与する場合、水がさらに典型的なキャリヤーである。塩溶液およびデキトロースおよびグリセロール水溶液も液体キャリヤーとして、特に注射可能な溶液に用いることができる。適当な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、シュクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。所望であれば、組成物は少量の湿潤剤や乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉剤、除放処方物等の形を取ることができる。組成物は慣用の結合剤やトリグリセリド等のキャリヤーとともに座薬として処方することができる。経口処方物としては、薬学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的なキャリヤーを含むことができる。適当な医薬キャリヤーの例はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は治療効果のある量の核酸またはタンパク質を、典型的には精製された形で、患者に適当な投与の形態を提供するように適当な量のキャリヤーとともに含むだろう。剤形は投与方法に対応している。
【０２４６】
典型的な実施態様において、医薬組成物は、日常的な操作に従ってヒトへの静脈内投与に適合する医薬組成物として処方する。典型的には、静脈内投与用の組成物は等張の滅菌水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、医薬は可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるリグノカイン等の局所麻酔剤を含むこともできる。一般的には、それらの成分は別個にまたは単位投与形で共に混合して、例えば、有効物質の品質を示すアンプルまたはプラスチック袋等の密封容器に凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。医薬が点滴により投与される場合、滅菌医薬グレードの水または塩溶液を含む点滴ビンで調合することができる。医薬が注射により投与される場合、注射用滅菌水または塩溶液のアンプルを提供することで成分を投与前に混合することができる。
【０２４７】
ある実施態様において、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体を含む医薬組成物はさらに第二の治療剤（例えば、第二のＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体または複合化させていない細胞毒性剤または免疫抑制剤、例えばここに記載のいずれか）を含むことができる。
【０２４８】
さらに、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形の抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体を含む容器および（ｂ）注射用の薬学的に許容される希釈剤（例えば、滅菌水）を含む第二の容器を含む薬学キットとして提供することができる。薬学的に許容される希釈剤は凍結乾燥ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の再構成または希釈に用いることができる。そのような容器に任意に付属させることのできるものは、医薬または生物学製品の製造、利用または販売を統制する政府機関により規定された形の通知であり、該通知は当局によるヒト投与に関する製品の製造、使用と販売についての承認を反映するものである。
【０２４９】
免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンの治療または予防に効果的なＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の量は標準的な臨床技術により決定することができる。さらに、インビトロアッセイを任意に用いて最適な投与量の範囲の同定の助けとしてもよい。処方物に用いられる正確な投与量は投与経路および免疫学的疾患またはＣＤ７０発現ガンの段階にも依存し、実施者および各患者の状況の判定に従って決定すべきである。効果的な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから得られる投与量−応答曲線から外挿してもよい。
【０２５０】
例えば、ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の毒性と治療有効性は、細胞培養物もしくは実験動物にて、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死となる投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して治療効果のある投与量）を決定する標準的な薬学操作によって決定することができる。毒性効果と治療効果との投与量比は治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表わすことができる。高い治療指標を示すＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が好ましい。ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が毒性のある副作用を示す場合、ＡＣＤまたはＡＤＣ誘導体を侵された組織の部位を標的とさせる輸送システムを用いて、ＣＤ７０を発現しない細胞に対する潜在的な損傷を最小化して副作用を低減させることができる。
【０２５１】
細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のために投与量の範囲を処方するために用いることができる。抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＣＤ誘導体の投与量は典型的にはＥＤ５０を含み、かつ毒性がないか、ほとんどない循環濃度の範囲にある。投与量は、この範囲内において、使用される投与形と利用される投与経路にしたがって変更してもよい。本方法で用いられるＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体に関して、治療効果のある投与量は、まずは細胞培養物アッセイから予測できる。投与量は、細胞培養物中で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分だけを阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な投与量をさらに正確に決定することができる。血漿中の量を例えば高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。
【０２５２】
一般的に、免疫学的疾患またはＣＤ７０発現ガンを有する患者に投与する抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の量は典型的には０．１ｍｇ／（被験体の体重）ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに典型的には、被験体に投与される量は０．１ｍｇ／（被験体の体重）ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、さらにより典型的には１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。通常、ヒトの抗体は、人体において、外来タンパク質に対する免疫応答のために他の種からの抗体よりも長い半減期を有する。よって、ヒト化、キメラまたはヒトの抗体からなるＡＤＣのさらに低い投与量とさらに頻度の低い投与がしばしば可能である。
【０２５３】
抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体は、免疫学的疾患またはＣＤ７０を発現するガンの治療または予防のために一つ以上の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。例えば、組合せ治療は、第二の細胞静止、細胞毒または細胞抑制剤（例えば、複合体ではない細胞静止、細胞毒または細胞抑制剤、例えばガンまたは免疫学的疾患の治療に慣用的に用いられているもの）を含むことができる。さらに、組合せ治療は、例えば活性化リンパ球、樹状細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞の表面上のＣＤ７０以外のレセプターまたはレセプター複合体を標的とする物質の投与を含むことができる。そのような物質の例は、活性化リンパ球、樹状細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞の表面にある分子に結合する第二の非ＣＤ７０抗体である。もう一つの例はそのようなレセプターまたはレセプター複合体を標的とするリガンドである。典型的にはそのような抗体またはリガンドは活性化リンパ球、樹状細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞上の細胞表面レセプターに結合し、細胞静止または細胞毒シグナルを活性化リンパ球、樹状細胞またはＣＤ７０発現ガン細胞に送ることにより抗ＣＤ７０抗体の細胞毒または細胞静止効果を向上させる。
【０２５４】
そのような組合せ投与は病気のパラメーター（例えば、症状の程度、症状の数、または再発の頻度）に対して加法的または相乗的効果を有しうる。
【０２５５】
組合せ投与の治療計画に関して、特定の実施態様において、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体が第二の治療剤と同時に投与される。もう一つの特定の実施態様において、第二の治療剤は、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の投与前または投与後に投与され、抗ＣＤ７０  ＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体の投与前または投与後の少なくとも１時間から数ヶ月までの期間、例えば少なくとも１時間、１２時間、一日、一週間、一ヶ月または三ヶ月の期間内に投与される。
【０２５６】
本発明はここに記載の特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。ここに記載のものに加えて本発明の多様な改良が前記の説明および添付の図面から当業者には明らかとなるだろう。そのような改良は添付の請求の範囲内にあるものである。
【０２５７】
本発明を下記の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。下記の実施例に記載の細胞系は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ社、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ（ＤＭＳＺ）に規定された条件に従う培養で維持した。細胞培養試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得た。
【０２５８】
（実施例１：抗ＣＤ７０モノクローナル抗体１Ｆ６と２Ｆ２の配列分析）
１Ｆ６および２Ｆ２  ｍＡｂの軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を決定するために、ＴＲＩｚｏｌ（商標登録）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の使用説明書に従って用いて１Ｆ６と２Ｆ２ハイブリドーマから全ＲＮＡを単離した。遺伝子に特異的なプライマーｍＩｇｃＫ１  ５’−ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＴＴＴ  Ｇ−３’（配列番号４１）およびプライマーｍＩｇＧ１  ５’−ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  Ｇ−３’（配列番号４２）を利用して、両ＲＮＡ調製物からの軽鎖可変（ＶＬ）と重鎖可変（ＶＨ）の第一鎖ｃＤＮＡをそれぞれ逆転写した。第一鎖ｃＤＮＡ反応はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標登録）  Ｆｉｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｈｔｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施した。次に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および供給されたＴｄＴ緩衝液を製造者により規定された条件で用いて、ＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡをｐｏｌｙ−Ｇ末端とした。次に、Ｐｏｌｙ−Ｇ末端ＶＬおよびＶＨ第一鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅に供した。ＶＬＶＨＰＣＲ用のフォワードプライマーは、ＡＮＣＴＡＩＬ  ５’  ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  Ｃ−３’（配列番号４３）であった。ＶＬを増幅するためのリバースプライマーは、ＨＢＳ−ｍｃｋ  ５’−ＣＧＴ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＡＣ−３’（配列番号４４）であった。ＶＨを増幅するためのリバースプライマーは、ＨＢＳ−ｍＧ１  ５’−ＣＧＴ  ＣＡＴ
ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ
ＴＴＡ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＣ−３’（配列番号４５）であった。ＰＣＲは、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）および提供された反応緩衝液を製造者により指定された条件で用いて実施した。ＶＬとＶＨＰＣＲ生成物を次にＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１９にクローニングした。組換えプラスミドクローンを同定し、１Ｆ６と２Ｆ２ハイブリドーマのヌクレオチド配列を決定した。
【０２５９】
