【手続補正書】
【提出日】平成19年7月11日(2007.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】１）SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:15と少なくとも70％の配列同一性を有すると同時に、SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:15に免疫学的に等価なアミノ酸配列類似体；
２）SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列のT-細胞エピトープ；及び
３）２)のT-細胞エピトープと少なくとも70％の配列同一性を有すると同時に、SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:15と免疫学的に等価なアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なポリペプチドフラグメント。
【請求項２】本質的に純粋な形態である請求項１によるポリペプチドフラグメント。
【請求項３】少なくとも７アミノ酸残基、例えば少なくとも８、少なくとも９、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも22、少なくとも24及び少なくとも30アミノ酸残基長を有する前記請求項のいずれかによるポリペプチドフラグメント。
【請求項４】いずれのシグナル配列も有しない前記請求項のいずれかによるポリペプチドフラグメント。
【請求項５】１）SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:15と少なくとも70％の配列同一性を有すると同時に、SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:15に免疫学的に等価なアミノ酸配列類似体；
２）SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列のT-細胞エピトープ；及び
３）２)のT-細胞エピトープと少なくとも70％の配列同一性を有すると同時に、SEQ ID NO:17又はSEQ ID NO:15と免疫学的に等価なアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列及び少なくとも１つの融合パートナーからなる融合ポリペプチド。
【請求項６】融合パートナーが、
１）SEQ ID NOs:７、13、15、17、19、21、23、25、27、29又は31に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドフラグメント；
２）SEQ ID NOs:７、13、15、17、19、21、23、25、27、29又は31に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の配列同一性を有すると同時に、該配列に免疫学的に等価なアミノ酸配列類似体からなるポリペプチドフラグメント；
３）SEQ ID NOs:７、13、15、17、19、21、23、25、27、29又は31に示すアミノ酸配列のT-細胞エピトープからなるポリペプチドフラグメント；
４）SEQ ID NOs:７、13、15、17、19、21、23、25、27、29又は31に示すアミノ酸配列のT-細胞エピトープと少なくとも70％の配列同一性を有すると同時に、そのアミノ酸配列に免疫学的に等価なアミノ酸配列からなるポリペプチドフラグメント；及び
５）ESAT-6又はその少なくとも１つのT-細胞エピトープ、TB10.4又はその少なくとも１つのT-細胞エピトープ、及びMPT59又はその少なくとも１つのT-細胞エピトープのような、結核菌群に属する細菌由来のポリペプチドフラグメント
からなる群から選択される請求項５による融合ポリペプチド。
【請求項７】融合パートナーが、DnaK、GroEL、ウレアーゼ、グルタミンシンセターゼ、プロリンリッチ複合体、L-アラニンデヒドロゲナーゼ、ホスフェート結合タンパク質、Ag 85複合体、HBHA(ヘパリン結合血球凝集素)、MPT51、スーパーオキシドジスムターゼ、19 kDaリポプロテイン、α-クリスタリン、GroES及びMPT59からなる群から選択される請求項５による融合ポリペプチドフラグメント。
【請求項８】ポリペプチドの自己アジュバント作用を可能にするよう脂質化される前記請求項のいずれかによるポリペプチド。
【請求項９】配列同一性が少なくとも80％、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％及び少なくとも99.5％である前記請求項のいずれかによるポリペプチドフラグメント。
