(57)【要約】  本発明は、精製及び濃縮ヒトミルクオリゴ糖組成物、並びにその作製及び使用方法に関する。
2019528740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ヒトミルクオリゴ糖組成物を作製する方法であって、
（ａ）人乳透過液を、前記人乳透過液中のラクトースの消化に好適な条件下でラクターゼと混合して、透過液／ラクターゼ混合物を作り出すことと、
（ｂ）前記透過液／ラクターゼ混合物から前記ラクターゼを除去することと、
（ｃ）前記混合物を濾過して、ヒトミルクオリゴ糖を精製及び濃縮することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記透過液のｐＨが、前記ラクターゼの添加前又はそれと同時に、約４．３〜約４．７のｐＨに調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨが、前記ラクトースを添加する前に４．５に調整される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記透過液が、前記ラクターゼの添加前又はそれと同時に、約４５℃〜約５５℃の温度に加熱される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記透過液が、前記ラクターゼを添加する前に約５０℃に加熱される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ラクターゼが、工程（ｉｉｉ）において約０．１％〜約０．５％重量／重量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ラクターゼが、約０．１％重量／重量で添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物を、ラクターゼの除去の前に約２０℃〜約３０℃の温度に冷却することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記温度が、約２５℃である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
デプスフィルタを通して前記ラクターゼ消化透過液を浄化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記デプスフィルタが、約１〜約５ミクロンのフィルタである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記濾過が、約５０，０００ダルトンの孔径を有する膜を通して工程（ｂ）の前記混合物を濾過して、５０ダルトンの濾過混合物を作り出すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
約２，０００ダルトン〜約３，０００ダルトンの孔径を有する膜を通して前記５０ダルトンの濾過混合物を濾過して、２／３ダルトンの濾過混合物を作り出すことを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
６００ダルトン以下の孔径を有する膜を通して、前記５０ダルトンの濾過混合物又は前記２／３ダルトンの濾過混合物を濾過することを更に含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）における精製後のヒトミルクオリゴ糖の濃度が、約１％〜約５％重量／重量である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトミルクオリゴ糖の前記濃度が、約５％重量／重量である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って作製された精製ヒトミルクオリゴ糖組成物。
【請求項１８】
５％以下のラクトースを含む、請求項１７に記載の精製ヒトミルクオリゴ糖組成物。
【請求項１９】
図５Ｅ及び図５Ｆに示されるような、請求項１７又は１８に記載の精製ヒトミルクオリゴ糖組成物。
【請求項２０】
ＮＥＣを予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量の請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の精製ＨＭＯ組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
全身性炎症を減少させることを必要とする対象においてそれを行うための方法であって、有効量の請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の精製ＨＭＯ組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
感染を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行うための方法であって、有効量の請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の精製ＨＭＯ組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３９６，７９９号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、実質的に精製されたヒトミルクオリゴ糖（human milk oligosaccharide、ＨＭＯ）組成物を産生するためのプロセス、それによって産生される実質的に精製された組成物、並びに組成物を使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、人乳に非常に豊富であり、母乳に固有である、構造的に多様な非共役グリカンのファミリーである。元々、ＨＭＯは、プレバイオティックな「ビフィズス因子」、又は腸のビフィズス菌種の成長を促進することが分かり、かつ調合乳で育てられた乳児と比較して母乳で育てられた乳児の大便中に独特に見られる人乳グリカンであることが提案されている。更なる研究は、多様な乳グリカンが授乳と関連する健康上の利益に部分的に関与していることを示唆している。今日、ＨＭＯは、ただの「菌のための食物」ではないことが知られている。増え続ける一連の証拠は、ＨＭＯが、乳児の粘膜面への病原体付着を防止し、それによりウイルス、細菌、及び原虫寄生体感染のリスクを低下させる可溶性デコイ受容体として機能する抗接着性抗菌剤であることを示唆している。加えて、ＨＭＯは、上皮及び免疫細胞応答を調節し、それにより過剰な粘膜白血球浸潤及び炎症を低減し、それにより壊死性腸炎のリスクを低下させ、かつ脳の発達及び認知に潜在的に必須な栄養素としてシアル酸を乳児に提供すると考えられている。
【０００４】
ＨＭＯは、５つのモノサッカライド、グルコース（glucose、Ｇｌｃ）、ガラクトース（galactose、Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine、ＧｌｃＮＡｃ）、フコース（fucose、Ｆｕｃ）、及びシアル酸（sialic acid、Ｓｉａ）からなり、Ｎ−アセチルノイラミン酸（N-acetylneuraminic acid、Ｎｅｕ５Ａｃ）は、Ｓｉａの形態のみではない場合に主要なものである。２００を超える異なるＨＭＯがこれまでに特定されているが、全ての女性がオリゴ糖の同じ組を、又は同じ量で合成するわけではない（Ｋｏｂａｔａ  ２０１０に概説されている）。したがって、ＨＭＯに対する集団多様性は、多くの場合、いずれか一人の女性の多様性よりもはるかに大きい。
【０００５】
更には、オリゴ糖の組成及び濃度もまた、授乳の過程で変化する（Ｋｕｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００に概説されている）。初乳は、２０〜２５ｇ／ＬほどのＨＭＯを含有するが、乳汁の分泌が発達すると、総ＨＭＯ濃度は、５〜２０ｇ／Ｌに低下し、多くの場合それでもなお総乳タンパク質濃度を超え、人乳のＨＭＯ画分をラクトース及び脂肪に次いで３番目に豊富な画分にする。ＨＭＯについて報告されているＨＭＯ濃度及び多様性の幅広い範囲は、女性間のグリコシル化経路の既知の遺伝的変異だけではなく、様々な学術研究及び委託研究の研究所によるＨＭＯの検出及び定量化で使用される分析方法の技術的差異も反映する。
【０００６】
しかしながら、明らかなことは、乳牛、ヒツジ、及びヤギなどの他の哺乳動物の乳中に存在するオリゴ糖が、人乳中のオリゴ糖よりもはるかに少なく、構造的に異なるということである。例えば、最もオリゴ糖が豊富なウシ乳の部分である初乳でさえ、約５０の分子種のオリゴ糖のみを含有する。ＨＭＯに最も構造的に類似したミルクオリゴ糖プロファイルを含有すると考えられているヤギ乳は、ＨＭＯの特徴的な多様性の２５％未満の約４０の分子種のみを含有する（Ｔｈｕｍ，ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【０００７】
原料の可用性に対する制限に加えて、ミルクオリゴ糖組成物の産生に対する別の主要な障害は、乳のオリゴ糖部分の単離及び濃縮中、特にタンパク質沈殿とは対照的に限外濾過がタンパク質を除去するために、かつ収率を失うことなくそれを行うために使用される場合、乳のオリゴ糖部分と共に濃縮する傾向があるラクトース及び他のミネラルの低減である。これは、処理されている乳の種にかかわらず、プロセス制限のままであるが、この問題がどこよりも強く感じられるのはヒトオリゴ糖組成物の調製であり、これは、出発物質が非常に乏しく、収率の損失を許容できないものにするためである。
【０００８】
溶媒ベースの系を使用してタンパク質及び他の主要栄養素を除去することによって、この問題を解決しようと試みた者もいた。この方法は、限外濾過プロセスと関連するラクトース及びミネラルの蓄積を防止する。実のところ、この方法が実際にラクトースの除去を補助することができることが報告されている（例えば、Ｓａｒｎｅｙ，２０００を参照されたい）。しかしながら、このプロセスは、溶媒の使用を必要とし、人乳の残りの部分を効果的に破壊し、それを他の生命を救う製品に使用できない状態にする。商品が人乳と同じくらい乏しい場合、これは、単純に許容できない。
【０００９】
本明細書で使用されるような人乳透過液を生成するために使用される限外濾過プロセスは、潜在的に有害な有機溶媒の使用を回避し、タンパク質画分を他の生命を救う製品で使用するために保存する一方で、乳中のラクトース及びミネラルの問題を悪化させるだけである。濃縮人乳透過液のラクトース含量は、例えば、乳中に見られる濃度である６％以下のラクトースレベルと比較して、場合によっては１０〜１５％にも達し得る。これらのレベルのラクトースは、ラクトースを消化することが酵素的に可能である人々にとってでさえも（可能ではない人々は言うまでもなく）消化することが困難である。酵素消化、続いて消化に使用された酵素を除去するための連続透析濾過を含む、ラクトースを除去するためのいくつかのアプローチが使用されてきた。ラクトース及びミネラルを濃縮する限外濾過とは対照的に、タンパク質が有機溶媒を用いた沈殿により除去されたこれらの試料中でさえ、有意なレベルのラクトースが透析濾過後に残っており、この組成物のミネラル含量は言うまでもない。（例えば、Ｓａｒｎｅｙ，２０００及びＧｒａｎｄｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ  ２００２を参照されたい）。更には、ＨＭＯ組成物の透析濾過はまた、低分子量のＨＭＯ種、例えば２ＦＬの許容できない損失をもたらす。
【００１０】
大量の精製ＨＭＯへのアクセスを提供するために利用可能な天然資源が存在しないため、市場の大部分の乳児用調合乳は、新生児にオリゴ糖を全く提供せず、提供する調合乳は、ガラクトオリゴ糖（galactooligosaccharide、ＧＯＳ）及びフラクトオリゴ糖（fructooligosaccharide、ＦＯＳ）を含む、ＨＭＯを模倣するように意図された非自然発生的オリゴ糖、又はより最近では、自然発生的ＨＭＯの化学合成型ＬＮｎＴ及び２’−ＦＬのいずれかを提供する（Ｂｏｄｅ，２０１５）。これらの組成物は、完全にＨＭＯを含まない組成物に対する改善を表し得るが、それらは、平均の人乳よりもＨＭＯの分子種に対して実質的にあまり多様ではなく、集団を見渡したときに人乳よりも確実にはるかに多様性が少ない。
【００１１】
必要とされるのは、構造的及び機能的に多様であるが、実質的に低減されたラクトース及び／又はミネラル含量を有するＨＭＯ組成物の効率的な回収、濃度、及び精製を可能にするプロセスである。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書では、実質的に低減されたラクトース及び／又はミネラル濃度を有する一方で、人乳の集団にわたって見られるオリゴ糖の構造的及び機能的多様性を保持するヒトミルクオリゴ糖組成物を製造する方法が提供される。本明細書に提供される方法は、拡張性があるという利点、及び例えばタンパク質を除去するために溶媒を使用することによって、残りの乳画分を破壊しないという追加の利点を有する。
【００１３】
一実施形態では、精製ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）組成物を製造するための方法が提供される。一実施形態では、方法は、人乳透過液を、人乳透過液中のラクトースの消化に好適な条件下で、かつそのような消化に十分な期間にわたって、ラクトースを消化することが可能な酵素と混合することを含む。いくつかの実施形態では、酵素は、ラクターゼ酵素である。いくつかの実施形態では、ラクターゼ酵素は、消化後にラクターゼ消化透過液混合物から除去される。いくつかの実施形態では、ラクターゼ除去の前に、透過液／ラクターゼ混合物は、例えば、デプスフィルタを通して浄化される。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、濾過によって混合物から除去される。いくつかの実施形態では、濾過は、約５０，０００ダルトンの孔径を有する膜を通した濾過を含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の追加のフィルタを通して混合物を濾過することを更に含む。一実施形態では、１つ以上の追加のフィルタは、約２，０００〜約３，０００ダルトンの孔径を有する膜を含む。一実施形態では、１つ以上の追加のフィルタは、約６００ダルトンの孔径を有する膜を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、透過液へのラクターゼ酵素の添加の前又はそれと同時に、透過液のｐＨ及び／又は熱は、調整される。一実施形態では、ｐＨは、約４．３〜約４．７に調整される。一実施形態では、ｐＨは、約４．５に調整される。一実施形態では、透過混合物の熱は、ラクターゼの添加の前又はそれと同時に調整される。一実施形態では、熱は、約４５℃〜約５５℃の温度に調整される。一実施形態では、熱は、約５０℃の温度に調整される。一実施形態では、透過液のｐＨは、約４．３〜約４．７に調整され、熱は、約４５℃〜約５５℃の温度に調整される。
【００１５】
一実施形態では、ラクターゼは、約０．１％〜約０．５％ｗ／ｗの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約０．１％ｗ／ｗの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約５〜約２２５分間透過液と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約１５〜約１２０分間透過液と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約３０〜約９０分間透過液と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約６０分間透過液と共にインキュベートされる。
【００１６】
一実施形態では、インキュベーション後、透過液／ラクターゼ混合物は、約２０℃〜約３０℃の温度に冷却される。一実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、約２５℃の温度に冷却される。一実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、浄化される。一実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、デプスフィルタを通して浄化される。一実施形態では、デプスフィルタは、約１ミクロン〜約５ミクロンのフィルタを含む。
