(57)【要約】核酸の自動化処理のためのデバイスおよび関連方法が、本明細書で提供される。いくつかの局面において、本出願は、少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される少なくとも１つの共有リソースを有するその少なくとも２つのカートリッジベイを含むデバイスに関する。いくつかの局面において、本発明は、核酸を処理するためのシステムおよび関連方法に関する。いくつかの実施形態において、上記システムは、核酸の自動化処理（自動化核酸ライブラリー調製を含む）を促進するカセットおよび／または微小流体チャネルを含むカートリッジを含む。いくつかの実施形態において、システムおよび関連方法は、次世代シーケンシングおよび／または他の下流分析技術の材料を生成する核酸の自動化処理のために提供される。
2019528750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応を行うためのデバイスであって、該デバイスは、
ｉ）少なくとも２つのカートリッジベイであって、各カートリッジベイは、反応容器を受容するための複数のレセプタクルを含むカートリッジベイアセンブリを収容するように構成される、少なくとも２つのカートリッジベイ；
ｉｉ）少なくとも２つのユーザーアクセスドアであって、各ドアは、該反応容器を含むカートリッジを１つのカートリッジベイから出し入れするための該１つのカートリッジベイへのアクセスを提供する２つのユーザーアクセスドア；および
ｉｉｉ）該少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される少なくとも１つの共有リソースであって、ここで該少なくとも１つの共有リソースは、該反応容器内の活性をモニターするように構成される、少なくとも１つの共有リソース、
を含むデバイス。
【請求項２】
前記カートリッジベイアセンブリは、サーマルカバーアセンブリを含み、該サーマルカバーアセンブリは、該サーマルカバーアセンブリと前記反応容器との間での熱交換を促進するように構成された熱伝導表面を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
少なくとも１つの共有リソースをさらに含み、該少なくとも１つの共有リソースは、前記少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有され、そして前記反応容器内での反応を処理するように構成される、請求項１〜２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項４】
少なくとも１つの共有リソースは、少なくとも１つの光学モジュールを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項５】
少なくとも１つの光学モジュールは、前記反応容器から発せられる電磁シグナルを集めるように構成される、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記集められる電磁シグナルは、蛍光シグナルを含む、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
少なくとも１つの光学モジュールは、前記反応容器へと電磁シグナルを発するように構成される、請求項４〜６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記発せられる電磁シグナルは、励起エネルギーを含む、請求項６に記載のデバイス。
【請求項９】
少なくとも１つの光学モジュールは、前記反応容器へと電磁シグナルを発し、該反応容器から電磁シグナルを集めるように構成される、請求項４〜８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１０】
少なくとも１つの光学モジュールは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項４〜９のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１１】
少なくとも１つの光学モジュールおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、電子モジュールによって駆動される、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
少なくとも１つの共有リソースは、少なくとも１つのバーコードスキャナーを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記バーコードスキャナーは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
少なくとも１つのバーコードスキャナーおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、電子モジュールによって駆動される、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
少なくとも１つの光学モジュールおよび少なくとも１つのバーコードスキャナーは、同じ自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１６】
少なくとも１つの共有リソースおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、同じ電子モジュールによって駆動される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１７】
少なくとも１つの自動化ポジショナーは、前記サーマルカバーアセンブリの上の指定された空間内で作動する、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１８】
反応を行うためのデバイスであって、該デバイスは、
ｉ）少なくとも２つのカートリッジベイであって、各カートリッジベイは、１つまたはこれより多くのカートリッジを受容するカートリッジベイアセンブリを収容するように構成される、少なくとも２つのカートリッジベイ；
ｉｉ）少なくとも２つのユーザーアクセスドアであって、各ドアは、カートリッジを１つのカートリッジベイから出し入れするための該１つのカートリッジベイへのアクセスを提供する、少なくとも２つのユーザーアクセスドア；
ｉｉｉ）該少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される少なくとも１つの共有リソースであって、ここで該少なくとも１つの共有リソースは、該反応をモニターするように構成される、少なくとも１つの共有リソース；および
ｉｖ）該少なくとも１つの共有リソースが該少なくとも２つのカートリッジベイのうちのいずれかによって利用されている間に、該少なくとも２つのカートリッジベイへのユーザーアクセスを禁止する制御特徴、
を含むデバイス。
【請求項１９】
前記カートリッジベイアセンブリは、反応容器を受容するための複数のレセプタクルを含む基部アセンブリを含む、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
１つまたはこれより多くのカートリッジは、前記反応容器を含む、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記カートリッジベイアセンブリは、サーマルカバーアセンブリを含み、該サーマルカバーアセンブリは、該サーマルカバーアセンブリと前記反応容器との間での熱交換を促進するように構成された熱伝導表面を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２２】
少なくとも１つの共有リソースをさらに含み、該少なくとも１つの共有リソースは、前記少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有され、そして前記反応容器内での反応を処理するように構成される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２３】
少なくとも１つの共有リソースは、少なくとも１つの光学モジュールを含む、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２４】
少なくとも１つの光学モジュールは、前記反応容器から発せられる電磁シグナルを集めるように構成される、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記集められる電磁シグナルは、蛍光シグナルを含む、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２６】
少なくとも１つの光学モジュールは、前記反応容器へと電磁シグナルを発するように構成される、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記発せられる電磁シグナルは、励起エネルギーを含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
少なくとも１つの光学モジュールは、前記反応容器へと電磁シグナルを発し、該反応容器から電磁シグナルを集めるように構成される、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２９】
少なくとも１つの光学モジュールは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３０】
少なくとも１つの光学モジュールおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、電子モジュールによって駆動される、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
少なくとも１つの共有リソースは、少なくとも１つのバーコードスキャナーを含む、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記バーコードスキャナーは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３３】
少なくとも１つのバーコードスキャナーおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、電子モジュールによって駆動される、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
少なくとも１つの光学モジュールおよび少なくとも１つのバーコードスキャナーは、同じ自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項３２〜３３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３５】
少なくとも１つの共有リソースおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、同じ電子モジュールによって駆動される、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３６】
少なくとも１つの自動化ポジショナーは、前記サーマルカバーアセンブリの上の指定された空間内で作動する、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３７】
核酸の自動化処理のためのデバイスであって、該デバイスは、
ｉ）核酸を処理するための少なくとも２つのカートリッジベイであって、ここで各カートリッジベイは、
基部アセンブリ、および
サーマルカバーアセンブリ、
を含むカートリッジベイアセンブリを収容するように構成され、ここで該基部アセンブリは、反応容器および複数の熱電素子を受容するための複数のレセプタクルを含み、ここで各レセプタクルは、少なくとも１つの熱電素子と熱伝達状態にあるサーマルジャケットを含み、ここで該サーマルジャケットは、反応容器の少なくとも一部を取り囲んで、該反応容器と該ジャケットとの間の熱交換を促進するように構成された第１の熱伝導表面を有し、そしてここで該サーマルカバーアセンブリは、該カバーアセンブリと該反応容器との間の熱交換を促進するように構成された第２の熱伝導表面を含む、２つのカートリッジベイ；
ｉｉ）少なくとも２つのユーザーアクセスドアであって、各ドアは、該反応容器を含むカートリッジを１つのカートリッジベイから出し入れするための該１つのカートリッジベイへのアクセスを提供する少なくとも２つのユーザーアクセスドア；ならびに
ｉｉｉ）該少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される少なくとも１つの光学モジュールであって、ここで該少なくとも１つの光学モジュールは、該カートリッジベイアセンブリ中の該反応容器から電磁シグナルを集めて、核酸の処理をモニターするように構成される少なくとも１つの光学モジュール、
を含むデバイス。
【請求項３８】
前記第２の熱伝導表面は、前記反応容器の上に位置づけられる複数の孔を含む、請求項３７に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記複数の孔は、核酸の処理をモニターするために少なくとも１つの光学モジュールのための光路を提供する、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４０】
前記集められる電磁シグナルは、蛍光シグナルを含む、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項４１】
少なくとも１つの光学モジュールは、前記反応容器へと電磁シグナルを発するように構成される、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項４２】
前記発せられる電磁シグナルは、励起エネルギーを含む、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
少なくとも１つの光学モジュールは、前記反応容器へと電磁シグナルを発し、該反応容器から電磁シグナルを集めるように構成される、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項４４】
少なくとも１つの光学モジュールは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項４５】
少なくとも１つの自動化ポジショナーは、前記少なくとも２つのカートリッジベイの前記サーマルカバーアセンブリの上の指定された空間内で作動する、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項４６】
前記デバイスは、前記少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される少なくとも１つのバーコードスキャナーを含む、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項４７】
少なくとも１つのバーコードスキャナーは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項４８】
少なくとも１つの光学モジュールおよび少なくとも１つのバーコードスキャナーは、同じ自動化ポジショナーによって移動されるように構成される、請求項４７に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国仮特許出願第６２／３９８，８４１号、第６２／３９９，１５２号、第６２／３９９，１５７号、第６２／３９９，１８４号、第６２／３９９，１９５号、第６２／３９９，２０５号、第６２／３９９，２１１号および第６２／３９９，２１９号（これらそれぞれは、２０１６年９月２３日に出願された）の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張し、２０１７年９月１５日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５１９２４号（２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３３９号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張する）、および２０１７年９月１５日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５１９２７号（２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３４７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張する）の米国特許法第１２０条および第３６５条（ｃ）項に基づく優先権を主張し、これらそれぞれの内容は、参照によって本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は一般に、分子（例えば、核酸）の自動化処理のためのシステムおよび関連方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
核酸を処理するための多くのアプローチが開発されてきた。このような方法はしばしば、複数の酵素工程、精製工程、および調製工程を含んだ。これらの工程は、汚染、システム上のユーザーエラー、およびプロセスバイアスと関連するエラーを含め、困難かつ間違えやすくする。結果として、このようなプロセスを信頼性高くかつ再現可能に実行することは、特に、そのプロセスが商業的に、例えば、多重またはハイスループットの状況で行われている場合には、しばしば困難である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
本発明は一般に、核酸を処理するためのシステム（例えば、デバイス）に関する。いくつかの実施形態において、上記システムは、２つまたはこれより多くのカートリッジベイおよび上記２つまたはそれより多くのカートリッジベイの間またはその中で共有される少なくとも１つの共有リソース（例えば、光学モジュール）を含む。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、共有リソース（例えば、光学モジュール）が１つまたはこれより多くのカートリッジベイによって利用されている間である場合、１つまたはこれより多くのカートリッジベイへのアクセスを禁止するように構成される。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、共有リソース（例えば、光学モジュール）が１つまたはこれより多くのカートリッジベイによって利用されていない場合、１つまたはこれより多くのカートリッジベイへのアクセスを許容するように構成される。
【０００５】
いくつかの局面において、本発明は、核酸を処理するためのシステムおよび関連方法に関する。いくつかの実施形態において、上記システムは、核酸の自動化処理（自動化核酸ライブラリー調製を含む）を促進するカセットおよび／または微小流体チャネルを含むカートリッジを含む。いくつかの実施形態において、システムおよび関連方法は、次世代シーケンシングおよび／または他の下流分析技術の材料を生成する核酸の自動化処理のために提供される。
【０００６】
いくつかの局面において、本開示は、反応を行うためのデバイスに関する。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、核酸を処理するための少なくとも２つのカートリッジベイ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのカートリッジベイ）を含む。いくつかの実施形態において、各カートリッジベイは、カートリッジベイアセンブリを収容するように構成され得る。いくつかの実施形態において、カートリッジベイアセンブリは、反応容器を受容するための複数のレセプタクルを含む。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、少なくとも２つのユーザーアクセスドア（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのユーザーアクセスドア）を含む。いくつかの実施形態において、各ユーザーアクセスドアは、１つのカートリッジベイへのアクセスを提供する。いくつかの実施形態において、上記１つのカートリッジベイへのアクセスは、上記反応容器を含むカートリッジを上記カートリッジベイから出し入れするために有用であり得る。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、少なくとも１つの共有リソースを含み、上記リソースは、少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共有リソースは、上記反応容器内の活性をモニターするように構成される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスは、少なくとも２つのカートリッジベイを含む。いくつかの実施形態において、カートリッジベイは、カートリッジベイアセンブリを含むように構成される。いくつかの実施形態において、上記カートリッジベイアセンブリは、反応容器を受容するための複数のレセプタクルを含む。いくつかの実施形態において、上記カートリッジベイアセンブリは、サーマルカバーアセンブリを含む。いくつかの実施形態において、上記サーマルカバーアセンブリは、熱伝導表面を含む。いくつかの実施形態において、上記熱伝導表面は、上記サーマルカバーアセンブリと上記反応容器との間での熱交換を促進するように構成される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスは、少なくとも２つのカートリッジベイおよび上記少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される少なくとも１つの共有リソースを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共有リソースは、上記反応容器内の反応を処理するように構成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共有リソースは、少なくとも１つの光学モジュールを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、上記反応容器から発せられる電磁シグナル（例えば、ルミネッセンスまたは蛍光）を集めるように構成される。いくつかの実施形態において、上記集められる電磁シグナルは、蛍光シグナルを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、上記反応容器へと電磁シグナルを発するように構成される。いくつかの実施形態において、上記発せられる電磁シグナルは、励起エネルギーを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、上記反応容器へと電磁シグナルを発し、上記反応容器から電磁シグナルを集めるように構成される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスは、複数のカートリッジベイ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのカートリッジベイ）の間またはその中で共有される少なくとも１つの共有リソースを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共有リソースは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される少なくとも１つの光学モジュールを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、電子モジュールによって駆動される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共有リソースは、少なくとも１つのバーコードスキャナーを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのバーコードスキャナーは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのバーコードスキャナーおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、電子モジュールによって駆動される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールおよび少なくとも１つのバーコードスキャナーは、同じ自動化ポジショナーによって移動されるように構成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共有リソースおよび少なくとも１つの自動化ポジショナーは、同じ電子モジュールによって駆動される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの自動化ポジショナーは、上記カートリッジベイアセンブリの上の（例えば、上記サーマルカバーアセンブリの上の）指定された空間内で作動する。
【００１０】
