【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年12月25日(2006.12.25)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルにおける遺伝子発現をモニタリングするための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子内のイントロンＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドを提供する工程であって、該イントロンＲＮＡ配列の発現が、該遺伝子内のエキソンｍＲＮＡ配列の発現と相関する、工程；
（ｂ）該ポリヌクレオチドを該イントロンＲＮＡ配列にハイブリダイズしてポリヌクレオチド−イントロンＲＮＡ複合体を形成する工程；および
（ｃ）  該ポリヌクレオチド−イントロンＲＮＡ複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記イントロンＲＮＡ配列が、前記標的遺伝子のｍＲＮＡと同時発現するイントロン配列を同定する工程、および該同時発現に関して最も高い相関係数を有するイントロンＲＮＡ配列を選択する工程により選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イントロンＲＮＡ配列が、少なくとも５０ヌクレオチド塩基長である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イントロンＲＮＡ配列が、少なくとも５５ヌクレオチド塩基長である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イントロンＲＮＡ配列が、少なくとも６０ヌクレオチド塩基長である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルが、組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組織が、腫瘍組織である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍が、癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳癌からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織サンプルが、固定された、ワックス包埋組織サンプルである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織サンプルが、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織サンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エキソンＲＮＡが、断片化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的サンプルが、生体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイゼーションが、ストリンジェントな条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記イントロンＲＮＡの発現を定量化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＰＣＲプローブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＣＲプローブが、前記イントロンＲＮＡ配列内の固有の配列に基づいて設計される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＰＣＲプライマーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＣＲプライマーが、前記イントロンＲＮＡ配列内の固有の配列に基づいて設計される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１種より多い標的遺伝子の発現が、モニタリングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも５０個の標的遺伝子を同時モニタリングする工程を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１００個の標的遺伝子を同時モニタリングする工程を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも５００個の標的遺伝子を同時モニタリングする工程を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１０，０００個の標的遺伝子を同時モニタリングする工程を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
複数の前記標的遺伝子に対応するイントロンＲＮＡ配列が、固体表面上に固定されたアレイとして提示される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的遺伝子が、図６に列挙される遺伝子から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
標的遺伝子の増幅のために一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）前記標的遺伝子の発現が、該標的遺伝子内のエキソンｍＲＮＡ配列の発現と相関する、該標的遺伝子内の少なくとも１つのイントロン配列を同定する工程；および
（ｂ）転写されたイントロン配列の少なくとも一部に対応する一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製する前に前記イントロン配列内の反復配列を同定する工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチド分子を調製する前に前記反復配列がマスクされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、ＰＣＲプライマーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＣＲプライマーが、前記転写されたイントロン配列内の標的配列の５’−配列を含むように設計されたフォワードプライマーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＣＲプライマーが、前記転写されたイントロン配列内のフォワードプライマーの下流の標的配列の５’−配列を相補するように設計されたリバースプライマーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的配列が、少なくとも５０ヌクレオチド塩基長である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的配列が、少なくとも５５ヌクレオチド塩基長である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的配列が、少なくとも６０ヌクレオチド塩基長である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＣＲプライマーが、１７〜３０ヌクレオチド塩基長である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＣＲプライマーが、約２０％から８０％のＧ塩基＋Ｃ塩基を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰＣＲプライマーの融解温度（Ｔｍ）が、約５０℃と約７０℃との間である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記一本鎖オリゴヌクレオチド分子が、ＰＣＲプローブである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＣＲプローブが、前記転写されたイントロン配列内の標的配列内の一部を含むか、または相補するように設計される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＣＲプローブが、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素により標識される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的遺伝子が、図６に列挙された遺伝子から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１種の目的の遺伝子を提示する固定されたパラフィン包埋組織サンプルにおけるイントロンＲＮＡを増幅するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）対応するエキソンＲＮＡの発現と相関する発現をするイントロンＲＮＡの逆転写により得られたＤＮＡを、該イントロンＲＮＡに対応するＰＣＲプライマーおよびプローブの少なくとも１セットと接触させる工程；ならびに
（ｂ）ＰＣＲ増幅を実施する工程；
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記ＰＣＲプライマーおよびプローブが、前記イントロンＲＮＡ内の固有の配列に基づいて設計される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルが、目的の複数遺伝子を呈示する断片化ＲＮＡを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプルが、イントロン内の固有の配列に基づいて設計されたＰＣＲプライマーおよびプローブのプールと接触され、該固有の配列の発現が、前記目的の遺伝子内に存在する対応するエキソンの発現と相関する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記プールが、図２に示されたイントロンベースのプライマー／プローブセットの少なくとも１つを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プールが、図２に示された少なくとも１つのフォワードプライマーもしくはリバースプライマーまたはプローブセットを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記組織サンプルが、腫瘍生検由来である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記腫瘍生検が、ヒト患者から得られる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記腫瘍が、乳癌である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記腫瘍が、肺癌である請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記腫瘍が、結腸直腸癌である請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記目的の遺伝子のＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＲＮＡ転写物またはそれらの産物の差示的発現が、処置に対して予測される患者の反応または患者の生存と相関する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記目的の遺伝子が、図６に列挙された遺伝子から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
請求項５２に記載の方法であって、前記腫瘍が浸潤性乳癌であって、該方法が、以下：
（１）前記サンプル中の、以下：
【化１】
2006518602.tif 000001
からなる群より選択される遺伝子または遺伝子セットのＲＮＡ転写物または発現産物の発現レベルを決定する工程；
（２）工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；ならびに、
（３）前記患者の乳癌再発を伴わない長期生存の可能性が増加するか、または減少するかを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５９】
前記ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の発現レベルが、前記乳癌組織サンプルにおける全ＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物、またはＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５２に記載の方法であって、前記腫瘍が、エストロゲンレセプター（ＥＲ）−陽性浸潤性乳癌であって、該方法が、以下：
（１）
【化２−１】
2006518602.tif 000002
【化２−２】
2006518602.tif 000003
からなる群より選択される遺伝子または遺伝子セットのＲＮＡ転写物または発現産物の発現レベルを決定する工程；
