(57)【要約】  本明細書は、神経細胞の損失予防及び再生用組成物に関し、より詳しくは、テロメラーゼに由来のペプチドを含めて、知られている神経細胞の損失及び再生不能による疾患に効果的な神経細胞の損失予防及び再生用組成物に関する。本発明によるペプチドは、アルツハイマー性疾患を含む神経細胞の損傷及び再生不能による疾患に対して、予防及び治療効果を示し、神経細胞の損傷及び再生不能による疾患に、新しい治療方法を提供できる。【選択図】図６３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、該アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドおよびそれらのフラグメントからなる群より選ばれる一つ以上を薬学的に有効な量で含む、神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項２】
前記フラグメントは、３個以上のアミノ酸からなるフラグメントペプチドを含む、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項３】
前記組成物は、神経細胞の損失及び再生不能による疾患の予防、治療、軽減、及び改善用であるか、又は、前記疾患による後遺症の予防、治療、軽減、及び改善用である、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項４】
前記神経細胞の損失及び再生不能による疾患は、脳血管疾患、又は、退行性神経系疾患である、請求項３に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項５】
前記脳血管疾患は、虚血性脳血管疾患、又は、出血性脳血管疾患である、請求項４に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項６】
前記退行性神経系疾患は、脳疾患、脊髄損傷、末梢神経損傷、末梢神経疾患、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、痴呆、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー性疾患、脊髄小脳変性症、及び多発性神経病症のうちいずれか一つである、請求項４に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項７】
前記組成物は、一つ以上の神経系疾患治療剤と併用される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項８】
前記アルツハイマー性疾患は、痴呆、認知障害、記憶力の低下のうちいずれか一つ以上を示す、請求項６に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項９】
前記アルツハイマー性疾患は、初期、進行性、又は重症アルツハイマー性疾患である、請求項６に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１０】
薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１１】
薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは０．０１〜２００ｍｇ投与される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１２】
薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは、１週間〜４週間ごとに１回、合計４回以上投与される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１３】
薬学的有効成分として配列番号１のペプチドを含む前記組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内、皮内、又は皮下に投与される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１４】
薬学的に有効な量の請求項１から１３のうちいずれか一項に記載の組成物を、これを必要とする個体に投与する工程を含む、神経細胞の損失予防及び再生方法。
【請求項１５】
請求項１から１３のうちいずれか一項に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物、及び、
薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドを０．０１〜２００ｍｇ、１週間〜４週間ごとに１回、これを必要とする個体に投与することを指示する指示書
を含む、神経細胞の損失予防及び再生用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の再生及び損失予防に効果的なペプチド及びこれを含む組成物に関し、より詳しくは、テロメラーゼに由来のペプチドを含み、神経細胞の再生及び損失予防の効果を示し、神経細胞の損失による疾病の予防及び治療に効果的な脳血管疾患、又は、退行性神経系疾患の予防及び治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、神経幹細胞 (neural stem cell)が分化することで、生み出される多様な種類の細胞である。神経幹細胞は、神経細胞（neuron）、神経膠細胞（glia）、アストロサイト（astrocyte）、オリゴデンドロサイト（oligodendrocyte）などで、多様に分化することで、神経系（nervous system）を構成する。
【０００３】
神経幹細胞が神経細胞へ分化する際に、各分化段階を示すマーカーが存在し、この段階には、増殖、分化、移動、標的化、シナプス生成が含まれる。ＤＣＸ（doublecortin）は、神経前駆体で発現されるタンパク質であって、未成熟の神経細胞を示し、ＴｕＪ１(neuron-specific class IIIβ Tubulin）は、盛んに分裂中の神経細胞前駆体、又は、新しく生成された未成熟の後分裂期の神経細胞で発現され，盛んに分裂中の神経細胞を示し、ＮｅｕＮ（neuronal nuclear antigen）は、分裂の後期で発現される核タンパク質であり、成熟の神経細胞を示す。これらのマーカーの発現量によって、神経細胞の分化及び増殖の可否、及び正常の増殖となっているか否かが分かる。
【０００４】
神経細胞の損傷は、様々な症状を招き、脳神経細胞が損傷される際、認知障害、視力減退などに繋がり得る。神経細胞の損傷を示すマーカーのうち、ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）は、アストロサイトを含んだ中枢神経系で発現されるタンパク質で、アストロサイトの細胞骨格を形成する機能を有する。このタンパク質の異常発現は、神経膠症（gliosis）を誘導し、認知能力の障害を招来する。また、ＧａｌＣ（galactosylceramidase）は、ガラクトース (galactose）を除去する酵素であり、オリゴデンドロサイトのマーカーとして、神経幹細胞が、オリゴデンドロサイトへ分化されたことを示す。これらのマーカーを介して、神経幹細胞が損傷されているか否かと、オリゴデンドロサイトの再生が行っているかが分かる。
【０００５】
神経機能に異常を招くことを、神経系疾患というが、これには、脳卒中、脳腫瘍、パーキンソン病、癲癇、片頭痛、睡眠障害、痴呆などが該当する。
【０００６】
神経系疾患のうち、脳卒中（stroke）は、 脳血管の病的な変化により、脳の異常が招かれる脳血管疾患（cerebrovascular disease）で、塞栓症（embolism）又は血栓症(thrombosis）による血管内腔の閉塞、血管の破裂などが起こられる。このような脳卒中は、脳血管が詰まったり、破れたりして発生する病で、脳梗塞と、脳出血との二つの類型に分かれる。脳梗塞は、虚血性脳血管疾患と呼ばれ、脳血管が詰まったりすることで、脳への血液や酸素の供給が順調でないため、脳細胞の死滅により発生する疾患である。一方、脳出血は、出血性脳血管疾患と呼ばれ、脳血管が破れることで、出血し、血液が溜まって、脳損傷が生じることである。前記脳梗塞と脳出血とは、脳の機能を喪失させ、これにより、半身麻痺、言語障害及び意識障害などが現れ、酷い場合、死に至る。
【０００７】
前記虚血性脳血管の疾患は、脳の血流が減少することにより、脳細胞への酸素やグルコースの供給が絶たれることで、海馬ＣＡ１領域で遅発性神経細胞死（delayed neuronal
death）が誘発されて発生する疾患である（Kirino, Brain Res., 239, p57-69, 1982）。また、虚血性脳疾患は、血栓症（thrombosis）、塞栓症（embolism）、一過性脳虚血発作 (transient ischemic attack）、及び小梗塞（lacunar infarction）などに細分される。
【０００８】
脳卒中のような虚血損傷の分子生物学的メカニズムは、脳質実の特定の部位に、血液の供給が遮断されると、酸素やグルコースの供給中断により、細胞膜内のイオンチャンネルを維持するために十分のＡＴＰの供給が不可能となり、ＮＤＭＡ（N-methyl-D-aspartic acid）受容体、ＡＭＰＡ（a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propinoic acid）及び代謝型グルタミン酸受容体（metabotropic glutamate receptor）の連続的な活性の誘導を通じたカルシウムイオンの細胞内への流入が増加する（Science, 244, p1360-1362, 1989）。カルシウムの細胞内への流入は、グルタミン酸及びアスパラギン酸の過度な放出により、フリーラジカルを含む細胞毒性分子が生成されて、ＤＮＡ及び細胞膜などの細胞構造物を破壊することにより、神経細胞の死を促すと知られている。
【０００９】
虚血性脳卒中は、単一の疾患としては、死亡原因の一位でありながら、治療に莫大な社会経済的費用を要する。脳卒中は、老人における発病率の高い疾患であるが、最近、３０〜４０代の脳卒中の発病率が、全脳卒中患者の１／４を占める程度で、発病年齢が若い世代にまで広がっている。しかし、現在まで、 脳卒中により引き起こされる神経細胞の損傷の防止に確実な効果を示す薬物は、開発されていない。殆どの患者達には、明確な治療がないので、保存的な治療と、二次予防のための治療に注力しているものの、深刻な後遺症をもたらすことになる。したがって、新しい治療法の開発を通じて、脳卒中による脳神経細胞の死滅を最小化することにより、その後遺症を減らそうとする研究が進んでいる。現在まで、脳卒中から神経細胞を保護するための目的として開発された薬物は、脳卒中により誘発されるアポトーシスの経路のうち、特定の部位のみを遮断して、効果を得ようとした。しかし、脳卒中による神経細胞の死滅は、様々な経路を通じて実施されるため、それほど効果的ではなかった。最近、虚血性脳卒中の正確な病理メカニズムを明らかにし、これに関与する多くの因子を調節することで、脳神経細胞の死滅を最小化しようとするターゲット治療法への研究が進んでいる。
【００１０】
本発明においては、テロメラーゼに由来のペプチドとして、抗がん、抗炎効果を有していると知られているＰＥＰ１の虚血性脳卒中のイン・ビトロ（in vitro）モデルである脱酸素・脱グルコース(Oxygen Glucose Deprivation、OGD）による神経細胞の死滅を抑制する効果を確認した。ＰＥＰ１は、様々な疾病をターゲットにした多数の臨床実験において、毒性実験を完了し、副作用に対する安定性を確認したところである。現在まで、虚血性脳卒中の治療剤として提示されている多様な薬物は、治療対象や発生時点に非常に限界的であり、出血症の副作用があるが、ＰＥＰ１は、予期しなかった驚くべき神経保護効果を示した。
【００１１】
神経系疾患の中で、環境、遺伝などの要因によって、脳や末梢の神経細胞が、退化、減少、細胞死するか、又は障害を受けるか、除外されることにより、発病する退行性神経系疾患には、痴呆、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、多発性神経病症、脊髄損傷、脳血管障害などがある。このような神経系疾患の治療には、神経細胞の障害により消失された神経伝達物質を補うか、神経細胞を再生することが、治療の核心である。
【００１２】
痴呆とは、脳細胞の損傷と、損傷に伴った脳細胞の減少が生じる脳疾患を有する人達において、一般に見付けられる認知機能の漸進的減少のような一連の症候群を意味する。脳細胞の減少は、老化の一過程であるが、痴呆を引き起こす疾患は、より速い脳細胞の減少を引き起こし、非正常的な脳機能を招く。２０１２年、痴呆有病率の調査結果によると、６５才以上の老人における痴呆有病率は、９．１８％であった。迅速な高齢化に伴い、痴呆有病率は、引き続き上昇しており、２０１２年の約５４万人から、２０３０年度には約１２７万人、２０５０年度には約２７１万人で、２０年毎に約２倍ずつ増えると見込んでいる。痴呆の主な原因としては、アルツハイマー性痴呆が占めている割合が、過半数を超えていると推定される。アルツハイマー性疾患に次いで，痴呆の２番目の原因としては、血管性痴呆を含んだ血管性認知障害（vascular cognitive impairment）である。
【００１３】
アルツハイマーは、最近、患者数が急増している傾向であり、患者や患者の家族に、多くの苦痛を与えることで、社会的問題となっている。
【００１４】
アルツハイマーは、大脳皮質の神経細胞の消失及び非正常的なタンパク質の浸潤などを特徴とし、大脳皮質（頭頂葉、側頭葉）の萎縮を招く退行性脳疾患であって、痴呆の最も一般的な原因の一つである。病因がまだ明らかになっていないが、病理学的には、非正常的なアミロイドタンパク質と、死滅された神経細胞及び炎症細胞から構成されたβ−アミロイド斑（βamyloid plaque）が、神経細胞の外部に浸潤し、神経細胞の内部には、タウ （tau）の過剰なリン酸化したタンパク質からなる神経原繊維変化（neurofibrillary tangle、ＮＦＴ）の濃縮を特徴とする。
【００１５】
アルツハイマー性疾患（ＡＤ）で現れる神経退行は、初期には、シナプス毒性及び好中球の減少、神経伝達物質の異常、細胞外βーアミロイド（Aβ）の蓄積(アミロイド/老人性斑）及び細胞内の神経原線維（neurofibril）変化（NFTs）、神経膠症（gliosis）が出現し、後期には、顕著な神経損失と、これと関連した脳の萎縮（atrophy）が出現する。初期段階には、嗅内皮質（entorhinal cortex）及び海馬（hippocampus）への影響に限られ、認知及び記憶力の損傷が現れる。ＡＤが進行されるにつれ、海馬の８０％までの神経が死滅し、ＡＤ症状が進行されながら、認知障害と日常の生活における障害が発生し、全般的な臨床印象指数（clinical globalimpression score）が悪化される。
【００１６】
アルツハイマーは、病因によって、遺伝性（familial）アルツハイマー疾患（ＡＤ）と、散発性ＡＤとに区分される。遺伝性ＡＤは、１％〜５％程度を占めると知られている。殆どのアルツハイマー疾患（ＡＤ）は、常染色体遺伝性を示さず、散発性ＡＤでは、環境的及び遺伝的要因が、危険因子として作用すると考えられる。遺伝性ＡＤにおいて、常染色体優性家族早期発現（autosomal dominal familial  early-onset）アルツハイマー疾患の患者において、以下の４つの遺伝子における突然変異と、アルツハイマー発病との関連性が提示されてきた：アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン（presenilin）１（ＰＳ１）、プレセニリン２（ＰＳ２）及びアポリポ蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）、ＡＰＰ及びＰＳタンパク質における突然変異は、Ａβペプチドの生成を増加させ、具体的には、老人性斑（senile plaque）の主要成分であるアミロイド生成の形態Ａβ４２の生成を増やすことができる。
【００１７】
いままで、アルツハイマー疾患の発病メカニズムと、原因とについては、明らかになっていないが、遺伝子突然変異の他に、その他の発病メカニズムとしは、神経伝達物質のレベルの減少や増加による神経伝達物質仮説（neurotransmitter hypothesis）、βアミロイド沈殿による神経損傷仮設（amyloid hypothesis）、タウの過リン酸化による神経損傷仮設（tau hypothesis）などが提示されてきた。
【００１８】
アルツハイマー発病メカニズムのうち、神経伝達物質仮説は、二種類の神経伝達物質が、アルツハイマー疾患と関連していると考えられる：アセチルコリン及びグルタミン酸。アセチルコリン（Ａｃｈ）は、筋肉を活性化させ、興奮、短期記憶能及び学習を助ける。ＡＤ患者は、低いレベルのＡｃｈを示す。グルタミン酸は、脳で最もありふれた神経伝達物質として、学習及び記憶能に関わる。ＡＤ患者の脳細胞が死滅しながら、過量のグルタミン酸を放出する。過量のグルタミン酸は、健康の脳細胞を過度に刺激して、興奮毒性（excitotoxicity）と知られた現象を示すことにより、神経細胞が損傷されるか、又は死滅するようにするので、有害な影響を与える。アルツハイマーの治療法として、ドネペジル（donepezil、商品名：Aricept）、リバスチグミン（rivastigmine、商品名：Exelon）、ガランタミン（galantamine、商品名：Razadyne）、及び、メマンチン（memantine、 商品名：Namenda）のようなコリン性神経系調節薬物は、低下されたシグナル伝達機能を改善するメカニズムを有し、グルタミン酸神経伝達物質は、神経細胞の損傷を抑制するＮＭＤＡ受容体拮抗体メカニズムを有するメマンチンが主に用いられる。しかし、これらの薬物は、単に症状を改善する程度の効能を保有している。
【００１９】
