(57)【要約】本発明は、ポリペプチド及び非イオン性サーファクタントを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量するための方法であって、この定量が非イオン性サーファクタントとポリペプチドとの間の干渉の低減を示す方法を提供する。組成物がＮ−アセチルトリプトファンをさらに含み、そして定量によって非イオン性サーファクタント、ポリペプチド、及びＮ−アセチルトリプトファンの間の干渉の低減が示される方法もまた提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の前記非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、定量中の前記非イオン性サーファクタントと前記ポリペプチドとの間の干渉が低減され、この方法は、
ａ）前記組成物をミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、ここで前記組成物は移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で前記クロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａは水中の酸を含み、移動相Ｂはメタノール中の酸を含み、ここで前記ポリペプチドは前記クロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に結合するステップと、
ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料から前記特異的に結合したポリペプチドを溶出させ、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率はステップａ）と比較して増大しているステップと、
ｃ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて前記クロマトグラフィー材料から前記非イオン性サーファクタント及び前記非特異的に結合したポリペプチドを溶出し、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率はステップｃ）と比較して増大しているステップと、
ｄ）前記非イオン性サーファクタントを定量し、ここで、定量中の前記非イオン性サーファクタントと前記ポリペプチドとの間の干渉は減少しているステップと、
を包含する。
【請求項２】
ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、約１０：９０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、ステップｂ）において約４０：６０に増大される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、ステップｃ）において約１００：０に増大される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
移動相Ａが、水中約２％の酸を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
移動相Ｂが、メタノール中約２％の酸を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記酸がギ酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記酸が酢酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記クロマトグラフィーの流速が、約１．２５ｍＬ／分である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）が、前記クロマトグラフィーが開始されてから約１分後に始まり、前記クロマトグラフィーが開始されてから約３．４分後に終わる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ）が、前記クロマトグラフィーが開始されてから約３．５分後に始まり、前記クロマトグラフィーが開始されてから約４．６分後に終わる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非イオン性サーファクタントがポロキサマー（Ｐ１８８）またはポリソルベートである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリソルベートが、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物中の前記非イオン性サーファクタントの濃度が、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物中のタンパク質濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記製剤が、約４．５〜約７．５のｐＨを有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記製剤が、対象への投与に適切な薬学的製剤である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療用ポリペプチドが、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、四級アミン部分を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、固体支持体を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、カラムに含まれる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料が、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記非イオン性界面活性剤が、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の前記非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ここで、前記方法は、
ａ）前記組成物をミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用するステップであって、前記組成物を移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で前記クロマトグラフィー材料にロードし、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、
ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料から前記ポリペプチドを溶出させ、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率はステップａ）と比較して増大しているステップと、
ｃ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて前記クロマトグラフィー材料から前記非イオン性サーファクタントを溶出し、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率はステップｃ）と比較して増大しているステップと、
ｄ）前記非イオン性サーファクタントを定量するステップと、
を包含する。
【請求項２９】
移動相Ｂの前記有機溶媒が、メタノールである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、約１０：９０である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、ステップｂ）において約４５：５５に増大される、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、ステップｃ）において約１００：０に増大される、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
移動相Ａが、水中に約２％の水酸化アンモニウムを含む、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
移動相Ｂが、メタノール中に約２％の水酸化アンモニウムを含む、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記クロマトグラフィーの流速が、約１．４ｍＬ／分である、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップｂ）が、前記クロマトグラフィーが開始されてから約１分後に始まり、前記クロマトグラフィーが開始されてから約４．４分後に終わる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ステップｃ）が、前記クロマトグラフィーが開始されてから約４．５分後に始まり、前記クロマトグラフィーが開始されてから約７．６分後に終わる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記非イオン性サーファクタントがポリソルベートである、請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリソルベートが、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項３８または３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
移動相Ｂの前記有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、約１０：９０である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、ステップｂ）において約４０：６０に増大される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
移動相Ｂ対移動相Ａの比率が、ステップｃ）において１００：０に増大される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
移動相Ａが、水中または４３％メタノール中に約２％の水酸化アンモニウムを含む、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
移動相Ｂが、アセトニトリル中に約２％の水酸化アンモニウムを含む、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記非イオン性サーファクタントがポロキサマーである、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポロキサマーがポロキサマーＰ１８８である、請求項４８に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物中のポロキサマーの濃度が、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物がさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む、請求項２８〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物中のメチオニンの濃度が、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物中のポリペプチド濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項２８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記製剤が、約４．５〜約７．５のｐＨを有する、請求項２８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項２８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物が、対象への投与に適切な薬学的製剤である、請求項２８〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、請求項２８〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療用ポリペプチドが、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む、請求項２８〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、スルホン酸部分を含む、請求項２８〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、固体支持体を含む、請求項２８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、カラムに含まれる、請求項２８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である、請求項２８〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である、請求項２８〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記非イオン性界面活性剤が、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される、請求項２８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１６年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３７５，３７３号の優先権を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリソルベートの存在についてポリペプチドの製剤を分析するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ポリソルベート２０（ＰＳ２０）は、加工及び貯蔵中の物理的損傷から生成物を保護するためにポリペプチド製剤において一般的に使用されているサーファクタントである（Ｋｅｒｗｉｎ、Ｂ．，２００７、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９７（８）：２９２４−２９３５）。製品の安定性にとって重要であることに起因して、ＰＳ２０は、各製品の管理システムで正確に定量しなければならない。ＰＳ２０は、分光光度アッセイ、蛍光ミセルアッセイ、または高速液体クロマトグラフィー−蒸発光散乱検出器（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ）アッセイによって定量され得る（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．ａｎｄ  Ｑｉｕ，Ｊ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  ｃｈｉｍｉｃａ  ａｃｔａ  ８０６：１４４−１５１，２０１４、Ｈｅｗｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１５（１）：１５６−１６０，２００８を参照のこと）。
【０００４】
蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）アッセイは、蛍光ミセルアッセイと比較して長いコンディショニング時間を必要としないので、対照系のアッセイとして好ましい。ＥＬＳＤ法はまた、製造において使用されたのと同じポリソルベートロットを標準曲線作成のために使用するという要件を不要にし得る。さらに、蛍光ミセルアッセイは、特に疎水性タンパク質及び抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）について、非特異的タンパク質干渉を受けやすい。ＡＤＣのｖｃＭＭＡＥリンカー薬物は、タンパク質に追加の疎水性を誘導し、ＰＳ２０を定量するときにタンパク質の干渉の増大をもたらし得る。場合によっては、この非特異的タンパク質干渉は、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤアッセイを使用することによって軽減され得る。
【０００５】
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤアッセイは、タンパク質干渉の程度を軽減し得るが、この干渉は完全には排除されない。タンパク質干渉の問題は、低ポリソルベート濃度で、そしてより疎水性のタンパク質及び／または濃縮されたタンパク質で特に問題となる。さらに、タンパク質干渉の影響は、使用されるカートリッジ樹脂ロットに大きく依存する。これらの問題を軽減するための戦略としては、ａ）ＰＳ２０応答を低下させることなくタンパク質干渉を希薄化するためのＰＳ２０のスパイク添加、及びｂ）タンパク質沈殿による試料からのタンパク質の除去が挙げられる。
【０００６】
スパイク添加アプローチは、製剤目標濃度でＰＳ２０原液を用いて試料を希釈することを必要とする。この試料調製では、ほぼ不変のＰＳ２０濃度を維持しながらタンパク質濃度を希釈する。次いで、試料にスパイクされたＰＳ２０の量をデータ分析の間に差し引く。ＥＬＳＤ応答と検出器で分析された質量との間の関係は、べき法則に従うので、ＰＳ２０におけるスパイクは、ＥＬＳＤ信号に対するタンパク質の寄与を不釣り合いに低減させる。スパイク添加アプローチは、場合によってはＰＳ２０定量の正確性を向上させることが示されているが、これが実行可能な解決策ではない場合は、タンパク質沈殿を使用する必要がある。タンパク質干渉を除去するのに効果的であるが、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ沈殿法は、一晩の試料調製時間、大量の試料体積、及び試料調製の変動に起因して理想的ではない。対照的に、タンパク質の除去は、同じだが、多大な試料調製手順のないＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ条件を使用する。必要とされているのは、タンパク質干渉を排除し、全てのクロマトグラフィー条件にわたって一貫したＰＳ２０定量を得るためのよりロバストな解決法である。
【０００７】
特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
いくつかの態様では、本発明は、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量化する方法であって、定量中の非イオン性サーファクタントとポリペプチドとの間の干渉を低減する方法を提供し、ここでこの方法は、ａ）組成物をミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用するステップであって、ここでこの組成物が、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、及び移動相Ｂが、メタノール中の酸を含み、ここでポリペプチドがクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に結合するステップと、ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液で、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料から、特異的に結合したポリペプチドを溶出するステップであって、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップａ）と比較して増大している、ステップと、ｃ）非イオン性サーファクタント及び非特異的に結合したポリペプチドを、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いてクロマトグラフィー材料から溶出するステップであって、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率がステップｃ）と比較して増大しているステップと、ｄ）非イオン性サーファクタントを定量するステップであって、定量中の非イオン性界面活性剤とポリペプチドとの間の干渉が減少されているステップと、を包含する。いくつかの実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｂ）において約４０：６０に増大される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｃ）において約１００：０に増大される。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中に約２％の酸を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、メタノール中に約２％の酸を含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．２５ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、クロマトグラフィーが開始されてから約１分後に始まり、クロマトグラフィーが開始されてから約３．４分後に終わる。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、クロマトグラフィーが開始されてから約３．５分後に始まり、クロマトグラフィーが開始されてから約４．６分後に終わる。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマー（Ｐ１８８）またはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタントの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、この製剤は、約４．５〜約７．５というｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【０００９】
いくつかの態様では、本発明は、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性界面活性剤を定量する方法であって、ここでこの方法は、ａ）組成物をミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用するステップであって、ここでこの組成物が、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、及び移動相Ｂが、有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて、ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料から、ポリペプチドを溶出するステップであって、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップａ）と比較して増大している、ステップと、ｃ）非イオン性サーファクタントを、移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いてクロマトグラフィー材料から溶出するステップであって、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率がステップｃ）と比較して増大しているステップと、ｄ）非イオン性サーファクタントを定量するステップと、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｂ）において約４５：５５に増大される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｃ）において約１００：０に増大される。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中に約２％の水酸化アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、メタノール中に約２％の水酸化アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．４ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、クロマトグラフィーが開始されてから約１分後に始まり、クロマトグラフィーが開始されてから約４．４分後に終わる。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、クロマトグラフィーが開始されてから約４．５分後に始まり、クロマトグラフィーが開始されてから約７．６分後に終わる。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｂ）において約４０：６０に増大される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｃ）において１００：０に増大される。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、水中に、または４３％のメタノール中に約２％の水酸化アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、アセトニトリル中に約２％の水酸化アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。いくつかの実施形態では、組成物中のポロキサマーの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、この製剤は、約４．５〜約７．５というｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、漸増する５％メタノールの多段階勾配を用いた、ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ及び０．６ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０標準の重ね合わせである。溶出溶媒には２％ギ酸が含まれている。
【図２】図２は、異なるカートリッジでのメタノール多段階勾配実験とイソプロパノール段階勾配実験（両方とも２％ギ酸を含有する）との比較を示す。各重ね合わせについて、最初のカートリッジにＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ（トレース１）、２番目のカートリッジにＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ（トレース２）、及びＰＳ２０標準（トレース３）がある。
【図３】図３は、実験方法最適化の設計からの結果を示す。実線は、ＪＭＰ１０ソフトウェアがデータに適合する統計モデルによる方向性を示している。各実線を囲む点線は、この適合に関連する誤差を示す。線の傾きは、各因子がＰＳ２０のピーク面積とＰＳ２０のピーク幅に及ぼす影響を示している。
【図４】図４は、４０％ＭｅＯＨ洗浄液及び５０％ＭｅＯＨ洗浄液を用いたＤｏＥ法最適化からのＰＳ２０法クロマトグラムの比較を示す。これらの実験では、流速は１．２５ｍＬ／分で、１２μｇのＰＳ２０をロードし、洗浄時間は３分であった。
【図５】図５は、ＰＳ２０フリーの１０ｍｇ／ｍｌのＡ１０  ＡＤＣ及び０．６ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０標準を示し、移動相に０．２％トリフルオロ酢酸を含む。
【図６】図６は、ＰＳ２０フリーの２０ｍｇ／ｍｌのＡ１  ＡＤＣ及び０．６ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０標準を示し、移動相に２％ギ酸を含む。
【図７】図７は、ＰＳ２０フリーの２０ｍｇ／ｍｌのＡ１  ＡＤＣ及び０．７ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０標準を示し、移動相中に２％酢酸を含む。
【図８−１】図８は、以下の試料を用いたギ酸含有移動相と酢酸含有移動相との間の比較を示す：水（トレース１）、ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ、２０ｍｇ／ｍＬ（トレース２）、及びＡ１  ＡＤＣ、２０ｍｇ／ｍＬにスパイクした０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（トレース３）。
【図８−２】図８は、以下の試料を用いたギ酸含有移動相と酢酸含有移動相との間の比較を示す：水（トレース１）、ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ、２０ｍｇ／ｍＬ（トレース２）、及びＡ１  ＡＤＣ、２０ｍｇ／ｍＬにスパイクした０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（トレース３）。
【図９】図９は、メタノール／酢酸を用いた溶出を使用して、様々なＯＡＳＩＳ（登録商標）ＭＡＸカートリッジで実行したＰＳ２０標準の様々なプロファイルを示している。典型的なプロファイル（トレース１）、テーリングを伴うピーク（トレース２）、分裂を示すピーク（トレース３）、及びわずかなテーリングを伴うピーク（トレース４）。このプロファイルの変動は、標準、対照、またはタンパク質試料の定量には影響しない。
【図１０】図１０は、ＭｅＯＨ／酢酸法を示す。典型的な２０μＬの水の注入（トレース１）、ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ製剤緩衝液（トレース２）、ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ（トレース３）、及び０．１ｍｇ／ｍＬの最低ＰＳ２０標準（トレース４）。
【図１１】図１１Ａ及び図１１Ｂは、実施例１の方法１を用いたＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７の評価を示す。図１ＡはＥＬＳＤを示し、図１ＢはＵＶ（２８０ｎｍ）を示す。水（トレース１）、ＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７製剤緩衝液（トレース２）、及びＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７タンパク質（トレース３）を、実施例１の方法１を用いて評価した。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、実施例１の方法を用いた、異なるＡ１６／Ａ１７緩衝液成分のＥＬＳＤクロマトグラムを示す。図１２Ａは、ＮＡＴありの緩衝液：２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＴ、５ｍＭメチオニン、２４０ｍＭスクロース（トレース１）、２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＴ、２４０ｍＭスクロース（トレース２）、２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＮＡＴ（トレース３）を示す。図１２Ｂは、ＮＡＴなしの緩衝液：２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、５ｍＭメチオニン、２４０ｍＭスクロース（トレース１）、２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、２５ｍＭメチオニン（トレース２）、２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ（トレース３）を示す。５０μＬの緩衝液注入。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、修正方法（移動相中のＭＣＸカートリッジ及び水酸化アンモニウム）を用いた、異なる緩衝液成分のＥＬＳＤクロマトグラムを示す。図１３Ａは、ＮＡＴありの緩衝液：２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＴ、５ｍＭメチオニン、２４０ｍＭスクロース（トレース１）、２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＴ、２４０ｍＭスクロース（トレース２）、２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＮＡＴ（トレース３）、及びＮＡＴを含むＰＳ２０フリーのタンパク質（トレース４）を示す。図１３Ｂは、ＮＡＴなしの緩衝液：２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、５ｍＭメチオニン、２４０ｍＭスクロース（トレース１）、２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、２５ｍＭメチオニン（トレース２）、２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ（トレース３）を示す。５０μＬの注入。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、移動相中に０．１５〜１．５０％の水酸化アンモニウム添加剤を含むＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７タンパク質の評価を示す。図１４Ａは、ＥＬＳＤクロマトグラムを示す。図１４Ｂは、ＵＶ（２８０ｎｍ）クロマトグラムを示す。移動相に０．１５、０．２９、０．７３、及び１．５％の水酸化アンモニウムを含むＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７タンパク質（それぞれトレース１、２、３、４）、及び１．５％水酸化アンモニウムを含むＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７製剤緩衝液（トレース５）の５０μＬ注入。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、２０〜６０％移動相Ｂ洗浄ステップの評価を示す。図１５Ａは、ＥＬＳＤクロマトグラムを示す。図１５Ｂは、ＵＶ（２８０ｎｍ）クロマトグラムを示す。ＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７タンパク質の１５μＬ注入。それぞれトレース１、２、３、４、及び５として示される、２０、３０、４０、５０、及び６０％の移動相Ｂ（洗浄ステップ）。
【図１６】図１６は、ＥＬＳＤクロマトグラフィーによるＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７タンパク質の洗浄時間及び注入体積の評価を示す。２５μＬのＰＳ２０フリーＡ１６／Ａ１７試料注入：３．４分の洗浄ステップ（トレース１）。５０μＬのＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７試料注入：３．４分の洗浄ステップ（トレース２）及び２．４分の洗浄ステップ（トレース３）。
【図１７Ａ】図１７Ａ及び１７Ｂは、ＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９についての異なる流速の評価を示す。図１７Ａは、ＥＬＳＤクロマトグラムを示す。図１７Ｂは、ＵＶ（２８０ｎｍ）クロマトグラムを示す。ＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９（１５０ｍｇ／ｍＬ）の種々の流速：１．６、１．４、１．２５、１．０、及び０．８ｍＬ／分の２５μＬ注入は、それぞれトレース１、２、３、４、及び５に相当する。
