(57)【要約】  本発明は、鳥対象における性別の決定及び特定の方法に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１つの性染色体Ｚ又はＷに組み込まれた少なくとも１つのレポーター遺伝子を含むトランスジェニック鳥動物を用いた非侵襲的な方法を提供する。本発明のトランスジェニック鳥動物は、未孵化鳥の卵内の胚の性別の決定及び選択のために使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥の受精した未孵化卵の性別決定の方法であって、
（ａ）性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの位置又は場所に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１羽のトランスジェニック鳥動物を提供／取得する工程、
（ｂ）前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも１個の受精卵を取得する工程、
（ｃ）少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されるかどうかを前記卵内で決定する工程であって、前記少なくとも１つの検出可能なシグナルの検出が、前記鳥胚内で前記少なくとも１つのレポーター遺伝子の発現、それによって、前記染色体Ｗ又は染色体Ｚの存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１羽のトランスジェニック鳥対象が、少なくとも２つの異なるレポーター遺伝子を含み、各レポーター遺伝子が、性染色体Ｚ又はＷの一方の少なくとも１つの遺伝子座に組み込まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーター遺伝子が、少なくとも１つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項１及び請求項２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法がさらに、工程（c）で検出される前記検出可能なシグナルの形成のために、工程（ｂ）の前記卵に、前記生物発光レポーター遺伝子と互換性のある基質及び酵素のうちの少なくとも一方を提供する工程を含む、請求項１、３及び４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのトランスジェニック鳥対象、具体的には、動物が雌の鳥動物であり、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌の染色体Ｚの少なくとも１つの位置に組み込まれ、それによって、検出可能なシグナルの検出が、前記未孵化卵内の前記胚が雄であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのトランスジェニック鳥対象、具体的には、動物が雌の鳥動物であり、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌の染色体Ｗの少なくとも１つの位置に組み込まれ、それによって、検出可能なシグナルの検出が、前記未孵化卵内の前記胚が雌であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、少なくとも１つのプログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）を用いて、前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物の前記性染色体に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＥＮが、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ））タイプＩＩシステムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ９（Ｃａｓ９）システムによって媒介される相同性指向性修復（ＨＤＲ）により前記トランスジェニック鳥動物の前記性染色体に組み込まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列、並びに（ｂ）少なくとも１つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を、前記鳥動物の少なくとも１つの細胞又は前記鳥動物に導入される少なくとも１つの細胞に共トランスフェクトすることによって、前記トランスジェニック鳥動物の性染色体に組み込まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子に、その５’及び３’で、前記組み込み部位でのＨＤＲのために相同アームが隣接している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか１つに作動可能に連結される、請求項１１及び１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも１つの非コード領域に組み込まれている、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性染色体Ｗの遺伝子座１０２２８５９〜１０２４２１５の少なくとも１つの部位に組み込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号１及び２のいずれか一項に示す核酸配列を含む、請求項１１及び１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｇＲＮＡが配列番号１に示す核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｇＲＮＡが配列番号２に示す核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥トランスジェニック動物。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのトランスジェニック動物が、少なくとも２つの異なるレポーター遺伝子を含み、各レポーター遺伝子が、性染色体Ｚ又はＷの一方の少なくとも１つの遺伝子座に組み込まれている、請求項１９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２１】
前記レポーター遺伝子が、少なくとも１つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項１９及び請求項２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２２】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項２１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
前記少なくとも１羽のトランスジェニック鳥動物が雌であり、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌染色体Ｚの少なくとも１つの位置に組み込まれている、請求項１９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２４】
前記少なくとも１羽のトランスジェニック鳥動物が雌であり、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌染色体Ｗの少なくとも１つの位置に組み込まれている、請求項１９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、少なくとも１つのＰＥＮを使用して前記トランスジェニック動物の前記性染色体に組み込まれている、請求項１９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２６】
前記ＰＥＮが、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステムである、請求項２５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって媒介されるＨＤＲによる前記トランスジェニック鳥動物の前記性染色体に組み込まれている、請求項２６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列、並びに（ｂ）少なくとも１つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を、前記鳥動物の少なくとも１つの細胞又は前記鳥動物に導入される少なくとも１つの細胞に共トランスフェクトすることによって、前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物の性染色体に組み込まれる、請求項２７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２９】
前記第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、前記組み込み部位でのＨＤＲのために相同アームが隣接している、請求項２８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３０】
前記第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか１つに作動可能に連結される、請求項２８及び２９のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも１つの非コード領域に組み込まれている、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性染色体Ｗの遺伝子座１０２２８５９〜１０２４２１５の少なくとも１つの部位に組み込まれている、請求項３１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号１及び２のいずれか一項に示す核酸配列を含む、請求項２８及び３２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３４】
前記ｇＲＮＡが、配列番号１に示す核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項３３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３５】
前記ｇＲＮＡが、配列番号２に示す核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項３３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３６】
性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞。
【請求項３７】
前記細胞が鳥細胞である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記鳥細胞が、始原生殖細胞（ＰＧＣ）である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列、並びに（ｂ）少なくとも１つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を前記細胞に共トランスフェクトすることによって、前記細胞の性染色体に組み込まれる、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、前記組み込み部位でのＨＤＲのために相同アームが隣接している、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記ｇＲＮＡが配列番号１に示す核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項３９及び４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記ｇＲＮＡが配列番号２に示す核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項３９及び４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；並びに
（ｂ）少なくとも１つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列、
を含むキット。
【請求項４４】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、前記組み込み部位でのＨＤＲのために相同アームが隣接している、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか１つに作動可能に連結される、請求項４３及び４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも１つの非コード領域に組み込まれ、前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号１及び２のいずれか１つに示す核酸配列を含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
前記ｇＲＮＡが配列番号１に示す核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記ｇＲＮＡが配列番号２に示す核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項４６に記載のキット。
【請求項４９】
前記レポーター遺伝子が、少なくとも１つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５０】
性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む１羽のトランスジェニック鳥動物の作製に使用するための、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥対象における性別の決定及び特定の方法に関する。より具体的には、本発明は、鳥の未孵化卵内の胚の性別の決定及び選択のための非侵襲的な方法並びにトランスジェニック鳥動物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に開示される主題の背景として関連すると考えられる参考文献を以下に記載する：
ＷＯ  ２０１０／１０３１１１
ＷＯ  ２０１４／０２９６７０７
米国特許第６２４４２１４号
０６１２４４５６Ａ２
米国特許公開第２０１４０６９３３６号
ＷＯ１６００５５３９
ＷＯ  ９６／３９５０５
ＷＯ  ９７／４９８０６
Ｑｕａｎｓａｈ，Ｅ．，Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ａ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．，Ｔｅｌｕｇｕ，Ｂ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｆｒｅｙ，Ｊ．Ａ．，Ｕｒｗｉｎ，Ｎ．２０１４．Ｓｐｅｒｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＰｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ．ＢＡＲＣ  Ｐｏｓｔｅｒ  Ｄａｙ．
Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．，Ｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，＆  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．（２０１２）．Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６），８１６−８２１．
Ｃｏｎｇ，Ｌ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１５）．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，１９７−２１７。
【０００３】
上記参考文献の謝辞は、本明細書では、これらが多少なりとも本開示の主題の特許性に関連するという意味として推察されるものではない。
【０００４】
（発明の背景）
食品業界では、雛は、窒息又はすりつぶしにより数十億が日常的に処分されている。雄は卵を産むのに有用ではないので、処分されるか又は食肉用に飼育され、弱いか又は不健康な雌も処分されている。したがって、孵化前に卵内での、又は胚の性別決定の方法は、倫理的及び経済的配慮の両方から非常に望まれている。
【０００５】
具体的には、家禽類の受精卵を視覚的に特定することにより、孵化費用を（未受精卵の孵化の防止により）節約し、受精卵と共に、これらの混入し易い未受精卵のインキュベーションの継続に関わるバイオセキュリティリスクを下げるために未受精卵の除去が可能になることが重要である。
【０００６】
未孵化卵内の胚の初期段階で卵の受精を視覚的に特定することは、外側から光源をあてることを伴い、初期胚の段階では困難で、事実上不可能であり得る。さらに大きな課題は、胚の性別を特定することであり、現在は、繁殖性があると思われる未孵化卵における雄と雌の識別に利用できる方法はない。しかしながら、初期胚の段階での受精の特定及び家禽の性別決定は、鳥類の飼育、科学研究、及び保全に不可欠である。形態学的特徴による若鳥の性別決定は、ほとんどの種にとって非常に困難である。性別は、個々のベント雌雄鑑別によって決定することができ、それは、雛から糞を手でつかみだすことを伴い、雛の肛門を少し開け、雛が小さい「隆起」を有しているかどうかを調べることができると、その鶏は雄であることを示す。しかしながら、この方法は、訓練を受けた人が手作業で行う面倒な作業と共に、鳥の傷害及び性別決定の間違いのリスクが高い。
【０００７】
ベント雌雄鑑別及び雛の雌雄鑑別は、通常、雛雌雄鑑別士又は鶏雌雄鑑別士と呼ばれる訓練を受けた人が鶏の性別と他の孵化を区別する方法である。鶏の雌雄鑑別は、性別グループに分けるための性別と、異なるプログラムに入れるための性別の違いを知っている必要がある大規模な商業孵化場で主に行われており、これにより、一方のグループは成長させ、他方のグループは商用ニーズを満たしていない性別であるために処分することを含むことができる（例として、産卵の商用品種の卵から孵化した雄。この雄は、食肉生産量が良好ではなく、卵を産まないので、雌雄鑑別後に処分される。雌雄鑑別後、関係する性別は、雄又は雌の目的を果たすためにそのコースを継続するが、他の性又はそのほとんどは、卵生産とは無関係であるので、孵化後数日以内に処分される）。
【０００８】
卵を生産する農場では、雄は不要であり、不要な性別の雛は、ブリーダーにかかる費用を削減するためにほとんどすぐに殺される。雛はコンベアベルトに置かれ、そこで雛雌雄鑑別士が、雄を取り除き、それらをシュートに投げ入れ、そこで、通常、雄は肉挽き器で生きたまますりつぶされる。
【０００９】
孵化前の卵の受精及び卵内の胚の性別の特定並びに決定は、卵の状態で未受精卵及び胚の不要な種類の除去を可能にし、ひいては、（大気汚染及びエネルギー消費量と共に、エネルギー及び効率費用を含む）インキュベーション費用を大幅に削減する。加えて、雛を苦しめなくなり、処分からの汚染が防止される。自動化された雌雄鑑別装置は、さらに鶏雌雄鑑別士の必要性を排除することによって卵の生産費用を削減し、早い段階でそのプロセスから卵の５０％が減るので必要な孵化場のサイズを低減し、ひいては、これらの卵を孵化させる費用、並びにそれ以降の任意の精巧な殺傷手段の必要性が低減される。
【００１０】
繁殖、産卵、又は食肉生産が目的の全ての商業的な鳥の種類において、受精及び胚の性別を決定する必要がある。省エネ、バイオセキュリティリスク低減、ゴミ処理、雌雄鑑別の人件費及び雌雄鑑別の間違い、処分費用及び廃棄、並びに動物の福祉において大きな経済的利益がある。
【００１１】
ＷＯ  ２０１０／１０３１１１は、とりわけ、胚上の性別特異的抗原と一致するように特別に設計された標識抗体を卵に導入する一連の工程を含む侵襲的方法について記載している。
【００１２】
