(57)【要約】  本発明は、ＶＥＧＦ拮抗薬を収容し、かつシリコーン不使用のプラスチックバレルを備えたプレフィルドシリンジ、このシリンジを含むキット、及び眼疾患の治療においてＶＥＧＦ拮抗薬を投与するための該シリンジの使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ拮抗薬の液体製剤を収容し、かつシリンジバレルを備えたプレフィルドシリンジにおいて、前記シリンジバレルはプラスチックからなり、かつシリコーン不使用であり、かつ格納不能なストッパーをさらに備える、プレフィルドシリンジ。
【請求項２】
ＶＥＧＦ拮抗薬の液体製剤を収容し、かつシリンジバレルを備えたプレフィルドシリンジにおいて、前記シリンジバレルはプラスチックからなり、シリコーン不使用であり、かつ４５ｍｍ〜６５ｍｍの長さを有する、プレフィルドシリンジ。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦ拮抗薬は、抗ＶＥＧＦ抗体、又はそのような抗体の抗原結合フラグメント、又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質である、請求項１又は２に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項４】
前記抗ＶＥＧＦ拮抗薬はラニビズマブ又はアフリベルセプトである、請求項３に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項５】
前記拮抗薬の濃度は１〜１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項６】
１０μｍ以上の直径を有する粒子を前記液体製剤１ｍＬ当たり５０個未満含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項７】
２５μｍ以上の直径を有する粒子を前記液体製剤１ｍＬ当たり５個未満含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項８】
１０Ｎ以下の滑動力を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項９】
シリコーン不使用のストッパーを備える、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項１０】
前記シリンジバレルは、シクロオレフィンポリマー又はシクロオレフィンコポリマーからなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項１１】
前記シリンジバレルは、シリコーンコーティング以外の内側コーティングを備える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項１２】
ステーキドニードルを備えた、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の１つ以上のプレフィルドシリンジを含むキット。
【請求項１４】
眼疾患を有する患者に対するＶＥＧＦ拮抗薬の液体製剤の投与に使用するための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
【請求項１５】
前記眼疾患は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害、網膜静脈閉塞（網膜分枝静脈閉塞又は網膜中心静脈閉塞）に付随して起こる黄斑浮腫による視力障害、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病網膜症、又は病的近視に付随して起こる脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）による視力障害のうちから選択される、請求項１３に記載の使用のためのプレフィルドシリンジ。
【請求項１６】
３０〜１００μＬの量の液体製剤が患者に投与される、請求項１４又は１５に記載の使用のためのプレフィルドシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦ拮抗薬を収容し、かつシリコーン不使用（シリコーンフリー）のプラスチックバレルを備えたプレフィルドシリンジ（薬剤充填済み注射器）、このシリンジを含むキット、及び眼疾患の治療においてＶＥＧＦ拮抗薬を投与するための該シリンジの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性症及び糖尿病性黄斑浮腫のような眼疾患は、眼内の血管の無制限な成長によって引き起こされる。従って、これら及び同様の疾患を治療する１つの選択肢は、眼内における血管新生を抑制することである。ＶＥＧＦは、血管新生を刺激する大きな因子であるので、ＶＥＧＦは血管新生を下方制御するための興味を引く標的である。
【０００３】
アイリーア（Ｅｙｌｅａ）（登録商標）の名称で販売されているアフリベルセプトは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ部に融合された、ヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメインからのＶＥＧＦ結合部からなる組換え融合タンパク質である。アフリベルセプトは滲出型黄斑変性の治療に承認されている。ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）（登録商標）の名称で販売されているラニビズマブは、ＶＥＧＦに対するヒト化マウスモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントであり、加齢黄斑変性症及び糖尿病性黄斑浮腫のような眼疾患の治療に承認された。加えて、眼疾患の治療について、ＶＥＧＦに対する完全長抗体ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））の適応外使用は一般的である。ラニビズマブ及びベバシズマブは、血管新生性加齢黄斑変性症の治療において同様の有効性プロファイルを有すると思われるが、稀な有害事象はベバシズマブにおいてより頻繁に生じるように思われる（非特許文献１）。
【０００４】
ベバシズマブ及びラニビズマブの双方はガラスバイアルで提供され、それらの薬剤は、通常、眼に注射する直前にシリンジ（注射器）によって前記ガラスバイアルから取り出される。これらの抗体の市販のバイアルの全量を使用するために、いくつかの企業は、前記バイアルを無菌条件下で、すぐに使用できるプラスチックシリンジに詰め直すことにより、１本のガラスバイアルから２本以上のシリンジをとることを可能にしている。しかしながら、詰め直されたシリンジ内において、シリコーンオイルの微小滴及びタンパク質凝集物が観察された（非特許文献２）。そのようなシリコーンオイル汚染物質及びタンパク質凝集物は、ベバシズマブ又はラニビズマブによって治療された患者に見られる眼内圧の上昇の原因となることがある（非特許文献３及び４）。
【０００５】
特許文献１は、シリンジのシリコーン含有量が低い、ＶＥＧＦ拮抗薬を収容したプレフィルドシリンジを開示している。この文書の開示全体はガラスシリンジの使用に焦点を当てており、従って、そのシリンジ内には低量のシリコーンが存在するはずであることを教示している。
【０００６】
さらに、最近、プレフィルドラニビズマブシリンジが欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ：ＥＭＡ）によって承認された。そのシリンジバレルは、シリコーンオイルの水中エマルジョンによって噴霧被覆され、続いて熱固定された（いわゆる「焼き付けシリコーン」）ホウケイ酸ガラスからなる（非特許文献５及び６）
プレフィルドシリンジは、バイアル及び別々に提供されるシリンジと比較して、利便性、値ごろ感、精度、無菌状態及び安全性の向上のような多くの利点を有する。プレフィルドシリンジの使用により、より高い投与量精度、バイアルから薬剤を吸い出す間に起こり得る針刺し事故の可能性の低減、薬剤を再構成したり、かつ／又は薬剤をシリンジに吸い込んだりする必要があることによる投薬過誤を低減するあらかじめ計量された投与量、及び薬剤の無駄を最小限にすることによりコストの削減を助けるシリンジの過剰充填の低減がもたらされる。
【０００７】
しかしながら、承認されたラニビズマブプレフィルドシリンジのようなガラスシリンジは破損し易く、プラスチックシリンジに比べて比較的大きな重量を有する。
さらに、ガラスシリンジは、ガラスバレル内におけるストッパーの正しい動作を可能にし、それにより効率的で正確な薬物送達を可能にするために、シリコーンによって処理される必要がある。ＶＥＧＦ拮抗薬の硝子体内投与後に硝子体腔内においてシリコーンオイル滴が生じることが分かっており、該シリコーンオイルは注射に用いられたニードル（注射針）及びシリンジから由来するという仮説が提示された（非特許文献７）
加えて、ステーキド−イン  ニードル（ｓｔａｋｅｄ−ｉｎ  ｎｅｅｄｌｅ）をガラスシリンジに取り付けるのに必要な接着剤は、不純物又はタンパク質の酸化の増大につながり得る（非特許文献８及び９）。
【０００８】
最後に、ガラスプレフィラブルシリンジの製造中に、通常、タングステンピンが用いられる。プレフィルドシリンジ内に見られる可溶性タングステンは、タンパク質の凝集及びタンパク質の酸化を招くことが示されている（非特許文献１０及び１１）。
【０００９】
ガラスプレフィルドシリンジに関する問題は、過去にいくつかの製品回収に至ったことがある。
いくつかの非ガラスプレフィルドシリンジが記載されている。特許文献２はポリカーボネートシリンジを開示しているが、シリンジバレルがシリコーンによって被覆されているかどうか、及びシリンジが眼内投与に適しているかどうかは明らかではない。特許文献３は、シリコーンで被覆されたガラスシリンジにおいてよりも、潤滑剤を有さない環状オレフィンポリマーシリンジにおける方が、可視粒子の形成が少ないことを開示している。しかしながら、このシリンジを眼科用途に用いることができるかどうかは明らかではない。
【００１０】
従って、薬剤を眼に安全に送達することができ、ガラスシリンジの使用における上記の不都合を回避することができるが、その内部で薬剤が保管期間中に安定している非ガラスシリンジが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】オーストラリア特許第ＡＵ２０１２１０１６７７Ａ４号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１１／１１７８７８Ａ１号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００９／０９９６４１Ａ２号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）及びシャルマー（Ｓｈａｒｍａ）、２０１３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、第２４巻、第３号、第２０５〜１２頁
【非特許文献２】リウ（Ｌｉｕ）ら、２０１１年、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．、第５２巻、第２号、第１０２３〜１０３４頁
