(57)【要約】  本開示は、Ａベータで特定された立体配座エピトープを含めたＣ末端エピトープ、それに対する抗体ならびに免疫原およびそれに特異的な抗体を作製および使用する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＶＶと最大６個のＡベータの連続する残基とを含むＡベータペプチドと、リンカーとを含み、前記リンカーが、前記ＡベータペプチドのＮ末端残基および前記ＡベータペプチドのＣ末端残基と共有結合している、環状化合物。
【請求項２】
前記ペプチドが、ＧＧＶＶ（配列番号１）、ＧＧＶＶＩ（配列番号８）、ＶＧＧＶＶＩ（配列番号７）、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）、およびＶＧＧＶ（配列番号５）から選択される、請求項１に記載の環状化合物。
【請求項３】
環状ペプチドである、請求項１または２に記載の環状化合物。
【請求項４】
ｉ）対応する直鎖状化合物および／または線維におけるＧおよび／またはＶと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％または少なくとも３０％異なる、環状化合物中のＧおよび／またはＶの曲率；ｉｉ）ＧおよびＶから選択される少なくとも１つの残基であって、前記残基の少なくとも１つの二面角が、対応する直鎖状化合物および／または線維における対応する二面角と比較して少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、または少なくとも１５０度異なる残基；；を含み、ならびに／あるいはｉｉｉ）対応する直鎖状化合物と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％強く拘束された、エントロピーにより測定されたＶの立体配座を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項５】
前記Ａベータペプチドが、ＧＧＶＶＩＡ（配列番号１５）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項６】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項７】
前記リンカーが、任意に１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む、１〜８個のアミノ酸および／またはこれと同等に機能的な分子を含む、あるいはこれよりなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項８】
前記リンカーのアミノ酸がＡおよびＧから選択され、任意に前記官能化可能な部分がＣである、請求項７に記載の環状化合物。
【請求項９】
前記リンカーが、アミノ酸ＧＣＧを含む、またはこれよりなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項１０】
前記リンカーがＰＥＧ分子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項１１】
以下の構造：
【化１】
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から選択される、請求項１に記載の環状化合物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の環状化合物を含む、免疫原。
【請求項１３】
前記化合物が、担体タンパク質または免疫原性増強物質と結合している、請求項１２に記載の免疫原。
【請求項１４】
前記担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、または前記免疫原性増強物質がキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））である、請求項１３に記載の免疫原。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の免疫原を含む、組成物。
【請求項１６】
アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントがリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
任意選択で配列番号１〜１５のいずれか１つで示される配列ＧＧＶＶまたは関連エピトープ配列を有するＡベータペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、対応する直鎖状化合物と比較して、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の環状化合物におけるＡベータ中のエピトープを特異的かつ／または選択的に結合する、請求項１８に記載の抗体
【請求項２０】
前記エピトープが、前記抗体との結合に主として関与するＧＶＶの少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含み、またはこれよりなり、前記少なくとも２個の連続するアミノ酸が、ＧＶＶ、任意にＧＧＶＶ（配列番号１）、もしくはＧＧＶＶＩ（配列番号８）内に組み込まれたＧＶであるか、ＧＧＶ、任意にＧＧＶＶ（配列番号１）  ＧＧＶＶＩ（配列番号８）内に組み込まれたＧＧであるか、または前記少なくとも２個の連続するアミノ酸が、ＧＶＶ、任意にＧＧＶＶ（配列番号１）もしくはＧＧＶＶＩ（配列番号８）内に組み込まれたＶＶである、請求項１８または１９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記Ａベータペプチドおよび／またはエピトープが、ＧＧＶＶ（配列番号１）、ＧＧＶＶＩ（配列番号８）、ＶＧＧＶＶＩ（配列番号７）、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）、およびＶＧＧＶ（配列番号５）を含む、またはこれよりなる、請求項１８、１９、または２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、対応する直鎖状ペプチドよりも、ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む環状化合物に選択的に結合する、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、前記対応する直鎖状ペプチドよりも、前記環状化合物に関して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２４】
Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりもＡベータオリゴマーと選択的に結合する、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体が、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりも、Ａベータオリゴマーに少なくとも２倍、３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
配列ＧＧＶＶまたは関連エピトープを含む直鎖状ペプチドと特異的かつ／または選択的に結合することがなく、任意選択で、前記直鎖状ペプチドの配列が、前記抗体を生じさせるのに使用する環状化合物の直鎖型、任意選択で配列番号２、３、または４で示される配列を有する直鎖状ペプチドである、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２７】
ｉｎ  ｓｉｔｕでＡベータモノマー斑および／またはＡベータ線維斑と結合しない、またはほとんど結合しない、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２８】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２９】
ヒト化抗体である、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３０】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される抗体結合フラグメントである、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３１】
任意選択で融合している軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が、配列：
ＣＤＲ−Ｈ１  ＧＦＴＦＳＮＹＷ（配列番号１７）
ＣＤＲ−Ｈ２  ＩＲＬＫＳＹＮＹＡＴ（配列番号１８）
ＣＤＲ−Ｈ３  ＬＲＷＩＤＹ（配列番号１９）
ＣＤＲ−Ｌ１  ＱＤＩＮＳＹ（配列番号２０）
ＣＤＲ−Ｌ２  ＲＡＮ（配列番号２１）
ＣＤＲ−Ｌ３  ＰＱＹＤＥＦＰＹＴ（配列番号２２）
を含む、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
ｉ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記ＣＤＲの配列が、配列番号１７、１８および１９で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む重鎖可変領域を含む、請求項１８〜３２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３３】
ｉ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％  ７０％の配列同一性を有し、前記ＣＤＲの配列が配列番号２０、２１および２２で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３４】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２３で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは、前記抗体が、配列番号２５で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項１８〜３３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３５】
前記重鎖可変領域が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなり、かつ／または、前記軽鎖可変領域が、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなる、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３６】
ヒトＡベータとの結合に関して、表１３に記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３７】
請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質とを含む、イムノコンジュゲート。
【請求項３８】
前記検出可能な標識が、任意選択でＰＥＴ撮像などの対象の撮像に使用する、陽電子放出放射性核種を含む、請求項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３９】
任意選択で希釈剤とともに、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物もしくは免疫原、請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体、または請求項３７もしくは３８に記載のイムノコンジュゲートを含む、組成物。
【請求項４０】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分、請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体、または請求項３７もしくは３８に記載のタンパク質性イムノコンジュゲートをコードする、核酸分子。
【請求項４１】
請求項４０に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４２】
請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体を発現し、かつ／または請求項４１に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項４３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の免疫原、請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体、請求項３７もしくは３８に記載のイムノコンジュゲート、請求項３９に記載の組成物、請求項４０に記載の核酸分子、請求項４１に記載のベクター、または請求項４２に記載の細胞を含む、キット。
【請求項４４】
請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体を作製する方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物もしくは免疫原または前記化合物もしくは免疫原を含む組成物を対象に投与することと、前記投与した化合物もしくは免疫原および／またはＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的であり、任意選択で、前記Ａベータペプチドを含む直鎖状ペプチドと結合しない、もしくはほとんど結合せず、かつ／または斑と結合しない、もしくはほとんど結合しない、抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することとを含む、方法。
【請求項４５】
生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、前記試料と、請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体または請求項３７もしくは３８に記載のイムノコンジュゲートとを接触させることと、
ｂ．何らかの複合体の存在を検出することと
を含む、方法。
【請求項４６】
前記生体試料がＡベータオリゴマーを含有するかどうかを判定するための請求項４５に記載の方法であって、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、前記試料と、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体または請求項３７もしくは３８に記載のイムノコンジュゲートとを接触させることと
ｂ．何らかの複合体の存在を検出することと
を含み、
検出可能な複合体の存在により、前記試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される、
請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
複合体の量を測定する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料が、脳組織もしくはその抽出物、全血、血漿、血清および／またはＣＳＦを含む、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記試料がヒト由来である、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料を対照、任意選択で以前の試料と比較する、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ＳＰＲによりＡベータのレベルを検出する、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
対象のＡベータのレベルを測定する方法であって、
ＡＤを有するリスクもしくは疑いがある、またはＡＤを有する対象に、請求項３７または３８に記載のイムノコンジュゲートであって、前記抗体が検出可能な標識とコンジュゲートされているイムノコンジュゲートを投与することと；前記標識を検出することと、任意選択で前記標識を定量的に検出することと
を含む、方法。
【請求項５３】
前記標識が陽電子放出放射性核種である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
対象に免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物もしくは化合物の組合せ、任意選択で、ＧＧＶＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を前記対象に投与することと；任意選択で、前記投与した化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することとを含む、方法。
【請求項５５】
Ａベータオリゴマーの伝播を阻害する方法であって、有効量の請求項１９〜３８のいずれか１項に記載のＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な抗体またはイムノコンジュゲートを、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータ凝集および／またはＡベータオリゴマー伝播を阻害することを含む、方法。
【請求項５６】
ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の請求項１９〜３８のいずれか１項に記載の抗体またはイムノコンジュゲート、任意選択で、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／もしくは選択的な抗体または前記抗体を含む医薬組成物を投与すること；２）ＧＧＶＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物または免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物あるいは３）１の抗体または２の免疫原をコードする核酸または核酸を含むベクターを、必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項５７】
本明細書に記載される抗体を用いて、前記治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
２つ以上の抗体または免疫原を投与する、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体、前記イムノコンジュゲート、前記免疫原、前記組成物または前記核酸もしくは前記ベクターを脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物が、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した前記化合物または前記免疫原を含む、医薬組成物である、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
配列番号で１〜１５に示される配列のいずれか１つの配列よりなるＡベータペプチドを含む、単離ペプチド。
【請求項６２】
リンカーを含み、前記リンカーが前記ＡベータペプチドのＮ末端残基および／または前記ＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状ペプチドである、請求項６１に記載の単離ペプチド。
【請求項６３】
検出可能な標識を含む、請求項６１または６２に記載の単離ペプチド。
【請求項６４】
請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の単離ペプチドをコードする、核酸配列。
【請求項６５】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞または細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
これは２０１５年１１月９日に出願された米国特許出願第６２／２５３０４４号、２０１６年６月２０日に出願された米国特許出願第６２／３５２，３４６号、２０１６年７月２２日に出願された米国特許出願第６２／３６５，６３４号および２０１６年９月１２日に出願された米国特許出願第６２／３９３，６１５号の優先権の利益を主張するＰＣＴ出願であり、上記の出願はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（分野）
本開示は、Ｃ末端アミロイドベータ（ＡベータまたはＡβ）エピトープおよびそれに対する抗体、より具体的には、Ａベータオリゴマー内で選択的に接触可能であると予測され、示されている立体配座Ａベータエピトープ、および関連する抗体組成物、ならびにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
３６〜４３アミノ酸のペプチドとして存在するアミロイドベータ（Ａベータ）は、酵素であるβセクレターゼおよびγセクレターゼによってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から放出される産物である。ＡＤ患者では、Ａベータは可溶性モノマー、不溶性線維および可溶性オリゴマーの形で存在し得る。モノマー型のＡベータは、主として不定形のポリペプチド鎖として存在する。線維型のＡベータは、よく株と呼ばれる様々な形態に凝集することができる。これらの構造のうちのいくつかは固体ＮＭＲにより決定されている。
【０００４】
例えば、原子分解三次元構造データの結晶学的データベースであるタンパク質データバンク（ＰＤＢ）では、３回対称性のＡβ構造（ＰＤＢエントリー２Ｍ４Ｊ）、Ａβ−４０モノマーの２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）およびＡβ−４２モノマーの一本鎖平行ｉｎ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）を含めたいくつかの線維の株の構造が入手可能である。
【０００５】
２Ｍ４Ｊの構造はＬｕら［８］に報告されており、２ＭＸＵの構造はＸｉａｏら［９］に報告されている。２ＬＭＮの構造はＰｅｔｋｏｖａら［１０］に報告されている。
【０００６】
Ａベータオリゴマーは、培養した細胞系およびニューロンを死滅させ、スライス培養物および動物生体において記憶を促進し長期増強（ＬＴＰ）と呼ばれる極めて重要なシナプス活性を遮断することが示されている。
【０００７】
これまでにオリゴマーの構造は決定されていない。さらに、ＮＭＲおよびその他の証拠から、オリゴマーが単一の明確に定められた構造ではなく、規則性に乏しく立体配座的に可塑性で順応性のある構造アンサンブルの形で存在することがわかっている。さらに、毒性オリゴマー種の濃度はモノマーまたは線維の濃度よりはるかに低い（推定値には幅があるが、約１０００分の１またはそれ以下である）ため、この標的は捉えどころのないものとなっている。
【０００８】
Ａベータと結合する抗体が記載されている。
【０００９】
表題ＢＩＯＭＡＲＫＥＲＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＤＩＡＧＮＯＳＩＮＧ  ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＭＩＬＤ  ＣＯＧＮＩＴＩＶＥ  ＩＭＰＡＩＲＭＥＮＴの国際特許公開公報第２０１０１２８１３９号は、所定の対象の体液中のｐＧｌｕ  Ａベータを結合できる抗体のレベルの評価を介したアルツハイマー病に関する診断方法を開示している。
【００１０】
米国特許第９，２７３，１２６号（表題ＨＵＭＡＮＩＺＥＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＴＨＥ  ＢＥＴＡ−ＡＭＹＬＯＩＤ  ＰＥＰＴＩＤＥ）は、Ａベータ配列ＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号１３）に対する抗体および診断のための方法を記載している。
【００１１】
表題ＮＯＶＥＬ  ＡＳＳＡＹ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＭＹＬＯＩＤ  ＢＥＴＡ  ＰＥＰＴＩＤＥＳの国際特許公開公報第２０１１０３３０４６号は、Ａベータ（１〜４０）の検出のための方法を開示している。
【００１２】
表題ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦの欧州特許第１７１７２５０号は、抗体ＡベータのＣ末端配列３５−４０  ＭＶＧＧＶＶ（配列番号１４）および３８−４２  ＧＶＶＩＡ（配列番号１５）、ならびにその用途を開示している。この抗体は、チログロブリンに結合したペプチドを使用して作製された。
【００１３】
表題ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  Αβ−ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＩＮ  Ａ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＡＭＰＬＥの国際特許公開公報第２０１４１６１８７５号は、アルツハイマー病の診断のため、Ａベータ変異体を使用してＡベータ特異的抗体を検出するための方法を開示している。
【００１４】
表題ＢＩＯＡＳＳＡＹ  ＦＯＲ  ＰＯＬＹＱ  ＰＲＯＴＥＩＮの国際特許公開公報第２０１００１５５９２号およびＷｅｉｈｏｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．［１２］は、ＧＧＶＶ（配列番号１）のＣ末端のタンパク質のタグを記載している。
【００１５】
Ｐａｇａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．［１１］はまた、Ａベータ１〜４０のレベルの判定のため、Ａベータ４０の遊離Ｃ末端ペプチドＧＧＶＶ（配列番号１）に対するＡベータ１〜４０に特異的なモノクローナル抗体の使用を記載している。
【００１６】
またＧＧＶＶ（配列番号１）は、モノクローナル抗体のパネルを用いたスクリーニングを介して、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの主要なアレルゲンのＮ末端で同定されている［１３］。
【００１７】
Ａベータのモノマーもしくは線維またはモノマーと線維の両方よりもＡベータオリゴマーと優先的または選択的と結合する抗体が望ましい。
【発明の概要】
【００１８】
本明細書には、残基ＧＧＶＶ（配列番号１）を含むおよび／またはこれよりなるＡベータのエピトープ、より具体的には立体配座エピトープまたは関連エピトープならびに前記エピトープに特異的かつ／または選択的と結合する抗体が記載される。エピトープは、オリゴマー種をモノマーおよび／または線維のものから区別する立体配座のＡベータのオリゴマー種において選択的に露出され得る。
【００１９】
一態様は、ＧＶＶと最大６個のＡベータの連続する残基と含むＡベータペプチドと、リンカーとを含む環状化合物であって、リンカーが、ＡベータペプチドのＮ末端残基およびＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状化合物を含む。
【００２０】
一実施形態では、ペプチドは、任意選択でＧＧＶＶ（配列番号１）、ＧＧＶＶＩ（配列番号８）、ＶＧＧＶＶＩ（配列番号７）、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）、およびＶＧＧＶ（配列番号５）から選択される。
【００２１】
別の実施形態では、環状化合物は環状ペプチドである。
【００２２】
別の実施形態では、本明細書に記載される環状化合物は、ｉ）対応する直鎖状化合物および／または線維におけるＧおよび／またはＶと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％または少なくとも３０％異なる、環状化合物中のＧおよび／またはＶの曲率；ｉｉ）ＧおよびＶから選択される少なくとも１つの残基であって、前記残基の少なくとも１つの二面角が、対応する直鎖状化合物および／または線維における対応する二面角と比較して少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、または少なくとも１５０度異なる、残基；を含み、ならびに／あるいはｉｖ）対応する直鎖状化合物と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％強く拘束された、エントロピーによって測定されたＶの立体配座を有する。
【００２３】
別の実施形態では、Ａベータペプチドは、ＧＧＶＶＩＡ（配列番号１５）である。
【００２４】
別の実施形態では、環状化合物は、検出可能な標識をさらに含む。
【００２５】
別の実施形態では、リンカーは、任意選択で１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む、１〜８個のアミノ酸および／またはこれと同等に機能する分子を含む、あるいはこれよりなる。
【００２６】
別の実施形態では、リンカーのアミノ酸がＡおよびＧから選択され、任意選択で官能化可能な部分がＣである。
【００２７】
別の実施形態では、リンカーは、アミノ酸ＧＣＧを含む、またはこれよりなる。別の実施形態では、リンカーはＰＥＧ分子を含む。
【００２８】
別の実施形態では、環状化合物は、以下の構造から選択される。
【化１】
2019505165.tif 000003
【００２９】
一態様は、本明細書に記載される環状化合物を含む、免疫原を含む。
【００３０】
一実施形態では、化合物は、担体タンパク質または免疫原性増強物質と結合している。
【００３１】
一実施形態では、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、または免疫原性増強物質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。
【００３２】
一態様は、本明細書に記載される化合物または本明細書に記載される免疫原を含む、組成物を含む。
【００３３】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００３４】
一実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである。  
【００３５】
一態様は、任意選択で配列番号１〜１５のいずれか１つで示される配列ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープ配列を有するＡベータペプチドに特異的と結合する、単離された抗体を含む。
【００３６】
一実施形態では、抗体は、対応する直鎖状化合物と比較して、本明細書中記載される環状化合物中のＡベータペプチドのエピトープを特異的かつ／または選択的に結合する。
【００３７】
別の実施形態では、エピトープは、抗体との結合に主として関与するＧＶＶの少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含み、またはこれよりなり、少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＧＶＶ、任意にＧＧＶＶ（配列番号１）もしくはＧＧＶＶＩ（配列番号８）内に組み込まれたＧＶであり、または少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＧＧＶ、任意にＧＧＶＶ（配列番号１）、ＧＧＶＶＩ（配列番号８）内に組み込まれたＧＧであり、または少なくとも２つの連続するアミノ酸は、ＧＶＶ、任意にＧＧＶＶ（配列番号１）もしくはＧＧＶＶＩ（配列番号８）内に組み込まれたＶＶである。
【００３８】
別の実施形態では、Ａベータのペプチドおよび／またはエピトープは、ＧＧＶＶ（配列番号１）、ＧＧＶＶＩ（配列番号８）、ＶＧＧＶＶＩ（配列番号７）、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）、およびＶＧＧＶ（配列番号５を含む、またはこれよりなる。
【００３９】
別の実施形態では、抗体は、対応する直鎖状ペプチドよりもＧＧＶＶ（配列番号１）を含む環状化合物に選択的に結合する。
【００４０】
別の実施形態では、抗体は、対応する直鎖状ペプチドよりも、環状化合物に関して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
【００４１】
別の実施形態では、抗体は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりもＡベータオリゴマーを選択的に結合する。
【００４２】
別の実施形態では、抗体は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりも、Ａベータオリゴマーに関して少なくとも２倍、３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
【００４３】
別の実施形態では、抗体は、配列ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープを含む直鎖状ペプチドに特異的かつおよび／または選択的と結合することがなく、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、抗体を生じさせるのに使用する環状化合物の直鎖型、任意選択で配列番号２、３、または４で示される配列を有する直鎖状ペプチドである。
【００４４】
別の実施形態では、抗体は、ｉｎ  ｓｉｔｕでＡベータモノマー斑および／またはＡベータ線維斑と結合しない、またはほとんど結合しない。
【００４５】
別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００４６】
別の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【００４７】
別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される抗体結合フラグメントである。
【００４８】
別の実施形態は、本明細書中記載される抗体は、任意選択で融合している軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は以下の配列を含む：
【表１】
2019505165.tif 000004
【００４９】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲの配列が配列番号１７、１８および１９で示される、アミノ酸配列；またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む重鎖可変領域を含む。
【００５０】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲの配列が配列番号２０、２１および２２で示される、アミノ酸配列；またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【００５１】
別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２３で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコートされ；かつ／あるいは、抗体が、配列番号２５で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなり、かつ／または、軽鎖可変領域が、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなる。
【００５３】
別の実施形態では、抗体は、ヒトＡベータとの結合に関して、表１３に記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する。
【００５４】
一態様は、本明細書に記載される抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質とを含む、イムノコンジュゲートを含む。
【００５５】
一実施形態では、検出可能な標識は、任意選択でＰＥＴ撮像などの対象の撮像に使用する、陽電子放出放射性核種を含む。
【００５６】
一態様は、任意選択で希釈剤とともに、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートを含む組成物を含む。
【００５７】
一態様は、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるタンパク質性イムノコンジュゲートをコードする、核酸分子を含む。
【００５８】
一態様は、本明細書に記載される核酸を含むベクターを含む。
【００５９】
一態様は、本明細書に記載される抗体を発現し、かつ／または本明細書中記載されるベクターを含む細胞を含む。
【００６０】
一態様は、本明細書に記載される化合物、本明細書に記載される免疫原、本明細書に記載される抗体、本明細書に記載されるイムノコンジュゲート、本明細書に記載される組成物、本明細書に記載される核酸分子、本明細書に記載されるベクターまたは本明細書に記載される細胞を含むキットを含む。
【００６１】
一態様は、本明細書に記載される抗体を作製する方法であって、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原または前記化合物もしくは免疫原を含む組成物を対象に投与することと、投与する化合物もしくは免疫原および／またはＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的であり、任意選択で、Ａベータペプチドを含む直鎖状ペプチドと結合しない、もしくはほとんど結合せず、かつ／または斑と結合しない、もしくはほとんど結合しない、抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することとを含む、方法を含む。