１Ｆ６と２Ｆ２  ｍＡｂの重鎖と軽鎖中の相補性決定領域（ＣＤＲ）をＫａｂａｔら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７に記載の定義に従って決定した（図１および２）。ｃＤＮＡとアミノ酸レベルにおける配列アライメントは、緊密に関連する軽鎖遺伝子がおそらく両ハイブリドーマで利用されていることを明らかにした。１Ｆ６ＶＬと２Ｆ２ＶＬとの間にアミノ酸レベルで９２％の配列同一性がある。ＣＤＲの配列比較により、１Ｆ６  ＣＤＲ−Ｌ１は２Ｆ２  ＣＤＲ−Ｌ１と同一であり、わずかに一つの異なる置換が１Ｆ６  ＣＤＲ−Ｌ２と２Ｆ２  ＣＤＲ−Ｌ２との間に存在し、わずかに２つの保存置換が１Ｆ６  ＣＤＲ−Ｌ３と２Ｆ２  ＣＤＲ−Ｌ３との間に存在することが示されている（図３）。一方、高度の配列多様性が１Ｆ６  ＶＨと２Ｆ２  ＶＨとの間に存在し、１３７アミノ酸残基のうち約６６残基が二つのＶＨとの間で異なる。ＣＤＲの配列比較により、１０アミノ残基のうち５残基が１Ｆ６  ＣＤＲ−Ｈ１と２Ｆ２  ＣＤＲ−Ｈ１との間で異なり（５置換のうち３置換が異なる）、１７残基のうち１２残基が１Ｆ６  ＣＤＲ−Ｈ２と２Ｆ２  ＣＤＲ−Ｈ２との間で異なり（１２置換のうち９置換が異なる）、９残基のうち５残基が１Ｆ６  ＣＤＲ−Ｈ３と２Ｆ２  ＣＤＲ−Ｈ３との間で異なる（５置換のうち４残基が異なる）ことが示されている（図３）。
【０２６０】
（実施例２：抗ＣＤ７０医薬複合体の合成）
抗ＣＤ７０が抗体医薬複合体（ＡＤＣ）の形において強力な細胞毒医薬を運び、ＣＤ７０発現細胞を除去する能力を調べた。モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オーリスタチンフェニルアラニンフェニレンジアミン（ＡＦＰ）およびモノメチルオーリスタチンフェニルアラニン（ＭＭＡＦ）をこの研究の標的化細胞毒医薬として用いた。これら医薬をバリン−シトルリン（ｖｃ）ジペプチドリンカーにより抗ＣＤ７０  ｍＡｂ  １Ｆ６に連結し、１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥ、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰ複合体および１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦを得た。
【０２６１】
Ａ．１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥの合成
【０２６２】
【化２７】
2006518753.tif 000030
上記に示される一般式を有するＡＤＣ  １Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥの合成を以下に示す。
１．医薬−リンカー化合物の合成
【０２６３】
【化２８】
2006518753.tif 000031
オーリスタチンＥの合成は既に記載されている（米国特許第５，６３５，４８３号；Ｐｅｔｔｉｔ，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．７０：１−７９）。オーリスタチンＥのモノメチル誘導体（ＭＭＡＥ）は、オーリスタチンＥの合成においてＮ，Ｎ−ジメチルバリンを保護形のモノメチルバリンで置換することにより調製した（Ｓｅｎｔｅｒら，米国仮出願第６０／４００，４０３号；およびＰＣＴ／ＵＳ０３／２４２０９（既出））。
【０２６４】
医薬リンカー化合物を調製するために、ＭＭＡＥ（１．６９ｇ、２．３５ｍｍｏｌ）、マレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコールｐ−ニトロフェニルカルボネート（２．６ｇ、３．５２ｍｍｏｌ、１．５当量、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８６９記載されたように調製）およびＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、０．２当量）をＤＭＦ（２５ｍＬ）で希釈した。２分後、ピリジン（５ｍＬ）を加えて、反応を逆相ＨＰＬＣでモニターした。反応は２４時間で完了することが示された。反応混合物を濃縮して、黒い油状物質を得て、これを３ｍＬのＤＭＦで希釈した。このＤＭＦ溶液をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出液勾配：１００％ジクロロメタン〜４：１ジクロロメタン−ＭｅＯＨ）を用いて精製した。適切な画分を一緒にし、濃縮して油状物質を得て、高度減圧下に固体化して、所望の医薬−リンカー化合物の混合物と非反応性ＭＭＡＥの混合物を汚れた黄色固体（９：１ジクロロメタン−ＭｅＯＨ中でＲｆ０．４０）として得た。この汚れた黄色固体をＤＭＦで希釈し、逆相調製用ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８カラム、４１．４ｍｍ×２５ｃｍ、８μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液を４５ｍＬ／分で１０％から１００％までの４０分間にわたるグラジエントの後１００％ＭｅＣＮを２０分間流す操作）を用いて精製し、所望の医薬−リンカー化合物を無定形の白色粉末（９：１ジクロロメタン−ＭｅＯＨ中でＲｆ０．４０）を得た。これはＨＰＬＣにより純度９５％を超え、１％未満のＭＭＡＥを含んでいた。収率：１．７８ｇ（５７％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １３１６．７［Ｍ＋Ｈ］＋；ＵＶ？ｍａｘ２１５，２４８ｎｍ。
【０２６５】
（２．複合体の調製）
抗体の還元。０．７ｍｌの１Ｆ６（１０ｍｇ／ｍＬ）に９０μＬの５００ｍＭホウ酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、次に９０μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ水溶液および２０μＬの水を加えた。３７℃で３０分間のインキュベーション後、緩衝液を、１ｍＭのＤＴＰＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで平衡化され溶出されるＧ２５樹脂での溶出により交換した。チオール／Ａｂ値は、溶液の２８０ｎｍ吸収からの還元抗体濃度、およびＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ）との反応によるチオール濃度と４１２ｎｍでの吸収を決定することによって、９．８であることがわかった。
【０２６６】
還元抗体の複合化。還元ｍＡｂを氷上で冷やした。医薬−リンカー化合物を、濃度がわかっているＤＭＳＯ溶液として使用し、反応混合物に加えた医薬−リンカーの量を以下の通りに計算した：原液のＬ＝Ｖ×［Ａｂ］×過剰倍／［医薬−リンカー］、式中、Ｖと［Ａｂ］はそれぞれ還元抗体溶液の体積とモル濃度である。０．９０４μＬの冷Ｈ２Ｏ、次に５００μＬの冷アセトニトリルを還元抗体溶液に加えた。３０．５μＬの１０．２ｍＭの医薬−リンカー化合物原液を１．４７ｍＬのアセトニトリルに希釈した。アセトニトリル医薬−リンカー溶液を氷上で冷やし、次に還元抗体溶液に加えた。反応は０．５時間後にマレイミドに対して２０倍モル過剰のシステインを加えることにより停止した。反応混合物は遠心限外ろ過により濃縮し、４℃でＰＢＳ中の脱塩Ｇ２５からの溶出により精製した。１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥを次に滅菌条件下で０．２ミクロンのフィルターによりろ過し、すぐに−８０℃で凍結した。１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥを１）ＵＶ吸収により濃度、２）サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集、３）ＤＴＮＢにより未反応チオールを測定することにより医薬／Ａｂ、および４）逆相ＨＰＬＣにより残留する遊離医薬について分析した。
【０２６７】
（Ｂ．ＩＦ６−ｖｃＡＦＰの合成：）
【０２６８】
【化２９】
2006518753.tif 000032
上記に示す一般構造を有するＡＤＣ  １Ｆ６−ｖｃＡＦＰの合成を以下に示す。
【０２６９】
１．ＡＦＰ合成
【０２７０】
【化３０】
2006518753.tif 000033
Ｂｏｃ−フェニルアラニン（１．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を、トリエチルアミン（１０．７ｍＬ、７６．０ｍｍｏｌ、２０当量）およびジクロロメタン（５０ｍＬ）中の１，４−ジアミノベンゼン・ＨＣｌ（３．５ｇ、１９．０ｍｍｏｌ、５．０当量）の懸濁液に加えた。得られた溶液にＤＥＰＣ（３．２ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ、５．０当量）をシリンジを用いて加えた。ＨＰＬＣは２４時間後には残留するＢｏｃ−ｐｈｅが存在しないことを示した。反応混合物をろ過し、ろ液を濃縮して暗黒色の固体を得た。暗黒色の固体残渣を１：１のＥｔＯＡｃ：水間に分配し、ＥｔＯＡｃ層を水および塩水で連続して洗浄した。ＥｔＯＡｃ層を乾燥、濃縮して、濃褐色／赤色残渣を得て、これをＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘカラム、４１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと水を４５ｍＬ／分で１０％から１００％までの４０分間にわたるグラジエントの後１００％ＭｅＣＮを２０分間流す操作）により精製した。適切な画分を一緒にし、濃縮して赤色／黄褐色の固体中間体を得た。収率：１．４ｇ（１００％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５５．９［Ｍ＋Ｈ］＋；ＵＶ  ？ｍａｘ  ２１５，２６５  ｎｍ；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  ｄ７．４８（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），７．２２−７．３７（５Ｈ，ｍ），７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７  Ｈｚ），７．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），５．１９  （１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．３９−４．４８（１Ｈ，ｍ），３．４９（２Ｈ，ｓ），３．１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７  Ｈｚ），１．４３（９Ｈ，ｓ）。
【０２７１】
赤色／黄褐色の固体中間体（０．５ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．３７ｍＬ、２．１１ｍｍｏｌ、１．５当量）をジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈し、得られた溶液にＦｍｏｃ−Ｃｌ（０．３８ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を攪拌し、白色固体沈殿物が数分後に形成した。反応はＨＰＬＣによれば１時間後に完結した。反応混合物をろ過し、ろ液を濃縮して油状物質を得た。油状物質をＥｔＯＡｃで析出させて、赤白色の中間体生成物を得て、これをろ過により集めて、減圧下に乾燥した。収率：０．７５ｇ（９３％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ５７８．１［Ｍ＋Ｈ］＋，５９５．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋
【０２７２】
赤白色中間体（０．４９ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、次に５ｍＬのトリフルオロ酢酸で処理した。反応は逆相ＨＰＬＣによれば３０分で完結した。反応混合物を濃縮し、得られた残渣をエーテルで析出して灰色がかった白色固体を得た。灰色がかった白色固体をろ過し、乾燥して、無定形粉末を得て、これを、Ｂｏｃ−ドラプロイン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９（９）：１９１３−１９２４に記載のように調製）（０．２４ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に加えた。この溶液にトリエチルアミン（０．３６ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＰｙＢｒｏｐ（０．５９ｇ、１．３ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。反応混合物は逆相ＨＰＬＣを用いてモニターした。反応が完結したら、反応混合物を濃縮し、得られた残渣をＥｔＯＡｃで希釈し、１０％クエン酸水溶液、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水および塩水で連続的に洗浄した。ＥｔＯＡｃ層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）を用いて精製して灰色がかった白色の粉末中間体を得た。収率：０．５７ｇ（８８％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ７６４．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋；ＵＶ  ？ｍａｘ  ２１５，２６５  ｎｍ；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）ｄ１０．０−１０．１５（１Ｈ，ｍ），
９．６３（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），８．４２（１／２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），８．２２（１／２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．７３  （２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．１１−７．５５（１３Ｈ，ｍ），４．６９−４．７５（１Ｈ，ｍ），４．４６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．２９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．２９（３Ｈ，ｓ），２．７７−３．４７（７Ｈ，ｍ），２．４８−２．５０（３Ｈ，ｍ），２．２５（２／３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，７．２Ｈｚ），１．４１−１．９６（４Ｈ，ｍ），１．３６（９Ｈ，ｓ），１．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，回転異性体），１．００  （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４，回転異性体）。
【０２７３】
