【手続補正書】
【提出日】平成19年4月3日(2007.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸29〜1012に対して少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体調製物により認識される、上記ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１５のアミノ酸29〜1013を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２３のヌクレオチド82〜3036によりコードされる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２３に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１６のアミノ酸29〜1013を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２４のヌクレオチド85〜3039によりコードされる、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸29〜1012を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１のヌクレオチド466〜3417によりコードされる、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸29〜533に対して少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体調製物により認識される、上記ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸29〜533を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１のヌクレオチド466〜1980によりコードされる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
大腸菌TOP10由来のプラスミドpJJ36-Jのインサートによりコードされる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
３７℃で５０％ホルムアミドの存在下で配列番号１のDNA配列と相補的なDNA配列とハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドと特異的に結合する抗体調製物により認識される、上記ポリペプチド。
【請求項１９】
核酸配列が４２℃で５０％ホルムアミドの存在下でハイブリダイズする、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号２３に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号２４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
大腸菌BL21由来のプラスミドpAH342（ATCC受託番号98538）のインサートによりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体調製物により認識される、上記ポリペプチド。
【請求項２４】
大腸菌BL21由来のプラスミドpAH342によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
大腸菌AR58由来のプラスミドpJJ701のインサートによりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体調製物により認識される、上記ポリペプチド。
【請求項２６】
大腸菌AR58由来のプラスミドpJJ701によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
クラミジア・トラコマティス、クラミジア・ペコラムまたはクラミジア・ニューモニエにより産生される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
異種ポリペプチドを更に含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
異種ポリペプチドが、プレまたはプロ配列、アフィニティー精製ペプチド、異種免疫原性ペプチドまたは前記異種ポリペプチドの２つまたはそれ以上の組み合わせである、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列の相補体を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３２】
発現手段を更に含む、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
発現手段がリーダー配列をコードする核酸を含む、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３６】
請求項３５に記載の抗体またはその断片を含む抗血清。
【請求項３７】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３０に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のベクター、請求項３４に記載の宿主細胞、または請求項３５に記載の抗体もしくはその断片、および担体を含む組成物。
【請求項３８】
アジュバントを更に含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
アジュバントが、ミョウバン、mLT、QS21、MPS、フロイント完全アジュバントまたは前記アジュバントの２つまたはそれ以上の組み合わせである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ポリペプチドと組合わせたターゲティング分子またはポリペプチドと複合体化したターゲティング分子を更に含む、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
ターゲティング分子がビタミンB12、細菌毒素もしくはその断片、モノクローナル抗体、タンパク質、核酸、炭水化物、または前記ターゲティング分子の２つまたはそれ以上の組み合わせである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
微粒子、カプセル、リポソーム製剤またはエマルジョンとして製剤化された、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
哺乳動物またはトリに投与したときに、ポリペプチドに対して体液性免疫応答（ＨＩＲ）または細胞性免疫応答（ＣＭＩ）を誘発する、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３０に記載のポリヌクレオチド、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のベクター、請求項３４に記載の宿主細胞、請求項３５に記載の抗体もしくはその断片、請求項３６に記載の抗血清または請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の組成物を含む、診断薬。
【請求項４５】
以下のステップ
（ａ）被験サンプルを請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させて、クラミジア抗原：抗クラミジア抗体免疫複合体を形成させること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）で形成された免疫複合体の存在を検出するか、または免疫複合体の量を測定すること、
を含む、被験サンプルの抗クラミジア抗体を検出する方法。
【請求項４６】
クラミジアに対する抗体またはその抗原結合断片を検出する診断キットであって、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド、ポリペプチドまたは組成物を被験サンプルと接触させるための容器手段、およびポリペプチドと抗体またはその抗原結合断片との間で形成されたクラミジア抗原：抗クラミジア抗体免疫複合体を検出または測定するための試薬手段を含む、上記キット。
【請求項４７】
以下のステップ
（ａ）請求項３５に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項３６に記載の抗血清と被験サンプルとを、抗体もしくはその断片がクラミジアと結合してクラミジア：抗クラミジア抗体免疫複合体を形成するのに十分な時間接触させること、及び
（ｂ）ステップ（ａ）で形成された免疫複合体の存在を検出するか、または免疫複合体の量を測定すること、
を含む、被験サンプルのクラミジアの存在を検出する方法。
【請求項４８】
クラミジアの存在を検出する診断キットであって、請求項３５に記載の抗体もしくはその断片または請求項３６に記載の抗血清、前記抗体または抗血清を被験サンプルと接触させるための容器手段、前記抗体またはその断片とクラミジアとの間で形成されたクラミジア：抗クラミジア抗体免疫複合体を検出するかまたは測定する試薬手段を含む、上記キット。
【請求項４９】
サンプル中のクラミジア核酸の存在を確認する方法であって、以下のステップ
（ａ）サンプルを請求項３０に記載のポリヌクレオチドもしくはその断片またはそれらの相補体と接触させ、該ポリヌクレオチドもしくはその断片またはそれらの相補体と、それらと特異的にハイブリダイズ可能なサンプル中の核酸とからなる二本鎖を生成させること、及び
（ｂ）二本鎖の生成を確認すること、
を含む、上記方法。
【請求項５０】
サンプル中のクラミジア核酸の存在を確認する診断キットであって、
（ａ）請求項３０に記載のポリヌクレオチドもしくはその断片またはそれらの相補体、
（ｂ）該ポリヌクレオチドをサンプルと接触させて、該ポリヌクレオチドと、それと特異的にハイブリダイズ可能なサンプル中の核酸とからなる二本鎖を生成させるための手段、及び
（ｃ）二本鎖の生成を確認する手段、
を含む、上記キット。
【請求項５１】
宿主に免疫応答を生じさせるための医薬の製造における、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５２】
免疫応答が体液性免疫応答である、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
免疫応答が細胞性免疫応答である、請求項５１に記載の使用。
【請求項５４】
宿主がトリまたは哺乳動物である、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
クラミジア関連疾患を予防、治療または軽減するための医薬の製造における、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５６】
疾患が、クラミジア菌感染症、トラコーマ、結膜炎、尿道炎、性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）、子宮頸炎、副睾丸炎、子宮内膜炎、骨盤炎症性疾患（ＰＩＤ）、卵管炎、卵管閉塞、不妊症、子宮頸癌およびアテローム硬化症からなる群より選択される、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
宿主がトリまたは哺乳動物である、請求項５５または５６に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の技術分野 
本発明は、一般的には、クラミジア属(Chlamydia)の高分子量(HMW)タンパク質、そのアミノ酸配列、およびHMWタンパク質に特異的に結合する抗体（細胞毒性抗体を含む）に関する。本発明はさらに、HMWタンパク質、その断片、またはHMWタンパク質もしくはその一部に特異的に結合する抗体、またはHMWタンパク質もしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を含有する、ワクチンをはじめとする予防用および治療用組成物を包含する。本発明はさらに、哺乳動物および鳥類のクラミジア感染関連疾患を予防、治療または軽減する方法ならびにクラミジアに対する免疫応答を引き出す方法を提供する。本発明はさらに、HMWタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列および縮重配列、該配列を含むベクター、ならびに該ベクターを含む宿主細胞を提供する。また、診断法および診断キットも含まれる。
【０００２】
２．発明の背景
クラミジア菌は性的感染症、肺炎などの呼吸器疾患、新生児結膜炎、失明といった障害を引き起こす、広範囲に流行しているヒト病原体である。クラミジア菌は真正の細胞内細菌であって、肺、結膜路または生殖路の上皮ライニングに感染する。クラミジア属の最も一般的な種としては、Chlamydia trachomatis、Chlamydia psittaci、Chlamydia pecorum、Chlamydia pneumoniaeなどがある。最近、新たに命名されたクラミジア属の種であるC. pneumoniae（以前は、C. trachomatis TWAR）は流行性のヒト肺炎の主因として関連づけられてきており、また、アテローム硬化症においてある役割を果たしている可能性がある。
【０００３】
現在のところ、トラコーマおよび広域の性的感染症を引き起こすC. trachomatisの血液型亜型は18種類が確認されており、Ａ、ＢおよびＣ血液型亜型は主としてトラコーマに関係しており、一方Ｄ〜Ｋ血液型亜型は生殖感染症の最も一般的な原因となる。
【０００４】
米国をはじめとする多くの工業先進国においては、C. trachomatisが性的感染症の主な原因菌となっている。米国でのC. trachomatis感染症の正確な罹患率は不明であるが、最近の疫学研究からは、淋菌性感染症がおよそ200万例であるのに対して、毎年400万例を超えるクラミジア感染症が発生していると報告されている。人種、民族、社会経済上のあらゆるグループが罹患するが、クラミジア感染症の最大の流行は、12〜20才の性的に活発な若者の間で起こる。大部分の泌尿生殖器クラミジア感染症は臨床的に無症候性である。男性でも女性でも長期保菌が普通である。クラミジア感染症であると診断された男性の25%および女性の75%もがはっきりとわかる感染の徴候をまったく呈していない。その結果、こうした無症候性の人々が大きな貯蔵所を構成し、一般社会にこの病原菌を伝播させることとなる。
【０００５】
これらの感染症からは、良性どころか、重症の疾病が発生することがある。例えば、尿道炎、性病性リンパ肉芽腫(LGV)、子宮頸炎、男性の副睾丸炎などである。子宮頸内膜からの上行性感染は通常、子宮内膜炎、骨盤炎症性疾患(PID)、および卵管を閉塞させて最終的には不妊症に至らせることのある卵管炎を起こす。
【０００６】
新生児のC. trachomatis感染は、母親の感染した子宮頸部に周産期に暴露されることにより生じる。クラミジア子宮頸炎の母親の膣から生まれた新生児のほぼ70%は産道通過中に感染してしまう。眼、中咽頭、泌尿器および直腸の粘膜が主な感染部位である。クラミジアによる結膜炎は最も普通に見られる形の新生児眼炎となってきている。暴露された乳児の約20〜30%は、硝酸銀または抗生物質軟膏による予防処置を受けた後でさえ、出生後14日以内に封入体結膜炎を発生する。C. trachomatisは米国での小児肺炎の主因でもある。感染した子宮頸部を通過した新生児の約10〜20%がクラミジア肺炎を発症し、何らかの医療介入が必要だろう。
【０００７】
開発途上国においては、C. trachomatisの眼への感染が慢性の濾胞性結膜炎であるトラコーマを引き起し、この場合は瘢痕形成の繰り返しにより眼瞼のゆがみと視力の低下が結果的に起こる。トラコーマは世界中の予防可能な失明の主な原因となっている。世界保健機関の推定によれば、世界中で50億人を超える人々（約15億人の子供を含む）が現在も活動性のトラコーマを患っており、600万人を超える人々がこの疾病によって失明している。
【０００８】
工業先進国においては、クラミジア感染症の治療にかかるコストが莫大である。米国では、かかる疾病の年間の治療コストが1992年には25〜30億ドルであると概算されたが、2000年には80億ドルを上回ると見積もられている。
【０００９】
この健康危機に対する１つの可能な解決策は有効なクラミジアワクチンを提供することである。幾つかの証拠が、有効なワクチンを開発することは実現可能であると提案している。
【００１０】
ヒトと霊長類の双方の研究により、C. trachomatisに対する短期防御免疫が全クラミジア(whole Chlamydia)を接種することで得られることが明らかになった。しかし、この防御は短命で、血液型亜型に特異的であり、粘膜抗体によるものである点に特徴があった。その上、いくつかのワクチンでは、免疫感作に使用したものと異なる血液型亜型にもともと感染している場合に疾病が悪化した。この有害な反応は結局、遅延型過敏症反応によるものであることが証明された。したがって、ききめがあるが、非感作性の免疫応答を引き出す能力があるサブユニットに基づくクラミジアワクチンを開発する必要がある。このようなサブユニットワクチンは、有効であるためには粘膜の中和分泌IgA抗体および／または細胞性免疫応答の両方を引き出す必要がある。
【００１１】
サブユニットワクチン開発のこれまでの努力はもっぱら主要な外膜タンパク質(MOMP)に集中していた。MOMPは大きさが約40kDaの細胞膜内タンパク質であって、感染性の基本小体(elementary body: EB)膜タンパク質の約60%までを構成している(Caldwell, H.D., J. Kromhout & L. Schachter, 1981, Infect. Immun., 31:1161-1176)。MOMPは細胞外EBに構造的完全性を付与し、この微生物が細胞内で増殖して代謝的に活動している場合はポーリン様分子として作用すると考えられる。４つの表面に露出した可変ドメイン(VDI〜VDIV)を除いて、MOMPは18全ての血液型亜型において高度に保存されている。MOMPは非常に免疫原性があって、局所の中和抗クラミジア抗体を誘導することができる。しかし、この方法には問題がある。
【００１２】
現在まで、マッピングされている大部分のMOMP特異的中和エピトープはVD領域内に位置しており、したがって血液型亜型に特異的な抗体のみをもたらす。各種ワクチンベクター（例えば、ポリオウイルス）内で血液型亜型特異的エピトープを合体させて、広範に交差反応する中和抗体を生成する試みは最小限の成功を収めたにすぎなかった(Murdin, A.D., H. Su, D.S. Manning, M.H. Klein, M.J. Parnell, and H.D. Caldwell, 1993, Infect. Immun., 61:4406-4414; Murdin, A.D., H. Su, M.H. Klein, and H.D. Caldwell, 1995, Infect. Immun., 63:1116-1121)。
【００１３】
C. trachomatisの他の２つの主要な外膜タンパク質である60kDaおよび12kDaのシステインに富むタンパク質、ならびに表面に露出しているリポ多糖類は高度に免疫原性であるが、MOMPと相違して、中和抗体を誘導しないことが示された(Cerroneら, 1991, Infect. Immun., 59:79-90)。それゆえに、新規なサブユニットに基づくクラミジアワクチンの必要性が依然として存在する。
【００１４】
３．発明の概要
本発明の目的は、単離されて、実質的に精製されたクラミジア種(Chlamydia sp.)の高分子量タンパク質(HMWタンパク質)またはその断片もしくは類似体を提供することであり、このHMWタンパク質はSDS-PAGEで測定したときの見かけの分子量が約105〜115kDaである。好ましくは、HMWタンパク質は実質的に配列番号２、15および16のいずれかのアミノ酸配列を有する。HMWタンパク質の好ましい断片には配列番号３、17および25〜37が含まれる。本明細書中で用いる場合、配列に対して「実質的に」とは、その配列が基準配列に対して少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%同一であることを意味するものである。好ましくは、HMWタンパク質は外膜タンパク質である。より好ましくは、外膜HMWタンパク質は表面に局在しているものである。好ましくは、HMWタンパク質はヘパリン結合ドメインを有する。好ましくは、HMWタンパク質はポーリン様ドメインを有する。本発明にはクラミジア属のあらゆる種が含まれるが、好ましい種としては、Chlamydia trachomatis、Chlamydia psittaci、Chlamydia pecorumおよびChlamydia pneumoniaeがある。実質的に精製されたHMWタンパク質は純度が70wt%以上、好ましくは約90wt%以上のものであり、その水溶液の形態であり得る。
【００１５】
また、本発明には、HMWタンパク質の組換え体またはその断片もしくは類似体も含まれ、形質転換したE. coli細胞において発現されたHMWタンパク質の組換え体は、SDS-PAGEで測定したときの見かけの分子量が約105〜115kDaである。HMW由来のペプチドとは、HMWタンパク質の断片; １個以上のアミノ酸欠失、挿入または置換を含む野生型HMWタンパク質またはその断片の変異体; およびHMWタンパク質の全体または一部のＣ末端またはＮ末端または内部セグメントに融合された異種ポリペプチドからなるキメラタンパク質を含むものである。
【００１６】
本明細書中で用いる「HMWタンパク質」とは、見かけの分子量（SDS-PAGEで測定）が約105〜115kDaであるクラミジア属の種の天然のまたは組換え体の精製された高分子量タンパク質をさす。本明細書中で用いる「rHMWタンパク質」とは組換え体のHMW タンパク質をさす。
【００１７】
本発明の別の目的は、HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、単離された実質的に純粋な核酸分子を提供することである。コードされるHMWタンパク質が配列番号２、15および16のいずれかのアミノ酸配列、またはその断片（特に配列番号３、17、25〜37）からなる核酸配列が好ましいものである。また、配列番号１、23〜24のいずれかのDNA配列またはその相補配列; 配列番号４〜14、18〜22のいずれかの核酸配列を有するHMW DNA配列の断片またはその相補配列; およびストリンジェント条件下で上記配列のいずれか１つにハイブリダイズする核酸配列からなる、単離された核酸分子も含まれる。ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸は、上記配列のいずれかと約70%の配列同一性、より好ましくは約90%の配列同一性をもつことが好ましい。
