(57)【要約】グリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートする工程およびラムノシル化フラボノイドを得る工程を含むラムノシル化フラボノイドの生産方法と、この方法における使用に好適なグリコシルトランスフェラーゼおよび前記グリコシルトランスフェラーゼを含むキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラムノシル化フラボノイドの生産のための方法であって、
（ａ）グリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させること／インキュベートすることと、
（ｂ）ラムノシル化フラボノイドを得ることを含み、
前記グリコシルトランスフェラーゼが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むか；
（ｂ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、５６、５８、６１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配を含むか、
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６  ３７、３８、５７、５９、６０、６２、もしくは６３の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるか；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６  ３７、３８、５７、５９、６０、６２、もしくは６３と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるか；
（ｅ）ストリンジェント条件下で、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、５７、５９、６０、６２、もしくは６３を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによりコードされ、
また、前記フラボノイドが、下式（Ｉ）：
【化１】
2019501662.tif 000079
（Ｉ）
式中、
【化２】
2019501662.tif 000080
は、二重結合または一重結合であり；
Ｌは、
【化３】
2019501662.tif 000081
であり；
Ｒ1およびＲ2は独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲｄ、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；ここで、Ｒ2は−ＯＨとは異なり；
あるいは、Ｒ1およびＲ2は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒeで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環を形成し；ここで、各Ｒeは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
あるいはまた、Ｒ4は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつ
Ｒ5およびＲ6は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒcで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環を形成し；
あるいはまた、Ｒ4およびＲ5は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒcで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環を形成し；かつ
Ｒ6は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒaは独立に、一重結合、Ｃ1-5アルキレン、Ｃ2-5アルケニレン、アリーレンおよびヘテロアリーレンから選択され；ここで、前記アルキレン、前記アルケニレン、前記アリーレンおよび前記ヘテロアリーレンはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5 アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく； 
各Ｒdは独立に、単糖、二糖およびオリゴ糖から選択され；かつ
Ｒ3は該方法によりラムノシル化されている
の化合物または溶媒和物である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フラボノイドが、水溶液中でのその溶解度を上回る、好ましくは約２００μＭを上回る、より好ましくは約５００μＭを上回る、さらにより好ましくは約１ｍＭを上回る終濃度で前記グリコシルトランスフェラーゼと接触される／インキュベートされる
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリコシルトランスフェラーゼで形質転換された宿主細胞を準備する工程をさらに含む
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞をフラボノイドと接触させる／インキュベートする前に前記宿主細胞がインキュベートされる
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞が大腸菌である
請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
接触および／またはインキュベートが約２０℃〜約３７℃の温度、好ましくは約２４℃〜約３０℃の温度、より好ましくは約２８℃の温度で行われる
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
接触／インキュベートが約６．５〜約８．５のｐＨ、好ましくは約７〜約８のｐＨ、より好ましくは約７．４のｐＨで行われる
請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
接触／インキュベートが約３０％〜約５０％の溶存酸素（ＤＯ）濃度で行われる
請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
溶存酸素濃度が約５０％を上回る場合に栄養素が添加され、好ましくは、栄養素はグルコース、スクロース、マルトースまたはグリセロールである
請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
接触／インキュベートが複合栄養培地で行われる
請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
接触／インキュベートが最少培地で行われる
請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞をフラボノイドと接触させる／インキュベートする前に前記インキュベートされた宿主細胞を回収する工程をさらに含む
請求項３ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
回収が膜濾過法、好ましくは、中空繊維膜装置、または遠心分離を用いて行われる
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞をフラボノイドと接触させる／インキュベートする前に回収された宿主細胞をバッファー中で可溶化することをさらに含み、好ましくは、前記バッファーが、好ましくは、炭素およびエネルギー源、好ましくは、グリセロール、グルコース、マルトース、および／またはスクロース、ならびに増殖添加剤、好ましくは、ビオチンおよび／またはチアミンを含むビタミンを添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である
請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記フラボノイドがフラバノン、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノノール、カルコン、フラバノール、アントシアニジン、オーロン、フラバン、クロメン、クロモンまたはキサントンである
請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ラムノシル化が請求項１に記載の式（Ｉ）のＲ3位における−Ｏ−（ラムノシル）の付加であり、前記ラムノシルは、その−ＯＨ基の１以上において、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、単糖、二糖およびオリゴ糖から独立に選択される１以上の基で置換される
請求項１ないし１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートする工程およびラムノシル化フラボノイドを得る工程を含む、ラムノシル化フラボノイドの生産のための方法に関する。加えて、本発明は、このような方法における使用に好適なグリコシルトランスフェラーゼおよび前記グリコシルトランスフェラーゼを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイドは、多様な植物に一般に見られるポリフェノール化合物種である。フラボノイドは、アントキサンチン、フラボノン、フラバノノール、フラバンおよびアントシアニジンなどの化合物のサブクラスを含む。フラボノイドは、これらの化合物を抗酸化剤、抗炎症薬、抗癌薬、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗アレルゲン、および心血管疾患を予防または治療するための薬剤としての使用に好適とする多数の有益な特性を有することが知られている。さらに、数種のフラボノイドは、風味増強または調整剤として有用であることが報告されている。
【０００３】
この広範な潜在的用途のために、フラボノイドは化粧品、食品、飲料、栄養補助商品(nutritional and dietary supplement)、医薬および動物飼料の成分として極めて重要な化合物である。しかしながら、これらの化合物の使用は、低い水溶解度、低い安定性および限定された利用率のために多くの場合で限定されてきた。これらの化合物の使用を甚だしく限定してきたさらなる要因は、自然界に相当量で存在するフラボノイドは数種だけであり、他のフラボノイドの存在量はほとんど無視できるものであるという事実である。結果として、多くのフラボノイドおよびそれらの誘導体は、大規模な工業的使用に必要な量では入手できない。
【０００４】
グリコシル化は、フラボノイドの最も多い修飾の一つであり、これらの化合物の特性を著しく調節することが報告されている。例えば、グリコシル化は、より高い溶解度および安定性の増強、例えば、放射線または温度に対するより高い安定性をもたらし得る。さらに、グリコシル化は、これらの化合物の薬理活性およびバイオアベイラビリティを調節し得る。
【０００５】
フラボノイドのグリコシル化誘導体は、自然界ではＯ−グリコシドまたはＣ−グリコシドとして存在するが、後者はずっと少ない。このような誘導体は、対応するアグリコンから出発するグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）の作用によって形成され得る。
【０００６】
天然に存在するＯ−グリコシドの例は、ケルセチン−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（イソケルセチン）およびゲニステイン−７−Ｏ−β−グルコシド（ゲニステイン）である。
【０００７】
しかしながら、フラボノイドは、自然界で最大のポリフェノールクラスを構成する（非特許文献１）。極めて多様なフラボノイドがこの環構造へ様々な官能基の付加に起源する。ゆえに、グリコシル化は最も豊富な形態であり、この糖部分の多様性がいっそうさらに多数のグリコンをもたらす。
【０００８】
しかし、自然界には分布しているフラボノイドグリコンは数種のみである。上記のように、これらの中には３−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド、例えば、イソクエルシトリン、フラボノイド−７−β−Ｄ−グルコシド、例えば、ゲニスチン、および３−および７−ラムノグルコシド、例えば、ルチンおよびナリンギンがある。一般に、グルコシドは、３−および７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド優位な最も多いグリコシド形態である。これに対し、他の糖部分、例えばラムノース、ならびにＣ３およびＣ７以外のグリコシル化部位に関するグリコシドの存在はまれであり、特定の植物器官に希少量で存在するに過ぎない。このことがこのような化合物の工業的使用を阻んでいる。例えば、非特許文献２は、３−Ｏ位でラムノシル化フラボノイドを生産するための方法を記載している。また、ナリンゲニンおよびケルセチンの３−Ｏラムノシル化型は非特許文献３により記載されている。一例としての、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）における３−Ｏラムノシド経路のケンフェロールによる代謝操作が非特許文献４により記載されている。最後に、３−Ｏラムノシル化ケルセチンおよびケンフェロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産が非特許文献５により記載されている。これらの文献に５−Ｏラムノシル化フラボノイドの生産を記載または示唆するものは無い。
【０００９】
実際に、当技術分野で知られている５−Ｏラムノシル化フラボノイドの例は極めて少ない。少数の例はケルセチン−５−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド、ルテオリン−５−Ｏ−グルコシド、およびクリシン−５−Ｏ−β−Ｄ−キシロシドである（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。これまでに記載されているのは４つのフラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドだけである。タキシフォリン−３，５−ジ−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドは、少量のヘスペレチン−７−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドも含有するインドの植物カキバチシャノキ（Ｃｏｒｄｉａ  ｏｂｌｉｑｕａ）から抽出された（非特許文献１０；非特許文献１１）。エリオジクチオール−５−ラムノシドは、ヒメフウチョウソウ（Ｃｌｅｏｍｅ  ｖｉｓｃｏｓａ）から単離された（非特許文献１２）。別のフラバノン、ナリンゲニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（Ｎ５Ｒ）は、ヒマラヤザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｃｅｒａｓｏｉｄｅｓ）種子から単離された（非特許文献１３）。２ｋｇの風乾粉末状種子からの抽出により８００ｍｇのＮ５Ｒが得られた。この絶対的に希少な存在量もまた、熱帯マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）植物の茎から単離されたナリンゲニン−４’−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（非特許文献１４）などの他のフラバノンラムノシドの商業的使用を阻んでいる。
【００１０】
特許文献１は、ポリフェノール、特に、フラボノイド、安息香酸誘導体、スチルベノイド、カルコノイド、クロモン、およびクマリン誘導体のグリコシル化を触媒する酵素に関するものである。加えて、特許文献１は、ポリフェノールのグリコシドの調製方法を開示している。しかしながら、グリコシル化は、ポリフェノールのＣ３、Ｃ３’、Ｃ４’およびＣ７に限られる。さらに、この開示は、ポリフェノールをラムノシル化する可能性についてはふれていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１９１５２４号
【特許文献２】欧州特許第１８６７７２９Ａ１号
【特許文献３】韓国登録特許第１０１６２９５０３Ｂ１号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１１／０１２３４８１Ａ１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖｅｒｖｅｒｉｄｉｓ  （２００７）  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｊ．  ２（１０）：１２１４−１２３４
【非特許文献２】Ｄｅ  Ｂｒｕｙｎ  （２０１５）  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  １４：１３８
【非特許文献３】Ｏｈａｓｈｉ  （２０１６）  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １００：６８７−６９６
【非特許文献４】Ｙａｎｇ  （２０１４）  Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ４１：１３１１−１８
【非特許文献５】Ｊｏｎｅｓ  （２００３）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：４３９１０−１８
【非特許文献６】Ｈｅｄｉｎ  （１９９０）  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ３８（８）：１７５５−７
【非特許文献７】Ｈｉｒａｙａｍａ  （２００８）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９（５）：１１４１−１１４９
【非特許文献８】Ｊｕｎｇ  （２０１２）  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ５０（６）：２１７１−２１７９
【非特許文献９】Ｃｈａｕｈａｎ  （１９８４）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３（１０）：２４０４−２４０５
【非特許文献１０】Ｃｈａｕｈａｎ  （１９７８）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：３３４
【非特許文献１１】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  （１９７９）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２０５８−２０５９
【非特許文献１２】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  （１９７９）  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｅｃｔ  Ｂ  １８：８６−８７
【非特許文献１３】Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖａ  （１９８２）  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｅｃｔ  Ｂ  ２１  （６）：４０６−４０７
【非特許文献１４】Ｙａｄａｖａ  （１９９７）  Ｊ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ７４（５）：４２６−４２７
【非特許文献１５】Ｃｏｕｔｉｎｈｏ  （２００３）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２８（２）：３０７−３１７
【非特許文献１６】Ｈｕｇｈｅｓ  （１９９４）  Ｍｉｔ  ＤＮＡ  ５（１）：４１−４９
【非特許文献１７】Ｒａｂａｕｓｃｈ  （２０１３）  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７９（１５）：４５５１−４５６３
【非特許文献１８】Ｊａｎｖａｒｙ  （２００９）  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ５７（９）：３５１２−３５１８
【非特許文献１９】Ｌｏｒｅｎｃ−Ｋｕｋａｌａ  （２００５）  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ５３（２）：２７２−２８１
【非特許文献２０】Ｔｏｈｇｅ  （２００５）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４２（２）：２１８−２３５
【非特許文献２１】Ｈｅ  （２００６）  ＪＢＣ  ２８１（４５）：３４４４１−７
【非特許文献２２】Ｄａｉｍｏｎ  （２０１０）  ＰＮＡＳ  １０７（２５）：１１４７１−１１４７６
【非特許文献２３】Ｘｕ  （２０１３）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ  ４０（５）：３６３１−３６３９
【非特許文献２４】Ｘｉｅ  （２０１３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ）  ７８（５）：５３６−５４１
【非特許文献２５】Ｎｏｇｕｃｈｉ  （２００８）  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ５６（２４）：１２０１６−１２０２４
【非特許文献２６】Ｓｈｉｍｏｄａ  （２０１０）  Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ  ２（２）：１７１−１８０
【非特許文献２７】Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）
【非特許文献２８】Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  １−１２  （１９８３）
【非特許文献２９】ｖａｎ  Ｌｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：４７−５２
【非特許文献３０】Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８：５９２５−５９３２
【非特許文献３１】Ｂｅｌａｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２３１  （２）：  １９７−２０４
【非特許文献３２】Ｏｄｄｏｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ６２（２）：  １０８−１８
【非特許文献３３】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２
【非特許文献３４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ  （２０１２））
【非特許文献３５】Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （２００２）
【非特許文献３６】Ｗｏｏｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １４：１４４８
【非特許文献３７】Ｃｏｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６９：２１１０−２１１４
【非特許文献３８】Ｈａｎａｈａｎ  （１９８３）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６６：５５７−５８０
【非特許文献３９】Ｍａｎｄｅｌ  ＆  Ｈｉｇａ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５３：１５９−１６２
【非特許文献４０】Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ＆  Ｄｏｗｅｒ  （１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１
【非特許文献４１】Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＆  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  （１９８７）  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，  Ｃｒｏｏｍ  Ｈｅｌｍ，  Ｌｏｎｄｏｎ
【非特許文献４２】Ｐｕｈｌｅｒ  （１９９３）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  ＮＹ；  Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ
【非特許文献４３】Ａｄｏｌｐｈ  （１９９６）  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ
【非特許文献４４】Ｂｉｒｒｅｎ  ＆  Ｌａｉ  （１９９６）  Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
【非特許文献４５】Ｓｈｉｍｏｄａ  ａｎｄ  Ｈａｍａｄａ  ２０１０，  Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ  ２：１７１−１８０，  ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎｕ２０２０１７１，  Ｐａｒｋ  ２００６，  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ７０（４）：９４０−９４８
【非特許文献４６】Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００，  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６４（１０）：  ２２４６−２２４９
【非特許文献４７】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５０：５０−５６
【非特許文献４８】Ｋｏｋ  （２０１４）  ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ  ３（２）：９７−１０６
【非特許文献４９】Ｂｅｙｅｒ  （２０１５）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（９）：ｅ０１３７６５２
【非特許文献５０】Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖａ  （１９８２）  Ｉｎｄ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｅｃｔ  Ｂ  ２１（６）：４０６−４０７
【非特許文献５１】Ｓｉｍｋｈａｄａ  （２００９）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌｓ  ２８：３９７−４０１
【非特許文献５２】Ｗｅｒｎｅｒ  （２０１０）  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  Ｅｎｇ  ３３：８６３−８７１
【非特許文献５３】Ｂｉｅｓａｌｓｋｉ  （２００７）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｃａｒｅ  １０（６）：７２４−７２８
【非特許文献５４】Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ  （２００７）  Ａｎｎ  Ｉｓｔ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓａｎｉｔａ  ４３（４）：  ３９４−４０５
【非特許文献５５】Ｌｉｍ  （２００３）  Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ４１：  ４４５−４５０
【非特許文献５６】Ｙａｎｏ  （２００１）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０７：４０９−４１７
【非特許文献５７】Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  （２００２）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ４：１５７−１６４
【非特許文献５８】Ｈｅｎｃｋｅｌｓ  （２０１３）  Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：２２９
【非特許文献５９】Ｃａｌｅｙ  （２０１５）  Ａｄｖ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ  ４：  ２２５−２３４
【非特許文献６０】Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ  ２００２，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４（３）：１５７−１６４
【非特許文献６１】Ｓａｎｃｈｏ  （２００３）  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６３：４２９−４３８
【非特許文献６２】Ｐｒａｓａｄ  （２０１０）  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ  ７６：  １０４４−１０６３
【非特許文献６３】Ｒｏｍｉｅｒ（２００８）  Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｎｕｔｒ  １００：  ５４２−５５１
【非特許文献６４】Ｌｉａｎｇ  （２０１２）  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ３２：１０６６２−１０６７３
【非特許文献６５】Ｃａｏ（２０１６）  Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ６，  ２１７３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
よって、商業的使用を可能とするために５−Ｏラムノシル化フラボノイドの大規模生産のための信頼性のある方法の差し迫った必要がある。
【００１４】