【請求項１０】医薬に用いるための請求項１〜９のいずれか１つによる実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項１１】マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アフリカヌム又はマイコバクテリウム・ボビスによって哺乳動物に引き起こされる結核に対する診断又はワクチン接種用医薬組成物の製造における請求項１〜９のいずれか１つによる実質的に純粋なポリペプチドの使用。
【請求項１２】請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドからなる免疫組成物。
【請求項１３】さらに、
−  SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29又は31に示すアミノ酸配列；
−  SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29又は31に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の配列同一性を有すると同時に、該アミノ酸配列に免疫学的に等価な類似体；
−  SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29又は31に示すアミノ酸配列のT-細胞エピトープ；及び
−  SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29又は31に示すアミノ酸配列のT-細胞エピトープと少なくとも70％の配列同一性を有すると同時に、該アミノ酸配列に免疫学的に等価なアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのポリペプチドフラグメントからなる請求項１２による免疫組成物。
【請求項１４】さらに免疫学的かつ医薬的に許容される担体、ビヒクル又はアジュバントからなる請求項１２又は１３のいずれかによる免疫組成物。
【請求項１５】担体が、ポリペプチドが疎水性の非共有相互作用により結合するプラスチックのようなポリマー、例えばポリスチレン、ポリペプチドが共有結合する多糖及びポリペプチドのようなポリマー、例えばウシ血清アルブミン、オバルブミン又はキーホールリンペットヘモシアニンからなる群から選択され；ビヒクルが希釈剤及び懸濁剤からなる群から選択され；かつアジュバントがジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、Quil A、ポリI:C、フロイントの不完全アジュバント、IFN-γ、IL-2、IL-12、モノホスホリルリピドA(MPL)及びムラミルジペプチド(MDP)からなる群から選択される請求項１４による免疫組成物。
【請求項1６】少なくとも２つの異なるポリペプチドフラグメントからなり、異なるポリペプチドフラグメントが、それぞれ請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドである請求項１２〜１５のいずれかによる免疫組成物。
【請求項１７】３〜20個の異なるポリペプチドフラグメントからなる請求項１６による免疫組成物。
【請求項１８】ワクチンの形態である請求項１２〜１７のいずれかによる免疫組成物。
【請求項１９】皮膚検査試薬の形態である請求項１２〜１８のいずれかによる免疫組成物。
【請求項２０】非病原性微生物を有効成分として含み、該微生物のゲノム中には、請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドをエンコードするDNA配列からなるDNAフラグメントの少なくとも１つのコピーが、該微生物がポリペプチドを発現し、任意に分泌し得るように導入されている、結核菌群に属するマイコバクテリアによって引き起こされる結核に対する、ヒトを含む動物の免疫化用ワクチン。
【請求項２１】微生物が細菌である請求項２０によるワクチン。
【請求項２２】細菌が、マイコバクテリウム属、サルモネラ属、シュードモナス属及びエシェリキア属からなる群から選択される請求項２１によるワクチン。
【請求項２３】微生物が、マイコバクテリウム・ボビスBCG、例えばマイコバクテリウム・ボビスBCG株: Danish 1331である請求項２２によるワクチン。
【請求項２４】請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドをエンコードするDNAフラグメントの少なくとも２つのコピーが、微生物のゲノム中に導入される請求項２０〜２３のいずれかによるワクチン。
【請求項２５】コピー数が少なくとも５である請求項２４によるワクチン。
【請求項２６】検出手段と任意に組み合わさった、請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドからなる、ヒトを含む動物における結核診断用組成物。
【請求項２７】１）SEQ ID NO:16又はSEQ ID NO:14に記載される配列を有する核酸配列からなり、
