(57)【要約】  本開示は、細胞増殖を促進するため及び／又は抗原認識後のサイトカイン分泌を促進するために遺伝子改変細胞において有用な新規共刺激ドメインを提供する。例えば、本明細書では、本明細書に開示の共刺激ドメインが組み入れられているキメラ抗原受容体又は誘導性調節構築物を含む遺伝子改変細胞が開示されている。本明細書では、共刺激ドメインをコードする核酸配列を含むプラスミド及びウイルスベクター、並びにがん等の疾患の症状、進行、又は発生を軽減するために新規共刺激ドメインを含む組成物を対象に投与する方法も開示されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８、５、６、又は７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
前記共刺激ドメインが少なくとも１つのＴＲＡＦ結合モチーフを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＴＲＡＦ結合モチーフが、配列番号１０、９、及び１１からなる群から選択される、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記共刺激ドメインが、スペーサ配列によって分離された２つのＴＲＡＦ結合モチーフを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記スペーサが、配列番号１５および１２〜１４からなる群から選択される、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記共刺激ドメインが、スペーサ配列によって分離された配列番号１０、９、及び１１からなる群から選択される２つのＴＲＡＦ結合モチーフを含み、前記スペーサ配列は配列番号１５及び１２〜１４からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記共刺激ドメインが、スペーサ配列によって分離された、配列番号９及び１１のＴＲＡＦ結合モチーフを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記スペーサ配列が配列番号１２を含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が共刺激ドメインをコードする、請求項７又は請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインをコードする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記共刺激ドメインが、スペーサ配列によって分離された、配列番号１０及び１１のＴＲＡＦ結合モチーフを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記スペーサ配列が、配列番号１５、１３、及び１４からなる群から選択される、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸分子が、配列番号４、２、又は３のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が共刺激ドメインをコードする、請求項１１又は１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号８、６、又は７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインをコードする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸分子がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＣＡＲが請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの共刺激ドメインを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記ＣＡＲが、配列番号８、５、６、又は７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの共刺激ドメインを含む、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記ＣＡＲが少なくとも２つの共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインの少なくとも１つが請求項１〜１４のいずれか１項に記載の共刺激ドメインである、請求項１５又は請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記ＣＡＲが請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも２つの共刺激ドメインを含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記ＣＡＲが少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζドメインである、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記核酸分子が誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列を含み、前記誘導性調節構築物が請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの共刺激ドメインを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記誘導性調節構築物が、前記誘導性調節構築物のうちの２つを二量体化させる結合ドメインを更に含み、二量体化が細胞への共刺激シグナルを開始する、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記結合ドメインが小分子又は抗体に結合する、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記結合ドメインがＦＫＢＰ１２の類似体を含む、請求項２２又は２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物、又はウイルスベクターのウイルスゲノムである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子を含む組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
前記組換えＤＮＡ構築物がウイルスベクターをコードし、前記ウイルスベクターが請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子を含む、請求項２６に記載の組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターが組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子を含むウイルスベクター。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項２９に記載のウイルスベクター。
【請求項３１】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子を含む遺伝子改変細胞。
【請求項３２】
前記遺伝子改変細胞が、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子を含む発現カセットを含む、請求項３１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３３】
前記核酸分子又は前記発現カセットが前記遺伝子改変細胞のゲノム内に存在する、請求項３２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３４】
前記核酸分子又は前記発現カセットが前記遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれていない、請求項３２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３５】
前記核酸分子又は前記発現カセットが、前記遺伝子改変細胞中の前記組換えＤＮＡ構築物において、ｍＲＮＡ中、又はウイルスゲノム中に存在し、前記遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれていない、請求項３４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３６】
前記遺伝子改変細胞が、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の前記共刺激ドメインを含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３７】
前記遺伝子改変細胞が、
（ｉ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載の共刺激ドメインを含まないＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＣＡＲ発現カセットと、
（ｉｉ）請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の誘導性調節構築物をコードする調節発現カセットと、
を含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３８】
前記遺伝子改変細胞が、
（ｉ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載の共刺激ドメインを含まないＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列と、
を含む発現カセットを含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３９】
前記遺伝子改変細胞が、
（ｉ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記共刺激ドメインを含まないＣＡＲと、
（ｉｉ）請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の誘導性調節ドメインと、
を含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４０】
前記遺伝子改変細胞が遺伝子改変真核細胞である、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４１】
前記遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞である、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４２】
前記遺伝子改変細胞が、配列番号８、５、６、又は７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する共刺激ドメインを含まない対照細胞と比較して、増加した増殖及び／又はサイトカイン分泌を示す、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４３】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの共刺激ドメインを含む遺伝子改変細胞の作製方法であって、前記方法が請求項１〜２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子を細胞に導入することを含む、方法。
【請求項４４】
前記核酸分子が、ＣＡＲをコードする、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の前記核酸分子である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸分子が、誘導性調節構築物をコードする請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法が、
（ｉ）操作されたヌクレアーゼをコードする第２の核酸分子であって、前記操作されたヌクレアーゼが前記細胞中で発現される、第２の核酸分子、又は、
（ｉｉ）操作されたヌクレアーゼタンパク質
を前記細胞に導入することを更に含み、
前記操作されたヌクレアーゼは、切断部位を生成するために前記細胞のゲノム中の認識配列を認識して切断し、
前記少なくとも１つの共刺激ドメインをコードする前記核酸分子は、前記切断部位で前記細胞のゲノムに挿入される、方法。
【請求項４７】
前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼ、組換えジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、組換え転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子は、前記核酸分子が相同組換えによって前記切断部位で前記細胞のゲノムに挿入されるように、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含む、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子は、前記核酸分子が非相同の末端結合によって前記細胞のゲノムに挿入されるように、前記切断部位に対して実質的な相同性を欠く、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記遺伝子改変細胞が遺伝子改変真核細胞である、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞である、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子が、請求項２５に記載の前記ｍＲＮＡを用いて前記細胞に導入される、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子が、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の前記組換えＤＮＡ構築物を用いて前記細胞に導入される、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記核酸分子が、請求項２９又は請求項３０に記載の前記ウイルスベクターを用いて前記細胞に導入される、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子改変細胞は、共刺激ドメインを含まない対照細胞と比較した場合に、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の核酸分子の導入後に活性化、増殖、及び／又はサイトカイン分泌の増加を示す、請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
薬学的に許容される担体と、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の前記遺伝子改変細胞と、を含む医薬組成物。
【請求項５８】
それを必要とする対象においてがんを治療するための免疫療法の方法であって、前記方法が前記対象に請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の前記遺伝子改変細胞を投与することを含む、方法。
【請求項５９】
前記方法は請求項５７に記載の前記医薬組成物を投与することを含み、前記医薬組成物は請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の前記遺伝子改変細胞を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記がんが癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、又は白血病である、請求項５８又は請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記がんが、Ｂ細胞起源のがん、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｂ細胞起源のがんが、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本開示は、Ｔ細胞増殖を刺激しＴ細胞枯渇を回避するように操作された新規共刺激ドメインに関する。本開示は更に、新規共刺激ドメインを含む遺伝子改変細胞、及びがん等の疾患の治療におけるそのような細胞の使用に関する。
【０００２】
ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。２０１７年１０月４日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１０９０７００１７ＷＯ００ＳＥＱ．ｔｘｔという名称で、サイズが１２４，２０７バイトである。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞養子免疫療法は、がん治療のための有望なアプローチである。この戦略は、特定の腫瘍関連抗原に対する特異性を増強するために遺伝的に改変されている単離されたヒトＴ細胞を利用する。遺伝子改変は、抗原特異性をＴ細胞に移植するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を含み得る。外因性Ｔ細胞受容体とは対照的に、ＣＡＲは、モノクローナル抗体の可変ドメインからそれらの特異性を引き出す。従って、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の非限定的な様式で腫瘍免疫反応性を誘導する。今日まで、Ｔ細胞養子免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び慢性リンパ性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、進行神経膠腫、卵巣癌、中皮腫、黒色腫、及び膵臓癌を含む多くのがんの臨床治療として利用されてきた。
【０００４】
Ｔ細胞活性化は内因性Ｔ細胞受容体によって開始され、それにより細胞に抗原特異性も提供される。Ｔ細胞によるシグナル伝達は、ＣＤ２８等の細胞表面共刺激受容体によって増幅される。共刺激がないと、Ｔ細胞受容体を介する刺激はＴ細胞増殖を促進するのに不十分であり、細胞アネルギーをもたらし得る。共刺激はまた、Ｔ細胞枯渇及びいくつかの形態の活性化誘導細胞死を回避するのにも役立つ。初期のキメラＴ細胞活性化受容体は、ＣＤ３のζ鎖をＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５を含むＴ細胞共受容体の細胞外ドメインに融合することによって生成された。
【０００５】
次いで、ＣＤ３ζ鎖を一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合することによって、いわゆる「第１世代」キメラ抗原受容体を生成し、これにより、抗原特異性及び抗原誘導性Ｔ細胞活性化が得られた。第１世代ＣＡＲは細胞傷害性を媒介することができたが、修飾された初代Ｔ細胞の抗原誘導性の拡大を指示することができなかった。実際、初期のトランスジェニックマウスモデルにおける研究は、アネルギー及び少量のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生のために、第一世代ＣＡＲを発現するＴ細胞が、インビボでの腫瘍進行に対して中程度の効果しかもたらさないことを明らかにした。「第２世代」キメラ抗原受容体は、シスにおいて単一の共刺激ドメインを細胞質ＣＤ３ζ鎖と更に融合させることによって生成された。研究は、共刺激ドメインの付加が、抗原曝露を繰り返した後の初代ＣＡＲ−Ｔ細胞の拡大、及びＩＦＮ−γ等のサイトカインの分泌増加を可能にすることを実証した。実際、第２世代ＣＡＲ−Ｔ細胞を利用した初期の臨床試験は、Ｂ細胞リンパ腫、ＣＬＬ、及びＢ細胞ＡＬＬに罹患した患者において有意に増強された持続性及び拡大を示した。ＣＤ２８、４−１ＢＢ、又はＯＸ−４０要素等の多数の共刺激ドメインがＣＡＲに導入されており、これらはＢ細胞悪性腫瘍患者に投与されるＣＡＲ−Ｔ細胞に利用されてきた。いわゆる「第３世代」キメラ抗原受容体は、細胞質ＣＤ３ζ鎖と共に２つの共刺激ドメインを導入して、抗原曝露を繰り返した後の細胞拡大及び／又はサイトカイン分泌の更なる増強を可能にした。
【０００６】
ＣＡＲ構築物内の共刺激ドメインの使用に加えて、グループはまた、ＣＡＲから分離することができる様々な「安全スイッチ」に共刺激ドメインを組み入れている。そのような安全スイッチの１つは、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ等の小分子によって結合されると二量体化する結合ドメインに融合された、ＭｙＤ８８及びＣＤ４０シグナル伝達ドメインを含む。この安全スイッチは、細胞活性化を促進するために細胞質ＣＤ３ζ鎖のみを含むＣＡＲ構築物と共に使用される。小分子を投与することにより、安全スイッチは二量体化し、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激シグナル伝達が別個のＣＡＲ構築物による抗原認識の後にＣＡＲ−Ｔ細胞拡大及びサイトカイン分泌を促進することを可能にする。
【０００７】
多数の共刺激ドメインが、特許及び文献の両方に以前から開示されている。例えば、特許文献１は、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの両方を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを特許請求している。しかしながら、本開示のドメイン、又は本開示のドメインに対して８０％の配列同一性を有する任意のドメインを開示したものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第８，３９９，６４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本開示は、細胞増殖を促進するため及び／又はサイトカイン分泌を促進するために遺伝子改変細胞を提供するのに有用な新規共刺激ドメインを提供する。本開示は、抗原誘導性細胞活性化後に異なる程度の細胞増殖及び／又はサイトカイン分泌を促進する新しい共刺激ドメインを提供することによって技術を進歩させる。例えば、本明細書に開示の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ及びＣＤ２８等の共刺激ドメインと比較した場合に優れた活性を提供する。また、本明細書には、本明細書に開示の１以上の共刺激ドメインが組み入れられているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む遺伝子改変細胞も開示されている。他の例では、本明細書に開示の遺伝子改変細胞は、本明細書に開示の１以上の共刺激ドメインが組み入れられている誘導性調節構築物を含む。また、本明細書では、共刺激ドメインをコードする核酸配列を含む核酸分子、組換えＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）、及びウイルスベクター、並びに疾患の症状、進行、又は発生を軽減するために対象に新規共刺激ドメインを含む組成物を投与する方法も提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の新規共刺激ドメインを含む遺伝子改変細胞は、医薬組成物として処方され、例えばがんの治療における免疫療法として使用される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、一態様では、本開示は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示の様々な態様では、本明細書に開示の共刺激ドメインの活性変異体又は断片は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインをコードする活性変異体又は断片アミノ酸配列は少なくとも１つのＴＲＡＦ結合モチーフを含む。特定の実施形態では、ＴＲＡＦ結合モチーフは、配列番号９〜１１からなる群から選択される。特定の実施形態では、共刺激ドメインをコードする活性変異体又は断片アミノ酸配列は、スペーサ配列によって分離された２つのＴＲＡＦ結合モチーフを含む。いくつかのそのような実施形態において、スペーサ配列は、配列番号１２〜１５からなる群から選択される。特定の実施形態では、共刺激ドメインをコードする変異体又は断片アミノ酸配列は、スペーサ配列で分離された、配列番号９〜１１からなる群から選択される２つのＴＲＡＦ結合モチーフを含み、スペーサ配列は配列番号１２〜１５からなる群から選択される。
【００１２】
特定の実施形態では、共刺激ドメインをコードする変異体又は断片アミノ酸配列は、配列番号１２に記載のスペーサ配列等のスペーサ配列によって分離された、配列番号９及び１１のＴＲＡＦ結合モチーフを含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインをコードする変異体又は断片アミノ酸配列は、配列番号１３〜１５のいずれかに記載のスペーサ配列等のスペーサ配列によって分離された、配列番号１０及び１１のＴＲＡＦ結合モチーフを含む。
【００１３】
特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１〜４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１〜４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するその変異体若しくは断片を含み、ヌクレオチド配列は共刺激ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１〜４のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、配列番号１〜４のいずれか１つの変異体又は断片を含むヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は活性共刺激ドメインをコードする。
【００１５】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ＣＡＲは、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む。いくつかのそのような実施形態では、核酸分子は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの共刺激ドメインを含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
他のそのような実施形態では、ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。様々な実施形態において、抗原結合ドメインはがん又は腫瘍抗原に対する特異性を有する。特定の実施形態では、コードされたＣＡＲはＣＤ１９特異的抗原結合ドメインを含む。
【００１７】
更なるそのような実施形態では、コードされたＣＡＲは少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。そのような実施形態では、少なくとも２つの共刺激ドメインは、本明細書に記載の共刺激ドメインであるか、あるいは本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ドメインと、当該分野で公知の少なくとも１つの追加の共刺激ドメインである（例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ）。いくつかの実施形態では、コードされたＣＡＲは少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζドメインである。
【００１８】
他の実施形態では、核酸分子は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの共刺激ドメインを含む誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、コードされた誘導性調節構築物は、２つの誘導性調節構築物が二量体化することを可能にする結合ドメインを更に含み、二量体化は細胞への共刺激シグナルを開始する。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、小分子（例えば、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）、抗体、又は二量体化を可能にする他の分子に結合する。結合ドメインが小分子に結合する特定の実施形態では、結合ドメインはＦＫＢＰ１２の類似体を含み（例えば、Ｆ３６Ｖ置換を含む）、小分子はｒｉｍｉｄｕｃｉｄ（即ち、ＡＰ１９０３）である。
【００１９】
特定の実施形態では、核酸分子は、ｍＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）であるか、又はウイルスベクターのウイルスゲノム内に含まれる。
【００２０】
別の態様では、本開示は組換えＤＮＡ構築物を提供し、組換えＤＮＡ構築物は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む本明細書に記載の核酸分子を含む。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含み、ＣＡＲは、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む。他の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載の誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
いくつかのそのような実施形態において、組換えＤＮＡ構築物は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターをコードする。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。
