(57)【要約】  本発明は、二重特異性タンパク質およびその製造方法に関し、重鎖および／または軽鎖に突然変異を導入することによって、重鎖（ＣＨ３ドメインまたはＦｃ）と重鎖（ＣＨ３ドメインまたはＦｃ）との間には、異種二量体形成率を増加させ、重鎖（ＣＨ１ドメイン）と軽鎖との間には同一物質を標的化する鎖同士の二量体形成率を増加させて、異種二量体の純度が高い異種特異性タンパク質およびその製造方法に関する。本発明による異種特異性タンパク質は、癌治療、信号調節、診断などの多様な分野に活用可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ＣＨ３ドメインまたはこれを含む第１Ｆｃ領域、および第２ＣＨ３ドメインまたはこれを含む第２Ｆｃ領域を含み、
前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対が、次の１つ以上の変異によって変異された変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含む、互いに異なる２種の標的を標的化する二重特異性タンパク質：
ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸が互いに交換された変異（スワッピング変異）；
ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異であって、前記アミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうち少なくとも１つは疎水性アミノ酸でない、変異（静電的相互作用導入変異）；および
ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換された変異（サイズ変異）、この時、前記大きさの大きいアミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、大きさの小さいアミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択される。
【請求項２】
前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、それぞれ独立してＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群より選択された免疫グロブリンに由来するものである、請求項１に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項３】
前記アミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対は、Ｅｕナンバリングにより、次の表に記載のＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインの１〜４０番目のアミノ酸対の中から選択された１つ以上またはこれに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのアミノ酸対からなる群より選択された１つ以上である、請求項１に記載の二重特異性タンパク質：
【表３９】
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【請求項４】
前記静電的相互作用導入変異は、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３９４番目の位置のトレオニンと３９４番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシン、３６６番目の位置のトレオニンと４０７番目の位置のチロシン、および３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリンからなる群より選択された１つ以上のアミノ酸対、または
前記１つ以上のアミノ酸対に対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのアミノ酸対
のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つは正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つは負電荷を有するアミノ酸に置換されたものである、請求項１に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項５】
前記負電荷を有するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、前記正電荷を有するアミノ酸は、リシンまたはアルギニンである、請求項４に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項６】
前記静電的相互作用導入変異は、ＩｇＧ１を基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項４に記載の二重特異性タンパク質：
３６４番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、３６８番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３９４番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、３９４番目の位置のトレオニンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、３７０番目の位置のリシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、３４９番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３６６番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、４０７番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３９４番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、３９７番目の位置のバリンを負電荷を有するアミノ酸に置換；および
３４９番目の位置のチロシンを正電荷を有するアミノ酸に、３５７番目の位置のグルタミン酸を負電荷を有するアミノ酸に置換。
【請求項７】
前記負電荷を有するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、前記正電荷を有するアミノ酸は、リシンまたはアルギニンである、請求項６に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項８】
前記スワッピング変異は、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、３５４番目の位置のグルタミンと３６０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のセリンと３４９番目の位置のチロシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３６０番目の位置のリシンと３４９番目の位置のチロシン、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３６８番目のロイシンと４０９番目のリシン、３９０番目の位置のアスパラギンと４００番目の位置のセリン、３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリン、３９８番目の位置のロイシンと３９２番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、および４１１番目の位置のトレオニンと３７０番目の位置のリシンからなる群より選択された１つ以上のアミノ酸対；または
前記１つ以上のアミノ酸対に対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのアミノ酸対
のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸が互いに交換されたものである、請求項１に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項９】
前記スワッピング変異は、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項８に記載の二重特異性タンパク質：
３６４番目の位置のセリンをリシンに、３７０番目の位置のリシンをセリンに置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換；
４０７番目の位置のチロシンをトレオニンに、３６６番目の位置のトレオニンをチロシンに置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸をリシンに、３７０番目の位置のリシンをグルタミン酸に置換；および
３５７番目の位置のセリンをチロシンに、３４９番目の位置のチロシンをセリンに置換。
【請求項１０】
前記サイズ変異は、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、４０９番目の位置のリシンと４０７番目の位置のチロシン、４０９番目の位置のリシンと４０５番目の位置のフェニルアラニン、またはこれらの組み合わせ；または
これに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのアミノ酸対
のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つは大きさの大きい疎水性アミノ酸に置換され、他の１つは大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換されたものであり、
前記大きい疎水性アミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、
前記小さい疎水性アミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択されたものである、請求項１に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１１】
前記大きさの大きいアミノ酸は、トリプトファンであり、前記大きさの小さいアミノ酸は、アラニンである、請求項１０に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１２】
前記サイズ変異は、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項１０に記載の二重特異性タンパク質：
４０９番目の位置のリシンをトリプトファンに、４０７番目の位置のチロシンをアラニンに置換；および
４０９番目の位置のリシンをトリプトファンに、４０５番目の位置のフェニルアラニンをアラニンに置換。
【請求項１３】
前記静電的相互作用導入変異、スワッピング変異、およびサイズ変異のうち２つ以上を含む、請求項１に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１４】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、
３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシンのうちいずれか１つは正電荷を有するアミノ酸に、他の１つは負電荷を有するアミノ酸に置換、
３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシンの交換、および
４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシンの交換
からなる群より選択された１つ以上の変異、または
前記１つ以上の変異に相当するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含む、請求項１に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項１５】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項１４に記載の二重特異性タンパク質：
（ａ）３６４番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに、３６８番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換；
（ｂ）３６４番目の位置のセリンをリシンに、３７０番目の位置のリシンをセリンに置換；および
（ｃ）４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換。
【請求項１６】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、互いに異なる２種の標的を標的化する二重特異性タンパク質：
４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンまたはトリプトファンに、４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシン、アルギニン、グルタミン、またはアスパラギンに置換；
３６８番目の位置のロイシンをアスパラギン酸、グルタミン酸、または、例えば、アスパラギン酸）に、３６４番目の位置のセリンをリシン、アルギニン、またはアスパラギンに置換；および
３７０番目の位置のリシンをセリンに、３６４番目の位置のセリンをリシン、アルギニン、またはアスパラギンに置換。
【請求項１７】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項１６に記載の二重特異性タンパク質：
４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換；
３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換；
３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換；および
４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換。
【請求項１８】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次のいずれか１つの変異、または前記変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項１７に記載の二重特異性タンパク質：
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；または
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換。
【請求項１９】
前記二重特異性タンパク質は、二重特異性抗体；二重特異性抗体の抗原結合断片、二重特異性抗体類似体、および標的特異的結合ポリペプチドとＦｃ領域またはＣＨ３ドメインの融合タンパク質からなる群より選択された１種以上である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２０】
前記標的特異的結合ポリペプチドは、受容体、エクトドメイン、およびリガンドからなる群より選択された１種以上である、請求項１９に記載の二重特異性タンパク質。
【請求項２１】
第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ１ドメインおよび軽鎖由来の第１ＣＬドメイン、および第２エピトープを認識する抗体由来の第２ＣＨ１ドメインおよび軽鎖由来の第２ＣＬドメインを含み、
次の中から選択された１つ以上の変異を含む変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
【請求項２２】
前記第１ＣＨ１ドメインと第２ＣＨ１ドメインは、互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換され、
前記第１ＣＬドメインは、前記第１ＣＨ１ドメインと相異なる電荷を有するアミノ酸に置換され、
前記第２ＣＬドメインは、前記第２ＣＨ１ドメインと相異なる電荷を有するアミノ酸に置換されたものである、請求項２１に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
前記正電荷を含むアミノ酸は、リシンまたはアルギニンであり、
前記負電荷を含むアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記正電荷を含むアミノ酸または負電荷を含むアミノ酸に置換されるＣＨ１ドメインのアミノ酸は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の中から選択された１つ以上、または前記１つ以上に対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ１ドメインのアミノ酸であり：
１４５番目の位置のロイシン、
１８３番目の位置のセリン、
１４７番目の位置のリシン、
１７０番目の位置のフェニルアラニン、
１７１番目の位置のプロリン、および
１８５番目の位置のバリン、
前記正電荷を含むアミノ酸または負電荷を含むアミノ酸に置換されるＣＬドメインのアミノ酸は、カッパタイプのＣＬドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の中から選択された１つ以上、または前記１つ以上に対応する位置のラムダタイプのＣＬドメインのアミノ酸である、請求項２１に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
１３１番目の位置のセリン、
１３３番目の位置のバリン、
１３５番目の位置のロイシン、
１６２番目の位置のセリン、および
１８０番目の位置のトレオニン。
【請求項２４】
前記正電荷を含むアミノ酸は、リシンまたはアルギニンであり、
前記負電荷を含むアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記正電荷を含むアミノ酸または負電荷を含むアミノ酸に置換されるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のアミノ酸対は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインとカッパタイプのＣＬドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の中から選択された１つ以上、または前記１つ以上に対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ１ドメインとラムダサブタイプのＣＬドメインのアミノ酸対である、請求項２１に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３１番目の位置のセリン、
ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリン、
ＣＨ１ドメインの１８３番目の位置のセリンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリン、
ＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンとＣＬドメインの１８０番目の位置のトレオニン、
ＣＨ１ドメインの１８５番目の位置のバリンとＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシン、
ＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンとＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシン、および
ＣＨ１ドメインの１７１番目の位置のプロリンとＣＬドメインの１６２番目の位置のセリン。
【請求項２５】
第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ３ドメインと第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対が、次の１つ以上の変異によって変異された変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含む、互いに異なる２種の標的を標的化する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸が互いに交換された変異（スワッピング変異）、
ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異であって、前記アミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうち少なくとも１つは疎水性アミノ酸でない、変異（静電的相互作用導入変異）；および
ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸に置換された変異（サイズ変異）、この時、前記大きい疎水性アミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、前記小さい疎水性アミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択される。
【請求項２６】
前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、それぞれ独立してＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群より選択された免疫グロブリンに由来するものである、請求項２５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
前記アミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対は、Ｅｕナンバリングにより、次の表に記載のＩｇＧ１由来のＣＨ３ドメインの１〜４０番目のアミノ酸対の中から選択された１つ以上またはこれに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのアミノ酸対からなる群より選択された１つ以上である、請求項２５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
【表４０】
2019530641.tif 000048
2019530641.tif 000049
【請求項２８】
前記静電的相互作用導入変異は、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３９４番目の位置のトレオニンと３９４番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシン、３６６番目の位置のトレオニンと４０７番目の位置のチロシン、および３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリンからなる群より選択された１つ以上のアミノ酸対、または
前記１つ以上のアミノ酸対に対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのアミノ酸対
のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つは正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つは負電荷を有するアミノ酸に置換されたものである、請求項２５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
前記負電荷を有するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、前記正電荷を有するアミノ酸は、リシンまたはアルギニンである、請求項２８に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３０】
前記静電的相互作用導入変異は、ＩｇＧ１を基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項２８に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
３６４番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、３６８番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３９４番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、３９４番目の位置のトレオニンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、３７０番目の位置のリシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、３４９番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３６６番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、４０７番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３９４番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、３９７番目の位置のバリンを負電荷を有するアミノ酸に置換；および
３４９番目の位置のチロシンを正電荷を有するアミノ酸に、３５７番目の位置のグルタミン酸を負電荷を有するアミノ酸に置換。
【請求項３１】
前記負電荷を有するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、前記正電荷を有するアミノ酸は、リシンまたはアルギニンである、請求項３０に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
前記スワッピング変異は、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、３５４番目の位置のグルタミンと３６０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のセリンと３４９番目の位置のチロシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３６０番目の位置のリシンと３４９番目の位置のチロシン、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、３６８番目のロイシンと４０９番目のリシン、３９０番目の位置のアスパラギンと４００番目の位置のセリン、３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリン、３９８番目の位置のロイシンと３９２番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、および４１１番目の位置のトレオニンと３７０番目の位置のリシンからなる群より選択された１つ以上のアミノ酸対；または
前記１つ以上のアミノ酸対に対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのアミノ酸対
のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸が互いに交換されたものである、請求項２５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３３】
前記スワッピング変異は、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項３２に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
３６４番目の位置のセリンをリシンに、３７０番目の位置のリシンをセリンに置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換；
４０７番目の位置のチロシンをトレオニンに、３６６番目の位置のトレオニンをチロシンに置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸をリシンに、３７０番目の位置のリシンをグルタミン酸に置換；および
３５７番目の位置のセリンをチロシンに、３４９番目の位置のチロシンをセリンに置換。
【請求項３４】
前記サイズ変異は、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、４０９番目の位置のリシンと４０７番目の位置のチロシン、４０９番目の位置のリシンと４０５番目の位置のフェニルアラニン、またはこれらの組み合わせ；または
これに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのアミノ酸対
のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つは大きさの大きい疎水性アミノ酸に置換され、他の１つは大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換されたものであり、
前記大きさの大きいアミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、大きさの小さいアミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択されたものである、請求項２５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３５】
前記大きさの大きいアミノ酸は、トリプトファンであり、前記大きさの小さいアミノ酸は、アラニンである、請求項３４に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３６】
前記サイズ変異は、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項３４に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
４０９番目の位置のリシンをトリプトファンに、４０７番目の位置のチロシンをアラニンに置換；および
４０９番目の位置のリシンをトリプトファンに、４０５番目の位置のフェニルアラニンをアラニンに置換。
【請求項３７】
前記静電的相互作用導入変異、スワッピング変異、およびサイズ変異のうち２つ以上を含む、請求項２５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３８】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、
３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシンのうちいずれか１つは正電荷を有するアミノ酸に、他の１つは負電荷を有するアミノ酸に置換、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシンの交換、および４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシンの交換からなる群より選択された１つ以上の変異または
前記１つ以上の変異に相当するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含む、請求項２５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３９】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項３８に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）３６４番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに、３６８番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換；
（ｂ）３６４番目の位置のセリンをリシンに、３７０番目の位置のリシンをセリンに置換；および
（ｃ）４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換。
【請求項４０】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含む、請求項２５に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片：
４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンまたはトリプトファンに、４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシン、アルギニン、グルタミン、またはアスパラギンに置換；
３６８番目の位置のロイシンをアスパラギン酸、グルタミン酸、または、例えば、アスパラギン酸）に、３６４番目の位置のセリンをリシン、アルギニン、またはアスパラギンに置換；および
３７０番目の位置のリシンをセリンに、３６４番目の位置のセリンをリシン、アルギニン、またはアスパラギンに置換。
【請求項４１】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次の１つ以上の変異、または前記１つ以上の変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項４０に記載の二重特異性タンパク質：
４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換；
３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換；
３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換；および
４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換。
【請求項４２】
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として（Ｅｕナンバリング）、次のいずれか１つの変異、または前記変異に対応するＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインの変異を含むものである、請求項４１に記載の二重特異性タンパク質：
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；または
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換。
【請求項４３】
次の１つ以上の段階を含み、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対に、次の１つ以上の変異を導入させる段階を含む、変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含み、互いに異なる標的を標的化する二重特異性タンパク質の製造方法：
第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸をなす２つのアミノ酸を互いに交換；
第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に、他の１つのアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換、この時、前記大きさの大きいアミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、大きさの小さいアミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択される。
【請求項４４】
次のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの変異段階を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法：
第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
【請求項４５】
次の１つ以上のＣＨ３ドメインの変異段階を追加的に含む、請求項４４に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法：
第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに交換；
第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ３ドメインと第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に、他の１つのアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換、この時、前記大きさの大きいアミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、大きさの小さいアミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択される。
【請求項４６】
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＢ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４７】
配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＡ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４８】
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＢ抗体、および配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＡ抗体を含む、抗−インフルエンザＡ／抗−インフルエンザＢ二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４９】
前記第１エピトープを認識する抗体は、配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＢ抗体であり、
前記第２エピトープを認識する抗体は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＡ抗体である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５０】
前記第１エピトープを認識する抗体は、配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＢ抗体であり、
前記第２エピトープを認識する抗体は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＡ抗体である、請求項２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種二量体形成率が高い二重特異性タンパク質およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＢｓＡｂｓ）は、相異なる標的抗原を認識する２つの抗原結合部位を有する抗体であって、前記相異なる標的抗原に同時に結合できる抗体またはその抗原結合断片を総称する。このような特性は、通常の単一クローン抗体では不可能な治療戦略を立てられるようにする。二重特異性抗体は、自然に生成される場合は珍しく、２つの異なる生物学的標的に同時結合するように人為的に製造されることが多い。このようなＢｓＡｂの二重標的化能力は、単一特異性抗体（Ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＭｓＡｂｓ）では適用できない新たな適用分野を提供することができる。治療的目的の側面から、（１）免疫細胞を標的細胞の近接部に確実に導入すること、（２）標的細胞から離れてそれぞれ別個に存在する２つの信号伝達経路を同時に抑制したり活性化させて上昇効果を起こすこと、（３）標的細胞に治療物質、放射活性物質、医薬、毒素などを特異的で調節可能に伝達すること、などが重要な関心事項として浮上している。
【０００３】
多様な（４５の異なるフォーマット）二重特異性抗体関連技術が開発された。これらの技術は、構造に基づいて４つのカテゴリーに分類される。第一、ノブ−イントゥ−ホール（Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ）または簡略にＫｉＨとして知られた構造的相補的状態、電荷極性補完（電気的ステアリング効果；ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）、またはＣＨ３ドメインシャッフリング（ＳＥＥＤｂｏｄｙＴＭと呼ばれる）を含む多様な方法により重鎖を異種性二重化させる技術；第二、ＤｉａｂｏｄｙＴＭ、ＢｉＴＥＴＭおよびＤＡＲＴＴＭ（Ｄｉａｂｏｄｙ：ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；ＢｉＴＥ：Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒｓ；ＤＡＲＴ：ｄｕａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）のような様々な抗体分節フォーマット、第三、Ｍｏｄｕｌａｒ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭ、ＺｙｂｏｄｙＴＭ、ｄＡｂｓＴＭおよびＤＶＤ−ＩＧＴＭ（ｄＡｂｓ：Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＤＶＤ−Ｉｇ：ｄｕａｌ−ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のような１つまたはそれ以上の機能的ドメインを使用する技術が完全な抗体に接合される技術；および第四、ＤｕｏｂｏｄｙＴＭ（Ｆａｂ−Ａｒｍ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ）、ＣｒｏｓｓＭａｂＴＭ、ＡｚｙｍｅｔｒｉｃＴＭ、およびｋＩ  ｂｏｄｙＴＭのような全長長さのＩｇＧ−類似設計を採用した技術が開発された。
【０００４】
例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓは、米国特許出願２０１３−８９２１９８号により、Ｆｃ領域で突然変異を有する免疫グロブリン鎖の異種性多量体（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙｍｅｒ）構造体について記載し、具体的には、二硫化結合をするシステイン部分を電荷を有するアミノ酸に変形して、電気的相互作用により異種性多量体構造の抗体を作ることができることを開示している。
【０００５】
既存の二重特異性抗体を製造するには、次の問題点があった：
第一は、所望しない重鎖の結合の生成が挙げられる。相異なるエピトープを有する２つの抗体からそれぞれ起源する重鎖（ＡおよびＢ）間の結合がランダムに行われる場合、２つの同一起源の重鎖間の結合（ＡＡおよびＢＢ）と１つの異種起源の重鎖間の結合（ＡＢまたはＢＡ）が形成される。二重特異性抗体を製造するにあたり、同一起源の重鎖間の結合は、所望しない不純物になって、二重特異性抗体の純度を低下させ、これを除去する工程が伴わなければならないので、抗体の分離精製に困難を誘発し、所望しない免疫反応または信号伝達を引き起こして副作用を誘発するなどの不利な効果につながることがある。したがって、純粋に異種起源の重鎖間の結合だけを形成しながら、同一起源の重鎖間の結合が形成されなかったり、少なくとも相当水準以下でのみ形成されるようにする技術が必要である。
【０００６】
第二は、軽鎖と重鎖の結合において同一起源の重鎖と軽鎖の結合が特異的に形成されなければならないが、異種起源の重鎖と軽鎖が結合する場合が発生する問題点が挙げられる。二重特異性抗体は、２種のエピトープを有している。それぞれのエピトープは、これを認識するそれぞれの抗体に由来する同種起源の軽鎖と重鎖が結合する場合に認識可能であるが、異種起源の重鎖と軽鎖が結合すると、意図した２種のエピトープ以外の新たなエピトープを認識する抗体が形成され、不純物として作用して抗体の分離精製に困難を誘発し、副作用を起こす原因になりうる。したがって、二重特異性抗体の生産において正確に２種類の特異性抗体が作られるように正しい対でのみ重鎖と軽鎖の結合が起こらなければならず、非特異な重鎖と軽鎖の結合が生成されなかったりわずかな水準で生成されなければならない。
【０００７】
前記のような二重特異性抗体を提供するうえでの問題点を考慮して二重特異性抗体の作製に必要な要件をまとめると、互いに異なる２つのエピトープを認識する２種の抗体に由来する重鎖と軽鎖の結合において、図１に示されるように、計１０の形態の結合が形成されるが、このうち、（１）重鎖間の結合は、互いに異なる抗体に由来する重鎖間に形成され、（２）重鎖と軽鎖の結合は、同一の抗体に由来する重鎖と軽鎖との間に形成されなければならず、このような組み合わせ形態は図１にて点線の円で表示されたものであり、その他の９つの組み合わせは生成されなかったり最小限に生成されなければならない。
【０００８】
本発明者の前の特許であるＷＯ２０１４１４２５９１号の「疎水性相互作用部位内に電気的相互作用が導入されたタンパク質およびその製造方法」が公開されている。前記特許には、タンパク質の疎水性相互作用をする部位内で選択された一対の疎水性アミノ酸において、１つの疎水性アミノ酸がポジティブ電荷を有する物質に、他の疎水性アミノ酸がネガティブ電荷を有する物質に変形して、前記ポジティブ電荷と前記ネガティブ電荷によってタンパク質の疎水性相互作用部位内に電気的相互作用が導入されたタンパク質または抗体が開示されている。本発明者らは、前記特許で考慮されていない疎水性相互作用をしない部分の静電的相互作用を利用しても二重特異性抗体を形成できることを見出し、前記静電的相互作用のほか、サイズ依存結合および／または結合対間のアミノ酸交換（スワッピング）方法によっても二重特異性抗体を高効率で形成できることを見出して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許公開第１０−２０１４−００１９３８５号（２０１４．０２．１４公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の問題を解決すべく、本発明は、純度が高い異種特異性抗体およびその製造方法を提供する。
【００１１】
一例は、抗体の第１ＣＨ３ドメインおよび第２ＣＨ３ドメインを含む二量体において、前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対が、次の１つ以上の変異によって変異された変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含む二量体を提供する：
（１）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異；
（２）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異；および
（３）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換された変異。
【００１２】
前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、互いに同一または異なる種類の抗体（免疫グロブリン）に由来するものであってもよい。
【００１３】
他の例は、前記変異ＣＨ３ドメインまたはこれを含む変異Ｆｃ領域を暗号化する核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００１４】
本明細書に使用されたものであって、「１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸．．他の１つのアミノ酸．．」は、１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つと他の１つのアミノ酸を指し示すために使用される（以下、同一である）。
【００１５】
他の例は、第１ＣＨ３ドメインまたはこれを含む第１Ｆｃ領域、および第２ＣＨ３ドメインまたはこれを含む第２Ｆｃ領域を含み、
前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対が、次の１つ以上の変異によって変異された変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含む、互いに異なる２種の標的を標的化する二重特異性タンパク質を提供する：
（１）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異；
（２）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸が互いに交換された変異；および
（３）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸に置換された変異。
【００１６】
前記段階（１）の互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸対は、疎水性相互作用をするアミノ酸対および／または疎水性相互作用をしないアミノ酸対であってもよいし、一例において、アミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうち少なくとも１つ以上が、疎水性アミノ酸でないアミノ酸（例えば、親水性アミノ酸）であってもよい。前記段階（１）の互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換させる段階により静電的相互作用が導入され、Ｆｃ領域間の異種二量体形成率を増進させるのに寄与できる。
【００１７】
本明細書に使用されたものであって、異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）は、互いに異なる２つのタンパク質が結合したことを意味するもので、例えば、互いに異なる標的を標的化する２つのタンパク質が結合して形成された二重特異性タンパク質（例えば、二重特異性抗体）などを意味することができる。
【００１８】
前記段階（２）のアミノ酸交換（スワッピング）は、Ｆｃ領域またはＣＨ３ドメインでアミノ酸−アミノ酸結合を形成するすべてのアミノ酸対で行われ、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、およびアミノ酸の大きさの差による相互作用以外の相互作用によって結合したすべてのアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対であってもよい。このように互いに相互作用（例えば、結合）するそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸残基（つまり、相互作用するアミノ酸対において、第１ＣＨ３ドメイン中の１つのアミノ酸残基および第２ＣＨ３ドメイン中の１つのアミノ酸残基）を互いに交換すると、同種由来のＣＨ３ドメイン間に（つまり、第１ＣＨ３ドメイン間、または第２ＣＨ３ドメイン間）は、前記アミノ酸相互作用するパートナー位置に同一のアミノ酸が存在するので、これらの間の結合を困難にすることによって、同種間の二量体形成率を低くし、異種二量体形成率を増進させるのに寄与できる（例えば、Ｓ３６４とＫ３７０アミノ酸対の場合、第１ＣＨ３ドメインにＳ３６４Ｋ変異、第２ＣＨ３ドメインにＫ３７０Ｓ変異が導入された場合、第１ＣＨ３では残基３６４と３７０がすべてリシン（Ｋ）であり、第２ＣＨ３ドメインでは残基３６４と３７０がすべてセリン（Ｓ）であることから、同一ＣＨ３ドメイン間には相互作用が起こり得ないので同種二量体は形成されず、異種ＣＨ３ドメイン間にのみ相互作用が起こるので異種二量体のみ形成される）。
【００１９】
