(57)【要約】  目的のタンパク質、例えば成体または新生児の心筋細胞またはインスリン産生ベータ細胞における増殖を再活性化する細胞周期誘導因子の細胞特異的転写（発現）のための発現調節システムを開示する。この発現調節システムは、標的細胞ｍｉＲに特異的に結合するマイクロＲＮＡ認識エレメントと、翻訳抑制タンパク質とをコードする第１の核酸；ならびに前記翻訳抑制タンパク質に結合する抑制タンパク質相互作用モチーフと、目的のタンパク質をコードする遺伝子とを含む第２の核酸を含む。目的の細胞に前記システムの第１および第２の核酸が同時トランスフェクトされると、目的のタンパク質は細胞特異的様式で発現する。
2019528736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の遺伝子（ＧＯＩ）の細胞特異的発現の発現調節システムであって、
標的細胞特異的ｍｉＲに特異的に結合するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）認識エレメント（その３’ＵＴＲの近くに）と、翻訳抑制タンパク質とをコードする第１の核酸；ならびに
前記翻訳抑制タンパク質に結合する抑制タンパク質相互作用モチーフと、目的のタンパク質をコードする遺伝子とを含む第２の核酸、
を含むシステム。
【請求項２】
前記第１および第２の核酸が修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記標的細胞が心筋細胞であり、前記標的細胞ｍｉＲが、ｍｉＲ１、ｍｉＲ２０８、およびｍｉＲ１＋ｍｉＲ２０８からなる群から選択される、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
前記翻訳抑制タンパク質がＬ７Ａｅであり、前記抑制タンパク質相互作用モチーフがｋ−モチーフである、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項５】
前記目的のタンパク質がレポータータンパク質または選択マーカーである、請求項１から３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記レポータータンパク質または選択マーカーが蛍光タンパク質または抗生物質耐性マーカーである、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記レポータータンパク質または選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、核ＧＦＰ（ｎＧＦＰ）、不活性ヒトＣＤ２５（ｉｈＣＤ２５）および不活性マウスＣＤ２５（ｉｍＣＤ２５）からなる群から選択される、請求項５または６に記載のシステム。
【請求項８】
前記目的のタンパク質が細胞周期誘導タンパク質である、請求項１、２または３に記載のシステム。
【請求項９】
前記細胞周期誘導タンパク質が、Ｌｉｎ２８およびＰｋｍ２からなる群から選択される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第１の核酸が、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記第２の核酸が、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の第１および第２の核酸を含む組成物。
【請求項１３】
前記発現産物がインビトロ転写によって得られる、実施形態１３に記載の組成物。
【請求項１４】
目的の細胞においてタンパク質を発現させる方法であって、前記細胞と、前記目的の細胞のｍｉＲ標的に特異的な抗ｍｉＲをコードするｍｏｄＲＮＡとを接触させることを含む方法。
【請求項１５】
心筋細胞（ＣＭ）においてタンパク質を発現させるための方法であって、前記ＣＭと、心筋細胞ｍｉＲ標的に特異的な抗ｍｉＲをコードするｍｏｄＲＮＡとを接触させることを含み、前記ｍｏｄＲＮＡが配列番号２、配列番号３、または配列番号３のヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の第１および第２の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１に記載の第１および第２の核酸、または請求項１に記載の第１および第２の核酸を含むベクターを含む発現調節キット。
【請求項１８】
心筋梗塞（ＭＩ）後にインビトロまたはインビボで新生児または成体の心筋細胞の増殖を誘導／再活性化する方法であって、前記心筋細胞の一部を、心筋細胞特異的ｍｉＲの認識エレメントと翻訳抑制タンパク質とをコードする第１のｍｏｄＲＮＡ、および翻訳抑制タンパク質に結合するためのｋモチーフと細胞周期誘導遺伝子とをコードする第２のｍｏｄＲＮＡ、と接触させることを含む方法。
【請求項１９】
前記細胞周期誘導遺伝子が、Ｌｉｎ２８およびＰｋｍ２ならびにサイクリンＤ２からなる群より選択される、実施形態４に記載の方法。
【請求項２０】
目的の遺伝子をヒトまたは霊長類の心筋細胞に発現させるが、他の細胞には発現させない方法であって、翻訳抑制因子結合部位と目的の遺伝子とをコードする第１のインビトロ合成ｍｏｄＲＮＡ、および翻訳抑制タンパク質と抗マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）とをコードする第２のインビトロ合成ｍｏｄＲＮＡを前記心筋細胞に導入することを含み、前記目的遺伝子の発現が、抑制タンパク質認識／結合部位とヒトまたは霊長類の心筋細胞に特異的な抗ｍｉＲ（ｍｉＲ）とをコードする前記第２のインビトロ合成ｍｏｄＲＮＡの調節制御下にある方法。
【請求項２１】
前記抗ｍｉＲが抗ｍｉＲ１、抗ｍｉＲ２０８、または抗ｍｉＲ１と抗ｍｉＲ２０８との組み合わせである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
心筋梗塞または心不全後の心筋細胞増殖の回復のための、請求項１に記載の発現調節システム、請求項１９に記載のベクターまたは請求項２０に記載のキットの使用。
【請求項２３】
ＭＩまたはＨＦの治療に使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現調節システム。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１６年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，７０１号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願には、２０１６年９月７日に作成された配列表が含まれ、ＡＳＣＩＩフォーマットのこのファイルは、３７１００２９Ｐ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称で１１，２７８バイトのサイズである。このファイルは、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、全体として、遺伝子発現抑制の細胞特異的ｍｉＲ無効化に基づく細胞特異的転写調節システムを使用して、インビトロ、エクスビボおよびインビボで治療用タンパク質を細胞特異的に発現させるためのプラットフォームに関する。
【背景技術】
【０００４】
化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）は、細胞機構がゲノムを修飾することなく目的の遺伝子の産生を可能にする治療戦略である。したがって、ｍｏｄＲＮＡは、ゲノム統合の欠如、発現の持続性、免疫原性、拡張性および生産の困難性、腫瘍形成および他の有害な臨床転帰の生涯にわたるモニタリングの必要性、ならびに体循環の中へのベクターの逃避と体内の他の場所での長期発現の可能性を含む、従来の遺伝子療法で生じた問題のいくつかを回避する。
【０００５】
ｍｏｄＲＮＡは疾患の治療法としてかなりの可能性を秘めている。例えば、ｍｏｄＲＮＡを介した細胞周期誘導因子の送達は、糖尿病を有する個体においてベータ細胞の増殖を誘発するか、または心筋梗塞もしくは心不全の後の心筋細胞の増殖を回復させると思われる。糖尿病性ニューロパチーは、神経成長因子をコードする遺伝子を送達する能力によって減少させることができる。さらに、ゲノム編集技術の出現により、一過性かつ細胞特異的様式で送達された場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のトランスフェクションがより安全になると思われる。
【０００６】
しかしながら、ｍｏｄＲＮＡのための利用可能なトランスフェクション試薬のいずれも、高レベルの遺伝子発現と任意の目的の細胞を標的とする能力との両方は提供しない。例えば、一般的なインビボトランスフェクション試薬はｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）ＳＡ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）であり、これはｍｏｄＲＮＡと複合体を形成してナノ粒子を形成するポリマーベースの試薬である。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩは主にインビボで肺組織を標的としており、裸のｍｏｄＲＮＡと比較してトランスフェクション効率が有意に低下する。
【０００７】
したがって、目的の細胞において高レベルの遺伝子発現排他性を達成するｍｏｄＲＮＡベースの遺伝子送達システムが必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、リプレッサーＲＮＡ結合タンパク質／ｋモチーフ相互作用を、送達されたｍｏｄＲＮＡの発現を細胞特異的様式で制御するリプレッサー機能の細胞特異的ｍｉＲ無効化と組み合わせて利用することに基づく、細胞特異的転写のための発現調節プラットフォームを提供する。細菌タンパク質Ｌ７ＡｅなどのＲＮＡ結合タンパク質およびＬ３０ｅなどのそれらの真核生物相同体は、特有のＲＮＡモチーフであるキンクターン（ｋｉｎｋ−ｔｕｒｎ）（本明細書中で言及されるようなｋターンまたはｋモチーフ）を認識する。目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１の構築物にｋモチーフを組み込み、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする第２の構築物に細胞特異的ｍｉＲの認識エレメントを含めることによって、２つの構築物が適切な細胞型に同時トランスフェクトされた場合にＧＯＩの発現の抑制が無効にされる。プラットフォームは修飾ｍＲＮＡを組み込んでいる。
【０００９】
したがって、本開示は、目的の細胞においてのみ発現が望まれる目的の遺伝子（ＧＯＩ）のｍｏｄＲＮＡの細胞特異的発現を達成するための方法に関する。一態様では、本開示は、細胞特異的転写のための発現調節システムであって、（１）細胞特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）認識エレメントと、（２）翻訳抑制タンパク質とをコードする第１の核酸；ならびに（１）その５’ＵＴＲの下流の、前記翻訳抑制タンパク質に結合する抑制タンパク質相互作用モチーフ、例えばＫモチーフと、（２）目的のタンパク質をコードする遺伝子とをコードする第２の核酸を含むシステムを記載する。これらの核酸はｍｏｄＲＮＡである。
【００１０】
ｍｉＲ認識エレメントを交換することによって、細胞特異性を調節することができ、システムを他の細胞型に適応させることができる。
【００１１】
別の態様では、本開示は、候補遺伝子、例えば細胞周期誘導遺伝子の心筋細胞（ＣＭ）特異的ｍｏｄＲＮＡの短期間発現に関し、その発現がＣＭの再生を再活性化し、このことが心筋梗塞後または心不全状況において重要である。この方法は、ＭＩ後に本開示の細胞特異的送達システムを使用してｍｏｄＲＮＡとして送達される細胞周期誘導遺伝子、例えばＬｉｎ２８およびＰｋｍ２が、ＣＭおよび非ＣＭの増殖を有意に誘導するという観察に基づく。非ＣＭ増殖の増加は心臓瘢痕化の亢進をもたらし得るので、心筋細胞においてのみ遺伝子の発現を可能にするＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡを開発することが必要であった。
【００１２】
本開示は、ＣＭにおいて排他的にｍｏｄＲＮＡ翻訳を可能にするＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡを記載する。一実施形態では、ＣＭ特異的Ｌｉｎ２８またはＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡの発現は、非ＣＭ増殖を有意に変化させることなく有意なＣＭ増殖をもたらす。別の実施形態では、ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡに基づいて、ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡを用いたＲｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏにおける同時発現不安定化Ｃｒｅレコンビナーゼおよび候補遺伝子に基づく新規な系統追跡成体マウスモデルを開発した。
【００１３】
一態様では、本開示は、標的心筋細胞ｍｉＲに特異的に結合するマイクロＲＮＡの認識エレメント（ｍｉＲ認識エレメントは抗ｍｉＲアプローチとして機能する）をコードして、抑制タンパク質（Ｌ７Ａｅ）の翻訳を妨げる第１の核酸、および目的の遺伝子と、前記抑制タンパク質（Ｌ７Ａｅ）によって結合されるキンクターンモチーフ（Ｋモチーフ）とを含む第２の核酸を含む、心筋細胞特異的発現のための発現調節システムに関する。ＫモチーフへのＬ７Ａｅの結合は、Ｋモチーフを有する遺伝子の発現を阻害する。
【００１４】
翻訳調節システムの一実施形態では、標的心筋細胞ｍｉＲは、ｍｉＲ１、ｍｉＲ２９、ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ１３３ａ、ｍｉＲ１９９、ｍｉＲ２０８ａおよびｍｉＲ３７８からなる群から選択される。別の実施形態では、標的心筋細胞ｍｉＲは、ｍｉＲ１、ｍｉＲ２０８ａ、およびｍｉＲ１とｍｉＲ２０８ａとの組み合わせからなる群から選択される。
【００１５】
発現調節システムの一実施形態では、抑制タンパク質はＬ７Ａｅであり、タンパク質相互作用モチーフはＫモチーフである。Ｌ７Ａｅは、標的転写産物の翻訳を阻止するＲＮＡ結合タンパク質である。Ｌ７Ａｅは、ｋモチーフまたはｋターンと呼ばれる特異的配列を標的とする。したがって、ｋモチーフは、ＧＯＩをコードする対の核酸に組み込まれる。通常、Ｌ７Ａｅをコードする対の他方の核酸が正常に発現される場合、Ｌ７Ａｅはｋモチーフに結合することができ、それによってその核酸によってコードされるＧＯＩの発現を阻止する。
【００１６】
本システムの一実施形態では、Ｌ７Ａｅをコードする核酸は細胞特異的ｍｉＲ認識エレメントも含む。適切な細胞中で発現されると、細胞特異的ｍｉＲはｍｉＲ認識エレメントと結合して、Ｌ７Ａｅの発現を停止させ、他の核酸上のＧＯＩの抑制を排除する。
【００１７】
翻訳調節システムの一実施形態では、目的のタンパク質はレポータータンパク質または他の目的の遺伝子である。翻訳調節システムの一実施形態では、レポータータンパク質または選択マーカーは、蛍光タンパク質、抗生物質耐性マーカー、または他の目的の遺伝子である。翻訳調節システムの一実施形態では、レポータータンパク質または選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、不活性ヒトＣＤ２５（ｉｈＣＤ２５）からなる群から選択される。本開示の転写／翻訳調節システムの一実施形態では、目的のタンパク質は細胞周期誘導タンパク質である。翻訳調節システムの一実施形態では、細胞周期誘導タンパク質は、Ｌｉｎ２８、Ｐｋｍ２、およびサイクリンＤ２からなる群から選択される。転写調節システムの一実施形態では、前記第１の核酸は、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のヌクレオチド配列を含む。転写調節システムの一実施形態では、前記第２の核酸は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
一態様では、本開示は、第１および第２の修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）を含む組成物に関し、ここで、前記第１のｍｏｄＲＮＡは、請求項１、２または３に記載の第１の核酸の発現産物であり、第２のｍｏｄＲＮＡは、第２の核酸の発現産物である。
【００１９】
一態様では、本開示は、心筋細胞（ＣＭ）においてタンパク質を発現させるための方法であって、前記ＣＭと、心筋細胞ｍｉＲ標的に特異的なｍｉＲ認識エレメントをコードするｍｏｄＲＮＡとを接触させることを含み、前記ｍｏｄＲＮＡが配列番号２、配列番号３、または配列番号３のヌクレオチド配列を含む方法に関する。
【００２０】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の第１および第２の核酸を含むベクターに関する。
【００２１】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の第１および第２の核酸、または本明細書に記載の第１および第２の核酸を含むベクターを含む転写／翻訳調節キットに関する。
【００２２】
一態様では、本開示は、心筋梗塞（ＭＩ）後の心筋細胞の増殖を誘導／再活性化するための方法であって、前記心筋細胞もしくは前記筋細胞の一部と、心筋細胞特異的ｍｉＲをコードする第１のｍｏｄＲＮＡおよび細胞周期誘導遺伝子をコードする第２のｍｏｄＲＮＡとを接触させることを含む方法に関する。
【００２３】
