【手続補正書】
【提出日】平成19年10月16日(2007.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非核性細胞小器官への標的シグナルに機能的にリンクされたタンパク質導入領域を含む、組み換え高移動性ポリペプチド、又はその断片であって：該組み換え高移動性ポリペプチドがポリヌクレオチドと会合し、該ポリヌクレオチドを非核性細胞小器官への送達のためにパッケージングする、前記ポリペプチド、又はその断片。
【請求項２】
前記組み換えポリヌクレオチドをパッケージングするポリペプチドが、約10〜約100ヌクレオチドの、標的とされた細胞小器官に送達されるべきポリヌクレオチドと会合し、それにより、該標的とされた細胞小器官への送達のために該ポリヌクレオチドをパッケージングする、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記組み換えポリペプチドが、配列番号209及び210、又はポリヌクレオチドを結合するのに十分なその断片から選択される配列を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記組み換えポリヌクレオチドをパッケージングするポリペプチドが、少なくとも１種のHMGボックスを含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記組み換えポリヌクレオチドをパッケージングするポリペプチドと物理的に会合するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記物理的結合が、前記ポリヌクレオチドを分解から保護する、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドをパッケージするポリペプチドが、ポリヌクレオチドの領域に可逆的に結合する、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記組み換えポリヌクレオチドをパッケージングするポリペプチドが、TFAMのポリヌクレオチド結合領域を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
細胞標的シグナルをさらに含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記標的シグナルが、ミトコンドリア局在化シグナル、又は葉緑体局在化シグナルを含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ミトコンドリア局在化シグナルが、下記の群から選択されるミトコンドリア局在化シグナルに80〜100％相同性を有する配列を含む、請求項１０記載のポリペプチドであって：該群が、へキソキナーゼI、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）A、へキソキナーゼ IV、膵臓ベータ細胞型、末梢型ベンゾジアゼピン受容体関連タンパク質、メタキシン2、推定ミトコンドリア外膜タンパク質輸入受容体(hTOM)、グルタチオントランスフェラーゼ、電位依存性アニオンチャンネル2 (ミトコンドリア外膜タンパク質ポリン)、へキソキナーゼIV、チトクロム b5、末梢ベンゾジアゼピン受容体、生殖細胞キナーゼアンカーS-AKAP84、A キナーゼアンカータンパク質、カルニチンO-パルミトイルトランスフェラーゼ I 前駆体、へキソキナーゼ II、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）B、長鎖脂肪酸-CoA リガーゼ 2、長鎖脂肪酸-CoA リガーゼ 1 (パルミトイル-CoA リガーゼ)、電位依存性アニオンチャンネル1、 メタキシン 1、ヒト推定ミトコンドリア外膜34 kDa トランスロカーゼ hTOM34、電位依存性アニオンチャンネル 4 (ミトコンドリア外膜タンパク質ポリン)、チトクロムb5 還元酵素、電位依存性アニオンチャンネル3 (ミトコンドリア外膜タンパク質ポリン)、ミトコンドリア輸入受容体サブユニットTOM20ホモログ（ミトコンドリア20 kd 外膜タンパク質）(ミトコンドリア外膜受容体TOM20)、腫瘍性成虫原基ホモログ前駆体 (HTID-1)、及び配列番号 18〜188からなる、前記ポリペプチド。
【請求項１２】
前記葉緑体局在化シグナルが、下記の群から選択される葉緑体局在化シグナルに80〜100％相同性を有する配列を含む、請求項１０記載のポリペプチドであって：該群が、アピコブラスト（apicoblast）リボソームタンパク質S9の通過ペプチド領域、マメグルタチオン還元酵素(GR)シグナルペプチド、推定グアノシン 3',5'-ビスピロリン酸(ppGpp)合成酵素-分解酵素をコードするCr-RSHのNH2末端、14-3-3タンパク質、cpSRP54、cpSRP43サブユニット、又はその断片などの葉緑体シグナル認識小片、膜貫通領域(TMD)、及びそのC-末端隣接７アミノ酸領域などの葉緑体通過ペプチド AtOEP7、THI1 N末端葉緑体通過ペプチド、及び配列番号189〜205からなる、前記ポリペプチド。
【請求項１３】
前記標的シグナルが核標的シグナルを含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記核標的シグナルが、SV40ウイルスT抗原の核局在化シグナル(NLS)を含む、請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記核局在化シグナルが、該SV40ウイルスT抗原の核局在化シグナルの少なくとも９アミノ酸を含む、請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記タンパク質導入領域が、生理的条件下で正味の正電荷を有する複数のアミノ酸残基を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記タンパク質導入領域が8〜15アミノ酸残基を含む、請求項１６記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記タンパク質導入領域が11アルギニン残基を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記タンパク質導入領域が下記の群から選択される、請求項１記載のポリペプチドであって：該群がYGRKKRRQRRR (配列番号: 1)、RKKRRQRRR (配列番号: 2)、HIV-1 TATタンパク質のアミノ酸48-60、アンテナペディアホメオドメインの第３へリックス、RQIKIWFQNRRMKWKK (配列番号: 207)、ポリアルギニン領域、約7アルギニン残基、RRQRRTSKLMKR (配列番号: 7)、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (配列番号: 8)、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (配列番号: 9)、その断片、又はその組合せからなる、前記ポリペプチド。