【非特許文献３】カフーク（Ｋａｈｏｏｋ）ら、２００９年、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇ．  Ｌａｓｅｒｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ、第４０巻、第２９３〜２９５頁
【非特許文献４】グッド（Ｇｏｏｄ）ら、２０１１年、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、第９５巻、第８号、第１１１１〜１１１４頁
【非特許文献５】２０１４年３月２０〜２３日に開催された５ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙにおけるクルナス（Ｃｌｕｎａｓ）らによるポスター発表
【非特許文献６】ｔｈｅ  ＡＲＶＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１４におけるミショー（Ｍｉｃｈａｕｄ）らのポスター発表
【非特許文献７】バクリ（Ｂａｋｒｉ）及びエクダヴィ（Ｅｋｄａｗｉ）、２００８年、Ｒｅｔｉｎａ、第２８巻、第  ９９６〜１００１頁
【非特許文献８】２０１１年１１月７〜１１日にバゼル（Ｂａｓｅｌ）で開催されたｔｈｅ  ２０１１  ＰＤＡ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｅ−Ｆｉｌｌｅｄ  Ｓｙｒｉｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓにおけるアドラー（Ａｄｌｅｒ）の発表
【非特許文献９】２０１１年６月２２〜２３日にベテスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）で開催されたｔｈｅ  ＰＤＡ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｕｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐにおけるマルコビッチ（Ｍａｒｋｏｖｉｃ）の発表
【非特許文献１０】リウ（Ｌｉｕ）ら（２０１０年）、ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第６４巻、第１号、第１１〜１９頁
【非特許文献１１】ザイドル（Ｓｅｉｄｌ）ら（２０１２年）、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、第２９巻、第１４５４〜１４６７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
プラスチックシリンジは、タンパク質の修飾をもたらし得る酸素のような気体に対してガラスシリンジよりも透過性が高いことを想定していたが（例えば、ディーリック（Ｄｉｅｒｉｃｋ）及びヨシノ、２０１５年、ＯｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ、第５５号、第１０〜１６頁を参照されたい）、本発明者らは、驚いたことに、抗ＶＥＧＦ抗体溶液が、シリコーン不使用のプラスチックシリンジバレルを備えたプレフィルドシリンジに充填された場合、保管中に安定している、すなわち抗体が有意に改質されず、かつ有意に凝集しないことを見出した。従って、前記シリンジを酸素吸収材と共に梱包する必要がない。さらに、本発明のプレフィルドシリンジは相当量の粒子を含有しない。最後に、本発明のプレフィルドシリンジからの溶液の注射に必要とされる力は、ガラスシリンジからの注射に必要とされる力と同等である。
【００１４】
よって、本発明のプレフィルドシリンジは、上記で検討したガラスシリンジの不都合を克服し、ＶＥＧＦ拮抗薬の眼への投与に用いられ得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、本発明は、ＶＥＧＦ拮抗薬の液体製剤を収容し、かつシリンジバレルを備えたプレフィルドシリンジを提供し、前記シリンジバレルは、プラスチックから製造されており、かつシリコーン不使用であり、かつ格納自在（リトラクタブル）でないストッパーをさらに備える。
【００１６】
本発明はまた、ＶＥＧＦ拮抗薬の液体製剤を収容し、かつシリンジバレルを備えたプレフィルドシリンジにも関し、前記シリンジバレルは、プラスチックから製造されており、シリコーン不使用であり、かつ４５ｍｍ〜６５ｍｍの長さを有する。
【００１７】
好適な実施形態において、前記ＶＥＧＦ拮抗薬は、抗ＶＥＧＦ抗体、又はそのような抗体の抗原結合フラグメント、又は可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質であり、より好適には、前記抗ＶＥＧＦ拮抗薬は、ラニビズマブ又はアフリベルセプトである。
【００１８】
好適には、拮抗薬濃度は１〜１００ｍｇ／ｍＬである。
本発明の一態様において、前記プレフィルドシリンジは、１０μｍ以上の直径を有する粒子を液体製剤１ｍＬ当たり５０個未満含有する。
【００１９】
本発明の別の態様において、前記プレフィルドシリンジは、２５μｍ以上の直径を有する粒子を液体製剤１ｍＬ当たり５個未満含有する。
本発明のさらに別の態様において、前記プレフィルドシリンジは１０Ｎ以下の滑動力を有する。
【００２０】
好適な実施形態において、前記プレフィルドシリンジは、シリコーン不使用のストッパーをさらに備える。より好適には、前記ストッパーは、フルオロポリマーフィルムによって被覆されている。
【００２１】
好適には、前記シリンジバレルは、シクロオレフィンポリマー又はシクロオレフィンコポリマーから製造されている。
好適な実施形態において、前記シリンジバレルは、シリコーンコーティング以外の内側コーティングを備える。
【００２２】
また好適には、前記プレフィルドシリンジはステーキドニードル（ｓｔａｋｅｄ  ｎｅｅｄｌｅ）を備える。
本発明はまた、本発明に従った１つ以上のプレフィルドシリンジを含むキットを提供する。好適には、前記キットはブリスターパックである。
【００２３】
前記プレフィルドシリンジは、眼疾患を有する患者、好適には、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害、網膜静脈閉塞（網膜分枝静脈閉塞又は網膜中心静脈閉塞）に付随して起こる黄斑浮腫による視力障害、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病網膜症、又は病的近視に付随して起こる脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）による視力障害のうちから選択される眼疾患を有する患者に対するＶＥＧＦ拮抗薬の投与に用いられ得る。
【００２４】
好適には、３０〜１００μＬの量の液体製剤が患者に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】４０℃／７５％の相対湿度において３か月間にわたってシリンジＳ６及びＳ２内に保管された試料の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下において例示的に記載される本発明は、本願に具体的には開示されていない任意の１つ以上の要素又は１つ以上の限定事項を有さない状態で適切に実施されてもよい。
本発明は特定の実施形態に関して記載するが、本発明はそれらの実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【００２７】
本説明及び特許請求の範囲において「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が用いられる場合、該用語は他の要素を排除しない。本発明において、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は「備える」という用語の好適な実施形態であると見なされる。以下において、ある群が少なくとも特定数の実施形態を備えると定義される場合には、これはまた、好適には、これらの実施形態のみからなる群を開示すると理解されるべきである。
【００２８】
本発明において、「得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」という用語は、「得られる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）」という用語の好適な実施形態であると見なされる。
単数名詞に言及するときに不定冠詞又は定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」が用いられる場合、特段の断りがない限り、これはその名詞の複数形を含む。
【００２９】
「プレフィルドシリンジ」は、充填された状態で製造業者によって供給されるシリンジである。すなわち、計量された投与量の投与すべき薬剤が購入時に既にシリンジ内に存在しており、投与の準備ができている。具体的には、薬剤を含有する医薬組成物を、該組成物を収容するバイアルから、空のシリンジを用いることによって取り出す必要がない。本発明の意味におけるプレフィルドシリンジという用語は、その内容物が詰め直し過程においてバイアルから取り出されたものであるシリンジを意味しない。
【００３０】
本発明のプレフィルドシリンジに収容された薬剤、すなわちＶＥＧＦ拮抗薬、好適には、抗ＶＥＧＦ抗体は、２〜８℃の温度で、少なくとも６か月間、好適には少なくとも９か月間、より好適には少なくとも１年間、特に好適には少なくとも１８か月間、最適には約２年間にわたって安定している。本発明のプレフィルドシリンジに収容された薬剤、すなわち、ＶＥＧＦ拮抗薬、好適には抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、より好適にはラニビズマブ又はアフリベルセプトは、室温、すなわち、２０℃〜２５℃の温度で、少なくとも３日間又は１週間、好適には少なくとも２週間又は３週間、より好適には約４週間、最適には少なくとも３か月間にわたって安定している。本発明のプレフィルドシリンジに収容された薬剤、すなわち、ＶＥＧＦ拮抗薬、好適には抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、より好適にはラニビズマブ又はアフリベルセプトは、約４０℃の温度で、少なくとも４時間又は６時間、好適には少なくとも１０時間又は１２時間、より好適には少なくとも１８時間又は２４時間、最適には１週間又は２週間にわたって安定している。
【００３１】
前記シリンジ内における薬剤の安定性は、酸化種及び脱アミド種などの薬剤の修飾物を検出することができるイオン交換クロマトグラフィ、又は薬剤の凝集物を検出することができるサイズ排除クロマトグラフィによって測定することができる。そのような分析の説明は実施例の節に示す。
【００３２】
前記薬剤、すなわちＶＥＧＦ拮抗薬、好適には、抗ＶＥＧＦ抗体は、凝集物及び化学的に修飾された種を含むすべての不純物の合計が、未修飾の凝集していない薬剤の量に対して、２％未満、好適には１．５％未満、より好適には１．２％、最適には１％未満である場合に安定していると考えられる。