一態様では、本開示は、細胞周期誘導遺伝子が、Ｌｉｎ２８、Ｐｋｍ２およびサイクリンＤ２からなる群から選択される開示の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本開示のｍｏｄＲＮＡの生成に使用されるｐＴＥＭＰＬＺのプラスミドマップを示す図である。
【００２５】
【図２】図２は、ＤＮＡテール鋳型を合成するためのＰＣＲ設定をグラフ（上パネル）および表形式（下パネル）で示す図である。ボックス内に示されているのは、配列インサートのサイズに基づいて設定されなければならない伸長工程である。伸長工程はＯＲＦインサート１ＫＢにつき３０秒を要する。ＰＣＲ設定は、２Ｘ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘキットの製造元の指示書に基づく。
【００２６】
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ｍｏｄＲＮＡ合成についての品質管理分析の結果を示す図である。Ａ．ＯＲＦインサートを含むプラスミドｐＴＥＭＰＬＺおよびＩＶＴのためのテールＤＮＡ鋳型の正しいサイズを決定する１％アガロースゲル。Ｂ．最終的なｍｏｄＲＮＡ産物の理想的なＮａｎｏｄｒｏｐ結果。理想的な濃度は１５〜２０μｇ／μｌの間である。２６０／２８０値が２に近いほど純粋である。Ｃ．合成されたｍｏｄＲＮＡの品質管理のためのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ結果。
【００２７】
【図４】Ａ．ＬａｃＺ遺伝子でコードされたｍｏｄＲＮＡをインビボで注射したマウス心臓の全心臓図である。注射の２４時間後、マウスを屠殺し、心臓を４％ＰＦＡで固定し、そしてｘ−ｇａｌで染色した。Ｂ．核ＧＦＰでコードされたｍｏｄＲＮＡをインビボで注射したマウス心臓の免疫染色の図である。核ＧＦＰ（緑色）について陽性の（左から）心筋細胞（ＴｒｏｐＴ：赤色）、内皮細胞（Ｐｅｃａｍ１：赤色）および平滑筋細胞（ｓｍＭＨＣ：赤色）。（ＤＡＰＩ：青色）。Ｃ．ＣｒｅリコンビナーゼでコードされたｍｏｄＲＮＡを注射したＲｏｓａ２６  ＬａｃＺマウス心臓の断面図である。Ｃｒｅリコンビナーゼをトランスフェクトした細胞は、ｘ−ｇａｌで染色することができ、濃い青色になる。
【００２８】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、成体マウスの心筋梗塞および心不全モデルを示す図である。成体マウス心筋梗塞モデル（ＭＩモデル）は、ｍｏｄＲＮＡの直接筋肉内注射後に左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）の永久結紮を使用して実施する。ＭＩの１日以上後に、心臓を収集して免疫染色に使用する。Ｂ．ＭＩ後の成体マウス心臓に、Ｌｕｃ；ＬａｃＺおよびｎＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡを高度にトランスフェクトする。Ａ．心筋細胞（ＣＭ）、心臓線維芽細胞（ＣＦ）および内皮細胞（ＥＣ）を含むいくつかの細胞型は、ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトされている。  ＊＊＊
【００２９】
【図６】図６Ａ〜６Ｈは、成体ＣＭにおけるＰｋｍ２発現がＭＩ後の増殖を誘導することを示す図である。Ａ．生後１日または１０日のマウスの心臓における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＰｋｍ２の相対的発現。Ｂ．マウス心臓発達の異なる段階におけるＰｋｍ２またはα−アクチニン（ＣＭマーカー）の免疫染色のための実験計画。Ｃ．マウス心臓発達の異なる段階におけるＰｋｍ２発現の代表的な画像。Ｄ．インビボにおけるｍｏｄＲＮＡ送達後のＰｋｍ２発現の薬物動態学。Ｅ．ＣＭ増殖に対するＰｋｍ２の効果を測定するための実験スケジュールＦ．ＭＩ後７日のＣＭ（α−アクチニン＋）および非ＣＭ（α−アクチニン−）細胞におけるＤＮＡ合成（ＢｒｄＵ＋）の代表的画像。Ｇ．およびＨ．ＭＩ後７日の生体マウスのＣＭ（Ｆ）または非ＣＭ（Ｇ）における特徴的増殖マーカーの定量。結果は２回の独立した実験を表す（ｎ＝４）；白い矢頭はＣＭを指し、黄色い矢頭は非ＣＭを指す、＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊、Ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定、スケールバー１０μｍ。
【００３０】
【図７】図７Ａ〜７Ｋは、インビボでのｃｍｓｍｏｄＲＮＡの設計および機能を示す図である。Ａ．ｃｍｓｍｉＲを同定するために使用される構築物の設計および実験スケジュール。Ｂ．トランスフェクション後の、異なるｍｉＲに対する認識エレメントを有する、または有さないｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡ発現（赤色）の免疫染色画像。Ｃ．ｃの実験の定量化。Ｄ．インビボでのｃｍｓＣｒｅまたはｃｍｓｎＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡ送達に使用されるｍｏｄＲＮＡ構築物の設計。Ｅ〜Ｆ．ＭＩ後４日の、ｎＧＦＰ−Ｋ  ｍｏｄＲＮＡ（緑色）の単独トランスフェクト、またはｍｉＲ１−２０８との同時トランスフェクト。（Ｅ）ＭＩ後７日の心臓の代表的画像。（Ｆ）異なる比率でのｎＧＦＰ−ＫおよびｍｉＲ１−２０８のトランスフェクション効率。ｇ．Ｃｒｅ−Ｋ＋ｍｉＲ１−２０８を同時トランスフェクトしたＲｏｓａ２６ｍＴｍＧマウス。Ｇ．Ｃｒｅ−Ｋ＋ｍｉＲ１−２０８の同時トランスフェクション。赤色：トロポニンＩ。Ｈ．ｇの実験の定量化。Ｉ．増殖に対するｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡの効果を評価するための実験スケジュール。ＭＩ後７日のＣＭ（Ｊ）または非ＣＭ（Ｋ）における特徴的増殖マーカーの定量。結果は２回の独立した実験を表す（ｎ＝３マウス）；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊、Ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ、有意でない、両側スチューデントｔ検定（ｆ）または一元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定（ｊ、ｃ、ｋ）。スケールバーは、ｃおよびｆまたはｈにおいてそれぞれ１０μｍまたは５０μｍ。
【００３１】
【図８】図８Ａ〜８Ｎは、ｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡがＭＩ後の心機能および転帰を改善することを示す図である。Ａ．心機能と転帰を評価するための実験スケジュール。Ｂ．ＭＩ後１ヶ月の左心室収縮機能のＭＲＩ評価。画像は、拡張期および収縮期の左心室（赤で囲まれている）を表す。Ｃ．ｂの実験の駆出率の割合。Ｄ．ＭＩ後２日目（ベースライン）と２８日目との間の左室内径短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｓｈｏｒｔｉｎｇ）の差のパーセンテージデルタのエコー評価。Ｅ．ＭＩ後２８日の瘢痕サイズを評価するためのマッソントリクローム染色の代表写真。Ｆ〜Ｉ．ＭＩ後２８日の瘢痕サイズ（Ｆ）、心臓重量対体重比（Ｇ）、ＣＭサイズ（Ｈ）、および毛細血管密度（Ｉ）の定量。Ｊ〜Ｍ．ＭＩ後２８日の異なる治療を用いたＣＭ数。Ｊ．各群のＣＭ数の代表的画像。Ｄ．ｊの実験の定量化Ｌ．単離されたＣＭの核（単核、二核または多核）の代表的な画像。Ｍ．ｌの実験の定量化。Ｎ．Ｐｋｍ２−Ｋまたはｌｕｃ−Ｋ  ｍｏｄＲＮＡを注射し、ｍｉＲ１−２０８を同時トランスフェクトしたマウスについてのＭＩ後長期生存曲線。結果は２回の独立した実験を表す（ｎ＝５マウス）；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊、Ｐ＜０．０５、一元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定。長期生存についてのＰ値は、マンテル−コックスログランク検定を用いて計算した。スケールバー１０μｍ。
【００３２】
【図９】図９Ａ〜９Ｍは、ＭＩ後のｃｍｓ  Ｐｋｍ２を発現するＣＭの系統追跡を示し、トランスフェクトされたＣＭの数の増加およびＰｋｍ２の機能の重要な下流メディエーターの誘導を示す図である。Ａ．Ｒ２６ｍＴｍＧマウスにおける心臓系統追跡のために使用した実験スケジュール。Ｂ．ＭＩ後２８日のＣＭまたは非ＣＭのトランスフェクション効率（ＧＦＰ＋％）。Ｃ．ＭＩ後２８日のＣＭおよびその子孫（ＧＦＰ＋）の代表的画像。Ｄ．ＭＩ後３日または２８日のＧＦＰ＋ＣＭの定量化。ＭＩ後２８日の、心臓対体重比（Ｅ）、ＧＦＰ＋ＣＭの相対サイズ（Ｆ）、および心臓のＧＦＰ＋ＣＭの核数（Ｇ）。Ｈ．ＭＩ後２８日のＧＦＰ＋ＣＭの、ｐＨ３＋またはＫｉ６７＋の代表的画像。ＭＩモデルにおけるｃｍｓＬｕｃまたはｃｍｓＰｋｍ２とｃｍｓＣｒｅ  ｍｏｄＲＮＡとのトランスフェクション後２８日のＧＦＰ＋ｐＨ３＋ＣＭ（Ｉ）またはＧＦＰ＋Ｋｉ６７＋ＣＭ（Ｊ）の定量化。ｋ〜ｍ．ＭＩおよびｃｍｓｉｈＣＤ２５とｃｍｓＬｕｃまたはｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡとの投与の２日後、成体ＣＭを磁気ビーズを用いて単離した。Ｋ．単離されたＣＭの純度を検証するためのｑＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｌ．成体ＣＭにおけるＰＰＰ（Ｇ６ＰＤ）と、Ｐｋｍ２の重要な下流間接的転写標的との両方に対する重要な遺伝子の遺伝子発現比較。Ｍ．細胞周期促進遺伝子または細胞周期阻害因子の発現。結果は２回の独立した実験を表す（ｎ＝３マウス）；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊、Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ、有意でない、両側スチューデントｔ検定（ｂ〜ｊ）、またはボンフェローニ事後検定による分散分析（ｋ〜ｍ）。スケールバーはそれぞれｃまたはｈにおいて５０または１０μｍ。
【００３３】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂ（Ｓ１）は、成体ＣＭがインビトロでｍｏｄＲＮＡを首尾よくトランスフェクトされることを示す。単離した成体ＣＭに核ＧＦＰ（ｎＧＦＰ）をトランスフェクトし、トランスフェクションの２０時間後に画像化した（バー＝１０μｍ）。  ＊＊＊
【００３４】
【図１１】図１１（Ｓ２）は、細胞周期誘導ｍｏｄＲＮＡを用いたインビボでの成体ＣＭの増殖の活性化が、ＣＭの完全性を損なわないことを示す棒グラフである。ＣＭサイズは、ＭＩおよび異なるｍｏｄＲＮＡ処理の７日後の心臓において、ＣＭの断面積評価のための小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）染色を用いて測定した。結果は、細胞周期誘導因子Ｌｉｎ２８またはＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡが成体マウスＭＩモデルに送達された場合、ＣＭの完全性およびサイズに有意差がないことを示している。結果は、２回の独立した実験を表す、ｎ＝３匹のマウス、Ｎ．Ｓ、有意ではない、両側スチューデントｔ検定。
【００３５】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃ（Ｓ３）は、細胞周期誘導ｍｏｄＲＮＡを使用するインビボでの成体ＣＭ増殖の活性化が、ＣＭアポトーシスを減少させ、毛細血管密度を増加させることを示す。ＣＭ増殖（Ｋｉ６７＋）、アポトーシス（ＴＵＮＥＬ＋）および毛細血管密度（Ｃｄ３１＋管腔構造）を、ＭＩおよび異なるｍｏｄＲＮＡ処理の７日後に心臓の左心室において測定した。Ａ．ＭＩの７日後のＬｉｎ２８、細胞周期誘導ｍｏｄＲＮＡ処理がＣＭ増殖を誘導し、アポトーシスを減少させ、毛細血管密度を増加させることを示す代表的データ。異なる処理によるアポトーシス（Ｂ）または毛細血管密度（Ｃ）レベルの定量化結果。結果は、Ｌｉｎ２８（赤色）およびＰＫＭ２などの細胞周期誘導遺伝子を用いたＣＭアポトーシスの有意な減少および毛細血管密度の上昇を示す。結果は、２回の独立した実験を表す、ｎ＝３匹のマウス、＊＊＊、Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定。
【００３６】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃ（Ｓ４）は、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８がインビトロでラット新生仔ＣＭにおいて排他的に発現されることを示す図である。Ａ．ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ１、ｍｉＲ１３３ａ、ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ１９９、ｍｉＲ３７８およびｍｉＲ２９ａに対するｍｉＲ認識エレメントを有する、または有さない不活性ヒトＣＤ２５（ｉｈＣＤ２５）ｍｏｄＲＮＡをインビトロで新生仔ＣＭにトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を固定し、抗ＣＤ２５（赤色）およびトロポノイン（Ｔｒｏｐｏｎｏｉｎ）Ｉ（ＣＭマーカー、緑色）で染色した。Ｂ．ｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡがｍｉＲ−１またはｍｉＲ−２０８の認識エレメントを有する場合、ＣＭ（トロポノインＩ＋細胞）はｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡ（トロポノインＩ＋およびｉｈＣＤ２５＋ＣＭ）を翻訳することができず、他の処理はＣＭにおいてｉｈＣＤ２５の翻訳をもたらしたことを示す、様々な処理についての画像。これは、ｍｉＲ−１またはｍｉＲ−２０８のみがＣＭ特異的であることを示している。Ｃ．実験の定量化。結果は、２回の独立した実験を表す、ｎ＝３ウェル、バー＝１０ｍｍ。
【００３７】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃ（Ｓ５）は、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８がインビトロでラット新生仔ＣＭにおいて排他的に発現されることを示す図である。Ａ．ｍｉＲ−２０８またはｍｉＲ１に対するｍｉＲ認識エレメントを含む、または含まないｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡを、インビトロで新生仔ＣＭにｎＧＦＰと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を固定し、抗ＣＤ２５（赤色）およびトロポニンＩ（ＣＭマーカー、緑色核）で染色した。ｎＧＦＰをトランスフェクション対照として使用した。Ｂ．ｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡがｍｉＲ−１またはｍｉＲ−２０８の認識エレメントを有する場合、ＣＭ（トロポノインＩ＋細胞）はｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡ（トロポノインＩ＋およびｉｈＣＤ２５＋細胞）を翻訳することができなかったが、ｍｉＲ認識エレメントを含まないｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡはＣＭにおいて翻訳することができたことを示す、様々な処理についての画像。全ての細胞にｎＧＦＰをトランスフェクトして、ｍｏｄＲＮＡが首尾よく送達されたことが示されている。Ｃ．実験の定量化。結果は、２回の独立した実験を表す、ｎ＝３ウェル、バー＝１０ｍｍ。
【００３８】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃ（Ｓ６）は、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８がインビボで成体マウス心臓において排他的に発現することを示す。Ａ．ｍｉＲ−２０８またはｍｉＲ１に対するｍｉＲ認識エレメントを含む、または含まないｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡを、ＭＩモデルの成体マウスの心臓にｎＧＦＰと同時トランスフェクトした。ＭＩおよびｍｏｄＲＮＡの送達の２０時間後、心臓を収集し、固定し、抗ＣＤ２５（赤色）、トロポノインＩ（ＣＭマーカー、白色）およびｎＧＦＰ（緑色）で染色した。ｎＧＦＰをトランスフェクション対照として使用した。Ｂ．ｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡがｍｉＲ−１またはｍｉＲ−２０８の認識エレメントを有する場合、ＣＭ（トロポノインＩ＋細胞）はｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡ（トロポノインＩ＋およびｉｈＣＤ２５＋細胞）を翻訳することができず、ｍｉＲ認識部位を含まないｉｈＣＤ２５のトランスフェクトにより、ｉｈＣＤ２５はＣＭにおいて翻訳されたことを示す、様々な処理についての画像。全ての細胞にｎＧＦＰをトランスフェクトして、ｍｏｄＲＮＡが首尾よく送達されたことが示されている。Ｃ．実験の定量化。結果は、２回の独立した実験を表す、合計でｎ＝５匹のマウス、バー＝１０ｍｍ。
【００３９】