【００１７】
一実施形態では、ラクターゼは、濾過を介して除去される。一実施形態では、ラクターゼは、約５０，０００ダルトンの孔径を有するフィルタを通した濾過を介して除去される。一実施形態では、組成物は、１つ以上の追加のフィルタを通して更に濾過される。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のフィルタは、約２，０００〜約３，０００ダルトンの孔径を有する膜を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のフィルタは、６００ダルトン以下の孔径を有する膜を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２，０００〜約３，０００ダルトンの膜を含むフィルタ、続いて６００ダルトン以下の膜を通した濾過の両方を通して濾過される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物が提供される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、透過液と比較して低減されたレベルのラクトース及びミネラルを有する。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約５．０％ｗ／ｗ未満のラクトースを含む。いくつかの実施形態では、ＨＭＯ組成物は、表１のミネラルプロファイルを含む。一実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約０．５％〜約７．５％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約１．０％〜約２．０％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約２．０％〜約４．０％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約４．０％〜約５．０％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約５．０％〜約７．５％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約５．０％ｗ／ｗのＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って作製されたＨＭＯプロファイルは、図５（Ｅ及びＦ）に示されるＨＭＯプロファイルを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物を投与することを必要とする対象にそれを行うための方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＮＥＣを治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行うための方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、全身性炎症を減少させるための方法が、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を投与することによって提供される。いくつかの実施形態では、感染を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行うための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を投与することによって、ウイルス又は細菌感染を治療又は予防するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、細菌感染は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ノロウイルス又はロタウイルスである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、追加の医薬品又は治療薬の前、最中、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、糞便、臓器、又は骨髄移植の前、最中、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、抗生物質、抗ウイルス、又は抗真菌治療レジメンの前、最中、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、プロバイオティック組成物の前、最中、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、化学療法及び／又は放射線療法の前、最中、又は後に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】例示的なＨＭＯ産生プロセスの概略図を示す。
【００２２】
【図２】代替的なＨＭＯ産生プロセスの概略図を示す。
【００２３】
【図３】８倍以上の濃縮透過液から８倍以上の濃縮透過液から２０倍の濃縮透過液を産生するために使用されるプロセスの概略図を示す。
【００２４】
【図４】（Ａ）精製ＨＭＯ組成物を製剤化するために使用されるプロセスの概略図、並びに（Ｂ）精製ＨＭＯ組成物を低温殺菌及び充填するために使用されるプロセスを示す。
【００２５】
【図５】プールされたドナー乳（Ａ及びＢ）、人乳透過液（Ｃ及びＤ）、並びに精製ＨＭＯ組成物（Ｅ及びＦ）からの中性（Ａ、Ｃ、及びＥ）並びにシアリル化（Ｂ、Ｄ及びＦ）ＨＭＯのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィの結果を示す。
【００２６】
【図６】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び極性ＬＣを使用して得られたＨＭＯが投与された成人からの血清、糞便、及び尿の網羅的非標的メタボロミクスを示す。結果は、（Ａ）血清、（Ｂ）尿、（Ｃ）糞便、及び（Ｄ）乳中で検出された非経口ＨＭＯ及びＨＭＯ分解産物を示す。
【００２７】
【図７】（Ａ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び極性ＬＣを使用して得られたエイコサノイドの代謝経路、並びに（Ｂ及びＣ）本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を摂取した対象における経時的なエイコサノイド代謝産物のレベルを示す。
【００２８】
【図８】本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を摂取した対象における経時的な、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び極性ＬＣを使用して得られるスフィンゴ脂質代謝産物の血清レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、実質的に低減されたラクトース及びミネラル含量を有する精製ヒトミルクオリゴ糖組成物を産生するためのプロセス、それにより産生された新規の組成物、並びにそのような新規の組成物を使用するための方法を提供する。プロセスは、プールされた人乳の濾過部分から開始し、したがって本発明の精製ＨＭＯ組成物は、任意の典型的な個々の女性と比較して、ＨＭＯの別々の分子種のより多様なプロファイルを含有することができる。したがって、本明細書の組成物は、多くの場合、ＨＭＯの集団を表すと言われ、それは、個人のＨＭＯプロファイルを表すこととは対照的である。
【００３０】
「ヒトミルクオリゴ糖（複数可）」（本明細書では「ＨＭＯ（複数可）」とも称される）は、ヒト母乳中に見られる構造的に多様な非共役グリカンのファミリーを意味する。
【００３１】
ヒトミルクオリゴ糖は、還元末端にラクトース、及び典型的には非還元末端にフコース又はシアル酸を含有する炭水化物である（Ｍｏｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。これらの末端糖は、細菌の選択的増殖、及び腸管内腔内の細菌病原体を含む他の分子又は細胞とのオリゴ糖の相互作用に最も強く影響する残基である。更に、シアル酸は、脳ガングリオシドの構造的及び機能的成分であり、乳児の神経学的発達に関与している。
【００３２】
オリゴ糖は、糖タンパク質、糖脂質などとして遊離し得るか、又は共役され得、グリカンとして分類される。それらは、ラクトース及び脂質に次いで３番目に多い人乳の固体成分を構成する（Ｍｏｒｒｏｗ，２００５）。しかしながら、ミルクオリゴ糖の大部分は、乳児によって消化されず、乳児の糞便中に大部分無傷で見つけられ得る。
【００３３】
「透過液」とは、限外濾過の生成物である乳（例えば、プールされた人乳）の一部分を意味する。具体的には、（例えば、約１〜１０００ＫＤａのフィルタを通した）限外濾過後に残される液体。この限外濾過プロセスを通過する液体が透過液と称される。このプロセスの未透過液は、人乳タンパク質を濃縮し、それは次いで、他の生命を救う製剤を作り出すために、例えば、米国特許第８，３７７，４５５号に記載されているものなどの人乳強化剤組成物を作製するために使用され得る。したがって、ＨＭＯ生成物を汚染し得る溶媒を用いたタンパク質沈殿に依存する方法とは対照的に、本明細書で使用されるような実質的にタンパク質を含まない出発物質を得るための限外濾過の使用は、有機溶媒の使用を回避しながら、人乳中の有益な主要栄養素の残りの部分を保存する。
【００３４】
「乳」とは、哺乳動物の乳腺によって産生され、乳房によって搾り出される流体を意味する。乳は、初乳、全乳、及び脱脂乳が挙げられるが、これらに限定されない全ての授乳製品を含む。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「乳」は、典型的には、ヒト全乳を指す。
【００３５】
「全乳」とは、脂肪が除去されていない乳（例えば、プールされた人乳）を意味する。
【００３６】
「脱脂乳」とは、脂肪の少なくとも７５％が除去された乳（例えば、プールされた人乳）、あるいは遠心分離に供されて脂肪を除去した乳を意味する。
【００３７】
「実質的に低減されたラクトース及び／又はミネラル含量」にあるような「実質的に」とは、ミネラル及び／又はラクトースのレベルの低減が、本方法に供されていない濃縮透過液と比較したときの統計的差異を表すことを意味する。一例として、いくつかの実施形態では、実質的に低減されたラクトースを有する精製ＨＭＯ組成物は、５％以下のラクトースレベルを含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」とは、他の主要な生物活性因子を除いて、特定の列挙された成分を含有する組成物を指す。例えば、ＨＭＯから本質的になる組成物は、タンパク質、脂肪、外因的に添加された材料のようなものを除外するが、例えば、水、許容可能なレベルのある特定の塩、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、又はエクソソームなどの他の不活性又は痕跡材料を含有してもよい。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「精製ＨＭＯ組成物」という用語は、実質的に低減されたレベルのラクトース及び／又はミネラルを有し、本明細書に提供される方法によって産生されるＨＭＯ組成物（例えば、濃縮ヒト透過液）を意味する。例示的な精製ＨＭＯ組成物は、図５（Ｅ）及び（Ｆ）に示される。
精製ＨＭＯ組成物を作製する方法
【００４０】
人乳透過液は、本発明の精製ＨＭＯ組成物が本明細書に記載されるプロセスによって産生される出発物質として機能する。人乳透過液を得るための方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，９２７，０２７号に見られる。
【００４１】
簡潔に、薬物、汚染物質、病原体、及び混和物に対してスクリーニングされ、耐熱性細菌胞子を除去するために濾過された、事前に選定されたドナーからのプールされた乳が、クリーム画分及びスキム画分に分離される（例えば、遠心分離によって）。スキム画分は、更なる濾過、例えば、１〜１０００ｋＤａの孔径を有する限外濾過を受けて、タンパク質豊富な未透過液及びＨＭＯ含有透過液を得る。このプロセスの詳細は、例えば、米国特許第８，５４５，９２０号、同第７，９１４，８２２号、同第７，９４３，３１５号、同第８，２７８，０４６号、同第８，６２８，９２１号、及び同第９，１４９，０５２号に見られ、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
一実施形態では、実質的に低減されたレベルのラクトースを有する精製ＨＭＯ組成物を産生するためのプロセスが提供される。このプロセスは、人乳透過液のＨＭＯ含量の収率の損失又は分子プロファイルの変化のない、ラクトースが豊富な人乳透過液画分からのラクトースの生化学的及び／又は酵素的除去を必要とする。また、いくつかの実施形態では、酵素消化がラクトースを低減するために使用される場合、残留不活性化異種タンパク質を残さない。
【００４３】
一実施形態では、人乳透過液から、したがって精製ＨＭＯ組成物からラクトースを低減するためのプロセスは、ａ）透過液混合物のｐＨを調整する工程と、ｂ）ｐＨ調整された混合物を加熱する工程と、ｃ）ラクターゼ酵素を加熱された透過液混合物に添加して、透過液／ラクターゼ混合物を作り出し、ある期間インキュベートする工程と、ｄ）混合物からラクターゼを除去し、混合物を濾過してラクターゼを除去する工程と、ｅ）ヒトミルクオリゴ糖を濃縮する工程とを含む。本明細書に記載される工程は、時系列で列挙されているが、当業者は、工程（ａ）〜（ｃ）が実施される順序が変更され得ることを理解するであろう。つまり、ほんの一例として、ラクターゼ酵素は、混合物を加熱する前に、あるいは加熱プロセス中の任意の時点で添加されてもよい。同様に、またほんの一例として、混合物は、ｐＨの調整前に加熱されてもよい。更に、いくつかの工程は、単一工程にグループ化されてもよく、例えば、「ラクトースの酵素消化」又は「ラクトースのラクターゼ消化」は、上記のような工程（ａ）〜（ｃ）を伴う。これらの工程は、同時に実施されてもよく、又は任意の順序で連続的であってもよい。したがって、本明細書で使用される場合、「ラクトース消化」は、任意の順序での連続的な又は同時の少なくともこれら３つの工程の実施を指す。
【００４４】
一実施形態では、透過液のｐＨは、約３〜約７．５のｐＨに調整される。一実施形態では、ｐＨは、約３．５〜約７．０のｐＨに調整される。別の実施形態では、ｐＨは、約３．０〜約６．０のｐＨに調整される。更に別の実施形態では、ｐＨは、約４〜約６．５のｐＨに調整される。更に別の実施形態では、ｐＨは、約４．５〜約６．０のｐＨに調整される。更に別の実施形態では、ｐＨは、約５．０〜約５．５のｐＨに調整される。更に別の実施形態では、ｐＨは、約４．３〜約４．７、好ましくは４．５のｐＨに調整される。ｐＨは、酸又は塩基を添加することによって調整され得る。いくつかの態様では、ｐＨは、酸、例えばＨＣｌを添加することによって調整される。更に他の態様では、ｐＨは、１Ｎ  ＨＣｌを添加し、ある期間、例えば約１５分間混合することによって調整される。
【００４５】
一実施形態では、ｐＨ調整された透過液は、約２５℃〜約６０℃の温度に加熱される。別の実施形態では、透過液は、約３０℃〜約５５℃の温度に加熱される。別の実施形態では、透過液は、約４０℃〜約５０℃の温度に加熱される。別の実施形態では、透過液は、約４８℃〜約５０℃の温度に加熱される。更に別の実施形態では、透過液は、約５０℃の温度に加熱される。更に別の実施形態では、透過液は、約４０℃以下の温度に加熱される。
【００４６】