現在まで、アルツハイマー疾患を、根本的に治療できる薬物はない。現在、市販中の薬物は、症状を緩和させ、進行を遅延する作用効果を有する。アルツハイマー病に対する既存の治療剤として用いられるのは、神経伝達物質の調節を通じて、薬効を示すもので、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン及びメマンチンがある。ドネペジル、リバスチグミン及びガランタミンは、脳のアセチルコリンの濃度を高めるアセチルコリンエステラーゼ（acetylcholine esterase）抑制剤系の薬物である。前記薬物は、アセチルコリンの分解に関わるアセチルコリンエステラーゼを抑制する機能を有し、アルツハイマー病患者の認知機能を改善する大衆的治療剤である。しかし、コリン分解酵素抑制剤の共通の副作用としては、アセチルコリンの増加によるムカツキ、嘔吐、下痢、食欲減退、筋肉痙攣及び睡眠障害が知られており、これらの薬物は、アルツハイマー病の症状を安定化させるか、一時的に緩和させるだけ、止めることができないため、根本的な治療剤ではない。メマンチンは、さらに別の神経伝達物質であるグルタミン酸を調節するもので、非競争的ＮＭＤＡ（N-methyl−D-asupartate）拮抗剤(noncompetitive NMDA  antagonist）として、グルタミン酸による細胞毒性を防ぐ役割を果たすことで、中等度及び重症アルツハイマー患者の治療に用いられる。グルタミン酸は、興奮性神経伝達物質として、ＮＭＤＡ受容体を活性化させ、過度に活性化されると、脳神経細胞内に、過度のカルシウムの流入を通じて、細胞を破壊する。アルツハイマー患者は、グルタミン酸が過度に分泌され、安定期にもいつもＮＭＤＡ受容体のカルシウムイオンチャンネルが開かれ、細胞内への過量のカルシウムの流入が行わられるが、メマンチンは、ＮＭＤＡ受容体内に位置したカルシウム移動チャンネルで、親和力の低い拮抗剤として作用することで、カルシウムの細胞内への流入を遮断して、脳神経細胞の破壊を防ぐ役割を果たす。しかし、メマンチンも、目まい、頭痛などの副作用を引き起こすと知られている。
【００２０】
アミロイド仮説は、細胞外アミロイドβ（Aβ）の凝集又はＡβ除去の減少が、毒性イベントを引き起こし、神経細胞の退化をもたらす疾患の主要原因であると仮定する。Ａβは、タイプ１細胞膜（integral membrane）グリコタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解を通じて生成される。ＡＰＰのＡβへの分解作用は、二つの主要経路、即ち、アミロイド形成（amyloidogenic）経路と、非アミロイド形成経路とで起こり、アルファ（α）、ベータ（β）及びガンマ（γ）セクリターゼと呼ばれる酵素群により切断される。γ−セクリターゼ活性によるＡＰＰプロセッシングが、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２全ての放出の最終段階に関与する。プレセニリン１（ＰＳ１）及びプレセニリン２（ＰＳ２）は、それぞれセクリターゼコンプレックスの形成に寄与する。Ａβは、二つの主要形態、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２として存在すると知られている（これらの二つは、共通のＮ−末端を有するが、Ｃ−末端が異なる）。正常的環境では、α−γ−セクリターゼによる分解で、Ａβ１−４０が形成される。Ａβ１−４０は、凝集を引き起こすか、毒性を示す確率が少ない。反面、病的環境では、β−γ−セクリターゼによる分解が起こることで、Ａβ１−４２が生成される。Ａβ１−４２は、ＡＤ患者の脳で最も多く見付けられる類型である。アミロイド仮説を裏付ける証拠のうちの一つは、アポリポ蛋白が、βアミロイドの分解を向上するが、ＡＰＯＥ４のような特定のアイソフォーム（isoform）は、このような分解作用が弱く、その結果、脳で過度のアミロイド蓄積を引き起こすということである。アミロイド仮説に基づいて、アミロイドβペプチドをターゲットにする抗体を、アルツハイマー疾患の治療薬物として開発しようとする試みがあった。いままで、β‐アミロイドペプチドを認識する抗体治療剤として期待を寄せていたバピヌズマブ（bapineuzumab、Pfizer社製）、ソラネズマブ（solanezumab、Lilly社製）及び免疫グロブリン基盤の薬物であるガンマガード（gammagard、Baxterd社製）についての臨床の３相が、全て失敗したことを示した。
【００２１】
このように、βアミロイドの不溶性、原繊維凝集体が、アルツハイマー疾患の神経病理学的に代表的な標識であるが、人間の脳機能障害と関連性がよく説明されていない。最近、アルツハイマーの発病と関連して、βアミロイドの役割についての新しい仮説として、βアミロイドの溶解性凝集体（oligomers）の細胞毒性の役割についての研究が行われてきた。アミロイド‐β二量体（dimer）、アミロイド‐β三量体（trimer）及びＡβ５６のようなアミロイド‐βオリゴマーが、動物モデルにおける認知能力に及ぼす影響についての研究が行われた。アミロイド‐β二量体及びＡβ５６が、健康な幼いラットに注射されたとき、脳機能を損傷させるという強力な証拠がある。
【００２２】
タウ仮説は、タウの過剰なリン酸化が、ＡＤの主要原因であると仮定している。アルツハイマー患者の脳で過リン酸化されたタウが、神経原線維変化（ＮＦＴｓ）の主要成分である。ＮＦＴｓは、アルツハイマー疾患及びその他のタウが関与する疾患において、タウを含む繊維性凝集体である。正常的環境で、タウは溶解されており、微細小管及び小嚢性（vesicular）運搬のアセンブリ、及び、安定性を維持する軸索(axon）で主に見付けられる。微細小管に関連のタウタンパク質は、哺乳類の脳で正常的神経活性に主要な役割を果たしていると報告された。一方、ＡＤ及びその他のタウが関与している病理的環境において、タウキナーゼと、フォスファターゼ活性との不均衡により、タウの過剰なリン酸化が起こり、タウの形態を変化させる。このような変化は、タウタンパク質が不溶性になるようにして、微細小管への親和力を減少することで、微細小管から脱着され、自己凝集を起こさせ、双螺旋フィラメント構造を作るようにする。これらのフィラメントは、ＮＦＴｓで凝集されて、軸索運搬を妨害し、阻害する。タウをコードする遺伝子ＭＡＰＴ（Microtubule -associated  protein tau）が位置する染色体の１７番から見付けられる３０種以上の突然変異が、遺伝性アルツハイマー（ＦＡＤ）と、パーキンソン病と関連している。また、ＭＡＰＴで確認された突然変異が、タウタンパク質が微細小管に付着することを減少し、非定常的フィラメントに凝集する傾向を増加させる。これは、散発性ＡＤにおけるタウ病理症状と一致する。これは、機能障害が起こったタウタンパク質が、神経退行疾患の主要原因であるという仮説を裏付けている。
【００２３】
遺伝性アルツハイマー疾患（ＦＡＤ）突然変異の確認は、ＡＤ動物モデルが作られるようにした。現在使用している動物モデルは、突然変異のＡＰＰ、ＰＳ１及びＭＡＰＴ遺伝子などを使用して開発された。
【００２４】
アルツハイマーを含む退行性神経系疾患の治療剤の開発のための効力、効能実験に用いられる動物モデルとしては、アミロイドβの蓄積及びＮＦＴが誘導されるように、三つの特定の遺伝子（ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＰＳ１）が変異されたマウス（3XTg-AD mouse  model）などがある。この三つの遺伝子の変異されたマウスは、時間が経過するほど、アルツハイマー症状を含んだ神経細胞損傷の発病進行の状況を示す。このような神経細胞の損失が誘導される動物に、開発した薬剤を投与することで、神経細胞の破壊の抑制及び再生能を観察し、非投与対照群と比較することで、治療剤候補の効力、効能を測定できると知られている。
【００２５】
本発明によるペプチド（以下、ＰＥＰ１）は、ＰＥＰ１が、テロメラーゼ（telomerase）の触媒部分に存在する１６個の重要なアミノ酸からなるペプチドで、抗炎症及び抗酸化などの効能を有すると知られている。本発明によるペプチドが、退行性神経系疾患の根本の原因である神経細胞の損失予防及び再生に効果があることが、動物実験などを通じて見付けられるに従い、ＰＥＰ１が、退行性神経系疾患の予防及び治療において、既存の治療剤の限界、即ち単純の症状の緩和効果を超えて、根本的な神経系疾患の予防及び治療効果を示すと期待される。
【００２６】
本発明は、テロメラーゼ（telomerase）の逆転写酵素（reverse transcriptase）に由来のペプチドを含む神経細胞の損失予防及び再生用組成物を提供する。具体的には、本発明は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase, ｈＴＥＲＴ）に由来のアミノ酸ペプチドを含む神経細胞の損失予防及び再生用組成物を提供する。より具体的には、本発明は、ｈＴＥＲＴに由来の１６個のアミノ酸ペプチド、ＰＥＰ１を、神経細胞の損失予防及び再生用組成物として提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】ＷＯ２０１０１２８８０７ Ａ２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
このような背景の下で、本発明者らは、副作用がほとんどなく、効果が優秀な神経細胞の損失予防及び再生の効能を有する神経細胞の損失予防及び再生用組成物を開発するために鋭意努力をした結果、本発明を完成するに至った。
【００２９】
本発明の目的は、効果的でありながら、同時に副作用がなく、神経細胞の損失による退行性の神経系疾患に対して、根本的な治療剤である、神経細胞の損失予防及び再生用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明の一態様によると、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド及びそれらのフラグメントからなる群より選択される一つ以上を、薬学的に有効な量で含む、神経細胞の損失予防及び再生用組成物が提供される。
【００３１】
本発明の他の一態様によると、神経細胞の損失予防及び再生に用いるための、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド及びそれらのフラグメントからなる群より選択される一つ以上が提供される。
【００３２】
また他の側面から、本明細書に開示された技術は、神経細胞の損失予防及び再生用組成物を製造するための、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド及びそれらのフラグメントからなる群より選択される一つ以上の使用を提供する。
【００３３】
本発明による組成物において、前記フラグメントは、３個以上のアミノ酸からなるフラグメントであってもよい。
【００３４】
本発明による組成物において、前記組成物は、神経細胞の損失及び再生不能による疾患の予防、治療、軽減、及び改善用であるか、又は、前記疾患による後遺症の予防、治療、軽減、及び改善用である。
【００３５】
本発明による組成物において、前記神経細胞の損失及び再生不能による疾患は、脳血管疾患又は退行性神経系疾患であり得る。
【００３６】
本発明による組成物において、前記脳血管疾患は、虚血性脳血管疾患、又は、出血性脳血管疾患であり得る。
【００３７】
本発明による組成物において、前記退行性神経系疾患は、脳疾患、脊髄損傷、末梢神経損傷、抹消神経系疾患、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral  sclerosis）、痴呆、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー性疾患、脊髄小脳変性症、及び多発性神経病症のうちいずれか一つであり得る。
【００３８】
本発明による組成物において、前記組成物は、一つ以上の神経系疾患の治療剤と併用され得る。
【００３９】
本発明による組成物において、前記アルツハイマー性疾患は、痴呆、認知障害、記憶力の低下のうちいずれか一つ以上を示し得る。
【００４０】
本発明による組成物において、前記アルツハイマー性疾患は、初期、進行性又は重症アルツハイマー性疾患であり得る。
【００４１】
本発明による組成物において、薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは、０．０００１ 〜 １００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与され得る。
【００４２】
本発明による組成物において、薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは、０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ投与され得る。
【００４３】
本発明による組成物において、薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは、１週間〜４週間ごとに１回、合計４回以上投与され得る。
【００４４】
本発明による組成物において、薬学的有効成分として配列番号１のペプチドを含む組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内、皮内、又は皮下に投与され得る。
【００４５】
本発明の他の一態様によると、薬学的に有効な量の本発明による組成物を、これを必要とする個体に投与する工程を含む、神経細胞の損失予防及び再生方法が提供される。
【００４６】
本発明のまた他の一態様によると、本発明による神経細胞の損失予防及び再生用組成物と、薬学的有効成分として配列番号１のペプチドを０．０１〜２００ｍｇ、１週間〜４週間ごとに１回、これを必要とする個体に投与することを指示する指示書とを含む、神経細胞の損失予防及び再生用キットが提供される。
【発明の効果】
【００４７】
本発明による配列番号の配列を有するペプチド、又は前記配列と８０％の相同性を有する配列を有するペプチド又はそれらのフラグメントは、神経細胞の損失予防及び再生に効能を有するので、神経細胞の損失及び再生不能による疾患の予防又は治療法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、神経幹細胞を、濃度別（０、２．５、５、１０、２０ 、４０μＭ）の Ａβ２５−３５（β‐アミロイド２５−３５）で処理したとき、細胞生存能力をＣＣＫ−８（cell count kit-8）で、細胞活性度をＢｒｄＵ染色法で測定した結果を、対照群に対する割合で示したグラフである。
【図２】図２は、神経幹細胞を、濃度別（０、１、１０、５０ 、１００、２００μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、細胞生存能力をＣＣＫ−８で、細胞活性度をＢｒｄＵ染色法で測定した結果を、対照群（０μＭ）に対する割合で示したグラフである。
【図３】図３は、 神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭ のＡβ２５−３５で処理し、また濃度別（０、１、１０、５０ 、１００μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、細胞生存能力をＣＣＫ−８、ＭＴＴ、ＬＤＨにより測定した結果を、吸光度及び対照群に対する割合で示したグラフである。
【図４】図４は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０、１００μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、細胞増殖の程度を示した吸光度グラフである。
【図５】図５は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０、１００μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、アポトーシス（apoptosis）を、ＤＡＰ１及びＴＵＮＥＬ染色により確認した写真である。
【図６】図６は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、集落形成単位（ＣＦＵ）測定法により、集落（colony）当りの細胞数を示したグラフである。
【図７】図７は、 神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０、１００μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、処理の前後のアポトーシスを、ＴＵＮＥＬ染色により確認した写真である。
【図８】図８は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０、１００μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、ＴＵＮＥＬ染色により評価した、処理の前後のアポトーシスの割合を示した吸光度グラフである。
【図９】図９は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、細胞移動能力を観察するために、ＱＣＭ−２４ウェル細胞移動法キットを用いて、細胞移動アッセイを実施した結果を示したグラフである。
【図１０】図１０は、１０μＭのＰＥＰ１で処理した後、神経幹細胞内へのＰＥＰ１の浸透過程を調べるために、ＰＥＰ１をＦＩＴＣでラベリングして、０〜２４時間処理した後、ミトコンドリア染色及び細胞膜染色により観察した写真である。
【図１１】図１１は、１０μＭのＰＥＰ１で処理した後、神経幹細胞内へのＰＥＰ１の浸透過程を調べるために、ＰＥＰ１をＦＩＴＣでラベリングして、０〜２４時間処理した後、ミトコンドリア染色及び細胞膜染色により観察した写真である。
【図１２】図１２は、２０μＭのＡβ２５−３５で処理した神経幹細胞を、１μＭのＰＥＰ１で処理した後、β‐アミロイド処理の神経幹細胞内へのＰＥＰ１の浸透過程を調べるために、ＰＥＰ１をＦＩＴＣでラベリングして、０〜２４時間処理した後、核染色により観察した写真である。
【図１３】図１３は、２０μＭのＡβ２５−３５で処理した神経幹細胞を、１μＭのＰＥＰ１で処理した後、β‐アミロイド処理の神経幹細胞内へのＰＥＰ１の浸透過程を調べるために、ＰＥＰ１をＦＩＴＣでラベリングして、０〜２４時間処理した後、核染色により観察した写真である。
【図１４】図１４は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、活性酸素（ＲＯＳ）の生成を測定するために、ＤＣＦＨ−ＤＡを染色し、ＤＣＦ蛍光値を測定した結果を示したグラフである。
【図１５】図１５は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、活性酸素（ＲＯＳ）の生成を測定するために、ＤＣＦＨ−ＤＡを染色し、ＤＣＦ蛍光値を測定した結果を示したグラフである。