（２）工程（１）で得られたデータを統計解析に供する工程；ならびに、
（３）前記患者の乳癌再発を伴わない長期生存の可能性が増加するか、または減少するかを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６１】
前記ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の発現レベルが、前記乳癌組織サンプルにおける全ＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物、またはＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項５２に記載の方法であって、前記腫瘍が乳癌であって、該方法が、以下：
（１）前記サンプルにおける全ＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物、またはＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化された、
【化３】
2006518602.tif 000004
からなる群より選択される遺伝子または遺伝子セットのＲＮＡ転写物または発現産物の発現レベルを決定する工程；
（２）  工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；ならびに
（３）  前記患者の乳癌再発を伴わない長期生存の可能性が増加するか、または減少するかを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６３】
前記ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の発現レベルが、前記乳癌組織サンプルにおける全ＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物、またはＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項５２に記載の方法であって、前記腫瘍が、浸潤性乳癌であって、該方法が、前記患者から得られた乳癌組織サンプル中の、以下：
【化４−１】
2006518602.tif 000005
【化４−２】
2006518602.tif 000006
からなる群の遺伝子または遺伝子セットのＲＮＡ転写物または発現産物の発現レベルを決定する工程；
（２）工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；ならびに、
（３）前記長期生存の可能性が増加するか、または減少するかを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６５】
前記ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の発現レベルが、前記乳癌組織サンプルにおける全ＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物、またはＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
固体表面に固定されている目的の標的遺伝子にハイブリダイズする複数のポリヌクレオチドを含むアレイを用いて遺伝子発現を測定するための方法であって、該ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、対応するエキソン配列の発現と相関する発現をするイントロンベースの配列を含む、方法。
【請求項６７】
前記ポリヌクレオチドの全てが、イントロン配列を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
図１Ａ〜Ｍに示されたアンプリコンの少なくとも１つまたはそれらの相補体を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
図１Ａ〜Ｍに示された２つ以上のアンプリコンまたはそれらの相補体を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
図１Ａ〜Ｍに示された全てのアンプリコンまたはそれらの相補体を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
請求項６６に記載の方法であって、以下
【化５】
2006518602.tif 000007
からなる群から選択される少なくとも１つの目的の遺伝子にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含し、ここで、前記アレイ上の配列の少なくとも８０％が、イントロンベースである、方法。
【請求項７２】
前記遺伝子の少なくとも５個にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記遺伝子の少なくとも１０個にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記遺伝子の全てにハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
請求項６６に記載の方法であって、該方法は、以下：
【化６】
2006518602.tif 000008
からなる群より選択される少なくとも１個の目的の遺伝子にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、方法。
【請求項７６】
前記遺伝子の少なくとも５個にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記遺伝子の少なくとも１０個にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記遺伝子の全てにハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
請求項６６に記載の方法であって、該方法は、以下：
【化７−１】
2006518602.tif 000009
【化７−２】
2006518602.tif 000010
からなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子セットにハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、方法。
【請求項８０】
請求項６６に記載の方法であって、該方法は、以下：
【化８−１】
2006518602.tif 000011
【化８−２】
2006518602.tif 000012
からなる群より選択される少なくとも１個の遺伝子セットにハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、方法。
【請求項８１】
請求項６６に記載の方法であって、該方法は、以下：
【化９−１】
2006518602.tif 000013
【化９−２】
2006518602.tif 000014
【化９−３】
2006518602.tif 000015
からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子セットにハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、方法。
【請求項８２】
請求項６６に記載の方法であって、該方法は、以下：
【化１０】
2006518602.tif 000016
からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にハイブリダイズするイントロンベースのポリヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項８３】
図６に列挙された遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に対応するイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項８４】
図６に列挙された遺伝子から選択される複数の遺伝子に対応するイントロンベースのポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項８５】
イントロンベースおよびエキソンベース両方のポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項８６】
目的の同一の標的遺伝子にハイブリダイズするイントロンベースおよびエキソンベース両方のポリヌクレオチド配列を使用する工程を包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項８７】
前記アレイが、少なくとも１００個の遺伝子を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項８８】
前記アレイが、１００μの切片に少なくとも１００個の遺伝子を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記アレイが、１００μの切片に少なくとも１５０個の遺伝子を含む、請求項８７に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】遺伝子発現を測定するためのイントロンＲＮＡの使用
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
細胞および組織内の遺伝子発現が、細胞、組織または患者の生理学的および病理学的状態を指示し得ることは十分に認識されている。数十年間の間、蛋白質マーカーの免疫組織化学的分析により測定された遺伝子発現が、治療決定を行うために用いられてきた。例えば、この方法で測定されたエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体の濃度は、抗エストロゲン薬によって治療する乳癌患者を選択するために、現在ルーチン的に用いられている。
【背景技術】
【０００２】
ごく最近の研究文献は、ｍＲＮＡ種の組織濃度が、診断的価値および予後的価値を有しているという証拠を提供している。複数のＲＴ−ＰＣＲおよびＤＮＡアレイプラットホームにより例示されているように、細胞ＲＮＡ濃度を測定するための技術は、非常に高感度、特異的、定量的であり得るため、これは前途有望な開発である。ＲＴ−ＰＣＲは、一般にＤＮＡアレイ技術よりも高感度であることが認められている。しかし、最適な実施に関して複数の基準が存在するため、ＲＴ−ＰＣＲプローブ／プライマーデザインおよび選択は魅力的であり得る。試験すべきサンプルＲＮＡが、固定化ワックス埋め込み組織からのものである場合、このようなＲＮＡは、高度に断片化されている傾向があるためこの魅力は特に大きい。（Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １５８：ｐ．４１９−２９［２００１］；Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：ｐ．８４−９１［２０００］）。
【０００３】
任意の所与の転写配列、スプライスされた配列、成熟ｍＲＮＡ配列（イントロン配列と対比的にエキソン配列）のいずれかの濃度をアッセイすることにより、所与の遺伝子発現を測定することは、容認された実践法である。理論的にエキソンは、成熟ＲＮＡ産物において示される分断化された遺伝子の任意の区分として定義され、また、イントロンは転写されているが、転写物のどちらかの側のエキソンと共にスプライシングすることにより、転写物内部から除去されているＤＮＡの区分として定義される［Ｂ．Ｌｅｗｉｎ．Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジ所在、１９９０年］。エキソン配列を用いる容認されている実践法の根拠は理論的に分かり易い。なぜならば、成熟ＲＮＡ類［ｍＲＮＡ類］は、細胞表現型を規定する蛋白質をコードするが、一方、イントロンＲＮＡは、比較してみると細胞表現型に殆ど影響を及ぼさないと考えられる。さらに、イントロンは急速に分解され、したがって、エキソン配列より検出しにくいということが一般的見解である｛以下の論文の序論を参照されたい：Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：ｐ．５３２−４０［２００２］；Ｃｌｅｍｅｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：ｐ．１６９１９−３０［２００１］；Ｓｈａｒｐら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：ｐ．１１１９−１１５０［１９８６］｝。
【０００４】