【００６２】
一態様は、生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体を形成可能な条件下で、試料と、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含む、方法を含む。
【００６３】
一実施形態では、生体試料がＡベータオリゴマーを含み、上記方法が、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、試料と、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
【００６４】
別の実施形態では、複合体の量を測定する。
【００６５】
別の実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物、全血、血漿、血清および／またはＣＳＦを含む。
【００６６】
別の実施形態では、試料はヒトから得られている。
【００６７】
別の実施形態では、試料を対照、任意選択で以前の試料と比較する。
【００６８】
別の実施形態では、ＳＰＲによりＡベータのレベルを検出する。
【００６９】
一態様は、対象のＡベータのレベルを測定する方法であって、ＡＤを有するリスクもしくは疑いがある、またはＡＤを有する対象に、抗体が検出可能な標識とコンジュゲートされている本明細書中に記載のイムノコンジュゲートを投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む、方法を含む。
【００７０】
一実施形態では、標識は陽電子放出放射性核種である。
【００７１】
一態様は、対象に免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載される化合物もしくは化合物の組合せ、任意選択で、ＧＧＶＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を対象に投与すること；ならびに任意選択で、投与した化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む、方法を含む。
【００７２】
一態様は、Ａベータオリゴマー伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体またはイムノコンジュゲートを、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマー伝播を阻害することを含む、方法を含む。
【００７３】
一態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲート、任意選択で、Ａベータオリゴマーに特異的もしくは選択的な抗体または前記抗体を含む医薬組成物を投与すること；２）ＧＧＶＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物または免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物あるいは３）１の抗体または２の免疫原をコードする核酸または核酸を含むベクターを、必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。
【００７４】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。
【００７５】
別の実施形態では、２つ以上の抗体または免疫原を投与する。
【００７６】
別の実施形態では、抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、組成物または核酸もしくはベクターを脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。
【００７７】
別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した化合物または免疫原を含む、医薬組成物である。
【００７８】
一態様は、配列番号１〜１５で示される配列のいずれか１つの配列よりなるＡベータペプチドを含む、単離ペプチドを含む。
【００７９】
一実施形態では、ペプチドは、リンカーを含み、リンカーがＡベータペプチドのＮ末端残基および／またはＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状ペプチドである。
【００８０】
別の実施形態では、本明細書中記載される単離ペプチドは検出可能な標識を含む。
【００８１】
一態様は、単離ペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００８２】
一態様は、抗体を発現するハイブリドーマを含む。
【００８３】
以下の詳細な説明から本開示のその他の特徴と利点が明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明から本開示の趣旨および範囲内に含まれる様々な変更および改変が当業者に明らかになることから、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示すと同時に、単に説明を目的として記載されるものであることが理解されるべきである。
【００８４】
これより本開示の実施形態を図面と関連させて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】集団座標法（パネルＡ）およびＰｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏ法（パネルＢ）により求めた配列の関数としての露出の可能性を示す図である。
【図２】曲率を残基インデックスの関数として示す図である。環状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の平衡アンサンブルの平均曲率（パネルＢ）が直鎖状ペプチドの曲率（パネルＡ）および線維での様々なモノマーの平均曲率（パネルＣ）とともに示されている。各ペプチドのすべての残基の曲率の値の平均値の収束の確認は、パネルＤからＦに示されている。
【図３】残基３８Ｇの側鎖および主鎖の原子を含む角度Ｏ−Ｃ−Ｃα−Ｈα１（パネルＡ）、Ｏ−Ｃ−Ｃα−Ｈα２（パネルＢ）、およびＯ−Ｃ−Ｃα−Ｎ（パネルＣ）に関する、および４０Ｖの側鎖を含む角度Ｏ−Ｃ−Ｃα−Ｃβ（パネルＤ）に関する二面角分布が示されている。３８Ｇおよび４０Ｖの概略が差し込み図に示されており、二面角が引き継がれている対応する結合は、他の結合よりも濃い色で示されている。重複のパーセンテージの値が表２に提供されている。分布のピークは表３に示されている。
【図４】各残基３７Ｇ（パネルＡ）、３８Ｇ（パネルＢ）、３９Ｖ（パネルＣ）および４０Ｖ（パネルＤ）に関してプロットされた、線維のエントロピーと比較した、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドにおける個々の二面角のエントロピー変化。パネルＥ：個々の残基の側鎖のエントロピー―主鎖のラマチャンドランエントロピーは含まれていない。パネルＦ：個々の残基の側鎖＋主鎖（合計）の立体配座エントロピー。環状ペプチドは、残基３９Ｖおよび４０Ｖに関して直鎖状ペプチドよりも強固である。環状ペプチドにおける少ない側鎖の立体配座エントロピーは、選択性の付与に役立ち得る良好に定義された立体配座の状態を支援する。パネルＧは、直鎖状ペプチドに対する各残基のエントロピーの損失をプロットし、環状アンサンブルに局在化したエントロピーの損失が有意であることを明らかに示すものである。これは、環状ペプチドと一致した立体配座を採用することは、直鎖状ペプチドではまれであることを示す。このような制限されたセットの立体配座にある確率は、おおよそｅｘｐ（−ΔＳ）＝０．００１である。線維の立体配座にある確率は、付随するエントロピーの損失に関するエンタルピーの補完により高められている。
【図５】線維２ＭＸＵ（右のパネル）における残基３８Ｇに関する主鎖のラマチャンドラン角に加えた、ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の環状（左のパネル）および直鎖状（中央のパネル）の形態における、残基３８Ｇに関する平衡主鎖のラマチャンドラン角。ラマチャンドラン角に関する各直鎖状、環状、および線維（２ＭＸＵ）の形態における残基３８Ｇ間の重複する確率が、表４に示されている。対応する分布のピーク角度が表５に示されている。
【図６】残基ＧＧＶＶ（配列番号１）に関する溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）のプロット。環状ペプチドは破線で示されている。直鎖状ペプチドは、濃灰色の実線で示されている。線維の２ＭＸＵは、淡灰色の実線で示されている。
【図７】パネルＡ：環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドの残基３７Ｇ、３８Ｇ、３９Ｖ、および４０Ｖのアライメントされた重量中心の構造が、２つの異なる視点から重複する写真で示されている。環状ペプチドの残基は黒色で示されており、直鎖状ペプチドの残基は白色で示されている。パネルＢ：環状ペプチド構造ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）および直鎖状ペプチド構造ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の２つの図面であり、両方がリコリス状態（ｌｉｃｏｒｉｃｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）で表されており、よって側鎖の配向を観察することができる。パネルＣ：環状ペプチド結合を伴う環状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）、Ｇ残基とＣ残基との間にＰＥＧ２リンカーを伴う環状ペプチドＣ−ＰＥＧ２−ＧＧＶＶＧ（配列番号３）、およびＣ残基とＶ残基との間にＰＥＧ２リンカーを伴う環状ペプチドＣＧＧＧＶＶ−ＰＥＧ２（配列番号４）を含む、エピトープ残基ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドの概略図。
【図８】エピトープＧＧＶＶ（配列番号１）の溶媒接触表面積が、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチド、ならびにＡベータポリペプチド２Ｍ４ＪのＣ末端の一部に関して示されている。
【図９】平均平方二乗誤差（ＲＭＳＤ）によるクラスタリングプロット；軸は、環状ペプチドアンサンブルの重量中心の構造におけるＧＧＶＶ（配列番号１）に対するＧＧＶＶ（配列番号１）のＲＭＳＤ、直鎖状ペプチドアンサンブルの重量中心の構造におけるＧＧＶＶ（配列番号１）に対するＧＧＶＶ（配列番号１）のＲＭＳＤ、およびＰＤＢ  ＩＤ  ２ＭＸＵの線維アンサンブルの重量中心の構造におけるＧＧＶＶ（配列番号１）に対するＧＧＶＶ（配列番号１）のＲＭＳＤに、対応する。各ポイントは、環状ペプチド平衡アンサンブル、直鎖状ペプチドの平衡アンサンブル、またはＰＤＢ  ＩＤ  ２ＭＸＵから開始した線維の平衡アンサンブルから得た所定の立体配座に対応する。３つの異なる視点が、パネルＡ〜Ｃに提示されている。濃灰色の丸で示されている環状ペプチドのアンサンブルは、直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブルと立体配座的に異なっている。パネルＤ〜Ｇは、ペプチドの環状形態、直鎖状形態、および線維形態の分布間での重複の収束の確認を示す。数字での重複パーセンテージが、表６に示されている。特に、環状ペプチドおよび線維ペプチドの２ＭＸＵは、０％の重複を有する。
【図１０】他の線維株の立体配座に関するＲＭＳＤによるクラスタリングプロット；軸は、環状ペプチドアンサンブルの重量中心の構造におけるＧＧＶＶ（配列番号１）に対するＧＧＶＶ（配列番号１）のＲＭＳＤ、直鎖状ペプチドアンサンブルの重量中心の構造におけるＧＧＶＶ（配列番号１）に対するＧＧＶＶ（配列番号１）のＲＭＳＤ、およびＡベータ４０のいくつかの線維モデルに関する平衡アンサンブルの重量中心の構造におけるＧＧＶＶ（配列番号１）に対するＧＧＶＶ（配列番号１）のＲＭＳＤに、対応する。各ポイントは、環状ペプチド、またはＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｍ４Ｊ、２ＬＭＮ、および２ＬＭＰに由来する様々な「株」の線維平衡アンサンブルから得られる所定の立体配座に対応する。
【図１１】パネルＡにおいて環状ペプチドおよび直鎖状ペプチド、ならびにパネルＢにおいてＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーに対する組織培養上清の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）直接結合アッセイを使用した、組織培養上清由来のクローンの一次スクリーニング。ＩｇＧのクローンのみが示されている。
【図１２】ＳＰＲ直接結合アッセイ対ＥＬＩＳＡにおける環状ペプチドとｍＡｂの結合性を比較したプロット。ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡのクローンが示されている。
【図１３】環状ペプチド、直鎖状ペプチド、Ａベータ（Ａβ）モノマー、およびＡベータオリゴマー（ＡβＯ）に対する選択クローンのＳＰＲ直接結合アッセイ
【図１４】６Ｅ１０陽性対照抗体（Ａ）およびシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）（Ｂ）に対して生じさせた抗体を用いた死体ＡＤ脳の斑の免疫組織化学染色を示す図である。
【図１５】選択し精製した抗体に関するＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いた二次スクリーニングを示す図である。ＡＤ患者からプールした可溶性脳抽出物（ＢＨ）の捕捉抗体に対するＳＰＲ結合応答から、非ＡＤ対照からプールした脳抽出物の捕捉抗体に対する結合応答を差し引いたもの。
【図１６】Ａベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、環状ペプチドに対して生じさせた選択した抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。
【図１７】ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドを用いて生じさせた代表的な抗体の存在下（星）または不在下（四角）におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＡベータ凝集伝播のプロットである。
【図１８−１】異なるモル比のアイソタイプの陰性対照（Ａ）またはシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体（Ｂ）の存在下または非存在下における、Ａベータオリゴマー（ＡβＯ）に曝露させたラットの初代の皮質ニューロンの生存率を示すプロットである。
【図１８−２】異なるモル比のアイソタイプの陰性対照（Ａ）またはシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体（Ｂ）の存在下または非存在下における、Ａベータオリゴマー（ＡβＯ）に曝露させたラットの初代の皮質ニューロンの生存率を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
表１は、直鎖状、環状、および線維の２ＭＸＵの形態における、３７Ｇ、３８Ｇ、３９Ｖ、および４０Ｖの残基による曲率の値を示す。
【００８７】
表２は、図３に提示されている二面角の分布の重複のパーセンテージを示す。
【００８８】
表３に、環状ペプチドと他の種との間に分布の有意な差がみられる二面角の二面角分布のピーク値を示す。列１は、検討した具体的な二面角であり、列２は、直鎖状ペプチドＣＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列３は、環状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列４は、線維構造２ＭＸＵにおけるペプチドＧＧＶＶ（配列番号１）の二面角分布のピーク値であり、列５は、直鎖状ペプチドと環状ペプチドの二面角分布のピーク値の差である。
【００８９】
表４に、図５に提示されている残基３８Ｇのラマチャンドラン角の重複確率を示す。  
【００９０】
表５に、ラマチャンドラン主鎖ファイ／プサイ角分布のピーク値を示す。第１の列は、検討した残基であり、丸括弧で示されている２つの角度ファイおよびプサイを提示している。第２の列は、直鎖状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）における残基３８Ｇのラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値を示し、第３の列は、環状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）における残基３８Ｇのラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値を示し、最後の列は、線維構造２ＭＸＵにおける３８Ｇのラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値を示す。図５を参照されたい。
【００９１】
表６に、図９に提示されている、直鎖状、環状、および線維（２ＭＸＵ）のペプチド形態の間のＲＭＳＤクラスタリングの重複のパーセンテージを示す。
【００９２】
表７に、環状、直鎖状、および線維のアンサンブルの重心立体配座における残基Ｇ３７、Ｇ３８、Ｖ３９、およびＶ４０に関する主鎖および側鎖の二面角の値を提供する。同様に、環状および直鎖状の重量中心構造の間、ならびに環状および直鎖状の重量中心構造の間における、二面角の差異をも提供する。
【００９３】
表８に、選択した抗体の結合特性を示す。
【００９４】
表９に、選択した抗体の結合特性のまとめを示す。
【００９５】
表１０に、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体のオリゴマー結合−モノマー結合を記載する。
【００９６】
表１１に、ホルマリン固定組織で試験した抗体の特性を記載する。
【００９７】
表１２は例示的毒性試験である。
【００９８】
表１３にＣＤＲ配列を記載する。
【００９９】
表１４に重鎖および軽鎖の可変配列を記載する。
【０１００】
表１５は、Ａベータ「エピトープ」配列およびリンカーを有する選択Ａベータ配列の表である。
【０１０１】
表１６にＡベータ１〜４２のアミノ酸配列を記載する。
【０１０２】
（本開示の詳細な説明）
本明細書には、アルツハイマー病に関連するオリゴマー種を含めたＡベータの毒性オリゴマー種内で優先的に接触可能なエピトープを標的とし得る抗体、免疫療法組成物および方法が提供される。Ａベータのオリゴマー種内での抗体結合に特異的かつ／または選択的に接触可能であり得るＡベータの領域が特定された。
【０１０３】
本明細書で示されるように、モノマーおよび／または線維上に存在しない、またはわずかに存在するＡベータペプチド上の標的を特定することにより、オリゴマー特異的抗体の作製を達成した。オリゴマー特異的エピトープは、モノマーまたは線維の対応するセグメントと一次配列が異なっている必要はないが、オリゴマーにおいて立体配座的に際立ったものであり得る。つまり、これらは、オリゴマー内で、主鎖および／または側鎖の立体配座の点でモノマーおよび／または線維にはみられない（または好ましくない）と考えられる際立った立体配座を示す。
【０１０４】
直鎖状ペプチド領域に対して生じさせた抗体は、オリゴマーに選択的でないものであり得、したがって、モノマー斑またはＡベータ斑にも結合し得る。
【０１０５】
本明細書に記載されるように、オリゴマー型のＡベータに選択的になり得る抗体を開発するため、本発明者らは、線維において破壊されやすく、オリゴマーの表面に露出し得るＡベータ配列の領域を特定することを目指した。
【０１０６】
実施例に記載されるように、本発明者らは、線維において破壊されやすいことが明らかになった領域を特定した。本発明者らは、その特定された標的を含む環状化合物が直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブルに対して別の立体配座の基準、例えば、より高い曲率、より大きい露出表面積、別の二面角分布および／または平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によるアライメントが容易ではないことなどを満たすようこれを設計した。
【０１０７】
標的領域を含む環状ペプチドを用いて、同じ配列の直鎖状ペプチド（例えば、対応する直鎖状配列）と比較して環状ペプチドと優先的と結合する抗体を生じさせることができた。実験結果が記載されており、合成モノマーと比較して合成オリゴマーと選択的と結合し、対照ＣＳＦよりもＡＤ患者のＣＳＦと優先的と結合し、かつ／または対照の可溶性脳抽出物よりもＡＤ患者の可溶性脳抽出物と優先的と結合する、エピトープ特異的かつ立体配座選択的な抗体が特定される。さらに、ＡＤ脳組織の染色では、斑との結合を全くまたはほとんど示さない抗体が特定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、抗体がＡβオリゴマーの伝播および凝集を阻害することがわかった。
【０１０８】
Ｉ．定義
本明細書で使用される「Ａベータ（Ａ−ｂｅｔａ）」という用語は、代替的に「アミロイドベータ」、「アミロイドβ」、Ａベータ（Ａｂｅｔａ）、Ａベータ（Ａ−ｂｅｔａ）または「Ａβ」と呼ばれ得る。本明細書中で使用されるアミロイドベータは、３６〜４３個のアミノ酸よりなるペプチドであり、あらゆる種のあらゆる野生型および変異型、特にヒトＡベータを包含する。Ａベータ４０は４０アミノ酸型を指し、Ａベータ４２は４２アミノ酸型を指すなど。ヒト野生型Ａベータ４２のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
【０１０９】
本明細書で使用される「Ａベータモノマー」という用語は、Ａベータ（例えば、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜４３）ペプチドの個々のサブユニット型を指す。
【０１１０】
本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、本明細書では、複数（例えば、少なくとも２つ）のＡベータモノマーが非共有結合によって、約１００個未満またはより通常には約５０個未満のモノマーからなり、立体配座に柔軟性があり、部分的に規則的である三次元の小球に凝集したＡベータサブユニットのいずれか複数のものを指す。例えば、オリゴマーは、３個、４個、５個またはそれ以上のモノマーを含み得る。本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、合成Ａベータオリゴマーおよび／または天然Ａベータオリゴマーの両方を包含する。「天然Ａベータオリゴマー」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばＡＤを有する対象の脳およびＣＳＦ内で形成されるＡベータオリゴマーを指す。
【０１１１】
本明細書で使用される「Ａベータ線維」という用語は、電子顕微鏡下で線維構造を示す個々のＡベータペプチドが非共有結合により会合した集合体を含む分子構造を指す。線維構造は通常、「クロスベータ」構造であり、理論上、多量体の大きさに上限はなく、線維は数千個または何千個ものモノマーを含み得る。線維は数千個単位で凝集し、ＡＤに特徴的な主な病理学的形態の１つである老人斑を形成し得る。
【０１１２】
「ＧＧＶＶ」という用語は、配列番号１で示されるグリシン、グリシン、バリン、およびバリンというアミノ酸配列を意味する。これと同様に、ＧＶＶ、ＧＧＶ、ＶＧＧＶ（配列番号５）、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）、ＶＧＧＶＶＩ（配列番号７）およびＧＧＶＶＩ（配列番号８）は、１文字アミノ酸コードによって識別されるアミノ酸配列を指す。文脈によっては、アミノ酸配列と記載される場合、それはＡベータまたは単離ペプチド内の配列、例えば環状化合物のアミノ酸配列などを指すことがある。
【０１１３】
本明細書で使用される「モノマーおよび／または線維内でアミノ酸残基Ｇ３７、Ｇ３８、Ｖ３９、および／またはＶ４０によって占められるものとは別の立体配座」という用語は、例えばＰＤＢ  ２ＭＸＵならびに図１〜１１および／または表に示される、Ａベータモノマー構造および／またはＡベータ線維構造の３７Ｇ、３８Ｇ、３９Ｖ、および／または４０Ｖの特性と比較して、溶媒露出度、電荷、エントロピー、曲率（例えば、実施例に記載される環状ペプチドで測定したペプチドＧＧＶＶ（配列番号１）の場合の曲率）、ＲＭＳＤ構造アライメントおよび１つもしくは複数の主鎖二面角または側鎖二面角の二面角から選択される１つまたは複数の立体配座特性が異なることを意味する。さらに、本明細書で使用される「直鎖状ペプチド内でＧ３７、Ｇ３８、Ｖ３９、および／またはＶ４０によって占められるものとは別の立体配座」という用語は、対応する直鎖状AベータペプチドまたはＧＧＶＶ（配列番号１）の３７Ｇ、３８Ｇ、３９Ｖ、および／または４０Ｖの特性と比較して、溶媒露出度、電荷、エントロピー、曲率（例えば、実施例に記載される環状ペプチドで測定したペプチドＧＧＶＶ（配列番号１）の場合の曲率）、ＲＭＳＤ構造アライメントおよび１つもしくは複数の主鎖二面角または側鎖二面角の二面角から選択される１つまたは複数の立体配座特性が異なることを意味する。例えば、図２および表１は、環状ペプチドアンサンブルのＧＧＶＶ（配列番号１）のＶ３９およびＶ４０の曲率が、線維立体配座のＧＧＶＶ（配列番号１）の曲率より有意に大きいことを示している。同様に、直鎖状ペプチドアンサンブルの対応する残基の曲率は、線維アンサンブルの曲率よりも大きい。さらに、環状ペプチドアンサンブルにおける曲率は、残基３９に関して、直鎖状ペプチドアンサンブルよりも大きく、直鎖状アンサンブルにおけるＶ４０の曲率は、環状ペプチドアンサンブルの曲率よりも大きい。環状アンサンブルにおけるＧ３７およびＧ３８の曲率は、同様に直鎖状ペプチドの曲率よりも小さく、線維における曲率と比較可能である。直鎖状または線維のアンサンブルとは異なる環状ペプチドアンサンブルのエピトープの曲率プロファイルは、立体配座の選択性が、特に直鎖状ペプチドまたは線維とは異なる環状ペプチドの曲率を呈する、Ｖ３９およびＶ４０により提供され得ることを暗示している。図３のパネルＡは、環状ペプチドアンサンブルにおけるＧ３８の角度（Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＨＡ１）の二面角分布が、直鎖状ペプチドおよび線維の対応する分布と最小限に重複しており、環状ペプチドの分布と直鎖状ペプチドおよび線維の分布の重複が、それぞれ４．４％および２．６％であることを示している。他の二面角の分布はより重複しているが、個々の二面角分布のさらに小さな差異は、全体的に異なる抗原プロファイルを提供するように関連し得る。これは、後述されるアライメントされた立体配座のクラスター解析を使用してより明確に説明されている。図４Ｇは、環状ペプチドが直鎖状ペプチドよりも拘束されているが、線維よりは拘束されていないことを示している。図４Ｆは、Ｖ３９およびＶ４０が、環状ペプチドアンサンブルでより拘束されており、その後これらがモノマーにあり、このことにより直鎖状モノマーが、きわめてまれに環状ペプチドと一致する立体配座になることを示している。図５は、環状ペプチドの主鎖Ｇ３８のラマチャンドラン二面角分布が、モノマーでの分布とは実質的に異なり、線維での分布とはより類似していることを例示している。図６は、残基ＧＧＶＶ（配列番号１）が、特にＶ３９およびＶ４０に関して、線維と比較して溶媒接触表面積ＳＡＳＡが増大したことを示している。図７は、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドの代表的な（重心）構造が、異なっていることを示している。図８は、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドの代表的な（重心）構造の表面積のプロファイルが異なっていることを示している。同様に、電荷を含むＡベータ４０の表面積のプロファイルが、環状のＧＧＶＶ（配列番号１）の表面積プロファイルと異なっており：Ｖ４０はＡベータ４０で正の電荷を有する。図９は、ＧＧＶＶ（配列番号１）の環状ペプチドでの平衡構造が、直鎖状ペプチドおよび線維２ＭＸＵにおける対応する配列の平衡構造とは明確に異なるようにクラスター化しており、直鎖状アンサンブルおよび線維アンサンブルには明確な区別がないことを示している。図１０は、このことが他の線維株に関してでも真であることを示している。
【０１１４】
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および修飾されたＬ−アミノ酸をすべて包含する。たとえば、アミノ酸の原子は様々な同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素に代わるジュウテリウム、窒素１４に代わる窒素１５および炭素１２に代わる炭素１３ならびにその他の同様の変化を含み得る。
【０１１５】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体ならびに例えば一本鎖Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメントまたは一本鎖Ｆｖフラグメントを含めた上記の抗体のフラグメントを包含するものとする。抗体は、組換え供給源由来のものおよび／またはウサギ、ラマ、サメなどの動物で産生されたものであり得る。また、トランスジェニック動物で産生され得る、もしくは生化学技術を用いて作製され得る、またはファージライブラリーなどのライブラリーから単離され得るヒト抗体も包含される。ヒト化抗体またはその他のキメラ抗体は、１種類または２種類以上のアイソタイプもしくはクラスまたは種由来の配列を含み得る。
【０１１６】
「単離された抗体」という語句は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生され、抗体を産生した供給源、例えば、動物、ハイブリドーマまたはその他の細胞系（抗体を産生する組換え昆虫、酵母または細菌細胞など）から取り出された抗体を指す。単離された抗体は任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度であることを意味する。
【０１１７】
本明細書で使用される「結合フラグメント」という用語は、抗体または抗体鎖の一部または一部分であって、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含み、抗原と結合する、またはインタクトの抗体と競合するものを指す。例示的結合フラグメントとしては、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体が挙げられる。フラグメントは、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖の化学処理または酵素処理によって得ることができる。フラグメントは、組換え手段によっても得ることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド架橋を還元する処理を実施して、Ｆａｂ’フラグメントを作製することができる。パパイン消化によりＦａｂフラグメントの形成を引き起こすことができる。また、組換え発現技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントならびにその他のフラグメントを構築することもできる。
【０１１８】
当該技術分野で認識されている「ＩＭＧＴ番号付け」または「ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース番号付け」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基より可変性のある（すなわち、超可変性の）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指す。
【０１１９】
ある抗体がＧＧＶＶ（配列番号１）などのエピトープに特異的と結合すると記載される場合、それは、その抗体が特定の残基またはその一部、例えばＨＤＳＧの少なくとも２つの残基を含むペプチドに最小限の親和性で特異的と結合し、例えばアイソタイプ対照抗体より大きい無関係な配列にも無関係な配列の空間定位にも結合しないことを意味する。このような抗体は必ずしもＧＧＶＶ（配列番号１）の各残基と接触するわけではなく、前記エピトープ内のあらゆるアミノ酸置換またはアミノ酸欠失が、必ずしも結合親和性に大きな影響を及ぼし、かつ／または同程度の影響を及ぼすというわけではない。
【０１２０】
ある抗体がエピトープ、例えばＧＧＶＶ（配列番号１）などの立体配座エピトープなどに選択的と結合すると記載される場合、それは、その抗体が特定の残基またはその一部を含む１つまたは複数の特定の立体配座に、別の立体配座の前記残基と結合する場合より大きい親和性で優先的と結合することを意味する。例えば、ある抗体が対応する直鎖状ペプチドよりもＧＧＶＶまたは関連エピトープを含むシクロペプチドに選択的と結合すると記載される場合、その抗体は、直鎖状ペプチドと結合する場合の少なくとも２倍の親和性でそのシクロペプチドと結合する。
【０１２１】
本明細書で使用される「立体配座エピトープ」という用語は、アミノ酸配列が特定の三次元構造を有し、対応する直鎖状ペプチド中に存在しない、または存在する可能性が低い三次元構造の少なくとも一面がコグネイト抗体によって特異的かつ／または選択的に認識される、エピトープを指す。立体配座特異的エピトープと特異的かつ／または選択的に結合する抗体は、その立体配座特異的／選択的エピトープの１つまたは複数のアミノ酸の空間的配置を認識する。例えば、ＧＧＶＶ（配列番号１）立体配座エピトープは、抗体によって特異的かつ／または選択的に、例えば直鎖状ＧＧＶＶ（配列番号１）と比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍もしくは１０００倍またはそれ以上選択的に認識される、ＧＧＶＶ（配列番号１）のエピトープを指す。
【０１２２】
本明細書で使用される「関連エピトープ」という用語は、抗原性であるＧＧＶＶ（配列番号１）の少なくとも２つの残基および／またはＡベータのＧＧＶＶ（配列番号１）の少なくとも２つの残基のＮ末端側もしくはＣ末端側のいずれかに１つもしくは２つのアミノ酸残基を含む配列を意味する。例えば、本明細書では、ＧＧＶＶ（配列番号１）、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）およびＧＧＶＶＩ（配列番号８）がＡベータ線維において不規則になりやすい領域として特定されたことが示される。したがって、ＧＧＶＶ（配列番号１）、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）およびＧＧＶＶＩ（配列番号８）は関連エピトープである。例示的関連エピトープとしては、配列が表１５に示されているエピトープが挙げられる。関連エピトープの配列は、「関連エピトープ配列」を意味する。
【０１２３】
本明細書でアミノ酸配列内のアミノ酸もしくはその側鎖（例えば、ＧＧＶＶ（配列番号１）のＧ３７またはＧ３８またはＶ３９またはＶ４０）またはより大きいポリペプチド内のアミノ酸配列に関して使用される「拘束された立体配座」という用語は、アミノ酸二面角の回転運動性が（たとえば直鎖状化合物である）対応する直鎖状ペプチド配列またはより大きいポリペプチドの配列よりも低下し、それにより、許容される立体配座の数が少なくなっていることを意味する。このことは、例えば、主鎖および側鎖の二面角自由度のアンサンブルのエントロピー減少を見出すことによって定量化することが可能であり、直鎖状アンサンブルと比較した、環状アンサンブルおよび線維アンサンブルにおけるエントロピーの減少に関して、各アミノ酸については図４Ｇにプロットされている。直鎖状および環状のペプチドアンサンブルの、線維アンサンブルからのエントロピーの増加は、各アミノ酸の個々の二面角に関して、図４〜Ｄにプロットされている。例えば、配列内の側鎖の立体配座自由度が直鎖状ペプチドより低ければ、エントロピーが減少することになる。このような立体配座の制約があれば、この抗原に対して特異的に生じた抗体の立体配座選択性が増大するものと思われる。
【０１２４】
本明細書で使用される「より拘束された立体配座」という用語は、１つまたは複数の二面角の二面角分布（許容される二面角のアンサンブル）が、例えば、アミノ酸、例えばＧおよび／またはＶのエントロピーによる判定（例えば、立体配座の拘束が強いほどエントロピーが低くなる）で、比較立体配座より少なくとも１０％強く拘束されていることを意味する。具体的には、全体的により拘束された環状立体配座アンサンブルにおけるＧＧＶＶ（配列番号１）の、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの平均エントロピーに対する平均エントロピー変化により測定されるエントロピーのパーセント減少、［（ΔＳ（ｃｙｃｌｉｃ）−ΔＳ（ｌｉｎｅａｒ））／（０．５＊（ΔＳ（ｃｙｃｌｉｃ）＋ΔＳ（ｌｉｎｅａｒ））］，は、拘束されていない立体配座のアンサンブルよりも、平均で、１０％超減少し、または２０％超減少し、または３０％超減少し、または４０％超減少している。上記の式のエントロピーΔＳは、線維と比較したエントロピーとして得られている。たとえばΔＳ（ｃｙｃｌｉｃ）＝Ｓ（ｃｙｃｌｉｃ）−Ｓ（ｆｉｂｒｉｌ）。例として、図４Ｆにプロットされたデータによる、エントロピーのパーセント減少は、Ｖ３９では６７％であり、Ｖ４０では３１％である。またＧ３８は、１３％のエントロピーの損失を示す。しかしながらＧ３７は、実際に、環状立体配座において６１％のエントロピー増加を示す。（線維エントロピーと比較した）環状ペプチドに対する直鎖状の総エントロピー減少は、（ΔＳ（ｃｙｃｌｉｃ）−ΔＳ（ｌｉｎｅａｒ））／（０．５＊（ΔＳ（ｃｙｃｌｉｃ）＋ΔＳ（ｌｉｎｅａｒ）））＝−２７％、すなわち２７％のエントロピー減少である。