ＷＯ  ２０１４／０２９６７０７は、鳥の卵に注入されるワクチンの定量化又は接種の効率を評価するためのバイオマーカーとして機能するように設計された輝度組成物について記載している。
【００１３】
性別決定については、本開示では記載も、示唆もしない。卵内注入装置及び検出方法は、米国特許第６２４４２１４号により開示された。
【００１４】
ＷＯ  ０６１２４４５６Ａ２は、鳥の卵からの胚性流体（例えば、尿膜腔液又は血液）の試料中のエストロゲン様ステロイド化合物の存在を決定することにより、鳥胚の卵内性別決定の侵襲的方法を開示している。化合物の存在を決定することは、蛍光顕微鏡を利用する競合イムノアッセイによって、該鳥の卵から得られた試料中の分析物を測定することで行われる。
【００１５】
分光法はまた、とりわけ、鳥胚の羽の色（孵化前）のスクリーニング及び羽の色に基づく鳥胚の性別の決定に基づく米国特許公開第２０１４０６９３３６号、又は入射光シグナルに対する殻特異的スペクトル反応を取得する装置を開示しているＷＯ１６００５５３９に記載されていた。
【００１６】
この問題のためのさらなる遺伝的手法は、鳥の染色体Ｚ及びＷ上に位置する２つの特定の遺伝子を検出するための、受精卵から得られるＤＮＡ試料のＤＮＡ配列決定（ＷＯ  ９６／３９５０５）、又は雌の染色体Ｗの特定の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む（ＷＯ  ９７／４９８０６）。これらの方法は侵襲的であり、したがって、安全戦略を提供しない。
【００１７】
クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ））／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、高い成功率で単純な構築物の設計を可能にする最先端の遺伝子編集システムである（Ｊ．Ｄｏｕｄｎａ，２０１２）。
【００１８】
Ｎｉｕら（２０１４）は、３つの標的遺伝子を改変するためにサル卵母細胞にガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓ９  ＲＮＡを注入し、Ｈｗａｎｇら（２０１３）は、２つの遺伝子座の変異体を得るために、ゼブラフィッシュ胚でｄｒｄ３及びｇｓｋ３ｂ遺伝子を改変した。Ｃｏｎｇ及びＺｈａｎｇ（２０１５）は、生細胞内で任意の遺伝子を編集するためにＣＲＩＳＰＲシステムを改変した。
【００１９】
Ｖｅｒｏｎ及び共同研究者（２０１５）は、鶏胚での体細胞の発現レベルがＰＡＸ７転写因子に対するＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡプラスミド（Ｎａｄｅｇｅら、２０１５）のエレクトロポレーションによって改変されることを実証し、Ｂａｉと共同研究者らは、ＰＰＡＲ−ｇ、ＡＴＰシンターゼのイプシロンサブユニット（ＡＴＰ５Ｅ）を編集した。
【００２０】
Ｑｕａｎｓａｈ、Ｅ．らは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムを用いて鶏における精子媒介遺伝子導入を開示した。特に、彼らは、ａＧＦＰプラスミドとリポフェクタミンＬＴＸＴＭ  ９ＬＰＸ）の組み合わせが、鶏精子の生存能力、可動性又は受精率に影響を及ぼさなかったことを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
そのため、鶏の孵化前の卵段階における性別特定のための効果的かつ非侵襲的な方法は、現在利用可能ではない。したがって、長い間、未孵化卵における胚の正確かつ安全な性の特定を可能にする方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の第一の態様は、鳥、又は未孵化卵、具体的には、受精した未孵化卵内の鳥胚の性別決定の方法に関する。いくつかの特定の実施形態において、本方法は、以下の工程を含むことができる：
最初に、工程（ａ）において、性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの位置又は場所（本明細書では遺伝子座とも呼ばれる）に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１羽のトランスジェニック鳥対象若しくは動物を提供又は取得する工程、
第２の工程（ｂ）で、トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも１個の受精卵を取得する工程、
次の工程（ｃ）は、少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されるか否かを卵において決定する工程を伴う。より具体的な実施形態において、少なくとも１つの検出可能なシグナルの検出は、該少なくとも１つのレポーター遺伝子の発現、それによる、鳥胚内の染色体Ｗ又は染色体Ｚの存在を示す。
【００２３】
第２の態様において、本発明は、その少なくとも１つの細胞において、性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの位置又は場所（本明細書では遺伝子座とも呼ばれる）に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥トランスジェニック動物に関する。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの位置又は遺伝子座に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞に関する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；並びに（ｂ）少なくとも１つの該レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列、
を含むキットを提供する。
【００２６】
本明細書に開示される主題をよりよく理解するため及びそれを実際に行うことができる方法を例示するために、添付図面を参照して、単なる非限定的な例としてこれから実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ−１Ｂ】ルシフェラーゼレポーター遺伝子シグナルは卵殻を貫通する。ルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスに、ルシフェリンを皮下注射した。その１０分後に、耳（図１Ａ）及び尾部（図１Ｂ）を切除し、未受精卵に組み込む。卵を、バイオスペース光子イメージャー（ｂｉｏ−ｓｐａｃｅ  ｐｈｏｔｏｎ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  ｓｐａｃｅ  ｌａｂ，ＵＳＡ））を使用して画像化した。
【図２Ａ−２Ｂ】ルシフェラーゼレポーター遺伝子シグナルは受精卵で形成され、卵殻を貫通する。ルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスから切除した耳（図２Ａ）及び尾部（図２Ｂ）を、１０日齢の鶏胚を有する受精卵に組み込んだ。その後、生物発光を誘導するためにルシフェリンを注入する。その１０分後に、バイオスペース光子イメージャー（Ｂｉｏ  ｓｐａｃｅ  ｌａｂ，ＵＳＡ）を使用して画像を取得した。
【図３Ａ−３Ｂ】ＧＦＰレポーター遺伝子シグナルは卵殻を通して検出されない。ＧＦＰ発現トランスジェニックマウスからの尾部を、鶏胚（１０日）に組み込むか、又は殻の外側に配置した。卵の殻の外側に配置した尾部からのみＧＦＰ蛍光が観察できた（図３Ａ）が、卵の中に配置した場合は、シグナルは検出されなかった（図３Ｂ）。その５分後に、Ｍａｅｓｔｒｏ  ２．２  Ｉｍａｇｅｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社、米国）を用いて画像を取得した。
【図４】雌の鳥胚の検出。ルシフェラーゼレポーター遺伝子（星）は、雌のトランスジェニック鶏（ｈｅｎ）の染色体Ｗに組み込まれている。染色体Ｗ及びＺを保有する雌の卵のみが、レポーター遺伝子、具体的には、ルシフェラーゼシグナルを提供する。
【図５】雄の鳥胚の検出。ルシフェラーゼレポーター遺伝子（星）は、雌のトランスジェニック鶏（ｈｅｎ）の染色体Ｚに組み込まれている。雄の胚は、ルシフェラーゼシグナルを介して検出され、雌は外来ＤＮＡを含まない。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
産卵又は食肉用に育てるのに有用ではないので、毎日、数十億の雄の雛が窒息又はすりつぶしにより処分されている。孵化前の胚の性別を決定する能力は、倫理的にも、経済的にも非常に重要である。鶏において、性染色体の遺伝的構成は、雄についてはＺＺで、雌についてはＺＷである。つまり、雌の性別を決定するのは染色体Ｗである。これは、雄の性別を決定するのが父からのＹであるヒトとは異なる。
【００２９】
本発明は、トランスジェニック鳥対象の性特異的染色体に組み込まれたレポーター遺伝子を使用して、性別決定の非侵襲的かつ効率的な方法を提供する。未孵化卵の胚におけるこのレポーター遺伝子の発現は、明確かつ正確に該胚の性別を特定する。
【００３０】
したがって、本発明の第一の態様は、性別決定の方法、必要に応じて、未孵化卵、具体的には、受精した未孵化卵内の鳥、又は鳥胚の選択の方法に関する。いくつかの特定の実施形態において、本方法は、以下の工程を含むことができる：
最初に、工程（ａ）において、性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの位置又は場所に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１羽のトランスジェニック鳥対象若しくは動物を提供又は取得する工程、
第２の工程（ｂ）で、トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも１個の受精卵を取得する工程、
次の工程（ｃ）は、少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されるか否かを卵において決定する工程を伴う。より具体的な実施形態において、少なくとも１つの検出可能なシグナルの検出は、少なくとも１つのレポーター遺伝子の発現、それによる、鳥胚内の染色体Ｗ又は染色体Ｚの存在を示す。したがって、レポーター遺伝子が雌トランスジェニック鳥の染色体Ｚに組み込まれた場合には、検査卵における検出可能なシグナルの特定は、その胚がその中に組み込まれたレポーター遺伝子を有する母系の染色体Ｚを有することを示し、それにより、その胚は雄として特定される。或いは、レポーター遺伝子が雌トランスジェニック鳥の染色体Ｗに組み込まれた場合には、検査卵における検出可能なシグナルの特定は、その胚が母系の染色体Ｗを保有し、したがって、雌として決定されることによってその性別決定を提供することを示す。
【００３１】
本明細書において詳細に後述するように、本発明によって提供されるトランスジェニック鳥は、雌又は雄のいずれかであり得ることを理解されたい。より具体的な実施形態において、トランスジェニック鳥対象が雌である場合、本発明の方法によって特定された卵は、本発明によって提供される雌のトランスジェニック鳥が産んだものである。より具体的な実施形態において、トランスジェニック雌は、トランスジェニック雄又は野生型鳥雄のいずれかによって受精し得る。さらに、受精は、トランスジェニック又は野生型の鳥雄から得られた精子との交配によって、又はトランスジェニック鳥雌への人工授精のいずれかによって起こり得る。さらに他の実施形態において、トランスジェニック鳥が雄である場合、本発明の方法によって特定される卵は、野生型又は本発明によって提供されるトランスジェニック雄と交配させたトランスジェニック雌のいずれかが産むことができるか、又はそれらの任意の細胞、具体的には、その性染色体に組み込まれた本発明の外因性レポーター遺伝子を含む精子細胞によって人工授精することができる。
【００３２】
したがって、本発明は、未孵化受精卵内の鳥胚の性別を検出する方法を提供する。本発明の方法は、鳥胚の任意の胚段階の未孵化卵に適用することができることを理解されたい。
【００３３】
本明細書で使用する「鳥胚の胚発生段階又は工程」は、胚ディスクが胚盤葉段階にあり、分割キャビティが暗いリング形状をとる１日目の段階、第一の溝が胚盤葉の中央に現れ、卵黄膜が現れる２日目の段階、血液循環が始まり、頭及び胴体を特定することができ、脳及び心臓が形成されて、鼓動が始まる３日目の段階、羊膜腔が胚を取り囲むように成長し、尿膜小胞が現れる４日目の段階、胚がＣ形状を取り、手足が伸びる５日目の段階、上下の手足の指が明確になる６日目の段階、首が明らかに頭部と身体を分離し、くちばしが形成され、脳が徐々に頭部領域に入る７日目の段階、眼の色素沈着が容易に目に見え、翼及び脚が区別され、外耳道が開口している８日目の段階、鉤爪が現れ、最初の羽包が出芽する９日目の段階、鼻孔が存在し、まぶたが成長し、卵歯が現れる１０日目の段階、眼瞼開口部が楕円形状を有し、胚が雛の側面を有する１１日目の段階、羽包が外耳道を囲み、上まぶたを覆うが、下まぶたは角膜の大部分を覆う１２日目の段階、尿膜が漿尿膜になり、鉤爪及び脚の大きさが明らかになる１３日目の段階、全身が急速に成長し、卵黄縮小が加速し、卵白が徐々に消える１４〜１６日目の段階、腎臓系が尿酸を生成し、くちばしが気室の方に向き、卵白が完全に吸収される１７日目の段階、卵黄が内部移行し、羊水の量が減る１８日目の段階、卵黄吸収が加速し、くちばしが内卵殻膜を貫通する準備ができている１９日目の段階、卵黄が完全に再吸収され、臍が閉じられ、雛が内卵殻膜を貫通し、気室で呼吸し、孵化する準備ができている２０日目の段階、雛が卵歯によって円形に殻を刺し通し、１２〜１８時間で殻から自身を出し、自身を乾燥させる２１日目の段階を指すことに留意されたい。
【００３４】
より具体的には、本発明の方法は、胚の発達過程の全ての段階で、卵の中の卵内の鳥胚の性別を決定する際に適用することができる。より具体的には、１日目から、２日目から、３日目から、４日目から、５日目から、６日目から、７日目から、８日目から、９日目から、１０日目から、１１日目から、１２日目から、１３日目から、１４日目から、１５日目から、１６日目から、１７日目から、１８日目から、１９日目から、２０日目から及び２１日目から適用できる。より具体的には、本発明の方法は、具体的には、１〜１０日、より具体的には、１〜５日に胚の性別の早期検出に適用することができる。
【００３５】
上述したように、本発明の方法は、受精した未孵化卵に適用することができる。用語「受精卵」は、本明細書以下では、雌鶏が産む卵を指し、その雌鶏は２週間以内に雄鶏と交尾すると、雄の精子が雌卵管漏斗に堆積し、卵巣からの卵子の放出の際に受精事象が生じることが可能になる。本明細書で使用する「未孵化卵」は、構造的に一体化（壊れていない）殻内に胚（本明細書では受精卵とも呼ばれる）を含有する卵に関する。
【００３６】
本発明の方法は、検査卵に存在するトランスジェニック鳥の雌又は雄の特定の遺伝子座に組み込まれたレポーター遺伝子によって形成された検出可能なシグナルの決定に基づいている。
【００３７】
本明細書で用いる「染色体への外来又は外因性ＤＮＡ／遺伝子の組み込み」は、本明細書以下では、生物の染色体のヌクレオチド配列の永久的な改変を指す。この改変はさらに、細胞分裂中に受け継がれ、胚細胞株で生じる場合には、子孫にも伝達される。この場合、組み込まれたレポーター遺伝子は、未孵化卵内の胚に受け継がれ得る。本明細書で使用する用語「外因性」とは、例えば、特別に操作されたベクター、ウイルス又は任意の他のビヒクルでの形質転換又はトランスフェクションによって生物に導入された生物の外部から派生することを指す。特定の実施形態による組み込まれた外因性遺伝子は、レポーター遺伝子であり得る。用語「レポーター遺伝子」は、発現を様々な公知のアッセイで検出することができ、検出されたシグナルのレベルが該レポーターの存在を示すポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
【００３８】
上述のように、外因性レポーター遺伝子は、鳥性染色体Ｚ又はＷに組み込まれ得る。本明細書で使用する鳥の「性染色体Ｚ又はＷ」は、雄が同型配偶子の性（ＺＺ）であり、雌が異型配偶子の性（ＺＷ）である鶏の子孫の性別を決定する染色体システムを指す。卵子の染色体Ｗの存在は、子孫の性別を決定するが、染色体Ｚは、より大きな、より多くの遺伝子を有することが知られている。
【００３９】
本発明の方法は、レポーター遺伝子の存在、それによる特定の性染色体の存在を示し、反映する検出可能なシグナルの検出に基づいている。「検出可能なシグナル」は、本明細書以下では、観察又は計器のいずれかによって知覚可能である変化を指す。限定することなく、シグナルは、試薬の存在下で、直接又は唯一検出することができる。いくつかの実施形態において、検出可能な応答は、化学発光基を含むが、これらに限定されない光シグナルである。
【００４０】
いくつかの特定の実施形態において、本発明の方法によって提供される少なくとも１羽のトランスジェニック鳥対象は、少なくとも２つの異なるレポーター遺伝子を含むことができ、各レポーター遺伝子は、性染色体Ｚ若しくはＷの一方の少なくとも１つの位置又は場所に組み込まれ得ることを理解されたい。少なくとも２つの異なるレポーター遺伝子の場合には、性染色体の各々は、別々に標識することができる。形成された検出可能なシグナルの評価は、試験した胚の性別を示すことができる。
【００４１】
さらにいくつかの特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥内に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも１つの生物発光レポーター遺伝子であり得る。そのため、いくつかの実施形態において、発現するポリペプチドは生物発光タンパク質であり、したがって、アッセイは生物発光反応から放出される光のレベルを測定する。用語「生物発光」は、タンパク質などの生体分子による光の放出を指す。本明細書以下で詳細に説明するように、生物発光は、酸素分子、オキシゲナーゼ、及び基質ルシフェリンに作用するルシフェラーゼを含む。
【００４２】
より具体的な実施形態において、該レポーター遺伝子はルシフェラーゼであり得る。用語「ルシフェラーゼ」は、本明細書以下で、生物発光（光子放出）を生成する酸化酵素のクラスを指す。放出された光子は、ルミノメーター又は改変光学顕微鏡などの感光性装置によって検出することができる。ルシフェラーゼは、主に、レポーター遺伝子として使用するための様々な生物において遺伝子工学により生成することができる。ルシフェラーゼは、細菌、藻類、真菌、クラゲ、昆虫、エビ、及びイカの中に天然に存在する。細菌において、発光反応を担う遺伝子（ｌｕｘオペロン中にコードされるｌｕｘ遺伝子）が単離され、４９０ｎｍの最大強度を有する青緑色光を発するバイオレポーターの構築に広く使用されている。ｌｕｘの３つの変異体が利用可能であり、１つは３０℃未満で、別のものは３７℃未満、及び３つ目は４５℃未満で機能する。ｌｕｘ遺伝子システムは、５つの遺伝子、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、及びｌｕｘＥからなる。使用されるこれらの遺伝子の組み合わせに依存して、生物発光バイオレポーターのいくつかの異なる種類を構築することができる。ルシフェラーゼタンパク質は、ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢの遺伝子産物によって形成されたヘテロ二量体である。ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、及びｌｕｘＥの遺伝子産物はそれぞれ、生物発光反応のためのアルデヒド基質を生成するために、単一複合体中で一緒に機能するレダクターゼ、トランスフェラーゼ、及びシンターゼをコードする。ｌｕｘＡＢバイオレポーターは、光シグナルを生成することができるｌｕｘＡ及びｌｕｘＢ遺伝子のみを含有する。しかしながら、発光反応を完全に完了するためには、基質（長鎖アルデヒド）を細胞に供給しなければならない。
【００４３】
一方、ｌｕｘＣＤＡＢＥバイオレポーターは、ｌｕｘカセットの全５つの遺伝子を含有し、それにより、基質の外部からの追加も、外部光源による励起も必要としない完全に独立した光生成システムを可能にする。リアルタイムに及びオンラインでバイオアッセイを繰り返し実行する能力と共に、それらの迅速性及び使いやすさが、ｌｕｘＣＤＡＢＥのバイオレポーターを非常に魅力的にさせている。そのため、ある実施形態において、本発明の方法は、レポーター遺伝子としてｌｕｘＣＤＡＢＥのバイオレポーターを使用することができる。