２）少なくとも10ヌクレオチド長を有し、かつSEQ ID NO:16又はSEQ ID NO:14に記載される配列又はそれに対する相補配列を有する核酸フラグメントと適度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
但し、S.T.Coleら(1998), Nature 393 (6685) 537-544に記載される核酸配列は除かれる、単離形態の核酸フラグメント。
【請求項２８】DNAフラグメントである請求項２７による核酸フラグメント。
【請求項２９】１）SEQ ID NO:16又はSEQ ID NO:14に記載される配列を有する核酸配列からなり、
２）少なくとも10ヌクレオチド長を有し、かつSEQ ID NO:16又はSEQ ID NO:14に記載される配列又はそれに対する相補配列を有する核酸フラグメントと適度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸フラグメント。
【請求項３０】マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アフリカヌム又はマイコバクテリウム・ボビスによって引き起こされる結核に対する診断又はワクチン接種用の医薬組成物の製造における請求項２７〜２９のいずれか１つによる核酸フラグメントの使用。
【請求項３１】投与したヒトを含む動物に抗原をインビボで発現させ、発現される抗原の量が、ヒトを含む動物における結核菌群のマイコバクテリア感染に対する耐性を実質的に増大するのに有効な、請求項２７〜２９のいずれか１つによる核酸フラグメントからなるワクチン。
【請求項３２】請求項２７〜２９のいずれか１つによる核酸フラグメントからなる複製可能な発現ベクター。
【請求項３３】ウイルス、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド及びミニ染色体からなる群から選択される請求項３２によるベクター。
【請求項３４】請求項３２又は３３による少なくとも１つのベクターを有する形質転換細胞。
【請求項３５】結核菌群に属する細菌、例えばエム.ツベルクローシスボビスBCG細胞である請求項３４による形質転換細胞。
【請求項３６】請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドを発現する、請求項３４又は３５による形質転換細胞。
【請求項３７】検出用手段と任意に組み合わさった、請求項２７〜２９のいずれか１つによる核酸フラグメントからなる、ヒトを含む動物での結核の診断用組成物。
【請求項３８】１）SEQ ID NO:16又はSEQ ID NO:14に記載される配列を有する核酸配列からなり、
２）少なくとも10ヌクレオチド長を有し、かつSEQ ID NO:16又はSEQ ID NO:14に記載される配列又はそれに対する相補配列を有する核酸フラグメントと適度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
核酸フラグメントを、宿主細胞中で複製可能なベクターに挿入し、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を、ポリペプチドを発現させるに十分な条件下、培養培地で培養し、かつ宿主細胞又は培養培地からポリペプチドを回収するか、又は、
結核菌群の全マイコバクテリアから、又はその溶解物又はフラクション、例えば細胞壁含有フラクションから、ポリペプチドを単離するか、又は
固相又は液相のペプチド合成によってポリペプチドを合成することからなる、請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドの産生方法。
【請求項３９】請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドを調製し、合成又は単離し、かつワクチン用媒体にポリペプチドを可溶化又は分散し、任意に他のエム.ツベルクローシス抗原及び/又は担体、ビヒクル及び/又はアジュバント物質を加えるか、又は
請求項３４〜３６のいずれかによる細胞を培養し、ワクチン用媒体に細胞を移し、任意に担体、ビヒクル及び/又はアジュバント物質を加えることからなる、請求項１２〜１９のいずれかによる免疫組成物の産生方法。
【請求項４０】ヒトを含む動物に、請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチド又は請求項１９による免疫組成物を皮内注射することからなり、注射部位での陽性の皮膚応答が動物が結核を有していることを示し、注射部位での陰性の皮膚応答が動物が結核を有していないことを示す、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アフリカヌム又はマイコバクテリウム・ボビスによって動物に引き起こされる結核の診断方法。
