【手続補正書】
【提出日】平成19年7月18日(2007.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／又はＡＡＶ粒子を精製するための、ＡＡＶの構造タンパク質であって、構造タンパク質がウイルスのクロマトグラフィー特性を変化させる突然変異を少なくとも１つ含むことを特徴とし、
（i）  突然変異（単数又は複数）が、該構造タンパク質のＹＫＱＩＳ  ＳＱＳＧＡ、ＹＬＴＬＮ  ＮＧＳＱＡ、ＹＹＬＳＲ  ＴＮＴＰＳ、ＥＥＫＦＦ  ＰＱＳＧＶ、ＮＰＶＡＴ  ＥＱＹＧＳ、ＬＱＲＧＮ  ＲＱＡＡＴ、ＮＶＤＦＴ  ＶＤＴＮＧから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に位置され、及び／又は
（ii）  該突然変異（単数又は複数）が該構造タンパク質のＮ末端に位置され、及び／又は
（iii）  該突然変異（単数又は複数）がＶＰ１−コーディング核酸のＸｈｏＩ切断部位における１つ以上の挿入によってもたらされ、及び／又は
（iv）  該突然変異（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸のＢｓｒＢＩ切断部位における１つ以上の挿入によってもたらされ、及び／又は
（v）  該突然変異（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸のＢｓｒＢＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の１つ以上の欠失と、１つ以上の挿入とによってもたらされ、及び／又は
（vi）  該突然変異（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸のＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ切断部位間の１つ以上の欠失によってもたらされ、及び／又は
（vii）  該突然変異（単数又は複数）が、ＶＰ１−コーディング核酸のＢｓｒＢＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の１つ以上の欠失によってもたらされる、構造タンパク質。
【請求項２】  クロマトグラフィー特性の変化が精製の改良、特にウイルス、好ましくはウイルス粒子のより高いタイターまでの濃縮、より高い純度までの精製及び／又はより高い効率の精製を可能にすることを特徴とする、請求項１記載の構造タンパク質。
【請求項３】  突然変異がウイルス感染性の無視できるほどの低減をもたらすにすぎないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の構造タンパク質。
【請求項４】  突然変異した構造タンパク質が粒子形成することができることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項５】  ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及び／又はＡＡＶ６に由来する、並びにこれらに、特にＡＡＶ２に由来する他のＡＡＶ血清型に由来することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項６】  請求項１の（i）及び／又は（ii）における突然変異が、点突然変異、複数個のアミノ酸の突然変異、１つ以上の欠失、特に１つ以上の挿入、又は前記修飾の組み合わせであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項７】  好ましくはアフイニティクロマトグラフィーに適した機能的配列のアミノ酸が挿入されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項８】  挿入されるアミノ酸配列が受容体のリガンド若しくはリガンドの受容体、抗体若しくは抗体の一部、特に抗体エピトープ、抗原若しくは抗原エピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、酵素、酵素基質、レクチン、糖支持アミノ酸、特にヒスチジン富化ペプチド（Ｈｉｓタグ）、多重荷電ペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴタグ）、抗体のＦｃ部分、免疫グロブリン結合ドメイン、例えばプロテインＡ若しくはプロテインＧ若しくはこれらの一部、レシチン、核酸結合部位、ヘパリン結合部位、特異性リガンド、特異性受容体、インテグリン、サイトカイン又はサイトカイン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体、細胞表面構造に対する抗体、エピトープ及び／又は抗体結合構造から選択されることを特徴とする、請求項７記載の構造タンパク質。
【請求項９】  配列QAGTFALRGDNPQGを有するペプチドが挿入されることを特徴とする、請求項７又は８のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項１０】  ＡＡＶ粒子の形態、特にＡＡＶカプシドの形態である、請求項１〜９のいずれかに記載の構造タンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ＡＡＶカプシドは３つの異なるタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から成り、これらの相対的割合は５％  ＶＰ１、５％  ＶＰ２及び９０％  ＶＰ３である。ＡＡＶカプシド遺伝子はＡＡＶゲノムの右手端部に位置され、異なる開始コドンと、２つの異なってスプライスされた転写物(transcript)とを用いて、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列をオーバーラップさせることによって、コードされる。ＶＰ１遺伝子はＶＰ２遺伝子配列全体を含有し、このＶＰ２遺伝子配列は、特異的なＮ末端領域を有するＶＰ３遺伝子配列全体を含有する。オーバーラッピングリーディングフレームが３種類のＡＡＶカプシドタンパク質の全てをコードするという事実が、全てのカプシドタンパク質の、程度の差こそあれ、必須の発現の原因である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
