(57)【要約】  カリマイシンの抗結核感染における応用である。その主な工程は、臨床における第１選択の抗結核薬イソニアジドおよびリファンピシンを対照とし、絶対濃度法を採用してカリマイシンの抗結核菌活性を測定することである。結果は、薬剤耐性菌を含む臨床分離した結核菌に対するカリマイシンの活性は、臨床における第１選択薬である対照薬イソニアジドおよびリファンピシンより明らかに優れており、結核感染症の治療薬の調製において、カリマイシンを使用する可能性があることを示している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗結核薬の調製におけるカリマイシンの応用。
【請求項２】
カリマイシンを有効成分とし、薬学的に許容可能な担体とからなる組成物の抗結核薬の調製における応用。
【請求項３】
抗結核感染の治療に採用するカリマイシンまたはカリマイシンの組成物を、経口剤型、注射剤型またはその他の適した剤型に調製することを特徴とする、請求項１または２に記載の応用。
【請求項４】
患者に有効量のカリマイシンを投与することを含む、抗結核感染の方法。
【請求項５】
患者に有効量のカリマイシンと、薬学的に許容可能な担体とからなる組成物を投与することを含む、抗結核感染の方法。
【請求項６】
抗結核感染の治療に採用するカリマイシンまたはカリマイシンの組成物を、経口剤型、注射剤型またはその他の適した剤型に調製することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核感染の治療におけるマクロライド系抗生物質の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は結核菌（ＭＴＢ）の感染により引き起こされる慢性感染症であり、肺に好発し、感染症において最も死亡人数が多い疾病である。結核は免疫機能が低下した人々に多く見られ、最も一般的なエイズに関係する日和見感染症でもある。世界保健機関（ＷＨＯ）の報告によると、全世界で毎年８００万〜１０００万が肺結核を新たに発症し、３００万〜４００万人が結核で死亡しており、発展途上国は深刻である。他に、予測によれば、２０００〜２０２０年に約１０億人が感染し、３５００万人が結核で死亡する。これと同時に、ＭＴＢの薬剤耐性は年々増加しており、全世界の結核の制御に対して大きな脅威となっている。中国は全世界で結核の発症率が高い２２の国家の１つであり、活動性結核の患者数は世界２位である。流行の特徴は、高感染率、高罹患率、高い薬剤耐性率および高死亡率であり、全国２００万のＭＴＢ陽性患者のうち、１／４以上が薬剤耐性結核の患者である。
【０００３】
現在、臨床で結核治療に常用される第１選択薬（明確な抗結核菌活性を有する）は、リファンピシン、イソニアジド、ストレプトマイシン、エタンブトール、およびピラジナミドなど５種である。しかしながらこれらの薬物は副作用が多く、殺菌作用に限度があり、治療クールが比較的長くて通常６ヶ月以上使用し、患者のコンプライアンスが悪い。第２選択薬の抗結核薬（結核菌に対して静菌作用を有する）は、カプレオマイシン、エチオナミド、４−アミノサリチル酸、サイクロセリン、シプロフロキサシン、アミカシン、およびカナマイシンなどがあり、これらの薬物は副作用が比較的多く、治療時間はさらに長く（１８〜２４か月）、出費が多く、治癒率もさらに低い。注目する価値があることとして、臨床研究により、第１選択の抗結核薬はいずれも肝臓を損傷させることが明らかにされている。例えばイソニアジドの副作用は末梢神経炎、肝毒性、中枢神経系統の障害およびアレルギー反応である；リファンピシンの副作用は肝毒性、消化器の不調、神経系の症状およびアレルギー反応である；エタンブトールの副作用は主に中毒性視神経症である；ピラジナミドの副作用は皮膚黄染の出現、および血中尿酸の上昇である；ストレプトマイシンの毒性および細菌の薬剤耐性の問題は深刻で、その応用は制限されている。その他の薬物と併用して、細菌の薬剤耐性の発生率を減少させることができるため、臨床応用は多くないが、抗結核の第１選択薬として用いられる（朱珊梅、海峡薬学、２０１０、２２（２）：１２３〜１２５）。他に、報告によると、２０１０年、５１８株の臨床分離した結核菌に対する研究により、第１選択薬において、イソニアジドに対する薬剤耐性率が最も高く、５３．