(57)【要約】  標的エピトープに結合し得る抗体を設計する、コンピュータにより実施される方法が開示される。ある配置では、本方法は、標的エピトープの上の１個以上のホットスポット部位のうち対応する１つにそれぞれ結合し得る１個以上のホットスポット残基を特定することを含む。候補抗体構造は、抗体構造内の特徴的な原子と、ホットスポットに特徴的な原子が、所定の閾値よりも小さい平均空間偏差で計算により重ね合わせられるように、データベースから選択される。設計された抗体は、推定アフィニティが増加するように、マッチング残基を異なる残基で置き換えることによって作成される。
2019505880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的エピトープに結合し得る抗体を設計する、コンピュータにより実施される方法であって、
ａ）前記標的エピトープ上の１個以上のホットスポット部位のそれぞれ対応する１つの部位に結合し得る１個以上のホットスポット残基を特定する工程であって、それぞれのホットスポット残基が、ホットスポットサブ構造に特徴的な１個以上の原子を含むホットスポットサブ構造を含む、工程と、
ｂ）抗体構造のデータベースから、１個以上の候補抗体構造を選択する工程であって、それぞれの候補抗体構造が、マッチング残基サブ構造に特徴的な１個以上の原子を含むマッチング残基サブ構造をそれぞれ含む１個以上のマッチング残基を含み、この選択が、前記抗体構造内の前記マッチング残基サブ構造に特徴的な原子の相対的な位置と、前記ホットスポットサブ構造に特徴的な原子の相対的な位置が、前記標的エピトープに結合したときに、前記マッチング残基サブ構造に特徴的な原子のうち少なくとも３個が、対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子に計算的に重ね合わせられ、重ね合わされた特徴的な原子のそれぞれの対の間の空間偏差が、全ての対に対して平均化され、これが所定の閾値未満であるように行われる、工程と、
ｃ）前記候補抗体構造の１つを改変することによって設計された抗体を作成する工程であって、この改変が、前記設計された抗体と前記標的エピトープとの間の推定アフィニティが、前記候補抗体構造と前記標的エピトープとの間の推定アフィニティよりも大きくなるように、前記マッチング残基の少なくとも１個を異なる残基と置き換えること、または、それぞれの前記マッチング残基が、既に、前記マッチング残基とマッチングする前記ホットスポット残基と同じアミノ酸の残基である場合には、設計された抗体構造として候補抗体構造の１つを出力することとを含む、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記所定の閾値が２．０オングストロームである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において、前記改変が、前記マッチング残基の少なくとも１個をそれぞれ、前記マッチング残基とマッチングする前記ホットスポット残基と同じアミノ酸の残基と置き換えることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記マッチング残基の少なくとも１個のα炭素原子が、前記重ね合わされた特徴的な原子の対の１つである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記重ね合わされた特徴的な原子の対が、前記α炭素と、カルボキシル基に由来する骨格炭素原子、骨格窒素、骨格酸素および少なくとも１個の前記マッチング残基のそれぞれの側鎖のβ炭素の少なくとも１つとを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記重ね合わされた特徴的な原子の対が、α炭素と、カルボキシル基に由来する骨格炭素原子、骨格窒素、骨格酸素および少なくとも１個の前記マッチング残基のそれぞれの側鎖のβ炭素の少なくとも２つとを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記１個以上のマッチング残基が、１個のマッチング残基のみからなる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができる、前記マッチング残基サブ構造に特徴的な少なくとも３個の原子は、前記マッチング残基のα原子と、前記マッチング残基のカルボキシル基に由来する骨格炭素、前記マッチング残基の骨格窒素、前記マッチング残基の骨格酸素および前記マッチング残基の側鎖のβ炭素の少なくとも２つとを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１個以上のマッチング残基が、第１のマッチング残基と第２のマッチング残基からなる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のマッチング残基が、前記対応するホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができる前記マッチング残基サブ構造に特徴的な少なくとも２個の原子を含み、前記第２のマッチング残基が、前記対応するホットスポットサブ構造の原子に重ね合わせることができる少なくとも前記マッチング残基サブ構造に特徴的な１個の原子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１個以上のマッチング残基が、第１のマッチング残基と、第２のマッチング残基と、第３のマッチング残基とからなる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のマッチング残基、前記第２のマッチング残基、および前記第３のマッチング残基のそれぞれが、前記対応するホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができる前記マッチング残基サブ構造に特徴的な３個の原子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記３個のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子が、α炭素原子、骨格炭素原子および骨格窒素原子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１個以上のマッチング残基が、少なくとも２個のマッチング残基を含み、前記データベースからの１個以上の候補抗体構造の選択が、さらに、
前記ホットスポット残基の異なるサブ構造中の同じ特徴的な原子間の全ての可能な対の間の分離を表す第１の距離のセットを決定する工程と、
前記マッチング残基の異なるサブ構造中の同じ特徴的な原子間の全ての可能な対の間の分離を表す第２の距離のセットを決定する工程と、
所定の分離閾値内でマッチングが得られるまで、異なる抗体構造についての第１の距離のセットと第２の距離のセットを比較する工程と
を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記１個以上のマッチング残基が、１個のマッチング残基を含み、前記データベースからの１個以上の候補抗体構造の選択が、さらに、
前記ホットスポット残基のサブ構造中の異なる特徴的な原子間の全ての可能な対の間の分離を表す第１の距離のセットを決定する工程と、
マッチング残基のサブ構造中の異なる特徴的な原子間の全ての可能な対の間の分離を表す第２の距離のセットを決定する工程と、
所定の分離閾値内でマッチングが得られるまで、異なる抗体構造についての第１の距離のセットと第２の距離のセットを比較する工程と
を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１の工程（ｂ）の選択が、マッチングが得られるまで、前記第１の距離のセットと前記第２の距離のセットを比較することによって、前記データベース中の抗体構造のサブセットを予備選択し、その後に、前記マッチング残基サブ構造に特徴的な原子の少なくとも３個を、前記対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができるかどうかを、前記重ね合わされた特徴的な原子のそれぞれの対の間の空間偏差を、全ての対に対して平均化し、これが所定の閾値未満であるかで判定することによって、候補抗体構造を得るためのさらなる選択を行うことにより行われる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記設計された抗体を作成することが、前記標的エピトープに結合するときに、前記候補抗体構造の中の１個以上の原子と前記標的エピトープ中の１個以上の原子との間で、１個以上の原子が、物理的に可能な状態よりもお互いに近い位置を占めると予想される場合に、幾何学的な衝突を検出することを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記検出された幾何学的な衝突が、前記候補抗体構造の残基の側鎖によるかどうかを判定し、それによる場合には、側鎖を改変することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記側鎖が、アラニン側鎖、グリシン側鎖、バリン側鎖、セリン側鎖、スレオニン側鎖またはホモアラニン側鎖に改変される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出された幾何学的な衝突が、任意の候補抗体残基の骨格またはβ炭素原子によるかどうかを判定し、それによる場合には、選択された候補抗体構造を破棄し、前記データベースから選択される異なる候補抗体構造を用い、この決定を繰り返すことをさらに含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記設計された抗体を作成することが、さらに、前記候補抗体構造の残基のアミノ酸タイプを繰り返し変異させ、前記設計された抗体と前記標的エピトープとの推定アフィニティを高めることを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記繰り返し変異される残基の選択が、前記ホットスポット残基が変異されないように制約される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記繰り返し変異される残基の選択が、ホットスポット残基の変異を避けるように制約されない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記設計された抗体を作成することが、さらに、前記候補抗体構造の１つ以上のＣＤＲループのそれぞれと、ＣＤＲループデータベースからのＣＤＲループとを繰り返しスワッピングし、前記候補抗体構造と前記標的エピトープとの推定アフィニティを高めることを含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＤＲループのスワッピングが、ホットスポット残基の全てが保持されるように制約される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤＲループのスワッピングが、ホットスポット残基の少なくとも１つが保持されるように制約される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＤＲループのスワッピングが、ＣＤＲＨ３ループおよびＣＤＲＬ３ループのうち少なくとも１つをスワッピングすることを含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＤＲループのスワッピングが、ＣＤＲＨ３ループを少なくともスワッピングすることを含む、請求項２４〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＤＲループをスワッピングすることが、さらに、スワッピングするＣＤＲループの中の残基のアミノ酸タイプを繰り返し変異させ、前記候補抗体構造と前記標的エピトープとの推定アフィニティを高めることを含む、請求項２３から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ホットスポット残基の特定が、前記標的エピトープに結合することが知られている同族タンパク質バインダーから得られる、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ホットスポット残基の特定が、前記残基を含む抗体と前記標的エピトープとの間で不釣合いな量の結合エネルギーが与えられることと一致させて、前記標的エピトープとの相互作用を与えることが予想される残基を繰り返し発見するための数値的な方法を使用することによって得られる、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記ホットスポット残基と、前記標的エピトープ上の前記対応するホットスポット部位とのそれぞれの対が、前記残基を含む抗体と前記標的エピトープとの間で不釣合いな量の結合エネルギーが与えられることと一致させて、前記ホットスポット残基と前記標的エピトープとの相互作用を規定する、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｂ）の選択が、前記抗体構造の上の相互作用部位内のマッチング残基をもっぱら探すことによって行われ、前記相互作用部位は、抗体Ｆｖドメインの表面にあるＣＤＲループまたはＣＤＲループと任意の領域からなる、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも工程（ｂ）がコンピュータによって実施される、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも工程（ｂ）および（ｃ）がコンピュータによって実施される、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）がそれぞれコンピュータによって実施される、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記設計された抗体が、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖを含む任意の抗体形態で出力される、請求項１から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
コンピュータに、請求項１から３７のいずれかに記載の方法を実行させるためのコンピュータ可読命令を含む、コンピュータ可読媒体または信号。
【請求項３９】
抗体を製造する方法であって、
請求項１〜３７のいずれかに記載の方法を用いて抗体を設計する工程と、
このようにして設計された抗体を製造する工程と
を含む、方法。
【請求項４０】
前記抗体を製造する工程が、宿主細胞において抗体のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現し、前記抗体を精製し、場合により、前記抗体をさらなる分子に接合させることを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載の方法を用いて得た、または得ることができる抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的エピトープに結合し得る抗体のコンピュテーショナルデザインに関する。
【背景技術】
【０００２】
正しいエピトープを標的とすることは、所望の作用機序を達成するためのモノクローナル抗体の選択において重要な段階である。治療用および診断用の新規抗体の発見のための現在の手法は、免疫化動物における標的タンパク質に対する抗体の惹起、またはディスプレイ技術を用いたナイーブライブラリまたは免疫化ライブラリのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに依存する。いずれの方法も、アフィニティ、特異性、エピトープおよび結合様式を完全に制御することはできない。
【０００３】
Ｓｏｒｍａｎｎｉら（Sormanni,P.,Aprile,F.A.,Vendruscolo,M.Rational design of antibodies targeting specific epitopes within intrinsically disordered proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.112,9902-9907(2015))、Robinsonら(Robinson,L.N.ら、Structure-guided design of an anti-dengue antibody directed to a non-immunodominant epitope.Cell 162,493-504(2015))、Lippowら(Lippow,S.M.,Wittrup,K.D.&Tidor,B.Computational design of antibody-affinity improvement beyond in vivo maturation.Nat.Biotechnol.25,1171-1176(2007))およびKurodaら(Kuroda,D.,Shirai,H.,Jacobson,M.P.&Nakamura,H.Computer-aided antibody design.Protein Eng.Des.Sel.,25,507-521(2012)）は、合理的に抗体を作成しようと試みて、ある程度の成功を示しているが、標的タンパク質に対する前もって選択されたエピトープを標的とする抗体のコンピュテーショナルデザインには、依然として困難な問題がある。
【０００４】
計算による抗体の設計は、界面のＣＤＲ配列空間のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスキャニングによって、アフィニティおよび安定性を高めるための抗体の合理的な設計を可能にしている（Lippowら(上述)およびJordanら(Jordan,A.L.ら、Structural understanding of stabilization patterns in engineered bispecific Ig-like antibody molecules.Proteins 77,832-841(2009))を参照）。ＯｐｔＭＡＶＥｎなどの一般的な抗体設計の手法の近年の進歩（Li,T.,Pantazes,R.J.,Maranas,C.D.OptMAVEn-a new framework for the de novo design of antibody variable region models targeting specific antigen epitopes.PLoS One.9,e105954(2014))およびAbDesign(Lapidoth,G.D.ら、AbDesign:An algorithm for combinatorial backbone design guided by natural conformations and sequences.Proteins 83,1385-1406(2015)）は、人工抗体足場の可能な結合状態をサンプリングするためのタンパク質−タンパク質ドッキング、その後の、コンビナトリアル骨格の構成の生成と配列空間のスキャニングに基づく。しかし、今まで、これらの方法から設計された抗体の実験的検証の究極の証明はなく、精密なエピトープを標的とする高アフィニティ抗体のコンピュテーショナルデザインは、依然として大部分が未解決の問題である。予備選択されたエピトープにおいて、高アフィニティで結合する抗体の設計のための計算方法の開発は、エピトープ依存性の作用機序を達成し、しばしば生物学的に関連性のある保存されたオルトステリック部位である免疫化盲点にアクセスするなどの広範囲の用途を有するだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sormanniら、Sormanni,P.,Aprile,F.A.,Vendruscolo,M.Rational design of antibodies targeting specific epitopes within intrinsically disordered proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.112,9902-9907(2015)