白色の固体中間体（８５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルｖａｌ−ｖａｌ−ｄｉｌ−Ｏ−ｔ−ブチル（５５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ；Ｐｅｔｔｉｔら  １９９６，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋ．Ｉ  ｐ．８５９に記載のように調製）をジクロロメタン（５ｍＬ）で希釈し、窒素雰囲気下二時間室温にて２．５ｍＬのトリフルオロ酢酸により処理した。反応の完結をＲＰ−ＨＰＬＣで確認した。溶媒を減圧下に除去し、得られた残渣をトルエンとともに共沸させて２回乾燥し、次に高減圧下に１２時間乾燥した。
【０２７４】
残渣をジクロロメタン（２ｍＬ）で希釈し、ジイソプロピルエチルアミン（３当量）、次にＤＥＰＣ（１．２当量）を加えた。反応が完了した後、反応混合物を減圧下に濃縮し、得られた残渣をＥｔＯＡｃで希釈し、１０％クエン酸水溶液、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液および塩水で連続的に洗浄した。ＥｔＯＡｃ層を乾燥し、ろ過し、濃縮して黄色の油状物質を得た。
【０２７５】
黄色の油状物質をジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈し、得られた溶液にジエチルアミン（５ｍＬ）を加えた。ＨＰＬＣによると、反応は２時間後に完結した。反応混合物を濃縮して油状物質を得た。油状物質をＤＭＳＯで希釈し、ＤＭＳＯ溶液を逆相調製用ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘカラム、２１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液を２０ｍＬ／分で１０％から１００％までの４０分間にわたるグラジエントの後１００％ＭｅＣＮを２０分間流す操作）を用いて精製した。適切な画分を一緒にし、濃縮して、所望の医薬を灰色がかった白色固体として得た。全体の収率：４２  ｍｇ（４４％全体）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ８３７．８［Ｍ＋Ｈ］＋，８５８．５［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＵＶ  ？ｍａｘ  ２１５，２４８  ｎｍ。
【０２７６】
（２．医薬リンカー化合物の調製）
【０２７７】
【化３１】
2006518753.tif 000034
ＡＦＰのトリフルオロ酢酸塩（０．３７ｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＦｍｏｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ（０．３０ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１．５当量；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８９６に従って調製）をＤＭＦ（５ｍＬ、０．１Ｍ）で希釈し、得られた溶液にピリジン（９５μＬ、１．２ｍｍｏｌ、３．０当量）を加えた。ＨＡＴＵ（０．２３ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１．５当量）を次に固体として加え、反応混合物を、ＨＰＬＣを用いてモニターしながら、窒素雰囲気下で攪拌した。反応は徐々に進み、４時間後に、１．０当量のジイソプロピルエチルアミンを加えた。反応は１時間で完結した。反応混合物を減圧下に濃縮し、得られた残渣を調製用ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８カラム、４１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液を４５ｍＬ／分で１０％から１００％までの４０分間にわたるグラジエントの後１００％ＭｅＣＮを２０分間流す操作）を用いて精製して、かすかに桃色の固体中間体を得た。
【０２７８】
この桃色の固体中間体をＤＭＦ（３０ｍＬ）で希釈し、得られた溶液にジエチルアミン（１５ｍＬ）を加えた。反応はＨＰＬＣによると２時間で完結した。反応混合物を濃縮し、得られた残渣をエーテルで二回洗浄した。固体中間体を高減圧下に乾燥し、次にこれを次の工程に直接用いた。
【０２７９】
固体中間体をＤＭＦ（２０ｍＬ）で希釈し、得られた溶液に６−（２，５−ジオキシ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキシ−ピロリジン−１−イルエステル（０．１２ｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）（ＥＭＣＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を加えた。４日後、反応混合物を濃縮して油状物質を得て、これを調製用ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８カラム、４１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液を４５ｍＬ／分で１０％から１００％までの４０分間にわたるグラジエントの後１００％ＭｅＣＮを２０分間流す操作）を用いて精製して、所望の医薬−リンカー化合物を白色の薄片状の固体として得た。収率：０．２１  ｇ（３８％全体）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １２８５．９  ［Ｍ＋Ｈ］＋；１３．０７．８  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＵＶ  ？ｍａｘ  ２１５，２６６  ｎｍ。
【０２８０】
（３．複合体の調製）
抗体の還元。０．４８ｍｌの１Ｆ６（１０．４ｍｇ／ｍＬ）に７５μＬの５００ｍＭホウ酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、次に７５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ水溶液および２０μＬのＰＢＳを加えた。３７℃で３０分間のインキュベーション後、緩衝液を、１ｍＭ  ＤＴＰＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで平衡化され溶出されるＧ２５樹脂での溶出により交換した。チオール／Ａｂ値は、溶液の２８０ｎｍ吸収から還元抗体濃度、およびＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ）による反応によるチオール濃度と４１２ｎｍでの吸収を決定することによって、１０．３であることがわかった。
還元抗体の複合化。還元ｍＡｂを氷上で冷やした。医薬−リンカー化合物を、濃度がわかっているＤＭＳＯ溶液として使用し、反応混合物に加えた医薬−リンカーの量を以下の通りに計算した：原液のＬ＝Ｖ×［Ａｂ］×過剰倍／［医薬−リンカー］、式中、Ｖと［Ａｂ］はそれぞれ還元抗体溶液の体積とモル濃度である。９８４μＬの冷ＰＢＳ／ＤＴＰＡを還元抗体溶液に加え、次に４００μＬのアセトニトリルを加え、混合物を氷上で冷やした。２６．４μＬの８．３ｍＭの医薬−リンカー化合物原液を次に還元抗体／ＤＭＳＯ溶液に加えた。反応は一時間後に４０μＬの１００ｍＭのシステインを加えることにより停止した。反応混合物は遠心限外ろ過により濃縮し、４℃でＰＢＳ中の脱塩Ｇ２５からの溶出により精製した。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰを次に滅菌条件下で０．２ミクロンのフィルターによりろ過し、すぐに−８０℃で凍結した。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰを、１）ＵＶ吸収により濃度、２）サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集、３）ＤＴＴ、次にＤＴＮＢ処理により未反応チオールの測定により医薬／Ａｂ、および４）逆相ＨＰＬＣにより残留する遊離医薬について分析した。
【０２８１】
（Ｃ．ＩＦ６−ｖｃＭＭＡＦの合成）
【０２８２】
【化３２】
2006518753.tif 000035
上記に示す一般構造を有するＡＤＣ  １Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦの合成を以下に示す。
【０２８３】
（１．ＭＭＡＦ合成）
【０２８４】
【化３３】
2006518753.tif 000036
ＭＭＡＦをそのｔ−ブチルエステル（化合物１）から以下に記載のように調製した。フェニルアラニンｔ−ブチルエステルＨＣｌ塩（８６８ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−ドラプロイン（６６８ｍｇ、１当量）、ＤＥＰＣ（８２０μＬ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（１．２ｍＬ）をジクロロメタン（３ｍＬ）で希釈した。室温（約２８℃）で二時間後、反応混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１０ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（２×１０ｍＬ）により連続的に洗浄した。有機層を分離し、濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに再懸濁し、酢酸エチルを用いるシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーで精製した。適切な画分を一緒にし、濃縮してジペプチドを白色固体として得た：６８４ｍｇ（４６％）。ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４９１．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２８５】
ｔ−ブチルエステルの存在下での選択Ｂｏｃ切断のために、上記のジペプチド（５００ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）をジオキサン（２ｍＬ）で希釈した。４ＭのＨＣｌ／ジオキサン（９６０μＬ、３当量）を加え、反応混合物を室温で一晩攪拌した。ほとんど完全なＢｏｃ脱保護が、最小量のｔ−ブチルエステル切断とともにＲＰ−ＨＰＬＣで観察された。混合物を氷浴で冷やし、トリエチルアミン（５００μＬ）を加えた。１０分後、混合物を冷却浴から取り出し、ジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１０ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（２×１０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を濃縮して黄色の気泡体を得た：２８７ｍｇ（５７％）。この中間体はさらに精製せずに用いた。
【０２８６】
トリペプチドＮ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルｖａｌ−ｖａｌ−ｄｉｌ−Ｏ−ｔ−ブチル（０．７３ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（３ｍＬ）、ジクロロメタン（３ｍＬ）で２時間室温にて処理した。混合物を蒸発乾固し、残渣をトルエン（３×２０ｍＬ）で共蒸発させ、一晩減圧下に乾燥した。残渣をジクロロメタン（５ｍＬ）で希釈し、脱保護されたジペプチドＤａｐ−ｐｈｅ−Ｏ−ｔ−ブチル（２８７ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）に加えた後に、ＤＩＥＡ（５５０μＬ、４当量）、ＤＥＰＣ（２０１μＬ、１．１当量）を加えた。室温で２時間後、反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（２×２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１０ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を分離し、濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに再懸濁し、酢酸エチルを用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。適切な画分を一緒にし、濃縮してＮ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルｖａｌ−ｖａｌ−ｄｉｌ−ｄａｐ−ｐｈｅ−Ｏ−ｔ−ブチルを白色固体として得た：５３３ｍｇ（７１％）。Ｒｆ０．４（ＥｔＯＡｃ）。ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １０１０．６［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２８７】
この生成物（２００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３ｍＬ）、ジエチルアミン（１ｍＬ）で希釈した。反応混合物を一晩室温で攪拌した。溶媒を除去して油状物質を得て、これを、ジクロロメタン中０〜１０％ＭｅＯＨのステップグラジエントを用いるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物１を白色固体として得た：１３７ｍｇ（８７％）。Ｒｆ０．３（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）。ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ７８８．６［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２８８】
【化３４】
2006518753.tif 000037
ＭＭＡＦは、４ＭのＨＣｌ／ジオキサン（４ｍｌ）による７時間の室温での処理により化合物１（３０ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）から調製した。溶媒を除去し、残渣を減圧下で一晩乾燥してＭＭＡＦを吸湿性白色固体：３５ｍｇ（ＨＣｌ塩として換算して１２０％）を得た。ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ７３２．５６［Ｍ＋Ｈ］＋
２．医薬−リンカー化合物の調製
