(57)【要約】  本発明は、免疫学および医学の分野に関する。本発明は、より具体的には、癌治療および免疫療法の分野に関する。本発明はさらに、免疫療法において、特に腫瘍を有する対象において使用するための組成物に関する。本発明はさらに、特に免疫療法の前に使用するための免疫抑制医薬組成物の使用に関する。本発明はさらに、免疫療法に使用するための組成物を提供する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体に投与される非自己免疫療法に使用するための免疫エフェクター細胞を含む組成物であって、前記免疫エフェクター細胞が前記個体に関して非ハプロタイプ一致であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記免疫エフェクター細胞が神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）について陽性であり、ＣＤ３およびＣＤ１９について陰性である、請求項１に記載の使用するための組成物。
【請求項３】
前記免疫エフェクター細胞が以下の細胞表面マーカー：ＣＤ１５９ａ、ＣＤ３１４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７の１つまたは複数を発現する、請求項１または２に記載の使用するための組成物。
【請求項４】
前記免疫エフェクター細胞がＣＤ３１４、ＣＤ３３６またはその両方を発現する、請求項３に記載の使用するための組成物。
【請求項５】
複数の細胞を含み、前記複数の細胞の３０〜１００％、好ましくは３０〜９０％、より好ましくは３０〜８０％、より好ましくは３０〜７０％、より好ましくは３０〜６０％、より好ましくは３０〜５０％、最も好ましくは３０〜４０％が請求項２から４のいずれか一項で定義される免疫エフェクター細胞であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項６】
複数の細胞を含み、前記複数の細胞の４０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、より好ましくは６０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％、より好ましくは８０〜１００％、最も好ましくは９０〜１００％が請求項２から４のいずれか一項で定義される免疫エフェクター細胞であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項７】
前記免疫療法が腫瘍を治療するためのものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項８】
前記免疫エフェクター細胞が幹細胞から体外で生成される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項９】
前記免疫エフェクター細胞が前駆細胞から体外で生成される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項１０】
前記幹細胞がＣＤ３４＋幹細胞である、請求項８に記載の使用するための組成物。
【請求項１１】
前記前駆細胞がＣＤ３４＋前駆細胞である、請求項９に記載の使用するための組成物。
【請求項１２】
前記個体がＩＬ−２および／またはＩＬ−１５で処置されていない、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項１３】
前記複数の細胞が単一のドナーから得られた細胞に由来する、請求項５から１２のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項１４】
前記複数の細胞が臍帯血および骨髄の少なくとも１つに由来する、請求項５から１３のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項１５】
以下のステップ：
ａ）ＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を含む試料を得るステップと、
ｂ）ａ）で得られた前記試料からのＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を親和性精製するステップと、
ｃ）ヒト血清と、３つ以上のＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＩＬ−６からなる低用量サイトカインカクテルと、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７およびＴＰＯを含む高用量サイトカインの２つ以上の特異的組み合わせと、低分子量ヘパリンとを補充した基礎増殖培地で、ｂ）で得られた前記精製ＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を増殖させるステップと、
ｄ）ヒト血清と、ＩＬ−１５と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２を含む追加の１つまたは複数のサイトカインとを補充した基礎増殖培地中で、ｃ）で得られた前記増殖ＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を分化させるステップと、
ｅ）ｄ）で生成した前記細胞を採取し、請求項１から１４のいずれか一項で定義される組成物を生成するステップと
を含む方法で、体外で生成される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項１６】
シクロホスファミドが４００〜１００００ｍｇ／ｍ２、好ましくは８００〜８０００、より好ましくは１６００〜６０００、より好ましくは２０００〜４０００、最も好ましくは約３６００ｍｇ／ｍ２の総用量で、１〜１０００、好ましくは１０〜５００、より好ましくは５０〜２５０、最も好ましくは約１２０ｍｇ／ｍ２の総用量の、好ましくは静脈内的に、フルダラビンと併用して、その後２、３、４または５日間、好ましくは静脈内的に投与されることを特徴とする、免疫抑制療法に使用するためのシクロホスファミド。
【請求項１７】
フルダラビンが１〜１０００、好ましくは１０〜５００、より好ましくは５０〜２５０、最も好ましくは約１２０ｍｇ／ｍ２の総用量で、４００〜１００００ｍｇ／ｍ２、好ましくは８００〜８０００、より好ましくは１６００〜６０００、より好ましくは２０００〜４０００、最も好ましくは約３６００ｍｇ／ｍ２の総用量の、好ましくは静脈内的に、シクロホスファミドと併用して、その後２、３、４または５日間、好ましくは静脈内的に投与されることを特徴とする、免疫抑制療法に使用するためのフルダラビン。
【請求項１８】
フルダラビンおよびシクロホスファミドが、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物の投与前に与えられる、請求項１６に記載の使用するためのシクロホスファミドまたは請求項１７に記載の使用するためのフルダラビン。
【請求項１９】
１回の治療で投与される組成物が少なくとも５×１０８個の細胞を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項２０】
１回の治療で投与される組成物が１×１０１０個以下の細胞を含む、請求項１から１５または１９のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項２１】
１回の治療で投与される組成物が２×１０８個未満のＣＤ３陽性細胞を含む、請求項１から１５または１９から２０のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項２２】
１回の治療で投与される組成物が１×１０９個未満のＣＤ１９陽性細胞を含む、請求項１から１５または１９から２１のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項２３】
静脈内経路によって投与される、請求項１から１５または１９から２２のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項２４】
局所経路によって投与される、請求項１から１５または１９から２３のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項２５】
前記腫瘍が造血もしくはリンパ腫瘍である、または腫瘍が固形腫瘍である、請求項７から１５または１９から２４のいずれか一項に記載の使用するための組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍が白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群または骨髄腫、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性Ｔ細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、組織球性リンパ腫または多発性骨髄腫から選択される白血病、リンパ腫または骨髄腫から選択される造血またはリンパ腫瘍である、請求項２５に記載の使用するための組成物。
【請求項２７】
前記白血病がＡＭＬである、請求項２６に記載の使用するための組成物。
【請求項２８】
前記腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌または小細胞癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍、肝細胞癌、肝芽腫、結腸腺癌、腎細胞癌、腎細胞腺癌、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頸部癌、肺癌、乳癌、メルケル細胞癌、横紋筋肉腫、悪性黒色腫、類表皮癌、肺癌、腎癌、腎臓腺癌、乳癌、乳腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、口腔癌、肛門癌、皮膚癌、ユーイング肉腫、胃癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、膵臓癌、膵臓腺癌、子宮頸癌、扁平上皮癌、髄芽腫、前立腺癌、結腸癌、結腸腺癌、転移性細胞癌、骨肉腫、腺管癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣腺癌、卵巣奇形癌、膀胱乳頭腫、神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠芽腫星状細胞腫、類上皮癌、黒色腫または網膜芽細胞腫から選択される固形腫瘍である、請求項２５に記載の使用するための組成物。
【請求項２９】
前記固形腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、子宮頸癌、小細胞癌および黒色腫から選択される子宮頸癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍から選択される、請求項２８に記載の使用するための組成物。
【請求項３０】
前記固形腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、結腸腺癌、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、結腸癌および黒色腫から選択される結腸直腸癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍から選択される、請求項２８に記載の使用するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および医学の分野に関する。本発明は、より具体的には、癌治療および免疫療法の分野に関する。本発明はさらに、免疫療法において、特に腫瘍を有する対象において使用するための組成物に関する。本発明はさらに、特に免疫療法の前に使用するための免疫抑制医薬組成物の使用に関する。本発明はさらに、免疫療法に使用するための組成物を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全てのタイプの細胞の形成は、ヒトに種々の重要な機能および組織再生を与えるのに極めて重要である。多細胞生物の発生は、主に体性幹細胞の機能に依存する。これらの細胞は、未分化細胞として定義され、長期間にわたって自己複製し、発生中により特異的な系統に確約された前駆細胞を生じる。幹細胞の制御された発生および分化は、非常に複雑な機能的器官または臓器系をもたらす。しかしながら、幹細胞における制御不能な分化または遺伝子異常は、死または癌、免疫不全、自己免疫もしくは骨髄不全の発症を招く可能性がある。
【０００３】
これらの固形腫瘍または血液腫瘍の悪性腫瘍は、一般的に、化学療法および放射線療法で治療される。しかしながら、薬物耐性および再発が依然として重大な問題であり、多くの場合、同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）がこれらの疾患の多くのための最終的な治療様式である。ＨＳＣの移植は、白血病および他のタイプの癌を治療するために広範に使用されている１、２。成人ＨＳＣおよび新生児ＨＳＣが、骨髄破壊治療後の患者の造血系を再構成する能力を保持していることが明確に実証されている３。そのため、ＨＳＣの重要な特徴は、成熟血液細胞の全ての系統を補充する能力である。
【０００４】
しかしながら、ＨＳＣＴは、依然として移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片の不全または感染症による治療関連死亡率などの種々の合併症の可能性を暗示する危険な処置である。ＨＳＣＴのリスクを低減し、患者の生活の質を改善するために、特定の薬物、抗体または種々の形態の養子免疫療法などの新しい薬物療法が現在開発中である。
【０００５】
腫瘍負荷を軽減し、長期の寛解を達成するために、５０年以上、化学療法および放射線療法による第一選択治療後に、ＨＳＣが血液学的癌およびいくらかの固形腫瘍を治療するための移植に使用されている４。薬剤耐性および再発が重大な課題のままであるので、自己およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致同種異系ＨＳＣＴが、悪性および非悪性の血液学的疾患の潜在的治療的細胞療法処置として使用されている。同種異系ＨＳＣＴでは、ドナーＴ細胞が強力な移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を媒介する５。しかしながら、Ｔ細胞はまたＧＶＨＤを引き起こすことがあるので、同種異系ＨＳＣＴの全体的な有効性を制限する。Ｔ細胞枯渇の種々の方法は、ＧＶＨＤのリスクを低下させ、さらに組織適合性障壁を越えた移植を可能にするが、移植片拒絶または再発のリスクを増加させる可能性がある。ハプロタイプ一致ＨＳＣＴ設定において、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が白血病再発および移植片拒絶を排除し、ＧＶＨＤから患者を保護することが記載されている６。幹細胞移植設定におけるハプロタイプ一致ＮＫ細胞は、自身でＧＶＨＤを引き起こすことなくＧＶＨＤを減少させることが示されている７。これは、主に、ＧＶＨＤ誘発におけるドナーＴ細胞の活性化に重要であるＧＶＨＤ誘発Ｔ細胞および宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ）を阻害および溶解する能力による。さらに、ハプロタイプ一致に無関係なＨＳＣＴにおける高ＮＫ細胞用量は、ＧｖＴ効果を維持しながら、重度のＧＶＨＤを予防するという臨床的証拠が存在する８。
【０００６】
ＮＫ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞に加えて、リンパ球の第３の主要な亜集団である。ＮＫ細胞は、事前感作なしに迅速なエフェクター機能を発揮することができる、すなわち「自然」殺傷するので、自然免疫系の重要なエフェクター細胞である。そのため、ＮＫ細胞は、ウイルスおよび細菌感染症に対する早期防御ならびに腫瘍免疫監視において重要な役割を果たす。ＮＫ細胞は、リンパ器官および種々の非リンパ組織に存在する。その細胞溶解活性の他に、ＮＫ細胞は、多種多様なサイトカインおよびケモカインを産生して免疫系の他の細胞コンパートメントに影響を及ぼすことができる。ＮＫ細胞は、循環リンパ球集団の５〜１５％を構成するＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性リンパ球として定義することができる。これらは、ＣＤ５６発現レベルに基づいて２つの主要なサブセットに細分される。末梢血ＮＫ細胞の約９０％を占めるＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞は、グランザイムおよびパーフォリン媒介殺傷を用いて著しい直接的細胞溶解性を有し、高レベルの低親和性Ｆｃ受容体ＩＩＩ（ＦｃＲγＩＩＩ；ＣＤ１６によって認識される）を発現して自身が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することを可能にする。対照的に、全ＮＫ細胞の約１０％を占めるＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞は、直接的な細胞傷害機能を発揮することなく、サイトカインの強力な産生によって媒介される免疫調節機能を主に有する。
【０００７】
ＮＫ細胞は、生殖系列コード化抑制性受容体（ＩＲ）または活性化受容体（ＡＲ）からのシグナルを通して、感染細胞または悪性形質転換細胞を認識し、死滅させる。これらのシグナルの組み合わせは、ＮＫ細胞エフェクター機能を釣り合わせ、調節する。
【０００８】
活性化シグナルはＡＲによって媒介され、そのＡＲの中で最も重要な受容体は、上記のＣＤ１６に加えて、ＣＤ３１４、ＣＤ２２６ならびに天然細胞傷害性受容体ＣＤ３３４、ＣＤ３３５およびＣＤ３３６である。細胞溶解性ＮＫ細胞は、事前免疫化なしで腫瘍細胞死を誘発することができ、リンパ節の樹状細胞を活性化することにおける重要なメディエーターであるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインを産生し、それによって自然ＮＫ細胞系免疫と適応Ｔ細胞媒介免疫を関連づけることができる。
【０００９】
自己Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの患者自身の免疫エフェクター細胞を増強するために、癌患者における自己ＮＫ細胞の活性化および増殖に対するＩＬ−２投与の効果を評価する試験が実施されている９、１０。しかしながら、結果は様々であり、その成績は、腫瘍のタイプおよびＩＬ−２治療薬の用量に大きく依存する。さらに、高用量のＩＬ−２治療薬は、毛細管漏出症候群および肺水腫に代表される生命を脅かす毒性と関連している１１、１２。ＩＬ−１５は、生存を促進するので、自己またはハプロタイプ一致ＮＫ細胞を増殖するのにＩＬ−２よりも効率的であり得、ＩＬ−１５は直ちに臨床第Ｉ／ＩＩ相試験（ＮＣＴ０１０２１０５９、ＮＣＴ０１３６９８８８、ＮＣＴ０１３８５４２３、ＮＣＴ０１５７２４９３）に入ったが、投与量および自己もしくはハプロタイプ一致ＮＫ細胞または他の免疫細胞に対する効果は今日までヒトで記載されていない１３、１４。サイトカインを用いた自己またはハプロタイプ一致ＮＫ細胞の細胞傷害性の活性化に加えて、自己ＮＫ細胞媒介腫瘍死滅を増強するためのいくつかの他の戦略が、小分子または抗体の使用などの組み合わせ療法として仮定されている。リツキシマブ（抗ＣＤ２０）などのモノクローナル抗体は、ＮＫ細胞のＡＤＣＣエフェクター機能を活性化するために非ホジキンリンパ腫患者に使用されている１５、１６。現在、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブおよびイマチニブなどのいくつかの薬物も、インビボで自己またはハプロタイプ一致ＮＫ細胞の生存、増殖および活性化を増強することによって免疫応答を増強するために使用されている１７〜１９。樹状細胞に直接的または間接的に影響を及ぼすことによって自己またはハプロタイプ一致ＮＫ細胞を活性化する、トール様受容体に作用する特異的ワクチンを使用することによって、自己またはハプロタイプ一致ＮＫ細胞活性化のためのいくつかのより複雑な機構が出現した（２０に概説）。
【００１０】
これまでのところ、自己ＮＫ細胞注入を用いた初期の研究では、有意な臨床的利益を示すことができなかった。しかし、移植設定と非移植設定の両方の最近の臨床試験で、同種異系ハプロタイプ一致ＮＫ細胞反応性がＡＭＬ患者で臨床的寛解を誘導することができることが明確に実証されている。ＨＬＡ不一致ハプロタイプ一致同種ＳＣＴの設定において、ＮＫ細胞のアロ反応性が、重度のＧＶＨＤを引き起こすことなくＡＭＬの再発を制御できることが実証されている。同種異系ハプロタイプ一致ＳＣＴの奨励臨床結果に基づいて、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞の養子移植が、ＡＭＬおよび他の悪性腫瘍における抗がん免疫を誘導するために使用されている。潜在的根治的治療としてのハプロタイプ一致ＮＫ細胞の役割を研究するために、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞の直接注入は、癌患者における抗腫瘍免疫を増強するための可能なアプローチとなる。しかし、非移植設定においても、同種異系ハプロタイプ一致ＮＫ細胞注入が予後不良の高齢ＡＭＬ患者において血液学的ＣＲを誘導することができることが実証されている。長期寛解を誘導するため小児ＡＭＬにおいても同様の治療選択肢が探索されている。化学療法とハプロタイプ一致ＮＫ細胞注入の組み合わせは、限られた非血液学的毒性およびＧＶＨＤの非誘発と関連していた。しかしながら、近年、免疫療法のためにハプロタイプ一致ＮＫ細胞を受けた患者が重度のＧＶＨＤを発症したことが報告されている２１。
【００１１】
Ｍｉｌｌｅｒおよび同僚らの研究によって、非移植設定におけるハプロタイプ一致ＮＫ細胞の最初の成功した移植が実証された２２。彼らは、最大２×１０７個細胞／ｋｇ体重の同種異系ハプロタイプ一致ＮＫ細胞注入が、ＧＶＨＤ誘発の証拠がなく、十分許容されることを実証した。この研究では、進行性癌（黒色腫、腎細胞癌およびＡＭＬ）を有する４３人の患者の異種グループが、非移植設定においてＩＬ−２と共に健康なドナーの除去療法産物から濃縮されたハプロタイプ一致ＮＫ細胞注入を受けた。ＡＭＬ患者は、注入ドナー細胞の免疫学的拒絶を防止し、生存因子（例えば、ＩＬ−１５）を誘導する、または細胞および可溶性阻害因子を枯渇させるために、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞注入の前に強力な免疫抑制コンディショニング化学療法を受けた。高用量のシクロホスファミドおよびフルダラビン（Ｈｉ−Ｃｙ／Ｆｌｕ）レジメンは、インビボでの持続性延長および注入されたハプロタイプ一致ＮＫ細胞の増殖を媒介した。興味深いことに、１９人のＡＭＬ患者のうち５人は、濃縮ＮＫ細胞産物の養子移植後にＣＲを得たが、注入産物が平均４０％±２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ハプロタイプ一致ＮＫ細胞（範囲１８％〜６８％）、１９±２％のＢ細胞、２５±１．６％の単球および約１％のＣＤ３＋Ｔ細胞を含んでいたので、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞のみが臨床効果を担っていたかどうか証明されないままである。Ｔ細胞投与は２．１±０．３（範囲０．５〜６．５）×１０５個Ｔ細胞／ｋｇに限定されたが、アロ反応性Ｔ細胞応答が、観察された移植片対白血病（ＧＶＬ）効果において何らかの役割を果たしていた可能性がある。毒性は、主にハプロタイプ一致ＮＫ細胞注入後の低用量ＩＬ−２注射による発熱、悪寒および筋肉痛を含む体質的症状に限定された。これらの知見は、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞が、インビボで持続および増殖し（７日目以降の生着率が１％超）、潜在的にＡＭＬの再発を減少させることができることを示唆している。
【００１２】
Ｒｕｂｎｉｔｚと共同研究者による最近の研究（「ＮＫＡＭＬ」研究）は、０．７〜２１歳の小児科ＡＭＬ患者のハプロタイプ一致ＮＫ細胞注入による初回完全寛解（ＣＲ）での治療を報告した。この「ＮＫＡＭＬ」研究では、２．９×１０７個のハプロタイプ一致ＮＫ細胞／ｋｇ体重の中央値が注入され、さらに１ｘ１０ＩＵ／ｍ２  ＩＬ−２の６回のその後の投与が与えられた。ハプロタイプ一致ＮＫ細胞生着は、１０日の中央値で検出され、ＫＩＲ−ＨＬＡ不一致ハプロタイプ一致ＮＫ細胞の有意な増殖を伴う。
【００１３】
最後に、Ｃｕｒｔｉらは、５人が活動性疾患であり、２人が分子再発であり、６人が形態学的ＣＲである１３人の高齢ＡＭＬ患者におけるハプロタイプ一致ＮＫ細胞の移植成功を報告した。Ｃｕｒｔｉらは、１０５／ｋｇ未満のＴ細胞含量を有する２．７４×１０６個ハプロタイプ一致ＮＫ細胞／ｋｇの中央値を注入した。最も興味深いことに、活動性疾患の５人の患者のうち１人が一過的ＣＲに達し、分子再発の２人の患者が４〜９ヶ月間持続するＣＲを達成した。さらに、ＣＲの６人の患者のうち３人は、１８〜３４ヶ月後も無病のままであった。注入されたハプロタイプ一致ＮＫ細胞は、末梢血および骨髄で見出され、インビトロ試験においてレシピエントの白血病標的細胞に対してアロ反応性を示した。
【００１４】
まとめると、これら３つの研究は、限定されたＧＶＨＤで非移植設定においてハプロタイプ一致ＮＫ細胞注入を使用する実行可能性を強調する。しかしながら、成人患者においては単回注入として一般に１×１０７個以下のハプロタイプ一致ＮＫ細胞／ｋｇ体重が投与されるので、これらの研究で使用されたハプロタイプ一致ＮＫ細胞産物は、細胞数が限られていた。さらに、産物には依然として、ＧＶＨＤを発症する一定のリスクを示す同種異系Ｔ細胞が含まれている。そのため、細胞養子免疫療法の臨床応用を増加させるためには、より高い細胞数、純度および機能活性を有する最適な細胞産物を提供するために、ＧＭＰに準拠した単離、活性化および体外増殖手順が必要である。
【００１５】
今日、細胞療法における革新的なアプローチは、ハプロタイプ一致の一致原理から離れ、遺伝子組換え（キメラ抗原受容体Ｔ細胞；ＣＡＲ−Ｔ）によるＴ細胞などの自己細胞を使用する２３〜２８。しかしながら、このようなアプローチは、困難なロジスティクスを必要とし、患者に個々の治療を適用するため高コストに終わる。
【００１６】
上記のように、自己またはハプロタイプ一致養子細胞移植は、養子移植の自己またはハプロタイプ一致の性質のために、細胞数が低いことおよび／または所望の細胞の活性が低いこと、移植日の注入産物の利用能が不確実であること、注入産物中に混入する望ましくない細胞が存在すること、注入前の高用量免疫抑制コンディショニング、および個人ベースでの養子移植のために細胞を生成する必要性などの欠点を明らかに有する。本発明は、ハプロタイプ一致の一致基準を必要とせず、養子細胞免疫療法のために既製のものとして使用することができる大量の免疫エフェクター細胞の生成および貯蔵を可能にする新規な免疫療法アプローチを用いることによって、これらの欠点の少なくとも１つを解決する。
【００１７】
診断時に乳房、結腸、直腸、肺、前立腺、子宮頸部および卵巣の固形腫瘍は、腫瘍負荷を軽減するために従来の方法（手術手術、化学療法および放射線療法）によって治療される。しかしながら、これらの腫瘍は化学療法に対する耐性を発達し、しばしば転移し、リンパ節および隣接器官に広がり、末梢血中の循環腫瘍細胞の数が増加する２９。
【００１８】
子宮頸癌は、進行した状態で治療するのが困難な疾患の１つである。高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による子宮頸部上皮の持続感染が、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌または腺癌などの浸潤性子宮頸癌に進行し得る子宮頸部上皮内腫瘍をもたらし得る３０、３１。子宮頸癌の治療には、従来の手術、化学療法および／または放射線が含まれる。さらに、進行性（転移性）疾患では、標的療法が広く検討されている。残念なことに、小分子、血管新生阻害剤、ならびに特定の腫瘍抗原および増殖経路に対するモノクローナル抗体を用いた標的介入戦略は、これまでのところ子宮頸腫瘍増殖を制限する効果が限定されている３２、３３。
【００１９】
子宮頸癌では、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）が腫瘍組織の８０％で不定に発現している３４。ＥＧＦＲの過剰発現は、子宮頸癌の不良予後と関連しており、ＥＧＦＲを治療標的化の明らかな候補にしている３５、３６。ＥＧＦＲ経路におけるＫＲＡＳ（Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子）の活性化突然変異が明らかに欠如しているにもかかわらず、単独療法としてのセツキシマブ（キメラＩｇＧ１、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ）または化学療法と組み合わせたセツキシマブによる治療は、子宮頸癌患者におい無効であった３７。しかしながら、以前公開されたように、ＮＫ細胞とセツキシマブとの組み合わせは、ＥＧＦＲを発現する結腸癌における改善された死滅をもたらし得るので、子宮頸癌においても研究され得、ＮＫ細胞による子宮頸部腫瘍の死滅増加に加えて、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ療法の改善を可能にする３８。さらに、腫瘍細胞上のインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の過剰発現が、免疫細胞が腫瘍細胞を認識するのを妨げることが報告されている３９。
【００２０】
浸潤性ＮＫ細胞は、低悪性度および高悪性度の子宮頸部上皮内腫瘍病変で認められ、子宮頸癌ではより少ない程度で認められる４０、４１。インビトロ試験は、末梢血ＮＫ細胞（ＰＢＮＫ）がＨＰＶ感染細胞株を死滅させることができることを示している４２。しかしながら、ＮＫ細胞は子宮頸癌患者では通常機能不全で数が少なく、そのため腫瘍に対して効率的な細胞傷害性を開始することができない４３、４４。ＮＫ細胞傷害性機能はまた、腫瘍細胞による活性化ＮＫ細胞受容体リガンド（例えば、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ、Ｎｅｃｔｉｎ、ＰＶＲ）の低い発現および抑制性非古典的ＨＬＡ分子（例えば、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇ）の異常発現を含むいくつかの子宮頸部腫瘍エスケープ機構によって打ち消される４２、４５、４６。ほとんどの研究において、固形腫瘍を治療するために養子移植された体外で増殖された自己ＮＫ細胞は、不本意な結果をもたらし、腫瘍関連ＮＫ細胞機能不全および癌細胞による細胞溶解に対する固有の耐性を克服するためのより強力な治療的アプローチの開発に対する緊急の必要性を強調している。子宮頸癌の免疫療法は臨床的に探索されており、限られた成功を収めている。これまでの努力は、効果的な抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘因するためのＨＰＶ由来癌遺伝子（Ｅ６およびＥ７）に対するワクチン接種アプローチにほとんど集中していた４７。臨床成績の改善の失敗は、少なくとも部分的には、子宮頸癌において一般的に観察される広範なＨＬＡ下方制御によるものであり得る。子宮頸部腫瘍が通常、ＭＨＣクラスＩ発現の下方制御を示すという事実は、通常はＴ細胞に対して無応答であるが、ＮＫ細胞による溶解を非常に好む。
【００２１】
結腸直腸癌は、進行した状態で治療するのが困難な別の疾患である。結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、世界の癌関連死の第４の主因である。遠隔転移は、主に肝臓、続いて肺でＣＲＣ患者の半数以上において起こる共通の脅威である４８〜５０。進行性および転移性の状態では、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）標的療法が、化学療法と組み合わせて、またはＥＧＦＲ＋ＲＡＳｗｔＣＲＣ患者のために化学療法に不応な状態に使用するために承認されている。抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）セツキシマブ、ＩｇＧ１（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））およびパニツムマブ、ＩｇＧ２（Ｖｅｃｔｉｂｕｘ（登録商標））が現在使用されている５１。しかしながら、これらの薬物は、ＲＡＳ遺伝子の変異を有するＣＲＣ患者においては無効であるので、転移性ＣＲＣ（ｍＣＲＣ）集団の４２％には標準治療選択肢が残っていない５２。よって、難治性癌に対する臨床的ニーズは満たされておらず、そのため、ＲＡＳ−ＭＡＰキナーゼ経路阻害剤およびキメラモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の組み合わせなどの能動的治療アプローチを開発して、治療薬に対する腫瘍細胞耐性を克服することにより大きな重点が置かれている５３〜５５。
