(57)【要約】  本発明は、認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療のための剤としての哺乳動物クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）の分泌されたスプライシングバリアント（ｓ−ＫＬ）の使用を開示する。本発明は、また、哺乳動物、特に齧歯類又はヒトの中枢神経系への該ｓ−ＫＬバリアントの送達のための遺伝子治療で有用な遺伝子構築体及び発現ベクターにも言及する。ＣＮＳにおいて蛋白質を発現させるための蛋白質ｓ−ＫＬ又はいずれかの遺伝子構築体を含む医薬組成物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療に使用するための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
【請求項２】
前記認知障害が学習及び記憶の障害からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
【請求項３】
前記行動障害が不安及び広場恐怖症から選択される、請求項１に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
【請求項４】
前記認知及び／又は前記行動障害が老化に関連する、請求項１に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
【請求項５】
前記神経変性及び／又は神経病理学的疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および筋委縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、クロイツェルフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、及び毛細血管拡張性運動失調症、発作後認知症、外傷後認知症、老人性認知症、及び頭蓋脳外傷からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアントまたはそれをコードする核酸配列。
【請求項６】
前記神経変性及び／又は神経病理学的疾患がアルツハイマー病である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
【請求項７】
アルツハイマー病における不安の予防及び／又は治療における使用である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
【請求項８】
前記スプライシングバリアントが、配列番号１、配列番号２、及び配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも８８％の同一性のパーセンテージを持つポリペプチドから選択されるポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列。
【請求項９】
発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント（ｓ−ＫＬ）をコードする核酸配列を含む、遺伝子構築体。
【請求項１０】
配列番号３の核酸配列を含む、請求項９に記載の遺伝子構築体。
【請求項１１】
配列番号３からなる、請求項９から１０のいずれか１項に記載の遺伝子構築体。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子構築体を含む、中枢神経系向性を持つ発現ベクター。
【請求項１３】
ウイルスベクターである、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
血清型ＡＡＶｒｈ１０のアデノ−関連ウイルスである、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
１種以上の医薬上許容される賦形剤又は担体と共に、治療上有効量の、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び／若しくは遺伝子構築体、並びに／又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療における使用のための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び／若しくは遺伝子構築体、並びに／又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のベクターと、他の活性剤との組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、記憶喪失に関連する、並びに学習困難に関連する疾患に罹っている患者において認知障害及び行動障害を予防及び／又は治療するための医学的アプローチの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
記憶は、年月と共に頻繁に失われ、いくつかの様相は変化しかねず、記憶効率の喪失に至ることが広く知られている。これらの様相の例としては、同時に１を超える物事に対して集中を維持する困難；努力を要する新しい事柄を学習するにおける困難、及びゆっくりとした昔の情報の回復が挙げられる。口頭能力、情報処理、問題解決、作業記憶、長期記憶及び空間的記憶及び能力は年齢と共に低下し、他方、意味記憶（語彙）、世界知識、及び潜在記憶等の専門及び認識能力は、年齢と共に安定したままであり、もし病理又は神経変性が存在しなければより良くなりさえする。
【０００３】
神経変性及び／又は神経病理学的疾患に関連して、老化に関するそれらの多くは認知障害も示唆する。これらの例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、鬱病、及び統合失調症が挙げられる。
【０００４】
加えて、老化と共に、又は神経変性及び／若しくは神経病理学的疾患の場合には、方向感覚喪失の増加、未知の状況又は場所に対する、あるいは方向感覚喪失それ自体さえに対する不安発症、並びに不合理な恐怖等の行動障害も観察される。
【０００５】
全てのこれらの認知及び行動障害は、神経変性及び／又は神経病理学的疾患のうちの多くの総体症状の治療におけるのみならず、加齢の間における認知及び行動の障害の予防にもおける主な目的である。
【０００６】
加齢の間における、又は神経病理学若しくは神経変性の場合における、記憶喪失に伴ういくつかのかつ複雑なメカニズムのうち、哺乳動物蛋白質クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）の役割が研究されてきた。
【０００７】
３つの独立したヒトアッセイにおいて、クロトー分泌の増加をイン・ビトロ（ｉｎ・ｖｉｔｒｏ）にて促進するクロトー対立遺伝子、即ち、ＫＬ−ＶＳクロトー対立遺伝子におけるいくつかの突然変異により、対象の年齢とは独立して認知試験において良好な結果を得ることが可能であったことが発見された。これらのデータは非特許文献１に由来する。
【０００８】
クロトーは、腎臓の遠位曲尿細管、副甲状腺ホルモン分泌細胞及び脳の脈絡叢上皮に主として検出される蛋白質である。より程度は低いが、α−クロトー遺伝子は、心臓、骨格筋、膀胱、胎盤、膵臓、精巣、卵巣、結腸、及び内耳においても発現されている。マウスにおけるいくつかの研究は、染色体１３上の単一遺伝子α−クロトーの突然変異が、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症／骨減少症、種々の組織における異所性石灰化、気腫、認知障害、及び不妊症等の擬態典型兆候を伴って、加速された加齢のプロセスを誘導することを明らかにした（非特許文献２及び３参照）。更に、ノックアウトされたα−クロトー（ｋｌ−／ｋｌ−）マウスは、２月齢前後で未熟で劇的に低下した生存を示した（Ｋｕｒｏ−ｏ，前掲）。対照的に、この遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、３０から４０％より大きい平均余命を有した。同様に、いくつかの研究は、ヒトクロトー遺伝子多型が、寿命、及び老化に伴う障害の様相にも影響することを示す。マウス及びヒトにおいて、α−クロトー遺伝子は５．２ｋｂの転写体をコードする。第三エクソンにおいて、一方は膜貫通形態（完全な転写体又は全長１０１４個のアミノ酸）をコードし、他方は該蛋白質の分泌形態（半膜貫通転写体、５５０個のアミノ酸）をコードする、２つの異なる転写体を生じさせることができる選択的スプライシングドナーがある。全長転写体は、ほぼ１３０ｋＤａの分子量を持つ単一パス膜貫通蛋白質（ｍ−ＫＬ）をコードする。該蛋白質は３つのドメイン：Ｃ末端における短い膜貫通ドメイン、各々ＫＬ１及びＫＬ２と呼ばれる約５５０個のアミノ酸の２つの内部反復配列から構成される細胞外ドメイン、並びに１０個のアミノ酸の非常に短い細胞内ドメインを含有する。選択的スプライシングからの転写体は、７０ｋＤａの近似分子量を持つ、ＫＬ１ドメインのみから形成される該蛋白質の切形形態（ｓ−ＫＬ）を生じさせる。この選択的ｍＲＮＡは、ｍ−ＫＬ転写体では見出されない１５個アミノ酸テイルからなる特異的分泌シグナルを含み、この理由で、クロトーの分泌されたアイソフォーム、ｓ−ＫＬ、又はクロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアントとも呼ばれる（非特許文献４参照）。しかしながら、この蛋白質（ｓ−ＫＬ）に関してはいくらか論争がある。なぜならば、それは抗体を用いて体液中で検出されていないからである。それはｍＲＮＡレベルでは具体的に検出されているが、蛋白質レベルでは検出されておらず、その理由は、入手可能な抗体は、それを、膜貫通クロトーから切断されたＫＬ１ドメインから区別できないからである。
【０００９】
加えて、膜貫通形態の細胞外ドメインはメタロプロテイナーゼＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７によって切断でき、その結果、約１３０ｋＤａの可溶性クロトーのもう１つの形態（蛋白質分解された膜アイソフォームにつきｐ−ＫＬと略する）がもたらされ、これは、血清、尿、及び脳脊髄液で検出されている。更に、２つの最近の研究は、１つは（選択的スプライシングから生じるが、特異的アミノ酸テイル無しのもののような）ＫＬ１ドメインのみを含有し、他方はＫＬ２ドメインを含有した、２つの新しい７０ｋＤａアイソフォームを生じる、ＫＬ１及びＫＬ２ドメインの間に位置するプロテアーゼＡＤＡＭ１０及び１７についての第二の認識部位があることを示す。かくして、クロトー蛋白質は、（ａ）選択的スプライシングからの（ｓ−ＫＬ）、並びに（ｂ）ＡＤＡＭ１０及び１７によって媒介された蛋白質分解切断による、２つの主たるメカニズムを通じて循環系に入り得る。しかしながら、これらの事象の各々が起こるパーセンテージは知られていない。
【００１０】
抗老化因子としての、並びに学習及び記憶技量を改善する剤としてのクロトーの役割を明瞭にする目的で、全身で過剰発現するクロトートランスジェニックマウスが得られている。Ｄｕｂａｌら、２０１４は、ヒトクロトー遺伝子ＫＬ−ＶＳのバリアントが、ヘテロ接合性キャリアにおいて増強された認知に関連することを開示している。この対立遺伝子は、血清においてクロトーレベルを増加させた。次いで、彼らは、学習及び記憶の多数の試験において対照よりもよく実行する、全長膜貫通クロトーの全体的過剰発現を伴うトランスジェニックマウスを分析した（非特許文献５）。
【００１１】
やはりＤｕｂａｌらによって分析されたもう１つのトランスジェニックマウスは、特に、アルツハイマー病に焦点を当てており、それは、クロトー発現の上昇が、全てｈＡＰＰのレベルを変更することなく、ヒトアミロイド前駆体蛋白質（ｈＡＰＰ）トランスジェニックマウスにおいて、若年死亡率、ネットワーク機能不全、認知欠乏、及び行動異常を減少させることを示す（非特許文献６）。
【００１２】
該トランスジェニックモデルにおいては、ほぼ１３０ｋＤａの分子量を持つ全長膜貫通蛋白質（ｍ−ＫＬ）、及びもし他のアイソフォームのいずれかが効果に寄与しているならば、特別には、プロセッシングされたクロトー（ｐ−ＫＬ）アイソフォームの効果が評価されているようであり、これは、著者らによって用いられた実験手法からは決定することができない。というのは、現在の入手可能な検出システムは、異なるクロトーアイソフォームの間を区別することができないからである。注目する蛋白質を過剰発現するトランスジェニック動物はその効果の分析のためのよいモデルであり得るが、それらは、この至るところ（身体及び脳）に発現されたこの蛋白質を有することの不便も示唆しており、データは、加えて、トランスジェニック動物の遺伝的背景によって構成され得る。
【００１３】
（ＳＡＭＰ８と命名された）老化のマウスモデルにおけるクロトーの潜在的役割を示すもう１つの文献は、非特許文献７のものである。この文献においては、リグスチリドが、記憶欠乏を低下させるためのアルツハイマー病（ＡＤ）における治療法として提案されている。データは、老化における、ＬＩＧの慢性的投与がＡＤ様神経病理及び記憶障害の発生を妨げることを示す。加えて、データは、おそらくは根底のメカニズムがクロトーのアップレギュレーションを含むことを示唆する。かくして、クロトー蛋白質は、年齢−関連ＡＤについての治療標的として提案されている。Ｋｕａｎｇらによって開示された実験方法（クロトー蛋白質を検出するためのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡの抗体の使用）によると、作用する蛋白質アイソフォームの間の識別は可能でない（ｍ−ＫＬ、ｐ−ＫＬ）。Ｋｕａｎｇらが「分泌されたクロトー」という場合、それは、哺乳動物クロトーの分泌されたスプライシングバリアントをいうのではなく、クロトーの他の可溶性形態をいう。事実、その時、本発明の発明者の発見までは、選択的に分泌されたクロトーアイソフォームは、発現されていない（又は無視できるレベルで発現された）非常に目立たないバリアントと考えられていた。事実、Ｆｏｒｓｔｅｒらによって報告されているように：「ＫＬ１及びＫＬ２両ドメインを含有するクロトーフォームは血清及び脳脊髄液（ＣＳＦ）双方で検出されており、ｍ−ＫＬの蛋白質分解断片と解釈されていた。選択的にスプライシングされたｍＲＮＡから生産されるであろうペプチドに正確に対応する循環クロトー種の存在は、血清又はＣＳＦで報告されていなかった」（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｄｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｋｌｏｔｈｏ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ａｎｄ  ｏｌｄ  ａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ”，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ−２００５，ｖｏｌ．３７８（１），ｐｐ．２２−２７