好ましい実施態様では、例えば、５〜３０アミノ酸、好ましくは８〜２０アミノ酸、特に１０〜１８アミノ酸を有するペプチドが挿入される。ペプチドは例えば配列QAGTFALRGDNPQG又はこれと高度にホモロジーである配列を有する。この特に好ましいリガンドは、ラミニンファミリーのα鎖のコア配列からの１４アミノ酸の長さを有するペプチドであるＰ１ペプチドである。この配列は例えば、特にウイルス粒子、例えばアデノウイルスのエンドサイトーシスを仲介する、インテグリン受容体を認識するために充分である。Ｐ１ペプチドは、その形態（線状又は環状）に拘わらず、インテグリン受容体に結合する。本発明によると、Ｐ１ペプチドのコーディングＤＮＡ配列は、例えばヘルパープラスミド上に位置される、ＡＡＶの構造タンパク質をコードする遺伝子中に組み込まれる。変異体ヘルパープラスミドによるパッケージングは，カプシド中にＰ１を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ−Ｐ１）を生じる。このペプチドの挿入に関して、これらのＡＡＶ粒子はカチオン交換体から非修飾ＡＡＶ粒子に比べて低い伝導率で溶離されるので、条件に依存して、改良された分離（例えば、野性型から）と精製を可能にすることを示すことができた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
突然変異（単数又は複数）は好ましくはウイルス表面に位置される。表面に位置される構造タンパク質領域の決定に関して、本発明によると、意外にも、ＣＰＶとＡＡＶ２の配列及び構造が匹敵するものであることが判明した。それ故、好ましくは、例えばパルボウイルスＢ１９又はＣＰＶ（イヌパルボウイルス）のようなパルボウイルスの既知結晶構造に頼って、ホモロジー比較によって、ウイルス表面に位置するタンパク質ドメインを同定することが可能である。それ故、本発明によると、例えば、ＣＰＶとＡＡＶ２とのコンピューター補助比較、及びパルボウイルスＢ１９とＡＡＶ２とのコンピューター補助比較が、意外にも、配列が変化して、即ち、低いホモロジーを有して、ウイルス表面に位置すると推定される、ＶＰ３中のループの再現可能な同定を生じた。体液性免疫応答に対する抗原は抗体に、したがってウイルス表面にアクセス可能でなければならないので、これらのループは突然変異のための好ましい候補である。このように、ＣＰＶ  ＶＰ２カプシドタンパク質の既知結晶構造（例えば、Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200, 209-211; Wu and Rossmann (1993), J. Mol. Biol., 233, 231-244）は、ウイルスカプシド表面上に暴露され、局部的アミノ酸配列に基づいて例えばペプチド配列の挿入を克服するために充分にフレキシブルである領域を見出すために、タンパク質の二次構造におけるＡＡＶ２  ＶＰ３との大きな類似性に基づいてパターンと見なされた。この場合に、カプシドを不安定化すると考えられる、ＡＡＶ２カプシドタンパク質の二次構造要素を選択しないように注意した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
好ましい実施態様では、突然変異（単数又は複数）は構造タンパク質のＮ末端に位置される、この理由は、例えばパルボウイルスＣＰＶ及びＢ１９では、Ｎ末端が細胞表面に位置されることが判明しているからである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
構造タンパク質の表面に位置する領域を決定するための他の可能性は、異なるＡＡＶ血清型からのカプシドコーディング核酸配列を比較することである。このために、例えばＡＡＶ２の可能なカプシド形態の構造分析のために、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５又はＡＡＶ６のような、異なるＡＡＶ血清型からの既知ＤＮＡ配列を用いることが可能であり、この場合に、最初から、可能な三次構造を算出して、一般に知られたアミノ酸性質に基づいて配列領域を内側又は外側カプシド領域に割り当てることが可能である。したがって、本発明によると、例えば、ペプチドを挿入して、それらをウイルス表面上に発現させることを可能にする、ＡＡＶ２カプシドのＶＰ３領域における可能な挿入部位を見出すことが可能であった（以下参照）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明の他の好ましい実施態様では、６２アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ切断部位間の１つ以上の欠失によって、突然変異（単数又は複数）がもたらされる（Hermonat, P.L. et al. (1984), J. Virol., 51, 329-339)。他の好ましい、対応する実施態様では、上記欠失内に位置され、２９アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断部位間に、欠失（単数又は複数）が位置される。この欠失はＲｅｐ遺伝子とのオーバーラップを有さないので、パッケージング機構に本質的に影響を及ぼさないという利点を有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
他の好ましい実施態様では、ＶＰ３構造タンパク質(Rutledge, E.A. et al. (1998) 上記文献) 中の YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT, EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNGから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に１つ以上の挿入が存在する、この理由はこれらの部位がループの暴露部位に位置され、この場合にはＶＰ３構造が変化する危険性が低いからである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
ＶＰ１における突然変異
（ａ）ＶＰ−１のＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ切断部位間の欠失（ΔＸｈｏ；６２アミノ酸、ＡＡ）(Hermonat et al. (1984) Journal of Virology 51, 329-339)、
（ｂ）上記欠失（ａ）内に位置され、２９ＡＡを含む、ＶＰ−１のＢｓｒＢＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断部位間の欠失（ΔＢＨ）；
（ｃ）ＢｓｒＢＩとＨｉｎｄＩＩ間の欠失と、リガンド（Ｐ１ペプチド）の挿入（ΔＢＨ＋Ｌ）；及び
（ｄ）ＢｓｒＢＩ切断部位におけるリガンド（Ｐ１ペプチド）の純粋な挿入（Ｂ＋Ｌ）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
（ＡＡＶ２のＶＰ−１におけるＮ末端の始点からのアミノ酸（ＡＡ）後に数えられるＡＡ数に応じて名付けられ、各場合にそのＮ末端に位置される５アミノ酸とそのＣ末端に位置される５アミノ酸とによって隣接される；その後に挿入が導入されるＡＡは、太字で示される）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
同様に、太字のＡＡの次の位置される、直接隣接する５ＡＡ中に挿入を導入することも可能である、この理由はこれらがＡＡＶ２カプシド中のループ内に同様に位置されるからである。