いくつかの局面において、本開示は、少なくとも２つのカートリッジベイを含む反応を行うためのデバイスに関する。いくつかの実施形態において、各カートリッジベイは、１つまたはこれより多くのカートリッジ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのカートリッジ）を受容するカートリッジベイアセンブリを収容するように構成される。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、少なくとも２つのユーザーアクセスドア（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのユーザーアクセスドア）を含み、各ユーザーアクセスドアは、１つのカートリッジベイへのアクセスを提供するように構成される。いくつかの実施形態において、上記１つのカートリッジベイへのアクセスは、カートリッジを上記１つのカートリッジベイから出し入れするために有用であり得る。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、少なくとも１つの共有リソースを含み、上記リソースは、少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共有リソースは、反応をモニターするように構成される。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、少なくとも１つの共有リソースが上記カートリッジベイのうちのいずれかによって利用されている間である間に、少なくとも２つのカートリッジベイへのユーザーアクセスを禁止する制御特徴を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスは、２つまたはこれより多くのカートリッジベイを含み、各カートリッジベイは、カートリッジベイアセンブリを含む。いくつかの実施形態において、上記カートリッジベイアセンブリは、基部アセンブリを含む。いくつかの実施形態において、上記基部アセンブリは、反応容器を受容するための複数のレセプタクルを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはこれより多くのカートリッジは、上記反応容器を含む。いくつかの実施形態において、上記カートリッジベイアセンブリは、サーマルカバーアセンブリを含む。いくつかの実施形態において、上記サーマルカバーアセンブリは、上記サーマルカバーアセンブリと上記反応容器との間の熱交換を促進するように構成された熱伝導表面を含む。
【００１２】
いくつかの局面において、本開示は、核酸の自動化処理のためのデバイスを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される場合、上記デバイスは、核酸を処理するための少なくとも２つのカートリッジベイ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのカートリッジベイ）を含む。いくつかの実施形態において、各カートリッジベイは、カートリッジベイアセンブリを収容するように構成され得る。いくつかの実施形態において、カートリッジベイアセンブリは、基部アセンブリおよびサーマルカバーアセンブリを含む。いくつかの実施形態において、上記基部アセンブリは、反応容器を受容するための複数のレセプタクルを含む。いくつかの実施形態において、上記基部アセンブリは、複数の熱電素子を含む。いくつかの実施形態において、上記基部アセンブリは、反応容器を受容するための複数のレセプタクルおよび複数の熱電素子を含む。いくつかの実施形態において、各レセプタクルは、少なくとも１つの熱電素子と熱伝達状態にあるサーマルジャケットを含む。いくつかの実施形態において、上記サーマルジャケットは、第１の熱伝導表面を含む。いくつかの実施形態において、上記第１の熱伝導表面は、反応容器の少なくとも一部を取り囲んで、上記反応容器と上記ジャケットとの間の熱交換を促進するように構成される。いくつかの実施形態において、上記サーマルカバーアセンブリは、第２の熱伝導表面を含む。いくつかの実施形態において、上記第２の熱伝導表面は、上記カバーアセンブリと上記反応容器との間の熱交換を促進するように構成される。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、少なくとも２つのユーザーアクセスドア（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのユーザーアクセスドア）を含む。いくつかの実施形態において、各ユーザーアクセスドアは、１つのカートリッジベイへのアクセスを提供する。いくつかの実施形態において、上記１つのカートリッジベイへのアクセスは、上記反応容器を含むカートリッジを上記１つのカートリッジベイから出し入れするために有用であり得る。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、少なくとも１つの光学モジュールを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、上記カートリッジベイアセンブリ中の上記反応容器から電磁シグナルを集めるように構成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、核酸の処理をモニターするように構成される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスは、２つまたはこれより多くのカートリッジベイアセンブリを含む２つまたはこれより多くのカートリッジベイを含む。いくつかの実施形態において、上記２つまたはこれより多くのカートリッジベイアセンブリは、基部アセンブリおよびサーマルカバーアセンブリを含む。いくつかの実施形態において、上記サーマルカバーアセンブリは、第２の熱伝導表面を含む。いくつかの実施形態において、上記第２の熱伝導表面は、上記反応容器の上に位置づけられる複数の孔を含む。いくつかの実施形態において、上記複数の孔は、核酸の処理をモニターするために少なくとも１つの光学モジュールのための光路を提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、電磁シグナルを集めることによって、核酸の処理をモニターする。いくつかの実施形態において、上記集められる電磁シグナルは、蛍光シグナルを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、上記反応容器へと電磁シグナルを発するように構成される。いくつかの実施形態において、上記発せられる電磁シグナルは、励起エネルギーを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、上記反応容器へと電磁シグナルを発し、上記反応容器から電磁シグナルを集めるように構成される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスは、核酸の処理をモニターするために少なくとも１つの光学モジュールを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールは、少なくとも１つの自動化ポジショナー（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはこれより多くの自動化ポジショナー）によって移動されるように構成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの自動化ポジショナーは、ＸＹポジショナー（例えば、ＸＹステージアセンブリ）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの自動化ポジショナーは、少なくとも２つのカートリッジベイアセンブリの上の（例えば、少なくとも２つのカートリッジベイのサーマルカバーアセンブリの上の）指定された空間内で作動する。いくつかの実施形態において、上記デバイスは、上記少なくとも２つのカートリッジベイの間またはその中で共有される少なくとも１つのバーコードスキャナー（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのバーコードスキャナー）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのバーコードスキャナーは、少なくとも１つの自動化ポジショナーによって移動されるように構成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの光学モジュールおよび少なくとも１つのバーコードスキャナーは、同じ自動化ポジショナーによって移動されるように構成される。
【００１５】
本発明の他の利点および新規な特徴は、添付の図面とともに考慮される場合に、本発明の種々の非限定的実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。本明細書および参考として援用される文献が矛盾するおよび／または一致しない開示を含む場合には、本明細書が優先するものとする。
【００１６】
本発明の非限定的実施形態は、添付の図面を参照して例示によって記載される。図面は、模式図であり、一定の縮尺で描かれることは意図されない。図面において、図示される各同一のまたはほぼ同一の構成要素は、代表的には、ひとつの数字によって表される。明瞭にする目的で、あらゆる構成要素があらゆる図においても表示されているわけではなく、当業者に本発明を理解させるために図示が必要でない場合には、本発明の各実施形態のあらゆる構成要素が示されるわけではない。図面において：
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、核酸ライブラリー調製ワークフローの模式図である。
【００１８】
【図２Ａ】図２Ａは、微小流体カートリッジを使用する自動化核酸ライブラリー調製のためのシステムの図である。
【００１９】
【図２Ｂ】図２Ｂは、微小流体カートリッジを使用する自動化核酸ライブラリー調製のためのシステムの内部構成要素を示す図である。
【００２０】
【図３】図３は、微小流体カートリッジベイアセンブリの透視図である。
【００２１】
【図４Ａ】図４Ａは、微小流体カートリッジキャリアアセンブリの上面図である。
【００２２】
【図４Ｂ】図４Ｂは、の微小流体カートリッジ透視図である。
【００２３】
【図５】図５は、微小流体カートリッジの分解組み立て図である。
【００２４】
【図６】図６は、微小流体カートリッジを使用する自動化核酸ライブラリー調製のためのシステムの内部構成要素を示す後面透視図の図面である。
【００２５】
【図７】図７は、微小流体カートリッジを使用する自動化核酸ライブラリー調製のためのシステムの内部構成要素を示す上面透視図の図面である。
【００２６】
【図８Ａ】図８Ａは、微小流体カートリッジを使用する自動化核酸ライブラリー調製のためのシステムの非限定的フレームアセンブリ内の例示的ＸＹポジショナーを示す図面である。
【００２７】
【図８Ｂ】図８Ｂは、非限定的光学モジュールを含む例示的ＸＹポジショナーの透視図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
核酸を処理するためのモジュール方式の構成要素（カセット）および／または微小流体チャネルを有するカートリッジを含むシステムが一般に提供される。いくつかの実施形態において、システムおよび関連方法が、次世代シーケンシングおよび／または他の下流分析技術のための材料を生成するための核酸の自動化処理のために提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるシステムは、フレーム、上記フレームへと挿入され得る１つまたはこれより多くのカセット、および流体を移動させるためのチャネルシステムを含むカートリッジを含む。ある種の実施形態において、その１つまたはこれより多くのカセットは、流体（例えば、貯蔵された試薬、サンプル）を含むおよび／または受容するように構成された１つもしくはこれより多くのレザバまたは容器を含む。いくつかの場合には、その貯蔵された試薬は、１つまたはこれより多くのリオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）を含み得る。本明細書で記載されるシステムおよび方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含め、核酸処理のための反応を含む化学的および／または生物学的反応を行うために有用であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、図１に示されるように核酸を処理するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、図１に示される核酸調製法（これは、本明細書でより詳細に記載される）は、多重様式で行われ得、複数の異なる（例えば、８までの異なる）サンプルが自動化様式で並行して処理される。このようなシステムおよび方法は、実験、臨床（例えば、病院）、または研究の状況の範囲内で実行され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）サンプル調製（例えば、ライブラリーサンプル調製）のために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、サンプル品質制御のために使用され得る。図２Ａおよび２Ｂは、多数の使い捨てカセット、プライマーカセット、およびバルク流体カセットを利用する実験用ベンチトップ機器として働く例示的システム２００を示す。いくつかの実施形態において、このシステムは、標準的な実験作業台上での使用に適している。
【００３０】
いくつかの実施形態において、システムは、タッチスクリーンインターフェイスを有し得る（例えば、タッチスクリーンインターフェイス２０２を含む図２Ａの例示的システムに記載されるとおり）。いくつかの実施形態において、そのインターフェイスは、１つまたはこれより多くのカートリッジベイの各々の状態を、「完了予定時間（ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」、「現在のプロセス工程（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｔｅｐ）」、または他のインジケーターとともに表示する。いくつかの実施形態において、ログファイルまたはレポートは、その１つまたはこれより多くのカートリッジの各々に関して作られ得る。いくつかの実施形態において、そのログファイルまたはレポートは、上記機器上で記憶され得る。いくつかの実施形態において、テキストファイルまたは出力が、その機器から、例えば、処理されているカートリッジの日付範囲に関して、または特定のシリアルナンバーを有するカートリッジに関して、送信され得る。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、１つまたはこれより多くの核酸調製カートリッジを受容し得る１つまたはこれより多くのカートリッジベイ（２つのカートリッジベイ２１０を含む図２Ｂの例示的システムに記載されるとおり、例えば、２つ）を含み得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジベイの上の空間は、光学モジュール２２６（および／またはバーコードスキャナー、例えば、２−Ｄバーコードスキャナー）を各カートリッジベイのふた２２８（例えば、加熱されたふた）の上に移動させるＸＹポジショナー２２４のために確保される。いくつかの実施形態において、そのシステムは、光学モジュール２２６およびＸＹポジショナー２２４を駆動する電子モジュール２２２を含む。いくつかの実施形態において、ＸＹポジショナー２２４は、光学モジュール２２６が容器の中の物質（例えば、発蛍光団）を励起し得るかつその発せられた蛍光を集め得るように、その光学モジュール２２６を位置づける。いくつかの実施形態において、これは、各容器の上にふた（例えば、加熱されたふた）に配置された孔を通じて起こる。いくつかの実施形態において、バーコードスキャナーは、適切なカートリッジおよびプライマーカセットが、そのシステムの中に挿入されていることを確認する。いくつかの実施形態において、光学モジュール２２６は、必要な場合には、サンプルの処理の間に、例えば、増幅された核酸のレベルを検出するために核酸の増幅の間に、各カートリッジベイにおける各カートリッジからの光シグナルを集める。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるシステムは、そのシステム内の構成要素の温度調節を補助する要素（例えば、１つまたはこれより多くのファンまたはファンアセンブリ（例えば、図２Ｂに示されるファンアセンブリ２２０）を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、１つまたはこれより多くのカートリッジベイは、核酸調製カートリッジを、任意の組み合わせで処理し得る。いくつかの実施形態において、各カートリッジベイは、例えば、操作者によって、またはロボットアセンブリによって、装填される。図３は、微小流体カートリッジベイアセンブリ３００の例示的図面を示す。いくつかの実施形態において、カートリッジは、そのカートリッジをキャリアプレート３７０の中に配置して、キャリアプレートアセンブリ３０４を形成することによって、ベイが開いた位置にある場合にそのベイに装填される。そのキャリアプレートは、それ自体、いくつかの実施形態において、そのカートリッジベイから外され得る独立型構成要素である。このカートリッジベイは、その機器に対して既知の位置においてカートリッジを保持する。いくつかの実施形態において、ふた３２８（例えば、加熱されたふた）は、１つもしくはこれより多くの容器の中で起こる処理および／または反応のモニタリングを促進するために、１つまたはこれより多くの孔３３０を含む。いくつかの実施形態において、新たなカートリッジをその機器上に装填する前に、プライマーカセットは、そのカートリッジの中に設置され得る。いくつかの実施形態において、そのプライマーカセットは、そのカートリッジとは別個にパッケージされる。いくつかの実施形態において、プライマーカセットは、カートリッジの中に配置され得る。いくつかの実施形態において、プライマーカセットおよびカートリッジの両方が識別され、その結果、これらの両方をその機器上に配置すると、その機器がこれらの両方を読み取り（例えば、バーコードスキャナーを使用して）、そのカセットと関連するプロトコルを開始することを可能にする。
【００３３】
いくつかの実施形態において、キャリアをその機器の中に設置する前に、バルク試薬がそのキャリアの中に装填され得る。いくつかの実施形態において、ユーザーまたはロボットアセンブリは、その試薬が装填されるべきか、およびそれらをどこに装填するべきかに関して、その機器または遠隔サンプル装填ステーション上のインターフェイスによって知らされ得る。いくつかの実施形態において、プライマーカセットを有するカートリッジを機器の中に装填した後、ユーザーは、ある種の反応条件（例えば、ＰＣＲサイクルの数）および／またはカートリッジ上で実行されるべきサンプルの量を選択するという選択肢を有する。いくつかの実施形態において、各カートリッジは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはこれより多くのサンプルという収容力を有し得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、ＲＮＡを処理するように構成され得る。しかし、いくつかの実施形態において、そのシステムは、ＤＮＡを処理するように構成され得る。いくつかの実施形態において、種々の核酸が、そのシステム内で連続してまたは並行して処理され得る。いくつかの実施形態において、カートリッジは、遺伝子融合アッセイを自動化様式で行うために、例えば、ＡＬＫ、ＲＥＴ、またはＲＯＳ１における遺伝的質の変化を検出するために使用され得る。このようなアッセイは、本明細書において、ならびに米国特許出願公開番号ＵＳ  ２０１３／０３０３４６１（これは、２０１３年１１月１４日に公開された）および米国特許出願公開番号２０１５／０２０１１０５０（これは、２０１３年７月２０日に公開された）において開示される（これらの各々の内容は、それらの全体において本明細書に参考として援用される）。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、自動化様式で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＸｇｅｎプロトコルまたは他の類似の核酸処理プロトコルを処理し得る。
【００３５】
いくつかの実施形態において、カートリッジおよびカセットは、特定のプロトコルを行うために必要とされる試薬の全てを有する。いくつかの実施形態において、キャリアがカートリッジベイへと一旦装填されると、そのベイへのアクセスドアが閉じられ、必要に応じて、ふた（例えば、加熱されたふた）が自動的に降ろされ得る。いくつかの実施形態において、そのふた（例えば、その加熱されたふた）を降ろすと、そのカートリッジの中の１つまたはこれより多くの温度制御された容器のセットの各々に合うヒータージャケットのアレイ上へとそのカートリッジが押し下げられる（または配置される）。いくつかの実施形態において、これは、引き出しアセンブリの中に垂直に、そのカートリッジを既知の位置に配置する。いくつかの実施形態において、ふたを降ろすと、そのカートリッジは、そのカートリッジに存在するロータリーバルブが、そのカートリッジ中のバルブの回転位置を制御する、対応する駆動部とかみ合い得る位置へと押し下げられる。いくつかの実施形態において、自動制御構成要素は、そのロータリーバルブがそれらの駆動部と適切にかみ合うことを担保するために提供される。
【００３６】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、カートリッジに（例えば、カセットの容器内に）存在する核酸サンプルは、リオスフェアと混合される。いくつかの実施形態において、そのリオスフェアは、そのサンプルに付着する発蛍光団を含む。いくつかの実施形態において、分子の（例えば、合成ＤＮＡの）既知の量を含むリオスフェアには、「参照物質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」もまた存在する。いくつかの実施形態において、「参照物質」に付着されるのは、そのサンプルの発蛍光団とは異なる波長の光を発する別の発蛍光団である。いくつかの実施形態において、使用される発蛍光団は、インターカレート色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）またはレポーター／クエンチャー化学現象（例えば、ＴａｑＭａｎなど）を介して、そのサンプルまたは「参照物質」に付着され得る。いくつかの実施形態において、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）サイクリングの間に、その２つの発蛍光団の蛍光はモニターされ、次いで、比較ＣＴ法によってそのサンプル中の核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）の量を決定するために使用される。
【００３７】
有利なことには、本明細書で記載されるある種のシステムは、行われるべき特異的反応および／または工程の調整を可能にし得るモジュール方式の構成要素（例えば、カセット）を含み得る。いくつかの実施形態において、特定のタイプの反応を行うためのある種のカセットは、そのカートリッジの中に含まれる。例えば、ＰＣＲ反応の多数の工程を行うための種々の試薬とともにリオスフェアを含む容器を含むカセットは、そのカートリッジ中に存在し得る。フレームまたはカートリッジは、そのカートリッジの中で行われるべき特定の反応（または反応のセット）のための特定の流体および／または試薬を含む１つもしくはこれより多くのカセットを挿入するために、ユーザー用の空の領域をさらに含み得る。例えば、ユーザーは、特定の緩衝液、試薬、アルコール、および／またはプライマーを含む１つもしくはこれより多くのカセットを、フレームまたはカートリッジの中へと挿入し得る。あるいは、ユーザーは、流体および／または試薬の異なるセットを含むカセットの異なるセットを、異なる反応および／または実験を行うためのフレームまたはカセットの空の領域へと挿入し得る。そのカセットがフレームまたはカートリッジへと挿入された後、それらは、反応／分析を行うために、流体を移動させるためのチャネルシステムと流体接続を形成し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、異なるカセットをカートリッジへと挿入することによって、多数の分析が同時にまたは連続的に行われ得る。例えば、本明細書で記載されるシステムおよび方法は、有利なことには、システムを開けるまたはカートリッジを変更する必要性なしに、２つまたはこれより多くのサンプルを分析する能力を提供し得る。例えば、いくつかの場合には、１つまたはこれより多くのサンプルでの１つまたはこれより多くの反応は、並行して行われ得る（例えば、２つまたはこれより多くのＰＣＲ反応を並行して行う）。このようなモジュール方式および融通性は、多数のサンプルの分析を可能にし得、その分析の各々は、単一の流体システム内の１またはいくつかの反応工程を必要とし得る。よって、多数の複雑な反応および分析が、本明細書で記載されるシステムおよび方法を使用して行われ得る。
【００３９】
