【手続補正書】
【提出日】平成19年7月26日(2007.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における、クマリンおよびその誘導体の標的としてのビタミンＫエポキシドリサイクリングポリペプチド（ＶＫＯＲＣ１）であって、
（ａ）配列番号１、１２および１７に記載の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列；
（ｂ）（ａ）に規定されるポリペプチド配列の、対立遺伝子のポリペプチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定されるポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ここで、該ポリペプチド配列がＶＫＯＲＣ１活性を有する、ポリペプチド配列；
（ｄ）ＶＫＯＲＣ１活性を有し、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定されるポリペプチド配列のフラグメントのポリペプチド配列、
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、ビタミンＫエポキシド還元酵素ポリペプチド（ＶＫＯＲＣ１）。
【請求項２】
ＶＫＯＲＣ１核酸であって、
（ａ）請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｂ）配列番号２、１３および１８に記載の配列からなる群から選択される核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定される核酸配列に対してストリンジェントな条件の下にハイブリダイズする核酸であって、ここで、ＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする。核酸配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定される核酸配列に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズし得る核酸配列であって、ここで、該核酸配列がＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列；および、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に規定される核酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントがＶＫＯＲＣ１活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント、
からなる群から選択される核酸配列を含む、ＶＫＯＲＣ１核酸。
【請求項３】
融合タンパクであって、
（ａ）請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、または、請求項２のＶＫＯＲＣ１核酸によってコードされるポリペプチド、および
（ｂ）異種部分
を含む、融合タンパク。
【請求項４】
請求項２のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクター。
【請求項５】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項４のベクター。
【請求項６】
前記ベクターがノックアウト遺伝子構築物である、請求項４または５のベクター。
【請求項７】
請求項２のＶＫＯＲＣ１核酸、または請求項４〜６のいずれか１項のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８】
非ヒト胚性幹細胞である、請求項７の宿主細胞。
【請求項９】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、請求項８の宿主細胞を含む、トランスジェニック哺乳動物。
【請求項１０】
請求項２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ。
【請求項１１】
請求項２のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＰＣＲプライマーであって、好ましくは、配列番号５３〜６９および７０に記載のＰＣＲプライマーからなる群から選択される、ＰＣＲプライマー。
【請求項１２】
請求項２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する低分子干渉性ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であって、好ましくは、配列番号２９、３０、３３、３４、３７、３８、４１、４２、４５、４６、４９および５０からなる群から選択される、ｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
請求項２のＶＫＯＲＣ１核酸に対する、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対するＲＮＡアプタマーであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、ＲＮＡアプタマー。
【請求項１５】
請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し、結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１６】
ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを生産する方法であって、
（Ｉ）請求項２のＶＫＯＲＣ１核酸、または、請求項４〜６のいずれか１項のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞において該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）該宿主細胞から該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）前記ＶＫＯＲＣ１核酸、または、該ＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクターを導入された宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）該宿主細胞において該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；
（ＩＩＩ）候補のクマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＶ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性を定量する工程（候補活性値）；
（Ｖ）該候補活性値をコントロール活性値と比較する工程；および、
（ＶＩ）提供される該候補活性値が該コントロール活性値と有意に異なる場合、該候補クマリン誘導体を、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼすクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、前記コントロール活性値は、
