(57)【要約】本開示は、例えば養子細胞療法として対象に投与するための改変幹メモリーＴ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を作製する方法を提供する。例えば養子細胞療法として対象に投与するための改変幹細胞メモリーＴ細胞を作製する方法の長年対処されていなかった当技術分野における必要性が存在する。本開示は、この長年対処されていなかった必要性に対する解決法を提供する。従来の生物学的製剤および化学療法薬とは異なり、本開示の改変Ｔ細胞は、抗原が認識されると急速に再生する能力を有し、それにより、処置を繰り返す必要性が潜在的になくなり得る。
2019528760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であって、
改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に、（ａ）抗原受容体、治療用タンパク質またはそれをコードする配列を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を導入するステップを含み、
前記改変Ｔ細胞が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される、方法。
【請求項２】
複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であって、
複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に、（ａ）抗原受容体、治療用タンパク質またはそれをコードする配列を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を導入するステップを含み、
前記複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される、方法。
【請求項３】
前記複数の改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であって、
改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に、（ａ）抗原受容体、治療用タンパク質またはそれをコードする配列を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を導入するステップを含み、
前記改変Ｔ細胞が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される、方法。
【請求項５】
複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であって、
複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に、（ａ）抗原受容体、治療用タンパク質またはそれをコードする配列を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を導入するステップを含み、
前記複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される、方法。
【請求項６】
前記複数の改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスポゾンが、２つのシス調節性インスレーターエレメントに挟まれた前記抗原受容体または前記治療用タンパク質をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記トランスポザーゼがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、配列番号４を含むアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、過剰活性バリアントであり、前記過剰活性バリアントが、配列番号４の３０位、１６５位、２８２位および５３８位の１つまたは複数にアミノ酸置換を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号４の３０位のアミノ酸置換が、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）（Ｉ３０Ｖ）による置換である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号４の１６５位のアミノ酸置換が、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）（Ｇ１６５Ｓ）による置換である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号４の２８２位のアミノ酸置換が、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）（Ｍ２８２Ｖ）による置換である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号４の５３８位のアミノ酸置換が、リシン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ５３８Ｋ）による置換である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＳＰＢ）トランスポザーゼである、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＳＰＢ）トランスポザーゼが、配列番号５を含むアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスポザーゼをコードする前記配列がｍＲＮＡ配列である、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記トランスポザーゼがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である、請求項１から６までまたは１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記トランスポザーゼがＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである、請求項１から６までまたは２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記トランスポザーゼがＴｏｌ２トランスポザーゼである、請求項１から６までまたは２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記トランスポゾンが任意の種に由来するまたはこれから組換えられている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記トランスポゾンが合成トランスポゾンである、請求項１から６までまたは２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原受容体がＴ細胞受容体である、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞受容体が天然に存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞受容体が天然に存在しない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞受容体が野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞受容体が組換えＴ細胞受容体である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＡＲがＣＡＲＴｙｒｉｎである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＡＲが１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＡＲがＶＣＡＲである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３３】
治療用タンパク質を発現することができる改変Ｔ細胞を作製するために、前記初代ヒトＴ細胞に（ｃ）前記治療用タンパク質をコードする配列を含む第２のトランスポゾンを含む組成物を導入するステップをさらに含む、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療用タンパク質が分泌タンパク質または分泌型タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療用タンパク質をコードする前記配列が核酸配列である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療用タンパク質をコードする前記配列がＤＮＡ配列である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記（ｂ）のトランスポザーゼ組成物により、前記（ａ）のトランスポゾンおよび前記（ｃ）の第２のトランスポゾンが移動する、請求項３３から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記初代ヒトＴ細胞に（ｄ）トランスポザーゼまたは前記トランスポザーゼをコードする配列を含む第２のトランスポザーゼ組成物を導入するステップをさらに含み、
前記（ｄ）の第２のトランスポザーゼが前記（ｃ）のトランスポゾンを転移させることができ、
前記（ｄ）の第２のトランスポザーゼ組成物と前記（ｂ）のトランスポザーゼ組成物が同一ではない、
請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記（ｂ）のトランスポザーゼ組成物により前記（ａ）のトランスポゾンが移動し、前記（ｄ）のトランスポザーゼ組成物により前記（ｃ）のトランスポゾンが移動する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であって、
（ａ）改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体、治療用タンパク質またはそれをコードする配列を含む組成物を導入するステップであり、前記抗原受容体または前記治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップと、
（ｂ）活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、前記改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、
前記活性化された改変Ｔ細胞が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される、方法。
【請求項４１】
複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であって、
（ａ）複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体、治療用タンパク質またはそれをコードする配列を含む組成物を導入するステップであり、前記抗原受容体または前記治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップと、
（ｂ）複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、前記複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、
前記複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される、方法。
【請求項４２】
前記複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であって、
（ａ）改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体、治療用タンパク質またはそれをコードする配列を含む組成物を導入するステップであり、前記抗原受容体または前記治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップと、
（ｂ）活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、前記改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、
前記活性化された改変Ｔ細胞がセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される、方法。
【請求項４４】
複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であって、
（ａ）複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体、治療用タンパク質またはそれをコードする配列を含む組成物を導入するステップであり、前記抗原受容体または前記治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップと、
（ｂ）複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、前記複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、
前記複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％がセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される、方法。
【請求項４５】
前記複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ウイルスベクターが前記抗原受容体または治療用タンパク質を含む、請求項４０から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスから単離されたまたはこれに由来する配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスから単離されたまたはこれに由来する配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記レトロウイルスがガンマレトロウイルスである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはこれに由来する配列を含む、請求項４０から４６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
核酸ベクターが前記抗原受容体または治療用タンパク質を含む、請求項４０から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ｍＲＮＡベクターが前記抗原受容体または治療用タンパク質を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ナノ粒子ベクターが前記抗原受容体または治療用タンパク質を含む、請求項４０から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記導入するステップが相同組換えを含む、請求項４０から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記相同組換えが、前記抗原受容体または前記治療用タンパク質、ゲノム編集構築物を含む前記組成物、および前記複数の初代ヒトＴ細胞の少なくとも１つの初代ヒトＴ細胞のゲノム配列を接触させることを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ベクターが前記抗原受容体または治療用タンパク質を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ベクターがアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ゲノム編集構築物が、ガイドＲＮＡおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、請求項５４から５７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ゲノム編集構築物が、融合タンパク質をコードする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ゲノム編集構築物が、前記ＤＮＡ結合性ドメインおよび前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼをコードし、発現されるＤＮＡ結合性ドメインと発現されるＩＩＳ型エンドヌクレアーゼが非共有結合により連結している、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ゲノム編集構築物がＣａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列を含む、請求項５８から６２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列が、不活性Ｃａｓ９をコードする、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列が、８４０位におけるヒスチジン（Ｈ）のアラニン（Ａ）によるアミノ酸置換（Ｈ８４０Ａ）を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列が、短縮型Ｃａｓ９をコードする、請求項６２から６５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列が、５８０位におけるアスパラギン（Ｎ）のアラニン（Ａ）によるアミノ酸置換（Ｎ５８０Ａ）を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列が、１０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）のアラニン（Ａ）によるアミノ酸置換（Ｄ１０Ａ）を含む、請求項６２から６７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ゲノム編集構築物が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に由来する配列を含む、請求項５８から６１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ＴＡＬＥＮに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ゲノム編集構築物がＴＡＬＥＮを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項７２】
前記ゲノム編集構築物がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に由来する配列を含む、請求項５８から６１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ＺＦＮに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ゲノム編集構築物がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項７５】
ゲノム編集構築物が、哺乳動物染色体上のセーフハーバー部位を標的とする、請求項５８から７４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ゲノム編集構築物が、ヒト染色体上のセーフハーバー部位を標的とする、請求項５８から７４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記染色体が、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにある、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
ゲノム編集構築物が、内因性Ｔ細胞受容体の構成成分をコードする配列または哺乳動物染色体上の内因性主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の構成成分をコードする配列を標的とする、請求項５８から７７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
ゲノム編集構築物が、内因性Ｔ細胞受容体の構成成分をコードする配列またはヒト染色体上の内因性主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の構成成分をコードする配列を標的とする、請求項５８から７７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗原受容体がＴ細胞受容体である、請求項４０から７９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｔ細胞受容体が天然に存在する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｔ細胞受容体が天然に存在しない、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｔ細胞受容体が野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｔ細胞受容体が組換えＴ細胞受容体である、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項４０から７９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＣＡＲが１つまたは複数のセンチリン配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＣＡＲがＣＡＲＴｙｒｉｎである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＣＡＲが１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＣＡＲがＶＣＡＲである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
治療用タンパク質を発現することができる改変Ｔ細胞を作製するために、前記初代ヒトＴ細胞に前記治療用タンパク質をコードする配列を含む組成物を導入するステップをさらに含む、請求項４０から８９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記治療用タンパク質が分泌タンパク質または分泌型タンパク質である、請求項４０から９０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記治療用タンパク質をコードする前記配列が核酸配列である、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記治療用タンパク質をコードする前記配列がＤＮＡ配列である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記導入するステップが、相同組換えを含む、請求項９０から９３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記（ｂ）のＴ細胞活性化因子組成物が、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体をさらに含む、請求項４０から９４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、前記活性化された改変Ｔ細胞を、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させるステップをさらに含み、
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、
請求項４０から４２までまたは４６から９５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、前記活性化された改変Ｔ細胞を、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させるステップをさらに含み、
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、
請求項４３から９５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
（ｄ）幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するために、前記複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させるステップをさらに含む、請求項４０から４２までまたは４６から１０１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
（ｄ）幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも６０％含む組成物を作製するために、前記複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させるステップをさらに含む、請求項４０から４２までまたは４６から１０１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
（ｄ）セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するために、前記複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させるステップをさらに含む、請求項４３から１０１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
（ｄ）セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも６０％含む組成物を作製するために、前記複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させるステップをさらに含む、請求項４３から１０１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記富化させるステップが、前記複数の富化された改変Ｔ細胞から幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することを含む、請求項１０２または１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記富化させるステップが、複数の増大した富化した改変ＴＳＣＭを作製するために、前記単離された改変ＴＳＣＭを、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させることをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記富化させるステップが、前記複数の富化した改変Ｔ細胞からセントラルメモリーＴ細胞（ＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することを含む、請求項１０４または１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記富化させるステップが、複数の増大した富化した改変ＴＣＭを作製するために、単離された改変ＴＣＭを、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させることをさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｔ細胞増大組成物が、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む、請求項４０から１０９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記Ｔ細胞増大組成物が、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項４０から１０９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｔ細胞増大組成物が、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記Ｔ細胞増大組成物が、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記Ｔ細胞増大組成物が、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のおよびステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記Ｔ細胞増大組成物が、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１６】
改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であって、
（ａ）改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体または治療用タンパク質を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが前記抗原受容体を含む、ステップと、
（ｂ）活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、前記改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、
前記活性化された改変Ｔ細胞が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される、方法。
【請求項１１７】
複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であって、
（ａ）複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体または治療用タンパク質を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが前記抗原受容体を含む、ステップと、
（ｂ）複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、前記複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、
前記複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される、方法。
【請求項１１８】
前記複数の活性化された改変−Ｔ細胞の少なくとも６０％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であって、
（ａ）改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体または治療用タンパク質を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが前記抗原受容体を含む、ステップと、
（ｂ）活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、前記改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、
前記活性化された改変Ｔ細胞がセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される、方法。
