(57)【要約】操作された三次元生物学的癌モデル、該操作された三次元生物学的癌モデルを生成する方法、および該操作された三次元生物学的癌モデルを利用して個体における癌に対する治療剤を特定する方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中胚葉に由来する結合組織細胞からなる操作された三次元組織構築物であって、該組織構築物の外面に線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からなる被膜を呈する、操作された三次元組織構築物。
【請求項２】
灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである、請求項1に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項３】
前記結合組織細胞が間質細胞である、請求項1に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項４】
前記間質細胞が、乳房間質細胞、肺間質細胞、肝臓間質細胞、腎臓間質細胞、前立腺間質細胞、腸間質細胞、膵臓間質細胞、または皮膚間質細胞である、請求項3に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項５】
線維芽細胞または線維芽細胞様細胞と、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、筋芽細胞、周皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および星状細胞からなる群より選択される少なくとも1つの他の間質細胞タイプとを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項６】
前記間質細胞が、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト脂肪細胞、前脂肪細胞、またはヒト脂肪細胞とヒト前脂肪細胞の混合物である、請求項3〜5のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項７】
各辺が1〜3mmである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項８】
各辺が0.25〜1mmである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項９】
線維芽細胞からなる被膜が、前記構築物の外形を維持しながら、前記構築物の貫通と、前記構築物内への細胞材料の堆積とを可能にする固さを提供する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項１０】
線維芽細胞からなる被膜が、前記構築物の外形を維持しながら、前記構築物の切開と、前記構築物内への細胞材料の堆積とを可能にする固さを提供する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項１１】
線維芽細胞からなる被膜が、前記構築物の外形を維持しながら、針による前記構築物の貫通と、前記構築物内への細胞材料の堆積とを可能にする固さを提供する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項１２】
少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項１３】
前記免疫細胞がミエロイド系列細胞である、請求項12に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項１４】
前記ミエロイド系列細胞が、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項１５】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項12に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項１６】
前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項15に記載の操作された三次元組織構築物。
【請求項１７】
以下の工程を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の操作された三次元組織構築物を作製する方法:
(a)中胚葉に由来する結合組織細胞を含むバイオインクを調製する工程;
(b)前記バイオインクを生体適合面に堆積させて細胞のアレイを形成する工程;
(c)堆積した細胞のアレイを非静的条件下で細胞培養培地中で成熟させ、それによって、外面に線維芽細胞を有する操作された三次元組織構築物を生成する工程。
【請求項１８】
前記バイオインクがバイオプリンティングによって堆積される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオインクが、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および0％〜20％の脂肪細胞、前脂肪細胞、またはそれらの混合物を含む、請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
堆積した細胞のアレイが細胞培養培地中で4〜10日間成熟される、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
非静的条件が、堆積した細胞のアレイに剪断応力を加える、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
非静的条件が、堆積した細胞のアレイを回転バイオリアクターの中で成熟させることによって作られる、請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオインクが少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫細胞がミエロイド系列細胞である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記ミエロイド系列細胞が、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
以下を含む、操作された三次元生物学的癌モデル：
(a)中胚葉に由来する結合組織細胞を含む、操作された三次元組織構築物であって、該組織構築物の外面に線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からなる被膜を呈する、操作された三次元組織構築物、および
(b)(a)の操作された三次元組織構築物の中にある、分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞。
【請求項２９】
(a)操作された三次元組織構築物が、中胚葉に由来する結合組織細胞からなり、該組織構築物の外面に線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からなる被膜を呈する、請求項28に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３０】
以下を含む、操作された三次元生物学的癌モデル：
(a)中胚葉に由来する結合組織細胞を含む、操作された三次元組織構築物であって、任意で、該組織構築物の外面に線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からなる被膜を呈する、操作された三次元組織構築物、および
(b)(a)の操作された三次元組織構築物の中にある、分離されていない、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、または精巣の初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞。
【請求項３１】
前記操作された三次元組織構築物が、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである、請求項28〜30のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３２】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、乳房、肺、肝臓、腎臓、前立腺、腸、膵臓、または皮膚の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項28に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３３】
前記結合組織細胞が間質細胞である、請求項28〜32のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３４】
前記間質細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞と前脂肪細胞の混合物、筋芽細胞、周皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および星状細胞である、請求項33に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３５】
前記間質細胞が、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト脂肪細胞、ヒト前脂肪細胞、またはヒト脂肪細胞とヒト前脂肪細胞の混合物である、請求項33に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３６】
各辺が1〜3mmである、請求項28〜35のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３７】
各辺が0.25〜1mmである、請求項28〜35のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３８】
複数の癌モデルがマルチウェルプレートのウェルの中にある、請求項28〜37のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項３９】
少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む、請求項28〜38のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４０】
前記免疫細胞がミエロイド系列細胞である、請求項39に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４１】
前記ミエロイド系列細胞が、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項40に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４２】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項40に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４３】
前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項42に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４４】
中胚葉に由来する結合組織を含む前記操作された三次元組織構築物の内部に、複数の(i)分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、または(ii)複数の分離されていない、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、もしくは精巣の初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞を含む、請求項28〜43のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４５】
複数の(i)または(ii)が、(a)の操作された三次元組織構築物の内部にある別々の区画に存在する、請求項44に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４６】
複数の(i)分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、または(ii)複数の分離されていない、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、もしくは精巣の初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞がそれぞれ、1つまたは複数の癌タイプのサブタイプである、請求項44または45に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４７】
固体支持体上に配置されている、請求項28〜46のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４８】
固体支持体上に配置された生体適合膜上に配置されている、請求項47に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項４９】
固体支持体がマルチウェルプレートである、請求項47または48に記載の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項５０】
請求項28〜46のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデルが非ヒト動物に移植されている、癌の非ヒト動物モデル。
【請求項５１】
前記非ヒト動物が免疫不全げっ歯動物である、請求項50に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項５２】
アレイの形態である、請求項28〜46のいずれか一項に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項５３】
前記アレイが固体支持体上に配置されている、請求項52に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項５４】
前記アレイが、固体支持体上に配置された生体適合膜上に配置されている、請求項53に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項５５】
固体支持体がマルチウェルプレートである、請求項53または54に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項５６】
各癌モデルが、1つまたは複数の癌タイプのサブタイプである、請求項52〜55のいずれか一項に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項５７】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、乳癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項５８】
前記アレイが、乳癌サブタイプであるルミナール(luminal)A、ルミナールB、HER2高発現(HER2-enriched)(HER2E)、基底様(basal-like)、および正常乳腺様(normal breast-like)からなる群より選択される少なくとも2つの乳癌モデルを含む、請求項57に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項５９】
前記アレイが、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、およびER-/PR-/HER2-からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの乳癌モデルを含む、請求項57に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６０】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、腸癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６１】
前記アレイが、結腸直腸サブタイプであるCMS1、CMS2、CMS3、およびCMS4からなる群より選択される少なくとも2つの結腸直腸癌モデルを含む、請求項60に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６２】
前記アレイが、MLH1、MLH2、MSH3、MSH6、PMS2、POLE、およびPOLD1からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの結腸直腸モデルを含む、請求項60に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６３】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、肺癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である。請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６４】
前記アレイが、肺癌サブタイプである扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、小細胞肺癌、および肺カルチノイド腫瘍からなる群より選択される少なくとも2つの肺癌モデルを含む、請求項63に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６５】
前記アレイが、iNTR、TUBB3、RRM1、ECC1、BRCA1、p53、BCL-2、ALK、MRP2、MSH2、TS、ムチン、BAG-1、pERK1/2、pAkt-1、p27、PARP-1、ATM、およびTopIIAからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの肺癌モデルを含む、請求項63に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６６】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、胃癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６７】
前記アレイが、胃癌サブタイプである間葉系様(mesenchymal-like)タイプ、マイクロサテライト不安定性(microsatellite-unstable)タイプ、腫瘍タンパク質53(TP53)活性タイプ、およびTP53不活性タイプからなる群より選択される少なくとも2つの胃癌モデルを含む、請求項66に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６８】
前記アレイが、マイクロRNAであるmiR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34、miR-196a、miR-378、miR-221、miR376c、miR-423-5p、let-7a、miR-17-5p、miR-21、miR-106a/b、miR-199a-3p、miR-218、miR-223、miR-370、miR-451、miR-486、miR-21、miR-106a、miR-129、およびmiR-421;TP53;PTKであるTIE-1およびMKK4;FYN;PLK1;GISP/RegIV;EGFR;ERBB2;VEGF;TGF;c-MET;IL-6;IL-11;サイクリンE;Bcl-2;Fas;サバイビング(surviving);Runx3;E-カドヘリン;WNT5A;IL-1;IL-10;癌胎児抗原(CEA);α-フェトプロテイン(AFP);CA19-9;CA72-4;遊離ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット(B-HCG)、ならびにペプシノーゲンI/IIからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの胃癌モデルを含む、請求項66に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項６９】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、前立腺癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７０】
前記アレイが、遺伝子融合ERG、ETV1、ETV4、およびFLI1を発現する前立腺癌サブタイプからなる群より選択されるか、または変異SPOP、FOXA1、およびIDH1を発現する前立腺癌サブタイプからなる群より選択される少なくとも2つの前立腺癌モデルを含む、請求項69に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７１】
前記アレイが、NKX3.1、MYC、TMPRSS2-ERG転座、PTEN、Akt/mTOR、Erk(p42/44)、Her2/NeuまたはSRCチロシンキナーゼ、WNT、APC、k-RAS、β-カテニン、FGFR1、FGF10、EZH2、PCA3、およびARからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの前立腺癌モデルを含む、請求項69に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７２】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、腎臓癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７３】
前記アレイが、腎臓癌サブタイプである腎細胞癌および移行上皮癌からなる群より選択される少なくとも2つの腎臓癌モデルを含む、請求項72に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７４】
前記腎細胞癌が、明細胞(通常の)(RCC)、乳頭状RCC、嫌色素性RCC、腎オンコサイトーマRCC、未分類RCC、集合管癌、髄質RCC、およびカルコマトイド(carcomatoid)DCCからなる群より選択される、請求項72に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７５】
前記アレイが、神経細胞特異的エノラーゼ(NSE)、TRAF-1、Hsp27、IL-1、IL-6、TFF-α、血清アミロイドA(SAA)、C反応性タンパク質(CRP)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、サイトケラチン(CK)、血清M65(サイトケラチン18のインタクト型)、低酸素誘導性転写因子(HIF-1αおよびHIF-1β)、VEGF、フォンヒッペル・リンダウ(VHL)、プロリルヒドロキシラーゼ-3(PHD3)、ピルビン酸キナーゼアイソエンザイムタイプM2(TuM2-PK)、チミジンキナーゼ1(TK1)、20Sプロテアソーム、フェチュインA、オステオポンチン(OPN)、オステオプロテジェリン、NMP-22、NGAL、KIM-1、MMP、ならびにPLIN2からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの腎臓癌モデルを含む、請求項72に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７６】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、皮膚癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７７】
前記アレイが、皮膚癌サブタイプである日光角化症、基底細胞癌、黒色腫、カルポジ(Karposi)肉腫、メルケル細胞癌、および扁平上皮癌からなる群より選択される少なくとも2つの皮膚癌モデルを含む、請求項76に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７８】
前記黒色腫が、変異BRAF、変異RAS、変異NF1、およびトリプル野生型からなる群より選択される、請求項77に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項７９】
前記アレイが、変異BRAF、変異RAS、変異NF1、トリプルWT(野生型)、BRAF、NRAS、CDKN2A/B、TP53、PTEN、RAC1、MAP2K1、PPP6C、ARID2、F1、IDH1、RB1、DDX3X、RAC1、IDH1、MRPS31、RPS27、TERT、ホスホMAP2K1/MAP2K2(MEK1/2)、MAPK1/MAPK3(ERK1/2)、CDK4、およびCCND1からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの皮膚癌モデルを含む、請求項76に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８０】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、卵巣癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８１】
前記アレイが、卵巣サブタイプである漿液性、類内膜、明細胞、および粘液性からなる群より選択される少なくとも2つの卵巣癌モデルを含む、請求項80に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８２】
前記アレイが、B-RAF、K-RAS、TP53、BRCA1/2、CA125、CA19.9、CA15.3、TAG.72、MSH2、MLH1、MLH6、PMS1、PMS2、ESR2、BRIP1、MSH6、RAD51C、RAD51D、CDH1、CHEK2、PALB2、RAD50、OVX1、sFas、CYFRA21.1、VEGF、ヒトカリクレイン10(hK10)、α-フェトプロテイン(αFP)、M-CSF、ならびにLDH、インヒビンα、βA、およびβBサブユニットからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの卵巣癌モデルを含む、請求項80に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８３】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、子宮頸癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８４】
前記アレイが、子宮頸癌サブタイプである扁平上皮癌および腺癌からなる群より選択される少なくとも2つの子宮頸癌モデルを含む、請求項83に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８５】
前記アレイが、p16ink4a、MCM3および5、CDC6、ジェミニン、サイクリンA〜D、TOP02A、CDCA1、BIRC5、UBE2C、CCNB1、CCNB2、PLOD2、NUP210、MELK、CDC20、IL8、INDO、ISG15、ISG20、AGRN、DTXL、MMP1、MMP3、CCL18、STAT1、リボソームタンパク質S12、ミトコンドリアサブユニットNADHデヒドロゲナーゼ4、16SリボソームRNA(rRNA)、ならびにキャッピングタンパク質筋Z線α1からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの子宮頸癌モデルを含む、請求項83に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８６】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、子宮癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８７】
前記アレイが、子宮癌サブタイプである類内膜、腺癌、漿液性腺癌、腺扁平上皮癌、および癌腫肉腫(carcinomasarcoma)からなる群より選択される少なくとも2つの子宮癌モデルを含む、請求項86に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８８】
前記アレイが、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、PTEN、BRCA1、BRCA2、TP53、MUTYH、CDKN2A、PGR、およびCHEK2からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの子宮癌モデルを含む、請求項86に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項８９】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、肝臓癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９０】
前記アレイが、肝臓癌サブタイプである肝細胞癌(HCC)、胆管癌、血管肉腫、および肝芽腫からなる群より選択される少なくとも2つの肝臓癌モデルを含む、請求項89に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９１】
前記アレイが、AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3、HSP70、HSP27、グリピカン-3(GPC3)、扁平上皮癌抗原(SCCA)、ゴルジタンパク質73(GP73)(Golph2およびGOLM1としても知られる)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、亜鉛-α2-糖タンパク質(ZAG)、デス-γ-カルボキシプロトロンビン(DCP)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、α-l-フコシダーゼ(AFU)、トランスフォーミング成長因子-β1(TGF-β1)、VEGF、マイクロRNA、例えば、miR-500、miR-122、miR-29、およびmiR-21; Δ様1ホモログ(DLK1)、ビリン1(Vil1)、TP53、CD34、RGS5、THY1、ADAMTS1、MMP2、MMP14、ケラチン17、ケラチン19、ならびにムチン1からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの肝臓癌モデルを含む、請求項89に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９２】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、膀胱癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９３】
前記アレイが、膀胱癌サブタイプである尿路上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、および小細胞型未分化癌からなる群より選択される少なくとも2つの膀胱癌モデルを含む、請求項92に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９４】
前記アレイが、HRAS、NRAS、KRAS2、FGFR3、ERBB2、CCND1、MDM2、E2F3、RASSF1A、FHIT、CDKN2A、PTCH、DBC1、TSC1、PTEN、RB1、TP53、SULF1、リソソームシステインプロテイナーゼカテプシンB、K、およびL; RGS1、RGS2、THBS1、THBS2、VEGFC、NRP2、CTSE、MMP2、CCNA2、CDC2、CDC6、TOP2A、SKALP PRKAG1、GAMT、ACOX1、ASAH1、SCD、AF1Q、AREG、DUSP6、LYAR、MAL、およびRARRESからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの膀胱癌モデルを含む、請求項92に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９５】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、食道癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９６】
前記アレイが、食道癌サブタイプである扁平上皮癌および腺癌からなる群より選択される少なくとも2つの食道癌モデルを含む、請求項95に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９７】
前記アレイが、SMYD3、RUNX1、CTNNA3、RBFOX1、CDKN2A/2B、CDK14、ERBB2、EGFR、RB1、GATA4/6、CCND1、MDM2、TP53、ARID1A、およびSMARCA4からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの食道癌モデルを含む、請求項95に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９８】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、膵臓癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項９９】
前記アレイが、膵臓癌サブタイプである外分泌腫瘍および膵神経内分泌腫瘍(PNET)からなる群より選択される少なくとも2つの膵臓癌モデルを含む、請求項98に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１００】
前記アレイが、膵臓癌サブタイプである扁平上皮、膵臓前駆細胞、免疫原性、および内分泌・外分泌異常分化(ADEX)からなる群より選択される少なくとも2つの膵臓癌モデルを含む、請求項98に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０１】
前記アレイが、TP53、KDM6A、MLL2、MLL3、PDX1、MNX1、GATA6、HNF1B、転写因子PDX1、MNX1、HNF4G、HNF4A、HNF1B、HNF1A、FOXA2、FOXA3、HES1、NR5A2、MIST1(BHLHA15Aとしても知られる)、およびRBPJL; INS、NEUROD1、NKX2-2、MAFA、AMY2B、PRSS1、PRSS3、CEL、およびINSからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの膵臓癌モデルを含む、請求項98に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０２】
前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、精巣癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である、請求項56に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０３】
前記アレイが、精巣癌サブタイプである生殖細胞腫瘍および間質腫瘍からなる群より選択される少なくとも2つの精巣癌モデルを含む、請求項102に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０４】
前記アレイが、AFP、HCG、LDH、HMGA1、HMGA2、OCT3/4(オクタマー結合タンパク質ファミリーの転写因子(POUホメオドメインタンパク質としても知られる))、SOX2、SOX17、CDK10、ならびに、KITLG、TERT、SPRY4、BAK1、DMRT1、ATF7IP、HPGDS、SMARCAD1、SEPT4、TEX14、RAD51C、PPM1E、TRIM37、MAD1L1、TEX14、SKA2、SMARCAD1、RFWD3、およびRAD51Cの内部に位置する遺伝子座からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの精巣癌モデルを含む、請求項102に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０５】
癌モデルと接触している、および/または癌モデルの内部にある培養培地中に少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む、請求項52〜104のいずれか一項に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０６】
前記免疫細胞がミエロイド系列細胞である、請求項105に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０７】
前記ミエロイド細胞が、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項106に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０８】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項105に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１０９】
前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項108に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１１０】
非静的培養条件下で培養培地中にある、請求項52〜109のいずれか一項に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１１１】
非静的培養条件が癌モデルを横切るラテラルフローである、請求項110に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１１２】
静的培養条件下で培養培地中にある、請求項52〜109のいずれか一項に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１１３】
ハイスループットアッセイにおいて使用するための、請求項52〜112のいずれか一項に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデル。
【請求項１１４】
以下の工程を含む、請求項28〜49のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデルを作製する方法:
(a)操作された三次元組織構築物に開口部を作る工程;
(b)分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞を前記開口部に挿入する工程;および
(c)操作された三次元生物学的癌モデルを細胞培養培地中で成熟させて前記開口部を埋める工程。
【請求項１１５】
以下の工程を含む、癌を処置するための治療剤を特定する方法:
(a)候補治療剤を、請求項28〜49のいずれか一項に記載の操作された三次元生物学的癌モデルまたは請求項52〜112のいずれか一項に記載の複数の操作された三次元生物学的癌モデルと接触させる工程;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、および/または中胚葉に由来する結合組織細胞に対する効果を測定する工程;ならびに
(c)測定された効果に基づいて、癌を処置するための治療剤を選択する工程。
【請求項１１６】
個体において癌を処置するための治療剤を特定するための方法であって、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、該個体に由来する、請求項115に記載の方法。
【請求項１１７】
前記癌が、乳癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、腸癌、膵臓癌、または皮膚癌である、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１１８】
前記癌が、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、食道癌、または精巣癌である、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１１９】
前記間質細胞が乳房間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、乳癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２０】