【非特許文献２】Robinsonら、Robinson,L.N.ら、Structure-guided design of an anti-dengue antibody directed to a non-immunodominant epitope.Cell 162,493-504(2015)
【非特許文献３】Lippowら、Lippow,S.M.,Wittrup,K.D.&Tidor,B.Computational design of antibody-affinity improvement beyond in vivo maturation.Nat.Biotechnol.25,1171-1176(2007)
【非特許文献４】Kurodaら、Kuroda,D.,Shirai,H.,Jacobson,M.P.&Nakamura,H.Computer-aided antibody design.Protein Eng.Des.Sel.,25,507-521(2012)
【非特許文献５】Jordanら、Jordan,A.L.ら、Structural understanding of stabilization patterns in engineered bispecific Ig-like antibody molecules.Proteins 77,832-841(2009)
【非特許文献６】Li,T.,Pantazes,R.J.,Maranas,C.D.OptMAVEn-a new framework for the de novo design of antibody variable region models targeting specific antigen epitopes.PLoS One.9,e105954(2014)
【非特許文献７】AbDesign(Lapidoth,G.D.ら、AbDesign:An algorithm for combinatorial backbone design guided by natural conformations and sequences.Proteins 83,1385-1406(2015)
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、抗体のコンピュテーショナルデザインのための別の枠組みを提供することである。
【０００７】
本発明の一態様によれば、標的エピトープに結合し得る抗体を設計する、コンピュータにより実施される方法であって、ａ）標的エピトープ上の１個以上のホットスポット部位のそれぞれ対応する１つの部位に結合し得る１個以上のホットスポット残基を特定する工程であって、それぞれのホットスポット残基が、１個以上のホットスポットサブ構造に特徴的な原子を含むホットスポットサブ構造を含む、工程と、ｂ）抗体構造のデータベースから、１個以上の候補抗体構造を選択する工程であって、それぞれの候補抗体構造が、１個以上のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子を含むマッチング残基サブ構造をそれぞれ含む１個以上のマッチング残基を含み、この選択が、抗体構造内のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子の相対的な位置と、ホットスポットサブ構造に特徴的な原子の相対的な位置が、標的エピトープに結合したときに、マッチング残基サブ構造に特徴的な原子のうち少なくとも３個が、対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子の上に計算的に重ね合わせられ、重ね合わされた特徴的な原子のそれぞれの対の間の空間偏差が、全ての対に対して平均化され、これが所定の閾値未満であるように行われる、選択する工程と、ｃ）候補抗体構造の１つを改変することによって設計された抗体を作成する工程であって、この改変することが、設計された抗体と標的エピトープとの間の推定アフィニティが、候補抗体構造と標的エピトープとの間の推定アフィニティよりも大きくなるように、マッチング残基の少なくとも１個を異なる残基と置き換えること、または、それぞれのマッチング残基が、既に、マッチング残基とマッチングするホットスポット残基と同じアミノ酸の残基である場合には、設計された抗体構造として候補抗体構造の１つを出力することとを含む、作成する工程とを含む、方法が提供される。
【０００８】
本願発明者らは、上述の枠組みに基づき、既に特定されたホットスポットが介在する相互作用によって導かれる、天然に存在するタンパク質結合部位に結合する新規な抗体を設計することができることを示した。この新規な計算手法は、治療用途および診断用途のための結合様式を正確に制御しつつ、新規な抗体の構造に基づく合理的な設計の可能性を与える。
【０００９】
設計された抗体の結合アフィニティは、場合により、ＣＤＲ配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスワップおよび再設計によって任意にさらに最適化される。例示は、核因子様２（Ｎｒｆ２）結合部位でのＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ関連タンパク質１（Ｋｅａｐ１）に対するナノモルレベルの結合アフィニティを有する抗体のコンピュテーショナルデザインにより達成された。設計された抗体の１つのＸ線共結晶構造は、対応するコンピュテーショナルモデルとの原子レベルの一致を示し、予備選択されたエピトープを標的とする抗体の実験的に検証されたコンピュテーショナルデザインの適用の成功を示している。
【００１０】
一実施形態では、データベースからの候補抗体構造の選択は、特徴的な原子間のマッチング距離に基づく予備選択を用い、その後、重ね合わされた特徴的な原子のそれぞれの対の間の空間偏差が、全ての対に対して平均化され、これが所定の閾値未満であるように、マッチング残基サブ構造に特徴的な原子のうち少なくとも３個を、対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができるかどうかを判定することに基づくさらなる選択を用いて行われる。この２工程の手法によって、候補抗体構造を、特に効率的にデータベースから選択することができる。この効率の増加は、抗体構造の利用可能なデータベースがさらに大きくなるにつれ、ますます重要になると予想される。
【００１１】
一実施形態では、設計された抗体を作成することは、さらに、候補抗体構造の１つ以上のＣＤＲループと、ＣＤＲループデータベースからのＣＤＲループとを繰り返しスワッピングし、候補抗体構造と標的エピトープとの推定アフィニティを高めることを含む。本願発明者らは、有利には、この工程が、設計された抗体と標的エピトープとの間のアフィニティの改良を達成することができる、さらなる立体配座の自由度を与えることを発見した。この工程がない場合、データベースから入手可能な抗体構造の数が比較的限られていることは、標的タンパク質に対する選択されたエピトープに対し、最適な形状／静電の相補性を生成するＣＤＲを含む高アフィニティ抗体を見つけることが困難であり得ることを意味する。ＣＤＲループのスワップは、多数の配列および実験的に決定されたＣＤＲ構成を他の抗体構造から活用して、新しいキメラ抗体モデルを構築する。ＣＤＲループのスワップを本発明の他の工程と組み合わせることにより、選択された結合部位を標的とする高アフィニティ抗体の迅速な生成が可能になる。
【００１２】
本発明の実施形態は、対応する参照符号が対応する部分を表している添付の図面を参照しつつ、単なる例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】標的エピトープに結合し得る抗体を設計する方法例における工程を示す。
【図２】データベースから候補抗体構造を選択する工程の実施例を示す。
【図３】複数のマッチング残基に関する予備選択過程を示す。
【図４】３個のホットスポットサブ構造について、第１の距離のセットを計算するための概略的な幾何形状の例を示す。
【図５】単一のマッチング残基に関する予備選択過程を示す。
【図６】重ね合わせに関与する３個の特徴的な原子を含むホットスポットサブ構造において、第１の距離のセットを計算するための概略的な幾何形状の例を示す。
【図７】重ね合わせに関与する４個の特徴的な原子を含むホットスポットサブ構造において、第１の距離のセットを計算するための概略的な幾何形状の例を示す。
【図８】特徴的な原子が、所定の閾値内の平均空間偏差でいつ重ね合わされるのかを判定するための手順の一例を示す。
【図９】幾何学的な衝突が検出されたときに、設計された抗体を洗練させるための手順の一例を示す。
【図１０】Ｎｒｆ２結合部位を標的とする抗−Ｋｅａｐ１抗体におけるホットスポットによって導かれる抗体足場接合設計のワークフローの一例を示す。
【図１１】Ｇ５４．１／ｋｅａｐ１およびＧ８５／ｋｅａｐ１相互作用のＳＰＲ動態プロフィールを示し、ｋｅａｐ１の滴定は、固定された抗−ｋｅａｐ１  Ｆａｂを含むチップ表面の上を流れ、Ｆａｂの設計は、接合されたＮｒｆ２ホットスポットから誘導された。
【図１２】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発からの対応する元のＰＤＢ足場構造および改変体を用いた、Ｇ５４（ａ）およびＧ８５（ｂ）の２種類の最良のホットスポット接合設計のＶＨ領域の配列アラインメントを示す。「Ｍ」と標識された残基は、ホットスポット接合と、衝突を減らすためのアラニン変異の後の足場とは異なるアミノ酸を表す。「Ｇ」は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発中に導入される残基を示し、それぞれ改変体Ｇ５４．１およびＧ８５．１を与える。接合される３種類のＮｒｆ２によって誘発されるホットスポットには、アスタリスクが付けられている。
【図１３】ｋｅａｐ１結合部位と相互作用する同族の高アフィニティＮｒｆ２ペプチドセグメントの競争滴定存在下、Ｇ５４．１／ｋｅａｐ１およびＧ８５／ｋｅａｐ１相互作用のＳＰＲ動態プロフィールを示し、したがって、ｋｅａｐ１のＮｒｆ２結合部位に対する設計された抗体の特異的な結合を示している。
【図１４】Ｎｒｆ２結合部位を標的とする抗−Ｋｅａｐ１における、Ｋｅａｐ１との複合体中の設計された抗体Ｇ５４．１（左）およびＧ８５（右）のモデル化された結合状態を示す。ＣＤＲＨ２ループおよびＮｒｆ２ペプチドの上に、３種類のホットスポット残基（棒状物として示される）骨格が重ね合わされている。
【図１５】Ｇ５４．１抗体のアフィニティ向上におけるＣＤＲＨ３ループスワップ設計のワークフローを示す。
【図１６】設計されたＧ５４．１抗体のＣＤＲループ型のＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアの分解を示す。Ｇ５４．１とＫｅａｐ１との間のＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアに対する個々のＣＤＲループの寄与は、モデル化されたＧ５４．１／Ｋｅａｐ１複合体構造のＦｖフラグメントからそれぞれのＣＤＲループを切断することによって概算された。
【図１７】ＣＤＲＨ３ループスワップによるＧ５４．１抗体のアフィニティ向上におけるＧ５４．１のＣＤＲＨ３スワップ改変体中のＣＤＲＨ３ループの配列アラインメントを示す。
【図１８】親Ｇ５４．１  Ｆａｂを超える設計されたＣＤＲＨ３スワップ改変体の相対的な結合アフィニティの向上を示す。
【図１９】ＣＤＲＨ３ループスワップによるＧ５４．１抗体のアフィニティ改良における、計算によりモデル化されたＣＤＲＨ３の構成と、親５４．１および４種類の最もアフィニティが高い改良されたＣＤＲＨ３スワップ設計と、Ｋｅａｐ１の相互作用態様を示す。ＣＤＲＨ３ループにおける鍵となる接触残基は、棒状物として示されている。
【図２０】４種類の最もアフィニティが高い改良されたＣＤＲＨ３スワップ設計の単離されたモデル化されたＣＤＲＨ３ループの構成と、Ｋｅａｐ１（ａ、ＬＳ１７１；ｂ、ＬＳ１４５；ｃ、ＬＳ１６８；ｄ、ＬＳ１４６）との相互作用態様の拡大図を示す。ＣＤＲＨ３（淡い灰色）とＫｅａｐ１（濃い灰色）の構成および相互作用態様は、上面（左）から側面（右）を示す。ＣＤＲＨ３ループにおける鍵となる接触残基は、棒状物として示されている。ＬＳ１７１のＶＨ９９ＬおよびＶＨ１００Ｙ、ＬＳ１６８のＶＨ９７Ｗ、ＬＳ１４６のＶＨ９７Ｙが、抗体とＫｅａｐ１との間の界面の空洞を占有しており、ＬＳ１４５またはＧ５４．１によって占有されていない（比較のために図１９も参照）。
【図２１】コンピュテーショナルデザインの精度を示すＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。
【図２２】ＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体における結晶充填を示す。非対称の単位は、ＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の２つのコピーを含む。
【図２３】ＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の接合されたホットスポット（ｈｏｔｐｏｔ）結合部位２Ｆ０−ＦＣマップを示す。２Ｆ０−ＦＣは、非対称単位において、２種類の分子のためのＫｅａｐ１と相互作用する接合したホットスポットおよび他のＬＳ１４６−ｓｃＦｖ  ＣＤＲＨ２残基のマップ電子密度（灰色の網掛け、１．０σで輪郭を示している）を省略している。結晶水は、灰色の球で示されている。
【図２４】Ｋｅａｐ１のＮｒｆ２結合部位を占有していることを確認する、ＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。
【図２５】コンピュテーショナルデザインの精度を示すＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。ＣＤＲＨ２のＬＳ１４６−ｓｃＦｖエピトープの拡大図。鍵となる接触残基は、棒状物として示されており、水素結合は、点線として示されている。
【図２６】接触しているＣＤＲという観点で着色されたＫｅａｐ１分子表面の上にマッピングされたＬＳ１４６−ｓｃＦｖエピトープの拡大図を示す。
【図２７】コンピュテーショナルデザインの精度を示すＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。ＣＤＲＨ３のＬＳ１４６−ｓｃＦｖエピトープの拡大図。鍵となる接触残基は、棒状物として示されており、水素結合は、点線として示されている。
【図２８】コンピュテーショナルデザインの精度を示すＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。ＣＤＲＨ１のＬＳ１４６−ｓｃＦｖエピトープの拡大図。鍵となる接触残基は、棒状物として示されており、水素結合は、点線として示されている。
【図２９】コンピュテーショナルデザインの精度を示すＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。ＶＨフレームワーク３（Ｆｒ３）のＬＳ１４６−ｓｃＦｖエピトープの拡大図。鍵となる接触残基は、棒状物として示されており、水素結合は、点線として示されている。
【図３０】コンピュテーショナルデザインの精度を示すＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。結晶ＬＳ１４６−ｓｃＦｖと、モデル化されたＬＳ１４６−Ｆａｂの結合様式を、Ｋｅａｐ１部位に重ね合わせることによって比較。
【図３１】コンピュテーショナルデザインの精度を示すＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。ＬＳ１４６  Ｆｖ領域の結晶（左）およびモデル化された（右）構造からのＣＤＲＨ２ループ（ホットスポットアクセプター）の骨格の構成および側鎖の向きの比較。鍵となるＣＤＲＨ３残基は、棒状物として示されており、推定モデルからＶＨ５２Ｄの構成に影響を与える水素結合は、点線として示されている。
【図３２】コンピュテーショナルデザインの精度を示すＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体の結晶構造を示す。結晶（左）およびモデル化された（右）構造からのＶＨ／ＶＬ界面に充填された残基の比較。推定から明らかな配座変化を受ける鍵となる充填残基は、棒状物として示される。
【図３３】Ｂｉａｃｏｒｅ競合アッセイにおけるＬＳ１４６−ｓｃＦｖ対ＬＳ１４６−Ｆａｂの効力の比較を示す。ＩＣ５０値は、正規化された応答／可変勾配モデルに対する対数濃度にフィッティングすることによって計算された。
【数１】
2019505880.tif 000003
【図３４】受容体によって誘発されるホットスポット残基とフレソリムマブによって誘発されるホットスポット残基の例を合わせて移すことによる、ｐａｎ−ＴＧＦｂブロッキングＦａｂフラグメント設計において、ＴＧＦβＲ１および２と、フレソリムマブとからの組み合わせたホットスポット残基を示す。
【図３５】受容体によって誘発されるホットスポット残基とフレソリムマブによって誘発されるホットスポット残基の例を合わせて移すことによる、ｐａｎ−ＴＧＦｂブロッキングＦａｂフラグメント設計において、チップに固定された設計された抗体Ｆａｂを用いたＦａｂ１８４／ＴＧＦβ複合体のＳＰＲ動態プロフィールを示す。
【図３６】受容体によって誘発されるホットスポット残基とフレソリムマブによって誘発されるホットスポット残基の例を合わせて移すことによる、ｐａｎ−ＴＧＦｂブロッキングＦａｂフラグメント設計において、ＨＥＫ  Ｂｌｕｅレポーター遺伝子細胞アッセイにおけるＦａｂ１８４  ＴＧＦβの滴定による、ＴＧＦβ受容体結合の中和を示す。
【図３７】受容体によって誘発されるホットスポット残基とフレソリムマブによって誘発されるホットスポット残基の例を合わせて移すことによる、ｐａｎ−ＴＧＦｂブロッキングＦａｂフラグメント設計において、結晶Ｆａｂ１８４と、ＴＧＦβ１側に重ね合わせることによってモデル化されたものとの結合様式の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一実施形態によれば、標的エピトープに結合し得る抗体を設計する、コンピュータにより実施される方法が提供される。図１〜図９は、フローチャート形式での方法の例示的な態様を概略的に示す。