本発明は、遺伝子発現を測定するためのイントロンＲＮＡの使用に関する。イントロンＲＮＡ配列は、固定組織からの広範に分解されたＲＮＡを使用しても、ＲＴ−ＰＣＲにより容易に検出される傾向があることが示されよう。さらに、イントロンＲＮＡ配列は、それら各々のエキソンによるそれらの発現に関連している傾向がある。転写されたイントロン配列およびエキソン配列の合成およびターンオーバーに関する全体の速度定数の比が同様であるという証拠は、殆どまたは全く存在しないため、後者の点は特に予期されていない。実際、科学論文は、前ｍＲＮＡおよびスプライスされたイントロンのターンオーバーの複雑性に関する証拠を提供している。例えば、効率的にスプライスアウトされず「未成熟ｍＲＮＡ種」として細胞質に輸送され、そこで核イントロンＲＮＡ配列とは異なった速度で減衰する（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４３６０−５［１９９７］）イントロンＲＮＡ類を含有するサブ集団を有する前ｍＲＮＡは、複数の速度論的プールに存在し得る（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＲｏｓｂａｓｈ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２９：ｐ．１８１−８［１９９６］）。さらに、一定のスプライスされたイントロンＲＮＡは、ラリアート構造において細胞質に入るようである（Ｃｌｅｍｅｎｔら、ＲＮＡ  ５：２０６−２０［１９９９］）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、定義によりヘテロ核ＲＮＡ内には存在しているが、典型的にはｍＲＮＡ内に組み込まれていない転写イントロン配列が、診断的および予後的な有用性を有するということを証明している実験的証拠に基づいている。これは、幾つかの理由で重要な発見である。典型的には、イントロン配列は、エキソン配列よりも２０倍以上長い。したがって、イントロンは、それらの平均長がはるかに長いことを考慮に入れると、例えば、ＲＴ−ＰＣＲの場合、最適な遺伝子発現プローブデザインの機会の比例的増加、より良好な技術的性能を有するプローブ／プライマーセットの創製を提供する。それとは独立に、イントロン配列は、エキソン配列よりも速やかに展開するため、イントロンＲＮＡ類は、遺伝子ファミリーの種々の密接に関連したメンバーの発現をモニタリングするために十分に適合化される。
【０００６】
一態様において、本発明は、
（ａ）イントロンＲＮＡ配列の発現が、標的遺伝子内のエキソンｍＲＮＡ配列の発現に関連している、標的遺伝子内のイントロンＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドを提供すること；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドをイントロンＲＮＡ配列にハイブリダイズして、ポリヌクレオチドイントロンＲＮＡ複合体を形成すること；および
（ｃ）ポリヌクレオチドイントロンＲＮＡ複合体を検出すること、
を含んでなる生物学的サンプルにおける遺伝子発現のモニタリング法に関する。
【０００７】
特定の一態様において、標的遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定され、その場合、上記の方法において、イントロンベースのプライマー／プローブのセットが使用できる。
【０００８】
他の態様において、本発明は、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー−プローブセットをデザインし、創製するためのイントロンベース配列の使用法に関する。そのようなプライマーとプローブは、高感度遺伝子発現分析のために、固定パラフィン埋め込み組織（ＦＰＥＴ）検体におけるイントロンＲＮＡの濃度を検出し、定量化する上で特に好適である。したがって、さらなる態様において、本発明は、種々の病態の診断および／または予後の予測のために、ＦＰＥＴサンプルの遺伝子発現分析などの遺伝子発現プロファイリングアッセイにおけるイントロンベースのプライマー−プローブセットの使用に関する。
【０００９】
特に本発明は、
（ａ）標的遺伝子内のイントロン配列の発現が、標的遺伝子内のエキソン配列の発現に関連している、標的遺伝子内の少なくとも１つのイントロン配列を同定すること；
（ｂ）転写イントロン配列の少なくとも一部に対応する一本鎖ポリオリゴヌクレオチド分子を調製すること；および
（ｃ）遺伝子発現を測定するために、オリゴヌクレオチド分子を使用すること、
を含んでなる標的遺伝子増幅のために一本鎖オリゴヌクレオチド分子を調製し、イントロ
ンＲＮＡ種の濃度を測定する方法に関する。
【００１０】
先と同様、遺伝子発現は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによって測定することができ、この場合、遺伝子発現を測定するために、イントロンベースのプライマー／プローブセット（２種のプライマーおよび１種のプローブからなる）が使用される。
【００１１】
オリゴヌクレオチドがフォワードプライマーの場合、典型的には、転写イントロン配列内の標的配列の５’配列を含んでなるように、それがデザインされる。オリゴヌクレオチドがリバースプライマーの場合、典型的には、フォワードプライマーの下流に転写イントロン配列内の標的配列の５’配列に相補的になるように、それがデザインされる。ＰＣＲ増幅のためには、十分に長い標的配列を同定し、使用することが重要である。標的配列は一般に、少なくとも約５０のヌクレオチド塩基長、特に少なくとも５５のヌクレオチド塩基長、幾つかの実施形態においては、少なくとも約６０のヌクレオチド塩基長である必要がある。ＰＣＲプライマーとプローブは、周知の原理に従ってデザインされる。したがって、ＰＣＲプライマーは、典型には、１７〜３０のヌクレオチド塩基の長さであり、通常、約２０％から８０％のＧ＋Ｃ塩基を含有する。融点（Ｔｍ）が、約５０℃と約７０℃との間のＰＣＲプライマーをデザインすることが好ましい。
【００１２】
一本鎖オリゴヌクレオチド分子がＰＣＲプローブである場合、それは、転写されたイントロン配列内に、標的配列の内部部分を含むか、またはそれと相補的であるように、通常デザインされる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅では、ＰＣＲプローブは、レポーター蛍光色素および消光剤部分によって標識化される。
【００１３】
他の態様において、本発明は、
（ａ）イントロン配列の発現が、標的遺伝子内の対応するエキソン配列の発現に関連している、標的遺伝子内の少なくとも１つの標的イントロン配列を同定すること；および
（ｂ）イントロン特異的ＰＣＲプライマー／プローブセットを用いて、転写された標的イントロン配列を増幅すること、
を含んでなるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的遺伝子の増幅によって、遺伝子の発現を測定する方法に関する。
【００１４】
標的イントロン配列は、典型的には、少なくとも約５０の塩基長であり、ＰＣＲのプライマーとプローブのセットは、転写された標的イントロン配列内のユニーク配列に対応するようにデザインされる。
【００１５】
さらに他の態様において、本発明は、
（ａ）サンプルを、ＰＣＲのプライマーとプローブの少なくとも１つのセットとを接触させる工程；および
（ｂ）ＰＣＲ増幅を実施する工程、
を含んでなる少なくとも１つの対象の遺伝子を表すサンプルにおけるＲＮＡ断片を増幅する方法に関するものであり、ＰＣＲのプライマーとプローブは、イントロン配列の発現が、関心対象の遺伝子内のエキソン配列の発現に関連している対象の遺伝子内に同定されたイントロン配列に基づいてデザインされる。
【００１６】
特定の実施形態において、ＰＣＲのプライマーとプローブは、典型的に同定されたイントロン内のユニーク配列に基づいてデザインされる。他の実施形態において、サンプルは、複数の対象遺伝子を表す断片化ＲＮＡを含んでなり、これを、対象遺伝子内に存在するイントロン内のユニーク配列に基づいてデザインされたＰＣＲのプライマーとプローブのプールに接触させる。
【００１７】
好ましい実施形態において、前記増幅は、例えば、ヒト患者から得られた腫瘍生検由来であり得る固定パラフィン埋め込み組織（ＦＰＥＴ）サンプルで実施される。前記腫瘍は、例えば、乳癌、肺癌、または結腸直腸癌などの任意の種類の固形腫瘍であり得る。前記腫瘍組織は、針生検、コア生検、または切除などの種々の方法によって採取することができる。
【００１８】
特定の一実施形態において、本発明は、初期乳癌を有する患者に対して疾患再発の可能性を予測するための遺伝子発現分析において、イントロンベースのＰＣＲプライマー−プローブセットを使用する方法に関する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、対象の標的遺伝子にハイブリダイズする複数のポリヌクレオチドを含んでなるアレイに関するものであり、前記ポリヌクレオチドの少なくとも７０％がイントロン配列を含むことが好ましい。
【００２０】
さらなる他の態様において、本発明は、イントロンベースのアンプリコン配列および遺伝子発現分析におけるそれらの使用に関する。
【００２１】
特定の一実施形態において、本発明は、
【００２２】
【化１１−１】
2006518602.tif 000017
【００２３】
【化１１−２】
2006518602.tif 000018
よりなる群から選択される遺伝子または遺伝子セットのＲＮＡ転写物または発現産物の発現レベルの決定に基づく浸潤性乳癌を表す生物学的サンプルの遺伝子発現分析に関するものであり、イントロンベース配列の使用を含む。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、
【００２５】
【化１２−１】
2006518602.tif 000019
【００２６】
【化１２−２】
2006518602.tif 000020
よりなる群から選択される遺伝子または遺伝子セットのＲＮＡ転写物または発現産物の発現レベルの決定に基づくＥＰ陽性乳癌を表す生物学的サンプルの遺伝子発現分析に関するものであり、イントロンベース配列の使用を含む。
【００２７】
さらなる実施形態において、癌は乳癌であり、分析される遺伝子（単数または複数）は、
【００２８】
【化１３】
2006518602.tif 000021
よりなる群から選択される。
【００２９】
また、さらなる実施形態において、本発明は、
【００３０】
【化１４−１】
2006518602.tif 000022
【００３１】
【化１４−２】
2006518602.tif 000023
よりなる群から選択される遺伝子または遺伝子セットのＲＮＡ転写物または発現産物の発現レベルの決定に基づく浸潤性乳癌を表す生物学的サンプルの遺伝子発現分析に関するものである。
【００３２】
別の一実施形態において、本発明は、
【００３３】
【化１５】
2006518602.tif 000024
よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子にハイブリダイズしているイントロンベースのポリヌクレオチド配列を用いる生物学的サンプルの遺伝子発現分析に関する。
【００３４】
遺伝子発現分析は、アレイ形式において実施でき、前記アレイは、５〜１０μセクションに少なくとも１００配列、より好ましくは少なくとも１５０配列、さらに好ましくは２００配列を含んでなる高密度アレイであることが好ましい。
【００３５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書に用いられている専門用語および科学用語は、本発明が属する通常の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら著Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（ニューヨーク州ニューヨーク所在、１９９４年）は、本適用に用いられる多くの用語への一般的な指針を当業者に提供している。
【００３６】
当業者は、本明細書に記載された方法および材料と同様の、または等価な多くの方法および材料を、本発明の実践に使用し得ることを認識するであろう。実際、本発明は、記載された方法および材料に決して限定されない。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
【００３７】
用語の「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」は、交換可能に用いられ、真核細胞の細胞質内に移動する連続的なコード配列を有する成熟ｍＲＮＡを生成するためにイントロンを除去し、エキソンを繋げるＲＮＡプロセッシングを言う。
【００３８】
理論的に用語の「エキソン」は、成熟ＲＮＡ産物において示されている断続的遺伝子の任意の区分を言う（Ｂ．Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジ所在、１９９０年）。理論的に、用語の「イントロン」は、転写はされるが、そのいずれかの側のエキソンと一緒のスプライシングによって、転写物の内部から除去される任意のＤＮＡの区分を言う。操作上、エキソン配列は、参照配列番号によって定義された遺伝子のｍＲＮＡ配列に存在する。操作上、イントロン配列は、遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在配列であり、エキソン配列によって夾叉されており、それらの５’境界および３’境界にＧＴおよびＡＧスプライスコンセンサス配列を有している。
【００３９】
用語の「マイクロアレイ」とは、基質上のハイブリダイズ可能なアレイ要素の順序づけられた配列、好ましくはポリヌクレオチドプローブを言う。
【００４０】