よって、本発明の基礎にある技術的問題は、式ＩのＲ3位に相当するＣ５におけるフラボノイドの効率的なラムノシル化のための信頼性のある手段および方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この技術的問題は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態の提供により解決される。
【００１６】
よって、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートすること、およびラムノシル化フラボノイドを得ることを含む、ラムノシル化フラボノイドの生産のための方法に関する。これに関して、驚くことに、また予期しないことに、グリコシルトランスフェラーゼがＣ５−ＯＨ、すなわち、Ｒ3位においてフラボノイドをラムノシル化することができることが見出された。特に、フラボノイドは下式（Ｉ）で表される。
【００１７】
【化１】
2019501662.tif 000002
（Ｉ）
【００１８】
従来技術に基づいて予想できたものとは対照的に、グリコシルトランスフェラーゼは、式Ｉの化合物を、特許文献１に記載されるようなポリフェノールのＣ５に相当するＲ3位においてラムノシル化することができる。よって、付属の実施例に示されるように、本発明の方法は、５−Ｏラムノシドの生産、特に、生産された５−Ｏラムノシドの商業的使用を可能とするように大規模での生産を可能とする。これに関して、驚くことに、反応物、すなわち、フラボノイドの、水溶液中でのその溶解度を上回る濃度を用いた実験でラムノシル化フラボノイドの最も効率的な生産が見られることが判明した。すなわち、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートすること、前記フラボノイドは、前記グリコシルトランスフェラーゼと水溶液中でのその溶解度を上回る、好ましくは約２００μＭを上回る、より好ましくは約５００μＭを上回る、さらにより好ましくは約１ｍＭを上回る終濃度で接触され／インキュベートされる、および次に、ラムノシル化フラボノイドを得ることを含む、ラムノシル化フラボノイドの生産のための方法に関する。当業者は、溶解度は本発明の方法で抽出物として使用されるフラボノイドによって異なることを認識するであろう。よって、上の値は使用されるフラボノイドによって変更可能である。
【００１９】
本発明の方法では、グリコシルトランスフェラーゼは、５−Ｏラムノシル化フラボノイドの効率的生産のために使用される。原則として、付属の実施例により証明されるようにいずれのグリコシルトランスフェラーゼを用いてもよい；例えば、実施例Ａ３、特に、表Ａ７およびＡ８参照。しかしながら、ＧＴ１ファミリーに属すグリコシルトランスフェラーゼを使用することが好ましい。これに関して、グリコシルトランスフェラーゼＧＴＣ、ＧＴＤ、ＧＴＦ、およびＧＴＳは、グリコシルトランスフェラーゼファミリーＧＴ１（ＥＣ  ２．４．１．ｘ）に属す（非特許文献１５）。このファミリーは、小さな親油性アクセプターへの糖の転移を媒介する酵素を含む。ＧＴ１ファミリーのメンバーは、ＧＴ−Ｂフォールドを独自に有する。これらのメンバーは糖ドナー内のグリコシド結合およびアクセプター複合体内で形成されたものに関する反転反応機構を触媒して、天然β−Ｄ−またはα−Ｌ−グリコシドを形成する。
【００２０】
ＧＴ−Ｂフォールド内で、この酵素は、間にリンカー領域を有する２つの主要なドメイン、１つのＮ末端とＣ末端を形成する。一般に、Ｎ末端はアクセプター結合を担うＡＡ残基を構成し、ドナー結合を決定する残基は主としてＣ末端に位置する。ＧＴ１ファミリーでは、Ｃ末端は、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）−糖結合に関与するＡＡ残基を有する保存性の高いモチーフを含む。このモチーフはまた、植物二次産物グリコシルトランスフェラーゼ（ＰＳＰＧ）ボックスとも呼ばれた（非特許文献１６）。
【００２１】
フラボノイドＧＴはＧＴ１ファミリーに属す。植物におけるフラボノイドの自然の生合成のために、これらの酵素のほとんどのものは植物から知られている。しかしながら、他の真核生物界、真菌および動物由来、およびまた細菌ドメイン由来の酵素もいくつか記載がある。真核生物では、ＧＴ１酵素の糖ドナーは一般に、ウリジル二リン酸（ＵＤＰ）で活性化されている。これらのいわゆるＵＧＴまたはＵＤＰＧＴのほとんどの酵素は、ＵＤＰ−グルコースからフラボノイドアクセプターへグルコース残基を転移させる。ＵＤＰ−ガラクトース、−ラムノース、−キシロース、−アラビノース、および−グルクロン酸由来の他の生物学的に関連する糖は、多くの場合で転移が少ない。
【００２２】
また、数種の細菌ＧＴ１は、フラボノイドアクセプターもグリコシル化できることが発見された。これらの酵素は全て抗生物質マクロライドＧＴ（ＭＧＴ）のＧＴ１サブファミリーに属す。細菌では、ＧＴ１酵素はドナー基質としてＵＤＰ−グルコースまたは−ガラクトースを使用するだけでなく、デオキシチミジニル二リン酸（ｄＴＤＰ）活性化糖も使用する。しかしながら、全ての細菌フラボノイド活性ＧＴ１酵素は、天然ドナーとしてＵＤＰ−グルコースを有する。知られている例外が１つだけあり、ラムノースをフラボノイドへ転移することが報告された（非特許文献１７）最初の細菌ＧＴ１であるメタゲノム由来酵素ＧｔｆＣである。しかしながら、本発明がなされるまでは、この活性はフラボノイドのＣ３−ＯＨまたはＣ７−ＯＨ基に限定されることが確認されていた。フラボノイドＣ−環のＣ３’−ＯＨおよびＣ４’−ＯＨへの転移はもはやあまり一般には見られなかった。他の位置はあるとしてもまれにしかグリコシル化されない。特に、Ｃ５−ＯＨ基のグリコシル化に関する例はごくわずかであり、これはＣ４にケト基が存在すればこの基が立体的保護されるという事実に基づく。従って、唯一の例はアントシアニジンに関するものである（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。このクラスのフラボノイドは、求核作用を助長するＣ４ケト基を欠いている。（イソ）フラボンおよび（イソ）フラボノンのＣ５−ＯＨ基は、Ｃ４で隣接するカルボニル基との水素架橋を介して保護される。これは、これらのクラスのＣ５での化学的グリコシル化アプローチを妨げさえすると思われた。
【００２３】
現在、フラボンの５−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを作り出すことが同定されているＧＴ１酵素は３つしかない。１つはタルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）由来のＵＧＴ７１Ｇ１であり、これは、位置選択的でないことが証明されており、ケルセチンのＣ５−ＯＨのグルコシル化にわずかな副活性を示した（非特許文献２１）。例外的ＵＧＴがケルセチン−５−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを特異的に形成することができるカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）で同定された（非特許文献２２；非特許文献２３）。最後に、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来のＭＧＴの突然変異体は、一ＡＡ交換の後に５−ヒドロキシフラボンのＣ５−ＯＨにおいて低活性を示した（非特許文献２４）。しかしながら、野生型ＭＧＴは、この能力も他のＭＧＴも持たなかった。
【００２４】
フラバノール−５−Ｏ−α−Ｄ−グルコシドは、ヒドロラーゼ、すなわち、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．ｘ）のトランスグルコシル化活性を介して合成された（非特許文献２５；非特許文献２６）。しかしながら、これらのフラバノールはまたＣ４＝Ｏ−基も欠き、これらの酵素は「非天然型」α−Ｄ−グルコシド結合を作り出す。
【００２５】
これまでに知られている５−Ｏ−ＧＴは全てグルコシル化のみを媒介したことは注目に値することである。従来技術は、フラボノイドのラムノシル化に関しては全くふれておらず、本発明の方法の使用はなおさらである。
【００２６】
よって、エルベ川堆積物メタゲノム由来のＧＴＣ、ジアドバクター・フェルメンタンス（Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来ＧＴＤ、フィブロソマ・リミ（Ｆｉｂｒｏｓｏｍａ  ｌｉｍｉ）由来ＧＴＦ、およびセゲチバクター・コレエンシス（Ｓｅｇｅｔｉｂａｃｔｅｒ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）由来ＧＴＳおよびキメラ１、３、および４は、初めて実験的に証明されたフラボノイド−５−Ｏ−ラムノシルトランスフェラーゼ（ＦＲＴ）である。これは付属の実施例により証明される。特に、実施例Ａ３は、表Ａ７およびＡ８で全てのキメラに関する結果を提供する。さらなる生産例は、特に、ＧＴＣを用いたさらなる実施例で示される。さらに、フラビフミバクター・ソリシルナエ（Ｆｌａｖｉｈｕｍｉｂａｃｔｅｒ  ｓｏｌｉｓｉｌｖａｅ）、ケシリバクター・アンダマネンシス（Ｃｅｓｉｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｎｄａｍａｎｅｎｓｉｓ）、ニアベラ・オランチアカ（Ｎｉａｂｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、スピロソマ・ラジオトレランス（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、フィブレラ・アエスツアリナ（Ｆｉｂｒｅｌｌａ  ａｅｓｔｕａｒｉｎａ）、フラビソリバクター種（Ｆｌａｖｉｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＬＣＳ９およびアキマリナ・マクロケファリ（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ  ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌｉ）由来の関連の酵素は、それらが重要なアミノ酸配列特徴を共有することから、同じ機能を呈する。ＮＤＰ−糖を用いる他の全てのＧＴ１酵素とは対照的に、ＦＲＴはいくつかのユニークなアミノ酸パターンを有する。
【００２７】
よって、本発明は、前記の保存されたアミノ酸を含むグリコシルトランスフェラーゼを用いた、５−Ｏ、すなわち、式ＩのＲ3ラムノシル化フラボノイドの生産のための方法に関する。驚くことに、また予期しないことに、本発明者らによって同定された、これらの保存されたアミノ酸配列は、下記のモチーフを含む（アミノ酸位置は全て野生型ＧＴＣアミノ酸配列に関して示す）：（１）双方ともＨｉｓ32の前後、すなわち、ＧＴ１酵素の活性部位残基に位置するモチーフ21Ｋ／Ｒ  ＩＬＦＡＸＸＰＸＤＧＨＦ  Ｎ／Ｓ  ＰＬＴＸ  Ｌ／Ｉ  Ａ40内の厳格に保存されたアミノ酸Ａｓｐ（Ｄ30）および芳香族Ｐｈｅ（Ｆ33）（ここで、３０位のアミノ酸は、好ましくは極性アミノ酸である）；（２）Ｎβ２の手前のループとストランドＮβ２を含むモチーフ47ＧＸＤＶＲＷ  Ｙ／Ｆ53；（３）モチーフ85Ｆ／Ｙ／Ｌ Ｐ Ｅ／Ｄ Ｒ88の厳格に保存されたアミノ酸Ａｒｇ（Ｒ88）（ここで、Ｐｒｏ86およびＧｌｕ87はＧＴ１酵素における基質結合に関して報告され、隣接するＡｒｇ（Ｒ88）はラムノシル−ＧＴにユニークである）；（４）長いＮ末端ヘリックスＮα３を形成するモチーフ100ＦＤＸＸＸＸＦＸＸＲＸＸＥ  Ｙ／Ｆ  ＸＸＤ116の厳格に保存されたアミノ酸Ｐｈｅ（Ｆ100）、Ａｓｐ（Ｄ101）、Ｐｈｅ（Ｆ106）、Ａｒｇ（Ｒ109）およびＡｓｐ（Ｄ116）（ここで、１０３位および１０８位のアミノ酸は、好ましくは比極性アミノ酸である）；（５）Ｎβ４の手前のループ、ストランドＮβ４、および下流Ｎ−α−ヘリックスへのループを含むモチーフ124Ｆ／Ｗ  ＰＦＸＸＸＸＸ  Ｄ／Ｅ  ＸＸＦＸＸＸＸＦ140（ここで、１２８〜１３０位のアミノ酸は、好ましくは非極性アミノ酸である）；（６）保存されたアミノ酸Ｇｌｙ（Ｇ170）を含むモチーフ156ＰＬＸＥＸＸＸＸＬ  Ｐ／Ａ  ＰＸＧＸＧＸＸＰＸＸＸＸＸＧ  Ｋ／Ｒ180；（７）Ｃ末端ドメインを伴い、Ｎ末端ドメインのリンカー領域の手前のモチーフ230ＬＱＸＧＸＸＧＦＥＹＸＲ241；（８）Ｃα１の手前のループおよびヘリックス  Ｃα１ならびに厳格に保存されたアミノ酸Ｔｈｒ（Ｔ284）およびＧｌｕ（Ｇ286）を含むモチーフ281ＴＱＧＴＸＥ Ｋ／Ｒ  ＸＸＸＫＸＸＸＰＴＬＥＡＦ  Ｒ／Ｋ301（ここで、Ｔｈｒは基質結合に関与し、２８５位のアミノ酸は、好ましくは非極性アミノ酸であり、２９２〜２９４位のアミノ酸は、好ましくは非極性アミノ酸である）；（９）ストランドＣβ２を形成するモチーフ306ＬＶＸＸＴＴＧＧ313（ここで、３０８位および３０９位のアミノ酸は、好ましくは非極性アミノ酸である）；および（１０）保存された酸性アミノ酸Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｅ／Ｄ331）、Ａｓｐ（Ｄ332）、ヘリックスＣα２の開始部に他のＧＴ１酵素のＧｌｎ（Ｑ）の代わりに保存された芳香族アミノ酸Ｐｈｅ（Ｆ336）、基質結合に関与する厳格に保存されたアミノ酸Ａｓｎ（Ｎ349）、および他のＧＴ１酵素のＰｒｏ（Ｐ）の代わりに厳格に保存されたアミノ酸Ｇｌｙ（Ｇ369）を含むモチーフ330Ｉ  Ｅ／Ｄ  ＤＦＩＰＦＸＸ  Ｖ／Ｉ  ＭＰＸＸＤＶ  Ｙ／Ｆ  Ｉ／Ｖ  Ｔ／Ｓ  ＮＧＧ  Ｙ／Ｆ  ＧＧＶ  Ｍ／Ｌ  ＬＸＩＸ  Ｎ／Ｈ  ＸＬＰＸＶＸＡＧＸＨＥＧＫＮＥ376（ここで、このモチーフはＧＴ１酵素の保存されたドナー結合領域を形成し、３６７位および３７２位のアミノ酸は、好ましくは非極性アミノ酸で���り、ＧＴ１酵素は通常、ヘキソース糖結合および触媒活性を担うＤ／Ｅ  Ｑ／Ｎ／Ｋ／Ｒモチーフを示すことから、371ＨＥＧＫＮＥ376モチーフは５−Ｏ−ＦＲＴに絶対的にユニークである）。
【００２８】
前記５−Ｏ−ＦＲＴの下記のアラインメントは相同なＡＡ位を示し、コンセンサスな配列番号１を示す（灰色の四角で強調）。
【００２９】
（表１（１））
2019501662.tif 000003
【００３０】
（表１（２））
2019501662.tif 000004
【００３１】
（表１（３））
2019501662.tif 000005
【００３２】
（表１（４））
2019501662.tif 000006
【００３３】
（表１（５））
2019501662.tif 000007
【００３４】
（表１（６））
2019501662.tif 000008
【００３５】
（表１（７））
2019501662.tif 000009
【００３６】
（表１（８））
2019501662.tif 000010
【００３７】
（表１（９））
2019501662.tif 000011
【００３８】
（表１（１０））
2019501662.tif 000012
【００３９】
（表１（１１））
2019501662.tif 000013
【００４０】
（表１（１２））
2019501662.tif 000014
【００４１】
（表１（１３））
2019501662.tif 000015
【００４２】
よって、本発明の方法では、グリコシルトランスフェラーゼが式（Ｉ）のＲ3位においてフラボノイドをラムノシル化するその所望の機能を維持する限り、上の保存されたアミノ酸／配列モチーフの幾つかまたは好ましくは全てを含むグリコシルトランスフェラーゼが使用されることが好ましい。これらのアミノ酸／配列モチーフは、配列番号１に含まれる。よって、本発明の好ましい一実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含み、かつ、フラボノイドの５−Ｏラムノシル化に相当する、上記に示されるような式（Ｉ）のＲ3位においてフラボノイドをラムノシル化する所望の活性を示すグリコシルトランスフェラーゼが使用される。本発明さらに、既知のグリコシルトランスフェラーゼＧＴＣ、ＧＴＤ、ＧＴＦまたはセゲチバクター・コレエンシス、フラビフミバクター・ソリシルナエ、ケシリバクター・アンダマネンシス、ニアベラ・オランチアカ、スピロソマ・ラジオトレランス、フィブレラ・アエスツアリナ、もしくはアキマリナ・マクロケファリ由来の関連の酵素のアミノ酸配列を含むグリコシルトランスフェラーゼを使用するフラボノイドのラムノシル化のための方法に関する。よって、一実施形態では、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、５６、５８、または６１のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼが本発明の方法で使用される。これに関して、当業者は、これらの配列はそのポリペプチドの機能を変更することなく変更可能であることに熟知している。例えば、グリコシルトランスフェラーゼなどの酵素はその酵素活性を担う活性部位を一般に有することが知られている。活性部位の外側のアミノ酸を、または活性部位内のアミノ酸であっても、酵素全体が同等または同一の活性を維持しつつ変更することができる。酵素活性はアミノ酸配列に対する変更により増強さえされる場合があることが知られている。従って、本発明の方法では、式（Ｉ）のＲ3位においてフラボノイドをラムノシル化する機能が維持される限り、それぞれ配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、５６、５８、または６１と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むグリコシルトランスフェラーゼが使用され得る。この活性を試験する方法は本明細書に記載されているか、かつ／または当業者に知られている。
【００４３】
本発明の方法では、上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるグリコシルトランスフェラーゼが使用可能である。特に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、５７、５９、６０、６２、または６３の核酸配列のいずれかを含むポリヌクレオチドによりコードされるグリコシルトランスフェラーゼが使用可能である。当技術分野で公知のように、遺伝コードは縮重し、これにより、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを変更することなく、ポリヌクレオチドに含まれる核酸の配列の変更が可能となる。よって、本発明の方法では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、５７、５９、６０、６２、または６３と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるグリコシルトランスフェラーゼが使用可能である。ポリヌクレオチドに対するさらなる変更は、コードされるポリペプチドの構造／機能を変更することなく行えるので、ストリンジェント条件下で配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、５７、５９、６０、６２、または６３を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによりコードされるグリコシルトランスフェラーゼが本発明の方法で使用可能である。
【００４４】
本発明の意味に範囲内で、用語「ポリペプチド」または「酵素」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターにより互いに連結されたアミノ酸を指し、２０の遺伝子コードアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによるか、または当技術分野で周知の化学修飾技術によって修飾されてもよい。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのいずれの場所に存在してもよい。同種の修飾が、あるポリペプチドの幾つかの部位に同じまたは異なる程度で存在してもよいことが認識されるであろう。また、あるポリペプチドが多種の修飾を持っていてもよい。修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化(myristolyation)、酸化、ＰＥＧ化(pergylation)、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、および／またはトランスファー−ＲＮＡにより媒介されるアルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸の付加を挙げることができる（非特許文献２７；非特許文献２８参照）。
【００４５】
本発明の方法で使用されるグリコシルトランスフェラーゼはフラボノイドと直接接触／インキュベートされてもよいが、本方法は、前記グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換された宿主細胞を提供する工程をさらに含むことが好ましい。従って、グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞により組換え発現され、フラボノイドと接触させる／インキュベートするために宿主細胞により提供される。宿主細胞をフラボノイドと接触させる／インキュベートする前に宿主細胞がインキュベートされることが好ましい。すなわち、そのラムノシル化型の生産のためにフラボノイドを添加する前に、宿主細胞がグリコシルトランスフェラーゼを組換え発現することが可能であることが好ましい。
【００４６】
宿主細胞のタイプは特に限定されない。原則として、いずれの細胞も、グリコシルトランスフェラーゼを組換え発現するために宿主細胞として使用可能である。例えば、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が由来する生物を使用してもよい。しかしながら、本発明の方法では、宿主細胞は原核生物宿主細胞であることが好ましい。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「原核生物」および「原核生物宿主細胞」は、核を含まず、従ってその染色体材料が細胞質から分離されない細胞を指す。原核生物は例えば細菌を含む。本発明により特に包含される原核生物宿主細胞としては、遺伝子操作および培養増殖に従うものが含まれる。組換えタンパク質発現において通常使用される例示的原核生物としては、限定されるものではないが、大腸菌、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（非特許文献２９）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（非特許文献３０）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）（非特許文献３１）、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（非特許文献３２）およびシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）（例えば、緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｅｎｏｓａ）、蛍光菌（Ｐ．  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）およびＰ．シリンガエ（Ｐ．  ｓｙｒｉｎｇａｅ））が挙げられる。原核生物宿主細胞は、商業ソース（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなど）からまたはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナサス、ＶＡ）などの寄託機関から入手することができる。
【００４８】
本発明の方法では、原核生物宿主細胞、特に、細菌宿主細胞は大腸菌であることが好ましい。大腸菌における組換えタンパク質の発現は当技術分野で周知である。大腸菌に基づく発現系のプロトコールは、非特許文献３３に示されている。
【００４９】
本発明の宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを保持する目的で遺伝的に改変されているという意味で組換えである。一般に、これは、対象とするタンパク質またはペプチドをコードする核酸分子を単離すること、および単離された核酸分子を原核細胞に導入することによって達成される。
【００５０】
対象とするタンパク質、すなわち、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子は、いずれかの従来法を用いて単離することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子は、制限断片として得てもよいし、あるいはポリメラーゼ連鎖反応増幅産物として得てもよい。グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質をコードする核酸分子を単離するための技術は、当技術分野で慣例的に実施され、非特許文献３４および非特許文献３５などの実験手引書に述べられている。
【００５１】
原核生物宿主細胞においてタンパク質（酵素を含む）またはペプチド、特に、グリコシルトランスフェラーゼの発現を促すためには、対象とするタンパク質またはペプチドをコードする単離された核酸分子を１以上の発現ベクターに組み込む。種々の原核生物宿主細胞に適合する発現ベクターが周知であり、本明細書に引用される当技術分野で記載されている。発現ベクターは一般に、核酸のクローニング、転写および翻訳に好適な要素を含む。このような要素には、例えば、５’から３’方向に、プロモーター（一方向性または双方向性）、対象とする核酸分子をプロモーターと作動可能に会合するための多重クローニング部位、および所望によりＲＮＡポリメラーゼに対する停止シグナルおよびポリアデニラーゼの対するポリアデニル化シグナルを含む終結配列が含まれる。本明細書で述べる調節制御配列に加え、発現ベクターは、付加的ヌクレオチド配列を含み得る。例えば、発現ベクターは、ベクターを組み込んだ宿主細胞を同定するための選択マーカー遺伝子をコードすることができる。選択マーカーをコードする核酸は、対象とする核酸を含有するものと同じベクターで宿主細胞に導入することもできるし、または別のベクターで導入することもできる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。発現ベクターは商業ソースから得ることができるか、または原核生物宿主細胞における組換えタンパク質発現で慣例的に使用されるプラスミドから産生され得る。例示的発現ベクターとしては、限定されるものではないが、大腸菌における異種ＤＮＡの発現のために改変された基本プラスミドであるｐＢＲ３２２；ＲＳＦ１０１０（非特許文献３６）；ｐＥＴ３（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ｐＡＬＥＸ２ベクター（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）；およびｐＥＴｌＯＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
【００５２】
発現ベクターで使用される調節配列は、対象とするタンパク質、すなわち、グリコシルトランスフェラーゼが構成的に発現されるべきか、誘導条件下で（例えば、ＩＰＴＧなどの外部刺激により）発現されるべきかを含むいくつかの因子に依存し得る。加えて、原核生物宿主細胞により発現されるタンパク質は、検出、単離および／または精製を容易にするためにタグを付けてもよい（例えば、ｈｉｓ６タグ、ＦＬＡＧタグまたはＧＳＴタグ）。
【００５３】
ベクターは、従来の形質転換技術によって原核生物宿主細胞に導入することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、塩化カルシウム（非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９）、エレクトロポレーション（非特許文献４０）、および非特許文献３３に記載されているものが挙げられる。微生物形質転換および発現系に関する実験プロトコールの総説としては、非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３；および非特許文献４４を参照。
【００５４】
発現ベクターの代わりとして、本明細書に開示されるタンパク質（酵素を含む）およびペプチドをコードする核酸が、前記核酸が宿主ゲノムに安定に組み込まれるように原核生物宿主細胞の特定のゲノム部位に遺伝子ターゲティングまたは相同組換えにより導入できることも企図される。
【００５５】
グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を保持する組換え原核生物宿主細胞は、選択マーカー発現、前記核酸のＰＣＲ増幅、および／またはグリコシルトランスフェラーゼの発現を検出するための活性アッセイなどの従来の方法によって同定できる。ひと度同定されれば、組換え原核生物宿主細胞は、慣例の実施に従って培養および／または保存することができる。
【００５６】
組換え宿主細胞の培養方法については、当業者は、このような細胞の効率的培養に好適な方法をどのように選択および最適化すればよいかを熟知している。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「培養する」などは、対象とする組換えタンパク質、特に、グリコシルトランスフェラーゼを生産し得る宿主細胞の集団を作出および維持するために使用される方法および技術、ならびに対象とするタンパク質、すなわち、グリコシルトランスフェラーゼの生産を最適化するための方法および技術を指す。例えば、ひと度、発現ベクターが適当な宿主、好ましくは、大腸菌に導入されれば、その宿主は適切なポリヌクレオチドの高レベル発現に好適な条件下で維持することができる。本発明の方法を使用する場合、対象とするタンパク質、すなわち、グリコシルトランスフェラーゼは培地に分泌され得る。対象とするタンパク質が培地に分泌される場合には、このような発現系からの上清をまず市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（商標）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限外濾過装置を用いて濃縮することができ、次にこれに限定されるものではないが、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含むアフィニティークロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１以上の付加的精製技術を施すことができる。
【００５８】
様々な組換え宿主細胞に使用される培養培地は当技術分野で周知である。一般に、増殖培地または培養培地は、液体または微生物もしくは細胞の増殖を支持するように設計されたゲルである。異なるタイプの細胞を増殖させるために異なるタイプの培地がある。
