(57)【要約】本発明は、新規抗BARF1モノクローナル抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖の1個の可変ドメインおよび軽鎖の1個の可変ドメインを少なくとも含む、受容体BARF1または相同体の細胞エピトープに対するモノクローナル抗体であって、重鎖可変ドメインVHが、SEQ.ID.N.3、SEQ.ID.n.4、およびSEQ.ID.n.5によってそれぞれコードされるCDR1配列、CDR2配列、CDR3配列を含み、軽鎖可変ドメインが、SEQ.ID.n.6の配列、配列：AGCACATCC、およびSEQ.ID.n.7の配列によってそれぞれコードされる軽鎖VKのCDR1配列、CDR2配列、CDR3配列を含む、モノクローナル抗体。
【請求項２】
重鎖の可変ドメインがSEQ.ID.n.1に相当する配列によってコードされ、軽鎖の可変ドメインがSEQ.ID.n.2に相当する配列によってコードされることを特徴とする、請求項1に記載の受容体BARF1または相同体の細胞エピトープに対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
完全免疫グロブリンならびに重鎖の1個の可変ドメインおよび軽鎖の1個の可変ドメインを少なくとも含む免疫グロブリン断片を含む群より選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の受容体BARF1または相同体の細胞エピトープに対するモノクローナル抗体。
【請求項４】
Fab断片、F(ab')2断片、単鎖Fv断片（scFv）を含む群より選択されることを特徴とする、前記請求項に記載の受容体BARF1または相同体の細胞エピトープに対するモノクローナル抗体。
【請求項５】
単鎖Fv断片（scFv）がリンパ系シグナル伝達ドメインに連結されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の受容体BARF1または相同体の細胞エピトープに対するモノクローナル抗体。
【請求項６】
リンパ系シグナル伝達ドメインがCD28、CD3ζ、CD137、OX-40を含むことを特徴とする、前記請求項に記載の受容体BARF1または相同体の細胞エピトープに対するモノクローナル抗体。
【請求項７】
マウス抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の受容体BARF1または相同体の細胞エピトープに対するモノクローナル抗体。
【請求項８】
抗BARF1抗体の重鎖の可変部分をコードするSEQ.ID.n.1、抗BARF1抗体の軽鎖の可変部分をコードするSEQ.ID.n.2、前記重鎖のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列をそれぞれコードするSEQ.ID.n.3、SEQ.ID.n.4、SEQ.ID.n.5、前記軽鎖のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列をそれぞれコードするSEQ.ID.n.6、配列：AGCACATCC、およびSEQ.ID.n.7からなる群より選択される、ヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体の使用を含む、キメラ抗原受容体の調製の方法。
【請求項１０】
エプスタインバー（Epstein-Barr）ウイルス（EBV）に関連する病理、またはそうでなければ前記抗体によって認識されるBARF1のエピトープの相同体を発現する病理の、処置、治癒、または診断において使用するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
医学的使用のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
養子免疫治療のためのリンパ系細胞の形質導入における医学的使用のための、前記請求項に記載の抗体。
【請求項１３】
腫瘍の処置または診断における医学的使用のための、請求項12に記載の抗体。
【請求項１４】
上咽頭癌（NPC）、ホジキンリンパ腫（HL）、バーキットリンパ腫、非ホジキンEBV+リンパ腫、移植後EBV+リンパ球増殖、T細胞性およびNK細胞性の新生物、ならびに胃癌（GC）を含む群より選択される腫瘍の処置または診断における医学的使用のための、請求項12に記載の抗体。
【請求項１５】
SEQ.ID no.10に相当する配列を有するウイルス抗原ペプチド08/08、またはSEQ.ID No.14に相当する配列を有するウイルス抗原ペプチド08/08'、および免疫原性エピトープのようなそれらの細胞相同体。
【請求項１６】
SEQ.ID No.11に相当する配列を有するウイルス抗原ペプチド08/08-1および免疫原性エピトープのような細胞相同体。
【請求項１７】
医学的使用のための、それぞれ請求項15または16に記載のウイルス抗原ペプチド08/08もしくは08/08'または08/08-1。
【請求項１８】
免疫化およびワクチン接種における医学的使用のための、それぞれ請求項15または16に記載のウイルス抗原ペプチド08/08もしくは08/08'または08/08-1。
【請求項１９】
腫瘍に対する免疫化およびワクチン接種における医学的使用のための、それぞれ請求項15または16に記載のウイルス抗原ペプチド08/08もしくは08/08'または08/08-1。
【請求項２０】
上咽頭癌（NPC）、ホジキンリンパ腫（HL）、バーキットリンパ腫、非ホジキンEBV+リンパ腫、移植後EBV+リンパ球増殖、T細胞性およびNK細胞性の新生物、ならびに胃癌（GC）を含む群より選択される腫瘍に対する免疫化およびワクチン接種における医学的使用のための、それぞれ請求項15または16に記載のウイルス抗原ペプチド08/08もしくは08/08'または08/08-1。
【請求項２１】
有効量の請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体または請求項15もしくは16のそれぞれに記載のペプチドのうちの1種と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的調製物。