化合物１（８３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、メレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコールｐ−ニトロフェニルカルボネート（８５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．ｌ当量）およびＨＯＢｔ（２．８ｍｇ、２１μｍｏｌ、０．２当量）をアルゴン下にて、無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）とピリジン（０．３ｍＬ）に取った。３０時間後、反応はＨＰＬＣによれば本質的に完結することがわかった。混合物を蒸発させ、最少量のＤＭＳＯに取り、調製用ＨＰＬＣ（Ｃ１２−ＲＰカラム、５μ、１００Å、水（０．１％ＴＦＡを含む）中のＭｅＣＮの１０％から１００％までの４０分間のリニアグラジエントおよびその後の２０分間の１００％ＭｅＣＮ、流速２５ｍＬ／分）により精製し、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ−Ｏ−ｔ−ブチルエステルを白色固体として得た。収率：１０３ｍｇ（７１％）。ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １３８７．０６［Ｍ＋Ｈ］＋，１４０９．０４［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＵＶ  ？ｍａｘ  ２０５，２４８ｎｍ。
【０２８９】
ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ−Ｏ−ｔ−ブチルエステル（４５ｍｇ、３２μｍｏｌ）を塩化メチレン（６ｍＬ）に懸濁した後に、ＴＦＡ（３ｍＬ）を加えた。得られた溶液を二時間放置した。反応混合物を減圧下に濃縮し、調製用ＨＰＬＣ（Ｃ１２−ＲＰカラム、５μ、１００Å、水（０．１％ＴＦＡを含む）中のＭｅＣＮの１０％から１００％までの４０分間のリニアグラジエントおよびその後の２０分間の１００％ＭｅＣＮ、流速２５ｍＬ／分）により精製した。所望の画分を濃縮して、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを灰色がかった白色固体として得た。収率：１１ｍｇ（２５％）。ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １３３０．２９［Ｍ＋Ｈ］＋，１３５２．２４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＵＶ  ？ｍａｘ  ２０５，２４８  ｎｍ。
【０２９０】
（３．複合体の調製）
抗体の還元。０．７５ｍＬの１Ｆ６（４．２ｍｇ／ｍＬ）に５０μＬの５００ｍＭホウ酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を加え、次に１００μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ水溶液および１００μＬのＰＢＳを加えた。３７℃で３０分間のインキュベーション後、緩衝液を、１ｍＭ  ＤＴＰＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで平衡化され溶出されるＧ２５樹脂での溶出により交換した。チオール／Ａｂ値は、溶液の２８０ｎｍ吸収からの還元抗体濃度、およびＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ）による反応によるチオール濃度と４１２ｎｍでの吸収の決定によって、８．９であることがわかった。
還元抗体の複合化。還元ｍＡｂを氷上で冷やした。医薬−リンカー化合物を、濃度がわかっているＤＭＳＯ溶液として使用し、反応混合物に加えた医薬−リンカーの量を以下の通りに計算した：原液のＬ＝Ｖ×［Ａｂ］×過剰倍／［医薬−リンカー］、式中、Ｖと［Ａｂ］はそれぞれ還元抗体溶液の体積とモル濃度である。還元された抗体（１．７７ｍｇ／ｍｌの７８５μｌ）を９２μｌのアセトニトリル中の１２．９ｍＭのＭＣｖｃＭＭＡＦの７．２μｌの混合物に加え、すばやく混合した。反応混合物を氷上で１時間インキュベートした後、４０μｌの１００ｍＭシステインを加えた。反応混合物を４℃のＰＢＳで平衡化されたＧ２５カラムで精製した。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰを次に０．２ミクロンのフィルターにより滅菌条件下でろ過し、すぐに−８０℃で凍結した。１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦを、１）ＵＶ吸収により濃度、２）サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集、３）ＤＴＴ、次にＤＴＮＢによる処理による未反応チオールの測定により医薬／Ａｂ、および４）逆相ＨＰＬＣにより残留する遊離医薬について分析した。
【０２９１】
（実施例３：血液細胞系上でのＣＤ７０の発現）
ＣＤ７０の表面発現を、フローサイトメトリーを用いて調べた。一般的に、０．２×１０６細胞を、単一色フローサイトメトリー用に蛍光色素複合ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を含有する５０μｌの染色媒体（５％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ−１６４０）または多色フローサイトメトリー用に蛍光色素複合ｍＡｂの混合物とともにインキュベートした。インキュベーションは氷上で２０〜３０分間行った。次に細胞を染色緩衝液で３回洗浄し、１％パラフォルムアルデヒドを含有するＰＢＳで固定した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤイムノサイトメトリー、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）またはＷｉｎＭＤＩソフトウエアのいずれかを用いてデータを分析した。抗ヒトＣＤ７０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１Ｆ６と２Ｆ２をＣｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（アムステルダム、オランダ）から得た。１Ｆ６をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に製造者の使用説明書に従って複合化し、ＡＦ複合１Ｆ６を用いて、必要であればフローサイトメトリーによりＣＤ７０を検出した。抗ＣＤ７０  ｍＡｂ  Ｋｉ−２４および抗ＣＤ３  ｍＡｂをＢＤ  ＰｈａｒＭｉｇｅｎ（サンジエゴ、ＣＡ）から購入した。
【０２９２】
細胞表面ＣＤ７０の発現を血液細胞系のパネル上で調べた。このパネルはエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）陰性アメリカバーキットリンパ腫（ＢＬ）とＥＢＶ＋アフリカバーキットリンパ腫系の両方、ＥＢＶ−、２種類のホジキン病（ＨＤ）系、２種類のＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞系（ＥＢＶ−ＬＣＬ）および急性Ｔ細胞白血病系Ｊｕｒｋａｔである多様な非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）系を含んだ（図４）。細胞系をＡＴＣＣまたはＤＳＭＺにより指定された培養条件で維持した。フローサイトメトリー分析のために、ＡＦ複合抗ＣＤ７０またはＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した市販の抗ＣＤ７０（クローンＫｉ−２４）を用いた。平均蛍光強度に基づいて、対照のＩｇＧ結合に比較して抗ＣＤ７０が２倍を超す結合を示す細胞系をＣＤ７０発現と任意に定義した。この基準に基づいて、調べられたＢＬ系のすべて、ＥＢＶ＋とＥＶＢ−の両方が低いレベルだが検出可能な量のＣＤ７０を発現した。１０種類のＮＨＬ細胞系のうち５細胞系がＣＤ７０を発現した。ＨＤとＥＢＶ−ＬＣＬの両者も、ＢＬとＮＨＬ系よりも一般的に高い量でＣＤ７０を発現した。急性Ｔ白血病細胞系ＪｕｒｋａｔはＣＤ７０−であることがわかった。
【０２９３】
（実施例４：ＣＤ７０＋血液系に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの増殖抑制効果と細胞毒性効果）
表４に示すＣＤ７０＋血液系の部分集合が１Ｆ６  ＡＤＣに対する感度について調べられた。これらの系を、各ウエルあたり５，０００細胞にて、９６ウエルプレート中、図５に示されたように段階的な量のＡＤＣを含む合計２００μｌの培養培地へ四重複（１検体につき４試験）で入れた。増殖アッセイは９６時間行った。インキュベーションの最後の１６時間中のトリチウム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）取り込みを用いてＤＮＡ合成を評価した。ＣＤ７０＋Ｂリンパ腫細胞系ＷＳＵ−ＮＨＬおよびＣＤ７０−Ｊｕｒｋａｔ細胞の応答を図５の上のパネルに示す。１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥと１Ｆ６−ｖｃＡＦＰの両方がＷＳＵ−ＮＨＬ細胞の増殖に対して量依存的な抑制効果を及ぼした。ＡＤＣが０．００５μｇ／ｍｌよりも高い濃度で用いられたときに、増殖抑制効果は明らかであった。非結合ＩｇＧ対照ＡＤＣは、０．５μｇ／ｍｌよりも低い濃度で有意な効果をもたらさなかった。一方、ＣＤ７０−Ｊｕｒｋａｔ急性Ｔ白血病細胞系の増殖は、２μｇ／ｍｌの高い濃度の１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥまたはＩＦ６−ｖｃＡＦＰのいずれによっても影響されなかった。よって、標的陽性細胞に対する１Ｆ６  ＡＤＣの増殖阻害活性は、標的細胞上に発現したＣＤ７０へのＡＤＣの特異的な結合に起因するものであった。調べられた他のＣＤ７０＋細胞系の応答を図５の下のパネルにまとめる。１Ｆ６  ＡＤＣによる有意な増殖抑制はＢ系統非ホジキンリンパ腫の３細胞系のうち２細胞系（ＭＣ１１６とＷＳＵ−ＮＨＬ）、ホジキン病の２細胞系のうち２細胞系、およびＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞系ＣＥＳＳで観察された。試験した応答性細胞系のすべてにおいて、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰは１６Ｆ−ｖｃＭＭＡＥよりも強い阻害活性を及ぼすことが示された。これらの結果は、抗ＣＤ７０  ＡＤＣがＣＤ７０＋リンパ腫の免疫治療に潜在的に利用可能であることを示唆する。さらに、ＥＢＶ−ＬＣＬは、活性化された正常なＢ細胞に対して表現型が非常に類似する。ＥＢＶ−ＬＣＬおよび活性化された正常なＢ細胞は双方とも、強力なＴ細胞促進活性を有する有効な抗原提示細胞である。抗ＣＤ７０  ＡＤＣがＥＢＶ−ＬＣＬ  ＣＥＳＳ細胞の増殖を十分に抑制できるとの観察は、抗ＣＤ７０  ＡＤＣが、活性化Ｂ細胞を除去することによって免疫応答を抑制するために利用できることも示す。
【０２９４】
（実施例５：固体腫瘍中のＣＤ７０転写物の発現）
ホジキン病と上咽頭癌腫（ＮＰＣ）は、腫瘍部位で、ＥＢＶと目立ったリンパ基質とにしばしば関連がある症状の二つの例である。このリンパ基質の役割は不明であり、腫瘍関連抗原に対する免疫応答の一部として、リンパ球の腫瘍への侵潤を表わすものかもしれない。もしくは、腫瘍細胞によるリンパ球の補充は、腫瘍細胞がサイトカインと成長因子をパラクライン形式で浸潤リンパ球から引き出す機構であるかもしれない。ＨＤに関して仮説が立てられているように、これらの成長因子のいくつかは腫瘍細胞増殖を支えることにより腫瘍の発達に寄与するものかもしれない（Ｇｒｕｓｓら，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：１５６−６３）。ＣＤ７０はＨＤ中でリード・スターンベルク細胞上に存在することがわかり、図６はＨＤ細胞系上でのＣＤ７０の発現を示す。ＥＢＶに関連する未分化上咽頭癌腫からの凍結腫瘍生検に関する研究において、８０％（２０例のうち１６例）が腫瘍細胞上でＣＤ７０タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を示した（Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕら，１９９５，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：１１５２−６０）。他でも、胸腺癌腫（Ｈｉｓｈｉｍａら，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈ．２４：７４２−７４６）、グリオーマおよび髄膜腫（Ｈｅｌｄ−Ｆｅｉｎｄｔ  ａｎｄ  Ｍｅｎｔｌｅｉｎ，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９８：３５２−５６）等のＥＢＶ−腫瘍上でのＣＤ７０の発現が報告されている。
【０２９５】
さらに、癌腫タイプにおけるＣＤ７０の潜在的な発現が、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｏｆｉｌｉｎｇ  Ａｒｒａｙ（ＣＰＡ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて調べられた。ＣＰＡは、個々の患者からの２４１の腫瘍および対応する正常組織からの正常化ｃＤＮＡを含む。これらの患者内でＣＤ７０メッセージの発現を調べるために、ＣＤ７０メッセージのヌクレオチド７３４〜８７４の３’非翻訳領域に対応するｃＤＮＡの一片を逆転写酵素ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて増幅した。第一鎖ｃＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標登録）  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲを用いるＢｕｒｋｉｔｔの癌腫細胞系ラモス（ＡＴＣＣ）から単離された全ＲＮＡから合成した。フォワードプライマー５’−ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＡＧ−３’（配列番号４６）、リバースプライマー５’−ＣＡＡ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ−３’（配列番号４７）およびＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）をＰＣＲに用いた。ＰＣＲ産物はｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、配列を確かめた。ハイブリダイゼーション用のプローブを作るために、ＰＣＲを、クローン化ｃＤＮＡを鋳型として、また上記のプライマー対、およびＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて実施した。プローブを３２Ｐ  ｄＧＴＰで標識するために、２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を７５ｎｇのランダムヘキサマー、３３μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、５μｌの３２Ｐ  ｄＧＴＰ（およそ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１μｌのクレノウ断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に５０μｌ全体積で混合した。反応混合物を室温で１５分間インキュベートし、ＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃度で加えて反応を停止した。ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて標識したプローブを精製した。ＢＤ  ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の使用説明書に従って用いて、このプローブを、ＣＰＡ上にスポットされた患者ｃＤＮＡにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションシグナルはＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ  ＳＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上でのホスホイメージングにより定量した。ハウスキーピングＥＦ−１遺伝子について同じＣＰＡの再プロービングにより各試料対について約１の腫瘍：正常比が得られ、ｃＤＮＡの匹敵する負荷を確認した。従って、腫瘍および正常ｃＤＮＡから得られたＣＤ７０ハイブリダイゼーションシグナル間の比率を、ＣＤ７０転写物発現に対して半定量的測定値として使用した。