用語の「ポリヌクレオチド」とは、単数または複数で用いられる場合、一般に非修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡであっても、修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般に言う。したがって、例えば、本明細書に定義されたポリヌクレオチドとしては、限定はしないが、一本鎖ならびに二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ならびに二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ならびに二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖ならびに二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖、もしくは一本鎖ならびに二本鎖領域を含み得るＤＮＡならびにＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子が挙げられる。さらに、本明細書に用いられる用語の「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの双方を含んでなる三本鎖領域を言う。そのような領域における鎖は、同一の分子由来または異なる分子由来であり得る。前記領域は、１種以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つかの分子のただ１つの領域を含む。三重螺旋領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。用語の「ポリヌクレオチド」は、具体的にはｃＤＮＡ類を含む。前記用語は、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ類（ｃＤＮＡ類を含む）およびＲＮＡ類を含む。したがって、安定性のため、または他の理由から修飾された主鎖を有するＤＮＡ類またはＲＮＡ類は、本明細書で意図されている用語の「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの特異的塩基またはトリチウム塩基などの修飾塩基を含んでなるＤＮＡ類またはＲＮＡ類は、本明細書に定義される用語の「ポリヌクレオチド」の範囲内に含まれる。一般に、用語の「ポリヌクレオチド」は、非修飾ポリヌクレオチドの全ての化学的に、酵素的に、および／または代謝的に修飾された形態、ならびにウィルスおよび単純型細胞および複雑型細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。
【００４１】
用語の「オリゴヌクレオチド」は、限定はしないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡ類などの比較的短いポリヌクレオチドを言う。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド類は、例えば、商品として入手できる自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて、化学的方法により合成されることが多い。しかし、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組替えＤＮＡ媒介法および細胞および生体におけるＤＮＡの発現によるなど、種々の他の方法によって作製できる。
【００４２】
用語の「差示的発現遺伝子」、「差示的遺伝子発現」およびそれらの同義語は交換可能に用いられ、その発現が、ある患者または試験被験体においては、他者に較べて、例えば、ある疾患、特に乳癌などの癌を患っている対象においては、正常な、または対照の被験体におけるその発現に較べて、より高い、またはより低いレベルである遺伝子を言う。また前記用語は、その発現が、同一の疾患の異なる病期において、より高い、またはより低いレベルへと活性化される遺伝子も含む。差示的に発現された遺伝子は、核酸濃度または蛋白質濃度において活性化できるか、もしくは阻害でき、または代替のスプライシングに供されて、異なるポリペプチド産物を生じ得る。このような差異は、例えば、ｍＲＮＡ濃度の変化、表面発現、分泌またはポリペプチドの他の区分化により証明できる。差示的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物間の発現の比較、または２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物間の発現比率の比較、またはさらに、正常な被験体と疾患、特に癌を患っている被験体との間で、または同一の疾患の種々の病期との間で異なる同一の遺伝子の２つの異なって処理された産物の比較を含み得る。差示的発現は、例えば、正常細胞と疾患細胞との間、または異なる疾患事象もしくは病期を経験した細胞間の遺伝子もしくはその発現産物における一時的な、または細胞の発現パターンにおける量的ならびに質的差異の双方を含む。本発明の目的のためには、正常被験体と疾患被験体において、またはある疾患被験体における疾患発症の種々の病期において、所与の遺伝子の発現間に、少なくとも約２倍、好ましくは、少なくとも約４倍、より好ましくは、少なくとも約６倍、最も好ましくは、少なくとも約１０倍の差異がある場合に、「差示的遺伝子発現」が存在すると考えられる。
【００４３】
ＲＮＡ転写物に関して用語の「過剰発現」は、検体中で測定された全転写物またはｍＲＮＡ類の特定の参照セットであり得る参照ｍＲＮＡの濃度に対する正規化によって決定された転写物濃度を言うために用いられる。
【００４４】
語句の「遺伝子増幅」とは、ある特定の細胞または細胞系において、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが形成される処理を言う。複製領域（増幅されたＤＮＡのひと続き）は、しばしば「アンプリコン」と呼ばれる。生じたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現レベルもまた、発現された特定の遺伝子によって作製されたコピーの数に比例して増大することが多い。
【００４５】
用語の「予後」は、本明細書において、乳癌などの新生物疾患の再発、転移性拡散および薬物耐性などの癌に起因する死亡または進行の可能性の予測を言う。用語の「予測」は、本明細書において、ある患者が、ある薬物または薬物のセットに対して、有利に、または不利に応答する可能性、およびそれらの応答の程度、またはある患者が外科手術による除去または原発腫瘍および／またはある一定期間の化学療法後に、癌が再発せずに生存する可能性を言う。本発明の予測法は、任意の特定の患者に対する最も適切な治療様式を選択することにより治療決定を行うために、臨床的に使用することができる。本発明の予測法は、ある患者が、外科的介入、所与の薬物または薬物の組合せによる化学療法および／または放射線療法などの治療法に有利に応答する見込みがあるかどうか、または、外科手術および／または化学療法の終結、または他の治療様式後にその患者が長期生存する見込みがあるかどうかを予測する上で貴重な手段である。
【００４６】
用語の「長期」生存とは、本明細書において外科手術または他の治療後の少なくとも３年間、より好ましくは少なくとも５年間、最も好ましくは少なくとも１０年間の生存を言うために用いられる。
【００４７】
特定の薬物または任意選択治療に対する用語の「耐性増加」とは、本発明に従って用いられる場合、薬物の標準的用量または標準的治療プロトコルに対する応答低下を意味する。
【００４８】
特定の薬物または任意選択治療に対する用語の「感受性低下」とは、本発明に従って用いられる場合、薬物の標準的用量または標準的治療プロトコルに対する応答低下であって、それが、薬物用量の増加または治療強度の増加によって補償できる（少なくとも部分的に）応答低下を意味する。
【００４９】
「患者反応」は、限定はしないが、（１）遅速化および完全な増殖停止など、腫瘍増殖のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの減少；（４）隣接周辺器官および／または周辺組織内への腫瘍細胞湿潤の阻害（すなわち、減少、遅速化または完全な停止）；（５）転移の阻害（すなわち、減少、遅速化または完全な停止）；（６）腫瘍の退縮または阻止を生じ得るが、必ずしも生じるとは限らない抗腫瘍免疫応答の増強；（７）腫瘍に伴う１つ以上の症状のある程度の軽減；（８）治療後生存期間の延長；および／または（９）治療後の所与の時点における死亡率の低下など、患者にとっての利益を示すいずれかのエンドポイントを用いて評価できる。
【００５０】
用語の「治療」とは、目的が標的とされた病態または障害を予防するか、遅速化する（減少させる）ことである治療的処置および予防的処置の双方または予防測定を言う。治療を必要とする患者には、既に障害を有する患者ならびに障害を有する傾向がある患者、または障害を予防すべき患者が含まれる。腫瘍（例えば癌）治療において、治療因子は、腫瘍細胞の症状を直接減少させることができるか、または他の治療因子、例えば、放射線および／または化学療法による治療に対して、腫瘍細胞がより影響を受け易くできる。
【００５１】
本明細書に用いられている用語の「腫瘍」とは、悪性であれ、良性であれ、全ての新生物性細胞の増殖ならびに前癌および癌細胞および組織を言う。
【００５２】
用語の「癌」および「癌性」とは、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的病態を言うか、または記述するものである。癌の例として、限定はしないが、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫および脳癌が挙げられる。
【００５３】
癌の「病理」は、患者の健康を損なう全ての現象を含む。これには、限定はしないが、異常な、または制御されていない細胞増殖、転移、近傍細胞の正常機能の妨害、サイトカイン類または他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症反応または免疫反応の抑制または増悪、腫瘍形成、前悪性疾患、悪性疾患、周辺のまたは遠隔の組織または器官（例えば、リンパ節）への湿潤などが含まれる。
【００５４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、通常の当業者によって容易に決定でき、一般にプローブ長、洗浄温度および塩の濃度に依存する経験的算定である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのために、より高い温度を必要とし、一方、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖が環境に存在する場合、それらの融解温度以下でリアニールする変性ＤＮＡの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用できる相対温度は高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向となり、一方、より低い温度は、ストリンジェンシーをより低くする傾向となる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細と説明に関しては、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９９５）を参照されたい。
【００５５】
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェントな条件」は典型的に：（１）洗浄に低イオン強度と高温、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーション時に４２℃で７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを有する０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液と共に、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどの変性剤を使用するか、または（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストランを使用し、４２℃で０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％ホルムアミド中洗浄した後、５５℃でＥＤＴＡ含有０．１ｘＳＳＣからなる高ストリンジェントな洗浄を行う。
【００５６】
「中程度ストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に記載されたとおり確認でき、上記のハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度ストリンジェントな条件の一例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中、３７℃にて一晩インキュベーション後、フィルタを約３７〜５０℃で１ｘＳＳＣにおいて洗浄する。当業技術者は、プローブ長などの因子に適合させる上で必要な温度、イオン強度などの調整の仕方を認識するであろう。
【００５７】
本発明に関連して、何らかの特定の遺伝子セットに掲載された遺伝子の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」などの言及は、掲載された遺伝子のいずれか、またはそれらのいずれか１つの、および全ての組合せを意味する。
【００５８】
（Ｂ．詳細な説明）