【００２２】
いくつかの因子がＣＲＣの予後の成績に影響し、腫瘍の制御における免疫細胞の役割は無視できない５６。免疫応答を惹起することによって、または免疫細胞を腫瘍部位に動員することによって、免疫系機能を回復させることを目的とした概説される臨床研究は、調査中である５７。細胞療法の中でも、体外で増殖させたＴ細胞の養子移植、チェックポイント阻害剤およびキメラ抗原受容体特異的Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）の使用を含むＴ細胞に基づく療法が、現在診療所でより一般的に使用されている５８。しかしながら、治療されたｍＣＲＣ患者が重度の副作用を発症し、ＣＲＣにおける遺伝子組換えＴ細胞の安全性に疑問を呈した５９、６０。
【００２３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＣＲＣ腫瘍を標的とする、これらの状況下で実行可能な選択肢となり得る。ＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩを発現している状態で、事前感作なしで作用し、腫瘍または感染細胞を自発的に同定および排除することができる６１。ＭＨＣクラスＩのひどく減少した、または異常な発現が、しばしば細胞傷害性Ｔ細胞に反応しない結腸直腸癌の大部分で報告されており６２、これらをＮＫ媒介性溶解の理想的な標的にしている。自然免疫系の一部であるＮＫ細胞は、ＣＤ５６の発現によって同定され、低親和性ＦｃγＲＩＩＩａ受容体であるＣＤ１６に基づく２つのサブセットを特徴とする。ＮＫ細胞の大部分はＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋であり、ＮＫ細胞の細胞傷害性において積極的な役割を果たし、ＣＤ１６を介してセツキシマブなどのＩｇＧ１治療モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と連動して抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を行うが、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６  ＮＫ細胞は主にサイトカインを分泌する機能において免疫調節性であり、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞よりも細胞傷害性が低い６３。
【００２４】
ＣＲＣ患者においてほとんどの場合、ＮＫ細胞の低頻度および機能不全の性質は、免疫抑制性腫瘍微小環境と共に、その機能性および腫瘍部位への能動的移動に多大な影響を与えた６４。よって、サイトカインまたは治療用ＡＤＣＣ増強ｍＡｂを用いてＮＫ細胞機能を増強する様々な方法が、末梢血中のＮＫ細胞数および腫瘍に供給される血管中のその増殖を増加させるために推定されている２０。別の代替法は、体外で操作され、増殖された自己または同種異系ＮＫ細胞を養子的に導入することである。これまでのところ、自己ＮＫ細胞は、固形腫瘍において有意な治療上の利益を実証することができていない６５〜６７。自己ＮＫ細胞からの抗腫瘍効果の欠如は、固形腫瘍を治療するための潜在的な養子細胞療法として同種異系ＮＫ細胞を開発することに焦点を移した。本発明者らは、以前の研究から、セツキシマブと組み合わせた同種異系ＰＢＮＫ細胞がＲＡＳ変異ＣＲＣ腫瘍を有効に標的化することができることを実証した６８。さらに、同種異系ＮＫ細胞は、Ｔ細胞とは異なり、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘発せず、それによって治療関連毒性を大幅に低減する２２。
【００２５】
これらの場合、ＮＫ細胞に基づく療法は、Ｔ細胞に基づくアプローチよりも有効であることが判明する場合がある。実際、（初期）感染の間の宿主防御およびウイルスクリアランスにおける自然免疫応答の役割は、十分に認識されている６９。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞標的を溶解するために、細胞傷害性グランザイムＢおよびパーフォリンを放出することによって、迅速な細胞傷害性を発揮するのに強力である。腫瘍細胞のＮＫ細胞媒介細胞溶解は、腫瘍標的化ＩｇＧ１モノクローナル抗体に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をもたらすことによって増強され得る。あるいは、健康なドナーからのサイトカイン活性化同種異系ＮＫ細胞を養子細胞移植に使用することができる７０。
【００２６】
同種異系関連またはハプロタイプ一致ＰＢＮＫ細胞の適用を使用して腎細胞癌、転移性黒色腫、乳癌および卵巣癌を治療した臨床研究では、多くの場合、有意な治療上の利益を実証することができなかった２２、７１。末梢血単核細胞に由来するＮＫ細胞産物の大部分はフィーダー細胞に基づく培養物であり、これらは複数回投与のＮＫ細胞注入にとって十分な数を有さない上に、その純度、インビボでの増殖能によって厳しく制限され、しばしば腫瘍に対して十分な細胞傷害性を発揮できなかった７０。しかしながら、代替法は、フィーダー細胞を含まない培養物であり、高純度（９２％±２％；ｎ＝４）を維持しながら、最大１００００倍まで効率的に増殖することができ、ＣＤ３＋細胞もＣＤ１９＋細胞も検出不能で、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を示す臍帯血ＣＤ３４＋由来ＮＫ細胞を使用することであるだろう７２、７３。
【００２７】
別の代替法は、体外で操作され、増殖された自己または同種異系ＮＫ細胞を養子的に導入することである。これまでのところ、自己ＮＫ細胞は固形腫瘍において有意な治療上の利益を実証することができていない６５〜６７。自己ＮＫ細胞からの抗腫瘍効果の欠如は、固形腫瘍を治療するための潜在的な養子細胞療法として同種異系ＮＫ細胞を開発することに焦点を移した。しかしながら、固形腫瘍を根絶することにおけるＮＫ細胞の臨床的有効性に関するデータはほとんどない。
【発明の概要】
【００２８】
第１の実施形態では、本発明は、個体に投与される非自己免疫療法に使用するための免疫エフェクター細胞を含む組成物であって、免疫エフェクター細胞が個体に関して非ハプロタイプ一致であることを特徴とする組成物を提供する。
【００２９】
導入部分で述べたように、本発明までは、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植においてまたはいくぶん精製された免疫細胞サブセットを用いて、自己または同種異系、ハプロタイプ一致養子細胞移植を用いて免疫療法が行われてきた。本発明までは、養子免疫エフェクター細胞移植のために、部分的不一致のみ（すなわち、ドナーとレシピエントが少なくともハプロタイプ一致でなければならない）が安全上の理由から許容されると考えられていた。そのため、ドナーは家族の血統（子供−親、兄弟、叔母／叔父−姪／甥等）内で求められる。しかしながら、本発明者らは、免疫療法に使用するために本発明によって定義される組成物を使用することにより、古典的ハプロタイプ一致の不一致を超えた免疫エフェクター細胞の養子移植が安全かつ有効であることを示した。
【００３０】
本明細書で使用される「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫学的に関連する標的に対して直接的もしくは間接的な効果を有し得る免疫学的活性物質の放出によって免疫機能を発揮する、または免疫学的に関連する標的による刺激に基づいて直接的細胞傷害性効果を及ぼす、骨髄またはリンパ系統の細胞を意味する。好ましくは、免疫エフェクター細胞という用語は、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞と同様に、標的細胞、好ましくは腫瘍細胞から少なくとも１つの活性化シグナルを受け取ることによって活性化され、活性化すると、この標的細胞に対して直接的細胞傷害性効果を及ぼす細胞のために確保される。
【００３１】
「非自己」という用語は、輸血または移植の設定において、ドナーとレシピエントが同一の個体ではない、すなわち自己ではないことを意味する。自己という言葉は、ギリシャ語起源である。定義は正確で、「ａｕｔｏｓ」は自身を意味し、「ｌｏｇｕｓ」は関連を意味する。したがって、意味は「自身に関する」である。例えば、自己輸血は、それらが採取されたのと同じ個体への血液または血液成分の再注入を示す。したがって、本明細書で使用される非自己とは、ある個体に由来する細胞の別の個体への注入を意味する。好ましくは、ドナー個体とレシピエント個体が血を分けていない、すなわち、兄弟、親および子、叔父または叔母、および姪または甥、いとこ等ではない。
【００３２】
「免疫療法」という用語は、癌などの疾患と戦うために人の免疫系の一定の部分を使用する治療を意味する。免疫系の部分は、疾患を有する人からでも、本発明の場合のように、「ドナー」と呼ばれる別の人からでもよい。本発明により使用するための組成物は、好ましくは、自己の非ハプロタイプ一致ドナー由来の免疫エフェクター細胞を、それを必要とするレシピエントに投与する細胞性免疫療法において使用される。
【００３３】
「ハプロタイプ一致」の一般的な定義は、「ハプロタイプを共有すること；１本の染色体上に密接に関連した遺伝子のセットで同じ対立遺伝子を有する」ことである。ＨＬＡに関連するハプロタイプ一致に関して、これは、ドナーとレシピエントが、両親から継承した２本の第６番染色体の１つに、密接に関連したＨＬＡ遺伝子の同じセットを有することを意味する。互いに完全に一致するのではなく、ハプロタイプ一致のドナーとレシピエントが半一致（ｈａｌｆ−ｍａｔｃｈ）である。
【００３４】
両親は常に子供の半一致であり、逆もまた同様である。兄弟は互いに半一致である確率が５０％である。（彼らが完全一致である確率は２５％、全く一致しない確率は２５％である）。
【００３５】
主要なＨＬＡ分子の遺伝子座は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子については８５００個超の異なる対立遺伝子およびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子については２５００個超の対立遺伝子における遺伝的変異を示す。
【００３６】
そのため、ハプロタイプは、全てのＨＬＡ遺伝子座およびその対立遺伝子についての完全なＨＬＡ遺伝子表現型からなる。それらの対立遺伝子の組み合わせは、既に２１００万を超えるだろう。そのため、ハプロタイプ一致（またはよりよい）無関係の一致を見つける可能性はごく極めて低い。
【００３７】
したがって、本明細書で使用される「非ハプロタイプ一致」という用語は、古典的なハプロタイプ一致の不一致を超えたＨＬＡ不一致を意味する。好ましくは、「非ハプロタイプ一致」という用語は、本明細書において、免疫エフェクター細胞のドナーと免疫エフェクター細胞のレシピエントが、２本の第６番染色体の１本上に少なくとも１組の密接に関連したＨＬＡ遺伝子を共有しない状況に関して使用される。換言すれば、これは、ＨＬＡ分子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱの少なくとも１つが、本発明の免疫エフェクター細胞と免疫エフェクター細胞のレシピエント、すなわち免疫療法を受けている個体との間に共通の少なくとも１つの対立遺伝子を有さないことを意味する。好ましくは、本発明の免疫エフェクター細胞とレシピエントとの間に共通の少なくとも１つの対立遺伝子を有さないＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃのうちの１つである。より好ましくは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃの少なくとも２つ、最も好ましくは３つ全てが、本発明の免疫エフェクター細胞とレシピエントとの間に共通の少なくとも１つの対立遺伝子を有さない。上記のように、典型的かつ大多数の場合、ＨＬＡは、ドナーとレシピエントが血を分けていない場合は、ハプロタイプ一致を超えて不一致である。したがって、「ハプロタイプ一致を超えて不一致」または「非ハプロタイプ一致」という用語は、２人がハプロタイプ一致である場合に存在するよりもドナーとレシピエントとの間の一致が少ないことを意味する。
【００３８】
本発明は、例えば、好ましくはＴ細胞汚染のない臍帯血（ＵＣＢ）由来ＣＤ３４＋前駆細胞から、免疫エフェクター細胞の大きなバッチを生成するためのＧＭＰに準拠した培養系で生成された細胞を好ましくは使用する。このような細胞を使用することは、一致が高く、例えば調節工程をはるかに容易にするので、好都合である。同時に、以前は安全上の懸念から、想定されたレシピエントとの少なくとも部分的な一致に基づいて個々のバッチを生成しなければならなかったので、本発明は免疫エフェクター細胞のこのような大きなバッチの使用を可能にする。しかしながら、本発明は、ハプロタイプ一致を超えて不一致である、本発明によって定義される免疫エフェクター細胞が、免疫療法において使用するのに安全であり、効果を示すことを示す。
【００３９】
好ましくは、本発明により使用するための組成物が、例えば注入のための水、生理的塩溶液（０．９％ＮａＣｌ）、または好ましくはヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などのタンパク質成分で置換された生理的塩溶液からなる細胞緩衝液などの少なくとも１種の賦形剤をさらに含む。
【００４０】
このような非ハプロタイプ一致の不一致状況に本発明の組成物を使用するために、本発明者らは、免疫エフェクター細胞がＢ細胞でもＴ細胞でない（すなわち、ＣＤ３およびＣＤ１９陰性）ことが好ましいが、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）について陽性であることを見出した。このような細胞は、レシピエントの遍在性のＨＬＡ発現細胞と激しく反応することなく、細胞溶解活性を有する。後者は、生命を脅かし得る移植片対宿主（ＧｖＨ）反応としても知られている。本発明による免疫療法のための免疫エフェクター細胞の使用は、試験された患者のいずれにおいてもＧｖＨ関連症状をもたらさなかった。好ましい実施形態では、本発明により使用するための組成物が移植片対宿主病をもたらさない。
【００４１】
好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞が神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）について陽性であり、ＣＤ３およびＣＤ１９について陰性である、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００４２】
神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）は、ニューロン、グリア、骨格筋およびナチュラルキラー細胞の表面上で発現される免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの糖タンパク質である。ＣＤ５６とも呼ばれるＮＣＡＭは、細胞−細胞接着、神経突起伸長、シナプス可塑性、ならびに学習および記憶において役割を果たすとされている。ＮＣＡＭは、好ましくは、本発明により使用するための分化した免疫エフェクター細胞の集団を定義するために使用され、末梢血中の患者のナチュラルキラー細胞から注入されたエフェクター細胞を識別するために使用することができる。
【００４３】
ＣＤ３は、Ｔリンパ球（またはＴ細胞）のみの表面上に見られる分子であるＴ細胞受容体（ＴＣ）複合体の一部である。ＣＤ３は、Ｔ細胞共受容体とも呼ばれる。ＴＣＲ複合体は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合する小型ペプチドに代表される抗原の認識を担う。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合して見られ、他の細胞型では実質的に見られない。この高い特異性が、Ｔ細胞発生の全ての段階でのＣＤ３の存在と組み合わせて、これを組織切片中のＴ細胞を同定するのに有用なものとしている。ＣＤ３は外来ＨＬＡを認識して拒絶するのに関与し、したがってＧＶＨＤに関連する。
【００４４】
ＣＤ１９は、Ｂ細胞の全寿命を通して存在するＢ細胞受容体複合体の一部である。Ｂリンパ球としても知られるＢ細胞は、白血球サブタイプである。その機能は、抗体を分泌することによって適応免疫系の成分である免疫エフェクター細胞としてのものであり、これらは抗原を提示することもできる。
【００４５】
Ｂ細胞は、ＥＢＶ誘発リンパ腫を発症する可能性のあるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に潜在的に感染するので、本発明は、産物ＣＤ１９陰性を定義することによってこのようなリスクから患者を保護することを目的とする。
【００４６】
本発明者らはさらに、本発明の免疫細胞がＣＤ１５９ａ、ＣＤ３１４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６またはＣＤ３３７の１つまたは複数を発現することが有利であることを見出した。
【００４７】
ＣＤ１５９ａおよびＣＤ８５ｊ／白血球Ｉｇ様受容体−１（ＬＩＲ−１）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞傷害性免疫エフェクター細胞上に発現する抑制性受容体である。これらはそれぞれＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇに結合することが知られており、そのため、細胞傷害性細胞が通常はＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを発現する正常な（健康な）組織を攻撃するのを防ぐ７４、７５。免疫エフェクター細胞がハプロタイプ一致の不一致を越えて不一致設定で使用されるため、これは、本発明で使用される免疫エフェクター細胞が正常組織を攻撃するのを防ぐ非常に効率的な機構である。
【００４８】
ＣＤ３１４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γ／δＴ細胞およびＮＫ細胞上で発現することが知られているＣ型レクチン様タンパク質である。ＣＤ３１４は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＩＣＢおよびＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）に結合し、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２アダプターとの非共有結合によって細胞を活性化する。ＣＤ３１４は、ＴＣＲ媒介性Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生のための共刺激受容体であり、さらにＮＫ細胞上の一次活性化受容体である。ＣＤ３１４とそのリガンドの相互作用は、病原体および腫瘍細胞に対する、ならびに自己免疫疾患の病因における重要な応答を示す。
【００４９】
ＣＤ３３５は、例えばＮＫ細胞において細胞傷害性を誘因する自然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）ファミリーのメンバーである。ＣＤ３３５は標的細胞の認識および溶解に直接関与し、例えばＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上で発現する。
【００５０】
ＣＤ３３６は、ｙ／δＴ細胞のサブセットおよびＩＬ−２活性化ＮＫ細胞上で発現する自然細胞傷害性受容体ファミリーのメンバーであるＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ３３６は、例えば、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞のＮＫ細胞媒介性細胞溶解を増強する。
【００５１】
ＣＤ３３７は、自然細胞傷害性受容体ファミリーのメンバーであるＩ型膜貫通タンパク質であり、例えば、休止および活性化ＮＫ細胞上で発現する。ＮＫｐ３０は、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子が欠損している腫瘍細胞のＮＫ細胞の細胞溶解を増強する。
【００５２】
したがって、本発明により使用するための組成物中に存在する免疫エフェクター細胞中で発現する上記細胞表面分子の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは４つ全てを有することが好ましい。
【００５３】
好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞および／またはウイルス感染細胞、好ましくは腫瘍細胞に対して細胞溶解活性を有する、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００５４】
好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞が以下の細胞表面マーカー：ＣＤ１５９ａ、ＣＤ３１４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、およびＣＤ３３７の１つまたは複数を発現する、本発明により使用するための組成物が提供される。好ましくは、免疫エフェクター細胞は、少なくともＣＤ３１４、ＣＤ３３６またはその両方を発現する。ＣＤ３１４とそのリガンドとの相互作用が腫瘍細胞に対する重要な応答を示し、またＣＤ３３６が腫瘍細胞のＴ細胞ならびにＮＫ細胞媒介性細胞溶解を増強するので、本発明によって定義される免疫エフェクター細胞に対するこの組み合わせは、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞によって活性化され、腫瘍細胞を死滅させるのに極めて有用である。
【００５５】
典型的には、本発明の組成物は、複数の細胞を含む。組成物中の全ての細胞が本発明によって定義される特徴および効果を有する必要はない。しかしながら、（生産中の）効率と（診療所における）有効性に関する適切なバランスを有するために、本発明により使用するための組成物中に、少なくとも一定割合の本発明で定義される免疫エフェクター細胞を有することが好ましい。好ましい実施形態では、複数の細胞を含み、複数の細胞の３０〜１００％、好ましくは３０〜９０％、より好ましくは３０〜８０％、より好ましくは３０〜７０％、より好ましくは３０〜６０％、より好ましくは３０〜５０％、最も好ましくは３０〜４０％が本発明によって定義される免疫エフェクター細胞であることを特徴とする、本発明により使用するための組成物が提供される。好ましくは、複数の細胞を含む組成物は、複数の細胞の４０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、より好ましくは６０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％、より好ましくは８０〜１００％、最も好ましくは９０〜１００％が本発明によって定義される免疫エフェクター細胞であることを特徴とする。本発明により使用するための組成物中の本発明によって定義される免疫エフェクター細胞の他の好ましい範囲は、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、８０〜９０％、４０〜８０％、５０〜８０％、６０〜８０％、４０〜７０％、４０〜６０％、５０〜６０％または４０〜５０％である。生産効率のためには、低い割合の本発明によって定義される免疫エフェクター細胞が望ましいが、他方で臨床的有効性および規制上の理由から、高い割合の本発明によって定義される免疫エフェクター細胞が望ましい。
【００５６】
ＮＣＡＭ陽性ならびにＣＤ３およびＣＤ１９陰性である免疫エフェクター細胞を生成するために、当業者に知られているいくつかの方法がある。このような免疫エフェクター細胞は、例えば、幹細胞または前駆細胞、特にＣＤ３４陽性である幹細胞または前駆細胞から体外で生成され得る。ＣＤ３４は細胞表面糖タンパク質であり、細胞−細胞接着因子として機能し、幹細胞と骨髄細胞外マトリックスとの相互作用を媒介する、または間質細胞に直接作用する。ＣＤ３４は、多分化能造血幹細胞および系統特異的造血前駆細胞上で発現される。ＣＤ３４は、新しい免疫系の生着を担う幹細胞および前駆細胞の含量を記載することにより、幹細胞移植の質の定義に臨床的に使用されている。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明は、免疫エフェクター細胞が、幹細胞または前駆細胞から体外で生成され、幹細胞が好ましくはＣＤ３４＋幹細胞である、および／または前駆細胞が好ましくはＣＤ３４＋前駆細胞である、本発明により使用するための組成物を提供する。
【００５８】
規制上の視点から、また効率の観点からも、本発明により使用するための組成物が単一のドナーから得られることが特に好ましい。ランダムな個体を本発明により使用するための組成物で処理しなければならない瞬間に大規模なバッチを生成し、清澄化し、または認定し、既製のものとして使用することができるように、単一のドナーが２回以上の治療用量を提供することがさらにより好ましい。好ましくは、免疫エフェクター細胞の生成が、少なくとも１０回、より好ましくは少なくとも２０回、より好ましくは少なくとも５０回、より好ましくは少なくとも１００回、最も好ましくは少なくとも２００回以上の本発明により使用するための単剤用量に十分である。例えば約５×１０８〜１×１０１０個の細胞を単剤に使用する場合、例えば、１０人の個体を治療するために、少なくとも１０１１個の免疫エフェクター細胞が、単一のドナーからのＣＤ３４陽性幹細胞または前駆細胞から生成されることが好ましい。このようにして生成された大きな細胞バッチを、容易に１バイアル当たり正確な量の細胞（例えば、約５×１０８〜１×１０１０個）でバイアルに移し、凍結および保存することができる。本発明により使用するための組成物が必要な瞬間に、このようなバイアルの１つを解凍し、免疫療法を必要とする個体に投与するために準備することができる。好ましい実施形態では、複数の細胞が単一のドナーから得られた細胞に由来する、本発明により使用するための組成物が提供される。好ましくは、臍帯血および骨髄がＣＤ３４陽性幹細胞および／または前駆細胞の豊富な供給源であるので、複数の細胞が臍帯血および骨髄の少なくとも１つに由来する。
【００５９】
本発明によって定義される部分的一致を必要としない設定で免疫エフェクター細胞を含む既製の組成物を使用する可能性のために、個々のレシピエントに一致する個々のドナーを探す必要がもはやないので、本発明により使用するための組成物は、細胞養子療法を、個別化医療からより一般的な医療に向けたステップへと移す。これはまた、治療費に有益な影響を与える。
【００６０】
本明細書で使用される「既製の」とは、このような組成物を必要に応じて直接使用のために調製および保存することを意味する。特に、入手可能な「既製の」ものである組成物は、１人の特定のレシピエントに対して生成されないが、一般に、異なる時点で異なるレシピエントに対して使用することができる。本発明によって定義される組成物は、例えば、凍結することができ、必要に応じて解凍し、本発明によって定義されるように使用することができる。本発明によって定義される組成物は、任意のランダムなレシピエントに必要とされる場合、理論的に数分以内に提供され得るＧＭＰ産生免疫エフェクター細胞の大規模生産を可能にする。
【００６１】
本発明は、好ましくは、ＵＣＢ  ＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞から機能的免疫エフェクター細胞を生成する効率的な増殖および分化細胞培養プロセスの結果である組成物を使用する７６。このような組成物は、受容体複合体ＣＤ９４／ＥＣＧ２Ａおよびキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）などの阻害受容体を差次的に発現するが、高レベルの活性化受容体を均一に発現するＮＣＡＭ陽性、ＣＤ３陰性エフェクター細胞サブセットを含むことが好ましい。本発明の範囲内で、ドナーとレシピエントの選択は、好ましくはレシピエントＨＬＡ関連ＫＩＲリガンドとドナーのＫＩＲ遺伝子型との間の不一致について一致しない。さらに、本発明により使用するための組成物は、標的細胞関与時にグランザイムＢ脱顆粒およびＩＦＮγ放出と相関し得る体外での例えばＡＭＬ細胞などの腫瘍細胞に対する強い細胞溶解活性を媒介する（データ図示せず）。
【００６２】
予後不良のＡＭＬ患者における養子免疫療法のために本発明によって定義される体外増殖免疫エフェクター細胞を利用するために、本方法をＧＭＰ条件下で同種異系免疫エフェクター細胞バッチを生成するための閉鎖系バイオプロセスに適応させた７２。開発した免疫エフェクター細胞生成手順は、２つの培養ステップからなる。最初のステップは、培養１４日でＣＤ３４＋細胞前駆体を増殖させることを含む。第２のステップは、増殖した前駆細胞の免疫エフェクター細胞系列への分化からなり、これにはさらに４週間の培養期間が必要である。独自のＧＭＰ適合性無血清Ｇｌｙｃｏｓｔｅｍ基礎増殖培地（ＧＢＧＭ）を用いた系の体系的な改良により、凍結臍帯血（ＵＣＢ）単位から極めて高純度のＮＣＡＭ陽性およびＣＤ３陰性免疫エフェクター細胞への１５０００倍超増殖へのＣＤ３４＋細胞の体外増殖および分化を可能にする臨床的に適用可能なプロトコルがもたらされた７６。
【００６３】
ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた大規模実験では、２段階増殖および分化プロトコルが、高純度でＣｌｉｎｉＭＡＣＳ細胞分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって濃縮されたＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞から１〜１０×１０９個のＮＣＡＭ陽性免疫エフェクター細胞を再現性よく生成することを実証した。Ｔ細胞およびＢ細胞は、フローサイトメトリーによって検出されなかった（それぞれ０．０１％未満のＣＤ３＋細胞および０．０１％未満のＣＤ１９＋細胞）。
【００６４】
１つの好ましい実施形態では、以下のステップ：
ａ）ＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を含む試料を得るステップと、
ｂ）ａ）で得られた試料からのＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を親和性精製するステップと、
ｃ）ヒト血清と、３つ以上のＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＩＬ−６からなる低用量サイトカインカクテルと、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７およびＴＰＯを含む高用量サイトカインの２つ以上の組み合わせと、低分子量ヘパリンとを補充した基礎増殖培地で、ｂ）で得られた精製ＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を増殖させるステップと、
ｄ）ヒト血清と、ＩＬ−１５と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２を含む追加の１つまたは複数のサイトカインとを補充した基礎増殖培地中で、ｃ）で得られた増殖ＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を分化させるステップと、
ｅ）ｄ）で生成した細胞を採取し、本発明で定義される組成物を生成するステップと
を含む方法で、体外で生成される、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００６５】
造血幹細胞および／または前駆細胞を含む試料は、例えば、骨髄、臍帯血、胎盤材料、末梢血、幹細胞動員剤で処置された人の末梢血などの幹および／または前駆含有細胞源を得るまたは回収する、胚性幹細胞またはその任意の逸脱から細胞培養ステップを用いて体外で生成する、あるいは誘導された多能性幹細胞およびその逸脱から細胞培養ステップを用いて体外で生成するなどの任意の考えられる方法で得ることができる。造血幹細胞および／または前駆細胞は、親和性精製法を用いて、このような幹および／または前駆含有細胞源からさらに精製することができる。