【請求項２２】
薬理学的に有効な量の請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体を患者へ投与する工程を含む、腫瘍の処置または診断の方法。
【請求項２３】
薬理学的に有効な量の請求項15または16に記載のペプチドを患者へ投与する工程を含む、腫瘍の処置または診断の方法。
【請求項２４】
薬理学的に有効な量の請求項21に記載の薬学的調製物を患者へ投与する工程を含む、腫瘍の処置または診断の方法。
【請求項２５】
腫瘍がエプスタインバーウイルスに関連する、請求項22〜24のいずれか一項に記載の腫瘍の処置または診断の方法。
【請求項２６】
腫瘍が、前記抗体によって認識されるBARF1のエピトープの相同体を発現する、請求項22に記載の腫瘍の処置または診断の方法。
【請求項２７】
腫瘍が上咽頭癌（NPC）、ホジキンリンパ腫（HL）、バーキットリンパ腫、非ホジキンEBV+リンパ腫、移植後EBV+リンパ球増殖、T細胞性およびNK細胞性の新生物、ならびに胃癌（GC）を含む群より選択される、請求項22〜26のいずれか一項に記載の腫瘍の処置または診断の方法。
【請求項２８】
薬理学的に有効な量の請求項15または16に記載のペプチドを患者へ投与する工程を含む、患者の免疫化またはワクチン接種の方法。
【請求項２９】
薬理学的に有効な量の請求項21に記載の薬学的調製物を患者へ投与する工程を含む、患者の免疫化またはワクチン接種の方法。
【請求項３０】
腫瘍が上咽頭癌（NPC）、ホジキンリンパ腫（HL）、バーキットリンパ腫、非ホジキンEBV+リンパ腫、移植後EBV+リンパ球増殖、T細胞性およびNK細胞性の新生物、ならびに胃癌（GC）を含む群より選択される、請求項28または29に記載の患者の免疫化またはワクチン接種の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の領域、具体的には、腫瘍の処置および診断において適用を見出す。
【背景技術】
【０００２】
エプスタインバー（Epstein-Barr）ウイルス（EBV）は、上咽頭癌（NPC）、ホジキンリンパ腫（HL）、バーキットリンパ腫、いくつかのT細胞性およびNK細胞性のリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、移植後EBV+リンパ球増殖、ならびに胃癌（GC）のようなヒト腫瘍に関連しているγヘルペスウイルスである。
【０００３】
人口の約95％が通常、このウイルスに無症候性感染している。時に、ウイルスは、再活性化され、唾液中に感染性の形態で存在することができる。そのディファレンシャルな発現が、腫瘍に見られる様々な潜伏形態を特徴づける潜伏遺伝子に加えて、2種の非コード非ポリアデニル化RNA、即ち、EBER1およびEBER2が、ウイルス潜伏の全ての形態において発現されている。
【０００４】
最近の研究は、BARF1が、EBV関連NPCの潜伏感染腫瘍細胞および胃癌において発現されるタンパク質であることを示した。
【０００５】
BARF1は、ヒトコロニー刺激因子1の受容体（癌遺伝子FMS）と限定的な相同性を共有しており、齧歯類の繊維芽細胞およびサルの初代上皮細胞において発現された時、腫瘍形成活性を示す。
【０００６】
BARF1遺伝子は、B95.8株のEBVゲノムのヌクレオチド位置165,449〜166,189に位置しており、221アミノ酸のタンパク質をコードする。この遺伝子は、分泌型で存在することもできる、EBV感染細胞の表面に発現される膜貫通タンパク質をコードする。
【０００７】
霊長類由来の上皮初代細胞に対するBARF1の不死化効果（Wei et al.1997）および齧歯類繊維芽細胞における悪性形質転換（Wei and Ooka 1989）が、既に記載されている。
【０００８】
興味深いことに、BARF1の細胞外ドメインは、切断されて細胞から放出され得、インビボで増殖因子として作用することができ；単核細胞からのαインターフェロンの分泌を阻害することができ、インビボで細胞分裂促進活性を有する。
【０００９】
このタンパク質の細胞内型および分泌型の生物学的効果は、未だ完全には解明されておらず、分泌型BARF1の受容体の同定は、インビボでのBARF1の機能を理解するために非常に重要であると考えられる。
【００１０】
EBV関連新生物の発生におけるBARF1の重要な病原的役割のため、そしてこのタンパク質がこれらの腫瘍のための妥当な治療標的を表し得ることを考慮すると、BARF1特異的モノクローナル抗体（mAb）の開発は、これらの新生物のより効果的なコントロールのための相当の治療的関連性を有する戦略を表し得る。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、BARF1特異的モノクローナル抗体（mAb）の開発および単離について記載し、そのインビトロ特徴決定および動物モデルにおいてインビボで誘導された治療効果の説明も記載する。
【００１２】
mAbは、インビボでの効率的な治療活性の必須の前提条件である、インビトロでの補体活性化アッセイ（補体依存性細胞傷害、CDC）および抗体依存性細胞傷害（ADCC）の誘導において有効であることが示されている。
【００１３】
さらに、蛍光色素とコンジュゲートされた抗BARF1抗体を使用して実施されたインビボ体内分布分析は、EBV陽性腫瘍塊のレベルでの選択的な抗体局在を示している。
【００１４】
mAbは、異なる型のEBV陽性細胞またはEBV陰性細胞を事前に移植されたSCIDマウスへの注射によるインビボ受動免疫治療実験のために使用され、EBV陽性BARF1発現腫瘍細胞の腫瘍成長を選択的に遅延させ得ることが示されている。
【００１５】
最後に、ルシフェラーゼが形質導入された腫瘍細胞のインビボイメージングを使用して、mAbのインビボの活性を経時的にモニタリングし、腫瘍を保持するマウスにおける処置の治療効果を確認することが可能であった。
【００１６】
全体として、これらのデータは、BARF1が、標的とすることができる新規のEBV特異的抗原であること、そして抗BARF1モノクローナル抗体の使用が、ウイルスに関連した腫瘍の検出および処置のための強力なツールであり得ることを示している。
【００１７】