他に指示されない限り、本発明の実践には、分子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来技法が用いられ、それらは当業技術の範囲内にある。それらの技法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編集、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、１９８７年）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集、１９８７年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７年）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら編集、１９９４年）などの文献において十分に説明されている。
【００５９】
（１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の目的は、さらなる使用に、より大量の核酸を提供するために遺伝子のコピーを作製することである。ＰＣＲは、４種のｄＮＴＰ類（ｓＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）および増幅すべき標的配列にフランキングしている２種のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する混合物中、所与のＤＮＡ鎖に対する相補鎖を合成できる特殊ポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）に基づく方法である。２種のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成させるために用いられる。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、２種のＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するためにデザインされる。プローブデザインは種々あるが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ法では、プローブシグナルは、レポーター蛍光色素および消光剤蛍光色素の近接によって制御される。レポーター色素からのレーザー誘導発光は、２種の色素がプローブ上にある時に共に接近した位置にある場合、消光剤色素によって消光される。増幅反応時、ポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）は、温度依存様式でプローブを開裂する。生じたプローブ断片は、溶液中、脱会合し、遊離したレポーター色素からのシグナルは、第２の蛍光発色団の消光作用を免れる。新たに合成された各分子に対し１分子のレポーター色素が遊離し、消光されないレポーター色素の検出によって、データの定量的解釈の基礎が提供される。
【００６０】
ＰＣＲの出発物質は、増幅される必要のあるＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは任意の他のポリヌクレオチドであり得る。ＰＣＲは、テンプレートとして一本鎖ＤＮＡを必要とするため、出発物質が、二本鎖ＤＮＡである場合は、一本鎖ＤＮＡを生成するために変性される必要がある。
【００６１】
ＲＮＡは、ＰＣＲのテンプレートとして働くことができないため、出発物質がＲＮＡの場合、第１の工程は、ＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡへと逆転写することであり、引き続いて、ＰＣＲ反応において指数関数的増幅が行われる。このＰＣＲ変法は、一般に逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）と呼ばれる。最も一般的に用いられる２つの逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、状況に依存して典型的には、特異的プライマー、ランダム六量体、またはオリゴ−ｄＴプライマーを用いて開始される。例えば、組織サンプル（例えば、ＦＰＥＴ）から抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国カリフォルニア州所在）を用いて製造元の取扱説明書に従って逆転写することができる。次いで誘導されたｃＤＮＡを、引き続くＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用できる。
【００６２】
ＰＣＲ工程には、種々の熱安定ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼが使用できるが、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠いているＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが典型的に使用される。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲでは、典型的にはＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、それと等価な５’−ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素が使用できる。この場合、プローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長できないようにデザインされる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー所在）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、独国マンハイム所在）などの、商品として入手できる装置を用いて実施することができる。好ましい一実施形態において、５’ヌクレアーゼ法は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）などのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置上で行われる。前記システムは、サーモサイクラー、レーザー、荷電結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータから構成される。前記システムは、サーモサイクラー上、９６ウェル型式でサンプルを増幅する。増幅時、レーザー誘導蛍光シグナルは、９６ウェル全てに関して光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで回収され、ＣＣＤで検出される。前記システムは、器械を操作し、データを解析するためのソフトウェアを含む。
【００６３】
５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、最初、Ｃｔすなわち閾値サイクルとして表される。上記で検討したように、蛍光値は各サイクル時に記録され、増幅反応においてその時点までに増幅された産物量を示す。蛍光シグナルが、統計的に有意なものとして最初に記録された点が閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【００６４】
サンプルによる変化の誤差および効果を最小化するために、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内標を用いて実施される。理想的な内標は、種々の組織間での一定のレベルにおいて表され、実験処理によって影響を受けない。遺伝子発現パターンを正規化するためにしばしば用いられるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンに関するｍＲＮＡ類である。
【００６５】
リアルタイム定量的ＰＣＲのさらなる詳細については、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：ｐ．９８６−９９４（１９９６）もまた参照されたい。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，６８３，１９５号；米国特許第４，９６５，１８８号；および米国特許第５，０７５，２１６号に記載されており、それらの開示の全体は、参照として本明細書に特に組み込まれている。
【００６６】
（２．イントロンおよびＲＮＡスプライシング）
高等真核生物の多くの遺伝子は、１０万ヌクレオチド対以上を含有し、２００万ヌクレオチド対以上を含有しているものもある。これは、約１０００ヌクレオチドの位数にある平均サイズの蛋白質（３００〜４００のアミノ酸）をコードするために必要とされるヌクレオチド配列よりも著しく長い。残りの長さの殆どは、その遺伝子配列内のコード化（エキソン）配列を分断している非コード化（イントロン）配列からなっている。ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡをコードしている多くの高等真核生物遺伝子およびｒＲＮＡをコードしている幾つかは、イントロン配列によって分断されている。ｍＲＮＡに対する遺伝子は典型的に、０から６０のイントロンを有し、一方、ｔＲＮＡに対する遺伝子は典型的に、０または１つのイントロンを含む。
【００６７】
ｍＲＮＡがＤＮＡから翻訳される時、最初、エキソン配列とイントロン配列の双方が、いわゆるヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）または未成熟ＲＮＡまたは前ＲＮＡへと翻訳される。しかし、ＲＮＡが核から出る前に、イントロン配列は、しばしばＲＮＡスプライシングとして知られている処理の結果、翻訳ｍＲＮＡから削除される。イントロン除去の過程には、エキソンに隣接した特定のヌクレオチド配列によって制御される正確なルーピング過程が含まれる。殆ど全てのイントロンは、特異的コンセンサス配列によって同定することができる。イントロンの最初の２つの塩基は常にＧＵであり、一方、最後の２つの塩基は常にＡＧであるが、５’および３’スプライス部位は、ＧＵモチーフおよびＡＧモチーフを超えて伸長するコンセンサス配列を典型的に有する。ｍＲＮＡのスプライシングは、スプライセオソームと呼ばれる粒子上で生じるが、一方、ｔＲＮＡとｒＲＮＡは、スプライセオソームを伴わない機構によってスプライスされる。
【００６８】
イントロンは典型的には、エキソン（ｍＲＮＡに存在する配列）よりもはるかに長い。真核生物の平均的エキソンは、約１５０ヌクレオチド長であり、一方、ヒトイントロン１つは、５０万ヌクレオチド近い長さになり得るが、典型的には、約２０００〜４０００ヌクレオチドである。一般に、真核生物の遺伝子は、下表（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓら編集、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ニューヨーク州ニューヨーク所在、１９９４年、ｐ．３４０）に示されるように、エキソン配列よりはるかに多くのイントロン配列を含有している：
（表１）
【００６９】
【表１】
2006518602.tif 000025
本発明の特定の一実施形態において、対象の遺伝子内のイントロン配列は、イントロンＲＮＡ配列または、同じ遺伝子のエキソンＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）配列と同時発現する配列を同定するために、選択処理に供される。その発現がエキソン配列の発現と関連している、このように選択されたイントロン配列は、可能性のある診断マーカーとして特に望ましい性質を有する：（１）それらの好都合な（具体的には、アッセイの特異性および選択性を最適化する）技術的性能のため、および（２）遺伝子のｍＲＮＡ濃度に付随する生物医学的な重要性がどんなものであれ、それは、イントロン配列の細胞濃度にも付随する。例えば、強力な増殖因子をコードするｍＲＮＡ種の高濃度は、細胞の高い増殖率に関連する可能性が大きい。この同じ遺伝子のｍＲＮＡ濃度に関連する細胞濃度を有するイントロン配列は、細胞の高い増殖率に関連する同じ可能性を有する。次いでこのように選択されたイントロン配列を、臨床的関連および診断的、予測的または予後的重要性を探る上で貴重な組織検体をスクリーニングするために使用することができる。
【００７０】
同じ遺伝子のｍＲＮＡと同時発現するイントロン配列を選択する代表的方法は以下のとおりである。簡略に述べると、対象の任意の遺伝子に関して、対象の患者集団の関連組織のセットをアッセイして、イントロン配列とｍＲＮＡ配列のセットの濃度を測定する。次に、エキソンＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列との同時発現に関して、最高のピアソン相関係数を有することが判明したイントロン配列が選択される。この方法で試験される患者数は、少なくとも約５０人以上であることが好ましく、少なくとも約１００人であることがより好ましい。
【００７１】
特定の一実施例において、対象の生物医学的問題では、乳癌を有する患者が考慮されており、対象の遺伝子は、腫瘍増殖マーカーＫｉ−６７であり得る。この場合、Ｋｉ−６７ｍＲＮＡ濃度および複数のＫｉ−６７イントロン配列の濃度を測定するために、５０人以上の乳癌患者の腫瘍が用いられ、エキソンＲＮＡとの同時発現に関し、最高のピアソン相関係数を有するイントロンが選択される。
【００７２】