【０２９６】
ＣＤ７０プローブの腫瘍ｃＤＮＡへの示差ハイブリダイゼーションは幾つかのガンの種類において観察された。最も注目すべきは、腎臓癌腫の２０例のうち９例および結腸、胃および直腸癌腫のそれぞれの１例からのｃＤＮＡは対応する正常組織からのｃＤＮＡよりも強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。図６中のすべてがＲＣＣと分類された腎臓ガンの９例（４５％）はＣＤ７０転写物の２倍を超える（２．３〜８．９の範囲）過剰発現を示した。示差ＣＤ７０  ｃＤＮＡハイブリダイゼーションを示す胃、結腸および直腸ガンの単一例において（図６）、腫瘍：正常比率はそれぞれ２．９、８．９および３．２であった。
【０２９７】
８つのＲＣＣと４つの正常腎臓ｃＤＮＡ試料（これらすべてＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から得た）中のＣＤ７０転写物の発現を定量するために、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いた。ＲＣＣ  ｃＤＮＡ試料は図６のＣＰＡ上の試料とは独立した提供者からのものである。レポーター染料を５’末端（ＦＡＭまたはＶＩＣ）および非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）を３’末端に含有するＴａｑＭａｎ（商標登録）  ＭＧＢ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に用いてＱＰＣＲ分析を実施した。ＣＤ７０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙ＃  Ｈｓ００１７４２９７＿ｍ１）または対照遺伝子ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＤＡＲ＃  ４３２６３１７Ｅ）のいずれかに対して特異的なアッセイを用いて試料を評価した。正常腎臓とＲＣＣ組織との間のＣＤ７０転写物発現の比較を既に報告されたように比較限界サイクル（Ｃｔ）法（Ｗｉｎｅｒら，１９９９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：４１−４９；Ａａｒｓｋｏｇ  ａｎｄ  Ｖｅｄｅｌｅｒ，２０００，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：４９４−４９８）に基づいて実施した。二つの独立した反応からのＣＤ７０およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｔ値を発生させた。正常腎臓およびＲＣＣ試料からのＧＡＰＤＨ転写物のＣｔ値は互いに有意には異ならず（＜１サイクル、スチューデントのｔ試験：ｐ＝０．４０５）、ＣＤ７０発現が、腫瘍：正常比較のためにＧＡＰＤＨに対して標準化できることを示唆した。ＲＣＣおよび正常腎臓試料中のＣＤ７０発現のΔＣｔ値はＣｔＣＤ７０からＣｔＧＡＰＤＨを引くことによりそれぞれΔＣｔＴｕｍｏｒおよびΔＣｔＮｏｒｍａｌを得ることで計算した。ΔΔＣｔ値は、ΔＣｔＴｕｍｏｒからΔＣｔＮｏｒｍａｌを引くことにより計算した。正常な腎臓よりも倍発現されたＲＣＣ中のＣＤ７０転写物発現は次に２∧（−ΔΔＣｔ）として表わした。ＣＤ７０転写物過剰発現（＞２倍）は８つのＲＣＣ  ｃＤＮＡ試料のうち６試料で観察され、ＣＰＡ実験から得られた結果と一致した（図６）。ＣＤ７０転写物の過剰発現は２．５〜１３３．７倍の範囲にあった（図７）。
【０２９８】
（実施例６：腎臓細胞癌腫上でのＣＤ７０タンパク質の発現）
ＲＣＣにおけるＣＤ７０転写物の過剰発現がＣＤ７０タンパク質発現に匹敵するかどうか決定するために免疫組織化学を用いた。ＣＤ７０転写物分析（図６および図７）で使用された試料とは独立した二人の患者からの凍結ＲＣＣ組織切片と正常な隣接する組織切片（図６および図７）をアセトン中、−２０℃で１０分間固定した。ＰＢＳ中での再水和化後、切片を５％の正常ヤギ血清とアビジンＤを含むＰＢＳにより３０分間室温でブロックし、ＰＢＳで洗浄した。切片を２μ／ｍｌの抗ＣＤ７０  ｍＡｂ  ２Ｆ２または非結合ＩｇＧとともに、５％の正常なヤギ血清とビオチンを含むＰＢＳ中、６０分間室温にてインキュベートした。ＰＢＳによる洗浄後、５％の正常なヤギ血清を含むＰＢＳで１：２５０の希釈をしたビオチニル化抗マウスＩｇＧ（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて、３０分間室温でインキュベートすることにより結合した一次抗体を検出した。過剰なビオチニル化抗マウスＩｇＧはＰＢＳによる洗浄で除去した。切片をＰＢＳ中の１％Ｈ２Ｏ２で３０分間室温にてクエンチし、洗浄し、製造者の使用説明書に従って作られたＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ複合体とともにインキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、色の展開のために製造者の使用説明書に従って作られたＤＡＢ溶液（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣキット）とともに切片を３０分間室温でインキュベートした。次に、切片を水で洗浄し、ヘマトキシリンで２分間抗染色し、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に取り付け、４０×光学顕微鏡を用いて観察した。
【０２９９】
二人の異なる提供者からのＲＣＣ腫瘍切片への２Ｆ２の強い結合が観察された（図８Ａ、右パネル）。対照的に、対照ＩｇＧは連続的な腫瘍切片に結合せず、ＣＤ７０に対する２Ｆ２の特異性を確認した（図８Ａ、左パネル）。また、２Ｆ２は、対照ＩｇＧを超える同一ＲＣＣ試料からの正常な隣接する組織への結合を示さず（図８Ｂ）、正常腎臓中の最小のＣＤ７０タンパク質発現または発現のないことを示唆した。これらの結果はＲＣＣ中のＣＤ７０転写物の過剰発現を確認し、ＲＣＣにおけるｉｎ  ｓｉｔｕ  ＣＤ７０タンパク質発現に直接の証拠を提供する。
【０３００】
ＣＤ７０タンパク質のＲＣＣ細胞表面での発現を次に調べた。７つのＲＣＣ系のパネルをフローサイトメトリーを用いて評価した。ＲＣＣ系であるＨｓ８３５．Ｔ、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、７８６−Ｏ、７６９−ＰおよびＡＣＨＮをＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得て、ＡＴＣＣに指定の条件下に保持した。ＲＣＣ系ＣＡＬ５４とＡ４９８は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ社（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）から得た。細胞系は販売者に指定された条件で維持した。ＲＣＣ系であるＳＫ−ＲＣ−６とＳＫ−ＲＣ−７は既に報告されている（Ｍｕｒａｋａｍｉら，１９８４，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４２：１９２−８）。ＳＫ−ＲＣ−６とＳＫ−ＲＣ−７は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補なわれたＤＭＥＭ中で維持した。二つの正常な腎臓小管上皮系であるＲＰＴＥＣとＨＲＣＥ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）も分析に含めた。図９Ａは、ＲＣＣ系の７８６−Ｏ、Ｃａｋｉ−１およびＣａｋｉ−２がＣＤ７０を発現したが、Ｈｓ  ８３５．Ｔはしなかったことを示す。また、低いが検出できる量のＣＤ７０発現が、正常腎臓小管上皮系のＰＲＴＥＣとＨＲＣＥに観察された。図９Ｂは、フローサイトメトリーから得られた平均蛍光強度に基づくＲＣＣ系および正常な腎臓上皮細胞系上で発現した相対量のＣＤ７０を要約する。試験した１０のＲＣＣ系のうち９がＣＤ７０発現であることがわかった。これらの結果は腎臓癌腫におけるＣＤ７０転写物とタンパク質の存在はガン細胞上のＣＤ７０の表面発現を伴ったことを示す。
【０３０１】
（実施例７：ＣＤ７０＋腎臓細胞癌腫細胞系に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの増殖抑制効果と細胞毒性効果）
１Ｆ６  ＡＤＣに対するＣＤ７０＋ＲＣＣ系の応答を調べるために、細胞を１００μｌの培地中、ウエルあたり１，０００〜３，０００細胞密度で加えた。細胞を一晩付着させた後、段階的な量のＡＤＣを含むさらなる１００μｌの培養培地をウエルに加えた。ＤＮＡ合成に加えて、ＡＤＣの細胞毒性活性の反映としての細胞生存度も、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標登録）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）の還元によりアッセイした。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標登録）染料はインキュベーションの最後の４〜２４時間中に１〜４倍希釈で加えた。染料還元は、それぞれ５３５ｎｍの励起波長と５９０ｎｍの発光波長を用いる蛍光分光測定によりアッセイした。分析のために、取り込まれた３Ｈ−ＴｄＲの量または処理された細胞によるａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標登録）還元の程度を未処理の対照細胞と比較した。図１０は、二つの代表的なＣＤ７０＋ＲＣＣ系に対する増殖（３Ｈ−ＴｄＲ取り込み）と生存度（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標登録）還元）に対する１Ｆ６−ｖｃＡＦＰの効果を示す。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰは、Ｃａｋｉ−１と７８６−Ｏ細胞に対する強い増殖抑制（図１０、上のパネル）および細胞毒（図１０、下のパネル）活性を示し、最大の効果が０．１μｇ／ｍｌ未満の濃度で得られた。対照的に、１μｇ／ｍｌ未満の濃度の非結合対照ＩｇＧ−ｖｃＡＦＰはこれらの細胞に対して最小の効果を及ぼした。
【０３０２】
図１１は、ＲＣＣおよび正常な腎臓小管上皮細胞での増殖の抑制および細胞毒性の誘導に対する１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥ、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰおよび１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦのＩＣ５０を要約する。１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥは、Ｃａｋｉ−１およびＣａｋｉ−２細胞の増殖の抑制に非常に効果的であり、そのＩＣ５０値が２０ｎｇ／ｍｌ未満であった。しかし、それは、他のＣＤ７０＋ＲＣＣ系、ＣＤ７０−Ｈｓ８３５．Ｔ細胞または正常な腎臓上皮系ＲＰＴＥＣおよびＨＲＣＥに対しては活性がなかった。ＩＦ６−ｖｃＡＦＰによる増殖抑制のＩＣ５０はＣＤ７０＋ＲＣＣ系に対して２〜２４７ｎｇ／ｍｌの範囲であった。ＣＤ７０−Ｈｓ８３５．Ｔに対する１Ｆ６−ｖｃＡＦＰに関しては実質的に高いＩＣ５０値が得られ、ＣＤ７０の特異的な標的化を示唆した。１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦも、調べられたすべてのＣＤ７０＋ＲＣＣ系において増殖を抑制するのに活性があり、そのＩＣ５０値は３０ｎｇ／ｍｌ未満であった。増殖抑制は細胞毒に匹敵した。ＩＦ６−ｖｃＡＦＰが細胞毒性を誘導するＩＣ５０値は、調べられた７種類のＣＤ７０＋ＲＣＣ系のうち４種類で２０ｎｇ／ｍｌ以下であったが、ＩＦ６−ｖｃＭＭＡＦのＩＣ５０値は、調べられた７種類のＣＤ７０＋ＲＣＣ系のうち５種類で３０ｎｇ／ｍｌ以下であった。１Ｆ６  ＡＤＣによるＣＤ７０に対する特異的な標的化は、すべての調べられた系で、対照非結合ＩｇＧ  ＡＤＣについて得られたさらに高いＩＣ５０（＞１０００ｎｇ／ｍｌ）によって確認された。さらに、ＣＤ７０の検出可能な発現にかかわらず、正常な腎臓上皮細胞は、ＣＤ７０＋ＲＣＣ系と比較した場合にＩＦ６  ＡＤＣに対して非常に非感受性であったため、ＲＣＣは抗ＣＤ７０  ＡＤＣ仲介増殖抑制と細胞毒に対して差別的にさらに感受性があるように思えた。
【０３０３】
（実施例８：ＲＣＣの異種移植モデルにおけるＩＦ６−ｖｃＡＦＰのインビボ有効性）