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｃ（Ｓ７）は、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−１、または１：１の比で両方に対する認識エレメントを担持するｎＧＦＰ  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡが、インビトロで主にＣＭにおいてｎＧＦＰ翻訳を示すことを示す図である。Ａ．ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡの設計。Ｂ．ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−１、または１：１の比でその両方に対する認識エレメントを担持するｎＧＦＰ  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡをインビトロで新生仔ラットＣＭにトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を固定し、ｎＧＦＰ（核、緑色）およびトロポニンＩ（ＣＭのマーカー、赤色）で染色した。Ｃ．Ｂに記載の実験の定量化。結果は２回の独立した実験を表す、ｎ＝３ウェル、バー＝１０ｍｍ。
【００４０】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃ（Ｓ８）は、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−１、または１：２．５の比で両方に対する認識エレメントを担持するｎＧＦＰ  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡが、インビトロでＣＭにおいて排他的にｎＧＦＰ翻訳を示すことを示す図である。Ａ．ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡの設計。Ｂ．ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−１、または異なる比で両方に対する認識エレメントを担持するｎＧＦＰ  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡを、インビトロで新生仔ラットＣＭにトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を固定し、ｎＧＦＰ（核、緑色）およびトロポニンＩ（ＣＭマーカー、赤色）について染色した。Ｃ．Ｂに記載の実験の定量化。結果は２回の独立した実験を表す、ｎ＝３ウェル、バー＝１０ｍｍ。
【００４１】
【図１８】図１８（Ｓ９）は、１：０．５以上の比で、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８の両方についての認識エレメントを担持するｎＧＦＰ  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡが、インビボでＣＭにおいて排他的にｎＧＦＰ翻訳を示す図である。結果は、２回の独立した実験を表す、ｎ＝３匹のマウス、バー＝１０ｍｍ。
【００４２】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃ（Ｓ１０）は、Ｐｋｍ２  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡが、ＣＭにおいて排他的に増殖を促進する図である。Ａ．実験スケジュールＢ．実験に使用したｍｏｄＲＮＡの設計。Ｃ．Ｌｉｎ２８／ＰＫＭ２  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡは、ＣＭにおいて排他的に増殖を促進する。Ｄ．Ｌ７ＡＥ−ｍｉＲ１およびｍｉＲ２０８と同時トランスフェクトしたｋモチーフを有するＰＫＭ２  ｍｏｄＲＮＡを、マウス心筋梗塞モデルにおける送達後７日目の成体マウス心筋細胞の増殖再活性化について試験した。赤い破線は対照増殖速度を表す。結果は、２回の独立した実験を表す、ｎ＝２匹のマウス（合計ｎ＝４匹のマウス）、＊＊＊Ｐ＜０．００１、Ｎ．Ｓ、有意ではない；両側スチューデントｔ検定。
【００４３】
【図２０】図２０（Ｓ１１）は、Ｌ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡが、成体マウス心筋梗塞モデルにおいて免疫応答を上昇させなかった図である。Ｌ７ＡＥを、様々なｍｉＲの認識エレメントを伴って、または伴わずに送達した後に免疫応答の上昇（ＣＤ４５＋細胞、赤）が見られないことを示す高品質の画像。スケールバー＝１０μｍ。
【００４４】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃ（Ｓ１２）は、ｍｉＲ−２０８またはｍｉＲ１または両方に対するｍｉＲ認識エレメントを含む、または含まないＬ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡの、インビボでのＣＭの増殖およびサイズに対する評価の図である。Ａ．ＭＩ後のマウス成体心臓に、ｍｉＲ認識エレメントを伴わずに、またはｍｉＲ−１もしくはｍｉＲ−２０８または両方に対する認識エレメントを伴って、Ｌｕｃ、Ｌ７ＡＥを注射した。ＭＩ後７日目に心臓を収集し、固定し、処理した心臓のＣＭサイズを測定するために、Ｋｉ６７、ＢｒｄＵ、Ｈ３ＰおよびＡｕｒｏｒａ  Ｂ（Ｂ）などの異なる増殖マーカーならびにＷＧＡについて染色した（Ｃ）。結果は、ｍｉＲ−２０８もしくはｍｉＲ−１またはその両方に対するｍｉＲ認識エレメントを伴うＬ７ＡＥが、ＣＭサイズを損なうことなくＣＭ増殖を誘導することを示す。結果は、２回の独立した実験を表す、ｎ＝３匹のマウス、Ｎ．Ｓ、有意ではない、＊＊＊、Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定。
【００４５】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃ（Ｓ１３）は、ｎＧＦＰを発現するために使用される転写／翻訳調節システムを示す。  ＊＊＊
【００４６】
【図２３】図２３は、ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡアプローチおよび磁気ビーズ選別を用いて、ＭＩ後の心臓からトランスフェクト成体ＣＭを単離した結果を示す。Ａ．成体ＣＭの単離は、ＭＩおよびｍｏｄＲＮＡ投与の２日後に行った。抗ｈＣＤ２５磁気ビーズを用いてＣＤ２５陽性細胞を単離した。Ｂ．ＣＦＷマウスに、ｉｈＣＤ２５およびｋモチーフを担持するｎＧＦＰをトランスフェクトした。このアプローチで単離された陽性細胞は全てＧＦＰ＋ｉｈＣＤ２５＋である。Ｃ．ｍｉＲ１およびｍｉＲ２０８の認識エレメントを担持するＬ７ＡＥ（ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡ）を一緒にトランスフェクトした場合、トランスフェクトＣＭ（ｎＧＦＰ＋およびｉｈＣＤ２５＋）および非トランスフェクトＣＭおよびｎｏ−ｃｍｓの混合物が生じる。Ｄ．ｈＣＤ２５磁気ビーズを使用すると、トランスフェクトＣＭのみを単離することができる。マウス＝３。
【００４７】
【図２４】図２４は、Ｌｉｎ２８またはＰｋｍ２  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡが、ＭＩおよび注射の２８日後にマウス心筋梗塞モデルにおいて心機能を改善することを示す図である。心エコー検査を使用して、ＭＩ後２日目および２８日目に異なる処理群について心機能を測定した。結果は、Ｌｉｎ２８またはＰｋｍ２がＣＭ特異的様式（＋Ｌ７Ａｅ  ｍｉＲ１＋ｍｉＲ２０８）で送達された場合、相乗効果によりＬｉｎ２８またはＰｋｍ２処理群において心機能の改善を示す。ｎ＝３匹のマウス、＊＊＊、Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定。
【発明の詳細な説明】
【００４８】
本明細書に引用された全ての特許、公開出願および他の参考文献は、参照により本出願に組み込まれる。本発明を開発するのに使用される方法論は、特に他のことが明示されない限り、当業者には周知である。
【００４９】
以下の説明では、専門用語の使用に関して特定の規則に従うものである。一般に、本明細書で使用される用語は、当業者に公知のそれらの用語の意味で一貫して解釈されることを意図している。いくつかの定義は純粋に読者の便宜のために提供される。
【００５０】
「ｍｉＲＮＡに対する認識エレメント」または「ｍｉＲＮＡ認識エレメント」という用語は、内因性ｍｉＲＮＡに結合し、認識エレメントを細胞に導入した場合に前記認識エレメントを含む構築物の発現を阻害するように設計された一本鎖ＲＮＡ系オリゴヌクレオチドを指す。
【００５１】
「ｍｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡの切断または翻訳の抑制に関与するｍＲＮＡに相補的な配列を指す。内因性成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導複合体の一部として機能し、これは、結合したｍｉＲＮＡと部分的に相補性のある配列を有するｍＲＮＡを、転写後に調節する能力を有する。抗ｍｉＲＮＡ配列のｍｉＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを通じて、ｍｉＲＮＡ配列の機能は、標的へのその選択的結合を妨げることによって中和される。
【００５２】
「ｍｏｄＲＮＡ」という用語は、目的の遺伝子の発現に使用することができる合成修飾型ＲＮＡを指す。ｍｏｄＲＮＡにおいてなされた化学修飾、例えばウリジンに対するプソイドウリジンの置換は、分子を安定化して転写を増強する。さらに、免疫系を活性化することができるタンパク質薬剤の細胞への直接送達とは異なり、ｍｏｄＲＮＡの送達は免疫の影響なしに達成することができる。インビボおよびインビトロ発現のためのｍｏｄＲＮＡの使用は、例えば、国際公開第２０１２／１３８４５３号パンフレットにさらに詳細に記載されている。
【００５３】
用語「不活性ヒトＣＤ２５」（ｉｈＣＤ２５）は、細胞外ドメインのみを有し、そして細胞内にシグナル伝達することができない切断型インターロイキン−２受容体を指す。他の種、例えば、不活性マウスＣＤ２５もまた開示された方法に使用することができる。
【００５４】
本開示は、目的の細胞において発現が望まれる目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするｍｏｄＲＮＡの、細胞特異的発現を達成するための方法論に関する。一態様では、本開示は、細胞特異的転写のための発現調節システムであって、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’ＵＴＲを有し、（１）その３’ＵＴＲの上流の細胞特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）認識エレメントと、（２）翻訳抑制タンパク質とをコードする第１の核酸；ならびに５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを有し、（１）その５’ＵＴＲの下流の、前記翻訳抑制タンパク質に結合する抑制タンパク質相互作用モチーフ、例えばＫモチーフと、（２）目的のタンパク質をコードする遺伝子とをコードする第２の核酸を含むシステムを記載する。
【００５５】
ＭＩに対する現在の治療法は、筋細胞の喪失の結果に対処しているが、喪失した心筋の心筋修復を増強するのには効果的ではない（３、５）。近年、１日目の成体哺乳動物心臓細胞（マウス）がＣＭの増殖を介して心臓自体を再生できることが実証された（７）。再生段階と非再生段階との間の遺伝的差異を調べると、これらの段階間で最も差次的に発現される遺伝子は有糸分裂および細胞周期カテゴリーに属することが見出された（７）。
【００５６】
修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）は体細胞遺伝子導入のための効果的かつ安全なツールとして浮上しており、心臓への遺伝子送達のために本発明者らおよび他の人々によって使用されて成功している。１０，１２−１５ここで本発明者らは、増殖促進因子であり、癌において高い頻度で調節不全となるピルビン酸キナーゼ筋アイソザイムＭ２（Ｐｋｍ２）１６，１７が、再生期の胎仔および初期の新生仔のＣＭでは高度に発現されるが、成体のＣＭでは発現されないことを示す。本開示のｍｏｄＲＮＡのＭＩ後の成体ＣＭ（ｃｍｓＰｋｍ２）への排他的送達を用いたＰｋｍ２レベルの回復は、有意かつ排他的にＣＭ増殖を誘導し、心機能改善、瘢痕サイズ減少、心臓対体重比の増加、ＣＭサイズ減少、アポトーシスの減少および毛細血管密度の増加を誘導した。これらの再生過程は、ＭＩ後の長期生存の増加につながった。系統追跡およびＰｋｍ２トランスフェクトＣＭの単離、それに続くＭＩ後の遺伝子発現分析を用いて、本発明者らは、Ｐｋｍ２トランスフェクトＣＭコロニーの数の増加、ならびに増殖促進性細胞質の重要な下流エフェクター（ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）による１８，１９）、およびＰｋｍ２の核（β−カテニンおよびＨｉｆ１αのトランス活性化２０，２１による）機能の関与の可能性を示す。本発明者らの結果は、高度に翻訳可能で臨床的に適応可能なプラットフォームを用いた、増殖促進性遺伝子の短いパルスが、ＣＭ増殖および心臓再生を誘導するのに十分であることを示している。これらの知見は、心疾患におけるｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡの治療的可能性を強調している。
【００５７】
ＣＭの増殖の再活性化は心臓再生戦略における重要なエレメントである。ゼブラフィッシュとイモリの心臓再生は、主にＣＭの増殖によって媒介される３，５，７，８。哺乳動物の胎仔の発達において、ＣＭの増殖は心臓の成長と再生のための別個の経路である９，２２。損傷後の成体ＣＭは胎仔遺伝子のサブセットを上方制御することが示されており、これは成体ＣＭが最終的に分化せず、ある程度の細胞可塑性を有することを示唆している４，９。成体哺乳動物ＣＭはインビトロおよびインビボで分裂することができ、この能力は増殖促進性遺伝子を上方制御することによって刺激することができる９，２２−３３。長年にわたり、成体のＣＭ細胞周期再突入の再活性化がタンパク質２３，２４，２６，３０，３４、ウイルス２６，３０，３１，３５、または増殖促進遺伝子のトランスジェニックマウスモデル２５，２８，３３を介して可能であることがいくつかの出版物によって示されている。細胞周期誘導を目的としたタンパク質投与は、非常に短い半減期、局所投与の困難性、ＣＭ特異性の欠如、および転写因子などの細胞内遺伝子を送達することができないために困難である。心臓特異的アデノ随伴ウイルス（ＣＭＳＡＡＶ）ベクターは免疫原性ではなく、多くの心臓研究で使用されているが、制御されていないＣＭサイズの増大および心臓肥大および不整脈につながる可能性がある非常に長い持続的な発現時間を有する。トランスジェニックマウスはＣＭ特異的および一過性の方法で使用することができるが、それらは遺伝子送達に関して臨床的に適切ではない。現在のアプローチでの課題は、細胞周期誘導遺伝子を安全かつ局所的に、一過性、効率的かつ制御された方法でＣＭに送達することができる効率的な遺伝子送達アプローチの必要性を強調している。ピルビン酸キナーゼ筋アイソザイムＭ２（Ｐｋｍ２）は細胞周期誘導因子である。発達中に、Ｐｋｍ２は脾臓および肺を含む多くの成体組織において発現されるが、成人期にはＰｋｍ２は高い同化活性を有する増殖細胞において厳密に発現される１６，１７。Ｐｋｍ２は、成体細胞および癌細胞の増殖、血管形成を増大させ、酸化ストレスによって引き起こされるアポトーシスを予防することが見出された１８，２０，３６−４２。Ｐｋｍ２は、その２つの別個の機能によってその機能を発揮する：細胞質において、Ｐｋｍ２は、ホスホエノールピルビン酸のピルビン酸への変換を減少させることによって、代謝運命を解糖からペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に移行させる１８，１９。これは、ガラクトースの蓄積、解糖中間体、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ｐｄ）によるＰＰＰの活性化をもたらす４３−４５。ＰＰＰ経路活性化は、ヌクレオチド、アミノ酸、および脂質の合成ならびに還元型ＮＡＤＰＨの生成をもたらし、一酸化窒素シンターゼおよびＤＮＡ修復を増加させる３８，３９，４１，４６−４８。また、Ｐｋｍ２は核内でも役割を果たしている。Ｐｋｍ２は、転写因子β−カテニンおよびＨｉｆ１αと直接相互作用する。この相互作用は、Ｃｃｄｎ１、ｃ−ＭｙｃおよびＶｅｇｆａ、ならびにＢｃｌ２などにおける遺伝子の発現を促進する２０，２１。図５（Ｓ１）の増殖細胞または癌細胞におけるＰｋｍ２の役割��要約を参照されたい。
【００５８】
いくつかの研究は、細胞周期誘導遺伝子がＣＭを増殖に誘導できることを示している（８〜２２）。しかしながら、ＣＭにおけるこれらの遺伝子の長期間にわたる活性化は、ＣＭの肥大、場合によっては肥大型心筋症およびＨＦをもたらす可能性がある（１４）。さらに、細胞周期誘導遺伝子の全身送達は、心臓内および体全体に非ＣＭ細胞の制御されない細胞増殖をもたらし得、そして安全性の問題を引き起こし得る。
【００５９】