前記間質細胞が肺間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、肺癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２１】
前記間質細胞が肝臓間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、肝臓癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２２】
前記間質細胞が腎臓間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、腎臓癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２３】
前記間質細胞が前立腺間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、前立腺癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２４】
前記間質細胞が腸間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、腸癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２５】
前記間質細胞が膵臓細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、膵臓癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２６】
前記間質細胞が皮膚細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、皮膚癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２７】
前記間質細胞が胃間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、胃癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２８】
前記間質細胞が卵巣間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、卵巣癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１２９】
前記間質細胞が子宮頸部間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、子宮頸癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１３０】
前記間質細胞が子宮間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、子宮癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１３１】
前記間質細胞が膀胱間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、膀胱癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１３２】
前記間質細胞が食道間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、食道癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１３３】
前記間質細胞が精巣間質細胞であり、かつ前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞が、精巣癌を有する個体に由来する、請求項114または115に記載の方法。
【請求項１３４】
複数の癌モデルの各癌モデルが、特定の癌タイプのサブタイプである、請求項114または115のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記癌モデルが非静的培養条件下で培養培地中にある、請求項114〜134のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
非静的条件が、癌モデルを横切るラテラルフローである、請求項135に記載の方法。
【請求項１３７】
前記癌モデルが静的培養条件下で培養培地中にある、請求項114〜134のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
ハイスループットアッセイで行われた場合の、請求項114〜137のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞に対する効果が、
(a)前記初代腫瘍もしくは初代腫瘍断片のサイズの何らかの縮小を検出すること;
(b)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の成長の何らかの低下を検出すること;
(c)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるアポトーシスを検出すること;
(d)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の損傷の程度を検出すること;
(e)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の生存率の低下を検出すること;
(f)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の表面における細胞マーカーの出現、レベル、もしくは消失を検出すること;
(g)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の増殖もしくは成長の速度の変化を検出すること;
(h)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の染色の変化を検出すること;
(i)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるRNAもしくはDNAおよび/またはその発現の変化を検出すること;
(j)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるタンパク質発現の変化を検出すること;
(k)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるサイトカインの発現および/もしくは分泌および/もしくはレベルの変化を検出すること;あるいは
(l)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるT細胞動員、ミエロイド系列細胞動員、浸潤、および/もしくは活性化を検出すること
の1つまたは複数によって測定される、請求項114〜138のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
以下の工程を含む、癌を処置するための候補治療剤の方法:
(a)請求項50〜51のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデルを候補治療剤と接触させる工程;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、および/または中胚葉に由来する結合組織細胞に対する効果を測定する工程;ならびに
(c)測定された効果に基づいて、癌を処置するための治療剤を選択する工程。
【請求項１４１】
前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞に対する効果が、
(a)前記初代腫瘍もしくは初代腫瘍断片のサイズの何らかの縮小を検出すること;
(b)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の成長の何らかの低下を検出すること;
(c)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるアポトーシスを検出すること;
(d)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の損傷の程度を検出すること;
(e)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の生存率の低下を検出すること;
(f)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の表面における細胞マーカーの出現、レベル、もしくは消失を検出すること;
(g)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の増殖もしくは成長の速度の変化を検出すること;
(h)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の染色の変化を検出すること;
(i)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるRNAもしくはDNAおよび/またはその発現の変化を検出すること;
(j)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるタンパク質発現の変化を検出すること;
(k)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるサイトカインの発現および/もしくは分泌および/もしくはレベルの変化を検出すること;あるいは
(l)前記初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるT細胞動員、ミエロイド系列細胞動員、浸潤、および/もしくは活性化を検出すること
の1つまたは複数によって測定される、請求項140に記載の方法。
【請求項１４２】
(a)間質組織および腫瘍組織を含む、操作された三次元組織構築物を含む、操作された三次元生物学的癌モデルであって、該腫瘍組織が該間質組織の中にあり、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものである、操作された三次元生物学的癌モデルと、
(b)前記操作された三次元生物学的癌モデルを含む、非ヒト動物と
を含む、癌の非ヒト動物モデルであって、但し、前記癌モデルは、前記腫瘍組織が前記間質組織と密着した後に、前記非ヒト動物に移植されている、癌の非ヒト動物モデル。
【請求項１４３】
前記非ヒト動物が、遺伝子操作されたげっ歯動物である、請求項142に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１４４】
前記非ヒト動物が免疫不全げっ歯動物である、請求項142または143に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１４５】
前記操作された三次元生物学的癌モデルが、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである、請求項142〜144のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１４６】
前記腫瘍組織が、複数の分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞を含む、請求項142〜145のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１４７】
前記間質組織が、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞と前脂肪細胞の混合物、筋芽細胞、周皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および星状細胞からなる群より選択される間質細胞を含む、請求項142〜146のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１４８】
前記間質組織が、乳房間質細胞、肺間質細胞、肝臓間質細胞、腎臓間質細胞、前立腺間質細胞、腸間質細胞、膵臓間質細胞、または皮膚間質細胞を含む、請求項142〜147のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１４９】
前記腫瘍組織が、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、および精巣の腫瘍組織からなる群より選択される腫瘍組織を含む、請求項142〜148のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５０】
前記腫瘍組織が乳房腫瘍組織であり、かつ該乳房腫瘍組織が、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、ER-/PR-/HER2-、MCF-7、SKBR3、HCC1143、およびMDA-MB-231からなる群より選択される細胞株を含む、請求項142〜148のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５１】
前記腫瘍組織が膵臓腫瘍組織であり、かつ該膵臓腫瘍組織が、膵臓細胞株に由来するマーカーを含む、請求項142〜149のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５２】
前記膵臓細胞株が、OPTR3099C、CAPAN1、CAPAN2、PANC1、MIAPACA2、CFPAC1、ASPC1、COLO357、PANC89、およびHPAFIIからなる群より選択される、請求項151に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５３】
前記腫瘍組織が周囲を間質組織に囲まれている、請求項142〜152のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５４】
前記癌モデルが、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項142〜153のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５５】
前記腫瘍組織がバイオプリントされたものである、請求項142〜154のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５６】
前記癌モデルの各辺が約1〜約3mmである、請求項142〜155のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５７】
前記癌モデルの各辺が約0.25〜約1mmである、請求項142〜155のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５８】
少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む、請求項142〜157のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１５９】
前記免疫細胞がミエロイド系列細胞である、請求項158に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１６０】
前記ミエロイド系列細胞が、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項159に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１６１】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項158に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１６２】
前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項161に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１６３】
(a)の操作された三次元生物学的癌モデルが非ヒト動物に皮下移植されたものである、請求項142〜162のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１６４】
前記間質組織が、中胚葉に由来する結合組織細胞を含む、請求項142〜163のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１６５】
前記腫瘍組織が、患者腫瘍に由来する初代癌細胞を含む、請求項142〜164のいずれか一項に記載の非ヒト動物モデル。
【請求項１６６】
以下の工程を含む、癌の非ヒト動物モデルを作製する方法:
間質組織を含む間質バイオインクをバイオプリンティングによって堆積させる工程;
腫瘍組織を間質組織の中に堆積させる工程;
堆積した間質組織および堆積した腫瘍組織を細胞培養培地中で成熟させて、間質組織を腫瘍組織と密着させて、操作された三次元生物学的癌モデルを形成する工程;ならびに
密着した操作された三次元生物学的癌モデルを非ヒト動物に移植する工程。
【請求項１６７】
以下の工程を含む、癌に対する治療剤を特定する方法:
間質組織を含む間質バイオインクをバイオプリンティングによって堆積させる工程;
複数の癌細胞を含む腫瘍組織を間質組織の中に堆積させる工程;
堆積した間質組織および堆積した腫瘍組織を細胞培養培地中で成熟させて、間質組織を腫瘍組織と密着させて、操作された三次元生物学的癌モデルを形成する工程;
密着した操作された三次元生物学的癌モデルを非ヒト動物に移植する工程;
候補治療剤を癌モデルに適用する工程;
癌細胞の生存率を測定する工程;ならびに
測定された癌細胞の生存率に基づいて治療剤を選択する工程。
【請求項１６８】
前記非ヒト動物が、遺伝子操作されたげっ歯動物である、請求項166または167に記載の方法。
【請求項１６９】
前記非ヒト動物が免疫不全げっ歯動物である。請求項166〜168のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記操作された三次元生物学的癌モデルが、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである、請求項166〜169のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記腫瘍組織が、複数の分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞を含む、請求項166〜170のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記間質組織が、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞と前脂肪細胞の混合物、筋芽細胞、周皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および星状細胞からなる群より選択される間質細胞を含む、請求項166〜171のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記間質組織が、乳房間質細胞、肺間質細胞、肝臓間質細胞、腎臓間質細胞、前立腺間質細胞、腸間質細胞、膵臓間質細胞、または皮膚間質細胞を含む、請求項166〜172のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記腫瘍組織が、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、および精巣の腫瘍組織からなる群より選択される腫瘍組織を含む、請求項166〜173のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記腫瘍組織が乳房腫瘍組織であり、かつ該乳房腫瘍組織が、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、ER-/PR-/HER2-、MCF-7、SKBR3、HCC1143、およびMDA-MB-231からなる群より選択される細胞株を含む、請求項166〜173のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記腫瘍組織が膵臓腫瘍組織であり、かつ該膵臓腫瘍組織が、膵臓細胞株に由来するマーカーを含む、請求項166〜174のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記膵臓細胞株が、OPTR3099C、CAPAN1、CAPAN2、PANC1、MIAPACA2、CFPAC1、ASPC1、COLO357、PANC89、およびHPAFIIからなる群より選択される、請求項176に記載の方法。
【請求項１７８】
前記腫瘍組織が周囲を間質組織に囲まれている、請求項166〜177のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記癌モデルが、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項166〜178のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
腫瘍組織をバイオプリンティングによって堆積させる工程をさらに含む、請求項166〜179のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記バイオプリンティングが押出しによるものである、請求項166〜180のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記癌モデルの各辺が約1〜約3mmである、請求項166〜181のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記癌モデルの各辺が約0.25〜1mmである、請求項166〜181のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
少なくとも1つのタイプの免疫細胞を堆積させる工程をさらに含む、請求項166〜183のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８５】
前記少なくとも1つのタイプの免疫細胞を堆積させる工程がバイオプリンティングによるものである、請求項184に記載の方法。
【請求項１８６】
前記バイオプリンティングが押出しによるものである、請求項185に記載の方法。
【請求項１８７】
前記免疫細胞がミエロイド系列細胞である、請求項184〜186のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記ミエロイド系列細胞が、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項187に記載の方法。
【請求項１８９】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項184〜186のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項189に記載の方法。
【請求項１９１】
前記癌モデルを非ヒト動物に移植する工程が皮下移植によるものである、請求項166〜190のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
腫瘍モデルが非ヒト動物の側腹部に移植される、請求項191に記載の方法。
【請求項１９３】
前記間質組織が、中胚葉に由来する結合組織細胞を含む、請求項166〜192のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
癌細胞が、患者腫瘍に由来する初代癌細胞である、請求項166〜193のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９５】
前記候補治療剤が、移植された癌モデルに適用される、請求項166〜194のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
移植された癌モデルを非ヒト動物から取り出す工程であって、該癌モデルが非ヒト動物から取り出された後に、前記候補治療剤が該癌モデルに適用される、工程
をさらに含む、請求項166〜195のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９７】
前記候補治療剤が免疫療法である、請求項115〜141または167〜196のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
前記免疫療法が、養子T細胞移入、Tc細胞およびNK細胞を活性化させる免疫チェックポイント阻害剤、または免疫細胞のリプログラミングおよび枯渇である、請求項197に記載の方法。
【請求項１９９】
(a)線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、および単球を含む、乳房間質組織と、  
(b)乳癌細胞、線維芽細胞、内皮細胞、および単球を含む、乳癌腫瘍組織であって、操作された三次元生物学的乳癌モデルを形成するように周囲を間質組織に囲まれている、乳癌腫瘍組織と
を含む、操作された三次元生物学的乳癌モデルであって、但し、前記間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされた、前記腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされた、または前記間質組織と前記腫瘍組織の両方がそれぞれのバイオインクからバイオプリントされたものである、操作された三次元生物学的乳癌モデル。
【請求項２００】
前記モデルが、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項199に記載の乳癌モデル。
【請求項２０１】
前記乳癌細胞が乳癌細胞株に由来する、請求項199または200に記載の乳癌モデル。
【請求項２０２】
前記乳癌細胞株が、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、およびER-/PR-/HER2-からなる群より選択される、請求項201に記載の乳癌モデル。
【請求項２０３】
前記乳癌細胞が、患者腫瘍に由来する初代癌細胞である、請求項199または200に記載の乳癌モデル。
【請求項２０４】
前記乳癌腫瘍組織が、操作された三次元生物学的乳癌モデルを形成するように周囲を乳房間質組織に完全に囲まれている、請求項199〜203のいずれか一項に記載の乳癌モデル。
【請求項２０５】
単球から分化した複数のマクロファージをさらに含む、請求項199〜204のいずれか一項に記載の乳癌モデル。
【請求項２０６】
以下の工程を含む、操作された三次元生物学的乳癌モデルを製作する方法:
(a)間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞タイプを含み、該間質細胞タイプが、押出し化合物、線維芽細胞、内皮細胞、単球、および脂肪細胞を含む、工程;
(b)腫瘍バイオインクを調製する工程であって、該腫瘍バイオインクが、押出し化合物、乳癌細胞タイプ、線維芽細胞、および単球を含む、工程;
(c)前記腫瘍バイオインクが前記間質バイオインクの中に、かつ周囲を前記間質バイオインクと接触した状態で埋め込まれるように、前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクを堆積させる工程;ならびに
(d)堆積した前記バイオインクを細胞培養培地中で成熟させて、押出し化合物を除去して、細胞を密着させて、操作された三次元生物学的乳癌モデルを形成する工程。
【請求項２０７】
前記バイオインクがバイオプリンティングによって堆積される、請求項206に記載の方法。
【請求項２０８】
前記乳癌細胞タイプが乳癌細胞株を含む、請求項206または207に記載の方法。
【請求項２０９】
前記乳癌細胞株が、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、およびER-/PR-/HER2-からなる群より選択される、請求項208に記載の方法。
【請求項２１０】
前記癌細胞タイプが、患者腫瘍に由来する初代乳癌細胞を含む、請求項206〜209のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
単球を複数のマクロファージに分化させる工程をさらに含む、請求項206〜210のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１２】
前記マクロファージを前記乳癌細胞タイプに向けて遊走させる工程をさらに含む、請求項211に記載の方法。
【請求項２１３】
前記操作された三次元生物学的乳癌モデルに、候補治療剤を適用する工程;
癌細胞の生存率を測定する工程;および
測定された癌細胞の生存率に基づいて、個体のための治療剤を選択する工程
をさらに含む、請求項206〜212のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１４】
前記候補治療剤が免疫療法である、請求項213に記載の方法。
【請求項２１５】
前記免疫療法が、養子T細胞移入、Tc細胞およびNK細胞を活性化させる免疫チェックポイント阻害剤、または免疫細胞のリプログラミングおよび枯渇である、請求項214に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本研究は、NIH/米国立癌研究所による資金提供を受けたSBIR Phase I Contract(Contract HHSN261201400024C)の一部として行われた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌細胞と、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、および免疫細胞で構成される周囲の間質細胞との間の相互作用は癌の開始、進行、および転移において重要な役割を果たしている。間質細胞は上皮由来癌細胞に対しては構造支持体の役割を果たし、細胞シグナル伝達を調節し、血管形成に影響を及ぼし、遠くにある標的組織への転移に影響を及ぼす。
【０００３】
ヒト腫瘍試料が分離されると、癌細胞は通常の三次元環境から取り出されるので根本から変化し、ヒト疾患を正確に模倣するのに必要な不均一性は消失する。研究者らは、この問題には、当初は、ヒト腫瘍の小さな断片を易感染性マウスに移植した動物モデルを用いることで対処した。腫瘍が生着した後、この動物を用いて個々の化学療法薬の効力を確かめることができた。または、この動物を用いてヒト腫瘍試料を連続して増やして、インビトロ薬物スクリーニング用またはインビボ薬物スクリーニング用の多量の患者腫瘍材料を得ることができた。
【０００４】
腫瘍異種移植マウスモデルの重大な欠点は、このモデルが、ヒトと比較して著しく小さく、代謝率がかなり大きく、同系交配され、寿命が短い動物に基づいているということである。別の重要な違いは腫瘍間質である。腫瘍間質がマウス由来であるので、その構成細胞は全てマウス細胞である。これらの間質細胞タイプには、内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞、腫瘍関連マクロファージ、および骨髄系由来サプレッサー細胞が含まれる。間質細胞は、腫瘍細胞がその上で増殖する単なるスキャフォールドではない。それどころか、間質細胞は腫瘍の形成、進行、および転移に積極的に関与し、サイトカイン/ケモカインの非常に多くのユニークな組み合わせを産生し、様々な接着分子を含む細胞外マトリックスを製造する。移植された腫瘍に動物間質細胞が存在すると、試験されている治療剤、特に、種特異性に頼るリガンド/受容体相互作用を破壊する分子標的治療剤の生物学的活性および/または効力の測定が悪影響を受ける。さらに、易感染性動物を用いると、免疫調節療法を試験する能力が妨げられる。
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、ハイスループット三次元エクスビボ系において有用な、操作された三次元生物学的癌モデル、ならびにヒトバイオプリント間質微小環境における細胞生着、リモデリング、およびヒト組織の増殖を測定するための方法を提供する。この系は、ヒト間質微小環境において、または候補療法(例えば、化学療法、免疫療法、放射線療法、および寒冷療法)の存在下で腫瘍組織、バイオプリント組織、または正常組織の生着能力を測定する。一態様において、本明細書に記載のエクスビボ系を用いると、有利なことに、標的組織の増殖および生着を測定するための28日を超える分析期間が可能になる。説明されるヒト系は、現在使用されている動物に基づく異種移植片の代替として用いられ得る。そして、前記の系および方法は、個々の標的癌治療剤を含む候補療法のさらに正確なスクリーニングを提供する。
【０００６】
一態様において、中胚葉に由来する結合組織細胞からなる操作された三次元組織構築物であって、組織構築物の外面に線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からなる被膜を呈する、操作された三次元組織構築物が提供される。一態様において、操作された三次元組織構築物は、例えば、製造時に、使用時に、または移植時に、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである。一態様において、結合組織細胞は間質細胞である。一態様において、間質細胞は、乳房間質細胞、肺間質細胞、肝臓間質細胞、腎臓間質細胞、前立腺間質細胞、腸間質細胞、膵臓間質細胞、または皮膚間質細胞である。一態様において、操作された三次元組織構築物は、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞と、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、筋芽細胞、周皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および星状細胞(stellate)からなる群より選択される少なくとも1つの他の間質細胞タイプとを含む。一態様において、間質細胞は、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト脂肪細胞、前脂肪細胞、またはヒト脂肪細胞とヒト前脂肪細胞の混合物である。
【０００７】
一態様において、操作された三次元組織構築物は各辺が1〜3mmである。別の態様において、操作された三次元組織構築物は各辺が0.25〜1mmである。
【０００８】
一態様において、線維芽細胞からなる被膜は、構築物の外形を維持しながら、構築物の貫通と、構築物内への細胞材料の堆積とを可能にする固さを提供する。一態様において、線維芽細胞からなる被膜は、構築物の外形を維持しながら、構築物の切開と、構築物内への細胞材料の堆積とを可能にする固さを提供する。一態様において、線維芽細胞からなる被膜は、構築物の外形を維持しながら、針による構築物の貫通と、構築物内への細胞材料の堆積とを可能にする固さを提供する。
【０００９】
少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む、操作された三次元組織構築物も提供される。一態様において、免疫細胞はミエロイド系列細胞である。一態様において、ミエロイド系列細胞は、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ(pre-differentiated macrophage)、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様において、免疫細胞はリンパ球である。一態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１０】
操作された三次元組織構築物を作製する方法であって、
(a)中胚葉に由来する結合組織細胞を含むバイオインクを調製する工程;
(b)バイオインクを生体適合面に堆積させて細胞のアレイを形成する工程;
(c)堆積した細胞のアレイを非静的条件下で細胞培養培地中で成熟させ、それによって、外面に線維芽細胞を有する操作された三次元組織構築物を生成する工程
を含む、方法も提供される。
【００１１】
一態様において、バイオインクはバイオプリンティングによって堆積される。一態様において、バイオインクは、55％〜75％の線維芽細胞、15％〜35％の内皮細胞、および0％〜20％の脂肪細胞、前脂肪細胞、またはそれらの混合物を含む。一態様において、堆積した細胞のアレイは細胞培養培地中で4〜10日間成熟される。一態様において、非静的条件は、堆積した細胞のアレイに剪断応力を加える。一態様において、非静的条件は、堆積した細胞のアレイを回転バイオリアクターの中で成熟させることによって作られる。
【００１２】
一態様において、バイオインクは少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む。一態様において、免疫細胞はミエロイド系列細胞である。一態様において、ミエロイド系列細胞は、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１３】
一態様において、免疫細胞はリンパ球である。一態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１４】
以下を含む、操作された三次元生物学的癌モデルも提供される：
(a)中胚葉に由来する結合組織細胞を含む操作された三次元組織構築物であって、組織構築物の外面に線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からなる被膜を呈する、操作された三次元組織構築物、および
(b)(a)の操作された三次元組織構築物の中にある、分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞。
【００１５】
一態様において、(a)操作された三次元組織構築物は、中胚葉に由来する結合組織細胞からなり、組織構築物の外面に線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からなる被膜を呈する。
【００１６】
以下を含む、操作された三次元生物学的癌モデルも提供される：
(a)中胚葉に由来する結合組織細胞を含む操作された三次元組織構築物であって、任意で、組織構築物の外面に線維芽細胞または線維芽細胞様細胞からなる被膜を呈する、操作された三次元組織構築物、および
(b)(a)の操作された三次元組織構築物の中にある、分離されていない、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、または精巣の初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞。
【００１７】
一態様において、操作された三次元組織構築物は、例えば、製造時に、使用時に、または移植時に、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである。
【００１８】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、乳房、肺、肝臓、腎臓、前立腺、腸、膵臓、または皮膚の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞である。一態様において、結合組織細胞は間質細胞である。一態様において、間質細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞と前脂肪細胞の混合物、筋芽細胞、周皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および星状細胞である。一態様において、間質細胞は、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト脂肪細胞、ヒト前脂肪細胞、またはヒト脂肪細胞とヒト前脂肪細胞の混合物である。
【００１９】
一態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは各辺が1〜3mmである。別の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは各辺が0.25〜1mmである。
【００２０】
一態様において、複数の癌モデルはマルチウェルプレートのウェルの中にある。
【００２１】
一態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む。一態様において、免疫細胞はミエロイド系列細胞である。一態様において、ミエロイド系列細胞は、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、免疫細胞はリンパ球である。一態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２２】