【００３３】
本発明のプレフィルドシリンジに収容された薬剤、すなわちＶＥＧＦ拮抗薬、好適には抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、より好適にはラニビズマブ又はアフリベルセプトは、２〜８℃の温度で、少なくとも６か月間、好適には少なくとも９か月間、より好適には少なくとも１年間、特に好適には少なくとも１８か月間、最適には約２年間にわたって保管された場合に、その生物学的活性を維持する。本発明のプレフィルドシリンジに収容された薬剤、すなわち、ＶＥＧＦ拮抗薬、好適には抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、より好適にはラニビズマブ又はアフリベルセプトは、室温、すなわち２０℃〜２５℃の温度及び６０％の相対湿度で、少なくとも１日間、好適には３日間又は１週間、より好適には２週間又は３週間、最適には１か月間にわたって保管された場合に、その生物学的活性を維持する。本発明のプレフィルドシリンジに収容された薬剤、すなわち、ＶＥＧＦ拮抗薬、好適には抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、より好適にはラニビズマブ又はアフリベルセプトは、約４０℃の温度及び７５％の相対湿度で、少なくとも１時間又は２時間、好適には少なくとも４時間又は６時間、より好適には少なくとも１０時間又は１２時間、最適には少なくとも１８時間又は２４時間にわたって保管された場合に、その生物学的活性を維持する。
【００３４】
前記ＶＥＧＦ拮抗薬、好適には抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、より好適にはラニビズマブ又はアフリベルセプトの生物学的活性は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びＶＥＧＦと共に上述した条件下で保管された拮抗薬の異なる稀釈液をインキュベートし、前記拮抗薬の存在下における細胞のＶＥＧＦによって誘導された増殖を前記拮抗薬と共にインキュベートされていない細胞と比較して測定することによって、すなわち、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入手可能なセルタイター−ブルー（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ）（登録商標）細胞生存性試験によって、測定することができる。ＶＥＧＦ拮抗薬はＶＥＧＦによって誘導される情報伝達を抑制するので、試料中に生物学的に活性なＶＥＧＦ拮抗薬が存在するならば、ＶＥＧＦによって誘導される増殖は低減されるであろう。
【００３５】
前記ＶＥＧＦ拮抗薬、好適には抗ＶＥＧＦ抗体、又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、より好適にはラニビズマブ又はアフリベルセプトは、前記プレフィルドシリンジ内での保管後にその生物学的活性を維持し、そのため、ＶＥＧＦによって誘発される増殖はＨＵＶＥＣ中で抑制される。ＶＥＧＦによって誘導される増殖が、少なくとも５０％だけ、好適には少なくとも５５％又は６０％だけ、より好適には少なくとも６５％、７０％、７５％又は８０％だけ、さらにより好適には少なくとも８５％、８７％又は９０％だけ、最適には少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％又は９９％だけ阻害される場合、前記ＶＥＧＦ拮抗薬、好適には抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、より好適にはラニビズマブ又はアフリベルセプトは、前記プレフィルドシリンジ内での保管後にその生物学的活性を維持する。
【００３６】
プレフィルドシリンジの構成要素は、当業者に知られており、基本的に、放出口から後端部に向けて、先端キャップ又はニードルシールドと、シリンジバレルと、シリンジバレル内に配置されたストッパーと、プランジャーロッドとを備える。
【００３７】
前記シリンジバレルは既定量の液体組成物を収容しており、該液体組成物は、プランジャーロッドがバレル内に押し込まれ、バレルに沿って移動すると、前記バレルの一端に配置された放出口を介してバレルから放出され得る。前記シリンジバレルは、典型的にはほぼ筒状形状を有する。前記放出口は、シリンジバレルの残部より小さな直径を有する通路が内部に延びる突出部を放出口端から備えてもよい。ステーキドニードルが使用されない場合、前記放出口は、例えば、ルアーロックタイプ接続によって、ニードルとの接続に適合し得る。この場合、バレルを密封するために、先端キャップが使用され、前記先端キャップは、ニードルがシリンジに取り付けられるようにするために除去され得る。この密封は、フェッター  ファーマ  インターナショナル  ゲーエムベーハー（Ｖｅｔｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ）のＯＶＳ（商標）システムのような既知の密封装置の使用によって行うことができる。前記先端キャップは、通常、エラストマーから製造されており、シリンジに接触する内側部分にフルオロポリマーコーティングを備え得る。
【００３８】
本発明のプレフィルドシリンジでは、前記プレフィルドシリンジがステーキドニードルを備えて供給され、使用前に組み立てられる必要がないように、前記シリンジ放出口はニードルと堅固に接続され得る。この場合、注射の前のシリンジの組み立て中におけるニードルによる怪我の危険性が低減される。使用するまでは、シリンジ内容物の無菌性を確保するために、ステーキドニードルは、典型的にはニードルシールドによって覆われている。
【００３９】
ステーキドニードルは、ステーキドニードルをシリンジ内に成形することができるので、接着剤を使用することなく、本発明のプレフィルドプラスチックシリンジに取り付けることができる。対照的に、ガラスシリンジにニードルを取り付けるためには接着剤が必要とされ、不純物又はタンパク質の酸化の増大につながり得る（２０１１年１１月７〜１１日にバーゼル（Ｂａｓｅｌ）で開催された２０１１  ＰＤＡ  Ｅｕｒｏｐｅ  「Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｅ−Ｆｉｌｌｅｄ  Ｓｙｒｉｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ」におけるアドラー（Ａｄｌｅｒ）の発表；２０１１年６月２２〜２３日にベテスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）で開催されたＰＤＡ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｕｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐにおけるマルコビッチの発表）。
【００４０】
硝子体内投与のためには、ニードルサイズは典型的には２９ゲージ、２９  １／２ゲージ又は３０ゲージであるが、３１ゲージ、３２ゲージ、３３ゲージ、及び３４ゲージのニードルも用いられてもよい。前記プレフィルドシリンジは、注入後の針刺しの危険性をさらに回避するために、受動的なニードル安全ガードを装備していてもよい。
【００４１】
本発明のプレフィルドシリンジは、プラスチック材料から製造されるシリンジバレルを備える。前記プラスチック材料は、好適には、シクロオレフィンポリマー及びシクロオレフィンコポリマーから選択され、より好適には、シクロオレフィンポリマーであり、最適には、クリスタル  ゼニス（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈ）（登録商標）として知られているシクロオレフィンポリマーである。
【００４２】
シクロオレフィンコポリマーは、８，９，１０−トリノルノルン−２−エン又は１，２，３，４，４ａ，５，８，８ａ−オクタヒドロ−１，４：５，８−ジメタノナフタレンのような環式モノマーのエタンとの連鎖共重合によって生成され得る。適当なコポリマーは、様々な等級で入手可能なトパス（Ｔｏｐａｓ）（商標）タイプのものである。
【００４３】
シクロオレフィンポリマーは、例えば、様々な環式モノマーの開環メタセシス重合、及びそれに続く水素化によって生成され得る。シクロオレフィンポリマー材料から製造された適当な市販の容器としては、クリスタル  ゼニス（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈ）（商標）樹脂、ゼオノール（Ｚｅｏｎｏｒ）（商標）及びゼオネックス（Ｚｅｏｎｅｘ）（商標）から製造された容器が挙げられる。そのような材料は、ガラス様の透明性を有し、ブレーク抵抗性が高く、優れた防湿バリアを提供する。
【００４４】
本発明によれば、前記シリンジバレルはシリコーン不使用である。シリコーン不使用とは、前記シリンジバレルの内面がシリコーンオイルで処理されていないことを意味する。従って、本発明のプレフィルドシリンジ内ではシリコーンオイルを検出することはできない。
【００４５】
シリコーン層の存在及び厚さは、シリンジバレル内のシリコーンオイルの量を測定するためにも用いることができるラップ  アイディ  レイヤー  エクスプローラ（ｒａｐ．ＩＤ  Ｌａｙｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）（登録商標）アプリケーションのような既知の方法によって測定することができる。前記シリンジバレル内のシリコーンオイルの量はまた、差分秤量法、及び適当な溶媒中に希釈した前記オイルの赤外分光法による定量化によって測定することもできる。
【００４６】
好適には、前記プレフィルドシリンジは未被覆であり得る、すなわち、前記シクロオレフィンポリマー又はコポリマー材料は、その内部に収容された液体組成物と直接接触し、前記シリンジバレルは、そのシリンジを形成するプラスチック材料以外のいかなる材料も含有しない。
【００４７】
これに代わって、前記プレフィルドシリンジはシリコーンコーティング以外の内側コーティングを備えていてもよい。「内側コーティング」という用語は、薬液、すなわち、液体組成物に接触するシリンジバレルの内側に対するコーティングを意味するものとする。そのような内側コーティングの例としては、変性エチレン−テトラフルオロエチレンコポリマーから製造されたフルオロカーボンフィルム（ウェスト  ファーマシューティカル  サービシーズ（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）から入手可能なフルロテック（Ｆｌｕｒｏｔｅｃ）（登録商標）フィルムとも称される）、及びアトモスフェリック  プラズマ  イモビリゼーション（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｌａｓｍａ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（商標）プロセスによって架橋されたパーフルオロポリエーテルフィルム（トリボフィルム  リサーチ（ＴｒｉｂｏＦｉｌｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能であり、国際公開第ＷＯ２００５／０９４２１４Ａ２号に記載されているトリボグライド（ＴｒｉｂｏＧｌｉｄｅ）（登録商標）とも称される）が挙げられる。