心臓における異なる細胞周期誘導遺伝子の差次的発現は心臓発達中に変化する。他者および本発明者らは、生後の２つの異なる時点（１日目と１０日目）が、心臓がＣＭ増殖による再生能力を有する（１日目）発達段階、およびこの能力を欠いている（１０日目）発達段階を表すので、これらの時点に注目した。図１ａに見られるように、いくつかの細胞周期誘導因子は発達の２つ段階の間で有意に変化する。しかし、マウス心臓のＰｋｍ２レベルは胎仔発達の間に高く４９、生後１０日目までに非常に有意に減少する。最も重要なＰｋｍ２はいくつかの細胞周期誘導遺伝子の上流にあり、Ｐｋｍ２とＣＭマーカーのα−アクチニンの共免疫染色に対するその変化により、Ｐｋｍ２は発達中および生後１日の間にＣＭにおいて高度に発現されることが明らかになったが、その発現は生後８週間には検出されなかった（図１ｂおよびｃ）。ＭＩ後心臓におけるＰｋｍ２発現は、免疫細胞（ＣＤ４５＋）および非ＣＭに限定されたが、ＣＭでは上方制御されなかった（補足図２ａおよびｂ）。本発明者らは、心筋へのＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡの直接注射によってＰｋｍ２レベルを回復させた（図１ｃ）。心筋注射後のＰｋｍ２レベルの薬物動態学的研究は、Ｐｋｍ２タンパク質発現が注射後数時間で起こり、そして少なくとも８日間持続されるが、１２日間までは持続しないことを示した（図１ｄ）。ＣＭ増殖に対するＰｋｍ２発現の効果を試験するために、本発明者らは、４日齢の新生仔ラットＣＭを単離し、それらにＬｕｃ対照またはＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡをランスフェクトした（補足図３ａおよびｂ）。Ｐｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡはトランスフェクションの１２時間後に翻訳され、レベルはトランスフェクション後１０日まで維持された（補足図３ｃ）。Ｐｋｍ２またはＬｕｃ  ｍｏｄＲＮＡを用いたトランスフェクションの３日後に、Ｐｋｍ２をトランスフェクトしたＣＭの増殖が有意に増加した（補足図３ｄおよびｅ）。ＭＩ状況におけるＰｋｍ２効果を試験するために、本発明者らはＬＡＤ結紮直後に心筋に直接Ｐｋｍ２またはＬｕｃ  ｍｏｄＲＮＡを注射した。１３−１５  ＭＩおよび注射の１週間後、Ｐｋｍ２はＣＭおよび非ＣＭの増殖を有意に誘導した（図１ｅ〜ｈ）。増殖能力の観察された改善は、より良い再生につながる可能性があり、ＭＩ後の転帰の改善をもたらし得るという仮説を立てた。しかしながら、心臓において非ＣＭの増殖を誘導することは、主に線維症および免疫応答を促進することによって、しばしば望ましくない効果をもたらす。したがって、本発明者らは２つの異なるｍｏｄＲＮＡに基づく独特なＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡ（ｃｍｓｍｏｄＲＮＡ）システムを開発した（図２と補足図４と５）。第１の構築物は、キンクターンモチーフ（Ｋモチーフ）を含む遺伝子の翻訳を調節する古細菌リボソームタンパク質であるＬ７ＡＥ、Ｌ７ＡＥに対する特異的結合部位を含む５０，５１。Ｌ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡの翻訳は、２つが細胞に同時トランスフェクトされている場合、設計された目的の遺伝子ｍｏｄＲＮＡの翻訳を抑制する。ＣＭ特異的マイクロＲＮＡ（ｃｍｓｍｉＲ）認識エレメントをＬ７ＡＥ遺伝子の３’ＵＴＲに加えることによって、本発明者らは、それらのｍｉＲを豊富に、かつほとんど��他的に発現するＣＭにおけるＬ７ＡＥの翻訳を妨げ、ＣＭにおける目的の遺伝子ｍｏｄＲＮＡの厳密な翻訳を可能にした（補足図４）。ｍｉＲ１−１（ｍｉＲ−１）、ｍｉＲ−２０８ａ（ｍｉＲ−２０８）、およびｍｉＲ−１９９ａ（ｍｉＲ−１９９）は、主にＣＭで発現されることが報告されている５２−５４。本発明者らは、ｈＣＤ２５の細胞外ドメインのみを含有する切断型遺伝子である不活性ヒトＣＤ２５（ｉｈＣＤ２５）を、細胞／組織の表面で発現されると免疫染色され得るレポーター遺伝子として生成することによって、本発明者らのモデルにおいてそれらのｍｉＲの発現を試験した。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０８、またはｍｉＲ−１９９の認識エレメントを伴う、または伴わないｉｈＣＤ２５構築物の２つのバージョンを設計した。ｍｏｄＲＮＡを新生仔ＣＭにトランスフェクトするか（補足図５ａ〜ｆ）、またはＭＩモデルを使用して注射した（図２ｇａ〜ｃおよび補足図５ｇおよびｈ）。ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８は、非ＣＭではｉｈＣＤ２５染色陽性で示されるがＣＭでは陽性ではないことから、ＣＭ特異的であることが見出された。ｍｉＲ−１とｍｉＲ−２０８の両方の認識エレメントを含むＬ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡ（ｍｉＲ−１−２０８）を設計し（図２ｄ−ｋ）、核ＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡ（ｎＧＦＰ−Ｋ）およびＫモチーフを含むＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ−Ｋ）ｍｏｄＲＮＡを使用した。本発明者らのＭＩモデルでは、ｎＧＦＰ−Ｋのトランスフェクションは、ＣＭおよび非ＣＭの両方においてｎＧＦＰの翻訳をもたらした。しかしながら、ｎＧＦＰ−ＫがｍｉＲ−１−２０８と同時トランスフェクトされた場合、ｎＧＦＰはＣＭにおいて排他的に翻訳された（図２ｅおよびｆ）。Ｒｏｓａ２６レポーターマウス（Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧ）を用いた本発明者らのＭＩモデルにおけるＣｒｅ−ＫとｍｉＲ−１−２０８との同時トランスフェクションは、厳密にＣＭにおいてＧＦＰ発現をもたらした（図２ｇ）。Ｃｒｅ−Ｋ単独の注射は、左心室（ＣＭおよび非ＣＭの両方）において心臓切片の約２４．８％／約２６００細胞のトランスフェクション効率をもたらした。しかしながら、Ｃｒｅ−Ｋ＋ｍｉＲ１−２０８の組み合わせは、７．７％／排他的に約８００細胞のＣＭ、というトランスフェクション効率をもたらした（図２ｈ）。本発明者らはまた、非哺乳動物タンパク質Ｌ７ＡＥがＭＩ後の免疫応答を悪化させないことを示す（補足図６）。本発明者らは、これがＭＩ直後の心臓におけるすでに活発な免疫応答によるものであると仮定する。本発明者らは、マウスモデルにおけるＬ７ＡＥの使用は免疫学的に安全であると結論した。本発明者らのＭＩモデルにおいて本発明者らのｃｍｓｍｏｄＲＮＡ送達プラットフォームの機能性を試験するために、Ｌｕｃ−Ｋ、ｍｉＲ１−２０８、Ｌｕｃ  Ｋ＋ｍｉＲ１−２０８、Ｐｋｍ２−Ｋ、Ｐｋｍ２＋ｍｉＲ１−２０８、またはＰｋｍ２−Ｋ＋ｍｉＲ１−２０８（ｃｍｓＰｋｍ２）を直接注射した。トランスフェクションの７日後に、本発明者らは心臓における増殖速度を測定した（図２ｉ）。Ｐｋｍ２−Ｋ  ｍｏｄＲＮＡ単独またはＰｋｍ２＋ｍｉＲ１−２０８は、Ｌｕｃ  ｍｏｄＲＮＡと比較して、ＣＭおよび非ＣＭの両方の増殖を有意に増���させた（Ｐ＜０．００１）（図２ｊおよびｋ）。しかしながら、ｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡは、ＣＭのみの増殖を有意に再活性化し（Ｐ＜０．００１）、非ＣＭの増殖には有意な影響を及ぼさなかった。新生仔ラットＣＭの２４時間のライブイメージングを使用して、ｃｍｓｎＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡとｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡの同時トランスフェクションが、ｃｍｓｎＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡ単独でのトランスフェクションと比較して、ＣＭ増殖を増加させることを見出した（補足動画１）。さらに、ｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡは、ＭＩ後２日または７日目の心筋においてアポトーシスを有意に減少させ、毛細血管密度を増加させた（補足図７ａ〜ｅ）。ＭＲＩまたはエコーは、ｃｍｓＰｋｍ２が駆出率のパーセンテージを有意に増加させ（図３ａ〜ｄおよび補足動画２および３）、ＭＩ後２日目（ベースライン）から２８日目までに左室内径短縮率のパーセンテージデルタを増加させた（図３ｄ）ことを示した。ＭＩ後２８日目の対照と比較して、ｃｍｓＰｋｍ２マウスでは左心室内径の収縮末期が増加し、左心室の内径の拡張末期が有意に増加した（補足図７ｆ〜ｈ）。ＭＩの２８日後、Ｐｋｍ２またはｃｍｓＰｋｍ２の発現は心瘢痕形成を有意に減少させた。さらに、ｃｍｓＰｋｍ２の注射後に心臓組織の異常（例えば血管腫、浮腫）は観察されず（図３ｅおよびｆ）、心臓重量対体重比は有意に増加した（図３ｇ）が、ＣＭサイズは有意に減少し、対照と比較して、Ｐｋｍ２またはｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡトランスフェクションにおいて、ＣＭの増殖（図３ｈおよび補足図７ｉ）、および毛細血管密度が有意に増加した（図３ｉ）ことを示している。最後に、ｃｍｓＰｋｍ２は、対照と比較して単核画分を増加させながら、ＣＭあたりの核数を上昇させることなく心臓においてＣＭ数を有意に増加させた（図３ｊ〜ｍ）。重要なことに、ｃｍｓＬｕｃまたはｃｍｓＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡでＭＩの直後に処理したマウスの長期生存曲線は、ＭＩおよびｃｍｓＰｋｍ２トランスフェクション後のマウスの生存において有意な改善を示した（図３ｎ）。ｃｍｓＰｋｍ２がＭＩ後の心機能を改善するメカニズムを理解するために、ｃｍｓｍｏｄＲＮＡとＲ２６ｍＴｍＧとを組み合わせて（図４ａ〜ｊ）、ＣＭにおいてＰｋｍ２／Ｌｕｃを排他的に発現する（ｃｍｓＰｋｍ２／ｃｍｓＬｕｃ＋ｃｍｓＣｒｅ  ｍｏｄＲＮＡを混合することによって；ＧＦＰ標識ＣＭ、図４ａおよびｂ）系統追跡モデルを使用し、ｃｍｓｍｏｄＲＮＡがもはや発現されなくなった後、経時的にトランスフェクトされたＣＭの運命および特性を追跡する。ｃｍｓＰｋｍ２＋Ｃｒｅ  ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトしたＣＭの数は、対照と比較して、ＭＩ後３日でより多く、ＭＩ後２８日で有意に多かった（図４ｃおよびｄ）。ｃｍｓＰｋｍ２＋Ｃｒｅ  ｍｏｄＲＮＡで処理したマウスでは、対照と比較して心臓重量対体重比は有意に増加し（図４ｅ）、一方、ＧＦＰ＋ＣＭサイズ（図４ｆ）および核数／細胞（図４ｇ）が有意に減少した。重要なことに、ｃｍｓＰｋｍ２＋Ｃｒｅ  ｍｏｄＲＮＡでの処理の２８日後、ＧＦＰ＋ＣＭは、Ｐｋｍ２が発現されなかった後長期に、ｐＨ３およびＫｉ６７などの増殖性マーカーの発現の上昇を示した（図４ｈ〜ｊ）。ＭＩ状況におけるｃｍｓＰｋｍ２またはｃｍｓＬｕｃと併せたｃｍｓｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡの送達後の遺伝子発現の変化を、注射の２日後に測定した。単離された細胞は、ＣＭマーカーが豊富であり、トロポニンＴの発現が有意に低かった（図４ｋ）。Ｐｋｍ２発現細胞は、その細胞質の下流のエフェクター（Ｇ６ｐｄ）および核（ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、Ｂｃｌ２、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰｄｋ１）機能を有意に上方制御した（図４ｌ）。増殖の増加に従って、Ｌｕｃ＋ｉｈＣＤ２５＋ＣＭと比較して、Ｐｋｍ２＋ｉｈＣＤ２５＋ＣＭにおいて細胞周期促進遺伝子（Ｃｄｃ２０、Ｃｄｋ１およびＣｃｎｄ２、Ｃｃｎｂ１）の上方制御、ならびに細胞周期阻害因子（ｐ２１およびｐ２７）の下方制御が観察された（図４ｍ）。
【００６０】
心臓再生能力の喪失と同時に起こる５５生後のＰｋｍ２の急速な下方制御は、胎仔および新生仔の心臓再生におけるＰｋｍ２の関与を示唆している。さらに、癌におけるＰｋｍ２の先に記載された増殖促進性および生存促進性の役割により、それは心臓の機能／再生を促進するのに理想的な候補となる。ｃｍｓＰｋｍ２は、おそらく心機能を改善することによってＭＩ後の転帰を改善するという本発明者らの発見は、それらがＭＩ直後のｃｍｓＰｋｍ２発現の潜在的治療価値を強調するので、生理学的および臨床的意義を有する。本発明者らの結果は、合成ｍｉＲの短期発現がＣＭの増殖および心臓再生の誘導に十分であることを示す最近の刊行物と一致している５６。さらに、その短い発現時間と一緒に本発明者らのｍｏｄＲＮＡの心臓特異性は、それを心臓再生のための安全で翻訳可能な戦略にする。本発明者らのデータは、タンパク質がもはや発現されなくなった後数週間続く、Ｐｋｍ２の高い効力および長期間の有益な効果でＣＭ恒常性をよりよく支持する代謝初期化を誘導するその能力を示唆している。本発明者らの実験アプローチおよびツールは、他の関連する増殖促進性および代謝初期化遺伝子、ならびに様々な疾患モデルにおけるそれらの治療可能性をさらに調査し、ＣＭ細胞の運命を効率的かつ正確に研究することを可能にする。特に、ｃｍｓｉｈＣＤ２５を用いた本発明者らの分離アプローチ（補足図８）は、成体のトランスフェクトＣＭのＦＡＣＳ選別の課題を克服する３１。ｍｏｄＲＮＡは安全で一過性であり、局所的および遺伝子導入のための非免疫原性プラットフォームであるので、本研究は、細胞挙動を操作し、心疾患に対する大きな治療可能性を保有するためのｃｍｓｍｏｄＲＮＡ使用の先駆けとなる。
【００６１】
心臓遺伝子療法の分野は拡大しているが、臨床現場でのその使用は限られている。心臓への遺伝子発現を標的化するために現在最も広く使用されている方法は、ウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによるものである（１〜３）。過去数十年の間に、アデノウイルス、関連アデノウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスおよびＤＮＡプラスミドを用いて目的の遺伝子をＣＭに挿入するためのいくつかの試みがなされた。ＡＡＶおよびアデノウイルスの両方が高いＣＭトランスフェクションレベルを有する一方で、レンチウイルスおよびＤＮＡプラスミドＣＭのトランスフェクション効率は低い。アデノウイルスは強力な免疫応答を誘発することができ、心臓への遺伝子送達システムのための適切な選択肢としてはＡＡＶのみが残る。ＡＡＶでＣＭ特異的プロモーターを使用すると、厳密にＣＭにおける細胞周期誘導遺伝子発現が可能になり得るが、心臓におけるその薬物動態（発現は４日目に始まり少なくとも１１ヶ月間持続する）は制御されない増殖および肥大型心筋症およびＨＦをもたらす可能性がある（３、５）。さらに、健康なヒト個体の６０％超が、この方法によって送達される遺伝子発現を効率的に中和することができるＡＡＶキャプシドに対する中和抗体を保有している（２１）。ウイルス遺伝子療法は有望であることを示しているが、その発現の長さおよび定量可能な用量様式で遺伝子発現を調節することができないためにその適用は制限されている（１−３）。
【００６２】
遺伝子送達方法としての未修飾外因性ＲＮＡの使用は、ゲノム組み込の危険性が低いためにプラスミドＤＮＡより安全であり得るので魅力的であるが、細胞外でのその不安定性および細胞にトランスフェクトされた場合、それが強い先天性免疫応答を誘発するために効果的ではない（１０、１１）。
【００６３】
Ｋａｒｉｋｏらは、ウリジンおよびシチジンをそれぞれプソイドウリジンおよび５−メチルシチジンで置換すると、外因性ＲＮＡにより引き起こされる免疫応答を劇的に減少させることを発見した（１１、１２）。安定性および翻訳効率を高めるために、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップアナログ（Ａｎｔｉ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）キャップがＲＮＡ分子の５’末端に置換される（４、５、１０）。したがって、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）は、インビトロまたはインビボの両方で使用するための短期間（１〜２週間）の滴定可能な遺伝子発現を提供する、新規かつ効果的な遺伝子送達方法を提供する（４〜９）。
【００６４】
修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）は体細胞遺伝子導入のための効果的かつ安全なツールとして浮上しており、心臓への遺伝子送達のために本発明者らおよび他の人々によって使用されて成功している。１０，１２−１５ここで本発明者らは、増殖促進因子であり、癌において高い頻度で調節不全となるピルビン酸キナーゼ筋アイソザイムＭ２（Ｐｋｍ２）１６，１７が、再生期の胎仔および初期の新生仔のＣＭでは高度に発現されるが、成体のＣＭでは発現されないことを示す。ｍｏｄＲＮＡのＭＩ後の成体ＣＭ（ｃｍｓＰｋｍ２）への排他的送達を用いたＰｋｍ２レベルの回復は、有意かつ排他的にＣＭ増殖を誘導し、心機能改善、瘢痕サイズ減少、心臓対体重比の増加、ＣＭサイズ減少、アポトーシスの減少および毛細血管密度の増加を誘導した。これらの再生過程は、ＭＩ後の長期生存の増加につながった。系統追跡およびＰｋｍ２トランスフェクトＣＭの単離、それに続くＭＩ後の遺伝子発現分析を用いて、本発明者らは、Ｐｋｍ２トランスフェクトＣＭコロニーの数の増加、ならびに増殖促進性細胞質の重要な下流エフェクター（ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）による１８，１９）、およびＰｋｍ２の核（β−カテニンおよびＨｉｆ１αのトランス活性化２０，２１による）機能の関与の可能性を示す。本発明者らの結果は、高度に翻訳可能で臨床的に適応可能なプラットフォームを用いた、増殖促進性遺伝子の短いパルスが、ＣＭ増殖および心臓再生を誘導するのに十分であることを示している。これらの知見は、心疾患におけるｃｍｓＰｋｍ  ２  ｍｏｄＲＮＡの治療的可能性を強調している。