【請求項１２０】
複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であって、
（ａ）複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体または治療用タンパク質を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが前記抗原受容体を含む、ステップと、
（ｂ）複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、前記複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、
前記複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％がセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、
それによって、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される、方法。
【請求項１２１】
前記複数の活性化された改変−Ｔ細胞の少なくとも６０％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記（ｂ）のＴ細胞活性化因子組成物が、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体をさらに含む、請求項１１６から１２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、前記活性化された改変Ｔ細胞を、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させるステップをさらに含み、
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、
請求項１１６から１１８までまたは１２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、前記活性化された改変Ｔ細胞を、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させるステップをさらに含み、
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する、
請求項１１９から１２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
（ｄ）幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するために、前記複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させるステップをさらに含む、請求項１１６から１１８までまたは１２２から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
（ｄ）幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも６０％含む組成物を作製するために、前記複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させるステップをさらに含む、請求項１１６から１１８までまたは１２２から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
（ｄ）幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するために、前記複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させるステップをさらに含む、請求項１１９から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
（ｄ）幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも６０％含む組成物を作製するために、前記複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させるステップをさらに含む、請求項１１９から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記富化させるステップが、前記複数の富化した改変Ｔ細胞から幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することを含む、請求項１２９または１３０に記載の方法。
【請求項１３４】
前記富化させるステップが、複数の増大した富化した改変ＴＳＣＭを作製するために、前記単離された改変ＴＳＣＭを、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させることをさらに含む、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記富化させるステップが、前記複数の富化した改変Ｔ細胞から幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することを含む、請求項１３１または１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記富化させるステップが、複数の増大した富化した改変ＴＳＣＭを作製するために、単離された改変ＴＳＣＭを、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させることをさらに含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記Ｔ細胞増大組成物が、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む、請求項１１６から１３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記Ｔ細胞増大組成物がオクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１１６から１３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記Ｔ細胞増大組成物が、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記Ｔ細胞増大組成物が、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
前記Ｔ細胞増大組成物が、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のおよびステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記Ｔ細胞増大組成物が、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４３】
治療用タンパク質を発現することができる改変Ｔ細胞を作製するために、前記初代ヒトＴ細胞に（ｃ）前記治療用タンパク質をコードする配列を含む第２のトランスポゾンを含む組成物を導入するステップをさらに含む、請求項１１６から１４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記治療用タンパク質が分泌タンパク質または分泌型タンパク質である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記治療用タンパク質をコードする前記配列が核酸配列である、請求項１４３または１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記治療用タンパク質をコードする前記配列がＤＮＡ配列である、請求項１４３または１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記（ｂ）のトランスポザーゼ組成物により、前記（ａ）のトランスポゾンおよび前記（ｃ）の第２のトランスポゾンが移動する、請求項１４３から１４６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記初代ヒトＴ細胞に（ｄ）トランスポザーゼまたは前記トランスポザーゼをコードする配列を含む第２のトランスポザーゼ組成物を導入するステップをさらに含み、
前記（ｄ）の第２のトランスポザーゼが前記（ｃ）のトランスポゾンを転移させることができ、
前記（ｄ）の第２のトランスポザーゼ組成物と前記（ｂ）のトランスポザーゼ組成物が同一ではない、
請求項１４３から１４７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記導入するステップが、ゲノム編集構築物を含む組成物をさらに含む、請求項１から１４８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ゲノム編集構築物が、ガイドＲＮＡおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ゲノム編集構築物が、融合タンパク質をコードする、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ゲノム編集構築物が、前記ＤＮＡ結合性ドメインおよび前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼをコードし、発現されるＤＮＡ結合性ドメインおよび発現されるＩＩＳ型エンドヌクレアーゼが非共有結合により連結している、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ゲノム編集構築物がＣａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列を含む、請求項１４９から１５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列が、不活性Ｃａｓ９をコードする、請求項１５４または１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列が８４０位におけるアラニン（Ａ）のヒスチジン（Ｈ）によるアミノ酸置換（Ｈ８４０Ａ）を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列が、短縮型Ｃａｓ９をコードする、請求項１５４から１５７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列が５８０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン（Ｎ）によるアミノ酸置換（Ｎ５８０Ａ）を含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列が１０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）によるアミノ酸置換（Ｄ１０Ａ）を含む、請求項１５４から１５９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ゲノム編集構築物が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に由来する配列を含む、請求項１４９から１５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
ＴＡＬＥＮに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記ゲノム編集構築物がＴＡＬＥＮを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１６４】
前記ゲノム編集構築物がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に由来する配列を含む、請求項１４９から１５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
ＺＦＮに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ゲノム編集構築物がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１６７】
初代ヒトＴ細胞に、治療用タンパク質をコードする配列を含む組成物を導入するステップをさらに含む、請求項１４９から１５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記治療用タンパク質が分泌タンパク質または分泌型タンパク質である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記治療用タンパク質が細胞内タンパク質である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記治療用タンパク質が細胞質タンパク質である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７１】
前記治療用タンパク質が膜結合タンパク質である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７２】
前記治療用タンパク質が膜貫通タンパク質である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７３】
前記改変ＴＳＣＭの細胞表面マーカーが、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む、請求項１から１７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記改変ＴＳＣＭの細胞表面マーカーが、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む、請求項１から１７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記改変ＴＳＣＭの細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む、請求項１から１７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記改変ＴＣＭの細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む、請求項１から１７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞がナイーブＴ細胞（改変ＴＮ）を含み、ＣＡＲ−ＴＮの細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む、請求項９６から１７６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞がセントラルメモリーＴ細胞（改変ＴＣＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＣＭの細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む、請求項９６から１７６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞がエフェクターメモリーＴ細胞（改変ＴＥＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＥＭの細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む、請求項９６から１７６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記複数の増大した改変Ｔ細胞がエフェクターＴ細胞（改変ＴＥＦＦ）を含み、ＣＡＲ−ＴＥＦＦの細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む、請求項９６から１７６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記トランスポゾンが、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する前記抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである、請求項１から３９までまたは１１６から１８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記導入するステップが、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ配列を含む組成物をさらに含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである、請求項１８１または１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記トランスポザーゼがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである、請求項１８１から１８３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８５】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、配列番号４を含むアミノ酸配列を含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが過剰活性バリアントであり、前記過剰活性バリアントが、配列番号４の３０位、１６５位、２８２位および５３８位の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含む、請求項１８４または１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
配列番号４の３０位のアミノ酸置換が、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）（Ｉ３０Ｖ）による置換である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
配列番号４の１６５位のアミノ酸置換が、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）（Ｇ１６５Ｓ）による置換である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８９】
配列番号４の２８２位のアミノ酸置換が、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）（Ｍ２８２Ｖ）による置換である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１９０】
配列番号４の５３８位のアミノ酸置換が、リシン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ５３８Ｋ）による置換である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１９１】
前記トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＳＰＢ）トランスポザーゼである、請求項１８３から１９０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＳＰＢ）トランスポザーゼが、配列番号５を含むアミノ酸配列を含む、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項１から３９までまたは１１６から１８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記トランスポザーゼがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである、請求項１から３９までまたは１１６から１８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
前記トランスポザーゼがＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである、請求項１から３９までまたは１１６から１８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
前記トランスポザーゼがＴｏｌ２トランスポザーゼである、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記トランスポザーゼをコードする前記配列がｍＲＮＡ配列である、請求項１から３９までまたは１１６から１９８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２００】
前記トランスポゾンが任意の種に由来するまたはそこから組換えられている、請求項１から３９までまたは１１６から１８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記トランスポゾンが合成トランスポゾンである、請求項１から３９までまたは１１６から１８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
前記トランスポゾンが選択遺伝子をさらに含む、請求項１から３９までまたは１１６−１８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記Ｔ細胞増大組成物が選択剤をさらに含む、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記抗原受容体がＴ細胞受容体である、請求項１から２０３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
前記Ｔ細胞受容体が天然に存在する、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記Ｔ細胞受容体が天然に存在しない、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０７】
前記Ｔ細胞受容体が野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記Ｔ細胞受容体が組換えＴ細胞受容体である、請求項２０６または２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１から２０３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
前記ＣＡＲが１つまたは複数のセンチリン配列を含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記ＣＡＲがＣＡＲＴｙｒｉｎである、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記ＣＡＲが１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１３】
前記ＣＡＲがＶＣＡＲである、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記導入するステップが、電気穿孔またはヌクレオフェクションを含む、請求項１から３９までおよび１１６から２１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１５】
前記導入するステップが、ヌクレオフェクションを含み、前記ヌクレオフェクションが、
（ａ）トランスポゾン組成物、トランスポザーゼ組成物、および複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物をキュベット中で接触させるステップと、
（ｂ）前記キュベットに１つまたは複数の電気パルスを印加するステップと、
（ｃ）前記複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物を、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物を含む組成物中、３７℃でインキュベートするステップと
を含む、請求項１から３９までおよび１１６から２１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
前記トランスポゾンが第１のトランスポゾンまたは第２のトランスポゾンである、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
前記トランスポザーゼ組成物が第１のトランスポザーゼ組成物または第２のトランスポザーゼ組成物である、請求項２１５または２１６に記載の方法。
【請求項２１８】
トランスポゾン１μｇを得るために、前記トランスポゾン組成物が、ヌクレアーゼを含まない水を含む０．５μｇ／μｌ溶液であり、前記キュベットが、前記トランスポゾン組成物２μｌを含む、請求項２１４から２１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１９】
前記トランスポゾン組成物がｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含む、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
前記トランスポゾン組成物がＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを含む、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記トランスポザーゼ組成物が５μｇのトランスポザーゼを含む、請求項２１９または２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記トランスポザーゼ組成物がＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＳＰＢ）トランスポザーゼを含む、請求項２２１に記載の方法。
【請求項２２３】
前記トランスポザーゼ組成物が過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポザーゼを含む、請求項２２１に記載の方法。
【請求項２２４】
前記トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンを含む、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２５】
前記トランスポザーゼ組成物がＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼを含む、請求項２２４に記載の方法。
【請求項２２６】
前記トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンを含む、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２７】
前記トランスポザーゼ組成物がＴｏｌ２トランスポザーゼを含む、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記初代ヒトＴ細胞を含む組成物が、前記初代ヒトＴ細胞の細胞生存能力のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する緩衝液を含む、請求項２１５から２２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２９】
前記ヌクレオフェクションの前に前記緩衝液により前記初代ヒトＴ細胞の細胞生存能力のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記ヌクレオフェクション中に前記緩衝液により前記初代ヒトＴ細胞の細胞生存能力のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３１】
前記ヌクレオフェクション後に前記緩衝液により前記初代ヒトＴ細胞の細胞生存能力のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３２】
前記緩衝液がＰ３初代細胞溶液を含む、請求項２２８から２３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣｌＮａ、グルコースおよびＣａ（ＮＯ３）２の１つまたは複数を任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含む、請求項２２８から２３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３４】
前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、およびリン酸緩衝液からなる群から選択される補充物質をさらに含む、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３５】
前記緩衝液が、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコースおよび０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２を含む、請求項２２８または２２９に記載の方法。
【請求項２３６】
前記緩衝液が、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含む補充物質をさらに含む請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
前記緩衝液が、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２を含む補充物質をさらに含む、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
前記初代ヒトＴ細胞を含む組成物で、ＣＤ１４、ＣＤ５６、および／またはＣＤ１９を発現する細胞が枯渇している、請求項２１５または２２８から２３７までに記載の方法。
【請求項２３９】
前記初代ヒトＴ細胞を含む組成物が、前記緩衝液１００μｌおよび細胞５×１０６個〜２５×１０６個を含む、請求項２１５から２３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４０】
１つまたは複数のキュベット中で同時に実施される、請求項２１５から２３９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４１】
前記インキュベートするステップが、前記複数の初代ヒトＴ細胞を含む前記組成物を、予め温めたＴ細胞増大組成物中でインキュベートすることを含む、請求項２１５から２４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４２】
前記インキュベーションステップの期間が２日間である、請求項２１５から２４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４３】
前記活性化補充物質が１つまたは複数のサイトカインを含む、請求項４０から２４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４４】
前記１つまたは複数のサイトカインがＩＬ−２を含む、請求項２４３に記載の方法。
【請求項２４５】
前記増大補充物質が１つまたは複数のサイトカインを含む、請求項９６から２４４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４６】
前記１つまたは複数のサイトカインがＩＬ−２を含む、請求項２４５に記載の方法。
【請求項２４７】
改変ＴＳＣＭ細胞または改変ＴＣＭ細胞にゲノム編集構築物を含む組成物を導入するステップをさらに含む、請求項１から２４６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４８】