【００４８】
好適には、前記プレフィルドシリンジは、内側コーティングを備えない。
前記シリンジはまた、周囲に接するシリンジの外面上に、酸素バリアコーティングのようなコーティングを備えてもよい。
【００４９】
前記シリンジバレルは、タングステン不使用である。すなわち、前記シリンジバレルは、シリンジ製造工程においてタングステンを用いる必要がないので、いかなる微量のタングステンも含有しない。従って、タングステンによって誘発されるタンパク質の凝集の危険性がない。
【００５０】
一実施形態において、前記シリンジバレルは、前記シリンジバレル上に印刷された線のようなマークを備える。そのような線は、液体組成物を注射する人がストッパー又はプランジャーロッドの（前面の先端のような）所定部分を前記マークと整合させることを可能にする。それにより、過剰な液体組成物及び潜在的な気泡がシリンジバレルから除去され、患者に対して正確な所定投与量を安全に投与することができる。
【００５１】
前記シリンジバレルは、４５ｍｍ〜６５ｍｍの長さを有する。前記シリンジが１ｍＬの公称最大充填量を有する場合、前記シリンジバレルの長さは６０ｍｍ〜６５ｍｍである。前記シリンジが０．５ｍＬの公称最大充填量を有する場合、シリンジバレルの長さは４５ｍｍ〜５０ｍｍである。前記シリンジバレルの長さは、後端部から、ニードル（しかし、ニードルは存在しても含めない）が取り付けられる放出口までの間の長さである。
【００５２】
前記シリンジバレルは、４ｍｍ〜６．５ｍｍの内径を有する。前記シリンジが１ｍＬの公称最大充填量を有する場合、前記シリンジバレルの内径は５．５ｍｍ〜６．５ｍｍである。前記シリンジが０．５ｍＬの公称最大充填量を有する場合、前記シリンジバレルの内径は４ｍｍ〜５ｍｍである。
【００５３】
前記シリンジバレルの壁は、０．６ｍｍ〜１．２ｍｍ、好適には０．８ｍｍ〜１ｍｍ、より好適には０．９ｍｍの厚さを有する。
前記プランジャーロッドを前記シリンジバレルの内側に沿って引いたり、押したりすることにより、前記シリンジが放出口を介して液体製剤を放出することが可能になる。前記プランジャーロッドは、ストッパー接触表面、ロッド及びフランジを（放出口端部から後端部へ並べて）備える。フランジに圧力をかけることにより、前記プランジャーロッドを、前記シリンジバレル中で後部から放出口に向けて移動させると、前記プランジャーロッドのストッパー接触表面が、前記ストッパーの後部と接触するようになり、前記ストッパーをバレル中で移動させて、前記シリンジバレルの放出口を介して、前記シリンジ内部に収容されている液体組成物を放出させる。前記プランジャーロッドの前記ストッパー接触表面は、好適には、実質的平坦であり、すなわち、前記ストッパーに対する接続のためのいずれの突起部も備えない。
【００５４】
前記シリンジの放出口と前記プランジャーロッドとの間のシリンジバレル内に、前記ストッパーが配置されている。前記ストッパーは、典型的には、天然ゴム又は合成ゴムのようなエラストマー材料から形成されており、前記エラストマー材料は前記シリンジバレルの内側表面に係合して、前記プランジャーロッドのフランジに圧力がかけられ、前記ストッパーが前記シリンジバレル中を移動するときに、前記シリンジからの液体製剤の放出を促進するシールを生じる。前記ストッパーは、投与前に、前記プランジャーロッドに対して機械的に結合された状態にはないので、格納できない。従って、「格納不能なストッパー」という用語によって、前記ストッパーを、前記シリンジの放出口の方向に向けてのみ移動させることができるが、反対の方向、すなわち、前記シリンジの後部の方向に向けては移動させることはできないことを意味するものとする。前記用語はまた、前記ストッパーと前記プランジャーロッドとは機械的に結合されていないことも意味する。従って、前記シリンジ内液体組成物が汚染されるリスクはすべて、最小限に留められる。
【００５５】
前記ストッパーは、少なくとも、プレフィルドシリンジ内部に収容される液体組成物と接触するようになる部分において、エチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ；フルロテック（ＦｌｕｒｏＴｅｃ）（登録商標）として販売されている）バリアフィルム、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ；テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）ＦＥＰとして販売されている）、又はオムニフレックス（Ｏｍｎｉｆｌｅｘ）ストッパーのために使用されるようなポリテトラフルオロエチレン様フィルム等のフルオロポリマーフィルムを用いて被覆され得る。この種のコーティングは、薬剤と前記エラストマーとの間の有効なバリアとして機能し、すべての材料に伴う抽出物又は浸出物の可能性を低減する。加えて、前記コーティングは、製剤がプランジャーロッドに吸着するか、又は吸収され得る逆過程の発生を低減する。前記ストッパーは好適にはシリコーン不使用である、すなわち、少なくとも薬液と接触する前記ストッパーの表面、より好適には、前記ストッパー全体は、シリコーンオイルによって被覆されていない。より好適には、前記ストッパーは、シリコーン不使用であり、かつエチレンテトラフルオロエチレンによるコーティングを備える。
【００５６】
前記シリンジは、０．３ｍＬ〜１．５ｍＬ、好適には０．５ｍＬ〜１．０ｍＬ、より好適には０．５ｍＬ又は１．０ｍＬ、最適には１．０ｍＬの公称最大充填量、すなわち、前記シリンジによって最大限に吸い上げることができる量を有する。
【００５７】
前記シリンジに充填される液体組成物の量は、約０．０５ｍＬ〜約１ｍＬ、好適には約０．１ｍＬ〜約０．５ｍＬ、より好適には０．１４ｍＬ〜０．３ｍＬ、最適には０．１５ｍＬ〜０．２ｍＬである。
【００５８】
当業者は、シリンジ及びニードル内の任意の死空間及びシリンジの注射の準備による損失を考慮するために、シリンジは、通常、患者に実際に投与される量よりも多い量で充填されることを分かっている。従って、患者に実際に投与される量は、０．０１ｍＬ〜１ｍＬ、好適には０．０２〜０．５ｍＬ、より好適には０．０２５〜０．５ｍＬ、さらにより好適には０．０３ｍＬ〜０．０５ｍＬ、及び最適には、患者に実際に投与される量は０．０５ｍＬである。
【００５９】
ラニビズマブは、典型的には６ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬのラニビズマブ濃度で０．０５ｍＬの量、又は１０ｍｇ／ｍＬのラニビズマブ濃度で０．０３ｍＬ又は０．０５ｍＬの量で投与されて、０．３ｍｇ又は０．５ｍｇの送達量をもたらす。アフリベルセプトについては、前記投与量は、典型的には４０ｍｇ／ｍＬのアフリベルセプト濃度で０．０５ｍＬであり、２ｍｇの送達量をもたらす。上記で検討したように、ベバシズマブは眼疾患の治療に適応外使用で用いられる。この場合、ベバシズマブの投与量は、２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ濃度で０．０５ｍＬであり、１．２５ｍｇの送達量をもたらす。
【００６０】
従って、一実施形態において、前記シリンジは、０．１５ｍＬ〜０．２ｍＬの量の液体組成物によって充填され、次に、０．０３ｍＬ〜０．０５ｍＬの液体組成物が患者に投与される。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明のプレフィルドシリンジは、ラニビズマブの液体製剤を収容し、かつシリコーン不使用のシクロオレフィンポリマーシリンジバレルと、先端キャップ又はニードルシールドと、リトラクタブルでない、シリコーン不使用のストッパーと、プランジャーロッドとを備え、前記ストッパーは、フルオロポリマーフィルムによって被覆されている。
【００６２】
別の特定の実施形態において、本発明のプレフィルドシリンジは、ラニビズマブの液体製剤を収容し、かつシリコーン不使用のシクロオレフィンポリマーシリンジバレルと、先端キャップ又はニードルシールドと、ストッパーと、プランジャーロッドとを備え、前記ストッパーは、フルオロポリマーフィルムによって被覆されており、かつ前記シリンジバレルは、４５ｍｍ〜６５ｍｍの長さを有する。
【００６３】
「ＶＥＧＦ拮抗薬」という用語は、ＶＥＧＦと特異的に相互作用し、その生物学的活性、例えばその細胞分裂活性、血管形成活性及び／又は血管透過活性のうちの１つ以上を抑制する分子を指す。該用語は、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合フラグメント、ならびに非抗体ＶＥＧＦ拮抗薬の双方を含むものとする。
【００６４】
非抗体ＶＥＧＦ拮抗薬としては、アフリベルセプト、ペガプタニブ及び抗体ミメティックが挙げられる。好適には、前記非抗体ＶＥＧＦ拮抗薬はアフリベルセプトである。現在アイリーア（Ｅｙｌｅａ）（登録商標）という名称で販売されており、またＶＥＧＦトラップとしても知られているアフリベルセプトは、ヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメインの一部がヒトＩｇＧｌのＦｃ部に融合されている組換えヒト可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質である（ホラッシュ（Ｈｏｌａｓｈ）ら、２００２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  、第９９巻、第１７号、第１１３９３〜１１３９８頁；国際公開第ＷＯ００／７５３１９Ａ１）。アフリベルセプトのＣＡＳ番号は８６２１１１−３２−８である。前記アフリベルセプトは、滲出型加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害、及び糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病網膜症の治療について販売認可を受けている。現在市販のアフリベルセプト調合物は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート２０、ショ糖及び注射用蒸留水を含有しており、４０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給されている。具体的には、前記アフリベルセプト調合物は、４０ｍｇ／ｍＬのアフリベルセプト、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０、５％のスクロース；及び注射用蒸留水を含有する。これに代わるアフリベルセプト調合物は、ヒスチジン緩衝液、塩化ナトリウム、ポリソルベート２０、スクロース及び注射用蒸留水を含有し得、４０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給されている。具体的には、前記アフリベルセプト調合物は、４０ｍｇ／ｍＬのアフリベルセプト、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０、５％のスクロース；及び注射用蒸留水を含有する。市販の調合物及びこれに代わるアフリベルセプト調合物のｐＨは、６．２に調整され得る。