前記段階（３）の大きさが相異なるアミノ酸に置換する段階は、大きさの大きいアミノ酸と大きさの小さいアミノ酸との間の構造的交換適合性を増進させることによって（つまり、大きさの大きいアミノ酸が大きさの小さいアミノ酸によって生成された余分な空間に挟まれることによって結合効率が増加する）、異種二量体形成率を増進させるのに寄与できる。特に、互いに相互作用するアミノ酸対の一方のアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に、残りの一方のアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸に突然変異化することによって、大きさの大きいアミノ酸同士または大きさの小さいアミノ酸同士の結合がよく行われないようにして同種二量体形成率を最小化させる一方（両側ｃｈａｉｎに大きさの大きいアミノ酸が存在する場合、アミノ酸の大きさのために２つのｃｈａｉｎ間の距離が遠くなって二量体形成（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）が妨げられ、両側ｃｈａｉｎともに大きさの小さいアミノ酸が存在すると、２つのアミノ酸間の距離が遠くなって相互作用確率が低くなり、相互作用自体が困難になる）、一方のＣＨ３ドメインまたはＦｃの大きさの大きい疎水性アミノ酸と他方のＣＨ３ドメインまたはＦｃの大きさの小さい疎水性アミノ酸は、突然変異前と比較して近い距離で疎水性相互作用を行えるため、異種二量体が形成されやすい条件になる。したがって、前記大きさの相異なるアミノ酸に置換する段階において、置換される大きさの大きいアミノ酸および大きさの小さいアミノ酸はいずれも、疎水性アミノ酸の中から選択されたものであってもよい。例えば、前記大きさの大きいアミノ酸は、疎水性アミノ酸であるトリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択された１種以上であってもよい。また、前記大きさの小さいアミノ酸は、疎水性アミノ酸であるアラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２０】
前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質は、互いに異なる２種の標的を標的化（例えば、特異的に認識および／または結合）するすべての形態のタンパク質の中から選択される。標的化のために、前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質は、互いに異なる２種の標的を標的化（特異な認識および／または結合）可能な標的化ドメイン（例えば、第１標的を標的化する第１標的化ドメインおよび第２標的を標的化する第２標的化ドメイン）を含むことができ、前記それぞれの標的化ドメインはそれぞれ、変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインに共有的または非共有的に直接または間接（例えば、リンカーなどを介して）連結（融合）されたものであってもよい。例えば、前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質は、互いに異なる２種の標的を同時に標的化する、二重特異性抗体、二重特異性抗体の抗原結合断片（例えば、（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）２など）、二重特異性抗体類似体（例えば、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、アプチド（ａｐｔｉｄｅ）など）、標的特異的結合ポリペプチドと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２１】
前記標的特異的結合ポリペプチドは、標的生体物質（生体に存在するタンパク質、核酸などを含むすべての化合物）に特異的に結合するすべてのポリペプチドの中から選択され、例えば、抗原結合部位（例えば、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲまたは可変領域）、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、膜タンパク質（例えば、各種受容体など）、膜タンパク質のエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、リガンド（例えば、各種成長因子、サイトカインなど）などからなる群より選択された１種以上のポリペプチドであってもよい。一例において、前記標的特異的結合ポリペプチドと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質は、膜タンパク質と変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質、膜タンパク質のエクトドメインと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質、リガンドと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質、ｓｃＦｖと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２２】
前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質が抗体、抗体の抗原結合断片、または抗体類似体の場合、前記標的化ドメインは、抗原結合部位（例えば、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲまたは可変領域）であってもよく、先に説明した融合タンパク質の場合、前記標的特異的結合ポリペプチドは、膜タンパク質（例えば、各種受容体）、膜タンパク質のエクトドメイン、リガンド（例えば、各種成長因子、サイトカインなど）、抗原結合部位（例えば、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲまたは可変領域）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２３】
前記互いに異なる２種の標的は、互いに異なる２種の生体物質（例えば、タンパク質）または同一の生体物質（例えば、タンパク質）内の互いに異なる領域を意味することができる。前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質は、非変異（野生型）Ｆｃ領域またはＣＨ３ドメインを含む場合と比較して、増加した異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成率、減少した同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）形成率、および／または安定性を有することを特徴とする。
【００２４】
他の例は、第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ１ドメインおよび軽鎖由来の第１ＣＬ（軽鎖不変領域）ドメイン、および第２エピトープを認識する抗体由来の第２ＣＨ１ドメインおよび軽鎖由来の第２ＣＬドメインを含み、次の変異の１つ以上を含む変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体またはその抗原結合断片を提供する：
第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は、負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
【００２５】
前記第１エピトープと第２エピトープは、互いに異なるタンパク質（抗原）であるか、同一のタンパク質（抗原）の互いに異なる（互いに区分される）部位に存在するものであってもよい。
【００２６】
一例において、前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、前記第１ＣＨ１ドメインと第２ＣＨ１ドメインは、互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換され、前記第１ＣＬドメインは、前記第１ＣＨ１ドメインと相異なる電荷を有するアミノ酸に置換され、前記第２ＣＬドメインは、前記第２ＣＨ１ドメインと相異なる電荷を有するアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【００２７】
例えば、前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、
第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のうち第１ＣＨ１ドメインに位置するアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、
前記第１アミノ酸対のうち第１ＣＬドメインに位置するアミノ酸は、前記第１ＣＨ１ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、負電荷を有するアミノ酸に置換され、
第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のうち第２ＣＨ１ドメインに位置するアミノ酸は、前記第１ＣＨ１ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、負電荷を有するアミノ酸に置換され、
前記第２アミノ酸対のうち第２ＣＬドメインに位置するアミノ酸は、前記第２ＣＨ１ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、正電荷を有するアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【００２８】
前記変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体またはその抗原結合断片において、前記置換される第１アミノ酸対と第２アミノ酸対は、互いに同一または異なっていてもよいし、前記第１アミノ酸対と第２アミノ酸対に置換される正電荷を有するアミノ酸と負電荷を有するアミノ酸は、互いに同一または異なっていてもよい。前記変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体の抗原結合断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片であってもよい。前記変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、非変異（野生型）ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを含む場合と比較して、増加した同一のエピトープを標的化する重鎖（または重鎖可変領域−ＣＨ１）−軽鎖間の二量体形成率および／または安定性を有することを特徴とする。
【００２９】
前記変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインまたはＦｃ領域であって、第１エピトープを認識する抗体由来の第１ＣＨ３ドメインと第２エピトープを認識する抗体由来の第２ＣＨ３ドメインが、次の１つ以上の変異によって変異された、変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含むものであってもよい：
（１）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異；
（２）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異；および
（３）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換された変異。
【００３０】
前記変異ＣＨ１ドメイン、変異ＣＬドメイン、および変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質または二重特異性抗体は、非変異ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、およびＦｃ領域またはＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質または抗体と比較して、増加した異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成率、増加した同一のエピトープを標的化する重鎖（または重鎖可変領域−ＣＨ１）−軽鎖間の二量体形成率、および／または安定性を有するものであってもよい。
【００３１】
他の例は、次の１つ以上の段階を含み、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対に、次の１つ以上の変異を導入させる段階を含む、変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含む、互いに異なる標的を標的化する二重特異性タンパク質の製造方法または互いに異なる標的を標的化する二重特異性タンパク質の異種二量体形成を増加させる方法を提供する：
（１）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；
（２）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに交換；および
（３）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に置換。
【００３２】
他の例は、次のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの変異段階を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法または同一のエピトープを標的化する重鎖（または重鎖可変領域−ＣＨ１）−軽鎖間の二量体形成率を増加させる方法を提供する：
第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
【００３３】
前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法または同一のエピトープを標的化する重鎖（または重鎖可変領域−ＣＨ１）−軽鎖間の二量体形成を増加させる方法は、前記ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの変異段階に加えて、次の１つ以上のＣＨ３ドメインの変異段階を追加的に含んでもよい：
（１）第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ３ドメインと第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；
（２）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに交換；および
（３）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換。
【００３４】
他の例は、次の１つ以上の段階を含み、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対に、次の１つ以上の変異を導入させる段階を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法または互いに異なる標的を標的化する二重特異性抗体または抗原結合断片の異種二量体形成を増加させる方法を提供する：
（１）第１エピトープを認識する重鎖由来の第１ＣＨ３ドメインと第２エピトープを認識する重鎖由来の第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；
（２）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のアミノ酸を互いに交換；および
（３）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換。
【００３５】
前記二重特異性抗体または抗原結合断片の製造方法は、次のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの変異段階を追加的に含んでもよい：
第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
【００３６】
前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法は、互いに異なるエピトープを認識する抗体由来のＣＨ３ドメインまたはＦｃ領域間の異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成を増加させ、同時に、同一のエピトープを認識する抗体由来のＣＨ１ドメイン（重鎖）とＣＬドメイン（軽鎖）との間の二量体形成を増加させることができる。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００３８】
本発明は、抗体のＦｃ保存（不変）領域および／またはＦａｂ保存（不変）領域を含む相異なる標的を標的化する二重特異性タンパク質またはその製造方法において、
互いに異なる標的化ドメインと連結（融合）されたＦｃ保存領域（ＣＨ３ドメイン）にアミノ酸変異を導入させることによって、互いに異なる標的化ドメインと連結されたＦｃ保存領域間の結合率を高めて異種二量体形成率を増加させ、同一の標的化ドメインと連結されたＦｃ間に結合した同種二量体形成率を減少させたり；および／または
互いに異なる標的化ドメインと連結されたＦａｂ保存領域にアミノ酸変異を導入させることによって、同一の標的化ドメインと連結されたＦａｂ保存領域間の結合力を高めて同一の標的化ドメインおよびこれと連結されたＦａｂ保存領域間の二量体形成率を増加させ、
互いに異なる標的化ドメインを有する二重特異性タンパク質の生成率を増進させる技術を提供する。
【００３９】
本明細書に記載の抗体（重鎖および軽鎖）、ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、Ｆｃ領域、およびＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸位置はすべて、Ｅｕナンバリングシステム［「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）」］に記載のＥＵ−インデックス］によりナンバリングされて表記され、配列リスト内の配列の位置を示す数字とは異なる。
【００４０】
前記抗体は、全種類の哺乳類または鳥類に由来する全種類の免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の中から選択された１種以上であってもよい。例えば、本明細書で使用された抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧタイプ１（ＩｇＧ１）、ＩｇＧタイプ２（ＩｇＧ２）、ＩｇＧタイプ３（ＩｇＧ３）、およびＩｇＧタイプ４（ＩｇＧ４））、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡタイプ１（ＩｇＡ１）およびＩｇＡタイプ２（ＩｇＡ２））、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記抗体は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などのような哺乳類由来の免疫グロブリン、例えば、ヒト由来の免疫グロブリンであってもよい。一例において、前記抗体は、ヒトＩｇＧ１（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＣ８２５２７．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２２８．１）、ヒトＩｇＧ２（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ５９３９３．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２３０．１）、ヒトＩｇＧ３（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ０１８６０、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０３６０４．１）、ヒトＩｇＧ４（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ５９３９４．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｋ０１３１６．１）、ヒトＩｇＡ１（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＴ７４０７０．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６４７９７８．１）、ヒトＩｇＡ２（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ５９３９６．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２２１．１）、ヒトＩｇＤ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ５２７７１．１、ＡＡＡ５２７７０．１）、ヒトＩｇＥ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ５９３９５．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２２２．１）、およびヒトＩｇＭ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＢ３７８３８．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５７０８６．１）の中から選択された１種以上であってもよい。一例において、前記抗体は、例えば、ヒト由来の、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。突然変異が導入される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメイン、第１ＣＨ１ドメインと第１ＣＬドメイン、および第２ＣＨ１ドメインと第２ＣＬドメインは、それぞれ独立して同一または異なる免疫グロブリンタイプから選択されたものであ���てもよい。
【００４１】
ヒトＩｇＧ１重鎖不変領域（配列番号３３）とヒトＩｇＡ１重鎖不変領域（配列番号３４）の配列整列結果を示す図３３Ａ、およびヒト免疫グロブリン軽鎖のカッパ不変領域（配列番号３５）とラムダ不変領域（配列番号３６）の配列整列結果を示す図３３Ｂに示されるように、重鎖不変領域および軽鎖不変領域のアミノ酸配列は、亜型間の保存度が非常に高い。
【００４２】
また、免疫グロブリンは、それに由来する種（ｓｐｅｃｉｅｓ）および亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）間の配列保存度が非常に高い。例えば、ヒトとマウスとラットのＩｇＧ亜型間の重鎖不変領域の配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）結果を示す図３３Ｃ（ＣＨ１ドメインの配列整列結果）および図３３Ｄ（ＣＨ３ドメインの配列整列結果）に示されるように、免疫グロブリンの重鎖不変領域のアミノ酸配列は、種間の保存度が非常に高い。
【００４３】
したがって、本明細書で提供されるＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインのアミノ酸位置はヒトＩｇＧ１を基準として、ＣＬドメインはヒトカッパ不変領域を基準として記載され、前記ヒトＩｇＧ１およびヒトカッパ不変領域を基準として記載されたアミノ酸位置は、通常の配列整列手段（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）により他の亜型の免疫グロブリンおよびヒト以外の種の免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸位置が明確に分かる（表１参照）。
【００４４】
また、本明細書で提供されるＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ３ドメインのアミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングシステムによって表現され、その詳細な事項は、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（重鎖不変領域）」、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＬＣｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（軽鎖ラムダ領域）」および「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＫＣｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（軽鎖カッパ領域）」により確認できる。
【００４５】
前記Ｅｕナンバリングによれば、ヒトＩｇＧ１を基準として、
（１）ＣＨ１ドメイン（配列番号１）は、１番目のアミノ酸（Ａｌａ）を１１８番目の位置にして一連番号でナンバリングされ（つまり、配列番号１のＣＨ１ドメインの１０８個のアミノ酸は、ＩｇＧ１の１１８番目から２１５番目までの位置に相当する）；
（２）ＣＨ３ドメイン（配列番号１５）は、１番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）を３４０番目の位置にして一連番号でナンバリングされる（つまり、配列番号１５のＣＨ３ドメインの１０８個アミノ酸は、ＩｇＧ１の３４０番目から４４７番目までの位置に相当する（以上、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ参照）。
【００４６】
本明細書におけるＣＨ１およびＣＨ３ドメインのアミノ酸位置およびこれに相当するアミノ酸種類は、ヒトＩｇＧ１を基準として記載する。
【００４７】
また、Ｅｕナンバリングによれば、
ヒトカッパ不変領域（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ５８９８９．１遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２４１．１）のＣＬドメイン（配列番号１０）は、１番目のアミノ酸（Ｖａｌ）を１１０番目の位置にして一連番号でナンバリングされ（つまり、配列番号１０のＣＬドメインの１０５個のアミノ酸は、１１０番目から２１４番目までの位置に相当する；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＫＣｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ参照）；
ヒトラムダ不変領域（配列番号１１（Ｌａｍｂｄａ１）、配列番号１２（Ｌａｍｂｄａ２）、配列番号１３（Ｌａｍｂｄａ３）、および配列番号１４（Ｌａｍｂｄａ７））では、１番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）を１１０番目の位置にして一連番号でナンバリングされる（ただし、ラムダ不変領域の場合、一連番号から１６９、２０１および２０２番目が脱落する；つまり、配列番号１１または配列番号１２のＣＬドメインの１０３個のアミノ酸は、１１０番目から１６８番目、１７０番目から２００番目、および２０３番目から２１５番目までの位置に相当する；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＬＣｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ参照）。本明細書におけるＣＬドメインのアミノ酸位置およびこれに相当するアミノ酸種類は、ヒトカッパ不変領域を基準として記載する。
【００４８】
前記Ｆａｂ保存領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＦａｂ断片の重鎖不変領域（つまり、ＣＨ１ドメイン）から選択されたいずれか１つである重鎖Ｆａｂの重鎖不変領域保存領域および免疫グロブリンの軽鎖のカッパタイプおよびラムダタイプ（例えば、ラムダタイプ１、ラムダタイプ２、ラムダタイプ３、およびラムダタイプ７）からなる群より選択されたいずれか１つの軽鎖不変領域（つまり、ＣＬドメイン）を含むことができる。
【００４９】
例えば、前記Ｆａｂ断片の重鎖不変領域（ＣＨ１ドメイン）として使用可能なＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ１ドメインはそれぞれ順次に、配列番号１（Ｅｕナンバリングで１１８番目から２１５番目までに相当する）、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、前記軽鎖不変領域（ＣＬドメイン）として使用可能な、カッパタイプ、ラムダタイプ１、ラムダタイプ２、ラムダタイプ３、およびラムダタイプ７のＣＬドメインであってもよいし、これらＣＬドメインはそれぞれ順次に、配列番号１０（Ｅｕナンバリングで１１０番目から２１４番目までに相当する）、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むものであってもよい。一例において、前記Ｆａｂ保存領域は、ＩｇＧタイプ１のＣＨ１ドメイン（配列番号１）およびカッパタイプの軽鎖不変領域（ＣＬドメイン）（配列番号１０）を含むことができる。同一の標的を標的化する分子間の二量体形成率を増加させるために、ＣＨ１ドメインで負電荷を有するアミノ酸または正電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、Ｅｕナンバリングシステムにより、ＩｇＧタイプ１（配列番号１）の１４５番目の位置のロイシン、１４７番目の位置のリシン、１７０番目の位置のフェニルアラニン、１７１番目の位置のプロリン、１８３番目の位置のセリン、および１８５番目の位置のバリンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。他の例において、ＣＨ１ドメインで負電荷を有するアミノ酸または正電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＩｇＧの他のサブタイプ（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ１ドメイン（順次に、配列番号２〜９）における配列番号１の１４５番目の位置のロイシン、１４７番目の位置のリシン、１７０番目の位置のフェニルアラニン、１７１番目の位置のプロリン、１８３番目の位置のセリン、および１８５番目の位置のバリンに対応する位置のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上であってもよい。
【００５０】
本明細書に使用された「対応する位置のアミノ酸」は、配列番号１のアミノ酸配列と対象アミノ酸配列（例えば、配列番号２〜９）との通常の配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって難なく決定される（以下、同一である）。
【００５１】
前記正電荷を有するアミノ酸（正電荷に荷電するアミノ酸）は、塩基性アミノ酸の中から選択され、例えば、リシンまたはアルギニンであってもよい。したがって、ＣＨ１ドメインに正電荷を有するアミノ酸が導入される場合、配列番号１の１４５番目の位置のロイシン、１４７番目の位置のリシン、１７０番目の位置のフェニルアラニン、１７１番目の位置のプロリン、１８３番目の位置のセリン、および１８５番目の位置のバリン、およびこれらに対応する位置の配列番号２〜９のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）がそれぞれ独立して塩基性アミノ酸、例えば、リシンまたはアルギニンに置換されていてもよい。
【００５２】
例えば、ＣＨ１ドメインは、正電荷を有するアミノ酸を導入するために、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の突然変異を含むことができる（配列番号１基準；配列番号２〜９における対応する位置のアミノ酸にも適用される）：
１４５番目の位置のロイシンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１８３番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１４７番目の位置のリシンをアルギニンに置換；
１７０番目の位置のフェニルアラニンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１７１番目の位置のプロリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；および
１８５番目の位置のバリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、アルギニンに置換）。
【００５３】
前記負電荷を有するアミノ酸は、酸性アミノ酸の中から選択され、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。したがって、ＣＨ１ドメインに負電荷を有するアミノ酸が導入される場合、配列番号１の１４５番目の位置のロイシン、１４７番目の位置のリシン、１７０番目の位置のフェニルアラニン、１７１番目の位置のプロリン、１８３番目の位置のセリン、および１８５番目の位置のバリン、およびこれらに対応する位置の配列番号２〜９のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）が、それぞれ独立して酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸に置換されていてもよい。例えば、ＣＨ１ドメインは、負電荷を有するアミノ酸を導入するために、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の突然変異を含むことができる（配列番号１基準；配列番号２〜９における対応する位置のアミノ酸にも適用される）：
１４５番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、グルタミン酸に置換）；
１４７番目の位置のリシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；
１８３番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、グルタミン酸に置換）；
１８５番目の位置のバリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；
１７０番目の位置のフェニルアラニンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；および
１７１番目の位置のプロリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）。
【００５４】
同一の標的を標的化する分子間の二量体形成率を増加させるために、軽鎖不変領域（ＣＬドメイン）で負電荷を有するアミノ酸または正電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、カッパタイプ（配列番号１０）の１３１番目の位置のセリン、１３３番目の位置のバリン、１３５番目の位置のロイシン、１６２番目の位置のセリン、および１８０番目の位置のトレオニンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。他の例において、ＣＬドメインで負電荷を有するアミノ酸または正電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ラムダタイプ（ラムダタイプ１、ラムダタイプ２、ラムダタイプ３、およびラムダタイプ７）のＣＬドメイン（順次に、配列番号１１〜１４）における配列番号１０の１３１番目の位置のセリン、１３３番目の位置のバリン、１３５番目の位置のロイシン、１６２番目の位置のセリン、および１８０番目の位置のトレオニンに対応する位置のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上であってもよい。
【００５５】
前記正電荷を有するアミノ酸（正電荷に荷電するアミノ酸）は、塩基性アミノ酸の中から選択され、例えば、リシンまたはアルギニンであってもよい。したがって、ＣＬドメインに正電荷を有するアミノ酸が導入される場合、配列番号１０の１３１番目の位置のセリン、１３３番目の位置のバリン、１３５番目の位置のロイシン、１６２番目の位置のセリン、および１８０番目の位置のトレオニン、およびこれらに対応する位置の配列番号１１〜１４のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）が、それぞれ独立して塩基性アミノ酸、例えば、リシンまたはアルギニンに置換されていてもよい。
【００５６】
例えば、ＣＬドメインは、正電荷を有するアミノ酸を導入するために、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の突然変異を含むことができる（配列番号１０基準；配列番号１１〜１４における対応する位置のアミノ酸にも適用される）：
１３１番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１３３番目の位置のバリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１３５番目の位置のロイシンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、アルギニンに置換）；
１６２番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；および
１８０番目の位置のトレオニンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、アルギニンに置換）。
【００５７】
同型二量体形成率をより高めるために、前記変異ＣＨ１ドメインおよび／または変異ＣＬドメインは、２つ以上の変異を同時に含むことができる。
【００５８】
例えば、ＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンと１８５番目の位置のバリンが正電荷を有するアミノ酸または負電荷を有するアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、第１ＣＨ１ドメインと第２ＣＨ１ドメインのうちいずれか１つのＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンと１８５番目の位置のバリンが正電荷を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）に置換され、他のＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンと１８５番目の位置のバリンは負電荷を有するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されていてもよい。また、ＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１８０番目の位置のトレオニンが正電荷を有するアミノ酸または負電荷を有するアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、第１ＣＬドメインと第２ＣＬドメインのうちいずれか１つのＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１８０番目の位置のトレオニンが正電荷を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）に置換され、他のＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１８０番目の位置のトレオニンは負電荷を有するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されていてもよい。
【００５９】
他の例において、ＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンと１７１番目の位置のプロリンが正電荷を有するアミノ酸または負電荷を有するアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、第１ＣＨ１ドメインと第２ＣＨ１ドメインのうちいずれか１つのＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンと１７１番目の位置のプロリンが正電荷を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）に置換され、他のＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンと１７１番目の位置のプロリンは負電荷を有するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されていてもよい。また、ＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１６２番目の位置のセリンが正電荷を有するアミノ酸または負電荷を有するアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、第１ＣＬドメインと第２ＣＬドメインのうちいずれか１つのＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１６２番目の位置のセリンが正電荷を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）に置換され、他のＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１６２番目の位置のセリンは負電荷を有するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されていてもよい。
【００６０】
前記負電荷を有するアミノ酸は、酸性アミノ酸の中から選択され、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。したがって、ＣＬドメインに負電荷を有するアミノ酸が導入される場合、配列番号１０の１３１番目の位置のセリン、１３３番目の位置のバリン、１３５番目の位置のロイシン、１６２番目の位置のセリン、および１８０番目の位置のトレオニン、およびこれらに対応する位置の配列番号１１〜１４のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）が、それぞれ独立して酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸に置換されていてもよい。例えば、ＣＬドメインは、正電荷を有するアミノ酸を導入するために、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の突然変異を含むことができる（配列番号１０基準；配列番号１１〜１４における対応する位置のアミノ酸にも適用される）：
１３１番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、グルタミン酸に置換）；
１３３番目の位置のバリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、グルタミン酸に置換）；
１３５番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；
１６２番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；および
１８０番目の位置のトレオニンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）。
【００６１】
一例において、前記のようにＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換する突然変異が導入されるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のアミノ酸対は、配列番号１（ＣＨ１ドメイン）および配列番号１０（ＣＬドメイン）のアミノ酸配列を基準として、ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３１番目の位置のセリンとの対、ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリンとの対、ＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンとＣＬドメインの１８０番目の位置のトレオニンとの対、ＣＨ１ドメインの１８３番目の位置のセリンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリンとの対、ＣＨ１ドメインの１８５番目の位置のバリンとＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンとの対、ＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンとＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンとの対、およびＣＨ１ドメインの１７１番目の位置のプロリンとＣＬドメインの１６２番目の位置のセリンとの対からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。例えば、前記突然変異が導入されるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のアミノ酸対は、配列番号１（ＣＨ１ドメイン）および配列番号１０（ＣＬドメイン）のアミノ酸配列を基準として、ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３１番目の位置のセリンとの対、ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリンとの対、ＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンとＣＬドメインの１８０番目の位置のトレオニンとの対、ＣＨ１ドメインの１８３番目の位置のセリンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリンとの対、およびＣＨ１ドメインの１８５番目の位置のバリンとＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンとの対からなる群より選択されたいずれか１つまたは２つ以上（例えば、２つ）であってもよい。
【００６２】
前記突然変異が導入される第１ＣＨ１ドメインと第１ＣＬドメインとの間のアミノ酸対と、第２ＣＨ１ドメインと第２ＣＬドメインとの間のアミノ酸対は、互いに同一または異なっていてもよい。
【００６３】
一例において、第１ＣＨ１ドメインに正電荷を有するアミノ酸が導入された場合（第１ＣＬドメインには負電荷を有するアミノ酸が導入される）、第２ＣＨ１ドメインには負電荷を有するアミノ酸が導入（第２ＣＬドメインには正電荷を有するアミノ酸が導入される）される。
【００６４】
異種二量体形成率を増加させるために、重鎖のＦｃ領域、具体的には、Ｆｃ領域中のＣＨ３ドメインに、次からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ、または３つの突然変異を導入することができる：
（１）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対（２つのアミノ酸のうち１つ以上は疎水性アミノ酸でない）のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異（以下、「静電的相互作用導入変異」）；
（２）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異（以下、「スワッピング変異」）；および
（３）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換された変異（以下、「サイズ変異」）。
【００６５】
このように変異が導入されるＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（配列番号１５；Ｅｕナンバリングにより、３４０番目から４４７番目までに相当する）、ヒトＩｇＧ２のＣＨ３ドメイン（配列番号１６）、ヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメイン（配列番号１７）、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン（配列番号１８）、ヒトＩｇＡ１のＣＨ３ドメイン（配列番号１９）、ヒトＩｇＡ２のＣＨ３ドメイン（配列番号２０）、ヒトＩｇＤのＣＨ３ドメイン（配列番号２１）、ヒトＩｇＥのＣＨ３ドメイン（配列番号２２）、およびヒトＩｇＭのＣＨ３ドメイン（配列番号２３）からなるグループより選択されるものであってもよい。
【００６６】
前記変異が導入される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、それぞれ独立してＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群より選択された、互いに同一または異なる免疫グロブリンタイプに由来するものであってもよい。一例において、前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインはいずれも、配列番号１５のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００６７】
以下に記載される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸対は、配列番号１５のヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として記載されたものであり、これに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメイン（順次に、配列番号１６〜２３）間のアミノ酸対にも適用される。
【００６８】
前記記載の変異が導入される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸対は、下記の表１に提示されたＣＨ３ドメイン間のアミノ酸対、およびこれに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメイン（順次に、配列番号１６〜２３）間のアミノ酸対からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。
【００６９】
【表１】
2019530641.tif 000003
2019530641.tif 000004
より具体的には、
（１）静電的相互作用導入変異（表２および図２にてＣｈａｒｇｅ（Ｊ）で表示）；
（２）スワッピング変異（表２および図２にてＳｗａｐ（Ｏ）で表示）；および
（３）サイズ変異（表２および図２にてＳｉｚｅ（Ｂ）で表示）
のうちいずれか１つ以上が導入される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸対は、下記の表２および図２に提示されたＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（配列番号１５）間のアミノ酸対、およびこれに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメイン（順次に、配列番号１６〜２３）間のアミノ酸対からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい：
【表２】
2019530641.tif 000005
2019530641.tif 000006
前記表２に記載の変異位置は、ＩｇＧ１を基準として表示されたが、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのこれに対応する位置にも適用される）
