(57)【要約】  本発明は、脱毛防止用組成物に関し、より詳細には、ミノキシジルとペプチドが化学的に連結された構造を有する化合物、及びこれを含む脱毛防止又は発毛促進用薬学的組成物又は化粧料組成物に関する。本発明のミノキシジルとペプチドが化学的に連結された構造を有する化合物は、脱毛の改善、発毛の促進、細胞成長の促進などのような生理活性に優れるだけでなく、水での安定性に優れるので、脱毛防止及び発毛促進用組成物として有用に用いられてよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミノキシジルとペプチドが化学的に結合された構造を有する化合物。
【請求項２】
前記ペプチドは、２から３０個のアミノ酸配列でなる請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ペプチドは、８から１５個のアミノ酸配列でなる請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ペプチドは、水溶性ペプチドである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が５０％以上である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が７０％以上である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が９０％以上である請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記親水性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びプロリン（Ｐｒｏ）からなる群より選択される請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が５個以下である請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が３個以下である請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群より選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列でなるノッキンペプチド、配列番号２のアミノ酸配列でなるケラミン２ペプチド、及び配列番号３のアミノ酸配列でなるＷＩＮＴペプチドからなる群より選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の化合物を含有する脱毛防止又は発毛促進用薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の化合物を含有する脱毛防止又は発毛促進用化粧料組成物。
【請求項１５】
柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゾルゲル、エマルジョン、オイル、ワックス及びエアロゾルからなる群より選択される剤形を有する請求項１４に記載の化粧料組成物。
【請求項１６】
請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の化合物を、脱毛が発生した個体の患部に経皮投与する段階；を含む脱毛防止又は発毛促進のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミノキシジルとペプチドの結合体に関し、より具体的には、ミノキシジルとペプチドそれぞれの特性はそのまま維持しつつも、それぞれの活性が互いに相乗作用を起こす結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛包は、哺乳動物の皮膚の独特の器官であって、原始表皮の下部が成長してより深い皮膚層に伸張された器官である。毛包の基部には、小嚢又は真皮乳頭細胞として知られている細胞のプラグが存在し、乳頭は毛包の正常な循環及び毛幹の成長に必須である。毛幹は、ケラチンフィラメントとフィラメント凝集タンパク質で充填され堅く密着された上皮細胞で製造されたトレッド状の構造である。
【０００３】
ヒトの毛髪は、周期的に生長期、退行期、休止期を繰り返して毛髪が抜け、再び生成される過程を経るようになる。毛髪の周期は、ホルモンの調節や多くの成長因子等の調節を介して決定され、酷いストレスや栄養欠乏などによって毛髪は早く退行期を経て休止期に入り、酷い脱毛症状を誘発する。
【０００４】
毛髪が頭皮から脱落する現象を脱毛とし、脱毛に影響を与える要因としては、気候、光又は熱による露出などの環境的な要因と、疾病、出産、ホルモン分泌及び変化、薬物の服用、栄養状態などの内的な要因とがある。脱毛は、酵素作用の他にも栄養不足、頭皮乾燥、ストレスなどによっても発生し得るところ、このような原因による脱毛の場合、十分な栄養供給、頭皮管理、及び抗酸化物質の摂取又は投与で脱毛を防止して発毛を促進することができる。
【０００５】
このような脱毛現象を治療するため、今までは医薬品として様々な物質が用いられてきたが、価格が高過ぎるか、効能に対する個人差が酷すぎるとの短所があった。その他、化粧品製品においては、価格は安いが効果が微々たる植物抽出物などを用いてきたが、その効果は僅かであった。脱毛に用いられる医薬品の代表的な例としては、ミノキシジルがある。ミノキシジルは、米国ＦＤＡで許可され、固有のカリウム通路開放剤（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｏｐｅｎｅｒ）としての血管拡張機能の外、休止期の毛髪周期から成長期に誘導し、誘導された成長期の毛髪周期を続けて維持させる活性が報告された。しかし、ミノキシジルの使用時に脱毛を遅延させることはできるものの、実際に新たな毛包の再生を誘導するための用途としては用いることができなかった。また、ミノキシジルは水に対する溶解性が低いため、沈澱され、使用が難しい点があった。これを解決するため、特許文献１（韓国公開特許第１０−２０１２−００１１６３２号公報）には、ミノキシジルの使用時に界面活性剤を添加する技術が開示されている。
【０００６】
一方、毛髪の成長及び退化の過程には非常に多くの要因が互いに連携されており、例えば、角質細胞の成長因子を促進し、血管内皮の成長因子の活性を促進し、ＷＩＮＴ経路を促進し、ＢＭＰ経路に関与するタンパク質の活性を抑制することにより、毛髪の生成を促進させる一連の成長因子を活用した研究が報告されてきた。しかし、成長因子類は、効果が非常に優れる反面、自然型の成長因子を得るためにリフォールディングという更なる工程と時間が求められ、また、精製の過程で大腸菌由来の汚染源を除去するための複雑な精製過程を要するようになり、安定性及び高い分子量によって毛髪の保護膜を容易に飛び越えることができない点などが、高い価格と相まって活用度が落ちるようになった。