【００１８】
HMWタンパク質の誘導体および類似体の生産と使用は本発明の範囲内である。特定の実施形態において、この誘導体または類似体は機能的に活性であり、すなわち、全長の野生型HMWタンパク質に関連した機能的活性を１以上示す能力がある。一例として、所望の免疫原性または抗原性をもつこのような誘導体または類似体は、例えばイムノアッセイや免疫感作のために使用することができる。特定の実施形態は抗HMW抗体によって結合され得るHMW断片に関する。HMWの誘導体または類似体はその所望の活性について当技術分野で公知の方法により試験することができる。
【００１９】
特に、HMW誘導体は、機能的に等価の分子をもたらす置換、付加または欠失によってHMW配列を改変することにより作製できる。ヌクレオチドコード配列の縮重のため、HMW遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列が本発明の実施において使用され得る。これらには、限定するものではないが、遺伝子の全部または一部が配列内の機能的に等価のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により改変されてサイレント変化をもたらすヌクレオチド配列が含まれる。同様に、本発明のHMW誘導体には、限定するものではないが、一次アミノ酸配列として、配列内の残基が機能的に等価のアミノ酸残基で置換されてサイレント変化をもたらす改変配列を含むHMWタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を含むものも含まれる。例えば、配列内の１個以上のアミノ酸残基が、機能的等価物として作用してサイレント変化をもたらす類似の極性の他のアミノ酸で置換され得る。配列内のアミノ酸の代替物はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択される。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンがある。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがある。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンがある。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸がある。
【００２０】
本発明の特定の実施形態においては、HMWタンパク質の少なくとも６（連続）アミノ酸からなるHMWタンパク質の断片からなる、または該断片を含んでなるタンパク質が提供される。他の実施形態では、該断片がHMWタンパク質の少なくとも７〜50アミノ酸からなる。特定の実施形態では、かかる断片は35、100または200アミノ酸より大きくない。HMWの誘導体または類似体には、限定するものではないが、HMWまたはその断片と実質的に相同な領域を含む分子（例えば、各種の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列に対してまたは当技術分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによりアライメントされた配列と比較したとき、60%以上または70%または80%または90%または95%の同一性）またはコードする核酸がストリンジェント条件、中度のストリンジェント条件または非ストリンジェント条件下でHMWコード配列にハイブリダイズすることができる分子が含まれる。
【００２１】
例えば、有用なコンピュータ相同性プログラムには次のものが含まれる：Karlin & Altschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68; 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77に記載の統計学的方法を用いて有意差があるとみなす配列類似性の検索に適合するようにした発見的検索アルゴリズムである、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Altschulら, 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, "The BLAST Algorithm"; Altschulら, 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402)。５つの特定のBLASTプログラムは次のタスクをおこなう。
【００２２】
１）BLASTPプログラムは、疑わしいアミノ酸配列をタンパク質配列データベースに対して比較するものである。
２）BLASTNプログラムは、疑わしいヌクレオチド配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較するものである。
３）BLASTXプログラムは、疑わしいヌクレオチド配列（両鎖）の６個のフレームでの概念上の翻訳産物をタンパク質配列データベースに対して比較するものである。
４）TBLASTNプログラムは、疑わしいタンパク質配列を６個すべてのリーディングフレームで翻訳されたヌクレオチド配列データベース（両鎖）に対して比較するものである。
５）TBLASTXプログラムは、疑わしいヌクレオチド配列の６個のフレームでの翻訳産物をヌクレオチド配列データベースの６個のフレームでの翻訳産物に対して比較するものである。
【００２３】
Smith-Waterman（データベース：European Bioinformatics Institute wwwz.ebi.ac.uk/bic sw/)(Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197)は配列アライメントのための数学的に厳格なアルゴリズムである。
【００２４】
FASTA(pearsonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448参照)はSmith-Watermanアルゴリズムに発見的に近似するものである。BLAST、Smith-WatermanおよびFASTAアルゴリズムの手法および利点の一般的論議については、Nicholasら, 1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods"(www.psc.edu)と本明細書中で引用した参考文献を参照されたい。
【００２５】
本発明のHMW誘導体および類似体は当技術分野で公知のいろいろな方法で生産することができる。その生産をもたらす操作は遺伝子またはタンパク質レベルで起こりうる。例えば、クローン化されたHMW遺伝子配列を当技術分野で公知の多数の戦略のいずれかにより修飾することができる(Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。配列を適切な部位で制限エンドヌクレアーゼにより切断し、続いてさらなる酵素的修飾をおこない、所望により単離し、in vitroでライゲートする。HMWの誘導体または類似体をコードする遺伝子の生産においては、修飾した遺伝子が確実にHMWと同じ翻訳リーディングフレーム内に存在して、目的のHMW活性をコードする領域が翻訳停止シグナルで中断されないように注意すべきである。
【００２６】
さらに、HMWをコードする核酸配列にin vitroまたはin vivoで突然変異を起こさせて、翻訳配列、開始配列および／または終結配列を導入および／または破壊したり、またはさらなるin vitro修飾を容易にするために、コード領域に改変を導入し、かつ／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成したりまたは既存のものを破壊したりすることが可能である。当技術分野で公知の突然変異誘発法のどれを使用してもよく、例えば、限定するものではないが、化学的突然変異誘発、in vitro部位特異的突然変異誘発(Hutchinson, C.ら, 1978, J. Biol. Chem 253:6551)、TAB(登録商標)リンカー(Pharmacia)の使用などがある。
【００２７】
HMW配列の操作はタンパク質レベルでも行うことができる。HMWタンパク質の断片、または翻訳中もしくは翻訳後に、例えばグリコシル化、リピド化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質加水分解、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などにより、異なって修飾された他の誘導体または類似体も本発明の範囲内に含まれる。化学的修飾は公知の方法により行うことができ、例えば、限定するものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝的合成などがある。
【００２８】
さらに、HMWの類似体および誘導体は化学的に合成することができる。例えば、目的のドメインを含むか、またはin vitroで所望の活性を媒介するHMWタンパク質の部分に相当するペプチドをペプチドシンセサイザーを使って合成する。さらに、所望により、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を置換もしくは付加によりHMW配列に導入してもよい。非古典的アミノ酸としては、通常のアミノ酸のＤ異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Abx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、デザイナーアミノ酸（β-メチルアミノ酸、Ｃα-メチルアミノ酸、Ｎα-メチルアミノ酸など）および一般的なアミノ酸類似体があるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）でありうる。
【００２９】
本発明の別の目的は、宿主の形質転換に適したまたは宿主へのHMWタンパク質の送達に適した、配列番号１、23もしくは24の核酸分子またはその断片を含む組換え発現ベクターを提供することである。好ましくは、組換え発現ベクターは宿主の形質転換に適しており、HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を宿主により発現させるための前記核酸分子に機能的に連結された発現手段を含有する。より好ましいものは、発現手段が宿主から該タンパク質を分泌させるためのリーダー配列をコードする核酸部分、あるいは該タンパク質またはその断片もしくは類似体のＮ末端とＣ末端のいずれかに結合されたアフィニティードメインを含む発現ベクターである。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、上記の発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞、ならびに形質転換宿主細胞から産生される組換えHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を含む。
【００３１】
本発明のさらに別の態様は、配列番号２、15〜16のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその断片もしくは保存的に置換された類似体に特異的に結合する抗体調製物により認識されるHMWタンパク質に関する。
【００３２】
抗原性および／または免疫原性組成物は本発明の別の態様であり、前記組成物は次の成分：
ａ）SDS-PAGEで測定したときの分子量が約105〜115kDaであるHMWタンパク質、またはその断片もしくは類似体；
ｂ）HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、単離された核酸分子；
ｃ）配列番号１、22、23または24の配列、その相補配列、またはストリンジェント条件下でそれにまたはその断片にハイブリダイズする核酸配列を有する、単離された核酸分子；
ｄ）上記ｂ）またはｃ）に規定する核酸分子と、HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を宿主により発現させるための該核酸分子に機能的に連結された発現手段とを含有する発現ベクターを含む形質転換宿主において産生される、単離された組換えHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体；
ｅ）HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする核酸を含有する組換えベクター；および ｆ）上記ｅ）のベクターを含む形質転換細胞；
からなる群より選択される成分少なくとも１種と、場合によりアジュバントと、そのための製薬上許容される担体もしくは希釈剤を含有し、宿主に投与したとき免疫応答を生ずるものである。好ましいアジュバントとしては、コレラホロトキシンまたはサブユニット、E. coli熱不安定ホロトキシン、そのサブユニットおよび変異型、アルム、QS21、MPLなどがある。特に、アルム、LTR192G、mLTおよびQS21が好ましい。
【００３３】
また、哺乳動物やトリに、有効量の上記抗原性または免疫原性組成物を投与することを含んでなる、哺乳動物またはトリにおいて免疫応答を引き出す方法も包含される。
【００３４】
本発明の他の態様は、本発明の抗原性または免疫原性組成物に対して誘導された抗血清、ならびにHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体に特異的に結合する抗血清中に存在する抗体に関する。好ましくは、抗体は配列番号２、15〜16のアミノ酸配列を有するHMWタンパク質またはその断片もしくは保存的に置換された類似体に特異的に結合する。HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体に特異的に結合するモノクローナル抗体も含まれる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、医薬およびワクチン組成物を含み、前記組成物は次の成分：
ａ）SDS-PAGEで測定したときの分子量が約105〜115kDaであるHMWタンパク質、またはその断片もしくは類似体；
ｂ）HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする、単離された核酸分子；
ｃ）配列番号１、22、23または24の配列、その相補配列、またはストリンジェント条件下でそれにまたはその断片にハイブリダイズする核酸配列を有する、単離された核酸分子；
ｄ）上記ｂ）またはｃ）に規定する核酸分子と、クラミジア種のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を宿主により発現させるための該核酸分子に機能的に連結された発現手段とを含有する発現ベクターを含む形質転換宿主において産生される、単離された組換えHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体；
ｅ）HMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする核酸を含有する組換えベクター；
ｆ）上記ｅ）のベクターを含む形質転換細胞；
ｇ）上記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）の成分と特異的に結合する抗体；からなる群より選択される成分少なくとも１種と、そのための製薬上許容される担体もしくは希釈剤を含有する。好ましいものは粘膜レベルで有効なワクチン組成物である。
【００３６】
本発明はまた、上記の態様のいずれか１つまたはそれ以上、例えば、上記の天然HMWタンパク質、組換えHMWタンパク質、核酸分子、免疫原性組成物、抗原性組成物、抗血清、抗体、核酸を含むベクター、およびベクターを含む形質転換細胞を含有する診断薬を包含する。
【００３７】
被験サンプル中のクラミジアまたは抗クラミジア抗体を検出するための方法および診断キットも包含され、前記方法は、
ａ）サンプルに、クラミジアのHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を含む抗原性もしくは免疫原性組成物またはそれに対する抗体を接触させて、クラミジア抗原：抗クラミジア抗体免疫複合体を形成させ、そしてさらに、
ｂ）被験サンプル中のクラミジアまたは抗クラミジア抗体の存在を示すものとして、ステップａ）で形成された免疫複合体の存在を検出するか、または免疫複合体の量を測定する、
各ステップを含んでなる。クラミジアまたはそれに対する抗体を検出するための診断キットは、抗体、またはクラミジアのHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体を含む抗原性もしくは免疫原性組成物；該抗体または組成物に、抗クラミジア抗体またはクラミジアを含む疑いのある被験サンプルを接触させるための容器手段；および抗原性もしくは免疫原性組成物または抗体と被験サンプルの間で形成されたクラミジア抗原：抗クラミジア抗体免疫複合体を検出または測定するための試薬手段を含有する。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、被験サンプル中のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする核酸の存在を確認する方法を提供し、前記方法は、
ａ）被験サンプルを、本明細書中で提供される核酸分子と接触させて、該核酸分子と、HMWタンパク質をコードしかつ該核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能なサンプル中の該核酸とからなる二本鎖を生成させ、そして
ｂ）該二本鎖の生成を確認する、
各ステップを含んでなる。
【００３９】
本発明はまた、サンプル中のHMWタンパク質またはその断片もしくは類似体をコードする核酸の存在を確認するための診断キットおよびそのための試薬を提供し、前記キットおよび試薬は、
ａ）本明細書中で提供される核酸分子；
ｂ）該核酸分子と、HMWタンパク質をコードしかつ該核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能なサンプル中の該核酸とからなる二本鎖を生成させるための、該核酸分子を被験サンプルに接触させる手段；および
ｃ）該二本鎖の生成を確認する手段；
を含有する。
【００４０】
さらに、本発明には、有効量の本発明の医薬組成物またはワクチン組成物を投与することを含んでなる、動物（哺乳動物と鳥類を含む）のクラミジア関連疾患を予防、治療または軽減する方法も含まれる。好適な疾患としては、クラミジア菌感染症、トラコーマ、結膜炎、尿道炎、性病性リンパ肉芽腫(LGV)、子宮頸炎、副睾丸炎、子宮内膜炎、骨盤炎症性疾患(PID)、卵管炎、卵管閉塞、不妊症、子宮頸癌、およびアテローム硬化症などがある。好ましいワクチンまたは医薬組成物は、クラミジア種が原因となる疾患から宿主を保護または治療するためにin vivo投与用に製剤化されたものである。微粒子、カプセル、リポソーム製剤またはエマルジョンとして製剤化された組成物も好ましい。
【００４１】
４．省略語
抗HMW ＝ HMWポリペプチド抗体または抗血清
ATCC ＝ アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
免疫反応性 ＝ 細胞性または体液性免疫応答を引き出す能力がある
kDa ＝ キロダルトン
OG ＝ n-オクチルβ-D-グルコピラノシドまたは オクチルグルコシド
OMP ＝ 外膜タンパク質
OMPs ＝ 外膜タンパク質類
PBS ＝ リン酸緩衝溶液
PAGE ＝ ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ポリペプチド ＝ 任意の長さのペプチド、好ましくは10個以上のアミノ 酸残基をもつもの
SDS ＝ ドデシル硫酸ナトリウム
SDS-PAGE ＝ ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動
【００４２】
本明細書において規定されるヌクレオチドまたは核酸配列は次のような塩基の一文字表記で表される。
A （アデニン）
C （シトシン）
G （グアニン）
T （チミン）
U （ウラシル）
M （AまたはC）
R （AまたはG）
W （AまたはT/U）
S （CまたはG）
Y （CまたはT/U）
K （GまたはT/U）
V （AまたはCまたはG; T/Uではない）
H （AまたはCまたはT/U; Gではない）
D （AまたはGまたはT/U; Cではない）
B （CまたはGまたはT/U; Aではない）
N （AまたはCまたはGまたはT/U）または（不明）
【００４３】
本明細書において規定されるペプチドおよびポリペプチド配列は次のようなアミノ酸残基の一文字表記で表される。
A （アラニン）
R （アルギニン）
N （アスパラギン）
D （アスパラギン酸）
C （システイン）
Q （グルタミン）
E （グルタミン酸）
G （グリシン）
H （ヒスチジン）
I （イソロイシン）
L （ロイシン）
K （リシン）
M （メチオニン）
F （フェニルアラニン）
P （プロリン）
S （セリン）
T （トレオニン）
W （トリプトファン）
Y （チロシン）
V （バリン）
X （不明）
【００４４】
本発明は、以下の発明の詳細な説明、発明の特定の実施形態の非限定的な実施例および添付の図面を参照することで、さらに理解されよう。
【００４５】
５．図面の説明 
図1はC.trachomatis L2エレメンタリーボディ(elementary body)（EB）群のウエスタンブロット分析を示す。
2-メルカプトエタノールを含有する標準Laemmli SDS-PAGE サンプルバッファ ー中に勾配精製したEB群を可溶化し、約3分間沸騰させ、SDSを含有する4-12％ Tris-グリシン勾配ゲル上にのせ、100Vで電気泳動した。電気泳動の直後に、4℃で約2.5時間、約50Vでタンパク質をPVDF膜上にエレクトロブロットした。抗rHMWP'抗体（K196）の1／5,000希釈物を使用して、ブロックした膜を室温で1.5時間プローブした。洗浄後、膜をHRPと複合体化したヤギ抗ウサギIgG抗体の1／5,000希釈物で室温で1時間処理した。標準TMB基質システムを使用して、ブロットを発色させた。EBおよびRB中に3つの免疫反応性バンドが検出された。ドットは約105-115kDaのHMWタンパク質を示す。
【００４６】