前記ゲノム編集構築物が、ガイドＲＮＡおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２４９】
前記ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
前記ゲノム編集構築物が、融合タンパク質をコードする、請求項２４９に記載の方法。
【請求項２５１】
前記ゲノム編集構築物が、前記ＤＮＡ結合性ドメインおよび前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼをコードし、発現されるＤＮＡ結合性ドメインおよび発現されるＩＩＳ型エンドヌクレアーゼが非共有結合により連結している、請求項２４９に記載の方法。
【請求項２５２】
前記ゲノム編集構築物がＣａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列を含む、請求項２４７から２５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５３】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項２５２に記載の方法。
【請求項２５４】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列が８４０位におけるアラニン（Ａ）のヒスチジン（Ｈ）によるアミノ酸置換（Ｈ８４０Ａ）を含む、請求項２５３に記載の方法。
【請求項２５５】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列が、短縮型Ｃａｓ９をコードする、請求項２５２から２５４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５６】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列が５８０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン（Ｎ）によるアミノ酸置換（Ｎ５８０Ａ）を含む、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２５７】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する前記配列が１０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）によるアミノ酸置換（Ｄ１０Ａ）を含む、請求項２５２から２５６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５８】
前記ゲノム編集構築物が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に由来する配列を含む、請求項２４７から２５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５９】
ＴＡＬＥＮに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
前記ゲノム編集構築物がＴＡＬＥＮを含む、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２６１】
前記ゲノム編集構築物がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に由来する配列を含む、請求項２４７から２５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６２】
ＺＦＮに由来する前記配列がＤＮＡ結合ドメインである、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２６３】
前記ゲノム編集構築物がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２６４】
前記初代ヒトＴ細胞が、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する、請求項１から２６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６５】
前記初代ヒトＴ細胞が、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）であり、前記ＴＮが、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する、請求項１から２６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６６】
前記初代ヒトＴ細胞が、Ｔメモリー幹細胞（Ｔ  ｍｅｍｏｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＴＳＣＭ）であり、前記ＴＳＣＭが、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する、請求項１から２６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６７】
前記初代ヒトＴ細胞が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）であり、前記ＴＣＭが、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する、請求項１から２６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６８】
前記初代ヒトＴ細胞が、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）であり、前記ＴＥＭが、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する、請求項１から２６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６９】
前記初代ヒトＴ細胞が、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）であり、前記ＴＥＦＦが、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する、請求項１から２６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７０】
前記初代ヒトＴ細胞が、ＣＤ４および／またはＣＤ８を発現する、請求項１から２６９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７１】
請求項１から２７０までのいずれか一項に記載の方法によって作製された改変ＴＳＣＭを含む組成物。
【請求項２７２】
請求項１から２７０までのいずれか一項に記載の方法によって作製された改変ＴＣＭを含む組成物。
【請求項２７３】
それを必要とする対象を処置するための医薬を製造するための、請求項２７１または２７２に記載の組成物の使用。
【請求項２７４】
前記改変ＴＳＣＭまたは改変ＴＣＭが、自己由来である、請求項２７３に記載の使用。
【請求項２７５】
前記改変ＴＳＣＭまたは改変ＴＣＭが、同種異系である、請求項２７４に記載の使用。
【請求項２７６】
前記抗原受容体が、Ｔ細胞受容体である、請求項２７３から２７５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７７】
前記Ｔ細胞受容体が、天然に存在する、請求項２７６に記載の使用。
【請求項２７８】
前記Ｔ細胞受容体が、天然に存在しない、請求項２７６に記載の使用。
【請求項２７９】
前記Ｔ細胞受容体が、野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む、請求項２７８に記載の使用。
【請求項２８０】
前記Ｔ細胞受容体が、組換えＴ細胞受容体である、請求項２７８または２７９に記載の使用。
【請求項２８１】
前記抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項２７３から２７５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８２】
前記ＣＡＲが、１つまたは複数のセンチリン配列を含む、請求項２８１に記載の使用。
【請求項２８３】
前記ＣＡＲが、ＣＡＲＴｙｒｉｎである、請求項２８２に記載の使用。
【請求項２８４】
前記ＣＡＲが１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む、請求項２８３に記載の方法。
【請求項２８５】
前記ＣＡＲがＶＣＡＲである、請求項２８４に記載の方法。
【請求項２８６】
それを必要とする対象における疾患または障害を処置する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項２７１または２７２に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２８７】
前記改変ＴＳＣＭまたは改変ＴＣＭが自己由来である、請求項２８６に記載の方法。
【請求項２８８】
前記改変ＴＳＣＭまたは改変ＴＣＭが同種異系である、請求項２８６に記載の方法。
【請求項２８９】
前記抗原受容体がＴ細胞受容体である、請求項２８６から２８８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９０】
前記Ｔ細胞受容体が天然に存在する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項２９１】
前記Ｔ細胞受容体が天然に存在しない、請求項２８９に記載の方法。
【請求項２９２】
前記Ｔ細胞受容体が野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む、請求項２９１に記載の方法。
【請求項２９３】
前記Ｔ細胞受容体が組換えＴ細胞受容体である、請求項２９１または２９２に記載の方法。
【請求項２９４】
前記抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項２８６から２８８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９５】
前記ＣＡＲが１つまたは複数のセンチリン配列を含む、請求項２９４に記載の方法。
【請求項２９６】
前記ＣＡＲがＣＡＲＴｙｒｉｎである、請求項２９５に記載の方法。
【請求項２９７】
前記ＣＡＲが１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む、請求項２９４に記載の方法。
【請求項２９８】
前記ＣＡＲがＶＣＡＲである、請求項２９７に記載の方法。
【請求項２９９】
前記疾患または障害が、がんであり、前記抗原受容体が、がん抗原を特異的に標的とする、請求項２８６から２９８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３００】
前記疾患または障害が、感染性疾患または障害であり、前記抗原受容体が、ウイルス抗原、細菌抗原、酵母抗原または微生物抗原を特異的に標的とする、請求項２８６から２９８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０１】
前記疾患もしくは障害が、分泌型タンパク質の活性が欠如していることもしくは存在量が少ないことを特徴とする疾患もしくは障害である、または、前記疾患もしくは障害が、分泌型タンパク質の活性または存在量を増大させることによって処置される疾患または障害である、請求項２８６から２９８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０２】
前記分泌型タンパク質が、凝固第ＶＩＩＩ因子タンパク質または凝固第ＩＸ因子タンパク質を含む、請求項３０１に記載の方法。
【請求項３０３】
前記分泌型タンパク質の存在量が局所部位において決定される、請求項３０１または３０２に記載の方法。
【請求項３０４】
前記局所部位が、改変ＴＳＣＭ細胞または改変ＴＣＭ細胞によって接近可能である、請求項３０３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年９月３０日に出願された米国仮出願番号第６２／４０２，７０７号、２０１７年５月５日に出願された同第６２／５０２，５０８号、２０１７年８月３１日に出願された同第６２／５５３，０５８号、および２０１７年９月８日に出願された同第６２／５５６，３０９号の利益を主張しており、これら出願の各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
配列表の援用
２０１７年１０月２日に作成され、サイズが１１０ＫＢである名称「ＰＯＴＨ−０１２＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」の出願されたテキストルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
発明の分野
本開示は、分子生物学、より具体的には、改変幹細胞メモリーＴ細胞（ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）を作出し、使用する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
背景
例えば養子細胞療法として対象に投与するための改変幹細胞メモリーＴ細胞を作製する方法の長年対処されていなかった当技術分野における必要性が存在する。本開示は、この長年対処されていなかった必要性に対する解決法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
従来の生物学的製剤および化学療法薬とは異なり、本開示の改変Ｔ細胞は、抗原が認識されると急速に再生する能力を有し、それにより、処置を繰り返す必要性が潜在的になくなる。これを実現するために、本開示の改変Ｔ細胞は、最初に腫瘍破壊を駆動するだけでなく、潜在的ながん再発を予防するために患者において生存可能なメモリーＴ細胞の安定な集団として持続される。したがって、抗原非依存性（トニック）シグナル伝達を通じたＴ細胞疲弊を引き起こさない抗原受容体分子、ならびに、初期メモリー細胞、特に、幹細胞メモリー（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ）（ＴＳＣＭ）を含有する改変Ｔ細胞製品の開発に集中的な試みの焦点が当てられている。本開示の幹細胞様改変Ｔ細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ−Ｔ  ｃｅｌｌ）は、自己再生の最大能力ならびにセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）およびエフェクターＴ細胞（ＴＥ）を引き出す多分化能を示し、それにより、より良好な腫瘍の根絶および長期間にわたる改変Ｔ細胞の生着が生じる。本開示の改変Ｔ細胞としては、これだけに限定されないが、本開示のタンパク質足場を含む抗原受容体を発現する細胞が挙げられる。本開示の改変Ｔ細胞としては、これだけに限定されないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（すなわち、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞）を発現する細胞が挙げられる。本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、これだけに限定されないが、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、抗体の１つまたは複数の断片を含む配列（例えば、ＶＨＨ、ＣＡＲに関してはＶＣＡＲと称される）、抗体模倣物、およびセンチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎ）（ＣＡＲに関してはＣＡＲＴｙｒｉｎと称される）を含めた、それぞれが抗原に特異的に結合する１つまたは複数の配列を含み得る。
【０００６】
本開示の改変細胞をさらにゲノム編集に供することができる。例えば、ゲノム編集構築物を本開示の改変細胞中に、トランスポゾンまたは電気穿孔もしくはヌクレオフェクションによる他の送達手段で導入し、続くインキュベーション段階の間に細胞のゲノム内に組み込ませることができる。得られる細胞は、幹様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）表現型を保持する、編集されたゲノムを有する改変Ｔ細胞である。幹様表現型を保持する編集されたゲノムを有するこの改変Ｔ細胞を細胞療法として使用することができる。その代わりに、またはそれに加えて、本開示の改変細胞を、第１の電気穿孔またはヌクレオフェクションおよびその後の電気穿孔またはヌクレオフェクションに供して、ゲノム編集構築物を導入することができる。
【０００７】
具体的には、本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、改変Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を複数の初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも５０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも６０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも７５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、プラスミドＤＮＡトランスポゾンであり、抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。
【０００８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、プラスミドＤＮＡトランスポゾンであり、抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。ある特定の実施形態、特に、トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである実施形態ではトランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。
【０００９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、
【化１−１】
2019528760.tif 000003
に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率同一なアミノ酸配列を含んでもよいし、からなってもよい。
【００１０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素
は、配列
【化１−２】
2019528760.tif 000004
の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位の１つまたは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。
【００１１】
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の配列の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの２またはそれより多くにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の配列の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの３またはそれより多くにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の配列の以下の３０位、１６５位、２８２位、および５３８位のうちのそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、配列番号４の配列の３０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の配列の１６５位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の配列の２８２位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の配列の５３８位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）による置換である。
【００１２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、本開示のＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の配列のアミノ酸配列を含んでもよいし、これからなってもよく、ここで３０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）による置換であり、１６５位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）による置換であり、２８２位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換であり、５３８位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）による置換である。ある特定の実施形態では、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、
【化２】
2019528760.tif 000005
に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率同一なアミノ酸配を含んでもよいし、からなってもよい。
【００１３】
トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位および５９１位の１つまたは複数におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、４６位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８５位、５０３位、５５２位および５７０位の１つまたは複数におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４６位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４６位のアミノ酸置換は、トレオニン（Ｔ）のアラニン（Ａ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の８２位のアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のイソロイシン（Ｉ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１０３位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１１９位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のアルギニン（Ｒ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１２５位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のシステイン（Ｃ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１２５位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のシステイン（Ｃ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１７７位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のチロシン（Ｙ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１７７位のアミノ酸置換は、ヒスチジン（Ｈ）のチロシン（Ｙ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８０位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８０位のアミノ酸置��は、イソロイシン（Ｉ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８５位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８７位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２００位のアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２０７位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２０９位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２２６位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２３５位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２４０位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２４１位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２４３位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のプロリン（Ｐ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２５８位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９６位のアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９６位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９６位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９８位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９８位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９８位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３１１位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のプロリン（Ｐ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３１１位のアミノ酸置換は、バリンのプロリン（Ｐ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３１５位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ��のアルギニン（Ｒ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３１９位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のトレオニン（Ｔ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３２７位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のチロシン（Ｙ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３２８位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のチロシン（Ｙ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３４０位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のシステイン（Ｃ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３４０位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のシステイン（Ｃ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４２１位のアミノ酸置換は、ヒスチジン（Ｈ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４３６位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４５６位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４７０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４８５位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５０３位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５０３位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５５２位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５７０位のアミノ酸置換は、トレオニン（Ｔ）のアラニン（Ａ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５９１位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５９１位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）による置換である。
【００１４】
トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位および５７０位の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含んでもよいし、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素はこれをさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位および５７０位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多くにおけるアミノ酸置換を含んでもよいし、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素はこれをさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位および５７０位におけるアミノ酸置換を含んでもよいし、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素はこれをさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１０３位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１９４位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３７２位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のアルギニン（Ｒ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３７５位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のリシン（Ｋ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４５０位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５０９位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５７０位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）による置換である。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の１９４位におけるバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換を含み得る。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が配列番号４の１９４位におけるバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換を含み得る実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の３７２位、３７５位および４５０におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の１９４位におけるバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換、配列番号４の３７２位におけるアラニン（Ａ）のアルギニン（Ｒ）による置換および配列番号４の３７５位におけるアラニン（Ａ）のリシン（Ｋ）による置換を含み得る。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の１９４位におけるバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換、配列番号４の３７２位におけるアラニン（Ａ）のアルギニン（Ｒ）による置換、配列番号４の３７５位におけるアラニン（Ａ）のリシン（Ｋ）による置換および配列番号４の４５０位におけるアスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換を含み得る。
【００１５】
本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、改変Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を複数の初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも５０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも６０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも７５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。
【００１６】
本開示の方法のある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ酵素は、
【化３】
2019528760.tif 000006
に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率同一なアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本開示の方法のある特定の実施形態では、過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポザーゼ酵素は、
【化４】
2019528760.tif 000007
に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率同一なアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、改変Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を複数の初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも５０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも６０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも７５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。
【００１９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼにより、約３０００〜３６００万年前に活動的であったコウモリゲノム由来の古来のエレメントであるＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンが移動する。本開示の例示的なＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンとしては、
【化５−１】
2019528760.tif 000008
【化５−２】
2019528760.tif 000009
【化５−３】
2019528760.tif 000010
【化５−４】
2019528760.tif 000011
を含む核酸配列を含むＨｅｌｉｂａｔ１が挙げられる。
【００２０】
他のトランスポザーゼとは異なり、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、ＲＮａｓｅ−Ｈ様触媒ドメインを含有しないが、その代わりに、複製開始ドメイン（Ｒｅｐ）およびＤＮＡヘリカーゼドメインで構成されるＲｅｐＨｅｌモチーフを含む。Ｒｅｐドメインは、ヌクレアーゼのＨＵＨスーパーファミリーのヌクレアーゼドメインである。
【００２１】
本開示の例示的なＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、
【化６】
2019528760.tif 000012
を含むアミノ酸配列を含む。
【００２２】
Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移では、トランスポゾンの３’末端の近くのヘアピンがターミネーターとして機能する。しかし、このヘアピンは、トランスポザーゼによって迂回され、それによって、隣接する配列の形質導入がもたらされ得る。さらに、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移により、共有結合により閉じた環状中間体が生じる。さらに、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移は、標的部位重複を欠き得る。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ配列では、トランスポザーゼは、ＬＴＳおよびＲＴＳと称される左末端配列および右末端配列に挟まれている。これらの配列は、保存された５’−ＴＣ／ＣＴＡＧ−３’モチーフで終結する。ヘアピン終結構造が形成される潜在性がある１９ｂｐのパリンドローム配列がＲＴＳの１１ヌクレオチド上流に位置し、配列ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧＴＧＣＡＣＣＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧ（配列番号２９）からなる。
【００２３】
本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、改変Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を複数の初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも５０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも６０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも７５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンである。トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼである。
【００２４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼである。Ｔｏｌ２トランスポゾンは、メダカのゲノムから単離するまたは引き出すことができ、ｈＡＴファミリーのトランスポゾンと類似したものであり得る。本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポゾンは、約４．７キロベースを含む配列によりコードされ、４つのエクソンを含有する、Ｔｏｌ２トランスポザーゼをコードする遺伝子を含有する。本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポザーゼは、以下：
【化７】
2019528760.tif 000013
を含むアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポザーゼは、逆方向反復、末端近くの配列およびＴｏｌ２トランスポザーゼを含め、以下：
【化８−１】
2019528760.tif 000014
【化８−２】
2019528760.tif 000015
【化８−３】
2019528760.tif 000016
の核酸配列にコードされる。
【００２６】
本開示は、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、改変Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を複数の初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２５％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも５０％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも６０％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも７５％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８０％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも８５％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９０％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも９５％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、プラスミドＤＮＡトランスポゾンであり、抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンである。トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼである。
【００２７】
本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む組成物を作製する方法を提供し、この方法は、複数の改変ＴＳＣＭおよび複数の改変ＴＣＭを含む組成物を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を複数の初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、複数の改変ＴＳＣＭは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現し、複数の改変ＴＣＭは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現し、それによって複数の改変ＴＳＣＭおよび複数の改変ＴＣＭを含む組成物が作製される。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数のうち少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率の細胞を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数のうち少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率の細胞を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも１０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも９０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも９０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも１０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも２０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも８０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも８０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも２０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも３０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも７０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも７０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも３０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細��（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも４０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも６０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも６０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも４０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも５０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも５０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、プラスミドＤＮＡトランスポゾンであり、抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンである。トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼである。
【００２８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは任意の種に由来するまたはそこから組換えられてもよい。代替的にまたは追加で、トランスポゾンは。合成トランスポゾンであり得る。
【００２９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、抗原受容体は、Ｔ細胞受容体である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在する。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在しない。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、組換えＴ細胞受容体である。この方法のある特定の実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲＴｙｒｉｎである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＶＣＡＲである。
【００３０】
方法が、初代ヒトＴ細胞に（ａ）抗原受容体を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を導入するステップを含む実施形態を含む本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に（ｃ）治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含む第２のトランスポゾン組成物を導入するステップであり、改変Ｔ細胞は治療用タンパク質を発現することができるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、治療用タンパク質は分泌型タンパク質であり、方法によって治療用タンパク質を分泌することができる改変Ｔ細胞が作製される。ある特定の実施形態では、（ｂ）のトランスポザーゼ組成物は、（ａ）のトランスポゾンおよび（ｃ）のトランスポゾンで転移が生じる。ある特定の実施形態では、この方法は、初代ヒトＴ細胞に（ｄ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含む第２のトランスポザーゼ組成物を導入するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、第２のトランスポザーゼ組成物は、（ｃ）のトランスポゾンで転移が生じる。ある特定の実施形態では、（ｂ）のトランスポザーゼ組成物は、（ａ）のトランスポゾンで転移が生じ、（ｄ）のトランスポザーゼ組成物は、（ｃ）のトランスポゾンで転移が生じる。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンである。トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼである。
【００３１】
本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であって、（ａ）複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップと、（ｂ）複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される、方法を提供する。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であって、（ａ）複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップと、（ｂ）複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するために、複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化因子組成物を接触させるステップとを含み、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも５０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも６０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも７５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも８０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも８５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも９０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも９５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、活性化された改変ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、活性化された改変ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。
【００３２】
（ａ）初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップと、（ｂ）改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップとを含む改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する本開示の方法のある特定の実施形態では、（ｂ）のＴ細胞活性化組成物は、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体をさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、活性化された改変Ｔ細胞と、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップであり、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するステップをさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。この方法のある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、この方法は、（ｄ）複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させて、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、（ｄ）複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させて、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも６０％含む組成物を作製するステップをさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の富化された改変Ｔ細胞から幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することを含む。この方法のある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の増大した富化された改変ＴＳＣＭを作製するために、単離された改変ＴＳＣＭと、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップをさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。
【００３３】
本開示は、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、活性化された改変Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによってセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも２５％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも５０％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも６０％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも７５％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも８０％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも８５％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも９０％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化された改変Ｔ細胞の少なくとも９５％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、活性化された改変ＴＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。
【００３４】
（ａ）初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する本開示の方法のある特定の実施形態では、（ｂ）のＴ細胞活性化組成物は、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体をさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、活性化された改変Ｔ細胞と、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップであり、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するステップをさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。この方法のある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、この方法は、（ｄ）複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させて、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、（ｄ）複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させて、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも６０％含む組成物を作製するステップをさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の富化された改変Ｔ細胞からセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することを含む。この方法のある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の増大した富化された改変ＴＣＭを作製するために、単離された改変ＴＣＭと、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップであり、をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。
【００３５】
本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む組成物を作製する方法であり、（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む組成物を作製するステップを含む方法を提供し、複数の活性化された改変ＴＳＣＭは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現し、複数の活性化された改変ＴＣＭは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現し、それによって複数の改変ＴＳＣＭおよび複数の改変ＴＣＭを含む組成物が作製される。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数のうち少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率の細胞を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数のうち少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率の細胞を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも１０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも９０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも９０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも１０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも２０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも８０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも８０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも２０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも３０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも７０％を占める。この方��のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも７０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも３０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも４０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも６０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも６０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも４０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも５０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも５０％を占める。
【００３６】