６７％に達し、ストレプトマイシンに対する薬剤耐性率は４５．９５％である；第２選択薬において、オフロキサシンに対する薬剤耐性率は３９．７７％に達し、アミカシンに対する薬剤耐性率は１５．８３％であり、カプレオマイシンに対する薬剤耐性率は２１．８１％である；１つ以上の第１選択薬に対する薬剤耐性菌３２１株において、オフロキサシンに対する薬剤耐性率は５７．０１％に達し、アミカシンおよびカプレオマイシンに対する薬剤耐性率はそれぞれ２５．５５％および３３．０２％である；２１７株の多剤耐性株において、オフロキサシンに対する薬剤耐性率は７２．３５％に達することが明らかにされている（劉一典ら、２０１０、中国防癆協会臨床基礎専業学術大会彙編、２７４〜２７５ページ）。これは、中国の結核に対する制御作業、特に多剤耐性結核に対する制御作業に、厳しさをもたらしている。したがって、できるだけ早く抗結核菌、特に抗多剤耐性菌の代替製品を探し出す必要があり、すでに一刻の猶予もない。
【０００４】
新しいマクロライド系薬剤のクラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシンは１４員環エリスロマイシンの誘導体であり、その抗菌作用のメカニズムは、上記の第１、第２選択の抗結核薬と異なり、菌体内のリボソームの５０Ｓサブユニットと可逆的に結合し、タンパク質の合成を阻害する。国内で、クラリスロマイシンの感受性結核菌に対するＭＩＣは０．２５〜２．０マイクログラム／ミリリットルであり、薬剤耐性菌に対するＭＩＣは２．０〜３２マイクログラム／ミリリットルである；アジスロマイシンの抗結核菌のＭＩＣは１２８マイクログラム／ミリリットルであることが報告されている（唐神結、抗結核薬物研究最新進展、中国防癆雑誌、２００６年、２８卷増刊１〜３ページ）。外国の報告によると、クラリスロマイシンのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ２７２９４）に対するＭＩＣは６マイクログラム／ミリリットルであり；アジスロマイシンのＭＩＣは９５マイクログラム／ミリリットルであり（Ｋａｎａｋｅｓｈｗａｒｉ  Ｆａｌｚａｒｉ  ｅｔ  ａｌ；Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２００５、４９（４）：１４４７〜１４５４）；ロキシスロマイシンのＭＩＣ≧６４マイクログラム／ミリリットルである。この種の薬物は臨床で結核感染を治療する薬物に加えられていないが、臨床において、単独または抗結核薬と併用して多剤耐性結核感染症を治療した報告がある（許麗ら、深せん市住院病人抗結核相関抗菌薬物応用調査、中国防癆雑誌、２０１０、３２（３）：１５１〜１５４）。
【０００５】
研究により、１６員環マクロライド系抗生物質は、１４員環マクロライド系抗生物質と類似の抗菌作用メカニズムを有することが証明されている。この種の薬物の結核菌に対する活性は低く、例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ２７２９４）に対して、タイロシンのＭＩＣは５８．６マイクログラム／ミリリットルであり、スピラマイシンおよびミデカマイシンはいずれも＞１００マイクログラム／ミリリットルである（Ｋａｎａｋｅｓｈｗａｒｉ  Ｆａｌｚａｒｉ  ｅｔ  ａｌ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２００５、４９（４）：１４４７〜１４５４）。したがって、これまでのところ、国内外でこの種の抗生物質を結核の臨床治療に用いた関連報告はまだない。
【０００６】
本研究室が開発した新規の１６員環マクロライド系抗生物質−カリマイシン（元の名はｓｈｅｎｇｊｉｍｙｃｉｎ、バイトスピラマイシン）は、イソバレリルスピラマイシンを主成分とした４’’−アシル化スピラマイシンであり、その作用メカニズムは細菌のリボソームと結合することにより、そのタンパク質の合成を抑制する。体内外の試験結果は、カリマイシンがグラム陽性菌、特にいくつかの薬剤耐性菌（例えばβ−ラクタム耐性黄色ブドウ球菌、エリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌など）に対して有効であり、同類薬と明らかな交叉耐性を有さないことを示している。