【非特許文献２】Ｋｕｒｏ−ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｋｌｏｔｈｏ  ｇｅｎｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ａｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ−１９９７，ｖｏｌ．ｎｏ．３９０，ｐｐ．：４５−５１
【非特許文献３】Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｋｌｏｔｈｏ”，Ａｇｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ−２００９，ｖｏｌ．ｎｏ．８，ｐｐ．：４３−５１１
【非特許文献４】Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｋｌｏｔｈ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｋｌｏｔｈｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｍ−１９９８，ｖｏｌ．Ｎｏ．２４２，ｐｐ．：６２６−６３０
【非特許文献５】Ｄｕｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｉｆｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｋｌｏｔｈｏ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ−２０１４，ｖｏｌ．７，ｐｐ．：１０６５−１０７６
【非特許文献６】Ｄｕｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｉｆｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｋｌｏｔｈｏ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈＡＰＰ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ”，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ−２０１５，ｖｏｌ．３５／６，ｐｐ．；２３５８−２３７１
【非特許文献７】Ｋｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｋｌｏｔｈｏ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｕｓｔｉｌｉｄｅ（ＬＩＧ）ｉｎ  ａｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ´ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ”，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ−２０１３，ｐｐ．１−１０
【非特許文献８】Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−ａｇｉｎｇ  Ｋｌｏｔｈｏ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２８；４１４（３）：５５７−５６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
老化又はいくつかの神経変性疾患による直面する認知障害に対するいくつかのアプローチにかかわらず、認知及び行動の維持を改善するための代替処置に対する要望が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、マウス野生型脳組織における哺乳動物クロトー蛋白質のスプライシングバリアントの（ｍＲＮＡとしてのみならず）蛋白質レベルの現実の発現の発明者らの判断に由来する。マウスｓ−ＫＬのＣ−末端の最後の２０個のアミノ酸に含まれたペプチドアミノ酸配列に対して生起した自作の抗体を用い、発明者らは、野生型マウス（Ｈａｒｉａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＢＶのＣ５７Ｂ１６）の全脳において、及び脳のいくつかの特定の部分において、クロトー蛋白質の発現されたアイソフォームが、翻訳後修飾を有するがｓ−ＫＬと同様に、７０ｋＤａ近くの分子量を有するアイソフォームであったことを検出した。加えて、発明者らは、この蛋白質の発現レベルが老化の間にＡＤの進行に伴って低下したことを見出した（データは示さず）。
【００１７】
更なるアッセイにより、脳において、このスプライシングバリアントは蛋白質レベルで決定できることが明らかにされた。更に、発明者らは、分泌されたクロトーアイソフォームが、腎臓におけるよりも脳において少なくとも１０倍豊富であることを見出し、これは、２つのアイソフォームが異なる機能を有するらしく、ｓ−ＫＬ活性は、神経系において重要な役割を持つアイソフォームであることを示唆する。
【００１８】
発明者らは、ここに、老化する脳においてｓ−ＫＬレベルを修飾することの、行動レベルにおける機能的関連性を研究した。彼らは、ＡＡＶｒｈ１０ベクターを用いて、成体及び中年の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄におけるｓ−ＫＬの発現を生じさせ、維持した。この研究は、イン・ビボにおいて最初に、ＣＮＳへのｓ−ＫＬの単回注入から６カ月後に、学習及び記憶能力の長く継続しかつ定量可能な増強が見出されることを証明している。より重要なことには、認知の改善が、中年において、一回処理された１８月齢マウスで観察可能である。これらの知見は、認知低下についての治療法としてのｓ−ＫＬの治療的潜在能力を証明する。
【００１９】
要約すると、ＡＡＶ−ｓＫＬベクターの単回投与後における脳中の局所的に分泌されたクロトーアイソフォームの局所的過剰発現が、年齢依存的記憶欠乏に対して保護することがここに証明され、これらの効果は老齢の動物において長く継続し且つ定量可能であり、従って、認知症のためのｓ−ＫＬの治療的存在能力を示唆する。ＣＮＳにおけるｓ−ＫＬの局所的発現は、老齢のマウスにおいて認知能力を改善する。ＣＮＳにおけるｓ−ＫＬ発現は、体重又は感覚運動技量に影響しない。認知改善が、中年において、一回処理された１８月齢マウスで観察される。重要なものとして、特異的ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬによる海馬での特異的ｓ−ＫＬ阻害は、認知能力を損なう。従って、発明者らは、（１）記憶力を増大させるｓＫＬ過剰発現、及び（２）記憶力を低下させるｓＫＬ阻害に基づくデュアル戦略を用いることによって、記憶形成における分泌されたクロトーの鍵となる関与を証明することができる。
【００２０】
かくして、発明者らは、初めて、選択的スプライシングによって生じたクロトー転写体が、彼らが、それが安定であることを示した７０ＫＤａの蛋白質を生じさせ、このアイソフォームは身体の他の部分におけるよりも脳においてより豊富であることを見出したと信じる。更に、分泌されたクロトーはイン・ビボで直接的に投与されたのは最初であり、トランスジェニックモデルによって発現されないと信じる。以前に言われていたように、ｓ−ＫＬの投与は認知及び行動能力の改善に導く。かくして、発明者らは、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害の新しい治療法としてのｓ−ＫＬの使用を提供する。これは、これらの疾患についてのより具体的且つＣＮＳに向けられた治療を表す。というのは、本明細書で、ｓ−ＫＬは、天然でｓ−ＫＬを発現する認知及び行動に関する脳部分における最も圧倒的なアイソフォームであることが証明されているからである。
【００２１】
先に説明したように、先行技術は、クロトーの全長コーディング領域を全身で過剰発現するトランスジェニックマウスに関する。しかしながら、全長コーディング領域は、膜貫通アイソフォームの転写のみならず、選択的にスプライシングされたアイソフォームの転写を可能とし得る。従って、報告された学習及び記憶効果の改善が、一方の又は他方のクロトーアイソフォームによるものが否かを解明することはできない。他方、発明者らは、双方のクロトーアイソフォームが記憶力に参画するように見えるが、興味深いことに、ｍ−ＫＬの過剰発現はこの時点で知られていない他の経路に非特異的に影響し得、その結果、本明細書の実施例２Ｃに記載されたもの等の関連副作用をもたらし得るが、他方、ｓ−ＫＬの特異的な過剰発現はそうしないことを観察した。加えて、先行技術のトランスジェニックマウスとは異なって、本アプローチは天然のクロトーレベルを動物の誕生から変えず、これは、老化プロセスにおける鍵となる段階に到達するまで、補償効果の出現を誘導し得る。従って、レベルは、ニューロン向性を持つＡＡＶｒｈ１０ベクターの投与を通じて脳において特異的に修飾される。
【００２２】
かくして、発明者らは、第一の態様として、哺乳動物において、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療における使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント又はそれをコードする核酸配列を提案する。
【００２３】
この態様は、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療のための薬剤の製造のための前記定義のｓ−ＫＬの使用としても処方することができる。本発明は、ヒトを含めたそれを必要とする対象において、医薬上許容される賦形剤又は担体と共に、治療上有効量の、前記定義のｓ−ＫＬ蛋白質、又はそれをコードする核酸配列を投与することを含む、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害を治療又は予防する方法にも関する。
【００２４】
クロトー蛋白質のスプライシングバリアントｓ−ＫＬは、先に明らかにしたように、Ｍａｔｓｕｍｕｒａに開示されているようである。加えて、他の文献もまたこのスプライシングバリアントに言及している。例として、文献Ｓｈｉｒａｋｉ−Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｋｌｏｔｈｏ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ−１９９８，ｖｏｌ  ４２４，ｐｐ．：６−１０は、ｍＲＮＡレベルで検出された、想定ｓ−ＫＬ１分泌蛋白質を開示している。他方、文献Ｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｋｌｏｔｈｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ａｎｄ  ＣＳＦ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｋｌｏｔｈｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ”，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ−２００１，ｖｏｌ  ５６５，ｐｐ．：１４３−１４７は、細胞外流体では検出されない推定分泌アイソフォームにも言及している。これらの文献のいずれも、クロトー蛋白質のスプライシングバリアントｓ−ＫＬのいずれの役割も指摘していない。
【００２５】
「ｓ−ＫＬ」と略される用語「哺乳動物クロトーの分泌されたスプライシングバリアント」とは、７０ｋＤａの近似分子量を持つ、ＫＬ１ドメインのみによって形成される蛋白質の切形形態（ｓ−ＫＬ）を生じる、選択的スプライシングからの転写体から得られる蛋白質をいう。この選択的ｍＲＮＡは、ｍ−ＫＬ転写体では見出されない１５個アミノ酸テイルからなる特異的分泌シグナルを誘導し、この理由で、クロトーの分泌アイソフォーム、ｓ−ＫＬ、又はクロトー蛋白質の分泌スプライシングバリアントとも呼ばれる。ｓ−ＫＬは、可溶性クロトーの他の形態、即ち、ｐ−ＫＬ、ｐ−ＫＬ１、及びｐ−ＫＬ２とは異なる。本明細書においては、ｍ−ＫＬは全長膜貫通形態を表し；ｐ−ＫＬは、ｍ−ＫＬの切断によって生じる、可溶性蛋白質分解されたクロトーを表し；並びにｐ−ＫＬ１及びｐ−ＫＬ２は、ｐ−ＫＬのＫＬ１ドメイン及びＫＬ２ドメインからなる可溶性クロトー形態を表す。ｍ−ＫＬは、ほぼ１３０ｋＤａの分子量を持つ単一パス膜貫通蛋白質（ｍ−ＫＬ）をコードする全長転写体に由来する。該蛋白質は３つのドメイン：Ｃ末端における短い膜貫通ドメイン、各々、ＫＬ１及びＫＬ２と呼ばれる約５５０個アミノ酸の２つの内部反復配列から構成される細胞外ドメイン、並びに１０個アミノ酸の非常に短い細胞内ドメインを含有する。該膜貫通形態の該細胞外ドメインは、メタロプロテイナーゼＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７によって切断され、（蛋白質分解された膜アイソフォームにつきｐ−ＫＬと略される）約１３０ｋＤａの可溶性クロトーのもう１つの形態を得ることができる。更に、該ＫＬ１及びＫＬ２ドメインの間に位置する該プロテアーゼＡＤＡＭ１０及び１７についての第二の認識部位があり、これは、２つの新しい７０ｋＤａアイソフォームを生じさせ、１つは、（該特異的アミノ酸テイル無しの選択的スプライシングから生じたもののような）ＫＬ１ドメインのみを含有し、他の１つは、ＫＬ２ドメインを含有するものであった。しかしながら、ｐ−ＫＬがｐ−ＫＬ１及びｐ−ＫＬ２に蛋白質分解されることは、イン・ビボでは証明されていない。