本明細書に使用されたものであって、例えば、「Ｑ３４７」は、配列番号１５のヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの３４７番目のアミノ酸位置のグルタミンを意味し、これは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメイン（順次に、配列番号１６〜２３）におけるこれに対応する位置のアミノ酸残基にも適用される（以下、同一である）。
【００７０】
以下に記載されるＣＨ３ドメインに変異が導入されるアミノ酸対は、配列番号１５を基準としてナンバリングして表示され、別途の反対の記載がない限り、ＩｇＧ１の表示された位置のアミノ酸だけでなく、他のタイプの免疫グロブリン（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）のＣＨ３ドメインのこれに対応する位置のアミノ酸にも適用されると解釈される。
【００７１】
前記静電的相互作用導入変異は、Ｆｃ領域またはＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対（２つのアミノ酸のうち１つ以上は疎水性アミノ酸でない）のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換によって、疎水性相互作用をしない部分に静電的相互作用を導入して静電的相互作用による結合力の増加に寄与する。
【００７２】
前記疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなるグループより選択されるものであってもよい。
【００７３】
前記負電荷を有するアミノ酸は、酸性アミノ酸の中から選択され、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。前記正電荷を有するアミノ酸は、塩基性アミノ酸の中から選択され、例えば、リシンまたはアルギニンであってもよい。
【００７４】
前記静電的相互作用導入変異が適用できる第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３との間のアミノ酸対は、前記表２のアミノ酸対番号１〜３９の中から選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよいし、例えば、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３９４番目の位置のトレオニンと３９４番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシン、３６６番目の位置のトレオニンと４０７番目の位置のチロシン、および３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。
【００７５】
つまり、前記ＣＨ３ドメインの静電的相互作用導入変異は、前記表２のアミノ酸対番号１〜３９の中から選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸を負電荷を有するアミノ酸に置換を含むことができ、例えば、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３９４番目の位置のトレオニンと３９４番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシン、３６６番目の位置のトレオニンと４０７番目の位置のチロシン、および３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸を負電荷を有するアミノ酸に置換を含むことができる。
【００７６】
例えば、前記ＣＨ３ドメインの静電的相互作用導入変異は、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の変異を含むことができる：
３６４番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、３６８番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３９４番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、３９４番目の位置のトレオニンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、３７０番目の位置のリシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、３４９番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３６６番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、４０７番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３９４番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、３９７番目の位置のバリンを負電荷を有するアミノ酸に置換；および
３４９番目の位置のチロシンを正電荷を有するアミノ酸に、３５７番目の位置のグルタミン酸を負電荷を有するアミノ酸に置換。
【００７７】
このようなＣＨ３ドメインの静電的相互作用導入によって、異種二量体形成率が６０％以上、６５％以上、７０％以上、７３％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％であってもよい。
【００７８】
前記スワッピング変異は、アミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに対等交換した（相互交換した）変異を意味する。
【００７９】
前記ＣＨ３ドメインのスワッピング変異が適用できる第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３との間のアミノ酸対は、表２および図２に示されているように、３５４番目の位置のグルタミンと３６０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のセリンと３４９番目の位置のチロシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３６０番目の位置のリシンと３４９番目の位置のチロシン、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、３６８番目のロイシンと４０９番目のリシン、３９０番目の位置のアスパラギンと４００番目の位置のセリン、３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリン、３９８番目の位置のロイシンと３９２番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、および４１１番目の位置のトレオニンと３７０番目の位置のリシンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよいし、例えば、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、および３５７番目の位置のセリンと３４９番目の位置のチロシンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。
【００８０】
つまり、前記ＣＨ３ドメインのスワッピング変異は、３５４番目の位置のグルタミンと３６０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のセリンと３４９番目の位置のチロシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３６０番目の位置のリシンと３４９番目の位置のチロシン、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、３６８番目のロイシンと４０９番目のリシン、３９０番目の位置のアスパラギンと４００番目の位置のセリン、３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリン、３９８番目の位置のロイシンと３９２番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、および４１１番目の位置のトレオニンと３７０番目の位置のリシンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに対等交換して置換（交換）されたものを含むことができ、例えば、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、および３５７番目の位置のセリンと３４９番目の位置のチロシンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに対等交換して置換（交換）されたものを含むことができる。
【００８１】
例えば、前記ＣＨ３ドメインのスワッピング変異は、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の変異を含むことができる：
３６４番目の位置のセリンをリシンに、３７０番目の位置のリシンをセリンに置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換；
４０７番目の位置のチロシンをトレオニンに、３６６番目の位置のトレオニンをチロシンに置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸をリシンに、３７０番目の位置のリシンをグルタミン酸に置換；および
３５７番目の位置のセリンをチロシンに、３４９番目の位置のチロシンをセリンに置換。
【００８２】
このようなＣＨ３ドメインのスワッピング変異により、異種二量体形成率が６０％以上、６５％以上、７０％以上、７３％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％であってもよい。
【００８３】
前記サイズ変異は、ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は、大きさの大きい疎水性アミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換された変異を意味するもので、大きいアミノ酸が小さいアミノ酸によって形成された空間に挟み合わされるので、ヘテロ二量体の形成に寄与できる。
【００８４】
前記大きいアミノ酸は、環状残基を含むものであってもよいし、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されたものであってもよく、例えば、トリプトファンであってもよい。前記小さいアミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択された１種以上であってもよく、例えば、アラニンであってもよい。
【００８５】
前記サイズ変異が適用できる第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３との間のアミノ酸対は、前記表２のアミノ酸対番号１〜４０の中から選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよく、例えば、４０９番目の位置のリシンと４０７番目の位置のチロシン、４０９番目の位置のリシンと４０５番目の位置のフェニルアラニン、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００８６】
つまり、前記サイズ変異は、前記表２のアミノ酸対番号１〜４０の中から選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸を大きさの大きい疎水性アミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）、例えば、トリプトファンに置換、他の１つのアミノ酸を大きさの小さい疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）、例えば、アラニンに置換を含むことができ、例えば、４０９番目の位置のリシンと４０７番目の位置のチロシン、４０９番目の位置のリシンと４０５番目の位置のフェニルアラニン、またはこれらすべてのうちそれぞれのアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸を大きさの大きい疎水性アミノ酸、例えば、フェニルアラニンまたはトリプトファンに置換、他の１つのアミノ酸を大きさの小さい疎水性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、またはバリンに置換を含むことができる。
【００８７】
例えば、前記ＣＨ３ドメインのサイズ変異は、次の１つ以上の変異を含むことができる：
４０９番目の位置のリシンをトリプトファンに、４０７番目の位置のチロシンをアラニンに置換；および
４０９番目の位置のリシンをトリプトファンに、４０５番目の位置のフェニルアラニンをアラニンに置換。
【００８８】
前記変異ＣＨ３ドメインは、先に説明した３つの変異、つまり、静電的相互作用導入変異、スワッピング変異、およびサイズ変異のうち１つ以上、例えば、１つまたは２つの変異をすべて含むことができる。
【００８９】
前記のような変異ＣＨ３ドメインにおいて、二量体の形成に最も有利な効果を奏するように、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシンのうちいずれか１つは正電荷を有するアミノ酸に、他の１つは負電荷を有するアミノ酸に置換（静電的相互作用導入変異）、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシンの交換（スワッピング変異）、および４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシンの交換（スワッピング変異）からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ、または３つの変異を含むことができる。
【００９０】
例えば、変異ＣＨ３ドメインは、次の変異のうち１つ以上、例えば、１つ、２つ、または３つの変異を含むものであってもよい：
（ａ）３６４番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、３６８番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
（ｂ）３６４番目の位置のセリンをリシンに、３７０番目の位置のリシンをセリンに置換；および
（ｃ）４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換。
【００９１】
単量体生成率を低くし、二量体形成率をより増加させるために、前記選択された３つの変異（（ａ）−（ｃ））導入後、追加のアミノ酸変異が導入されてもよい。このように追加のアミノ酸変異が導入できるアミノ酸は、３６４番目の位置のセリン、４０５番目の位置のフェニルアラニン、および／または４０９番目の位置のリシンであってもよいし、例えば、静電的相互作用導入変異が起こるアミノ酸対である３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシンとのアミノ酸対において、３６８番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸、例えば、アスパラギン酸）に置換する場合、３６４番目の位置のセリンは正電荷を有するアミノ酸（リシンまたはアルギニン）に置換されたり（Ｓ３６４ＫまたはＳ３６４Ｒ；静電的相互作用導入変異）、アスパラギンに置換（Ｓ３６４Ｎ）されていてもよい。また、スワッピング変異が起こるアミノ酸対である３７０番目の位置のリシンと３６４番目の位置のセリンとのアミノ酸対において、３７０番目の位置のリシンをセリンに、３６４番目の位置のセリンはリシンに置換されたり（Ｓ３６４Ｋ；スワッピング変異）、アルギニンまたはアスパラギンに置換（Ｓ３６４ＲまたはＳ３６４Ｎ）されていてもよい。
【００９２】
また、スワッピング変異が起こるアミノ酸対である４０９番目の位置のリシンと４０５番目の位置のフェニルアラニンとのアミノ酸対において、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換されたり（スワッピング変異）、トリプトファンに置換されていてもよく、４０５番目の位置のフェニルアラニンはリシンに置換されたり（Ｆ４０５Ｋ；スワッピング変異）、アルギニン、グルタミン、またはアスパラギンに置換（Ｆ４０５Ｒ、Ｆ４０５Ｑ、またはＦ４０５Ｎ）されていてもよい。
【００９３】
一例において、変異ＣＨ３ドメインは、次から選択された１つ以上の変異を含むものであってもよい：
３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換；
３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換；および
４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換。
【００９４】
一例において、変異ＣＨ３ドメインは、次から選択された二重変異を含むものであってもよい：
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；または
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換。
【００９５】
前記のようにＣＨ３ドメインが二重変異を含む場合の異種二量体形成率は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上または９６％以上であってもよい。
【００９６】
他の例は、配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＢ抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の例は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＡ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００９７】
他の例は、配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＢ抗体、および配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＡ抗体を含む、抗−インフルエンザＡ／抗−インフルエンザＢの二重特異性抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗−インフルエンザＡ／抗−インフルエンザＢの二重特異性抗体は、先に説明した（１）変異ＣＨ３ドメイン（つまり、先に説明したＣＨ３−ＣＨ３の突然変異対導入）；（２）変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメイン（つまり、先に説明したＣＨ１−ＣＬの突然変異対導入）；または（２）変異ＣＨ３ドメインと変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインをすべて含むものであってもよい。
【００９８】
本発明による二重特異性タンパク質または二重特異性抗体は、タンパク質の小単位間で関連付けられ調和の取れた境界突然変異（Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｏｕｓ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ；以下、Ｃｈｉｍｐｓという）により生成された異種特異性物質である。
【００９９】
用語「抗体」は、４つともがジスルフィド結合によって相互連結された一対の低分子量軽鎖（Ｌ）および一対の重鎖（Ｈ）の二対のポリペプチド鎖からなる、構造上関連する糖タンパク質のクラスを示す。抗体の構造は特徴がよく決定されている（例えば、文献［Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）］参照）。簡単に説明すれば、それぞれの重鎖は、概して重鎖可変領域（本願でＶＨと略称する）および重鎖不変領域からなる。重鎖不変領域は、概して３つのドメイン、つまり、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」でジスルフィド結合により相互連結される。それぞれの軽鎖は、概して軽鎖可変領域（本願でＶＬと略称する）および軽鎖不変領域からなる。軽鎖不変領域は、概して１つのドメインＣＬからなる。一般に、前記不変領域内におけるアミノ酸残基のナンバリングは、文献［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］に記載のＥＵ−インデックスにより行われる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変領域（または配列が超可変性であり／であったり構造的に規定されたループを形成きる超可変領域）に追加的に細分され、これら領域には、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。それぞれのＶＨおよびＶＬは、概して３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらは、アミノ−末端からカルボキシ−末端へと次の順に配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（また、文献［Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７（１９８７）］参照）。
【０１００】
本明細書において、用語「Ｆａｂ、またはＦａｂ−ａｒｍ」は、１つの重鎖−軽鎖対を意味する。
【０１０１】
本明細書において、用語「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む抗体領域を意味し、場合によって、ヒンジ領域を追加的に含んでもよい。
【０１０２】
用語「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの相異なるエピトープ、一般に、非−重複エピトープに対して特異性を有する抗体を意味する。
【０１０３】
用語「全長抗体」は、本願で使用される時、イソ型の抗体で通常発見されるすべての重鎖および軽鎖の不変および可変ドメインを含有する抗体を意味する。一例において、全長抗体は、２つの全長重鎖と２つの全長軽鎖とを含む。本願で使用されるように、「イソ型」は、重鎖不変領域の遺伝子によってコーディングされる抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を意味する。
【０１０４】
用語「抗原結合断片」は、抗体の可変ドメインを含む抗体の一部を意味するもので、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）などから選択されるが、これらに制限されるわけではない。
【０１０５】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定子を意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖のような分子の表面の群から一般的になり、一般に特異的な３次元構造特性だけでなく、特異的な電荷特性を有する。
【０１０６】
二重特異性抗体は、互いに異なる２つの抗原または１つの抗原のうちの区分される（非重複する）互いに異なる２つのエピトープを認識および／または結合する抗体を総称する。一例において、前記二重特異性抗体は、腫瘍細胞抗原に対する１つの抗原結合部位および細胞毒性開始分子に対する他の抗原結合部位を含むものであってもよいし、例えば、二重特異性抗体は、抗−ＦｃγＲＩ／抗−ＣＤ１５、抗−ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）抗−ＣＤ３／抗−悪性Ｂ−細胞（１Ｄ１０）、抗−ＣＤ３／抗−ｐ１８５ＨＥＲ２、抗−ＣＤ３／抗−ｐ９７、抗−ＣＤ３／抗−腎臓細胞癌、抗−ＣＤ３／抗−ＯＶＣＡＲ−３、抗−ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗−大腸癌）、抗−ＣＤ３／抗−メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗−ＥＧＦ受容体／抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ３／抗−ＣＡＭＡ１、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗−中性細胞付着分子（ＮＣＡＭ）／抗−ＣＤ３、抗−フォレート結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗−ＣＤ３、抗−汎癌腫関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗−ＣＤ３などからなる群より選択されたものであってもよいが、これらに制限されるわけではない。他の例において、腫瘍抗原に特異的に結合する１つの抗原結合部位および毒素に結合する１つの抗原結合部位を有する二重特異性抗体は、例えば、抗−サポリン／抗−Ｉｄ−１、抗−ＣＤ２２／抗−サポリン、抗−ＣＤ７／抗−サポリン、抗−ＣＤ３８／抗−サポリン、抗−ＣＥＡ／抗−リシンＡ鎖、抗−インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗−ハイブリードマイディオタイプ、抗−ＣＥＡ／抗−ビンカアルカロイドなどからなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−ＣＤ３０／抗−アルカラインホスファターゼ（マイトマイシンホスフェート前駆薬物をマイトマイシンアルコールに転換を触媒する）のように、転換酵素活性化前駆薬物用に使用されるものの中から選択されたものであってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−フィブリン／抗−組織プラスミノゲン活性因子（ｔＰＡ）、抗−フィブリン／抗−ウロキナーゼ類型プラスミノゲン活性因子（ｕＰＡ）のように、フィブリン分解製剤として使用可能なものの中から選択されるが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−低密度脂タンパク質（ＬＤＬ）／抗−Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）などのような細胞表面受容体に免疫複合体を標的化させるものの中から選択されるが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−インフルエンザＡ／抗−インフルエンザＢ、抗−ＣＤ３／抗−単純性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗−Ｔ−細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗−インフルエンザ、抗−ＦｃγＲ／抗−ＨＩＶなどのような感染性疾患（例えば、ウイルス性感染疾患）の治療に使用されるものの中から選択されるが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、試験管内または生体内腫瘍検出用二重特異性抗体であってもよいし、例えば、抗−ＣＥＡ／抗−ＥＯＴＵＢＥ、抗−��ＥＡ／抗−ＤＰＴＡ、抗−ｐ１８５ＨＥＲ２／抗−ハプテンなどからなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−ウサギＩｇＧ／抗−フェリチン、抗−ワサビダイコンフェロキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗−ホルモン、抗−ソマトスタチン／抗−サブスタンスＰ、抗−ＨＲＰ／抗−ＦＩＴＣ、抗−ＣＥＡ／抗−β−ガラクトシダーゼなどのように、診断手段に使用可能なものであってもよい。さらに他の例において、二重特異性抗体は、ＣＤ３０と結合する第１抗原結合部位およびｅｒｂＢ２と結合する第２抗原結合部位を含むもの；ＣＤ３０と結合する第１抗原結合部位およびシュードモナス外毒素（ＰＥ）と結合する第２抗原結合部位を含むもの；ＣＤ３０と結合する第１抗原結合部位およびストレプタビジンと結合する第２抗原結合部位を含むものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【０１０７】
他の例において、二重特異性タンパク質は、前記標的化ドメインとして、各種膜タンパク質、例えば、各種受容体（例えば、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）など）、前記受容体のエクトドメイン（細胞外ドメイン）、各種リガンド（例えば、各種成長因子、サイトカインなど）などからなる群より選択された１種以上の標的特異的結合ポリペプチドを含むことができる。例えば、前記受容体は、腫瘍壊死因子受容体（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＮＦＲ）（例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２など）、上皮細胞成長因子受容体（例えば、Ｈｅｒ１（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、Ｈｅｒ３（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ３））、アンジオポエチンレセプタ（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２など）、形質転換成長因子受容体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（例えば、ＴＧＦｂＲ１、ＴＧＦｂＲ２、ＴＧＦｂＲ３、ＴＧＦａＲ１など）、骨形成タンパク質受容体（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；例えば、ＢＭＰＲ１ｂ）、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１２Ｒ−ｂ１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｅｔａ１）、ＩＬ−４Ｒａ、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１Ｒ１Ｌ、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１２Ｒ−ｂ２、ＩＬ−１３Ｒａ１、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７Ｆなど）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＡ４（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ４）、ＩＴＧＡ２Ｂ（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ２ｂ）、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３など）、インターフェロン受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１）、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲなど）、Ｆａｓ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ６；ＴＮＦＲＳＦ６）、ＶＥＧＦ受容体（例えば、Ｆｌｔ１（ｆｍｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ１）など）、肝細胞成長因子受容体（例えば、Ｍｅｔなど）、ＩＦＮＧＲ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記リガンドは、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄなど）、アンジオポエチン（例えば、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２など）、形質転換成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７など）、インターロイキン、インターフェロンなどからなる群��り選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【０１０８】
本願で使用される用語「宿主細胞」は、発現ベクター、例えば、本発明の抗体をコーディングする発現ベクターが導入された細胞を指し示すように意図される。組換え宿主細胞は、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ／０細胞、およびリンパ構成細胞を含む。
【０１０９】
本発明の抗体のＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｆｃ部位（例えば、ＣＨ３ドメイン）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４亜型、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのような任意の抗体から得ることができる。前記抗体は、ヒト、サルなどの霊長類、またはマウス、ラットなどの齧歯類などのような哺乳類由来のものであってもよい。哺乳類由来の抗体は、特に、不変部位において、各種間の高い配列相同性および構造相同性を示すので、本明細書で説明されたＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ３ドメインに関する説明は、哺乳類由来の抗体に一般に適用可能である。一具体例において、前記ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）に由来するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。言及したように、本発明で記述された抗体のＦｃ部位は、２つの同一でない重鎖（例えば、可変ドメインの配列において相異なる）を含むが、前記２つの同一でない重鎖のうち少なくとも１つは、前記同一でない重鎖の安定した異種二量体を形成する確率を高め、同一の重鎖の安定した同種二量体を形成する確率を低くするために、アミノ酸変異を含む。
【０１１０】
本明細書で提供される二重特異性タンパク質、二重特異性抗体およびその抗原結合断片は、通常のすべての手段によって製造され、例えば、化学的合成または組換え的な方法によって生産される。前記タンパク質、抗体および断片は、自然に得られないもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。
【０１１１】
本発明において、Ｆｃの異種二重化のために突然変異化位置を図２に示した。静電的相互作用導入変異の場合は、３９個の位置を対象とし、スワッピングのためには１４個の位置を対象とし、サイズ変異は４０個の位置を対象とした。図２では、アミノ酸は、通常の方法により英大文字で表し、前記不変領域内におけるアミノ酸残基のナンバリングは、文献［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］に記載のＥＵ−インデックスにより示した。
【０１１２】
他の例は、先に説明した二重特異性タンパク質または二重特異性抗体、および任意に、薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物を提供する。他の例は、先に説明した二重特異性タンパク質または二重特異性抗体を薬学組成物の製造に使用する用途を提供する。他の例は、先に説明した二重特異性タンパク質または二重特異性抗体を含有する薬学組成物の製造方法を提供する。
【０１１３】
抗体およびこれを含む組成物（例、薬学組成物）を診断および治療適用に使用可能であり、かかるものとして治療または診断キットに含まれる。
【０１１４】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」は、生理的に両立する任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング物、抗菌、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、その他薬物の製造に通常使用される担体、賦形剤、添加剤などからなる群より選択された１種以上であってもよい。好ましくは、前記担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に好適な担体であってもよい（例、注射または注入により）。
【０１１５】
本発明の組成物は、当分野で公知の多様な方法により投与される。熟練者に理解されるように、投与経路および／または様相は、所望の結果に応じて変化する。本発明の化合物を特定の投与方法で投与するために、前記化合物をその不活性化を防止する物質でコーティングしたり共に投与することが必要でありうる。例えば、前記化合物を好適な担体、例えば、リポソームや希釈剤内で対象体に投与される。薬学的許容希釈剤は、食塩水および水性緩衝液を含む。薬学担体は、滅菌水性液や分散液、および滅菌注射液や分散液の臨時的な製造物用滅菌粉末を含む。そのような薬学的活性物質用培地と製剤の使用は、当該分野に公知である。
【０１１６】
用語「非経口投与」および「非経口投与される」は、本発明で使用されるように、腸管および局所外の投与方式を指し示すもので通常注射によるもので、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜内、関節腔内、眼内、心臓内、皮内、腹腔内、経器官内、皮下、角皮下、関節内、関節腔下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射と注入を含む。
【０１１７】
このような組成物はまた、保存剤、湿潤剤、エマルジョン剤、および分散剤のような補助剤を含む。微生物存在の防止は、前記滅菌過程によって、およびパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などのような多様な抗菌および抗真菌剤を含むことによって行われる。糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を前記組成物に含ませることが好ましい。また、注射用薬学形態を長期間吸収させることは、アルミニウムモノステアレートとゼラチンのような吸収を遅延させる製剤を含むことによって行われる。選択された投与経路と関係なく、本発明の化合物は、適切な水和形態および／または本発明の薬学組成物で使用できるが、当該分野における熟練者に公知の通常の方法で薬学許容投薬形態に製剤化される。
【０１１８】
本発明の薬学組成物において、活性成分の実際の投薬水準は、特定患者の所望の治療的反応を達成するのに効果的な量、組成および投与様相を患者に毒性的でないように得るために変化可能である。選択された投与水準は、使用される本発明の特定組成物の活性、投与経過、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせ使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および前の医学履歴、および医学分野に公知の他の要素を含む多様な躍動学的要素にかかっている。
【０１１９】
前記投与対象患者は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などのような哺乳類、およびこれらから分離された細胞、組織、体液（例えば、血液など）およびこれらの培養物から選択されたものであってもよい。
【発明の効果】
【０１２０】
本発明は、Ｃｈｉｍｐｓタンパク質（例えば、抗体）は、同種二量体またはモノマーによる汚染が少ない高い純度の異種二重化されたタンパク質およびその製造技術を提供する。本発明の他の利点は、天然の抗体に導入される変異個数を最小限にしながら二重特異性抗体の純度を高めることができて、天然抗体の構造に何ら意味のある構造的変化を起こさず、これにより抗体の機能喪失または異常、および／または免疫拒絶反応が起こる危険性を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、一実施例による二重特異性抗体の抗体を製造するのに作られる多様な形態の抗体（計１０個）のうちただ１つの抗体（円内部の抗体）のみが完全な異種二量体形態の二重特異性抗体であることを示す模式図である。ＡとＢは、それぞれ異なる重鎖を示し、ａとｂは、それぞれ異なる軽鎖を示す。
【図２】図２は、一実施例においてＦｃ不変領域で異種特異的結合を誘導するために使用された静電的相互作用、スワッピング、サイズ方法に使用された抗体の残基位置およびこれに関連する残基の位置を示す。
【図３】図３は、表４に記載されているように、静電的相互作用による突然変異による異種二量体の形成結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実行後に比較したものである。
【図４】図４は、表５に記載されているように、スワッピングによる関連突然変異による異種二量体の形成結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実行後に行った後に比較したものである。
【図５】図５は、表６に記載されているように、サイズによる突然変異による異種二量体の形成結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実行後に比較したものである。
【図６Ａ】図６Ａは、表７に記載の単一突然変異のうち優れた異種二重化が起こる突然変異１２個を比較したものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、一実施例で選択された２つのキー突然変異のうちＳ３６４Ｋを他のアミノ酸に置換させて得られた異種二量体の形成結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、一実施例で選択された２つのキー突然変異のうちＦ４０５Ｋを他のアミノ酸に置換させて得られた異種二量体の形成結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、一実施例で選択された３つのｋｅｙ−ｌｏｃｋ突然変異対であるＳ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、およびＦ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆに追加の突然変異を導入して得られた異種二量体の形成結果を示し、縦軸の数値は分子量（ｋＤ）を示す。
【図７】図７は、単一突然変異Ｓ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆの異種二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の効率を、従来の技術（ＫｉＨ、ＣＰＣ、ＡｚＳ対照群）と比較して効率を確認したものである。各キーに相当するアミノ酸をそれぞれ異なるアミノ酸に変えた場合、Ｓ３６４の場合、Ｋが最善であり、Ｆ４０５の場合、ＫとＲ（アルギニン）がほぼ類似の効果を示す。Ａ鎖およびＢ鎖において単一突然変異が起こる部分を示し、異種二量体化の程度を数値で示す。
【図８】図８は、Ｓ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆの３つの突然変異対を組み合わせて２つの二重突然変異対を得て、それぞれの対でＦ４０５をＫとＲの２種類に作って計４種類の二重突然変異対の異種二量体化の効率を、従来の技術（ＫｉＨ、ＣＰＣ、ＡｚＳ対照群）と比較して効率を確認したものである。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｃは、ロック（Ｌｏｃｋ）突然変異に相当するアミノ酸を他の突然変異に変えた場合、より良い効果があるかを確認するために、二重突然変異対でロック（ｌｏｃｋ）に相当するＬ３６８、Ｋ３７０、Ｋ４０９を他のアミノ酸に表６により突然変異させてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。
【図９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｃは、ロック（Ｌｏｃｋ）突然変異に相当するアミノ酸を他の突然変異に変えた場合、より良い効果があるかを確認するために、二重突然変異対でロック（ｌｏｃｋ）に相当するＬ３６８、Ｋ３７０、Ｋ４０９を他のアミノ酸に表６により突然変異させてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。
【図９Ｃ】図９Ａ〜図９Ｃは、ロック（Ｌｏｃｋ）突然変異に相当するアミノ酸を他の突然変異に変えた場合、より良い効果があるかを確認するために、二重突然変異対でロック（ｌｏｃｋ）に相当するＬ３６８、Ｋ３７０、Ｋ４０９を他のアミノ酸に表６により突然変異させてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。
【図１０】図１０は、抗体のＦａｂで静電的相互作用に関連する突然変異、サイズ関連突然変異、スワッピング関連突然変異の位置を示す。
【図１１】図１１は、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｐａｉｒｉｎｇ（ＣＰＰ）  Ａｓｓａｙ過程を模式的に示す。
【図１２】図１２は、４Ｄ９と２Ｂ９を用いて、すでに効果的と報告されているＣ１、ＤｕｅｔＭａｂ、Ｖ２３の重鎖と軽鎖との間の突然変異対をクローニングして共同−発現して、図１１の過程によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１３】図１３は、重鎖と軽鎖との間に静電気相互作用による関連突然変異の一つでＡ鎖（２Ｂ９重鎖）の当該アミノ酸をＫ（リシン）に、Ｂ鎖（４Ｄ９重鎖）の場合には、Ｄ（アスパラギン酸）に変えた突然変異が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を示す。
【図１４】図１４は、４Ｄ９および２Ｂ９抗体を用いた突然変異対のリストのうちＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で比較した結果、比較的正確にペアリングしやすい３０番目の突然変異を重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をＲとＤに変えた場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１５】図１５と図１６は、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＥまたはＤとＲに変えたものに、軽鎖に２９番目の突然変異Ｓ１３１Ｄおよび／またはＳ１３１Ｋを加えた突然変異が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１６】図１５と図１６は、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＥまたはＤとＲに変えたものに、軽鎖に２９番目の突然変異Ｓ１３１Ｄおよび／またはＳ１３１Ｋを加えた突然変異が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１７】図１７は、４８番目の突然変異対（重鎖のＳ１８３と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫ（Ｒ）とＤ（Ｅ）に変えたもの）のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１８】図１８は、表１９に示された突然変異対ｃ２９ｃ３０ｃ４８ＦΦ２９ｆ３０ｆ４８、およびその変形突然変異対が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１９】図１９は、表２０の突然変異対が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図２０】図２０は、表２１の突然変異対が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図２１】図２１は、一実施例による重鎖と軽鎖対の突然変異のうち３４番目の突然変異と５１番目の突然変異とを組み合わせて導入させた場合のペアリング程度を示す結果である。
【図２２】図２２は、一実施例による重鎖と軽鎖対の突然変異のうちｃ３４Фｆ５１突然変異対を導入させた場合のペアリング程度を示す結果である。
【図２３】図２３は、一実施例による重鎖と軽鎖対の突然変異のうちｃ４０Фｆ４４突然変異対を導入させた場合のペアリング程度を示す結果である。
【図２４】図２４は、一実施例により重鎖および軽鎖が突然変異化された二重特異性抗体の模式図である。
【図２５】図２５は、一実施例により製造された抗体の重鎖Ａ鎖およびＢ鎖、および軽鎖ａ鎖およびｂ鎖の熱的安定性を示すグラフである。
【図２６】図２６は、ｐｃＤＮＡ３の開裂地図である。
【図２７】図２７は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖおよびＡｄａｂｅｖのＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）結果を示すグラフである。
【図２８】図２８は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖのＳｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）  Ａｎａｌｙｓｉｓ）結果を示すグラフである。
【図２９】図２９は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＡｄａｂｅｖのＳｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）  Ａｎａｌｙｓｉｓ結果を示すグラフである。
【図３０】図３０は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖおよびＡｄａｂｅｖの二量体の形成様相を示す結果である。
【図３１】図３１は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体Ｔｒａｂｅｖの抗原（Ｈｅｒ２およびＶＥＧＦ）に対する結合力を示すグラフである。
【図３２】図３２は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体Ａｄａｂｅｖの抗原（ＴＮＦ−ａｌｐｈａおよびＶＥＧＦ）に対する結合力を示すグラフである。
【図３３Ａ】図３３Ａは、ヒトＩｇＧ１重鎖不変領域とヒトＩｇＡ１重鎖不変領域の配列整列結果を示す（ヒトＩｇＧ１重鎖不変領域：配列番号３３；ヒトＩｇＡ１重鎖不変領域：配列番号３４）。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、ヒト免疫グロブリン軽鎖のカッパ不変領域とラムダ不変領域の配列整列結果を示す（ヒト免疫グロブリン軽鎖のカッパ不変領域：配列番号３５；ヒト免疫グロブリン軽鎖のラムダ不変領域：配列番号３６）。