本発明はまた、中胚葉に由来する結合組織を含む操作された三次元組織構築物の内部に、複数の(i)分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、または(ii)複数の分離されていない、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、もしくは精巣の初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞を含む、操作された三次元生物学的癌モデルも提供する。一態様において、複数の(i)または(ii)は、(a)の操作された三次元組織構築物の内部にある別々の区画に存在する。
【００２３】
一態様において、複数の(i)分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、または(ii)複数の分離されていない、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、もしくは精巣の初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞はそれぞれ、1つまたは複数の癌タイプのサブタイプである。
【００２４】
固体支持体上に配置された、操作された三次元生物学的癌モデルも提供される。一態様において、前記モデルは、固体支持体上に配置された生体適合膜上に配置されている。一態様において、固体支持体はマルチウェルプレートである。
【００２５】
本明細書に記載の操作された三次元生物学的癌モデルが非ヒト動物に移植されている、癌の非ヒト動物モデルも提供される。一態様において、非ヒト動物は免疫不全げっ歯動物である。
【００２６】
アレイの形態である、複数の操作された三次元生物学的癌モデルも提供される。一態様において、前記アレイは固体支持体上に配置されている。一態様において、前記アレイは、固体支持体上に配置された生体適合膜上に配置されている。一態様において、固体支持体はマルチウェルプレートである。一態様において、各癌モデルは1つまたは複数の癌タイプのサブタイプである。
【００２７】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、乳癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、乳癌サブタイプであるルミナール(luminal)A、ルミナールB、HER2高発現(HER2-enriched)(HER2E)、基底様(basal-like)、および正常乳腺様(normal breast-like)からなる群より選択される少なくとも2つの乳癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、およびER-/PR-/HER2-からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの乳癌モデルを含む。
【００２８】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、腸癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、結腸直腸サブタイプであるCMS1、CMS2、CMS3、およびCMS4からなる群より選択される少なくとも2つの結腸直腸癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、MLH1、MLH2、MSH3、MSH6、PMS2、POLE、およびPOLD1からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの結腸直腸モデルを含む。
【００２９】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、肺癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、肺癌サブタイプである扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、小細胞肺癌、および肺カルチノイド腫瘍からなる群より選択される少なくとも2つの肺癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、iNTR、TUBB3、RRM1、ECC1、BRCA1、p53、BCL-2、ALK、MRP2、MSH2、TS、ムチン、BAG-1、pERK1/2、pAkt-1、p27、PARP-1、ATM、およびTopIIAからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの肺癌モデルを含む。
【００３０】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、胃癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、胃癌サブタイプである間葉系様(mesenchymal-like)タイプ、マイクロサテライト不安定性(microsatellite-unstable)タイプ、腫瘍タンパク質53(TP53)活性タイプ、およびTP53不活性タイプからなる群より選択される少なくとも2つの胃癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、マイクロRNAであるmiR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34、miR-196a、miR-378、miR-221、miR376c、miR-423-5p、let-7a、miR-17-5p、miR-21、miR-106a/b、miR-199a-3p、miR-218、miR-223、miR-370、miR-451、miR-486、miR-21、miR-106a、miR-129、およびmiR-421;TP53;PTKであるTIE-1およびMKK4;FYN;PLK1;GISP/RegIV;EGFR;ERBB2;VEGF;TGF;c-MET;IL-6;IL-11;サイクリンE;Bcl-2;Fas;サバイビング(surviving);Runx3;E-カドヘリン;WNT5A;IL-1;IL-10;癌胎児抗原(CEA);α-フェトプロテイン(AFP);CA19-9;CA72-4;遊離ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット(B-HCG)、ならびにペプシノーゲンI/IIからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの胃癌モデルを含む。
【００３１】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、前立腺癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、遺伝子融合ERG、ETV1、ETV4、およびFLI1を発現する前立腺癌サブタイプからなる群より選択されるか、または変異SPOP、FOXA1、およびIDH1を発現する前立腺癌サブタイプからなる群より選択される少なくとも2つの前立腺癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、NKX3.1、MYC、TMPRSS2-ERG転座、PTEN、Akt/mTOR、Erk(p42/44)、Her2/Neu、またはSRCチロシンキナーゼ、WNT、APC、k-RAS、β-カテニン、FGFR1、FGF10、EZH2、PCA3、およびARからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの前立腺癌モデルを含む。
【００３２】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、腎臓癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、腎臓癌サブタイプである腎細胞癌および移行上皮癌からなる群より選択される少なくとも2つの腎臓癌モデルを含む。一態様において、腎細胞癌は、明細胞(通常の)(RCC)、乳頭状RCC、嫌色素性RCC、腎オンコサイトーマRCC、未分類RCC、集合管癌、髄質RCC、およびカルコマトイド(carcomatoid)DCCからなる群より選択される。一態様において、前記アレイは、神経細胞特異的エノラーゼ(NSE)、TRAF-1、Hsp27、IL-1、IL-6、TNF-α、血清アミロイドA(SAA)、C反応性タンパク質(CRP)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、サイトケラチン(CK)、血清M65(サイトケラチン18のインタクト型)、低酸素誘導性転写因子(HIF-1αおよびHIF-1β)、VEGF、フォンヒッペル・リンダウ(VHL)、プロリルヒドロキシラーゼ-3(PHD3)、ピルビン酸キナーゼアイソエンザイムタイプM2(TuM2-PK)、チミジンキナーゼ1(TK1)、20Sプロテアソーム、フェチュインA、オステオポンチン(OPN)、オステオプロテジェリン、NMP-22、NGAL、KIM-1、MMP、およびPLIN2からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの腎臓癌モデルを含む。
【００３３】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、皮膚癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、皮膚癌サブタイプである日光角化症、基底細胞癌、黒色腫、カルポジ(Karposi)肉腫、メルケル細胞癌、および扁平上皮癌からなる群より選択される少なくとも2つの皮膚癌モデルを含む。一態様において、黒色腫は、変異BRAF、変異RAS、変異NF1、およびトリプル野生型(triple-wild type)からなる群より選択される。一態様において、前記アレイは、変異BRAF、変異RAS、変異NF1、トリプルWT(野生型)、BRAF、NRAS、CDKN2A/B、TP53、PTEN、RAC1、MAP2K1、PPP6C、ARID2、F1、IDH1、RB1、DDX3X、RAC1、IDH1、MRPS31、RPS27、TERT、ホスホMAP2K1/MAP2K2(MEK1/2)、MAPK1/MAPK3(ERK1/2)、CDK4、およびCCND1からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの皮膚癌モデルを含む。
【００３４】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、卵巣癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、卵巣サブタイプである漿液性、類内膜、明細胞、および粘液性からなる群より選択される少なくとも2つの卵巣癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、B-RAF、K-RAS、TP53、BRCA1/2、CA125、CA19.9、CA15.3、TAG.72、MSH2、MLH1、MLH6、PMS1、PMS2、ESR2、BRIP1、MSH6、RAD51C、RAD51D、CDH1、CHEK2、PALB2、RAD50、OVX1、sFas、CYFRA21.1、VEGF、ヒトカリクレイン10(hK10)、α-フェトプロテイン(αFP)、M-CSF、ならびにLDH、インヒビンα、βA、およびβBサブユニットからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの卵巣癌モデルを含む。
【００３５】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、子宮頸癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、子宮頸癌サブタイプである扁平上皮癌および腺癌からなる群より選択される少なくとも2つの子宮頸癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、p16ink4a、MCM3および5、CDC6、ジェミニン、サイクリンA〜D、TOP02A、CDCA1、BIRC5、UBE2C、CCNB1、CCNB2、PLOD2、NUP210、MELK、CDC20、IL8、INDO、ISG15、ISG20、AGRN、DTXL、MMP1、MMP3、CCL18、STAT1、リボソームタンパク質S12、ミトコンドリアサブユニットNADHデヒドロゲナーゼ4、16SリボソームRNA(rRNA)、およびキャッピングタンパク質筋Z線α1からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの子宮頸癌モデルを含む。
【００３６】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、子宮癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、子宮癌サブタイプである類内膜、腺癌、漿液性腺癌、腺扁平上皮癌、および癌腫肉腫(carcinomasarcoma)からなる群より選択される少なくとも2つの子宮癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、PTEN、BRCA1、BRCA2、TP53、MUTYH、CDKN2A、PGR、およびCHEK2からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの子宮癌モデルを含む。
【００３７】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、肝臓癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、肝臓癌サブタイプである肝細胞癌(HCC)、胆管癌、血管肉腫、および肝芽腫からなる群より選択される少なくとも2つの肝臓癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3、HSP70、HSP27、グリピカン-3(GPC3)、扁平上皮癌抗原(SCCA)、ゴルジタンパク質73(GP73)(Golph2およびGOLM1としても知られる)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、亜鉛-α2-糖タンパク質(ZAG)、デス-γ-カルボキシプロトロンビン(DCP)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、α-l-フコシダーゼ(AFU)、トランスフォーミング成長因子-β1(TGF-β1)、VEGF、マイクロRNA、例えば、miR-500、miR-122、miR-29、およびmiR-21; Δ様1ホモログ(DLK1)、ビリン1(Vil1)、TP53、CD34、RGS5、THY1、ADAMTS1、MMP2、MMP14、ケラチン17、ケラチン19、ならびにムチン1からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの肝臓癌モデルを含む。
【００３８】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、膀胱癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、膀胱癌サブタイプである尿路上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、および小細胞型未分化癌からなる群より選択される少なくとも2つの膀胱癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、HRAS、NRAS、KRAS2、FGFR3、ERBB2、CCND1、MDM2、E2F3、RASSF1A、FHIT、CDKN2A、PTCH、DBC1、TSC1、PTEN、RB1、TP53、SULF1、リソソームシステインプロテイナーゼカテプシンB、K、およびL; RGS1、RGS2、THBS1、THBS2、VEGFC、NRP2、CTSE、MMP2、CCNA2、CDC2、CDC6、TOP2A、SKALP PRKAG1、GAMT、ACOX1、ASAH1、SCD、AF1Q、AREG、DUSP6、LYAR、MAL、ならびにRARRESからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの膀胱癌モデルを含む。
【００３９】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、食道癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、食道癌サブタイプである扁平上皮癌および腺癌からなる群より選択される少なくとも2つの食道癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、SMYD3、RUNX1、CTNNA3、RBFOX1、CDKN2A/2B、CDK14、ERBB2、EGFR、RB1、GATA4/6、CCND1、MDM2、TP53、ARID1A、およびSMARCA4からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの食道癌モデルを含む。
【００４０】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、膵臓癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、膵臓癌サブタイプである外分泌腫瘍および膵神経内分泌腫瘍(PNET)からなる群より選択される少なくとも2つの膵臓癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、膵臓癌サブタイプである扁平上皮、膵臓前駆細胞、免疫原性、および内分泌・外分泌異常分化(ADEX)からなる群より選択される少なくとも2つの膵臓癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、TP53、KDM6A、MLL2、MLL3、PDX1、MNX1、GATA6、HNF1B、転写因子PDX1、MNX1、HNF4G、HNF4A、HNF1B、HNF1A、FOXA2、FOXA3、HES1、NR5A2、MIST1(BHLHA15Aとしても知られる)、およびRBPJL; INS、NEUROD1、NKX2-2、MAFA、AMY2B、PRSS1、PRSS3、CEL、ならびにINSからなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの膵臓癌モデルを含む。
【００４１】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、精巣癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、前記アレイは、精巣癌サブタイプである生殖細胞腫瘍および間質腫瘍からなる群より選択される少なくとも2つの精巣癌モデルを含む。一態様において、前記アレイは、AFP、HCG、LDH、HMGA1、HMGA2、OCT3/4(オクタマー結合タンパク質ファミリーの転写因子(POUホメオドメインタンパク質としても知られる))、SOX2、SOX17、CDK10、ならびに、KITLG、TERT、SPRY4、BAK1、DMRT1、ATF7IP、HPGDS、SMARCAD1、SEPT4、TEX14、RAD51C、PPM1E、TRIM37、MAD1L1、TEX14、SKA2、SMARCAD1、RFWD3、およびRAD51Cの内部に位置する遺伝子座からなる群より選択されるマーカーを発現する少なくとも2つの精巣癌モデルを含む。
【００４２】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは、癌モデルと接触している、および/または癌モデルの内部にある培養培地中に少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む。一態様において、免疫細胞はミエロイド系列細胞である。一態様において、ミエロイド細胞は、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様において、免疫細胞はリンパ球である。一態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００４３】
一態様において、複数の操作された三次元生物学的癌モデルは非静的培養条件下で培養培地中にある。一態様において、非静的培養条件は癌モデルを横切るラテラルフローである。一態様において、癌モデルは静的培養条件下で培養培地中にある。
【００４４】
ハイスループットアッセイにおいて使用するための、複数の操作された三次元生物学的癌モデルも提供される。
【００４５】
操作された三次元生物学的癌モデルを作製する方法であって、
(a)操作された三次元組織構築物に開口部を作る工程、
(b)分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞を開口部に挿入する工程、および
(c)操作された三次元生物学的癌モデルを細胞培養培地中で成熟させて開口部を埋める工程
を含む、方法も提供される。
【００４６】
癌を処置するための治療剤を特定する方法であって、
(a)候補治療剤を、操作された三次元生物学的癌モデルまたは複数の操作された三次元生物学的癌モデルと接触させる工程;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、および/または中胚葉に由来する結合組織細胞に対する効果を測定する工程;ならびに
(c)測定された効果に基づいて、癌を処置するための治療剤を選択する工程
を含む、方法も提供される。
【００４７】
一態様において、前記方法は、個体において癌を処置するための治療剤を特定するための方法であり、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、その個体に由来する。
【００４８】
一態様において、癌は、乳癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、腸癌、膵臓癌、または皮膚癌である。一態様において、癌は、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、食道癌、または精巣癌である。
【００４９】
一態様において、間質細胞は乳房間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、乳癌を有する個体に由来する。
【００５０】
一態様において、間質細胞は肺間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、肺癌を有する個体に由来する。
【００５１】
一態様において、間質細胞は肝臓間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、肝臓癌を有する個体に由来する。
【００５２】
一態様において、間質細胞は腎臓間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、腎臓癌を有する個体に由来する。
【００５３】
一態様において、間質細胞は前立腺間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、前立腺癌を有する個体に由来する。
【００５４】
一態様において、間質細胞は腸間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、腸癌を有する個体に由来する。
【００５５】
一態様において、間質細胞は膵臓細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、膵臓癌を有する個体に由来する。
【００５６】
一態様において、間質細胞は皮膚細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、皮膚癌を有する個体に由来する。
【００５７】
一態様において、間質細胞は胃間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、胃癌を有する個体に由来する。
【００５８】
一態様において、間質細胞は卵巣間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、卵巣癌を有する個体に由来する。
【００５９】
一態様において、間質細胞は子宮頸部間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、子宮頸癌を有する個体に由来する。
【００６０】
一態様において、間質細胞は子宮間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、子宮癌を有する個体に由来する。
【００６１】
一態様において、間質細胞は膀胱間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、膀胱癌を有する個体に由来する。
【００６２】
一態様において、間質細胞は食道間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、食道癌を有する個体に由来する。
【００６３】
一態様において、間質細胞は精巣間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、精巣癌を有する個体に由来する。
【００６４】
一態様において、複数の癌モデルの各癌モデルは特定の癌タイプのサブタイプである。
【００６５】
一態様において、癌モデルは非静的培養条件下で培養培地中にある。一態様において、非静的条件は癌モデルを横切るラテラルフローである。一態様において、癌モデルは静的培養条件下で培養培地中にある。一態様において、前記アッセイはハイスループットアッセイ形式で行われる。
【００６６】
一態様において、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞に対する効果は、
(a)初代腫瘍もしくは初代腫瘍断片のサイズの何らかの縮小を検出すること;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の成長の何らかの低下を検出すること;
(c)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるアポトーシスを検出すること;
(d)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の損傷の程度を検出すること;
(e)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の生存率の低下を検出すること;
(f)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の表面における細胞マーカーの出現、レベル、もしくは消失を検出すること;
(g)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の増殖もしくは成長の速度の変化を検出すること;
(h)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の染色の変化を検出すること;
(i)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるRNAもしくはDNAおよび/またはその発現の変化を検出すること;
(j)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるタンパク質発現の変化を検出すること;
(k)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるサイトカインの発現および/もしくは分泌および/もしくはレベルの変化を検出すること;あるいは
(l)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるT細胞動員、ミエロイド系列細胞動員、浸潤、および/もしくは活性化を検出すること
の1つまたは複数によって測定される。
【００６７】
癌を処置するための候補治療剤をスクリーニングする方法であって、
(a)本明細書に記載の非ヒト動物モデルを候補治療剤と接触させる工程;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、および/または中胚葉に由来する結合組織細胞に対する効果を測定する工程;ならびに
(c)測定された効果に基づいて、癌を処置するための治療剤を選択する工程
を含む、方法も提供される。
【００６８】
一部の態様において、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞に対する効果は、
(a)初代腫瘍もしくは初代腫瘍断片のサイズの何らかの縮小を検出すること;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の成長の何らかの低下を検出すること;
(c)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるアポトーシスを検出すること;
(d)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の損傷の程度を検出すること;
(e)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の生存率の低下を検出すること;
(f)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の表面における細胞マーカーの出現、レベル、もしくは消失を検出すること;
(g)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の増殖もしくは成長の速度の変化を検出すること;
(h)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の染色の変化を検出すること;
(i)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるRNAもしくはDNAおよび/またはその発現の変化を検出すること;
(j)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるタンパク質発現の変化を検出すること;
(k)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるサイトカインの発現および/もしくは分泌および/もしくはレベルの変化を検出すること;あるいは
(l)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるT細胞動員、ミエロイド系列細胞動員、浸潤、および/もしくは活性化を検出すること
の1つまたは複数によって測定される。
【００６９】
以下を含む、癌の非ヒト動物モデルも提供される：(a)間質組織および腫瘍組織を含む、操作された三次元組織構築物を含む、操作された三次元生物学的癌モデルであって、腫瘍組織が間質組織の中にあり、間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものである、操作された三次元生物学的癌モデル、および(b)操作された三次元生物学的癌モデルを含む、非ヒト動物。但し、前記癌モデルは、腫瘍組織が間質組織と密着した後に非ヒト動物に移植される。
【００７０】
一態様において、非ヒト動物は、遺伝子操作されたげっ歯動物である。
【００７１】
一態様において、非ヒト動物は、免疫不全げっ歯動物である。
【００７２】
一態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである。
【００７３】
一態様において、腫瘍組織は、複数の分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。
【００７４】
一態様において、間質組織は、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞と前脂肪細胞の混合物、筋芽細胞、周皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および星状細胞からなる群より選択される間質細胞を含む。
【００７５】
一態様において、間質組織は、乳房間質細胞、肺間質細胞、肝臓間質細胞、腎臓間質細胞、前立腺間質細胞、腸間質細胞、膵臓間質細胞、または皮膚間質細胞を含む。
【００７６】
一態様において、腫瘍組織は、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、および精巣の腫瘍組織からなる群より選択される腫瘍組織を含む。
【００７７】
一態様において、腫瘍組織は乳房腫瘍組織であり、乳房腫瘍組織は、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、ER-/PR-/HER2-、MCF-7、SKBR3、HCC1143、およびMDA-MB-231からなる群より選択される細胞株を含む。
【００７８】
一態様において、腫瘍組織は膵臓腫瘍組織であり、膵臓腫瘍組織は、膵臓細胞株に由来するマーカーを含む。一態様において、膵臓細胞株は、OPTR3099C、CAPAN1、CAPAN2、PANC1、MIAPACA2、CFPAC1、ASPC1、COLO357、PANC89、またはHPAFIIからなる群より選択される。
【００７９】
一態様において、腫瘍組織は周囲を間質組織に囲まれている。
【００８０】
一態様において、癌モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。
【００８１】
一態様において、腫瘍組織はバイオプリントされた。
【００８２】
一態様において、癌モデルは各辺が約1〜約3mmである。
【００８３】
一態様において、癌モデルは各辺が約0.25〜約1mmである。
【００８４】
一態様において、癌の非ヒト動物モデルは少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む。一態様において、免疫細胞はミエロイド系列細胞である。一態様において、ミエロイド系列細胞は、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様において、免疫細胞はリンパ球である。一態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００８５】
一態様において、(a)の操作された三次元生物学的癌モデルは非ヒト動物に皮下移植された。
【００８６】
一態様において、間質組織は、中胚葉に由来する結合組織細胞を含む。
【００８７】
一態様において、腫瘍組織は、患者腫瘍に由来する初代癌細胞を含む。
【００８８】
癌の非ヒト動物モデルを作製する方法であって、間質組織を含む間質バイオインクをバイオプリンティングによって堆積させる工程;腫瘍組織を間質組織の中に堆積させる工程;堆積した間質組織および堆積した腫瘍組織を細胞培養培地中で成熟させて、間質組織を腫瘍組織と密着させて、操作された三次元生物学的癌モデルを形成する工程;ならびに密着した操作された三次元生物学的癌モデルを非ヒト動物に移植する工程を含む、方法も提供される。
【００８９】
癌に対する治療剤を特定する方法であって、間質組織を含む間質バイオインクをバイオプリンティングによって堆積させる工程;複数の癌細胞を含む腫瘍組織を間質組織の中に堆積させる工程;堆積した間質組織および堆積した腫瘍組織を細胞培養培地中で成熟させて、間質組織を腫瘍組織と密着させて、操作された三次元生物学的癌モデルを形成する工程;密着した操作された三次元生物学的癌モデルを非ヒト動物に移植する工程;候補治療剤を癌モデルに適用する工程;癌細胞の生存率を測定する工程;ならびに測定された癌細胞の生存率に基づいて治療剤を選択する工程を含む、方法も提供される。
【００９０】
前記方法のいずれかの一態様において、非ヒト動物は、遺伝子操作されたげっ歯動物である。前記方法のいずれかの一態様において、非ヒト動物は免疫不全げっ歯動物である。
【００９１】
前記方法のいずれかの一態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである。
【００９２】
前記方法のいずれかの一態様において、腫瘍組織は、複数の分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。
【００９３】
前記方法のいずれかの一態様において、間質組織は、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞と前脂肪細胞の混合物、筋芽細胞、周皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および星状細胞からなる群より選択される間質細胞を含む。
【００９４】
前記方法のいずれかの一態様において、間質組織は、乳房間質細胞、肺間質細胞、肝臓間質細胞、腎臓間質細胞、前立腺間質細胞、腸間質細胞、膵臓間質細胞、または皮膚間質細胞を含む。
【００９５】
前記方法のいずれかの一態様において、腫瘍組織は、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、および精巣の腫瘍組織からなる群より選択される腫瘍組織を含む。
【００９６】
前記方法のいずれかの一態様において、腫瘍組織は乳房腫瘍組織であり、乳房腫瘍組織は、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、ER-/PR-/HER2-、MCF-7、SKBR3、HCC1143、およびMDA-MB-231からなる群より選択される細胞株を含む。
【００９７】
前記方法のいずれかの一態様において、腫瘍組織は膵臓腫瘍組織であり、膵臓腫瘍組織は、膵臓細胞株、例えば、OPTR3099C、CAPAN1、CAPAN2、PANC1、MIAPACA2、CFPAC1、ASPC1、COLO357、PANC89、またはHPAFIIに由来するマーカーを含む。
【００９８】
前記方法のいずれかの一態様において、腫瘍組織は周囲を間質組織に囲まれている。
【００９９】
前記方法のいずれかの一態様において、癌モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。
【０１００】
一態様において、前記方法のうちどの方法も、腫瘍組織をバイオプリンティングによって堆積させる工程をさらに含む。
【０１０１】
前記方法のいずれかの一態様において、バイオプリンティングは押出しによるものである。
【０１０２】
前記方法のいずれかの一態様において、癌モデルは各辺が約1〜約3mmである。
【０１０３】
前記方法のいずれかの一態様において、癌モデルは各辺が約0.25〜約1mmである。
【０１０４】
一態様において、前記方法のうちどの方法も、少なくとも1つのタイプの免疫細胞を堆積させる工程をさらに含む。一態様において、少なくとも1つのタイプの免疫細胞を堆積させる工程はバイオプリンティングによるものである。一態様において、バイオプリンティングは押出しによるものである。一態様において、免疫細胞はミエロイド系列細胞である。一態様において、ミエロイド系列細胞は、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様において、免疫細胞はリンパ球である。一態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１０５】
前記方法のいずれかの一態様において、癌モデルを非ヒト動物に移植する工程は皮下移植によるものである。一態様において、腫瘍モデルは非ヒト動物の側腹部に移植される。
【０１０６】
前記方法のいずれかの一態様において、間質組織は、中胚葉に由来する結合組織細胞を含む。
【０１０７】
前記方法のいずれかの一態様において、癌細胞は、患者腫瘍に由来する初代癌細胞である。
【０１０８】
前記方法のいずれかの一態様において、候補治療剤は、移植された癌モデルに適用される。
【０１０９】
一態様において、前記方法のうちどの方法も、移植された癌モデルを非ヒト動物から取り出す工程であって、癌モデルが非ヒト動物から取り出された後に、候補治療剤が癌モデルに適用される、工程をさらに含む。
【０１１０】
前記方法のいずれかの一態様において、候補治療剤は免疫療法である。一態様において、免疫療法は、養子T細胞移入、Tc細胞およびNK細胞を活性化させる免疫チェックポイント阻害剤、または免疫細胞のリプログラミングおよび枯渇である。
【０１１１】
以下を含む、操作された三次元生物学的乳癌モデルも提供される：(a)線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、および単球を含む、乳房間質組織、および(b)乳癌細胞、線維芽細胞、内皮細胞、および単球を含む、乳癌腫瘍組織であって、操作された三次元生物学的乳癌モデルを形成するように周囲を間質組織に囲まれている、乳癌腫瘍組織。但し、前記間質組織は間質バイオインクからバイオプリントされたか、前記腫瘍組織は腫瘍バイオインクからバイオプリントされたか、または前記間質組織と腫瘍組織の両方はそれぞれのバイオインクからバイオプリントされた。
【０１１２】
一態様において、前記モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。
【０１１３】