【００４４】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法は、レポーター遺伝子としてｌｕｃ遺伝子を使用することができる。ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ遺伝子）は、５５０〜５７５ｎｍの範囲の可視光を生成する反応を触媒する。５９５ｎｍに近いピークで光を生成するコメツキムシルシフェラーゼも利用可能である。両方のルシフェラーゼは、光反応を発生させるために、外因性基質（ルシフェリン）の添加を必要とする。
【００４５】
当技術分野で公知の任意の供給源の、本明細書に記載のルシフェラーゼのいずれも、本発明の方法及びキットに適用することができることを理解されたい。
【００４６】
さらにいくつかの特定の実施形態において、本発明の方法によって使用することができるルシフェラーゼは、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼであり得る。さらにより具体的な実施形態において、本発明により使用されるルシフェラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＧ５４０９５．１によって開示されるアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ０１５９９３．１によって開示される核酸配列によってコードされるルシフェラーゼであり得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明の方法及びキットで使用されるルシフェラーゼは、配列番号２２によって示される配列を含む核酸配列によってコードされ得る。さらにいくつかのさらなる実施形態において、かかるルシフェラーゼは、配列番号２３に示すアミノ酸配列、又はその任意の相同体、変異体若しくは誘導体を含み得る。
【００４７】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明により使用されるルシフェラーゼは、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）ルシフェラーゼであり得る。いくつかの特定の実施形態において、かかるルシフェラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２９７９５．１によって開示されるアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ１５０７７．１によって開示される核酸配列によってコードされるルシフェラーゼであり得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明の方法及びキットで使用されるルシフェラーゼは、配列番号２０によって示される配列を含む核酸配列によってコードされ得る。さらにいくつかのさらなる実施形態において、かかるルシフェラーゼは、配列番号２１によって示すアミノ酸配列、又はその任意の相同体、変異体若しくは誘導体を含むことができる。
【００４８】
上述したように、本発明の方法で使用されるルシフェラーゼは、さらなる試薬、具体的には、基質を補う必要があり得る。
【００４９】
したがって、さらにいくつかのさらなる実施形態において、本方法はさらに、工程（ｂ）の該卵に、生物発光レポーター遺伝子と互換性のある基質及び酵素のうちの少なくとも一方を提供する工程を含むことができる。かかる基質又は酵素は、工程（c）で検出された検出可能なシグナルの形成に必要とされ得ることに留意されたい。より具体的には、本発明の方法は、例えば、注入により、ルシフェラーゼの基質を工程（ｂ）の卵に提供する工程を含むことができる。いくつかの特定の実施形態において、かかる基質はルシフェリンであり得る。本明細書で使用するルシフェリンは、生物発光を生成する生物において見出される発光化合物の総称である。ルシフェリンは、典型的には、酵素触媒酸化を受け、得られた励起状態の中間体は、その基底状態に減衰する際に光を発する。さらにいくつかのさらなる実施形態において、該検出可能なシグナルの形成に必須の要素である基質ルシフェリンは、工程（c）で実行されるとおり、具体的には、該シグナルの測定及び決定の前に、該卵に注入される。いくつかの実施形態において、該基質は、該鳥対象、具体的には動物の胚発生の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１日目に注入することができる。さらにいくつかのさらなる実施形態において、検出可能なシグナルの形成に必要な基質及び／又はさらなる酵素は、該レポーター遺伝子と作動可能に連結された該基質及び／又は酵素をコードする核酸配列として受精卵に提供することができる。かかる特定の実施形態は、例えば、上記のようなｌｕｘＣＤＡＢＥバイオレポーターの使用を指すことができる。ＬｕｘＣＤＡＢＥシステムは、ｌｕｘカセットの５つの遺伝子を含有し、それにより基質の外部からの追加も、外部光源による励起も必要としない完全に独立した光生成システムを可能にする。
【００５０】
いくつかの実施形態において、検出可能なシグナル、具体的には、生物発光シグナルは、適切な生物発光手段を用いて検出することができることに留意されたい。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子によって形成された検出シグナルは、ルミノメーター又は改良された光学顕微鏡又は電荷結合素子（ＣＣＤ）、高感度光子検出器などの光感応装置によって検出することができる。
【００５１】
さらに別の実施形態において、本発明の方法によって提供される少なくとも１羽のトランスジェニック鳥対象又は動物は、雌の鳥対象又は動物であり得る。より具体的な実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌の染色体Ｚの少なくとも１つの位置に組み込まれた場合、検出可能なシグナルの検出は、未孵化卵における胚が雄であることを示す。
【００５２】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法によって提供される少なくとも１羽のトランスジェニック鳥対象又は動物は、雌の鳥対象又は動物であり得る。いくつかの具体的な実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌の染色体Ｗの少なくとも１つの位置に組み込まれた場合、検出可能なシグナルの検出は、未孵化卵における胚が雌であることを示す。
【００５３】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法によって提供されるトランスジェニック動物は、その染色体Ｚに組み込まれたレポーター遺伝子を有する雄の対象であり得る。このような場合には、かかるトランスジェニック雄又はそれらの任意の精子によって受精された卵で決定される検出可能なシグナルは、胚がトランスジェニックレポーター遺伝子を含む父系染色体Ｚを保有し、それゆえ雄であることを示す。さらなる実施形態において、両方とも、その染色体Ｚに組み込まれた本発明のレポーター遺伝子を保有するトランスジェニック雄鳥によって受精され、トランスジェニック雌鳥が産んだ卵における検出可能なシグナルの検出は、強いシグナルの場合に、胚がその雌及び雄の染色体Ｚに組み込まれたレポーター遺伝子の２コピーを保有することを示すことができる。より弱い強度のシグナルの場合、卵は雌と決定することができる。
【００５４】
本明細書上記の本発明の方法は、トランスジェニック鳥動物の提供を伴う。トランスジェニック鳥動物の作製は、特異的ヌクレアーゼを使用することができる遺伝子工学的手法を使用する必要がある。
【００５５】
したがって、さらにより具体的な実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのプログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）を用いて、本発明の方法によって提供されるトランスジェニック鳥対象又は動物の性染色体に組み込むことができる。本明細書で使用する用語「プログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）」は、二本鎖ＤＮＡ損傷のＤＮＡ修復に関与する天然に存在するヌクレアーゼに由来し、特異的ＤＮＡ配列を切断して、直接ゲノム編集を可能にする合成酵素を指す。
【００５６】
クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）タイプＩＩシステムは、ゲノム工学のために改変された細菌の免疫システムである。しかしながら、全てのゲノム標的に特異的なヌクレアーゼペアの設計及び作製を必要するカスタマイズ可能なＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼの使用に依存するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のような他のゲノム遺伝子工学的手法も、本明細書で利用可能であり得ることを理解されたい。
【００５７】
本明細書で使用する場合、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られているＣＲＩＳＰＲアレイは、通常、特定の細菌種に特異的である最近説明されたＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲアレイは、大腸菌で最初に認識された異なるクラスの散在型短い配列のリピート（ＳＳＲ）である。その後の数年間に、同様のＣＲＩＳＰＲアレイが、結核菌、ハロフェラックス・メディテラネイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、サーモトガ・マリティマ及び他の細菌並びに古細菌で見出された。本発明は、既知のＣＲＩＳＰＲシステム、特に、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲシステムのいずれかの使用を企図することを理解されたい。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、外来ＤＮＡ又はＲＮＡを標的化することによって、ファージ攻撃及び望ましくないプラスミド複製から保護するために原核生物で進化してきた。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、リピート間に存在するスペーサーと呼ばれる短い相同なＤＮＡ配列に基づいてＤＮＡ分子を標的化する。これらのスペーサーは、プロトスペーサーと呼ばれる外来ＤＮＡ内の一致する（及び／又は相補的）配列にＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を導き、プロトスペーサーはその後切断される。スペーサーは、合理的に任意のＤＮＡ配列を標的化するように設計することができる。さらに、この認識要素は、任意の所望の標的を認識し、標的化するように別々に設計することができる。当業者によって認識されるように、ＣＲＩＳＰＲシステムに関して、天然ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構造は、一般に「リピート」と呼ばれるいくつかの短い反復配列を含む。リピートは、クラスター内で発生し、通常、「スペーサー」と呼ばれる独特の介在配列によって一定の間隔を置いて配置されている。典型的には、ＣＲＩＳＰＲリピートは、長さが約２４〜４７塩基対（ｂｐ）で変化し、部分的にパリンドロームである。スペーサーは、２つのリピートの間に位置しており、典型的には、各スペーサーは、長さが約２０ｂｐ又はそれ未満から７２ｂｐ又はそれ以上である独特な配列を有する。このように、特定の実施形態において、本発明の方法及びキットの少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする配列に使用されるＣＲＩＳＰＲスペーサーは、それぞれ１０〜７５ヌクレオチド（ｎｔ）を含むことができる。より具体的には、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５又はそれ以上である。いくつかの特定の実施形態において、該スペーサーは、約２０〜２５ヌクレオチド、より具体的には約２０核酸塩基を含む。
【００５８】
少なくとも１つのリピート及び少なくとも１つのスペーサーに加えて、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、リーダー配列、及び必要に応じて少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を含む。リーダー配列は、典型的には、最初のリピートの５’末端に直接隣接する最大５５０塩基対のＡＴリッチな配列である。
【００５９】
より具体的な実施形態において、ＰＥＮは、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）タイプＩＩシステムであり得る。
【００６０】
より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの３つの主要な種類：タイプＩ、タイプＩＩ及びタイプＩＩＩが示される。
【００６１】
タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、「ＨＮＨ」型システム（連鎖球菌；髄膜炎菌血清型Ａ  ｓｔｒ．Ｚ２４９１、又はＣＡＳＳ４についてＮｍｅｎｉサブタイプとしても知られている）を含み、その中の、単一の非常に大きなタンパク質であるＣａｓ９は、広範に分布するＣａｓ１及びＣａｓ２に加えて、ｃｒＲＮＡを作製し、標的ＤＮＡを切断するのに十分であると思われる。Ｃａｓ９は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含有し、アミノ末端近くにＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びタンパク質の中央にＨＮＨ（又はＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインがあるが、これらのドメインの機能はまだ解明されていない。しかしながら、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは制限酵素に豊富で、標的切断に関与するエンドヌクレアーゼ活性を有している。
【００６２】
タイプＩＩシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡとプレｃｒＲＮＡ中のリピートの一部との間の二本鎖形成を伴う独特な機構を介してプレｃｒＲＮＡを切断する。続いて、プレｃｒＲＮＡプロセシング経路の最初の切断は、このリピート領域で生じる。さらに、タイプＩＩシステムはｃａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２  ｃｓｎ２、及びｃａｓ４遺伝子の少なくとも１つを含むことに留意されたい。任意のタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、具体的には、タイプＩＩ−Ａ又はタイプＩＩ−Ｂのいずれか１つを本発明で適用することができることを理解されたい。
【００６３】
したがって、さらにいくつかのさらなる及び代替的な実施形態において、本発明の方法及びキットで使用される少なくとも１つのｃａｓ遺伝子は、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステム（タイプＩＩ−Ａ又はタイプＩＩ−Ｂのいずれか）の少なくとも１つのｃａｓ遺伝子であり得る。より特定の実施形態において、本発明の方法及びキットで使用されるタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子が、ｃａｓ９遺伝子であり得る。かかるシステムはさらに、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｓｎ２及びｃａｓ４遺伝子の少なくとも１つを含むことができることを理解されたい。
【００６４】
Ｃａｓ９による二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断は、「タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」免疫系の特徴である。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ９は、配列特異的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断のための標的部位を特定するために、ＲＮＡ：ＤＮＡ相補性を使用するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、特定の標的配列、例えば、鳥性染色体Ｗ及びＺ内の特定の標的にレポーター遺伝子を組み込むＨＤＲに必要な二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす。標的ＤＮＡ配列は、短いパリンドロームリピートによって分けられた一連の約３０〜４０塩基対のスペーサーであるＣＲＩＳＰＲアレイによって特定される。アレイは、プレｃｒＲＮＡとして転写され、プロトスペーサーとしても知られている相補的ＤＮＡ配列を標的化するためのＣａｓタンパク質複合体と結合するより短いｃｒＲＮＡにプロセシングされる。これらのプロトスペーサー標的はまた、標的認識に必要とされるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られている追加の隣接配列を有していなければならない。結合後、Ｃａｓタンパク質複合体は、標的の両方の鎖を切断するＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し、その後、ＤＮＡ分解がエキソヌクレアーゼ活性を介して生じる。
【００６５】
本明細書で使用するＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステムは、２つの必須成分：「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含める必要がある。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９に結合するのに必要な「足場」配列及び改変されるゲノム標的を定義する約２０ヌクレオチド長の「スペーサー」又は「標的化」配列から構成される短い合成ＲＮＡである。そのため、ｇＲＮＡに存在する標的化配列を単に変更することによってＣａｓ９のゲノム標的を変更することができる。本明細書で使用するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的特異性と足場／結合能の両方を提供する、内因性細菌ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合物を指す。「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれる。ＣＲＩＳＰＲはもともと、様々な細胞型及び生物において標的遺伝子を「ノックアウト」するために使用されたが、Ｃａｓ９酵素の改変によって、標的遺伝子を「ノックイン」し、標的遺伝子を選択的に活性化又は抑制し、特定のＤＮＡ領域を精製し、さらには蛍光顕微鏡を用いた生細胞のＤＮＡを画像化するようにＣＲＩＳＰＲの適用が拡張された。さらに、ｇＲＮＡの作製の容易さは、ＣＲＩＳＰＲを最もスケーラブルなゲノム編集技術の１つにさせ、最近はゲノムワイドスクリーニングに利用されている。
【００６６】
編集されるゲノム内の標的、具体的には、本発明のレポーター遺伝子が組み込まれる予定の性染色体Ｚ又はＷ内の特定の標的遺伝子座は、プロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ））のすぐ上流に存在すべきである。
【００６７】