Ｃａｋｉ−１細胞の皮下異種移植片をＲＣＣのモデルとしてうまく用いて、抗ＶＥＧＦ抗体等の抗体に基づく治療の有効性（Ｄａｇｎａｅｓ−Ｈａｎｓｅｎら，２００３，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２３：１６２５−３０）および抗ガンマグルタミルトランスフェラーゼ抗体に複合させたカリケアミシンテタール１からなるＡＤＣ（Ｋｎｏｌｌら，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６０８９−９４）を調べた。ヌードマウスにおけるＣａｋｉ−１系の異種移植片を用いて、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰのインビトロ抗腫瘍活性を調べた。Ｃａｋｉ−１腫瘍を確立するために、ヌードマウスに０．２ｍｌのＰＢＳ中の５×１０６個のＣａｋｉ−１細胞を皮下注射した。平均腫瘍サイズは注射後５５日以内で５００ｍｍ３を超えるまで大きくなった。Ｃａｋｉ−１を含有する腫瘍を、腫瘍を有するマウスから切り取り、約３０ｍｍ３の腫瘍組織ブロックを調製した。抗ＣＤ７０  ＡＤＣのインビボ抗腫瘍活性を評価するために用いられた純粋なヌードマウスにそれぞれ３０ｍｍ３の一つの腫瘍ブロックを皮下に移植した。移植後、腫瘍の大きさは処置なしでは４０日以内で８００ｍｍ３を超えるまで大きくなった（図１２）。処置は、一グループ内の平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ３であるときに開始した（図１２、矢印）。１Ｆ６で処置されたマウスの腫瘍成長速度は未処置対照またはＩｇＧ処置群のいずれかと実質的に同じであったために、１Ｆ６には治療効果がほとんど検出されなかった。しかし、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰによるマウスの処置は腫瘍の成長を顕著に阻害した。１ｍｇ／ｍｌの１Ｆ６−ｖｃＡＦＰで処置したマウスでの平均腫瘍サイズは、処置の開始から５６日後で＜６００ｍｍ３であったが、ＩｇＧ−ｖｃＡＦＰの同じ投与量により処置されたグループでは処置の開始から２０日後で既に＞６００ｍｍ３であった（図１０、上のパネル）。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰ投与量の３ｍｇ／ｍｌまでの増加はさらに腫瘍成長を抑制した；平均腫瘍サイズは処置の開始から７０日後で２００ｍｍ３以下に保持されたが、同じ投与量のＩｇＧ−ｖｃ−ＡＦＰは処置の開始から４２日後に＞４００ｍｍ３の腫瘍をもたらした（図１２、上のパネル）。別の実験からの１Ｆ６−ｖｃＡＦＰの３ｍｇ／ｋｇでの強く、特異的なインビボ抗腫瘍活性を図１２の下のパネルに示す。
【０３０４】
（実施例９：活性化Ｔ細胞におけるＣＤ７０の発現）
Ｔ細胞クローンの産出と維持は、米国仮出願第６０／３３１，７５０号および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３７２２３（両者ともに文献の援用によりそのすべてを本明細書に編入する）に記載されている。休止Ｔ細胞クローンを活性化するために、ＰＨＡ−Ｌ（１〜２μｇ／ｍｌ）（シグマ）、１０×１０６個の照射フィーダー細胞（ＣＥＳＳ）、ｒｈＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）およびＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含有し、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＰＲＭＩ−１６４０中で５×１０６個のＴ細胞をインキュベートした。Ｔ細胞クローンは通常再刺激前の１０〜１４日間に拡大した。抗原非特異的Ｔ細胞クローンのパネルをＣＤ７０発現に関して調べた。表２は調べられたＴ細胞クローンの特徴を要約している。このパネルは、ＣＤ４＋とＣＤ８＋のＴ細胞クローンの両方を含み、両クローンはそれらのサイトカインプロフィールにより示唆されたように異なるＴ細胞分化経路に属するように思える。調べられたクローンのすべてで顕著な量のＣＤ７０が検出可能であった。Ｔ細胞クローンは、ＰＨＡ、照射フィーダー細胞（ＣＥＳＳ）、およびｒＩＬ−２によって活性化され、ＣＤ２５とＣＤ７０の発現はフローサイトメトリー分析によりモニターした。他のＴ細胞クローンを代表するクローンＣ１Ａは、二日目にはピークとなったＣＤ２５の広範な上方調整を示した（図１３）。これはＴリンパ球活性化を示すものである。ＣＤ２５の発現はその後日数とともに徐々に低下した。ＣＤ７０発現の誘導はＣＤ２５発現の誘導と匹敵するものであった。また、ＣＤ７０誘導ピークは刺激の二日後に見られた。かなりのＣＤ７０発現が８日目にも検出可能であった。調べられたすべてのＴ細胞クローンは、表２に示すものを含めて、ＣＤ７０の活性化誘導発現の類似の動力学および程度を示した。
【０３０５】
【表２】
2006518753.tif 000038
＊抗ＣＤ７０結合と対照ＩｇＧ結合の平均ｌｏｇ蛍光強度間の平均
（実施例１０：活性化Ｔ細胞に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの増殖阻害効果）
活性化Ｔ細胞、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）および抗原開始Ｔ細胞を用いて、活性化Ｔ細胞の増殖に対する１Ｆ６  ＡＤＣの効果を調べた。
【０３０６】
４重複試験での９６ウエルフォーマットの標準的な増殖アッセイを用いて、活性化Ｔ細胞に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの効果を評価した。ＭＬＲのために、ＰＢＭＣを５０，０００細胞／ウエルで、５０，０００個の照射同種ＣＥＳＳとともに培地中２００μｌの最終容積にして加えた。破傷風トキソイド誘導Ｔ細胞増殖のために、破傷風トキソイド反応性Ｔ細胞を２０，０００細胞／ウエルにて２，０００個の同原ＤＣとともに全容積２００μｌにして加えた。透析され透明化された破傷風トキソイド（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を１：５０希釈の最終濃度で用いた。二日間活性化されたＴ細胞クローンを各ウエルに１０，０００細胞にて加えた。増殖アッセイは通常７２〜１２０時間実施した。インキュベーションの最後の１６時間中のトリチウム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）取り込みとシンチレーション計数を用いてＤＮＡ合成を評価した。分析のために、処置細胞により取り込まれたチミジンの量を未処置の対照細胞と比較した。
【０３０７】
第一のシステムにおいて、Ｔ細胞クローンの１Ｆ６  ＡＤＣに対する応答を調べた。休止Ｔ細胞クローンを活性化して図１３に示すようにＣＤ７０発現を誘導した。２日後の活性化後、細胞の一部をＣＤ２５とＣＤ７０発現についてフローサイトメトリーで分析して、細胞活性化とＣＤ７０誘導を確認した。残りの細胞はペレット化して、２００ＩＵ／ｍｌのｒＩＬ−２または２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含有する新しい培地に再懸濁した。次に、細胞を、１０，０００細胞／ウエルにて、段階的な濃度の１Ｆ６  ＡＤＣまたは非結合ＩｇＧ  ＡＤＣを含む培地に２００μｌの最終体積となるように加えた。細胞をさらに７２時間インキュベートし、最後の１６時間は３Ｈ−ＴｄＲによるパルスを与えて細胞ＤＮＡ合成を評価した。ＡＤＣ処理に対する３種類のＴ細胞クローンの応答の結果を図１４に示した。０．０１μｇ／ｍｌを超える濃度の１Ｆ６  ＡＤＣはＴ細胞クローンの増殖を有意に阻害した。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰは１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥよりも活性があることがわかった；すべての３クローンに対する１Ｆ６−ｖｃＡＦＰのＩＣ５０は０．０５μｇ／ｍｌ未満であることがわかった。対照ＡＤＣ  ｃＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＥとｃＩｇＧ−ｖｃＡＦＰは２μｇ／ｍｌ未満の濃度で増殖を有意に阻害することはなく、１Ｆ６  ＡＤＣの抗原特異性が確認された。
【０３０８】
第二のシステムにおいて、ＭＬＲをＰＢＭＣと照射同種刺激細胞ＣＥＳＳとの間に設定した。末梢血液Ｔ細胞の同種活性化を慣用の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により達成した。ＰＢＭＣと照射同種エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂリンパ芽球ＣＥＳＳ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を一つのＴ細胞に対して１０個の照射ＣＥＳＳ細胞の比率で混合することによりＭＬＲを開始した。Ｔ細胞密度は、１０％ＦＢＳと２ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＰＲＭＩ−１６４０の１ｍｌあたり０．２５×１０６個のＴ細胞に調節した。同種異系反応性Ｔ細胞の迅速な増殖と拡大が約９６時間の培養後に観察された。５日日の刺激後、抗ＣＤ７０  ｍＡｂ  １Ｆ６を用いるＣＤ７０発現についてフローサイトメトリーによって細胞を評価した。フローサイトメトリー分析は、生存可能なゲート内のほとんどの細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞であり、ＣＤ７０は生存可能なＣＤ３＋Ｔ細胞上に発現することを示した。図１５の上のパネルは、ＭＬＲの最後（開始から１２０時間後）にＣＤ７０の発現を示す。９６ウエルプレートでの並行培養物において、段階的な量の１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥまたは１Ｆ６−ｖｃＡＦＰのいずれかを開始時の培養物中に含めた。ＤＮＡ合成は５日間の培養の最後の１６時間に３Ｈ−ＴｄＲをパルスすることにより検定した。１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥと１Ｆ６−ｖｃＡＦＰは両方ともにＴ細胞増殖を実質的に阻害した（図１５、下のパネル）。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰは１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥよりも活性があり、そのＩＣ５０はおよそ０．１μｇ／ｍｌであった。
【０３０９】
第三のシステムにおいて、抗原で誘導されたＴ細胞増殖に対する１Ｆ６および１Ｆ６  ＡＤＣの効果を調べた。抗原に特異的なＴ細胞活性化を評価するために、同原ＤＣの存在下に破傷風トキソイドによる複数回の抗原刺激により、破傷風トキソイドに特異的なＴ細胞をＰＢＭＣから濃縮した。Ｔ細胞の抗原刺激前に、破傷風トキソイドでパルスした成熟同原ＤＣを上記のように調製した。次に、同原ＰＢＭＣを抗原パルス成熟ＤＣと１０個のＰＢＭＣに対して１個のＤＣの比率で、１０％ＦＢＳと２ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ−１６４０の１ｍｌあたり０．２５〜０．５×１０６個のＰＢＭＣ密度で共培養した。Ｔ細胞活性化と拡大を７日間続けた。生存可能なＴ細胞を培養物から集め、初回の活性化と同じ条件下で、破傷風トキソイドをパルスした同原成熟ＤＣにより再び再度刺激した。さらなる同一の活性化を二回行って破傷風トキソイドに特異的なＴ細胞をさらに濃縮した。
【０３１０】
破傷風トキソイドに特異的なＴ細胞を、上記のように破傷風トキソイドと同原ＤＣによる連続的な４回の刺激により富化、拡大させた。四回目の刺激の後に、休止している破傷風トキソイドに特異的なＴ細胞を、同原ＤＣ（２，０００細胞／ウエル）と破傷風トキソイドの存在下で２０，０００細胞／ウエルにて９６ウエルプレートにプレートした。段階的な量の１Ｆ６、１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥおよび１Ｆ６−ｖｃＡＦＰを開始時の培養物中に含ませた。ＤＮＡ合成は、３Ｈ−ＴｄＲ取り込みにより最後の１６時間アッセイした。非複合１Ｆ６は、破傷風トキソイド誘導のＴ細胞増殖に対して有意な効果を示さなかった一方で、１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥと１Ｆ６−ｖｃＡＦＰの両方が０．０３μｇ／ｍｌを超える量で実質的な阻害を及ぼした（図１６）。
【０３１１】
（実施例１１：抗原に特異的なインビトロ免疫応答中の活性化Ｔ細胞上でのＣＤ７０発現）
インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質に由来する９アミノ酸ペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ、Ｍ１ペプチド）はＨＬＡ−Ａ０２０１分子のペプチド結合溝に結合する。ＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する抗原提示細胞によるＭ１ペプチドの同原Ｔ細胞への提示は、Ｔ細胞レセプターＶβ１７鎖を発現するＣＤ８＋細胞毒Ｔ細胞の活性化と拡大を特異的に促進させ（Ｌｅｈｎｅｒら，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：７９−９１）、抗原特異的なＴ細胞の活性化と拡大をそれらの母性抗原まで突き止める便利なインビトロ実験系を構成する。
【０３１２】
活性化抗原特異的Ｔ細胞上でのＣＤ７０発現を調べるために、ＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する正常な提供者からのＰＢＭＣをＭ１ペプチドにより刺激した。ＰＢＭＣを２×１０６細胞／ｍｌにて、５μｇ／ｍｌのＭ１ペプチドとともに、５％のヒトＡＢ血清を補ったＡＩＭＶ培地に入れた。ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ）およびＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）のそれぞれ２０ＩＵ／ｍｌと５ｎｇ／ｍｌの最終濃度での添加を、培養の開始後二日目から二日につき１回の割合で開始した。ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞の拡大とＣＤ８＋／Ｖβ１７＋上のＣＤ７０の誘導に続いて三色フローサイトメトリーを行った。Ｖβ１７＋Ｔ細胞は抗ＴＣＲＶβ１７  ｍＡｂクローンＥ１７．５Ｆ３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）により同定した。代表的実験からの結果を図１７ＡとＢに示す。図１７Ａの上のパネルは、培養開始の二日後、リンパ球集団内のわずかに０．９％の細胞がＣＤ８＋／Ｖβ１７＋であったことを示す。Ｔ細胞の拡大はＣＤ８＋／Ｖβ１７＋集団内で明らかなだけであった。ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋のパーセントは１１日目で漸進的に２３％に増加した。ＣＤ７０の発現は抗原刺激の３日後に検出可能となった（図１７Ａ、下のパネル）。７日目に、拡大ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞の約６０％がＣＤ７０を発現した（図１７Ａ，左下のパネル）。また、平均蛍光強度（ＭＦＩ）により示されるＣＤ７０発現の最大量が７日目に検出された（図１７Ａ、右下のパネル）。ＣＤ７０＋／ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞のパーセントとＣＤ８＋／Ｖβ１７＋上のＣＤ７０発現のＭＦＩはその後減少し始めた。ＣＤ７０はＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞上で明らかに発現した一方で、ＣＤ８＋／Ｖβ１７−上にはＣＤ７０を検出することはできなかった（図１７Ｂ）。これらの結果から、ＣＤ７０誘導が、バイスタンダーである抗原非特異的なＴ細胞ではなく、抗原刺激に対応する活性化Ｔ細胞に限定されることが確認された。