【００５９】
組換え細菌細胞を培養するために使用される培養培地は、細菌の属性に依存する。培養培地は一般に、無機塩および化合物、アミノ酸、炭水化物、ビタミンおよび宿主細胞の増殖に不可欠であるかまたは宿主細胞の健康もしくは増殖もしくは両方を改善するその他の化合物を含む。特に、培養培地は一般に、全てではないにしても多くのグリコシルトランスフェラーゼの補因子であるマンガン（Ｍｎ2+）およびマグネシウム（Ｍｇ2+）イオンを含む。微生物の最も一般的な増殖／培養培地はＬＢ培地（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ）である。ＬＢは栄養培地である。
【００６０】
栄養培地は、ほとんどの細菌が増殖に必要とし、かつ、非選択性の要素を全て含有し、従って、それらの培地は実験的培養コレクションで維持される細菌の一般的培養および維持に使用される。
【００６１】
これに関して、非定義培地（基本培地または複合培地としても知られる）は、細菌増殖のためのグルコースなどの炭素源、水、細菌増殖に必要とされる種々の塩類、アミノ酸および窒素源（例えば、牛肉、酵母抽出物）を含有する培地である。これに対し、定義培地（化学的定義培地または合成培地としても知られる）は、使用される化学物質の全てが既知であり、かつ、酵母、動物または植物組織が存在しない培地である。本発明の方法では、定義または非定義栄養培地のいずれもが使用可能である。しかしながら、本発明の方法ではＬｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地、ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地、Ｒｉｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＭ）、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉ培地またはそれらの混合物を使用することが好ましい。
【００６２】
あるいは、最少培地も本発明の方法で使用可能である。最少培地は、一般にアミノ酸の存在なく、コロニー増殖が可能な最少の栄養素を含有するものである。最少培地は一般に、細菌増殖のための炭素源（グルコースなどの糖であり得る）またはコハク酸塩などのエネルギー豊富でない供給源、種々の塩類を含有し、これらは細菌種および増殖条件の間で異なり得、これらは一般に、タンパク質および核酸および水を合成することを可能とするようにマグネシウム、窒素、リン、および硫黄などの必須元素を提供する。補足最少培地は、単一の選択された薬剤、通常はアミノ酸または糖も含有する最少培地の一種である。この補足は、栄養要求性組換えの特定の系統の培養を可能とする。よって、一実施形態では、本発明の方法は最少培地で行われる。好ましくは、最少培地は、炭素源およびエネルギー源を補足した無機塩培地（ＭＳＭ）またはＭ９培地であり、ここで、好ましくは前記炭素およびエネルギー源はグリセロール、グルコース、マルトース、スクロース、デンプンおよび／または糖蜜である。
【００６３】
本発明の方法で使用される培地は、当技術分野で周知の方法に従って調製される。これに関して、培養培地を調製するための方法は一般に、「基本培地」の調製を含む。用語「基本培地」または培養液は、当業者により容易に認識され、かつ、その詳細な組成が培養される微生物の増殖を許容しつつ変更可能である特定の基本的な必要成分を含む部分的培養液を指す。よって、実施形態では、限定されるものではないが、基本培地は塩、バッファー、およびタンパク質抽出物を含み得、また、実施形態では、塩化ナトリウム、第一および第二リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムを含み得る。実施形態では、１リットルのコア培地は個々の培地に関して技術分野で公知の一般的な配合を有し得るが、別の実施形態では、コア培地は水、寒天、タンパク質、アミノ酸、カゼイン加水分解物、塩類、脂質、炭水化物、塩類、無機物、およびｐＨ緩衝剤のうち１以上を含むであろうし、または含み得、肉抽出物、酵母抽出物、トリプトン、フィトン、ペプトン、および麦芽抽出物などの抽出物を含有してよく、実施形態では、培地は、ｌｕｒｉａ  ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地；低塩ＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母抽出物、および０．５％ＮａＣｌ）、ＳＯＢ培地（２％ペプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4）、ＳＯＣ培地（２％ペプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２０ｍＭグルコース）、Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（３．２％ペプトン、２％酵母抽出物、および０．５％ＮａＣＩ）、２×ＴＹ培地（１．６％ペプトン、１％酵母抽出物、および０．５％ＮａＣｌ）、ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（ＴＢ）（１．２％ペプトン、２．４％酵母抽出物、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、および０．４％グリセロール）、ＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｂｒｏｔｈまたはＬＢ  Ｌｅｎｎｏｘ  ｂｒｏｔｈ（１％ペプトン、０．５％酵母抽出物、および１％ＮａＣｌ）であり得るか、またはそれらを含み得る。特定の実施形態では、基本培地から１以上の成分を除いてもよいことが理解されるであろう。
【００６４】
本発明の方法では、宿主細胞は、宿主細胞を外来遺伝子、すなわち、グリコシルトランスフェラーゼの発現を誘導するための薬剤とインキュベートする／接触させる前、および生物変換されるフラボノイドの添加前に培地中で培養可能である。あるいは、フラボノイドは、宿主細胞とともに、従って、培養培地中で宿主細胞の数を増複する前に培養に加えてもよい。
【００６５】
当業者ならば、所望の微生物、特に大腸菌の増殖は、対象とする微生物に好適な選択温度で最も良く増進されることを容易に理解できるであろう。特定の実施形態では、培養は約２８℃で行ってよく、使用するブロスは、試験のためのサンプル接種の前にこの温度に予温してよい。しかしながら、本発明の方法では、培養は、所望の目的、すなわち、ラムノシル化フラボノイドの生産に好適ないずれの温度で行ってもよい。しかしながら、培養は約２０℃〜約３７℃の間の温度で行われるのが好ましい。すなわち、培養は好ましくは、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃または約３７℃の温度で行われる。より好ましくは、培養は約２４℃〜約３０℃の間の温度で行われ得る。最も好ましくは、本発明の方法で培養は約２８℃の温度で行われる。
【００６６】
同様に、培養宿主細胞をフラボノイドと接触させる／インキュベートすることは、ラムノシル化フラボノイドの効率的生産に好適ないずれの温度で行ってもよい。好ましくは、宿主細胞を培養するための温度および宿主細胞およびグリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートするための温度はほぼ同一である。すなわち、宿主細胞および発現されたグリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートすることは、約２０℃〜約３７℃の間の温度で行われる。宿主細胞および発現されたグリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートすることは、好ましくは、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃または約３７℃の温度で行われる。より好ましくは、宿主細胞および発現されたグリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートすることは、約２４℃〜約３０℃の間の温度で行われ得る。最も好ましくは、本発明の方法で宿主細胞および発現されたグリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させる／インキュベートすることは、約２８℃の温度で行われる。
【００６７】
本発明の方法で、培養培地のｐＨは一般に約６．５〜約８．５の間に設定され、例えば、特定の実施形態では、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４もしくは８．５であるかまたはその約その値であり、あるいは上記の値のいずれか２つによって区切られた範囲であり得る。よって、特定の実施形態では、培養培地のｐＨは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、または８．４の下限および約６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４または８．５の上限を有する範囲である。好ましい実施形態では、培養培地は、約７．０〜８．０の間のｐＨを有する。本発明のより好ましい実施形態では、培地は約７．４のｐＨを有する。しかしながら、Ｈ６．５〜８．５の外側のｐＨもなお本発明の方法で使用可能であるものの、培養の効率および選択性は悪影響を受ける場合があることが理解されるであろう。
【００６８】
培養物は、組換え宿主細胞を接種した後にいずれの所望の期間増殖させてもよいが、２０℃を上回る温度で３時間の培養期間、および６００ｎｍで光学密度（ＯＤ）０．１からの出発で、グリコシルトランスフェラーゼの効率的発現およびその後の首尾良い生物変換のためのフラボノイドとの接触／インキュベートを可能とするのに十分に大腸菌含量を富化するのに十分であることが判明した。しかしながら、培養期間はより長くても短くてもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくそれを超える時間まで、または未満であってもよい。当業者ならば、特定の要件を満たすための好適な培養期間を容易に選択できる。
【００６９】
本発明の方法では、培養培地はさらに高濃度化／補足してもよい。すなわち、宿主細胞の培養中および／または宿主細胞および発現されたグリコシルトランスフェラーゼをフラボノイドと接触させている／インキュベートしている間、溶存酸素（ＤＯ）の濃度をモニタリングし、所望の値に維持することが好ましい。好ましくは、本発明の方法では、溶存酸素（ＤＯ）濃度は約３０％〜約５０％に維持される。さらに、溶存酸素の濃度が約５０％を上回る場合には栄養素を添加してよく、好ましくは、栄養素はグルコース、スクロース、マルトースまたはグリセロールである。すなわち、培地は、培養／接触／インキュベート中に、グリコシルトランスフェラーゼの効率的生産および／またはフラボノイドの効率的生物変換を可能とする条件を維持するために補足／高濃度化してもよい。
【００７０】
一実施形態では、本発明の方法は、流加培養または半回分培養として行ってよい。これらの用語は、培養中にバイリアクターに１以上の栄養素（基質）が送り込まれ（供給され）、かつ、その実施の収量までバイオリアクター内に生成物が留まるバイオテクノロジープロセスの操作技術を指して互換的に使用される。いくつかの実施形態では、全ての栄養素はバイオリアクターに送り込まれる。
【００７１】
本発明の方法では、インキュベートされた宿主細胞を、宿主細胞をフラボノイドと接触させる／インキュベートする前に回収する工程が付加されてよい。すなわち、本発明の方法は、培養培地中で宿主細胞を所望の光学密度（ＯＤ）まで培養すること、所望のＯＤが達成された際に宿主細胞を回収することを含み得る。ＯＤは、約０．６〜１．０の間、好ましくは約０．８であり得る。グリコシルトランスフェラーゼの発現は、回収前に誘導されるか、または回収後に、例えば、フラボノイドの添加とともに誘導されるかのいずれでもよい。培養培地は回収後に変更してもよく、または宿主細胞は宿主細胞の増殖に使用される培養培地に再懸濁させてもよい。すなわち、一実施形態では、本発明の方法は、回収された宿主細胞を、宿主細胞をフラボノイドと接触させる／インキュベートする前にバッファーに可溶化することをさらに含み、好ましくは、バッファーは、好ましくは、炭素およびエネルギー源、好ましくは、グリセロール、グルコース、マルトース、および／またはスクロース、ならびに増殖添加剤、好ましくは、ビオチンおよび／もしくはチアミンを含むビタミン類を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００７２】
本発明の方法では、回収は、その目的に好適ないずれの方法を用いて行ってもよい。回収は膜濾過法、好ましくは、中空繊維膜装置、または遠心分離を用いて行われることが好ましい。
【００７３】
本発明の方法では、ラムノシル化されるフラボノイドは、フラボノイドが当技術分野で公知のフラボノイド種に属する限り特に限定されず、従って、多くの機能を満たす、植物中に広く分布する化合物の一群のメンバーである。フラボノイドは、受粉動物を誘引するように設計された花弁に黄色または赤／青の着色をもたらす、花色に最も重要な植物色素である。高等植物では、フラボノイドは、ＵＶ濾過、共生窒素固定および花の着色に関与する。
【００７４】
従って、フラボノイドは、好ましくは、フラバノン、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノノール、カルコン、フラバノール、アントシアニジン、オーロン、フラバン、クロメン、クロモンまたはキサントンである。本発明の意味に範囲内で、後者の３つのものがこのクラスに含まれる。従って、用語「フラボノイド」は、一般式（Ｉ）下に入るいずれの化合物も指し、よって、一般にフラボノイド型化合物と考えられる化合物に限定されない。
【００７５】
本発明の方法で使用されるフラボノイドは下式（Ｉ）の化合物または溶媒和物であることが好ましく、
【００７６】
【化２】
2019501662.tif 000016
(I)
【００７７】
式中、
【００７８】
【化３】
2019501662.tif 000017
【００７９】
は、二重結合または一重結合であり；
Ｌは、
【００８０】
【化４】
2019501662.tif 000018
【００８１】
であり；
Ｒ1およびＲ2は独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；ここで、Ｒ2は−ＯＨとは異なり；
またはＲ1およびＲ2は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒeで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環を形成し；ここで、各Ｒeは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
あるいはまた、Ｒ4は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ5およびＲ6は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒcで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環を生成し；
あるいはまた、Ｒ4およびＲ5は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒcで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環を形成し；かつＲ6は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒaは独立に、一重結合、Ｃ1-5アルキレン、Ｃ2-5アルケニレン、アリーレンおよびヘテロアリーレンから選択され；ここで、前記アルキレン、前記アルケニレン、前記アリーレンおよび前記ヘテロアリーレンはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
各Ｒdは独立に、単糖、二糖およびオリゴ糖から選択され；かつ
Ｒ3は、本発明の方法によりラムノシル化されている。
【００８２】
これに関して、ラムノシル化は、好ましくは、上記に示されるような式（Ｉ）のＲ3位における−Ｏ−（ラムノシル）の付加であり、前記ラムノシルは、その−ＯＨ基の１以上においてＣ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、単糖、二糖およびオリゴ糖から独立に選択される１以上の基で置換される。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「炭化水素基」は、炭素原子と水素原子からなる基を指す。この基の例は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、カルボシル(carbocyl）およびアリールである。一価および二価両方の基が包含される。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「アルキル」は、直鎖型でも分岐型でもよい一価飽和非環式（すなわち、非環式）炭化水素基を指す。よって、「アルキル」基は、炭素間二重結合または炭素間三重結合を含まない。「Ｃ1-5アルキル」は、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基を表す。好ましい例示的アルキル基は、メチル、エチル、プロピル（例えば、ｎ−プロピルまたはイソプロピル）、またはブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）である。そうではないことが定義されない限り、用語「アルキル」は、好ましくは、Ｃ1-4アルキル、より好ましくは、メチルまたはエチル、さらにより好ましくは、メチルを指す。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「アルケニル」は、直鎖型でも分岐型でもよい一価不飽和非環式炭化水素基を指し、１個以上（例えば、１または２個）の炭素間二重結合を含むが、それは炭素間三重結合を含まない。用語「Ｃ2-5アルケニル」は、２〜５個の炭素原子を有するアルケニル基を表す。好ましい例示的アルケニル基は、エテニル、プロペニル（例えば、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、またはプロプ−２−エン−１−イル）、ブテニル、ブタジエニル（例えば、ブタ−１，３−ジエン−１−イルまたはブタ−１，３−ジエン−２−イル）、ペンテニル、またはペンタジエニル（例えば、イソプレニル）である。そうではないことが定義されない限り、用語「アルケニル」は、好ましくは、Ｃ2-4アルケニルを指す。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「アルキニル」は、直鎖型でも分岐型でもよい一価不飽和非環式炭化水素基を指し、１個以上（例えば、１または２個）の炭素間三重結合、および任意に、１個以上の炭素間二重結合を含む。用語「Ｃ2-5アルキニル」は、２〜５個の炭素原子を有するアルキニル基を表す。好ましい例示的アルキニル基は、エチニル、プロピニル、またはブチニルである。そうではないことが定義されない限り、用語「アルキニル」は、好ましくは、Ｃ2-4アルキニルを指す。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「アルキレン」は、直鎖型でも分岐型でもよい、アルカンジイル基、すなわち、二価飽和非環式炭化水素基を指す。「Ｃ1-5アルキレン」は、１〜５個の炭素原子を有するアルキレン基を表し、用語「Ｃ0-3アルキレン」は、共有結合（選択肢「Ｃ0アルキレン」に相当）またはＣ1−3アルキレンが存在することを示す。好ましい例示的アルキレン基は、メチレン（−ＣＨ2−）、エチレン（例えば、−ＣＨ2−ＣＨ2−または−ＣＨ（−ＣＨ3）−）、プロピレン（例えば、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ（−ＣＨ2−ＣＨ3）−、−ＣＨ2−ＣＨ（−ＣＨ3）−、または−ＣＨ（−ＣＨ3）−ＣＨ2−）、またはブチレン（例えば、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）である。そうではないことが定義されない限り、用語「アルキレン」は、好ましくは、Ｃ1-4アルキレン（特に、直鎖Ｃ1-4アルキレンを含む）、より好ましくは、メチレンまたはエチレン、さらにより好ましくは、メチレンを指す。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「カルボシクリル」は、単環式環ならびに架橋環、スピロ環および／または縮合環系（例えば、２環または３環で構成され得る）を含む炭化水素環基を指し、ここで、前記環基は、飽和、部分的不飽和（すなわち、不飽和であるが芳香族でない）または芳香族であり得る。そうではないことが定義されない限り、「カルボシクリル」は、好ましくは、アリール、シクロアルキルまたはシクロアルケニルを指す。
【００８９】
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロシクリル」は、単環式環ならびに架橋環、スピロ環および／または縮合環系（例えば、２環または３環から構成され得る）を含む環基を指し、ここで、前記環基は、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個以上（例えば、１、２、３、または４個）の環ヘテロ原子を含み、かつ、残りの環原子は炭素原子であり、１個以上のＳ環原子（存在する場合）および／または１個以上のＮ環原子（存在する場合）が任意に酸化されていてもよく、１個以上の炭素環原子が任意に酸化されていてもよく（すなわち、オキソ基を形成する）、かつ、さらに、前記環基は飽和、部分的不飽和（すなわち、不飽和であるが芳香族でない）または芳香族であり得る。そうではないことが定義されない限り、「ヘテロシクリル」は、好ましくは、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニルを指す。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「複素環式環」は、好ましくは酸素、窒素および硫黄から選択される１個以上のヘテロ原子を含有する飽和または不飽和環を指す。例としては、本明細書で定義されるヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルが挙げられる。好ましい例は、５または６原子を含み、特定例は１，４−ジオキサン、ピロールおよびピリジンである。
【００９１】
用語「炭素環」は、好ましくは５または６個の炭素原子を含む、飽和または不飽和炭素環、例えば、アリールまたはシクロアルキルを意味する。例としては、本明細書に定義されるアリールおよびシクロアルキルである。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語「アリール」は、単環式芳香環ならびに少なくとも１つの芳香環（例えば、２つもしくは３つの縮合環から構成される環系、これらの縮合環の少なくとも１つは芳香族である；または２つもしくは３つの環から構成される架橋環系、これらの架橋環の少なくとも１つは芳香族である）を含む架橋環および／または縮合環系をはじめとする芳香族炭化水素環基を指す。「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、ジアリニル（すなわち、１，２−ジヒドロナフチル）、テトラリニル（すなわち、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル）、アントラセニル、またはフェナントレニルを指し得る。そうではないことが定義されない限り、「アリール」好ましくは、６〜１４個の環原子、より好ましくは、６〜１０個の環原子を有し、最も好ましくは、フェニルを指す。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロアリール」は、単環式芳香環ならびに少なくとも１つの芳香環を含む架橋環および／または縮合環系（例えば、２つまたは３つの縮合環から構成される環系、これらの縮合環の少なくとも１つは芳香族である；または２つもしくは３つの環から構成される架橋環系、これらの架橋環の少なくとも１つは芳香族である）をはじめとする芳香環基を指し、前記芳香環基は、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個以上の（例えば、１、２、３、または４個）の環ヘテロ原子を含み、かつ、残りの環原子は炭素原子であり、ここで、１個以上のＳ環原子（存在する場合）および／または１個以上のＮ環原子（存在する場合）は任意に酸化されていてもよく、かつ、さらに１個以上の炭素環原子は任意に酸化されていてもよい（すなわち、オキソ基を形成する）。「ヘテロアリール」は、例えば、チエニル（すなわち、チオフェニル）、ベンゾ［ｂ］チエニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、チアントレニル、フリル（すなわち、フラニル）、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、ピロリル（例えば、２Ｈ−ピロリル）、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル（すなわち、ピリジニル；例えば、２−ピリジル、３−ピリジル、または４−ピリジル）、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、インドリル（例えば、３Ｈ−インドリル）、インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル（例えば、［１，１０］フェナントリニル、［１，７］フェナントロリニル、または［４，７］フェナントロリニル）、フェナジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、フラザニル、フェノキサジニル、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジニル（例えば、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）、１，２−ベンゾイソキサゾール−３−イル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、１Ｈ−テトラゾリル、２Ｈ−テトラゾリル、クマリニル、またはクロモニルを指し得る。そうではないことが定義されない限り、「ヘテロアリール」は、好ましくは、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個以上（例えば、１、２、３または４個）の環ヘテロ原子を含む５〜１４員（より好ましくは、５〜１０員）単環式環または縮合環系を指し、ここで、１個以上のＳ環原子（存在する場合）および／または１個以上のＮ環原子（存在する場合）は任意に酸化されていてもよく、かつ、１個以上の炭素環原子は任意に酸化されていてもよく；さらにより好ましくは、「ヘテロアリール」は、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個以上（例えば、１、２または３個の）環ヘテロ原子を含む５または６員単環式環を指し、ここで、１個以上のＳ環原子（存在する場合）および／または１個以上のＮ環原子（存在する場合）は任意に酸化されていてもよく、かつ、１個以上の炭素環原子は任意に酸化されていてもよい。
【００９４】
用語「ヘテロアルキル」は、１〜６個の炭素原子および１〜４個の炭素原子を含む１〜１２個の炭素原子の飽和直鎖または分岐鎖一価炭化水素基を指し、ここで、少なくとも１個の炭素原子はＮ、Ｏ、またはＳから選択されるヘテロ原子で置換され、かつ、このラジカルは炭素ラジカルまたはヘテロ原子ラジカルであり得る（すなわち、ヘテロ原子は、このラジカルの中央または末端に見られ得る）。ヘテロアルキルラジカルは、本明細書に記載の１個以上の置換基で任意に独立に置換されていてもよい。用語「ヘテロアルキル」は、アルコキシおよびヘテロアルコキシラジカルを包含する。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語「シクロアルキル」は、単環式環ならびに架橋環、スピロ環および／または縮合環系（例えば、２環または３環から構成され得る；例えば、２つまたは３つの縮合環から構成される縮合環系）をはじめとする飽和炭化水素環基を指す。「シクロアルキル」は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、またはアダマンチルを指し得る。そうではないことが定義されない限り、「シクロアルキル」は、好ましくはＣ3-11シクロアルキルを指し、より好ましくはＣ3-7シクロアルキルを指す。特に好ましい「シクロアルキル」は、３〜７環員を有する単環式飽和炭化水素環である。
【００９６】
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロシクロアルキル」は、単環式環ならびに架橋環、スピロ環および／または縮合環系（例えば、２環または３環から構成され得る；例えば、２つまたは３つの縮合環から構成される縮合環系）をはじめとする飽和環基を指し、ここで、前記環基はＯ、ＳおよびＮから独立に選択される１個以上（例えば、１、２、３、または４個）の環ヘテロ原子を含み、かつ、残りの環原子は炭素原子であり、１個以上のＳ環原子（存在する場合）および／または１個以上のＮ環原子（存在する場合）は任意に酸化されていてもよく、かつさらに１個以上の炭素環原子は任意に酸化されていてもよい（すなわち、オキソ基を形成する）。「ヘテロシクロアルキル」は、例えば、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、モルホリニル（例えば、モルホリン−４−イル）、ピラゾリジニル、テトラヒドロチエニル、オクタヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、アゼパニル、ジアゼパニル、オキシアゼパニルまたは２−オキサ−５−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−イルを指し得る。そうではないことが定義されない限り、「ヘテロシクロアルキル」は好ましくは３〜１１員飽和環基を指し、これは単環式環または縮合環系（例えば、２つの縮合環から構成される縮合環系）であり、ここで、前記環基は、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個以上（例えば、１、２、３、または４個）の環ヘテロ原子を含み、ここで、１個以上のＳ環原子（存在する場合）および／または１個以上のＮ環原子（存在する場合）は任意に酸化されていてもよく、かつ、１個以上の炭素環原子は任意に酸化されていてもよく；より好ましくは、「ヘテロシクロアルキル」は、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個以上（例えば、１、２、または３個）の環ヘテロ原子を含む５〜７員飽和単環式環基を指し、ここで、１個以上のＳ環原子（存在する場合）および／または１個以上のＮ環原子（存在する場合）は任意に酸化されていてもよく、かつ、１個以上の炭素環原子は任意に酸化されていてもよい。