【図１７Ｂ】図１７Ａ及び１７Ｂは、ＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９についての異なる流速の評価を示す。図１７Ａは、ＥＬＳＤクロマトグラムを示す。図１７Ｂは、ＵＶ（２８０ｎｍ）クロマトグラムを示す。ＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９（１５０ｍｇ／ｍＬ）の種々の流速：１．６、１．４、１．２５、１．０、及び０．８ｍＬ／分の２５μＬ注入は、それぞれトレース１、２、３、４、及び５に相当する。
【図１８】図１８は、ＥＬＳＤクロマトグラフィーによる水中のＰＳ２０についての異なる溶出時間の評価を示す。水中０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０の５０μＬ注入、３．１分の溶出ステップ（トレース１）または１．１分の溶出ステップ（トレース２）。
【図１９】図１９は、ＥＬＳＤクロマトグラフィーによる最終方法２の評価を示す。方法２の最終パラメーターを使用した、２５μＬの水の注入（トレース１）、１５０ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９（トレース２）、水にスパイクした０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（トレース３）、及びＡ１８／Ａ１９にスパイクした０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（トレース４）。
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｆは、３つの異なる生成物に対する特異性の評価を示す。図２０Ａ（Ａ１８／Ａ１９）、図２０Ｃ（Ａ１６／Ａ１７）、及び図２０Ｅ（Ａ１４／Ａ２０）は、ＥＬＳＤクロマトグラムを示す。図２０Ｂ（Ａ１８／Ａ１９）、図２０Ｄ（Ａ１６／Ａ１７）、及び図２０Ｆ（Ａ１４／Ａ２０）は、ＵＶ（２８０ｎｍ）クロマトグラムを示す。ＰＳ２０フリーの製剤（トレース１）、ＰＳ２０フリーのタンパク質（トレース２）、及び水中の０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（トレース３）。
【図２０−２】図２０Ａ〜２０Ｆは、３つの異なる生成物に対する特異性の評価を示す。図２０Ａ（Ａ１８／Ａ１９）、図２０Ｃ（Ａ１６／Ａ１７）、及び図２０Ｅ（Ａ１４／Ａ２０）は、ＥＬＳＤクロマトグラムを示す。図２０Ｂ（Ａ１８／Ａ１９）、図２０Ｄ（Ａ１６／Ａ１７）、及び図２０Ｆ（Ａ１４／Ａ２０）は、ＵＶ（２８０ｎｍ）クロマトグラムを示す。ＰＳ２０フリーの製剤（トレース１）、ＰＳ２０フリーのタンパク質（トレース２）、及び水中の０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（トレース３）。
【図２１】図２１は、ＥＬＳＤクロマトグラフィーによる、水中にスパイクしたＰＳ２０またはＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９を使用したカートリッジ間の変動性の評価を示す。カートリッジ２、０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０をＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９の中にスパイク（トレース１）、カートリッジ６、０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０をＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９の中にスパイク（トレース２）、カートリッジ２、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０を水中にスパイク（トレース３）、及びカートリッジ６、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０を水中にスパイクした（トレース４）。
【図２２】図２２は、ＥＬＳＤクロマトグラフィーによる、水中にスパイクしたＰＳ２０またはＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９を使用したカートリッジ間の変動性の評価を示す。カートリッジ４、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０をＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９の中にスパイク（トレース１）、カートリッジ６、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０をＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９の中にスパイク（トレース２）、カートリッジ４、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０を水中にスパイク（トレース３）、及びカートリッジ６、０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０を水中にスパイク（トレース４）。
【図２３】図２３は、単一カートリッジ上の１００回のＡ１８／Ａ１９注入を含むシーケンス中で用いられる対照試料のＥＬＳＤクロマトグラムを示す。シーケンス全体に注入された１１の対照試料の重ね合わせ。
【図２４】図２４は、単一のカートリッジ上に１００回のＡ１８／Ａ１９注入を含むシーケンスで使用されたＡ１８／Ａ１９試料についてのＥＬＳＤクロマトグラムを示す。シーケンス全体を通じた１００回のＡ１８／Ａ１９試料注入の重ね合わせ。
【図２５】図２５Ａ及び２５Ｂは、単一のカートリッジ上での１００回のＡ１８／Ａ１９注入を含む、１回のシーケンスからの１回目、５０回目、及び１００回目のタンパク質注入のクロマトグラムを示す。
【図２６】図２６Ａ及び図２６Ｂは、カートリッジ４を使用したＡ１８／Ａ１９試料（公称０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０）の１００回の注入からの定量結果を示す。図２６Ａは、ＰＳ２０面積対注入回数を示す。図２６Ｂは、ＰＳ２０濃度対注入回数を示す。
【図２７】図２７Ａ及び２７Ｂは、カートリッジ５を使用したＡ１８／Ａ１９製剤緩衝液（公称０．２ｍｇ／ｍＬ  ＰＳ２０）の１００回の注入からの定量結果を示す。図２７ＡはＰＳ２０面積対注入回数を示す。図２７Ｂは、ＰＳ２０濃度対注入回数を示す。
【図２８】図２８Ａ及び２８Ｂは、カートリッジ３を使用して水中にスパイクした０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０の１００回の注入からの定量結果を示す。図２８Ａは、ＰＳ２０面積対注入回数を示す。図２８Ｂは、ＰＳ２０濃度対注入回数を示す。
【図２９−１】図２９Ａ〜図２９Ｆは、ＥＬＳＤクロマトグラフィーによる方法１及び方法２を用いた３つの低ｐＩ生成物の評価を示す。図２９Ａ、図２９Ｃ、及び図２９Ｅは、それぞれＡ２１、Ａ１４／Ａ１５、及びＡ１４を用いた方法１のクロマトグラムを示す。図２９Ｂ、２９Ｄ、及び２９Ｆは、それぞれＡ２１、Ａ１４／Ａ１５、及びＡ１４を用いた方法２のクロマトグラムを示す。
【図２９−２】図２９Ａ〜図２９Ｆは、ＥＬＳＤクロマトグラフィーによる方法１及び方法２を用いた３つの低ｐＩ生成物の評価を示す。図２９Ａ、図２９Ｃ、及び図２９Ｅは、それぞれＡ２１、Ａ１４／Ａ１５、及びＡ１４を用いた方法１のクロマトグラムを示す。図２９Ｂ、２９Ｄ、及び２９Ｆは、それぞれＡ２１、Ａ１４／Ａ１５、及びＡ１４を用いた方法２のクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ポリペプチド及び非イオン性サーファクタントを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量するための方法であって、この定量が非イオン性サーファクタントとポリペプチドとの間の干渉の低減を示す方法を提供する。組成物がＮ−アセチルトリプトファンをさらに含み、そして定量によって非イオン性サーファクタント、ポリペプチド、及びＮ−アセチルトリプトファンの間の干渉の減少が示される方法もまた提供される。
【００１２】
Ｉ．定義
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では同義に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分もしくは毒素とのコンジュゲーション等によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は具体的には抗体を包含する。
【００１３】
「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）とは、ポリペプチドがその天然環境下で存在するよりもさらに純粋な形態で存在するように、及び／または実験室条件下で最初に合成及び／または増幅された場合、ポリペプチドの純度が増大したことを意味する。純度は、相対用語であり、必ずしも絶対純度を意味しない。
【００１４】
「アンタゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を包含する。同様の様式で、「アゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を包含する。適切なアゴニストまたはアンタゴニスト分子としては、具体的には、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、天然ポリペプチドのフラグメントまたはアミノ酸配列変異体などが挙げられる。ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法は、ポリペプチドを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させること、及びポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを包含し得る。
【００１５】
目的の抗原、例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的「と結合する」ポリペプチドは、ポリペプチドが、抗原を発現する細胞または組織を標的とするのに診断及び／または治療剤として有用であり、他のポリペプチドと有意には交差反応しないように十分な親和性でその抗原と結合するものである。このような実施形態では、ポリペプチドの「非標的」ポリペプチドへの結合の程度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定されるように、ポリペプチドのその特定の標的ポリペプチドへの結合の約１０％未満である。
【００１６】
標的分子へのポリペプチドの結合に関して、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープの「特異的結合」、またはそれに「特異的に結合する」、またはそれに「特異的な」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子、例えば、過剰な標識されていない標的との競合によって決定し得る。この場合、標識された標的のプローブへの結合が過剰な標識されていない標的によって競合的に阻害されると、特異的結合が示される。
【００１７】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を包含するが、これは、それらが所望の生物活性を呈する場合に限る。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で抗体と同義に使用される。
【００１８】
抗体は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子であり、それらの構造は全て免疫グロブリン折り畳みに基づく。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合して機能的抗体を形成する２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖はそれ自体、「定常」（Ｃ）領域及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域が抗体の抗原結合特異性を決定する一方で、Ｃ領域は、構造的支持を提供し、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体または抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性とは、ある抗体が特定の抗原に特異的に結合する能力である。
【００１９】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴によって決定される。可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸長にわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各々９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」（ＨＶＲ）と呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって隔てられている１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変の伸長部からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用する４つのＦＲを含み、これらは３つの超可変領域により連結され、これら超可変領域はβシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して一緒に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。
【００２０】
各Ｖ領域は、典型的には、３つのＨＶＲ、例えば、相補性決定領域（各々が「超可変ループ」を含有する「ＣＤＲ」）、及び４つのフレームワーク領域を含む。したがって、特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するために必要とされる最小の構造単位である抗体結合部位は、典型的には、３つのＣＤＲと、適切な立体配座でＣＤＲを保持し提示するためにそれらの間に散在する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域とを含む。古典的な４つの鎖抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが協働して定義される抗原結合部位を有する。ラクダ及びサメ抗体等の特定の抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。単一ドメインの操作された免疫グロブリンが調製され得、ここでは、ＶＨとＶＬとの間に協働がない場合、結合部位が重鎖または軽鎖のみによって形成されている。
【００２１】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が抗体の中で配列が大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等には分布していない。これは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用する４つのＦＲを含み、これらは３つの超可変領域により連結され、これら超可変領域はβシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって近接近し一緒に保持されており、他方の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。
【００２２】
「超可変領域」（ＨＶＲ）という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶＬでは残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）前後、ＶＨでは約３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）前後（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、及び／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶＬでは残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）、ＶＨでは２６〜３２（Ｈ１）、５２Ａ〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含んでもよい。
【００２３】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書に定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２４】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、直鎖状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））、１アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、一本鎖抗体分子、抗体断片から形成される多重特異性抗体（例えば、限定されないが、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃ、ジ−ｓｃＦｖ、バイ−ｓｃＦｖ、またはタンデム（ジ、トリ）−ｓｃＦｖ、及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が挙げられる。
【００２５】
抗体のパパイン消化は、各々、単一の抗原結合部位を持つ、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映する名称を持つ、残った「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有しながら依然として抗原に架橋し得る、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００２６】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な超可変領域を３つのみ含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性が低い。
【００２７】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’の表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものである。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【００２８】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てられ得る。
【００２９】
抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てられ得る。インタクト抗体には５つの主要なクラス、すなわち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分け得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。
【００３０】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在している。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによって、ｓｃＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関する考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００３１】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を生成することが可能になる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに詳述されている。
【００３２】
「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、ポリエピトープ特異性を有する抗体を具体的に包含する。かかる多重特異性抗体としては、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体（ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する）、２つ以上のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体（各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合する）、２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体（各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する）、全長抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重機能性抗体、共有結合している抗体断片または共有結合していない抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合し得る能力を指す。「単一特異性」とは、１つのエピトープのみに結合し得る能力を指す。一実施形態によれば、多重特異性抗体は、５μＭ〜０．００１ｐＭ、３μＭ〜０．００１ｐＭ、１μＭ〜０．００１ｐＭ、０．５μＭ〜０．００１ｐＭ、または０．１μＭ〜０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。
【００３３】
「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）または「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、一般に、単一可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）が抗原結合を付与し得る抗体を指す。言い換えれば、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要はない。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科動物（ラマ及びラクダ）ならびに軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）由来の抗体、ならびにヒト及びマウス抗体からの組換え方法から得られる抗体が挙げられる（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４−５４６、Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３０：４３−５６、Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（２００１）２６：２３０−２３５、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）：２１：４８４−４９０、ＷＯ２００５／０３５５７２、ＷＯ０３／０３５６９４、Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ（１９９４）３３９：２８５−２９０、ＷＯ００／２９００４、ＷＯ０２／０５１８７０）。
【００３４】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体を除いて、同一であり、及び／または同じエピトープに結合し、かかる変異体は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されない点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しており、いかなる特定の方法による抗体の産生を必要とするものとも解釈されるべきではない。例えば、本明細書に提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイブリドーマ法によって作製されても、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００３５】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにかかる抗体の断片を特異的に含むが、これは、それらが所望の生物活性を呈する場合に限る（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書において目的のキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、またはカニクイザル等の旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が挙げられる（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００３６】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の能力をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、上述のＦＲ置換（複数可）を除いて、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００３７】
本明細書の目的に関しては、「インタクト抗体」とは、重及び軽可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含む抗体である。定常ドメインとは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクト抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００３８】
「天然抗体」とは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。
【００３９】
「裸抗体」とは、細胞毒性部分または放射標識等の異種分子にコンジュゲートされない（本明細書に定義される）抗体である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、以下が挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方調節。
【００４１】
「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価してもよい。
【００４２】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を実行する白血球である。いくつかの実施形態では、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球を含み、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。
【００４３】
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の、同種抗原と複合した分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体））への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０２：１６３（１９９６）に記載されるＣＤＣアッセイを実施してもよい。
【００４４】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及びオルタナティブスプライシング型も含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）、及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。将来的に特定されるものも含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語はまた、母体のＩｇＧの胎児への転移を担う新生児受容体である、ＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００４５】
「不純物」とは、所望のポリペプチド生成物とは異なる物質を指す。本発明のいくつかの実施形態では、不純物は、ポリペプチドの荷電変異体を含む。本発明のいくつかの実施形態では、不純物は、抗体または抗体断片の荷電変異体を含む。本発明の他の実施形態では、不純物としては、限定するものではないが：宿主細胞物質、例えばＣＨＯＰ、浸出されたタンパク質Ａ、核酸、所望のポリペプチドの変異体、断片、凝集体、または誘導体、別のポリペプチド、エンドトキシン、ウイルス性混入物、細胞培養培地成分等が挙げられる。
【００４６】
本明細書に使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種ポリペプチドの結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせている、抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、「異種の」）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的に、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む連続したアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得られ得る。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「サーファクタント」とは、表面活性剤、好ましくは、非イオン性サーファクタントを指す。本明細書におけるサーファクタントの例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０）、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグルコシドナトリウム、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン、ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン、メチルココイルタウリン酸ナトリウムまたはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム、ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８等）、等が挙げられる。一実施形態では、本明細書におけるサーファクタントは、ポリソルベート２０である。なお別の実施形態では、本明細書におけるサーファクタントは、ポロキサマー１８８である。
【００４８】
クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「連続」という用語は、第１のクロマトグラフィーに続いて第２のクロマトグラフィーを有することを指す。さらなるステップが第１のクロマトグラフィーと第２のクロマトグラフィーとの間に含まれてもよい。
【００４９】
クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「連続」という用語は、直接接続されるかまたは連続流を可能にする２つのクロマトグラフィー材料の間のいくつかの他の機構を介して接続された第１のクロマトグラフィー材料と第２のクロマトグラフィーを有することを指す。
【００５０】
「ローディング密度」とは、クロマトグラフィー材料の体積（例えば、リットル）と接触した組成物の量（例えば、グラム）を指す。いくつかの例では、ローディング密度は、ｇ／Ｌで表される。
【００５１】
「干渉」という用語は、ある種（例えば、非イオン性サーファクタント）の定量に関して本明細書で用いる場合、その定量に対するその種以外のいくつかの成分（例えば、ポリペプチド）の寄与を指す。例えば、ポリソルベート２０とポリペプチドの両方を含有するクロマトグラフィー画分のＥＬＳＤシグナルは、ポリソルベート２０及びポリペプチドの両方からの寄与を有し、その画分中のポリソルベート２０の定量は、ポリペプチドからの干渉を有するであろう。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「本質的に同じ」とは、ある値またはパラメーターが、有意な影響により変更されていないことを示す。例えば、カラム出口のクロマトグラフィー移動相のイオン強度は、イオン強度が著しく変化していない場合、移動相の最初のイオン強度と本質的に同じである。例えば、初期イオン強度の１０％、５％、または１％以内であるカラム出口のイオン強度は、初期イオン強度と本質的に同じである。
【００５３】
本明細書において「約」値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする変動を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」について言及する記述は、「Ｘ」の記述を包含する。
【００５４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「または」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書に記載の本発明の態様及び変形は、態様及び変形「からなる」及び／または「本質的にからなる」を含むことが理解される。
【００５５】
ＩＩ．クロマトグラフィーの方法
いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド及び非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベート２０、すなわちＰＳ２０）を含む組成物の分析方法であって、ローディング緩衝液を使用してポリペプチド及び非イオン性サーファクタントをミックスモードイオン交換クロマトグラフィー材料に結合させること、ならびにポリペプチド及び非イオン性サーファクタントがクロマトグラフィー材料から異なる画分で溶出するように、緩衝剤を使用してクロマトグラフィー材料からポリペプチド及び非イオン性サーファクタントを溶出することを包含する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、このクロマトグラフィー法は、様々なｐＩを有するポリペプチドを含む、複数のポリペプチド（例えば、ポリペプチド産物）を含む組成物に適している。例えば、この方法は、非イオン性サーファクタントと、６．０〜９．５の範囲のｐＩを有する抗体生成物などのいくつかの異なる抗体生成物とを含む組成物を分析するために使用してもよい。他の実施形態では、このクロマトグラフィー方法は、本明細書に記載の方法によって同定された最適条件（例えば、クロマトグラフィー材料、緩衝液、勾配、ステップ期間、流速、試料ロード）の使用を包含する。