【０３１３】
（実施例１２：抗ＣＤ７０  ＡＤＣによるＣＤ７０＋抗原特異的Ｔ細胞のインビトロ欠失）
ＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する正常な提供者からのＰＢＭＣをＭ１ペプチドで実施例１１に記載のように刺激した。５日目に、細胞を集め、洗浄し、５％のヒトＡＢ、２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を補った新鮮なＡＩＭＶ培地に０．５〜１×１０６細胞／ｍｌ（約１００，０００個のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞）にて再度加えた。１Ｆ６または対照非結合ＩｇＧ（ｃＩｇＧ）ＡＤＣを１μｇ／ｍｌの最終濃度で幾つかの培養物に加えた。すべての生存可能な細胞の計数をＡＤＣ添加の２４、４８および７６時間後に行った。二色フローサイトメトリーを行って、生存可能な細胞間のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞のパーセントを決定した。次に、各培養物中のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞の絶対数を計算した。二つの対照培養物中のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞の数は７６時間後に８００，０００を超えるまで増加した（図１８、上のパネル）。ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞膨張の実質的な阻害が１Ｆ６  ＡＤＣ処理培養物中に見られた。ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞の数は、ｃＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＥ処理培養物中の＞８００，０００に比較して１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥ処理培養物中でおよそ４００，０００であった。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰ処理培養物中でＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞の実質的な膨張は起こらなかった一方で、＞５００，０００個のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞がｃＩｇＧ−ｖｃＡＦＰ処理培養物に存在した。１Ｆ６  ＡＤＣのＣＤ８＋／Ｖβ１７−細胞に対する効果も評価した。図１８の下のパネルは、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰ処理培養物と１Ｆ６−ｖｃＭＭＥＡ処理培養物中のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞は、実験の終わりにおいて対照未処理培養物のそれぞれ＜４０％と＜２０％であったことを示す。対照的に、ＡＤＣ処理培養物中の抗原非特異的バイスタンダーである抗原非特異的ＣＤ８＋／Ｖβ１７−細胞は未処理の培養物の＞６０％であった。これらの結果は、１Ｆ６  ＡＤＣがＣＤ７０＋／ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞を特異的に標的とし、同じ培養物を共阻害したＣＤ７０−／ＣＤ８＋／Ｖβ１７−Ｔ細胞に対しては限定された効果を示し、１Ｆ６  ＡＤＣの限定されたバイスタンダー毒性を示唆した。
【０３１４】
三つの１Ｆ６  ＡＤＣの有効性を次に比較した。ＨＬＡ−Ａ０２０１  ＰＢＭＣをＭ１ペプチドで刺激し、図１８に示されたように多様なＡＤＣとともに示された濃度（図１９）で再度加えた。９６時間のインキュベーション後にＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞のパーセントを決定した。ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞拡大の投与量依存性阻害は、１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥ、−ｖｃＡＦＰおよび−ｖｃＭＭＡＦを用いたときに観察されたが、１μｇ／ｍｌの最高濃度の対応するＩｇＧ対照ＡＤＣは無医薬対照培養物と比較して検出可能な阻害活性を示さなかった。１Ｆ６−ｖｃＡＦＰと１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦのＩＣ５０値は０．１〜０．０１μｇ／ｍｌであった。ＩＦ６−ｖｃＭＭＡＥの阻害活性は１Ｆ６−ｖｓＡＦＰと１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦとの両方よりも弱いように思われた。
【０３１５】
再刺激アッセイを用いて、バイスタンダーである抗原非特異的ＣＤ８＋／Ｖβ１７−Ｔ細胞の機能的能力を評価した。ＰＢＭＣを発現するＨＬＡ−Ａ０２０１をＭ１ペプチドで刺激し、次に１μｌ／ｍｌの１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦで５日目に処置して、ＣＤ７０＋／ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞を図１８と図１９に記載されるように欠失させた。予想されたように、ＡＤＣ処理培養物中のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞の数は未処理の培養物よりも、１４％対４７％で低かった（図２０、左のカラム）。残っている細胞のミトゲンによる再刺激に対する応答を評価した。再刺激アッセイに用いられたＶβ１７−Ｔ細胞の数を正常化し、ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞の増殖応答への寄与を最小化するために、Ｖβ１７−Ｔ細胞を陰性免疫選択により濃縮した。簡単に説明すると、９日目の細胞を集め、洗浄し、５×１０７細胞／ｍｌにて、抗ＴＣＲＶβ１７  ｍＡｂ（クローンＥ１７．５Ｆ３）を含む培地中に１〜２μｇ／１０６標的Ｔ細胞で再懸濁させた。４℃で３０分間のインキュベーションの後、未結合の抗ＴＣＲＶβ１７  ｍＡｂを、０．１％ヒト血清を含有するＰＢＳで細胞を２回洗浄することにより除去した。細胞を２〜５×１０６個／ｍｌの濃度で培地中の２洗浄液に再懸濁し、ダイナビーズＭ−４５０ヤギ抗マウスＩｇＧ常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を、１個の標的Ｔ細胞に対して４個の常磁性ビーズの割合で加えた。混合物を４℃で３０分間回転させた。次に、結合したＶβ１７＋Ｔ細胞を有する常磁性ビーズを、磁気装置によって残りの細胞から分離した。Ｖβ１７＋Ｔ細胞の除去は二色フローサイトメトリーにより確認した。図２０の中央のカラムは、細胞のわずかに３％と５％とが１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ処理培養物と未処理培養物中にそれぞれ残っていたことを示す。組織培養ウエルに段階的な濃度で固定化された抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８を用いて、外因性ＩＬ−２の非存在下でＶβ１７−細胞を再刺激した。２０，０００個のＶβ１７−細胞を、９６ウエルプレートの各ウエル上の５％ヒト血清を補った合計２００μｌＡＩＭＶ培地に入れた。細胞を９６時間培養し、ＤＮＡ合成は培養の最後の１８時間の３Ｈ−ＴｄＲの取り込みによって評価した。１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ処理培養物から濃縮されたＶβ１７−Ｔ細胞は、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８との再刺激に対して、未処理の細胞に匹敵する量依存性応答を示した。このことは、Ｖβ１７−Ｔ細胞が、１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦの存在下で４日間ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞とともにインキュベートされたものの、それらは増殖能力を保持していたことを示唆する。さらに重要なことに、外因性ＩＬ−２の非存在下での増殖応答を示す能力は、それらがそれらの増殖に必要とされる必要なサイトカインを発現し、分泌する能力に関して機能的に損なわれていないことを示している。以上をまとめてみると、これらの結果は、抗ＣＤ７０  ＡＤＣが、バイスタンダーＴ細胞に対して実質的に二次的な損傷を引き起こすことなくＣＤ７０＋活性化Ｔ細胞を選択的に欠失させることができることを示唆する。この特徴は、それらが、宿主に対する免疫レパートリーに対して最小の影響を有しうる免疫抑制剤として適用できることを示��する。
【０３１６】
（実施例１３：抗ＣＤ７０  ＡＤＣの投与による実験的アレルギー性脳脊髄炎の治療）
細胞仲介自己免疫病、例えば、自己免疫脱髄疾病等におけるＴｈ１仲介免疫応答を増強する際のＣＤ７０／ＣＤ２７仲介Ｔ細胞／Ｔ細胞相互作用の役割を研究で示す。この実施例において、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、脱髄病多発性硬化症（ＭＥ）の動物モデルを、（ａ）ＡＦＰまたはＭＭＡＥとｖａｌ−ｃｉｔ（ｖｃ）リンカーにより複合化させ、（ｂ）ヒトＣＤ７０の１Ｆ６エピトープに対応するマウスＣＤ７０のエピトープを認識する抗体を含むＡＤＣで処置する。
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導と臨床的評価：２００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａと４０μｇのプロテオリピドタンパク質の免疫優先エピトープＰＬＰ１３９−１５１を含む１００μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）エマルジョンによる皮下免疫により、Ｒ−ＥＡＥ（再発性ＥＡＥ）を６〜７週齢のメスＳＪＬマウスに誘導する。ＥＡＥの徴候は下記のように０〜５段階で採点する：（０）正常；（１）弱々しい尾または後ろ脚の虚弱；（２）弱々しい尾または後ろ脚の虚弱（よたよた歩き）；（３）部分的な後ろ脚の麻痺；（４）完全な後ろ脚の麻痺；および（５）死にかけている。再発とは、動物が少なくとも全臨床的スコアで既に改善し、少なくとも２日間安定化した後にみられる、少なくとも一つの全グレードにおける（２日を超える）臨床スコアの維持された増加と定義される。データを、特定の処置群の全動物の平均的な臨床スコアまたは再発率（あるグループの再発の合計数を該グループのマウスの合計数で割ったもの）としてプロットする。
抗ＣＤ７０  ＡＤＣ投与計画：抗ＣＤ７０  ＡＤＣ（０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重）を合計体積１００μｌで腹腔内投与する。マウスを連続する三週間、一週につき３回処置する（合計９回の処置）。処置は病気の発症前（７日目）または急性疾患のピーク時（１４日目）に開始する。対照として、ＥＡＥ誘導マウスの一グループは未処理のままにした。
ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ誘導の阻害：ＥＡＥの脳中のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの誘導の証明は、抗ＣＤ７０  ＡＤＣで処置されたＳＪＬマウスの脳中のこれらサイトカインのＥＡＥ病の進展と阻害を示す免疫病プロセスがＥＡＥの予防または治療に抗ＣＤ７０  ＡＤＣ治療の価値を示すことを明らかにする。前臨床的に処置され（３回の処置後の１３日目および９回の処置後の２６日目）および急性疾患のピーク（３回の処置後の２０日目および９回の処置後の３３日目）の少なくとも３匹の動物から脳を集める。脳を固定し（１０％緩衝化ホルマリン）、組織をパラフィンに包埋し、切片化する。次に、各サイトカインに特異的な一次抗体とのインキュベートと、それに続くＦＩＴＣに複合させた二次抗体とのインキュベートにより、切片をＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γについて独立して染色する。組織切片を次に標本用媒体中で標本とし、免疫蛍光顕微鏡検査により分析する。ＡＤＣ処置マウス対未処置ＥＡＥ誘導マウスにおけるＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γ染色の減少量は、抗ＣＤ７０  ＡＤＣ治療を用いた炎症サイトカイン誘導の阻害を示す。
病気の症状の抑制または再発率：治療集団中のＥＡＥ誘導ＳＪＬマウスを未処置ＥＡＥ誘導マウスと比較して、病気の発症の予防または確立した病気を治療する抗ＣＤ７０  ＡＤＣ治療の有効性を評価する。前臨床的に処置されたマウスに関して、未処置の対照群と比較した場合のＥＡＥ病気の平均スコアの減少は病気を予防する抗ＣＤ７０  ＡＤＣ治療の有効性を示す。急性疾患のピークで処置されたマウスに関して、未処置の対照群と比較した場合の（ａ）再発率の低下または（ｂ）ＥＡＥの処置後の平均スコアの減少は、確立された病気の治療における抗ＣＤ７０  ＡＤＣ治療の有効性を示す。
【０３１７】
本発明はここに記載の具体的な実施態様によってその範囲が限定されるものではない。実際、ここに記載のものに加えて本発明の多様な改良が前記の説明と添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような改良は添付の請求の範囲内にあることが意図される。
【０３１８】
特許出願、特許および科学出版物等の多様な文献がここで挙げられたが、それら各々の内容は文献の援用によりそのすべてがここに編入される。
【図面の簡単な説明】
【０３１９】
【図１】１Ｆ６のＶＬとＶＨ  ｃＤＮＡとアミノ酸配列。１Ｆ６の軽鎖（ＶＬ、上の二つのパネル）と重鎖（ＶＨ、下の二つのパネル）可変領域のコード配列とアミノ酸配列を決定した。ＶＬとＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７に記載の基準に基づいて同定した。ＣＤＲに対応するアミノ酸残基には下線を付す。ＶＬとＶＨのシグナルペプチドはそれぞれアミノ残基−２０〜０と−１９〜０であると同定されている。
