【手続補正書】
【提出日】平成18年12月4日(2006.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  全能性細胞が培養されたものである、全能性ブタ細胞。
【請求項２】  細胞が胚生殖細胞の形態を有する、請求項１記載の全能性ブタ細胞。
【請求項３】  （ａ）少なくとも１個の前駆細胞を分離し、
（ｂ）細胞培養培地で前駆細胞を培養し、そして
（ｃ）刺激因子を前駆細胞へ導入することにより、前駆細胞を全能性ブタ細胞に変換させる
段階を含む方法により製造される、全能性ブタ細胞。
【請求項４】  ａ）１個またはそれ以上の前駆細胞を分離し、そして
（ｂ）細胞培養培地で前駆細胞を培養することにより、全能性ブタ細胞を樹立する
段階を含む方法により製造される全能性ブタ細胞であって、胚生殖細胞形態を有するブタ全能性細胞。
【請求項５】  刺激因子がレセプターリガンドカクテルを含む、請求項４記載の全能性ブタ細胞。
【請求項６】  前駆細胞が、非胚性細胞、分化細胞、線維芽細胞、胎児細胞、胎児線維芽細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、胚性細胞、卵丘細胞、羊膜細胞および肝細胞から成る群から選択される、請求項３または４記載の全能性ブタ細胞。
【請求項７】  ブタ細胞が修飾核ＤＮＡを含む、請求項１、２、３または４記載の全能性ブタ細胞。
【請求項８】  ブタ細胞がアルカリ性ホスファターゼに関して認め得るほどには染色されない、請求項１、２、３または４記載の全能性ブタ細胞。
【請求項９】  ブタ細胞に操作が加えられている、請求項１、２、３または４記載の全能性ブタ細胞。
【請求項１０】  細胞培養培地が支持細胞を含む、請求項３または４記載の全能性ブタ細胞。
【請求項１１】  細胞培養培地がかなりの濃度のグルコースを含む、請求項３または４記載の全能性ブタ細胞。
【請求項１２】  かなりの濃度のグルコースが、１０ミリモルを越えるグルコースである、請求項１１記載の全能性ブタ細胞。
【請求項１３】  かなりの濃度のグルコースが、約１７ミリモルのグルコースである、請求項１２記載の全能性ブタ細胞。
【請求項１４】  細胞培養培地が１つまたはそれ以上の支持細胞を含む、請求項３または４記載の全能性ブタ細胞。
【請求項１５】  （ａ）少なくとも１個の前駆細胞を分離し、
（ｂ）細胞培養培地で前駆細胞を培養し、そして
（ｃ）刺激因子を前駆細胞へ導入することにより、前駆細胞を全能性ブタ細胞に変換させる
段階を含む、全能性ブタ細胞の製造方法。
【請求項１６】  ａ）１個またはそれ以上の前駆細胞を分離し、そして
（ｂ）細胞培養培地で前駆細胞を培養することにより、全能性ブタ細胞を樹立する
段階を含む、全能性ブタ細胞の製造方法であって、全能性ブタ細胞が胚生殖細胞形態を有している方法。
【請求項１７】  胚が全能性であり、胚が全能性細胞から生じる、クローン化ブタ胚。
【請求項１８】  胚が全能性であって、核ドナーおよび卵母細胞間の核移植を含む方法により製造され、核ドナーが全能性ブタ細胞であり、卵母細胞が胚を形成させ得る段階にある、クローン化ブタ胚。
【請求項１９】  核移植が全能性ブタ細胞および卵母細胞の活性化を含む、請求項１８記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２０】  （ａ）核ドナーを卵母細胞へ転移させることにより核移植卵母細胞を確立させ、そして
（ｂ）核移植卵母細胞の非電気的活性化によりブタ胚を確立させる
段階を含む方法により製造される、クローン化ブタ胚。
【請求項２１】  胚の１つまたはそれ以上の細胞が修飾核ＤＮＡを含む、請求項１７、１８または２０記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２２】  卵母細胞が核ドナーの種とは異なる種に由来する、請求項１８または２０記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２３】  転移が核ドナーおよび卵母細胞の融合段階を含む、請求項２０記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２４】  非電気的活性化が、
（ａ）卵母細胞における２価カチオンの細胞内レベルを増加させ、そして
（ｂ）卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化を低減化する