（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む組成物を作製するステップを含む複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む組成物を作製する本開示の方法のある特定の実施形態では、（ｂ）のＴ細胞活性化組成物は、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体をさらに含む。ある特定の実施形態では、この方法は、（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、組成物、複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）をヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させるステップであり、複数の増大した改変ＴＳＣＭは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現し、複数の増大した改変ＴＣＭは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現し、それによって、複数の増大した改変ＴＳＣＭおよび複数の増大した改変ＴＣＭを含む組成物が作製されるステップをさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の富化された改変Ｔ細胞から幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離すること、または複数の富化された改変Ｔ細胞からセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することを含む。この方法のある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の富化された改変Ｔ細胞からを単離すること幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞、および複数の富化された改変Ｔ細胞からセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することを含む。この方法のある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の増大した富化された改変ＴＳＣＭおよび複数の増大した富化された改変ＴＣＭを含む組成物を作製するために、単離された改変ＴＳＣＭおよび単離された改変ＴＣＭを含む組成物をヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物と接触させるステップをさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７��９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数をさらに含む。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数のうち少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率の細胞を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数のうち少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率の細胞を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも１０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも９０％��占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも９０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも１０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも２０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも８０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも８０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも２０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも３０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも７０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも７０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも３０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも４０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも６０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも６０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも４０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも５０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも５０％を占める。
【００３７】
（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、１つまたは複数の抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させるステップを含む方法を含む本開示の活性化された改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、導入するステップは、相同組換えを含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物を複数のＴ細胞の少なくとも１つの初代Ｔ細胞のゲノム配列と接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物を複数のＴ細胞の初代Ｔ細胞の一部のゲノム配列と接触させる。ある特定の実施形態では、初代Ｔ細胞の一部は、複数のＴ細胞内の初代Ｔ細胞の総数の少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率である。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物を複数のＴ細胞の各初代Ｔ細胞のゲノム配列と接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物により一本鎖切断が誘導される。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物により二本鎖切断が誘導される。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、導入ステップは、ドナー配列組成物をさらに含む。ある特定の実施形態では、ドナー配列組成物は、抗原受容体をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、ドナー配列組成物は、抗原受容体をコードする配列、５’ゲノム配列および３’ゲノム配列を含み、ここで、５’ゲノム配列は、ゲノム編集組成物によって誘導される切断点に対して５’側にある、初代Ｔ細胞のゲノム配列と相同または同一であり、３’ゲノム配列は、ゲノム編集組成物によって誘導される切断点に対して３’側にある、初代Ｔ細胞のゲノム配列に相同または同一である。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物およびドナー配列組成物をゲノム配列に同時にまたは逐次的に接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物およびドナー配列組成物をゲノム配列と逐次的に接触させ、ゲノム編集組成物を最初にもたらす。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物は、ＤＮＡ結合性ドメインをコードする配列およびヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物は、ＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはその配列を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、不活性Ｃａｓ９（配列番号３３、１０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換（Ｄ１０Ａ）、および８４０位におけるアラニン（Ａ）のヒスチジン（Ｈ）による置換（Ｈ８４０Ａ）を含む）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、短い不活性Ｃａｓ９（配列番号３２、１０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換（Ｄ１０Ａ）および５４０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン（Ｎ）による置換（Ｎ５４０Ａ）を含む）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む、またはさらに含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１を含む。ある特定の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＴＡＬＥＮまたはそのヌクレアーゼドメインを含むかまたはこれをさらに含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮまたはそのヌクレアーゼドメインを含むかまたはこれをさらに含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物によりゲノム配列内の切断を誘導し、初代Ｔ細胞の内因性ＤＮＡ修復機構を使用してドナー配列組成物を挿入する。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ドナー配列組成物の挿入によりゲノム編集組成物のＤＮＡ結合性部位が排除され、それにより、ゲノム編集組成物のさらなる活性が妨げられる。
【００３８】
（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させるステップを含む方法を含む本開示の活性化された改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスから単離された、それに由来するまたはそこから組換えられた１つまたは複数の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、単鎖または二本鎖ウイルスである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスから単離された、それに由来するまたはそこから組換えられた１つまたは複数の配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡウイルスは、単鎖または二本鎖ウイルスである。ある特定の実施形態では、ウイルスは、複製欠損である。
【００３９】
（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させるステップを含む方法を含む本開示の活性化された改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離されたまたはこれに由来する配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離されたまたはこれに由来する配列を含む。
【００４０】
（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させるステップを含む方法を含む本開示の活性化された改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離されたまたはこれに由来する配列を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ガンマレトロウイルスから単離されたまたはこれに由来する配列を含む。
【００４１】
（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させるステップを含む方法を含む本開示の活性化された改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはこれに由来する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、血清型のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１の１つまたは複数からの配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１の１つまたは複数から単離された、それに由来するまたは組換えられた配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２から単離された、それに由来するまたは組換えられた配列を含む。ベクターが血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る実施形態を含むある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ９から単離された、それに由来するまたは組換えられた配列を含む。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスとしては、これだけに限定されないが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）および１つの血清型のゲノムおよび別の血清型のカプシドを含有するＡＡＶハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＤＪ８）が挙げられる。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスとしては、これだけに限定されないが、ｒＡＡＶ−ＬＫ０３、ｒＡＡＶ−ＮＰ５９およびｒＡＡＶ−ＮＰ８４が挙げられる。
【００４２】
本開示の活性化改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、核酸ベクターは、抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡベクターは、抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡベクターは、抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、核酸ベクターは、プラスミドまたはミニサークルベクターである。
【００４３】
本開示の活性化改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、抗原受容体を含む。ナノ粒子は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１２／０９４６７９号、国際特許公開第ＷＯ２０１６／０２２８０５号、国際特許公開第ＷＯ／２０１１／１３３６３５号、国際特許公開第ＷＯ／２０１６／０９０１１１号、国際特許公開第ＷＯ／２０１７／００４４９８号、同第ＷＯ／２０１７／００４５０９号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０２７１号、米国特許第６，８３５，３９４号、米国特許第７，２１７，４２７号、および米国特許第７，８６７，５１２号に開示されているポリマーで構成されるものであってよい。
【００４４】
本開示の活性化された改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、抗原受容体は、Ｔ細胞受容体である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在する。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在しない。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、組換えＴ細胞受容体である。この方法のある特定の実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲＴｙｒｉｎである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＶＣＡＲである。
【００４５】
（ａ）複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入して複数の改変Ｔ細胞を作製するステップであり、ここで抗原受容体または治療用タンパク質がトランスポゾン中に含有されていない、ステップ、および（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させるステップを含む方法を含む本開示の活性化された改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、方法は、治療用タンパク質を発現することができる改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に治療用タンパク質を含む組成物を導入するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、治療用タンパク質は分泌型タンパク質であり、方法によって、治療用タンパク質を分泌することができる改変Ｔ細胞が作製される。ある特定の実施形態では、導入するステップは、相同組換えを含み、ドナー配列は、治療用タンパク質をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、抗原受容体を含むドナー配列は、治療用タンパク質をさらに含む。ある特定の実施形態では、第１のドナー配列は抗原受容体を含み、第２のドナー配列は、治療用タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、治療用タンパク質をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子である。ある特定の実施形態では、抗原受容体を含むベクターは、治療用タンパク質をさらに含む。ある特定の実施形態では、第１のベクターは抗原受容体を含み、第２のベクター鋳型は、治療用タンパク質を含む。
【００４６】
本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが抗原受容体を含む、ステップと、（ｂ）改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、活性化された改変−Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが抗原受容体を含む、ステップと、（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、複数の活性化された改変−Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。この方法のある特定の実施形態では、複数の活性化された改変−Ｔ細胞の少なくとも６０％は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。この方法のある特定の実施形態では、（ｂ）のＴ細胞活性化組成物は、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体をさらに含む。本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップ、および（ｂ）ＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによってＣＡＲ発現幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）（ＣＡＲ−ＴＳＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）複数のＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップ、および（ｂ）複数のＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって、複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、活性化された改変Ｔ細胞と、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップであり、ここで、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数を含むかまたはこれをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、方法は、（ｄ）複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させて幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｄ）複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させて、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも６０％含む組成物を作製するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の富化された改変Ｔ細胞から幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の増大した富化された改変ＴＳＣＭを作製するために、単離された改変ＴＳＣＭと、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つ���たは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／
ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。
【００４７】
本開示は、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが抗原受容体を含む、ステップと、（ｂ）改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、活性化された改変−Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）複数の改変Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが抗原受容体を含む、ステップと、（ｂ）複数の改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、複数の活性化された改変−Ｔ細胞の少なくとも２５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。この方法のある特定の実施形態では、複数の活性化された改変−Ｔ細胞の少なくとも６０％は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する。この方法のある特定の実施形態では、（ｂ）のＴ細胞活性化組成物は、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体をさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、活性化された改変Ｔ細胞と、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップであり、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数を含むかまたはこれをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率���、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞の少なくとも６０％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、方法、（ｄ）複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させて、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｄ）複数の増大した改変Ｔ細胞を富化させて、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも６０％含む組成物を作製するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の富化された改変Ｔ細胞からセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の増大した富化された改変ＴＣＭを作製するために、単離された改変ＴＣＭと、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１���ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。
【００４８】
本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む組成物を作製する方法であり、（ａ）複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む組成物を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが抗原受容体を含む、ステップと、（ｂ）組成物と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化された改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および複数の活性化された改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を含む組成物を作製するステップを含む方法を提供し、複数の活性化された改変ＴＳＣＭがＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現し、複数の活性化された改変ＴＣＭがＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現し、それによって、複数の改変ＴＳＣＭおよび複数の改変ＴＣＭを含む組成物が作製される。この方法のある特定の実施形態では、（ｂ）のＴ細胞活性化組成物は、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体をさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、組成物と、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップであり、複数の増大した改変Ｔ細胞を含む組成物の少なくとも２％が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｃ）複数の増大した改変Ｔ細胞を作製するために、組成物と、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップであり、複数の増大した改変Ｔ細胞を含む組成物の少なくとも２％が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数を含むかまたはこれをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋ��〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変ＴＳＣＭおよび複数の増大した改変ＴＣＭを含む組成物の細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変ＴＳＣＭおよび複数の増大した改変ＴＣＭを含む組成物の細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、方法は、（ｄ）組成物を富化させて、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｄ）組成物を富化させて、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む組成物を作製するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、富化させるステップは、組成物から幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離すること、または組成物からセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、富化させるステップは、から幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離すること、および組成物からセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する改変Ｔ細胞を単離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、富化させるステップは、複数の増大した富化された改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを含む組成物を作製するために、単離された改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭと、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの
濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数のうち少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率の細胞を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数のうち少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率の細胞を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも１０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも９０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも９０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも１０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも２０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも８０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも８０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも２０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも３０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも７０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも７０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも３０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも４０％を占め、改���セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも６０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも６０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも４０％を占める。この方法のある特定の実施形態では、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも５０％を占め、改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、組成物の細胞の総数の少なくとも５０％を占める。