発明の目的
第1の目的において、本発明は、抗BARF1モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインの相補性決定領域（CDR）の配列、ならびにこれら重鎖および軽鎖の全可変ドメインの配列を提供する。
【００１８】
具体的には、重鎖の配列CDR1、CDR2、およびCDR3は、SEQ.ID.n.3、4、および5にそれぞれ相当し、軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3は、配列SEQ.ID.n.6、配列AGCACATCC、および配列SEQ.ID.7にそれぞれ相当する。
【００１９】
重鎖の可変ドメインに関して、これは、SEQ.ID.n.1に相当する配列によってコードされ、軽鎖の可変ドメインは、SEQ.ID.n.2に相当する。
【００２０】
各配列は、本発明のさらなる目的を表す。
【００２１】
従って、本発明は、前記の配列から構成された免疫グロブリン遺伝子の発現に由来する抗体を記載する。
【００２２】
本発明によると、抗体は、完全免疫グロブリンまたは重鎖の1個の可変ドメインおよび軽鎖の1個の可変ドメインを少なくとも含む免疫グロブリン断片であり得る。
【００２３】
断片は、好ましくは、Fab断片、F(ab')2断片、単鎖Fv断片（単鎖可変断片、scFv）、またはそれらの誘導体（ジアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）等）である。
【００２４】
具体的な局面において、この単鎖Fv断片は、キメラ抗原受容体（CAR）のフォーマットでリンパ系シグナル伝達ドメインに連結される。
【００２５】
さらに具体的には、ドメインは、CD28、CD3ζ、CD137、OX-40を含み得る。
【００２６】
本発明の抗体またはその断片は、ヒト化またはマウスのいずれかであり得る。
【００２７】
抗体は、医学的使用のためにも記載され、具体的には、エプスタインバーウイルス感染に関連する腫瘍またはそうでなければ該抗体によって認識されるBARF1のエピトープの相同体を発現する腫瘍の処置および診断に関して、本明細書に記載される。
【００２８】
具体的には、上咽頭癌（NPC）、ホジキンリンパ腫（HL）、バーキットリンパ腫、非ホジキンEBV+リンパ腫、T細胞性およびNK細胞性のリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、移植後EBV+リンパ球増殖、ならびに胃癌（GC）のようなヒト癌の処置および診断におけるものである。
【００２９】
抗体は、キメラ抗原受容体の作製および養子免疫治療のためのリンパ系細胞の形質導入における使用のためにも記載される。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、SEQ.ID n.10に相当する配列を有するウイルス抗原ペプチド（以後、08/08と示される）またはSEQ.ID n.14に相当する配列を有するウイルス抗原ペプチド、および、好ましくはSEQ.ID n.11を有するものである、SEQ.ID n.11またはSEQ.ID n.12に相当する配列を有するオクタマーを提供する。
【００３１】
そのようなペプチドおよびそのようなオクタマーは、免疫原性エピトープのような細胞相同体と共に、医学的使用のため、具体的には、免疫化および能動的ワクチン接種のプロトコルにおける医学的使用のため、本明細書に記載される。
【００３２】
この目的のため、本発明の抗体またはペプチドのうちの1種もしくは複数種を、1種または複数種の薬学的に許容される賦形剤と共に含む薬学的調製物が、本明細書に記載される。
【００３３】
本発明は、本特許出願において記載された抗体を、薬理学的に有効な量、患者へ投与する工程を含む、腫瘍の診断または処置の方法を記載する。
【００３４】
さらなる局面によると、本発明は、前記のウイルス抗原ペプチドのうちの1種を、薬理学的に有効な量、患者へ投与する工程を含む、腫瘍の診断または処置の方法を記載する。
【００３５】
具体的には、そのようなペプチドは、SEQ.ID.n.10またはSEQ.ID.n.11またはSEQ.ID.n.12またはSEQ.ID.n.14に相当する配列を有するものであり；好ましくは、そのようなペプチドは、SEQ.ID.n.11に相当する。
【００３６】
本発明は、前記の抗体またはウイルス抗原ペプチドのうちの1種を含む薬学的調製物を、薬理学的に有効な量、患者へ投与する工程を含む、腫瘍の処置または診断の方法をさらに記載する。
【００３７】
具体的な局面によると、本発明の処置または診断の方法は、エプスタインバーウイルス関連腫瘍に関する。
【００３８】
もう一つの具体的な局面によると、腫瘍は、該抗体によって認識されるBARF1のエピトープと相同のエピトープを発現する。
【００３９】
さらなる局面によると、本発明は、前記のウイルス抗原ペプチドを、薬理学的に有効な量、患者へ投与する工程を含む、患者の免疫化またはワクチン接種（能動的ワクチン接種でありうる）の方法を記載する。
【００４０】
具体的には、そのようなペプチドは、SEQ.ID.n.10またはSEQ.ID.n.11またはSEQ.ID.n.12またはSEQ.ID.n.14に相当する配列を特徴とし；好ましくは、そのようなペプチドは、SEQ.ID.n.11に相当する。
【００４１】
別の局面によると、本発明は、前記の抗体またはペプチドのうちの1種を含む薬学的調製物を、薬理学的に有効な量、患者へ投与する工程を含む、患者の免疫化またはワクチン接種の方法を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】（a）Seq.ID n.13に相当するBARF1タンパク質のアミノ酸配列。（b）ドットブロット。免疫のために使用されたペプチド、およびペプチド08/08'に由来するペプチドを、PVDF膜に結合させ、抗BARF1抗体によって標識した。ペプチド08/08'および08/08-1についてのみ陽性が存在し、従って、それらは選択された抗原の最小エピトープを表す。（c）フローサイトメトリー分析の結果としての3種のBARF1陽性細胞（GRANTA-519、C-666、BL-41 B95.8）ならびに2種のBARF1陰性細胞株（RAJIおよびBL-41）の蛍光および平均蛍光強度（MFI）の百分率。（d）フローサイトメトリー。MKN-45細胞に、BARF1をコードするプラスミドを形質導入し、抗BARF1 mAbによって標識した。形質導入された細胞株は、高い陽性シグナルを示した。