ことを含む、請求項２０記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２５】  非電気的活性化が、イオノマイシンおよびＤＭＡＰを核移植胚へ導入する段階を含む、請求項２０記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２６】  イオノマイシンが約１０マイクロモルであり、ＤＭＡＰが約２ミリモルである、請求項２３記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２７】  核ドナーが、胚生殖細胞、および胚性幹細胞、卵丘細胞、羊膜細胞、非胚性細胞、分化細胞、線維芽細胞、胎児細胞、胎児線維芽細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、胚性細胞、分化細胞、未分化細胞および肝細胞から成る群から選択される、請求項２０記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２８】  胚に操作が加えられる、請求項１７、１８または２０記載のクローン化ブタ胚。
【請求項２９】  操作にクローン化ブタ胚のインビトロ培養が含まれる、請求項２８記載のクローン化ブタ胚。
【請求項３０】  操作に、適当な有蹄動物の子宮へのクローン化ブタ胚の移植が含まれる、請求項２８記載のクローン化ブタ胚。
【請求項３１】  操作が、
（ａ）クローン化ブタ胚を１個またはそれ以上の個々の細胞に分離し、そして
（ｂ）（ｉ）（ａ）の個々の細胞、および
（ii）卵母細胞
間で少なくとも１回の後続核移植を遂行する
段階を含む、請求項２８記載のクローン化ブタ胚。
【請求項３２】  核ドナーおよび卵母細胞間における核移植を含む、クローン化ブタ胚の製造方法であって、核ドナーが全能性ブタ細胞であり、卵母細胞が胚形成させ得る段階にある方法。
【請求項３３】  （ａ）核ドナーを卵母細胞に転移させることにより核移植卵母細胞を確立し、および
（ｂ）核移植卵母細胞の非電気的活性化によりブタ胚を確立させる
段階を含む、クローン化ブタ胚の製造方法。
【請求項３４】  請求項１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１のいずれか１項記載の胚から生じるブタクローン動物。
【請求項３５】  （ａ）請求項１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１のいずれか１項記載のクローン化ブタ胚を製造し、および
（ｂ）発達して動物となるようにクローン化ブタ胚に操作を加える
段階を含む方法により製造されるブタクローン動物。
【請求項３６】  （ａ）核ドナーを卵母細胞へ転移させることにより、核移植卵母細胞を確立し、
（ｂ）核移植卵母細胞の非電気的活性化によりクローン化ブタ胚を確立し、そして
（ｃ）ブタ胚を雌レシピエントへ移植し、そこでブタ胚が発達してブタクローン動物となる
段階を含む方法により製造されるブタクローン動物。
【請求項３７】  動物の１個またはそれ以上の細胞が修飾核ＤＮＡを含む、請求項３４、３５または３６記載のブタクローン動物。
【請求項３８】  （ａ）ブタ動物から少なくとも一成分を単離し、そして
（ｂ）その成分を別の動物へ移入する
段階を含み、上記成分が、体液、細胞、組織および器官から成る群から選択される、ブタクローン動物の使用方法。
【請求項３９】  体液が精液である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】  器官が、神経組織、脳組織、脾臓、心臓、肺、胆嚢、膵臓、精巣、卵巣および腎臓から成る群から選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】  （ａ）請求項３２または３３記載の方法によりクローン化ブタ胚を製造し、そして
（ｂ）発達して動物になるようにクローン化ブタ胚に操作を加える
段階を含む、ブタクローン動物の製造方法。
【請求項４２】  （ａ）核ドナーを卵母細胞に転移させることにより核移植卵母細胞を確立し、
（ｂ）核移植卵母細胞の非電気的活性化によりクローン化ブタ胚を確立し、そして
（ｃ）ブタ胚を雌レシピエントへ移入し、そこでブタ胚が発達してブタクローン動物となる
段階を含む、ブタクローン動物の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
