【手続補正書】
【提出日】平成19年4月6日(2007.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の機能的成熟β細胞を含む哺乳動物膵臓細胞を得るための方法であって、該方法は、以下：
少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドを、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の分化を達成するために十分な量で有する、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団を提供する工程であって、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団は、前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する細胞において富化され、それにより、複数の機能的成熟β細胞が得られる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記マーカーがＣＫ１９である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する細胞において、ＦＡＣＳによって富化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、複数の幹細胞または管上皮細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞が、臍帯、胚、および樹立幹細胞株からなる群から選択される１つ以上の供給源由来である細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上の膵島が、前記管上皮細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、不死化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団の増殖を達成するために十分な量の少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数の機能的成熟β細胞を含む哺乳動物膵臓細胞集団を得るための方法であって、該方法は、以下：
前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団を、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の分化を達成するために十分な量の、少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドと共に提供する工程であって、該細胞の約１０％〜約２０％が、該マーカーを発現し、それにより、複数の機能的成熟β細胞が得られる工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記細胞が、機能的成熟β細胞の前記集団の、約２倍〜約５倍までの増殖を誘導するために十分な量の、少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
増殖が、約３倍〜約４倍である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記提供が、インビトロであり、前記ＥＧＦレセプターリガンドの前記量が、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌであり、そして前記ガストリンレセプターリガンドの前記量が、約０．５μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記提供が、インビトロであり、前記ＥＧＦレセプターリガンドの前記量が、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌであり、そして前記ガストリンレセプターリガンドの前記量が、約０．６μｇ／ｍｌ〜約１．５μｇ／ｍｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の機能的成熟β細胞が、ＰＤＸ−１を発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前駆体哺乳動物膵臓細胞が、ヒト細胞またはブタ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガストリンレセプターリガンドが、ヒトガストリン１−１７／Ｌｅｕ１５である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥＧＦレセプターリガンドが、ヒトＥＧＦ５１Ｎである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
以下：
複数の増殖性成熟膵臓β細胞を含む細胞培養物であって、該増殖性膵臓β細胞が、少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドおよび少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドを提供する方法によって得られ、ここで、該細胞培養物は、ＣＫ１９管細胞において富化され、そしてガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドと共に提供されない細胞と比較した場合、ＰＤＸ−１の発現が増加する、細胞培養物
を、含有する組成物。
【請求項１９】
ＣＫ１９を発現する前駆体細胞を、少なくとも２０％含むように富化された、哺乳動物膵臓前駆体細胞の集団。
【請求項２０】
膵島細胞分化を刺激する化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
哺乳動物膵臓前駆体細胞の集団を、該化合物および必要に応じて少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供する工程；および
ＰＤＸ−１の発現を、該化合物が膵島細胞分化を達成する指標として検出する工程、
を、包含する、方法。
【請求項２１】
前記ガストリンレセプターリガンドは、ヒトガストリン１−１７／Ｌｅｕ１５である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
患者における１型糖尿病を処置するための方法において使用するためのガストリンとＥＧＦとの組み合わせであって、該方法は、該患者へ１つ以上のドナー膵臓から膵島を移植する工程を包含し、ここで改善は、移植のための機能的膵島の数を増大させるに十分な量において、移植する前の該膵島を、ガストリンとＥＧＦとの組み合わせと接触させることを包含する、組み合わせ。
【請求項２３】
１型糖尿病を有する患者への膵島移植に必要とされるドナー膵臓の数を減少させるためのエキソビボでの方法であって、該方法は、ドナー膵臓由来の膵島と、ガストリンとＥＧＦとの組み合わせとを、移植のための機能的膵島の数を増大させるに十分な量において接触させ、それによって、各移植に必要とされるドナー膵臓の数を減少させる工程、を包含する方法。
【請求項２４】
請求項１〜１７、２１および２２のいずれか１項に記載の方法によって得られる複数の増殖性成熟膵臓β細胞を含む細胞培養物を含む、組成物。
【請求項２５】
被験体への移植によって１型糖尿病を処置するための医薬品の製造における、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
機能的成熟膵臓β細胞の組成物を得るためのエキソビボ方法であって、
（ａ）臍帯、胚または樹立培養幹細胞株から哺乳動物前駆体膵臓β細胞を得る工程；
（ｂ）ＣＫ１９、ネスチン、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、炭酸脱水酵素ＩＩ、ＤＵ−ＰＡＮ２、炭水化物抗原１９−９およびムチンＭＵＣ１のうちの１種以上を発現する前駆体膵臓β細胞の集団を単離する工程；
（ｃ）該前駆体膵臓β細胞を、前駆体膵臓β細胞の数を増大させるに十分な量において、ＥＧＦレセプターリガンド単独でかまたはガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドと組み合わせて処理する工程；ならびに
（ｄ）該増大させた数の前駆体膵臓β細胞を、機能的成熟膵臓β細胞の組成物を得るために該前駆体膵臓β細胞を機能的成熟膵臓β細胞へ分化させる量において、ガストリンレセプターリガンドおよび／またはＥＧＦレセプターリガンドで処理する工程；
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドが、ガストリンもしくはコレシストキニン、またはこれらに対する活性なアナログもしくはフラグメント、あるいは内因性ガストリンの分泌を増大させる化合物のうちの１種以上である、請求項１または２に記載のエキソビボ方法。
【請求項２８】
前記ガストリンは、ガストリン３４、ガストリン１７、ガストリン８またはそれらのアナログ、フラグメントもしくは改変物である、請求項２７に記載のエキソビボ方法。
【請求項２９】
前記ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドは、内因性ガストリンの分泌を増大させる化合物である、請求項２６、２７または２８に記載のエキソビボ方法。
【請求項３０】
前記ＥＧＦレセプターリガンドは、ＥＧＦ１−５３、ＥＧＦ１−４８、ＥＧＦ１−４９、ＥＧＦ１−５２、またはそれらのフラグメントもしくは活性なアナログ、あるいはＴＧＦα  １〜４８、ＴＧＦα  １〜４７、ＴＧＦα  １−５１、アンフィレグリンまたはポックスウイルス増殖因子である、請求項２６、２７、２８または２９に記載のエキソビボ方法。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のプロセスによって得られる機能的成熟膵臓β細胞の組成物。