【００２２】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む本明細書に記載の核酸分子を含むウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは本明細書に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含み、ＣＡＲは、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む。他の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載の誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。
【００２４】
別の態様では、本開示は遺伝子改変細胞を提供し、遺伝子改変細胞は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む本明細書に記載の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、本明細書に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、ＣＡＲは、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変細胞は本明細書に記載の誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、誘導性調節構築物は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む。いくつかのそのような実施形態において、本明細書に記載の核酸分子、又は本明細書に記載の発現カセットは、遺伝子改変細胞のゲノム内に存在するか、あるいは細胞のゲノムに組み込まれていない。いくつかのそのような実施形態において、本明細書に記載の核酸分子、又は本明細書に記載の発現カセットは、組換えＤＮＡ構築物中、ｍＲＮＡ中、又はウイルスゲノム中の遺伝子改変細胞に存在し、細胞のゲノムには組み込まれていない。
【００２５】
更なる実施形態では、遺伝子改変細胞は、（ｉ）本明細書に記載の共刺激ドメインを含まないＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＣＡＲ発現カセットと、（ｉｉ）配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む、本明細書に記載の誘導性調節構築物をコードする調節発現カセットとを含む。従って、特定の実施形態では、遺伝子改変細胞は、（ｉ）本明細書に記載の共刺激ドメインが組み入れられていないＣＡＲと、（ｉｉ）本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ドメインを含む誘導性調節ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、（ｉ）本明細書に記載の共刺激ドメインを含まないＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ドメインを含む誘導性調節ドメインをコードするヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含む。各実施形態では、ＣＡＲ発現カセット及び／又は調節発現カセットは、遺伝子改変真核細胞のゲノム内にあるか、あるいは細胞のゲノムに組み込まれていない。いくつかのそのような実施形態において、ＣＡＲ発現カセット及び／又は調節発現カセットは、組換えＤＮＡ構築物中、ｍＲＮＡ中、又はウイルスゲノム中の遺伝子改変真核細胞に存在し、細胞のゲノムに組み込まれていない。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変細胞は、遺伝子改変真核細胞である。特定の実施形態では、細胞はＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。他の実施形態では、遺伝子改変細胞は初代ヒトＴ細胞又は初代ヒトＮＫ細胞である。更なる実施形態では、遺伝子改変細胞はヒトＣＡＲ−Ｔ細胞又はヒトＣＡＲ−ＮＫ細胞である。
【００２７】
特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変細胞は、本明細書に記載の共刺激ドメインを含まない対照細胞と比較して、増加した増殖及び／又はサイトカイン分泌を示す。いくつかの実施形態において、増加した増殖及び／又はサイトカイン分泌はインビトロ及び／又はインビボで示される。特定の実施形態では、サイトカイン分泌の増加は、本明細書に記載の共刺激ドメインを含まない対照細胞と比較して、細胞活性化及び／又は増殖に関連するＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、又は他のサイトカインの増加を含む。
【００２８】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む遺伝子改変細胞の作製方法を提供し、この方法は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードする本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子を細胞に導入することを含む。
【００２９】
本方法のいくつかの実施形態では、導入された核酸分子は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載のＣＡＲをコードする。
【００３０】
本方法のいくつかの実施形態では、導入された核酸分子は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載の誘導性調節構築物をコードする。
【００３１】
いくつかの実施形態では、この方法は更に、（ｉ）操作されたヌクレアーゼをコードする第２の核酸分子であって、操作されたヌクレアーゼが細胞内で発現される第２の核酸分子、又は（ｉｉ）操作されたヌクレアーゼタンパク質を、細胞に導入することを含み、ここで、操作されたヌクレアーゼは、認識配列を認識し切断して細胞のゲノムに切断部位を生成し、少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードする核酸は、切断部位でゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼ、組換えジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、組換え転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、又はｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼである。本方法の特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは操作されたメガヌクレアーゼである。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは一本鎖メガヌクレアーゼである。
【００３２】
本方法のそのような一実施形態では、細胞に導入された、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードする核酸分子は、核酸分子が相同組換えによって切断部位でゲノムに挿入されるように、ヌクレアーゼ切断部位に隣接する配列に相同な配列をさらに含む。本方法の別のそのような実施形態では、核酸分子は、核酸分子が非相同末端結合によってゲノムに挿入されるように、ヌクレアーゼ切断部位に対する実質的な相同性を欠いている。
【００３３】
本方法のいくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。特定の実施形態では、細胞は、初代ヒトＴ細胞、又は初代ヒトＮＫ細胞等のＴ細胞若しくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。特定の実施形態では、この方法によって作製される遺伝子改変細胞は、ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞又はヒトＣＡＲ−ＮＫ細胞である。
【００３４】
本方法の特定の実施形態では、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードする核酸分子は、本明細書に記載のｍＲＮＡ、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物、又は本明細書に記載のウイルスベクターを使用して細胞内に導入される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片をコードする本明細書に記載の少なくとも１つの核酸分子の導入は、遺伝子改変細胞の活性化、増殖、及び／又はサイトカイン分泌を増加させる。特定の実施形態では、サイトカイン分泌の増加は、本明細書に記載の共刺激ドメインを含まない対照細胞と比較した場合に、細胞活性化及び／又は増殖に関連するＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、又は任意の他のサイトカインの分泌増加を含む。
【００３６】
別の態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載の遺伝子改変細胞とを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、遺伝子改変細胞は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載のＣＡＲを含む。他の実施形態では、遺伝子改変細胞は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載の誘導性調節構築物を含む。
【００３７】
特定の実施形態では、遺伝子改変細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞である。いくつかのそのような実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する本明細書に記載の共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含むＣＡＲを含む。他のそのような実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、本明細書に記載の共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含まないＣＡＲを含み、更に、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む誘導性調節構築物を含む。様々な実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞はがん又は腫瘍特異的抗原に対する特異性を有し、医薬組成物はがん免疫療法の方法において有用である。
【００３８】
別の態様では、本開示は、遺伝子改変細胞を対象に投与する方法を提供し、遺伝子改変細胞は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載のものである。本方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載のＣＡＲを含む。本方法の他の実施形態では、遺伝子改変細胞は、配列番号５〜８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体若しくは断片を含む本明細書に記載の誘導性調節構築物を含む。
【００３９】
本方法の特定の実施形態では、遺伝子改変細胞を投与される対象はがん等の疾患を有する。本方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞である。いくつかのそのような実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はがん又は腫瘍特異的抗原に対する特異性を有し、がん免疫療法の方法において有用である。いくつかの実施形態において、がんは、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、又は慢性リンパ性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、進行神経膠腫、卵巣癌、中皮腫、黒色腫、又は膵臓癌である。特定の実施形態では、がんはＢ細胞リンパ腫である。
【００４０】
別の態様では、本開示は、医薬品として使用するための本明細書に記載の遺伝子改変細胞を提供する。本開示は更に、それを必要とする対象において疾患を治療するための医薬品の製造における、本明細書に記載の遺伝子改変細胞の使用を提供する。そのような一態様では、医薬品はそれを必要とする対象におけるがん免疫療法に有用である。
【００４１】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを治療するための免疫療法の方法を提供し、本明細書に開示される方法によって作製される遺伝子改変細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、がんは、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び白血病のがんからなる群から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、がんは、Ｂ細胞起源のがん、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞起源のがんは、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
【００４４】
本発明の前述及び他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参照することによってより完全に理解することができる。明確にするために別々の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできる。実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの全ての組み合わせが個別に且つ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切な下位組み合わせで提供することもできる。実施形態に列挙された特徴の全ての下位組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの全てのそのような下位組み合わせが本明細書に個別に且つ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。本明細書に開示された本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて本発明の他の各態様に適用される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】新規共刺激ドメイン新規１（配列番号５）、新規３（配列番号６）、新規５（配列番号７）、及び新規６（配列番号８）のアラインメントを示す。個々のＴＲＡＦ結合モチーフが同定され、列挙された各共刺激ドメイン内のＴＲＡＦ結合モチーフの間にスペーサ領域を見出すことができる。
【図２】抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ構築物を示す。示される共刺激ドメインには、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、新規１（Ｎ１）、新規３（Ｎ３）、新規５（Ｎ５）、及び新規６（Ｎ６）が含まれる。共刺激ドメインを欠くＣＡＲ構築物も示されている。
【図３Ａ−Ｈ】ドナーヒトＴ細胞のレンチウイルス形質導入後のＣＡＲ発現を実証するＧＦＰ分析の結果を報告する。結果は、新規共刺激ドメイン新規１（Ｎ１）、新規３（Ｎ３）、新規５（Ｎ５）、及び新規６（Ｎ６）の各々について報告されている。図３Ａ）偽形質導入を示す。図３Ｂ）４−１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＡＲによる形質導入を示す。図３Ｃ）ＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＡＲによる形質導入を示す。図３Ｄ）共刺激ドメインを含まない（ＢＢ−）ＣＡＲによる形質導入を示す。図３Ｅ）新規１（Ｎ１）共刺激ドメインを含むＣＡＲによる形質導入を示す。図３Ｆ）新規３（Ｎ３）共刺激ドメインを含むＣＡＲによる形質導入を示す。図３Ｇ）新規５（Ｎ５）共刺激ドメインを含むＣＡＲによる形質導入を示す。図３Ｈ）新規６（Ｎ６）共刺激ドメインを含むＣＡＲによる形質導入を示す。
【図４Ａ−Ｃ】Ｒａｊｉ培養物中で抗原誘発活性化を繰り返した後に経時的に測定されたＣＡＲ−Ｔ細胞拡大数を示す。結果は、新規共刺激ドメイン新規１（Ｎ１）、新規３（Ｎ３）、新規５（Ｎ５）、及び新規６（Ｎ６）の各々について報告されている。図４ＡはＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の混合集団について得られた結果を示す。図４ＢはＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞集団について得られた結果を示す。図４ＣはＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞集団について得られた結果を示す。
【図５Ａ−Ｃ】形質導入後３、７、１０、及び１４日目の各形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞集団におけるサイトカイン分泌を示す。図５Ａはインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌を示す。図５ＢはＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ−α）分泌を示す。図５ＣはＩＬ−２分泌を示す。
【図６Ａ−Ｃ】より頻繁な抗原遭遇及びより高い標的：エフェクター比を使用して、Ｒａｊｉ培養物中の抗原誘発活性化を繰り返した後に経時的に測定されたＣＡＲ−Ｔ細胞拡大数を示す。結果は、新規共刺激ドメイン新規１（Ｎ１）、新規３（Ｎ３）、新規５（Ｎ５）、及び新規６（Ｎ６）の各々について報告されている。図５ＡはＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の混合集団について得られた結果を示す。図５ＢはＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞集団について得られた結果を示す。図５ＣはＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞集団について得られた結果を示す。
【図７】５’から３’に、５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、５’相同性アーム、プロモータ、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖのコード配列、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＳＶ４０ポリＡシグナル、３’相同性アーム、及び３’ＩＴＲを含むドナー鋳型構築物を示す。示されている共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、新規１（Ｎ１）、及び新規６（Ｎ６）を含む。
【図８Ａ−Ｂ】２人の異なるドナーから調製したＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた抗原に応答した経時的なＣＡＲ−Ｔ増殖を示す。増殖は、４−１ＢＢ、Ｎ１、又はＮ６共刺激ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞について測定した。新規共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢシグナル伝達によって支持される増殖レベルと同等又はそれ以上の増殖レベルを支持することが見出された。図８ＡはドナーＫ７９９から調製したＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた結果を示す。図８Ｂはドナーｚ４１００から調製したＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた結果を示す。
【図９Ａ−Ｂ】４−１ＢＢ、Ｎ１、又はＮ６共刺激ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞との２４時間及び７２時間の共培養における様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でのＫ１９細胞の殺傷を示す。図９ＡはドナーＫ７９９から調製したＣＡＲ−Ｔ細胞を示す。図９Ｂはドナーｚ４１００から調製したＣＡＲ−Ｔ細胞を示す。
【図１０Ａ−Ｃ】ＣＤ１９＋標的細胞に応答した４−１ＢＢ、Ｎ１、又はＮ６共刺激ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞の相対的増殖を決定するために使用した細胞増殖アッセイの結果のヒストグラムを示す。図１０Ａは２つの異なるＥ：Ｔ比での陰性対照ＴＲＣ  ＫＯ  Ｔ細胞と比較したＣＡＲ−４−１ＢＢ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を示す。図１０ＢはＣＡＲ−Ｎ１Ｔ細胞と比較したＣＡＲ−４−１ＢＢ  Ｔ細胞の増殖を示す。図１０ＣはＣＡＲ−Ｎ６Ｔ細胞と比較したＣＡＲ−４−１ＢＢ  Ｔ細胞の増殖を示す。
【図１１】５’から３’に、５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、５’相同性アーム、プロモータ、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖのコード配列、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＳＶ４０ポリＡシグナル又はＳＶ４０ビポリＡシグナル、３’相同性アーム、及び３’ＩＴＲを含む７２４１、７２０５、及び７２０６ドナー鋳型構築物を示す。示されている共刺激ドメインは、４−１ＢＢ（構築物７２４１）及び新規６（Ｎ６；構築物７２０５及び７２０６）を含む。
【図１２Ａ−Ｇ】Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃ細胞の生着及び成長並びにそれに続くＴＣＲ  ＫＯ細胞、又は７２０５、７２０６、若しくは４−１ＢＢのＣＡＲ構築物を有するＣＡＲ  Ｔ細胞での処置後にマウスにおいてインビボで観察された背側及び腹側総フラックスの値を示す。図１２ＡはＴＣＲ  ＫＯ細胞で処理した後の背側フラックスを示す。図１２Ｂは７２０５ＣＡＲ  Ｔ細胞で処理した後の背側フラックスを示す。図１２Ｃは７２０６ＣＡＲ  Ｔ細胞で処理した後の背側フラックスを示す。図１２Ｄは４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した後の背側フラックスを示す。図１２ＥはＴＣＲ  ＫＯ細胞で処理した後の腹側フラックスを示す。図１２Ｆは７２０５ＣＡＲ  Ｔ細胞で処理した後の腹側フラックスを示す。図１２Ｇは７２０６ＣＡＲ  Ｔ細胞で処理した後の腹側フラックスを示す。図１２Ｈは４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した後の腹側フラックスを示す。
【図１３Ａ−Ｄ】Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃ細胞の生着及び成長並びにそれに続くＴＣＲ  ＫＯ細胞、又は７２０５、７２０６、若しくは４−１ＢＢのＣＡＲ構築物を有するＣＡＲ  Ｔ細胞での処置後にマウスにおいてインビボで観察された背側及び腹側総フラックスの画像化を示す。図１３Ａは、ＴＣＲ  ＫＯ細胞、７２０５  ＣＡＲ  Ｔ細胞、７２０６ＣＡＲ  Ｔ細胞、及び４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した群における７、１０、及び１６日目の背側フラックスの画像化を示す。図１３Ｂは、７２０５ＣＡＲ  Ｔ細胞、７２０６ＣＡＲ  Ｔ細胞、及び４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した群における２４、３１、及び３８日目の背側フラックスの画像化を示す。図１３Ｃは、ＴＣＲ  ＫＯ細胞、７２０５  ＣＡＲ  Ｔ細胞、７２０６ＣＡＲ  Ｔ細胞、及び４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した群における７、１０、及び１６日目の腹側フラックスの画像化を示す。図１３Ｄは、７２０５ＣＡＲ  Ｔ細胞、７２０６ＣＡＲ  Ｔ細胞、及び４−１ＢＢ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した群における２４、３１、及び３８日目の腹側フラックスの画像化を示す。
【図１４】Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃ細胞の生着及び成長、並びにそれに続くＴＣＲ  ＫＯ細胞、又は７２０５、７２０６、若しくは４−１ＢＢのＣＡＲ構築物を有するＣＡＲ  Ｔ細胞による処理後のマウスの生存曲線を示す。
【図１５】５’から３’に、５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、５’相同性アーム、プロモータ、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖのコード配列、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、ＭｙＤ８８共刺激ドメイン、新規６（Ｎ６）共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＳＶ４０ビポリＡシグナル、３’相同性アーム、及び３’ＩＴＲを含む７２４０ドナー鋳型構築物を示す。
【図１６Ａ−Ｆ】新規６（Ｎ６）共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、又はＭｙＤ８８及び新規６（Ｎ６）共刺激ドメインの両方を含むＣＡＲを発現するようにトランスフェクトしたヒトＴ細胞を用いたセルトレースバイオレット増殖アッセイの結果を示す。トランスフェクトした細胞をセルトレースバイオレットで標識し、ＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞又は操作されたＣＤ１９陽性Ｋ５６２細胞（Ｋ１９細胞）と共培養した。増殖は、Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットについてフローサイトメトリによって評価した。図１６ＡはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのみでトランスフェクトしたＣＤ４＋細胞を示す。図１６ＢはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのみでトランスフェクトしたＣＤ８＋細胞を示す。図１６ＣはＴＲＣ１−２×．８７ＥＥメガヌクレアーゼ及びＮ６  ＣＡＲドナー鋳型でトランスフェクトしたＣＤ４＋細胞を示す。図１６ＤはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ及びＮ６  ＣＡＲドナー鋳型でトランスフェクトしたＣＤ８＋細胞を示す。図１６ＥはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ及びＭｙＤ８８／Ｎ６  ＣＡＲドナー鋳型でトランスフェクトしたＣＤ４＋細胞を示す。図１６ＦはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ及びＭｙＤ８８／Ｎ６  ＣＡＲドナー鋳型でトランスフェクトしたＣＤ８＋細胞を示す。
【図１７】５’から３’に、５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、５’相同性アーム、プロモータ、ＭｙＤ８８共刺激ドメインのコード配列、新規６（Ｎ６）共刺激ドメイン、及びタンデムリガンド結合ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン（Ｆｖ）、Ｔ２Ａ要素、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列、並びにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＳＶ４０ビポリＡシグナル、３’相同性アーム、及び３’ＩＴＲを含む７２３５ドナー鋳型構築物を示す。
【図１８Ａ−Ｂ】ドナー鋳型なしでＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのみを発現するようにトランスフェクトしたヒトＴ細胞を用いたセルトレースバイオレット増殖アッセイの結果を示す。トランスフェクトした細胞をセルトレースバイオレットで標識し、ＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞又は操作されたＣＤ１９陽性Ｋ５６２細胞（Ｋ１９細胞）と共培養した。増殖は、Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットについてフローサイトメトリによって評価した。図１８Ａは細胞のＣＤ４＋サブセットを示す。図１８Ｂは細胞のＣＤ８＋サブセットを示す。