【図１６】図１６は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、活性酸素（ＲＯＳ）の生成を測定するために、ＤＣＦＨ−ＤＡを染色し、ＤＣＦ蛍光値を測定した結果を示したグラフである。
【図１７】図１７は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、ミトコンドリアの酸化的ＤＮＡ損傷の程度を調べるために、８−ＯＨｄＧ ＥＬＩＳＡキットを用いて観察した結果を示したグラフである。
【図１８】図１８は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、ミトコンドリアの細胞膜電位を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて観察した結果を示したグラフである。
【図１９】図１９は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、ミトコンドリアの細胞膜電位を、ＪＣ−１キットを用いて観察して、死滅された細胞又は不健康の細胞の場合、ＦＩＴＣ波長で観察した結果を示したグラフである。
【図２０】図２０は、 神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、ミトコンドリアの細胞膜電位を、ＪＣ−１キットを用いて観察して、健常細胞の場合、ローダミン波長及びテキサスレッド波長で観察した結果を示したグラフである。
【図２１】図２１は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、ＡＴＰ濃度（ｎｍｏｌ／μＬ）を示したグラフである。
【図２２】図２２は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、ＰＥＰ１の細胞内タンパク質の発現レベルに及ぼす影響の程度を、タンパク質解析の観点から調べるために行われた抗体マイクロアレイの結果写真である。
【図２３】図２３は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、各々の条件で発現及び減少する細胞内のタンパク質を示した表である。
【図２４】図２４は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０及び１０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、マイクロアレイにより細胞内タンパク質の発現レベルを示した写真である。
【図２５】図２５は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０及び１０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、各々の条件で発現及び減少する細胞内タンパク質を示した表である。
【図２６】図２６は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＫｉ６７、ＰＩ３Ｋ、Ｓｅｒ４７３、Ｓｅｒ９、ＨＭＧＢ−１の発現程度を、免疫染色法を用いて測定した結果の写真である。
【図２７】図２７は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＫｉ６７、ＰＩ３Ｋ、Ｓｅｒ４７３、Ｓｅｒ９、ＨＭＧＢ−１の発現程度を、免疫染色法を用いて測定した結果を数値化したグラフである。
【図２８】図２８は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＢａｘ、シトクロムＣ（cytochrome c）、カスパーゼ−３（caspase-3）の発現程度を、免疫染色法を用いて測定した結果の写真である。
【図２９】図２９は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＢａｘ、シトクロムＣ（cytochrome c）、カスパーゼ−３（caspase-3）の発現程度を、免疫染色法を用いて測定した結果を数値化したグラフである。
【図３０】図３０は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＨＭＧＢ−１の経時変化を示した写真である。
【図３１】図３１は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＰＩ３Ｋ、Ｓｅｒ４７３、Ａｋｔ、Ｓｅｒ９、Ｂｃｌ−２の発現程度を、免疫染色法を用いて測定した結果の写真である。
【図３２】図３２は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＰＩ３Ｋ、Ｓｅｒ４７３、Ａｋｔ、Ｓｅｒ９、Ｂｃｌ−２の発現程度を、免疫染色法を用いて測定した結果を数値化したグラフである。
【図３３】図３３は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＰＡＲＰ、Ｂａｘ、シトクロムＣ（cytochrome c）、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３の発現程度を、免疫染色法を用いて測定した結果の写真である。
【図３４】図３４は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理したとき、発現されるＰＡＲＰ、Ｂａｘ、シトクロムＣ（cytochrome c）、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３の発現程度を、免疫染色法を用いて測定した結果を数値化したグラフである。
【図３５】図３５は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ＰＩＫ３阻害剤として知られたＬＹ２９４００２で処理したとき、細胞生存能力を観察した結果を示したグラフである。
【図３６】図３６は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図３７】図３７は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図３８】図３８は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図３９】図３９は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４０】図４０は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４１】図４１は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４２】図４２は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４３】図４３は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４４】図４４は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４５】図４５は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４６】図４６は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４７】図４７は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４８】図４８は、神経幹細胞を、０μＭ（対照群）及び２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ｂＦＧＦ（basic FGF）有りの状態又は無しの状態で、それぞれ神経幹細胞の分化及び分裂の段階別マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、Ｔｕｊ１の発現程度を、ＤＡＰＩ染色法及び免疫染色法により観察した写真及びグラフである。
【図４９】図４９は、ヒト神経幹細胞を、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）１μｇで過発現した後、シャトルベクター及びＴＥＲＴを、それぞれＧＦＰでタグして観察した写真である。
【図５０】図５０は、ヒト神経幹細胞を、２０μＭのＡβ２５−３５で処理した後、ｈＴＥＲＴ１μｇで過発現したものと、１μＭのＰＥＰ１で処理したものとを、比較したマイクロアレイ写真である。
【図５１】図５１は、シャトルベクター及びｈＴＥＲＴを、ＧＦＰでタグして、ＴＥＲＴの発現を確認した電気泳動の写真である。
【図５２】図５２は、過発現されたｈＴＥＲＴ及びＰＥＰ１により増加又は減少されたタンパク質を示したリストである。
【図５３】図５３は、ヒト神経幹細胞を、０又は２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ＴＥＲＴの発現程度を観察した写真である。
【図５４】図５４は、ヒト神経幹細胞を、０又は２０μＭのＡβ２５−３５で処理し、これと共に、濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、ＴＥＲＴの発現程度を数値化して示したグラフである。
【図５５】図５５は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの海馬（hippocampus）及び全体の脳で、ＮｅｕＮの発現程度をウェスタンブロット（western blot）で測定した結果の写真及びこれを数値化したグラフである。
【図５６】図５６は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの海馬（hippocampus）及び全体の脳で、ＤＣＸの発現程度をウェスタンブロット（western blot）で測定した結果の写真及びこれを数値化したグラフである。
【図５７】図５７は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルのＳＶＺ（Subventricular zone）部位で、神経組織を免疫染色（immune staining）して、ＤＣＸ及びＮｅｕＮの発現程度を観察した写真である。
【図５８】図５８は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの海馬（hippocampus）及び全体の脳で、Ｔｕｊ１の発現程度をウェスタンブロットで測定した結果の写真及びこれを数値化したグラフである。
【図５９】図５９は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルのＳＵＺ（Subventricular zone）部位で、神経組織を免疫染色して、Ｔｕｊ１の発現程度を確認した写真である。
【図６０】図６０は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの海馬（hippocampus）及び全体の脳で、ＧＦＡＰの発現程度をウェスタンブロットで測定した結果の写真及びこれを数値化したグラフである。
【図６１】図６１は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの海馬（hippocampus）及び全体の脳で、ＧａｌＣの発現程度をウェスタンブロットで測定した結果の写真及びこれを数値化したグラフである。
【図６２】図６２は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルのＳＶＺ部位で、神経組織を免疫染色して、ＤＣＸ及びＮｅｕＮの発現程度を観察した写真である。
【図６３】図６３は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの海馬（hippocampus）及び全体の脳で、モノマーのβ‐アミロイドの発現程度を、ウェスタンブロットで測定した結果の写真及びこれを数値化したグラフである。
【図６４】図６４は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの海馬（hippocampus）及び全体の脳で、オリゴマーのβ‐アミロイドの発現程度を、ウェスタンブロットで測定した結果の写真及びこれを数値化したグラフである。
【図６５】図６５は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの海馬（hippocampus）及び全体の脳で、ＮＦＴの発生程度を示すマーカーであるＴａｕの発現程度を、ウェスタンブロットで測定した結果の写真及びこれを数値化したグラフである。
【図６６】図６６は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの神経組織を、免疫染色して、神経細胞でＮＦＴ（Ｔａｕで測定）及びβ‐アミロイドの発現程度を確認した写真である。
【図６７】図６７は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの受動回避実験の結果を評価して、良い（good、斜線）及び悪い（bad、斜線なし）の比率を示したグラフである。
【図６８】図６８は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルの受動回避実験において、反応時間（秒単位）を示したグラフである。
【図６９】図６９は、対照群（生理食塩水及びスクランブルペプチド１ｍｇ／ｋｇ）及び濃度別（０．０１、０．１、１ｍｇ／ｋｇ）のＰＥＰ１、既存の薬物であるドネペジル （donepezil、１ｍｇ／ｋｇ）の投与群別の動物モデルのＹ−ｍａｚｅ実験の結果を評価して示したグラフである。
【図７０】図７０は、重症アルツハイマー動物モデルの受動回避実験の結果を評価して、明るい部屋に滞在する個体数の比率を示したグラフである。
【図７１】図７１は、重症アルツハイマー動物モデルのＹ−ｍａｚｅ実験の結果を評価して、変更行動力を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、多様な変換を加えてもよく、様々な実施例を有してもよい。以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に限定することではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むことを理解すべきである。本発明を説明するにあたって、関連の公知技術に関する具体的な説明が、本発明の要旨を曖昧にする恐れがあると判断する場合、その詳細な説明を省略する。
【００５０】
神経系疾患では、神経細胞が、退化、減少又は細胞死することで、多様な病理的症状を引き起こす。神経細胞の損失及び再生不能による疾患には、虚血性脳卒中のような脳血管疾患と、痴呆又はアルツハイマー疾患のような退行性神経系疾患とがある。現在まで、退行性神経系疾患の治療剤は、症状の改善のための薬物であるだけ、疾患の経過を変更できないので、根本的な治療法としては、神経保護治療剤又は神経再生治療法の開発が、求められている。また、現在まで、虚血性脳卒中から神経細胞を保護する目的で、開発された薬物は、脳卒中により誘発されるアポトーシス経路中の特定の部位のみを遮断して効果を得ようとしているが、脳卒中による神経細胞の死滅は、様々な経路を通じてなされるため、根本的な解決策を提示できなかった。したがって、虚血性脳卒中に関わる多くの因子を、同時に調節することにより、脳神経細胞の死滅を最小化する標的治療法が要求されている。
【００５１】
テロメア（telomere）は、染色体の末端に繰り返して存在する遺伝物質であって、当該染色体の損傷や他の染色体との結合を防止すると知られている。テロメアの長さは、細胞が分裂する度に、少しずつ短くなって、一定の回数以上の細胞分裂があれば、テロメアは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死になる。その反面、テロメアを長くすると、細胞の寿命が延長されると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（telomerase）という酵素が分泌され、テロメアが短くなることを防ぐため、癌細胞が死ぬことなく、増殖し続けることができると知られている。テロメラーゼに由来のペプチドであるＰＥＰ１は、膵臓癌を始めて、様々な癌に対する抗がん剤として開発されてきたが、抗がん効果のほかにも、抗炎症、抗酸化、細胞透過性、及び細胞内の主要シグナル伝達過程に関与すると明らかになり、ＰＥＰ１のこのような細胞内機能に着目して、既存の抗がん剤としての用途以外に、新しい適応症への活用の可能性が探求されてきた。本発明者らは、テロメラーゼに由来のペプチドが、脳神経疾患を引き起こす炎症作用を抑制するメカニズムを有し、神経細胞の損失予防及び再生に効果的であることを確認し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明では、アルツハイマー動物モデル実験を通じて、ＰＥＰ１が、アルツハイマー疾患の発病の原因と推定されているβ‐アミロイドの凝集形成を減少し、タウタンパク質の過リン酸化により形成される神経原線維変化（neurofibrillary tangles）を減少する結果を確認した。これと共に、本発明では、様々な神経細胞マーカーの発現量により、ＰＥＰ１が神経細胞の分化及び増殖にポジティブ効果を示していることを確認した。
【００５２】
本発明の一態様において、配列番号１のペプチド（ＰＥＰ1）、配列番号１のフラグメントであるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼ、具体的に、ヒト（Homo sapiens）テロメラーゼに由来のペプチドを含む。
【００５３】
本明細書に開示されたペプチドは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有するペプチドを含んでもよい。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチド又はそのフラグメントと、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸又は７個以上のアミノ酸が変化されたペプチドとを含んでもよい。
【００５４】
本発明の一態様において、アミノ酸の変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上し、気質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるなどのアミノ酸の変化が行われてもよい。