（Ａ）工程（Ｉ）に従って宿主細胞を提供する工程；
（Ｂ）該宿主細胞において前記ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する工程；および、
（Ｃ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性を定量する工程（コントロール活性値）
を包含する方法によって決定される、方法。
【請求項１９】
請求項１７の方法であって、前記定量されたＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性は、ビタミンＫ２，３−エポキシドのビタミンＫキノンへのジチオスレイトール依存性変換であり、ここで、前記有意に異なる活性値は、前記コントロール活性値よりも有意に高い候補活性値である、方法。
【請求項２０】
請求項１７の方法であって、少なくとも１つのさらなる化合物が前記宿主細胞に導入され、該化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、ならびにγ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸とからなる群から選択される、方法。
【請求項２１】
ＶＫＯＲＣ１活性に対して発揮されるクマリン作用を伝えるＶＫＯＲＣ１ポリペプチド配列を決定する方法であって、
（Ｉ）少なくとも１つの配列異常を有する、請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性を定量する工程（配列異常活性値）；および、
（ＩＶ）該配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程を包含し、
ここで、該コントロール配列活性値に対する、該配列異常活性値の有意な偏差は、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの配列異常が、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して発揮される該クマリン作用を伝えることの指標である、方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法であって、前記コントロール配列活性値は、
（Ｉ）請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する工程；
（ＩＩ）クマリンまたはその誘導体を該細胞に投与する工程；および、
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性を定量する工程（コントロール配列活性値）
を包含する方法によって決定される、方法。
【請求項２３】
請求項２１の決定方法であって、前記定量された活性は、ビタミンＫ２，３−エポキシドのビタミンＫキノンへのジチオスレイトール依存性変換であり、ここで、前記有意に異なる値とは、前記コントロール配列活性値よりも有意に高い配列異常活性値である、方法。
【請求項２４】
請求項２１の方法であって、少なくとも１つのさらなる化合物が前記細胞に導入され、該化合物は、ビタミンＫ、シトクロームＢ５、ならびにγ−グルタミル−カルボキシラーゼ、ミクロソームのエポキシデヒドロラーゼ、カルメニン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸とからなる群から選 択される、方法。
【請求項２５】
請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して作用を及ぼす、少なくとも１つの配列異常を含む、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２５のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドであって、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１または１２に記載のポリペプチドであり、かつ、前記配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８Ｒ，およびＹ１３９Ｃからなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項２７】
ＶＫＯＲＣ１核酸であって、
（ａ）請求項２５または２６のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列番号３、４、５、６、７、１４および９４に記載の配列からなる群から選択される核酸配列；および、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定される核酸に対して、遺伝子コードの縮重がなければ、ハイブリダイズし得る核酸配列であって、ここで、該核酸配列が、請求項２５または２６のポリペプチドをコードする、核酸配列、
からなる群から選択される、核酸。
【請求項２８】
請求項２７のＶＫＯＲＣ１核酸を含むベクター。
【請求項２９】
請求項２７のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ。
【請求項３０】
請求項２７のＶＫＯＲＣ１核酸に対するＰＣＲプライマー。
【請求項３１】
請求項２５または２６のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを特異的に認識し、結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項３２】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、請求項２７のＶＫＯＲＣ１核酸、または請求項２８に記載のベクターを含む幹細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３３】
請求項２７のＶＫＯＲＣ１核酸、請求項２９のＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブ、請求項３０のＰＣＲプライマー、および請求項３１の抗体からなる群から選択される化合物を含む、診断薬。
【請求項３４】
患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症の診断を支援するための方法であって、
（Ｉ）該患者から得られたＤＮＡサンプルを増幅するか、または該患者から得られたＲＮＡサンプルを逆転写してＤＮＡとし、該ＤＮＡを増幅する工程；および、
（ＩＩ）工程（Ｉ）の増幅されたＤＮＡを分析し、請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドをコードする核酸配列において、または、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１つの配列異常を決定する工程を包含し、
ここで、該決定される配列異常は、該患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患すること、好ましくはワルファリン耐性を患っていることの指標である、方法。
【請求項３５】
請求項３４の方法であって、前記増幅されたＤＮＡは、配列番号１に記載のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの少なくとも部分配列をコードし、ここで、前記配列異常は、Ｖ２９Ｌ、Ｖ４５Ａ、Ｒ５８Ｇ、Ｒ９８Ｗ、Ｌ１２８ＲおよびＹ１３９Ｃからなる群から選択される、方法。