【００６６】
「体外」という用語は、行われる工程または方法が、生きた個体内で使用されず、例えば細胞を培養することができる装置、好ましくは培養フラスコ、使い捨てバッグまたはバイオリアクターなどの開放または閉鎖細胞培養装置で使用されることを意味する。
【００６７】
好ましい実施形態では、上記のように体外で生成され、ステップｄで、追加の少なくとも１つまたは複数のサイトカインがＳＣＦ、好ましくはＳＣＦおよびＩＬ−２より好ましくはＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−７、より好ましくはＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２およびＩＬ−１２、最も好ましくはＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８である、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００６８】
別の好ましい実施形態では、上記のように生成され、ステップｄで、追加の少なくとも１つまたは複数のサイトカインがＳＣＦ、好ましくはＳＣＦおよびＦｌｔ３Ｌ、より好ましくはＳＣＦ、Ｆｌｔ３ＬおよびＩＬ−２、より好ましくはＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−２およびＩＬ−７、より好ましくはＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７、ＩＬ−２およびＩＬ−１２、最も好ましくはＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８である、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００６９】
好ましい実施形態では、上記のように生成され、ステップｃで、少なくとも２つのサイトカインの組み合わせがＴＰＯおよびＦｌｔ３Ｌ、より好ましくはＳＣＦおよびＦｌｔ３Ｌ、より好ましくはＳＣＦおよびＴＰＯ、最も好ましくはＳＣＦおよびＩＬ−７である、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００７０】
別の好ましい実施形態では、上記のように生成され、ステップｃで、少なくとも２つ以上のサイトカインの組み合わせがＳＣＦおよびＦｌｔ３Ｌ、より好ましくはＳＣＦ、Ｆｌｔ３ＬおよびＴＰＯ、より好ましくはＳＣＦ、Ｆｌｔ３ＬおよびＩＬ−７、より好ましくはＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ−７、最も好ましくはＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３ＬおよびＩＬ−７である、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００７１】
「ＣＤ３４＋幹細胞」という用語は、好ましくは幹細胞である細胞表面上でＣＤ３４抗原を発現する多能性幹細胞を意味し、あらゆる特定のタイプの血液細胞、より好ましくは血統の系統特異的前駆細胞を生じさせることができる細胞になることができる。
【００７２】
「ＣＤ３４＋前駆細胞」という用語は、好ましくは前駆細胞である細胞表面上でＣＤ３４抗原を発現する多能性前駆細胞を意味し、種々のタイプの血液細胞、より好ましくは特定の血統の系統特異的前駆細胞を生じさせることができる細胞になることができる。
【００７３】
本明細書で使用される「親和性精製」という用語は、例えば分離目的で対象となる特異的エピトープを標的化する、例えば分離方法による検出に適した薬剤と結合した抗体で抗原を標的化する、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの精製方法のために蛍光色素と結合した抗体を使用する、および／または例えば磁気選択手順のために磁気粒子と結合した抗体を使用することによって、精製すべき細胞を標識することを意味する。親和性精製法は当技術分野で公知であり、例えば、抗原と抗体、酵素と基質、または受容体とリガンドの間のような高度に特異的な相互作用に基づいて生化学混合物を分離する任意の方法であり得る。
【００７４】
本明細書で使用される「増殖する」という用語は、好ましくは細胞の表現型を本質的に変化させる（これは一般的に「分化」と呼ばれる）ことなく、細胞培養ステップによって引き起こされる細胞分裂事象による細胞の増殖を意味する。「細胞の表現型を本質的に変化させることなく」という句は、細胞が好ましくはその機能、その細胞表面マーカーおよび／またはその形態を変化させないことを意味する。
【００７５】
本明細書で使用される「分化する」という用語は、細胞の表現型を変化させることを意味し、これは細胞培養工程中にある表面分子の発現を変化させること、細胞の機能を変化させること、および／または細胞の形態を変化させることを意味し、細胞は好ましくは依然として細胞培養培地の添加により増殖することができる。前に示されるように、本発明者らは、本発明によって定義される免疫療法に使用するための組成物が腫瘍の治療に特に有用であることを示した。好ましい実施形態によると、本発明により使用するための組成物は、腫瘍を治療するためのものである。腫瘍は、本発明の意味において、造血腫瘍または固形腫瘍を含む。腫瘍は悪性または良性のいずれかであり得る。
【００７６】
本発明による免疫療法に使用するための組成物は、腫瘍の治療、特に例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの造血腫瘍の治療において様々な段階で使用することができる。例えば、本発明によって例示されるように、組成物は、好ましくは、骨髄移植を受けるのに適格でない（高齢の）患者における強化療法として使用することができる。さらに、別の治療を用いて他によって示されるように、本発明による免疫エフェクター細胞療法は、好ましくは導入療法で完全に寛解しない患者（難治性患者）または導入療法の直後に再発した患者（再発性患者）に使用することができる。同種異系ＨＳＴＣレジメンにおける本発明によって定義される免疫エフェクター細胞の追加的使用などの、免疫エフェクター細胞療法の他の強化療法への組み込みもまた実行可能であり、好ましい。
【００７７】
しかしながら、従来のハプロタイプ一致ＮＫ細胞療法および自己Ｔ細胞療法の欠点および問題のために、本発明は、免疫エフェクター細胞が、好ましくは例えばＵＣＢから単離されたＣＤ３４＋造血前駆細胞からの体外生成を通した多数の高度に活性化された免疫エフェクター細胞のバッチから得られる、免疫療法における免疫エフェクター細胞の新規な使用を開発した。第Ｉ相用量漸増試験の予備的結果は、高齢者（５５歳超）の治療に使用するための組成物の安全性、耐容性ならびに生物学的および臨床的活性を示している。ＡＭＬ患者は、本発明によって定義される組成物で治療するのに好ましい群である。
【００７８】
実施例において、組成物を高齢ＡＭＬ患者で試験し、患者にシクロホスファミド（Ｃｙ；９００ｍｇ／ｍ２／日）およびフルダラビン（Ｆｌｕ；３０ｍｇ／ｍ２／日）からなる準備化学療法を、−６日目〜−３日目に与えた。０日目に、ＵＣＢ由来免疫エフェクター細胞を、３、１０または最大３０ｘ１０６／ｋｇ体重の用量でＩＬ−２処理なしで注入して、ＩＬ−２の支持なしにインビボでの増殖が得られるかどうかを試験した。患者を毒性およびＧＶＨＤについて評価した。予想通り、準備Ｃｙ／Ｆｌｕは２０±１６日間の好中球減少期間を誘発したが、重度の感染症は見られなかった。
【００７９】
一実施形態では、本発明は、シクロホスファミドが４００〜１００００ｍｇ／ｍ２、好ましくは８００〜８０００、より好ましくは１６００〜６０００、より好ましくは２０００〜４０００、最も好ましくは約３６００ｍｇ／ｍ２の総用量で、好ましくは１〜１０００、好ましくは１０〜５００、より好ましくは５０〜２５０、最も好ましくは約１２０ｍｇ／ｍ２の総用量のフルダラビンと併用して、その後２、３、４または５日間投与されることを特徴とする、免疫抑制療法に使用するためのシクロホスファミドを提供する。
【００８０】
本発明で使用されるように、シクロホスファミドは、標準的な骨髄破壊レジメンと比較して減少した強度で使用される。通常、シクロホスファミドはまたこのレジメンよりも高濃度かつ少ない日数で与えられる。注目すべきことに、ＡＭＬ芽球は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）を有し、これがシクロホスファミドが活性型に代謝されないようにするので、一定レベルのシクロホスファミド処理に対して耐性である。ＡＬＤＨはリンパ球には存在しないので、シクロホスファミドが活性化して細胞を枯渇させる。
【００８１】
好ましくは、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビンを静脈内投与する。
【００８２】
フルダラビンは休止および分裂細胞でプリン類似体として作用するが、より低濃度で分裂細胞に対する強い効果を有する。本発明の前に、休止細胞であり、応答するためにより高レベルの薬物を必要とする白血病幹細胞を標的とするために使用したので、投薬は最初は高かった。本発明の範囲内では、低投与量を非骨髄破壊レジメンとして使用し、引き起こす副作用がはるかに少ない。
【００８３】
本発明はさらに、フルダラビンが１〜１０００、好ましくは１０〜５００、より好ましくは５０〜２５０、最も好ましくは約１２０ｍｇ／ｍ２の総用量で、好ましくは４００〜１００００ｍｇ／ｍ２、好ましくは８００〜８０００、より好ましくは１６００〜６０００、より好ましくは２０００〜４０００、最も好ましくは約３６００ｍｇ／ｍ２の総用量のシクロホスファミドと併用して、その後２、３、４または５日間投与されることを特徴とする、免疫抑制療法に使用するためのフルダラビンを提供する。
【００８４】
好ましい実施形態では、フルダラビンおよびシクロホスファミドが本発明によって定義される組成物の投与前に与えられる、本発明により使用するためのシクロホスファミドまたは本発明により使用するためのフルダラビンが提供される。特に、本明細書で使用されるフルダラビンとシクロホスファミドとの組み合わせは、幹細胞（芽球）におけるシクロホスファミドのより良好な蓄積をもたらし、潜在的により強い効果を引き起こす。本発明により使用するための組成物の投与前の、記載されるシクロホスファミドおよびフルダラビンを用いたコンディショニングは、標準的な骨髄破壊コンディショニングレジメンを用いるよりも軽度の方法で患者の免疫エフェクター細胞が枯渇し、腫瘍幹細胞に対する潜在的な効果が与えられれば、注入された免疫エフェクター細胞の拒絶が一定期間防がれる、または注入された免疫エフェクター細胞に対してより脆弱になるという効果を有する。
【００８５】
好ましい実施形態では、１回の治療で投与される組成物が、少なくとも５×１０６個の細胞、好ましくは少なくとも５×１０７個の細胞、より好ましくは少なくとも５×１０８個、より好ましくは少なくとも５ｘ１０９個、最も好ましくは少なくとも５ｘ１０１０個、いずれの場合も、好ましくは５ｘ１０１１個以下の細胞を含む、本発明により使用するための組成物が提供される。実施例において、本発明者らは、これらの範囲内の用量が安全かつ有効であることを示した。
【００８６】
注入後、ＩＬ−２またはＩＬ−１５注入を支持することなく、ＵＣＢ由来免疫エフェクター細胞が再生息し、成熟し、ＢＭに移動する。本発明者らは、低メチル化剤による処置で患者におけるＭＲＤの減少を観察したので、このＵＣＢ由来免疫エフェクター細胞療法は、高齢ＡＭＬ患者においてＣＲを誘発または持続させる可能性があり、難治性ＡＭＬ患者の代替強化治療として働くまたはアロ−ＳＣＴとの橋を提供し得る。
【００８７】
好ましい実施形態によると、個体がＩＬ−２および／またはＩＬ−１５で処置されていない本発明により使用するための組成物が提供される。
【００８８】
好ましい実施形態では、１回の治療で投与される組成物が２×１０８個未満のＣＤ３陽性細胞、より好ましくは２×１０７個未満のＣＤ３陽性細胞、より好ましくは２×１０６個未満のＣＤ３陽性細胞、最も好ましくは１×１０５個未満のＣＤ３陽性細胞を含む、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００８９】
好ましい実施形態では、１回の治療で投与される組成物が１×１０９個未満のＣＤ１９陽性細胞、より好ましくは１×１０８個未満のＣＤ１９陽性細胞、より好ましくは１×１０７個未満のＣＤ１９陽性細胞、最も好ましくは１×１０６個未満のＣＤ１９陽性細胞を含む、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００９０】
好ましい実施形態では、組成物中に存在する全細胞の数に対するＣＤ３陽性細胞の％が１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、より好ましくは０．１％を超えず、最も好ましくは組成物中に存在する細胞の総数に対して０．０１％を超えない。
【００９１】
好ましい実施形態では、組成物中に存在する全細胞の数に対するＣＤ１９陽性細胞の％が１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、より好ましくは０．１％を超えず、最も好ましくは組成物中に存在する細胞の総数に対して０．０１％を超えない。
【００９２】
本発明の組成物は、免疫エフェクター細胞が個体においてその標的に達することができれば、任意の許容可能な方法を通して投与することができる。例えば、静脈内経路またはそれだけに限らないが、眼、真皮、肺、頬および鼻腔内経路を含む局所経路を介して、本発明の組成物を投与することが可能である。本明細書で使用される局所経路は、例えば骨髄などの任意の直接局所投与も意味するが、例えば固形腫瘍に直接注射されることも意味する。特定の場合、例えば、免疫療法が胃腸管の粘膜層に対する効果を目的とする場合、経口経路を使用することができる。
【００９３】
好ましくは、静脈内経路によって、または局所経路によって、または経口経路によって、または３つの経路の任意の組み合わせによって投与される、本発明により使用するための組成物が提供される。本明細書で使用される「局所的」という用語は、免疫エフェクター細胞が局所的に、好ましくは腫瘍の部位に施用されることを意味し、腫瘍は任意の解剖学的部位に局在化し得る、より具体的には、腫瘍は骨髄または任意の他の器官に局在し得る。本発明により使用するための組成物は１回投与することができるが、必要と思われる場合には、組成物を複数回投与してもよい。これらは１日、１週間または１ヶ月に複数回であってもよい。第１の投与、例えば注入の臨床結果を最初に待つことも可能であるが、組成物が有効でない場合には、必要に応じて第２の投与、さらには第３、第４などを行うことが可能である。
【００９４】
前に既に詳述したように、本発明により使用するための組成物は、腫瘍を治療するための免疫療法において特に有用である。療法に拘束されることなく、ＨＬＡ不一致免疫エフェクター細胞は、その標的を認識した後、分泌型リソソームエキソサイトーシスを通して腫瘍細胞を死滅させると考えられている。標的細胞認識は、免疫エフェクター細胞とその標的との間の溶解性免疫シナプスの形成を誘導する。次いで、分泌型リソソームの分極エキソサイトーシスが活性化され、これらの細胞小器官が、溶血性シナプスにおいて細胞傷害性内容物を放出し、標的細胞を特異的に死滅させる。腫瘍の治療に使用するための本発明により使用するための組成物は、造血またはリンパ腫瘍と固形腫瘍の両方に有用である。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞が分泌型リソソームエキソサイトーシスを通して腫瘍細胞を死滅させることができる、本発明による組成物が提供される。
【００９５】
１つの好ましい実施形態では、腫瘍が造血もしくはリンパ腫瘍である、または腫瘍が固形腫瘍である、腫瘍を治療するための本発明により使用するための組成物が提供される。
【００９６】
「血液学的」、「造血」または「リンパ」腫瘍という用語は、これらが造血およびリンパ組織の腫瘍であることを意味する。造血およびリンパ悪性腫瘍は、血液、骨髄、リンパおよびリンパ系を冒す腫瘍である。
【００９７】
本発明は、造血腫瘍と固形腫瘍の両方の治療に使用するための本発明の組成物の有効性に関する例示的な結果を示す。
【００９８】
腫瘍が造血またはリンパ腫瘍である場合、腫瘍が白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群または骨髄腫、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性Ｔ細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、組織球性リンパ腫または多発性骨髄腫から選択される白血病、リンパ腫または骨髄腫、好ましくはＡＭＬの１つまたは複数である、本発明により使用するための組成物が提供される。
【００９９】
腫瘍が固形腫瘍である場合、腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌または小細胞癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍、肝細胞癌、肝芽腫、結腸腺癌、腎細胞癌、腎細胞腺癌、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頸部癌、肺癌、乳癌、メルケル細胞癌、横紋筋肉腫、悪性黒色腫、類表皮癌、肺癌、腎癌、腎臓腺癌、乳癌、乳腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、口腔癌、肛門癌、皮膚癌、ユーイング肉腫、胃癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、膵臓癌、膵臓腺癌、子宮頸癌、扁平上皮癌、髄芽腫、前立腺癌、結腸癌、結腸腺癌、転移性細胞癌、骨肉腫、腺管癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣腺癌、卵巣奇形癌、膀胱乳頭腫、神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠芽腫星状細胞腫、類上皮癌、黒色腫または網膜芽細胞腫の１つである、本発明により使用するための組成物が提供される。
【０１００】
好ましい実施形態では、固形腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、子宮頸癌、小細胞癌および黒色腫から選択される子宮頸癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍から選択される、本発明により使用するための組成物が提供される。別の好ましい実施形態では、固形腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、結腸腺癌、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、結腸癌および黒色腫から選択される結腸直腸癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍から選択される、本発明により使用するための組成物が提供される。
【０１０１】
本発明の組成物は、これまでに知られている治療選択肢に関していくつかの利点を有する。本発明の組成物は、ＨＰＶ型、腫瘍組織学、腫瘍ＥＧＦＲ発現およびＫＲＡＳ状態と独立に有益である。それに加えて、本発明の免疫エフェクター細胞はまた、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇおよび（ＩＤＯ）阻害を克服し、したがって腫瘍、特に子宮頸癌および結腸直腸癌に対する抗腫瘍効果増強をもたらす。
【０１０２】
一般に記載されているように、「上皮増殖因子受容体」またはＥＧＦＲという用語は、ほぼ全ての健康な組織で広く発現されている細胞表面タンパク質を指す。ＥＧＦＲタンパク質は、膜貫通糖タンパク質によってコードされ、プロテインキナーゼファミリーのメンバーである。その下流のシグナル伝達経路におけるＥＧＦＲの過剰発現および突然変異は、結腸、肺および子宮頸管などのいくつかの固形腫瘍における悪い予後と関連している。
【０１０３】
カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子（ＫＲＡＳ）という用語は、ＥＧＦＲ下流シグナル伝達経路の一部である正常組織シグナル伝達の調節に積極的に関与する遺伝子を指す。しかしながら、結腸、直腸および肺の固形腫瘍の腫瘍細胞において、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異が報告されている。結腸直腸癌患者の５０％超で起こるこの活性化突然変異は、腫瘍細胞がセツキシマブおよびパニツムマブなどのＥＧＦＲ標的薬を回避するのを助ける。
【０１０４】
本明細書で使用される「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）」という用語は、女性において子宮頸癌を引き起こすウイルスの群を指す。ＨＰＶウイルスは、口、咽喉、外陰部、子宮頸部および膣を囲む皮膚および湿った膜を冒す。ＨＰＶ感染は、子宮頸部において癌につながる異常な細胞変化を引き起こす。
【０１０５】
本明細書で使用されるインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）という用語は、アミノ酸Ｌ−トリプトファンをＮ−ホルミルキヌレニンに分解する際の触媒として作用する酵素を指す。前立腺、胃、卵巣、子宮頸部および結腸の固形腫瘍で一般的に報告されるＩＤＯの過剰発現は、腫瘍細胞が細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞による殺傷を回避することを可能にする。
【０１０６】
医学的処置に対する請求を可能にする管轄権について、以下の実施形態も本発明によって提供される。
【０１０７】
免疫エフェクター細胞を含む組成物を個体に投与するステップを含む、免疫療法を必要とする個体を治療する方法であって、免疫エフェクター細胞が個体に関して非ハプロタイプ一致であることを特徴とする方法。
【０１０８】
免疫エフェクター細胞が神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）について陽性であり、ＣＤ３およびＣＤ１９について陰性である、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１０９】
免疫エフェクター細胞が以下の細胞表面マーカー：ＣＤ１５９ａ、ＣＤ３１４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７の１つまたは複数を発現する、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１０】
免疫エフェクター細胞がＣＤ３１４、ＣＤ３３６またはその両方を発現する、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１１】
複数の細胞を含み、複数の細胞の３０〜１００％、好ましくは３０〜９０％、より好ましくは３０〜８０％、より好ましくは３０〜７０％、より好ましくは３０〜６０％、より好ましくは３０〜５０％、最も好ましくは３０〜４０％が本発明で定義される免疫エフェクター細胞であることを特徴とする、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１２】
複数の細胞を含み、複数の細胞の４０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、より好ましくは６０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％、より好ましくは８０〜１００％、最も好ましくは９０〜１００％が本発明で定義される免疫エフェクター細胞であることを特徴とする、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１３】
免疫療法が腫瘍を治療するためのものである、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１４】
免疫エフェクター細胞が幹細胞から体外で生成される、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１５】
免疫エフェクター細胞が前駆細胞から体外で生成される、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１６】
幹細胞がＣＤ３４＋幹細胞である、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１７】
前駆細胞がＣＤ３４＋前駆細胞である、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１８】
個体がＩＬ−２および／またはＩＬ−１５で処置されていない、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１１９】
複数の細胞が単一のドナーから得られた細胞に由来する、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２０】
複数の細胞が臍帯血および骨髄の少なくとも１つに由来する、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２１】
組成物が以下のステップ：
ＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を含む試料を得るステップと、
ａ）で得られた試料からのＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆細胞を親和性精製するステップと、
ヒト血清と、３つ以上のＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＭＩＰ−１αおよびＩＬ−６からなる低用量サイトカインカクテルと、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７およびＴＰＯを含む高用量サイトカインの２つ以上の特異的組み合わせと、低分子量ヘパリンとを補充した基礎増殖培地で、ｂ）で得られた精製ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を増殖させるステップと、
ヒト血清と、ＩＬ−１５と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２を含む追加の１つまたは複数のサイトカインとを補充した基礎増殖培地中で、ｃ）で得られた増殖ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を分化させるステップと、
ｄ）で生成した細胞を採取し、請求項１から１４のいずれか一項で定義される組成物を生成するステップと
を含む方法で、体外で生成される、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２２】
免疫抑制療法を必要とする個体を治療する方法であって、前記個体にシクロホスファミドおよび／またはフルダラビンを投与するステップを含み、シクロホスファミドが４００〜１００００ｍｇ／ｍ２、好ましくは８００〜８０００、より好ましくは１６００〜６０００、より好ましくは２０００〜４０００、最も好ましくは約３６００ｍｇ／ｍ２の総用量で、その後２、３、４または５日間投与される、および／またはフルダラビンが１〜１０００、好ましくは１０〜５００、より好ましくは５０〜２５０、最も好ましくは約１２０ｍｇ／ｍ２の総用量で、その後２、３、４または５日間投与されることを特徴とする、方法。
【０１２３】
フルダラビンおよびシクロホスファミドが本発明で定義される組成物の投与前に与えられる、本発明による免疫抑制療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２４】
１回の治療で投与される組成物が少なくとも５×１０８個の細胞を含む、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２５】
１回の治療で投与される組成物が１×１０１０個以下の細胞を含む、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２６】
１回の治療で投与される組成物が２×１０８個未満のＣＤ３陽性細胞を含む、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２７】
１回の治療で投与される組成物が１×１０９個未満のＣＤ１９陽性細胞を含む、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２８】
組成物が静脈内経路によって投与される、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１２９】
組成物が局所経路によって投与される、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１３０】
腫瘍が造血もしくはリンパ腫瘍である、または腫瘍が固形腫瘍である、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１３１】
腫瘍が白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群または骨髄腫、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性Ｔ細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、組織球性リンパ腫、多発性骨髄腫などから選択される白血病、リンパ腫または骨髄腫から選択される造血またはリンパ腫瘍である、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１３２】
白血病がＡＭＬである、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１３３】
腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌または小細胞癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍、肝細胞癌、肝芽腫、結腸腺癌、腎細胞癌、腎細胞腺癌、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頸部癌、肺癌、乳癌、メルケル細胞癌、横紋筋肉腫、悪性黒色腫、類表皮癌、肺癌、腎癌、腎臓腺癌、乳癌、乳腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、口腔癌、肛門癌、皮膚癌、ユーイング肉腫、胃癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、膵臓癌、膵臓腺癌、子宮頸癌、扁平上皮癌、髄芽腫、前立腺癌、結腸癌、結腸腺癌、転移性細胞癌、骨肉腫、腺管癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣腺癌、卵巣奇形癌、膀胱乳頭腫、神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠芽腫星状細胞腫、類上皮癌、黒色腫および網膜芽細胞腫から選択される固形腫瘍である、本発明による免疫療法を必要とする個体を治療する方法。
【０１３４】
好ましい実施形態では、固形腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、子宮頸癌、小細胞癌および黒色腫から選択される子宮頸癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍から選択される、本発明による方法が提供される。
【０１３５】
別の好ましい実施形態では、固形腫瘍が腺癌、扁平上皮癌、結腸腺癌、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、結腸癌および黒色腫から選択される結腸直腸癌の悪性新生物または転移誘発性二次腫瘍から選択される、本発明による方法が提供される。
【０１３６】
本発明を、以下の非限定的な実施例でさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】：臨床研究のセットアップ  幹細胞移植（ＳＣＴ）に適格でない５５歳より上の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者が、標準的寛解導入療法（ＲＩＣ）処置を受けた。臨床的寛解（Ｃ）を受けた患者が、免疫療法試験に参加するのに適格であった。本発明の免疫療法製品を、シクロホスファミド（Ｃｙ）およびフルダラビン（Ｆｌｕ）による免疫抑制準備処置の後に漸増用量で与えた。この製品はＨＬＡ不一致免疫エフェクター細胞を含み、これらをこの製品の安全性および毒性を評価するために漸増用量で施用した。さらに、インビボ生存、増殖およびＭＲＤへの効果などの生物学的機能を試験した。