【００１５】
本方法は、ａ）標的エピトープの上の１個以上のホットスポット部位のうち対応する１つにそれぞれ結合し得る１個以上のホットスポット残基を特定すること（図１の工程１００）を含む。各ホットスポット残基は、ホットスポットサブ構造を含む。ホットスポットサブ構造は、１個以上のホットスポットサブ構造に特徴的な原子を含む。ホットスポットサブ構造に特徴的な原子は、ホットスポット残基とは潜在的に異なる（すなわち、異なるアミノ酸に由来する）残基のマッチングのために使用される原子である。したがって、特徴的な原子は、異なる種類のアミノ酸の残基に共通する原子である。
【００１６】
本方法は、さらに、ｂ）抗体構造のデータベースから１個以上の候補抗体構造を選択すること（図１の工程２００）を含む。抗体構造、または抗体構造の関連部分は、抗体足場と呼ばれる場合がある。この選択は、ホットスポット残基（以下に記載する）とマッチングする残基を有するように改変することができる抗体構造または足場を見つけるために行われる。データベースの性質または由来は、特に限定されない。データベースのエントリーは、必要に応じてフィルタリングされてもよく、または再フォーマットされてもよい。例えば、一実施形態では、Ｘ線結晶学によって解明された構造を表すデータベースエントリーのみが使用される。一実施形態では、複数の結晶のコピーが、異なる鎖識別子を有する同じ抗体構造のために利用可能である場合、ＰＤＢファイルに現れる最初のコピーのみを使用のために保持してもよい。一実施形態では、Ｆｖ領域のみがＦａｂ構造から保たれる。一実施形態では、Ａｂｎｕｍ手順（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，Ｋ．Ｒ．＆Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５，３８３２−３８３９（２００８））を使用し、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．＆Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７３，９２７−９４８（１９９７））に従ってＦｖ構造中の残基の番号を付け直す。一実施形態では、ポリペプチドＣＤＲループが破壊された構造は廃棄される。
【００１７】
それぞれの候補抗体構造は、１個以上のマッチング残基を有する。それぞれのマッチング残基は、ホットスポット残基の対応する１つとマッチングする（以下に説明される意味で）。それぞれのマッチング残基は、マッチング残基サブ構造を含む。それぞれのマッチング残基サブ構造は、１個以上のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子を含む。この選択は、抗体構造内のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子の相対的な位置と、ホットスポットサブ構造に特徴的な原子の相対的な位置が、標的エピトープに結合したときに、マッチング残基サブ構造に特徴的な原子のうち少なくとも３個を、対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子の上に計算的に重ね合わせることができ、重ね合わされた特徴的な原子のそれぞれの対の間の空間偏差が、全ての対に対して平均化され、これが所定の閾値未満であるように行われる。平均化は、例えば、重ね合わされた特徴的な原子のそれぞれの対の間の空間的な分離を計算し、空間的な分離の平均値による平均または二乗平均平方根による平均を計算することによって達成することができる。対応するマッチング残基サブ構造に特徴的な原子およびホットスポットサブ構造に特徴的な原子のそれぞれは、一般的に、同じ種類の特徴的な原子を含む（例えば、α炭素、カルボキシル基に由来する骨格炭素、骨格窒素、骨格酸素、側鎖のβ炭素など）。したがって、２つの残基それぞれからの対応する特徴的な原子が、比較的高精度で互いに重なり合うことができるとき、マッチング残基を、ホットスポット残基とマッチングさせる（その結果、全体的に、平均偏差は、上述の所定の閾値を満足する）。マッチング残基は、ホットスポット残基と同じ種類の（すなわち、同じ側鎖を有する）アミノ酸である必要はない。マッチングは、２つの残基が、比較的高い精度で重ね合わせることができるサブ構造内の特徴的な原子を有するかどうかにのみ依存する。所与の抗体構造について、この要求を満たしたかどうかを判定するための手法の一例を、図８を参照しつつ以下に記載する。
【００１８】
少なくとも３個のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子と、対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子とを用いたマッチングは、１つ以上の特定されたホットスポット残基および標的エピトープのパラトープ／エピトープ相互作用の幾何形状の機能的に関連する態様を少なくとも部分的に保持するために、標的エピトープに対する候補抗体構造の位置および向きを制約する。３個より多い特徴的な原子のマッチングおよび／または１個より多いマッチング残基を用いたマッチングは、幾何形状の制約を増やし、パラトープ／エピトープ相互作用の幾何形状をもっと密に保持する傾向がある（以下の実施例を参照）。
【００１９】
一実施形態では、工程（ｂ）の選択は、抗体構造の上の相互作用部位内のマッチング残基を排他的に探すことによって行われ、この相互作用部位は、抗体Ｆｖドメインの表面にあるＣＤＲループまたはＣＤＲループと任意の領域からなる。
【００２０】
本方法は、さらに、ｃ）工程ｂ）で選択される候補抗体構造の１つを使用し、設計された抗体を作成すること（図１の工程３００）を含む。一実施形態では、候補抗体構造は、設計された抗体と標的エピトープとの間の推定アフィニティが、候補抗体構造と標的エピトープとの間の推定アフィニティよりも大きくなるように、マッチング残基の少なくとも１個を異なる残基と置き換えることによって改変される。異なる残基は、例えば、対応するホットスポット残基と同じ種類のアミノ酸の残基であってもよい。マッチング残基を異なる残基と置き換えることは、異なる残基の接合と呼ばれることがある。別の実施形態では、候補抗体構造は、それぞれのマッチング残基が、既に、マッチング残基とマッチングするホットスポット残基と同じアミノ酸の残基である場合には、この段階で改変することなく、設計された抗体構造として出力される。上述のいずれかの手順に従って製造された、設計された抗体構造は、設計された抗体と標的エピトープとのアフィニティをさらに高めるために、後の工程で改変されてもよい。
【００２１】
一実施形態では、工程（ｂ）で使用される所定の閾値は、２．０オングストロームであり、場合により１．７５オングストロームであり、場合により１．５オングストロームであり、場合により１．２５オングストロームであり、場合により１．０オングストロームである。所定の閾値を選択するために、ある程度の自由度がある。比較的高い閾値を選択することにより、データベースからより多くの候補抗体構造が選択されるだろう。このことは、高いアフィニティで設計された抗体構造を見つける機会が増える可能性がるが、例えば、選択された候補抗体構造の可能性を評価するために使用されるさらなる処理工程に対する要求も増える傾向がある（例えば、実際のアフィニティまたは推定アフィニティと、さらなる改変がどの程度までアフィニティを向上させ得るかを評価することによって）。比較的小さな閾値を選択することにより、データベースから選択される候補抗体構造が少なくなる可能性があるが、これらの選択された構造は平均して、より大きな可能性があるだろう。これにより、さらなる処理工程を、より集約させることが可能となり、それにより、高アフィニティの新規抗体構造をより迅速に発見する可能性がある。
【００２２】
一実施形態では、工程（ｃ）において、改変することが、マッチング残基の少なくとも１個をそれぞれ、マッチング残基とマッチングするホットスポット残基と同じアミノ酸の残基と置き換えることを含む。多くの場合、これにより、側鎖という観点でホットスポット残基と同じ少なくとも１つの残基を提示することによって、比較的高いアフィニティを達成し、ホットスポット残基が標的エピトープに結合している場合には（定義によれば、これは高アフィニティで起こる）、ホットスポット残基と非常によく似た様式で配置され、向けられている、設計された抗体構造が得られるだろう。しかし、全てのマッチング残基が、対応するホットスポットと同じ種類のアミノ酸残基と置き換わっていることは必須ではない。いくつかの場合には、マッチング残基の少なくともサブセットについて、マッチング残基を置き換えないことによって、またはマッチング残基と、対応するホットスポット残基と同じではない種類のアミノ酸残基とを置き換えることによって、さらに高いアフィニティが得られる場合がある。
【００２３】
特徴的な原子（ホットスポット残基サブ構造またはマッチング残基サブ構造のいずれか）は、α炭素、カルボキシル基に由来する骨格炭素原子、骨格窒素、骨格酸素、側鎖のβ炭素のうち１つ以上を含んでいてもよい。
【００２４】
一実施形態では、マッチング残基の少なくとも１個のα炭素原子は、重ね合わされた特徴的な原子の対の１つの中にある。
【００２５】
一実施形態では、重ね合わされた特徴的な原子の対は、α炭素と、カルボキシル基に由来する骨格炭素原子、骨格窒素、骨格酸素、および少なくとも１個のマッチング残基のそれぞれの側鎖のβ炭素のうちの少なくとも１つとを含む。したがって、この実施形態では、マッチング残基の少なくとも１つは、重ね合わせプロセスに関与する２個の特徴的な原子を含む。これにより、選択プロセスを過度に制約することなく、位置および向きに関し、比較的良好なマッチングを与える。
【００２６】
一実施形態では、重ね合わされた特徴的な原子の対は、α炭素と、カルボキシル基に由来する骨格炭素原子、骨格窒素、骨格酸素、および少なくとも１個のマッチング残基のそれぞれの側鎖のβ炭素のうちの少なくとも２つとを含む。したがって、この実施形態では、マッチング残基の少なくとも１つは、重ね合わせプロセスに関与する３個の特徴的な原子を含む。これは、残基の位置および向きの比較的高いマッチング度を与える。
【００２７】
一実施形態では、１個以上のマッチング残基は、１個のマッチング残基のみからなる。そのような実施形態では、重ね合わされた特徴的な原子の対のそれぞれは、単一のマッチング残基からの異なる特徴的な原子を含む。この種の実施形態例では、対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができる、少なくとも３個のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子は、場合により、マッチング残基のα原子と、マッチング残基のカルボキシル基に由来する骨格炭素、マッチング残基の骨格窒素、マッチング残基の骨格酸素、およびマッチング残基の側鎖のβ炭素のうちの少なくとも２つとを含む。
【００２８】
一実施形態では、１個以上のマッチング残基は、第１のマッチング残基と、第２のマッチング残基とからなる（場合により、第１のマッチング残基と第２のマッチングのみ）。この種の一実施形態の例では、第１のマッチング残基は、対応するホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができる少なくとも２個のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子を含み、第２のマッチング残基は、対応するホットスポットサブ構造の原子に重ね合わせることができる少なくとも１個のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子を含む。
【００２９】
一実施形態では、１個以上のマッチング残基は、第１のマッチング残基と、第２のマッチング残基と、第３のマッチング残基とからなる（場合により、第１のマッチング残基、第２のマッチングおよび第３のマッチング残基のみ）。この種の一実施形態の例では、第１のマッチング残基、第２のマッチング残基、第３のマッチング残基のそれぞれが、対応するホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができる３個のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子を含む。この手法は、３個のマッチング残基の相対的な位置および向きに比較的高い制約を課し、それによって、アフィニティをさらに高めるためのさらなる改変を行うことなく、（候補抗体構造の制限がより少ない選択と比較して）比較的高い平均アフィニティを有する候補抗体構造に比較的集中した選択を与える。この実施形態の特定の例では、重ね合わせに関与する３個のマッチング残基それぞれにおける３個のマッチング残基サブ構造に特徴的な原子は、α炭素原子、骨格炭素原子、骨格窒素原子を含む。本願発明者らは、以下に記載する詳細なＫｅａｐ１の例に示されるように、この組み合わせが特に有効であることを見出した。
【００３０】
図２に示されるように、一実施形態では、１個以上の候補抗体構造の選択（図１の工程２００）は、抗体構造のサブセットの予備選択（図２の工程２１０）、その後、さらなる選択（図２の工程２２０）を含む。
【００３１】
一実施形態では、予備選択（工程２１０）は、図３に示され、図４に示される概略的な幾何形状の例を参照しつつ以下に説明される工程を含む。予備選択は、ホットスポット残基の異なるサブ構造中の同じ特徴的な原子間の全ての可能な対の間の分離を表す第１の距離のセットを決定すること（工程２１１Ａ）を含む。これは、図４に概略的に示されており、二次元図で簡略化されている。図４は、３個の異なるホットスポット残基について、ホットスポット残基サブ構造に特徴的な原子を示す。円Ａ１〜Ａ３は、第１のホットスポット残基の特徴的な原子を表し、円Ｂ１〜Ｂ３は、第２のホットスポット残基の特徴的な原子を表し、円Ｃ１〜Ｃ３は、第３のホットスポット残基の特徴的な原子を表す。破線は、同じ種類の特徴的な原子（例えば、α炭素、カルボキシル基に由来する骨格炭素、骨格窒素、骨格酸素、側鎖のβ炭素など）の特徴的な原子の全ての可能な対を一緒に接続している。全ての破線の長さは、第１の距離のセット｛ｓ１１、ｓ１２、ｓ１３、ｓ２１、ｓ２２、ｓ２３、ｓ３１、ｓ３２、ｓ３３｝を表す。
【００３２】
予備選択は、さらに、マッチング残基の異なるサブ構造中の同じ特徴的な原子間の全ての可能な対の間の分離を表す第２の距離のセットを決定すること（工程２１２Ａ）を含む。このプロセスは、ホットスポット残基の代わりにマッチング残基の特徴的な原子を使用する点を除き、工程２１１Ａのプロセスと同じである。第２の距離のセットは、第１の距離のセット（例えば、９個の数字を含むセット）と同じ形態をとるだろう。一実施形態では、数値は、所定の精度レベル（例えば、最も近いオングストロームに丸められる）で表される。一実施形態では、第１の距離のセットおよび第２の距離のセットは、異なる抗体構造から得られた配列間の比較を容易にするために、正規化された形態の一連の数字として表される。一連の数字は、抗体構造のデータベースを検索するための指数として使用されてもよい（以下のＫｅａｐ１の例を参照）。
【００３３】
予備選択は、さらに、第１の距離のセットと第２の距離のセットを比較し、所定の分離閾値内でマッチングが得られたかどうかを判定すること（工程２１３Ａ）を含む。例えば、所定の精度レベル（所定の分離閾値を効果的に規定する。これより低い精度レベルは、もっと大きな所定の分離閾値に対応し、その逆も成り立つ）で表されている第１のセットを表す一連の数字を、同じ所定の精度レベルで表されている第２のセットを表す一連の数字と比較する。「はい」の場合、このプロセスは工程２１５Ａに進み、さらなる処理のために、抗体構造が出力される。「いいえ」の場合、このプロセスは、工程２１４Ａ、２１２Ａおよび２１３Ａを通ってループし、第２の距離のセットの決定と、第１の距離のセットとの比較を、マッチングが得られるまで反復して繰り返す。このプロセスは、さらなる処理のために複数の抗体構造を選択するために、出力工程２１５Ａの後に工程２１４Ａ、２１２Ａおよび２１３Ａを通ってループしてもよい。
【００３４】
一実施形態では、予備選択（工程２１０）は、図５に示され、図６および７に示される概略的な幾何形状の例を参照しつつ以下に説明される工程を含む。この実施形態では、予備選択は、１個のホットスポット残基のサブ構造中の異なる特徴的な原子間の全ての可能な対の間の分離を表す第１の距離のセットを決定すること（工程２１１Ｂ）を含む。これは、図６および７の異なる例のホットスポットサブ構造について概略的に示されており、二次元図で簡略化されている。図６は、３個の特徴的な原子Ａ１、Ａ２およびＡ３が、対応するマッチング残基サブ構造（対応する種類の対応する３個の特徴的な原子を含む）との重ね合わせに関与する、ホットスポットサブ構造の一例を示す。図７は、４個の特徴的な原子Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４が、対応するマッチング残基サブ構造（対応する種類の対応する４個の特徴的な原子を含む）との重ね合わせに関与する、ホットスポットサブ構造の代替例を示す。図６および７において、破線は、ホットスポット残基中の特徴的な原子の全ての可能な対を一緒に接続している。定義によれば、それぞれの対は、異なる種類の特徴的な原子間の対を含む。これらが同じ残基内にあるからである。全ての破線の長さは、図６の｛ｄ１、ｄ２、ｄ３｝と図７の｛ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４、ｄ５、ｄ６｝の第１の距離のセットを表す。
【００３５】
予備選択は、さらに、マッチング残基のサブ構造中の異なる特徴的な原子間の全ての可能な対の間の分離を表す第２の距離のセットを決定すること（工程２１２Ｂ）を含む。このプロセスは、ホットスポット残基の特徴的な原子の代わりにマッチング残基の特徴的な原子を使用する点を除き、工程Ｓ２１１Ｂのプロセスと同じである。第２の距離のセットは、第１の距離のセット（例えば、図６および７に示される特定の幾何形状について、３個または６個の数字を含むセット）と同じ形態をとるだろう。一実施形態では、数値は、所定の精度レベル（例えば、最も近いオングストロームに丸められる）で表される。一実施形態では、第１の距離のセットおよび第２の距離のセットは、異なる抗体構造から得られた配列間の比較を容易にするために、正規化された形態の一連の数字として表される。
【００３６】
予備選択は、さらに、第１の距離のセットと第２の距離のセットを比較し、所定の分離閾値内でマッチングが得られたかどうかを判定すること（工程２１３Ｂ）を含む。例えば、所定の精度レベル（所定の分離閾値を効果的に規定する。これより低い精度レベルは、もっと大きな所定の分離閾値に対応し、その逆も成り立つ）で表されている第１のセットを表す一連の数字を、同じ所定の精度レベルで表されている第２のセットを表す一連の数字と比較する。「はい」の場合、このプロセスは工程２１５Ｂに進み、さらなる処理のために、抗体構造が出力される。「いいえ」の場合、このプロセスは、工程２１４Ｂ、２１２Ｂおよび２１３Ｂを通ってループし、第２の距離のセットの決定と、第１の距離のセットとの比較を、マッチングが得られるまで反復して繰り返す。このプロセスは、さらなる処理のために複数の抗体構造を選択するために、出力工程２１５Ｂの後に工程２１４Ｂ、２１２Ｂおよび２１３Ｂを通ってループしてもよい。