【図１９Ａ−Ｄ】新規６（Ｎ６）ドメインを含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するようにトランスフェクトしたヒトＴ細胞を用いたセルトレースバイオレット増殖アッセイの結果を示す。トランスフェクトした細胞をセルトレースバイオレットで標識し、ＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞又は操作されたＣＤ１９陽性Ｋ５６２細胞（Ｋ１９細胞）と共培養した。増殖は、Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットについてフローサイトメトリによって評価した。更に、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄの存在下又は非存在下でのＫ１９共培養において細胞を評価した。図１９ＡはＫ１９又はＫ５６２細胞上で培養した細胞のＣＤ４＋サブセットを示す。図１９Ｂはｒｉｍｉｄｕｃｉｄの存在下又は非存在下で、Ｋ１９細胞上で培養した細胞のＣＤ４＋サブセットを示す。図１９ＣはＫ１９又はＫ５６２細胞上で培養した細胞のＣＤ８＋サブセットを示す。図１９Ｄはｒｉｍｉｄｕｃｉｄの存在下又は非存在下で、Ｋ１９細胞上で培養した細胞のＣＤ８＋サブセットを示す。
【図２０Ａ−Ｄ】ＭｙＤ８８及び新規６（Ｎ６）共刺激ドメイン（ｉＭｙＤ８８／Ｎ６  ＣＡＲ）の両方を含む誘導性構築物と組み合わせて、共刺激ドメインを欠く抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するようにトランスフェクトしたヒトＴ細胞を用いたセルトレースバイオレット増殖アッセイの結果を示す。トランスフェクトした細胞をセルトレースバイオレットで標識し、ＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞又は操作されたＣＤ１９陽性Ｋ５６２細胞（Ｋ１９細胞）と共培養した。更に、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄの存在下又は非存在下でのＫ１９共培養において細胞を評価した。増殖は、Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットについてフローサイトメトリによって評価した。図２０ＡはＫ１９又はＫ５６２細胞上で培養した細胞のＣＤ４＋サブセットを示す。図２０Ｂはｒｉｍｉｄｕｃｉｄの存在下又は非存在下で、Ｋ１９細胞上で培養した細胞のＣＤ４＋サブセットを示す。図２０ＣはＫ１９又はＫ５６２細胞上で培養した細胞のＣＤ８＋サブセットを示す。図２０Ｄはｒｉｍｉｄｕｃｉｄの存在下又は非存在下で、Ｋ１９細胞上で培養した細胞のＣＤ８＋サブセットを示す。
【００４６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、新規１共刺激ドメインをコードする核酸配列を示す。
【００４７】
配列番号２は、新規３共刺激ドメインをコードする核酸配列を示す。
【００４８】
配列番号３は、新規５共刺激ドメインをコードする核酸配列を示す。
【００４９】
配列番号４は、新規６共刺激ドメインをコードする核酸配列を示す。
【００５０】
配列番号５は、新規１共刺激ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００５１】
配列番号６は、新規３共刺激ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００５２】
配列番号７は、新規５共刺激ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００５３】
配列番号８は、新規６共刺激ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００５４】
配列番号９は、新規共刺激ドメインに見出されるＴＲＡＦ結合モチーフのアミノ酸配列を示す。
【００５５】
配列番号１０は、新規共刺激ドメインに見出されるＴＲＡＦ結合モチーフのアミノ酸配列を示す。
【００５６】
配列番号１１は、新規共刺激ドメインに見出されるＴＲＡＦ結合モチーフのアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号１２は、新規共刺激ドメインに見出されるスペーサ配列のアミノ酸配列を示す。
【００５８】
配列番号１３は、新規共刺激ドメインに見出されるスペーサ配列のアミノ酸配列を示す。
【００５９】
配列番号１４は、新規共刺激ドメインに見出されるスペーサ配列のアミノ酸配列を示す。
【００６０】
配列番号１５は、新規共刺激ドメインに見出されるスペーサ配列のアミノ酸配列を示す。
【００６１】
配列番号１６は、キメラ抗原受容体シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００６２】
配列番号１７は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。
【００６３】
配列番号１８は、キメラ抗原受容体ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域のアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号１９は、ＣＤ３−ζ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００６５】
配列番号２０は、ＣＤ２８共刺激ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００６６】
配列番号２１は、４−１ＢＢ共刺激ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００６７】
配列番号２２は、共刺激ドメインを欠く抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のアミノ酸配列を示す。
【００６８】
配列番号２３は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のアミノ酸配列を示す。
【００６９】
配列番号２４は、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のアミノ酸配列を示す。
【００７０】
配列番号２５は、新規１共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のアミノ酸配列を示す。
【００７１】
配列番号２６は、新規３共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のアミノ酸配列を示す。
【００７２】
配列番号２７は、新規５共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のアミノ酸配列を示す。
【００７３】
配列番号２８は、新規６共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体のアミノ酸配列を示す。
【００７４】
配列番号２９は、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするベクターの核酸配列を示す。
【００７５】
配列番号３０は、新規１共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするベクターの核酸配列を示す。
【００７６】
配列番号３１は、新規６共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするベクターの核酸配列を示す。
【００７７】
配列番号３２は、ＪｅＴプロモータの核酸配列を示す。
【００７８】
配列番号３３は、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列の核酸配列を示す。
【００７９】
配列番号３４は、第１のＳＶ４０ビポリＡシグナル配列の核酸配列を示す。
【００８０】
配列番号３５は、第２のＳＶ４０ビポリＡシグナル配列の核酸配列を示す。
【００８１】
配列番号３６は、４−１ＢＢ共刺激ドメイン及びＳＶ４０ポリＡシグナルを含む７２４１抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物をコードするベクターの核酸配列を示す。
【００８２】
配列番号３７は、新規６共刺激ドメイン及びＳＶ４０ポリＡシグナルを含む７２０５抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物をコードするベクターの核酸配列を示す。
【００８３】
配列番号３８は、新規６共刺激ドメイン及びＳＶ４０ビポリＡシグナルを含む７２０６抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物をコードするベクターの核酸配列を示す。
【００８４】
配列番号３９は、ＭｙＤ８８共刺激ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００８５】
配列番号４０は、ＭｙＤ８８及び新規６共刺激ドメインを含む７２４０抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物をコードするベクターの核酸配列を示す。
【００８６】
配列番号４１は、タンデムリガンド結合ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００８７】
配列番号４２は、第１世代ＣＡＲをコードする７２３５抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物と、ＭｙＤ８８及び新規６共刺激ドメイン並びにタンデムリガンド結合ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインを含む誘導性調節構築物とをコードするベクターの核酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
１．１  参照と定義
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用する発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及びＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列を含む参考文献は、あたかも各々が具体的且つ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【００８９】
本開示は異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。そうではなく、これらの実施形態は、この開示が徹底的且つ完全であり、且つ本開示の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み入れることができ、特定の実施形態に関して例示した特徴をその実施形態から削除することができる。更に、本明細書に示唆された実施形態に対する本開示から逸脱しない多数の変形及び追加が、本開示に照らして当業者には明らかであろう。
【００９０】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の本開示の説明に使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本開示を限定することを意図するものではない。
【００９１】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は、１又は複数を意味し得る。例えば、「ａ」細胞は、単一細胞又は多数の細胞を意味し得る。
【００９３】
本明細書で使用される場合、他に具体的に示されない限り、単語「又は」は、「及び／又は」の包括的な意味で使用され、「いずれか／又は」の排他的な意味では使用されない。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「共刺激ドメイン」とは、活性化の際に細胞内増殖シグナル及び／又は細胞生存シグナルを伝達するポリペプチドドメインを指す。共刺激ドメインの活性化は、２つの共刺激ドメインポリペプチドのホモ二量体化に続いて起こり得る。活性化はまた、例えば、共刺激ドメインを含む構築物（例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節構築物）の活性化後にも起こり得る。一般に、共刺激ドメインは膜貫通共刺激受容体、特に共刺激受容体の細胞内部分から誘導することができる。共刺激ポリペプチドの非限定的な例には、本明細書に記載の共刺激ドメイン、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、及びＣＤ２７が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、抗原又は他のリガンド若しくは分子に対する特異性を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に移植する操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、少なくとも細胞外リガンド結合ドメイン又は部分、並びに１又は複数のシグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分は、特定のエピトープ又は抗原（例えば、がん細胞又は他の疾患を引き起こす細胞又は粒子等の細胞の表面上に優先的に存在するエピトープ又は抗原）に対する特異性を提供するモノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはリンカー配列を介して結合している。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは任意の目的の抗原又はエピトープに特異的である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはヒト化されている。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは自己抗原を含み（Ｐａｙｎｅら（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．３５３（６２９５）：１７９−１８４参照）、これはＢリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され、従って、抗体を介した自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的とし、殺すようにＴ細胞に指示する。そのようなＣＡＲはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ぶことができ、そのようなＣＡＡＲへの本明細書に記載の１以上の共刺激ドメインの組み入れは本開示に包含される。
【００９７】
細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合に続いて活性化シグナルを細胞に伝達する細胞質ドメインである。細胞内シグナル伝達ドメインは、当技術分野において公知の目的の任意の細胞内シグナル伝達ドメインであり得る。そのような細胞質シグナル伝達ドメインは、限定されないが、ＣＤ３ζを含み得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインはまた、細胞外ドメインの結合後に細胞増殖、細胞生存、及び／又はサイトカイン分泌を促進する共刺激シグナルを伝達する、本明細書に記載のもの等の１以上の細胞内共刺激ドメインを含む。そのような細胞内共刺激ドメインは、限定されないが、本明細書に開示される任意の共刺激ドメイン又は当技術分野において公知のドメイン、例えば、ＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＯＸ−４０ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、又はＣＤ２７ドメイン等を含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ヒンジ又は接合配列を介して細胞外リガンド結合ドメインに結合している膜貫通ドメインを含む追加の構造要素を更に含む。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「誘導性調節構築物」とは、細胞増殖、細胞生存、及び／又はサイトカイン分泌を促進するための誘導性共刺激シグナルを提供する、細胞内で発現される膜貫通又は細胞内構築物を指す。そのような構築物は、活性化の際に共刺激シグナルを提供する、本明細書に記載されるもの及び／又は当該分野で公知の他のもの等の１以上の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナルは、例えば、２つの誘導性調節構築物ポリペプチドのホモ二量体化によって誘導される。誘導性調節構築物は、一般に、小分子、抗体、又は２つの構築物ポリペプチドのホモ二量体化を可能にする他の分子の結合後にホモ二量体化を可能にする結合ドメインを含む。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル」とは、インビトロ及び／又はインビボで細胞増殖、細胞集団の拡大を促進し、細胞生存を促進し、サイトカインの分泌を調節（例えば上方制御又は下方制御）し、及び／又は他の免疫調節分子の産生及び／又は分泌を調節する、共刺激ドメインによって誘導される細胞内シグナルを指す。いくつかの実施形態では、共刺激シグナルは、２つの共刺激ドメインポリペプチドのホモ二量体化に続いて誘導される。いくつかの実施形態では、共刺激シグナルは、共刺激ドメインを含む構築物（例えば、キメラ抗原受容体又は誘導性調節構築物）の活性化後に誘導される。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、用語「活性化」とは、検出可能なエフェクター機能を誘導するために十分に刺激された細胞（例えば、Ｔ細胞）の状態を指す。いくつかの実施形態では、活性化は、誘導されたサイトカイン産生及び／又は誘導された細胞の増殖及び拡大と関連している。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「抗腫瘍活性」又は「抗腫瘍効果」とは、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、又はがん性状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって明示され得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、第一に腫瘍の発生の予防における本開示の遺伝子改変細胞の能力によって明らかにされ得る。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、タンパク質に関して、用語「操作された」又は「組換え」は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物への遺伝子工学技術の適用の結果として変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、用語「操作された」又は「組換え」は、遺伝子工学的技術の適用の結果として変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術には、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、形質転換及び他の遺伝子移入技術、相同組換え、部位特異的変異誘発、並びに遺伝子融合が含まれるがこれらに限定されない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主におけるクローニング及び発現によって産生されるタンパク質は、組換え体とは見なされない。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「野生型」とは、所与の表現型に関与する最も一般的な天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を指す。野生型の対立遺伝子又はポリペプチドは生物に正常な表現型を付与することができるが、変種又は変異体の対立遺伝子又はポリペプチドは場合によっては変化した表現型を付与することができる。
【０１０５】
組換えタンパク質に関して本明細書で使用される場合、用語「改変」は、参照配列（例えば、野生型又は天然の配列）に対する組換え配列中のアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、又は置換を意味する。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「相同組換え」又は「ＨＲ」は、ドナー鋳型として相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６参照）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性染色体又はエピソーム配列又は外因性核酸であり得る。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」は、二本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ  １１：１９５８−１９７６参照）。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「減少した」とは、疾患の症状又は重症度の任意の減少、又はがん性細胞の増殖又は数の任意の減少を指す。いずれの場合も、そのような減少は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は最大１００％であり得る。従って、用語「減少した」は、病状の部分的減少及び完全な減少の両方を包含する。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「増加する」とは、本明細書に開示の共刺激ドメイン、又はその活性断片若しくは変異体を含むように遺伝子改変された細胞の活性化、増殖、又はサイトカインシグナル伝達の任意の増加を指す。そのような増加は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は最大１００％以上であり得る。細胞の活性化、増殖、又はサイトカインシグナル伝達の増加を測定するために任意の方法を使用することができる。例えば、活性化及び／又はサイトカイン発現の増加は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、又は細胞の活性化及び／又は増殖における変化を決定するために使用され得る任意の他のサイトカインのいずれか１つの発現の増加を包含することができる。いくつかの実施形態では、増殖の増加は細胞数又は細胞分裂の増加を包含し、細胞集団の拡大を含む。
【０１１０】
アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、用語「同一性パーセント」、「配列同一性」、「類似性パーセント」、「配列類似性」等は、整列したアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似性を最大にし、且つ同一又は類似の残基又はヌクレオチドの数、全残基又はヌクレオチドの数、並びに配列アラインメントにおけるギャップの存在及び長さの関数である配列アラインメントに基づく、２つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するための様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴｐプログラム及び核酸配列についてのＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方とも国立バイオテクノロジー情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して入手可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎら（１９９６）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１〜１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３  ８９−３４０２）；Ｚｈａｎｇら（２０００）、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ７（１−２）：２０３−１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムのパラメータ、即ち語長＝３、ギャップオープニングペナルティ＝−１１、ギャップエクステンションペナルティ＝−１、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に基づくスコアである。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムのパラメータ、即ち語長＝１１、ギャップオープニングペナルティ＝−５、ギャップエクステンションペナルティ＝−２、マッチリワード＝１、ミスマッチペナルティ＝−３に基づくスコアである。
【０１１１】
２つのタンパク質又はアミノ酸配列の修飾に関して本明細書で使用される場合、用語「対応する」は、第１のタンパク質における特定の修飾が第２のタンパク質における修飾におけるのと同じアミノ酸残基の置換であることを示し、また２つのタンパク質が（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）標準的な配列アラインメントを受けた場合に、第１のタンパク質中の修飾のアミノ酸位置が、第２のタンパク質中の修飾のアミノ酸位置に対応するか又は整列することを示すために使用される。従って、配列のアラインメントにおいて残基Ｘ及びＹが互いに対応する場合、ＸとＹは異なる数であるかもしれないという事実にもかかわらず、第１のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｘ」の修飾は、第２のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｙ」の修飾に対応する。
【０１１２】
用語「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」は、本明細書では互換的に用いられ、直鎖状又は環状核酸分子である。組換え構築物は、制限なく調節及びコード配列を含む核酸分子の人工の又は天然に存在しない組み合わせを含む。組換え構築物は全体として天然には存在しないが、構築物の一部は天然に見出され得る。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列及びコード配列を含み得る。そのような構築物はそれ自体で使用されてもよく、又はベクターと共に使用されてもよい。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、所与の宿主細胞においてポリペプチドコード配列の転写及び翻訳が可能である複製系及び配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように宿主細胞を形質転換するために使用されるであろう方法に依存する。ベクターは、プラスミドベクター及び組換えレンチウイルス若しくは組換えＡＡＶベクター、又は本開示の共刺激ドメインをコードする遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当該分野で公知の任意の他のベクターを含み得るが、これらに限定されない。当業者は、本開示の任意の単離されたヌクレオチド又は核酸配列を含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択、及び増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝要素をよく知っている。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「ベクター」はまたウイルスベクターを指すことができる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含み得るが、これらに限定されない。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、２つ以上の要素間の機能的連結を意味することを意図する。例えば、本明細書に開示されるようなヌクレアーゼをコードする核酸配列と調節配列（例えば、プロモータ）との間の作動可能な連結は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結された要素は、連続的又は非連続的であり得る。２つのタンパク質コード領域の結合を指すために使用される場合、作動可能に連結されているとは、コード領域が同じ読み枠内にあることを意図する。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」又は「ヌクレオフェクトされた」とは、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、又は形質導入されたものである。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「ヒトＴ細胞」又は「Ｔ細胞」とは、ヒトドナーから単離されたＴ細胞を指す。ヒトＴ細胞、及びそれに由来する細胞には、培養で継代されていない単離されたＴ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代され維持されたＴ細胞、及び不死化され無期限に細胞培養下で維持することができるＴ細胞が含まれる。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「ヒトナチュラルキラー細胞」又は「ヒトＮＫ細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」又は「ＮＫ細胞」とは、先天性免疫系にとって重要な細胞傷害性リンパ球の一種を指す。ＮＫ細胞が果たす役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞の役割と類似している。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞に対して迅速な反応を示し、腫瘍形成に反応し、感染後約３日で作用する。ヒトＮＫ細胞、及びそれに由来する細胞には、培養で継代されていない単離されたＮＫ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代され維持されたＮＫ細胞、及び不死化され無期限に細胞培養下で維持することができるＮＫ細胞が含まれる。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「対照」又は「対照細胞」とは、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、即ち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝子変異のための出発材料と同じ遺伝子型の細胞、（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物（即ち、対象となる形質に既知の効果を及ぼさない構築物）で形質転換されている細胞、あるいは（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型又は表現型の発現を誘導するであろう条件、刺激、又は更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含み得る。