【００５５】
本明細書において、「アミノ酸」というのは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸のみならず、Ｄ−異性体及び変形されたアミノ酸を含む。これにより、本発明の一態様において、ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドであってもよい。一方、本発明の別の態様において、ペプチドは、翻訳後修飾（post-translational modification）の非標準アミノ酸などを含んでもよい。翻訳後修飾の例には、リン酸化（phosphorylation）、グリコシル化（glycosylation）、アシル化（acylation）（例えば、アセチル化（acetylation）、ミリストイル化（myristoylation）及びパルミトイル化（palmitoylation）を含む）、アルキル化（alkylation）、カルボキシル化（carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）、糖化反応（glycation）、ビオチニル化（biotinylation）、ユビキチニル化（ubiquitinylation）、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去脱アミド化 、脱アミド化）、及び構造的変化（例えば、二黄化物ブリッジの形成）が含まれる。また、ペプチドコンジュゲートを形成するための架橋剤（cros slinker）との結合過程で起こる化学反応により生じるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボキシ基、又は側鎖における変化のようなアミノ酸の変化が含まれる。
【００５６】
本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から、同定及び分離された野生型ペプチドであってもよい。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１のフラグメントであるペプチドと比較して、一つ以上のアミノ酸が、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む、人工変異体であってもよい。人工変異体のみならず、野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸の変化は、タンパク質のフォールディング（folding）及び／又は活性に有意義な影響を及ばさないアミノ酸の保存性アミノ酸の置換を含む。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般に、特異的活性を変更させないアミノ酸の置換が、本分野に公知されている。最も頻繁に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、そしてこれらと逆のものである。保存的置換の他の例は、以下の表に示している。
【００５７】
【表１】
2019501210.tif 000003
【００５８】
ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート又は螺旋立体構造の保持におけるこれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷又は疎水性の保持におけるこれらの効果、又は（ｃ）側鎖のバルクの保持におけるこれらの効果が、相当に異なる置換部を選択することにより行われる。天然の残基は、通常の側鎖の特性に基づいて、次のグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、 ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３）酸性： ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、 ｐｒｏ、及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらの類型のうちの一つの構成員を、また他の類型に交換することにより行われる。ペプチドの適当な立体構造の保持と関連のないいかなるシステイン残基も、一般にセリンに置換されて、前記分子の酸化的安定性を向上し、異常な架橋結合を防ぐことができる。逆に言えば、システイン結合（複数の結合）を前記ペプチドに加え、その安定性を向上することができる。
【００５９】
ペプチドの他の類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化されたものである。変化とは、ペプチドで見付けられた一つ以上の炭水化物残基の欠失及び／又はペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００６０】
ペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−結合されるか、Ｏ−結合されるものである。Ｎ−結合されるとは、炭水化物残基が、アスパラギン残基の側鎖に付着したものを言う。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）は、炭水化物残基を、アスパラギン側鎖に酵素的付着するための認識配列である。従って、これらのトリペプチド配列のうちの一つが、ポリペプチドに存在することにより、潜伏的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ−結合されたグリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース及びキシロースのうちの一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も通常的には、セリン又はトレオニンに付着することを意味するが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを用いてもよい。
【００６１】
ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、前に挙げられたトリペプチド配列の一つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化することで、便宜に行われる（Ｎ−結合されたグリコシル化部位の場合）。このような変化は、一つ以上のセリン又はトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、これらの残基で置換することにより行われてもよい（Ｏ−結合されたグリコシル化部位の場合）。
【００６２】
また、本発明の一態様による配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列のフラグメント又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、細胞内毒性が低く、生体内安定性が高いという長所を有する。本発明における配列番号１は、テロメラーゼに由来のペプチドとして、以下のように１６個のアミノ酸からなるペプチドである。
【００６３】
配列番号１に記載されたペプチドは、以下の表２の通りである。以下の表２における「名称」は、ペプチドを区別するために命名したものである。本発明の一態様において、配列番号１に記載されたペプチドは、ヒトのテロメラーゼの全ペプチドを示す。本発明の他の態様において、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列のフラグメントであるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼに含まれたペプチドのうち、当該位置のペプチドを選別して合成した「合成ペプチド」を含む。配列番号２は、全テロメラーゼのアミノ酸配列を示したものである。
【００６４】
【表２】
2019501210.tif 000004
【００６５】
本発明の一態様では、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントである、神経細胞の損失予防及び再生の効能を有するペプチドを、有効成分として含む薬学的組成物を提供する。
【００６６】
本発明の一態様による神経細胞の損失予防及び再生の効能を有する薬学組成物は、一態様においては、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントであるペプチドを、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでもよいが、治療対象別に用量による効果の差を示す場合、これを適切に調整することができる。前記範囲又はそれ以下の範囲で含む場合、本発明の意図した効果を奏するのに適切であるだけではなく、組成物の安定性及び安全性の両方を満たすことができ、費用対比効果の観点からも、前記範囲で含むことが適切であり得る。
【００６７】
本発明の一態様による組成物は、ヒト、イヌ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ギニアピグ又はサルを含む全ての動物に適用できる。
【００６８】
本発明の一態様において、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントである、神経細胞の損失予防及び再生の効能を有するペプチドを含む薬学組成物を提供する。本発明の一態様による薬学組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内、皮内、又は皮下などに、好ましくは、腹腔内、皮内、血管又は、皮下に、より好ましくは、皮下に投与できる。
【００６９】
経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質又は硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、又は乳濁剤であってもよいが、これに限定されない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチ、又は噴霧剤であってもよいが、これに限定されない。
【００７０】
本発明の一態様による薬学組成物は、必要に応じて、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩解剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料、又は甘味剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の一態様による薬学組成物は、当業界の通常的な方法により製造できる。
【００７１】
本発明の一態様による薬学組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその重症度、投与経路又は処方者の判断によって異なる。このような因子に基づいた適用量の決定は、当業者のレベル内にあり、この一日投与量は、例えば、０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ ／日、より好ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日 となってもよいが、用量による効果の差を示す場合、これを適切に調整してもよい。本発明の一態様による薬学組成物は、１日１回〜３回投与してもよいが、これに限定されない。
【００７２】
本発明の一態様による薬学組成物の有効成分の投与用量及び投与間隔の決定は、当業者のレベル内にあり、例えば、投与用量は、０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは、０．１ｍｇ〜５ ｍｇ、より好ましくは、０．４ ｍｇ〜１．２ｍｇ、さらにより好ましくは、０．４ ｍｇ、０．５６ ｍｇ、又は１．１２ ｍｇ投与してもよく、投与間隔は、１週間〜４週間ごとに合計４回以上、好ましくは、１週間〜２週間ごとに１回、合計６回〜２６回投与してもよいが、これに制限されない。
【００７３】
本発明の一態様において、前記組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising） ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド又はそのフラグメントを、有効成分として含む神経細胞の損失予防及び再生用組成物を提供する。
【００７４】
本発明の一態様による組成物の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などに剤形化することができる。各剤形は、有効成分の他に、当該分野において通常用いられる成分を、剤形又は使用目的に応じて、当業者が容易に適宜選択して配合でき、他の原料と同時に適用する場合、相昇効果を奏することができる。
【００７５】
本明細書において用いられた用語は、特定の具体例を説明するための目的のみで意図されたものであり、本発明を限定しようとする意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞の物品が、一つ以上存在することを示すものである。用語「含む」、「有する」、及び「含有する」とは、包括的意味と解釈される（即ち、「含まれるが、これに限定されない」という意味）。
【００７６】
数値の範囲を言及するのは、単にその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を、個別的に言及することに代わる容易な方法であるためであり、それではないと明示されていない限り、各数値は、個別的に明細書に言及されているように本明細書に適用される。全ての範囲の限界値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。
【００７７】
本明細書に述べられる全ての方法は、特に明示されているか、文脈により明白に矛盾しない限り、適切な順序で行われ得る。いずれか一つの実施例及び全ての実施例又は例示的言語（例えば、「〜のような」）を使用するのは、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明の一態様の記載を容易にするためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書のいかなる言語も、請求されていない構成要素を、本発明の実施に必須的なものであると解釈してはいけない。特に定めのない限り、本明細書に用いられる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者により通常理解されるような意味を有する。
【００７８】
本発明の一態様による好適な具体例は、本発明を実行するために、発明者に知られた最適のモードを含む。好適な具体例の変形は、先行する記載に触れれば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に利用することを期待し、発明者らは、本明細書の記載とは異なる方式で、本発明が実施されることを期待する。従って、本発明は、一態様において、特許法により許容されているように、添付の特許請求の範囲に述べられた発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変形内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせも、ここで異なって明示するか、文脈上、明白に矛盾しない限り、本発明に含まれる。本発明は、例示的な具体例を参照して、具体的に開示し、記述されたが、当業者は、添付の特許請求の範囲により定められる発明の思想及び範囲を逸脱することなく、形態及びディテールにおいて多様な変化が可能であることがよく分かる。
【００７９】
以下、実施例及び実験例をもって、本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例及び実験例は、本発明の理解を助けるために例示の目的にのみ提供されたものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲を限定するものではない。
【００８０】
実施例
実施例１：ペプチドの合成
配列番号１のペプチド（以下、「ＰＥＰ１」という）を、従来知られている固相ペプチド合成法（solid phase peptide synthesis, ＳＰＰＳ）に従って製造した。具体的に、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron, Inc., 大韓民国・大田）を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成法でＣ−末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることにより合成した。次のように、ペプチドのＣ−末端の一番目のアミノ酸が、レジンに付着されたものを用いた。例えば、以下の通りである。
【００８１】
ＮＨ２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ２−Ａｌａ−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ２−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−クロロ−トリチルレジン
ペプチドの合成に用いた全てのアミノ酸原料は、Ｎ−末端がＦｍｏｃで保護（protection）され、残基は全て酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（t-ブチルエステル）、Ｐｂｆ（２、２、４、６、７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルフォニル）などで保護されたものを用いた。例えば、次の通りである。
【００８２】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−メルカプト酢酸。
【００８３】