ある種の既存の流体システムおよび方法とは異なり、本明細書で記載されるシステムおよび方法は、再使用可能（例えば、再使用可能キャリアプレート）または使い捨て可能（例えば、カセットおよび種々の流体構成要素を含む消耗構成要素）であり得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されるシステムは、類似の反応および実験を行うためのある種の既存の流体システムと比較して、比較的小さな設置面積を占め得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、そのカセットおよび／またはカートリッジは、１つまたはこれより多くのサンプルで特定の反応または分析（または反応もしくは分析のセット）を行うために必要とされる貯蔵された流体および／または試薬を含む。カセットの例としては、試薬カセット、プライマーカセット、緩衝液カセット、廃棄物カセット、サンプルカセット、および出力カセットが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なモジュールまたはカセットが使用され得る。このようなカセットは、それら試薬を使用する前にその貯蔵された試薬の汚染または喪失を防止または排除する様式で構成され得る。他の利点は、以下でより詳細に記載される。
【００４１】
一実施形態において、図４Ａおよび４Ｂに例証として示されるように、カートリッジ４００は、フレーム４１０ならびにカセット４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、および４４０を含む。いくつかの実施形態において、これらカセットの各々は、チャネルシステムと流体伝達状態にあり得る（例えば、そのカセットの下に位置づけられる（示されない））。いくつかの実施形態において、カセット４２８（例えば、試薬カセット）、４３０（例えば、試薬カセット）、および４３２（例えば、試薬カセット）のうちの少なくとも１つは、そのカセットがそのチャネルシステムと流体伝達状態にあるように、ユーザーによってフレーム４１０へと挿入され得る。例えば、いくつかの実施形態において、カセット４２８、４３０、および４３２のうちの１つは、反応緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液）を含む試薬カセットである。ある種の実施形態において、カセット４２８、４３０および／または４３２は、反応または反応のセットのための１つもしくはこれより多くの試薬および／または反応容器を含み得る。いくつかの実施形態において、モジュール４４０は、複数のサンプルウェルおよび／または出力ウェル（例えば、１つまたはこれより多くのサンプルを受容するように構成されたサンプルウェル）を含む。いくつかの場合には、カセット４２０、４２２、４２４、および４２６は、１つもしくはこれより多くの貯蔵された試薬または反応物（例えば、リオスフェア）を含み得る。例えば、カセット４２０、４２２、４２４、および４２６の各々は、別個の反応を行うために貯蔵された試薬または反応物の異なるセットを含み得る。例えば、カセット４２０は、第１のＰＣＲ反応を行うための第１の試薬セットを含み得、カセット４２２は、第２のＰＣＲ反応を行うための第２の試薬セットを含み得る。その第１のおよび第２の反応は、同時に（例えば、並行して）または連続的に行われ得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、図４Ａに例証として示されるように、キャリアプレートアセンブリ４８０は、キャリアプレート４７０ならびにモジュール４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０を含むさらなるカセットを含む。例示的な実施形態において、カセット４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０は各々、１つもしくはこれより多くの貯蔵された試薬を含み得、そして／または１つもしくはこれより多くの流体を受容するように構成および配列され得る（例えば、モジュール４５８は、反応廃棄物流体を集めるように構成された廃棄物モジュールであり得る）。いくつかの実施形態において、カセット４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、および４６０のうちの１つもしくはこれより多くが、詰め替え可能であり得る。
【００４３】
図５は、実施形態の１セットに従う例示的なカートリッジ５００の分解組み立て図である。カートリッジ５００は、プライマーカセット５１０およびプライマーカセット５１５を含み、これらカセットは、フレーム５２０の中の１つまたはこれより多くの開口部へと挿入され得る。カートリッジ５００は、フレーム５２０に隣接しかつ一体化していないチャネルシステムを含む流体層アセンブリ５４０をさらに含む。いくつかの実施形態において、カセット５３２のセット（例えば、１つもしくはこれより多くのプライマーカセット、緩衝液カセット、試薬カセット、および／または廃棄物カセットを含み、各々必要に応じて、１つまたはこれより多くの容器を含む）、反応カセット５３４のセット（これは、反応容器を含む）、入力／出力カセット５３３（これは、サンプル入力容器５３６および出力容器５３８を含む）は、フレーム５２０の中の１つまたはこれより多くの開口部へと挿入され得る。いくつかの実施形態において、カートリッジ５００は、バルブプレート５５０を含む。いくつかの実施形態において、バルブプレート５５０は、フレーム５２０へと接続し（例えば、かちっとはまり）、流体層アセンブリ５４０ならびにカセット５３２、５３３および５３４をフレーム５２０の中で適所に保持する。ある種の実施形態において、カートリッジ５００は、バルブ５６０（本明細書で記載されるとおり）、および複数のシール５６５を含む。いくつかの場合には、フレーム５２０および／または１つもしくはこれより多くのモジュールは、カバー５７０、５７２、および／または５７４によって覆われ得る。
【００４４】
２つのカートリッジベイ６１０を含む例示的システム６００の後面透視図が、図６に示される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのシステムまたはデバイスは、２つまたはこれより多くのカートリッジベイ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０またはこれより多くのカートリッジベイ）を含み得る。本明細書で記載されるとおりのシステムまたはデバイスは、そのカートリッジベイの間またはその中で共有されるべき１つまたはこれより多くの共有リソースを含む。このような共有リソース（例えば、光学モジュール）は、電子モジュール６２２によって駆動され得る。電子モジュールは、そのシステムまたはデバイス内でさらなる要素（例えば、ＸＹポジショナー）の作動を駆動し得る。そのシステムまたはデバイスは、作動を開始しかつ作動を終了させるための電源スイッチ６０１を含み得る。いくつかの実施形態において、そのシステムは、そのシステム内での構成要素の温度調節を補助するために、ファンアセンブリ６２０を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスまたはシステムは、１つまたはこれより多くのファンアセンブリ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つまたはこれより多くのファンアセンブリ）を含む。いくつかの実施形態において、各ファンアセンブリは、１つまたはこれより多くのファン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０またはこれより多くのファン）を含み得る。
【００４５】
本明細書で記載される場合、システムまたはデバイスは、種々のカートリッジベイにおいて反応をモニターするおよび／または処理するために利用され得る１つまたはこれより多くの共有リソースを含む。２つのカートリッジベイを含む例示的システム７００の上面透視図が、図７に示される。光学モジュール７２６は、例示的な共有リソースとして示される。この非限定的な例では、その光学モジュールは、自動化ポジショナー（例えば、ＸＹポジショナー、ＸＹステージアセンブリ）の使用によって、２つのカートリッジベイにわたって反応を処理および／またはモニターし得る。その光学モジュール７２６は、第１の軌道７２３を使用して第１の軸（例えば、Ｘ軸）を横切って、および第２の軌道７２５を使用して第２の軸（例えば、Ｙ軸）を横切って、光学モジュールを移動させるＸＹポジショナーによって位置付けられるように示される。この例示的なシステムでは、その光学モジュールは、そのカートリッジベイアセンブリの加熱されたふた７２８の上の空間において作動することが示される。ＸＹポジショナーによって特定の反応容器の上に一旦整列されると、その加熱されたふたにおける１つまたはこれより多くの孔７３０は、その容器の中で起こる反応を処理および／またはモニターするために、その光学モジュールのための光路を提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、光学モジュール（例えば、光学デバイス）は、分光光度シグナルが適切なサイズにされた反応容器において正確かつ精密に測定されることを可能にするように構成される。いくつかの実施形態において、その光学モジュールは、測定されている間の容器への励起光の送達を、隣接する容器への測定できる程度の励起光の導入なしに可能にするために、位置づけられる。いくつかの実施形態において、光学モジュールは、容器の中の反応から発せられる、得られた光の十分な捕捉を容易にして、その反応において評価されている活性に比例する測定できる程度のシグナルが測定されることを可能にするように、十分に多くの開口を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、光学モジュールは、１つまたはこれより多くのフィルタを含む。例えば、光源（例えば、アークランプ）からの励起波長の光は、光の励起波長を容器内容物の照明のためのレンズへと分離するために、干渉フィルタまたは他の手段を通じて通され得る。そのレンズは、その容器の中の反応によって発せられる光の一部を捕捉する。同様に、その光学モジュールによって検出される発光は、反応において測定されるべき発せられる光の波長のみを感光性検出器（例えば、フォトダイオード、光電子増倍管、または電荷結合素子）の表面へと通す干渉フィルタを通じて、通され得る。いくつかの実施形態において、その光学モジュールは、光の１つまたはこれより多くの波長を発し得るおよび／または検出し得る。例えば、その光学モジュールは、共鳴エネルギー移動プローブのドナーおよびアクセプター発光強度のようなその容器の中の多数の発蛍光団、または異なる生物学的分子の活性を報告する同じサンプル中の異なる発蛍光団から、多数の発光波長を測定し得る。
【００４８】
いくつかの実施形態において、光学モジュールは、測定されることが望まれる反応容器の内容物の生化学的または生物物理学的状態の徴候を提供する広く種々の物理的シグナルの検出および測定のために適合され得る。いくつかの実施形態において、その光学モジュールは、その内容物を照射し、そして多くの波長帯においてその容器内容物によって発せられる光強度を測定して、マルチ容器構成要素（例えば、カートリッジ、カセット）の各容器を調査し得る分光光度リーダー（例えば、蛍光リーダー）であり得る。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルの変化は、当該分野で公知の手段を使用して、２つの異なる発光波長にある蛍光の比として決定される。吸光度、蛍光、共鳴エネルギー移動、時間分解蛍光もしくは共鳴エネルギー移動、蛍光偏光（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、あるいは他のモノスペクトルもしくはマルチスペクトルルミネッセンスまたは蛍光モダリティーを含む考えられる種々の分光光度モダリティーに加えて、その光学モジュールは、新規な発蛍光団（例えば、赤外波長の光とともに使用するために開発されたもの（例えば、量子ドット））を使用するために容易に適合され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスは、共有リソース（例えば、光学モジュール）の利用に依存する１つまたはこれより多くのカートリッジベイへのアクセスを許容または拒否するように構成され得る。いくつかの実施形態において、そのデバイスは、カートリッジベイが共有リソース（例えば、光学モジュール）を利用している間である場合に、そのカートリッジベイへのアクセスを禁止するように構成される。いくつかの実施形態において、そのデバイスは、共有リソース（例えば、光学モジュール）がカートリッジベイによって利用されていない場合に、そのカートリッジベイへのアクセスを禁止するように構成される。いくつかの実施形態において、そのデバイスは、光学モジュールが１つまたはこれより多くのカートリッジベイによって利用されている間である場合に、その１つまたはこれより多くのカートリッジベイへのアクセスを禁止するように構成される。いくつかの実施形態において、１つまたはこれより多くのカートリッジベイへのアクセスを禁止すると、有利なことには、光学モジュールがそのデバイス内で作動している間である場合に、光（例えば、隣接するベイからのまたは外部環境からの光）の導入が最小化または排除され得る。例えば、そのデバイス自体に対して外部にある光源からそのデバイスへの光の導入は、光学モジュールによる反応のモニタリングに干渉し得る。いくつかの実施形態において、そのデバイスは、共有リソース（例えば、光学モジュール）が１つまたはこれより多くのカートリッジベイによって利用されていない場合に、その１つまたはこれより多くのカートリッジベイへのアクセスを許容するように構成される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、マルチ容器構成要素（例えば、カートリッジ、カセット）の１つまたはこれより多くの容器を調査し得る光学デバイスを移動させるために、その光学モジュールは、ロボットステージアセンブリ（例えば、自動化Ｘ−Ｙポジショナー）によって位置づけられ得る。そのロボットステージアセンブリは、その容器の上に、または別の適切な配列において据えられ得る。単一光子検出モードで作動され得る光検出器を利用するいくつかの実施形態において、その容器の上のその光学モジュールの非常に短い滞留時間のみが、分光光度読み取りを得るために必要とされ得る。例えば、いくつかの分光光度リーダーは、多数の小型化したアッセイまたは反応を並行して実行することによって引き起こされるスループットおよび感度要求を取り扱い得る。
【００５１】
図８Ａは、非限定的なフレームアセンブリ内で自動化ポジショナー（例えば、ＸＹポジショナー）を示す例示的システム８００の正面透視図を示す。この例では、光学モジュール８２６は、自動化二軸ポジショナーを使用してそのシステム内に位置づけられる。そのポジショナーは、第１の軌道８２３を使用して、第１の軸（例えば、Ｘ軸）に沿ったある種の点にその光学モジュールを位置づける。第２の軌道８２５（その第１の軌道へと取り付け点８２１において取り付けられる）は、その光学モジュールを第２の軸（例えば、Ｙ軸）に沿ったある種の点に位置づける。この例では、その第１の軸に沿った位置付けは、どのカートリッジベイがその光学モジュールを利用している間であるかを決定し、両軸に沿った位置付けは、所定のカートリッジベイの中のどの容器がその光学モジュールによってモニターおよび／または処理されている間であるかを決定する。例示的な光学モジュール８２６を含む非限定的なＸＹポジショナー８２４の分離図（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｖｉｅｗ）が、図８Ｂに示される。この例では、その例示的な光学モジュール８２６は、バーコードリーダー８２７を含むことが示される。記載されるように、ＸＹポジショナー８２４は、第１の軌道８２３および第２の軌道８２５を使用してシステム内に位置づけられ、そこでその第１のおよび第２の軌道は、取り付け点８２１において取り付けられる。
【００５２】
増幅（ＡＭＰ）方法
本明細書で記載されるのは、既知の標的ヌクレオチド配列に連続したヌクレオチド配列を決定するための方法である。その方法は、本明細書で開示されるシステムを使用して自動化様式で実行され得る。旧来のシーケンシング法は、配列情報を無作為に（例えば、「ショットガン（ｓｈｏｔｇｕｎ）」シーケンシング）、またはプライマーをデザインするために使用される２つの既知の配列の間で生成する。対照的に、本明細書で開示される方法のうちのある種のものは、いくつかの実施形態において、高レベルの特異性および感度で既知の配列のうちの１つの領域の上流または下流にあるヌクレオチド配列を決定する（例えば、シーケンシングする）ことを可能にする。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、例えば、自動化様式で、次世代シーケンシング技術を使用して特定のヌクレオチド配列を決定する前に、その特定のヌクレオチド配列を富化するための方法を実行するように構成され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むサンプルを富化することに関し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、（ａ）既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸を、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとライゲーションする工程；（ｂ）その標的核酸の一部およびそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖を、第１のアダプタープライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｃ）工程（ｂ）から得られたアンプリコンの一部を第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；ならびに（ｄ）そのＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジの中の微小流体チャネルおよびバルブは、反応物質／流体をカートリッジの中で１つの容器から別の容器へと移動させることを促進して、自動化様式で反応を進めることを可能にする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ溶液は、次世代シーケンシング技術を使用して、第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでその後シーケンシングされ得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムを使用して処理されるサンプルは、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡを含むサンプルは、工程（ａ）の前にフラグメント化工程を包含する。いくつかの実施形態において、各ライゲーションおよび増幅工程は、必要に応じて、その後の精製工程（例えば、工程（ａ）と工程（ｂ）との間にサンプル精製、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間にサンプル精製、ならびに／または工程（ｃ）の後にサンプル精製）を含み得る。例えば、ゲノムＤＮＡを含むサンプルを富化するための方法は、（ａ）ゲノムＤＮＡのフラグメント化；（ｂ）既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸をユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとライゲーションする工程；（ｃ）ライゲーション後のサンプル精製；（ｄ）その標的核酸の一部およびそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖を第１のアダプタープライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｅ）増幅後のサンプル精製；（ｆ）工程（ｄ）から得られたアンプリコンの一部を第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｇ）増幅後のサンプル精製；ならびに（ｈ）その精製されたＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、その方法の工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。いくつかの実施形態において、そのカートリッジの中の微小流体チャネルおよびバルブは、反応物質／流体を、カートリッジの中で１つの容器から別の容器へと自動化様式で移動させることを促進する。その精製されたサンプルは、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでその後シーケンシングされ得る。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、図１の例示的なワークフローに示されるように、核酸を処理するために使用され得る。核酸サンプル１２０が提供される。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、ＤＮＡ（例えば、２本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）および／または２本鎖のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）１０２）を含む。いくつかの実施形態において、その核酸サンプルは、核酸末端修復および／またはｄＡテール付加を含む工程１０２に供される。いくつかの実施形態において、その核酸サンプルは、アダプターライゲーションを含む工程１０４に供される。いくつかの実施形態において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドアダプター１２２は、その核酸サンプル中の１つまたはこれより多くの核酸にライゲーションされる。いくつかの実施形態において、そのライゲーション工程は、平滑末端ライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、そのライゲーション工程は、付着末端ライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、そのライゲーション工程は、オーバーハングライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、そのライゲーション工程は、ＴＡライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、そのｄＡテール付加工程１０２は、ユニバーサルオリゴヌクレオチドアダプターにおけるオーバーハングに相補的な核酸サンプル中のオーバーハングを生成するために行われる（例えば、ＴＡライゲーション）。いくつかの実施形態において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドアダプターは、ユニバーサルオリゴヌクレオチドアダプターが隣接する核酸１２４を生成するために、その核酸サンプルにおいて１つまたはこれより多くの核酸の両末端にライゲーションされる。いくつかの実施形態において、最初の増幅ラウンドは、アダプタープライマー１３０および第１の標的特異的プライマー１３２を使用して行われる。いくつかの実施形態において、その増幅されたサンプルは、アダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマー１３４を使用して第２の増幅ラウンドに供される。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、バーコード、インデックス、アダプター配列、またはシーケンシングプライマー部位を含み得るハイブリダイゼーション配列（例えば、共通配列）に対して５’側にさらなる配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、その第２の標的特異的プライマー（１３４によって示されるとおり）の共通配列とハイブリダイズするさらなるプライマーによってさらに接触される。