一態様において、乳癌細胞は乳癌細胞株に由来する。一態様において、乳癌細胞株は、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、およびER-/PR-/HER2-からなる群より選択される。
【０１１４】
一態様において、乳癌細胞は、患者腫瘍に由来する初代癌細胞である。
【０１１５】
一態様において、操作された三次元生物学的乳癌モデルを形成するように、乳癌腫瘍組織は周囲を乳房間質組織に完全に囲まれている。
【０１１６】
一態様において、乳癌モデルは、単球から分化した複数のマクロファージをさらに含む。
【０１１７】
操作された三次元生物学的乳癌モデルを製作する方法であって、(a)間質バイオインクを調製する工程であって、間質バイオインクが複数の間質細胞タイプを含み、間質細胞タイプが、押出し化合物、線維芽細胞、内皮細胞、単球、および脂肪細胞を含む、工程;(b)腫瘍バイオインクを調製する工程であって、腫瘍バイオインクが、押出し化合物、乳癌細胞タイプ、線維芽細胞、および単球を含む、工程;(c)腫瘍バイオインクが間質バイオインクの中に、かつ周囲を間質バイオインクと接触した状態で埋め込まれるように、間質バイオインクおよび腫瘍バイオインクを堆積させる工程;ならびに(d)堆積したバイオインクを細胞培養培地中で成熟させて、押出し化合物を除去して、細胞を密着させて、操作された三次元生物学的乳癌モデルを形成する工程を含む、方法も提供される。
【０１１８】
一態様において、バイオインクはバイオプリンティングによって堆積される。
【０１１９】
一態様において、乳癌細胞タイプは乳癌細胞株を含む。一態様において、乳癌細胞株は、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、およびER-/PR-/HER2-からなる群より選択される。
【０１２０】
一態様において、癌細胞タイプは、患者腫瘍に由来する初代乳癌細胞を含む。
【０１２１】
一態様において、前記方法は、単球を複数のマクロファージに分化させる工程をさらに含む。一態様において、前記方法は、マクロファージを乳癌細胞タイプに向けて遊走させる工程をさらに含む。
【０１２２】
一態様において、前記方法は、操作された三次元生物学的乳癌モデルに、候補治療剤を適用する工程;癌細胞の生存率を測定する工程;および測定された癌細胞の生存率に基づいて、個体のための治療剤を選択する工程をさらに含む。一態様において、候補治療剤は免疫療法である。一態様において、免疫療法は、養子T細胞移入、Tc細胞およびNK細胞を活性化させる免疫チェックポイント阻害剤、または免疫細胞のリプログラミングおよび枯渇である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】バイオプリントされた間質組織または間質のボックス(stromal box)を示す。
【図２】バイオプリント乳房間質組織に移植する前に7日間、回転バイオリアクター中で灌流した初代乳房腫瘍組織のヘマトキシリン・エオシン染色(H&E染色)を示す。
【図３】バイオプリント乳房間質組織に移植し、回転バイオリアクター中で7日間または28日間灌流した初代乳房腫瘍組織のH&E染色を示す。
【図４】増殖細胞核抗原(PCNA)(カラー図の中の緑色)を用いた、移植した初代腫瘍組織の存在下での間質組織の増殖を示す。
【図５】CD31(Abcamカタログ番号7653300)の染色による、移植した初代腫瘍組織の存在下での間質組織中の内皮細胞網の組織化を示す。
【図６】切除し、間質組織に移植し、回転バイオリアクター中で7日間灌流した、リモデリングした初代乳房腫瘍組織のH&E染色(出発材料中の上皮細胞の増加)を示す。
【図７】MCF7乳癌細胞が、乳房線維芽細胞、内皮細胞、および脂肪細胞を含む間質に囲まれているバイオプリント3D乳癌モデルを横切る培地のラテラルフローを示す。図7Aは、ラテラルフローを供給するために細胞培養培地と同時に灌流した6つのバイオリアクター(Kiyatec, Inc.)の写真である。図7B〜7Eは、フロー状態がECM組織化と組織接着を向上させることを示した顕微鏡写真である。
【図８】フロー灌流(flow perfusion)を受けた3Dバイオプリント乳癌モデルがドキソルビシン耐性の増大を示し、従って、2D共培養細胞および静的3Dバイオプリント細胞と比較して正確なモデルとなることを示す。図8Aは、ビヒクル(対照)および漸増濃度のドキソルビシンについて3D乳癌モデルに対するドキソルビシン毒性を示したグラフである。図8Bは、培養2D正常ヒト乳房線維芽細胞(NHMF)、2Dヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、2D皮下前脂肪細胞(SPA)、2D MCF7癌細胞、2D共培養細胞(全細胞タイプの混合物)、静的培養を用いた3D乳癌モデル、およびフロー灌流を用いた3D乳癌モデル(3Dモデルには、2D共培養細胞と同じ比の細胞タイプがあった)のドキソルビシンLD50(μM)を示したグラフである。
【図９】フロー灌流を受けた3D乳癌モデルでは、細胞タイプに特異的な作用を観察できることを示した顕微鏡写真を示す。左上のパネルは、フロー灌流のあるビヒクルと接触した間質細胞を示した顕微鏡写真である。右上のパネルは、フロー灌流を受けた間質細胞に対する10μMドキソルビシンの作用を示した顕微鏡写真である。左下のパネルは、フロー灌流のあるビヒクルと接触した癌細胞を示した顕微鏡写真である。右下のパネルは、フロー灌流を受けた癌細胞に対する10μMドキソルビシンの作用を示した顕微鏡写真である。
【図１０】乳癌細胞を含む3Dバイオプリント乳房組織のH&E染色(図10A)および免疫蛍光(図10B)、ならびに乳癌細胞を含むバイオプリント乳房組織に由来する異種移植片のH&E染色(図10C)を示す。
【図１１】3匹の免疫不全マウスの皮下に異種移植した膵臓癌細胞を含む3Dバイオプリント膵臓組織の成長を経時的に示す(図11A)。異種移植した3Dバイオプリント膵臓組織から作製した膵臓腫瘍組織の代表的なH&E染色を示す(図11B)。
【図１２】図12A〜Bは、バイオプリンティング後7日目の、免疫細胞を含む乳癌組織構築物のH&E染色を示す。図12C〜Dは、バイオプリンティング後14日目の、免疫細胞を含む、この乳癌組織構築物のH&E染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
発明の詳細な説明
一態様において、本発明は、分離されていない初代癌腫瘍、初代腫瘍断片、または初代腫瘍細胞の周囲を取り囲んでいる、中胚葉に由来する複数の結合組織細胞を含む、操作された三次元生物学的癌モデルを提供する。一態様において、中胚葉に由来する複数の結合組織細胞は間質細胞である。別の態様において、間質細胞タイプは、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞、またはヒト脂肪細胞とヒト前脂肪細胞の混合物である。別の態様において、癌腫瘍または腫瘍断片は、複数の間質細胞タイプとは異なる患者に由来する。別の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは、(a)灌流可能な成熟血管網を含まないか、(b)成熟赤血球を含まないか、(c)神経分布を含まないか、(d)神経組織を含まないか、または(a)〜(d)の組み合わせである。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、操作された三次元生物学的組織モデルを提供するために細胞培養培地中で成熟され得るバイオプリント構築物を提供する。バイオプリント構築物は、中胚葉に由来する複数の結合組織細胞を多数の積み重ねられたアレイの形態で含む。一態様において、中胚葉に由来する複数の結合組織細胞はバイオインクの一部である。別の態様において、バイオインクは押出し化合物をさらに含む。別の態様において、中胚葉に由来する複数の結合組織細胞は、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト前脂肪細胞、またはヒト前脂肪細胞と脂肪細胞の混合物に限定される。別の態様において、中胚葉に由来する複数の結合組織細胞は筋線維芽細胞を含む。
【０１２６】
別の態様において、本発明は、操作された三次元生物学的組織モデルを製作する方法であって、中胚葉細胞タイプに由来する複数の結合組織細胞を含むバイオインクを調製する工程;バイオインクを生体適合面に堆積させて、多数の積み重ねられたアレイの形態をとる、中胚葉細胞タイプに由来する複数の結合組織細胞を得る工程;および多数の積み重ねられたアレイの形態をとる、中胚葉細胞タイプに由来する複数の結合組織細胞を細胞培養培地中で成熟させて、前記細胞を密着させて、操作された三次元組織モデルを形成する工程を含む、方法を提供する。一態様において、バイオインクは押出し化合物をさらに含む。別の態様において、積み重ねられたアレイの形態をとる複数の間質細胞タイプが培養培地中で成熟される時に、押出し化合物は除去される。別の態様において、中胚葉に由来する複数の結合組織細胞は間質細胞である。別の態様において、バイオインク中の間質細胞は、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト前脂肪細胞に限定される。一態様において、前脂肪細胞は細胞培養培地中で成熟されると、間質乳房組織中で見出されるように成熟して脂肪細胞を形成する。
【０１２７】
別の態様において、本発明は、操作された三次元生物学的癌モデルを製作する方法であって、初代癌腫瘍細胞、分離されていない、初代の、患者に由来する癌腫瘍および/もしくは腫瘍断片、または不死化細胞を、操作された三次元組織モデルに挿入する工程;ならびに細胞培養培地中で成熟させて、操作された三次元生物学的癌モデルを得る工程を含む、方法を提供する。一態様において、前記腫瘍細胞、腫瘍および/もしくは腫瘍断片、または不死化細胞は、注射によって、操作された三次元組織に挿入され、次いで、注射によって生じた開口部が埋まるように細胞培養培地中で成熟される。別の態様において、前記腫瘍細胞、腫瘍もしくは腫瘍断片、または不死化細胞は、操作された三次元組織に切り込みを入れることで挿入され、腫瘍細胞、腫瘍もしくは腫瘍断片は切開部に挿入され、切開によって生じた開口部が埋まるように細胞培養培地中で成熟される。一態様において、複数の間質細胞タイプは、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞に限定される。別の態様において、前記癌細胞、腫瘍もしくは腫瘍断片は、複数の間質細胞タイプとは異なる患者に由来する。
【０１２８】
別の態様において、本発明は、癌を処置するための治療剤を特定する方法であって、操作された三次元生物学的癌モデルを候補治療剤と接触させる工程;および癌の腫瘍、腫瘍断片、または腫瘍細胞に対する効果を測定する工程を含む、方法を提供する。一態様において、前記方法は、個体において癌を処置するための治療剤を特定するための方法であり、前記腫瘍、腫瘍断片もしくは腫瘍細胞、または不死化細胞は、その個体に由来する。一態様において、効果は、腫瘍サイズまたは腫瘍成長の程度、もしあれば、腫瘍サイズまたは腫瘍成長の縮小の程度である。別の態様において、効果は、アポトーシスの程度、損傷の程度、生存率の低下、腫瘍細胞マーカーの出現、レベル、もしくは消失、分泌サイトカインの出現、レベル、もしくは消失、または腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の増殖の速度である。さらなる態様において、治療剤が腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞に対して効果があれば、本発明は、治療剤を個体に投与する工程を提供する。
【０１２９】
いくつかの定義
特に定義のない限り、本明細書において用いられる技術用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈によってはっきりと規定されていない限り複数への言及を含む。本明細書における「または」についての、あらゆる言及は、特に定めのない限り、「および/または」を包含することが意図される。
【０１３０】
「非ヒト動物」はヒト以外の任意の種でよい。一態様において、非ヒト動物は哺乳動物である。別の態様において、非ヒト動物は脊椎動物である。別の態様において、非ヒト動物は、マウス、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類からなる群より選択される。
【０１３１】
本明細書で使用する「治療剤」とは、疾患を治療するために認可されたか、疾患を治療するために研究されているか、または生物学的応答、例えば、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の変化を誘発する、任意の分子、生物製剤、化合物、または組成物を意味する。
【０１３２】
本明細書で使用する「組織」とは細胞の凝集物を意味する。
【０１３３】
本明細書で使用する「中胚葉に由来する結合組織細胞」とは、結合組織を形成する中胚葉由来細胞を指す。
【０１３４】
本明細書で使用する「間質」とは、生物学的細胞、組織、または臓器の結合性支持性の枠組みを指す。一態様において、間質細胞は、ヒトに由来する初代間質細胞である。本発明の実施において有用な市販の間質細胞には、WPMY-1(ATCC(登録商標)CRL-2854(商標))、GMMe(ATCC(登録商標)CRL-2674(商標))、Sl/Sl4 hSCF220(ATCC(登録商標)CRL-2453(商標))、GMMs(ATCC(登録商標)CRL-2675(商標))、KMC8.8(ATCC(登録商標)CRL-2212(商標))、KM114(ATCC(登録商標)TIB-242(商標))、KM201(ATCC(登録商標)TIB-240(商標))、KM703(ATCC(登録商標)CRL-1896(商標))、KM81(ATCC(登録商標)TIB-241(商標))、M2-10B4(ATCC(登録商標)CRL-1972(商標))、RWPE-1(ATCC(登録商標)CRL-11609(商標))、EML細胞株、クローン1(ATCC(登録商標)CRL-11691(商標))、PWR-1E(ATCC(登録商標)CRL-11611(商標))、PS/2(ATCC(登録商標)CRL-1911(商標))、M/K-1.9(ATCC(登録商標)CRL-1910(商標))、M/K-2.7(ATCC(登録商標)CRL-1909(商標))、KMI6(ATCC(登録商標)CRL-2179(商標))、Sl/Sl4(ATCC(登録商標)CRL-2452(商標))、CCD-1086Sk(ATCC(登録商標)CRL-2103(商標))、Hs574.T(ATCC(登録商標)CRL-7345(商標))、MD2(ATCC(登録商標)HB-229(商標))、5E10(ATCC(登録商標)CRL-2698(商標))、CDR1(ATCC(登録商標)HB-213(商標))、T HESCs(ATCC(登録商標)CRL-4003(商標))、Sl/Sl4 hSCF248(ATCC(登録商標)CRL-2454(商標))、AFT024(ATCC(登録商標)SCRC-1007(商標))、D16(ATCC(登録商標)CRL-3281(商標))、X9(ATCC(登録商標)CRL-3282(商標))、D12(ATCC(登録商標)CRL-3280(商標))、D1 O RLUVA(ATCC(登録商標)CRL-12424(商標))、HS-5(ATCC(登録商標)CRL-11882(商標))、7F2(ATCC(登録商標)CRL-12557(商標))、W-20-17(ATCC(登録商標)CRL-2623(商標))、2E8(ATCC(登録商標)TIB-239(商標))、HS-27A(ATCC(登録商標)CRL-2496(商標))、MYC1-9E10.2(ATCC(登録商標)CRL-1729(商標))、BEND(ATCC(登録商標)CRL-2398(商標))、VIII-6G10(ATCC(登録商標)HB-10519(商標))、初代皮膚線維芽細胞;正常、ヒト、成人(ATCC(登録商標)PCS-201-012(商標))、SR-4987(ATCC(登録商標)CRL-2028(商標))、AFT024 IRR(ATCC(登録商標)SCRC-1007.1(商標))、WPE1-NB11(ATCC(登録商標)CRL-2851(商標))、WPE1-NB26(ATCC(登録商標)CRL-2852(商標))、WPE1-NB14(ATCC(登録商標)CRL-2850(商標))、WPE1-NA22(ATCC(登録商標)CRL-2849(商標))、WPE-stem(ATCC(登録商標)CRL-2887(商標))、RWPE2-W99(ATCC(登録商標)CRL-2853(商標))、WPE1-NB26-64(ATCC(登録商標)CRL-2889(商標))、WPE-int(ATCC(登録商標)CRL-2888(商標))、およびWPE1-NB26-65(ATCC(登録商標)CRL-2890(商標))(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)が含まれる。
【０１３５】
間質細胞は、高効率の系列特異的な分化を介してヒト人工多能性幹細胞から得ることができる。1つのアプローチでは、分化中のヒト多能性細胞から、シングル細胞に基づく間質細胞を約20日で誘導するために、合成培地、フィーダーフリー条件、ならびにCD105陽性CD24陰性選択を使用する。Lian et al., Methods in Molecular Biology 1416: 289-298 (2016)。
【０１３６】
腎臓間質細胞は、ある特定の因子を用いて中間中胚葉(IM)から得られる場合がある。Pietila and Vainio, Nephron Exp. Nephrol. 126: 40-40 (2014)。腎臓発生を制御する間質系列は中間中胚葉 (IM)に由来する。さらに、腎臓間質細胞の大きな集団は傍軸中胚葉からも生じる。中胚葉を中間ドメインおよび傍軸ドメインにさらに分けるシグナルが腎臓間質系列の特定において役割を果たしている可能性がある。Guillaume et al., Developmental Biology 329: 169-175 (2009)。
【０１３７】
本明細書で使用する「線維芽細胞様細胞」とは、通常、重なり合って成長する細長い線維構造を有する細胞、例えば、ヒト肺細胞MRC5を指す。線維芽細胞様細胞株は、通常、単層で成長する極性立方上皮(polar cuboidal)細胞構造によって特定可能な上皮様細胞株と区別することができる。
【０１３８】
本発明の実施において用いられ得る例示的な線維芽細胞または線維芽細胞様細胞には、初代正常膀胱線維芽細胞(ATCC(登録商標)PCS-420-013(商標))、初代肺線維芽細胞(ATCC(登録商標)PCS-201-013(商標))、BJ(ATCC(登録商標)CRL-2522(商標))、初代皮膚線維芽細胞(ATCC(登録商標)PCS-201-011(商標))、WI-38(ATCC(登録商標)CCL-75(商標))、初代皮膚線維芽細胞(ATCC(登録商標)PCS-201-012(商標))、初代皮膚線維芽細胞正常(ATCC(登録商標)PCS-201-010(商標))、IRR-MRC-5[放射線照射MRC-5](ATCC(登録商標)55-X(商標))、IMR-90(ATCC(登録商標)CCL-186(商標))、WPMY-1(ATCC(登録商標)CRL-2854(商標))、HFF-1(ATCC(登録商標)SCRC-1041(商標))、WI-38 VA-13サブライン(subline)2RA(ATCC(登録商標)CCL-75.1(商標))、HFF-1 IRR(ATCC(登録商標)SCRC-1041.1(商標))、BJ-5ta(ATCC(登録商標)CRL-4001(商標))、Hs27(ATCC(登録商標)CRL-1634(商標))、MRC-5(ATCC(登録商標)CCL-171(商標))、Detroit551(ATCC(登録商標)CCL-110(商標))、CCD-16Lu(ATCC(登録商標)CCL-204(商標))、CCD-19Lu(ATCC(登録商標)CCL-210(商標))、CCD-27Sk(ATCC(登録商標)CRL-1475(商標))、LL47(MaDo)(ATCC(登録商標)CCL-135(商標))、MRC-9(ATCC(登録商標)CCL-212(商標))、Malme-3(ATCC(登録商標)HTB-102(商標))、CCD-986Sk(ATCC(登録商標)CRL-1947(商標))、CCD-1079Sk(ATCC(登録商標)CRL-2097(商標))、CCD-1070Sk(ATCC(登録商標)CRL-2091(商標))、WS1(ATCC(登録商標)CRL-1502(商標))、LL24(ATCC(登録商標)CCL-151(商標))、CCD-1064Sk(ATCC(登録商標)CRL-2076(商標))、Hs68(ATCC(登録商標)CRL-1635(商標))、CCD-1059Sk(ATCC(登録商標)CRL-2072(商標))、CCD-33Lu(ATCC(登録商標)CRL-1490(商標))、LL29(AnHa)(ATCC(登録商標)CCL-134(商標))、HEL299(ATCC(登録商標)CCL-137(商標))、LL97A(AlMy)(ATCC(登録商標)CCL-191(商標))、HFL1(ATCC(登録商標)CCL-153(商標))、CCD-1090Sk(ATCC(登録商標)CRL-2106(商標))、CHON-002(ATCC(登録商標)CRL-2847(商標))、およびC211(ATCC(登録商標)CCL-123(商標))(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)が含まれる。
【０１３９】
「筋線維芽細胞」は、表現型の点から見て線維芽細胞と平滑筋の間にある細胞である。一部の態様において、筋線維芽細胞は腸組織筋線維芽細胞である。様々な態様において、腸組織筋線維芽細胞は、ヒト腸から単離された初代細胞に由来する。一部の態様において、筋線維芽細胞は皮膚由来または血管由来である。筋線維芽細胞は、例えば、ATTCから市販されており、WPMY-1(ATCC(登録商標)CRL-2854(商標))を含む。
【０１４０】
本明細書で使用する「脂肪細胞(adipocyte)」(「脂質細胞(lipocyte)」または「脂肪細胞(fat cell)」としても知られる)は、脂肪組織の主な構成要素であり、エネルギーを脂肪として貯蔵するのに特化した細胞を指す。
【０１４１】
本明細書で使用する「前脂肪細胞」とは、刺激すると脂肪細胞を形成することができる任意の細胞を指す。
【０１４２】
本明細書で使用する「組織」とは細胞が凝集したものを意味する。
【０１４３】
本明細書で使用する「遺伝子マーカー」という用語は、対象によって異なる(例えば、染色体の中にある)ヌクレオチド配列である。一部の態様において、遺伝子マーカーは、一塩基多型、制限断片長多型、マイクロサテライト、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの付加、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの反復もしくは重複、ヌクレオチドの転座、および/またはタンパク質の切断型もしくは伸長型を生じる原因となる異常なスプライス部位もしくは選択的スプライス部位でもよい。
【０１４４】
「分子マーカー」、「バイオマーカー」、または「生物学的マーカー」という用語は、生物または他の物体から採取された試料の内部に含まれる分子(例えば、核酸またはタンパク質)であり、その活性または発現を測定および使用して、それぞれの供給源に関する、ある特定の特徴を明らかにすることができる分子を指すために本明細書において同義に用いられる。
【０１４５】
本明細書で使用する「バイオインク」とは、バイオプリンティングにおいて使用するための液体、半固体、または固体の組成物を意味する。一部の態様において、バイオインクは、細胞溶液、細胞凝集物、細胞を含むゲル、多細胞体、または組織を含む。一部の態様において、バイオインクは、バイオプリンティングを可能にする特定の生化学的特性を提供する非細胞材料をさらに含む。一部の態様において、バイオインクは押出し化合物を含む。
【０１４６】
本明細書で使用する「バイオプリンティング」とは、自動または半自動のコンピュータ支援三次元試作装置(例えば、バイオプリンター)と適合する方法を介した、細胞(例えば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮物、多細胞凝集物、多細胞体など)の三次元の正確な堆積を利用することを意味する。
【０１４７】
本明細書で使用する「スキャフォールド」とは、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、前もって形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および脱細胞組織、ならびに操作された組織の物理構造に不可欠であり、かつ組織を損傷/破壊することなく組織から除去することができない他の任意のタイプの前もって形成されたスキャフォールドを指す。さらなる態様において、脱細胞組織スキャフォールドには、脱細胞天然組織、または任意の手法で培養細胞によって生成された脱細胞細胞材料、例えば、生きている間に細胞層が産生したECMを残しながら、死滅させた、または脱細胞した細胞層が含まれる。従って、「スキャフォールドレス(scaffoldless)」という用語は、スキャフォールドが、使用時に、除去されているか、または操作された組織の不活性成分として残っているので、操作された組織の不可欠な部分ではないことを意味することが意図される。「スキャフォールドレス」は「スキャフォールドフリー」および「前もって形成されたスキャフォールドを含まない」と同義に用いられる。
【０１４８】
本明細書で使用する「アッセイ」とは、有機試料または生物試料(例えば、細胞凝集物、組織、臓器、生物など)の中にある物質(例えば、化学物質、分子、生化学物質、タンパク質、ホルモン、または薬物など)の存在または活性を試験または測定するための手順を意味する。
【０１４９】
本明細書で使用する、「細胞のアレイ」とは、予め決められたパターンで堆積している細胞である。一態様において、細胞のアレイとは、一列に並んだ細胞である。別の態様において、細胞のアレイとは、パターンが平面の細胞のアレイである。さらなる態様において、細胞のアレイは、パターンが平面の細胞のアレイからなる積み重ねられたアレイである。このようなアレイは天然では生じない。
【０１５０】
アッセイに関連する「アレイ」とは、1つの試料に対して複数の試験を行うことができるように、複数の試料に対して1つまたは複数の試験を行うことができるように、またはその両方ができるように空間的に並べられた複数の要素のつながりを含む科学ツールである。一部の態様において、アレイは、ミディアムスループットまたはハイスループットのスクリーニングに関連するスクリーニング方法および装置を含むスクリーニング方法および装置に合わせられるか、またはこれらと適合する。さらなる態様において、アレイを用いると複数の試験を同時に行うことが可能になる。さらなる態様において、アレイを用いると複数の試料を同時に試験することが可能になる。一部の態様において、アレイは、操作された三次元生物学的癌モデルのマイクロアレイである。さらなる態様において、アレイは固体支持体の表面にある。他の態様において、アレイは組織マイクロアレイである。さらなる態様において、アレイは、複数の生化学分析、代謝分析、分子分析、または組織分析を行うことができるように組み立てられている。
【０１５１】
組織マイクロアレイを収容するために用いられ得る例示的なマルチウェルプレートには、Corning(登録商標)CellBIND(登録商標)cell culture multi-well plate、Corning(登録商標)Costar(登録商標)cell culture plate、Corning(登録商標)Costar(登録商標)Ultra-Low attachment multi-well plate、Corning(登録商標)osteo assay surface multi-well plate、Corning(登録商標)Synthemax(登録商標)-R surface multi-well plate、Corning(登録商標)Synthemax(登録商標)-T surface multi-well plate、TPP(登録商標)tissue culture plate、Greiner CELLSTAR(登録商標)multi-well culture plate、Nunclon(登録商標)Δ Multidishes、およびNunc(登録商標)MicroWell(登録商標)MiniTrays(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)が含まれる。
【０１５２】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは生体適合性マルチウェル容器のウェル中に存在する。一部の態様において、各モデルはウェルの中に入れられる。他の態様において、各モデルは、複数の間質細胞タイプをウェルにバイオプリンティングし、バイオプリント構築物を成熟させ、分離されていない、初代の、患者に由来する癌腫瘍、腫瘍断片、または腫瘍細胞を開口部に挿入し、操作された三次元生物学的癌モデルを成熟させて開口部を埋めることによってウェルに添加される。さらなる態様において、ウェルはコーティングされている。様々なさらなる態様において、ウェルは、生体適合性ヒドロゲル、1種類または複数種のタンパク質、1種類または複数種の化学物質、1種類または複数種のペプチド、1種類または複数種の抗体、および1種類または複数種の増殖因子の1つまたは複数で、それらの組み合わせを含めてコーティングされている。一部の態様において、ウェルはNovoGel(登録商標)でコーティングされている。他の態様において、ウェルはアガロースでコーティングされている。一部の態様において、各組織は、生体適合性マルチウェル容器のウェルの内部にある多孔性生体適合膜上に存在する。一部の態様において、マルチウェル容器の各ウェルは2以上の組織を収容する。他の態様において、各癌モデルは2以上の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞を別々の区画に含む。
【０１５３】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは1つまたは複数の側面が生体適合面に固定されている。組織モデルを生体適合面に固定するのに多くの方法が適している。様々な態様において、組織モデルは、例えば、1つもしくは複数の側面全体に沿って、1つもしくは複数の側面の端だけで、または1つもしくは複数の側面の真ん中だけで生体適合面に適切に固定されている。様々なさらなる態様において、組織モデルは、生体適合面に一体化されているか、または生体適合面と関連付けられているホルダまたはキャリアによって生体適合面に適切に固定されている。様々なさらなる態様において、組織モデルは、生体適合面に一体化されているか、または生体適合面と関連付けられている1つまたは複数のピンチクランプ(pinch-clamp)またはプラスチックナブ(nub)によって生体適合面に適切に固定されている。一部の態様において、組織モデルは、多孔膜への細胞接着によって生体適合面に適切に固定されている。一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは、1つまたは複数の側面が生体適合面に取り付けられることでアレイ配置に保たれる。さらなる態様において、組織モデルは1、2、3、4、またはそれより多い側面が生体適合面に取り付けられている。一部の態様において、生体適合面は、損傷または毒性の大きな危険を組織モデルに呈さない任意の表面である。さらなる態様において、生体適合面は、従来の組織培養方法に適した任意の表面である。適切な生体適合面には、非限定的な例として、処理が施されているプラスチック、膜、多孔膜、コーティングが施されている膜、コーティングが施されているプラスチック、金属、コーティングが施されている金属、ガラス、処理が施されているガラス、およびコーティングが施されているガラスが含まれ、適切なコーティングには、ヒドロゲル、ECM成分、化学物質、タンパク質などが含まれ、コーティングまたは処理は、細胞および組織が生体適合面に接着するのを刺激または阻止する手段を提供する。
【０１５４】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは2以上の要素のつながりを含む。様々な態様において、アレイは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、または500の要素のつながりを含み、その中の増加分を含む。さらなる態様において、各要素は、操作された三次元生物学的癌モデルを含む。
【０１５５】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルのアレイは、予め決められたパターンで空間的に並べられた複数の要素を含む。さらなる態様において、パターンは、要素の任意の適切な空間配置である。様々な態様において、配置のパターンには、非限定的な例として、二次元格子(grid)、三次元格子、1つまたは複数の線、弧(arc)、または丸、一続きの横列または縦列などが含まれる。さらなる態様において、パターンは、ミディアムスループットもしくはハイスループットの生物学的アッセイまたはスクリーニング方法もしくは装置と適合するように選択される。
【０１５６】
一部の態様において、アレイの内部にある、それぞれの操作された三次元生物学的癌モデルは独立して培養状態で維持される。さらなる態様において、アレイの内部にある各モデル組織の培養条件は、他の組織から隔離され、培地も、培地に溶けている因子も交換できないような条件である。さらなる態様において、アレイの内部にある2以上の個々の組織モデルの培養条件は、培地および培地に溶けている因子を他の組織と交換するような条件である。様々な態様において、組織モデルのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、もしくはそれより多く、その中の増加分を含めて、交換培地、および/または可溶性因子がアレイの内部にある。他の様々な態様において、組織モデルの1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％、その中の増加分を含めて、交換培地、および/または可溶性因子がアレイの内部にある。
【０１５７】
一部の態様において、本明細書に記載の操作された三次元生物学的癌モデルは、非限定的な例として、画像に基づくアッセイ、分泌タンパク質の測定、マーカーの発現、およびタンパク質の産生において用いられ得る。様々なさらなる態様において、本明細書に記載の操作された三次元生物学的癌モデルは、分子結合(放射性リガンド結合を含む)、分子の取り込み、活性(例えば、酵素活性および受容体活性など)、遺伝子発現、タンパク質発現、受容体アゴニズム、受容体アンタゴニズム、細胞シグナル伝達、アポトーシス、化学感受性、トランスフェクション、細胞遊走、走化性、細胞生存率、細胞増殖、安全性、効力、代謝、毒性、および乱用傾向(abuse liability)の1つまたは複数を検出または測定するためのアッセイにおいて用いられ得る。
【０１５８】
一部の態様において、本明細書に記載の操作された三次元生物学的癌モデルはイムノアッセイにおいて用いられ得る。さらなる態様において、イムノアッセイは競合的イムノアッセイまたは非競合的イムノアッセイである。競合的イムノアッセイでは、例えば、試料中の抗原は抗体との結合において標識抗原と競合し、次いで、抗体部位に結合した標識抗原の量が測定される。非競合的イムノアッセイ(「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる)では、例えば、試料中の抗原は抗体部位に結合し、その後に、標識抗体が抗原に結合し、次いで、その部位上にある標識抗体の量が測定される。
【０１５９】
一部の態様において、本明細書に記載の操作された三次元生物学的癌モデルは酵素結合免疫測定法(ELISA)において用いられ得る。さらなる態様において、ELISAは、試料中の抗体または抗原の存在を検出するのに用いられる生化学的技法である。ELISAでは、例えば、特定の抗原に対して特異性を有する少なくとも1種類の抗体が利用される。さらなる例として、未知量の抗原を含む試料が、固体支持体(例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート)上に非特異的に(表面への吸着を介して)、または特異的に(「サンドイッチ」ELISAでは、同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉を介して)固定化される。なおさらなる例として、抗原が固定化された後に検出抗体が添加されると、抗原との複合体が形成する。例えば、検出抗体は酵素と共有結合しているか、またはそのものが、バイオコンゲーション(bioconjugation)によって酵素と結合した二次抗体によって検出される。
【０１６０】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルのアレイは、薬物スクリーニングに、創薬に、または癌を処置するための候補治療剤を特定するために用いられ得る。さらなる態様において、操作された三次元生物学的モデルのアレイは、薬物スクリーニング、創薬、または個別化医療のためのキットの一部でもよい。一部の態様において、それぞれの操作された三次元生物学的癌モデルは生体適合性マルチウェル容器のウェルの内部に存在してもよく、この容器は、1つまたは複数の自動薬物スクリーニング手順および/または装置と適合する。さらなる態様において、自動薬物スクリーニング手順および/または装置には、コンピュータまたはロボットにより支援される任意の適切な手順または装置が含まれる。
【０１６１】
癌を処置するための治療剤を特定する方法であって、
(a)候補治療剤を、本明細書に記載の操作された三次元生物学的癌モデルまたは複数の操作された三次元生物学的癌モデルと接触させる工程;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞に対する効果を測定する工程;および
(c)測定された効果に基づいて、癌を処置するための治療剤を選択する工程
を含む、方法が提供される。
【０１６２】
一態様において、前記方法は、個体において癌を処置するための治療剤を特定するための方法であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、その個体に由来する。別の態様において、癌は、乳癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、腸(例えば、結腸直腸)癌、膵臓癌、または皮膚癌である。別の態様において、癌は、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、食道癌、または精巣癌である。
【０１６３】
一態様において、間質細胞は乳房間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、乳癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は肺間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、肺癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は肝臓間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、肝臓癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は腎臓間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、腎臓癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は前立腺間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、前立腺癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は腸(例えば、結腸直腸)間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、腸(例えば、結腸直腸)癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は膵臓細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、膵臓癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は皮膚細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、皮膚癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は胃間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、胃癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は卵巣間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、卵巣癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は子宮頸部間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、子宮頸癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は子宮間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、子宮癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は膀胱間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、膀胱癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は食道間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、食道癌を有する個体に由来する。別の態様において、間質細胞は精巣間質細胞であり、前記腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、精巣癌を有する個体に由来する。