【００３７】
一実施形態では、図２のさらなる選択工程２２０は、重ね合わされた原子のそれぞれの対の間の空間偏差が、全ての対に対して平均化され、これが所定の閾値未満であるように、マッチング残基サブ構造に特徴的な原子のうち少なくとも３個を、対応する少なくとも３個のホットスポットサブ構造に特徴的な原子に重ね合わせることができるかどうかを判定することを含む。図８は、所与の抗体構造について、いつこの要求を満たしたかを判定するための手法の例を示す。
【００３８】
図８の工程２２１において、マッチング残基サブ構造に特徴的な原子は、ホットスポットサブ構造に特徴的な原子の上に、標的エピトープに結合したときにこれらの原子が占める１つ以上の相対的な位置において、計算的に重ね合わせられる（すなわち、オーバーレイされる）。この最初の重ね合わせが実行される様式は、特に限定されない。工程２２２では、マッチング残基と、対応するホットスポット残基とのそれぞれの対において、同じ特徴的な原子のそれぞれの対について、空間偏差を計算する。次いで、これらの空間偏差の平均は、例えば、平均値による平均または二乗平均平方根による平均を計算することによって得られる。特徴的な原子が、全て正確に重ね合わされている場合、平均空間偏差はゼロになるだろう。そうなっていない場合、平均空間偏差は、この反復のための抗体構造の特定の相対的な位置および向きについて、特徴的な原子対のセットがどの程度重なり合っているかの指標となるだろう。工程２２３では、平均空間偏差が所定の閾値より下であるかどうかが判定される。この判定は、このフィッティングが満足のいくものに十分に近いかどうかを試験する。「はい」であれば、その抗体構造が候補抗体構造であると結論付けられ、その結果が、さらなる処理のために出力される（工程２２７）。「いいえ」であれば、このプロセスは、工程２２４、２２５、２２２および２２３を通ってループし、抗体構造は、ホットスポット残基に対してシフトされ、平均空間偏差が再び計算され、閾値と比較される。このプロセスは、十分に良好なマッチングが得られるまで（例えば、工程２２７に達することによって）、または所定の最大反復数が達成されるまで続き、この場合、工程２２４の「はい」の枝分かれの後、工程２２６に続き、プロセスは、異なる抗体構造を用い、工程２２１から再び開始する。
【００３９】
一実施形態では、設計された抗体を作成することは、候補抗体構造を改変し、標的エピトープとの推定アフィニティをさらに高めるために（例えば、残基を繰り返し変異させることによって、またはＣＤＲループを繰り返しスワッピングすることによって。以下を参照）、またはうまく機能しない（例えば、衝突に起因して。以下を参照）抗体構造を破棄するために、１つ以上のさらなる処理工程を含む。これらのさらなる処理工程は、設計された抗体が、特定されたホットスポット残基にマッチングすることによって規定される結合位置にありつつ、候補抗体構造を計算によって改変することを含む。したがって、上述の選択工程（ｂ）の重ね合わせに使用されるサブ構造に特徴的な原子に対応する抗体構造のサブ構造の原子は、対応するホットスポットサブ構造に特徴的な原子と同じ位置にある標的エピトープに対して配置される。この様式で、この重ね合わせプロセスは、データベースから最も適した候補抗体構造を選択するのに役立つだけではなく、重要なパラトープ／エピトープ相互作用の幾何形状を保存する様式で抗体構造を固定するための効果的なリファレンスを与えるのにも役立つため、効率的かつ効果的な様式でさらなる処理工程を行うことができる。
【００４０】
一実施形態では、設計された抗体を作成することは、幾何学的な衝突を検出することを含む。幾何学的な衝突は、候補抗体構造が標的エピトープに計算によって結合するときに、１個以上の原子が、物理的に可能な状態よりもお互いに近い位置を占めると予想される場合である。幾何学的な衝突に対処するための手順の例を図９に示す。
【００４１】
工程３０１において、幾何学的な衝突が起こったかどうかが判定され、起こった場合には、どの原子が幾何学的な衝突に関与しているかが判定される。「いいえ」の場合、このプロセスは、工程３０６に進み、さらなる処理のために、候補抗体構造が出力される。「はい」であれば、このプロセスは、工程３０２に進む。
【００４２】
工程３０２において、幾何学的な衝突が、任意の候補抗体残基の骨格を含むかどうかが判定される。「はい」の場合、このプロセスは、工程３０４および３０１に進み、その候補抗体構造は破棄され、異なる候補抗体構造を用い、このプロセスが繰り返される。「いいえ」であれば、このプロセスは、工程３０３に進む。
【００４３】
工程３０３において、幾何学的な衝突が、任意の候補抗体残基のβ炭素原子を含むかどうかが判定される。「はい」の場合、このプロセスは、工程３０４および３０１に進み、その候補抗体構造は破棄され、異なる候補抗体構造を用い、このプロセスが繰り返される。「いいえ」であれば、このプロセスは、工程３０５に進む。
【００４４】
工程３０５において、幾何学的な衝突が、候補抗体構造の残基の側鎖を伴うかどうかが判定される。「はい」の場合、このプロセスは、工程３０７に進み、側鎖が改変される。この改変は、側鎖を異なるアミノ酸の側鎖（例えば、もっと小さなアミノ酸）にスワッピングすることを含んでいてもよい。例えば、側鎖は、アラニン側鎖、グリシン側鎖、バリン側鎖、セリン側鎖、スレオニン側鎖またはホモアラニン側鎖に改変されていてもよい。次に、このプロセスは、工程３０１に進み、幾何学的な衝突が依然として存在しているかどうかが判定される。工程３０５で「いいえ」の場合、このプロセスは、工程３０６に進み、さらなる処理のために、候補抗体構造が出力される。
【００４５】
一実施形態では、設計された抗体を作成することは、さらに、候補抗体構造の中の残基のアミノ酸タイプを繰り返し変異させ、設計された抗体と標的エピトープとの推定アフィニティを高めることを含む。このプロセスは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ変異誘発と呼ばれることがある。一実施形態では、繰り返し変異される残基の選択は、ホットスポット残基が変異されないように制約される。他の実施形態において、残基の選択は、ホットスポット残基の変異を避けるように制限されない。上述の潜在的な制約に付随して、反復的な突然変異は、標的エピトープ（例えば、界面領域）との相互作用に有意に関与することが期待される候補抗体上の領域中の全ての残基を、例えば全ての他のアミノ酸型（グリシン、プロリン、およびシステインを除く）に単純に突然変異させることを含んでいてもよい。当業者は、タンパク質の標的への結合に関連する自由エネルギーを減少させるために、残基の繰り返し突然変異を含む計算分析を行うための様々なアルゴリズムを知っているだろう。例えば、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア群を使用してもよい（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｓｅｔｔａｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ／）。
【００４６】
一実施形態では、設計された抗体を作成することは、さらに、候補抗体構造の１つ以上のＣＤＲループのそれぞれと、ＣＤＲループデータベースからのＣＤＲループとを繰り返しスワッピングし、候補抗体構造と標的エピトープとの推定アフィニティを高めることを含む。アフィニティは、例えば、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア群などの公的に入手可能なソフトウェアを用いて予測することができる。ＣＤＲループのスワッピングにより、設計の自由度が大幅に向上し、元のデータベースで利用可能な抗体構造の数に比べて試験可能な抗体構造の数が効果的に増加する。
【００４７】
一実施形態では、ＣＤＲループのスワッピングは、ホットスポット残基の全てが保持されるように制約される。本発明者らは、この手法が、コンピューティングリソースに過剰な要求を課すことなく、高アフィニティの設計された残基を得ることを可能にすることを見出した。
【００４８】
代替的な実施形態では、ＣＤＲループのスワッピングは、ホットスポット残基の少なくとも１つが保持されるように制約される。本発明者らは、この手法が、全てのホットスポット残基が必要とされる実施形態よりも突然変異の自由度が高く、コンピューティングリソースに対する要求が高くなりすぎず、より高いアフィニティを有する抗体が見出される可能性があることを発見した。
【００４９】
一実施形態では、ＣＤＲループのスワッピングは、ＣＤＲＨ３ループおよびＣＤＲＬ３ループのうち少なくとも１つをスワッピングすることを含む。これらのループは、最も高い変動性を示す。これらのループをスワッピングすることに焦点を当てることで、アフィニティをさらに効率的に改善することができる。
【００５０】
一実施形態では、ＣＤＲループのスワッピングは、ＣＤＲＨ３ループを少なくともスワッピングすることを含む。このループは、最も変動性が高い。このループをスワッピングすることに焦点を当てることで、アフィニティをさらに効率的に改善することができる。
【００５１】
一実施形態では、ＣＤＲループをスワッピングすることは、さらに、スワッピングするＣＤＲループの中の残基のアミノ酸タイプを繰り返し変異させ、候補抗体構造と標的エピトープとの推定アフィニティを高めることを含む。この工程により、アフィニティをさらに増加させることができる。
【００５２】
１個以上のホットスポット残基自体が、様々な異なる方法で特定されてもよい（図１の工程１００）。一実施形態では、ホットスポット残基は、標的エピトープに結合することが知られている同族タンパク質のバインダーから特定される。この手法は、高レベルの信頼性および予測可能なアフィニティを有するホットスポット残基を提供する。しかし、この方法で特定することができるホットスポット残基の範囲は限られている。以下に詳述するＫｅａｐ１の例において、ホットスポット残基は、既知の同族結合相手であるＮｒｆ２に基づいて決定された。
【００５３】
これに代えて、またはこれに加えて、１個以上のホットスポット残基は、残基を含む抗体と標的エピトープとの間の不釣合いな量の結合エネルギーを与えることと一致する標的エピトープとの相互作用を与えることが予想される残基を繰り返し発見するための数値的な方法を使用して特定されてもよい。
【００５４】
タンパク質結合の観点における「ホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ）」という用語は、当該技術分野において周知である。当業者は、ホットスポット残基と、標的エピトープに対する対応するホットスポット部位とのそれぞれの対が、ホットスポット残基と標的エピトープとの相互作用を規定し、これは、ホットスポット残基を含む抗体と標的エピトープとの間の不釣合いな量の結合エネルギーを与えることと一致していることを理解するだろう。例えば、Ｆｌｅｉｓｈｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３２，  ８１６−８２１（２０１１）；Ｌｉｕ，Ｓ．ら、Ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−ｐａｉｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｂｙ  ｋｅｙ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４，５３３０−５３３５（２００７）；およびＦｌｅｉｓｈｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｈｏｔｓｐｏｔ−ｃｅｎｔｒｉｃ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｅｒｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１３，１０４７−１０６２（２０１１）を参照。
【００５５】
一実施形態では、複数の設計された抗体が得られ、好ましい設計された抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴を用いて決定された標的エピトープに対するその実際のアフィニティに基づいて選択される。
【００５６】
本発明の実施形態の工程のいずれかまたは全ては、適切なソフトウェアおよび／またはファームウェアと組み合わせて当業者に知られている計算装置を使用して実行することができる。ソフトウェアは、外部ソースからの信号として提供されてもよいし、メモリまたはコンピュータ可読媒体に記録されていてもよい。
さらなる詳細、具体的な例と結果
Ｋｅａｐ１の例
【００５７】
特定の例において、本発明の実施形態は、酸化ストレスに応答してＮｒｆ２、ｂＺＩＰ転写因子の定常状態でのレベルを制御するＢＴＢ−Ｋｅｌｃｈ基質アダプタータンパク質であるＫｅａｐ１に対して結合する抗体を設計するために適用された。Ｎｒｆ２は、結合アフィニティがそれぞれ５μＭおよび５ｎＭの２つのヘアピンループモチーフを介し、１：２の化学量論比率でＫｅａｐ１に結合する。高アフィニティＮｒｆ２ループ中のホットスポット残基Ｇｌｕ７９、Ｔｈｒ８０およびＧｌｕ８２から誘導される３種類の相互作用パターン（補足の表１を参照）を、設計された抗体の結合界面に接合させ、計算された結合エネルギーによってランク付けした（図１０および補足の表２）。５種類の設計を選択し、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発を行い、Ｋｅａｐ１に対する結合エネルギーが改善したＣＤＲループにおける余分な潜在的な界面点突然変異を特定し、元々の設計の変異体を作成した。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発の前後で１０種類の設計された抗体は、Ｆａｂ形態で発現し、その結合アフィニティは、プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。１０種類の選択された抗体のＦａｂ設計のうち８種類が、Ｋｅａｐ１に対する検出可能な結合を示し、最良の２種類（Ｇ５４．１およびＧ８５）は、低モル濃度から中程度のモル濃度までの範囲で結合アフィニティを示した（図１１、図１２および補足の表２〜４）。同族のＮｒｆ２ペプチドバインダーを競合剤として添加すると結合が減少し（図１３）、Ｋｅａｐ１上の設計された抗体のエピトープはＮｒｆ２のものと重複していることが示唆された。Ｇ５４．１およびＧ８５の元々の抗体足場（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の寄託コードはそれぞれ３ＩＶＫおよび２ＪＢ５）は、Ｋｅａｐ１に結合せず、対応する天然抗原はどれも、Ｋｅａｐ１またはＮｒｆ２と生物学的に会合せず（補足の表４）、このことは、両抗体のＫｅａｐ１結合が、計算により設計された界面によって媒介されることを強く示唆している。モデル化された構造は、２個の抗体足場のＣＤＲＨ２ループに接合した３個のＮｒｆ２ホットスポットが、Ｎｒｆ２ペプチドと同様の配座を示し、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ３ループと共にＫｅａｐ１に対するＮｒｆ２結合部位を完全に占有していることを示唆していた（図１４）。
【００５８】
高アフィニティ抗体を設計する上での障壁は、現在の手法が、その骨格の自由度の乱れを最小限にしつつ、その足場を剛性構造として処理することである。しかし、異なるループ型の構造的保存のために異なる抗体フレームワークにＣＤＲループを移植するための実験的に検証された先例が存在し、これにより、これまで剛性骨格による設計方法によって未開拓であった代替的なさらなる立体配座の自由度が提供される。例えば、以下の刊行物を参照：Ｃｌａｒｋ，Ｌ．Ａ．ら、Ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｏｏｐ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ａ  ｌｏｏｐ−ｓｗａｐｐｅｄ  ｄｉｍｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２２，９３−１０１（２００９）；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ，Ｅ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＣＤＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８５２−８５６（２０００）；Ｎｏｒｔｈ，Ｂ．，Ｌｅｈｍａｎｎ，Ａ．，Ｄｕｎｂｒａｃｋ，Ｒ．Ｌ．Ａ  Ｎｅｗ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＤＲ  ｌｏｏｐ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４０６，２２８−２５６（２０１１）。
【００５９】
ＣＤＲＨ３は、６種類のＣＤＲの中で長さおよび配座という観点で最も多様な抗体として知られており、この場合には、ホットスポット残基を与えないことから（図１４および図１６）、さらに結合アフィニティを改善するために、Ｇ５４．１のＣＤＲＨ３ループと、キュレーションされたＣＤＲＨ３ループフラグメント構造ライブラリからのものとをスワッピングするための計算方法が開発された（図１５）。Ｋｅａｐ１との複合体の状態で生成されたキメラＦｖフラグメントのＣＤＲＨ３配列を、ＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎ（Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｂ．ら、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄ  ｗｉｔｈ  ａｔｏｍｉｃ−ｌｅｖｅｌ  ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２，１３６４−１３６８（２００３））を用いてさらに最適化し、計算された結合エネルギーによってランク分けした。１９のＧ５４．１のＣＤＲＨ３−スワップ改変体を選択し（図１７および補足の表５〜７）、そのうち４つは、明らかに向上したアフィニティを示し、最良のアフィニティである４．１ｎＭおよび５．４ｎＭは、ＬＳ１７１およびＬＳ１４５から測定され、それぞれ、親のＧ５４．１と比べて、それぞれ３０倍および２３倍のアフィニティの向上を表しており（図１８および補足の表７）、同族Ｎｒｆ２のアフィニティに匹敵する。ＬＳ１４８およびＬＳ１４６は、より弱いアフィニティを有するにもかかわらず、それぞれ１３倍および６倍の改善を示す。これら４種類のＣＤＲＨ３スワップ設計は、Ｇ５４．１とは異なる配座を有する完全に新しいＣＤＲＨ３ループを有しており（配列および長さ、図１７）、Ｋｅａｐ１との改善された形状相補性スコアを示す（補足の表５）。モデル化された構造（図１９および図２０）に示されるように、これらのアフィニティが改良されたＧ５４．１変異体は、より短いＣＤＲＨ３（Ｇ５４．１の１３に対して１０）における芳香族残基置換を採用して、Ｇ５４．１とＫｅａｐ１表面（ＬＳ１７１のＶＨ９９ＬおよびＶＨ１００Ｙ、ＬＳ１６８のＶＨ９７ＷおよびＬＳ１４６のＶＨ９７Ｙなど）の間の空洞を埋めるか、またはＫｅａｐ１との大きなＣＤＲＨ３接触表面積を有する（Ｇ５４．１の２５８３Å２に対し、ＬＳ１６８で２７３４Å２）。