図2はC.trachomatis LGV L2由来のHMWタンパク質のオープンリーディングフレームをコードする共通核酸配列（配列番号１）を示す。
【００４７】
図3はC.trachomatis LGV L2由来のPCRオープンリーディングフレームから推定されるHMWタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００４８】
図4は大腸菌中で発現したC.trachomatis LGV L2由来の部分精製した組換えHMWタンパク質のSDS-PAGEを示す。分子量マーカーとして、対比染色および前染色したSDS-PAGE標準を使用した。ゲル中の分子量マーカーの位置を、図の左側および右側にいくつかのマーカーの分子量（kDa）に対する線によって示す。詳細については本文の実施例10を参照されたい。
レーンＡ：Mark 12 Wide Range Molecular Weight Markers(Novex)；ミオシン、200 Kdal；B-ガラクトシダーゼ、116.3 Kdal；ホスホリラーゼ B、97.4 Kdal ；ウシ血清アルブミン、66.3 Kdal。
レーンＢ：C.trachomatis L2組換えHMWP。
レーンＣ：SeeBlue Prestained Molecular Weight Markers(Novex)；ミオシン、250 Kdal；ウシ血清アルブミン、98 Kdal；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、64 Kdal。
【００４９】
図5はプラスミド pAH306、pAH310、pAH312、pAH316およびPCRオープンリーディングフレームのマップを示す。
【００５０】
図6はC.trachomatis L2、B、およびFに関するHMWタンパク質の予測されるアミノ酸配列を示す。
C.trachomatis L2配列（配列番号４３）を最上段に示し、成熟タンパク質の第１残基、Eで始まる（配列番号２のアミノ酸残基29〜1012を参照）。真核 N-グリコシル化が可能な配列に下線をつけている。プロリンに富むセグメントに隣接し、脂質二重層まで到達する好適な長さの疎水性ヘリックス領域に下線をつけ、ブラケットで囲んである。B（配列番号１５のアミノ酸残基29〜1013を参照）およびF（配列番号１６のアミノ酸残基29〜1013を参照）血清型（serovars）において同定されたアミノ酸の差異をL2HMWPタンパク質配列の下に記載している。
【００５１】
図7は抗rHMWP'抗体を使用したC.trachomatis N11（F血清型）封入体の間接蛍光抗体染色を示す。
パネルＡ：ウサギ K196からの免疫化後の血清。クラミジア封入体は黄色に染 色する。
パネルＢ：ウサギ K196からの免疫化前の血清。
６．発明の詳細な説明 
本明細書および請求の範囲中で使用する用語「抗原」およびこれに関連する用語「抗原性」とは、抗体またはＴ細胞受容体に特異的に結合する物質に関して称する。好ましくはこの抗原は免疫原性を有する。
【００５２】
本明細書および請求の範囲中で使用する用語「免疫原性」とは、動物、好ましくは哺乳類または鳥類において免疫応答、例えば抗体および／または細胞性免疫応答を誘発する能力を称する。
本明細書および請求の範囲中で使用する用語「宿主」とは、動物中での in vivoまたは哺乳類細胞培養物内での in vitroのいずれかを称する。
【００５３】
限定するわけではないが、ワクチンなどの本発明の抗原性、免疫原性、医薬組成物の有効量を投与すべきである。ここで「有効量」は、被験体中で、限定するわけではないが免疫応答などの、所望の予防、治療または改善性応答を産生するのに十分な量と定義される。必要とされる量は使用するHMWタンパク質、断片、核酸若しくは誘導体の免疫原性、ならびに投与される被験体の種類および体重に応じて変更されることになるが、標準的技術を使用して確定することができる。組成物は、被験体中に抗HMWタンパク質抗体およびオプソニン作用性若しくは殺菌性抗体を含む抗体を産生するような免疫応答を誘発する。本発明の限定するわけではない好ましい実施形態において、有効量の本発明の組成物は投与前の抗体力価の少なくとも３倍までの抗体力価の上昇をもたらす。本発明の限定するわけではない好ましい特定の実施形態において、宿主に対して約0.01-2000μgおよび好ましくは0.1-500μgが投与される。その外にアジュバントを含有する組成物が好ましい。
【００５４】
免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物を液状溶液またはエマルジョンなどの注射可能なものとして調製することができる。HMWタンパク質を１種以上 の製薬上許容される賦形剤でそのHMWタンパク質に適合するものと混合してもよ い。こうした賦形剤として、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれる。
【００５５】
免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物に湿潤化若しくは乳化剤、pH緩衝剤、またはそれらの有効性を強化するアジュバントなどの１種以上の補助剤をさらに含ませることができる。免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物は皮下若しくは筋肉内注射によって非経口投与することができる。
【００５６】
あるいは、本発明にしたがって形成した免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物を粘膜表面で免疫応答を喚起するような方法で製剤化して送達することができる。例えば、免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物を粘膜表面に、例えば鼻、口（胃内）、眼内、鰓内（branchiolar）、腟内または直腸内経由によって投与することができる。あるいは、坐剤および経口製剤を含むその他の投与形態も望ましい。坐剤のためには、結合剤および担体として、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。経口製剤には例えば医薬品グレードのサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用されるインシピエント(incipient)を含ませることができる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、 ピル、カプセル、徐放剤または粉末の形態とすることができ、そしてHMWタンパ ク質を約0.001-95％含有させることができる。免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物を投与剤型に適合する様相で、かつ治療上有効、予防的または免疫原性となる量で投与する。
【００５７】
さらに、免疫原性、抗原性、医薬およびワクチン組成物を、粘膜表面などの免疫システムの特定の細胞に送達するために１以上のターゲティング分子と組合せるかこれと複合体化して使用することができる。限定するわけではないが、いくつかの例として、ビタミンB１２、細菌毒素若しくはその断片、モノクローナル抗体 およびその他の特異的ターゲティング脂質、タンパク質、核酸若しくは炭水化物が含まれる。
【００５８】
投与すべき量は、例えば抗体を合成するための、そして必要ならば細胞性免疫応答を産生するための個体の免疫システムの能力を含む、治療すべき被験体に応じて決まる。投与するために必要とされる活性成分の正確な量は実務者の判断に応じて決まる。しかし、好適な投与量範囲は当業者によって容易に決定することができるもので、HMWタンパク質、断片またはそれらの類似体の0.1-1000マ イクログラム程度が可能である。初発投与およびブースター投与の用量に関する好適な方式もまた変更し得るが、初発投与に続くその後の投与が含まれる。投与量は投与の経路（群）によっても決まり、宿主のサイズにしたがって変更される。
【００５９】
本発明に従う免疫原性、抗原性若しくは医薬組成物におけるHMWタンパク質の濃度は一般的に約0.001-95％である。１病原体のみの抗原性物質を含有するワクチンは１価ワクチンである。何種類かの病原体の抗原性物質を含有するワクチンは複合ワクチンであるが、これも本発明に属する。こうした複合ワクチンは、例えば各種の病原体からの、若しくは同一の病原体の各種の菌株からの物質、または各種の病原体の組合せからの物質を含有する。
【００６０】
ワクチンなどの、免疫原性、抗原性若しくは医薬組成物は、免疫刺激物質としてHMWタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部を含むヌクレオチドベクターを含んでもよく、またはこの遺伝子の少なくとも一部を免疫化のために直接使用してもよい。
【００６１】
体液性免疫応答（HIR）および細胞性免疫（CMI）を効果的に誘発するため、免疫原は典型的にはアジュバント中に乳化される。免疫原をアジュバントとともに投与すると、免疫原性は著しく改善される。アジュバントは、免疫原を投与部位の近辺に局在させて保留することによって、免疫システムの細胞への抗原の緩慢で持続的な放出を助長する貯蔵（depot）効果を産生するような作用をすることができる。アジュバントは免疫システムの細胞を免疫原貯蔵所に誘引してこの細胞を刺激して免疫応答を引き出すこともできる。
【００６２】
多くのアジュバントは毒性であり、肉芽腫、急性および慢性炎症（フロイント完全アジュバント、FCA）、細胞溶解（サポニンおよびプルロニックポリマー）
ならび に発熱原性、関節炎および前ブドウ膜炎（LPSおよびMDP）を誘発する。FCAは優 れたアジュバントであって研究においては広範に使用されるが、その毒性のためにヒトまたは動物ワクチンでの使用は認可されていない。
【００６３】
理想的なアジュバントの望ましい特徴として以下のものが含まれる：
(1) 毒性のないこと；
(2) 長期間継続する免疫応答を刺激する能力；
(3) 製造の簡便性および長期間の保存安定性；
(4) 必要な場合、各種の経路によって投与された抗原に対してCMI若しくはHIRまたはその両方を誘発する能力；
(5) 他のアジュバントとの相乗性；
(6) 抗原提示細胞（APC）の集団と選択的に相互作用する能力；
(7) 適切なTH1またはTH2細胞特異的免疫応答を特異的に誘発する能力；ならびに (8) 抗原に対する適切な抗体イソタイプレベル（例えばIgA）を選択的に増大 させる能力。
【００６４】
例えばワクチンに対する宿主の免疫応答を改善するため、多年にわたって免疫刺激剤またはアジュバントが使用されてきた。リポポリサッカライドなどの内因性アジュバントは普通はワクチンとして使用する死滅または弱毒化細菌の成分である。外因性アジュバントは典型的には抗原に非共有結合的に連結される免疫調節剤で、宿主の免疫応答を増強するために製剤化される。このように、アジュバントは非経口的に送達される抗原に対する免疫応答を増強するものとして同定されてきた。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（普通、ミョウバンと総称される）がヒトおよび動物ワクチンにおいてアジュバントとして通常使用される。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答を増大させるミョウバンの効力は十分確定されており、またHBsAgワクチンがミョウバンをアジュバントとしている。
【００６５】
その他の外因性アジュバントとして、膜タンパク質抗原と複合体化したサポニン（免疫刺激性複合体）、ミネラル油を含むプルロニックポリマー、ミネラル油中の死滅マイコバクテリア、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド（MDP）およびリポポリサッカライド（LPS）などの細菌産物、そしてリピドA、およびリポソームが含まれる。
【００６６】
参照により本明細書中に組み入れる、国際特許出願、PCT/US95/09005には、エンテロトキシン原性大腸菌の熱不安定性毒素の変異型（「mLT」）について記載されている。参照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,057,540号には、アジュバント、Qs21が記載され、英国特許第2,220,211号には南アメリカの樹木、Quiliaja saponaria molinaの樹皮からのサポニンのHPLC精製した非毒性画分 、3D-MPLが記載され、これを参照により本明細書に組み入れる。
【００６７】
参照により本明細書に組み入れる、1989年8月8日、Lockhoffらに付与された米国特許第4,855,283号には、免疫調節剤またはアジュバントとして、それぞれ糖残基においてアミノ酸によって置換されている、N-グリコシルアミド、N-グリコシル尿素およびN-グリコシルカルバメートを含む、糖脂質類似体が教示されている。LockhoffはN-グリコホスホリピドおよびグリコグリセロリピドが単純ヘルペスウイルスワクチンおよび偽性狂犬病ウイルスワクチンの両方において強力な免疫応答を誘発することができることを報告した。天然のリピド残基の機能を模倣するため、アノマー炭素原子を介して直接糖に結合している長鎖アルキルアミンおよび脂肪酸から、いくつかの糖脂質が合成された。
【００６８】
参照により本明細書に組み入れる、Moloneyに付与された米国特許第4,258,029号には、オクタデシルチロシン塩酸（OTH）が、破傷風トキソイドならびにホルマリン不活性化タイプI、IIおよびIIIポリオウイルスワクチンと複合体化させたとき、アジュバントとして機能したことが教示されている。合成ペプチドのリピド化もこれらの免疫原性を増大させるために使用された。
【００６９】
したがって、本発明においては、HMWタンパク質またはその断片若しくは誘導体、あるいはHMWをコードする核酸若しくはその断片、あるいはこれらを発現するベクターを含有する、ワクチンなどの、免疫原性、抗原性、医薬組成物にさらに、限定するわけではないが、ミョウバン、mLT、QS21および上に列記したすべてのものなどのアジュバントを含ませることができる。好ましくは、アジュバントはミョウバン、LT、3D-mPL若しくはBacille Calmette-Guerine（BCG）ならびに上記のものの変異若しくは修飾型、特にmLTおよびLTR192Gから選択される。本発明の組成物に、限定するわけではないが、生理食塩水、炭酸水素塩、デキストロースまたはその他の水性溶液などの、好適な医薬用担体をさらに含ませてもよい。その他の好適な医薬用担体は、この分野における標準的参考書である、Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company、に記載されており、その全文を参照により本明細書に組み入れる。
【００７０】
ワクチンなどの、免疫原性、抗原性および医薬組成物は、好適な非毒性の医薬用担体中に入れて投与してもよく、マイクロカプセル中に含ませてもよく、及び／または持続放出性埋め込み体中に含ませてもよい。
ワクチンなどの、免疫原性、抗原性および医薬組成物を、抗体レベルの持続のために、望ましくは時間をおいて複数回投与してもよく、及び／またはその他の殺菌若しくは静菌方法と組合せて使用してもよい。
【００７１】
本明細書および請求の範囲において使用する、本発明の「抗体」は、限定するわけではないが、Antibodies A Laboratory Manual（E.Harlow,D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）に記載された方法などの、当業者に知られた任意の通常の方法によって取得することができる。この全文を参照により本明細書に組み入れる。用語「抗体」は限定するわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、精製IgG、IgM、IgAおよび限定するわけではないが、Fv、単鎖Fv（scFv）、F(ab')2、Eab断片などを含むその断片（Harlow and Leon,1988,Antibody,Cold Spring Harbor）；単鎖抗体（米国特許第4,946,778号）；キメラま たはヒト化抗体（Morrisonら、1984,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 81:6851)；Neubergerら、1984,Nature 81:6851）；および相補性決定領域（CDR）（Verhoeyen andWindust,Molecular Immunology 2ed.,B.D.Hames and D.M.Glover,IRL Press,Oxford University Press,1996,pp.283-325を参照されたい）、その他などのすべての形態を含むことを意図している。
【００７２】
一般的に、本発明のHMWタンパク質若しくは核酸配列またはそれらの免疫原性 断片若しくは誘導体は、その免疫原の効力を増強するアジュバント若しくは任意の薬剤の不在下または存在下で、動物（広範囲の脊椎動物種を使用することができるが、最も普通にはマウス、ラット、モルモット、ウシ、ブタ、ハムスター、ヒツジ、トリおよびウサギ）に免疫し、一定の間隔でブースター免疫する。任意の通常の方法によって、所望の抗体の存在について、動物の血清をアッセイする。その動物の血清または血液をポリクローナル抗体の原料として使用することができる。
【００７３】
モノクローナル抗体については、動物を上記のように処理する。許容される抗体力価が検出されたとき、動物を安楽死させて、融合のために脾臓を無菌的に取り出す。この脾臓細胞を特定して選択した永久増殖ミエローマ細胞系と混合し、次に混合物を細胞の融合を促進する薬剤、典型的にはポリエチレングリコールなど、に曝露する。これらの状況下では、融合はランダム選択で発生し、その結果生成するものは各タイプの非融合細胞と融合細胞との混合物である。融合のために使用するミエローマ細胞系は、HAT：ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび チミジン、などの選別用培地の使用によって、融合混合物から培養物中に残存する細胞が免疫したドナーに由来する細胞とミエローマ細胞とのハイブリッドのみになるように、特定して選択される。融合後、細胞を希釈して、選別用培地中で培養する。選定した抗原に対して所望の特異性を有する抗体の存在について、この培養培地をスクリーニングする。最良の抗体を含有する培養物を、培養物が単一の細胞起源であることが確証されるまで限界希釈することによって、クローン化する。
【００７４】
抗原、免疫原およびイムノアッセイ 
HMWタンパク質またはこれをコードする核酸、およびそれらの断片は、抗HMWタンパク質抗体の作製のための抗原若しくは免疫原として、または抗細菌性、抗クラミジアおよび抗HMWタンパク質抗体の検出のための、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）および当分野で既知のその他の非酵素結合抗体結合アッセイ若しくは操作法を含むイムノアッセイにおける抗原として、有用である。ELISAアッセイにおいては、HMWタンパク質を選択した表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなどの、タンパク質を結合させることが可能な表面上に固定化する。洗浄して不完全に吸着されたHMWタンパク質を除去した後、試験サンプルに関して抗原性としては中性であることが知られている非特異的タンパク質溶液を、この選択した表面に結合させてもよい。これによって、固定化表面上の非特異的吸着部位をブロックすることができ、したがって表面への抗血清の非特異的結合に起因するバックグラウンド値を減少させることができる。
【００７５】
次に、この固定化表面を臨床または生物材料などの試験するサンプルと、免疫複合体（抗原／抗体）の形成を誘導するような様相で、接触させる。これには、ウシガンマグロブリン（BGG）溶液および／またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）／Tweenなどの希釈剤でのサンプルの希釈が含まれる。次にサンプルを約20から37℃程度の温度で2-4時間インキュベートする。インキュベート後、サンプルと接触させた表面を洗浄して、非免疫複合体化物質を除去する。洗浄操作には、PBS／Tweenまたはホウ酸塩バッファーなどの溶液での洗浄が含まれる。試験サンプルおよび結合したHMWタンパク質間での特異的免疫複合体の形成ならびにそれに続く洗浄後、免疫複合体の形成の出現、およびさらにその量を、この第１の抗体に対して特異性を有する第２の抗体に免疫複合体を反応させることによって、判定することができる。試験サンプルがヒト起源の場合は、第２抗体はヒトイムノグロブリン、一般的にはIgGに特異性を有する抗体である。
【００７６】
検出手段を提供するため、第２抗体は、例えば適切な色素原基質とインキュベートした時に発色するような、酵素活性などの、関連する活性を有するものとすることができる。その後、発色を検出することによって、検出を達成することができる。次に、例えば可視分光光度計を使用して発色の程度を測定し、適切な標準と比較することによって、定量を達成することができる。当業者に知られたその他のあらゆる検出手段が含まれる。
【００７７】
別の実施形態として、本発明に従う所望のイムノアッセイを実施するために必要な基本的試薬のすべてを含む診断用キットが含まれる。この診断用キットは必要な試薬を収納した１以上の容器の組合せとして市販用の包装体に入れて提供することができる。こうしたキットには、HMWタンパク質若しくはこれをコードする核酸またはそれらの断片、本発明のモノクローナル若しくはポリクローナル抗体が数種の通常のキット成分と組み合わされて含まれることができる。通常のキット成分は当業者にとって容易に明らかになるものであり、Antibodies A Laboratory Manual（E.Harlow,D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）を含む多数の出版物に開示されている。この全文を参照により本明細書に組み入れる。通常のキット成分として、例えばマイクロタイタープレート、アッセイ混合物のpHを維持するためのバッファー（限定するわけではないがTris、HEPES、その他など）、ペルオキシダーゼと複合体化した抗マウスIgG（または第１抗体が由来する動物に対する任意の抗IgG）などの複合体化した第２抗体、およびその他の標準試薬、などの品目が含まれる。
【００７８】
核酸およびその使用 