【００６５】
近年、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）技術を用いることによって、ｍｏｄＲＮＡは、免疫応答の誘発またはゲノムの損傷がなく、高いトランスフェクションレベルで心臓における一過性の安全な遺伝子発現を推進することができることが示されている（１）（５，２２）。細胞膜を介して細胞に入る外因性の未修飾ｍＲＮＡは、エンドソームＴｏｌｌ様受容体７／８および３によって認識される（２３、２４）。この過程はタンパク質翻訳を阻害し、そして先天的免疫応答を活性化し、最終的には宿主細胞のアポトーシスをもたらす。ＭｏｄＲＮＡは、リボヌクレオチドを天然に修飾されたリボヌクレオチドで置換することによって合成される。これらの修飾リボヌクレオチドの使用は、合成ｍＲＮＡの二次構造を変化させ、それはＴｏｌｌ様受容体がｍｏｄＲＮＡを認識することを妨げ、したがって免疫応答の誘発またはゲノムの損傷がなく、リボソーム機構による機能性タンパク質へのその翻訳を可能にする（５、２２）。
【００６６】
本出願人らは以前、ｍｏｄＲＮＡがＣＭを含む心臓内の異なる細胞型を高効率でトランスフェクトし、一過性のパルス様動態（インビトロで３〜５日およびインビボで７〜１０日の期間）で即時および高レベルのタンパク質発現をもたらすことを示した。２つの個々のｍｏｄＲＮＡの同時トランスフェクションは両方の同時翻訳をもたらした。ＭＩモデル（５）および心筋におけるＬｕｃ、ＬａｃＺおよびｎＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡ送達を用いて、本出願人らは、ＭＩ後の心臓組織にｍｏｄＲＮＡが十分トランスフェクトされ、ＣＭおよび非ＣＭなどのいくつかの細胞型が左心室に高度にトランスフェクトされることを示す。次に、本出願人らは、心臓発達中に新生仔ＣＭを誘導する能力（ＣＤＫ２、βカテニン）（１６）またはトランスジェニックマウスモデルにおける成体ＣＭ増殖の再活性化（ＣｙｃｌｉｎＤ２、ｃＭＹＣ）（１２、１４）を有することが以前に示されたいくつかの候補細胞周期誘導遺伝子、ならびに異なる臓器および細胞型で強い増殖能を示したが、心筋細胞や心臓では試験されたことがない他のもの（Ｌｉｎ２８、ＰＫＭ２）（２４、２５）を選択した。
【００６７】
概して、細胞特異的修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）を作製するためのプラットフォームは以下の通りである。
【００６８】
まず、細胞特異的なｍｏｄＲＮＡを作成するための目的の細胞型を選択する。目的の細胞において、好ましくは目的の細胞においてのみ発現することが報告されている候補マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を同定する（例えば、心筋細胞の場合、ｍｉＲ１、ｍｉＲ２９、ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ１３３、ｍｉＲ１９９、ｍｉＲ２０８、ｍｉＲ３７８）。この配列に対する特定のｍｉＲの認識を可能にする各ｍｉＲ配列について逆相補配列を同定する。ｋモチーフを担持するｈＣＤ２５の切断型受容体であるｉｈＣＤ２５  ｋモチーフに、すでに計算されたそれぞれのｍｉＲ逆相補配列を３’ＵＴＲに付加する。これにより、逆相補配列が標的としている特異的ｍｉＲを欠いている細胞においてのみｉｈＣＤ２５を発現させることが可能になる。
【００６９】
目的の細胞および他の細胞型（例えば、線維芽細胞）を含む細胞の混合物、ならびにｎＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡおよび異なるｍｉＲ−ｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡを同時トランスフェクトする。約１８時間後、細胞を固定し、ＧＦＰ（ｍｏｄＲＮＡでトランスフェクトした細胞を表示）およびレポーター遺伝子（抗ｈＣＤ２５を使用、標的であるｍｉＲを欠く細胞を表示）および細胞特異的マーカー（例えば、心筋細胞にはトロポニンＩ、内皮細胞にはＰｅｃａｍ１など）で細胞を染色する。
【００７０】
細胞特異的マーカーについても陽性である（例えば心筋細胞にはトロポニンＩ）が、レポーター遺伝子（ｈＣＤ２５）については陰性であるＧＦＰ陽性細胞を同定する。これは、ｍｏｄＲＮＡがこの細胞型に送達されたにもかかわらず、この特異的なｍｉＲ−ｉｈＣＤ２５が翻訳されなかったことを意味する。これは、このｍｉＲが目的の細胞型において特異的に発現され、細胞特異的ｍｏｄＲＮＡを作製するために使用できることを示すものである。Ｌ７ＡＥの３’ＵＴＲに目的の細胞においてｉｈＣＤ２５を阻害する配列を付加して、細胞特異的なｍｏｄＲＮＡを作製する。
ｍｉｒ−Ｌ７ＡＥおよび５’ＵＴＲにｋモチーフを担持する目的の遺伝子を同時にトランスフェクトする。これら２つのｍｏｄＲＮＡにより、目的の遺伝子を特定の細胞型に特異的に送達することができる。
【００７１】
一実施形態では、本出願人は上記遺伝子のそれぞれについてｍｏｄＲＮＡを設計および作製した。ラット新生仔ＣＭを使用して、本出願人は各ｍｏｄＲＮＡの翻訳を試験した。さらに、対照および候補細胞誘導ｍｏｄＲＮＡを用いてラット新生仔ＣＭの増殖速度を測定することによってタンパク質の機能性を試験した。全ての候補細胞周期誘導ｍｏｄＲＮＡは、ＭＩ後の新生仔ラットＣＭの増殖および成体ＣＭの増殖を様々な程度まで増加させる。Ｌｉｎ２８およびＰＫＭ２は両方ともＣＭの増殖能力を有意に増加させた。したがって、それらの遺伝子はさらなる研究のために選択された。
【００７２】
Ｌｉｎ２８は、細胞周期調節因子を厳密に制御するＬｅｔ７の公知の抑制因子である（２５〜２９）。Ｌｉｎ２８が細胞周期調節因子を誘導するかどうかを試験するために、ｎＧＦＰ（対照ｍｏｄＲＮＡ）またはＬｉｎ２８  ｍｏｄＲＮＡをＬＡＤ結紮の直後に注射し、ＲＴ−ＰＣＲを用いた３日後にＣｃｎｂ１、Ｃｃｎｂ２、Ｃｄｃ２０、Ｃｄｋ１およびＡｕｒｋａ細胞周期遺伝子の発現の有意な増加を見出した。Ｌｉｎ２８  ｍｏｄＲＮＡなどの細胞周期誘導ｍｏｄＲＮＡを非特異的様式で使用すると、ＣＭにおいてだけでなく、非ＣＭにおいても増殖が増加し、モデルおよび仮説が心臓再生増加を達成するための手段としてＣＭの増殖を試験することを目的としているので、このことは実験課題を示している。
【００７３】
この課題に取り組むために、本出願人らは、２つの異なるｍｏｄＲＮＡに基づくＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡシステムを設計した（図５）。第１の構築物は、古細菌リボソームタンパク質であるＬ７ＡＥを担持する抑制ｍｏｄＲＮＡであり、これはＬ７ＡＥの特異的結合部位であるキンクターンモチーフを有する設計された目的の遺伝子ｍｏｄＲＮＡの翻訳を調節する（３０、３１）。Ｌ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡの翻訳は、２つが細胞内に同時トランスフェクトされた場合、設計された目的の遺伝子ｍｏｄＲＮＡの翻訳を抑制する。ＣＭ特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）認識エレメントをＬ７ＡＥ遺伝子に付加することにより、ｍｉＲを豊富に、そしてほとんど排他的に発現するＣＭにおいてＬ７ＡＥの翻訳を妨げることができ（「抑制因子を抑制する」アプローチ）、ＣＭにおける目的の遺伝子ｍｏｄＲＮＡの翻訳を可能にする。ｍｉＲ認識エレメントを使用することが、標的ｍｉＲのコピー数を減少させることは以前に示されている（３２、３３）。心臓におけるｍｉＲの数の減少は心臓に有害にも、または有益にもなり得る（３３−４２）。本発明者らのアプローチでは、心臓再生に有益なｍｉＲ発現を減らすのではなく、心臓再生に有害なｍｉＲ発現を減らすことを保証する必要がある。ｍｉＲ１−２（ｍｉＲ１）、ｍｉＲ２０８ａ（ｍｉＲ２０８）およびｍｉＲ１９９ａ（ｍｉＲ１９９）は、大部分がＣＭで発現されている（３３、３９、４１）。ｍｉＲ１およびｍｉＲ２０８は、成体動物研究およびヒトにおいてＭＩ後に上方制御されることが見出された（３３、３８、４１、４３）。ｍｉＲ１およびｍｉＲ２０８の上方制御は有害な影響を有するが、その下方制御はＭＩおよび心臓疾患の後に有益な効果をもたらす（３２〜４２）。
【００７４】
ＣＭにおけるこれらのｍｉＲの発現を試験するために、不活性ヒトＣＤ２５（ｉｈＣＤ２５）遺伝子、レポーター遺伝子としてのｈＣＤ２５の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のみを含む切断型遺伝子を作製した。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０８、またはｍｉＲ−１９９のｍｉＲ認識エレメントを含む、または含まない、２つのバージョンのｉｈＣＤ２５構築物を設計した。次に、インビトロおよびＭＩモデルを用いてインビボでｍｏｄＲＮＡを新生仔ＣＭにトランスフェクトした（図２）。図６に見られるように、ｉｈＣＤ２５の翻訳が非ＣＭでは観察されたがＣＭでは観察されなかったので、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８の両方がＣＭ特異的であることが見出された。対照的に、ｍｉＲ−１９９認識エレメントを含む、または含まないｍｏｄＲＮＡは、インビトロおよびインビボでＣＭ特異的ではないことが見出された。次に、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８の両方の認識エレメントを担持するＬ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡ（Ｌ７ＡＥ  ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−２０８）を設計した。さらに、核ＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡ（ｎＧＦＰ−ｋモチーフ）およびｋモチーフ（Ｌ７ＡＥ認識部位）を含む不安定化Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＤＤ−Ｃｒｅ−ｋモチーフ）ｍｏｄＲＮＡを作製した。本発明者らの成体マウスＭＩモデルを用いると、ｎＧＦＰ−ｋモチーフのトランスフェクションがＣＭおよび非ＣＭの両方においてｎＧＦＰの翻訳をもたらしたことが示される（図７）。しかしながら、ｎＧＦＰ−ｋモチーフをＬ７ＡＥ  ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−２０８と同時トランスフェクトした場合、ＣＭのみがｎＧＦＰを翻訳した。加えて、Ｒｏｓａ２６Ｔｄｔｏｍａｔｏを用いてＭＩモデルにおいて、Ｌ７ＡＥ  ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−２０８とＤＤ−Ｃｒｅ−ｋモチーフとを同時トランスフェクトすると、厳密にＣＭにおいて遺伝子活性化（トマト蛍光）がもたらされた。これら２つの方法の組み合わせは、本発明者らの目的の遺伝子をＣＭにおいて排他的に的確に発現することを可能にし、目的の遺伝子ｍｏｄＲＮＡがもはや発現されなくなった後のより長い期間にわたる系統追跡を可能にする。
【００７５】
本発明者らのＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡの機能を試験するために、Ｌｕｃ対照ｍｏｄＲＮＡまたはＬｉｎ２８−ＫおよびＰＫＭ２−ｋモチーフｍｏｄＲＮＡを単独で、またはＬ７ＡＥ  ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−２０８（Ｌｉｎ２８／ＰＫＭ２  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡ）と一緒に本発明者らのＭＩモデルを用いて直接注射する。トランスフェクションの７日後に、ＣＭおよび非ＣＭ両方の増殖を（特徴的な増殖マーカーである、ＢｒｄＵ、Ｋｉ６７、Ｈ３ＰおよびＡｕｒｏｒａ  Ｂを使用して）測定した。図８に示されるように、Ｌｉｎ２８−ｋまたはＰＫＭ２−ｋモチーフｍｏｄＲＮＡ単独は、Ｌｕｃ  ｍｏｄＲＮＡと比較して、ＣＭおよび非ＣＭの両方の増殖を有意に増加させた（Ｐ＜０．００１）。しかしながら、Ｌｉｎ２８およびＰＫＭ２  ＣＭ−特異的ｍｏｄＲＮＡは、ＣＭのみの増殖を有意に再活性化し（Ｐ＜０．００１）、非ＣＭの増殖には有意な影響を及ぼさなかった。重要なことに、Ｌ７ＡＥは哺乳動物タンパク質ではないので、ＭＩ後のＬ７ＡＥの免疫原性を試験するために、Ｌｕｃ対照ｍｏｄＲＮＡまたはＬ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡをｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０８、またはその両方と共に、または伴わずに成体マウスＭＩモデルに注射した。図８に見られるように、ＭＩ後７日後に、免疫応答の有意な上昇および全てのＬ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡでのアポトーシスの増加は見られなかった。本発明者らは、マウスにおけるＬ７ＡＥの使用は免疫学的に安全であると結論付けた。
【００７６】
プラスミド
ｐＴＥＭＰＬＺは、目的のＯＲＦをＵＴＲ間に挿入できるクローニングベクターである。一実施形態では、開示の方法で使用するためのプラスミドは表１に示すものが挙げられる。
【表１】
2019528736.tif 000003
2019528736.tif 000004
2019528736.tif 000005
【００７７】
ｉｈＣＤ２５  ｍｏｄＲＮＡベースのＣＭ特異的細胞選別
排他的にＣＭにおいて本発明者らの目的の遺伝子の一過性遺伝子発現を可能にする本発明者らの新規なＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡベースのデザインが、革新的な不活性（細胞外ドメインのみ）ヒトＣＤ２５（ｉｈＣＤ２５）に基づく選別（磁気ビーズ）システムによるトランスフェクトＣＭのみの単離に使用できるかどうかを試験するために、ＭＩ後、心臓にｎＧＦＰ  ｋモチーフをｉｈＣＤ２５  ｋモチーフｍｏｄＲＮＡと共に注射し、細胞を単離し、ＣＤ２５特異的磁気ビーズで選別した。ｎＧＦＰ陽性のＣＭおよび非ＣＭの両方が観察された。ｎＧＦＰ  ｋモチーフ、ｉｈＣＤ２５  ｋモチーフとＬ７ＡＥ  ｍｉＲ１−ｍｉＲ２０８が同時トランスフェクトされ、磁気分離されなかった場合、ＣＭ特異的ｎＧＦＰ発現が見られた。培養物はまた、ｎＧＦＰ陰性のＣＭおよび非ＣＭを含む。磁気分離を適用した場合、純粋なｎＧＦＰ陽性ＣＭのみが観察された（図９）。
【００７８】
一実施形態では、外因性遺伝子の産生は、リプレッサータンパク質もコードする第１のレプリコンからの抗ｍｉＲの発現によって推進される。発現された抗ｍｉＲは、ヒトおよび霊長類の心筋細胞に天然に存在するｍｉＲに結合し、リプレッサータンパク質の転写は妨げられる。リプレッサータンパク質の非存在下では、遺伝子をコードし、リプレッサータンパク質認識部位を含む第２のレプリコンからの目的の遺伝子の発現が進行し得る。
【００７９】
細胞周期誘導遺伝子
目的の遺伝子、例えば増殖誘導遺伝子の発現は、一対の核酸のうちの一方が、標的心筋細胞特異的ｍｉＲに特異的に結合する抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲ）をコードする転写／翻訳調節システムの制御下に該遺伝子の転写／翻訳を置くことによって、心筋細胞特異的にすることができる。第２の核酸は翻訳抑制タンパク質であり、第２の核酸は翻訳抑制タンパク質と結合する抑制タンパク質相互作用モチーフおよび目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００８０】
本明細書に記載の方法を使用すると、その発現は一過性であり、肥大などの無制限の発現に関連する問題を回避する。
【００８１】
ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に挿入された特異的ＲＮＡモチーフに結合するリプレッサー／抑制タンパク質は、哺乳動物細胞におけるそのメッセージの翻訳を調節する。ヒトおよび霊長類の心筋細胞に対する発現特異性は、マウス、ブタ、ヒトおよび非ヒト霊長類の心筋細胞に見られる内因性ｍｉＲＮＡに特異的な認識エレメントをコードする配列をリプレッサー／抑制オリゴヌクレオチドに含めることによって達成される。
【００８２】
インビボ使用のためのｍｏｄＲＮＡの合成は４つの段階を含む：所望の転写産物、インビトロ転写（ＩＶＴ）、南極ホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）による５’リン酸除去、および５Ｍ酢酸アンモニウム塩による沈殿を含むＤＮＡ鋳型の作製。実験目的および臨床目的のためのｍｏｄＲＮＡの使用についての調査は急速に成長している。初期化因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、およびＫＬＦ４をコードするｍｏｄＲＮＡを用いた毎日のトランスフェクションは、ヒト線維芽細胞を多能性に初期化することに成功した（５、８）。さらに、ｍｏｄＲＮＡは、線維芽細胞から骨格筋細胞への変換もたらすＭｙｏＤ  ｍｏｄＲＮＡを使用することによって、インビトロで細胞の運命を指示できることが示されている（２）。ＭｏｄＲＮＡはまた、インビボで細胞運命を指示することにおいて有望性を示している。インビボでのｍｏｄＲＮＡ技術の使用の拡大および心臓遺伝子治療の分野におけるその使用可能性は、インビボでの使用のためのｍｏｄＲＮＡの効果的な合成のための段階的で合理化されたプロトコルを生み出す動機となった。