【００６０】
回折品質の結晶を生じる他の３つの最も高いアフィニティを有するＣＤＲＨ３スワップ設計による結晶学的試験の失敗のために、ＬＳ１４６との複合体におけるＫｅａｐ１の高分解能（１．８５Å）結晶構造（図２１〜図２３）を解決した。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として作られるＬＳ１４６は、Ｋｅａｐ１のＮｒｆ２結合部位（図２４）に設計されたものとほとんど同一に結合し、ＣＤＲＨ２はＫｅａｐ１残基との最も広い接触（界面水素結合の網目構造）を形成する（図２５および図２６））。１２マー長のＣＤＲＨ３ループは、ヘアピン様配座に折り畳まれ、予測されるように２つのＫｅａｐ１プロペラブレードの終わりにループと相互作用する（図２７）。結合に関与する他のＣＤＲループは、ＣＤＲＨ１（図２８）およびＶＨフレームワーク３の一部（図２９）である。Ｋｅａｐ１に結合されたＬＳ１４６−ｓｃＦｖの構造は、設計モデルと、一般的に原子レベルの一致を示す（界面−Ｃα原子二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）＝２．５Å、２つの複合体構造が、Ｋｅａｐ１側に重ね合わされている、図３０）。３つの接合されたホットスポットは、ＶＨ５３Ｅの骨格アミドとの予期しない分子内水素結合に起因するＶＨ５２Ｄの反転した側鎖を除き、予想通り、ほぼ同一の側鎖の向きをとる（重原子ＲＭＳＤ＝１．６Å；図３１）。ＶＨ９６Ｙ、ＶＨ１００ＣＹ、ＶＬ４９ＹおよびＶＬ５５Ｙの側鎖の再編成によって生じるＣＤＲＨ３ループの先端で、明らかな配座の移動が起こり（図３２）、ＣＤＲＨ１とＬ１との間のねじれ角が変化し、ＶＬがＫｅａｐ１から完全に切り離される（補足の表８）。ｓｃＦｖへの変換は、ＶＨ／ＶＬの向きの変動およびその後のアフィニティの喪失につながる場合があることが知られており、このことは、なぜＬＳ１４６−ｓｃＦｖの効力がそのＦａｂ形態の効力の３分の１と低いのかを説明することができる（図３３）。
【００６１】
ＬＳ１４６のＣＤＲＨ２は、同様の構造配座（Ｃα−原子ＲＭＳＤ＝０．２７Å）と、ホットスポット残基ドナーＮｒｆ２「ＤＥＥＴＧＥ」ペプチドセグメントを含み、高い配列同一性（８３％）を示すが、ＣＤＲＨ２は、抗体足場接合で特定される唯一のホットスポット残基アクセプターではなかった。トリプレットハッシング（以下参照）が、全ての表面ＣＤＲ残基に対して実施されたので、ＣＤＲＨ３も、かなり弱いアフィニティであるにもかかわらず、いくつかの設計ではＮｒｆ２由来のホットスポットを与えることがわかった（補足の表４）。強い結合設計と弱い結合設計の特性の比較は、より望ましい計算されたＫｅａｐ１−抗体結合エネルギー、より大きな界面表面積、およびより少ない埋め込まれた不飽和極性原子が、最も重要な因子であることを示唆している（図１１および補足の表２）。これらは、計算による抗原−抗体界面設計（大きな極性結合表面がループの相互作用を支配した）のよく知られた課題を連想させる。ＣＤＲ配座を合理的にスワッピングすることにより、限られた数の足場構造に依存するホットスポットによって導かれる接合設計によって開発されていない代替形状および化学的相補性の探索が可能になる（補足の表５）。試験されるループスワップ設計は、固有のＣＤＲＨ３骨格配座および配列を有し、同じエピトープを標的とすることによって、改良された結合アフィニティを示し、このことは、記載した計算によるＣＤＲスワップ戦略を使用することにより、よりアフィニティが高い改変体を実験的に選択するためのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計された抗体の最適化が可能になることを示唆している。
【００６２】
細胞内タンパク質であることを前提として、治療抗体のための従来からある標的ではないが、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２相互作用は、予備選択されたエピトープを標的とする新規抗体の構造に基づく設計のための理想的な概念実証システムを与える、容易に識別可能なホットスポット残基を特徴とし、同族のタンパク質−タンパク質相互作用を直接的に遮断するか、または予想される遷移状態を捕捉し、一時的な配座を単離または安定化する必要性を回避する。設計された配列空間の計算による精度および並行したプロービングをさらに改良しつつ、より強い結合変異体の効率的な選択のために、現代のオリゴヌクレオチドアセンブリ法（例えば、集中的なディスプレイライブラリ設計）および次世代のシーケンシングを使用して、構造に基づく設計方法は、治療用途および診断用途のための抗体を迅速に作成する可能性を与える。
Ｋｅａｐ１の例に適用される計算方法のさらなる詳細
一般的な計算方法
【００６３】
ＣＤＲにおいて幾何学的にマッチングする位置にＮｒｆ２ホットスポットが介在する相互作用パターンを収容することができる抗体足場結晶構造を検索するために、残基に基づくトリプレットハッシング法によって、次いで、選択した設計の代替的なループ構成を探索するためのＣＤＲＨ３スワップによって、Ｎｒｆ２結合部位を標的とする抗−Ｋｅａｐ１抗体を設計した。Ｋｅａｐ１に対する推定結合エネルギーを改良するために、ＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎを利用し、これら２つの段階の間に、設計のＣＤＲループの配列を最適化した。ホットスポット接合、ＣＤＲＨ３スワップ、および使用されるＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ設計プロトコルのための擬似コードは、本記載の最後に記載されている。
ホットスポット接合
【００６４】
トリプレット系ハッシング法は、図１の工程２００を参照しつつ上に記載したプロセスの一例であり、３個のマッチング残基が使用される場合には、それぞれが、重ね合わせに関与する３個のサブ構造に特徴的な原子を含む。トリプレットハッシングを実行するためのさらなる情報は、以下の刊行物に記載されている。Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ｈ．Ｊ．＆Ｒｉｇｏｕｔｓｏｓ，Ｉ．Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｈａｓｈｉｎｇ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．４，１０−２１（１９９７）。トリプレットハッシングは、ＳＡｂＤａｂデータベース中の１４１７の抗体結晶構造から、ホットスポットが介在する相互作用パターンを与えることができる抗体構造（「足場」）を検索するために実施された（補足の表９）。「トリプレット」は、それぞれ３個の残基の骨格Ｃα、ＮおよびＣ原子に接続する３個の仮想三角形からなるものと定義された。任意の３個のＮｒｆ２ホットスポットを、トリプレットにまとめ、検索するための固有のキーと共にインデックスを付けた。抗体足場構造中のＣＤＲ残基の全ての可能なトリプレットを列挙し、同じ様式でインデックスを付けた。ホットスポットおよび抗体足場からの同一のトリプレットを、それぞれのインデックスキーを比較することによって特定した。３個のトリプレット三角形における９個の頂点の２つのセット間のＲＭＳＤを最小化するために、対応する同一のホットスポットの上に足場トリプレットを重ね合わせることによって、ホットスポットの上に抗体足場を接合させた。３個の足場トリプレット残基を、対応するホットスポット残基と置き換えた。接合した抗体足場中の残基の骨格原子が、Ｋｅａｐ１と衝突した場合には、トリプレットの重ね合わせおよびホットスポット接合の後、設計された構造を破棄した。
ＣＤＲＨ３ループのスワップ
【００６５】
全ての外因性ＣＤＲＨ３ループを上記の１４１７抗体骨格構造から切断した。元々のＣＤＲＨ３ループを同じ様式でＧ５４．１／Ｋｅａｐ１複合体構造から除去し、その上に、それぞれの外因性ＣＤＲＨ３ループを、アンカー残基の骨格原子を重ね合わせることによって接合し、次いで、新しいＣＤＲＨ３アンカー残基と、隣接するＧ５４．１フレームワーク残基とを接続することによって、Ｇ５４．１フレームワークに接続した。新しいＣＤＲＨ３ループの骨格原子が元のＧ５４．１  ＦｖまたはＫｅａｐ１のいずれかと衝突した場合、その設計された構造は、廃棄された。
Ｒｏｓｅｔｔａ配列設計
【００６６】
それぞれホットスポットの接合およびＣＤＲＨ３ループのスワップから得られた設計について、計算された結合エネルギーを最適化することを目的として、２回のＲｏｓｅｔｔａ配列設計を使用した。１回目の間、３個のＮｒｆ２ホットスポットが介在する相互作用パターンを収容する５種類の設計された抗体構造から出発し、抗体側でのそれぞれの界面の位置は、他の全ての種類のアミノ酸（グリシン、プロリンおよびシステインを除く）へと単独で変異された。それぞれの突然変異構造は、全ての界面残基のリパックおよび最小化によって最適化された。それぞれの点変異に対する計算された結合エネルギーの変化（ΔΔＧと呼ばれる）を、ロングレンジ静電補正を伴うＲｏｓｅｔｔａ全原子スコアリング補正で評価した（Ｆｌｅｉｓｈｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ら、ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ：Ａ  ｓｃｒｉｐｔｉｎｇ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｏｓｅｔｔａ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ２０１６１（２０１１）を参照）。高い方から５位までの単一点突然変異を、最小ΔΔＧスコアという観点で、それぞれの元々の設計の組み合わせた変異体への手動での組み込みのために選択した。２回目の間、Ｇ５４．１のＣＤＲＨ３スワップ変異体中の全てのＣＤＲＨ３残基を、他の全ての種類のアミノ酸（グリシン、プロリンおよびシステインを除く）へと同時に変異させ、バックラブ法（変異側鎖の予測を改良するのに役立つことが報告されている）を用いてＣＤＲおよびＫｅａｐ１の上の全ての界面残基の骨格配座を局所的に乱させた（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．，Ｋｏｒｔｅｍｍｅ，Ｔ．Ｂａｃｋｒｕｂ−ｌｉｋｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８０，７４２−７５６（２００８）。３個の反復配列設計を使用し、軟らかい反発力から始め、デフォルトの標準的なファンデルワールスパラメータまでで終わり、さらに高いアフィニティの相互作用を見つけることができる可能性を高めた。
設計スコアリング
【００６７】
計算された結合エネルギー（ＲｏｓｅｔｔａΔＧスコア）、埋め込まれた溶媒接近可能表面領域（ＳＡＳＡ）および形状相補性（Ｓｃ）スコアによって、設計を評価した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｃｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４．９４６−９５０（１９９３）を参照）。ホットスポット接合においてＳｃ＜０．５、ＣＤＲＨ３スワップにおいてＳｃ＜０．６である設計を拒絶することにより、高い形状相補性が得られた。それぞれの設計された複合体構造についてのＲｏｓｅｔｔａの総エネルギー、埋め込まれた不飽和極性原子の数（Ｓｔｒａｎｇｅｓ，Ｐ．Ｂ．＆Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｂ．Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｎｄ  ｆａｉｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｂｕｒｉｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２２，７４−８２（２０１３））を、同様に設計の品質評価のリファレンスとして使用した。
一般的な実験方法
【００６８】
Ｋｅａｐ１タンパク質の詳細な手順、抗体の発現、クローニング、精製、結晶化を以下および補足の表１０、１１に示す。
結合分析
【００６９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行い、詳細実験の詳細を以下に示す。簡単に言うと、発現したＦａｂを含む上清（または偽トランスフェクト上清コントロール）を、ＣＭ５チップの上に固定された抗−ヒトＦ（ａｂ’）２ポリクローナルの上に注入した。Ｋｅａｐ１の滴定またはゼロ検体コントロールの２回目の注入によって、会合と解離の動態を監視することができた。各センサグラムサイクルで、チップの再生を完了した。捕捉したＦａｂがゆっくりと解離することによって起こるベースラインドリフトについて、隣接するゼロ検体コントロールサイクルを引き算することによって、センサグラムを補正した。各濃度でのＫｅａｐ１の非特異的な結合を、等価なベースライン補正されたコントロール上清サイクルのセンサグラムを引き算することによって補正した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェアを使用して会合および解離動の動態をフィッティングさせ、それによりアフィニティ定数（ＫＤ）を決定した。Ｋｅａｐ１に対するＦａｂ結合の特異性を、一定濃度のＫｅａｐ１に対するＮｒｆ２ペプチドアナログの滴定によって、同じプロトコルによって評価した。
補足情報
Ｎｒｆ２ホットスポットの識別
【００７０】
Ｋｅａｐ１への結合を支配する３個のＮｒｆ２ホットスポット残基を、Ｒｏｓｅｔｔａのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアラニンスキャニングスクリプトＡｌａＳｃａｎ．ｘｍｌを用いて特定した（Ｄａｓ，Ｒ．，Ｂａｋｅｒ，Ｄ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｒｏｓｅｔｔａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７，３６３−３８２（２００８）を参照）。複合体構造におけるＮｒｆ２とＫｅａｐ１の結合エネルギー（ＰＤＢ寄託コード２ＦＬＵ−Ｌｏ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｈｅｎｚｌ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｅａｍｅｒ，Ｌ．Ｊ．＆Ｈａｎｎｉｎｋ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｅａｐ１：Ｎｒｆ２  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  Ｎｒｆ２  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｅｍｂｏ  Ｊ．２５，３６０５−３６１７（２００６）を参照）を、結合した構造と結合していない構造との間のデフォルトの全原子力場（スコア１２の重み付け）を用い、Ｒｏｓｅｔｔａ総エネルギーを計算することによって予測した（以下、ＲｏｓｅｔｔａのΔＧスコアと呼ぶ）。それぞれのＮｒｆ２残基をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでアラニンへと変異させ、上から３位までのＮｒｆ２残基（Ｇｌｕ７９、Ｔｈｒ８０およびＧｌｕ８２）のＲｏｓｅｔｔａのΔＧスコアは、アラニン変異後に少なくとも０．８Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー単位（ＲＥＵ）まで減少し、これがホットスポットであることを確認した（補足の表１）。ホットスポットの配座は、ＲｏｓｅｔｔａスクリプトＩｎｖｅｒｓｅＲｏｔａｍｅｒｓ．ｘｍｌ．を用い、Ｋｅａｐ１表面に最も近い側鎖の原子から出発し、逆ロータマーを生成することによって多様化した。余分なロータマーのサンプリング（２つの半値幅の標準偏差）を、全ての側鎖のねじれ角の周囲で行った。
抗体Ｖ領域足場構造
【００７１】
ＰＤＢに保存された少なくとも１つの対になったＶＨ／ＶＬを含む抗体Ｖ領域足場構造を、２０１４年にＳａｂＤａｂ（ｈｔｔｐ：／／ｏｐｉｇ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｓａｂｄａｂ）データベースから抽出した。ＦａｂおよびｓｃＦｖフォーマットを含む、Ｘ線結晶学によって解明された構造のみを使用した。複数の結晶のコピーが、異なる鎖識別子を有する同じ抗体構造のために利用可能である場合、ＰＤＢファイルに現れる最初のコピーのみを保存した。Ｆｖ領域のみがＦａｂ構造から保たれた。Ａｂｎｕｍ手順（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，Ｋ．Ｒ．＆Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５，３８３２−３８３９（２００８））を使用し、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従ってＦｖ構造中の残基の番号を付け直した（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．＆Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７３，９２７−９４８（１９９７））。ポリペプチドＣＤＲループが破壊された構造は廃棄された。最後に、１４１７抗体Ｆｖ足場構造を、ホットスポット接合設計のために保存した（補足の表８）。
抗体足場構造上へのＮｒｆ２ホットスポットの接合
【００７２】
残基に基づくトリプレットハッシング法を実施し、Ｋｅａｐ１との元々のホットスポットの相互作用パターンを維持しつつ、３種類のＮｒｆ２ホットスポットを接合するのに最良の抗体足場構造を検索した。本願発明者らは、「残基のトリプレット」を、それぞれ３個の残基の骨格Ｃα、ＮおよびＣ原子に接続する３個の仮想三角形からなるものと定義した。トリプレットは、９個の頂点（Ｖα１、Ｖα２、Ｖα３、ＶＮ１、ＶＮ２、ＶＮ３、ＶＣ１、ＶＣ２およびＶＣ３、トリプレットからなる３個の残基の９個の骨格Ｃα、ＮおよびＣ原子の位置に対応する）と、９個の辺（Ｅα１、Ｅα２、Ｅα３、ＥＮ１、ＥＮ２、ＥＮ３、ＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３、３個の三角形からの辺に対応する）を特徴とする。ホットスポット側では、３個のＮｒｆ２ホットスポット残基（Ｇｌｕ７９、Ｔｈｒ８０およびＧｌｕ８２）から任意の３個の逆ロータマーを列挙し、これを残基のトリプレットにまとめた。各トリプレットは、最も長いＣα辺と二番目に長いＣα辺が、常にそれぞれＥα１およびＥα２に確実に対応するようにすることによって標準化された。各トリプレットは、６個の辺の丸めた（ＲＯ）長さを順に連結することによって、固有の文字列キーのインデックスが付けられた。例えば、Ｅα１＝６．３２、Ｅα２＝４．６７、Ｅα３＝８．８、ＥＮ１＝４．３、ＥＮ２＝３．９３、ＥＮ３＝７．２１、ＥＣ１＝５．２８、ＥＣ２＝５．４およびＥＣ３＝９．８２を有する所与のトリプレットでは、キーは、以下のように表される。