本発明のヌクレオチド配列は、DNAおよびRNAを含み、HMWタンパク質もしくはその断片もしくはその類似体をコードする配列を含むが、それらの配列は従来法の化学的アプローチ、もしくは都合の良いオリゴヌクレオチドプライマーのペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)による増幅、および連続したオリゴヌクレオチドの一組を用いたリガーゼ連鎖反応法などの当業界では既知の方法を用いて合成することができる。またその配列によって、クラミジアのどのような種からもHMWタンパク質の遺伝子の同定およびクローニングを、例えばクラミジアのゲノムライブラリーもしくは発現ライブラリーのスクリーニングにその配列を用いることにより行うことができる。
【００７９】
本発明のHMWタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、他のタンパク質の遺伝子の相補的なストレッチと二本鎖分子を選択的に形成する能力があるので有用である。応用方法の如何によって、様々な配列の同定を行いうるように種々のハイブリダイゼーション条件を用いることができる。特定の態様においては、HMWタンパク質の遺伝子の少なくとも10、15、25、50、100、200もしくは250個のヌクレオチドに対して相補的である配列を含む核酸が提供される(図2)。特定の実施形態においては、核酸はHMWタンパク質核酸(例えば配列番号1,23もしくは24の配列を有するもの)と低、中、もしくは高ストリンジェンシー条件のアニーリング条件下でハイブリダイズするものである。
【００８０】
高度の選択性を持たせるためには、比較的ストリンジェントな条件、例えば、例として示すもので限定するものではないが、0.02M〜0.15MのNaClで約50℃〜70℃の間の温度などの低塩濃度および/または高温などの条件が二本鎖形成のために用いられる。いくつかの応用においてはより低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、例えば、例として示すもので限定するものではないが、0.15M〜0.9Mの塩、約20℃〜55℃の間の範囲の温度などの条件が必要とされる。ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッド二本鎖を不安定化させるために、ホルムアミドの量を増量して添加することによってよりストリンジェントにさせることもできる。このように特定のハイブリダイゼーション条件を容易に操作することができ、所望の結果に応じて通常選ぶべき方法である。例として示すもので限定するものではないが、通常は、50%ホルムアミド存在下のハイブリダイゼーション温度として都合がよいのは：標的断片と95%〜100%相同のプローブには42℃：90〜95%相同の場合には37℃、70〜90%相同の場合には32℃である。
【００８１】
低、中、および高ストリンジェンシー条件は当業者には良く知られたものであり、特定の核酸配列の塩基組成および長さに依存して、およびその核酸配列が由来する特定の生物体に依存して予見可能に変わる。そのような条件に関するガイダンスとしては例えば次のものを参照のこと：Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, 米国ニューヨーク州, pp.9.47-9.57; Ausbelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, 米国ニューヨーク州。 これは本明細書中に参照により組み入れる。
【００８２】
ゲノムライブラリーの調製においては、DNA断片が作製され、そのうちのいくつかはクラミジアHMWタンパク質の一部もしくは全体をコードする。そのDNAを各種の制限酵素を用いて特定の部位で切断することができる。また別に、そのDNAを断片化するためにマンガンの存在下でデオキシリボヌクレアーゼ(Dnase)を用いるか、もしくは例えば音波などでそのDNAを物理的にせん断することができる。次いでそのDNA断片を、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、ならびにショ糖密度勾配遠心などの、それらには限定されないが、標準的な方法によってその大きさに基づいて分離することができる。次いで、そのDNA断片をプラスミド、コスミド、バクテリオファージλもしくはT4、バクミド(bacmide)及び酵母人工染色体(YAC)などの、それらには限定されないが、適切なベクター中に挿入することができる。(例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 米国ニューヨーク州; Glover, D.M.(編), 1985, DNA Cloning:A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, 英国 第I,II巻を参照のこと。) ゲノムライブラリーは標識されたプローブに対して核酸ハイブリダイゼーションさせることによってスクリーニングすることができる(BentonとDavis, 1977, Science 196:180; GrunsteinとHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961)。
【００８３】
ゲノムライブラリーは、当業界では既知の最適なアプローチを用いてHMWタンパク質の何らかのペプチドのアミノ酸配列に対応する標識された縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングを行うことができる。特定の実施形態においては、スクリーニングに用いるプローブは配列番号4の配列に対応する縮重オリゴヌクレオチドである。別の実施形態においては、配列番号5の配列に対応する縮重オリゴヌクレオチドをスクリーニング用プローブとすることができる。またさらに別の実施形態においては、配列番号6-9, 12-14, および18-21のいずれかのオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることができる。さらに別の実施形態においては、配列番号1, 10-11, 22-24のうちのいずれかの配列、もしくはそれらのいずれかの断片、またはそれらの配列もしくは断片の相補体をプローブとして用いることができる。用いるプローブは、ヌクレオチド15個もしくはそれより長いものが好ましい。
【００８４】
ライブラリー中にあるHMWタンパク質もしくはその断片をコードする挿入DNAを有するクローンは、1つ以上の縮重オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする。そのようなオリゴヌクレオチドプローブとゲノムライブラリーとのハイブリダイゼーションは当業界で既知の方法を用いて行う。例えば、上記の2つのオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションは2xSSC, 1.0% SDS中で50℃で行い、同じ条件を用いて洗うことができる。
【００８５】
また別の態様においては、HMWタンパク質もしくはHMW由来のポリペプチドの一部もしくは全体をコードするヌクレオチド配列のクローンはクラミジア発現ライブラリーをスクリーニングすることによっても得ることができる。例えば、クラミジアDNA、もしくはRNAから作製したクラミジアcDNAを単離しランダムな断片を調製し、ベクター中に挿入された配列がその後にそのベクターが導入される宿主細胞によって発現されうるように発現ベクター(例えばバクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、もしくはコスミド)中に連結される。次いで発現されたHMWタンパク質もしくはHMW由来のポリペプチドを選択するために各種のスクリーニングアッセイ法を用いることができる。１つの実施形態においては、本発明の各種の抗HMW抗体を当業界では既知の方法を用いて所望のクローンを同定するために用いることができる。例えば、HarlowとLane, 1988, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 米国ニューヨーク州, 付録IVを参照もこと。ライブラリーから得たクローンもしくはプラークを抗体と接触させて結合するクローンを同定する。
【００８６】
ある実施形態においては、HMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドをコードするDNAを含有するコロニーもしくはプラークはOlsvickら, 第29回ICAAC, Houston, 米国テキサス州, 1989（これは本明細書に参照により組み入れる）に従ってDYNA Beadsを用いて検出しうる。抗HMW抗体はトシル化したDYNA Beads M280とクロスリンクし、次いでこれらの抗体含有ビーズはHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドを発現しているコロニーもしくはプラークを吸着するために用いられる。HMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドを発現しているコロニーもしくはプラークは、コロニーもしくはプラークのうちビーズと結合しているものとして同定される。
【００８７】
また別に、抗HMW抗体は非特異的に適切な担体、例えばシリカもしくはセライトTM樹脂などに固定化することができる。次いでこの材料を、前述のパラグラフで述べたHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドを発現している細菌性コロニーに吸着させるために用いうる。
【００８８】
別の態様においては、クラミジアゲノムDNAからのHMWタンパク質の一部もしくは全体をコードする実質的に純粋なDNAを産生するためにPCR増幅を用いることができる。既知のHMWタンパク質配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを縮重したものもしくはそれ以外のもののいずれであっても、プライマーとして用いることができる。特定の実施形態においては、配列番号2, 3, もしくは15-17のアミノ酸配列を有するペプチドまたはそれらの任意の部分をコードするオリゴヌクレオチドは、縮重させたものもしくはそれ以外のもののいずれであっても、5'プライマーとして用いることができる。断片の例として、5'プライマーを配列番号4-7, 10, 12, 22-24もしくはそれらの部分のヌクレオチド配列のいずれか1つから作製することができる。配列番号11, 13, もしくは14の逆方向相補体であるヌクレオチド配列は、縮重させたものもしくはそれ以外のもののいずれであっても、3'プライマーとして用いることができる。
【００８９】
PCRは例えばPerkin-Elmer CetusサーマルサイクラーおよびTaqポリメラーゼ(Gene AmpTM)を用いて行うことができる。PCR反応に用いるために数種の異なる縮重プライマーを合成することを選択することができる。PCR反応を開始する際に用いるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えて縮重プライマーと対応するクラミジアDNA中の配列との間のヌクレオチド配列の類似性の度合いをより高くもしくはより低くさせることもできる。HMWタンパク質をコードする配列のセグメントを首尾よく増幅した後、そのセグメントをクローン化し配列を決定し、完全なゲノムクローンを単離するためのプローブとして用いることができる。このことが、その後、後述するとおりその遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および機能分析のためのその遺伝子のタンパク質産物の産生を可能にするだろう。
【００９０】
臨床的診断の実施形態においては、本発明のHMWタンパク質の遺伝子の核酸配列はハイブリダイゼーションを測定するために適切な標識などの指示法と組み合わせて用いることができる。放射性、酵素、もしくはアビジン/ビオチンなどおよびジゴキシゲニン標識などのその他のリガンドなどの多種の検出可能なシグナルを提供することのできる指示法が当業界で知られている。いくつかの診断用の実施形態においては放射性タグの替わりにウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを用いることができる。酵素タグの場合にはHMWタンパク質の遺伝子配列を含有するサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定するために、肉眼的にもしくは分光光学的に観測できる方法を提供するものとして比色分析用指示剤基質が知られている。
【００９１】
本発明のHMWタンパク質の遺伝子の核酸配列は溶液中でのハイブリダイゼーションおよび固相法を行う実施形態においてハイブリダイゼーションプローブとして有用である。固相法を用いる実施形態においては、臨床的に得たサンプル、例えば浸出液、体液(例えば血清、羊水、中耳浸出液、痰、精液、尿、涙液、粘液、気管支肺胞洗浄液)もしくは組織などのサンプルから得た供試DNA(もしくはRNA)を吸着させるかあるいは選択されたマトリクスもしくは表面へ付着させる。次いで固定化された一重鎖核酸を、本発明のHMWタンパク質をコードする遺伝子もしくはその断片もしくはその類似体の核酸配列を含む選択されたプローブと所望の条件下で特異的ハイブリダイゼーションさせる。条件の選択は、例えばG+C含量、標的核酸のタイプ、核酸のソース、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどの如何によって必要とされる特定の規準に基づく特定の状況に依拠する。非特異的に結合しているプローブ分子を除去するためにハイブリダイズさせた表面を洗った後、標識を用いてその特異的ハイブリダイゼーションの検出もしくは定量をも行われる。クラミジアの種の間で保存されている核酸配列部分を選択することが好ましい。選択されたプローブは少なくとも15bp、約30から90bpの範囲である。
【００９２】
HMWタンパク質の遺伝子の発現 
宿主細胞と適合しうる種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有しているプラスミドベクターを、発現系中でのHMWタンパク質もしくはその断片をコードする遺伝子の発現に用いることができる。発現ベクターは、タンパク質をコードする挿入された配列の転写、翻訳のために必要な全てのエレメントを含有している。ベクターは通常は複製部位、および形質転換細胞での表現型による選択が行いうるようなマーキング配列を含んでいる。例えば、大腸菌(E.coli)は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性細胞とするための遺伝子を含有しているpBR322を用いて形質転換することができる。その他の市販のベクターは有用であり、それらとしては、pZERO, pTrc99A, pUC19, pUC18, pKK223-3, pEX1, pCAL, pET, pSPUTK, pTrxFus, pFastBac, pThioHis, pTrcHis, pTrcHis2, およびpLExなどが挙げられるがそれらに限定されない。プラスミドもしくはファージも、宿主細胞がそれ自体のタンパク質の発現のために用いることのできるプロモーターを含有しているかあるいは含有するように改変されていなければならない。
【００９３】
さらに、宿主に適合しうる、レプリコンおよび制御配列を含んでいるファージベクターは、これらの宿主との関連において形質転換ベクターとして用いることができる。例えば、λGEMTM-11ファージを、大腸菌LE392などの宿主細胞を形質転換するために用いうる組換えファージベクターを作成するために利用することができる。
【００９４】
組換えDNA構築物中で通常用いられるプロモーターとしてはβ-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーター系および米国特許4,952,496号に記載のT7プロモーター系などのその他の微生物プロモーターがある。プロモーターのヌクレオチド配列の詳細については既知であり、熟練した技術者であればそれらのプロモーターを機能を有する形で遺伝子に連結させることができる。用いられる特定のプロモーターは、通常は所望する結果如何によって選択することができる。
【００９５】
本発明に従って、特にある種のクラミジアの培養物から単離されたもののような天然のHMWタンパク質が痕跡量の毒性物質もしくはその他の夾雑物を含んでいる可能性のある場合には、組換え法によってHMWタンパク質を作ることが好ましい。この問題は異種の系で組換え法で産生させたHMWタンパク質では宿主から単離された物質中の夾雑物が最小となるようなやり方で単離しうるため、このようなHMWタンパク質を用いることによって避けることができる。この観点から見て特に望ましい発現用宿主としては、LPSを有さず従ってエンドトキシンのないグラム陽性細菌が挙げられる。そのような宿主としてはバチラス(Bacillus)属に属する種のものが挙げられ、パイロジェンを含まないrHMWタンパク質、その断片もしくは類似体の産生に特に有用であろう。
【００９６】
タンパク質をコードする配列を発現させるために各種の宿主-ベクター系を用いることができる。このようなものとしては、ウイルス(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)を感染させた哺乳類細胞系；ウイルス(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含んでいる酵母などの微生物もしくはバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換された細菌が挙げられるがそれらに限定されない。HMWタンパク質遺伝子、その断片、類似体もしくは変異体の発現に適切な宿主としては、大腸菌(E.coli)、バチラス属の種、ヘモフィルス(Haemophilus)属、真菌、サッカロマイセス・ピチア（Saccharomyces pichia）などの酵母、ボルデテーラ（Bordetella）もしくはバキュロウイルス発現系などを用いることができる。好ましくは宿主細胞は細菌であり、最も好ましくはその細菌は大腸菌(E.coli)、枯草菌(B.Subtilis)もしくはサルモネラである。
【００９７】
ベクターの発現エレメントは強度および特異性が様々である。用いる宿主-ベクター系の如何によって多数の適切な転写及び翻訳エレメントのうちのいずれか１つを用いることができる。好ましい実施形態においてはHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチド配列ならびに宿主細胞のプレおよび/もしくはプロ配列を含むキメラタンパク質を発現させる。別の好ましい実施形態においてはHMWタンパク質もしくはHMW由来のポリペプチド配列を、例えばアフィニティー精製したタンパク質と融合させたものからなるキメラタンパク質を発現させる。さらに好ましい実施形態においてはHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチド配列と有用な免疫原性を有するペプチドもしくはタンパク質とを含むキメラタンパク質を発現させる。好ましい実施形態においては、発現されたHMW由来タンパク質は天然のHMWタンパク質の外表面のエピトープもしくは受容体結合ドメインのいずれかを形成する配列を含んでいる。
【００９８】
適切な転写/翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために、DNA断片をベクター中に挿入するための方法として当業界で既知のいかなる方法も用いることができる。これらの方法としてはin vitro組換えDNAおよび合成法およびin vivo組換え体(遺伝子組換え)を挙げることができる。HMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は第2の核酸配列によって、組換えDNA分子で形質転換された宿主中で挿入された配列が発現されるように調節することができる。例えば、挿入された配列の発現を当業界で既知の何らかのプロモーター/エンハンサーエレメントによって調節することができる。挿入された配列の発現を調節するために用いることのできるプロモーターとしては、動物細胞中での発現用としては、SV40初期プロモーター領域(BernoistとChambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列中に含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42)；細菌細胞中での発現用としてはβ-ラクタマーゼ(Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)、tac(DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)、PL、もしくはtrc("Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94も参照)；植え込まれた細胞での発現用としては、ノパリン合成酵素プロモーター領域もしくはカリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター(Gardnerら, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素であるリブロースビリン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaら, 1984, Nature 310:115-120)； Gal4プロモーターなどのその他の真菌もしくは酵母のプロモーターエレメント、ADC(アルコール脱水素酵素)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼのプロモーターが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９９】
HMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターの同定は次の3種類の一般的なアプローチによって行うことができる：(a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)"マーカー"遺伝子機能の存在もしくは不在、(c)抗HMW抗体との反応性などの挿入された配列の発現。第1のアプローチにおいては、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドをコードする配列に対して相同な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第2のアプローチでは、組換えベクター/宿主系は、ベクター中に挿入された外来遺伝子によって生ずる特定の"マーカー"遺伝子機能(例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中の閉鎖体(occlusion body)形成など)の存在もしくは不在に基づいて同定され選択することができる。例えば、HMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドをコードする配列がベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入される場合には、そのインサートを含む組換え体はマーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。第3のアプローチにおいては、組換え発現ベクターはその組換え体によって発現される外来遺伝子産物をアッセイすることによって同定することができる。そのようなアッセイはin vitroアッセイ系においてHMWタンパク質もしくはHMW由来ポリペプチドの例えばHMWリガンドもしくは受容体との結合、または宿主細胞の赤血球凝集能力もしくは細胞抽出物のクラミジアによる赤血球凝集反応を阻害する活性などの物理的もしくは機能的特性に基づいて行うことができる。