【０１６４】
別の態様において、複数の癌モデルの各癌モデルは特定の癌タイプのサブタイプである。
【０１６５】
別の態様において、癌モデルは静的培養条件下で培養培地中にある。別の態様において、癌モデルは非静的培養条件下で培養培地中にある。一態様において、非静的条件は、癌モデルを横切るラテラルフローである。実施例8に開示されるように、癌モデルを横切る培養培地のラテラルフローが、薬物試験のより良いモデルをもたらすことが予期せず発見された。
【０１６６】
別の態様において、前記アッセイはハイスループットアッセイで行われる。
【０１６７】
初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞に対する効果は、
周知の方法に従って、
(a)初代腫瘍もしくは初代腫瘍断片のサイズの何らかの縮小を検出すること;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の成長の何らかの低下を検出すること;
(c)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるアポトーシスを検出すること;
(d)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の損傷の程度を検出すること;
(e)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の生存率の低下を検出すること;
(f)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の表面における細胞マーカーの出現もしくは消失を検出すること;
(g)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の増殖もしくは成長の速度の変化を検出すること;
(h)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の染色の変化を検出すること;
(i)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるRNAもしくはDNAおよび/または発現レベルの変化を検出すること;
(j)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるタンパク質発現の変化を検出すること;
(k)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるサイトカインの発現もしくはレベルの変化を検出すること;または
(l)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるT細胞動員、ミエロイド系列細胞動員、浸潤、および/もしくは活性化を検出すること
の1つまたは複数によって測定され得る。
【０１６８】
操作された三次元生物学的癌モデルを用いて試験され得る候補治療剤には、既知の抗癌剤、または抗癌特性について試験されている抗癌剤が含まれる。抗癌剤の例には、アロマターゼ阻害剤;抗エストロゲン;抗アンドロゲン;ゴナドレリンアゴニスト;トポイソメラーゼI阻害剤;トポイソメラーゼII阻害剤;微小管活性剤;アルキル化剤;レチノイド、カロンテノイド(carontenoid)、もしくはトコフェロール;シクロオキシゲナーゼ阻害剤;MMP阻害剤;mTOR阻害剤;代謝拮抗物質;プラチン(platin)化合物;メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤;ビスホスホネート;抗増殖性抗体;ヘパラナーゼ阻害剤;Ras発癌アイソフォームの阻害剤;テロメラーゼ阻害剤;プロテアソーム阻害剤;血液悪性腫瘍の処置において用いられる化合物;Flt-3阻害剤;Hsp90阻害剤;キネシン紡錘体タンパク質阻害剤;MEK阻害剤;抗腫瘍性抗生物質;ニトロソ尿素;タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする/減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする/減少させる化合物、または任意のさらなる抗血管新生化合物が含まれるが、これに限定されない。
【０１６９】
非限定的な例示的なアロマターゼ阻害剤には、ステロイド、例えば、アタメスタン(atamestane)、エキセメスタン、およびホルメスタン、および非ステロイド、例えば、アミノグルテチミド、ログレチミド(roglethimide)、ピリドグルテチミド(pyridoglutethimide)、トリロスタン、テストラクトン、ケトコナゾール(ketokonazole)、ボロゾール、ファドロゾール、アナストロゾール、およびレトロゾールが含まれるが、これに限定されない。
【０１７０】
非限定的な抗エストロゲンには、タモキシフェン、フルベストラント、ラロキシフェン、および塩酸ラロキシフェンが含まれるが、これに限定されない。抗アンドロゲンにはビカルタミドが含まれるが、これに限定されない。ゴナドレリンアゴニストには、アバレリックス、ゴセレリン、および酢酸ゴセレリンが含まれるが、これに限定されない。
【０１７１】
例示的なトポイソメラーゼI阻害剤には、トポテカン、ギマテカン(gimatecan)、イリノテカン、カンプトテシンおよびその類似体、9-ニトロカンプトテシン、ならびに高分子カンプトテシン結合体PNU-166148が含まれるが、これに限定されない。トポイソメラーゼII阻害剤には、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、およびネモルビシン(nemorubicin);アントラキノン、例えば、ミトキサントロンおよびロソキサントロン(losoxantrone);ならびにポドフィロトキシン(podophillotoxine)、例えば、エトポシドおよびテニポシドが含まれるが、これに限定されない。
【０１７２】
微小管活性薬剤には、タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル;ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンクリスチン、および硫酸ビンクリスチン、ならびにビノレルビン;ディスコデルモリド;コチヒン(cochicine)およびエポシロン、ならびにその誘導体を含むが、これに限定されない、微小管安定化化合物、微小管不安定化化合物、およびマイクロチューブリン(microtubulin)重合阻害剤が含まれる。
【０１７３】
例示的な非限定的なアルキル化剤には、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ならびにニトロソ尿素、例えば、カルムスチンおよびロムスチンが含まれる。
【０１７４】
例示的な非限定的なシクロオキシゲナーゼ阻害剤には、Cox-2阻害剤、5-アルキル置換2-アリールアミノフェニル酢酸および誘導体、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、バルデコキシブ、または5-アルキル-2-アリールアミノフェニル酢酸、例えば、ルミラコキシブが含まれる。
【０１７５】
例示的な非限定的なマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤(「MMP阻害剤」)には、コラーゲンペプチドミメティックおよび非ペプチドミメティック阻害剤、テトラサイクリン誘導体、バチマスタット、マリマスタット、プリノマスタット、メタスタット(metastat)、BMS-279251、BAY12-9566、TAA211、MMI270B、ならびにAAJ996が含まれる。
【０１７６】
例示的な非限定的なmTOR阻害剤には、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質(mTOR)を阻害し、抗増殖活性を有する化合物、例えば、シロリムス、エベロリムス、CCI-779、およびABT578が含まれる。
【０１７７】
例示的な非限定的な代謝拮抗物質には、5-フルオロウラシル(5-FU)、カペシタビン、ゲムシタビン、DNA脱メチル化合物、例えば、5-アザシチジンおよびデシタビン、メトトレキセートおよびエダトレキサート、ならびに葉酸アンタゴニスト、例えば、ペメトレキセドが含まれる。
【０１７８】
例示的な非限定的なプラチン化合物には、カルボプラチン、シスプラチン、シスプラチナム、およびオキサリプラチンが含まれる。
【０１７９】
例示的な非限定的なメチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤には、ベンガミド(bengamide)またはその誘導体ならびにPPI-2458が含まれる。
【０１８０】
例示的な非限定的なビスホスホネートには、エトリドン酸(etridonic acid)、クロドロン酸、チルドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸、およびゾレドロン酸が含まれる。
【０１８１】
例示的な非限定的な抗増殖性抗体には、トラスツズマブ、トラスツズマブ-DMl、セツキシマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、PR064553、および2C4が含まれる。「抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体、および望ましい生物学的活性を示す限り抗体断片を含むことが意図される。
【０１８２】
例示的な非限定的なヘパラナーゼ阻害剤には、硫酸ヘパリン分解を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、PI-88およびOGT2115が含まれる。
【０１８３】
本明細書で使用する、H-Ras、K-Ras、またはN-Rasなどの「Ras発癌アイソフォームの阻害剤」という用語は、Rasの発癌活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、L-744832、DK8G557、ティピファニブ、およびロナファーニブを指す。
【０１８４】
例示的な非限定的なテロメラーゼ阻害剤には、テロメラーゼ活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、テロメラーゼ受容体を阻害する化合物、例えば、テロメスタチンが含まれる。
【０１８５】
例示的な非限定的なプロテアソーム阻害剤には、ボルテゾミド(bortezomid)を含むが、これに限定されない、プロテアソーム活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物が含まれる。
【０１８６】
本明細書で使用する「血液悪性腫瘍の処置において用いられる化合物」という句は、FMS様チロシンキナーゼ受容体(Flt-3R)の活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物であるFMS様チロシンキナーゼ阻害剤;インターフェロン、I-β-D-アラビノフランシルシトシン(arabinofuransylcytosine)(ara-c)、およびビスルファン(bisulfan);ならびに未分化リンパ腫キナーゼを標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物であるALK阻害剤を含む。
【０１８７】
例示的な非限定的なFlt-3阻害剤には、PKC412、ミドスタウリン、スタウロスポリン誘導体、SU11248、およびMLN518が含まれる。
【０１８８】
例示的な非限定的なHSP90阻害剤には、HSP90の内在性のATPアーゼ活性を標的とするか、減少させるか、もしくは阻害する化合物;またはユビキチンプロテオソーム経路を介してHSP90クライアント(client)タンパク質を分解するか、標的とするか、減少させるか、もしくは阻害する化合物が含まれる。HSP90の内在性ATPアーゼ活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物は、特に、HSP90のATPアーゼ活性を阻害する化合物、タンパク質、または抗体、例えば、17-アリルアミノ,17-デメトキシゲルダナマイシン(17AAG)、ゲルダナマイシン誘導体;他のゲルダナマイシン関連化合物;ラディシコールおよびHDAC阻害剤である。
【０１８９】
タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性;またはタンパク質または脂質ホスファターゼ活性を標的とする/減少させる化合物;あるいは任意のさらなる抗血管新生化合物には、タンパク質チロシンキナーゼならびに/またはセリンおよび/もしくはスレオニンキナーゼ阻害剤または脂質キナーゼ阻害剤、例えば、a)血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)の活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、PDGFRの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体、例えば、イマチニブ、SUlOl、SU6668、およびGFB-111;b)線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)の活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物;c)インシュリン様増殖因子受容体I(IGF-IR)の活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、IGF-IRの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物;d)Trk受容体型チロシンキナーゼファミリーの活性を標的とするか、減少させるか、もしくは阻害する化合物、またはエフリンB4阻害剤;e)Axl受容体型チロシンキナーゼファミリーの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物;f)Ret受容体型チロシンキナーゼの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物;g)Kit/SCFR受容体型チロシンキナーゼの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、イマチニブ;h)c-Kit受容体型チロシンキナーゼの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、イマチニブ;i)c-Ablファミリーのメンバー、その遺伝子融合産物(例えば、Bcr-Ablキナーゼ)および変異体の活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体、例えば、イマチニブまたはニロチニブ;PD180970;AG957;NSC680410;PD173955;またはダサチニブ;j)プロテインキナーゼC(PKC)およびセリン/スレオニンキナーゼのRafファミリーのメンバー、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK1、PKB/Akt、およびRas/MAPKファミリーのメンバー、ならびに/またはサイクリン依存性キナーゼファミリー(CDK)のメンバーの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、米国特許第5,093,330号に開示されるスタウロスポリン誘導体、例えば、ミドスタウリン。さらなる化合物の例には、UCN-01、サフィンゴール、BAY43-9006、ブリオスタチン1、ペリフォシン;リモフォシン(ilmofosine);RO318220およびRO320432;GO6976;Isis3521;LY333531/LY379196;イソキノリン(isochinoline)化合物;ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤;PD184352またはQAN697、またはAT7519が含まれる;k)タンパク質-チロシンキナーゼの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物、例えば、メシル酸イマチニブまたはチロホスチン、例えば、チロホスチンA23/RG-50810;AG99;チロホスチンAG213;チロホスチンAG1748;チロホスチンAG490;チロホスチンB44;チロホスチンB44(+)鏡像異性体;チロホスチンAG555;AG494;チロホスチンAG556、AG957、およびアダフォスチン(4-{[(2,5-ジヒドロキシフェニル)メチル]アミノ}-安息香酸アダマンチルエステル;NSC680410、アダフォスチン);l)受容体型チロシンキナーゼの上皮細胞増殖因子ファミリーの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物(ホモ二量体またはヘテロ二量体としてEGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)およびその変異体、例えば、CP358774、ZD1839、ZM105180;トラスツズマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、OSI-774、Cl-1033、EKB-569、GW-2016、抗体E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3、およびE7.6.3、ならびに7H-ピロロ-[2,3-d]ピリミジン誘導体;ならびにm)c-Met受容体の活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する化合物が含まれる。
【０１９０】
タンパク質または脂質ホスファターゼの活性を標的とするか、減少させるか、または阻害する例示的な化合物には、ホスファターゼ1、ホスファターゼ2A、またはCDC25の阻害剤、例えば、オカダ酸またはその誘導体が含まれる。
【０１９１】
さらなる抗血管新生化合物には、タンパク質または脂質キナーゼ阻害に関連しない別の活性機構を有する化合物、例えば、サリドマイドおよびTNP-470が含まれる。
【０１９２】
さらなる非限定的な候補治療剤には、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、カルボプラチン、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、リン酸フルダラビン、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1,3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、もしくはその薬学的に許容される塩、コハク酸1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、アンギオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン(macugon);FLT-4阻害剤、FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgGI抗体、RPI4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-a-エピヒドロコチゾール(epihydrocotisol)、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および/もしくはアンタゴニスト、生物学的応答調節物質、例えば、リンホカインまたはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、ならびにsiRNAが含まれる。
【０１９３】
さらなる非限定的な候補治療剤には、免疫療法、例えば、養子T細胞移入、Tc細胞およびNK細胞を活性化させる免疫チェックポイント阻害剤、ならびに免疫細胞のリプログラミングおよび枯渇が含まれる。養子T細胞移入において、候補治療剤の非限定的な例には、遺伝子組換えされたT細胞、例えば、合成TCRまたはT細胞を連続して活性化させることができるキメラ抗原受容体(CAR)が遺伝子導入されたT細胞が含まれる。CAR受容体を発現するように遺伝子組換えされたT細胞の養子移入は、CD19の目標をB-ALL、CLL、およびMMにするのに使用することができる。免疫チェックポイント阻害剤がTc細胞およびNK細胞を活性化させる場合、候補治療剤の非限定的な例には、抗CTLA-4(すなわち、イピリムマブ(Yervoy))、抗PD-L1(すなわち、ペンブロリズマブ(Keytruda))、抗PD1(すなわち、ニボルマブ(Opdivo))、および抗KIR(すなわち、リルルマブ(lirulumab))が含まれる。免疫細胞のリプログラミングおよび枯渇の場合、候補治療剤の非限定的な例には、抗CSF1R、抗CXCR4(すなわち、AMD3100(Plerixafor))、抗CXCR2(すなわち、AZD5069)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(すなわち、IDO1)阻害剤(Epacadostat))、およびアルギナーゼ阻害剤(すなわち、CB-1158))が含まれる。
【０１９４】
候補治療剤で処置され得る癌には、副腎癌、腺房細胞腫、聴神経腫、末端黒子型(acral lentigious)黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性赤白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺様歯原性腫瘍、腺扁平上皮癌、脂肪組織新生物、副腎皮質癌、成人T細胞白血病/リンパ腫、高悪性度NK細胞白血病、AIDS関連リンパ腫、胞巣状横紋筋肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、未分化大細胞リンパ腫、組織非形成性甲状腺癌、血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、星状細胞腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞前リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、芽腫、骨癌、ブレンナー腫瘍、ブラウン腫瘍、バーキットリンパ腫、乳癌、脳癌、癌腫、上皮内癌、癌肉腫、軟骨腫瘍、セメント質腫、骨髄肉腫、軟骨腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、腎臓の明細胞肉腫、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、デゴス病、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍(dysembryoplastic neuroepithelial tumor)、未分化胚細胞腫、胚性癌腫、内分泌腺新生物、内胚葉洞腫瘍、腸症関連T細胞リンパ腫、食道癌、胎児内胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺癌、神経節神経腫、胃腸癌、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛癌(gestational choriocarcinoma)、巨細胞線維芽細胞腫、骨の巨細胞腫瘍、グリア腫瘍、多形性神経膠芽腫、神経膠腫、大脳神経膠腫症、グルカゴノーマ、性腺芽腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、胆嚢癌、胃癌、毛様細胞性白血病、血管芽腫、頭頚部癌、血管周囲細胞腫、血液腫瘍、肝芽腫、肝脾T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、浸潤性小葉癌、腸癌、腎臓癌、喉頭癌、悪性黒子、致死性正中癌、白血病、ライディッヒ細胞腫、脂肪肉腫、肺癌、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病(acute myelogeous leukemia)、慢性リンパ球性白血病、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、MALTリンパ腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫、悪性トリトン腫瘍、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、マスト細胞白血病、縦隔生殖細胞腫瘍、乳房の髄様癌、甲状腺髄様癌、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性尿路上皮癌、ミュラー管混合腫瘍、粘液性腫瘍、多発性骨髄腫、筋肉組織新生物、菌状息肉腫、粘液性脂肪肉腫、粘液腫、粘液肉腫、鼻咽頭癌、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経腫、結節型黒色腫、眼癌、乏突起膠星細胞腫、乏突起神経膠腫、オンコサイトーマ、視神経鞘髄膜腫、視神経腫瘍、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、パンコースト腫瘍、甲状腺乳頭癌、パラガングリオーマ、松果体芽腫、松果体細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫、多胚腫、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、膵臓癌、咽頭癌、腹膜偽粘液腫(pseudomyxoma periotonei)、腎細胞癌、腎臓髄様癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒタートランスフォーメーション(Richter's transformation)、直腸癌、肉��、神経鞘腫症、セミノーマ、セルトリ細胞腫、性索性腺間質腫瘍、印環細胞癌、皮膚癌、小青色円形細胞腫瘍(small blue round cell tumor)、小細胞癌、軟部組織肉腫、ソマトスタチノーマ、ばい煙性いぼ、脊髄腫瘍、脾臓周辺帯リンパ腫、扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)、滑膜肉腫、セザリー病、小腸癌、扁平上皮癌(squamous carcinoma)、胃癌、T細胞リンパ腫、精巣癌、莢膜細胞腫、甲状腺癌、移行上皮癌、咽頭癌、尿膜管癌、泌尿生殖器癌、尿路上皮癌、ぶどう膜黒色腫、子宮癌、いぼ状癌、視覚路神経膠腫、外陰部癌、腟癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ワルティン腫瘍、およびウィルムス腫瘍が含まれるが、これに限定されない。本明細書に記載の癌モデルでは、上述の癌に由来する任意の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞を使用することができる。
【０１９５】
方法
本明細書に記載のエクスビボ系は、高密度のバイオプリント三次元間質カプセルまたは間質ブロックを含む。組織の外面にある線維芽細胞は、切開と、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の移植を容易にする。ヒト間質環境があると、腫瘍細胞に対する免疫療法の試験を容易にするための、免疫細胞、患者特異的腫瘍細胞の保持ならびに/または免疫細胞の動員および保持が可能になる。
【０１９６】
従って、一部の態様では、操作された三次元生物学的癌モデルを製作する方法は、中胚葉に由来する結合組織細胞を含むバイオインクを調製する工程を含む。さらなる態様において、間質バイオインクは1つまたは複数の間質細胞タイプを含む。なおさらなる態様において、間質細胞タイプは、ヒト乳房線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞、前脂肪細胞、または脂肪細胞と前脂肪細胞の組み合わせの1つまたは複数を含む。一部の態様において、間質バイオインクは1種類または複数種の押出し化合物を含む。様々な態様において、適切な押出し化合物には、非限定的な例として、アルギン酸塩、ヒドロゲル、Novogel、Matrigel、細胞外マトリックス成分などが含まれる。様々なさらなる態様において、適切な押出し化合物には、非限定的な例として、水溶性、架橋性、および生分解性のポリマー、ゲルなどが含まれる。一態様において、押出し化合物は押出される前、押出されている間、または押出された後にUV放射線への曝露によって架橋される。US2014/0093932を参照されたい。別の態様において、架橋された押出し化合物は細胞密着後に酵素分解によって除去される。例えば、押出し化合物がアルギン酸塩である場合、アルギン酸リアーゼの存在下でのインキュベーションによって除去され得る。
【０１９７】
間質バイオインクは、積み重ねられた細胞アレイを形成するように適切に調製および堆積され、天然間質組織をある程度まで再現する操作された三次元間質組織を形成するように成熟される。操作された間質組織には、操作、注射、および切開を十分に許容する構造完全性がある。そして、多くの操作された上皮間質組織が、本明細書に記載の方法での使用に適している。
【０１９８】
バイオプリント構築物は、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃度、多細胞体(例えば、円柱、回転楕円体、リボンなど)と、任意で、閉じ込め(confinement)材料を含む細胞アレイを生体適合面(例えば、ヒドロゲルおよび/または多孔膜で構成される)に三次元送達装置(例えば、バイオプリンター)によって三次元で自動的にコンピュータ支援を用いて堆積させることに基づく迅速な試作技術を利用する方法によって作られる。一部の態様において、本明細書で使用する「操作された」という用語は、組織について言及している時には、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞凝集物、およびその層が、コンピュータスクリプトに従ってコンピュータ支援装置(例えば、バイオプリンター)によって三次元構造を形成するようにアレイの形態で配置されることを意味する。さらなる態様において、コンピュータスクリプトは、例えば、1つまたは複数のコンピュータプログラム、コンピュータアプリケーション、またはコンピュータモジュールである。なおさらなる態様において、三次元組織構造は、細胞または多細胞体のプリンティング後、融合によって形成し、この融合は、場合によっては、初期形態形成における自己集合現象に似ている。
【０１９９】
細胞、多細胞凝集物、および/またはその層を生体適合面に並べて三次元構造を生成するために、手作業による配置を含む多くの方法を利用することができるが、バイオプリンターなどの自動コンピュータ支援機械によるアレイへの配置が有利である。この技術を用いて細胞または多細胞体を送達する利点には、細胞または多細胞体を迅速、正確に、かつ再現可能に配置して、計画された、または予め決められた、様々な組成を有する細胞、多細胞凝集物、および/またはその層のアレイを示す構築物を生成することが含まれる。利点には、細胞損傷を最小限にしながら、高い細胞密度が保証されることも含まれる。
【０２００】
一部の態様において、バイオプリンティング方法は連続する、および/または実質的に連続する。連続バイオプリンティング方法の非限定的な例は、バイオプリンターからバイオインク(すなわち、細胞、賦形剤もしくは押出し化合物と組み合わせた細胞、または細胞凝集物)を、バイオインクのリザーバーと接続した分注用先端(例えば、注射器、針、毛細管チューブなど)を通して分注することである。さらなる非限定的な態様において、連続バイオプリンティング方法はバイオインクを機能単位の反復パターンで分注する。様々な態様において、反復機能単位は、例えば、丸、四角、長方形、三角、多角形、および不規則な外形を含む任意の適切な外形を有し、それによって、別個のバイオインクおよび/または空隙の空間的パターン成形を介して平面外形を有する1つまたは複数の組織層が得られる。さらなる態様において、バイオプリントされた機能単位の反復パターンは複数の層を含み、複数の層は、層状外形を有する操作された組織または臓器を形成するように隣り合って(例えば、積み重ねられて)バイオプリントされる。様々な態様において、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、またはそれより多い層が、操作された組織を形成するように隣り合って(例えば、積み重ねられて)バイオプリントされる。さらなる態様において、層状外形を有する1つまたは複数の組織層は平面外形も有する。
【０２０１】
一部の態様において、バイオプリントされた機能単位は碁盤目状(tessellated)パターンで繰り返し現れる。「碁盤目状パターン」とは、重複も隙間もなく平面を占めている、図形からなる平面である。連続する、および/または碁盤目状のバイオプリンティングの利点には、非限定的な例として、バイオプリント組織の生産性が高いことが含まれる。別の非限定的な例示的な利点は、バイオプリンターを、以前に堆積されたバイオインク要素にそろえる必要がないことである。一部の態様では、連続バイオプリンティングを行うと、任意で、注射機構を用いて大きなバイオインクリザーバーから、もっと大きな組織を印刷することが容易になる。連続バイオプリンティングはまた、押出し化合物、ヒドロゲル、ポリマー、バイオインク、または印刷後に形状を保持することができる任意の印刷可能な材料を用いて、空間的に規定された境界を同時印刷する便利な手法でもあり、作られた境界は、任意で、1種類または複数種のバイオインクのバイオプリンティングを介して埋められ、それによって、空間的に規定された平面外形を有するモザイク組織が作られる。
【０２０２】
一部の態様において、間質バイオインクはバイオプリンター装置によって堆積される。適切なバイオプリンターには、Novogen Bioprinter(登録商標)(Organovo, Inc., San Diego, CA)が含まれる。一部の態様において、バイオプリンティングは、固体または半固体のバイオインクを表面に押出して、一層一層積み重ねられたアレイを得る工程を含む。
【０２０３】
バイオプリント組織の多くの形状およびサイズが適している。例として、様々な態様において、バイオプリント組織の適切な形状には、平面、長方形、立方形、三角形、角錐、五角形、六角形、円柱形、回転楕円体、卵形、および不規則が含まれる。例として、様々な態様において、バイオプリント組織の適切なサイズには、約100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、950μm、960μm、970μm、980μm、990μm、1000μm、またはそれより大きなサイズが、その中の増加分を含めて含まれる。さらなる例として、様々な態様において、バイオプリント組織の適切なサイズには、約1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、またはそれより大きなサイズが、その中の増加分を含めて含まれる。本明細書において提供される開示を考慮すれば、最小サイズは、一部の態様では、少なくとも一つには、開口部を形成するのに、表面にある組織の切開または注射に必要な、利用可能な面積によって決まることを当業者は認める。同様に、本明細書において提供される開示を考慮すれば、最大サイズは、一部の態様では、少なくとも一つには、栄養分と気体が組織の中心に到達する能力によって決まることを当業者は認める。
【０２０４】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルを製作する方法は、堆積したバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程を含む。一態様において、細胞培養培地は真核細胞培養培地である。本発明の実施において用いられ得る真核細胞培養培地の例には、BGJb、BME、ブリンスター（Brinster）BMOC-3、CMRL、C02独立培地(C02-Independent Medium)、DMEM培地、DMEM/F-12培地、F-10栄養混合物(Nutrient Mixture)、F-12栄養混合物、グラスゴー(Glasgow)(G-MEM)、変法MEM(Improved MEM)、イスコブ(Iscove)(IMDM)、レイボヴィッツ(Leibovitz)L-15、マッコイ(McCoy)5A、MCDB131、培地199、最小必須培地(MEM)、変法イーグル培地(MEM)、Opti-MEM(登録商標)I、フィッシャー(Fischer)培地、MEM Rega-3、NCTC-135培地、RPMI培地1640、ウェイマウス(Waymouth)MB752/1、およびウィリアムズ(Williams)培地E(ThermoFisher Scientific, Grand Island, New York)が含まれる。さらなる態様において、細胞培養物中で成熟させると細胞は密着して、操作された三次元間質組織が形成する。なおさらなる態様において、細胞培養培地中で成熟させると押出し化合物の除去が容易になる。
【０２０５】
一部の態様において、操作された間質組織は非静的培養条件下でコンディショニングされる。非静的条件下でプレコンディショニングされた間質組織は組織の外面に高密度の線維芽細胞被膜を呈し、これは、針による注射および/またはメスによる切開を容易にする。
【０２０６】
非静的条件には、液体細胞培養物が動いている条件が含まれる。非静的条件は、例えば、ローティングウォールベッセル(rotating wall vessel)または回転細胞培養系のように、スピナーフラスコ(攪拌懸濁液)、ローラーボトル(roller bottle)、灌流、エアレーション、攪拌、または回転を用いて引き起こされてもよい。スピナーフラスコの例には、Corning(登録商標)ProCultureスピナーフラスコおよびCorning(登録商標)使い捨てスピナーフラスコ(Sigma-Aldrich, St. Louis、Missouri)が含まれるが、これに限定されない。ローラーボトルの例には、Corning(登録商標)Roller Bottles CellBIND(登録商標)Cell Culture SurfaceおよびCorning(登録商標)Roller Bottles Tissue Culture Treated(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)が含まれるが、これに限定されない。ローティングウォールベッセルの例には、Disposable HARV、HARV、およびSTLV(Synthecon, Houston, Texas)が含まれるが、これに限定されない。
【０２０７】