Ｋｅｙ＝Ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅ［ＲＯ（Ｅ）］＝６５９４４７５５１０。
【００７３】
ホットスポットのトリプレットの非冗長インデックスキーは全て、対応するホットスポットトリプレットの情報に迅速にアクセスするために、抗体足場構造のＣＤＲへの後の接合を容易にするための頂点の残基の種類および原子軌道を含め、ルックアップテーブルに格納された。
【００７４】
抗体足場側では、任意の３つのＣＤＲ残基を列挙し、トリプレットにまとめた。インデックスキーのルックアップテーブルは、ホットスポットトリプレットと同じ方法で生成された。ＣＤＲの幾何学的にマッチングした位置に３個のホットスポット残基を収容することができる抗体足場構造を発見するために、同一のホットスポットと抗体足場トリプレットを、それぞれのインデックスキーと直接比較することによって特定した。３個のトリプレット三角形における９個の頂点の２つのセット間のＲＭＳＤを最小化するために、対応する同一のホットスポットの上に足場トリプレットを重ね合わせることによって、ホットスポットの上に抗体足場を接合させた。抗体トリプレットの残基のいずれかに対し、ホットスポット骨格原子をフィッティングすることによって、３個の足場トリプレットの残基を、対応するホットスポットの残基と置き換えた。
【００７５】
ホットスポット接合から得られた各抗体設計について、Ｋｅａｐ１原子と衝突する抗体足場中の界面残基の側鎖をアラニンに突然変異させ、衝突を減らした。置き換え前後のホットスポット側鎖原子の重原子ＲＭＳＤを計算した。Ｒｏｓｅｔｔａ  ｐｐｋ．ｘｍｌスクリプトを使用し、全ての残基を再充填し、最小化した。以下に記載するいくつかのフィルターを適用し、設計を分類した。
・抗体足場への置き換え前後のホットスポットの重原子ＲＭＳＤは、２．０Åより小さかった。
・結合の際の埋め込まれた溶媒接近可能表面領域（ＳＡＳＡ）は、１２００Åより大きかった（Ｈｕ，Ｚ．，Ｍａ，Ｂ．，Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ｈ．＆Ｎｕｓｓｉｎｏｖ，Ｒ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌａｒ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｓ  ｈｏｔ  ｓｐｏｔｓ  ａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３９，３３１−３４２（２０００）。
・形状相補性（Ｓｃ）スコアは、０．５より大きかった。
・ＲｏｓｅｔｔａΔＧスコア（結合エネルギー）は、０．０ＲＥＵより低かった。
【００７６】
フィルタリング規則を通過した生き残った設計は、最終的に、ＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアによってランク付けされた。
ＣＤＲＨ３ループのスワップ
【００７７】
Ｇ５４．１のＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアに対する個々のＣＤＲループの寄与は、モデル化されたＧ５４．１／Ｋｅａｐ１複合体構造のＦｖ領域から各ＣＤＲループを切断することによって計算された（図１６）。各ＣＤＲ切断変異体のＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアを再計算した。個々のＣＤＲの結合への寄与は、各ＣＤＲ切断変異体と元のＧ５４．１抗体との間のＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアの差を計算することによって推定した。
【００７８】
以前のホットスポット接合段階で使用された抗体足場結晶構造からの外因性ＣＤＲＨ３ループは全て、Ｆｖ構造のＶＨ９３からＶＨ１０３（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームによる）の位置で切断され、ＣＤＲＨ３アンカー残基として標識された。外因性ＣＤＲＨ３ループをＧ５４．１に接合するために、Ｇ５４．１の元のＣＤＲＨ３ループをＶＨ９４からＶＨ１０２の位置で除去し、ＶＨ９３およびＶＨ１０３をＦｖアンカー残基として残した。各外因性ＣＤＲＨ３ループを、２セットのアンカー残基からの骨格原子を重ね合わせることによってＧ５４．１Ｆｖ構造に対してフィッティングした。Ｇ５４．１のＦｖアンカー残基を後で除去し、ＣＤＲＨ３アンカー残基と、隣接するＧ５４．１残基（ＶＨ９２およびＶＨ１０４）とを連結することによって、Ｇ５４．１の上に、接合した外因性ＣＤＲＨ３ループを結合させた。新しいＣＤＲＨ３ループの骨格原子が元のＧ５４．１Ｆｖ／Ｋｅａｐ１複合体構造と衝突した場合、その得られた構造は、廃棄された。衝突を減らすために、Ｇ５４．１／Ｋｅａｐ１残基と衝突するＣＤＲＨ３残基側鎖はアラニンに変異させた。ＣＤＲＨ３スワップから得られた最終構造は、工程２のようにＲｏｓｅｔｔａ  ｐｐｋ．ｘｍｌスクリプトを使用して再充填し、最小化し、ＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアによってランク付けした。
Ｒｏｓｅｔｔａ配列設計
【００７９】
ホットスポット接合およびＣＤＲＨ３スワップからそれぞれ設計された抗体の結合アフィニティを最適化するために、２回のＲｏｓｅｔｔａ配列設計を行った。
【００８０】
１回目の間、３個のＮｒｆ２ホットスポットが介在するＫｅａｐ１相互作用パターンを収容する５種類の設計された抗体構造から出発し、抗体側でのそれぞれの界面ＣＤＲ残基は、他の全ての種類のアミノ酸（システイン、グリシンおよびプロリンを除く）へと変異され、設計された抗体とＫｅａｐ１との計算された結合エネルギーを改良することができる可能性を有する変異体を特定するために、ＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアに対する変異体の影響を調べた。改変された静電スコアリング項目を有するスコアリング関数を用い、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発中の結合遊離エネルギーの変化を計算するためのＲｏｓｅｔｔａスクリプトＭｕｔａｔｉｏｎＳｃａｎＰＢ．ｘｍｌを使用し、単一点突然変異体リストを作成した。点突然変異は、ＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアの変化、または各突然変異体と対応する野生型構造との間の変化を計算することによってランク付けした。最上位ランクの単一点突然変異を選択し、組み合わせ（最大５個の突然変異）、元の抗体接合の改変体を作成した。
【００８１】
２回目の間、Ｇ５４．１に対するスワッピングされたＣＤＲＨ３ループの全ての残基を、バックラブ法を用いてＣＤＲおよびＫｅａｐ１の上の全ての界面残基の骨格配座を局所的に乱されながら、Ｒｏｓｅｔｔａのｆｌｅｘｂｂ−ｉｎｔｅｒｆａｃｅｄｅｓｉｇｎ．ｘｍｌ  スクリプトを用い、他の全ての種類のアミノ酸（グリシン、プロリンおよびシステインを除く）へと同時に変異させた。明白な静電気は、スコアリング機能には使用されなかった。再設計と最小化の３回の反復を使用し、軟らかい反発力（ｓｏｆｔ＿ｒｅｐ  ｗｅｉｇｈｔｓ）から始め、デフォルトの全原子の力場（スコア１２の重み付け）までで終わり、さらに高いアフィニティの相互作用を見つけることができる可能性を高めた。ホットスポット接合設計について既に記載したのと同様のフィルタリングルールを使用し、得られたＣＤＲＨ３スワップ設計された構造を選別し、ランク分けした。
・結合の際に埋め込まれたＳＡＳＡは、２０００Åより大きかった。
・ＲｏｓｅｔｔａΔＧスコアは、−２０．０ＲＥＵより低かった。
・Ｓｃスコアは、０．６より大きかった。
設計スコアリング
【００８２】
設計のフィルタリングまたはランク付けに使用される全ての既に記載した計算特徴（補足の表２、５）は、Ｒｏｓｅｔｔａ３．４  ＩｎｔｅｒｆａｃｅＡｎａｌｙｚｅｒアプリケーションによって計算された。
・Ｒｏｓｅｔｔａ  ΔＧスコアまたは結合エネルギーは、結合した状態および結合していない状態の系全体のエネルギーの差であると定義される。それぞれの状態において、界面残留物を再充填した。
・モデル化された複合体構造のＲｏｓｅｔｔａ総エネルギー。
・埋め込まれた溶媒接近可能面積（ＳＡＳＡ）は、結合した状態および結合していない状態の系全体のＳＡＳＡの差であると定義された。
・モデル化された抗体／Ｋｅａｐ１複合体構造の形状相補性（Ｓｃ）スコア。
・埋め込まれた不飽和極性原子。
【００８３】
最後に、ホットスポット接合の後の５種類の固有の足場における１０個の設計（補足の表３）およびＧ５４．１の１９のＣＤＲＨ３スワップ変異体を実験的試験のために選択した（補足の表６）。
Ｋｅａｐ１の発現と精製
【００８４】
Ｋｅａｐ１のＫｅｌｃｈドメインをコードする遺伝子を、Ｎ末端のＨｉｓタグおよびＴＥＶプロテアーゼ開裂部位を有するフレーム内で発現ベクターｐＥＴ−２８ａへとクローニングした。この構築物をＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）内で形質転換し、続いて、２５ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ＴＹ培地中、３７℃で培養した。タンパク質の産生は、０．３ｍＭのイソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用い、Ｏ．Ｄ．６００の４で誘発された。ＩＰＴＧを添加してすぐに、グリセロール系供給物（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４／ＭｇＣｌ２、２％のグリセロール）を、培養物に添加し、培養物を１７℃で一晩、さらにインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５％トリトーム−Ｘ１００、２０ｍＭイミダゾールおよび十分な量のプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有するバッファーに溶解した。遠心分離によって予め清澄化した溶解物を０．２μＭフィルターでろ過し、次いでＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。ビーズを、５０ｍＭトリスｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾールおよび１ｍＭ  ＤＴＴで洗浄した後、Ｋｅａｐ１を、２５０ｍＭの濃度にイミダゾールを補充した上述のバッファーを用いて溶出させた。Ｈｉｓタグが切断された後、サンプルをＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムに適用し、Ｎｉ結合性タンパク質を除去した。フロースルーを回収し、サイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および必要に応じてイオン交換（Ｍｏｎｏ  Ｑ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーによりさらに精製した。精製されたｋｅａｐ１を濃縮し、−８０℃で２０ｍＭトリスｐＨ７．５および５ｍＭ  ＤＴＴ中に保存した。
抗体のクローニングと発現
【００８５】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計された重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．によって化学合成した。転写活性なＰＣＲ（ＴＡＰ）を使用し、重鎖および軽鎖の可変領域を別個に増幅させ、その後、ｈＣＭＶプロモーター配列、ヒトγ１ＣＨ１およびＣκ（Ｋｍ３アロタイプ）定常領域およびポリ（Ａ）尾部をコードするＤＮＡ配列を導入した。得られた構築物は、一過性の細胞発現のために必要な成分の全てを含有していた。ＳＰＲ分析のためのＦａｂフラグメントを生成するために、ＨＥＫ−２９３細胞を２９３Ｆｅｃｔｉｎ脂質トランスフェクション（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造業者の説明書に従って）を用いてＴＡＰ産物と共に一時的にトランスフェクトした。
【００８６】
Ｆａｂフォーマットにおける上位４位までの高アフィニティＣＤＲＨ３スワップ抗体を用いた結晶学的試験では、Ｋｅａｐ１との複合体において回折品質の結晶が得られなかった。ＬＳ１４６をＦａｂからｓｃＦｖ構築物に変換するために、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを介してＶＬに融合したＶＨをコードする遺伝子、ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位を有するＨｉｓ１０タグを合成し、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．によってＵＣＢ独自の発現ベクターにクローニングした。遺伝子産物のアミノ酸配列を補足の表１０に示す。ＣＨＯ−Ｓ  ＸＥ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞株をエレクトロポレーションを用いてプラスミドＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。細胞を遠心分離により除去し、ｓｃＦｖ−ＴＥＶ−Ｈｉｓタグ化タンパク質をＩＭＡＣにより精製した。上清を０．２ｕＭフィルターでろ過し、次いでＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に入れた。カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４５ｍＭイミダゾールで洗浄した後、抗体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた。Ｈｉｓタグを除去した後、サンプルをＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌカラムに再び適用し、Ｎｉ結合性の混入タンパク質を除去した。フロースルーを回収し、サイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーによりさらに精製した。精製した抗体を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロールで濃縮し、必要になるまで−８０℃で、等分に分けて保存した。
結合分析
【００８７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、同じ製造業者から得た試薬を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。Ｆａｂは、抗−ヒトＦ（ａｂ’）２に特異的なアフィニティ精製されたヤギポリクローナルトＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  １０９−００６−０９７）を介し、ＣＭ５センサーチップの表面に捕捉された。後者を、活性化したカルボキシメチルデキストラン表面に、アミンカップリングによって以下のように固定した。５０ｍＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドおよび２００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの新鮮な混合物を、流速１０μｌ／分で５分間注入し、その後、１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．０バッファー中の５０μｇ／ｍｌの抗−ヒトＦ（ａｂ’）２を同じ流速で５分間注入した。最後に、表面を、１Ｍエタノールアミン・ＨＣｌ  ｐＨ８．５を１０分間断続的に流して失活させた。チップ上のリファレンスフローセルは、上述の手順からタンパク質を省くことによって調製し、次いで、以下の実験において、抗−Ｆ（ａｂ’）２とリファレンスフローセルとの間の応答単位の差としてセンサグラムを得た。発現したＦａｂに対するＫｅａｐ１の初期の結合を、操作バッファーで５分の１に希釈した５０μｌの上清を、リファレンスおよび抗−Ｆ（ａｂ’）２フローセルに流速１０μｌ／分で注入し、次いで、操作バッファー中、０、５００または５０００ｎＭのＫｅａｐ１を含む１５０μｌを流速３０μｌ／分で注入することによって評価した。少なくとも５分間続く解離段階の後、チップ表面を、４０ｍＭのＨＣｌを６０秒間、間に同じ流速で５ｍＭ  ＮａＯＨを３０秒間用いて再生した。捕捉されたＦａｂに対するＫｅａｐ１の結合の会合および解離の動態は、以下の濃度で少なくとも８個の値で、同じプロトコルによって決定された。７５、１００、１５０、２５０、３５０、５００、７５０、１０００、１５００、２５００、３５００および５０００ｎＭ。ベースラインドリフトを補正するために、ゼロＫｅａｐ１コントロールを前のサイクルの間に挟み、Ｋｅａｐ１の非特異的結合を決定し、補正するために、偽トランスフェクト上清を各Ｋｅａｐ１濃度で評価した。Ｋｅａｐ１に対するＦａｂ結合の特異性を、より強いＫｅａｐ１結合ループモチーフを含むＮｒｆ２残基７４〜８７に対応する高アフィニティＮｒｆ２ペプチド類似体、ビオチン−ＰＥＧ−ＬＱＬＤＥＥＴＧＥＦＬＰＩＱ−アミドとの競合によって評価した。捕捉されたＦａｂへのペプチド滴定存在下でのペプチドＫｅａｐ１の結合を、上述のプロトコルを用いて追跡した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェアを使用し、全てのセンサグラムを、解離および会合速度論を適合させる前に、ゼロＫｅａｐ１制御サイクルおよび対応する非特異的制御サイクルを差し引くことによって最初に変換した。解離定数（ＫＤ）は、少なくとも６つのＫｅａｐ１濃度にわたって測定された値の対数平均として推定された。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いて、以下の式で表される正規化された応答／可変勾配モデル対数濃度にフィッティングすることによって計算した。ここで、３つの報告点についての阻害値のパーセントを各濃度での繰り返しとして処理した。
【数２】
2019505880.tif 000004
結晶化
【００８８】