【図２】：毒性  患者を、０日目に細胞治療を受ける前に、−６、−５、−４および−３日目にシクロホスファミドおよびフルダラビンで処置する。このグラフは、Ａで個々の患者について、Ｂで全研究集団についての好中球数の減少を（模式的に）示す。細胞注入後の毒性の観察は報告されなかった。主に、免疫抑制レジメンにより予想される血液学的毒性が報告されている。ほとんどの患者は、個々の患者（Ａ）および全研究集団（Ｂ）について示されるように、１４日後に速やかな好中球回復を示した。
【図３】：リンパ球枯渇（Ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）およびＩＬ−１５レベル  Ｃｙ／Ｆｌｕコンディショニング後に白血球の数を追跡した。コンディショニングは、ＩＬ−１５レベルの上昇と並行する全個々の患者の白血球の減少をもたらした（正方形による線；矢印で示される凡例参照）。１４日後、両方の線がほぼ定常状態の条件に再び達した。
【図４】：全血および骨髄におけるドナー細胞キメラ現象  ドナー細胞キメラ現象を、全血試料または骨髄試料中に存在するドナーＤＮＡ％に基づくＳＮＰ−ＰＣＲによって分析する。注入された細胞産物のキメラ現象を経時的に追跡した。末梢血（Ａ）では、個々の患者のキメラ現象を最大１４日まで検出することができた。対応するキメラ現象は、骨髄（Ｂ）においても見出された。
【図５】：注入された免疫エフェクター細胞の循環  注入された免疫エフェクター細胞は、ＮＣＡＭ（矢印によって示される４分の１区）の高発現によって患者末梢血中に検出され、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの患者自身のエフェクター細胞から分離される。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。代表的な例をここに示す。注入前に、エフェクター細胞を検出することはできない。注入４時間後（０日目＋４）に、免疫エフェクター細胞を血液中に検出することができる。その間、細胞は持続し、８日目まで増殖する。
【図６】：ＭＲＤ（ＵＰＮ７）の減少  ＵＰＮ７では、白血病性芽球の潜在的クローンを白血病関連表現型（ＬＡＰ）ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７−／ＣＤ１３３＋によって記載した。本発明の細胞産物を用いた免疫療法後、６．７％から０．０１％未満の検出不能限界に向かって白血病性芽球数の減少を観察することができた。
【図７】：ＭＲＤ（ＵＰＮ８）の減少  ＵＰＮ８では、白血病性芽球の潜在的クローンを白血病関連表現型（ＬＡＰ）ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ７＋／ＣＤ１３３＋によって記載した。本発明の細胞産物を用いた免疫療法後、６．３％から０．０２％のほぼ検出不能限界に向かって白血病性芽球数の減少を観察することができた。
【図８】：全生存率  治療した全患者の生存率を、試験限界１８０日を超えて追跡した。それまでに、１０人の患者のうち４人が死亡した。６５〜７４歳のＡＭＬ患者の既存対照群（生存率％を＊によって示す）と比較して、相対生存率は有意に改善しているようである。対照データはオランダ癌登録（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）（ｗｗｗ．ｄｕｔｃｈｃａｎｃｅｒｆｉｇｕｒｅｓ．ｎｌ）からとった。
【図９】：無増悪生存率  無増悪生存を、試験限界１８０日を超えて追跡した。１０人の患者の５０％がこれまでに再発し、そのうち１人の患者は治療後１年より後に再発した。４人の患者は治療の５〜７ヶ月後に再発した。
【図１０】：類表皮癌に対する体外で生成されたエフェクター細胞の細胞傷害性  本発明に記載される免疫エフェクター細胞（ＵＣＢ−ＥＣ）は、７−アミノアクチノマイシンＤの割合（７ＡＡＤ％）によって示されるように、末梢血からの活性化ナチュラルキラー細胞（ＰＢＮＫ）よりも効率的に、類表皮癌細胞（Ａ４３１）を死滅させることができる。＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図１１】：結腸癌に対する体外で生成されたエフェクター細胞の細胞傷害性  本発明に記載される免疫エフェクター細胞（ＵＣＢ−ＥＣ）は、７−アミノアクチノマイシンＤの割合（７ＡＡＤ％）によって示されるように、ＲＡＳまたはＢＲＡＦ状態とは無関係に、末梢血からの活性化ナチュラルキラー細胞（ＰＢＮＫ）よりも効率的に、結腸癌細胞を死滅させることができる。
【図１２】：子宮頸癌に対する体外で生成されたエフェクター細胞の細胞傷害性  本発明に記載される免疫エフェクター細胞（ＵＣＢ−ＥＣ）は、７−アミノアクチノマイシンＤの割合（７ＡＡＤ％）によって示されるように、ＨＰＶ状態および型とは無関係に、末梢血からの活性化ナチュラルキラー細胞よりも効率的に、子宮頸癌細胞を死滅させることができる。
【図１３】：造血癌に対する体外で生成されたエフェクター細胞の細胞傷害性  本発明に記載される免疫エフェクター細胞は、白血病（Ｋ５６２）または多発性骨髄腫（Ｕ２６６）などの血液学的癌細胞を死滅させることができる。
【図１４】：液性および固形腫瘍に対する体外で生成されたエフェクター細胞の細胞傷害性  本発明に記載される免疫エフェクター細胞は、７−アミノアクチノマイシンＤの割合（７ＡＡＤ％）によって示されるように、血液学的癌細胞を死滅させることができ、急性リンパ芽球性白血病（ＣＣＲＦ−ＣＭ、ＭＯＬＴ−４）、膵癌（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ−２）または肺癌（ＮＣＩ−Ｈ８２）（小細胞肺癌）に対して高い活性（ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ１）発現を用いた細胞傷害性顆粒の脱顆粒によって測定される）を示す。
【図１５】：免疫細胞産物に対するＦｃＲγＩＩＩａの発現  臨床研究において免疫細胞産物使用についてＦｃＲγＩＩＩａ発現を分析した。  結果は、ＦｃＲγＩＩＩａの発現のばらつきを示す。測定値をグラフに要約し、表に表示する。平均値、最大値、最小値および標準偏差（ＳＤ）を計算した。
【図１６】：免疫細胞産物および末梢血ナチュラルキラー細胞に対するＦｃＲγＩＩｌａの発現の比較  ＦｃＲγＩＩＩａ（＝ＣＤ１６ａ）発現を、細胞傷害性実験に使用される免疫細胞産物で分析した。結果は、末梢血からの刺激ナチュラルキラー細胞および非刺激ナチュラルキラー細胞の発現レベルと比較して、ＦｃＲγＩＩＩａの発現が低いことを示す。測定値をグラフに要約する。平均値、最大値、最小値および標準偏差（ＳＤ）を計算した。表中、ＵＰＮ（固有の患者番号）番号は、この特定の患者が受け取った特定のエフェクター細胞産物を表す。
【図１７】：分化段階中の種々の組み合わせにおけるＩＬ−１２とＩＬ−２の比較  ＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞からＵＣＢ−ＥＣ細胞を培養するための培養手順。ＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞を増殖培地Ｉで２週間培養する。次に、前駆細胞を、ＩＬ−１５、ＳＣＦおよびＩＬ−７の高用量サイトカイン組み合わせを含む分化Ｉ培地で培養する。  追加のＩＬ−２および／またはＩＬ−１２サイトカインを２、３または４週目後の３つの異なる時点で培養培地に添加する。１２の培養条件を右側にコード化されるように使用した。下線（＿）は、２〜３週目または３〜４週目までの週の経過を意味し、マイナス記号（−）は、その週に追加のサイトカインを添加しないことを意味する。
【図１８】：ＵＣＢ−ＥＣはＰＢＮＫ細胞よりも有意に高い腫瘍ＨＬＡ  ＡＢＣ阻害を克服する  子宮頸癌細胞上のＮＫ阻害性リガンドＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す代表的なヒストグラムプロット；２〜３の別々の分析の代表的なプロットを示す（Ａ）。（Ｂ）ＰＢＮＫ、（Ｃ）ＰＢＮＫ＋セツキシマブおよび（Ｄ）ＵＣＢ−ＥＣによるＨＬＡ−ＡＢＣのＭＦＩと細胞傷害性（Ａ７ＡＡＤ）％の相関分析。点線は回帰直線の９５％信頼区間を表す。ピアソン解析を用いてＰ値を計算した。
【図１９】：活性化ＵＣＢ−ＥＣ細胞は腫瘍ＨＬＡ−Ｅ阻害を克服する  ＨＬＡ−Ｅ過剰発現細胞株Ｓｉｈａ、ＣＣｌＯａおよびＣａｓｋｉに対するＵＣＢ−ＥＣ細胞の細胞傷害性を、Ｅ：Ｔ  １：１の比でＵＣＢ−ＥＣを標的と同時培養して試験した。標的細胞死（Ａ）およびＵＣＢ−ＥＣ脱顆粒（Ｂ）を定量化して、活性化ＰＢＮＫと比較して腫瘍標的を溶解するＵＣＢ−ＥＣの能力を決定した。同様に、次のレベルで、標的細胞死（Ｃ）およびＵＣＢ−ＥＣ脱顆粒（Ｄ）をＰＢＮＫ＋ＣＥＴ条件と比較した。提示されるデータは、４つの個々のＰＢＮＫ（網掛けバー）および５つのＵＣＢ−ＥＣ（斜線バー）ドナーからのものである；バーはＳＥＭを表す。平均±ＳＥＭを一元配置ａｎｏｖａを用いて計算し、各有意な条件をｐ＝＜０．０５＊、＜０．０１＊＊、＜０．００５＊＊＊、＜０．００１＊＊＊＊として表す。
【図２０】：活性化ＵＣＢ−ＥＣ細胞は腫瘍ＨＬＡ−Ｇ阻害を克服する  スクリーニングした子宮頸癌細胞株のパネルから、Ｓｉｈａ、ＣＣＩＯＡ、ＣＣ８およびＣＣＩＯＢが高レベルのＨＬＡ−Ｇを発現した。これらの標的に対する腫瘍溶解を開始するＵＣＢ−ＥＣの能力を、死細胞（Ａ）およびＵＣＢ−ＥＣ脱顆粒（Ｂ）の割合を定量化し、活性化ＰＢＮＫと比較することによって測定した。さらに、図Ｃおよび図Ｄに示されるように、これをＰＢＮＫ＋ＣＥＴ条件と比較した。提示されるデータは、４つの個々のＰＢＮＫ（網掛けバー）および５つのＵＣＢ−ＥＣ（斜線バー）ドナーからのものである；バーはＳＥＭを表す。平均±ＳＥＭを一元配置ａｎｏｖａを用いて計算し、各有意な条件をｐ＝＜０．０５＊、＜０．０１＊＊、＜０．００５＊＊＊、＜０．００１＊＊＊＊として表す。
【図２１】：ＵＣＢ−ＥＣによる子宮頸癌の不定の死滅はＨＰＶ型依存しない  ＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫ細胞単独ならびにＰＢＮＫ＋セツキシマブ（ＣＥＴ）の細胞傷害性を、異なるＨＰＶ型に基づいて１０種の子宮頸癌細胞株をグループ分けして比較した。子宮頸癌細胞株のＨＰＶ型によるＰＢＮＫ（開いたバー）、ＰＢＮＫ＋（ＣＥＴ）（閉じたバー）、およびＵＣＢ−ＥＣ（斜線バー）細胞傷害性レベル。バーは平均±ＳＥＭを表す。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８におけるＰＢＮＫおよびＰＢＮＫ＋ＣＥＴ条件と比較して高いＵＣＢ−ＥＣの殺傷を＊で示す。
【図２２】：ＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫ細胞による子宮頸部腫瘍の死滅は、腫瘍組織学から独立している  試験で使用される１０種の子宮頸癌細胞株を、それらの組織学的起源に従って分類した。  ＵＣＢ−ＥＣ、ＰＢＮＫ単独およびＰＢＮＫ＋セツキシマブの腫瘍細胞溶解を開始する能力を測定した。組織学的分類によるＰＢＮＫ（開いたバー）、ＰＢＮＫ＋セツキシマブ（ＣＥＴ）（閉じたバー）、およびＵＣＢ−ＥＣ（斜線バー）細胞傷害性レベル。バーは平均±ＳＥＭを表す。ＡＣ：腺癌；ＳＣＣ：扁平上皮癌；ＡＳＣ：腺扁平上皮癌。バーは平均±ＳＥＭを表し、扁平上皮癌および類表皮癌細胞型におけるＰＢＮＫおよびＰＢＮＫ＋ＣＥＴ条件と比較して高いＵＣＢ−ＥＣの殺傷を＊で示す。
【図２３】：ＥＧＦＲ発現およびＲＡＳｗ子宮頸癌細胞株に対するセツキシマブ単独療法  １０種の子宮頸癌細胞株を５μｇ／ｍｌのセツキシマブと３７℃で４時間インキュベートし、７ＡＡＤマーカーを用いて細胞死を監視することにより抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブに対する感受性を試験した。提示されるデータは、３つの独立した実験からのものである。バーは平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値を、列手段間の多重比較を用いた二元配置ａｎｏｖａを用いて計算する。平均±ＳＥＭを一元配置ａｎｏｖａを用いて計算し、各有意な条件をｐ＝＜０．０５＊、＜０．０１＊＊、＜０．００５＊＊＊、＜０．００１＊＊＊＊として表す。
【図２４】：腫瘍ＥＧＦＲおよびＲＡＳ型と無関係のＵＣＢ−ＥＣの殺傷  ＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫを、種々のレベルのＥＧＦＲを発現する子宮頸癌細胞株と共培養した。子宮頸癌標的をＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫと共にインキュベートし、ＥＧＦＲ高、低および陰性細胞株を溶解するその能力について測定することによって、細胞傷害性アッセイを行った。（Ａ）１０種の子宮頸癌細胞株に対するＰＢＮＫ（開いたバー）およびＵＣＢ−ＥＣ（斜線バー）の細胞傷害性レベル（Ａ７ＡＡＤ）。バーは、Ｃ３３Ａ、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣＣ１１Ｂ、ＣＣ１１Ａ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣＩＯＡ、ＣａＳｋｉについての４つの実験、ならびにＰＢＮＫを用いたＣＳＣＣ７およびＣＣ８についての２つの実験、ならびに全細胞株についてのＵＣＢ−ＥＣを用いた５つの実験の３連値の平均値である；バーはスチューデントＴ検定を用いて計算した平均±ＳＥＭを表す。ＰＢＮＫおよびＰＢＮＫ＋ＣＥＴ条件と比較して統計学的に有意な（ｐ＝＜０．０５）ＵＣＢ−ＥＣ細胞傷害性を＊で示す。
【図２５】：子宮頸癌細胞に対するＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫ細胞傷害性の比較  Ｃ３３Ａ、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣＣ１１Ｂ、ＣＣ１１Ａ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣＩＯＡ、ＣａＳｋｉについての４つの実験、ならびにＰＢＮＫを用いたＣＳＣＣ７およびＣＣ８についての２つの実験、ならびに全細胞株についてのＵＣＢ−ＥＣを用いた５つの実験の３連値の平均値は図（Ａ）に示される通りである。ＰＢＮＫと比較して、ＵＣＢ−ＥＣとの共培養後、全ての細胞株で有意に高い細胞傷害性レベル（Ａ７ＡＡＤ）が観察された。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００５は対応のあるスチューデントｔ検定を用いて計算した。
【図２６】：ＵＣＢ−ＥＣの殺傷および機能性はＰＢＮＫ＋ＣＥＴ条件に匹敵する  Ｃ３３Ａ、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣＣ１１Ｂ、ＣＣ１１Ａ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣＩＯＡ、ＣａＳｋｉについての４つの実験、ならびにＰＢＮＫおよびＰＢＮＫ＋ＣＥＴ条件を用いたＣＳＣＣ７およびＣＣ８についての２つの実験、ならびに全細胞株についてのＵＣＢ−ＥＣを用いた５つの実験の３連値の平均値は図（Ａ）に示される通りである。  ＰＢＮＫ単独条件と比較して有意に高いレベルのＮＫ脱顆粒（ＡＣＤ１０７ａ）が、ＰＢＮＫ＋ＣＥＴおよびＵＣＢ−ＥＣ条件で見られた。三角形は低いＥＧＦレベルを有する細胞株を示す、すなわちＣ３３Ａ、ＨｅＬａ、およびＳｉＨａ。＊＊Ｐ＜０．０１は一元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニの多重比較検定を用いて計算した。
【図２７】：ＰＢＮＫ細胞と同様のＤＮＡＭ−１およびＮＫＧ２Ｄに依存するＵＣＢ−ＥＣ殺傷機構  ＮＫ活性化リガンドＰＶＲ（ＤＮＡＭ−１受容体のリガンド）、ＭＩＣＡ／ＢならびにＵＬＢＰ１、−３および−２／５／６（ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド）についての幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すヒストグラムの代表例を図Ａに示す。（Ｂ）ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣを、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＤＮＡＭ−１ブロッキング抗体でコーティングし、Ｃ３３ＡおよびＳｉＨａ細胞と共にインキュベートした。  細胞傷害性レベル（Ａ７ＡＡＤ）を、４時間アッセイの最後に７ＡＡＤ＋Ｃ３３ＡおよびＳｉＨａ細胞から測定した。提示されるデータは３つの独立した実験からの３連値の平均である；バーは平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１は列手段の対応のある二元配置ＡＮＯＶＡ多重比較を用いて計算した。
【図２８】：ＵＣＢ−ＥＣ細胞は子宮頸癌細胞のＩＤＯ阻害効果を克服する  本発明に記載される免疫エフェクター細胞（ＵＣＢ−ＥＣ）は、阻害性ＩＤＯを過剰発現する子宮頸癌細胞ＣａｓｋｉおよびＳｉｈａを、７ＡＡＤ陽性標的細胞の割合によって示されるように活性化ＰＢＮＫ細胞よりも高レベルで死滅させることができる。提示されるデータは４つの独立した実験からの３連値の平均である；バーは平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊Ｐ＜０．００５は列手段の一元配置ＡＮＯＶＡ多重比較を用いて計算した。
【図２９】：ＣＲＣ細胞に対するＡ−ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＮＫ細胞のインビトロ細胞傷害性効果の比較（Ａ）様々なＥＧＦＲ発現レベルならびに異なるＲＡＳおよびＢＲＡＦ状態、ＣＯＬＯ３２０（ＥＧＦＲ−、ＲＡＳｗｔ）、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋、ＲＡＳｍｕｔ）およびＨＴ−２９（ＥＧＦＲ＋、ＲＡＳｗｔ、ＢＲＡＦｍｕｔ）のＣＲＣ細胞株を、２つの同種異系ＮＫ細胞産物、Ａ−ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＮＫ細胞を用いてＮＫ殺傷に供した。腫瘍細胞をＮＫ細胞とＥ：Ｔ比１：１、３７℃で４時間インキュベートして、ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイを行った。ＮＫ  ＡＤＣＣ効果を測定するために、セツキシマブでコーティングしたまたはコーティングしていないＣＲＣ細胞株を使用した。７ＡＡＤを使用して標的細胞死を決定し（Ａ）、ＣＤ１０７ａを使用して標的刺激でのＮＫ脱顆粒を定量化した（Ｂ）。ここに提示されるデータは、５人のＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＮＫ健常ドナーからのものである。実験を３連で行った。バーは平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１は列手段間の二元配置ＡＮＯＶＡ、多重比較を用いて計算した。
【図３０】：インビボでのＵＣＢ−ＮＫ細胞およびセツキシマブの組み合わせ試験の実験的タイムラインおよび試験設計  ２４匹のＢＲＧＳｗｔマウスを対照群と処理群に分けた。ＳＷ４８０（Ａ）は対照群であり、ＳＷ４８０＋セツキシマブ（Ｂ）、ＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＮＫ（Ｃ）およびＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＮＫ＋セツキシマブ（Ｄ）の処理群が続く。マウス１匹当たり０．５×１０６個のＧｌｕｃ形質導入ＳＷ４８０細胞を０日目に全ての群に静脈内投与した。腫瘍注射後１日目（投与Ｉ）に、Ｂ群およびＤ群マウスにマウス１匹当たり０．５ｍｇのセツキシマブを腹腔内投与し、Ｃ群およびＤ群に１０ｘ１０６個のＵＣＢ−ＮＫ細胞を静脈内注入した。それぞれの群について同濃度のセツキシマブおよびＵＣＢ−ＮＫ細胞を３日目（投与ＩＩ）および７日目（投与ＩＩＩ）に繰り返して、マウス１匹当たり合計１．５ｍｇのセツキシマブおよびマウス１匹当たり最大３０ｘ１０６個のＮＫ細胞注入とした。０．５μｇのＩＬ−１５を７．５μｇのＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒａ）と混合し、１、４、７、１０および１４日目にＵＣＢ−ＮＫ細胞群に投与した。治療効果を、血中Ｇｌｕｃレベルを用いて、１週間に２回血液２５μｌを採取することによって監視し、さらに腫瘍を３５日目に画像化した。
【図３１】：血中Ｇｌｕｃアッセイによって示されるＵＣＢ−ＮＫ細胞の有意な抗腫瘍効果  １週間に２回マウスの血液からＧｌｕｃレベルを測定して、腫瘍の進行および治療応答のリアルタイムモニタリングを行った。ベースラインＧｌｕｃ値を、腫瘍注射前日（−１日目）の全マウスから得て、３５日目までさらに監視を続けた。腫瘍注射後−１、４、７、１０、１４、１７、２０、２４、３０および３５日目に尾静脈から血液２５μｌを採取し、較正照度計を用いてＧｌｕｃ活性を取得した。統計解析のために、同様のＧｌｕｃレベルを有する群、ＳＷ４８０のみおよびＳＷ４８０＋セツキシマブを１つとして分類し、ＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＮＫおよびＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＮＫ＋セツキシマブ群の合わせたデータと比較した。Ｇｌｕｃレベルは、ＵＣＢ−ＮＫ処理群で有意に低下し、ＵＣＢ−ＮＫ群とＵＣＢ−ＮＫ＋セツキシマブ群との間に差異は観察されなかった。提示されるデータは、１群当たり６匹のマウスからのものである（ｎ＝６）。散布図は平均±ＳＥＭを表す。＊＊Ｐ＜０．０１３は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算した。
【図３２】：インビボでの生物発光イメージングによって明らかにされたＵＣＢ−ＮＫ細胞による腫瘍除去の成功  対照および処理群の４匹のマウスを腫瘍増殖について３５日目に画像化した。マウスにＧｌｕｃ基質セレンテラジンを後眼窩注射し、画像を５分間取得した。（Ａ）ＳＷ４８０対照およびＳＷ４８０＋セツキシマブ群では、腫瘍増殖が広がり、高度に散在性で、身体のほとんどの部分に広がったが、ＵＣＢ−ＮＫおよびＵＣＢ−ＮＫ＋セツキシマブ群では、腫瘍負荷が有意に低下し、これを図Ｂに示されるように群間の平均放射輝度を計算することによってさらに検証した（１群当たりｎ＝４マウス）。（Ｃ）ＥＧＦＲ＋＋＋ＲＡＳｗｔ  Ａ４３１細胞に対するセツキシマブの機能性を、ＢＲＧＳｗｔマウスにおいてＳＷ４８０試験と並行して試験した（１群当たりｎ＝３マウス）。図Ｂおよび図Ｃについて、バーは平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００５は、図Ｂについては列手段間の一元配置ＡＮＯＶＡ、多重比較を用いて、図Ｃについては対応のあるｔ検定を用いて計算した。
【図３３】：ＵＣＢ−ＮＫ細胞で処理したセツキシマブ耐性ＲＡＳ変異腫瘍保有マウスにおける有意な生存利益  Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を、０日目から６５日目までの全実験試験期間についてプロットした。腫瘍注射後１、４および７日目の、ＰＢＳのみ（黒色）、セツキシマブのみ（青色）、ＵＣＢ−ＮＫのみ（緑色）およびＵＣＢ−ＮＫ＋セツキシマブ（橙色）で処理した後のＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋、ＲＡＳｍｕｔ）腫瘍保有マウス（１群当たりｎ＝６）。ＵＣＢ−ＮＫ処理群の生存利益は、ＰＢＳ対照群およびセツキシマブ処理群と比較して統計学的に有意であった。グループ間の統計的有意差を、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を用いて計算し、図の下部に示した。
【実施例】
【０１３８】
[実施例１]
体外で生成された同種異系免疫エフェクター細胞を、シクロホスファミド／フルダラビン（Ｃｙ／Ｆｌｕ）コンディショニング後の予後不良急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者に注入する。この免疫抑制コンディショニングレジメンは、拒絶反応を予防するために必要であり、注入された免疫エフェクター細胞のインビボ寿命延長および増殖を促進するＩＬ−１５などの免疫エフェクター細胞生存因子を誘導することが示されている。免疫エフェクター細胞産物は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）発現が７０％超であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞がほとんどなく、それによってドナーＴ細胞媒介性ＧＶＨＤを最小化する。試験参加者は、臨床的および免疫学的評価を受ける。１回または２回の誘導化学療法コース後の完全寛解（骨髄における５％未満の芽球）を達成した後、患者を、血清学的試験およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ）によってＨＬＡクラスＩ対立遺伝子について分類し、標準的Ｌｕｍｉｎｅｘプロトコルを用いて抗ＨＬＡ抗体の非存在について試験する。適格ＡＭＬ患者は、抗ＨＬＡ抗体を持たず、抗原レベルでＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂについての利用可能なＨＬＡ一致を示す同種異系非ハプロタイプ一致ＵＣＢ単位が５０のランダムに選択されたＵＣＢ単位のプールに見出され得る患者である。ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰ一致は、ＵＣＢ単位選択に使用しなかった。割り当て直後に、強化療法を標準プロトコルに従って行いながら、利用可能なＵＣＢ単位を、体外免疫エフェクター細胞増殖のための適切なドナーを選択するためにスクリーニングする。
【０１３９】
免疫エフェクター注入の６週間前に、適切な同種異系ＵＣＢ単位を解凍し、免疫磁気粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に結合したＣＤ３４と結合させた後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ細胞分離装置を使用して、ＣＤ３４＋細胞を濃縮する。濃縮ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞を、検証された手順７２に従って、分化および増殖を介して、ＮＣＡＭ陽性免疫エフェクター細胞産物の体外生成に使用する。細胞単離、濃縮および培養手順は、ＪＡＣＩＥ、ＮＥＴＣＯＲＤ  ＦＡＣＴガイドラインならびにＥＵ指令２００１／８３および２００９／１２０に従って確立されたＳＯＰを用いて、クリーンルーム内で医薬品製造品質管理基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）条件下で実施する。
【０１４０】
同種異系ドナーからのＣＤ３４＋臍帯血（ＵＣＢ）細胞からの不一致の体外で生成された免疫エフェクター細胞を用いた、第Ｉ相用量漸増試験としての臨床試験（図１ならびに表１および２）。
【０１４１】
【表１】
2019501956.tif 000002
【０１４２】
ドナーと患者の間の差異を特定するために、ＨＬＡ分類を行った。一致した遺伝子型を下線付き太字で示す。
【０１４３】
【表２】
2019501956.tif 000003
【０１４４】
ドナーと患者を、ＫＩＲおよびＨＬＡについて分類する。ＫＩＲについて欠損したＨＬＡリガンドを同定し、表に要約する。さらに、全てのドナーのＫＩＲハプロタイプを、ＫＩＲ分類に基づいて決定した。
【０１４５】
ＤＮＡ多型を識別するために、Ｑ−ＰＣによってドナーキメラ現象を測定した。免疫エフェクター細胞の増殖および表現型をフローサイトメトリーによって分析した。ＭＲＤをフローサイトメトリーおよび分子技術によって評価した。２〜３の標準的化学療法コース（ｎ＝６）、または１つの標準的な化学療法コース、続く低メチル化剤（アザシチジンまたはデシタビン）による処置（ｎ＝６）後の形態的ＣＲに１２人のＡＭＬ患者（６８〜７６歳）を全て含めた。患者を、Ｃｙ／Ｆｌｕおよび漸増量の部分的ＨＬＡ一致ＵＣＢ由来免疫エフェクター細胞で処理した。４人の患者は予後良好／中等度のリスク、４人は予後不良および４人は極めて予後不良のＡＭＬを有していた。現在まで、９人の患者は１ｘ１０４／ｋｇ未満のＣＤ３＋Ｔ細胞および３ｘ１０５／ｋｇ未満のＣＤ１９＋Ｂ細胞と共に、中央値７４％の高度に活性化されたＮＣＡＭ陽性、ＣＤ３陰性免疫エフェクター細胞を含む組成物を受けた。残りの細胞は、ＣＤ１４＋および／またはＣＤ１５＋単球細胞ならびに骨髄球細胞であった。フォローアップは、免疫エフェクター細胞に起因するＧＶＨＤも毒性も示さなかった。強化療法からの血液学的回復から２週間後、および体外で生成した免疫エフェクター細胞産物の注入の６日前に、ＡＭＬ患者は、−６、−５、−４、−３日にシクロホスファミド（９００ｍｇ／ｍ２／日）およびフルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２／日）からなる静脈内非骨髄破壊免疫抑制を受ける。このＣｙ／Ｆｌｕレジメンを入院患者入院設定に投与する。体外で生成された免疫エフェクター細胞産物の注入の６日前に非骨髄破壊免疫抑制を開始し、患者は、葉酸（１ｄｄ  ５ｍｇ）と組み合わせたシプロフロキサシン（好中球減少の回復まで２ｄｄ  ５００ｍｇ）、バラシクロビル（化学療法開始の１２ヶ月後）およびコトリモキサゾール（１ｄｄ  ４８０ｍｇ）からなる日和見感染症予防を受ける。８日目に、患者は好中球減少を短縮するためにペグフィルグラスチム（６ｍｇ  ｓ．ｃ．）の単回投与を受ける。
【０１４６】
このようにして免疫抑制され、処置された患者は、化学療法の最終投与の２日後（０日目）に免疫エフェクター細胞の３０分間静脈内注入を受ける。３人の患者のコホートにおいて、免疫エフェクター細胞を、３ｘ１０６、１０ｘ１０６および３ｘ１０７個の免疫エフェクター細胞／ｋｇ体重の漸増用量で注入する。注入前に、患者は、経口的アセトアミノフェン５００ｍｇおよび静脈内クレマスチン２ｍｇからなる前投薬を受ける。身体検査、毒性スコアおよび標準的血液検査、例えばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ヘマトクリット（Ｈｔ）、全血球数（ＣＢＣ）、分化、血小板、血清ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜リン酸、クレアチニン、ビリルビン、アルブミン、全タンパク質、アルカリホスファターゼ、γグルタミルトランスペプチダーゼ（ｇＧｔ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＡＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、尿素）を含めて患者を評価する。治療への応答を調べるために、患者からの末梢血（予備試験、免疫エフェクター細胞注入後４時間、１日目、２日目、５日目、７日目、１４日目、２８日目および５６日目）および骨髄穿刺液（予備試験、免疫エフェクター細胞注入の７日後、３ヶ月後および６ヶ月後）を回収する。
【０１４７】
ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞を、血液学の実験室のクリーンルーム施設で実施される幹細胞実験室のＪＡＣＩＥ標準に従って濃縮する。液体窒素中に保存したＵＣＢ単位を３７℃で解凍し、５％ＨＳＡ、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ  ２および１００Ｕ／ｍｌ  Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（臨床グレードＤＮアーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、Ｗｏｅｒｄｅｎ、オランダ）を含有するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）に再懸濁する。全培地は臨床グレードであり、この目的のために使用することができる。３０分のインキュベーション後、ＵＣＢ細胞を洗浄し、製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）によって与えられる標準的な手順に従って、免疫磁気粒子に結合したＣＤ３４と結合させた後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ細胞分離装置を用いてＣＤ３４＋細胞を濃縮する。