【００２６】
第二の態様において、本発明は、発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント（ｓ−ＫＬ）をコードする核酸配列を含む遺伝子構築体に関する。
【００２７】
本発明のもう１つの態様は、前記定義の遺伝子構築体を含む、かくして、発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント（ｓ−ＫＬ）をコードする核酸配列を含む中枢神経系向性を持つ発現ベクターである。
【００２８】
本発明のなおもう１つの態様は、１種以上の医薬上許容される賦形剤又は担体と共に、治療上有効量の、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び／若しくは前記定義の遺伝子構築体、並びに／又は前記定義のベクターを含む医薬組成物である。
【００２９】
また、患者において、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療のための組合せ療法で用いるための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシング変種バリアント又はそれをコードする核酸配列も本発明の態様であり、ここで、該蛋白質又はそれをコードする該核酸配列は、同一の適応症のためのもう１つの有効な剤と組み合わせて投与される。
【００３０】
また、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療における使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び／若しくは前記定義の核酸構築体、並びに／又は前記定義のベクターと、もう１つの活性剤との組合せも本発明の態様である。該組合せは、治療上有効な間隔内で、任意の順序で、別々になすことができる、ｓ−ＫＬと任意の他の活性な剤との投与のための、又は該活性な剤の同時投与のための、医薬組成物又は製剤に関する。
【００３１】
以下、本発明に由来する利点及び以下に提供する実験手法から得られた結果を記載する。
【００３２】
オープンフィールド試験を用いて、ｓ−ＫＬが、運動力、探求活性、情動性、新奇恐怖症、及び不安様行動に影響できるか否かを調べた。簡単に述べると、発明者らは、年齢にかかわらず、ｓ−ＫＬを過剰発現する動物は、対照動物と比較した場合に、温和な活動亢進、増大した自発運動活性を示し、従って、ＣＮＳにおけるｓ−ＫＬの投与は、１２月齢前後で観察された自発運動活性の漸次の減少を少なくとも部分的に逆行させるようであることを見出した。加えて、運動の待ち時間（新奇恐怖症又は不安の結果としての行動阻害のインジケーター）は、ｓ−ＫＬ処理動物においてより短い傾向があり、これはより高い脱抑制を示すが、この効果は中年動物（６→１２設定）においてのみ統計学的有意性に到達したが、老齢の動物（１２→１８設定）においては到達しなかった。首尾一貫して、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬによって媒介されるｓ−ＫＬ発現の抑制は、反対の効果を有した。かくして、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ群のいくらかの動物は、試験の開始時に行動抑制を呈し、これは、ｓ−ＫＬを過剰発現するマウスよりもかなり優れた、すくみ、硬直、及び中心領域を去るまでの待ち時間を示す。
【００３３】
次に、作業記憶に対するｓ−ＫＬ過剰発現の効果を評価するために、Ｔ−迷路試験を用いた。再度、結果は、ｓ−ＫＬの投与が、年齢とは無関係に、認知能力を改善することを示す。というのは、ｓ−ＫＬで処理したマウスは、対照動物と比較して、仕事の解決において誤りを犯すのがより少ないためである。これらの結果は、（１２→１８月設定）動物の前頭前皮質で見出されたｓ−ＫＬレベルの増加と一致する。マウスにおいては、作業記憶の不足は、２４月齢前後に出現すると仮定すれば、クロトーは、認知機能の増強剤として作用しているように見える。
【００３４】
最後に、モリス水迷路試験を用いて、視覚知覚学習及び記憶及び学習能力に対するｓ−ＫＬ過剰発現／抑制の効果を評価した。双方の実験からの結果は、再度、ｓ−ＫＬで処理したマウスは、仕事の解決においてより効果的であり、それらは、対照動物よりも速く学習することを示し、これは、ｓ−ＫＬがマウスにおいて有意に長期記憶を改善することを示す。対照的に、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬを注射した動物は、仕事を学習するにおいて問題を示し、より長い距離を泳いで、プラットフォームに到達した。更に、これらの反対の効果も、最終の記憶試験（最後の訓練から２４時間後）に観察された。ｓ−ＫＬを過剰発現する動物は、プラットフォームが従前に突き止められた四分円における調査を優先させ、他方、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ処理動物は訓練四分円に対して特別な優先は示さず、これは、記憶及び／又は学習の障害を示唆する。予測されるように、対照と比較した場合、処理（ｍＲＮＡ及び蛋白質の双方）から６か月後におけるｓ−ＫＬレベルの定量は、認知能力と非常に強い正の相関を示し、ＡＡＶ／ｓ−ＫＬ処理マウスにおいて統計学的により高く、ＡＡＶ／ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ処理マウスにおいてより低かった。このパターンは、動物が成体期（６→１２月設定）又は中年（１２→１８月設定）において注入されているか否かにかかわらず観察された。
【００３５】
まとめると、この研究は、低い認知能力に関連する海馬における低下したレベルを伴う、認知機能におけるｓ−ＫＬの重要な役割を示す新しい証拠を提供する。該研究は、ＣＮＳへのｓ−ＫＬの単回ｉｃｖ注射が、認知技量を刺激するための長く継続し定量可能な剤としての大きな潜在能力を有し、マウスを老齢において処理した場合に年齢−依存的認知減少を保護さえすることも証明する。発明者らの知識の限りでは、これらは、分泌されたクロトー蛋白質のみの作用が、成体期において処理した場合に、老齢動物の学習及び記憶能力を改善する、イン・ビボで得られた最初のデータである。更に、これらの実験がナイーブな年齢の動物で行われたことを考慮すると、該結果は、ｓ−ＫＬが認知症に対する治療的潜在能力を有し得ることを示唆する。これは、とりわけ、アルツハイマー病又は多発性硬化症等の神経変性障害に対する有望な新しい治療アプローチを表す。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】クロトー蛋白質の種々のバリアントを発現させるための本発明の遺伝子構築体を備えたプラスミドを運ぶベクターとしてのアデノ関連ウイルスを構築するための手法の模式図である。（Ａ）において、ｐＵＣ５７−ＫＬ合成プラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）は、クロトー蛋白質をコードするインサートを示し、及び制限部位を示すことが部分的に表されている。ＫＬ１は、ＫＬ１ドメインをコードする配列を示し、それは、クロトーｓ−ＫＬの分泌されたスプライシングバリアントにおいてのみ存在するアミノ酸テイルをコードする配列を表す隣接四角を含む。ＫＬ２は、クロトーのＫＬ２ドメインをコードする配列を表す。パネル（Ｂ）において、合成ｐＵＣ５７−ｐＫＬから、クロトー蛋白質をコードする配列を運ぶｐＧＧ２−ｓＫＬプラスミドを得るための戦略が模式的に図示される。次いで、このプラスミドは２９３−ＡＡＶ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入される。ＡＡＶ−ｓ−ＫＬ（又はＡＡＶｒｈ１０−ｓ−ＫＬ）は、ｓ−ＫＬをコードする遺伝子構築体を備えたプラスミドを運ぶアデノ−関連ウイルスを示す。この図面は実施例１に関係している。
【図２】各々、Ｎｕｌｌ、ｍ−ＫＬ、又はｓ−ＫＬの１８月齢マウスによってなされたオープンフィールド試験における合計距離（ｃｍ）（パネルＡ）；マウスの各タイプについて１分当たりになされた合計距離（ｃｍ）（パネルＢ）を示し、これは、１分間の間に記録されたものである（Ｘ軸、ＭＩＮはアッセイの１から５分であり、丸はＮｕｌｌであり、四角はｍ−ＫＬであり、三角はｓ−ＫＬである）。この図面は実施例２Ｃに関連している。
【図３】対照マウス（四角）及びｓ−ＫＬマウス（丸）において行ったＴ−迷路試験の結果を示す。自由選択試験における成功のパーセンテージは、アッセイの異なる日に沿って分布していた（１日から３日）。この図面は実施例２Ｄに関連している。
【図４】ｓ−ＫＬマウス（丸）及びＮｕｌｌマウス（四角）で行ったモリス水迷路試験の結果を描く。図４（Ａ）は、行った各場所仕事（ＰＴ）試験１から４当たりの、プラットフォームに到達するための（ｃｍ／秒で表した）平均速度を描く。図４（Ｂ）は、プラットフォームに到達するための（ｃｍで表した）平均距離を示す。該試験は１８月齢マウスで行った。この図は実施例２Ｄに関連する。
【図５】モリス水迷路試験の手掛り試験部分から２４時間後に行われた長期記憶試験の結果を示すグラフである。該試験は、１８月齢マウスで行った。Ｙ軸において、水泳プールのいくつかの四角で行われた合計に対する距離のパーセンテージ（％）が記録される。各群（Ｎｕｌｌ、又はｓ−ＫＬ）における左側棒線は、従前に、プラットフォームが配された四角（ＰＴｆ四角）における距離のパーセンテージであり；各群における第二の棒線は反対の四角（ＯｐｏｓＰＴｆ）における距離のパーセンテージを示し、第三の棒線は、プラットフォームに対して直角の四角（Ｒ  ＰＴｆ）でなされた距離のパーセンテージであり、各群における右側の棒線は、プラットフォームの左側の四角（Ｌ  ＰＴｆ）でなされた距離のパーセンテージである。この図面は実施例２Ｄに関連する。
【図６】図６は、ＡＡＶ処理動物のいくつかの脳部分又は切片（前脳前皮質、ＰＦＣ；皮質、Ｃ；海馬、Ｈ；及び小脳、ＣＢ）におけるｓ−ＫＬの対照に対する相対的発現を示す。この図面は実施例２Ｅに関連する。
【図７】各々、ｓ−ＫＬ、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ、及び対照、１２月齢マウスによってなされたオープンフィールド試験における合計距離（ｃｍ）（パネルＡ）；１分の間に記録された、マウスの各タイプについての１分当たりになされた合計距離（ｃｍ）（パネルＢ）、（Ｘ軸において、ＭＩＮはアッセイの１から５分であり、四角はＮｕｌｌについてであり、三角はｓｈＲＮＡ−ｓＫＬについてであり、及び丸はｓ−ＫＬについてである）；並びにオープンフィールド試験において探求活性を評価するための異なるパラメータ（パネルＣ）を示す。この図面は実施例３Ｂに関連する。
【図８】１２月齢マウス、ｓ−ＫＬマウス（丸）、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬマウス（三角）、及びＮｕｌｌマウス（四角）においてなされたモリス水迷路試験の結果を描く。図８（Ａ）は、行われた各場所仕事（ＰＴ）試験１から４当たりの、プラットフォームを獲得するための（秒数、秒で表した）平均待ち時間を描く。図８（Ｂ）は、プラットフォームを獲得するための（ｃｍで表した）平均距離を示す。試験は、１８月齢マウスで行った。図８（Ｃ）は、１２月齢マウスで行った、及び試験の手掛り試験部分から２４時間後に行った、モリス水迷路記憶試験の結果を示す。Ｙ軸において、水泳プールのいくつかの四角でなされた合計距離に対する距離のパーセンテージ（％）が記録される。各群（ｓ−ＫＬ、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ及び対照）における左側棒線は、先にプラットフォームが配された四角（ＰＴｆ四角）における距離のパーセンテージであり；各群における第二の棒線は、反対側四角（Ｏｐｏｓ  ＰＴｆ）における距離のパーセンテージを示し、第三の棒線は、プラットフォームの右の四角（Ｒ  ＰＴｆ）でなされた距離のパーセンテージであり、各群における右側棒線は、プラットフォームの左の四角（Ｌ  ＰＴｆ）でなされた距離のパーセンテージである。この図面は実施例３Ｃに関連する。
【図９】市販の抗体（Ｃｏｓｍｏｂｉｏ  ＪａｐａｎのＫＭ２０７６）を備えた野生型マウス（Ｃ５７ＢＩ６）組織におけるクロトー蛋白質を検出するために行われたアッセイのウエスタンブロット像である；腎臓、全脳、及び特定の脳切片前脳前皮質（ＣＰｆ）、皮質（Ｃｘ）、小脳（ＣＢ）、及び海馬（ＨＣ）。脳中のクロトー蛋白質は７０及び１００ＫＤａの間の分子量を有し、他方、腎臓においては、該蛋白質は１３０ＫＤａ近くの分子量を有する。この図面は実施例４に関連する。