【図２】（a）CDC（補体依存性細胞傷害）。異なる濃度の抗BARF1 mAbに曝し、続いて補体に曝した後のEBV陽性細胞株（GRANTA-519、C-666、およびBL-41 B95.8）ならびにEBV陰性細胞株（BL-41）の特異的溶解の百分率。全てのEBV陽性細胞株が、程度は異なるが溶解された一方で、EBV陰性細胞株は溶解されなかった。各実験条件について、アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。（b）ADCC（抗体依存性細胞傷害）。抗BARF1 mAbに曝し、続いて、ヒトエフェクター細胞（PBMC）に曝した後のEBV陽性細胞株（GRANTA-519およびC-666）ならびにEBV陰性細胞株（BL-41）の特異的溶解。全てのEBV陽性細胞株が、程度は異なるが溶解された一方で、EBV陰性細胞株は溶解されなかった。各実験条件について、アイソタイプ対照、および免疫グロブリンの非存在下でのエフェクター細胞の存在（PBMCのみ）を、陰性対照として使用した。
【図３】体内分布。Alexa680とコンジュゲートした抗BARF1 mAbのi.v.注射の後の異なる日における、MKN-45およびMKN-45 BARF1を形質導入した腫瘍塊から得られた蛍光の統計分析。ANOVA分析は、二群間の統計的に有意な差（p＜0.001）を示す。
【図４】a：SCIDマウスにおけるC-666細胞（5×106個）のs.c.接種によって誘導された腫瘍の成長動態。5匹のマウスは処置されず、9匹のマウスは全部で1mgの抗BARF1抗体を受けた。統計分析（ウィルコクソン検定）は、抗BARF1 mAbの投与によって達成された腫瘍成長の低下が、24日目、26日目、および28日目に、統計的に有意であることを示した（それぞれ、p＝0.0028、p＝0.002、およびp＝0.0026）。b：0日目に5×106個のC-666-LUX細胞を皮下注射されたマウスの生物発光分析。画像は、対照群（対照、未処置）および処置群（抗BARF1 mAb）の14日目および49日目をさす。値は、放射輝度（p/sec/cm2/sr）として表される。c：0日目に5×106個のC-666-LUX細胞をs.c.注射されたマウスの放射輝度の統計分析。対照群は処置されず、処置群は抗BARF1 mAb（1mg）を受けた。49日目に、処置群の平均輝度は、対照と比較して有意に低い（p＜0.001）。
【図５】a.SCIDマウスにおいてGRANTA-519細胞（5×106個）の皮下接種によって誘導された腫瘍の成長動態。9匹のマウスは処置されず、13匹のマウスは全部で1mgの抗BARF1抗体を受けた。統計分析（ウィルコクソン検定）は、抗BARF1 mAbの投与によって達成された腫瘍成長の低下が、21日目に統計的に有意であることを示した（p＜0.001）。b：GRANTA-519細胞を静脈内接種されたSCIDマウスの生存率分析。カプランマイヤー試験は、処置群の生存率の統計的に有意な改善を示した（p＝0.002）。c：0日目に3×106個のGRANTA-519-LUX細胞を静脈内注射されたマウスの生物発光分析。画像は、対照群（未処置）および処置群（抗BARF1 mAb）の14日目および21日目をさす。リンパ節区域におけるシグナルの存在が観察され得る。値は、放射輝度（p/sec/cm2/sr）として表される。d：0日目に3×106個のGRANTA-519-LUX細胞をi.v.注射されたマウスの放射輝度の統計分析。21日目に、処置群の平均放射輝度は、対照群と比較して有意に低かった（p＜0.05）。
【図６】CDR1、CDR2、およびCDR3の配列が示されたハイブリドーマ3D4のVH配列。
【図７】CDR1、CDR2、およびCDR3の配列が示されたハイブリドーマ3D4のVK配列。
【図８】BARF1タンパク質の配列。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
以下の配列が同定された。
VHハイブリドーマ3D4
2019501209.tif 000002
更に詳しくは以下の通り。
2019501209.tif 000003
【００４４】
VKハイブリドーマ3D4
2019501209.tif 000004
更に詳しくは以下の通り。
2019501209.tif 000005
【００４５】
材料および方法
細胞株：
以下のヒト細胞株を使用した：GRANTA-519（マントルB細胞リンパ腫、EBV+、BARF1+）、C-666（NPC、EBV+、BARF1+）、BL-41（バーキットリンパ腫、EBV-）、BL-41 B95.8（EBVに感染した同細胞株）、Raji（リンパ芽球様細胞株B、EBV+、BARF1-）、およびMKN-45（胃癌、EBV-）。
【００４６】
B95.8は、EBVビリオンの生成のために使用されるサル細胞株である。MKN-45を除く全ての細胞株を、10％熱不活化ウシ胎仔血清（FBS、Gibco）、10mM Hepes、1mMピルビン酸Na、2mM Ultraglutamine（全て、Lonza BioWhittaker）、および1％抗生物質/抗真菌剤（Gibco）を補足したRPMI 1640培地（Euroclone）（以下、完全RPMI培地と呼ぶ）中で培養した。
【００４７】
MKN-45は、同じ添加剤を補足したDMEM（完全DMEM培地と呼ぶ）中で増殖させた。
【００４８】
NS0細胞株は、ハイブリドーマの生成のために使用されるマウス骨髄腫株である。NS0細胞は、10％熱不活化FBS、10mM Hepes、5×10-3mM βメルカプトエタノール、2mM Ultraglutamine、1％抗生物質/抗真菌剤を補足したDMEM中で培養される。
【００４９】
抗体作製
BARF1配列を、バイオインフォマティクスツールを使用して分析した。
【００５０】
3種類の主要なエピトープが同定された。
2019501209.tif 000006
【００５１】
