【手続補正書】
【提出日】平成18年11月29日(2006.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α1サブユニットのI-IIループまたは少なくともAIDドメインを含むその断片を、NH2またはCOOH末端に融合した少なくとも1つのβサブユニットまたは少なくともBIDドメインを含むβサブユニットの断片を含むことを特徴とする高閾値カルシウムチャネルに由来するキメラタンパク質。
【請求項２】
α1サブユニットのI-IIループを、NH2またはCOOH末端に融合したβサブユニットからなることを特徴とする請求項1に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
α1サブユニットのI-IIループを、NH2またはCOOH末端に融合したβサブユニットのGK様ドメインからなることを特徴とする請求項1に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
βサブユニットまたはその断片と、I-IIループまたはその断片とが、スペーサーペプチドで分離されていることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載のタンパク質。
【請求項５】
Gタンパク質感受性高閾値カルシウムチャネルに由来することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
α1A、α1Bおよびα1Eから選択されるα1サブユニットのI-IIループ、またはその断片を含むことを特徴とする請求項5に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
β1、β2、β3およびβ4からなる群より選択されるβサブユニット、またはその断片を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1つに記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
βサブユニットおよび／またはα1サブユニットのI-IIループの配列の少なくとも1つのアミノ酸の突然変異を有することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1つに記載のキメラタンパク質に由来する変異キメラタンパク質。
【請求項９】
突然変異が、α1サブユニットのI-IIループの断片に対するβサブユニットの親和性、および／またはその逆を修飾することを特徴とする請求項8に記載の変異キメラタンパク質。
【請求項１０】
突然変異が、α1サブユニットのI-IIループのAIDドメインの次の突然変異：Q383A、Q384A、E386D、E386S、L389H、G391R、Y392S、Y392F、W395A、I396AおよびE400Aから選択されることを特徴とする請求項8または9に記載の変異キメラタンパク質。
【請求項１１】
当該タンパク質の検出および／または精製および／または固定化を許容する少なくとも1種の適切な標識に、好ましくは共有結合で結合していることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1つに記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
そのNH2および／またはCOOH末端に、それぞれ受容または供与蛍光体を含むことを特徴とする請求項11に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
受容蛍光体が、蛍光タンパク質CFPまたはBFPであり、供与蛍光体が蛍光タンパク質GFPまたはYFPであることを特徴とする請求項12に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質の配列の少なくとも7つのアミノ酸の断片を含み、該断片が、請求項1で規定されるカルシウムチャネルのβサブユニットおよびα1サブユニットのI-IIループまたはそれらの断片の接合部に位置する少なくとも7つのアミノ酸を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項１５】
請求項14に記載のペプチドに指向し、かつ請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質を排他的に認識することを特徴とする抗体。
【請求項１６】
請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質または請求項14に記載のペプチドをエンコードする配列と、センスまたはアンチセンスであり得る該配列に相補的な配列とからなる群より選択されることを特徴とする核酸分子。
【請求項１７】
請求項1で規定されるカルシウムチャネルのβサブユニットおよびα1サブユニットのI-IIループ、またはそれらの断片の接合部に位置する配列に対応する約10〜30ヌクレオチドの配列を含むことを特徴とするプローブまたはプライマー。
【請求項１８】
配列番号1、2、4、6、7、8および9の配列からなる群より選択されることを特徴とする、カルシウムチャネルのβサブユニットおよび／またはα1サブユニットのI-IIループあるいは請求項1で規定されるそれらの断片を増幅可能なプライマー。
【請求項１９】
請求項16に記載の核酸分子からなる群より選択される挿入断片を含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項２０】
配列番号5および配列番号10の配列からなる群より選択される配列を有する真核生物発現ベクターであることを特徴とする、請求項19に記載の組換えベクター。
【請求項２１】
請求項19もしくは20に記載の組換えベクターで改変されたか、請求項16に記載の核酸分子で改変されたか、または請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質で改変された細胞。