【図１０】ｓ−ＫＬに対して特異的に生起された、（自己作成され、Ａｂ  Ｋ１１３と命名される）ウサギ抗−マウス抗体を用いるウエスタンブロットによるｓ−ＫＬ蛋白質の分析を示す。６及び１８月齢のＣ５７ＢＩ／６マウス（若い６Ｍ、老齢８Ｍ）の前頭前皮質（ＰｆＣｘ、パネル（Ａ））、皮質（ＣＸ、パネル（Ｂ））、海馬（ＨＣ、パネル（Ｃ））、及び小脳（ＣＢ、パネル（Ｄ））。アクチン（４２ｋＤａ）を用いて、分析した蛋白質の量を正規化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア、パブリックドメイン、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈで開発されたＪａｖａ（登録商標）−ベースの画像処理プログラムを用いるデンシトメトリーによって、試料を定量した。分析した各脳領域については、６月齢マウスから得られたものに対する１８月齢マウスからの倍数変化を棒図表で描く。
【図１１】ＡＡＶ処理マウスにおけるｓ−ＫＬ及びｍ−ＫＬ発現レベルを示す。ｓ−ＫＬレベルは、海馬投与から６か月後に、ｓ−ＫＬ、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ、及びｎｕｌｌ処理動物の海馬において定量した。ｓ−ＫＬ及びｍ−ＫＬ転写体のｍＲＮＡレベルを、対照動物で得られた値に対して正規化した。この図面は実施例５に関連する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書中で用いる全ての用語は、そうでないことが述べられているのでなければ、当該分野で知られたそれらの通常の意味で理解されるべきである。本出願で用いるある種の用語についての他のより具体的な定義を以下に記載し、そうでない明示的に記載された定義がより広い定義を提供しているのでなければ、明細書及び特許請求の範囲を通じて一様に適用されることを意図する。
【００３８】
本発明による「遺伝子構築体」は、「発現カセット」と命名することもできる。それは、発現プロモータに操作可能に連結された、注目する蛋白質をコードする配列を含めたポリヌクレオチド配列をいい、該プロモータは、該蛋白質をコードする配列の発現を制御する。「操作可能に連結された」は、該蛋白質をコードする配列が（５’−３’方向で）プロモータの配列の後に、又は制限部位が含まれるか、あるいは遺伝子構築の他の安定化エレメントが存在する場合は該プロモータの近くに配置されると理解されるべきである。遺伝子構築体（発現カセット）は、それをより複雑な発現系（ベクター、プラスミド）に適合させるための有用な配列を持つ小さな断片、又は注目する蛋白質をコードする配列の後に配置されたポリアデニル化テイルも含んでよい。発現カセットそれ自体は、遺伝子構築体を保護し、又はウイルスベクターの場合には細胞への進入を促進するのに更に用いるベクター又はプラスミドである発現系でもある。「プロモータ」は、特別な遺伝子の転写を開始するＤＮＡ領域のものである。プロモータは、同一ストランド上で、且つ（センスストランドの５’領域に向けて）ＤＮＡの上流の、遺伝子の転写開始部位近くに位置する。プロモータは約１００から１０００塩基対の長さとすることができる。「構成的プロモータ」は、「誘導性プロモータ」等の、調節され、特異的な刺激に応答してのみ細胞において活性となる他のものとは反対に、細胞中で全ての状況において活性なプロモータである。他のプロモータは、「ニューロン特異的プロモータ」等、組織又は細胞特異的である。「ポリヌクレオチド配列」については、それは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と理解されるべきである。核酸は一本鎖又は二本鎖とすることができ、それは限定されるものではないが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
用語「アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）」は、本明細書中で用いる場合、分裂中の及び静止霊長類（及びヒト）細胞の双方に感染するウイルスベクターをいう。それらはいずれの病源効果も欠如しているように見え、且つ通常、ゲノムと同一の場所（染色体１９においては、ＡＡＶＳ１部位）に一体化されているので、このウイルスベクターは、遺伝子治療適用において、外来性ＤＮＡをヒト細胞に導入するのに安全に用いることができる。そうでなければ、「発現構築体」として知られた「発現ベクター」は、通常、細胞における蛋白質発現のために設計されたプラスミド又はウイルスである。該ベクターは、特異的な遺伝子を標的細胞に導入するのに用いられ、細胞のメカニズムに、蛋白質合成について、当該遺伝子によってコードされた蛋白質を生産するように挑発することができる。発現ベクターは、蛋白質の生産のためのバイオテクノロジーにおける基本的なツールである。発現ベクターは、複製起点、選択マーカー、及び多重クローニング部位等の遺伝子の挿入のための適切な部位などの、いずれのベクターも有し得る特徴を有する。
【００４０】
２つのアミノ酸配列の間の「相同性のパーセンテージ」は、当該分野における専門家によって知られた広く受け入れられている分類に従って、同一であるか、あるいは同様な特徴の側鎖を備えた他のアミノ酸（即ち、極性、非極性、アミノ基を持つ、−ＳＨ基を持つ、即ち、アミノ酸の同一クラス）で置き換えられた配列位置のパーセンテージと理解されるべきである。２つのアミノ酸配列の間の「同一性のパーセンテージ」は、同一のアミノ酸を備えた配列位置のパーセンテージと理解されるべきである。配列の間の相同性の、及び同一性のパーセンテージは、「配列整列」によって計算され得る。配列整列は局所的又は全体的であってよい。本発明の意味では、相同性及び同一性のパーセンテージは、好ましくは、全配列又は配列の全活性断片の間の、全体的整列にわたって計算される。全体的整列は、配列が同様であって、ほぼ同一のサイズ（長さ）を有する場合により有用である。これらの全体的整列を行うための技術水準で入手できるいくつかのアルゴリズムがある。また、配列の間の同一性及び相同性のパーセンテージを得るためのそのようなアルゴリズムを用いるバイオインフォーマティックスツールもある。例として、配列の間の全体的整列は、よく知られたＧＧＳＥＡＲＣＨ又はＧＬＳＥＡＲＣＨソフトウェアによって行ってよい。２つのアミノ酸配列の間の同一性は、好ましくは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ−１９９７，Ｖｏｌ．Ｎｏ．２５，ｐｐ．：３３８９−３４０２、及びＮＣＢＩ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴに開示されたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いることによって決定される。
【００４１】
以下の実施例で示されるように、発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント（ｓ−ＫＬ）をコードする核酸配列を備えた遺伝子構築体を含む発現ベクターのマウスへの脳注入は、これらのマウスをいくつかの試験に付した場合に、認知及び行動機能の改善に導く。これらのデータは、ｓ−ＫＬを、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、認知及び／又は行動障害の治療及び／又は予防で用いることができることを証明する。
【００４２】
本発明は、蛋白質としての、あるいはそれをコードする核酸配列としての、双方のｓ−ＫＬの投与を含み、これは、遺伝子構築体及び／又は発現ベクターの形態等の、投与されるべき適切な形態で存続する。かくして、「ｓ−ＫＬ」は、本明細書中においては、ｓ−ＫＬの双方の形態を意味する。
【００４３】
特別な実施態様において、認知及び／又は行動障害は老化に関連する。用語「に関連する」は、老人性認知症におけるなどの、認知及び／又は行動障害が、哺乳動物、特に、ヒトが老齢となる（老化）場合に起こり、いくつかの神経変性及び／又は神経病理学的疾患においても起こり得るが、これは、該疾患においてやはり影響された生理学的パラメータの原因又は結果であることを意味する。老人性認知症は、天然の非病理学的老化のため出現する状態であり、それは、バランスの問題、震え、記憶のゆがみ、不安、鬱病、無感動、動揺、及び刺激等の多くの認知及び／又は行動障害を示唆する。老人性認知症は、アルツハイマー病としての神経変性疾患とも関連し得る。
【００４４】
特別な実施態様において、老化に関連する認知及び／又は行動障害は、老人性認知症で発現されるものである。
【００４５】
かくして、本発明の第一の態様の特別な実施態様において、ｓ−ＫＬは、学習及び記憶の障害からなる群から選択される認知障害の予防及び／又は治療で用いられるものである。更に詳しくは、学習障害、特に学習手法障害、及び記憶の障害、特に記憶の喪失、作業記憶の障害、及び長期記憶の障害で用いられるものであり、後者は空間的及び発症記憶障害を含む。
【００４６】
もう１つの特別な実施態様において、所望により、前記又は後記のいずれかの実施態様と組み合わせて、ｓ−ＫＬは、不安及び広場恐怖症から選択される行動障害の予防及び／又は治療で用いられるものである。
【００４７】
また、もう１つの特別な実施態様において、所望により、前記又は後記のいずれかの実施態様と組み合わせて、ｓ−ＫＬは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及び筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、発作後認知症、外傷後認知症、老人性認知症、並びに頭蓋脳外傷からなる群から選択される神経変性及び／又は神経病理学的疾患に関連する認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療で用いられるものである。
【００４８】
より特別な実施態様において、ｓ−ＫＬは、アルツハイマー病に関連する認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療で用いられる。特に、それは、アルツハイマー病における不安障害の予防及び／又は治療で用いられる。
【００４９】
かくして、本発明による使用のためのｓ−ＫＬは、特別な実施態様においては、哺乳動物、特にヒトにおける認知及び／又は行動障害の予防及び／及び治療のためである。クロトー蛋白質は、以下の表（ＢＬＡＳＴによる分析、ＮＣＢＩからのアミノ酸配列）に示されているように、哺乳動物の間で、相同性の高いパーセンテージを有する。
【００５０】
【数１】
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【００５１】
特別な実施態様において、前記で明らかにした使用のためのｓ−ＫＬは、配列番号１、配列番号２、及び配列番号１又は配列番号２のいずれかに対して少なくとも８８％の同一性のパーセンテージを持つポリペプチドから選択されるポリペプチドである。同一性のパーセンテージは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いることによって決定される。
【００５２】
なおより特別な実施態様において、それは、アミノ酸配列、配列番号１及び配列番号２から選択されるポリペプチドである。他の特別な実施態様において、先に明らかとした使用のためのｓ−ＫＬは、８８％から１００％までの配列番号１又は配列番号２いずれかとの同一性のあるパーセンテージを持つポリペプチドである。同一性パーセンテージの範囲は、８８％、８８．５％、８９％、８９．５％、９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、及び１００％を含む。もう１つのより特別な実施態様において、ポリペプチドの同一性のパーセンテージは８８％から９０％であり；なおより特別には８８％から８８．５％である。
【００５３】
配列番号１は、７０ｋＤａの近似的分子量を持つが、ｍ−ＫＬ転写体で見出されない１５個アミノ酸テイルからなる特異的分泌シグナルを持たない、ＫＬ１ドメイン配列を含む、α−クロトーヒト遺伝子の選択的スプライシングからの転写体のアミノ酸配列である。α−クロトーヒト遺伝子は、ゲノムリファレンスコンソーシアム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）によって維持されたヒトゲノムについてのアセンブリＧＲＣｈ３８（２４．１２．２０１３）の染色体１３ＮＣ＿００００１３．１１（３３０１６０６３．．３３０６６１４５）に位置するものである。配列番号１は、５０１２塩基対のＧｅｎＢａｎｋデータベースアクセション番号ＮＭ＿００４７９５、０３．Ｍａｙ．２０１４のバージョン３を持つｍＲＮＡの選択的スプライシング転写体に由来する、配列番号５の対応するｃＤＮＡに由来する。
【００５４】
配列番号２は、７０ｋＤａの近似的分子量を持つが、ｍ−ＫＬ転写体に見出されない１５個アミノ酸テイルからなる特異的分泌シグナルを有する、ＫＬ１ドメイン配列を含む、α−クロトーマウス遺伝子の選択的スプライシングからの転写体のアミノ酸配列である。α−クロトーマウス遺伝子は、マウスゲノムについてのマウス２００７年７月（ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９）アセンブリに関するＵＣＳＣゲノムブラウザの染色体５に位置するものである（１５０，９５２，６０７−１５０，９９３，８０９）。配列番号２は、５１２４塩基対のＧｅｎＢａｎｋデータベースアクセション番号ＮＭ＿０１３８２３、１５．Ｆｅｂｒｕａｒｙ．２０１５のバージョン２を持つｍＲＮＡ配列の選択的スプライシング転写体から由来する、配列番号６の対応するｃＤＮＡに由来する。
【００５５】
配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも８８％の同一性のパーセンテージを持つポリペプチドは、配列番号１又は２における単一又は２又は３個のアミノ酸置換、１又は２個のアミノ酸の欠失、配列のいずれかの位置における１又は２個のアミノ酸の挿入、配列番号１又は２に関する全てのこれらのアミノ酸変異を含めた、配列のアミノ酸変異に由来する哺乳動物蛋白質を含み、但し、得られた蛋白質は、それが由来するｓ−ＫＬと同一の機能を有するものとする。配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも８８％の同一性のパーセンテージを持つポリペプチドは、マウス及びヒト以外の哺乳動物のｓ−ＫＬも含む。先に示したように、同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって行った配列の間の全体的整列によって決定される。