ペプチドを、Imject Maleimide Activated mcKLHキット（Thermo Scientific）を使用して、KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）とコンジュゲートし、マウスのワクチン接種のために使用した。
【００５２】
抗BARF1ハイブリドーマは、完全フロイントアジュバント（CFA）中のKLHとコンジュゲートされた各ペプチド100μgによって1回、次いで、不完全フロイントアジュバント（IFA）中のKLHとコンジュゲートされた各ペプチド100μgによって2回、皮下免疫されたBALB/cマウスの脾細胞との、マウスNS0骨髄腫細胞の融合に由来した。
【００５３】
必要である時には、付加的なワクチン接種をIFAで実施した。
【００５４】
標準的な手法に従って、免疫されたマウスに由来する脾細胞を収集し、ポリエチレングリコール（PEG）を使用してNS0骨髄腫細胞と融合させた。
【００５５】
融合の後、96穴プレートに細胞を播種し、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT）を含有する培地中でハイブリドーマを選択した。
【００５６】
選択培地中で増殖することができるハイブリドーマ株を、酵素イムノアッセイ（ELISA）およびフローサイトメトリーによって抗BARF1反応性についてスクリーニングした。
【００５７】
ELISA試験は以下のように実施した：96穴プレートを、100μL/ウェルの特異的ペプチド（10μg/mL）と共に4℃で一晩インキュベートし；37℃で2時間、1％BSAによってブロッキングした後、100μLのハイブリドーマ上清と共に37℃で1時間インキュベートし、繰り返し洗浄した後、HRPとコンジュゲートされた抗マウスヤギ抗体（GE Healthcare）と共に1時間インキュベートした。
【００５８】
OPD（Sigma-Aldrich）を使用したシグナル発生の後、50μLの3N塩酸によって反応を止め、Victor Multilabel X3プレートリーダー（Perkin Elmer）によって450nmで吸光度を読み取った。フローサイトメトリーのため、GRANTA-519細胞をクローン上清によって標識し、次いで、二次FITC抗マウス抗体を添加し（Dako）、FACSCalibur（BD）を使用して細胞を分析した。
【００５９】
フローサイトメトリーによって評価して陽性シグナルを与えるクローンのみを、その後の実験のために使用した。
【００６０】
抗体特異性をドットブロットによって評価した。
【００６１】
簡単に説明すると、元のペプチド08/0827-40および08/08'28-38に由来する4アミノ酸がオーバーラップしている8アミノ酸ペプチドを合成した：実際、全ての実験のために使用されたmAbが、この後者のペプチドによって免疫されたマウスに由来する。
【００６２】
オーバーラップしている8アミノ酸ペプチド、ならびに元の08/0827-40ペプチド、08/08'28-38ペプチド、05/08201-221ペプチド、および06/08104-120ペプチドを、PVDF膜（約10μg/スポット、Millipore）に移した。
【００６３】
PBS/10％Tween/3％BSAによってブロッキングした後、プレートを、抗BARF1 mAbと共にインキュベートし、次いで、HRPとコンジュゲートされた抗マウスヤギIgと共にインキュベートし、最後に、ECL Plus Western Blotting Substrate（Pierce）を使用してシグナルを検出した。
【００６４】
XRS Chemidoc装置およびQuantityOneソフトウェア（バージョン4.6）（いずれもBioRad）を使用して、化学発光を評価した。
【００６５】
インビトロアッセイ
標識
EBV陰性細胞株（BL-41）、EBV陽性BARF1陰性細胞株（Raji）、ならびにEBV陽性BARF1陽性細胞株（GRANTA-519、C-666、およびBL-41 B95.8）を、氷上で15分間、1μgの抗BARF1 mAbによって標識し、次いで、二次抗マウスFITC IgGによって標識した。
【００６６】
BARF1を特異的に同定するため、BARF1を形質導入した細胞株を作製した。
【００６７】
BARF1プラスミドは、Dottor Dolcettiの研究室から厚意によって提供され、これを使用して、Phoenix細胞を前記のようにトランスフェクトした。
【００６８】
BARF1-レトロウイルス（BARF1-RV）粒子は-80℃で保管した。
【００６９】
EBV陰性細胞株MKN-45を、ポリブレン（8mg/mL）の存在下で、2mL BARF1-RVと共に6穴プレートに播種した（4×106個）。
【００７０】
遠心分離（1800rpmで45分）の後、細胞を32℃で2時間インキュベートし、培地をBARF1-RVおよびポリブレンを含有する2mLの新鮮な培地に交換した。
【００７１】
さらなる遠心分離の後、MKN-45細胞を32℃で4時間インキュベートし、次いで、培地を新鮮な完全DMEM培地に交換し、37℃で一晩放置した。
【００７２】
翌日、完全DMEM培地を、ポリブレンを含む4mlのBARF1-RVに交換し、遠心分離し；32℃での5時間のインキュベーションの後、ウイルス粒子を含有している培地を、完全DMEMに交換し、37℃でインキュベートした。
【００７３】
G418（250μg/mL、Sigma-Aldrich）による選択を翌日開始した。
【００７４】
G418の存在下で1週間培養した後、BARF1を形質導入した細胞および野生型細胞を、RT-PCRによってBARF1 mRNAの存在について分析した。
【００７５】
抗BARF1抗体を使用したフローサイトメトリーによっても、細胞を分析した。
【００７６】
補体依存性細胞傷害（CDC）
標的細胞（6×105個のGRANTA-519細胞、C-666、およびRaji）に、37℃で1時間30分間、100μCi Na251CrO4（Perkin-Elmer）を負荷した。
【００７７】
次いで、細胞を2×103細胞/ウェルで三つ組で播種し、約1μgの抗BARF1 mAbによって標識した。
【００７８】