ＰＡＭ配列は、標的結合に絶対的に必要であり、正確な配列はＣａｓ９の種（ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９の５’ＮＧＧ  ３’）に依存している。特定の実施形態において、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９は、本発明の方法及びキットで使用される。それにもかかわらず、任意の既知のＣａｓ９が適用できることを理解されたい。本開示において有用なＣａｓ９の非限定的な例としては、ＳｐＣａｓ９としても本明細書で示される化膿連鎖球菌（ＳＰ）、本明細書でＳａＣａｓ９としても示される黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、本明細書でＮｍＣａｓ９としても示される髄膜炎菌（ＮＭ）、本明細書でＳｔＣａｓ９としても示されるストレプトコッカス・サーモフィルス（ＳＴ）及び本明細書でＴｄＣａｓ９としても示されるトレポネーマ・デンティコラ（ＴＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの特定の実施形態において、ストレプトコッカス・ピオゲネスのＭ１  ＧＡＳのＣａｓ９、具体的には、タンパク質ｉｄ：ＡＡＫ３３９３６．１のＣａｓ９は、本発明の方法及びキットに適用することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２４に示す核酸配列によってコードされ得る。さらに特定の実施形態においては、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２５に示すアミノ酸配列、又は任意の誘導体、変異体、又はそれらの変異体を含むことができる。発現すると、Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ「足場」ドメインとＣａｓ９上の正電荷の表面に露出した溝との間の相互作用を介してリボタンパク質複合体を形成する。Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡ結合の際に、不活性の非ＤＮＡ結合立体構造から活性のあるＤＮＡ結合立体構造に分子をシフトする立体構造変化を受ける。重要なことに、ｇＲＮＡの「スペーサー」配列は、標的ＤＮＡと相互作用するために遊離状態のままである。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、ＰＡＭを有する任意のゲノム配列に結合するが、Ｃａｓ９が切断するかどうかは、ｇＲＮＡスペーサーが標的ＤＮＡと一致する程度によって決まる。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が推定ＤＮＡ標的に結合すると、ｇＲＮＡの標的化配列の３’末端の「シード」配列は、標的ＤＮＡにアニールし始める。シード配列及び標的ＤＮＡ配列が一致する場合は、ｇＲＮＡは、３’から５’方向に標的ＤＮＡにアニールし続ける。
【００６８】
十分な相同性がｇＲＮＡスペーサーと標的配列の間に存在する場合、Ｃａｓ９のみが標的を切断する。さらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能性エンドヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、標的結合の際に、標的ＤＮＡの反対の鎖を切断するようにヌクレアーゼドメインを配置する第２の立体構造変化を受ける。Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断の最終結果は、ＰＡＭ配列の約３〜４ヌクレオチド上流に生じる標的ＤＮＡ内の二本鎖切断（ＤＳＢ）である。
【００６９】
得られたＤＳＢは、その後、効率的であるが、エラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路及び効率的ではないが、高忠実度の相同性指向性修復（ＨＤＲ）経路の２つの一般的な修復経路のうちの１つによって修復することができる。いくつかの実施形態において、性染色体Ｗ又はＺ内の特定の標的遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を特異的に組み込む挿入は、Ｃａｓ９によって引き起こされるＤＳＢの修復の結果である。いくつかの特定の実施形態において、本発明のレポーター遺伝子は、ＨＤＲによって標的遺伝子座に組み込まれるか、又はノックインされる。
【００７０】
本明細書で使用する用語「相同性指向性修復（ＨＤＲ）」は、二本鎖ＤＮＡの損傷を修復するための細胞内機構を指す。ＨＤＲの最も一般的な形態は相同組換えである。ＨＤＲ修復機構は、ほとんどが細胞周期のＧ２及びＳ期の核にＤＮＡの相同部分が存在する場合に、細胞が唯一使用することができる。ホモログＤＮＡ断片が存在しない場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と呼ばれる別のプロセスが、代わりに生じ得る。ゲノム編集のためのプログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）方法は、特定の二本鎖ＤＮＡ切断後のＨＤＲ機構の細胞の活性化に基づいている。
【００７１】
前述したように、Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ及びＨＮＨの組み合わせ活性を介して二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす。エンドヌクレアーゼ活性に重要である各ヌクレアーゼドメイン内の正確なアミノ酸残基は、公知であり（Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９においてＨＮＨについてはＤ１０Ａ及びＲｕｖＣについてはＨ８４０Ａ）、唯一の活性触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変バージョン（「Ｃａｓ９ニッカーゼ」と呼ばれる）が作製されている。Ｃａｓ９ニッカーゼは、依然としてｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡに結合するが、ニッカーゼは、ＤＳＢの代わりに、ＤＮＡ鎖の一方のみを切断し、「ニック」、又は一本鎖切断をもたらすことができる。ＤＮＡニックは、鋳型として無傷の相補的ＤＮＡ鎖を用いてＨＤＲ（相同性指向性修復）によって急速に修復される。そのため、反対の鎖を標的にする２つのニッカーゼが、標的ＤＮＡ内でＤＳＢをもたらすのに必要とされる（しばしば「ダブルニック」又は「デュアルニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれる）。２つのオフターゲットニックは、ＤＳＢを引き起こすのに十分な近接内で生成されることはほとんどないので、この要件は標的特異性を劇的に高める。したがって、本発明はさらに、特異性を高め、オフターゲット効果を減少させるために二重ニック誘発性ＤＳＢをもたらすためのデュアルニッカーゼアプローチの使用を包含することを理解されたい。
【００７２】
したがって、特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ９（Ｃａｓ９）システムによって媒介される相同性指向性修復（ＨＤＲ）によってトランスジェニック鳥対象、具体的には動物の性染色体に組み込むことができる。
【００７３】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明のキットのｇＲＮＡは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及び少なくとも１つのトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。
【００７４】
いくつかの代替実施形態において、本発明のキットは、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。そのような核酸配列は、標的ゲノムＤＮＡ配列中の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的化し、したがって、これと同一である少なくとも１つのスペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含むことができる。核酸配列はさらに少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を含むことに留意されたい。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本開示に係るＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも１つのスペーサー及び少なくとも１つのリピートを含む。さらに別の実施形態において、本発明は、さらに、同一又は異なる標的を標的にすることができるいくつかの最終ｇＲＮＡ生成物にプロセシングすることができるプレｃｒＲＮＡを提供する選択を包含する。
【００７６】
さらにいくつかのより特定の実施形態において、本発明のｇＲＮＡに含まれるｃｒＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）配列であり得る。いくつかの具体的な実施形態において、標的ゲノムＤＮＡ配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ上流及びさらに上流に配置され得る。
【００７７】
本明細書で示されるように、本発明のキットのｇＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡに、少なくとも部分的に相補的であり得る。ある実施形態において、「相補性」は、それぞれ、ロック・アンド・キー原理に従う２つの構造の間の関係を指す。自然界では、相補性は、配列が互いに反平行に整列されている場合、配列中の各位置でのヌクレオチド塩基が相補的（例えば、ＡとＴ又はＵ、ＣとＧ）であるように２つのＤＮＡ又はＲＮＡ配列間で共有される特性であるので、ＤＮＡの複製及び転写の基本的な原理である。
【００７８】
上記に示したように、本発明のキットのｇＲＮＡによって標的化されるゲノムＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流に位置する。いくつかの実施形態において、このようなＰＡＭ配列は、核酸配列ＮＧＧの配列であり得る。
【００７９】
ある実施形態において、本発明によって言及されるＰＡＭ配列は、Ｎ、すなわち任意のヌクレオチド、具体的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）のいずれか１つを含むことができる。さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明に係るＰＡＭ配列は、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴ及び２つのグアニンから構成される。
【００８０】
一実施形態によれば、本発明のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つのスペーサー、及び必要に応じて、少なくとも１つのリピートを含むことができる。さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明のｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００又はそれ以上、具体的には、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれ以上のスペーサーを含むことができる。いくつかの実施形態において、各スペーサーは、２つのリピートの間に配置される。さらに、本発明のｇＲＮＡをコードする核酸配列のスペーサーは、同一又は異なるスペーサーのいずれかであり得ることを理解されたい。より多くの実施形態において、これらのスペーサーは、同一又は異なる標的ゲノムＤＮＡのいずれかを標的とし得る。さらにいくつかの他の実施形態において、そのようなスペーサーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００又はそれ以上の標的ゲノムＤＮＡ配列を標的とし得る。これらの標的配列は、単一遺伝子座、或いは、いくつかの標的遺伝子座に由来し得る。
【００８１】
本明細書で使用する用語「スペーサー」は、特定の配列を標的化するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲアレイの複数の短いダイレクトリピート（すなわち、ＣＲＩＳＰＲリピート）との間に配置される非反復スペーサー配列を指す。いくつかの特定の実施形態において、スペーサーは、約１５〜約３０ヌクレオチド、具体的には、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。より具体的には、約２０〜２５ヌクレオチドである。
【００８２】
本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによりコードされるガイドＲＮＡ又は標的化ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲスペーサーによりコードされる標的化ＲＮＡの配列は、本明細書で「プロトスペーサー」とも呼ばれる、鳥ゲノムＤＮＡ中の標的配列を指向する（すなわち、同一又は相補的であるセグメントを有する）要件によること以外は特に限定されるものではない。そのようなプロトスペーサーは、本発明の方法及びキットのｇＲＮＡをコードする核酸配列内に含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーによりコードされる標的化ＲＮＡに十分な相補性を有する核酸配列を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ｎｔのスペーサー（標的化）配列に続く１９〜３６ｎｔのリピート配列を含むか、又はそれらからなる。特定の非限定的な実施形態において、標的化スペーサーは、代表的なスペーサー配列が、本明細書に示されているゲノムＤＮＡ配列のいずれか１つを標的にするセグメントを含むか、又はそれからなることができる。
【００８４】
いくつかの特定の実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムのスペーサーは、標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードすることができることに留意されたい。「ｇＲＮＡ」又は「標的化ＲＮＡ」は、それをコードするＣＲＩＳＰＲシステムの一部から転写された場合に、標的ゲノムＤＮＡ中のＤＮＡ配列と同一（ＲＮＡの場合、ＴとＵを置換することを除いて）又は相補的（そのため、「標的」）であるＲＮＡ配列の少なくとも１つのセグメントを含むＲＮＡである。本開示のＣＲＩＳＰＲシステムは、必要に応じて、複数の標的化ＲＮＡをコードすることができ、標的化ＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ中の１以上の標的配列を指向することができる。
【００８５】
さらに、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列、並びに（ｂ）少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を、鳥対象、具体的には、動物の少なくとも１つの細胞、又は鳥対象、具体的には、動物に導入される少なくとも１つの細胞に共トランスフェクトすることによって、トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物の性染色体に組み込むことができる。
【００８６】
したがって、本発明の方法によって使用されるトランスジェニック鳥動物を作製するための少なくとも２つの核酸分子が提供されるべきである。
【００８７】
本明細書で使用する「核酸又は核酸分子」は、用語「ポリヌクレオチド（複数可）」と交換可能であり、一般に、非改変ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は改変ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせであり得る任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「核酸」は、限定することなく、１本鎖及び２本鎖の核酸を含む。本明細書で使用する用語「核酸（複数可）」はまた、１以上の改変塩基を含有する上記のＤＮＡ又はＲＮＡを含む。本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、２以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド、好ましくは３以上から構成される分子として定義される。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、ひいては、オリゴヌクレオチドの最終的な機能及び使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、約８〜約１，０００ヌクレオチド長であり得る。より具体的には、本発明のキットで使用されるオリゴヌクレオチド分子（複数可）は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００又はそれ以上の塩基長のいずれか１つを含むことができる。
【００８８】
核酸分子は、（ＤＮＡ及びＲＮＡなどの）天然に存在するヌクレオチド、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー型）、又は改変ヌクレオチド若しくはそれらの任意の組み合わせである単量体から構成され得る。本明細書において、この用語はまた、ｃＤＮＡ、すなわち逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の作用によりＲＮＡ鋳型から生成された相補的ＤＮＡ又はコピーＤＮＡを包含する。
【００８９】
これに関連して、「単離されたポリヌクレオチド」は、生物のゲノムから分離された核酸分子である。例えば、本発明の方法及びキットで使用されるレポーター遺伝子又はその任意の誘導体若しくはホモログ、並びに本発明の方法及びキットのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びｇＲＮＡをコードする配列をコードし、細胞のゲノムＤＮＡから分離されたＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子である。単離核酸分子の別の例として、生物のゲノム中に組み込まれていない化学合成核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。いくつかの実施形態において、本発明の方法及びキットによって使用される核酸配列、具体的には、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、或いは本発明のレポーター遺伝子をコードする配列を含む核酸配列は、ベクター内に構築して提供することができる。したがって、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物、及び必要に応じて、本発明の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、調節エレメント及び制御エレメント、翻訳シグナル、発現シグナル及び他のシグナルなどのさらなる追加の要素に関する。
【００９０】
本明細書で使用する用語「組換えＤＮＡ」、「組換え核酸配列」又は「組換え遺伝子」は、鳥染色体Ｚ及び／又はＷ内の特定の遺伝子座にＣａｓ９を標的化する本発明のｇＲＮＡと共に、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの１つ、具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タイプＩＩをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。さらなる別の実施形態において、本明細書で使用される組換えＤＮＡはさらに、本発明のレポーター遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸、具体的には、導入遺伝子を指す。
【００９１】