哺乳動物細胞を使用した最初の核転移実験の成功は１９８３年に報告されており、ここでは、マウスの接合子から単離した前核を、除核した卵母細胞内に挿入し、生きている子孫を得た。McGrathおよびSolter、1983，Science 220:1300-1302。続いて別の者が、マウスの始原生殖細胞（ＰＧＣ）を用いたキメラマウス胚（例えば、胚にある他の細胞とは有意に異なる核ＤＮＡを有する細胞のサブセットを含む胚）の生成を記載した。これらの細胞は多能性細胞であり、且つ多能性細胞を生ずることができる。Matsui等、1992、Cell 70:841-847、およびResnick等、1992、Nature 359:550；Kato等、1994、Journal of Reproduction and Fertility、抄録集、受胎能研究学会、年次総会、サザンプトン、13:38。１９９８年、研究者等は、クローニングされたマウス族動物を確立するためのクローニング技術でマウス卵丘細胞を核ドナーとして使用できることを報告した。Wakayama等、1998、Nature 394:369-374。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
好ましい態様において、（１）全能性細胞はアルカリホスファターゼ陽性ではなく（例えば、細胞はアルカリホスファターゼについて認知し得るほど染色されない）；（２）全能性細胞は少なくとも１個の前駆細胞から生じ；（３）前駆細胞はブタ族動物の任意の領域から単離されそして／または生じ；（４）前駆細胞は培養中の任意の細胞から単離されそして／または生じ；（５）前駆細胞は、非胚性細胞、非胎児性細胞、分化した細胞、分化していない細胞、体細胞、胚性細胞、胎児性細胞、胚性幹細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、卵丘細胞、羊膜細胞、胎児線維芽細胞、肝細胞、胚性生殖細胞、成体細胞、非同調的細胞集団から単離された細胞、および、同調的集団が細胞周期のＧ０期で停止していない、同調的細胞集団から単離された細胞、より成る群から選ばれ；（６）全能性細胞は胚性生殖細胞の形態学を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
本明細書中使用する「卵丘細胞」という語は、卵母細胞を取り巻く組織および／または細胞から単離される、任意の培養されたまたは培養されていない細胞を指すことができる。当業者は卵丘細胞を容易に同定することができる。卵丘細胞を単離および培養するための方法の例は、Damiani等、1996、Mol.Reprod.Dev. 45:521-534；Long等、1994、J.Reprod.Fert. 102:361-369；およびWakayama等、1998、Nature 394:369-373に記載されており、これらの各々は、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書の一部とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
本明細書中使用する「調節要素」という語は、別のＤＮＡ配列から生成される生成物の量を増加させ、または低下させることのできるＤＮＡ配列を指すことができる。調節要素は生成物の構成的産生をもたらし得る（例えば、生成物が絶えず発現され得る）。これとは別に、調節要素は、組換え生成物の産生を誘導的に増強または減少させることができる（例えば、生成物は特異的シグナルに応答して発現され得る）。調節要素は、例えば栄養によって、光によって、またはトランスジェニック生物の系に或る物質を添加することによって制御され得る。当業者によく知られる調節要素の例は、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、およびレプレッサーである。例えば、Transgenic Animals, Generation and Use、1997、L.M.Houdebine編、Hardwood Acedemic Publishers、オーストラリア、を参照されたく、これは、引用により、全ての図面、表、および描画を包含する全内容を本明細書の一部とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