【００８３】
心筋細胞
一実施形態では、本開示は、対象における心筋梗塞（ＭＩ）または心不全（ＨＦ）後の対象を治療する方法であって、少なくとも２つの合成ｍｏｄＲＮＡを含む組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００８４】
タンパク質発現は、５〜２０日間、いくつかの実施形態では７〜１４日間続き、非修飾ＲＮＡと比較して免疫学的応答が低い。
【００８５】
とりわけ、本開示は、候補細胞周期誘導遺伝子の新しいセット：Ｌｉｎ２８、Ｐｋｍ２、およびサイクリンＤ２を記載し、ｍｏｄＲＮＡとして送達された場合、これらはインビボで哺乳動物の心筋細胞（ＣＭ）の増殖を（ＣＭサイズまたは核数を増加させずに）再活性化でき、心筋梗塞（ＭＩ）後のＣＭアポトーシスを減少させ、全体的な左心室血管新生を増加させることができる。細胞周期誘導遺伝子の発現が心筋細胞特異的転写（発現）のための転写／翻訳調節（発現調節）システムの制御下に置かれると、結果は、損傷、例えば、心筋梗塞（ＭＩ）または心不全（ＨＦ）の結果としての損傷の後の細胞周期誘導遺伝子の心筋細胞特異的発現−増殖推進のためのツールとなる。
【００８６】
修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）は、ＭＩまたはＨＦ後のＣＭに対する細胞周期誘導遺伝子の効果を調査可能にする安全で効率的な一過性の非免疫原性遺伝子送達システムである。Ｋａｒｉｋｏらは、ウリジンおよびシチジンをそれぞれプソイドウリジンおよび５−メチルシチジンで置換すると、外因性ＲＮＡから引き起こされる免疫応答を劇的に減少させることを発見した（１１、１２）。メカニズムを調査したところ、ヌクレオシド置換によって、Ｔｏｌｌ様受容体３、７、および８（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）、およびレチノイン酸誘導遺伝子１（ＲＩＧ−１）による応答の低下を起こす、ＲＮＡの立体構造変化がもたらされたことが明らかになった（１３）。５’三リン酸を除去すると、ｍｏｄＲＮＡからのＲＩＧ−１応答のさらなる減少が見られた（４、１０）。安定性および翻訳効率を高めるために、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップアナログ（Ａｎｔｉ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）キャップがＲＮＡ分子の５’末端に置換される（４、５、１０）。
【００８７】
抗ｈＣＤ２５親和性による細胞選択
伝統的なＦＡＣＳ細胞選別による心筋細胞の細胞選択は、細胞の大きさのために問題となり得る。細胞選択に対する別のアプローチが考案された。一実施形態では、本開示の転写調節システムを使用して、ｈＣＤ２５細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードする核酸が、目的の遺伝子をコードする核酸を含む構築物に含まれる。対照または候補遺伝子ｍｏｄＲＮＡのいずれかを一過性に発現するＣＭを単離するために、ｈＣＤ２５  ＥＣＤおよび目的の遺伝子を同時発現する細胞を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにおいて抗ＣＤ２５  ＥＣＤ抗体を使用して、またはパニング法を使用して選択する。これらの細胞を使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑ技術を用いた遺伝子発現プロファイルを作成し、差次的に発現された遺伝子を同定する。
【実施例】
【００８８】
実施例１：材料
以下の材料を、開示された方法と併せて使用する。
【００８９】
特に指定のない限り、全ての溶液はヌクレアーゼフリー水で生成するものとする。このプロトコルで使用する全ての材料はヌクレアーゼフリーでなければならない。
【００９０】
使用する機器は以下の通りである。
１．ＰＣＲサーモサイクラー
２．微量遠心管
３．ボルテックスミキサー
４．サーモミキサー（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標））
５．Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ
６．ヌクレアーゼフリー水
７．１５ｍｌのヌクレアーゼフリーコニカルチューブ
８．ヌクレアーゼフリーストリップＰＣＲチューブ
９．エタノール（１００％および７０％）
１０．２ｍｌのアンビオン溶出チューブ
【００９１】
テールＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。
フォワードプライマー：５’−ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＣＧＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ−３’（配列番号９）
リバースプライマー：５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号１０）
【００９２】
ｐＴＥＭＰＬＺプラスミドを用いたインビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型の構築は以下の通りである。
１．Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素
２．１００ｍＭ  ＡＴＰ
３．２Ｘ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  ＰＣＲマスターミックス
４．ＡｌｅＩ酵素
５．ＡｆｅＩ酵素
６．南極ホスファターゼ酵素
７．Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ酵素
８．Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ｃｃｄＢ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ（商標）２  Ｔ１ファージ耐性（Ｔ１Ｒ）細胞
９．ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット
１０．ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット
１１．Ｏｎｅ  ｓｈｏｔケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
１２．ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンＭｉｎｉｐｒｅｐキット
１３．１０×リン酸化緩衝液
【００９３】
ＩＶＴ反応のためのポリＴテールを有する線状ＤＮＡ鋳型の合成
１．２Ｘ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  ＰＣＲマスターミックス
２．プライマー溶液：それぞれ１μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
３．ＤｐｎＩ酵素
４．ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット
【００９４】
インビトロ転写反応
１．Ａｍｂｉｏｎ  Ｔ７  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キット（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号：ａｍ１３３４−５）
２．ＧＴＰ  ７５ｍＭ溶液（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キットに付属）
３．ＡＴＰ  ７５ｍＭ溶液（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キットに付属）
４．ＣＴＰ  ７５ｍＭ溶液（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キットに付属）
５．５−メチルプソイドウリジン−５’−三リン酸（Ｔｒｉｌｉｎｋ）
６．Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓアンチリバースキャップアナログ、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  １０マイクロモル（カタログ番号：Ｎ−７００３）
７．Ｔ７  ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ酵素（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キットに付属）
８．Ａｍｂｉｏｎ  ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号：ＡＭ１９０８）。
【００９５】
ＲＮＡホスファターゼ処理
１．南極ホスファターゼ酵素
【００９６】
ＲＮＡ沈殿
１．５Ｍ酢酸アンモニウム塩溶液（ＡｍｂｉｏｎＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）キットに付属）
２．溶出バッファー（ＡｍｂｉｏｎＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）キットに付属）
【００９７】
ｍｏｄＲＮＡ注射の準備
１．Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  カタログ番号：１３７７８１５０）
２．ＯｐｔｉＭＥＭ低血清培地、フェノールレッド非含有
３．Ｕｌｔｒａ−Ｆｉｎｅインスリン注射器針３１ｇ  ８ｍｍ
【００９８】
方法
以下の方法を、開示された方法と併せて使用する。特記しない限り、全ての手順は室温において、非無菌環境中で実施した。使用する全ての材料はヌクレアーゼフリーでなければならない。
【００９９】
ｍｏｄＲＮＡの合成
ＭｏｄＲＮＡを、先に記載のように４８−５０アンチリバースキャップアナログ、３´−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（６ｍＭ、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グアノシン三リン酸、（１．５ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、アデノシン三リン酸（７．５ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、シチジン三リン酸（７．５ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＮ１−メチルプソイドウリジン−５’−三リン酸（７．５ｍＭ、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のカスタムリボヌクレオチドブレンドを用いて、プラスミド鋳型からインビトロで転写した。ｍＲＮＡを、Ｍｅｇａｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて精製し、南極ホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、続いてＭｅｇａｃｌｅａｒキットを用いて再精製した。ｍＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、エタノールと酢酸アンモニウムで沈殿させ、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した。詳しいプロトコルについては本発明者らの最近の出版物４８を参照されたい。
【０１００】
ｍｏｄＲＮＡトランスフェクション。インビボでのｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションは、２０μｌのヌクレアーゼフリー水中スクロース（０．３ｇ／ｍｌ）、２０μｌのクエン酸塩（０．１Ｍ  ｐＨ＝７；Ｓｉｇｍａ）を含むクエン酸スクロース緩衝液と、２０μｌの異なる濃度の食塩水中ｍｏｄＲＮＡとを混合して全量６０μｌにしたものを使用して行った。トランスフェクション混合物を心筋に直接注射した（３回の個別注射、各２０μｌ）。インビトロトランスフェクションには、製造元の推奨に従って使用したＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。
【０１０１】
ｋモチーフを担持するｐＴＥＭＰＬＺプラスミドを用いたインビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型の構築。
ｐＴＥＭＰＬＺは、目的のＯＲＦをＵＴＲ間に挿入できるクローニングベクターである（図１）。５’−および３’−ＵＴＲは合成オリゴによって初めから合成する。合成したＵＴＲを１つにアニールして、フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて増幅する。ＯＲＦの挿入部位を提供するために、ＡｌｅＩおよびＡｆｅＩ制限部位を５’と３’ＵＴＲの間に導入する（第１コドン（ＡＴＧ）のアデニンヌクレオチド（Ａ）はＡｌｅＩ部位によって提供されるので、フォワードプライマー配列から省略することができる）。ＰＣＲ増幅断片およびアンピシリン耐性を有するｐＺＥｒＯ−２ベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＴＥＭＰＬＺを作製するために一緒に連結する（ｐＴＥＭＰＬＺプラスミドおよび誘導体は、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ｃｃｄＢ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ（商標）２  Ｔ１  Ｐｈａｇｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  （Ｔ１Ｒ）細胞などのｃｃｄＢ遺伝子産物に耐性の細菌株において増殖させるべきである）。
【０１０２】
ｐＴＥＭＰＬＺに挿入する前に、目的の遺伝子のリン酸化フォワードスプライマーおよびリバースプライマー対を使用してＯＲＦを増幅させる。プライマーのリン酸化は、以下の反応に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて行う：
１０×リン酸化緩衝液５μｌ
フォワードプライマー（１００μＭ）３μｌ
リバースプライマー（１００μＭ）３μｌ
１００ｍＭ  ＡＴＰ  ０．５μｌ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０Ｕ
ヌクレアーゼフリー水５０μｌ
反応液を３７℃において１時間インキュベートする。
酵素を不活性化するために、反応液を６５℃において２０分間インキュベートする。２５０μｌの水を加えて反応液を３００μｌに希釈し、最終の１μＭのプライマー混合物を得る。
【０１０３】
目的のＯＲＦの増幅は、以下のＰＣＲ反応を用いて行う。
１０μｌ以上のプライマーミックス（１μＭ）
鋳型ＤＮＡ  １〜１００ｎｇ
水５０μｌ
ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ｒｅａｄｙ  ｍｉｘ（２ｘ）２５μｌ
混合物を、図２に従った設定でサーモサイクラー中に流す。増幅された標的はＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて単離する。ＯＲＦを挿入する前に、ｐＴＥＭＰｌｚを線状化し、脱リン酸化する。プラスミドを線状化するために、ｐＴＥＭＰｌｚを以下の反応に従ってＡｌｅＩおよびＡｆｅＩで消化する。
ｐＴＥＭＰＬＺプラスミドＤＮＡ  ２μｇ
ヌクレアーゼフリー水３０μｌ
１０×緩衝液４  ３μｌ
ＡｌｅＩ  ５Ｕ
ＡｆｅＩ  ５Ｕ
サーモミキサー中で３７℃において１時間インキュベートする。消化物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、３０μｌの溶出緩衝液で溶出した。
【０１０４】
線状化ｐＴＥＭＰＬＺを、以下の反応に従って脱リン酸化する：
ステップ１からの線状化プラスミド３０μｌ
１０×南極ホスファターゼ緩衝液５μｌ
南極ホスファターゼ５Ｕ
ヌクレアーゼフリー水５０μｌ
反応液を３７℃において１時間インキュベートする。６５℃において１５分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。
【０１０５】
線状化および脱リン酸化プラスミドをＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キットを用いて単離し、ｐＴＥＭＰＬＺ産物の量をＮａｎｏｄｒｏｐを用いて決定する。プラスミドは今後の使用のために−２０℃で保存することができる。
【０１０６】
目的のＯＲＦの平滑末端ライゲーションを以下の反応に従ってｐＴＥＭＰＬＺに実施する。
線状脱リン酸化ＴＥＭＰｌｚプラスミド５０ｎｇ
増幅されたＯＲＦ  ３倍モル過剰量
１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液２μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ４Ｕ
ヌクレアーゼフリー水２０μｌ
試薬を混合し、溶解氷上で室温または１６℃において一晩インキュベートする。陰性対照ライゲーション反応液が、プラスミドの自己ライゲーションをモニターするために必要であると思われる。