【００６５】
マクジェン（Ｍａｃｕｇｅｎ）（登録商標）という名称で現在販売されているペガプタニブは、ペグ化された（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）抗−血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アプタマーである（ベル（Ｂｅｌｌ）ら、１９９９年、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．、３５巻、第９号、第５３３〜４２頁）。ペガプタニブのＣＡＳ番号は、２２２７１６−８６−１である。
【００６６】
ＶＥＧＦ拮抗薬である抗体ミメティックは、ＶＥＧＦに結合して、受容体へのその結合を阻害するアンキリン反復ドメインを含む、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ＭＰ０１１２のような結合タンパク質を含む（国際公開第ＷＯ２０１０／０６０７４８号及び同第ＷＯ２０１１／１３５０６７号も参照されたい）。
【００６７】
「抗ＶＥＧＦ抗体」という用語は、ＶＥＧＦに特異的に結合し、その生物学的活性、例えば、その細胞分裂活性、血管形成活性、及び／又は血管透過活性のうちの１つ以上を阻害する抗体、又はＦａｂもしくはｓｃＦＶフラグメントのような抗体フラグメントを指す。抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、ＶＥＧＦの細胞レセプターへの結合を妨げることにより、ＶＥＧＦの細胞レセプターへの結合後に血管内皮細胞の活性化を妨げることにより、又はＶＥＧＦによって活性化された細胞を殺すことによって作用する。抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、抗体Ａ４．６．１、ベバシズマブ、ラニビズマブ、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３、ならびに、例えば国際公開第ＷＯ９８／４５３３１号、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０１９０３１７号、米国特許第ＵＳ６，５８２，９５９号、米国特許第ＵＳ６，７０３，０２０号、国際公開第ＷＯ９８／４５３３２号、国際公開第ＷＯ９６／３００４６号、国際公開第ＷＯ９４／１０２０２号、国際公開第ＷＯ２００５／０４４８５３号、欧州特許第ＥＰ０６６６８６８Ｂ１号、国際公開第ＷＯ２００９／１５５７２４号、及びポプコフ（Ｐｏｐｋｏｖ）ら、２００４年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、第２８８巻、第１４９〜６４頁に記載されているような他のものを含む。本発明の医薬組成物中に存在する抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントは、好適には、ラニビズマブ又はベバシズマブであり、最適には、ラニビズマブ又はその抗原結合フラグメントである。
【００６８】
「ラニビズマブ」は、国際公開第ＷＯ９８／４５３３１号及びチェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９９年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第２９３巻、第８６５〜８１頁のＳＥＱ  ＩＤ番号１１５及び１１６に記載されているような、Ｙ０３１７の軽鎖及び重鎖可変ドメイン配列を有するＶＥＧＦ−Ａに対するヒト化モノクローナルＦａｂフラグメントである。ラニビズマブのＣＡＳ番号は３４７３９６−８２−１である。ラニビズマブは内皮細胞増殖及び血管新生を阻害し、血管新生性（滲出型）加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害の治療、網膜静脈閉塞（網膜分枝静脈閉塞（ｂｒａｎｃｈ  ＲＶＯ）又は網膜中心静脈閉塞（ｃｅｎｔｒａｌ  ＲＶＯ））に付随して起こる黄斑浮腫による視力障害の治療、又は病的近視に付随して起こる脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）による視力障害の治療に対して承認されている。ラニビズマブは、ベバシズマブに関連し、ベバシズマブと同一の親マウス抗体に由来するが、親分子よりはるかに小さく、また親和性成熟されており、ＶＥＧＦ−Ａに対するより強力な結合を提供する。ラニビズマブは、例えば、国際公開第ＷＯ９８／４５３３１Ａ２号に記載されているように、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において組換えにより生成される。現在市販のラニビズマブ調合物は、α，α−トレハロース二水和物、ヒスチジン塩酸塩一水和物、ヒスチジン、ポリソルベート２０及び注射用蒸留水を含有し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給されている。具体的には、ラニビズマブは、６ｍｇ又は１０ｍｇのラニビズマブ、１００ｍｇのα，α−トレハロース（脱水）；０．３２ｍｇのＬ−ヒスチジン、１．６６ｍｇのＬ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、０．１ｍｇのポリソルベート２０、及び全量１ｍＬとするための適量の注射用蒸留水を含有する。現在市販のラニビズマブ調合物のｐＨは、ｐＨ５．５に調整され得る。
【００６９】
「ベバシズマブ」は、ＶＥＧＦのすべてのイソ型を認識する完全長のヒト化マウスモノクローナル抗体であり、該抗体はラニビズマブの親抗体である。ベバシズマブのＣＡＳ番号は２１６９７４−７５−３である。ベバシズマブは血管新生を阻害し、現在、様々な癌型の治療に対して承認されている。しかしながら、ベバシズマブも加齢黄斑変性症のような眼疾患においては適応外使用で用いられている。現在市販のベバシズマブ調合物は、α，α−トレハロース二水和物、リン酸ナトリウム、ポリソルベート２０及び注射用蒸留水を含有し、２５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する濃縮物として供給されている。具体的には、ベバシズマブ調合物は、２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブ、２４０ｍｇのα，α−トレハロース二水和物、２３．２ｍｇのリン酸ナトリウム（一塩基性、一水和物）、４．８ｍｇのリン酸ナトリウム（二塩基性、無水）、１．６ｍｇのポリソルベート２０、及び４ｍＬとするための注射用蒸留水、ＵＳＰを含有する。
【００７０】
本発明のプレフィルドシリンジ内の抗体濃度は、典型的には、１〜１００ｍｇ／ｍＬであり、好適には２〜７５ｍｇ／ｍＬ、より好適には３〜５０ｍｇ／ｍＬ、さらに好適には５〜３０ｍｇ／ｍＬ、最適には６ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬである。本発明のプレフィルドシリンジ内にラニビズマブが収容されている場合、そのラニビズマブ濃度は１０ｍｇ／ｍＬである。本発明のプレフィルドシリンジ内にアフリベルセプトが収容されている場合、そのアフリベルセプトの濃度は、４０ｍｇ／ｍＬである。
【００７１】
プレフィルドシリンジは、ＶＥＧＦ拮抗薬に加えて、１つ以上の薬理学的に活性な物質を収容することができる。薬理学的に活性な物質は、対象に対して投与される場合に、薬理学的な作用を発揮することができる。好適には、追加の薬理学的に活性な物質は、ＰＤＧＦ拮抗薬又はＡｎｇ２拮抗薬である。より好適には、ＰＤＧＦ拮抗薬は、リヌクマブのような抗ＰＤＧＦ抗体、又はフォビスタ（Ｆｏｖｉｓｔａ）（登録商標）として販売されているＥ１００３０のようなアプタマーである。最適には、ＰＤＧＦ拮抗薬はＥ１００３０であり、前記ＰＤＧＦ拮抗薬は、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、第１４４１３頁；米国特許第ＵＳ６，２０７，８１６号；米国特許第ＵＳ５，７３１，１４４号；米国特許第ＵＳ５，７３１，４２４号；及び米国特許第ＵＳ６，１２４，４４９号に記載されている。また、Ａｎｇ２抗体は、より好適には抗Ａｎｇ２抗体であり、最適にはネスバクマブである。
【００７２】
本発明のプレフィルドシリンジ内の液体組成物は低粒子含有量を有する。具体的には、前記液体組成物は、５℃又は２５℃又は４０℃において３か月間にわたってシリンジを保管した後に、１０μｍを超える大きさを有する粒子を５０個未満含有する。これに代わって、又はこれに加えて、前記液体組成物は、５℃又は２５℃又は４０℃で３か月間にわたってシリンジを保管した後に、２５μｍを超える大きさを有する粒子を５個未満含有する。従って、前記プレフィルドシリンジは、これらの粒子サイズに関して、点眼剤に対する米国薬局方＜７８９＞の要件を満たしている。
【００７３】
本発明のプレフィルドシリンジは優れた滑動挙動をさらに有する。具体的には、ブレークルース力、すなわち、プランジャーロッドの移動を開始するのに必要とされる力は、１０Ｎ未満又は９Ｎ未満であり、好適には８Ｎ未満又は７Ｎ未満であり、より好適には６Ｎ未満であり、最適には５Ｎ未満である。ブレークルース力は、シリンジが５℃、２５℃又は４０℃の温度で１か月又は３か月のような長期間にわたって保管された場合に、著しくは変化せず、すなわち、依然として上記の特定の範囲内にある。対照的に、シリコーンを含んでいるシリンジでは、ブレークルース力は、保管によってより大きな増大を示す。
【００７４】
さらに、滑動力、すなわち液体組成物を放出するためにシリンジバレルに沿ってプランジャーの移動を維持するのに必要とされる力は、１０未満Ｎであり、好適には９Ｎ未満、より好適には８Ｎ未満、さらにより好適には７Ｎ未満、最適には６Ｎ未満である。滑動力は、シリンジが５℃、２５℃又は４０℃の温度で１か月又は３か月のような長期間にわたって保管された場合に、著しくは変化せず、すなわち、依然として上記の特定の範囲内にある。
【００７５】
本発明はまた、本発明の１つ以上のプレフィルドシリンジを含むキットを提供する。好適には、前記キットはブリスターパックを含む。「ブリスターパック」は、通常は熱成形プラスチックから製造された空洞部又はポケットと、厚紙の裏材又はアルミニウム箔又はプラスチックの蓋封止材とを有する。前記ブリスターパックは、その中に滅菌したシリンジを無菌状態下で包装する前に、滅菌され得る。従って、包装後の滅菌は必要とされない。前記キットは、前記プレフィルドシリンジがステーキド−イン  ニードルを備えていない場合には、さらにニードルを含んでもよい。前記キットはさらに使用説明書を含んでもよい。
【００７６】
好適には、前記キットは、典型的にはブリスターパックのようなパッケージ内の酸素濃度を低下させるために用いられる酸素吸収材を含まない。酸素吸収材は、通常、高い親和性によってパッケージ内の酸素と反応することにより、そのパッケージの酸素含有量を低減する炭酸鉄又はアスコビル酸塩のような物質を含有する。
【００７７】