【０００７】
よって、本発明者達は、天然の成長因子と同一又は類似の機能又は作用ができながらも、天然の成長因子より安定性に優れ、天然の成長因子の大きな分子量による問題点を改善することができるペプチドとして、配列番号３のアミノ酸配列からなるノッキンペプチド（特許文献２：韓国公開特許第１０−２０１０−００８５４０７号公報）、配列番号２のアミノ酸配列からなるケラミン２ペプチド（特許文献３：韓国公開特許第１０−２００９−０１０８３２３号公報）、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるＷＩＮＴペプチド（特許文献４：韓国公開特許第１０−２０１１−００２３９９１号公報）を開発したことがある。
【０００８】
しかし、従来用いられるミノキシジルや、前記配列番号１から配列番号３のアミノ酸配列でなるペプチドは、脱毛の防止及び発毛促進性能の向上、副作用の減少、及び水に対する溶解度の増加という側面で、依然と改善の必要性があった。
【０００９】
本発明者達は、このような問題点を改善するため、前記配列番号１から配列番号３のアミノ酸配列でなるペプチドをミノキシジルにそれぞれ化学的に結合することで、ミノキシジル−ノッキン、ミノキシジル−ケラミン２、ミノキシジル−ＷＩＮＴペプチドを製作し、前記化合物が毛髪の成長に連携されている血管内皮の成長因子の活性を促進し、ＷＩＮＴ経路を促進し、毛髪の損失において主なＢＭＰ経路に関与するタンパク質の活性を抑制することを確認することにより、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記の通りの、従来の発毛剤が有している問題点を改善するためのものであって、天然の成長因子や前記配列番号１から配列番号３のアミノ酸配列でなるペプチド、又はミノキシジルのような従来の発毛剤と比べ、同一であるかさらに優れた脱毛の防止及び／又は発毛促進の機能ができるとともに、それらより水に対する安定性などの生理学的特性に優れる物質を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を達成するため、本発明は、ミノキシジルとペプチドが化学的に結合された構造を有する化合物を提供する。
【００１２】
本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは、２から３０個、好ましくは５から２０個、さらに好ましくは８から１５個、さらに好ましくは１０から１２個のアミノ酸配列からなっていてよいが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドは、水溶性ペプチドであることが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい具現例によれば、前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％と高いことが好ましい。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が５個以下、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下で存在し、存在しないことが最も好ましい。
【００１４】
本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるノッキンペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるケラミン２ペプチド、又は配列番号３のアミノ酸配列からなるＷＩＮＴペプチドであってよいが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、前記で開示されたいずれか一つの化合物を含有する脱毛防止又は発毛促進用の薬学的組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記で開示されたいずれか一つの化合物を含有する脱毛防止又は発毛促進用の化粧料組成物を提供する。
【００１６】
本発明の一具現例によれば、前記化粧料組成物は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゾルゲル、エマルジョン、オイル、ワックス、エアロゾルなどの剤形を有してよいが、これらに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のミノキシジルとペプチドが化学的に結合された構造を有する化合物は、脱毛の改善、発毛の促進、細胞成長の促進などのような生理活性に優れるだけでなく、水での安定性及び皮膚透過率に優れるため、脱毛防止及び発毛促進用組成物として有用に用いられ得る。
【００１８】
但し、本発明の効果は、前記で言及した効果に制限されず、言及されていないまた他の効果等は、下記の記載から当業者に明確に理解され得るものであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の化合物及びミノキシジルの水に対する溶解度を示す写真である。
【図２】本発明の化合物処理時のヒト臍帯静脈血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ、ＨＵＶＥＣ）に対する細胞増殖の程度を示したグラフである。
【図３】本発明の化合物処理時のヒト毛髪真皮乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｈａｉｒ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＨＤＰＣ）に対する細胞増殖の程度を示したグラフである。
【図４】本発明の化合物処理時のＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１のｍＲＮＡ量を確認した結果である。
【図５】本発明の化合物処理時のＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１のｍＲＮＡ量を確認した結果である。
【図６】本発明の化合物処理時のＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１のｍＲＮＡ量を確認した結果である。
【図７】本発明の化合物処理時のＶＥＧＦタンパク質量を確認した結果である。
【図８】本発明の化合物処理時の血管形成の程度を示したイメージである。
【図９】本発明の化合物処理時の血管形成の程度を示したイメージである。