いくつかの実施形態において、第２の増幅ラウンドは、核酸シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング法）に適切な核酸１２６を生成する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５１９２４（これは、２０１７年９月１５日に出願され、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３３９号の優先権を主張する）およびＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５１９２７（これは、２０１７年９月１５日に出願され、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３４７号の優先権を主張する）（核酸ライブラリー調製に関するこれらの各々の内容全体は、参考として援用される）に記載されるように、核酸を処理するために使用され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムを使用して処理されるサンプルは、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、以下を包含する方法によってＲＮＡを処理するために有用であり得る：（ａ）既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子と、ランダムプライマーの集団とを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズしたランダムプライマーによってプライムされかつテンプレートとしてハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｃ）工程（ｂ）の生成物と最初の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｄ）ハイブリダイズした最初の標的特異的プライマーによってプライムされかつテンプレートとしてその標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｅ）その核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供する工程；（ｆ）その既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸をユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとライゲーションする工程；（ｇ）その標的核酸の一部およびそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖を、第１のアダプタープライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｈ）工程（ｇ）から得られたアンプリコンの一部を第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；ならびに（ｉ）ｃＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ溶液は、その後、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでシーケンスされ得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、各ライゲーションおよび増幅工程は、必要に応じて、その後のサンプル精製工程（例えば、工程（ｆ）と工程（ｇ）との間にサンプル精製工程、工程（ｇ）と工程（ｈ）との間にサンプル精製工程、および／または工程（ｈ）の後にサンプル精製）を含み得る。例えば、ＲＮＡを含むサンプルを富化するための方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子とランダムプライマーの集団とをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズしたランダムプライマーによってプライムされかつテンプレートとしてハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｃ）工程（ｂ）の生成物と最初の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｄ）ハイブリダイズした最初の標的特異的プライマーによってプライムされかつテンプレートとしてその標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｅ）その核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供する工程；（ｆ）その既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸をユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとライゲーションする工程；（ｇ）ライゲーション後のサンプル精製；（ｈ）その標的核酸の一部およびそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖を第１のアダプタープライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｉ）増幅後のサンプル精製；（ｊ）工程（ｈ）から得られたアンプリコンの一部を第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｋ）増幅後のサンプル精製；ならびに（ｌ）その精製されたｃＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。その精製されたサンプルは、その後、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでシーケンスされ得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、例えば、自動化様式で、未知のヌクレオチド配列の隣接領域から下流に既知の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（例えば、未知の配列を含む５’領域および既知の配列を含む３’領域を含むヌクレオチド配列）を富化するための方法を実行するように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、以下の工程を包含する：（ａ）その既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子と最初の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズした最初の標的特異的プライマーによってプライムされかつテンプレートとしてその標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｃ）工程（ｂ）の生成物とテール付加ランダムプライマーの集団とをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｄ）ハイブリダイズしたテール付加ランダムプライマーによってプライムされかつテンプレートとしてハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｅ）その標的核酸分子の一部およびそのテール付加ランダムプライマー配列を第１のテールプライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｆ）工程（ｅ）で得られたアンプリコンの一部を第２のテールプライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；ならびに（ｇ）そのｃＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程。そのｃＤＮＡ溶液は、その後、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでシーケンシングされ得る。いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーの集団は、第１のシーケンシングプライマーと同一の５’核酸配列および約６〜約１２個のランダムヌクレオチドを含む３’核酸配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、その第１の標的特異的プライマーは、その標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列に、アニーリング温度で特異的にアニールし得る核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、工程（ｅ）から生じるアンプリコンによって含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部に特異的にアニールし得る核酸配列を含む３’部分、および第２のシーケンシングプライマーに同一の核酸配列を含む５’部分を含み、その第２の標的特異的プライマーは、第１の標的特異的プライマーに関してネスト化され得る。いくつかの実施形態において、その第１のテールプライマーは、テール付加ランダムプライマーと同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２のテールプライマーは、その第１のシーケンシングプライマーの一部と同一の核酸配列を含み、第１のテールプライマーに関してネスト化される。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、例えば、自動化様式で、未知のヌクレオチド配列の隣接領域から上流にある既知の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（例えば、既知の配列を含む５’領域および未知の配列を含む３’領域を含むヌクレオチド配列）を富化するための方法を実行するように構成され得る。いくつかの実施形態において、その方法は、以下を包含する：（ａ）その既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子とテール付加ランダムプライマーの集団とを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズしたテール付加ランダムプライマーによってプライムされかつテンプレートとしてハイブリダイゼーション部位の下流にある標的核酸分子の一部を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｃ）工程（ｂ）の生成物と最初の標的特異的プライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｄ）ハイブリダイズした最初の標的特異的プライマーによってプライムされかつテンプレートとしてその標的核酸分子を使用するテンプレート依存性伸長反応を行う工程；（ｅ）その標的核酸分子の一部およびそのテール付加ランダムプライマー配列を、第１のテールプライマーおよび第１の標的特異的プライマーで増幅する工程；（ｆ）工程（ｅ）から得られたアンプリコンの一部を第２のテールプライマーおよび第２の標的特異的プライマーで増幅する工程；ならびに（ｇ）そのｃＤＮＡ溶液をユーザーへと移動させる工程。そのｃＤＮＡ溶液は、その後、次世代シーケンシング技術を使用して第１のおよび第２のシーケンシングプライマーでシーケンシングされ得る。いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーの集団は、第１のシーケンシングプライマーと同一の５’核酸配列および約６〜約１２のランダムヌクレオチドを含む３’核酸配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、その第１の標的特異的プライマーは、その標的核酸の既知の標的ヌクレオチド配列にアニーリング温度で特異的にアニールし得る核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、工程（ｃ）から得られたアンプリコンによって含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部に特異的にアニールし得る核酸配列を含む３’部分および第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む５’部分を含み、その第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに関してネスト化される。いくつかの実施形態において、その第１のテールプライマーは、テール付加ランダムプライマーと同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２のテールプライマーは、その第１のシーケンシングプライマーの一部と同一の核酸配列を含み、その第１のテールプライマーに関してネスト化される。いくつかの実施形態において、その方法のうちの１つまたはこれより多くの工程は、本明細書で提供されるカートリッジの異なる容器内で行われ得る。いくつかの実施形態において、その方法は、そのサンプルとＲＮａｓｅとをその最初の標的特異的プライマーの伸長後に接触させる工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、そのテール付加ランダムプライマーは、ヘアピンループ構造を形成し得る。いくつかの実施形態において、その最初の標的特異的プライマーおよびその第１の標的特異的プライマーは、同一である。いくつかの実施形態において、そのテール付加ランダムプライマーは、第１のシーケンシングプライマーと同一の５’核酸配列と６〜１２個のランダムヌクレオチドを含む３’核酸配列との間に６〜１２個のランダムヌクレオチドを含むバーコード部分をさらに含む。
【００６１】
ユニバーサルオリゴヌクレオチドテールアダプター
本明細書で使用される場合、用語「ユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプター（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔａｉｌ−ａｄａｐｔｅｒ）」とは、２本の鎖（ブロッキング鎖および増幅鎖）から構成され、第１のライゲーション可能な二重鎖末端（ｄｕｐｌｅｘ  ｅｎｄ）および第２の不対末端を含む核酸分子をいう。そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターのブロッキング鎖は、５’二重鎖部分を含む。その増幅鎖は、不対５’部分、３’二重鎖部分、３’Ｔオーバーハング、ならびに第１のおよび第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む。そのブロッキング鎖および増幅鎖の二重鎖部分は、実質的に相補的であり、３’Ｔオーバーハングを含む第１のライゲーション可能な二重鎖末端を形成し、その二重鎖部分は、ライゲーション温度において二重鎖形態を保持するために十分な長さである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む増幅鎖の一部は、少なくとも部分的に、その増幅鎖の５’不対部分によって含まれ得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターは、二重鎖部分および不対部分を含み得、ここでその不対部分は、その増幅鎖の５’部分のみを含む、すなわち、そのブロッキング鎖の全体は、二重鎖部分である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターは、「Ｙ」形状を有し得る、すなわち、その不対部分は、ブロッキング鎖および増幅鎖の両方の部分を含み得、これらの鎖は不対である。そのブロッキング鎖の不対部分は、その増幅鎖の不対部分より短くてもよいし、長くてもよいし、長さが等しくてもよい。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖の不対部分は、その増幅鎖の不対部分より短い可能性がある。Ｙ形状のユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターは、そのブロッキング鎖の不対部分がＰＣＲレジメンの間の３’伸長に左右されないという利点を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターのブロッキング鎖は、その増幅鎖の５’不対部分に実質的に相補的でない３’不対部分をさらに含み得る；そしてここでそのブロッキング鎖の３’不対部分は、プライマーのうちのいずれにも実質的に相補的でないか、または実質的に同一でない。いくつかの実施形態において、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターのブロッキング鎖は、その増幅鎖の５’不対部分にアニーリング温度で特異的にアニールしない３’不対部分をさらに含み得る；そしてここでそのブロッキング鎖の３’不対部分は、プライマーまたはその相補体のうちのいずれにも、アニーリング温度で特異的にアニールしない。
【００６６】
第１の増幅工程
本明細書で使用される場合、用語「第１の標的特異的プライマー（ｆｉｒｓｔ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、適したアニーリング条件下で標的核酸に特徴的な鎖を有する核酸テンプレートに特異的にアニールし得る核酸配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドに言及する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、プライマー（例えば、標的特異的プライマー）は、５’タグ配列部分を含み得る。いくつかの実施形態において、反応中に存在する多数のプライマー（例えば、全ての第１の標的特異的プライマー）は、同一の５’タグ配列部分を含み得る。いくつかの実施形態において、多重ＰＣＲ反応において、種々のプライマー種が、互いとオフターゲット様式で相互作用し得、プライマー伸長およびその後にＤＮＡポリメラーゼによる増幅をもたらす。このような実施形態において、これらプライマーダイマーは、短い傾向にあり、それらの効率的増幅は、反応を追い越して優位を占め得、所望の標的配列の不十分な増幅を生じ得る。よって、いくつかの実施形態において、プライマーに（例えば、標的特異的プライマー上に）５’タグ配列を含めることは、両方の鎖上に同じ相補的テールを含むプライマーダイマーの形成を生じ得る。いくつかの実施形態において、その後の増幅サイクルにおいて、このようなプライマーダイマーは、１本鎖ＤＮＡプライマーダイマーへと変性し、各々は、５’タグによって導入されるそれらの２つの末端上に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、これらの１本鎖ＤＮＡプライマーダイマーにアニールするプライマーの代わりに、分子内ヘアピン（フライパンの柄様の構造）形成は、別個の分子上の新たなプライマーとの分子間相互作用の代わりに、同じプライマーダイマー分子上の相補的タグの近位のアクセスしやすさに起因して起こり得る。よって、いくつかの実施形態において、これらのプライマーダイマーは、不十分にしか増幅されない可能性があり、その結果、プライマーは、増幅のためのダイマーによって指数関数的に消費されない；むしろそのタグ化プライマーは、標的配列の所望の特異的増幅のために高いかつ十分な濃度で残り得る。いくつかの実施形態において、プライマーダイマーの蓄積は、多重増幅の状況で望ましくない可能性がある。なぜならそれらは、その反応の中で他の試薬と競合し、消費するからである。
【００６８】
いくつかの実施形態において、５’タグ配列は、ＧＣリッチ配列であり得る。いくつかの実施形態において、５’タグ配列は、少なくとも５０％  ＧＣ含量、少なくとも５５％  ＧＣ含量、少なくとも６０％  ＧＣ含量、少なくとも６５％  ＧＣ含量、少なくとも７０％  ＧＣ含量、少なくとも７５％  ＧＣ含量、少なくとも８０％  ＧＣ含量、またはより高いＧＣ含量を含み得る。いくつかの実施形態において、タグ配列は、少なくとも６０％  ＧＣ含量を含み得る。いくつかの実施形態において、タグ配列は、少なくとも６５％  ＧＣ含量を含み得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「第１のアダプタープライマー（ｆｉｒｓｔ  ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、第１のシーケンシングプライマーの５’部分と同一の核酸配列を含む核酸分子に言及する。従って、第１のテール−アダプタープライマーが増幅鎖（相補鎖とは対照的に）の配列のうちの少なくとも一部と同一であるので、ユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプター自体の任意の部分に特異的にアニールできない。
【００７０】
第１の増幅工程の第１のＰＣＲ増幅サイクルにおいて、その第１の標的特異的プライマーは、既知の標的ヌクレオチド配列を含む任意の核酸のテンプレート鎖に特異的にアニールし得る。その第１の標的特異的プライマーがデザインされた配向に依存して、その既知の標的ヌクレオチド配列の上流または下流にある配列は、そのテンプレート鎖に相補的な鎖として合成される。ＰＣＲの伸長相の間に、そのテンプレート鎖の５’末端がライゲーションされたユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターにおいて終了する場合、その新たに合成された生成物鎖の３’末端は、その第１のテール−アダプタープライマーに相補的な配列を含む。その後のＰＣＲ増幅サイクルでは、その第１の標的特異的プライマーおよびその第１のテール−アダプタープライマーの両方が、その標的核酸配列の適切な鎖に特異的にアニールし得、その既知のヌクレオチド標的配列とそのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターとの間の配列が、増幅され得る（すなわち、コピーされ得る）。
【００７１】
第２の増幅工程
本明細書で使用される場合、用語「第２の標的特異的プライマー（ｓｅｃｏｎｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、先立つ増幅工程から生じるアンプリコンによって含まれる既知の標的ヌクレオチド配列の一部に特異的にアニールし得る核酸配列を含む３’部分、および第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む５’部分を含む１本鎖オリゴヌクレオチドに言及する。その第２の標的特異的プライマーは、その第２の標的特異的プライマーの共通配列とハイブリダイズするさらなるプライマー（例えば、３’シーケンシングアダプター／インデックス配列を有するプライマー）によってさらに接触され得る。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、バーコード、インデックス、アダプター配列、またはシーケンシングプライマー部位を含み得るハイブリダイゼーション配列の５’側にさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、包括的シーケンシングアダプター／インデクスプライマーである。その第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに関してネスト化される。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーは、第１の標的特異的プライマーに関して、少なくとも３ヌクレオチド、例えば、３もしくはこれより多くの、４もしくはこれより多くの、５もしくはこれより多くの、６もしくはこれより多くの、７もしくはこれより多くの、８もしくはこれより多くの、９もしくはこれより多くの、１０もしくはこれより多くの、または１５もしくはこれより多くのヌクレオチドがネスト化される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、反応に存在するその第２の標的特異的プライマーのうちの全ては、同じ５’部分を含む。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーの５’部分は、本明細書中上記の第１の標的特異的プライマーの５’タグに関して記載されるように、プライマーダイマーを抑制するように働き得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２の標的特異的プライマーは、その標的核酸の同じ鎖に実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、その既知の標的配列に特異的にアニールするその第１のおよび第２の標的特異的プライマーの一部は、合計で、その既知の標的ヌクレオチド配列の少なくとも２０個の特有の塩基、例えば、２０個もしくはこれより多くの特有の塩基、２５個もしくはこれより多くの特有の塩基、３０個もしくはこれより多くの特有の塩基、３５個もしくはこれより多くの特有の塩基、４０個もしくはこれより多くの特有の塩基、または５０個もしくはこれより多くの特有の塩基を含み得る。いくつかの実施形態において、その既知の標的配列に特異的にアニールするその第１のおよび第２の標的特異的プライマーの一部は、合計で、その既知の標的ヌクレオチド配列の少なくとも３０個の特有の塩基を含み得る。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「第２のアダプタープライマー（ｓｅｃｏｎｄ  ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、その第１のシーケンシングプライマーの一部と同一の核酸配列を含む核酸分子に言及し、その第１のアダプタープライマーに関してネスト化される。従って、その第２のテール−アダプタープライマーは、増幅鎖（相補鎖とは対照的に）の配列の少なくとも一部と同一であるので、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプター自体のいかなる部分にも特異的にアニールできない。いくつかの実施形態において、その第２のアダプタープライマーは、その第１のシーケンシングプライマーと同一である。
【００７５】