【０１００】
ひとたび特定の組換えDNA分子が同定され単離された後は、それを増殖させるために当業界では既知の各種の方法を用いることができる。ひとたび適切な宿主系および増殖条件が確立された後は組換え発現ベクターを増殖させ、多量に調製することができる。上記説明のとおり、用いることのできる発現ベクターは次のベクターもしくはその誘導体が挙げられるが、それらに限定されない：ワクシニアウイルスもしくはアデノウイルスなどのヒトもしくは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター(例えばλ)、ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクターなどを少数であるが挙げることができる。
【０１０１】
さらに、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節するもしくは所望する特別な様式で遺伝子産物を改変しプロセスするものが選択される。特定のプロモーターからの発現は特定のインデューサーの存在で増大し、従って遺伝子的に操作されたHMWタンパク質もしくはHMW由来HMWの発現が制御される。さらに異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳及び翻訳後のプロセシングと改変のための特徴的で特異的なメカニズムを有している。発現した外来遺伝子の所望の改変とプロセシングを確保するために適切な細胞系もしくは宿主系を選択することができる。
【０１０２】
本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および核酸はクラミジア感染の臨床的もしくは医学的診断のため、およびクラミジアの病原性の特性、毒性(virulence)、および感染性、ならびに宿主防御システムの科学的研究のための試薬として有用である。例えば、生物学的被検体中のクラミジアの存在をハイブリダイゼーションもしくはPCR増幅によって同定するためのプローブとして本発明のDNAおよびRNAを用いることができる。このDNAとRNAはまた、クラミジアHMWタンパク質関連のポリペプチドをコードしている可能性のある他の細菌を同定するためにも用いることができる。本発明のタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーで本発明のタンパク質を含有する組成物をさらに精製するために用いられるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製するために用いることができる。このタンパク質はまた、サンプル中のクラミジアに対する抗体の存在をスクリーニングするための標準的なイムノアッセイ法に用いることもできる。
【０１０３】
7. 生物体の寄託 
本明細書中で記述し、引用したクラミジアのHMWタンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームを有する遺伝子の部分を含有する特定のプラスミドを、American Type Culture Collection(ATCC) (10801 University boulevard, Manassas, 米国バージニア州20110-2209)に、ブダペスト条約に従い、また37 CFR 1.808に従って、本特許出願の出願前に寄託した。これらのプラスミド中に存在する遺伝子の関連部分の受託番号は下記に示す。
【０１０４】
この米国特許出願に基づく特許の許可がおりれば、寄託された物質のサンプルは一般に入手可能となる。本明細書中に記載し、範囲を請求した本発明は、寄託の実施形態は本発明の説明としてのみ意図されたものであるので寄託されたプラスミドの範囲に限定されるべきではない。本明細書で述べたものと類似もしくは等価のタンパク質もしくはその断片もしくは類似体をコードする等価もしくは類似のいかなるプラスミドも本発明の範囲に包含される。
【０１０５】
プラスミド   ATCC受託番号    寄託日 
pAH342       ATCC 98538    1997年9月8日
【０１０６】
8. 実施例 
上記の開示は本発明を一般的に述べたものである。より特定した説明は下記の実施例において提供する。これらの実施例は説明の目的のみのために記述したものであり本発明の範囲を限定することは意図していない。形態の変更および等価なものへの置換は、状況からみて好都合であると示唆されるかもしくは好都合であるとされるものを意図している。ここでは特別の用語を用いてはいるがそのような用語は記述のために用いているのであり、限定するために用いているものではない。
【０１０７】
この開示および実施例中に用いられてはいるが明瞭には述べられていない分子遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学の方法は科学文献中に豊富に記載されており、それらは当業者であれば十分理解可能なものである。
【０１０８】
8.1 実施例1：成熟したクラミジアタンパク質の単離と精製 
マッコイ(McCoy)細胞を標準的な225cm2の組織培養フラスコ中もしくはBellcoスピナーフラスコ(Cytodex ミクロキャリアー, Pharmacia)中のいずれかでクラミジア抗体不含有の10%ウシ胎児血清、ブドウ糖、および非必須アミノ酸を添加したDMEM培地を用いて、5%CO2下で37℃で培養した。感染したマッコイ細胞の溶解物からC. trachomatis L2 基本小体(elementary bodies; Ebs) (ATCC VR-902B)を調製した。基本的にはC. trachomatis L2(LGV)を感染させたマッコイ細胞を、超音波処理し、細胞の破砕残査を遠心で除去した。次いでクラミジアの基本小体を含有している上清を遠心し、基本小体を含有するペレットをハンクス平衡塩溶液(HBSS)中に再懸濁した。リボヌクレアーゼ/デオキシリボヌクレアーゼ溶液を添加し時々攪拌しながら37℃で1時間インキュベートした。基本小体を含有する溶液を、Angiovist 370(ジアトリゾエートメルグミンおよびナトリウムジアトリゾエートの混合物, Berlex Laboratories, Wayne, 米国ニュージャージー州)の不連続密度勾配(40%, 44%および54%)上に重層し、基本小体を密度勾配へ分離させるために超遠心した。遠心後、基本小体を密度勾配の44%および55%のAngiovist 370層の間の界面から回収した。基本小体をリン酸緩衝食塩水中で洗いHBSS中に再懸濁した。
【０１０９】
精製した基本小体はHBSS中で0.1%のOGP(高イオン強度)を用いて順次抽出して周辺表面タンパク質(peripheral surface protein)を除去し氷上に保持した。次いで同じ基本小体調製品を1.0%のOGP、10mM DTT、1mM PMSF、10mM EDTAを50mMのTris 緩衝液pH7.4中に含むもので抽出した。界面活性剤およびその他の試薬を除去するために抽出物を透析し(3500 MWCO)、凍結乾燥で濃縮した。タンパク質を含有する抽出物をHBSSで希釈し市販のヘパリン-セファロースカラム(HiTrap Col., Pharmacia)に通した。サンプルをヘパリンカラムにアプライした後、未吸着のタンパク質は過剰のHBSSで洗って除去した。結合したタンパク質はバッチ式で2M 塩化ナトリウム含有のPBSで溶出した。溶出物の塩を除去するために十分に透析し、次いで凍結乾燥した。ヘパリンに結合したタンパク質はSDS-PAGEで大きさによる分画を行い、銀染色による可視化、もしくはウエスタンブロッティング分析を行った。図1に示すとおり、中程度の量存在する約105-115 kDaのタンパク質が検出された。天然のHMWタンパク質の等電点は約5.95と測定されている。
【０１１０】
Ｎ末端のアミノ酸配列を得るために、十分量のHMWタンパク質(>= 5μg)をPVDF膜(Applied Biosystems)上にエレクトロブロットし、クーマシーブルーで染色した。固定化HMWタンパク質を膜から放出させ、その場（in situ）で低レベルのエンドペプチダーゼLys-C、エンドペプチダーゼArg-C、および/またはエンドペプチダーゼGlu-Cを用いて天然タンパク質を断片化するために処理した。この結果できたペプチド断片をHPLCで精製し、Ｎ末端のアミノ酸配列をABI 430 Protein Sequenatorおよび標準的なタンパク質配列決定法を用いて決定した。そのＮ末端アミノ酸配列は：
Ｅ-Ｉ-Ｍ-Ｖ-Ｐ-Ｑ-Ｇ-Ｉ-Ｙ-Ｄ-Ｇ-Ｅ-Ｔ-Ｌ-Ｔ-Ｖ-Ｓ-Ｆ-Ｘ-Ｙ
であり、配列番号3とした。
【０１１１】
このHMWタンパク質Ｎ末端配列(20残基)を複合PDB+SwissProt+PIR+GenPeptデータベース(>145 K ユニーク配列)で厳格にパラメーターをマッチさせて検索すると、正確に相同なものは発見できなかった。従ってこのHMWタンパク質は新規のクラミジアタンパク質である。このタンパク質は周辺膜タンパク質(例えばOmp2)のみを放出するような条件下で単離されたものなので、これらのデータはHMWタンパク質が表面関連タンパク質であることを示している。
【０１１２】
8.2. 実施例2：クラミジア基本小体全体に対する抗体の調製 
HMWタンパク質の特性の検討を助けるため、C. trachomatis L2から得た全基本小体に対して高度免疫ウサギ抗血清を作製した。各ウサギに1回の注射あたり約250μgのクラミジア基本小体(フロイントの完全アジュバントで開始し、その後フロイントの不完全アジュバントを使用)を約21日間隔で計3回免疫した。各免疫では、約半量を筋肉内投与(i.m.)し、半量を結節内(intranodally)注射した。第3回目のワクチン接種の14日後に第4のブースターとして約100μgの基本小体を筋肉内投与し、ウサギをその7-10日後に放血した。ELISAで測定したところ、1:100,000のタイターが得られた。
【０１１３】
8.3. 実施例3：翻訳後の改変の測定 
最近、いくつかのC. trachomatis膜関連タンパク質が翻訳後に改変を受けていることが示された。18 kDaおよび32 kDaのシステインに富む基本小体タンパク質は、レクチン結合タンパク質であるが、このタンパク質は特異的炭水化物部分を有することが示された(Swanson, A.F. およびC.C.Kuo, 1990, Infect. Immun. 58:502-507)。放射性標識パルミチン酸の取り込みは、約27kDaのC. trachomatis Mip様タンパク質が脂質付加されていることを示すために用いられてきた(Lundemose, A.G., C.W.Rouch, C.W. Penn, およびJ.H. Pearce, 1993 J.Bacteriol. 175:3669-3671)。Swansonらは、L2 血清型からのMOMPがN-アセチルグルコサミンおよび/またはN-アセチルガラクトサミンを含有していること、およびこれらの炭水化物部分がMOMPのHela細胞膜への結合をメディエートすることを見出した。
HMWタンパク質が糖鎖付加されているか確認するために、基本小体をマッコイ細胞上でトリチウム標識ガラクトースもしくはグルコサミンの存在下で増殖させ、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにかけ、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーでヘパリン結合タンパク質を分析する。簡潔に述べれば、標準的な条件(DMEM+10% FCS, フラスコあたり35ml, 10% CO2)下でマッコイ細胞をT225フラスコ中で約90%のコンフルエンシーとなるまで増殖し十分な量の基本小体を接種して約90-100%の感染性となるようにする。37℃3時間の感染期間をおいた後、シクロヘキシミドを添加(1μg/ml)して宿主細胞のタンパク質合成を阻害し、培養物をさらに4-6時間再インキュベーションする。次いで約0.5mCiのトリチウム標識ガラクトース(D-[4,5-3H(N)]ガラクトース, NEN)もしくはグルコサミン(D-[1,6-3H(N)グルコサミン, NEN]を各フラスコに添加し、培養物はさらに30-40時間インキュベートする。細胞を掻きとって集め、基本小体を勾配遠心で精製する。HMWタンパク質は1.0% OGP表面抽出物からアフィニティークロマトグラフィーで単離し、塩化ナトリウムで溶出し、14C標識分子量マーカー(BRL)を用いてSDS-PAGEで分析し、オートラジオグラフィーにかける。乾燥させたゲルをKodak X-ARフィルムに対して−70℃で1-4週間露出させる。
【０１１４】
合成後の脂質の改変を測定するためにC. trachomatis 血清型 L2をマッコイ細胞の単層上で標準的な方法に従って培養する。感染の約24時間後、従来の培地(DMEM+10% FCS)を除去し、シクロヘキシミド(1μg/ml)および[U-14C]パルミチン酸(0.5mCi/T225フラスコ, NEN)を含有する無血清培地と置換し、さらに16-24時間インキュベートしてタンパク質への脂質付加(lipidation)が起こるようにする。表面基本小体抽出物を調製し、ヘパリン結合タンパク質を単離し、上述のとおりオートラジオグラフィーで分析する。
【０１１５】
糖鎖付加もしくは脂質付加された分子の官能性を全基本小体もしくはOGP表面抽出物を適切なグリコシダーゼで処理することによって推定する。炭水化物を除去した後、抽出物をアフィニティークロマトグラフィーおよびSDS-PAGEにかけ、HMWタンパク質が硫酸ヘパリンとの結合能を保持しているか測定する。
【０１１６】
8.4. 実施例４： HMWタンパク質遺伝子のＮ末端セグメントのクローニング 
変性オリゴヌクレオチドを、HMWタンパク質のＮ末端アミノ酸配列に基づいて設計かつ合成した。次いでこれらのオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーションプローブとして用いる遺伝子特異的PCR産物を生成し、C. trachomatis L2λZAPII DNAライブラリーをスクリーニングしてHMWタンパク質の遺伝子を単離した。
【０１１７】
簡単には、適切な低縮重性ペプチドセグメントをＮ末端および内部アミノ酸配列のデータからコンピュータ解析によって同定し(MacVector, IBI)、これに基づいて低縮重性配列に特異的なオリゴヌクレオチドPCRプライマーのセットを設計した。
【０１１８】
Ｎ末端一次配列を基準として使用し、HMWペプチドの最初の６残基E-I-M-V-P-Q(配列番号３の残基１〜６に対応する配列番号４２)をコードするヌクレオチドに相補的であって、かつ可能なヌクレオチドの組み合わせの全て(総縮重度＝192配列)を含んでなる４個の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計しておき、順方向増幅プライマーとして使用した。
配列番号４ 5'-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3'
配列番号５ 5'-GAA-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3'
配列番号６ 5'-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAA-3'
配列番号７ 5'-GAG-ATH-ATG-GTN-CCN-CAG-3'
５残基の内部ペプチドY-D-G-E-T(配列番号３の残基９〜13)の逆相補DNA配列に相当し、かつ可能なヌクレオチドの組み合わせの全て(総縮重度＝128配列)を含んでなる２個のオリゴヌクレオチドプローブをさらに設計しておき、逆方向増幅プライマーとして使用した。
配列番号８ 5'-NGT-YTC-NCC-RTC-ATA-3'
配列番号９ 5'-NGT-YTC-NCC-RTC-GTA-3'
【０１１９】
ABI Model 380B DNA合成装置にて、0.2μmolスケールのカラム(トリチル-オン、自己開裂)と標準的なホスホルアミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。粗オリゴヌクレオチドをC-18シリンジカラム(OPカラム、ABI)にかけて手動で精製した。純度および収率を分光測光法にて確認した(230/260/280比)。
【０１２０】
標準的なPCR増幅反応(２mM Mg2+、200μmolのdNTP、0.75単位のAmpliTaq、50μlの最終容量)を、約0.2μgのC. trachomatis L2 DNA(単一コピーであれば、約３×107コピーのHMWタンパク質遺伝子)および約100pmolの各順方向(Ｎ末端オリゴ)および逆方向(内部オリゴ)プライマーを用いて計画した。プライマーの縮重度を補償するため、通常の濃度よりも高いプライマー濃度(約20pmol/50μl)を少なくとも増幅の最初に使用した。標的配列の増幅は、標準的な30サイクルの３段階温度プロフィール(即ち、95℃で30秒、60℃で45秒、72℃で１分)を使用して行った。密封した50μlガラス製キャピラリーチューブ中、Idaho Technologies製サーマルサイクラーを使用して増幅を行った。これらの増幅反応時に生成したPCR産物がHMWタンパク質コード配列に特異的であり、かつ「プライマー二量体」または他のDNA増幅アーティファクトではないことを確認するため、シリカゲルスピンカラム(QIAGEN)を使用してアンプリマー(amplimer)を精製し、PCRクローニングベクターpZERO(StrataGene)へクローニングし、直接DNA配列分析にかけた。
【０１２１】
クローニングされたPCR産物のDNA配列は、従来のジデオキシターミネーター配列決定化学および改質T7 DNAポリメラーゼ(Sequenase, USB)を用いて決定した。簡単には、各二本鎖プラスミド鋳型を、NaOHを用いる簡単な処理で変性した。中和した後、各変性鋳型を使用して４つの異なる配列決定反応を計画した。各反応ではM13普遍的順方向配列決定プライマー(21量体)を使用したが、ddNTP/dNTPターミネーション混合物(即ち、A、G、CまたはT)は異なる。[α-35S]dATPを反応に添加してターミネーション産物を標識した(約50μCi／反応、＞3000Ci／mmol、Amersham)。個々の伸長産物を変性し(ホルムアミド、約95℃)、高分解能の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた(６％アクリルアミド、８Ｍ尿素、TAEバッファー、約500V、約90分)。次いで配列決定ゲルを濾紙(Whatmann 3MM)へ転写し、減圧下で乾燥させ、次いで-70℃で24〜72時間オートラジオグラフィーを行った。塩基ラダーを各ゲルから手動で読み取り、コンセンサス配列を決定した。
【０１２２】
ライブラリーのスクリーニングおよび／またはサザンブロッティングに適したHMWタンパク質特異的アンプリマーをPCRで生成し、増幅工程中に[α-32P]dNTP(約50μCiの各dNTP、Amersham、＞5000Ci/mmol)を反応混合物へ添加して均一に放射性標識した。標識反応は上述の通りに行った。但し、反応を0.5mlの微量遠心チューブ中にてBellco製サーマルサイクラーを用いて行った。組込まれなかった標識と増幅プライマーを、遠心サイズ排除クロマトグラフィーカラム(BioSpin６カラム、BioRad)を用いて反応混合物から除去した。
【０１２３】
高度に重複したC. trachomatis血液型亜型L2 DNAライブラリー(50,000個を越える一次クローン)を、ゲノムDNAのEcoRI部分消化物から生成させた10Kbp以上のサイズ分画断片をλクローニングベクターλZAPII(Stratagene)へクローニングして構築しておいた。放射性標識HMWタンパク質に特異的なPCR産物を使用して、HMWタンパク質コード配列の全部または一部を保有する組換えクローンについてこのライブラリーをスクリーニングした。標準的な組換えDNAの手法と方法論をこれらの実験に利用した。これらのプローブとハイブリダイズする全てのファージを、平板培養とハイブリダイゼーションスクリーニングを連続的に繰り返して均一になるまで精製した。反応性のファージを精製したら、インサートを含有するファージミド(pBluescript SK-誘導体)を、適切なヘルパーファージ(例えば、R408またはVCSM13；Stratagene)と共に宿主細胞に同時感染させて親ファージから切出した。アンピシリン(100μg/ml)を含有するLB寒天上に線条接種して個々のコロニーを選択することにより、個々のファージミドをさらに精製した。
【０１２４】
HMWタンパク質配列を保有する精製ファージミド誘導体を確認するために、プラスミドDNAを調製し、これを使用してHMWタンパク質特異的PCRプライマーのセットを含む増幅反応を計画した。HMWタンパク質特異的インサートの有無は、適切なサイズのPCR産物の生成によって確認した。
【０１２５】
プラスミドpAH306は、これらの方法論によって単離されたHMWタンパク質含有誘導体の一つである。
【０１２６】
pAH306の物理的マッピング 
pAH306由来のインサートを物理的にマッピングし、HMWタンパク質遺伝子の位置を適切な６塩基制限エンドヌクレアーゼ(例えば、EcoRI、HindIII、BamHI、PstI、SmaI、KpnI等)を使用して決定し、放射性標識Ｎ末端特異的PCR産物をプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーションによってHMWタンパク質コード配列の位置を決定した。HMWタンパク質特異的配列の方向および領域はPCR分析によって判定し、この分析には、クローニングベクター中に位置するT3もしくはT7プロモーター配列のいずれかに相補的なHMWタンパク質特異的順方向プライマーと逆方向プライマーとからなるプライマーセットを用いた。
【０１２７】