この方法の利点は、好ましいイントロン配列の選択が、比較的容易に利用でき、豊富にある組織検体（例えば、高価な臨床記録が付随していない検体）によって実施できることである。このような組織は、スクリーニングするＲＮＡを大量に提供できるため、例え至適以下のプローブからでも遺伝子発現シグナルを検出することが可能となる。次いで、選択されたイントロン配列に基づいた高感度で特異的なアッセイを用いて、貴重な組織検体、例えば、疾患の再発、死亡または規定された治療薬または治療法への応答などの重要な臨床的情報と結びついた検体をスクリーニングすることができる。
【００７３】
（３．イントロンベースのＰＣＲプライマー／プローブセットを用いた遺伝子発現プロファイリング）
現在、ＰＣＲのプライマーおよびプローブは、イントロン配列を考慮することなく、ｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列に基づいてデザインされている。実際、イントロンは、通常スプライシング時に除去され、一般に急速に分解される「パッケージング」物質と見なされている。
【００７４】
本発明は、例え固定パラフィン埋め込み組織検体の高度に分解されたＲＮＡを用いても、イントロンＲＮＡ類がＲＴ−ＰＣＲによって容易に検出できるという予期されなかった実験上の発見に基づいている。特に、所与の遺伝子に関する遺伝子発現プロファイリングにおいて、イントロンベースのプローブ／プライマーセットからのＲＴ−ＰＣＲシグナルは、エキソンベースのＲＴ−ＰＣＲシグナルと同じくらい、またはそれよりも大きくなり得ることが判明した。この発見は、一定のｍＲＮＡ種による２，３の最近の発見によって支持されているが、イントロンは、スプライシング後に非常に急速に分解されるという一般的な見方（Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：ｐ．５３２−４０［２００２］；Ｃｌｅｍｅｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：ｐ．１６９１９−３０［２００１］；Ｓｈａｒｐら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：ｐ．１１１９−１１５０［１９８６］）に合致しない。
【００７５】
本発明の基礎となっているやはり予想されなかった実験上の発見は、発現したイントロン配列とエキソン配列の組織量は、相関する傾向があるため、イントロンＲＮＡが遺伝子発現プロファイリングに使用できることを示している。この結果は予期されないものである。なぜならば、転写されたイントロン配列およびエキソン配列の合成およびターンオーバーに関する全体的な速度定数比が同様であるという証拠は乏しいか、または全くないからである。実際、科学文献は、前ｍＲＮＡとスプライスされたイントロンのターンオーバーの複雑さの証拠を提供している。例えば、効率的にスプライスアウトされず、「未成熟」なｍＲＮＡ種において細胞質へと輸送され、そこで核イントロンＲＮＡ配列とは異なる速度で減衰し得る（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：ｐ．４３６０−５［１９９７］）イントロンＲＮＡを含有する副集団と共に、前ｍＲＮＡは、複数の動態学的プールに存在し得る（ＥｌｌｉｏｔおよびＲｏｓｂａｓｈ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２９：ｐ．１８１−８［１９９６］）。一定のスプライスされたイントロンＲＮＡがラリアート構造において細胞質に進入する証拠が存在している（Ｃｌｅｍｅｎｔら、ＲＮＡ  ５：ｐ．２０６−２０［１９９９］）。
【００７６】
最後に本明細書に提示されたデータは、イントロン配列が、診断的または予後的分子マーカーとして役立ち得ることを示す。以前、癌において予後的であることが実証されている４種のｍＲＮＡを調べると、それらの対応するイントロン配列もまた予後的であり、転写エキソン親配列と同じ方向（すなわち、正の予後的か、または負の予後的）であることが示される。
【００７７】
要するに、本発明のアプローチは、以下のとおり証明された。参照として、その全体の開示が、本明細書に特に組み込まれている、２００２年９月１８日に出願の同時係属出願第６０／４１２，０４９号は、乳癌再発の可能性を予測する遺伝子のセットを記載している。その試験では、１４６人の患者の固定パラフィン埋め込み乳癌組織検体における転写エキソン配列の濃度が、エキソンベースのＰＣＲプライマー／プローブセットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより測定された。本明細書に記載された試験においては、先に同定されたマーカー遺伝子の４種の内部の転写イントロン配列の濃度を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲアッセイが創製され、次いで６０の固定パラフィン埋め込み生検検体（先の試験でサブセットが評価された６０人の異なる患者を表す）からのＲＮＡをスクリーニングするために用いられた。下記の実施例に提示されたデータは、各遺伝子に関して、イントロンとエキソンは同時発現し、イントロンは、先のエキソンベースのデータにより予測されたように疾病再発の危険性を予測するということを示している。
【００７８】
（３．イントロンベースのＰＣＲプライマーおよびプローブのデザイン）
本発明の一態様によれば、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅すべき遺伝子内に存在しているイントロン配列に基づいてデザインされる。したがって、プライマー／プローブデザインの最初の工程は、遺伝子内部にあるイントロン配列の記述である。これは、Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：ｐ．６５６−６４（２００２）によって開発されたＤＮＡＢＬＡＴソフトウェアなどの一般に入手できるソフトウェアまたは、変型を含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって実施することができる。その後の工程は、ＰＣＲプライマーおよびプローブデザインの十分に確立された方法が続く。
【００７９】
非特異的シグナルを避けるために、前記プライマーとプローブをデザインする際は、イントロン内部の反復配列をマスクすることが重要である。これは、Ｂａｙｌｏｒ医科大学を介してオンラインで利用できるＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いて、容易に達成できるが、このプログラムにより、反復要素のライブラリに対してＤＮＡ配列をスクリーンされ、反復要素がマスクされているクエリー配列が戻される。次に、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢアッセイ−バイ−デザイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  ＲｏｚｅｎおよびＨｅｌｅｎ  Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）一般ユーザー用および生物学者プログラマー用にＷＷＷに対するＰｒｉｍｅｒ３．Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ、Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（編集）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ所在、ｐ．３６５−３８６において）などの商品として、または他に一般入手できるプライマー／プローブデザインパッケージを用いて、プライマー配列およびプローブ配列をデザインするために、マスクされたイントロン配列を使用することができる。
【００８０】
ＰＣＲプライマーデザインにおいて考慮される最も重要な因子としては、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、ならびにＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列および３’末端配列が挙げられる。一般に最適なＰＣＲプライマーは、一般に１７〜３０の塩基長であり、例えば、約５０〜６０％など、約２０〜８０％のＧ塩基＋Ｃ塩基を含有する。Ｔｍは、５０℃と８０℃との間であり、例えば、約５０℃から７０℃が典型的に好ましい。
【００８１】
ＰＣＲプライマーおよびプローブのデザインに関するさらなる指針には、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．ら著、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒの「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク所在、１９９５年、ｐ．１３３−１５５；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ著、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓの「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン所在、１９９４年、ｐ．５−１１；およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：ｐ．５２０−５２７（１９９７）を参照されたく、それら全体の開示が参照として本明細書に特に組み込まれている。
【００８２】
（４．適用）
本発明の方法、具体的には、本明細書におけるイントロンベースのＰＣＲプライマーおよびプローブ、遺伝子または遺伝子断片を表している核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ならびに一般に全てのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む）の増幅が必要とされている全ての分野における利用である。したがって、本発明によって、設計されたＰＣＲプライマーおよびプローブは、限定はしないが、定量的ＰＣＲ（例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ）およびマイクロアレイ分析ならびにビーズベースのアッセイによる遺伝子発現プロファイリングなど、任意の方法論による遺伝子発現プロファイリングを目的として、生物学的サンプルに存在する個々の遺伝子または複数の遺伝子を増幅するために使用することができる。
【００８３】
例えば、マイクロアレイ法の特定の一実施形態において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入物が、高密度アレイにおける基質に適用される。少なくとも１０，０００のヌクレオチド配列が、基質に適用されることが好ましい。少なくとも各１０，０００の要素において、マイクロチップに固定されたマイクロアレイ遺伝子が、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにとって好適である。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、対象組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組込みによって創製できる。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異性を有してハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄により、非特異的に結合したプローブを除去した後、共焦点レーザー顕微鏡により、またはＣＣＤカメラなどの他の検出法により、チップをスキャンする。各アレイ要素のハイブリダイゼーションの定量化では、対応するｍＲＮＡの存在量を考慮に入れる。二重色蛍光により、２つのＲＮＡ出所から生成された、別個に標識化されたｃＤＮＡプローブは、アレイに対して対になってハイブリダイズされる。したがって、特定の各遺伝子に対応する２つの出所の転写物の相対的存在量が同時に決定される。ハイブリダイゼーションのスケールを小型化することにより、多数の遺伝子発現パターンを簡便に、迅速に評価することができる。このような方法は、１つの細胞当たり２，３のコピーで発現される希少な転写物の検出、および発現レベルにおける少なくとも凡そ２倍の差異の再現性よい検出に必要とされる感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｍａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２）：ｐ．１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析は、商品として入手できる装置により、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ法またはＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ法を用いるなど、製造元のプロトコルに従って実施できる。
【００８４】