【請求項３６】
請求項３４の方法であって、前記増幅されたＤＮＡは、ＰＣＲベースの分析、制限消化分析、およびＤＮＡ配列決定分析からなる群から選択される技術によって分析される、方法。
【請求項３７】
患者においてＶＫＯＲＣ１関連欠乏症の診断を支援するための方法であって、
（Ｉ）該患者からのサンプルを提供する工程；および、
（ＩＩ）請求項３１の抗体を用いて、該サンプルにおいて配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを検出する工程を包含し、
ここで、決定される配列異常は、該患者が、ＶＫＯＲＣ１関連欠乏症に罹患することの指標である、方法。
【請求項３８】
請求項３７の方法であって、前記サンプルは、免疫組織化学的検出、イムノブロッティング、好ましくはウェスタンブロッティング、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される技術によって分析される、方法。
【請求項３９】
少なくとも１つの配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）請求項２５または２６に記載のＶＫＯＲＣ１ポリペプチド、好ましくは、配列番号３、４、５、６、７、１４および９４からなる群から選択される配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ＩＩ）候補クマリン誘導体を該細胞に投与する工程；
（ＩＩＩ）該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性を定量する工程（配列異常活性値）；および、
（ＩＶ）該配列異常活性値を、コントロール配列活性値と比較する工程、
（Ｖ）該候補クマリン誘導体の投与が、該コントロール配列活性値よりも有意に低い配列異常活性値をもたらす場合、該候補クマリン誘導体を、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドの活性に対して抑制作用を及ぼすクマリン誘導体として同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
ワルファリン耐性げっ歯動物において毒物学的に有効なクマリン誘導体を同定する方法であって、
（Ｉ）ワルファリン耐性げっ歯動物を提供する工程；
（ＩＩ）該げっ歯動物に候補クマリン誘導体を投与する工程；
（ＩＩＩ）該げっ歯動物に対する該候補クマリン誘導体の毒性を定量する工程（候補クマリン誘導体毒性値）；
（ＩＶ）該候補クマリン誘導体毒性値をコントロールクマリン毒性値と比較する工程；
（Ｖ）該候補クマリン誘導体毒性値が、該コントロールクマリン毒性値よりも有意に大きい場合、該候補クマリン誘導体を、毒物学的に有効なクマリン誘導体であると同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０の方法であって、ワルファリン耐性げっ歯動物は、請求項１のＶＫＯＲＣ１ポリペプチドについてトランスジェニックなげっ歯動物であり、該ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、ワルファリン耐性を引き起こす少なくとも１つの配列異常、好ましくは、配列番号１４に記載の配列によってコードされるポリペ プチドを含む、方法。
【請求項４２】
請求項４０の方法であって、ＶＫＯＲＣ１ポリペプチドは、配列番号１２に記載のポリペプチドであり、かつ、該配列異常は、Ｖ２９Ｌ（８５Ｇ＞Ｔ）、Ｖ４５Ａ（１３４Ｔ＞Ｃ）、Ｒ５８Ｇ（１７２Ａ＞Ｇ）、Ｒ９８Ｗ（２９２Ｃ＞Ｔ）、およびＬ１２８Ｒ（３８３Ｔ＞Ｇ）、およびＹ１３９Ｃ（４１６Ａ＞Ｇ） からなる群から選択される、方法。
【請求項４３】
げっ歯類を殺す組成物であって、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法によって同定されたクマリン誘導体の毒物学的に有効な量を含む、組成物。
【請求項４４】
配列番号８８〜９１に記載のＰＣＲプライマーの使用であって、ラットから得たサンプルにおいて、該ラットがワルファリン耐性遺伝子型を有するか否かを決定するための、使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
サンプルを獲得する方法は既に詳述した。配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドを検出する方法は、配列異常（単数または複数）を担うタンパクを特異的に検出するものである限り、特に限定はされない。そのような方法の例としては、例えば、免疫組織化学的検出、イムノブロッティング、好ましくはウェスタ ンブロッティング、および、ポリペプチドのＥＬＩＳＡ、特に、上に定義した配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチドに対して特異的な抗体によるＥＬＩＳＡが挙げられる。アミノ酸配列のレベルにおける配列異常の分析は特に限定されないが、例えば、１個以上の配列異常を有するＶＫＯＲＣ１ポリペプチ ドを特異的に認識し、結合するＶＫＯＲＣ１抗体を用いて実施してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
驚くべきことに、調査した全てのＶＫＣＦＤ２およびＷＲ被験者において、機能不明の遺伝子にミスセンス突然変異が認められた（図２）。この遺伝子（ＩＭＡＧＥ３４５５２００）は、５１２６ｂｐのゲノム領域に広がっており、１６３個のアミノ酸から成るタンパクをコードする３個のエキソンを含む。これを、ビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク１（ＶＫＯＲＣ１）と名づけた。無関係のＶＫＣＦＤ２患者、および同様の病気を有する兄弟達のいずれも第３エキソン（２９２Ｃ＞Ｔ）に同じホモの点突然変異を抱えているが、一方、両親はヘテロであることが判明した。この突然変異は、アミノ酸残基９８におい て、アルギニンがトリプトファンによって置換されたことによって生じたものである（Ｒ９８Ｗ）。この家系はドイツおよびレバノン起源を有する。突然変異遺伝子周辺のホモ接合体領域におけるハプロタイプは、両家系で異なっており、独立した突然変異事象であることを示している。ＷＲ患者では、３種の異なるヘテ ロ突然変異が、バリンのロイシンによる置換（患者Ｃ：Ｖ２９Ｌ）、アルギニンのグリシンによる置換（患者Ｄ：Ｒ５８Ｇ）、および、ロイシンのアルギニンとの交換（患者Ｅ：Ｌ１２８Ｒ）をもたらすことが判明した。このＲ５８Ｇ突然変異は、指標患者Ｄの二人の同病兄弟も共有している。このミスセンス突然変異 は、３８４本のコントロール染色体には存在しなかった。コントロール染色体の配列決定を行うことによって、二つの、非同義的一塩基多型（Ｃ４３Ｃ；Ｌ１２０Ｌ）が明らかにされた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
ＶＫＯＲＣ１の最高発現レベルは、胎児および成人の肝臓に観察される（図４）。胎児の心臓、腎臓および肺において、また、成人の心臓および膵臓においても高い発現レベルが観察された。胎児の脳、成人の胎盤と骨格筋は、中等度の発現レベルを示した。僅かな発現レベルが成人の脳、肺、および腎臓に検出された。