【００９７】
本明細書で使用する場合、用語「ハロゲン」は、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、またはヨード（−Ｉ）を指す。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「ハロアルキル」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードから独立に選択される１個以上（好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個）のハロゲン原子で置換されたアルキル基を指し、好ましくは、総てフルオロ原子である。ハロゲン原子の最大数は利用可能な結合部位によって制限され、従って、ハロアルキル基のアルキル部分に含まれる炭素原子の数に依存することが理解されるであろう。「ハロアルキル」は、例えば、−ＣＦ3、−ＣＨＦ2、−ＣＨ2Ｆ、−ＣＦ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＨＦ2、−ＣＨ2−ＣＦ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＦ2−ＣＦ3、または−ＣＨ（ＣＦ3）2を指し得る。
【００９９】
本明細書で使用する場合、用語「ラムノシル」は、好ましくはそのＣ１−ＯＨ基を介して接続される置換または非置換ラムノース残基を指す。
【０１００】
用語「単糖」は、本明細書で使用する場合、単一の糖単位のみからなる糖を指す。これらは、一般に糖と呼称されるあらゆる化合物を含み、糖アルコールおよびアミノ糖を含む。例としては、テトロース、ペントース、ヘキソースおよびヘプトース、特に、アルドテトロース、アルドペントース、アルドヘキソースおよびアルドヘプトースが挙げられる。
【０１０１】
アルドテトロースにはエリトロースおよびトレオースが含まれ、ケトテトロースにはエリトルロースが含まれる。
【０１０２】
アルドペントースには、アピオース、リボース、アラビノース、リキソース、およびキシロースおよびケトペントースには、リブロースおよびキシルロースが含まれる。ペントースに起源する糖アルコールはペンチトールと呼称され、アラビトール、キシリトール、およびアドニトールが含まれる。サッカリン酸には、キシロサッカリン酸、リボサッカリン酸、およびアラボサッカリン酸が含まれる。
【０１０３】
アルドヘキソースには、ガラクトース、タロース、アルトロース、アロース、グルコース、イドース、マンノース、ラムノース、フコース、オリボース、ロジノース、およびグロースが含まれ、ケトヘキソースには、タガトース、プシコース、ソルボース、およびフルクトースが含まれる。ヘキソースの糖アルコールであるヘキシトールには、タリトール、ソルビトール、マンニトール、イジトール、アロダルシトール、およびダルシトールが含まれる。ヘキソースのサッカリン酸には、マンノサッカリン酸、グルコサッカリン酸、ヨードサッカリン酸、タロムチン酸、アロムチン酸、およびムチン酸が含まれる。
【０１０４】
アルドヘプトースの例は、ヨードヘプトース、ガラクトヘプトース、マンノヘプトース、グルコヘプトース、およびタロヘプトースである。ケトヘプトースには、アロヘプツロース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、およびタロヘプツロースである。
【０１０５】
アミノ糖の例は、フコサアミン、ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびＮ−アセチルガラクトサミンである。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、用語「二糖」は、２つの単糖からなる基を指す。二糖は、水などの小分子の排出を含む縮合反応で２つの単糖を反応させることにより形成され得る。
【０１０７】
二糖の例は、マルトース、イソマルトース、ラクトース、ニゲロース、アンブビオース、ソホロース、トレハロース、サッカロース、ルチノース、およびネオヘスペリドースである。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、用語「オリゴ糖」は、３〜８の単糖単位からなる基を指す。オリゴ糖は、水などの小分子の排出を含む縮合反応で３〜８の単糖を反応させることにより形成され得る。オリゴ糖は直鎖型でも分岐型でもよい。
【０１０９】
例は、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、およびマルトオクタオースとしてのデキストリン、ケストース、ニストース、フルクトシルニストース、ビフルクトース、イヌロビオース、イヌロトリオース、およびイヌロテトラオースとしてのフルクト−オリゴ糖、ガラクト−オリゴ糖、またはマンナン−オリゴ糖である。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、「化合物がＲ3のＯＨ基に加えて少なくとも１個のＯＨ基を含む」という表現は、化合物の残基Ｒ3以外の位置に少なくとも１個のＯＨ基が存在することを示す。Ｒ3のＯＨ基の例は、ラムノシル基の、またはそのいずれかの置換基のＯＨ基である。結局、上記の表現が満たされるかどうかを判定する目的では、残基Ｒ3は無視され、化合物内の残りのＯＨ基の数が決定される。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「炭素原子に直接連結されたＯＨ基が二重結合を介して隣接する炭素原子または窒素原子に連結される」という表現は、下記の部分構造の基を示し、
【０１１２】
【化５】
2019501662.tif 000019
【０１１３】
式中、ＱはＮまたはＣであり、さらに置換されていてもよい。ＣとＱの間の二重結合は、より大きい芳香族系の一部であってもよく、従って、非局在化されていてよい。このようなＯＨ基の例としては、アリールまたはヘテロアリール基などの芳香族部分と直接結合しているＯＨ基が挙げられる。一具体例は、フェノール性ＯＨ基である。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、用語「その−ＯＨ基の１個以上において置換されている」とは、置換基が結果として生じる基が「−Ｏ−置換基」により表され得るような様式で「−ＯＨ」基の１個以上に結合されていてもよいことを示す。
【０１１５】
本明細書において種々の基が「任意に置換されていてもよい」と言われる。一般に、これらの基は、１個以上の置換基、例えば、１、２、３または４個の置換基を有し得る。置換基の最大数は置換部分の利用可能な結合部位の数により制限されることが理解されるであろう。そうではないことが定義されない限り、本明細書で言及される「任意に置換されていてもよい」基は、好ましくは、２個以下の置換基を有し、特に、１個の置換基のみを有し得る。さらに、そうではないことが定義されない限り、任意の置換基は存在しない、すなわち、対応する基は非置換型であることが好ましい。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、用語「任意の」、「任意に」および「してもよい」は、示された特徴が存在してもよいが、存在しなくてもよいことを表す。用語「任意の」、「任意に」または「してもよい」が使用される場合は常に、本発明は具体的に、両方の可能性、すなわち、対応する特徴は存在する、あるいは、対応する特徴が存在しない場合に関する。例えば、「ＸがＹで任意に置換されていてもよい」（または「ＸがＹで置換されていてもよい」）は、ＸがＹで置換されている、または置換されていないことを意味する。同様に、組成物の成分が「任意」であることが示されていれば、本発明は具体的に、両方の可能性、すなわち、対応する成分が存在する（組成物に含まれる）ことまたは対応する成分が組成物に存在しないことに関する。
【０１１７】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の特定の位置が言及される場合、それらの位置は次のように呼称される。
【０１１８】
【化６】
2019501662.tif 000020
【０１１９】
当業者は、式（Ｉ）の化合物に含まれる置換基が対応する特定の置換基のいくつかの異なる位置を介して個々の化合物の残部に結合され得ることを認識するであろう。そうではないことが定義されない限り、種々の特定の置換基に関する好ましい結合位置は、例に示されるとおりである。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、好ましくは、示される数値の±１０％、より好ましくは、示される数値の±５％、特に、ちょうど示される数値を指す。
【０１２１】
よって、下式（Ｉ）の化合物またはその溶媒和物が本発明の方法において出発化合物として使用されることが好ましい。
【０１２２】
【化７】
2019501662.tif 000021
（Ｉ）
【０１２３】
下式（Ｉ）の化合物の多くの具体例、例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の化合物が本明細書に開示される。また、式（Ｉ）の化合物に対して言及される場合、この言及は式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）などのいずれの化合物も含むと理解されるべきである。
【０１２４】
本発明では、記号
【０１２５】
【化８】
2019501662.tif 000022
【０１２６】
は、二重結合または一重結合を表す。いくつかの例では、記号
【０１２７】
【化９】
2019501662.tif 000023
【０１２８】
は、一重結合を表す。他の例では、記号
【０１２９】
【化１０】
2019501662.tif 000024
【０１３０】
は、二重結合を表す。
Ｌは、
【０１３１】
【化１１】
2019501662.tif 000025
【０１３２】
であり；Ｌは
【０１３３】
【化１２】
2019501662.tif 000026
【０１３４】
であることが好ましい。
【０１３５】
式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ1およびＲ2は独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；ここで、Ｒ2は−ＯＨとは異なる。
【０１３６】
式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ1は、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。式（Ｉ）のより好ましい化合物では、Ｒ1は、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。式（Ｉ）のさらにより好ましい化合物では、Ｒ1は、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。式（Ｉ）のいっそうより好ましい化合物では、Ｒ1は、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。式（Ｉ）のいっそうより好ましい化合物では、Ｒ1は、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよいアリールである。式（Ｉ）のある化合物では、Ｒ1は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１、２または３個の基で任意に置換されていてもよいアリールである。いっそうより好ましくは、Ｒ1は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１、２または３個の基で任意に置換されていてもよいフェニルである。
【０１３７】
式（Ｉ）の他の好ましい化合物では、Ｒ2は、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく、かつ、Ｒ2は−ＯＨとは異なる。式（Ｉ）のより好ましい化合物では、Ｒ2は、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。式（Ｉ）のさらにより好ましい化合物では、Ｒ2は、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。式（Ｉ）のいっそうより好ましい化合物では、Ｒ2は、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ2は、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよいアリールである。式（Ｉ）のいくつかの化合物では、Ｒ2は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１、２または３個の基で任意に置換されていてもよいアリールである。いっそうより好ましくは、Ｒ2は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１、２または３個の基で任意に置換されていてもよいフェニルである。
【０１３８】
あるいは、Ｒ1およびＲ2は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒeで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環を形成し；ここで、各Ｒeは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。
【０１３９】
好ましくは、各Ｒeは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。より好ましくは、各Ｒeは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒeは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキルおよび前記ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒeは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−ＯＲbおよび−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキルおよび前記ヘテロシクロアルキルは、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒeは独立に、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルおよび−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒeは独立に、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。最も好ましくは、各Ｒeは独立に、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１４０】
Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択することができ；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。
【０１４１】
あるいは、Ｒ4は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ5およびＲ6は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒcで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環を形成する。
【０１４２】
さらなる選択肢では、Ｒ4およびＲ5は一体となって、それらが結合している炭素原子とともに、１個以上の置換基Ｒcで任意に置換されていてもよい炭素環式環または複素環式環であり；かつＲ6は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。
【０１４３】
Ｒ4は、好ましくは、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。より好ましくは、Ｒ4は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。さらにより好ましくは、Ｒ4は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキルおよび前記ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ4は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−ＯＲbおよび−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキルおよび前記ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1-5アルキル、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルおよび−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。最も好ましくは、Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１４４】
Ｒ5は、好ましくは、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。より好ましくは、Ｒ5は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。さらにより好ましくは、Ｒ5は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキルおよび前記ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ5は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ5は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−ＯＲbおよび−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよび−Ｏ−アリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記−Ｏ−アリール内のアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；最も好ましくは、Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
【０１４５】
Ｒ6は、好ましくは、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。より好ましくは、Ｒ6は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。さらにより好ましくは、Ｒ6は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒa−ＯＲbおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロアルキルおよび前記ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ6は、水素、−ＯＨ、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロシクロアルキルおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび前記ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ6は、水素、−ＯＨ、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｒa−ＯＲdから選択され；ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルおよび前記ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。最も好ましくは、Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルは、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい；
【０１４６】
本発明の全ての化合物において、各Ｒ3は−Ｏ−（ラムノシル）、すなわち、本発明の方法によりラムノシル化される残基であり、ここで、前記ラムノシルは、その−ＯＨ基の１個以上において、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、単糖、二糖およびオリゴ糖から独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。−Ｏ−Ｒ3のラムノシル基は、いずれの位置を介して−Ｏ−基と結合していてもよい。好ましくは、ラムノシル基は、Ｃ１位を介して−Ｏ−基と結合している。任意の置換基は、残りのヒドロキシル基のいずれにおいてラムノシル基と結合していてもよい。
【０１４７】
本発明の好ましい実施形態では、Ｒ3は、−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル、−Ｏ−α−Ｄ−ラムノピラノシル、−Ｏ−β−Ｌ−ラムノピラノシルまたは−Ｏ−β−Ｄ−ラムノピラノシルである。
【０１４８】
本発明において、各Ｒaは独立に、一重結合、Ｃ1-5アルキレン、Ｃ2-5アルケニレン、アリーレンおよびヘテロアリーレンから選択され；ここで、前記アルキレン、前記アルケニレン、前記アリーレンおよび前記ヘテロアリーレンはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。好ましくは、各Ｒaは独立に、一重結合、Ｃ1-5アルキレンおよびＣ2-5アルケニレンから選択され；ここで、前記アルキレンおよび前記アルケニレンはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。より好ましくは、各Ｒaは独立に、一重結合、Ｃ1-5アルキレンおよびＣ2-5アルケニレンから選択され；ここで、前記アルキレンおよび前記アルケニレンはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。さらにより好ましくは、各Ｒaは独立に、一重結合、Ｃ1-5アルキレンおよびＣ2-5アルケニレンから選択され；ここで、前記アルキレンおよび前記アルケニレンはそれぞれ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒaは独立に、一重結合およびＣ1-5アルキレンから選択され；ここで、前記アルキレンは、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。最も好ましくは、各Ｒaは独立に、一重結合およびＣ1-5アルキレンから選択される。
【０１４９】
本発明において、各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。好ましくは、各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。より好ましくは、各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。さらにより好ましくは、各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよびアリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび前記アリールはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒbは独立に、水素、Ｃ1-5アルキルおよびアリールから選択され；ここで、前記アルキルおよび前記アリールはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。いっそうより好ましくは、各Ｒbは独立に、水素およびＣ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキルは、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。最も好ましくは、各Ｒbは独立に、水素およびＣ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキルは、ハロゲンから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１５０】
本発明において、各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１５１】
好ましくは、各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１５２】
より好ましくは、各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１５３】
さらにより好ましくは、各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１５４】
いっそうより好ましくは、各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され；ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１５５】
いっそうより好ましくは、各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され；ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲンから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１５６】
本発明において、各Ｒdは独立に、単糖、二糖およびオリゴ糖から選択される。
【０１５７】
Ｒdは、例えば、アラビノシジル、ガラクトシジル、ガラクツロニジル、マンノシジル、グルコシジル、ラムノシジル、アピオシジル、アロシジル、グルクロニジル、Ｎ−アセチル−グルコサミジル、Ｎ−アセチル−マンノシジル、フコシジル、フコサミニル、６−デオキシタロシジル、オリボシジル、ロジノシジル、およびキシロシジルから独立に選択され得る。
【０１５８】
Ｒdの具体例としては、マルトシド、イソマルトシド、ラクトシド、メリビオシド、ニゲロシド、ルチノシド、ネオヘスペリドシドグルコース（１→３）ラムノシド、グルコース（１→４）ラムノシド、およびガラクトース（１→２）ラムノシドなどの二糖類が挙げられる。
【０１５９】
Ｒdの具体例としては、さらにマルトデキストリン（マルトトリオシド、マルトテトラオシド、マルトペンタオシド、マルトヘキサオシド、マルトヘプタオシド(maltoseptaoside)、マルトオクタオシド）、ガラクトオリゴ糖、およびフルクトオリゴ糖としてのオリゴ糖が挙げられる。
【０１６０】
本発明の化合物のいくつかでは、各Ｒdは独立に、アラビノシジル、ガラクトシジル、ガラクツロニジル、マンノシジル、グルコシジル、ラムノシジル、アピオシジル、アロシジル、グルクロニジル、Ｎ−アセチル−グルコサミニル、Ｎ−アセチル−マンノサミニル、フコシジル、フコサミニル、６−デオキシタロシジル、オリボシジル、ロジノシジル、およびキシロシジルから選択される。
【０１６１】
式（Ｉ）の化合物は、Ｒ3のＯＨ基に加えて少なくとも１個のＯＨ基を含んでよく、好ましくは、炭素原子に直接連結されたＯＨ基が二重結合を介して隣接する炭素原子または窒素原子に連結されている。このようなＯＨ基の例としては、アリールまたはヘテロアリール基などの芳香族部分と直接結合しているＯＨ基が挙げられる。一具体例は、フェノール性ＯＨ基である。
【０１６２】
Ｒ3においてラムノシル残基に加えて、付加的単糖、二糖またはオリゴ糖を導入するための手順は文献で知られている。よって、例としては、Ｃ４‘‘−ＯＨ位およびＣ３‘‘−ＯＨ位にグルコシド残基を導入するためのシクロデキストリン−グルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）およびグルカンスクラーゼ（例えば、特許文献２に記載のとおり）の使用が挙げられる（非特許文献４５、非特許文献４６、非特許文献４７）。
【０１６３】
式（Ｉ）の化合物の第１の好ましい例、すなわち、本発明の方法で出発材料として使用される化合物の好ましい例は、式（ＩＩ）の化合物またはその溶媒和物である。
【０１６４】
【化１３】
2019501662.tif 000027
(II)
【０１６５】
下式（ＩＩ）の化合物の多くの例、例えば、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）の化合物が本明細書で開示される。また、式（ＩＩ）の化合物に対して言及される場合、この言及は式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）などのいずれの化合物も含むと理解されるべきである。
【０１６６】
式（ＩＩ）では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、これらの残基の好ましい定義を含め、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０１６７】
式（ＩＩ）の化合物に関する第１の条件では、化合物ナリンゲニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシドおよびエリオジクチオール−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシドは好ましくは除外される。第２の条件では、式（ＩＩ）の化合物のＲ１は、Ｒ4が水素であり、Ｒ5が−ＯＨであり、かつ
【０１６８】
【化１４】
2019501662.tif 000028
【０１６９】
が二重結合である場合には、好ましくは、メチルでない。
【０１７０】
