【手続補正書】
【提出日】平成19年11月1日(2007.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
アポトーシス率（％）を、実施例６に示すように決定した。（ａ）〜（ｇ）の文字は、実施例１０に示す研究と実施例１０において選択した特定の実験条件とに対応している（実施例１０参照）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
アポトーシス率は、実施例６に示すように決定された。新鮮培養液中での培養は対照であり、静置細胞培養における自発アポトーシス率を示す。状態調節培養液は、すでに４８〜７２時間、内皮細胞を培養したものであり、したがって内皮細胞によって分泌された因子を含む。状態調節された培養液によって生じるアポトーシス率は、新鮮培養液＋ＴＳＰ−１と同じレベルであり、これは、一つ以上のアポトーシス媒介物質がこの状態調節培養液中に存在するはずである、ということを示す。状態調節培養液の調製については、実施例５で説明する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明の方法により試験すべき活性物質は、特に、分子生物学および遺伝子操作の通常の方法により容易に得ることのできるモノクローナル抗体およびペプチドである。しかし、明らかに、同様の効果を有する他の物質も本発明の試験法により見出すことができる。ここでは、“抗体”という言葉は、完全抗体（すなわち、二つの重鎖と二つの軽鎖とを有する抗体）と抗原結合部位を有する抗体フラグメントとの両方を意味する。抗アポトーシス活性を有する抗ＴＳＰ−１抗体の識別について、実施例１０で述べる。同様にして、アポトーシスの誘発を防ぐために多数の他の抗体および抗体フラグメントを試験することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
本発明は、また、通常の製薬基剤とともに、有効量の、抗アポトーシス活性を有する物質を含む製剤を提供する。製薬基剤は、たとえば、固体または液体増量剤、カプセル材料または溶剤である。製薬基剤として使用できる材料の例としては、糖（たとえば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）、デンプン（たとえば、コーンスターチ、およびジャガイモデンプン）、セルロースおよびその誘導体（たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、およびセテイン酸セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｃｅｔａｔｅ））、粉末化トラガント、モルト、ゼラチン、タロー、薬物基剤（たとえば、カカオバター、および座剤ロウ）、油（たとえば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油）、ポリオール（たとえば、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール）、エステル（たとえば、オレイン酸エチル、およびエチルラウレエート（ｌａｕｒｅａｔｅ））、寒天、緩衝剤（たとえば、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウム）、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、およびリン酸塩緩衝剤溶液、ならびに薬剤組成物に使用される他の非毒性の融和性の物質、がある。湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、たとえばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、滑沢剤、被覆剤、ならびに芳香剤（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇａｇｅｎｔ）および保存料も、同様に、製薬技術者の要求に応じて、製剤中に存在することができる。一回分の服用量とするために基剤物質に混合する活性成分の量は、治療を受ける患者および投与法によって変わる。そのような薬剤組成物の一例を実施例１３に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
アポトーシス率は、実施例６に示すようにしてＤＡＰＩ染色したあと測定した（それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す）。パーセントアポトーシス率は、全細胞カウント数に対するものである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
実施例９ 
抗アポトーシス活性を有するペプチドまたは蛋白質に関する試験系 
細胞を、実施例１および実施例２に述べたようにして培養した。細胞を適当な培養容器に植えつけて（たとえば、２４ウェルプレート；ウェルあたり０．５ｍｌ）、完全な密集に達したあと、試験に使用した。内皮細胞のアポトーシス率に及ぼすいろいろなペプチドと蛋白質の影響に関する研究を実施した（表２）。この目的のために、ペプチドと蛋白質（表４）を培養液（実施例１）に溶解させ、示されている濃度（表４）で使用した。溶解試料を含む培養液を細胞に加え、培養条件（実施例１）下で３日間培養した。次に、細胞をＤＡＰＩによって染色し、実施例６に示すようにしてアポトーシス率を決定した。３回の独立の実験の結果の平均値と標準偏差を、表２にまとめて示す。状態調節培養液、ＴＳＰ−１、および活性ＲＧＤペプチド、ならびにＣＢＤペプチドのアポトーシス誘発効果が明らかである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
