【手続補正書】
【提出日】平成19年11月2日(2007.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  生物学的試料中の血管内皮増殖因子（VEGF）の複数のアイソフォームを検出する方法であって、
（a）固体担体上に固定化された捕獲試薬と共に生物学的試料をインキュベートして、捕獲試薬にVEGFの複数のアイソフォームを結合させるステップであって、該捕獲試薬は、VEGFに結合するポリクローナル抗体とヒトVEGFのＣ末端アミノ酸残基111-165に特異的に結合するモノクローナル抗体を含んでなる混合物を含むスッテプと、
（b）固定化された捕獲試薬に結合したVEGFを、VEGFのＮ末端アミノ酸残基1-110と結合する検出可能抗体に該結合VEGFを接触させることによって、検出するステップ、
を含んで成る方法。
【請求項２】  生物学的試料がヒトから単離される請求項１に記載の方法。
【請求項３】  ヒトが血管性の、糖尿病の、又は癌の患者である請求項２に記載の方法。
【請求項４】  生物学的試料が血漿、血清又は尿である請求項１に記載の方法。
【請求項５】  固体担体がマイクロタイタープレートである請求項１に記載の方法。
【請求項６】  ステップ(a)のインキュベーションのpHが6.0から9.5である請求項１に記載の方法。
【請求項７】  前記pHが、
(a)6.0から7.0；
(b)6.0から6.5；又は
(c)6.34から6.36
の一つである請求項６に記載の方法。
【請求項８】  ステップ(a)のインキュベーションの温度が0℃から40℃である請求項１に記載の方法。
【請求項９】  前記温度が36℃から38℃である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  ステップ(a)のインキュベーションが0.5から3.0時間である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】  前記インキュベーションが3時間である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】  ステップ(a)のインキュベーションが一晩である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】  (c) (b)で検出されたVEGFの量を測定し、該量は標準曲線を使って定量することをさらに含んで成る請求項１から１２のいずれか一つの方法。
【請求項１４】  捕獲試薬が、0.8：1から1.2：1のモノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の重量比で固定化される請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】  モノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の重量比が1：1である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】  固定化されたモノクローナル抗体の量が0.4μg/mlであり、固定化されたポリクローナル抗体の量が0.4μg/mlである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】  検出可能抗体が直接検出可能である請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】  検出可能抗体がビオチン化または蛍光定量試薬により増幅される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】  捕獲試薬モノクローナル抗体がATCC受領番号HB PTA-3499であるハイブリドーマまたはその継代から産生されるMAb
3.5F8である請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】  捕獲試薬ポリクローナル抗体がウサギ又はヤギポリクローナル抗体である請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】  捕獲試薬ポリクローナル抗体がアフィニティー精製される請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】  捕獲試薬モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】  検出可能抗体がモノクローナル抗体である請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】  検出可能モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】  検出可能モノクローナル抗体がATCC受領番号HB10709のハイブリドーマまたはその継代から産生されるMAb A4.6.1である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】  生物学的試料中の血管内皮増殖因子（VEGF）の複数のアイソフォームを検出するためのイムノアッセイキットであって、
（a）捕獲試薬として、VEGFに結合するポリクローナル抗体とヒトVEGFのＣ末端アミノ酸残基111-165に特異的に結合するモノクローナル抗体とを含んで成る混合物、及び
（b）検出試薬として、VEGFのＮ末端アミノ酸残基1-110に結合する検出可能抗体、
を含んで成るキット。
【請求項２７】  抗原標準として精製VEGFを更に含んでなる請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】  検出可能抗体が蛍光的に標識される請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】  捕獲試薬モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】  捕獲試薬ポリクローナル抗体がウサギ又はヤギポリクローナル抗体である請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】  捕獲試薬ポリクローナル抗体がアフィニティー精製される請求項２６に記載のキット。
【請求項３２】  検出可能抗体がモノクローナル抗体である請求項２６に記載のキット。
【請求項３３】  捕獲試薬モノクローナル抗体がATCC受領番号HB PTA-3499のハイブリドーマまたはその継代から産生されるMAb 3.5F8である請求項２９に記載のキット。
【請求項３４】  検出可能モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】  検出可能モノクローナル抗体がATCC受領番号HB10709のハイブリドーマまたはその継代から産生されるMAb A4.6.1である請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】  捕獲試薬が、0.8：1から1.2：1のモノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の重量比で固定化される請求項２７から３３のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】  固体担体がマイクロタイタープレートである請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】  モノクローナル抗体：ポリクローナル抗体の重量比が1：1である請求項３６に記載のキット。
【請求項３９】  固定化されたモノクローナル抗体の量が0.4μg/mlであり、固定化されたポリクローナル抗体の量が0.4μg/mlである請求項３６に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００３】
血管形成の正の調節因子の探索により、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、ＨＧＦ、ＴＮＦ-α、アンジオゲニン、ＩＬ-８等を含む多くの候補薬が得られている（Folkman等、上掲、及びKlagsbrun等, 上掲）。これまでに同定されている負の調節因子には、トロンボスポンジン(Good等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87：6624-6628(1990))、プロラクチンの１６-キロダルトンのＮ-末端フラグメント(Clapp等, Endocrinology, 133：1292-1299(1993))、アンギオスタチン(O'Reilly等, Cell, 79：315-328(1994))及びエンドスタチンが含まれる（O'Reilly等, Cell, 88：277-285(1996)）。
最近の数年間にわたってなされた研究で、正常及び異常な血管新生の調節における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の重要な役割が確立されている（Ferrara等, Endocr. Rev., 18：4-25(1997)）。一つのＶＥＧＦ対立遺伝子さえ喪失すると胎児死亡に至るという知見は、血管系の発達と分化におけるこの因子が担っている代替できない役割を示している（Ferrara等, 上掲）。