【請求項４１】ヒトを含む動物に、請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチド、請求項１８による免疫組成物又は請求項２０〜２５のいずれかによるワクチンを投与することからなる、結核菌群に属するマイコバクテリアによって引き起こされる結核に対する動物の免疫化方法。
【請求項４２】ポリペプチド、免疫組成物又はワクチンが、非経口(例えば静脈内及び動脈内)、腹膜内、筋肉内、皮下、皮内、経口、頬、舌下、鼻、直腸又は経皮経路によって投与される請求項４１による方法。
【請求項４３】動物又はヒト由来の血液試料を提供し、請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドと動物由来の試料を接触させることからなり、血液試料中の単核細胞による少なくとも１つのサイトカインの細胞外相への有意な放出が、動物が感作されていることを示す、動物又はヒトにおいて結核菌群に属する細菌での過去もしくは現在の感作を診断する方法。
【請求項４４】イムノアッセイで、請求項１〜９のいずれか１つによるポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、又は該抗体の特異的結合性フラグメント。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
発明の詳細な開示
この明細書及び請求の範囲において、用語「ポリペプチドフラグメント」又はその変形は、少なくとも2アミノ酸残基、多くて10アミノ酸残基の短いペプチド、オリゴペプチド(11〜100アミノ酸残基)及びより長いペプチドを意味する。ポリペプチドフラグメントは、グリコシル化により、脂質化により、あるいは置換基からなることにより化学的に修飾されていてもよい。
この明細書において、用語「実質的に純粋なポリペプチドフラグメント」は、自然に結合する他のポリペプチド物質を多くて5重量％含むポリペプチド調製物を意味する(他のポリペプチド物質についてはより低い％、例えば多くて4％、多くて3％、多くて2％、多くて1％及び多くて1/2％が好ましい)。実質的に純粋なポリペプチドは、少なくとも96％純粋、つまりポリペプチドが調製物中の全ポリペプチド物質の少なくとも96重量％を構成することが好ましい。％は高い方が好ましく、例えば少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99,25％、少なくとも99,5％及び少なくとも99,75％である。ポリペプチドフラグメントは「本質的に純粋な形態」、つまりポリペプチドフラグメントが自然に結合するいずれかの他の抗原、つまり結核菌群に属する細菌由来のいずれかの他の抗原を本質的に有しないことが好ましい。これは、後述する非マイコバクテリア宿主細胞における組換え手段によりポリペプチドフラグメントを調製することによって、又は固相もしくは液相ペプチド合成の周知方法、例えばMerrifieldにより記載される方法あるいはその変形でポリペプチドフラグメントを合成することによって、行うことができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
「結核菌群」はその通常の意味を有する。つまり、TBを引起こすマイコバクテリア群には、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ボビスBCG及びマイコバクテリウム・アフリカヌム(Mycobacterium africanum)がある。
用語「毒性マイコバクテリア」によれば、ヒトを含む哺乳動物で結核疾患を引起こし得る細菌と理解される。毒性マイコバクテリアの例は、エム・ツベルクローシス、エム・アフリカヌム及びエム・ボビスである。
用語「TB患者」によれば、毒性マイコバクテリアでの感染が培養又は顕微鏡学的に明らかにされた個体、及び/又はTBと臨床的に診断された個体及び抗-TB化学療法に感受性の個体と理解される。TBの培養、顕微鏡及び臨床的な診断は、当業者に周知である。
用語「PPD陽性個体」によれば、マントー試験が陽性の個体又はPPDが末梢血液単核細胞(PBMC)もしくは血液全体からの少なくとも1,000pg/mlのINF-γの放出によって測定される回収反応(recall reaction)のインビトロでの増加を誘発する個体と理解される。誘発は、約1.0〜2.5 x 105 PBMCからなる懸濁液に2.5〜5 μgのPPD/mlを加えて行われる。IFN-γの放出は、懸濁液にPPDを添加してから5日後に回収される上清中のINF-γを、PPDを加えないINF-γの放出と比較した測定によって評価される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