式（ＩＩ）の好ましい化合物では、Ｒ1は、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ2は、水素、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択される。式（ＩＩ）のより好ましい化合物では、Ｒ1は、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ2は、水素およびＣ1-5アルキルから選択される。式（ＩＩ）のさらにより好ましい化合物では、Ｒ1は、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ2は、水素およびＣ1-5アルキルから選択される。式（ＩＩ）のいっそうより好ましい化合物では、Ｒ1は、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ2は、水素およびＣ1-5アルキルから選択される。いっそうより好ましくは、Ｒ1は、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよいアリールであり、かつ、Ｒ2は−Ｈである。式（ＩＩ）のいくつかの化合物では、Ｒ1は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１、２または３個の基で任意に置換されていてもよいアリールであり、かつ、Ｒ2は−Ｈである。いっそうより好ましくは、Ｒ1は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択され１、２または３個の基で任意に置換されていてもよいフェニルであり；かつＲ2は−Ｈである。
【０１７１】
式（ＩＩ）の別の好ましい化合物では、Ｒ2は、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｒa−Ｒb、−Ｒa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲd、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲb、−Ｒa−ＯＲa−ＯＲd、−Ｒa−ＳＲb、−Ｒa−ＳＲa−ＳＲb、−Ｒa−ＮＲbＲb、−Ｒa−ハロゲン、−Ｒa−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−Ｒa−ＣＮ、−Ｒa−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−Ｏ−Ｒb、−Ｒa−Ｏ−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＣＯ−ＮＲbＲb、−Ｒa−ＮＲb−ＣＯ−Ｒb、−Ｒa−ＳＯ2−ＮＲbＲbおよび−Ｒa−ＮＲb−ＳＯ2−Ｒbから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記ヘテロアルキル、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；ここで、Ｒ2は−ＯＨとは異なり；かつＲ1は、水素、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択される。式（ＩＩ）のより好ましい化合物では、Ｒ2は、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記シクロアルキル、前記ヘテロシクロアルキル、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ1は、水素およびＣ1-5アルキルから選択される。式（ＩＩ）のさらにより好ましい化合物では、Ｒ2は、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ1は、水素およびＣ1-5アルキルから選択される。式（ＩＩ）のいっそうより好ましい化合物では、Ｒ2は、アリールおよびヘテロアリールから選択され；ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつＲ1は、水素およびＣ1-5アルキルから選択される。いっそうより好ましくは、Ｒ2は、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよいアリールであり、かつ、Ｒ1は−Ｈである。式（ＩＩ）の化合物のいくつかでは、Ｒ2は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択され１、２または３個の基で任意に置換されていてもよいアリールであり、かつ、Ｒ1は−Ｈである。いっそうより好ましくは、Ｒ2は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１、２または３個の基で任意に置換されていてもよいフェニルであり；かつＲ1は−Ｈである。
【０１７２】
各Ｒcは、好ましくは、独立に、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキル、−Ｏ−アリール、−Ｓ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−アリールから選択できる。
【０１７３】
式（ＩＩ）の好ましい化合物では、各Ｒdは独立に、アラビノシジル、ガラクトシジル、ガラクツロニジル、マンノシジル、グルコシジル、ラムノシジル、アピオシジル、アロシジル、グルクロニジル、Ｎ−アセチル−グルコサミジル、Ｎ−アセチル−マンノシジル、フコシジル、フコサミニル、６−デオキシタロシジル、オリボシジル、ロジノシジル、およびキシロシジルから選択される。
【０１７４】
式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ3のＯＨ基に加えて少なくとも１個のＯＨ基を含んでよく、好ましくは、炭素原子に直接連結されたＯＨ基が二重結合を介して隣接する炭素原子または窒素原子に連結されている。このようなＯＨ基の例としては、アリールまたはヘテロアリール基などの芳香族部分と直接結合しているＯＨ基が挙げられる。一具体例は、フェノール性ＯＨ基である。
【０１７５】
Ｒ4、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択され得る。
【０１７６】
式（ＩＩ）のいくつかの化合物では、Ｒ5は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdまたは−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）である。式（ＩＩ）のいくつかの化合物では、Ｒ4および／またはＲ6は、水素または−ＯＨである。最も好ましくは、Ｒ2は、Ｈまたは−（Ｃ2-5アルケニル）である。
【０１７７】
さらに、Ｒ1および／またはＲ2は独立に、アリールおよびヘテロアリールから選択され得、ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。
【０１７８】
式（ＩＩ）の化合物の第１の例は、下式（ＩＩａ）の化合物またはその溶媒和物であり、
【０１７９】
【化１５】
2019501662.tif 000029
（ＩＩａ）
【０１８０】
式中、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、これらの残基のそれぞれの好ましい定義を含めて、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり、
各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記アリールおよび前記アルキレンおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
ｎは、０〜５の整数、好ましくは、１、２、または３である。
【０１８１】
好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１８２】
より好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１８３】
さらにより好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１８４】
下記の残基の組合せが式（ＩＩａ）の化合物において好ましく、
Ｒ2は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、および−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよび−Ｏ−アリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記−Ｏ−アリール内のアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキル、アリールまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；かつ
ｎは、０〜３の整数である。
【０１８５】
下記の残基の組合せが式（ＩＩａ）の化合物においてさらに好ましく、
Ｒ2は、水素、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、基Ｒ7内のアルキル、アルケニルおよびアルキレンはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨ、および−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；かつ
ｎは、０、１または２である。
【０１８６】
さらにより好ましくは、式（ＩＩａ）の化合物は、下記の化合物またはそれらの溶媒和物から選択され、
【０１８７】
【化１６】
2019501662.tif 000030
【０１８８】
式中、Ｒ3は一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０１８９】
式（ＩＩ）の化合物の第２の例は、下式（ＩＩｂ）の化合物またはその溶媒和物であり、
【０１９０】
【化１７】
2019501662.tif 000031
（ＩＩｂ）
【０１９１】
式中、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、これらの残基の好ましい定義を含め、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；
各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記アリールおよび前記アルキレンおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；かつ
ｎは０〜５の整数、好ましくは、１、２、または３である。
【０１９２】
好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１９３】
より好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１９４】
さらにより好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０１９５】
下記の残基の組合せが式（ＩＩｂ）の化合物において好ましく、
Ｒ2は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；
Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよび−Ｏ−アリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記−Ｏ−アリール内のアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され；ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキル、アリールまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；かつ
ｎは、０〜３の整数である。
【０１９６】
下記の残基の組合せが式（ＩＩｂ）の化合物においてより好ましく、
Ｒ2は、水素、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；
Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキルにおけるアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキルにおけるアルキルおよび前記アルキレンはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、基Ｒ7内のアルキル、アルケニルおよびアルキレンはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；かつ
ｎは、０、１または２である。
【０１９７】
さらにより好ましくは、化合物は、下記の化合物またはそれらの溶媒和物から選択され、
【０１９８】
【化１８】
2019501662.tif 000032
【０１９９】
式中、Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０２００】
式（ＩＩ）の化合物の第３の例は、下式（ＩＩｃ）の化合物またはその溶媒和物であり、
【０２０１】
【化１９】
2019501662.tif 000033
（ＩＩｃ）
【０２０２】
式中、
Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、これらの残基の好ましい定義を含め、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；
各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、Ｃ2-5アルキニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−ＳＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｓ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記アリールおよび前記アルキレンおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；かつ
ｎは０〜５の整数、好ましくは、１、２、または３である。
【０２０３】
好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０２０４】
より好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０２０５】
さらにより好ましくは、各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒdから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニルおよび上述の基Ｒ7のいずれに含まれるアルキルまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよい。
【０２０６】
下記の残基の組合せが式（ＩＩｃ）の化合物において好ましく、
Ｒ1は、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；
Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよび−Ｏ−アリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記−Ｏ−アリール内のアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒcは独立に、Ｃ1-5アルキル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−アリール、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ハロゲン、−（Ｃ0-3アルキレン）−（Ｃ1-5ハロアルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＮ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＨＯ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＣＯ−（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ2、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＮＨ−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）、および−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｎ（Ｃ1-5アルキル）−ＳＯ2−（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、前記アルキルおよび上述の基Ｒcのいずれに含まれるアルキル、アリールまたはアルキレン部分もそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdおよび−Ｏ−Ｃ1-4アルキルから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
ｎは、０〜３の整数である。
【０２０７】
下記の残基の組合せが式（ＩＩｃ）の化合物においてより好ましくは、
Ｒ1は、水素、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；
Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
各Ｒ7は独立に、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択され；ここで、基Ｒ7内のアルキル、アルケニルおよびアルキレンはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；かつ
ｎは、０、１または２である。
【０２０８】
さらにより好ましいものが、下記の化合物またはそれらの溶媒和物から選択される式（ＩＩｃ）の化合物であり、
【０２０９】
【化２０】
2019501662.tif 000034
【０２１０】
式中、Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０２１１】
式（ＩＩ）の化合物の第４の例は、下式（ＩＩｄ）の化合物またはその溶媒和物であり、
【０２１２】
【化２１】
2019501662.tif 000035
（ＩＩｄ）
【０２１３】
式中、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲeは、これらの残基の好ましい定義を含め、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；かつ
ｍは、０〜４、好ましくは０〜３、より好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１または２の整数である。
【０２１４】
下記の残基の組合せが式（ＩＩｄ）の化合物において好ましく、
Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；
Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニルおよび−Ｏ−Ｃ1-5アルキルから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、および前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルはそれぞれ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ  −ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよび−Ｏ−アリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記−Ｏ−アリール内のアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルは、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；
各Ｒeは独立に、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよび−Ｏ−アリールから選択され；ここで、前記アルキル、前記アルケニル、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記−Ｏ−アリール内のアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよく；かつ
ｍは、０〜３の整数である。
【０２１５】
下記の残基の組合せが式（ＩＩｄ）の化合物において好ましく、
Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりであり；
Ｒ4は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ5は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ6は、水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記アルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；
各Ｒeは独立に、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-5アルキルおよびＣ2-5アルケニルから選択され、ここで、前記−Ｏ−Ｃ1-5アルキル内のアルキルおよび前記アルケニルはそれぞれ、ハロゲン、−ＯＨおよび−Ｏ−Ｒdから独立に選択される１個以上の基で任意に置換されていてもよく；かつ
ｍは、０、１または２である。
【０２１６】
式（ＩＩｄ）の化合物のさらにより好ましい例は、下記の化合物またはそれらの溶媒和物から選択される化合物であり、
【０２１７】
【化２２】
2019501662.tif 000036
【０２１８】
式中、Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０２１９】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）の好ましい化合物では、Ｒ3は、−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル、−Ｏ−α−Ｄ−ラムノピラノシル、−Ｏ−β−Ｌ−ラムノピラノシルまたは−Ｏ−β−Ｄ−ラムノピラノシルである。
【０２２０】
式（Ｉ）の化合物の第２の例は、式（ＩＩＩ）の化合物またはその溶媒和物であり、
【０２２１】
【化２３】
2019501662.tif 000037
（ＩＩＩ）
【０２２２】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、これらの残基の好ましい定義を含め、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０２２３】
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例では、Ｒ1は、アリールおよびヘテロアリールから選択され、ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換されていてもよい。
【０２２４】
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例では、各Ｒcは独立に、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキル、−Ｏ−アリール、−Ｓ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−アリールから選択される。
【０２２５】
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例では、化合物は、Ｒ3のＯＨ基に加えて少なくとも１個のＯＨ基を含み、好ましくは、炭素原子に直接連結されたＯＨ基が二重結合を介して隣接する炭素原子または窒素原子に連結されている。このようなＯＨ基の例としては、アリールまたはヘテロアリール基などの芳香族部分と直接結合しているＯＨ基が挙げられる。一具体例は、フェノール性ＯＨ基である。
【０２２６】
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例では、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択される。
【０２２７】
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例では、Ｒ5は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdまたは−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）である。
【０２２８】
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例では、Ｒ4および／またはＲ6は水素または−ＯＨである。
【０２２９】
式（ＩＩＩ）の化合物の特定の例として、下記の化合物またはそれらの溶媒和物が挙げられ、
【０２３０】
【化２４】
2019501662.tif 000038
【０２３１】
式中、Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０２３２】
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例では、Ｒ3は、−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル、−Ｏ−α−Ｄ−ラムノピラノシル、−Ｏ−β−Ｌ−ラムノピラノシルまたは−Ｏ−β−Ｄ−ラムノピラノシルである。
【０２３３】
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい例では、各Ｒdは独立に、アラビノシジル、ガラクトシジル、ガラクツロニジル、マンノシジル、グルコシジル、ラムノシジル、アピオシジル、アロシジル、グルクロニジル、Ｎ−アセチル−グルコサミジル、Ｎ−アセチル−マンノシジル、フコシジル、フコサミニル、６−デオキシタロシジル、オリボシジル、ロジノシジル、およびキシロシジルから選択される。
【０２３４】
式（Ｉ）の化合物のなおさらなる例は、式（ＩＶ）の化合物またはその溶媒和物であり、
【０２３５】
【化２５】
2019501662.tif 000039
（ＩＶ）
【０２３６】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲcは、これらの残基の好ましい定義を含め、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０２３７】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施例では、Ｒ1はアリールおよびヘテロアリールから選択され、ここで、前記アリールおよび前記ヘテロアリールはそれぞれ、１個以上の基Ｒcで任意に置換される。
【０２３８】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施例では、各Ｒcは、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒd、−Ｏ−Ｃ1-4アルキル、−Ｏ−アリール、−Ｓ−Ｃ1-4アルキルおよび−Ｓ−アリールから独立に選択される。
【０２３９】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施例では、化合物は、Ｒ3のＯＨ基に加えて少なくとも１個のＯＨ基を含み、好ましくは、炭素原子に直接連結されたＯＨ基が二重結合を介して隣接する炭素原子または窒素原子に連結されている。
【０２４０】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施例では、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に、水素、Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、−（Ｃ0-3アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ−Ｒd、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−ＯＨ、−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ−Ｒdおよび−（Ｃ0-3アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキレン）−Ｏ（Ｃ1-5アルキル）から選択される。
【０２４１】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施例では、Ｒ5は、−ＯＨ、−Ｏ−Ｒdまたは−Ｏ−（Ｃ1-5アルキル）である。
【０２４２】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施例では、Ｒ4および／またはＲ6は水素または−ＯＨである。
【０２４３】
式（ＩＶ）の化合物の特定の例としては、下記の化合物またはそれらの溶媒和物が挙げられ、
【０２４４】
【化２６】
2019501662.tif 000040
【０２４５】
式中、Ｒ3は、一般式（Ｉ）の化合物に関して定義されたとおりである。
【０２４６】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施例では、Ｒ3は、−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル、−Ｏ−α−Ｄ−ラムノピラノシル、−Ｏ−β−Ｌ−ラムノピラノシルまたは−Ｏ−β−Ｄ−ラムノピラノシルである。
【０２４７】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施例では、各Ｒdは、アラビノシジル、ガラクトシジル、ガラクツロニジル、マンノシジル、グルコシジル、ラムノシジル、アピオシジル、アロシジル、グルクロニジル、Ｎ−アセチル−グルコサミジル、Ｎ−アセチル−マンノシジル、フコシジル、フコサミニル、６−デオキシタロシジル、オリボシジル、ロジノシジル、およびキシロシジルから独立に選択される。
【０２４８】
本発明を下記の限定されない図および例を参照してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】水におけるナリンゲニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（ＮＲ１）の溶解度の決定。規定濃度のＮＲ１をＨＰＬＣに注入する前に０．２２μｍフィルターに通した。可溶濃度は、決定された回帰曲線によりピーク面積から算出した。