【０１２０】
用語「有効量」又は「治療有効量」は、有益な又は望ましい生物学的及び／又は臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。量は、治療用（例えば、遺伝子改変細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞）製剤又は組成物、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重、体調、及び応答性に応じて変わるであろう。特定の実施形態では、本明細書に開示の共刺激ドメイン又は本明細書に開示の医薬組成物を含む細胞の有効量は、少なくとも１つの症状又は疾患の進行を軽減する。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」又は「治療」は、対象が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの徴候又は症状の頻度又は重症度を軽減することを意味する。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「がん」は、異常な細胞成長を特徴とする（浸潤性又は転移性か否かを問わず）あらゆる新生物性疾患を包含するものと理解されるべきである。侵襲性又は転移性のがんは、体の他の部分に広がる可能性がある。制御されていない細胞分裂を伴うがんは、悪性腫瘍又は腫瘍を引き起こす可能性があるが、ゆっくり分裂する細胞を有するがんは、良性腫瘍又は腫瘍を引き起こす可能性がある。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、用語「癌腫」は、上皮細胞で構成される悪性腫瘍を指す。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「白血病」とは、造血器官／造血系の悪性腫瘍を指し、一般に、血液及び骨髄における白血球並びにそれらの前駆体の異常な増殖及び発達を特徴とする。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、用語「肉腫」とは、胚結合組織のような物質から構成され、一般に、原線維物質、不均一物質、又は均一物質に埋め込まれた密集した細胞で構成される腫瘍を指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、用語「黒色腫」は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を指す。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、用語「リンパ腫」とは、リンパ球から発生する一群の血球腫瘍を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「芽細胞腫」は、前駆細胞又は芽細胞（未成熟組織又は胚組織）の悪性腫瘍によって引き起こされる癌の一種を指す。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、用語「メガヌクレアーゼ」とは、１２塩基対よりも大きい認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩに由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えばＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、又は二量体化特性に関して、天然のＩ−ＣｒｅＩに対して改変されているＩ−ＣｒｅＩの操作された変異体を指すことができる。そのような改変されたＩ−ＣｒｅＩの変異体を作製する方法は、当技術分野において公知である（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを用いて単一のポリペプチドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、細胞、特にヒトＴ細胞において発現された場合に実質的に無毒であり、そのため本明細書に記載の方法を使用して測定した場合に細胞生存率に対する有害な影響又はメガヌクレアーゼ切断活性の有意な減少を観察することなく細胞にトランスフェクトして３７℃で維持することができる。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「単鎖メガヌクレアーゼ」は、リンカーによって結合された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖メガヌクレアーゼはＮ末端サブユニット−リンカー−Ｃ末端サブユニットの構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般にアミノ酸配列において同一ではなく、同一でないＤＮＡ配列を認識するであろう。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似パリンドローム認識配列又は非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、用語「メガヌクレアーゼ」は、二量体又は単鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」とは、２つのメガヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに結合させるために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見出される配列を有してもよく、又はいかなる天然タンパク質にも見出されない人工的な配列であってもよい。リンカーは柔軟で二次構造を欠いていてもよく、又は生理学的条件下で特定の３次元構造を形成する傾向を有してもよい。リンカーは、米国特許第８，４４５，２５１号及び第９，４３４，９３１号に包含されるもののいずれかを含むが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ」とは、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮアーゼＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質を指す。ジンクフィンガーヌクレアーゼの設計に有用なヌクレアーゼドメインには、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、ＳｔｓＩ制限酵素を含むがこれらに限定されない、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ由来のものが含まれる。追加のＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは、国際公開第２００７／０１４２７５号に記載されており、これはその全体が参照により組み入れられる。ジンクフィンガードメインの構造は、亜鉛イオンの配位によって安定化される。１以上のジンクフィンガードメインを含むＤＮＡ結合タンパク質は、配列特異的にＤＮＡと結合する。ジンクフィンガードメインは、天然配列であり得るか、又は約１８塩基対の長さの所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生するために合理的又は実験的手段を通して再設計され得る。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，２００，７５９号、及び国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、及び国際公開第０２／０９９０８４号（これらは各々その全体が参考として組み入れられる）を参照されたい。この操作されたタンパク質ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼ等のヌクレアーゼドメインに融合することによって、ゲノムレベルの特異性でＤＮＡ切断を標的化することが可能である。標的部位の選択、ジンクフィンガータンパク質、及びジンクフィンガーヌクレアーゼの設計及び構築のための方法は当業者に公知であり、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、第２００５０２０８４８９号、第２００５０６４４７４号、第２００５００２６１５７号、第２００６０１８８９８７号、及び国際公開第０７／０１４２７５号に詳細に記載されており、これらは各々その全体が参照により組み入れられる。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、用語「ＴＡＬＥＮ」とは、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮアーゼＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、及び酵母ＨＯエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメイン又はその活性部分に融合した複数のＴＡＬドメイン反復を含むＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。例えば、その全体が参考として組み入れられる、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１８６：７５７−７６１を参照されたい。ＴＡＬＥＮの設計に有用なヌクレアーゼドメインには、ＦｏｋＩ、ＦｏＭ、ＳｔｓＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、及びＡｌｗＩを含むがこれらに限定されない、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ由来のものが含まれるがこれらに限定されない。更なるＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは国際公開第２００７／０１４２７５号に記載されている。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン又はその活性部分である。ＴＡＬドメイン反復は、キサントモナス属の植物病原体による感染過程で使用されるタンパク質のＴＡＬＥ（転写活性化剤様エフェクター）ファミリーに由来し得る。ＴＡＬドメイン反復は、異なる１２位及び１３位のアミノ酸を有する３３〜３４アミノ酸配列である。反復可変ジペプチド（ＲＶＤ）と呼ばれるこれらの２つの位置は高度に可変的であり、特異的ヌクレオチド認識と強い相関を示す。ＤＮＡ標的配列中の各塩基対は単一のＴＡＬ反復により接触し、その特異性はＲＶＤから生じる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは１６〜２２個のＴＡＬドメイン反復を含む。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断は、非特異的中央領域に隣接する２つのＤＮＡ認識領域（即ち「スペーサ」）を必要とする。ＴＡＬＥＮに関して用語「スペーサ」は、ＴＡＬＥＮを構成する各モノマーによって認識され結合される２つの核酸配列を分離する核酸配列を指す。ＴＡＬドメイン反復は、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質由来の天然配列であり得るか、又は所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産生するために合理的又は実験的手段を通して再設計され得る（例えば、Ｂｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０９−１５１２及びＭｏｓｃｏｕ及びＢｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０１（各々その全体が参考として組み入れられる）を参照）。ＲＶＤ及びそれらの対応する標的ヌクレオチドの特定の配列及び例を認識するためにＴＡＬＥＮを操作するための方法については、米国特許出願公開第２０１１０１４５９４０号及び国際公開第２０１０／０７９４３０号も参照されたい。いくつかの実施形態では、各ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）モノマーは、異なるＤＮＡ配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合することができ、２つの認識部位がごく接近している場合にのみ、不活性モノマーが一緒になって機能的酵素を作り出す。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語「コンパクトＴＡＬＥＮ」は、Ｉ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼ又は米国特許出願第２０１３０１１７８６９号（その全体が参考として組み入れられる）の表２に挙げられているいずれかのエンドヌクレアーゼの任意の部分に任意の方向で融合された１以上のＴＡＬドメイン反復を有するＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指し、ＭｍｅＩ、ＥｎｄＡ、Ｅｎｄ１、Ｉ−ＢａｓＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＴｗｏＩ、ＭｓｐＩ、ＭｖａＩ、ＮｕｃＡ、及びＮｕｃＭを含むがこれらに限定されない。コンパクトＴＡＬＥＮは、ＤＮＡプロセシング活性のために二量体化を必要とせず、介在するＤＮＡスペーサを有する二重標的部位の必要性を軽減する。いくつかの実施形態では、コンパクトＴＡＬＥＮは１６〜２２個のＴＡＬドメイン反復を含む。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、Ｃａｓ９等のカスパーゼ、及びゲノムＤＮＡ内の認識部位にハイブリダイズすることによってカスパーゼのＤＮＡ切断を指示するガイドＲＮＡを含むカスパーゼベースのエンドヌクレアーゼを指す。ＣＲＩＳＰＲのカスパーゼ成分はＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。特定の実施形態では、カスパーゼはクラスＩＩ  Ｃａｓ酵素である。これらの実施形態のいくつかにおいて、カスパーゼはクラスＩＩ、タイプＩＩ酵素、例えばＣａｓ９である。他の実施形態では、カスパーゼは、クラスＩＩ、タイプＶ酵素、例えばＣｐｆ１である。ガイドＲＮＡは、標的認識部位に相補的である直接反復及びガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではしばしばスペーサと呼ばれる）を含む。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲは、ガイドＲＮＡ上に存在する直接反復配列（時にはｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列と呼ばれる）に対して（完全に又は部分的に）相補的なｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を更に含む。特定の実施形態では、カスパーゼは、ニッカーゼとして機能し標的ＤＮＡの一本鎖のみを切断する標的ポリヌクレオチドの一本鎖を切断する能力を酵素が欠くように、対応する野生型酵素に関して変異させることができる。ニッカーゼとして機能するカスパーゼ酵素の非限定的な例には、ＲｕｖＣｌ触媒ドメイン内にＤ１０Ａ突然変異を有するか、又はＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、若しくはＮ８６３Ａ突然変異を有するＣａｓ９酵素が含まれる。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、用語「ｍｅｇａＴＡＬ」は、操作された配列特異的ホーミングエンドヌクレアーゼと共に転写活性化剤様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む一本鎖ヌクレアーゼを指す。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、用語「認識配列」とは、エンドヌクレアーゼによって結合及び切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離されている一対の反転した９塩基対の「半部位」を含む。一本鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１の半部位と接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２の半部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４つの塩基対３’「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって作製することができる短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ−ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼ及び単鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは２２塩基対認識配列の１０〜１３塩基を含む。コンパクトＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ−ＴｅｖＩドメインによって認識される第１のＣＮＮＮＧＮ配列、それに続く長さが４〜１６塩基対の非特異的スペーサ、及びそれに続く、ＴＡＬ−エフェクタードメインによって認識される（この配列は典型的には５’Ｔ塩基を有する）長さが１６〜２２ｂｐの第２の配列を含むことができる。コンパクトＴＡＬＥＮによる切断は、２つの塩基対３’オーバーハングを生じる。ＣＲＩＳＰＲの場合、認識配列は、ガイドＲＮＡが直接Ｃａｓ９切断に結合する配列、典型的には１６〜２４塩基対である。ガイド配列と認識配列との間の完全な相補性は、切断をもたらすために必ずしも必要ではない。ＣＲＩＳＰＲによる切断は、カスパーゼに応じて、平滑末端（クラスＩＩ、タイプＩＩカスパーゼによる等）又は突出末端（クラスＩＩ、タイプＶカスパーゼによる等）を生じ得る。ＣｐｆＩカスパーゼを利用する実施形態において、ＣｐｆＩカスパーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体による切断は、５’オーバーハングをもたらし、特定の実施形態では５ヌクレオチドの５’オーバーハングをもたらす。各カスパーゼ酵素はまた、ガイドＲＮＡに相補的な認識配列に近いＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列の認識を必要とする。正確な配列、ＰＡＭに必要な長さ、及び標的配列からの距離はカスパーゼ酵素によって異なるが、ＰＡＭは典型的には標的／認識配列に隣接する２〜５塩基対の配列である。特定のカスパーゼ酵素のＰＡＭ配列は当技術分野において公知であり（例えば、各々参照によりその全体が組み入れられる、米国特許第８，６９７，３５９号及び米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号を参照）、新規又は操作されたカスパーゼ酵素のＰＡＭ配列は、ＰＡＭ枯渇アッセイ（例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Ｋａｒｖｅｌｉｓら（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ１２１−１２２：３−８を参照）等の当技術分野において公知の方法を用いて同定することができる。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、用語「標的部位」又は「標的配列」とは、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子」又は「ＴＣＲアルファ遺伝子」は交換可能であり、Ｔ細胞受容体αサブユニットをコードするＴ細胞中の遺伝子座を指す。Ｔ細胞受容体アルファは、再構成の前又は後に、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号６９５５を指すことができる。再構成後、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子は、内因性プロモータ、再構成されたＶ及びＪセグメント、内因性スプライス供与部位、イントロン、内因性スプライス受容部位、並びにサブユニットコーディングエクソンを含むＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座を含む。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子」とは、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子のコード配列を指す。Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子には、ＮＣＢＩ  遺伝子ＩＤ番号２８７５５によって同定される野生型配列及びその機能的変異体が含まれる。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、変数についての数値範囲の列挙は、本開示がその範囲内の値のうちのいずれかに等しい変数で実施され得ることを伝えることを意図している。従って、本質的に離散的な変数については、その変数は、その範囲の端点を含む、数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数については、その変数は、その範囲の端点を含む、その数値範囲内の任意の実数値に等しくなり得る。限定ではなく例として、０から２の間の値を有すると記載された変数は、その変数が本質的に離散的である場合には０、１、又は２の値を取り得、その変数が本質的に連続的である場合には０．０、０．１、０．０１、０．００１の値又は０以上２以下の任意の他の実数値を取り得る。
【０１４２】
２．１  発明の原理
本開示は、部分的には、操作された共刺激ドメインが従来の共刺激ドメインと比較して同等又は優れた活性を示すことができるという発見に基づいている。特定の例において、本明細書に開示の共刺激ドメインは、抗原誘導活性化後の細胞増殖及び／又はサイトカイン分泌に関して同等又は優れた共刺激活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される共刺激ドメインのうちの１つをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、例えばキメラ抗原受容体又は誘導性調節構築物等の構築物の一部として遺伝子改変細胞中で発現される。従って、本明細書に開示の新規共刺激ドメインを含む細胞及び新規共刺激ドメインを含む細胞を作成する方法が提供される。更に本明細書では、疾患の症状又は重症度を軽減するために本明細書に開示の共刺激ドメインを含む遺伝子改変細胞を投与する方法が開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の共刺激ドメインを含む遺伝子改変細胞の投与は、がん、自己免疫障害、及び本開示の遺伝子改変細胞によって標的とされ得る他の状態等の疾患の症状又は重症度を軽減する。本明細書では、本明細書に開示の遺伝子改変細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてがんを治療するための免疫療法の方法も開示される。
【０１４３】
２．２  共刺激ドメインをコードする核酸分子
本明細書では、新規共刺激ドメインをコードする核酸分子、及び共刺激活性を有するその変異体（即ち、活性変異体）が提供される。個々のドメインの共刺激活性は、免疫細胞等の細胞の活性化、増殖、及びサイトカイン分泌を測定する当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定することができる。そのような方法の一例は、Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１７６（１９９２）、１５９５−６０４に開示されているものである。更なる例には、細胞増殖及びサイトカイン分泌を測定するための本明細書に記載の方法が含まれる。
【０１４４】
従って、配列番号５〜８に記載の共刺激ドメインをコードする核酸配列を含む核酸分子及びその活性変異体が提供される。具体的には、配列番号１に記載の核酸配列は、本明細書で新規１ドメインと呼ぶ配列番号５の共刺激ドメインをコードする。配列番号２に記載の核酸配列は、本明細書で新規３ドメインと呼ぶ配列番号６の共刺激ドメインをコードする。配列番号３に記載の核酸配列は、本明細書で新規５ドメインと呼ぶ配列番号７の共刺激ドメインをコードする。配列番号４に記載の核酸配列は、本明細書で新規６ドメインと呼ぶ配列番号８の共刺激ドメインをコードする。
【０１４５】
本明細書には、本明細書に開示の共刺激ドメインをコードする核酸配列の活性変異体も提供され、変異体核酸配列は共刺激活性を有するドメインをコードする。共刺激活性を保持する、本明細書に開示の共刺激ドメインの変異体が更に提供される。本明細書で使用される場合、「変異体」は実質的に類似の配列を意味することを意図している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１以上の内部部位における１以上のアミノ酸の欠失及び／又は付加によって、及び／又は天然ポリペプチドの１以上の部位における１以上のアミノ酸の置換によって、「天然」ポリペプチドから誘導されるポリペプチドを意味することを意図する。同様に、「変異体」ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチド配列中の１以上の部位における１以上の核酸の欠失及び／又は付加によって「天然」ポリヌクレオチドから誘導されるポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。特定の実施形態では、共刺激ドメインをコードする変異体ポリヌクレオチドの親核酸配列は配列番号１〜４を含む。同様に、いくつかの実施形態では、新規共刺激ドメインをコードする変異体ポリペプチドの親ポリペプチド配列は配列番号５〜８を含む。
【０１４６】
実施形態に包含される変異体ポリペプチドは生物学的に活性である。即ち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性、即ち、共刺激活性を保有し続けている。そのような変異体は、例えば、ヒトによる操作から生じ得る。実施形態の天然共刺激ドメインの生物学的に活性な変異体（例えば、配列番号５〜８）、又は本明細書に開示の共刺激ドメインをコードする天然核酸配列の変異体（例えば、配列番号１〜４）は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータにより決定されるように、天然ポリペプチドのアミノ酸配列又は天然ポリヌクレオチドの核酸配列に対して少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有するであろう。実施形態の共刺激ドメインの生物学的に活性な変異体は、そのような共刺激ドメインと、わずか約１〜２０個のアミノ酸残基、わずか約１〜１０個、わずか約１〜５個、わずか約４個、わずか３個、２個、又は更には１個のアミノ酸残基で異なり得る。
【０１４７】
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法で変化させることができる。そのような操作の方法は当該分野で一般的に知られている。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発及びポリヌクレオチド改変の方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ及びＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク州）及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができ、これは参照により本明細書に組み入れられる。アミノ酸を類似の特性を有するものと交換する等の保存的置換が最適であり得る。
【０１４８】