次いで、細胞を、37℃で1時間、25％ヒト血清（非熱不活化であり、従って、補体の全てのタンパク質の活性を維持している；Lonza）を含有する200μLのRPMIに再懸濁した。
【００７９】
陰性（または自然放出）対照は、mAbによって標識されず、陽性対照（最大放出）には100μLの5％Triton（Sigma Aldrich）が添加された。
【００８０】
インキュベーションの後、γ線カウンター（Cobra Gamma Counting System, Packard Instrument Company）を使用して、100μLの上清を放射能について評価した。
【００８１】
細胞傷害指数を以下のように評価した。
2019501209.tif 000007
式中、
％試験は、mAb＋補体で得られた細胞傷害の百分率であり、
％自然は、補体単独の細胞傷害の百分率である。
【００８２】
抗体依存性細胞傷害（ADCC）
ADCCは、カルセイン-AMプロトコル（Invitrogen）を使用して実施された。
【００８３】
簡単に説明すると、1×106個の標的細胞を、5％FBSを補足した1mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS-FBS、5.4mM KCl、0.3mM Na2HPO4、0.4mM KH2PO4、0.2mM NaHCO3、0.5mM MgCl2、0.4mM MgSO4、137mM NaCl、全てSigma Aldrich）に再懸濁し、37℃で30分間、7.5μLのカルセイン-AM（1mg/mL）によって標識した。
【００８４】
次いで、細胞を、20μg/mL、10μg/mL、および5μg/mLの濃度の抗BARF1 mAbによって標識し；陰性対照をHBSS-FBSのみで実施した。
【００８５】
陽性対照として、標的細胞を5％Tritonによって溶解した。
【００８６】
播種の後、細胞をエフェクター細胞に添加した：健常ドナー由来の解凍直後のPBMCを、異なるエフェクター:標的比（300:1、150:1、および75:1）で37℃で4時間播種し、次いで、100μLの上清を収集し、不透明96穴プレート（Nunc）に播種した。
【００８７】
RTで15分後、プレートをVictor X3 Multilabel Reader Plate装置を使用して、485nmで読み取った。
【００８８】
溶解の百分率（％Lys）は以下のように計算した。
2019501209.tif 000008
式中、
試験は、実験値であり、
自然は、未処置の標的細胞の値であり、
最大は、陽性対照値である。
【００８９】
インビボアッセイ
体内分布
抗体の体内分布を研究するため、SAIVI Rapid Antibody Labeling Kit（Invitrogen）を使用して、製造業者の指示に従って、モノクローナル抗BARF1をAlexa 680とコンジュゲートした。
【００９０】
SCIDマウスの片側にEBV陰性細胞株（MKN-45など）を皮下注射し、他方の側にEBV陽性細胞株（BARF1-MKN-45、C-666、またはSNU-719など）を皮下注射した。
【００９１】
両方の腫瘍が触知可能になったらすぐに、麻酔下の動物の尾静脈へ100μgのAlexa-680抗BARF1抗体を注射し、eXplore Optix装置（GE Healthcare）を使用することによって24時間毎に蛍光シグナルを分析した。
【００９２】
腫瘍塊上に検出された蛍光強度を比較し、反復測定のためのANOVA統計検定によって傾向を分析した。
【００９３】
治療
マウスは、SPF（特定病原体除去）動物施設で、一定温度で、バランスのとれた食餌によって、プラスチックケージにおいて維持された。
【００９４】
動物に関わる手法および飼育は、国内法（Legislative Decree No. 116/92）およびCeasa（University of Padua, Ethics Committee for animal experimentation）に準拠した施設内ガイドラインに従って実施された。
【００９５】
全てのインビボ腫瘍成長実験が、United Kingdom Co-ordinating Committee on Cancer Research (UKCCCR)のガイドライン (Cancer Metastasis 1989 "UKCCCR guidelines for the welfare of animals in experimental neoplasia")に従って実施された。
【００９６】
6〜8週齢のSCIDマウスおよびRAG-/-γ鎖-/-マウスに、5×106個のGRANTA-519細胞またはC-666細胞をs.c.注射した。
【００９７】
次いで、マウスを、1mLのPBSを受ける未処置群または1mgのモノクローナル抗BARF1を受ける処置群へ分割した（2日毎に各0.2mLの5回のi.p.注射）。
【００９８】
2日毎に、最大径および最小径を測定することによって、腫瘍塊の成長を評価し、以下の式を適用することによって計算した。
2019501209.tif 000009
式中、dは最小径であり、Dは最大径である。
【００９９】
腫瘍成長動態をより正確に評価するため、ルシフェラーゼに基づくインビボイメージングアプローチを使用した。
【０１００】
この目的のため、腫瘍細胞株にルシフェラーゼ酵素を形質導入した。
【０１０１】
簡単に説明すると、既に発表されているプロトコルに従って、ベクター（pHR'tripCMV-luc2-IRES-tNGFR-SIN）、エンベローププラスミド（HCMV-G）、およびパッケージングプラスミド（p8.74）の一過性コトランスフェクションによって、293T細胞において、ルシフェラーゼをコードするレンチウイルス粒子（LUX-LV）を作製した。
【０１０２】
トランスフェクションの48時間後および72時間後にウイルスを採集し、超遠心分離によって濃縮した。
【０１０３】
5×105個のGRANTA-519細胞およびC-666細胞を採集し、濃縮（3〜5倍）されたLV-LUXを含む1mLの完全RPMI培地に再懸濁させた。
【０１０４】
細胞を、ウイルスの存在下で37℃で一晩インキュベートし、次いで、ビリオンを含有する上清を廃棄し、新鮮な培地を添加した。
【０１０５】