これと同時に、マイコプラズマ、クラミジアに対して良好な抗菌活性を有し、一部のグラム陰性菌に対しても抗菌作用を有し、トキソプラズマ、レジオネラなどに対しても良好な抗菌効果を有する（王以光ら、「必特螺旋黴素及其在抗感染性疾病中的応用」、２００３年１２月２３日、中国発明特許登録番号第２００３１０１２２４２０．９号明細書）。カリマイシンは良好な組織浸透性を有し、その体内の抗菌活性は明らかに体外より優れており、潜在的な免疫調節作用を有する。第１、２、３相の臨床研究により、カリマイシンが、使用が安全で治療効果が顕著な抗生物質であることが証明されている。本研究室は、カリマイシンの潜在的な効果をさらに発掘し、カリマイシンの臨床適応症および使用範囲を拡大する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国発明特許登録番号第２００３１０１２２４２０．９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】朱珊梅、海峡薬学、２０１０、２２（２）：１２３〜１２５
【非特許文献２】劉一典ら、２０１０、中国防癆協会臨床基礎専業学術大会彙編、２７４〜２７５ページ
【非特許文献３】唐神結、抗結核薬物研究最新進展、中国防癆雑誌、２００６年、２８卷増刊１〜３ページ
【非特許文献４】Ｋａｎａｋｅｓｈｗａｒｉ  Ｆａｌｚａｒｉ  ｅｔ  ａｌ；Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｌｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、２００５、４９（４）：１４４７〜１４５４
【非特許文献５】許麗ら、深せん市住院病人抗結核相関抗菌薬物応用調査、中国防癆雑誌、２０１０、３２（３）：１５１〜１５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、臨床分離した結核菌に対するカリマイシンの活性についての一連の測定、実験研究を提供し、結核感染症の治療に新しく使用する可能性があることを証明する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主な工程は、絶対濃度法を採用し、臨床分離した結核菌に対してカリマイシンの抗結核菌活性を測定し、臨床で使用する抗結核の第１選択薬であるイソニアジドおよびリファンピシンを対照とする。実験結果は、臨床分離した２４０株の結核菌のうち、カリマイシンが活性を示す菌株は１７２株で、総有効率は７１．６６％であり、このうち活性がイソニアジドより優れているのは３７株で、有効菌数の２１．５％を占める；活性がリファンピシンより優れているのは３９株で、有効菌数の２２．７％を占める；活性が両者より優れているのは２３株で、有効菌数の１３．４％を占めることを示している。本発明の結果は、イソニアジドおよびリファンピシン耐性の結核感染症に対する治療において、カリマイシンを新しく使用する可能性があることを示している。
【００１１】
本発明は、カリマイシンを有効成分とし、薬学的に許容可能な担体とからなる組成物の抗結核薬の調製における応用をさらに提供する。
【００１２】
本発明の前記応用は、経口剤型を採用することも、注射剤型またはその他の適した剤型を採用することもできる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の実施例は、当業者が本発明をより良好に理解するためのものに過ぎず、いかなる方式でも本発明を制限しない。
【００１４】
具体的な実施方式において、臨床で常用される抗結核の第１選択薬を対照とし、カリマイシンの抗結核菌活性を測定する一連の研究を行う。結果は、臨床分離した結核菌に対して、前記カリマイシンが活性を示した菌株の有効数は、いずれも対照群より優れていることを示している。これは、いくつかの薬剤耐性結核感染症の治療で応用される。
【実施例】
【００１５】
《実施例１》結核菌標本の取得および処理