文脈に応じて、「断片」とは、ポリペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列の一部、又はポリペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列の一部をコードするポリヌクレオチドを指す。断片は元のタンパク質の活性を保持することができ、従って、そのような「活性」断片は、例えば、共刺激活性を保持する配列番号５〜８のいずれか１つの断片等の共刺激ドメインの断片を含む。配列番号１〜４のいずれか１つの断片等の共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列の断片は、生物学的に活性なタンパク質断片をコードし得る。生物学的に活性なヌクレオチド断片は、共刺激ドメインをコードする核酸配列の一部を単離し、共刺激ドメインのコードされた部分を発現させ、共刺激ドメインのコードされた部分の活性を評価することによって調製できる。共刺激ドメインの断片は、配列番号５〜８の断片を含む。共刺激ドメインの断片は、少なくとも約１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、又は４２のアミノ酸を含む。
【０１４９】
特定の実施形態において、本明細書に開示される共刺激ドメインの変異体又は断片は、本明細書においてＴＲＡＦモチーフと呼ぶ少なくとも１つのＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）結合モチーフを含む。本明細書に提供されるＴＲＡＦモチーフの例には、ＱＭＥＤ（配列番号９）、ＱＥＥＤ（配列番号１０）、及びＥＥＥＧ（配列番号１１）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の共刺激ドメインの活性変異体又は断片は、配列番号９及び１１又は配列番号１０及び１１を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメイン又はその変異体若しくは断片は、スペーサ領域によって分離された２つのＴＲＡＦモチーフを含む。本明細書で使用される場合、用語「スペーサ領域」とは、共刺激ドメインの２つの予測ＴＲＡＦモチーフの間の領域を指す。特定の実施形態では、スペーサ領域は、アミノ酸配列ＡＳＳＣＲＣＰＱ（配列番号１２）、ＡＳＳＣＲＦＰＥ（配列番号１３）、ＡＳＳＣＲＦＰＱ（配列番号１４）、及びＡＳＳＣＲＡＰＳ（配列番号１５）のうちの１つを含む。特定の活性変異体共刺激ドメインにおいて、配列番号１２のスペーサ領域は、配列番号９と配列番号１１のＴＲＡＦ結合モチーフの間に位置する。他の活性変異体共刺激ドメインにおいて、配列番号１３のスペーサ領域は、配列番号１０と配列番号１１のＴＲＡＦ結合モチーフの間に位置する。いくつかの活性変異体共刺激ドメインにおいて、配列番号１４のスペーサ領域は、配列番号１０と配列番号１１のＴＲＡＦ結合モチーフの間に位置する。他の活性変異体共刺激ドメインにおいて、配列番号１５のスペーサ領域は、配列番号１０と配列番号１１のＴＲＡＦ結合モチーフの間に位置する。あるいは、スペーサ領域は、変異体ドメインの共刺激活性を維持する任意の配列であり得る。
【０１５１】
特定の実施形態では、発現カセット又は発現構築物は、細胞内で、本明細書に開示の少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体を発現させるために提供される。いくつかの実施形態において、カセットは、新規共刺激ドメイン又はその活性変異体をコードする本明細書に提供される核酸分子に作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含む。「作動可能に連結された」とは、２以上の要素間の機能的連結を意味することを意図している。例えば、本明細書に開示の共刺激ドメインをコードする核酸配列と調節配列（例えば、プロモータ）との間の作動可能な連結は、共刺激ドメインをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結された要素は、連続的又は非連続的であり得る。２つのタンパク質コード領域の結合を指すために使用される場合、作動可能に連結されているとは、コード領域が同じ読み枠内にあることを意図する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、カセットは更に、細胞に同時形質転換される少なくとも１つのさらなる遺伝子を含む。更なる実施形態では、更なる遺伝子は複数の発現カセット上に提供される。いくつかの実施形態では、そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下にあるように組換えポリヌクレオチドを挿入するための複数の制限部位及び／又は組換え部位を備える。いくつかの実施形態では、発現カセットは選択マーカー遺伝子を更に含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、発現カセットは、転写の５’〜３’方向に、転写及び翻訳開始領域（即ち、プロモータ）、本明細書で開示されるような共刺激ドメインをコードする核酸配列又はその活性変異体、並びに本開示の遺伝子改変細胞において機能的な転写及び翻訳終止領域（即ち、終止領域）を含む。本明細書で提供される調節領域（即ち、プロモータ、転写調節領域、及び翻訳終止領域）及び／又は核酸分子は、天然であるか、宿主細胞に対して又は互いに類似していてもよい。あるいは、本明細書に提供される調節領域及び／又は核酸分子は、宿主細胞に対して又は互いに異種であってもよい。本明細書で使用される場合、配列に関して「異種」とは、外来種に由来するか、又は同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座においてその天然型から実質的に改変されている配列である。例えば、異種核酸分子に作動可能に連結されたプロモータは、その核酸分子が由来した種とは異なる種に由来するか、又は同じ／類似の種に由来する場合、一方又は両方がその元の形態及び／又はゲノム遺伝子座から実質的に改変されているか、あるいはそのプロモータは作動可能に連結された核酸分子に対する天然のプロモータではない。あるいは、本明細書に提供される調節領域及び／又は核酸分子は完全に合成的であってもよい。
【０１５４】
終止領域は、転写開始領域に対して天然であり得るか、作動可能に連結された核酸分子に対して天然であり得るか、細胞宿主に対して天然であり得るか、又はプロモータ、核酸分子、細胞宿主、若しくはそれらの任意の組み合わせに対して別の供給源（即ち外来又は異種）に由来し得る。発現カセットを調製する際に、ＤＮＡ配列を適切な向きにするために、様々なＤＮＡ断片を操作することができる。この目的のために、アダプター又はリンカーを使用してＤＮＡ断片を結合させることができ、あるいは他の操作を用いて都合のよい制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去等を提供することができる。この目的のために、インビトロでの突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば遷移及びトランスバージョンが関与し得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される発現カセットにおいていくつかのプロモータが使用される。適切なプロモータの一例は前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモータ配列である。適切なプロモータの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタインバーウイルス前初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、並びに、例えば、限定されるものではないがアクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、及びクレアチンキナーゼプロモータ等のヒト遺伝子プロモータを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモータ配列も使用され得る。更に、本開示は構成的プロモータの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモータも本開示の一部として企図される。誘導性プロモータの使用は、作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をそのような発現が望まれるときにオンにすることができる、又は発現が望まれないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモータの例には、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリンプロモータが含まれるがこれらに限定されない。合成プロモータ、例えば、ＪｅＴプロモータも本開示の一部として企図されている（国際公開第２００２／０１２５１４号参照）。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、プロモータは所望の結果に基づいて選択される。本明細書に開示されるポリヌクレオチドの発現のタイミング、位置及び／又はレベルを調節するために発現カセット中に異なるプロモータを使用することによって、異なる用途が増強され得ることが認識される。そのような発現構築物はまた、所望であれば、プロモータ調節領域（例えば、誘導的、構成的、環境的に、若しくは発生的に調節される、又は細胞若しくは組織特異的／選択的発現を付与するもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終止部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。
【０１５７】
共刺激ドメイン又は共刺激ドメインを含むＣＡＲポリペプチドの発現を評価するために、発現カセットはまた、選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子、又はその両方を含み、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させることを目的とした細胞の集団から発現細胞を同定及び選択することを容易にすることができる。他の態様では、選択マーカーは別のＤＮＡ片上に担持され、同時トランスフェクション手順において使用され得る。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にするために適切な調節配列と隣接し得る。有用な選択マーカーには、例えば、抗生物質耐性遺伝子及び蛍光マーカー遺伝子が含まれる。
【０１５８】
特定の実施形態では、本明細書に開示の少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体を含むＣＡＲをコードする核酸分子を含む発現カセットが提供される。本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ発現カセット」とは、ＣＡＲをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む発現カセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現カセットは、共刺激ドメインを含まないＣＡＲをコードする。ＣＡＲ発現カセットはまた、本明細書に開示の共刺激ドメインを含むＣＡＲをコードし得るか、又は本明細書に開示されない共刺激ドメインを含むＣＡＲをコードし得る。例えば、いくつかの実施形態では、発現カセットは、本明細書に開示されるように、細胞外リガンド結合ドメイン及び共刺激ドメインを含む細胞内刺激ドメイン、又はその活性変異体をコードする１つ以上の配列を含む。特定の実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、例えばＢ細胞リンパ腫に特異的な抗原等、がん細胞の抗原に特異的である。
【０１５９】
特定の実施形態では、発現カセットは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、新規１共刺激ドメイン（配列番号５）又はその活性変異体、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする。他の実施形態では、発現カセットは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、新規３共刺激ドメイン（配列番号６）又はその活性変異体、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする。他の実施形態では、発現カセットは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、新規５共刺激ドメイン（配列番号７）又はその活性変異体、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする。他の実施形態では、発現カセットは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、新規６共刺激ドメイン（配列番号８）又はその活性変異体、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする。これらの発現カセットは、任意の適切な疾患特異的抗原又は分子に対する特異性を有するように操作することができると考えられる。
【０１６０】
他の特定の実施形態では、本明細書に開示の少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体を含む誘導性調節構築物をコードする核酸分子を含む発現カセットが提供される。本明細書で使用される場合、「調節発現カセット」とは、誘導性調節構築物をコードする核酸分子を含む発現カセットを指す。発現カセットは、ＣＡＲ発現カセット及び調節発現カセットの両方であり得る。いくつかの実施形態では、単一の発現カセットは、配列番号５〜８のいずれか１つの共刺激ドメイン又はその活性断片若しくは変異体、及び本明細書に記載の誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列を含まないＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１６１】
例えば、いくつかの実施形態では、発現カセットは、本明細書に開示されるように、結合ドメイン及び少なくとも１つの共刺激ドメイン、又はその活性変異体をコードする配列を含み、小分子、抗体、又は他の分子は結合ドメインに結合して２つの誘導性調節構築物の二量体化を誘導する。いくつかの実施形態では、そのような二量体化は細胞への共刺激シグナルを開始して、増殖、生存、及び／又はサイトカイン分泌を促進する。結合ドメインが小分子に結合することができるいくつかの実施形態では、結合ドメインはＦＫＢＰ１２の類似体（例えば、Ｆ３６Ｖ置換を含む）を含み、小分子はｒｉｍｉｄｕｃｉｄ（即ち、ＡＰ１９０３）である。ＣＡＲ−Ｔ細胞安全スイッチ等、そのような誘導性調節構築物において有用であることが当技術分野において公知である任意の結合ドメインが本開示において企図される。
【０１６２】
特定の実施形態では、発現カセットは、結合ドメイン及び新規１共刺激ドメイン（配列番号５）又はその活性変異体を含む誘導性調節構築物をコードする。他の実施形態では、発現カセットは、結合ドメイン及び新規１３共刺激ドメイン（配列番号６）又はその活性変異体を含む誘導性調節構築物をコードする。他の実施形態では、発現カセットは、結合ドメイン及び新規５共刺激ドメイン（配列番号７）又はその活性変異体を含む誘導性調節構築物をコードする。他の実施形態では、発現カセットは、結合ドメイン及び新規６共刺激ドメイン（配列番号８）又はその活性変異体を含む誘導性調節構築物をコードする。
【０１６３】
本明細書には、本開示の新規共刺激ドメインをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に開示されているような新規共刺激ドメイン又は発現カセットをコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の共刺激ドメインをコードする核酸は、いくつかの種類のベクターにクローニングされる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされる。特に関係のあるベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターを含む。
【０１６４】
特定の実施形態では、共刺激ドメインをコードする核酸分子は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルスベクター上に提供される。ウイルスベクター技術は当該分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるがこれらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモータ配列、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１又は複数の選択マーカーを含む（例えば、国際公開第０１／９６５８４号、国際公開第０１／２９０５８号、及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０１６５】
２．３  キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と誘導性調節構築物
本明細書では、細胞表面キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞が提供される。一般に、本開示のＣＡＲは少なくとも細胞外ドメインと細胞内ドメインとを含むであろう。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン又は部分とも呼ばれる標的特異的結合要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメイン、又は細胞質ドメインは、本明細書に開示されているように、少なくとも１つの共刺激ドメイン又はその活性変異体、及び例えばＣＤ３ζ等の１以上のシグナル伝達ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＣＡＲは、配列番号５〜８に提供されるもの等、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む細胞内ドメイン、又はその活性変異体を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示のＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメイン（少なくとも１つの共刺激ドメインは配列番号５〜８に記載されている）又は本明細書に開示の活性断片若しくは変異体を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、リガンド結合ドメイン又は部分とも呼ばれる細胞外の標的特異的結合要素を含む。リガンド結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類及び数に依存する。例えば、リガンド結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。従って、本開示のＣＡＲにおいてリガンド結合ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス感染症、細菌感染症、及び寄生虫感染症、自己免疫疾患、並びにがん細胞に関連するものが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望のリガンド結合部分を操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的とするように操作される。本開示の文脈において、「腫瘍抗原」は、がん等の特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を指す。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、対象となる任意の腫瘍抗原又はエピトープに対して特異的である。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、標的の抗原は、腫瘍関連表面抗原、例えばＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシドＧＤ２、乳管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ−７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、Ｂヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＡ−ｌａ、ｐ５３、プロスタイン、ＰＳＭＡ、生存及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦｌ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、並びにテネイシンＣのＡｌドメイン（ＴｎＣ  Ａｌ）及び線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）；系統特異的又は組織特異的抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＣＳ１、又はＨＩＶ特異的抗原（例えばＨＩＶ  ｇｐｌ２０）等のウイルス特異的表面抗原；ＥＢＶ特異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、Ｅ６又はＥ７癌タンパク質等のＨＰＶ特異的抗原、Ｌａｓｓｅウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、並びにこれらの表面マーカーの任意の誘導体又は変異体である。本開示の特定の実施形態では、リガンド結合ドメインはＣＤ１９に特異的である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞によって認識され得る自己抗原を更に含み（Ｐａｙｎｅら（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．３５３（６２９５）：１７９−１８４を参照）、抗体を介した自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的とし殺すようにＴ細胞に指示する。そのようなＣＡＲはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ぶことができ、そのようなＣＡＡＲへの本明細書に記載の１以上の共刺激ドメインの組み入れは本開示に包含される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン又は自己抗原と細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインとを連結する膜貫通ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ポリペプチドである。
【０１７０】
本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化及び／又は増殖経路並びに細胞生存経路の活性化に関与している。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。ＣＤ３ζ等の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合に応答して細胞に活性化シグナルを提供することができる。論じたように、活性化シグナルは、例えば細胞溶解活性又はサイトカイン分泌等、細胞のエフェクター機能を誘導することができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、細胞外ドメインの結合後に細胞増殖、細胞生存、及び／又はサイトカイン分泌を促進する共刺激シグナルを伝達する、本明細書に記載のもの等の１以上の細胞内共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのような細胞内共刺激ドメインは、限定されないが、本明細書に開示の任意の共刺激ドメイン又は当技術分野で公知のドメイン、例えばＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＯＸ−４０ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、又はＣＤ２７ドメイン等を含む。
【０１７２】
本明細書には、誘導性調節構築物を発現する遺伝子改変細胞も提供されている。いくつかの実施形態では、誘導性調節構築物は、細胞増殖、細胞生存、及び／又はサイトカイン分泌を促進するための誘導性共刺激シグナルを提供する、細胞内で発現される膜貫通又は細胞内構築物である。いくつかの実施形態では、誘導性調節構築物は、活性化の際に共刺激シグナルを提供する、本明細書に記載のもの及び／又は当技術分野で公知の他のもの等の１以上の共刺激ドメインを含む。一般に、共刺激シグナルは、例えば、２つの誘導性調節構築物ポリペプチドのホモ二量体化によって誘導することができる。誘導性調節構築物は、典型的には、小分子、抗体、又は２つの構築物ポリペプチドのホモ二量体化を可能にする他の分子の結合後にホモ二量体化を可能にする結合ドメインを含む。二量体化は細胞への共刺激シグナルを開始して、増殖、生存、及び／又はサイトカイン分泌を促進することができる。結合ドメインが小分子に結合するいくつかの実施形態では、結合ドメインはＦＫＢＰ１２の類似体（例えば、Ｆ３６Ｖ置換を含む）を含み、小分子はｒｉｍｉｄｕｃｉｄ（即ち、ＡＰ１９０３）である。ＣＡＲ−Ｔ細胞安全スイッチ等、そのような誘導性調節構築物において有用であることが当技術分野において公知である任意の結合ドメインが本開示において企図される。
【０１７３】
特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ由来のシグナル伝達ドメイン及び少なくとも１つの新規共刺激ドメイン、例えば配列番号５〜８、又はそれらの活性変異体を含む。
【０１７４】
他の特定の実施形態では、本明細書に開示の誘導性調節構築物は、２つの構築物の二量体化を可能にする結合ドメイン、及び少なくとも１つの新規共刺激ドメイン（例えば、配列番号５〜８）又はその活性変異体を含む。
【０１７５】
２．４  組換えウイルスベクターの作製方法
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の方法で使用するための組換えＡＡＶベクターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ−２９３等の哺乳動物細胞株において作製される。ウイルスのｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、その自己複製を防止して治療遺伝子（例えばエンドヌクレアーゼ遺伝子）を送達するための空間を空けるためにベクターから除去されるため、組換えＡＡＶベクターはパッケージング細胞株内にトランスで提供する必要がある。更に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」（例えばアデノウイルス）成分を提供する必要がある（Ｃｏｔｓ  Ｄ、Ｂｏｓｃｈ  Ａ、Ｃｈｉｌｌｏｎ  Ｍ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０−８１）。多くの場合、組換えＡＡＶベクターは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在ＤＮＡ配列を含有するウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドで細胞株をトランスフェクトするトリプルトランスフェクションを用いて作製される。次いで、キャプシドに包まれたゲノム（ＩＴＲ及び目的の介在遺伝子）を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当該分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、続いて細胞、組織、又はヒト患者等の生物に対して目的の遺伝子に送達する。従って、本明細書に記載の共刺激ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列、例えば配列番号５〜８、又はそれらの活性変異体を含む組換えＡＡＶベクターの作製方法が本明細書に提供される。同様に、本明細書ではＣＡＲ、又は本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ドメイン、例えば配列番号５〜８、又はそれらの活性変異体を含む誘導性調節構築物をコードする組換えＡＡＶベクターの作製方法が提供される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、遺伝子移入はレンチウイルスベクターを介して達成される。他のレトロウイルスとは対照的に、いくつかの状況において、レンチウイルスは、特定の非分裂細胞に形質導入するために使用され得る。レンチウイルスベクターの非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−２、又はウマ感染性貧血ウイルス（Ｅ１ＡＶ）等のレンチウイルスに由来するものが含まれる。例えば、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ毒性遺伝子を多重弱毒化することにより生成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆは欠失し、治療目的のためにベクターをより安全にしている。レンチウイルスベクターは当技術分野において公知であり、Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６及び１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）；Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；及び第５，９９４，１３６号を参照されたい。いくつかの実施形態では、これらのウイルスベクターはプラスミドベース又はウイルスベースであり、外来核酸を組み入れるため、選択のため、及び核酸を宿主細胞に移入するための必須配列を保有するように構成される。既知のレンチウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ユニバーシティブルバード、マナッサス、バージニア州２０１１０〜２２０９）等の寄託機関又はコレクションから容易に入手することができ、又は一般に利用可能な技術を用いて既知の供給源から単離することができる。