感染の72時間後に、2×105個の細胞を採集し、50μLのPBSに再懸濁させ、不透明96穴プレート（Nunc）に播種した。
【０１０６】
次いで、50μLのD-ルシフェリン（0.3mg/mL、Caliper）を5分間細胞に添加し、プレートをIVIS Lumina IIを使用して分析した。
【０１０７】
ルシフェラーゼを形質導入したGRANTA-519細胞およびC-666細胞を、0日目に、SCIDマウスにs.c.注射した（5×106個/200μL RPMI/マウス）。
【０１０８】
7日目に、注射されたマウスをランダムに二群へ分割し、そのうちの一方を、0.3mg/マウスの抗BARF1 mAbによって毎週処置した。
【０１０９】
動物に、i.p.麻酔をかけ（1〜3％イソフルラン、 Merial Italia SpA）、150mg/kgのD-ルシフェリンを含むPBSを注射した。ルシフェリンの注射の8分後に、マウスを、IVIS Lumina IIを使用して、光子放射について分析した。
【０１１０】
同じ分析を毎週実施し、（p/sec/cm2/srとして表される）光子の平均輝度を評価した。
【０１１１】
異なる実験において、SCIDマウスに、ルシフェラーゼを形質導入したGRANTA-519細胞およびC-666細胞を、3×106個、i.v.注射した。
【０１１２】
次いで、マウスの一部を、7日目以降毎週、0.3mg/マウスの抗BARF1 mAbによって処置した。
【０１１３】
全てのマウスを、IVIS Lumina IIを使用して毎週分析した。
【０１１４】
各取得の終わりに、写真画像を入手した。
【０１１５】
グレイスケールのマウス画像に重ねられた擬似色生物発光画像が示され、検出された最も強いルシフェラーゼシグナルは赤色で示され、より弱いシグナルは青色で示される。
【０１１６】
統計分析
腫瘍成長分析および生物発光分析の両方について、各回に最も適切な試験を適用して、MedCalcソフトウェア（バージョン9.4.2.0）を使用して、統計分析を実施した。
【０１１７】
生存曲線および生存データ（カプランマイヤー試験を使用）の分析を、同じ統計ソフトウェアによって実施した。
【０１１８】
結果
抗体作製
従来のBALB/cマウスを、KLHとコンジュゲートされたペプチド（05/08、06/08、およびSEQ.ID n.14の08/08'；図1a）によって、ルーチンのプログラムに従って免疫し、血清を収集し、ELISAによって分析した。
【０１１９】
全てのペプチドが、免疫の後に、極めて高い希釈率ですら、高い吸光度値を与え、従って、KLHとコンジュゲートされたペプチドの免疫原性が証明された。
【０１２０】
他方、BARF1は感染細胞の表面上に発現されるため、本発明者らは、BARF1 mRNAを発現するヒトEBV+マントルB細胞リンパ腫細胞株であるGRANTA-519細胞株を、マウスの血清によって標識し、フローサイトメトリーによって分析を実施した。
【０１２１】
最初の一連の3回のワクチン接種の後、GRANTA-519細胞は陰性であり、適切なシグナルが検出される前に、マウスの付加的なワクチン接種を必要とした。
【０１２２】
ELISA試験によって評価される免疫グロブリン力価は、ほぼ同じレベルであり続け、そのことから、通常のワクチン接種プログラムの後に、高力価の抗体がマウスに既に存在するが、いくつかの抗体は、反復的なワクチン接種の後にのみ、細胞表面上に天然に形成され生理学的に提示されたエピトープを認識し得るようになったことが示されたことに注目することは興味深い。
【０１２３】
ハイブリドーマの生成、ならびにELISAおよびフローサイトメトリーによって実施された選択の後、1個のクローン（SEQ.ID n.14のペプチド08/08'によって免疫されたマウスに由来する3D4）のみを、その後の分析のために選択した。
【０１２４】
アイソタイプ特徴決定は、3D4抗体がIgG2a免疫グロブリンに属することを明らかにした。
【０１２５】
第1のBARF1認識試験として、抗体をドットブロットアッセイによって試験した：抗BARF1 3D4抗体によって認識されるエピトープを同定し、確認するため、免疫のために使用されたペプチド、およびSEQ.ID n.14のペプチド08/08'に由来する4アミノ酸がオーバーラップしているペプチドを、PVDF膜に結合させた。
【０１２６】
ドットブロット分析は、3D4 mAbは、無関係のペプチド（05/08および06/08）を認識しないが、ペプチド08/08'は陽性に標識されることを明らかにした。
【０１２７】
さらに、SEQ.ID n.10のペプチド08/08およびSEQ.ID n.14の08/08'から、08/08'のAA 1〜8（08/08-1）、08/08の6〜13（08/08-2）、および08/08'の5〜11（08/08-2'）に及ぶ付加的なペプチドを作出した。
2019501209.tif 000010
【０１２８】
ペプチド08/08-1のみが抗BARF1 3D4抗体によって認識され、従って、認識されるエピトープがその配列内に存在することが示された（図1b）。
【０１２９】
BLAST分析は、エピトープの配列が、BARF1タンパク質、およびBARF1タンパク質と高い相同性を共有していることが既に記載されているヒトコロニー刺激因子1（hCSF-1）に特異的であることを明らかにした。
【０１３０】
インビトロアッセイ
免疫蛍光による染色
抗BARF1 3D4抗体を、EBV感染の存在下または非存在下で、異なる組織学的型に属する腫瘍細胞株を標識するために使用した。
【０１３１】
染色能力は異なるが、3D4クローンは、BARF1陽性細胞を染色する能力を示し、EBV陰性細胞およびBARF1陰性細胞は、陰性のままであった（図1c）。
【０１３２】
陽性細胞において観察された染色強度の差は、BARF1のディファレンシャルな発現に起因する可能性が最も高い：実際、細胞表面上のBARF1の発現に関する情報はほとんど入手されておらず、従って、異なる細胞株または異なる培養段階（新鮮な培地もしくは酸性化された培地の中）にある同一の細胞株におけるディファレンシャルなタンパク質発現を予想することができる。
【０１３３】
さらに、BARF1の細胞外ドメインの切断が記載されているが、切断の割合は未だ明確になっていない。
【０１３４】