本明細書で言及する用語「遺伝子」又は「導入遺伝子」は、タンパク質生成物をコードする天然又は合成のいずれかの核酸を意味する。用語「核酸」は、天然及び／又は合成のヌクレオチド及びヌクレオシド、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、及びＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及びそれらの誘導体の直鎖、環状並びに連続的なアレイを意味することを意図する。
【００９２】
語句「作動可能に連結された」は、導入遺伝子の転写を可能にする方法での結合を意味することを意図する。用語「コードする」は、例えば、本発明の核酸が適切なベクター（例えば、発現ベクター）中のプロモーター及びエンハンサーエレメントなどの適切な制御配列に連結される場合、及びベクターが適切なシステム又は細胞に導入される場合に、本発明の核酸が、適切な発現系において所望のポリペプチド又は本発明のタンパク質のいずれかに転写及び翻訳され得ることを意味することが意図される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法及びキットによって提供され、使用される第１並びに第２の核酸配列の少なくとも１つは、ベクター内で構築され、ベクター内に含まれ得ることを理解されたい。本明細書で使用する「ベクター」又は「ビヒクル」は、宿主のゲノムへのＤＮＡ断片の組み込みを可能にするか、或いは、組み込まれない遺伝的要素の発現を可能にするプラスミド、ファージミド、ウイルス、組み込み可能なＤＮＡ断片、及び他のビヒクルなどのベクターを包含する。ベクターは、典型的には、所望の核酸配列を含有し、かつ適切な宿主細胞内で認識され、所望のスペーサーの翻訳に影響を及ぼす作動可能に連結された遺伝子制御エレメントを含有する自己複製ＤＮＡ又はＲＮＡ構築物である。一般的に、遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系又は真核生物プロモーター発現制御システムを含むことができる。そのようなシステムは、典型的には、ＲＮＡ発現レベルを上昇させる転写プロモーター、転写エンハンサーを含む。ベクターは、通常、宿主細胞から独立してベクターの複製を可能にする複製起点を含有する。さらなるいくつかの代替実施形態において、本発明で使用される発現ベクターは、鳥の性別特異的染色体Ｗ及び／又はＺへの本発明の所望のレポーター遺伝子の組み込みに必要な要素を含むことができる。
【００９４】
したがって、用語「制御及び調節エレメント」は、プロモーター、ターミネーター及び他の発現制御要素を含む。かかる調節エレメントは、Ｇｏｅｄｄｅｌ；［Ｇｏｅｄｄｅｌら，遺伝子発現技術：酵素学の方法（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）］に記載されている。例えば、作動可能に連結される場合に、ＤＮＡ配列の発現を制御する様々な発現制御配列のいずれかは、本発明の方法を使用して任意の所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させるために、これらのベクターにおいて使用することができる。
【００９５】
ベクターはさらに、ベクター含有細胞の選択に適切な制限部位、抗生物質耐性又は他のマーカーを含むことができる。プラスミドは、最も一般的に用いられるベクターの形態であるが、同等の機能を果たしており、当技術分野で公知であるか、又は公知になるベクターの他の形態が本明細書で使用するのに適している。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｏｕｗｅｌｓら，クローニングベクター：実験室マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（１９８５及び補遺），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．；並びにＲｏｄｒｉｑｕｅｚら（編）ベクター：分子クローニングベクター及びその使用の調査（Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ（１９８８）を参照されたい。
【００９６】
本発明の方法で使用されるトランスジェニック鳥動物を作製するために、その性染色体Ｚ又はＷ内の特定の遺伝子座に組み込まれたレポーター遺伝子を含む鳥細胞を調製しなければならない。かかる細胞は、本発明の方法及びキットによって提供される第１及び第２の核酸配列、又はこれを含む任意の構築物を該細胞に共トランスフェクトすることによって調製することができる。本明細書で使用する「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞にＤＮＡ及び二本鎖ＲＮＡなどの遺伝物質を挿入する過程を意味する。細胞へのＤＮＡの挿入は、細胞自身の機構を使用してタンパク質の発現、又は生成を可能にする。したがって、本明細書で使用する共トランスフェクションは、各単一細胞への少なくとも２つの異なる核酸分子又はこれを含む任意のベクターの同時トランスフェクションを指す。さらに、トランスフェクトされる核酸配列は、一過的に短期間発現させるか、又はゲノムＤＮＡに組み込むことができ、分裂により変化が細胞から細胞へ受け継がれる。
【００９７】
本発明は、したがって、レポーター遺伝子、具体的には、ルシフェラーゼの発現に基づく卵内での鳥胚の卵内性別決定法を提供する。「発現」は、一般的に、遺伝子コード情報が細胞内に存在し、動作する構造体に変換されるプロセスを指す。したがって、本発明によると、レポーター遺伝子の「発現」は、具体的には、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、又はさらにはタンパク質の翻訳後修飾を指すことができる。
【００９８】
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、第２の核酸配列における少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で相同アームが隣接し得る。いくつかの実施形態において、これらのアームは、必要とされるため、組み込まれる部位でのレポーター遺伝子のＨＤＲを促進することを理解されたい。
【００９９】
より具体的な実施形態において、本発明の方法によって使用される第２の核酸配列中のレポーター遺伝子は、ＨＤＲを介して特定の組み込みを促進するための組み込み部位として機能する、性染色体Ｚ又はＷ内の標的遺伝子座内に含まれる少なくとも１つの核酸配列と相同であるか、又は約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性若しくは同一性を示す２つのアームと隣接し得る。特定の実施形態において、標的配列は、本明細書では、本発明で使用されるｇＲＮＡの一部である「スペーサー」配列により認識され、第１の核酸配列によって提供される少なくとも１つの「プロトスペーサー」とも呼ばれる。
【０１００】
本明細書で使用される用語「相同アーム」は、改変される標的配列の周囲にある程度の相同性（使用されるＰＥＮに依存する）を有する遺伝子に特定の変異又は新しい要素の挿入を行うために使用される特定のベクター又はウイルスに導入されるＨＤＲ鋳型を指す。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲがＰＥＮとして使用される場合、アーム配列（左、上流及び右、下流）は、約１０〜５０００ｂｐ、具体的には、約５０〜１０００ｂｐ、１００〜５００、具体的には、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｂｐを含むことができる。
【０１０１】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法及びキットによって提供される第１の核酸配列によってコードされるｇＲＮＡ内の標的化配列は、本明細書で「スペーサー」配列とも呼ばれ、本明細書で「プロトスペーサー」と呼ばれる性染色体Ｚ又はＷ内の標的遺伝子座内に含まれる少なくとも１つの核酸配列と約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性又は同一性を示す。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター（例えば、Ｍａｓｏｎら、１９９６に記載のα−グロビンプロモーター）及び誘導性プロモーター（例えば、米国特許第５７５０３８５号に記載の大豆ＳＳＵ遺伝子に由来する、又はＷｅｉｓｓｈａａｒら、１９９１に記載のパセリのカルコン合成酵素ＣＨＳプロモーターに由来する光誘導性プロモーター、又はＭｅｔｔａ−Ｍｅｎａら、２０１４から引用される青色光で照射したときに発現を活性化する細菌の光−酸素−電圧タンパク質であるＥＬ２２２の工学処理バージョン）の任意の１つに作動可能に連結することができる。さらにより具体的な実施形態において、該レポーター遺伝子は、胚性プロモーターの制御下にあり、それによって、トランスジェニックレポーター遺伝子の発現を胚段階に制限するので、成体鶏では発現しない。かかる実施形態において、レポーター導入遺伝子は、診断目的のために使用され、胚段階でのみ発現する。
【０１０３】
より具体的には、本明細書で使用される「プロモーター」は、下流に配置されている遺伝子の発現を制御する能力を有するＤＮＡの特定領域を指す。このように、「雛における性別特異的プロモーター」は、本明細書以下で、特定の雛の性別（すなわち、雄又は雌）でのみ遺伝子の発現を活性化するプロモーターを指す。さらに、「雛における発達に特異的なプロモーター」は、雛の発達の特定の段階でのみ遺伝子の発現を活性化するプロモーターを指す。
【０１０４】
いくつかの特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、標的性染色体の少なくとも１つの非コード領域に挿入し、それによって組み込むことができる。そのようなアプローチは、未孵化胚の発達及び成熟に必要とされ得る遺伝子の破壊を回避する。
【０１０５】
本明細書で使用する「非コード領域」は、タンパク質配列をコードしない生物のＤＮＡの構成要素を指す。いくつかの非コードＤＮＡ領域は、機能的非コードＲＮＡ分子に転写され、非コードＤＮＡ領域の他の機能には、タンパク質コード配列の転写及び翻訳調節、足場付着領域、ＤＮＡ複製の起点、セントロメア及びテロメアが含まれる。機能しないと仮定される部分（又は未知の機能のＤＮＡ）は、しばしば「ジャンクＤＮＡ」と呼ばれている。
【０１０６】
いくつかの特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性染色体Ｗの少なくとも１つの部位に組み込むことができる。より具体的な実施形態において、染色体Ｗの特定の遺伝子座は、位置１０２２８５９〜１０２４２１５であり得る。いくつかの特定の実施形態において、標的遺伝子座は、配列番号３に示す核酸配列を含むことができる。
【０１０７】
より具体的な実施形態において、染色体Ｗ中のかかる特定の位置へレポーター遺伝子を標的化するのに必要な少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１及び２のいずれか１つに示す核酸配列を含むことができ、これらのｇＲＮＡは、それぞれｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２として本明細書に示されている。
【０１０８】
さらにいくつかのより具体的な実施形態において、トランスジェニック鳥雌を調製するために本発明の方法で使用されるｇＲＮＡは、配列番号１（ｇＲＮＡ１）に示す核酸配列を含むことができる。このような場合には、該第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ染色体Ｗ内の該特定の遺伝子座へのその組み込みを促進する配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。これらのアームはまた、本明細書ではそれぞれ左アーム及び右アームと呼ばれることを理解されたい。
【０１０９】
さらにいくつかの代替実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥雌を調製するために使用されるｇＲＮＡは、配列番号２（ｇＲＮＡ２）に示す核酸配列を含むことができる。このような場合には、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接する。これらのアームはまた、本明細書ではそれぞれ左アーム及び右アームと呼ばれることを理解されたい。
【０１１０】
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、トランスジェニック鳥動物を作製するための本発明の方法で使用される少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性染色体Ｚの少なくとも１つの部位に組み込むことができる。より具体的な実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Ｚの配列番号１５に示す領域９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６に示す領域２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７に示す領域４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８に示す領域６３３６３６５６〜６３３６８６５６、及び配列番号１９に示す領域７８７７７４７７〜７８７８２４７７のいずれか１つであり得る。
【０１１１】
より具体的な実施形態において、染色体Ｚ内のかかる特定の場所へレポーター遺伝子を標的化するのに必要な少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１１に示すｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ；配列番号１２に示すｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ；配列番号１３に示すｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ；配列番号１４に示すｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡのいずれか１つによって示される核酸配列を含むことができる。
【０１１２】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１１のｇＲＮＡ３が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１２のｇＲＮＡ４が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１３のｇＲＮＡ５が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１４のｇＲＮＡ６が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。染色体Ｚ内の特定の遺伝子座への組み込みに適するｇＲＮＡ配列のさらなる非限定的な例として、配列番号２６にも示す核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１のｇＲＮＡ７、配列番号２７にも示す核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８にも示す核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９にも示す核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、及び配列番号３０にも示す核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１１３】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２６のｇＲＮＡ７が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２７のｇＲＮＡ８が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２８のｇＲＮＡ９が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２９のｇＲＮＡ１０が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３９に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４０に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号３０のｇＲＮＡ１１が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
【０１１４】
鳥宿主の受精卵細胞の遺伝子座が外因性配列、具体的には、本発明で使用されるレポーター遺伝子を標的化及び／又はトランスフェクトする場合、トランスジェニック動物を作製するためにそのような細胞を使用することが望ましい場合がある。このような手順のために、胚性幹（ＥＳ）細胞へのターゲッティング構築物の導入後、細胞を適切な培地、例えば、成長因子及びサイトカイン、ウシ胎児血清及び抗生物質を補完したＤＭＥＭ中でフィーダー層上に播種することができる。胚性幹細胞は、単一の標的遺伝子座（ヘテロ接合）又は両方の標的遺伝子座（ホモ接合）を有することができる。該構築物を含有する細胞は、選択培地を用いることによって検出することができ、十分な時間コロニーを増殖させた後、コロニーを採取し、遺伝子標的化の発生について分析することができる。いくつかの特定の実施形態において、ＰＣＲを適用して、構築物配列の内側及び外側のプライマーを用いて、標的遺伝子座への所望の外因性配列の組み込みを確認することができる。次いで、遺伝子標的化を示すコロニーを、鳥の胚への注入のために使用することができる。次いで、ＥＳ細胞を、トリプシン処理することができ、改変細胞を、卵の脇に形成された開口を介して注入することができる。卵は、密封した後、孵化するまで適切な条件下でインキュベートすることができる。新しく孵化した鳥を、例えば、その生物学的試料、例えば、その血液試料を調べることによって、標的構築物配列の存在について試験することができる。鳥は成熟した後交配し、外因性の組み込まれた配列が生殖系列を介して伝達されるかどうかを決定するためにそれらの子孫を調べることができる。
【０１１５】
生殖系列を介して遺伝子改変を伝えることができる、改変された胚性幹細胞又は受精卵細胞に部分的に由来するキメラ鳥を作製する。外因性配列、具体的には、本発明で使用するレポーター遺伝子又はその一部を含有する鳥系統を、鳥の野生型遺伝子座又はその一部を修復した系統と交配すると、卵内での検出可能な性別を示す子孫が生じるはずである。
【０１１６】
さらに、トランスジェニック鳥も他の方法によって生成することができ、そのいくつかを以下で説明する。トランスジェニック動物を作製するための形質転換に適する鳥細胞には、始原生殖細胞（ＰＧＣ）、精子細胞及び受精卵細胞（胚性幹細胞を含む）がある。精子細胞は、エレクトロポレーション、微粒子銃、及びリポフェクションなどを含む任意の適切な方法によりＤＮＡ構築物で形質転換することができる。精子は、鳥の人工授精に使用することができる。上記のように、受精鳥の子孫を外因性配列について調べることができる。
【０１１７】
或いは、始原生殖細胞を、鳥の卵から単離して、任意の適切な方法によって本発明の外因性レポーター遺伝子でトランスフェクトし、新しい胚に移すか、又は挿入することができ、その胚で発達している生殖腺に組み込むことができる。孵化鳥及びその子孫は、本発明に記載のとおり、外因性レポーター遺伝子配列を調べることができる。
【０１１８】
さらに別のアプローチでは、卵から単離され、分散している胚盤葉細胞を、任意の適切な手段により外因性レポーター遺伝子配列又はその一部でトランスフェクトし、性別特異的染色体Ｚ又はＷに組み込まれた後、無傷の卵の胚下腔に注入することができる。上記のように、孵化した鳥対象及びそれらの子孫を、外因性レポーター遺伝子について検査することができる。
【０１１９】
鶏始原生殖細胞（ＰＧＣ）は卵子及び精子の前駆体である。したがって、そのいくつかの態様において、本発明は、性別特異的染色体Ｗ及びＺへのレポーター遺伝子の組み込みを指示するレポーター遺伝子構築物及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ構築物で共トランスフェクトしたＰＧＣを用いた生殖系列伝達システムを介するトランスジェニック鶏の生成を提供する。ＰＧＣを、選別し、生殖細胞系伝達のために２．５日目のレシピエント胚の血流中に移す。