プラスミドの形質転換をコンピテント細胞を用いて行い、アンピシリン寒天プレート上で増殖させる。
【０１０７】
正しい向きで陽性クローンを単離するためにコロニーＰＣＲを行う。ピペットチップを用いてアンピシリン寒天プレートから８〜１０個のコロニーを抽出する。個々のチップを２００μｌのルリアブロス（ＬＢ）に刺し、７５μｌのＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０以下で数回すすぎ、チップを振盪機内で３７℃においてインキュベートする。次にチューブを５分間煮沸して細菌を溶解させ、ペレットのデブリを遠心分離する。２μｌの上清を用い、フォワードプライマーおよび遺伝子特異的リバースプライマーを使用してコロニーＰＣＲを行う。ＰＣＲサンプルを１％アガロースゲル上で泳動させて、正の配向を有するクローンを同定する。２００μｌのＬＢを、３７℃のシェーカー内で、大容量のＬＢ中で正しい方向のクローンと共に一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンＭｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して抽出する。プラスミド生成物の量を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定し、１〜５ｎｇ／μｌの濃度に希釈する。
【０１０８】
テールＤＮＡ鋳型の合成
１６００μｌのＰＣＲマスター溶液を、以下の反応に従って調製した：
プラスミド溶液（１〜５ｎｇ／μｌ）（注３を参照）４００μｌ
プライマー溶液（１μＭプライマー）４００μｌ
２Ｘ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ。８００μｌ
５０μｌのＰＣＲマスター溶液を３２本の別々のＰＣＲチューブに等分した。ＰＣＲはサーモサイクラー（図２に記載されている設定）を使用して行う。伸長ステップの長さは、使用するＤＮＡポリメラーゼおよびＯＲＦの長さに応じて異なる（例えば、２Ｘ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを使用する場合、サーモサイクラーの伸長ステップはＯＲＦの長さ１Ｋｂあたり３０秒の比率で設定すべきである）。
【０１０９】
メチル化プラスミドＤＮＡを消化するために、生成物を１つのＥＰＰＥＮＤＯＲ（商標）チューブに合わせ、３０μｌのＤｐｎＩで消化する。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  カタログ番号：２８１０６）を用いて精製し、最終産物をヌクレアーゼフリー水で溶出する。テール生成物の濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ機を使用して測定し、濃度をヌクレアーゼフリー水を使用して１００〜２００ｎｇ／μｌに調整する。
品質管理分析のために、テールＤＮＡ鋳型産物の純度を、元のＤＮＡプラスミドと共に１％アガロースゲルでチェックする（図３ａ）。
【０１１０】
インビトロ転写（ＩＶＴ）反応（反応容量１ｍｌ）
カスタムＮＴＰ混合物を表２に従って１本のＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブ中で調製する。ＩＶＴ反応用の試薬を、次の順序で１つのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブ中に混合する：
ａ．４００μｌの表２のカスタムＮＴＰ。
ｂ．４００μｌのＤＮＡテール鋳型（２００ｎｇ／μｌ）。
ｃ．Ｔ７  ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキットの１０ｘ反応緩衝液をボルテックス混合して、全ての沈殿物を溶解させ、１００μｌを加える。
ｄ．１００μｌのＴ７酵素を加える。これにより１ｍｌのＩＶＴ反応液が得られる
ｅ．よく混合し、３７℃のサーモミキサーにおいて４〜６時間インキュベートする。
３０μｌのＴ７  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅを添加し、穏やかに混合し、次にサーモミキサー中で３７℃において１５〜２０分間インキュベート（ｎｃｕｂａｔｅｄ）して反応を停止させた（注５参照）。
Ａｍｂｉｏｎ  ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキットを用いて反応液を精製し、各チューブを５０μｌの９５℃の溶出緩衝液で３回溶出し、各チューブ中に１５０μｌのＲＮＡ産物を得る。各チューブのＲＮＡ混合液を１本のＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブに組み合わせる。
【０１１１】
ＲＮＡホスファターゼ処理
ヌクレアーゼフリー水をＲＮＡに添加して１．５ｍｌの溶液を得る。１５０μｌの南極ホスファターゼ緩衝液（×１０）および１５０μｌの南極ホスファターゼ酵素を添加し、十分に混合し、サーモミキサー中で３７℃において１時間インキュベートする。
【０１１２】
酢酸アンモニウムを用いたＲＮＡ沈殿
１８００μｌのＲＮＡ溶液を１５ｍｌのコニカルチューブに移す。１８０μｌの５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し完全に混合する。５２００μｌの冷たい（−２０℃）１００％エタノールを溶液に添加し、３〜４個の２ｍｌのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブに等分する。チューブを−２０℃で一晩放置する。チューブを４℃において３０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を慎重に廃棄する。各ペレットを５００μｌの７０％エタノールに溶解する。各チューブのｍｏｄＲＮＡエタノール溶液を１本のＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブにまとめる。チューブを４℃において３０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を静かに注ぎ出して廃棄し、キムワイプを使用して、チューブの内側を穏やかに清浄にする。ペレットを乱さないように注意を払う。チューブを逆さにしてペレットを風乾させるために２分以内放置する。ピペットを使用して、ペレットの周囲に残っているエタノールの小滴を全てそっと取り除く。ペレットを４５〜５０μｌの溶出緩衝液を用いて再懸濁する。ｍｏｄＲＮＡを溶出緩衝液中に５分間放置し、次いでペレットが溶解するまで穏やかにピペッティングする。ここで、ＲＮＡ溶液はインビボで使用することができ、−２０℃で６ヶ月間、または−８０℃で５年間保存可能である。
【０１１３】
ＭｏｄＲＮＡの収量
濃度はＮａｎｏｄｒｏｐ機を用いて測定する（図３ｂ）。Ａ２６０／Ａ２８０の比は１．８より大きくなければならず、２．０に近い値はより高い純度を示す。収量に応じて、濃度は２０μｇ／μｌに近いはずである。より良い品質管理分析のために、最終ｍｏｄＲＮＡ溶液からの１μｌのサンプルを１００μｌのヌクレアーゼフリー水で希釈する。試料をバイオアナライザー機を用いて分析する（図３ｃ）。
【０１１４】
マウスへの心筋注射用ｍｏｄＲＮＡの調製
４０μｌのＲＮＡｉＭａｘを、５μｌのＯｐｔｉＭＥＭとＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブ内で混合し、ボルテックス混合する。混合物を室温で１０分間静置する。別のＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブ中で１５０〜２００ｕｇのｍｏｄＲＮＡを５μｌのＯｐｔｉＭＥＭと混ぜ合わせる。チューブの側面の液体を排除するためにチューブを回転させる。ＲＮＡｉＭＡＸとＯｐｔｉＭＥＭの混合物を室温で１０分間静置した後、ｍｏｄＲＮＡ混合物を含むチューブの液体をＲＮＡｉＭＡＸ混合物を含む試験管に加える。（いくつかの実施形態では、ｍｏｄＲＮＡ混合物をＲＮＡｉＭＡＸ混合物に加えることが重要であり、その逆ではない。）合わせた混合物を室温で１５分間放置する。混合物を３１ゲージのインスリン注射器に抜き取り、マウス心筋に注射する。（図４に示す結果の例）
【０１１５】
マウス
動物の処理は全て、Ｉｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルの下で実施した。ＣＦＷ（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスまたはＲｏｓａ２６ｍＴｍＧマウスの雄および雌を使用した。ＭｏｄＲＮＡは、上記のようにインビトロ転写によって合成する。修飾ヌクレオチド（Ｔｒｉｄｅｎｔ）は、プソイドウリジン、５−メチル−シチジン、およびキャップ類似体である。ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬と複合体を形成した合計１００〜２００μｇの修飾ＲＮＡを、ＭＩの誘発後の開胸手術において心筋の梗塞周囲領域に注射する。ＭＲＩは軽い麻酔下で行う（心拍数と鎮静レベルに対して滴定する）。ＬＡＤ結紮および組織学的分析は、以前に記載されている通りに実施される（４６）。各実験に３〜８匹の動物を用いた。長期生存のために、ＣＦＷ（８〜１０週齢）をＭＩ誘導後にＣＭ特異的ＬｕｃまたはＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡ（ｎ＝１０）で処理し、動物施設で６ヶ月間回復させるために放置した。死亡を経時的にモニターし、記録した。
【０１１６】
成体マウス心臓からの細胞の単離
心臓を摘出し、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ技術を用いて灌流し、ＣＤ２５特異的磁気ビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ２５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞をさらに処理し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを細胞から単離する。ＲＮＡはさらにＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲＴ−ＰＣＲ分析に使用する。
【０１１７】
成体マウスの心筋梗塞および心不全モデル
図５に記載のＭＩモデルを使用して、ＣＦＷマウスまたはＲｏｓａ２６ＣＤ２５マウスにおけるＣＭ特異的Ｌｉｎ２８、Ｐｋｍ２を用いた処理後の治療効果を試験した。実験計画は、ａ）ビヒクルのみ、ｂ）１００μｇ／心臓の、ＫモチーフｍｏｄＲＮＡを担持するＬｕｃ、ｃ）１００μｇ／心臓の、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８認識エレメントの両方を担持するＬ７ＡＥ  ｍｏｄＲＮＡ（Ｌ７ＡＥ  ｍｉＲ１＋ｍｉＲ２０８）およびｄ）ＫモチーフｍｏｄＲＮＡおよびＬ７ＡＥ  ｍｉＲ１＋ｍｉＲ２０８を、各ｍｏｄＲＮＡから１００μｇ／心臓（合計２００μｇ／心臓）担持するＬｕｃの混合物を含有するＬｕｃ  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡで処理した４つの対照群を含む。対照群は、細胞周期誘導ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡに直接関係しない、心臓におけるｍｉＲ−１およびｍｉＲ−２０８の減少の非特異的効果を評価するために機能する。本出願人らは、対照群と、ＫモチーフｍｏｄＲＮＡを担持する１００μｇ／心臓のａ）Ｌｉｎ２８およびｂ）Ｐｋｍ２、ならびにＫモチーフｍｏｄＲＮＡを担持するｄ）Ｌｉｎ２８およびｅ）Ｐｋｍ２とＬ７ＡＥ  ｍｉＲ１＋ｍｉＲ２０８との混合物（細胞周期誘導ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡ、各ｍｏｄＲＮＡから１００μｇ／心臓（合計でｍｏｄＲＮＡ２００ｐｇ／心臓）を用いた４つの実験群とを比較した。ＭＩの２８日後にＭＲＩを用いて心機能の改善を分析し、対照ｍｏｄＲＮＡと比較して、高率の長期生存につながる瘢痕形成の減少および毛細血管密度の増加を分析した。さらに、ＭＩモデルにおけるトランスフェクトＣＭの系統追跡モデルのためにＲｏｓａ２６Ｔｄｔｏｍａｔｏマウスを使用する。本発明者らの実験計画には、１００ｐｇ／心臓のＬ７ＡＥ  ｍｉＲ１＋ｍｉＲ２０８と混合したＣＭ特異的Ｌｕｃ（５０ｐｇ／心臓）およびＤＤ−Ｃｒｅ（５０ｐｇ／心臓）で処理した１つの対照群が含まれる。対照群とＣＭ特異的細胞周期誘導因子ｍｏｄＲＮＡで処理した３つの実験群とを比較する。ＤＤ−Ｃｒｅ（５０ｐｇ／心臓）およびＫモチーフｍｏｄＲＮＡを担持する細胞周期誘導遺伝子（Ｌｉｎ２８およびＰｋｍ２  ５０ｐｇ／心臓）を１００ｐｇ／心臓のＬ７ＡＥ  ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−２０８と一緒に含む混合物（合計２００ｐｇ／心臓）を使用する。Ｒｏｓａ２６Ｔｄｔｏｍａｔｏマウスの心臓に、合計１００または２００ｐｇのｍｏｄＲＮＡを筋肉内注射する。ＣＭ系統追跡モデルを用いて、免疫蛍光分析において抗小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）抗体を用いたＣＭ断面積評価を使用して、注射後２８日目のトランスフェクトＣＭサイズを試験する。左心室あたりのトランスフェクトＣＭの数を計数し、各処理においてＣＭあたりの核の数を評価する。Ｒｏｓａ２６Ｔｄｔｏｍａｔｏマウスを用いたこれらの試験は、ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡを用いた様々な処理後のＣＭ機能の変化を経時的に評価可能にするものである。
【０１１８】
図５に記載のＭＩモデルはまた、左心室のトランスフェクトＣＭおよび非トランスフェクト細胞における遺伝子発現の変化を試験するためにも使用する。本発明者らの実験計画は、異なるＣＭ特異的Ｌｕｃ（５０μｇ／心臓）および不活性（細胞外ドメインのみ）ヒトＣＤ２５（ｉｈＣＤ２５、図１および８を参照されたい、５０μｇ／心臓）を１００μｇ／心臓のＬ７ＡＥ  ｍｉＲ１＋ｍｉＲ２０８と混合して（合計ｍｏｄＲＮＡ  ２００μｇ／心臓）処理した３つ対照群を含む。対照群と、ＣＭ特異的細胞周期誘導ｍｏｄＲＮＡで処理した３つの実験群とを比較する。出願人らは、ｉｈＣＤ２５（５０μｇ／心臓）およびＫモチーフｍｏｄＲＮＡを担持する細胞周期誘導遺伝子（Ｌｉｎ２８およびＰｋｍ２、５０μｇ／心臓）を１００ｐｇ／心臓のＬ７ＡＥ  ｍｉＲ−１＋ｍｉＲ−２０８と混合して含む混合物（合計２００μｇ／心臓）を使用した。ＣＦＷマウスで２００μｇのＣＭ特異的な異なるＬｕｃ対照または細胞周期誘導因子のＬｉｎ２８またはＰｋｍ２を投与した３日後（ｎ＝１０）、マウスを屠殺し、心臓をコラゲナーゼで解離させる。トランスフェクトＣＭは、本発明者らのＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡ選別アプローチを用いて心臓細胞懸濁液から単離される。この選別アプローチは、ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡ  ｉｈＣＤ２５および市販の抗ｈＣＤ２５磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の使用に基づいている。磁気ビーズ単離は、３０年以上にわたり、細胞選別を含む様々な用途に使用されている。細胞選別に使用される磁気ビーズは、細胞表面遺伝子を認識することができる抗体と予め結合されている。トランスフェクトＣＭは通常、特異的細胞表面遺伝子を担持していないので、トランスフェクトＣＭをマークして抗ｈＣＤ２５磁気ビーズがトランスフェクトＣＭを認識し排他的に付着できるように切断型ｈＣＤ２５を使用する。磁石ならびに残留ビーズおよび非トランスフェクト細胞の溶出を使用して、純粋に単離されたトランスフェクトＣＭ細胞集団を得る。単離直後に、選別されたトランスフェクトＣＭおよび溶出された細胞画分（非トランスフェクト細胞）からＲＮＡを抽出し、Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙのＨＩｓｅｑ２５００システムを用いてＲＮＡ−ｓｅｑに送る。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いたＲＮＡ−ｓｅｑ測定の検証には、一部のＲＮＡを使用する。下流標的選択は以下に基づいている：ａ）対照Ｌｕｃにおいて差次的に発現される遺伝子対ＣＭにおいて特異的に発現されるｍｏｄＲＮＡ；ｂ）異なる細胞周期誘導ｍｏｄＲＮＡ処理間の重複候補；ｃ）非トランスフェクト細胞において観察される遺伝子発現に影響を及ぼし得る、ＣＭにおいて差次的に発現される遺伝子。例えば、非トランスフェクト集団における関連受容体の上方制御は、ＣＭからのそのリガンドの分泌を示す。ｄ）文献のデータマイニング。上記のアプローチを用いて、３〜５個の標的を検証のために選択する。仮説を検証するために、ＭＩ後にＣＭ特異的ｎＧＦＰ  ｋモチーフ、不活性化（細胞外ドメインのみ）ヒトＣＤ２５（ｉｈＣＤ２５）を、Ｌ７ＡＥ  ｍｉＲ１−ｍｉＲ２０８と混合して注射し、注射２４時間後にｎＧＦＰおよびｉｈ���Ｄ２５発現ＣＭの選別に成功した。図１９
【０１１９】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）および心エコー検査（Ｅｃｈｏ）。