【００５６】
本発明の第一の態様のもう１つの特別な実施態様において、先に明らかにした使用のためのｓ−ＫＬは、配列番号１又は配列番号２からなるポリペプチドである。
【００５７】
ｓ−ＫＬは、便宜には、脳又は中枢神経（ＣＮＳ）に向けられた、あるいは最後にそれに到達する、蛋白質の形態で直接的に用いてよい。この蛋白質は、例えば、当該蛋白質を安定化するための許容される賦形剤と共に、脳への注入で有用な、あるいは（主として）静脈内注射で有用な、担体（溶媒）に懸濁させた又は溶解させた治療量の蛋白質を含む医薬組成物の形態で投与することができる。
【００５８】
他方、ｓ−ＫＬは、遺伝子治療によって、ＣＮＳの標的細胞内部で発現させることができる。この目的で、本発明は、発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント（ｓ−ＫＬ）をコードする核酸配列を含む新しい遺伝子構築体も提供する。本発明において、該「哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント（ｓ−ＫＬ）をコードする核酸配列」は、特に、哺乳動物において該ｓ−ＫＬについてｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）から得られるｃＤＮＡ配列と理解されるべきである。特別な実施態様において、操作可能に連結された発現プロモータは、構成的発現プロモータ、誘導性プロモータ、及びニューロン−特異的発現プロモータから選択される。特別な実施態様において、本発明による遺伝子構築体は核酸配列、配列番号３を含む。配列番号３は、サイトメガロウイルス即時型初期（ＣＭＶ  ＩＥ）プロモータ、ｓ−ＫＬをコードする配列（マウスｓ−ＫＬのｃＤＮＡ）、及びポリアデニル化鎖（ポリＡ）を含む。もう１つの特別な実施態様において、本発明による遺伝子構築体は、ヒトｓ−ＫＬ蛋白質をコードする配列（ヒトｓ−ＫＬのｃＤＮＡ）を含む以外は、配列番号３と同等である核酸配列、配列番号４を含む。
【００５９】
もう１つの特別な実施態様において、遺伝子構築体は、配列番号３又は配列番号４からなる。
【００６０】
全てのこれらの遺伝子構築体は、一旦細胞に入ると、特にＣＮＳ細胞に入ると、注目する蛋白質を発現させることができる。
【００６１】
構築体の投与を容易とするために、本発明は、前記定義の遺伝子構築体を含む、かくして、発現プロモータに、特に、構成的発現プロモータに操作可能に連結された哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント（ｓ−ＫＬ）をコードする核酸配列を含む中枢神経系向性を持つ新しい発現ベクターも提案する。
【００６２】
本発明の目的で適切な発現ベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）向性を持つ、又はＣＮＳ細胞に効果的に形質導入するベクターである。遺伝子治療のための発現ベクターは通常はウイルスであり、特別には、レトロウイルス、アデノウイルス、ウイルスベクターのエンベロープ蛋白質シュードタイピング、複製能力があるベクター、シス及びトランス−作用性エレメント、単純疱疹ウイルスである。
【００６３】
これらの発現ベクターの特別な実施態様において、それらはウイルスベクターである。更に詳しくは、発現ベクターはアデノ関連ウイルス、より特別には、血清型１から１０とすることができる、ＣＮＳ向性を持つアデノ関連ウイルスである。特に、アデノ関連ウイルスは、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）のものである。
【００６４】
ｓ−ＫＬコーディング配列を含む遺伝子構築体の送達のための他の可能なベクターは、リポソーム、遺伝子構築体の損傷を回避し、更に、ＣＮＳ細胞内への構築体の進入を有効且つ特異的に容易とするミクロ−及びナノ粒子を含む。プラスミド又は裸のＤＮＡの形態であるｓ−ＫＬは、裸のＤＮＡの注射、送達を増強するための物理的方法、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、又は水力学送達等の非ウイルス方法によって遺伝子治療のために投与することもできる。送達を増強するための他の化学的方法は、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、又は無機ナノ粒子の使用である。
【００６５】
本発明のもう１つの態様は、先に明らかにしたように、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、老化に関連する認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療における使用のための、哺乳動物クロトー蛋白質の分泌されたスプライシングバリアント及び／若しくは前記定義の核酸構築体、並びに／又は前記定義のベクターと、もう１つの活性剤との組合せである。
【００６６】
特別な実施態様において、該組合せは、アルツハイマー病（ＡＤ）と関連する認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療のためである。該組合せは、治療上有効な間隔内で、任意の順序で、別々になすことができる、あるいは活性な剤の同時投与のための、ドネペジル塩酸塩（Ａｒｉｃｅｐｔ、Ｐｆｉｚｅｒ）、メマンチン、リバスチグミン、及びリグスチリド等の任意の他の活性な剤と共に、ｓ−ＫＬを投与するための医薬組成物又は製剤に関する。なおより特別な実施態様において、該組合せは、ＡＤの患者において、不安の予防及び／又は治療で用いられる。
【００６７】
ｓ−ＫＬは、粘膜を介して（例えば、鼻、舌下、膣、頬、又は直腸）、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、若しくは動脈内注射、ボーラス又は点滴のいずれか）、経口、経皮、あるいは、例えば、エアロゾルによる吸入を介して患者に投与することができる。例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路による等の、非経口投与に適した剤型は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、及び当該剤型を意図した受容者の血液と等張とする溶質を含有することができる、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、及び懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、並びに保存剤を含むことができる、水性及び非水性滅菌懸濁剤を含む。注射溶液及び懸濁剤は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することもできる。いくつかの実施態様において、該組成物は、例えば、貯蔵器又は浸透圧ミニポンプ又は筋注器を用い、注射によって、例えば、皮下投与、腹腔内投与、膀胱内投与、静脈内投与、点滴によって投与される。該剤型は、アンプル及びバイアルなどの、単位用量及び多回用量のシールされた容器中にて供することができる。
【００６８】
特別な実施態様において、ｓ−ＫＬは患者に非経口、より特別には静脈内投与される。
【００６９】
他の特別な実施態様において、ｓ−ＫＬは、直接送達にて中枢神経系に投与され、より特別には、くも膜下腔内又は槽内マグナ（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａ  ｍａｇｎａ）（ＩＣＭ）、特に、パッチ、マイクロポンプ、又はマイクロカプセル送達系によって注射される。
【００７０】
明細書及び特許請求の範囲を通じて、用語「含む」及び該用語の変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は工程を排除することを意図しない。更に、用語「含む」は、「からなる」の場合を含む。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、明細書を精査すると、当業者に明らかになり、又は本発明の実施によって学習できる。以下の実施例は例示によって提供され、それらは、本発明を限定する意図ではない。更に、本発明は、本明細書中に記載された特別な及び好ましい実施態様の全ての可能な組合せをカバーする。
【実施例】
【００７１】
実施例１；分泌されたクロトー蛋白質をコードするプラスミドベクターの生成。導入のためのＡＡＶウイルスベクターの生産
【００７２】
遺伝子治療のためのウイルスベクターの生成は、合成構築体から行った。遺伝子構築体（プラスミド）ｐＣＲ−ＫＬ−ＴＯＰＯ−ＫＬ（ＩｍａＧｅｎｅｓ（商標）、ドイツ国）は、クロトーの膜貫通蛋白質アイソフォーム（ｍ−ＫＬ）の全長ｃＤＮＡをコードした。次いで、クロトー配列を、制限酵素での連結によって（配列番号１２の、及びＧｅｎｔｈｏｎの好意による）ｐＧＧ２プラスミドにクローン化し、該ｐＧＧｓプラスミドは、アデノ−関連ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、及び注目する遺伝子が、サイトメガロウイルス即時型プロモータ（ＣＭＶ  ＩＥ）の制御下でクローン化される場所である多重クローニング部位（ＭＣＳ）を運ぶ。これを行うために、同酵素を用い、ｍ−ＫＬのｃＤＮＡを、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素でｐＣＲ−ＫＬ−ＴＯＰＯ−ＫＬから抽出し、ＣＭＶ  ＩＥプロモータ（ＭｏＢｉＴｅｃ、Ａｌｅｍａｎｉａ）の配列、ＥＭＢＬ−ＥＢＩアクセション番号Ｚ４６７３３、２９．Ａｕｇ２０１４のリリース１２１を含むベクターｐ１２３Ｔに該断片をクローン化した。ＣＭＶ  ＩＥプロモータの配列及び（ここではＣＭＶ  ＩＥ−ｍＫＬという）ｍ−ＫＬをコードする配列を含む断片を、ＣＭＶ  ＩＥプロモータの配列を含むｐＧＧ２プラスミドにクローン化して、逆位末端反復（ＩＴＲ）で隣接して挟まれた発現カセットを得た。このプラスミドを（配列番号１３の）ｐＧＧ２−ｍ−ＫＬと命名した。
【００７３】
ｓ−ＫＬをコードするｃＤＮＡを含む遺伝子構築体は、配列番号１４の合成ｐＵＣ５７−ＫＬ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）から生じさせた。このプラスミドは、ｓ−ＫＬをコードする適切な制限部位を含有した。図１（Ａ）においては、プラスミドマップが模式的に描かれている。図１（Ｂ）は、合成ｐＵＣ５７−ＫＬから由来することができたｓ−ＫＬアイソフォームをクローン化する戦略を示す。
【００７４】
ｓ−ＫＬコーディング配列を含むプラスミド（ｐＧＧ２−ｓ−ＫＬ、配列番号１５）は、ｐＧＧ２ベクターを開くためのＮｏｔＩ／ＸｂａＩに適合するＸｂａＩ／Ｂｓｐ１２０Ｉ標的にて生成させた。
【００７５】
ｐＧＧ２−ｓ−ＫＬ及びｐＧＧ２−ｍ−ＫＬは、この特別な実施例において、ｐＧＧ２プラスミドで得た。それにもかかわらず、他のプラスミドは、ｓ−ＫＬをコードする配列に操作可能に連結されたＣＭＶ  ＩＥプロモータ及びポリアデニル化鎖（ネズミｓ−ＫＬについては配列番号３、及びヒトｓ−ＫＬについては配列番号４）を含む遺伝子構築体の；並びにｍ−ＫＬ／ヒト又はネズミ）についての同構築体のウイルスキャプシドにパッケージングすることを可能としつつ、有用である。これらの配列のパッケージングは、以下に例示されるＡＡＶの生成で用いたプラスミドとは独立して、同ウイルスゲノム及びウイルスキャプシド蛋白質に導く。
【００７６】
プラスミドｐＧＧ２−ｍＫＬ又はｐＧＧ２−ｓＫＬいずれかを含む更なるＡＡＶベクターは、ｐＧＧ２プラスミド、ＡＡＶ増幅用のＡＡＶ遺伝子を運ぶｐＸＸ６プラスミド（配列番号１６、Ｇｅｎｅｔｈｏｎの好意）、及びプラスミドｐＲＥｐ２Ｃａｐ１０（配列番号１７）（ＭＴＡ  Ｇ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｌ博士、ペンシルベニア大学）での、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの２９３−ＡＡＶ細胞（７０％密集）の三重トランスフェクションによって生成させ、この後者はＡＡＶｒｈ１０の配列Ｃａｐ及びＲｅｐを運ぶ。次いで、イオジキサノールグラジエントでの超遠心を用いてウイルスを精製し、ピコグリーン方法（Ｐｉｅｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒａｐｉｄ，ｒｏｂｕｓｔ，ａｎｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｔｉｔｅｒ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ−２０１５，ｖｏｌ  ２６（１），ｐｐ：３５−４２；ｏｒ  ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１４．１２０  ＰＭＩＤ：２５６４００２１）によってカウントし、使用の瞬間まで−８０℃で貯蔵した。この発現ベクターをＡＡＶｒｈ１０＿ｐＧＧ２−ｓＫＬ及びＡＡＶｒｈ１０＿ｐＧＧ２＿ｍＫＬと命名した。ＡＡＶｒｈ１０＿ｐＧＧ２＿ｍＫＬの定量のためのプライマーは、ｍ−ＫＬ−順方向５’−ＴＴＣＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号７）、及びｍ−ＫＬ−逆方向５’−ＣＣＡＧＧＣＡＧＡＣＧＴＴＣＡＣＡＴＴＡ−３’（配列番号８）である。
【００７７】