【図１０】本発明の化合物がＷＩＮＴの信号経路であるβ−カテニンの核転座に及ぼす影響を確認した結果である。
【図１１】本発明の化合物がＷＩＮＴの信号経路であるβ−カテニンの核転座に及ぼす影響を確認した結果である。
【図１２】本発明の化合物が毛髪損失の主要因子であるＢＭＰ信号経路を阻害するのか否かをｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８活性化（細胞質から核内への移動）阻害で確認した結果である。
【図１３】本発明の化合物が毛髪損失の主要因子であるＢＭＰ信号経路を阻害するのか否かをｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８活性化（細胞質から核内への移動）阻害で確認した結果である。
【図１４】本発明の化合物処理時の毛髪生長の程度を確認した結果である。
【図１５】本発明の化合物処理時の毛髪生長の程度を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
前記課題を達成するため、本発明は、ミノキシジルとペプチドが化学的に結合された構造を有する化合物を提供する。
【００２１】
前記ミノキシジルは、６−アミノ−１，２−ジヒドロ−１−ヒドロキシ−２−イミノ−４−フェノキシピリミジン（６−Ａｍｉｎｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−１−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｉｍｉｎｏ−４−ｐｈｅｎｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）を示すものであって、下記化学式１で表される構造を有する。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２４】
本明細書において、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。前記ペプチドは、本技術分野に公知の通常の生物学的又は化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって製造されてよい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．, ８５：２１４９−５４（１９６３））。
【００２５】
前記ペプチドは、ミノキシジルの水溶性を増加させるためのものであり、このような側面で、前記ペプチドは水溶性ペプチドであることが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは、２から３０個、好ましくは５から２０個、さらに好ましくは８から１５個、さらに好ましくは１０から１２個のアミノ酸配列でなる。本発明の好ましい具現例によれば、前記ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％と高いことが好ましい。他の一方、前記ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸の比率が５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％と低いことが好ましい。本発明において、「親水性側鎖を有するアミノ酸」は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びプロリン（Ｐｒｏ）を示し、「疎水性側鎖を有するアミノ酸」は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）を示すが、これらに限定されるものではなく、前記のような自然界に存在するアミノ酸以外にも、これらの変形体等も制限なく用いられてよい。本発明の好ましい具現例によれば、前記疎水性側鎖を有するアミノ酸は、前記ペプチド内に５個以下、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下で存在し、存在しないことが最も好ましい。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるノッキンペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるケラミン２ペプチド、及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＷＩＮＴペプチドであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の一具現例によれば、本発明の化合物は、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ、ＨＵＶＥＣ）及びヒト毛髪真皮乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ Ｈａｉｒ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌｓ、ＨＨＤＰＣ）に対する細胞の成長促進能を有する。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、ＷＮＴ信号伝達経路を活性化させる機能を有する。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、β−カテニンを核内に伝達する。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、毛髪損失の主要因子であるＢＭＰ信号経路を遮断する。
【００２７】
本発明の化合物は、それ自体でも安定性に優れるが、化合物に結合されたペプチドをなす任意のアミノ酸を変形させることにより安定性がさらに向上され得る。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される保護基が結合されて安定性をさらに向上させることができる。本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される保護基が結合されて安定性をさらに向上させることができる。
【００２８】
前述したようなアミノ酸の変形は、本発明の化合物の安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において、「安定性」という用語は、「生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）」安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）のような「試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」安定性も包括する意味として用いられる。また、前述した保護基は、生体内及び試験管内でタンパク質切断酵素の攻撃から本発明の化合物を保護する作用をする。