【図３３Ｃ】図３３Ｃおよび図３３Ｄは、ヒトとマウスとラットのＩｇＧ亜型間の重鎖不変領域の配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）結果を示すもので、図３３Ｃは、ＣＨ１ドメインの配列整列結果を、図３３Ｄは、ＣＨ３ドメインの配列整列結果をそれぞれ示す（図３３Ｃにて、（ＣＨ１  ｄｏｍａｉｎ）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１：配列番号１、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２：配列番号２、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３：配列番号３、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４：配列番号４、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１：配列番号３７、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａｂ：配列番号３８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａａ：配列番号３９、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４０、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３：配列番号４１、Ｒａｔ  ＩｇＧ１：配列番号４２、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ：配列番号４３、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４４、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｃ：配列番号４５；図３３Ｄにて、（ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎ）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１：配列番号１５、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２：配列番号１６、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３：配列番号１７、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４：配列番号１８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１：配列番号４６、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａｂ：配列番号４７、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａａ：配列番号４８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４９、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３：配列番号５０、Ｒａｔ  ＩｇＧ１：配列番号５１、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ：配列番号５２、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号５３、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｃ：配列番号５４）。
【図３３Ｄ】図３３Ｃおよび図３３Ｄは、ヒトとマウスとラットのＩｇＧ亜型間の重鎖不変領域の配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）結果を示すもので、図３３Ｃは、ＣＨ１ドメインの配列整列結果を、図３３Ｄは、ＣＨ３ドメインの配列整列結果をそれぞれ示す（図３３Ｃにて、（ＣＨ１  ｄｏｍａｉｎ）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１：配列番号１、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２：配列番号２、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３：配列番号３、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４：配列番号４、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１：配列番号３７、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａｂ：配列番号３８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａａ：配列番号３９、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４０、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３：配列番号４１、Ｒａｔ  ＩｇＧ１：配列番号４２、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ：配列番号４３、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４４、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｃ：配列番号４５；図３３Ｄにて、（ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎ）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１：配列番号１５、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２：配列番号１６、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３：配列番号１７、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４：配列番号１８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１：配列番号４６、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａｂ：配列番号４７、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａａ：配列番号４８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４９、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３：配列番号５０、Ｒａｔ  ＩｇＧ１：配列番号５１、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ：配列番号５２、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号５３、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｃ：配列番号５４）。
【図３４】図３４は、一実施例により製造されたｃ３４Фｆ５１突然変異対が導入された抗体の軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を示す結果である。
【図３５】図３５は、一実施例により製造されたｃ３４Фｆ５１突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖのＨＩＣ結果を示すグラフである。
【図３６】図３６は、一実施例により製造されたｃ３４Фｆ５１突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＡｄａｂｅｖのＨＩＣ結果を示すグラフである。
【図３７】図３７は、一実施例により製造されたｃ３４Фｆ５１突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖおよびＡｄａｂｅｖの二量体の形成様相を示す結果である。
【図３８】図３８は、一実施例により製造されたｃ４０Фｆ４４突然変異対が導入された抗体の軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を示す結果である。
【図３９】図３９は、一実施例により製造されたｃ４０Фｆ４４突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖのＨＩＣ結果を示すグラフである。
【図４０】図４０は、一実施例により製造されたｃ４０Фｆ４４突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＡｄａｂｅｖのＨＩＣ結果を示すグラフである。
【図４１】図４１は、一実施例により製造されたｃ４０Фｆ４４突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖおよびＡｄａｂｅｖの二量体の形成様相を示す結果である。
【図４２】図４２は、比較例によるＥｎｂ−ＦｃとＦａｓ−Ｆｃをそれぞれｓｉｎｇｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥで同種二量体の形成程度を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
本発明を下記の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明の権利範囲が下記の実施例に限定される意図ではない。
【０１２３】
本発明の実施のために、すべての試料は、次の過程を経て準備された。
【０１２４】
タンパク質発現
１．ターゲットとなる遺伝子を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；図）にクローニングした。
【０１２５】
２．Ｈｅｋ２９３Ｅ（ＡＴＣＣ）細胞を湿潤化されたＣＯ２インキュベータで５％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が補充された高濃度ブドウ糖ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。
【０１２６】
３．準備されたプラスミドＤＮＡをフルコンフルエンシーでＨｅｋ２９３Ｅ細胞に一時的注入（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する。転移前に培養培地をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、血清のない高濃度ＤＭＥＭに入れ替える。
【０１２７】
４．１週間インキュベーション後に、コンディションされた培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）で収穫してろ過した。Ｆｃ−融合タンパク質および抗体をプロテインＡクロマトグラフィーによって分離した。
【０１２８】
５．精製されたタンパク質の濃度の定量は２８０ｎｍの波長を観測して測定した。
【０１２９】
＜実施例１＞２つのＦｃ領域の異種二重化の突然変異の選択
２つのＦｃ領域（ＣＨ３ドメイン；配列番号１５）（ＩｇＧ１基準）の異種二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）のための突然変異位置は図２に示した。静電的相互作用による関連突然変異（静電的相互作用導入変異）のために３９個の位置が選定され（「Ｃｈａｒｇｅ  Ｊ」で表示）、スワッピングによる関連突然変異（スワッピング変異）のために１４個の位置が選定され（「Ｓｗａｐ  Ｏ」で表示）、サイズによる関連突然変異（サイズ変異）のために４０個の位置が選定された（「Ｓｉｚｅ  Ｂ」で表示）。最終的に選定されたＣＨ３ドメインの位置および突然変異したアミノ酸を表３に示した。各突然変異対を互いに異なる抗体に由来する２つのＦｃ領域（それぞれＡ鎖とＢ鎖で表現）に適用してクローニングして共同−発現した。静電気相互作用による関連突然変異の場合は、Ａ鎖の当該アミノ酸を正電荷を含むアミノ酸を代表してＫ（リシン）に、Ｂ鎖の場合には、負電荷を含むアミノ酸を代表してＤ（アスパラギン酸）に変えた。スワッピングによる関連突然変異の場合には、Ａ鎖とＢ鎖のアミノ酸を互いに置き換えた。サイズによる関連突然変異の場合には、Ａ鎖はＷ（トリプトファン）に、Ｂ鎖はサイズの小さいＡ（アラニン）に変えた。
【０１３０】
【表３】
2019530641.tif 000007
2019530641.tif 000008
Ｆｃ−融合タンパク質において同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）と異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより容易に区別するために、ｐｃＤＮＡ３ｖｅｃｔｏｒ（図２６参照；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をバックボーンとして用いて、一方の鎖（鎖Ａ：Ｅｎｂｒｅｌ）にはＴＮＦ−アルファ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：ＮＰ＿００１０５７．１（暗号化遺伝子：ＮＭ＿００１０６６．２のＣＤＳ；配列番号２４））の細胞外ドメイン（配列番号２４の１−７７１部位の暗号化配列）をＦｃ（暗号化遺伝子：配列番号２６）に融合させ、他方（鎖Ｂ：Ｆａｓ）にはＦａｓ受容体（ＮＰ＿００００３４．１（暗号化遺伝子：ＮＭ＿００００４３．５のＣＤＳ；配列番号２５））の細胞外ドメイン（配列番号２５の１−５１９部位の暗号化配列）をＦｃ（暗号化遺伝子：配列番号２６）に融合させた。Ａ鎖のモノマーは５３ｋＤであり、Ｂ鎖のモノマーは約４４ｋＤである。前記Ｆｃ−細胞外ドメインが融合されている鎖ＡとＢのサイズが相異なるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２つの同型結合（ＡＡおよびＢＢ）および異種結合（ＡＢ）が容易に区別される。
【０１３１】
Ａ鎖とＡ鎖の結合（同型結合）数値（％）をＳＡＡで表し、Ａ鎖とＢ鎖の結合（異種結合）数値（％）をＳＡＢで表し、Ｂ鎖とＢ鎖との間の結合数値（％）をＳＢＢで表した。
【０１３２】
表３に表されるような突然変異が導入されたＡ鎖とＢ鎖の接合様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察した同型結合（ＡＡおよびＢＢ）および異種結合（ＡＢ）比率（％）を、変異の起こらないＡ鎖とＢ鎖（それぞれＷＴで表示）の結果と比較し、このうち静電的相互作用による突然変異が導入された場合の結果を表４および図３に示し、サイズによる突然変異が導入された場合の結果を表５および図４に示し、スワッピングによる関連突然変異が導入された場合の結果を表６および図５に示した。
【０１３３】
【表４】
2019530641.tif 000009
【表５】
2019530641.tif 000010
【表６】
2019530641.tif 000011
前記表４〜６中、異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成率（％；ＳＡＢ）が７０％を超える突然変異を太い文字で表した。前記表４〜６から確認されるように、試験された突然変異対は６０％以上の異種二量体形成率を示した。
【０１３４】
前記結果により、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）より異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成率が高く、異種二量体形成率が７０％以上の１２対（Ｙ３４９Ｋ−Ｅ３５７Ｄ、Ｅ３５７Ｋ−Ｙ３４９Ｄ、Ｅ３５７Ｋ−Ｋ３７０Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｔ３６６Ｋ−Ｙ４０７Ｄ、Ｔ３９４Ｋ−Ｔ３９４Ｄ、Ｔ３９４Ｋ−Ｖ３９７Ｄ；以上、静電的相互作用導入変異、Ｅ３５７Ｙ−Ｙ３４９Ｅ、Ｅ３５７Ｋ−Ｋ３７０Ｅ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ｔ−Ｔ３６６Ｙ；以上、スワッピング変異）の突然変異が選択された（表４および５で太い文字で表示）。
【０１３５】
前記選択された１２対のアミノ酸対に含まれている１２個のアミノ酸残基変異をＦａｓ−Ｆｃ融合タンパク質にそれぞれ導入させて、前記アミノ酸位置で単一変異を含む変異Ｆａｓ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させることによって、同等の条件における同種二量体および単量体残存率（Ｓｓｍ；１＝１００％）を比較して、その結果を表７および図６Ａに示した。
【０１３６】
【表７】
2019530641.tif 000012
表７および図６Ａ中、同種二量体形成率が低く、単量体残存率が高い（５０％以上）２つの突然変異Ｓ３６４Ｋ、Ｆ４０５Ｋを選択した。
【０１３７】
選択された２つの突然変異を「キー（ｋｅｙ）」突然変異とし、これと相互作用する他の鎖のＣＨ３ドメインの部分を「ロック（ｌｏｃｋ）」突然変異とみて、これを組み合わせて、Ｓ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆの３つのｋｅｙ−ｌｏｃｋ突然変異対を選択した。この突然変異対をＡ鎖（キー突然変異）およびＢ鎖（ロック突然変異）に導入して、３種類の単一突然変異対を得た（表８参照）。
【０１３８】
【表８】
2019530641.tif 000013
それぞれのキー突然変異が起こる位置のアミノ酸を他のアミノ酸に変えて、先に説明したような単一変異による異種二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）効果を試験して、前記位置から異種二量体化に効果が良い突然変異の種類を確認した。Ｓ３６４において、Ｋ（リシン）に置換される場合、異種二量体化効果が最も良く現れ、Ｎ（アスパラギン）とＲ（アルギニン）に置換された場合にも、異種二量体化効果が優れていた（図６Ｂ参照）。Ｆ４０５においては、ＫとＲに置換される場合、類似する程度の優れた異種二量体化効果を示し、ＮとＱ（グルタミン）に置換される場合にも、優れた異種二量体化効果を示した（図６Ｃ参照）。
【０１３９】
前記選択された３つのｋｅｙ−ｌｏｃｋ突然変異対であるＳ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、およびＦ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆに、図６Ｂおよび図６Ｃから確認された追加の突然変異Ｓ３６４Ｎ、Ｓ３６４Ｒ、Ｆ４０５Ｒ、Ｆ４０５Ｎ、およびＦ４０５Ｑを適用して、ｌｏｃｋ突然変異をＡ  ｃｈａｉｎ（ＴＮＦＲ２−Ｆｃ）に導入させ、ｋｅｙ突然変異をＢ  ｃｈａｉｎ（Ｆａｓ−Ｆｃ）に導入させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で異種二量体化効果を試験した。
【０１４０】
前記得られた結果を表９および図６Ｄに示した：
【表９】
2019530641.tif 000014
＜実施例２＞単一突然変異によるＦｃ領域の異種二量体化試験
前記実施例１で選択された３つのｋｅｙ−ｌｏｃｋ突然変異対であるＳ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、およびＦ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆと、ｋｅｙ突然変異位置のＦ４０５をＫの代わりにＲに変異させたＦ４０５ＲＫ４０９Ｆ突然変異対の異種二量体化効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定して、すでに知られた異種二量体Ｆｃ突然変異対の対照群ＫｉＨ、ＣＰＣ、およびＡｚＳの結果と比較した。
【０１４１】
本実施例を含む下記のすべての実施例におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の定量化は、ＧｅｌＱｕａｎｔ．ＮＥＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてバンド強度（ｂａｎｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を数値化したものである。
【０１４２】
前記得られた結果を表１０および図７に示した：
【表１０】
2019530641.tif 000015
前記Ｔｍは次の方法で測定した：
Ｒｅａｇｅｎｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ４４６１１４６「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＳｈｉｆｔＴＭ」Ｄｙｅ  Ｋｉｔ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ：Ｃｈｒｏｍｏ４−ＰＴＣ２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ：２０μｌ  ｉｎ  ｔｏｔａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ                                                      １０μｌ
ＤＷ                                                                ３μｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＳｈｉｆｔＴＭ  Ｂｕｆｆｅｒ          ５μｌ
１／１００  ｄｉｌｕｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＳｈｉｆｔＴＭ  Ｄｙｅ                                                                  ２μｌ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：
１．Ｉｎｃｕｂａｔｅ  ａｔ  ５０．０℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ；
２．Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｃｕｒｖｅ  ｆｒｏｍ  ５０．０℃  ｔｏ  ９０．０℃、ｒｅａｄ  ｅｖｅｒｙ  ０．２℃、ｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ２ｓｅｃ；
３．Ｉｎｃｕｂａｔｅ  ａｔ  ９０．０℃  ｆｏｒ  ２ｍｉｎ
４．Ｉｎｃｕｂａｔｅ  ａｔ  １０．０℃  ｆｏｒｅｖｅｒ
５．Ｅｎｄ
表１０および図７のように、Ａ鎖とＢ鎖をそれぞれ単一発現した場合、キー（ｋｅｙ）が入っているＡ鎖は同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）をほとんど形成せずモノマーで発現し、共同−発現した試料からも、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）はほとんどなく異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）としてのみ存在することが確認された（図７参照）。
【０１４３】
＜実施例３＞二重突然変異によるＦｃ領域の異種二量体化
キー突然変異がＡ、Ｂ鎖のうち一方にのみ存在することより両方ともに存在する場合、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）化の可能性を低下させることから、実施例１で選択された３つの突然変異対を組み合わせて２つの二重突然変異対を得て、それぞれの対でＦ４０５をＫとＲの２種類に作って計４種類の二重突然変異対を得た。これら４つの二重突然変異対の異種二量体化効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定して、対照群ＫｉＨ、ＣＰＣ、ＡｚＳの結果と比較した。
【０１４４】
前記得られた結果を表１１および図８に示した：
【表１１】
2019530641.tif 000016
表１１および図８のように、４つの突然変異対とも、両鎖に入っているキー突然変異によって単一発現した場合、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）が別に形成されず、共同−発現した試料から、ほぼすべてのタンパク質が異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）としてのみ発現することが確認された（図８参照）。また、Ｆ４０５ＫよりＦ４０５Ｒが導入された二重突然変異対がより高い熱的安定性を示した（表１１）。
【０１４５】
ロック（Ｌｏｃｋ）突然変異に相当するアミノ酸を他の突然変異に変えた場合により良い効果があるかを確認するために、二重突然変異対でロック（ｌｏｃｋ）に相当するＬ３６８、Ｋ３７０、およびＫ４０９を他のアミノ酸に突然変異させた。Ｌ３６８、Ｋ３７０、およびＫ４０９を多様に突然変異させた突然変異の組み合わせを表１２にまとめ、これら組み合わせの異種二量体化効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定して（ＮＲ：８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ；Ｓａｍｐｌｅ：２４ｕｌ  Ｌｏａｄｉｎｇ）、その結果を図９Ａ〜９Ｃに示した。
【０１４６】
【表１２】
2019530641.tif 000017
2019530641.tif 000018
これら組み合わせに対する熱的安定性を測定（実施例２参照）して、その結果を表１３に示した。
【０１４７】
【表１３】
2019530641.tif 000019
熱的安定性を分析した結果、Ｋ４０９をトリプトファン（Ｗ）に突然変異させる場合に、Ｋ４０９Ｆよりも高い熱的安定性を示した。
【０１４８】
前記結果を参照して、下記のＦｃ異種二量体試験のためのＣＨ３ドメインに導入される突然変異として、Ａ鎖にはＳ３６４Ｋ、Ｋ４０９Ｗが入り、Ｂ鎖にはＫ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｒが入った二重突然変異を選択して、ＡＷＢＢ突然変異対と名付けた。
【０１４９】
＜実施例４＞抗体のＦａｂにおける重鎖と軽鎖に対する突然変異の選択
抗体の重鎖と軽鎖の突然変異を選択するために、静電的相互作用関連する突然変異、サイズ関連突然変異、スワッピング関連突然変異を行った。重鎖と軽鎖における相互作用の位置を図１０に示した。
【０１５０】
重鎖と軽鎖の突然変異を容易に確認するために、同一の軽鎖を有する抗体をクローニングした。４Ｄ９抗体（ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と２Ｂ９抗体（ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）はいずれも、抗−インフルエンザ抗体として同一の軽鎖（ｃｏｍｍｏｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：ＣＬＣ）を有する。これらは同一の軽鎖を有しているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより重鎖と軽鎖との間の相互作用を容易に把握できる。４Ｄ９と２Ｂ９の両抗体は、軽鎖のアミノ酸配列は同一であるが、重鎖の配列も異なり、大きさも差があるため（２Ｂ９の重鎖が４Ｄ９の重鎖よりアミノ酸６個がさらに多く、タンパク質の大きさも２Ｂ９の重鎖（５０１３０．６２Ｄａｌｔｏｎｓ）が４Ｄ９の重鎖（４９４９９．９８Ｄａｌｔｏｎｓ）より大きい：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で明確に識別可能である）、両方のいずれの重鎖が軽鎖と相互作用するかの還元条件で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズとして区別可能である。
【０１５１】
４Ｄ９と２Ｂ９の両抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびこれを暗号化する核酸配列を下記の表１４に示した：
【表１４】
2019530641.tif 000020
４Ｄ９と２Ｂ９の両抗体の重鎖不変領域はＩｇＧ１の不変領域を、軽鎖不変領域はカッパ不変領域をそれぞれ使用した。
【０１５２】
軽鎖に突然変異を導入し、その突然変異と相互作用する突然変異を有する重鎖の鎖だけがこの軽鎖と結合するかを確認するために、軽鎖、その軽鎖とペアリングする重鎖と誤った結合（ｍｉｓｐａｉｒ）をなす重鎖を共同−発現して作られた抗体を、還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥすればペアリングがどれほど正確に行われたかを確認できる。便宜上、４Ｄ９重鎖をＡ鎖、これとペアリングする軽鎖をａ鎖、そして２Ｂ９重鎖をＢ鎖、これとペアリングする軽鎖をｂ鎖と呼ぶこととする（下表を参照）。
【０１５３】
【表０】
2019530641.tif 000021
まず、４Ｄ９と２Ｂ９を用いて、すでに効果的と報告されている従来の重鎖と軽鎖との間の突然変異対をクローニングして共同−発現して、変異させた２つの重鎖と１つの軽鎖のｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎにより形成されたペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｐａｉｒｉｎｇ（ＣＰＰ）  Ａｓｓａｙ）。前記Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｐａｉｒｉｎｇ（ＣＰＰ）  Ａｓｓａｙ過程を図１１に模式的に示し、得られた結果を図１２に示した。図１２のように、すでに報告されたすべての突然変異対が正常なペア（ｐａｉｒ）と異常ペア（ｍｉｓｐａｉｒ）のように起こることが確認された。
【０１５４】
重鎖と軽鎖との間に静電気相互作用による関連突然変異の場合は、Ｂ鎖（２Ｂ９重鎖）の当該アミノ酸をＫ（リシン）に、Ａ鎖（４Ｄ９重鎖）の場合にはＤ（アスパラギン酸）に変えながら、多様な突然変異対が導入された抗体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＣＰＰ  ａｓｓａｙ（図１１参照）を行った。
【０１５５】
その結果、静電的相互作用による関連突然変異グループで比較的正確にペアリングが起こることが確認された７つの候補突然変異対をスクリーニングした。スクリーニングされた７つの突然変異対が導入された抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＣＰＰ  ａｓｓａｙ結果を表１５および図１３に示した。
【０１５６】
【表１５】
2019530641.tif 000022
４Ｄ９（Ａ鎖）および２Ｂ９（Ｂ鎖）抗体を用いた突然変異対のリストのうち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で比較した結果、比較的正確にペアリングが起こる突然変異対のいくつかを発見することができた（表１５で太い文字で表示）。これに対する追加の研究をするために、前記３０番目の突然変異（ｃ３０Φｆ３０で表示）を表１６のように変形した。
【０１５７】
【表１６】
2019530641.tif 000023
３０番目の突然変異は重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫとＤに変えたものであり、前記表１６のように、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をＲとＤに変えた変形形態の場合も効果（ペアリング精度：ＡａペアまたはＢｂペア比率）が良かった（図１４参照（Ａａペアリング精度７５％、Ｂｂペアリング精度：６０％））。
【０１５８】
前記３０番目の突然変異またはその変形（重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫまたはＲとＤまたはＥに置換）に、軽鎖に突然変異Ｓ１３１Ｄ（２９番目の突然変異と称する）を加えると、ペアリング精度がより向上した（表１７および図１５（ｃ２９ｃＲ３０ΦｆＲ３０の結果；Ａａペアリング精度：８０％、Ｂｂペアリング精度：７０％）および図１６（ｃＲ２９ｃＲＥ３０ΦｆＲ２９ｆＲＥ３０の結果；Ａａペアリング精度：９０％、Ｂｂペアリング精度：８０％）参照）。
【０１５９】
【表１７】
2019530641.tif 000024
図１４および図１５から確認されるように、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫとＤに変えた３０番目の突然変異だけでなく、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＲとＤに置換した場合と、重鎖のＬ１４５をＲまたはＥに、軽鎖のＳ１３１およびＶ１３３をそれぞれＫとＲ、またはＤとＥに置換した場合もペアリング精度に優れていた。
【０１６０】
また、重鎖のＳ１８３と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫ（またはＲ）とＤ（またはＥ）に変えた突然変異対（４８番目の突然変異と称する）も効果的であることが確認された（表１８および図１７（Ａａペアリング精度（下側バンド）：４５％、Ｂｂペアリング精度（上側バンド）：９５％）。
【０１６１】
【表１８】
2019530641.tif 000025
先に説明した２９番目の突然変異、３０番目の突然変異、および４８番目の突然変異を組み合わせた突然変異対（ｃ２９ｃ３０ｃ４８ＦФ２９ｆ３０ｆ４８）またはその変形突然変異対を含む抗体を作製し（表１９参照）、これらのペアリング精度を試験して、その結果を図１８に示した（図１８にて、下側バンドがＡａペアを、上側バンドがＢｂペアを示す）：
【表１９】
2019530641.tif 000026
また、先に説明した２９番目の突然変異、３０番目の突然変異、および４８番目の突然変異のうち１つ以上を組み合わせた変形突然変異対（表２０参照）を含む抗体についてペアリング精度を測定して、図１９に示した（図１９にて、下側バンドがＡａペアを、上側バンドがＢｂペアを示す）：
【表２０】
2019530641.tif 000027
また、先に説明した２９番目の突然変異、３０番目の突然変異、および４８番目の突然変異の組み合わせにおいて、ＤとＥを互いに変えながら比較的に正確なペアリングを可能にする組み合わせを得た（表２１および図２０）。
【０１６２】
【表２１】
2019530641.tif 000028
前記表２１と図２０に示されるように、試験された突然変異対ａｂ、ｇｈ、およびａｂｇｈとも６５％以上または９５％以上のペアリング精度を示した。このうちａｂｇｈを選択して、これをｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対と名付けた。
【０１６３】
また、表１５から確認された突然変異対のうち３４番目の突然変異対と５１番目の突然変異対とを組み合わせて導入させた場合のペアリング程度を試験して、下記の表２２および図２１に示した。
【０１６４】
【表２２】
2019530641.tif 000029
また、表１５の３４番目の突然変異対と５１番目の突然変異対においてＫをＲに、ＤをＥに置換してペアリング程度を試験して、ペアリング精度が改善された組み合わせを探した。その組み合わせは、軽鎖のＬ１３５とＴ１８０をそれぞれＥに変えた突然変異対で、これをｃ３４Фｆ５１突然変異対と名付けた（表２３および図２２参照）。
【０１６５】
【表２３】
2019530641.tif 000030
また、表１５から発見した複数の突然変異対のうち、４０番目の突然変異に４４番目の突然変異を加えた時、ペアリング精度が向上することを確認した。
【０１６６】
さらに、前記実施例と同様に、突然変異対のすべてのＫとＲを互いに変え、すべてのＤとＥを互いに置き換えることで、最も正確なペアリングを可能にする組み合わせを探した。その組み合わせは、軽鎖のＬ１３５をそれぞれＲとＥに変えた突然変異対で、これをｃ４０Фｆ４４突然変異対と名付けた（表２４および図２３参照）：
【表２４】
2019530641.tif 000031
＜実施例５＞重鎖間および重鎖および軽鎖間の結合による二重抗体形成
５．１．ｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対が導入された二重抗体
５．１．１．４Ｄ９／２Ｂ９抗体を用いた重鎖および軽鎖間の結合試験
前記試験されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対を含む重鎖と軽鎖を結合して抗体を作製した（表２５参照）：
【表２５】
2019530641.tif 000032
前記二重抗体のＡ鎖、Ｂ鎖、ａ鎖およびｂ鎖のペアリング精度を確認するために、それぞれ重鎖と軽鎖を正常ペアおよび異常ペアの形態に可能なすべての組み合わせで共同−発現した後、発現程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を下記の表２６に示し、熱的安定性（Ｔｍ）を測定して、その結果を表２７および図２５に示した：
【表２６】
2019530641.tif 000033
【表２７】
2019530641.tif 000034
熱的安定性（Ｔｍ）は、実施例２に記載の方法を参照して測定した。
【０１６７】
前記表２６、表２７、および図２５に示されるように、ｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対が導入された二重抗体の場合、正常ペア（Ａａ／Ｂｂ）の場合、異常ペア（Ａｂ／Ｂａ）に比べて、発現水準が高く、熱的安定性も非常に優れていることが確認された。
【０１６８】
５．１．２．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ／Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ二重抗体またはＡｄａｌｉｍｕｍａｂ／Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ二重抗体
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＲ；Ｒｏｃｈｅ）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；Ｒｏｃｈｅ）、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕｍｉｒａＲ；Ａｂｂｖｉｅ）を購入してアミノ酸配列をシーケンシングし（基礎科学支援センター（ＫＢＳＩ）；韓国）、これに相当するｃＤＮＡを合成し、これを用いて下記の表２８の組み合わせでｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対と実施例３で選択されたＣＨ３ドメインのＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体を作製した（ｐｃＤＮＡ３  ｖｅｃｔｏｒ（図２６参照）使用）。
【０１６９】
【表２８】
2019530641.tif 000035
前記得られた二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖについて、次の条件でＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）を行って、その結果を図２７（ｙ軸：Ｖａｌｕｅ（ｍＡＵ）、ｘ軸：時間（ｍｉｎ））にそれぞれ示した：
装備：ＨＰＬＣ−Ｕ３０００
カラム：ＭＡｂＰａｃ  Ｈｉｃ−２０
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ、２８０ｎｍ
Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ：０．１０Ｍ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．０
前記得られたタンパク質をＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎに通過させると、タンパク質の疎水性程度に応じて互いに異なる時間帯にピークが生成され、これにより二重抗体がよく作られたかを確認できる。図２７に示されているように、２つの同種二量体抗体（ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂまたはＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）のピークのうち、異種二量体の二重抗体（ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖ）のピークが明確に観察される。これは、それぞれの抗体のｈａｌｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。
【０１７０】
また、前記得られた二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖについて、次の条件でＳｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）  Ａｎａｌｙｓｉｓを行って、その結果を表２９、図２８および図２９（ｘ軸：時間（ｍｉｎ））に示した：
装備：ＨＰＬＣ−Ｕ３０００
カラム：Ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｔ  ＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ、２８０ｎｍ
Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
【表２９】
2019530641.tif 000036
前記ＳＥＣ分析においてタンパク質の大きさに応じてｐｅａｋが出ており、タンパク質間の凝集状態などが分かる。表２９、図２８および図２９に示されるように、二重抗体のピークが２つの単一抗体ピークの中間時間帯に位置することを確認できる。これは、二重抗体がよく生成されていることを意味する。
【０１７１】
また、前記得られた二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で二量体の形成様相を図３０に示した。図３０から確認されるように、異種二量体である二重抗体Ｔｒａｂｅｖは、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂの中間ｓｉｚｅに、Ａｄａｂｅｖは、ＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂの中間ｓｉｚｅに単一ｂａｎｄとして現れた。これは、同種二量体が形成されず、単に正常ペアの二重特異性抗体だけが作られたことを意味する。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡによりＢｓＡｂがそれぞれの抗原（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ：Ｈｅｒ２）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＶＥＧＦ）、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）によく結合するかを試験した。
【０１７３】
抗原結合力の測定は次を参照して行った：
Ｒｅａｇｅｎｔ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ−ＨＲＰ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ、２０６０−０５）
ＴＭＢ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、００２０２３）
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
Ｅｍａｘ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
Ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：Ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ９．６
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ（ＴＢＳ）  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ：０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＴＢＳ、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）
Ｄｉｌｕｅｎｔ：０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＴＢＳ、ｐＨ７．４
Ｓｔｏｐ  ｂｕｆｆｅｒ：１Ｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＣｌ）
過程
Ｃｏａｔｉｎｇ：ａｎｔｉｇｅｎをｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに希釈して、ｗｅｌｌあたり１００ｕｌずつｌｏａｄｉｎｇ、４℃  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ（Ｈｅｒ２、ＶＥＧＦ：５０ｎｇ／ｗｅｌｌ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ：１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）；
Ｗａｓｈｉｎｇ  ３ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ；
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ３００ｕｌ分注、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ａｔ  ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＲＴ）  ｆｏｒ  １ｈｏｕｒ；
Ｗａｓｈｉｎｇ  ３ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ；
Ｂｉｎｄｉｎｇ：ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １００ｎｇ／ｗｅｌｌでｌｏａｄｉｎｇ、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ＲＴ  １ｈｒ；
Ｗａｓｈｉｎｇ  ３ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ；
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ−ＨＲＰをＴＢＳＴに１：４０００で稀釈、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ＲＴ  １ｈｒ；
Ｗａｓｈｉｎｇ  ３ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＴＭＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００ｕｌずつｌｏａｄｉｎｇ、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ＲＴ  ３ｍｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄａｒｋ；
Ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：１Ｎ  ＨＣｌ  １００ｕｌずつｌｏａｄｉｎｇ；
Ｒｅａｄｉｎｇ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ４５０ｎｍで測定
前記得られた結果を表３０と図３１（以上、Ｔｒａｂｅｖに関する結果）、および表３１と図３２（以上、Ａｄａｂｅｖに関する結果）にそれぞれ示した：
【表３０】
2019530641.tif 000037
【表３１】
2019530641.tif 000038
表２９および図３１に示されるように、二重抗体Ｔｒａｂｅｖは、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの抗原であるＨｅｒ２と、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの抗原であるＶＥＧＦともに結合することが確認され、表３０および図３２に示されるように、二重抗体Ａｄａｂｅｖも、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂの抗原であるＴＮＦ−ａｌｐｈａとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂの抗原であるＶＥＧＦともに結合することが確認された。このような結果は、意図した機能を正常に発揮する２つの二重抗体が生成に成功したことを改めて確認させるものである。
【０１７４】
５．２．ｃ３４Фｆ５１突然変異対が導入された二重抗体
実施例５．１．１を参照して、４Ｄ９（Ａａ）と２Ｂ９（Ｂｂ）にｃ３４Фｆ５１突然変異対（表２３参照）が導入された抗体を作製した。各重鎖別に軽鎖ａとｂと共に発現させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を測定し（重鎖ＡおよびＢに対してそれぞれ実施する）、実施例２を参照してＴｍを測定して、その結果を下記の表３２および図３４に示した。
【０１７５】
【表３２】
2019530641.tif 000039
表３２および図３４に示されるように、正常な重鎖／軽鎖対（ＡａまたはＢｂ）の形成率がそれぞれ９０％および８９％と非常に高く、熱的安定性にも優れていることが確認された。
【０１７６】
また、実施例５．１．２の二重抗体の作製過程を参照して、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＲ；Ｒｏｃｈｅ）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；Ｒｏｃｈｅ）、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕｍｉｒａＲ；Ａｂｂｖｉｅ）を用いてｃ３４Фｆ５１突然変異対および実施例３で選択されたＣＨ３ドメインＡＷＢＢ突然変異対（Ａａ：Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｗ；Ｂｂ：Ｋ３７０Ｓ／Ｆ４０５Ｒ）が導入された二重抗体Ｔｒａｂｅｖ（Ａａ：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；Ｂｂ：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）とＡｄａｂｅｖ（Ａａ：Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；Ｂｂ：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）をそれぞれ作製した。
【０１７７】
実施例５．１．２のＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）方法を参照して、前記作製されたｃ３４Фｆ５１突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖを分析した。
【０１７８】
前記得られた分析結果を表３３と図３５（以上、Ｔｒａｂｅｖ）および表３４と図３６（以上、Ａｄａｂｅｖ）に示した。
【０１７９】
【表３３】
2019530641.tif 000040
【表３４】
2019530641.tif 000041
表３３と図３５および表３４と図３６に示されるように、２つの同種二量体抗体（ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂまたはＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）のピークのうち、異種二量体の二重抗体（ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖ）のピークが明確に観察される。これは、ｃ３４Фｆ５１突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入されたそれぞれの抗体のｈａｌｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。
【０１８０】
また、前記ｃ３４Фｆ５１突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体の二量体の形成様相を試験して、図３７に示した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ６％、Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。図３７に示されるように、すでに知られた抗体にｃ３４Фｆ５１突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対を同時に導入させた時、純粋な異種二量体バンドが形成されることを確認できる。