剪断応力は、液体と遠位(distal)細胞膜との摩擦によって引き起こされる機械的な力である。剪断応力には、一方向の層流、拍動性の層流、乱流、振動流、および不均一な層流性剪断応力が含まれ得る。層流性剪断応力の例には、28ダイン/cm2未満、5〜25ダイン/cm2、6〜25ダイン/cm2、7〜25ダイン/cm2、8〜25ダイン/cm2、9〜25ダイン/cm2、10〜25ダイン/cm2、11〜25ダイン/cm2、12〜25ダイン/cm2、13〜25ダイン/cm2、14〜25ダイン/cm2、15〜25ダイン/cm2、16〜25ダイン/cm2、17〜25ダイン/cm2、18〜25ダイン/cm2、19〜25ダイン/cm2、20〜25ダイン/cm2、21〜25ダイン/cm2、22〜25ダイン/cm2、23〜25ダイン/cm2、24〜25ダイン/cm2、5〜24ダイン/cm2、6〜24ダイン/cm2、7〜24ダイン/cm2、8〜24ダイン/cm2、9〜24ダイン/cm2、10〜24ダイン/cm2、11〜24ダイン/cm2、12〜24ダイン/cm2、13〜24ダイン/cm2、14〜24ダイン/cm2、15〜24ダイン/cm2、16〜24ダイン/cm2、17〜24ダイン/cm2、18〜24ダイン/cm2、19〜24ダイン/cm2、20〜24ダイン/cm2、21〜24ダイン/cm2、22〜24ダイン/cm2、23〜24ダイン/cm2、5〜23ダイン/cm2、6〜23ダイン/cm2、7〜23ダイン/cm2、8〜23ダイン/cm2、9〜23ダイン/cm2、10〜23ダイン/cm2、11〜23ダイン/cm2、12〜23ダイン/cm2、13〜23ダイン/cm2、14〜23ダイン/cm2、15〜23ダイン/cm2、16〜23ダイン/cm2、17〜23ダイン/cm2、18〜23ダイン/cm2、19〜23ダイン/cm2、20〜23ダイン/cm2、21〜23ダイン/cm2、22〜23ダイン/cm2、5〜22ダイン/cm2、6〜22ダイン/cm2、7〜22ダイン/cm2、8〜22ダイン/cm2、9〜22ダイン/cm2、10〜22ダイン/cm2、11〜22ダイン/cm2、12〜22ダイン/cm2、13〜22ダイン/cm2、14〜22ダイン/cm2、15〜22ダイン/cm2、16〜22ダイン/cm2、17〜22ダイン/cm2、18〜22ダイン/cm2、19〜22ダイン/cm2、20〜22ダイン/cm2、21〜22ダイン/cm2、5〜21ダイン/cm2、6〜21ダイン/cm2、7〜21ダイン/cm2、8〜21ダイン/cm2、9〜21ダイン/cm2、10〜21ダイン/cm2、11〜21ダイン/cm2、12〜21ダイン/cm2、13〜21ダイン/cm2、14〜21ダイン/cm2、15〜21ダイン/cm2、16〜21ダイン/cm2、17〜21ダイン/cm2、18〜21ダイン/cm2、19〜21ダイン/cm2、20〜21ダイン/cm2、5〜20ダイン/cm2、6〜20ダイン/cm2、7〜20ダイン/cm2、8〜20ダイン/cm2、9〜20ダイン/cm2、10〜20ダイン/cm2、11〜20ダイン/cm2、12〜20ダイン/cm2、13〜20ダイン/cm2、14〜20ダイン/cm2、15〜20ダイン/cm2、16〜20ダイン/cm2、17〜20ダイン/cm2、18〜20ダイン/cm2、19〜20ダイン/cm2、5〜19ダイン/cm2、6〜19ダイン/cm2、7〜19ダイン/cm2、8〜19ダイン/cm2、9〜19ダイン/cm2、10〜19ダイン/cm2、11〜19ダイン/cm2、12〜19ダイン/cm2、13〜19ダイン/cm2、14〜19ダイン/cm2、15〜19ダイン/cm2、16〜19ダイン/cm2、17〜19ダイン/cm2、18〜19ダイン/cm2、5〜18ダイン/cm2、6〜18ダイン/cm2、7〜18ダイン/cm2、8〜18ダイン/cm2、9〜18ダイン/cm2、10〜18ダイン/cm2、11〜18ダイン/cm2、12〜18ダイン/cm2、13〜18ダイン/cm2、14〜18ダイン/cm2、15〜18ダイン/cm2、16〜18ダイン/cm2、17〜18ダイン/cm2、5〜17ダイン/cm2、6〜17ダイン/cm2、7〜17ダイン/cm2、8〜17ダイン/cm2、9〜17ダイン/cm2、10〜17ダイン/cm2、11〜17ダイン/cm2、12〜17ダイン/cm2、13〜17ダイン/cm2、14〜17ダイン/cm2、15〜17ダイン/cm2、16〜17ダイン/cm2、5〜16ダイン/cm2、6〜16ダイン/cm2、7〜16ダイン/cm2、8〜16ダイン/cm2、9〜16ダイン/cm2、10〜16ダイン/cm2、11〜16ダイン/cm2、12〜16ダイン/cm2、13〜16ダイン/cm2、14〜16ダイン/cm2、15〜16ダイン/cm2、5〜15ダイン/cm2、6〜15ダイン/cm2、7〜15ダイン/cm2、8〜15ダイン/cm2、9〜15ダイン/cm2、10〜15ダイン/cm2、11〜15ダイン/cm2、12〜15ダイン/cm2、13〜15ダイン/cm2、14〜15ダイン/cm2、5〜14ダイン/cm2、6〜14ダイン/cm2、7〜14ダイン/cm2、8〜14ダイン/cm2、9〜14ダイン/cm2、10〜14ダイン/cm2、11〜14ダイン/cm2、12〜14ダイン/cm2、13〜14ダイン/cm2、5〜13ダイン/cm2、6〜13ダイン/cm2、7〜13ダイン/cm2、8〜13ダイン/cm2、9〜13ダイン/cm2、10〜13ダイン/cm2、11〜13ダイン/cm2、12〜13ダイン/cm2、5〜12ダイン/cm2、6〜12ダイン/cm2、7〜12ダイン/cm2、8〜12ダイン/cm2、9〜12ダイン/cm2、10〜12ダイン/cm2、11〜12ダイン/cm2、5〜11ダイン/cm2、6〜11ダイン/cm2、7〜11ダイン/cm2、8〜11ダイン/cm2、9〜11ダイン/cm2、10〜11ダイン/cm2、5〜10ダイン/cm2、6〜10ダイン/cm2、7〜10ダイン/cm2、8〜10ダイン/cm2、9〜10ダイン/cm2、5〜9ダイン/cm2、6〜9ダイン/cm2、7〜9ダイン/cm2、8〜9ダイン/cm2、5〜8ダイン/cm2、6〜8ダイン/cm2、7〜8ダイン/cm2、5〜7ダイン/cm2、6〜7ダイン/cm2、および5〜6ダイン/cm2が含まれるが、これに限定されない。Qui et al., Journal of The Royal Society Interface 11: 20130852 (2013)を参照されたい。
【０２０８】
培養ウェル内部での剪断応力はMicroS3.v10プローブ(Viosense Corporation, Pasadena,California)を用いて測定され得る。MicroS3プローブは、光学ドップラー速度測定を用いて、表面から166μm以内の剪断応力を測定する。このプローブが設置され、ウェルの中心に存在する剪断応力をサンプリングするためにはウェルの中心点から1mm、周辺部に存在する剪断応力をサンプリングするためには中心点から12mmで測定が行われる。プローブの先端が底面と同じ高さにそろえられ、従って、播種された細胞の高さで剪断応力が測定されるように、プローブは、ウェルの底部を貫通する穴を通って設置される。剪断応力=fDoppler・K・μである。式中、fDopplerは、センサーによってサンプリングされた領域でのドップラー偏移の平均周波数(Hz)であり、高速フーリエ変換によって計算される。Kは、各センサーについて特徴付けられる定数であるフリンジダイバージェンス(fringe divergence)である。μは動的粘性率であり、運動粘性率(υ)と密度(ρ)の積に等しい。レイノルズ数はωR2/υと計算され、式中、ωはオービタルシェーカーの回転速度であり、Rはオービタルシェーカーの回転半径であり、υは運動粘性率である。ウェルと、取り付けられたプローブはオービタルシェーカーの表面に設置され、次いで、オービタルシェーカーは60〜210rpmに調整され、剪断応力が30rpm間隔で測定された。各点で約100回の独立した測定が行われた(Dardik et al., J. Vasc. Surg. 41: 869-880 (2005))。
【０２０９】
一部の態様において、脂肪細胞に分化させるために、1種類または複数種の前脂肪細胞分化シグナルが前脂肪細胞に供給される。前脂肪細胞分化シグナルは、操作された間質組織の成熟中に供給されてもよく、その後で供給されてもよい。前脂肪細胞分化シグナルの例には、1-イソブチル-3-メチルキサンチン、デキサメタゾン、インシュリンおよびそれらの混合物(Qui et al., J. Biol.Chem. 276: 11988-11995 (2001)、カルパイン(Patel and Lane, J. Biol.Chem. 275: 17653-17660 (2000)、グルココルチコイド、3,3',5-トリヨードチロニン、レチノイン酸、成長ホルモン、インシュリン様増殖因子I、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インターロイキン-1、インターフェロン-α、腫瘍壊死因子-α、プロスタグランジン-F2α、プロスタグランジン-I2、フォルスコリン(forskolinm)ジブチリルcAMPL、および12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセテート(Gregoire, et al., Phys.Rev. 78(3):783-809 (1998))が含まれる。
【０２１０】
バイオインク
一部の態様において、バイオインクは、ある決まった体積で複数の細胞を収集することによって生成され、細胞成分は総体積の少なくとも約30％、多くて約100％に相当する。一部の態様において、バイオインクは半固体または固体の多細胞凝集物または多細胞体を含む。さらなる態様において、バイオインクは、1)複数の細胞または細胞凝集物と、生体適合性の液体またはゲルを予め決められた比で混合してバイオインクを得る、2)バイオインクを圧縮して、望ましい細胞密度と粘度のあるバイオインクを生成することによって生成される。一部の態様において、バイオインクの圧縮は、遠心分離、タンジェンシャルフローフィルトレーション(「TFF」)、またはそれらの組み合わせによって成し遂げられる。
【０２１１】
一部の態様において、本明細書において開示されたバイオインクは、体積で高い細胞充実性、例えば、高濃度の生細胞を特徴とする。さらなる態様において、バイオインクは、溶液1ミリリットルにつき、少なくとも約2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万、1億、1.1億、1.2億、1.3億、1.4億、1.5億、1.6億、1.7億、1.8億、1.9億、2.0億、2.1億、2.2億、2.3億、2.4億、2.5億、2.6億、2.7億、2.8億、2.9億、3.0億、3.1億、3.2億、3.3億、3.4億、3.5億、3.6億、3.7億、3.8億、3.9億、4億の、またはそれより多い細胞を含む。特定の態様において、バイオインクは1mLにつき約5000万〜約3億の細胞を含む。一部の態様において、体積で高い細胞充実性を有するバイオインクは、高い細胞密度を有する操作された組織および構築物をバイオプリントするのに用いられる。さらなる態様において、操作された組織および構築物は、少なくとも約30パーセント、35パーセント、40パーセント、45パーセント、50パーセント、55パーセント、60パーセント、65パーセント、70パーセント、75パーセント、80パーセント、またはそれより多い細胞である。
【０２１２】
一部の態様において、バイオインクを圧縮すると、多細胞凝集物または多細胞体の形成を可能にする、押出し可能な(extrudable)組成物が得られる。一部の態様において「押出し可能な」とは、(例えば、加圧下で)強引にノズルまたはオリフィス(例えば、1つまたは複数の穴またはチューブ)を通過させることで成型できることを意味する。一部の態様において、バイオインクの圧縮は細胞を適切な密度まで増殖させることに起因する。バイオインクに必要な細胞密度は、使用される細胞および生成される組織または臓器によって異なる。
【０２１３】
一部の態様において、バイオインクの細胞は密着および/または接着される。一部の態様において、「密着する」、「密着した」、および「密着」とは、細胞、多細胞凝集物、多細胞体、および/またはその層を結合する細胞間接着特性を指す。さらなる態様において、この用語は「融合する」、「融合された」、および「融合」と同義に用いられる。一部の態様において、バイオインクは、支持体材料、細胞培養培地(またはそのサプリメント)、細胞外マトリックス(またはその成分)、細胞接着薬剤、細胞死阻害剤、抗アポトーシス剤、抗酸化物質、押出し化合物、およびそれらの組み合わせをさらに含む。
【０２１４】
押出し化合物
一部の態様において、バイオインクは、押出し化合物(すなわち、バイオインクの押出し特性を改変する化合物)を含む。押出し化合物の例には、ゲル、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性剤ポリオール(例えば、Pluronic F-127またはPF-127)、温度応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、細胞外マトリックス成分(およびその誘導体)、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然ポリマーまたは合成ポリマー、ナノファイバー、ならびに自己組織化ナノファイバーが含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、押出し化合物は、バイオプリンティングの後に、バイオプリント細胞が密着した後に、またはバイオプリント構築物が成熟した後に物理的手段、化学的手段、または酵素手段によって除去される。
【０２１５】
適切なヒドロゲルには、コラーゲン、ヒアルロン酸塩、ヒアルロナン、フィブリン、アルギン酸塩、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するヒドロゲルが含まれる。他の態様において、適切なヒドロゲルは合成ポリマーである。さらなる態様において、適切なヒドロゲルには、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(酸化エチレン)およびそのコポリマー、ポリ(ビニルアルコール)、ポリフォスファーゼン、ならびにそれらの組み合わせに由来するヒドロゲルが含まれる。様々な特定の態様において、閉じ込め材料は、ヒドロゲル、NovoGel(登録商標)(Organovo, Inc.; San Diego, Calif)、アガロース、アルギン酸塩、ゼラチン、Matrigel(商標)、ヒアルロナン、ポロキサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ(イソプロピルn-ポリアクリルアミド)、ポリエチレングリコールジアクリレート(PEG-DA)、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ(乳酸)、ケイ素、絹、またはそれらの組み合わせより選択される。
【０２１６】
一部の態様において、ヒドロゲルベースの押出し化合物は、架橋可能なゲルである。さらなる態様において、架橋可能なゲルには、化学的手段によって架橋可能なゲルが含まれる。例えば、一部の態様において、適切なヒドロゲルには、アルギン酸塩を含有する架橋可能なヒドロゲルが含まれる。様々な態様において、適切なヒドロゲルは、約0.1パーセント、0.5パーセント、1パーセント、2パーセント、3パーセント、4パーセント、5パーセント、6パーセント、7パーセント、8パーセント、9パーセント、10パーセントの、またはそれより多いアルギン酸塩を含む。一部の態様において、バイオプリンティング後に、構築物は、任意で、細胞密着前にバイオプリント構造を保存するために、ヒドロゲルを化学架橋する薬剤、例えば、CaCl2溶液とインキュベートされる。さらに、一部の態様において、バイオプリント構築物は、任意で、ヒドロゲルを酵素分解するためにアルギン酸リアーゼとインキュベートされる。さらなる態様において、バイオプリント構築物は、任意で、ヒドロゲルを酵素分解するために、約0.2〜0.5mg/mlの濃度のアルギン酸リアーゼとインキュベートされる。
【０２１７】
一部の態様において、適切なヒドロゲルにはゼラチンが含まれる。様々な態様において、適切なヒドロゲルは、約1パーセント、2パーセント、3パーセント、4パーセント、5パーセント、6パーセント、7パーセント、8パーセント、9パーセント、10パーセント、11パーセント、12パーセント、13パーセント、14パーセント、15パーセント、16パーセント、17パーセント、18パーセント、19パーセント、20パーセントの、またはそれよりゼラチンを含む。
【０２１８】
一部の態様において、押出し化合物またはヒドロゲルの中でゼラチンの濃度は約5〜15％であり、アルギン酸塩の濃度は約0.5〜5％である。特定の態様において、押出し化合物またはヒドロゲルの中でゼラチンの濃度は10％であり、アルギン酸塩の濃度は1％である。
【０２１９】
一部の態様において、ヒドロゲルベースの押出し化合物は熱可逆性ゲル(温度応答性ゲルまたはサーモゲル(thermogel)としても知られる)である。一部の態様において、適切な熱可逆性ヒドロゲルは室温で液体ではない。特定の態様において、適切なヒドロゲルのゲル化温度(Tgel)は、約10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、または40℃であり、その中の増加分を含む。ある特定の態様において、適切なヒドロゲルのTgelは約10℃〜約40℃である。さらなる態様において、適切なヒドロゲルのTgelは約20℃〜約30℃である。一部の態様において、本明細書に記載のバイオインク(例えば、ヒドロゲル、1つまたは複数の細胞タイプ、および他の添加物などを含む)は室温で液体ではない。一部の態様において、適切な熱可逆性ヒドロゲルは哺乳動物の体温で液体ではない。特定の態様において、適切なヒドロゲルのゲル化温度(Tgel)は、約22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、41℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、または52℃であり、その中の増加分を含む。ある特定の態様において、適切なヒドロゲルのTgelは約22℃〜約52℃である。さらなる態様において、適切なヒドロゲルのTgelは約32℃〜約42℃である。一部の態様において、本明細書に記載のバイオインク(例えば、ヒドロゲル、1つまたは複数の細胞タイプ、および他の添加物などを含む)は哺乳動物の体温で液体ではない。特定の態様において、本明細書に記載のバイオインクのゲル化温度(Tgel)は、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、または約55℃であり、その中の増加分を含む。
【０２２０】
ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンで構成されるポリマーは、水溶液に取り入れられた時に熱可逆性ゲルを形成する。これらのポリマーには、バイオプリンター装置の中で維持可能な温度で液体状態からゲル状態に変わる能力がある。液体状態からゲル状態の相転移はポリマー濃度と溶液中の成分に左右される。
【０２２１】
一部の態様において、本明細書において示されるヒドロゲルおよびバイオインクの粘度は、記載の任意の手段によって測定される。例えば、一部の態様では、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を計算するために、LVDV-II+CP Cone Plate ViscometerおよびCone Spindle CPE-40が用いられる。他の態様では、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を計算するために、Brookfield(スピンドル(spindle)およびカップ(cup))粘度計が用いられる。一部の態様において、本明細書において言及される粘度範囲は室温で測定される。他の態様において、本明細書において言及される粘度範囲は体温(例えば、健常ヒトの平均体温)で測定される。
【０２２２】
さらなる態様において、ヒドロゲルおよび/またはバイオインクは、約500〜1,000,000センチポアズ、約750〜1,000,000センチポアズ;約1000〜1,000,000センチポアズ;約1000〜400,000センチポアズ;約2000〜100,000センチポアズ;約3000〜50,000センチポアズ;約4000〜25,000センチポアズ;約5000〜20,000センチポアズ;または約6000〜15,000センチポアズの粘度を有することを特徴とする。
【０２２３】
一部の態様において、バイオインクの非細胞成分(例えば、押出し化合物など)は、操作された三次元生物学的癌モデルを使用する前に除去される。さらなる態様において、非細胞成分は、例えば、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸をベースとするゲル、界面活性剤ポリオール、温度応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、コラーゲン、または他の生体適合性の天然ポリマーもしくは合成ポリマーである。なおさらなる態様において、非細胞成分は、物理的手段、化学的手段、または酵素手段によって除去される。一部の態様において、使用時に非細胞成分の一部は細胞成分と結合したままである。
【０２２４】
前もって形成されたスキャフォールド
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを含まないか、または実質的に含まない。さらなる態様において、「スキャフォールド」とは、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、前もって形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、ならびに脱細胞組織、ならびに操作された組織および/または臓器の物理構造を一体化し、その組織および/または臓器から除去されていない他の任意のタイプの前もって形成されたスキャフォールドを指す。なおさらなる態様において、脱細胞組織スキャフォールドには、脱細胞天然組織、または任意のやり方で培養細胞が生じた脱細胞細胞材料;例えば、死滅したか、脱細胞され、生きている間に産生されたECMが残っている細胞層が含まれる。
【０２２５】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデル(そのアレイを含む)は、例えば、組織、組織の任意の層を形成するために、または組織の形状を形成するために、前もって形成されたスキャフォールドを利用しない。非限定的な例として、操作された三次元生物学的癌モデルは、製造時または使用時に、前もって形成された合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールド、前もって形成された細胞外マトリックス層、または他の任意のタイプの前もって形成されたスキャフォールドを利用しなくてもよい。一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。さらなる態様において、操作された三次元生物学的癌モデルの細胞成分は、検出可能だが、微量の、またはごくわずかな量のスキャフォールド、例えば、全組成物の2.0％未満、1.0％未満、0.5％未満、または0.1％未満を含有する。なおさらなる態様において、微量の、またはごくわずかな量のスキャフォールドは、操作された三次元生物学的癌モデルもしくはそのアレイの長期挙動に影響を及ぼすには不十分であるか、またはその主要な生物学的機能に干渉するには不十分である。さらなる態様において、スキャフォールド成分はプリンティング後に物理的手段、化学的手段、または酵素手段によって除去されて、スキャフォールド成分を含まないか、または実質的に含まない操作された組織が生じる。
【０２２６】
腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、および不死化細胞を挿入する方法
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルを製作する方法は、操作された三次元組織に切開部を作る工程を含む。さらなる態様において、切開部は、操作された三次元組織に開口部、空洞、またはポケットを形成する。様々な態様において、切開部は、メス、ハサミなどの切断器具によって適切に作られる。別の態様において、切開部はレーザーによって適切に作られる。様々なさらなる態様において、切開部は、手作業で、または自動もしくは半自動のロボット装置の助けを借りて適切に作られる。
【０２２７】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌腫瘍モデルを形成するために、操作された三次元生物学的癌モデルを製作する方法は、癌細胞、腫瘍、または腫瘍断片を開口部に植え付ける工程を含む。様々な態様において、植え付ける工程は、手作業で、または自動もしくは半自動のロボット装置の助けを借りて適切に行われる。さらなる態様において、癌腫瘍または腫瘍断片は、分離されていない、初代の、患者に由来する癌腫瘍または腫瘍断片である。一態様において、前記癌腫瘍または腫瘍断片は、間質バイオインクの間質細胞タイプの1つ、一部、または全てのドナー供給源と遺伝的に同一でない患者から切除される。
【０２２８】
別の態様において、操作された三次元生物学的癌腫瘍モデルを形成するために、最初に切開部を作ることなく、操作された三次元組織に初代の癌細胞、腫瘍もしくは腫瘍断片、または不死化細胞が導入される。例として、一態様において、前記癌腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、注射によって、例えば、機械制御穿刺装置を介して、操作された三次元組織に導入される。さらなる例として、他の態様において、前記癌腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞は、器具を用いて手で押しつける、圧縮ガスを噴射することで発射するなどによって、操作された三次元組織に導入される。
【０２２９】
操作された三次元生物学的腫瘍モデルを形成するために、操作された間質組織に多くのタイプの癌細胞、腫瘍、または腫瘍断片が適切に植え付けられる。例えば、前記細胞、腫瘍、または腫瘍断片が、関連する間質組織タイプに囲まれていたのであれば、多くの上皮固形腫瘍タイプが、本明細書に記載の方法において使用するのに適している。一態様において、適切な癌細胞、腫瘍、または腫瘍断片タイプには、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、炎症性乳癌、乳房パジェット病、葉状腫瘍、血管肉腫、腺様嚢胞癌、低悪性度腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液性癌、乳頭状癌、管状癌、中期癌(metaphasic carcinoma)、微小乳頭癌(micropapillary carcinoma)、および混合癌が含まれる。
【０２３０】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、乳癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。乳癌は様々な判断基準に基づいてカテゴリーに分けられる。ほとんどの乳癌は癌腫である。肉腫などの他のタイプの癌も乳房に生じることがある。病理学に基づいて、乳癌は、非浸潤性乳管癌、浸潤性(invasive)(または浸潤性(infiltrating))乳管癌、浸潤性(invasive)(または浸潤性(infiltrating))小葉癌、炎症性乳癌、乳頭パジェット病、葉状腫瘍、および血管肉腫に分類することができる。浸潤癌のサブタイプには、腺様嚢胞(adenoid cystic)(または腺様嚢胞(adenocystic))癌、低悪性度腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液性癌(または膠様癌)、乳頭状癌、管状癌、化生性癌(紡錘細胞癌と扁平上皮癌を含む)、微小乳頭癌、および混合癌(浸潤性乳管癌と小葉癌の両方の特徴を有する)が含まれる(cancer.org/cancer/breastcancer/detailedguide/breast-cancer-breast-cancer-typesのウエブを参照されたい)。乳癌の受容体状況は、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、およびヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)の存在に基づいて免疫組織化学(IHC)によって特定され得る。ゲノムデータに基づいた、さらなる乳癌の固有サブタイプには、ルミナールA、ルミナールB、HER2高発現(HER2E)、低クローディン（Claudin-low）、基底様、および正常乳腺様グループが含まれる。ルミナールA腫瘍はER陽性HER2陰性であることが多い。ルミナールB腫瘍はER陽性PR陽性であることが多い。ルミナールB腫瘍はHER2陽性またはHER2陰性になることがある。基底様腫瘍はER/PR/HER2陰性であり、トリプルネガティブ乳癌(TNBC)とも呼ばれる。HER2E腫瘍は、GRB7およびPGAP3などのHER2アンプリコンにある遺伝子を過剰発現することを特徴とする。HER2E腫瘍はHER2陽性またはHER2陰性になることがある。低クローディンは、ごく最近になって述べられたサブタイプである。これはトリプルネガティブであることが多く、E-カドヘリンを含む細胞間接合部タンパク質の低発現を有し、高頻度でリンパ球浸潤を示す。
【０２３１】
遺伝子マーカー、例えば、TP53、PIK3CA、GATA3 PTEN、AKT1、CDH1、RB1、MLL3、MAP3K1、CDKN1B、TBX3、RUNX1、CBFB、AFF2、PIK3R1、PTPN22、PTPRD、NF1、SF3B1、CCND3、およびTBX3などは乳癌と関連付けられている。さらに、ある特定の遺伝子マーカーは様々なサブタイプにおいて豊富にあると見出される。例えば、HER2/p-HER2/HER1/p-HER1シグネチャーはHER2高発現サブタイプの内部に特定される。HER2E/HER2陽性腫瘍の遺伝子マーカーには、FGFR4、HER1/EGFR、HER2そのもの、およびHER2アンプリコンの内部にある遺伝子(すなわち、GRB7)の高発現が含まれる。ルミナール/ER陽性乳癌の遺伝子マーカーには、ESR1、BCL2、GATA3、FOXA1、XBP1、およびcMYBの高発現、MAP3K1、MAP2K4、PIK3CA、GATA3、FOXA1、ESR1、XBP1、RUNX1、およびCBFBの高頻度変異、ATM、PTEN、およびINPP4Bの消失、TP53不活性化、MDM2、FGFR、IGFR1、およびサイクリンD1/CDK4/CDK6の増幅が含まれる。基底様腫瘍(TNBC)の遺伝子マーカーには、BRCA1不活性化、サイクリンE1、PIK3CA、KRAS、BRAF、HER1/EGFR、cMYC、FGFR1、FGFR2、IGFR1、c-KIT、MET、PDGFRA、およびFOXM1の増幅、TP53およびPIK3CAの高頻度の変異、PI3K/AKTおよびHIF1α/ARNT経路の高活性、RB1、PTEN、およびINPP4Bの消失、ならびにケラチン5、6、および17ならびに細胞増殖に関連する遺伝子の高発現が含まれる。ルミナールAサブタイプの遺伝子マーカーには、MAP3K1、MAP2K4、GATA3、PIK3CA、TP53、CDH1、RUNX1、およびCBFBの特異的変異の増幅、ESR1、GATA3、FOXA1、XBP1 cMYB、ER、PR、AR、BCL2、GATA3、およびINPP4Bの高発現が含まれる。低クローディンサブタイプ腫瘍(大部分がTNBC)において発現が低い遺伝子マーカーには、HER2、ESR1、GATA3、管腔ケラチン8および18、クローディン3、4、および7、シングリン(cingulin)、オクルディン、E-カドヘリン、CD24、EpCAM、ならびにMUC1が含まれる。低クローディンサブタイプ腫瘍において発現が高い遺伝子マーカーには、Tリンパ系細胞およびBリンパ系細胞が発現する遺伝子(すなわち、CD4およびCD79a)、インターロイキン6、CXCL2、ビメンチン、N-カドヘリン、ならびにいくつかの既知のE-カドヘリン転写リプレッサー(すなわち、TWIST1)が含まれる。さらに、乳癌はEGFRまたはKRASの状況によって特徴付けることができる。例えば、乳癌の最も臨床的に悪性度が高いサブタイプであるIBC症例の30％と、TNBC症例の少なくとも50％はEGFR過剰発現とも関連付けられる。HER2過剰発現乳癌ではKRAS変異体はかなり豊富にある。ゲノムワイド遺伝子マーカー解析は、ゲノムDNAコピー数アレイ、DNAメチル化、エクソーム配列決定、mRNAアレイ、マイクロRNA配列決定、および逆相タンパク質アレイなどの様々な方法によって行うことができる。乳癌およびサブタイプの包括的な遺伝子プロファイルおよび検出方法が、Dai X, Li T, Bai Z, Yang Y, Liu X, Zhan J, Shi B (2015). Breast cancer intrinsic subtype classification, clinical use and future trends. Am J Cancer Res.5(10):2929-43; Prat A and Perou CM (2011). Deconstructing the molecular portraits of breast cancer. Mol Oncol. 5(1):5-23;およびKoboldt DC (2012). Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2012 490(7418):61-70;およびMasuda H, Zhang D, Bartholomeusz C, Doihara H, Hortobagyi GN, and Ueno NT (2012). Role of epidermal growth factor receptor in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 136(2):331-45に記載されている。
【０２３２】
一態様において、乳癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。乳癌細胞株は、例えば、ATCCまたはSigmaから市販されている。例えば、ATCC Breast Cancer Biomarkers Cell Line Panel 1(ATCC(登録商標)TCP-1004(商標))は、別個の病理学的サブタイプおよび遺伝子マーカー情報を有する乳癌細胞の一団を含む。さらに、乳癌細胞株と、対応するサブタイプ遺伝子プロファイルのリストは、Holliday DL and Speirs V (2011). Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Res. 2011 13(4):215に示される。一般的に用いられる癌細胞株の遺伝子変異情報は、Sanger COSMIC細胞株データベース(cancer.sanger.ac.uk/cell_lines/cbrowse/all)から入手可能である。さらに、遺伝子変異によって特徴付けられる癌細胞株がATCCから入手可能である。乳癌腫瘍は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)、CureLine(cureline.com/human-tumor-tissues)、または Discovery Life Sciences(discoverylifesciences.com/clinical-research-specimens/cancer)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２３３】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、腸癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。結腸直腸癌は、Colorectal Cancer Subtyping Consortiumによって、遺伝子発現プロファイルからのゲノムデータセットを組み合わせることで4つのコンセンサス分子サブタイプ(CMS)に分類される。CMS1は患者の14％を含み、CpGアイランドメチル化形質(CIMP)が多いこと、高頻度突然変異があること、BRAF変異があること、主にTH1および細胞傷害性T細胞からなる、びまん性免疫浸潤(diffuse immune infiltration)に関連する遺伝子の発現が高いこと、免疫回避経路が活性化されること、体細胞コピー数変化(SCNA)が少ないことを特徴とする。CMS1は、DNA損傷修復タンパク質の過剰発現と、DNAミスマッチ修復能力の障害を伴う、ほとんどのマイクロサテライト不安定性(MSI)癌を含む。CMS2は、患者の37％を含む最もよく見られるサブセットである。CMS2腫瘍は、染色体不安定性、強力なWNT/MYC経路活性化、TP53変異、およびEGFR増幅/過剰発現を示す。CMS3腫瘍は患者の13％において見られる。CMS3腫瘍は、低い染色体不安定性、中程度のWNT/MYC経路活性化、KRASおよびPIK3CA変異、およびIGFBP2過剰発現に関連する。CMS4は患者の23％を含む。CMS4腫瘍はCIN/MSIが不均一であり、間葉系/TGF-β活性化およびNOTCH3/VEGFR2過剰発現を特徴とする。
【０２３４】
結腸直腸癌の遺伝子マーカーには、ミスマッチ修復経路に関与する遺伝子、例えば、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS2、POLE、およびPOLD1などが含まれる。結腸直腸癌のさらなる遺伝子マーカーには、BRAF、PIK3CA、P53、RAS、H3K36me3、PTEN、MET、EGFR、ALK/ROS1、およびATMが含まれる。結腸直腸癌に関連する遺伝子マーカーは、例えば、遺伝子発現プロファイリングによって特定することができる。結腸直腸癌のサブタイプ、遺伝子マーカー、および検出方法は、Guinney J, et al. (2015). The consensus molecular subtypes of colorectal cancer. Nat Med. 21(11): 1350-1356; Graham DM, Coyle VM, Kennedy RD, Wilson RH (2016). Molecular Subtypes and Personalized Therapy in Metastatic Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12: 141-150;およびYiu AJ and Yiu CY (2016). Molecular markers in Colorectal Cancer. Anticancer Res. 36(3): 1093-102によって概説されている。
【０２３５】
一態様において、腸の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。結腸直腸癌細胞株は、例えば、ATCCまたはSigmaから市販されている。一般的に用いられる癌細胞株の遺伝子変異情報はSanger COSMIC細胞株データベースから入手可能である。さらに、24種類の結腸癌細胞株のエピジェネティック特徴および遺伝子特徴とこのような細胞株の供給源が、Ahmed D, Eide PW, Eilertsen IA, Danielsen SA, Eknaes M, Hektoen M, Lind GE, and Lothe RA (2013). Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines. Oncogenesis. 2:e71に示されている。さらに、結腸直腸癌細胞株および遺伝情報の包括的なリストはColorectal Cancer Atlasで見られる(colonatlas.org/browseのウエブを参照されたい)。結腸直腸癌腫瘍は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)またはCureLine(cureline.com/human-tumor-tissues)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２３６】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、肺癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。肺癌は、一般的に、3つの主なタイプ:非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、および肺カルチノイド腫瘍に分類される。NSCLCは、扁平上皮癌、腺癌、および大細胞癌のサブタイプをさらに含む(cancer.orgのウエブを参照されたい)。肺癌の例示的な遺伝子マーカーには、iNTR、TUBB3、RRM1、ERCC1、BRCA1、p53、BCL-2、ALK、MRP2、MSH2、TS、ムチン、BAG-1、pERK1/2、pAkt-1、p27、TUBB3、PARP1、ATM、およびTopIIAが含まれる。肺癌のさらなる遺伝子マーカーには、CCND1、Napsin-A、およびTTF-1が含まれる。さらに、扁平上皮癌に関連する遺伝子マーカーには、CDKN2A、TP53、PTEN、PIK3CA、KEAP1、MLL2、HLA-A、NFE2L2、NOTCH1/2、RB1、FAM123B(WTX)、HRAS、FBXW7、SMARCA4、NF1、SMAD4、EGFR、APC、TSC1、BRAF、TNFAIP3、CREBBP、NFE2L2、KEAP1、CUL3、FGFR1、WHSC1L1、S0X2、TP63、ASCL4、およびFOXP1が含まれる。肺癌の分子マーカーおよび遺伝子マーカーは、IHC、RNA-Seq、および遺伝子発現マイクロアレイによって評価することができる。このようなマーカーの包括的な総説および検出方法は、Wallerek S and Sorensen JB (2015). Biomarkers for efficacy of adjuvant chemotherapy following complete resection in NSCLC stages I-IIIA. Eur Respir Rev. 24(136):340-55; Zhu CQ and Tsao MS (2014). Prognostic markers in lung cancer: is it ready for prime time? Transl Lung Cancer Res. 3(3): 149-58; Ye J, Findeis-Hosey JJ, Yang Q, McMahon LA, Yao JL, Li F, Xu H (2011). Combination of napsin A and TTF-1 immunohistochemistry helps in differentiating primary lung adenocarcinoma from metastatic carcinoma in the lung. Appl Immunohistochem Mol Morphol.19(4):313-7; Hammerman PS et al. (2012) Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489(7417): 519-25に示されている。