【００５６】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料は、以下の機能のうちの１つ以上が可能な官能基を含むミックスモード材料である：陰イオン交換、陽イオン交換、水素結合、及び疎水性相互作用。いくつかの実施形態では、ミックスモード材料は、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード材料は、ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、ミックスモード材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。上記のいくつかの実施形態では、ミックスモード材料は、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィーカラムもしくはカートリッジなどのミックスモードクロマトグラフィーカラムもしくはカートリッジ、またはミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィーもしくはカートリッジである。いくつかの実施形態では、このミックスモード材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。
【００５７】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、イオン交換材料は、従来のクロマトグラフィー材料または対流クロマトグラフィー材料を利用し得る。従来のクロマトグラフィー材料としては、例えば、灌流材料（例えば、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂）及び拡散材料（例えば、架橋アガロース樹脂）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂は、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）樹脂であってもよい。いくつかの実施形態では、架橋アガロース樹脂は、スルホプロピル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（「ＳＰＳＦＦ」）樹脂であってもよい。対流クロマトグラフィー材料は、膜（例えば、ポリエーテルスルホン）またはモノリス材料（例えば、架橋ポリマー）であってもよい。ポリエーテルスルホン膜は、Ｍｕｓｔａｎｇであってもよい。架橋ポリマーモノリス材料は、架橋ポリ（グリシジルメタクリレート−コ−エチレンジメタクリレート）であってもよい。
【００５８】
本発明の任意の方法のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラムもしくはカートリッジ、例えばミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィーカラムもしくはカートリッジ、またはミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィーカラムもしくはカートリッジ中にある。いくつかの実施形態では、このクロマトグラフィーカラムまたはカートリッジは、液体クロマトグラフィーに使用される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムまたはカートリッジは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に使用される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムまたはカートリッジは、ＨＰＬＣクロマトグラフィーカラムまたはカートリッジ、例えば、ミックスモード陽イオン交換ＨＰＬＣカラムもしくはカートリッジ、またはミックスモード陰イオン交換ＨＰＬＣカラムもしくはカートリッジである。
【００５９】
例えば、いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酸を含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）この非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３０：７０〜約５０：５０（約３２：６８、３４：６６、３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、及び４８：５２のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマー（Ｐ１８８）またはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタントの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭ���Ｂ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酸を含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、ここでこの第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が、第２の比率より大きいステップと、ｄ）非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこの非イオン性サーファクタントの定量が約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）のポリペプチドからの干渉を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３０：７０〜約５０：５０（約３２：６８、３４：６６、３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、及び４８：５２のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマー（Ｐ１８８）またはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタントの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリ���プチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酸を含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、ここでこの第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が、第２の比率より大きいステップと、ｄ）非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこの溶出液が、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含むステップ、とを包含する方法、が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３０：７０〜約５０：５０（約３２：６８、３４：６６、３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、及び４８：５２のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマー（Ｐ１８８）またはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタントの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード���イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酢酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酢酸を含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）この非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３０：７０〜約５０：５０（約３２：６８、３４：６６、３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、及び４８：５２のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酢酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酢酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマー（Ｐ１８８）またはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタントの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロ���トグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酸を含むステップと、ｂ）約３５：６５〜約４５：５５という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出するステップと、ｄ）この非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４０：６０である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくと���約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマー（Ｐ１８８）またはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタントの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロ���トグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酸を含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３０：７０〜約５０：５０（約３２：６８、３４：６６、３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、及び４８：５２のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックス���ード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酸を含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、ここでこの第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が、第２の比率より大きいステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこの非イオン性サーファクタントの定量が約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）のポリペプチドからの干渉を含むステップとを包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３０：７０〜約５０：５０（約３２：６８、３４：６６、３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、及び４８：５２のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭ���Ｂ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酸を含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、ここでこの第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が、第２の比率より大きいステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこの溶出液が、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３０：７０〜約５０：５０（約３２：６８、３４：６６、３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、及び４８：５２のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつか���実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフ���ー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酢酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酢酸を含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３０：７０〜約５０：５０（約３２：６８、３４：６６、３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、及び４８：５２のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酢酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酢酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態���は、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酸を含むステップと、ｂ）約３５：６５〜約４５：５５という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出するステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４０：６０である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、この酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、この酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、���．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）���ＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、ここで移動相Ａが水中の酢酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酢酸を含むステップと、ｂ）約３５：６５〜約４５：５５という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出するステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこの非イオン性サーファクタントの定量が約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）のポリペプチドからの干渉を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４０：６０である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酢酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酢酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつ���の実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラ���ィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、ここで移動相Ａが水中の酢酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の酢酸を含むステップと、ｂ）約３５：６５〜約４５：５５という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出するステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこのステップｃ）由来の溶出液が、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４０：６０である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酢酸を水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の酢酸をメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．���、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれか）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベート２０を定量する方法であって、ａ）ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、約１０：９０という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の約２％の酢酸を含み、移動相Ｂがメタノール中の約２％の酢酸を含むステップと、ｂ）約４０：６０という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を有する溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベート２０を溶出するステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．２５ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約２０μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約１（少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベート２０の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範��を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムまたはカートリッジに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）この非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベートまたはポロキサマー）の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン（またＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンとも呼ばれる）及び／またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６���、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、ここでこの第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が、第２の比率より大きいステップと、ｄ）非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこの非イオン性サーファクタントの定量が約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）のポリペプチドからの干渉を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベートまたはポロキサマー）の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、こ���らの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、ここでこの第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が、第２の比率より大きいステップと、ｄ）非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこのステップｃ）からの溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベートまたはポロキサマー）の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組���物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがメタノール中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）この非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムをメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベートまたはポロキサマー）の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．���、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがアセトニトリル中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）この非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムをアセトニトリル中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベートまたはポロキサマー）の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．���、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）約４０：６０〜約５０：５０という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出するステップと、ｄ）この非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベートまたはポロキサマー）の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０���１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００７８】
製剤中にＮ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）を含有する生成物を、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ条件を用いて試験すると、ＰＳ２０領域に有意な干渉が観察される。したがって、状況によっては、ＮＡＴとタンパク質の両方の関連の干渉を排除するために代替条件が必要である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント、ポリペプチド及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中の非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料から非イオン性サーファクタントを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）この非イオン性サーファクタントを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタント（例えば、ポリソルベートまたはポロキサマー）の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含���）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤の定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート及びポリペプチドを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）���ｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド、及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、ここでこの第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が、第２の比率より大きいステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこのポリソルベートの定量が約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約���、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド、及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、ここでこの第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が、第２の比率より大きいステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでステップｃ）由来の溶出液が、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）及び組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、���のポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド、及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがメタノール中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムをメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の���意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド、及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがアセトニトリル中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出し、この第２の比率が第１の比率よりも大きいステップと、ｃ）移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出し、ここでこの第３の比率が第２の比率より大きいステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約０：１００〜約２０：８０（約２：９８、４：９６、６：９４、８：９２、１０：９０、１２：８８、１４：８６、１６：８４、及び１８：８２のうちのいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第２の比率は、約３５：６５〜約５５：４５（約３６：６４、３８：６２、４０：６０、４２：５８、４４：５６、４６：５４、４８：５２、５０：５０、５２：４８、及び５４：４６のいずれかなど、これらの比率の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、第３の比率は約８０：２０〜約１００：０（約８２：１８、８４：１６、８６：１４、８８：１２、９０：１０、９２：８、９４：６、９６：４、及び９８：２のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムをアセトニトリル中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの���の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）約４０：６０〜約５０：５０という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出するステップと、ｄ）このポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、メタノールである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂの有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４５：５５である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトニトリル）中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクロ���ナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、ここで移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがメタノール中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）約４０：６０〜約５０：５０という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出するステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこのポリソルベートの定量が約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４５：５５である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムをメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形���では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、ここで移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがメタノール中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）約４０：６０〜約５０：５０という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出するステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこのステップｃ）由来の溶出液が、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）及び組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４５：５５である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムをメタノール中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上���いずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材���は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、ここで移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがアセトニトリル中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）約４０：６０〜約５０：５０という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出するステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこのポリソルベートの定量が約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に、そしてステップｂ）のポリペプチド溶出液の少なくとも約９０％（少なくとも約９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のうちのいずれかなど）で結合する。いくつかの実施形態では、ステップｃ）からの溶出液は、非特異的に結合したポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４５：５５である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムをアセトニトリル中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつか���実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート、ポリペプチド及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベートを定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、この組成物が約５：９５〜約１５：８５という移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、ここで移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがアセトニトリル中の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）約４０：６０〜約５０：５０という移動相Ｂ対移動相Ａの第２の比率を含む溶液を使用してミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約９０：１０〜約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの第３の比率を含む溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベートを溶出するステップと、ｄ）ポリソルベートを、ステップｃ）の溶出液中で定量し、ここでこのステップｃ）由来の溶出液が、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）及び組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含むステップとを包含する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの第１の比率は、約１０：９０である。いくつかの実施形態では、この第２の比率は約４５：５５である。いくつかの実施形態では、この第３の比率は、約１００：０である。いくつかの実施形態では、移動相Ａは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムを水の中に含む。いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、約０．５％〜約５％（ｖ／ｖ）（約０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、及び４．５％のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）の水酸化アンモニウムをアセトニトリル中に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、または���れ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラ���ィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチドからの干渉を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０、ポリペプチド、及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベート２０を定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、約１０：９０という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の約１．５％の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがメタノール中の約１．５％の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）約４５：５５という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベート２０を溶出するステップと、ｄ）このポリソルベート２０を、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．４０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約２５μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２分、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５分またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、��成物中のポリソルベート２０の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％、７��、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０、ポリペプチド、及びＮ−アセチルトリプトファンを含む組成物中のポリソルベート２０を定量する方法であって、ａ）ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に組成物を適用し、ここでこの組成物が、約１０：９０という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を含む溶液中でクロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａが水中の約１．５％の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂがアセトニトリル中の約１．５％の水酸化アンモニウムを含むステップと、ｂ）約４５：５５という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を有する溶液を使用してミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するステップと、ｃ）約１００：０という移動相Ｂ対移動相Ａの比率を有する溶液を使用してクロマトグラフィー材料からポリソルベート２０を溶出するステップと、ｄ）このポリソルベート２０を、ステップｃ）の溶出液中で定量するステップと、を包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ポリペプチドの約１０％未満（約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、ステップｃ）由来の溶出液は、組成物中の総ＮＡＴの約５％未満（約４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下のいずれか未満など）を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約０．５〜２．５（約０．７、０．９、１．１、１．３、１．４、１．５、１．７、１．９、２．１、及び２．３のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．４０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約１〜約５０（約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び４５のうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）μＬである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料に適用される組成物の体積は、約２５μＬである。いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップａ）の開始後、少なくとも約０．５（少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５、またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の終了後少なくとも約０．０５（少なくとも約０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２分、またはそれ以上のいずれかなど）分で開始し、少なくとも約２（少なくとも約２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．１、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．５、５分またはそれ以上のいずれかなど）分続く。いくつかの実施形態で��、組成物中のポリソルベート２０の濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲（約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、及び０．９％のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにメチオニンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲（約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＭなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ（約２、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、及び２４０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は約４．５〜約７．５（約４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４のいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。いくつかの実施形態では、このミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。いくつかの実施形態では、この非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。いくつかの実施形態では、ポリソルベートの定量は、約１０％未満（約９％、８％��７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％またはそれ未満のいずれかなど）のポリペプチド及びＮＡＴからの干渉を含む。
【００９２】
上記の任意の方法のいくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントは、組成物にポリペプチドを添加する前に非イオン性サーファクタントを含む組成物中で定量される。いくつかの実施形態では、組成物中の非イオン性サーファクタントの濃度は、ポリペプチドに添加する前に、より大きい（例えば、組成物中の非イオン性サーファクタントは、ポリペプチドの添加の際に希釈される）。上記の任意の方法のいくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタントは、非イオン性サーファクタントを含む組成物中で、組成物に対するポリペプチドの前に、ただし伴わず定量される。このような定量は、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物に対する対照または比較因子として用いられ得る。
【００９３】
上記の任意の方法のいくつかの実施形態では、分析される組成物の試料は、クロマトグラフィー機器（例えば、ＨＰＬＣ機器）のオートサンプラーに添加される。いくつかの実施形態では、オートサンプラー内の試料は冷蔵されている（例えば、５±３℃）。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料を含む１つ以上のカラムは、クロマトグラフィー機器のカラムコンパートメントに配置される。いくつかの実施形態では、分析中にカラムコンパートメントの温度を設定点から狭い範囲内（例えば、±１℃）に維持するために温度制御機能を使用してもよい。いくつかの実施形態では、カラム流出物は２８０ｎｍでモニターされる。
【００９４】
上記の任意の方法のいくつかの実施形態では、分析される組成物の試料は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬの標的ポリペプチド濃度（約０．２、０．４、０．６、０．８、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｍｇ／ｍＬのいずれかなど、これらの値の間の任意の範囲を含む）までローディング緩衝液を用いて希釈される。
【００９５】
上記の任意の方法のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー機器としては、グラジエントポンプ（例えば、低圧四次グラジエントポンプ）、オートサンプラー（例えば、温度制御能力を有するオートサンプラー）、カラムコンパートメント（例えば、熱制御カラムコンパートメント）、ＵＶ検出器（例えば、ダイオードアレイＵＶ検出器）、及び蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー機器は、ｐＨ及び導電率データをリアルタイムで収集するために、ｐＨ及び導電率モニター（例えば、ＰＣＭ−３０００）をさらに含む。機器制御、データ取得、及びデータ分析は、適切なソフトウェア（例えばＪＭＰ１０）を用いて行われる。
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態では、移動相、例えば、溶出緩衝液のイオン強度は、移動相の導電率によって測定される。伝導度とは、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力を指す。溶液中で、電流は、イオン輸送により流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると、この溶液は、より高い伝導度を有するようになる。伝導度の尺度の基本単位は、ジーメンス（Ｓｉｅｍｅｎ）（またはモー（ｍｈｏ））、ｍｈｏ（ｍｓ／ｃｍ）であり、様々なモデルのＯｒｉｏｎ伝導度計等の伝導度計を使用して測定され得る。電解質伝導度が電流を搬送する溶液中のイオンの能力であるため、溶液の伝導度は、その中のイオンの濃度を変化させることによって変更され得る。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度及び／または塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、または塩化カリウム）の濃度を変更して、所望の伝導度を達成してもよい。好ましくは、様々な緩衝液の塩濃度は、所望の伝導度を達成するために修正される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの移動相は、約０．０ｍＳ／ｃｍ、０．５ｍＳ／ｃｍ、１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、９．０ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７．０ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、１９．０ｍＳ／ｃｍ、または２０．０ｍＳ／ｃｍのいずれかよりも大きい初期導電率を有する。いくつかの実施形態では、移動相の導電率は、例えば、イオン強度勾配によって、クロマトグラフィーの過程にわたって増大される。いくつかの実施形態では、溶出完了時の移動相の導電率は、約１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、４．０ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、５．０ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、６．０ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、７．０ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、９．０ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７．０ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、１９．０ｍＳ／ｃｍ、または２０．０ｍＳ／ｃｍのいずれかよりも大きい。いくつかの実施形態では、移動相の導電率は、線形勾配によって増大される。いくつかの実施形態では、移動相の導電率、１つ以上のステップを含む段階的勾配によって増大される。
【００９８】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、ポリペプチド及び非イオン性サーファクタントを含む組成物を、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００μｇのいずれか１つを超えるポリペプチドの量でクロマトグラフィー材料にロードする。いくつかの実施形態では、組成物を、約０．５、１、１．５、２、２．５、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ｍｇ／ｍＬのいずれか１つを超える濃度でクロマトグラフィー材料にロードする。いくつかの実施形態では、この組成物をクロマトグラフィー材料にロードする前に希釈する。例えば、１：１、１：２、１：５、１：１０または１：１０超に希釈する。いくつかの実施形態では、この組成物をクロマトグラフィーの移動相に希釈する。いくつかの実施形態では、この組成物をローディング緩衝液に希釈する。
【００９９】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料はカラムまたはカートリッジ内にある。いくつかの実施形態では、このカラムはＨＰＬＣカラムまたはカートリッジである。カラムまたはカートリッジは、クロマトグラフィー機器と適合する任意の寸法を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、カラムまたはカートリッジは、以下の寸法のうちのいずれか１つを有する：２．１×２０ｍｍ、４×５０ｍｍ、４×１００ｍｍ、４×１５０ｍｍ、４×２００ｍｍ、４×２５０ｍｍ、または２×２５０ｍｍ。
【０１００】
ＩＩＩ．ポリペプチド
ポリペプチドは、分離条件が本明細書に記載されるように最適化されているイオン交換クロマトグラフィーの任意の方法における使用のために提供される。本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチドの組成物は、イオン交換クロマトグラフィーによって分析される。そのような方法は、組成物内のポリペプチドの電荷変異体を同定するのに有用である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約６．０〜約９．５の範囲のｐＩを有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約６．０〜約９．５の範囲のｐＩを有する抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの電荷対ｐＨの曲線における変曲点（ＩＰ）は、本発明の方法によって提供される。いくつかの実施形態では、温度の変化に伴うＩＰの変化（ｄＩＰ／ｄＴ）は、本発明の方法によって提供される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはイムノアドヘシンである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、１５，０００ダルトン、２５，０００ダルトン、５０，０００ダルトン、７５，０００ダルトン、１００，０００ダルトン、１２５，０００ダルトン、または１５０，０００ダルトンのいずれかよりも大きい分子量を有する。ポリペプチドは、約５０，０００ダルトン〜２００，０００ダルトンまたは１００，０００ダルトン〜２００，０００ダルトンのいずれかの間の分子量を有し得る。あるいは、本明細書で使用されるポリペプチドは、約１２０，０００ダルトンまたは約２５，０００ダルトンの分子量を有し得る。
【０１０３】
ｐＩは等電点であり、特定の分子または表面が正味の電荷を帯びないｐＨである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ポリペプチドを含む複数の組成物に使用してもよく、この組成物中のポリペプチド、例えば、抗体のｐＩは、約６．０〜約９．５の範囲である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約９．５より大きい、例えば、約９．５〜約１２のｐＩを有する。本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、抗体のｐＩは、約７未満、例えば、約４〜約７であり得る。
【０１０４】
本明細書に記載の任意の方法の実施形態では、ポリペプチド及び１つ以上の混入物質を含む組成物中の１つ以上の混入物質は、ポリペプチド電荷変異体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド電荷変異体は、ポリペプチドの電荷が変化するようにその天然状態から修飾されているポリペプチドである。いくつかの実施形態では、電荷変異体は、親ポリペプチドよりも酸性である、すなわち、親ポリペプチドよりも低いｐＩを有する。他の実施形態では、電荷変異体は親ポリペプチドよりも塩基性である、すなわち、親ポリペプチドよりも高いｐＩを有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド電荷変異体は、操作されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド電荷変異体は、天然のプロセス（例えば、酸化、アミド分解、リジン残基のＣ末端プロセシング、Ｎ末端ピログルタメート形成、及び糖化）の結果である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド電荷変異体は、糖タンパク質の電荷が親糖タンパク質と比較して変化するようにタンパク質に結合したグリカンが修飾されている糖タンパク質である（例えば、シアル酸またはその誘導体の添加による）。いくつかの実施形態では、ポリペプチド電荷変異体は抗体電荷変異体である。
【０１０５】
本明細書に記載の方法を使用して分析されるポリペプチドは、概して、組換え技術を使用して産生される。組換えタンパク質を産生するための方法は、例えば、参照により本明細書に具体的に組み入れられる、米国特許第５，５３４，６１５号及び同第４，８１６，５６７号に記載されている。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ＣＨＯ細胞中で産生される（例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内で産生される。例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号及び同第５，８４０，５２３号（発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載している）を参照のこと。また、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５〜２５４も参照のこと（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を記載している）。組換え技術を使用する場合、ポリペプチドは、細胞内に産生されても、細胞膜周辺腔に産生されても、または培地に直接分泌されてもよい。
【０１０６】
ポリペプチドは、培養培地または宿主細胞溶解物から回収され得る。ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、様々な物理的または化学的手段、例えば、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤によって破壊され得る。ポリペプチドが細胞内に産生される場合、第１のステップとして、粒子状残屑、宿主細胞、または溶解された断片のいずれかが、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌されるポリペプチドを単離するための手順を記載している。要するに、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞片は遠心分離によって除去され得る。ポリペプチドが培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、一般に、市販のポリペプチド濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が、タンパク質分解を阻害するために前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、抗生物質が、外来性混入物質の成長を阻止するために含まれてもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド及び１つ以上の混入物質を含む組成物中のポリペプチドは、本発明の方法により分析前に精製または部分的に精製されている。例えば、方法のポリペプチドは、親和性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶離液中にある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶離液中にある。
【０１０８】
本発明の方法によって分析され得るポリペプチドの例としては、限定するものではないが、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫コンジュゲート、サイトカイン、及びインターロイキンが挙げられる。（Ａ）抗体
【０１０９】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、ポリペプチド及び本明細書に記載される方法によってポリペプチドを含む製剤を分析する方法のうちのいずれかで使用するためのポリペプチドは、抗体である。
【０１１０】
抗体の分子標的としては、（ｉ）ＣＤタンパク質及びそれらのリガンド、例えば、限定するものではないが：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＣＤ１２２、及びＣＤ１３７、（ｉｉ）サイトカイン、例えば、限定するものではないが：ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、及びＩＬ−３３、（ｉｉｉ）ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体、（ｉｖ）細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ及びαｖ／β３インテグリン（これらのαまたはβサブユニットのいずれかを含む）（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）、（ｖ）ＶＥＧＦなどの増殖因子、ＴＧＦβ、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ−４、プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ−ｍｅｔ、組織因子、β７など、（ｖｉ）免疫調節タンパク質、例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡ、ならびに（ｖｉｉ）細胞表面及び膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているものなど（限定するものではないが、ＮａＰｉ２ｂを含む）が挙げられる。
【０１１１】
他の例示的な抗体としては、限定するものではないが、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅカドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ癌タンパク質抗体、抗Ｌｅｗｉｓ  Ｘ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ユビキチン抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＳｔａｐｈＡ抗体、抗ＦｃＲＨ５抗体、抗Ｌｙ６Ｅ抗体、抗ＳＴＥＡＰ抗体、抗ＦｌｕＢ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ａｎｇ２抗体、抗ＦＧＦＲ１抗体、抗ＫＬＢ抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶタンパク質抗体、抗カッパ軽鎖抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体、抗Ｔｎ抗原抗体、及びＭｅｔＭａｂから選択される抗体が挙げられる。
【０１１２】
（ｉ）モノクローナル抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られ、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる想定される変異体は除外され、かかる変異体は、概して、少量で存在する。したがって「モノクローナル」という修飾語は、個別のまたはポリクローナル抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。
【０１１３】
例えば、モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載されるハイブリドーマ法を使用して作製されてもよいし、または組換えＤＮＡ法により作製されてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０１１４】
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスター等の他の適切な宿主動物を、本明細書に記載されるように免疫化して、免疫化のために使用されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１１５】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を播種して、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する適切な培養培地で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質が、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性を示すものである。これらの中で、いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するもの等のマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１１７】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって測定される。
【０１１８】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャチャード分析によって測定され得る。
【０１１９】
所望の特異性、親和性、及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準の方法により成長させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に適切な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長されてもよい。
【０１２０】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、ポリペプチドＡ−セファロース（登録商標）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー等によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【０１２１】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定される。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの供給源としての機能を果たす。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に配置され得、次いで、宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞等にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成体が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６−２６２（１９９３）ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【０１２２】
さらなる一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーから単離されてもよい。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記載する。その後の刊行物は、非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略として、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに組み合わせ感染及びインビボ組換えによる高い親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生を記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替案である。
【０１２３】
ＤＮＡは、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって修飾されてもよいし（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって修飾されてもよい。
【０１２４】
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに置換されるか、またはそれらは、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【０１２５】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。
【０１２６】
（ｉｉ）ヒト化抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野において記載されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって行ってもよい。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている、キメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基、かつ可能性としてはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１２７】
ヒト化抗体を作製するのに使用される軽及び重の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列が、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽または重鎖可変領域の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するの特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用されてもよい（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【０１２８】
抗体は、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、本方法のいくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念上のヒト化生成物の分析プロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、そして当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの精査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このように、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性等の所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせてもよい。概して、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的に、かつ最も実質的に関与している。
【０１２９】
（ｉｉｉ）ヒト抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。ヒト化の代替物として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、免疫化すると内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。かかる生殖系突然変異マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原攻撃に際してヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）、及び米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号、及び第５，５４５，８０７号を参照のこと。