融合ポリペプチドを産生することにより、この発明のポリペプチドフラグメントの優れた特性が得られる。例えば、組換えによって産生された場合にポリペプチドの輸出を助ける融合パートナー、ポリペプチドの精製を助ける融合パートナー及びこの発明のポリペプチドフラグメントの免疫原性を高める融合パートナーが、興味ある可能性の全てである。従って、この発明はまた、上記の少なくとも1個のポリペプチドフラグメントと少なくとも1個の融合パートナーとを含む融合ポリペプチドに関する。免疫原性を高めるためには、融合パートナーは、例えば、上記の(関連エピトープの多重発現を可能にする)別のポリペプチドフラグメント、及び、ESAT-6、TB10.4、CFP10、FP17、CFP21、CFP25、CFP29、MPB59、MPT59、MPB64及びMPT64又はこれらの抗原のいずれかの少なくとも1つのT-細胞エピトープのような結核菌群に属する細菌由来の別のポリペプチドからなる群から選択することができる。融合パートナーとして役立ち得る免疫原性を高める他のポリペプチドは、T細胞エピトープ(例えばポリペプチドESAT-6、MPB64、MPT64又はMPB59から誘導されたT細胞エピトープ)、又は、標的遺伝子産物の免疫原性を高める免疫原性エピトープ、例えばIFN-γ、IL-2及びIL-12のようなリンホカインである。発現及び/又は精製を容易にするためには、融合パートナーは、例えば、細菌の線毛タンパク質、例えば毛成分pilin及びpapA; プロテインＡ; ZZ-ペプチド (ZZ-融合体はスウェーデンの Pharmaciaにより市販);マルトース結合タンパク質; グルタチオン S-トランスフェラーゼ; β-ガラクタトシダーゼ;又はポリ-ヒスチジンであってもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
従って、この発明は、この発明のポリペプチドフラグメントの産生方法にも関する。この方法は、上記核酸フラグメントを、 宿主細胞中で複製可能なベクターに挿入し、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入し(形質転換細胞は、分画ハイブリッド形成、融合レポーター遺伝子産物、抵抗マーカー、抗-抗原抗体等の同定によるスクリーニングを含む種々の技術を用いて選択できる)、この宿主細胞を、ポリペプチドの発現を行うのに十分な条件下、培養培地で培養し(当然、細胞は状況に適した条件下で培養でき、DNAが所望される場合には複製条件を用いる)、宿主細胞又は培養培地からポリペプチドを回収するか; 又は、
結核菌群のマイコバクテリアの全体から、又はその溶解物又はフラクション、例えば細胞壁含有フラクションから、ポリペプチドを単離するか、又は
固相又は液相のペプチド合成によってポリペプチドを合成することからなる。
形質転換細胞の成長に用いられる培地は、目的にかなった通常の培地であればいかなる培地であってもよい。好適なベクターは上記ベクターのいずれであってもよく、好適な宿主細胞は上記細胞型のいずれであってもよい。ベクターを構築し、それを宿主細胞に導入するのに用いられる方法は、組換えDNA分野におけるこうした目的の場合に知られるいずれの方法であってもよい。以下に、可能性についてより詳細に説明する:
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
一般的には、当然、原核生物は、この発明の核酸配列の初期クローニング、及びこの発明に有用なベクターの構築に好ましい。例えば、後述のより詳細な開示に記載される特定の菌株に加えて、例として、大腸菌K12 株294 (ATCC No. 31446)、大腸菌B、及び大腸菌X 1776 (ATCC No. 31537)のような菌株が挙げられる。これらの例は、当然、例示的なものであり限定的なものではない。
原核生物は、発現にも好ましい。上記の菌株ならびに大腸菌W3110 (F-、λ-、野生株、ATCC No. 273325)、枯草菌のような桿菌、又はサルモネラ・ティフィムリムもしくはセラチア・マルセッセンスのような他の腸内細菌、及び種々の シュードモナス種を用いてもよい。特に興味あるものは、成長の早いマイコバクテリア、例えばエム.スメグマチスである。というのは、これらの細菌は、結核菌群のマイコバクテリアに高度に類似しており、従って、発現産物の翻訳後修飾を行う必要性を低減する良好な可能性を有するためである。この発明の１つの局面においては、この発明のポリペプチドをGRAS生物、例えばラクトコッカス(lactococcus)において産生するのが好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