【０１７７】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からクローニングされたｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、及びｒｅｖ遺伝子をコードするプラスミド、並びに偽型ウイルス粒子に使用される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）からのエンベロープタンパク質をコードする第２のプラスミドを用いて調製される。ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳベクター等のトランスファーベクターは、ＪｅＴプロモータ又はＥＦ１プロモータ等の適切なプロモータと共に使用することができる。次いで、ＣＡＲシグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に開示の共刺激ドメイン及びその活性変異体をプロモータの下流に挿入し、続いてＩＲＥＳ及びＧＦＰを挿入することができる。次いで、３つ全てのプラスミドをＬｅｎｔｉ−Ｘ−２９３Ｔ細胞等のレンチウイルス細胞にトランスフェクトすることができ、次いで適切なインキュベーション時間の後にレンチウイルスを回収し、濃縮し、スクリーニングすることができる。従って、本明細書では、少なくとも１つの核酸配列、本明細書に記載の共刺激ドメイン、例えば配列番号５〜８、又はそれらの活性変異体を含む組換えレンチウイルスベクターの作製方法が提供される。同様に、本明細書では、本明細書に記載の少なくとも１つの共刺激ドメイン（例えば配列番号５〜８）又はその活性変異体を含むＣＡＲ又は誘導性調節構築物をコードする組換えレンチウイルスベクターの作製方法が提供される。
【０１７８】
２．５  遺伝子改変細胞及び新規共刺激ドメインを含むその集団
本明細書では、本明細書に開示されるように少なくとも１つの新規共刺激ドメイン（例えば、配列番号５〜８）又はその活性変異体を含むように遺伝子改変された細胞が提供される。特定の実施形態では、遺伝子改変細胞は、本明細書に記載の少なくとも１つの新規共刺激ドメイン（例えば、配列番号５〜８）又はその活性変異体が組み入れられているＣＡＲ又は誘導性調節構築物をコードする核酸分子を含む。本開示の異なる変形形態では、本明細書に記載の新規共刺激ドメインをコードする核酸分子又は発現カセットは、遺伝子改変細胞のゲノム内に存在するか、あるいは細胞のゲノムに組み込まれていない。核酸分子又は発現カセットがゲノムに組み込まれていないいくつかの実施形態では、核酸分子又は発現カセットは、組換えＤＮＡ構築物中、ｍＲＮＡ中、ウイルスゲノム中、又は細胞のゲノムに組み込まれていない他の核酸の遺伝子改変細胞中に存在する。特定の実施形態では、遺伝子改変細胞は、本明細書に記載の共刺激ドメインをコードする核酸分子を含むことができ、更に、本明細書に開示された共刺激ドメインを含まないＣＡＲをコードするヌクレオチド配列及び／又は誘導性調節構築物をコードするヌクレオチド配列を含む本明細書に開示された少なくとも１つの発現カセットを含むことができる。
【０１７９】
本明細書で具体化されたいくつかの遺伝子改変細胞において、本明細書に記載の少なくとも１つの新規共刺激ドメインが組み入れられているＣＡＲ又は誘導性調節構築物をコードする核酸分子は、細胞の内因性Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子と共に位置する。これらの実施形態のいくつかにおいて、核酸分子は、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のエクソン１内等、内因性Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子内に位置する。
【０１８０】
特定の実施形態では、新規共刺激ドメイン又はその活性変異体を含む細胞は真核細胞である。特定の実施形態では、新規共刺激ドメイン又はその活性変異体を含む細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞、特にヒトＴ細胞又はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は初代Ｔ細胞又は初代ＮＫ細胞である。
【０１８１】
Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。本開示の特定の実施形態では、当該分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株及びＮＫ細胞株が使用され得る。本開示のいくつかの実施形態において、Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、当業者に公知の任意の数の技術を使用して対象から収集された血液の単位から得られる。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。
【０１８２】
本明細書に開示の新規共刺激ドメイン又はその活性変異体を含む遺伝子改変細胞は、新規共刺激ドメイン又はその活性変異体を含まない適切な対照細胞と比較した場合に、増殖の増加を示すことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の新規共刺激ドメイン又はその活性変異体を含む細胞は、適切な抗原で刺激した後にインビトロ又はインビボで活性化及び増殖の増加を更に示す。例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＣＡＲ−ＮＫ細胞等の細胞は、本明細書に開示の新規共刺激ドメイン又はその活性変異体を含まない対照細胞と比較して、活性化、増殖、及び／又はサイトカイン分泌の増加を示すことができる。サイトカイン分泌の増加は、とりわけ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αの分泌の増加を含み得る。細胞活性化及びサイトカイン産生の測定方法は当技術分野において周知であり、いくつかの適切な方法は本明細書の実施例に提供されている。
【０１８３】
本開示は更に、本明細書に記載の少なくとも１つの新規共刺激ドメイン（例えば、配列番号５〜８）又はその活性変異体が組み入れられているＣＡＲ又は誘導性調節構築物をコードする核酸分子をそのゲノム中に含む、本明細書に記載の複数の遺伝子改変細胞を含む遺伝子改変細胞の集団を提供する。従って、本発明の様々な実施形態では遺伝子改変細胞の集団が提供され、集団の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％が、本明細書に開示の新規共刺激ドメインを含む遺伝子改変細胞である。特定の実施形態では、遺伝子改変細胞の集団が提供され、集団の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％が、本明細書に記載の新規共刺激ドメインを含むＣＡＲを発現する。他の実施形態では、遺伝子改変細胞の集団が提供され、集団の細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％が、本明細書に開示の新規共刺激ドメインを含む誘導性調節構築物と本明細書に記載の共刺激ドメインを含まないＣＡＲを発現する。
【０１８４】
２．６  遺伝子改変細胞の作製方法
本開示は、本明細書に開示の新規共刺激ドメイン又はその活性変異体を含む遺伝子改変細胞の作製方法を提供する。特定の実施形態では、少なくとも１つの新規共刺激ドメイン（例えば、配列番号５〜８）又はその活性変異体が組み入れられているＣＡＲをコードする核酸配列分子を含むように細胞を改変する方法が提供される。他の実施形態では、少なくとも１つの新規共刺激ドメイン（例えば、配列番号５〜８）又はその活性変異体が組み入れられている誘導性調節構築物をコードする核酸分子を含むように細胞を改変する方法が提供される。本開示の異なる態様では、本明細書に開示の新規共刺激ドメイン又はその活性変異体をコードする核酸分子又は発現カセットは、細胞のゲノムに組み込まれているか、あるいは細胞のゲノムに組み込まれていない。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示の新規共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは、当技術分野において公知の任意の技術を用いて細胞に導入される。特定の実施形態では、本明細書に開示の新規共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）をコードする核酸を含むベクター又は発現カセットは、ウイルスベクターを用いて細胞に導入される。そのようなベクターは当技術分野において公知であり、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉら、（２０１３  Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１−２２に概説））。本開示において有用な組換えＡＡＶベクターは、ウイルスの細胞内への形質導入、及びヌクレアーゼ遺伝子の細胞内への挿入、そして特定の実施形態においては細胞ゲノム内への挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ６の血清型を有する。組換えＡＡＶベクターはまた、それらが宿主細胞中で第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１２４８−５４）。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示の核酸分子又は発現カセットは、ＤＮＡ（例えば、環状又は線状化プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）又はＲＮＡの形態で細胞内に送達される。操作されたヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡ形態で（例えばプラスミド）及び／又はウイルスベクター（例えばＡＡＶ又はレンチウイルスベクター）を介して送達されるいくつかの実施形態では、それらはプロモータに作動可能に連結されるか又は本明細書に開示の発現カセットに見出される。いくつかの実施形態では、プロモータは、ウイルスベクター由来の内因性プロモータ（例えば、レンチウイルスベクターのＬＴＲ）又は周知のサイトメガロウイルス又はＳＶ４０ウイルス初期プロモータ等のウイルスプロモータである。他の実施形態では、プロモータは、ＪｅＴプロモータ等の合成プロモータである。特定の実施形態では、本明細書に開示の新規共刺激ドメイン又はＣＡＲをコードする遺伝子は、標的細胞（例えば、ヒトＴ細胞）において優先的に遺伝子発現を駆動するプロモータに作動可能に連結されている。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示の共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）をコードする核酸分子又は発現カセットは、当技術分野で公知の方法を用いてナノ粒子に共有結合又は非共有結合するか、又はそのようなナノ粒子内に封入される（Ｓｈａｒｍａら、（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１４）。ナノ粒子は、その長さスケールが＜１μｍ、好ましくは＜１００ｎｍであるナノスケール送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生体高分子で構成されるコアを用いて設計することができ、核酸分子又は発現カセットの複数のコピーをナノ粒子コアに付着させるか又は封入することができる。これは、各細胞に送達されるＤＮＡのコピー数を増加させ、従って、操作された各ヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）が発現される可能性を最大にする。そのようなナノ粒子の表面をポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質）で更に修飾して、その表面が細胞送達及びペイロードの取り込みを増強する更なる機能性を付与するコア−シェルナノ粒子を形成し得る（Ｊｉａｎら（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３３（３０）：７６２１−３０）。ナノ粒子を適切な細胞型に向かわせるために、及び／又は細胞取り込みの可能性を高めるために、ナノ粒子を更にターゲティング分子に有利に結合させることができる。そのようなターゲティング分子の例には、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体に天然のリガンド（又は天然のリガンドの一部）が含まれる。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示の共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）をコードする核酸分子又は発現カセットは、リポソーム内にカプセル化されるか、カチオン性脂質を用いて複合体化される（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｚｕｒｉｓら（２０１５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３−８０；Ｍｉｓｈｒａら（２０１１）Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照）。リポソーム製剤及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、細胞の細胞膜との融合及び／又は細胞膜の破壊を介して細胞取り込み及び送達効率を促進することができる。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示の共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）をコードする核酸分子又は発現カセットは、ポリマー足場（例えばＰＬＧＡ）内にカプセル化されるか、カチオン性ポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を用いて複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉら（２０１１）Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３−５３６）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）をコードする核酸分子又は発現カセットは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わされる（Ｔｏｎｇら（２００７）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．９（１１）：９５６−６６）。ポリマーミセルは、凝集を防ぎ、且つ電荷相互作用をマスクし、且つ細胞外の非特異的相互作用を減少させることができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含み得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）をコードする核酸分子又は発現カセットは、細胞への送達用のエマルジョンとして処方される。用語「エマルジョン」は、限定するものではないが、脂質構造を含む任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴を指し、水不混和性相が水相と混合されたときに、無極性残基（例えば長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向かわせる疎水性力の結果として形成することができる。これらの他の脂質構造には、単層、少層、及び多層脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が含まれるがこれらに限定されない。エマルジョンは、水相と親油性相（典型的には油と有機溶媒を含む）で構成される。エマルジョンはまた、１以上の界面活性剤をしばしば含有する。ナノエマルジョン配合物はよく知られており、例えば、米国特許出願第２００２／００４５６６７号及び第２００４／００４３０４１号、並びに米国特許第６，０１５，８３２号、第６，５０６，８０３号、第６，６３５，６７６号、及び第６，５５９，１８９号に記載され、これらは各々参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の共刺激ドメイン（又はＣＡＲ若しくは誘導性調節構築物）をコードする核酸分子又は発現カセットは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合又は非共有結合する（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓら（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５−５６；Ｃｈｅｎｇら（２００８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９７（１）：１２３−４３）。デンドリマーの生成は、ペイロード容量及びサイズを制御することができ、高いペイロード容量を提供することができる。更に、複数の表面基の表示を利用して安定性を改善し、非特異的相互作用を減らすことができる。
【０１９２】
細胞内に遺伝子を導入し発現させる方法は当技術分野において公知である。発現ベクターの文脈では、ベクターは当該技術分野の任意の方法により宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞の作製方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス等に由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア及びビーズ等のコロイド分散系、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための例示的なコロイド系はリポソーム（例えば人工膜小胞）である。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本発明は更に、本明細書に開示された核酸分子又は発現カセットのＴ細胞受容体アルファ遺伝子への導入を提供する。特定の実施形態では、核酸分子又は発現カセットは、Ｔ細胞受容体αサブユニットのコード配列を含むＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に存在する認識配列に導入される。そのように、核酸分子又は発現カセットの導入は、内因性Ｔ細胞受容体αサブユニットの発現を破壊し、結果として内因性Ｔ細胞受容体の発現を破壊する。特定の実施形態では、そのような認識配列は、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のエクソン１内に存在し得る。
【０１９４】
特定の実施形態では、本明細書に開示の共刺激ドメインをコードする核酸分子をＴ細胞又はＮＫ細胞等の細胞に導入することにより、本明細書に開示の共刺激ドメインを含まない対照細胞と比較した場合に、細胞の活性化、増殖、及び／又はサイトカイン分泌を増加させることができる。いくつかの実施形態では、細胞の活性化、増殖、及び／又はサイトカイン分泌は、本明細書に開示の共刺激ドメインをコードする核酸分子を導入することによってインビトロ又はインビボで増加させることができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの新規共刺激ドメイン又はその活性断片若しくは変異体をＴ細胞又はＮＫ細胞等の細胞に導入することは、本明細書に開示の新規共刺激ドメインを含まない対照細胞と比較した場合に、細胞増殖期間及び／又は細胞集団の拡大を延長する、及び／又は細胞枯渇を遅らせる。細胞の拡大及び枯渇（Ｔ細胞又はＮＫ細胞の拡大及び枯渇等）を測定する方法は、当技術分野において公知であり、本明細書の他の箇所に開示されている。
【０１９６】
２．７  医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の遺伝子改変細胞又は遺伝子改変細胞の集団と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は既知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００５）を参照されたい。本開示による医薬製剤の製造において、細胞は典型的には薬学的に許容される担体と混合され、得られた組成物は対象に投与される。担体は、もちろん、製剤中の他の任意の成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、対象にとって有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、対象における疾患の治療に有用な１以上の追加の薬剤を更に含む。遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞若しくはＮＫ細胞（又はそれらに由来する細胞）である更なる実施形態では、本開示の医薬組成物は、インビボでの細胞増殖及び生着を促進するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１）等の生体分子を更に含む。本開示の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、追加の薬剤又は生物学的分子と同じ組成物中で投与され得るか、あるいは、別々の組成物中で同時投与され得る。
【０１９７】
本開示はまた、医薬品として使用するための本明細書に記載の遺伝子改変細胞又はその集団を提供する。本開示は更に、それを必要とする対象において疾患を治療するための医薬品の製造における、本明細書に記載の遺伝子改変細胞又はその集団の使用を提供する。そのような一態様では、医薬品はそれを必要とする対象におけるがん免疫療法に有用である。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物及び医薬品は、Ｔ細胞養子免疫療法によって標的とされ得るあらゆる病状を治療するために有用である。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物及び医薬品は癌治療における免疫療法として有用である。本開示の医薬組成物及び医薬品で治療することができるがんの非限定的な例は、癌腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍であり、限定されるものではないが、Ｂ細胞起源のがん、神経芽細胞腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚又は眼内悪性黒色腫、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発性がん、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、及びＴ細胞リンパ腫並びにこれらのがんの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞起源のがんは、非限定的に、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、プレＢ  ＡＬＬ（小児適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む。
【０１９９】
２．８  遺伝子改変細胞の投与方法
本明細書に開示される別の態様は、本開示の遺伝子改変細胞のそれを必要とする対象への投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物はそれを必要とする対象に投与される。例えば、本明細書に記載の新規共刺激ドメイン又はその活性変異体を含む有効量の細胞集団を、疾患を有する対象に投与することができる。特定の実施形態では、疾患はがん、例えばＢ細胞起源のがんであり得る。従って、本開示はまた、哺乳動物にＣＡＲ−Ｔ細胞を投与する工程を含む、哺乳動物中の標的細胞集団又は組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を提供する方法を提供し、ここで、ＣＡＲは、所定の標的と特異的に相互作用する細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、腫瘍抗原）、並びに少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）と本明細書に記載の少なくとも１つの新規共刺激シグナル伝達ドメイン又はその活性変異体とを含む細胞内ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは本明細書に記載の新規共刺激ドメインを含まないが、細胞は、本明細書に記載の少なくとも１つの新規共刺激ドメインを含む誘導性調節構築物を更に含み、誘導性調節構築物の二量体化が細胞への共刺激シグナルを開始する。そのような実施形態において、方法は、インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞集団の細胞増殖及び拡大を促進するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞において増殖性及び／又は生存シグナルを誘導するために、誘導性調節構築物の二量体化を誘導する小分子、抗体、又は他の分子の投与を更に含む。投与されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、レシピエントにおいて増殖を減少させるか、数を減少させるか、又は標的細胞を殺すことができる。抗体療法とは異なり、本開示の遺伝子改変細胞は、インビボで複製及び増殖することができ、その結果、疾患の持続的な制御につながり得る長期の持続性をもたらす。
【０２００】
可能な投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、又は注入）投与が含まれる。更に、投与は、連続注入又は単回若しくは複数回のボーラス投与によるものであり得る。特定の実施形態では、一方又は両方の薬剤が約１２時間、６時間、４時間、３時間、２時間、又は１時間未満の期間にわたって注入される。更に他の実施形態では、注入は最初はゆっくり起こり、その後経時的に増加する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞は、がんを治療する目的で腫瘍抗原を標的とする。このようながんには、限定ではないが、癌腫、腺癌、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽細胞腫、白血病、及び胚細胞腫瘍を含むことができ、限定されるものではないが、Ｂ細胞起源のがん、神経芽細胞腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、肝臓癌、胃癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚、又は眼内悪性黒色腫、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発性癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、及びＴ細胞リンパ腫、並びにこれらのがんの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞起源のがんは、非限定的に、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、プレＢ  ＡＬＬ（小児適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む。
【０２０２】
ここで開示されている遺伝子改変細胞によってがんが治療されるこれらの実施形態のいくつかにおいては、遺伝子改変細胞を投与された対象に、放射線、外科手術、又は化学療法剤等の追加の治療薬が更に投与される。
【０２０３】
「有効量」又は「治療量」が示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ（存在する場合）、感染又は転移の程度、及び患者（対象）の状態の個人差を考慮して医師によって決定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重の投与量で投与され、この範囲内の全ての整数値を含む。さらなる実施形態では、投与量は１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重であり、この範囲内の全ての整数値を含む。いくつかの実施形態では、細胞組成物はこれらの投与量で複数回投与される。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を用いて投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ３１９：１６７６、１９８８を参照）。特定の患者に対する最適な投与量及び治療計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することにより、医学の当業者が容易に決定することができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞の投与は、標的の疾患又は状態の少なくとも１つの症状を軽減する。例えば、本開示の遺伝子改変細胞の投与は、Ｂ細胞起源のがん等のがんの少なくとも１つの症状を軽減することができる。Ｂ細胞起源のがん等のがんの症状は当技術分野で周知であり、既知の技術によって決定することができる。