【０１３０】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及び抗体断片をインビトロで産生してもよい。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄ等の糸状バクテリオファージの主要または非主要なコートポリペプチド遺伝子中にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択により、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらされる。したがって、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで行い得る。それらの概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用してもよい。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの膵臓に由来するＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多種多様なアレイを単離した。免疫されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築してもよく、そして多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、本質的にＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載の技術に従って単離してもよい。米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号も参照のこと。
【０１３１】
また、ヒト抗体は、インビトロで活性化Ｂ細胞によって生成されてもよい（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【０１３２】
（ｉｖ）抗体断片
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。抗体断片を産生するための様々な技術が開発されている。従来は、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化により誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は、現在では、組換え宿主細胞により直接産生されてもよい。例えば、抗体断片は、上記で考察される抗体ファージライブラリーから単離され得る。代替法として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収されてもよく、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成してもよい（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離されてもよい。抗体断片を産生するための他の技術は、当業者に明らかである。他の実施形態では、選り抜きの抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、「線状抗体」であってもよい。かかる線状抗体断片は、単一特異性であっても、または二重特異性であってもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の断片が提供される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディからなる群より選択される。
【０１３４】
（ｖ）二重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、二重特異性抗体結合アームは、細胞に対する細胞防御機序に集中するために、白血球上の誘発分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）、またはＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組合され得る。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製されてもよい。
【０１３５】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野で公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）が１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、それらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常は親和性クロマトグラフィーステップにより行われる正しい分子の精製は、やや煩雑であり、生成物収率は低い。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１３６】
異なるアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。いくつかの実施形態では、融合は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。いくつかの実施形態では、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物のうちの少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合物と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時トランスフェクトされる。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不等比率が最適収率をもたらす実施形態では、３つのポリペプチド断片の相互比率の調整において優れた柔軟性が提供される。しかしながら、等比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高収率がもたらされる場合、またはそれらの比率が特に重要ではない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１３７】
このアプローチのいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームに（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対からなる。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するため、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物の望ましくない免疫グロブリン鎖組み合わせからの分離を容易にすることが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１３８】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載される別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にしてもよい。いくつかの実施形態では、界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きな側鎖（複数可）と同一または同様の大きさの補償的な「空洞」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）と置き換えることによって、第２の抗体分子の界面上に作り出される。これは、ホモ二量体等の他の望ましくない最終産物を上回るヘテロ二量体の収率を増大するための機序を提供する。
【０１３９】
二重特異性抗体としては、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方がアビジンにカップリングし得、他方がビオチンにカップリングし得る。かかる抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞の標的とするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染を処置するために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及び欧州特許第０３０８９号）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製されてもよい。適切な架橋剤が当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１４０】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術もこの文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクト抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載している。これらの断片を、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接ジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つを、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用されてもよい。
【０１４１】
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製及び単離するための様々な技術についても記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生にも利用してもよい。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機序を提供している。この断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用して二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１４２】
２価を上回る抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製されてもよい。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１４３】
（ｖｉ）多価抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、多価抗体である。多価抗体は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（及び／または異化）され得る。本明細書に提供される抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する（ＩｇＭクラス以外の）多価抗体（例えば、四価抗体）であってもよく、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生され得る。多価抗体は、二量体化ドメイン、及び３つ以上の抗原結合部位を含んでもよい。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれらからなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端側に３つ以上の抗原結合部位とを含む。本明細書において好ましい多価抗体は、３〜約８個、ただし好ましくは４個の抗原結合部位を含む（またはそれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、このポリペプチド鎖（複数可）は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでもよく、ここで、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、以下を含んでもよい：ＶＨ−ＣＨ１−可動性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖、またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖。本明細書における多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ（また好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書における多価抗体は、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでもよい。本明細書に企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、必要に応じて、ＣＬドメインをさらに含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、抗体は、多重特異性抗体である。多重特異性抗体の例としては、限定するものではないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体（ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する）、２つ以上のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体（各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合する）、２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体（各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する）、全長抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重機能性抗体、共有結合または非共有結合している抗体断片が挙げられる。いくつかの実施形態では、その抗体は、ポリエピトープ特異性、例えば、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、その抗体は、単一特異性、例えば、１つのエピトープにのみ結合する抗体である。一実施形態によれば、多重特異性抗体は、５μＭ〜０．００１ｐＭ、３μＭ〜０．００１ｐＭ、１μＭ〜０．００１ｐＭ、０．５μＭ〜０．００１ｐＭ、または０．１μＭ〜０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。
【０１４５】
（ｖｉｉ）他の抗体修飾
例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本明細書に提供される抗体を修飾することが望ましい場合がある。これは、１つ以上のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域内に導入することによって達成され得る。あるいはまたは加えて、システイン残基（複数可）を、Ｆｃ領域内に導入して、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にしてもよい。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力、及び／または増加した補体媒介性細胞殺滅及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載される、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それにより、増強された補体媒介溶解及びＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を操作してもよい。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１４６】
抗体の血清半減期を増大するために、アミノ酸代替物を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００６／００６７９３０に記載される抗体において作製してもよい。
【０１４７】
（Ｂ）ポリペプチド変異体及び修飾
本明細書に記載の抗体を含むポリペプチドのアミノ酸配列修飾（複数可）は、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、抗体）を精製する方法で使用され得る。
【０１４８】
（ｉ）変異体ポリペプチド
「ポリペプチド変異体」とは、ポリペプチドの全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、本明細書に定義されるポリペプチド、好ましくは活性ポリペプチドを意味する。かかるポリペプチド変異体としては、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に付加または欠失されたポリペプチドが挙げられる。通常、ＴＡＴポリペプチド変異体は、全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のうちの任意のアミノ酸配列同一性を有する。通常、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して１つ以下の保存的アミノ酸置換を有し、あるいは天然ポリペプチド配列と比較して約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個のうちの任意の個数以下の保存的アミノ酸置換を有する。
【０１４９】
変異体ポリペプチドは、Ｎ末端もしくはＣ末端で切断されてもよいし、または例えば、全長天然ポリペプチドと比較して、内部残基を欠く場合もある。ある特定の変異体ポリペプチドは、所望の生物学的活性にとって不可欠ではないアミノ酸残基を欠き得る。切断、欠失、及び挿入を有するこれらの変異体ポリペプチドは、任意の多数の従来の技術のうちのいずれかによって調製され得る。所望の変異体ポリペプチドは、化学的に合成されてもよい。別の適切な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望の変異体ポリペプチドをコードする核酸断片の単離及び増幅することを伴う。核酸断片の所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’プライマー及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、変異体ポリペプチドは、本明細書に開示される天然ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／または免疫学的活性を共有する。
【０１５０】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体の血清半減期を増大する酵素またはポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が挙げられる。
【０１５１】
例えば、ポリペプチドの結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかる修飾としては、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するためになされるが、ただし、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸変化は、ポリペプチド（例えば、抗体）の翻訳後プロセスも改変し得、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化し得る。
【０１５２】
どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を及ぼすことなく挿入、置換、または欠失され得るかを決定する際の手引きは、ポリペプチドの配列を同種の既知のポリペプチド分子の配列と比較すること、及び相同性の高い領域にできたアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることによって見出され得る。
【０１５３】
変異誘発の好ましい位置であるポリペプチド（例えば、抗体）のある特定の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基または標的残基群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置き換えられて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置は、さらなるまたは他の変異体を置換部位に、またはそこの代わりに導入することにより洗練される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されている一方で、変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異生成を標的コドンまたは領域で実行し、発現された抗体変異体を所望の活性に関してスクリーニングする。
【０１５４】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基に置き換えられた抗体分子内に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発に関する最も関心ある部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変も企図される。保存的置換は、「保存的置換」という見出しで下の表１に示される。かかる置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的な置換」と表示されるか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される、さらに実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされ得る。
表１
2019530857.tif 000003
【０１５５】
ポリペプチドの生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域中のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくは螺旋立体配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、を維持するそれらの効果において大いに異なる置換を選択することによって達成される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従って群分けされ得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０１５６】
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群分けされてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１５７】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０１５８】
抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基も概してセリンで置換されて、分子の酸化的安定性が改善され、異常な架橋が阻止され得る。逆に、システイン結合（複数可）をポリペプチドに付加して、その安定性を改善してもよい（特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。
【０１５９】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。概して、さらなる開発のために選択されて得られた変異体（複数可）は、それらが生成される親抗体に対して改善された生物学的特性を有する。かかる置換変異体を生成するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）を、各部位に全ての可能なアミノ置換を生成するために突然変異する。このように生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として糸状ファージ粒子からの一価様式で表示される。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示されるそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング突然変異生成を行い、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を特定してもよい。あるいは、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と標的との間の接触点を特定することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述される技術に従う置換の候補である。かかる変異体が生成されると、変異体のパネルが本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体がさらなる開発のために選択され得る。
【０１６０】
ポリペプチドの別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。ポリペプチドは、非アミノ酸部分を含み得る。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化されてもよい。かかるグリコシル化は、宿主細胞もしくは宿主生物でのポリペプチドの発現中に天然に生じてもよいし、またはヒト介入に起因する計画的な修飾であってもよい。改変とは、ポリペプチドに見られる１つ以上の炭水化物部分の欠失、及び／またはポリペプチド中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
【０１６１】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド内でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化は、糖類であるＮ−アセイルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。
【０１６２】
グリコシル化部位のポリペプチドへの付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。改変は、（Ｏ連結グリコシル化部位のための）元の抗体の配列への１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはそれによる置換によっても行われ得る。
【０１６３】
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的に、またはグリコシル化の標的としての機能を果たすアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって達成され得る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【０１６４】
他の修飾としては、グルタミニル及びアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１６５】
（ｉｉ）キメラポリペプチド
本明細書に記載のポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。かかるエピトープタグ形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリックスを使用してポリペプチドが親和性精製によって容易に精製されることも可能になる。
【０１６６】
代替的な実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合を含み得る。二価の形態のキメラ分子は、「イムノアドヘシン」と称される。
【０１６７】
本明細書に使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種ポリペプチドの結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせている、抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、「異種の」）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的に、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む連続したアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得られ得る。
【０１６８】
Ｉｇ融合物は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、可溶性の（膜貫通ドメインが欠失または不活性化されている）形態のポリペプチドの置換を含む。特定の好ましい実施形態では、免疫グロブリン融合体には、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域が含まれる。
【０１６９】
（ｉｉｉ）ポリペプチドコンジュゲート
ポリペプチド製剤において使用するためのポリペプチドは、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）とコンジュゲートされてもよい。
【０１７０】
かかるコンジュゲートの生成において有用な化学療法剤を使用してもよい。さらに、使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。多様な放射性同位体は、放射性複合ポリペプチドの産生のために利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。ポリペプチドと細胞毒性剤とのコンジュゲートは、多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジル等）、アルデヒド（グルタレルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製してもよい。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、ポリペプチドへの放射性ヌクレオチドのコンジュゲージョンのための例示的なキレート剤である。
【０１７１】
ポリペプチドと、１つ以上の小分子毒素、例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテン、及びＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有する、これらの毒素の誘導体とのコンジュゲートがまた、本明細書において企図される。
【０１７２】
マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木であるＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された。その後、特定の微生物もまた、マイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステル等のマイタンシノイドを産生することが発見された。合成マイタンシノールならびにその誘導体及び類似体もまた、企図される。ポリペプチド−マイタンシノイドコンジュゲートを作製するための当該技術分野で公知の多くの連結基があり、これには、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号に開示されているものを含む。連結基としては、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光不安定性基、ペプチターゼに不安定な基、またはエステラーゼに不安定な基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１７３】
結合の種類に応じて、リンカーが様々な位置でマイタンシノイド分子に結合され得る。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応によって形成され得る。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾したＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾したＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じ得る。好ましい実施形態では、結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノール類似体のＣ−３位に形成される。
【０１７４】
目的の別のコンジュゲートは、１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされたポリペプチドを含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモルを下回る濃度で二本鎖ＤＮＡの切断をもたらし得る。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、例えば、米国特許第５，７１２，３７４号を参照のこと。使用され得るカリケアマイシンの構造類似体としては、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ１Ｉが挙げられる。抗体がコンジュゲートされ得る別の抗腫瘍薬物は、抗葉酸剤であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡはともに、作用の細胞内部位を有し、原形質膜と容易に交差しない。したがって、ポリペプチド（例えば、抗体）媒介性内部移行を通したこれらの薬剤の細胞取り込みによって、それらの細胞毒性効果が大いに増強される。
【０１７５】
本明細書に記載されるポリペプチドにコンジュゲートされ得る他の抗腫瘍薬剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシル、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体に既知の薬剤ファミリー、ならびにエスペラミシンが挙げられる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドと核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ、またはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ）との間のコンジュゲートであり得る。
【０１７７】