好ましい態様において、（１）前駆細胞は支持細胞と共に培養し；（２）前駆細胞は支持細胞と共に培養せず；（３）支持細胞は胎児細胞から確立し；（４）胎児細胞は、いかなる細胞型もその胎児から除去されていない胎児から生じ（例えば、胎児全体を乖離し、細胞培養系中に入れる）；（５）胎児細胞は、１またはそれ以上の細胞型がその胎児から除去されている胎児から生じ（例えば、頭領域を除去し、胎児の残部を乖離し細胞培養系中に入れる）；（６）刺激を支持細胞によって前駆細胞に導入し；（７）支持細胞は刺激の唯一の供給源であり；（８）刺激は機械的様式で前駆細胞に導入し；（９）前駆細胞に導入される唯一の刺激が機械的様式で導入され；（１０）刺激が支持細胞により機械的様式で前駆細胞に導入され；（１１）刺激は前駆細胞をレセプターリガンド混合物と共にインキュベートする工程を含み；（１２）前駆細胞は有蹄動物、好ましくはブタ族動物から単離し；（１３）前駆細胞は、非胚性細胞、非胎児細胞、分化した細胞、分化していない細胞、体細胞、胚性細胞、胎児細胞、胚性幹細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、卵丘細胞、羊膜細胞、胎児線維芽細胞、肝細胞、胚性生殖細胞、成体細胞、非同調的細胞集団から単離された細胞、および同調的細胞集団から単離された細胞［ここで、同調的集団は細胞周期のＧ０期で停止していない］；（１４）レセプターリガンド混合物は、サイトカイン、成長因子、栄養因子、および神経栄養因子、ＬＩＦ、およびＦＧＦより成る群から選ばれる少なくとも１個の成分を含み；（１５）ＬＩＦはヒトＬＩＦのアミノ酸配列と実質上類似のアミノ酸配列を持ち；そして（１６）ＦＧＦはウシｂＦＧＦのアミノ酸配列と実質上類似のアミノ酸配列を持つ。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
本明細書中使用する「適当な培地」という語は、細胞増殖をさせ、または胚の静止をさせる任意の培地を指すことができる。培地が細胞増殖をさせる場合、適当な培地は最大の増殖を推進する必要はなく、測定可能な細胞増殖を推進するだけでよい。胚の発育にとって適当な培地は、本明細書の実施例により記載される胚培養基であってよい。「支持細胞」という語は本明細書中、前に定義した。本発明に係る胚は支持細胞を伴うまたは伴わない培地で培養することができる。別の好ましい態様では、支持細胞は卵丘細胞とすることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
好ましい態様において、（１）卵母細胞は除核した卵母細胞であり；（２）この卵母細胞は好ましくは有蹄動物を起源とし、より好ましくはブタ族動物を起源としており；（３）この卵母細胞は成熟しており；（４）この卵母細胞は４８時間以上成熟しており；（５）この卵母細胞は約５３時間成熟しており；（６）核ドナーは卵母細胞の卵黄周囲腔に位置し；（７）核転移に利用される核ドナーは前記の細胞（例えば、非胚性細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、分化した細胞、胎児細胞、非胎児細胞、非始原生殖細胞、非同調的細胞集団から単離された細胞、同調的細胞集団から単離された細胞、存在している動物から単離された細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、羊膜細胞、卵丘細胞、および胎児線維芽細胞）のいずれかから生ずることができ；（８）核転移は、レシピエント卵母細胞中への核ドナーの転置の工程を含むことができ；（９）この転置は、レシピエント卵母細胞中への核ドナーの注入の工程を含むことができ；（１０）この転置は核ドナーおよび卵母細胞の融合の工程を含むことができ；（１１）融合は、核ドナーおよび卵母細胞に１またはそれ以上の電気的パルスを施す工程を含むことができ；（１２）融合は、核ドナーおよび卵母細胞に少なくとも一つの適当な濃度の融合剤を到達させる工程を含むことができ；（１３）核転移は核ドナーおよび卵母細胞の活性化の工程を含むことができ；（１４）活性化は（ｉ）細胞中の二価カチオンの細胞内レベルを増大させ、そして（ii）細胞中の細胞蛋白の燐酸化を低下させる、ことによって達成し；（１５）活性化は（ｉ）細胞に二価イオンイオノフォアを導入し、そして（ii）細胞に蛋白キナーゼインヒビターを導入する、ことによって達成し；（１６）この二価イオンイオノフォアはＣａ２＋イオノフォアであり；（１７）Ｃａ２＋イオノフォアはイオノマイシンであり；（１８）蛋白キナーゼインヒビターはＤＭＡＰであり；そして（１９）活性化は、細胞にＤＭＡＰおよびイオノマイシンを導入することにより達成する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