その第２のアダプタープライマーは、第１のアダプタープライマーに関してネスト化されるはずである、すなわち、その第１のアダプタープライマーは、第２のアダプタープライマーによって含まれずかつその第２のアダプタープライマーによって含まれる増幅鎖と同一の配列のうちのいずれとも異なる、その増幅プライマーの５’末端の近位に位置するその増幅鎖に同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、その第２のアダプタープライマーは、少なくとも３個のヌクレオチド、例えば、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、またはこれより多くがネスト化される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、その第１のアダプタープライマーは、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖の約２０個の最も５’側の塩基と同一の核酸配列を含み得、その第２のアダプタープライマーは、そのユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターの増幅鎖の約３０個の塩基と同一の核酸配列と、その増幅鎖の５’末端の３’側にある少なくとも３個のヌクレオチドである５’塩基とを含み得る。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ネスト化されたプライマーセットが使用され得る。いくつかの実施形態において、ネスト化されたアダプタープライマーの使用は、増幅可能である（例えば、ブリッジＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲの間に）が、ある種の技術を使用して効率的にシーケンシングできない最終アンプリコンを生成する可能性を排除する。いくつかの実施形態において、半ネスト化されたプライマーセットが使用され得る。
【００７８】
サンプル精製工程
いくつかの実施形態において、標的核酸および／またはその増幅生成物は、１つの方法のうちの任意の適切な工程の前および／または後で、酵素、プライマー、または緩衝液構成要素から単離され得る。核酸を単離するための任意の適切な方法が、使用され得る。いくつかの実施形態において、その単離は、固相可逆的固定法（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ））クリーンアップを含み得る。ＳＰＲＩクリーンアップのための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  −  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（カタログ番号Ａ６３８８０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；  Ｂｒｅａ，  ＣＡ））。いくつかの実施形態において、酵素は、加熱処理によって不活性化され得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしなかったプライマーは、適切な方法（例えば、精製、消化など）を使用して核酸調製物から除去され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）は、調製物からプライマーを除去するために使用される。いくつかの実施形態において、このようなヌクレアーゼは、プライマー消化後に熱不活性化される。そのヌクレアーゼが一旦不活性化されると、プライマーのさらなるセットが、さらなる増幅反応を行うために、他の適切な構成要素（例えば、酵素、緩衝液）と一緒に添加され得る。
【００８０】
シーケンシング
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、オリゴヌクレオチドシーケンシングのために核酸サンプルを富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングは、次世代シーケンシング法によって行われ得る。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」とは、数千から数百万のシーケンシング反応を並行して行いかつ読み取ることに起因して、従来のシーケンシング法（例えば、サンガーシーケンシング法）で可能な速度を上回る速度でオリゴヌクレオチドをシーケンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシーケンシング技術をいう。次世代シーケンシング法／プラットフォームの非限定的な例としては、以下が挙げられる：大規模並行シグネチャーシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；４５４パイロシーケンシング（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ，  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）；ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；イオン半導体シーケンシング（Ｉｏｎ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＩＯＮ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）；ＤＮＡナノボールシーケンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）；ならびにＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な技術。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングプライマーは、選択された次世代シーケンシング法と適合性の部分を含み得る。次世代シーケンシング技術およびその制約、ならびに関連したシーケンシングプライマーのデザインパラメーターは、当該分野で周知である（例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら，「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００８，  ｖｏｌ．  ２６，  Ｎｏ．  １０，  １１３５−１１４５；Ｍａｒｄｉｓ，  「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００７，  ｖｏｌ．  ２４，  Ｎｏ．  ３，  ｐｐ．  １３３−１４１；  Ｓｕら，  「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ，  ２０１１，  １１（３）：３３３−４３；Ｚｈａｎｇら，  「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ」，  Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２０１１，  ３８（３）：９５−１０９；（Ｎｙｒｅｎ，  Ｐ．ら  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０８：  １７１７５（１９９３）；  Ｂｅｎｔｌｅｙ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｃｕｒｒ  ���ｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １６：５４５−５２（２００６）；  Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ｌ．ら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｏｄａｙ  １３：５６９−７７（２００８）；米国特許第７，２８２，３３７号；米国特許第７，２７９，５６３号；米国特許第７，２２６，７２０号；米国特許第７，２２０，５４９号；米国特許第７，１６９，５６０号；米国特許第６，８１８，３９５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国公開番号２００６／０２５２０７７；同２００７／００７０３４９；および同２００７００７０３４９を参照のこと；これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）。
【００８１】
いくつかの実施形態において、そのシーケンシング工程は、第１のおよび第２のシーケンシングプライマーの使用に依拠する。いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２のシーケンシングプライマーは、本明細書で記載されるとおりの次世代シーケンシング法と適合性であるように選択される。
【００８２】
シーケンシングリードをゲノムおよび／またはｃＤＮＡ配列の既知の配列データベースに整列させるための方法は、当該分野で周知であり、ソフトウェアは、このプロセスのために市販される。いくつかの実施形態において、それらの全体において、野生型配列データベースにマッピングされないリード（より小さいシーケンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列）は、ゲノム再編成または大きなインデル変異であり得る。いくつかの実施形態において、ゲノム中の多数の位置にマッピングされる配列を含むリード（より小さいシーケンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列）は、ゲノム再編成であり得る。
【００８３】
ＡＭＰプライマー
いくつかの実施形態において、プライマーの４タイプ（第１のおよび第２の標的特異的プライマー、ならびに第１のおよび第２のアダプタープライマー）を、これらが、約６１〜７２℃、例えば、約６１〜６９℃、約６３〜６９℃、約６３〜６７℃、約６４〜６６℃のアニーリング温度において、これらの相補的配列に特異的にアニールするように、デザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーのその４タイプは、これらが７２℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーのその４タイプは、これらが７０℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーのその４タイプは、これらが６８℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーのその４タイプは、これらが約６５℃のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクリングすることによって）変更して、プライマーアニーリングを促進するように構成される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部は、約６１〜７２℃、例えば、約６１〜６９℃、約６３〜６９℃、約６３〜６７℃、約６４〜６６℃の温度で特異的にアニールする。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部は、約６５℃の温度で、ＰＣＲ緩衝液中で特異的にアニールする。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるプライマーおよび／またはアダプターは、改変された塩基を含むことができない（例えば、そのプライマーおよび／またはアダプターは、ブロッキング３’アミンを含むことができない）。
【００８６】
核酸伸長、増幅、およびＰＣＲ
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、伸長レジメンまたは工程を含む。このような実施形態において、伸長は、１つまたはこれより多くのハイブリダイズしたテール付加ランダムプライマーから、プライマーがテンプレートに関してハイブリダイズされる核酸分子を使用して、進み得る。伸長工程は、本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、１つまたはこれより多くのテール付加ランダムプライマーは、サンプル中の核酸の実質的に全てにハイブリダイズし得、そのうちの多くは、既知の標的ヌクレオチド配列を含まなくてもよい。よって、いくつかの実施形態において、ランダムプライマーの伸長は、既知の標的ヌクレオチド配列を含まないテンプレートとのハイブリダイゼーションに起因して起こり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅レジメンを包含し得る（１つまたはこれより多くの増幅サイクルを包含する）。本明細書で記載される方法の増幅工程は、各々ＰＣＲ増幅レジメンを、すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅サイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクルすることによって）変更して、種々のＰＣＲ工程、例えば、融解、アニーリング、伸長などを促進するように構成される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、自動化様式で増幅レジメンを実行するように構成される。本明細書で使用される場合、用語「増幅レジメン（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｍｅｎ）」とは、目的の核酸を特異的に増幅する（その存在量を増大させる）プロセスをいう。いくつかの実施形態において、指数関数的増幅は、以前のポリメラーゼ伸長の生成物が連続する伸長ラウンドにわたってテンプレートとして働く場合に起こる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従うＰＣＲ増幅レジメンは、少なくとも１回、およびいくつかの場合には、少なくとも５回またはこれより多くの反復サイクルを含み得る。いくつかの実施形態において、各反復サイクルは、１）鎖分離（例えば、熱変性）；２）テンプレート分子へのオリゴヌクレオチドプライマーアニーリング；および３）そのアニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼ伸長という工程を含み得る。これらの工程の各々に関与する任意の適切な条件および時間が使用され得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、選択される条件および時間は、長さ、配列の内容、融解温度、二次構造特徴、または反応において使用される核酸テンプレートおよび／もしくはプライマーに関する他の因子に依存し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う増幅レジメンは、サーマルサイクラー（そのうちの多くは市販されている）で行われる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、核酸伸長反応は、核酸ポリメラーゼの使用を包含する。本明細書で使用される場合、語句「核酸ポリメラーゼ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」とは、ヌクレオシド三リン酸のテンプレート依存性重合を触媒して、テンプレート核酸配列に相補的なプライマー伸長生成物を形成する酵素をいう。核酸ポリメラーゼ酵素は、アニールしたプライマーの３’末端における合成を開始し、そのテンプレートの５’末端に向かう方向で進む。多くの核酸ポリメラーゼは、当該分野で公知であり、市販されている。核酸ポリメラーゼのうちの１グループは、熱安定性である。すなわち、それらは、相補的な核酸のアニールした鎖を変性させるために十分な温度（例えば、９４℃、または時にはより高い）に供された後に機能を保持する。増幅のためのプロトコルの非限定的な例は、以下の条件下でポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｔａｑ、ＶｅｒａＳｅｑ）を使用することを包含する：９８℃で３０秒間、続いて、以下を含む１４〜２２回のサイクル（９８℃で１０秒間での融解、続いて、６８℃で３０秒間のアニーリング、続いて、７２℃で３分間の伸長、続いて、４℃での反応の保持）。しかし、他の適切な反応条件が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アニーリング／伸長温度は、塩濃度における差異を考慮するために調節され得る（例えば、より高い塩濃度に対して３℃高い）。いくつかの実施形態において、例えば、９８℃から６５℃への傾斜率を（例えば、１℃／秒、０．５℃／秒、０．２８℃／秒、０．１℃／秒またはよりゆっくりと）遅らせることは、より多重化したサンプル中でプライマー性能および適用範囲の均一性を改善する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクルさせ、制御された上昇率または下降率を有することによって）変更して、増幅を促進するように構成される。
【００９０】
いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、その酵素がテンプレート依存性伸長を行う条件下で使用される。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＶｅｒａＳｅｑ  ＵＬｔｒａポリメラーゼ、ＶｅｒａＳｅｑ  ＨＦ  ２．０ポリメラーゼ、ＥｎｚＳｃｒｉｐｔ、または別の適切なポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素ではない。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、伸長反応は、相補的なＤＮＡ分子を生成するために、ＲＮＡに対して行われる逆転写を包含する（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、マウスのモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、または別の適切な逆転写酵素である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、核酸増幅反応は、反応混合物の加熱を概して要する鎖分離工程を包含するサイクルを要する。本明細書で使用される場合、用語「鎖分離（ｓｔｒａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）」または「鎖を分離する（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｎｄ）」とは、相補的な２本鎖分子が、オリゴヌクレオチドプライマーにアニールするために利用可能な２本の単一の鎖へと分離されるようにする核酸サンプルの処理を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う鎖分離は、核酸サンプルをその融解点（Ｔｍ）を上回って加熱することによって達成される。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼに適した反応調製物における核酸分子を含むサンプルに関しては、９４℃への加熱は、鎖分離を達成するために十分である。いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１種またはこれより多くの塩（例えば、１〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、少なくとも１種の緩衝化剤（例えば、１〜２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、およびキャリア（例えば、０．０１〜０．５％  ＢＳＡ）を含む。適切な緩衝液の非限定的な例は、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５〜３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．１％  ＢＳＡを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、核酸増幅は、標的核酸に特徴的な鎖を有する核酸テンプレートにプライマーをアニールさせることを包含する。いくつかの実施形態において、標的核酸の鎖は、テンプレート核酸として働き得る。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「アニールする（ａｎｎｅａｌ）とは、２つの核酸の間での１つまたはこれより多くの相補的塩基対の形成をいう。いくつかの実施形態において、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は、２つの相補的または実質的に相補的な核酸鎖が一緒にハイブリダイズすることを要する。いくつかの実施形態において、伸長反応の状況では、アニーリングは、テンプレート依存性ポリメラーゼ酵素のプライマー伸長基質が形成されるように、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを要する。いくつかの実施形態において、アニーリング（例えば、プライマーと核酸テンプレートとの間）の条件は、プライマーの長さおよび配列に基づいて変動し得る。いくつかの実施形態において、アニーリングの条件は、プライマーのＴｍ（例えば、計算されたＴｍ）に基づく。いくつかの実施形態において、伸長レジメンのアニーリング工程は、鎖分離工程後の温度を、プライマーのＴｍ（例えば、計算されたＴｍ）に基づく温度へと、このようなアニーリングを可能にするために十分な時間にわたって低下させることを要する。いくつかの実施形態において、Ｔｍは、多くのアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ．  Ｃｏｌｏｒａｄｏ）プライマーデザインソフトウェアおよびＶＥＮＴＲＯ  ＮＴＩＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）プライマーデザインソフトウェアおよびインターネット上で入手可能なプログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３、Ｏｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ、およびＮｅｔＰｒｉｍｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ；  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ；およびワールドワイドウェブ上で（例えば、ａｔ  ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ／Ｈｅｌｐ／ｘｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ．ｈｔｍｌにおいて）無料で入手可能なものが挙げられる）のうちのいずれかを使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、プライマーのＴｍは、以下の式を使用して計算され得る（これは、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒソフトウェアによって使用され、Ｆｒｉｅｉｒ，ら  ＰＮＡＳ  １９８６  ８３：９３７３−９３７７（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）により詳細に記載される）
Ｔｍ＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃ／４））＋１６．６  ｌｏｇ（［Ｋ＋］／（１＋０．７［Ｋ＋］））−２７３．１５