【０１８１】
４．３．ｃ４０Фｆ４４突然変異対が導入された二重抗体
実施例５．１．１を参照して、４Ｄ９（Ａａ）と２Ｂ９（Ｂｂ）にｃ４０Фｆ４４突然変異対（表２４参照）が導入された抗体を作製した。各重鎖別に軽鎖ａとｂと共に発現させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を測定し（重鎖ＡおよびＢに対してそれぞれ実施する）、実施例２を参照してＴｍを測定して、その結果を下記の表３５および図３８に示した。
【０１８２】
【表３５】
2019530641.tif 000042
表３５および図３８に示されるように、正常な重鎖／軽鎖対（ＡａまたはＢｂ）の形成率がすべて９９％と非常に高く、熱的安定性にも優れていることが確認された。
【０１８３】
また、実施例５．１．２の二重抗体の作製過程を参照して、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＲ；Ｒｏｃｈｅ）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；Ｒｏｃｈｅ）、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕｍｉｒａＲ；Ａｂｂｖｉｅ）を用いてｃ４０Фｆ４４突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対（Ａ：Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｗ；Ｂ：Ｋ３７０Ｓ／Ｆ４０５Ｒ）が導入された二重抗体Ｔｒａｂｅｖ（Ａａ：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；Ｂｂ：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）とＡｄａｂｅｖ（Ａａ：Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；Ｂｂ：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）をそれぞれ作製した。
【０１８４】
実施例５．１．２のＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）方法を参照して、前記作製されたｃ４０Фｆ４４突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖを分析した。
【０１８５】
前記得られた分析結果を表３６と図３９（以上、Ｔｒａｂｅｖ）および表３７と図４０（以上、Ａｄａｂｅｖ）に示した。
【０１８６】
【表３６】
2019530641.tif 000043
【表３７】
2019530641.tif 000044
表３６と図３９および表３７と図４０に示されるように、２つの同種二量体抗体（ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂまたはＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）のピークのうち、異種二量体の二重抗体（ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖ）のピークが明確に観察される。これは、ｃ４０Фｆ４４突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入されたそれぞれの抗体のｈａｌｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。また、２つの同種二量体抗体の間に明確なｐｅａｋがただ１つだけが現れることから、２つの重鎖の間、そしてそれぞれ重鎖と軽鎖との間に誤ったペアリングが起こらずただ１種類の正常にペアリングされた二重特異性抗体だけが作られたことが分かる。
【０１８７】
また、前記ｃ４０Фｆ４４突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体の二量体の形成様相を試験して、図４１に示した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ６％、Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。図４１に示されるように、すでに知られた抗体にｃ４０Фｆ４４突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対を同時に導入させた時、純粋な異種二量体バンドが形成されることを確認できる。
【０１８８】
＜比較例１＞
本明細書で提示されるＣＨ３ドメインの突然変異において、同一のアミノ酸対でも実施例１〜３で提示される突然変異と相異なる突然変異が導入される場合の異種二量体形成率を試験した。
【０１８９】
比較例として、実施例１を参照して、下記の表３８の突然変異が導入されたＴＮＦＲＳＦ１Ｂ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｅｎｂｒｅｌ；Ｅｎｂ）とＦａｓ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｆａｓ）を製造した（表３８にてＢＥＡＴ−ＡおよびＢＥＡＴ−Ｂで表示）。
【０１９０】
【表３８】
2019530641.tif 000045
本明細書で提示されるＣＨ３ドメインの突然変異を代表するために、実施例３で選択されたＣＨ３ドメイン突然変異を含むＴＮＦＲＳＦ１Ｂ−Ｆｃ融合タンパク質（Ａ鎖）とＦａｓ−Ｆｃ融合タンパク質（つまり、Ｓ３６４ＫおよびＫ４０９Ｗが導入されたＡ鎖およびＫ３７０ＳおよびＦ４０５Ｒが導入されたＢ鎖）（表３８にてＡＷ／ＢＢで表示）を準備した。
【０１９１】
また、前記表３８に記載の突然変異対を含むＥｎｂ−ＦｃとＦａｓ−Ｆｃをそれぞれｓｉｎｇｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせた場合の同種二量体の形成様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察して、図４２に示した。
【０１９２】
図４２に示されるように、ＡＷ／ＢＢではｍｏｎｏｍｅｒの比率が高いのに対し、ＢＥＡＴ−ＡおよびＢＥＡＴ−Ｂではｍｏｎｏｍｅｒよりはｈｏｍｏｄｉｍｅｒの比率がさらに高かった。このような結果に基づいて、Ａ  ｃｈａｉｎとＢ  ｃｈａｉｎのｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ量に差がある場合、ｈｏｍｏｄｉｍｅｒを形成する確率は、ＡＷ／ＢＢよりＢＥＡＴ−ＡおよびＢＥＡＴ−Ｂの方がより高いといえる。また、二重抗体を作るためにｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎとｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎを組み合わせた時、ｈｏｍｏｄｉｍｅｒが多く作られると、このｈｏｍｏｄｉｍｅｒは正常に作られたｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒと物性に差がほとんどないため、正常に作られたｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒを分離することが非常に困難になる。したがって、ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎを最小化することは、純度の高い二重抗体を製造するうえで非常に重要といえ、できる限りｈｏｍｏｄｉｍｅｒを形成しない突然変異の組み合わせが二重特異性二重抗体の作製に有利といえる。
【０１９３】
このような結果からみて、ＢＥＡＴ−ＡおよびＢＥＡＴ−Ｂの場合、ＡＷ／ＢＢと比較して、同種二量体形成率が高いので、ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌが低いといえ、うまく形成された異種二量体の分離に困難がある。
【図１】
2019530641.tif 000050
【図２】
2019530641.tif 000051
【図３】
2019530641.tif 000052
【図４】
2019530641.tif 000053
【図５】
2019530641.tif 000054
【図６Ａ】
2019530641.tif 000055
【図６Ｂ】
2019530641.tif 000056
【図６Ｃ】
2019530641.tif 000057
【図６Ｄ】
2019530641.tif 000058
【図７】
2019530641.tif 000059
【図８】
2019530641.tif 000060
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2019530641.tif 000063
【図１０】
2019530641.tif 000064
【図１１】
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【図１２】
2019530641.tif 000066
【図１３】
2019530641.tif 000067
【図１４】
2019530641.tif 000068
【図１５】
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【図１６】
2019530641.tif 000070
【図１７】
2019530641.tif 000071
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2019530641.tif 000074
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月22日(2019.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種二量体形成率が高い二重特異性タンパク質およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＢｓＡｂｓ）は、相異なる標的抗原を認識する２つの抗原結合部位を有する抗体であって、前記相異なる標的抗原に同時に結合できる抗体またはその抗原結合断片を総称する。このような特性は、通常の単一クローン抗体では不可能な治療戦略を立てられるようにする。二重特異性抗体は、自然に生成される場合は珍しく、２つの異なる生物学的標的に同時結合するように人為的に製造されることが多い。このようなＢｓＡｂの二重標的化能力は、単一特異性抗体（Ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＭｓＡｂｓ）では適用できない新たな適用分野を提供することができる。治療的目的の側面から、（１）免疫細胞を標的細胞の近接部に確実に導入すること、（２）標的細胞から離れてそれぞれ別個に存在する２つの信号伝達経路を同時に抑制したり活性化させて上昇効果を起こすこと、（３）標的細胞に治療物質、放射活性物質、医薬、毒素などを特異的で調節可能に伝達すること、などが重要な関心事項として浮上している。
【０００３】
多様な（４５の異なるフォーマット）二重特異性抗体関連技術が開発された。これらの技術は、構造に基づいて４つのカテゴリーに分類される。第一、ノブ−イントゥ−ホール（Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ）または簡略にＫｉＨとして知られた構造的相補的状態、電荷極性補完（電気的ステアリング効果；ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）、またはＣＨ３ドメインシャッフリング（ＳＥＥＤｂｏｄｙＴＭと呼ばれる）を含む多様な方法により重鎖を異種性二重化させる技術；第二、ＤｉａｂｏｄｙＴＭ、ＢｉＴＥＴＭおよびＤＡＲＴＴＭ（Ｄｉａｂｏｄｙ：ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；ＢｉＴＥ：Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒｓ；ＤＡＲＴ：ｄｕａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）のような様々な抗体分節フォーマット、第三、Ｍｏｄｕｌａｒ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭ、ＺｙｂｏｄｙＴＭ、ｄＡｂｓＴＭおよびＤＶＤ−ＩＧＴＭ（ｄＡｂｓ：Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＤＶＤ−Ｉｇ：ｄｕａｌ−ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のような１つまたはそれ以上の機能的ドメインを使用する技術が完全な抗体に接合される技術；および第四、ＤｕｏｂｏｄｙＴＭ（Ｆａｂ−Ａｒｍ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ）、ＣｒｏｓｓＭａｂＴＭ、ＡｚｙｍｅｔｒｉｃＴＭ、およびｋＩ  ｂｏｄｙＴＭのような全長長さのＩｇＧ−類似設計を採用した技術が開発された。
【０００４】
例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓは、米国特許出願２０１３−８９２１９８号により、Ｆｃ領域で突然変異を有する免疫グロブリン鎖の異種性多量体（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙｍｅｒ）構造体について記載し、具体的には、二硫化結合をするシステイン部分を電荷を有するアミノ酸に変形して、電気的相互作用により異種性多量体構造の抗体を作ることができることを開示している。
【０００５】
既存の二重特異性抗体を製造するには、次の問題点があった：
第一は、所望しない重鎖の結合の生成が挙げられる。相異なるエピトープを有する２つの抗体からそれぞれ起源する重鎖（ＡおよびＢ）間の結合がランダムに行われる場合、２つの同一起源の重鎖間の結合（ＡＡおよびＢＢ）と１つの異種起源の重鎖間の結合（ＡＢまたはＢＡ）が形成される。二重特異性抗体を製造するにあたり、同一起源の重鎖間の結合は、所望しない不純物になって、二重特異性抗体の純度を低下させ、これを除去する工程が伴わなければならないので、抗体の分離精製に困難を誘発し、所望しない免疫反応または信号伝達を引き起こして副作用を誘発するなどの不利な効果につながることがある。したがって、純粋に異種起源の重鎖間の結合だけを形成しながら、同一起源の重鎖間の結合が形成されなかったり、少なくとも相当水準以下でのみ形成されるようにする技術が必要である。
【０００６】
第二は、軽鎖と重鎖の結合において同一起源の重鎖と軽鎖の結合が特異的に形成されなければならないが、異種起源の重鎖と軽鎖が結合する場合が発生する問題点が挙げられる。二重特異性抗体は、２種のエピトープを有している。それぞれのエピトープは、これを認識するそれぞれの抗体に由来する同種起源の軽鎖と重鎖が結合する場合に認識可能であるが、異種起源の重鎖と軽鎖が結合すると、意図した２種のエピトープ以外の新たなエピトープを認識する抗体が形成され、不純物として作用して抗体の分離精製に困難を誘発し、副作用を起こす原因になりうる。したがって、二重特異性抗体の生産において正確に２種類の特異性抗体が作られるように正しい対でのみ重鎖と軽鎖の結合が起こらなければならず、非特異な重鎖と軽鎖の結合が生成されなかったりわずかな水準で生成されなければならない。
【０００７】
前記のような二重特異性抗体を提供するうえでの問題点を考慮して二重特異性抗体の作製に必要な要件をまとめると、互いに異なる２つのエピトープを認識する２種の抗体に由来する重鎖と軽鎖の結合において、図１に示されるように、計１０の形態の結合が形成されるが、このうち、（１）重鎖間の結合は、互いに異なる抗体に由来する重鎖間に形成され、（２）重鎖と軽鎖の結合は、同一の抗体に由来する重鎖と軽鎖との間に形成されなければならず、このような組み合わせ形態は図１にて点線の円で表示されたものであり、その他の９つの組み合わせは生成されなかったり最小限に生成されなければならない。
【０００８】
本発明者の前の特許であるＷＯ２０１４１４２５９１号の「疎水性相互作用部位内に電気的相互作用が導入されたタンパク質およびその製造方法」が公開されている。前記特許には、タンパク質の疎水性相互作用をする部位内で選択された一対の疎水性アミノ酸において、１つの疎水性アミノ酸がポジティブ電荷を有する物質に、他の疎水性アミノ酸がネガティブ電荷を有する物質に変形して、前記ポジティブ電荷と前記ネガティブ電荷によってタンパク質の疎水性相互作用部位内に電気的相互作用が導入されたタンパク質または抗体が開示されている。本発明者らは、前記特許で考慮されていない疎水性相互作用をしない部分の静電的相互作用を利用しても二重特異性抗体を形成できることを見出し、前記静電的相互作用のほか、サイズ依存結合および／または結合対間のアミノ酸交換（スワッピング）方法によっても二重特異性抗体を高効率で形成できることを見出して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許公開第１０−２０１４−００１９３８５号（２０１４．０２．１４公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の問題を解決すべく、本発明は、純度が高い異種特異性抗体およびその製造方法を提供する。
【００１１】
一例は、抗体の第１ＣＨ３ドメインおよび第２ＣＨ３ドメインを含む二量体において、前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対が、次の１つ以上の変異によって変異された変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含む二量体を提供する：
（１）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異；
（２）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異；および
（３）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換された変異。
【００１２】
前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、互いに同一または異なる種類の抗体（免疫グロブリン）に由来するものであってもよい。
【００１３】
他の例は、前記変異ＣＨ３ドメインまたはこれを含む変異Ｆｃ領域を暗号化する核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００１４】
本明細書に使用されたものであって、「１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸．．他の１つのアミノ酸．．」は、１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つと他の１つのアミノ酸を指し示すために使用される（以下、同一である）。
【００１５】
他の例は、第１ＣＨ３ドメインまたはこれを含む第１Ｆｃ領域、および第２ＣＨ３ドメインまたはこれを含む第２Ｆｃ領域を含み、
前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対が、次の１つ以上の変異によって変異された変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含む、互いに異なる２種の標的を標的化する二重特異性タンパク質を提供する：
（１）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異；
（２）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸が互いに交換された変異；および
（３）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸に置換された変異。
【００１６】
前記段階（１）の互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸対は、疎水性相互作用をするアミノ酸対および／または疎水性相互作用をしないアミノ酸対であってもよいし、一例において、アミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうち少なくとも１つ以上が、疎水性アミノ酸でないアミノ酸（例えば、親水性アミノ酸）であってもよい。前記段階（１）の互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換させる段階により静電的相互作用が導入され、Ｆｃ領域間の異種二量体形成率を増進させるのに寄与できる。
【００１７】
本明細書に使用されたものであって、異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）は、互いに異なる２つのタンパク質が結合したことを意味するもので、例えば、互いに異なる標的を標的化する２つのタンパク質が結合して形成された二重特異性タンパク質（例えば、二重特異性抗体）などを意味することができる。
【００１８】
前記段階（２）のアミノ酸交換（スワッピング）は、Ｆｃ領域またはＣＨ３ドメインでアミノ酸−アミノ酸結合を形成するすべてのアミノ酸対で行われ、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、およびアミノ酸の大きさの差による相互作用以外の相互作用によって結合したすべてのアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対であってもよい。このように互いに相互作用（例えば、結合）するそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸残基（つまり、相互作用するアミノ酸対において、第１ＣＨ３ドメイン中の１つのアミノ酸残基および第２ＣＨ３ドメイン中の１つのアミノ酸残基）を互いに交換すると、同種由来のＣＨ３ドメイン間に（つまり、第１ＣＨ３ドメイン間、または第２ＣＨ３ドメイン間）は、前記アミノ酸相互作用するパートナー位置に同一のアミノ酸が存在するので、これらの間の結合を困難にすることによって、同種間の二量体形成率を低くし、異種二量体形成率を増進させるのに寄与できる（例えば、Ｓ３６４とＫ３７０アミノ酸対の場合、第１ＣＨ３ドメインにＳ３６４Ｋ変異、第２ＣＨ３ドメインにＫ３７０Ｓ変異が導入された場合、第１ＣＨ３では残基３６４と３７０がすべてリシン（Ｋ）であり、第２ＣＨ３ドメインでは残基３６４と３７０がすべてセリン（Ｓ）であることから、同一ＣＨ３ドメイン間には相互作用が起こり得ないので同種二量体は形成されず、異種ＣＨ３ドメイン間にのみ相互作用が起こるので異種二量体のみ形成される）。
【００１９】
前記段階（３）の大きさが相異なるアミノ酸に置換する段階は、大きさの大きいアミノ酸と大きさの小さいアミノ酸との間の構造的交換適合性を増進させることによって（つまり、大きさの大きいアミノ酸が大きさの小さいアミノ酸によって生成された余分な空間に挟まれることによって結合効率が増加する）、異種二量体形成率を増進させるのに寄与できる。特に、互いに相互作用するアミノ酸対の一方のアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に、残りの一方のアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸に突然変異化することによって、大きさの大きいアミノ酸同士または大きさの小さいアミノ酸同士の結合がよく行われないようにして同種二量体形成率を最小化させる一方（両側ｃｈａｉｎに大きさの大きいアミノ酸が存在する場合、アミノ酸の大きさのために２つのｃｈａｉｎ間の距離が遠くなって二量体形成（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）が妨げられ、両側ｃｈａｉｎともに大きさの小さいアミノ酸が存在すると、２つのアミノ酸間の距離が遠くなって相互作用確率が低くなり、相互作用自体が困難になる）、一方のＣＨ３ドメインまたはＦｃの大きさの大きい疎水性アミノ酸と他方のＣＨ３ドメインまたはＦｃの大きさの小さい疎水性アミノ酸は、突然変異前と比較して近い距離で疎水性相互作用を行えるため、異種二量体が形成されやすい条件になる。したがって、前記大きさの相異なるアミノ酸に置換する段階において、置換される大きさの大きいアミノ酸および大きさの小さいアミノ酸はいずれも、疎水性アミノ酸の中から選択されたものであってもよい。例えば、前記大きさの大きいアミノ酸は、疎水性アミノ酸であるトリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択された１種以上であってもよい。また、前記大きさの小さいアミノ酸は、疎水性アミノ酸であるアラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２０】
前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質は、互いに異なる２種の標的を標的化（例えば、特異的に認識および／または結合）するすべての形態のタンパク質の中から選択される。標的化のために、前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質は、互いに異なる２種の標的を標的化（特異な認識および／または結合）可能な標的化ドメイン（例えば、第１標的を標的化する第１標的化ドメインおよび第２標的を標的化する第２標的化ドメイン）を含むことができ、前記それぞれの標的化ドメインはそれぞれ、変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインに共有的または非共有的に直接または間接（例えば、リンカーなどを介して）連結（融合）されたものであってもよい。例えば、前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質は、互いに異なる２種の標的を同時に標的化する、二重特異性抗体、二重特異性抗体の抗原結合断片（例えば、（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）２など）、二重特異性抗体類似体（例えば、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、アプチド（ａｐｔｉｄｅ）など）、標的特異的結合ポリペプチドと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２１】
前記標的特異的結合ポリペプチドは、標的生体物質（生体に存在するタンパク質、核酸などを含むすべての化合物）に特異的に結合するすべてのポリペプチドの中から選択され、例えば、抗原結合部位（例えば、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲまたは可変領域）、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、膜タンパク質（例えば、各種受容体など）、膜タンパク質のエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、リガンド（例えば、各種成長因子、サイトカインなど）などからなる群より選択された１種以上のポリペプチドであってもよい。一例において、前記標的特異的結合ポリペプチドと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質は、膜タンパク質と変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質、膜タンパク質のエクトドメインと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質、リガンドと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質、ｓｃＦｖと変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインの融合タンパク質などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２２】
前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質が抗体、抗体の抗原結合断片、または抗体類似体の場合、前記標的化ドメインは、抗原結合部位（例えば、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲまたは可変領域）であってもよく、先に説明した融合タンパク質の場合、前記標的特異的結合ポリペプチドは、膜タンパク質（例えば、各種受容体）、膜タンパク質のエクトドメイン、リガンド（例えば、各種成長因子、サイトカインなど）、抗原結合部位（例えば、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲまたは可変領域）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００２３】
前記互いに異なる２種の標的は、互いに異なる２種の生体物質（例えば、タンパク質）または同一の生体物質（例えば、タンパク質）内の互いに異なる領域を意味することができる。前記変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質は、非変異（野生型）Ｆｃ領域またはＣＨ３ドメインを含む場合と比較して、増加した異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成率、減少した同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）形成率、および／または安定性を有することを特徴とする。
【００２４】
他の例は、第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ１ドメインおよび軽鎖由来の第１ＣＬ（軽鎖不変領域）ドメイン、および第２エピトープを認識する抗体由来の第２ＣＨ１ドメインおよび軽鎖由来の第２ＣＬドメインを含み、次の変異の１つ以上を含む変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体またはその抗原結合断片を提供する：
第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は、負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
【００２５】
前記第１エピトープと第２エピトープは、互いに異なるタンパク質（抗原）であるか、同一のタンパク質（抗原）の互いに異なる（互いに区分される）部位に存在するものであってもよい。
【００２６】
一例において、前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、前記第１ＣＨ１ドメインと第２ＣＨ１ドメインは、互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換され、前記第１ＣＬドメインは、前記第１ＣＨ１ドメインと相異なる電荷を有するアミノ酸に置換され、前記第２ＣＬドメインは、前記第２ＣＨ１ドメインと相異なる電荷を有するアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【００２７】
例えば、前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、
第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のうち第１ＣＨ１ドメインに位置するアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、
前記第１アミノ酸対のうち第１ＣＬドメインに位置するアミノ酸は、前記第１ＣＨ１ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、負電荷を有するアミノ酸に置換され、
第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のうち第２ＣＨ１ドメインに位置するアミノ酸は、前記第１ＣＨ１ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、負電荷を有するアミノ酸に置換され、
前記第２アミノ酸対のうち第２ＣＬドメインに位置するアミノ酸は、前記第２ＣＨ１ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、正電荷を有するアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【００２８】
前記変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体またはその抗原結合断片において、前記置換される第１アミノ酸対と第２アミノ酸対は、互いに同一または異なっていてもよいし、前記第１アミノ酸対と第２アミノ酸対に置換される正電荷を有するアミノ酸と負電荷を有するアミノ酸は、互いに同一または異なっていてもよい。前記変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体の抗原結合断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片であってもよい。前記変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、非変異（野生型）ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを含む場合と比較して、増加した同一のエピトープを標的化する重鎖（または重鎖可変領域−ＣＨ１）−軽鎖間の二量体形成率および／または安定性を有することを特徴とする。
【００２９】
前記変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインを含む二重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインまたはＦｃ領域であって、第１エピトープを認識する抗体由来の第１ＣＨ３ドメインと第２エピトープを認識する抗体由来の第２ＣＨ３ドメインが、次の１つ以上の変異によって変異された、変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含むものであってもよい：
（１）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異；
（２）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異；および
（３）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換された変異。
【００３０】
前記変異ＣＨ１ドメイン、変異ＣＬドメイン、および変異Ｆｃ領域または変異ＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質または二重特異性抗体は、非変異ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、およびＦｃ領域またはＣＨ３ドメインを含む二重特異性タンパク質または抗体と比較して、増加した異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成率、増加した同一のエピトープを標的化する重鎖（または重鎖可変領域−ＣＨ１）−軽鎖間の二量体形成率、および／または安定性を有するものであってもよい。
【００３１】
他の例は、次の１つ以上の段階を含み、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対に、次の１つ以上の変異を導入させる段階を含む、変異ＣＨ３ドメインまたは前記変異ＣＨ３ドメインを含む変異Ｆｃ領域を含む、互いに異なる標的を標的化する二重特異性タンパク質の製造方法または互いに異なる標的を標的化する二重特異性タンパク質の異種二量体形成を増加させる方法を提供する：
（１）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；
（２）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに交換；および
（３）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に置換。
【００３２】
他の例は、次のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの変異段階を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法または同一のエピトープを標的化する重鎖（または重鎖可変領域−ＣＨ１）−軽鎖間の二量体形成率を増加させる方法を提供する：
第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
【００３３】
前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法または同一のエピトープを標的化する重鎖（または重鎖可変領域−ＣＨ１）−軽鎖間の二量体形成を増加させる方法は、前記ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの変異段階に加えて、次の１つ以上のＣＨ３ドメインの変異段階を追加的に含んでもよい：
（１）第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ３ドメインと第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；
（２）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに交換；および
（３）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換。
【００３４】
他の例は、次の１つ以上の段階を含み、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対に、次の１つ以上の変異を導入させる段階を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法または互いに異なる標的を標的化する二重特異性抗体または抗原結合断片の異種二量体形成を増加させる方法を提供する：
（１）第１エピトープを認識する重鎖由来の第１ＣＨ３ドメインと第２エピトープを認識する重鎖由来の第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；
（２）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のアミノ酸を互いに交換；および
（３）第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換。
【００３５】
前記二重特異性抗体または抗原結合断片の製造方法は、次のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインの変異段階を追加的に含んでもよい：
第１エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第１ＣＨ１ドメインおよび第１ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第１アミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換；および
第２エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された１つ以上の第２アミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
【００３６】
前記二重特異性抗体またはその抗原結合断片の製造方法は、互いに異なるエピトープを認識する抗体由来のＣＨ３ドメインまたはＦｃ領域間の異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成を増加させ、同時に、同一のエピトープを認識する抗体由来のＣＨ１ドメイン（重鎖）とＣＬドメイン（軽鎖）との間の二量体形成を増加させることができる。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００３８】
本発明は、抗体のＦｃ保存（不変）領域および／またはＦａｂ保存（不変）領域を含む相異なる標的を標的化する二重特異性タンパク質またはその製造方法において、
互いに異なる標的化ドメインと連結（融合）されたＦｃ保存領域（ＣＨ３ドメイン）にアミノ酸変異を導入させることによって、互いに異なる標的化ドメインと連結されたＦｃ保存領域間の結合率を高めて異種二量体形成率を増加させ、同一の標的化ドメインと連結されたＦｃ間に結合した同種二量体形成率を減少させたり；および／または
互いに異なる標的化ドメインと連結されたＦａｂ保存領域にアミノ酸変異を導入させることによって、同一の標的化ドメインと連結されたＦａｂ保存領域間の結合力を高めて同一の標的化ドメインおよびこれと連結されたＦａｂ保存領域間の二量体形成率を増加させ、
互いに異なる標的化ドメインを有する二重特異性タンパク質の生成率を増進させる技術を提供する。
【００３９】
本明細書に記載の抗体（重鎖および軽鎖）、ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、Ｆｃ領域、およびＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸位置はすべて、Ｅｕナンバリングシステム［「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）」］に記載のＥＵ−インデックス］によりナンバリングされて表記され、配列リスト内の配列の位置を示す数字とは異なる。
【００４０】
前記抗体は、全種類の哺乳類または鳥類に由来する全種類の免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の中から選択された１種以上であってもよい。例えば、本明細書で使用された抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧタイプ１（ＩｇＧ１）、ＩｇＧタイプ２（ＩｇＧ２）、ＩｇＧタイプ３（ＩｇＧ３）、およびＩｇＧタイプ４（ＩｇＧ４））、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡタイプ１（ＩｇＡ１）およびＩｇＡタイプ２（ＩｇＡ２））、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記抗体は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などのような哺乳類由来の免疫グロブリン、例えば、ヒト由来の免疫グロブリンであってもよい。一例において、前記抗体は、ヒトＩｇＧ１（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＣ８２５２７．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２２８．１）、ヒトＩｇＧ２（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ５９３９３．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２３０．１）、ヒトＩｇＧ３（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ０１８６０、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０３６０４．１）、ヒトＩｇＧ４（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ５９３９４．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｋ０１３１６．１）、ヒトＩｇＡ１（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＴ７４０７０．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６４７９７８．１）、ヒトＩｇＡ２（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ５９３９６．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２２１．１）、ヒトＩｇＤ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ５２７７１．１、ＡＡＡ５２７７０．１）、ヒトＩｇＥ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ５９３９５．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２２２．１）、およびヒトＩｇＭ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＢ３７８３８．１、遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５７０８６．１）の中から選択された１種以上であってもよい。一例において、前記抗体は、例えば、ヒト由来の、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。突然変異が導入される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメイン、第１ＣＨ１ドメインと第１ＣＬドメイン、および第２ＣＨ１ドメインと第２ＣＬドメインは、それぞれ独立して同一または異なる免疫グロブリンタイプから選択されたものであ���てもよい。
【００４１】
ヒトＩｇＧ１重鎖不変領域（配列番号３３）とヒトＩｇＡ１重鎖不変領域（配列番号３４）の配列整列結果を示す図３３Ａ、およびヒト免疫グロブリン軽鎖のカッパ不変領域（配列番号３５）とラムダ不変領域（配列番号３６）の配列整列結果を示す図３３Ｂに示されるように、重鎖不変領域および軽鎖不変領域のアミノ酸配列は、亜型間の保存度が非常に高い。
【００４２】
また、免疫グロブリンは、それに由来する種（ｓｐｅｃｉｅｓ）および亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）間の配列保存度が非常に高い。例えば、ヒトとマウスとラットのＩｇＧ亜型間の重鎖不変領域の配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）結果を示す図３３Ｃ（ＣＨ１ドメインの配列整列結果）および図３３Ｄ（ＣＨ３ドメインの配列整列結果）に示されるように、免疫グロブリンの重鎖不変領域のアミノ酸配列は、種間の保存度が非常に高い。
【００４３】
したがって、本明細書で提供されるＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインのアミノ酸位置はヒトＩｇＧ１を基準として、ＣＬドメインはヒトカッパ不変領域を基準として記載され、前記ヒトＩｇＧ１およびヒトカッパ不変領域を基準として記載されたアミノ酸位置は、通常の配列整列手段（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）により他の亜型の免疫グロブリンおよびヒト以外の種の免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸位置が明確に分かる（表１参照）。
【００４４】
また、本明細書で提供されるＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ３ドメインのアミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングシステムによって表現され、その詳細な事項は、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（重鎖不変領域）」、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＬＣｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（軽鎖ラムダ領域）」および「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＫＣｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ（軽鎖カッパ領域）」により確認できる。
【００４５】
前記Ｅｕナンバリングによれば、ヒトＩｇＧ１を基準として、
（１）ＣＨ１ドメイン（配列番号１）は、１番目のアミノ酸（Ａｌａ）を１１８番目の位置にして一連番号でナンバリングされ（つまり、配列番号１のＣＨ１ドメインの１０８個のアミノ酸は、ＩｇＧ１の１１８番目から２１５番目までの位置に相当する）；
（２）ＣＨ３ドメイン（配列番号１５）は、１番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）を３４０番目の位置にして一連番号でナンバリングされる（つまり、配列番号１５のＣＨ３ドメインの１０８個アミノ酸は、ＩｇＧ１の３４０番目から４４７番目までの位置に相当する（以上、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ参照）。
【００４６】
本明細書におけるＣＨ１およびＣＨ３ドメインのアミノ酸位置およびこれに相当するアミノ酸種類は、ヒトＩｇＧ１を基準として記載する。
【００４７】
また、Ｅｕナンバリングによれば、
ヒトカッパ不変領域（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ５８９８９．１遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００２４１．１）のＣＬドメイン（配列番号１０）は、１番目のアミノ酸（Ｖａｌ）を１１０番目の位置にして一連番号でナンバリングされ（つまり、配列番号１０のＣＬドメインの１０５個のアミノ酸は、１１０番目から２１４番目までの位置に相当する；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＫＣｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ参照）；
ヒトラムダ不変領域（配列番号１１（Ｌａｍｂｄａ１）、配列番号１２（Ｌａｍｂｄａ２）、配列番号１３（Ｌａｍｂｄａ３）、および配列番号１４（Ｌａｍｂｄａ７））では、１番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）を１１０番目の位置にして一連番号でナンバリングされる（ただし、ラムダ不変領域の場合、一連番号から１６９、２０１および２０２番目が脱落する；つまり、配列番号１１または配列番号１２のＣＬドメインの１０３個のアミノ酸は、１１０番目から１６８番目、１７０番目から２００番目、および２０３番目から２１５番目までの位置に相当する；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＬＣｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ参照）。本明細書におけるＣＬドメインのアミノ酸位置およびこれに相当するアミノ酸種類は、ヒトカッパ不変領域を基準として記載する。
【００４８】
前記Ｆａｂ保存領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＦａｂ断片の重鎖不変領域（つまり、ＣＨ１ドメイン）から選択されたいずれか１つである重鎖Ｆａｂの重鎖不変領域保存領域および免疫グロブリンの軽鎖のカッパタイプおよびラムダタイプ（例えば、ラムダタイプ１、ラムダタイプ２、ラムダタイプ３、およびラムダタイプ７）からなる群より選択されたいずれか１つの軽鎖不変領域（つまり、ＣＬドメイン）を含むことができる。
【００４９】