【０１２０】
したがって、いくつかの特定の実施形態において、「トランスジェニック鳥動物の作製」は、ゲノムが改変された鶏の生成のための遺伝子工学技術を含む多段階法を指し、その中で、ａ）始原生殖細胞（ＰＧＣ）を２日齢雛胚の血液から単離し、ｂ）導入遺伝子構築物を、レンチウイルスシステム、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンベクター、ＴＡＬＥＮＳ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いることによって培養したＰＧＣに組み込み；（ｃ）トランスジェニックＰＧＣを特定し、胚の循環系に注入し、発達している生殖腺に移行させ；ｄ）レシピエント胚を孵化するまで３７℃でインキュベートし、（ｄ）孵化した雄を、性的に成熟するまで飼育し、野生型雌鳥と交配し、（ｅ）子孫をスクリーニングして、トランスジェニックＰＧＣに由来するものを特定する。
【０１２１】
したがって、第２の態様において、本発明は、その少なくとも１つの細胞において、性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの位置又は場所（本明細書では遺伝子座とも呼ぶ）に組み込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥トランスジェニック動物に関する。
【０１２２】
用語「鳥」は、羽、歯のないくちばしをもつ顎、硬い殻の卵を産むこと、高い代謝率、４つ部屋からなる心臓、及び軽量だが強力な骨格を特徴とする鳥由来の任意の種に関する。鳥の種には、限定されないが、鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、キジ目（Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ）の種、ガチョウ、キジ及び他の家禽が含まれる。用語「雌鳥」には、鳥の種の全ての雌が含まれる。「トランスジェニック鳥」は、一般に、鳥の生殖細胞の染色体に組み込まれた異種ＤＮＡ配列、又は通常、鳥にとって内因性の１以上の追加のＤＮＡ配列（本明細書では総称して「導入遺伝子」と呼ぶ）を有する鳥を指す。そのような導入及び組み込みの結果として、導入配列は、トランスジェニック鳥の子孫へ生殖細胞を介して受け継がれ得る。トランスジェニック鳥（その子孫を含む）はまた、体細胞の性染色体に組み込まれた導入遺伝子を有する。
【０１２３】
いくつかの特定の実施形態において、本発明の少なくとも１つのトランスジェニック動物は、少なくとも２つの異なるレポーター遺伝子を含むことができる。このような場合に、各レポーター遺伝子は、性染色体Ｚ若しくはＷの一方の少なくとも１つの位置又は場所に組み込むことができる。
【０１２４】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明のトランスジェニック動物内に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも１つの生物発光レポーター遺伝子であり得る。
【０１２５】
より具体的な実施形態において、かかる生物発光レポーター遺伝子はルシフェラーゼを含むことができるか、又はルシフェラーゼであり得る。
【０１２６】
ある実施形態において、本発明によって提供される少なくとも１羽のトランスジェニック鳥動物は、雌であり得る。より具体的な実施形態において、かかるトランスジェニック鳥雌内の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、雌の染色体Ｚの少なくとも１つの位置に組み込むことができる。
【０１２７】
さらにいくつかの代替実施形態において、少なくとも１羽のトランスジェニック鳥動物は、雌の染色体Ｗの少なくとも１つの位置に組み込まれた少なくとも１つのレポーター遺伝子を有する雌であり得る。
【０１２８】
いくつかの特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのＰＥＮを使用して、本発明のトランスジェニック動物の性染色体に組み込むことができる。
【０１２９】
より具体的には、かかるＰＥＮは、ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステムであり得る。
【０１３０】
さらにより具体的な実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって媒介されるＨＤＲによって、本発明のトランスジェニック鳥動物の性染色体に組み込むことができる。
【０１３１】
より具体的な実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、この鳥動物の少なくとも１つの細胞、又は該鳥動物に導入される少なくとも１つの細胞に少なくとも２つの核酸配列と共にトランスフェクトすることにより、本発明のトランスジェニック鳥動物の性染色体に組み込むことができる。より具体的には、かかる細胞に、（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列、並びに（ｂ）少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を共トランスフェクトすることによって、ＣＲＩＳＰＲ媒介組み込みを提供することができる。
【０１３２】
より具体的な実施形態において、第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で相同アームが隣接し得る。これらのアームは、標的性染色体内での組み込み標的部位に相同性を示し、それによって、組み込まれた部位でＨＤＲを促進する。
【０１３３】
さらにより具体的な実施形態において、第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか１つに作動可能に連結することができる。かかるプロモーターは、本発明のレポーター遺伝子の発現を特定の所望の性別（性別特異的プロモーターの場合）、特定の胚段階（胚特異的プロモーター）、又は特定の条件（誘導条件）に制限しなければならない。
【０１３４】
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥動物内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その性染色体の１つの少なくとも１つの非コード領域に組み込むことができる。
【０１３５】
ある実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性染色体Ｗの少なくとも１つの部位に組み込むことができる。いくつかの特定の実施形態において、組み込み部位は、染色体Ｗの遺伝子座１０２２８５９−１０２４２１５、具体的には、染色体Ｗ：１０２２８５９−１０２４２１５のｇａｌＧａｌ５＿ｄｎａ範囲に配置することができる。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、かかる遺伝子座は、配列番号３に示す核酸配列を含む。
【０１３６】
上記の遺伝子座内の任意の位置での本発明のレポーター遺伝子の特異的組み込みのために、特異的ｇＲＮＡが必要とされ得る。したがって、いくつかの特定の非限定的な実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥動物の作製のために使用される適切なｇＲＮＡは、配列番号１及び２のいずれか１つによって示される核酸配列を含むことができる。いくつかの特定の実施形態において、これらｇＲＮＡは、本明細書では、それぞれｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２と呼ばれる。
【０１３７】
いくつかの特定の実施形態において、本発明によって提供されるトランスジェニック鳥動物を、配列番号１に示す核酸配列を含むｇＲＮＡ１を用いて調製した。かかる特定の場所に本発明のレポーター遺伝子の組み込みを可能にするために、組み込まれるべきレポーター遺伝子は、ある実施形態において、使用されるｇＲＮＡによって指向される標的組み込み部位におけるその取り込みを促進する特定のアームを保有しなければならない。したがって、いくつかの特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、第２の核酸配列内に含めることができ、このレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している。
【０１３８】
さらにいくつかの代替実施形態において、本発明によって提供されるトランスジェニック鳥動物は、配列番号２に示す核酸配列を含むｇＲＮＡ２を用いて調製することができる。そのような場合、該ｇＲＮＡ２によって認識される特異的部位での本発明のレポーター遺伝子の組み込みを可能にするために、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、特定の実施形態によれば、その５’及び３’で、それぞれ配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
【０１３９】
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥動物は、性染色体Ｚの少なくとも１つの部位に組み込まれた少なくとも１つのレポーター遺伝子を含むことができる。いくつかの特定の非限定的な実施形態において、かかる鳥トランスジェニック動物は、染色体Ｚに組み込まれたトランスジェニックレポーター遺伝子を保有する雌であり得る。より具体的な実施形態において、染色体Ｚ中の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Ｚの、配列番号１５に示す領域９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６に示す領域２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７に示す領域４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８に示す領域６３３６３６５６〜６３３６８６５６、及び配列番号１９に示す領域７８７７７４７７〜７８７８２４７７のいずれか１つであり得る。
【０１４０】
より具体的な実施形態において、染色体Ｚ内のかかる特定の場所にレポーター遺伝子を標的化するのに必要な少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１１に示すｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ；配列番号１２に示すｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ；配列番号１３に示すｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ；配列番号１４に示すｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡのいずれか１つに示す核酸配列を含むことができる。
【０１４１】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１１のｇＲＮＡ３が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１２のｇＲＮＡ４が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１３のｇＲＮＡ５が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１４のｇＲＮＡ６が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
【０１４２】
染色体Ｚ内の特定の遺伝子座への組み込みに適するｇＲＮＡ配列のさらなる非限定的な例として、配列番号２６にも示す核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１のｇＲＮＡ７、配列番号２７にも示す核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８にも示す核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９にも示す核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、及び配列番号３０にも示す核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１４３】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２６のｇＲＮＡ７が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２７のｇＲＮＡ８が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２８のｇＲＮＡ９が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２９のｇＲＮＡ１０が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３９に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４０に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号３０のｇＲＮＡ１１が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
【０１４４】
さらに別の態様において、本発明は、性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの位置又は場所に組み込まれる少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞に関する。
【０１４５】
いくつかの具体的な実施形態において、本発明によって提供される細胞は鳥細胞であり得る。
【０１４６】
いくつかの特定の実施形態において、本発明によって提供される鳥細胞は、始原生殖細胞（ＰＧＣ）であり得る。
【０１４７】
用語「生殖細胞」は、別の生殖細胞と結合する際に、配偶子へと発達する胚細胞を指す。本明細書で使用する「始原生殖細胞（ＰＧＣ）」は、配偶子の前駆体として働き、多能性胚性幹細胞を生じる生殖細胞系列幹細胞に関する。胚形成の間に、ＰＧＣになるようにシグナル伝達される原腸形成胚内の細胞は、生殖隆起に移動し、生殖腺になり、成熟した配偶子に分化する。
【０１４８】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明によって提供される細胞は、細胞の性染色体に組み込まれた少なくとも１つのレポーター遺伝子を含むことができる。より具体的な実施形態において、かかるレポーター遺伝子の特定の組み込みは、（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；並びに（ｂ）少なくとも１つの該レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を細胞に共トランスフェクトすることによって可能になり得る。
【０１４９】
特定の実施形態において、本発明の細胞に共トランスフェクトされる第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、組み込み部位でのＨＤＲのためにその５’及び３’で相同アームが隣接し得る。
【０１５０】
いくつかの特定の実施形態において、本発明によって提供される細胞中の染色体Ｗにレポーター遺伝子の組み込みを標的化するために、特定のｇＲＮＡが使用されるべきである。さらなる特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１に示す、本明細書でｇＲＮＡ１と呼ばれる核酸配列を含むことができる。このような場合、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
【０１５１】
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、本発明によって提供される細胞は、本明細書でｇＲＮＡ２と呼ばれるｇＲＮＡを用いて調製することができる。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ２は、配列番号２に示す核酸配列を含むことができる。かかる特定の実施形態において、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
【０１５２】
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、本発明によって提供される細胞は、細胞の染色体Ｚに、本発明の少なくとも１つのレポーター遺伝子を組み込むことによって調製することができる。特定の実施形態において、本発明の細胞を調製するために、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性染色体Ｚの少なくとも１つの部位に組み込むことができる。より具体的な実施形態において、染色体Ｚにおける特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Ｚの、配列番号１５に示す領域９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６に示す領域２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７に示す領域４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８に示す領域６３３６３６５６〜６３３６８６５６、及び配列番号１９に示す領域７８７７７４７７〜７８７８２４７７のいずれか１つであり得る。
【０１５３】
より具体的な実施形態において、本発明の細胞の染色体Ｚ内のかかる特定の場所にレポーター遺伝子を標的化するのに必要な少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１１に示すｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ；配列番号１２に示すｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ；配列番号１３に示すｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ；配列番号１４に示すｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡのいずれか１つによって示される核酸配列を含むことができる。