一態様では、ラクターゼ酵素が、ｐＨ調整され加熱された透過液に添加されて、透過液／ラクターゼ混合物を作り出し、ラクトースをモノサッカライドに分解する。一実施形態では、ラクターゼ酵素は、約０．１％ｗ／ｗ〜約０．５％ｗ／ｗの濃度で添加される。更に別の態様では、ラクターゼ酵素は、約０．１％ｗ／ｗ、又は０．２％、又は０．３％、又は０．４％、又は０．５％ｗ／ｗで添加される。使用され得る多くの市販のラクターゼ酵素が存在する。したがって、ラクターゼ酵素は、任意の起源由来であってもよい（例えば、真菌又は細菌由来）。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ｐＨ調整され加熱された透過液は、ラクターゼ酵素と共に約５〜約２２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約１５分〜約９０分である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約３０分〜約９０分である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約６０分である。当業者は、インキュベーション時間が、使用される酵素源、混合物の温度及びｐＨ、並びに使用される酵素の濃度が挙げられるが、これらに限定されない無数の要因に依存することを理解するであろう。これらの変数のいずれも、ラクターゼ酵素とのより長い又はより短いインキュベーション時間を必要とする場合がある。本明細書に提供されるｐＨ、温度、及び酵素インキュベーション条件は、本明細書に記載されるプロセスに最適に作用するものであるが、当業者は、同様の結果を達成するために、これらの変数のうちの１つ以上に修正が行われ得ることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載される約０．１％ｗ／ｗ〜約０．５％ｗ／ｗよりも少ない酵素が使用される場合、インキュベーション時間は、同じレベルのラクトース消化を達成するために延長される必要があり得る。同様に、温度及びｐＨ変数の両方に対しても同様の調整が行われ得る。
【００４８】
一実施形態では、インキュベーション後、透過液／ラクターゼ混合物は、約２０℃〜約３０℃の温度に冷却される。特定の実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、約２５℃の温度に冷却される。
【００４９】
一実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、浄化されて不溶性構成成分を除去する。ある特定の場合では、不溶性材料は、ｐＨ及び温度の変化全体を通して形成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、混合物を浄化して、例えば、デプスフィルタを通してこれらの不溶性構成成分を除去することが必要であるか、又は有益であり得る。フィルタは、０．１〜１０ミクロンのフィルタであってもよい。いくつかの実施形態では、フィルタは、約１〜約５ミクロンのフィルタである。あるいは、不溶性構成成分の除去は、遠心分離プロセス、又は遠心分離及び膜濾過の組み合わせによって達成され得る。浄化工程は、本明細書に記載される多様なＨＭＯ組成物の調製に必須ではなく、むしろ、この任意の工程は、より精製されたＨＭＯ組成物を得るのを補助する。更に、浄化工程は、濾過膜の再利用性、したがってプロセスの拡張性において重要である。適切な浄化がないと、実質的により多くのフィルタ材料を必要とし、臨床規模でＨＭＯ組成物を産生することを困難かつ高価にする。しかしながら、製剤化及び適用に応じて、より多くの又はより少ない精製ＨＭＯ組成物を産生するために、この段階で、より厳密な又はあまり厳密ではない浄化が形成され得ることを理解するであろう。例えば、沈殿したミネラルは、脆弱集団（例えば、新生児）で使用するための液体製剤（複数可）と比較して、凍結乾燥のための製剤又は健康な成人で使用するための製剤に関する問題が少ない場合がある。
【００５０】
更に、場合によっては、浄化された透過液／ラクターゼ混合物から使用済み及び過剰なラクターゼ酵素を除去することが望ましい場合がある。しかしながら、不活性化異種タンパク質が生物学的危険性を有しない場合があり、したがって、ラクターゼ除去の追加工程又は不活性化さえ必要ではない場合がある。いくつかの実施形態では、使用済み及び過剰なラクターゼは、例えば、高温、高圧、又は両方によって不活性化される。いくつかの実施形態では、不活性化ラクターゼは、組成物から除去されない。
【００５１】
しかしながら、他の実施形態では、異種タンパク質を除去するための更なる精製が求められる。そのような実施形態では、ラクターゼ酵素の除去は、限外濾過によって達成され得る。いくつかの実施形態では、限外濾過は、限外濾過膜を使用して、例えば、５０，０００ダルトン以下の分子量カットオフを有する膜、例えば、ＢＩＯＭＡＸ−５０Ｋを使用して達成される。（例えば、図１を参照されたい）
【００５２】
いくつかの実施形態では、追加の限外濾過は、５０，０００ダルトン以下の分子量カットオフを有する初期の膜よりも小さい膜を通して実施される。いくつかの実施形態では、更なる限外濾過は、約２，０００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を用いて実施される。任意にこの追加の濾過工程は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及びエクソソームなどのより小さい潜在的に生物活性及び／又は免疫原性の因子を除去するのを補助することによって、ＨＭＯ生成物の全体的な純度を更に補助する。図３は、この追加の濾過工程を伴う実施形態を示す。
【００５３】
一実施形態では、少なくとも１回、場合によっては２回以上の限外濾過（又は代替のラクターゼ除去手段）を受けた浄化された混合物は、更に濾過されて、ヒトミルクオリゴ糖を精製及び濃縮し、ミネラル及びモノサッカライド含量を低減する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、濾過は、ナノ濾過膜を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、膜は、１，０００ダルトン以下の分子量カットオフを有する。いくつかの実施形態では、膜は、６００ダルトン以下の分子量カットオフを有する。更に他の実施形態では、膜は、約４００〜約５００ダルトンの分子量カットオフを有する。この追加のナノ濾過は、モノサッカライド、ミネラル、特にカルシウム、及びより小さい分子を除去して、最終精製ＨＭＯ組成物を産生する際に重要な工程である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ミネラルの除去のために追加又は代替の工程が行われてもよい。そのような追加の工程としては、例えば、遠心分離、膜浄化（０．６ミクロン以下）、又は加熱された（４０℃以上）か、若しくは冷蔵／凍結及び解凍されたＨＭＯ濃縮物の遠心分離及び膜濾過の組み合わせが挙げられ得る。これらの追加又は代替の工程の回収された上清又は濾液は、いくつかの実施形態では、ナノ濾過膜を使用して更に濃縮される。いくつかの実施形態では、ナノ濾過は、６００ダルトン以下の分子カットオフを有する膜を通した濾過を含む。いくつかの実施形態では、これらの追加の工程は、低温殺菌の前又は後が挙げられるが、これらに限定されないプロセスの任意の段階で実施されてもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ナノ濾過膜の物理的特性は、濃縮されたシアリル化ＨＭＯが好ましい場合、シアリル化ＨＭＯを選択的に濃縮し、例えば、ＨＭＯ濃縮物からの中性ＨＭＯの除去のより高い効率を可能にするように、化学修飾などの修飾が行われ得る。
【００５７】
一実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、滅菌される。滅菌は、当該技術分野において既知の任意の手段によって行われ得る。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、低温殺菌される。いくつかの態様では、低温殺菌は、最低３０分間６３℃以上で達成される。低温殺菌後、組成物は、約２５℃〜約３０℃に冷却され、０．２ミクロンのフィルタを通して浄化されて、いかなる残留沈殿物質も除去する。
精製ＨＭＯ組成物
【００５８】
本発明の精製ＨＭＯ組成物は、実質的に低減されたレベルのラクトース及び／又はミネラルを有する。「実質的に低減された」という用語は、それがラクトースレベルに関連する場合、かつ本明細書で使用される場合、５％ｗ／ｗ以下のラクトースレベルを有することを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された精製ＨＭＯ組成物は、約４．５〜約８．５グラムのＨＭＯと、約５％ｗ／ｗ以下のラクトースと、表１に示されるミネラル組成物とを含む。
【表１】
2019528740.tif 000003
【００５９】
当業者は、精製ＨＭＯ生成物が粉末として製剤化される場合など、場合によっては、ミネラルの還元がそれほど重要ではない場合があることを理解するであろう。したがって、上記の値は、例示的な製剤、具体的には例示的な液体製剤としてのみ提供されるが、この製剤が粉末化され得ない理由はない。
【００６０】
いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約０．５％〜約７．５％を構成する。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約１．０％〜約２．０％を構成する。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約２．０％〜約４．０％を構成する。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約４．０％〜約５．０％を構成する。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約５．０％〜約７．５％を構成する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約２０００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約１０％ｗ／ｗ以下のグルコースを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物は、約１０％ｗ／ｗ以下のガラクトースを含む。モノサッカライド、グルコース、及びガラクトースの存在は、ラクトースの分解の結果であり、ラクトースレベルが低下すると、モノサッカライドレベルは増加する。モノサッカライド含量の大部分は、ミネラル及び残留ラクターゼを除去する同じ濾過プロセスを介して除去され得るが、低レベルのモノサッカライドは、精製ＨＭＯ生成物中に残る。しかしながら、二糖類ラクトースとは異なり、これらのモノサッカライドの存在は、特にこれらの低レベルで、膨大な数の個体に対して臨床的問題を生じない。
【００６２】
本発明のヒトミルクオリゴ糖組成物は、ヒト全乳の集団にわたって観察されるＨＭＯのプロファイルと構造的及び機能的の両方で実質的に同様である。つまり、組成物は、個々のドナーではなくむしろドナーのプールから得られるため、ＨＭＯの配列は、任意の一人の典型的な個人よりも多様である。図５は、プールされた人乳（Ａ及びＢ）、人乳透過液（Ｃ及びＤ）、並びに本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物（Ｅ及びＦ）の代表的なクロマトグラムを示す。
【００６３】
ＨＭＯ多様性の最大の変数のうちの１つは、母親のルイス血液型から、具体的には、活性フコシルトランスフェラーゼ２（fucosyltrasferase 2、ＦＵＴ２）及び／又はフコシルトランスフェラーゼ３（fucosyltrasferase 3、ＦＵＴ３）遺伝子を有するかどうかから得られる。活性ＦＵＴ２遺伝子が存在する場合、α１−２結合フコースが産生されるが、フコース残基は、α１−４結合され、ＦＵＴ３遺伝子は、活性である。この「分泌者の状態」の結果は、一般的に、「分泌者」（即ち、活性ＦＵＴ２遺伝子を有するもの）が、α１−２結合オリゴ糖によって支配されるＨＭＯのはるかにより多様なプロファイルを産生する一方で、「非分泌者」（即ち、活性ＦＵＴ２遺伝子を有しないもの）が、例えば、α１，−４結合オリゴ糖のより様々な配列を含み得るが（分泌者と比較して）、非分泌者が分泌者のＨＭＯレパートリの主要成分を合成することができないため、多様性の過剰な減少を含む場合があるということである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、乳のプールは、例えば、分泌者の状態に基づき構築され得る。つまり、いくつかの実施形態では、分泌者ではない母親からの乳のプールとは別の分泌者である母親から乳のプールを回収することが有益であり得る。分泌者である母親からの乳のプールは、α１−２結合ＨＭＯの大部分を含み、例えば、腸の健康を促進するために、又は炎症を低減するために有用であり得る。非分泌者である母親からの乳のプールは、α１−４結合オリゴ糖のはるかに多様な配列を含み、例えば、ノロウイルス又はロタウイルスを含むある特定の胃腸ウイルス感染の治療又は予防に有用であり得る。いくつかの実施形態では、分泌者対非分泌者から得られ、逆もまた同様である、本明細書に記載される精製ＨＭＯ組成物を作製するために使用される任意の人乳プールのある特定の割合が存在することを確実にして、可能な限り多様かつ代表的なＨＭＯプロファイルを確実にすることが有益であり得る。ＦＵＴ２及びＦＵＴ３における多型性は、特定のプールのためのドナーを選択するために使用され得る多型性の単なる一般的な例である。当業者は、任意の多型性に基づき乳のプールを選別して、ある特定のＨＭＯプロファイルを有する乳のプールを構築することが、任意の多型性に対して行われ得ることを理解するであろう。
【００６５】
母親は、提供前に分泌者又は非分泌者であると判定されてもよく、あるいは、又は加えて、ドナーとしての母親の事前資格審査中に、及び／又はいったん提供された乳が受け取られると、母親の分泌者の状態が得られ得る。分泌者の状態のスクリーニングは所定であり、任意の常法によって実施され得る。
精製ＨＭＯ組成物の使用
【００６６】
本発明の精製ＨＭＯ組成物は、人乳強化剤組成物、人乳、乳児用調合乳、非人乳などに添加されて、その栄養価及び／又は免疫学的値を高め得る。あるいは、本発明の精製ヒトミルクオリゴ糖組成物は、乳児、より年齢の高い小児、及び成人による消費のために、経口溶液中に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物は、凍結乾燥、又はフリーズ乾燥、又は別様に粉末化されてもよい。
【００６７】
本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物の抗感染、免疫調節、及びプレバイオティック効果により、組成物は、多種多様な生物学的及び臨床的状況で使用される。そのような使用としては、腸上皮細胞応答のモジュレータとして、免疫調節因子として、及び／又は壊死性腸炎（necrotizing enterocolitis、ＮＥＣ）に対する保護剤としてが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明の精製ヒトミルクオリゴ糖組成物は、抗炎症メディエータの生成に影響を及ぼすヒト粘膜（例えば、胃腸管又は尿生殖路）の微生物叢に良い変化を及ぼすのに、かつ／又は腸上皮表面への病原菌の付着を防止するのに有用である。
【００６９】
本発明は、本明細書に記載される方法に従って作製された精製ＨＭＯ組成物を対象に投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト早産児又は満期出産乳児である。いくつかの実施形態では、対象は、小児である。いくつかの実施形態では、対象は、成人である。いくつかの実施形態では、組成物は、局所、経口、又は直腸投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、栄養管を介して経口投与される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明の精製ＨＭＯ組成物は、別の活性剤での処理の前、最中、又は後に投与され得る。例えば、精製ＨＭＯ組成物は、抗生物質、抗ウイルス、抗真菌、及び／又はプロバイオティック治療過程の一部として、かつ抗生物質及びプロバイオティック剤と組み合わせて投与され得る。一実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、化学療法又は放射線療法に関連して投与され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製される精製ＨＭＯ組成物は、抗生物質と組み合わせて投与される場合、相乗効果を有する。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、糞便移植と併せて、又は糞便移植を受けているか、受けることになっているか、若しくは最近受けた対象に投与され得る。