【００２９】
また、本発明は、前記化合物を有効成分として含む脱毛治療又は改善用組成物を提供する。本発明の他の具現例によれば、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用組成物を提供する。本発明において、前記組成物は、薬学的組成物又は健康食品の形態であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の組成物は、前述した本発明の化合物を有効成分として含むため、この２つの間に共通された内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００３１】
本発明の一具現例によれば、本発明の化合物による脱毛の治療又は改善は、発毛の促進又は毛髪の生成である。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の化合物は、ＨＵＶＥＣ及びＨＨＤＰＣ細胞の成長促進能を有し、ＷＩＮＴタンパク質の代表的な信号伝達経路であるβ−カテニン信号伝達の経路を促進させる。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、毛髪損失の主要因子であるＢＭＰ信号経路を遮断する。このような結果に基づいて実施した動物実験を介し、本発明の化合物が毛髪の成長を顕著に促進するとのことが分かった。よって、本発明の組成物は、毛髪の成長及び皮膚状態の改善に非常に効果的である。
【００３２】
また、本発明の一具現例によれば、本発明の化合物による皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷の除去又は皮膚の再生である。
【００３３】
本発明の組成物は、前述した本発明の化合物を有効成分として含むため、この２つの間に共通された内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００３４】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明の化合物の薬学的有効量；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。
【００３５】
本明細書において、「薬学的有効量」という用語は、前述した本発明の化合物の効能又は活性の達成に十分な量を意味する。
【００３６】
本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤等を追加で含んでよい。好適な薬学的に許容される担体及び製剤は、韓国公開特許第２０１７−００２７３１２号に詳しく記載されている。
【００３７】
本発明の薬学的組成物は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施し得る方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤 を用いて製剤化することにより、単位容量の形態に製造されるか又は多用量の容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態や、エックス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ヒドロゲル）の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤を追加的に含んでよい。
【００３８】
本発明による薬学的組成物は、臨床投与時に経口又は非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で用いられてよい。すなわち、本発明の薬学的組成物は、実際の臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与されてよく、製剤化する場合には、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤又は賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、生薬抽出物又は生薬発酵物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチン等を交ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当されるところ、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステル等が用いられてよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチン等が用いられてよい。
【００３９】
投薬の単位は、例えば、個別投薬量の１、２、３又は４倍で、又は１／２、１／３又は１／４倍で含有し得る。個別投薬量は、有効薬物が１回に投与される量を含有し、これは通常、１日投与量の全部、１／２、１／３又は１／４倍に該当する。
【００４０】
本発明の薬学的組成物は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態に製造されるか又は多用量の容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態や、エックス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ヒドロゲル）の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤を追加的に含んでよい。
【００４１】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明の化合物の化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。
【００４２】
本明細書において、「化粧品学的有効量」という用語は、前述した本発明の組成物の皮膚改善効能の達成に十分な量を意味する。
【００４３】