【０１５４】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１１のｇＲＮＡ３が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１２のｇＲＮＡ４が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１３のｇＲＮＡ５が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１４のｇＲＮＡ６が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。染色体Ｚ内の特定の遺伝子座への組み込みに適するｇＲＮＡ配列のさらなる非限定的な例として、配列番号２６にも示す核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１のｇＲＮＡ７、配列番号２７にも示す核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８にも示す核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９にも示す核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、及び配列番号３０にも示す核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１５５】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の細胞の染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２６のｇＲＮＡ７が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２７のｇＲＮＡ８が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２８のｇＲＮＡ９が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２９のｇＲＮＡ１０が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３９に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４０に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号３０のｇＲＮＡ１１が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
【０１５６】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列及び少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列、並びに（ｂ）少なくとも１つの該レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列、
を含むキットを提供する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本発明のキット内に含まれる第２の核酸配列における少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、組み込み部位でのＨＤＲのために相同アームが隣接し得る。
【０１５８】
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明のキットの第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか１つに作動可能に連結することができる。
【０１５９】
特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性染色体、具体的には、染色体Ｗの少なくとも１つの非コード領域に組み込むことができる。このような場合に、本発明のキットの第１の核酸配列は、本明細書ではそれぞれｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２とも呼ばれる配列番号１並びに２のいずれか１つに示す核酸配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードすることができる。
【０１６０】
いくつかの特定の実施形態において、本発明のキットの第１の核酸配列は、ｇＲＮＡ１であるｇＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態において、かかるｇＲＮＡ１は、配列番号１に示す核酸配列を含むことができる。このような場合において、本発明のキットの該第２の核酸配列内に含まれるレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
【０１６１】
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、本発明のキットは、その第１の核酸配列中にｇＲＮＡ２をコードする配列を含むことができる。いくつかの特定の実施形態において、かかる配列は、配列番号２に示す核酸配列をコードする。さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、それぞれ配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
【０１６２】
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性染色体Ｚの少なくとも１つの部位に組み込むことができる。より具体的な実施形態において、染色体Ｚ中の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Ｚの、配列番号１５に示す領域９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６に示す領域２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７に示す領域４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８に示す領域６３３６３６５６〜６３３６８６５６、及び配列番号１９に示す領域７８７７７４７７〜７８７８２４７７のいずれか１つであり得る。
【０１６３】
したがって、より具体的な実施形態において、本発明のキットの第１の核酸配列は、配列番号１１に示すｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ；配列番号１２に示すｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ；配列番号１３に示すｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ；配列番号１４に示すｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡの少なくとも１つであるｇＲＮＡを含むことができる。
【０１６４】
さらなる実施形態において、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、配列番号４１〜４８のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。より具体的には、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１１のｇＲＮＡ３が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１２のｇＲＮＡ４が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１３のｇＲＮＡ５が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号４７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号１４のｇＲＮＡ６が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
【０１６５】
本発明のキットの第１の核酸配列の非限定的なさらなる例としては、配列番号２６にも示す核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１のｇＲＮＡ７、配列番号２７にも示す核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８にも示す核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９にも示す核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、及び配列番号３０にも示す核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１のうちの少なくとも１つであるｇＲＮＡを挙げることができる。
【０１６６】
さらなる実施形態において、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’及び３’で、配列番号３１〜４０のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。より具体的には、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２６のｇＲＮＡ７が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２７のｇＲＮＡ８が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２８のｇＲＮＡ９が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２９のｇＲＮＡ１０が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３９に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４０に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号３０のｇＲＮＡ１１が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも１つの生物発光レポーター遺伝子であり得る。
【０１６８】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明のキットは、性染色体Ｚ及びＷの少なくとも一方の少なくとも１つの位置又は場所に組み込まれる少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含むトランスジェニック鳥動物の作製に使用するのに適切であり得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載の本発明のキットのいずれかを使用することができる。
【０１７０】
さらに、本発明のキットはさらに、本発明のトランスジェニック鳥動物の作製に必要な試薬、緩衝液、媒体又は材料を含むことができることが理解されなければならない。本発明のキットはさらに、取扱説明書及びその異なる成分用の容器を含むことができる。
【０１７１】
ある実施形態において、本発明のキット（複数可）及び方法（複数可）で使用されるオリゴヌクレオチド（複数可）又はポリヌクレオチド（複数可）は、単離及び／又は精製された分子であることを理解されたい。本明細書で使用する場合、核酸に関連して使用される場合「単離された」又は「精製された」は、天然に存在する配列がその正常な細胞（例えば、染色体）環境から取り出されたか、又は非天然環境（例えば、人工合成）で合成されることを意味する。したがって、「単離された」又は「精製された」配列は、無細胞溶液中にあるか、又は異なる細胞環境に置くことができる。用語「精製された」は、配列が存在する唯一のヌクレオチドであるが、それと自然界で関連する非ヌクレオチド物質を本質的に含まず（約９０％〜９５％純粋）、したがって、単離された染色体とは区別されることを意味するものではない。
【０１７２】
本明細書で使用される全ての科学用語及び技術用語は、特に断りのない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書でしばしば使用される特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
【０１７３】
本発明の特定の態様及び実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、特定の方法、及び記載される実験条件に限定されず、かかる方法及び条件は変化することができることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０１７４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈が特に明確に指示しない限り、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その」は、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載の、かつ／又は本開示などを読む際に当業者に明らかになるであろう１以上の方法、及び／又は種類の工程を含む。
【０１７５】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をこれから記載する。
【０１７６】
特に文脈が必要としない限り、以下の本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、規定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程のグループを包含するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程のグループを除外しないことを意味すると理解される。より具体的には、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」及びそれらの活用形は、「含むが、これに限定されない」を意味する。この用語は、用語「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。語句「から本質的になる」は、組成物又は方法が、追加の成分及び／又は工程を含むことができるが、ただし、追加の成分及び／又は工程は、特許請求の組成物又は方法の基本的かつ新規な特徴を著しく変えないことを意味する。
【０１７７】
本明細書で使用される用語「約」は、言及される値よりも最大１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、場合によっては最大２０％高く又は低く逸脱することができる値を示し、偏差範囲は、整数値及び、該当する場合、同様に非整数値を含み、連続した範囲を構成する。本明細書で使用する用語「約」は、±１０％を指す。
【０１７８】
本発明の様々な実施形態が範囲形式で提示され得ることに留意されたい。範囲形式での記載は便宜と簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能なサブ範囲並びにその範囲内の個々の数値を有すると考慮されるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示されるサブ範囲、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、及び６を有すると考慮されるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用する。数値範囲が本明細書に示されているときはいつでも、示された範囲内の任意の引用される数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の示される数と第２の示される数の「間の範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅ）」及び第１の示される数「から」第２の示される数「の範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅ）」という語句は、本明細書で互換的に使用され、第１及び第２の示される数、並びにその間の全ての小数及び整数を含むことが意図される。
【０１７９】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を作製し、使用する方法の完全な開示並びに説明を当業者に提供するために記載されており、本発明者らが彼らの発明として考えるもの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するように努力は行われているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又は大気圧に近い。
【０１８０】
実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らによって使用される技術の代表例である。これらの技術は、本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であるが、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び意図される範囲から逸脱することなく、多くの変更を行うことができることを認識することを理解されたい。
【０１８１】
明確にするために、別々の実施形態の文脈に記載されている本発明の特定の特徴はまた、単一実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一実施形態の文脈で記載する本発明の様々な特徴はまた、別々に、又は任意の適切なサブコンビネーションで、又は本発明の任意の他の記載される実施形態において好適なものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で記載するいくつかの特徴は、実施形態がそれらの要素なしに機能できない限り、これらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
【０１８２】
上述し、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例における実験的裏付けとなる。
【０１８３】
開示及び記載されるように、本発明は、本明細書に開示される特定の実施例、方法、工程、及び組成物に限定されるものではなく、かかる方法、工程及び組成物は多少変更することができることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のために使用され、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０１８４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、内容が特に明確に指示しない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。
【０１８５】
実施例
さらに詳述することなく、当業者は、前述の説明を用いて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。以下の好ましい特定の実施形態は、したがって、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる意味でも特許請求される発明を限定するものではない。
【０１８６】
当技術分野で公知の、本明細書に具体的に記載されていない標準的な分子生物学プロトコルは、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２），及びＡｕｓｕｂｅｌら，分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８８）に基本的に従う。
【０１８７】
試薬
動物：
商業用白色レグホン鶏を、ヘンドリックスＩＳＡ、及びＭｉｎｎｅｓｏｔａから入手する。
マーカーライン鶏は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ａｇｒｉ−Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ａｇａｓｓｉｚ，カナダのブリティッシュコロンビア州からのものである。
トランスジェニックマウスＣＡＧ−ｌｕｃ−ｅＧＦＰは、ジャクソン研究所（カタログ番号Ｌ２Ｇ８５）からのものである。
トランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／Ｊは、ジャクソン研究所（カタログ番号００３２９）からのものである。
【０１８８】
動物実験は、ＩＡＣＵＣ承認プロトコルに厳密に従い、実験の過程で病気に苦しむ動物も、死ぬ動物もいないことを確実にしながら、クリスタルバイオサイエンス（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ＩＡＣＵＣ委員会の監督下で行った。
【０１８９】
ベクター：
Ｃａｓ９  ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅ（商標）オールインワンタグ付きベクターは、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号ＣＡＳ８／９ｘｘシリーズから注文する。