本明細書中使用する「核ドナー」という語は、核受容体中に転置する、細胞または細胞由来の核を指すことができる。核ドナーは全能性ブタ細胞であってよい。さらに、核ドナーは本明細書に記載される任意の細胞であってよく、非胚性細胞、非胎児細胞、分化した細胞、体細胞、胚性細胞、胎児細胞、胚性幹細胞、始原生殖細胞、生殖隆起細胞、卵丘細胞、羊膜細胞、胎児線維芽細胞、肝細胞、胚性生殖細胞、成体細胞、非同調的細胞集団から単離された細胞、および同調的細胞集団から単離された細胞［ここで、同調的集団は細胞周期のＧ０期に停止していない］を包含するが、これらに限定される訳ではない。核ドナー細胞はさらに、胚性幹細胞から分化した細胞であってよい。例えば、Piedrahita等、1998、Biol.Reprod. 58:1321-1329；Shim等、1997、Biol.Reprod. 57:1089-1095；Tsung等、1995、Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao 28:173-189；およびWheeler、1994、Reprod.Fertil.Dev. 6:563-568を参照されたく、これらの各々は、引用により、全ての図面、描画、および表を包含する全内容を本明細書の一部とする。加えて、核ドナーは前もって凍結または低温保存された細胞であってよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
好ましい態様において、（１）核ドナーは培養細胞であり、且つ本明細書に記載の任意の細胞型から選択され；（２）核ドナーは全能性細胞であるか、または全能性細胞から単離され；（３）核ドナーは本明細書に記載の任意の細胞型であり（例えば、胚性生殖細胞、卵丘細胞、羊膜細胞、線維芽細胞）；（４）転置は融合の工程を含み；そして（５）このプロセスは胚をインビトロで培養する工程を含む。ブタ胚に関して、そしてとりわけ活性化に関して本明細書に記載したその他の好ましい態様は、いずれも本発明の態様に関係する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
（好ましい態様の詳細な記載）
本発明は、ブタなる動物に対するクローニング技術に関するものである。本発明は、ブタなる動物のクローニング分野で現在使用されている手段および方法を凌ぐ多様な利点を提供する。例えば、本発明は、部分的にはブタなる動物のクローニングに有用な全能性細胞に関するものである。これらの全能性細胞は、事実上あらゆるタイプの細胞を利用することによるブタクローン動物の製造方法を生み出し得る。例えば、生きて生まれた動物から単離された細胞は、全能性細胞へ再プログラム化され得る。本発明のこの特徴により、既存のブタなる動物の表現型を評価し、次いでその動物をクローニングするための全能性セルラインを容易に樹立することが可能となる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
Ｉ．全能性ブタ細胞
Ａ．全能性細胞の確立
本発明の全能性細胞は、いかなるタイプの前駆細胞からでも製造され得る。本発明の好ましい態様は、下記タイプの前駆細胞に関するものである。すなわち、（１）インビトロまたはインビボで合体した２つの配偶子から生じる胚、（２）培養胚性細胞（例、前未分化胚芽細胞および内部細胞塊細胞）から生じる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、（３）胚から分離された培養および非培養内部細胞塊細胞、（４）培養および非培養前未分化胚芽細胞、（５）培養および非培養胎児細胞、（６）培養および非培養始原生殖細胞、（７）本明細書で定義されている培養胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、（８）動物から単離された培養および非培養細胞、（９）培養および非培養卵丘細胞、（１０）培養および非培養羊膜細胞、（１１）培養および非培養胎児線維芽細胞、（１２）培養および非培養生殖隆起細胞、（１３）培養および非培養分化細胞、および（１４）培養および非培養非分化細胞または未分化細胞。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