プラスミドpAH306は、クラミジアを起源とする単一の約6.6Kbp EcoRI断片を含むと判定された。pAH306のディレクショナル(directional)PCR分析によって、この誘導体がHMWタンパク質遺伝子の約1.5KbpのＮ末端領域をコードすることが判明した。
【０１２８】
pAH306上にコードされるHMWタンパク質遺伝子のDNA配列は、両鎖とも、非対称PCRサイクル配列決定法と組み合わせた従来の「配列歩行」によって得られた(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer)。配列決定反応は、未消化のプラスミドDNA(約0.5μg/rxn)を鋳型とし、適切なHMWタンパク質特異的配列決定プライマー(約3.5pmol/rxn)を用いて計画した。
【０１２９】
鋳型および配列決定プライマーの他にも、各配列決定反応(約20μl)には４つの異なるdNTP(即ち、A、G、CおよびT)と４つの対応するddNTP(即ち、ddA、ddG、ddCおよびddT)ターミネーターヌクレオチドが含まれ、各ターミネーターを４種の異なる蛍光染料のうちの一つに結合させた。１本鎖の配列決定伸長産物を、染料標識ddNTPターミネーターを組込むことで鋳型に沿って任意の位置で終結させた。蛍光染料標識ターミネーション産物を微量遠心サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Princeton Genetics)を用いて精製し、減圧下で乾燥させ、Template Resuspension Buffer (Perkin-Elmer)に懸濁し、95℃で約５分間変性し、ABI 310 Automated DNA Sequenator (Perkin-Elmer)上で高分解能キャピラリー電気泳動を行って分析した。
【０１３０】
個々の反応から得られたDNA配列のデータを収集し、相対蛍光ピーク強度をPowerMACコンピュータでABI Sequence Analysis Software (Perkin-Elmer)を用いて自動解析した。個別に自動解析したDNA配列の精度を手動で編集した後、AutoAssemblerソフトウエア(Perkin-Elmer)を用いてコンセンサス配列「ストリング」にマージした。pAH306によってコードされるHMWタンパク質遺伝子セグメントの両鎖を配列決定し、これらのデータをコンパイルしてHMWタンパク質遺伝子セグメントの複合配列を作製した。HMWタンパク質のセグメントをコードする配列を配列番号10として示す。この配列は図２のヌクレオチド466〜1976に相当する。pAH306の地図を図５に示す。
【０１３１】
HMWタンパク質のDNA配列および推定アミノ酸配列のデータベース解析(例えば、一次アミノ酸相同性、ヒドロパシープロフィール、N-/O-グリコシル化部位、官能性／構造性ドメインの解析)を、GeneRunnerおよびIntelligenticsソフトウエアを用いて行ったところ、HMWタンパク質が新規であることが判明した。
【０１３２】
8.5. 実施例５： HMWタンパク質遺伝子のＣ末端セグメントのクローニング 
染色体歩行を利用してHMWタンパク質遺伝子のＣ末端部分を単離した。成熟HMWタンパク質のＮ末端配列から遠く、かつベクターのT3プロモーター配列に隣接する約0.6KbpのBamHI-EcoRI断片を、初期染色体歩行用のプローブとして選択した。簡単には、pAH306をBamHIおよびEcoRIで完全に消化し、アガロースゲル電気泳動(0.8％アガロース、TAEバッファー中)によって消化産物をサイズ分画した。所望の約0.6KbpのBamHI/EcoRI(B/E)バンドをゲルから切り出し、市販のシリカゲル微量遠心クロマトグラフィーカラムおよび試薬(QIAGEN)を用いて精製した。
【０１３３】
0.6Kbpの精製B/E断片を、ランダムプライミング標識法にて市販の試薬(Boehringer Mannheim)を用いて[α-dATP](＞3000Ci/mmol, Amersham)で放射性標識し、HindIIIで完全に消化しておいたC. trachomatis L2ゲノムDNAのサザンブロットを釣り上げるのに使用した。
【０１３４】
pAH306由来の0.6KbpのB/Eプローブは約1.4KbpのHindIIIゲノム断片にハイブリダイズした。pAH306上にコードされるHMWタンパク質遺伝子セグメントの実験的に誘導した制限地図によれば、この断片は約0.2KpbのＣ末端HMWタンパク質配列をコードする。
【０１３５】
次いで、放射性標識した0.6KbpのB/E断片を使用して、中程度の重複性(約5,000個の一次クローン)のC. trachomatis L2ライブラリーを釣り上げて約1.4KbpのHindIII断片を含むクローンを同定した。簡単には、C. trachomatis L2ゲノムDNAを、約10倍過剰の制限エンドヌクレアーゼHindIII(ゲノムDNA１μg当たり約10単位、37℃、18〜24時間)を使用して完全に消化した。消化産物をアガロースゲル電気泳動(0.8％アガロース、TAE)によってサイズ分画し、サイズが約1.0Kbp〜2.0KbpのDNA断片をゲルから切り出した。切り出したアガロースのストリップには所望のDNA断片サイズが含まれており、可溶化／結合溶液(QX1、QIAGEN)に溶解し、市販のシリカゲルスピンカラム(QIAGEN)を使用して精製した。次いで、予めHindIIIで完全に消化し、かつベクターの再ライゲーションを防ぐためウシ小腸ホスファターゼで処理しておいたpBlueScript SK-プラスミドへ、1.0〜2.0Kbpの精製ゲノムHindIII断片をクローニングした。
【０１３６】
ベクター／インサートのライゲーションを約50μlの最終反応容量(50mM Tris-HCl、pH7.00、10mM NaCl、１mM ATP、0.5mM DTT)で25℃にて約16〜24時間、T4 DNAリガーゼ(約10単位／反応)を用いて行った。ベクター：インサートのモル比は約１：10とした。ライゲーションの後、アリコート(約50ngのライゲートしたDNA)を使用してコンピテントな大腸菌宿主(例えば、大腸菌TOP10)にエレクトロポレーションした。次いで、エレクトロポレーションを行った細胞を、約100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天上に接種し、プラスミドを保有するクローンを選択した。約1,000個のプラスミドを保有するApR形質転換体をLB Ap100寒天プレートからナイロン膜(HyBond N+、Amersham)へ毛管作用によって直接転写した。
【０１３７】
転写した後、プレートを37℃で再インキュベートし、生育可能なコロニーをさらなる操作のために再び生成させた。膜に転写したコロニーを溶解し、コロニーのブロットを変性SDS/NaOH溶液で処理してDNAを遊離させた。Tris緩衝NaCl溶液を使用して溶解物質を中和して安定化させた。遊離したDNAをUV照射によって膜に固定化した。標準的な組換えDNAの手法および方法論を使用して、0.6Kbpの放射性標識B/E断片を含むコロニーのブロットを釣り上げ、所望の約1.4KbpのHindIII断片を保有する組換え誘導体を同定した。
【０１３８】
プラスミドpAH310は、これらの手法によって単離された誘導体の一つであり、HMWタンパク質のコードセグメントは図２のヌクレオチド994〜2401に相当する。
【０１３９】
HindIIIおよびEcoRIを使用する制限分析を、精製プラスミドDNAのDNA配列分析と個別におよび組み合わせて用いたところ、pAH310が推定約1.4KbpのHindIII断片をコードすることを確認した。これらの分析からは、約1.4Kbpのインサートが、pAH306に存在する約1.2Kbpの同じHindIII-EcoRI断片と、Ｃ末端HMWタンパク質特異的DNAをコードする約0.2KbpのユニークなEcoRI-HindIII断片とからなることも判明した。
【０１４０】
約0.2KbpのEcoRI-HindIII(E/H)断片を、第２の染色体歩行用のプローブとして選択した。簡単には、pAH310をEcoRIおよびHindIIIで完全に消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動(0.8％アガロース、TAEバッファー中)でサイズ分画した。所望の約0.2Kbp(E/H)バンドをゲルから切り出して精製し、[α-P32]dATPで放射性標識し、これをプローブとして使用して、元のC. trachomatis L2λZAPIIゲノムライブラリーに含まれるHMWタンパク質遺伝子のＣ末端セグメントをコードするクローンを同定した。
【０１４１】
プラスミドpAH316は、これらの手法によって単離された誘導体の一つである。pAH316の制限分析より、この誘導体が、約2.5Kbpと約2.0Kbpのサイズの２個のEcoRI断片からなる約4.5KbpのC. trachomatis L2インサートを含むことが判明した。約0.2KbpのE/H断片をプローブとして使用するサザンハイブリダイゼーション分析では、この配列はpAH316の約2.5KbpのEcoRI断片に位置した。精製pAH316プラスミドDNAを鋳型として使用し、約0.2KbpのE/H断片並びにT3およびT7ベクター配列に特異的な増幅プライマーのセットを使用するディレクショナルPCR分析からは、pAH316がHMWタンパク質遺伝子のＣ末端セグメントをコードすることが判明した。HMWタンパク質のコードセグメントは図２のヌクレオチド1977〜3420に相当し、配列番号11として示す。
【０１４２】
8.6 実施例６： 末端切断HMW組換えタンパク質の生成 
HMWタンパク質のＮ末端側の半分を約1.5Kbp断片として市販の大腸菌発現プラスミドpTrcHisB(Invitrogen)へPCRクローニングした。これらの反応に使用した順方向プライマーは140FXHO(57量体)と呼ばれ(配列番号18として示す)、成熟HMWタンパク質の最初の10個のＮ末端残基に相補的な配列を含む。HMWタンパク質コード配列の他にも、この順方向プライマーは、ベクタープラスミド上にコードされた(His)6アフィニティー精製ドメインへ適切に融合するための成熟HMWタンパク質(Glu/E)の最初の残基の上流に最適に位置するユニークなXhoI制限部位と、効率的な増幅のための5'末端の６塩基G/Cクランプおよびエンドヌクレアーゼによる効率的な認識と消化のための12塩基内部スペーサーを保有する。
配列番号18 5'-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGC-TCG-AGA-GAA-ATT-ATG-GTT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC-GAT-3'
配列番号19 5'-CGC-TCT-AGA-ACT-AGT-GGA-TC-3'
pAH306のEcoRI部位の下流にあるファージミド配列に相補的な市販の逆配列決定プライマーSK(20量体、StrataGene；配列番号19)を、これらの反応に逆方向増幅プライマーとして使用した。HMWタンパク質ORF産物(約１.5Kbp)の許容できる収率を得るために、一次増幅ポリメラーゼとしてのT. thermophilus DNAポリメラーゼ(Advantage Polymerase)と、さらに5'-3'プルーフリーディング活性をもたらす微量の忠実度の高い第２の熱安定性DNAポリメラーゼ(CloneTech)とからなる熱安定性DNAポリメラーゼの混合物を用いてPCR増幅を行った。抗Tth DNAポリメラーゼ抗体を反応混合物に添加して、2Kbpを越えるアンプリマーの生成を促進する自動「ホットスタート(hot-start)」条件を与えた。市販のアルカリ／SDS系(QIAGEN)およびシリカゲルスピンカラム(QIAGEN)を用いて精製したpAH306プラスミドDNAを使用してこれらの増幅反応を計画した(約0.2ng／反応)。
【０１４３】
シリカゲルスピンカラムを用いて、組込まれていないプライマーから約1.5Kbpのアンプリマーを精製し、過剰のXhoIおよびEcoRI(DNA１μg当たり約10単位)を使用して完全に消化した。次いで、精製かつ消化したＮ末端切断HMWタンパク質ORFを、XhoIおよびEcoRIの両方で予め消化しておいた市販の発現プラスミドpTrcHisBへクローニングした(5:1のインサート：ベクター比)。次いで、ライゲーション反応からのアリコートを使用して、適切な大腸菌宿主(例えば、TOP10)を電気的に形質転換した。
【０１４４】
ランダムに採取したアンピシリン耐性形質転換体由来のミニプレップDNA (mini-prep DNA)を調製し、XhoI、EcoRIまたは両者の組み合わせで完全に消化し、約1.5Kbpの末端切断HMWタンパク質ORFインサートの有無および方向についてアガロースゲル電気泳動にて試験した。約1.5KbpのXhoI/EcoRIインサートを保有すると判定されたクローン由来のミニプレップDNAを調製し、これを使用して非対称PCR DNA配列決定反応を計画し、HMWタンパク質断片と発現ベクターの(His)6アフィニティー精製ドメインとの間に形成される結合の忠実度を確認した。プラスミドpJJ36-Jは、これらの手法で単離された組換え誘導体の一つであり、図２のヌクレオチド466〜1980に相当する。HMWタンパク質の末端切断断片の推定アミノ酸配列は、図３のアミノ酸29〜533に相当し、配列番号17として示す。
【０１４５】
8.7.実施例７： 他の種における存在の判定 
ポリメラーゼ連鎖反応分析を行って、複数の臨床上認識されている C. trachomatis株と他のクラミジア種(例えば、C. pneumoniae)にHMW遺伝子が存在するかを確認した。凍結ストックとしてATCC(Rockville, MD)から入手したChlamydia trachomatis株を使用して、McCoy細胞のコンフルエントに達していない(subconfluent)単層(約80％)に標準的な手法に従って感染させた。感染させた単層をSorvall RT6000B遠心分離機で遠心分離し(約1,300rpm、25℃、30分)、および／または硫酸デキストラン(約50μg/ml)で感染時に処理して感染力の低い次亜種(biovar)(non-LGV)の宿主細胞への初期結合を強化させ、最終的なEB収率を増加させた。
約48時間後に、感染単層を掻き取って回収し、宿主細胞を超音波処理で破壊して基本小体(EB)を遊離させた。全DNAを各株の精製EB(約107〜108)からプロテイナーゼＫ／Nonidet P40法(Denamurら, J. Gen. Microbiol. 137:2525-2530, 1991に記載、本文献は引用により本明細書に含まれるものとする)を使用して抽出し、フェノール／クロロホルム抽出と塩析沈殿でさらに精製した。精製Chlamydia penumoniae(AR-139)のゲノムDNAはAdvanced Biotechonologies Inc.より購入した。
【０１４６】
これらの株におけるHMWタンパク質遺伝子の有無を判定するため、全クラミジアDNAを鋳型とし、以下に示すHMWタンパク質セグメント特異的オリゴヌクレオチドプライマー(21量体)のセットを使用する増幅反応を計画した。
配列番号20 5'-ATG-GTT-CCT-CAA-GGA-ATT-TAC-G-3' 
配列番号21 5'-GGT-CCC-CCA-TCA-GCG-GGA-G-3' 
【０１４７】
簡単には、標準的なPCR増幅反応(２mM Mg2+、100μmol dNTP、0.75単位のAmpliTaqポリメラーゼ、最終容量50μl)を、約15μlの粗C. trachomatis DNA抽出物(約10μlの市販のC. pneumoniae DNA)と約20pmolの順方向および逆方向の各HMWタンパク質特異的増幅プライマー(配列番号20および21)を使用して計画した。短い標的配列(２Kbp以下)の増幅は、32サイクルの３段階温度プロフィール(即ち、95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で１分)を用いて行った。ORF-クローニングおよび配列決定用の長い標的配列の増幅は、粗DNA抽出物を同様に用いて行った。但し、MAbで不活化したTth/Vent DNAポリメラーゼ酵素の組み合わせを使用し(Advantage PCR, Clontech)、72℃での伸長時間は、所望のPCR産物のサイズに２分間を足した時間を使用した(即ち、所望のPCR産物＝6Kbpの場合、伸長時間＝８分)。
【０１４８】
従来のPCRおよびロングディスタンスPCR(long-distance PCR)の双方を、0.2mlの薄壁ポリプロピレン遠心分離チューブを使用してABI 2400サーマルサイクラー(Perkin-Elmer)中で行った。温度サイクルを行った後、反応のアリコート(約20μl)を分析し、PCR産物を標準的なアガロースゲル電気泳動(0.8％アガロース、TAEバッファー中)と臭化エチジウム染色で同定した。その結果、HMWタンパク質が、臨床上関連のある血液型亜型中に高度に保存されていることが判明し、HMW遺伝子は試験を行った全てのクラミジアサンプル株(血液型亜型B、Ba、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2およびMoPn並びにC. pneumoniae)中に存在した。
【０１４９】
8.8. 実施例８： 配列変異の判定 
異なるクラミジア株間のDNAおよびアミノ酸の配列変異の程度を確認するため、HMWタンパク質の遺伝子をC. trachomatis B血液型亜型(トラコーマ属の生物に相当)および C. trachomatis F血液型亜型(感染力の低いSTD次亜種に相当)の双方からPCRクローニングし、HMWタンパク質コンセンサスC. trachomatis L2配列と比較した。
【０１５０】
簡単には、LD-PCRを使用して、成熟HMWタンパク質の全コード配列を含む約６KbpのHMWタンパク質特異的DNA断片をC. trachomatis BおよびFゲノムDNAから生成した。これらのLD-PCR操作の増幅条件は、実施例６に記載の通りとした。これらの反応に使用した逆方向増幅プライマー(p316Kpn-RC、56量体、配列番号13として記載)は、推定HMWタンパク質終結コドンの約３Kbp下流に位置する配列に相補的なものである。所望の約６Kbpのアンプリマーをクローニングするため、クラミジア配列の5'側の１個のKpnI制限エンドヌクレアーゼ部位を遺伝子操作によってp316Kpn-RCプライマーへ組込んだ。これらの反応に使用した順方向増幅プライマー(p306Kpn-F、56量体、配列番号12として記載)には、成熟HMWタンパク質を特定する最初の10アミノ酸残基(30ヌクレオチド)とKpnI部位を特定する5'配列に相補的な配列が含まれる。約６Kbpアンプリマーを大腸菌発現ベクターpTrcHisB(ClonTech)のKpnI部位へ挿入した場合に、成熟HMWタンパク質のＮ末端をコードする配列が、このベクター上の高効率trcプロモーターの下流にコードされている６Hisアフィニティードメインにインフレームで連結し得るようにP306Kpn-Fを設計した。
配列番号12 5'-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGG-GTA-CCG-AAA-TTA-TGG-TTC-CTC-AAG-GAA-TTT-ACG-AT-3'
配列番号13 5'-AAG-GGC-CCA-ATT-ACG-CAG-AGG-GTA-CCC-TAA-GAA-GAA-GGC-ATG-CCG-TGC-TAG-CGG-AG-3'約６KbpのHMWタンパク質産物をシリカゲルスピンカラム(QIAGEN)を用いて精製し、10倍過剰のKpnI(精製断片１μg当たり約10単位、37℃)を用いるKpnI消化の８〜10時間サイクルに断片を２回かけた。２回目の消化の後、残留する制限酵素活性をQIAGENスピンカラムを用いて除去し、予めKpnIで完全に消化し、かつベクターの再ライゲーションを防ぐためウシ小腸ホスファターゼで処理しておいたpTrcHisBプラスミドへ約6KbpのKpnI HMWタンパク質断片をクローニングした。
【０１５１】
ベクター／インサートのライゲーションを約50μlの最終反応容量(50mM Tris-HCl、pH7.00、10mM NaCl、１mM ATP、0.5mM DTT)で25℃にて約２時間、T4 DNAリガーゼ(約10単位／反応)を用いて行った。ベクター：インサートのモル比は約１：５とした。ライゲーションの後、アリコート(約50ngのライゲートしたDNA)を使用してコンピテントな大腸菌宿主(例えば、大腸菌TOP10)にエレクトロポレーションした。電気的に形質転換した細胞を約100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天上に接種して、プラスミドを保有する形質転換体を選択した。37℃で約18〜24時間インキュベートした後に現れるアンピシリン耐性(ApR)形質転換体をランダムに採取し、精製のため、同様の選択培地上へ再び線条接種した。
【０１５２】
最初の形質転換体からそれぞれ得られた単一の精製ApRコロニーを使用して、約５mlのLBブロスへ接種して37℃で一晩インキュベーター振盪機(約200rpm)中にて適度に通気しながら増殖させた。ブロス培養から得られた細胞を遠心分離で回収し、これを使用して少量のプラスミドDNAを調製した。市販の試薬(QIAGEN Plasmid Mini Kits)をこれらのプラスミド抽出に使用した。消化されなかったプラスミドDNAをアガロースゲル(0.8％アガロース、TAEバッファー中)で電気泳動してベクタープラスミドよりもサイズの大きい誘導体を同定することにより、インサートを保有するプラスミド誘導体を推定で同定した。インサートを含有する誘導体を確認し、ベクター配列に対するHMWタンパク質インサートの方向を適切な制限エンドヌクレアーゼ(KpnI、EcoRI、HindIII、BamHI等)を個別にまたは様々に組み合わせて用いて決定した。
【０１５３】
「配列歩行」(染料-ターミネーター非対称PCRサイクル配列決定法(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer)、実施例４に記載)を用いてC. trachomatis BおよびFのHMWタンパク質遺伝子のDNA配列を両鎖とも得た。プラスミドのミニプレップDNAと、L2型株由来のHMWタンパク質遺伝子の配列決定に使用する個々のHMWタンパク質配列特異的プライマーを用いて反応を計画した。
【０１５４】
ABI 310 Sequenatorを使用してDNA配列のデータを収集し、実施例４に記載したようなPowerMACコンピュータと適切なコンピュータソフトウエアで自動解析した。個別に自動解析したDNA配列の精度を手動で編集した後、AutoAssemblerソフトウエア(Perkin-Elmer)を用いてコンセンサス配列「ストリング」にマージした。C. trachomatis BおよびF血液型亜型に由来するHMWタンパク質遺伝子の両鎖を配列決定し、これらのデータをコンパイルしてC. trachomatis BおよびF HMWタンパク質遺伝子の両方について複合コンセンサス配列を作製した。これらの配列を配列番号15および16として示す。L2、FおよびB株の配列比較を図６に示す。