【０１４８】
免疫エフェクター細胞産物を、確立されたプロトコル７２に従ってＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞から生成する。要約すると、１０％ウイルスフリーヒト血清（Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ）、２５ＥＨｇ／ｍｌの低分子量ヘパリン（Ｃｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）、Ｆｌｅｘｙｘ）およびＧＭＰグレードの組換えＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−７（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｐｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（２５０ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（５０ｐｇ／ｍｌ）（サイトカインはＣｅｌｌＧｅｎｉｘ製である）を含有する臨床グレードのＧｌｙｃｏｓｔｅｍ基礎増殖培地（ＧＢＧＭ）（Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｅｒｎｅｍ、ベルギー）中ＶｕｅＬｉｆｅＴＭ培養バッグ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で濃縮ＣＤ３４＋細胞を培養する。９日目に、ＴＰＯをＩＬ−１５（２０ｎｇ／ｍｌ）に置き換える。１０日目から、ＣＤ３４＋細胞は、ＧＢＧＭ培地、１０％ヒト血清、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−７（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｐｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（２５０ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（５０ｐｇ／ｍｌ）中で免疫エフェクター細胞に分化する。細胞培養物を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で維持する。最終的な免疫エフェクター細胞産物を洗浄し、注入緩衝液（１０％ＨＳＡを含む０．９％塩化ナトリウム）に再懸濁する。細胞培養は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、遠心分離器、ＣＯ２インキュベーター、顕微鏡および自動セルカウンターなどの必要な全ての装置を備えた血液学の実験室のクリーンルーム施設で、ＧＭＰ標準に従って行う。
【０１４９】
体外で生成した免疫エフェクター細胞産物を、以下の放出基準について試験する。
微生物学的制御：細菌、真菌およびマイコプラズマ汚染について陰性である。
表現型：フローサイトメトリーによって決定される自然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ＋）、ＣＤ９４＋、ＣＤ１５９ａ＋、ＣＤ３１４＋成熟免疫エフェクター細胞。
純度：フローサイトメトリーによって決定される７０％超のＮＣＡＭ＋免疫エフェクター細胞。
Ｔ細胞の汚染：患者の最大体重２００ｋｇで約２×１０６個未満の全Ｔ細胞である患者の体重１ｋｇ当たり１ｘ１０４個未満のＣＤ３＋Ｔ細胞。
Ｂ細胞の汚染：患者の最大体重２００ｋｇで約６×１０７個未満の全Ｔ細胞である患者の体重１ｋｇ当たり３ｘ１０５個未満のＣＤ１９＋Ｂ細胞。
生存率：７−ＡＡＤ排除によって決定される７０％超。
結果は表３を参照されたい。
【０１５０】
[実施例２]
入院患者入院設定で−６、−５、−４、−３日目にシクロホスファミド（９００ｍｇ／ｍ２／日）およびフルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２／日）からなる静脈内非骨髄破壊免疫抑制を受けた実施例１による患者群。
【０１５１】
注入の前および治療の評価中に、以下の試験を行う。
−病歴、身体検査（バイタルサインおよび活動指標を含む）、毒性評価、完全な血球数および生化学。
−ヘパリン添加血および血清用の血液を免疫学的試験のために得る。
−ＥＤＴＡ血液をＡＭＬ−ＭＲＤ分析のために得る。
−ＥＤＴＡ血液をキメラ現象分析のために得る。
−細胞注入７日、３ヶ月および６ヶ月後に骨髄穿刺を行って、形態学的、免疫表現型および分子分析によりキメラ現象および疾患状態を評価する。この試験の主要評価項目は、Ｃｙ／Ｆｌｕコンディショニング後の体外で生成された免疫エフェクター細胞の漸増用量注入の安全性および毒性を評価することである。免疫エフェクター細胞を、体重１ｋｇ当たり３×１０６個、１０×１０６個および３×１０７個のエフェクター細胞の漸増用量で注入する。この試験で合計１０人の患者を治療する（表４）。
【０１５２】
【表３】
2019501956.tif 000004
【０１５３】
【表４】
2019501956.tif 000005
【０１５４】
免疫エフェクター療法で治療した患者に固有の患者番号（ＵＰＮ）を与えた。急性骨髄性白血病の型に言及し、既知の分子異常を与える。さらに、表は、ドナーＫＩＲ−Ｌ不一致を示すレシピエント細胞上の欠損ＫＩＲリガンドを要約している。さらなるドナーＫＩＲハプロタイプを記載し、細胞注入前の疾患状態を列挙する。１人の患者は治療前３回目の臨床的寛解（ＣＲ）にあった。他の全ての患者は、最初のＣＲを有していた。
【０１５５】
免疫抑制コンディショニングレジメンおよび細胞注入の毒性を別々に評価する。全ての患者を、ＣＴＣＡＥ毒性基準を使用するコンディショニングレジメンによって引き起こされる毒性およびＧＶＨＤについて集中的に評価する。重度の毒性は報告されていないが、コンディショニングレジメンのために一時的な血球減少が監視される（図２）。さらに、この処置は、血液試料からの細胞−核計数器を使用することによって分析されるように、最大１４日までのリンパ球数の減少を示す。血清レベルに対するＥｌｉｓａアッセイは、リンパ球枯渇後のＩＬ−１５値の上昇を示す（全て図３、表５）。
【０１５６】
両効果は、１４日間の細胞注入後に正常レベルに戻される。さらに、様々な時点からの血液試料を用いて、ドナー細胞キメラ現象に従ってＳＮＰ−ＰＣＲによって患者を監視する。全患者が、最大１４日目まで細胞注入後のキメラキメラ現象増加を示し、１４日目後、ドナー細胞キメラ現象は末梢血ではそれ以上検出されない（図４および表４）。さらに、細胞注入後７／８日目の骨髄試料において、同じ方法を用いたキメラ現象分析は、おそらく白血病が起こる部位ある患者の骨髄でドナー細胞が検出されることを明らかに示している（図４、表６）。
【０１５７】
【表５】
2019501956.tif 000006
【０１５８】
【表６】
2019501956.tif 000007
【０１５９】
合計全血球（ＷＢＣ）または骨髄（ＢＭ）の％でのドナーキメラ現象を示す。一塩基多型（ＳＮＰ）Ｑ−ＰＣＲ分析によって分析を行った。（＊）の付いた数字は、抗ＨＬＡ−Ｂ１３抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定した。ＮＥ＝低ＤＮＡ量のため評価不能
【０１６０】
[実施例３]
治療を受ける患者を実施例１および２に記載されるように試験で選択およびコンディショニングし、注入されたエフェクター細胞を、以前の研究７７で使用されたように抗ＮＣＡＭおよびＣＤ３（図５）などのモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーによって追跡する。ＵＣＢ由来免疫エフェクター細胞の一時的な再増殖および持続を注入後１日から８日の間に患者の末梢血において検出することができ、これはほとんどの患者で観察されたＩＬ−１５血漿レベルの上昇と関連していた。興味深いことに、高用量の注入ＵＣＢ由来免疫エフェクター細胞でドナーキメラ現象が増加し、７／８日目に骨髄（ＢＭ）で最大３．５％のドナーキメラ現象が認められた。インビボでのさらなるＵＣＢ免疫エフェクター細胞の成熟が、ＣＤ１６およびＫＩＲの獲得によって観察され、活性化受容体の発現が維持された。これまで治療を受けた患者９人のうち、５人（５６％）が４３、３５、３１、５および４ヶ月後に依然としてＣＲであるのに対して、４人の患者が５、６（２ｐｔｓ）および１５ヶ月後に再発した。アザシチジン処置中の形態学的ＣＲにかかわらず、２人の患者のＢＭへの免疫エフェクター細胞注入の前に、フローサイトメトリーによって白血病関連表現型を有する６〜７％の残存病変を検出することができた。両患者で、ＭＲＤが、Ｆｌｕ／Ｃｙコンディショニング後のＵＣＢ由来免疫エフェクター細胞療法の９０日後に０．０５％未満に減少した。これらの結果は、免疫抑制化学療法後、非移植適格ＡＭＬ患者に、最大３０ｘ１０６個の免疫エフェクター細胞／ｋｇ体重を含むＧＭＰ準拠のＵＣＢ由来免疫エフェクター細胞を安全に注入できることを示している。さらに、これらの患者の中には最小限の残存病変しか検出されておらず、このような白血病性芽球の潜在的クローンを、フローサイトメトリーによって分析される白血病関連表現型（ＬＡＰ）ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７−／ＣＤ１３３＋によって記載した７８。本発明の細胞産物を用いた免疫療法後、６．７％から０．０１％未満の検出不能限界に向かって白血病性芽球数の減少を観察することができた（図６）。ＵＰＮ８では、白血病性芽球の潜在的クローンを白血病関連表現型（ＬＡＰ）ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ７＋／ＣＤ１３３＋によって記載した。本発明の細胞産物を用いた免疫療法後、６．３％から０．０２％のほぼ検出不能限界に向かって白血病性芽球数の減少を観察することができた（図７）。さらに、これらの患者を、細胞療法処置後に追跡し、再発および生存について監視した。高齢のＡＭＬ患者の歴史的生存と比較して、処置された患者群で優れた生存が観察された（図８、表７）。また、再発率は、患者のわずか５０％超が再発しているに過ぎないので、これらの患者にとっての有益性を示している（図９、表７）。
【０１６１】
【表７】
2019501956.tif 000008
【０１６２】
[実施例４]
以前記載された７６基本的プロトコルに従ってフローサイトメトリーに基づく細胞傷害性および脱顆粒アッセイを用いた、ＰＢＮＫ細胞と比較したエフェクター細胞の抗腫瘍効果。
【０１６３】
より詳細には、抗ＥＧＦＲ療法が無効であると予想され得る結腸癌細胞株ＣＯＬＯ３２０（ＥＧＦ−、ＲＡＳｗｔ）、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋、ＲＡＳｍｕｔ）およびＨＴ２９（ＥＧＦＲ−、ＲＡＳｗｔ、ＢＲＡＦｍｕｔ）を、臍帯血で生成されるエフェクター細胞（ＵＣＢ−ＥＣ）と末梢血で活性化されるナチュラルキラー細胞（ＰＢＮＫ）の殺傷の比較に供する。結果から、ＲＡＳｗｔとＲＡＳｍｕｔ結腸癌細胞の両方がＰＢＮＫ細胞よりもＵＣＢ−ＥＣ殺傷に対して感受性であることが自明である。ＵＣＢ−ＥＣ細胞のもう１つの重要な態様は、それらがＨＬＡ−Ｅ耐性を克服することであり、例えば、ＳＷ４８０細胞は、しばしばＨＬＡ−Ｅ発現が高く、ＰＢＮＫ細胞より優れた死滅になる。これらのデータは、ＵＣＢ−ＥＣ細胞が、腫瘍がＲＡＳｍｕｔまたはＥＧＦＲ−を保有する状況でさえ、結腸癌療法の効果を改善する可能性を有することを示している。
細胞株
【０１６４】
細胞株Ａ４３１（類表皮癌）、Ｃｏｌｏ３２０、ＳＷ４８０（結腸直腸癌）およびＨｅｌａ、Ｓｉｈａ、Ｃａｓｋｉ、Ｃ３３Ａ、ＣＳＣＣ７、ＣＣ８、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣ１１Ａ、ＣＣ１１Ｂ（子宮頸癌）を、ＡＴＣＣまたは患者由来細胞株（Ｌｅｉｄｅｎ大学）の細胞ストックから得て、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｔｅｇｒｏ、Ｚａａｎｄａｍ、オランダ）を含有するダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）で培養する。細胞培養物を５日ごとに継代し、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーター中で維持する。
全血検体からの末梢血ＮＫ細胞の単離および活性化
【０１６５】
健康なボランティアからの全血を、書面でのインフォームドコンセントと共に回収する。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）密度勾配遠心分離を用いて単核細胞（ＭＮＣ）を単離する。製造業者の指示に従って、ＭＡＣＳ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いてＰＢＮＫ細胞をＭＮＣから単離する。単離されたＮＫ細胞画分の細胞数および純度を、フローサイトメトリーによって分析する。単離されたＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイに使用するために、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で一晩活性化する。ＮＫ細胞の純度および生存率を、ＣＤ３  ＰＥ、７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０およびＣＤ１６  ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて確認する。前に言及した、活性化後の予備的パラメータは、それぞれＮＫ純度（ＣＤ５６＋％、８３±９％および８２±９％）、ＮＫ  ＣＤ１６％８８±１０％および８５±１１％およびＮＫ生存率（９１±３％および８６±２％）である。
ＵＣＢ−ＥＣ細胞培養物
ＣＤ３４陽性前駆細胞の体外増殖
【０１６６】
ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞（１×１０４〜３×１０５個／ｍｌ）を、１０％ヒト血清（ＨＳ；Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ、オランダ）、２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−７（全てＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補充したＧＢＧＭ中２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に蒔く。９日目〜１４日目に、ＴＰＯを、増殖培養物中２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）に置き換える。培養の最初の１４日間中、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）（Ｃｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）を、最終濃度２５μｇ／ｍｌで、また１０ｐｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）からなる低用量サイトカインカクテルを増殖培地に添加する。細胞培養物を２〜３日ごとに新しい培地で再生する。培養物を３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーターで維持する。
体外で増殖したＣＤ３４陽性細胞のＵＣＢ−ＥＣ細胞への分化
【０１６７】
増殖したＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞を分化させ、エフェクター細胞分化培地を用いてさらに増殖させる。この培地は、２％ＨＳ、低用量サイトカインカクテル（前述）および２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、ＳＣＦ、ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）からなる新たな高用量サイトカインカクテルを補充した、ＣＤ３４増殖ステップに使用されるのと同じ基礎培地からなり、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（ＰｒｏｌｅｕｋｉｎＲ；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）を分化培地に添加する。培地を、１４日目以降、週２回再生する。
フローサイトメトリー
【０１６８】
フローサイトメトリー分析をＢＤ  ＬＳ  ＦＯＲＴＥＳＳＡ  Ｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行う。細胞数および細胞表面マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって決定する。生存細胞の細胞数および集団を、順方向散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）に基づいてＣＤ４５＋細胞をゲーティングすることによって決定する。表現型を分析するために、細胞をＦＳＣ／ＳＳＣ上でのみゲーティングし、対象となる特異的抗原についてさらに分析した。細胞を、適切な濃度の抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁する。
フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性および脱顆粒試験
【０１６９】
フローサイトメトリーを、細胞傷害性アッセイの読み出しに使用する。標的細胞を１×１０７個細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１０分間、５μＭパシフィックブルースクシニミジルエステル（ＰＢＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）で標識する。等体積のＦＣＳを添加し、引き続いて室温で２分間インキュベートすることにより反応を停止し、その後、染色細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで２回洗浄する。洗浄後、細胞を最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに懸濁する。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＧｌｙｃｏｓｔｅｍ  Ｂａｓａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＢＧＭ）＋２％ＦＣＳに懸濁する。標的細胞を、９６ウェル平底プレート中、総体積２５０μｌで、Ｅ：Ｔ比１：１でエフェクター細胞と共培養する（１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中５×１０４個の標的を、２５μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳおよびＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地をさらに補充した１００μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳ中５×１０４個のエフェクターとインキュベートする）。ＰＢＮＫ細胞、ＵＣＢ−ＥＣ細胞および標的細胞のみを対照として３連で蒔く。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞による脱顆粒を測定するために、抗ＣＤ１０７ａ  ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を１：２０希釈でウェルに添加する。３７℃で４時間インキュベートした後、７５μｌの上清を回収し、サイトカイン産生を分析するために−２０℃で保存する。残りの容量の細胞を採取し、７ＡＡＤ（１：２０）で染色する。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞の脱顆粒を、ＣＤ１０７ａの細胞表面発現を検出することによって測定する。３７℃で４時間インキュベートした後、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０（１：２５）およびＣＤ１６  ＡＰＣ（１：２５）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を共培養物に添加し、ＮＫ  ＣＤ１０７ａ脱顆粒をＣＤ５６＋ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞について測定する。
統計解析
【０１７０】
統計解析を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行う。条件間の差異は、列手段間の多重比較を用いた二元配置Ａｎｏｖａを用いて決定する。細胞傷害性実験の結果を、平均±平均の標準偏差（ＳＤ）として記載する。０．０５未満のｐ値を統計学的に有意とみなす。
【０１７１】
結果は、類表皮癌（図１０）ならびに結腸癌（図１１）および子宮頸癌（図１２）に対して、ＰＢＮＫに対するＵＣＢ−ＥＣの有意に優れた殺傷を示す。
【０１７２】
[実施例５]
エフェクター細胞の抗腫瘍効果を、フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性および脱顆粒アッセイを用いて試験する。骨髄腫癌細胞Ｋ５６２（ＣＭＬ）、Ｕ２６６（多発性骨髄腫）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｔ細胞ＡＬＬ）、ＭＯＬＴ４（Ｔ細胞ＡＬＬ）および固形腫瘍細胞、例えばＭＩＡ  ＰａＣａ−２（腺管癌）およびＮＣＩ−Ｈ８２（小細胞癌）を、実施例４に記載されるのと同じ方法に従って、臍帯血エフェクター細胞（ＵＣＢ−ＥＣ）による殺傷アッセイに使用する。
細胞株
【０１７３】
１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｔｅｇｒｏ、Ｚａａｎｄａｍ、オランダ）を含有するＩＭＤＭまたはダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）で細胞株を培養する。細胞培養物を５日ごとに継代し、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーター中で維持する。
ＵＣＢ−ＥＣ細胞培養物
ＣＤ３４陽性前駆細胞の体外増殖
【０１７４】
より具体的には、ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞を、１０％ヒト血清（ＨＳ；Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ、オランダ）、２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−７（全てＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補充したＧｌｙｃｏｓｔｅｍ基礎増殖培地（ＧＢＧＭ）（Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｅｒｎｅｍ、ベルギー）中２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に蒔く。９日目〜１４日目に、ＴＰＯを、増殖培養物中２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）に置き換える。培養の最初の１４日間中、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）（Ｃｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）を、最終濃度２５μｇ／ｍｌで、また１０ｐｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）からなる低用量サイトカインカクテルを増殖培地に添加する。細胞培養物を２〜３日ごとに新しい培地で再生する。培養物を３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーターで維持する。
体外で増殖したＣＤ３４陽性細胞のＵＣＢ−ＥＣ細胞への分化
【０１７５】
増殖したＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞を分化させ、エフェクター細胞分化培地を用いてさらに増殖させる。この培地は、２％ＨＳ、低用量サイトカインカクテル（前述）および２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、ＳＣＦ、ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）からなる新たな高用量サイトカインカクテルを補充した、ＣＤ３４増殖ステップに使用されるのと同じ基礎培地からなり、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）を分化培地に添加する。培地を、１４日目以降、週２回再生する。
フローサイトメトリー
【０１７６】
フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行う。細胞数および細胞表面マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって決定する。生存細胞の細胞数および集団を、順方向散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）に基づいてＣＤ４５＋細胞をゲーティングすることによって決定する。表現型を分析するために、細胞をＦＳＣ／ＳＳＣ上でのみゲーティングし、対象となる特異的抗原についてさらに分析する。細胞を、適切な濃度の抗体と共に４℃で３０分間インキュベートする。洗浄後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁する。
フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性および脱顆粒試験
【０１７７】
フローサイトメトリーを、細胞傷害性アッセイの読み出しに使用する。標的細胞を１×１０７個細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１０分間、５μＭパシフィックブルースクシニミジルエステル（ＰＢＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）で標識する。等体積のＦＣＳを添加し、引き続いて室温で２分間インキュベートすることにより反応を停止し、その後、染色細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで２回洗浄する。洗浄後、細胞を最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに懸濁する。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＧｌｙｃｏｓｔｅｍ  Ｂａｓａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＢＧＭ）＋２％ＦＣＳに懸濁する。標的細胞を、９６ウェル平底プレート中、総体積２５０μｌで、Ｅ：Ｔ比１：１または５０：１でエフェクター細胞と共培養する（１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中５×１０４個の標的を、２５μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳおよびＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地をさらに補充した１００μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳ中５×１０４個のエフェクターとインキュベートする）。ＰＢＮＫ細胞、ＵＣＢ−ＥＣ細胞および標的細胞のみを対照として３連で蒔く。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞による脱顆粒を測定するために、抗ＣＤ１０７ａ  ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を１：２０希釈でウェルに添加する。３７℃で４時間インキュベートした後、７５μｌの上清を回収し、サイトカイン産生を分析するために−２０℃で保存した。残りの容量の細胞を採取し、７ＡＡＤ（１：２０）で染色する。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞の脱顆粒を、ＣＤ１０７ａの細胞表面発現を検出することによって測定する。３７℃で４時間インキュベートした後、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０（１：２５）およびＣＤ１６  ＡＰＣ（１：２５）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を共培養物に添加し、ＮＫ  ＣＤ１０７ａ脱顆粒をＣＤ５６＋ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞について測定した。
【０１７８】
結果は、ＵＣＢ−ＥＣによる様々な骨髄腫瘍（図１３）および固形腫瘍細胞株（図１４）の高い死滅を示す。
【０１７９】
[実施例６]
ＦｃＲγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）の発現レベルを標準的なフローサイトメトリーを用いて分析する実験。実施例１および２に記載されるように臨床研究で使用される全ての細胞産物は低いＦｃＲγＩＩＩａ発現を示す（図１５）。さらに、臍帯血から生成された免疫エフェクター細胞をナチュラルキラー細胞（ＰＢＮＫ）と比較する。一晩のＩＬ−２刺激後でさえ、１０００Ｕ／ｍｌのＧＢＧＭ培地ＰＢＮＫは高いＣＤ１６発現のままである（図１６）。第１のステップで、前駆細胞の増殖ならびに機能的ＥＣ細胞の分化に使用することができる新たな無血清培地を開発した。具体的には、この培地に、ヒトまたは組換えヒトタンパク質のみを配合し、臨床または医薬品生産への橋渡しを可能にする。臨床グレードのヘパリンと組み合わせた補助サイトカインカクテルの体系的な洗練化は、非常に効率的な細胞培養プロトコルにつながる。ＮＣＡＭ陽性、ＣＤ３陰性ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物を、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠く、１５０００倍超の平均増殖率および純度ほぼ１００％で、新たに単離されたＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞から実験室規模で、日常的に生成することがでた。比較的高い割合のこのＮＣＡＭ陽性、ＣＤ３陰性ＥＣ細胞集団は阻害性ＣＤ９４／ＥＣＧ２Ａ複合体（５０〜９０％）を発現したが、中間サブセットのみがＣＤ１６について低陽性であった。さらに、ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物は、ＨＬＡ−Ｃｗグループ２対立遺伝子（ＫＩＲ２ＤＬ１／ＤＳ１）、ＨＬＡ−Ｃｗグループ１対立遺伝子（ＫＩＲ２ＤＬ２／ＤＳ２）およびＨＬＡ−Ｂｗ対立遺伝子（ＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＳ１）の両方に特異的なＫＩＲ受容体を発現する約５〜１０％のＥＣ細胞サブセットを含んでいた。さらに、ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物は、ＩＬ−２（ＣＤ２５；ＩＬ−２Ｒ）、ＳＣＦ（ＣＤ１１７）、ＩＬ−７（ＣＤ１２７；ＩＬ−７Ｒ）およびＩＬ−１５（ＣＤ１２２；ＩＬ−１５Ｒ）に対するいくつかのサイトカイン受容体鎖ならびに注入されたＥＣ細胞のインビボでの増殖および移動に重要となり得るケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３）を発現する。これらのデータは、最終的なＮＣＡＭ陽性ＣＤ３陰性ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物が、活性化および抑制性ＥＣ細胞受容体ならびに細胞生存に重要なサイトカイン受容体の発現に関する活性化表現型を示すことを示している。