この発明の核酸フラグメントは、この発明のポリペプチド合成及びハイブリッド形成プローブ(直接的なハイブリッド形成アッセイ、又は例えばPCRもしくは他の分子増幅法におけるプライマーとして有用)のための開始点として用いることとは別に、抗原のインビボ発現に用いてもよい。即ち、核酸フラグメントをいわゆるDNAワクチンに用いてもよい。最近の研究から、真核細胞において非複製的なベクターでクローンされたDNAフラグメントは、例えば筋肉内注射又は経皮投与 (いわゆる"遺伝子銃"法)により動物（ヒトを含む）に導入され得ることが明らかにされている。DNAは、例えば筋肉細胞により吸収され、興味ある遺伝子が、真核生物において機能しているプロモーター、例えばウィルス性プロモーターにより発現され、その後、遺伝子産物が免疫系を刺激する。これらの新しく発見された方法は、引用によりここに組み込まれるUlmerら, 1993において検討されている。
従って、この発明は、この発明による核酸フラグメントからなるワクチンにも関し、このワクチンは、これを投与したヒトを含む動物により、抗原をインビボで発現する。発現される抗原の量は、ヒトを含む動物における結核菌群のマイコバクテリア感染に対する耐性を実質的に増大するのに有効である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
従って、この発明の他の重要な局面は、現在入手可能な生BCGワクチンの改良であって、上記ポリペプチドをエンコードするDNA配列の1以上のコピーが、微生物がポリペプチドを発現し、分泌し得るように微生物ゲノムに導入されている微生物を有効成分として含むことからなる、結核菌群に属するマイコバクテリアによって引き起こされるTBに対する、ヒトを含む動物の免疫化用ワクチンである。
この明細書において、用語「ゲノム」は、微生物の染色体ならびに染色体外のDNA又はRNA、例えば プラスミドを指す。しかしながら、この発明のDNA配列は、非病原性微生物の染色体に導入されていることが好ましい。というのは、これにより、導入された遺伝物質の損失が防止されるからである。
非病原性微生物は、例えばマイコバクテリウム、サルモネラ、シュードモナス及びエシェリキア属からなる群から選択される細菌が好ましい。非病原性微生物は、マイコバクテリウム・ボビスBCG、例えばマイコバクテリウム・ボビス BCG 菌株: Danish 1331であることが特に好ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
また、この発明は、ヒトを含む動物に、この発明によるポリペプチド又は上記皮膚試験試薬を皮内注射することからなる、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アフリカヌム又はマイコバクテリウム・ボビスによって動物に引起こされるTBを診断する方法に関する。注射部位における陽性の皮膚応答は動物がTBを有していることを示し、注射部位における陰性の皮膚応答は動物がTBを有していないことを示す。陽性の応答は、少なくとも 5 mmの直径を有する皮膚応答であるが、より大きい、例えば少なくとも 1 cm、1.5 cm及び 少なくとも 2 cm の直径を有する反応が好ましい。皮膚試験試薬に用いられる組成物は、ワクチンについて上記したのと同じ方法で調製することができる。
ワクチンの調製及び使用に関する上記の開示に伴い、この発明は、この発明のポリペプチド、又は上述のこの発明のワクチン組成物、又は上述の生ワクチンをヒトを含む動物に投与することからなる、結核菌群に属するマイコバクテリアによって引き起こされたTBに対して動物を免疫感作する方法にも関する。好ましい投与経路は、非経口(例えば静脈内及び動脈内)、腹膜内、筋肉内、皮下、皮内、経口、頬、舌下、鼻、直腸又は経皮経路である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
多数の可能な診断アッセイ及び方法が想定される:
毒性マイコバクテリアによる過去又は現在の感染についての診断が目的である場合、患者由来の単核細胞(すなわちTリンパ球)からなる血液試料を、この発明の１以上のポリペプチドの試料と接触させることができる。この接触はインビトロで行うことができ、陽性反応は、例えば、T細胞の増殖又はγ-インターフェロンのようなサイトカインの細胞外相(例えば培養上清)への放出であってもよい。適当なインビボ試験は、上記皮膚試験であろう。患者由来の血清試料をこの発明のポリペプチドに接触させることも考えられ、血清試料中の抗体とポリペプチドとの結合に関する立証が、過去又は現在の感染を示す。
従って、この発明は、結核菌群に属する細菌による動物又はヒトでの現在又は過去の感作をインビトロで診断する方法にも関する。この方法は、動物又はヒト由来の血液試料を提供し、動物由来の試料とこの発明のポリペプチドとを接触させることからなり、血液試料中の単核細胞による少なくとも1個のサイトカインの細胞外相への有意な放出が、動物が感作していることを示す。用語「有意な放出」は、サイトカインの放出が、TB診断のない患者由来の血液試料からのサイトカインの放出よりも(スチューデントの両側(two-tailed)T 検定のような適当な統計分析により定義された95%の信頼区間で)著しく多いことを意味する。通常は、有意な放出は、こうした試料から観察される放出の少なくとも2倍である。