例えば、前記Ｆａｂ断片の重鎖不変領域（ＣＨ１ドメイン）として使用可能なＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ１ドメインはそれぞれ順次に、配列番号１（Ｅｕナンバリングで１１８番目から２１５番目までに相当する）、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、前記軽鎖不変領域（ＣＬドメイン）として使用可能な、カッパタイプ、ラムダタイプ１、ラムダタイプ２、ラムダタイプ３、およびラムダタイプ７のＣＬドメインであってもよいし、これらＣＬドメインはそれぞれ順次に、配列番号１０（Ｅｕナンバリングで１１０番目から２１４番目までに相当する）、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むものであってもよい。一例において、前記Ｆａｂ保存領域は、ＩｇＧタイプ１のＣＨ１ドメイン（配列番号１）およびカッパタイプの軽鎖不変領域（ＣＬドメイン）（配列番号１０）を含むことができる。同一の標的を標的化する分子間の二量体形成率を増加させるために、ＣＨ１ドメインで負電荷を有するアミノ酸または正電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、Ｅｕナンバリングシステムにより、ＩｇＧタイプ１（配列番号１）の１４５番目の位置のロイシン、１４７番目の位置のリシン、１７０番目の位置のフェニルアラニン、１７１番目の位置のプロリン、１８３番目の位置のセリン、および１８５番目の位置のバリンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。他の例において、ＣＨ１ドメインで負電荷を有するアミノ酸または正電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＩｇＧの他のサブタイプ（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ１ドメイン（順次に、配列番号２〜９）における配列番号１の１４５番目の位置のロイシン、１４７番目の位置のリシン、１７０番目の位置のフェニルアラニン、１７１番目の位置のプロリン、１８３番目の位置のセリン、および１８５番目の位置のバリンに対応する位置のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上であってもよい。
【００５０】
本明細書に使用された「対応する位置のアミノ酸」は、配列番号１のアミノ酸配列と対象アミノ酸配列（例えば、配列番号２〜９）との通常の配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって難なく決定される（以下、同一である）。
【００５１】
前記正電荷を有するアミノ酸（正電荷に荷電するアミノ酸）は、塩基性アミノ酸の中から選択され、例えば、リシンまたはアルギニンであってもよい。したがって、ＣＨ１ドメインに正電荷を有するアミノ酸が導入される場合、配列番号１の１４５番目の位置のロイシン、１４７番目の位置のリシン、１７０番目の位置のフェニルアラニン、１７１番目の位置のプロリン、１８３番目の位置のセリン、および１８５番目の位置のバリン、およびこれらに対応する位置の配列番号２〜９のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）がそれぞれ独立して塩基性アミノ酸、例えば、リシンまたはアルギニンに置換されていてもよい。
【００５２】
例えば、ＣＨ１ドメインは、正電荷を有するアミノ酸を導入するために、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の突然変異を含むことができる（配列番号１基準；配列番号２〜９における対応する位置のアミノ酸にも適用される）：
１４５番目の位置のロイシンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１８３番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１４７番目の位置のリシンをアルギニンに置換；
１７０番目の位置のフェニルアラニンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１７１番目の位置のプロリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；および
１８５番目の位置のバリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、アルギニンに置換）。
【００５３】
前記負電荷を有するアミノ酸は、酸性アミノ酸の中から選択され、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。したがって、ＣＨ１ドメインに負電荷を有するアミノ酸が導入される場合、配列番号１の１４５番目の位置のロイシン、１４７番目の位置のリシン、１７０番目の位置のフェニルアラニン、１７１番目の位置のプロリン、１８３番目の位置のセリン、および１８５番目の位置のバリン、およびこれらに対応する位置の配列番号２〜９のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）が、それぞれ独立して酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸に置換されていてもよい。例えば、ＣＨ１ドメインは、負電荷を有するアミノ酸を導入するために、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の突然変異を含むことができる（配列番号１基準；配列番号２〜９における対応する位置のアミノ酸にも適用される）：
１４５番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、グルタミン酸に置換）；
１４７番目の位置のリシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；
１８３番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、グルタミン酸に置換）；
１８５番目の位置のバリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；
１７０番目の位置のフェニルアラニンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；および
１７１番目の位置のプロリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）。
【００５４】
同一の標的を標的化する分子間の二量体形成率を増加させるために、軽鎖不変領域（ＣＬドメイン）で負電荷を有するアミノ酸または正電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、カッパタイプ（配列番号１０）の１３１番目の位置のセリン、１３３番目の位置のバリン、１３５番目の位置のロイシン、１６２番目の位置のセリン、および１８０番目の位置のトレオニンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。他の例において、ＣＬドメインで負電荷を有するアミノ酸または正電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ラムダタイプ（ラムダタイプ１、ラムダタイプ２、ラムダタイプ３、およびラムダタイプ７）のＣＬドメイン（順次に、配列番号１１〜１４）における配列番号１０の１３１番目の位置のセリン、１３３番目の位置のバリン、１３５番目の位置のロイシン、１６２番目の位置のセリン、および１８０番目の位置のトレオニンに対応する位置のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上であってもよい。
【００５５】
前記正電荷を有するアミノ酸（正電荷に荷電するアミノ酸）は、塩基性アミノ酸の中から選択され、例えば、リシンまたはアルギニンであってもよい。したがって、ＣＬドメインに正電荷を有するアミノ酸が導入される場合、配列番号１０の１３１番目の位置のセリン、１３３番目の位置のバリン、１３５番目の位置のロイシン、１６２番目の位置のセリン、および１８０番目の位置のトレオニン、およびこれらに対応する位置の配列番号１１〜１４のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）が、それぞれ独立して塩基性アミノ酸、例えば、リシンまたはアルギニンに置換されていてもよい。
【００５６】
例えば、ＣＬドメインは、正電荷を有するアミノ酸を導入するために、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の突然変異を含むことができる（配列番号１０基準；配列番号１１〜１４における対応する位置のアミノ酸にも適用される）：
１３１番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１３３番目の位置のバリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；
１３５番目の位置のロイシンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、アルギニンに置換）；
１６２番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、リシンに置換）；および
１８０番目の位置のトレオニンをリシンまたはアルギニンに置換（例えば、アルギニンに置換）。
【００５７】
同型二量体形成率をより高めるために、前記変異ＣＨ１ドメインおよび／または変異ＣＬドメインは、２つ以上の変異を同時に含むことができる。
【００５８】
例えば、ＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンと１８５番目の位置のバリンが正電荷を有するアミノ酸または負電荷を有するアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、第１ＣＨ１ドメインと第２ＣＨ１ドメインのうちいずれか１つのＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンと１８５番目の位置のバリンが正電荷を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）に置換され、他のＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンと１８５番目の位置のバリンは負電荷を有するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されていてもよい。また、ＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１８０番目の位置のトレオニンが正電荷を有するアミノ酸または負電荷を有するアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、第１ＣＬドメインと第２ＣＬドメインのうちいずれか１つのＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１８０番目の位置のトレオニンが正電荷を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）に置換され、他のＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１８０番目の位置のトレオニンは負電荷を有するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されていてもよい。
【００５９】
他の例において、ＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンと１７１番目の位置のプロリンが正電荷を有するアミノ酸または負電荷を有するアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、第１ＣＨ１ドメインと第２ＣＨ１ドメインのうちいずれか１つのＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンと１７１番目の位置のプロリンが正電荷を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）に置換され、他のＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンと１７１番目の位置のプロリンは負電荷を有するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されていてもよい。また、ＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１６２番目の位置のセリンが正電荷を有するアミノ酸または負電荷を有するアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、第１ＣＬドメインと第２ＣＬドメインのうちいずれか１つのＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１６２番目の位置のセリンが正電荷を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）に置換され、他のＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンと１６２番目の位置のセリンは負電荷を有するアミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されていてもよい。
【００６０】
前記負電荷を有するアミノ酸は、酸性アミノ酸の中から選択され、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。したがって、ＣＬドメインに負電荷を有するアミノ酸が導入される場合、配列番号１０の１３１番目の位置のセリン、１３３番目の位置のバリン、１３５番目の位置のロイシン、１６２番目の位置のセリン、および１８０番目の位置のトレオニン、およびこれらに対応する位置の配列番号１１〜１４のアミノ酸からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）が、それぞれ独立して酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸に置換されていてもよい。例えば、ＣＬドメインは、正電荷を有するアミノ酸を導入するために、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の突然変異を含むことができる（配列番号１０基準；配列番号１１〜１４における対応する位置のアミノ酸にも適用される）：
１３１番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、グルタミン酸に置換）；
１３３番目の位置のバリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、グルタミン酸に置換）；
１３５番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；
１６２番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）；および
１８０番目の位置のトレオニンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換（例えば、アスパラギン酸に置換）。
【００６１】
一例において、前記のようにＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに異なる電荷を有するアミノ酸に置換する突然変異が導入されるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のアミノ酸対は、配列番号１（ＣＨ１ドメイン）および配列番号１０（ＣＬドメイン）のアミノ酸配列を基準として、ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３１番目の位置のセリンとの対、ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリンとの対、ＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンとＣＬドメインの１８０番目の位置のトレオニンとの対、ＣＨ１ドメインの１８３番目の位置のセリンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリンとの対、ＣＨ１ドメインの１８５番目の位置のバリンとＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンとの対、ＣＨ１ドメインの１７０番目の位置のフェニルアラニンとＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンとの対、およびＣＨ１ドメインの１７１番目の位置のプロリンとＣＬドメインの１６２番目の位置のセリンとの対からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。例えば、前記突然変異が導入されるＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のアミノ酸対は、配列番号１（ＣＨ１ドメイン）および配列番号１０（ＣＬドメイン）のアミノ酸配列を基準として、ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３１番目の位置のセリンとの対、ＣＨ１ドメインの１４５番目の位置のロイシンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリンとの対、ＣＨ１ドメインの１４７番目の位置のリシンとＣＬドメインの１８０番目の位置のトレオニンとの対、ＣＨ１ドメインの１８３番目の位置のセリンとＣＬドメインの１３３番目の位置のバリンとの対、およびＣＨ１ドメインの１８５番目の位置のバリンとＣＬドメインの１３５番目の位置のロイシンとの対からなる群より選択されたいずれか１つまたは２つ以上（例えば、２つ）であってもよい。
【００６２】
前記突然変異が導入される第１ＣＨ１ドメインと第１ＣＬドメインとの間のアミノ酸対と、第２ＣＨ１ドメインと第２ＣＬドメインとの間のアミノ酸対は、互いに同一または異なっていてもよい。
【００６３】
一例において、第１ＣＨ１ドメインに正電荷を有するアミノ酸が導入された場合（第１ＣＬドメインには負電荷を有するアミノ酸が導入される）、第２ＣＨ１ドメインには負電荷を有するアミノ酸が導入（第２ＣＬドメインには正電荷を有するアミノ酸が導入される）される。
【００６４】
異種二量体形成率を増加させるために、重鎖のＦｃ領域、具体的には、Ｆｃ領域中のＣＨ３ドメインに、次からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ、または３つの突然変異を導入することができる：
（１）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対（２つのアミノ酸のうち１つ以上は疎水性アミノ酸でない）のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異（以下、「静電的相互作用導入変異」）；
（２）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異（以下、「スワッピング変異」）；および
（３）ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換された変異（以下、「サイズ変異」）。
【００６５】
このように変異が導入されるＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（配列番号１５；Ｅｕナンバリングにより、３４０番目から４４７番目までに相当する）、ヒトＩｇＧ２のＣＨ３ドメイン（配列番号１６）、ヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメイン（配列番号１７）、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン（配列番号１８）、ヒトＩｇＡ１のＣＨ３ドメイン（配列番号１９）、ヒトＩｇＡ２のＣＨ３ドメイン（配列番号２０）、ヒトＩｇＤのＣＨ３ドメイン（配列番号２１）、ヒトＩｇＥのＣＨ３ドメイン（配列番号２２）、およびヒトＩｇＭのＣＨ３ドメイン（配列番号２３）からなるグループより選択されるものであってもよい。
【００６６】
前記変異が導入される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、それぞれ独立してＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭからなる群より選択された、互いに同一または異なる免疫グロブリンタイプに由来するものであってもよい。一例において、前記第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインはいずれも、配列番号１５のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００６７】
以下に記載される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸対は、配列番号１５のヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準として記載されたものであり、これに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメイン（順次に、配列番号１６〜２３）間のアミノ酸対にも適用される。
【００６８】
前記記載の変異が導入される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸対は、下記の表１に提示されたＣＨ３ドメイン間のアミノ酸対、およびこれに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメイン（順次に、配列番号１６〜２３）間のアミノ酸対からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。
【００６９】
【表１】
2019530641.tif 000100
2019530641.tif 000101
より具体的には、
（１）静電的相互作用導入変異（表２および図２にてＣｈａｒｇｅ（Ｊ）で表示）；
（２）スワッピング変異（表２および図２にてＳｗａｐ（Ｏ）で表示）；および
（３）サイズ変異（表２および図２にてＳｉｚｅ（Ｂ）で表示）
のうちいずれか１つ以上が導入される第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間のアミノ酸対は、下記の表２および図２に提示されたＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（配列番号１５）間のアミノ酸対、およびこれに対応する位置のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメイン（順次に、配列番号１６〜２３）間のアミノ酸対からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい：
【表２】
2019530641.tif 000102
2019530641.tif 000103
前記表２に記載の変異位置は、ＩｇＧ１を基準として表示されたが、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメインのこれに対応する位置にも適用される）
本明細書に使用されたものであって、例えば、「Ｑ３４７」は、配列番号１５のヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの３４７番目のアミノ酸位置のグルタミンを意味し、これは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのＣＨ３ドメイン（順次に、配列番号１６〜２３）におけるこれに対応する位置のアミノ酸残基にも適用される（以下、同一である）。
【００７０】
以下に記載されるＣＨ３ドメインに変異が導入されるアミノ酸対は、配列番号１５を基準としてナンバリングして表示され、別途の反対の記載がない限り、ＩｇＧ１の表示された位置のアミノ酸だけでなく、他のタイプの免疫グロブリン（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）のＣＨ３ドメインのこれに対応する位置のアミノ酸にも適用されると解釈される。
【００７１】
前記静電的相互作用導入変異は、Ｆｃ領域またはＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対（２つのアミノ酸のうち１つ以上は疎水性アミノ酸でない）のうちいずれか１つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換、他の１つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換によって、疎水性相互作用をしない部分に静電的相互作用を導入して静電的相互作用による結合力の増加に寄与する。
【００７２】
前記疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなるグループより選択されるものであってもよい。
【００７３】
前記負電荷を有するアミノ酸は、酸性アミノ酸の中から選択され、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。前記正電荷を有するアミノ酸は、塩基性アミノ酸の中から選択され、例えば、リシンまたはアルギニンであってもよい。
【００７４】
前記静電的相互作用導入変異が適用できる第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３との間のアミノ酸対は、前記表２のアミノ酸対番号１〜３９の中から選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよいし、例えば、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３９４番目の位置のトレオニンと３９４番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシン、３６６番目の位置のトレオニンと４０７番目の位置のチロシン、および３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。
【００７５】
つまり、前記ＣＨ３ドメインの静電的相互作用導入変異は、前記表２のアミノ酸対番号１〜３９の中から選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸を負電荷を有するアミノ酸に置換を含むことができ、例えば、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３９４番目の位置のトレオニンと３９４番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシン、３６６番目の位置のトレオニンと４０７番目の位置のチロシン、および３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸に、他の１つのアミノ酸を負電荷を有するアミノ酸に置換を含むことができる。
【００７６】
例えば、前記ＣＨ３ドメインの静電的相互作用導入変異は、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の変異を含むことができる：
３６４番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、３６８番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３９４番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、３９４番目の位置のトレオニンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、３７０番目の位置のリシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、３４９番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３６６番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、４０７番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
３９４番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、３９７番目の位置のバリンを負電荷を有するアミノ酸に置換；および
３４９番目の位置のチロシンを正電荷を有するアミノ酸に、３５７番目の位置のグルタミン酸を負電荷を有するアミノ酸に置換。
【００７７】
このようなＣＨ３ドメインの静電的相互作用導入によって、異種二量体形成率が６０％以上、６５％以上、７０％以上、７３％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％であってもよい。
【００７８】
前記スワッピング変異は、アミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに対等交換した（相互交換した）変異を意味する。
【００７９】
前記ＣＨ３ドメインのスワッピング変異が適用できる第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３との間のアミノ酸対は、表２および図２に示されているように、３４７番目の位置のグルタミンと３６０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシン、３５４位のセリンと３４９位のチロシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３６０番目の位置のリシンと３４９番目の位置のチロシン、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、３６８番目のロイシンと４０９番目のリシン、３９０番目の位置のアスパラギンと４００番目の位置のセリン、３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリン、３９８番目の位置のロイシンと３９２番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、および４１１番目の位置のトレオニンと３７０番目の位置のリシンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよいし、例えば、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、および３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよい。
【００８０】
つまり、前記ＣＨ３ドメインのスワッピング変異は、３４７番目の位置のグルタミンと３６０番目の位置のリシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシン、３５４位のセリンと３４９位のチロシン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、３６０番目の位置のリシンと３４９番目の位置のチロシン、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシン、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、３６８番目のロイシンと４０９番目のリシン、３９０番目の位置のアスパラギンと４００番目の位置のセリン、３９４番目の位置のトレオニンと３９７番目の位置のバリン、３９８番目の位置のロイシンと３９２番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、および４１１番目の位置のトレオニンと３７０番目の位置のリシンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに対等交換して置換（交換）されたものを含むことができ、例えば、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシン、４０７番目の位置のチロシンと３６６番目の位置のトレオニン、３５７番目の位置のグルタミン酸と３７０番目の位置のリシン、４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシン、および３５７番目の位置のグルタミン酸と３４９番目の位置のチロシンからなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす２つのアミノ酸を互いに対等交換して置換（交換）されたものを含むことができる。
【００８１】
例えば、前記ＣＨ３ドメインのスワッピング変異は、次の１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）の変異を含むことができる：
３６４番目の位置のセリンをリシンに、３７０番目の位置のリシンをセリンに置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換；
４０７番目の位置のチロシンをトレオニンに、３６６番目の位置のトレオニンをチロシンに置換；
３５７番目の位置のグルタミン酸をリシンに、３７０番目の位置のリシンをグルタミン酸に置換；および
３５７番目の位置のグルタミン酸をチロシンに、３４９番目の位置のチロシンをセリンに置換。
【００８２】
このようなＣＨ３ドメインのスワッピング変異により、異種二量体形成率が６０％以上、６５％以上、７０％以上、７３％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％であってもよい。
【００８３】
前記サイズ変異は、ＣＨ３ドメイン間の１つ以上のアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸は、大きさの大きい疎水性アミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）に置換され、他の１つのアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）に置換された変異を意味するもので、大きいアミノ酸が小さいアミノ酸によって形成された空間に挟み合わされるので、ヘテロ二量体の形成に寄与できる。
【００８４】
前記大きいアミノ酸は、環状残基を含むものであってもよいし、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されたものであってもよく、例えば、トリプトファンであってもよい。前記小さいアミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択された１種以上であってもよく、例えば、アラニンであってもよい。
【００８５】
前記サイズ変異が適用できる第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３との間のアミノ酸対は、前記表２のアミノ酸対番号１〜４０の中から選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）であってもよく、例えば、４０９番目の位置のリシンと４０７番目の位置のチロシン、４０９番目の位置のリシンと４０５番目の位置のフェニルアラニン、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００８６】
つまり、前記サイズ変異は、前記表２のアミノ酸対番号１〜４０の中から選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ以上（例えば、２つ）、３つ以上（例えば、３つ）、または４つ以上（例えば、４つ）のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸を大きさの大きい疎水性アミノ酸（例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸）、例えば、トリプトファンに置換、他の１つのアミノ酸を大きさの小さい疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸）、例えば、アラニンに置換を含むことができ、例えば、４０９番目の位置のリシンと４０７番目の位置のチロシン、４０９番目の位置のリシンと４０５番目の位置のフェニルアラニン、またはこれらすべてのうちそれぞれのアミノ酸対のうちいずれか１つのアミノ酸を大きさの大きい疎水性アミノ酸、例えば、フェニルアラニンまたはトリプトファンに置換、他の１つのアミノ酸を大きさの小さい疎水性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、またはバリンに置換を含むことができる。
【００８７】
例えば、前記ＣＨ３ドメインのサイズ変異は、次の１つ以上の変異を含むことができる：
４０９番目の位置のリシンをトリプトファンに、４０７番目の位置のチロシンをアラニンに置換；および
４０９番目の位置のリシンをトリプトファンに、４０５番目の位置のフェニルアラニンをアラニンに置換。
【００８８】
前記変異ＣＨ３ドメインは、先に説明した３つの変異、つまり、静電的相互作用導入変異、スワッピング変異、およびサイズ変異のうち１つ以上、例えば、１つまたは２つの変異をすべて含むことができる。
【００８９】
前記のような変異ＣＨ３ドメインにおいて、二量体の形成に最も有利な効果を奏するように、３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシンのうちいずれか１つは正電荷を有するアミノ酸に、他の１つは負電荷を有するアミノ酸に置換（静電的相互作用導入変異）、３６４番目の位置のセリンと３７０番目の位置のリシンの交換（スワッピング変異）、および４０５番目の位置のフェニルアラニンと４０９番目の位置のリシンの交換（スワッピング変異）からなる群より選択された１つ以上、例えば、１つ、２つ、または３つの変異を含むことができる。
【００９０】
例えば、変異ＣＨ３ドメインは、次の変異のうち１つ以上、例えば、１つ、２つ、または３つの変異を含むものであってもよい：
（ａ）３６４番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、３６８番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換；
（ｂ）３６４番目の位置のセリンをリシンに、３７０番目の位置のリシンをセリンに置換；および
（ｃ）４０５番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換。
【００９１】
単量体生成率を低くし、二量体形成率をより増加させるために、前記選択された３つの変異（（ａ）−（ｃ））導入後、追加のアミノ酸変異が導入されてもよい。このように追加のアミノ酸変異が導入できるアミノ酸は、３６４番目の位置のセリン、４０５番目の位置のフェニルアラニン、および／または４０９番目の位置のリシンであってもよいし、例えば、静電的相互作用導入変異が起こるアミノ酸対である３６４番目の位置のセリンと３６８番目の位置のロイシンとのアミノ酸対において、３６８番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸、例えば、アスパラギン酸）に置換する場合、３６４番目の位置のセリンは正電荷を有するアミノ酸（リシンまたはアルギニン）に置換されたり（Ｓ３６４ＫまたはＳ３６４Ｒ；静電的相互作用導入変異）、アスパラギンに置換（Ｓ３６４Ｎ）されていてもよい。また、スワッピング変異が起こるアミノ酸対である３７０番目の位置のリシンと３６４番目の位置のセリンとのアミノ酸対において、３７０番目の位置のリシンをセリンに、３６４番目の位置のセリンはリシンに置換されたり（Ｓ３６４Ｋ；スワッピング変異）、アルギニンまたはアスパラギンに置換（Ｓ３６４ＲまたはＳ３６４Ｎ）されていてもよい。
【００９２】
また、スワッピング変異が起こるアミノ酸対である４０９番目の位置のリシンと４０５番目の位置のフェニルアラニンとのアミノ酸対において、４０９番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換されたり（スワッピング変異）、トリプトファンに置換されていてもよく、４０５番目の位置のフェニルアラニンはリシンに置換されたり（Ｆ４０５Ｋ；スワッピング変異）、アルギニン、グルタミン、またはアスパラギンに置換（Ｆ４０５Ｒ、Ｆ４０５Ｑ、またはＦ４０５Ｎ）されていてもよい。
【００９３】
一例において、変異ＣＨ３ドメインは、次から選択された１つ以上の変異を含むものであってもよい：
３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換；
３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換；
４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換；および
４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換。
【００９４】
一例において、変異ＣＨ３ドメインは、次から選択された二重変異を含むものであってもよい：
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３６８番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換；
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換；または
第１ＣＨ３ドメインの３６４番目の位置のセリンのリシンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの３７０番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第１ＣＨ３ドメインの４０９番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第２ＣＨ３ドメインの４０５番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換。
【００９５】
前記のようにＣＨ３ドメインが二重変異を含む場合の異種二量体形成率は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上または９６％以上であってもよい。
【００９６】
他の例は、配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＢ抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の例は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＡ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００９７】
他の例は、配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＢ抗体、および配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗−インフルエンザＡ抗体を含む、抗−インフルエンザＡ／抗−インフルエンザＢの二重特異性抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗−インフルエンザＡ／抗−インフルエンザＢの二重特異性抗体は、先に説明した（１）変異ＣＨ３ドメイン（つまり、先に説明したＣＨ３−ＣＨ３の突然変異対導入）；（２）変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメイン（つまり、先に説明したＣＨ１−ＣＬの突然変異対導入）；または（２）変異ＣＨ３ドメインと変異ＣＨ１ドメインおよび変異ＣＬドメインをすべて含むものであってもよい。
【００９８】
本発明による二重特異性タンパク質または二重特異性抗体は、タンパク質の小単位間で関連付けられ調和の取れた境界突然変異（Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｏｕｓ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ；以下、Ｃｈｉｍｐｓという）により生成された異種特異性物質である。
【００９９】
用語「抗体」は、４つともがジスルフィド結合によって相互連結された一対の低分子量軽鎖（Ｌ）および一対の重鎖（Ｈ）の二対のポリペプチド鎖からなる、構造上関連する糖タンパク質のクラスを示す。抗体の構造は特徴がよく決定されている（例えば、文献［Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）］参照）。簡単に説明すれば、それぞれの重鎖は、概して重鎖可変領域（本願でＶＨと略称する）および重鎖不変領域からなる。重鎖不変領域は、概して３つのドメイン、つまり、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」でジスルフィド結合により相互連結される。それぞれの軽鎖は、概して軽鎖可変領域（本願でＶＬと略称する）および軽鎖不変領域からなる。軽鎖不変領域は、概して１つのドメインＣＬからなる。一般に、前記不変領域内におけるアミノ酸残基のナンバリングは、文献［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］に記載のＥＵ−インデックスにより行われる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変領域（または配列が超可変性であり／であったり構造的に規定されたループを形成きる超可変領域）に追加的に細分され、これら領域には、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。それぞれのＶＨおよびＶＬは、概して３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらは、アミノ−末端からカルボキシ−末端へと次の順に配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（また、文献［Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７（１９８７）］参照）。
【０１００】
本明細書において、用語「Ｆａｂ、またはＦａｂ−ａｒｍ」は、１つの重鎖−軽鎖対を意味する。
【０１０１】
本明細書において、用語「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む抗体領域を意味し、場合によって、ヒンジ領域を追加的に含んでもよい。
【０１０２】
用語「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの相異なるエピトープ、一般に、非−重複エピトープに対して特異性を有する抗体を意味する。
【０１０３】
用語「全長抗体」は、本願で使用される時、イソ型の抗体で通常発見されるすべての重鎖および軽鎖の不変および可変ドメインを含有する抗体を意味する。一例において、全長抗体は、２つの全長重鎖と２つの全長軽鎖とを含む。本願で使用されるように、「イソ型」は、重鎖不変領域の遺伝子によってコーディングされる抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を意味する。
【０１０４】
用語「抗原結合断片」は、抗体の可変ドメインを含む抗体の一部を意味するもので、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）などから選択されるが、これらに制限されるわけではない。
【０１０５】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定子を意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖のような分子の表面の群から一般的になり、一般に特異的な３次元構造特性だけでなく、特異的な電荷特性を有する。
【０１０６】
二重特異性抗体は、互いに異なる２つの抗原または１つの抗原のうちの区分される（非重複する）互いに異なる２つのエピトープを認識および／または結合する抗体を総称する。一例において、前記二重特異性抗体は、腫瘍細胞抗原に対する１つの抗原結合部位および細胞毒性開始分子に対する他の抗原結合部位を含むものであってもよいし、例えば、二重特異性抗体は、抗−ＦｃγＲＩ／抗−ＣＤ１５、抗−ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）抗−ＣＤ３／抗−悪性Ｂ−細胞（１Ｄ１０）、抗−ＣＤ３／抗−ｐ１８５ＨＥＲ２、抗−ＣＤ３／抗−ｐ９７、抗−ＣＤ３／抗−腎臓細胞癌、抗−ＣＤ３／抗−ＯＶＣＡＲ−３、抗−ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗−大腸癌）、抗−ＣＤ３／抗−メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗−ＥＧＦ受容体／抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ３／抗−ＣＡＭＡ１、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗−中性細胞付着分子（ＮＣＡＭ）／抗−ＣＤ３、抗−フォレート結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗−ＣＤ３、抗−汎癌腫関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗−ＣＤ３などからなる群より選択されたものであってもよいが、これらに制限されるわけではない。他の例において、腫瘍抗原に特異的に結合する１つの抗原結合部位および毒素に結合する１つの抗原結合部位を有する二重特異性抗体は、例えば、抗−サポリン／抗−Ｉｄ−１、抗−ＣＤ２２／抗−サポリン、抗−ＣＤ７／抗−サポリン、抗−ＣＤ３８／抗−サポリン、抗−ＣＥＡ／抗−リシンＡ鎖、抗−インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗−ハイブリードマイディオタイプ、抗−ＣＥＡ／抗−ビンカアルカロイドなどからなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−ＣＤ３０／抗−アルカラインホスファターゼ（マイトマイシンホスフェート前駆薬物をマイトマイシンアルコールに転換を触媒する）のように、転換酵素活性化前駆薬物用に使用されるものの中から選択されたものであってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−フィブリン／抗−組織プラスミノゲン活性因子（ｔＰＡ）、抗−フィブリン／抗−ウロキナーゼ類型プラスミノゲン活性因子（ｕＰＡ）のように、フィブリン分解製剤として使用可能なものの中から選択されるが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−低密度脂タンパク質（ＬＤＬ）／抗−Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）などのような細胞表面受容体に免疫複合体を標的化させるものの中から選択されるが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−インフルエンザＡ／抗−インフルエンザＢ、抗−ＣＤ３／抗−単純性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗−Ｔ−細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗−インフルエンザ、抗−ＦｃγＲ／抗−ＨＩＶなどのような感染性疾患（例えば、ウイルス性感染疾患）の治療に使用されるものの中から選択されるが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、試験管内または生体内腫瘍検出用二重特異性抗体であってもよいし、例えば、抗−ＣＥＡ／抗−ＥＯＴＵＢＥ、抗−��ＥＡ／抗−ＤＰＴＡ、抗−ｐ１８５ＨＥＲ２／抗−ハプテンなどからなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに他の例において、二重特異性抗体は、抗−ウサギＩｇＧ／抗−フェリチン、抗−ワサビダイコンフェロキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗−ホルモン、抗−ソマトスタチン／抗−サブスタンスＰ、抗−ＨＲＰ／抗−ＦＩＴＣ、抗−ＣＥＡ／抗−β−ガラクトシダーゼなどのように、診断手段に使用可能なものであってもよい。さらに他の例において、二重特異性抗体は、ＣＤ３０と結合する第１抗原結合部位およびｅｒｂＢ２と結合する第２抗原結合部位を含むもの；ＣＤ３０と結合する第１抗原結合部位およびシュードモナス外毒素（ＰＥ）と結合する第２抗原結合部位を含むもの；ＣＤ３０と結合する第１抗原結合部位およびストレプタビジンと結合する第２抗原結合部位を含むものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【０１０７】