カップリング試薬（Coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ[２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１、１、３、３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスファート]／ＨＯＢｔ[Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾル]／ＮＭＭ［４−メチルモルホリン]を用いた。Ｆｍｏｃの除去は、２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in DMF）を用いた。合成されたペプチドを、レジンから分離及び残基の保護基の除去には、切断カクテル（Cleavage Cocktail）［ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）／ＥＤＴ（エタンジチオール）／Ｈ２Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を用いた。
【００８４】
アミノ酸の保護基が結合された出発アミノ酸が、固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸を各々反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護の過程を繰り返すことにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを、レジンから切り取った後、ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで合成の可否を確認した後、凍結乾燥した。
【００８５】
本実施例に用いられたペプチドへの高速液体クロマトグラフィーの結果、全てのペプチドの純度は、９５％以上であった。
【００８６】
ペプチドＰＥＰ１の製造についての具体的な過程は、以下の通りである。
【００８７】
１）カップリング
ＮＨ２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジンに、保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解して加えた後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ 、ＤＭＦの順に洗浄した。
【００８８】
２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in DMF）を加えて、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ 、ＤＭＦの順に洗浄した。
【００８９】
３）前記１）と２）の反応を繰り返して行い、ペプチドの基本骨格ＮＨ２−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジンを作製した。
【００９０】
４）切断（Cleavage）：合成が完了されたペプチドレジンに、切断カクテル（Cleavage Cocktail）を加えて、レジンからペプチドを分離した。
【００９１】
５）得られた混合物に、冷却ジエチルエーテルを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈殿した。
【００９２】
６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認し、凍結してパウダーとして製造した。
【００９３】
実施例２：実験用意及び材料
実施例２−１：神経幹細胞及び1次皮質神経細胞の培養と処理
動物に関する全ての手続きは、ハンヤン大学校（Hanyang University）の実験動物ガイドラインに従って実施した。全ての実験は、動物の個体数と、苦痛とを最小化し、全ての動物は、一度だけ使用した。
【００９４】
神経幹細胞は、ラット胚芽の脳から分離され、培養及び拡張した。神経幹細胞の培養は、以下のような方式で行った。簡単に説明すると、ラットの胚芽は、胚芽期の１３日目に得て、脳を素早く摘出し、冷たいハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）が入っているペトリディシーに置いた。
【００９５】
ラット胎児大脳皮質、外部神経節突起、胚の中間脳から単一細胞を分離した。この細胞は、カルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、Ｌ−オルニチンと、フィブロネクチンとで前処理コーティングしたディシーに、ｃｍ２当りの２０、０００細胞の密度で入れた。そして、Ｎ２培地（ＤＭＥＭ Ｆ／１２、４．４ｎＭのインシュリン、１００ｍｇ／Ｌのトレンスぺリン、３０ｎＭのセレナイト、０．６Ｍのプトレシン、２０ｎＭのプロゲステロン、０．２ｍＭのアスコルビン酸、２ｎＭのＬ−グルタミン、８．６ｍＭのＤ(＋)グルコース、２０ｎＭの炭酸水素ナトリウム)で培養した。培養は、加湿の５％二酸化炭素の状態で、４〜６日間、３７℃で維持した。
【００９６】
神経幹細胞の分化は、細胞培養培地をｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）のないＮ２培地に変えることにより誘導し、この培地は、毎日交替した。
【００９７】
神経幹細胞を、６個のサンプルに分けた後、適正の濃度を調べるために、各サンプルを、０、２．５、５、２０、４０μＭのＡβ２５−３０オリゴマーで４８時間処理した。Ａβ２５−３０の水溶性オリゴマーの形態は、以下のように知られたレポートに従い、用意した。簡単に説明すると、Ａβ２５−３０は、ヘキサフルオロイソプロパノールを用いて、１ｍＭ濃度となるように溶かした。そして、滅菌の超微細遠心分離機のチューブを用いて分注した。ヘキサフルオロイソプロパノールは、真空乾燥システムを用いて除去し、ペプチドフィルムは、−２０℃で貯蔵及び乾燥した。オリゴマーを用意するために、ペプチドは、無水のジメチルスルホキシドで、５ｍＭの濃度となるように混合した。そして、ハム（Ham's）Ｆ−１２培地に、最終濃度が１ｍＭとなるように加えた。このような過程で、４℃で２４時間培養した。
【００９８】
神経幹細胞でＰＥＰ１の効果を調べるために、ＰＥＰ１を、０、１、１０、５０、１００、２００μＭの様々な濃度で４８時間処理した。Ａβ２５−３０誘導の神経毒性に対するＰＥＰ１の効果を調べるために、神経幹細胞を、０、１、１０、５０、１００μＭの様々濃度のＰＥＰ１と、２０μＭのＡβ２５−３０とで、４８時間処理した。プレートを、丁寧にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で数回洗浄し、細胞生存能力を、ＣＣＫ−８（Cell counting  kit-8）とＭＴＴと、そして、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase 、ＬＤＨ）を用いて測定した。
【００９９】
ＰＥＰ１のメカニズムにおいて、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達体系の役割を調べるために、神経幹細胞を、５０μＭのＰＥＰ１と２０μＭのＡβ２５−３０で処理する前に、ＰＩ３Ｋ抑制剤であるＬＹ２９４００２で１時間処理した。神経幹細胞は、次の四つの群に分けた：対照群（１群）、２０μＭのＡβ２５−３５で４８時間処理した群（２群）、５０μＭのＰＥＰ１と共に、２０μＭのＡβ２５−３０とで、４８時間処理した群（３群）、５０μＭのＰＥＰ１と共に、１０μＭのＬＹ２９４００２及び２０μＭのＡβ２５−３５とで、４８時間処理した群（４群）。
【０１００】
１次培養の皮質神経は、胚芽期の１６日目のラット胎児大脳皮質（cerebral cortex）から得た。簡単に説明すると、ラットから脳を素早く摘出し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）を含んでいるペトリディシーに置いた。単一細胞を、大脳皮質から分離し、予めポリ‐Ｌ‐リジンでコーティングされた直径１００ｍｍのコーニングディシー（Corning dish）に入れるか、又はガラスのカバースリップ（coverslip）を、６−、２４−ウェルプレートに入れた。この培養は、ＤＭＥＭ（高グルコース）で培養された。
【０１０１】
細胞を入れてから２日の後、神経細胞でない細胞は、５μＭシトシンアラビノシドで２４時間処理して除去した。成熟の培養物（試験管内で７日）のみが、実験に用いられた。神経細胞の集団は、１次皮質のニューロンから７９．７％程度収得された。
【０１０２】
ヒト神経幹細胞（H9 hESC-derived、GIBCO）は、Ｄ−ＰＢＳ中にＣａ２＋／Ｍｇ２＋を溶解したＣＥＬＬＳｔａｒｔ（ＧＩＢＣＯ）で予めコーティングされた培養ディシーに、５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でプレートし、ＳｔｅｍＰｒｏ ＮＳＣ ＳＦＭ培地（KnockOut DMEM/F-12、2mM GlutaMAXsupplement、2%  StemPro neural supplement、20 ng/mL 基本FGF組換えタンパク質、及び20ng/mL EGF組換えタンパク質）で培養した。培養培地は、３７℃を維持し、湿気のある５％ＣＯ２大気下で４〜６日間行った。
【０１０３】
実施例２−２：細胞生存能力を測定するためのＣＣＫ−８及びＬＤＨ分泌検査法
ＷＳＴ−８（２−［２−メトキシ−４−ニトロフェニル］−３−［４−ニトロフェニル］５−［２、４−ジスルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩）を、ＰＭＳ（１−メトキシフェナジニウムメチルスルフェート）と結合することにより、生細胞の数をカウントする方法として、ＣＣＫ−８を用いた。簡単に説明すると、細胞のある９６‐ウェルプレートに、１０μＬのキット試薬を入れ、３時間培養した。細胞生存能力は、４５０ｎｍで吸光度の測定により観察した。全ての結果は、細胞のないウェルに基づいて、正規化した。比色分析法は、培養した神経幹細胞のＬＤＨ量を測定するために使用した。細胞生存能力は、４５０ｎｍで吸光度、６９０ｎｍで参考吸光度を用いて測定した。全ての結果は、細胞のないウェルに基づいて、正規化した。
【０１０４】
実施例２−３：ブロモデオキシウリジン細胞分裂測定法
神経幹細胞は、濃度別のＰＥＰ１と、２０μＭのＡβ２５−３０とで４８時間処理した。その後、神経幹細胞は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）−ラベルの培地で、５時間培養した後、キットを用いて観察した。細胞分裂は、３７０ｎｍでの吸光度と、４９２ｎｍでの参考吸光度とを用いて観察した。全ての結果は、細胞のないウェルに基づいて、正規化した。
【０１０５】
実施例２−４：集落形成単位測定法（ＣＦＵ）
ＣＦＵ測定法は、次のような方法により行った。簡単に説明すると、神経幹細胞は、０．２５ｘ１０５個の密度で、６‐ウェルプレートに入れ、２０μＭのＡβ２５−３０と、１、１０、５０μＭのＰＥＰ１とで４８時間処理した。細胞は、ＤＰＢＳで洗浄した後、細胞培地に交換した。１４日後、細胞を、再びＤＰＢＳで洗浄した後、メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットの溶液で、常温で３０分間染色した。染色後に、プレートを、ＤＰＢＳで洗浄した後、乾燥した。コロニー個数は、実体顕微鏡により観察し、コロニーのうち、２ｍｍ以下で、微かに染色された部分は、除去した。
【０１０６】
実施例２−５：アポトーシスを観察するためのＴＵＮＥＬ染色法
神経幹細胞を、直径１３ｍｍのコラーゲン−コーティングされたガラスのカバースリップに入れ、次のような条件に応じて、グループに分けた：１）Ａβ２５−３０及びＰＥＰ１で処理、２）２０μＭのＡβ２５−３０のみで処理、３）２０μＭのＡβ２５−３０及び濃度別（１、１０、５０、１００μＭ）の ＰＥＰ１で処理。各条件で４８時間処理を行った。
【０１０７】
細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。
【０１０８】
ＴＵＮＥＬ染色法は、アポトーシスを確認するための方法である。無傷の凝縮された破片の核を観察するために、ＴＵＮＥＬ染色が終わった細胞は、核を染色するために、２０分間、１００μg／ｍｌのＤＡＰＩで処理し、ＤＡＰＩが混合されたマウンティング培地のあるグラススライド上に載せた。
【０１０９】
細胞は、蛍光顕微鏡上で観察し、ＤＡＰＩとＴＵＮＥＬとが該当する刺激蛍光波長で観察した。
【０１１０】
実施例２−６：細胞移動観察法
細胞移動観察法は、ＱＣＭ‐２４ウェル細胞移動法キットを用いて行った。簡単に説明すると、２０μＭのＡβ２５−３０及び濃度別（１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１を、下側のチャンバー内に入れ、上側のチャンバーには、３ｘ１０５個の神経幹細胞を入れて、３７℃で２４時間培養した。神経幹細胞は、膜の方へ移動し、移動された細胞数を観察するために、染色をした後、５６０ｎｍで吸光度により観察した。
【０１１１】
実施例２−７： ＰＥＰ１の神経幹細胞への浸透過程の確認
神経幹細胞は、ウェル当りの１ｘ１０５個の密度で入れた。この細胞を２０μＭのＡβ２５−３０に露出させ、対照群と共に、１μＭのＦＩＴＣ‐ラベルのＰＥＰ１で、０〜２４時間処理の後、ミトコンドリアと細胞膜とに染色されたことを観察した。ミトコンドリア染色は、１００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＦＭで、１０分間３７℃で染色し、細胞膜の染色は、１μＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｋｅｒ ＣＭ−Ｄｉｌで、５分間３７℃で染色した。染色が終わった後、細胞は、細胞培地で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで、常温で１５分間固定した。この後、ＰＢＳで数回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有のマウンティング培地のあるガラススライド上に、サンプルを載せた。細胞は、蛍光顕微鏡で観察し、適切な刺激波長を使用した。
【０１１２】
実施例２−８：活性酸素生成の観察
神経幹細胞を、２０μＭのＡβ２５−３０で４８時間処理し、活性酸素を測定するために、ＤＣＦＨ−ＤＡで１５分間染色した。神経幹細胞を、濃度別のＰＥＰ１と、２０μＭのＡβ２５−３０とで４８時間処理した。培養の後、１０μＭのＤＣＦＨ−ＤＡを用いて、３７℃で１５分間染色し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。ＤＣＦＨ−ＤＡは、自由に細胞膜を通過し、細胞内のエステラーゼにより、ＤＣＦに分解される。従って、ＤＣＦの蛍光値は、細胞内の過酸化水素（ＲＯＳ）のレベルを意味する。ＤＣＦの蓄積は、４９０ｎｍでの吸光度と、６９０ｎｍでの参考吸光度により、リーダーを通じて観察した。フローサイトメトリーは、ＡｃｃｕｒｉTM Ｃ６フローサイトメーターで観察して分析した。
【０１１３】
Ａβ２５−３０と、ＰＥＰ１とが、活性酸素（ＲＯＳ）に及ぼす影響を調べるために、細胞のない方式であるセルフリー方式で、ＤＨＢＡ量を測定して観察した。この方法は、２０μＭのＡβ２５−３０及び濃度別（０、１、１０、５０μＭ）の ＰＥＰ１が含まれたチューブで、ＨＰＬＣによりＤＨＢＡ量を観察する方式で行われた。
【０１１４】
実施例２−９：ミトコンドリアの酸化的ＤＮＡ損傷の観察法
ミトコンドリアの酸化的ＤＮＡ損傷の観察法は、８−ＯＨｄＧ ＥＬＩＳＡキットを用いて実施した。ミトコンドリアＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ分離キットを用いて得られた。サンプルと、対照群とに、８−ＯＨｄＧ単一抗体を加え、当該ＨＲＰ付きの２次抗体を加えた。サンプルは、８−ＯＨｄＧを用いて定量し、４５０ｎｍでの吸光度を用いて観察した。
【０１１５】
実施例２−１０：ミトコンドリア細胞膜電位の測定法
神経幹細胞を、ウェル当りの５ｘ１０５個の密度で、９６ウェルプレートに入れた。この細胞を、２０μＭのＡβ２５−３０及び濃度別（１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１を加えて、３７℃で４８時間処理した。
【０１１６】
ミトコンドリア細胞膜電位は、ＪＣ−１ミトコンドリア細胞膜電位観察キットを用いて測定した。ミトコンドリア細胞膜電位は、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて観察した。健常細胞は、ローダミン波長と、テキサスレッド波長とで観察して、殆どＪＣ−１が凝集していることを確認した。死滅された細胞又は健康でない細胞の場合、ＦＩＴＣ波長で観察して、ＪＣ−１がモノマー状態であることを確認した。
【０１１７】
実施例２−１１：アデノシントリフォスフェート測定法
アデノシントリフォスフェート（ＡＴＰ）濃度は、ＡＴＰ測定キットを用いて観察し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いた。ＡＴＰ濃度は、刺激／排出波長５３５／５８７ｎｍで観察した。
【０１１８】
実施例２−１２：タンパク質解析
タンパク質サンプルの用意
培養した神経幹細胞を、冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、超音波発生装置（sonicator） を用いて、ライシスバッファー（lysis buffer）中で１０秒間、細胞を破砕した。そして、さらに1時間、常温で細胞を破砕した。１５１℃で1時間、１５０００ｇで遠心分離の後、非水溶性サンプルを除去し、水溶性サンプルのみを、２次元電気泳動に適用した。タンパク質の濃度は、ブラッドフォード法（ Bradford method）により定量した。
【０１１９】
２次元ポリアクリルアミド電気泳動
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐゲル上に、２００μｇのタンパク質サンプルをかけた。電子焦点は、２０℃で実施した。電子焦点のために、サンプルが、ゲルの内に流入するように、電圧を３時間が超えるように、１５０ボルトから３５００ボルトに増加させた。２次元に入り込む前に、サンプルを、１０分間、平衡バッファーで培養した。平衡バッファー中に含まれているサンプルは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの内に浸透するが、ホッパー２Ｄシステムを用いて観察し、条件は、２０℃で１７００砲を用いた。
