【手続補正書】
【提出日】平成19年7月24日(2007.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養物を取得する方法であって、
（ａ）始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞を原条形成後のトリ胚から集め；
（ｂ）そのトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて付着させ；そして
（ｃ）本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ生殖腺細胞を培地の存在下に予め調整しておいたフィーダーマトリックスで増殖させる；
ことを含んでなる方法。
【請求項２】  トリ生殖腺細胞を１４期〜４５期の胚から集める、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  トリ生殖腺細胞を１５期〜３１期の胚から集める、請求項２に記載の方法。
【請求項４】  トリ生殖腺細胞を２７期〜３０期の胚から集める、請求項３に記載の方法。
【請求項５】  トリ生殖腺細胞を約１０,０００〜約２０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】  約２０,０００のトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて付着させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】  予め調整しておいたフィーダーマトリックスが繊維芽細胞を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】  繊維芽細胞が約４０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】  繊維芽細胞が約５０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  繊維芽細胞が約５５,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  約６０,０００の繊維芽細胞が予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】  繊維芽細胞がマウス繊維芽細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】  マウス繊維芽細胞がマウス繊維芽細胞フィーダー層を形成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】  マウス繊維芽細胞がマウスＳＴＯ繊維芽細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】  未分化のトリ細胞を培地の存在下に予め調整しておいた繊維芽細胞フィーダーマトリックスで少なくとも３日間増殖させる場合に幹細胞表現型を保持することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】  トリ胚が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジの胚よりなる群から選択される胚である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】  トリ胚がニワトリ胚である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】  培地が調整培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】  胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養物を取得する方法であって、
（ａ）始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞を原条形成後のトリ胚から集め；
（ｂ）そのトリ生殖腺細胞を予め調整しておいた繊維芽細胞フィーダー細胞マトリックスと接触させて付着させ；そして
（ｃ）本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ生殖腺細胞を培地の存在下にフィーダー細胞マトリックスで増殖させる；
ことを含んでなる方法。
【請求項２０】  トリ生殖腺細胞を１４期〜４５期の胚から集める、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】  トリ生殖腺細胞を１５期〜３１期の胚から集める、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】  トリ生殖腺細胞を２７期〜３０期の胚から集める、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】  トリ生殖腺細胞を約１０,０００〜約２０,０００生殖腺細胞の範囲数でフィーダー細胞マトリックスと接触させて付着させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】  約２０,０００のトリ生殖腺細胞をフィーダー細胞マトリックスと接触させて付着させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】  繊維芽細胞が約４０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】  繊維芽細胞が約５０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】  繊維芽細胞が約５５,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】  約６０,０００の繊維芽細胞が繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】  繊維芽細胞フィーダーマトリックスがマウス繊維芽細胞を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】  マウス繊維芽細胞がマウスＳＴＯ繊維芽細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】  未分化のトリ細胞を培地の存在下に繊維芽細胞フィーダーマトリックスで少なくとも３日間増殖させる場合に幹細胞表現型を保持することができる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】  トリ胚が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジの胚よりなる群から選択される胚である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】  トリ胚がニワトリ胚である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】  培地が調整培地である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】  胚幹細胞表現型を発現する未分化のニワトリ細胞の持続性培養物を取得する方法であって、
（ａ）生殖腺細胞を２７期〜３０期のニワトリ胚から集め；
（ｂ）その生殖腺細胞を予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層と接触させて付着させ；そして
（ｃ）持続性トリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、その生殖腺細胞を調整培地の存在下に予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層で増殖させ、その持続性トリ細胞培養物は、本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなる；
ことを含んでなる方法。
【請求項３６】  生殖腺細胞を約１０,０００〜約２０,０００生殖腺細胞の範囲数で予め調整しておいたマウスフィーダー細胞層と接触させて付着させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】  約２０,０００の生殖腺細胞を予め調整しておいたマウスフィーダー細胞層と接触させて付着させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】  繊維芽細胞が約４０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】  繊維芽細胞が約５０,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】  繊維芽細胞が約５５,０００〜約６０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】  約６０,０００の繊維芽細胞が予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】  予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層がマウスＳＴＯ繊維芽細胞フィーダー細胞層である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】  未分化のトリ細胞を培地の存在下に予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層で少なくとも３日間増殖させる場合に幹細胞表現型を保持することができる、請求項３５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