本発明の化粧品組成物は、本技術分野で通常製造される任意の剤形にも製造されてよく、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレー等に剤形化されてよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゲル等のように、溶液、ゾルゲル、エマルジョン、オイル、ワックス、エアロゾル等の多様な形態に製造されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛等が用いられてよい。
【００４５】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート又はポリアミドパウダーが用いられてよく、特にスプレーの場合には、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進体を含んでよいが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルが用いられてよいが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー又はトラガカント等が用いられてよいが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウリン、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体又はエトキシ化グリセリン脂肪酸エステル等が利用されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明の剤形がヘアシャンプーである場合には、本発明の化合物に、増粘剤、界面活性剤、粘度調節剤、保湿剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、エッセンシャルオイル等のように、シャンプーを組成するためのベース成分を混合する。増粘剤としてはＣＤＥが用いられてよく、界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤であるＬＥＳと両性界面活性剤であるココベタイン、粘度調節剤としてはポリクオタニウム、保湿剤としてグリセリン、ｐＨ調節剤としてクエン酸、水酸化ナトリウム、防腐剤としてはグレープフルーツ抽出物が用いられてよく、それ以外にもシダーウッド、ペパーミント、ローズマリー等のエッセンシャルオイルと、シルクアミノ酸、ペンタノール、ビタミンＥが添加されてよい。本発明の一具現例によれば、前記本発明の化合物を１００重量部にするとき、ＣＤＥ  ５〜１０重量部、ＬＥＳ  ３０〜４０重量部、ココベタイン１０〜２０重量部、ポリクオタニウム０.１〜０.２重量部、グリセリン５〜１０重量部、グレープフルーツ抽出物０.１〜１.０１重量部、シルクアミノ酸０.５〜１重量部、ペンタノール０.５〜１重量部、ビタミンＥ  ０.５〜２重量部、エッセンシャルオイルとしてシダーウッド、ペパーミント、ローズマリーのうち一つが０.０１〜０.１重量部混合されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としての本発明の化合物と担体成分の他に化粧品組成物に通常用いられる成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤を含んでよいが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
また、本発明は、前記化合物を、脱毛が発生した個体の患部に経皮投与する段階；を含む、脱毛防止又は発毛促進のための方法を提供する。
【００５２】
前記経皮投与は、局所塗布法（ｔｏｐｉｃａｌ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）又は注射法（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を用いることであってよいが、これに限定されるものではない。
【００５３】
前記患部は、頭皮、顔、あごひげ、頭、鼻ひげ、身体、眉毛及び瞼の部位から選択される少なくとも一つ以上を含み、これらに限定されるものではない。
【００５４】
前記脱毛の発生した個体は、アンドロゲン脱毛症、円形脱毛症、全身脱毛症、退行性脱毛症、抜毛癖、休止期脱毛、成長期脱毛、瘢痕性脱毛、傷あと脱毛、頭皮の菲薄化、毛幹異常症、伝染性毛髪疾患、遺伝的疾患及び化学的治療療法、ホルモン不均衡、かび感染、薬物摂取による脱毛症状のいずれか一つの脱毛障害を有した患者であってよい。
【００５５】
以下、本発明を実施例及び実験例により詳しく説明する。
但し、下記実施例及び実験例は本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の内容が下記実施例及び実験例によって限定されるものではない。
【００５６】
＜実施例１＞  本発明の化合物の合成及び溶解性の評価
【００５７】
＜１−１＞  ペプチドの合成
【００５８】
＜１−１−１＞  配列番号３のペプチドの合成
クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｈｌｏｒｏ ｔｒｉｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ，Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ［００６４］Ｃａｔ  Ｎｏ. ０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れ、メチレンクロリド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間の間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄してメタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かし、１０分間反応させて過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去してそれぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＣｙｓ（ｔｒｔ）−ＣＴＬ樹脂を製造した。
【００５９】