【００４９】
方法が、初代ヒトＴ細胞に導入するステップ、（ａ）改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが抗原受容体を含む、ステップと、（ｂ）改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む実施形態を含む本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に（ｃ）治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含む第２のトランスポゾン組成物を導入するステップであり、ここで、改変Ｔ細胞は治療用タンパク質を発現することができるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、治療用タンパク質は分泌型タンパク質であり、方法によって、治療用タンパク質を分泌することができる改変Ｔ細胞が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、トランスポザーゼ組成物を導入するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ組成物は、（ａ）のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンで転移する。ある特定の実施形態では、方法は、第１のトランスポザーゼ組成物および第２のトランスポザーゼ組成物を導入するステップを含む。方法が、第１のトランスポザーゼ組成物および第２のトランスポザーゼ組成物を導入するステップを含む実施形態を含むある特定の実施形態では、第１のトランスポザーゼ組成物は、（ａ）のトランスポゾンで転移し、第２のトランスポザーゼ組成物は、第２のトランスポゾンで転移する。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。この方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンである。トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼである。
【００５０】
方法が、初代ヒトＴ細胞に導入するステップ、（ａ）改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を含む組成物を導入するステップであり、トランスポゾンが抗原受容体を含む、ステップと、（ｂ）改変Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化された改変Ｔ細胞を作製するステップを含む実施形態を含む本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞に治療用タンパク質をコードする配列を導入するステップであり、ここで、改変Ｔ細胞は治療用タンパク質を発現することができるステップをさらに含む。治療用タンパク質をコードする配列を導入するステップのある特定の実施形態では、導入するステップは、相同組換えを含む。治療用タンパク質をコードする配列を導入するステップのある特定の実施形態では、ベクターは、治療用タンパク質をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子である。
【００５１】
本開示の方法のある特定の実施形態では、導入するステップは、ゲノム編集構築物を含む組成物をさらに含む。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ガイドＲＮＡおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼをコードし、発現されるＤＮＡ結合ドメインおよび発現されるＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、非共有結合的に連結されている。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列を含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、ＤＮＡ結合ドメインである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列がＤＮＡ結合ドメインである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、不活性Ｃａｓ９をコードする。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列がＤＮＡ結合ドメインである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、短縮型Ｃａｓ９をコードする。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、１０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）によるアミノ酸置換（Ｄ１０Ａ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、８４０位におけるアラニン（Ａ）のヒスチジン（Ｈ）によるアミノ酸置換（Ｈ８４０Ａ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、ｄＣａｓ９（配列番号３３）を含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、５８０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン（Ｎ）によるアミノ酸置換（Ｎ５８０Ａ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、ｄＳａＣａｓ９（配列番号３２）を含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に由来する配列を含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮに由来する配列は、ＤＮＡ結合ドメインである。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ＴＡＬＥＮを含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に由来する配列を含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ＺＦＮに由来する配列は、ＤＮＡ結合ドメインである。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。
【００５２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。この方法のある特定の実施形態では、導入するステップは、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ配列を含む組成物をさらに含む。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。ある特定の実施形態、特に、トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである実施形態では、トランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼは、配列番号４を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが過剰活性バリアントであり、過剰活性バリアントが、配列番号４の３０位、１６５位、２８２位および５３８位の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、配列番号４の３０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）（Ｉ３０Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の１６５位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）（Ｇ１６５Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の２８２位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）（Ｍ２８２Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の５３８位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ５３８Ｋ）による置換である。ある特定の実施形態では、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＳＰＢ）トランスポザーゼは、配列番号５を含むアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼである。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは任意の種に由来するまたはそこから組換えられてもよい。代替的にまたは追加で、トランスポゾンは、合成トランスポゾンであり得る。
【００５３】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、選択遺伝子をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、選択剤をさらに含む。
【００５４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、抗原受容体は、Ｔ細胞受容体である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在する。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在しない。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、組換えＴ細胞受容体である。この方法のある特定の実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲＴｙｒｉｎである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＶＣＡＲである。
【００５５】
本開示の方法のある特定の実施形態では、改変ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、改変ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、改変ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。
【００５６】
本開示の方法のある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞（改変ＴＮ）を含み、ＣＡＲ−ＴＮの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（改変ＴＣＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞（改変ＴＥＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＥＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞（改変ＴＥＦＦ）を含み、ＣＡＲ−ＴＥＦＦの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。
【００５７】
本開示の方法のある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（改変ＴＣＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞におけるもっとも豊富なＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（改変ＴＣＭ）であり、ＣＡＲ−ＴＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。複数の増大した改変Ｔ細胞におけるもっとも豊富なＴ細胞がセントラルメモリーＴ細胞（改変ＴＣＭ）であるある特定の実施形態では、複数の増大した改変Ｔ細胞は、ＴＳＣＭ細胞を含み、ＴＳＣＭ細胞の細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。
【００５８】
本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップ、および（ｂ）ＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによってＣＡＲ発現幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）（ＣＡＲ−ＴＳＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）複数のＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップ、および（ｂ）複数のＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも５０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも６０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも７５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも８０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも８５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも９０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも９５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、活性化されたＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、活性化されたＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップ、および（ｂ）ＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによってＣＡＲ発現幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）（ＣＡＲ−ＴＳＣＭ）が作製される。
【００５９】
本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）複数のＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップ、および（ｂ）複数のＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも５０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも６０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも７５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも８０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも８５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも９０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも９５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、活性化されたＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、活性化されたＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。
【００６０】
ある特定の実施形態では、この方法は、（ｃ）複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞と、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物とを接触させるステップであり、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２％が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）（ＣＡＲ−ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するステップをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定���実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）（ＣＡＲ−ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ−ＴＳＣＭ）について富化させることができ、そうすることで富化させるステップの後、方法は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）（ＣＡＲ−ＴＳＣＭ）の細胞表面マーカーを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率含む富化された組成物を作製し得る。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞（ＣＡＲ−ＴＮ）を含み、ＣＡＲ−ＴＮの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＡＲ−ＴＣＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＡＲ−ＴＥＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＥＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つ��たは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞（ＣＡＲ−ＴＥＦＦ）を含み、ＣＡＲ−ＴＥＦＦの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。追加の細胞表面マーカーは、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１１  Ｓｅｐ  １８；１７（１０）：１２９０−７；その内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載される。
【００６１】
本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、初代ヒトＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップ、および（ｂ）ＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによってＣＡＲ発現幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）（ＣＡＲ−ＴＳＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を作製する方法であり、（ａ）複数のＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するために、複数の初代ヒトＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップ、および（ｂ）複数のＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ヒトＣＤ３単一特異的な四量体の抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異的な四量体の抗体複合体および活性化補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞活性化組成物とを接触させて複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するステップを含む方法を提供し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率が、幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって、複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも２５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも５０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも６０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法は、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも７５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法によって、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞が作製され、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも８０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法によって、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞が作製され、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも８５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法によって、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞が作製され、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも９０％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、方法によって、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞が作製され、ここで、複数の活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞の少なくとも９５％は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって複数の活性化されたＣＡＲ幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）が作製される。ある特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態では、活性化されたＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、活性化されたＣＡＲ−ＴＳＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。
【００６２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞（ＣＡＲ−ＴＮ）を含み、ＣＡＲ−ＴＮの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＡＲ−ＴＣＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＣＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＡＲ−ＴＥＭ）を含み、ＣＡＲ−ＴＥＭの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、複数の増大したＣＡＲ−Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞（ＣＡＲ−ＴＥＦＦ）を含み、ＣＡＲ−ＴＥＦＦの細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を含む。
【００６３】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。トランスポゾンは、２つのシス調節性インスレーターエレメントに挟まれたＣＡＲをコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンであってよい。ある特定の好ましい実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物を導入するステップは、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ配列を含む組成物を導入することをさらに含み得る。ある特定の好ましい実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本開示のトランスポゾンは、選択遺伝子をさらに含み得る。本開示のトランスポゾンが選択遺伝子を含む場合、本開示の方法のＴ細胞増大組成物は、本開示の活性化または改変Ｔ細胞を同時に選択し、増大させるために、選択剤をさらに含み得る。
【００６５】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＡＲＴｙｒｉｎであり得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＶＣＡＲである。
【００６６】
本開示の改変ＴＳＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、導入するステップは、電気穿孔またはヌクレオフェクションを含み得る。導入するステップが、ヌクレオフェクションを含む場合、ヌクレオフェクションは、（ａ）トランスポゾン組成物、トランスポザーゼ組成物、および複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物をキュベット中で接触させるステップと、（ｂ）キュベットに１つまたは複数の電気パルスを印加するステップと、（ｃ）複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物を、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含むＴ細胞増大組成物を含む組成物中、３７℃でインキュベートするステップとを含み得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロールおよびアルカンの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、トランスポゾン組成物は、ヌクレアーゼ不含水を含む０．５μｇ／μｌ溶液であり、キュベットは２μｌのトランスポゾン組成物を含み、１μｇのトランスポゾンを生じる。トランスポゾン組成物は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含み得る。トランスポゾン組成物は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを含み得る。ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、トランスポザーゼ組成物は、５μｇのトランスポザーゼを含む。トランスポザーゼ組成物は、過剰活性ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼを含み得る。トランスポザーゼ組成物は、過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポザーゼを含み得る。ある特定の実施形態では、トランスポゾンはＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンを含んでもよく、トランスポザーゼ組成物は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼを含み得る。ある特定の実施形態では、トランスポゾンはＴｏｌ２トランスポゾンを含んでもよく、トランスポザーゼ組成物は、Ｔｏｌ２トランスポザーゼを含む。
【００６７】