【０１８０】
臍帯血（ＵＣＢ）造血幹細胞からのＥＣ細胞の体外増殖のための新規なサイトカインおよびヘパリンに基づく培養プロトコルを、完全に閉鎖された大規模細胞培養バイオプロセスに変換した７２。閉鎖されたプロセスを用いて、凍結保存された「既製の」ＵＣＢ製品からのＣＤ３４＋選択の最適化などのハードルを達成することによって、種々のバイオリアクターシステムを試験して、多数のＥＣ細胞を生成するための完全に閉鎖された細胞培養プロセスを開発および最適化した。予後不良のＡＭＬ患者において養子免疫療法にＵＣＢ−ＥＣ細胞産物を利用するために、この方法を、ＧＭＰ条件下でＵＣＢ−ＥＣ細胞産物バッチを製造するための閉鎖系バイオプロセスに適合させた。ガス透過性培養バッグを用いた大規模実験は、最初に、二段階増殖および分化プロトコルが、平均純度７０％で、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ細胞分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって濃縮されたＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞からＮＣＡＭ陽性、ＣＤ３陰性ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物細胞を再現性よく生成することを実証した。これらの培養物中の汚染細胞は、成熟骨髄細胞を表していた。汚染Ｔ細胞およびＢ細胞の数は非常に低かった（それぞれ０．０１％未満のＣＤ３＋細胞および０．０１％未満のＣＤ１９＋細胞）。ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（登録商標）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＥＣ細胞増殖ステップのさらなるアップスケールにより、１〜１０×１０６個のＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞から１〜１０×１０９個のＥＣ細胞を生成することができ、また純度を９０％超のＮＣＡＭ  ＣＤ３−ＥＣ細胞まで増加させることができた。広範な製品放出試験および下流処理により、ＥＣ細胞免疫療法製品の安全かつ十分に制御された放出が保証される。ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物を、滅菌性、生存率、ならびに培養培地からのエンドトキシンおよび残存サイトカインの非存在についてさらに試験したが、４つの試験は全て放出基準を通過した。さらに、広範な核型分類試験では異常は示されず、洗浄後８０％超の細胞回収も許容できる結果を示した。これらの結果は、養子免疫療法のための多数のＵＣＢ−ＥＣ細胞産物を、臨床試験において使用するための閉鎖された大規模バイオリアクターで生成することができることを実証している。
【０１８１】
[実施例７]
ＣＭＬ  Ｋ５６２ならびにＡＭＬ細胞株ＫＧ  ｌａおよびＴＨＰ−１（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｗｅｓｅｌ、ドイツ）を３７℃で解凍し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｔｅｇｒｏ、Ｚａａｎｄａｍ、オランダ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）に再懸濁した。培養物を、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２で５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＰＳ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、米国）および１０％ＦＣＳを補充したＩＭＤＭ中Ｔ２５またはＴ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）に入れた。培地を３または４日ごとに再生して、細胞を２×１０５〜３×１０５個細胞／ｍＬの密度で置いた。
【０１８２】
単核細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  １０７７  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により勾配を使用して、臍帯血（ＵＣＢ；臍帯血バンクラドバウド大学ナイメーヘン医療センター（ＲＵＮＭＣ））から選択した。赤血球を溶解緩衝液で１０分間インキュベートすることによって溶解した後、白血球を遠心沈殿し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１μｌのＣＤ３４−ＰＣ７（５８１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国）で染色することによってＣＤ３４＋細胞について確認した。ＣＤ３４＋細胞を、製造者のプロトコルに従って、抗ＣＤ３４免疫磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて選択した。ＣＤ３４＋およびＣＤ３４＋細胞を、１：１ヒト血清（ＨＳ；Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｅｄｂａｎｋ、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ）および７％ＤＭＳＯを含有するＧｌｙｃｏｓｔｅｍ基礎増殖培地（ＧＢＧＭ、Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｅｒｎｅｍ、ベルギー）に別々に再懸濁し、液体窒素中で保存した。
【０１８３】
ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞を３７℃で解凍し、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００μｌ  ＤＮアーゼを含有するＨＳに再懸濁した。１０分のインキュベーション後、造血前駆幹細胞を洗浄し、２４ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に蒔き、最初の１４日間増殖させた。ＧＢＧＭに１０％ＨＳならびに１０ｐｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）からなる低用量サイトカインカクテルを補充した。また、２７ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７（全てＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）および２５μｇ／ｍｌの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ；Ｃｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）からなる高用量サイトカインカクテルを添加した。細胞培養物を２〜３日ごとに再生し、３７℃、湿度９５％および５％ＣＯ２で維持した。
【０１８４】
１４日目以降、以前記載されたように、増殖ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞をさらに増殖させ、ＧＢＧＭ−ＣＢＲ、１０％ＨＳおよび低用量サイトカインカクテルからなるＵＣＢ−ＥＣ細胞分化培地を用いて分化させた。高用量のサイトカインカクテルは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＳＣＦ（全てＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で変化させた（表８）。３〜４日ごとに細胞密度を確認し、分化培地を添加または再生することにより約１．５×１０６個細胞／ｍｌに調整した。再び、培養物を３７℃、湿度９５％および５％ＣＯ２インキュベーターで維持した。
【０１８５】
【表８】
2019501956.tif 000009
ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物評価
【０１８６】
生存ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物を、５０μｌ培養液（０．５〜２．５×１０６個細胞／ｍｌ）を用いて、体積１００μｌで１．５μｌのＣＤ４５−ＥＣＤ（Ｊ３３、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国）および１μｌのＮＣＡＭ−ＰＣ７（Ｎ９０１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国）で細胞を染色して、３〜４日ごとに計数した。これらの抗体と４℃で１５分間インキュベートした後、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）を添加して、アポトーシス細胞を排除した。また、産物の成熟を、抗体混合物１を用いた増殖中ならびに混合物２および３（表９）を用いた分化中に染色することにより、毎週確認した（共に４℃で１５分間、体積２５μｌで約１５００００個の細胞）。全ての染色を、ＦＣ５００サイトメーター（ＦＣ５００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＵＳＡ）でのフローサイトメトリーによって測定した。追加の染色ミックスを結果で言及する。
【０１８７】
【表９】
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ＣＦＳＥに基づく細胞傷害性アッセイ
【０１８８】
フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性試験を行って、共インキュベーション中にＣＭＬ／ＡＭＬ標的細胞を死滅させるＵＣＢ−ＥＣ細胞の能力を監視した。標的細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃で１０分間、１μＭカルボキシフルオセイン二酢酸スクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）で標識した。１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ５ｍｌを添加して反応を停止させた後、細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって計数した。細胞を、使用する濃度で同じ培地に遠心沈殿し再懸濁した。ＵＣＢ−ＥＣ細胞も同様にＦＡＣＳによって計数し、必要な濃度で再懸濁した。
【０１８９】
標的細胞およびＵＣＢ−ＥＣ細胞を、対照として３連で単独で蒔いた。ＵＣＢ−ＥＣ細胞およびＡＭＬ／ＣＭＬ細胞を、２７５μｌの体積で種々のＥ：Ｔ比（１：１、５：１）で、３７℃で一晩共培養した。一晩のインキュベーションの前に、ＣＤ１０７ａ−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を添加して、脱顆粒を確認した。試料採取前に、上清７０μＬを採取し、ＥＬＩＳＡアッセイのために凍結した。細胞を採取し、１μｌのＣＤ５６−ＰＣ７（Ｎ９０１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国）で少なくとも１５分間染色して、ＵＣＢ−ＥＣ細胞上のゲーティングを調整し、持続する標的細胞の数を、ＣＦＳＥ陽性染色に基づくＦＡＣＳを用いて定量化した（Ｆｏｕｔ！Ｖｅｒｗｉｊｚｉｎｇｓｂｒｏｎ  ｎｉｅｔ  ｇｅｖｏｎｄｅｎ）。傷害性％は、ＵＣＢ−ＥＣ細胞と同時培養の生存ＣＦＳＥ陽性細胞の数を生存ＣＦＳＥ陽性標的細胞単独の数で割り、この数に１００％を掛けることによって計算した。
【数１】
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酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）
【０１９０】
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生を定量化するために、ＣＦＳＥに基づく細胞傷害性アッセイ後にＥＬＩＳＡを実施した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、室温（ＲＴ）でＰＢＳ中１．５μｇ／ｍｌ  １００μｌコーティング抗体抗ヒトＩＦＮ−γ（ＩｇＧｑ、２Ｇ１、Ｅｎｄｏｇｅｎ）で一晩コーティングした。インキュベーション後、抗体を除去し、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を室温で１時間添加した。ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｍｅｒｃｋ））で３回洗浄し、５０μｌの試料およびヒトＩＦＮ−γ標準（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）系列希釈液（１：１  ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳおよびＧＢＧＭ−ＣＢ＋１０％ＨＳに希釈した２０００ｐｇ／ｍｌ〜０．８５ｐｇ／ｍｌを）をコーティングプレートに移した。室温でさらに１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、引き続いて５０μｌの０．２μｇ／ｍｌビオチン標識モノクローナル抗体（ＩｇＧ１、７−Ｂ６−１、Ｍａｂｔｅｃｈ）を添加した。余分な抗体を洗浄緩衝液で洗い流し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン抗体（Ｓａｎｑｕｉｎ）の１：１２５００希釈液５０μｌをさらに３０分間インキュベートした。別の洗浄ステップの後、１００μｌのＴＭＢとペルオキシダーゼＢ（ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌペルオキシダーゼ基質システム、ＫＬＰ）の１：１混合物を全てのコーディングウェルに添加した。プレートを、２つの最高濃度のＩＦＮ−γ標準が同じ青色強度を有するまで（約１０分）インキュベートした後、１Ｍ  Ｈ３ＨＰＯ４（Ｍｅｒｃｋ）１００μｌで酵素反応を停止させた。この産物の吸光度をＭｕｌｔｉｓｃａｎ  ＭＣＣ／３４０  ＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、米国）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０１９１】
培養工程を主に増殖期と分化期に分ける。両期間について、種々の高用量および低用量サイトカインならびに特異的ヘパリンの特定の組み合わせを使用して、高純度および機能的ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物の細胞増殖を達成する。臨床または医薬目的のためのＵＣＢ−ＥＣ細胞産物および製造工程を最適化するために、ＵＣＢ−ＥＣ細胞分化のために開発される本サイトカインの組み合わせからの各サイトカインの効果を評価することを目的とした。そのため、ＵＣＢ由来ＣＤ３４＋幹細胞を、以前記載されたプロトコル７６に従って２週間増殖させた。その後、あらかじめ増殖したＵＣＢ−ＥＣ前駆細胞を、培養法において８種類の高用量サイトカインカクテルを用いて成熟および機能的ＵＣＢ−ＥＣ細胞に分化させた（）。ＩＬ−１５はＣＤ３４＋造血前駆細胞のＵＣＢ−ＥＣ細胞への増殖および分化を誘導することができるので、８つの条件全てで、ＩＬ−１５を使用した。ＩＬ−１５を基礎として、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＳＣＦを用いた種々の組み合わせを全て、ＵＣＢ−ＥＣ細胞の増殖および分化に対する効果ならびにその白血病標的細胞を溶解する能力について分析した。
【０１９２】
最初に、ＵＣＢ−ＥＣ細胞培養物の増殖および分化速度ならびに純度を分析した。平均総細胞増殖を５週間追跡し、フローサイトメトリーによって測定した。さらに、ＵＣＢ由来のＣＤ３４＋細胞のサイトカイン増加は、全４人のドナーにおいて高用量のサイトカインカクテルに対するＳＣＦの添加によって顕著に影響された。３人のドナーの結果は、非ＳＣＦ培養物（６５４６±２６９０）に対するＳＣＦ培養物（２０２２２±１１４２３）の有意に高い全体的な増殖を示す（ｐ＜０．０１）。ＩＬ−２またはＩＬ−７の添加は、２番目に最もプラスの効果をもたらした。第２に、サイトカインの組み合わせ１つ当たりの平均分化速度を３週間追跡し、主に全てのサイトカインの組み合わせが、ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物と同じ高純度をもたらす。
【０１９３】
ＣＦＳＥに基づく細胞傷害性アッセイおよびＩＦＮ−γＥＬＩＳＡをＵＣＢ−ＥＣ細胞機能性の測定に使用した。細胞傷害性アッセイをエフェクター：標的（ＥＴ）比１：１で実施して、ＵＣＢ−ＥＣ細胞媒介性溶解に対する分化培地中の高用量サイトカイン組み合わせの効果を決定した。結果は、体外で生成されたＵＣＢ−ＥＣ細胞がＨＬＡ欠損Ｋ５６２標的細胞を効率的に溶解することを明らかにした。ＩＬ−１５とＩＬ−２の高用量サイトカインの組み合わせ（６４％±５％）と培養したＵＣＢ−ＥＣ細胞産物についてのＵＣＢ−ＥＣ細胞媒介性細胞傷害性は、ＩＬ−１５単独（４２％±１５％、ｐ＜０．０５）と比べてより細胞傷害性である。ＩＬ−１５およびＩＬ−２へのＳＣＦの添加は、Ｋ５６２標的細胞に対するＵＣＢ−ＥＣ細胞産物の細胞傷害性を低下させる（４６％±８％、ｐ＜０．０５）。さらに、本発明者らは、産生されたインターフェロン−γ（異なる標的細胞による刺激の際に活性化されたＵＣＢ−ＥＣ細胞のＩＦＮγ）を研究することを目的とした。ＣＦＳＥに基づく細胞傷害性実験後の上清中のＩＦＮγ濃度の評価を、白血病標的との共培養中のＵＣＢ−ＥＣ細胞活性の指標として使用することができた。要約すると、３週間の分化培養に使用した高用量サイトカインカクテルにＳＣＦを添加することによって、増殖がほとんど改善された。しかしながら、得られたＵＣＢ−ＥＣ細胞産物の純度は、分化期の間にＩＬ−２、ＩＬ−７またはＳＣＦの添加によって増加しない。機能分析に関して、ＩＬ−２と共に培養したＵＣＢ−ＥＣ細胞産物はＫ５６２の溶解を増加させたが、ＳＣＦ添加は細胞傷害性にマイナスの効果を与えた。高用量のサイトカインの組み合わせにつき全ての実験の結果を比較すると、体外ＵＣＢ−ＥＣ細胞の３週間の分化培養物をＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−７で濃縮した場合に、最良の全体結果が得られたことを示す。
【０１９４】
【表１０】
2019501956.tif 000012
ＵＣＢ−ＥＣ細胞分化中の異なる時点におけるＩＬ−２とＩＬ−１２サイトカインの組み合わせの影響
【０１９５】
最初の実験では、ＵＣＢ−ＥＣ細胞分化のために開発されたサイトカインカクテルに現在使用されている各サイトカインの効果を試験した。ＳＣＦは増殖および細胞数に最も大きな影響を与えるが、ＩＬ−２は細胞溶解機能に最もプラスに影響を与えた。しかしながら、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１などのいくつかの他のサイトカインが、ＵＣＢ−ＥＣ細胞の機能および活性化に有意な効果を示すことが知られている。これらのサイトカインの１つであるＩＬ−１２は、増殖を誘導し、ＩＦＮ−ｇなどのサイトカインの産生を刺激し、ＵＣＢ−ＥＣ細胞のより高い細胞溶解機能をもたらすことが示されている。さらに、ＩＬ−１２は、ＵＣＢ−ＥＣ細胞の表面受容体発現に影響を及ぼす。
【０１９６】
臨床または医薬目的のためのＵＣＢ−ＥＣ細胞産物および製造工程を最適化するために、ＵＣＢ−ＥＣ細胞分化のために開発されたサイトカインにおいて種々の時点に対するＩＬ−２および追加のＩＬ−１２の効果を評価することを目的とした。そのため、ＵＣＢ由来ＣＤ３４＋幹細胞を、以前記載されたプロトコル７６に従って２週間増殖させた。その後、体外ＵＣＢ−ＥＣ前駆体を、全ての条件においてＩＬ−１５、ＳＣＦおよびＩＬ−７の高用量サイトカインの組み合わせを用いて体外でＵＣＢ−ＥＣ細胞に分化させた。追加のサイトカインＩＬ−２および／またはＩＬ−１２を、第２週以降から始めて、第３または第４週に添加した（スキームについては図１７参照）。これらの１２の異なる培養条件を用いて、体外で生成されたＵＣＢ−ＥＣ細胞の増殖、純度、細胞傷害性および成熟に対する異なる時点におけるＩＬ−２および／またはＩＬ−１２の効果を分析した。
【０１９７】
全ての実験の平均結果を、高用量サイトカインの組み合わせごとに比較し、表１１に示す。ＩＬ−２とＩＬ−１２の種々の組み合わせで、高用量ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物の特性のマトリックスが分化する。相対値を実験結果に基づいて条件に割り当てた。特定の特性内の異なる条件間の格付けを実験平均値に従って実施した。ＵＣＢ−ＥＣ細胞産物にとって絶対細胞数が最も重要であると思われたので、増殖からの値を使用して合計を増やした。差がないことを示す特性を１に設定した。この概要は、ＩＬ−２を２週間後に添加して、分化期の開始から、体外ＵＣＢ−ＥＣ細胞の５週間の培養物をＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＩＬ−７およびＩＬ−１２で濃縮すると、最良の全体結果が得られたことを示している。
【０１９８】
【表１１】
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【０１９９】
【表１２】
2019501956.tif 000014
【０２００】
[実施例８]
腫瘍ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＧおよびＥ阻害を克服するＵＣＢ−ＥＣ能力の試験
【０２０１】
子宮頸癌細胞株ＣＳＣＣ７、ＣＣ８、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣｌｌＡおよびＣＣｌｌＢを、以前記載されたように７９原発腫瘍からＬｅｉｄｅｎ大学医療センター（オランダ）の病理学部門で作成した。これらの患者由来細胞株ならびに商業的に得られた子宮頸癌由来細胞株、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉおよびＣ３３Ａ（ＡＴＣＣ）を、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位ペニシリン／１００単位ストレプトマイシン／０．３ｍｇ／ｍＬグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ）中で維持した。細胞培養物を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で維持した。フローサイトメトリーを用いてＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅ発現レベルについて、標的細胞（Ｈｅｌａ、Ｓｉｈａ、Ｃａｓｋｉ、Ｃ３３Ａ、ＣＳＣＣ７、ＣＣ８、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣｌｌＡおよびＣＣｌｌＢ）をスクリーニングした。
子宮頸癌細胞株の表現型解析
【０２０２】
子宮頸癌細胞株を表現型解析するために、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３（ＦＡＣＳ緩衝液）を補充したＰＢＳ中の細胞懸濁液を、ＨＬＡ−ＡＢＣ（クローンｗ６／３２、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）（ＦＩＴＣで標識）、ＨＬＡ−Ｅ（クローン３Ｄ１２ＨＬＡ−Ｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＨＬＡ−Ｇ（クローン８７Ｇ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する抗体を用いて４℃で３０分間染色した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメーターＬＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅ発現についてのスクリーニングを、標的細胞株の異なるバッチ培養から独立に４ヶ月の期間にわたって試験した。表現型解析を、各細胞株で行った少なくとも２回の独立した実験から得た。Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてデータを分析し、特異的（幾何学的）平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ＭＦＩ；マーカーの幾何学的平均蛍光−アイソタイプの幾何学的平均蛍光）として計算した。ＮＫ阻害リガンド発現レベルについては表１２を参照されたい。さらに、エフェクター細胞（ＵＣＢ−ＥＣおよび活性化ＰＢＮＫ）を、可変レベルのＮＫ細胞機能の阻害性リガンドであるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅを発現する１０種の子宮頸癌細胞株と共に培養した。５×１０４個のエフェクターを３７℃で４時間Ｅ：Ｔ１：１で、５×１０４個の標的（Ｈｅｌａ、Ｓｉｈａ、Ｃａｓｋｉ、Ｃ３３Ａ、ＣＳＣＣ７、ＣＣ８、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣ１１ＡおよびＣＣ１１Ｂ）と共培養した。ＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫによって誘発される標的細胞死の割合は、試験した子宮頸癌細胞株のＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅレベルと相関する。結果から、ＰＢＮＫ細胞より有意に高いＨＬＡ−Ｇ（図１９）およびＨＬＡ−Ｅ（図２０）発現細胞株の有効な腫瘍細胞溶解を誘導することに加えて、ＵＣＢ−ＥＣが活性化ＰＢＮＫ細胞より有意に高い腫瘍ＨＬＡ−ＡＢＣ阻害を克服することができる（図１８Ａ、図１８Ｂ）ことが自明であった。
【０２０３】
[実施例９]
ＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫの殺傷に対するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型および腫瘍組織学の影響
【０２０４】
ＵＣＢ−ＥＣ、ＰＢＮＫ単独およびＰＢＮＫ＋セツキシマブの腫瘍殺傷が異なるＨＰＶ型および／または腫瘍組織学によって影響されるかどうかを理解し、それらの中で最も強力な免疫エフェクター細胞産物を同定するために、選択された標的を、ｉ）異なるＨＰＶ型（Ｃ３３Ａ−ＨＰＶ陰性；ＨｅＬａ−ＨＰＶ１８；ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉ、ＣＳＣＣ７−ＨＰＶ１６；ＣＣ８、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ−ＨＰＶ４５；ＣＣ１１Ａ、ＣＣ１１Ｂ−ＨＰＶ６７）およびｉｉ）組織学（ＨｅＬａ、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣ１１Ａ−腺癌；ＳｉＨａ、Ｃ３３Ａ、ＣＳＣＣ７、ＣＣ１１Ｂ−扁平上皮癌；ＣＣ８−腺扁平上皮癌；ＣａＳｋｉ−類表皮癌）に従ってグループ分けした。ＰＢＮＫ＋セツキシマブ条件については、標的細胞を５μｇ／ｍｌセツキシマブでコーティングし、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋０．０５％ＢＳＡで洗浄し、細胞傷害性アッセイのためにエフェクター細胞に添加した。
エフェクター細胞の調製
【０２０５】
末梢静脈血試料を、ヘパリンナトリウム抗凝固剤を含む試験管に採取した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）を用いた密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、製造業者の指示に従って、ヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて末梢血ＮＫ細胞を単離するために、洗浄およびＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ＢＳＡ）に再懸濁した。単離されたＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイに使用するために、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で一晩活性化する。ＮＫ細胞の純度および生存率を、ＣＤ３  ＰＥ、７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０およびＣＤ１６  ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて確認する。
標的細胞の調製：
【０２０６】
細胞株Ｈｅｌａ、Ｓｉｈａ、Ｃａｓｋｉ、Ｃ３３Ａ、ＣＳＣＣ７、ＣＣ８、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣ１１Ａ、ＣＣ１１Ｂ（子宮頸癌）を、ＡＴＣＣまたは患者由来細胞株（Ｌｅｉｄｅｎ大学）の細胞ストックから得て、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｔｅｇｒｏ、Ｚａａｎｄａｍ、オランダ）を含有するダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）で培養する。細胞培養物を５日ごとに継代し、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーター中で維持する。標的細胞を１×１０７個細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１０分間、５μＭパシフィックブルースクシニミジルエステル（ＰＢＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）で染色した。等体積のＦＣＳを添加し、引き続いて室温で２分間インキュベートすることにより反応を停止し、その後、染色細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで２回洗浄する。洗浄後、細胞を最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに懸濁する。
フローサイトメトリーに基づくＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ
【０２０７】
未処理およびセツキシマブで処理したＰＢＳＥ染色標的を、異なるＨＰＶ陽性および陰性標的と共培養し、それらの細胞傷害性をＵＣＢ−ＥＣ細胞と比較した。ＰＢＳＥ陽性およびＣＤ４５＋ＣＤ５６＋染色を用いて、標的およびエフェクター細胞を識別した。７ＡＡＤを用いて標的細胞死を検出し、ＰＢＳＥ＋標的上の７ＡＡＤ取り込みを示すＦＡＣＳプロットから死標的細胞の割合を計算した。ＮＫ細胞単独、セツキシマブで処理したＮＫ細胞、標的細胞単独およびセツキシマブ処理した標的細胞単独を対照試料として使用した。標的およびエフェクター細胞をエフェクター：標的比１：１で４時間インキュベートした。図２１および図２２は、５つの同一の実験を表す。得られた結果から、ＰＢＮＫとＵＣＢ−ＥＣの殺傷の両方がＨＰＶ型および腫瘍組織学の影響を受けず、より興味深いことに、ＵＣＢ−ＥＣ細胞がＰＢＮＫより有意に高いレベルでＨＰＶ（図２１）および組織学（図２２）とは無関係に全ての腫瘍型を有意に死滅させ、ＰＢＮＫ＋セツキシマブ条件と等しく細胞傷害性であることが自明であった。
【０２０８】
[実施例１０]
ＵＣＢ−ＥＣによるＥＧＦＲ（陰性、低および高）発現子宮頸癌細胞に対する抗腫瘍効果を、以前記載された７６基本プロトコルに従ってフローサイトメトリーに基づく細胞傷害性および脱顆粒アッセイを用いて、ＰＢＮＫ細胞およびセツキシマブコーティングＰＢＮＫ細胞と比較する。
細胞株
【０２０９】