Ｋｅａｐ１を、複合体形成の前にＬＳ１４６−ｓｃＦｖ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５％グリセロール）の保存バッファーと交換した。これにより、Ｋｅａｐ１保存バッファーからＤＴＴが除去され、抗体中のジスルフィド結合を破壊することが防止された。次いで、Ｋｅａｐ１を１：１．５のモル比でＬＳ１４６−ｓｃＦｖと混合し、室温で３０分間インキュベートした。この複合体をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（商標）２６／６０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製し、５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。シッティングドロップ蒸気拡散形式の２００ｎｌのタンパク質溶液と２００ｎｌのリザーバー溶液（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた最初の結晶化試験は、２つの条件で結晶を生成した。最初のスクリーニングから得られた種結晶を用いて、ヒットした結晶化条件の１つ（０．２Ｍ酢酸ナトリウムおよび２０％ＰＥＧ３５００）の再現および最適化により、回折品質の結晶が生成した。結晶を母液中で凍結保護し、ＰＥＧ３３５０を３５％（ｗ／ｖ）まで補充し、データ収集前に液体窒素中でガラス化した。
結晶学的データの収集と処理
【００８９】
結晶ＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１複合体からのデータセットをＤｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ設備（ジドコット、英国）で、ビームライン１０４−１、波長０．９１７Åで集めた。Ｋｅａｐ１（ＰＤＢ  寄託コード１Ｘ２Ｊ１２）、ＣＤＲループを含まないＶＨおよびＶＫのフレームワーク（ＰＤＢ寄託コード３ＩＶＫ１３）をモデルとして用い、ＣＣＰ４ソフトウェア群１０、１１のプログラムＰＨＡＳＥＲ９を用いて分子の置き換えを行った。参照：ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．ら、Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．４０，６５８−６７４（２００７）；Ｐｏｔｔｅｒｔｏｎ，Ｅ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｐ．，Ｔｕｒｋｅｎｂｕｒｇ，Ｍ．およびＤｏｄｓｏｎ，Ｅ．Ａ  ｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｕｓｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｐｒｏｇｒａｍ  ｓｕｉｔｅ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ  ５９，１１３１−１１３７（２００３）；Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ  ６７，２３５−２４２（２０１１）；Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｂ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｋｅａｐ１  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｖｏｋｅｄ  ｂｙ  ｉｔｓ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３，６８９−７００（２００６）；およびＳｈｅｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，１２７１−１２７５（２００９）。
【００９０】
結晶の溶媒含有量は４６．０９％と決定され、非対称単位中に錯体のコピーが２つ存在する。解決策は３つの段階で見つかった。Ｋｅａｐ１の２つのコピーの位置を最初に検索して得、次いで重鎖および２つの軽鎖の２つのコピーを得た。Ｒｅｆｍａｃ５．４（ＭＡＣｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ構造のＲＥＦｉｎｅｍｅｎｔ）とＣＯＯＴ（Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ｏｂｊｅｃｔ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｔｏｏｌｋｉｔ）をそれぞれ用いて、洗練とモデル構築を行った。Ｒａｍｐａｇｅ、ＰｒｏＣｈｅｃｋ、ＳＦＣｈｅｃｋ、およびＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースが提供する検証ツールを使用して、最終モデルの幾何学的品質を検証した。ＬＳ１４６−ｓｃＦｖ／Ｋｅａｐ１のデータ収集および精密化した統計は補足の表１１に示されている。参照：Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ｖａｇｉｎ，Ａ．Ａ．＆Ｄｏｄｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５３，２４０−２５５（１９９７）；Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．＆Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ  ６０，２１２６−２１３２（２００４）；Ｌｏｖｅｌｌ，Ｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃａｌｐｈａ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ：ｐｈｉ，ｐｓｉ  ａｎｄ  Ｃｂｅｔａ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５０，４３７−４５０（２００２）．１７．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｍｏｓｓ，Ｄ．Ｓ．，＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．ＰＲＯＣＨＥＣＫ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｃｈｅｃｋ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２６，２８３−２９１（１９９３）；およびＶａｇｕｉｎｅ，Ａ．Ａ．，Ｒｉｃｈｅｌｌｅ，Ｊ．，＆Ｗｏｄａｋ，Ｓ．Ｊ．ＳＦＣＨＥＣＫ：ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆａｃｔｏｒ  ｄａｔａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｇｒｅｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｔｏｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ  ５５，１９１−２０５（１９９９）。
さらなる例−天然のＴＧＦβ受容体および公知の抗ＴＧＦβ抗体からの組み合わされたホットスポット残基を移植することによる新規ｐａｎ−ＴＧＦβブロッキング抗体Ｆａｂ断片のコンピュテーショナルデザイン
【００９１】
Ｋｅａｐ１を標的とした抗体設計の成功に影響を受けて、本願発明者らは、ｐａｎ特異的な抗ＴＧＦβ抗体を設計するために同じ手法をＴＧＦβに適用した。ＴＧＦβは広く発現され、免疫恒常性および線維化調節を含む多数の異なる機能を有する。ＴＧＦβはホモダイマー形式で存在し、ＴＧＦβダイマーと３つの膜受容体（ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、およびＴＧＦβＲ３）からなる同じ受容体複合体を介してシグナル伝達する少なくとも３つの相同アイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）が存在する。ＴＧＦβＲ２は、最初にＴＧＦβ上の「フィンガー」の先端に結合し、その後、ＴＧＦβ二量体界面に結合する他の２つの受容体を動員する。ＴＧＦβ１の結晶複合体構造およびＴＧＦβＲ１およびＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインが解明されている。本願発明者らは、２つの受容体からの５種類の界面ホットスポット残基を移植することによって、この２つの受容体と同じ領域に結合する抗体を設計しようと企てたが、残念なことに、実験的に有効な結合を生成しなかった。受容体によって誘発されるホットスポットは、ホットスポットドナーであるＴＧＦβ受容体のアフィニティが非常に弱いため、所望の結合部位で抗体足場テンプレートを固定するのに十分なほど強くないと推測された（ＴＧＦβＲ１およびＴＧＦβＲ２のＫＤ値は、それぞれ２．５μＭおよび０．４μＭ）。フレソリムマブ（ＧＣ−１００８）は、低ナノモル濃度のアフィニティを有するｐａｎ−ＴＧＦβブロッキング抗体である。ＴＧＦβ３との複合体におけるフレソリムマブの結晶構造から、フレソリムマブのエピトープが受容体結合部位と高度に重複していることが明らかになっている。したがって、２つの受容体からのホットスポット残基とフレソリムマブを、組み合わせクエリとして混合することによって、同じ領域に結合する抗体バインダーを生成する機会が増えることが推測される。フレソリムマブからの受容体１および２および９の残基からの５個の残基を、仮想アラニンスキャニングによって選択し、混合クエリホットスポットとして使用した。本願発明者らのホットスポット移植手法は、残基のトリプレットハッシングに基づくものであり、各回に、１４のホットスポット残基のうち３個のみが最初に移植され、所与の抗体テンプレートのための向きを決定し、これにより、残ったホットスポットを、現在のホットスポットトリプレットによって固定された抗体テンプレートの向きに対してその骨格原子の位置が、任意の残基の位置に近いかどうかを確認することによって移植することを注記しておく。ホットスポット移植後、抗体テンプレートのＣＤＲループ上の残基をＲｏｓｅｔｔａによって突然変異させ、Ｋｅａｐ１の場合と同じ上述の方法を用いて現在の移植および向きを安定化させる新しい配列を作成する。３つのＴＧＦβの受容体結合部位での相同性が高いことから、ＴＧＦβＲ１とＴＧＦβＲ２の複合体由来のＴＧＦβ１構造のみを抗原標的として用いて、設計された各抗体Ｆａｂ構造モデルのＲｏｓｅｔｔａ結合エネルギーを計算した。
【００９２】
設計した抗体Ｆａｂフラグメントのアフィニティを、上述のＢｉａｃｏｒｅを用いて測定した。１つの設計されたＦａｂのみがＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対して明らかなアフィニティを示し（ＫＤはそれぞれ１０６および３２．９ｎＭである）、ＴＧＦβ２に対するアフィニティは、はるかに弱い（結合曲線をフィッティングするのは困難であった）。アフィニティは、リファレンス抗体であるフレソリムマブよりもはるかに弱いが、受容体のアフィニティよりはわずかに強い。設計された抗体が受容体の結合を遮断し、開始された下流のシグナル伝達を妨害することができるかどうかを試験するために、ＴＧＦβ結合によって駆動される細胞レポーター遺伝子アッセイを開発して、設計された抗体の遮断効果を決定した。抗体結合に際して、対応する受容体と結合する３つのＴＧＦβの全てによって開始された下流シグナル伝達が、濃度依存的な様式で部分的に妨害されたことが実証されている。ＩＣ５０を決定し、生物物理学的結合アッセイからのＫＤとの相関を示した。設計された抗体Ｆａｂは、弱いアフィニティを示すが、受容体およびフレソリムマブのエピトープと重複する領域でおそらく結合しており、したがってｐａｎ−特異的な様式で期待されるように受容体結合を遮断することが示される。
【００９３】
設計したＦａｂとＴＧＦβ１との複合体を結晶化させ、構造を解明した。予測したように、ＦａｂはＴＧＦβ１上の両方の受容体結合部位を完全に占有し、予想される結合状態と非常によく重なっている。抗体の重鎖は、受容体およびフレソリムマブからの４つのホットスポット残基を含むＣＤＲ  Ｈ２およびＨ３を含む疎水性残基を使用して、結合部位の大部分を占有している。
【００９４】
補足の表１２は、ホットスポット接合からの規則的な抗体Ｆａｂ設計の結合アフィニティを示す。解離定数（ＫＤ）は、ＳＰＲによって決定した。
【００９５】
補足の表１３は、ホットスポット接合からの規則的な抗体設計のＦｖ領域のアミノ酸配列を示す。
【００９６】
補足の表１４は、レポーター遺伝子アッセイ（ｎ＝２）における、ホットスポット接合からのＦａｂ１８４設計のパンブロッキングＩＣ５０を示す。
【００９７】
図３４〜図３７は、受容体によって誘発されたホットスポット残基とフレソリムマブによって誘発されたホットスポ
ット残基の組み合わせを移すことによる、ｐａｎ−ＴＧＦｂブロッキングＦａｂフラグメントの設計を示す。図３４−ＴＧＦβＲ１および２と、フレソリムマブとからの組み合わせたホットスポット残基。図３５−チップに固定された、設計された抗体Ｆａｂを用いたＦａｂ１８４／ＴＧＦβ複合体のＳＰＲ動態プロフィール。図３６−ＨＥＫ  Ｂｌｕｅレポーター遺伝子細胞アッセイにおけるＦａｂ１８４  ＴＧＦβの滴定による、ＴＧＦβ受容体結合の中和。図３７−結晶Ｆａｂ１８４と、ＴＧＦβ１側に重ね合わせることによってモデル化されたものとの結合様式の比較。
補足の表
【００９８】
【表１】
2019505880.tif 000005
【００９９】
【表２】
2019505880.tif 000006
【０１００】
【表３】
2019505880.tif 000007
【０１０１】
【表４】
2019505880.tif 000008
【０１０２】
【表５】
2019505880.tif 000009
【０１０３】
【表６】
2019505880.tif 000010
【０１０４】
【表７】
2019505880.tif 000011
【０１０５】
【表８】
2019505880.tif 000012
【０１０６】
【表９−１】
2019505880.tif 000013
【表９−２】
2019505880.tif 000014
【表９−３】
2019505880.tif 000015
【表９−４】
2019505880.tif 000016
【表９−５】
2019505880.tif 000017
【０１０７】
【表１０】
2019505880.tif 000018
【０１０８】
【表１１】
2019505880.tif 000019
【０１０９】
補足の表１２．ホットスポット接合からの規則的な抗体Ｆａｂ設計の結合アフィニティ解離定数（ＫＤ）は、ＳＰＲによって決定した。
【表１２】
2019505880.tif 000020
【０１１０】
補足の表１３．ホットスポット接合からの規則的な抗体設計のＦｖ領域のアミノ酸配列
【表１３】
2019505880.tif 000021
【０１１１】
補足の表１４．レポーター遺伝子アッセイ（ｎ＝２）における、ホットスポット接合からのＦａｂ１８４設計の受容体のｐａｎ−ブロッキングＩＣ５０。
【表１４】
2019505880.tif 000022
擬似コード
【０１１２】
抗体足場構造に接合するホットスポットの擬似コード：
# Main function:iterate all antibody scaffold structures, do graftScaffoldOntoHotspots
DEF Main (String AntigenPDB, String HotspotsPDB, String ScaffoldsPath):
# load antigen and hotspots
Protein antigen = readPDB (AntigenPDB)
Protein hotspots = readPDB (HotspotsPDB)
# Iterate each template
FOR scaffoldPDB IN ScaffoldsPath:
Protein scaffold = readPDB (scaffoldPDB)
# generate grafted complex structure
Protein graft = graftScaffoldOntoHotspots (antigen, hotspots, scaffold)
# dump the transplant structure
dumpPDB (graft)
# FUNCTION graftScaffoldOntoHotspots:graft one antibody scaffold onto the hotspots
DEF graftScaffoldOntoHotspots (Protein Antigen, Protein Hotspots, Protein Scaffold):
# Enumerate all hotspots triplets and store in hotspotsTripletList
List hotspotsTripletList = []
FOR r1, r2, r3 IN hotspots:
Triplet hotspotsTriplet = setupTriplet (r1, r2, r3)
hotspotsTripletList.append (hotspotsTriplet)
# Enumerate all template CDR triplets and store in scaffoldTripletList
List scaffoldTripletList = []
FOR r1, r2, r3 IN scaffold’s CDR residues:
Triplet scaffoldTriplet = setupTriplet (r1, r2, r3)
scaffoldTripletList.append (scaffoldTriplet)
# iterate each pair of scaffoldTriplets and hotspotsTriplets, find the pair with identical key, and align the corresponding triplets
List SolutionList = []
FOR hotspotsTriplet IN hotspotsTripletList:
FOR scaffoldTriplet IN scaffoldTripletList:
IF hotspotsTriplet.key == scaffoldTriplet.key:
# Alignment and residue mutation
Align the antibody template onto the Hotspots by corresponding triplets using rms fitting
Replace the three template triplet residues with the corresponding hotspots
# Clashing check
Mutate any clashing residues on antibody with antigen’s backbones to alanines
IF clashes remain after alanine mutation:
Discard current Graft
ELSE:
Append current Graft to the SolutionList
Sort SolutionList by ascending hotspots RMSD