本発明の重要な一態様は、患者に最良の薬剤、または薬剤の組合せをマッチさせ、予後の情報を提供するために、遺伝子発現プロファイリングの一部として、イントロンベースの遺伝子増幅を利用することである。例えば、癌組織（例えば、生検乳癌組織）内の遺伝子発現測定は、外科手術および／または他の癌療法後の患者における長期の疾患のない生存可能性を予測するために、またはある特定の治療法に対する患者の応答を予測するために使用できる。この目的のために、アッセイされたＲＮＡ量の違いおよび使用されたＲＮＡの質のばらつきの双方を補正する（正規化する）ことが典型的に必要である。したがって、本発明のアッセイは、通常ＧＡＰＤＨやＣｙＰ１などの周知の参照遺伝子を含む一定の正規化遺伝子の発現を測定し、組み込んでいる。あるいは、正規化は、アッセイされた全遺伝子またはその多数のサブセットの平均シグナルまたは中央値シグナル（Ｃｔ）に基づくことができる（全体的な正規化アプローチ）。遺伝子ごとをベースにして、患者の腫瘍ｍＲＮＡの測定された正規化量を、癌、例えば、乳癌の組織参照セットに見られる量と比較する。この参照セットにおける癌、例えば乳癌の組織の数（Ｎ）は、種々の参照セット（全体として）が、本質的に同じように挙動することを確認する上で十分に高いはずである。この条件に合えば、ある特定のセットに存在する個々の乳癌組織の身元は、アッセイされた遺伝子の相対量に有意な影響を及ぼさないであろう。通常、乳癌組織参照セットは、少なくとも約３０、好ましくは、少なくとも約４０の異なる固定パラフィン埋め込み（ＦＰＥ）乳癌組織検体からなる。他に特記しない限り、各ｍＲＮＡ／試験腫瘍／患者の正規化した発現レベルは、参照セットにおいて測定された発現レベルのパーセンテージとして表される。より具体的には、十分に数の多い（例えば、４０）腫瘍の参照セットにより、各ｍＲＮＡ種の正規化レベルの分布が得られる。分析すべき特定の腫瘍サンプルにおいて測定されたレベルは、この範囲内のあるパーセンタイルに入り、それを当業界で周知の方法により決定できる。
【００８５】
浸潤性乳癌のパラフィン埋め込み固定組織サンプルにおける遺伝子発現の第ＩＩ相試験では、乳癌組織における以下の遺伝子のいずれかの過剰発現が、外科手術後の癌再発を伴わない生存可能性の減少を示すことが判明している；ＦＯＸＭ１；ＰＲＡＭＥ；ＳＫＴ１５；Ｋｉ−６７；ＣＡ９；ＮＭＥ１；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＹＢ−１；ＲＰＳ６ＫＢ１；Ｓｒｃ；Ｃｈｋ１；ＣＣＮＢ１；Ｃｈｋ２；ＣＤＣ２５Ｂ；ＣＹＰ３Ａ４；ＥｐＣＡＭ；ＶＥＧＦＣ；ｈＥＮＴ１；ＢＲＣＡ２；ＥＧＦＲ；ＴＫ１；ＶＤＲ。
【００８６】
同じ試験で、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの過剰発現が、外科手術後の癌再発を伴わない生存に関してより良好な予後を示している：Ｂｌｃ１２；ＣＥＧＰ１；ＧＳＴＭ１；ＰＲ；ＢＢＣ３；ＧＡＴＡ３；ＤＰＹＤ；ＧＳＴＭ３；ＩＤ１；ＥｓｔＲ１；ｐ２７；ＸＩＡＰ；ＩＧＦ１Ｒ；ＡＫ０５５６９９；Ｐ１３ＫＣ２Ａ；ＴＧＦＢ３；ＢＡＧＩ１；ｐＳ２；ＷＩＳＰ１；ＨＮＦ３Ａ；ＮＦＫＢｐ６５。
【００８７】
ＥＲ陽性乳癌のパラフィン埋め込み固定組織サンプルにおける遺伝子発現のこの同じ第ＩＩ相試験で、以下の遺伝子の過剰発現が、外科手術後の癌再発を伴わない生存可能性の減少を示している；ＰＲＡＭＥ；ＦＯＸＭ１；ＥＰＨＸ１；ＨＩＦ１Ａ；ＶＥＧＦＣ；Ｋｉ−６７；ＶＤＲ；ＮＭＥ１。また、これらの遺伝子（ＰＲＡＭＥ；ＦＯＸＭ１；ＶＥＧＦＣ；Ｋｉ−６７；ＶＤＲ；およびＮＭＥ１）の幾つかは、ＥＲ陽性乳癌に限定されず、先の分析において予後不良の指標としても確認されている。残りの遺伝子（ＥＰＨＸ１およびＨＩＦ１Ａ）の過剰発現は、ＥＲ陽性乳癌のみにおいて疾患を伴わない生存の負の指標であることが判明している。ＥＲ陽性乳癌における以下の遺伝子の過剰発現は、外科手術後の癌再発を伴わない生存に関してより良好な予後を示すことが判明している：Ｂｃｌ−２；ＤＩＡＢＬＯ；ＩＧＦ１Ｒ；ＧＳＴＭ３。後者の遺伝子のうち、Ｂｃｌ−２；ＩＧＦＲ１；およびＧＳＴＭ３は、ＥＲ陽性乳癌に限定されず、先の分析において良好な予後の指標としても確認されている。ＤＩＡＢＬＯの過剰発現は、ＥＲ陽性乳癌のみにおいて疾患を伴わない生存の正の指標のようであった。さらなる詳細に関しては、その開示全体が参照として本明細書に特に組み込まれている、２００２年１１月１５日に出願の同時係属出願第６０／４２７０９０号を参照されたい。
【００８８】
上記の試験は、遺伝子増幅が、エキソンベースのアンプリコンを用いて試験されたことを除いては、本質的に下記の実施例２に記載されたとおり実施された。さらなる詳細に関しては、その開示全体が参照として本明細書に特に組み込まれている、２００２年３月１３日に出願の同時係属出願第６０／３６４，８９０号を参照されたい。実施例２において提示されたデータにより証明されたように、イントロンベースのアンプリコンを用いて得られたデータは、初期のデータと優れた相関性を示し、また、典型的に、感度の増大という追加利益を提供している。
【００８９】
湿潤性乳管癌の先の第ＩＩ相試験の知見を、以下の等式を使用したコックス比例ハザードモデルを用いて、多変量段階的解析に供した：
ＲＲ＝指数［係数（遺伝子Ａ）ｘ  Ｃｔ（遺伝子Ａ）＋係数（遺伝子Ｂ）ｘ  Ｃｔ（遺伝子Ｂ）＋係数（遺伝子Ｃ）ｘ  Ｃｔ（遺伝子Ｃ）＋．．．．．］。
【００９０】
この等式において、有益な結果を予測する遺伝子の係数は正の数であり、不利な結果を予測する遺伝子の係数は負の数である。等式中の「Ｃｔ」値は、ΔＣｔすなわち、ある集団に関する平均正規化Ｃｔ値と問題の患者に関して測定された正規化Ｃｔとの間の差を表している。解析に用いられる慣例は、集団平均の上と、下のΔＣｔは、それぞれ正の符号と負の符号を有する（より多い、またはより少ないｍＲＮＡ存在量を表している）。この等式を解くことによって算出された相対的危険度（ＲＲ）は、その患者が、癌の再発を伴わずに長期生存するチャンスが増大するか、減少するかを示した。
【００９１】
数を減少させた遺伝子を含む質問セットを用いた多変量解析において、以下の１０遺伝子セットが、原発腫瘍の外科手術による除去後、癌再発を伴わない患者生存の特に強力な予測値を有することが確認されている。
【００９２】
【化１６】
2006518602.tif 000026
同定された全ての遺伝子を含む質問セットを用いた多変量解析において、以下の１０遺伝子セットが、原発腫瘍の外科手術による除去後、癌再発を伴わない患者生存の特に強力な予測値を有することが確認されている。
【００９３】
【化１７−１】
2006518602.tif 000027
【００９４】
【化１７−２】
2006518602.tif 000028
ＥＲ−陽性乳癌に対し、同じ多変量解析法を用いて、以下の１０遺伝子セットが、原発腫瘍の外科手術による除去後、癌再発を伴わない患者生存の特に強力な予測値を有することが確認されている。
【００９５】
【化１８−１】
2006518602.tif 000029
【００９６】
【化１８−２】
2006518602.tif 000030
エキソンベースの遺伝子発現プロファイリング結果とイントロンベースのそれとの間の優れた相関（実施例２を参照のこと）を考えると、遺伝子発現プロファイリングがイントロンベースのプライマー／プローブセットからのＲＴ−ＰＣＲシグナルの定量化に基づく場合、同じ遺伝子セットが、同様な予後価値を有すると考えられる。
【００９７】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例から明らかとなろう。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
（イントロン特異的ＰＣＲプライマー／プローブセットのデザインおよび使用）
ホルマリン固定パラフィン埋め込み（ＦＰＥＴ）乳癌生検検体（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、マサチューセッツ州ピッツフィールド所在）から、以下のとおりＲＮＡを抽出した。３つの１０μＭ切片を切断し、１．５ｍｌ管に入れた。キシレン抽出（１ｍｌ、３回）に続いてエタノール洗浄（１ｍｌ、２回）により、パラフィンを除去した。ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州マジソン所在）を用いて、切片組織塊からＲＮＡを単離した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によりＲＮＡを定量化した。次いで２０個のＦＲＥＴ  ＲＮＡサンプルをプールし、以下のとおり使用した。
【００９９】
プールされたＦＲＥＴ  ＲＮＡ（４００ｍｇ）を用い、プールされた遺伝子特異的プライマー（図２に示された逆プライマー）のランダム六量体およびＲＮアーゼ阻害剤により、Ｑｉａｇｅｎのオムニスクリプト逆転写酵素を用いて、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。１５０ｎｇのプールされたＦＲＥＴ  ＲＮＡ、５ｎｇ／ウェルにおいてＴａｑｍａｎ増幅を行う上で十分なＲＮＡにより、非逆転写（ＲＴ）反応もまた実施した。
【０１００】
（表２）
【０１０１】
【表２】
2006518602.tif 000031
（ＴａｑＭａｎアッセイ）
１アッセイ当たり２５μｌの反応液容量および５ｎｇのＲＮＡ投入量により、３とおりのウェルで、４８遺伝子パネルに関してＴａｑＭａｎアッセイを実施した。ＤＮＡシグナルではなくてＲＮＡシグナルが測定されていることを確認するために、１つのウェルにおいて、各遺伝子に関してコントロールとして「非ＲＴ」反応を実施した。以下のパラメータを用いて、ＡＢＩ７７００上で、リアルタイムの定量化を実施した：
サイクリング条件：９５℃、１０分で１サイクル、９５℃、２０秒に次いで、６０℃、４５秒で４０サイクル。
【０１０２】
反応容量：２５μｌ
色素層設定：ＦＡＭ（受動対照はＲＯＸ）
（結果）
ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥおよびＳＴＫ１５遺伝子のマスクされたイントロンに基づいて、イントロン特異的Ｔａｑｍａｎプライマー−プローブセットをデザインした。遺伝子内のイントロン配列を記述するために、サンタクルーズ大学オンラインゲノム資源サイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）で利用できるＢＬＡＳＴ様配置手法（ＢＬＡＴ）プログラムを用いて、各ｍＲＮＡ（ＮＭ＿ＸＸＸＸＸＸ）に関して、ＮＣＢＩ参照配列をヒトゲノムに対して配置した。次にベイラー医科大学を介してオンラインできる（ｈｔｔｐ：／／ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ−ｕｔｉｌ／ｓｅｑ−ｕｔｉｌ．ｈｔｍｌ）Ｒｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いて、イントロン配列を反復配列に関して探索した。Ａｌｕ反復などの反復配列は、このプログラムによって同定され、マスクされた。これらの配列は、強い非特異的シグナルを生じるため、プライマー−プローブをデザインする前に、これらを排除することが重要である。次に、Ｔａｑｍａｎプライマー−プローブセットをデザインするため、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＡＢＩ）を用いて、マスクされたイントロン配列（図１Ａ〜Ｍ）を使用した。プライマー−プローブセットに好適な他のプログラムとしては、例えば、ＭＧＢデザインアッセイ（ＡＢＩ）のための新規プライマー−プローブデザインプログラムが挙げられる。各プライマー−プローブセットに関するアンプリコンは、図１において太字で記載されている。各々の特異的プライマー−プローブセットは、図２に示されている。
【０１０３】
標準的Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現プロフィル実験においては、プールされたＦＰＥＴ  ＲＮＡを用いて、イントロン特異的プライマー−プローブセット（試験遺伝子）が、それらの対応するエキソン特異的プライマー−プローブセット（参照遺伝子）と共に使用された。正規化発現を式２ΔＣｔによって算出したが、ここで、ΔＣｔは、試験遺伝子プライマー−プローブセットのＣｔと参照遺伝子プライマー−プローブセットのＣｔとの差［Ｃｔ（参照）−Ｃｔ（試験）］である。
【０１０４】
（実施例２）
（前悪性および悪性乳房腫における遺伝子発現の第ＩＩ相試験）
湿潤性乳管癌のパラフィン埋め込み固定組織サンプルにおける遺伝子発現を分子的に特性化することを第１の目標とし、また、そのような分子プロフィルと疾患を伴わない生存との間の相関性を探索するために、遺伝子発現試験をデザインし、実施した。
【０１０５】
（試験デザイン）
乳癌と診断された６０人の患者個々から得られたパラフィン埋め込みホルマリン固定乳房腫組織において分子アッセイを実施した。患者は全て、乳房の湿潤性癌と診断され外科手術を受けた。患者は、材料と方法の節で記載されたとおり実施された組織病理学的評価で、十分な腫瘍組織量と同種の病状を示した場合のみ、試験に含めた。
【０１０６】
（材料と方法）
各代表的腫瘍塊を、診断、腫瘍量の半定量的評価、および腫瘍グレードに関して、標準的な組織病理学によって特性化した。合計６切片（各１０ミクロンの厚さ）を調製し、２本のＣｏｓｔａｒブランドのミクロ遠心管（ポリプロピレン、１．７ｍＬ管、透明；各管に３切片）に入れた。腫瘍が、総検体面積の３０％未満を占める場合は、全体顕微解剖を用い、病理学者によって粗く切開し、その腫瘍組織を直接Ｃｏｓｔａｒ管に入れておいてもよい。