標的に対する抗体の特異性をより正確に定義するため、本発明者らは、BARF1発現細胞モデルを作製した：BARF1を形質導入した細胞株MKN-45の抗BARF1 3D4 mAbによる標識は、BARF1陰性親細胞株と比較して高い陽性を明らかにし（図1d）、従って、生成された抗体の特異性が証明された。
【０１３５】
CDCおよびADCC
補体によって媒介される溶解（CDC）を、標準的なクロム放出アッセイにおいて評価した。この試験においても、本発明者らは、標的細胞としてEBV陽性細胞株およびEBV陰性細胞株の両方を使用した。
【０１３６】
図2aは、最適な実験条件（E:T比300:1）の下での代表的な実験を示す。
【０１３７】
EBV陽性細胞株（GRANTA-519、C-666、およびBL-41 B95.8）は、補体に曝された時、溶解されたが、BL-41細胞株（EBV陰性細胞株）の溶解は、バックグラウンドシグナルとほぼ同等であった。
【０１３８】
フローサイトメトリー分析について記載したように、本発明者らは、異なる標的細胞株についての異なる溶解の割合を観察し、繰り返しになるが、これは細胞表面上のディファレンシャルなBARF1発現に起因し得る（図2a）。
【０１３９】
抗体依存性細胞傷害（ADCC）アッセイを、カルセインAMプロトコルを使用して実行した。
【０１４０】
この試験についても、EBV陽性細胞（GRANTA-519、C-666）およびEBV陰性細胞（BL-41）を使用し、健常ドナーのバフィーコート由来のPBMCを、エフェクター細胞として使用した（図2b）。
【０１４１】
図2bは、実施された様々な実験の代表である。
【０１４２】
最も高いBARF1陽性細胞溶解は、300:1のエフェクター:標的比で、20μg/mLのクローン3D4によって得られた。
【０１４３】
NK集団（CD56およびCD16陽性）をPBMCにおいて評価した：NK細胞の百分率は、全集団の12％〜15％と定量化された。
【０１４４】
インビボアッセイ
体内分布
体内分布分析のため、Alexa-680とコンジュゲートさせた抗BARF1抗体の蛍光シグナルを、EBV陽性腫瘍塊およびEBV陰性腫瘍塊を保持するマウスにおいて分析した。
【０１４５】
マウスの片側にMKN-45細胞を注射し、他方の側にBARF1を形質導入したMKN-45細胞を注射した。
【０１４６】
1週間、毎日、分析を実施し、2個の腫瘍塊についての蛍光強度値を報告した。
【０１４７】
統計分析は、BARF1陽性腫瘍塊において特異的に3D4抗体が蓄積することを明らかにした（図3、p＜0.01）。
【０１４８】
治療
マウスモデルにおける抗BARF1 3D4抗体の治療能力を評価するため、腫瘍細胞株をSCIDマウスに注射した。
【０１４９】
C-666細胞を、SCIDマウスに皮下注射し、それらの一部を、抗BARF1 3D4 mAbによって処置した。
【０１５０】
対照と比較した、処置したマウスにおける腫瘍成長動態の統計分析は、抗BARF1 3D4 mAbの注射が腫瘍成長を遅延させ低下させたことを明らかにした（24日目、26日目、および28日目に、それぞれ、p＝0.0028、p＝0.002、およびp＝0.0026；図4a）。
【０１５１】
30日後に処置の治療効果が減少し、C-666腫瘍塊は処置群においても急速に成長し始める。
【０１５２】
対照的に、EBV陽性BARF1陰性RAJI細胞を皮下注射したマウスにおいて、処置は、インビトロの結果から予想される通り、腫瘍塊の低下をもたらさなかった。
【０１５３】
C-666細胞をRAG-/-γ鎖-/-マウス（機能性のB細胞、T細胞、およびNK細胞を欠く）にも皮下注射したが、対照群と処置群との間に差は観察されず（p＝0.77；データ示さず）、従って、選択されたmAbの主要な作用モードはおそらくADCCであることが示された。
【０１５４】
生物発光モデルを、尾静脈を通して注射された同細胞株の分析のために使用した：実際、C-666細胞に酵素ルシフェラーゼを形質導入し、マウスに静脈内注射した。
【０１５５】
マウス腫瘍モデルを、IVIS Lumina II装置によって毎週分析し、関心区域内の光子の数が、統計分析のために使用されたパラメータである。
【０１５６】
s.c.腫瘍成長動態について上に示したように、C-666腫瘍の進行は、3D4抗BARF1抗体による処置によって遅延した（図4b）。
【０１５７】
平均放射輝度に対して統計分析を実施したところ（図4c）、対照（n＝12）と比べて有意に低下した処置群（n＝12）における腫瘍成長が明らかになり（49日目にp＜0.001）、従って、抗BARF1 3D4抗体に治療活性が賦与されていることが証明された。
【０１５８】
最後に、本発明者らは、処置マウスおよび対照マウスの生存を分析したところ、対照群と比較した処置群における有意な改善が示された（データ示さず）。
【０１５９】
同じ実験をGRANTA-519細胞株を使用して実施した。
【０１６０】
対照群において、腫瘍成長は、速く、侵襲性であったが、3D4 mAbによって処置したマウスにおいては、有意に低下した（21日目にp＜0.05；図5a）。
【０１６１】
既に記載したように、同じ試験をRAG-/-γ鎖-/-マウスにおいて実施した時、腫瘍成長の有意差はないことが示され、従って、抗BARF1抗体によって媒介される細胞傷害の機序としてのADCCの重要性が強調された（p＝0.14；データ示さず）。
【０１６２】
さらに、GRANTA-519細胞に、ルシフェラーゼ遺伝子を形質導入し、i.v.注射し、生物発光によって分析した。
【０１６３】
この情況においても、生存率の統計分析は、処置されたマウスの、対照と比較してより良好な傾向を示した（p＝0.002；図5b）。
【０１６４】
研究は、この条件においても、抗BARF1 3D4 mAbによる処置が、対照群と比べて腫瘍の拡散を遅延させることを明らかにした（21日目にp＜0.05；図5cおよび5d）。
【図１】
2019501209.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019501209.tif 000016
2019501209.tif 000017
2019501209.tif 000018
2019501209.tif 000019