新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡを分画して２回にわたって入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を、脱保護された樹脂がある反応容器に入れ、１時間の間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応樹脂を少量採取してカイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ Ｔｅｓｔ）を用いて反応の程度を点検した。脱保護溶液で前記と同様に２回脱保護反応させ、Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＣＴＬ樹脂を製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再度カイザーテストを行った後、前記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。
【００６０】
選定されたアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）の順で連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間の間アセチル化を行なった後、製造されたペプチジル樹脂をＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥し、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸９５％、蒸溜水２.５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２.５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングを行って樹脂をろ過し、樹脂を少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体の体積が半分程度残るように蒸溜し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のＮＨ２−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−ＯＨペプチド（配列番号３）を０.６５ｇ合成した（収率：９２.６％）。分子量測定器を用いて測定した時、分子量１２８７.１（理論値：１２８６.５）を得ることができた。
【００６１】
＜１−１−２＞  配列番号１及び配列番号２のペプチドの合成
前記実施例＜１−１−１＞と同様の方法を用いて配列番号１のペプチド（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐ：ＥＬＩＥＨＧＧＧＲＰＡＤ）及び配列番号２のペプチド（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ：Ａｃ−ＹＫＳＫＫＧＧＷＴＨ）を合成した。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
＜１−２＞  本発明の化合物の合成
ペプチド反応器にペプチジル樹脂（１ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）３．９ｇ（３ｍｍｏｌ、３．０ｅｑｕｉｖ.）を１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）１０ｍＬに溶かした後、無水コハク酸２００ｍｇ（２ｍｍｏｌ、２. ０ｅｑｕｉｖ. ）を投入して常温で２時間反応した。溶媒をろ過して除去し、新たなＮＭＰ（５ｍＬ  Ｘ  ２）を用いて洗浄することでペプチジル樹脂−コハク酸結合体を収得した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）２７０ｍｇ（０.２ｍｍｏｌ、２.０ｅｑｕｉｖ.）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）７５９ｍｇ（０.２ｍｍｏｌ、２.０ｅｑｕｉｖ.）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬに溶かして３０分間反応した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）３８８ｍｇ（０.３ｍｍｏｌ、３ｅｑｕｉｖ.）、ミノキシジル類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）４１.８ｍｇ（０.２ｍＭ）及びペプチジル樹脂−コハク酸結合体（０.１ｍｍｏｌ）を添加して常温で７２時間の間反応し、ろ過して反応されたペプチジル樹脂を収得した。収得された樹脂を、切断溶液（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて常温で２時間反応することで樹脂及び保護基を除去し、ジエチルエーテル１０ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）を用いて結晶化することでミノキシジルハイブリッドペプチドを収得した。
【００６４】
【化２】
2019528289.tif 000005
【００６５】
【化３】
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【００６６】
【化４】
2019528289.tif 000007
【００６７】
【化５】
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【００６８】
＜１−３＞  溶解性の評価
前記実施例＜１−１＞で製造されたミノキシジル−ＣＧ−ノッキン、ミノキシジル−ＣＧ−ケラミン２、ミノキシジル−ＣＧ−ＷＩＮＴをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＷに溶解させた。対照群としては、ミノキシジルを用いた。
【００６９】
その結果、ミノキシジルの場合、同一の濃度で水に殆ど溶解されないため不透明な状態を示したのに反し、本発明の化合物３種は、いずれも水に完全に溶解されることを確認した（図１参照）。
【００７０】
＜実施例２＞  本発明の化合物処理時の細胞増殖の程度の評価
【００７１】
＜２−１＞  ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ、ＨＵＶＥＣ）に対する細胞増殖の程度の評価
実施例１で合成された本発明の化合物の機能を確認するため、ＨＵＶＥＣに本発明の化合物を処理して増殖の程度を確認した。ＨＵＶＥＣを９６ウェルプレートに３０００個ずつ入れ、２４時間の間ＣＯ２培養器で培養した。２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地に変更し、実施例１で合成された本発明の化合物３種とミノキシジルをそれぞれ０.５ｕＭ、５ｕＭ、５０ｕＭの濃度で細胞に処理した後、７２時間の間培養した。培養が完了した後、培養上澄み液を除去し、エタノールを用いて細胞を固定した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液で処理し、１％の酢酸で十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して生存細胞の状態を観察し、染色された細胞に１０ｍＭのトリス塩基（ｐＨ  １０.５）溶液を加えてＳＲＢを溶出させた後、５６０ｎｍ波長の紫外線で吸光度を測定して細胞の生存状態を測定した。