導入するステップがヌクレオフェクションまたは電気穿孔を含む実施形態を含めた本開示の方法のある特定の実施形態では、ヌクレオフェクションは、第１のトランスポゾン組成物および第１のトランスポザーゼ組成物および複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物をキュベット中で接触させることを含む。導入するステップがヌクレオフェクションまたは電気穿孔を含む実施形態を含めた本開示の方法のある特定の実施形態では、ヌクレオフェクションは、第１のトランスポゾン組成物、第２のトランスポゾン組成物、第１のトランスポザーゼ組成物および複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物をキュベット中で接触させることを含む。導入するステップがヌクレオフェクションまたは電気穿孔を含む実施形態を含めた本開示の方法のある特定の実施形態では、ヌクレオフェクションは、第１のトランスポゾン組成物、第２のトランスポゾン組成物、第１のトランスポザーゼ組成物、第２のトランスポザーゼ組成物および複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物をキュベット中で接触させることを含む。ある特定の実施形態では、第１のトランスポゾンは、抗原受容体をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のトランスポゾンは、治療用タンパク質をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のトランスポゾン組成物と第２のトランスポゾン組成物は同一である。ある特定の実施形態では、第１のトランスポゾン組成物と第２のトランスポゾン組成物は同一ではない。ある特定の実施形態では、第１のトランスポザーゼにより、第１のトランスポゾン組成物および第２のトランスポゾン組成物が移動する。ある特定の実施形態では、第１のトランスポザーゼにより、第１のトランスポゾン組成物が移動するが、第２のトランスポゾン組成物は移動しない。ある特定の実施形態では、第２のトランスポザーゼにより、第２のトランスポゾン組成物が移動するが、第１のトランスポゾン組成物は移動しない。ある特定の実施形態では、第１のトランスポザーゼにより、第１のトランスポゾン組成物が移動し、第２のトランスポザーゼにより、第２のトランスポゾン組成物が移動する。ある特定の実施形態では、第１のトランスポゾン組成物または第２のトランスポゾン組成物は、抗原受容体をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のトランスポゾン組成物または第２のトランスポゾン組成物は、治療用タンパク質をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のトランスポゾン組成物は、抗原受容体をコードする配列を含み、第２のトランスポゾン組成物は、治療用タンパク質をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、治療用タンパク質は、分泌型または分泌可能なタンパク質である。導入するステップがヌクレオフェクションまたは電気穿孔を含む実施形態を含めた本開示の方法のある特定の実施形態では、ヌクレオフェクションは、トランスポゾン組成物、第１のトランスポザーゼ組成物、第２のトランスポザーゼ組成物および複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物をキュベット中で接触させることを含む。ある特定の実施形態では、トランスポゾン組成物は、抗原受容体をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、トランスポゾン組成物は、治療用タンパク質をコードする配列を含む。導入するステップがヌクレオフェクションまたは電気穿孔を含む実施形態を含めた本開示の方法のある特定の実施形態では、ヌクレオフェクションは、ゲノム内の特定の部位において相同組換えを誘導することが可能な組成物を複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物とキュベット中で接触させることをさらに含む。ある特定の実施形態では、相同組換えを誘導することが可能な組成物は、外因性ドナー分子を含む。ある特定の実施形態では、外因性ドナー分子は、抗原受容体をコードする配列を含み、トランスポゾンは、治療用タンパク質をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、外因性ドナー分子は、治療用タンパク質をコードする配列を含み、トランスポゾンは、抗原受容体をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、トランスポゾンを含む組成物、トランスポザーゼを含む組成物、およびゲノム内の特定の部位において相同組換えを誘導することが可能な組成物を、複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物と同時に接触させる。ある特定の実施形態では、第１に、トランスポゾンを含む組成物およびトランスポザーゼを含む組成物を複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物と接触させ、第２に、ゲノム内の特定の部位において相同組換えを誘導することが可能な組成物を複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物と接触させる。ある特定の実施形態では、第１に、ゲノム内の特定の部位において相同組換えを誘導することが可能な組成物を複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物と接触させ、第２に、トランスポゾンを含む組成物およびトランスポザーゼを含む組成物を複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物と接触させる。本開示の改変ＴＳＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞を含む組成物は、初代ヒトＴ細胞の細胞生存能力のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する緩衝液を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオフェクションの前に、緩衝液により初代ヒトＴ細胞の細胞生存能力のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する。ある特定の実施形態では、ヌクレオフェクション中に、緩衝液により初代ヒトＴ細胞の細胞生存能力のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する。ある特定の実施形態では、ヌクレオフェクション後に、緩衝液により初代ヒトＴ細胞の細胞生存能力のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する。ある特定の実施形態では、緩衝液は、Ｐ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣｌＮａ、グルコースおよびＣａ（ＮＯ３）２の１つまたは複数を任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含み、任意選択で、緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、およびリン酸緩衝液からなる群から選択される補充物質をさらに含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコースおよび０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコースおよび０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、ならびに２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含む補充物質を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコースおよび０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、ならびに４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２を含む補充物質を含む。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞を含む組成物は、緩衝液１００μｌおよび細胞５×１０６個〜２５×１０６個を含む。
【００６８】
本開示の改変ＴＳＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞を含む組成物で、ＣＤ１４、ＣＤ５６、および／またはＣＤ１９を発現する細胞が枯渇している。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞を含む組成物は、緩衝液１００μｌおよび細胞５×１０６個〜２５×１０６個を含む。
【００６９】
本明細書で使用される「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含む培地、３７℃と互換的に使用することができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、リン、オクタン脂肪酸、パルミチン脂肪酸、リノール脂肪酸およびオレイン酸の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、培地は、例えば、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＩＭＤＭ）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃにおいてＣａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ１２４４００５３で入手可能）に見ることができる量の１０倍の量のリンを含む。
【００７０】
本明細書で使用される「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含む培地、３７℃と互換的に使用することができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の要素：ホウ素、ナトリウム、マグネシウム、リン、カリウム、およびカルシウムの１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、対応する平均濃度で存在する以下の要素：  ホウ素、３．７ｍｇ／Ｌ、ナトリウム、３０００ｍｇ／Ｌ、マグネシウム、１８ｍｇ／Ｌ、リン、２９ｍｇ／Ｌ、カリウム、１５ｍｇ／Ｌおよびカルシウム、４ｍｇ／Ｌの１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。
【００７１】
本明細書で使用される「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含む培地、３７℃と互換的に使用することができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の成分：オクタン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２４−０７−２）、ニコチンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．９８−９２−０）、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２６−８６−３）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．６９３８−９４−９）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２２−８４−２）、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル（ＣＡＳ  Ｎｏ．８４−６９−５）、パルミチン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．５７−１０−３）、リノール酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．６０−３３−３）、オレイン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．１１２−８０−１）、ステアリン酸ヒドラジド（ＣＡＳ  Ｎｏ．４１３０−５４−５）、オレアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３３２２−６２−１）、ステロール（例えば、コレステロール）（ＣＡＳ  Ｎｏ．５７−８８−５）、およびアルカン（例えば、ノナデカン）（ＣＡＳ  Ｎｏ．６２９−９２−５）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の成分：オクタン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２４−０７−２）、ニコチンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．９８−９２−０）、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２６−８６−３）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．６９３８−９４−９）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３６２２−８４−２）、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル（ＣＡＳ  Ｎｏ．８４−６９−５）、パルミチン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．５７−１０−３）、リノール酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．６０−３３−３）、オレイン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．１１２−８０−１）、ステアリン酸ヒドラジド（ＣＡＳ  Ｎｏ．４１３０−５４−５）、オレアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３３２２−６２−１）、ステロール（例えば、コレステロール）（ＣＡＳ  Ｎｏ．５７−８８−５）、アルカン（例えば、ノナデカン）（ＣＡＳ  Ｎｏ．６２９−９２−５）、およびフェノールレッド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１４３−７４−８）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の成分：オクタン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２４−０７−２）、ニコチンアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．９８−９２−０）、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２６−８６−３）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．６９３８−９４−９）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド（ＣＡＳ  ��ｏ．３６２２−８４−２）、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル（ＣＡＳ  Ｎｏ．８４−６９−５）、パルミチン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．５７−１０−３）、リノール酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．６０−３３−３）、オレイン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．１１２−８０−１）、ステアリン酸ヒドラジド（ＣＡＳ  Ｎｏ．４１３０−５４−５）、オレアミド（ＣＡＳ  Ｎｏ．３３２２−６２−１）、フェノールレッド（ＣＡＳ  Ｎｏ．１４３−７４−８）およびラノリンアルコールの１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。
【００７２】
本明細書で使用される「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含む培地、３７℃と互換的に使用することができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下のイオン：ナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物イオン、硫酸およびリン酸の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。
【００７３】
本明細書で使用される「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増大補充物質の１つまたは複数を含む培地、３７℃と互換的に使用することができる。代替的にまたは追加で、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の遊離アミノ酸：ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、プロリン、システイン、リシン、チロシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンの１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、対応する平均モル百分率で以下の遊離アミノ酸：ヒスチジン（約１％）、アスパラギン（約０．５％）、セリン（約１．５％）、グルタミン（約６７％）、アルギニン（約１．５％）、グリシン（約１．５％）、アスパラギン酸（約１％）、グルタミン酸（約２％）、トレオニン（約２％）、アラニン（約１％）、プロリン（約１．５％）、システイン（約１．５％）、リシン（約３％）、チロシン（約１．５％）、メチオニン（約１％）、バリン（約３．５％）、イソロイシン（約３％）、ロイシン（約３．５％）、フェニルアラニン（約１．５％）およびトリプトファン（約０．５％）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、対応する平均モル百分率で以下の遊離アミノ酸：ヒスチジン（約．７８％）、アスパラギン（約０．４％）、セリン（約１．６％）、グルタミン（約６７．０１％）、アルギニン（約１．６７％）、グリシン（約１．７２％）、アスパラギン酸（約１．００％）、グルタミン酸（約１．９３％）、トレオニン（約２．３８％）、アラニン（約１．１１％）、プロリン（約１．４９％）、システイン（約１．６５％）、リシン（約２．８４％）、チロシン（約１．６２％）、メチオニン（約０．８５％）、バリン（約３．４５％）、イソロイシン（約３．１４％）、ロイシン（約３．３％）、フェニルアラニン（約１．６４％）およびトリプトファン（約０．３７％）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。
【００７４】
本明細書で使用される「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸およびステロール（例えば、コレステロール）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、端点を含め０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸；および端点を含め約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）の１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、端点を含め６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸；端点を含め０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸；端点を含め０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸；端点を含め０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のおよびステロールの１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つまたは複数を含む培地と互換的に使用することができる。
【００７５】
本明細書で使用される「Ｐ３緩衝液」という用語は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣｌＮａ、グルコースおよびＣａ（ＮＯ３）２の１つまたは複数を任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含み、任意選択で、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、およびリン酸緩衝液からなる群から選択される補充物質をさらに含む緩衝液と互換的に使用することができる。「Ｐ３緩衝液」という用語は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコースおよび０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２を含み、任意選択で、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、およびリン酸緩衝液からなる群から選択される補充物質をさらに含む緩衝液と互換的に使用することができる。「Ｐ３緩衝液」という用語は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコースおよび０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２および２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含む補充物質を含む緩衝液と互換的に使用することができる。「Ｐ３緩衝液」という用語は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコースおよび０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２および４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２を含む補充物質を含む緩衝液と互換的に使用することができる。
【００７６】
本明細書で使用される「補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地」または「Ｔ細胞馴化培地（ＴＣＣＭ）」という用語は、水、ウシ胎仔血清、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、１つまたは複数の非必須アミノ酸、フェノールレッド指示薬、硝酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム（無水）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン（無水）、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン  ２Ｎａ  ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ−パントテン酸（ヘミカルシウム）、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、ビタミンＢ１２、Ｄ−グルコース、グルタチオン（還元型）、Ｌ−グルタミンおよび２−メルカプトエタノールの１つまたは複数を任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含む培地と互換的に使用することができる。「補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地」または「Ｔ細胞馴化培地（ＴＣＣＭ）」という用語は、水、ウシ胎仔血清、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、１つまたは複数の非必須アミノ酸、フェノールレッド指示薬、硝酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム（無水）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン（無水）、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ−パントテン酸（ヘミカルシウム）、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、ビタミンＢ１２、Ｄ−グルコース、グルタチオン（還元型）、Ｌ−グルタミンおよび２−メルカプトエタノールを任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含む培地と互換的に使用することができる。
【００７７】
本明細書で使用される「補充されたＡＩＭ−Ｖ」または「補充されたＡＩＭＶ」培地という用語は、水、ヒト血清アルブミン、ストレプトマイシン硫酸塩、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、１つまたは複数の非必須アミノ酸、フェノールレッド指示薬、硝酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム（無水）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン（無水）、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン  ２Ｎａ  ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ−パントテン酸（ヘミカルシウム）、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、ビタミンＢ１２、Ｄ−グルコース、グルタチオン（還元型）、Ｌ−グルタミンおよび２−メルカプトエタノールの１つまたは複数を任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含む培地と互換的に使用することができる。「補充されたＡＩＭ−Ｖ」または「補充されたＡＩＭＶ」培地という用語は、水、ヒト血清アルブミン、ストレプトマイシン硫酸塩、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、１つまたは複数の非必須アミノ酸、フェノールレッド指示薬、硝酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム（無水）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン（無水）、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａ２Ｈ２Ｏ、Ｌ−バリン、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ−パントテン酸（ヘミカルシウム）、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、ビタミンＢ１２、Ｄ−グルコース、グルタチオン（還元型）、Ｌ−グルタミンおよび２−メルカプトエタノールを任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含む培地と互換的に使用することができる。
【００７８】
本明細書で使用される「ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）培地」という用語は、水、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩Ｈ２０、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩、Ｌ−バリン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、ｉ−イノシトール、塩化カルシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、硝酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、一塩基リン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、Ｄ−グルコース、ＨＥＰＥＳおよびピルビン酸ナトリウムの１つまたは複数を任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含む培地と互換的に使用することができる。「ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）培地」という用語は、水、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩Ｈ２０、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩、Ｌ−バリン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、ｉ−イノシトール、塩化カルシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、硝酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、一塩基リン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、Ｄ−グルコース、ＨＥＰＥＳおよびピルビン酸ナトリウムを任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含む培地と互換的に使用することができる。
【００７９】
本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを含めた本開示の改変Ｔ細胞を、手順の方法の任意のステップにおいて、ＰＩ３Ｋ経路の１つまたは複数のインヒビター成分を含む成長培地と共にインキュベートする、培養する、成長させる、保管する、または他のやり方で合わせることができる。ＰＩ３Ｋ経路の例示的なインヒビター成分としては、これだけに限定されないが、ＴＷＳ１１９（ＧＳＫ  ３ＢインヒビターＸＩＩとしても公知；ＣＡＳ番号６０１５１４−１９−６、化学式Ｃ１８Ｈ１４Ｎ４Ｏ２を有する）などのＧＳＫ３βインヒビターが挙げられる。ＰＩ３Ｋ経路の例示的なインヒビター成分としては、これだけに限定されないが、ｂｂ００７（ＢＬＵＥＢＩＲＤＢＩＯ（商標））が挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用される「電気穿孔」および「ヌクレオフェクション」という用語は、本開示の核酸、トランスポゾン、ベクターまたは組成物を、電気パルスを供給して細胞膜（細胞膜、核膜、もしくは両方）が本開示の核酸、トランスポゾン、ベクターまたは組成物に対して透過性になるようにまたはより透過性になるように誘導することによって細胞に送達するための代替手段を記載することが意図されている。
【００８１】
ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、当該方法を１つまたは複数のキュベット中で同時に実施する。ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、当該方法を２つのキュベット中で同時に実施する。臨床的または商業的適用のためにより大きな規模で実施されるプロセスに関しては、例えば、ヌクレオフェクションを、大きな体積カセットで多くの手順を同時に行いながら実施することができる。ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、インキュベートするステップは、複数の初代ヒトＴ細胞を含む組成物を、予め温めたＴ細胞増大組成物中でインキュベートすることを含む。インキュベーションステップの期間は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、またはこれらの間の任意の時間数／部分であり得る。インキュベーションステップの期間は、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間またはこれらの間の任意の日数／部分であり得る。インキュベーションステップの期間は、少なくとも１週間であり得る。ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、インキュベーションステップの期間は２日間である。ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、適用ステップは、以下のプログラム、ＥＩ−１１５、ＥＩ−１５１、ＥＩ−１５６、ＥＩ−１５８、ＥＧ−１１５、ＥＧ−１４２、ＥＧ−１５１、ＥＳ−１１５、ＥＳ−１５１、ＥＯ−１５１、ＥＯ−１４８、ＥＯ−１５６、ＥＯ−２１０、ＥＯ−２１３、およびＦＩ−１５６の１つまたは複数を適用することを含み得る。ある特定の実施形態では、適用ステップは、以下のプログラム、ＥＩ−１１５、ＥＩ−１５１、ＥＩ−１５６、ＥＩ−１５８、ＥＧ−１１５、ＥＧ−１４２、ＥＧ−１５１、ＥＳ−１１５、ＥＳ−１５１、ＥＯ−１５１、ＥＯ−１４８、ＥＯ−１５６、ＥＯ−２１０、ＥＯ−２１３、およびＦＩ−１５６の１つもしくは複数、または各パルスが同じ持続時間および強度を有する同数の電気パルスならびに実質的に同様の中間パルス持続時間をもたらすプログラムを適用することを含み得る。ある特定の実施形態では、適用ステップは、これだけに限定されないが、Ｌｏｎｚａ  Ａｍａｘａ、ＭａｘＣｙｔｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢＴＸ  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ、およびＢｉｏＲａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを含めた公知の電気穿孔／ヌクレオフェクションデバイスを使用して実施することができる。ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、適用ステップは、少なくとも１つの電気パルスを適用することを含み得る。ヌクレオフェクションのある特定の実施形態では、適用ステップは、細胞の細胞膜および／または核膜を本開示の組成物に対して透過性になるように誘導するために十分な少なくとも１つの電気パルスを適用することを含み得る。