手法は以下の通りであった：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの２９３−ＡＡＶ細胞（７０％密集）を含む１５ｃｍの直径の２０枚のプレートを、５００μｇのｐＸＸ６、２５０μｇのｐＲｅｐ２Ｃａｐ１０及び２５０μｇのｐＧＧ２プラスミドを含むポリエチレンイミンＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）でトランスフェクトした。該３つのプラスミドを培地ＤＭＥＭ中で混合し、該プレートに、１４ｍｌ／プレートの最終容量まで加えた。６時間後に、該培地を交換した。４８時間のポスト−トランスフェクション細胞を掻き取り、遠心した。それらを溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｐａｎｒｅａｃ）、及び２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｐａｎｒｅａｃ））中に再懸濁した。ＡＡＶ精製のため、フロスト及びデフロストの３サイクル後に、遠心によって細胞残渣が得られ、上清を貯蔵した。ベンゾナーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）を上清に加えて、細胞ＤＮＡを分解した。ウイルス粒子をポリエチレングリコール（１ｍｌ／４ｍｌの細胞溶解物におけるＰＥＧ）で更に沈殿させた。１５分間の８０００ｇでの遠心により、ウイルス粒子を含むペレットを得た。１５ｍｌの溶解緩衝液をイオジキサノールグラジエント管に加え、１時間の６９００００ｇにおける遠心後にウイルス粒子を除去した。
【００７８】
実施例２  老齢マウスにおけるＡＡＶ  ｓ−ＫＬベクターのイン・ビボ投与
【００７９】
実施例２Ａ：ＡＡＶベクターの投与
【００８０】
老化しているＣＮＳにおけるクロトー過剰発現の長期効果を、１２月齢（中年、Ｎ＝１０）において注射したＣ５７ＢＬ／６マウスで評価し、それらが老齢（１８月）に達すると、行動評価及び機能分析のための一連の試験を通じて６月後に試験した（図２及び図３）。対照群に、無関係なＤＮＡ配列をコードするＡＡＶｒｈ１０ベクターを注射し、処理群に、分泌された（ｓ−ＫＬ）クロトーアイソフォームをコードするＡＡＶｒｈ１０ベクターを注射した。ＡＡＶベクターを脳心室（ｉｃｖ）注射して、ＣＮＳで生じたクロトーをＣＳＦに放出させ、脳全体に分布させる内因性生産システムを模倣した。
【００８１】
イン・ビボアッセイでは、Ｈａｒｌａｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＢＶのＣ５７Ｂ１６マウス（野生型雄）を用いた。動物での全ての実験及び剖検は、スペイン国で適用される法律に従って、バルセロナの自治大学（スペイン国）で行った。プロトコルは、倫理委員会によって承認された。動物には、８：００時間で開始し、２２℃及び１２時間の暗及び明サイクルにてＭａｃｒｏｌｏｎケージ中で自由に食料を与えた。
【００８２】
ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ体重；Ｉｍａｌｇｅｎｅ５００；Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉｅｕｘ）及びキシラジン（１ｍｇ／ｋｇ体重；Ｒｏｍｐｕｎ；Ｂａｙｅｒ）の腹腔内注射によってマウスを麻酔し、定位フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）に設置した。野生型マウス（１２月齢）の脳に注射して、実施例１の発現ベクターを含む脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達させた。従って、（ＡＡＶｒｈ１０−ｓ−ＫＬとも略されるＡＡＶｒｈ１０＿ｐＧＧ２−ｓＫＬを注射した）ｓ−ＫＬマウスを生じた。対照（Ｎｕｌｌマウス）として、無関係な遺伝子をコードするベクターを用いた。実験群は、群当たり１０匹の動物からなるものであった（ｎ＝１０）。脳室内注射を、定位固定デバイスの助けを借りて第三側脳室で行った。発現ＡＡＶベクターの投与された用量は、３μＬの単一用量中、マウス当たり１．１０１０ベクターゲノムであった。
【００８３】
実施例２Ｂ；ＣＮＳ中のｓ−ＫＬの過剰発現は、老齢マウスにおいて体重又は感覚運動に影響しない。
【００８４】
行動及び認知試験を、マウスが１８月齢になると行った。最初に、感覚運動試験を行い（１日）、続いて、コーナー試験及びオープンフィールド試験を行った（２日）。次に、Ｔ−迷路試験を行った（３から５日）。モリス水迷路（ＭＷＭ）試験は最後に行った（６から１２日）。
【００８５】
動物の体重は、１２から１９月齢に、月当たり１回モニターした。反射（視覚性反射及び後脚伸展反射試験）は、動物を自己の尾によって保持し、それをゆっくりと黒い表面まで降下させることによって３回測定した。運動協調性及び平衡は、各々、カバーされた距離、及び２回の連続２０秒のトライアルにて水平木製ロッド（１．３ｃｍ幅）から落ちるまでの待ち時間によって評価した。仕事の困難性を増加させるために、試験は、金属ワイヤロッド（１ｃｍ直径）上で反復した。把握性及び運動協調性は、ワイヤ吊り下げ試験でカバーされた距離として測定し、これは、５秒の２回のトライアル及び第三の６０秒のトライアルにつき、動物にその前足で水平ワイヤ（直径：２ｍｍ、長さ：４０ｃｍ、８つの５ｃｍセグメントに分割）の中央からしがみつかせることよりなるものであった。筋肉の強さは、６０秒のトライアルにおいてワイヤから落ちるまでの時間として測定した。全ての装置を、詰め物をしたテーブル上方４０ｃｍに吊り下げた。
【００８６】
処理された動物の行動評価は、身体の状態、即ち、体重及び反射並びにバランス、協調性、把握性、強さ及び抵抗性等の基本的な感覚運動機能における、ｓ−ＫＬの推定効果の評価で開始した。これらの測定は、運動力に依存して引き続いて結果に影響し得る群の間の可能な差を検出することを可能とする。注目すべきは、動物の双方の群の間で平均体重の有意な差はなかった（ｐ＝０．４８）。しかしながら、ｓ−ＫＬ処理マウスは、６か月の後注射を通じて比較的安定した体重を有し、他方、ｎｕｌｌ処理群の体重は中年の間に徐々に増加し、老齢では減少した。表１に示す結果は、視覚性置き直し及び後肢反射試験、木製及び金属ロッド試験；並びに吊り下げ試験によって測定した、ｓ−ＫＬ処理及び対照群において同様な感覚運動機能も示す。従って、全ての動物は、引き続いての行動試験で分析した場合、同様な身体の条件であったと推定される。
【００８７】
【表１】
2019501643.tif 000003
【００８８】
実施例２Ｃ：ＣＮＳでのｓ−ＫＬ過剰発現は、老齢マウスにおける不安様行動に影響することなく、年齢関連運動低下を改善する。
【００８９】
ヒトの老化、正常及び年齢関連病の双方は、認知及び動機付けの変化に平行する運動行為のかなり相関する変化に関連する。従って、運動力及び探求行動は年齢と共に減少するので、我々は、まず、オープンフィールド試験を用い、ＣＮＳにおける分泌されたクロトーアイソフォームの過剰発現が、対照と比較して、注射したマウスにおいて運動／探求行動に影響し得るか否かを決定することを求めた。
【００９０】
この試験は、新奇恐怖症及び不安様行動を調べるために開発され、最もしばしば、齧歯類で用いて、一般的な自発運動活動（水平方向及び垂直方向活動）及び（垂直方向活動によってほとんどは示される）探求する意欲を定性的に及び定量的に測定する。進んだ合計距離、立ち上がり探求行動、行動事象の待ち時間、自己−毛づくろい行動、及び排便を含めたオープンフィールド活動を調べて、老齢マウスの脳におけるｓＫＬ過剰発現が、運動力、探求活性、情動、及び不安様行動の変化を誘導するか否かを判断した。
【００９１】
ｍ−ＫＬ及びｓ−ＫＬが処理された動物において異なる効果を誘導し得るか否かを具体的に知るために、また、野生型マウス（１２月齢）に、ＡＡＶｒｈ１０＿ｐＧＧ２＿ｍＫＬベクターを脳室内注射した（ｎ＝１０）。
【００９２】
この試験の結果を図２（Ａ、Ｂ）に示す。図２（Ａ）において、オープンフィールドでなされた合計距離（ｃｍ）を棒線で描く。図２（Ｂ）において、マウスの各型について、１分当たりになされた合計距離（ｃｍ）を記録する。表２における、オープンフィールド試験での動物の探求活動を評価するための異なるパラメータ。
【００９３】
【表２】
2019501643.tif 000004
【００９４】
図２Ａに示されるように、１８から１９月齢に試験すると、従前にｓ−ＫＬ又はｍ−ＫＬを１２月にてｉｃｖ投与されたマウスは、対照マウスと比較してより長い合計距離を進んだ（各々、ｐ＜０．０１；ｐ＜０．００１）。興味深いことには、ｍ−ＫＬ処理マウスで観察されたより大きな自発運動活動は不安に関連するように見える。というのは、進んだ距離の差は試験の最初の３分で観察されなかったからである（図２Ｂ）。比較において、ｓ−ＫＬマウスで観察されたより大きな自発運動活動は不安に関連しない。というのは、該距離の走行は、試験の最後において統計学的に有意だからであり、従って、より若い動物により典型的な探求行動により関連しているからである（図２Ｂ）。これは、行動事象の順番、及び排便の数等の測定された他のパラメータに合致し、これは、オープンアリーナに向かい合う場合、動物の双方の群において新奇恐怖症及び情動性の同様なレベルを示す（表２）。唯一、処理した動物における毛づくろいの数の低下（ｐ＝０．００３２）は統計学的に有意であった。
【００９５】
実施例２Ｄ：ＣＮＳ  ｓ−ＫＬ過剰発現は、老齢のマウスにおいて認知能力を改善する。
【００９６】
ＣＮＳにおけるクロトーの可能な長く継続する神経保護効果を調べるために、２つの学習及び記憶試験：Ｔ−迷路及びモリス水迷路において動物の認知技量を評価した。
【００９７】
自然発生的な探求行動を、Ｔ−形状迷路（アーム、長さ２５ｃｍ）で試験した。動物を、末端壁に向かい合った垂直アームの内側に置いた。動物が３つのアームの交点を横切るまで（４足動物の基準）経過した時間を決定することによって、能力を評価した。作業記憶パラダイムは、２つの連続試行：９０秒の試行間の間隔で、１つは強制選択であり、１つは自由選択、からなるものであった。強制選択においては、（各群においてバランスしていない）ランダムな順序に従って、アームのうちの１つのみがアクセス可能であった。各マウスを、その頭部を末端壁に向けて、迷路の「垂直」アームに入れ、迷路を探求させた。アクセス可能なアーム（学習の基準）において２０秒費やした後、動物をホームケージ出発ボックスに戻した。１９秒後に、それを、再度、双方のアームがアクセス可能な自由選択試行で迷路を探求させた。マウスによって選択されたアーム及び自由選択の間に各アームで消費された時間を記録した。アクセス不可能であったアームを探求する前に従前の試行において既に訪問したアームの選択は誤りと考えた。また、迷路において３つのアームの探求を完了するのに費やした時間を記録した。嗅覚試行は、試行間の間隔の間に迷路の表面を清掃することによって除外した。
【００９８】
【表３】
2019501643.tif 000005
【００９９】
表３に示されたように、全ての動物が仕事を完了することができたのではないが、Ｔ−迷路における強制選択の仕事においては、全ての群が同様に基準を満足した。引き続いて、基準を満足した動物のみに、記憶仕事である第二の試行を与えた。結果は、老齢のマウスにおけるＣＮＳでのｓ−ＫＬ発現の増加が、対照群（２．９４／６の誤りの頻度）と比較して、それらの記憶スコアを統計学的に改善した（０．６５／５の誤りの頻度）。これは、迷路経路を選択するにおける有意により少ない誤りによって証明される（ｐ＝０．００１８）。更に、この能力は、３連続日にわたって維持された（図３）。
【０１００】
これらのデータは、ＣＮＳにおけるｓ−ＫＬの発現の増加が、対照に対して中断を改善することを可能とすることを示した。これは更に、良好な作業記憶、老化している人々及びアルツハイマー病における特に興味深い該記憶を示唆する。
【０１０１】
処理された動物における認知能力の更なる分析を、モリス水迷路で行った。この試験は、視覚知覚学習のための１つの手掛り仕事、空間参照学習及び記憶のための４日間の場所仕事、続いての、長期（２４時間）記憶についての探索試行からなる。場所−学習仕事においては、遠位の視覚的手掛りを備えた試験室中に位置した循環プール（Ｉｎｔｅｘ  Ｒｅｃｒｅａｔｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．ＣＡ，ＵＳＡ；９１ｃｍ直径、４０ｃｍ高さ、２５℃の濁水）中のプラットフォーム（７ｃｍ直径、水面下１．５ｃｍ、目に見える５×８ｃｍの縞模様の旗によって示された位置）を突き止めるようにマウスを訓練した。これは、１５分間隔の試行にて、１日当たり４回のプラットフォーム試行セッションを必要とした。各試行においては、マウスを、１つのランダムに選択された出発点（Ｎ、Ｓ、Ｅ、又はＷ）から（壁に向かって）穏やかに放し、（常に、ＳＥ四分円の中央にある）プラットフォームに逃げるまで泳がせた。６０秒以内にプラットフォームを見つけられなかったマウスを、２０秒間その上に置いたが、これは、成功した動物に許容されたのと同一の期間である。最後の手掛り付きプラットフォーム試行から２４時間後に、動物を、４つの隠れたプラットフォーム試行からなる目に見えるプラットフォームの手掛り学習について試験した（２０分間隔）。プラットフォームは、水面から１．５センチ下に隠れており、その新しい位置（ＮＷ）は目に見える縞模様の旗（５×８ｃｍ）によって示され、遠位手掛りは取り除いた。各試行の間に、逃避待ち時間、移動した距離、及び平均速度を、コンピュータ化追跡システム（ＳＭＡＲＴ、Ｐａｎｌａｂ  Ｓ．Ａ．，スペイン国）によって測定した。
【０１０２】
注目すべきことには、泳ぐ速度は、ｓ−ＫＬで処理した群において有意により高かった（図４Ａ）。これは、オープンフィールド試験においてこれらの同一動物で観察された増加した水平方向自発運動活動と合致する。我々は、従って、これらの動物において、距離は、学習及び記憶の技量を評価するための待ち時間又は速度よりも正確な変数であると考えた。重要なことには、それらの年齢にかかわらず、両方の群は、訓練の４日間にわたった学習を示した。というのは、仕事を解決するためにカバーされた距離の漸進的な低下があったからである（図４Ｂ、対照ではｐ＜０．０１；ｓ−ＫＬではｐ＜０．００１）。最後に、空間学習の獲得は、群にかかわらず同様であった。これは、記憶試験前に、全ての動物は、仕事に直面すると同等であったことを示す。