【００７２】
その結果、本発明の化合物３種の場合、低い濃度では対照群であるミノキシジルと類似の細胞増殖を示したが、濃度が増加するほど、ミノキシジルに比べて細胞増殖の程度が顕著に増加することが分かった（図２参照）。
【００７３】
＜２−２＞  ヒト毛髪真皮乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｈａｉｒ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＨＤＰＣ）に対する細胞増殖の評価
９６ウェルプレートにＨＨＤＰＣを各ウェル当り３０００細胞ずつ入れ、２４時間の間ＣＯ２培養器で培養した。無血清のＤＭＥＭ培地に変更した後、本発明の化合物３種とミノキシジルをそれぞれ０.５ｕＭ、５ｕＭ、５０ｕＭの濃度で処理し、７２時間の間培養した。培養が完了した後、前記実施例＜２−１＞の方法と同様の方法で細胞を染色してＳＲＢを溶出し、細胞増殖の程度を数値化した。
【００７４】
その結果、本発明の化合物３種は、ミノキシジルに比べて細胞増殖の程度が高く、処理濃度に比例して細胞増殖の程度も顕著に高くなることが確認された（図３参照）。
【００７５】
＜実施例３＞  本発明の化合物のＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１発現に対する影響の評価
ＶＥＧＦは血管の生成及び拡張の機能において役割を示し、ＴＧＦβ１は脱毛に影響を与えるため、本発明の化合物処理時のＶＥＧＦとＴＧＦβ１の発現の程度を確認した。
【００７６】
＜３−１＞  ｍＲＮＡ量の評価（転写レベル）
ＶＥＧＦの発現はＨＵＶＥＣを用い、ＴＧＦβ１の発現は毛包の毛乳頭真皮細胞（Ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ）を用いた。６ウェルプレートに２つの細胞をそれぞれ各ウェル当り１×１０５細胞ずつ入れた。２４時間の間ＣＯ２培養器で培養した後、無血清のＤＭＥＭ培地に変更し、本発明の化合物３種とミノキシジルを５ｕＭ、５０ｕＭの濃度で細胞に処理した後、２４時間の間培養した。培養が完了した細胞を回収し、ＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲしてＶＥＧＦとＴＧＦβ１の発現の程度を確認した。ＲＴ−ＰＣＲ時に用いたプライマーは表２に示した。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
その結果、本発明の化合物３種は、ミノキシジルに比べてＶＥＧＦの発現量が高く示され、特にミノキシジル−ノッキンとミノキシジル−ケラミン２の場合、ミノキシジルよりＶＥＧＦの発現量が顕著に高かった（図４から図６参照）。また、ＴＧＦβ１の発現の様態は、本発明の化合物３種がミノキシジルに比べて低く、特にミノキシジル−ノッキンが同一の濃度でミノキシジルよりＴＧＦβ１の発現量が顕著に低かった（図４から図６参照）。このような結果から、本発明の化合物３種が、ミノキシジルに比べて血管の生成及び拡張の機能において役割を示すＶＥＧＦの発現量が高く、脱毛に関与するＴＧＦβ１の発現量が低いため、本発明の化合物３種を脱毛防止又は改善に用いることができることが分かる。
【００７９】
＜３−２＞  タンパク質量の評価（翻訳段階）
６ウェルプレートにＨＵＶＥＣを各ウェル当り１×１０５細胞ずつ入れた。２４時間の間ＣＯ２培養器で培養した。無血清のＤＭＥＭ培地に変更し、本発明の化合物３種とミノキシジルを５ｕＭ、５０ｕＭの濃度で細胞に処理した後、２４時間の間培養した。タンパク質抽出キットを用いてタンパク質を抽出した後、ウエスタンブロットを実施した。１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを製造した後、製造されたＳＤＳ−ＰＡＧＥに１５ｕｇのタンパク質をローディングし、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。常温で１時間の間、５％の脱脂粉乳溶液でブロッキングした。１／３０００の濃度で２時間の間、常温で１次抗体（ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｎｔｉ−ａｌｐｈａ  ｔｕｂｕｌｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）をつけた。ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄し、１／５０００の濃度で１時間の間、常温で２次抗体をつけた。ＢＳＴで１５分間３回洗浄した後、検出した。
【００８０】
その結果、本発明の化合物３種が、ミノキシジルと類似するか、ミノキシジルに比べてＶＥＧＦの発現量が高いことが分かった（図７参照）。本発明の化合物３種が血管の生成及び拡張の機能において役割を示すＶＥＧＦの発現を増加させるため、本発明の化合物を脱毛防止又は改善に有用に用いることができる。
【００８１】
＜実施例４＞  本発明の化合物の血管形成の程度の評価
２４ウェルプレートにマトリゲルを２００ｕｌずつ添加し、１時間培養した。マトリゲルにＨＵＶＥＣを１×１０５細胞ずつ入れた。細胞が播種されたマトリゲルに、本発明の化合物３種とミノキシジルをそれぞれ５ｕＭ、５０ｕＭの濃度で処理した。陽性対照群として用いたＶＥＧＦは、５０ｎＭ、１００ｎＭの濃度で処理した。６時間後、顕微鏡を介してＨＵＶＥＣの血管形成の程度を観察した。
【００８２】
その結果、本発明の化合物３種を処理した場合、血管形成の程度に優れ、特にミノキシジルより優れ、ＶＥＧＦ処理時と類似の程度に血管を形成した（図８参照）。各実験群の血管形成の程度を、一定単位の面積内で完全に形成された血管の個数で比べたとき、本発明の化合物３種は、ミノキシジルに比べて相対的に優れた血管形成を示すものと現われた（図９参照）。
【００８３】
＜実施例５＞  本発明のミノキシジル−ＷＩＮＴがＷＩＮＴの信号経路であるβ−カテニンの核転座に関与するのかの確認