【請求項２２】
真核生物細胞であることを特徴とする請求項21に記載の改変された細胞。
【請求項２３】
Gタンパク質と共役可能な少なくとも1つの受容体を発現することを特徴とする請求項21または22に記載の改変された細胞。
【請求項２４】
その全てまたは一部の細胞が、請求項16に記載の核酸分子で形質転換されたことを特徴とするヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２５】
請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質、請求項16に記載の核酸分子、請求項19または20に記載の組換えベクター、請求項21〜23のいずれか1つに記載の改変された細胞、および請求項24に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物からなる群より選択される物質の、Gタンパク質共役型受容体依存性細胞シグナリングおよび調節経路の研究のための使用。
【請求項２６】
請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質、請求項16に記載の核酸分子、請求項19または20に記載の組換えベクター、請求項21〜23のいずれか1つに記載の改変された細胞、および請求項24に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物からなる群より選択される物質の、Gタンパク質共役型受容体依存性細胞シグナリングおよび調節経路のアゴニストおよび／またはアンタゴニストをスクリーニングするための使用。
【請求項２７】
請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質、請求項16に記載の核酸分子、請求項19または20に記載の組換えベクター、請求項21〜23のいずれか1つに記載の改変された細胞、および請求項24に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物からなる群より選択される物質の、高閾値カルシウムチャネルのα1サブユニットとβサブユニットとの間の相互作用のアンタゴニストをスクリーニングするための使用。
【請求項２８】
Gタンパク質共役型受容体依存性細胞シグナリングおよび調節経路を研究するための、
少なくとも次の工程：
a1) Gタンパク質感受性カルシウムチャネルに由来するキメラタンパク質と、Gタンパク質共役型受容体とを発現する請求項23に記載の改変された細胞を培養する工程、
b1) 該Gタンパク質共役型受容体を介して、いずれの適切な手段によりシグナルを変換する工程、および
c1) いずれの適切な手段により、細胞において発現されたキメラタンパク質のGβγサブ
ユニットに結合した割合を測定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
Gタンパク質共役型受容体依存性細胞シグナリングおよび調節経路のアゴニストおよび
／またはアンタゴニストをスクリーニングするための、少なくとも次の工程：
a2) Gタンパク質感受性カルシウムチャネルに由来するキメラタンパク質と、Gタンパク質共役型受容体とを発現する請求項23に記載の改変された細胞を培養する工程、
b2) Gタンパク質共役型受容体を介して、いずれの適切な手段によりシグナルを変換する工程、
c2) いずれの適切な手段により、細胞において発現されたキメラタンパク質のGβγサブユニットに結合した割合を、該細胞をb2)において、試験される分子と接触させる前と後とで比較測定する工程、ならびに
d2) 遊離のGβγサブユニットの細胞濃度をそれぞれ増加および減少させ得るものに相当する、Gタンパク質共役型受容体依存性細胞シグナリングおよび調節経路のアゴニスト／アンタゴニストである分子を同定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
a1)またはa2)における改変された細胞が、そのNH2またはCOOH末端において、それぞれ蛍光供与蛍光体および蛍光受容蛍光体と結合したキメラタンパク質を発現し、c1)またはc2)における測定が、蛍光転移(FRET)法により行われることを特徴とする請求項28または29に記載の方法。
【請求項３１】
高閾値カルシウムチャネルのα1サブユニットとβサブユニットの間の相互作用のアンタゴニストをスクリーニングするための、少なくとも次の工程：
a3) 試験する分子を、請求項1〜13のいずれか1つに記載のGタンパク質感受性または非感受性のカルシウムチャネルに由来するキメラタンパク質、およびGタンパク質非感受性α1サブユニットのAIDドメインを含むペプチドと接触させる工程、
b3) いずれの適切な手段により、該キメラタンパク質の該ペプチドへの結合を測定する工程、ならびに
c3) それを用いて該キメラタンパク質の該ペプチドへの結合が観察されるものに相当する、α1サブユニットとβサブユニットとの間の相互作用のアンタゴニストを同定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
AIDドメインを含むペプチドが、固体支持体に固定化され、キメラタンパク質が、請求項11〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質であることを特徴とする請求項31に記載のスクリーニングする方法。
【請求項３３】
請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラタンパク質、請求項16に記載の核酸分子、請求項19または20に記載の組換えベクター、請求項21〜23のいずれか1つに記載の改変された細胞、および請求項24に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物からなる群より選択される少なくとも1つの物質を含むことを特徴とする、請求項28〜32のいずれか1つに記載の方法を実行するためのキット。