衛生部が発表した国家標準ＷＳ２８８−２００８《肺結核診断標準》の規定に基づき、臨床症状、兆候および胸部画像診断で診断したか、または高度に疑われる結核患者を選択する。選択された患者の痰、胸水、脳脊髄液、膿の標本を約２ｍＬ採取し、スクリューキャップ付の５０ｍＬ遠心管に入れる。標本と等量のＮ−アセチル−Ｌ−システイン水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ−ＮＡＬＣ）前処理液を添加して、２０秒ボルテックスする。室温で１８分間静置する。ＰＢＳ（ｐＨ６．８）を４０ｍＬまで添加し、３０００ｇで２０分間遠心分離し、その後、上清を捨て、沈殿を残す。２ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ６．８）を添加し、懸濁液を調製する。処理後の標本を培地に接種して固体培養する。
【００１６】
《実施例２》結核菌標本の分離培養、同定
１．培地の調製
培地の成分は表１に示す通りである。示した分量に応じて各成分を蒸留水に添加し、充分に溶解させる；３０分間煮沸するか、または１２１℃、高圧に１５分間置く。
【００１７】
新鮮な鶏卵を水道水で洗浄し、石鹸水できれいにこすり洗いし、乾燥させてから、７５％アルコールで拭き、消毒する。無菌操作下で、卵液を滅菌済みの目盛付ほうろうカップ内に入れ、充分に撹拌混合し、滅菌ガーゼでろ過した後、１０００ｍＬを採取して添加し、充分に混合する；２％マラカイトグリーンを２０ｍＬ添加し、充分に混合する；試験管（１８ｍｍ×１８０ｍｍ）に培地７ｍＬを分注し、蒸気恒温槽内に置き、８５℃で５０分間凝固させる。５％の調製した培地を管に取り、３７℃で４８時間培養し、無菌試験を行う；無菌試験に合格すると、４℃の冷蔵庫に置き、１か月内に使用する。
【００１８】
表１  培地
【００１９】
【表１】
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【００２０】
２．結核菌の接種、培養
《実施例１》で処理した標本を０．１ｍＬ吸い取る。これを培地の斜面に均等に摂取し、懸濁液は斜面全体に広げなければならない。３７℃のインキュベータ内で培養する。３日目、７日目に細菌の生長状況を観察し、その後は毎週１回観察するが、陽性が疑われるものを発見した場合、速やかに選り分け、毎日観察しなければならない。陽性の生長は塗布標本の染色により検証しなければならない。８週まで培養しても細菌の生長が見られない場合、結核菌の培養が陰性である。
【００２１】
３．結核菌の抗酸染色
上記結核菌の培養陽性菌叢を少し取り、スライドグラスに均等に塗布し、火炎固定する。石炭酸フクシン液で染色し、火炎上で５分間加熱し、３％塩酸アルコールで１分間前後脱色する。水で洗浄してから、アルカリ性メチレンブルー溶液で１分間対比染色し、水で洗浄する。水分を吸って乾燥させた後、油浸レンズ下で観察し、赤色に染色されたものが結核菌である。
【００２２】
《実施例３》カリマイシンの抗結核菌活性の実験
１．絶対濃度法
１）抗結核薬
カリマイシン標準品：中国薬品生物製品検定所から入手する；対照薬：イソニアジド、リファンピシンはＳｉｇｍａ社の標準品を採用する。抗結核薬は一定濃度で原液を調製し、その後一定量に応じて培地を添加し、所要の分量を調製する（表２）。
【００２３】
２）菌株の接種
臨床標本から分離した菌株について、塗抹標本で抗酸菌の培養物であると確認する。１０％のポリソルベート８０を含む生理食塩水で希釈し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度標準液（広東環凱微生物科技有限公司）と比濁する。１０−２ｍｇ／ｍＬ菌液を調製し、検査薬物を含む培地に接種する。
【００２４】
各試験に陰性対照および陽性対照を設ける。陰性対照は薬物を添加していない培地である。陽性対照は結核菌標準株Ｈ３７Ｒｖである。各管の接種量は０．１ｍＬである。接種後の培地を３７℃で培養する。
【００２５】
表２  培地に添加する抗結核薬の分量
【００２６】
【表２】
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注：本発明の実験における第１選択薬の使用量は、臨床における実際の使用量に基づいて設定したものである。
【００２７】
３）結果の観察および判定
菌液を接種した後、３日目に１回観察し、以降、毎週１回観察し、４週で結果を報告する。
培養結果は以下の基準で判定する。
１．８週培養してコロニーの生長が見られない場合、結核菌の培養が陰性（−）であると報告する；