【図２】ナリンゲニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドのＨＰＬＣクロマトグラム
【図３】ナリンゲニン−４’−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドのＨＰＬＣクロマトグラム
【図４】プルニン（ナリンゲニン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド）のＨＰＬＣクロマトグラム
【図５】ホモエリオジクチオール−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（ＨＥＤＲ１）のＨＰＬＣクロマトグラム
【図６】ＨＥＤＲ３（４：１モル比のホモエリオジクチオール−７−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドおよびホモエリオジクチオール−４’−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド）のＨＰＬＣクロマトグラム
【図７】ホモエリオジクチオール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（ＨＥＤ４’Ｇｌｃ）のＨＰＬＣクロマトグラム
【図８】ヘスペレチン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（ＨＥＳＲ１）のＨＰＬＣクロマトグラム
【図９】ヘスペレチン−３’−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（ＨＥＳＲ２）のＨＰＬＣクロマトグラム
【図１０】ヘスペレチン生物変換１４１０２０のＵＶ254クロマトグラム、サンプル注入容量は１．２Ｌであり、ポンプシステムにより適用した。
【図１１】ヘスペレチン生物変換＿１４１０２０からの画分３のＥＳＩ−ＴＯＦネガティブモードＭＳ分析
【図１２】ヘスペレチン生物変換＿１４１０２０からの画分６のＥＳＩ−ＴＯＦネガティブモードＭＳ分析
【図１３】生物変換１４１０２０画分３のＰＦＰ−ＨＰＬＣの分取ＬＣ  ＵＶ2５４クロマトグラム；３．１分と３．５分の間の主ピーク（ＨＥＳＲ１）はＨＥＳＲ１であった。
【図１４】１４０４２４＿ナリンゲニン−ＰｅｔＣからの画分３のＥＳＩ−ＴＯＦネガティブモードＭＳ分析
【図１５】１４０４２４＿ナリンゲニン−ＰｅｔＣからの画分５のＥＳＩ−ＴＯＦネガティブモードＭＳ分析
【図１６】１５０６０３＿ナリンゲニン−ＰｅｔＣの、バイオリアクターユニット１内で２４時間後の変換のＵＶクロマトグラム
【図１７】ＰｅｔＤを用いたナリンゲニン生物変換からの抽出物のＵＶ330クロマトグラム
【図１８】ＰｅｔＣを用いたナリンゲニン生物変換からの抽出物のＵＶ330クロマトグラム
【図１９】ナリンゲニン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドであるプルニン（淡）に対する、図Ｕ１（中間）およびＵ２（濃）からのＮ５ＲピークのＵＶ２１０〜４００ｎｍ吸収スペクトル
【図２０】プルニン（淡）に対するＧＴＦ生成物ピークＲｆ０．７７（濃）のＵＶ２１０−４００ｎｍ吸収スペクトル
【図２１】ＰｅｔＦを用いたナリンゲニン生物変換からの抽出物のＵＶ330クロマトグラム
【図２２】正常ヒト表皮ケラチノサイトに対するフラボノイド−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドの細胞傷害性
【図２３】正常ヒト表皮ケラチノサイト、正常ヒト皮膚線維芽細胞、および正常ヒト表皮メラノサイトに対するフラボノイド−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドの抗炎症活性、保護活性、および刺激活性。
【実施例】
【０２５０】
本節に記載される化合物は、それらの化学式およびそれらの対応する化学名により定義される。本明細書に示される化学式と対応する化学名の間に矛盾がある場合には、本発明は、化学式により定義される化合物と化学名により定義される化合物の両方に関する。
【０２５１】
パートＡ：５−Ｏ−ラムノシル化フラボノイドの調製
実施例Ａ１−培地およびバッファーの調製
本発明の方法は、添付の実施例で示されるように、ラムノシル化フラボノイドの生産のために使用できる。
【０２５２】
いくつかの増殖培地および生物変換培地をフラボノイドのラムノシル化に使用した。よって、好適な培地としては、リッチ培地（ＲＭ）（バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ）１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ、牛肉抽出物（Ｄｉｆｃｏ）２ｇ、麦芽抽出物（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ、グリセロール２ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ2Ｏ  １ｇ、ツィーン８０  ０．０５ｇおよびＨ2Ｏ  １０００ｍＬまで、最終ｐＨ約７．２）；無機塩培地（ＭＳＭ）（バッファーおよび無機塩保存溶液をオートクレーブ処理した。これらの溶液を冷却した後、１００ｍＬの各保存溶液を合わせ、１ｍＬビタミンおよび１ｍＬ微量元素保存溶液を加えた。次に、無菌水を最終容量１Ｌまで加えた。これらの保存溶液は、Ｎａ2ＨＰＯ４  ７０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  ２０ｇおよびＨ2Ｏ  １０００ｍＬまでのバッファー保存溶液（１０倍）；（ＮＨ4）2ＳＯ４  １０ｇ、ＭｇＣｌ2×６  Ｈ2Ｏ  ２ｇ、Ｃａ（ＮＯ3）2×４Ｈ2Ｏ  １ｇおよびＨ2Ｏ  １０００ｍＬまでの無機塩保存溶液（１０倍）；ＥＤＴＡ  ５００ｍｇ、ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ  ３００ｍｇ、ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ  ５ｍｇ、ＺｎＳＯ4×７  Ｈ2Ｏ  ５ｍｇ、ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ  ３ｍｇ、ＮａＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ  ３ｍｇ、ＮｉＣｌ2×６Ｈ2Ｏ  ２ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3  ２ｍｇ、ＣｕＣｌ2×２Ｈ2Ｏ  １ｍｇおよびＨ2Ｏ  ２００ｍＬまでの微量元素保存溶液（１０００倍）であった。この溶液を無菌濾過した。パントテン酸Ｃａ  １０ｍｇ、シアノコバラミン１０ｍｇ、ニコチン酸１０ｍｇ、ピリドキサール−ＨＣｌ  １０ｍｇ、リボフラビン１０ｍｇ、チアミン−ＨＣｌ  １０ｍｇ、ビオチン１ｍｇ、葉酸１ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸１ｍｇおよびＨ2Ｏ  １００ｍＬまでのビタミン保存溶液（１０００倍）。この溶液を無菌濾過した。）；Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｌｏｔｈ（ＬＢ）（酵母抽出物５ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇおよびＨ2Ｏ  １０００ｍＬまで）；Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）（カゼイン１２ｇ、酵母抽出物２４ｇ、Ｋ2ＨＰＯ４  １２．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ４  ２．３ｇおよびＨ2Ｏ  １０００ｍＬまで  ｐＨ７．２）が含まれる。一部の実施例では、特に、溶存酸素（ＤＯ）の濃度が約５０％を超えた場合には、その溶液に栄養素を加えた。これはグルコース５００ｇ、ＭｇＳＯ４  １０ｇ、チアミン１ｍｇおよびＨ2Ｏ  １０００ｍＬまでの供給溶液を用いて行った。一部の実験では、特に、ラムノシル化フラボノイドの生産を開始するまえにグリコシルトランスフェラーゼ発現細胞が採取された場合には、細胞をバッファー溶液、特に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｋ2ＨＰＯ４／ＫＨ2ＰＯ４  １００ｍＭ  ｐＨ６．４〜７．４を用いて溶液を調製した。
【０２５３】
実施例Ａ２−ラムノシル化フラボノイドの生産に使用したグリコシルトランスフェラーゼ
数種の異なるグリコシルトランスフェラーゼを、本発明の方法でラムノシル化フラボノイドを生産するために使用した。特に、フラボノイドラムノシド生産に使用したグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）は、以下のものであった。
１．ＧＴＣ、好ましくは、配列番号４に示されるポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、メタゲノム的に誘導されたＧＴ（ＡＧＨ１８１３９）。大腸菌での発現のためにコドンが最適化された配列を配列番号２７に示す。
【０２５４】
２．ＧＴＤ、好ましくは、配列番号６に示されるポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する、ディアドバクター・ファーメンタンス（Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のＧＴ（ＷＰ＿０１５８１１４１７）。大腸菌での発現のためにコドンが最適化された配列を配列番号２８に示す。
【０２５５】
３．ＧＴＦ、好ましくは、配列番号８に示されるポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する、フィブリソーマ・リミ（Ｆｉｂｒｉｓｏｍａ  ｌｉｍｉ）由来のＧＴ（ＷＰ＿００９２８０６７４）。大腸菌での発現のためにコドンが最適化された配列を配列番号２９に示す。
【０２５６】
４．好ましくは、配列番号１０に示されるポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する、セゲキバクター・コレエンシス（Ｓｅｇｅｔｉｂａｃｔｅｒ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）由来のＧＴＳ（ＷＰ＿０１８６１１９３０）。大腸菌での発現のためにコドンが最適化された配列を配列番号３０に示す。
【０２５７】
５．好ましくは、配列番号５９に示されるポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有する、ＧＴＤのＡＡ１〜３１６およびＧＴＣのＡＡ  ３２４〜４５９を有するキメラ３。大腸菌での発現のためにコドンが最適化された配列を配列番号６０に示す。
【０２５８】
６．好ましくは、配列番号６２に示されるポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する、ＧＴＤのＡＡ１〜２６８およびＧＴＣのＡＡ  ２７６〜４５９を有するキメラ４。大腸菌での発現のためにコドンが最適化された配列を配列番号６３に示す。
【０２５９】
７．好ましくは、配列番号５６に示されるポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する、ＧＴＤのＡＡ１〜２３４およびＧＴＣのＡＡ  ２４２〜４４３を有するキメラ１フレームシフト。
【０２６０】
ＧＴ遺伝子を、表Ａ１に示される個々のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。精製したＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＤｒｉｖｅ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に連結した。化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５αを熱ショックによる連結反応で形質転換させ、陽性クローンをインキュベーション後の青／白スクリーニングによって確認した。セゲキバクター・コレエンシス由来のＧＴをそのままコドンが最適化されたヌクレオチド配列として使用した。
【０２６１】
キメラ３およびキメラ４は、ＧＴＤおよびＧＴＣ由来のコドンを最適化したヌクレオチド配列から作出し、キメラ１は配列番号４および配列番号６から構築した。キメラ１は、非特許文献４８によって記載されるリガーゼサイクリング反応法に従って作出した。よって、各キメラフラグメントの２つのヌクレオチド配列をＰＣＲにより増幅し、両フラグメントの隣接するヌクレオチド部分の末端に相補的な一本鎖架橋オリゴを用いてアセンブルした。耐熱性リガーゼを用いてこれらのヌクレオチドを連結してキメラ酵素の全長配列を作製した。
【０２６２】
キメラ３およびキメラ４は、非特許文献４９によって記載されるＡＱＵＡクローニング法に従って構築した。よって、ヌクレオチドフラグメントを、２０〜２５ヌクレオチドの相補領域を用いて増幅し、アガロースゲルで精製し、水に混合し、室温で１時間インキュベートし、化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。キメラ構築に使用したプライマーを表Ａ２に示す。
【０２６３】
（表２）
表Ａ１：ＰＣＲによるＧＴ遺伝子の増幅のために使用したプライマー
2019501662.tif 000041
【０２６４】
（表３）
表Ａ２：キメラ酵素の構築に使用したプライマー
2019501662.tif 000042
【０２６５】
発現宿主を確立するために、精製したｐＤｒｉｖｅ：：ＧＴベクターを各エンドヌクレアーゼ（表Ａ１）とともにインキュベートし、対象とするフラグメントをゲル電気泳動後にアガロースから精製した。あるいは、増幅および精製したＰＣＲ産物をそのまま各エンドヌクレアーゼとともにインキュベートし、電気泳動後にアガロースゲルから精製した。これらのフラグメントを調製したｐＥＴ１９ｂまたはｐＴｒｃＨｉｓＡプラスミドに連結し、コンピテント大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）を熱ショックにより形質転換させた。一晩増殖させた後に陽性クローンを、それぞれＴ７プロモータープライマーおよびＧＴ遺伝子リバースプライマーを用い、直接コロニーＰＣＲにより確認した。
【０２６６】
合わせて７つの生産株を樹立した。
１．ＰｅｔＣ  大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＣ
２．ＰｅｔＤ  大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＤ
３．ＰｅｔＦ  大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＦ
４．ＰｅｔＳ  大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＳ
５．ＰｅｔＣｈｉｍ１ｆｓ  大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：キメラ１フレームシフト
６．ＰｅｔＣｈｉｍ３大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：キメラ３
７．ＰｅｔＣｈｉｍ４  大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：キメラ４
【０２６７】
実施例Ａ３−生物変換におけるラムノシル化フラボノイドの生産
３種類の全細胞生物変換（生物変換）を行った。全ての培養物を、各株の一晩前培養物とともに１／１００で接種した。前培養物は、３７℃、十分培地、適当な抗生物質を添加した５〜１００ｍＬの容量で増殖させた。
【０２６８】
１．分析的小規模および定量的振盪フラスコ培養
分析的活性評価のために、２０ｍＬの生物変換を１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコで行い、定量的生物変換は３Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中の５００ｍＬ培養物で行った。細菌増殖は、適当な抗生物質を添加した複合培地、例えば、ＬＢ、ＴＢ、およびＲＭ、またはＭ９中、２８℃で、ＯＤ600  ０．８まで行った。５０または１００μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、１７℃および１７５ｒｐｍ振盪で一晩（１６時間）遺伝子発現を誘導した。次に、ポリフェノール基質、例えば、ナリンゲニン、ヘスペレチンまたはその他を、２００〜８００μＭの濃度で培養物に加えた。あるいは、ポリフェノール基質は直接ＩＰＴＧで補った。第３の選択肢は発現培養物を軽い遠心分離（５．０００ｇ、１８℃、１０分）により採取することであり、同容量のＰＢＳに懸濁させ、１％（ｗ／ｖ）のグルコース、任意に、ビオチンおよび／またはチアミン各１ｍｇ／Ｌ、適当な抗生物質および基質を上記の濃度で添加した。全ての生物変換反応を３Ｌ振盪フラスコ内で、２８℃、１７５ｒｐｍで最大４８時間インキュベートした。
【０２６９】
２．定量的バイオリアクター（ファーメンター）培養
モニタリング可能な方法のために、生物変換はＤａｓｇｉｐファーメンターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）にて０．５Ｌの容量で行った。前工程は２６〜２８℃で行い、ｐＨ７．０に維持した。溶存酸素（ＤＯ）は最低３０％に維持した。増殖中、ＤＯは炭水化物消費のために上昇する。ＤＯ５０％で、式
ｙ＝ｅ０．1ｘ
（式中、ｙは追加容量（ｍＬ）、ｘは時間（時間）を表す）
に従い、１ｍＬ／時でグルコースの追加供給を開始した。
【０２７０】
細胞増殖のために、菌株をＬＢ、ＴＢ、ＲＭまたはＭ９で一晩増殖させた。ＯＤ600  １０〜５０で、５０μＭのＩＰＴＧおよびポリフェノール基質（４００〜１５００μＭ）を培養物に加えた。反応を２４〜４８時間行った。
【０２７１】
全ての生物変換反応は、いずれも、遠心分離（１３，０００ｇ、４℃、２０分）による細胞採取とその後の０．２２μＭ  ＰＥＳ膜（Ｓｔｅｒｉｔｏｐ(商標)、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ）での無菌濾過による細胞採取により停止させた。あるいは、培養物を、中空繊維膜濾過技術、例えば、ＴＦＦ  Ｃｅｎｔｒａｍｅｄシステム（Ｐａｌｌ、ＵＳＡ）により採取した。上清をそのまま精製し、または４℃で短期保存した（遮光）。
生物変換反応物および生成物の定性分析
生物変換生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬＣにより決定した。
【０２７２】
定性ＴＬＣ分析のため、１ｍＬの培養上清を等量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出した。遠心分離（５分、３，０００ｇ）後、有機相をＨＰＬＣ平底バイアルに移し、ＴＬＣ分析に使用した。２０μＬのサンプルを、ＡＴＳ  ４（ＣＡＭＡＧ、スイス）による２００ｐｍｏｌの参照フラボノイドに対して、２０×１０ｃｍ2（ＨＰ）ＴＬＣシリカ６０Ｆ254プレート（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）に適用した。物質のキャリーオーバーを避けるため、すなわち、偽陽性を避けるために、間に２回シリンジをすすいで、サンプルをスポットした。サンプリングしたＴＬＣプレートはＥｔＯＡｃ／酢酸／ギ酸／水（ＥｔＯＡｃ／ＨＡｃ／ＨＦｏ／Ｈ2Ｏ）１００：１１：１１：２７で展開した。分離後、ＴＬＣプレートを温風で１分間乾燥させた。クロマトグラムを読み取り、分離したバンドの吸光度を、ＴＬＣ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３（ＣＡＭＡＧ、スイス）により２８５〜３７０ｎｍ（Ｄ２）での抽出物の最大吸光度に応じて濃度測定的に決定した。
【０２７３】
分析的ＨＰＬＣ条件
ＨＰＬＣ分析は、ダイオードアレイ検出を備えたＶＷＲ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅデバイスで行った。
カラム：  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８  ２５０×４、６ｍｍ、５μＭ
流速：  １ｍＬ／分
移動相：  Ａ：Ｈ2Ｏ＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ
勾配：  ０〜５’：５％Ｂ、５〜１５’：１５％Ｂ、１５〜２５’：２５％Ｂ、２５〜２５’：３５％Ｂ、３５〜４５’：４０％、４５〜５５’  １００％Ｂ、５５〜６３’：５％Ｂ
サンプル注入容量  １００〜５００μＬ
【０２７４】
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ分析は、Ｂｒｕｋｅｒ（Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）からエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）を用い、マイクロＯＴＯＦ−Ｑにて取得した。ＥＳＩ源は４０００Ｖにて陰イオンモードで作動させた。サンプルをシリンジポンプにより、流速２００μＬ／分で注入した。
【０２７５】
ポリフェノールグリコシドを精製するために、２つの異なる精製手順が首尾良く適用された。
【０２７６】
１．抽出およびその後の分取ＨＰＬＣ
１．１液液抽出では、生物変換培養上清を半量のイソ−ブタノールまたはＥｔＯＡｃで２回抽出した。
１．２固相抽出（ＳＰＥ）では、上清をまず好適なポリマー基質、例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ樹脂またはシリカに基づく官能基化相、例えば、Ｃ−１８に結合させ、次に、有機溶媒、例えば、ＡＣＮ、メタノール（ＭｅＯＨ）、ＥｔＯＡｃ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などまたはそれぞれその好適な水溶液で溶出させた。
【０２７７】
有機溶媒を蒸発させ、残渣を水−アセトニトリル（Ｈ2Ｏ−ＡＣＮ）８０：２０に完全に溶解させた。この濃縮液を下記のようにさらにＨＰＬＣにより処理した。
【０２７８】
２．分取ＨＰＬＣの直接分画
無菌濾過した（０．２μｍ）生物変換培養上清または予備濃縮した抽出物を十分なＲＰ１８カラム（５μｍ、２５０ｍｍ）にロードし、下記の一般条件下、Ｈ2Ｏ−ＡＣＮ勾配で分画した：
システム：  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣシステム。
カラム：  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８  分取ＨＴ  ２５０×２１．２ｍｍ、７μｍ。
流速：  ２０ｍＬ／分
移動相：  Ａ：水＋０．１ギ酸
Ｂ：ＡＣＮ＋０．１ギ酸
勾配：  ０〜５分      ５〜３０％Ｂ
５〜１０分    ３０％Ｂ
１０〜１５分  ３５％Ｂ
１５〜２０分  ４０％Ｂ
２０〜２５分  １００％Ｂ
ポリフェノールグリコシドを含有する画分を蒸発させ、かつ／または凍結乾燥させた。二重ピークまたは不純物を分離するためにＨＰＬＣによりペンタフルオル−フェニル（ＰＦＰ）相を用いて第２の仕上げ工程を行った。
【０２７９】
ラムノース転移活性は、分取および分析生物変換反応において、酵素ＧＴＣ、ＧＴＤ、ＧＴＦおよびＧＴＳおよび３つのキメラ酵素、キメラ１フレームシフト、キメラ３およびキメラ４を用いて示された。これらの酵素は、異なるベクター系において発現された場合に機能的であった。ＧＴ活性は、ＧＴ遺伝子を有するｐＤｒｉｖｅベクター（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）で形質転換されたクローニング系、例えば、大腸菌ＤＨ５αですでに決定可能であった。ＧＴ遺伝子が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋保有大腸菌もまたフラボノイドを活発にグリコシル化していた。分取スケールのために、生産株ＰｅｔＣ、ＰｅｔＤ、ＰｅｔＦ、ＰｅｔＳ、ＰｅｔＣｈｉｍ１ｆｓ、ＰｅｔＣｈｉｍ３およびＰｅｔＣｈｉｍ４の生産は首尾良く使用された。生成物はＨＰＬＣ、ＴＬＣ、ＬＣ−ＭＳおよびＮＭＲ分析により決定された。
【０２８０】
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＣ（ＰｅｔＣ）を用いたフラバノンヘスペレチンの生物変換
分取スケール反応において、ヘスペレチン（３’，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシフラバノン、２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ＣＡＳ  Ｎｏ．５２０−３３−２）を変換した。この生物変換は、一般的な分取振盪フラスコ増殖および生物変換条件に従って行った。
【０２８１】
ヘスペレチンの生物変換（＞９８％、Ｃａｙｍａｎ、ＵＳＡ）を開始時（Ｔ＝０）、２８℃で３時間および２４時間反応時に採取した５００μＬサンプルのＨＰＬＣ分析によりモニタリングした。培養上清を、ポンプ流を介して分取ＲＰ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）に直接ロードした。段階的溶出を行い、図１０および表Ａ２に従って７画分を回収した。
【０２８２】
７画分全てを次にＨＰＬＣおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ分析により分析した。陰イオンモードでのＭＳ分析は、画分３および画分６がそれぞれヘスペレチン−Ｏ−ラムノシド（Ｃ22Ｈ24Ｏ10）に相当する４４８Ｄａの分子量を有する化合物を含有することを明らかにした（図１１および１２表Ａ２）。これら２つの化合物をさらに精製するために、画分３および６を凍結乾燥させ、３０％ＡＣＮに溶かした。
【０２８３】
最終的な精製は、ＰＦＰカラムを用いてＨＰＬＣにより行った。第２の精製はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ランガーヴェーエ、ドイツ）から購入し、流速６ｍＬ／分（移動相：Ａ：水、Ｂ：ＡＣＮ、直線勾配溶出（０’〜８’：９５％〜４０％Ａ、８’〜１３’：１００％Ｂ）で作動するＨｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  ＰＦＰ、２５０×１０ｍｍ、５μｍで行った（図１３）。次に、ＰＦＰ画分のＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析は、個々の各部においてＨＥＳＲ１およびＨＥＳＲ２と呼ばれる標的化合物を同定した（表Ａ３）。
【０２８４】
凍結乾燥後、ＮＭＲ分析は、それぞれＨＥＳＲ１およびＨＥＳＲ２の分子構造を明らかにした（実施例Ｂ−２）。ＨＥＳＲ１はヘスペレチン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドであることが分かり、分析的ＨＰＬＣ条件でＲＴ２８．９１分を有した。この時点で、この化合物は事前に単離も合成もされたことはなかった。
【０２８５】
（表４）
表Ａ２：分取ＬＣ分離によるヘスペレチン生物変換の分画
2019501662.tif 000043
【０２８６】
（表５）
表Ａ３：画分３ヘスペレチン生物変換のＰＦＰ−ＨＰＬＣのピーク表
2019501662.tif 000044
【０２８７】
分取振盪フラスコ培養におけるＰｅｔＣを用いたフラバノンナリンゲニンの生物変換
ナリンゲニン（４’，５，７−トリヒドロキシフラバノン、２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ＣＡＳ  Ｎｏ．  ６７６０４−４８−２）を分取スケール反応で変換した。この生物変換は、一般的な分取振盪フラスコ増殖および生物変換条件に従って行った。
【０２８８】
ナリンゲニン（９８％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス）の生物変換は、２４時間反応後の５００μＬサンプルのＨＰＬＣ分析により制御した。培養上清を、ポンプ流を介して分取ＲＰ１８カラムに直接ロードした。段階的溶出を行い、表Ａ４に従って７画分を回収した。
【０２８９】
７画分全てを次にＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析により分析した。陰イオンモードでのＭＳ分析は、画分３および画分５がそれぞれナリンゲニン−Ｏ−ラムノシド（Ｃ21Ｈ22Ｏ9）の分子量である４１８Ｄａの分子量を有する化合物を含有することを明らかにした（表Ａ４）。ＮＲ１およびＮＲ２と呼称されるこれら２つの化合物を凍結乾燥させた。分析的条件のＨＰＬＣ分析は、ＲＴがそれぞれＮＲ１ではおよそ２７．２分、ＮＲ２ではおよそ３５．７分であることを明らかにした。ＮＭＲ分析はＮＲ１の分子構造を解明した（実施例Ｂ−３）。ＮＲ１は、Ｓ−およびＲ−ナリンゲニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（Ｎ５Ｒ）の鏡像異性体１：１混合物であると同定された。使用した前駆体も両鏡像異性体から構成されたことから、この構造分析は、両異性体がＧＴＣによって変換されたことを証明した。我々の知る限り、これはナリンゲニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドが生合成された最初の報告である。この化合物は植物材料から単離された（非特許文献５０）。しかしながら、この希少なフラボノイドグリコシドの自然発生の低さが産業上の利用の試みを阻んできた。
【０２９０】
これに対して、ナリンゲニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドのこの初めての生物変換は、この化合物のバイオテクノロジー的生産法の道を拓く。これまで、バイオテクノロジー的生産は例えば、ナリンゲニン−７−Ｏ−α−Ｌ−キシロシドおよびナリンゲニン−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドでしか示されていなかった（非特許文献５１、非特許文献５２）。
【０２９１】
（表６）
表Ａ４：分取ＬＣ分離によるナリンゲニン生物変換の分画
2019501662.tif 000045
【０２９２】
モニタリングバイリアクターシステムにおける大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＣ（ＰｅｔＣ）を用いたナリンゲニンの生物変換
振盪フラスコ培養でのナリンゲニンラムノシドの生産の次に、モニタリング培養パラメーター下でスケールアップの適用性を証明するために、バイオリアクター法が首尾良く樹立された。
【０２９３】
Ｄａｓｇｉｐファーメンターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）にて、ナリンゲニンを上述の条件下、４つのファーメンターユニットで並行して変換した。
【０２９４】
ＯＤ600が５０の際に、ＩＰＴＧによりＰｅｔＣでの発現を誘導し、同時に各ユニットにつき０．４ｇのナリンゲニン（９８％  ＣＡＳ  Ｎｏ．６７６０４−４８−２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス）の添加を行った。よって、終濃度は２．９４ｍＭの基質となった。
【０２９５】
生物変換２４時間後に、生物変換を終了し、遠心分離した。次に、無細胞上清を等容量のイソブタノールで１回、１分間強く振盪することによって抽出した。規定濃度のナリンゲニンラムノシドを用いた予備抽出実験で、７８．６７％の平均効率が明らかになった（表Ａ５）。
【０２９６】
これらのバイオリアクター反応のＨＰＬＣ分析は、両生成物ＮＲ１（ＲＴ  ２７、２８’）とＮＲ２（ＲＴ３５．７’）が首尾良く構築されたことを示した（図１６）。ＥＳＩ−ＭＳ分析により、両生成物について４１８Ｄａの分子量が確認された。生物変換生成物の定量分析により、反応収量が明らかになった。濃度計算は、ＮＲ１およびＮＲ２の回帰曲線の決定の後にピーク面積から行った（表Ａ６）。ＮＲ１は平均生成物濃度３９３ｍｇ／Ｌで得られ、副生成物としてのＮＲ２は平均１０５ｍｇ／Ｌで得られた。
【０２９７】
（表７）
表Ａ５：上清からのナリンゲニン生物変換生成物のイソブタノールを用いた抽出
2019501662.tif 000046
【０２９８】
（表８）
表Ａ６：ＮＲ１およびＮＲ２のＨＰＬＣクロマトグラムピーク面積および得られた生成物濃度
2019501662.tif 000047
【０２９９】
それぞれ大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＣ（ＰｅｔＣ）、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＤ（ＰｅｔＤ）、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＦ（ＰｅｔＦ）、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：ＧＴＳ（ＰｅｔＳ）、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：キメラ１フレームシフト（ＰｅｔＣｈｉｍ１ｆｓ）、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：キメラ３（ＰｅｔＣｈｉｍ３）および大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＥＴ１９ｂ：：キメラ４（ＰｅｔＣｈｉｍ４）を用いたナリンゲニン(narengenin)の生物変換
ＧＴＣ、ＧＴＤ、ＧＴＦおよびＧＴＳならびに３つのキメラ酵素、キメラ１フレームシフト、キメラ３およびキメラ４の位置特異性を調べるために、とりわけ基質としてナリンゲニンを用いる分取フラスコ培養生物変換と同様に、２０ｍＬ培養系で生物変換を行った。形成されたフラボノイドラムノシドを精製するために、生物変換の上清をＣ6Ｈ5固相抽出（ＳＰＥ）カラムにロードした。基材を２０％アセトニトリルで１回洗浄した。フラボノイドラムノシドを１００％アセトニトリル(aceteonitrile)で溶出させた。生物変換の分析は、分析的ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳを用いて行った。ナリンゲニン生物変換に関して、各生産株について、形成された生成物ＮＲ１およびＮＲ２の結果をそれぞれ表Ａ７およびＡ８に示す。
【０３００】
（表９）
表Ａ７：種々の生産株を用いたナリンゲニンの生物変換において形成されたＮＲ１生成物
2019501662.tif 000048
【０３０１】
（表１０）
表Ａ８：種々の生産株を用いたナリンゲニンの生物変換において形成されたＮＲ２生成物
2019501662.tif 000049
【０３０２】
ＰｅｔＣを用いたフラバノンホモエリオジクチオール（ＨＥＤ）の生物変換
分取スケールで、ＨＥＤ（５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−４−クロマノン、ＣＡＳ  Ｎｏ．４４６−７１−９）をＰｅｔＣによってグリコシル化した。この生物変換は、一般的な分取振盪フラスコ増殖および生物変換条件に従って行った。
【０３０３】
ＨＥＤの生物変換は、ＨＰＬＣ分析によってモニタリングした。培養上清を、ポンプ流を介して分取ＲＰ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）に直接ロードした。段階的溶出を行い、表Ａ５に従って９画分を回収した。
【０３０４】
９画分全てを次にＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析により分析した。陰イオンモードでの画分５および８のＭＳ分析は、双方とも、ＨＥＤ−Ｏ−ラムノシドのサイズに相当した４４８Ｄａの分子量を有する化合物を含有していたことを示し、これらをＨＥＤＲ１およびＨＥＤＲ３と呼称した。画分７（ＨＥＤＲ２）のＭＳ分析は４３４Ｄａの分子量を示した。しかしながら、３つの画分全てのＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ分析では１４６Ｄａの脱離基が同定され、画分７にもラムノシド残基が示唆される。
【０３０５】
（ＰＦＰ）相およびその後の凍結乾燥によるＨＰＬＣ仕上げ工程の後、ＨＥＤＲ１の分子構造をＮＭＲ分析によって明らかにした（実施例Ｂ−１）。ＨＥＤＲ１（分析的ＨＰＬＣでＲＴ  ２８．２６分）は、純粋な化合物ＨＥＤ−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドとして同定された。
【０３０６】
（表１１）
表Ａ９：分取ＬＣ分離によるＨＥＤ生物変換の分画
2019501662.tif 000050
【０３０７】
ＰｅｔＣを用いたイソフラボノンゲニステインの、ＰｅｔＣを用いた生物変換反応
分取スケールで、ゲニステイン（４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボン、５，７−ジヒドロキシ−３−（４−ヒドロオキシフェニル）クロメン−４−オン、ＣＡＳ  Ｎｏ．４４６−７２−０）を、ＰｅｔＣを用いた生物変換反応でグリコシル化した。この生物変換は、一般的な分取振盪フラスコ増殖および生物変換条件に従い、ＰＢＳ中で行った。
【０３０８】
ゲニステインの生物変換はＨＰＬＣによってモニタリングした。ゲニステインアグリコンはおよそ４１分のＲＴを示した。反応の進行ととともに、およそ２６分、３０分、３４．７分、および３５．６分のＲＴを有する反応生成物の４つのピーク（ＧＲ１〜４）が生物変換物内に蓄積した（表Ａ１０）。４０時間後に細胞採取により反応を停止させ、分取ＲＰ１８  ＨＰＬＣにおいて段階的溶出を行った。全ての画分をＨＰＬＣおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によって分析した。
【０３０９】
画分３、４、および５はそれぞれ、ＭＳ分析でゲニステインラムノシドの分子量を示した。画分３は、２つの別の主要ピーク（ＲＴ  ２６分および３０分）を含有していた。画分４は、３４．７分および３５．６分の二重ピークを示し、画分５は、ＲＴ  ３５．６分に遅い方の生成物ピークのみを示した。これらのピークの陰イオンモードでの別のＭＳ分析で、全てのピークがゲニステイン−Ｏ−ラムノシドのサイズに相当した４１６の同一の分子量を有する化合物を含有していたいことが明らかになった。ＧＲ１のＮＭＲ分析は、ゲニステイン−５，７−ジ−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（実施例Ｂ−９）を同定した。
【０３１０】
ＰｅｔＣを用いたイソフラボンビオカニンＡの生物変換
分取スケールで、ビオカニンＡ（５，７−ジヒドロキシ−３−（４−メトキシフェニル）クロメン−４−オン、ＣＡＳ  Ｎｏ．４９１−８０−５）を、ＰｅｔＣを用いた生物変換反応でグリコシル化した。この生物変換は、一般的な分取振盪フラスコ増殖および生物変換条件に従って行った。
【０３１１】
ビオカニンＡの生物変換をＨＰＬＣによりモニタリングした。ビオカニンＡアグリコンはおよそ５３．７分のＲＴを示した。反応の進行ととともに、およそ３２．５’、３６．６’、および４５．６’の３つの生成物ピークが生物変換物中に蓄積した（表Ａ１０）。これらをそれぞれＢＲ１、ＢＲ２、およびＢＲ３と呼称した。２４時間後に遠心分離（１３，０００  ｇ、４℃）による細胞採取によって反応を停止させた。濾過した上清を分取ＲＰ１８カラムにロードし、段階的溶出により分画した。全ての画分をＨＰＬＣおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によって分析した。
【０３１２】
３２．５分のＲＴを有するＰｅｔＣ生成物ＢＲ１は、ＮＭＲによって、ビオカニンＡの５，７−ジ−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（実施例Ｂ−４）と同定された。ＢＲ２（ＲＴ  ３６．６’）のＮＭＲ分析は、５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（実施例Ｂ−５）を示した。他のフラボノイドの５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド、例えば、ＨＥＤ−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドによれば、ＢＲ２は、ＨＥＤＲ１に比べてやや遅い、最も親水性の大きいモノラムノシドであった。前駆体ビオカニンＡ（ＲＴ  ５３．５’）の疎水性がより大きいことを考慮すれば、ゲニステイン（ＲＴ  ４１’）のＣ４’−ＯＨに比べてヒドロキシ基およびそのＣ４’−メトキシ官能基が少ないため、ＧＲ２に比べた場合のこのＢＲ２の遅延が説明できる。
【０３１３】
ＰｅｔＣを用いたフラボンクリシンの生物変換
分取スケールで、クリシン（５，７−ジヒドロキシフラボン、５，７−ジヒドロキシ−２−フェニル−４H−クロメン−４−オン、ＣＡＳ  Ｎｏ．４８０−４０−０）を、ＰｅｔＣを用いた生物変換反応でグリコシル化した。この生物変換は、ＰＢＳ中での記述の分取振盪フラスコ条件に従って行った。
【０３１４】
クリシンの生物変換はＨＰＬＣ分析によってモニタリングした。クリシンアグリコンは、５３．５分のＲＴを示した。ＰｅｔＣ生物変換(biocenversions)で、３つの反応生成物ピークが反応に蓄積し、それぞれＲＴ  ３０．６分にＣＲ１、ＲＴ３６．４分にＣＲ２、およびＲＴ４３．４にＣＲ３であった（表Ａ１０）。全ての生成物をＨＰＬＣおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によって分析した。
【０３１５】
ＣＲ１はさらに、ＮＭＲによってクリシンの５，７−ジ−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（実施例Ｂ−６）と同定され、ＮＭＲ分析では、ＣＲ２は、５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（実施例Ｂ−７）であることが判明した。ＢＲ２と同様に、ＣＲ２も、Ｃ環に遊離のＯＨ基を有するフラボノイド、例えば、ヘスペレチンおよびナリンゲニンの５−Ｏ−ラムノシドよりも親水性が小さかったが、ＣＲ２はクリシンの最も親水性の大きいモノラムノシドであった。
【０３１６】
ＰｅｔＣを用いたフラボンジオスメチンの生物変換
ジオスメチン（５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシフラボン、５，７−ジヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）クロメン−４−オン、ＣＡＳ  Ｎｏ．５２０−３４−３）を、ＰｅｔＣを用いた生物変換反応でグリコシル化した。この生物変換は前述のように行った。
【０３１７】
ジオスメチンの生物変換はＨＰＬＣによってモニタリングした。ジオスメチンアグリコンは、所与の方法を用い、４１．５分のＲＴを示した。反応の進行ととともに、２６．５’（ＤＲ１）、２９．１’（ＤＲ２）、および３６’（ＤＲ３）に推定反応生成物の３つのピークが蓄積した（表Ａ１０）。
【０３１８】
２９．１分のＲＴを有する生成物ＤＲ２はさらに、ジオスメチン（Ｄ５Ｒ）の５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド（実施例Ｂ−１０）と同定された。ＤＲ１は、ＥＳＩ−ＭＳ分析によってジオスメチンのジラムノシドであることが示された。他のフラボノイド、例えば、ヘスペレチンの５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドによれば、ＤＲ２は、分析的ＲＰ１８  ＨＰＬＣ条件で同等の保持を示した。
【０３１９】
表Ａ１０は、供試した様々なフラボノイド前駆体によるＰｅｔＣ生物変換の全ての反応生成物をまとめたものである。
【０３２０】
（表１２）
表Ａ１０：適用した前駆体および対応するラムノシル化生成物の編集
2019501662.tif 000051
【０３２１】
パートＢ：ラムノシル化フラボノイドのＮＭＲ分析
下記の実施例は、上記のパートＡに記載した手順に従って調製した。
【０３２２】
実施例Ｂ−１：ＨＥＤ−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３２３】
【化２７】
2019501662.tif 000052
【０３２４】
１Ｈ  ＮＭＲ（（６００  ＭＨｚメタノール−ｄ４）：  δ  ＝  ７．０６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０５（ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９１ （ｄｔ，Ｊ  ＝  ８．２，  ２．１，  ０．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９０  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．１，  ２．０，  ０．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．８１  （ｄ，  Ｊ＝８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．８０  （ｄ，  Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２，３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．２９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２，３Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．０９  （ｔ，Ｊ  ＝  ２，３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ５．４４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝７．７，  ２．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３１  （ｄｄ，Ｊ  ＝８．１，  ３．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１２  （ｄｄｄ，  Ｊ＝  １１．２，  ３．５，  １．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．０８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．５，  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．５，  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．６９  −  ３．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４６ （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ９．５，  ５．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．０６  −  ３．０２  （ｍ，  １Ｈ），  ３．０２  −  ２．９８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．６４  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  １６．６，  １５．５，  ３．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．２５  （ｄ，  Ｊ＝６．２Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．２３  （ｄ，  Ｊ＝６．３Ｈｚ，  ３Ｈ）．
【０３２５】
実施例Ｂ−２：ヘスペレチン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３２６】
【化２８】
2019501662.tif 000053
【０３２７】
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  １．１０  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２６  Ｈｚ，  ＣＨ３），  ２．４５  （ｍ，  Ｈ−３（ａ），  ＤＭＳＯと重なっている），  ２．９７  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．５，  １６．５  Ｈｚ，  Ｈ３（ｂ）），  ３．２７  （１Ｈ，  ｔ，  ９．４９  Ｈｚ，  Ｈ（ｂ）），  ３．４８  （ｍ，  Ｈ（ａ），  ＨＤＯと重なっている），  ３．７６  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＨ３），  ３．９  −３．８  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ（ｃ），Ｈｄ），  ５．３１  （１Ｈ，  ｄ，  １．７６  Ｈｚ，  Ｈｅ），  ５．３３  （１Ｈ，  ｄｄ，  １２．５，  ２．８３  Ｈｚ，  Ｈ２），  ６．０３  （１Ｈ，ｄ，  ２．１９  Ｈｚ，  Ｈ６／Ｈ８），  ６．２０  （１Ｈ，  ｄ，  ２．１９  Ｈｚ，  Ｈ６／Ｈ８），  ６．８６  （１Ｈ，  ｄｄ，  ８．２，  ２．０  Ｈｚ，  Ｈ６‘），  ６．９０  （１Ｈ，  ｄ，  ２．０  Ｈｚ，  Ｈ２‘），  ６．９３  （１Ｈ，  ｄ，  ８．２  Ｈｚ，  Ｈ５‘）
【０３２８】
実施例Ｂ−３：ナリンゲニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３２９】
【化２９】
2019501662.tif 000054
【０３３０】
１Ｈ  ＮＭＲ  （６００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  ７．３０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．２０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．０２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．０１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．７，  ３．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．０，  ２．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９０  −  ３．８８  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８８  −  ３．８５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８５  −  ３．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５０  （ｄｑ，  Ｊ  ＝  ９．２，  ６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４８  （ｄｑ，  Ｊ  ＝  ９．１，  ６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．２９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ９．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．０７  −  ２．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．５５  −  ２．４８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．１２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．１０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ３Ｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ  （１５１  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  １８７．７５，  １８７．７１，  １６４．０４，  １６３．９２，  １６３．８０，  １５８．３３，  １５８．２３，  １５７．４８，  １５７．４４，  １２９．２６，  １２９．２４，  １２９．１８，  １２９．１５，  １２８．０７，  １２８．００，  １１５．００，  １０５．１９，  １０５．０６，  ９８．５８，  ９８．４４，  ９７．２５，  ９６．８５，  ９６．７７，  ９６．６４，  ７８．０３，  ７７．９７，  ７１．６７，  ７１．６５，  ６９．９８，  ６９．９５，  ６９．６６，  ６９．６４，  ４４．７８，  ４４．７４，  １７．８０，  １７．７５．
【０３３１】
実施例Ｂ−４：ビオカニンＡ−５，７−ジ−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３３２】
【化３０】
2019501662.tif 000055
【０３３３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  ８．２１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．９７ （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，      ２Ｈ），  ６．８６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．５３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．４１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１５  （ｓ，  １Ｈ），  ５．００  （ｓ，  １Ｈ），  ４．９３  （ｓ，  １Ｈ），  ４．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ４．７０  （ｓ，  １Ｈ），  ３．９３  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．８７  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．８５  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．６４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．３，３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５４  （ｄｑ，  Ｊ  ＝  ９．４，  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４４  （ｄｑ，  Ｊ  ＝  ９．４，  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．３４  （ｂｒ，  １Ｈ），  １．１３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  ３Ｈ）
【０３３４】
実施例Ｂ−５：ビオカニンＡ  ５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３３５】
【化３１】
2019501662.tif 000056
【０３３６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  ８．２１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．９６ （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７  Ｈｚ   ２Ｈ），  ６．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１  −  ４．１  （ｂｒ，  ｎＨ），  ３．９１  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．８６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．７，  １Ｈ），  ３．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．４８  （ｂｒ， 不純物と重なっている, １Ｈ），  ３．４４  （不純物），  ３．３  （ＨＤＯと重なっている），  １．１０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ３Ｈ）
【０３３７】
実施例Ｂ−６：クリシン−ジ−５，７−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３３８】
【化３２】
2019501662.tif 000057
【０３３９】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  ８．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．０８ （ｓ，  １Ｈ），  ６．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．７５  （ｓ，  １Ｈ），  ５．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１７  （ｓ，  １Ｈ），  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ４．８６  （ｓ，  １Ｈ），  ４．７１  （ｓ，  １Ｈ），  ３．９７  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．８８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．５，３．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８７  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．６６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．３，３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５６  （ｄｑ，  Ｊ  ＝  ９．４，  ６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４７  （ｄｑ，  Ｊ  ＝  ９．４，  ６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．３２  （HDOと重なっている, ２Ｈ），  １．１４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ３Ｈ）
【０３４０】
実施例Ｂ−７：クリシン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３４１】
【化３３】
2019501662.tif 000058
【０３４２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  ８．０１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５６  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．６６ （ｓ，  １Ｈ），  ６．６４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０１  （ｓ，  １Ｈ），  ４．８５  （ｄ，  Ｊ  ＝４．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．９６  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．８７  （ｍｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５４  （ｄｑ，  Ｊ  ＝  ９．４，  ６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．３  （ＨＤＯと重なっている），  １．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  ３Ｈ）
【０３４３】
実施例Ｂ−８：シリビニン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３４４】
【化３４】
2019501662.tif 000059