# Output the complex structure of antigen and transplanted antibody scaffold (with mutated Hotpots)
Return SolutionList.top
# CLASS Triplet and FUNCTION setupTriplet:Setup residue triplets
CLASS Triplet:
Residue residue1, residue2, residue3
String key
DEF setupTriplet (Residue r1, Residue r2, Residue r3):
# Edge lengths of the resdue triangle by residue1.Cα, residue2.Cα, residue3.Cα
dCα12 = Distance (r1.Cα, r2.Cα), dCα23 = Distance (r2.Cα, r3.Cα), dCα13 = Distance (r1.Cα, r3.Cα)
# Edge lengths of the resdue triangle by residue1.N, residue2.N, residue3.N
dN12 = Distance (r1.N, r2.N), dN23 = Distance (r2.N, r3.N), dN13 = Distance (r1.N, r3.N)
# Edge lengths of the resdue triangle by residue1.C, residue2.C, residue3.C
dC12 = Distance (r1.C, r2.C), dC23 = Distance (r2.C, r3.C), dC13 = Distance (r1.C, r3.C)
# Filter the triangles with any length less than 3.5 A
IF any dCα, dN, or dC <= 3.5:
Return False
# r1 and r2 corresponds to the longest Cα edge, r1 and r3 corresponds to the shortest Cα edge
Reorder r1, r2, r3 corresponding to descending dCα12, dCα23, dCα13
# Indexing key of the triplets by rounding up the edge lengths and concatenating into string
key = String (roundup (dCα1)) + String (roundup (dCα2)) + String (roundup (dCα3)) + String (roundup (dN1)) + String (roundup (dN2)) + String (roundup (dN3)) + String (roundup (dC1)) + String (roundup (dC2)) + String (roundup (dC3))
# return reordered r1, r2, r3 and key into a triplet
Return Triplet (r1, r2, r3, key)
Ｇ５４．１のＣＤＲＨ３ループスワッピングの擬似コード：
# Main function:iterate all antibody CDRH3 loop structures, do swapCDRH3
DEF Main (String AntibodyAntigenComplexPDB, String CDRH3sPath):
# load antibody-antigen complex PDB structure
Protein system = readPDB (AntibodyAntigenComplexPDB)
# chop off wt CDRH3 loop
Protein truncatedH3System = chopCDRH3 (system)
# Iterate each exogenous CDRH3 loop structure
FOR CDRH3LoopPDB IN CDRH3sPath:
Protein h3loop = readPDB (CDRH3LoopPDB)
# generate H3 swapped complex structure
Protein loopswap = swapCDRH3 (truncatedH3System, h3loop)
# dump the transplant structure
dumpPDB (loopswap)
# FUNCTION swapCDRH3:graft one exogenous CDRH3 loop onto the CDRH3-truncated antibody-antigen complex structure
DEF swapCDRH3 (Protein truncatedH3System, Protein h3loop):
# Alignment of the anchor residues of exogenous H3 loop onto those of CDRH3-truncated Fv
Align the h3loop anchor residues (VH93 and VH103) onto those of truncatedH3System
Remove the original VH93 and VH103 residues from truncatedH3System
Ligate the backbones of new h3loop’s VH93 and VH103 with VH92 and VH104 of truncatedH3System, respectively, generating a swappedH3System (new H3 loop inserted into original Fv in complex with antigen)
# Clashing check
FOR any clashing residues on h3loop with rest of swappedH3System’s backbones, mutate them to alanine
IF clashes remain after alanine mutation:
Discard current swappedH3System
ELSE:
# Output the complex structure of antigen-Fv and transplanted new H3 loop
Return current swappedH3System
RosettaScripts:AlaScan.xml:
<dock_design>
<FILTERS>
<AlaScan name=scan partner1=0 partner2=1 scorefxn=score12 interface_distance_cutoff=8.0 repeats=3/>
</FILTERS>
<MOVERS>
<RepackMinimize name=intermin scorefxn_repack=score12 scorefxn_minimize=score12 interface_cutoff_distance=8.0 repack_partner1=0 repack_partner2=0 design_partner1=0 design_partner2=0 minimize_bb=0 minimize_sc=1 minimize_rb=0/>
</MOVERS>
<PROTOCOLS>
<Add mover_name=intermin/>
<Add filter_name=scan/>
</PROTOCOLS>
</dock_design>
RosettaScripts:InverseRotamers.xml:
<dock_design>
<FILTERS>
<EnergyPerResidue name=energy pdb_num=79B energy_cutoff=0.0/>
<Ddg name=ddg threshold=-1.0/>
</FILTERS>
<MOVERS>
<TryRotamers name=try pdb_num=79B/>
</MOVERS>
<PROTOCOLS>
<Add mover_name=try/>
<Add filter_name=energy/>
<Add filter_name=ddg/>
</PROTOCOLS>
</dock_design>
RosettaScripts:ppk.xml:
<dock_design>
<MOVERS>
<Prepack name=ppk jump_number=0 scorefxn=score12/> Jump_number=0 to prepack the entire structure without moving the partners apart.
<MinMover name=min scorefxn=score12 chi=1 bb=0 jump=0/>
</MOVERS>
<PROTOCOLS>
<Add mover_name=ppk/>
<Add mover_name=min/>
</PROTOCOLS>
</dock_design>
RosettaScripts:MutationScanPB.xml:
<dock_design>
<SCOREFXNS>
<local_score weights=score12_full patch=’’pb_elec.wts_patch’’/>
<local_score_soft weights=soft_rep patch=’’pb_elec.wts_patch’’/>
</SCOREFXNS>
<TASKOPERATIONS>
<InitializeFromCommandline name=init/>
<ProteinInterfaceDesign name=pid repack_chain1=1 repack_chain2=1 design_chain1=0 design_chain2=1 interface_distance_cutoff=8/>
<ProteinInterfaceDesign name=pio repack_chain1=1 repack_chain2=1 design_chain1=0 design_chain2=0 interface_distance_cutoff=8/>
</TASKOPERATIONS>
<MOVERS>
<AtomTree name=docking_tree docking_ft=1/>
<MinMover name=min_sc scorefxn=local_score bb=0 chi=1 jump=1/> minimize sc, rb
<PackRotamersMover name=pack_interface scorefxn=local_score task_operations=init,pio/>
<PackRotamersMover name=pack_interface_soft scorefxn=local_score_soft task_operations=init,pio/>
<ParsedProtocol name=relax_before_baseline>
<Add mover=docking_tree/>
<Add mover=pack_interface/>
<Add mover= min_sc/>
</ParsedProtocol>
</MOVERS>
<FILTERS>
<Ddg name=ddg scorefxn=local_score confidence=0.0/>
<Delta name=delta_ddg filter=ddg upper=1 lower=0 range=-0.5 relax_mover=relax_before_baseline/>
<FilterScan name=scan_binding scorefxn=local_score relax_mover=relax_before_baseline task_operations=pid,init filter=delta_ddg triage_filter=delta_ddg resfile_name=’’scan.resfile’’/>
<Time name=scan_binding_timer/>
</FILTERS>
<PROTOCOLS>
<Add mover=docking_tree/>
<Add filter=scan_binding_timer/>
<Add filter=scan_binding/>
<Add filter=scan_binding_timer/>
</PROTOCOLS>
</dock_design>
RosettaScripts:FlexbbInterfaceDesign.xml:
<dock_design>
<TASKOPERATIONS>
<ProteinInterfaceDesign name=pio repack_chain1=1 repack_chain2=1 design_chain1=0 design_chain2=0 interface_distance_cutoff=10/>
<ReadResfile name=resfile filename=’’design.resfile’’/>
</TASKOPERATIONS>
<FILTERS>
<Ddg name=ddG scorefxn=score12 threshold=-20 repeats=2/>
<Sasa name=sasa threshold=2000/>
<CompoundStatement name=ddg_sasa>
<AND filter_name=ddG/>
<AND filter_name=sasa/>
</CompoundStatement>
</FILTERS>
<MOVERS>
<BackrubDD name=backrub partner1=0 partner2=1 interface_distance_cutoff=8.0 moves=1000 sc_move_probability=0.25 scorefxn=score12 small_move_probability=0.15 bbg_move_probability=0.25 task_operations=pio/>
<RepackMinimize name=des1 scorefxn_repack=soft_rep scorefxn_minimize=soft_rep minimize_bb=0 minimize_rb=1 task_operations=resfile/>
<RepackMinimize name=des2 scorefxn_repack=score12 scorefxn_minimize=score12 minimize_bb=0 minimize_rb=1 task_operations=resfile/> Design &minimization at the interface
<RepackMinimize name=des3 minimize_bb=1 minimize_rb=0 task_operations=resfile/>
<ParsedProtocol name=design>
<Add mover_name=backrub/>
<Add mover_name=des1/>
<Add mover_name=des2/>
<Add mover_name=des3 filter_name=ddg_sasa/>
</ParsedProtocol>
<GenericMonteCarlo name=iterate scorefxn_name=score12 mover_name=design trials=3/>
<InterfaceAnalyzerMover name=IAM scorefxn=score12 packstat=1 interface_sc=1 pack_input=1 pack_separated=1 tracer=0 fixedchains=H,L/>
</MOVERS>
<PROTOCOLS>
<Add mover=iterate/>
<Add mover=IAM/>
</PROTOCOLS>
</dock_design >
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１〜３９：＜２２３＞Ｆｖ領域
配列番号４０：＜２２３＞結晶化のために使用したＫｅａｐ１構築物
配列番号４１：＜２２３＞結晶化のために使用したＬＳ１４６−ｓｃＦｖ構築物
配列番号４２〜４７：＜２２３＞Ｆｖ領域
配列番号４８〜５３：＜２２３＞ＶＨ
配列番号５４〜７３：＜２２３＞ループスワップ
【図１】
2019505880.tif 000023
【図２】
2019505880.tif 000024
【図３】
2019505880.tif 000025
【図４】
2019505880.tif 000026
【図５】
2019505880.tif 000027
【図６】
2019505880.tif 000028
【図７】
2019505880.tif 000029
【図８】
2019505880.tif 000030
【図９】
2019505880.tif 000031
【図１０】
2019505880.tif 000032
【図１１】
2019505880.tif 000033
【図１２ａ】
2019505880.tif 000034
【図１２ｂ】
2019505880.tif 000035
【図１３】
2019505880.tif 000036
【図１４】
2019505880.tif 000037
【図１５】
2019505880.tif 000038
【図１６】
2019505880.tif 000039
【図１７】
2019505880.tif 000040
【図１８】
2019505880.tif 000041
【図１９】
2019505880.tif 000042
【図２０ａ】
2019505880.tif 000043
【図２０ｂ】
2019505880.tif 000044
【図２０ｃ】
2019505880.tif 000045
【図２０ｄ】
2019505880.tif 000046
【図２１】
2019505880.tif 000047
【図２２】
2019505880.tif 000048
【図２３】
2019505880.tif 000049
【図２４】
2019505880.tif 000050
【図２５】
2019505880.tif 000051
【図２６】
2019505880.tif 000052
【図２７】
2019505880.tif 000053
【図２８】
2019505880.tif 000054
【図２９】
2019505880.tif 000055
【図３０】
2019505880.tif 000056
【図３１】
2019505880.tif 000057
【図３２】
2019505880.tif 000058
【図３３】
2019505880.tif 000059
【図３４】
2019505880.tif 000060
【図３５】
2019505880.tif 000061
【図３６】
2019505880.tif 000062
【図３７】
2019505880.tif 000063
【配列表】
2019505880000001.app
【国際調査報告】
2019505880.tif 000064
2019505880.tif 000065