２．培地の斜面に２０個以下のコロニーが生長した場合、結核菌が陽性であること、およびコロニー数を報告する；
３．培地の斜面にコロニーが分散して生長し、コロニー数が２０個以上であり、斜面の面積の１／４以下を占めるものを、結核菌陽性（１＋）と報告する；
４．培地の斜面にコロニーが分散して生長し、斜面の１／４以上１／２以下を占めるものを、結核菌の培養が陽性（２＋）であると報告する；
５．培地の斜面にコロニーが密集して生長するか、または一部が融合し、斜面の１／２以上３／４以下を占めるものを、結核菌陽性（３＋）と報告する；
６．培地の斜面にコロニーが密集して生長し、斜面の面積の３／４以上を占めるものを、結核菌陽性（４＋）と報告する。
【００２８】
２．カリマイシンの抗結核菌活性
１）カリマイシンに感受性を示す臨床結核菌
臨床分離し、同定した２４０株の結核菌のうち、カリマイシン１または２０（μｇ／ｍｌ）に感受性を示す菌株は１７２株ある（表３）。表３から、臨床分離した１７２株のカリマイシンに感受性を示す菌株のうち、９２株の菌の感受性が研究室の品質管理株Ｈ３７Ｒｖに相当し、有効菌株の５３．４８％を占める；その他の８０株の感受性は明らかに研究室の品質管理株より高い；５４株は１μｇ／ｍｌのカリマイシンに感受性を示し、総有効菌の３１．３９％を占めることがわかる。カリマイシンが臨床分離した結核菌に対して比較的良好な活性を有すると説明できる。
【００２９】
表３  カリマイシンに感受性を示す臨床結核菌
【００３０】
【表３】
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品質管理：結核菌の研究室標準株Ｈ３７Ｒｖを陽性対照として用いる；
対照：薬物を添加しない培地。薬物を含有しない培地で生長させると、すべての分離菌株がいずれも４＋となる。
【００３１】
２）いくつかの臨床結核菌に対するカリマイシンおよびイソニアジドの活性の比較
臨床結核菌に対する、カリマイシンと臨床における第１選択の抗結核薬イソニアジドとの活性を比較する。結果は、カリマイシン２０μｇ／ｍｌが３７株のイソニアジド耐性の臨床結核菌に対して有効であることを示している（表４）。
【００３２】
表４  臨床結核菌の感受性に対するカリマイシンおよびイソニアジドの比較
【００３３】
【表４】
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【００３４】
３）いくつかの臨床結核菌に対するカリマイシンおよびリファンピシンの活性の比較
臨床分離した結核菌に対する、カリマイシンと臨床における第１選択の抗結核薬リファンピシンとの活性を比較する。実験結果は、カリマイシン２０μｇ／ｍｌが３９株のリファンピシン耐性の臨床結核菌に対して有効であることを示している（表５）。
【００３５】
表５  臨床結核菌の感受性に対するカリマイシンおよびリファンピシンの比較
【００３６】
【表５】
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【００３７】
いくつかの臨床結核菌に対するカリマイシンの活性は、２５０μｇ／ｍｌのリファンピシンより優れている。
【００３８】
４）いくつかのイソニアジド耐性およびリファンピシン耐性の臨床結核菌に対するカリマイシン活性の比較
イソニアジド耐性およびリファンピシン耐性の臨床結核菌に対するカリマイシンの活性を比較する。実験結果は、２３株の臨床結核菌に対するカリマイシン２０μｇ／ｍｌの活性が、１μｇ／ｍｌイソニアジドおよび２５０μｇ／ｍｌリファンピシンより優れていることを示している（表６）。
【００３９】
表６  いくつかのイソニアジド耐性およびリファンピシン耐性の臨床結核菌に対するカリマイシン活性の比較
【００４０】
【表６】
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【００４１】
本発明の実験研究の結果は、カリマイシンが臨床における第１選択の抗結核薬イソニアジドおよびリファンピシンに感受性を示す菌に対して活性を有するだけでなく、一部のイソニアジドおよびリファンピシン耐性菌に対しても活性を有し、薬剤耐性結核感染症の臨床治療において新しい応用の可能性があることを示している。
【国際調査報告】
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