細胞株Ｈｅｌａ、Ｓｉｈａ、Ｃａｓｋｉ、Ｃ３３Ａ、ＣＳＣＣ７、ＣＣ８、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣ１１Ａ、ＣＣ１１Ｂ（子宮頸癌）を、ＡＴＣＣまたは患者由来細胞株（Ｌｅｉｄｅｎ大学）の細胞ストックから得て、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｔｅｇｒｏ、Ｚａａｎｄａｍ、オランダ）を含有するダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）で培養する。細胞培養物を５日ごとに継代し、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーター中で維持する。
子宮頸癌細胞株の表現型解析
【０２１０】
ＥＧＦＲの子宮頸癌細胞株を表現型解析するために、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３（ＦＡＣＳ緩衝液）を補充したＰＢＳ中の細胞懸濁液を、抗体、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＥＧＦＲ（クローンＥＧＦＲ．１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、４℃で３０分間染色した。ＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメーターＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。標的細胞ＥＧＦＲ発現についてのスクリーニングを、標的細胞株の異なる培養から独立に４ヶ月の期間にわたって試験した。表現型解析を、各細胞株で行った少なくとも２回の独立した実験から得た。Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてデータを分析し、特異的（幾何学的）平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ＭＦＩ；マーカーの幾何学的平均蛍光−アイソタイプの幾何学的平均蛍光）として計算した。子宮頸癌細胞株ＥＧ  ＦＲ発現レベルについては、表１２を参照されたい。
全血検体からの末梢血ＮＫ細胞の単離および活性化
【０２１１】
健康なボランティアからの全血を、書面でのインフォームドコンセントと共に回収する。単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）密度勾配遠心分離を用いて単離する。製造業者の指示に従って、ＭＡＣＳヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて、ＰＢＮＫ細胞をＭＮＣから単離する。単離されたＮＫ細胞画分の細胞数および純度を、フローサイトメトリーによって分析する。単離されたＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイに使用するために、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で一晩活性化する。ＮＫ細胞の純度および生存率を、ＣＤ３  ＰＥ、７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０およびＣＤ１６  ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて確認する。前に言及した、活性化後の予備的パラメータは、それぞれＮＫ純度（ＣＤ５６＋％、８３±９％および８２±９％）、ＮＫ  ＣＤ１６％８８±１０％および８５±１１％およびＮＫ生存率（９１±３％および８６±２％）である。
ＵＣＢ−ＥＣ細胞培養物
【０２１２】
ＣＤ３４陽性前駆細胞の体外増殖
ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞（１×１０４〜３×１０５個／ｍｌ）を、１０％ヒト血清（ＨＳ；Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ、オランダ）、２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−７（全てＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補充したＧＢＧＭ中２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に蒔く。９日目〜１４日目に、ＴＰＯを、増殖培養物中２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）に置き換える。培養の最初の１４日間中、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）（Ｃｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）を、最終濃度２５μｇ／ｍｌで、また１０ｐｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）からなる低用量サイトカインカクテルを増殖培地に添加する。細胞培養物を２〜３日ごとに新しい培地で再生する。培養物を３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーターで維持する。
体外で増殖したＣＤ３４陽性細胞のＵＣＢ−ＥＣ細胞への分化
【０２１３】
増殖したＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞を分化させ、エフェクター細胞分化培地を用いてさらに増殖させる。この培地は、２％ＨＳ、低用量サイトカインカクテル（前述）および２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、ＳＣＦ、ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）からなる新たな高用量サイトカインカクテルを補充した、ＣＤ３４増殖ステップに使用されるのと同じ基礎培地からなり、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）を分化培地に添加する。培地を、１４日目以降、週２回再生する。
フローサイトメトリー
【０２１４】
フローサイトメトリー分析をＢＤ  ＬＳ  ＦＯＲＴＥＳＳＡ  Ｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行う。細胞数および細胞表面マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって決定する。生存細胞の細胞数および集団を、順方向散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）に基づいてＣＤ４５＋細胞をゲーティングすることによって決定する。表現型を分析するために、細胞をＦＳＣ／ＳＳＣ上でのみゲーティングし、対象となる特異的抗原についてさらに分析した。細胞を、適切な濃度の抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁する。
フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性および脱顆粒試験
【０２１５】
フローサイトメトリーを、細胞傷害性アッセイの読み出しに使用する。標的細胞を１×１０７個細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１０分間、５μＭパシフィックブルースクシニミジルエステル（ＰＢＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）で標識する。等体積のＦＣＳを添加し、引き続いて室温で２分間インキュベートすることにより反応を停止し、その後、染色細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで２回洗浄する。洗浄後、細胞を最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに懸濁する。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＧｌｙｃｏｓｔｅｍ  Ｂａｓａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＢＧＭ）＋２％ＦＣＳに懸濁する。標的細胞を、９６ウェル平底プレート中、総体積２５０μｌで、Ｅ：Ｔ比１：１でエフェクター細胞と共培養する（１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中５×１０４個の標的を、２５μｌのＧＢＧ  Ｍ＋２％ＦＣＳおよびＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地をさらに補充した１００μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳ中５×１０４個のエフェクターとインキュベートする）。ＰＢＮＫ細胞、ＵＣＢ−ＥＣ細胞および標的細胞のみを対照として３連で蒔く。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞による脱顆粒を測定するために、抗ＣＤ１０７ａ  ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を１：２０希釈でウェルに添加する。３７℃で４時間インキュベートした後、７５μｌの上清を回収し、サイトカイン産生を分析するために−２０℃で保存する。残りの容量の細胞を採取し、７ＡＡＤ（１：２０）で染色する。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞の脱顆粒を、ＣＤ１０７ａの細胞表面発現を検出することによって測定する。３７℃で４時間インキュベートした後、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０（１：２５）およびＣＤ１６  ＡＰＣ（１：２５）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を共培養物に添加し、ＮＫ  ＣＤ１０７ａ脱顆粒をＣＤ５６＋ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞について測定する。
統計解析
【０２１６】
統計解析を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行う。条件間の差異は、列手段間の多重比較を用いた一元配置Ａｎｏｖａ、二元配置Ａｎｏｖａおよびスチューデントｔ検定を用いて決定する。細胞傷害性実験の結果を、平均±平均の標準偏差（ＳＤ）として記載する。０．０５未満のｐ値を統計学的に有意とみなす。
【０２１７】
子宮頸癌患者の臨床試験からのデータは、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ療法（セツキシマブ）がＥＧ  ＦＲ発現ＲＡＳ野生型患者において無効であったことを明らかに指摘している８０。彼らの知見を確認するために、本発明者らはインビトロでのセツキシマブ単独療法の抗腫瘍効果について、ＥＧＦＲを発現するＣ３３Ａを除いて、子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａ、Ｓｉｈａ、Ｃａｓｋｉ、ＣＳＣＣ７、ＣＣ８、ＣＣＩＯＡ、ＣＣＩＯＢ、ＣＣ１１ＡおよびＣＣ１１Ｂを試験した。以前の研究と一致して、単独療法としてのセツキシマブは、試験した細胞株のいずれにおいても細胞死を誘発しなかった（図２３）。
【０２１８】
次に、活性化ＰＢＮＫを、標的細胞死を誘発する能力についてＵＣＢ−ＥＣと比較した。ＵＣＢ−ＥＣはＰＢＮＫよりも有意に細胞傷害性であり、試験した全ての細胞株においてより高い割合の腫瘍細胞死を一貫して誘発した（Ｐ＜０．００１）（図２４Ａ、図２４Ｂ）。これは、ＣＤ１０７ａ表面発現によって測定されるように、子宮頸癌細胞株への曝露に応答するＮＫ細胞の観察された脱顆粒レベルによってさらに裏付けられた。これらは、ＰＢＮＫ単独よりもＰＢＮＫ＋セツキシマブおよびＵＣＢ−ＥＣ状態において同等および有意に上昇した（図２４Ｃ）。興味深いことに、ＰＢＮＫ脱顆粒レベルは、低レベルのＥＧＦＲを発現する子宮頸癌細胞株（Ｃ３３ａ、ＨｅＬａおよびＳｉＨａ：三角形によって図１９Ｃで示される）に曝露すると、セツキシマブとの組み合わせで低かった。対照的に、ＵＣＢ−ＥＣの脱顆粒レベルは常に高かった（図２４Ｃ）。
【０２１９】
[実施例１１]
ＵＣＢ−ＥＣは、ＰＢＮＫ細胞と共通の機能相同性を共有する
細胞株
【０２２０】
細胞株、Ｃ３３ＡおよびＳｉＨａ（子宮頸癌）をＡＴＣＣから得て、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｔｅｇｒｏ、Ｚａａｎｄａｍ、オランダ）を含有するダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）で培養する。細胞培養物を５日ごとに継代し、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーター中で維持する。
子宮頸癌細胞株の表現型解析
【０２２１】
Ｃ３３ＡおよびＳｉＨａを表現型解析するために、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３（ＦＡＣＳ緩衝液）を補充したＰＢＳ中の細胞懸濁液を、ＰＶＲ（クローンＳＫ１１．４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＭＩＣＡ／Ｂ（クローン６Ｄ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＵＬＢＰ２／５／６（クローン＃１６５９０３、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＵＬＢＰ１（クローン＃１７０８１８、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＵＬＢＰ３（クローン＃１６６５１０、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）（全てフィコエリトリン（ＰＥ）で標識）に対する抗体を用いて４℃で３０分間染色した。ＩｇＧ１，１ｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメーターＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。ＰＶＲ（ＤＮＡＭ−１のリガンド）およびＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＢＰ３（ＮＫＧ２Ｄのリガンド）についてのスクリーニングを、標的細胞株の異なるバッチ培養から独立に４ヶ月の期間にわたって試験した。
表現型解析を、各細胞株で行った少なくとも２回の独立した実験から得た。Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてデータを分析し、特異的（幾何学的）平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ＭＦＩ；マーカーの幾何学的平均蛍光−アイソタイプの幾何学的平均蛍光）として計算した。ＮＫ活性化リガンド発現レベルについては表１２を参照されたい。
ブロッキング試験のためのＵＣＢ−ＥＣ培養
【０２２２】
ＵＣＢ−ＥＣ細胞を、以前記載されたように７２、７６、凍結保存されたＵＣＢ造血幹細胞から生成した。ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞（３ｘ１０５／ｍｌ）を、２％ヒト血清（ＨＳ；Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ、オランダ）、２０μｇ／ｍＬのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−７（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補充したＧｌｙｃｏｓｔｅｍ基礎増殖培地（ＧＢＧＭ（登録商標））（Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｅｒｎｅｍ、ベルギー）中１２ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に蒔いた。増殖期ＩＩでは、９日目から１４日目まで、ＴＰＯを２０μｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）に置き換えた。培養の最初の１４日間中、最終濃度２５μｇ／ｍｌの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）（Ｃｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）、ならびに１０ｐｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、２５０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）からなる低用量サイトカインカクテルを増殖培地に添加した。細胞を新しい培地で週２回再生し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。１４日目に、ＮＫ細胞分化工程を、ＮＫ細胞分化培地の添加によって開始した。これは、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、ＳＣＦ、ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）および１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｉｉｎｃｈｅｎ、ドイツ）からなる新たな高用量サイトカインカクテルによる増殖ステップと同じ２％ＨＳおよび低用量サイトカインカクテルを含む基礎培地からなる。培養物を２〜３日ごとに再生し、３５日目まで維持した。細胞傷害性アッセイのために、ＵＣＢ−ＥＣを８５％超の純度のＣＤ５６＋細胞と使用した。
ＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫのブロッキング細胞傷害性アッセイ
【０２２３】
子宮頸癌細胞株（Ｃ３３ＡおよびＳｉＨａ）を、１×１０７個細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１５分間、パシフィックブルースクシニミジルエステル（ＰＢＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）で標識した。インキュベーション後、細胞を１０％ＦＣＳ、ゲンタマイシン／アンホテリシンＢおよびペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを含有するＤＭＥＭ培養培地に最終濃度が５×１０５／ｍｌになるまで再懸濁した。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣをＰＢＳで洗浄し、２％ＦＣＳを含むＧＢＧＭ培地に最終濃度が５×１０５／ｍｌになるまで懸濁した。標的細胞を、ＦＡＣＳチューブ中総容量１００μｌ中、Ｅ：Ｔ比１：１で５μｇ／ｍｌセツキシマブの存在下または非存在下でエフェクター細胞（ＰＢＮＫまたはＵＣＢ−ＥＣ）と共培養した（５０μｌの培養培地中５×１０４個標的を５０μｌのＧＢＧＭ培地中５×１０４個のエフェクターと共にインキュベートした）。ＰＢＮＫ、ＵＣＢ−ＥＣおよび標的細胞単独を対照として３連で培養した。ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣによる脱顆粒を測定するために、アッセイの開始時に抗ＣＤ１０７ａ  ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を採取し、７ＡＡＤで染色し、ＣＤ５６（ＡＰＣ−Ｖｉｏ７７０で標識した）およびＣＤ１６（ＡＰＣで標識した）（全てＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ製）を共培養物に添加し、ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣについてＮＫ  ＣＤ１０７ａ脱顆粒を測定した。ＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫのブロッキング実験のために、ＮＫＧ２Ｄ  ＰＥ（クローンＯＮ７２、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＤＮＡＭ−１（クローンＤＸ１１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を１０μｇ／ｍｌで使用した。ＵＣＢ−ＥＣおよびＰＢＮＫ細胞を、ＤＮＡＭ−１およびＮＫＧ２Ｄブロッキング抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）を細胞傷害性アッセイの読み出しに使用した。ＮＫ活性化受容体ブロッキング試験も、上記の細胞傷害性アッセイと同様の設定で実施した。フローサイトメトリーを、細胞傷害性アッセイの読み出しに使用した。
【０２２４】
ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣの細胞傷害性における活性化受容体の役割を調べるために、２つの主要なＮＫ活性化受容体ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１ならびにそれらのリガンドＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ（ＮＫＧ２Ｄ）、ＰＶＲ（ＤＮＡＭ−１）を試験した。図２７Ａに示されるようにＮＫ活性化リガンドについてスクリーニングした細胞株のパネルから、ＳｉＨａ（ＰＶＲおよびＵＬＢＰ−２／５／６の最高発現レベル）およびＣ３３Ａ（ＰＶＲおよびＵＬＢＰ−２／５／６の最低発現レベル）を標的細胞として選択し、上記と同様のＮＫ細胞傷害性アッセイの設定で遮断実験を行った。
【０２２５】
ＮＫ活性化リガンドのＭＦＩレベルについては、表１２を参照されたい。Ｃ３３Ａの場合、ＤＮＡＭ−１とＮＫＧ２Ｄの組み合わせ遮断のみが、個々の遮断よりもＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ殺傷に対する感受性の有意な低下をもたらした。Ｃ３３Ａ細胞上で発現するＮＫ活性化リガンドのレベルが低いと、Ｃ３３Ａ細胞に有意な影響を及ぼすために組み合わせ作用を必要とした。しかしながら、ＳｉＨａでは、ＮＫ認識に必要とされるＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１リガンドの高い発現によってよく説明される（図２７Ｂ）組み合わせに見られる違いがなく、ＤＮＡＭ−１およびＮＫＧ２Ｄのみの条件では、遮断のより強い効果が観察された。両エフェクターは、ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１の遮断に対する同様の応答を有し、この実験は、ＮＫ細胞傷害性を増強するためのＮＫ細胞上のＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１受容体ならびに標的細胞上に存在するリガンドの十分なレベルの必要性を強調する。
【０２２６】
[実施例１２]
ＵＣＢ−ＥＣは、ＰＢＮＫ細胞と比較してＩＤＯ過剰発現細胞に対する高い細胞傷害性効果を示す
細胞株
【０２２７】
細胞株、ＣａＳｋｉおよびＳｉＨａ（子宮頸癌）をＡＴＣＣから得て、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｔｅｇｒｏ、Ｚａａｎｄａｍ、オランダ）を含有するダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）で培養する。細胞培養物を５日ごとに継代し、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーター中で維持する。
ＰＢＭＣ単離およびＮＫ細胞単離
【０２２８】
４人の健康なボランティアからの全血試料を収集した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）密度勾配遠心分離を用いて単離した。製造業者の指示に従って、ＭＡＣＳ（登録商標）ヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＰＢＭＣから単離した。単離されたＰＢＮＫの細胞数および純度をフローサイトメトリーによって分析した。単離されたＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイに使用する前に、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で一晩活性化した。ＮＫ細胞の純度および生存率を、以下の抗体：７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＤ３（ＶｉｏＢｌｕｅで標識）、ＣＤ５６（ＡＰＣ−Ｖｉｏ７７０で標識）およびＣＤ１６（ＡＰＣで標識）（全てＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いてフローサイトメトリーによって確認した。細胞傷害性アッセイのために、ＣＤ１６発現率が８０％を超えるＰＢＮＫ細胞のみを使用した。
ＵＣＢ−ＥＣの単離および培養
【０２２９】
同種異系ＮＫ細胞（ＵＣＢ−ＥＣ）を、以前記載されたように（３２）、凍結保存された臍帯血（ＵＣＢ）造血幹細胞から生成した。ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞（３ｘ１０５／ｍｌ）を、２％ヒト血清（ＨＳ；Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ、オランダ）、２０μｇ／ｍＬのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯおよびＩＬ−７（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補充したＧｌｙｃｏｓｔｅｍ基礎増殖培地（ＧＢＧＭ（登録商標））（Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｅｒｎｅｍ、ベルギー）中１２ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に蒔いた。増殖期ＩＩでは、９日目から１４日目まで、ＴＰＯを２０μｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）に置き換えた。培養の最初の１４日間中、最終濃度２５μｇ／ｍｌの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）（Ｃｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）、ならびに１０ｐｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、２５０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦおよび５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）からなる低用量サイトカインカクテルを増殖培地に添加した。細胞を新しい培地で週２回再生し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。１４日目に、２％ＨＳを含むが、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、ＳＣＦ、ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）および１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）からなる高用量サイトカインカクテルを含む同じ基礎培地からなるＮＫ細胞分化培地を添加することによって、ＮＫ細胞分化工程を開始した。培養物を２〜３日ごとに再生し、３５日目まで維持した。細胞傷害性アッセイのために、ＵＣＢ−ＥＣを８５％超の純度のＣＤ５６＋細胞と使用した。
フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性および脱顆粒試験
【０２３０】
フローサイトメトリーを細胞傷害性アッセイの読み出しに使用した。標的細胞を１×１０７個細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１０分間、５μＭパシフィックブルースクシニミジルエステル（ＰＢＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）で標識した。等体積のＦＣＳを添加し、引き続いて室温で２分間インキュベートすることにより反応を停止し、その後、染色細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで２回洗浄した。洗浄後、細胞を最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに懸濁した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＧｌｙｃｏｓｔｅｍ  Ｂａｓａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＢＧＭ）＋２％ＦＣＳに懸濁した。標的細胞を、９６ウェル平底プレート中、総体積２５０μｌで、Ｅ：Ｔ比１：１でエフェクター細胞と共培養した（１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中５×１０４個の標的を、２５μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳおよびＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地をさらに補充した１００μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳ中５×１０４個のエフェクターとインキュベートする）。ＮＫ細胞および標的細胞のみを対照として３連で蒔いた。標的細胞（ＣａＳｋｉおよびＳｉＨａ）を、４℃で１時間、ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ−１ブロッキング抗体でコーティングした。細胞を洗浄し、活性化ＰＢＮＫおよびＵＣＢ−ＥＣ細胞と共培養した。ＮＫ細胞による脱顆粒を測定するために、抗ＣＤ１０７ａ  ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を１：２０希釈でウェルに添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を採取し、７ＡＡＤ（１：２０）で染色した。ＮＫ細胞の脱顆粒を、ＣＤ１０７ａの細胞表面発現を検出することによって測定した。３７℃で４時間インキュベートした後、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０（１：２５）およびＣＤ１６  ＡＰＣ（１：２５）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を共培養物に添加し、ＮＫ  ＣＤ１０７ａ脱顆粒をＣＤ５６＋ＮＫ、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫおよびＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞について測定した。
【０２３１】
子宮頸癌患者では、免疫エフェクター機能を遮断し、腫瘍増殖を促進し得る免疫抑制酵素インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）のレベル上昇が見られる３９、８１〜８３。ＩＤＯの下方制御が、ＰＢＮＫ殺傷に対する感受性増強に加えて、インビボで腫瘍間質中のＮＫ細胞蓄積増加をもたらすことができることが示されている８４。臨床研究はまた、患者のＰＢＮＫの機能に直接影響を及ぼす子宮頸癌患者におけるＮＫ自然細胞傷害性受容体（ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６）およびＮＫＧ２Ｄの有意な下方制御が存在することを指摘している８５。ＩＤＯ発現細胞株についてＰＢＮＫとＵＣＢ−ＥＣによって誘発された標的細胞死を比較すると、ＳｉＨａとＣａＳｋｉの両方がＵＣＢ−ＥＣによって有意に高レベルで死滅した（図２８）。これは、ＵＣＢ−ＥＣによる、またおそらく子宮頸癌細胞に対するより強い効果を開始するＩＤＯ遮断薬と組み合わせた、ＩＤＯ発現子宮頸癌細胞を標的とするための理想的なプラットフォームを提供する。ＵＣＢ−ＥＣがＩＤＯの耐性を克服する能力は、ＵＣＢ−ＥＣにより子宮頸癌腫瘍を治療する優れた機会を提供する。