ここで：ΔＨは，ヘリックス形成のエンタルピーであり；ΔＳは、ヘリックス形成のエントロピーであり；Ｒは、モル気体定数（１．９８７ｃａｌ／℃×ｍｏｌ）であり；Ｃは、核酸濃度であり；そして［Ｋ＋］は、塩濃度である。大部分の増幅レジメンに関して、アニーリング温度は、推定Ｔｍより約５℃低いように選択されるが、例えば、推定Ｔｍより５℃より大きく低い温度（例えば、６℃低い、８℃低い、１０℃低い、またはより低い）であり得るように、Ｔｍにより近く、Ｔｍを上回る温度（例えば、推定Ｔｍより１℃〜５℃の間または低い、推定Ｔｍより１℃〜５℃の間高い）が使用され得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度がＴｍに近いほど、アニーリングはより特異的になる。いくつかの実施形態において、伸長反応の間（例えば、ＰＣＲ増幅レジメンの状況内で）プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、反応の容積に基づいて決定される（例えば、容積が大きいほど、より長い時間を要する）。いくつかの実施形態において、伸長反応の間に（例えば、ＰＣＲ増幅レジメンの状況内で）プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、プライマーおよびテンプレート濃度に基づいて決定される（例えば、テンプレートに対するプライマーの相対的濃度が高いほど、より低い相対的濃度より、より短い時間を要する）。いくつかの実施形態において、容積および相対的プライマー／テンプレート濃度に依存して、伸長反応における（例えば、増幅レジメンの状況内での）プライマーアニーリング工程は、１秒〜５分、１０秒〜２分、または３０秒〜２分の範囲内であり得る。本明細書で使用される場合、「実質的にアニールする（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ａｎｎｅａｌ）」とは、相補的塩基対が、ＰＣＲ増幅レジメンの状況において使用される場合に、特異的に増幅された生成物の検出可能なレベルを生じるために十分である２つの核酸の間で形成する程度に言及する。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ伸長（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」とは、核酸ポリメラーゼによる、核酸テンプレートにアニールされるプライマーの３’末端への少なくとも１個の相補的ヌクレオチドのテンプレート依存性付加をいう。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、例えば、テンプレートの全長に相当するヌクレオチドまでおよびそれを含む１個より多くのヌクレオチドを付加する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長の条件は、少なくとも部分的に、使用されるポリメラーゼが何であるかに基づく。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長に使用されるテンプレートは、その酵素の既知の活性特性に基づく。アニーリング温度がその酵素の至適温度を下回るいくつかの実施形態において、より低い伸長温度を使用することは、許容可能であり得る。いくつかの実施形態において、酵素は、それらの至適伸長温度より下で少なくとも部分的活性を保持し得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長（例えば、Ｔａｑポリメラーゼおよびその改変体のような熱安定性ポリメラーゼで行われる）は、６５℃〜７５℃または６８℃〜７２℃で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、ＰＣＲ増幅レジメンの各サイクルにおいて核酸テンプレートにアニールされるプライマーのポリメラーゼ伸長を要する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、比較的強い鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して行われる。いくつかの実施形態において、強い鎖置換を有するポリメラーゼは、融合物（例えば、５’融合物）を検出する目的で核酸を調製するために有用である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、プライマー伸長は、アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を可能にする条件下で行われる。本明細書で使用される場合、用語「伸長生成物が生成されるようにアニールしたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｅｒｍｉｔ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｎｅａｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｃｈ  ｔｈａｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｒｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）」とは、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する条件のセット（例えば、温度、塩および補因子濃度、ｐＨ、ならびに酵素濃度）をいう。いくつかの実施形態において、このような条件は、少なくとも部分的に、使用されている核酸ポリメラーゼに基づく。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、適切な反応調製物中でプライマー伸長反応を行い得る。いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１つまたはこれより多くの塩（例えば、１〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、少なくとも１つの緩衝化剤（例えば、１〜２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、キャリア（例えば、０．０１〜０．５％  ＢＳＡ）、および１つまたはこれより多くのＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの各々が１０〜２００μＭ）を含む。条件の非限定的なセットは、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒する７２℃において５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５〜３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、および０．１％  ＢＳＡである。いくつかの実施形態において、開始および伸長の条件は、適切な緩衝液中に、１種、２種、３種または４種の種々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰから選択される）および重合誘導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在を含み得る。いくつかの実施形態において、「緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）」とは、溶媒（例えば、水性溶媒）に加えて、ｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす適切な補因子および試薬を含み得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、自動化様式で、多数の核酸増幅サイクルを実行するように構成される。いくつかの実施形態において、核酸増幅は、５回まで、１０まで、２０まで、３０まで、４０まで、またはこれより多くのラウンド（サイクル）の増幅を要する。いくつかの実施形態において、核酸増幅は、長さが５サイクル〜２０サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、増幅工程は、長さが１０サイクル〜２０サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、各増幅工程は、長さが１２サイクル〜１６サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、７０℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、７２℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約６５℃であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約６１〜約７２℃であり得る。
【００９７】
種々の実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、本明細書で記載されるプライマーのタイプのうちの１つまたはこれより多くを用いてＰＣＲ増幅レジメンを行うことに関する。本明細書で使用される場合、「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」とは、核酸テンプレートに特異的にアニーリングし、テンプレート依存性ポリメラーゼの基質として働く３’末端を提供して、そのテンプレートに相補的な伸長生成物を生成し得るオリゴヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態において、プライマーは、プライマーおよびその相補体がアニールして２つの鎖を形成し得るようにする１本鎖である。本明細書に記載される方法および組成物に従うプライマーは、長さが３００ヌクレオチド以下であり、例えば、３００以下、または２５０、または２００、または１５０、または１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、またはこれより少ない、または２０もしくはこれより少ない、または１５もしくはこれより少ないが、長さが少なくとも６ヌクレオチドであるハイブリダイゼーション配列（例えば、核酸テンプレートとアニールする配列）を含み得る。いくつかの実施形態において、プライマーのハイブリダイゼーション配列は、長さが６〜５０ヌクレオチド、長さが６〜３５ヌクレオチド、長さが６〜２０ヌクレオチド、長さが１０〜２５ヌクレオチドであり得る。
【００９８】
任意の適切な方法が、オリゴヌクレオチドおよびプライマーを合成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、市販の供給源は、本明細書で記載される方法および組成物における使用のためのプライマーを提供するために適したオリゴヌクレオチド合成サービス（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  ＩＡ）からの特注のＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏ）を提供する。
【００９９】
ＤＮＡ剪断／フラグメント化
本明細書で使用される核酸（例えば、シーケンシングの前）は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る（例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得る）。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびＣｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）から市販されるＡＦＡＴＭ剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、核酸が、例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得る、例えば、カートリッジ内に嵌められているカセット内に１つまたはこれより多くの容器を有し得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、標的核酸は、剪断も消化もされない。いくつかの実施形態において、調製工程の核酸生成物（例えば、伸長生成物、増幅生成物）は、剪断も酵素消化もされない。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、標的核酸がＲＮＡである場合、そのサンプルは、ＤＮＡテンプレートを生成するために逆転写酵素レジメンに供され得、次いで、そのＤＮＡテンプレートは、剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを含むサンプルは、新鮮なまたは分解された標本のいずれかから抽出された全核酸を使用して；ｃＤＮＡシーケンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要性なしに；ｃＤＮＡシーケンシングのためにリボソームＲＮＡを枯渇させる必要性なしに；工程のうちのいずれかにおける機械的剪断または酵素による剪断の必要性もなしに；ランダムヘキサマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成のためにＲＮＡを供することによって、本明細書で記載される方法において使用され得る。
【０１０２】
標的核酸
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、目的の核酸分子（例えば、分析されるべき核酸）をいう。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知のまたは所定のヌクレオチド配列）および決定されるべき隣接するヌクレオチド配列（これは、未知の配列といわれ得る）の両方を含む。標的核酸は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２本鎖である。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、１本鎖である。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）であり得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ゲノムＤＮＡによって含まれ得る。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡによって含まれ得る。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、ｃＤＮＡによって含まれ得る。本明細書で記載される方法における使用に適したシーケンシング法のうちの多くは、数十から数百のヌクレオチド塩基の至適リード長でのシーケンシング実行を提供する（例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、２００〜４００ｂｐのリード長を生成し得る）。例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによって含まれる標的核酸は、この至適リード長より実質的に長い核酸分子によって含まれ得る。第２の増幅工程から生じる増幅された核酸部分が特定のシーケンシング技術における使用のための適切な長さのものであるために、その既知の標的ヌクレオチド配列とユニバーサルオリゴヌクレオチドテール−アダプターがライゲーションされ得る標的核酸の末端との間の平均距離は、選択された技術の至適リード長に可能な限り近いべきである。例えば、所定のシーケンシング技術の至適リード長が２００ｂｐである場合、本明細書で記載される方法に従って増幅される核酸分子は、約４００ｂｐまたはこれより短い平均長を有するべきである。例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによって含まれる標的核酸は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る（例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得る）。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびＣｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）から市販されるＡＦＡＴＭ剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡによって含まれる標的核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、その標的核酸がＲＮＡによって含まれる場合、そのサンプルは、ＤＮＡテンプレートを生成するために逆転写酵素レジメンに供され得、次いで、そのＤＮＡテンプレートは、剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを含むサンプルは、新鮮なまたは分解された標本のいずれかから抽出された全核酸を使用して；ｃＤＮＡシーケンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要性なしに；ｃＤＮＡシーケンシングのためにリボソームＲＮＡを枯渇させる必要性なしに；工程のうちのいずれかにおける機械的剪断または酵素による剪断の必要性もなしに；ランダムヘキサマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成のためにＲＮＡを供することによって；およびその核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供することによって、本明細書で記載される方法において使用され得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列は、遺伝子再編成によって含まれ得る。本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および／または何であるかを決定するために適合される。なぜならその遺伝子再編成の半分のみが何であるかが、先に決定されなければならないからである（すなわち、遺伝子特異的プライマーによって標的化されるべき遺伝子再編成の半分）。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、発がん遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「既知の標的ヌクレオチド配列（ｋｎｏｗｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、その配列（例えば、その核酸が何であるかおよびその核酸のヌクレオチド塩基の順序）が既知である標的核酸の一部をいう。例えば、いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列は、既知であるかまたはその核酸の隣接する未知の配列のインターロゲーションより先に決定された核酸のヌクレオチド配列である。既知の標的ヌクレオチド配列は、任意の適切な長さであり得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）は、１０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、２００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５００個もしくはこれより多くのヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）は、１０〜１００個のヌクレオチド、１０〜５００個のヌクレオチド、１０〜１０００個のヌクレオチド、１００〜５００個のヌクレオチド、１００〜１０００個のヌクレオチド、５００〜１０００個のヌクレオチド、５００〜５０００個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、方法は、核酸の連続する（または隣接する）部分の配列を決定するために、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、用語「に連続するヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｔｏ）」とは、別のヌクレオチド配列（例えば、既知のヌクレオチド配列）の直ぐ上流または下流にある核酸分子（例えば、標的核酸）のヌクレオチド配列に言及する。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、１ｋｂまたはこれより短いヌクレオチド配列、例えば、１ｋｂまたはこれより短いヌクレオチド配列、７５０ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、５００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、４００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、３００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、２００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、１００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列を含む。サンプルが既知の標的ヌクレオチド配列を含む種々の標的核酸（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列が、そのゲノムに、または別個の同一でない染色体上に何度も出現する細胞）を含むいくつかの実施形態において、その既知の標的ヌクレオチド配列「に連続するヌクレオチド配列」を含む多数の配列が存在し得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列（またはそのヌクレオチド配列）を決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａ（ｏｒ  ｔｈｅ）  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、核酸のヌクレオチド塩基が何であるかおよびその相対的位置を決定することに言及する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、既知の標的核酸は、遺伝子再編成から生じる融合配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および／または何であるかを決定するために適している。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成の１つの部分が何であるかは、先に既知であり（例えば、遺伝子特異的プライマーによって標的化されるべき遺伝子再編成の一部）、他の部分の配列は、本明細書で開示される方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子を要し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。
【０１１０】
サンプル
いくつかの実施形態において、標的核酸は、適切なサンプル（例えば、食品サンプル、環境サンプル、生物学的サンプル、例えば、血液サンプルなど）中に存在するかまたはこれらサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、被験体から得られる生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られる診断サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、タンパク質、細胞、流体、生物学的流体、保存剤、および／または他の物質をさらに含み得る。非限定的な例によれば、サンプルは、口内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離物、胸膜液、心膜液、嚢胞液、腫瘍組織、組織、生検物、唾液、吸引物、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、切除物または生検物によって得られ得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、そのサンプルは、遺伝子変化（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）と関連する疾患（例えば、がんまたは遺伝性疾患）の処置の必要性のある被験体から得られ得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子に存在する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、サンプルは、がんの処置の必要性のある被験体から得られる。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、腫瘍細胞の集団、例えば、少なくとも１個の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、腫瘍生検物（非処理の生検組織物または処理生検組織物（例えば、ホルマリン固定および／またはパラフィン包埋した生検組織）が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、そのサンプルは、新たに集められる。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において使用される前に貯蔵される。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、非処理サンプルである。本明細書で使用される場合、「非処理サンプル（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ）」とは、溶液中での希釈および／または懸濁を除いて、いかなる事前のサンプル事前処理をも有しなかった生物学的サンプルをいう。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られ、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に保存または処理される。非限定的な例によれば、サンプルは、パラフィンワックス中に包埋され得るか、冷蔵され得るか、または凍結され得る。凍結サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物に従って、核酸の存在を決定する前に融解され得る。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｏｒ  ｔｒｅａｔｅｄ）サンプルであり得る。サンプルを処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）ための例示的な方法としては、遠心分離、濾過、超音波処理、ホモジナイゼーション、加熱、凍結および融解、保存剤（例えば、抗凝固剤またはヌクレアーゼインヒビター）との接触、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは、化学的および／または生物学的試薬で処理され得る。化学的および／または生物学的試薬は、処理および／または貯蔵の間に、サンプルの安定性またはそのサンプルによって含まれる核酸を保護および／または維持するために使用され得る。さらに、または代わりに、化学的および／または生物学的試薬は、そのサンプルの他の構成要素から核酸を放出するために使用され得る。非限定的な例によれば、血液サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に、抗凝固剤で処理され得る。核酸分析のためのサンプルの処理、保存、または処理に適切な方法およびプロセスは、本明細書で開示される方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、清澄にした流体サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、その清澄にされる流体サンプルを含む上清の低速遠心分離（例えば、３，０００×ｇまたはこれより小さい）および収集によって清澄にされ得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する核酸は、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に単離され得るか、富化され得るか、または精製され得る。サンプルから核酸を単離、富化、または精製するために適した方法は、使用され得る。例えば、ゲノムＤＮＡを種々のサンプルタイプから単離するためのキットは、市販されている（例えば、カタログ番号５１１０４、５１３０４、５６５０４、および５６４０４；  Ｑｉａｇｅｎ；  Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，  ＭＤ）。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、例えば、標的核酸のシーケンシングの前に、標的核酸を富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、富化されるべき標的核酸の一方の末端の配列は、シーケンシングの前には知られていない。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、次世代シーケンシング技術を使用してヌクレオチド配列を決定する前に、特定のヌクレオチド配列を富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、特定のヌクレオチド配列を富化するための方法は、ハイブリダイゼーション富化を含まない。