「眼内血管新生性疾患」は眼の血管新生を特徴とする疾患である。眼内血管新生性疾患の例としては、例えば、増殖性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病その他の虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病網膜症、病的近視、フォンヒッペル−リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生が挙げられる。「加齢黄斑変性症」という用語は、通常は高齢者が罹患するものであり、網膜の損傷により視野の中心（黄斑）において視力低下を生じる医学的状態を指す。
【００７８】
好適には、前記プレフィルドシリンジは、本願で定義されるようなＶＥＧＦ拮抗薬の硝子体内注射に使用するためのものである。
「硝子体内注射」という用語は、薬物を眼に直接注射する医薬組成物の投与を指す。より具体的には、前記薬物は、ヒト及び他の脊椎動物の眼球の水晶体と網膜との間の空間を充填する透明ゲルである硝子体液（硝子体又は単に硝子体とも称される）に注射される。
【００７９】
本発明を図面及び前述の記載において詳細に図示して説明してきたが、そのような図及び記載は、例証又は例示するものであり、限定するものではないと見なされるべきである。本発明は、開示した実施形態に限定されない。当業者は、図面、開示及び従属請求項の検討から、権利請求された発明を実施する際に、開示した実施形態に対する他の変更を理解し、実施することができる。
【００８０】
詳細な説明は、本質的に例示に過ぎず、用途及び使用法を限定するようには意図されない。以下の実施例は、本発明の範囲をそれらの実施例に限定することなく、本発明をさらに示す。当業者は本発明の記載に基づいて様々な変更及び修正をなすことができ、そのような変更及び修正も本発明に含まれる。
実施例
１．異なる条件に供された様々なシリンジにおける様々な大きさの粒度測定
ヒスチジン緩衝液、トレハロース二水和物、ポリソルベート２０、すなわち、ラニビズマブ自体ではなく、ラニビズマブ調合物の構成要素を含有したｐＨ５．５の溶液４００μＬを下記のシリンジに充填した：
【００８１】
【表１】
2019501687.tif 000003
【００８２】
表１からのシリンジを、５℃／６０％の相対湿度、２５℃／６０％の相対湿度及び４０℃／７５％の相対湿度で３か月間にわたってインキュベートした。その後、光遮蔽（ｌｉｇｈｔ  ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）を、フローカム（ＦｌｏｗＣａｍ）（登録商標）  ＰＶ  ベンチトップシステム（米国メーン州所在のフルーイド  イメージング  インコーポレテッド）によって、システムソフトウェア（ビジュアルスプレッドシート（ＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ）ソフトウェア、  バージョン３．４．８）及び下記のパラメータを用いて測定した。
【００８３】
モード：              オートイメージ
プライミング方法：    試料を用いるマニュアルプライム
流量：                ０．１００ｍｌ／分
再校正：              ０
停止理由：            試料体積が処理されたこと
吸引される試料体積：  １．０４２１ｍｌ
処理される試料体積：  １．０３９２ｍｌ
撮像される液量：      ０．３４２１ｍｌ
フレームレート：      ２２．００ｆｐｓ
倍率：                １０×
校正係数：            ０．６９７９
シリンジサイズ：      １．００ｍｌ
分析の結果を表２に示す。プレフィルドシリコーン不使用シクロオレフィンポリマーシリンジ６は試験したすべての条件下で低い粒子レベルを有する。
【００８４】
【表２】
2019501687.tif 000004
【００８５】
２．異なる条件に供されたプラスチックシリンジ及びガラスシリンジにおけるラニビズマブの安定性の測定
１０ｍｇ／ｍＬの抗ＶＥＧＦ抗体ラニビズマブ及びヒスチジン緩衝液、トレハロース二水和物、ポリソルベート２０を含有したｐＨ５．５の溶液１６５μＬを、上記で表１に列挙したシリンジに充填した。
【００８６】
上記で表１に列挙したシリンジを、２５℃／６０％の相対湿度及び４０℃／７５％の相対湿度で２週間、１か月間及び３か月間にわたってインキュベートし、５℃で３か月間にわたってインキュベートした。
【００８７】
その後、試料を、親水性種の存在についてはＲＰ−ＨＰＬＣによって、抗体の酸性バリアント（ａｃｉｄｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）及び塩基性バリアント（ｂａｓｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）の存在については陽イオン交換クロマトグラフィによって、凝集物の存在についてはサイズ排除クロマトグラフィによって、分析した。
【００８８】
ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣ分析
前記シリンジからのタンパク質試料をゾーバックス（ＺＯＲＢＡＸ）（登録商標）  ３００ＳＢ−Ｃ１８、４．６×１００ｍｍ、３．５μｍのカラムに導入して、親水性不純物及び疎水性不純物を検出した。
【００８９】
前記タンパク質は、以下の表３に従って溶離液Ａ（水中に０．１％のトリフルオロ酢酸）及び溶離液Ｂ（７０％のアセトニトリル、２０％の１−プロパノール及び１０％の水中に０．１％のトリフルオロ酢酸）の勾配によって溶離した。
【００９０】
【表３】
2019501687.tif 000005
【００９１】
溶出した種（以下「溶出種」と記載）を検出し、溶出種の濃度対時間を示すグラフに表示した。溶出プロフィルは、未修飾タンパク質によるメインピークと、そのメインピークの前後に溶出するいくつかのさらなるピークを示し、それらのピークはそれぞれ前記タンパク質の親水性バリアント及び疎水性バリアントを表す。すべてのピークの合計面積及び単一ピークの面積を求めた。表４は、表１のシリンジについて溶出種のピーク面積の合計に対する親水性種のピーク面積のパーセンテージを示す。
【００９２】
【表４】
2019501687.tif 000006
【００９３】
2019501687.tif 000007
【００９４】
ｂ）陽イオン交換分析
シリンジからのタンパク質試料をダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）のＢｉｏＬＣＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ−１０、４．０×２５０ｍｍ、１０μｍカラムに導入して、タンパク質の酸性バリアント及び塩基性バリアントを検出した。
【００９５】
前記タンパク質を、以下の表５に従って、移動相Ａ（２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）及び移動相Ｂ（２５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）の勾配で溶離した。
【００９６】
【表５】
2019501687.tif 000008
【００９７】
溶出種を検出し、溶出種の濃度対時間を示すグラフに表示した。溶出プロフィルは、未修飾タンパク質によるメインピークと、そのメインピークの前後に溶出するいくつかのさらなるピークを示し、それらのピークは前記タンパク質の酸性バリアント及び塩基性バリアントをそれぞれ表す。すべてのピークの合計面積及び単一ピークの面積を求めた。表６は、表１のシリンジについて溶出種のピーク面積の合計に対する酸性バリアント及び塩基性バリアントのピーク面積のパーセンテージをそれぞれ示す。
【００９８】
【表６】
2019501687.tif 000009
【００９９】
2019501687.tif 000010
【０１００】
ｃ）サイズ排除クロマトグラフィ
前記シリンジからのタンパク質試料をワイエムシー−パック  ジオール−２００（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−２００）、５μｍ、２０ｎｍ（８．０×３００ｍｍ）カラムに導入して、該タンパク質の凝集物を検出した。
【０１０１】
前記タンパク質は、０．１Ｍのリン酸カリウム及び０．２Ｍの塩化ナトリウムを用いて、定組成溶離によって溶離した。溶出種を検出して、溶出種の濃度対時間を示すグラフに表示した。溶出プロフィルは、凝集していないタンパク質によるメインピークと、タンパク質の凝集型を表すいくつかのさらなるタンパク質のピークとを示した。すべてのピークの面積を求めた。表７は、表１のシリンジについて溶出種のピーク面積の合計に対する凝集物のピーク面積のパーセンテージを示す。
【０１０２】
【表７】
2019501687.tif 000011
【０１０３】
2019501687.tif 000012
【０１０４】
表２、４、６及び７に示した結果から、本発明のプレフィルドプラスチックシリンジ（シリンジ６）におけるラニビズマブの安定性は、試験した条件下において、ガラスシリンジにおけるラニビズマブの安定性と少なくとも同等であることは明らかである。
３．ラニビズマブを収容した様々なシリンジにおける滑動力の測定
上記で表１に列記したシリンジを、それらのストッパー移動力、すなわちブレークルース力、及び滑動力について試験した。この目的で、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液、１０％（ｗ／ｖ）のトレハロース二水和物、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、すなわち、ラニビズマブ自体ではなく、ラニビズマブ調合物の構成要素を含有したｐＨ５．５の溶液４００μＬを上記のシリンジに充填した。試験前に、２７Ｇ×１．２７ｃｍ（０．５”）のニードルをルアーコーンシリンジに取り付けた。該試験は、引張試験機（ＴＨ２７３０、トゥムラー（Ｔｈｕｍｌｅｒ））において、１０．９ｍｍの移動長に対して１９０ｍｍ／分のストッパー速度で実施した。
【０１０５】
試験結果を下記の表８に示す。
【０１０６】
【表８】
2019501687.tif 000013
【０１０７】
2019501687.tif 000014
【０１０８】
プレフィルドシリコーン不使用シクロオレフィンポリマーシリンジ６、すなわち本発明のシリンジは、シリコーンオイルで被覆されたガラスシリンジの滑動挙動と同等であるか、又はそれよりも優れた滑動挙動を有する。
４．アフリベルセプトを収容し、かつ異なる条件に供された様々なシリンジにおける様々なサイズの粒度測定
１ｍｇ／ｍＬの抗体及び１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、４０ｍＭの塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）のショ糖、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含有した、ｐＨ６．２のＶＥＧＦ受容体融合タンパク質アフリベルセプトの溶液４００μＬを以下のシリンジに充填した。
【０１０９】
【表９】
2019501687.tif 000015
【０１１０】