【０１２０】
イメージ分析
定量分析のために、ＰＤＱｕｅｓｔを用いた。各スポットの量を測定するために、全体のスポットで定量化した。タンパク質スポットは、２倍以上増加したものを選択した。
【０１２１】
ペプチド質量指紋法
ペプチド質量指紋法によりタンパク質を確認するために、タンパク質スポットを切り出し、トリプシンで溶解した後、５０％アセトニトリル中のα-シアノ‐４−ヒドロキシケイ皮酸／０．１％ＴＦＡとよく混ぜた後、マルジトプロ分析を行った。
【０１２２】
スペクトルは、スペクトル当たりの３００丈から得て、トリプシンを用いた自動分解ピークにより補正を行った。ピークリストは、Ｆｌｅｘ分析システムにより補正した。ピークの検出は、以下のように、限界点を用いて行った。Ｓ／Ｎのために、モノアイソトピック質量の最小限の解像度を選択した。分析プログラムであるＭＡＳＣＯＴで観察することで、質量指紋法により見付けられたタンパク質を確認した。データベース検索に使用されたパラメータは、次のようである：分解酵素のトリプシン、見逃された分解の最大値、完成された変化の値Ｃｙｓ、部分変化の値、 Ｍｅｔ、モノアイソトピック質量、質量の寛容。
【０１２３】
ペプチド質量指紋法は、蓋然性のあるタンパク質スコアに応じて分類した。
【０１２４】
実施例２−１３：抗体マイクロアレイ
抗体マイクロアレイは、パノラマ抗体マイクロアレイ細胞内シグナル伝達キットを用いて観察した。簡単に説明すると、１．５ｘ１０７細胞を、１００ｍｍのディシーに入れて、２０μＭのＡβ２５−３５及び１０μＭのＰＥＰ１で、４８時間処理した。細胞を集めて、タンパク質細胞を用意した。タンパク質サンプルは、Ｃｙ３、Ｃｙ５でラベルを付けて、抗体マイクロアレイを行った。アレイスライドは、スキャナーにより読み取り、スキャン本をもって、分析プログラムにより分析した。
【０１２５】
実施例２−１４：ウェスタンブロット及び免疫染色
ウェスタンブロットには、以下の抗体を用いた： Ｋｉ６７（1:200 abcam）、Ｐ８５ａ（1:1000、milipore）、ｐＡＫＴ（ser473、1:500、Cell signaling）、ＧＳＫ−３ｂ（ser9、1:1000. Santa cruz  biotech）、ＨＳＴＦ−１（1:1000、Santa Cruz）、ａｎｔｉ−Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ‐２（1:1000、Cell  signaling）、ＨＭＧＢ−１（1:500、cell signaling）、Ｂａｘ（1:1000、cell signaling）、Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（1:200、cell signaling）、Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ３（Asp175、1: 1000、cell  signaling）、c−Ｍｙｃ（1: 1000、cell signaling）、ＧＦＰ（1: 1000、cell signaling）、ｈＴＥＲＴ(1:500、santa cruz）、ｒＴＥＲＴ（1:500、santa cruz）。
【０１２６】
細胞内シグナル伝達システムを確認するために、ウェスタンブロットを、４８時間処理の後に行った。
【０１２７】
ミトコンドリアと、細胞質内のタンパク質とを得るために、ミトコンドリア／細胞内分離キットを用いた（Abcam）。全てのブロットは、ＥＣＬソリューションを用いて観察し、観察されたイメージは、分析プログラムを用いて分析した。
【０１２８】
免疫染色の場合、細胞内の発現及び位置を確認するために行われた。免疫染色には、以下のような抗体を用いた：Ｋｉ６７（1:100 abcam）、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（1 mg/mL; Abcam）、ＧＦＡＰ（rabbit anti-glial fibrillary acidic protein）(1:5000; Abcam）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｔｕｊ１（1 mg/mL; Abcam）、 ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＧａｌＣ（1 mg/mL;  Millipore）、and ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ＨＭＧＢ１（1:100; Cell Signaling）。
【０１２９】
データは、オリンパス蛍光顕微鏡で観察し、適切な蛍光を用いた。
【０１３０】
実施例２−１５：アネクシン‐５、ヨウ化プロピジウム観察法（アポトーシスを観察するための実験法）
アネクシン‐５及びヨウ化プロピジウム観察法は、ＦＩＴＣアネクシン‐５アポトーシスキットを用いて行った。簡単に説明すると、採集した大脳皮質を、２０μＭのＡβ２５−３５及び濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で処理した後、それぞれ３７℃で、４８時間培養した。細胞を、冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、１ｘバインディングバッファーと混ぜた。その後、１００μＬ中、１ｘ１０５個の細胞を、１．５ｍｌのチューブに入れた後、５μＬのＦＩＴＣラベルのアネクシン‐５と、１０μＬのヨウ化プロピジウムとを加えた。常温で、１５分間培養した後、４００μＬのバインディングバッファーを加えて、フローサイトメーターを用いて分析した。
【０１３１】
実施例２−１６：テロメラーゼ逆転写酵素の過発現
プラスミドベクター
ｈＴＥＲＴ−ＧＦＰ間のベクターと、シャトルベクターとを、オリジンテクノロジーから購入した。
【０１３２】
ネオン遺伝子の導入
遺伝子導入のために、ヒト幹細胞（H9 hESCs、GIBCO）を用意した。単一細胞として分離した後、２０μＬのネオンバッファー‐Ｒと共に混ぜた。直流高電圧をかけて、遺伝子の導入を試みる電気穿孔（electroporation）をするために、細胞と１μｇのＴＥＲＴとを、滅菌のチューブに入れた。ネオンチップを、ネオンパイペットの内に入れた後、ＤＮＡと細胞との混合体を、チップ内に滴ができないように、押し込んだ。ネオンパイペットは、３ｍＬのネオン電気分解バッファーＥのあるネオンチューブに挿入した。１３００ボルトで、一度に電気衝撃を与えた。衝撃の後、細胞を素早く、ＳｔｅｍＰｒｏ ＮＳＣ ＳＦＭ中のＣｅｌｌ−ｓｔａｒがコーティングされた培養プレートに移った。
【０１３３】
実施例２−１７：統計分析
全てのデータは、各々の実験を５回実施して、統計分析を行い、Ｐ値が０．０５未満の場合、有意的な実験値であると判断した。
【０１３４】
実施例３：細胞段階におけるＰＥＰ１の神経損傷防止及び再生効果の分析
実施例３−１：Ａβ２５−３５及びＰＥＰ１の神経幹細胞の生存能力、増殖及び移動に対する影響の評価
本研究者らは、濃度別（０、２．５、５、１０、２０、４０μＭ）のＡβ２５−３５で４８時間、神経幹細胞を処理して、神経幹細胞の生存能力、増殖及び移動への影響を確認した。細胞生活性は、ＣＣＫ‐８、ＭＩＴ及びＬＤＨアッセイで測定した。これと共に、神経幹細胞の増殖を、ＢｒｄＵ及びＣＦＵアッセイで評価した。Ａβ２５−３５で処理した後、細胞生存能力及び増殖が、濃度依存的に顕著に減少した。しかし、増殖は、生存能力と比べて、Ａβ２５−３５のより低い濃度で減少された（図１参照）。
【０１３５】
本研究者らは、ＰＥＰ１単独の神経幹細胞に及ぼす影響を研究するために、神経幹細胞を、濃度別（０、１、１０、５０、１００、２００μＭ）のＰＥＰ１で処理した。細胞生存能力及び増殖は、ＣＣＫ‐８及びＢｒｄＵアッセイで測定されたように、１００μＭまでの濃度で影響を受けなかった（図２参照）。
【０１３６】
Ａβにより誘導されたストレス環境の下で、ＰＥＰ１の神経幹細胞への影響を評価するために、神経幹細胞を、４８時間、２０μＭのＡβ２５−３５に露出させ、同時に、濃度別（０、１、１０、５０、１００μＭ）のＰＥＰ１で処理した。神経幹細胞の生存能力を、 ＭＴＴ、ＣＣＫ−８及びＬＤＨ分析で測定し、ＢｒｄＵ及びＣＦＵアッセイで、増殖を測定した。２０μＭのＡβ２５−３５のみで処理した神経幹細胞と比較して、２０μＭのＡβ２５−３５と、ＰＥＰ１との共同処理（１００μＭまで）は、濃度依存的に神経幹細胞の生存能力及び増殖を、漸進的に増加させた（図３〜図６参照）。
【０１３７】
ＤＡＰＩ及びＴＵＮＥＬ染色を用いて、Ａβにより誘導された神経幹細胞のアポトーシスに対するＰＥＰ１の影響を測定した。百分率で表した神経幹細胞のアポトーシスの程度は、２０μＭのＡβ２５−３５を用いて、４８時間処理したとき、顕著に増加したが（ｐ＜０．０１）、ＰＥＰ１との共同処理（１００μＭまで）により、顕著に減少した（ ｐ＜０．０５）（図７〜図８参照；図７の明るい部分が、ＴＵＮＥＬ染色の神経幹細胞である）。
【０１３８】
幹細胞の重要な特徴である幹細胞の移動性が、Ａβ及びＰＥＰ１により影響を受けるかを調べるために、神経幹細胞を、２０μＭのＡβ２５−３５及び濃度別（０、１、１０、５０μＭ）のＰＥＰ１で、４８時間処理した。次いで、移動分析キットを用いて、移動能力を評価した。２０μＭのＡβ２５−３５による処理の結果、神経幹細胞の移動能力は、減少したが、様々な濃度のＰＥＰ１処理は、効果的に移動を回復させた（図９参照）。
【０１３９】
実施例３−２：神経幹細胞内へのＰＥＰ１の透過
ＰＥＰ１が、神経幹細胞を通過する能力を分析するために、１０μＭのＦＩＴＣ‐標識のＰＥＰ１及び／又は２０μＭのＡβ２５−３５を用いて、神経幹細胞を処理した。実験の結果より、ＰＥＰ１は、正常的な環境の下で、効果的に神経幹細胞に浸透し、主に細胞質及びミトコンドリアに局所化した。細胞内のＰＥＰ１の量は、時間依存的に増加した。しかし、神経幹細胞が、２０μＭのＡβ２５−３５による処理で損傷されたとき、一部のＰＥＰ１は、核内に浸透することを示している（図１０〜図１３参照；図１０〜図１３の明るい部分が、ＦＩＴＣ‐標識のＰＥＰ１である）。
【０１４０】
実施例３−３：Ａβ２５−３５による活性酸素の生成及び酸化的ミトコンドリアＤＮＡの損傷に対するＰＥＰ１の効果
ＰＥＰ１が細胞内に浸透する能力を観察した後、ＰＥＰ１が、活性酸素の阻害効果を示すかを調べた。Ａβ２５−３５による酸化的ストレスを誘導し、神経幹細胞の細胞死を、ＰＥＰ１が効果的に阻害することを考慮して、本発明では、ＰＥＰ１が抗酸化剤の効果があるかを調べた。その結果、ＰＥＰ１が、顕著に、Ａβ２５−３５により誘導された活性酸素の量を減少することを示した（図１４又は図１５参照）。本発明において、Ａβ２５−３５によるＲＯＳ産生に対するＰＥＰ１の直接な効果を、もう一度確認しようとしたが、細胞のない条件で、βアミロイドと、ＰＥＰ１の両方とも、ＲＯＳ産生に顕著な影響は与えないと示している（図１６参照）。酸化的ストレスによるミトコンドリアＤＮＡの損傷は、同様に測定した。その結果、酸化的なミトコンドリアＤＮＡの損傷は、Ａβ２５−３５で処理したとき、有意的に増加し、ＰＥＰ１処理の場合、効果的に酸化的ミトコンドリアＤＮＡの損傷が減少されることが分かった（図１７参照）。
【０１４１】
実施例３−４： ＰＥＰ１のＡβ２５−３５により損傷を受けた神経幹細胞ミトコンドリアへの影響
Ａβ２５−３５毒性により損傷を受けた神経幹細胞ミトコンドリアに対するＰＥＰ１の効果を観察するために、本研究チームは、ミトコンドリア細胞膜電位と、ＡＴＰレベルとを測定した。神経幹細胞において、ミトコンドリア細胞膜電位は、Ａβ２５−３５により減少され、ＰＥＰ１は、定常範囲の数値まで、細胞膜電位を回復させた（図１８〜図２０参照）。ＡＴＰレベルは、Ａβ２５−３５により減少されており、ＰＥＰ１は、有意的にＡＴＰレベルを回復させた（図２１参照）。
【０１４２】
実施例３−５：細胞内のタンパク質レベルに対するＡβ２５−３５及びＰＥＰ１の効果
神経幹細胞において、細胞内のタンパク質の産生に対するＡβ２５−３５及びＰＥＰ１の効果を調べるために、タンパク質解析の研究を行った。Ａβ２５−３５により変化された多様なタンパク質の生成と、ＰＥＰ１処理の際に回復されたタンパク質を定量化した。抗体マイクロアレイは、タンパク質のリン酸化パターンを観察すために行われ、その結果、増殖に関連する様々なリン酸化タンパク質が、Ａβ２５−３５により減少され、ＰＥＰ１により回復されることが示された（図２２〜図２５参照；図２４の明るい部分が、炎症反応、ＴＣＡサイクル、細胞移動、ＧＰＣＲなどに関連したスポットである）。
【０１４３】
本発明の発明者らは、ウェスタンブロットと免疫染色とを通じて、Ａβ２５−３５及びＰＥＰ１により誘導された幾つかのタンパク質の免疫反応を直接的に観察した。神経幹細胞において、増殖能力に関連したタンパク質のｋｉ６７は、Ａβ２５−３５により減少されたが、ＰＥＰ１により濃度依存的に増加することを示した。増殖に関連したタンパク質のＰ８５ａＰＩ３Ｋ、ｐＡＫＴ（Ｓｅｒ３２７）、リン酸化ＧＳＫ３−３ｂ（Ｓｅｒ９）、ＨＳＴＦ−１、細胞質内ＨＭＧＢ−１は、Ａβ２５−３５により減少されたが、ＰＥＰ１により回復されることが示された。反面、死滅関連のタンパク質であるＢａｘ、細胞質内チトクロームＣ、ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３は、Ａβ２５−３５により増加し、ＰＥＰ１により有意的に減少された。細胞質内ＨＭＧＢ‐１の発現は（免疫染色から観察された）、Ａβ２５−３５により減少されたが、ＰＥＰ１で同時処理する場合、ＨＭＧＢ−１の発現は、濃度依存的に回復された（図２６〜図３０参照；図３０の明るい部分が、ＨＭＧＢ−１発現関連の免疫染色部分である）。
【０１４４】
損傷を受けたニューロンの細胞内シグナル伝達タンパク質に対するＰＥＰ１の効果を調べた結果、増殖関連のタンパク質は多く観察され、死滅関連のタンパク質は、少なく観察された（図３１〜図３４参照）。
【０１４５】
実施例３−６：Ａβ２５−３５毒性により誘導されたＰＩ３Ｋ経路を通じた神経保護に対するＰＥＰ１効果の評価
Ａβ２５−３５毒性により誘導されたＰＩ３Ｋ経路を通じた神経保護に対するＰＥＰ１の効果を調べるために、神経幹細胞は、以下のように四つの群に分けた：対照群（1群）、２０μＭのＡβ２５−３５で４８時間処理した群（２群）、２０μＭのＡβ２５−３５及び１０μＭのＰＥＰ１で４８時間処理した群（３群）、１０μＭのＬＹ２９４００２で４９時間処理した後、２０μＭのＡβ２５−３５及び１０μＭのＰＥＰ１で４８時間処理した群（４群）。
【０１４６】
実験の結果より、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２で、前処理した４群において、神経幹細胞の生存能力は、３群に比べて、約１６％減少したと示され（図３５参照）、これにより、ＰＩ３Ｋ経路が、ＰＥＰ１の神経保護効果と関連していることが類推できた。
【０１４７】
実施例３−７：Ａβ２５−３５毒性による神経幹細胞の分化に対するＰＥＰ１の影響の評価
Ａβ２５−３５毒性による神経幹細胞の多様な分化段階別のＰＥＰ１の影響を評価するために、本発明の発明者らは、培養培地を、ｂＦＧＦの無いＮ２培地に交替することにより、神経細胞の分化を誘導した。分化の前に、特別の事項がなくても、Ｎｅｓｔｉｎと、Ｋｉ６７との免疫反応は、分化後には現れなかった。しかし、多数のＧＦＡＰ−陽性細胞と、ＮｅｕＮ‐陽性細胞とは、分化後に増加した。また、Ａβ２５−３５の処理は、神経幹細胞が、ＧＦＡＰ‐陽性細胞に分化する傾向を増加させ、ＮｅｕＮ‐陽性細胞に分化することを減少すると示した。しかし、ＰＥＰ１の処理時、反対の効果が観察された（図３６〜図４８参照；図３６の明るい部分が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７発現関連の免疫染色部分、図３７の明るい部分が、Ｎｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰ、ＤＡＰＩ発現関連の免疫染色部分、図３８の明るい部分が、ＮｅｕＮ、ＤＣＸ、ＤＡＰＩ発現関連の免疫染色部分、図３９の明るい部分が、Ｔｕｊ１、ＤＡＰＩ発現関連の免疫染色部分、図４０の明るい部分が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｋｉ６７、ＤＡＰＩ発現関連の免疫染色部分、図４３の明るい部分が、ＧａｌＣ、ＧＦＡＰ、ＤＡＰＩ発現関連の免疫染色部分、図４６の明るい部分が、ＮｅｕＮ、ＤＡＰＩ発現関連の免疫染色部分）。
【０１４８】
実施例３−８：ヒト神経幹細胞におけるｈＴＥＲＴ過発現への効果の評価
ＰＥＰ１の効果が、ｈＴＥＲＴの外部‐テロメラーゼ活性と直接に関連のあるか否かを確認するために、本発明者らは、ヒト神経幹細胞でｈＴＥＲＴ過発現を誘導した。ｈＴＥＲＴが過発現されたが、ヒト神経幹細胞の生存能力は、遺伝子の導入により減少された。タンパク質解析的結果から、ＰＥＰ１処理により影響を受けた類似のタンパク質が、ｈＴＥＲＴ過発現によっても影響を受けることが示された（図４９〜図５４参照）。
【０１４９】
実施例４：動物モデル（3XTg-AD）におけるＰＥＰ１の神経の損失予防及び再生の効果分析
実施例４−１：実験のための動物モデルの用意及び実験設計
アルツハイマー疾患におけるＰＥＰ１の効力をテストするために、ジャッソン実験室（Jackson Laboratory）から、アルツハイマー形質転換のマウス（3XTg-AD）を購入した。この形質転換のマウスの遺伝的特性は、以下のようである：Ｂ６；１２９−Ｐｓｅｎ１ｔｍ１Ｍｐｍ Ｔｇ（APPSwe、 TauP301L）１Ｌｆａ、Ｍｍｊａｘ。８週令の前記形質転換のマウスを分譲して、予備飼育した後、形質転換のマウスの個体数を増やすために、オスとメスとの割合を１：２にして、ケージに保管し、約７〜８日の経過後に分離し、約７〜８週間を待ちながら、妊娠の可否を観察する。妊娠が確認されたマウスは、１週が過ぎた後、出産し、３週間の離乳過程を経た。そして、２週の経過後、成熟のマウスを得ることができた。
【０１５０】
予備飼育及び実験全体の期間の間、温度２３±２℃、相対湿度６０±１０％を維持し、１２時間の明暗周期を守って飼育した。実験動物は、５個の群に区分して、各群毎に１０匹ずつ配置した。区分した実験群は、以下の通りである。
１群：生理食塩水の投与、２群：ＰＥＰ１を０．０１ｍｇ／ｋｇ投与、３群：ＰＥＰ１を１ｍｇ／ｋｇ投与、４群：Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌを１ｍｇ／ｋｇ投与した陽性対照群、５群：スクランブルペプチド（１６個のアミノ酸長さのランダムペプチド）を投与。