【実施例】
【０２０５】
実験
本開示を以下の実施例によってさらに説明するが、実施例は限定として解釈されるべきではない。当業者は、日常的な程度の簡単な実験を用いて、本明細書に記載された特定の物質及び手順の多数の等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【０２０６】
実施例１
新規共刺激ドメインを有するＣＡＲの発現のためのレンチウイルスベクターの作製
本研究の目的は、抗原刺激後のＣＡＲ−Ｔ細胞拡大及びサイトカイン分泌を促進するために開発された新規共刺激ドメインを評価し特性化することであった。
【０２０７】
図１に示すように、２つのＴＲＡＦ結合モチーフを含む４つの新規共刺激ドメインを設計した。これらのドメインを、新規１（Ｎ１；配列番号５）、新規３（Ｎ３；配列番号６）、新規５（Ｎ５；配列番号７）、及び新規６（Ｎ６；配列番号８）と呼ぶ。各新規共刺激ドメインを評価するために、レンチウイルスベクターを用いて抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞を調製した。各ＣＡＲは、５’から３’に、シグナルペプチド（配列番号１６）、（Ｇ４Ｓ）３ポリペプチドリンカーが連結したＦＭＣ６３抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（配列番号１７）、ＣＤ８ヒンジ領域及び膜貫通ドメイン（配列番号１８）、並びに２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内領域を含んでいた。ＳＶ４０ポリアデニル化（ポリＡ）配列（配列番号２２）をＣＡＲ配列の３’下流に配置した。いくつかのレンチウイルスベクターは、その細胞内領域が（ｉ）新規共刺激ドメイン、及び（ｉｉ）ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン（配列番号１９）を含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードした。共刺激ドメインを欠くＣＡＲ（ヌル）をコードする陰性対照ベクターを調製し、ＣＤ２８（配列番号２０）又は４−１ＢＢ（配列番号２１）共刺激ドメイン及びＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲをコードする更なるベクターを調製した。この研究のために調製されたレンチウイルスベクターを表１に要約する。各ＣＡＲは図２に示されており、そのそれぞれの配列は配列番号２２〜２８に記載されている。
【０２０８】
【表１】
2019528769.tif 000003
【０２０９】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からクローニングされたｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、及びｒｅｖをコードするプラスミドを用いて、第２世代のアプローチでレンチウイルスベクターを調製した。水疱性口内炎ウイルス由来のエンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする第２のプラスミドを用いて、ウイルス粒子を偽型化した。トランスファーベクターｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を、ＥＦ１プロモータではなくＪｅＴプロモータ（配列番号３２）を含むように改変し、ＣＡＲシグナル伝達変異体をプロモータの下流にクローニングし、続いてＩＲＥＳ及びＧＦＰをクローニングした。３つ全てのプラスミドをＬｅｎｔｉ−Ｘ−２９３Ｔ細胞（ＣｌｏｎＴｅｃｈ／Ｔａｋａｒａから購入）にトランスフェクトし、３日後に上清からレンチウイルスを回収した。ウイルス粒子をＬｅｎｔｉ−Ｘ濃縮装置（ＣｌｏｎＴｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ）を用いて濃縮し、Ｌｅｎｔｉ−ＸｑＲＴ−ＰＣＲ滴定キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ／Ｔａｋｅｄａ）を用いて定量してウイルスゲノム数／ｍｌを決定し、また２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）での滴定を行って形質導入単位／ｍｌを決定した。
【０２１０】
実施例２
ヒトＴ細胞における新規共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現及び抗原誘発ストレス試験における特性化
【０２１１】
１．ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製と抗原誘発ストレス試験
本研究の目的は、抗原誘発ストレスにおける新規共刺激ドメインを評価することであった。手短に言えば、レンチウイルスベクターを実施例１に記載したように調製した。レンチウイルス形質導入用のドナーヒトＴ細胞を調製するために、Ｔ細胞をＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８多量体（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２中で４日間刺激した。次いで細胞を収集し、個々のレンチウイルスベクターによる形質導入のために別々のウェルに入れた。Ｔ細胞あたり５個の形質導入可能単位を培養物に添加した。形質導入は、ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）及び８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）のみを添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で実施した。培地を交換する前に、ベクターとＴ細胞の同時インキュベーションを一晩行った（Ｘ−Ｖｉｖｏ１５＋２０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋５％正常ヒト血清）。
【０２１２】
ＣＡＲ発現は、レンチウイルス形質導入の４日後に始まり、ＧＦＰ分析によって確認された（図３）。各レンチウイルス形質導入Ｔ細胞培養物の試料を得て、ＧＦＰシグナルをＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬＳＲ：Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータで測定した。各培養物中のＧＦＰ＋Ｔ細胞集団は、図３においてＣＡＲ−ＧＦＰ＋と題された領域によって同定され、ＧＦＰ＋事象の頻度は各ドットプロット上に列挙されている。
【０２１３】
続いて、５×１０４個のＣＡＲ−Ｔ細胞を同数のＲａｊｉ細胞と共に培養した。図４に示す時点（ｄ３、６、１０、１４、１７、及び２０）で、細胞数及び生存率を自動細胞計数及びトリパンブルー排除によって測定した。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４及びＣＤ８に対する抗体を用いてＣＤ４＋又はＣＤ８＋として同定し、フローサイトメトリを用いてＧＦＰシグナルを同定した。ＣＡＲ−Ｔ数を計算し、１×１０５個のＣＡＲ−Ｔ細胞を５×１０４個の追加のＲａｊｉ細胞（２：１エフェクター：標的比）と共に再培養した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＡＲ−Ｔ細胞の総数を追跡し、経時的にプロットした。各時点で、５０μｌの培養上清を回収し、３重サイトカイン分泌アッセイのために−２０℃で保存した。上清中のサイトカインレベルは、ＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅヒトＩＬ−２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγ磁気ビーズキット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元の推奨に従って使用して測定した。データはＬｕｍｉｎｅｘＭａｇＰｉｘ装置を用いて取得した。
【０２１４】
第２の研究では、本発明者らの新規共刺激ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞を上記のように構築し、１×１０５個のＣＡＲ−Ｔ細胞を１×１０５個のＲａｊｉ腫瘍細胞と共に培養した。図６のＸ軸上に示した時点で、細胞数及び生存率を自動細胞計数及びトリパンブルー排除によって測定した。ヒトＣＤ４及びＣＤ８に対する抗体を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を同定し、フローサイトメトリを用いてＧＦＰシグナルを同定した。ＣＡＲ−Ｔ数を計算し、１×１０５個のＣＡＲ−Ｔ細胞を１×１０５個の追加のＲａｊｉ細胞と共に再培養した。尚、図６では、標的：エフェクター比を１：１に調整し、Ｒａｊｉ細胞をより頻繁にｄ３、５、７、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２４、２６、２８、及び３１で培養物に添加した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＡＲ−Ｔ細胞の総数を追跡し、経時的にプロットした。
【０２１５】
形質導入の４日後、但しＲａｊｉ細胞との共培養の前に、Ｔ細胞培養物を前述のようにフローサイトメトリによりＣＡＲ−ＧＦＰ発現について評価した。Ｔ細胞を細胞あたり５個の形質導入可能単位のＭＯＩで形質導入し、全てのレンチウイルス試料についてほぼ同様の効率が観察された。
【０２１６】
２．実験結果その１
ＣＡＲ−Ｔ細胞数を経時的に測定し、図４にプロットした。ＣＡＲ−Ｔ数の違いは、１０日目以降に明らかになった。４１ＢＢｚシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ２８ｚドメインを有するものよりも持続的な増殖を示した。この実験において、ＢＢヌル対照は最低レベルのＣＡＲ−Ｔ拡大を示した。新規ドメインＮ５及びＮ６は高レベルの持続的増殖を示した。各サブセットは同様の速度で増殖したため、ＣＤ４（図４Ｂ）又はＣＤ８（図４Ｃ）Ｔ細胞拡大に対する選好は観察されなかった。この増殖アッセイにおける性能の降順では、結果は、Ｎ６＞Ｎ５＞４１ＢＢｚ＞Ｎ１＞＞ＢＢヌル＝ＣＤ２８ｚ＞Ｎ３である。
【０２１７】
ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２の分泌をＬｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイによって測定し、それぞれ図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃに示す。一般に、全てのサイトカインの分泌レベルは経時的に減少した。ｄ３でのＩＦＮγ分泌に関するドメインのランキングは、４１ＢＢｚ＝ＣＤ２８ｚ＞Ｎ１＞Ｎ５＞ＢＢヌル＝Ｎ３＞Ｎ６である。ＩＦＮγのレベルは、ｄ７時点で全ての実験群において５０％以上減少し、実験の残りの部分で減少し続けた。ＴＮＦα分泌に関するドメインのランキングは、ＣＤ２８ｚ＞Ｎ５＝４１ＢＢｚ．ＢＢヌル＞Ｎ１＝Ｎ６＞Ｎ３となる。培養３日目と７日目の間に、ＴＮＦα産生レベルはＣＤ２８ｚ、ＢＢヌル、Ｎ３、及びＮ５培養物では約５０％減少するが、４１ＢＢｚ、Ｎ１、及びＮ６培養物は７日目までＴＮＦα産生レベルを維持する。一方、ＩＬ−２の産生は、４１ＢＢｚ及びＣＤ２８ｚと比較した場合、全ての新規ドメイン共培養物において低かった。ＩＬ−２測定値は、一部の培養物中に存在する急速に増殖するＴ細胞による高率のＩＬ−２消費によって混乱する可能性がある（図４参照）。
【０２１８】
３．実験結果その２
第２の実験（図６）では、より頻繁な抗原遭遇及びより高い標的：エフェクター比を使用し、結果の降順に、Ｎ３＞Ｎ５＞ＣＤ２８ｚ＞Ｎ１＞Ｎ６＞４１ＢＢｚ＞ＢＢヌルであった。この実験では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は培養期間を通して連続的に拡大した。ＣＤ４ＣＡＲ−Ｔ細胞はＲａｊｉ共培養中で約１２日後に拡大を停止したが（図６Ｂ）、ＣＤ８ＣＡＲ−Ｔ細胞は拡大を続けた（図６Ｃ）。
【０２１９】
４．結論
いくつかの新規シグナル伝達ドメインは、比較的低い（図４）又は高い（図６）抗原負荷下で４１ＢＢｚ及び／又はＣＤ２８ｚと同等又はそれ以上の性能を発揮する。Ｎ５シグナル伝達ドメインを保有するＣＡＲは、両方の条件下で４１ＢＢｚ及びＣＤ２８ｚよりも優れていた。Ｎ５は、両方の実験においてＣＤ４コンパートメント中の４１ＢＢｚと同様の性能を発揮するように見えるが、Ｎ５は、両方の実験においてＣＤ８コンパートメント中の４１ＢＢｚよりも優れている。
【０２２０】
実施例３
４１ＢＢ、Ｎ１、又はＮ６共刺激ドメインのＣＡＲの標的挿入にＡＡＶを使用したストレス試験
【０２２１】
１．ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製と抗原誘発ストレス試験
新規細胞内シグナル伝達ドメインを評価するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、抗原遭遇に対するそれらの応答を測定した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣＤ３陽性選択キットを使用して、健康なヒトドナーから収集したアフェレーシス試料からＴ細胞を単離した。このアッセイでは、Ｋ７９９及びｚ４１００と称される２つの異なるドナーを使用した。Ｔ細胞を、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔａｎｔｉ−ＣＤ２／３／２８（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈ）を用いて３日間活性化及び拡大させた後、ＴＲＣ１−２ｘ８７ＥＥを用いたヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ４Ｄｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を行った。ヌクレオフェクション直後に、異なる細胞内シグナル伝達ドメインを特徴とする抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするＡＡＶ６ベクターを細胞に形質導入した。この実験に含まれるＣＡＲ変異体は、４−１ＢＢ、Ｎ１、又はＮ６共刺激ドメインを含んでいた。全てのベクターにおいて、ＪｅＴプロモータでＣＡＲ発現を促進した。各ＣＡＲドナー鋳型は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ認識配列の上流及び下流の領域に対して相同性を有する５’及び３’相同性アームに隣接させた。ＣＡＲドナー鋳型を更に５’及び３’逆方向末端反復配列に隣接させた。各ＣＡＲのドナー鋳型を図７に示し、ＣＤ１９−４−１ＢＢＣＡＲ、ＣＤ１９−Ｎ１  ＣＡＲ、及びＣＤ１９−Ｎ６  ＣＡＲをコードするＡＡＶを生成するために使用したベクターの配列を配列番号２９〜３１にそれぞれ示す。
【０２２２】
感染多重度は５０，０００であった。ヌクレオフェクション／形質導入の５日後、非編集型ＣＤ３＋細胞を磁気的除去によって取り除いた（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈＣＤ３陽性選択キット）。次いで、細胞をＣＤ３−画分の純度について評価し、抗ＣＤ３−ＢｒｉｌｌｉａｎＶｉｏｌｅｔ−７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びＣＤ１９−Ｆｃ−ビオチン（Ａｃｒｏ）、続いてストレプトアビジン−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてフローサイトメトリによってＣＡＲ発現について評価した。翌日、Ｔ細胞とＣＤ１９を発現するように操作されたＫ５６２（「Ｋ１９」細胞）とを含有する共培養物を組み立てた。上記のフローサイトメトリアッセイで決定されたＣＤ１９−Ｆｃ＋頻度を用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞の入力数を計算し、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比２：１を確立した。共培養の３、６、８、及び１０日目に、共培養物中の腫瘍細胞数及びＣＡＲ−Ｔ細胞数のフローサイトメトリ評価のために試料を取得した。各時点でのＣＡＲ−Ｔ細胞の数は、抗原遭遇後のＣＡＲ−Ｔの拡大の証明として図８にプロットされている。計算したＣＡＲ−Ｔ細胞の数及び各時点で検出された残りの腫瘍細胞を使用して、２：１のＥ：Ｔを再確立するために必要数の新鮮なＫ１９細胞を共培養に戻した。更に、平行共培養プレートを可変のＥ：Ｔ比（２：１、１：１、及び１：２）で設定した。これらの共培養物の試料を２４時間及び７２時間で採取し、ＣＤ１９＋細胞の数をフローサイトメトリによって決定した。結果を図９に示す。ＣＡＲ−Ｔ細胞との共培養を生き残ったＣＤ１９＋細胞の数は、標的細胞殺傷の指標として役立つ。
【０２２３】
２．抗原誘導性ストレス試験の結果
入力Ｔ細胞集団をＣＡＲ＋細胞の頻度に対して正規化し、同数のＣＡＲ−Ｔ細胞をＥ：Ｔ、２でＫ１９標的で攻撃した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を、ドナーＫ７９９（図８Ａ）及びドナーｚ４１００（図８Ｂ）から作製したＴ細胞について評価した。ＴＲＡＣを含む細胞は編集するが、ＣＡＲ挿入を含まない（ＴＲＣＫＯ）細胞は抗原遭遇に応答して増殖しなかった。対照的に、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを使用して作製したＣＡＲ−Ｔ細胞は、共培養の最初の１週間は強く増殖し、１２日目で収縮した。Ｎ１又はＮ６変異体を用いて作製したＣＡＲ−Ｔ細胞が示した増殖速度は、４−１ＢＢによって支持される速度と実質的に異なることが見出されなかった。ＣＤ１９＋標的細胞の殺傷も共培養の２４時間後及び７２時間後に様々なＥ：Ｔ比で評価し、その時点で培養試料を残りのＣＤ１９＋細胞の数について分析し、同数のＫ１９細胞を含有するがＣＡＲ−Ｔ細胞を含まない対照ウェルに対して結果をプロットした。無Ｔ細胞対照よりも少ないＫ１９の数は細胞殺傷と解釈する。ドナーＫ７９９由来の材料を使用して作製したＣＡＲ−Ｔ細胞は、２４時間の時点でほとんど細胞溶解性を示さず、最少の厳しさのＥ：Ｔ比２：１でのみ顕著な殺傷を示した（図９、パネルＡ）。しかしながら、７２時間までに、全てのＥ：Ｔ比で広範囲の殺傷が観察された。Ｎ１及びＮ６は４−１ＢＢと同程度かそれ以上であった。Ｎ１は４−１ＢＢと比較して細胞溶解活性が優れているように見えた。ドナーｚ４１００から作製したＣＡＲ−Ｔ細胞を含有する共培養物では、２４時間及び７２時間の両方の時点で広範囲の殺傷が観察された（図９Ｂ）。上記のように、Ｎ１及びＮ６は、４−１ＢＢと比較した場合、細胞溶解活性に関して同等又は優れていた。一般に、ドナーｚ４１００から作製したＣＡＲ−Ｔ細胞ではより広範囲の殺傷が観察された。ドナーＫ７９９におけるＣＤ４：ＣＤ８比はほぼ３：１であり、一方ｚ４１００における比は１：１であることに留意することが重要である。従って、（これらの実験の場合のように）固定数の全ＣＡＲ−Ｔ細胞を含有する試料は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれの数が異なり、ｚ４１００はほぼ２倍の数のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し、このドナー由来の細胞で観察された致死活性増強を説明する。
【０２２４】
３．結論
新規共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢシグナル伝達によって支持されるレベルと同等又はそれ以上の増殖及び標的細胞殺傷レベルを支持することが見出された。重要なことに、本発明者らは、ランダムに挿入されたレンチウイルスベクターによってＣＡＲが送達された他のデータに加えて、本発明者らの標的挿入戦略によって作製されたＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＮ１及びＮ６のこの特徴をここに示す。この方法は、抗原に対するＣＡＲ−Ｔ応答の差が、異なるＣＡＲ−Ｔ調製物間の積算コピー数の差に起因し得る可能性を減らす。重要なことに、無作為挿入法及び標的挿入法の両方が、特にＮ６が天然の４−１ＢＢによって提供される共刺激的支持に対する実行可能な代替法であることを示した。
【０２２５】
実施例４
共刺激ドメインとして４１ＢＢ、Ｎ１、又はＮ６を有するＣＡＲ−Ｔ細胞における増殖アッセイ
【０２２６】
１．共刺激ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞の調製と増殖アッセイ
新規共刺激ドメインを特徴とするＣＡＲ要素をレンチウイルス移入ベクターからクローニングし、ｐＤＩベクターに結合させた。ＣＡＲ要素の発現はＪｅＴプロモータによって制御し、標的遺伝子挿入を可能にするためにこの要素をＴＲＡＣ相同性アームに隣接させる。ＡＡＶ６粒子へのパッケージングを可能にするために、このドナー鋳型を逆方向末端反復配列に隣接させる。これらのプラスミドを最初に制限エンドヌクレアーゼ消化及びエタノール沈殿により線状化した。次いで、初回抗原刺激を受けたＴ細胞をＴＲＣ１−２×８７ＥＥ、線状化ＣＡＲプラスミド、及びＳＴＩＮＧｓｉＲＮＡでヌクレオフェクトして、細胞内核酸センサーによって媒介される毒性を低減した。Ｌｏｎｚａ４Ｄヌクレオフェクターを用いて核酸送達を行った。編集したＴ細胞を、プールした５％ヒト血清及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸＶＩＶＯ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で成長させた。７日間培養を行った後、ヒトＣＤ３陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、編集されていないＣＤ３＋細胞を磁気的に除去した。細胞を２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２中に一晩静置した後、製造元の推奨に従って２μＭのセルトレースバイオレット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識した。セルトレースバイオレット（ＣＴＶ）は細胞内エステラーゼの基質であり、カルボキシフルオロセイン−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）とよく似た働きをする。ＣＴＶは膜を越えて細胞質に拡散し、そこで生細胞の細胞質に豊富に存在するエステラーゼ酵素によって切断される。切断された生成物は細胞膜を越えて拡散せず、細胞質タンパク質に見られる遊離アミノ基と非常に強く反応し、蛍光性である。標識された細胞が分裂すると、蛍光細胞質タンパク質は娘細胞の間で均等に分裂し、各々が親世代の半分の明るさを有する２つの細胞になる。ＣＴＶの蛍光を時間的（０日目の対照等）又は生物学的対照（例えば非刺激細胞）と比較することによって、フローサイトメトリを使用してＣＴＶの薄暗い事象の頻度を比較することによって様々な細胞集団の増殖速度を測定できる。次いで、ＣＡＲ、ＣＡＲ−４−１ＢＢ、ＣＡＲ−Ｎ１、又はＣＡＲ−Ｎ６のいずれも発現していないＴ細胞のＣＴＶ標識ＣＤ３画分を、抗原を担持する腫瘍細胞で攻撃した。このアッセイのために、ＣＤ１９を安定に発現するＫ５６２細胞を２つの異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比、２：１及び１：１で使用した。重要なことに、ＣＡＲ＋頻度は、ビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃ及びストレプトアビジン−ＰＥを用いて各共培養物について決定した。Ｔ細胞の入力数をそれらのＣＡＲ＋頻度に基づいて正規化した。Ｔ細胞とＣＤ１９＋Ｋ５６２の共培養を５日間行った後、フローサイトメトリ分析を行った。ＣＤ４−ＰＥ及びＣＤ８−ＡＰＣ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてＴ細胞を明確に同定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータを取得及び分析し、色素希釈によって増殖を評価した。
【０２２７】
２．増殖アッセイの結果
増殖アッセイからの結果を図１０に示す。図１０Ａの重ね合わせたヒストグラムは、２つの異なるＥ：Ｔ比でのＣＡＲ−４−１ＢＢＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖及び陰性対照ＴＲＣＫＯＴ細胞の増殖の欠如を示す。わずかに半分を超えるＣＡＲ−４−１ＢＢＴ細胞がＣＤ１９＋標的細胞に応答して増殖したが、対照試料では１３％が分裂した。図１０Ｂの重ね合わせたヒストグラムは、ＣＡＲ−Ｎ１細胞に対するＣＡＲ−４−１ＢＢ細胞の増殖速度を示す。ほぼ等しい頻度の分裂細胞が各培養物中に見られる。図１０Ｃの重ね合わせたヒストグラムは、ＣＡＲ−Ｎ６Ｔ細胞と比較したＣＡＲ−４−１ＢＢＴ細胞の増殖速度を示す。Ｎ６は７７％の細胞において増殖を支持し、一方４−１ＢＢは５６％の細胞において増殖を支持する。各培養物中の分裂細胞の頻度の表を以下に示す。
【０２２８】
表２．抗原を担持する腫瘍細胞と共培養したＣＡＲ−Ｔ細胞の分裂頻度
【表２】
2019528769.tif 000004
【０２２９】
３．結論
レンチウイルスのスクリーニングは、ＣＡＲ構築物に組み入れるための代替的及び／又は優れたシグナル伝達ドメインを同定する試みにおいて、Ｎ６を主要候補として同定した。この実験は、レンチウイルス送達に典型的なランダム挿入／可変コピー数シナリオではなく、単一コピー標的挿入シナリオで機能する新規シグナル伝達ドメインの能力を実証した。これらのデータサポートは、機能的シグナル伝達変異体が設計及び送達され得ることを実証する。重要なことに、Ｎ６は、抗原との遭遇後のＣＤ３ｚに関連する共刺激シグナルトランスデューサーとして４−１ＢＢよりも優れていることが特に見出された。
【０２３０】
実施例５
播種性Ｂ細胞リンパ腫のマウス異種移植モデルにおける４−１ＢＢとＮ６の共刺激ドメインを持つＣＡＲＴ細胞の有効性
【０２３１】
１．ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製と担癌マウスへの注射
本研究の目的は、Ｎ６共刺激ドメインを含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物を発現するように操作されたＣＡＲＴ細胞の有効性を評価し、これらの細胞とＣＡＲに組み込まれた４−１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲＴ細胞とを比較することであった。
【０２３２】
４−１ＢＢ又はＮ６共刺激ドメインを特徴とする抗ＣＤ１９  ＣＡＲ配列をｐＤＩプラスミドにクローニングし、ＡＡＶ６ウイルスベクターを作製するために使用した。ＣＡＲ要素の発現はＪｅＴプロモータによって制御し、このドナー鋳型がＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ部位特異的エンドヌクレアーゼと共に送達されたときに、標的遺伝子のＴＲＡＣ遺伝子座への挿入を可能にするために、導入遺伝子はＴＲＡＣ相同性アームに隣接させた。このＣＡＲ導入遺伝子ドナー鋳型は、ＡＡＶ６粒子へのパッケージングを可能にするために逆方向末端反復配列に隣接させた。
【０２３３】
Ｎ６共刺激ドメインについては、試験のために２つの異なるＣＡＲ導入遺伝子を作製し、異なるＡＡＶベクターにパッケージングした。これらの２つのＮ６含有ＣＡＲ要素は、これらのポリＡ配列がＣＡＲ  Ｔ細胞の機能に影響を与えるかどうかを評価するために、ＣＡＲ導入遺伝子の３’末端で利用される異なるポリアデニル化（ポリＡ）配列を含んでいた。７２４１（４−１ＢＢ）及び７２０５（Ｎ６）構築物において利用したポリＡ配列は、配列番号３３を含むＳＶ４０ポリＡ配列であった。７２０６（Ｎ６）構築物において利用したポリＡ配列は、配列番号３４を含む第１の配列と配列番号３５を含む第２の配列とを有するＳＶ４０ビポリＡ配列である。表３は、本研究で使用したＣＡＲ構築物の特徴を概説しており、それらは図１１に示されている。７２４１（４−１ＢＢ）構築物、７２０５（Ｎ６）構築物、及び７２０６（Ｎ６）構築物をコードするＡＡＶを生成するために使用したベクターの配列は、それぞれ配列番号３６〜３８に提供されている。
【０２３４】
ＡＡＶベクター
【表３】
2019528769.tif 000005
【０２３５】
初回抗原刺激を受けたＴ細胞をＴＲＣ１−２×８７ＥＥｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。Ｌｏｎｚａ４ＤＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて核酸送達を行った。エレクトロポレーションの後、細胞を偽形質導入するか、又は４−１ＢＢ若しくはＮ６共刺激ドメインのいずれかを含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲ導入遺伝子を備えたドナー鋳型を有するＡＡＶ６ベクターで形質導入した。
【０２３６】
編集したＴ細胞を、プールした５％ヒト血清及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸＶＩＶＯ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で成長させた。細胞を５日間培養した後、ヒトＣＤ３陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、編集されていないＣＤ３＋細胞を磁気的に除去した。細胞を更に３日間培養した。
【０２３７】