【０２３７】
一態様において、肺癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。肺癌細胞株および細胞株の遺伝情報はATCCまたはSigmaなどの商業的供給業者から入手可能である。米国立癌研究所は、肺癌を含む60種類のヒト癌細胞株からなる一団(NCI-60細胞株と呼ばれる)を提供している。一般的に用いられる癌細胞株の遺伝子変異情報はSanger COSMIC細胞株データベースから入手可能である。dtp.cancer.gov/discovery_development/nci-60/cell_list.htmのウエブからリストにアクセスすることができる。さらに、AKT1、BRAF、MET、EGFR、ERBB2、KRAS、STK11、MYC、MYCL、MYCN、NRAS、PIK3CA、PTEN、CDKN2A、RB1、TP53、およびEML4-ALK融合を含む17種類の遺伝子マーカーが、一般的に用いられる18種類の肺癌細胞株において試験されている。この情報は、Blanco R, Iwakawa R, Tang M, Kohno T, Angulo B, Pio R, Montuenga LM, Minna JD, Yokota J, and Sanchez-Cespedes M (2009). A gene-alteration profile of human lung cancer cell lines. Hum Mutat. 30(8): 1199-206に示されている。さらに、肺癌腫瘍は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)、CureLine(cureline.com/human-tumor-tissues)、またはDiscovery Life Sciences, Inc.(pre-treatment: discoverylifesciences.com/clinical-research-specimens/cancer/lung-cancer-pre-treatment)、およびNSCLC(discoverylifesciences.com/clinical-research-specimens/cancer/nsclc)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２３８】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、胃癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。胃癌は、遺伝子発現データに基づいて、間葉系様タイプ、マイクロサテライト不安定性タイプ、腫瘍タンパク質53(TP53)活性タイプ、およびTP53不活性タイプを含む4つの分子サブタイプに分類することができる。胃癌の遺伝子マーカーには、マイクロRNA、例えば、miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34、miR-196a、miR-378、miR-221、miR376c、miR-423-5p、let-7a、miR-17-5p、miR-21、miR-106a/b、miR-199a-3p、miR-218、miR-223、miR-370、miR-451、miR-486、miR-21、miR-106a、miR-129、およびmiR-421が含まれ得る。胃癌のさらなる遺伝子マーカーには、TP53、PTK(例えば、TIE-1およびMKK4)、FYN、PLK1、GISP/RegIV、EGFR、ERBB2、VEGF、TGF、c-MET、IL-6、IL-11、サイクリンE、Bcl-2、Fas、サバイビン、Runx3、E-カドヘリン、WNT5A、IL-1、およびIL-10が含まれる。胃癌の他の遺伝子マーカーには、癌胎児抗原(CEA);α-フェトプロテイン(AFP);CA19-9、CA72-4、遊離ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット(B-HCG)、およびペプシノーゲンI/IIが含まれる。胃癌の遺伝子マーカーは、ノザンブロット分析、モノクローナル/ポリクローナル抗体に基づく免疫学的検出、または遺伝子発現マイクロアレイによって評価することができる。さらに、これらのマーカーは遺伝子発現制限解析(restriction analysis of gene expression)(RAGE)分析または遺伝子発現連鎖解析(SAGE)によっても評価することができる。胃癌の分子マーカーのさらに網羅したリストおよびその検出方法は、Cristescu R. et al., (2015). Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes. Nat Med. 21(5):449-56; Hua-Hsi Wu, Wen-chang Lin, and Kuo-Wang Tsai (2014). Advances in molecular biomarkers for gastric cancer: miRNAs as emerging novel cancer markers. Expert Rev Mol Med. 16:el;およびZiliang Jin, Weihua Jiang, and Liwei Wang (2015).Biomarkers for gastric cancer: Progression in early diagnosis and prognosis. Oncol Lett. 9(4): 1502-1508に記載されている。
【０２３９】
一態様において、胃の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。胃癌細胞株は市販されている。例えば、胃(Stomach)(胃(Gastric))癌パネル(ATCC(登録商標)No.TCP-1008(商標))は、特定された遺伝子マーカーを用いて原発部位と転移部位の両方から単離した6種類の胃癌細胞株を含む。さらなる胃腸腫瘍細胞株もATCCから入手可能である(atcc.org/〜/media/PDFs/Gastrointestinal_Tumor_Cell_Lines.ashxのウエブを参照されたい)。一般的に用いられる癌細胞株の遺伝子変異情報はSanger COSMICデータベースから入手可能である。さらに、胃癌腫瘍は、例えば、Discovery Life Sciences, Inc.(discoverylifesciences.com/clinical-research-specimens/cancer/gastric-cancer)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２４０】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、前立腺癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。前立腺癌は、特異的な遺伝子融合(ERG、ETV1、ETV4、およびFLI1)または変異(SPOP、FOXA1、およびIDH1)に基づいて、The Cancer Genome Atlas(TCGA)Research Networkによって7つの異なるサブタイプに分類される。前立腺癌の例示的な遺伝子マーカーには、NKX3.1、MYC、TMPRSS2-ERG転座、PTEN、Akt/mTOR、Erk(p42/44)、Her2/NeuまたはSRCチロシンキナーゼ、WNT、APC、k-RAS、β-カテニン、FGFR1、FGF10、EZH2、PCA3、およびARが含まれるが、これに限定されない。前立腺癌の遺伝子マーカーは、例えば、遺伝子発現プロファイリング、miRNA発現プロファイリング、血清プロテオミクス、メタボロミクス、および全エクソーム配列決定によって評価することができる。このような遺伝子マーカーおよびその検出方法は、Abeshouse A, et al., (2015). The Molecular Taxonomy of Primary Prostate Cancer. Cell 163(4): 1011-25およびMichael M. Shen and Cory Abate-Shen (2010) Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges Genes & Dev. 24: 1967-2000に示されている。
【０２４１】
一態様において、前立腺の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。前立腺癌細胞株は、例えば、NCI-60細胞株およびATCCから入手可能である。一般的に用いられる癌細胞株の遺伝子変異情報はCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。例えば、LNCaPクローンFGCはATCC(ATCC(登録商標)CRL-1740(商標))から入手可能であり、詳細な遺伝子プロファイルはCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。さらに、前立腺癌細胞株の遺伝子マーカーおよび分子マーカーは、P.J.Russell and E.A.Kingsley. Ch. 2 Human Prostate Cancer Cell Lines, Methods in Molecular Medicine, Vol. 81: Prostate Cancer Methods and Protocolsに記載されている。ヒト前立腺癌組織試料は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)、CureLine(cureline.com/human-tumor-tissues)、またはDiscovery Life Sciences(pre-treatment: discoverylifesciences.com/clinical-research-specimens/cancer/prostate-cancerおよびdiscoverylifesciences.com/clinical-research-specimens/cancer)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２４２】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、腎臓癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。腎臓の癌には、2つの主なタイプ:腎細胞癌(RCC)および移行上皮癌(TCC)が含まれる。腎細胞癌は、以下のサブタイプ:明細胞(通常の)RCC、乳頭状RCC、嫌色素性RCC、腎オンコサイトーマRCC、未分類RCC、集合管癌、髄質RCC、および肉腫様RCCにさらに分けることができる(kidneycancer.org/knowledge/learn/about-kidney-cancer/のウエブを参照されたい)。RCCの例示的な分子マーカーには、神経細胞特異的エノラーゼ(NSE)、TRAF-1、Hsp27、IL-1、IL-6、TNF-α、血清アミロイドA(SAA)、C反応性タンパク質(CRP)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、サイトケラチン(CK)、血清M65(サイトケラチン18のインタクト型)、低酸素誘導性転写因子(HIF-1αおよびHIF-1β)、VEGF、フォンヒッペル・リンダウ(VHL)、プロリルヒドロキシラーゼ-3(PHD3)、ピルビン酸キナーゼアイソエンザイムタイプM2(TuM2-PK)、チミジンキナーゼ1(TK1)、20Sプロテアソーム、フェチュインA、オステオポンチン(OPN)、オステオプロテジェリン、NMP-22、NGAL、KIM-1、MMP、およびPLIN2が含まれる。腎臓癌の分子マーカーは、イムノアッセイ、例えば、ELISAもしくは免疫比濁法、または質量分析法によって評価することができる。Kusama K, Asano M, Moro I, Sekine T, Kakizoe T, Tobisu K, and Kishi K (1991). Tumor markers in human renal cell carcinoma. Tumour Biol. 12(4): 189-97、およびPastore AL, Palleschi G, Silvestri L, Moschese D, Ricci S, Petrozza V, Carbone A, Di Carlo A (2015). Serum and urine biomarkers for human renal cell carcinoma. Dis Markers. 2015:251403。
【０２４３】
一態様において、腎臓の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。腎臓癌細胞株は、例えば、ATCCまたはSigmaから市販されており、細胞株の遺伝情報はCOSMIC細胞株データベースで見つけることができる。腎臓癌腫瘍は、商業的に、例えば、USBiomaxInc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)またはCureLine(cureline.com/human-tumor-tissues)から入手することができる。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。皮膚癌には、日光角化症、基底細胞癌、黒色腫、カポジ肉腫(KS)、メルケル細胞癌、および扁平上皮癌が含まれる(skincancer.org/skin-cancer-informationおよびdermatology.ucsf.edu/skincancer/professionals/types.aspxのウエブを参照されたい)。さらに、黒色腫は、最も多く見られる、大きく変異している遺伝子のパターンに基づいて4つのサブタイプ:変異BRAF、変異RAS、変異体NF1、およびトリプルWT(野生型)に分けることができる。皮膚癌(例えば、黒色腫)の例示的な遺伝子マーカーには、上記に加えて、NRAS、CDKN2A/B、TP53、PTEN、RAC1、MAP2K1、PPP6C、ARID2、F1、IDH1、RB1、DDX3X、RAC1、IDH1、MRPS31、RPS27、TERT、ホスホMAP2K1/MAP2K2(MEK1/2)、MAPK1/MAPK3(ERK1/2)、CDK4、およびCCND1が含まれる。皮膚癌(例えば、黒色腫)の遺伝子マーカーは、DNAコピー数および一塩基多型アレイ、全ゲノム配列決定、RNA-Seq、逆相タンパク質アレイ、ならびにマイクロRNA配列決定によって評価することができる。皮膚癌の遺伝子マーカーのさらに完全なリストおよびその検出方法は、Akbani R. et al. (2015). Genomic Classification of Cutaneous Melanoma. Cell. 161(7): 1681-96に示されている。
【０２４４】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、皮膚癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。一態様において、皮膚癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。皮膚癌細胞株は、例えば、ATCCまたはSigmaから市販されている。特に、ATCC 転移性黒色腫癌細胞パネル(Metastatic Melanoma Cancer Cell Panel)(ATCC(登録商標)TCP-1014(商標))は、様々な程度の遺伝子複雑性を有する4種類の転移性黒色腫癌細胞株を含む。以下の遺伝子:BRAF、TP53、CDKN2A、およびPTENの1つまたは複数にある遺伝子変異はCOSMIC細胞株データベースに従って特定されている。皮膚癌腫瘍は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)またはCureLine(B-raf状況を含む黒色腫。cureline.com/human-tumor-tissues)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２４５】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、卵巣癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。卵巣癌は、起源となる細胞のタイプに基づいて30を超えるタイプ、例えば、上皮卵巣癌、卵巣生殖細胞癌、および卵巣間質癌などに分けることができる。上皮卵巣癌は、最もよく見られる4つのサブタイプ:漿液性、類内膜、明細胞、および粘液性を含む、新生物の不均一なグループをさらに含む。上皮卵巣癌の約10％は未分化または未分類である。卵巣癌の一般的な遺伝子マーカーには、B-RAF、K-RAS、TP53、およびBRCA1/2が含まれる。卵巣癌に関連するさらなる遺伝子マーカーには、CA125、CA19.9、CA15.3、TAG.72、MSH2、MLH1、MLH6、PMS1、PMS2、ESR2、BRIP1、MSH6、RAD51C、RAD51D、CDH1、CHEK2、PALB2、RAD50、OVX1、sFas、CYFRA21.1、VEGF、およびヒトカリクレイン10(hK10)が含まれる。さらに、卵巣生殖細胞腫瘍に関連する分子マーカーには、α-フェトプロテイン(αFP)、M-CSF、およびLDHなどが含まれる。さらに、卵巣顆粒膜細胞腫瘍(卵巣癌の珍しいタイプであり、間質癌のサブタイプ)に関連する例示的な分子マーカーには、インヒビンα、βA、およびβBサブユニットが含まれる。このような遺伝子マーカーは、例えば、直接配列決定またはマイクロアレイ分析によって評価することができる。さらなる検出方法には免疫染色が含まれる。McCluggage WG (2011).Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and pathogenesis. Pathology. 43(5):420-32; Norquist BM et al. (2015). Inherited mutations in women with ovarian carcinoma. JAMA Oncol. 30: 1-9; Kuusisto KM, Bebel A, Vihinen M, Schleutker J, Sallinen SL (2011). Screening for BRCA1, BRCA2, CHEK2, PALB2, BRIP1, RAD50, and CDH1 mutations in high-risk Finnish BRCAl/2-founder mutation-negative breast and/or ovarian cancer individuals. Breast Cancer Res. 13 (1): R20;およびGadducci A, Cosio S, Carpi A, Nicolini A, and Genazzani AR (2004). Serum tumor markers in the management of ovarian, endometrial and cervical cancer. Biomed Pharmacother.58(1):24-38。
【０２４６】
一態様において、卵巣の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。卵巣癌細胞株は、例えば、ATCCまたはSigmaから市販されている。例えば、卵巣癌パネル(ATCC(登録商標)No.TCP-1021(商標))は4種類の卵巣癌細胞株を含み、これらは、COSMIC細胞株データベースによれば、以下の遺伝子:APC、CDKN2A、FAM123B、KRAS、MLH1、NRAS、PIK3CA、STK11、およびTP53の1つまたは複数にゲノム変異を有する。卵巣腫瘍は、例えば、Discovery Life Sciences(discoverylifesciences.com/clinical-research-specimens/cancer/ovarian-carcinoma)、CureLink(cureline.com/human-tumor-tissues)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２４７】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、子宮頸癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。子宮頸癌の2つの主要なタイプが扁平上皮癌および腺癌である。CA19-9、CA125、CA15-3、SCC抗原、CYFRA21.1、CEA、M-CSF、sFas、VEGF、およびチミジンキナーゼ(TK)の血清中濃度が、子宮頸癌の一般的に用いられる分子マーカーである。子宮頸癌に関連する遺伝子マーカーには、p16ink4a、MCM3および5、CDC6、ジェミニン、サイクリンA〜D、TOP02A、CDCA1、ならびにBIRC5が含まれる。子宮頸癌の他の遺伝子マーカーには、UBE2C、CCNB1、CCNB2、PLOD2、NUP210、MELK、CDC20、IL8、INDO、ISG15、ISG20、AGRN、DTXL、MMP1、MMP3、CCL18、およびSTAT1が含まれる。さらに、子宮頸部扁平上皮癌において過剰発現している分子マーカーには、リボソームタンパク質S12、ミトコンドリアサブユニットNADHデヒドロゲナーゼ4、16SリボソームRNA(rRNA)、およびキャッピングタンパク質筋Z線α1などが含まれる。このような遺伝子マーカーは高密度マイクロアレイによって検出することができ、mRNAおよびタンパク質の発現は、それぞれ、リアルタイムPCRおよびIHCによって検出することができる。さらなる検出方法には、RNA-RNAインサイチューハイブリダイゼーション、ノザンブロット分析、リバースノザンブロット、ならびにディファレンシャルディスプレイおよび遺伝子断片クローニングなどが含まれる。子宮頸癌に関連する遺伝子マーカーの包括的なリストおよび検出方法は、Gadducci A, Cosio S, Carpi A, Nicolini A, and Genazzani AR (2004). Serum tumor markers in the management of ovarian, endometrial and cervical cancer. Biomed Pharmacother. 58(1):24-38; Martin CM, Astbury K, McEvoy L, O'Toole S, Sheils O, and O'Leary JJ (2009). Gene expression profiling in cervical cancer:identification of novel markers for disease diagnosis and therapy. Methods Mol Biol. 511:333-59; Rajkumar T, Sabitha K, Vijayalakshmi N, Shirley S, Bose MV, Gopal G, and Selvaluxmy G (2011). Identification and validation of genes involved in cervical tumourigenesis. BMC Cancer. 11:80;およびCheng Q, Lau WM, Chew SH, Ho TH, Tay SK, Hui KM (2002). Identification of molecular markers for the early detection of human squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Br J Cancer. 86(2):274-81に示されている。
【０２４８】
一態様において、子宮頸癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。子宮頸癌細胞株はATCCまたはSigmaから市販されている。例えば、ATCC子宮頸癌細胞パネル(ATCC(登録商標)TCP-1022(商標))は4種類の子宮頸癌細胞株を含み、これらの遺伝子変異情報はCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。さらに、子宮頸癌腫瘍は、例えば、BioreclamationIVT(bioreclamationivt.com/disease-state-tissues)から市販されている。バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２４９】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、子宮癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。子宮(子宮内膜)癌は4つのサブタイプ:類内膜腺癌、漿液性腺癌、腺扁平上皮癌、および癌腫肉腫に分けることができる(mskcc.org/cancer-care/types/uterine-endometrialのウエブを参照されたい)。遺伝性子宮癌のうち約50〜70パーセントは、リンチ症候群としても知られる遺伝性非腺腫性大腸癌(HNPCC)症候群と関連する(cedars-sinai.edu/Patients/Programs-and-Services/Womens-Cancer-Program/Patient-Guide/Uterine-cancer-genetic-risk.aspxのウエブを参照されたい)。リンチ症候群に関連する遺伝子マーカーも遺伝性子宮癌と関連する。これらの遺伝子マーカーには、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、PTEN、BRCA1、BRCA2、TP53、MUTYH、CDKN2A、PGR、およびCHEK2が含まれる。このような遺伝子マーカーは、一般的に、ゲノムワイド関連解析によって特定される。Meyer LA, Broaddus RR, Lu KH (2009).Endometrial cancer and Lynch syndrome: clinical and pathologic considerations. Cancer Control. 16(1): 14-22、およびGayther SA and Pharoah PD (2010). The inherited genetics of ovarian and endometrial cancer. Curr Opin Genet Dev 20(3):231-8。
【０２５０】
一態様において、子宮癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。子宮癌細胞株は、商業的供給業者、例えば、ATCCから入手することができる。例えば、HEC-1-A(ATCC(登録商標)HTB-112(商標))は子宮内膜腺扁平上皮癌である。HEC-1-A細胞株の遺伝子変異情報はCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。子宮癌腫瘍は、例えば、BioreclamationIVT(bioreclamationivt.com/disease-state-tissues)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２５１】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、肝臓癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。原発性肝臓癌には、4つの主要なタイプ:肝細胞癌(HCC)、胆管癌(cholangiocarcinoma)(胆管癌(bile duct cancer))、血管肉腫(angiosarcoma)(血管肉腫(haemangiosarcoma)とも呼ばれる)、および肝芽腫(cancerresearchuk.org/about-cancer/liver-cancer/typesのウエブを参照されたい)が含まれる。AFP(AFP-L1、AFP-L2、およびAFP-L3を含む)は、HCCの早期検出に現在利用可能な、最も広く用いられる腫瘍バイオマーカーである。HCCのさらなる分子マーカーおよび遺伝子マーカーには、HSP70、HSP27、グリピカン-3(GPC3)、扁平上皮癌抗原(SCCA)、ゴルジタンパク質73(GP73)(Golph2およびGOLM1としても知られる)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、亜鉛-α2-糖タンパク質(ZAG)、デス-γ-カルボキシプロトロンビン(DCP)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、α-l-フコシダーゼ(AFU)、トランスフォーミング成長因子-β1(TGF-β1)、およびVEGF、マイクロRNA、例えば、miR-500、miR-122、miR-29、およびmiR-21、Δ様1ホモログ(DLK1)、ならびにビリン1(Vil1)が含まれる。HCCのさらなる遺伝子マーカーには、TP53、CD34、RGS5、THY1、ADAMTS1、MMP2、MMP14、ケラチン17、ケラチン19、およびムチン1などが含まれる。AFPは、様々な方法、例えば、等電点電気泳動(IEF)、レクチン電気泳動、またはRIA、IRMA、MEIAを含むイムノアッセイ、比濁分析、および電気化学発光などによって検出することができる。HCCに関連する分子マーカーおよび遺伝子マーカーを特定するのに用いられる他の検出方法には、IHC、サザンブロット、およびcDNAマイクロアレイなどが含まれる。肝臓癌の分子マーカーおよび遺伝子マーカーならびに検出方法は、Debruyne EN and Delanghe JR (2008).Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma with alpha-fetoprotein: new aspects and applications. Clin Chim Acta. 395(1-2): 19-26; Zhao YJ, Ju Q, and Li GC (2013). Tumor markers for hepatocellular carcinoma. Mol Clin Oncoll(4):593-598;およびChen X, Cheung ST, So S, Fan ST, Barry C, Higgins J, Lai KM, Ji J, Dudoit S, Ng IO, Van De Rijn M, Botstein D, and Brown PO (2002). Gene expression patterns in human liver cancers. Mol Biol Cell. 13(6): 1929-39に開示される。
【０２５２】
一態様において、肝臓癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。肝臓癌細胞株は、商業的供給業者、例えば、ATCCまたはSigmaから入手することができる。例えば、ATCC肝臓癌パネル(ATCC(登録商標)TCP-1011(商標))は7種類の細胞株を含む。これらの遺伝子変異情報はCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。肝臓癌腫瘍は、例えば、BioreclamationIVT(bioreclamationivt.com/disease-state-tissues)またはDiscover Life Sciences(discovery lifesciences.com/clinical-research-specimens/cancer/liver-cancer-pre%E2%80%93treatment)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２５３】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、膀胱癌腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。膀胱癌は、病理組織学的観察に基づいて3つの主要なタイプ:尿路上皮癌(例えば、移行上皮癌(TCC))、扁平上皮癌(SCC)、および腺癌に分けられる。膀胱癌のあまり一般的でないタイプには肉腫および小細胞型未分化癌が含まれる。膀胱癌は、その細胞タイプに加えて非浸潤性、非筋肉浸潤性、または筋肉浸潤性と呼ばれることがある(cancer.net/cancer-types/bladder-cancer/overviewのウエブを参照されたい)。膀胱癌に関連する遺伝子マーカーには、HRAS、NRAS、KRAS2、FGFR3、ERBB2、CCND1、MDM2、E2F3、RASSF1A、FHIT、CDKN2A、PTCH、DBC1、TSC1、PTEN、RB1、およびTP53が含まれる。さらに、SULF1ならびにリソソームシステインプロテイナーゼカテプシンB、K、およびL、RGS1、RGS2、THBS1、THBS2、VEGFC、NRP2は筋肉浸潤性腫瘍と関連する。CTSEは表在性腫瘍において高い発現レベルを示した。膀胱癌に関連する他の遺伝子マーカーは、MMP2、CCNA2、CDC2、CDC6、TOP2A、SKALP PRKAG1、GAMT、ACOX1、ASAH1、SCD、AF1Q、AREG、DUSP6、LYAR、MAL、およびRARRESである。このような遺伝子マーカーは、例えば、発現マイクロアレイ分析によって評価することができる。Margaret A. Knowles (2006). Molecular subtypes of bladder cancer: Jekyll and Hyde or chalk and cheese? Carcinogenesis 27(3): 361-373; Knowles MA (2008).Bladder cancer subtypes defined by genomic alterations. Scand J Urol Nephrol Suppl. (218): 116-30;およびBlaveri E, Simko JP, Korkola JE, Brewer JL, Baehner F, Mehta K, Devries S, Koppie T, Pejavar S, Carroll P, Waldman FM (2005). Bladder cancer outcome and subtype classification by gene expression. Clin Cancer Res. 11(11):4044-55。
【０２５４】
一態様において、膀胱癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。膀胱癌細胞株は、例えば、ATCCまたはSigmaから市販されている。最もよく用いられる癌細胞株の遺伝子変異情報はCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。さらに、膀胱癌に関与する遺伝子(FGFR3、PIK3CA、TP53、およびRAS)の変異状態に関する情報を含む40種類の尿路上皮膀胱癌細胞株の包括的なゲノム特徴付けが、Earl J., et al., (2015). The UBC-40 Urothelial Bladder Cancer cell line index: a genomic resource for functional studies. BMC Genomics. 16:403に示されている。膀胱癌腫瘍は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)またはBioreclamationIVT(bioreclamationivt.com/disease-state-tissues)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２５５】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、食道癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。食道癌は、コピー数の変化および大規模な再編成によって支配される高度に不均一な癌である。食道癌には2つの主要なタイプ、すなわち、扁平上皮癌および腺癌がある。さらに、変異シグネチャーに基づいて、食道癌は、潜在的な治療関連性(therapeutic relevance)のある3つの異なる分子サブタイプ、すなわち、DDR(DNA損傷修復)障害、C>A/Tドミナント、および変異原性に分けることができる。食道癌に関連する例示的な遺伝子マーカーには、SMYD3、RUNX1、CTNNA3、RBFOX1、CDKN2A/2B、CDK14、ERBB2、EGFR、RB1、GATA4/6、CCND1、およびMDM2などが含まれる。DDR障害サブタイプに関連する遺伝子マーカーには、TP53、ARID1A、およびSMARCA4が含まれる。このようなゲノムワイド遺伝子解析はディープシークエンシングによって行うことができる。これは、Secrier M, et al.(2016). Mutational signatures in esophageal adenocarcinoma define etiologically distinct subgroups with therapeutic relevance. Nat Genet. 48(10): 1131-41に記載されている。
【０２５６】
一態様において、食道癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。食道癌細胞株は、そのジェノタイピング情報と共に、ECACC General Cell Collectionに寄託されている。さらなる食道癌細胞株(例えば、OE33細胞株)もSigmaなどの商業的供給業者から入手可能である。食道癌細胞株、例えば、OE33の遺伝子変異情報はCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。食道癌腫瘍は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)またはBioreclamationIVT(bioreclamationivt.com/disease-state-tissues)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２５７】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、膵臓癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。細胞のタイプに基づいて、膵臓癌は外分泌腫瘍および膵神経内分泌腫瘍(PNET)に分類することができる。外分泌膵臓腫瘍は、腺癌、腺房細胞癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍(ipmn)、および粘液性嚢胞腺癌をさらに含む(www.pancan.org/facing-pancreatic-cancer/learn/types-of-pancreatic-cancer/exocrine/のウエブを参照されたい)。膵臓癌のゲノム解析から、周知の癌遺伝子:KRAS、TP53、SMAD4、およびCDKN2Aにおける4つの一般的な発癌事象を伴う複雑な変異景観(mutational landscape)が明らかになる。さらに、膵臓の発生および再生の間の系列特定化および分化において重要な転写因子および下流標的の発現差異に基づいて、膵臓癌は、4つのサブタイプ:(1)扁平上皮;(2)膵臓前駆細胞;(3)免疫原性;および(4)内分泌・外分泌異常分化(ADEX)に分類される。扁平上皮腫瘍の遺伝子マーカーには、炎症、低酸素応答、代謝リプログラミング、TGF-βシグナル伝達、MYC経路活性化、オートファジーに関与する遺伝子ネットワーク、ならびにTP63ΔNおよびその標的遺伝子のアップレギュレートした発現が含まれる。例示的な遺伝子には、TP53、KDM6A、MLL2、MLL3、PDX1、MNX1、GATA6、およびHNF1Bが含まれる。膵臓前駆細胞サブタイプは、転写因子PDX1、MNX1、HNF4G、HNF4A、HNF1B、HNF1A、FOXA2、FOXA3、およびHES1を含む転写ネットワークを特徴とする。ADEXに関連する遺伝子マーカーには、転写因子NR5A2、MIST1(BHLHA15Aとしても知られる)、およびRBPJL、ならびにこれらの下流標的;内分泌分化およびMODYに関連する遺伝子 (INS、NEUROD1、NKX2-2、およびMAFAを含む)、ならびにAMY2B、PRSS1、PRSS3、CEL、およびINSを含む高分化型膵臓腫瘍に関連する遺伝子が含まれる。免疫原性サブタイプは膵臓前駆細胞サブタイプの特徴の多くを共有するが、多量の免疫浸潤物の証拠と関連する。膵臓癌サブタイプ、それぞれのサブタイプに関連する遺伝子マーカー、および検出方法は、Bailey P, et al. (2016). Genomic analyses identify molecular subtypes of pancreatic cancer. Nature 531(7592):47-52に記載されている。