【０１２５】
本明細書で抗体に関して使用される「斑との結合が全くまたはほとんどみられない」または「斑と結合しない、またはほとんど結合しない」という用語は、抗体が（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕの）免疫組織化学法で典型的な斑の染色形態を示さず、染色のレベルが、ＩｇＧ陰性の（例えば、無関係な）アイソタイプ対照でみられるレベルと同等である、またはその２倍以下であることを意味する。
【０１２６】
「単離ペプチド」という用語は、例えば組換え技術または合成技術によって作製され、ペプチドを作製した組換え細胞または残存ペプチド合成反応物などの供給源から取り出されたペプチドを指す。単離ペプチドは、任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度および任意選択で医薬品等級の純度であることを意味する。
【０１２７】
本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、本明細書に記載されるペプチドまたは化合物内に付加または導入することができるペプチド配列（ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグまたはＮＥタグなど）、蛍光タンパク質などの部分であって、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することが可能な部分を指す。例えば、標識は、（例えば、ＰＥＴ撮像に使用する）放射線不透性の陽電子放出放射性核種もしくは放射性同位元素、例えば３Ｈ、１３Ｎ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど；蛍光化合物（フルオロフォア）もしくは化学発光化合物（発色団）、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミンもしくはルシフェリンなど；酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなど；造影剤；または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば二次抗体を用いて間接的に検出可能なものであり得る。
【０１２８】
通常使用される「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に認識される抗原の抗体結合部位、通常、ポリペプチドセグメントを意味する。本明細書で使用される「エピトープ」はまた、エピトープ配列を含むペプチドを使用して抗体を生じさせることができる、記載される集団座標法を用いてＡベータ上で特定され得るアミノ酸配列またはその一部を指すこともある。例えば、特定された標的領域ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む環状化合物に対応する単離ペプチドに対して作製した抗体は、前記「エピトープ」配列の一部または全部を認識する。エピトープが抗体による結合に接触可能な場合、それは本明細書において「接触可能な」ものである。
【０１２９】
本明細書で使用される「より高い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚより強く（Ｋｏｎ）かつ／または小さい解離定数（Ｋｏｆｆ）で標的Ｙと結合する場合の相対的抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより高い親和性を有する。これと同様に、本明細書の「より低い親和性」は、抗体Ｘが標的Ｚより弱くかつ／または大きい解離定数で標的Ｙと結合する場合の相対的抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより低い親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性はＫＡ＝１／ＫＤで表すことができ、式中、ＫＤ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆである。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの値は、表面プラズモン共鳴技術を用いて、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ−１）（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて測定することができる。環状化合物、例えば任意選択の環状ペプチド中に提示される立体配座に選択的な抗体は、環状化合物（例えば、環状ペプチド）に対する親和性が直鎖状形態の対応する配列（例えば、非環化配列）より大きい。
【０１３０】
同じく本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、抗体の産生を誘発し、免疫原の免疫原性部分に対するＴ細胞およびその他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
【０１３１】
環状化合物に関する「対応する直鎖状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列もしくは化学的部分を含む、またはこれよりなるが、直鎖状（すなわち、非環状）形態であり、例えば溶液中でみられ得る直鎖状ペプチドの特性を有する、化合物、任意選択でペプチドを指す。例えば、対応する直鎖状化合物は、環化されていない合成ペプチドであり得る。
【０１３２】
ある抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」は、その抗体がエピトープ配列を認識し、最小限の親和性でその標的抗原と結合することを意味する。例えば、多価抗体は、その標的と少なくとも１ｅ−６、少なくとも１ｅ−７、少なくとも１ｅ−８、少なくとも１ｅ−９または少なくとも１ｅ−１０のＫＤで結合する。少なくとも１ｅ−８より高い親和性が好ましいものであり得る。可変ドメインを１つ含むＦａｂフラグメントなどの抗原結合フラグメントは、非フラグメント化抗体との多価相互作用の１０倍または１００倍低い親和性でその標的と結合する。
【０１３３】
ある形態のＡベータ（例えば、線維、モノマーまたはオリゴマー）または環状化合物と選択的に結合する抗体に関して本明細書で使用される「選択的に結合する」という用語は、その抗体が上記の形態と少なくとも２倍、少なくとも３倍または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍もしくは少なくとも１０００倍またはそれ以上の親和性で結合することを意味する。したがって、特定の立体配座（例えば、オリゴマー）に対してより選択的な抗体は、別の形態のペプチドおよび／または直鎖状ペプチドの少なくとも２倍などの親和性で特定の形態のＡベータと優先的に結合する。
【０１３４】
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、ＧＧＶＶ（配列番号１）エピトープペプチドを含むペプチドと共有結合して、任意選択でＧＧＶＶ（配列番号１）ペプチドのＮ末端およびＣ末端と結合して、環状化合物を生じさせることができる化学的部分を指す。リンカーは、スペーサーおよび／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含み得る。リンカーは、官能化可能な部分を介して担体タンパク質またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原強化物質と結合することができる。
【０１３５】
本明細書で使用される「スペーサー」という用語は、ペプチドのＮ末端およびＣ末端と直接的または間接的に共有結合して、長さがペプチド自体より長い環状化合物を生じさせることができる、好ましくは非免疫原性または低免疫原性の任意の化学的部分を意味し、例えば、スペーサーは、ＧＧＶＶ（配列番号１）よりなるペプチドのＮ末端およびＣ末端と結合して、主鎖の長さがＧＧＶＶ（配列番号１）配列自体より長い環状化合物を生じさせることができる。つまり、（例えば、３アミノ酸残基の）スペーサーを有するペプチドが環化されると、スペーサーのないペプチドより大きい閉環が生じる。スペーサーとしては、特に限定されないが、Ｇリピート、ＡリピートまたはＰＥＧリピートなどの部分、例えばＡベータ（Ａ−ｂｅａｔ）ペプチドと組み合わせる場合、配列は、ＧＧＧＶＶＧ（配列番号９）ＧＧＶＶＧ（配列番号１０）、ＧＧＧＶＶ（配列番号１１）などが挙げられる。スペーサーは、１つもしくは複数のシステイン（Ｃ）残基などの１つもしくは複数の官能化部分を含む、またはこれと結合しているものであり得、官能化部分はスペーサー内に散在している、またはスペーサーの一端または両端と共有結合しているものであり得る。Ｃ残基などの官能化可能な部分がスペーサーの１つまたは複数の末端と共有結合している場合、スペーサーはペプチドと間接的に共有結合している。スペーサーはまた、ビオチン分子がアミノ酸残基内に導入されている場合のように、スペーサー残基内に官能化可能な部分を含み得る。
【０１３６】
本明細書で使用される「官能化可能な部分」という用語は、「官能基」を有する化学物質を指し、本明細書で使用される「官能基」は、別の原子団または単一原子（いわゆる「相補性官能基」）と反応して、２つの原子団または原子の間で化学的相互作用を形成する、原子団または単一原子を指す。システインの場合、官能基は、反応してジスルフィド結合を形成することができる−ＳＨであり得る。したがって、リンカーは、例えばＣＣＣであり得る。別の原子団との反応は、共有結合または例えば、Ｋｄが約１ｅ−１４になり得るビオチン−ストレプトアビジン結合としての場合のような強い非共有結合であり得る。本明細書で使用される強い非共有結合は、Ｋｄが少なくとも１ｅ−９、少なくとも１ｅ−１０、少なくとも１ｅ−１１、少なくとも１ｅ−１２、少なくとも１ｅ−１３または少なくとも１ｅ−１４の相互作用を意味する。
【０１３７】
タンパク質および／またはその他の物質を免疫原性に役立つ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のプローブとして作用するよう環状化合物に機能化（例えば、結合）させ得る。この目的には、反応すること（例えば、共有結合または共有結合ではない強い結合を形成すること）が可能な任意の官能化可能な部分を使用し得る。ある特定の実施形態では、官能化可能な部分は、目的のタンパク質上にある対形成していないシステインと反応してジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり、目的のタンパク質は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫ブロットもしくは免疫組織化学アッセイに使用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質であり得る。
【０１３８】
本明細書で使用される「〜と反応する」という用語は一般に、電子の流れまたは静電荷の移動が起こることにより化学的相互作用が形成されることを意味する。
【０１３９】
本明細書で使用される「動物」または「対象」という用語は、任意選択でヒトを含む、または含まない哺乳動物を含めた動物界のあらゆるメンバーを包含する。
【０１４０】
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質の所望の特性を打ち消すことなく、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換わるアミノ酸置換のことである。適切な保存的アミノ酸置換は、疎水性、極性およびＲ鎖長が互いに類似したアミノ酸同士を置き換えることにより実施することができる。保存的アミノ酸置換の例としては以下のものが挙げられる。
【０１４１】
【表２】
2019505165.tif 000005
【０１４２】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、配列を最適な比較目的で整列させる（例えば、第二のアミノ酸配列または核酸配列との最適アライメントのために第一のアミノ酸配列または核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列内のある位置が第二の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子は上記の位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、その配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重複位置の数／一の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて実施することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例には、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５８７７で改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムがある。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムにはそのようなアルゴリズムが組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを例えばスコア＝１００、ワード長＝１２に設定してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施し、本願の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを例えばスコア−５０、ワード長＝３に設定してＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されているＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（同文献）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータを用いることができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照されたい）。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例には、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムがある。ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いることができる。ギャップを許容するかしないかを問わず、上記のものと類似した技術を用いて２つの配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性を算出する際には通常、完全一致のみをカウントする。
【０１４３】
抗体に関しては、抗体配列をＩＭＧＴまたはその他のもの（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けの慣例）により最大限に整列させたとき、パーセンテージ配列同一性を決定することができる。アライメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較している場合、対象抗体領域と参照抗体領域の間のパーセンテージ配列同一性は、ギャップをカウントせず、対象抗体領域および参照抗体領域の両方で同じアミノ酸によって占められている位置の数を、整列させた２つの領域の位置の総数で除したものに１００を乗じてパーセンテージに変換したものとする。
【０１４４】
本明細書で使用される「核酸配列」は、天然の塩基、糖および糖間（主鎖）結合よりなるヌクレオシドモノマーまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、非天然のモノマーまたはその一部分を含む修飾または置換された配列を包含する。本願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含めた天然の塩基を包含し得る。配列はまた、修飾塩基を含み得る。このような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、ミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は二本鎖または一本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補的核酸配列およびコドン最適化等価物または同義コドン等価物を包含する。本明細書で使用される「単離核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術により作製された場合は実質的に細胞物質も培地も含まない核酸、あるいは化学的に合成された場合は化学的前駆体またはその他の化学物質を指す。単離核酸はまた、その核酸が由来する核酸に天然の状態で隣接する配列（すなわち、核酸の５’側および３’側に位置する配列）を実質的に含まない。
【０１４５】
「作動可能に連結されている」は、核酸の発現が可能なようにその核酸が制御配列を連結されていることを意味するものとする。適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。適切な制御配列の選択は、選択する宿主細胞によって決まり、当業者により容易に達成され得る。このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。
【０１４６】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、核酸分子を例えば、原核細胞および／または真核細胞内に導入し、かつ／あるいはゲノム内に組み込むことを可能にする前記核酸分子の任意の中間運搬体を含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルス系ベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどがこれに包含される。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は一般に、通常は環状ＤＮＡ二本鎖であり、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物を指す。
【０１４７】
「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、溶液中の２つの相補的核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件を選択することを意味する。ハイブリダイゼーションは核酸配列分子の全部または一部に起こり得る。ハイブリダイズする部分は通常、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチドの長さである。当業者には、核酸の二本鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝液中でのナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴｍ（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）またはこれと類似した方程式）によって決まることが認識されよう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメータはナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子に類似しているが同一ではない分子を特定するには、１％のミスマッチによりＴｍが約１℃低下するものと考えられ、例えば、同一性が９５％を上回る核酸分子を探索するのであれば、最終洗浄温度は約５℃低下することになる。当業者は、これらの考慮事項に基づき、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することが可能であろう。好ましい実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を選択する。例として、以下の条件を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施し得る：上の方程式に基づき、Ｔｍを−５℃とし、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳで、ハイブリダイゼーションを実施し、次いで、６０℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４２℃、３×ＳＳＣでの洗浄段階が含まれる。ただし、上のものに代わる緩衝液、塩および温度を用いても同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１にみることができる。
【０１４８】
本明細書で使用され、当該技術分野でも十分に理解されている「治療すること」または「治療」という用語は、臨床結果を含めた有益な結果または所望の結果を得る方法を意味する。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、特に限定されないが、検出可能なものであるか検出不可能なものであるかを問わず、１つまたは複数の症状または病態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の拡散の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または緩和、疾患再発の減少および寛解（部分寛解または完全寛解を問わない）が挙げられる。「治療すること」および「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間が長くなることを意味し得る。本明細書で使用される「治療すること」および「治療」はまた、予防的治療を包含する。例えば、初期段階のＡＤを有する対象を本明細書に記載される化合物、抗体、免疫原、核酸または組成物で治療して進行を予防することができる。
【０１４９】
本明細書で使用される「投与される」という用語は、細胞または対象への治療有効量の開示の化合物または組成物の投与を意味する。
【０１５０】
本明細書で使用される「有効量」という語句は、所望の結果を得るのに必要な投与回数および期間で効果が得られる量を意味する。対象に投与する場合、有効量は対象の病状、年齢、性別、体重などの因子に応じて異なり得る。最適な治療反応を得るために投与レジメンを調整し得る。
【０１５１】
「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤または補形剤が、製剤の他の成分と適合性があり、その被投与者に対して実質的に有害でないことを意味する。
【０１５２】
１つまたは複数の記載される要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇまたはｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅまたはｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、抗体を単独で、または他の成分とともに含有し得る。
【０１５３】
本開示の範囲を理解するにあたっては、本明細書で使用される「〜よりなる」という用語またはその派生語は、記載される特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を明記し、また他の記載されていない特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を排除する、オープンエンドな用語であるものとする。
【０１５４】
本明細書で端点により数値範囲が記載されている場合、その範囲内に含まれる数および端数がいずれも含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５が含まれる）。また、数およびその端数はすべて「約」という用語によって修飾されるものと考えられることを理解するべきである。さらに、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容からそうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象を包含することを理解するべきである。「約」という用語は、言及されている数のプラスまたはマイナス０．１〜５０％、５〜５０％または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
【０１５５】
さらに、当業者であれば理解するように、特定のセクションに記載される定義および実施形態は、本明細書に記載される他の実施形態のうちそれらが適しているものに適用可能であるものとする。例えば、以下の節では、本発明の様々な態様がさらに詳細に定義される。そのように定義された各態様は、そうでないことが明記されない限り、１つまたは複数の他の任意の態様と組み合わせ得る。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴と、好ましいまたは有利であると示されている他の任意の特徴とを組み合わせ得る。
【０１５６】
冠詞の単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数の指示物を包含する。例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、複数の化合物をその混合物も含め包含し得る。
【０１５７】
ＩＩ．エピトープおよび結合タンパク質
本発明者らは、Ａベータのアミノ酸３７〜４０にＧＧＶＶ（配列番号１）を含むＡベータのエピトープを特定した。本発明者らはさらに、そのエピトープまたはその一部が立体配座エピトープであり得ることおよびＧＧＶＶ（配列番号１）がＡベータのオリゴマー種での抗体結合に選択的に接触可能であり得ることを明らかにした。
【０１５８】
理論に束縛されることを望むものではないが、線維は、オリゴマー化を触媒する傾向のある相互作用部位を示し得る。このことは、株に特異的であり得、正常な個体には存在しない選択的な線維表面が露出され、よってモノマーとの異常な相互作用を起こす（すなわちモノマーに提示される）ことが可能である場合にのみ起こり得る。低ｐＨ、炎症時に存在するオスモライトまたは酸化的損傷などの環境変化が線維の破壊を誘発し、より安定性の低い領域の露出を引き起こし得ると考えられる。その結果、これらの低安定性領域を予測し、そのような予測を用いて、上記の領域を標的とする抗体を合理的に設計することに関心が持たれている。さらに、線維内で破壊される可能性のある領域はまた、オリゴマー種内で露出する領域の有力な候補となり得る。
【０１５９】
不規則になりやすい隣接するタンパク質領域を予測するためのコンピュータに基づくシステムおよび方法が、２０１５年１１月９日に出願され全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／２５３０４４号「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｂｉａｓｉｎｇ」および２００９年１０月６日に出願された米国特許出願第１２／５７４，６３７号「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ  ＭＩＳＦＯＬＤＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＰＩＴＯＰＥＳ」に記載されている。実施例に記載されるように、この方法をＡベータに適用し、本明細書で示されるように、Ａベータオリゴマーにおいて特異的または選択的により接触可能なエピトープを特定した。
【０１６０】
実施例に記載されるように、環状ペプチドであるシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）は、モノマー種および／または線維種と比較したオリゴマーのＧＧＶＶ（配列番号１）エピトープの立体配座の差を１つまたは複数捕捉し得る。例えば、環状７量体シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）の溶媒接触表面、曲率、ＲＭＳＤ構造アライメントならびにアミノ酸および二面角の二面角分布の差は、モノマーおよび／または線維と実質的に異なっていることが明らかになり、環状ペプチドが直線状ペプチドとは異なる立体配座エピトープをもたらすことが示唆された。シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を含む免疫原に対して生じさせた抗体は、直鎖状ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）よりも選択的にシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）と結合し、単量体のＡベータ斑およびＡベータ線維斑と比較して合成および／または天然のオリゴマーＡベータ種と選択的に結合した。さらに、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体によりＡベータ凝集のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの伝播を阻害することができた。さらに、毒性アッセイで例示されているように、（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体は、Ａベータオリゴマーの神経細胞への毒性を阻害した。
【０１６１】
ａ）ＧＧＶＶ（配列番号１）「エピトープ」化合物
したがって、本開示は、ＧＶＶなどのアミノ酸ＧＧＶＶ（配列番号１）またはその一部よりなるＡベータのエピトープを特定するものであり、ＧＧＶＶ（配列番号１）はＡベータのアミノ酸残基３７〜４０に対応する。実施例で示されるように、エピトープＧＧＶＶ（配列番号１）、ＧＧＶＶＩ（配列番号８）およびＶＧＧＶＶ（配列番号６）（本明細書でまとめて「ＧＧＶＶ（配列番号１）および関連エピトープ」と呼ばれるエピトープに包含される）がＡベータ線維で不規則になりやすい領域として特定された。残基ＧＧＶＶ（配列番号１）は集団座標法を用いた２つの予測に現れたものであり、このエピトープの隣接残基である３６Ｖおよび４１Ｉはそれぞれ、１つの予測にみられたものである。また残基ＧＧＶＶ（配列番号１）は、Ｐｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏ方法を使用して、明らかになった。
【０１６２】
一態様は、ＧＧＶＶ（配列番号１）、上記のいずれかの一部を含む関連エピトープの配列を含むまたはこれよりなるＡベータペプチドを含む化合物であって、ペプチドがＧＧＶＶ（配列番号１）である場合、ペプチドは、直鎖状ＧＧＶＶ（配列番号１）とは少なくとも１つの特徴で異なり、たとえば末端のバリンが、このカルボキシル末端を介してアミノ酸または他の部分と結合し、よって荷電していない、化合物を含む。たとえば、環状立体配座において、Ｃ末端のバリンは、環化によりカルボキシレート陰性電荷を含まない。
【０１６３】
一実施形態では、Ａベータペプチドは、ＧＧＶＶ（配列番号１）、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）またはＧＧＶＶＩ（配列番号８）を含む、またはこれよりなるアミノ酸配列から選択される。一実施形態では、Ａベータペプチドは、表１４に記載のＡベータペプチドの配列のいずれか１つに記載された配列を有する。
【０１６４】
一実施形態では、化合物はシクロペプチドなどの環状化合物である。シクロペプチドおよび環状ペプチドという用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ＧＧＶＶ（配列番号１）（またはその一部）、または関連エピトープの配列を含むＡベータペプチド、任意選択で立体配座ペプチドは、ＧＧＶＶ（配列番号１）（またはその一部）のＮ末端および／またはＣ末端に、Ａベータに追加の残基を１個または２個含んでよく、例えば、Ａベータペプチドは、Ｃ末端側に残基を１個含み、ＶＧＧＶＶ（配列番号６）となり得る。例えば配列番号１６のＡベータ配列に示されるように、ＡベータのＧＧＶＶ（配列番号１）のＮ末端側の３個のアミノ酸はＬＭＶであり、Ａベータ１〜４２および１〜４３の形態におけるＧＧＶＶ（配列番号１）のＣ末端側の２個のアミノ酸はＩＡである。Ａベータペプチドを含む化合物が環化されている実施形態では、Ａベータペプチドは、６個のＡベータ残基である、またはこれを最長とする残基である。一実施形態では、Ａベータペプチドは、５個のＡベータ残基である、またはこれを最長とする残基である。さらなる別の実施形態では、Ａベータペプチド（たとえば環状化合物などの化合物におけるＡベータペプチド）は４個のＡベータ残基であり、任意にＧＧＶＶ（配列番号１）である。
【０１６６】
一実施形態では、化合物はリンカーをさらに含む。リンカーは、スペーサーおよび／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む。リンカーは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個のアミノ酸および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの同等に機能する分子ならびに／あるいはその組合せを含み得る。一実施形態では、スペーサーアミノ酸は、非免疫原性または低免疫原性のアミノ酸残基、例えばＧおよびＡなどから選択され、例えば、スペーサーは、ＧＧＧ、ＧＡＧ、Ｇ（ＰＥＧ）Ｇ、ＰＥＧ−ＰＥＧ（ＰＥＧ２とも呼ばれる）−ＧＧなどであり得る。１つまたは複数の官能化可能な部分、例えば官能基を有するアミノ酸は、例えば、化合物と、作用物質もしくは検出可能な標識、ＢＳＡなどの担体またはＫＬＨなどの免疫原性増強物質とを結合させるために含まれ得る。
【０１６７】
一実施形態では、リンカーは、ＧＣ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＧＣ、ＧＣＧまたはＰＥＧ２−ＣＧを含む。
【０１６８】
一実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７個または８個のアミノ酸を含む。
【０１６９】
特定の実施形態では、環状化合物は、最大１２、１１、１０、９、８、または７個の残基、任意に、ＰＥＧ単位または他の類似する大きさの化学的部分などのアミノ酸残基および／または同等の単位を有する。
【０１７０】
ＧＧＶＶ（配列番号１）またはその一部または関連エピトープの配列を含むＡベータペプチドが、ＡベータにみられＧＧＶＶ（配列番号１）のＮ末端側および／またはＣ末端側にある追加の残基を１個、２個または３個含む実施形態では、リンカーは、Ａベータ残基のＮ末端および／またはＣ末端と共有結合している（例えば、ペプチドがＶＧＧＶＶ（配列番号６）である場合、リンカーはＲ残基およびＧ残基と共有結合している）。これと同様に、ＡベータペプチドがＧＧＶＶ（配列番号１）である場合、リンカーは残基ＧおよびＧＶと共有結合し、ＡベータペプチドがＧＧＶＶＩ（配列番号８）である場合、リンカーは残基ＧおよびＩと共有結合している。
【０１７１】
化合物（またはリンカーもタンパク質性である化合物）のタンパク質性部分は、タンパク質化学でよく知られている固相合成または均質溶液中での合成などの技術を用いる化学合成により調製し得る。
【０１７２】
上記のように、化合物は環状化合物であり得る。本明細書で「環状ペプチド」と記載される場合、それは（例えば、リンカーが１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸である）完全にタンパク質性の化合物を指す。実施例で決定され環状ペプチドについて記載される特性を、非アミノ酸リンカー分子を含む他の化合物（例えば、環状化合物）に組み込み得ることが理解される。
【０１７３】
したがって、一態様では、ペプチドＧＧＶＶ（配列番号１）（またはＧＧＶなどの上記ペプチドの一部）または関連エピトープの配列とリンカーとを含み、リンカーが、ＧＧＶＶ（配列番号１）を含むペプチド（例えば、ペプチドがＧＧＶＶ（配列番号１）よりなる場合、Ｇ残基およびＶ残基）と直接的または間接的に共有結合している、環状化合物が提供される。環状化合物内では、例えば、Ｇおよび／またはＶの残基のうちの少なくとも１つが、直鎖状化合物、任意に対応する直鎖状ペプチド、任意選択でより拘束された立体配座でのＧおよび／またはＶの残基とは別の立体配座にある。
【０１７４】