【０１０３】
最後に、獲得の最後のセッションから２４時間後に（探索試行２４時間）、老齢の対照マウスは、長期記憶試行においてより貧弱な成績を有した。それらは、それらが短期記憶試行において示したのより、訓練四分円ではより低い成績を示した。対照的に、ｓ−ＫＬ処理群は、訓練四分円について明瞭な優先性を有しており、対照よりも統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１、図５）。これらの結果は、ＣＮＳにおけるｓ−ＫＬの増大したレベルの認知効果が長期記憶における選択的改善と結び付けられることを示す。
【０１０４】
実施例２Ｅ  注射されたマウスのＣＮＳにおけるウイルスゲノムの定量
【０１０５】
全ての試験を終了させた後、マウスを犠牲にし、脳の半分の一方を組織学のためにパラホルムアルデヒド（４％）中で固定した。脳の他の半分は、異なる脳切片（前頭前皮質、ＰＦＣ；皮質、Ｃ；海馬、Ｈ；及び小脳、ＣＢ）において、ウイルスゲノム（ｖｇ）の存在及びｓ−ＫＬの発現レベルを決定するのに用いた。
【０１０６】
これらの分析では、定量的ＰＣＲを行った。ウイルスゲノムの検出では、ＤＮＡ  Ｈｉｒｔ抽出プロセス（Ｈｉｒｔ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ”，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ−１９６７，ｖｏｌ  ２６，ｐｐ：３６５−３６９）を行い、細胞内部からウイルスエピソームを単離させた。定量的ＰＣＲを、ＣＭＶ  ＩＥプロモータ用の特異的プライマーで行った。ｓ−ＫＬの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）レベルによって検出するのに用いたプライマーは以下の通りであった：
ｓ−ＫＬ−順方向  ５’−ＴＧＧＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号９）、
ｓ−ＫＬ−逆方向  ５’−ＧＣＣＧＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号１０）、
ＣＭＷ−順方向：  ５’−ＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣ−３’（配列番号１８）、及び
ＣＭＶ−逆方向：  ５’−ＡＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＴ−３’（配列番号１９）。
【０１０７】
ウイルス発現は、ＲＮＡを脳切片から抽出することによって行った。ｑＰＣＲは、ｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）、サーモサイクラーＣＦＸ３８４  ＴｏｕｃｈＴＭリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）、Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ  Ｒｈｉｎ−Ｗａｌｌ  ３８４−ＷｅｅｌスカーテッドＰＣＲプレート（ＢｉｏＲａｄ）、Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ「Ｂ」接着シール（ＢｉｏＲａｄ）にて、供給業者の指示に従って行った。ｃＤＮＡを１／５希釈した。増幅プログラムは、２分間の９８℃、４０サイクルの５秒間の９５℃及び３０秒間の５８℃であった。
【０１０８】
ＡＡＶゲノムは全ての注射された動物で検出され、ＡＡＶ−ｓ−ＫＬはＡＡＶ−Ｎｕｌｌ対照と同様に分布していた（データは示さず）。かくして、脳室内投与から６か月後に、ＡＡＶｒｈ１０ベクターは、１８月齢マウスのＣＮＳに依然として存在した。より重要なことには、ｓ−ＫＬ発現は、（ｓ−ＫＬ  ｍＲＮＡに関するｑＰＣＲによって）分析した全ての脳領域で増加し、小脳における２倍高いから前頭前皮質及び海馬における４倍高いまでの範囲であった（図６）。これらの結果により、老齢マウスについて先に開示した行動及び認知試験における差は、ｓ−クロトー過剰発現によるものであったことが確認される。
【０１０９】
実施例３；若いマウスにおけるｓ−ＫＬのイン・ビボ投与
【０１１０】
ｓ−ＫＬの長期発現が中年動物の身体的、非認知及び認知状態を改善できるか否かを調べるために、マウスの第二の組（ｎ＝１１から１４）を６月齢で処理した。次いで、それらを同一の一連の試験によって１２月において評価した。より若い脳と比較して、より高齢において、ＡＡＶ導入のかなり低い有効性がある。比較的若い成体動物の群を試験することによって、我々はこの制限を回避することができた。加えて、この群では、ＡＡＶを特異的に海馬に注射した。主な理由は、（ｉ）クロトー遺伝子は海馬において豊富に発現されていること；（ｉｉ）海馬は学習及び記憶プロセスに関与していること；並びに（ｉｉｉ）マウスにおいては、海馬は１２月齢まで構造的に発生し、後に、年齢依存性機能低下を受けることである。現実には、クロトーがやはり高度に発現されている他の脳領域がある（例えば、脈絡叢、及び小脳）。しかしながら、我々は、塑性の期間の間に海馬においてｓ−ＫＬを特異的に増強させることが、海馬依存性学習及び記憶プロセスを改善し、それにより、機能の低下の将来のインパクトを低下させるかを見るのに興味を覚えた。
【０１１１】
同一の実験の設計において、我々は、ｓ−ＫＬ阻害が、対照処理及びｓ−ＫＬ処理動物に対して、ナイーブなマウスで認知欠乏を悪化させるか否かも比較した。分泌されたクロトーアイソフォームの特異的阻害を達成するために、我々は、ｓ−ＫＬに対するｓｈＲＮＡを運ぶＡＡＶベクターを投与した。ｓｈＲＮＡ配列は、ｍ−ＫＬに存在しないｓ−ＫＬのテイル中の余分な配列に対して設計した。ｓｈＲＮＡ−スクランブル配列を運ぶＡＡＶを対照として用いた。
【０１１２】
実施例３Ａ  ＡＡベクターの投与
【０１１３】
イン・ビボアッセイを実施例２のように行ったが、若い動物（ｓ−ＫＬについてのコーディング配列又は対照としてのスクランブルＤＮＡを含むＡＡＶベクターを注射したときに６月齢）についてであった。この場合、動物の海馬に注射した（５×１０９ｖｇ／マウスの２回の注射、半球当たり１回の注射）。動物の体重を実験の開始時（６月齢）、並びに９及び１２月齢に測定した。同一の行動及び認知試験を、マウスが１２月齢となると行った。実施例２におけるように、（毎月決定した）体重は、予測されたように、アッセイの間に増加した。注目すべきは、経時的なｓ−ＫＬの維持された過剰発現又は阻害は有意な効果を有さず、全ての群はむらのない同様な体重増加を示した（データは示さず）。
【０１１４】
【表４】
2019501643.tif 000006
【０１１５】
同様に、より老齢の動物での従前の実験においては、６から１２月齢でのｓ−ＫＬの維持された過剰発現又は阻害は、全ての群の反射及び感覚運動技量に影響せず、全ての群の反射及び感覚運動技量は影響されなかった（表４）。
【０１１６】
実施例３Ｂ；海馬ｓ−ＫＬ過剰発現の結果、水平活動の増加がもたらされ、中年成体マウスにおいて温和な不安効果を有する。
【０１１７】
オープンフィールド試験（図７）においては、クロトーの過剰発現は、野生型マウスに対して、自然発生活動の変化を誘導することも観察できた。老齢のマウスでの従前の結果と合致して、遺伝子治療アプローチによるｓ−ＫＬレベルの修飾は、オープンフィールド試験において、水平方向自発運動活動を変化させることができた（図７Ａ、７Ｂ）が、マウスの垂直方向活動はそうでなかった（データは示さず）。かくして、ｓ−ＫＬ  ｃＤＮＡが海馬で過剰発現されると、マウスが移動した合計距離は他の２つの群におけるよりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（対照：１３６５±１４ｃｍ；ｓ−ＫＬ：１７３４±８ｃｍ；ｓｈＲＮＡ／ｓ−ＫＬ：１２５９±２７．ｃｍ）。他方、最初の１分の試験の間に、何匹かの対照動物はしばらくすくみ、これは増大した不安の直接的な尺度である。ｓ−ＫＬを過剰発現するマウスの場合、中心領域を去るまでのより短い待ち時間が記録されたが、この差は、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬを注射したマウスに関して統計学的に有意であったに過ぎない（ｐ＝０．０００８）（表５）。分析した他の変数においては、群間で差は検出されなかった。
【０１１８】
【表５】
2019501643.tif 000007
【０１１９】
実施例３Ｃ；海馬のｓ−ＫＬ過剰発現は、中年成体マウスにおける認知能力を改善し、他方、ｓ−ＫＬ阻害はそれを損なう。
【０１２０】
作業記憶をＴ迷路試験で評価すると、処理及び対照動物の間で意味がある差がやはり観察される。
【０１２１】
結果は、３試験日の各々で得られた平均値として表す。まず、強制選択試行では、全ての対照動物及びｓ−ＫＬを過剰発現する動物は基準を満たすことができた。対照的に、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ処理動物の約１０％は満足せず、従って、捨てた。加えて、最初の試行において、ｓ−ＫＬを過剰発現するマウスは、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬを注射したマウスと比較して、迷路の交差点に到達するまでに要する時間が短かった（ｐ＝０．００９）（表６）。その後、自由選択試行において、全ての動物は全ての確立された基準を満たしたが、群間の差が、正しい経路を選択する効率において観察された。対照群は仕事を解決し、３６．３６％の誤り率であった。このスコアは、２１．４２％の誤り率にて、ｓ−ＫＬ過剰発現群において改善された。対照的に、ｓ−ＫＬの発現停止は４０％まで誤りパーセンテージを増大させた（表６）。
【０１２２】
【表６】
2019501643.tif 000008
【０１２３】
最後に、モリス水迷路試験において、学習仕事待ち時間の間に、おそらくは、マウスが若いため、意味がある差は観察されなかった。
【０１２４】
場所仕事において、全ての群は、訓練を行う時の学習曲線を示し、これは、プラットフォームに到達するまでのより短い距離として見られる。対照に対して、ｍ−ＫＬ及びｓ−ＫＬマウスは、日ごとに、より速い学習曲線を有した。
【０１２５】
記憶試験において、最後の手掛りアッセイから２時間後に、プラットフォームを取り除き、マウスが、プラットフォームがどこにあるかを思い出せるかを見るためにマウスを評価した。これを行い、プラットフォームがある四角（ＰＴｆ）、反対の四角における距離（Ｏｐｏｓ  ＰＴｆ）、右側のプラットフォームの四角（Ｒ  ＰＴｆ）、及び左側のプラットフォームの四角（Ｌ  ＰＴｆ）でマウスになされた距離を決定した。データは示さないが、全ての群（ｎｕｌｌ、及びｓ−ＫＬ）はＰＴｆ四角を優先することができた。他方、もしテストを最後の手掛り試験（長期記憶試験）から２４時間後に行えば、クロトー処理群は、対照よりも効率的にＰＴｆ四角を優先することができた（ｓ−ＫＬ注射マウスにつきｐ＜０．００１）。グラフデータは図８に示し、そこでは、四角の各々でなされた合計距離のパーセンテージを各マウス型について示す。
【０１２６】
再度、より老齢のマウスにおけるように、クロトー処理は記憶技量（この場合、長期記憶）を改良すると結論できた。
【０１２７】
視覚的知覚学習、並びに空間参照学習及び記憶を、先に用いたのと同一のプロトコルに従い、モリス水迷路で評価した。場所学習仕事（ＰＴ）においては、全ての群は、プラットフォームに到着するまでの待ち時間（図８Ａ）及びそこまで移動した距離（図８Ｂ）の漸次の低下によって反映された、仕事を学習する能力を示した。最後に、最後の訓練セッションから２４時間後に行った記憶探索試験により、我々は、１２月齢マウスにおける長期記憶でのｓ−ＫＬの効果を評価することができた。図９Ｃは、ｓ−ＫＬを過剰発現するマウスは、訓練四分円についてより大きな能力を有することを示す（ｐ＝０．０００３−対−対照及びｐ＜０．０００１−対−ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ）。以前のように、ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ処理動物は、訓練四分円につき最低の優先傾向、及び他の四分円につきランダムな優先傾向を示した（ｐ＜０．０００１−対−対照動物）。従って、我々は、老齢の動物におけるように、ｓ−ＫＬレベルの上昇が、特に長期において、四分円を識別する能力を増強すると結論する。更に、ｓ−ＫＬの発現停止させることは動物の能力を悪化させ、それは認知機能で役割を有することが確認される。
【０１２８】
実施例４  特異的抗体でのｓ−ＫＬ蛋白質アイソフォームの検出
【０１２９】
組織試料からの蛋白質抽出物（試料当たり１５から２５μｇ）を、変性アクリルアミドゲル中に流し、次いで、ＰＤＶＦ膜まで電気移動させた（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。膜を、５％スキムミルクを含有するＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックし、一次Ｋ１１３抗体と共にインキュベートした。検出は、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合二次抗体（ＥＺＢｉｏｌａｂ，ＩＮ，ＵＳＡ）及び増強されたケミルミネセンス試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。Ｋ１１３抗体は１／５，０００希釈で用い；ＫＭ２０７６抗体は１／１０００希釈で用い；ポリクローナルウサギ抗−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ２０６６，ＵＳＡ）は１／１，０００希釈で用い；及び二次ＨＲＰ−抗−Ｉｇ抗体（Ｄａｋｏ−Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｐ０３９９，デンマーク国）は１／１０，０００希釈で用いた。