【０２５８】
一態様において、膵臓癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。公知の遺伝情報を有する膵臓細胞株は、ATCCまたはSigmaなどの商業的供給業者から入手することができる。例えば、ATCC(登録商標)TCP-1026(商標)は、特定された遺伝子マーカーを有する7種類の膵臓癌細胞株を含む膵臓癌パネルである。最もよく用いられる癌細胞株の遺伝子変異情報はCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。さらに、KRAS、TP53、SMAD4、およびCDKN2A遺伝情報をもつ一般的に用いられる膵臓癌細胞株は、Deer EL, Gonzalez-Hernandez J, Coursen JD, Shea JE, Ngatia J, Scaife CL, Firpo MA, and Mulvihill SJ (2010). Phenotype and genotype of pancreatic cancer cell lines. Pancreas. 2010 39(4):425-35に記載されている。膵臓癌腫瘍は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)、CureLine(cureline.com/human-tumor-tissues)、またはBioreclamationIVT(bioreclamationivt.com/disease-state-tissues)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２５９】
一態様において、前記腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞は、精巣癌の腫瘍、腫瘍断片、細胞、または不死化細胞である。精巣腫瘍は2つの主要なサブタイプ:生殖細胞および間質腫瘍に分けられる。精巣腫瘍の診断、予後予測、およびサーベイランスでは3種類の十分に確立した血清バイオマーカーであるAFP、HCG、およびLDHが用いられる。精巣腫瘍に関連する他の分子マーカーには、HMGA1、HMGA2、OCT3/4(オクタマー結合タンパク質ファミリーの転写因子(POUホメオドメインタンパク質としても知られる))、SOX2、SOX17、およびCDK10が含まれる。さらに、KITLG、TERT、SPRY4、BAK1、DMRT1、ATF7IP、HPGDS、SMARCAD1、SEPT4、TEX14、RAD51C、PPM1E、TRIM37、MAD1L1、TEX14、SKA2、SMARCAD1、RFWD3、およびRAD51Cなどの内部に位置する遺伝子座も精巣生殖細胞腫瘍と関連付けられている。遺伝子マーカーは、様々なジェノタイピングプラットフォーム、例えば、5' exonuclease assay(TaqMan(商標))、ABI prism 7900HT sequence detection system、またはiPLEX mass array platform(Sequenom, Inc.)を用いて評価することができる。遺伝子マーカーおよび検出方法は、Kreydin EI, Barrisford GW, Feldman AS, and Preston MA (2013). Testicular cancer: what the radiologist needs to know. AJR Am J Roentgenol. 200(6): 1215-25; Leman ES and Gonzalgo ML (2010). Prognostic features and markers for testicular cancer management. Indian J Urol. 26(1):76-81;およびChung CC (2013). Meta-analysis identifies four new loci associated with testicular germ cell tumor. Nat Genet. 45(6):680-5に記載されている。
【０２６０】
一態様において、精巣癌の腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞はヒト患者から得られる。精巣腫瘍細胞株は、例えば、ATCCまたはSigmaから市販されている(例えば、NTERA-2クローンD1)。細胞株の遺伝子変異情報はCOSMIC細胞株データベースから入手可能である。さらに、ヒト精巣生殖細胞腫瘍に由来する細胞株833K-Eが、Bronson DL, Andrews PW, Solter D, Cervenka J, Lange PH, and Fraley EE (1980)Cell line derived from a metastasis of a human testicular germ cell tumor. Cancer Res. 40(7):2500-6において述べられている。833K-E細胞株に関するさらなる情報はExPAsy(アクセッション番号2292)で入手可能である。精巣腫瘍は、例えば、US Biomax Inc.(biomax.us/tissue-section.php?product=HuFTU)またはBioreclamationIVT(bioreclamationivt.com/disease-state-tissues)から市販されている。さらに、バイオバンク、組織バンク、およびバイオレポジトリーの包括的なディレクトリにはspecimencentral.com/biobank-directoryでアクセスすることができる。さらに、注文製作の組織コレクションを含む新鮮凍結した腫瘍が、例えば、ProteoGenex,Inc.(proteogenex.com/biorepository/human-tissue-specimens/fresh-frozen-tissues/)から市販されている。
【０２６１】
腫瘍または腫瘍断片の多くの形状およびサイズが適している。例として、様々な態様では、腫瘍または腫瘍断片の適切な形状には、平面、長方形、立方形、三角形、角錐、五角形、六角形、円柱形、回転楕円体、卵形、および不規則が含まれる。例として、様々な態様では、腫瘍または腫瘍断片の適切なサイズには、約10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、950μm、960μm、970μm、980μm、990μm、1000μm、またはそれより大きなサイズが、その中の増加分を含めて含まれる。さらなる例として、様々な態様では、腫瘍または腫瘍断片の適切なサイズには、約1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、またはそれより大きなサイズが、その中の増加分を含めて含まれる。本明細書において示される開示を考慮すれば、最小サイズは、一部の態様では、少なくとも一つには、ヒトまたは機械によって処理および操作される腫瘍または腫瘍断片が生着を促進する能力によって決まることを当業者は認める。同様に、本明細書において示される開示を考慮すれば、最大サイズは、一部の態様では、少なくとも一つには、栄養分と気体が腫瘍または腫瘍断片の中心に到達する能力によって決まることを当業者は認める。
【０２６２】
一部の態様において、操作された三次元生物学的癌モデルを製作する方法は、第2の成熟工程、具体的には、操作された三次元生物学的癌腫瘍モデルを細胞培養培地中で成熟させる工程を含む。さらなる態様において、細胞培養培地中での、操作された三次元生物学的癌腫瘍モデルの第2の成熟は、開口部が閉じるのを可能にする。
【０２６３】
図1を見ると、特定の態様では、正常乳房線維芽細胞、HUVEC、および前脂肪細胞で構成されるバイオプリントヒト乳房間質組織が赤色蛍光細胞マーカーで標識され、回転バイオリアクター中で培養される。この態様では、表面に切開部(白色の線)が作られ、1本のピンセットを用いてヒト乳癌組織の小さな断片が挿入された。さらに、この態様では、創傷はひとりでに閉じ、複合組織は回転バイオリアクターに入れられて培養に戻される。図2を参照されたい(回転バイオリアクター中で7日間コンディショニングした組織のH&E染色)。
【０２６４】
図3A〜3Eを見ると、特定の態様では、初代腫瘍出発材料は高レベルの免疫浸潤物と低レベルの癌細胞を示す(図3A、H&E染色)。この態様では、小さな腫瘍断片が、もっと大きな腫瘤から切除され、バイオプリント間質組織に移植され、7日間または28日間灌流される(図3B〜3E)。さらに、この態様では、50Xおよび200Xの代表的なH&E画像は、腫瘍断片がバイオプリント間質と合体し、間質が浸潤およびリモデリングし始めることを示している(矢印)。
【０２６５】
図4A〜4Cを見ると、特定の態様では、増殖を評価するために、初代腫瘍が移植されたバイオプリント間質のPCNA(カラー図の中の緑色)が染色されている。2つの代表的な組織を示した(図4B)。この態様では、高倍率(図4C)から、最も外側の間質細胞が増殖しており、赤色のCellTracker色素の発現を失っていることが分かる。腫瘍移植片の位置は染色が無いことで示される。
【０２６６】
図5A〜5Cを見ると、特定の態様では、内皮細胞網の組織化を評価するために、初代腫瘍が移植されたバイオプリント間質のCD31(カラー図の中の緑色)が染色されている。2つの代表的な組織を示した(図5Aおよび図5B)。この態様では、高倍率(図5C)から、バイオプリント内皮細胞は組織の間質部分における組織化および枝分かれを示し、患者腫瘍断片に天然の内皮細胞は保持されていることが分かる。腫瘍移植片の位置は染色が無いことで示される。
【０２６７】
図6A〜6Eを見ると、特定の態様では、初代腫瘍出発材料は多数の癌細胞を示す(図6A、H&E染色)。この態様では、小さな腫瘍断片が、もっと大きな腫瘤から切除され、バイオプリント間質組織に移植され、7日間灌流される(図6B〜6E)。さらに、この態様では、2つの組織からの50Xおよび200Xの代表的なH&E画像は患者腫瘍細胞の保持およびバイオプリント間質への浸潤の増大を示す。
【０２６８】
一部の態様において、前記方法は、個体における疾患状態を処置するための(例えば、個別化医療において使用するための)治療剤を特定および評価する工程を含む。さらなる態様において、治療剤は癌療法である。従って、一部の態様では、個体における癌に対する治療剤を特定する方法は、候補治療剤を前記構築物に適用する工程を含む。他の態様において、前記方法は、創薬において癌を処置するための治療剤を特定する工程を含む。
【０２６９】
一部の態様において、個体における癌に対する候補治療剤を特定する方法は、癌細胞、腫瘍、または腫瘍断片に対する効果を測定する工程をさらに含む。さらなる態様において、この効果には、アポトーシス、癌細胞、腫瘍、腫瘍断片、もしくは不死化細胞に対する損傷、または癌細胞、腫瘍、腫瘍断片、もしくは不死化細胞の生存率の低下が含まれる。さらなる態様において、癌細胞に対する損傷または癌細胞の生存率の低下は、1つもしくは複数のバイオマーカー、機能的効果、または構造的効果によって評価される。他の態様において、この効果には、候補治療剤と接触していないモデルまたは異なる候補もしくは既知の癌治療剤と接触したモデルにおける腫瘍または腫瘍細胞断片のサイズと比較した、治療剤と接触した癌モデルにおける腫瘍または腫瘍細胞断片のサイズの測定が含まれる。一部の態様において、個体における癌に対する治療剤を特定する方法は、癌細胞、腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞に対する治療剤の測定された効果に基づいて、個体のための治療剤を選択する工程を含む。
【０２７０】
さらなる例示的な使用
抗癌療法を評価する目的で、およびさらに優れた標的イメージングツールを開発する目的で、患者に由来する腫瘍、腫瘍断片、または腫瘍細胞の増殖能力および生着能力を測定するための、操作された三次元生物学的癌モデルの利用が本明細書においてさらに説明される。操作された三次元生物学的癌モデルはまた、標的化されたMRI薬剤を開発するためのエクスビボプラットフォームとしても用いられ得る。例えば、生検材料の必要なく癌タイプを特定するために、造影剤の一団が、癌細胞上にある、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロンなどの受容体に結合するエストロゲン、プロゲステロン、テストステロンなどと結合され得る。
【０２７１】
小動物に対してMRIを行うことは難しい。操作された三次元生物学的癌モデルは、組織工学者の管理の下で、(天然組織の複雑さを完全に再現することなく)天然組織の複雑さを程度の差こそあれ模倣するので有用であり、イメージング試薬を開発する際にヒトで使用する前に用いられ得る。
【０２７２】
動物モデル
本明細書に記載の操作された三次元生物学的癌モデルが非ヒト動物に移植されている、癌の非ヒト動物モデルも提供される。一態様において、非ヒト動物は、マウス、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、および任意の非ヒト霊長類を含むが、これに限定されない任意の種からなる群より選択される。特定の態様において、非ヒト動物は、げっ歯動物である。別の特定の態様において、非ヒト動物は免疫不全げっ歯動物である。さらに具体的な態様において、動物はNOD SCIDγマウスである。癌モデルは非ヒト動物の任意の部分に移植することができる。一態様において、癌組織モデルは非ヒト動物の腹膜に移植される。別の態様において、癌組織モデルは非ヒト動物に皮下移植される。別の態様において、癌組織モデルは、げっ歯動物の側腹部に皮下移植される。
【０２７３】
一態様において、癌の非ヒト動物モデルは以下を含む：間質組織と腫瘍組織を含む、操作された三次元組織構築物を含む、操作された三次元生物学的癌モデルであって、腫瘍組織が間質組織の中にあり、間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものである、操作された三次元生物学的癌モデル；および操作された三次元生物学的癌モデルを含む、非ヒト動物。但し、前記癌モデルは、腫瘍組織が間質組織と密着した後に非ヒト動物に移植される。一態様において、非ヒト動物は、遺伝子操作されたげっ歯動物である。一態様において、非ヒト動物は免疫不全げっ歯動物である。一態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである。一態様において、腫瘍組織は、複数の分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。
【０２７４】
一態様において、腫瘍組織は、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、および精巣の腫瘍組織からなる群より選択される腫瘍組織を含む。一態様において、間質組織は、乳房間質細胞、肺間質細胞、肝臓間質細胞、腎臓間質細胞、前立腺間質細胞、腸間質細胞、膵臓間質細胞、または皮膚間質細胞を含む。一態様において、腫瘍組織は乳房腫瘍組織であり、乳房腫瘍組織は、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、ER-/PR-/HER2-、MCF-7、SKBR3、HCC1143、およびMDA-MB-231からなる群より選択される細胞株を含む。一態様において、腫瘍組織は膵臓腫瘍組織であり、膵臓腫瘍組織は、膵臓細胞株、例えば、OPTR3099C、CAPAN1、CAPAN2、PANC1、MIAPACA2、CFPAC1、ASPC1、COLO357、PANC89、またはHPAFIIに由来するマーカーを含む。一態様において、腫瘍組織は周囲を間質組織に囲まれている。一態様において、癌モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。一態様において、腫瘍組織はバイオプリントされた。一態様において、癌モデルは各辺が約1〜約3mmである。一態様において、癌モデルは各辺が約0.25〜約1mmである。
【０２７５】
別の態様において、癌の非ヒト動物モデルは少なくとも1つのタイプの免疫細胞をさらに含む。一態様において、免疫細胞はミエロイド系列細胞である。一態様において、ミエロイド系列細胞は、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様において、免疫細胞はリンパ球である。一態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは非ヒト動物に皮下移植された。一態様において、非ヒト動物は、皮下移植片として、操作された三次元生物学的癌モデルを含む。一態様において、間質組織は、中胚葉に由来する結合組織細胞を含む。
【０２７６】
癌の非ヒト動物モデルを作製する方法であって、間質組織を含む間質バイオインクをバイオプリンティングによって堆積させる工程、腫瘍組織を間質組織の中に堆積させる工程、堆積した間質組織および堆積した腫瘍組織を細胞培養培地中で成熟させて、間質組織を腫瘍組織と密着させて、操作された三次元生物学的癌モデルを形成する工程、ならびに密着した操作された三次元生物学的癌モデルを非ヒト動物に移植する工程を含む、方法も提供される。一態様において、非ヒト動物は、遺伝子操作されたげっ歯動物である。一態様において、非ヒト動物は免疫不全げっ歯動物である。一態様において、操作された三次元生物学的癌モデルは、灌流可能な成熟血管網を含まないか、成熟赤血球を含まないか、神経分布を含まないか、神経組織を含まないか、またはそれらの組み合わせである。一態様において、腫瘍組織は、複数の分離されていない、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞を含む。一態様において、腫瘍組織は、腸、肺、胃、前立腺、腎臓、皮膚、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、膀胱、食道、膵臓、および精巣の腫瘍組織からなる群より選択される腫瘍組織を含む。一態様において、間質組織は、乳房間質細胞、肺間質細胞、肝臓間質細胞、腎臓間質細胞、前立腺間質細胞、腸間質細胞、膵臓間質細胞、または皮膚間質細胞を含む。一態様において、腫瘍組織は乳房腫瘍組織であり、乳房腫瘍組織は、ER+、ER-、PR+、PR-、HER2+、HER2-、ER-/PR-/HER2-、MCF-7、SKBR3、HCC1143、およびMDA-MB-231からなる群より選択される細胞株を含む。一態様において、腫瘍組織は膵臓腫瘍組織であり、膵臓腫瘍組織は、膵臓細胞株、例えば、OPTR3099C、CAPAN1、CAPAN2、PANC1、MIAPACA2、CFPAC1、ASPC1、COLO357、PANC89、またはHPAFIIに由来するマーカーを含む。一態様において、腫瘍組織は周囲を間質組織に囲まれている。一態様において、癌モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に含まない。一態様において、腫瘍組織はバイオプリントされた。一態様において、癌モデルは各辺が約1〜約3mmである。一態様において、癌モデルは各辺が約0.25〜約1mmである。
【０２７７】
一態様において、前記方法は、腫瘍組織をバイオプリンティングによって堆積させる工程をさらに含む。一態様において、前記方法は、少なくとも1つのタイプの免疫細胞を堆積させる工程をさらに含む。一態様において、前記方法は、押出しによって免疫細胞をバイオプリンティングする工程をさらに含む。一態様において、免疫細胞はミエロイド系列細胞である。一態様において、ミエロイド系列細胞は、単球、マクロファージ、前分化マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、巨核球、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様において、免疫細胞はリンパ球である。一態様において、リンパ球は、ナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞、B細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０２７８】
一態様において、前記方法は、癌モデルを非ヒト動物に移植する工程をさらに含み、癌モデルを非ヒト動物に移植する工程は皮下移植によるものである。一態様において、前記方法は、癌モデルを非ヒト動物の側腹部に移植する工程をさらに含む。
【０２７９】
癌に対する治療剤を特定する方法であって、間質組織を含む間質バイオインクをバイオプリンティングによって堆積させる工程、複数の癌細胞を含む腫瘍組織を間質組織の中に堆積させる工程、堆積した間質組織および堆積した腫瘍組織を細胞培養培地中で成熟させて、間質組織を腫瘍組織と密着させて、操作された三次元生物学的癌モデルを形成する工程、密着した操作された三次元生物学的癌モデルを非ヒト動物に移植する工程、候補治療剤を癌モデルに適用する工程、癌細胞の生存率を測定する工程、ならびに測定された癌細胞の生存率に基づいて治療剤を選択する工程を含む、方法も提供される。一態様において、前記方法は、候補治療剤を、移植された癌モデルに適用する工程をさらに含む。一態様において、前記方法は、移植された癌モデルを非ヒト動物から取り出す工程であって、癌モデルが非ヒト動物から取り出された後に、候補治療剤が癌モデルに適用される、工程をさらに含む。
【０２８０】
一態様において、癌を処置するための候補治療剤の方法であって、
(a)本明細書に記載の非ヒト動物モデルを候補治療剤と接触させる工程;
(b)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞、および/または中胚葉に由来する結合組織細胞に対する効果を測定する工程;ならびに
(c)測定された効果に基づいて、癌を処置するための治療剤を選択する工程
を含む、方法が提供される。
【０２８１】
一態様において、初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、または不死化細胞に対する効果は、
(d)初代腫瘍もしくは初代腫瘍断片のサイズの何らかの縮小を検出すること;
(e)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の成長の何らかの低下を検出すること;
(f)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるアポトーシスを検出すること;
(g)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の損傷の程度を検出すること;
(h)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の生存率の低下を検出すること;
(i)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の表面における細胞マーカーの出現、レベル、もしくは消失を検出すること;
(j)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の増殖もしくは成長の速度の変化を検出すること;
(k)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞の染色の変化を検出すること;
(l)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるRNAもしくはDNAおよび/またはその発現の変化を検出すること;
(m)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるタンパク質発現の変化を検出すること;
(n)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるサイトカインの発現および/もしくは分泌および/もしくはレベルの変化を検出すること;あるいは
(o)初代腫瘍、初代腫瘍断片、初代腫瘍細胞、もしくは不死化細胞におけるT細胞動員、ミエロイド系列細胞動員、浸潤、および/もしくは活性化を検出すること
の1つまたは複数によって測定される。
【０２８２】
接触させる方法は、経口投与、注射、または吸入を含む任意の方法によって非ヒト動物に投与することによるものである。
【実施例】
【０２８３】
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載の方法および腫瘍モデルの態様を代表するものであり、限定することは全く意図されていない。
【０２８４】
実施例1-間質組織ブロックのバイオプリンティング
間質区画は、寸法が約2mmx2mmx2mmの個体の立方体として印刷された、ヒト乳房線維芽細胞、内皮細胞、および前脂肪細胞を含んだ。バイオプリントされた細胞または移植された細胞の位置を追跡するために、赤色蛍光色素(CellTracker CMRA Orange(ThermoFisher))をバイオプリント組織に取り込ませた。
【０２８５】
実施例2-間質組織ブロックのプレコンディショニング
バイオプリント間質組織を50mM塩化カルシウムを用いて架橋し、50mL vented cap tube(CellTreat)に入れて回転バイオリアクターの中で18rpmで3日間培養した。間質組織を調製するために、組織をバイオリアクターチューブに入れて50mg/mLアルギン酸リアーゼで一晩処理し、培養培地に入れてバイオリアクターの中で、もう4日間培養した。回転バイオリアクターの中で培養した、プレコンディショニングした組織は、組織の外面に、メスによる切開を可能にする高密度の線維芽細胞被膜を呈した。図2を参照されたい。
【０２８６】
実施例3-間質組織ブロック内への初代ヒト固形腫瘍断片の移植
次いで、小さな切開部を作った後に、ヒト乳癌組織の小さなセグメント(約0.5mmx0.5mmx0.5mm)をバイオプリント間質組織の内部に移植した。移植中に引き起こされた創傷は自然に塞がり、腫瘍組織を構造の内部に保持するために縫合糸も接着剤も必要としない。
【０２８７】
実施例4-ヒト間質カプセル内への移植腫瘍細胞の生着の測定
移植後に、腫瘍組織を少なくとも7日間培養した。間質カプセル内への腫瘍細胞の生着は組織学によって特徴付けられた。図3A〜3Eを参照されたい。50Xおよび200Xの代表的なH&E画像から、腫瘍断片はバイオプリント間質と合体していることが分かる。
【０２８８】
実施例5-ヒト間質カプセルの中にある移植腫瘍細胞の細胞リモデリングの測定
代表的なH&E画像は、7日以内または28日以内にバイオプリント間質組織と一体化した、患者に由来する腫瘍細胞材料を示している(図3A〜3E)。培養して28日目に、組織の外側部分に向かっている脂肪細胞と、患者由来材料へのバイオプリント間質の浸潤により証明されるように、腫瘍材料はリモデリングし続けていた。(移植された、患者に由来する)出発乳房腫瘍材料の内部には上皮も細胞材料もほとんど検出されなかったか、全く検出されなかった。このことは、個々の患者腫瘍に見出される上皮細胞の量が少ないことを反映している可能性がある。
【０２８９】
実施例6-ヒト間質カプセルの中でリモデリングした、癌上皮細胞含有量が多い腫瘍細胞からの腫瘍細胞不均一性増大の測定
間質への腫瘍細胞の浸潤に及ぼす、腫瘍出発材料の中にある癌上皮細胞数の影響を試験した。多数の癌細胞を含むドナー腫瘍細胞材料を用いて、高度の不均一性につながる、間質への移植腫瘍細胞の浸潤および保持の増大が観察された。図6A〜6Eを参照されたい。不均一性が増大すると、同じ腫瘍の異なる部分がどのように抗癌化合物に応答するかを調べる研究が可能になる。
【０２９０】
実施例7-移植腫瘍細胞の増殖の測定
間質または腫瘍組織の増殖を評価するために、初代腫瘍が移植されたバイオプリント間質をPCNA(カラー図の中の緑色)で染色することによって増殖を評価した。図4A〜4Cは、間質区画における増殖が観察されたことを示す(図4B、50X(間質)および50X(腫瘍))。高倍率(図4C、200X(間質))から、最も外側の間質細胞が増殖しており、赤色CellTracker Red CMTPX色素(ThermoFisher Scientific)の発現を失っていることが分かる。このことから、最も外側の細胞は最も著しく増殖していることが証明される。腫瘍移植片の位置は、赤色染色が存在しないことで特定される。7日間培養した後に、移植組織ならびにバイオプリント間質組織の中に内皮細胞網が観察された。図5A〜5Cを参照されたい。
【０２９１】
実施例8-フロー灌流は、より良いモデルを提供する
図7A〜7Eは、MCF7乳癌細胞が、乳房線維芽細胞、内皮細胞、および脂肪細胞を含む間質に囲まれているバイオプリント乳房3D癌モデルを横切る培地のラテラルフローを示す。図7Aは、ラテラルフローを供給するために細胞培養培地と同時に灌流された6つのバイオリアクターの写真である。横向きの再循環する灌流があると、化合物または薬物を連続して供給または投与することが可能になる。そして、ラテラルフローはインビボ微小環境をより良く模倣する。図7B〜7Eは、フロー状態がECM組織化と組織密着を向上させることを示した顕微鏡写真である。
【０２９２】
図8A〜8Bは、フロー灌流を受けた3Dバイオプリント乳癌モデルがドキソルビシン耐性の増大を示し、従って、2D共培養細胞および静的3Dバイオプリント細胞と比較して正確なモデルとなることを示す。図8Aは、ビヒクル(対照)および漸増濃度のドキソルビシンについて、3D乳癌モデルに対するドキソルビシン毒性を示したグラフである。図8Bは、培養2D正常ヒト乳房線維芽細胞(NHMF)、2Dヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、2D皮下前脂肪細胞(SPA)、2D MCF7癌細胞、2D共培養細胞(全細胞タイプ。混合物)、静的培養を用いた3D乳癌モデル、およびフロー灌流を用いた3D乳癌モデルのドキソルビシンLD50(μM)を示したグラフである。
【０２９３】
図9は、フロー灌流を受けた3D乳癌モデルにおいて、細胞タイプに特異的な作用を観察できることを示した顕微鏡写真を示す。左上のパネルは、フロー灌流のあるビヒクルと接触した間質細胞を示した顕微鏡写真である。右上のパネルは、フロー灌流を受けた間質細胞に対する10μMドキソルビシンの作用を示した顕微鏡写真である。左下のパネルは、フロー灌流のあるビヒクルと接触した癌細胞を示した顕微鏡写真である。右下のパネルは、フロー灌流を受けた癌細胞に対する10μMドキソルビシンの作用を示した顕微鏡写真である。
【０２９４】
実施例9-癌細胞を含む異種移植3Dバイオプリント乳房組織
図10Aは、MDA-MB-231乳癌細胞を含む3Dバイオプリント乳癌組織モデルのH&E染色を示す。図10Bは、KRT8/18、ビメンチン、およびCD31を染色した、MDA-MB-231乳癌細胞を含む3Dバイオプリント乳房組織の免疫蛍光を示す。図10Cは、MDA-MB-231乳癌細胞を含む3Dバイオプリント乳房組織に由来する異種移植片のH&E染色を示す。図10A〜Cは、3Dバイオプリント乳房組織に印刷されたMDA-MB-231乳癌細胞が腫瘍形成性を保持し、異種移植片として増殖したことをまとめて示す。
【０２９５】
図10の3Dバイオプリント乳癌組織モデルを、Novogen Bioprinter(登録商標)Instrument(Organovo, Inc., San Diego, CA)を用いて0.4um Transwell透明ポリエステルメンブレンインサート(clear polyester membrane insert)(Corning Costar, Corning, NY)にバイオプリントした。それぞれの区画、間質または癌の細胞を組み合わせ、1.5〜2.0x108細胞/mLの最終濃度になるまでNovogel 3.0(Organovo, Inc., San Diego, CA)に再懸濁した。間質組織区画はヒト乳房線維芽細胞(HMF)とヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を含んだ。腫瘍組織区画は、クローディンロー(claudin low)MDA-MB-231細胞株に由来する乳癌細胞とHUVECを含んだ。バイオプリント組織の寸法は約2mmX2mmX1mmであった。バイオプリンティング後に、組織を、含まれている各細胞タイプを支持するのに用いたサプリメントを含む培地中で培養した。印刷して2日後に、Novogelを除去するために組織をリアーゼ(Sigma-Aldrich)で処理した。組織を10日間培養状態で維持し、培地を毎日交換した。10日目に、3Dバイオプリント乳癌組織を組織培養トランスウェルから取り出し、Matrigelでコーティングし、易感染性マウスの側腹部に皮下移植した。腫瘍を経時的にノギスで測定し、直径1.5cmで採取した。次いで、後の組織学的分析のために、腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。重要なことに、図10A〜Cに示したように、移植した癌細胞は腫瘍形成性を保持し、異種移植片として増殖した。
【０２９６】
実施例10-癌細胞を含む異種移植3Dバイオプリント膵臓組織
図11Aは、3匹のNSG免疫不全マウスの皮下に異種移植した3Dバイオプリント膵臓組織の成長を経時的に示したグラフである。特に、成長は、mm3の単位で測定した体積増加の倍率として確かめた。グラフから、30日の期間にわたって体積が少なくとも5倍増加したことが分かる。腫瘍生着後に、これらのマウスを用いて、個々の治療薬物の効力を確かめることができた。または、これらのマウスを用いて、膵臓腫瘍試料を連続して増やして、インビトロ薬物スクリーニング用またはインビボ薬物スクリーニング用に多量の患者腫瘍材料を得ることができた。
【０２９７】
図11Bは、膵臓癌細胞を含む異種移植3Dバイオプリント膵臓組織から作製した膵臓腫瘍組織のH&E染色である。スケールバーは100μmを表している。図11Bに図示した組織構造から、膵臓癌細胞を含むバイオプリント3D膵臓組織をNSG免疫不全マウスに移植するとインビボでロバストな腫瘍形成が生じることが分かる。図11の3Dバイオプリント膵臓癌組織モデルは、Novogen Bioprinter(商標)Instrument(Organovo, Inc., San Diego, CA)を用いて0.4 um Transwell透明ポリエステルメンブレンインサート(Corning Costar, Corning, NY)にバイオプリントした。それぞれの区画、間質または癌の細胞を組み合わせ、1.5〜2.0x108細胞/mLの最終濃度になるまでNovogel 3.0(Organovo, Inc., San Diego, CA)に再懸濁した。間質組織区画はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)とヒト初代膵臓星状細胞(PSC)を含んだ。PSCは、膵臓癌、例えば、膵臓腺癌(PDA)を有する患者において見出される高密度の線維形成反応を担うと考えられている線維芽細胞様細胞である。腫瘍組織区画はHPAFII膵臓癌細胞を含んだ。または、3Dバイオプリント膵臓癌組織モデルは、膵臓癌につながる様々なトランスフォーメーション状態を有するように操作された膵臓上皮細胞、例えば、HPNE、HPNE +E6/E7、HPNE +E6/E7+KRAS、HPNE +E6/E7+KRAS+SmallTを用いて作製することができる。
【０２９８】
バイオプリント組織の寸法は約2mmX2mmX1mmであった。バイオプリンティング後に、組織を、含まれている各細胞タイプを支持するのに用いたサプリメントを含む培地中で培養した。組織を10日間培養状態で維持し、培地を毎日交換した。10日目に、この3Dバイオプリント膵臓癌組織モデルを易感染性マウスの側腹部に皮下移植した。腫瘍を経時的にノギスで測定し、直径1.5cmで採取した。次いで、後の組織学的分析のために腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。重要なことに、図11A〜Bに示したように、移植した癌細胞は腫瘍形成性を保持し、インビボでのロバストな腫瘍形成を導き、異種移植片として増殖した。
【０２９９】
実施例11-免疫細胞を含む、操作された三次元バイオプリントヒト乳癌組織
乳癌は大きな浸潤性マクロファージ集団を示すことが多い。高密度の浸潤性マクロファージは高い腫瘍グレードと関連し、乳癌患者の無再発生存期間と全生存期間の両方について予後悪化と関連する。例えば、多数の腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、トリプルネガティブ乳癌(TNBC)であるER-/PR-/HER2-乳癌のある患者の予後悪化と正の相関関係がある。
【０３００】
2つの主なマクロファージタイプであるM1様マクロファージおよびM2様マクロファージがある。M1様マクロファージは古典的活性化マクロファージとも呼ばれ、炎症促進性、抗腫瘍形成性になる傾向があり、適応免疫系を開始する。対照的に、M2様マクロファージは選択的活性化マクロファージとも呼ばれ、抗炎症性(すなわち、創傷治癒)、免疫抑制性、および腫瘍形成促進性になる傾向がある。ほとんどの腫瘍関連マクロファージ(TAM)はM2様マクロファージである。従って、トリプルネガティブ乳癌細胞(TNBC:ER-/PR-/HER2-乳癌)を単球と共培養することで、単球はM2様マクロファージに分化し、そして次に、M2様マクロファージはTNBC細胞の増殖を支持する可能性がある。
【０３０１】
免疫細胞を含む、操作された三次元(3D)バイオプリントヒト乳癌組織構築物はNovogenバイオプリンター(登録商標)Instrument(Organovo, Inc., San Diego, CA)を用いて生成した。免疫細胞はミエロイド系列細胞であり、具体的には、ヒト末梢血単核球(PBMC)由来ミエロイド系列細胞に由来する単球であった。
【０３０２】
間質組織は、ヒト乳房線維芽細胞(HMF)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、単球、および脂肪細胞の混合物を含む間質バイオインクからバイオプリントした。従って、バイオプリント間質組織はHMF、HUVEC、単球、および脂肪細胞の混合物を含んだ。特に、単球はヒト末梢血単核球(PBMC)由来ミエロイド系列細胞に由来した。腫瘍組織は、線維芽細胞、HUVEC、単球、およびMDA-MB231細胞株に由来する乳癌細胞の混合物で構成される腫瘍バイオインクからバイオプリントした。MDA-MB231細胞株はトリプルネガティブ乳癌株(TNBC:ER-/PR-/HER2)である。従って、バイオプリント腫瘍組織は、線維芽細胞、HUVEC、単球、およびER-/PR-/HER2-乳癌細胞の混合物で構成された。または、本開示全体を通して認められるように、MDA-MB231細胞株の代わりに他の乳癌細胞株を使用することができる。本実施例では、バイオプリント腫瘍組織は周囲をバイオプリント間質組織に完全に囲まれるようにバイオプリント間質組織の中に配置した。
【０３０３】
バイオプリントした後に、ヒト乳癌組織構築物を、細胞培養培地を含む6ウェルプレートに入れてバイオプリンティング後14日まで培養した。図12A〜Bは、バイオプリンティング後7日目の、免疫細胞を含む、この乳癌組織構築物のH&E染色を示す。図12C〜Dは、バイオプリンティング後14日目の、免疫細胞を含む、この乳癌組織構築物のH&E染色を示す。図12Aおよび図12Cは5x倍率のH&E染色である。これに対して、図12Bおよび図12Dは40x倍率のH&E染色である。図12Aおよび図12Cは、バイオプリント腫瘍組織が周囲をバイオプリント間質組織に囲まれるようにバイオプリント間質組織で十分に包まれていることを示す。図12Bおよび図12Dの矢印は、単球から分化したマクロファージを示す。意義深いことに、図12Dに示したように、これらの組織構築物の中にある単球の大部分がマクロファージに分化しており、組織構築物の中に単球はまれにしか見出されない。図12BおよびDに示したように、マクロファージの大部分が腫瘍組織領域の中とその近くに見出されたことも意義深いことであった。このことは、分化したマクロファージが癌の中心に向かって遊走した可能性を示している。図12Dはまた高レベルの脂肪変性も示している。
【０３０４】
本発明の好ましい態様が本明細書において示され、説明されたが、このような態様は単に例として示されたことが当業者に明らかである。今や、本発明から逸脱することなく、非常に多くの変化、変更、および置換が当業者の頭に浮かぶ。本明細書に記載の本発明の態様の様々な代案が本発明の実施において用いられ得ることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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