【００７２】
本発明は、感染を有するか、又は感染を発症するリスクがある対象を治療する方法を提供し、精製ヒトミルクオリゴ糖組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、感染の症状は、細菌、細菌毒素、真菌、又はウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、感染は、細菌によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態では、感染は、ウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ノロウイルス又はロタウイルスである。別の実施形態では、ウイルスは、炎症性バーストによって症状を引き起こす出血性ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、エボラウイルス又は他の出血性発熱ウイルスである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト新生児、乳児、小児、又は成人である。いくつかの実施形態では、処置は、感染の少なくとも１つの症状を改善することを含む。いくつかの実施形態では、処置は、有益な腸内細菌の発達を促進することを含む。いくつかの実施形態では、有益な腸内細菌は、ビフィズス菌、乳酸菌、連鎖球菌、又は腸球菌のうちの１つ以上である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明の精製ＨＭＯ組成物は、抗炎症剤として、それを必要とする対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は、炎症状態を有する。いくつかの実施形態では、対象は、炎症性腸疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、大腸炎を有する。いくつかの実施形態では、対象は、潰瘍性大腸炎を有する。いくつかの実施形態では、対象は、回腸嚢炎を有する。いくつかの実施形態では、対象は、クローン病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物は、移植に関連して使用され得る。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、移植を受けている患者における移植片対宿主病の拒絶又は罹患のリスクを減少させる。いくつかの実施形態では、移植は、固体臓器移植であり、いくつかの実施形態では、移植は、骨髄移植である。
実施例
【００７５】
実施例１：ヒトミルクオリゴ糖産生
【００７６】
精製ＨＭＯ組成物を産生するためのプロセスは、上記に定義されたように透過液から開始し、それを解凍及びプールした。出発透過液温度は、２３℃〜２８℃であった。透過液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌの添加で４．３〜４．７（目標４．５）に調整し、約１５分間混合した。次いで、透過液を約４８℃〜約５５℃、好ましくは５０℃に加熱した。ラクターゼ酵素（０．１％  ｗ／ｗ）を添加して、ラクトースをモノサッカライドに分解し、次いで溶液を約６０分間混合した。次いで、透過液／ラクターゼ酵素混合物を約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃に冷却し、デプスフィルタ（ＣＵＮＯ６０ＳＰ）を通して浄化した。限外濾過膜（Ｂｉｏｍａｘ−５０Ｋ）を使用して、ＣＵＮＯ浄化処理流からラクターゼを除去した。Ｂｉｏｍａｘ−５０Ｋから回収した透過液を、公称４００〜５００分子量カットオフのナノ濾過膜（ＧＥ  Ｇ−５  ＵＦ）を使用して濃縮した。透過液濃縮物（permeate concentrate、ＰＣ）がヒトミルクオリゴ糖の５％（ｗ／ｗ）の目標に達したとき、Ｇ−５  ＵＦ濃度プロセスを終了した。製剤化されたＰＣを低温殺菌し、充填前に０．２ｕｍ滅菌フィルタを通して浄化した。ＰＣを生成物出荷前に−２０℃以下で容器内に保管し、ラベル付し、かつ包装した。このプロセスは、図１に図式化されている。代替的なプロセスは、図２に示されている。
【００７７】
実施例２：透過液濃縮物（ＰＣ）を透過液濃縮物−濃縮物（permeate concentrate-concentrate、ｐｃ−ｃ）に処理する
【００７８】
実施例１に従って産生された凍結透過液濃縮物（８倍以上、「ＰＣ」と称される）を約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃の温度範囲を維持しながら解凍及びプールし、約１０分間混合した。ＰＣを、例えばＧＥ  Ｇ−５  ＵＦを使用した限外濾過によって更に濃縮して、目標の２０倍以上の濃縮を達成した。透過液濃縮物−濃縮物（ＰＣ−Ｃ）を乳貯蔵容器内に移し、その後の処理の継続のために−２０℃以下の冷凍庫に保管した。このプロセスは、図３に図式化されている。
【００７９】
実施例３：ＨＭＯ製剤
【００８０】
約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃の温度範囲を維持しながら、ＰＣ−Ｃを解凍及びプールした。計算された量のＰ２−ＯｎｅＡ又は精製水をＰＣ−Ｃに添加して、最終目標の５％ｗ／ｗのＨＭＯを得た。この工程は、ＰＣ−Ｃ試料中のＨＭＯ濃度の調整が必要でない場合には必須ではない。このプロセスは、図４（Ａ）に図式化されている。
【００８１】
実施例４：最終容器低温殺菌及び濾過
【００８２】
凍結した場合、濃縮ＨＭＯを約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃に解凍した。次いで、それを６３℃以上で約３０分間低温殺菌した。低温殺菌後、濃縮ＨＭＯを約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃の温度に冷却し、０．２ミクロンの滅菌フィルタを通して浄化した後、約２℃〜約８℃で保管した。代表的な試料を目視検査、総ＨＭＯ計算、ｐＨ、オスモル濃度、ミネラル、及び糖分析のために採取した。
【００８３】
全ＨＭＯ結果が利用可能である場合、各用量の目標ＨＭＯ範囲を達成するために、全ＨＭＯ結果に基づき充填体積を計算した。
【００８４】
ＨＭＯ結果が完了し、ラベルを作成すると、生成物を冷凍庫から取り出し、ＩＳＯ  ８クリーンルームに移した。ラベルを各ボトルに貼り付け、各ラベル付きボトルを気密バッグ又は気密耐タンパー性ボトル内に配置し、クレート内に配置した。いったんクレートが完了すると、クレートを二重の袋に入れ、生成物が出荷の準備が整うまで、−２０℃以下の冷凍庫に戻した。このプロセスは、図４（Ｂ）に図式化されている。
【００８５】
実施例５：精製ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、良好な仕様を完成した
【００８６】
期限及び保存：期限は、低温殺菌の日から１年マイナス１日であり、保存は、−２０℃以下の冷凍であった。
【００８７】
１つの代表的な試料を、浄化工程中に滅菌フィルタ容器のうちの１つから、０．２ミクロンのフィルタを通して採取した。試料を目視検査、ｐＨ、オスモル濃度、糖プロファイル、ミネラル含量、及び総ＨＭＯ計算に使用した。この試験の結果は、表２に要約される。
【表２】
2019528740.tif 000004
【００８８】
バイオバーデン最終容器出荷試験
代表的な試料を充填プロセスから採取した。各最終バルクロット充填には、１つのバイオバーデン試料のみが必要であった。実施例：１つの最終バルクロットを０．１ｘ及び０．２ｘの目標用量に充填した場合、１つの試料のみを採取して、充填された０．１ｘ及び０．２ｘの目標用量の両方を表した。これらの試験の結果は、表３に示される。
【表３】
2019528740.tif 000005
１結果が１００ＣＦＵ／ｍＬ以上である場合、例外的条件を開始し、追加の２つの試料が試験される。最終的に報告された結果は、３つの試料の平均である。
２結果が１００ＣＦＵ／ｍＬ以上である場合、例外的条件を開始し、追加の２つの試料が試験される。最終的に報告された結果は、３つの試料の平均である。
【００８９】
実施例６：精製ＨＭＯの生物学的利用能及び生物活性の評価
【００９０】
１８歳〜５０歳の年齢の３２名の健康な成人における漸増用量制御初期相試験を実施して、本発明の方法によって作製され、前述の実施例に記載された精製ＨＭＯ組成物の免疫系に対する生物学的利用能及び潜在的効果を評価した。
【００９１】
研究対象は、前の実施例に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ濃縮物を、１日当たり３回、７日間連続して経口摂取した（１〜７日目）。男性及び女性研究対象の４つの別々の群は、以下の濃度、０．１ｘ、０．２ｘ、０．５ｘ、及び１ｘで精製ＨＭＯ組成物を投与され、ここでｘは、人乳中の濃度及び早産児に重量ベース当たり与えられる用量に基づき、７０ｋｇの成人に与えられるように計算されたＨＭＯの総重量を表す。現在、これは、１５０ｍＬ／ｋｇ／日の乳児授乳体積に基づき０．７５ｇ／ｋｇに達する。結果として、１Ｘを投与される７０ｋｇの成人は、５２．５ｇの本明細書で作製された精製ＨＭＯ組成物を投与される。
【００９２】
全ての対象からの血液、尿、糞便、及び唾液の試料、並びに女性対象からの膣スワブを、−１（１日目は、精製ＨＭＯ組成物の摂取の初日）、７、１４、及び２８日目に採取した。親ＨＭＯ  ３−シアルラクトース並びにＨＭＯ塩基、グルコース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びシアル酸の存在について、尿、血液、及び糞便を試験した。非経口ＨＭＯ  ３−シアルラクトースは、尿中のみで無傷で見られ、ＨＭＯの再循環を示唆したが、ＨＭＯの分解生成物は、尿、血液、及び糞便の３つ全てで見られ（図６）、経口送達された精製ＨＭＯ組成物が生物学的に利用可能であることを確認した。
【００９３】
本研究で投与された経口摂取された精製ＨＭＯ組成物が生物活性であるか、特に精製ＨＭＯ組成物が炎症の全身性マーカーに生理学的効果を有するかどうかを判定するために、血清エイコサノイドを分析した。エイコサノイドは、細胞膜リン脂質に対するホスホリパーゼＡの作用によって産生される免疫活性化剤の多様なファミリーであり（図７（Ａ）を参照されたい）、血清中のそれらの上昇は、免疫応答の兆候を表す。
【００９４】
図７（Ｂ）及び（Ｃ）に示されるように、研究対象の血清中に存在するエイコサノイド及びそれらの代謝産物のレベルの減少があり、この減少は、経時的により有意になるだけであったことから、精製ＨＭＯ組成物が生物学的に利用可能であるだけでなく、生物活性であり、かつ組成物を投与された対象の全体的な炎症特徴を減少させることが可能であることも示唆している。
【００９５】
この生物活性を更に検証するために、炎症の別のマーカーであるスフィンゴ脂質代謝の血清代謝産物も分析した。図８に示されるように、エイコサノイドと同様に、いくつかのスフィンゴ脂質代謝産物もまた、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を投与された対象において、経時的に低減される。
【００９６】
総合すると、本明細書に初めて提示されるのは、ラクトース及び／又はミネラル含量が実質的に低減された、ＨＭＯの完全補体を含む精製ＨＭＯ組成物を効率的に産生するための方法である。更には、この新規の精製ＨＭＯ組成物は、生物学的に利用可能、並びに免疫系に対して顕著な効果を有する生物活性の両方であることが本明細書に示される。
１．Ｂａｏ  Ｙ，Ｚｈｕ  Ｌ，Ｎｅｗｂｕｒｇ  ＤＳ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉａｌｙｌｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７；３７０：２０６〜２１４．
２．Ｂｏｄｅ，Ｌ．Ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｅｖｅｒｙ  ｂａｂｙ  ｎｅｅｄｓ  ａ  ｓｕｇａｒ  ｍａｍａ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１２  Ｓｅｐ；２２（９）：１１４７〜１１６２．２０１２年４月１８日にオンラインで公開。
３．１４．Ｂｏｄｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，７４（１０）：６３５〜６４４
４．Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  Ｐ，Ｗａｒｒｅｎ  ＣＤ，Ａｌｔａｙｅ  Ｍ，Ｍｏｒｒｏｗ  ＡＬ，Ｒｕｉｚ−Ｐａｌａｃｉｏｓ  Ｇ，Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  ＬＫ，Ｎｅｗｂｕｒｇ  ＤＳ．Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｖａｒｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ａｎｄ  ｏｖｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｌａｃｔａｔｉｏｎ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００１；１１：３６５〜３７２．
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７．Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ  Ｏ，Ｚａｍｐｉｎｉ  Ｌ，Ｇａｌｅａｚｚｉ  Ｔ，Ｐａｄｅｌｌａ  Ｌ，Ｓａｎｔｏｒｏ  Ｌ，Ｐｅｉｌａ  Ｃ，Ｇｉｕｌｉａｎｉ  Ｆ，Ｂｅｒｔｉｎｏ  Ｅ，Ｆａｂｒｉｓ  Ｃ，Ｃｏｐｐａ  ＧＶ．Ｐｒｅｔｅｒｍ  ｍｉｌｋ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｍｏｎｔｈ  ｏｆ  ｌａｃｔａｔｉｏｎ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１１；１２８：ｅ１５２０〜１５３１．
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１０．Ｋｕｎｚ  Ｃ，Ｒｕｄｌｏｆｆ  Ｓ，Ｂａｉｅｒ  Ｗ，Ｋｌｅｉｎ  Ｎ，Ｓｔｒｏｂｅｌ  Ｓ．Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．２０００；２０：６９９〜７２２．
１１．Ｋｕｎｚ  Ｃ，Ｒｕｄｌｏｆｆ  Ｓ，Ｓｃｈａｄ  Ｗ，Ｂｒａｕｎ  Ｄ．Ｌａｃｔｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｅｌｅｐｈａｎｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ．Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．１９９９；８２：３９１〜３９９．
１２．Ｋｕｎｚ  ｅｔ  ａｌ．「Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｌｋ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」ｐａｇｅ  ５  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｄｒ．Ｆ．Ｊａｖｉｅｒ  Ｍｏｒｅｎｏ  ａｎｄ  Ｄｒ．Ｍａｒｉａ  Ｌｕｚ  Ｓａｎｚ編集