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ  ２ベクターは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ番号Ｎ８０８１Ｓから注文する。
【０１９０】
細胞株：
雌の細胞は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ鶏のＴリンパ球細胞である。
雄の細胞は、ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＣＲＬ−２１１８（商標）から注文したＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ鶏の肝臓のものである。
始原生殖細胞（ＰＧＣ）株。
【０１９１】
実験手順
卵の殻を通したレポーター遺伝子の生物発光検出
Ｄ−ルシフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ、イスラエル、カタログ番号２５９１−１７−５）を、室温で、１５ｍｇ／ｍＬの最終濃度までＤＰＢＳに溶解する。０．１ｍｌの量のルシフェリン又は生理食塩水（陰性対照）を、トランスジェニックルシフェラーゼ発現マウスの首及び肩の領域の周囲の弛緩性皮膚に皮下注射する。耳及び尾部を、１０分後に摘出し、鶏胚（１０日齢）に導入する。
【０１９２】
或いは、トランスジェニックルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスから摘出した耳及び尾部を、０．１ｍｌのルシフェリン又は生理食塩水を卵に直接注入する前に鶏胚に組み込む。
【０１９３】
生物発光を、バイオ空間光子イメージャー（Ｂｉｏ  ｓｐａｃｅ  ｌａｂ、ＵＳＡ）を用いて観察する。
【０１９４】
制限のない（ＲＦ）クローニング
Ｃａｓ９−ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅ（商標）ベクターへのｇＲＮＡの挿入は、制限フリー方法（Ｐｅｌｅｇ  Ｙら，２０１０）を適用することによって行う。プライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）から注文し、続いて、ＲＦ反応をＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ）を用いて行った。プラスミド精製を、ＭＥＧＡｓｐｉｎキット及びＤＮＡ−ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（それぞれＩｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｅｊｏｅｎ，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）を用いて行う。
【０１９５】
細胞培養
ＰＧＣを、その４０％をバッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ、ＡＴＣＣ）に予め馴化させ、７．５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２．５％照射鶏血清、１×非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒト線維芽細胞増殖因子、６ｎｇ／ｍｌの組換えマウス幹細胞因子（両方ともＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）を補完したＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させ、ＢＲＬ細胞の照射したフィーダー層上で成長させる。細胞を新鮮なフィーダー層上に、週３回継代する。
【０１９６】
トランスフェクション
染色体Ｗ又はＺの上記遺伝子座を標的化する安定したトランスフェクタントのために、１５μｇのベクター含有ｇＲＮＡ及び１５μｇの環状ルシフェラーゼ含有ベクターを、５×１０６個の細胞に加え、Ｖ−緩衝液（ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で１００μｌの体積にした。細胞懸濁液を２ｍｍのキュベットに移し、３５０ボルト／１００μ秒の８つの方形波パルス（ＢＴＸ  ８３０電気穿孔器）に供する。次いで、細胞をネオマイシン耐性照射ＢＲＬと共にプレーティングし、ウェル当たり１０５個の細胞密度で４８ウェルプレートに播種する。３日後、４０μｇ／ｍｌのネオマイシンを添加し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の安定な組み込みを有する細胞を選択する。
【０１９７】
トランスジェニック鶏の作製
濃縮ビヒクル（約１０７  ＭＯＩの力価のレンチウイルス又はプラスミドＤＮＡのいずれかであり得る）を、２５個の産みたて卵の胚に注入する。注入は週３回行う。注入した胚は、注入後３週間で孵化する。これらは、Ｇ０鳥である。孵化直後に、ＤＮＡを、孵化した雛のＣＡＭ試料から抽出し、ベクターＤＮＡの存在／不在の検出を半定量ＰＣＲによって行う。血液を、２〜３週齢のＧ０鳥から採取し、ＰＣＲスクリーニングを繰り返す。Ｇ０鳥は、雄については１６〜２０週、雌については２０〜２４週の性成熟まで育てる。雄の雛鳥を、約１６週から精液の生成について試験する。雌鳥を受精させ、受精卵を毎日収集する。Ｇ１雛は３週間後に孵化し、各個々の雛の翼を縛って、雛の漿尿膜（ＣＡＭ）試料を殻から採取する。ＣＡＭ試料からＤＮＡを抽出し、導入遺伝子の存在についてＰＣＲスクリーニングを行い、単一コピーレベルであると予測する。２〜３週間後に確認のためのスクリーニングを繰り返し、血液試料からのＤＮＡ上で雛の性別を判定する。数週齢の時点で、血液試料をＧ１鳥から採取し、ＰＣＲ分析のためにゲノムＤＮＡを調製する。Ｇ１鳥をＧ２の繁殖のために使用する。
【０１９８】
実施例１
家禽における視覚的な性別特定のためのレポーター遺伝子の選択
卵内の家禽の性別を視覚的に特定する実現可能性を実証するために、蛍光レポーター遺伝子と比較する生物発光の使用を評価した。したがって、ホタルルシフェラーゼなどの（配列番号２０に示す核酸配列を有し、配列番号２１に示すアミノ酸配列をコードする）レポーター遺伝子及び緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウスを、最初に使用した。
【０１９９】
ルシフェラーゼ活性を観察するため、図１で、ルシフェリンをルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスに皮下注射し、次いで、尾部及び耳を切除し、未受精卵の卵殻に５ｍｍの穴を通して導入した。図に示すように、ルシフェラーゼの検出可能なシグナルが、明らかに、卵殻を通して尾部及び耳の試料（図１Ａ、１Ｂ）で観察される。したがって、本発明者らは、次に、卵内でルシフェラーゼ反応を誘導する実現可能性を調べた。したがって、ルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスの耳及び尾部を切除し、１０日齢の鶏の胚を保有する受精卵に穴から導入し、その後、ルシフェリンを注入した。図２Ａ及び図２Ｂにはっきり示されているとおり、卵内ルシフェラーゼ反応は、卵殻を貫通することができる検出可能なシグナルをもたらすのに成功した。
【０２００】
一方、レポーター遺伝子としてＧＦＰを用いて実行した同様の実験は、図３に見られるように、ＧＦＰ発現トランスジェニックマウスの尾部及び耳の鶏胚への組み込み後に、ＧＦＰシグナルは検出可能ではないことをはっきりと示した。
【０２０１】
したがって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、具体的には、ホタルルシフェラーゼ（配列番号２０に示す核酸配列がコードする配列番号２１に示すアミノ酸配列を含む）を、性染色体Ｗ及びＺに組み込むためにさらに選択した。
【０２０２】
図４は、卵内の胚の性別を特定するための本発明の方法の概略図を表す。より具体的には、その中に組み込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する性特異的染色体（Ｗ）を含有するトランスジェニック鳥の雌鶏を提供する。該雌鶏が産んだ卵において、検出可能なシグナルによって観察されるレポーター遺伝子の発現は、胚が性染色体Ｗを保有し、したがって、雌であることを示す。これにより、レポーター遺伝子を保有する雌は廃棄されるが、雄の継続的なインキュベーションについての選択が可能になる。この選択は、おそらく、家禽にとってより適切である。
【０２０３】
図５は、卵内の雄胚の決定を容易にするさらなる代替法を概略的に示す。より具体的には、その中に組み込まれたレポーター遺伝子を有する性別特異的染色体Ｚを保有するトランスジェニック雌鶏の提供により、レポーター遺伝子を含まない（母系野生型染色体Ｗを受け取った）雌胚又はトランスジェニックルシフェラーゼ遺伝子を発現する（母系標識染色体Ｚを受け取った）雄胚が得られる。
【０２０４】
実施例２
ガイドＲＮＡベクターの設計
性染色体Ｗ又はＺにルシフェラーゼレポーター遺伝子を組み込むために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲ法を選択する。次いで、関連ｇＲＮＡ部位を、両方の性染色体からさがす。
【０２０５】
配列番号３に示す核酸配列を含む雌鶏の染色体Ｗの領域１０２２８５９〜１０２４２１５を、ガイドＲＮＡ設計のために分析する。２つのガイドＲＮＡ：配列番号１に示すｇＲＮＡ１：ＧＣＡＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧ及び配列番号２に示すｇＲＮＡ２：ＧＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＧＣＴＡＧＧを選択し、合成し、制限のないクローニングプロトコルによって、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｈｏｒｉｚｏｎ）を含有するＣａｓ９  ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅベクターに別々にクローニングする。
【０２０６】
これらの２つのｇＲＮＡの予測パラメーターを表１に提示する。
【表１】
2019505175.tif 000002
【０２０７】
雌鶏の染色体Ｚの、配列番号１５に示す領域９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６に示す領域２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７に示す領域４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８に示す領域６３３６３６５６〜６３３６８６５６、及び配列番号１９に示す領域７８７７７４７７〜７８７８２４７７を、ガイドＲＮＡ設計のために分析する。４つのガイドＲＮＡ：配列番号１１に示すｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ；配列番号１２に示すｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ；配列番号１３に示すｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ；配列番号１４に示すｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡを選択し、合成し、制限のないクローニングプロトコルによって、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｈｏｒｉｚｏｎ）を含有するＣａｓ９  ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅベクターに別々にクローニングする。
【０２０８】
染色体Ｚ内の特定の遺伝子座への組み込みに適するｇＲＮＡ配列のさらなる非限定的な例として、配列番号２６にも示す核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１のｇＲＮＡ７、配列番号２７にも示す核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８にも示す核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９にも示す核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、及び配列番号３０にも示す核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含む染色体Ｚ遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１を挙げることができるが、これらに限定されない。これらのｇＲＮＡは、予測されるオフターゲット部位がほとんどなく、そのどれも既知のコード配列中にない。
【０２０９】
実施例３
ルシフェラーゼ標的化ベクターの設計
雌の染色体Ｗ又は雌の染色体Ｚの遺伝子座の上記で示した適切な隣接配列と相同性のある隣接配列を、ＣＭＶプロモーターの上流及びネオマイシン耐性の下流或いはポリＡ部位（注文した合成ＤＮＡ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）の下流の位置でルシフェラーゼ発現ベクターに導入する。
【０２１０】
雌の染色体Ｗについては、レポーター遺伝子、具体的には、ルシフェラーゼを、配列番号１に示すガイド１（ｇＲＮＡ１）又は配列番号２に示すガイド２（ｇＲＮＡ２）のいずれかを使用するためにクローニングすることができる。ｇＲＮＡ１を用いてクローニングするために、配列番号４に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号５に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。ｇＲＮＡ２を用いてクローニングするために、配列番号６に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号７に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。
【０２１１】
さらに、ＣＭＶプロモーターの上流領域の「左アーム」は、配列番号８に示す核酸配列を含み、ネオマイシン耐性の下流領域の場合の「右アーム」は、配列番号９に示す核酸配列を含み、ポリＡ部位の下流領域の場合は配列番号１０に示す核酸配列を含むことができる。雌の染色体Ｚについては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、配列番号１１に示すｇＲＮＡ３、配列番号１２に示すｇＲＮＡ４、配列番号１３に示すｇＲＮＡ５、配列番号１４に示すｇＲＮＡ６のいずれかを使用するためにクローニングすることができる。
【０２１２】
ｇＲＮＡ３を用いてクローニングするために、配列番号４１に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号４２に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。ｇＲＮＡ４を用いてクローニングするために、配列番号４３に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号４４に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。ｇＲＮＡ５を用いてクローニングするために、配列番号４５に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号４６に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。ｇＲＮＡ６を用いてクローニングするために、配列番号４７に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号４８に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に、本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３１に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３２に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２６のｇＲＮＡ７が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３３に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３４に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２７のｇＲＮＡ８が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３５に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３６に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２８のｇＲＮＡ９が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３７に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号３８に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号２９のｇＲＮＡ１０が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Ｚ内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号３９に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号４０に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号３０のｇＲＮＡ１１が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
【０２１３】
実施例４
ＣＲＩＳＰＲ処理細胞の生殖系列伝達
２つの上記のベクター、具体的には、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９及びレポーター遺伝子ベクターを、実験手順に詳述するＰＧＣに共トランスフェクトする。安定なクローンを特定した後、細胞を増殖させ、ＰＣＲによるルシフェラーゼ組み込みについて確認する。確認したクローンを、段階１４〜１６のレシピエント鶏胚（Ｈ＆Ｈ）に注入する。注入した胚を代理の殻に移し、３７℃で孵化するまでインキュベートする。雛の性別を、染色体ＷについてＰＣＲによる孵化後に決定する。
【０２１４】
雌及び雄のキメラを、性的に成熟するまで成長させ、野生型のオス及びメスの鶏と交配する。孵化した雛をルシフェラーゼの発現について評価し、標的ルシフェラーゼを保有するかについて生殖細胞系列の子孫をＰＣＲによって確認する。
【図１Ａ】
2019505175.tif 000003
【図１Ｂ】
2019505175.tif 000004
【図２Ａ】
2019505175.tif 000005
【図２Ｂ】
2019505175.tif 000006
【図３Ａ】
2019505175.tif 000007
【図３Ｂ】
2019505175.tif 000008
【図４】
2019505175.tif 000009
【図５】
2019505175.tif 000010
【配列表】
2019505175000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月16日(2018.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019505175000001.app
【国際調査報告】
2019505175.tif 000011
2019505175.tif 000012
2019505175.tif 000013