他の例において、二重特異性タンパク質は、前記標的化ドメインとして、各種膜タンパク質、例えば、各種受容体（例えば、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）など）、前記受容体のエクトドメイン（細胞外ドメイン）、各種リガンド（例えば、各種成長因子、サイトカインなど）などからなる群より選択された１種以上の標的特異的結合ポリペプチドを含むことができる。例えば、前記受容体は、腫瘍壊死因子受容体（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＮＦＲ）（例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２など）、上皮細胞成長因子受容体（例えば、Ｈｅｒ１（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、Ｈｅｒ３（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ３））、アンジオポエチンレセプタ（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２など）、形質転換成長因子受容体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（例えば、ＴＧＦｂＲ１、ＴＧＦｂＲ２、ＴＧＦｂＲ３、ＴＧＦａＲ１など）、骨形成タンパク質受容体（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；例えば、ＢＭＰＲ１ｂ）、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１２Ｒ−ｂ１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｅｔａ１）、ＩＬ−４Ｒａ、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１Ｒ１Ｌ、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１２Ｒ−ｂ２、ＩＬ−１３Ｒａ１、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７Ｆなど）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＡ４（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ４）、ＩＴＧＡ２Ｂ（ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ２ｂ）、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３など）、インターフェロン受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１）、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲなど）、Ｆａｓ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ６；ＴＮＦＲＳＦ６）、ＶＥＧＦ受容体（例えば、Ｆｌｔ１（ｆｍｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ１）など）、肝細胞成長因子受容体（例えば、Ｍｅｔなど）、ＩＦＮＧＲ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記リガンドは、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄなど）、アンジオポエチン（例えば、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２など）、形質転換成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７など）、インターロイキン、インターフェロンなどからなる群��り選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【０１０８】
本願で使用される用語「宿主細胞」は、発現ベクター、例えば、本発明の抗体をコーディングする発現ベクターが導入された細胞を指し示すように意図される。組換え宿主細胞は、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ／０細胞、およびリンパ構成細胞を含む。
【０１０９】
本発明の抗体のＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、Ｆｃ部位（例えば、ＣＨ３ドメイン）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４亜型、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのような任意の抗体から得ることができる。前記抗体は、ヒト、サルなどの霊長類、またはマウス、ラットなどの齧歯類などのような哺乳類由来のものであってもよい。哺乳類由来の抗体は、特に、不変部位において、各種間の高い配列相同性および構造相同性を示すので、本明細書で説明されたＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ３ドメインに関する説明は、哺乳類由来の抗体に一般に適用可能である。一具体例において、前記ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）に由来するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。言及したように、本発明で記述された抗体のＦｃ部位は、２つの同一でない重鎖（例えば、可変ドメインの配列において相異なる）を含むが、前記２つの同一でない重鎖のうち少なくとも１つは、前記同一でない重鎖の安定した異種二量体を形成する確率を高め、同一の重鎖の安定した同種二量体を形成する確率を低くするために、アミノ酸変異を含む。
【０１１０】
本明細書で提供される二重特異性タンパク質、二重特異性抗体およびその抗原結合断片は、通常のすべての手段によって製造され、例えば、化学的合成または組換え的な方法によって生産される。前記タンパク質、抗体および断片は、自然に得られないもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。
【０１１１】
本発明において、Ｆｃの異種二重化のために突然変異化位置を図２に示した。静電的相互作用導入変異の場合は、３９個の位置を対象とし、スワッピングのためには１４個の位置を対象とし、サイズ変異は４０個の位置を対象とした。図２では、アミノ酸は、通常の方法により英大文字で表し、前記不変領域内におけるアミノ酸残基のナンバリングは、文献［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］に記載のＥＵ−インデックスにより示した。
【０１１２】
他の例は、先に説明した二重特異性タンパク質または二重特異性抗体、および任意に、薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物を提供する。他の例は、先に説明した二重特異性タンパク質または二重特異性抗体を薬学組成物の製造に使用する用途を提供する。他の例は、先に説明した二重特異性タンパク質または二重特異性抗体を含有する薬学組成物の製造方法を提供する。
【０１１３】
抗体およびこれを含む組成物（例、薬学組成物）を診断および治療適用に使用可能であり、かかるものとして治療または診断キットに含まれる。
【０１１４】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」は、生理的に両立する任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング物、抗菌、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、その他薬物の製造に通常使用される担体、賦形剤、添加剤などからなる群より選択された１種以上であってもよい。好ましくは、前記担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に好適な担体であってもよい（例、注射または注入により）。
【０１１５】
本発明の組成物は、当分野で公知の多様な方法により投与される。熟練者に理解されるように、投与経路および／または様相は、所望の結果に応じて変化する。本発明の化合物を特定の投与方法で投与するために、前記化合物をその不活性化を防止する物質でコーティングしたり共に投与することが必要でありうる。例えば、前記化合物を好適な担体、例えば、リポソームや希釈剤内で対象体に投与される。薬学的許容希釈剤は、食塩水および水性緩衝液を含む。薬学担体は、滅菌水性液や分散液、および滅菌注射液や分散液の臨時的な製造物用滅菌粉末を含む。そのような薬学的活性物質用培地と製剤の使用は、当該分野に公知である。
【０１１６】
用語「非経口投与」および「非経口投与される」は、本発明で使用されるように、腸管および局所外の投与方式を指し示すもので通常注射によるもので、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜内、関節腔内、眼内、心臓内、皮内、腹腔内、経器官内、皮下、角皮下、関節内、関節腔下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射と注入を含む。
【０１１７】
このような組成物はまた、保存剤、湿潤剤、エマルジョン剤、および分散剤のような補助剤を含む。微生物存在の防止は、前記滅菌過程によって、およびパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などのような多様な抗菌および抗真菌剤を含むことによって行われる。糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を前記組成物に含ませることが好ましい。また、注射用薬学形態を長期間吸収させることは、アルミニウムモノステアレートとゼラチンのような吸収を遅延させる製剤を含むことによって行われる。選択された投与経路と関係なく、本発明の化合物は、適切な水和形態および／または本発明の薬学組成物で使用できるが、当該分野における熟練者に公知の通常の方法で薬学許容投薬形態に製剤化される。
【０１１８】
本発明の薬学組成物において、活性成分の実際の投薬水準は、特定患者の所望の治療的反応を達成するのに効果的な量、組成および投与様相を患者に毒性的でないように得るために変化可能である。選択された投与水準は、使用される本発明の特定組成物の活性、投与経過、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせ使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および前の医学履歴、および医学分野に公知の他の要素を含む多様な躍動学的要素にかかっている。
【０１１９】
前記投与対象患者は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などのような哺乳類、およびこれらから分離された細胞、組織、体液（例えば、血液など）およびこれらの培養物から選択されたものであってもよい。
【発明の効果】
【０１２０】
本発明は、Ｃｈｉｍｐｓタンパク質（例えば、抗体）は、同種二量体またはモノマーによる汚染が少ない高い純度の異種二重化されたタンパク質およびその製造技術を提供する。本発明の他の利点は、天然の抗体に導入される変異個数を最小限にしながら二重特異性抗体の純度を高めることができて、天然抗体の構造に何ら意味のある構造的変化を起こさず、これにより抗体の機能喪失または異常、および／または免疫拒絶反応が起こる危険性を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、一実施例による二重特異性抗体の抗体を製造するのに作られる多様な形態の抗体（計１０個）のうちただ１つの抗体（円内部の抗体）のみが完全な異種二量体形態の二重特異性抗体であることを示す模式図である。ＡとＢは、それぞれ異なる重鎖を示し、ａとｂは、それぞれ異なる軽鎖を示す。
【図２】図２は、一実施例においてＦｃ不変領域で異種特異的結合を誘導するために使用された静電的相互作用、スワッピング、サイズ方法に使用された抗体の残基位置およびこれに関連する残基の位置を示す。
【図３】図３は、表４に記載されているように、静電的相互作用による突然変異による異種二量体の形成結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実行後に比較したものである。
【図４】図４は、表５に記載されているように、スワッピングによる関連突然変異による異種二量体の形成結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実行後に行った後に比較したものである。
【図５】図５は、表６に記載されているように、サイズによる突然変異による異種二量体の形成結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実行後に比較したものである。
【図６Ａ】図６Ａは、表７に記載の単一突然変異のうち優れた異種二重化が起こる突然変異１２個を比較したものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、一実施例で選択された２つのキー突然変異のうちＳ３６４Ｋを他のアミノ酸に置換させて得られた異種二量体の形成結果を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、一実施例で選択された２つのキー突然変異のうちＦ４０５Ｋを他のアミノ酸に置換させて得られた異種二量体の形成結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、一実施例で選択された３つのｋｅｙ−ｌｏｃｋ突然変異対であるＳ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、およびＦ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆに追加の突然変異を導入して得られた異種二量体の形成結果を示し、縦軸の数値は分子量（ｋＤ）を示す。
【図７】図７は、単一突然変異Ｓ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆの異種二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の効率を、従来の技術（ＫｉＨ、ＣＰＣ、ＡｚＳ対照群）と比較して効率を確認したものである。各キーに相当するアミノ酸をそれぞれ異なるアミノ酸に変えた場合、Ｓ３６４の場合、Ｋが最善であり、Ｆ４０５の場合、ＫとＲ（アルギニン）がほぼ類似の効果を示す。Ａ鎖およびＢ鎖において単一突然変異が起こる部分を示し、異種二量体化の程度を数値で示す。
【図８】図８は、Ｓ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆの３つの突然変異対を組み合わせて２つの二重突然変異対を得て、それぞれの対でＦ４０５をＫとＲの２種類に作って計４種類の二重突然変異対の異種二量体化の効率を、従来の技術（ＫｉＨ、ＣＰＣ、ＡｚＳ対照群）と比較して効率を確認したものである。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｃは、ロック（Ｌｏｃｋ）突然変異に相当するアミノ酸を他の突然変異に変えた場合、より良い効果があるかを確認するために、二重突然変異対でロック（ｌｏｃｋ）に相当するＬ３６８、Ｋ３７０、Ｋ４０９を他のアミノ酸に表６により突然変異させてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。
【図９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｃは、ロック（Ｌｏｃｋ）突然変異に相当するアミノ酸を他の突然変異に変えた場合、より良い効果があるかを確認するために、二重突然変異対でロック（ｌｏｃｋ）に相当するＬ３６８、Ｋ３７０、Ｋ４０９を他のアミノ酸に表６により突然変異させてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。
【図９Ｃ】図９Ａ〜図９Ｃは、ロック（Ｌｏｃｋ）突然変異に相当するアミノ酸を他の突然変異に変えた場合、より良い効果があるかを確認するために、二重突然変異対でロック（ｌｏｃｋ）に相当するＬ３６８、Ｋ３７０、Ｋ４０９を他のアミノ酸に表６により突然変異させてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。
【図１０】図１０は、抗体のＦａｂで静電的相互作用に関連する突然変異、サイズ関連突然変異、スワッピング関連突然変異の位置を示す。
【図１１】図１１は、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｐａｉｒｉｎｇ（ＣＰＰ）  Ａｓｓａｙ過程を模式的に示す。
【図１２】図１２は、４Ｄ９と２Ｂ９を用いて、すでに効果的と報告されているＣ１、ＤｕｅｔＭａｂ、Ｖ２３の重鎖と軽鎖との間の突然変異対をクローニングして共同−発現して、図１１の過程によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１３】図１３は、重鎖と軽鎖との間に静電気相互作用による関連突然変異の一つでＡ鎖（２Ｂ９重鎖）の当該アミノ酸をＫ（リシン）に、Ｂ鎖（４Ｄ９重鎖）の場合には、Ｄ（アスパラギン酸）に変えた突然変異が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を示す。
【図１４】図１４は、４Ｄ９および２Ｂ９抗体を用いた突然変異対のリストのうちＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で比較した結果、比較的正確にペアリングしやすい３０番目の突然変異を重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をＲとＤに変えた場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１５】図１５と図１６は、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＥまたはＤとＲに変えたものに、軽鎖に２９番目の突然変異Ｓ１３１Ｄおよび／またはＳ１３１Ｋを加えた突然変異が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１６】図１５と図１６は、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＥまたはＤとＲに変えたものに、軽鎖に２９番目の突然変異Ｓ１３１Ｄおよび／またはＳ１３１Ｋを加えた突然変異が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１７】図１７は、４８番目の突然変異対（重鎖のＳ１８３と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫ（Ｒ）とＤ（Ｅ）に変えたもの）のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１８】図１８は、表１９に示された突然変異対ｃ２９ｃ３０ｃ４８ＦΦ２９ｆ３０ｆ４８、およびその変形突然変異対が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１９】図１９は、表２０の突然変異対が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図２０】図２０は、表２１の突然変異対が導入された場合のペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図２１】図２１は、一実施例による重鎖と軽鎖対の突然変異のうち３４番目の突然変異と５１番目の突然変異とを組み合わせて導入させた場合のペアリング程度を示す結果である。
【図２２】図２２は、一実施例による重鎖と軽鎖対の突然変異のうちｃ３４Фｆ５１突然変異対を導入させた場合のペアリング程度を示す結果である。
【図２３】図２３は、一実施例による重鎖と軽鎖対の突然変異のうちｃ４０Фｆ４４突然変異対を導入させた場合のペアリング程度を示す結果である。
【図２４】図２４は、一実施例により重鎖および軽鎖が突然変異化された二重特異性抗体の模式図である。
【図２５】図２５は、一実施例により製造された抗体の重鎖Ａ鎖およびＢ鎖、および軽鎖ａ鎖およびｂ鎖の熱的安定性を示すグラフである。
【図２６】図２６は、ｐｃＤＮＡ３の開裂地図である。
【図２７】図２７は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖおよびＡｄａｂｅｖのＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）結果を示すグラフである。
【図２８】図２８は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖのＳｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）  Ａｎａｌｙｓｉｓ）結果を示すグラフである。
【図２９】図２９は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＡｄａｂｅｖのＳｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）  Ａｎａｌｙｓｉｓ結果を示すグラフである。
【図３０】図３０は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖおよびＡｄａｂｅｖの二量体の形成様相を示す結果である。
【図３１】図３１は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体Ｔｒａｂｅｖの抗原（Ｈｅｒ２およびＶＥＧＦ）に対する結合力を示すグラフである。
【図３２】図３２は、一実施例により製造されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体Ａｄａｂｅｖの抗原（ＴＮＦ−ａｌｐｈａおよびＶＥＧＦ）に対する結合力を示すグラフである。
【図３３Ａ】図３３Ａは、ヒトＩｇＧ１重鎖不変領域とヒトＩｇＡ１重鎖不変領域の配列整列結果を示す（ヒトＩｇＧ１重鎖不変領域：配列番号３３；ヒトＩｇＡ１重鎖不変領域：配列番号３４）。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、ヒト免疫グロブリン軽鎖のカッパ不変領域とラムダ不変領域の配列整列結果を示す（ヒト免疫グロブリン軽鎖のカッパ不変領域：配列番号３５；ヒト免疫グロブリン軽鎖のラムダ不変領域：配列番号３６）。
【図３３Ｃ】図３３Ｃおよび図３３Ｄは、ヒトとマウスとラットのＩｇＧ亜型間の重鎖不変領域の配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）結果を示すもので、図３３Ｃは、ＣＨ１ドメインの配列整列結果を、図３３Ｄは、ＣＨ３ドメインの配列整列結果をそれぞれ示す（図３３Ｃにて、（ＣＨ１  ｄｏｍａｉｎ）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１：配列番号１、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２：配列番号２、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３：配列番号３、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４：配列番号４、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１：配列番号３７、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａｂ：配列番号３８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａａ：配列番号３９、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４０、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３：配列番号４１、Ｒａｔ  ＩｇＧ１：配列番号４２、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ：配列番号４３、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４４、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｃ：配列番号４５；図３３Ｄにて、（ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎ）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１：配列番号１５、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２：配列番号１６、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３：配列番号１７、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４：配列番号１８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１：配列番号４６、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａｂ：配列番号４７、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａａ：配列番号４８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４９、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３：配列番号５０、Ｒａｔ  ＩｇＧ１：配列番号５１、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ：配列番号５２、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号５３、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｃ：配列番号５４）。
【図３３Ｄ】図３３Ｃおよび図３３Ｄは、ヒトとマウスとラットのＩｇＧ亜型間の重鎖不変領域の配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）結果を示すもので、図３３Ｃは、ＣＨ１ドメインの配列整列結果を、図３３Ｄは、ＣＨ３ドメインの配列整列結果をそれぞれ示す（図３３Ｃにて、（ＣＨ１  ｄｏｍａｉｎ）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１：配列番号１、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２：配列番号２、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３：配列番号３、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４：配列番号４、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１：配列番号３７、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａｂ：配列番号３８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａａ：配列番号３９、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４０、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３：配列番号４１、Ｒａｔ  ＩｇＧ１：配列番号４２、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ：配列番号４３、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４４、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｃ：配列番号４５；図３３Ｄにて、（ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎ）、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１：配列番号１５、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２：配列番号１６、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３：配列番号１７、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４：配列番号１８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１：配列番号４６、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａｂ：配列番号４７、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａａ：配列番号４８、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号４９、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ３：配列番号５０、Ｒａｔ  ＩｇＧ１：配列番号５１、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ：配列番号５２、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ：配列番号５３、Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｃ：配列番号５４）。
【図３４】図３４は、一実施例により製造されたｃ３４Фｆ５１突然変異対が導入された抗体の軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を示す結果である。
【図３５】図３５は、一実施例により製造されたｃ３４Фｆ５１突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖのＨＩＣ結果を示すグラフである。
【図３６】図３６は、一実施例により製造されたｃ３４Фｆ５１突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＡｄａｂｅｖのＨＩＣ結果を示すグラフである。
【図３７】図３７は、一実施例により製造されたｃ３４Фｆ５１突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖおよびＡｄａｂｅｖの二量体の形成様相を示す結果である。
【図３８】図３８は、一実施例により製造されたｃ４０Фｆ４４突然変異対が導入された抗体の軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を示す結果である。
【図３９】図３９は、一実施例により製造されたｃ４０Фｆ４４突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖのＨＩＣ結果を示すグラフである。
【図４０】図４０は、一実施例により製造されたｃ４０Фｆ４４突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＡｄａｂｅｖのＨＩＣ結果を示すグラフである。
【図４１】図４１は、一実施例により製造されたｃ４０Фｆ４４突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖおよびＡｄａｂｅｖの二量体の形成様相を示す結果である。
【図４２】図４２は、比較例によるＥｎｂ−ＦｃとＦａｓ−Ｆｃをそれぞれｓｉｎｇｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥで同種二量体の形成程度を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
本発明を下記の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明の権利範囲が下記の実施例に限定される意図ではない。
【０１２３】
本発明の実施のために、すべての試料は、次の過程を経て準備された。
【０１２４】
タンパク質発現
１．ターゲットとなる遺伝子を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；図）にクローニングした。
【０１２５】
２．Ｈｅｋ２９３Ｅ（ＡＴＣＣ）細胞を湿潤化されたＣＯ２インキュベータで５％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が補充された高濃度ブドウ糖ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。
【０１２６】
３．準備されたプラスミドＤＮＡをフルコンフルエンシーでＨｅｋ２９３Ｅ細胞に一時的注入（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する。転移前に培養培地をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、血清のない高濃度ＤＭＥＭに入れ替える。
【０１２７】
４．１週間インキュベーション後に、コンディションされた培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）で収穫してろ過した。Ｆｃ−融合タンパク質および抗体をプロテインＡクロマトグラフィーによって分離した。
【０１２８】
５．精製されたタンパク質の濃度の定量は２８０ｎｍの波長を観測して測定した。
【０１２９】
＜実施例１＞２つのＦｃ領域の異種二重化の突然変異の選択
２つのＦｃ領域（ＣＨ３ドメイン；配列番号１５）（ＩｇＧ１基準）の異種二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）のための突然変異位置は図２に示した。静電的相互作用による関連突然変異（静電的相互作用導入変異）のために３９個の位置が選定され（「Ｃｈａｒｇｅ  Ｊ」で表示）、スワッピングによる関連突然変異（スワッピング変異）のために１４個の位置が選定され（「Ｓｗａｐ  Ｏ」で表示）、サイズによる関連突然変異（サイズ変異）のために４０個の位置が選定された（「Ｓｉｚｅ  Ｂ」で表示）。最終的に選定されたＣＨ３ドメインの位置および突然変異したアミノ酸を表３に示した。各突然変異対を互いに異なる抗体に由来する２つのＦｃ領域（それぞれＡ鎖とＢ鎖で表現）に適用してクローニングして共同−発現した。静電気相互作用による関連突然変異の場合は、Ａ鎖の当該アミノ酸を正電荷を含むアミノ酸を代表してＫ（リシン）に、Ｂ鎖の場合には、負電荷を含むアミノ酸を代表してＤ（アスパラギン酸）に変えた。スワッピングによる関連突然変異の場合には、Ａ鎖とＢ鎖のアミノ酸を互いに置き換えた。サイズによる関連突然変異の場合には、Ａ鎖はＷ（トリプトファン）に、Ｂ鎖はサイズの小さいＡ（アラニン）に変えた。
【０１３０】
【表３】
2019530641.tif 000104
2019530641.tif 000105
Ｆｃ−融合タンパク質において同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）と異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより容易に区別するために、ｐｃＤＮＡ３ｖｅｃｔｏｒ（図２６参照；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をバックボーンとして用いて、一方の鎖（鎖Ａ：Ｅｎｂｒｅｌ）にはＴＮＦ−アルファ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：ＮＰ＿００１０５７．１（暗号化遺伝子：ＮＭ＿００１０６６．２のＣＤＳ；配列番号２４））の細胞外ドメイン（配列番号２４の１−７７１部位の暗号化配列）をＦｃ（暗号化遺伝子：配列番号２６）に融合させ、他方（鎖Ｂ：Ｆａｓ）にはＦａｓ受容体（ＮＰ＿００００３４．１（暗号化遺伝子：ＮＭ＿００００４３．５のＣＤＳ；配列番号２５））の細胞外ドメイン（配列番号２５の１−５１９部位の暗号化配列）をＦｃ（暗号化遺伝子：配列番号２６）に融合させた。Ａ鎖のモノマーは５３ｋＤであり、Ｂ鎖のモノマーは約４４ｋＤである。前記Ｆｃ−細胞外ドメインが融合されている鎖ＡとＢのサイズが相異なるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２つの同型結合（ＡＡおよびＢＢ）および異種結合（ＡＢ）が容易に区別される。
【０１３１】
Ａ鎖とＡ鎖の結合（同型結合）数値（％）をＳＡＡで表し、Ａ鎖とＢ鎖の結合（異種結合）数値（％）をＳＡＢで表し、Ｂ鎖とＢ鎖との間の結合数値（％）をＳＢＢで表した。
【０１３２】
表３に表されるような突然変異が導入されたＡ鎖とＢ鎖の接合様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察した同型結合（ＡＡおよびＢＢ）および異種結合（ＡＢ）比率（％）を、変異の起こらないＡ鎖とＢ鎖（それぞれＷＴで表示）の結果と比較し、このうち静電的相互作用による突然変異が導入された場合の結果を表４および図３に示し、サイズによる突然変異が導入された場合の結果を表５および図４に示し、スワッピングによる関連突然変異が導入された場合の結果を表６および図５に示した。
【０１３３】
【表４】
2019530641.tif 000106
【表５】
2019530641.tif 000107
【表６】
2019530641.tif 000108
前記表４〜６中、異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成率（％；ＳＡＢ）が７０％を超える突然変異を太い文字で表した。前記表４〜６から確認されるように、試験された突然変異対は６０％以上の異種二量体形成率を示した。
【０１３４】
前記結果により、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）より異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成率が高く、異種二量体形成率が７０％以上の１２対（Ｙ３４９Ｋ−Ｅ３５７Ｄ、Ｅ３５７Ｋ−Ｙ３４９Ｄ、Ｅ３５７Ｋ−Ｋ３７０Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｔ３６６Ｋ−Ｙ４０７Ｄ、Ｔ３９４Ｋ−Ｔ３９４Ｄ、Ｔ３９４Ｋ−Ｖ３９７Ｄ；以上、静電的相互作用導入変異、Ｅ３５７Ｙ−Ｙ３４９Ｅ、Ｅ３５７Ｋ−Ｋ３７０Ｅ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ｔ−Ｔ３６６Ｙ；以上、スワッピング変異）の突然変異が選択された（表４および５で太い文字で表示）。
【０１３５】
前記選択された１２対のアミノ酸対に含まれている１２個のアミノ酸残基変異をＦａｓ−Ｆｃ融合タンパク質にそれぞれ導入させて、前記アミノ酸位置で単一変異を含む変異Ｆａｓ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させることによって、同等の条件における同種二量体および単量体残存率（Ｓｓｍ；１＝１００％）を比較して、その結果を表７および図６Ａに示した。
【０１３６】
【表７】
2019530641.tif 000109
表７および図６Ａ中、同種二量体形成率が低く、単量体残存率が高い（５０％以上）２つの突然変異Ｓ３６４Ｋ、Ｆ４０５Ｋを選択した。
【０１３７】
選択された２つの突然変異を「キー（ｋｅｙ）」突然変異とし、これと相互作用する他の鎖のＣＨ３ドメインの部分を「ロック（ｌｏｃｋ）」突然変異とみて、これを組み合わせて、Ｓ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆの３つのｋｅｙ−ｌｏｃｋ突然変異対を選択した。この突然変異対をＡ鎖（キー突然変異）およびＢ鎖（ロック突然変異）に導入して、３種類の単一突然変異対を得た（表８参照）。
【０１３８】
【表８】
2019530641.tif 000110
それぞれのキー突然変異が起こる位置のアミノ酸を他のアミノ酸に変えて、先に説明したような単一変異による異種二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）効果を試験して、前記位置から異種二量体化に効果が良い突然変異の種類を確認した。Ｓ３６４において、Ｋ（リシン）に置換される場合、異種二量体化効果が最も良く現れ、Ｎ（アスパラギン）とＲ（アルギニン）に置換された場合にも、異種二量体化効果が優れていた（図６Ｂ参照）。Ｆ４０５においては、ＫとＲに置換される場合、類似する程度の優れた異種二量体化効果を示し、ＮとＱ（グルタミン）に置換される場合にも、優れた異種二量体化効果を示した（図６Ｃ参照）。
【０１３９】
前記選択された３つのｋｅｙ−ｌｏｃｋ突然変異対であるＳ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、およびＦ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆに、図６Ｂおよび図６Ｃから確認された追加の突然変異Ｓ３６４Ｎ、Ｓ３６４Ｒ、Ｆ４０５Ｒ、Ｆ４０５Ｎ、およびＦ４０５Ｑを適用して、ｌｏｃｋ突然変異をＡ  ｃｈａｉｎ（ＴＮＦＲ２−Ｆｃ）に導入させ、ｋｅｙ突然変異をＢ  ｃｈａｉｎ（Ｆａｓ−Ｆｃ）に導入させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で異種二量体化効果を試験した。
【０１４０】
前記得られた結果を表９および図６Ｄに示した：
【表９】
2019530641.tif 000111
＜実施例２＞単一突然変異によるＦｃ領域の異種二量体化試験
前記実施例１で選択された３つのｋｅｙ−ｌｏｃｋ突然変異対であるＳ３６４Ｋ−Ｌ３６８Ｄ、Ｓ３６４Ｋ−Ｋ３７０Ｓ、およびＦ４０５Ｋ−Ｋ４０９Ｆと、ｋｅｙ突然変異位置のＦ４０５をＫの代わりにＲに変異させたＦ４０５ＲＫ４０９Ｆ突然変異対の異種二量体化効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定して、すでに知られた異種二量体Ｆｃ突然変異対の対照群ＫｉＨ、ＣＰＣ、およびＡｚＳの結果と比較した。
【０１４１】
本実施例を含む下記のすべての実施例におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の定量化は、ＧｅｌＱｕａｎｔ．ＮＥＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてバンド強度（ｂａｎｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を数値化したものである。
【０１４２】
前記得られた結果を表１０および図７に示した：
【表１０】
2019530641.tif 000112
前記Ｔｍは次の方法で測定した：
Ｒｅａｇｅｎｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ４４６１１４６「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＳｈｉｆｔＴＭ」Ｄｙｅ  Ｋｉｔ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ：Ｃｈｒｏｍｏ４−ＰＴＣ２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ：２０μｌ  ｉｎ  ｔｏｔａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ                                                      １０μｌ
ＤＷ                                                                ３μｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＳｈｉｆｔＴＭ  Ｂｕｆｆｅｒ          ５μｌ
１／１００  ｄｉｌｕｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＳｈｉｆｔＴＭ  Ｄｙｅ                                                                  ２μｌ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：
１．Ｉｎｃｕｂａｔｅ  ａｔ  ５０．０℃  ｆｏｒ  ３０ｓｅｃ；
２．Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｃｕｒｖｅ  ｆｒｏｍ  ５０．０℃  ｔｏ  ９０．０℃、ｒｅａｄ  ｅｖｅｒｙ  ０．２℃、ｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ２ｓｅｃ；
３．Ｉｎｃｕｂａｔｅ  ａｔ  ９０．０℃  ｆｏｒ  ２ｍｉｎ
４．Ｉｎｃｕｂａｔｅ  ａｔ  １０．０℃  ｆｏｒｅｖｅｒ
５．Ｅｎｄ
表１０および図７のように、Ａ鎖とＢ鎖をそれぞれ単一発現した場合、キー（ｋｅｙ）が入っているＡ鎖は同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）をほとんど形成せずモノマーで発現し、共同−発現した試料からも、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）はほとんどなく異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）としてのみ存在することが確認された（図７参照）。
【０１４３】
＜実施例３＞二重突然変異によるＦｃ領域の異種二量体化
キー突然変異がＡ、Ｂ鎖のうち一方にのみ存在することより両方ともに存在する場合、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）化の可能性を低下させることから、実施例１で選択された３つの突然変異対を組み合わせて２つの二重突然変異対を得て、それぞれの対でＦ４０５をＫとＲの２種類に作って計４種類の二重突然変異対を得た。これら４つの二重突然変異対の異種二量体化効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定して、対照群ＫｉＨ、ＣＰＣ、ＡｚＳの結果と比較した。
【０１４４】
前記得られた結果を表１１および図８に示した：
【表１１】
2019530641.tif 000113
表１１および図８のように、４つの突然変異対とも、両鎖に入っているキー突然変異によって単一発現した場合、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）が別に形成されず、共同−発現した試料から、ほぼすべてのタンパク質が異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）としてのみ発現することが確認された（図８参照）。また、Ｆ４０５ＫよりＦ４０５Ｒが導入された二重突然変異対がより高い熱的安定性を示した（表１１）。
【０１４５】
ロック（Ｌｏｃｋ）突然変異に相当するアミノ酸を他の突然変異に変えた場合により良い効果があるかを確認するために、二重突然変異対でロック（ｌｏｃｋ）に相当するＬ３６８、Ｋ３７０、およびＫ４０９を他のアミノ酸に突然変異させた。Ｌ３６８、Ｋ３７０、およびＫ４０９を多様に突然変異させた突然変異の組み合わせを表１２にまとめ、これら組み合わせの異種二量体化効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で測定して（ＮＲ：８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ；Ｓａｍｐｌｅ：２４ｕｌ  Ｌｏａｄｉｎｇ）、その結果を図９Ａ〜９Ｃに示した。
【０１４６】
【表１２】
2019530641.tif 000114
2019530641.tif 000115
これら組み合わせに対する熱的安定性を測定（実施例２参照）して、その結果を表１３に示した。
【０１４７】
【表１３】
2019530641.tif 000116
熱的安定性を分析した結果、Ｋ４０９をトリプトファン（Ｗ）に突然変異させる場合に、Ｋ４０９Ｆよりも高い熱的安定性を示した。
【０１４８】
前記結果を参照して、下記のＦｃ異種二量体試験のためのＣＨ３ドメインに導入される突然変異として、Ａ鎖にはＳ３６４Ｋ、Ｋ４０９Ｗが入り、Ｂ鎖にはＫ３７０Ｓ、Ｆ４０５Ｒが入った二重突然変異を選択して、ＡＷＢＢ突然変異対と名付けた。
【０１４９】
＜実施例４＞抗体のＦａｂにおける重鎖と軽鎖に対する突然変異の選択
抗体の重鎖と軽鎖の突然変異を選択するために、静電的相互作用関連する突然変異、サイズ関連突然変異、スワッピング関連突然変異を行った。重鎖と軽鎖における相互作用の位置を図１０に示した。
【０１５０】
重鎖と軽鎖の突然変異を容易に確認するために、同一の軽鎖を有する抗体をクローニングした。４Ｄ９抗体（ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と２Ｂ９抗体（ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）はいずれも、抗−インフルエンザ抗体として同一の軽鎖（ｃｏｍｍｏｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：ＣＬＣ）を有する。これらは同一の軽鎖を有しているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより重鎖と軽鎖との間の相互作用を容易に把握できる。４Ｄ９と２Ｂ９の両抗体は、軽鎖のアミノ酸配列は同一であるが、重鎖の配列も異なり、大きさも差があるため（２Ｂ９の重鎖が４Ｄ９の重鎖よりアミノ酸６個がさらに多く、タンパク質の大きさも２Ｂ９の重鎖（５０１３０．６２Ｄａｌｔｏｎｓ）が４Ｄ９の重鎖（４９４９９．９８Ｄａｌｔｏｎｓ）より大きい：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で明確に識別可能である）、両方のいずれの重鎖が軽鎖と相互作用するかの還元条件で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズとして区別可能である。
【０１５１】
４Ｄ９と２Ｂ９の両抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびこれを暗号化する核酸配列を下記の表１４に示した：
【表１４】
2019530641.tif 000117
４Ｄ９と２Ｂ９の両抗体の重鎖不変領域はＩｇＧ１の不変領域を、軽鎖不変領域はカッパ不変領域をそれぞれ使用した。
【０１５２】
軽鎖に突然変異を導入し、その突然変異と相互作用する突然変異を有する重鎖の鎖だけがこの軽鎖と結合するかを確認するために、軽鎖、その軽鎖とペアリングする重鎖と誤った結合（ｍｉｓｐａｉｒ）をなす重鎖を共同−発現して作られた抗体を、還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥすればペアリングがどれほど正確に行われたかを確認できる。便宜上、４Ｄ９重鎖をＡ鎖、これとペアリングする軽鎖をａ鎖、そして２Ｂ９重鎖をＢ鎖、これとペアリングする軽鎖をｂ鎖と呼ぶこととする（下表を参照）。