１３．Ｍｏｒｒｏｗ  Ｒｕｉｚ−Ｐａｌａｃｉｏｓ  ＧＭ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｎｅｗｂｕｒｇ  ＤＳ．，Ｈｕｍａｎ−ｍｉｌｋ  ｇｌｙｃａｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｂｒｅａｓｔ−ｆｅｅｄｉｎｇ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．１３５：１３０４〜０７，２００５．
１４．Ｎｅｗｂｕｒｇ  ＤＳ，Ｓｈｅｎ  Ｚ，Ｗａｒｒｅｎ  ＣＤ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２０００；４７８：３８１〜３８２．
１５．Ｓａｒｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６９：４６１〜４６７
１６．Ｔｈｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐ  ａｎｄ  Ａｎａｌ．，４２：３０〜３７．
１７．Ｗａｒｄ（２００９）Ｏｐｅｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２：９〜１５
１８．Ｚｉｖｋｏｖｉｃ，ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０８（ｓ１）：４６５３〜４６５８．
【図１】
2019528740.tif 000006
【図２】
2019528740.tif 000007
【図３】
2019528740.tif 000008
【図４】
2019528740.tif 000009
【図５】
2019528740.tif 000010
【図６】
2019528740.tif 000011
【図７】
2019528740.tif 000012
【図８】
2019528740.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月21日(2019.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３９６，７９９号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、実質的に精製されたヒトミルクオリゴ糖（human milk oligosaccharide、ＨＭＯ）組成物を産生するためのプロセス、それによって産生される実質的に精製された組成物、並びに組成物を使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、人乳に非常に豊富であり、母乳に固有である、構造的に多様な非共役グリカンのファミリーである。元々、ＨＭＯは、プレバイオティックな「ビフィズス因子」、又は腸のビフィズス菌種の成長を促進することが分かり、かつ調合乳で育てられた乳児と比較して母乳で育てられた乳児の大便中に独特に見られる人乳グリカンであることが提案されている。更なる研究は、多様な乳グリカンが授乳と関連する健康上の利益に部分的に関与していることを示唆している。今日、ＨＭＯは、ただの「菌のための食物」ではないことが知られている。増え続ける一連の証拠は、ＨＭＯが、乳児の粘膜面への病原体付着を防止し、それによりウイルス、細菌、及び原虫寄生体感染のリスクを低下させる可溶性デコイ受容体として機能する抗接着性抗菌剤であることを示唆している。加えて、ＨＭＯは、上皮及び免疫細胞応答を調節し、それにより過剰な粘膜白血球浸潤及び炎症を低減し、それにより壊死性腸炎のリスクを低下させ、かつ脳の発達及び認知に潜在的に必須な栄養素としてシアル酸を乳児に提供すると考えられている。
【０００４】
ＨＭＯは、５つのモノサッカライド、グルコース（glucose、Ｇｌｃ）、ガラクトース（galactose、Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine、ＧｌｃＮＡｃ）、フコース（fucose、Ｆｕｃ）、及びシアル酸（sialic acid、Ｓｉａ）からなり、Ｎ−アセチルノイラミン酸（N-acetylneuraminic acid、Ｎｅｕ５Ａｃ）は、Ｓｉａの形態のみではない場合に主要なものである。２００を超える異なるＨＭＯがこれまでに特定されているが、全ての女性がオリゴ糖の同じ組を、又は同じ量で合成するわけではない（Ｋｏｂａｔａ  ２０１０に概説されている）。したがって、ＨＭＯに対する集団多様性は、多くの場合、いずれか一人の女性の多様性よりもはるかに大きい。
【０００５】
更には、オリゴ糖の組成及び濃度もまた、授乳の過程で変化する（Ｋｕｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００に概説されている）。初乳は、２０〜２５ｇ／ＬほどのＨＭＯを含有するが、乳汁の分泌が発達すると、総ＨＭＯ濃度は、５〜２０ｇ／Ｌに低下し、多くの場合それでもなお総乳タンパク質濃度を超え、人乳のＨＭＯ画分をラクトース及び脂肪に次いで３番目に豊富な画分にする。ＨＭＯについて報告されているＨＭＯ濃度及び多様性の幅広い範囲は、女性間のグリコシル化経路の既知の遺伝的変異だけではなく、様々な学術研究及び委託研究の研究所によるＨＭＯの検出及び定量化で使用される分析方法の技術的差異も反映する。
【０００６】
しかしながら、明らかなことは、乳牛、ヒツジ、及びヤギなどの他の哺乳動物の乳中に存在するオリゴ糖が、人乳中のオリゴ糖よりもはるかに少なく、構造的に異なるということである。例えば、最もオリゴ糖が豊富なウシ乳の部分である初乳でさえ、約５０の分子種のオリゴ糖のみを含有する。ＨＭＯに最も構造的に類似したミルクオリゴ糖プロファイルを含有すると考えられているヤギ乳は、ＨＭＯの特徴的な多様性の２５％未満の約４０の分子種のみを含有する（Ｔｈｕｍ，ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【０００７】
原料の可用性に対する制限に加えて、ミルクオリゴ糖組成物の産生に対する別の主要な障害は、乳のオリゴ糖部分の単離及び濃縮中、特にタンパク質沈殿とは対照的に限外濾過がタンパク質を除去するために、かつ収率を失うことなくそれを行うために使用される場合、乳のオリゴ糖部分と共に濃縮する傾向があるラクトース及び他のミネラルの低減である。これは、処理されている乳の種にかかわらず、プロセス制限のままであるが、この問題がどこよりも強く感じられるのはヒトオリゴ糖組成物の調製であり、これは、出発物質が非常に乏しく、収率の損失を許容できないものにするためである。
【０００８】
溶媒ベースの系を使用してタンパク質及び他の主要栄養素を除去することによって、この問題を解決しようと試みた者もいた。この方法は、限外濾過プロセスと関連するラクトース及びミネラルの蓄積を防止する。実のところ、この方法が実際にラクトースの除去を補助することができることが報告されている（例えば、Ｓａｒｎｅｙ，２０００を参照されたい）。しかしながら、このプロセスは、溶媒の使用を必要とし、人乳の残りの部分を効果的に破壊し、それを他の生命を救う製品に使用できない状態にする。商品が人乳と同じくらい乏しい場合、これは、単純に許容できない。
【０００９】
本明細書で使用されるような人乳透過液を生成するために使用される限外濾過プロセスは、潜在的に有害な有機溶媒の使用を回避し、タンパク質画分を他の生命を救う製品で使用するために保存する一方で、乳中のラクトース及びミネラルの問題を悪化させるだけである。濃縮人乳透過液のラクトース含量は、例えば、乳中に見られる濃度である６％以下のラクトースレベルと比較して、場合によっては１０〜１５％にも達し得る。これらのレベルのラクトースは、ラクトースを消化することが酵素的に可能である人々にとってでさえも（可能ではない人々は言うまでもなく）消化することが困難である。酵素消化、続いて消化に使用された酵素を除去するための連続透析濾過を含む、ラクトースを除去するためのいくつかのアプローチが使用されてきた。ラクトース及びミネラルを濃縮する限外濾過とは対照的に、タンパク質が有機溶媒を用いた沈殿により除去されたこれらの試料中でさえ、有意なレベルのラクトースが透析濾過後に残っており、この組成物のミネラル含量は言うまでもない。（例えば、Ｓａｒｎｅｙ，２０００及びＧｒａｎｄｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ  ２００２を参照されたい）。更には、ＨＭＯ組成物の透析濾過はまた、低分子量のＨＭＯ種、例えば２ＦＬの許容できない損失をもたらす。
【００１０】
大量の精製ＨＭＯへのアクセスを提供するために利用可能な天然資源が存在しないため、市場の大部分の乳児用調合乳は、新生児にオリゴ糖を全く提供せず、提供する調合乳は、ガラクトオリゴ糖（galactooligosaccharide、ＧＯＳ）及びフラクトオリゴ糖（fructooligosaccharide、ＦＯＳ）を含む、ＨＭＯを模倣するように意図された非自然発生的オリゴ糖、又はより最近では、自然発生的ＨＭＯの化学合成型ＬＮｎＴ及び２’−ＦＬのいずれかを提供する（Ｂｏｄｅ，２０１５）。これらの組成物は、完全にＨＭＯを含まない組成物に対する改善を表し得るが、それらは、平均の人乳よりもＨＭＯの分子種に対して実質的にあまり多様ではなく、集団を見渡したときに人乳よりも確実にはるかに多様性が少ない。
【００１１】
必要とされるのは、構造的及び機能的に多様であるが、実質的に低減されたラクトース及び／又はミネラル含量を有するＨＭＯ組成物の効率的な回収、濃度、及び精製を可能にするプロセスである。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書では、実質的に低減されたラクトース及び／又はミネラル濃度を有する一方で、人乳の集団にわたって見られるオリゴ糖の構造的及び機能的多様性を保持するヒトミルクオリゴ糖組成物を製造する方法が提供される。本明細書に提供される方法は、拡張性があるという利点、及び例えばタンパク質を除去するために溶媒を使用することによって、残りの乳画分を破壊しないという追加の利点を有する。
【００１３】
一実施形態では、精製ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）組成物を製造するための方法が提供される。一実施形態では、方法は、人乳透過液を、人乳透過液中のラクトースの消化に好適な条件下で、かつそのような消化に十分な期間にわたって、ラクトースを消化することが可能な酵素と混合することを含む。いくつかの実施形態では、酵素は、ラクターゼ酵素である。いくつかの実施形態では、ラクターゼ酵素は、消化後にラクターゼ消化透過液混合物から除去される。いくつかの実施形態では、ラクターゼ除去の前に、透過液／ラクターゼ混合物は、例えば、デプスフィルタを通して浄化される。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、濾過によって混合物から除去される。いくつかの実施形態では、濾過は、約５０，０００ダルトンの孔径を有する膜を通した濾過を含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の追加のフィルタを通して混合物を濾過することを更に含む。一実施形態では、１つ以上の追加のフィルタは、約２，０００〜約３，０００ダルトンの孔径を有する膜を含む。一実施形態では、１つ以上の追加のフィルタは、約６００ダルトンの孔径を有する膜を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、透過液へのラクターゼ酵素の添加の前又はそれと同時に、透過液のｐＨ及び／又は熱は、調整される。一実施形態では、ｐＨは、約４．３〜約４．７に調整される。一実施形態では、ｐＨは、約４．５に調整される。一実施形態では、透過混合物の熱は、ラクターゼの添加の前又はそれと同時に調整される。一実施形態では、熱は、約４５℃〜約５５℃の温度に調整される。一実施形態では、熱は、約５０℃の温度に調整される。一実施形態では、透過液のｐＨは、約４．３〜約４．７に調整され、熱は、約４５℃〜約５５℃の温度に調整される。
【００１５】
一実施形態では、ラクターゼは、約０．１％〜約０．５％ｗ／ｗの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約０．１％ｗ／ｗの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約５〜約２２５分間透過液と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約１５〜約１２０分間透過液と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約３０〜約９０分間透過液と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ラクターゼは、約６０分間透過液と共にインキュベートされる。
【００１６】
一実施形態では、インキュベーション後、透過液／ラクターゼ混合物は、約２０℃〜約３０℃の温度に冷却される。一実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、約２５℃の温度に冷却される。一実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、浄化される。一実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、デプスフィルタを通して浄化される。一実施形態では、デプスフィルタは、約１ミクロン〜約５ミクロンのフィルタを含む。
【００１７】
一実施形態では、ラクターゼは、濾過を介して除去される。一実施形態では、ラクターゼは、約５０，０００ダルトンの孔径を有するフィルタを通した濾過を介して除去される。一実施形態では、組成物は、１つ以上の追加のフィルタを通して更に濾過される。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のフィルタは、約２，０００〜約３，０００ダルトンの孔径を有する膜を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のフィルタは、６００ダルトン以下の孔径を有する膜を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２，０００〜約３，０００ダルトンの膜を含むフィルタ、続いて６００ダルトン以下の膜を通した濾過の両方を通して濾過される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物が提供される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、透過液と比較して低減されたレベルのラクトース及びミネラルを有する。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約５．０％ｗ／ｗ未満のラクトースを含む。いくつかの実施形態では、ＨＭＯ組成物は、表１のミネラルプロファイルを含む。一実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約０．５％〜約７．５％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約１．０％〜約２．０％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約２．０％〜約４．０％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約４．０％〜約５．０％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約５．０％〜約７．５％のＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約５．０％ｗ／ｗのＨＭＯのＨＭＯ濃度を含む。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って作製されたＨＭＯプロファイルは、図５（Ｅ及びＦ）に示されるＨＭＯプロファイルを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物を投与することを必要とする対象にそれを行うための方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＮＥＣを治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行うための方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、全身性炎症を減少させるための方法が、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を投与することによって提供される。いくつかの実施形態では、感染を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行うための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を投与することによって、ウイルス又は細菌感染を治療又は予防するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、細菌感染は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ノロウイルス又はロタウイルスである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、追加の医薬品又は治療薬の前、最中、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、糞便、臓器、又は骨髄移植の前、最中、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、抗生物質、抗ウイルス、又は抗真菌治療レジメンの前、最中、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、プロバイオティック組成物の前、最中、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、化学療法及び／又は放射線療法の前、最中、又は後に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】例示的なＨＭＯ産生プロセスの概略図を示す。