【０２３２】
[実施例１３]
体外で生成された同種異系免疫エフェクター細胞を、シクロホスファミド／フルダラビン（Ｃｙ／Ｆｌｕ）コンディショニング後の予後不良急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者に注入する。この免疫抑制コンディショニングレジメンは、拒絶反応を予防するために必要であり、注入された免疫エフェクター細胞のインビボ寿命延長および増殖を促進するＩＬ−１５などの免疫エフェクター細胞生存因子を誘導することが示されている。免疫エフェクター細胞産物は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）発現が７０％超であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞がほとんどなく、それによってドナーＴ細胞媒介性ＧＶＨＤを最小化する。試験参加者は、臨床的および免疫学的評価を受ける。１回または２回の誘導化学療法コース後の完全寛解（骨髄における５％未満の芽球）を達成した後、患者を、血清学的試験およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ）によってＨＬＡクラスＩ対立遺伝子について分類し、標準的Ｌｕｍｉｎｅｘプロトコルを用いて抗ＨＬＡ抗体の非存在について試験する。適格ＡＭＬ患者は、抗ＨＬＡ抗体を持たず、抗原レベルでＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂについての利用可能なＨＬＡ一致を示す同種異系非ハプロタイプ一致ＵＣＢ単位が５０のランダムに選択されたＵＣＢ単位のプールに見出され得る患者である。ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰ一致は、ＵＣＢ単位選択に使用しなかった。割り当て直後に、強化療法を標準プロトコルに従って行いながら、利用可能なＵＣＢ単位を、体外免疫エフェクター細胞増殖のための適切なドナーを選択するためにスクリーニングする。
【０２３３】
免疫エフェクター注入の６週間前に、適切な同種異系ＵＣＢ単位を解凍し、免疫磁気粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に結合したＣＤ３４と結合させた後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ細胞分離装置を使用して、ＣＤ３４＋細胞を濃縮する。濃縮ＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞を、検証された手順７２に従って、分化および増殖を介して、ＮＣＡＭ陽性免疫エフェクター細胞産物の体外生成に使用する。細胞単離、濃縮および培養手順は、ＪＡＣＩＥ、ＮＥＴＣＯＲＤ  ＦＡＣＴガイドラインならびにＥＵ指令２００１／８３および２００９／１２０に従って確立されたＳＯＰを用いて、クリーンルーム内で医薬品製造品質管理基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）条件下で実施する。
【０２３４】
[実施例１４]
インビトロでの結腸癌細胞に対するＵＣＢ−ＥＣ細胞による細胞傷害性の増強
細胞株
【０２３５】
細胞株Ａ４３１（類表皮癌）、ＣＯＬＯ３２０、ＳＷ４８０およびＨＴ−２９（結腸癌）をアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から得て、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｔｅｇｒｏ、Ｚａａｎｄａｍ、オランダ）を含有するダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、米国）で培養する。細胞培養物を５日ごとに継代し、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２インキュベーター中で維持した。
ＰＢＭＣおよびＰＢＮＫの単離
【０２３６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、インフォームドコンセントにより健康なドナーおよび結腸直腸癌患者のヘパリン添加血から単離した。ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、ドイツ）密度勾配遠心分離を用いて単離した。製造業者の指示に従って、ＭＡＣＳヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＰＢＭＣから単離した。ＰＢＮＫ細胞の純度および生存率を、ＣＤ３  ＢｉｏＢｌｕｅ、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０およびＣＤ１６  ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）および７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて確認した。サイトカインによる刺激の前後で比較したパラメータは、それぞれＮＫ純度（ＣＤ５６＋％、８７±５％対８４±２％）、ＮＫ  ＣＤ１６％９２±１２％対８８±８％）およびＮＫ生存率（８９±５％対８４±８％）であった。単離されたＰＢＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイに使用するために、１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で一晩活性化した。
ＵＣＢ−ＥＣ培養
【０２３７】
同種異系ＮＫ細胞（ＵＣＢ−ＥＣ）を、以前記載されたように７６、凍結保存された臍帯血（ＵＣＢ）造血幹細胞から生成した。６人のＵＣＢドナーからのＣＤ３４＋ＵＣＢ細胞（４ｘ１０５／ｍｌ）を、２％ヒト血清（ＨＳ；Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄｂａｎｋ、アムステルダム、オランダ）、２０μｇ／ｍＬのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯおよびＩＬ−７（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補充したＧｌｙｃｏｓｔｅｍ基礎増殖培地（ＧＢＧＭ（登録商標））（Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｅｒｎｅｍ、ベルギー）中１２ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、米国）に蒔いた。増殖期ＩＩでは、９日目から１４日目まで、ＴＰＯを２０μｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）に置き換えた。培養の最初の１４日間中、最終濃度２５μｇ／ｍｌの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）（Ｃｌｉｖａｒｉｎ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）、ならびに１０ｐｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、２５０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦおよび５０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）からなる低用量サイトカインカクテルを増殖培地に添加した。細胞を新しい培地で週２回再生し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。１４日目に、２％ＨＳを含むが、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、ＳＣＦ、ＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）および１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、ドイツ）からなる高用量サイトカインカクテルを含む同じ基礎培地からなるＮＫ細胞分化培地を添加することによって、ＮＫ細胞分化工程を開始した。培養物を２〜３日ごとに再生し、４２日目まで維持した。細胞傷害性アッセイのために、５種類のＵＣＢ−ＥＣ培養物を、純度９２％超のＣＤ５６＋細胞と使用し、１つのＵＣＢ−ＥＣ単位をマウス試験のために大規模に増殖させ、純度９５％のＣＤ５６＋細胞と使用した。
ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ
【０２３８】
フローサイトメトリーを細胞傷害性アッセイの読み出しに使用した。標的細胞（ＣＯＬＯ３２０、ＳＷ４８０およびＨＴ−２９）を１×１０７個細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１０分間、５μＭパシフィックブルースクシニミジルエステル（ＰＢＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）で標識した。等体積のＦＣＳを添加し、引き続いて室温で５分間インキュベートすることにより反応を停止し、その後、染色細胞を２回洗浄し、最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに懸濁した。一晩活性化したＰＢＮＫ細胞およびＵＣＢ−ＥＣ細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度が５×１０５／ｍｌになるようにＧｌｙｃｏｓｔｅｍ  Ｂａｓａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＢＧＭ）＋２％ＦＣＳに懸濁した。標的細胞を、９６ウェル平底プレート中、総体積２５０μｌで、Ｅ：Ｔ比１：１でエフェクター細胞と共培養した（１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中５×１０４個の標的を、２５μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳおよびＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地をさらに補充した１００μｌのＧＢＧＭ＋２％ＦＣＳ中５×１０４個のエフェクターとインキュベートする）。ＮＫ細胞および標的細胞のみを対照として３連で蒔いた。標的細胞を４℃で１時間コーティングした。ＮＫ細胞による脱顆粒を測定するために、抗ＣＤ１０７ａ  ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を１：２０希釈でウェルに添加した。３７℃で４時間インキュベートした後。残りの容量の細胞を採取し、７ＡＡＤ（１：２０）で染色した。ＮＫ細胞の脱顆粒を、ＣＤ１０７ａの細胞表面発現を検出することによって測定した。３７℃で４時間インキュベートした後、ＣＤ５６  ＡＰＣ  Ｖｉｏ  ７７０（１：２５）およびＣＤ１６  ＡＰＣ（１：２５）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を共培養物に添加し、ＮＫ  ＣＤ１０７ａ脱顆粒をＣＤ５６＋ＮＫ、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫおよびＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞について測定した。
抗ＥＧＦモノクローナル抗体
【０２３９】
セツキシマブ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）は、ＮＫ細胞ＡＤＣＣ実験のためにＶＵ医療センター薬局から購入した。
【０２４０】
進行したＣＲＣでは、おそらく薬剤耐性腫瘍も標的とすることができる、機能不全ＮＫ細胞を置換するための新規な療法を開発し、これを探索する必要がある。この試験では、同種異系ＮＫ細胞産物の２つの異なる供給源を試験して、ＣＲＣ患者の免疫系をさらに強化するＮＫ代替物を見出した。それらの機能的役割を特徴付けるために、Ａ−ＰＢＮＫ細胞とＵＣＢ−ＥＣ細胞との間で一連のインビトロＮＫ細胞傷害性アッセイを設定した。結腸癌起源の３つの異なる細胞株を使用した；結果から、両ＮＫ細胞がＥＧＦＲおよびＲＡＳ状態とは無関係に細胞溶解を誘導することが自明であった。ＥＧＦＲ陰性であるＣＯＬＯ３２０の場合、セツキシマブの追加効果は見られなかったが、Ａ−ＰＢＮＫ細胞よりも有意に高いレベル（ｐ＜０．０１）でＵＣＢ−ＥＣ細胞単独によって死滅した。ＥＧＦＲ＋ＲＡＳｍｕ  ＳＷ４８０およびＥＧＦＲ＋ＢＲＡＦｍｕ  ＨＴ−２９について、Ａ−ＰＢＮＫ＋ＣＥＴの組み合わせはＡＤＣＣを介した腫瘍死滅を増強し、それらの死滅レベルはＵＣＢ−ＥＣ細胞に匹敵した（図３１Ａ）。ＵＣＢ−ＥＣ細胞は、インビトロで低いＣＤ１６レベルのためにセツキシマブと組み合わせてＡＤＣＣを行うことができなかった７３。同様に、ＮＫ脱顆粒は、試験した細胞株のＮＫ殺傷を反映していた（図３１Ｂ）。
【０２４１】
これらの結果は、ＵＣＢ−ＥＣ細胞が、セツキシマブ耐性結腸癌細胞に対してインビトロでＡ−ＰＢＮＫ細胞より優れた細胞傷害性効果を有することを示す。
【０２４２】
[実施例１５]
ＵＣＢ−ＥＣはインビボで腫瘍増殖および転移を阻害する
標的細胞レンチウイルス感染
【０２４３】
ＥＧＦＲ＋ＲＡＳｗｔ  Ａ４３１およびＥＧＦＲ＋ＲＡＳｍｕｔ  ＳＷ４８０細胞株にインビボ試験のためにガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を安定的に形質導入した。Ｃｅｒｕｌｅａｎ蛍光タンパク質（ＣＦＰ）陽性Ｇｌｕｃウイルス（ＬＶ−ＣＦＰ−Ｇｌｕｃ）のレンチウイルス（ＬＶ）上清は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｕｄｒｉｎｇｅｒによって親切にも提供され、Ｗｕｄｒｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：５８２〜５９１）８６に記載されるプロトコルに従って製造された。細胞を２回選別してより高い純度を達成し、形質導入効果をフローサイトメトリーを用いて確認した。Ｇｌｕｃ純度が９５％未満のＳＷ４８０細胞をマウスへの腫瘍注射に使用した。
マウス
【０２４４】
免疫不全ＢＲＧＳマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｒａｇ２ｔｍｌＦｗａ  ＩＬ−２Ｒγｃｔｍ１ＣｇｎＳＩＲＰαＮＯＤ）をこの試験に使用した１。２４匹の成体マウスに、尾静脈を介して、０．５×１０６個のＳＷ４８０  Ｇｌｕｃ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、ＳＷ４８０単独（Ｉ）、ＳＷ４８０＋セツキシマブ（ＩＩ）、ＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＥＣ（ＩＩＩ）およびＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ（ＩＶ）の４群にランダム化した。処理群ＩＩＩおよびＩＶについて、マウス１匹当たり３０×１０６個のＵＣＢ−ＥＣを、腫瘍注射後１、３および７日目にｉ．ｖ．注入した（１０×１０６個細胞／注射）。同様に、ＩＩおよびＩＶ群について、マウス１匹当たり０．５ｍｇのセツキシマブを、１、３および７日目に腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。血中Ｇｌｕｃレベルおよび生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、治療効果を監視した。ＢＲＧＳマウスの全ての操作を、層流条件下で行った。
倫理声明
【０２４５】
動物は、人道的ケアを伴う病原体のない条件下で隔離飼育器に収容し、苦痛を最小限に抑えるために吸入イソフルラン麻酔を用いて麻酔を実施した。実験は、パスツール研究所の倫理委員会（参照番号２００７−００６）によって承認され、フランス教育研究省（参照番号０２１６２．０１）によって検証された。
インビトロでの血中Ｇｌｕｃ定量
【０２４６】
分泌されたＧｌｕｃは、以前に記載されたプロトコルに従って測定した２。１０μｌの血液を、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＣＢチューブを含むＥＤＴＡに毛管現象により回収した。血液試料を９６穴黒色プレートに分配し、次いで、ＰＢＳ（Ｐ．Ｊ．Ｋ．ＧｍｂＨ；Ｋｌｅｉｎｂｌｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆ、ドイツ）中１００ｍＭ  Ｇｌｕｃ基質天然セレンテラジン１００μｌと混合した。腫瘍接種前に採取した血液がベースライン値として働いた。測定を３５日目まで週２回行った。Ｇｌｕｃ活性を、ＩＶＩＳスペクトルインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてルミノメーターを用いて測定した。
生物発光イメージング
【０２４７】
２．５ｐｍのガス流で誘導チャンバー内でイソフルランガスを用いてマウスを麻酔した。セレンテラジン（４ｍｇ／ｋｇ体重）の後眼窩注射を投与し、マウスをイメージングチャンバー内の麻酔マニホールドに入れ、基質注射後５分以内に画像化した。マウスを光チャンバーに入れ、オーバーレイ画像を１５分間収集した。次いで、画像をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを用いて分析した。
【０２４８】
ＵＣＢ−ＥＣ細胞がインビボで同様の抗腫瘍効果を示すことができるかどうかに対処するために、本発明者らは、ＢＲＧＳｗｔマウスでＧｌｕｃ形質導入ＳＷ４８０細胞に対するＵＣＢ−ＥＣ細胞の細胞傷害性効果を試験した。ＳＷ４８０細胞はＥＧＦＲ＋ＲＡＳｍｕｔであり、セツキシマブ単独療法耐性である。ＮＳＧマウスにおけるＵＣＢ−ＥＣ細胞を用いた以前の研究は、２週間でＣＤ１６の２％から８０％へのインビボ上方制御を報告し８７、ＢＲＧＳｗマウスにおいてインビボでそれがＡＤＣＣになり得る場合、セツキシマブとの併用療法が報告されたが、本発明者らはインビトロではＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ試験の利益を認めなかった（図３０）。マウスを対照群（ＳＷ４８０単独およびＳＷ４８０＋セツキシマブ）および処理群（ＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＥＣおよびＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ）に分けた。０．５×１０６個のＧｌｕｃ  ＳＷ４８０細胞を静脈内（ｉ．ｖ）注射し、引き続いて３０分間ＮＫ細胞を、ＵＣＢ−ＥＣ単独およびＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ群に１注射（ｉ．ｖ）当たり１０００万個のＮＫ細胞として注入し、０．５ｍｇのセツキシマブを腫瘍注射後１、４および７日目にＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ群に腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。腫瘍増殖を画像化するため、および血中Ｇｌｕｃ試験（図３１）と相関する手段として、生物発光イメージングを３５日目に行った。腫瘍増殖および転移を制御するＮＫ細胞の潜在的役割を評価するために、本発明者らは、腫瘍注射後１週間に２回、ガウシアルシフェラーゼレベルについてマウス血液を調べた。血中Ｇｌｕｃレベルは、治療有意性に関するリアルタイムの情報を積極的に提供することに加えて、腫瘍体積を直接反映する８８。血中Ｇｌｕｃレベルから、インビトロでセツキシマブに耐性であったＳＷ４８０腫瘍細胞の増殖が、セツキシマブによる処理後もインビボでは影響を受けないことが確認された。しかしながら、興味深いことに、ＵＣＢ−ＥＣ細胞単独での処理は、両処理群において腫瘍負荷を有意に減少させた。ＵＣＢ−ＥＣ細胞へのセツキシマブの添加は、ＡＳ突然変異腫瘍の増殖を阻害する効果を全く有さなかった。データを組み合わせると、対照群（図３２）と比較して、処理群では血中Ｇｌｕｃレベルが有意に（ｐ＝０．０１３）低下していることが観察された。異なる時間点でのＧｌｕｃ測定は、治療の縦方向分析を可能にし、養子移植されたＵＣＢ−ＥＣ細胞による抗腫瘍能力および全身転移の抑制を明らかに実証している。これらのデータは、しばしば抗体療法が有効でない状況における、結腸癌の治療へのＵＣＢ−ＥＣ細胞の使用について非常に示唆的である。
【０２４９】
[実施例１６]
ＵＣＢ−ＥＣ細胞はインビボでセツキシマブ耐性ＲＡＳ変異結腸癌細胞を有効に標的化し、溶解する
標的細胞レンチウイルス感染
【０２５０】
ＥＧＦＲ＋ＲＡＳｗｔ  Ａ４３１およびＥＧＦＲ＋ＲＡＳｍｕｔ  ＳＷ４８０細胞株にインビボ試験のためにガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を安定的に形質導入した。Ｃｅｒｕｌｅａｎ蛍光タンパク質（ＣＦＰ）陽性Ｇｌｕｃウイルス（ＬＶ−ＣＦＰ−Ｇｌｕｃ）のレンチウイルス（ＬＶ）上清は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｕｄｒｉｎｇｅｒによって親切にも提供され、Ｗｕｄｒｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：５８２〜５９１）８６に記載されるプロトコルに従って製造された。細胞を２回選別してより高い純度を達成し、形質導入効果をフローサイトメトリーを用いて確認した。Ｇｌｕｃ純度が９５％未満のＳＷ４８０細胞をマウスへの腫瘍注射に使用した。
マウス
【０２５１】
免疫不全ＢＲＧＳマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｒａｇ２ｔｍ１Ｆｗａ  ＩＬ−２Ｒγｃｔｍ１ＣｇｎＳＩＲＰαＮＯＤ）をこの試験に使用した３。２４匹の成体マウスに、尾静脈を介して、０．５×１０６個のＳＷ４８０  Ｇｌｕｃ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、ＳＷ４８０単独（Ｉ）、ＳＷ４８０＋セツキシマブ（ＩＩ）、ＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＥＣ（ＩＩＩ）およびＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ（ＩＶ）の４群にランダム化した。処理群ＩＩＩおよびＩＶについて、マウス１匹当たり３０×１０６個のＵＣＢ−ＥＣを、腫瘍注射後１、３および７日目にｉ．ｖ．注入した（１０×１０６個細胞／注射）。同様に、ＩＩおよびＩＶ群について、マウス１匹当たり０．５ｍｇのセツキシマブを、１、３および７日目に腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。血中Ｇｌｕｃレベルおよび生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、治療効果を監視した。ＢＲＧＳマウスの全ての操作を、層流条件下で行った。
倫理声明
【０２５２】
動物は、人道的ケアを伴う病原体のない条件下で隔離飼育器に収容し、苦痛を最小限に抑えるために吸入イソフルラン麻酔を用いて麻酔を実施した。実験は、パスツール研究所の倫理委員会（参照番号２００７−００６）によって承認され、フランス教育研究省（参照番号０２１６２．０１）によって検証された。
生物発光イメージング
【０２５３】
２．５ｐｍのガス流で誘導チャンバー内でイソフルランガスを用いてマウスを麻酔した。セレンテラジン（４ｍｇ／ｋｇ体重）の後眼窩注射を投与し、マウスをイメージングチャンバー内の麻酔マニホールドに入れ、基質注射後５分以内に画像化した。マウスを光チャンバーに入れ、オーバーレイ画像を１５分間収集した。次いで、画像をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを用いて分析した。
【０２５４】
ＵＣＢ−ＥＣ細胞のインビボ投与は血中Ｇｌｕｃ読み取りから原発腫瘍負荷および転移を減少させることができたが、次に、本発明者らは腫瘍分布および治療効果の程度を確認するためにマウスを画像化した。腫瘍注射の３５日後に各群から４匹のマウスを画像化した。ＳＷ４８０細胞の尾静脈注射後、４匹のマウスのうち３匹が、ＳＷ４８０単独およびＳＷ４８０＋セツキシマブ群に示されるように、最初に肺で腫瘍負荷が検出され、さらに肝臓、脾臓、結腸および腹腔に広がった一方、処理群３／４および２／４は、対照群と比較して有意に低下した放射輝度で、ＵＣＢ−ＥＣ単独およびＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ群において完全に腫瘍がなかった（図３３Ａおよび３３Ｂ）。さらに、ＳＷ４８０実験と並行して、セツキシマブがＢＧＳｗｔマウスにおいてインビボで機能的であるかどうかを検証するために、セツキシマブ感受性のＥＧＦＲ過剰発現ＲＡＳｗｔ  Ａ４３１細胞株を用いてセツキシマブの抗腫瘍効果を試験した。Ａ４３１腫瘍をＳＷ４８０細胞と同じ濃度のセツキシマブで処理した場合、腫瘍負荷の有意な減少が観察された（図３３Ｃ）。全体としてＳＷ４８０試験のイメージング結果は、血中Ｇｌｕｃ試験と相関し、さらに、ＵＣＢ−ＥＣ対ＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ群の間に明らかな差異はなかった。したがって、単独療法としてのまたはＵＣＢ−ＥＣ細胞と組み合わせたセツキシマブは、インビボでＲＡＳ変異腫瘍に有意な治療上の利益を発揮することができないことが確認された。これらの結果は、セツキシマブ治療に耐性のｍＣＲＣ患者における治療のための普遍的な選択肢としてのＵＣＢ−ＥＣ細胞の使用を探索することをさらに肯定する。
【０２５５】
[実施例１７]
ＵＣＢ−ＥＣ細胞治療はインビボで腫瘍増殖を減少させ、生存率を増加させる
標的細胞レンチウイルス感染
【０２５６】
ＥＧＦＲ＋ＲＡＳｗｔ  Ａ４３１およびＥＧＦＲ＋ＲＡＳｍｕｔ  ＳＷ４８０細胞株にインビボ試験のためにガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を安定的に形質導入した。Ｃｅｒｕｌｅａｎ蛍光タンパク質（ＣＦＰ）陽性Ｇｌｕｃウイルス（ＬＶ−ＣＦＰ−Ｇｌｕｃ）のレンチウイルス（ＬＶ）上清は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｕｄｒｉｎｇｅｒによって親切にも提供され、Ｗｕｄｒｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：５８２〜５９１）８６に記載されるプロトコルに従って製造された。細胞を２回選別してより高い純度を達成し、形質導入効果をフローサイトメトリーを用いて確認した。Ｇｌｕｃ純度が９５％未満のＳＷ４８０細胞をマウスへの腫瘍注射に使用した。
マウス
【０２５７】
免疫不全ＢＲＧＳマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｒａｇ２ｔｍ１Ｆｗａ  ＩＬ−２Ｒγｃｔｍ１ＣｇｎＳＩＲＰαＮＯＤ）をこの試験に使用した４。２４匹の成体マウスに、尾静脈を介して、０．５×１０６個のＳＷ４８０  Ｇｌｕｃ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、ＳＷ４８０単独（Ｉ）、ＳＷ４８０＋セツキシマブ（ＩＩ）、ＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＥＣ（ＩＩＩ）およびＳＷ４８０＋ＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ（ＩＶ）の４群にランダム化した。処理群ＩＩＩおよびＩＶについて、マウス１匹当たり３０×１０６個のＵＣＢ−ＥＣを、腫瘍注射後１、３および７日目にｉ．ｖ．注入した（１０×１０６個細胞／注射）。同様に、ＩＩおよびＩＶ群について、マウス１匹当たり０．５ｍｇのセツキシマブを、１、３および７日目に腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。血中Ｇｌｕｃレベルおよび生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて、治療効果を監視した。ＢＲＧＳマウスの全ての操作を、層流条件下で行った。
倫理声明
【０２５８】
動物は、人道的ケアを伴う病原体のない条件下で隔離飼育器に収容し、苦痛を最小限に抑えるために吸入イソフルラン麻酔を用いて麻酔を実施した。実験は、パスツール研究所の倫理委員会（参照番号２００７−００６）によって承認され、フランス教育研究省（参照番号０２１６２．０１）によって検証された。
インビトロでの血中Ｇｌｕｃ定量
【０２５９】
分泌されたＧｌｕｃは、以前に記載されたプロトコルに従って測定した５。１０μｌの血液を、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＣＢチューブを含むＥＤＴＡに毛管現象により回収した。血液試料を９６穴黒色プレートに分配し、次いで、ＰＢＳ（Ｐ．Ｊ．Ｋ．ＧｍｂＨ；Ｋｌｅｉｎｂｌｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆ、ドイツ）中１００ｍＭ  Ｇｌｕｃ基質天然セレンテラジン１００μｌと混合した。腫瘍接種前に採取した血液がベースライン値として働いた。測定を３５日目まで週２回行った。Ｇｌｕｃ活性を、ＩＶＩＳスペクトルインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてルミノメーターを用いて測定した。
生物発光イメージング
【０２６０】
２．５ｐｍのガス流で誘導チャンバー内でイソフルランガスを用いてマウスを麻酔した。セレンテラジン（４ｍｇ／ｋｇ体重）の後眼窩注射を投与し、マウスをイメージングチャンバー内の麻酔マニホールドに入れ、基質注射後５分以内に画像化した。マウスを光チャンバーに入れ、オーバーレイ画像を１５分間収集した。次いで、画像をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ４．０ソフトウェアを用いて分析した。
【０２６１】
ＵＣＢ−ＥＣ細胞による有意な抗腫瘍効果がインビボでの生存利益になり得るかどうかに対処するために、マウスの生存利益を監視した。ＳＷ４８０細胞の堅固な増殖および広がりは、４０日目までに全てのＰＢＳ対照マウスの死をもたらした。セツキシマブで処理したマウスは４４日まで生存し、ＳＷ４８０単独とＳＷ４８０＋セツキシマブ群との間に有意な差は観察されなかった。ＵＣＢ−ＥＣ細胞単独による処理は、ＰＢＳ対照群と比較して、ＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブについてさらに２２日（ｐ＝０．００７）および２５日（ｐ＝０．００３）の有意な生存の増加をもたらした。同様に、ＵＣＢ−ＥＣ（ｐ＝０．００１２）およびＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブ（ｐ＝０．００１５）をセツキシマブ単独処理群と比較すると、データは有意であった。ＵＣＢ−ＥＣおよびＵＣＢ−ＥＣ＋セツキシマブの生存率は、互いに有意には異ならなかった。
【０２６２】
本発明者らの結果は、ＵＣＢ−ＥＣ細胞がＥＧＦＲ＋ＲＡＳ変異腫瘍を効率的に標的化し、ＵＣＢ−ＥＣ処理マウスにおける生存率の増加を促進することを立証する。報告されたデータは、ＵＣＢ−ＥＣ細胞の有意な抗腫瘍応答を示し、いくつかの他の化学療法抵抗性固形腫瘍における治療成績を実質的に改善するように拡大することができる。
【０２６３】
参考文献
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2019501956.tif 000021
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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