一実施形態では、環状化合物は、ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープの配列と最大６個のＡベータ残基（例えば、ＧＧＶＶ（配列番号１）のＮ末端および／またはＣ末端の１個または２個のアミノ酸）とを含むＡベータペプチドと、リンカーと含み、リンカーが、ＡベータペプチドのペプチドＮ末端残基およびＣ末端残基と直接的または間接的に共有結合している。環状化合物内では、例えば、少なくともＶが対応する直鎖状ペプチド内でのＶとは別の立体配座にある、または少なくともＧが対応する直鎖状ペプチド内でのＧとは別の立体配座にあり、任意選択で、少なくともＧまたは少なくともＶが、直鎖状化合物、任意にＧＧＶＶ（配列番号１）を含む対応する直鎖状ペプチド内で占められる立体配座より拘束された立体配座にある。
【０１７５】
Ａベータ配列を含む直鎖状ペプチドは、直鎖状化合物に含まれ得る。ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む直鎖状化合物または直鎖状ペプチドは、一実施形態において、対応する直鎖状ペプチドである。別の実施形態では、直鎖状ペプチドは、ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む任意の長さのＡベータペプチドであって、たとえばＡベータの残基１０〜４２、またはＡベータの残基２０〜４２、２０〜４０、３０〜４２などのより小さなその一部などを含み、任意にリンカー配列を含む直鎖状ペプチドが挙げられる。また、直鎖状ペプチドは、一部の実施形態では、完全長のＡベータペプチドとすることもできる。
【０１７６】
一実施形態では、環状化合物は、配列番号２〜４のいずれか１つの配列を含む。
【０１７７】
環状化合物を環化前に、Ａベータペプチド、任意選択でＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープを含むペプチドのＮ末端またはＣ末端と共有結合したリンカーを有する、直鎖状分子として合成することができる。あるいは、環化前に、リンカーの一部をＮ末端と共有結合させ、一部をＣ末端と共有結合させる。いずれの場合も、直鎖状化合物を例えば頭−尾環化（例えば、アミド結合環化）で環化する。
【０１７８】
一実施形態では、環状化合物は、ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む、またはこれよりなるＡベータペプチドと、リンカーとを含み、リンカーが、ペプチドのＮ末端およびＣ末端（例えば、ペプチドがＧＧＶＶ（配列番号１）よりなる場合、Ｇ残基およびＶ残基）と結合している。一実施形態では、Ｇおよび／またはＶの残基のうちの少なくとも１つが環状化合物内で、ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチド内でＧおよび／またはＶの残基のうちの少なくとも１つによって占められるものとは別の立体配座にある。
【０１７９】
一実施形態では、環状化合物におけるＧおよび／またはＶの残基のうちの少なくとも１つは、モノマーおよび／または線維のある残基、任意にＧおよび／またはＶの残基により占められるものとは別の立体配座にある。
【０１８０】
一実施形態では、Ｇおよび／またはＶの残基のうちの少なくとも１つは、が環状化合物内で、モノマーおよび／または線維内の残基によって占められるものとは別の立体配座にある。
【０１８１】
一実施形態では、別の立体配座は拘束された立体配座である。
【０１８２】
一実施形態では、少なくともＶは任意選択で、単独で、または少なくとも第２のＶと組み合わさって、ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドにおいて占められる立体配座より拘束された立体配座にある。
【０１８３】
一実施形態では、Ｇ、および／またはＧと組み合わさったＶ、および／またはＶの立体配座は、別の立体配座、任意選択でより拘束された立体配座の化合物に含まれる。
【０１８４】
例えば、別の立体配座は、直鎖状ペプチドおよび／または線維におけるペプチドの二面角と異なる、残基Ｇ３８における１つあるいは複数の異なる二面角を含み得る。
【０１８５】
一実施形態では、環状化合物は、環状化合物と直鎖状ペプチドとの間で差異の平均値が最小の側鎖／主鎖二面角を含む。
【０１８６】
一実施形態では、環状化合物は、ＧおよびＶから選択される残基を含み、環状化合物の少なくとも１つの二面角が、直鎖状化合物および／または線維化合物において対応する二面角と少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、または少なくとも１５０度異なる。
【０１８７】
一実施形態では、ＧはＧ３８であり、ＶはＶ４０である。
【０１８８】
２０３
図３に示されるように、Ｇ３８および同様にＶ４０の二面角分布は、環状ペプチドにおいて、直鎖状ペプチド、または線維２ＭＸＵにおける残基と実質的に異なっている。たとえば表３から、シミュレートした直鎖状ペプチド、環状ペプチドおよび線維では、Ｇ３８の二面角Ｏ−Ｃ−ＣΑ−Ｎの差は、環状と直鎖状との間では約−１７２．５度、環状と線維との間では約４０．０度である可能性が最も高いことが示されている。一実施形態では、環状化合物は、直鎖状ペプチドおよび／または線維における対応する二面角と、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、または少なくとも１５０度異なるＯ−Ｃ−Ｃα−Ｎ（Ｏ−Ｃ−ＣΑ−Ｎとも呼ばれる）を含むＧ残基を含む。同様に、Ｇ３８残基の二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−Ｈ１、Ｏ−Ｃ−ＣΑ−Ｈ２に関する環状ペプチドと直鎖状ペプチドとの間の二面角の差異は、それぞれ約６０度および５５度である可能性が最も高い。よって一実施形態では、環状化合物は、直鎖状化合物における対応する二面角と少なくとも２０度異なる、少なくとも３０度異なる、または少なくとも４０度異なる二面角Ｏ−Ｃ−Ｃα−Ｈ１および／またはＯ−Ｃ−Ｃα−Ｈ２を含むＧを含む。Ｇ３８の二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−Ｈ１、Ｏ−Ｃ−ＣＡ−Ｈ２での、環状ペプチドと線維ペプチドとの間での最も可能性のある二面角の対応する差異は、それぞれ９１度および１６０度である。よって、一実施形態では、環状化合物は、線維における対応する二面角と、少なくとも２０度、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、または少なくとも１５０度異なるＯ−Ｃ−Ｃα−Ｈ１および／またはＯ−Ｃ−Ｃα−Ｈ２の二面角を含むＧを含む。
【０１８９】
表３からまた、例えば残基３８Ｇおよび４０Ｖのものを含めた他の角の二面角分布に差があることが確認される。
【０１９０】
表５に提供されているラマチャンドラン角のピーク値により、最も可能性のあるラマチャンドランのψの値は、環状ペプチドと直鎖ペプチドとの間で異なっている。直鎖状ペプチドは、４つのピーク値を提示し；環状ペプチドは２つのピーク値を提示している。直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドのピーク値の間に８つの対応する差異Δψ：１７５度、１７０度、１７５度、１７５度、１７０度、１７５度、１６０度、および１７０度が存在する。Δψ値は、直鎖状ペプチドと環状ペプチドとの間で実質的に異なっている。
【０１９１】
また表３は、Ｖ４０に関する二面角の差異を記載している。Ｖ４０  Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢの二面角分布は、環状および直鎖状で２つのピークを有し；環状ペプチドと直鎖状ペプチドとの間でのＶ４０  Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢの差異は、約１５度および３０度の可能性が最も高い。線維の分布は１つのピークを有する。環状ペプチドと線維との間を比較する場合、Ｖ４０  Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢの差異は、約１０度および１７０度の可能性が最も高い。
【０１９２】
一実施形態では、環状化合物は、直鎖状化合物および／または線維化合物における対応する二面角と、少なくとも１０度、少なくとも２０度、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度少なくとも１４０度、または少なくとも１５０度異なる二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢを含むＶを含む。。
【０１９３】
角の差は、例えば正または負、（＋）または（−）であり得る。
【０１９４】
別の立体配座は別の主鎖配向を含み得る。例えば、環状エピトープが抗体に対して露出する主鎖配向は、直鎖型または線維型と比較して異なるものである。
【０１９５】
図５は、配列ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）よりなる直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの両方ならびにＰＤＢ  ２ＭＸＵの初期条件を用いた平衡化線維構造におけるＧＧＶＶ（配列番号１）の残基３８Ｇについて、平衡シミュレーションでサンプリングした主鎖のファイ角およびプサイ角をプロットしたものである。図５から、環状ペプチドの主鎖二面角（ラマチャンドランファイ／プサイ角）の分布が、残基Ｇ３８に関して、直鎖状ペプチドについてサンプリングしたラマチャンドラン角の分布とは異なり、線維構造２ＭＸＵにおけるペプチドＧＧＶＶ（配列番号１）とは類似していることがわかる。表５は、主鎖のファイ／プサイ角の分布のピーク値を列挙しており、表４は、主鎖のファイ／プサイ角の分布の間の重複を列挙している。環状の分布と直鎖状の分布との間の重複は少なく、直鎖状の分布は、環状分布と約１６％重複している。さらに、最も大きい環状クラスター、最も大きい直鎖状のクラスターおよび最も大きい線維のクラスターの重量中心立体配座（重量中心の構造は図７および図８に示されている）では、Ｇ３８のラマチャンドラン角は、それぞれ、（φ，ψ）＝（−７５．４，−１７４．３）、（φ，ψ）＝（７１．６，９．９）、および（φ，ψ）＝（９８．０，１１６．９）である。よって、主鎖のラマチャンドラン角の差異は、ＧＧＶＶ（配列番号１）のＧ３８では環状ペプチドと直鎖状ペプチドとの間で（Δφ，Δψ）＝（−１４７，１７５．８）であり、ＧＧＶＶ（配列番号１）のＧ３８では環状ペプチドと線維ペプチドとの間の主鎖のラマチャンドラン角の差異は（Δφ，Δψ）＝（−１７３．４，６８．８）である。このことは、それぞれの構造が、異なる主鎖の二面角を有することを示唆している。
【０１９６】
したがって、一実施形態では、環状化合物は、主鎖ファイ／プサイ角が、直鎖状化合物、任意に対応する直鎖状ペプチドまたは線維ＰＤＢ構造におけるものと比較して少なくとも２０度、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度異なる、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、または少なくとも１５０度である少なくとも１個の残基を有する、Ａベータペプチドを含む。
【０１９７】
別の立体配座はまた、直鎖状化合物、任意に対応する直鎖状ペプチドおよび／またはＡベータ線維と比較して、アミノ酸を中心とする曲率またはＧＧＶＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープを含む環状化合物の曲率の増大または減少を含み得る。
【０１９８】
一実施形態では、別の立体配座ＧＧＶＶ（配列番号１）は、直鎖状ＧＧＶＶ（配列番号１）または線維構造２ＭＸＵにおけるＧＧＶＶ（配列番号１）と比較して変化した曲率プロファイルを有する。数が表１に提供されている図２Ｇに示されているように、環状ペプチドにおけるＶ３９の曲率は、直鎖状ペプチドまたは線維の値よりも実質的に大きい。環状のＶ４０の曲率は、線維とモノマーとの間の中間にある。
【０１９９】
曲率の値は、線維におけるシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）、直鎖状（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）のＮ末端からＣ末端のＧ、Ｇ、Ｖ、およびＶに関して決定されており、これを実施例２に記載する。
【０２００】
したがって、化合物は、別の立体配座のＶ３９の曲率が、対応する線維における直鎖状ペプチドと比較して少なくとも０．１ラジアン、０．２ラジアン、０．３ラジアンまたはそれ以上増大している、Ａベータペプチドを含む。
【０２０１】
一実施形態では、末端のＶ、ＧＧ、ＧＶ、ＶＶ、ＶＶＧ、および／またはＧＧＶＶ（配列番号１）は、例えば直鎖状ペプチドおよび／または線維などの非オリゴマー立体配座でこれら残基によって占められるものと比較して、別の立体配座にある。
【０２０２】
図２Ａは、異なる平衡シミュレーションの時間から得た直鎖状ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の曲率をプロットしている。説明文は、１０ｎｓから開始し、３０ｎｓ、５０ｎｓ、７０ｎｓ、または９０ｎｓまで続行するいくつかの曲線を示す。シミュレーション時間が増大すると、曲率の値は、上記および表１に記録されている値に集束する。同様に、環状ペプチドに関する試験が図２Ｂに示されており、線維に関する試験が図２Ｃに示されている。パネルＤ、Ｅ、およびＦは、それぞれ直鎖状、環状、および線維の立体配座に対する、シミュレーション時間の関数としての曲率の値の合計の収束を示している。収束の度合いは、エラーバーが、環状ペプチドでは約０．０１６ラジアン、直鎖状ペプチドでは０．０５ラジアン、および線維では０．０１ラジアンであることを示す。
【０２０３】
同様の変化を示す環状化合物も包含される。
【０２０４】
ＧＧＶＶ（配列番号１）を含むペプチドを含む、いくつかの実施形態の環状化合物は、ＡベータのＧＧＶＶ（配列番号１）の上流および／または下流に１個または２個またはそれ以上の残基を含み得る。このような場合、Ａベータ配列の対応する残基の末端のＮ末端およびＣ末端にスペーサーが共有結合している。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、ＡベータペプチドのＮ末端残基およびＣ末端残基と間接的に結合している。
【０２０６】
一実施形態では、環状化合物は図１７Ｃに示される化合物である。
【０２０７】
環化ペプチドを作製する方法は当該技術分野で公知であり、ＳＳ環化またはアミド環化（頭−尾環化または主鎖環化）がこれに含まれる。実施例３に方法をさらに記載する。例えば、Ｎ末端およびＣ末端に「Ｃ」残基を有するペプチド、例えばＣＧＧＧＶＶＧＣ（配列番号１２）をＳＳ環化により反応させて、環状ペプチドを得ることができる。実施例２に記載されるように、図７Ｃの環状化合物について、特定された立体配座エピトープとの関連性を評価した。ＧＧＶＶ（配列番号１）ペプチドを含む環状化合物は、例えば、１つまたは複数の立体配座的特徴に選択的な抗体を生じさせるのに使用することができる。
【０２０８】
本明細書に記載されるエピトープＧＧＶＶ（配列番号１）および／またはその一部は、Ａベータに含まれるＡベータのミスフォールドされた伝播性の株における潜在的な標的となり得、その立体配座エピトープを認識する抗体は、例えば、そのような伝播性の株の検出に有用であり得る。
【０２０９】
別の態様では、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドを含めた本明細書に記載されるＡベータペプチド配列を含む、単離ペプチドも提供される。直鎖状ペプチドは、例えば、それと結合しない抗体の選択に使用することができる。単離ペプチドは、本明細書に記載されるリンカー配列を含み得る。リンカーは、ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）直鎖状ペプチドでは、Ｎ末端またはＣ末端と共有結合していても、あるいは一部がＮ末端と結合し、一部がＣ末端と結合していてもよい。環状ペプチドでは、リンカーはＣ末端およびＮ末端と直接的または間接的に結合している。
【０２１０】
別の態様は、本明細書に記載される化合物、任意選択で環状化合物を含む、免疫原を含む。免疫原はまた、ほかのＡベータ配列を含み得る。ＧＧＶＶ（配列番号１）および関連エピトープ配列のすぐ上流および／または下流（すなわち、Ｎ末端側および／またはＣ末端側）にはアミノ酸が存在し得る。このような免疫原に対して生じさせた抗体を、例えば、ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープを含むシクロペプチドとの結合に関して選択することができる。
【０２１１】
免疫原は、対象への投与のために適切に調製または製剤化され、例えば、免疫原は無菌のものまたは精製されたものであり得る。一実施形態では、免疫原は、ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープの配列を含む環状ペプチドである。
【０２１２】
一実施形態では、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＭＡＰ抗原などの免疫原性増強物質を含む。免疫原性増強物質は、アミド結合などを介して直接、またはリンカーの官能化可能な部分を介して間接的に、化合物と結合していてよい。（例えば、環状化合物内のＡベータペプチドが６アミノ酸残基であり）リンカーが単一のアミノ酸残基である場合、リンカーは官能化可能な部分（例えば、システイン残基）であり得る。
【０２１３】
免疫原は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬａｔｅｅｆら（２００７）に記載されている方法を用いて、拘束されたエピトープペプチドを含む環状化合物と、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体とをコンジュゲートすることにより作製することができる。一実施形態では、実施例３または４に記載される方法を用いる。
【０２１４】
さらなる態様は、本明細書に記載される化合物または免疫原のタンパク質性部分をコードする単離核酸分子である。
【０２１５】
実施形態では、核酸分子は、配列番号１〜１５で示されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードする。
【０２１６】
一実施形態では、核酸分子は、ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープおよび任意選択で、本明細書に記載されるリンカーをコードする。
【０２１７】
さらなる態様は、前記核酸を含むベクターである。適切なベクターについては本明細書の他の箇所に記載する。
【０２１８】
ｂ）抗体、細胞および核酸
実施例６および７に示されているように、環状化合物ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）は免疫原性であり、直鎖状化合物、任意に対応する直鎖状ペプチドと比較して環状化合物を選択的に結合する複数の抗体を産生させた。本明細書中記載されるように、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を使用して生じさせた抗体は、環状化合物に選択的であり、モノマーよりもＡベータオリゴマーに選択的に結合し、ＡＤ組織において認識可能なプラーク染色を含まない抗体を含むものであった。本明細書中記載されるエピトープＧＧＶＶ（配列番号１）および／またはその一部は、Ａベータに関与するＡベータのミスフォールドされた伝搬株の潜在的な標的であってもよく、立体配座エピトープを認識する抗体は、たとえばこのような伝搬株の検出に有益であり得る。さらに、環状化合物に対して生じさせた抗体は、Ａベータの凝集を阻害し、またＡベータオリゴマーにより誘導される神経細胞への毒性を阻害した。このことにより、これらの治療上の有用性が示唆されている。
【０２１９】
よって、上記の化合物および特に環状化合物を用いて、Ａベータ内のＶＶ、ＧＶＶ、および／またはＧＧＶＶ（配列番号１）と特異的に結合する抗体および／または本明細書中記載される１つもしくは複数の差次的な特徴を含むＡベータにおけるこれら残基の特定の立体配座を認識する抗体を生じさせることができる。これと同様に、例えばＶＧＧＶＶ（配列番号６）、ＧＧＶＶＩ（配列番号８）、ＶＧＧＶＶＩ（配列番号７）および／または本明細書に記載されるその他の関連エピトープ配列を含む環状化合物を用いて、ＧＧＶＶ（配列番号１）などおよび／またはその特定の立体配座エピトープと特異的に結合する抗体を生じさせることができる。
【０２２０】
したがって、一態様は、例えば配列番号１〜１５のいずれか１つで示される配列ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープ配列の配列、たとえばＡベータの配列を有するＡベータペプチドと特異的に結合する、抗体（その結合フラグメントを含む）を含む。
【０２２１】
一実施形態では、Ａベータペプチドは環状ペプチド内に含まれており、抗体は、環状化合物内で提示されるＡベータに対して特異的かつ／または選択的なものである。
【０２２２】
一実施形態では、抗体は本明細書中記載される環状化合物のＡベータペプチドと特別かつ／または選択的に結合し、Ａベータは、配列番号１〜１５のいずれか１つ、たとえば配列番号１、および５〜１５のうちの１つに示されているＡベータ配列を有する。一実施形態では、環状化合物は、配列番号２〜４のいずれか１つで示される配列を含む
【０２２３】
一実施形態では、環状化合物は環状ペプチドである。一実施形態では、環状ペプチド内のＡベータペプチドは、配列番号１〜１５のいずれか、たとえば配列番号１、および５〜１５のうちの１つのＡベータペプチドである。
【０２２４】
一実施形態では、抗体は、配列番号２〜４のいずれか１つの環状化合物または上記化合物を含む免疫原を使用して、産生されている。
【０２２５】
実施例に記載されるように、実施例に記載されるアッセイを用いて、１つまたは複数の特性を有する抗体を選択することができる。
【０２２６】
一実施形態では、抗体は、配列ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドとは結合せず、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、抗体を生じさせるために使用され任意選択で配列番号２に示される環状配列の直鎖型である。
【０２２７】
一実施形態では、抗体は、Ａベータペプチドを含む対応する直鎖状化合物よりも環状化合物内で提示されるＡベータペプチドに対して選択的である。
【０２２８】
一実施形態では、抗体はＡベータ上のエピトープと特異的に結合し、エピトープは、ＧＧＶＶ（配列番号１）またはその関連エピトープ含む、またはこれよりなる。
【０２２９】
一実施形態では、Ａベータ上で抗体により特異的または選択的に認識されるエピトープは、立体配座エピトープである。
【０２３０】
一実施形態では、抗体は単離されている。
【０２３１】
一実施形態では、抗体は外来抗体である。
【０２３２】
一実施形態では、抗体は、ＧＧＶＶ（配列番号１）からなるペプチドを含む環状化合物と比較して、直鎖状ＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号１３）、直鎖状ＭＶＧＧＶＶ（配列番号１４）、または直鎖状ＧＶＶＩＡ（配列番号１５）に特異的に結合しない、かつ／または選択的ではない。選択性は、本明細書中に記載されるＥＬＩＳＡを使用して測定することができる。
【０２３３】
したがって、さらなる態様は、Ａベータに存在するエピトープと特異的に結合する抗体であり、ここでは、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも１個のアミノ酸残基を含む、またはこれよりなるものであり、その少なくとも１個のアミノ酸は、配列ＧＧＶＶ（配列番号１）内に組み込まれたＧまたはＶであり、ＧＧＶＶ（配列番号１）からなる場合、エピトープは、立体配座エピトープである（たとえば、直鎖状化合物、任意に、たとえばエピトープの少なくとも１つのアミノ酸がより拘束されている対応する直鎖状化合物と比較して、任意に拘束された別の立体配座にあるペプチドを選択的に結合する）。一実施形態では、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含む、またはこれよりなるものであり、その少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＧＧＶＶ（配列番号１）内に組み込まれたＧＧまたはＧＶまたはＶＶである。
【０２３４】
別の実施形態では、エピトープはＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープよりなる。
【０２３５】
別の実施形態では、エピトープは、立体配座エピトープであり、ＧＧＶＶ（配列番号１）からなる。一実施形態では、抗体は、環状ペプチドにおいて、対応する直鎖状ペプチドと比較して、ＧＧＶＶ（配列番号１）、任意にシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）と選択的に結合する。
【０２３６】
一実施形態では、抗体は、本明細書中記載される少なくとも１つの別の立体配座の特徴を含む本明細書中記載のエピトープ（たとえば直鎖状化合物と比較した、環状化合物におけるエピトープ）のペプチド配列を含む環状化合物を特異的かつ／または選択的に結合する。例えば、特定のエピトープ立体配座と結合する抗体は、立体配座特異的抗体と呼ぶことができる。このような抗体は、本明細書に記載される方法を用いて選択することができる。立体配座特異的抗体は、特定のＡベータ種または関連種（例えば、二量体、三量体およびその他のオリゴマー種）のグループを区別して認識することが可能であり、ある種または種のグループに対して別の種（例えば、モノマー種または線維種）より高い親和性を有し得る。
【０２３７】
一実施形態では、抗体は単量体Ａベータと特異的に結合しない。一実施形態では、抗体は、例えばＡＤの脳組織においてｉｎ  ｓｉｔｕで、Ａベータ老人斑と特異的に結合しない。
【０２３８】
別の実施形態では、抗体は、天然または合成のオリゴマーＡベータより単量体Ａベータと選択的に結合することはない。
【０２３９】
例えば、抗体は、ＧおよびＶから選択され、環状化合物における少なくとも１つの二面角が、直鎖状化合物において対応する二面角と少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、少なくとも１５０度異なる残基を含む、環状化合物と特異的に結合し得る。
【０２４０】
一実施形態では、抗体は、対応する配列などの任意に直鎖状ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）におけるＧＧＶＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドよりも、環状化合物内にあり任意にシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）におけるＧＧＶＶ（配列番号１）またはその一部を含むＡベータペプチドと選択的に結合する。例えば、一実施形態では、抗体は、環状立体配座のＧＧＶＶ（配列番号１）と選択的に結合し、例えばＥＬＩＳＡもしくは表面プラズモン共鳴、または任意選択で本明細書に記載される方法を使用することにより測定された、環状立体配座のＧＧＶＶ（配列番号１）に対する選択性（例えば、結合親和性）が、直鎖状ペプチド内のＧＧＶＶ（配列番号１）の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍である。
【０２４１】
一実施形態では、環状化合物は、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）である。
【０２４２】
一実施形態では、抗体は、環状化合物内のＡベータペプチドおよび／またはＡベータと選択的に結合する。一実施形態では、選択性は、環状化合物内のＡベータペプチドおよび／またはＡベータオリゴマーに対して、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維から選択されるＡベータ種ならびに／あるいは直鎖状ＧＧＶＶ（配列番号１）、任意に直鎖状ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
【０２４３】
一実施形態では、Ａベータオリゴマーは、Ａベータ１〜４２のサブユニットを含む。
【０２４４】
一実施形態では、抗体はＡベータ線維斑（老人斑とも呼ばれる）染色を示さない。斑染色がみられないことは、Ａベータ特異的抗体である６Ｅ１０および４Ｇ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）または２Ｃ８（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ファーミングデール、ニューヨーク州）、またはＡベータの線維形態に反応性のある他のいずれかの抗体などの陽性対照ならびにアイソタイプ対照と比較することにより評価することができる。本明細書に記載される抗体は、その抗体が典型的な斑形態染色を示さず、染色のレベルがＩｇＧ陰性アイソタイプ対照でみられるレベルの２倍と同等またはそれ以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さない、またはほとんど示さないことになる。尺度は、例えば、アイソタイプ対照での染色レベルを１に設定し、６Ｅ１０での染色レベルを１０に設定することができる。抗体は、そのような尺度で染色レベルが２以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さないことになる。実施形態では、抗体は、例えば上記の尺度で、最小限のＡベータ線維斑染色を示し、そのレベルのスコアは少なくとも３程度または３未満である。
【０２４５】
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【０２４６】
モノクローナル抗体を作製するには、本明細書に記載される免疫原で免疫感作した対象から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、標準的な体細胞融合法によりミエローマ細胞と融合し、それにより上記の細胞を不死化してハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当該技術分野で周知である（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））ならびにその他の技術、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：１４０−６７（１９８６））およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９）など）。望ましいエピトープと特異的に反応する抗体の産生に関してハイブリドーマ細胞を免疫学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。
【０２４７】
特定の抗原または分子に対して反応性の特異的抗体または抗体フラグメントはまた、細胞表面成分とともに細菌内で発現する免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることにより作製し得る。例えば、ファージ発現ライブラリーを用いて、完全Ｆａｂフラグメント、ＶＨ領域およびＦＶ領域を細菌内で発現させることができる（例えば、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照されたい）。
【０２４８】
一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【０２４９】
非ヒト種からの抗体のヒト化については文献に十分に記載されている。例えば、欧州特許第号第０２３９４００号（Ｂ１）ならびにＣａｒｔｅｒおよびＭｅｒｃｈａｎｔ  １９９７（全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８，４４９−４５４，１９９７）を参照されたい。ヒト化抗体はまた、商業的に容易に入手できる（例えば、イギリス、ミドルセックス、トゥイッケナム、ホーリーロード２番のＳｃｏｔｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）。
【０２５０】
ヒト化型のげっ歯類抗体は、ＣＤＲ移植（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８）によって容易に作製される。この方法では、げっ歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む６つのＣＤＲループと、対応するヒトフレームワーク領域とを結合させる。ＣＤＲ移植では、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原認識に影響を及ぼし得ることから、親和性が低下した抗体が得られることが多い（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２４：４８７−４９９，１９９２）。抗体の親和性を維持するには多くの場合、部位特異的変異誘発またはその他の組換え技術により特定のフレームワーク残基を置き換える必要があり、コンピュータによる抗原結合部位のモデル化を援用することもある（Ｃｏら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：２９６８−２９７６，１９９４）。
【０２５１】
ヒト化型の抗体は任意選択で、リサーフィシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３５：９５９−９７３，１９９４）によって得られる。この方法ではげっ歯類抗体の表面残基のみをヒト化する。
【０２５２】
特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージディスプレイ戦略（Ｊｅｓｐｅｒｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９−９０３，１９９４）によって特定され得る。１つの方法では、特異的抗原に対するげっ歯類抗体の重鎖をクローン化し、ヒト軽鎖のレパートリーと対にして、繊維状ファージ上にＦａｂフラグメントとして提示させる。抗原との結合によりファージを選択する。次いで、選択されたヒト軽鎖をヒト重鎖のレパートリーと対にしてファージ上に提示させ、再び抗原との結合によりファージを選択する。その結果は、特定の抗原に特異的なヒト抗体Ｆａｂフラグメントとなる。別の方法では、メンバーがその外表面に様々なヒト抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦｖ）を提示するファージのライブラリーを作製する（Ｄｏｗｅｒら，国際公開第９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，国際公開第９２／０１０４７号）。特異的抗原に対するアフィニティー濃縮により所望の特異性を有する抗体を提示するファージを選択する。いずれかの方法で特定されたヒトＦａｂフラグメントまたはヒトＦｖフラグメントをクローン化して、哺乳動物細胞でヒト抗体として発現させ得る。
【０２５３】
ヒト抗体は任意選択で、トランスジェニック動物から得られる（米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；および同第５，７７０，４２９号）。この方法では、キメラマウスまたは生殖系列変異体マウスの重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子を欠失させる。次いで、そのような変異体マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する。次いで、得られたトランスジェニックマウスは抗原曝露時にヒト抗体の全レパートリーを作製することが可能になる。
【０２５４】
ヒト化抗体は通常、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖおよび単一ドメイン抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントまたは重鎖と軽鎖がスペーサーにより連結された一本鎖抗体として作製される。また、ヒト抗体またはヒト化抗体はモノマー型またはポリマー型で存在し得る。ヒト化抗体は任意選択で、１本の非ヒト鎖と１本のヒト化鎖（すなわち、１本のヒト化重鎖または軽鎖）とを含む。
【０２５５】
ヒト化抗体またはヒト抗体を含めた抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥを含めた任意のクラスの免疫グロブリン；ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めた任意のアイソタイプから選択される。キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体は、１つまたは２つ以上のアイソタイプまたはクラスに由来する配列を含み得る。
【０２５６】
さらに、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより容易に単離される。例えば、任意選択で本発明の疾患特異的なエピトープを使用することにより、抗体ファージライブラリーをスクリーニングして、疾患特異的なエピトープに特異的な抗体フラグメントを同定する。任意選択で、特定された抗体フラグメントを用いて、本明細書に記載される様々な実施形態に有用な様々な組換え抗体を作製する。抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えばＸｏｍａ社（バークレー、カリフォルニア州）から市販されている。ファージライブラリーをスクリーニングする方法は当該技術分野で周知である。
【０２５７】