【００２２】
【図２】代替的なＨＭＯ産生プロセスの概略図を示す。
【００２３】
【図３】８倍以上の濃縮透過液から８倍以上の濃縮透過液から２０倍の濃縮透過液を産生するために使用されるプロセスの概略図を示す。
【００２４】
【図４】（Ａ）精製ＨＭＯ組成物を製剤化するために使用されるプロセスの概略図、並びに（Ｂ）精製ＨＭＯ組成物を低温殺菌及び充填するために使用されるプロセスを示す。
【００２５】
【図５】プールされたドナー乳（Ａ及びＢ）、人乳透過液（Ｃ及びＤ）、並びに精製ＨＭＯ組成物（Ｅ及びＦ）からの中性（Ａ、Ｃ、及びＥ）並びにシアリル化（Ｂ、Ｄ及びＦ）ＨＭＯのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィの結果を示す。
【００２６】
【図６】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び極性ＬＣを使用して得られたＨＭＯが投与された成人からの血清、糞便、及び尿の網羅的非標的メタボロミクスを示す。結果は、（Ａ）血清、（Ｂ）尿、（Ｃ）糞便、及び（Ｄ）乳中で検出された非経口ＨＭＯ及びＨＭＯ分解産物を示す。
【００２７】
【図７】（Ａ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び極性ＬＣを使用して得られたエイコサノイドの代謝経路、並びに（Ｂ及びＣ）本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を摂取した対象における経時的なエイコサノイド代謝産物のレベルを示す。
【００２８】
【図８】本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を摂取した対象における経時的な、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び極性ＬＣを使用して得られるスフィンゴ脂質代謝産物の血清レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、実質的に低減されたラクトース及びミネラル含量を有する精製ヒトミルクオリゴ糖組成物を産生するためのプロセス、それにより産生された新規の組成物、並びにそのような新規の組成物を使用するための方法を提供する。プロセスは、プールされた人乳の濾過部分から開始し、したがって本発明の精製ＨＭＯ組成物は、任意の典型的な個々の女性と比較して、ＨＭＯの別々の分子種のより多様なプロファイルを含有することができる。したがって、本明細書の組成物は、多くの場合、ＨＭＯの集団を表すと言われ、それは、個人のＨＭＯプロファイルを表すこととは対照的である。
【００３０】
「ヒトミルクオリゴ糖（複数可）」（本明細書では「ＨＭＯ（複数可）」とも称される）は、ヒト母乳中に見られる構造的に多様な非共役グリカンのファミリーを意味する。
【００３１】
ヒトミルクオリゴ糖は、還元末端にラクトース、及び典型的には非還元末端にフコース又はシアル酸を含有する炭水化物である（Ｍｏｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。これらの末端糖は、細菌の選択的増殖、及び腸管内腔内の細菌病原体を含む他の分子又は細胞とのオリゴ糖の相互作用に最も強く影響する残基である。更に、シアル酸は、脳ガングリオシドの構造的及び機能的成分であり、乳児の神経学的発達に関与している。
【００３２】
オリゴ糖は、糖タンパク質、糖脂質などとして遊離し得るか、又は共役され得、グリカンとして分類される。それらは、ラクトース及び脂質に次いで３番目に多い人乳の固体成分を構成する（Ｍｏｒｒｏｗ，２００５）。しかしながら、ミルクオリゴ糖の大部分は、乳児によって消化されず、乳児の糞便中に大部分無傷で見つけられ得る。
【００３３】
「透過液」とは、限外濾過の生成物である乳（例えば、プールされた人乳）の一部分を意味する。具体的には、（例えば、約１〜１０００ＫＤａのフィルタを通した）限外濾過後に残される液体。この限外濾過プロセスを通過する液体が透過液と称される。このプロセスの未透過液は、人乳タンパク質を濃縮し、それは次いで、他の生命を救う製剤を作り出すために、例えば、米国特許第８，３７７，４５５号に記載されているものなどの人乳強化剤組成物を作製するために使用され得る。したがって、ＨＭＯ生成物を汚染し得る溶媒を用いたタンパク質沈殿に依存する方法とは対照的に、本明細書で使用されるような実質的にタンパク質を含まない出発物質を得るための限外濾過の使用は、有機溶媒の使用を回避しながら、人乳中の有益な主要栄養素の残りの部分を保存する。
【００３４】
「乳」とは、哺乳動物の乳腺によって産生され、乳房によって搾り出される流体を意味する。乳は、初乳、全乳、及び脱脂乳が挙げられるが、これらに限定されない全ての授乳製品を含む。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「乳」は、典型的には、ヒト全乳を指す。
【００３５】
「全乳」とは、脂肪が除去されていない乳（例えば、プールされた人乳）を意味する。
【００３６】
「脱脂乳」とは、脂肪の少なくとも７５％が除去された乳（例えば、プールされた人乳）、あるいは遠心分離に供されて脂肪を除去した乳を意味する。
【００３７】
「実質的に低減されたラクトース及び／又はミネラル含量」にあるような「実質的に」とは、ミネラル及び／又はラクトースのレベルの低減が、本方法に供されていない濃縮透過液と比較したときの統計的差異を表すことを意味する。一例として、いくつかの実施形態では、実質的に低減されたラクトースを有する精製ＨＭＯ組成物は、５％以下のラクトースレベルを含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」とは、他の主要な生物活性因子を除いて、特定の列挙された成分を含有する組成物を指す。例えば、ＨＭＯから本質的になる組成物は、タンパク質、脂肪、外因的に添加された材料のようなものを除外するが、例えば、水、許容可能なレベルのある特定の塩、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、又はエクソソームなどの他の不活性又は痕跡材料を含有してもよい。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「精製ＨＭＯ組成物」という用語は、実質的に低減されたレベルのラクトース及び／又はミネラルを有し、本明細書に提供される方法によって産生されるＨＭＯ組成物（例えば、濃縮ヒト透過液）を意味する。例示的な精製ＨＭＯ組成物は、図５（Ｅ）及び（Ｆ）に示される。
精製ＨＭＯ組成物を作製する方法
【００４０】
人乳透過液は、本発明の精製ＨＭＯ組成物が本明細書に記載されるプロセスによって産生される出発物質として機能する。人乳透過液を得るための方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，９２７，０２７号に見られる。
【００４１】
簡潔に、薬物、汚染物質、病原体、及び混和物に対してスクリーニングされ、耐熱性細菌胞子を除去するために濾過された、事前に選定されたドナーからのプールされた乳が、クリーム画分及びスキム画分に分離される（例えば、遠心分離によって）。スキム画分は、更なる濾過、例えば、１〜１０００ｋＤａの孔径を有する限外濾過を受けて、タンパク質豊富な未透過液及びＨＭＯ含有透過液を得る。このプロセスの詳細は、例えば、米国特許第８，５４５，９２０号、同第７，９１４，８２２号、同第７，９４３，３１５号、同第８，２７８，０４６号、同第８，６２８，９２１号、及び同第９，１４９，０５２号に見られ、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
一実施形態では、実質的に低減されたレベルのラクトースを有する精製ＨＭＯ組成物を産生するためのプロセスが提供される。このプロセスは、人乳透過液のＨＭＯ含量の収率の損失又は分子プロファイルの変化のない、ラクトースが豊富な人乳透過液画分からのラクトースの生化学的及び／又は酵素的除去を必要とする。また、いくつかの実施形態では、酵素消化がラクトースを低減するために使用される場合、残留不活性化異種タンパク質を残さない。
【００４３】
一実施形態では、人乳透過液から、したがって精製ＨＭＯ組成物からラクトースを低減するためのプロセスは、ａ）透過液混合物のｐＨを調整する工程と、ｂ）ｐＨ調整された混合物を加熱する工程と、ｃ）ラクターゼ酵素を加熱された透過液混合物に添加して、透過液／ラクターゼ混合物を作り出し、ある期間インキュベートする工程と、ｄ）混合物からラクターゼを除去し、混合物を濾過してラクターゼを除去する工程と、ｅ）ヒトミルクオリゴ糖を濃縮する工程とを含む。本明細書に記載される工程は、時系列で列挙されているが、当業者は、工程（ａ）〜（ｃ）が実施される順序が変更され得ることを理解するであろう。つまり、ほんの一例として、ラクターゼ酵素は、混合物を加熱する前に、あるいは加熱プロセス中の任意の時点で添加されてもよい。同様に、またほんの一例として、混合物は、ｐＨの調整前に加熱されてもよい。更に、いくつかの工程は、単一工程にグループ化されてもよく、例えば、「ラクトースの酵素消化」又は「ラクトースのラクターゼ消化」は、上記のような工程（ａ）〜（ｃ）を伴う。これらの工程は、同時に実施されてもよく、又は任意の順序で連続的であってもよい。したがって、本明細書で使用される場合、「ラクトース消化」は、任意の順序での連続的な又は同時の少なくともこれら３つの工程の実施を指す。
【００４４】
一実施形態では、透過液のｐＨは、約３〜約７．５のｐＨに調整される。一実施形態では、ｐＨは、約３．５〜約７．０のｐＨに調整される。別の実施形態では、ｐＨは、約３．０〜約６．０のｐＨに調整される。更に別の実施形態では、ｐＨは、約４〜約６．５のｐＨに調整される。更に別の実施形態では、ｐＨは、約４．５〜約６．０のｐＨに調整される。更に別の実施形態では、ｐＨは、約５．０〜約５．５のｐＨに調整される。更に別の実施形態では、ｐＨは、約４．３〜約４．７、好ましくは４．５のｐＨに調整される。ｐＨは、酸又は塩基を添加することによって調整され得る。いくつかの態様では、ｐＨは、酸、例えばＨＣｌを添加することによって調整される。更に他の態様では、ｐＨは、１Ｎ  ＨＣｌを添加し、ある期間、例えば約１５分間混合することによって調整される。
【００４５】
一実施形態では、ｐＨ調整された透過液は、約２５℃〜約６０℃の温度に加熱される。別の実施形態では、透過液は、約３０℃〜約５５℃の温度に加熱される。別の実施形態では、透過液は、約４０℃〜約５０℃の温度に加熱される。別の実施形態では、透過液は、約４８℃〜約５０℃の温度に加熱される。更に別の実施形態では、透過液は、約５０℃の温度に加熱される。更に別の実施形態では、透過液は、約４０℃以下の温度に加熱される。
【００４６】
一態様では、ラクターゼ酵素が、ｐＨ調整され加熱された透過液に添加されて、透過液／ラクターゼ混合物を作り出し、ラクトースをモノサッカライドに分解する。一実施形態では、ラクターゼ酵素は、約０．１％ｗ／ｗ〜約０．５％ｗ／ｗの濃度で添加される。更に別の態様では、ラクターゼ酵素は、約０．１％ｗ／ｗ、又は０．２％、又は０．３％、又は０．４％、又は０．５％ｗ／ｗで添加される。使用され得る多くの市販のラクターゼ酵素が存在する。したがって、ラクターゼ酵素は、任意の起源由来であってもよい（例えば、真菌又は細菌由来）。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ｐＨ調整され加熱された透過液は、ラクターゼ酵素と共に約５〜約２２５分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約１５分〜約９０分である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約３０分〜約９０分である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約６０分である。当業者は、インキュベーション時間が、使用される酵素源、混合物の温度及びｐＨ、並びに使用される酵素の濃度が挙げられるが、これらに限定されない無数の要因に依存することを理解するであろう。これらの変数のいずれも、ラクターゼ酵素とのより長い又はより短いインキュベーション時間を必要とする場合がある。本明細書に提供されるｐＨ、温度、及び酵素インキュベーション条件は、本明細書に記載されるプロセスに最適に作用するものであるが、当業者は、同様の結果を達成するために、これらの変数のうちの１つ以上に修正が行われ得ることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載される約０．１％ｗ／ｗ〜約０．５％ｗ／ｗよりも少ない酵素が使用される場合、インキュベーション時間は、同じレベルのラクトース消化を達成するために延長される必要があり得る。同様に、温度及びｐＨ変数の両方に対しても同様の調整が行われ得る。
【００４８】
一実施形態では、インキュベーション後、透過液／ラクターゼ混合物は、約２０℃〜約３０℃の温度に冷却される。特定の実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、約２５℃の温度に冷却される。
【００４９】
一実施形態では、透過液／ラクターゼ混合物は、浄化されて不溶性構成成分を除去する。ある特定の場合では、不溶性材料は、ｐＨ及び温度の変化全体を通して形成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、混合物を浄化して、例えば、デプスフィルタを通してこれらの不溶性構成成分を除去することが必要であるか、又は有益であり得る。フィルタは、０．１〜１０ミクロンのフィルタであってもよい。いくつかの実施形態では、フィルタは、約１〜約５ミクロンのフィルタである。あるいは、不溶性構成成分の除去は、遠心分離プロセス、又は遠心分離及び膜濾過の組み合わせによって達成され得る。浄化工程は、本明細書に記載される多様なＨＭＯ組成物の調製に必須ではなく、むしろ、この任意の工程は、より精製されたＨＭＯ組成物を得るのを補助する。更に、浄化工程は、濾過膜の再利用性、したがってプロセスの拡張性において重要である。適切な浄化がないと、実質的により多くのフィルタ材料を必要とし、臨床規模でＨＭＯ組成物を産生することを困難かつ高価にする。しかしながら、製剤化及び適用に応じて、より多くの又はより少ない精製ＨＭＯ組成物を産生するために、この段階で、より厳密な又はあまり厳密ではない浄化が行われ得ることを理解するであろう。例えば、沈殿したミネラルは、脆弱集団（例えば、新生児）で使用するための液体製剤（複数可）と比較して、凍結乾燥のための製剤又は健康な成人で使用するための製剤に関する問題が少ない場合がある。