【０１５５】
8.9. 実施例９：組換えタンパク質の製造 
免疫原性試験および動物防御試験の両方に対して十分な量の組換えHMWタンパク質を製造するために、HMW遺伝子を適当なE.coliおよびバキュロウイルス発現系にＰＣＲクローニングした。E.coliを基礎とする系においてN末端(His)6アフィニティ精製ドメインを含むキメラ融合タンパク質として大量のrHMWタンパク質を産生させた。完全HMWタンパク質オープンリーディングフレーム(ORF)をC.trachomatis L2ゲノムから１個の(single)KpnI断片としてPCRクローニングし、実施例５に記載したとおりに、高発現プラスミドベクターpTrcHisB(CloneTech)にコードされた(His)6アフィニティ精製ドメインに適正な方向および正確な読み枠になるように融合した。
【０１５６】
(His)6アフィニティ精製ドメインは、高効率tacプロモーター(IPTG-誘導性）および(His)6アフィニティ精製ドメインのすぐ上流に位置するコンセンサスシャイン・ダルガノリボソーム結合部位(RBS)からなる高発現遺伝子座の一部である。C.trachomatis LGV L2、C.trachomatis BおよびC.trachomatis F由来のHMWタンパク質遺伝子を〜3.0Kbp断片としてPCRクローニングした。これらの反応に用いられる順方向プライマー（56マー）をp306Kpn-Fと命名した。このプライマーは、配列番号12に列挙した成熟HMWタンパク質の最初の10個のN末端アミノ酸残基に相補的な配列を含む。この順方向プライマーは、HMWタンパク質コード配列の他に、ベクタープラスミドにコードされている(His)6アフィニティ精製ドメインへの適正な融合のための成熟HMWタンパク質の最初の残基(Glu)の上流に任意に位置するユニーク(unique)KpnI制限部位、効率的な増幅のための5'末端6塩基G/Cクランプ(clamp)および効率的なエンドヌクレアーゼ認識／消化のための12塩基内部スペーサーも有する。p316Kpn-3RCと称される逆方向PCRプライマーは、配列番号14に示したHMWタンパク質終結コドンから〜0.2Kbp下流に位置するC.trachomatis配列に対する逆方向相補配列を含む。p306Kpn-Fの場合と同様に、逆方向プライマーもC.trachomatis配列の5'側にKpnI制限部位を含み、さらに6塩基G/Cクランプおよび12塩基内部スペーサーを含む。
【０１５７】
許容できる収量のHMWタンパク質ORF産物（約3,500bp)を得るために、主要な増幅ポリメラーゼとしてT.thermophilus DNAポリメラーゼからなる耐熱性DNAポリメラーゼと、さらなる5'-3'プルーフリーディング活性を得るための少量の第二の高忠実度(fedelity)耐熱性DNAポリメラーゼ(Advantage Polymerase, CloneTech)との混合物を用いてPCR増幅を行った。抗-Tth DNAポリメラーゼ抗体を反応混合物に加えて大型（2Kbpより大）のアンプライマー(amplimer)の製造を促進する自動「ホットスタート(hot-start)」条件を得た。
【０１５８】
種々のC.trachomatis株由来のゲノムDNAを上記の実施例で記載したようにEBから単離し、これらの反応のプログラムするのに用いた。増幅後、市販のシリカゲルスピンカラムおよび試薬(QIAGEN)を用いて所望の反応産物を過剰のプライマーから精製し、過剰のKpnI（DNA 1μg当たり〜10単位）を用いて完全に消化した。次いで、精製し、消化したKpnI HMWタンパク質ORFをKpnI予備消化pTrcHisB発現プラスミド(5:1、挿入断片：ベクター比）にクローニングした。その後、ライゲーション反応から得たアリコートを用いて適当なE.coli宿主(例えばTOP10)を電気形質転換した。
【０１５９】
ランダムに選択したアンピシリン耐性形質転換体由来のmini- prep DNAを調製し、KpnI、HindIII、またはその両方の組合せを用いて完全に消化し、そしてアガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により〜3.2KbpのHMWタンパク質ORF挿入断片の存在および方向について試験した。上記の実施例に記載したようにmini-prep DNAを用いて非対称PCR DNA配列決定反応をプログラムし、ベクターのHMWタンパク質断片と(His)6アフィニティ精製ドメインとの間に形成された結合部(junction)の忠実度を確認した。プラスミドpAH342はこれらの操作により単離された誘導体の一つであり、C.tarchomatis L2由来のHMWタンパク質遺伝子ORFを含み、図２においてヌクレオチド466〜3421に示されている。
【０１６０】
100μg/mlのAPを含む2X-YTブロス中で組換え体を対数増殖期中期（〜0.5 O.D.600)まで増殖させ、IPTG（最終1mM)でさらに４〜５時間誘導してベクターtrcプロモーターからの転写を活性化した。細胞を遠心分離によって採取し、フレンチ加圧セル(French pressure cell)を用いて溶解することにより粗細胞溶解物を調製した。
【０１６１】
一方、バキュロウイルス発現系を用いることによりrHMWタンパク質の発現を得てもよい。ここで、C.trachomatis L2およびC.trachomatis F由来のHMWタンパク質ORFを、pTrcHisBについて記載した手法と本質的に同じ手法で予めKpnIで完全に消化し、CIPで処理することによりベクター再結合を最小にしたバキュロウイルストランスファー(transfer)ベクター（例えばpFastBacHTb)に〜３Kbp PCR産物としてPCR-クローニングした。次いで、このクローニングエクササイズにおいて作製されたHMWタンパク質発現カートリッジ（すなわちバキュロウイルス多面体プロモーター、N末端(His)6アフィニティ精製ドメイン、HMWタンパク質遺伝子ORF）を、市販のbacmid系(Bac-to-Bac, Gibco)を用いた部位特異的転位によりバキュロウイルスゲノムに転移させた。
【０１６２】
簡単に述べると、HMWタンパク質バキュロウイルス発現プラスミドを用いることによりゲンタマイシン耐性に対するbacmid（ハイブリッドバキュロウイルスプラスミドレプリコン）を含むコンピテントE.coli DH10bac(Gibco)細胞を標準的な形質転換および選別方法により形質転換した。HMWタンパク質発現カートリッジが発現プラスミドからbacmidレプリコン上に位置するlacZ遺伝子内の適切な受容体部位にうまく転位された形質転換体を、標準的なIPTG/X-galブルー-ホワイト選択を用いて同定した。
【０１６３】
白色のGmR形質転換体をランダムに選択し、再線条接種した(restreaked)。Ish-Horowitz, N.A.R.9:2989-2993(1981)（参照により本明細書に含まれる）の方法によりブロス培養物からbacmid DNAを調製し、これを用いてSpodoptera frugiperda 9細胞をトランスフェクトする。プラーク精製後、組換えHMWタンパク質バキュロウイルスを用いて大量のSpodoptera懸濁培養物に感染させる。酵母発現系を用いることによりグリコシル化型のHMWタンパク質を産生させる。
【０１６４】
8.10. 実施例10：組換えタンパク質の精製 
組換えHMWタンパク質を標準的な分取固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC)法を用いて均質になるまで精製した。簡単に述べると、HMWタンパク質遺伝子を含有する発現プラスミドを有するE.coli株を、5Lの発酵槽(New Brunswick)においてルリアブロス中で37℃にて適度に通気しながら対数増殖中期(〜0.5O.D.600）になるまで増殖させ、４〜５時間IPTG（最終1mM）を用いて誘導した。細胞ペーストを集めて、PBS中で洗浄し、-20℃で保存した。凍結した細胞ペーストのアリコート（湿潤重量で〜９〜10ｇ）を機械的撹拌により〜120mlのD-PBSに懸濁し、フレンチ加圧セル(2×、14,000psi、4℃)を通過させて溶解した。次いで、可溶性タンパク質を高速遠心分離（〜10,000×g、4℃、30分）によりrHMWタンパク質封入体から除去した。
【０１６５】
rHMWタンパク質を含む不溶性ペレットを〜20mlの氷冷D-PBSにホモジナイズすることにより懸濁し、上記と同様に遠心分離した。次いで、洗浄したrHMWタンパク質封入体を6M塩酸グアニジンを含むリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.0)に懸濁することにより変性し、Fast-Flow Chelating Sepharose(Pharmacia)から調製したNi2+アフィニティカラム(1.5cm×25cm、カラム床体積〜15ml）に加えて標準的な手順でNi2+またはZn2+イオンを充填した。カラムを8M尿素を含むリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH7.0)〜５〜10カラム容量で洗浄することにより非結合材料を除去した。
【０１６６】
N末端(His)6アフィニティ精製ドメインによってアフィニティ樹脂に結合した組換えHMWタンパク質を、pH4.0のリン酸ナトリウム／8Mの尿素緩衝液（〜20ml）を用いて溶出した。溶出した材料を1.0Mのトリス-HCl（〜2.5ml、pH7.5）を加えることにより中和し、SDS(0.5％)を含むTE緩衝液に対して透析することにより尿素を除去した。透析した材料をCentricon-30遠心濃縮器(Amicon、30,000MWCO)を用いて濃縮し、1mMの2-メルカプトエタノール(Lammeli)を含む５×SDSゲル試料緩衝液1/5容量と混合して100℃にて5分間煮沸した。
【０１６７】
試料をトリス／グリシン分取アクリルアミドゲル（４％濃縮用ゲル、12％分析ゲル(resolving gel)、30:0.8のアクリルアミド：ビス溶液、厚さ3mm）に加えた。予備染色した分子量標準(SeeBlue, Novex)をrHMWタンパク質試料と平行に流してゲル上のサイズ分画を同定した。分子量〜105〜115Kdalのタンパク質を含有するゲルの領域を切り出して、製造業者が指定したようにElu-Trap装置および膜(S&S)を用いてタンパク質を電気溶出させた。電気溶出したタンパク質を透析してSDSを除去した。試料のタンパク質濃度をMicro-BCAシステム(Pierce)を用い、濃度標準としてBSAを用いて測定した。図４に示したようにrHMWタンパク質の純度を通常のSDS-PAGEおよび市販の銀染色試薬(Silver Stain Plus, Novex)を用いて測定した。
【０１６８】
単離された成熟rHMWの見かけの分子量はSDS-PAGEで測定したところ約105〜115ｋDaである。
【０１６９】
8.11. 実施例11：HMWタンパク質に対する抗体の調製 
ウサギに精製HMWタンパク質またはその断片をワクチン接種することによりHMWタンパク質に対して誘導される多価抗血清を作製した。1回当たり約250μgのHMWタンパク質またはその断片を注射することにより約21日間隔で合計3回各動物を免疫感作した（完全フロイントアジュバントで開始し、不完全フロイントアジュバントがそれに続く）。各免疫感作において、約半分の材料を筋内(i.m.)投与し、半分を結節間注射した。3回目のワクチン接種の14日後、約100μgのHMWタンパク質をi.m.投与することにより4回目の追加免疫を行い、７〜10日後に動物から瀉血した。捕獲リガンドとして精製HMWタンパク質(1.0μg/ウェル)またはC.trachomatis L2 EB（全および粗タンパク質抽出物）を用いるELISAによって抗HMWタンパク質力価を測定した。精製rHMW先端切断タンパク質を用いた場合、免疫原特異的IgG ELISA力価1/320,000が観察され、EBまたはRBを用いた場合、1/2500が観察された。
【０１７０】
PBSで抗血清の連続希釈を行い、２個一組にしてELISAで試験した。1/1000に希釈したヤギHRP-結合抗ウサギ抗体を、これらのアッセイの第２のレポーター抗体として用いた。力価は、陽性ELISA反応（すなわちO.D.450値が平均陰性対照値（予備出血(prebleed)ウサギ血清）よりも2SD以上高い）を示す最大希釈度として示される。次いで高度免疫抗血清を用いて粗EBまたはRB抽出物ならびに1.0％OGP EB抽出調製物のウェスタンブロットを調べることにより、その他のC.trachomatis血液型亜型およびクラミジア種がHMWタンパク質を発現するか否かを確認した。C.trachomatis血液型亜型B、Ba、D、F、G、I、J、K、L1、L2、L3、MoPnおよびChlamydia pneumoniaeを試験したところ、HMWタンパク質に対して作製した抗血清と反応する見かけの分子量105〜115KDaのタンパク質を有することが分かった。
【０１７１】
8.12. 実施例12：表面局在化 
種々のクラミジア株および誘導体におけるHMWタンパク質の表面局在化を間接的蛍光抗体(IFA)で調べた。一次抗体として高度免疫抗HMWタンパク質を用いて当技術分野で一般的に公知の方法によってIFAを行った。C.trachomatis血液型亜型L2、B、およびFの一つ、C.pneumoniaeまたはC.psittaci由来の全EBに感染したHak細胞は下記の方法により得られる。
【０１７２】
McCoyまたはHak細胞を24ウェル組織培養プレートの中の12mmの平坦なカバーガラス上にてD-MEM培地中で集密になるまで増殖させ、次いで〜５×104封入体形成単位(IFU)のC.trachomatis株N11（血液型亜型F)を遠心的に接種した。〜24時間インキュベートした後、培地を除去し、感染細胞を10分間メタノール中に固定した。次いで固定化された単層をPBS(1×)で洗浄して固定液を除去し、PBS中で〜1/100に希釈した＞300μlの抗60Kdal先端切断HMWPウサギ抗体を重ね合わせた。一次抗体とともに1時間インキュベートした後、細胞をPBSで穏やかに洗浄し、次いでFITCと結合したマウス抗ウサギIgG抗体の1/200希釈物とともに〜30分間インキュベートした。対比染色として0.0091％エバンスブルーを含むPBSを用いて第2の抗体を希釈することにより単層を視覚化した。細胞をPBSで2回洗浄して二次抗体を除去し、培養皿からカバーガラスを取り除いて蛍光封入剤を用いて顕微鏡スライド上に固定した。
【０１７３】
予備出血ウサギ抗体またはFITC結合第２抗体単独で染色した同一の細胞試料を並行して処理し、抗体特異性（陰性）対照として用いた。対比染色した試料をplan-neoflur対物レンズを備えたZeiss Axioskop顕微鏡写真機を用いて倍率1000×で調べた。C.trachomatis NI1(F血液型亜型）を用いた結果を図７に示す。この結果は、HMWタンパク質抗体で染色した試料の蛍光発光性が対照と比べて増大しているということはHMWタンパク質が表面に位置していることを裏付けるものであることを示すものである。さらに、HMWタンパク質抗体で染色された試料の蛍光発光は、L2、BおよびMoPn血液型亜型およびC.pneuomoniae由来の表面局在化HMWタンパク質への結合を示すものである。
【０１７４】
9. 実施例13：in vitro中和モデル 
in vitro中和モデルを用いることにより、防御抗血清が種々の組織培養細胞系のクラミジア感染を抑制（中和）したことが示されている。動物モデルは、前臨床評価に必要な小動物（非霊長類）および霊長類モデルの両方についてのワクチン有効性試験にも必須である。モルモットをモルモット封入体性結膜炎物質(GPIC)、C.psittaciによる実験的な眼および性器感染の試験に用いた。
【０１７５】
マウスは、ヒト生殖管分離菌を用いた生殖管感染の安定した再現性のあるモデルを提供する。このマウスモデルは一般的に許容された前臨床検定であり、サブユニットワクチンとしてのMOMPを評価するために用いた。別のモデルは、分泌型IgAの誘導が防御の主要な構成要素であることが示されているトラコーマ感染の霊長類モデルとして公知である。上記の一般的に許容されたin vitro中和および動物モデル系を用いて新規サブユニット抗原候補物質のワクチン原能力を測定する。
【０１７６】
動物防御試験の予備的なエクササイズとして、高度免疫抗HMW抗体を、種々のC.trachomatis血液型亜型(例えばL2、B、F)のin vitroの感染性をブロックするその能力について評価した。McCoy細胞を用いてクラミジアを伝播させたが、これらの細胞はFc受容体による抗体介在取り込みも可能にする。したがって、感染性の抗HMW抗体阻害を評価するために、Fc受容体を表示しないHak細胞をこれらの分析に用いた。
【０１７７】
24ウェルプレート内のカバーガラス上で細胞をサブ集密的な単層（集密性約90％＝１×105細胞/ml)になるまで５％CO2中で37℃にて増殖させた。抗HMW抗体をスクロース-リン酸-グルタミン酸(SPG)緩衝液中で約100μg/ml（総タンパク質）まで希釈し、次いでSPG緩衝液中で連続的に希釈した。予め力価測定したクラミジアの凍結アリコートをSPG緩衝液中で約２×104IFU/mlになるまで希釈した。EBを希釈した抗HMW抗体と約10〜20IFU/μlになるまで予備混合し、振動プラットフォーム(rocking platform)上で37℃にて30分間インキュベートした。
【０１７８】
調製したHak細胞をHBSS中で洗浄し、次いで抗HMW抗体／クラミジアEB混合物と500IFU/mlにて各抗体につき3個一組でインキュベートした。プレートを37℃で2時間インキュベートし、次いで接種材料を除去し、プレートをHBSSで3回洗浄した。1μg/mlのシクロヘキサミドを含む組織培養培地を加え、プレートを５％CO2中で37℃にて約24〜36時間インキュベートすることにより封入体を生じさせた。インキュベーション後、培地を除去し、細胞単層をPBS中で3回洗浄した。プレートをメタノール中に20分間固定してPBS中で再洗浄した。
【０１７９】
細胞を染色して抗クラミジアLPS抗体（約1:500に希釈、ViroStat)とインキュベートすることにより封入体を視覚化し、細胞をPBS中で３回洗浄し、その後FITC結合ヤギ二次抗体と37℃にて30分間インキュベートした。カバーガラスを洗浄し、空気乾燥し、カバーガラス上のグリセロール中に固定した。Zeiss蛍光顕微鏡写真機にてカバーガラスの中央線を通る５つの領域内の封入体を計数した。結果を、異種抗体対照（ウサギ予備出血血清）に対する封入体含有細胞の減少割合として報告する。
【０１８０】
10. 実施例14：ワクチン効力（卵管炎および妊性(fertility)のマウスモデル）
10.1 方法
10.1.1 免疫感作および抗原投与 
Tuffreyマウス妊性(fertility)モデルを用いることにより、rHMWの、Chlamydia trachomati誘発型卵管炎および不妊症に対して動物を防御する効力を評価した。17匹の雌C3H HeOuJマウス（〜6週齢、Jackson Lab)からなる群(3群）をこの評価に用いた。約10〜12μgのゲル精製rHMWPとアジュバントとして〜5μgのmLT(SmithKline Beecham)とを含有するワクチン製剤〜20μlを鼻腔内投与することにより0週目、2週目および3週目に17匹のマウスからなる試験群を免疫感作した。16％のKetajectおよび16％のXylajectを加えた68％の発熱性物質無しのPBSからなる麻酔カクテル（100μl i.p./動物）を用いて免疫感作前にマウスを鎮静させた。鎮静マウスを仰向けに寝かせて標準的な実験用ピペットを用いてワクチン製剤を投与した。投与は鼻孔当たり〜10μlのワクチン溶液を5分間隔で注入することにより行った。
【０１８１】
17匹の雌マウス（試験群当たり）からなる２群を、5μgのmLTのみを含む調製物（すなわちアジュバントのみで抗原なし）を投与した以外は同様にして免疫感作した。続いて、これらの群の中の一つにC.trachomatisを抗原投与して（偽免疫感作、感染）陰性妊性対照として用い、その他の群は抗原投与せずに（偽免疫感作、偽感染）陽性妊性対照として用いた。
【０１８２】
４週目に、全動物に単回i.p.用量のプロゲステロン（発熱性物質を含まないPBS中2.5mg、Depo-Provera、Upjohn)を投与して子宮上皮を安定化させた。５週目に、rHMWで免疫感作した動物および陰性対照群の動物に、子宮内左右接種(bilateral intrauterine inoculation)により、100μlのスクロースリン酸グルタミン酸緩衝液(SPG)に加えた〜５×105封入体形成単位(IFU)のC.trachomatis NI1（血液型亜型F)を感染させた。その他の2群が経験した生殖管に対する処理を模擬するために、陽性対照の動物にC.trachomatisを含まない100μlのMcCoy細胞抽出物を左右接種した。7週目に、各群の５〜７匹のマウスをCO2窒息により屠殺し、完全生殖管（上部、下部生殖管の両方）を組織病理学的分析のために取り出した。9週目に、各群の残りの雌を８〜10週齢雄C3Hマウスとともに2ヶ月間ケージに入れて飼育し、妊性を評価した（１ゲージ当たり2匹の雌を入れ、1匹の雄を入れる。各群の雄は週1回入れ替えをする。異なる実験群のマウスは混合しなかった）
。触診と定期的な体重測定によって各ペアのマウスが妊娠した時期を確認した。群の妊性の評価に用いたパラメーターは下記のとおりである：F、交配期間中に少なくとも1回出産したマウスの数をその試験群のマウスの総数で割ったもの；M、新生児マウス（死産(born dead）または生存(alive))の数を交配期間中にその群で生まれた同腹子の数で割ったもの；ならびにN、新生児マウス（死産または生存)の数をその群のマウスの総数で割ったもの。
【０１８３】
10.1.2. 組織病理学 
生殖管をブワン固定液中で24時間以上処理し、徐々に50％、70％、および100％メタノールで脱水し、トルオールに浸漬し、OCT化合物(Tissue-TEK, Miles)中にパラフィン包埋または直接包埋し、その後液体窒素中で急激に (snap)凍結した。組織切片（〜６μm）をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（ブワン固定化試料の脱パラフィン後に染色）。卵管および卵巣内の炎症性の変化を下記のようにして等級付けした：０、識別できる炎症性反応なし；１、２〜３個の単核細胞が卵巣傍腔(periovarial space)または卵管の粘膜下組織に浸潤している；２、１と同じであるが、より程度が大きい；３、２と同じであるが、卵管粘膜下組織が厚くなり、卵管管腔に炎症細胞が存在する；４、３と同じであるがより程度が大きい。観察された上皮内浸潤のレベルに基づいて子宮頸部／膣の炎症のスコアを付けた。