【０１３０】
前記で示したように、本発明は、クロトーアイソフォーム、おそらくは、哺乳動物クロトー蛋白質のスプライシングバリアントの（ｍＲＮＡとしてのみならず）蛋白質レベルでの現実の発現のマウス野生型脳組織における発明者らの判断に由来する。
【０１３１】
この仮説は、野生型マウス組織で検出可能なクロトー蛋白質の分析に由来する。市販の抗体（ＫＭ２０７６、Ｃｏｓｍｏｂｉｏ  Ｊａｐａｎ）を用い、腎臓においては、１３０ｋＤａの膜アイソフォームが存在し、他方、脳においては、７０ｋＤａ（クロトー又はｓ−ＫＬバリアントのＫＬ１ドメインの近似的分子量）のそれと同様な分子量を持つアイソフォームを検出することができたに過ぎないと、ウエスタンブロットアッセイ（図９）で判断することができた。脳検出可能クロトーアイソフォームの分子量は、おそらくは、アミノ酸配列における転写後修飾のため、７０ＫＤａ及び１００ＫＤａの間の分子量を有していた。図９は、全脳における、また、前頭前皮質（ＣＰｆ）、皮質（Ｃｘ）、小脳（ＣＢ）、及び海馬（ＨＣ）における検出を示す。
【０１３２】
それに加えて、平行アッセイにおいて、発明者らは、マウスｓ−ＫＬに特異的な自己作成ポリクローナル抗体で、このアイソフォームが異なる脳切片に存在するかを判断した。ｓ−ＫＬに対する（ここではＡｂ  Ｋ１１３と命名する）この特異的ポリクローナル抗体を、抗原としての配列番号１１（ＳＰＬＴＫＰＳＶＧＬＬＬＰＨ）の設計された免疫原性ペプチドを用い、ＥＺＢｉｏｌａｂ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃａｒｍｅｌ，ＵＳＡ）によるウサギで生じさせた。この配列は、ｍ−ＫＬ又はいずれのｐ−ＫＬでも存在せず、該抗体がｓ−ＫＬアイソフォームに特異的なのはこの理由である。
【０１３３】
ｓ−ＫＬ蛋白質のレベルを、そのＫ１１３抗体を用い、６月齢及び１８月齢マウスの前頭前皮質（ＰｆＣＸ  ｓ−ＫＬ）、皮質（ＣＸ  ｓ−ＫＬ）、海馬（ＨＣ  ｓ−ＫＬ）、及び小脳（ＣＢ  ｓ−ＫＬ）において特に分析した。データは図１０に示し、そこでは、ウエスタンブロット分析が、（Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いる）デンシトメトリーアッセイと共に、各領域について示される。図１０（Ａ）はＰｆＣＸからのデータを示し、図１０（Ｂ）はＣＸからのデータを示し、図１０（Ｃ）はＨＣからのデータを示し、及び図１０（Ｄ）はＣＢからのデータを示す。
【０１３４】
全てのこれらのデータは、脳において市販の抗体によって検出された７０から１００ＫＤａの間のアイソフォームが、図１０の平行アッセイにおいて発明者らのＫ１１３抗体によって特異的に検出されたもののように、ｓ−ＫＬだったようであると結論することを可能とする。
【０１３５】
従って、もし脳において内因的に発現されるクロトー蛋白質のバリアントが主としてｓ−ＫＬであれば、それを、神経変性及び／又は神経病理学的疾患を伴う及び／又は伴わない、老化に関連する認知及び／又は行動障害の予防及び／又は治療で用いると、現実の利点が想定される。
【０１３６】
まず、なぜならば、本発明の実施例２及び３のデータから、ｓ−ＫＬ処理が非処理動物との関係で、改善技量（記憶及び挙動）を想定させることが導かれるからである。
【０１３７】
第二に、Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｋｌｏｔｈｏ”，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ−２００６，ｖｏｌ  ２８１（１０），ｐｐ．：６１２０−３から、ｍ−ＫＬが、ＦＧＦ２３の線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦ２３Ｒ）の共受容体として作用することが知られている。この受容体はカルシウムのホメオスタシスに関与している。従って、ｓ−ＫＬを用いることによって、ｍ−ＫＬと同様な効果でもって、これは、カルシウムホメオスタシスとの何らかの干渉を回避するであろう。というのは、ｓ−ＫＬはＦＧＦ２３Ｒの共受容体ではないからである。
【０１３８】
発明者らの知識によると、これは、ｓ−ＫＬが野生型動物（マウス）に（この場合、遺伝子治療によって）投与された最初である。更に、この蛋白質は、アルツハイマー病（ＡＤ）等のいくつかの神経変性疾患を伴う、老化（特に、老人性認知症）に関連する認知及び行動障害を予防し、並びに／又は改善するにおいて治療的に有効であることはもっともらしいとされている。特に、記憶喪失及び不安等の記憶技量における障害を予防するにおいて治療的に効果的であり、それらの全ては、通常は、老齢の人々及びＡＤの人々において共通する。
【０１３９】
神経変性疾患及び神経病理学的疾患の場合には、もしあれば、付随的処置としてｓ−ＫＬを提案するのは、かなり推奨できる。
【０１４０】
実施例５；海馬においてベクターを発現するｓ−ＫＬ及びｓｈＲＮＡ−ｓＫＬの投与は、ｓ−ＫＬの発現レベルを特異的に修飾するが、ｍ−ＫＬの発現レベルは修飾しない。
【０１４１】
ｓ−ＫＬレベルを処理した動物の海馬において定量して、認知で観察された効果がｓ−ＫＬ過剰発現及び／又はｓ−ＫＬ阻害によって誘導されるか否かを判断した。よって、ＡＡＶ／ｓ−ＫＬ注射群におけるｓ−ＫＬのｍＲＮＡレベルは、ＡＡＶ−対照を注射した動物に対して７．２５±２．０倍増加し（ｐ＝０．０３５）、他方、ＡＡＶ／ｓｈＲＮＡ−ｓＫＬ動物において、ｓ−ＫＬ発現レベルは１３．６±２．５倍低下した（ｐ＝０．００７）（図１１）。これらの変化は、分泌されたクロトーアイソフォームに特異的であった。というのは、ｍ−ＫＬ膜貫通アイソフォームの発現は、ｓ−ＫＬ過剰発現によっても（１．１５±１．１倍  ｖｓ  対照）、又は特異的ｓ−ＫＬの阻害によっても（−１．２４±０．２７倍  ｖｓ  対照）影響されなかったからである。
【０１４２】
統計学的解析
【０１４３】
値は平均値±ＳＥＭとして表される。統計学的解析及び計算は、Ｇ−Ｓｔａｔバージョン２．０及びＰｒｉｓｍ５．０４プログラムを用いて行った。個々の群の間の統計学的解析は、両側独立スチューデントｔ−検定又は一元配置偏差ＡＮＯＶＡ、続いて、テューキー事後検定によって行った。全ての場合において、平均の差は、ｐ＜０．０５であれば、統計学的に有意と考えた。
【０１４４】
出願で引用した文献
【０１４５】
−Ｄｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｋｌｏｔｈｏ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ａｎｄ  ｏｌｄ  ａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ”，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ−２００５，ｖｏｌ．３７８（１），ｐｐ．２２−２７．
−Ｋｕｒｏ−ｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｋｌｏｔｈｏ  ｇｅｎｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ａｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ−１９９７，ｖｏｌ．ｎｏ．３９０，ｐｐ．：４５−５１．
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−Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｋｌｏｔｈｏ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｋｌｏｔｈｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ−１９８８，ｖｏｌ．Ｎｏ．２４２，ｐｐ．：６２６−６３０．
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−Ｄｕｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｉｆｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｋｌｏｔｈｏ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈＡＰＰ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ”，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ−２０１５，ｖｏｌ．３５／６，ｐｐ．：２３５８−２３７１．
−Ｋｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｋｌｏｔｈｏ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｕｓｔｉｌｉｄｅ  ｉｎ  ａｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ´ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ”，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ−２０１３，ｐｐ．１−１０．
−Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−ａｇｉｎｇ  Ｋｌｏｔｈｏ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２８；４１４（３）：５５７−５６２
−Ｓｉｒａｋｉ−Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｋｌｏｔｈｏ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍａｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ−１９９８，ｖｏｌ  ４２４，ｐｐ．：６−１０．
−Ｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｋｌｏｔｈｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ａｎｄ  ＣＳＦ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｋｌｏｔｈｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ”，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ−２００１，ｖｏｌ  ５６５，ｐｐ．：１４３−１４７．
−Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ−１９９７，Ｖｏｌ．Ｎｏ．２５，ｐｐ．：３３８９−３４０２．
−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ
−Ｐｉｅｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒａｐｉｄ，ｒｏｂｕｓｔ，ａｎｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｔｉｔｅｒ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ−２０１５，ｖｏｌ２６（１），ｐｐ：３５−４２；ｏｒ  ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１４．１２０  ＰＭＩＤ：２５６４００２１．
−Ｈｉｒｔ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ”，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ−１９６７，ｖｏｌ  ２６，ｐｐ：３６５−３６９．
−Ｋｕｒｏｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｋｌｏｔｈｏ”，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ−２００６，ｖｏｌ  ２８１（１０），ｐｐ．：６１２０−３．
【図１】
2019501643.tif 000009
【図２】
2019501643.tif 000010
【図３】
2019501643.tif 000011
【図４】
2019501643.tif 000012
【図５】
2019501643.tif 000013
【図６】
2019501643.tif 000014
【図７】
2019501643.tif 000015
【図８】
2019501643.tif 000016
【図９】
2019501643.tif 000017
【図１０−１】
2019501643.tif 000018
【図１０−２】
2019501643.tif 000019
【図１１】
2019501643.tif 000020
【配列表】
2019501643000001.app
【国際調査報告】
2019501643.tif 000021
2019501643.tif 000022
2019501643.tif 000023