【０１１５】
標的遺伝子（ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ）および治療適用
本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列の決定は、疾患の処置と直接関連する情報を提供し得る。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、疾患を処置することを補助するために使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、遺伝的変化と関連する疾患の処置の必要性のある被験体に由来し得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子、例えば、発がん遺伝子の配列である。いくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列および／またはその既知のオリゴヌクレオチド標的配列は、疾患に関連する変異または遺伝的異常（例えば、ＳＮＰ、挿入、欠失、および／または遺伝子再編成）を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する既知の標的配列に連続する配列および／または既知の標的配列は、遺伝子再編成生成物の配列を含んだ。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子、例えば、融合発がん遺伝子であり得る。
【０１１６】
がんのある種の処置は、ある種の発がん遺伝子を含む腫瘍に対して特に有効である。例えば、所定の融合発がん遺伝子の作用または発現を標的化する処置薬剤は、その融合発がん遺伝子を含む腫瘍に対して有効であり得るが、その融合発がん遺伝子を欠く腫瘍に対しては有効でない。本明細書で記載される方法は、発がん遺伝子状態（例えば、変異、ＳＮＰ、および／または再編成）を明らかにする特定の配列の決定を促進し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、隣接する領域の配列が既知である場合に、特定の配列の決定をさらに可能にし得る。例えば、本明細書で記載される方法は、精密な位置および／または再編成パートナーが、本明細書で記載される方法が行われる前に既知ではない既知の遺伝子（例えば、発がん遺伝子）を要する遺伝子再編成の存在および何であるかを決定し得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、被験体は、肺がんの処置の必要性がある。いくつかの実施形態において、例えば、そのサンプルが、肺がんの処置の必要性のある被験体から得られる場合、その既知の標的配列は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、およびＲＥＴの群から選択される遺伝子に由来する配列を含み得る。よって、いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、またはＲＥＴを含む融合物を生じる。ＡＬＫ、ＲＯＳ１、またはＲＥＴを含む遺伝子再編成の非限定的な例は、例えば、以下に記載される：Ｓｏｄａら  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７  ４４８５６１−６：  Ｒｉｋｏｖａら  Ｃｅｌｌ  ２００７  １３１：１１９０−１２０３；  Ｋｏｈｎｏら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  １８：３７５−７；  Ｔａｋｏｕｃｈｉら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  １８：３７８−８１；これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される。しかし、再編成に関与する第２の遺伝子の遺伝子再編成の精密な位置および何であるかが予め既知でなくてもよいことは、認識されるべきである。よって、本明細書で記載される方法において、このような再編成の存在および何であるかは、遺伝子再編成に関与する第２の遺伝子の再編成の位置または何であるかを知る必要なしに検出され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、その既知の標的配列は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、およびＲＥＴの群から選択される遺伝子に由来する配列を含み得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＡＬＫの遺伝子再編成の存在は、その腫瘍が以下からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る：ＡＬＫインヒビター；クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６）；ＡＰ２６１１３；ＬＤＫ３７８；３−３９；ＡＦ８０２；ＩＰＩ−５０４；ＡＳＰ３０２６；ＡＰ−２６１１３；Ｘ−３９６；ＧＳＫ−１８３８７０５Ａ；ＣＨ５４２４８０２；ＡＬＫキナーゼ活性のジアミノおよびアミノピリミジンインヒビター（例えば、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−０２３４１０６６（例えば、Ｇａｌｋｉｎら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２００７，  １０４：２７０−２７５；  Ｚｏｕら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００７，  ６７：４４０８−４４１７；  Ｈａｌｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｆ１０００  Ｍｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１１  ３：２１；  Ｓａｋａｍｏｔｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１１  １９：６７９−６９０；およびＷＯ  ０４／０７９３２６で開示される分子を参照のこと）。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。ＡＬＫインヒビターは、ＡＬＫまたはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＡＬＫまたはその一部の発現および／または活性を低減する例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合「未分化リンパ腫キナーゼ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｋｉｎａｓｅ）」または「ＡＬＫ」とは、代表的には野生型形態におけるニューロン調節に関与する膜貫通チロシンキナーゼ（ｔｙＲＯＳ１ｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）をいう。ＡＬＫ遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２３８の下で註釈されるとおり）。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＲＯＳ１の遺伝子再編成の存在は、腫瘍がＲＯＳ１インヒビターおよび上記で記載されるとおりのＡＬＫインヒビター（例えば、ククリゾチニブ）からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る。ＲＯＳ１インヒビターは、ＲＯＳ１またはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＲＯＳ１またはその一部の発現および／または活性を低減する、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合「ｃ−ｒｏｓ発癌遺伝子１（ｃ−ｒｏｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １）」または「ＲＯＳ１」（当該分野ではｒｏｓ−１ともいわれる）は、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓサブファミリーの膜貫通チロシンキナーゼに言及し、これは、ＰＴＰＮ６と相互作用する。ＲＯＳ１遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６０９８の下で註釈されるとおり）。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＲＥＴの遺伝子再編成の存在は、その腫瘍が以下からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る：ＲＥＴインヒビター；ＤＰ−２４９０、ＤＰ−３６３６、ＳＵ５４１６；ＢＡＹ  ４３−９００６、ＢＡＹ  ７３−４５０６（レゴラフェニブ）、ＺＤ６４７４、ＮＶＰ−ＡＳＴ４８７、ソラフェニブ、ＲＰＩ−１、ＸＬ１８４、バンデタニブ、スニチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ、ゲフィチニブ、およびウィザフェリンＡ（例えば、Ｓａｍａｄｉら，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２０１０  １４８：１２２８−３６；  Ｃｕｃｃｕｒｕら，  ＪＮＣＩ  ２００４  １３：１００６−１０１４；  Ａｋｅｎｏ−Ｓｔｕａｒｔら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７  ６７：６９５６；  Ｇｒａｚｍａら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０  ２８：１５ｓ  ５５５９；  Ｍｏｌｏｇｎｉら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００６  ３７：１９９−２１２；  Ｃａｌｍｏｍａｇｎｏら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ＮＣＩ  ２００６  ９８：３２６−３３４；  Ｍｏｌｏｇｎｉ，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１１  １８：１６２−１７５；ならびにＷＯ  ０６／０３４８３３で開示される化合物；米国特許公開２０１１／０２０１５９８および米国特許第８，０６７，４３４号で開示される化合物を参照のこと）。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。ＲＥＴインヒビターは、ＲＥＴまたはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＲＥＴまたはその一部の発現および／または活性を低減する、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合、「トランスフェクションの間に再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「ＲＥＴ」とは、神経堤発生に関与し、グリア細胞由来神経栄養因子ファミリーシグナル伝達分子を認識するカドヘリンスーパーファミリーのレセプターチロシンキナーゼをいう。ＲＥＴ遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５９７９の下で註釈されるとおり）。
【０１２２】
本明細書で記載される方法の適用のさらなる非限定的な例としては、造血悪性腫瘍マーカーおよびその一団の検出（例えば、リンパ腫および白血病においてゲノム再編成を検出するものが挙げられる）、肉腫関連ゲノム再編成およびその一団の検出；ならびにリンパ腫検査のためのＩＧＨ／ＴＣＲ遺伝子再編成およびその一団の検出が挙げられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、例えば、がんを有するまたはがんを有すると診断された被験体を、がんの処置で処置することに関する。がんを有する被験体は、がんを診断するための現在の方法を使用して医師によって同定され得る。例えば、肺がんの状態を特徴付けかつ診断を補助する、肺がんの症状および／または合併症は、当該分野で周知であり、呼吸の虚弱（ｗｅａｋ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、鎖骨上リンパ節腫脹、肺の異常音、胸部を軽くたたいた場合の濁音（ｄｕｌｌｎｅｓｓ）および胸痛が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、肺がんの診断を補助し得る検査としては、ｘ線、高レベルのある種の物質（例えば、カルシウム）に関する血液検査、ＣＴスキャン、および腫瘍生検が挙げられるが、これらに限定されない。肺がんの家族歴、または肺がんのリスク因子への曝露（例えば、喫煙または煙および／もしくは空気汚染への曝露）はまた、被験体が肺がんを有するようであるか否かを決定するか、または肺がんの診断を行うことを補助し得る。
【０１２４】
がんとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：癌腫（腺がん、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、白血病、扁平細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化管がん、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、膠芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、脳のがん（膠芽腫および髄芽腫が挙げられる）が挙げられる）；乳がん、子宮頚がん、絨毛がん；結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、子宮内膜がん；食道がん、胃がん；種々のタイプの頭頚部がん、上皮内新生物（ボーエン病およびパジェット病が挙げられる）；血液新生物（急性リンパ性白血病および骨髄性白血病が挙げられる）；カポジ肉腫、ヘアリーセル白血病；慢性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、リンパ腫（ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫が挙げられる）；肝臓がん（例えば、肝臓癌腫および肝細胞がん）、メル血細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫；神経芽腫；口腔がん（扁平上皮がんが挙げられる）；卵巣がん（上皮細胞に由来するものが挙げられる）、肉腫（平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫（ｆｉｂＲＯＳ１ａｒｃｏｍａ）、および骨肉腫が挙げられる）；膵臓がん；皮膚がん（黒色腫、間質細胞、胚細胞および間葉系細胞が挙げられる）；前立腺がん（ｐＲＯＳ１ｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん；外陰部がん（ｖｕｌｖａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腎がん（腺癌を含む）；精巣がん（胚細胞腫瘍（例えば、精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛がん）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍が挙げられる）；甲状腺がん（甲状腺腺がんおよび髄様がんを含む）；食道がん、唾液腺がん、およびウィルムス腫瘍。いくつかの実施形態において、そのがんは、肺がんであり得る。
【０１２５】
多重方法
本明細書で記載される方法は、多重形式で使用され得る。本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、１つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定することを含み得る。本明細書で使用される場合、「多重増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、１つまたはこれより多くの反応容器において１より多くの標的核酸の同時増幅を包含するプロセスをいう。いくつかの実施形態において、方法は、プライマーの１つまたはこれより多くのセットを使用して、多重増幅生成物の配列のその後の決定を包含する。多重とは、約２〜１，０００個の間の異なる標的配列を１つの反応において検出することを指し得る。本明細書で使用される場合、多重とは、２〜１，０００の間の任意の範囲、例えば、５〜５００個、２５〜１，０００個、または１０〜１００個などの間の異なる標的配列を１つの反応において検出することに言及する。ＰＣＲに当てはまる場合の用語「多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」とは、同じＰＣＲ反応において少なくとも２個の異なる標的配列に特異的なプライマーが存在することを示唆する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、サンプル中の標的核酸、またはサンプルの別個の部分は、複数のプライマー（例えば、複数の第１のおよび第２の標的特異的プライマー）で増幅され得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、複数の第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、１つの反応混合物中に存在し得る。例えば、多数の増幅生成物は、同じ反応混合物中で生成され得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、第１のおよび第２の標的特異的プライマーの複数のセット）は、別個の遺伝子によって含まれる既知の標的配列に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、既知の標的配列の異なる部分に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、１つの遺伝子によって含まれる既知の標的配列の異なる部分に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、既知の標的配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、第１の標的特異的プライマー）は、同一の５’タグ配列部分を含み得る。
【０１２７】
本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、１つのシーケンシング反応またはシーケンシング実行において多数のサンプル中の１つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、多数のサンプルは、異なる起源のもの、例えば、異なる組織および／または異なる被験体に由来するものであり得る。このような実施形態において、プライマー（例えば、テール付加ランダムプライマー）は、バーコード部分をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、特有のバーコード部分を有するプライマー（例えば、テール付加ランダムプライマー）は、各サンプルに添加され得、その中の核酸にライゲーションされ得る；そのサンプルはその後、プールされ得る。このような実施形態において、増幅生成物の各得られたシーケンシングリードは、増幅生成物が由来するテンプレート核酸を含むサンプルを同定するバーコードを含む。
【０１２８】
分子バーコード
いくつかの実施形態において、プライマーは、識別子配列（例えば、バーコード、インデックス）、シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション配列（例えば、Ｒｄ１）、およびアダプター配列のようなさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、次世代シーケンシングシステムとともに使用される配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースのシーケンシング技術のためのＰ５およびＰ７配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング技術と適合性のＰ１およびＡである。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用される場合、「分子バーコード（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｒｃｏｄｅ）」、「分子バーコードタグ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｒｃｏｄｅ  ｔａｇ）」および「インデックス（ｉｎｄｅｘ）」は、交換可能に使用され得、そして一般に、識別子（例えば、その核酸の供給源識別子、位置識別子、日付もしくは時間識別子（例えば、サンプリングまたは処理の日付もしくは時間）、または他の識別子のような）として有用である核酸のヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、このような分子バーコードまたはインデックス配列は、核酸の集団に存在する核酸の異なる局面を同定するために有用である。いくつかの実施形態において、分子バーコードまたはインデックス配列は、標的核酸の供給源または位置識別子を提供し得る。例えば、分子バーコードまたはインデックス配列は、核酸が得られる患者を同定するように働き得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードまたはインデックス配列は、１つの反応（例えば、１つのフローセルで行われる）での多数の異なるサンプルのシーケンシングを可能にする。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、個々のシーケンシング反応を検出する目的で配列イメージャーを配向するために使用され得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードまたはインデックス配列は、長さが２〜２５ヌクレオチド、長さが２〜１５ヌクレオチド、長さが２〜１０ヌクレオチド、長さが２〜６ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、バーコードまたはインデックスは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーの集団が、本明細書で記載される方法に従って使用される場合、多数の区別可能な増幅生成物は、増幅後に存在し得る。いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーは、サンプルの核酸分子全体を通じて種々の位置においてハイブリダイズするので、標的特異的プライマーのセットは、１回より多くのハイブリダイゼーション事象によって作られる伸長生成物をハイブリダイズ（および増幅）し得る。例えば、１つのテール付加ランダムプライマーは、標的特異的プライマーハイブリダイゼーション部位から第１の距離（例えば、１００ヌクレオチド）においてハイブリダイズし得、別のテール付加ランダムプライマーは、標的特異的プライマーハイブリダイゼーション部位から第２の距離（例えば、２００ヌクレオチド）においてハイブリダイズし得、それによって、２つの増幅生成物（例えば、約１００ｂｐを含む第１の増幅生成物および約２００ｂｐを含む第２の増幅生成物）を生じ得る。いくつかの実施形態において、これらの多数の増幅生成物は各々、次世代シーケンシング技術を使用してシーケンシングされ得る。いくつかの実施形態において、これらの多数の増幅生成物のシーケンシングは、増幅またはシーケンシングプロセスの間に導入される配列エラーを検出するために互いと比較され得る多数の重なり合う配列リードを提供することから有利である。いくつかの実施形態において、個々の増幅生成物が整列され得、それらが特定の塩基において存在する配列の中で異なる場合、ＰＣＲおよび／またはシーケンシングのアーチファクトまたはエラーが存在し得る。