６ウェルプレートに毛包真皮乳頭細胞（Ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ）を各ウェル当り１×１０５細胞ずつ入れた。２４時間の間、ＣＯ２培養器で培養した。無血清のＤＭＥＭ培地に変更し、ミノキシジル、ミノキシジル−ＷＩＮＴ、ＷＩＮＴを５ｕＭ、５０ｕＭの濃度で細胞に処理した後、２４時間の間培養した。タンパク質抽出キットを用いてタンパク質を抽出（核／細胞質タンパク質をそれぞれ抽出）した。１次抗体として抗−βカテニン抗体、抗−ＨＤＡＣ抗体、抗アルファチューブリン抗体を用いたこと以外には、実施例＜３−２＞の方法と同様にウエスタンブロットを実施した。
【００８４】
その結果、同一の濃度で本発明の化合物であるミノキシジル−ＷＩＮＴは、β−カテニンの核への転座が確認されたのに反し、ミノキシジル単独はβ−カテニンの核への転座を起こす程度が顕著に低いものと確認された（図１０参照）。ミノキシジル−ＷＩＮＴの核への転座は、ミノキシジル単独に比べて最大２.８倍以上のものと確認された（図１１参照）。このような結果から、本発明の化合物であるミノキシジル−ＷＩＮＴもＷＩＮＴの信号経路であるβ−カテニンを核内に伝達することが可能であり、ミノキシジルよりもβ−カテニンの核転座を起こす程度が高いので、本発明の化合物を発毛促進又は脱毛防止に用いることができる。
【００８５】
＜実施例６＞  本発明のミノキシジル−ノッキンがＮｏｋｋｉｎの信号経路であるｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８の核転座に関与するのかの確認
本発明のミノキシジル−ノッキンが毛髪損失の主要因子であるＢＭＰ信号経路を阻害するのか否かを、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８活性化（細胞質から核内への移動）阻害で確認した。実施例５の方法と同様にして、ＢＭＰ２の存在下でミノキシジル−ＷＩＮＴの代りにミノキシジル−ノッキンを処理し、１次抗体は、抗−Ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８抗体、抗−ＨＤＡＣ１抗体を用いたことだけ異なるようにして実験を進めた。
【００８６】
その結果、ミノキシジル−ノッキンの処理時には、ミノキシジルの処理時と比べてＰ−Ｓｍａｄ１／５／８の核内への伝達が減少するものと現れ、ミノキシジル−ノッキンの濃度が高くなるほど、核内のＰ−Ｓｍａｄ１／５／８はさらに減少するものと現れた（図１２及び図１３参照）。この結果から、本発明のミノキシジル−ノッキンが毛髪損失に対するＢＭＰ信号経路を遮断することができるので、本発明のミノキシジル−ノッキンを発毛促進又は脱毛防止に用いることができる。
【００８７】
＜実施例７＞  本発明の化合物処理時の毛髪生長の確認
７週齢のＣ５７ＢＬ雄マウス６匹に本発明のミノキシジル−ノッキンを塗って毛髪生長の程度を確認した。７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの背中の毛を除毛クリームを用いて全て除毛した。ＰＢＳにミノキシジル及びミノキシジル−ノッキンをそれぞれ１００ｕｇ／ｍｌの濃度で添加して試料を製造した。毎日、一日に一度ずつ、マウスの背中の皮膚にくまなく塗った。マウスの背中の皮膚の毛が育つのかを観察した後、背中の皮膚の色が黒く変わる時点から写真撮影して観察した。組織学検査のためにマウスを屠殺し、マウスの背中の皮膚を採取して４％のＰＦＡに固定した後、パラフィンで包理した。包理されたブロックを４ｕｍにセクションしてＨ＆Ｅ染色した後、毛包を観察した。
【００８８】
その結果、本発明の化合物を塗った場合には、試料を処理していない対照群やミノキシジルを処理した群に比べ、毛髪の生長速度が顕著に早いことを確認した（図１４参照）。Ｈ＆Ｅ検査で毛包を確認したとき、本発明の化合物を処理した群は、対照群やミノキシジルを処理した群に比べて毛包が皮膚深く位置しており、毛包の個数がさらに多く、毛包内の毛根が長く成長して皮膚の表面に育つ形態から、毛包の成長と発達が促進されたことを確認した（図１５参照）。前記のような結果から、本発明の化合物を発毛促進又は脱毛防止に用いることができることが分かる。
【００８９】
＜剤形例＞
剤形例１：柔軟化粧水
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、下記表３の組成でなる柔軟化粧水を一般的な化粧水の製造方法によって製造した。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
剤形例２．栄養クリーム
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、下記表４の組成でなる栄養クリームを一般的な栄養クリームの製造方法によって製造した。
【００９２】
【表４】
2019528289.tif 000011
【００９３】
剤形例３．栄養化粧水
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、下記表５の組成でなる栄養化粧水を一般的な化粧水の製造方法によって製造した。
【００９４】
【表５】
2019528289.tif 000012
【００９５】
剤形例４．エッセンス
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、下記表６の組成でなるエッセンスを一般的なエッセンスの製造方法によって製造した。
【００９６】
【表６】
2019528289.tif 000013
【００９７】
剤形例５．ヘアセラム
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、下記表７の組成でなるヘアセラムを一般的なヘアセラムの製造方法によって製造した。
【００９８】
【表７】
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【００９９】
剤形例６．ヘアトナー
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、下記表８の組成でなるヘアトナーを一般的なヘアトナーの製造方法によって製造した。
【０１００】
【表８】
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【０１０１】
前記では、本発明の好ましい実施例を例示的に説明したが、本発明の範囲は前記のような特定の実施例にのみ限定されず、当該分野で通常の知識を有する者であれば、本発明の特許請求の範囲に記載されている範疇内で適宜変更が可能であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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