Ｌｕｃ  ｋモチーフ、Ｌｕｃ  ｋモチーフ＋ｍｉＲ１−２０８、ｍｉＲ１−２０８、Ｐｋｍ２  ｋモチーフおよびＰｋｍ２  ｋモチーフ＋ｍｉＲ１−２０８  ｍｏｄＲＮＡで処理したＣＦＷマウス（８週齢）を、ＬＡＤ結紮後２８日目にＭＲＩ評価に供した。１１心臓および呼吸ゲーティングで７−Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｐｈａｒｍａｓｃａｎ（ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において遅延造影ＣＩＮＥ画像を得た。マウスを１〜２％イソフルラン／空気混合物で麻酔した。ＥＣＧプローブ、呼吸プローブ、および温度プローブをマウスに配置し、これによりスキャン中は温かく保った。０．３ｍｍｏｌ／ｋｇのガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸のＩＶ注射の１０〜２０分後にイメージングを行った。心尖から心底までの心臓の８〜１０個の短軸スライスのスタックを、以下のパラメータを有するＥＣＧ誘発および呼吸同期ＦＬＡＳＨシーケンスを用いて取得した：エコー時間（ＴＥ）２．７ミリ秒、分解能２００μｍ×２００μｍ；スライス厚１ｍｍ；Ｒ−Ｒ間隔あたり１６フレーム；フリップ角６０°で４回の励起。駆出率は、拡張末期と収縮末期の体積の差を拡張末期の体積で割ったものとして計算した。ＭＲＩの取得および分析は処理群に対して盲検化して実施した。左心室収縮機能のエコー評価のために、４０ＭＨｚマウス超音波プローブを備えたＧＥ  ｃａｒｅｓ  ｉｎ  ｓｉｔｅ（Ｖ７Ｒ５０４９）を使用した。Ｍモード超音波から得られた拡張末期および収縮末期の寸法に基づいて、左室内径短縮率を計算した。心エコー図を６〜８心臓／治療群について行った。
【０１２０】
リアルタイムＰＣＲを用いたＲＮＡの単離と遺伝子発現プロファイリング
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造元の指示に従って逆転写した。リアルタイムｑＰＣＲ分析は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット、Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｒｅａｌｐｌｅｘ  ４  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で行った。必要に応じて、データを１８ｓ発現に対して正規化した（内因性対照）。遺伝子発現の倍率変化は∂∂ＣＴ法によって決定し、内部対照と比較して提示した。ＰＣＲプライマー配列を補足表３に示す。
【表３】
2019528736.tif 000006
【０１２１】
Ｒ２６ｍＴｍＧマウスにおける系統追跡
Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。全ての実験は、年齢および性別が一致した、等しい比率の雄マウスと雌マウスで実施した。各実験について、増殖コロニーから健康なマウスを無作為に選択した。このマウス系統では、膜標的化ｔｄＴｏｍａｔｏはＲｏｓａ２６遺伝子座上の遍在性プロモーターの制御下で発現されるのに対して、膜標的化ｅＧＦＰはｆｌｏｘｅｄ  ｔｄＴｏｍａｔｏのＣｒｅ媒介性切断後に活性となる。ＣＭ特異的Ｃｒｅ  ｍｏｄＲＮＡ（Ｃｒｅ  Ｋモチーフ＋ｍｉＲ１−ｍｉＲ２０８）を用いて、トランスフェクトＣＭにおいてＣｒｅを排他的に発現させた。これにより、ｍｏｄＲＮＡ発現が減少した後も長期に（＞１０日）、トランスフェクトＣＭおよびそれらの子孫の系統追跡が可能となった。Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載されているように、テールＤＮＡを用いたＰＣＲによって遺伝子型決定した。プライマー配列は以下の通りである：Ｒｏｓａ２６ｍＴ／ｍＧ、野生型フォワード、５’ＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴ−３’、野生型リバース、５’−ＣＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＡ−３’、および変異型リバース、５’−ＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＣＧＴＴ−３。このモデルにおいて、ＣＭ特異的ＬｕｃまたはＰｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクション後のＣＭにおいて、ＣＭ特異的Ｃｒｅ  ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションレベル、ＣＭのサイズおよび数、ならびにＣＭの核数を測定した。
【０１２２】
新生仔ラットおよび成体マウスＣＭの単離
３〜４日齢の新生仔ラットの心臓のＣＭを前述のように単離した１。新生仔ラットの心室ＣＭは４日齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｃｋｓｏｎ）から単離した。０．１４  ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による複数回の消化を使用した。各消化後、上清をウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に回収した。全細胞懸濁液を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を０．１ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．５％インスリン−トランスフェリン−セレン（１００×）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地に再懸濁した。ほとんどの非筋細胞が皿に付着し、筋細胞が懸濁状態になるまで、細胞をプラスチック培養皿に９０分間プレーティングした。次いで筋細胞を２４ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種した。新生仔ラットＣＭを、５％ウマ血清＋Ａｒａ  ｃを含有するＤＭＥＭ培地中で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、本文中に記載されているように、細胞に異なる用量の異なるｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトした。ＭＩの２８日後に成体ＣＭをＣＦＷマウスから単離し、前述のようにＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆの方法を用いてｍｏｄＲＮＡを注射した２。ＣＭ数については、血球計を用いて３回の異なる計数／サンプルおよび３つの心臓／群を平均した。計数されたＣＭの総数は約１５０〜２００ＣＭ／アリコート（消化後に得られたＣＭの全体積からの広口径ピペットを用いた１０μｌのアリコートサンプル）であった。培養したＣＭを、核計数のためにα−アクチニン（ＣＭ、赤色）抗体（ａｂｃａｍ）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した。核計数については、１群あたり３〜４個の独立した試料を用いて、１試料あたり約１×１０３個のＣＭを計数した。核計数を、計数したＣＭのパーセンテージとしてプロットした。トランスフェクト成体ＣＭの単離とＲＮＡの単離については、補足図８を参照されたい。
【０１２３】
マウスＭＩモデルおよび組織学
マウスを用いた全ての外科的および実験的手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ  ａｔ  Ｉｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）およびＭＳＳＭ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（ＣＣＭＳ）によって承認されたプロトコルに従って行った。ＣＦＷ、Ｒ２６ｍＴｍＧマウス（６〜８週齢）をイソフルランで麻酔した。前述のように、ＭＩはＬＡＤの永久結紮によって誘発した３。簡潔には、左胸部を剃毛して滅菌した。挿管後、心臓を左開胸術により露出させた。縫合糸を配置してＬＡＤを結紮した。開胸および皮膚を層にして縫合して閉じた。過剰な空気を胸腔から除去し、通常の呼吸が確立されたときにマウスを換気から外した。ＭＩ後の心血管転帰に対するｍｏｄＲＮＡの効果を決定するために、ｍｏｄＲＮＡ（１００〜１５０μｇ／心臓）を、ＬＡＤ結紮直後に梗塞領域に注射した。心尖付近の梗塞周囲領域は、ＲＮＡ単離およびその後のリアルタイムｑＰＣＲ研究のために急速冷凍するか、または凍結切片化および免疫染色のために４％ＰＦＡで固定した。全ての実験において、外科医は治療群に対して盲検化された。心臓組織学の評価のために、各研究の終わりに心臓を収集した。心臓を摘出し、ＰＢＳ中で簡単に洗浄し、灌流緩衝液で灌流し、秤量し、そして４％ＰＦＡ中で４℃において一晩固定した。翌日、心臓をＰＢＳで洗浄し、３０％スクロース中で一晩インキュベートした。次に、心臓をＯＣＴに入れ、凍結し、−８０℃で保存した。クリオスタットを使用して心臓ブロックを８〜９μｍに横断切片化した。スライドをさらに免疫染色（下記参照）またはＭａｓｓｏｎのトリクローム染色キット（Ｓｉｇｍａ）を使用した組織学的瘢痕染色を用いて評価するために処理し、標準的な手順に従って行った。心臓重量対体重の比率の測定は秤を用いて行った。各実験の終点で比率を測定した。この比率は、マウスの全体重に対する心臓組織重量としてグラム（ｇ）で算出した。
【０１２４】
ｍｏｄＲＮＡ処理後の心臓切片の免疫染色
マウス心臓を摘出し、灌流緩衝液および４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて灌流した。心臓を４％ＰＦＡ／ＰＢＳ中で一晩振盪機において固定し、次いでＰＢＳで１時間洗浄し、３０％スクロース／ＰＢＳ中で４℃において一晩インキュベートした。翌日、心臓をＯＣＴで固定し、−８０℃で凍結した。横断心臓切片（８〜１０μＭ）をクリオスタットによって作製した。凍結切片をＰＢＳ中で５分間再水和した後、０．１％トリトンＸ１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で７分間透過処理した。次にスライドを３％Ｈ２Ｏ２で５分間処理した。ＰＢＳＴで５分間ずつ３回洗浄した後、サンプルをＰＢＳ＋５％ロバ正常血清＋０．１％トリトン  Ｘ１００（ＰＢＳＳＴ）で室温において２時間ブロックし、ＰＢＳＳＴで希釈した一次抗体を加えた。次にスライドを４℃において一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳＴで（４分間ずつ５回）洗浄し、続いてＰＢＳＴで希釈した二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２００）と共に室温において２時間インキュベートした。サンプルをさらにＰＢＳＴで洗浄し（５分間ずつ３回）、ＰＢＳＴで希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１μｇ／ｍｌ）で７分間染色した。ＰＢＳＴでそれぞれ４分間、および水道水で１回（４分間）５回洗浄した後、スライドをイメージング用の封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）で封入した。染色スライドを４℃で保存した。全ての染色は、３〜８心臓／群、２〜３切片／心臓で行った。ＣＭサイズの定量化のための小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）による免疫染色の場合、２０倍の倍率で画像を捕捉し、ＩｍａｇｅＪを使用して各細胞の面積を決定した。定量分析は、１群あたり３〜６個の独立した心臓、および３切片／心臓（評価された１視野あたり約５０細胞、サンプルあたり合計約２５０細胞）からの複数視野の計数を含んだ。ＢｒｄＵ免疫染色のために、心臓を摘出する前に、ＢｒｄＵ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を７〜１０日間、成体マウス（２〜３ヶ月齢）の飲料水に添加した。定量分析は、１群あたり３つの独立したサンプル、および３切片／心臓からの複数視野におけるＢｒｄＵ陽性ＣＭを計数することを含んた。カウントされたＣＭの総数は、１切片あたり約１〜２ｘ１０３ＣＭであった。ＴＵＮＥＬ免疫染色は、製造業者の推奨に従って行った（インサイチュ細胞死検出キット、フルオレセイン、カタログ番号１１６８４７９５９１０、Ｒｏｃｈｅ）。ｍｏｄＲＮＡ処理後の新生仔ＣＭの免疫染色のために、ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトした新生仔ＣＭを３．７％ＰＦＡを有するカバーガラス上に室温で１５分間固定した。ＰＢＳ中０．５％トリトンＸを用いて室温で１０分間透過処理した後、細胞を５％正常ヤギ／ロバ血清＋０．５％ツイーン２０で３０分間ブロックした。カバーガラスを一次抗体（補足表１参照）と共に湿潤チャンバー内で室温において１時間インキュベートし、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５にコンジュゲートした対応する二次抗体とインキュベートし、核を可視化するためＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色した。（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅから）。蛍光画像は、１０倍、２０倍および４０倍の倍率でＺｅｉ��ｓ蛍光顕微鏡で撮影した。
【０１２５】
単離したラット新生仔心筋細胞の生細胞イメージング
ｎＧＦＰ  ＣＭ特異的ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクション後またはｎＧＦＰおよびＣＭ特異的Ｐｋｍ２  ｍｏｄＲＮＡの同時トランスフェクト後の単離ラット新生仔心筋細胞の経時的画像を、１０秒ごとに１０倍対物レンズで共焦点回転ディスク顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、その後２４時間の低速度撮影で取得した。
【０１２６】
統計分析
統計的有意性は、ＭＲＩ結果については対応のあるｔ検定、生存曲線についてはログランク（マンテル−コックス）検定、またはそれぞれの図の説明に詳述するように、他の実験についてはスチューデントｔ検定、一元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定によって決定した、＊ｐ＜０．０５以下を有意とみなす。全てのグラフは平均値を表し、値は平均値±平均値の標準誤差として報告した。両側スチューデントのｔ検定は、仮定された正規分布に基づく。ＣＤ３１内腔構造、ＷＧＡ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＴＵＮＥＬ、ＢｒｄＵ＋、ｋｉ６７＋、ｐＨ３＋またはＡｕｒｏｒａ  Ｂ＋ＣＭの数の定量化については、結果は少なくとも３つの心臓切片から得た。
【表２】
2019528736.tif 000007
【０１２７】
参考文献
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【図１】
2019528736.tif 000008
【図２−１】
2019528736.tif 000009
【図２−２】
2019528736.tif 000010
【図３Ａ】
2019528736.tif 000011
【図３Ｂ】
2019528736.tif 000012
【図３Ｃ】
2019528736.tif 000013
【図４Ａ】
2019528736.tif 000014
【図４Ｂ】
2019528736.tif 000015
【図４Ｃ】
2019528736.tif 000016
【図５Ａ】
2019528736.tif 000017
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2019528736.tif 000019
【図６Ｂ】
2019528736.tif 000020
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
2019528736.tif 000025
【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
2019528736.tif 000027
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2019528736.tif 000030
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
2019528736.tif 000037
【図８Ａ】
2019528736.tif 000038
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2019528736.tif 000040
【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
2019528736.tif 000050
【図８Ｎ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
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【図９Ｍ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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2019528736.tif 000103
2019528736.tif 000104
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