細胞培養条件の別の例は、一つまたはそれ以上のレセプターリガンドを含む細胞培養培地である。レセプターリガンドの例は当業界の平均的技術者には熟知されている。サイトカイン類および／または成長因子は、本発明の好ましいレセプターリガンドである。例えば、Ｒ＆Ｄシステムズ・カタログ（６１４マッキンリー・プレースＮ.Ｅ.、ミネアポリス、ミネソタ５５４１３）参照。実施態様において、様々な量のヒト組換え白血病阻止因子（ｈｒＬＩＦ）および塩基性ウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を培養培地に加えることにより、前駆細胞は全能性細胞に再プログラム化され得る。様々な濃度のこれら２種のサイトカインは、好ましくは１−１０００ng／mLの濃度、さらに好ましくは１０−５００ng／mL間の濃度、および最も好ましくは約１００ng／mLの濃度で培養培地に加えられ得る。スチール因子の外生可溶性および膜結合形態は、前駆細胞を全能性細胞に変換するのに必要とはされない。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
他のサイトカイン類およびサイトカイン類以外の他の分子が後記実施態様に記載されたレセプターリガンドカクテルから追加または削除されることにより、前項で記載された細胞のいずれかから全能性細胞が樹立され得る。全能性細胞生成条件のいずれかにここで記載されたものから修正が加えられ得る。これらの修正された全能性細胞生成条件の能力は、後記「全能性細胞の同定」項で特定された方法によりモニターされ得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
巨大分子マーカーは、核酸ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、成長因子、成長因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、癌遺伝子、癌遺伝子産物および特異的糖蛋白質を含む幾つかの種類に分けられ得る。巨大分子マーカーは、細胞外タンパク質、膜結合タンパク質および／または細胞内タンパク質から成る群から選択され得、これらは膜結合状態または可溶性であり得る。永久細胞に関する上記一マーカーは、例えばテロメラーゼまたはその付随活性である。米国特許５６４５９８６（前出）参照。永久細胞に特異的なマーカーの他の例は、下記リストから選択され得る。これらの例は限定的なものではなく、本発明は、当業界において知られている永久細胞に特異的なマーカーをすべて包含するものとする。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
１）表皮成長因子（ＥＧＦ）およびそのレセプター（ＥＧＦ−Ｒ）
２）トランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）およびそのレセプター
３）ｃ−ｅｒｂＢ２レセプターチロシンキナーゼ（ＨＥＲ２生成物）
４）ヒアルロナンレセプター（恐らくＣＤ４４、内在性膜糖蛋白質）
５）腫瘍マーカーの癌胎児性抗原（ＣＥＡ）群（例えば、Ｔ１、グリコシル化タンパク質）
６）テロメラーゼ、永久細胞においてテロメア長を維持するリボ核タンパク質
７）ホスファターゼ類：胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、生殖細胞アルカリ性ホスファターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＳ）
８）カテプシンＤ（ラミニンの分解を触媒する）
９）オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）（ポリアミン合成における律速段階を触媒する）
１０）ベータ−グルクロニダーゼ
１１）アルファ−６インテグリン
１２）ケラチンＫ８
１３）癌遺伝子産物：ｒａｓ癌遺伝子（ｋ−ｒａｓ、Ｈａ−ｒａｓ、ｐ２１）、−ｓｒｃ、ｃ−ｍｙｃ
１４）サイクリンＤ１、サイクリンＡ、および網膜芽腫遺伝子タンパク質（Ｒｂ）
１５）ｐ５３発現における変化またはｐ５３突然変異
１６）異種リボ核タンパク質−Ａ２（ｈｎＲＮＰ−Ａ２）過剰発現
１７）Ｌ−プラスチン
１８）ガングリオシドフコシル−ＧＭ１
１９）Ｍｏｂ−１発現（ｍｏｂ−１）（前炎症性サイトカインと相同性）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
調節要素に関するＤＮＡ配列と連係的に利用できる有効な組換えＤＮＡ技術およびデータベースおよび商業セクターで容易に利用できる遺伝子故に、当業界における平均的技術者であれば、ここに記載された材料および方法を用いてトランスジェニック細胞の樹立に適したＤＮＡ構築物を容易に生成し得る。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