【０１５１】
ＰＥＰ１及び生理食塩水、Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ、スクランブルペプチドは、１２ケ月の時から、二ケ月間、１週に３回ずつ、各濃度別に皮下注射した後、２ケ月後に、認知機能と記憶機能の向上程度を調べる認知／記憶行動実験（受動回避実験及びＹ  ｍａｚｅ）を行った。その後、脳を摘出して、海馬を分離した後、海馬及び脳全体におけるアミロイドβの量と、アミロイドβオリゴマー及びタウの過リン酸化による神経原線維変化（ＮＦＴ、 neurofibrillary Tangles）の量を、ウェスタンブロット方法と、免疫染色方法とを用いて確認した。また、様々な脳内のＰＥＰ１による特定のタンパク質の変化を、ウェスタンブロットにより観察した。
【０１５２】
実施例４−２：海馬及び脳の全域における多くのタンパク質の免疫染色法の分析法
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行った後、再び４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）で再灌流して固定した。４％パラで固定した脳を取り出して、４％パラホルムアルデヒドを含有する１５ｍｌのチューブに入れた。このように放置した脳を、翌日、３０％スクロース（sucrose）に入れる。脳が、３０％スクロース中に沈降するまで待つ。固定された組織は、Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンドを用いて、−２０℃で組織を凍結した。凍結した組織は、Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて、厚さ２０μｍと切り出す。切り出した組織切片を、０．０１ＭのＰＢＳと５０％エタノールとの混合物で、３０分間処理して、抗体が組織内へよく湿潤するようにした。０．３％過酸化水素で１０分間処理して、組織に内在しているパーオキシダーゼ（ peroxidase）活性を除去した。この組織切片を、１０％ノーマルセラム（ N/S、normal serum）中で１時間放置した。その後、０．５％Ｎ／Ｓで希釈した一次抗体が含まれた溶液に、一日中、４℃で放置した。
【０１５３】
免疫蛍光染色に用いた一次抗体は、次の通りである：anti-β-amyloid（D54D2）(1:100、 Cell signaling、Beverly、MA、USA）、anti-oligomer β-amyloid（1:100、Millipore）、anti-Tau（2μg/ml、Invitrogen）、anti-NeuN（1:100、Millipore）、anti-DCX(1:100、Cell Signaling）、anti-Tuj1（2μg/ml、Abcam）、anti-GFAP（1:1000、Abcam） andanti-GalC（1:000、 Millipore）。
【０１５４】
その後、組織切片を、２次抗体が含まれた溶液中で２時間放置した。このとき、使われた２次抗体は、次のようである：goat-anti-rabbit Alexa Fluor 488（Molecular Probes）、anti-rabbit tetramethylrhodamine（Molecular Probes）and goat-anti-mouse Alexa Fluor  488（Molecular Probes）。
【０１５５】
組織切片を、ＰＢＳで３回洗浄した後、ガラススライドの上に載せ、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング培地（Vector Laboratories）を用いて、マウンティングした。その後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１５６】
実施例４−３：ＰＥＰ１の ＮｅｕＮ 発現への影響の評価
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行い、全血を除去した。その後、脳を摘出し、海馬部位と全体の脳部位とに分離し、脳組織を得て、液体窒素で急激に凍結した。その後に、組織を粉砕し、ライシスバッファー（lysis  buffer, 1X RIPA II cell lysis buffer, 1mM sodium orthovanadate(Na3VO4), 100mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF), 1mM sodium fluoride(NaF), 1XProtease Inhibitor cocktail）を加えて、組織を溶解した。得られたタンパク質の量を定量し、同量（３５μｇ）のライセート（lysate）をもって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動されたタンパク質を、トランスファー（transfer）した。トランスファーしたタンパク質付着のＰＶＤＦ膜を、先に２％脱脂乳（skim milk）中で１時間放置した後、５％ＢＳＡ中に１：１０００で希釈されたＮｅｕＮ（Neuronal Nuclei、MAB377、Millipore）抗体溶液中に、一日中４℃で放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴＢＳ／Ｔで洗浄し、１：３０００で希釈されたＨＲＰのコンジュゲート抗マウス（anti-mouse）ＩｇＧ抗体を用いて、１時間放置した。ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、West-Q Chemiluminescent  Substrate Plus Kit（GenDEPOT、TX、USA）を用いて発光した後、イメージ分析器（image analyzer）によりイメージのバンド強度を分析した。
【０１５７】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、同量のＰＥＰ１処理の時、ＮｅｕＮを、海馬及び脳の全域（whole brain）で、増加させることが示された（図５５参照）。核タンパク質の分裂の後期に発現されて、成熟の神経細胞を示すマーカーであるＮｅｕＮが、ＰＥＰ１により多く発現されるのは、成熟の神経細胞が、ＰＥＰ１により多く生成できることを示すと言える。
【０１５８】
実施例４−４：ＰＥＰ１のＤＣＸ発現への影響の評価
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行い、全血を除去した。その後、脳を摘出し、海馬部位と全体の脳部位とに分離し、脳組織を得て、液体窒素で急激に凍結した。その後に、組織を粉砕し、ライシスバッファー（1X RIPA II cell lysis buffer, 1mM sodium orthovanadate(Na3VO4), 100mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF), 1mM sodium fluoride(NaF), 1XProtease Inhibitor cocktail）を加えて、組織を溶解した。得られたタンパク質の量を定量し、 同量（３５μｇ）のライセートをもって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動されたタンパク質をトランスファー（transfer）した。トランスファーしたタンパク質付着のＰＶＤＦ膜を、先に２％脱脂乳（skim milk）中で１時間放置した後、５％ＢＳＡ中に１：１００００で希釈されたＧＦＡＰ（ab7260、 Abcam）抗体溶液中に、一日中４℃で放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴＢＳ／Ｔで洗浄し、１：３０００で希釈されたＨＲＰのコンジュゲート抗ラビットＩｇＧ抗体を用いて、１時間放置した。ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、West-Q Chemiluminescent  Substrate Plus Kit（GenDEPOT、TX、USA）を用いて発光した後、イメージ分析器によりイメージのバンド強度を分析した。
【０１５９】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、同量のＰＥＰ１処理の時、ＤＣＸを、海馬及び脳の全域で、増加させることが示された（図５６〜図５７参照；図５７の明るい部分が、ＤＣＸ 、ＮｅｕＮ発現関連の免疫染色部分である）。神経細胞の前駆体で発現される未成熟神経細胞の神経前駆体で多く発現されるＤＣＸが、ＰＥＰ１により多く発現されることから、ＰＥＰ１により、初期神経細胞前駆体が多く発現されるので、ＰＥＰ１が神経細胞の増殖に影響を与え得ることが言える。
【０１６０】
実施例４−５：ＰＥＰ１のＴｕｊ１発現への影響の評価
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行い、全血を除去した。その後、脳を摘出し、海馬部位と全体の脳部位とに分離し、脳組織を得て、液体窒素で急激に凍結した。その後に、組織を粉砕し、ライシスバッファー（1X RIPA II cell lysis buffer, 1mM sodium orthovanadate(Na3VO4), 100mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF), 1mM sodium fluoride(NaF), 1XProtease Inhibitor cocktail）を加えて、組織を溶解した。得られたタンパク質の量を定量し、同量（３５μｇ）のライセートをもって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動されたタンパク質をトランスファー（transfer）した。トランスファーしたタンパク質付着のＰＶＤＦ膜を、先に２％脱脂乳（skim milk）中で１時間放置した後、５％ＢＳＡ中に１：１００００で希釈されたＴｕｊ１（ab18207、Abcam）抗体溶液中に、一日中４℃で放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴＢＳ／Ｔで洗浄し、１：３０００で希釈されたＨＲＰのコンジュゲート抗ラビット（anti-rabbit）ＩｇＧ抗体を用いて、１時間放置した。ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、West-Q Chemiluminescent  Substrate Plus Kit（GenDEPOT、TX、USA）を用いて発光した後、イメージ分析器によりイメージのバンド強度を分析した。
【０１６１】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、同量のＰＥＰ１処理の時、Ｔｕｊ１を、海馬及び脳の全域で、増加させることが示された（図５８〜図５９参照；図５９の明るい部分が、Ｔｕｊ１発現関連の免疫染色部分である）。分裂の最中である神経細胞の前駆体又は新しく生成された未成熟の後分裂期の神経細胞で発現されると知られたＴｕｊ１が、ＰＥＰ１により多く発現されることから、ＰＥＰ１の投与は、新しい神経細胞の分裂、生成、分化の誘導に影響を与えることが言える。
【０１６２】
実施例４−６：ＰＥＰ１の ＧＦＡＰ発現への影響の評価
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行い、全血を除去した。その後、脳を摘出し、海馬部位と全体の脳部位とに分離し、脳組織を得て、液体窒素で急激に凍結した。その後に、組織を粉砕し、ライシスバッファー（1X RIPA II cell lysis buffer, 1mM sodium orthovanadate(Na3VO4), 100mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF), 1mM sodium fluoride(NaF), 1XProtease Inhibitor cocktail）を加えて、組織を溶解した。得られたタンパク質の量を定量し、同量（３５μｇ）のライセートをもって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動されたタンパク質をトランスファー（transfer）した。トランスファーしたタンパク質付着のＰＶＤＦ膜を、先に２％脱脂乳（skim milk）中で１時間放置した後、５％ＢＳＡ中に１：１００００で希釈されたＧＦＡＰ（ab7260、Abcam）抗体溶液中に、一日中４℃で放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴＢＳ／Ｔで洗浄し、１：３０００で希釈されたＨＲＰのコンジュゲート抗ラビット（anti-rabbit）ＩｇＧ抗体を用いて、１時間放置した。ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、West-Q Chemiluminescent  Substrate Plus Kit（GenDEPOT、TX、USA）を用いて発光した後、イメージ分析器によりイメージのバンド強度を分析した。
【０１６３】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、同量のＰＥＰ１処理の時、ＧＦＡＰ を、海馬及び脳の全域で、減少させることが示された（図６０参照）。中枢神経系のアストロサイトで発現されるＧＦＡＰは、過発現又は異常発現の時、神経膠症（gliosis）などの疾患を引き起こすが、知保誘導の動物モデルにおいて、過発現されているＧＦＡＰが、ＰＥＰ１の投与により減少することから、ＰＥＰ１が神経系疾患の発生を予防及び減少する効果を有することが分かる。
【０１６４】
実施例４−７：ＰＥＰ１のＧａｌｃ発現への影響の評価
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行い、全血を除去した。その後、脳を摘出し、海馬部位と全体の脳部位とに分離し、脳組織を得て、液体窒素で急激に凍結した。その後に、組織を粉砕し、ライシスバッファー（1X RIPA II cell lysis buffer, 1mM sodium orthovanadate(Na3VO4), 100mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF), 1mM sodium fluoride(NaF), 1XProtease Inhibitor cocktail）を加えて、組織を溶解した。得られたタンパク質の量を定量し、同量（３５μｇ）のライセートをもって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動されたタンパク質をトランスファー（transfer）した。トランスファーしたタンパク質付着のＰＶＤＦ膜を、先に２％脱脂乳中で１時間放置した後、５％ＢＳＡ中に１：５００で希釈されたＧａｌＣ（Galactocerebroside、MAB342、Millipore）抗体溶液中に、一日中４℃で放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴＢＳ／Ｔで洗浄し、１：３０００で希釈されたＨＲＰのコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、１時間放置した。ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、West-Q Chemiluminescent  Substrate Plus Kit（GenDEPOT、TX、USA）を用いて発光した後、イメージ分析器によりイメージのバンド強度を分析した。
【０１６５】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、同量のＰＥＰ１処理の時、ＧａｌＣを、海馬及び脳の全域で、増加させることが示された（図６１及び図６２参照；図６２の明るい部物が、ＧＦＡＰ、ＧａｌＣ、ＤＡＰＩ発現関連の免疫染色部分である） 。ＧａｌＣは、ガラクトース（galactose）を除去する酵素であり、オリゴデンドロサイト（oligodendrocyte）のマーカーとして、神経幹細胞が、オリゴデンドロサイトに分化したことが分かるが、ＰＥＰ１がＧａｌＣを増加させることから、健康な神経細胞に必要なオリゴデンドロサイトの形成に、ＰＥＰ１が影響を与えることが分かる。
【０１６６】
実施例４−８： 全Ａβ(アミロイドβ）の発現量に及ぼすＰＥＰ１の影響の評価
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行い、全血を除去した。その後、脳を摘出し、海馬部位と全体の脳部位とに分離し、脳組織を得て、液体窒素で急激に凍結した。その後に、組織を粉砕し、ライシスバッファー（1X RIPA II cell lysis buffer, 1mM sodium orthovanadate(Na3VO4), 100mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF), 1mM sodium fluoride(NaF), 1XProtease Inhibitor cocktail）を加えて、組織を溶解した。得られたタンパク質の量を定量し、同量（３５μｇ）のライセートをもって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動されたタンパク質トランスファー（transfer）した。トランスファーしたタンパク質付着のＰＶＤＦ膜を、先に２％脱脂乳中で１時間放置した後、５％ＢＳＡ中に１：１０００で希釈された抗β‐アミロイド（D54D2、Cell signaling、Beverly、MA、USA）抗体溶液中に、一日中４℃で放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴＢＳ／Ｔで洗浄し、１：２０００で希釈されたＨＲＰのコンジュゲート抗ラビット（anti-rabbit）ＩｇＧ抗体を用いて、１時間放置した。ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、West-Q Chemiluminescent  Substrate Plus Kit（GenDEPOT、TX、USA）を用いて発光した後、イメージ分析器によりイメージのバンド強度を分析した。