【図２】２Ｆ２のＶＬとＶＨ  ｃＤＮＡとアミノ酸配列。２Ｆ２の軽鎖（ＶＬ、上の二つのパネル）と重鎖（ＶＨ、下の二つのパネル）可変領域のコード配列とアミノ酸配列を決定した。ＶＬとＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７に記載の基準に基づいて同定した。ＣＤＲに対応するアミノ酸残基には下線を付す。ＶＬとＶＨのシグナルペプチドはそれぞれアミノ残基−２０〜０と−１９〜０であると同定されている。
【図３】１Ｆ６のＣＤＲと２Ｆ２のＣＤＲとのアミノ酸配列の比較。１Ｆ６のＣＤＲと２Ｆ２のＣＤＲのアミノ酸配列を並べている。下線の残基は保存置換を表わし、括弧内のイタリックの残基は異なる置換を表わす。
【図４】血液細胞系におけるＣＤ７０の発現。異なる組織起源と原料の血液細胞系のパネル表面上のＣＤ７０発現はフローサイトメトリーで測定した。ＣＤ７０発現は抗ＣＤ７０  ｍＡｂと対照ＩｇＧとの結合比として表わした。
【図５】形質転換血液細胞系の増殖に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの効果。図４に示されるＣＤ７０＋細胞系の部分集合およびＣＤ７０−Ｊｕｒｋａｔ細胞系のＩＦ６  ＡＤＣに対する感受性を調べた。段階的な量の１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥ、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰまたは対応する非結合対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）のＡＤＣを培養の開始時に細胞に加えた。細胞を合計９６時間、ＡＤＣに連続的に曝した。増殖はインキュベーションの最後の１６時間、３Ｈ−ＴｄＲによるパルスにより決定した。上のパネルはＷＳＵ−ＮＨＬとＪｕｒｋａｔ系の応答を示す。下のパネルは１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥと１Ｆ６−ｖｃＡＦＰに対する試験細胞系の応答を要約して、ＩＣ５０の形で示す。
【図６】多発性ガンタイプにおけるＣＤ７０メッセージの発現のガンプロファイリングアレイ（ＣＰＡ）分析。ＣＰＡ上において、２４１の腫瘍単離物および対応する隣接正常組織でのＣＤ７０の発現をＣＤ７０  ｃＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションにより決定した。１３の腫瘍タイプが図に示されているようにアレイ上に存在する。各対のドットは腫瘍試料（右側、Ｔ）と対応する正常組織（左側、Ｎ）を表わす。四角内に示す試料セットに例示されるいくつかのｃＤＮＡセットについて、左上スポットのｃＤＮＡ試料は正常組織から得られ、右上は転移性腫瘍から得られ、右下は原発性腫瘍から得られた。アスタリスクはｃＤＮＡ対を示し、ここではＣＤ７０転写物の過剰発現が腫瘍ｃＤＮＡにおいて検出された（腫瘍：正常比：ハイブリダイゼーション強度に基づき＞２倍）。
【図７】定量的ＰＣＲにより検出された腎臓細胞癌腫（ＲＣＣ）におけるＣＤ７０転写物の過剰発現。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列決定システムおよび？Ｃｔ法を用いる定量的ＰＣＲにより、ＲＣＣ  ｃＤＮＡ試料中のＣＤ７０発現を４つの正常腎臓のプールで検出された発現と比較した。数はＲＣＣでのＣＤ７０転写物発現の、正常腎臓での発現に対する倍数を示す。
【図８】図８ＡおよびＢは、ＲＣＣの凍結腫瘍切片におけるＣＤ７０タンパク質の発現。（Ａ）二人のＲＣＣ提供者からの連続的凍結腫瘍切片に対する抗ＣＤ７０  ｍＡｂ  ２Ｆ２（右カラム）と対照ＩｇＧ（左カラム）の結合は免疫組織化学染色により測定した。顕微鏡写真は４０倍の倍率で取った。（Ｂ）同一対の抗体を用いて、（Ａ）で用いた同じＲＣＣ提供者から得られた腫瘍に隣接する連続的な凍結正常組織切片を染色した。
【図９Ａ】図９ＡおよびＢ：腎臓細胞癌腫細胞系（ＲＣＣ）でのＣＤ７０の発現。ＲＣＣのパネル上の表面でのＣＤ７０発現はフローサイトメトリーにより決定した。（Ａ）４種類の代表的なＲＣＣ細胞系の７８６−Ｏ、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２およびＨｓ８３５．Ｔおよび２種類の正常な小管上皮系のＲＰＴＥＣとＨＲＣＥに対する抗ＣＤ７０（白抜きの曲線）と対照ＩｇＧ（黒塗りの曲線）の染色プロフィールを示す。（Ｂ）さらなるＲＣＣ細胞系（ＣＡＬ５４、ＳＫ−ＲＣ−６、ＳＫ−ＲＣ−７、７８６−Ｏ、Ａ−４９８およびＡＣＨＮ）でのＣＤ７０の発現を（Ａ）で示された細胞系と比較する。抗ＣＤ７０染色の平均蛍光強度とバックグラウンド蛍光をプロットする。各バー上の数字は、抗ＣＤ７０結合から得られた平均蛍光強度またはバックグラウンド蛍光のいずれかを示す。
【図９Ｂ】図９ＡおよびＢ：腎臓細胞癌腫細胞系（ＲＣＣ）でのＣＤ７０の発現。ＲＣＣのパネル上の表面でのＣＤ７０発現はフローサイトメトリーにより決定した。（Ａ）４種類の代表的なＲＣＣ細胞系の７８６−Ｏ、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２およびＨｓ８３５．Ｔおよび２種類の正常な小管上皮系のＲＰＴＥＣとＨＲＣＥに対する抗ＣＤ７０（白抜きの曲線）と対照ＩｇＧ（黒塗りの曲線）の染色プロフィールを示す。（Ｂ）さらなるＲＣＣ細胞系（ＣＡＬ５４、ＳＫ−ＲＣ−６、ＳＫ−ＲＣ−７、７８６−Ｏ、Ａ−４９８およびＡＣＨＮ）でのＣＤ７０の発現を（Ａ）で示された細胞系と比較する。抗ＣＤ７０染色の平均蛍光強度とバックグラウンド蛍光をプロットする。各バー上の数字は、抗ＣＤ７０結合から得られた平均蛍光強度またはバックグラウンド蛍光のいずれかを示す。
【図１０】１Ｆ６−ｖｃＡＦＰの成長阻害および細胞毒性活性。７８６−ＯまたはＣａｋｉ−１細胞を、段階的な量の１Ｆ６−ｖｃＡＦＰまたは非結合対照ＩｇＧ−ｖｃＡＦＰとともにインキュベートした。細胞を合計９６時間インキュベートした。３Ｈ−チミジン取り込み（上のパネル）およびａｌａｍａｒＢｌｕｅの還元（下のパネル）を用いて増殖と細胞生存度をそれぞれ決定した。データポイントを未処置の対照のパーセントとして表わす。エラー・バーは４重複ウエルから得られた値の標準偏差を表わす。
【図１１】ＲＣＣ細胞系の増殖に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの効果。１Ｆ６  ＡＤＣの成長阻害または細胞毒性に関する投与量応答曲線を図１０に記載のように決定してＩＣ５０値を得た。ＣＤ７０＋ＲＣＣ系（Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、７８６−Ｏ、７６９−Ｐ、ＳＫ−ＲＣ−６、ＳＫ−ＲＣ−７、ＡＣＨＮ、ＣＡＬ５４およびＡ４９８）、ＣＤ７０−ＲＣＣ系（Ｈｓ８３５．Ｔ）および正常な腎臓小管上皮細胞系（ＲＰＴＥＣおよびＨＲＣＥ）の増殖に対する１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥ、１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦ、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰまたは二つの対照の非結合ＩｇＧ（ＩｇＧ）ＡＤＣのＩＣ５０を要約する。細胞系の部分集団の生存度に対する１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦおよび１Ｆ６−ｖｃＡＦＰの効果も要約する。
【図１２】ＲＣＣモデルにおける１Ｆ６−ｖｃＡＦＰのインビボ有効性。Ｃａｋｉ−１細胞を含有する組織腫瘍ブロック（３０ｍｍ３の大きさ）を移植することによりヌードマウスに腫瘍を引き起こした。処置群内の平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３前後であるときに処置を開始した。上のパネルにおいて、ＩｇＧ群と１Ｆ６群の処置は移植後の１７日目に開始し（黒矢印）、一方、ＩＦ６−ｖｃＡＦＰ群とＩｇＧ−ｖｃＡＦＰ群の処置は移植後の２５日目に開始した（白矢印）。示された投与量の未複合ｍＡｂまたはそれらのＡＤＣのいずれかを一続きの処置に対してｑ４ｄ×４スケジュールで与えた。下のパネルは、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰまたはＩｇＧ−ｖｃＡＦＰの３ｍｇ／ｋｇとｑ４ｄ×４スケジュールによる処置を腫瘍移植後の１４日目（黒矢印）に始めたときの繰返し実験の結果を示す。
【図１３】Ｔ細胞クローン上の活性化誘導ＣＤ７０の発現。フィトヘマグチニンＡ−Ｌ（ＰＨＡ−Ｌ）、照射フィーダー細胞、ＩＬ−２およびＩＬ−４によって、代表的なＴ細胞クローンＣ１Ａを活性化した。０、２、４および８日目のＣＤ２５（左のパネル）およびＣＤ７０（右のパネル）の発現をフローサイトメトリー分析により決定した。
【図１４】活性化Ｔ細胞クローンの増殖に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの効果。休止Ｔ細胞クローンＣ２Ａ、４０Ｄ８および４．０１．１を誘導してＣＤ７０を記載のように発現させた。ＣＤ７０発現（活性化の二日後）のピークで、細胞を集めて、ｒｈＩＬ−２およびｒｈＩＬ−４の存在下に段階的な量の１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥ、１Ｆ６−ｖｃＡＦＰまたは対応する非結合対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）ＡＤＣを図に示されたように処置した。細胞をさらに７２時間連続的にＡＤＣに曝した。インキュベーションの最後の１６時間、３Ｈ−ＴｄＲによるパルスによりＴ細胞増殖を決定した。
【図１５】混合リンパ球反応に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの効果。ＰＢＭＣと照射同種ＣＥＳＳ細胞との間にＭＬＲを設定した。活性化同種反応性Ｔ細胞上でのＣＤ７０の発現を上のパネルに示す。抗ＣＤ７０  ｍＡｂと対照ＩｇＧの結合を、白抜きの曲線と黒塗りの曲線でそれぞれ示す。段階的な量の１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥと１Ｆ６−ｖｃＡＦＰを開始時に培養物に加えた。培養物を合計１２０時間、ＡＤＣに曝した。Ｔ細胞増殖はインキュベーションの最後の１６時間、３Ｈチミジンによるパルスを加えて決定した（下のパネル）。
【図１６】抗原誘導Ｔ細胞増殖に対する抗ＣＤ７０および抗ＣＤ７０  ＡＤＣの影響。破傷風トキソイド反応性のために濃縮したＴ細胞を、段階的な量の１Ｆ６、１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＥまたは１Ｆ６−ｖｃＡＦＰの存在下に同原樹状細胞と破傷風トキソイドによって合計９６時間刺激した。Ｔ細胞増殖はインキュベーションの最後の１６時間、３Ｈチミジンによるパルスを加えて決定した。
【図１７Ａ】図１７ＡおよびＢ：抗原に特異的なＴ細胞拡大中のＣＤ７０誘導。正常ＨＬＡ−Ａ０２０１提供者からのＰＢＭＣを、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質に由来するＭ１ペプチドで刺激した。（Ａ）ＴＣＲ  Ｖβ１７鎖を発現するＭ１ペプチド特異的ＣＤ８＋細胞の拡大後にフローサイトメトリーを行った（上のパネル）。左下のパネルは、ＣＤ７０を発現するＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞のパーセントを示し、右下のパネルは、拡大するＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞上のＣＤ７０発現の強度を示す。
【図１７Ｂ】図１７ＡおよびＢ：抗原に特異的なＴ細胞拡大中のＣＤ７０誘導。正常ＨＬＡ−Ａ０２０１提供者からのＰＢＭＣを、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質に由来するＭ１ペプチドで刺激した。（Ｂ）Ｍ１ペプチドによる５日間の刺激後の拡大ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋上の特異的ＣＤ７０誘導の代表的な例。ＣＤ８＋／Ｖβ１７−またはＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞上の対照ＩｇＧ（白抜きの曲線）および抗ＣＤ７０  ｍＡｂ（黒塗りの曲線）の結合を示す。
【図１８】抗ＣＤ７０  ＡＤＣによる抗原特異的ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋Ｔ細胞の特異的な欠失。正常ＨＬＡ−Ａ０２０１提供者からのＰＢＭＣを、Ｍ１ペプチドにより５日間刺激した。１Ｆ６  ＡＤＣまたは対照の非結合ＩｇＧ（ｃＩｇＧ）ＡＤＣを細胞に１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。すべての生存細胞の計数を、医薬添加の２４、４８および７６時間後に行った。各培養条件におけるＣＤ８＋／Ｖβ１７＋のパーセントを、フローサイトメトリーにより図１７に示すように決定した。各培養条件でのＣＤ８＋／Ｖβ１７＋の合計数を計算する（上のパネル）。１Ｆ６−ＡＤＣ処理培養物中のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋およびＣＤ８＋／Ｖβ１７−細胞の数は、未処置の対照培養物のパーセントとして表わす（下のパネル）。
【図１９】抗原特異的ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞の欠失に対する抗ＣＤ７０  ＡＤＣの投与量−応答比較。正常ＨＬＡ−Ａ０２０１提供者からのＰＢＭＣをＭ１ペプチドで５日間刺激した。１Ｆ６  ＡＤＣまたは対照の非結合ＩｇＧ（ｃＩｇＧ）ＡＤＣを指定された最終濃度で細胞に与えた。ＡＤＣ添加の４日後のＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞のパーセントをフローサイトメトリーにより図１７のように決定した。
【図２０】ＣＤ７０−バイスタンダーＴ細胞の増殖能力に対する１Ｆ６  ＡＤＣの制限された効果。正常ＨＬＡ−Ａ０２０１提供者からのＰＢＭＣをＭ１ペプチドで５日間刺激した。細胞を、さらに４日間、拡大させるか、または１μｇ／ｍｌの１Ｆ６−ｖｃＭＭＡＦにより処理した。ＣＤ８＋／Ｖβ１７＋細胞のパーセントをフローサイトメトリーで決定した（左のカラム）。ＣＤ７０−バイスタンダーの増殖能力を評価するために、抗原非特異的Ｔ細胞、Ｖβ１７＋Ｔ細胞を培養物から免疫低下法により除去した（中央のカラム）。得られたＶβ１７−細胞を次に段階的な量の固定化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂにより合計９６時間刺激し、ＤＮＡ合成を、インキュベーションの最後の１８時間、３Ｈ−ＴｄＲによるパルスによって検出した。