【請求項２０】
前記タンパク質導入領域が膜を通過することを促進し、かつ該膜が、細胞膜、原形質膜、細胞小器官膜、ミセル膜、二重層膜、単層膜、小胞膜、核膜、又はミトコンドリア膜である、請求項１〜１６のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドが、ポリペプチド、siRNA、又はアンチセンスポリヌクレオチドをコードする核酸配列に機能的にリンクされたプロモーターを含む、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドがRNA、DNA、又はその組合せを含む、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドが酵素領域を含む、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドが酵素RNA、又は酵素DNAを含む、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが一本鎖、又は多重鎖である、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドをパッケージングする方法であって：ポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドをパッケージングするのに十分な組み換えポリペプチドと組合せること含み、その中で該組み換えポリペプチドが少なくとも１種のHMGボックス領域、並びに該組み換えポリペプチドに機能的にリンクされたタンパク質導入領域及び細胞小器官標的シグナルの両方を含み、該タンパク質導入領域、及び該標的シグナルがパッケージングされたポリヌクレオチドの外面に示される、前記方法。
【請求項２７】
前記組み換えポリペプチドが、前記ポリヌクレオチドと可逆的に会合する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記組み換えポリペプチドが、前記ポリヌクレオチドをコーティングする、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記組み換えポリペプチドの前記ポリヌクレオチドとの会合が、該ポリヌクレオチドの立体構造変化を誘導する、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記HMGボックス領域が、配列特異的様式で前記ポリヌクレオチドと会合する、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記HMGボックス領域が、前記ポリヌクレオチドと非特異的に会合する、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
前記組合せ工程がインビトロで生じる、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
治療に使用するための請求項１〜２５のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ポリヌクレオチド−ポリペプチド複合体であって：
（１）非核性細胞小器官への標的シグナル及びポリヌクレオチド結合領域に機能的にリンクされたタンパク質導入領域を含むポリペプチド；及び、
（２）第一の酵素的ポリペプチド又は酵素的核酸をコードするポリヌクレオチド；
を含む、前記ポリヌクレオチド−ポリペプチド複合体。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが、ミトコンドリアゲノム又はその断片を含む、請求項３４記載の複合体。
【請求項３６】
前記非核性細胞小器官がミトコンドリアである、請求項３４記載の複合体。
【請求項３７】
前記第一の酵素的ポリペプチドがエンドヌクレアーゼである、請求項３４記載の複合体。
【請求項３８】
前記酵素的核酸が、DNA、RNA、又はその組合せを含む、請求項３４記載の複合体。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドが、２種以上のミトコンドリアポリペプチドをコードする、請求項３４記載の複合体。
【請求項４０】
非核性細胞小器官のゲノムを修飾する方法において使用するための請求項３４〜３９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド−ポリペプチド複合体であって、該方法が：
（ａ）細胞を該ポリヌクレオチド−ポリペプチド複合体と接触させる工程；及び
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを非核性細胞小器官で発現させる工程であって、前記第一の酵素的ポリペプチドは、非核性細胞小器官に内在性の核酸を切断し、かつ該ポリヌクレオチドを切断しない、前記工程；
を含む、前記方法。
【請求項４１】
ミトコンドリア局在化シグナル又は葉緑体局在化シグナル、若しくはその断片、及び任意に、タンパク質導入領域を含む、組み換えヌクレアーゼであって、該ヌクレアーゼが、非核性細胞小器官内の内在性核酸に存在する切断部位に特異的であるが、該非核性細胞小器官内に存在する異種の核酸に存在する切断部位に特異的でない、前記組み換えヌクレアーゼ。  
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
また別の実施態様は、非核性細胞小器官のゲノムを改質する方法を提供する。この方法は、細胞を、酵素ポリペプチドで接触することを含み、該酵素ポリペプチドはPTD、及び該酵素ポリペプチドに機能的にリンクされた標的シグナルを含む。該酵素ポリペプチドは、ヌクレアーゼ、又は該非核性細胞小器官のゲノムにある制限酵素切断部位に特異的な制限酵素であり得る。代わりとして、該酵素ポリペプチドは、異種の核酸にあるが該非核性細胞小器官に内在性の核酸にない、部位で核酸を切断することができる。酵素ポリペプチドを単独で、又はポリヌクレオチドと組合せて送達することができる。