【０１６７】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、ＰＥＰ１処理の時、全種類のＡβの発現量が、海馬及び脳の全域で減少することが示された（図６３参照）。これは、ＰＥＰ１がオリゴマーとして形成されて、プラーク（plaque）形態となる前の段階のＡβの絶対量を減少することで、神経の損傷を予防できる効果があると言える。
【０１６８】
実施例４−９：オリゴマーＡβ(アミロイドβ）の発現量に及ぼすＰＥＰ１の影響の評価
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行い、全血を除去した。その後、脳を摘出し、海馬部位と全体の脳部位とに分離し、脳組織を得て、液体窒素で急激に凍結した。その後に、組織を粉砕し、ライシスバッファー（1X RIPA II cell lysis buffer, 1mM sodium orthovanadate(Na3VO4), 100mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF), 1mM sodium fluoride(NaF), 1XProtease Inhibitor cocktail）を加えて、組織を溶解した。得られたタンパク質の量を定量し、 同量（３５μｇ）のライセートをもって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動されたタンパク質をトランスファー（transfer）した。トランスファーしたタンパク質付着のＰＶＤＦ膜を、先に２％脱脂乳中で１時間放置した後、５％ＢＳＡ中に１：１０００で希釈されたβ‐アミロイドオリゴマー（AB9234、Millipore）抗体溶液に、一日中４℃で放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴＢＳ／Ｔで洗浄し、１：３０００で希釈されたＨＲＰのコンジュゲート抗ラビット（anti-rabbit）ＩｇＧ抗体を用いて、１時間放置した。ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、West-Q Chemiluminescent  Substrate Plus Kit（GenDEPOT、TX、USA）を用いて発光した後、イメージ分析器によりイメージのバンド強度を分析した。
【０１６９】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、ＰＥＰ１処理の時、オリゴマーＡβの発現量が、海馬及び脳の全域で、減少することが示された（図６４参照）。これは、ＰＥＰ１がプラーク（plaque）形態になって、神経細胞外部の損傷及び死滅を誘導する直前の段階であるオリゴマーＡβの絶対量を減少することで、神経の損傷及び死滅を予防及び治療できる効果があると示される。
【０１７０】
実施例４−１０：ＮＦＴ生成に及ぼすＰＥＰ１の影響の評価
動物行動実験を済んだマウス（各群当りの１０匹）において、麻酔の後、０．９％生理食塩水を用いて、マウスの心臓を通した再灌流を行い、全血を除去した。その後、脳を摘出し、海馬部位と全体の脳部位とに分離し、脳組織を得て、液体窒素で急激に凍結した。その後に、組織を粉砕し、ライシスバッファー（1X RIPA II cell lysis buffer, 1mM sodium orthovanadate(Na3VO4), 100mg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF), 1mM sodium fluoride(NaF), 1XProtease Inhibitor cocktail）を加えて、組織を溶解した。得られたタンパク質の量を定量し、同量（３５μｇ）のライセートをもって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施した後、ＰＶＤＦ膜で電気泳動されたタンパク質をトランスファー（transfer）した。トランスファーしたタンパク質付着のＰＶＤＦ膜を、先に２％脱脂乳中で１時間放置した後、１μｇ／ｍｌの濃度で５％ＢＳＡに希釈したＴａｕ（Neurofibrillary Tangles Marker、AHB0042、Invitrogen）抗体溶液中で、一日中、４℃で放置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴＢＳ／Ｔで洗浄し、１：３０００で希釈されたＨＲＰのコンジュゲート抗−マウスＩｇＧ抗体を用いて、１時間放置した。ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、West-Q Chemiluminescent  Substrate Plus Kit（GenDEPOT、TX、USA）を用いて発光した後、イメージ分析器によりイメージのバンド強度を分析した。
【０１７１】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、ＰＥＰ１処理の時、Ｔａｕの発現量が、海馬及び脳の全域で、減少することが示された（図６５〜図６６参照；図６６の明るい部分が、β‐アミロイド、ＮＦＴ、ＤＡＰＩ発現関連の免疫染色部分である）。神経細胞の内部構造が絡まれて、神経細胞の損傷及び死滅を招くＮＦＴの発生程度を測定するＴａｕの発現が、ＰＥＰ１により減少するというのは、ＰＥＰ１が、ＮＦＴの生成を防止することで、神経細胞の損失を予防する効果があることを示す。
【０１７２】
実施例５：動物モデルの行動実験分析によるＰＥＰ１の神経損失予防及び再生の効果の評価
実施例５−１：受動回避実験による動物モデルにおけるＰＥＰ１の効果の評価
実施例４−１で述べたように、薬物が注入されたアルツハイマー形質転換のマウスを、群当りの１０匹をもって、受動回避実験を行った。薬物注射から２ケ月後に、次のような受動回避実験を行った。明室と暗室とを有するボックスを用意し、二つの部屋の間に自由な往来が可能であるように、ドアーを設けた。動物実験の初日に、光のあるボックスに入れて、動き始めたら、光のない部屋の出入り口が、自動に開き、１８０秒間、待っていた。翌日にも、初日と同様の方法で行うが、今回は、光のない部屋に入ったとき、５Ｖ／０．０５ｍＡの直流電気を、１０秒間印加した。三日目となると、初日と同様な方法で行いながら、光のない部屋に入る時間及び頻度を測定した。全ての待ち時間は、１８０秒を超えない。三日目の動物行動実験において、動物の動きがなくてもよく、動いていない場合、物理的力を加えて動けるようにするいかなる刺激も与えない。
【０１７３】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、ＰＥＰ１を処理した動物が、優れた回避能力を見せることが示された（図６７及び図６８参照）。認知能力の増加は、神経細胞の状態により影響を受けると知られており、実験の結果を通じて、ＰＥＰ１の投与時、神経細胞の損失予防及び再生に効能を示すことで、認知能力が上昇することが推定できる。
【０１７４】
実施例５−２：Ｙ−迷路実験による動物モデルにおけるＰＥＰ１の効果の評価
実施例４−１に記載の方法に従い、群当りの１０匹の、各々の薬物が注入完了されたアルツハイマー形質転換のマウスをもって、Ｙ−迷路実験を行った。Ｙ−迷路実験（Y-maze task）において、ＰＥＰ１が、アルツハイマー形質転換のマウスの空間知覚能力及び短期記憶能力の回復（short-term memory recovery）に役に立っているかを調べるための実験である。Ｙ模様となっている３個のアームがある迷路で、行動実験を行った。各アームは、互いに１２０°の一定の角度で配置されている。マウスは、自由に三つのアームを往来できるようにした。マウスは、新しいところへの探索を好んだ。したがって、マウスは、普通、自分たちが訪問したアームに戻ってくるよりは、新しいアームへ行くのをより好んだ。各々のアームを、Ａ、Ｂ、Ｃ領域と決めた後、一つの領域に、マウスの頭が壁の方を向くようにして放置し、１８０秒間、自由に動くようにした後、実験動物が入っていた領域を観察して記録した。各迷路に入った回数及び順序を測定して、変更行動力（spontaneous alteration、％）を評価した。
【０１７５】
分析の結果より、対照群及び陽性対照群（doneperzil）に比べて、ＰＥＰ１を処理した動物が、優れた行動判断力を見せると示された（図６９参照）。Ｙ−迷路は、新しい通路を選択する能力及び既に通った通路を記憶する能力を判断できる実験であって、実験の結果から、ＰＥＰ１投与の動物が、より高い能力を有する傾向があると示されることから、ＰＥＰ１の投与時、認知能力のみならず、記憶能力及び行動力が向上すると言える。
【０１７６】
実施例５−３：重症アルツハイマー動物モデルの行動実験分析によるＰＥＰ１の神経損失予防及び再生の効果の評価
実施例４−１に記載の方法に従い、アルツハイマー形質転換のマウス（３ＸＴｇ−ＡＤ）を、２０ヶ月以上飼い、重症アルツハイマーモデルに相当する２０ヶ月令以上のアルツハイマー形質転換のマウスを用意した。ＰＥＰ１及び生理食塩水を、２０ケ月から２ケ月の間、１週に３回、皮下注射した後、２ケ月後に、認知機能と記憶機能の向上程度を調べる認知／記憶行動実験（受動回避実験及び Ｙ  ｍａｚｅ）を行った。７匹のＰＥＰ１(１ｍｇ／ｋｇ）投与群と、６匹の生理食塩水投与群（対照群）との重症アルツハイマー形質転換のマウスを対象として、実施例５に記載の方法と類似の方法で、認知／記憶行動実験を行った。
【０１７７】
より具体的に、薬物投与してから２か月後に、明室及び暗室のあるボックスを用意し、電気刺激の後、光のない部屋に入る時間及び頻度を測定する受動回避実験と、Ｙ模様となっている３個のアームのある迷路で、１８０秒間、自由に動くようにした後、各迷路に入った回数及び順序を測定して、変更行動力を評価するＹ−迷路実験を行った（具体的な実験方法は、実施例５−１及び５−２を参照）。
【０１７８】
分析結果、受動回避実験の場合、対照群に比べて、ＰＥＰ１投与群は、明室で滞在する時間及び頻度が増加して、優れた回避能力、即ち、記憶力の回復能力を見せることを示し（図７０を参照）、Ｙ−迷路実験の場合、対照群に比べて、ＰＥＰ１投与群は、新しい通路を選択する能力（変更行動力）が増加して、優れた認知／記憶回復能力を見せることを示した（図７１を参照）。以上のように、重症アルツハイマー疾患においても、ＰＥＰ１を投与したモデルが、より高い認知／記憶能力を示す傾向があることが分かり、これにより、重症アルツハイマー疾患の場合にも、ＰＥＰ１の投与時、認知能力、記憶能力、及び行動力が向上できると言える。
【０１７９】
実施例６：臨床実験によるＰＥＰ１の神経損失予防及び再生の効果の評価
実施例６−１：臨床実験の投与方法及び対象
臨床実験は、神経細胞の損失及びこれによる退行性神経系疾患のうち、最も代表的に知られた軽度、中等度及び重症のアルツハイマー疾患を有する対象を募集して実施する。実験は、無作為割当、偽薬対照、二重盲検、平行デザイン、多器官、２相臨床実験として設計され、疾病の進行程度は、広く知られた痴呆疾患程度の測定法を用いて行われる。
【０１８０】
臨床実験は、投与によって、次の４つの群に分けて投与される。
【０１８１】
１）対照群：偽薬（０．９％saline）を１週おきに４回、以降、２週間おきに２２回、合計２６回訪問して、訪問の時毎に、皮下に投与する。
【０１８２】
２）試験群１：実施例１により製造された０．４０ｍｇのＰＥＰ１を、１週おきに４回、以降、２週間おきに２２回、合計２６回訪問して、訪問の時毎に皮下に投与する。
【０１８３】
３）試験群２：実施例１により製造された０．５６ｍｇのＰＥＰ１を、毎１週おきに４回、以降毎２週間おきに２２回、合計２６回訪問して、訪問時毎に皮下に投与する。
【０１８４】
４）試験群３：実施例１により製造された１．１２ｍｇのＰＥＰ１を、１週おきに４回、以降、２週間おきに２２回、合計２６回訪問して、訪問の時毎に皮下に投与する。
【０１８５】
本臨床実験は、アルツハイマー患者らに投与されたＰＥＰ１の有効性及び安全性を評価するための、無作為割当、偽薬対照、二重盲検、平行デザイン、多器官、２相臨床実験として設計された。臨床実験に適合な対象者は、三つの試験群及び偽薬群のうちいずれか一つの群に無作為に割当てられる。無作為割当てを受けた対象者のうち、試験群に該当する対象者は、既に決められた用量を、１週間おきに４回、その後、２週間おきに２２回、合計２６回皮下に薬物を投薬される。対照群として選定された対象者は、試験薬と同量の偽薬（０．９％saline）とを同様の方法で投与される。
【０１８６】
実施例６−２：臨床実験の評価基準及び方法
有効性評価変数の分析は、ＦＡＳ（Full analysis set）分析群を対象として実施する予定であり、付加的に、ＰＰ（Per-protocol）分析群を対象とした結果と比較する。
【０１８７】
有効性評価変数は、次のように、二つに分けて評価する。
１）一次有効性評価変数（Primary Endpoint）：ベースライン（Baseline）対比のＡＤＡＳ−ｃｏｇ及びＡＤＣＳ−ＡＤＬの変化量（０、１２週、２４週、３６週、４８週に測定）
２）２次有効性評価変数（Secondary Endpoints）：ベースライン対比のＣＩＢＩＣ−Ｐｌｕｓ及びＱＯＬ−ＡＤの変化量（０、１２週、２４週、３６週、４８週に測定）、ベースライン対比の総海馬萎縮（total  hippocampal atrophy）及び脳脊髄液（cerebrospinal fluid、ＣＳＦ）Ａβ(１−ｘ）の変化量（スクリーニングの時、２４週、４８週に測定）
安全性評価変数は、異常反応評価及び臨床実験実績検査値（一般血液検査、血液生化学検査、尿検査）の変化により測定される。
【０１８８】
前記多数の実施例により、ＰＥＰ１が、細胞段階のみならず、動物モデルを用いた実験及び臨床実験においても、神経細胞の損失予防及び再生、これによる認知能力の向上などに優れた効果を示すことが分かる。したがって、本発明によるペプチドＰＥＰ１は、神経細胞の損失及びこれによる退行性神経系疾患の予防又は治療剤として開発することができ、これを利用して、神経系疾患の根本的な予防及び治療方法を提供することができる。また、既存の神経系疾患の治療剤との併用投与の時にも顕著な相昇効果を発揮すると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月3日(2018.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、該アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドおよびそれらのフラグメントからなる群より選ばれる一つ以上を薬学的に有効な量で含む、神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項２】
前記フラグメントは、３個以上のアミノ酸からなるフラグメントペプチドを含む、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項３】
前記組成物は、神経細胞の損失及び再生不能による疾患の予防、治療、軽減、及び改善用であるか、又は、前記疾患による後遺症の予防、治療、軽減、及び改善用である、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項４】
前記神経細胞の損失及び再生不能による疾患は、脳血管疾患、又は、退行性神経系疾患である、請求項３に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項５】
前記脳血管疾患は、虚血性脳血管疾患、又は、出血性脳血管疾患である、請求項４に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項６】
前記退行性神経系疾患は、脳疾患、脊髄損傷、末梢神経損傷、末梢神経疾患、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、痴呆、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー性疾患、脊髄小脳変性症、及び多発性神経病症のうちいずれか一つである、請求項４に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項７】
前記組成物は、一つ以上の神経系疾患治療剤と併用される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項８】
前記アルツハイマー性疾患は、痴呆、認知障害、記憶力の低下のうちいずれか一つ以上を示す、請求項６に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項９】
前記アルツハイマー性疾患は、初期、進行性、又は重症アルツハイマー性疾患である、請求項６に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１０】
薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１１】
薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは０．０１〜２００ｍｇ投与される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１２】
薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドは、１週間〜４週間ごとに１回、合計４回以上投与される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１３】
薬学的有効成分として配列番号１のペプチドを含む前記組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内、皮内、又は皮下に投与される、請求項１に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物。
【請求項１４】
請求項１から１３のうちいずれか一項に記載の神経細胞の損失予防及び再生用組成物、及び、
薬学的有効成分として、配列番号１のペプチドを０．０１〜２００ｍｇ、１週間〜４週間ごとに１回、これを必要とする個体に投与することを指示する指示書
を含む、神経細胞の損失予防及び再生用キット。
【国際調査報告】
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