【手続補正書】
【提出日】平成19年10月19日(2007.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、ここに、そのポリペプチドの発現は、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで、
ｂ）レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ分子が、人工セグメントまたはその相補体であり、人工セグメントが、さらにセグメントの５'ＵＴＲおよびセグメントの３'ＵＴＲを含み、ここに、該５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲのうちの少なくとも１つは、ウイルスのＵＴＲであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
５'ＵＴＲを含む人工セグメントが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの５'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
人工セグメントの３'ＵＴＲが、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＰセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質および分泌アルカリフォスファターゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質およびホタルルシフェラーゼよりなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量の検出が、ポリペプチドにより発光された光量子シグナルの不存在、存在または量を検出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、２９３Ｔ腎臓細胞、ＬＡ−４細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ１細胞、ＨＥｐ２細胞、２ｆＴＧＨ細胞、Ｕ３Ａ細胞、ＢＨＫ細胞、サル初代腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、ここに、該ポリペプチドの発現は、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで、
ｂ）レポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項１１】
組換えＤＮＡ分子が、５'から３'の順序にて、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
人工セグメントをコード化するＤＮＡ配列；および
転写終結部位を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩ用のプロモーターであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
転写開始部位が、ＲＮＡポリメラーゼＩ用の転写開始部位であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
人工セグメントをコードするＤＮＡ配列が、人工セグメントの転写がアンチセンス配向にあるようにそのプロモーターに作動可能に連結されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
人工セグメントをコード化するＤＮＡが、人工セグメントの転写がセンス配向にあるようにそのプロモーターに作動可能に連結される請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
人工セグメントが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、レポーター遺伝子、およびマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含み、ここに、３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの少なくとも１つは、生物学的試料を含むことが疑われるウイルスのＵＴＲであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
転写終結シグナルが、ＲＮＡポリメラーゼＩの転写終結シグナルであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
転写終結部位が、自己切断リボザイムをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、一過性にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
生物学的試料中のインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型およびいずれでもないウイルス感染間の鑑別診断を決定する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された細胞の集団とを接触させ、ここに、実質的に複数の遺伝子改変された細胞は、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み、ここに、該ポリペプチドの発現は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し；次いで
ｂ）遺伝子改変された細胞の集団におけるレポーター遺伝子の発現を測定することを特徴とする該方法。
【請求項２２】
組換えＲＮＡが、インフルエンザＡ型ウイルスの人工セグメントであり、人工セグメントが、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの５'ＵＴＲ、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームおよびインフルエンザＡ型ウイルスのセグメントの３'ＵＴＲを含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
生物学的試料中の第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ、該細胞が、第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＲＮＡ分子、ここに、その発現が、第１の分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し、ならびに第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＲＮＡ分子、ここに、その発現が、第２の分節化されたマイナス鎖ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存し、を含み；次いで、
ｂ）第１のレポーター遺伝子によりコード化された第１のポリペプチドの不存在、存在もしくは量、または第２のレポーター遺伝子によりコード化された第２のポリペプチドの不存在、存在もしくは量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２４】
第１もしくは第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むことが疑われる生物学的試料中の第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの存在、不存在または量を検出する方法であって、
ａ）生物学的試料と、その発現が第１の分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第１のレポーター遺伝子を含む第１の組換えＤＮＡ分子、ならびにその発現が第２の分節化されたマイナス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡの細胞内の存在に依存する第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子改変された脊椎動物細胞とを接触させ；次いで、
ｂ）第１および第２のレポーター遺伝子によりコード化されたポリペプチドの不存在、存在または量を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２５】
第１の組換えＲＮＡ分子が、５'から３'の順序にて：
ａ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｂ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｃ）第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列および第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含む第１の人工セグメント；
ｄ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含み、
第２の組換えＲＮＡ分子が、５'から３'の順序にて：
ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター；
ｆ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写開始部位；
ｇ）第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ、第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列、および第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのセグメントの３'ＵＴＲのｃＤＮＡを含む第２の人工セグメント；および
ｈ)ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の転写終結部位を含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第１のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第１の転写開始部位；
第１の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第１の５'ＵＴＲおよび第１の３'ＵＴＲならびに第１のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む第１の人工セグメントをコードする第１のＤＮＡ配列；
第１の転写終結部位；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第２のプロモーター；
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の第２の転写開始部位；
第２の分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスの第２の５'ＵＴＲおよび第２の３'ＵＴＲならびに第２のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームを含む第２の人工セグメントをコードする第２のＤＮＡ配列；ならびに
第２の転写終結部位を含む組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
使用説明書および単離された組換えＤＮＡ分子を含み、ここに、該単離された組換えＤＮＡ分子は、その分子でトランスフェクトした細胞における発現が、分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するレポーター遺伝子を含む、分節化されたマイナス鎖ウイルスの存在、不存在または量を検出するためのキット。
【請求項２８】
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法であって、
ａ）候補抗ウイルス化合物と、遺伝子改変された細胞または細胞集団とを接触させ、ここに、該細胞または細胞集団は、その発現がそのウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み、さらに分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含み；次いで、
ｂ）細胞または細胞集団により生成されたポリペプチドの量を検出する
ことを特徴とする該方法。
【請求項２９】
候補抗ウイルス化合物と、そのウイルスによる増殖感染に感受性である第１の細胞とを接触させ；
第１の細胞を分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスで感染させ、それにより生成試料を供し；
第２の細胞とその生成試料とを接触させ、ここに、第２が、その発現が該ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの細胞内の存在に依存するポリペプチドをコードするレポーター遺伝子を含む組換えＲＮＡ分子を含み；次いで、
第２の細胞により生成されたポリペプチドの量を検出することを含む、
分節化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスに指向された抗−ウイルス薬のための定量的スクリーニング方法。
【請求項３０】
遺伝子改変された脊椎動物細胞が、安定的にトランスフェクトした遺伝子改変された脊椎動物細胞であり、該細胞が組換えＲＮＡをコード化する組換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項２９記載の抗ウイルス薬についての定量的スクリーニング方法。