【０１３１】
コンピューターおよび制御装置
本明細書で提供されるシステムは、いくつかの構成要素（センサー、環境制御システム（例えば、ヒーター、ファン）、ロボット（例えば、ＸＹポジショナー）などが挙げられる）を含み、これらは、コンピューター、プロセッサー、マイクロコントローラーまたは他のコントローラーの指示で一緒に作動し得る。その構成要素としては、例えば、ＸＹポジショナー、液体取り扱いデバイス、微小流体ポンプ、リニアアクチュエーター、バルブドライバー、ドア作動システム、光学アセンブリ、バーコードスキャナー、画像化または検出デバイス、タッチスクリーンインターフェイスなどが挙げられ得る。
【０１３２】
いくつかの場合には、作動（例えば、中で提供されるかまたはともにインターフェイス接続するシステムおよび／または構成要素の作動制御）は、ハードウェア、ソフトウェアまたはこれらの組み合わせを使用して実行され得る。ソフトウェアで実行される場合、ソフトウェアコードは、単一の構成要素において提供されようと、多数の構成要素の中で割り振られようと、任意の適切なプロセッサーまたはプロセッサーの集まり上で実行され得る。このようなプロセッサーは、集積回路として、集積回路構成要素の中の１つまたはこれより多くのプロセッサーで実行され得る。プロセッサーは、任意の適切な形式で回路を使用して実行され得る。
【０１３３】
コンピューターは、多くの形態のうちのいずれか（例えば、ラックマウント式コンピューター、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、またはタブレットコンピューター）において具現化され得る。さらに、コンピューターは、コンピューターとしては概して見做されないが、適切な処理能力を有するデバイス（パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、スマートフォンまたは任意の他の適切なポータブル、モバイルまたは固定の電子デバイス（システム自体を含む）が挙げられる）の中に埋め込まれ得る。
【０１３４】
いくつかの場合には、コンピューターは、１つまたはこれより多くの入力および出力デバイスを有し得る。これらのデバイスは、とりわけ、ユーザーインターフェイスを提示するために使用され得る。ユーザーインターフェイスを提供するために使用され得る出力デバイスの例としては、出力の視覚的提示のためのプリンターまたはディスプレイスクリーン、および出力の可聴式提示のためのスピーカーまたは他の音声生成デバイスが挙げられる。ユーザーインターフェイスのために使用され得る入力デバイスの例としては、キーボード、およびポインティングデバイス（例えば、マウス、タッチパッド、およびディジタイザータブレット（ｄｉｇｉｔｉｚｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ））が挙げられる。他の例では、コンピューターは、音声認識を通じて、または他の可聴式形式において、視覚的なジェスチャーを通じて、触覚入力（例えば、振動、触知できるおよび／または他の力を含む）を通じて、またはこれらの任意の組み合わせを通じて、入力情報を受容し得る。
【０１３５】
１つまたはこれより多くのコンピューターは、任意の適切な形式で１つまたはこれより多くのネットワーク（ローカルエリアネットワークまたはワイドエリアネットワーク（例えば、エンタープライズネットワークまたはインターネット）として含まれる）によって相互接続され得る。このようなネットワークは、任意の適切な技術に基づき得、任意の適切なプロトコルに従って作動し得、そして無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバーネットワークを含み得る。
【０１３６】
本明細書で概説される種々の方法またはプロセスは、種々のオペレーティングシステムまたはプラットフォームのうちのいずれか１つを使用する１つまたはこれより多くのプロセッサー上で実行可能なソフトウェアとしてコードされ得る。このようなソフトウェアは、多くの適切なプログラミング言語および／またはプログラミングもしくはスクリプトツールのうちのいずれかを使用して書かれ得、機械言語コードまたはフレームワークもしくは仮想マシン上で実行される実行可能な中間コードとしてコンパイルされ得る。
【０１３７】
本明細書で提供される方法またはプロセスを制御するための１つまたはこれより多くのアルゴリズムは、１つまたはこれより多くのコンピューターまたは他のプロセッサー上で実行される場合に、本明細書で記載される種々の方法またはプロセスを実行する方法を行う１つまたはこれより多くのプログラムでコードされる読み取り可能な記憶媒体（または多数の読み取り可能な媒体）（例えば、コンピューターメモリ、１つまたはこれより多くのフロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、光学ディスク、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、磁気テープ、フラッシュメモリ、フィールドプログラマブルゲートアレイにある回路構成もしくは他の半導体デバイス、または他の触知可能な記憶媒体）として具現化され得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、コンピューター読み取り可能な記憶媒体は、一過性でない形態でコンピューター実行可能な指示を提供するために十分な時間にわたって情報を保持し得る。このようなコンピューター読み取り可能な記憶媒体は、その中に記憶されたプログラムが本明細書で記載される方法またはプロセスの種々の局面を実行するために、１つまたはこれより多くの異なるコンピューターまたは他のプロセッサー上にロードされ得るように可搬性であり得る。本明細書で使用される場合、用語「コンピューター読み取り可能な記憶媒体（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｒｅａｄａｂｌｅ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」は、製造品（例えば、製造物品）または機械であると考えられ得るコンピューター読み取り可能な媒体のみを包含する。代わりにまたはさらに、本明細書で記載される方法またはプロセスは、コンピューター読み取り可能な記憶媒体以外のコンピューター読み取り可能な媒体（例えば、伝播シグナル）として具現化され得る。
【０１３９】
用語「プログラム（ｐｒｏｇｒａｍ）」または「ソフトウェア（ｓｏｆｔｗａｒｅ）」とは、コンピューターまたは他のプロセッサーをプログラムして、本明細書で記載される方法またはプロセスの種々の局面を実行するために使用され得る実行可能なコードまたは指示のセットのいずれかのタイプを指すために、包括的な意味において本明細書で使用される。さらに、この実施形態の一局面によれば、実行される場合に、本明細書で記載される方法またはプロセスを行う１つまたはこれより多くのプログラムは、１つのコンピューターまたはプロセッサー上にある必要はないが、種々の手順または作動を実行するために、多くの異なるコンピューターまたはプロセッサーの中で、モジュラー様式で割り振られていてもよいことは、認識されるべきである。
【０１４０】
実行可能な指示は、１つまたはこれより多くのコンピューターまたは他のデバイスによって実行される多くの形態（例えば、プログラムモジュール）で存在し得る。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを行うかまたは特定の抽象データ型を実行する、ルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。代表的には、そのプログラムモジュールの機能性は、種々の実施形態において望ましい場合、組み合わされ得るかまたは割り振られ得る。
【０１４１】
また、データ構造は、任意の適切な形態でコンピューター読み取り可能な媒体に記憶され得る。データ記憶の非限定的な例としては、構造化、非構造化、ローカライズされた、割り振られた、短期間および／または長期間の記憶が挙げられる。データを伝達するために使用され得るプロトコルの非限定的な例としては、所有権によって保護されたおよび／または業界標準プロトコル（例えば、ＨＴＴＰ、ＨＴＭＬ、ＸＭＬ、ＪＳＯＮ、ＳＱＬ、ウェブサービス、テキスト、スプレッドシートなど、またはこれらの任意の組み合わせ）が挙げられる。例証を単純化するために、データ構造は、そのデータ構造における位置を通じて関連するフィールドを有することが示され得る。このような関連性は、そのフィールドに関する記憶を、そのフィールド間の関連性を伝えるコンピューター読み取り可能な媒体における位置とともに割り当てることによって、同様に達成され得る。しかし、任意の適切な機構は、データ構造のフィールドにおける情報間の関係性を確立するために使用され得る（ポインター、タグ、またはデータ要素間の関係性を確立する他の機構の使用を通じるものを含む）。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、そのシステムの作動に関する情報（例えば、温度、画像化または光学的情報）、蛍光シグナル、構成要素の位置（例えば、加熱されたふたの位置、ロータリーバルブの位置）、液体取り扱い状態、バーコード状態、ベイアクセスドアの位置、またはこれらの任意の組み合わせ）は、そのシステムと関連した（例えば、そのシステム内に位置した）１つまたはこれより多くのセンサーまたはリーダーから得られ得、プロセス（例えば、自動化ライブラリー調製プロセス）の間の状態についての情報を提供するためにコンピューター読み取り可能な媒体の中に記憶され得る。いくつかの実施形態において、その読み取り可能な媒体は、データベースを含む。いくつかの実施形態において、上記データベースは、１つのシステムから（例えば、１つまたはこれより多くのベイから）のデータを含む。いくつかの実施形態において、上記データベースは、複数のシステムからのデータを含む。いくつかの実施形態において、データは、これを改竄防止にする様式で記憶される。いくつかの実施形態において、そのシステムによって生成される全てのデータは、記憶される。いくつかの実施形態において、データの部分セットが記憶される。
【実施例】
【０１４３】
以下の実施例は、本発明のある種の局面を含め、本明細書で記載されるある種の実施形態を例証することが意図されるが、本発明の全範囲を例示するのではない。
【０１４４】
実施例１：核酸調製のためのシステム
例示的なシステム６００が、図６に示される。この非限定的な実施形態において、そのシステムは、２つのカートリッジベイ６１０を含む。この特定の実施形態の作動は、電源スイッチ６０１を使用して開始または終了され得る。作動する間に、電子モジュール６２２は、そのシステム内の１つまたはこれより多くの要素または構成要素を制御する（例えば、駆動する）ことを担い得る。また、作動する間に、それは、そのシステムの温度調節の１つまたはこれより多くの形態を提供するために有用であり得る。例えば、この例示的なシステムは、ファンアセンブリ６２０を含む。
【０１４５】
図６における例示的なシステムの上面図は、図７に示される。例示的なシステム７００は、光学モジュール７２６がいずれかのカートリッジベイの容器の中で起こっている反応をモニターすることを可能にする非限定的な自動化ポジショナーを示す。その自動化ポジショナーは、第１の軌道７２３を利用することによって第１の軸に沿って、および第２の軌道７２５を利用することによって第２の軸に沿って、その光学モジュールを移動させる。一旦反応容器の上に適切に位置づけられると、その光学モジュールからのその容器への光路は、加熱されたふた７２８における複数の孔７３０によって提供される。
【０１４６】
図８Ａに示されるように、例示的なシステム８００の正面透視図は、非限定的なフレームアセンブリ内の自動化ポジショナーに取り付けられる光学モジュール８２６を示す。示されるように、第１の軸に沿った移動を可能にする第１の軌道８２３は、取り付け点８２１において、第２の軸に沿った移動を可能にする第２の軌道８２５と繋げられる。図８Ｂに示される分離図は、例示的なバーコードスキャナー８２７を含む場合の光学モジュールを示す。
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を行うならびに／または結果および／もしくは本明細書で記載される利点のうちの１つもしくはこれより多くを得るための、種々の他の手段および／または指示を容易に想定し得、このようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本発明の範囲内にあると見做される。より一般には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、物質、および構成が、例示的であることが意味され、その実際のパラメーター、寸法、物質、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書で記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。従って、前述の実施形態が例示によって提示されるに過ぎず、そして添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本発明が具体的に記載されかつ請求項に記載されるとおりのもの以外の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本発明は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法に関する。さらに、２つまたはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法が相互に矛盾しなければ、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４８】
不定冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、そうでないことが明確に示されなければ、「少なくとも１」を意味することが理解されるべきである。
【０１４９】
語句「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、そのように結合された要素のうちの「いずれかまたは両方（ｅｉｔｈｅｒ  ｏｒ  ｂｏｔｈ）」、すなわち、いくつかの場合には結合的に存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味することが理解されるべきである。他の要素は、必要に応じて、そうでないことが明確に示されなければ、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、その「および／または」節によって具体的に識別される要素以外に存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような制約のない文言とともに使用される場合、一実施形態において、ＢなしのＡ（必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態において、ＡなしのＢ（必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態においてＡおよびＢの両方（必要に応じて、他の要素を含む）；などに言及し得る。
【０１５０】
本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストの中で項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、多くの要素または要素のリストのうちの少なくとも１（しかし１より多くを含む）、そして必要に応じて、さらなる列挙されない項目をも包含すると解釈されるものとする。そうでないことが明確に示される用語のみ、例えば、「のうちの１のみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」もしくは「のうちの正確に１（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または請求項において使用される場合に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、多くの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指す。一般に、用語「または」は、本明細書で使用される場合、排他的な用語（例えば、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「のうちの１（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「のうちの１のみ」、または「のうちの正確に１」が先行する時に排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない（ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」を示すと解釈されるに過ぎないものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野で使用されるとおりのその通常の意味を有するものとする。
【０１５１】
本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、１つまたはこれより多くの要素のリストへの言及において語句「少なくとも１（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）とは、要素のリスト中にある要素のうちのいずれか１つまたはこれより多くから選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素およびあらゆる要素のうちの少なくとも１を必ずしも含むわけではなく、要素のリスト中にある要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、要素のリスト（これに対して文言「少なくとも１」が言及する）内で具体的に識別される要素以外の要素が必要に応じて存在し得ることを可能にする。従って、非限定的な例としては、「ＡおよびＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」（または、等しくは、「ＡまたはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」、または、等しくは、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ）」は、一実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）ＡであってＢは存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）に；別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ｂであって、Ａは存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ａ、および少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ｂ（および必要に応じて、他の要素を含む）；などに言及し得る。
【０１５２】
請求項において、上記の明細書においても同様に、全ての移行句（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」などは、制約がないこと、すなわち、が挙げられるが、これらに限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみが、米国特許審査基準２１１１．０３節に示されるように、それぞれ、制約のあるまたは半制約の移行句であるものとする。
【０１５３】
例えば、１つもしくはこれより多くの物品、構造、力、フィールド、流れ、方向／軌跡、および／もしくはこれらの部分構成要素および／もしくはこれらの組み合わせならびに／またはこのような用語による特徴付けに従う上記で列挙されない任意の他の触知可能なまたは触知不能な要素のあるいはこれらの間の形状、配向、アラインメント、および／または幾何的関係性に関して本明細書で使用される場合の任意の用語は、別段定義されるかまたは示されることがなければ、このような用語の数理的定義への絶対的適合を要しないと理解されるものとするが、むしろ、このような主題に最も近く関連する当業者によって理解されるように特徴づけられるような主題に関して考えられる程度まで、このような用語の数理的定義への適合を示すと理解されるものとする。形状、配向、および／または幾何的関連性に関するこのような用語の例としては、以下を記載する用語が挙げられるが、これらに限定されない：形状（例えば、丸い、四角の、環状の／環、矩形の／矩形、三角形の／三角形、円筒状の／円筒、楕円状の／楕円、（ｎ）角形の／（ｎ）角形など）；角度配向（例えば、垂直の、直交の、平行の、鉛直の、水平の、共線の、など）；輪郭および／または軌跡（例えば、平面／平面状、同一平面上、半球状（ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、半球状（ｓｅｍｉ−ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、直線／直線状、双曲線の、放物線の、平らな、弯曲した、まっすぐな、弓状の、正弦波の、接線／接線のなど）；方向（例えば、北、南、東、西など）；表面および／またはバルク物質特性および／または空間／時間分解および／または分布（例えば、滑らかな、反射性の、透明な、透き通った、不透明な、剛性の、不浸透性の、均一な（に）、不活性な、非湿潤性の（ｎｏｎ−ｗｅｔｔａｂｌｅ）、不溶性の、固定した、不変の、一定の、均質な、など）；ならびに関連分野の当業者に明らかな多くの他のもの。一例として、「四角」であると本明細書で記載される製作された物品は、このような物品が、完全に平面のまたは直線状でありかつ正確に９０度の角度で横断する面または側面を有することは要求されない（実際に、このような物品は、数理的抽象化として存在し得るに過ぎない）が、むしろ、このような物品の形状は、「四角の」（数理的に定義されるとおり）を、代表的には、当業者によって理解されるかまたは具体的に記載されるとおりの記載される製作技術のために達成可能でありかつ達成される程度に近いと解釈されるべきである。別の例として、「整列され（ａｌｉｇｎｅｄ）」る本明細書で記載される２つまたはこれより多くの製作された物品は、このような物品が完璧に整列される面または側面を有することは要求されない（実際に、このような物品は、数理的抽象化として存在し得るに過ぎない）が、むしろ、このような物品の配置は、「整列される」（数理的に定義されるとおり）を、代表的には、当業者によって理解されるかまたは具体的に記載されるとおりの記載される製作技術のために達成可能でありかつ達成される程度に近いと解釈されるべきである。
【図１】
2019528750.tif 000003
【図２Ａ】
2019528750.tif 000004
【図２Ｂ】
2019528750.tif 000005
【図３】
2019528750.tif 000006
【図４Ａ】
2019528750.tif 000007
【図４Ｂ】
2019528750.tif 000008
【図５】
2019528750.tif 000009
【図６】
2019528750.tif 000010
【図７】
2019528750.tif 000011
【図８Ａ】
2019528750.tif 000012
【図８Ｂ】
2019528750.tif 000013
【国際調査報告】
2019528750.tif 000014
2019528750.tif 000015