細胞内Ｃａの測定値（実施例７）を、初期指標として使用することができる。この目的のために、まず、細胞を実施例７で述べたようにして前処理し、ペプチドまたはＴＳＰ−１の添加時に蛍光計で測定した。ＴＳＰ−１添加または二つのペプチドの同時添加の場合にのみ、細胞内Ｃａレベルの上昇がもたらされた（図３）。新鮮培養液の添加または一つのペプチドのみの添加は、Ｃａレベルに影響を及ぼさない。細胞へのＣａの流入は初期指標として使用することができる。正物質の確認（Ｃａ信号）は、少なくとも２４時間の培養後に、ＤＡＰＩによってアポトーシス率を測定する（実施例６）ことによって、行うことができる。このようにして、抗アポトーシス活性を有する化合物を迅速かつあいまいさなしで識別することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
実施例１０ 
本発明の方法を使用した抗アポトーシス活性を有する抗体の識別
細胞を、実施例１および実施例２に述べたようにして培養した。細胞を適当な培養容器に植えつけて（たとえば、２４ウェルプレート；ウェルあたり０．５ｍｌ）、完全な密集に達したあと、試験に使用した。細胞に、次のように、新たに培養液を供給した。（ａ）新鮮培養液（基本アポトーシス率）、（ｂ）状態調節培養液（実施例５）（アポトーシス誘発効果）、（ｃ）ウサギの抗ＴＳＰ−１抗血清を含む状態調節した培養液（１：２０）（アポトーシス誘発およびアポトーシス阻害物質）、（ｄ）ウサギの抗ＴＳＰ−１抗血清を含む新鮮な培養液（１：２０）（アポトーシス阻害物質）、（ｅ）１μｇ／ｍｌのＴＳＰ−１を含む新鮮な培養液（アポトーシス誘発物質）、（ｆ）１μｇ／ｍｌのＴＳＰ−１およびウサギの抗ＴＳＰ−１抗血清を含む新鮮な培養液（１：２０）（アポトーシス誘発およびアポトーシス阻害物質）、（ｇ）モノクローナル抗ＴＳＰ−１抗体を含む新鮮な培養液（１：３０）（アポトーシス阻害物質）。培養条件（実施例１）下での２４時間の培養のあと、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色して、蛍光顕微鏡下で形態を調べるか、またはフローサイトメトリーによって調べた（実施例６）。アポトーシス細胞数と全細胞数とをカウントし、アポトーシス率（アポトーシス細胞の百分率）を算出した。３回の独立の実験のデータの平均値と標準偏差とを表１に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
この試験方法は、Ｃａ指示薬Ｆｌｕｏ−３ＡＭを用いて実施することもできる。そのために、細胞を、実施例１および実施例２に述べたようにして、培養した。細胞が完全な密集に達したあと、試験に使用した。細胞にＣａ指示薬を加え（実施例７）、蛍光計内に配置して、測定した。測定中、物質ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇを、細胞に加えた。これらの例のそれぞれには、活性化物質（状態調節培養液またはＴＳＰ−１）が含まれている。例ｂ）とｅ）では、Ｃａ流入があり、したがって測定蛍光値が増大した。例ｃ）、ｆ）、およびｇ）におけるように、同時にアポトーシス誘発物質をも添加すると、この増大は見られなかった。ＴＳＰ−１またはポリクローナル抗血清に対するモノクローナル抗体はＣａの流入を阻止し、したがってアポトーシスの誘発を阻止する。したがって、活性化物質（たとえば、ＴＳＰ−１）と試験すべき物質との同時添加による、アポトーシス阻害物質となる可能性のある物質の迅速な試験方法が確立されたと言える。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
手順： 
細胞は、実施例１に述べたようにして調製し、密集に到達したあと、さらに２４時間、コーン−プレート剪断装置によって培養した（実施例４参照）。培養皿を取りだし、適当なインサートを配置することにより、１２の独立培養ウェル（各ウェルの培養面積は０．８ｃｍ2）に分割した。培養物の半分を、ＥＧＴＡを含む培養液内で培養し、残りの半分をＥＧＴＡを含まない培養液内で培養した。下記の表５によれば、ＥＧＴＡを含む培養液内での培養の結果、アポトーシス率が有意に減少している。すなわち、ＣａがＥＧＴＡと錯体を形成することにより、アポトーシスの阻害がもたらされる。アポトーシス率はアポトーシス細胞をＤＡＰＩで染色することによって決定した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
アポトーシス率は、基本特許の実施例６に示すような、ＤＡＰＩ染色法を用いて決定した（それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す）。パーセントアポトーシス率は、全細胞カウント数に対するものである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例１２ 
Ｃａの錯体形成による、生体活性ペプチドによって誘発されるアポトーシスの抑制
器材（実施例４に加えて）：
− 生体活性ペプチドを含む培養液（基本特許の実施例１０、表４と比較されたい）
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
手順： 
細胞は、実施例１に述べたようにして調製し、完全な密集に到達したあと、さらに２４時間、コーン−プレート剪断装置によって培養した（実施例４参照）。剪断装置から培養皿を取りだし、実施例１１ですでに述べたように、適当なインサートを配置することにより、１２の独立培養ウェルに分割した。一方で、生体活性ペプチドを、０．５ｍＭのＥＧＴＡを含む培養液に溶解し、他方で、ＥＧＴＡを含まない培養液に溶解した（濃度：ＲＧＤペプチド：２５０μｇ／ｍｌ（０．５ｍＭ）；ＩＡＰペプチド：４００μｇ／ｍｌ（０．５ｍＭ））。そのあと、試料の半分を、ＥＧＴＡと活性ペプチドを含む培養液で処理し、残りの半分を、活性ペプチドを含むがＥＧＴＡを含まない培養液で処理した。これらの研究の結果を、下記の表６に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
アポトーシス率は、基本特許の実施例６に示すような、ＤＡＰＩ染色法を用いて決定した（それぞれの場合について、平均値と標準偏差を示す）。パーセントアポトーシス率は、全細胞カウント数に対するものである。