発明の要約
胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養物を取得する方法を開示する。その方法の好ましい態様は、（ａ）始原生殖細胞を含有するトリ細胞を原条形成後のトリ胚から集め；（ｂ）そのトリ細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて付着させ；そして（ｃ）本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ細胞を培地の存在下にフィーダーマトリックスで増殖させる；ことを含んでなる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
そのトリ細胞は、１４期以降の胚（Ｈ ＆ Ｈ）、好ましくは１４期〜４５期の胚、より好ましくは１５期〜３１期の胚、そしてさらにより好ましくは２７期〜３０期の胚から集める。より好ましくは、そのトリ細胞を約１０,０００〜約２０,０００細胞の範囲数でフィーダーマトリックスと接触させて付着させる。さらにより好ましくは、約２０,０００のトリ細胞をフィーダーマトリックスと接触させて付着させる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
図４Ｃは、３日間培養した後の、ＰＧＣ由来のＥＳ細胞の大きなコロニーを図示する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
図４Ｆは、５日間培養した後の、ＰＧＣ由来のＥＳ細胞コロニーの高倍率像を図示する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
当業界で知られている手順に従って、本明細書中で使用するフィーダーマトリックスを構築する。上述したように、フィーダーマトリックスを予め調整しておくのが好ましい。「予め調整しておく」という用語は、始原生殖細胞を含有する生殖腺細胞をフィーダーマトリックスと接触させて付着させるより前の時間、例えば、フィーダーマトリックスによる増殖因子または他の因子の産生を開始させて確立するのに十分な時間、フィーダーマトリックスを培地の存在下に培養することを意味する。実験例に開示するように、始原生殖細胞を含有する生殖腺細胞をフィーダーマトリックスと接触させて付着させるより前に、フィーダーマトリックス自体を１〜２日間培養することにより、フィーダーマトリックスを予め調整しておく。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
トリ種において、レシピエントの胚へと注入した場合に生存能力を保有する、あるドナーの細胞型を単離している。Ｅtchesら，Ｐoultry Ｓcience ７２：８８２−８８７（１９９３）；Ｅtchesら，Ａvian Ｉncubationにおいて，第２２章、Ｂutterworth Ｐublishers（１９９０）；Ｖerrinder Ｇibbinsら，Ｆourth Ｗorld Ｃongress on Ｇenetics Ａpplied to Ｌivestock Ｐroduction，Ｅdinburgh（１９９０）；Ｐetitteら，Ｄevelopment １０８，１８５−１８９（１９９０）を参照されたい。これらの試験は、Ｘ期の胚（産卵時の胚）から誘導された胞胚葉細胞が、比較可能なレシピエントのＸ期の胚に移された場合でも生存能力を持ったままであることを示した。このように、本発明は、トリの表現型を変える新たな方法、および本明細書中に開示するトリ胚幹細胞でそのように産生されたトリを提供する。その方法は、本明細書中に開示するトリ胚幹細胞にインビトロでＤＮＡ配列を（例えば、レトロウイルスベクターでの電気穿孔またはトランスフォーメーションにより）トランスフェクトした後、そのトランスフェクトした胚幹細胞を、孵化後のトリにおいて表現型の変化（例えば、タンパク質発現の変化、増殖率、試料効率、疾患抵抗性、またはこれらの因子全ての組み合わせの変化）をもたらすのに有効であるＤＮＡ配列と共に、トリ胚を含有する卵へと（例えば、卵黄嚢へと、または漿尿膜へと、好ましくは胚下腔へと、そして好ましくは初期の胚発生の間に（例えば、インキュベーションの２または３日前に、そして最も好ましくはインキュベーションの１日前に））注入することを含んでなる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
ベクターは、目的の遺伝子をコードするＤＮＡを増幅および／または発現させるために本明細書中で使用する製可能なＤＮＡ構築物である。適当な発現ベクターは、そのベクターを正しい宿主へと導入した場合にクローンcＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを正しい方向で発現させることができる調節要素を有するであろう。そのような要素には、典型的には、限定されるものではないが、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するプロモーター領域、または誘発剤の投与により誘発可能であり得るプロモーター領域、結合した非相同プロモーター、スプライスアクセプターおよび／またはドナー配列からの転写を何倍も刺激することができるエンハンサー要素、並びに終止およびポリアデニル化シグナルが含まれる。翻訳を可能とすることができるリボソーム結合部位のための配列も必要であって、これを発現させるべき遺伝子に操作可能なように結合させる。最近、骨格筋構造遺伝子および必須近位プロモーター配列の両方の上流に位置して、操作可能なように互いに関連する、筋肉に特異的なプロモーターが単離された（ＭarおよびＯrdahl，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８５，６４０４−６４０８（１９８８））。ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、および組換えにより宿主ゲノムへと組み込み可能なＤＮＡフラグメントを含んでなる。そのベクターは、場合により、独立して宿主ゲノムを複製して機能するのがよく、または幾つかの場合には、ゲノム自体へと組み込むのがよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
実施例１
生殖腺細胞の収集
ＥＤＴＡを使用して、生殖腺ＰＧＣおよびストローマ細胞の混合物を２７−３０期（Ｈ ＆ Ｈ）の胚生殖腺から集めた。単一細胞懸濁液を得るよう注意する。特に、２７−３０期（Ｈ ＆ Ｈ）のニワトリ胚からの生殖腺を適当な(blunt)切開により集めて、Ｃa２＋およびＭg２＋を含んでいないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ(−)）１滴にプールした。胚から集めた後、１.５mlのＥppendorfチューブ中、その生殖腺を０.０２％ ＥＤＴＡ １mlへと入れた後、３７℃のインキュベーターに１０分間入れた。次いで、そのチューブを２００Ｇで３分間遠心分離にかけて、上澄みを除去した。次いで、集めた生殖腺を、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭと共に、細胞濾過器（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）２３６０、細孔径１００μＭ）から新たなチューブへと通した。これは、単一細胞懸濁液を与えた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例２
生殖腺細胞の培養
生殖腺細胞をＳＴＯフィーダー層で３−５日間培養して、抗ＳＳＥＡ−１で染色した。単一のＳＳＥＡ−１陽性ＰＧＣ数およびＳＳＥＡ−１陽性コロニー数を、培養の０、１、３および５日目に試験した。最も多くの場合、多数のＰＧＣの死が最初の２４時間の培養物で起こり、続いて、単一のＰＧＣ数の増大が３−５日目に起こった。生殖腺ＰＧＣの生存および増殖は、ＳＴＯフィーダー層の質、播種したＳＴＯ細胞数、ＳＴＯフィーダー層の予調整、および初期に播種した生殖腺細胞数により影響を受ける。実験の間に、多数の変動がＦＢＳの１つのバッチ内で観察され、ＦＢＳ起源が培養物に影響を及ぼし得ることが提唱された。