【０１５３】
【表０】
2019530641.tif 000118
まず、４Ｄ９と２Ｂ９を用いて、すでに効果的と報告されている従来の重鎖と軽鎖との間の突然変異対をクローニングして共同−発現して、変異させた２つの重鎖と１つの軽鎖のｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎにより形成されたペアリング様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｐａｉｒｉｎｇ（ＣＰＰ）  Ａｓｓａｙ）。前記Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｐａｉｒｉｎｇ（ＣＰＰ）  Ａｓｓａｙ過程を図１１に模式的に示し、得られた結果を図１２に示した。図１２のように、すでに報告されたすべての突然変異対が正常なペア（ｐａｉｒ）と異常ペア（ｍｉｓｐａｉｒ）のように起こることが確認された。
【０１５４】
重鎖と軽鎖との間に静電気相互作用による関連突然変異の場合は、Ｂ鎖（２Ｂ９重鎖）の当該アミノ酸をＫ（リシン）に、Ａ鎖（４Ｄ９重鎖）の場合にはＤ（アスパラギン酸）に変えながら、多様な突然変異対が導入された抗体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＣＰＰ  ａｓｓａｙ（図１１参照）を行った。
【０１５５】
その結果、静電的相互作用による関連突然変異グループで比較的正確にペアリングが起こることが確認された７つの候補突然変異対をスクリーニングした。スクリーニングされた７つの突然変異対が導入された抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＣＰＰ  ａｓｓａｙ結果を表１５および図１３に示した。
【０１５６】
【表１５】
2019530641.tif 000119
４Ｄ９（Ａ鎖）および２Ｂ９（Ｂ鎖）抗体を用いた突然変異対のリストのうち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で比較した結果、比較的正確にペアリングが起こる突然変異対のいくつかを発見することができた（表１５で太い文字で表示）。これに対する追加の研究をするために、前記３０番目の突然変異（ｃ３０Φｆ３０で表示）を表１６のように変形した。
【０１５７】
【表１６】
2019530641.tif 000120
３０番目の突然変異は重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫとＤに変えたものであり、前記表１６のように、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をＲとＤに変えた変形形態の場合も効果（ペアリング精度：ＡａペアまたはＢｂペア比率）が良かった（図１４参照（Ａａペアリング精度７５％、Ｂｂペアリング精度：６０％））。
【０１５８】
前記３０番目の突然変異またはその変形（重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫまたはＲとＤまたはＥに置換）に、軽鎖に突然変異Ｓ１３１Ｄ（２９番目の突然変異と称する）を加えると、ペアリング精度がより向上した（表１７および図１５（ｃ２９ｃＲ３０ΦｆＲ３０の結果；Ａａペアリング精度：８０％、Ｂｂペアリング精度：７０％）および図１６（ｃＲ２９ｃＲＥ３０ΦｆＲ２９ｆＲＥ３０の結果；Ａａペアリング精度：９０％、Ｂｂペアリング精度：８０％）参照）。
【０１５９】
【表１７】
2019530641.tif 000121
図１４および図１５から確認されるように、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫとＤに変えた３０番目の突然変異だけでなく、重鎖のＬ１４５と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＲとＤに置換した場合と、重鎖のＬ１４５をＲまたはＥに、軽鎖のＳ１３１およびＶ１３３をそれぞれＫとＲ、またはＤとＥに置換した場合もペアリング精度に優れていた。
【０１６０】
また、重鎖のＳ１８３と軽鎖のＶ１３３をそれぞれＫ（またはＲ）とＤ（またはＥ）に変えた突然変異対（４８番目の突然変異と称する）も効果的であることが確認された（表１８および図１７（Ａａペアリング精度（下側バンド）：４５％、Ｂｂペアリング精度（上側バンド）：９５％）。
【０１６１】
【表１８】
2019530641.tif 000122
先に説明した２９番目の突然変異、３０番目の突然変異、および４８番目の突然変異を組み合わせた突然変異対（ｃ２９ｃ３０ｃ４８ＦФ２９ｆ３０ｆ４８）またはその変形突然変異対を含む抗体を作製し（表１９参照）、これらのペアリング精度を試験して、その結果を図１８に示した（図１８にて、下側バンドがＡａペアを、上側バンドがＢｂペアを示す）：
【表１９】
2019530641.tif 000123
また、先に説明した２９番目の突然変異、３０番目の突然変異、および４８番目の突然変異のうち１つ以上を組み合わせた変形突然変異対（表２０参照）を含む抗体についてペアリング精度を測定して、図１９に示した（図１９にて、下側バンドがＡａペアを、上側バンドがＢｂペアを示す）：
【表２０】
2019530641.tif 000124
また、先に説明した２９番目の突然変異、３０番目の突然変異、および４８番目の突然変異の組み合わせにおいて、ＤとＥを互いに変えながら比較的に正確なペアリングを可能にする組み合わせを得た（表２１および図２０）。
【０１６２】
【表２１】
2019530641.tif 000125
前記表２１と図２０に示されるように、試験された突然変異対ａｂ、ｇｈ、およびａｂｇｈとも６５％以上または９５％以上のペアリング精度を示した。このうちａｂｇｈを選択して、これをｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対と名付けた。
【０１６３】
また、表１５から確認された突然変異対のうち３４番目の突然変異対と５１番目の突然変異対とを組み合わせて導入させた場合のペアリング程度を試験して、下記の表２２および図２１に示した。
【０１６４】
【表２２】
2019530641.tif 000126
また、表１５の３４番目の突然変異対と５１番目の突然変異対においてＫをＲに、ＤをＥに置換してペアリング程度を試験して、ペアリング精度が改善された組み合わせを探した。その組み合わせは、軽鎖のＬ１３５とＴ１８０をそれぞれＥに変えた突然変異対で、これをｃ３４Фｆ５１突然変異対と名付けた（表２３および図２２参照）。
【０１６５】
【表２３】
2019530641.tif 000127
また、表１５から発見した複数の突然変異対のうち、４０番目の突然変異に４４番目の突然変異を加えた時、ペアリング精度が向上することを確認した。
【０１６６】
さらに、前記実施例と同様に、突然変異対のすべてのＫとＲを互いに変え、すべてのＤとＥを互いに置き換えることで、最も正確なペアリングを可能にする組み合わせを探した。その組み合わせは、軽鎖のＬ１３５をそれぞれＲとＥに変えた突然変異対で、これをｃ４０Фｆ４４突然変異対と名付けた（表２４および図２３参照）：
【表２４】
2019530641.tif 000128
＜実施例５＞重鎖間および重鎖および軽鎖間の結合による二重抗体形成
５．１．ｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対が導入された二重抗体
５．１．１．４Ｄ９／２Ｂ９抗体を用いた重鎖および軽鎖間の結合試験
前記試験されたｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対を含む重鎖と軽鎖を結合して抗体を作製した（表２５参照）：
【表２５】
2019530641.tif 000129
前記二重抗体のＡ鎖、Ｂ鎖、ａ鎖およびｂ鎖のペアリング精度を確認するために、それぞれ重鎖と軽鎖を正常ペアおよび異常ペアの形態に可能なすべての組み合わせで共同−発現した後、発現程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を下記の表２６に示し、熱的安定性（Ｔｍ）を測定して、その結果を表２７および図２５に示した：
【表２６】
2019530641.tif 000130
【表２７】
2019530641.tif 000131
熱的安定性（Ｔｍ）は、実施例２に記載の方法を参照して測定した。
【０１６７】
前記表２６、表２７、および図２５に示されるように、ｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対が導入された二重抗体の場合、正常ペア（Ａａ／Ｂｂ）の場合、異常ペア（Ａｂ／Ｂａ）に比べて、発現水準が高く、熱的安定性も非常に優れていることが確認された。
【０１６８】
５．１．２．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ／Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ二重抗体またはＡｄａｌｉｍｕｍａｂ／Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ二重抗体
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＲ；Ｒｏｃｈｅ）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；Ｒｏｃｈｅ）、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕｍｉｒａＲ；Ａｂｂｖｉｅ）を購入してアミノ酸配列をシーケンシングし（基礎科学支援センター（ＫＢＳＩ）；韓国）、これに相当するｃＤＮＡを合成し、これを用いて下記の表２８の組み合わせでｃ’２９ｃ’３０ｃ４８Фｆ’２９ｆ’３０ｆ’４８突然変異対と実施例３で選択されたＣＨ３ドメインのＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体を作製した（ｐｃＤＮＡ３  ｖｅｃｔｏｒ（図２６参照）使用）。
【０１６９】
【表２８】
2019530641.tif 000132
前記得られた二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖについて、次の条件でＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）を行って、その結果を図２７（ｙ軸：Ｖａｌｕｅ（ｍＡＵ）、ｘ軸：時間（ｍｉｎ））にそれぞれ示した：
装備：ＨＰＬＣ−Ｕ３０００
カラム：ＭＡｂＰａｃ  Ｈｉｃ−２０
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ、２８０ｎｍ
Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ：０．１０Ｍ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．０
前記得られたタンパク質をＨＩＣ  Ｃｏｌｕｍｎに通過させると、タンパク質の疎水性程度に応じて互いに異なる時間帯にピークが生成され、これにより二重抗体がよく作られたかを確認できる。図２７に示されているように、２つの同種二量体抗体（ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂまたはＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）のピークのうち、異種二量体の二重抗体（ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖ）のピークが明確に観察される。これは、それぞれの抗体のｈａｌｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。
【０１７０】
また、前記得られた二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖについて、次の条件でＳｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）  Ａｎａｌｙｓｉｓを行って、その結果を表２９、図２８および図２９（ｘ軸：時間（ｍｉｎ））に示した：
装備：ＨＰＬＣ−Ｕ３０００
カラム：Ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｔ  ＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ、２８０ｎｍ
Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
【表２９】
2019530641.tif 000133
前記ＳＥＣ分析においてタンパク質の大きさに応じてｐｅａｋが出ており、タンパク質間の凝集状態などが分かる。表２９、図２８および図２９に示されるように、二重抗体のピークが２つの単一抗体ピークの中間時間帯に位置することを確認できる。これは、二重抗体がよく生成されていることを意味する。
【０１７１】
また、前記得られた二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で二量体の形成様相を図３０に示した。図３０から確認されるように、異種二量体である二重抗体Ｔｒａｂｅｖは、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂの中間ｓｉｚｅに、Ａｄａｂｅｖは、ＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂの中間ｓｉｚｅに単一ｂａｎｄとして現れた。これは、同種二量体が形成されず、単に正常ペアの二重特異性抗体だけが作られたことを意味する。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡによりＢｓＡｂがそれぞれの抗原（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ：Ｈｅｒ２）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＶＥＧＦ）、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）によく結合するかを試験した。
【０１７３】
抗原結合力の測定は次を参照して行った：
Ｒｅａｇｅｎｔ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ−ＨＲＰ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ、２０６０−０５）
ＴＭＢ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、００２０２３）
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
Ｅｍａｘ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
Ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：Ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ９．６
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒｅｅ（ＴＢＳ）  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ：０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＴＢＳ、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）
Ｄｉｌｕｅｎｔ：０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＴＢＳ、ｐＨ７．４
Ｓｔｏｐ  ｂｕｆｆｅｒ：１Ｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＣｌ）
過程
Ｃｏａｔｉｎｇ：ａｎｔｉｇｅｎをｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに希釈して、ｗｅｌｌあたり１００ｕｌずつｌｏａｄｉｎｇ、４℃  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ（Ｈｅｒ２、ＶＥＧＦ：５０ｎｇ／ｗｅｌｌ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ：１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）；
Ｗａｓｈｉｎｇ  ３ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ；
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ３００ｕｌ分注、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ａｔ  ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＲＴ）  ｆｏｒ  １ｈｏｕｒ；
Ｗａｓｈｉｎｇ  ３ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ；
Ｂｉｎｄｉｎｇ：ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １００ｎｇ／ｗｅｌｌでｌｏａｄｉｎｇ、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ＲＴ  １ｈｒ；
Ｗａｓｈｉｎｇ  ３ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ；
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ−ＨＲＰをＴＢＳＴに１：４０００で稀釈、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ＲＴ  １ｈｒ；
Ｗａｓｈｉｎｇ  ３ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＴＭＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００ｕｌずつｌｏａｄｉｎｇ、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ＲＴ  ３ｍｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄａｒｋ；
Ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：１Ｎ  ＨＣｌ  １００ｕｌずつｌｏａｄｉｎｇ；
Ｒｅａｄｉｎｇ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ４５０ｎｍで測定
前記得られた結果を表３０と図３１（以上、Ｔｒａｂｅｖに関する結果）、および表３１と図３２（以上、Ａｄａｂｅｖに関する結果）にそれぞれ示した：
【表３０】
2019530641.tif 000134
【表３１】
2019530641.tif 000135
表２９および図３１に示されるように、二重抗体Ｔｒａｂｅｖは、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの抗原であるＨｅｒ２と、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの抗原であるＶＥＧＦともに結合することが確認され、表３０および図３２に示されるように、二重抗体Ａｄａｂｅｖも、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂの抗原であるＴＮＦ−ａｌｐｈａとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂの抗原であるＶＥＧＦともに結合することが確認された。このような結果は、意図した機能を正常に発揮する２つの二重抗体が生成に成功したことを改めて確認させるものである。
【０１７４】
５．２．ｃ３４Фｆ５１突然変異対が導入された二重抗体
実施例５．１．１を参照して、４Ｄ９（Ａａ）と２Ｂ９（Ｂｂ）にｃ３４Фｆ５１突然変異対（表２３参照）が導入された抗体を作製した。各重鎖別に軽鎖ａとｂと共に発現させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を測定し（重鎖ＡおよびＢに対してそれぞれ実施する）、実施例２を参照してＴｍを測定して、その結果を下記の表３２および図３４に示した。
【０１７５】
【表３２】
2019530641.tif 000136
表３２および図３４に示されるように、正常な重鎖／軽鎖対（ＡａまたはＢｂ）の形成率がそれぞれ９０％および８９％と非常に高く、熱的安定性にも優れていることが確認された。
【０１７６】
また、実施例５．１．２の二重抗体の作製過程を参照して、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＲ；Ｒｏｃｈｅ）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；Ｒｏｃｈｅ）、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕｍｉｒａＲ；Ａｂｂｖｉｅ）を用いてｃ３４Фｆ５１突然変異対および実施例３で選択されたＣＨ３ドメインＡＷＢＢ突然変異対（Ａａ：Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｗ；Ｂｂ：Ｋ３７０Ｓ／Ｆ４０５Ｒ）が導入された二重抗体Ｔｒａｂｅｖ（Ａａ：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；Ｂｂ：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）とＡｄａｂｅｖ（Ａａ：Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；Ｂｂ：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）をそれぞれ作製した。
【０１７７】
実施例５．１．２のＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）方法を参照して、前記作製されたｃ３４Фｆ５１突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖを分析した。
【０１７８】
前記得られた分析結果を表３３と図３５（以上、Ｔｒａｂｅｖ）および表３４と図３６（以上、Ａｄａｂｅｖ）に示した。
【０１７９】
【表３３】
2019530641.tif 000137
【表３４】
2019530641.tif 000138
表３３と図３５および表３４と図３６に示されるように、２つの同種二量体抗体（ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂまたはＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）のピークのうち、異種二量体の二重抗体（ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖ）のピークが明確に観察される。これは、ｃ３４Фｆ５１突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入されたそれぞれの抗体のｈａｌｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。
【０１８０】
また、前記ｃ３４Фｆ５１突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体の二量体の形成様相を試験して、図３７に示した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ６％、Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。図３７に示されるように、すでに知られた抗体にｃ３４Фｆ５１突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対を同時に導入させた時、純粋な異種二量体バンドが形成されることを確認できる。
【０１８１】
４．３．ｃ４０Фｆ４４突然変異対が導入された二重抗体
実施例５．１．１を参照して、４Ｄ９（Ａａ）と２Ｂ９（Ｂｂ）にｃ４０Фｆ４４突然変異対（表２４参照）が導入された抗体を作製した。各重鎖別に軽鎖ａとｂと共に発現させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を測定し（重鎖ＡおよびＢに対してそれぞれ実施する）、実施例２を参照してＴｍを測定して、その結果を下記の表３５および図３８に示した。
【０１８２】
【表３５】
2019530641.tif 000139
表３５および図３８に示されるように、正常な重鎖／軽鎖対（ＡａまたはＢｂ）の形成率がすべて９９％と非常に高く、熱的安定性にも優れていることが確認された。
【０１８３】
また、実施例５．１．２の二重抗体の作製過程を参照して、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＲ；Ｒｏｃｈｅ）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；Ｒｏｃｈｅ）、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕｍｉｒａＲ；Ａｂｂｖｉｅ）を用いてｃ４０Фｆ４４突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対（Ａ：Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｗ；Ｂ：Ｋ３７０Ｓ／Ｆ４０５Ｒ）が導入された二重抗体Ｔｒａｂｅｖ（Ａａ：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；Ｂｂ：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）とＡｄａｂｅｖ（Ａａ：Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；Ｂｂ：Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）をそれぞれ作製した。
【０１８４】
実施例５．１．２のＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）方法を参照して、前記作製されたｃ４０Фｆ４４突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖを分析した。
【０１８５】
前記得られた分析結果を表３６と図３９（以上、Ｔｒａｂｅｖ）および表３７と図４０（以上、Ａｄａｂｅｖ）に示した。
【０１８６】
【表３６】
2019530641.tif 000140
【表３７】
2019530641.tif 000141
表３６と図３９および表３７と図４０に示されるように、２つの同種二量体抗体（ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂまたはＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）のピークのうち、異種二量体の二重抗体（ＴｒａｂｅｖとＡｄａｂｅｖ）のピークが明確に観察される。これは、ｃ４０Фｆ４４突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入されたそれぞれの抗体のｈａｌｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。また、２つの同種二量体抗体の間に明確なｐｅａｋがただ１つだけが現れることから、２つの重鎖の間、そしてそれぞれ重鎖と軽鎖との間に誤ったペアリングが起こらずただ１種類の正常にペアリングされた二重特異性抗体だけが作られたことが分かる。
【０１８７】
また、前記ｃ４０Фｆ４４突然変異対およびＡＷＢＢ突然変異対が導入された二重抗体の二量体の形成様相を試験して、図４１に示した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ６％、Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。図４１に示されるように、すでに知られた抗体にｃ４０Фｆ４４突然変異対とＡＷＢＢ突然変異対を同時に導入させた時、純粋な異種二量体バンドが形成されることを確認できる。
【０１８８】
＜比較例１＞
本明細書で提示されるＣＨ３ドメインの突然変異において、同一のアミノ酸対でも実施例１〜３で提示される突然変異と相異なる突然変異が導入される場合の異種二量体形成率を試験した。
【０１８９】
比較例として、実施例１を参照して、下記の表３８の突然変異が導入されたＴＮＦＲＳＦ１Ｂ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｅｎｂｒｅｌ；Ｅｎｂ）とＦａｓ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｆａｓ）を製造した（表３８にてＢＥＡＴ−ＡおよびＢＥＡＴ−Ｂで表示）。
【０１９０】
【表３８】
2019530641.tif 000142
本明細書で提示されるＣＨ３ドメインの突然変異を代表するために、実施例３で選択されたＣＨ３ドメイン突然変異を含むＴＮＦＲＳＦ１Ｂ−Ｆｃ融合タンパク質（Ａ鎖）とＦａｓ−Ｆｃ融合タンパク質（つまり、Ｓ３６４ＫおよびＫ４０９Ｗが導入されたＡ鎖およびＫ３７０ＳおよびＦ４０５Ｒが導入されたＢ鎖）（表３８にてＡＷ／ＢＢで表示）を準備した。
【０１９１】
また、前記表３８に記載の突然変異対を含むＥｎｂ−ＦｃとＦａｓ−Ｆｃをそれぞれｓｉｎｇｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせた場合の同種二量体の形成様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察して、図４２に示した。
【０１９２】
図４２に示されるように、ＡＷ／ＢＢではｍｏｎｏｍｅｒの比率が高いのに対し、ＢＥＡＴ−ＡおよびＢＥＡＴ−Ｂではｍｏｎｏｍｅｒよりはｈｏｍｏｄｉｍｅｒの比率がさらに高かった。このような結果に基づいて、Ａ  ｃｈａｉｎとＢ  ｃｈａｉｎのｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ量に差がある場合、ｈｏｍｏｄｉｍｅｒを形成する確率は、ＡＷ／ＢＢよりＢＥＡＴ−ＡおよびＢＥＡＴ−Ｂの方がより高いといえる。また、二重抗体を作るためにｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎとｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎを組み合わせた時、ｈｏｍｏｄｉｍｅｒが多く作られると、このｈｏｍｏｄｉｍｅｒは正常に作られたｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒと物性に差がほとんどないため、正常に作られたｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒを分離することが非常に困難になる。したがって、ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎを最小化することは、純度の高い二重抗体を製造するうえで非常に重要といえ、できる限りｈｏｍｏｄｉｍｅｒを形成しない突然変異の組み合わせが二重特異性二重抗体の作製に有利といえる。
【０１９３】
このような結果からみて、ＢＥＡＴ−ＡおよびＢＥＡＴ−Ｂの場合、ＡＷ／ＢＢと比較して、同種二量体形成率が高いので、ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌが低いといえ、うまく形成された異種二量体の分離に困難がある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なる種の標的を標的化する二重特異性タンパク質であって、第１ＣＨ３ドメインまたはこれを含む第１Ｆｃ領域、および第２ＣＨ３ドメインまたはこれを含む第２Ｆｃ領域を含み、
ここで、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間の各アミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択される少なくとも１つが、ＣＨ３ドメイン間の少なくとも１つのアミノ酸対における２つのアミノ酸が互いに交換された変異により改変されるように、変異しており（スワッピング変異）、そして
ここで、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、それぞれ独立してＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭからなる群より選択される免疫グロブリンに由来する、
二重特異性タンパク質。
【請求項２】
スワッピング変異が、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、３６４位のセリンと３７０位のリシン、４０７位のチロシンと３６６位のトレオニン、３５７位のグルタミン酸と３７０位のリシン、３５７位のグルタミン酸と３４９位のチロシン、４０５位のフェニルアラニンと４０９位のリシン、３６４位のセリンと３６８位のロイシン、４１１位のトレオニンと３７０位のリシン、３４７位のグルタミンと３６０位のリシン、３５４位のセリンと３４９位のチロシン、３６０位のリシンと３４９位のチロシン、３６８位のロイシンと４０９位のリシン、３９０位のアスパラギンと４００位のセリン、３９４位のトレオニンと３９７位のバリン、３９８位のロイシンと３９２位のリシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸対；または
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸対に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸対
における２つの対になったアミノ酸残基の間で交換がなされている置換である、請求項１記載の二重特異性タンパク質。
【請求項３】
スワッピング変異が、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、少なくとも１つの以下の突然変異：
３６４位のセリンのリシンによる、および３７０位のリシンのセリンによる置換；
４０７位のチロシンのトレオニンによる、および３６６位のトレオニンのチロシンによる置換；
３５７位のグルタミン酸のリシンによる、および３７０位のリシンのグルタミン酸による置換；
３５７位のグルタミン酸のチロシンによる、および３４９位のチロシンのセリンによる置換；および
４０５位のフェニルアラニンのリシンによる、および４０９位のリシンのフェニルアラニンによる置換、
またはＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの突然変異に対応する少なくとも１つの突然変異
を含む、請求項１または２記載の二重特異性タンパク質。
【請求項４】
第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインが、さらに以下の突然変異：
ＣＨ３ドメイン間の少なくとも１つのアミノ酸対のうち、一方のアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸により置換され、他方のアミノ酸が、負電荷を有するアミノ酸により置換され、アミノ酸対における２つのアミノ酸残基のうち少なくとも１つが、疎水性ではなく（静電的相互作用導入変異）、ここで、負電荷を有するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、正電荷を有するアミノ酸は、リシンまたはアルギニンである、突然変異；および
ＣＨ３ドメイン間の少なくとも１つのアミノ酸対のうち、一方のアミノ酸が、大きさの大きい疎水性アミノ酸により置換され、他方のアミノ酸が、大きさの小さい疎水性アミノ酸により置換され（サイズ変異）、ここで、大きさの大きいアミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、大きさの小さいアミノ酸は、アラニン、グリシンおよびバリンからなる群より選択される、突然変異
のうちの少なくとも１つにより改変されている、請求項１〜３のいずれか一項記載の二重特異性タンパク質。
【請求項５】
請求項４記載の二重特異性タンパク質であって、
ここで、静電的相互作用導入変異が、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインにおける（ＥＵナンバリング）、３６４位のセリンと３６８位のロイシン、３９４位のトレオニンと３９４位のトレオニン、３５７位のグルタミン酸と３７０位のリシン、３５７位のグルタミン酸と３４９位のチロシン、３６６位のトレオニンと４０７位のチロシン、および３９４位のトレオニンと３９７位のバリンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸対；または
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸対に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸対
にある２つのアミノ酸のうち、
一方のアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸により置換され、他方のアミノ酸が、負電荷を有するアミノ酸により置換された突然変異であり；および／または
ここで、サイズ変異が、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、４０９位のリシンと４０７位のチロシンの対、４０９位のリシンと４０５位のフェニルアラニンの対、およびそれらの組合わせからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸対；または
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸対に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸対にある２つの対になったアミノ酸残基のうち、
一方のアミノ酸が、大きさの大きい疎水性アミノ酸により置換され、他方のアミノ酸が、大きさの小さい疎水性アミノ酸により置換され、ここで、大きさの大きい疎水性アミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、大きさの小さい疎水性アミノ酸は、アラニン、グリシンおよびバリンからなる群より選択される、置換を含む
二重特異性タンパク質。
【請求項６】
請求項５記載の二重特異性タンパク質であって、
ここで、静電的相互作用導入変異が、
ＩｇＧ１を基準とする（ＥＵナンバリング）、少なくとも１つの以下の突然変異：
３６４位のセリンの正電荷を有するアミノ酸による置換、および３６８位のロイシンの負電荷を有するアミノ酸による置換；
３９４位のトレオニンの正電荷を有するアミノ酸による置換、および３９４位のトレオニンの負電荷を有するアミノ酸による置換；
３５７位のグルタミン酸の正電荷を有するアミノ酸による置換、および３７０位のリシンの負電荷を有するアミノ酸による置換；
３５７位のグルタミン酸の正電荷を有するアミノ酸による置換、および３４９位のチロシンの負電荷を有するアミノ酸による置換；
３６６位のトレオニンの正電荷を有するアミノ酸による置換、および４０７位のチロシンの負電荷を有するアミノ酸による置換；
３９４位のトレオニンの正電荷を有するアミノ酸による置換、および３９７位のバリンの負電荷を有するアミノ酸による置換；および
３４９位のチロシンの正電荷を有するアミノ酸による置換、および３５７位のグルタミン酸の負電荷を有するアミノ酸による置換；または
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの対応する突然変異を含み、および／または
ここで、サイズ変異が、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、以下の突然変異：
４０９位のリシンのトリプトファンによる置換、および４０７位のチロシンのアラニンによる置換；および
４０９位のリシンのトリプトファンによる置換、および４０５位のフェニルアラニンのアラニンによる置換
から選択される少なくとも１つの突然変異；および
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの突然変異に対応する少なくとも１つの突然変異を含む、
二重特異性タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載の二重特異性タンパク質であって、
ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、３６４位のセリンと３６８位のロイシンのうちの一方の正電荷を有するアミノ酸による置換、および他方の負電荷を有するアミノ酸による置換、３６４位のセリンのリシンによる、そして３７０位のリシンのセリンによる置換、および４０５位のフェニルアラニンのリシンによる、そして４０９位のリシンのフェニルアラニンによる置換；または
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの突然変異に対応する少なくとも１つの突然変異を含む、
二重特異性タンパク質。
【請求項８】
２つの異なる種の標的を標的化する二重特異性タンパク質であって、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、少なくとも１つの以下の突然変異：
４０９位のリシンのフェニルアラニンまたはトリプトファンによる置換、および４０５位のフェニルアラニンのリシン、アルギニン、グルタミンまたはアスパラギンによる置換；
３６８位のロイシンのアスパラギン酸、グルタミン酸、または例えばアスパラギン酸による置換、および３６４位のセリンのリシン、アルギニンまたはアスパラギンによる置換；および
３７０位のリシンのセリンによる置換、および３６４位のセリンのリシン、アルギニンまたはアスパラギンによる置換、または
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの突然変異に対応する少なくとも１つの突然変異を含む、
二重特異性タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載の二重特異性タンパク質であって、ここで、
二重特異性タンパク質は、第１のエピトープを認識する、それぞれ抗体の重鎖および軽鎖に由来する第１ＣＨ１ドメイン及び第１ＣＬ（軽鎖定常領域）ドメイン、および第２のエピトープを認識する、それぞれ抗体の重鎖および軽鎖に由来する第２ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＬドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であり、
ここで、二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、さらにＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインに少なくとも１つの以下の突然変異：
第１ＣＨ１ドメインと第１ＣＬドメインの間の各アミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択される１つ以上の第１のアミノ酸対のうちの各対をなす２つのアミノ酸のうち、一方が、正電荷を有するアミノ酸により置換され、他方が、負電荷を有するアミノ酸により置換されている、突然変異；および
第２ＣＨ１ドメインと第２ＣＬドメインの間の各アミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択される１つ以上の第２のアミノ酸対のうちの各対をなす２つのアミノ酸のうち、一方が、正電荷を有するアミノ酸により置換され、他方が、負電荷を有するアミノ酸により置換されている、突然変異
を含み、そして
ここで、正電荷を有するアミノ酸が、リシンまたはアルギニンであり、負電荷を有するアミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、そして
ここで、第１ＣＨ１ドメインおよび第２ＣＨ１ドメインにおける各置換されたアミノ酸が、反対の電荷を有し、第１ＣＬドメインおよび第１ＣＨ１ドメインにおける各置換されたアミノ酸が、反対の電荷を有し、そして第２ＣＬドメインおよび第２ＣＨ１ドメインにおける各置換されたアミノ酸が、反対の電荷を有する、
二重特異性タンパク質。
【請求項１０】
請求項９記載の二重特異性タンパク質であって、ここで、ＣＨ１ドメインにおける正電荷または負電荷を有するアミノ酸により置換されるアミノ酸が、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、少なくとも１つの以下のアミノ酸：
１４５位のロイシン
１８３位のセリン、
１４７位のリシン、
１７０位のフェニルアラニン、
１７１位のプロリン、および
１８５位のバリン、または
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸に対応する位置のアミノ酸であり、そして
ＣＬドメインにおける正電荷または負電荷を有するアミノ酸により置換されるアミノ酸が、カッパタイプのＣＬドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、少なくとも１つの以下のアミノ酸：
１３１位のセリン、
１３３位のバリン、
１３５位のロイシン、
１６２位のセリン、および
１８０位のトレオニン、または
ラムダタイプのＣＬドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸に対応する位置のアミノ酸である、
二重特異性タンパク質。
【請求項１１】
請求項９または１０記載の二重特異性タンパク質であって、ここで、
ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間のアミノ酸対を形成する２つのアミノ酸のセットが、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインおよびカッパタイプのＣＬドメインを基準とする（ＥＵナンバリング）、少なくとも１つの以下のアミノ酸対：
ＣＨ１ドメインにおける１４５位のロイシンとＣＬドメインにおける１３１位のセリンの対、
ＣＨ１ドメインにおける１４５位のロイシンとＣＬドメインにおける１３３位のバリンの対、
ＣＨ１ドメインにおける１８３位のセリンとＣＬドメインにおける１３３位のバリンの対、
ＣＨ１ドメインにおける１４７位のリシンとＣＬドメインにおける１８０位のトレオニンの対、
ＣＨ１ドメインの１８５位のバリンとＣＬドメインにおける１３５位のロイシンの対、
ＣＨ１ドメインの１７０位のフェニルアラニンとＣＬドメインの１３５位のロイシンの対、および
ＣＨ１ドメインにおける１７１位のプロリンとＣＬドメインにおける１６２位のセリンの対、または
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥまたはＩｇＭのＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸対に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸対である、
二重特異性タンパク質。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項記載の二重特異性タンパク質であって、ここで、
第１のエピトープを認識する抗体が、配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗インフルエンザＢ抗体であり、そして
第２のエピトープを認識する抗体が、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗インフルエンザＡ抗体である、
二重特異性タンパク質。
【請求項１３】
異なる標的を標的化する二重特異性タンパク質を構築する方法であって、ここで、
二重特異性タンパク質が、第１ＣＨ３ドメインまたは第１ＣＨ３ドメインを含む第１Ｆｃ領域、および第２ＣＨ３ドメインまたは第２ＣＨ３ドメインを含む第２Ｆｃ領域を含み、そして
方法が、第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間の互いのアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択される少なくとも１つのアミノ酸対における２つのアミノ酸を交換する工程を含む、
方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法であって、さらに
ＣＨ３ドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択される少なくとも１つのアミノ酸対における２つのアミノ酸のうちの一方を正電荷を有するアミノ酸により、そして他方を負電荷を有するアミノ酸により置換する工程を含み、
ここで、負電荷を有するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、そして正電荷を有するアミノ酸は、リシンまたはアルギニンであり；および／または
ＣＨ３ドメイン間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択される少なくとも１つのアミノ酸対における２つのアミノ酸のうちの一方を大きさの大きい疎水性アミノ酸により、そして他方を大きさの小さい疎水性アミノ酸により置換する工程、
ここで、大きい疎水性アミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、小さい疎水性アミノ酸は、アラニン、グリシンおよびバリンからなる群より選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の方法であって、さらに以下のＣＨ１およびＣＬドメイン変異工程：
第１のエピトープを認識する抗体の重鎖に由来する第１ＣＨ１ドメインと第１ＣＬドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択される少なくとも１つをなす２つのアミノ酸残基のうちの一方を正電荷を有するアミノ酸により、そして他方を負電荷を有するアミノ酸により置換する工程；および
第２のエピトープを認識する抗体の重鎖に由来する第２ＣＨ１ドメインと第２ＣＬドメインとの間のアミノ酸−アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択される少なくとも１つをなす２つのアミノ酸残基のうちの一方を正電荷を有するアミノ酸により、そして他方を負電荷を有するアミノ酸により置換する工程
を含む、方法。
【請求項１６】
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む、抗インフルエンザＢ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む、抗インフルエンザＡ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
配列番号２７の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗インフルエンザＢ抗体を含み、そして配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３１の軽鎖可変領域を含む抗インフルエンザＡ抗体を含む、抗インフルエンザＡ／抗インフルエンザＢ二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
【国際調査報告】
2019530641.tif 000143
2019530641.tif 000144
2019530641.tif 000145
2019530641.tif 000146