ＮＳＧマウス（１群あたりｎ＝５）に、ホタルルシフェラーゼを発現する２ｅ５のＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃ）を注射した。３日後、マウスに各々１ｅ６対照ＴＣＲＫＯ細胞、又は７２０５（Ｎ６）、７２０６（Ｎ６）、又は７２４１（４−１ＢＢ）ベクターを用いて作製した１ｅ６ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射した。示された日に、生きているマウスにルシフェリン基質（食塩水中１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、麻酔し、７分後にＩＶＩＳスペクトル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅｓｏｆｔｗａｒｅ４．５．２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いてデータを分析しエクスポートした。画像中のルミネセンスシグナル強度は、ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒの放射輝度で表される。動物全体を対象領域として用いて、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅｓｏｆｔｗａｒｅ４．５．２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して総フラックスも計算した。マウスを疾患進行の徴候についてモニターし、必要に応じて所定の基準に従って安楽死させた。
【０２３８】
２．マウス異種移植モデルの結果
表３に記載のＣＡＲ構築物の有効性を評価する播種性Ｂ細胞リンパ腫のマウス異種移植モデルの結果を図１２〜図１４に示す。
【０２３９】
Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃの注射後７日目のマウスの腹側及び背側の画像化によって、ＴＣＲＫＯ細胞を投与した対照マウスにおけるＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃ細胞の生着及び成長が可視化され、１０日目及び１６日目の発光シグナルの増加によって示されるように、これらのマウスでＲａｊｉ細胞の急速な成長が観察された（図１２、図１３Ａ、及び図１３Ｃ）。対照的に、７２０５（Ｎ６）、７２０６（Ｎ６）、及び７２４１（４−１ＢＢ）構築物を有するＣＡＲ  Ｔ細胞によるマウスの処置は、腫瘍成長の遅延をもたらした（図１２及び図１３）。動物の背側及び腹側の画像化によって証明されるように、Ｒａｊｉ成長は、７２０５（Ｎ６）及び７２４１（４−１ＢＢ）ＣＡＲ  Ｔ群のマウスのサブセットにおいておよそ２０日目から開始されることが検出された。しかしながら、７２０６（Ｎ６）ＣＡＲ  Ｔ治療群では、４０日間の研究中に明らかな腫瘍成長は観察されなかった。
【０２４０】
図１４に示すように、ＴＲＣＫＯ対照群の５匹のマウス全ては、完全後肢麻痺を含む疾患関連症状の急速な発症により１９日目に安楽死させた。しかしながら、７２０５（Ｎ６）及び７２０６（Ｎ６）ベクターを用いて作製したＣＡＲ  Ｔ細胞による処置は、マウスの生存を増強し、これらの群の全てのマウスは４０日目に生存したままであった（７２０６群の１匹のマウスは、腫瘍の増殖やＣＡＲ  Ｔの注入とは無関係の死亡により研究から除外した）。７２４１の４−１ＢＢ含有ＣＡＲ構築物で処置したマウスも、この処置群におけるマウスの生存期間を延長し、１匹のマウスは３８日目に安楽死を必要とし、他の４匹のマウスは研究の４０日間を通して生き続けた。
【０２４１】
３．結論
Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃＣＤ１９＋細胞を移植したマウスを、Ｎ６共刺激ドメインを有する第２世代ＣＡＲを発現する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置すると（７２０５及び７２０６構成の両方で）、ＴＣＲＫＯ細胞を投与したマウスと比較して、マウスの生存期間延長及び腫瘍負荷の劇的な減少がもたらされた。重要なことに、研究の４０日間を通して、７２０５（Ｎ６）構築物は、７２４１４−１ＢＢ含有−ＣＡＲと同等の性能を発揮するように見え、７２０６（Ｎ６）構築物は、Ｒａｊｉ細胞成長の持続的抑制の観点から７２０５（Ｎ６）構成及び７２４１（４−１ＢＢ）構成の両方よりも優れているように見えた。全体として、これらのデータは、Ｎ６共刺激ドメインが共刺激ドメインとして機能し、構築物のインビトロ活性を評価する実験と一致してインビボでＣＤ１９＋標的を殺傷するＣＡＲ  Ｔ細胞の能力を支持するというインビトロでの発見を裏付ける。更に、Ｎ６共刺激ドメインを有する構築物は、４−１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲ  Ｔ構築物の活性と一致するか又はそれを超えた。
【０２４２】
実施例６
複数の共刺激ドメインを含む第３世代ＣＡＲの特性化
【０２４３】
１．第３世代ＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の作製
第３世代ＣＡＲの一部として本発明に包含される新規共刺激ドメインを評価するために更なる構築物を調製し、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインは２つの共刺激ドメインと１つのＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインとを含む。
【０２４４】
特定の実施例において、５’から３’に、シグナル配列（配列番号１６）、ＦＭＣ６３ベースのＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ（配列番号１７）、上記のＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン（配列番号１８）、それに続くＭｙＤ８８共刺激ドメイン（配列番号３９；国際公開第２０１６／０３６７４６号から得られた配列）、Ｎ６共刺激ドメイン（配列番号８）、及びＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン（配列番号１９）を含む、第３世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲを調製した。配列番号３４及び配列番号３５を含むＳＶ４０ビポリＡシグナル配列は、ＣＡＲ配列の３’下流に位置していた。先の実施例に記載したように、この構築物をコードする配列をｐＤＩプラスミドにクローニングし、ＣＡＲの発現をＪｅＴプロモータによって制御した。更に、このドナー鋳型がＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ部位特異的エンドヌクレアーゼと共に送達されたときに、標的遺伝子のＴＲＡＣ遺伝子座への挿入を可能にするために、導入遺伝子はＴＲＡＣ相同性アームに隣接させた。このＣＡＲ導入遺伝子ドナー鋳型を更に逆方向末端反復配列に隣接させた。ＭｙＤ８８／Ｎ６  ＣＡＲドナー鋳型を図１５に示し、ドナー鋳型を含むベクターの配列を配列番号４０として提供する。
【０２４５】
いくつかの実験では、ＣＡＲドナー鋳型は、ｐＤＩプラスミドの線状化後に線状化ＤＮＡとして送達されるであろう。他の場合には、ドナー鋳型はウイルス送達のためにＡＡＶ６粒子にパッケージングされるであろう。
【０２４６】
２．殺細胞、増殖、及びサイトカイン分泌に関するＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞の評価
いくつかの実験において、ＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞は、初回抗原刺激を受けたＴ細胞を線状化ＣＡＲ鋳型プラスミド、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ、及びＳＴＩＮＧｓｉＲＮＡでヌクレオフェクションして、細胞内核酸センサーにより媒介される毒性を低減することによって、実施例４で上述したように作製する。ＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞を記載のように更に成長及び拡大させる。
【０２４７】
ＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞を殺細胞能力、増殖、及びサイトカイン分泌に関して特性化する。殺細胞能力及び増殖を評価するために、ＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞を実施例３で上述したように抗原誘発ストレス試験にかけ、ここでＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々なエフェクター：標的比でＣＤ１９（「Ｋ１９」細胞）を発現するように操作されたＫ５６２細胞と共培養する。増殖についても、セルトレースバイオレットで細胞を標識し、抗原を担持するＫ１９細胞と様々なエフェクター：標的比で共培養することによって、実施例４で記載したように評価する。サイトカイン分泌（例えば、ヒトＩＬ−２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγ）は、様々なエフェクター：標的比でＫ１９細胞と共培養した後、上記の実施例２で記載したように決定する。
【０２４８】
殺細胞、増殖、及びサイトカイン分泌を調べる同様の実験は、組換えＡＡＶ粒子の形質導入を用いて、初回抗原刺激を受けたＴ細胞にＣＡＲドナー鋳型を送達し、ＴＲＣ１−２×．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでこれを更にヌクレオフェクトして行う。
【０２４９】
３．ＭｙＤ８８／Ｎ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖
ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＮ６及びＭｙＤ８８／Ｎ６共刺激ドメインの機能を比較するために、Ｎ６共刺激ドメイン又はＭｙＤ８８／Ｎ６共刺激ドメインを含む新規第３世代ＣＡＲを発現する線状化プラスミドＤＮＡを、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ部位特異的エンドヌクレアーゼ及びＳＴＩＮＧｓｉＲＮＡと共にヒトＴ細胞にヌクレオフェクトした。ＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲコード構築物を図１５に示す。Ｎ６ＣＡＲをコードする構築物を７２０６と呼び、配列番号３８として提供する。ＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲをコードする構築物を７２４０と呼び、配列番号４０として提供する。
【０２５０】
ヌクレオフェクション後、細胞を５％ＦＢＳ及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ−Ｖｉｖｏ培地（Ｌｏｎｚａ）中で５日間成長させた。５日目に、残りのＣＤ３＋Ｔ細胞をヒトＣＤ３陽性選択キットＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて標識し、製造元の推奨に従って磁気的に除去した。残りのＣＤ３枯渇画分を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５及び３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ−Ｖｉｖｏ培地に再懸濁し、更に２日間成長させた。アッセイ用の試料を調製するために、Ｎ６及びＭｙＤ８８／Ｎ６条件からの２ｅ６Ｔ細胞、並びにＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのみ処理した対照Ｔ細胞をインビトロでセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）溶液の２μＭ溶液で標識した。インキュベーション後、ＣＤ１９−ビオチンＦｃ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びストレプトアビジンＰＥ（ＢＤ）で染色した後、ＣＴＶ標識の一貫性及びＣＡＲ  Ｔ細胞頻度をＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬＳＲ：Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータで評価した。増殖アッセイのために、サイトカインの添加なしのＸ−Ｖｉｖｏ培地中で、９６ウェル丸底プレート上の２つのウェルに２ｅ５の全Ｔ細胞（２ｅ３のＣＡＲ  Ｔ細胞）を加えて、ＣＡＲ  Ｔ細胞頻度を加えた全Ｔ細胞集団の１％に正規化した。抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を評価するため、非特異的バックグラウンド増殖を計算するために４ｅ３Ｋ１９細胞を１つのウェルに添加し、４ｅ３Ｋ５６２細胞を第２のウェルに添加した。細胞を混合し、合計６日間インキュベートした。
【０２５１】
共培養後６日目に、細胞を遠心してＰＢＳで２回洗浄した。個々のＴ細胞サブセットの増殖を分析するため、死細胞を排除するために試料をＣＤ４ＢＶ７１１及びＣＤ８ＢＶ７８５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、並びにゴースト染料ＢＶ５１０（ＴＯＮＢＯｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。染色後、試料を流し、データをＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬＳＲ：Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータで収集した。
【０２５２】
４．増殖研究の結果
Ｎ６及びＭｙＤ８８／Ｎ６共刺激ドメインを比較した増殖アッセイの結果を図１６に示す。ＣＡＲ陰性集団のバックグラウンド増殖を測定するために、ＴＲＣのみのヌクレオフェクト対照試料に由来するＴ細胞におけるＣＴＶ希釈物を、Ｋ１９細胞又はＫ５６２細胞と共培養したウェルにおいて比較した。重要なことに、両方のＴ細胞サブセットは、Ｋ１９（淡い陰影）及びＫ５６２細胞（濃い陰影）の存在下で同様のレベルの非特異的増殖を示し、いずれの増殖もＣＤ１９非依存性であることを示唆した（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。比較すると、Ｎ６共刺激ドメインを発現する線状化プラスミドＤＮＡでヌクレオフェクトしたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞はどちらもＫ５６２対照と比較してＫ１９細胞の存在下でより大きいＣＴＶ希釈を示し、実質的な抗原特異的増殖を示した（図１６Ｃ及び図１６Ｄ）。特に、ＭｙＤ８８／Ｎ６共刺激ドメインを発現するＴ細胞で行った同じ評価においても、Ｋ１９細胞に応答してＣＡＲ  Ｔ細胞のより大きい増殖を示した（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）。ＣＴＶの全体的な希釈は、Ｎ６共刺激ドメイン単独を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してＭｙＤ８８／Ｎ６発現Ｔ細胞では少なかったが、いずれかの共刺激ドメインの発現は、ＴＲＣのみの対照Ｔ細胞と比較してＣＴＶのより大きな希釈をもたらした。
【０２５３】
５．結論
初回抗原刺激を受けたＴ細胞を、Ｎ６又は第３世代ＭｙＤ８８／Ｎ６共刺激ドメインのいずれかを発現する線状化プラスミドＤＮＡでヌクレオフェクションすると、ＣＴＶの希釈によって示されるように抗原特異的に増殖できるＣＡＲＴ細胞が得られた。更に、増殖は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方で起こり、非ＣＡＲ発現対照細胞において見られるバックグラウンドよりも上で起こった。まとめると、この研究は、Ｎ６及びＭｙＤ８８／Ｎ６の両方がＣＡＲ  Ｔ細胞において共刺激ドメインとして機能し得ることを実証した。
【０２５４】
実施例７
誘導性構築物における新規共刺激ドメインの特性化
【０２５５】
１．第１世代ＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞及び新規共刺激ドメインを含む誘導性構築物の作製
ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインを含む第１世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲと同時発現される誘導性共刺激構築物の一部として本発明に包含される新規共刺激ドメインを評価するために、更なる構築物を調製した。
【０２５６】
特定の実施例において、５’から３’に、誘導性共刺激構築物のための発現カセット、Ｔ２Ａ要素、及び第１世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするＣＡＲ発現カセットを含む構築物を調製した。
【０２５７】
ＣＡＲ発現カセットによってコードされる第１世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、５’から３’に、シグナル配列（配列番号１６）、ＦＭＣ６３ベースのＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ（配列番号１７）、及び細胞内領域がＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン（配列番号１９）を含む上記のＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン（配列番号１８）を含んでいた。配列番号３４及び配列番号３４を含むＳＶ４０ビポリＡシグナル配列は、ＣＡＲ配列の３’下流に位置していた。
【０２５８】
誘導性共刺激構築物は、５’から３’に、Ｎ６共刺激ドメイン単独（配列番号８）、又はＭｙＤ８８ドメイン（配列番号３９）及びＮ６ドメイン（配列番号８）のタンデムを含み、２つのタンデムリガンド結合ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン（配列番号４１；国際公開第２０１５／１２３５２７号から得られる配列）を含むＦｖドメインが続き、それが小分子ｒｉｍｉｄｕｃｉｄに結合して構築物の二量体化及び共刺激シグナル伝達の活性化を誘導する。
【０２５９】
先の実施例に記載したように、これらの構築物をｐＤＩプラスミドにクローニングし、誘導性共刺激構築物及び抗ＣＤ１９  ＣＡＲの両方の発現をＪｅＴプロモータによって制御した。更に、これらの構築物は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ部位特異的エンドヌクレアーゼと共に送達されたときにＴＲＡＣ遺伝子座への標的遺伝子の挿入を可能にするために、ＴＲＡＣ相同性アームに隣接させた。これらの構築物を逆方向末端反復配列に更に隣接させた。
【０２６０】
いくつかの実験において、ドナー鋳型は、ｐＤＩプラスミドの線状化後に線状化ＤＮＡとして送達されるであろう。他の場合には、ドナー鋳型はウイルス送達のためにＡＡＶ６粒子にパッケージングされるであろう。
【０２６１】
Ｎ６共刺激ドメインのみを有する誘導性共刺激構築物と共に抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を、ｉＮ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞と呼ぶ。ＭｙＤ８８及びＮ６共刺激ドメインの両方を有する誘導性共刺激構築物と共に抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を、ｉＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞と呼ぶ。
【０２６２】
２．殺細胞、増殖、及びサイトカイン分泌に関する誘導性構築物を用いたＣＡＲＴ細胞の評価
いくつかの実験において、ｉＮ６ＣＡＲ  Ｔ細胞又はｉＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞は、初回抗原刺激を受けたＴ細胞を線形化鋳型プラスミド、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ、及びＳＴＩＮＧｓｉＲＮＡでヌクレオフェクションして、細胞内核酸センサーにより媒介される毒性を低減することによって、実施例４で上述したように作製する。ｉＮ６ＣＡＲ  Ｔ細胞又はｉＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞を記載のように更に成長及び拡大させる。
【０２６３】
誘導性構築物の二量体化を誘導し、細胞内で共刺激シグナル伝達を開始する小分子ｒｉｍｉｄｕｃｉｄの存在下及び非存在下における殺細胞能力、増殖、及びサイトカイン分泌について、ｉＮ６ＣＡＲ  Ｔ細胞及びｉＭｙＤ８８／Ｎ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞を特性化する。殺細胞能力及び増殖を評価するために、ＣＡＲ  Ｔ細胞を実施例３で上述した抗原誘発ストレス試験にかけ、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々なエフェクター：標的比でＣＤ１９（「Ｋ１９」細胞）を発現するように操作されたＫ５６２細胞と共培養する。増殖についても、セルトレースバイオレットで細胞を標識し、抗原を担持するＫ１９細胞と様々なエフェクター：標的比で共培養することによって、実施例４で記載したように評価する。サイトカイン分泌（例えば、ヒトＩＬ−２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγ）は、様々なエフェクター：標的比でＫ１９細胞と共培養した後、上記の実施例２で記載したように決定する。
【０２６４】
殺細胞、増殖、及びサイトカイン分泌を調べる同様の実験は、組換えＡＡＶ粒子の形質導入を用いて、初回抗原刺激を受けたＴ細胞にドナー鋳型を送達し、ＴＲＣ１−２×．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでこれを更にヌクレオフェクトして行う。
【０２６５】
３．ｉＭｙＤ８８／Ｎ６ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖
誘導性構築物中の新規共刺激ドメインの機能性を特性化するために、初回抗原刺激を受けたＴ細胞を、ｉＭｙＤ８８／Ｎ６誘導性共刺激構築物を発現する線状化プラスミドＤＮＡ、又は対照としてＣＡＲの一部として発現させたＮ６共刺激ドメインでヌクレオフェクトした。細胞を、上記のようにＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ部位特異的エンドヌクレアーゼ及びＳＴＩＮＧｓｉＲＮＡで更にヌクレオフェクトした。陰性対照として、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ部位特異的エンドヌクレアーゼ及びＳＴＩＮＧｓｉＲＮＡのみを用いて別個の試料をヌクレオフェクトした。ＣＡＲドナー鋳型構築物を図１７に示す。上記のように、Ｎ６  ＣＡＲをコードする構築物を７２０６と呼び、配列番号３８として提供する。ｉＭｙＤ８８／Ｎ６共刺激ドメインをコードする構築物を７２３５と呼び、配列番号４２として提供する。
【０２６６】
ヌクレオフェクション後、Ｔ細胞試料を、５％ＦＢＳ及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ−Ｖｉｖｏ（Ｌｏｎｚａ）培地中に６時間静置した。次いで、試料を半分に別々のウェルに分け、一方のウェルには５ナノモルの最終濃度でｒｉｍｉｄｕｃｉｄを入れ、他方のウェルは未処理のままにした。続いて細胞を５日間インキュベートした。５日目に、残りのＣＤ３＋Ｔ細胞をヒトＣＤ３陽性選択キットＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて標識し、製造元の推奨に従って磁気的に除去した。残りのＣＤ３枯渇画分を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５及び３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＸ−Ｖｉｖｏ培地に再懸濁した。ヌクレオフェクション後０日目にｒｉｍｉｄｕｃｉｄを入れた試料には、５ナノモルの最終濃度で新鮮なｒｉｍｉｄｕｃｉｄをスパイクしたが、未処理の試料はサイトカイン添加Ｘ−Ｖｉｖｏのみに再懸濁した。次に細胞を更に２日間インキュベートした。
【０２６７】
アッセイ用の試料を調製するために、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄを入れた、又は入れなかったｉＭｙＤ８８／Ｎ６条件及びＮ６条件の２ｅ６Ｔ細胞と、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのみの対照Ｔ細胞を、セルトレースバイオレット（ＣＴＶ）溶液の２μＭ溶液で、インビトロで標識した。インキュベーション後、ＣＤ１９−ビオチンＦｃ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びストレプトアビジンＰＥ（ＢＤ）で染色した後、ＣＴＶ標識の一貫性及びＣＡＲ  Ｔ細胞頻度をＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬＳＲ：Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータで評価した。ＣＡＲ  Ｔ細胞頻度は、サイトカインを添加していないＸ−Ｖｉｖｏ培地中の９６ウェル丸底プレート上の２つの別々のウェルに２ｅ５総Ｔ細胞（２ｅ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞）を加えて、加えた全Ｔ細胞集団の１％に対して正規化した。次いで、一方のウェルに４ｅ３の標的Ｋ１９細胞を入れ、他方のウェルには対照として４ｅ３のＫ５６２細胞を入れた。次に、ヌクレオフェクション後０日目と５日目にそれぞれｒｉｍｉｄｕｃｉｄを入れた試料に、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄを加えた。細胞を混合し、合計６日間インキュベートした。
【０２６８】
共培養後６日目に、フローサイトメトリ分析のために試料を染色した。個々のＴ細胞サブセットの増殖を定量するために、試料をＣＤ４ＢＶ７１１及びＣＤ８ＢＶ７８５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ゴースト色素ＢＶ５１０（ＴＯＮＢＯｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を染色カクテルに添加することによって分析中に死細胞を排除した。染色後、試料を流し、データをＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬＳＲ：Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータで収集した。
【０２６９】
４．増殖研究の結果
新規誘導性共刺激構築物ｉＭｙＤ８８／Ｎ６をＮ６ＣＡＲと比較した増殖アッセイの結果を図１８〜図２０に示す。非ＣＡＲ発現ＴＲＣのみのヌクレオフェクト細胞からのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｋ１９細胞（淡い陰影）又はＫ５６２細胞（濃い陰影）のいずれかと共培養した場合に、同様のレベルの非特異的増殖を示した（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。
【０２７０】
対照的に、Ｎ６ＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖は、Ｋ５６２細胞（濃い陰影）とは反対にＫ１９細胞（淡い陰影）と共培養したときにＣＴＶの希釈が大きかったため、抗原依存的であった（図１９Ａ及び図１９Ｃ）。更に、非誘導性Ｎ６ＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ及びＫ１９細胞の存在下（濃い陰影）又は非存在下（淡い陰影）で両方のＴ細胞サブセットの実質的な増殖を示し（図１９Ｂ及び図１９Ｄ）、スイッチ依存性共刺激ドメインの非存在下ではｒｉｍｉｄｕｃｉｄはいかなる機能も有さないことを示した。
【０２７１】
誘導性共刺激構築物について、ｉＭｙＤ８８／Ｎ６を発現するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖は、Ｋ５６２対照細胞（濃い陰影）と比較して、Ｋ１９細胞（淡い陰影）と共培養した場合に多かった（図２０Ａ及び図２０Ｃ）。重要なことに、ＣＴＶ希釈の増加は、分析した両方のＴ細胞サブセットについてＫ１９細胞と共に培養した場合、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ処理していない試料（淡い陰影）と比較してｒｉｍｉｄｕｃｉｄ（濃い陰影）に依存し、ｉＭｙＤ８８／Ｎ６スイッチの誘導機能を支持した（図２０Ｂ及び図２０Ｄ）。
【０２７２】
５．結論
ＣＡＲ  Ｔ細胞上の新規誘導性共刺激構築物ｉＭｙＤ８８／Ｎ６の発現は、抗原依存性であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖をもたらした。驚くべきことに、培養Ｔ細胞上のＣＴＶの希釈は、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄの存在下で最大であり、ＣＡＲ  Ｔ細胞中で発現された場合の共刺激ドメイン構築物の誘導性の性質を示している。共刺激ドメインがＣＡＲの一部として発現される場合に、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄはＣＡＲ  Ｔ細胞増殖に影響を及ぼさなかったため、これらのデータは、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能に対する新規スイッチ共刺激ドメインの機能性を支持する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019528769.tif 000043
2019528769.tif 000044
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