【００５０】
更に、場合によっては、浄化された透過液／ラクターゼ混合物から使用済み及び過剰なラクターゼ酵素を除去することが望ましい場合がある。しかしながら、不活性化異種タンパク質が生物学的危険性を有しない場合があり、したがって、ラクターゼ除去の追加工程又は不活性化さえ必要ではない場合がある。いくつかの実施形態では、使用済み及び過剰なラクターゼは、例えば、高温、高圧、又は両方によって不活性化される。いくつかの実施形態では、不活性化ラクターゼは、組成物から除去されない。
【００５１】
しかしながら、他の実施形態では、異種タンパク質を除去するための更なる精製が求められる。そのような実施形態では、ラクターゼ酵素の除去は、限外濾過によって達成され得る。いくつかの実施形態では、限外濾過は、限外濾過膜を使用して、例えば、５０，０００ダルトン以下の分子量カットオフを有する膜、例えば、ＢＩＯＭＡＸ−５０Ｋを使用して達成される。（例えば、図１を参照されたい）
【００５２】
いくつかの実施形態では、追加の限外濾過は、５０，０００ダルトン以下の分子量カットオフを有する初期の膜よりも小さい膜を通して実施される。いくつかの実施形態では、更なる限外濾過は、約２，０００〜３，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を用いて実施される。この追加の任意の濾過工程は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及びエクソソームなどのより小さい潜在的に生物活性及び／又は免疫原性の因子を除去するのを補助することによって、ＨＭＯ生成物の全体的な純度を更に補助する。図３は、この追加の濾過工程を伴う実施形態を示す。
【００５３】
一実施形態では、少なくとも１回、場合によっては２回以上の限外濾過（又は代替のラクターゼ除去手段）を受けた浄化された混合物は、更に濾過されて、ヒトミルクオリゴ糖を精製及び濃縮し、ミネラル及びモノサッカライド含量を低減する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、濾過は、ナノ濾過膜を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、膜は、１，０００ダルトン以下の分子量カットオフを有する。いくつかの実施形態では、膜は、６００ダルトン以下の分子量カットオフを有する。更に他の実施形態では、膜は、約４００〜約５００ダルトンの分子量カットオフを有する。この追加のナノ濾過は、モノサッカライド、ミネラル、特にカルシウム、及びより小さい分子を除去して、最終精製ＨＭＯ組成物を産生する際に重要な工程である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ミネラルの除去のために追加又は代替の工程が行われてもよい。そのような追加の工程としては、例えば、遠心分離、膜浄化（０．６ミクロン以下）、又は加熱された（４０℃以上）か、若しくは冷蔵／凍結及び解凍されたＨＭＯ濃縮物の遠心分離及び膜濾過の組み合わせが挙げられ得る。これらの追加又は代替の工程の回収された上清又は濾液は、いくつかの実施形態では、ナノ濾過膜を使用して更に濃縮される。いくつかの実施形態では、ナノ濾過は、６００ダルトン以下の分子カットオフを有する膜を通した濾過を含む。いくつかの実施形態では、これらの追加の工程は、低温殺菌の前又は後が挙げられるが、これらに限定されないプロセスの任意の段階で実施されてもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ナノ濾過膜の物理的特性は、濃縮されたシアリル化ＨＭＯが好ましい場合、シアリル化ＨＭＯを選択的に濃縮し、例えば、ＨＭＯ濃縮物からの中性ＨＭＯの除去のより高い効率を可能にするように、化学修飾などの修飾が行われ得る。
【００５７】
一実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、滅菌される。滅菌は、当該技術分野において既知の任意の手段によって行われ得る。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、低温殺菌される。いくつかの態様では、低温殺菌は、最低３０分間６３℃以上で達成される。低温殺菌後、組成物は、約２５℃〜約３０℃に冷却され、０．２ミクロンのフィルタを通して浄化されて、いかなる残留沈殿物質も除去する。
精製ＨＭＯ組成物
【００５８】
本発明の精製ＨＭＯ組成物は、実質的に低減されたレベルのラクトース及び／又はミネラルを有する。「実質的に低減された」という用語は、それがラクトースレベルに関連する場合、かつ本明細書で使用される場合、５％ｗ／ｗ以下のラクトースレベルを有することを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された精製ＨＭＯ組成物は、約４．５〜約８．５グラムのＨＭＯと、約５％ｗ／ｗ以下のラクトースと、表１に示されるミネラル組成物とを含む。
【表１】
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【００５９】
当業者は、精製ＨＭＯ生成物が粉末として製剤化される場合など、場合によっては、ミネラルの還元がそれほど重要ではない場合があることを理解するであろう。したがって、上記の値は、例示的な製剤、具体的には例示的な液体製剤としてのみ提供されるが、この製剤が粉末化され得ない理由はない。
【００６０】
いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約０．５％〜約７．５％ｗ／ｗＨＭＯを含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約１．０％〜約２．０％ｗ／ｗＨＭＯを含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約２．０％〜約４．０％ｗ／ｗＨＭＯを含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約４．０％〜約５．０％ｗ／ｗＨＭＯを含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約５．０％〜約７．５％ｗ／ｗＨＭＯを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約２０００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、約１０％ｗ／ｗ以下のグルコースを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物は、約１０％ｗ／ｗ以下のガラクトースを含む。モノサッカライド、グルコース、及びガラクトースの存在は、ラクトースの分解の結果であり、ラクトースレベルが低下すると、モノサッカライドレベルは増加する。モノサッカライド含量の大部分は、ミネラル及び残留ラクターゼを除去する同じ濾過プロセスを介して除去され得るが、低レベルのモノサッカライドは、精製ＨＭＯ生成物中に残る。しかしながら、二糖類ラクトースとは異なり、これらのモノサッカライドの存在は、特にこれらの低レベルで、膨大な数の個体に対して臨床的問題を生じない。
【００６２】
本発明のヒトミルクオリゴ糖組成物は、ヒト全乳の集団にわたって観察されるＨＭＯのプロファイルと構造的及び機能的の両方で実質的に同様である。つまり、組成物は、個々のドナーではなくむしろドナーのプールから得られるため、ＨＭＯの配列は、任意の一人の典型的な個人よりも多様である。図５は、プールされた人乳（Ａ及びＢ）、人乳透過液（Ｃ及びＤ）、並びに本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物（Ｅ及びＦ）の代表的なクロマトグラムを示す。
【００６３】
ＨＭＯ多様性の最大の変数のうちの１つは、母親のルイス血液型から、具体的には、活性フコシルトランスフェラーゼ２（fucosyltrasferase 2、ＦＵＴ２）及び／又はフコシルトランスフェラーゼ３（fucosyltrasferase 3、ＦＵＴ３）遺伝子を有するかどうかから得られる。活性ＦＵＴ２遺伝子が存在する場合、α１−２結合フコースが産生されるが、フコース残基は、α１−４結合され、ＦＵＴ３遺伝子は、活性である。この「分泌者の状態」の結果は、一般的に、「分泌者」（即ち、活性ＦＵＴ２遺伝子を有するもの）が、α１−２結合オリゴ糖によって支配されるＨＭＯのはるかにより多様なプロファイルを産生する一方で、「非分泌者」（即ち、活性ＦＵＴ２遺伝子を有しないもの）が、例えば、α１，−４結合オリゴ糖のより様々な配列を含み得るが（分泌者と比較して）、非分泌者が分泌者のＨＭＯレパートリの主要成分を合成することができないため、多様性の全体的な減少を含む場合があるということである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、乳のプールは、例えば、分泌者の状態に基づき構築され得る。つまり、いくつかの実施形態では、分泌者ではない母親からの乳のプールとは別の分泌者である母親から乳のプールを回収することが有益であり得る。分泌者である母親からの乳のプールは、α１−２結合ＨＭＯの大部分を含み、例えば、腸の健康を促進するために、又は炎症を低減するために有用であり得る。非分泌者である母親からの乳のプールは、α１−４結合オリゴ糖のはるかに多様な配列を含み、例えば、ノロウイルス又はロタウイルスを含むある特定の胃腸ウイルス感染の治療又は予防に有用であり得る。いくつかの実施形態では、分泌者対非分泌者から得られ、逆もまた同様である、本明細書に記載される精製ＨＭＯ組成物を作製するために使用される任意の人乳プールのある特定の割合が存在することを確実にして、可能な限り多様かつ代表的なＨＭＯプロファイルを確実にすることが有益であり得る。ＦＵＴ２及びＦＵＴ３における多型性は、特定のプールのためのドナーを選択するために使用され得る多型性の単なる一般的な例である。当業者は、任意の多型性に基づき乳のプールを選別して、ある特定のＨＭＯプロファイルを有する乳のプールを構築することが、任意の多型性に対して行われ得ることを理解するであろう。
【００６５】
母親は、提供前に分泌者又は非分泌者であると判定されてもよく、あるいは、又は加えて、ドナーとしての母親の事前資格審査中に、及び／又はいったん提供された乳が受け取られると、母親の分泌者の状態が得られ得る。分泌者の状態のスクリーニングは所定であり、任意の常法によって実施され得る。
精製ＨＭＯ組成物の使用
【００６６】
本発明の精製ＨＭＯ組成物は、人乳強化剤組成物、人乳、乳児用調合乳、非人乳などに添加されて、その栄養価及び／又は免疫学的値を高め得る。あるいは、本発明の精製ヒトミルクオリゴ糖組成物は、乳児、より年齢の高い小児、及び成人による消費のために、経口溶液中に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物は、凍結乾燥、又はフリーズ乾燥、又は別様に粉末化されてもよい。
【００６７】
本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物の抗感染、免疫調節、及びプレバイオティック効果により、組成物は、多種多様な生物学的及び臨床的状況で使用される。そのような使用としては、腸上皮細胞応答のモジュレータとして、免疫調節因子として、及び／又は壊死性腸炎（necrotizing enterocolitis、ＮＥＣ）に対する保護剤としてが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明の精製ヒトミルクオリゴ糖組成物は、抗炎症メディエータの生成に影響を及ぼすヒト粘膜（例えば、胃腸管又は尿生殖路）の微生物叢に良い変化を及ぼすのに、かつ／又は腸上皮表面への病原菌の付着を防止するのに有用である。
【００６９】
本発明は、本明細書に記載される方法に従って作製された精製ＨＭＯ組成物を対象に投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト早産児又は満期出産乳児である。いくつかの実施形態では、対象は、小児である。いくつかの実施形態では、対象は、成人である。いくつかの実施形態では、組成物は、局所、経口、又は直腸投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、栄養管を介して経口投与される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明の精製ＨＭＯ組成物は、別の活性剤での処理の前、最中、又は後に投与され得る。例えば、精製ＨＭＯ組成物は、抗生物質、抗ウイルス、抗真菌、及び／又はプロバイオティック治療過程の一部として、かつ抗生物質及びプロバイオティック剤と組み合わせて投与され得る。一実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、化学療法又は放射線療法に関連して投与され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製される精製ＨＭＯ組成物は、抗生物質と組み合わせて投与される場合、相乗効果を有する。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、糞便移植と併せて、又は糞便移植を受けているか、受けることになっているか、若しくは最近受けた対象に投与され得る。
【００７２】
本発明は、感染を有するか、又は感染を発症するリスクがある対象を治療する方法を提供し、精製ヒトミルクオリゴ糖組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、感染の症状は、細菌、細菌毒素、真菌、又はウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、感染は、細菌によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態では、感染は、ウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ノロウイルス又はロタウイルスである。別の実施形態では、ウイルスは、炎症性バーストによって症状を引き起こす出血性ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、エボラウイルス又は他の出血性発熱ウイルスである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト新生児、乳児、小児、又は成人である。いくつかの実施形態では、処置は、感染の少なくとも１つの症状を改善することを含む。いくつかの実施形態では、処置は、有益な腸内細菌の発達を促進することを含む。いくつかの実施形態では、有益な腸内細菌は、ビフィズス菌、乳酸菌、連鎖球菌、又は腸球菌のうちの１つ以上である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明の精製ＨＭＯ組成物は、抗炎症剤として、それを必要とする対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は、炎症状態を有する。いくつかの実施形態では、対象は、炎症性腸疾患を有する。いくつかの実施形態では、対象は、大腸炎を有する。いくつかの実施形態では、対象は、潰瘍性大腸炎を有する。いくつかの実施形態では、対象は、回腸嚢炎を有する。いくつかの実施形態では、対象は、クローン病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物は、移植に関連して使用され得る。いくつかの実施形態では、精製ＨＭＯ組成物は、移植を受けている患者における移植片対宿主病の拒絶又は罹患のリスクを減少させる。いくつかの実施形態では、移植は、固体臓器移植であり、いくつかの実施形態では、移植は、骨髄移植である。