【０１０７】
外科手術操作の部分として、１つ以上の腫瘍塊が得られた場合は、全ての腫瘍塊を上記の同じ特性化に供し、その疾患の最も代表的な塊を分析に用いた。
【０１０８】
（遺伝子発現分析）
固定パラフィン埋め込み組織サンプルからｍＲＮＡを抽出、精製し、遺伝子発現分析のために上記のとおり調製した。
【０１０９】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー所在）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより定量的遺伝子発現の分子アッセイを行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００（商標）は、サーモサイクラー、レーザー、荷電結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータから構成されている。前記システムは、サーモサイクラー上、３８４ウェル型式においてサンプルを増幅する。増幅時、レーザー誘導蛍光シグナルは、３８４ウェル全てに関して光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで回収され、ＣＣＤで検出される。前記システムは、器械を操作し、データを解析するためのソフトウェアを含む。
【０１１０】
（解析および結果）
３７の異なる遺伝子産物を表す４８の異なるＲＮＡ配列の発現に関して腫瘍組織を分析した。各患者の閾値サイクル（Ｃｔ）値を、その特定の患者に関する全遺伝子の中央値に基づいて正規化した。臨床結果のデータは、全ての患者に関して登録データのレビューおよび選択された患者カルテから入手できた。
【０１１１】
結果は以下のとおり分類された：
０  乳癌もしくは原因不明により死亡または乳癌再発を伴って生存；
１  乳癌再発を伴わずに生存または乳癌以外の原因により死亡
解析は以下により実施された：
乳癌再発を伴わずに生存または乳癌以外の原因により死亡した患者の正規化遺伝子発現と結果（上記のとおり０または１）までの時間との間の相関解析を調べた。このアプローチは、個々の遺伝子および複数の遺伝子セットの予後的影響を評価するために用いられた。
【０１１２】
各遺伝子に関して、再発または死亡までの時間を従属変数とし、その遺伝子の発現レベルを独立変数として、Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓモデル（例えば、Ｃｏｘ，Ｄ．Ｒ．およびＯａｋｅｓ，Ｄ．（１９８４）、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｄａｔａ、ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ、ニューヨーク州ロンドンを参照）を規定した。Ｃｏｘモデルにおいて、ｐ値＜０．０５を有する遺伝子を同定した。各遺伝子に関し、Ｃｏｘモデルは、遺伝子発現における単位変化に関する再発または死亡の相対的危険度（ＲＲ）を提供する。その遺伝子が、不良な（ＲＲ＞１．０１）予後の指標であるか、良好な（ＲＲ＜１．０１）予後の指標であるかによって、閾値以上の発現値を有する患者は全て危険度が高く、閾値以下の発現値を有する患者は全て危険度が低いか、またはその逆となる、測定された発現の任意の閾値（Ｃｔ基準で）で、患者を副集団に分けるために選択できる。したがって、何らかの閾値が、危険度がそれぞれ高いか、または低い患者の副集団を規定することになる。
【０１１３】
下表３は、遺伝子ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５に関する被験イントロンとエキソンとの間の発現の対相関（相関係数として示される）を示している。４つの遺伝子のうちの２つ、ＣＥＧＰ１およびＰＲＡＭＥに関して、イントロンは約０．９０の相関係数［それらの各々のエキソンとの同時発現に関して］を生じることが判明した。ＳＴＫ１５の場合は、１つのイントロンが、約０．８０の相関係数でエキソン発現と相関している。ＦＯＸＭ１に関しては、イントロン：エキソン発現相関性は著しく低かった。しかし、この最後のケースでは、実際の発現の相関性は高いかもしれないが、技術上の理由から検出不可能であると思われる。多くの患者において、ＦＯＸＭ１エキソンの発現は、アッセイの検出閾値以下であり、そのことが、存在し得る高い相関性の検出を妨げている可能性がある。この仮定が正しければ、ＦＯＸＭ１イントロンは、先にＦＯＸＭ１に関して証明したように、負の臨床予後マーカーとして依然として登録されると考えられる。後に示されるようにこの結果が生じる。
【０１１４】
図３、図４、図５は、ＣＥＧＰ１、ＰＲＡＭＥおよびＳＴＫ１５エキソンＲＮＡ類に対する試験ＲＮＡ類発現の対相関を示している。示されているように、これら遺伝子個々のイントロンから高い相関性が得られた。我々が選択した遺伝子を含む４８の遺伝子パネルは、幾つかのバイオインフォーマティックスに基づいた方法により、ＣＥＧＰ１、ＰＲＡＭＥ、ＳＴＫ１５、およびＦＯＸＭ１との発現に特に相関性がありそうなことは注目すべきである。それらの非イントロンベース法は、ＳＴＫ１５の場合、幾つかの候補遺伝子が、０．６〜０．７の範囲の発現相関係数を有していたため、最も好結果となった。
【０１１５】
（表３．４種の遺伝子に関するイントロン発現とエキソン発現との間の相関性）
【０１１６】
【表３】
2006518602.tif 000032
下表４は、患者の生存率に及ぼすＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥおよびＳＴＫ１５のエキソンおよびイントロン発現の影響を示している。患者のエキソンは全て、ＦＯＸＭ１を除いて先に我々が決定したように、相対的危険度［ＲＲ］に対し、統計的に有意な影響を有していた。本試験では元の１４６人の患者群のうち６０人の患者を評価したため、減少したデータセットを調べた統計的危険性のために、ＦＯＸＭ１マーカーは、有意性から外れた可能性がある。４種の被験遺伝子全てに関して、イントロン発現はＲＲに有意な影響を及ぼし、親エキソンと同じ方向性にあったことは、極めて注目すべきである。
【０１１７】
（表４．乳癌患者６０人に関するＣｏｘモデルの結果）
【０１１８】
【表４】
2006518602.tif 000033
転写エキソン配列の定常状態濃度は、転写イントロン配列のそれを大きく超過するという一般的な認識が存在している（Ｓｈａｒｐら、Ａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：ｐ．１１１９−５０［１９８６］）。それにもかかわらず、我々は、固定パラフィン埋め込み乳癌組織からのＲＮＡをアッセイするために、ＴａｑＭａｎ［ＴＭ］ＲＴ−ＰＣＲを用いたＣＥＧＰ１、ＦｏｘＭ１、ＰＲＡＭＥおよびＳＴＫ１５のエキソンとイントロンの発現を調べて、イントロンとエキソンのシグナル強度が同じ範囲にあり、また、全ての場合において、アッセイの有用な検出範囲にあることを証明した［データは示していない］。ＲＮＡを分解し、したがってＲＮＡ検出能力を大きく制限するホルマリンにおいて使用組織が固定されたため、本試験におけるイントロンＲＮＡの検出は、一層注目すべきことである（Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇ．２：ｐ．８４−９１［２０００］）。ＣＥＧＰ１の場合、試験イントロンのうち３つが、エキソンよりも低いシグナルを生じ、１つがより高いシグナルを生じた。ＦＯＸＭ１の場合、９つの被験イントロンのうち５つが、エキソンよりも高いシグナルを生じた。ＰＲＡＭＥの場合、試験したイントロンとエキソンのシグナル強度はほぼ等しかった。最後にＳＴＫ１５に関しては、全てのイントロンが、エキソンのシグナル強度の１／４から１／２０のシグナル強度を有したが、依然としてアッセイの有用な範囲内にあった。したがって、これらの結果は、発現したイントロンの定常状態濃度が、分子マーカーとしてのイントロンＲＮＡ鎖の使用にとって、十分であることを示している。
【０１１９】
実施例を含め、本開示を通して引用された全ての引用文献は、参照としてそれらの開示全体を本明細書に特に組み込まれている。
【０１２０】
本明細書は、特定の実施例と考えられるものに関して記載されたが、本発明は、そのように限定されるものではないことを認識すべきである。それとは反対に、本発明は、添付の請求項の精神と範囲内に含まれる種々の修飾および等価物を含むことが意図されている。例えば、本開示は、種々の乳癌関連の遺伝子ならびに遺伝子セットを含むが、他のタイプの癌に関する同様な遺伝子ならびに遺伝子セットおよび方法が具体的に本明細書の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１−１】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−２】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−３】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−４】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−５】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−６】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−７】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−８】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−９】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−１０】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図１−１１】図１Ａ〜Ｍは、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５遺伝子に関するマスクされたイントロン配列を示している。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたアンプリコンはイタリックで示されている。
【図２】図２は、ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、およびＳＴＫ１５に関するプライマー／プローブセットを示している。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ「Ｆ」および「Ｒ」によって示されている。プライマーの配列は、「Ｐ」で示されている。
【図３】図３は、ＣＥＧＰ１エキソンＲＮＡと他の４７のＲＮＡ配列との同時発現に関する相関係数［Ｒ］を示している。記号：菱形＝ＣＥＧＰ１エキソン自己対自己（＝１．０、定義により）；正方形＝ＣＥＧＰ１イントロン；三角形＝他の遺伝子配列。
【図４】図４は、ＰＲＡＭＥエキソンＲＮＡと他の４７のＲＮＡ配列との同時発現に関する相関係数［Ｒ］を示している。記号：菱形＝ＰＲＡＭＥエキソン自己対自己（＝１．０、定義により）；正方形＝ＰＲＡＭＥイントロン；三角形＝他の遺伝子配列。
【図５】図５は、ＳＴＫ１５エキソンＲＮＡと他の４７のＲＮＡ配列との同時発現に関する相関係数［Ｒ］を示している。記号：菱形＝ＳＴＫ１５エキソン自己対自己（＝１．０、定義により）；正方形＝ＳＴＫ１５イントロン；三角形＝他の遺伝子配列。
【図６−１】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−２】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−３】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−４】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−５】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−６】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−７】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−８】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−９】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−１０】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−１１】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−１２】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−１３】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−１４】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。
【図６−１５】図６は、本発明の方法によって発現を分析できる典型的な遺伝子セットを示している。