さらなる態様は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下に記載する配列を含む、抗体および／またはその結合フラグメントである。
【０２５８】
【表３】
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【０２５９】
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体はキメラ抗体、例えば表１２に記載されるＣＤＲ配列を含むヒト化抗体などである。
【０２６０】
別の態様は、表１２に記載されているＣＤＲを含む抗体と、ヒトのＡベータに対する結合性に関して競合する抗体を含む。
【０２６１】
別の実施形態では、任意選択で一本鎖抗体において、表１２のＣＤＲと軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、抗体も提供される。
【０２６２】
さらに別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号１７、１８および１９で示される、アミノ酸配列またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号２０、２１および２２で示される、アミノ酸配列またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域アミノ酸配列が、配列番号２３で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重最適化型によってコードされている。別の実施形態では、抗体は、配列番号２５で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む。
【０２６３】
別の態様は、表１２に記載されるＣＤＲ配列を有する抗体と同じエピトープと特異的に結合する抗体である。
【０２６４】
抗体間の競合は、例えば、被験抗体が参照抗体と共通の抗原との特異的結合を阻害する能力を評価するアッセイを用いて判定することができる。競合結合アッセイで測定したとき、過剰の被験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍または２０倍）が参照抗体の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％阻害する場合、被験抗体は参照抗体と競合することになる。
【０２６５】
さらなる態様は、治療剤、検出可能な標識または細胞毒性物質とコンジュゲートした抗体である。一実施形態では、検出可能な標識は陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えばＰＥＴ撮像で使用され得る。
【０２６６】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体および／またはその結合フラグメントとオリゴマーＡベータとを含む、抗体複合体に関する。
【０２６７】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体またはその一部をコードする、単離核酸である。
【０２６８】
また、重鎖または軽鎖をコードする、例えば、本明細書に記載されるＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域および／またはＣＤＲ−Ｈ３領域を含む重鎖をコードする、あるいは本明細書に記載されるＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域および／またはＣＤＲ−Ｌ３領域を含む軽鎖をコードする、核酸も提供される。
【０２６９】
本開示はまた、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列のバリアントを提供する。例えば、バリアントとしては、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列と少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列またはコドン縮重配列もしくはコドン最適化配列が挙げられる。別の実施形態では、バリアント核酸配列は、配列番号２４および２６をコードする核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０２７０】
一実施形態では、核酸は単離核酸である。
【０２７１】
別の態様は、本明細書に開示される核酸を含む発現カセットまたはベクターである。一実施形態では、ベクターは単離ベクターである。
【０２７２】
ベクターは、抗体および／またはその結合フラグメントの作製あるいは本明細書に記載されるエピトープのペプチド配列の発現に適したベクターを含めた任意のベクターであり得る。
【０２７３】
既知の方法で、タンパク質を確実に発現させる適切な発現ベクター内に核酸分子を組み込み得る。考え得る発現ベクターとしては、特に限定されないが、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。ベクターは使用する宿主細胞と適合性のあるものであるべきである。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に適した」ものであり、これは、その発現ベクターが、本明細書に記載されるエピトープまたは抗体に対応するペプチドをコードする核酸分子を含んでいることを意味する。
【０２７４】
一実施形態では、ベクターは、遺伝子治療により例えば一本鎖抗体を発現させるのに適したものである。ベクターは、例えば神経特異的プロモーターなどを用いて、神経組織での特異的発現に適合させることができる。一実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳを含み、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の発現を可能にする。このようなベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体を送達するのに用いることができる。
【０２７５】
適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。
【０２７６】
このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。
【０２７７】
一実施形態では、制御配列は、神経組織および／または細胞での発現を指令する、または増大させる。
【０２７８】
一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【０２７９】
組換え発現ベクターはまた、本明細書に記載される抗体またはエピトープペプチドを発現させるためにベクターにより形質転換、感染または形質移入した宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含み得る。
【０２８０】
組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドを発現または安定性を増大させる；組換えペプチドの溶解度を増大させる；ならびに例えば本明細書に記載されるタグおよび標識を含めたアフィニティー精製のリガンドとして作用することにより標的組換えペプチドの精製を補助する融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする、遺伝子を含み得る。さらに、標的組換えタンパク質にタンパク質分解切断部位を付加して、融合タンパク質精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離させ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ社、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、マサチューセッツ州）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられ、これらは組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを融合させるものである。
【０２８１】
例えばニューロンおよび神経組織内にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で遺伝子を導入するシステムとしては、ウイルス、中でもとりわけ単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスを含めたレトロウイルスに基づくベクターが挙げられる。これに代わる遺伝子送達の方法としては、裸のプラスミドＤＮＡおよびリポソーム−ＤＮＡ複合体の使用が挙げられる。別の方法には、ＤＮＡをポリカチオン濃縮して脂質に封入し、脳内遺伝子送達により脳内に導入する、ＡＡＶプラスミドの使用（Ｌｅｏｎｅら，米国特許出願公開第２００２０７６３９４号）がある。
【０２８２】
したがって、別の態様では、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターおよび抗体をリポソーム、ナノ粒子およびウイルスタンパク質粒子などの小胞で製剤化し、例えば、本明細書に記載される抗体、化合物、免疫原および核酸を送達し得る。特に、ポリマーソームを含めた合成ポリマー小胞を用いて抗体を投与することができる。
【０２８３】
別の態様では、本明細書に記載される抗体を発現する、または本明細書に開示される発現カセットまたはベクターを含む細胞、任意選択で単離細胞および／または組換え細胞も提供される。
【０２８４】
組換え細胞は、ポリペプチドの産生に適した、例えば抗体および／またはその結合フラグメントの産生に適した任意の細胞を用いて作製することができる。例えば、核酸（例えば、ベクター）を細胞内に導入するには、用いるベクターに応じて、細胞に形質移入し得る、細胞を形質転換し得る、または細胞に感染させ得る。
【０２８５】
適切な宿主細胞としては、多種多様な原核宿主細胞および真核宿主細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載されるペプチドおよび抗体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現させ得る。
【０２８６】
一実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞、蠕虫細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および哺乳動物細胞から選択される真核細胞である。
【０２８７】
別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ミエローマ細胞、脾臓細胞またはハイブリドーマ細胞である。
【０２８８】
一実施形態では、細胞は神経細胞である。
【０２８９】
抗体またはペプチドを発現させるのに適した酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、特に限定されないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属またはクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の様々な種が挙げられる。酵母（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）で発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）が挙げられる。酵母および真菌を形質転換させるプロトコルは当業者に周知である。
【０２９０】
適切であり得る哺乳動物細胞としては、特にＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）およびＮＳ−１細胞が挙げられる。哺乳動物細胞での発現を指令するのに適した発現ベクターは一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０などのウイルス材料由来のもの）ならびにその他の転写制御配列および翻訳制御配列を含む。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。
【０２９１】
さらなる態様は、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体を産生するハイブリドーマである。
【０２９２】
ＩＶ．組成物
さらなる態様は、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターまたは抗体を含む組成物である。
【０２９３】
一実施形態では、組成物は希釈剤を含む。
【０２９４】
核酸に適した希釈剤としては、特に限定されないが、水、生理食塩水およびエタノールが挙げられる。
【０２９５】
抗体もしくはそのフラグメントを含めたポリペプチドおよび／または細胞に適した希釈剤としては、特に限定されないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝溶液およびグリセロール溶液あるいはポリペプチドおよび／または細胞を凍結させるのに適した他の溶液が挙げられる。
【０２９６】
一実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるペプチド、免疫原、抗体、核酸またはベクターのいずれかを含み、任意選択で薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。
【０２９７】
本明細書に記載される組成物は、対象に投与することができる薬学的に許容される組成物を調製する既知の方法それ自体により、任意選択でワクチンとして、有効量の活性物質が薬学的に許容される溶媒との混合物の形で組み合わさるように調製することができる。
【０２９８】
医薬組成物としては、特に限定されないが、凍結乾燥粉末剤または水性もしくは非水性の無菌注射用液剤もしくは無菌注射用懸濁剤が挙げられ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および組成物を目的とする被投与者の組織または血液に実質的に適合させる溶質をさらに含有し得る。このような組成物中に記載の存在し得るその他の成分としては、例えば水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎなど）、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。無菌粉末剤、顆粒剤、錠剤または濃縮した液剤もしくは懸濁剤から即時注射液剤および即時注射懸濁剤を調製し得る。組成物は、例えば、特に限定されないが、患者に投与する前に滅菌水または生理食塩水で再構築する凍結乾燥粉末として供給され得る。
【０２９９】
医薬組成物は薬学的に許容される担体を含み得る。適切な薬学的に許容される担体としては、実質的に化学的に不活性で無毒性であり医薬組成物の生物活性の効果に干渉しない組成物を含む。適切な医薬担体の例としては、特に限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスファチジル−エタノールアミン（ｄｉｏｌｅｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）およびリポソームが挙げられる。このような組成物は、患者に直接投与する形態になるように、治療有効量の化合物を適量の担体とともに含有するべきである。
【０３００】
組成物は薬学的に許容される塩の形態であり得、このような塩としては、特に限定されないが、遊離アミノ基を用いて形成される塩、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するなどおよび遊離カルボキシル基を用いて形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアルニノエタノール（２−ｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｏ  ｅｔｈａｎｏｌ）、ヒスチジン、プロカインなどに由来するなどが挙げられる。
【０３０１】
本明細書に記載される化合物または免疫原を含む実施形態では、組成物はアジュバントを含む。
【０３０２】
使用し得るアジュバントとしては例えば、通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒菌の成分である、内因性アジュバント（リポ多糖など）が挙げられる。外因性アジュバントには、通常、抗原と非共有結合し、宿主免疫応答を増強するよう製剤化される、免疫調節物質がある。水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（一般にミョウバンと総称される）はアジュバントとして日常的に使用される。様々なアジュバントが免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こし得る。このようなものとしては、サポニン、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ社、ウスター、マサチューセッツ州）またはそれから生成されるＩＳＣＯＭおよび（免疫刺激複合体）および膜タンパク質抗原と複合体を形成したＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（免疫刺激複合体）などの粒子など、プルロニックポリマーと鉱油、死滅マイコバクテリアと鉱油、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖などの細菌生成物ならびにリピドＡおよびリポソームが挙げられる。
【０３０３】
一実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。水中油型乳剤としては、スクアレン；ラッカセイ油；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４３８７号）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型乳剤は、免疫刺激物質、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ  ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＴＰ−ＤＰＰ）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））またはその他の細菌細胞壁成分とともに使用し得る。
【０３０４】
アジュバントを単一組成物として免疫原とともに投与し得る。あるいは、アジュバントを免疫原投与の前に、免疫原投与と同時に、かつ／または免疫原投与の後に投与し得る。
【０３０５】
アジュバントは一般に、リン酸緩衝生理食塩水に溶かした０．０５〜１．０パーセント溶液として使用される。アジュバントは免疫原の免疫原性を増強するが、アジュバント自体は必ずしも免疫原性であるわけではない。アジュバントは、投与部位付近に免疫原を局所的に保持することよって作用し、免疫系細胞への免疫原の緩徐で持続的な放出を促進するデポとしての効果をもたらし得る。アジュバントはまた、免疫原デポに免疫系細胞を誘引し、そのような細胞を刺激して免疫応答を誘発し得る。したがって、諸実施形態は、アジュバントをさらに含む組成物を包含する。
【０３０６】
非経口免疫感作のためのアジュバントとしては、アルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびヒドロキシリン酸アルミニウム）が挙げられる。標準的プロトコルに従って、抗原をアルミニウム化合物とともに沈殿させる、またはアルミニウム化合物上に吸着させることができる。ＲＩＢＩ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）などのその他のアジュバントも非経口投与に使用することができる。
【０３０７】
粘膜免疫感作のためのアジュバントとしては、細菌毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび百日咳毒素（ＰＴ）またはその組合せ、サブユニット、トキソイドもしくは変異体）が挙げられる。例えば、天然のコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）の精製調製物が有用であり得る。上記のいずれかの毒素のフラグメント、ホモログ、誘導体および融合物も、アジュバント活性を保持している限り適切なものである。好ましくは、毒性が低下した変異体を使用する。適切な変異体については、（例えば、国際公開第９５／１７２１１号（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ  ＣＴ変異体）、国際公開第９６／６６２７号（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ  ＬＴ変異体）および国際公開第９５／３４３２３号（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ  ＰＴ変異体）に）既に記載されている。方法および組成物に使用し得る追加のＬＴ変異体としては、例えば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ変異体、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙ変異体、Ｇｌｕ−１１０−Ａｓｐ変異体およびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐ変異体が挙げられる。その他のアジュバント（様々な供給源（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍもしくはシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ））の細菌モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、サポニンまたはポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアなど）も粘膜投与に使用することができる。
【０３０８】
その他のアジュバントとしては、インターロイキンなどのサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１２、ケモカイン、例えばＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５、マクロファージ刺激因子ならびに／あるいは腫瘍壊死因子が挙げられる。使用し得るその他のアジュバントとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｄａｖｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４７：１７１−１８３，２０００）が挙げられる。
【０３０９】
水中油型乳剤としては、スクアレン；ラッカセイ油；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４３８７号）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型乳剤は、免疫刺激物質、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ  ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＴＰ−ＤＰＰ）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））またはその他の細菌細胞壁成分とともに使用され得る。
【０３１０】
粘膜免疫感作および非経口免疫感作の両方に有用なアジュバントとしては、ポリホスファゼン（例えば、国際公開第９５／２４１５号）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３ｂ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール（例えば、米国特許第５，２８３，１８５号および国際公開第９６／１４８３１）号およびＱＳ−２１（例えば、国際公開第８８／９３３６号）が挙げられる。
【０３１１】
アジュバントを免疫原と結合させて投与し得る。例えば、免疫原を含むペプチドの立体配座の変化が免疫原に対する免疫応答の性質に影響を及ぼさないように、パルミチン酸などの脂質を１つまたは複数のペプチドと直接結合させ得る。
【０３１２】
アジュバントは、単一組成物として免疫原と共に投与されてもよい。さらに、アジュバントは、免疫原の投与の前、投与中、または投与後に投与されてもよい。
【０３１３】
一実施形態では、組成物は本明細書に記載される抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載される抗体と希釈剤とを含む。一実施形態では、組成物は無菌組成物である。
【０３１４】
さらなる態様は、本明細書中記載される抗体およびＡベータ、任意にＡベータオリゴマーを含む抗体の複合体を含む。この複合体は、溶液中であってもよく、組織に含まれていてもよく、または任意にｉｎ  ｖｉｔｒｏにあってもよい。
【０３１５】
ＩＶ．キット
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルあるいはその他の筐体に入った本明細書に記載されるｉ）抗体および／またはその結合フラグメント、ｉｉ）核酸、ｉｉｉ）ペプチドまたは免疫原、ｉｖ）組成物あるいはｖ）組換え細胞と、任意選択で参照物質および／またはキットの使用のための説明書とを含む、キットに関する。
【０３１６】
一実施形態では、キットは、収集バイアル、標準緩衝液および検出試薬のうちの１つまたは複数のものをさらに含む。
【０３１７】
Ｖ．方法
本明細書に記載される化合物、免疫原および抗体を作製および使用する方法が含まれる。
【０３１８】
特に、ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープの立体配座エピトープに特異的かつ／または選択的な抗体を作製する方法であって、対象、任意選択で非ヒト対象に本明細書に記載されるエピトープ配列を含み立体配座的に制約のある化合物、任意選択でＧＧＶＶ（配列番号１）または関連エピトープを含む環状化合物を投与することと、環状化合物と特異的または選択的に結合し、任意選択で、ｉ）合成および／または天然のオリゴマーと特異的または選択的に結合し、かつ／あるいはｉｎ  ｓｉｔｕ組織試料で老人斑との結合が全くもしくはほとんどみられない、または直鎖状化合物、任意に対応する直鎖状ペプチドとの結合が全くもしくはほとんどない、抗体産生細胞あるいは抗体を単離することとを含む、方法が提供される。環状化合物は、例えば、本明細書に記載される環状化合物を含む、本明細書に記載されるいずれかの「エピトープ」を含み得る。
【０３１９】
一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、モノクローナル抗体を作製するためのものである。
【０３２０】
一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、ヒト化抗体を作製するためのものである。
【０３２１】
環状化合物を用いて作製する抗体は、本明細書および実施例に記載される通りに選択される。一実施形態では、この方法は、任意選択で本明細書に記載される方法を用いて、直鎖状ペプチドよりも環状ペプチドと特異的または選択的に結合し、エピトープ配列に特異的であり、オリゴマーと特異的に結合し、かつ／あるいはｉｎ  ｓｉｔｕの斑および／または対応する直鎖状ペプチドと結合しない、またはほとんど結合しない抗体を単離することを含む。
【０３２２】
さらなる態様では、生体試料がＡベータを含むかどうかを検出する方法であって、生体試料と本明細書に記載される抗体とを接触させることと、何らかの抗体複合体の存在を検出することとを含む、方法が提供される。一実施形態では、この方法は、生体試料が、残基ＧまたはＶのうちの少なくとも１つが非オリゴマー立体配座のＧおよび／またはＶによって占められるものとは別の立体配座にある、Ａベータを含むかどうかを検出するためのものである。一実施形態では、この方法は、生体試料がオリゴマーＡベータを含むかどうかを検出するためのものである。
【０３２３】
一実施形態では、この方法は、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、生体試料と、本明細書のＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体とを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
【０３２４】
一実施形態では、形成された複合体のレベルを、適切なＩｇ対照または無関係な抗体などの被験抗体と比較する。
【０３２５】
一実施形態では、検出を定量化し、生成した複合体の量を測定する。測定は、例えば標準物質に対して相対的なものであり得る。
【０３２６】
一実施形態では、測定された量を対照と比較する。
【０３２７】
別の実施形態では、この方法は、
（ａ）抗体−抗原複合体の生成が可能な条件下で、前記対象の生体試料と本明細書に記載される抗体とを接触させること；
（ｂ）被験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定すること；および
（ｃ）被験試料中の抗体−抗原複合体の量と対照とを比較すること
を含み、
対照と比較して生体試料中に抗体−抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータを含むことが示される。
【０３２８】
対照は、試料対照（例えば、ＡＤを有さない対象または軽度、中等度もしくは進行型といった特定の型のＡＤを有する対象に由来するもの）または対象のＡベータオリゴマーレベルの変化をモニターするための同じ対象由来の以前の試料であり得る。
【０３２９】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を使用する。
【０３３０】
一実施形態では、抗体は、ＧＧＶＶ（配列番号１）または関連立体配座エピトープを含むＡベータの立体配座を特異的かつ／または選択的に認識し、生体試料中に抗体抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータオリゴマーを含むことが示される。
【０３３１】
一実施形態では、試料は生体試料である。一実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物および／またはＣＳＦを含む。一実施形態では、試料は、全血、血漿または血清を含む。一実施形態では、試料はヒト対象から採取されるものである。一実施形態では、対象は、ＡＤが疑われる、ＡＤのリスクがある、またはＡＤを有する。
【０３３２】
本明細書に記載される抗体を用いてＡベータ：抗体複合体を検出し、それにより生体試料中にＧＧＶＶ（配列番号１）もしくは関連立体配座エピトープを含むＡベータおよび／またはＡベータオリゴマーが存在するかどうかを判定するには、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥなどのイムノアッセイならびに免疫細胞化学を含めたいくつかの方法を用いることができる。
【０３３３】
実施例に記載されるように、表面プラズモン共鳴技術を用いて立体配座特異的結合を評価することができる。抗体を標識する、または複合体の抗体に特異的な検出可能に標識した二次抗体を用いる場合、その標識を検出することができる。一般に用いられる試薬としては、蛍光発光抗体およびＨＲＰ標識抗体が挙げられる。定量的方法では、発生したシグナルの量を標準物質または対照との比較により測定することができる。測定はまた、相対的なものであり得る。
【０３３４】
さらなる態様は、対象または組織中のＡベータのレベルを測定する、またはそのようなＡベータを撮像する方法であって、任意選択で、測定または撮像するＡベータがオリゴマーＡベータである、方法を含む。一実施形態では、この方法は、ＡＤを有するリスクがある、ＡＤを有することが疑われる、またはＡＤを有する対象に検出可能な標識とコンジュゲートした抗体を投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む。標識は、一実施形態では、例えばＰＥＴ撮像に使用することができる陽電子放出放射性核種である。
【０３３５】
さらなる態様は、対象に免疫応答を誘導する方法であって、対象に本明細書に記載される化合物、任意選択で、ＧＧＶＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を投与すること；ならびに任意選択で、投与した化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的かつ／または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む、方法を含む。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した化合物または免疫原を含む、医薬組成物である。
【０３３６】
一実施形態では、対象はげっ歯類などの非ヒト対象である。作製された抗体産生細胞は、一実施形態ではハイブリドーマ細胞系を作製するために使用する。
【０３３７】
一実施形態では、投与する免疫原は、図７Ｃの化合物を含む。
【０３３８】
本明細書では、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体が、Ａベータオリゴマーと特異的かつ／または選択的に結合し、Ａベータ斑染色を示さないことが示される。リゴマーＡベータ種は、ＡＤにおいて毒性のある伝播性の種であると考えられる。さらに、図１９に示されるように、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を用いて生じさせ、オリゴマーに特異的な抗体は、Ａベータの凝集およびＡベータオリゴマーの伝播を阻害した。したがって、Ａベータオリゴマーの伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な抗体を、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマーの伝播を阻害することを含む、方法も提供される。実施例１０に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイをモニターすることができる。
【０３３９】
抗体はまた、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患の治療に有用であり得る。例えば、レビー小体型認知症のバリアントおよび封入体筋炎（筋肉疾患の１つ）では、ＡＤと類似した斑がみられ、脳アミロイド血管症に関与する凝集体をＡベータが形成し得る。上記のように、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体は、ＡＤの毒素原性のＡベータ種であると考えられるオリゴマーＡベータと結合し、毒素原性Ａベータオリゴマーの形成を阻害する。
【０３４０】
したがって、さらなる態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の本明細書に記載される抗体、任意選択で、前記抗体を含むＡベータオリゴマーに特異的かつ／もしくは選択的な抗体もしくは医薬組成物を投与すること；あるいは２）必要とする対象にＧＧＶＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物、免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法である。
【０３４１】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。一実施形態では、検出可能なＡベータレベル（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される、または撮像により測定されるＡベータ抗体複合体）を有する対象を抗体で治療する。
【０３４２】
抗体および免疫原を例えば、本明細書に記載される医薬組成物に含ませ、例えば小胞に製剤化して送達を改善することができる。
【０３４３】
１つまたは複数の、本明細書中に記載される標的化する抗体、たとえば環状化合物中に提示されているＧＧＶＶ（配列番号１）を標的とする１つまたは複数の抗体および／または関連抗体を組み合わせて投与することができる。さらに、本明細書に開示される抗体をベータセクレターゼ阻害剤またはコリンエステラーゼ阻害剤などの１つまたは複数の他の治療剤とともに投与することができる。
【０３４４】
一実施形態では、抗体は、任意選択でＡベータオリゴマーと特異的または選択的に結合する、立体配座特異的／選択的抗体である。
【０３４５】
また、ＡＤを標的とする組成物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸の使用が提供される。
【０３４６】
本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸、ベクターなどを、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、眼窩内、点眼、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾール投与または経口投与により投与することができる。
【０３４７】
ある特定の実施形態では、医薬組成物を全身投与する。
【０３４８】