【０１８４】
10.1.3 rHMWP特異的体液性応答の測定 
免疫感作および抗原投与の期間中、血液試料を逆行眼窩(retroorbital)出血によって定期的に回収し、血清を遠心分離によって調製した。50μlの滅菌PBSを標準的な実験用ピペットを用いて膣に繰り返し注入し、ただちに溶液を回収することにより膣分泌物を回収した。注入／回収サイクルを２〜３回行った。
【０１８５】
ELISAによる抗体(Ab)応答の定量を8.11節に記載したとおりに行った。Abレベルを測定するためのマイクロウェルELISAプレート(Maxisorb, NUNC)を、4℃にて一晩かけてウェル当たり10mM炭酸塩／重炭酸塩緩衝液(pH9.6)に加えた〜0.5〜1.0μgのゲル精製rHMWPで被覆し、0.1％Tween-20を含むPBS（洗浄用緩衝液）で洗浄し、3％BSAを含むPBS溶液で37℃にて〜1時間ブロックした。抗原特異的血清IgGレベルの測定のために、試験血清を0.5％BSAを含む洗浄用緩衝液で連続的に希釈し、アリコート(100μl）を抗原被覆ウェル中で37℃にて〜2時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG第2抗体(Sigma)とともに37℃にて〜1時間インキュベートした。HRP結合ヤギ抗マウスIgA二次抗体を用いて膣分泌物中のrHMWP特異的IgAの存在を検出した。適当な二次Abとともにインキュベートした後、プレートを洗浄し、室温にてTMB基質(Sigma)とともに〜20〜30分間インキュベートした。2MのH2SO4を加えることにより反応を停止させ、Molecular Devices SpectroMax マイクロプレートリーダーを用いて450nmにおける吸光度を測定した。力価を450nmにおける光学濃度1.0に対応する試料希釈倍数(dilution)の逆数として測定した。
【０１８６】
10.1.4. rHMWP特異的細胞応答の測定 
６匹の雌C3H HeOuJマウス(Jackson labs)からなる群を鎮静させ、10.1.3節に記載されたようにしてrHMWP＋mLTワクチンを鼻腔内投与することにより０、２および３週目に免疫感作した。４週目および５週目の、それぞれプロゲステロン処置および子宮内抗原投与直前に、各群の３匹のマウスをCO2窒息により屠殺し、脾臓を無菌的に取り出し、単一細胞懸濁物を通常の方法を用いて調製した。免疫感作したマウスから得た脾臓細胞を別個に分析した。陽性対照群（偽免疫感作、偽感染）と陰性対照群（偽免疫感作、感染）の両方について、脾臓細胞をプールして再刺激に関して試験した。
【０１８７】
脾臓細胞増殖の測定のために、脾臓を、10％ウシ胎児血清、25mM HEPES、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、1mm ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および50μM 2-メルカプトエタノール(Gibco-BRL)を補給した５mlのRPMI 1640 Glutamax I中で細かく砕いた（５〜10回転）。生細胞をトリパンブルー染色により計数し、1.0〜2.0×106細胞/mlの密度になるまで同培地中で希釈した（Falcon 2063 ポリプロピレンチューブ）。培養物を3個一組で、丸底96ウェル培養プレート（Nunclon, Nunc)中に加えた。200μl中、ウェル当たり〜５×105レスポンダー細胞で添加した。細胞を、1.0μg/mlのrHMWP（抗原特異的増殖）または陽性刺激対照として4μg/mlコンカナバリンA（Boerhinger Mannheim)のいずれかを用いて刺激し；非再刺激細胞培養物を細胞活性化の陰性対照として用いた。５％CO2中で37℃にて72〜96時間インキュベートした後、細胞をウェル当たり1.0μCiの3H-チミジン(Amersham)で18時間かけてパルス標識した(pulsed labelled)。パルス細胞をTomtec Cell Harvester(Mk III)を用いてガラスファイバーシート上に採取し、３チャンネルWallac 1450 Trilux 液体シンチレーションカウンターにてβ放射を計数した。試料の刺激指数(SI)（個別のものまたはプールしたもの）は、3個一組のウェルについての抗原またはConA-刺激T細胞の3H-チミジンの取り込みの平均を、3個一組のウェルについての非刺激取り込みの平均で割り算したものと定義した。抗原特異的(rHMWP-特異的）およびConA特異的増殖の両方についてのSIを測定した。
【０１８８】
10.2. 結果
10.2.1. 異型抗原投与後のマウス妊性における効果 
mLTとrHMWPの組み合わせによる粘膜免疫感作がC.trachomatis（NI1株、血液型亜型F)のヒト臨床単離菌によって引き起こされた不妊症に対する防御を付与し得るという証拠を表１に示す。rHMWPで免疫感作した動物は、陰性対照群の動物（30％、偽免疫感作、感染）よりも有意に高い受精率（70％、すなわち群内の妊性雌の数／その群内の動物の総数）を示した。同様に、rHMWP免疫感作群はより多くの子を産み、陰性対照群において観察されたよりも大きな群生殖力を示した（それぞれ、子51対24、生殖力スコア5.1±4.7対2.4±4.6）。rHMWPワクチンで免疫感作された動物の群は、偽感染陽性対照群で観察されたものと同等の受精率、子の総数、および生殖力スコアを示した（受精率80％、子の総数56匹、生殖力4.9±2.7）。
【０１８９】
この実験で得られたC.trachomatisにより誘発された不妊症に対する防御は、C.trachomatis疾患に対する交差次亜種(cross-biovar)および交差血液型亜型(cross-serovar)防御を付与するというrHMWPの効用も示すものである。本実験で用いられた組換えHMWP抗原は、眼および生殖管の全身性ならびにより局在化した粘膜感染を引き起こすC.trachomatis性病性リンパ肉芽腫(LGV)群(L2株）に属する株からクローニングされた。これらの実験で用いられたC.trachomatis抗原投与生物、NI1株は、多数の尿生殖管感染を引き起こすトラコーマ次亜種に属するF血液型亜型生物である。
【０１９０】
【表１】
2001518489.tif 000001
【０１９１】
10.2.2. 細胞免疫応答に対する影響 
細胞免疫系のrHMWP特異的活性化を、従来の脾臓細胞増殖アッセイを用いて実際に行った。脾臓細胞を、４週目(黄体ホルモン処置の直前)(表２)と５週目(ホルモン処置の約７日後であって子宮内チャレンジの前)(表３)の間に検査したところ、rHMWPで免疫された動物から回収した全サンプルが、強力な抗原特異的増殖免疫応答を示した。黄体ホルモン処置前にrHMWP免疫された動物から得られた抗原特異的刺激指数(SI)は、ConAでのマイトジェン刺激を介して得られたSIと同等もしくはそれよりも大きかった(３匹のrHMWP免疫動物から得られた抗原およびConA刺激の平均値は、それぞれ26.2対18.4であった)。偽免疫された動物または純粋な動物(つまり、rHMWP抗原またはmLTのいずれにも暴露されなかった動物)から得られた脾臓細胞はいずれも、rHMWP物質でのin vitro再刺激に対して応答しなかったので、免疫化動物で観察される増殖応答の特異性を確立した。黄体ホルモン処置は、rHMWP免疫された動物で観察される抗原特異的増殖応答に影響を及ぼさなかった。ホルモン処置後の脾臓細胞を用いて得られる抗原特異的SIは、マイトジェン刺激を介して得られたものよりも大きかった(３匹のrHMWP免疫動物から得られた抗原およびConA刺激の平均値は、それぞれ92.4対37.8であった)。偽免疫した動物または純粋な動物から回収したサンプルは、やはり抗原特異的増殖応答を全く示さなかった。
【０１９２】
【表２】
2001518489.tif 000002
【０１９３】
【表３】
2001518489.tif 000003
【０１９４】
10.2.3. 体液性免疫応答に対する影響 
全長rHMWPでの免疫化が体液性免疫応答を生じることを示すために、チャレンジ直前の５週目(すなわち、３回目の免疫化の約２週間後)に回収した血清に対するELISAによってIgG力価を測定した。表４に示すように、３回の約10〜12μgのrHMWP投与でのC3Hマウスの免疫化により、全ての動物において検出可能なレベルの抗rHMWP IgGが生成された。これらの動物から、同時点で膣分泌物も回収し、抗-rHMWP粘膜IgAの存在について検査した。３匹の動物で抗原特異的膣IgAが検出された(表４)。
【０１９５】
【表４】
2001518489.tif 000004
【０１９６】
11．実施例15：PJJ701の構築 
pAH306(第8.4節に記載)のHMWP Ｎ-末端の上流にあるEcoRI部位を選択的に除去することによってC.trachomatis L2 HMWP遺伝子全体を含むプラスミドを構築した。これは、pAH306をXhoIで完全に消化し、プラスミドを再度ライゲートしてpAH306-Xho△-1を作製することによって達成した。残りのHMWP Ｃ-末端を含むpAH316由来の約2.5KbpのEcoRI断片(第8.5節に記載)を、pAH316の完全なEcoRI消化物を充填された分離用アガロースゲルから単離した。適切な約2.5Kbp断片を含むアガロースゲル薄片を切り出し、NaI緩衝液で溶解し、ヒドロキシアパタイトスピンカラムクロマトグラフィー(QiaGen)で残ったアガロースから精製した。次いで、精製したＣ-末端HMWP EcoRI断片を、HMWP Ｎ-末端コード配列の３'末端に位置する、pAH306-Xho△-1の単一のEcoRI部位に、T4 DNAリガーゼおよび標準的な分子生物学的プロトコールを使用してライゲートした。大腸菌Top10細胞を、pAH306-Xho△-1(EcoRIで消化し、ホスファターゼで処理したベクター)のアリコートおよび2.5KbpのEcoRIＣ-末端断片ライゲーション反応で形質転換し、そして100μg/mlアンピシリンを含有する2X-YT寒天上で組換え体を選択した。アンピシリン耐性形質転換体をランダムに取った。プラスミドDNAを、QiaGen Mini-PrepプラスミドDNA単離システムを用いて個体ApR形質転換体から単離し、従来のアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によってpAH306-Xho△-1よりも大きさが大きいプラスミドの存在についてスクリーニングした。全長HMWPの発現が可能な正しい配向で2.5Kbp HMWP断片を担持するpAH306-Xho△-1の誘導体を、EcoRIおよび/またはXhoIを用いた制限分析で同定した。プラスミドpAH374は、この実験で単離された誘導体の１つである。
【０１９７】
PCRに基づく部位特異的突然変異法(Quik-Change Site-Directed Mutagenesis System, Stratagene)を用いて、所望のDNA変化をもたらした(すなわち、pAH374のHMWPコード配列内のNdeI部位を除去する)。変異用PCRプライマー(41塩基の長さで、NdeI部位を含む配列と相補的で、140-Nde-FXおよび140-NdeRCXと命名した)を設計し、対応タンパク質のコード配列を変えることなくNdeI認識部位を無くした。pAH374中のNdeI部位を除去するために用いた２つのPCR変異用プライマーの配列を以下に示す。
140-Nde-FX(配列番号38)5'-GGG TTT GGG AAT CAG CAC ATG AAA ACC TCA TAT ACA TTT GC-3'140-Nde-RCX(配列番号39)5'-GCA AAT GTA TAT GAG GTT TTC ATG TGC TGA TTC CCA AAC CC-3'
【０１９８】
PfuDNAポリメラーゼ（Stratagene）突然変異誘発および非改変pAH374親プラスミドを切断するためのDpnI消化の後に、突然変異プラスミドDNAを大腸菌XL1-Blue中に形質転換した。プラスミドを有する形質転換体を、100μg/mlアンピシリンを含む2X-YT寒天上で選択した。抗生物質耐性形質転換体を無作為に取り出し、pAH374と同じサイズのプラスミドについてスクリーニングした。形質転換体から単離したプラスミドの同定を、EcoRIを用いた制限酵素消化により行った。これらのプラスミド中のNdeI部位の不在を、NdeIを用いた消化により確認した。HMWP NdeI部位の欠失を実証するため、および突然変異誘発過程においてこの領域中に不本意なDNA配列変化が起きていないことを確かめるために、突然変異誘発させたプラスミドをさらに、NdeI部位の上流に位置する配列特異的配列決定プライマーを用いてDNA配列分析にかけた。プラスミドpAH374-NdeΔ-1は、この実験から単離した１つのプラスミドであった。
【０１９９】
内部NdeI部位を含まないC.trachomatis L2 HMWPをコードするDNA断片であるプラスミドpAH374-NdeΔ-1を、プラスミドpAH374-NdeΔ-1（約50ng）ならびにプライマー306-Nde-Met1および312Ｈ6Ｘba1を用いてプログラミングされた反応によりＰＣＲ増幅した。pMG81へのダイレクトクローニングのために中央にNdeＩ部位を含むように、プライマー306NdeMet1を設計した。306NdeMet1中のNdeI部位は、HMWPシグナル配列のためのATG開始コドンに重複し、5'側で20塩基G/Cクランプに、および3'側でHMWPシグナル配列の最初の15塩基に相補的な配列に、隣接していた。HMWPのＣ末端に相補的な配列とそれに続く6-ヒスチジン親和性精製ドメインを特定する(CAT)6モチーフを含むように、プライマー312H6Xba1を設計した。このプライマーも、２つのUAA終結コドン、XbaI認識配列、および該プライマーの3'末端に20塩基G/Cクランプを含んでいた。306NdeMet1および312H6Xba1 PCRプライマーを以下に記載する。
【０２００】
306NdeMet1（配列番号40）
5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG ACA TAT GGA AAC GTC TTT CCA TAA GTT CTT TCT TTC A-3'
312H6Xba1（配列番号41）
5'- AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGT CTA GAT TAT TAA TGA TGA TGA TGA TGA TGG AAC CGG ACT CTA CTT CCT GCA CTC AAA CC−3' 
【０２０１】
第8.4節で記載したPCR増幅条件を用いて、NdeI-XbaI HMWP遺伝子カセットを生成した。増幅後、ヒドロキシアパタイトスピンカラム（QiaGen）を用いてPCR産物を精製し、約10倍過剰のNdeIおよびXbaIを用いて37℃にて一晩消化し、必要な「突出部（overhang）」を該断片の両端に生成した。スピンカラムを用いて該消化断片を再び精製し、その約250ngを、予めNdeIおよびXbaIで完全消化してからCIPで処理してベクターの再連結を防止しておいた約50ngのpMG81プラスミドDNAに連結した。連結反応物のアリコートを用いて、LederbergおよびCohenの方法によりコンピテントとした大腸菌AR58株を形質転換した。形質転換体を、40μg/ml硫酸カナマイシンを含む2X-YT寒天上で選択した。pMG81上の温度誘導性プロモーターにより、該形質転換細胞は30℃にて増殖した。カナマイシン耐性形質転換体を無作為に取り出し、pMG81よりも約3.0Kbp大きいプラスミドの存在についてスクリーニングした。インサートを含むpMG81の誘導体は、NdeI、XbaI、EcoRIおよびNcoIを用いた制限酵素分析により確認した。プラスミドpJJ701は、この実験から単離した１つのプラスミドであった。
【０２０２】
12. 実施例16： AR58から得た全長rHMWPの産生（PJJ701） 
プラスミドpJJ701を含む大腸菌AR58株の冷凍ストック１mlを用いて、40μg/mlカナマイシンを含む約100mlの2X-YTブロスに接種し、30℃にて一晩増殖させて、発酵槽種培養物を調製した。つぎに一晩種培養物（約20ml）を用いて、40μg/mlのカナマイシンを含む約2.0lの2X-YTブロスを載せたNew Brunswick Bioflow 3000発酵槽に接種した。このAR58(pJJ701)培養物を勢い良く曝気しながら、O.D.625値が0.5〜0.6になるまで30℃にて培養した。発酵槽の培養物の温度を約39℃〜42℃に上げて、rHMWPの発現を誘導した。この高い温度でのインキュベーションを約4〜5時間続けた。
【０２０３】
誘導時間の最後に、該大腸菌培養物（古典的な組換えタンパク質封入体を示す細胞を含む）を、Heraeus Contifuge 28RS遠心分離器を用いて連続フロー遠心分離により収集した。遠心分離のあと、細胞の塊を遠心分離ボールから掻き出し、処理するまで-70℃で保存した。
【０２０４】
AR58（pJJ701）冷凍細胞ペースト（約15gm）を、氷冷した10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.3）（約40ml）中でボルテックスしすり潰すことにより、再懸濁した。懸濁したら、リゾチーム（鶏卵白、Sigma）およびDNアーゼI（ウシ膵臓、Sigma）を加えてそれぞれ最終濃度1.0mg/mlおよび0.01mg/mlとし、該混合物を氷上で30〜45分間インキュベートした。予め冷却しておいた（約4℃）SLM Aminco French Pressure Cell (約14 Kpsi, 1"径穴)に２回連続通して細胞を破壊した。次に、該細胞溶解物を、Sorvall SS34ローターの中で約500Xg(4℃)にて5分間遠心分離して、破壊されていない細胞を除去した。rHMWPを含む不溶性物質を、Sorvall SS34ローターで約20,000Xg(4℃)にて45分間遠心分離して単離（ペレットに）した。この遠心分離物から上清を捨て、不溶性画分をペレット状で-20℃にて保存した。
【０２０５】
混入タンパク質を選択的に抽出し、またエンドトキシンを除去するために、該rHMWP含有不溶性ペレットを氷上で解凍し、2.0％Triton X-100を含む10mlのPBS緩衝液で２回洗浄した。洗浄は室温にて行い、ゲル状のrHMWP含有ペレットを、従来のガラス組織粉砕器でのボルテックスおよびホモジナイズにより懸濁した。該rHMWPを含む不溶性物質を、Sorvall SS34ローターで約10,000Xgで20分間（室温）の遠心分離により洗浄したあとに回収した。つぎに、不溶性物質を、2.0M NaClを含む4.0M尿素溶液（10ml）で２回（ふたたびボルテックスおよびホモジナイズにより）洗浄した。洗浄したrHMWP物質を上記のように遠心分離により回収した。1.0% Zwittergent 3-14(Sigma)を含むPBS溶液（10ml）で、該不溶性rHMWP画分を更に2回洗浄した。
【０２０６】
最後の洗浄を行った溶液を遠心分離して回収したrHMWPペレットを、次に4M尿素を含む標準Laemelli SDS-PAGEサンプル緩衝液中に室温にて2時間かけて可溶化した。可溶化したrHMWPを、標準的な約14cm×約20cm×約3mmの10％ポリアクリルアミド（36：1、アクリルアミド：ビス-アクリルアミド）Tris/グリシン/SDS分取ゲルによる電気泳動により、約110Kdalの１つのタンパク質バンドにサイズ分画された。5-ウェルの約500μl/ウェル分取コーム（comb）を用いて作成した4％ポリアクリルアミド・スタッキングゲルを、分離ゲルの上でポリマー化した。従来のTris/グリシン/SDS泳動緩衝液（BioRad）を用いて、BioRad タンパク質ユニット上で約22℃（約80〜85V、定電圧）にて約12時間、電気泳動を行った。予め染色した分子量標準物（See Blue, Novex）を並行なレーンに載せ、タンパク質種の分離度および分離効率を測定するために使用した。電気泳動のあと、ゲル・サンドイッチを解体して垂直スライスを分子量マーカーの隣のrHMWPサンプルレーンから取り出し、クーマシーブルーR250で染色してrHMWPバンドを可視化した。次にこの染色した部分を、残った未染色分取ゲルに再びのせ、該rHMWPを含むアクリルアミドのストリップを同定し、切り出した。
【０２０７】
Schleicher and Schuell EluTrap電気溶出装置を用いてrHMWPを該ゲル・スライスから溶出した。電気溶出は、1/4強度SDS泳動緩衝液（Novex）を溶出緩衝液として使用した以外は、製造社の推奨事項に従って行った。溶出は、約40mAで約12〜14時間、室温にて行った。溶出時間の最後に、細胞の極性を約２〜３分間逆にして、BT1膜に吸着されたタンパク質を除去した。該rHMWP含有溶液を収集チャンバーから取り出し、ポリプロピレンの円錐形チューブ中で４℃にて保存した。
【０２０８】
SDS沈殿システム（SDS-OUT沈殿キット、Pierce Chemical）を用いて、余分なSDS界面活性剤を除去した。ゲル溶出したタンパク質溶液からの過剰SDS界面活性剤の除去は、この製造社のプロトコールに従って行った。界面活性剤抽出rHMWPを、エンドトキシンを含まない滅菌した10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）
で約15倍に希釈し、さらにYM30限外濾過膜を用いてAmicon攪拌濃縮細胞での限外濾過により、約1.0mg/mlに濃縮した。
【０２０９】
残留したエンドトキシンを、ポリミキシンB Affi-Prepポリミキシン・マトリックス(BioRad)処理により、濃縮したrHMWP溶液から除去した。製造社の推奨事項に従って、４℃にて一晩、バッチ・モードでAffi-Prep処理を行った。
該濃縮したポリミキシンB-処理rHMWPのタンパク質濃度を、Micro BCA法（Pierce Chem.）を用い、BSAを標準物として測定した。
【０２１０】
精製したrHMWP(約0.9〜1.2mg/mlタンパク質濃度)の純度、アイデンティティー、および残留エンドトキシン負荷量を、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、および比色エンドトキシンアッセイ（BioWhittaker）によりそれぞれ評価した。このゲル精製したrHMWP物質は、ゲル分析により推定分子サイズ（約110Kdal）の単一のバンドとして95％を超える純度を示し、ウェスタンブロットにおいてrHMWP特異的K196抗体と活発に反応した。残留エンドトキシンを計算すると、＜0.05EU/μgであった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2001518489000001.app