Ｂ．ＤＮＡ構築物のエレメントおよびＤＮＡ構築物の製造
宿主の性質により、広く多様な転写および翻訳調節配列が使用され得る。転写および翻訳調節シグナルは、ウイルス性供給源、例えばアデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルス、シミアンウイルスなどから誘導され得、調節シグナルは高レベルの発現潜在性を有する特定遺伝子配列を伴う。別法として、哺乳類発現産物、例えばアクチン、カゼイン、アルファ−ラクトアルブミン、ウロプラキン、コラーゲン、ミオシンなどからのプロモーターが使用され得る。転写調節シグナルは、遺伝子産物の発現が変調され得るように抑制または活性化させるものが選択され得る。興味の対象は、外部因子、例えば化学物質または薬剤により抑制または開始され得る調節シグナルである。これらの例は限定的なものではなく、本発明は調節要素を全て包含する。調節要素の他の例はここに記載されている。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９７】
Ｃ．好ましい組換え産物の例
様々なタンパク質およびポリペプチドは、トランスジェニック細胞の作製に適したＤＮＡ構築物内に含まれる遺伝子によりコード化され得る。それらのタンパク質またはポリペプチドには、ホルモン、成長因子、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、レセプター、薬剤、医薬、バイオシューティカル（bioceutical）、機能性食品、癌遺伝子、腫瘍抗原、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、ウイルス性抗原、寄生体抗原、細菌性抗原および化学合成ポリマーおよび化学的、細胞および／または酵素的プロセスにより生合成および／または修飾されたポリマーがある。これらの化合物の具体例には、プロインシュリン、インシュリン、成長ホルモン、アンドロゲンレセプター、インシュリン様成長因子Ｉ，インシュリン様成長因子II、インシュリン成長因子結合タンパク質、上皮成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、皮膚成長因子（ＰＤＧＦ）、血管新生因子（例、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子およびアンギオゲニン）、血管新生阻害因子（例、エンドスタチンおよびアンギオスタチン）、マトリックスタンパク質（IV型コラーゲン、VII型コラーゲン、ラミニン）、癌遺伝子（ｒａｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｓｉｓ、ｊｕｎ）、Ｅ６またはＥ７トランスフォーミング配列、ｐ５３タンパク質、サイトカインレセプター、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２、α、βまたはγＩＦＮ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ウイルスのキャプシドタンパク質、およびウイルス、細菌および寄生体由来のタンパク質がある。発現され得る他の特異的タンパク質またはポリペプチドには、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１−アンチトリプシン、コレステロール−７α−ヒドロキシラーゼ、先端切除アポリポタンパク質Ｂ、リポタンパク質リパーゼ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ１、ＬＤＬレセプター、酸化リポタンパク質に関するスカベンジャーレセプター、各々の分子変異体、ＶＥＧＦおよびそれらの組み合わせがある。他の例は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、凝固因子、アポリポタンパク質、薬剤、腫瘍抗原、ウイルス性抗原、寄生体抗原、モノクローナル抗体および細菌性抗原である。当業界の一専門技術者であれば、これらのタンパク質が広く多様な種類のタンパク質に属すること、およびこれらの種類の範囲内またはこれらの種類の範囲外における他のタンパク質も使用され得ることは容易に認めるはずである。これらは単なる例に過ぎず、いずれにしても限定を意味するものではない。