表９からのシリンジを、４０℃において１サイクル／１０秒の速度で５分間、２週間、４週間にわたってニードルからストッパーまで回転させるか、又は５回の凍結／解凍サイクル（１℃／分で＋５から−２０℃）に供した。また前記シリンジを、５℃で３か月間、６か月間、及び１２か月間にわたって、２５℃／６０％の相対湿度で２週間、１か月間、及び３か月間にわたって、４０℃／７５％の相対湿度で回転なしでインキュベートし、次に、表１からのシリンジについて上述したように分析した。
５．アフリベルセプトを収容した様々なプラスチックシリンジ及びガラスシリンジにおける滑動力の測定
上記で表９に列挙したシリンジを、それらのストッパー移動力、すなわちブレークルース力、及び滑動力について試験した。この目的で、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、４０ｍＭの塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、すなわち、アフリベルセプト自体ではなく、アフリベルセプト調合物の構成要素を含有したｐＨ６．２の溶液０．１６５ｍＬを、表９の上記のシリンジに充填した。試験前に、３０Ｇ×１．２７ｃｍ（０．５”）のニードルを、ルアーコーンシリンジに取り付けた。該試験は、引張試験機（ＴＨ２７３０、トゥムラー）において、１０．９ｍｍの移動長に対して１９０ｍｍ／分のストッパー速度で実施した。
６．異なる条件に供された、アフリベルセプトが充填されている様々なシリンジにおける様々な大きさの粒度測定
アフリベルセプト自体ではなく、アフリベルセプトの標的処方（１０ｍＭのヒスチジン緩衝液、４０ｍＭの塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、ｐＨ６．２）を含有した溶液４００μＬを、表１０に列挙したシリンジに充填した。
【０１１１】
表１０に列挙したシリンジを、５℃／６０％の相対湿度、２５℃／６０％の相対湿度及び４０℃／７５％の相対湿度で最長３か月間にわたってインキュベートした。その後、試料を、それらのストッパー移動力、すなわちブレークルース力、及び滑動力について、かつマイクロ流体画像法（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ）（ＭＦＩ）によって決定されたサブビジブル粒子について分析した。
【０１１２】
【表１０】
2019501687.tif 000016
【０１１３】
ａ）ＭＦＩによって測定されたサブビジブル粒子
表１０からのシリンジを、５℃／６０％の相対湿度、２５℃／６０％の相対湿度及び４０℃／７５％の相対湿度で３か月間にわたってインキュベートした。その後、光遮蔽（ｌｉｇｈｔ  ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）を、フローカム（ＦｌｏｗＣａｍ）ＰＶベンチトップシステム（米国メーン州所在のフルーイド  イメージング  インコーポレイテッド（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．））によって、システムソフトウェア（ビジュアルスプレッドシート（ＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ）ソフトウェア、バージョン３．４．８）及び下記のパラメータを用いて測定した。
【０１１４】
モード：              オートイメージ
プライミング方法：    試料を用いるマニュアルプライム
流量：                ０．１００ｍＬ／分
再校正：              ０
停止理由：            試料体積が処理されたこと
吸引される試料体積：  １．０４２１ｍＬ
処理される試料体積：  １．０３９２ｍＬ
撮像される液量：      ０．３４２１ｍＬ
フレームレート：      ２２．００ｆｐｓ
倍率：                １０×
校正係数：            ０．６９７９
シリンジサイズ：      １．００ｍＬ
５本のシリンジをプールし、各時点で測定した。前記シリンジの中身を円錐領域から出し、約１ｍＬの試料を希釈せずに測定した。分析の結果を表１１に示す。プレフィルドシリコーン不使用シクロオレフィンポリマーシリンジ６は、試験したすべての条件下で、低い粒子レベルを有し、一方、焼き付けシリコーン処理ガラスシリンジＳ２は、高温で３か月間にわたって保管した場合には、≧１０μｍの粒子レベルを含んだ；この粒子レベルは、眼科において使用するためのＵＳＰ＜７８９＞規格を満たさない。
【０１１５】
【表１１】
2019501687.tif 000017
【０１１６】
７．プラスチックシリンジ及びガラスシリンジにおけるブレークルース力及び滑動力の測定
表１０からのシリンジを、５℃／６０％の相対湿度、２５℃／６０％の相対湿度及び４０℃／７５％の相対湿度で１か月間及び３か月間にわたってインキュベートした。前記シリンジすべてに無菌ろ過した製剤０．４００ｍＬを充填し、シリンジシステムのブレークルース力及び滑動力に関して試験した。
【０１１７】
５つの試料を各時点で測定した。前記試験は、引張試験機（ＴＨ２７３０、トゥムラー）において、１００ｍｍの移動長に対して１９０ｍｍ／分のストッパー速度で実施した。
試験手順の前に、２７Ｇ×１．２７ｃｍ（０．５”）のニードルをルアーコーンシリンジＳ２及びＳ６に取り付けた。
【０１１８】
【表１２】
2019501687.tif 000018
【０１１９】
プレフィルドシリコーン不使用シクロオレフィンポリマーシリンジ６、すなわち、本発明のシリンジは、シリコーンオイルで被覆されたガラスシリンジのブレークルース挙動及び活動挙動と同等であるか、又はそれよりも優れたブレークルース挙動及び滑動挙動を有する。
８．異なる条件に供されたプラスチックシリンジ及びガラスシリンジにおけるアフリベルセプトの安定性の測定
ａ）試料の調製
４０ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦ拮抗薬アフリベルセプト及び１０ｍＭのヒスチジン緩衝液、４０ｍＭの塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含有したｐＨ６．２の溶液１６５μＬを、表１０に列挙したシリンジに充填し、前記シリンジを、５Ｃ／６０％の相対湿度、２５℃／６０％の相対湿度及び４０℃／７５％の相対湿度で１か月間及び３か月間にわたってインキュベートした。
【０１２０】
その後、タンパク質濃度についてはＵＶ−Ｖｉｓによって、高分子量種（ＨＭＷＳ）の存在についてはサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）及び非対称流フィールドフロー分画（ＡＦ４）によって、断片及びＨＭＷＳの存在については非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、メチオニン酸化及び脱アミド化の存在については還元型ペプチドマッピングによって、試料を分析した。アフリベルセプトの電荷バリアントをもたらす化学的な修飾については、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を使用して、試料を分析した。また、ｐＨも、全インキュベーション期間にわたりモニターした。
【０１２１】
安定性プログラム全体を通して、すべての試料において、タンパク質濃度（分光光度法による２８０ｎｍにおける定量化；ｎ＝３）及びｐＨ（ｎ＝２）の著しい変化は検出されなかった。
【０１２２】
ｂ）ＡＦ４
非対称流フィールドフロー分画（ＡＦ４）は、アフリベルセプトのより大きな分子量種を、それらのサイズに基づいて同定し、定量化するための技法である。チャネルを横切る液体のフローが引き起こすフローフィールドにおける移動度（拡散係数）の差によって、こうした分離が得られる。ＭＡＬＳ（多角度光散乱）及び濃度依存性の検出器としてのＵＶ（２８０ｎｍ）と組み合わせると、アフリベルセプト凝集物を特徴付け、定量化することができる。
【０１２３】
Ｗ４９０分離スペーサー（ワイアット  テクノロジー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））及びＰＬＧＣ  １０ｋＤ  ｓｃ−５メンブラン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））と組み合わせた１５．５ｃｍの分離チャネル１５．５ｃｍ（短いチャネル）（ワイアット  テクノロジー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））上に、アフリベルセプト２０μｇを導入した。０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び０．０２％のアジ化ナトリウムを用いて、分離の間のクロスフロー及びフォーカスフローを表す表１３に示した溶出条件（チャネルフロー：０．８ｍＬ／分）に従って、タンパク質を溶出した。
【０１２４】
溶出種を２８０ｎｍの波長で検出し、溶出種の濃度対時間を示すグラフに表示した。溶出プロファイルは、凝集していないタンパク質によるメインピークと、より高い分子量の形態のタンパク質を表すいくつかのさらなるタンパク質のピークとを示した。ＭＡＬＬＳ検出器によって、対応する分子量を計算した。
【０１２５】
【表１３】
2019501687.tif 000019
【０１２６】
表１０のシリンジを４０℃／７５％の相対湿度で１か月間及び３か月間にわたってインキュベートした場合の、溶出種のピーク面積の合計に対する、より大きな分子量種のピーク面積のパーセンテージを、表１４に示す。別段の記載がない限り、各試料を二つ組で測定して調べた。
【０１２７】
いずれのその他の温度（５℃／６０％の相対湿度及び２５℃／６０％の相対湿度）からも、出発物質と比較した、より大きな分子量種の保管の間の著しい増加は示されなかった。
【０１２８】
【表１４】
2019501687.tif 000020
【０１２９】
ＡＦ４−ＭＡＬＳによって測定した、４０℃／７５の相対湿度における最長３か月間の期間にわたったインキュベーションの間のＨＭＷＳの生成は、２つのシリンジ、Ｓ２（ガラスシリンジ）とＳ６（ＣＯＰ）との間で極めて同等であった。同定されたより大きな分子量種も温度依存性の動態も、２つの一次包装システムの間で同等であった。
【０１３０】
ｃ）ＳＥＣ
シリンジからのタンパク質試料をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー、３００×７．８ｍｍ、５μｍ）カラムに導入して、アフリベルセプトの高分子量種を検出した。
【０１３１】
０．０２Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び０．８Ｍの塩化ナトリウムを使用する定組成溶出によって、１．０ｍＬ／分の流速、２５℃で、タンパク質を溶出した。溶出種を２１４ｎｍの波長で検出し、溶出種の濃度対時間を示すグラフに表示した。溶出プロファイルは、凝集していないタンパク質によるメインピークと、より高い分子量の形態のタンパク質を表すいくつかのさらなるタンパク質のピークとを示した。すべてのピークの面積を求めた。表１のシリンジについて、溶出種のピーク面積の合計に対する凝集物のピーク面積のパーセンテージを、表１５に示す。各試料を、二つ組で測定して調べた。