さらに別の実施形態では、ポリペプチド（例えば、抗体）は、腫瘍前標的化において利用するために「受容体」（ストレプトアビジン等）とコンジュゲートさせてもよく、この場合、ポリペプチド受容体コンジュゲートが患者に投与され、続いて除去剤を使用して血液循環から非結合コンジュゲートが除去された後、細胞毒性薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）とコンジュゲートされている「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤）を活性抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートしてもよい。免疫コンジュゲートの酵素構成成分としては、プロドラッグにおいて、それをより活性な細胞毒性形態に変換するような方法で作用し得る任意の酵素が含まれる。
【０１７９】
有用である酵素としては、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ、硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ、無毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物である、５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ、ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）等のプロテアーゼ、Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ等の炭水化物切断酵素、β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ、ならびにアミン窒素において、フェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基でそれぞれ誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ等のペニシリンアミダーゼが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、「アブザイム」としても当技術分野で公知の酵素活性を有する抗体が、プロドラッグを遊離活性薬物に変換するために使用され得る。
【０１８０】
（ｉｖ）その他
ポリペプチドの別の種類の共有結合修飾は、ポリペプチドを様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーのうちの１つに連結することを含む。ポリペプチドはまた、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル）中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、またはマイクロエマルジョン中に封入され得る。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｅｄ．，（１９９０）において開示されている。
【０１８１】
ＩＶ．製剤における使用のためのポリペプチドの取得及び方法
本明細書に記載される分析方法で使用されるポリペプチドは、組換え方法を含む、当技術分野で周知の方法を使用して得られ得る。以下のセクションは、これらの方法に関する手引きを提供する。
【０１８２】
（Ａ）ポリヌクレオチド
本明細書で同義に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
【０１８３】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドｍＲＮＡを保有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられている組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含むが、これに限定されない、任意の供給源から得られ得る。したがって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得られ得る。ポリペプチドをコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから、または公知の合成手順（例えば、自動核酸合成）によっても得られ得る。
【０１８４】
例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖または重鎖等の全体の免疫グロブリン分子鎖をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく、重鎖定常領域（ＣＨ）も含み、これは典型的には以下の３つの定常ドメインを含む：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、及び「ヒンジ」領域。場合によっては、定常領域の存在が望ましい。
【０１８５】
ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドとしては、抗原結合抗体断片、例えば、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２及び「ミニボディ」が挙げられる。ミニボディは（通常は）二価抗体断片であり、これからＣＨ１及びＣＫまたはＣＬドメインが切り出されている。ミニボディは、従来の抗体より小さいので、それらは臨床／診断用途では良好な組織浸透を達成するはずであるが、二価であって、ｄＡｂのような一価抗体断片よりも高い結合親和性を保持しなければならない。したがって、別途文脈が規定しない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、全ての抗体分子だけでなく、上記で考察される型の抗原結合抗体断片も包含する。好ましくは、コードされたポリペプチド中に存在する各フレームワーク領域は、対応するヒト受容体フレームワークに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。したがって、例えば、フレームワーク領域は、受容体フレームワーク領域に対して、合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換を含み得る。
【０１８６】
Ｖ．例示的な実施形態
実施形態１．いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の前記非イオン性サーファクタントを定量する方法であって、定量中の前記非イオン性サーファクタントと前記ポリペプチドとの間の干渉が低減される方法が提供され、ここで、前記方法は以下のステップを包含する：
ａ）前記組成物をミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、ここで前記組成物は移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で前記クロマトグラフィー材料上にロードされ、移動相Ａは水中の酸を含み、移動相Ｂはメタノール中の酸を含み、ここで前記ポリペプチドは前記クロマトグラフィー材料に特異的及び非特異的に結合するステップと、
ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料から前記ポリペプチドを溶出させ、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率はステップａ）と比較して増大しているステップと、
ｃ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて前記クロマトグラフィー材料から前記非イオン性サーファクタント及び前記非特異的に結合したポリペプチドを溶出し、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率はステップｃ）と比較して増大しているステップと、
ｄ）前記非イオン性サーファクタントを定量し、ここで、定量中の前記非イオン性サーファクタントと前記ポリペプチドとの間の干渉は減少しているステップ。
【０１８７】
実施形態２．実施形態１のいくつかのさらなる実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、約１０：９０である。
【０１８８】
実施形態３．実施形態１または２のいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｂ）において約４０：６０に増大される。
【０１８９】
実施形態４．実施形態１〜３のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｃ）において約１００：０に増大される。
【０１９０】
実施形態５．実施形態１〜４のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ａは、水中に約２％の酸を含む。
【０１９１】
実施形態６．実施形態１〜５のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂは、メタノール中に約２％の酸を含む。
【０１９２】
実施形態７．実施形態１〜６のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記酸は、ギ酸である。
【０１９３】
実施形態８．実施形態１〜６のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記酸は、酢酸である。
【０１９４】
実施形態９．実施形態１〜８のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記クロマトグラフィーの流速は、約１．２５ｍＬ／分である。
【０１９５】
実施形態１０．実施形態９のいくつかのさらなる実施形態では、ステップｂ）は、前記クロマトグラフィーが開始されてから約１分後に始まり、前記クロマトグラフィーが開始されてから約３．４分後に終わる。
【０１９６】
実施形態１１．実施形態９または１０のいくつかのさらなる実施形態では、ステップｃ）は、前記クロマトグラフィーが開始されてから約３．５分後に始まり、前記クロマトグラフィーが開始されてから約４．６分後に終わる。
【０１９７】
実施形態１２．実施形態１〜１１のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記非イオン性サーファクタントはポロキサマー（Ｐ１８８）またはポリソルベートである。
【０１９８】
実施形態１３．実施形態１２のいくつかのさらなる実施形態では、前記ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。
【０１９９】
実施形態１４．実施形態１〜１３のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物中の前記非イオン性サーファクタントの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【０２００】
実施形態１５．実施形態１〜１４のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物中のタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。
【０２０１】
実施形態１６．実施形態１〜１５のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。
【０２０２】
実施形態１７．実施形態１〜１６のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物は、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。
【０２０３】
実施形態１８．実施形態１〜１７のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。
【０２０４】
実施形態１９．実施形態１〜１８のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。
【０２０５】
実施形態２０．実施形態１６のいくつかのさらなる実施形態では、前記治療用ポリペプチドは、融合タンパク質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。
【０２０６】
実施形態２１．実施形態１〜２０のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陰イオン交換ポリマーを含む。
【０２０７】
実施形態２２．実施形態１〜２１のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級アミン部分を含む。
【０２０８】
実施形態２３．実施形態１〜２２のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。
【０２０９】
実施形態２４．実施形態１〜２３のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。
【０２１０】
実施形態２５．実施形態１〜２４のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。
【０２１１】
実施形態２６．実施形態１〜２５のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸクロマトグラフィー材料である。
【０２１２】
実施形態２７．実施形態１〜２６のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【０２１３】
実施形態２８．いくつかの実施形態では、非イオン性サーファクタント及びポリペプチドを含む組成物中の前記非イオン性サーファクタントを定量する方法が提供され、ここで、前記方法は以下のステップを包含する：
ａ）前記組成物をミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用するステップであって、前記組成物を移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液中で前記クロマトグラフィー材料にロードし、移動相Ａが水中の水酸化アンモニウムを含み、移動相Ｂが有機溶媒中の水酸化アンモニウムを含むステップと、
ｂ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料から前記ポリペプチドを溶出させ、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率はステップａ）と比較して増大しているステップと、
ｃ）移動相Ａ及び移動相Ｂを含む溶液を用いて前記クロマトグラフィー材料から前記非イオン性サーファクタントを溶出し、ここで移動相Ｂ対移動相Ａの比率はステップｃ）と比較して増大しているステップと、
ｄ）前記非イオン性サーファクタントを定量するステップ。
【０２１４】
実施形態２９．実施形態２８のいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂの前記有機溶媒は、メタノールである。
【０２１５】
実施形態３０．実施形態２８または２９のいくつかのさらなる実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、約１０：９０である。
【０２１６】
実施形態３１．実施形態２８〜３０のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｂ）において約４５：５５に増大される。
【０２１７】
実施形態３２．実施形態２８〜３１のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｃ）において約１００：０に増大される。
【０２１８】
実施形態３３．実施形態２８〜３２のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ａは、水中に約２％の水酸化アンモニウムを含む。
【０２１９】
実施形態３４．実施形態２８〜３３のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂは、メタノール中に約２％の水酸化アンモニウムを含む。
【０２２０】
実施形態３５．実施形態２８〜３４のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、クロマトグラフィーの流速は、約１．４ｍＬ／分である。
【０２２１】
実施形態３６．実施形態３５のいくつかのさらなる実施形態では、ステップｂ）は、前記クロマトグラフィーが開始されてから約１分後に始まり、前記クロマトグラフィーが開始されてから約４．４分後に終わる。
【０２２２】
実施形態３７．実施形態３５または３６のいくつかのさらなる実施形態では、ステップｃ）は、前記クロマトグラフィーが開始されてから約４．５分後に始まり、前記クロマトグラフィーが開始されてから約７．６分後に終わる。
【０２２３】
実施形態３８．実施形態２８〜３７のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記非イオン性サーファクタントはポリソルベートである。
【０２２４】
実施形態３９．実施形態３８のいくつかのさらなる実施形態では、前記ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。
【０２２５】
実施形態４０．実施形態３８または３９のいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【０２２６】
実施形態４１．実施形態２８のいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂの前記有機溶媒は、アセトニトリルである。
【０２２７】
実施形態４２．実施形態４１のいくつかのさらなる実施形態では、ステップａ）における移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、約１０：９０である。
【０２２８】
実施形態４３．実施形態４１または４２のいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｂ）において約４０：６０に増大される。
【０２２９】
実施形態４４．実施形態４１〜４３のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂ対移動相Ａの比率は、ステップｃ）において１００：０に増大される。
【０２３０】
実施形態４５．実施形態４１〜４４のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ａは、水中に約２％の水酸化アンモニウムを含む。
【０２３１】
実施形態４６．実施形態４１〜４５のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、移動相Ｂは、アセトニトリル中に約２％の水酸化アンモニウムを含む。
【０２３２】
実施形態４７．実施形態４１〜４６のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記非イオン性サーファクタントはポロキサマーである。
【０２３３】
実施形態４８．実施形態４８のいくつかのさらなる実施形態では、前記ポロキサマーは、ポロキサマーＰ１８８である。
【０２３４】
実施形態４９．実施形態４８または４９のいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物中のポロキサマーの濃度は、約０．００１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲にある。
【０２３５】
実施形態５０．実施形態２８〜４９のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物はさらにＮ−アセチルトリプトファン及び／またはメチオニンを含む。
【０２３６】
実施形態５１．実施形態５０のいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物中のＮ−アセチルトリプトファンの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。
【０２３７】
実施形態５２．実施形態５０のいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物中のメチオニンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である。
【０２３８】
実施形態５３．実施形態２８〜５２のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。
【０２３９】
実施形態５４．実施形態２８〜５３のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。
【０２４０】
実施形態５５．実施形態２８〜５４のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物は、安定剤、緩衝液、及び等張化剤からなる群より選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。
【０２４１】
実施形態５６．実施形態２８〜５５のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記組成物は、対象への投与に適切な薬学的製剤である。
【０２４２】
実施形態５７．実施形態２８〜５６のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。
【０２４３】
実施形態５８．実施形態５７のいくつかのさらなる実施形態では、前記治療用タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、糖鎖操作抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物コンジュゲートである。
【０２４４】
実施形態５９．実施形態２８〜５８のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、逆相の強陽イオン交換ポリマーを含む。
【０２４５】
実施形態６０．実施形態２８〜５９のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホン酸部分を含む。
【０２４６】
実施形態６１．実施形態２８〜６０のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、固体支持体を含む。
【０２４７】
実施形態６２．実施形態２８〜６１のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに含まれる。
【０２４８】
実施形態６３．実施形態２８〜６２のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）材料である。
【０２４９】
実施形態６４．実施形態２８〜６３のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記ミックスモード陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸクロマトグラフィー材料である。
【０２５０】
実施形態６５．実施形態２８〜６４のいずれか１つのいくつかのさらなる実施形態では、前記非イオン性界面活性剤は、蒸発光散乱法（ＥＬＳＤ）によって、または荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用することによって定量される。
【０２５１】
本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。したがって、別途明確に示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。
【０２５２】
本発明のさらなる詳細が、以下の非限定的な実施例により例示されている。本明細書における全ての参考文献の開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０２５３】
以下の実施例は、単に本発明の例示となるよう意図されており、したがって、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定するものではなく、例証として提供されている。
【０２５４】
実施例の材料及び方法
以下の材料及び方法を、特に断りのない限り、実施例に使用した。
【０２５５】
材料
全てのｍＡｂ（Ａ１〜Ａ２０）は、安定したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株または大腸菌細胞を使用して製造した。
【０２５６】
Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジ（２．１×２０ｍｍ、３０μｍ粒径、ＰＮ＃１８６００２０５２）及びＷａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸカートリッジ（２．１×２０ｍｍ、３０μｍ粒径、ＰＮ＃１８６００２０５１）を、Ｗａｔｅｒｓから購入した。ポリソルベート２０は、Ｓｉｇｍａから入手した（Ｐ／Ｎ  Ｔ２７００−１００ＭＬ）。ギ酸はＦｌｕｋａから入手した（Ｐ／Ｎ  ９４３１８−２５０ＭＬ−Ｆ）。ＨＰＬＣグレードの氷酢酸は、ＪＴ  Ｂａｋｅｒから入手した（Ｐ／Ｎ  ９５１５−０３）。ＨＰＬＣグレードのイソプロパノール（Ｐ／Ｎ  ＰＸ１８３４−１）及びメタノール（Ｐ／Ｎ  ＭＸ０４８８−１）は、ＯｍｎｉＳｏｌｖから入手した。ＨＰＬＣグレードの水は、ＨｏｎｅｙＷｅｌｌから入手した（カタログ番号３６５−４）。２７〜３１％のアンモニア溶液は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した（Ｐ／Ｎ  ＡＭ１８０）。
【０２５７】
実施例１．最適化
必要とされているのは、タンパク質干渉を排除し、全てのＨＰＬＣカートリッジロットにわたって一貫したＰＳ２０定量を得るためのさらにロバストな解決法である。出発点として、本発明の方法を用いて他の分子を評価する前に、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）製剤を用いて以前の方法に対する修飾の有効性を評価した。実験の目的は、タンパク質からの干渉を最小化または完全に除去することによって、複数の製品製剤にわたってＰＳ２０のロバストな定量を可能にするＰＳアッセイを開発し、本発明のアッセイが、カートリッジの複数のロットにまたがるロバストネスを含め、以前のアッセイと比較してＰＳ２０定量の正確性及び再現性を改良することを実証し、ならびに選択された製品処方におけるＰＳ２０の正確性、精度、特異性、再現性、及び中間精度を評価するための認定研究を実施することであった。
【０２５８】
方法
全ての実験で、以下のＥＬＳＤ設定を使用した：
光源強度（ＬＥＤ）は７５％に設定した
検出器ゲイン（ＰＭＴ）は１に設定した
【０２５９】
ＨＰＬＣアッセイでは、ＰＳ２０エステルは、カートリッジに保持され、一方で他の賦形剤、タンパク質、及びエステル化されていないＰＳ２０種は、フロースルーまたは洗浄ステップで溶出する。洗浄ステップに続いて、切り換え弁を用いて蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）をインラインに配置し、エステル化ポリソルベート種を、より高い有機相％の段階勾配で溶出させる。エステル化されていないＰＳ２０種は、全ＰＳ２０組成の約２０％を占める（Ｈｅｗｉｔｔ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１８：２１３８−２１４５）。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤアッセイは、標準の調製に使用されるＰＳ２０のロットが試料中のＰＳ２０と比較して同量のＰＳ２０エステルを含有する限り、十分なＰＳ２０エステルのみを定量する。標準の同様のＰＳ２０エステル組成物は、等価プロトコル（Ｈｅｗｉｔｔ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１５：１５６−１６０）によって、または標準を作るために使用されるＰＳ２０のロットを試料で用いられるロットに合わせることによって保証され得る。
【０２６０】
方法０とも呼ばれる元の方法のＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ条件は、以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣ及びＶａｒｉａｎ  ３８０  ＥＬＳＤ、カートリッジは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ  ＭＡＸオンラインカートリッジであり、移動相Ａは、水中２％ギ酸であり、移動相Ｂは、イソプロパノール中２％ギ酸であり、流速は１ｍＬ／分であり、注入体積は２０μＬであった。使用した勾配を表２に示す。
表２：方法０の勾配
2019530857.tif 000004
【０２６１】
太字／下線付きのオリジナルからの変更を伴う、方法１とも呼ばれる最終的な方法を以下に要約する。表３はＬＣ勾配を示し、表４はこのアッセイの典型的な注入順序を示す。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ条件は以下のとおりであった：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣ及びＶａｒｉａｎ  ３８０  ＥＬＳＤ、カートリッジは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ  ＭＡＸオンラインカートリッジであり、移動相Ａは、水中２％ギ酸または水中２％酢酸であり、移動相Ｂは、イソプロパノール中２％ギ酸またはメタノール中２％酢酸であり、流速は１．２５ｍＬ／分であり、注入体積は２０μＬであった（ＰＳ２０濃度範囲依存性）。最終的な条件には、酢酸を最終的には選択したが、最初は移動相に２％ギ酸を使用していくつかの適格性及びロバストネス研究を行った。
表３：方法１の勾配
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表４：代表的な配列
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【０２６２】
方法最適化
１．最初に試みた条件：
方法１開発の過程において、タンパク質干渉の影響を最小にする目的で、最終的なメタノール系移動相が選択される前に、複数の異なる実験条件を評価した。これらの実験は表５に要約されている。
表５：他の試みられた解決法の概要（特に明記しない限り移動相のギ酸）
2019530857.tif 000007
【０２６３】
方法のロバストネスの実験
表６及び表７は、複数の製品にわたり方法のロバストネスを試験するために使用される生成物及びカートリッジを記載する。
表６：９つのカートリッジにまたがって方法の正確性を比較したときに試験した生成物
2019530857.tif 000008
表７：方法のロバストネスの試験に使用される吸着剤のバッチ及びロット
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【０２６４】
１．カートリッジ全体の方法のロバストネス：
表８は、２つの異なるカートリッジを使用して１２の参照標準（表９に示す）に対する方法の頑健性を評価するために使用されたカートリッジを記載する：一方は方法０において許容可能な特異性を示し、他方は方法０において許容できない特異性を示した。表８に示されているカートリッジ番号は、表７に示されている番号に対応している。
表８：複数の製品にまたがる方法のロバストネスを説明するために使用されるカートリッジ
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表９：参照標準パネル（２０μＬ注入）
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【０２６５】
方法認定
方法の認定は、直線性、正確性、精度（中間精度を含む）、及び特異性を評価することによって完了した。表１０は、中間精度に使用される機器とカートリッジを記載している。
表１０：中間精度のための条件
2019530857.tif 000012
【０２６６】
結果：
方法最適化
多段階勾配実験：
異なる移動相の評価中、ポリソルベートを典型的なタンパク質製剤の他の成分から完全に分離され得るか否かを決定するための方法が必要であった。この分析を実施するために、多段階勾配実験を実施した（図１）。これらの実験は、１０％有機溶媒中の２％揮発性酸（ギ酸、トリフルオロ酢酸、または酢酸のいずれか）からなる移動相でカートリッジを平衡化すること、移動相中の有機溶媒の濃度を５％ずつ増大させること、そして１分間、各濃度で保持してＰＳ２０定量方法の洗浄ステップをシミュレートすることを必要とした。９８％の有機（＋２％の揮発性酸）移動相に達するまで、これらの５％ステップを繰り返した。この方法の間、１ｍＬ／分の一定流速を維持した。これらの実験は、ＰＳ２０以外の製剤の全ての成分を完全に溶出する移動相組成を決定するためのＰＳ２０フリーのタンパク質の試料と、ＰＳ２０エステル種を溶出し始めた移動相組成を決定するための水中のＰＳ２０標準との両方を用いて行った。これら２つの移動相有機溶媒濃度を比較して、タンパク質マトリックス成分とポリソルベートエステルとを完全に分離する最適な移動相組成を見出し得るか否かを決定した。この最適な移動相組成物を使用して、カートリッジに保持されているかもしれないあらゆるタンパク質を、分析方法の洗浄ステップ中に除去してもよい。多段階勾配は、２つの理由で線形勾配よりも望ましいものであった。第一に、線形勾配は、この方法の洗浄ステップをシミュレートしない、そして第二に、線形勾配中に各成分の溶出を引き起こす離散的な移動相組成を決定することは困難である。
【０２６７】
多段階勾配実験によって、カートリッジからタンパク質を洗浄するがＰＳ２０エステル種を保持するのに最適なメタノール濃度は、４０％〜５０％であることが明らかになった（図１及び図２）。２％ギ酸が依然として移動相にあることが注目される。４０％及び５０％メタノール洗浄ステップの両方を試験したところ、両方ともがＡ１  ＡＤＣからのタンパク質干渉を排除した。４０％メタノール洗浄によるＰＳ２０ピーク面積は、５０％メタノール洗浄によるＰＳ２０ピークよりも平均３８％大きかった（ｎ＝８）。したがって、ＰＳ２０感度を改善するために４０％メタノールを選択した。５０％洗浄でのより低いピーク面積は、タンパク質洗浄ステップの間に、より疎水性の低いＰＳ２０エステルのいくつかが溶出したことを示し得るが、この可能性はさらに調査されることはなかった。
【０２６８】
図１は、典型的なステップ勾配重ね合わせ（ＰＳ２０フリー製品及びＰＳ２０標準）の一例を示す。この重ね合わせは、全てのタンパク質が４０％〜５０％のメタノールで溶出され、ＰＳ２０エステルが５０％のメタノールで溶出し始めることを示している。ＨＰＬＣとＥＬＳＤの間のバルブは、検出器の飽和を避けるために、タンパク質試料の最初の１分間は切り換えモードであることに注意のこと。ＰＳ２０標準に示されている複数のピークは、疎水性が増す順にカートリッジから溶出する、様々なポリソルベート種に起因する可能性が最も高い。各段階変化で溶出する異なるタンパク質ピークは、特徴付けられていない。この重ね合わせは、ＰＳ２０エステルを保持しながら、カートリッジからタンパク質を洗い流すのに最適なメタノール濃度を見つけるための迅速な方法を提供する。
【０２６９】