【０３４５】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  ７．０５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝５．３，１．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０１  （ｂｒ，  １Ｈ），  ６．９９ （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．５，４．４，１．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．８６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．２５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．９７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ２．１，３．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．３６  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝１１．２，６．５，４．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１６  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．６，３．０，４．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８３  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５３  （ｍ，  ３Ｈ），    ３．３０  （ＨＤＯと重なっている,  ３Ｈ），  １．１３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ３Ｈ）
【０３４６】
実施例Ｂ−９：ゲニステイン−５，７−ジ−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３４７】
【化３５】
2019501662.tif 000060
【０３４８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  ８．１６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．８５ （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．７３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  １Ｈ），    ５．８３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９３  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．８７  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．８５  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．６４  （ｂｒ，  １Ｈ），  ３．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．２  （ＨＤＯが重なっている, ２Ｈ），  １．１２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ３Ｈ）
【０３４９】
実施例Ｂ−１０：ジオスメチン−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド
【０３５０】
【化３６】
2019501662.tif 000061
【０３５１】
１Ｈ  ＮＭＲ（６００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ＝  ７．４５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．５，２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３６（ｄ，  Ｊ  ＝  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．４５ （ｓ，  １Ｈ），  ５．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．５，  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｄｑ，  Ｊ  ＝９．４，  ６．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．３０  （ＨＤＯと重なっている, １Ｈ），  １．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．２，  ３Ｈ）
【０３５２】
パートＣ：溶解度
図１は、最大２５ｍＭの規定量のナリンゲニン−５−ラムノシドを含有する０．２μｍ濾過溶液をロードした後の、ＲＰ１８  ＨＰＬＣカラムから再捕捉されたナリンゲニン−５−ラムノシドの量を示す。量は回帰曲線から計算した。ナリンゲニン−５−ラムノシドの最大水溶解度はおよそ１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、これは４．２ｇ／Ｌに相当する。
【０３５３】
分子の親水性はまた、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーにおける保持時間にも反映される。疎水性分子はより遅い保持時間を有し、これをそれらの水溶解度の質的決定として使用できる。
【０３５４】
ＨＰＬＣ−クロマトグラフィーは、下記の条件下、ダイオードアレイ検出を備えたＶＷＲ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ装置を用いて行った。
カラム：  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８  ２５０×４、６ｍｍ、５μＭ、流速１ｍＬ／分
移動相：  Ａ：Ｈ2Ｏ＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；
Ｂ：  ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ
サンプル注入容量：  ５００μＬ；
勾配：０〜５分：５％Ｂ、５〜１５分：１５％Ｂ、１５〜２５分：２５％Ｂ、２５〜２５分：３５％Ｂ、３５〜４５分：４０％、４５〜５５分：１００％Ｂ、５５〜６３分：５％Ｂ
【０３５５】
表Ｂ１は、図２〜９および実施例Ａ−２に従う保持時間のまとめを含む。
【０３５６】
（表１３）
2019501662.tif 000062
【０３５７】
一般に、親油性小分子のグルコシドは、それらの対応するラムノシドに比べて水によく溶けることがよく知られている、例えば、イソクエルシトリン（ケルセチン−３−グルコシド）とクエルシトリン（ケルセチン−３−ラムノシド）。表Ｂ１は、５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドは、フラボノイド骨格の他の位置のα−Ｌ−ラムノシドおよびβ−Ｄ−グルコシドよりも溶解度が大きいことを包括的に示す。５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドは全て、ＲＰ１８逆相ＨＰＬＣで３０分未満に溶出した。これに対し、フラバノングルコシドは、その骨格における位置に依存せずに３０分を超えるＲＴでもっぱら保持される。ＨＥＤの場合、他の位置の中でもこのＣ４’およびＣ７に、α−Ｌ−ラムノシドの保持時間に関する違いの境界があったが、Ｃ５位はそれに対して強い効果を有した。これは全く予想されない発見であった。
【０３５８】
溶解度の明らかな違いは、ポリフェノール足場の糖の結合部位によって明らかに誘導される。４−オン−５−ヒドロキシベンゾピランでは、ＯＨ基とケト官能基は水素結合を形成する。この結合は、Ｃ５におけるα−Ｌ−ラムノシドの置換によって障害を受け、分子を取り巻く最適な溶媒和シェルを生じる。さらに、水性環境で、Ｃ５位の親水性ラムノース残基が、周囲の水分子との接触を減らす効果を持つ疎水性ポリフェノールの、より広い面積を覆い隠し得る。もう１つの説明は、Ｃ５位の占有が親水性の糖類部分と疎水性のポリフェノール部分の空間的分離を持つ分子をより効果的に形成するということであろう。これは乳化特性およびミセルの形成をもたらすと思われる。よって、エマルションは、含まれる化合物の溶解度を高める。
【０３５９】
パートＤ：ラムノシル化フラボノイドの活性
実施例Ｄ−１：フラボノイド−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドの細胞傷害性
フラボノイド−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドの細胞傷害性を決定するために、細胞単層培養でそれらのアグリコン誘導体に対して試験を行った。この目的で、１μＭ〜２５０μＭの範囲の濃度を選択した。正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）の生存率は、ＭＴＴ還元アッセイおよび顕微鏡による形態観察によって２回評価した。ＮＨＥＫは０．２５ｎｇ／ｍＬの上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、２５μｇ／ｍＬの下垂体抽出物（ＰＥ）およびゲンタマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を添加したケラチノサイト−ＳＦＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ2曝気下で２４時間増殖させ、継代培養３代目に使用した。細胞傷害性試験については、プレインキュベートしたＮＨＥＫに特定の濃度の試験化合物を含有する新鮮培養培地を与え、２４時間インキュベートした。同じ試験濃度で培地交換を行った後、細胞を、生存率が決定されるまでさらに２４時間インキュベートした。試験結果を表Ｂ２に示し、図１０に表す。
【０３６０】
（表１４）
表Ｂ２：正常ヒト表皮ケラチノサイトに対するフラボノイド−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドの細胞傷害性
2019501662.tif 000063
【０３６１】
ＮＨＥＫの単層培養に対する細胞傷害性測定により、漸増濃度で、５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドの、それらのフラボノイドアグリコンよりも良好な適合性が示された。１００μＭまでは、一貫した差は見られなかった（図１０）。しかしながら、２５０μＭ濃度のアグリコン、ヘスペレチンおよびナリンゲニンでは、ＮＨＥＫの生存率は約５０％に低下したが、対応する５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドで処理したＮＨＥＫのミトコンドリア活性は、より低濃度に比べていっそう影響を受けなかった。フラボノイドアグリコンの溶解度は一般に水相で１００μＭ未満であり、グリコシド誘導体のそれは２５０μＭを超えることから特に、これらの結果は予想されなかった。これらのデータは、５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドは正常ヒトケラチノサイトに対する毒性が低いことを明らかに示した。
【０３６２】
実施例Ｄ−２：抗炎症特性
抗炎症能
ＮＨＥＫを試験化合物とともに２４時間プレインキュベートした。培地を、炎症誘導物質（ＰＭＡまたはポリＩ：Ｃ）を含有するＮＨＥＫ培養培地に置き換え、さらに２４時間インキュベートした。陽性対照および陰性対照を並行して実施した。エンドポイントにおいて、培養上清においてＥＬＩＳＡの手段により、分泌されたＩＬ−８、ＰＧＥ２およびＴＮＦ−αを定量した。
【０３６３】
ＮＨＥＫ細胞培養における５−Ｏ−ラムノシドの抗炎症作用
【０３６４】
（表１５）
表Ｂ３：ヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）におけるサイトカイン放出に対する５−Ｏ−ラムノシドの阻害
2019501662.tif 000064
【０３６５】
対照実験と比較した場合、５−Ｏ−ラムノシドは、炎症刺激（ＰＭＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ））下、３つの異なる炎症マーカーＩＬ−８、ＴＮＦα、およびＰＧＥ2に関してヒトケラチノサイトに抗炎症活性を示した。特に、ＰＧＥ2に対するＨＥＳＲ１の活性が７４％阻害と顕著であった。抗炎症活性はフラボノイド誘導体に関して十分に証明される。また、いく人かの筆者が、ＣＯＸ、ＮＦκＢ、およびＭＡＰＫ経路を介したそれらの作用を報告している（非特許文献５３、非特許文献５４）。しかしながら、本明細書に開示されるフラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドの例外的な水溶解度は、これらの化合物の細胞内濃度を、それらの稀な可溶性アグリコン対応物で達成可能なものよりもずっと高くする。アグリコン溶解度はほとんどの場合、それらの有効濃度に満たない。よって、本発明は抗炎症目的でより高い有効性を可能とする。
【０３６６】
多くの他調節活性の中にあって、ＴＮＦαは毛包成長の強力な阻害剤でもある（非特許文献５５）。よって、ＴＮＦα阻害化合物は、正常な健康的な毛髪成長の維持またはその刺激にも寄与する。
【０３６７】
実施例Ｄ−３：抗酸化特性
ＮＨＥＫ細胞培養における５−Ｏ−ラムノシドの抗酸化作用
プレインキュベートしたＮＨＥＫを試験化合物とともに２４時間インキュベートした。次に、過酸化水素（ＤＨＲ）の測定のための特異的蛍光プローブまたは脂質ペルオキシダーゼ（Ｃ１１−ｆｌｕｏｒ）を加え、４５分間インキュベートした。Ｈ2Ｏ2を測定しながら、脂質の過酸化において、それぞれＳＯＬ５００  Ｓｕｎ  Ｓｉｍｕｌａｔｏｒランプを用い、ＵＶＢ  １８０ｍＪ／ｃｍ2（＋ＵＶＡ  ２８３９ｍＪ／ｃｍ2）またはＵＶＢ  ２４０ｍＪ／ｃｍ2（＋ＵＶＡ  ３５３８ｍＪ／ｃｍ2）で照射を行った。照射後、細胞をフローサイトメトリー分析前に３０分間プレインキュベートした。
【０３６８】
（表１６）
表Ｂ４：ＮＨＥＫ細胞におけるＵＶにより誘導されるＨ２Ｏ２ストレスに対する５−Ｏ−ラムノシドの保護
2019501662.tif 000065
【０３６９】
（表１７）
表Ｂ５：ＮＨＥＫ細胞におけるＵＶにより誘導される脂質過酸化に対する５−Ｏ−ラムノシドの保護
2019501662.tif 000066
【０３７０】
供試フラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドの抗酸化機能は、それぞれミトコンドリアにより生産される過酸化水素種に対してはＨＥＳＲ１に関して、および過酸化脂質に対してはＮＲ１に関して観察することができる。しかしながら、これらのパラメーターが種々の細胞内代謝産物および因子、例えば、グルタチオン(gluthation)によっても影響を受けるとも言える。ゆえに、抗酸化応答の解釈において、単一の決定因子を取り扱うことが難しい場合が多い。
【０３７１】
実施例Ｄ−４：５−Ｏ−ラムノシドの刺激特性
継代培養８代目の正常ヒト皮膚線維芽細胞培養物で試験を行った。細胞を、２ｍＭのグルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）および１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気で増殖させた。
【０３７２】
ＮＨＤＦ細胞におけるプロコラーゲンＩの合成、ＶＥＧＦの放出、およびフィブロネクチン生産に対するフラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドの刺激
線維芽細胞を２４時間培養した後、細胞を試験化合物とともにさらに７２時間インキュベートした。インキュベーション後、プロコラーゲンＩ、ＶＥＧＦ、およびフィブロネクチンの放出量をＥＬＩＳＡの手段により測定するために、培養上清を採取した。参照試験化合物は、ビタミンＣ（プロコラーゲンＩ）、ＰＭＡ（ＶＥＧＦ）、およびＴＧＦ−β（フィブロネクチン）とした。
【０３７３】
（表１８）
表Ｂ６：ＮＨＤＦ細胞におけるプロコラーゲンＩ合成に対する５−Ｏ−ラムノシドの刺激
2019501662.tif 000067
【０３７４】
（表１９）
表Ｂ７：ＮＨＤＦ細胞におけるＶＥＧＦ放出に対する５−Ｏ−ラムノシドの刺激
2019501662.tif 000068
【０３７５】
（表２０）
表Ｂ８：ＮＨＤＦ細胞におけるフィブロネクチン合成に対する５−Ｏ−ラムノシドの刺激
2019501662.tif 000069
【０３７６】
結果は、フラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドが細胞外マトリックス成分に良い影響を与え得ることを示した。ＨＥＳＲ１は、ＮＨＤＦにおいてプロコラーゲンＩ合成を１００μＭで約２０％刺激した。１００μＭのＮＲ１は、ＮＨＤＦにおいてｈフィブロネクチン合成に２０％増の刺激効果を有した。両ポリマーは、ヒト皮膚において重要な細胞外組織安定化因子であることが周知である。ゆえに、コラーゲン合成またはフィブロネクチン合成を促進する物質は張りのある皮膚を支持し、しわを減らし、皮膚老化を少なくする。ＶＥＧＦ放出もまたＮＲ１によっておよそ３０％刺激され、フラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドの血管新生特性を示す。ＶＥＧＦレベルの適度な上昇は、血管新生を介した毛髪および皮膚栄養に良い影響を与え、従って、例えば、毛髪成長を促進することが知られている（非特許文献５６、特許文献３）。また、フィブロネクチンは、特許文献４に述べられているように、ヒト毛髪成長の促進因子であることが記載されている。ゆえに、ＮＲ１は、正常ヒト線維芽細胞においてＶＥＧＦの放出ならびにフィブロネクチンの合成を刺激することによって毛髪成長を刺激する。
【０３７７】
ＵＶＡ照射ＮＨＤＦにおけるＭＭＰ−１放出に対するフラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドの刺激
ヒト線維芽細胞を２４時間培養した後に、細胞を試験化合物または対照化合物（デキサメタゾン）とともにさらに２４時間プレインキュベートした。培地を、試験化合物を含有する照射培地（ＥＢＳＳ、ＣａＣｌ2  ０．２６４ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌＳＯ４  ０．２ｇ／Ｌ）に置き換え、細胞にＵＶＡ（１５Ｊ／ｃｍ2）を照射した。照射培地を、再び試験化合物を含む培養培地に置き換え、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、培養上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ１（ＭＭＰ−１）の量を、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【０３７８】
（表２１）
表Ｂ１０：ＮＨＤＦ細胞におけるＵＶにより誘導されるＭＭＰ−１放出に対する５−Ｏ−ラムノシドの刺激
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【０３７９】
フラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドは、ＮＨＤＦにおけるＭＭＰ−１レベルに対して高い活性を示した。ＮＲ１は、ＵＶ照射条件でＭＭＰ−１生合成に４倍近い劇的なアップレギュレーションを引き起こした。
【０３８０】
間質性コラゲナーゼとしても知られるＭＭＰ−１は、ヒト組織においてコラーゲン分解を担う。ここで、ＭＭＰ−１は、病原性関節疾患に重要な役割を果たすだけでなく、転移および腫瘍形成を介して癌にも関与していた（非特許文献５７、非特許文献５８）。加えて、ＭＭＰ−１活性は、創傷治癒の初期段階に重要である（非特許文献５９）。よって、ＭＭＰ−１調節化合物は、特にそれらが上述のように抗炎症活性およびＶＥＧＦ活性を有する場合には新規な創傷ケア療法において有用であり得る。
【０３８１】
ＮＲ１はさらに、新規な生体調節標的を介して関節疾患に対する新規な療法を可能とする。例えば、ＭＭＰ−１発現は、全域的なＭＡＰＫ経路またはＮＦκＢ経路を介して調節される（非特許文献６０）。フラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドはここで、抗炎症活性を有し、ＩＬ−８、ＴＮＦα、およびＰＧＥ−２放出を低減することが開示されるので、ＭＡＰＫおよびＮＦκＢによっても調節される経路。よって、フラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドによるＭＭＰ−１刺激は、関節疾患に対抗するために新規な医薬によって取り組まれ得る別の未知の経路によるものであると推測できる。
【０３８２】
皮膚のしわを減らすための現行の皮膚化粧品の概念は、コラゲナーゼの活性に取り組むものである。コラゲナーゼ阻害に次ぐ、１つの対立概念はその活性を支持することである。この概念では、組織内で固化する不適切に折り畳まれたコラーゲン線維が、コラゲナーゼの作用によって分解される。同時に、皮膚の張りを再構築するために新たなコラーゲンが組織によって合成されなければならない。この概念では、開示されているフラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドは、それらがプロコラーゲンおよびＭＭＰ−１の活性を刺激することが示されているので、理想的な活性を併せ持つ。
【０３８３】
最後に、ＭＭＰ−１をアップレギュレートするフラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドは、デュプュイトラン拘縮のような異常コラーゲン症候群に対抗するための局所治療薬における薬剤として役立つ。
【０３８４】
実施例Ｄ−５：フラボノイド−５−Ｏ−ラムノシドによる転写レギュレーターの調節
線維芽細胞におけるＮＦ−κＢ活性
ＮＩＨ３Ｔ３−ＫＢＦ−Ｌｕｃ細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子を駆動する最小シミアンウイルス４０プロモーターに融合された３コピーのＮＦ−κＢ結合部位（主要組織適合性遺伝子複合体プロモーター由来）を含むＫＢＦ−Ｌｕｃプラスミド（非特許文献６１）で安定トランスフェクトした。細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−ＫＢＦ−Ｌｕｃの場合１×１０4）をアッセイ前日に９６ウェルプレートに播種した。次に、これらの細胞を試験物質で１５分間処理し、その後、３０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで刺激した。６時間後、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２５ｍＭトリスリン酸（ｐＨ７．８）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％トリトンＸ−１００、および７％グリセロールを含有する５０μｌの溶解バッファーに、水平シェーカーにて室温で１５分間溶解させた。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、メディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）の説明書に従い、ＧｌｏＭａｘ  ９６マイクロプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ＲＬＵを計算し、結果をＴＮＦαにより誘導されたＮＦ−κＢ活性（１００％活性化）に対する阻害パーセンテージとして表した（表Ｂ１０．１〜Ｂ１０．３）。実験は試験品の各濃度について３反復のウェルで行った。
【０３８５】
（表２２）
表Ｂ１０．１：ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＦ−κＢ活性に対する５−Ｏ−ラムノシドの影響
2019501662.tif 000071
【０３８６】
（表２３）
表Ｂ１０．２：ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＦ−κＢ活性に対する５−Ｏ−ラムノシドの影響
2019501662.tif 000072
【０３８７】
（表２４）
表Ｂ１０．３：ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＦ−κＢ活性に対する５−Ｏ−ラムノシドの影響
2019501662.tif 000073
【０３８８】
ＮＦ−κＢ活性は多くのフラボノイドによって低減されることが報告されている（非特許文献６２）。クリシンは、ＩκＢαのリン酸化の阻害を介してＮＦ−κＢ活性を阻害することが報告されている（非特許文献６３）。しかしながら、ＮＩＨ３Ｔ３−ＫＢＦ−Ｌｕｃ細胞をＴＮＦαで刺激した場合、ＮＦ−κＢの活性は一般に、それぞれ１０μＭおよび２５μＭのフラボノイドおよびそれらの５−Ｏ−ラムノシドにより共刺激された。
【０３８９】
ＳＴＡＴ３活性
ＨｅＬａ−ＳＴＡＴ３−ｌｕｃ細胞を、プラスミド４ｘＭ６７  ｐＴＡＴＡ  ＴＫ−Ｌｕｃで安定トランスフェクトした。細胞（２０×１０3細胞／ｍｌ）をアッセイの前日に９６ウェルプレートに播種した。次に、これらの細胞を試験物質で１５分間処理し、その後、ＩＦＮ−γ  ２５ＩＵ／ｍｌで刺激した。６時間後、これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２５ｍＭトリスリン酸（ｐＨ７．８）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％トリトンＸ−１００、および７％グリセロールを含有する５０μｌの溶解バッファーに、水平シェーカーにて室温で１５分間溶解させた。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、メディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）の説明書に従い、ＧｌｏＭａｘ  ９６マイクロプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ＲＬＵを計算し、結果をＩＦＮ−γにより誘導されたＳＴＡＴ３活性（１００％活性化）に対する阻害パーセンテージとして表した（表Ｂ１１．１〜Ｂ１１．３）。実験は試験品の各濃度について３反復のウェルで行った。
【０３９０】
（表２５）
表Ｂ１１．１：ＨｅＬａ細胞におけるフラボノイドおよびそれらの５−Ｏ−ラムノシドによるＳＴＡＴ３の活性化
2019501662.tif 000074
【０３９１】
（表２６）
表Ｂ１１．２：ＨｅＬａ細胞におけるフラボノイドおよびそれらの５−Ｏ−ラムノシドによるＳＴＡＴ３の活性化
2019501662.tif 000075
【０３９２】
（表２７）
表Ｂ１１．３：ＨｅＬａ細胞におけるフラボノイドおよびそれらの５−Ｏ−ラムノシドによるＳＴＡＴ３の活性化
2019501662.tif 000076
【０３９３】
ＳＴＡＴ３は、表皮の恒常性に関連する多くの遺伝子の転写因子である。その活性は組織修復および創傷治癒に対して効果を有するだけでなく、毛包再生も阻害している（非特許文献６４）。ＳＴＡＴ３活性は、黒色腫を増進したり、癌および転移に関連する遺伝子の発現を増強したりさえし得る（非特許文献６５）。
【０３９４】
実施例Ｄ−６：フラボノイド５−Ｏ−ラムノシドによる細胞へのグルコース取り込みの変更
ケラチノサイトにおけるグルコース取り込みの測定
ＨａＣａＴ細胞（５×１０4）を９６ウェル黒色プレートに播種し、２４時間インキュベートした。次に、培地を除去し、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中で培養し、５０μＭ  ２−ＮＢＤＧ（２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコースで標識し、試験物質または陽性対照ロシグリタゾンで２４時間処理した。培地を除去し、ウェルをＰＢＳで注意深く洗浄し、ＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）中でインキュベートした。最後に、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  ＦＬＲソフトウエアを用いて蛍光を測定し、イメージングシステムＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＨＤ（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）の総緑色対象積分強度(total green object integrated intensity)（ＧＣＵｘμｍ２ｘＷｅｌｌ）によってデータを解析した。ロシグリタゾンの蛍光を１００％のグルコース取り込みとし、グルコース取り込みを（％グルコース取り込み）＝１００（Ｔ−Ｂ）／（Ｒ−Ｂ）として計算した。なお、式中、Ｔ（処理）は試験物質で処理した細胞の蛍光であり、Ｂ（基底）は２−ＮＢＤＧ細胞の蛍光であり、Ｐ（陽性対照）はロシグリタゾンで処理した細胞の蛍光である。３反復測定の結果を表Ｂ１２．１およびＢ１２．２に示す。
【０３９５】
（表２８）
表Ｂ１２．１：ＨａＣａＴ細胞におけるグルコース取り込みに対するフラボノイド５−Ｏ−ラムノシドの影響
2019501662.tif 000077
【０３９６】
（表２９）
表Ｂ１２．２：ＨａＣａＴ細胞におけるグルコース取り込みに対するフラボノイド５−Ｏ−ラムノシドの影響
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【図１】
2019501662.tif 000082
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019501662.tif 000088
【図８】
2019501662.tif 000089
【図９】
2019501662.tif 000090
【図１０】
2019501662.tif 000091
【図１１】
2019501662.tif 000092
【図１２】
2019501662.tif 000093
【図１３】
2019501662.tif 000094
【図１４】
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【図１５】
2019501662.tif 000096
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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