他の実施形態では、医薬組成物を脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。例えば、このような方法は、埋込み型カテーテルおよびポンプの使用を含み、これらはカテーテルを通して注入部位に所定用量を放出するものである。当業者であればさらに、理解されよう。カテーテルは、それを可視化して脳内の所望の投与部位または注入部位に隣接する位置に配置することが可能な外科技術により埋め込まれ得る。このような技術は、参照により本明細書に組み込まれるＥｌｓｂｅｒｒｙらの米国特許第５，８１４，０１４号「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｂｙ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ」に記載されている。また、米国特許出願公開第２００６０１２９１２６号（ＫａｐｌｉｔｔおよびＤｕｒｉｎｇ，「Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｆｕｓｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ」）に記載されているもの方法などの方法が企図される。脳およびＣＮＳの他の部分に薬物を送達する装置が市販されている（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標）ＥＬ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社、ミネアポリス、ミネソタ州）。
【０３４９】
別の実施形態では、血液脳関門を通過する受容体介在型輸送が可能になるよう投与する化合物を修飾するなどの方法を用いて、医薬組成物を脳に投与する。
【０３５０】
他の実施形態では、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸と、血液脳関門を通過する輸送を促進することが知られている生物学的に活性な分子との共投与が企図される。
【０３５１】
また、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸を血液脳関門を通過させて投与する方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７０１２０６１号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ」に記載されている、血液脳関門の透過性を一時的に増大させることを目的とする方法などが企図される。
【０３５２】
当業者には、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸を脳に直接投与する、または血液脳関門を通過させて投与するのに適切な様々な方法が理解され、本明細書に記載される製品を安全に投与するためにこれらの方法を修正することが可能であろう。
【０３５３】
上の開示は本願を全体的に説明するものである。以下の具体例を参照することにより、さらに十全な理解することができる。これらの例は単に説明を目的として記載されるものであって、本願の範囲を限定することを意図するものではない。状況によって好都合であることが示唆される、または好都合である場合、形態の変更および均等物による置換が企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は説明的な意味を意図するものであって、限定を目的とするものではない。
【０３５４】
以下の非限定的な例は本開示を例示するものである。
【０３５５】
（実施例）
実施例１
集団座標予測
ミスフォールドされたエピトープを予測する方法は、２０１５年１１月９日に出願され参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／２５３０４４号、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｂｉａｓｉｎｇ」に記載されている「集団座標バイアス」によって得られる。そこに記載されているように、この方法は、あるタンパク質（またはペプチド凝集体）にグローバル座標のバイアスをかけて、そのタンパク質（またはペプチド凝集体）をミスフォールドさせた後、部分的に構造化されていないタンパク質（またはペプチド凝集体）のフォールドされない可能性が最も高いアンフォールド領域を予測する、分子動力学に基づくシミュレーションを用いるものである。バイアスシミュレーションを実施し、各残基インデックスに対応する（検討するタンパク質の初期構造のものと比較した）溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）。ＳＡＳＡはＨ２Ｏが接触可能な表面積を表す。ＳＡＳＡの（検討するタンパク質の初期構造のものと比較した）正の変化は、関連する残基インデックスの領域におけるアンフォールドを示すと考え得る。この方法を、単鎖、ならびにそれぞれが独自の形態を有する３種類のＡベータ株、すなわち、３回対称性構造（またはモノマー）（ＰＤＢエントリー２Ｍ４Ｊ）のＡβ−４０ペプチド、２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）のＡβ−４０モノマーおよび一本鎖平行ｉｎ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ（例えば、一本の鎖の残基が近接する鎖の同じ残基と相互作用するベータシートが反復したもの）構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）のＡβ−４２モノマーに適用した。
【０３５６】
米国特許出願第６２／２５３０４４号に記載されている集団座標法ならびにＫ．Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｅ．Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｄａｒｉａｎ，Ｏ．Ｇｕｖｅｎｃｈ，Ｐ．Ｌｏｐｅｓ，Ｉ．ＶｏｒｏｂｙｏｖおよびＡ．Ｄ．Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ．Ｃｈａｒｍｍ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ：Ａ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｈａｒｍｍ  ａｌｌ−ａｔｏｍ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４）：６７１−６９０，２０１０；ならびにＰ．Ｂｊｅｌｋｍａｒ，Ｐ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｅｎｄｅｔ，Ｂ．ＨｅｓｓおよびＥ．Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＨＡＲＭＭ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎ  ＧＲＯＭＡＣＳ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｆｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｍａｐｓ，ｖｉｒｔｕａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ  ｗａｔｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏ．Ｃｏｍｐ．，６：４５９−４６６，２０１０に記載されているＣＨＡＲＭＭ力場パラメータ（ともに参照により本明細書に組み込まれる）をＴＩＰ３Ｐ水とともに用いて、各初期構造に対するシミュレーションを実施した。
【０３５７】
この方法を用いて予測されたエピトープを実施例２に記載する。
【０３５８】
Ａベータオリゴマー特異的エピトープを予測するためのＧ−ｏモデルの方法
第２のエピトープ予測モデルは、天然の状態からの部分的なタンパク質のアンフォールディングの自由エネルギー地形に基づくものである。この天然の状態は、実験に由来する線維構造に引き継がれている。タンパク質が、所定の量の一次配列だけ、天然の状態から部分的にアンフォールディングされている場合、エピトープ候補は、不規則に対する最小の自由エネルギーを消費する連続した配列のセグメントである。所定のタンパク質の立体配座の自由エネルギーは、折りたたまれていない状態を好む立体配座のエントロピーおよび極性官能基の溶媒和、ならびに天然の状態をエンタルピー的に安定させる静電作用およびファンデルワールス相互作用―タンパク質相互作用の損失を含む、いくつかの寄与から生じる。
【０３５９】
Ａ．部分的アンフォールドタンパク質の地形のＧ−ｏ様モデル
アンフォールディング中に行われる自由エネルギーの変化を考慮する近似モデルは、固定したエネルギーを天然の状態におけるすべての接触に割り当て、ここでの接触は、固定したカットオフ距離ｒｃｕｔｏｆｆの中の１対の重（非水素）原子として定義されている。Ｇ−ｏ様モデルは、以前のタンパク質のフォールディングの試験でうまく行われた。Ｇ−ｏ様モデルは、天然のタンパク質の相互作用のトポロジーから生じる効果を分離しており、実際にアンフォールディングされている自由エネルギー地形は、単一の天然の状態の構造から容易に計算することができる。
【０３６０】
あるセグメントをアンフォールディングする総自由エネルギー消費は、アンフォールディングされた領域の立体配座のエントロピーの観点と合わせて、妨害される相互作用の数に依拠している。
【０３６１】
以下の式では、小文字の変数は原子を表し、大文字の変数は残基を表す。Ｔは、タンパク質中のすべての残基のセットとし、Ｕは、タンパク質中のアンフォールディングされている残基のセットとし、Ｆを、タンパク質中でフォールディングされている残基のサブセットとする（よって（Ｔ＝Ｕ∪Ｆ）。本来度合が高いアンフォールディングの機構は、複数の不規則な残基の連続した鎖からなる。ここで単一の連続したアンフォールディングされた鎖の近似値を採用し、この連続した鎖を不規則化するための自由エネルギー消費を計算した。
【０３６２】
残基Ｕのセットをアンフォールディングするための総自由エネルギーの変化
【数１】
2019505165.tif 000007
は、
【数２】
2019505165.tif 000008
である。
【０３６３】
アンフォールディングのエンタルピーの関数
【数３】
2019505165.tif 000009
は、Ｕ残基のセットのアンフォールディングにより妨害される相互作用の数により得られる。
【数４】
2019505165.tif 000010
【０３６４】
式２では、ｉ，ｊの合計は、アンフォールディングされた領域中の１つまたは両方の原子のいずれかを有するすべての固有の重原子対に関するものであり、ｒｉおよびｒｊは、原子ｉおよびｊの座標である。ｒｃｕｔｏｆｆ（４．８Åとされる）は、相互作用の距離のカットオフである。
【数５】
2019505165.tif 000011
は、ｘが正である場合、
【数６】
2019505165.tif 000012
、その他の場合は０により定義されているヘヴィサイド関数である。接触あたりのエネルギーは、室温でタンパク質を完全にアンフォールディングする際の、全体の実験的な安定性
【数７】
2019505165.tif 000013
をまとめるために選択されてもよい。
【数８】
2019505165.tif 000014
【０３６５】
結果はこの値に依存するものではなく；単にこの問題の一般的なエネルギー尺度全体を設定している。このモデルでは、この自由エネルギーを、４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌに相当する定数とした。この値は、エピトープ予測の方法で不規則であると考えられている同一のタンパク質の異なる領域に関する相対的な自由エネルギーの消費であるため、一番の関心ごとではない。
【０３６６】
アンフォールディングのエントロピー用語
【数９】
2019505165.tif 000015
の計算が、以下のＢに論述されている。
【０３６７】
Ｂ．エントロピーの計算
アンフォールディングされた状態のタンパク質と接触可能なマイクロ状態の数は、天然の状態で接触可能な数よりもかなり多いため、アンフォールディングに関する立体配座のエントロピーの好都合な増分が存在する。アンフォールディングされた領域の残基Ｋすべてを合計することによりアンフォールディングセグメントＵの総エントロピーが計算される。
【数１０】
2019505165.tif 000016
式中、
【数１１】
2019505165.tif 000017
は、参照文献［３］に列挙されている残基Ｋの３つの立体配座のエントロピー構成要素であり、
【数１２】
2019505165.tif 000018
は、天然の状態からアンフォールディングされた状態までの主鎖のエントロピーの変化であり、
【数１３】
2019505165.tif 000019
は、タンパク質中に埋もれた側鎖からタンパク質の表面までのエントロピーの変化であり、
【数１４】
2019505165.tif 000020
は、表面から溶液までの側鎖に関して得られたエントロピーである。
【０３６８】
単一の配列の近似では、部分的にアンフォールディングされた鎖のエンドポイントは、天然の構造ではこれら位置で固定されているため、補正をアンフォールディングされた状態の立体配座のエントロピーに適用する。これは、完全にアンフォールディングされた状態には存在しない、部分的にアンフォールディングされた構造における末端を拘束するために対となっているループエントロピーのペナルティが存在することを意味する。
【数１５】
2019505165.tif 000021
【０３６９】
ここで、
【数１６】
2019505165.tif 000022
は、確率を計算することにより、理想的なランダムウォークが、ランダムウォークの間にタンパク質に浸透が戻ることなく、Ｎステップの後に位置Ｒを中心とした体積ΔＴのボックスに戻ることが見いだされる。約ｎ＝２０の残基より短い長さの鎖では、溶けた鎖の大きさは、タンパク質の直径よりもずっと小さく、タンパク質の立体上の排除された体積が、入り込めない面として良好に処理されている。溶けた鎖の重合状態の数は、タンパク質の表面上の起点から、溶けたポリマーが入り込めない面に接触または当該面を通ることなくタンパク質に再度戻る場所まで移動するランダムウォークの割合により乗算されなければならない。上記の状態の割合は、以下の形態
【数１７】
2019505165.tif 000023
によって書くことができる。式中、Ｒは、出口と入口の場所の間の末端から末端の距離であり、Ｎは溶けた領域の残基の数であり、ａ、Ｉ、Ｖｃは、アンフォールディングされたポリペプチドのシミュレーションに適合することにより決定されたパラメータである。パラメータＩは、２つのＣα原子の間の有効なアーク長であり、Ｖｃは、各残基に関する平均排除体積である。シミュレーションの結果に式６を適合することにより、パラメータの値、ａ＝０．０２１７、Ｉ＝４．８６７、Ｖｃ＝３．２９１を得る。エントロピーのペナルティは一般的なものであり、配列とは無関係である。
【０３７０】
ジスルフィド結合は、アンフォールディングされたセグメントの動きをさらに制限するため、ループエントロピーの観点でさらに考慮することが必要である。存在する場合、ジスルフィドは、ループが通過しなければならない追加的なノードとして処理され、実際には、完全なループを２つの小さなループに分割し、両方に上述の境界条件を課す。
【０３７１】
Ｃ．自由エネルギー地形からのエピトープの予測
タンパク質を部分的にアンフォールディングする自由エネルギー地形を得た後、可変エネルギーの閾値Ｅｔｈを適用し、閾値より小さな自由エネルギーの消費を伴い、３つ未満のアミノ酸を含むセグメントを、エピトープの候補として予測する。この予測は、閾値Ｅｔｈの変動に関して安定している。
【０３７２】
この方法を使用して予測したエピトープは実施例２に記載されている。
【０３７３】
実施例２
【０３７４】
Ｉ．立体配座特異的エピトープ
本開示は、プリオン様の伝搬およびシナプス小胞との干渉がアルツハイマー病（ＡＤ）で起こるシナプスの機能不全および認知低下の原因であると考えられているミスフォールドされたタンパク質種である、オリゴマーのＡβペプチド、特には毒性のあるＡβペプチドのオリゴマーに選択性があり得る抗体に関するものである。Ａβは、ガンマセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断により生じる長さ３６〜４３アミノ酸のペプチドである。ＡＤ患者では、モノマー、線維および不溶性オリゴマーで存在する。Ａβ線維はＡＤ患者の脳にみられるアミロイド斑の主成分である。
【０３７５】
モノマー型では、Ａβは非構造化ポリペプチド鎖として存在する。線維型では、Ａβは異なる形態に凝集することができ、これらは多くの場合、株と呼ばれる。上記の構造のうちいくつかのものは固体ＮＭＲにより決定されたものであり、一部の線維構造はｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で得られたものであり、それ以外は、ＡＤ患者から採取したアミロイド斑を用いて線維を播種することにより得られたものである。
【０３７６】
オリゴマーは、毒性のある伝播性のペプチド種であり、モノマーのＡβをオリゴマー、最終的には線維へと動員し変換することが示唆されている。
【０３７７】
オリゴマー特異的抗体を作製するための必要条件の１つが、モノマーまたは線維には存在しないＡβペプチド上の標的の特定である。これらのオリゴマー特異的エピトープは、モノマーまたは線維の対応するセグメントと一次配列が異なるわけではないが、オリゴマーにおいて立体配座が異なるものとなる。つまり、これらは、モノマーにも線維にも存在しない独特の立体配座でオリゴマー中に存在することになる。
【０３７８】
これまでにオリゴマーの構造は決定されておらず、さらに、ＮＭＲの証拠から、オリゴマーが単一の明確に定められた構造ではなく、規則性に乏しく立体配座的に可塑性で順応性のある構造アンサンブルの形で存在することが示されている。さらに、オリゴマー種の濃度はモノマーまたは線維のものよりもはるかに低い（推定値には幅があるが、約１０００分の１またはそれ以下である）ため、この標的は捉えどころのないものとなっている。
【０３７９】
一次配列（例えば、直鎖状配列）の連続する鎖または線維構造に対する抗体は、その効果を制限する問題点をいくつか抱え得る。直鎖状ペプチド領域に対して生じさせた抗体は、オリゴマーに対して選択的ではない傾向があり、このため、モノマーとも結合する。モノマーの濃度は実質的にオリゴマーの濃度より高いため、そのような抗体治療剤は「標的に対する注意散漫」という問題を抱えることがあり、オリゴマー種を選択的に標的とし除去するのではなく、むしろ主としてモノマーと結合し、機能的Ａβの除去を促進する。アミロイド封入体に対して生じさせた抗体は主として線維と結合し、その結果、血管原性浮腫および／または微小出血を表すと考えられるシグナル変化を含めたアミロイド関連画像異常（ＡＲＩＡ）が生じた。
【０３８０】
オリゴマー型のＡβに選択的な抗体を開発するため、線維内で破壊され得る領域を特定した。理論に拘束されるのを望むわけではないが、線維における破壊がオリゴマーの表面にも露出するのではないかという仮説を立てた。しかし、オリゴマー上では、これらの配列領域は、モノマーおよび／または線維のものとは異なる立体配座で露出し得る。例えば、表面にあるとき、それらは線維またはモノマー（たとえば直鎖状ペプチド）にみられる対応する量より曲率が高く、露出表面積が大きく、それとは異なる二面角分布を示し、かつ／または、異なる、構造上のアライメントにより決定される全体的な立体配座の幾何学を有するターン領域の形で露出し得る。
【０３８１】
ＧＧＶＶ（配列番号１）を含む環状化合物を本明細書に記載し、図７のパネルＣに示す。この環状化合物は、上記の基準を１つまたは複数満たすよう設計したものである。
【０３８２】
線維内の破壊されやすい領域を特定することの潜在的有益性の１つは、それにより線維がモノマーからオリゴマーの核を形成する触媒基質としての役割を果たし得る二次的な核形成過程に関与する領域が特定され得ることである［３］。側鎖が露出した線維の領域の方が付近のモノマーとの異常な相互作用に関与してモノマーの付着を促進する可能性が高いと思われ、次いで、このように付着したモノマーは、線維の表面またはその付近で効率的に増大する濃度という環境に曝され、それによりオリゴマーを含めた多量体凝集体を形成する可能性が高くなるものと思われる。Ａβの露出領域を有する加齢線維または損傷線維は毒性オリゴマーの産生を増大させ得るものであり、線維上のこれらの不規則な領域に対する抗体は、このような伝播機序を阻止するのに効果的であるものと思われる。
【０３８３】
ＩＩ．集団座標予測およびＰｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏの予測
エピトープＧＧＶＶ（配列番号１）は実施例１に記載した集団座標およびＰｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏの手法から予測される２ＭＸＵ株由来のエピトープとして現れる。この予測されたエピトープを示す対応する図面は図１にある。パネルＡでは、グラフは左で、部分的に不規則な線維から生じたエピトープ予測を表し、右でグラフは、２つのエンドキャッピングモノマーが位置的に制限されている場合に部分的に不規則な線維から生じさせたエピトープ予測を表す。ＧＧＶＶ（配列番号１）エピトープは、ＰＤＢ構造２ＭＸＵの予測として現れる。線維構造２ＭＸＵでは、左および右からＧＧＶＶ（配列番号１）を挟んでいる２つの配列３７−４１  ＧＧＶＶＩ（配列番号８）および３６−４０  ＶＧＧＶＶ（配列番号６）が、集団座標を使用して予測されている（それぞれで、エンドキャップは制限されておらず、かつ制限されている）。
【０３８４】
ＧＧＶＶ（配列番号１）の残基３７〜４０が、２つの予測から現れ、よって、これら２つの予測の間をコンセンサス配列として処理する。Ｐｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏ法は、ＰＤＢの２ＭＸＵの鎖ＡおよびＬ（エンドキャップ鎖）に特異的な配列ＧＧＶＶＩＡ（配列番号１５）を含むＡβのアミノ酸３７〜４２からなるエピトープを予測する。鎖Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、およびＫでは、エピトープＧＧＶＶ（配列番号１）は、２ＭＸＵ構造を制限していないエンドキャップを使用して予測されている。
【０３８５】
ＩＩＩ．環状ペプチドの曲率
繊維２ＸＭＵの曲率のプロファイルに加えて、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の曲率プロファイルが、図２に示されている。グリシン残基Ｇ３７およびＧ３８は、直鎖状ペプチドとは異なる曲率を有するが、線維と類似の曲率を有する。環状ペプチドにおいて、バリン残基Ｖ３９は、直鎖状ペプチドまたは線維のＶ３９と比較して有意に大きな曲率を有する。環状ペプチドにおけるバリン残基Ｖ４０は、直鎖状ペプチドまたは線維とは異なる曲率を有し、ここでの曲率は、直鎖状ペプチドと線維との間の中間である。
【０３８６】
図２Ａは、異なる平衡シミュレーション時間から得た直鎖状ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の曲率をプロットしている。説明文は、１０ｎｓから開始し、３０ｎｓ、５０ｎｓ、７０ｎｓ、または９０ｎｓまで続行する。シミュレーション時間が増加すると、曲率の値は、上記および表１に報告された値に収束する。環状ペプチドに関する同様の試験が図２Ｂに示されており、線維に関しては図２Ｃに示されている。パネルＤ、Ｅ、およびＦは、それぞれ、直鎖状、環状、および線維の立体配座に関するシミュレーション時間の関数としての曲率の合計の収束を示している。収束の度合いは、エラーバーが、環状ペプチドで０．０１６ラジアン、直鎖状ペプチドで０．０５ラジアン、および線維で０．０１ラジアンであることを示している。曲率の値が、直鎖状アンサンブルおよび環状アンサンブルの両方で、７０ｎｓ後に収束したことが観察された。ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の残基インデックスの関数としての平均曲率が、パネルＧに示されており、ここで直鎖状ペプチドが実線の濃灰色で、環状ペプチドが実線の淡灰色で、線維が破線で示されている。残基３７Ｇ、３８Ｇ、３９Ｖ、および４０Ｖの曲率の数値が表１に提供されている。直鎖状配列および環状配列の曲率の値は線維の曲率の値の範囲内ではあるが、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの両方の曲率は、ＧＧＶＶ（配列番号１）に関して全体的に、線維のこれら残基の曲率よりも大きい。
【０３８７】
ペプチドのすべての残基の曲率の値が、個々の平衡アンサンブルにわたる平均化の後に得られる。パネルＡ、Ｂ、またはＣの直鎖状、環状、または線維の２ＭＸＵのプロットのポイント（ｘ，ｙ）は、ＧＧＶＶ（配列番号１）の天然の残基３７〜４０の曲率に対応する；パネルＡおよびＢにおけるこの範囲外の残基、すなわち、パネルＡの３６、およびパネルＢの３５、３６、および４１は、それぞれ、直鎖状構築物および環状構築物に存在する天然ではない残基に対応する。１０ｎｓから、増加していく時間３５ｎｓ、５０ｎｓ、７０ｎｓ、および９０ｎｓまで、アンサンブルを平均化することにより、収束が示される。
【０３８８】
図１〜１０のプロットに関しては、Ｃｈａｒｍｍ２７  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄを用いる陽溶媒（ＴＩＰ３Ｐ）での平衡シミュレーションからデータを得る。各アンサンブルのシミュレーション時間および立体配置数は以下の通りである。環状ペプチドアンサンブル：シミュレーション時間１００ナノ秒、２００００のフレームを含む；直鎖状ペプチドアンサンブル：シミュレーション時間１００ナノ秒、２００００のフレームを含む；２Ｍ４Ｊアンサンブル：２０ナノ秒、１２０００のフレームを含む。
【０３８９】
環状エピトープの曲率は直鎖状ペプチドまたは線維とプロファイルが異なるため、これらの残基を含むオリゴマー上のアミノ酸の対応する伸縮振動は線維またはモノマーのものとは異なる主鎖配向を有するのでなないかと予想される。しかし、曲率の大きさは非物理学的なものであると思われ、環状ペプチドを特徴付ける曲率の数値は線維のいくつかの位置で得られる。
【０３９０】
図２に基づき、残基３７Ｇ、３８Ｇ、３９Ｖ、および４０Ｖの曲率の値を、直鎖状ペプチド、環状ペプチド、および線維（２ＭＸＵ）ペプチドに関して表１に示す。
【表４】
2019505165.tif 000024
【０３９１】
ＩＶ．二面角分布
オリゴマー選択的エピトープを特定するためのさらなるコンピュータ支援が、オリゴマー内の露出エピトープの代わりである環状ペプチドの側鎖二面角分布ならびに主鎖二面角のラマチャンドランφおよびΨ分布の両方によって得られ、これらの分布は、いくつかの角について線維またはモノマーの対応する分布とは実質的に異なる。
【０３９２】
残基３８Ｇおよび４０Ｖの側鎖二面分布および主鎖二面分布を検討した。３８Ｇで示される二面角は環状形態と他の形態との間で区別があるが、大部分の二面角は、環状形態と他の形態との間で重複を示した。分布のパーセント重複、たとえば分布「環状」における「直鎖状」は、５度のエレメントに角度を分割し、次いで環状分布の９０％がカットオフを超え、１０％がカットオフ未満を維持するまで、無限の数量から確率振幅のカットオフを減少させることにより、得られる。これは、許容可能な角度における１つまたは複数の領域を定義する。次に、この領域の中の直鎖状の分布のパーセントを見出した。この手法は逆数ではなく、一般的に、分布対の間では異なる数を提供する（たとえば直鎖状／環状の４０Ｖ：Ｏ−Ｃ−Ｃα−Ｃβでは５０．９％および７６．７％）。
【０３９３】
環状ペプチドの３８Ｇに関するＯ−Ｃ−Ｃα−ＨＡ１およびＯ−Ｃ−Ｃα−ＨＡ２の二面角の分布は、直鎖状または線維とは異なっている。環状ペプチドのＯ−Ｃ−Ｃα−Ｎの二面角の分布は、直鎖状ペプチドと類似しているが、線維のものとは異なっている。３つすべての形態でのＯ−Ｃ−Ｃα−Ｃβの二面角の分布は類似している（図３）。以下の説明および図面では、ＣＡ、Ｃａ、またはＣαは、Ｃアルファ原子を説明するために互換可能に使用されており、このことはＣＢ、Ｃｂ、およびＣβなどに関しても同様である。  
【０３９４】
３８Ｇおよび４０Ｖに関する二面角分布を図３に示す。３８Ｇの二面角に関して、直鎖状ペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は以下の通りである：
Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＨＡ１：４．４％
Ｎ−ＣＡ−ＣＢ−ＨＡ２：３５．８％
Ｏ−Ｃ−ＣΑ−Ｎ：１７．４％。
【０３９５】
４０Ｖの二面角に関して、直鎖状ペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は以下の通りである：
Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢ：５０．９％。
【０３９６】
個々の二面角における比較的小さな差異の集積が、以下の実施例ＶＩＩＩでさらに説明されているように、ペプチドの全体的な立体配座に大きく有意な差異をもたらし得ることに留意されたい。
【０３９７】
３８Ｇの二面角に関して、線維におけるペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は以下の通りである：
Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＨＡ１：２．６％
Ｎ−ＣＡ−ＣＢ−ＨＡ２：１．１％
Ｏ−Ｃ−ＣΑ−Ｎ：５２％。
【０３９８】
４０Ｖの二面角に関して、線維におけるペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は以下の通りである：
Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢ：９８．６％。
【０３９９】
図３に基づき、表２は、直鎖状、環状、および線維（２ＭＸＵ）の形態における残基３８Ｇおよび４０Ｖの主鎖および側鎖の角度の、互いと比較した二面角分布のパーセント重複を示している。
【表５】
2019505165.tif 000025
【０４００】
上の側鎖二面角分布および主鎖二面角分布の解析によれば、残基３８Ｇが直鎖状ペプチドおよび線維のアンサンブルとの相違が最も大きい残基である。これらの方法により、３８Ｇは、立体配座選択性を付与するエピトープ上の重要な残基であり得る。残基４０Ｖはこれよりも小さな差異を示しているが、立体配座選択性の付与を支援し得る。
【０４０１】
図３に示されるデータに基づき、環状ペプチド種とそれ以外の種との間に分布の有意差がみられる二面角について二面角分布のピーク値を表３に挙げる。表３の列１は、検討した具体的な二面角であり、列２は、直鎖状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列３は、環状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列４は、直鎖状ペプチドと環状ペプチドの二面角分布のピーク値の差であり、列５は、線維構造２ＭＸＵにおけるペプチドＧＧＶＶ（配列番号１）の二面角分布のピーク値である。
【０４０２】
【表６】
2019505165.tif 000026
【０４０３】
Ｖ．側鎖のエントロピー
残基の側鎖のエントロピーは、
【数１８】
2019505165.tif 000027
から概算され得る。
式中、総和は特定の残基の側鎖の全二面角であり、ｐ（φｉ）は上で解析した二面角分布である。
【０４０４】
側鎖の残基部分のエントロピーの詳細な分析
３７Ｇ、３８Ｇ、３９Ｖ、および４０Ｖのそれぞれの二面角のエントロピーを検討した。各残基の二面角のエントロピーを図４のパネルＡ〜Ｄにプロットする。３９Ｖおよび４０Ｖのいくつかの二面角のエントロピーが直鎖状の形態と比較して減少しており、このことは、直鎖状の形態、おそらくはモノマーとは異なる傾向がある立体配座においてそれらの角のポーズが制約されることを示している。パネルＥは、線維のエントロピーと比較した、残基Ｇ３７、Ｇ３８、Ｖ３９、およびＶ４０に関する総側鎖エントロピー（主鎖のラマチャンドラン角を含まない）をプロットしており、たとえば環状ペプチドのΔＳはＳ（ｃｙｃｌｉｃ）−Ｓ（ｆｉｂｒｉｌ）である。このことは、エントロピーが、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドに関しては、線維と比較して増大しているが、環状ペプチドは直鎖状ペプチドよりも少ないエントロピーを有することを示している。パネルＦは、線維のエントロピーと比較した、残基Ｇ３７、Ｇ３８、Ｖ３９、およびＶ４０に関する側鎖＋主鎖の総エントロピーをプロットしている。これは、先と同様にエントロピーが線維と比較して増大しているが、環状ペプチドが直鎖状ペプチドよりも少ないエントロピーを有し、よってより強力に拘束されていることを示している。また、パネルＧは、直鎖状モノマーのエントロピーと比較した、残基Ｇ３７、Ｇ３８、Ｖ３９、およびＶ４０に関する立体配座の総エントロピーを再度プロットしている。このことは、環状ペプチドに存在する立体配座が、直鎖状ペプチドにおいて相対的に希少であり、よって、偶然にサンプリングされる可能性が低いであろうことを示している。このような拘束された一連の立体配座である確率は、おおよそｅｘｐ（−ＡＳ）≒０．００１である。線維の立体配座である確率は、同時に起こるエントロピーの損失をエンタルピー的に補完することにより、高められる。
【０４０５】
ＶＩ．ラマチャンドラン角
エピトープが抗体に対して露出する主鎖配向は、ペプチドが直鎖状型であるか、環状型であるか、または繊維型であるかによって異なる。この相違は、直鎖ペプチドおよび環状ペプチドの両方の残基３８Ｇについて、主鎖に沿ってラマチャンドラン角ファイおよびプサイ（またはΦおよびΨ）をプロットすることにより定量化することができる。配列ＣＧＧＧＶＧ（配列番号２）よりなる直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの両方ならびに線維構造２ＭＸＵにおけるＧＧＶＶ（配列番号１）の残基３８Ｇについて平衡シミュレーションでサンプリングしたファイ角およびプサイ角を図５にプロットする。図５から、環状ペプチドの主鎖二面角分布は、直鎖状ペプチドについてサンプリングした二面角の分布と異なり、線維構造２ＭＸＵにおける残基ＧＧＶＶ（配列番号１）の主鎖の角度とはより類似していることが、観察できる。
【０４０６】
環状の形態のラマチャンドラン角と９０％重複する直鎖状の形態の残基３８Ｇのラマチャンドラン角の確率は１６％である。環状の形態のラマチャンドラン角と９０％重複する線維形態の残基３８Ｇのラマチャンドラン角の確率は４３％である。環状ペプチドのラマチャンドラン角分布が繊維状形態のものと類似している可能性がより大きい。表４を参照されたい。
【表７】
2019505165.tif 000028
【０４０７】
具体例として、残基３８Ｇに関して、表５は、図５にプロットされているラマチャンドランΦ、Ψ角のピーク（最も可能性のある）値を提供する。環状ペプチドの分布は、（φ，ψ）＝（（７０°，１８０°）、（−８０°，１７５°）、（−８５，−１７０°）および（７５°，−１８０°）でピーク値（最も可能性のある値）を有する（４つのピークが存在する）。直鎖状ペプチドでは、最も可能性のある値は（φ，ψ）＝（８５°，５°）、および（−８５°，−１０°）であり（２つのピークが存在する）、線維構造２ＭＸＵでは、これらの最も可能性のある値は（φ，ψ）＝（−６０°，１４５°）、（８０°，１７０°）および（７０°，−１８０°）である。これら二面角のピーク値の多くの差異は、環状エピトープ立体配座に対して選択した抗体が直鎖状エピトープおよび線維エピトープに対して低い親和性を有する可能性があることを示している。
【０４０８】
３８Ｇに関するラマチャンドラン主鎖Φ、Ψ分布のピーク値（最も可能性が高い値）を表５に示す。表５の第１列には、検討した残基が記載されており、この残基は括弧内に示される２つの角ファイおよびプサイを示す。第２列には、直鎖状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）における３８Ｇのラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されており、第３列には、環状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）における３８Ｇのラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されており、最終列には、線維構造２ＭＸＵにおける３８Ｇのラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されている。
【０４０９】
【表８】
2019505165.tif 000029
【０４１０】
ＶＩＩ．エピトープの溶解度および抗原性
図６は、溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）をプロットしている。これは、環状ペプチドにおける残基ＧＧＶＶ（配列番号１）のＳＡＳＡが線維よりも大きいことを示しており、溶媒へより露出することにより抗体結合に接触できるであろうことを示唆している。この露出の増大は、残基Ｖ３９およびＶ４０にとって最も重要である。Ｖ３９は、線維に完全に埋め込まれており、環状ペプチドで最も露出されている。
【０４１１】
線維構造でのＧＧＶＶ（配列番号１）の立体配座の残基と比較して露出および抗体結合への接触可能性が異なる可能性が最も高い残基Ｖ３９、およびより低い度合でＶ４０が得られる。