タンパク質及びＰＳ２０領域の溶出をメタノールと比較するために、イソプロパノールを使用して多段階勾配実験を繰り返した。図２は、２つの異なるカートリッジ上のＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ及びＰＳ２０標準についてのメタノール及びイソプロパノールの異なる多段階溶出プロファイルを示す。最初のカートリッジ（トレース１）は以前に評価されており、最初のカートリッジは、方法０（トレース１）で正常に実行されたが、２番目のカートリッジは最適ではなかった（トレース２）。イソプロパノールを用いた多段階勾配実験によって、洗浄ステップにおける最適イソプロパノール濃度が２０％であることが示された。これは、１〜３．４分の２０％イソプロパノール洗浄を使用する方法０と一致している。しかし、イソプロパノール洗浄によるタンパク質とＰＳ２０エステルとの分離は、異なるカートリッジ間で一貫しておらず、カートリッジごとのタンパク質干渉の変動性を示している。特定のカートリッジ（例えば、図２で使用されたカートリッジ）では、タンパク質の一部がＰＳ２０エステルと同じイソプロパノール濃度で溶出した。この挙動は、これらの特定のカートリッジがイソプロパノール法でＰＳ２０を定量するときに著しい量のタンパク質干渉を示すことを示し、そしてこの効果は実験的に確認された。
【０２７０】
図２の下のパネルとは対照的に、上のパネルは、異なるカートリッジ上のメタノール多段階勾配が、４０％メタノール段階及び５０％メタノールで始まるＰＳ２０エステルによって一貫して全てのタンパク質を溶出したことを示し、イソプロパノール段階勾配と比較してＰＳ２０領域に対するタンパク質領域のより広い分離ウインドウが示されている。この結果、４０％メタノール洗浄液を使用すると、ＰＳ２０エステルからタンパク質を一貫して分離し、これによってカートリッジ間のＰＳ２０定量の変動性を減少させることが示された。
【０２７１】
多段階勾配実験を使用して、異なるカートリッジ及び移動相組成にわたるＰＳ２０とタンパク質との分離を迅速に評価した（図１及び図２）。
【０２７２】
このアプローチは、ＰＳ２０アッセイのための洗浄条件を首尾よく決定し、そして異なるカートリッジ及び移動相を使用する他の分析物の分離のための洗浄ステップの有効性を評価するために潜在的に使用され得る。
【０２７３】
実験のデザイン：
ギ酸を含有する修正ＰＳ２０法を最適化するために、２水準の実験完全実施要因計画（２  ｌｅｖｅｌ  ｆｕｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）（ＤｏＥ）を使用した。検査したパラメーターは、以下のとおりであった：
洗浄ステップ中のメタノール濃度（４０％、５０％）
洗浄時間（１．８分、３．０分）
流速（０．７５ｍＬ／分、１．２５ｍＬ／分）
ロードされたＰＳ２０の質量（４μｇ、１２μｇ）
【０２７４】
「洗浄」ステップとは、カートリッジからいずれの残留タンパク質も洗い流すために有機濃度が一定に保たれるＨＰＬＣ法の一部を指すことに留意されたい。２水準の完全実施要因順列に加えて、中点（４５％の有機洗浄、２．４分の洗浄期間、１ｍＬ／分の流速、８μｇのＰＳ２０ロード）を、シーケンスの最初と最後に試験した。この実験は、以下の３つの試料について別々に実施した：水中のＰＳ２０、ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ、及びＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣにスパイクされたＰＳ２０。ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ試料に関しては、ＰＳ２０ロードのパラメーターは適用しなかった。
【０２７５】
最適化に使用した基準は以下のとおりであった：
ＰＳ２０の保持時間でタンパク質の干渉を最小限に抑える（ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ試料についてのみ）
タンパク質とＰＳ２０ピークとの間の分解能を最大にする（ＰＳ２０＋Ａ１  ＡＤＣ試料用）
ＰＳ２０のピーク幅を１０％のピーク高さで最小にする（水試料中のＰＳ２０）
ＰＳ２０ピーク面積を最大にする（水試料中のＰＳ２０）
【０２７６】
ＤｏＥの結果によって、試験した全ての条件がタンパク質干渉を排除することが示された。ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣを注入したとき、タンパク質干渉は観察されなかった。同様に、タンパク質とＰＳ２０ピークとの間の分解能は、分解能が以下の式（式１）によって計算される全ての場合について３よりも大きいことが見出された。
方程式１：分解能
2019530857.tif 000013
【０２７７】
ここで、ｔは各ピークの保持時間であり、Ｗ５０％は、５０％の高さでのピーク幅である。
【０２７８】
試験した全ての条件についてタンパク質の干渉または分解能に対する影響は観察されなかったので、ＰＳ２０のピーク面積及び幅は感度及びピーク形状に関して最適化された。ＰＳ２０ピーク面積及び幅に対する流速、メタノール洗浄濃度及び洗浄時間の影響のまとめを図３に示す。流速を上げるとＰＳ２０ピーク幅が狭くなり、洗浄ステップでメタノール濃度を５０％から４０％に下げると、ＰＳ２０ピーク面積が３８％増えた。５０％メタノール洗浄では、追加のＰＳ２０ピークが、エステル化されていないＰＳ２０種よりも遅い保持時間で、洗浄ステップ中に溶出し、この追加のピークは、より疎水性の低いＰＳ２０エステルのより早い溶出によるものと疑われる。最も関連性のある所見は、ＰＳ２０ピーク面積が洗浄相中のＭｅＯＨ濃度の増大と共に減少し、そして流速の増大がピーク幅を低下させるということであった。
【０２７９】
４０％メタノール洗浄と５０％メタノール洗浄の比較を図４に示す。約１．８〜３．５分からのこの追加のピークは、４５％メタノール洗浄では存在しなかった。試験したＰＳ２０ロードはいずれの評価基準にも影響を及ぼさないことが分かった。最低メタノール洗浄濃度（４０％）、最高流速（１．２５ｍＬ／分）、及び中間点洗浄時間（２．４分）を、方法１の最適化パラメーターとして選択した。選択した最終条件を表３に示す。
【０２８０】
方法のロバストネスの実験
多段階勾配実験を用いて、最適なメタノール洗浄濃度を一旦、決定すれば、方法１（ギ酸＋メタノール）を、方法０（ギ酸＋イソプロパノール）と比較して改善について試験した。
【０２８１】
生成物全体の方法のロバストネス
方法１（ギ酸＋メタノール）と方法０（ギ酸＋イソプロパノール）との間のタンパク質干渉の影響をさらに比較するために、ＰＳ２０を、２つのカートリッジを使用して１２の異なる参照標準において定量した。カートリッジは、１つのカートリッジ（カートリッジ１）が許容可能であるとみなされ、方法０で正確な結果が得られるように、かつ１つのカートリッジ（カートリッジ５）が方法０で高レベルのタンパク質干渉に起因して許容できないとみなされるように、選択した。この実験の目的は、方法１が、複数の生成物に対する「許容」カートリッジと「非許容」カートリッジとの間の変動をどの程度減少させたかを示すことであった。各方法を用いたＰＳ２０定量の一貫性を、それぞれ表８及び表９の方法に記載されたカートリッジ及び参照標準について比較した。
【０２８２】
各方法について参照標準及びそれらの測定されたＰＳ２０濃度を表１１に列挙する。各参照標準についてＡのＣに列挙されたＰＳ２０濃度は、スパイクされた試料の場合のように理論値として扱うことができないため、各方法の正確性は計算されなかった。したがって、各方法の正確性は、これらの参照標準に対して評価することはできない。
表１１：方法の比較：種々の参照標準についての測定されたＰＳ２０濃度におけるカートリッジ間の相違
2019530857.tif 000014
＊ＦＡ＝ギ酸
＊＊各方法のＰＳ２０定量における絶対相違％は、式２で計算される。
【０２８３】
表１１のデータによって、移動相にメタノールを使用した２つのカートリッジ間のＰＳ２０定量の相違が一貫して５％未満であることが示される。対照的に、移動相にイソプロパノールを使用した場合のＰＳ２０定量の相違は、カートリッジ間の変動の程度がはるかに大きいことを示している。方法０（ギ酸＋イソプロパノール）は、カートリッジの変動に対してさらに敏感である。表１１のデータによって、移動相においてギ酸＋メタノールを使用すると、カートリッジが方法０でどのように実行されるかにかかわらず、全ての生成物で異なるカートリッジにまたがってより一貫したＰＳ２０定量が得られることが示される。ＰＳ２０定量における絶対相違％は、方程式２を使用して算出した：
方程式２：ＰＳ２０定量における絶対相違％
｜１００×（［カートリッジ５濃度］−［カートリッジ１濃度］）／［カートリッジ１濃度］｜
【０２８４】
カートリッジ全体の方法のロバストネス
方法０及び方法１（ギ酸＋メタノール）を、４つの生成物を有する９つのカートリッジにまたがって両方の条件を試験することによって比較した。各生成物の目標製剤濃度の５０％で、ＰＳ２０をＰＳ２０フリーのタンパク質マトリックスにスパイクした。このアプローチは、分析承認基準の証明書に基づいてアッセイが各生成物について定量する必要があるであろう最低のＰＳ２０濃度を表した。ＰＳ２０を水中にスパイクすることによって標準及び対照を調製した。２つのＨＰＬＣ／ＥＬＳＤシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００／Ａｇｉｌｅｎｔ  ３８０及びＷａｔｅｒｓ  ２６９５／Ｖａｒｉａｎ  ３８０）を試験に使用した。試験された生成物及びカートリッジは、それぞれ、方法のセクション、表６及び表７に詳細に記載されている。試験されたカートリッジは、ロット、年齢、及び過去の能力を幅広くカバーするように意図的に選択した。
【０２８５】
ＰＳ２０フリーの生成物の試料及びＰＳ２０をスパイクした試料を試験して、ＰＳ２０アッセイによるタンパク質干渉及びＰＳ２０定量の正確性をそれぞれ評価した。Ａ１  ＡＤＣ、Ａ２、Ａ３、及びＡ４試料を、９つのカートリッジで、ギ酸＋メタノールと、ギ酸＋イソプロパノールの両方で試験した（方法０）。両方の方法を用いた全カートリッジにまたがる平均回収率、相対標準偏差、及び範囲を表１２に示す。
表１２：９つのＷａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジにまたがるＰＳ２０フリーのタンパク質にスパイクしたＰＳ２０の回収率及びＲＳＤ％。
2019530857.tif 000015
【０２８６】
表１２によって、移動相にメタノールを使用するとＰＳ２０定量の正確性が向上し（平均回収率が１００％に近い）、カートリッジにまたがる変動が減少する（ＲＳＤ％が減少する）ことが示される。これらのデータにより、移動相にイソプロパノールの代わりにメタノールを使用すると、Ａ１  ＡＤＣ及びＡ２製剤におけるＰＳ２０の定量に特に有効に機能することが示されている。Ａ４製剤でＰＳ２０が偏って過剰回収されたのは、カートリッジにロードされたＰＳ２０がわずか１μｇの場合のシグナル対ノイズ比の低下に起因し得る（２０μＬ注入、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＰＳ２０濃度）。Ｒ＆Ｄの方法認定（ギ酸＋メタノール）の間に、ＰＳ２０ロードの増大（５０μＬ注入）を使用し、過剰回収は観察されなかった。
【０２８７】
移動相にメタノールを使用した場合、Ａ３の過剰回収が観察されたが、これは依然としてイソプロパノール移動相を超える改善であった。この分子の低いｐＩは、部分的にはそのグリカン上のシアル酸基の存在量の増加に起因しており、固定相の正に帯電した四級アミン基上の静電引力によってタンパク質の保持を引き起こすという仮説がたてられる。
【０２８８】
さらなる方法最適化
移動相酸の選択
実験は、メタノール系移動相及び異なる移動相有機酸を用いた段階的勾配を用いて行い、タンパク質干渉を最小化することに関してこの方法に最適な添加剤を決定した。メタノール段階勾配実験は、タンパク質の溶出に対する酸の影響をモニターするために、ＥＬＳＤ検出を用いてギ酸、酢酸、またはトリフルオロ酢酸のいずれかを使用して、ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ及びＰＳ２０フリーのＡ１０  ＡＤＣで行った。水中のＰＳ２０標準を使用してＰＳ２０の保持をモニターした。
【０２８９】
移動相添加剤を変更することで、タンパク質がどのようにカートリッジ上に保持されるかについての洞察が得られた。図５、６、及び７は、移動相における、ＰＳ２０フリーのＡＤＣ及びＰＳ２０標準と、それぞれトリフルオロ酢酸、ギ酸、及び酢酸とのメタノール多段階勾配重ね合わせを示している。全ての移動相添加剤について、ＰＳ２０エステルは５０％メタノールで溶出し始める。図５は、移動相にトリフルオロ酢酸を添加したＰＳ２０フリーのＡ１０  ＡＤＣ及びＰＳ２０標準を示している。タンパク質溶出は、約８０％メタノールで完了した。したがって、タンパク質の多くはＰＳ２０エステルと共溶出し、ＰＳ２０の定量に干渉する。図６は、移動相にギ酸を使用したＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ及びＰＳ２０標準を示している。タンパク質は約４０％メタノールで完全に溶出し、これは４０％メタノール洗浄がタンパク質をポリソルベートから分離することを示している。この結果は、開発された方法１と一致していた。図７は、移動相に酢酸を添加した、ＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣ及びＰＳ２０標準を示している。この場合、タンパク質は１５％メタノールによって完全に溶出された。この知見によって、タンパク質が１５％〜５０％の範囲の任意のメタノール洗浄によってＰＳ２０エステルから分離され得ることが示される。これらの移動相添加剤のイオン対強度は以下のとおりであった：トリフルオロ酢酸＞ギ酸＞酢酸。対応して、タンパク質が逆相の固定相との疎水性相互作用を介して結合している場合に予想されるように、タンパク質は移動相中のイオン対形成剤の強度の増大につれてさらに強力に保持された。
【０２９０】
理論に拘束されるものではないが、酸性移動相の低いｐＨは、タンパク質に正味の正電荷を生じさせる。正電荷を帯びたタンパク質と正電荷を帯びたＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ固定相との相互作用は、クーロン力的に不利であるはずであり、タンパク質が固定相に保持されないことにつながる。対照的に、イオン対形成移動相添加剤は、タンパク質と相互作用してタンパク質を効率的にさらに疎水性にさせ得る（Ｘｉｎｄｕ，Ｇ．，＆Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，２９６：１５−３０，１９８４）。この相互作用は、十分に強力なイオン対形成剤（例えば、ＴＦＡなど）との疎水性相互作用の機構によってタンパク質をカートリッジに保持させるであろう。移動相中のイオン対形成剤の強度を低下させると、続いてタンパク質／固定相相互作用が低下するであろう。試験した３つのうちの最も弱いイオン対形成剤として、移動相中の酢酸は、カートリッジ上のタンパク質保持を著しく減少させるように思われる。したがって、移動相添加剤としての酢酸によって、試験された他の添加剤よりもタンパク質とＰＳ２０エステルとの間のより良好な分離が可能になった。
【０２９１】
図８は、移動相添加剤としての酢酸とギ酸との間の分析方法の能力の比較を示す。図８に示すように、移動相添加剤としてギ酸を用いた水注入と比較して、タンパク質注入ではベースラインの非常にわずかな増大（約３ｍＶ）が観察される。この干渉は最小とみなされるが、酢酸が移動相における添加剤である場合、タンパク質マトリックス注入はＥＬＳＤベースラインを増大させないことが観察される。さらに、タンパク質の保持及びクリアランスを観察するために、２８０ｎｍの吸光度を診断目的でモニターした。移動相に酢酸を使用する場合、タンパク質はほぼ完全に空隙容量で消失されるが、添加剤としてギ酸を使用するとタンパク質はカートリッジに弱く保持され、１〜２分の保持時間で溶出する。ＬＣの流れは２．４分でＥＬＳＤに切り換えられるため、ギ酸が添加剤の場合、タンパク質が完全には除去されない機会が増大し、タンパク質の干渉が生じる可能性が高くなる。
【０２９２】
酢酸＋メタノール溶出条件からの、異なるカートリッジを使用した代表的なクロマトグラム（ロット特異的な詳細については表７を参照のこと）を図９に示す。カートリッジ１のピーク形状は一般的である（トレース１）が、これらのデータは、ＰＳ２０のピークプロファイルがカートリッジによって異なる場合があることを示している。カートリッジ４などの特定のカートリッジでは（トレース２）、ＰＳ２０のピークがテーリングする傾向があり、このカートリッジをさらに使用すると、テーリングが最終的にＰＳ２０のピーク分割になり得る（トレース３）。カートリッジ２（データは示されていない）及び４が、方法開発を通じてピーク分割を示した唯一の試験済みカートリッジであるため、この動作は一般的ではなかった。カートリッジ５（トレース４）などの他の場合では、わずかなピークテーリングが観察される。ちなみに、メタノール移動相でピークテーリング及びピーク分割の増大を示すカートリッジではまた、移動相にイソプロパノールを使用するとタンパク質干渉のレベル増大も受ける。この所見によって、ピークテーリングの増大を示すカートリッジが疎水性分子をさらに強力に保持することが示され得る。ピーク形状にかかわらず、ＰＳ２０の定量及び積分処理方法は影響を受けなかった。
【０２９３】
ＰＳ２０定量化のための最終方法１は、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジ上のギ酸に対してタンパク質とＰＳ２０との分離を改善することが示されたので、移動相中に２％酢酸を用いて実施される（図９）。
【０２９４】
方法認定
洗浄ステップを最適化するために段階勾配実験を使用し、そして方法のロバストネスの実験を実施した後、移動相において２％ギ酸の代わりに２％酢酸を使用することは、タンパク質及びＰＳ２０エステルの分離を改善することが見出された。したがって、この実施例では、ギ酸／メタノール移動相（初期方法開発から）及び酢酸／メタノール移動相（最終方法）の両方を使用して実行された認定実験について説明する。
【０２９５】
アッセイを認定するために使用された方法は、以下のパラメーターを除いて、方法０におけるＨＰＬＣ−ＥＬＳＤアッセイと一致していた：
流速＝１．２５ｍＬ／分
移動相Ａ＝水中２％ギ酸または水中２％酢酸
移動相Ｂ＝メタノール中２％ギ酸またはメタノール中２％酢酸
表３の勾配を用いた。
カートリッジへのロードが同様になるように、製剤中のＰＳ２０の濃度に応じて注入量を調整した。表１３を参照のこと。
【０２９６】
ＰＳ２０フリーＡ１  ＡＤＣ、ＰＳ２０フリーＡ１、ＰＳ２０フリーＡ４、ＰＳ２０フリーＡ５、及びＰＳ２０フリーＡ１１を使用して認定試験を実施した。アッセイの正確性を決定するために、既知量のＰＳ２０を各試料にスパイクした。アッセイ（１生成物あたりに使用される添加剤については表１３を参照のこと）は、正確性、精度、特異性、再現性、及び中間精度について評価した。
【０２９７】
正確性及び精度：
アッセイの正確性を決定するために、ＰＳ２０（ロットＭＫＢＬ２６４６Ｖ）をＰＳ２０フリーのタンパク質試料に既知の濃度でスパイクした（生成物依存、表１３を参照のこと）。この実験は、高濃度のＰＳ２０ストック溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）を使用して行われたため、スパイクによるタンパク質の希釈は最小限に抑えられた。各濃度について、特に断りのない限り、ＰＳ２０をスパイクした試料を３連で注入した。ＰＳ２０回収率を用いてＰＳ２０定量の正確性を決定した。平均回収率の範囲を用いて精度を決定した。指定範囲の直線性（表１３）も測定した。表１３は、各製品にスパイクされたＰＳ２０の濃度を示している。第ＩＩＩ相製剤ロック前の最悪の（すなわち最低の）ＰＳ２０濃度（０．４ｍｇ／ｍｌ）及びより高い濃度（０．７ｍｇ／ｍｌ）をカバーするために、２範囲のＤＮＩＢ０６００Ｓを使用したことに留意されたい。０．２ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０の範囲にわたってＰＳ２０を正確に定量するために、ＥＬＳＤ設定を変更する必要があるので、２つの別々の範囲を使用した。各範囲について、検出器設定を変えるのではなく、注入量を変えた。製剤ロック後、単一の範囲を用いて最終製剤（１．２ｍｇ／ｍＬ  ＰＳ２０）及びより高いタンパク質濃度（４０ｍｇ／ｍＬ）について別の評価を実施した。
表１３：方法認定中に評価された生成物
2019530857.tif 000016
＊３種類のＰＳ２０濃度での重複注入
【０２９８】
各濃度セットについての標準は、水中のＰＳ２０から作成された。タンパク質試料の前に標準を二重に注入した。試験品の６回ごとの注入は、括弧で囲んでおり、水中のＰＳ２０の対照試料を用いた。ＰＳ２０対照は標準とは別に調製した（ＰＳ２０ロットＭＫＢＪ７２３７Ｖから）。各ＰＳ２０フリーのタンパク質生成物にスパイクされたＰＳ２０濃度の範囲をカバーするように標準の濃度を選択した。
【０２９９】
ＰＳ２０対照の濃度は、各生成物の原薬製剤について可能性のあるまたは実際のＰＳ２０濃度に基づいて選択された。表１４は、各濃度範囲にわたる分析に使用した標準及び対照ＰＳ２０試料の濃度を示す。
表１４：各生成物の検量線及び対照に使用したＰＳ２０濃度
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【０３００】
方法１の正確性及び精度を、複数の生成物に対して試験した。正確性について許容可能な結果により、各スパイクした濃度での平均回収率が８０％〜１２０％であることが示されるはずである。各生成物の結果を表１５に示す。
表１５：平均回収率（％）及び範囲
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【０３０１】
表１５に示すように、試験した全生成物の平均回収率（％）（全濃度）は、合格基準（８０％〜１２０％）を満たし、８２．４％〜１１４．８％の範囲であった。したがって、このアッセイによって、試験したＰＳ２０範囲にわたって全ての生成物について許容可能な正確性及び精度が実証された。
【０３０２】
注入体積は変動するので、アッセイ範囲は（製剤中のＰＳ２０濃度によるのではなく）ＰＳ２０質量に関して表してもよい。これらの結果から、１．２５（０．０２５μｇ／μＬ×５０μＬ）−１６μｇ（１．６０μｇ／μＬ×１０μＬ）のＰＳ２０をカートリッジにロードして、正確に定量され得ることが示された。
【０３０３】
直線性
ピアソンの相関係数（ｒ）＞０．９９を決定することによって直線性を評価した。ＰＳ２０濃度の各範囲についてこれらの値を表１６に示す。
表１６：ＰＳ２０濃度範囲にまたがるピアソンの相関係数
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【０３０４】
試験したＰＳ２０の範囲について、ピアソンの相関係数の値は全て０．９９以上であった。したがって、直線性は複数の生成物にわたってこのアッセイで許容された。
【０３０５】
特異性：
ＰＳ２０フリーの製剤緩衝液及びＰＳ２０フリーの生成物の注入がＰＳ２０ピークに寄与しないことを確認することによって、９つの生成物について特異性を決定した。製剤緩衝液及びＰＳ２０フリーのタンパク質試料の注入は２連で行った。ＰＳ２０フリーの製剤緩衝液及びＰＳ２０フリーのタンパク質マトリックスのピーク面積を、各生成物の標的ＰＳ２０濃度の５０％の標準の応答と比較した。ＰＳ２０フリー試料のピーク面積が最低標準のピーク面積の１０％以下であれば、合格基準は満たされる。ＰＳ２０領域に可視のタンパク質干渉がいくつかある場合、特異性の数値推定値を導き出すために以下の式を使用した：
方程式３：特異性計算
特異性＝（ＰＳ２０フリーのタンパク質の面積／ＰＳ２０規格の５０％の面積）×１００
【０３０６】
図１０（Ａ１  ＡＤＣを含む）に示すように、ＰＳ２０フリーの製剤緩衝液もＰＳ２０フリーのタンパク質試料も、ＰＳ２０ピークを妨害しない。他の全ての生成物の特異性値を表１７に示す。ギ酸法の認定実験の後、目標ＰＳ２０濃度をＡ１  ＡＤＣについて選択したので、さらに低い目標ＰＳ２０濃度を使用して試料の特異性を計算した（アスタリスクで示す）。より低い標的ＰＳ２０濃度を使用することはより高い特異性値をもたらすであろうが、報告された全ての値は依然として１０％をかなり下回る。
表１７：特異性
2019530857.tif 000020
Ｎ／Ａ：ＰＳ２０フリーのタンパク質注入は、水注入と同じである。
【０３０７】
再現性：
２０ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣにスパイクした０．４ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０及び１５０ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０フリーのＡ１４／Ａ１５にスパイクした０．３ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０を含有する試料を６回注入した。これらの注入についてのＰＳ２０ピーク面積及び対応する濃度を表１８に示す。繰り返し注入の面積及び濃度についてのＲＳＤ％によって、許容可能な注入再現性が実証された。
表１８：注入の再現性
2019530857.tif 000021
【０３０８】
繰り返し注入の面積及び濃度のＲＳＤ％によって、アッセイの再現性が実証された。
【０３０９】
中間精度：
中間精度（ギ酸＋メタノールのみ）は、３つの異なるＰＳ２０標準及び緩衝液調製物を用いる２つの異なるＨＰＬＣ−ＥＬＳＤシステムで、ならびに２つの異なる分析者によって、３つのカートリッジについて決定された。各日の各試料について、２回の注入の平均を表１９に報告する。全ての注入の平均及び標準偏差を表１９の下部に報告する。注入した試料は、２０ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０フリーのＡ１  ＡＤＣにスパイクした０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０、ＰＳ２０フリーのＡ１にスパイクした０．１ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０、及びＰＳ２０フリーのＡ４にスパイクした０．１ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０であった。各日の条件は、方法セクションの表１０に示す。方法１のための修飾剤として酢酸が最終決定される前にギ酸を使用して中間精度を行った。認定の他の全てのパラメーターは２つの修飾剤間で同等であり、試料調製はどちらの条件でも同じであるので、中間精度は移動相中の酢酸では繰り返さなかった。
【０３１０】
中間精度を試験する３日間にわたる３つ全ての試料についてのＲＳＤ％は１０％未満であった。これらの結果により、アッセイが様々なカートリッジ、試料調製、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤシステム、及び解析者に関して一貫していることが示されている。２日目の濃度については、わずかに低い傾向が注目された。
表１９：中間精度（全ての実験はギ酸を用いて行った）
2019530857.tif 000022
【０３１１】
結論：
新しいバージョンの方法の開発中に、ＥＬＳＤ方法０アッセイに以下の変更を行った。
移動相Ｂはイソプロパノールからメタノールに切り替わった。
添加剤は２％ギ酸から２％酢酸に変更した。
１〜３．４分の洗浄ステップにおける有機物の濃度が、２０％から４０％の移動相Ｂに切り替わった。
流速は１．００ｍＬ／分から１．２５ｍＬ／分に変更した。
【０３１２】
まとめると、これらの修飾は、タンパク質干渉及びカートリッジ間の性能の変動の両方を有意に減少させた。移動相Ｂ有機物をイソプロパノールからメタノールに変えることによって（図２）、以前の条件と比較してタンパク質とＰＳ２０の分離が改善された。メタノール／ＦＡ及びイソプロパノール／ＦＡの両方の比較実験（表１１及び表１２）からの結果により、方法１がＰＳ２０定量及びカートリッジ間再現性を有意に改善したことが示された。移動相添加剤としてギ酸を酢酸で置き換えると（図８）、カートリッジへのタンパク質の保持がさらに減少した。さらに、有機洗浄ステップを２０％から４０％に変更することにより、タンパク質の干渉が有意に最小化された。
【０３１３】
複数の生成物についてのこの改変アッセイの認定からの結果により、このアッセイが様々な分子フォーマット、タンパク質濃度、及びＰＳ２０濃度にわたってＰＳ２０を定量するのに適していることが示され、したがって、方法１がプラットフォームＰＳ２０定量アッセイの候補であることが示される。
【０３１４】
実施例２．Ｎ−アセチルトリプトファン含有製剤のためのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤポリソ
ルベート２０定量法の開発
上記のＰＳ２０法（方法１）を評価する過程で、製剤中に追加の賦形剤として存在すると、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）がポリソルベート２０（ＰＳ２０）を有意に妨害することが発見された。実施例１の方法１は、試験された製剤の大部分のカートリッジについて最小のタンパク質干渉及びカートリッジ間の変動の減少を示したが、Ｎ−アセチルトリプトファンは、この方法の条件下でカートリッジ上に保持され、ＰＳ２０と同じ保持時間で溶出された。理論に縛られるものではないが、方法１で使用したミックスモード陰イオン交換樹脂（ＭＡＸ）カートリッジと相互作用する分子上のカルボキシレート基の存在に起因して、ＮＡＴはカートリッジ上に保持され得る。
【０３１５】
以下に記載されるように、方法１は、以下によってＮＡＴ干渉を排除するように修正された：
１）カートリッジをＭＡＸ樹脂からミックスモード陽イオン交換樹脂（ＭＣＸ）に変更すること
２）移動相添加剤を酢酸から水酸化アンモニウムに変えること
【０３１６】
さらに、方法２とも呼ばれる方法のさらなる最適化を、有機洗浄液を４０％Ｂから４５％Ｂに増大させ、洗浄ステップ時間及び溶出ステップ時間をそれぞれ＋１分及び＋２分増大させることによって実施した。ＮＡＴを用いて製剤化されたプロジェクトのＰＳ２０定量を可能にする条件の開発を、この実施例に記載する。方法２を正確性、精度、直線性、特異性、再現性、及びロバストネスについて評価することにより、製剤にＮＡＴを含む３つの生成物を使用して新しい条件を評価した。
【０３１７】
ＭＡＸカートリッジを使用した以前のＬＣ−ＥＬＳＤアッセイでは、低ｐＩ分子とのより高いタンパク質干渉が観察された。したがって、低ｐＩ分子の評価を、方法１と方法２の両方で実施して、どの方法が正しいＰＳ２０定量に適しているかを判断した。
材料
ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤシステム：例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣ−Ｖａｒｉａｎ  ３８０  ＥＬＳＤ
ポリソルベート２０：シグマＰ／Ｎ：Ｔ２７００−１００ＭＬ
ＨＰＬＣグレードの氷酢酸：ＪＴ  Ｂａｋｅｒ
強いアンモニア溶液、２７〜３１％：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
ＨＰＬＣグレード水  ＨｏｎｅｙＷｅｌｌ
ＨＰＬＣグレードメタノール：ＯｍｎｉＳｏｌｖ
ＷａｔｅｒｓＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジ２．１×２０ｍｍ、粒径３０μｍ
ＷａｔｅｒｓＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸカートリッジ２．１×２０ｍｍ、粒径３０μｍ（表２０）
ＮＡＴ含有生成物（表２１）
表２０：方法２の開発中に使用されたＭＣＸカートリッジ
2019530857.tif 000023
表２１：生成物情報
2019530857.tif 000024
【０３１８】
方法：
全ての実験について、ＥＬＳＤ光源強度（ＬＥＤ）を７５％に設定し、検出器ゲイン（ＰＭＴ）を１に設定した。アッセイをＮＡＴ含有製剤と適合させるための方法に対する最終的な修正の要約は以下のとおりである：
Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣ（または同等品）及びＶａｒｉａｎ  ３８０  ＥＬＳＤ（または同等品）
カートリッジ：Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸオンラインカートリッジ
移動相Ａ：水中１．５％水酸化アンモニウム
移動相Ｂ：メタノール中１．５％水酸化アンモニウム
流量：１．４０ｍＬ／分
切り換え弁のタイミング：４．００分でＥＬＳＤに流れる
注入体積：２５＊μＬ（＊生成物次第）
表２２：修正されたＰＳ２０勾配法（方法２）
2019530857.tif 000025
【０３１９】
結果：
干渉の決定
方法開発の最初の焦点は、ＮＡＴが以前のアッセイで観察された干渉の原因であるか否かを決定することであった。この研究は、ＮＡＴを含むかまたはそれを除外した一連の緩衝液（緩衝液の詳細は、材料のセクション（表２１）及び結果のセクション（表２３）に記載されている）を研究することによって行った。
【０３２０】
ＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７製剤緩衝液（２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＴ、５ｍＭメチオニン、２４０ｍＭスクロース、ｐＨ５．５）及びＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７を標的濃度で（公称＝８０ｍｇ／ｍＬ）、実施例１の方法１を使用して最初に評価した。各試料の組成を以下に示す：
【０３２１】
ＰＳ２０フリーの製剤緩衝液−２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＴ、５ｍＭメチオニン、２４０ｍＭスクロース、ｐＨ５．５。
【０３２２】
ＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７試料−２０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＴ、５ｍＭメチオニン、２４０ｍＭスクロース、ｐＨ５．５中８０ｍｇ／ｍＬ（公称）。
【０３２３】
図１１Ａは、この評価のＥＬＳＤ結果を示しており、そこでは、両方の試料についてＰＳ２０の保持時間（約４．５分）でＥＬＳＤにおいて有意な干渉が観察された。水（トレース１）、ＰＳ２０フリーの製剤緩衝液（トレース２）、及びＰＳ２０フリーのタンパク質試料（トレース３）の注入が示されている。さらに、図１１Ｂは、各試料についてのＵＶ（２８０ｎｍ）シグナルを表示しており、ここで成分はＰＳ２０のおよその保持時間で検出される。ＰＳ２０フリーの製剤を注射したときに観察された干渉の大きさはタンパク質試料とほぼ同じであったので、その供給源はタンパク質のみに起因するものではないと思われ、そして本発明者らは、緩衝液中の賦形剤がカートリッジによって保持されているという仮説に導かれた。
【０３２４】
本発明者らは、ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）が以下の理由によって、図１１Ａ及び１１Ｂで観察された干渉物質であることを確認した：１）ＮＡＴ含有製剤は方法１で以前に試験されておらず、したがってこれは以前の評価との主な違いとして際立っていた、２）ＮＡＴは４．１の見かけのｐＫａを有してカルボキシレート基を保有し、それをその脱プロトン化陰イオン形態でＭＡＸカートリッジのアンモニウム陽イオン樹脂に保持し得る、そして３）ＮＡＴ吸収極大は２８０ｎｍ付近である（Ｈ．Ｅｄｅｌｈｏｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．６，ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ  １９６７）、そしてＮＡＴ製剤試料では、ＰＳ２０保持時間（約４．３分）で２８０ｎｍの吸光度が観察された（図１１Ｂ）。
【０３２５】