実施例
【００７５】
実施例１：ヒトミルクオリゴ糖産生
【００７６】
精製ＨＭＯ組成物を産生するためのプロセスは、上記に定義されたように透過液から開始し、それを解凍及びプールした。出発透過液温度は、２３℃〜２８℃であった。透過液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌの添加で４．３〜４．７（目標４．５）に調整し、約１５分間混合した。次いで、透過液を約４８℃〜約５５℃、好ましくは５０℃に加熱した。ラクターゼ酵素（０．１％  ｗ／ｗ）を添加して、ラクトースをモノサッカライドに分解し、次いで溶液を約６０分間混合した。次いで、透過液／ラクターゼ酵素混合物を約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃に冷却し、デプスフィルタ（ＣＵＮＯ６０ＳＰ）を通して浄化した。限外濾過膜（Ｂｉｏｍａｘ−５０Ｋ）を使用して、ＣＵＮＯ浄化処理流からラクターゼを除去した。Ｂｉｏｍａｘ−５０Ｋから回収した透過液を、公称４００〜５００分子量カットオフのナノ濾過膜（ＧＥ  Ｇ−５  ＵＦ）を使用して濃縮した。透過液濃縮物（permeate concentrate、ＰＣ）がヒトミルクオリゴ糖の５％（ｗ／ｗ）の目標に達したとき、Ｇ−５  ＵＦ濃度プロセスを終了した。製剤化されたＰＣを低温殺菌し、充填前に０．２ｕｍ滅菌フィルタを通して浄化した。ＰＣを生成物出荷前に−２０℃以下で容器内に保管し、ラベル付し、かつ包装した。このプロセスは、図１に図式化されている。代替的なプロセスは、図２に示されている。
【００７７】
実施例２：透過液濃縮物（ＰＣ）を透過液濃縮物−濃縮物（permeate concentrate-concentrate、ｐｃ−ｃ）に処理する
【００７８】
実施例１に従って産生された凍結透過液濃縮物（８倍以上、「ＰＣ」と称される）を約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃の温度範囲を維持しながら解凍及びプールし、約１０分間混合した。ＰＣを、例えばＧＥ  Ｇ−５  ＵＦを使用した限外濾過によって更に濃縮して、目標の２０倍以上の濃縮を達成した。透過液濃縮物−濃縮物（ＰＣ−Ｃ）を乳貯蔵容器内に移し、その後の処理の継続のために−２０℃以下の冷凍庫に保管した。このプロセスは、図３に図式化されている。
【００７９】
実施例３：ＨＭＯ製剤
【００８０】
約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃の温度範囲を維持しながら、ＰＣ−Ｃを解凍及びプールした。計算された量のＰ２−ＯｎｅＡ又は精製水をＰＣ−Ｃに添加して、最終目標の５％ｗ／ｗのＨＭＯを得た。この工程は、ＰＣ−Ｃ試料中のＨＭＯ濃度の調整が必要でない場合には必須ではない。このプロセスは、図４（Ａ）に図式化されている。
【００８１】
実施例４：最終容器低温殺菌及び濾過
【００８２】
凍結した場合、濃縮ＨＭＯを約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃に解凍した。次いで、それを６３℃以上で約３０分間低温殺菌した。低温殺菌後、濃縮ＨＭＯを約２０℃〜約３０℃、好ましくは２５℃の温度に冷却し、０．２ミクロンの滅菌フィルタを通して浄化した後、約２℃〜約８℃で保管した。代表的な試料を目視検査、総ＨＭＯ計算、ｐＨ、オスモル濃度、ミネラル、及び糖分析のために採取した。
【００８３】
全ＨＭＯ結果が利用可能である場合、各用量の目標ＨＭＯ範囲を達成するために、全ＨＭＯ結果に基づき充填体積を計算した。
【００８４】
ＨＭＯ結果が完了し、ラベルを作成すると、生成物を冷凍庫から取り出し、ＩＳＯ  ８クリーンルームに移した。ラベルを各ボトルに貼り付け、各ラベル付きボトルを気密バッグ又は気密耐タンパー性ボトル内に配置し、クレート内に配置した。いったんクレートが完了すると、クレートを二重の袋に入れ、生成物が出荷の準備が整うまで、−２０℃以下の冷凍庫に戻した。このプロセスは、図４（Ｂ）に図式化されている。
【００８５】
実施例５：精製ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、良好な仕様を完成した
【００８６】
期限及び保存：期限は、低温殺菌の日から１年マイナス１日であり、保存は、−２０℃以下の冷凍であった。
【００８７】
１つの代表的な試料を、浄化工程中に滅菌フィルタ容器のうちの１つから、０．２ミクロンのフィルタを通して採取した。試料を目視検査、ｐＨ、オスモル濃度、糖プロファイル、ミネラル含量、及び総ＨＭＯ計算に使用した。この試験の結果は、表２に要約される。
【表２】
2019528740.tif 000015
【００８８】
バイオバーデン最終容器出荷試験
代表的な試料を充填プロセスから採取した。各最終バルクロット充填には、１つのバイオバーデン試料のみが必要であった。実施例：１つの最終バルクロットを０．１ｘ及び０．２ｘの目標用量に充填した場合、１つの試料のみを採取して、充填された０．１ｘ及び０．２ｘの目標用量の両方を表した。これらの試験の結果は、表３に示される。
【表３】
2019528740.tif 000016
１結果が１００ＣＦＵ／ｍＬ以上である場合、例外的条件を開始し、追加の２つの試料が試験される。最終的に報告された結果は、３つの試料の平均である。
２結果が１００ＣＦＵ／ｍＬ以上である場合、例外的条件を開始し、追加の２つの試料が試験される。最終的に報告された結果は、３つの試料の平均である。
【００８９】
実施例６：精製ＨＭＯの生物学的利用能及び生物活性の評価
【００９０】
１８歳〜５０歳の年齢の３２名の健康な成人における漸増用量制御初期相試験を実施して、本発明の方法によって作製され、前述の実施例に記載された精製ＨＭＯ組成物の免疫系に対する生物学的利用能及び潜在的効果を評価した。
【００９１】
研究対象は、前の実施例に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ濃縮物を、１日当たり３回、７日間連続して経口摂取した（１〜７日目）。男性及び女性研究対象の４つの別々の群は、以下の濃度、０．１ｘ、０．２ｘ、０．５ｘ、及び１ｘで精製ＨＭＯ組成物を投与され、ここでｘは、人乳中の濃度及び早産児に重量ベース当たり与えられる用量に基づき、７０ｋｇの成人に与えられるように計算されたＨＭＯの総重量を表す。現在、これは、１５０ｍＬ／ｋｇ／日の乳児授乳体積に基づき０．７５ｇ／ｋｇに達する。結果として、１Ｘを投与される７０ｋｇの成人は、５２．５ｇの本明細書で作製された精製ＨＭＯ組成物を投与される。
【００９２】
全ての対象からの血液、尿、糞便、及び唾液の試料、並びに女性対象からの膣スワブを、−１（１日目は、精製ＨＭＯ組成物の摂取の初日）、７、１４、及び２８日目に採取した。親ＨＭＯ  ３−シアルラクトース並びにＨＭＯ塩基、グルコース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びシアル酸の存在について、尿、血液、及び糞便を試験した。親ＨＭＯ  ３−シアルラクトースは、尿中のみで無傷で見られ、ＨＭＯの再循環を示唆したが、ＨＭＯの分解生成物は、尿、血液、及び糞便の３つ全てで見られ（図６）、経口送達された精製ＨＭＯ組成物が生物学的に利用可能であることを確認した。
【００９３】
本研究で投与された経口摂取された精製ＨＭＯ組成物が生物活性であるか、特に精製ＨＭＯ組成物が炎症の全身性マーカーに生理学的効果を有するかどうかを判定するために、血清エイコサノイドを分析した。エイコサノイドは、細胞膜リン脂質に対するホスホリパーゼＡの作用によって産生される免疫活性化剤の多様なファミリーであり（図７（Ａ）を参照されたい）、血清中のそれらの上昇は、免疫応答の兆候を表す。
【００９４】
図７（Ｂ）及び（Ｃ）に示されるように、研究対象の血清中に存在するエイコサノイド及びそれらの代謝産物のレベルの減少があり、この減少は、経時的により有意になるだけであったことから、精製ＨＭＯ組成物が生物学的に利用可能であるだけでなく、生物活性であり、かつ組成物を投与された対象の全体的な炎症特徴を減少させることが可能であることも示唆している。
【００９５】
この生物活性を更に検証するために、炎症の別のマーカーであるスフィンゴ脂質代謝の血清代謝産物も分析した。図８に示されるように、エイコサノイドと同様に、いくつかのスフィンゴ脂質代謝産物もまた、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＨＭＯ組成物を投与された対象において、経時的に低減される。
【００９６】
総合すると、本明細書に初めて提示されるのは、ラクトース及び／又はミネラル含量が実質的に低減された、ＨＭＯの完全補体を含む精製ＨＭＯ組成物を効率的に産生するための方法である。更には、この新規の精製ＨＭＯ組成物は、生物学的に利用可能、並びに免疫系に対して顕著な効果を有する生物活性の両方であることが本明細書に示される。
１．Ｂａｏ  Ｙ，Ｚｈｕ  Ｌ，Ｎｅｗｂｕｒｇ  ＤＳ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉａｌｙｌｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７；３７０：２０６〜２１４．
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１３．Ｍｏｒｒｏｗ  Ｒｕｉｚ−Ｐａｌａｃｉｏｓ  ＧＭ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｎｅｗｂｕｒｇ  ＤＳ．，Ｈｕｍａｎ−ｍｉｌｋ  ｇｌｙｃａｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｂｒｅａｓｔ−ｆｅｅｄｉｎｇ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．１３５：１３０４〜０７，２００５．
１４．Ｎｅｗｂｕｒｇ  ＤＳ，Ｓｈｅｎ  Ｚ，Ｗａｒｒｅｎ  ＣＤ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２０００；４７８：３８１〜３８２．
１５．Ｓａｒｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６９：４６１〜４６７
１６．Ｔｈｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐ  ａｎｄ  Ａｎａｌ．，４２：３０〜３７．
１７．Ｗａｒｄ（２００９）Ｏｐｅｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２：９〜１５
１８．Ｚｉｖｋｏｖｉｃ，ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０８（ｓ１）：４６５３〜４６５８．
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ヒトミルクオリゴ糖組成物を作製する方法であって、
（ａ）人乳透過液を、前記人乳透過液中のラクトースの消化に好適な条件下でラクターゼと混合して、透過液／ラクターゼ混合物を作り出すことと、
（ｂ）前記透過液／ラクターゼ混合物から前記ラクターゼを除去することと、
（ｃ）前記混合物を濾過して、ヒトミルクオリゴ糖を精製及び濃縮することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記透過液のｐＨが、前記ラクターゼの添加前又はそれと同時に、約４．３〜約４．７のｐＨに調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨが、前記ラクトースを添加する前に４．５に調整される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記透過液が、前記ラクターゼの添加前又はそれと同時に、約４５℃〜約５５℃の温度に加熱される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記透過液が、前記ラクターゼを添加する前に約５０℃に加熱される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ラクターゼが、工程（ｉｉｉ）において約０．１％〜約０．５％重量／重量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ラクターゼが、約０．１％重量／重量で添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物を、ラクターゼの除去の前に約２０℃〜約３０℃の温度に冷却することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記温度が、約２５℃である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
デプスフィルタを通して前記ラクターゼ消化透過液を浄化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記デプスフィルタが、約１〜約５ミクロンのフィルタである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記濾過が、約５０，０００ダルトンの孔径を有する膜を通して工程（ｂ）の前記混合物を濾過して、５０，０００ダルトンの濾過混合物を作り出すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
約２，０００ダルトン〜約３，０００ダルトンの孔径を有する膜を通して前記５０，０００ダルトンの濾過混合物を濾過して、２，０００〜３，０００ダルトンの濾過混合物を作り出すことを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
６００ダルトン以下の孔径を有する膜を通して、前記５０，０００ダルトンの濾過混合物又は前記２，０００〜３，０００ダルトンの濾過混合物を濾過することを更に含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）における精製後のヒトミルクオリゴ糖の濃度が、約１％〜約５％重量／重量である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトミルクオリゴ糖の前記濃度が、約５％重量／重量である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に従って作製された精製ヒトミルクオリゴ糖組成物。
【請求項１８】
５％以下のラクトースを含む、請求項１７に記載の精製ヒトミルクオリゴ糖組成物。
【請求項１９】
図５Ｅ及び図５Ｆに示されるような、請求項１７又は１８に記載の精製ヒトミルクオリゴ糖組成物。
【請求項２０】
ＮＥＣを予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量の請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の精製ＨＭＯ組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
全身性炎症を減少させることを必要とする対象においてそれを行うための方法であって、有効量の請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の精製ＨＭＯ組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
感染を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行うための方法であって、有効量の請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の精製ＨＭＯ組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【国際調査報告】
2019528740.tif 000017
2019528740.tif 000018