【０４１２】
ＶＩＩＩ．環状ペプチド立体配座のアンサンブルは直鎖状立体配座または線維立体配座のアンサンブルとは異なる方法でクラスター化する
立体配座間に標準的な構造アライメントの測定基準を用い、次いでクラスタリング解析を実施することにより、配列ＧＧＶＶ（配列番号１）が環状ペプチドにおいて直鎖状ペプチドとは異なる立体配座を提示するという決定的証拠を確認することができる。直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドのＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）ならびにＰＤＢ  ＩＤ  ２ＭＸＵに対応する構造の完全長線維について立体配座の平衡アンサンブルを得る。これらのアンサンブルから残基ＧＧＶＶ（配列番号１）に関する立体配座のスナップショットを収集し、次いで、環状ペプチドアンサンブルの最も大きいクラスター、直鎖状ペプチドアンサンブルの最も大きいクラスター、および線維アンサンブルのＧＧＶＶ（配列番号１）の最も大きいクラスターの重心を構造的に整列させ、次にこの３つの値の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を記録し、プロットする。ここでは、最大クラスターアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｍａｘｃｌｕｓｔｅｒ）によりクラスタリングを実施する。図９に、直鎖状アンサンブル、環状アンサンブルおよび線維アンサンブルの３つの対応するＲＭＳＤ値を三次元散布図としてプロットする。
【０４１３】
表６は、直鎖状、環状、および線維（２ＭＸＵ）のペプチドの立体配座のＲＭＳＤの散布図のパーセント重複を示す。列１は、直鎖状の形態と環状の形態との間のパーセント重複がたったの３％ときわめて小さいことを示している。
【表９】
2019505165.tif 000030
【０４１４】
図９から、３つのアンサンブルが互いに異なる方法でクラスター化することは明らかである。特に、環状ペプチド構造のアンサンブルは直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブルとは異なっており、このことは、環状ペプチドエピトープに特異的な抗体が直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブル内で提示される立体配座に対して低い親和性を有する可能性があることを示している。環状ペプチドに対して生じさせた抗体は、Ａベータの直鎖状または線維の立体配座よりもオリゴマー形態を立体配座的に選択的かつ優先的に結合することができる。このような抗体はまた、これらの株で存在する荷電した末端のため、Ａベータ４０の様々な株を優先的に結合する可能性が低い。アンサンブル間の差異は、いくつかの側鎖および主鎖の二面角分布間に重複があるにも関わらず、起こる；上述の多くのの大抵の場合は小さな差次的な特徴が、全体的に異なる立体配座の分布をもたらす。
【０４１５】
アンサンブル間の重複を以下のように計算した。環状アンサンブルと重複する直鎖状アンサンブルの割合（％）は、まず、長さ０．１オングストロームの立方体（ｃｕｂｉｃ）のエレメントに、この３次元のＲＭＳＤのスペースアップの体積を分割することにより、得られる。次に、環状分布の複数のポイントの「カットオフ密度」を、カットオフ密度以上の環状分布密度を有する立方体が、環状分布の９０％を含むように見出す。このことは、環状分布を含む特徴的な体積を提供する体積（連続ではない場合がある）を定義し、異常値による不自然な結果を除去する。次に、この領域内にある直鎖状の分布から複数のポイントの割合を見出す。この方法を用いて、直鎖状における線維、直鎖状における環状などの重複パーセンテージを見出すことが可能である。一般的に、非常に低い重複が観察される。
【０４１６】
表６に、上記の方法により得た重複パーセンテージの数値を提供する。特に、環状ペプチドおよび線維ペプチド２ＭＸＵは０％の重複を有する。上記の方法により、環状分布と直鎖状分布の重複は３％であり、直鎖状ペプチドの分布と環状の分布の重複は１０％である。
【０４１７】
図９はのパネルＤ〜Ｇは、アンサンブルの重複値の収束を例示している。図９Ｄは、直鎖状および線維のアンサンブルが、１％未満に収束した重複を有することを示している。図９Ｅは、直鎖状アンサンブルが、約３％の収束値で環状アンサンブルと重複することを示している。図９Ｆは、直鎖状アンサンブルが、０．０４％未満の収束値で線維アンサンブルと重複することを示している。図９Ｇは、環状アンサンブルが、約１０％の収束値で直鎖状アンサンブルと重複することを示している。
【０４１８】
環状ペプチドアンサンブルの構造から最も大きなクラスターの重心を構成する、環状ペプチドアンサンブル由来のＧＧＶＶ（配列番号１）の代表的な立体配座の２つの図を、図７のパネル７に黒色で示す。同様に、最も大きなクラスターの重心を構成する、直鎖状ペプチドのアンサンブルの最も代表的な立体配座を図７に白色で示しており、これは、異なる配向を明示させるために、ＲＭＳＤを使用して最適に調節することにより、黒色で示されている環状ペプチドと重ね合わされている。図７のパネルＢは、先と同様にＲＭＳＤに関して調節することにより最適に重ね合わされた、配列ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）の環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドの対応する重心の立体配座を示す。黒色の立体配座は環状ペプチドの最も大きなクラスターの重心であり、よって環状ペプチドの典型的な立体配座を最良に表している。白色の立体配座は、直鎖状ペプチドの最大のクラスターの重心であり、環状の立体配座と調節して並べられている。重ね合わせられ、並べられた構造は、異なる二面角および全体的なエピトープの立体配座が、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドにとって好ましい傾向があることを示している。
【０４１９】
表７は、環状ペプチドアンサンブル、直鎖状ペプチドアンサンブル、および線維アンサンブルの重量中心の構造のＧ３７、Ｇ３８、Ｖ３９、およびＶ４０により占められている主鎖および側鎖のラマチャンドラン二面角の値を列挙している；環状および直鎖状の重量中心の立体配座は図７にプロットされている。これら重量中心の構造は、環状の立体配座と直鎖状または線維の立体配座との間で実質的に異なるいくつかの二面角を呈する。表７の列１は、対象の残基を提供し、列２は、対象の二面角を列挙し、列３は、環状アンサンブルの重量中心の構造の二面角の値を提供し、列４は、直鎖状アンサンブルの重量中心の二面角の値を提供し、列５は、線維アンサンブルの重量中心の二面角の値を提供し、列６は、環状の重量中心と直鎖状の重量中心との間の二面角の差異を提供し、列７は、環状の重量中心と線維の重量中心との間の二面角の差異を提供する。表７における二面角の多くは、大きくは拘束されておらず、たとえば１ＨＧ１、２ＨＧ１、３ＨＧ１、１ＨＧ２、２ＨＧ２、および３ＨＧ２で終結する二面角は１２０度未満である。しかしながら、環状の二面角の多くは、直鎖状または線維の重量中心の対応する二面角とは有意に異なることが明らかである。
【表１０】
2019505165.tif 000031
2019505165.tif 000032
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【０４２０】
図８は、再度、環状、直鎖状、および２Ｍ４Ｊ線維のアンサンブルに関する重量中心の構造を示している。表面積のプロファイルは抗体に対して提示することができ、重量中心の立体配座間で異なっている。具体的には、２Ｍ４Ｊは、残基Ｖ４０で終結し、よって荷電したカルボキシル末端を有する。よって、Ａベータ４０においてこの領域に対して生じさせた抗体は、環状ＧＧＶＶ（配列番号１）と結合する可能性が低く、逆に、環状ＧＧＶＶ（配列番号１）に対して生じさせた抗体は、Ａベータ４０においてこの領域と結合する可能性が少ない。
【０４２１】
図１０は、環状アンサンブルがＡベータ線維の他の株のいずれかと重複しないことを示している。具体的には、環状ペプチドアンサンブルと線維分布との間の重複は０である。図１０Ａは、ＰＤＢ  ２Ｍ４Ｊに関する結果を示し、図１０ＢはＰＤＢ  ２ＬＭＮに関する結果を示し、図１０ＣはＰＤＢ  ２ＬＭＰに関する結果を示している。
【０４２２】
実施例３
立体配座拘束エピトープを含む環状化合物構築
シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）などのＧＧＶＶ（配列番号１）を含むペプチドは頭−尾環化することができる。
【０４２３】
Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成などの既知の方法を単独で、または他の方法と組み合わせて用い、ＧＧＶＶ（配列番号１）と、好ましくは２個、３個もしくは４個のアミノ酸および／またはＰＥＧ単位を含むリンカーとを含む、直鎖状ペプチドを合成することができる。例えばＨａｍｌｅｙ（２０１４）［６］およびＲｏｂｅｒｔｓら（２０１２）［７］（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているカップリング化学を用いて、ＰＥＧ分子をＮ末端のアミン基に結合させることができる。直鎖状ペプチド化合物は、１）ペプチド＋リンカーのアミノ末端とカルボキシ末端を共有結合させてペプチド結合を形成させること（例えば、主鎖の環化）、２）ペプチド＋リンカー内のアミノ末端もしくはカルボキシ末端と側鎖を共有結合させること、または３）ペプチド＋リンカー内の２つの側鎖を共有結合させることにより環化され得る。
【０４２４】
環状化合物内の結合は、すべて通常のペプチド結合であっても（ホモデティック環状ペプチド）、あるいはエステル結合、エーテル結合、アミド結合もしくはジスルフィド結合などの他のタイプの結合を含んでも（ヘテロデティック環状ペプチド）よい。
【０４２５】
ペプチドをＮ末端もしくはＣ末端またはペプチドの内側にある、例えばシステインおよびホモシステインを含めたチオール含有残基またはメルカプタン含有残基の酸化により環化させ得る。例えば、ペプチドに隣接する２つのシステイン残基を酸化させてジスルフィド結合を形成させ得る。用い得る酸化試薬としては、例えば、酸素（空気）、ジメチルスルホキシド、酸化グルタチオン、シスチン、塩化銅（ＩＩ）、フェリシアン化カリウム、トリフルオロ酢酸タリウム（ＩＩＩ）またはその他の酸化試薬、例えば当業者に公知であり当業者に公知の方法とともに使用し得る酸化試薬などが挙げられる。
【０４２６】
米国特許出願公開第２００９／０２１５１７２号、米国特許出願公開第２０１０／０２４０８６５号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７５５９号には環状ペプチド合成に関連する方法および組成物が記載されており、米国特許第７，５６９，５４１には環化の様々な方法が記載されている。国際公開第０１／９２４６６号およびＡｎｄｒｅｕら，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：９１−１６９にはその他の例が記載されている。
【０４２７】
より具体的には、システイン残基が隣接し、かつ／または挿入されているスペーサーを含むリンカーを付加することにより、ＧＧＶＶ（配列番号１）エピトープを含む環状ペプチドを構築することができる。ペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加した非天然システイン残基の間でジスルフィド結合を形成させることにより、ペプチドを環状立体配座に構築することができる。また、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸の間でペプチド結合を形成させること（例えば、頭−尾環化）により、それを環状化合物に合成することができる。
【０４２８】
ペプチド合成を標準的な製造方法に従いＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（サニーベール、カリフォルニア州、米国）で実施する。
【０４２９】
例えば、ＧＧＶＶ（配列番号１）を含むペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加したシステイン残基間のジスルフィド結合を用いて、拘束された環状立体配座の立体配座エピトープＧＧＶＶ（配列番号１）を含むシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧＣ）（配列番号１２）環状ペプチドを構築することができる。２つの非天然システイン残基にうち１つをＧＧＧＶＶ（配列番号１１）のＣ末端に、１つをＮ末端に付加した。この２つのシステインを制御された条件下で酸化してジスルフィド架橋を形成させる、または頭部と尾部を反応させてペプチド結合を生じさせる。
【０４３０】
上記の通り、ＡベータオリゴマーのＧＧＶＶ（配列番号１）のアミノ酸の主鎖および側鎖の立体配座および配向を模倣するように環状ペプチドの構造を設計した。
【０４３１】
シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）
以下の方法（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）を用いてシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を合成した。標準的な従来のＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成により、保護された直鎖状ペプチドを２−クロロトリチルクロリド樹脂上で合成し、次いで、３０％ＨＦＩＰ／ＤＣＭを用いて樹脂から切断した。低濃度のＥＤＣ．ＨＣｌ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液を用いることにより、保護された直鎖状ペプチドを対応する保護された環状ペプチドに環化した。保護された環状ペプチドをＴＦＡにより脱保護して粗環状ペプチドを得、粗ペプチドをＲＰ  ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後、純粋な環状ペプチドを得た。
【０４３２】
直鎖状ペプチドＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）のアミド縮合によりシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を調製することができる。
【０４３３】
直鎖状化合物Ｃ−ＰＥＧ２−ＧＧＶＶＧ（配列番号３）のアミド縮合によりシクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＧＧＶＶＧ）（配列番号３）を調製することができる。
【０４３４】
直鎖状化合物ＣＧＧＧＶＶ−ＰＥＧ２（配列番号４）のアミド縮合により、シクロ（ＣＧＧＧＶＶ−ＰＥＧ２）（配列番号４）を調製することができる。
【０４３５】
直鎖状（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を調製した（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）。標準的な従来のＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成により、保護された直鎖状ペプチドをＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂上で合成し、次いで、保護されたペプチドをＴＦＡにより切断して粗ペプチドを得、粗ペプチドをＲＰ  ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後、純粋なペプチドを得、これを用いてＢＳＡをコンジュゲートした。
【０４３６】
免疫原構築
環状化合物シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を上記の通りに合成し、次いでＢＳＡおよび／またはＫＬＨとコンジュゲートした（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）。ＰＢＳ緩衝液に溶かしたＳＭＣＣによりＢＳＡまたはＫＬＨを再活性化し、次いで、純粋なペプチドをＰＢＳ緩衝液に溶かした溶液をコンジュゲーション混合物に加え、コンジュゲーション混合物を室温で２時間攪拌した。次いで、コンジュゲーション混合物を透析後に凍結乾燥させて、コンジュゲーション産物を得た。
【０４３７】
実施例４
抗体の作製および選択
立体配座拘束化合物、任意選択で環状化合物、例えばシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）ペプチドなどのＧＧＶＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドなどとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とを結合させる。カナダ動物管理協会により承認されたプロトコルに従ったマウスモノクローナル抗体作製（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社（ビクトリア、ブリティッシュコロンビア州、カナダ））のためにシクロペプチドを送る。ＢＳＡと結合した、抗体の作製に使用する立体配座ペプチドまたは関連ペプチド、例えばシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を用いて、マウス血清をスクリーニングする。
【０４３８】
実施例６にさらに記載するように、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を含む免疫原を用いてハイブリドーマを作製した。ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲにより、本明細書に記載される直鎖状ペプチドよりもシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）ペプチドと優先的に結合するハイブリドーマ上清をスクリーニングした。陽性ＩｇＧ分泌クローンを大規模生産およびプロテインＧを用いるさらなる精製に供する。
【０４３９】
実施例５
斑／線維との結合の有無の評価
新鮮な凍結ヒト脳切片または１０％ホルマリンで固定した後の凍結ヒト脳切片で免疫組織化学を実施することができる。過酸化水素の０．５％メタノール溶液を２０分間用いて、内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させることができる。ｐＨ６．０のクエン酸ナトリウムおよび２５分間の蒸気加熱を用いて抗原回復を達成することができ、次いで室温（ＲＴ）で３０分間冷却する。ＴＢＳ中で５〜７分間安定化させた後、切片を７０％ギ酸によりＲＴで１５分間処理し、次いでＴＢＳで３×１５分間洗浄する。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ  Ｃａｎａｄａ社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）と１時間インキュベートすることにより非特異的染色をブロックする。
【０４４０】
免疫染色には、本明細書に記載される抗体、陽性対照の６Ｅ１０（１μｇ／ｍｌ）およびアイソタイプ対照のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３（１μｇ／ｍｌ、Ａｂｃａｍ社）を一次抗体として用いる。切片を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３×５分間洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００、ＥＣＬ社）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ−Ｔで３×５分間洗浄する。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスする。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を５０倍、２００倍および４００倍の倍率で記録する。
【０４４１】
実施例６
方法および材料
免疫原
米国カリフォルニア州サニーベールのＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社で環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドを作製した。トリフルオロ酢酸対イオンプロトコルを用いてペプチドをＫＬＨ（免疫感作用）およびＢＳＡ（スクリーニング用）とコンジュゲートした。ペプチドを脱塩し、ＭＳおよびＨＰＬＣにより確認し、純度９５％であると判断された。ペプチドをＩＰＡ社に発送し、マウスを用いたモノクローナル抗体の作製に使用した。
【０４４２】
抗体
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体をいくつか作製した。
【０４４３】
５０日齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ケベック州）を免疫感作した。抗原を含有するがアジュバントは含有しない一連の皮下水性注射剤を１９日間にわたって投与した。環状ペプチド−ＫＬＨの０．５ｍｇ／ｍＬ無菌生理食塩水溶液の注射によりマウスを１匹当たり１００μｇで免疫感作した。マウスをＬａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社の換気ラックシステムで飼育した。第１９日、マウス全４匹を安楽死させ、ハイブリドーマ細胞系の作製用にリンパ球を回収した。
【０４４４】
融合／ハイブリドーマの発育
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）の存在下でマウスＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。融合した細胞をＨＡＴ選択を用いて培養した。この方法では、半固形メチルセルロース系ＨＡＴ選択培地を用いてハイブリドーマ選択とクローン化とを１つの段階に組み合わせる。半固形培地上で単一細胞由来のハイブリドーマが増殖してモノクローナルコロニーを形成した。融合事象から１０日後、得られたハイブリドーマクローンを９６ウェル組織培養プレートに移し、中期対数増殖期に達するまで（５日）ＨＴ含有培地で増殖させた。
【０４４５】
ハイブリドーマの解析（スクリーニング）
ハイブリドーマの組織培養上清を間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニング抗原（環状ペプチド−ＢＳＡ）（一次スクリーニング）で試験し、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ二次抗体を用いてＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の両方について探索し、ＴＭＢ基質で発色させた。このアッセイで０．２ＯＤ超であったクローンを次の試験ラウンドに進めた。陽性培養物をスクリーニング抗原で再試験して分泌を確認し、無関係の抗原（ヒトトランスフェリン）で再試験して非特異的ｍＡｂを除去し、偽陽性を除外した。抗体捕捉ＥＬＩＳＡにより目的とする全クローンにアイソタイピングを実施して、それらがＩｇＧアイソタイプであるのか、またはＩｇＭアイソタイプであるのかを判定した。また、目的とする全クローンを間接ＥＬＩＳＡにより他の環状ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートおよび直鎖状ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートで試験して、交差反応性を評価した。
【０４４６】
ＢＳＡとコンジュゲートしたシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）を用いた間接ＥＬＩＳＡにより、マウスハイブリドーマ抗体をスクリーニングした。
【０４４７】
ＥＬＩＳＡ抗体スクリーニング
簡潔に述べれば、ＥＬＩＳＡプレートを４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）コンジュゲートＢＳＡ  １００ｕＬ／ウェルでコートし、脱脂粉乳の３％ＰＢＳ溶液を用いて室温で１時間ブロックした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１：１０，０００の１００ｕＬ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０４４８】
さらなる試験のため陽性クローンを選択した。マウスのＧＧＶＶ（配列番号１）のハイブリドーマの陽性クローンを間接ＥＬＩＳＡにより、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）コンジュゲートＢＳＡおよびヒトトランスフェリン（ＨＴ）に対する反応性について試験した。プレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；または２）３７℃のｄＨ２Ｏ  Ｏ／Ｎ中０．２５ｕｇ／ウェルのＨＴ抗原５０ｕＬ／ウェルでコートした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０４４９】
ＥＬＩＳＡによるシクロＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）化合物と直鎖状ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）化合物の選択性
ＥＬＩＳＡプレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；２））４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの直鎖状ＣＧＨＤＳＧＧコンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；または３）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの陰性ペプチド１００ｕＬ／ウェルでコートした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０４５０】
アイソタイピング
抗体捕捉実験を用いてハイブリドーマ抗体にアイソタイピングを実施した。捕捉プレートをｐＨ９．６の炭酸塩コーティング緩衝液中、４℃で一晩、１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）抗体でコートした。ブロッキング段階は用いなかった。一次抗体（ハイブリドーマ上清）を加えた（１００ｕｇ／ｍＬ）。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：５，０００ヤギ抗マウスＩｇＧγ−ＨＲＰまたは１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ−ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０４５１】
ＳＰＲ結合アッセイ−一次および二次スクリーニング
抗体とＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーとの結合に関するＳＰＲ解析
氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）にＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーの調製組換えＡベータ４０およびＡベータ４２ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国）を溶かした。一晩蒸発させることによりＨＦＩＰを除去し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心機で乾燥させた。モノマーの調製には、ペプチド薄膜をＤＭＳＯで戻して５ｍＭとし、ｄＨ２Ｏでさらに１００μＭに希釈し、直ちに使用した。５ｍＭのＤＭＳＯペプチド溶液を無フェノールレッドＦ１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）で希釈して最終濃度１００μＭとすることによりオリゴマーを調製し、４℃で２４時間〜７日間インキュベートした。
【０４５２】
ＳＰＲ解析高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ−１）（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて、全ＳＰＲ測定を実施した。ＳＰＲ直接結合アッセイを用いて組織培養上清の一次スクリーニングを実施し、このアッセイでは、Ｈｉｇｈ  Ａｍｉｎｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＡＣ）センサーチップ（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）の個々のフローセル上にＢＳＡコンジュゲートペプチド、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、表面に抗体を流した。二次スクリーニングでは、プロテインＧで精製したｍＡｂをＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いて解析し、このアッセイでは、プロテインＡ誘導体化センサーチップ（ＸａｎＴｅｃ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ社、デュッセルドルフ、ドイツデュッセルドルフ、ドイツ）上に抗体を捕捉し、表面にＡベータ４０モノマー、Ａベータ４２オリゴマー、可溶性脳抽出物および脳脊髄液を流した。ＳＰＲ直接結合アッセイで、ＨＡＣセンサーチップの個々のフローセル上にＡベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、精製ｍＡｂを流すことにより抗体の特異性を検証した。
【０４５３】
可溶性脳抽出物およびＣＳＦ試料のＳＰＲ解析
可溶性脳抽出物およびＣＳＦの調製ＵＢＣ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｃｌｉｎｉｃで評価した患者からヒトの脳組織およびＣＳＦを採取した。推定ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準［５］に基づくものである。腰椎穿刺後１時間以内にＣＳＦをポリプロピレンチューブに収集し、処理し、１００μＬポリプロピレンバイアルに等分し、−８０℃で保管する。
【０４５４】
ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳ（カナダケベック州ラヴァルのＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社の無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルを添加したもの）に浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホノジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）する。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかける（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、−８０℃で保管する。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求める。
【０４５５】
ＳＰＲ解析ＡＤ患者４例および同年齢の対照４例の脳抽出物ならびにＡＤ患者９例および同年齢の対照９例のＣＳＦ試料をプールし解析した。プロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に精製ｍＡｂを捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
【０４５６】
Ａベータモノマーとの結合の有無の評価
組織培養上清の一次スクリーニングでは、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを直接結合アッセイに用いた。二次スクリーニングでは、Ａベータ４０モノマーおよびＡベータ４２オリゴマー、可溶性脳抽出物およびＣＳＦ試料を間接（捕捉）結合アッセイに用いた。
【０４５７】
一次スクリーニング
コグネイト環状ペプチドに対する抗体の結合の有無について組織培養上清をスクリーニングした。各試料を希釈し、固定化したペプチドおよびＢＳＡ参照の表面に１２０秒間、二重反復で注入し、次いで、３００秒間の解離相にのみランニング緩衝液を注入した。解析サイクル毎に、センサーチップ表面を再生した。ＢＳＡ参照表面およびブランクランニング緩衝液注入から結合を減算することによりセンサグラムを二重参照し、解離相の結合応答報告点を収集した。
【０４５８】
オリゴマー結合アッセイ
次の合成Ａベータ４２オリゴマーを上記の通りに作製および固定化し、抗体結合応答を解析した。Ａベータ４２オリゴマーに対する抗体結合応答を環状に対する結合応答と比較した。
【０４５９】
Ａベータオリゴマーとの結合の検証。
Ａベータ４２オリゴマー結合をさらに検証および確認するため、抗体を共有結合で固定化し、次いで、市販の調製済みの安定なＡベータ４２オリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー、フランス）を表面に注入した。
【０４６０】
結果
ＥＬＩＳＡ試験では、ハイブリドーマクローンの大部分がシクロペプチドと結合することがわかった。
【０４６１】
次のクローンをシクロＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）化合物および直鎖状ＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）化合物に対する選択性についてＥＬＩＳＡにより試験した。複数のクローンが直鎖状ＣＧＧＧＶＶＧコンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）よりも優先的にシクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）と結合した。
【０４６２】
アイソタイピングでは、クローンの大部分がＩｇＧ１クローン、ＩｇＧ２ａクローンおよびＩｇＧ３クローンを含めたＩｇＧであることがわかった。ＩｇＭクローンおよびＩｇＡクローンも複数同定されたが、それ以上追究しなかった。
【０４６３】
表面プラズモン共鳴技術を用いた直接結合解析を実施して、配列番号２の環状ペプチドと結合する組織培養上清中の抗体についてスクリーニングした。
【０４６４】
図１２は、ＳＰＲ直接結合アッセイの結果およびＥＬＩＳＡの結果の間の相関をプロットしたものであり、直接結合の結果とＥＬＩＳＡの結果との間に相関があることを示している。
【０４６５】
上記の通りに調製した環状ペプチド、直鎖状ペプチド、Ａベータ１〜４２モノマーおよびＡベータ１〜４２オリゴマーとの結合能についてクローンを再試験した。上記のＳＰＲを用いて結合アッセイを実施した（直接結合アッセイ）。表５に示すように、実施した結合アッセイに基づきクローンをいくつか選択した。
【０４６６】
選択したクローンはＩｇＧ  ｍＡｂであった。負の数は結合がみられなかったことを示している。
【０４６７】
【表１１】
2019505165.tif 000035
【０４６８】
ＥＬＩＳＡプレスクリーニング
ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡプレスクリーニングにより、直鎖状ペプチドと比較して環状ペプチドとの結合の増大を示すクローンを特定した。そのクローンの一部はＫＬＨ−エピトープリンカーペプチドに対して反応性であった。これらはさらなる検討から除外した。本明細書に記載されるアイソタイピング法を用いて、クローンの大部分がＩｇＧアイソタイプであることが明らかになった。
【０４６９】
表面プラズモン共鳴により測定する直接結合−一次スクリーニング
表面プラズモン共鳴を用いて、抗体クローンを含有する組織培養上清を環状ペプチド、直鎖状ペプチド（図１１Ａに示されている）、ＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマー（図１１Ｂに示されている）との直接結合について試験した。エピトープ／リンカーとの公差反応性のないＩｇＧクローンのみが示されている。大部分のクローンでは、直鎖状ペプチドに対する結合は０以下であり、対照的に、環状ペプチドに対する結合は、大部分のクローンで正である（図１１Ａ）。同様のパターンが、ＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマー（ＡβＯ）の結合性で観察される。ここでは６つのクローンが、参照表面よりもモノマーに対して反応性が低いが、これらを除くすべてのクローンがＡβＯに強力に結合する（図１１Ｂ）。
【０４７０】
図１３に、選択したクローンの結合プロファイルを比較して示す。表面プラズモン共鳴を用いて、環状ペプチド、直鎖状ペプチド、Ａベータ（Ａβ）モノマーおよびＡベータオリゴマー（ＡβＯ）における特定のエピトープに対する直接結合について各クローンを評価する。
【０４７１】
実施例７
二次スクリーニング
免疫組織化学