【０１３２】
【表１５】
2019501687.tif 000021
【０１３３】
ＳＥＣによって測定したＨＭＷＳの生成は、すべてのインキュベーションパラメータ（温度、保管時間）について、２つのシリンジ、Ｓ２（ガラスシリンジ）とＳ６（ＣＯＰ）との間で極めて同等であった。同定されたより大きな分子量種も温度依存性の動態も、２つの一次包装システムの間で同等であった。
ｄ）非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、表１０に従う異なるシリンジシステムにおけるアフリベルセプトの断片化及びオリゴマー化のような物理的修飾を測定した。
【０１３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、４〜１２％のｔｒｉｓ−グリシンゲル中の非還元条件下で実施した。試料は、水を加えて０．４ｍｇ／ｍＬにあらかじめ希釈し、さらに、ＳＤＳ試料緩衝液を加えて０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。試料を、９５℃で５分間にわたってインキュベートした。運転後、ゲルを、１００ｍＬの脱イオン水を用いて３回濯ぎ、クーマシーを用いて室温で一晩染色した。ゲルが変色したら、前記ゲルを、スキャンし、クォンティティーワン  ソフトウェア（ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。
運転条件を下記に示した：
電圧：  １２５Ｖ
電流：  ３５ｍＡ
出力：  ５Ｗ
時間：  １３０分
３か月間の全インキュベーション期間を終えたすべての温度の試料について、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。いずれの一次包装システムにおいても、前記試料の５℃における保管によって、バンド形成のパターンの著しい変化は生じず、双方のシリンジ材料において、全インキュベーション期間にわたって不純物の新しいバンドの生成も不純物の現存するバンドの著しい増加も検出することができなかった。前記試料の２５℃／６０％の相対湿度における保管によって、不純物のより強いバンドが生じた；４０℃／７５％の相対湿度で３か月間にわたってインキュベートした試料の非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を図１に示す。
【０１３５】
４０℃／７５の相対湿度で３か月間にわたってインキュベートしたすべての試料の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、アフリベルセプトの断片及びより大きな分子量種を表すバンドが視認された。表１０に示す双方の一次包装システムにおいて、３か月間のインキュベーションの間の断片及びＨＭＷＳの生成は極めて同等であり、動態及び同定された不純物もまた極めて同等であった。
【０１３６】
ｅ）ＩＥＦ
等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、アフリベルセプトの異なるアイソフォームを、例えば脱アミド化に起因するそれらの等電点の差によって分離する。使用準備済みＩＥＦゲル（フォーカスゲル（Ｆｏｃｕｓ  Ｇｅｌ）（ｐＨ６〜１１）、セルバ（Ｓｅｒｖａ）製、４３３２９．０１番）は、ゲル内にｐＨ勾配を含有する。タンパク質は、ゲルに添加すると、それらの正味の電荷に起因して、ｐＨ勾配中をそれらの等電点（ＩＥＰ、ＩＰ）と同等なｐＨに到達するまで移動する。超純水を加えて、アフリベルセプト試料を０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。５μｇのアフリベルセプトに等しい、前記試料の１０μＬを、泳動ゲル上に添加した。各試料は、二つ組として分析した。
【０１３７】
運転後、タンパク質を、１２％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸及び３．５％の５−スルホサリチル酸二水和物（ｗ／ｖ）を含有した溶液中で６０分間にわたって固定し、脱イオン水を用いて３回濯ぎ、クーマシーを用いて室温で一晩染色した。ゲルを２０％のエタノールを用いて変色させた後に、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）製のＧＳ８００濃度計によってスキャンし、分析した。
表１６に、泳動条件を示す：
【０１３８】
【表１６】
2019501687.tif 000022
【０１３９】
ＩＥＦにおいて、いずれの一次包装システムにおいても、すべての温度における１か月間の保管の後に、基準と比較したアフリベルセプトのバンド形成のパターンの変化は検出することができなかった。３か月間後、５℃／６０％及び２５℃／６０％でインキュベートした試料のみが、基準に適合し（ｃｏｍｐｌｙ）、出発物質と比較して変化を示さなかった。試験したいずれの一次包装材料においても、４０℃／７５％の相対湿度でインキュベートした試料は酸性種への同等のシフトを含み、従って、表１０に示す異なる一次包装材料に関する差はなかった。
【０１４０】
ｆ）還元型ペプチドマッピング：
トリプシンによる消化、及び質量分析にカップリングさせた液体クロマトグラフィ（ＬＣ−ＭＳ）の後に、還元型ペプチドマッピングによって、脱アミド化及びメチオニン酸化に関するアフリベルセプトの純度を分析した。タンパク質に対して、還元及びアルキル化の後に、トリプシンによる酵素切断を行った。結果として生じたペプチドを、ＲＰ−ＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した。前記ペプチドを、クロマトグラフィにおいて、移動相を高い極性（水中のトリフルオロ酢酸）からより低い極性（アセトニトリル中のトリフルオロ酢酸）へ変化させることにより溶出し、質量分析（ゼヴォ（Ｘｅｖｏ）Ｇ２−ＸＳ  ＱＴＯＦ）によって分析した。前記ペプチドのデータを処理し、理論的なタンパク質配列及び基準試料と比較して、酸化及び脱アミド化を検出した。
【０１４１】
表１０に示すシリンジを、５℃／６０％の相対湿度、２５℃／６０％の相対湿度及び４０℃／７５の相対湿度における３か月間のインキュベーションの後に単回測定して分析し、０時の出発物質と比較した。
【０１４２】
変性緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を加えて、試料を希釈して、１．２５ｍｇ／ｍＬのアフリベルセプトの濃度を得た。前記希釈した試料８０μＬを、（（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン）中に溶解させた）０．５％のラビジェスト（ＲａｐｉＧｅｓｔ）（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））１０μＬと混合し、９５℃で５分間インキュベートした。還元のために、（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）−アミノメタン中に溶解させた）０．０２ＭのＤＴＴ４．５μＬを添加し、３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。アフリベルセプトの消化のために、（５０ｍＭの酢酸中に溶解させた）１ｍｇ／ｍＬのトリプシン溶液５μＬを添加し、３７℃でさらに３時間にわたってインキュベートした。２％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸２０μＬを加えて反応を停止し、３７℃で３０分間にわたってインキュベーションを行った。ペプチドの分析のために、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）−アミノメタンを加えて、上清を０．１２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。
ＵＰＬＣパラメータ：
アクイティ（ＡＣＱＵＩＴＹ）ＵＰＬＣ−ＣＳＨＣ−１８カラム、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）製、１００ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ上に、消化された、シリンジからのタンパク質試料を導入した．前記消化された試料０．２５μｇを、溶離液Ａ（水）、溶離液Ｂ（アセトニトリル）、溶離液Ｃ（０．２５％トリフルオロ酢酸）及び溶離液Ｄ（ｎ−プロパノール）の勾配を用いて、下記の表１７に従って６５℃で溶出した：
【０１４３】
【表１７】
2019501687.tif 000023
【０１４４】
質量分析法のパラメータ：
イオン化の種類：ＥＳＩ          極性：陽性
分析装置のモード：感度          実験の種類：ＭＳ
開始質量：５０ｍ／ｚ            コーンガス流量：３０Ｌ／時間
終了質量：２０００ｍ／ｚ        脱溶媒和ガス流量：１０００Ｌ／時間
発生源の温度：１２０℃          スキャン時間：０．５秒
脱溶媒和の温度：４５０℃        キャピラリー電圧：３．０ｋＶ
コーン電圧：３５Ｖ
ロックスプレー（ＬｏｃｋＳｐｒａｙ）のプロファイル
基準化合物：ロイシンエンケファリン
ＭＳのロックマス：５５６．２７６６ｍ／ｚ
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間隔：３０秒
アフリベルセプト中の酸化状態のメチオニン４種を、前記ペプチドにおいて同定することができ（１：Ｔ１＿ＡＳ２０、１：Ｔ２２、１：Ｔ２８、１：Ｔ４８）、酸化の合計の評価のために総計した（表１８を参照されたい）。
【０１４５】
アフリベルセプトの脱アミド化６種を、前記ペプチドにおいて同定することができ（１：Ｔ１０＿ＡＳ１２；１：Ｔ１１；１：Ｔ１０＿ＡＳ１２；１：Ｔ１２＿ＡＳ３；１：Ｔ１２＿ＡＳ３；１：Ｔ３０＿ＡＳ１２；１：Ｔ３０＿ＡＳ？；１：Ｔ３３＿ＡＳ１４）、脱アミド化の合計の評価のために総計した（表１８を参照されたい）。
【０１４６】
【表１８】
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【０１４７】
表１０に示すシリンジはいずれも、メチオニン酸化及び脱アミド化に関して同一の安定性を備えた。
いずれの温度条件においても、双方のシリンジ材料（ガラス対ＣＯＰ）において、メチオニン酸化の著しい増加を検出することはできず、一方、脱アミド化の増加は温度に依存した。安定性プログラムにおいて、双方のシリンジシステムが、脱アミド化を同等に増加させた。
【０１４８】
示された結果から、試験した条件下において、本発明のプレフィルドプラスチックシリンジ（シリンジ６）におけるアフリベルセプトの安定性は、ガラスシリンジ（シリンジ２）におけるラニビズマブの安定性と少なくとも同等であることは明らかである。
【図１】
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【国際調査報告】
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