上記のように、ＮＡＴがＰＳ２０と干渉していることを確認するために、ＮＡＴを伴ってまたは伴わずに、一連のＡ１６／Ａ１７製剤緩衝液を試験した。図１２Ａ及び１２Ｂは、図１２Ａに示されたＮＡＴを含む緩衝液、及び図１２Ｂに示されたＮＡＴなしの緩衝液を用いたこの評価のＨＰＬＣ−ＥＬＳＤの結果を示す。図１２Ａの各ＮＡＴ含有緩衝液は、またＰＳ２０の保持時間でピークを示した。対照的に、ＮＡＴが除外された全ての緩衝液は妨害ピークを示さなかった。併せて、図１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、及び１２Ｂに示すデータによって、干渉がタンパク質または他の賦形剤によって引き起こされたのではなく、ＮＡＴがＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジ上に保持され、ＰＳ２０と共溶出したことが示される。
表２３：方法１及び方法２で試験された緩衝液
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【０３２６】
ＮＡＴはカルボキシレート基を含み、そして陰イオン交換を介してカートリッジ中に見出される樹脂に保持し得る。ＰＳ２０からＮＡＴをよりよく分離するために、本発明者らは、代替のＯａｓｉｓ（登録商標）カートリッジ（Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸ）の使用を検討した。アンモニウムベースの陽イオン性樹脂を含むＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジとは異なり、Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸカートリッジは、陰イオン性亜硫酸塩樹脂を含む。最初に、方法１で使用したものと同じ移動相（メタノール＋酢酸）を使用してＭＣＸカートリッジを評価した。しかし、これらの条件下では、タンパク質干渉は許容できないレベルまで上昇することが判明した（データ示さず）。Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）試料抽出方法は、ＭＣＸ樹脂のプレートフォーマットにおける固相抽出手順における移動相添加剤として水酸化アンモニウムの使用を推奨する（Ｗａｔｅｒｓ，“Ｏａｓｉｓ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，２０１１）。したがって、製造業者が推奨する条件をよりよく模倣するために、２％酢酸を１．５％水酸化アンモニウムで置き換えることによって移動相を改変した。これらの修正を方法において行い、ＭＣＸカートリッジを使用してＡ１６／Ａ１７緩衝液の異なる誘導体を評価し、そのデータを図１３Ａ及び図１３Ｂ）に示す。
【０３２７】
方法１で得られた結果とは異なり、ＮＡＴの有無にかかわらず、ＰＳ２０の保持時間で干渉は観察されず、全ての賦形剤は１分よりも前にカートリッジから溶出された（図１３Ａ及び１３Ｂ）。さらに、５０μＬのＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７タンパク質（図１３Ａ、トレース４）を注入した場合、ＥＬＳＤ中のＰＳ２０領域に干渉は観察されず、この方法がＰＳ２０からタンパク質を分離する可能性があることが示されている。移動相添加剤として水酸化アンモニウムを使用する、ＭＣＸカートリッジを、ＮＡＴ含有製剤についてＰＳ２０定量を評価するための使用のために選択した。
【０３２８】
方法改変
ＮＡＴ含有製剤を分析するための予備的条件が、一旦、上記のように確立されたら、以下のパラメーターをさらに詳細に調べた：
移動相中の水酸化アンモニウム％
洗浄ステップで使用されるＢ％（２０〜６０％Ｂを試験）
洗浄時間（２．４分及び３．４分）及び注入体積（２５及び５０μＬの注入体積）
流速（０．８ｍＬ／分〜１．６ｍＬ／分）
溶出時間（１．１分、３．１分）
【０３２９】
移動相中の水酸化アンモニウム％
Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ（登録商標）試料抽出方法は、ＭＣＸ樹脂のプレートフォーマットにおける固相抽出手順における移動相添加剤としての水酸化アンモニウムの使用を推奨する（Ｗａｔｅｒｓ，“Ｏａｓｉｓ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，２０１１）。この実験は、ＥＬＳＤ（図１４Ａ）及びＵＶ（図１４Ｂ）の両方による検出を用いて行った。ＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７タンパク質は、移動相において０．１５、０．２９、０．７３または１．５％の水酸化アンモニウムを使用してカートリッジからのタンパク質及びＮＡＴ溶出の両方を評価するために使用された試料であった（それぞれ、図１４Ａ及び１４Ｂ、トレース１、２、３、及び４）。ＵＶ検出器は切り換え弁の前にインラインであるので、ＰＳ２０の前に溶出する発色団（例えば、ＮＡＴ及びタンパク質）を有する分析物を検出してもよい。ＮＡＴを除去する能力を評価するために、Ａ１６／Ａ１７  ＰＳ２０フリーの製剤緩衝液も同様に注入した（図１４Ａ及び１４Ｂ、トレース５）。
【０３３０】
切り換え弁を切り替えることによって２．４分でカートリッジ流出液をＥＬＳＤに導入した場合、ベースラインよりわずかに高いことによって証明されるように、移動相中に０．１５％の水酸化アンモニウムでわずかな干渉が観察された（図１４Ａ、トレース１）。ＵＶトレースはまた、流出液がＥＬＳＤに入る前にタンパク質及び／またはＮＡＴがカートリッジからほとんど溶出されたことも示している。これらの潜在的な干渉物質の大部分は、空隙容積に溶出した。水酸化アンモニウム添加剤の割合が増大するにつれて（０．２９から１．５％）、ＥＬＳＤによって観察されるタンパク質またはＮＡＴ干渉の程度にはほとんど差がなかった（図１４Ａ、トレース２〜４）。さらに、ＵＶトレースによって、試験した全ての水酸化アンモニウムレベルで、この方法がタンパク質及びＮＡＴを十分に除去したことが示される（図１４Ｂ、トレース２〜４）。ＰＳ２０フリーのタンパク質を、移動相に１．５％の水酸化アンモニウムとともに注入した場合（図１４Ａ、トレース４）、より低い水酸化アンモニウムの割合で注入された同じタンパク質と比較して、流出液をＰＳ２０領域に２．４分で導入したとき（４．０〜５．５分）、タンパク質の干渉が少ないように思われた。ＰＳ２０フリーの製剤化緩衝液（図１４Ｂトレース５）ＵＶトレースによって、移動相中の１．５％水酸化アンモニウムでＮＡＴが効率的に除去されることが示される。したがって、この方法で使用するために、この割合の添加剤を選択した。
【０３３１】
２８０ｎｍにおける吸光度（図１４Ｂ）によって、移動相において０．１５〜１．５％の水酸化アンモニウムを使用した場合、タンパク質及びＮＡＴが十分に除去され、これらの干渉物質のある程度のテーリングが約２．５分で存在することが示される。この発見によって、検出器が汚染されるのを防ぎ、ＥＬＳＤにおけるタンパク質及びＮＡＴの干渉を最小限に抑えるために、メタノール＋水酸化アンモニウム法を、２．４分ではなく３．０分でＥＬＳＤに流す切り換えをするように変更した。ＰＳ２０の溶出は約４．５分であるので、この変化はそのピークに影響を与えないはずである。
【０３３２】
洗浄ステップで使用されたＢ％（２０〜６０％で試験）
以前は、ＮＡＴを含まない製剤における方法１の開発のために、ＰＳ２０からタンパク質を分離するための洗浄ステップ中に使用されるメタノールの％を、段階勾配アプローチを使用して最適化した。方法２の開発に使用されたメタノール％を、この方法に対するいくつかの重要な変更がタンパク質保持に及ぼす未知の影響に起因して再検討した。固定相をＭＣＸ樹脂に変更して、移動相添加剤を水酸化アンモニウムに訂正した。この実験では、１０％（ｖ／ｖ）刻みでＢ％（メタノール＋１．５％水酸化アンモニウム）の４つの異なるレベルを、２０〜６０％の濃度範囲にわたって試験した。各試験条件下でタンパク質の溶出をモニターするためにＥＬＳＤ及びＵＶ検出の両方を使用した。ポリソルベートフリーのＡ１６／Ａ１７試料を、評価に使用し、ＥＬＳＤ及びＵＶデータをそれぞれ図１５Ａ及び図１５Ｂに示す。
【０３３３】
図１５Ｂでは、２８０ｎｍ吸光度クロマトグラムは、ＰＳ２−の保持時間（約４．５分）で明確なピークを示し、これによって、１５μＬのＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７タンパク質を注入した場合、２０％Ｂ洗浄時にカートリッジ上にタンパク質及び／またはＮＡＴ保持があったことが示唆される（トレース１）。はるかに大きいピークがまた空隙容積にも観察され、これはタンパク質とＮＡＴとの混合物である可能性が高い。この同じ条件について、ＰＳ２０領域における干渉として、明確なピークもＥＬＳＤにおいて検出された（図１５Ａ）。洗浄ステップのＢ％を３０％に増大させると、ＵＶ及びＥＬＳＤトレースの両方におけるＰＳ２０領域のピークの減少によって証明されるように、ＮＡＴ及びタンパク質のクリアランスが改善された（トレース２）。ＮＡＴ及びタンパク質は４０％Ｂでより効率的に除去されたが、それでもＥＬＳＤ中のＰＳ２０領域にわずかな干渉が存在していた（図１５Ａ）。ＮＡＴ及びタンパク質は、５０及び６０％のＢ洗浄で最も効率的に除去され（それぞれ、トレース４及び５）、存在する干渉は最小限であった。この方法で使用するために、洗浄ステップで４５％のＢを選択した。方法１の以前の開発中に、洗浄条件として５０％までのメタノールも試験したが、これらの条件下ではＰＳ２０のごく一部が早く溶出することが観察された（４５％メタノールではこの小さなピークは観察されなかった）。これらのピークは、より短い鎖長のエステルであり得、これは疎水性が少なく、そして５０％メタノール条件がほぼエステル化種が溶出する点であることを示していた。この以前の観察、及び４０％Ｂがタンパク質を除去するのに十分であることを示す本結果に起因して、本発明者らは、ロバストなタンパク質除去とＰＳ２０保持との間の妥協点を得るために洗浄ステップについて４５％Ｂ条件を決定した。さらに、図１５ＢのＵＶデータによって、タンパク質が５０％Ｂ洗浄条件でわずかに早く溶出したことが示される。
【０３３４】
洗浄時間（２．４分及び３．４分）及び注入体積（２５及び５０μＬの注入体積）
ＰＳ２０領域における干渉をさらに最小にするために、２．４分及び３．４分の洗浄ステップを評価した。図１６に示すように、ＰＳ２０領域は、２．４分または３．４分の洗浄の間で同様である（それぞれ、トレース３及びトレース２）。特異性がわずかに改善され、より長い洗浄時間で明らかな悪影響がなかったので、この方法で使用するために３．４分の洗浄を選択した。さらに、フローは、２．４分ではなく４．０分でＥＬＳＤに切り換えられるように選択した。
【０３３５】
ベースラインに対する注入体積の影響もまた、試料体積を５０μＬから２５μＬに減少させることによって評価した（それぞれ図１６、トレース２及びトレース１）。２５μＬ注入トレースのベースラインはわずかにきれいに見え、これは、カートリッジから除去するタンパク質と賦形剤が少ないためであると予想される。最終的には、注入体積は特異性に関して性能に有意に影響しなかった。
【０３３６】
流速（０．８ｍＬ／分〜１．６ｍＬ／分）
タンパク質及びＮＡＴが効率的に除去されていることを確実にするために流速を評価した。流速は、０．８〜１．６ｍＬ／分で変化させた。図１７Ａ及び図１７Ｂは、１．６０、１．４０、１．２５、１．００、及び０．８０ｍＬ／分の流速を用いた、１５０ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９タンパク質の２５μＬの試料注入を示す（それぞれ、トレース１、２、３、４、及び５）。
【０３３７】
最も遅い流速０．８ｍＬ／分（トレース５）では、ＥＬＳＤのピークによって示されるように、ＰＳ２０領域にまだタンパク質及び賦形剤が溶出していた（図１７Ａ）。この状態のＵＶトレース（図１７Ｂ）もまた、より高い流速の場合よりも遅く溶出する妨害物の増大を示した。流速が１．００ｍＬ／分（トレース４）まで増大されると、干渉は減少し、流速が一旦１．２５ｍＬ／分まで増大されるとほとんど無視できるほどになった（トレース３）。流速を１．４０及び１．６０ｍＬ／分（それぞれトレース２及び１）に増大させると、ＵＶトレースは、ほとんどのタンパク質及び賦形剤が低い方の流速よりも、２．０分までにさらに完全にカートリッジから溶出されたことを示しており、この方法で使用するために１．４０ｍＬ／分の流速を選択した。本発明者らは、性能が１．４ｍＬ／でほとんど同等であったため、また、１．６ｍＬ／分でのより高い背圧に起因する漏出のリスクを最小限にしたかったため、１．６ｍＬ／分まで増やさなかった。
【０３３８】
溶出時間（１．１分、３．１分）
方法１の１００％Ｂでの溶出ステップは、１．１分間保持する。試料とは関係なく、ウォーターブランクを含め、あらゆる注入で観察された、約６．５分で溶出する未知の同一性のピークがある。移動相のＢ％が再平衡条件に戻った後、未知のピークが溶出したようである。ピークがＰＳ２０からよりよく分離され得るか否かを試験するために、溶出時間を延長した。図１８は、ＰＳ２０ピークの積分を示しており、これは約５．２分で始まり、この未知のピークが始まるときにほぼ終了する（トレース２）。これは定量に有意な影響を与えなかったが、将来のこのピークからの潜在的な干渉を防ぐために、溶出ステップを３．１分の保持時間まで増やし（トレース１）、ＰＳ２０領域の分離及び積分を改善させた。図１９は、確定したパラメーターによる方法２を使用して、水、１５０ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９、水にスパイクした０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０、及びＡ１８／Ａ１９にスパイクした０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０についての結果（それぞれトレース１、２、３及び４）を示す。
【０３３９】
方法認定実験
特異性
特異性は、ＰＳ２０フリーの製剤緩衝液及びＰＳ２０フリーの生成物の注入がＰＳ２０領域において干渉し得るいかなるピークにも寄与しないことを確認することによって決定した。これらを、最低のＰＳ２０校正標準（通常は標的ＰＳ２０濃度の５０％である）と比較した。
【０３４０】
ＰＳ２０フリーの製剤化緩衝液、ＰＳ２０フリーのタンパク質、及び０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（５０％標的）を水にスパイクした典型的なクロマトグラムを図２０Ａ〜図２０Ｆに示す。ＰＳ２０フリーの３種類の異なる生成物を評価した。Ａ１８／Ａ１９（図２０Ａ及び２０Ｂ）、Ａ１６／Ａ１７（図２０Ｃ及び２０Ｄ）、及びＡ１４／Ａ２０（図２０Ｅ及び２０Ｆ）は、それぞれ１５０、８０、及び１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する。これらの生成物についての詳細は表２１に示す。視覚的には、ＰＳ２０フリーのタンパク質試料を注入したときに、全ての生成物がＥＬＳＤ内のＰＳ２０領域においていくらかの干渉を有した（図２０Ａ、２０Ｃ及び２０Ｅ、トレース２）。しかしながら、ＰＳ２０フリーの製剤緩衝液は、ＰＳ２０領域において視覚的干渉を示さず（図２０Ａ、２０Ｃ、及び２０Ｅ、トレース１）、干渉が主にタンパク質からのものであることが示された。
【０３４１】
この方法の許容基準は、ＰＳ２０フリーの試料中のピーク面積が最低標準中のピーク面積の１０％以下である場合に満たされる。ＰＳ２０領域にはタンパク質の干渉が見られたので、特異性は方程式を使用して決定しなければならない。特異性を決定するために使用される様々なアプローチがある。この研究のために、以下の式を使用して特異性の数値推定値を導き出した：
方程式１：特異性
干渉（％）＝（ＰＳ２０フリーのタンパク質の面積／ＰＳ２０規格の５０％の面積）×１００
【０３４２】
この方程式を使用して、３つの生成物について干渉％を計算した（表２４）。ＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７（８０ｍｇ／ｍＬ）（図２０Ｃ）は、水中０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（５０％標的）と比較したとき７％の特異性を有することが確認された。ＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９（１５０ｍｇ／ｍＬ）（図２０Ａ）は、わずか４％の干渉しか示さなかったが、Ａ１４／Ａ２０（１５０ｍｇ／ｍＬ）（図２０Ｅ）は、水中０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（標的５０％）と比較して１３％の干渉を有した。
【０３４３】
全ての生成物についての２８０ｎｍでのＵＶトレース（図２０Ｂ、２０Ｄ、及び２０Ｆ）は、４．０分で流れがＥＬＳＤに切り換えられる時間までにタンパク質及びＮＡＴが効率的に除去されたことを示す。Ａ１４／Ａ２０の干渉は１３％であったが、この生成物のその後の評価における再現性、正確性、及び直線性は、許容範囲内であった。
表２４：３つの生成物の特異性
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【０３４４】
正確性
アッセイの正確性を決定するために、既知量のＰＳ２０をＰＳ２０フリーのタンパク質にスパイクし、そして各濃度についての回収率を決定した（表２５）。典型的な検証合格基準は、回収率％が８０〜１２０％以内であることを必要とする。
【０３４５】
ＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９（１５０ｍｇ／ｍＬ）及びＰＳ２０フリーのＡ１６／Ａ１７（８０ｍｇ／ｍＬ）を、０．１〜０．６ｍｇ／ｍＬの範囲でＰＳ２０をスパイクすることによって評価した。正確性データを表２５に要約する。試験したＰＳ２０濃度において、Ａ１６／Ａ１７及びＡ１８／Ａ１９の回収率の範囲は、それぞれ９４〜１００％及び７８〜１００％であった。ＰＳ２０フリーのＡ１８／Ａ１９にスパイクした０．４ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０で、試料は７８％回収率となった。括弧で囲んだＰＳ２０濃度（０．２及び０．６ｍｇ／ｍＬ）の回収率は規格の範囲内であり、この１つの試料についての試料調製または注入誤差を示唆している。０．４ｍｇ／ｍＬの試料を除外した場合、Ａ１８／Ａ１９の回収率の範囲は８８〜１００％である。
【０３４６】
ＰＳ２０フリーのＡ１４／Ａ２０（１５０ｍｇ／ｍＬ）の正確性は、０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬの範囲でＰＳ２０をスパイクすることによって評価した。Ａ１４／Ａ２０のＰＳ２０回収率は９２〜１０９％の範囲であった。全体として、試験した３つ全ての生成物のスパイクした回収実験のデータによって、この方法が正確であることが示されている。さらに、これらの結果、２．５μｇ（０．１μｇ／μＬ＊２５μＬ）−１５μｇ（０．６μｇ／μＬ＊２５μＬ）のＰＳ２０をカートリッジにロードして正確に定量可能であることが示されている。
表２５：正確性
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【０３４７】
直線性
３つの生成物について試験した範囲にわたってピアソンの相関係数（ｒ）≧０．９９を決定することによって直線性を評価した。これらの値を、各生成物のＰＳ２０濃度の各範囲について表２６に示す。試験したＰＳ２０範囲について、ピアソンの相関係数の値は全て０．９９より大きかった。それゆえ、直線性は、試験した３つの生成物にまたがってこのアッセイについて許容可能であった。
表２６：直線性：ピアソンの相関係数
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【０３４８】
再現性
再現性は、Ａ１８／Ａ１９試料の６回の反復注入（公称０．２ｍｇ／ｍＬ  ＰＳ２０）及びＡ１６／Ａ１７試料の６回の反復注入（公称０．２ｍｇ／ｍＬ  ＰＳ２０）を用い、ならびにＰＳ２０ピーク面積のＲＳＤ％を測定することによって評価した。この評価の結果は表２７に示されており、そしてアッセイの精度は両方の生成物について許容可能であることが示されている。
表２７：Ａ１８／Ａ１９及びＡ１６／Ａ１７の再現性
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【０３４９】
再現性はまた、５つの濃度の３つの複製を試験し、ＰＳ２０ピーク面積のＲＳＤ％を測定することによっても評価した。この実験は、ＰＳ２０フリーのＡ１４／Ａ２０に０．１０〜０．３０ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０をスパイクして実施した。この評価の結果を表２８に示しており、そしてアッセイの精度がＡ１４／Ａ２０について許容可能であることが示されている。
表２８：Ａ１４／Ａ２０の再現性
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【０３５０】
方法のロバストネスの実験
カートリッジ間
実施例１の方法１で行われた以前の研究では、カートリッジの収着剤バッチが同じであっても、カートリッジは、タンパク質クリアランス及び特異性に関して異なる挙動を示し得ることが示された。カートリッジ間の変動を判断するために、３つのＭＣＸカートリッジを評価した。これらのうち、ＭＣＸカートリッジ２及び４は、同じ吸収剤バッチ（００９３）を有し、一方６は異なった（０１０３）（表２０）。
【０３５１】
３つのＭＣＸカートリッジ全てを、水中にスパイクした０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０、及びＰＳ２０含有生成物を用いて評価した。図２１及び図２２は、これらの評価のクロマトグラムを示し、表２９に結果の概要を示す。図２１のトレース３及び４、ならびに図２２のトレース３は、３つのカートリッジにわたって注入された水試料中の０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０についてのピーク高さ及び幅の差を示す。最も注目すべきことに、ピークの高さ及び面積は、カートリッジごとに異なり、カートリッジ２（図２１のトレース１及び３）とカートリッジ６（図２１のトレース２及び４）との間に最大の差が観察される。カートリッジ２のピークの面積は、試験した両試料タイプ（すなわち、水中のＰＳ２０及びＡ１８／Ａ１９中のＰＳ２０）において、カートリッジ６のピークの面積の約６０％であった。ピーク面積の差が試料の種類（例えば、タンパク質の有無）とは無関係であることが観察されたならば、変動はタンパク質の干渉によって引き起こされる可能性は低い。試験した２つのカートリッジの間で面積値は非常に異なっていたが、カートリッジ４と６の間の差はより小さく、カートリッジ４の面積は、カートリッジ６の約８５％であった。カートリッジ２と４の両方が同じ樹脂バッチを共有し、また異なるピーク面積を生じたため、カートリッジ間のＰＳ２０ピーク面積の変動は、樹脂バッチにのみ依存するとは思われない。
【０３５２】
この変動は理想的ではないが、同じカラム上で分析された検量線から決定されたＰＳ２０の濃度は、計算されたＰＳ２０量を得るために標準が一旦実行されれば、全てのカートリッジにわたる理論濃度と比較して正確であった。これらのデータに基づいて、ＥＬＳＤ検出器の線形範囲内で十分に応答を提供するＰＳ２０の注入量を利用することが重要であろう。例えば、フルスケールの８０％（例えば８００ｍＶ）の最大検出器応答がＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ方法には一般的に推奨されているが、カートリッジごとに観察される変動を考えれば、ＭＣＸ方法のこの標的応答を下げて、検出器が特定のカートリッジに対して飽和しないことをさらに保証することが賢明であり得る。全体として、試験した試料及びカートリッジについて、この方法について報告されたＰＳ２０量に関して、カートリッジ間の変動は最小であった。
表２９：カートリッジ間の変動
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【０３５３】
Ａ１８／Ａ１９試料の１００×注入
上記の実験は、ＯＡＳＩＳ（登録商標）ＭＣＸカートリッジがＰＳ２０をロバストかつ正確に定量化し得ることを実証しているが、本発明者らは、タンパク質含有試料を用いて長いシーケンスを実行することによってカートリッジ耐久性を試験したい。この方法が最初に開発された生成物の１つは、１５０ｍｇ／ｍＬの非常に高い標的タンパク質濃度を有し、カートリッジ上のタンパク質蓄積に起因してカートリッジの故障／過圧につながり得る。通常、方法実行時の圧力は約２５〜４５ｂａｒであった。圧力がこの範囲を超えて増加した場合、カートリッジはタンパク質及び／または賦形剤を蓄積している可能性が高く、綿密にモニターするか、もしくはカートリッジを交換すべきである。カートリッジの漏出が始まった場合、それを廃棄して直ちに交換しなければならない。
【０３５４】
カートリッジの再現性、ならびにタンパク質及びＮＡＴを一貫して除去する能力を、新しいカートリッジを使用してタンパク質（１５０ｍｇ／ｍＬ）を１００回注入することによって評価した（シーケンスについては表３０を参照のこと）。対照（ｎ＝１１）は、１０回のタンパク質注入ごとに括弧で括られ、シーケンスが有効であることを確実にするために最初に分析された。図２３は、対照の重ね合わせを示す。ベースライン開始時（４．０〜５．０分後、及び８．５分より後）及びベースラインの後端で増大（最大５ｍＶまで）があったが、これらの変化は、積分または最終ＰＳ２０定量に影響せず（表３１）平均ＰＳ２０量は、０．２±０．００５（２．８％ＲＳＤ）ｍｇ／ｍＬで計算された。
表３０：シーケンス（全ての２５μＬ注入）
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表３１：１００×タンパク質シーケンスで使用される対照の定量
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【０３５５】
対照は実験を通して定性的及び定量的に一貫していたので、公称０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０を含む１００個のＡ１８／Ａ１９試料（１５０ｍｇ／ｍＬ）を積分し（図２４）、定量した（図２６Ｂ、表３２）。図２４は、ＰＳ２０領域の前、４．０〜５．０分の時点、及び８．５分より後のベースラインが増大する（約５ｍＶ）、対照と同じ傾向を示す。面積対注入数、及び量対注入数をプロットすると、タンパク質の定量化は最小の偏差を有したが、最初の２０回の注入について計算された面積及び量についてはわずかに減少傾向があり、これはカートリッジの平衡に起因し得る（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。最終的に、Ａ１８／Ａ１９試料の１００回の注入に対して定量されたＰＳ２０の平均面積及び量は、それぞれ１８．３±０．７６（４．２％ＲＳＤ）ｍＶ*分及び０．２±０．００５（２．６％ＲＳＤ）ｍｇ／ｍＬであった（表３２）。３７５ｍｇのタンパク質が１００回目の注入終了までにカートリッジにロードされたことに留意されたい。この方法は、ＵＶトレース（図２５Ｂ）に示されるように、シーケンス全体にわたって４．０分で流出液がＥＬＳＤに入る（図２５Ａ）前に、タンパク質及び賦形剤を十分に一貫して除去した。
【０３５６】
下降傾向のため、公称０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０を含むＡ１８／Ａ１９製剤緩衝液の１００回の注入を、この効果がタンパク質または製剤に起因するものであるか否かを決定するために新しいＭＣＸカートリッジ（カートリッジ５）で評価した。興味深いことに、最初の４９回の注入についても、面積値［ｎ＝１００、平均３１．３±１．３（４．１％ＲＳＤ）ｍｖ*分］に同様の減少傾向があった（図２７Ａ）。この挙動は、定量に大きな影響を及ぼさなかった［ｎ＝１００、平均０．２２±０．００５（２．１％ＲＳＤ）］（図２７Ｂ、及び表３２）。
【０３５７】
水にスパイクされた０．２ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０もまた、真新しいカートリッジ（カートリッジ３）で評価したとき、そのような減少傾向はなかった。この試料について、面積値［ｎ＝１００、平均２０．７±０．３（１．５％ＲＳＤ）ｍｖ*分］（図２８Ａ）は、定量化［ｎ＝１００、平均０．２０±０．００２（０．９％ＲＳＤ）］（図２８Ｂ、表３２）と共に一貫したままであった。水＋ＰＳ２０試料からのこの結果によって、以前に観察された下方傾向（図２６Ａ及び２７Ａ）が製剤中の他の賦形剤またはタンパク質の存在に関連していることが示され得る。別の可能性は、それが使用された特定のカートリッジに関連した効果であり、そして他の配合成分に依存しないということである。
表３２：水中にスパイクしたＰＳ２０、Ａ１８／Ａ１９製剤緩衝液、Ａ１８／Ａ１９試料の１００×注入の定量
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【０３５８】
全体として、１００回のＰＳ２０注入後に３つのカートリッジがそれぞれ効率的に機能し得、ＭＣＸカートリッジの再現性及び耐久性がＱＣ環境での日常的な使用に適していることが示されている。さらに重要なことに、１００回のタンパク質注入の吸光度プロファイルは、シーケンス全体を通してタンパク質とＮＡＴの両方の同様のクリアランスを明らかに示す（図２５Ｂ）。ＰＳ２０の定量は、シーケンス全体を通して統計的に一定のままであった。
【０３５９】
３つの低ｐＩ生成物のＰＳ２０定量評価
３つの異なる低ｐＩ生成物、Ａ２１、Ａ１４／Ａ１５及びＡ１４（表３３）を、方法１（実施例１に記載）及び方法２を用いて評価した。この評価に使用したカートリッジを表３４に列挙する。試験された方法の性能特性は、特異性、正確性、直線性、及び再現性であった。
表３３．評価した分子
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＊ｐＩは括弧囲み（検量線）アプローチ法により決定
＊＊ｉｃＩＥＦ対照システムアッセイにより決定されたｐＩ
表３４．方法開発中に使用されたカートリッジ
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【０３６０】
特異性
３つの分子について計算された特異性を表３５に示す。対応するクロマトグラムを図２９Ａ〜図２９Ｆに示す。Ａ２１（１５０ｍｇ／ｍＬ）は、水中の０．１ｍｇ／ｍＬ  ＰＳ２０（５０％標的）と比較して、方法１（メタノールと酢酸を含むＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ）で評価すると１６％の干渉を有し、方法２（メタノールと水酸化アンモニウムを含むＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸ）で評価すると７％の干渉を有した。これは、低ｐＩ生成物と陽イオン交換樹脂（亜硫酸塩陰イオン基）との相互作用が弱くなり、タンパク質の干渉が最小限に抑えられることに起因し得る。Ａ１４／Ａ１５（１９２ｍｇ／ｍＬ）は、水中０．１５ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（５０％標的）と比較して、方法１で評価した場合３％の干渉、及び方法２で評価した場合２％の干渉を有した。Ａ１４（１６１ｍｇ／ｍＬ）は、水中０．１５ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０（５０％標的）と比較して、両方の方法で評価した場合、約１％の干渉を有した。これらの生成物の特異性は、この方法によって有意な影響を受けなかった。
表３５．３つの低ｐＩ分子の特異性
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【０３６１】
正確性
アッセイの正確性を決定するために、既知量のＰＳ２０を、ＰＳ２０フリーのタンパク質にスパイクし、各濃度に対する回収率を決定した（表３６）。典型的な検証合格基準は、回収率％が８０〜１２０％以内であることを必要とする。
【０３６２】
ＰＳ２０フリーのＡ２１を、０．１０〜０．３０ｍｇ／ｍＬの範囲でＰＳ２０をスパイクすることによって評価した。正確性データを表３６に要約する。試験したＰＳ２０濃度において、方法１及び方法２を用いて試料を分析したときの回収率の範囲は、それぞれ９９〜１０８％及び１０１〜１１０％であった。ＰＳ２０フリーのＡ１４／Ａ１５及びＡ１４の正確性は、０．１５〜０．４５ｍｇ／ｍＬの範囲でＰＳ２０をスパイクすることによって評価した。Ａ１４／Ａ１５のＰＳ２０回収率は、方法１と方法２を使用して試料を分析した場合、それぞれ９７〜１０１％及び９２〜９９％の範囲であった。Ａ１４のＰＳ２０回収率は、方法１と方法２を使用して試料を分析した場合、それぞれ１０２〜１０８％及び１０２〜１１０％の範囲であった。全体として、試験した３つの生成物全てについてのスパイクした回収実験のデータによって、両方の方法とも正確であることが実証された。
表３６．３つの低ｐＩ生成物の回収
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三連、２０μＬ注入
【０３６３】
直線性
方法１及び方法２で評価した３つの低ｐＩ生成物について試験した範囲にわたってピアソンの相関係数（ｒ）≧０．９９を決定することによって、直線性を評価した。これらの値をそれぞれの生成物のＰＳ２０濃度の範囲ごとに表３７に示す。試験したＰＳ２０の範囲では、ピアソンの相関係数の値は全て０．９９を超えていた。したがって、試験した３つの生成物にわたって、方法１及び方法２の直線性は許容範囲内であった。
表３７．３つの低ｐＩ生成物の直線性
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【０３６４】
再現性
再現性は、５つの濃度の３つの再現を試験すること、及びＰＳ２０ピーク面積のＲＳＤ％を測定することにより評価した。この実験は、ＰＳ２０フリーのＡ２１に０．１０〜０．３０ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０をスパイクし、ＰＳ２０フリーのＡ１４／Ａ１５及びＡ１４に０．１５〜０．４５ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０をスパイクして行った。この評価の結果を表３８に示し、そしてアッセイの精度が試験した３つの生成物にわたって方法１及び方法２の両方について許容できたことが示される。
表３８．３つの低ｐＩ生成物の再現性
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三連、２０μＬ注入
【０３６５】
結論：
実施例１の方法１からの以下の改変を、現在のＥＬＳＤアッセイ、方法２に対して行った：
移動相添加剤を２％酢酸から１．５％水酸化アンモニウムに切り替えた
流速を１．２５ｍＬ／分から１．４０ｍＬ／分に変更した
廃棄物からＥＬＳＤへのＬＣフローは２．４分から４．０分に変更された
洗浄ステップでのＢ％濃度は４０％から４５％の移動相Ｂに切り換わった
洗浄ステップにおける有機物の時間は１．０〜３．４分から１．０〜４．４分に切り換わった
溶出ステップの時間は３．５〜４．６分から４．５〜７．６分に変更された
４．７〜６．６分の平衡化ステップの時間が７．７〜９．６分に変更された
【０３６６】
これらの改変は、ＮＡＴ及びタンパク質干渉の両方を排除し、そしてカートリッジ間の定量の変動が最小であった。３つのＮＡＴ含有生成物についてのこの改変アッセイの認定からの結果、このアッセイがこれらの製剤中のポリソルベート２０の定量に適していることが示された。
【０３６７】
３つの低ｐＩ分子を、方法１と方法２の両方で評価した。合格基準を満たすことができなかった唯一の例は、方法１をＡ２１と共に使用した場合の特異性に関するものであった。これ以外に、両方の方法とも、３つの低ｐＩ生成物全ての正確性、直線性、及び再現性の基準に合格していた。これらの結果により、さらに、方法２がＰＳ２０を定量することもでき、そしてＮＡＴ非含有生成物に特に有用であることが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【国際調査報告】
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