固定も抗原回復も実施していない凍結ヒト脳切片に免疫組織化学を実施した。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ  Ｃａｎａｄａ社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）と１時間インキュベートすることにより非特異的結合をブロックした。免疫染色には以下の一次抗体を使用した：マウスモノクローナルアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂならびに抗アミロイドβ６Ｅ１０（以上、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入）ならびにシクロペプチドに対して反応性を示す選択した精製クローン。いずれの抗体も１μｇ／ｍＬで使用した。切片を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３×５分間洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００、ＥＣＬ社）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ−Ｔで３×５分間洗浄した。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスした。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を２０倍および４０倍の倍率で記録した。Ａｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏｓｈｏｐでＬｅｖｅｌｓ  Ａｕｔｏ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いて画像を最適化した。
【０４７２】
ＣＳＦおよび脳抽出物
ＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ（Ｃ０４−０５９５）から承認を受け、メリーランド大学のＢｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋからヒト脳組織を入手した。ＵＢＣ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌｉｎｉｃ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓで評価した患者からＣＳＦを採取した。この試験はＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄにより承認を受けたものであり、ＣＳＦ試料を収集する前に参加者または法律上の近親者から書面による同意を得た。推定ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準に基づくものとした。腰椎穿刺後１時間以内にＣＳＦをポリプロピレンチューブに収集し、処理し、１００μＬポリプロピレンバイアルに等分し、−８０で保管した。
【０４７３】
ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳおよびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（ラヴェル、ケベック州、カナダ）の無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルに浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）した。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかけた（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、−８０℃で保管した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求めた。
【０４７４】
ＣＳＦ：ＡＤを有するドナー９例およびＡＤを有さないドナー９例からＣＳＦをプールした。精製ＩｇＧを全抗体とも３０マイクログラム／ｍｌの濃度で用いて、試料をＳＰＲにより解析した。マウスＩｇＧを抗体対照として使用し、いずれの実験も少なくとも２回反復した。
【０４７５】
抗体６Ｅ１０を用いてＣＳＦおよび脳抽出物での陽性結合を確認した。
【０４７６】
ＳＰＲ解析：ＡＤ患者の脳抽出物４例および同年齢の対照の脳抽出物４例をプールし解析した。ＴＢＳ中でホモジナイズした脳試料には前頭皮質のブロードマン第９野が含まれていた。いずれの実験も、高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーである、実施例６に記載のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ−１）（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて実施した。本明細書に記載されるシクロペプチドに対して作製した精製抗体をプロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
【０４７７】
結果
ＣＳＦ脳抽出物および免疫組織化学
いくつかのクローンをＣＳＦ、可溶性脳抽出物中でのＡベータとの結合能について試験し、死体ＡＤ脳の組織試料を表９に示す。表９では陽性度がプラス印の数により示されている。
【０４７８】
表９および表１０は、選択したクローンが本明細書に記載されるＳＰＲによる測定でモノマーよりもオリゴマーに対して結合選択性を有することのデータとなる。
【０４７９】
表９にはＩＨＣの結果もまとめてあり、ここでは、「＋／−」は、アイソタイプ対照と類似した染色またはアイソタイプ対照と異なる染色であるが明確な斑形態はみられないことを表す。
【０４８０】
６Ｅ１０抗体（Ａ）でみられる陽性斑染色と比較して、クローン３０４−４７（７Ｄ７）（Ｂ）では新鮮な凍結切片上に斑染色がみられない例を図１４に示す。
【０４８１】
ＧＧＶＶ（配列番号１）を含むシクロペプチドに対して生じさせた抗体が、対照の患者のものよりも高い度合でＡＤ患者の脳抽出物中のＡベータを結合する抗体を含むものであったことを図１５に示す。
【０４８２】
表９、１０および図１４に示されるように、免疫原としてＧＧＶＶ（配列番号１）を含むシクロペプチドを使用して、脳抽出物および／またはＣＳＦ中のＡベータに結合する産生させた抗体は、しかしながら、ＳＰＲではモノマーとあまり結合せず、ＩＨＣによる斑線維とあまり結合しなかった。
【０４８３】
【表１２】
2019505165.tif 000036
＊スコアリングは同じ試料カテゴリーで他のクローンに対して相対的なものである。
【０４８４】
【表１３】
2019505165.tif 000037
【０４８５】
実施例８
合成オリゴマー結合
共有結合で固定化した抗体との結合について市販の調製済み合成アミロイドベータオリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー）の連続２倍希釈物（７．８ｎＭ〜２０００ｎＭ）を試験した。対照抗体ｍＡｂ６Ｅ１０の結果を図１６Ａに示し、マウス対照ＩｇＧの結果を図１６Ｂに示す。シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体を用いた結果を図１６Ｃに示す。
【０４８６】
実施例９
ホルマリン固定組織での免疫組織化学
シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体を用いてヒト脳組織を評価した。患者はそれまでに、（ｉ）老人斑および神経原線維濃縮体を示すビルショウスキー銀法、（ｉｉ）アミロイドを示すコンゴーレッドならびに（ｉｉｉ）濃縮体を示し老人斑が「神経突起性」であることを確認するタウ免疫組織化学法の３部よりなる方法でアルツハイマー病であることが特徴付けられ診断されていた。この組織を用いて、選択したモノクローナル抗体クローンの斑反応性を試験した。脳組織を１０％緩衝ホルマリンで数日間固定し、Ｓａｋｕｒａ  ＶＩＰ組織処理装置でパラフィン処理した。組織切片にマイクロ波による抗原回復（ＡＲ）を実施するか、または実施せずに、１μｇ／ｍｌの抗体で探索した。陽性対照として、汎アミロイドベータ反応性抗体６Ｅ１０を選択した抗体クローンと同時にインキュベートした。抗体を抗体希釈剤（Ｖｅｎｔａｎａ社）で希釈し、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ（Ｖｅｎｔａｎａ社）で発色させた。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ  ＩＨＣ染色装置で染色を実施した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４５顕微鏡で画像を取得した。画像は神経病理学の専門知識を有する専門の病理学者が盲検的に解析した。
【０４８７】
下の表１１に示されるように、固定組織を用いると、被験抗体は抗原回復の有無を問わず、老人斑アミロイドの特異的染色が陰性であった。陽性対照には６Ｅ１０を用いた。
【０４８８】
【表１４】
2019505165.tif 000038
【０４８９】
実施例１０
オリゴマー伝播の阻害
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイを用いてアミロイドベータ（Ａβ）凝集に対する抗体の効果を検討することにより、その生物学的機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。Ａβ凝集は、予め形成された小さいＡβオリゴマーの核によって誘導され、この核を介して伝播し、単量体Ａβから可溶性オリゴマー、次いで不溶性線維への全過程には同時に、ベータシート形成の増大が伴う。このことはベンゾチアゾール塩のＴｈＴによってモニターすることができ、ＴｈＴがベータシートに富む構造に結合すると、その励起および発光の最大値がそれぞれ３８５ｎｍから４５０ｎｍおよび４４５ｎｍから４８２ｎｍに遷移し、それにより蛍光が増大する。簡潔に述べれば、Ａβ１〜４２（Ｂａｃｈｅｍ  Ａｍｅｒｉｃａｓ社、トーランス、カリフォルニア州）を可溶化し、超音波処理し、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、黒色の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社、モンロー、ノースカロライナ州）のウェルに加え、これに等体積のシクロペプチドに対する抗体または無関係のマウスＩｇＧ抗体アイソタイプ対照を加え、Ａβ１〜４２ペプチドと抗体のモル比を１：５とした。ＴｈＴを加え、プレートを室温で２４時間インキュベートし、１時間毎にＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてＴｈＴ蛍光を測定し記録した。全ウェルからバックグラウンド緩衝液の蛍光読取り値を減算し、さらに、対応するウェルから抗体単独のウェルの読取り値を減算した。
【０４９０】
図１７に示されるように、ＴｈＴ蛍光によりモニターしたＡβ４２凝集は、蛍光が最小である最初の遅滞期、蛍光が急激に増大する対数期および最後にＡβ分子種が平衡状態にあり蛍光の増大がみられないプラトー期を特徴とするＳ字形を示した。Ａβ４２と無関係のマウス抗体との共インキュベーションでは、凝集過程に対する有意な効果が全くみられなかった。これに対し、Ａβ４２と被験抗体との共インキュベーションでは、凝集過程のいずれの期も阻害された。図１７には抗体クローン４７（７Ｄ７；ＩｇＧ１アイソタイプ）で得られた結果が示されている。ＴｈＴ凝集アッセイは、ＡＤの病理発生に極めて重要なＡβ伝播およびモノマー、オリゴマー、前原線維および線維からのＡβ凝集のｉｎ  ｖｉｖｏの生物物理学的／生化学的段階を模倣するものであることから、シクロＣＧＧＧＶＶＧ（配列番号２）に対して生じさせた抗体はこの過程を完全に打ち消す可能性を秘めている。マウスＩｇＧ対照を用いて実施したアイソタイプ対照では阻害はみられなかった。
【０４９１】
実施例１１
アルツハイマー病の免疫療法に最適なプロファイルの達成：毒性Ａベータオリゴマーに特異的な抗体の合理的作製
目的：毒性アミロイドβオリゴマー（ＡβＯ）に特異的な抗体を作製すること
背景：現時点での証拠から、ＡβＯの伝播性プリオン様株は、モノマーおよび線維とは対照的に、ニューロンに対して優先的に毒性を示し、アルツハイマー病（ＡＤ）のタウ病態を誘発することが示唆される。さらに、臨床試験では、用量制限有害作用がＡβ線維認識と関係があることがわかっている。これらの観察結果から、安全性および有効性のためには毒性ＡβＯの特異的中和が望ましいものであり得ることが示唆される。
【０４９２】
設計／方法：本明細書に記載されるように、標準力場による分子動力学を用いてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅに蓄積されているＡβ線維の原子レベルの構造を攪乱するコンピュータシミュレーションを用いた。新生前原線維またはオリゴマーではわずかに安定な領域が露出する可能性が高いという仮説を立てた。オリゴマーにおいて提示される場合とモノマーまたは線維において提示される場合の抗原性プロファイルの差を定量化するクラスタリング解析、曲率、溶媒への露出、溶解度、二面角分布およびラマチャンドラン角分布をすべて用いて予測エピトープの立体配座特性を特徴付けた。局所的なＡβＯ立体配座を模倣し得る環状フォーマットで候補ペプチドエピトープを合成し、担体タンパク質とコンジュゲートし、マウスでのモノクローナル抗体作製に用いた。精製した抗体をＳＰＲおよび免疫組織化学によりスクリーニングした。
【０４９３】
結果：
コグネイト構造化ペプチドおよび合成ＡβＯを認識することが可能であり、非構造化ペプチド、リンカーペプチドまたはＡβモノマーとはほとんどまたは全く結合しないことに基づき、５種類の予測エピトープに対するＩｇＧクローンを６６種類選択し精製した。さらなるスクリーニングにより、対照と比較してＡＤ患者のＣＳＦおよび脳抽出物中の天然の可溶性ＡβＯと優先的に結合する抗体を特定した。ＡＤ脳の免疫組織化学的解析により、斑と反応しない抗体クローンを選択することができた。
【０４９４】
結論：コンピュータにより特定したＡβＯエピトープにより、天然のＡＤ  ＡβＯと選択的に結合しモノマーにも線維にも有意な交差反応性を示さないという所望の標的プロファイルを有する抗体を作製することができた。
【０４９５】
実施例１２
毒性阻害アッセイ
シクロペプチドに対して生じさせた抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性の阻害をラット一次皮質ニューロンアッセイで試験することができる。
【０４９６】
抗体および対照ＩｇＧをそれぞれ２ｍｇ／ｍＬなどの濃度に調節する。様々なモル比のＡベータオリゴマーと抗体を溶媒対照、Ａベータオリゴマー単独および神経保護ペプチドのヒューマニン（ＨＮＧ）などの陽性対照とともに試験する。
【０４９７】
例示的設定を表１２に示す。
【０４９８】
室温で１０分間プレインキュベートした後、体積を培地で８４０マイクロリットルに調節する。この溶液を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、溶液を一次皮質ニューロンに直接添加し、細胞を２４時間インキュベートする。ＭＴＴ試験を用いて細胞生存率を求めることができる。
【０４９９】
【表１５】
2019505165.tif 000039
【０５００】
この試験は、Ａベータオリゴマーの毒性の阻害を例証した３０４抗体クローン４７を使用して行った。
【０５０１】
実施例１３
ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性阻害アッセイ
シクロペプチドに対して生じさせた抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性の阻害をマウス行動試験でｉｎ  ｖｉｖｏで試験することができる。
【０５０２】
マウスの脳室内（ＩＣＶ）に注射する前に、抗体およびアイソタイプ対照をそれぞれＡベータ４２オリゴマーと２以上の様々なモル比で予め混合する。対照群には、溶媒単独を注射するマウス、オリゴマー単独を注射するマウス、抗体単独を注射するマウスおよび神経保護ペプチドのヒューマニンなどの陽性対照を注射するマウスを含める。あるいは、抗体をオリゴマーのＩＣＶ注射前、注射時および／または注射後に全身投与してもよい。オリゴマーのＩＣＶ注射から約４〜７日後に開始して、マウス空間認識試験（ＳＲＴ）、Ｙ迷路試験、モーリス水迷路モデルおよび新奇物体認識モデル（ＮＯＲ）などの学習および記憶に関する行動試験で認知を評価する。
【０５０３】
マウス空間認識試験（ＳＲＴ）は、海馬機能の尺度である地理的記憶を評価するものである（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。このモデルでは２チャンバの装置を使用し、この装置のチャンバは形状、模様および色が異なっている（すなわち、地理的差）。チャンバは透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ製の廊下で繋がっている。最初に個々のマウスを探索期の５分間、一方のチャンバにのみアクセスできる装置の中に入れておく。次いで、マウスをホームケージに３０分間戻し、「選択」期の５分間、再び装置の中に入れ、その間、マウスは両方のチャンバにアクセスできる。正常な認知機能を有するマウスは前回探索したチャンバを記憶しており、新規なチャンバで費やす時間の方が長い。ＤＩ＝（ＴＮ−ＴＦ）／（ＴＮ＋ＴＦ）で識別指数（ＤＩ）を算出し、式中、ＴＮは新規なチャンバで費やした時間の量であり、ＴＦは馴染みのあるチャンバで費やす時間の量である。毒性ＡベータオリゴマーによりＤＩの低下が起こるが、ヒューマニン陽性対照により一部レスキューされ得る。ＩＣＶ注射後の様々な時間におけるこの試験の成績を用いて、シクロペプチドに対して生じさせた抗体がＡベータオリゴマー毒性をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する可能性を評価することができる。
【０５０４】
Ｙ迷路試験（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）は、主として前頭前皮質（作業記憶）および海馬（空間構成要素）が仲介する空間作業記憶の試験である。マウスが２本の腕を探索することができるＹ字形の迷路の中にマウスを置く。短期記憶が無傷なマウスは連続試行で交互に２本の腕に行く。毒性ＡベータオリゴマーをＩＣＶ注射したマウスは認知に障害がみられ、ランダム値５０％（これに対し正常個体は約７０％）付近の交互のランダム行動を示す。この障害は、コリンエステラーゼ阻害剤ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）またはヒューマニンによりそれぞれ部分的または全面的に正常に戻る。この試験により、被験抗体のＡベータオリゴマー毒性に対する防御活性に関してまた別のｉｎ  ｖｉｖｏ評価ができる。
【０５０５】
モーリス水迷路はまた別の広く認められている認知モデルであり、主として海馬機能に依存する空間学習および長期地理的記憶を検討するものである（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。マウスを複数回の試行で、不透明な水面の下に隠したプラットフォームを見つけるよう訓練する。プラットフォームの位置の想起に関するマウスの学習成績は、視覚的な手掛かりおよび記録したビデオに基づく。マウスを水に放ってからプラットフォームを見つけるまでの時間は着実に短縮され、これをマウスの学習速度とし、複数日にわたって測定する。認知が正常なマウスでは、プラットフォームを見つけるのに必要な時間が連日短縮される（学習）。長期記憶の解析には、訓練後に試験を複数日反復する。つまり、プラットフォームを取り去り、以前のプラットフォームの位置の上を横切る回数または最初に横切るまでの時間を長期記憶を評価する尺度として用いる。毒性ＡベータオリゴマーをＩＣＶ注射したマウスは、学習および長期記憶の両方に欠陥がみられ、被験抗体の防御活性を評価するためのモデルとなる。
【０５０６】
新奇物体認識（ＮＯＲ）モデルは、新奇な物体を既知の物体より有意に長い時間をかけて調べるというげっ歯類の正常な行動を利用するものであり、この行動は主として嗅周皮質機能に依存する（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。習得試行でマウスまたはラットに２つの同一の物体を探索させる。短時間の試行間間隔の後、一方の物体を新奇な物体に置き換える。動物を活動領域に戻し、各物体を能動的に探索して費やした時間を記録する。正常なげっ歯類は馴染みのある物体を思い出し、新奇な物体の方の探索に有意に長い時間を費やす。これに対し、Ａベータオリゴマー処置したげっ歯類は明確な認知障害を示し、「馴染みのある」物体と「新奇な」物体の両方の探索に同程度の時間を費やす。これは、既知の臨床認知機能改善薬（例えば、ドネペジル）により一時的に正常に戻すことができる。ＮＯＲ試験を縦断研究で複数回実施して、験抗体の認知に対する潜在的な有益性を評価することができる。
【０５０７】
行動試験に加え、脳組織を収集し、シナプスマーカー（ＰＳＤ９５、ＳＮＡＰ２５、シナプトフィジン）および炎症マーカー（ＩＬ−１ベータ）のレベルを解析することができる。オリゴマーのＩＣＶ注射から約１４日後にマウスを屠殺し、生理食塩水を灌流する。海馬を収集し、急速凍結し、解析まで−８０℃で保管する。ホモジナイズした試料のタンパク質濃度をＢＣＡにより求める。ＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ社、米国）を用いてシナプスマーカーの濃度を求める。シナプスマーカーは通常、Ａベータオリゴマーを注射したマウスで２５〜３０％減少し、ヒューマニン陽性対照により９０〜１００％に回復する。ＩＬ−１ベータ炎症性マーカーの濃度は、Ａベータオリゴマーを注射したマウスで約３倍になり、この増大はヒューマニンによって大幅に抑えられる。これらのアッセイは、被験抗体の防御活性に関する分子レベルでのまた別の尺度となる。
【０５０８】
実施例１４
ｉｎ  ｖｉｖｏ伝播阻害アッセイ
Ａベータ毒性オリゴマーのｉｎ  ｖｉｖｏの伝播およびそれに関連する病態を様々なアルツハイマー病（ＡＤ）げっ歯類モデルで研究することができる。例えば、ヒトＡＰＰのトランスジェニックマウス（例えば、ＡＰＰ２３マウス）またはヒトＡＰＰとＰＳＥＮ１のトランスジェニックマウス（ＡＰＰＰＳ１マウス）は高レベルのＡベータを発現し、加齢とともに炎症および神経損傷を伴うアミロイド沈着が徐々にみられるようになる。オリゴマー含有脳抽出物の脳内接種によりこの過程１３、１４）を大幅に加速させることができる。これらのモデルは、脳内または全身に投与した抗体によるＡベータオリゴマー伝播の阻害を研究するためのシステムとなる。
【０５０９】
実施例１５
ＣＤＲシーケンシング
ＩｇＧ１重鎖とカッパ軽鎖とを有することが明らかになった３０４−７Ｄ７．１を重鎖および軽鎖のＣＤＲおよび可変領域に選択した。
【０５１０】
５’ＲＡＣＥならびに適切なマウス免疫グロブリンの重鎖（ＩｇＧ１／ＩｇＧ３／ＩｇＧ２Ａ）および軽鎖（カッパ）の可変領域配列を増幅する遺伝子特異的逆方向プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０５１１】
シーケンシング用に特異的バンドを切り取ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。
【０５１２】
各鎖について少なくとも８種類のクローンを選定し、シーケンシングの前に増幅領域の有無についてＰＣＲでスクリーニングした。選択したＰＣＲ陽性クローンにシーケンシングを実施した。
【０５１３】
ＣＤＲ配列を表１３に記載する。重鎖および軽鎖の可変部分のコンセンサスＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表１４に記載する。
【０５１４】
【表１６】
2019505165.tif 000040
【０５１５】
【表１７】
2019505165.tif 000041
【０５１６】
表１５．Ａベータエピトープ配列およびリンカーを有するＡベータ配列
ＧＧＶＶ（配列番号１）
ＣＧＧＧＶＶＧ、シクロ（ＣＧＧＧＶＶＧ）（配列番号２）
ＣＧＧＶＶＧ、Ｃ−ＰＥＧ２−ＧＧＶＶＧ（配列番号３）
ＣＧＧＧＶＶ、ＣＧＧＧＶＶ−ＰＥＧ２（配列番号４）
ＶＧＧＶ（配列番号５）
ＶＧＧＶＶ（配列番号６）
ＶＧＧＶＶＩ（配列番号７）
ＧＧＶＶＩ（配列番号８）
ＧＧＧＶＶＧ（配列番号９）
ＧＧＶＶＧ（配列番号１０）
ＧＧＧＶＶ（配列番号１１）
ＣＧＧＧＶＶＧＣ（配列番号１２）
ＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号１３）
ＭＶＧＧＶＶ（配列番号１４）
ＧＧＶＶＩＡ（配列番号１５）
【０５１７】
表１６
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１６）
【０５１８】
ここまで、現時点で好ましい例であると考えるものに関して本願を記載してきたが、本願は本開示の例に限定されないことを理解するべきである。これとは逆に、本願は、添付の請求項の趣旨および範囲に含まれる様々な改変および同等の構成を包含するものとする。
【０５１９】
刊行物、特許および特許出願はいずれも、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照により組み込まれることが明記された場合と同じように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、例えば表またはその他の箇所に記載されるアクセッション番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含めた本明細書に記載される各アクセッション番号に関連する配列は、その全体が参照により組み込まれる。
【０５２０】
請求項の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、記載全体と一致する最も広い解釈がなされるべきである。
【０５２１】
（本明細書で参照される参考文献の引用）
［１］Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ａ．Ｎ．Ｃｒｅｓｐｉ，Ｓｔｅｆａｎ  Ｊ．Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｐａｒｋｅｒ，ａｎｄ  Ｌｕｋｅ  Ａ．Ｍｉｌｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｍｉｄ−ｒｅｇｉｏｎ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｂｙ  ｌｅａｄｉｎｇ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ｜５：９６４９，２０１５｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０９６４９
［２］Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｊ．Ｈｉｌｓｅｒ  ａｎｄ  Ｅｒｎｅｓｔｏ  Ｆｒｅｉｒｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７５６−７７２，１９９６．Ｔｈｅ  ＣＯＲＥＸ  ａｐｐｒｏａｃｈ．
［３］Ｓａｍｕｅｌ  Ｉ．Ａ．Ｃｏｈｅｎ，Ｓａｒａ  Ｌｉｎｓｅ，Ｌｅｉｌａ  Ｍ．Ｌｕｈｅｓｈｉ，Ｅｒｉｋ  Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ，Ｄｕｎｃａｎ  Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｌｕｋｅ  Ｒａｊａｈ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｅ．Ｏｔｚｅｎ，Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｍ．Ｄｏｂｓｏｎ，ａｎｄ  Ｔｕｏｍａｓ  Ｐ．Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ−β４２  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｏｃｃｕｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１０（２４）：９７５８−９７６３，２０１３．
［４］Ｐｉｅｔｒｏ  Ｓｏｒｍａｎｎｉ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ａ．Ａｐｒｉｌｅ，ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ．Ｔｈｅ  ｃａｍｓｏｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２７（２）：４７８−４９０，２０１５．
［５］Ｄｅｂｏｒａｈ  Ｂｌａｃｋｅｒ，ＭＤ，ＳｃＤ；Ｍａｒｉｌｙｎ  Ｓ．Ａｌｂｅｒｔ，ＰｈＤ；Ｓｕｓａｎ  Ｓ．Ｂａｓｓｅｔｔ，ＰｈＤ；Ｒｏｄｎｅｙ  Ｃ．Ｐ．Ｇｏ，ＰｈＤ；Ｌｉｎｄｙ  Ｅ．Ｈａｒｒｅｌｌ，ＭＤ，ＰｈＤ；Ｍａｒｓｈａｉ  Ｆ．Ｆｏｌｓｔｅｉｎ，ＭＤ  Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ．Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９４；５１（１２）：１１９８−１２０４．ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｎｅｕｒ．１９９４．００５４０２４００４２０１４．
［６］Ｈａｍｌｅｙ，Ｉ．Ｗ．ＰＥＧ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ２０１４；１５，１５４３−１５５９；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ５００２４６ｗ
［７］Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＭＪ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ６４：１１６−１２７．
［８］Ｊ．Ｘ．Ｌｕ，Ｗ．Ｑｉａｎｇ，Ｗ．Ｍ．Ｙａｕ，Ｃ．Ｄ．Ｓｃｈｗｉｅｔｅｒｓ，Ｓ．Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｒ．Ｔｙｃｋｏ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＯＦ  ＢＥＴＡ−ＡＭＹＬＯＩＤ  ＦＩＢＲＩＬＳ  ＩＮ  ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ＢＲＡＩＮ  ＴＩＳＳＵＥ．ＣＥＬＬ  Ｖｏｌ．１５４  ｐ．１２５７（２０１３）
［９］Ｙ．Ｘｉａｏ，Ｂ．ＭＡ，Ｄ．ＭｃＥｌｈｅｎｙ，Ｓ．Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｆ．Ｌｏｎｇ，Ｍ．Ｈｏｓｈｉ，Ｒ．Ｎｕｓｓｉｎｏｖ，Ｙ．Ｉｓｈｉｉ，Ａ  ＢＥＴＡ（１−４２）ＦＩＢＲＩＬ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＩＬＬＵＭＩＮＡＴＥＳ  ＳＥＬＦ−ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＭＹＬＯＩＤ  ＩＮ  ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ．ＮＡＴ．ＳＴＲＵＣＴ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．Ｖｏｌ．２２    ｐ．４９９（２０１５）．
［１０］Ａ．Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｗ．Ｙａｕ，Ｒ．Ｔｙｃｋｏ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＣＯＮＳＴＲＡＩＮＴＳ  ＯＮ  ＱＵＡＴＥＲＮＡＲＹ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＩＮ  ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＢＥＴＡ−ＡＭＹＬＯＩＤ  ＦＩＢＲＩＬＳ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ｖ．４５    ４９８  ２００６．
［１１］Ｐａｇａｎｅｔｔｉ  ＰＡ，  Ｌｉｓ  Ｍ，  Ｋｌａｆｉ  ＨＷ，  Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌ  Ｍ．  Ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｔ  ａｎｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｓｉｔｅｓ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｔｏ  β−ａｍｙｌｏｉｄ，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  ４６  （１９９６）  ２８３−２９３．
［１２］Ｗｅｉｈｏｆｅｎ  Ａ，  Ｌｅｍｂｅｒｇ  ＭＫ，  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｅ，  Ｒｕｅｅｇｅｒ  Ｈ，  Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ａ，  Ｐａｇｎｅｔｔｉ  Ｐ，  Ｒｏｖｅｌｌｉ  Ｇ，  Ｍａｒｔｏｇｌｉｏ  Ｂ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｌｉｎ−ｔｙｐｅ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｗｉｔｈ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３；  ２７８（１９），  １６５２８−３３．
［１３］Ｋａｈｌｅｒｔ  Ｈ，  Ｗｅｂｅｒ  Ｂ，  Ｔｅｐｐｋｅ  Ｍ，  Ｗａｈｌ  Ｒ，  Ｃｒｏｍｗｅｌｌ  Ｏ，  Ｆｉｅｂｉｇ  Ｈ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｏｆ  Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ．  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６  Ｆｅｂ；  １０９（２）：  １４１  −９．
【図１−１】
2019505165.tif 000043
【図１−２】
2019505165.tif 000044
【図２−１】
2019505165.tif 000045
【図２−２】
2019505165.tif 000046
【図２−３】
2019505165.tif 000047
【図２−４】
2019505165.tif 000048
【図３】
2019505165.tif 000049
【図４−１】
2019505165.tif 000050
【図４−２】
2019505165.tif 000051
【図４−３】
2019505165.tif 000052
【図４−４】
2019505165.tif 000053
【図５】
2019505165.tif 000054
【図６】
2019505165.tif 000055
【図７−１】
2019505165.tif 000056
【図７−２】
2019505165.tif 000057
【図８】
2019505165.tif 000058
【図９−１】
2019505165.tif 000059
【図９−２】
2019505165.tif 000060
【図９−３】
2019505165.tif 000061
【図１０−１】
2019505165.tif 000062
【図１０−２】
2019505165.tif 000063
【図１１】
2019505165.tif 000064
【図１２】
2019505165.tif 000065
【図１３】
2019505165.tif 000066
【図１４】
2019505165.tif 000067
【図１５】
2019505165.tif 000068
【図１６−１】
2019505165.tif 000069
【図１６−２】
2019505165.tif 000070
【図１６−３】
2019505165.tif 000071
【図１６−４】
2019505165.tif 000072
【図１７】
2019505165.tif 000073
【図１８−１】
2019505165.tif 000074
【図１８−２】
2019505165.tif 000075
【配列表】
2019505165000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月4日(2018.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019505165000001.app
【国際調査報告】
2019505165.tif 000076
2019505165.tif 000077
2019505165.tif 000078
2019505165.tif 000079
2019505165.tif 000080