【００８２】
本明細書に提示される量は、例示的であり、限定するものではないが、これらの量の間の関係（例えば、比または相対的な存在量）を使用して、本明細書において例示されている方法をより大きな規模のプロセスおよび製造のために修正することができる。
【００８３】
本開示の改変Ｔ細胞（例えば、ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭ）を作製する方法のある特定の実施形態では、活性化補充物質は、１つまたは複数のサイトカインを含む。１つまたは複数のサイトカインは、リンホカインが挙げられるがこれに限定されない任意のサイトカインを含み得る。例示的なリンホカインとして、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターフェロン−ガンマ（ＩＮＦγ）が挙げられるがこれに限定されない。１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ−２を含み得る。
【００８４】
本開示の改変Ｔ細胞（例えば、ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭ）を作製する方法のある特定の実施形態では、増大補充物質は、１つまたは複数のサイトカインを含む。１つまたは複数のサイトカインは、リンホカインが挙げられるがこれに限定されない任意のサイトカインを含み得る。例示的なリンホカインとして、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターフェロン−ガンマ（ＩＮＦγ）が挙げられるがこれに限定されない。１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ−２を含み得る。
【００８５】
本開示の改変Ｔ細胞（例えば、ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭ）を作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、ナイーブＴ細胞である。ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌを発現し得る。ある特定の実施形態では、方法は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはこれらの間の任意の百分率のナイーブＴ細胞を含む細胞集団に適用される。ある特定の実施形態では、本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭの作製の効率を、本開示の方法を適用する細胞集団内のナイーブＴ細胞の割合または百分率を上昇させることによって上昇させることができる。
【００８６】
本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、メモリーＴ細胞である。
【００８７】
本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する。
【００８８】
本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞はナイーブＴ細胞（改変ＴＮ）であり、改変ＴＮは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する。本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は改変ＴＳＣＭＴメモリー幹細胞（改変ＴＳＣＭ）であり、改変ＴＳＣＭは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する。本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞はセントラルメモリーＴ細胞（改変ＴＣＭ）であり、改変ＴＣＭは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する。本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞はエフェクターメモリーＴ細胞（改変ＴＥＭ）であり、改変ＴＥＭは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する。本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞はエフェクターＴ細胞（改変ＴＥＦＦ）であり、改変ＴＥＦＦは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する。
【００８９】
本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、ＣＤ４および／またはＣＤ８を発現し得る。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、ＣＤ４および／またはＣＤ８を種々の比で発現し得る。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、天然に存在しないＣＤ４および／またはＣＤ８を種々の比で発現し得る。ある特定の実施形態では、天然に存在しない可能性があるＣＤ４および／またはＣＤ８を種々の比で発現する初代ヒトＴ細胞は、異種細胞集団である。
【００９０】
本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを作製する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、例えば、全血、末梢血、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、リンパ液、リンパ節組織、骨髄、および脳脊髄液（ＣＳＦ）から単離する、調製するまたは引き出すことができる。「末梢血」という用語は、本明細書で使用される場合、血液の循環プールから得られたまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔離されていない血液の細胞成分（例えば、赤血球、白血球および血小板）を指す。臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）は、末梢血およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔離されている血液とは別個である。「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）」という用語は、互換的に使用することができ、出産後に胎盤内に留まり、臍帯に付着している血液を指す。臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）は、多くの場合、造血細胞を含めた幹細胞を含有する。
【００９１】
本開示の初代ヒトＴ細胞は、汎Ｔ細胞を含み得る。本明細書で使用される汎Ｔ細胞は、生体試料から、亜型、活性化の状態、成熟化の状態、または細胞表面マーカーの発現による選別を伴わずに単離された全てのＴリンパ球を含む。
【００９２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、方法は、改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭ細胞にゲノム編集構築物または組成物を含む組成物を導入するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ガイドＲＮＡおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼをコードし、発現されるＤＮＡ結合ドメインおよび発現されるＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、非共有結合的に連結されている。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列を含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、ＤＮＡ結合ドメインである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列がＤＮＡ結合ドメインである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、不活性Ｃａｓ９をコードする。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列がＤＮＡ結合ドメインである実施形態を含め、ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、短縮型Ｃａｓ９をコードする。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、１０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）によるアミノ酸置換（Ｄ１０Ａ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、８４０位におけるアラニン（Ａ）のヒスチジン（Ｈ）によるアミノ酸置換（Ｈ８４０Ａ）を含むかまたはこれをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、不活性化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）（配列番号３３）を含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、５８０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン（Ｎ）によるアミノ酸置換（Ｎ５８０Ａ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに由来する配列は、短縮型かつ不活性化されたＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）（配列番号３２）を含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に由来する配列を含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮに由来する配列は、ＤＮＡ結合ドメインである。ある特定の実施形態では、ゲノム編��構築物は、ＴＡＬＥＮを含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に由来する配列を含む。ゲノム編集構築物がＤＮＡ結合ドメインおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ＺＦＮに由来する配列は、ＤＮＡ結合ドメインである。ある特定の実施形態では、ゲノム編集構築物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。
【００９３】
本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭ細胞を作出する方法は、より多くの数またはより大きな割合の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭ細胞が作製されるように最適化することができる。例えば、本開示の方法に供される細胞の集団を、増加した数またはより大きな割合のナイーブＴ細胞が含有されるように富化することができる。本開示の方法に供されるＴ細胞の集団内のナイーブＴ細胞の数および／または割合が増大するにしたがって、作製される本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭ細胞の数および／または割合も増大する。その代わりに、またはそれに加えて、開示の方法を先に行うのに必要な時間の長さまたは持続時間が減少するにしたがって、当該方法によって作製される本開示の改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭ細胞の数および／または割合が増大する。開示の方法を先に行うのに必要な時間の長さもしくは持続時間、または「製造期間」は、本開示の方法に供されるＴ細胞の「アウトオブライフ（ｏｕｔ−ｏｆ−ｌｉｆｅ）期間」とも称することができる。
【００９４】
本開示の改変Ｔ細胞を作出する方法のある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）であり、ＴＮはＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、Ｔメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）であり、ＴＳＣＭはＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）であり、ＴＣＭはＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現する。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）であり、ＥＭはＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）であり、ＴＥＦＦはＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβの１つまたは複数を発現する。ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞は、ＣＤ４および／またはＣＤ８を発現する。
【００９５】
本開示は、本開示の方法で作製された改変ＴＳＣＭを含む組成物を提供する。本開示は、本開示の方法で作製された改変ＴＣＭを含む組成物を提供する。本開示は、本開示の方法で作製された改変ＴＳＣＭおよび改変ＴＣＭを含む組成物を提供する。本開示の方法によって作製された改変ＴＳＣＭおよび改変ＴＣＭを含む組成物のある特定の実施形態では、複数のＴＳＣＭは、組成物の少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％を占め得る。本開示の方法によって作製された改変ＴＳＣＭおよび改変ＴＣＭを含む組成物のある特定の実施形態では、複数のＴＣＭは、組成物の少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％を占め得る。
【００９６】
本開示は、それを必要とする対象を処置するための医薬を製造するための、本開示の方法で作製された改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを含む組成物の使用を提供する。この使用のある特定の実施形態では、改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭは自己由来である。この使用のある特定の実施形態では、改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭは同種異系である。ある特定の実施形態では、抗原受容体は、Ｔ細胞受容体である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在する。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在しない。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、組換えＴ細胞受容体である。ある特定の実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲＴｙｒｉｎである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＶＣＡＲである。
【００９７】
本開示は、それを必要とする対象における疾患または障害を処置するための方法であって、本開示の方法で作製された改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭを含む治療有効量の組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。この方法のある特定の実施形態では、改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭは自己由来である。この方法のある特定の実施形態では、改変ＴＳＣＭおよび／またはＴＣＭは同種異系である。ある特定の実施形態では、抗原受容体は、Ｔ細胞受容体である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在する。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体は天然に存在しない。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の突然変異を含む。ある特定の実施形態、特に、Ｔ細胞受容体が天然に存在しない実施形態では、Ｔ細胞受容体は、組換えＴ細胞受容体である。ある特定の実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲＴｙｒｉｎである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数のＶＨＨ配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＶＣＡＲである。この方法のある特定の実施形態では、疾患または障害は、がんであり、抗原受容体は、がん抗原を特異的に標的とする。この方法のある特定の実施形態では、疾患または障害は、感染性疾患または障害であり、抗原受容体は、ウイルス抗原、細菌抗原、酵母抗原または微生物抗原を特異的に標的とする。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、分泌型タンパク質の活性が欠如していることまたは量が不十分であることによって引き起こされる疾患または障害である。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、治療用タンパク質の活性を置き換えることによって、または治療用タンパク質の量を増加させることによって処置される疾患または障害である。ある特定の実施形態では、治療用タンパク質は、分泌タンパク質である。ある特定の実施形態では、体の局所領域内の分泌型タンパク質の活性が欠如しているまたはその量が不十分である。ある特定の実施形態では、体の局所領域は、ネイティブなＴ細胞または改変Ｔ細胞によって接近可能である。ある特定の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで作製される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、実施例１の方法の１１日目におけるＣＡＲ−ＴＳＣＭ表現型の出現を示す一連のプロットである。細胞を、代理ＣＡＲＴｙｒｉｎプラスミドを用いてヌクレオフェクトした。ＣＡＲ−ＴＳＣＭ細胞は、下の２つのプロットに示されている通り、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを発現する。
【００９９】
【図２】図２は、１９日目における実施例１の方法によって作製されたＣＡＲ−ＴＳＣＭの純度を示す一連のプロットである。１９日目における実施例１に記載されている方法によって作製されたＣＡＲ−ＴＳＣＭ細胞の集団は、Ｂ細胞もリンパ球も含有しなかった。大多数の細胞はＣＤ３＋Ｔ細胞である。１．１％のみがナチュラルキラー細胞であり、１．７％がナチュラルキラーＴ細胞である。
【０１００】
【図３】図３は、実施例１に記載されている方法の１１日目において、作製されたＴ細胞の大多数がＣＡＲＴｙｒｉｎを発現することを示すプロットである。
【０１０１】
【図４】図４は、実施例１に記載されている方法の１９日目におけるＣＡＲ−ＴＳＣＭ表現型の富化を示す一連のプロットである。細胞を、代理ＣＡＲＴｙｒｉｎプラスミドを用いてヌクレオフェクトした。ＣＡＲ−ＴＳＣＭ細胞は、下の２つのプロットに示されている通り、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを発現する。
【０１０２】
【図５】図５は、実施例１に記載されている方法の１９日目においてＴ細胞疲弊がないことを示す一連のプロットである。１９日目に、この方法によって作製された細胞集団は、Ｔ細胞活性化および疲弊のマーカーであるＰＤ１を発現しない。ＣＡＲＴｙｒｉｎを発現するこれらの細胞は、製造後に休止状態にほぼ首尾よく到達した。これらの細胞は、そうでなければ高レベルのＰＤ１発現を駆動する、抗原非依存性（トニック）シグナル伝達の徴候を示さない。トニックシグナル伝達は、初期疲弊を導き、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性を低下させる一部のＣＡＲ分子によって引き起こされるという仮説が立てられる。
【０１０３】
【図６Ａ】図６Ａは、誘導性カスパーゼポリペプチド（安全スイッチ、「ｉＣ９」）、ＣＡＲＴｙｒｉｎ（抗ＢＣＭＡ）、および選択マーカーをコードする配列を含むトランスポゾンをコードする配列を含有するプラスミドを用いて転移を生じさせたＴ細胞を示す一連のプロットである。左側のプロットは、プラスミドの非存在下でトランスポザーゼに曝露させた生Ｔ細胞を示す。右側のプロットは、プラスミドの存在下でトランスポザーゼに曝露させた生Ｔ細胞を示す。細胞を過剰活性トランスポザーゼ（「Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ」）または野生型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのいずれかに曝露させた。
【０１０４】
【図６Ｂ】図６Ｂは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列を含有するプラスミドを用いて転移を生じさせたＴ細胞を示す一連のプロットである。左側のプロットは、プラスミドの非存在下でトランスポザーゼに曝露させた生Ｔ細胞を示す。右側のプロットは、プラスミドの存在下でトランスポザーゼに曝露させた生Ｔ細胞を示す。細胞を過剰活性トランスポザーゼ（「Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ」）または野生型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのいずれかに曝露させた。
【０１０５】
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＷＴｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼを用いた転移と、それに対して過剰活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼを用いた転移から生じた、形質転換されたＴ細胞のパーセントを示す表である。過剰活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ）と接触させたＴ細胞は、ＷＴトランスポザーゼよりも４倍高い率で形質転換された。
【０１０６】
【図６Ｄ】図６Ｄは、ヌクレオフェクションの５日後の、ＷＴｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼを用いた転移と、それに対して過剰活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼを用いた転移から生じた、形質転換されたＴ細胞のパーセントを示す表である。過剰活性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ）と接触させたＴ細胞はＷＴトランスポザーゼよりもはるかに高い率で形質転換された。
【０１０７】
【図７】図７は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）によって作製されたＣＡＲ＋Ｔ細胞とレンチウイルスによって作製されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型の差異を示すグラフである。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ｐｉｇｇｙＢａｃによる転移またはレンチウイルスによる形質導入のいずれかを使用して作製した。ヒト汎Ｔ細胞に対して、ＣＡＲをコードするｐｉｇｇｙＢａｃを用いて転移を生じさせ、転移の２日後に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激し、増大させ、転移の１９日後に試験した。レンチウイルスを使用した作製に関しては、汎Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激し、ＣＡＲ（ＭＯＩ  ５）をコードするレンチウイルスを用いて形質導入し、増大させ、刺激後１８日目に試験した。次いで、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の各集団を、標準のメモリーマーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ９５の発現に基づいて特徴付けた。各ＣＡＲ＋Ｔ細胞サブセットの百分率を、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、Ｔｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−）、Ｔｅｍ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−）およびＴｅｆｆ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋）と定義した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞は全てＣＤ９５＋であった。
【０１０８】
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｂは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）により、ナイーブＴ細胞で優先的に転移が生じることを示すグラフの対である。ヒト汎Ｔ細胞を、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）サブセット、Ｔｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−）サブセット、Ｔｅｍ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−）サブセット、およびＴｅｆｆ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋）サブセットに選別した（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩフローサイトメーターを使用した）。選別されたサブセットをそれぞれ、ｐｉｇｇｙＢａｃ−ＧＦＰを用いて転移を生じさせたか、またはレンチウイルス−ＧＦＰを用いて形質導入した。前者に関しては、選別された各サブセットに対して、ＰｉｇｇｙＢａｃ−ＧＦＰを用いて転移を生じさせ、転移の２日後に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激し、増大させ、転移の１９日後に試験した。後者に関しては、選別されたサブセットを、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激し、ＧＦＰ（ＭＯＩ  ５）をコードするレンチウイルスを用いて形質導入し、増大させ、刺激後１９日目に試験した。ｎ＝３ドナー。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｂは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）により、ナイーブＴ細胞で優先的に転移が生じることを示すグラフの対である。ヒト汎Ｔ細胞を、ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）サブセット、Ｔｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−）サブセット、Ｔｅｍ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−）サブセット、およびＴｅｆｆ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋）サブセットに選別した（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩフローサイトメーターを使用した）。選別されたサブセットをそれぞれ、ｐｉｇｇｙＢａｃ−ＧＦＰを用いて転移を生じさせたか、またはレンチウイルス−ＧＦＰを用いて形質導入した。前者に関しては、選別された各サブセットに対して、ＰｉｇｇｙＢａｃ−ＧＦＰを用いて転移を生じさせ、転移の２日後に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激し、増大させ、転移の１９日後に試験した。後者に関しては、選別されたサブセットを、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激し、ＧＦＰ（ＭＯＩ  ５）をコードするレンチウイルスを用いて形質導入し、増大させ、刺激後１９日目に試験した。ｎ＝３ドナー。
【０１０９】
【図９】図９は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）製造プロセスにより、ナイーブＴ細胞が希少である場合であっても、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来の試料中で高レベルのＴＳＣＭが得られることを示すグラフの対である。ＭＭ患者由来のＴ細胞（三角形）および健康なドナー由来のＴ細胞（丸）を、Ｐｏｓｅｉｄａ製造プロセスの前（左）および後（右）に、フローサイトメトリーによってメモリーマーカー発現について特徴付けた。ＭＭ患者および健康なドナーについてＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌの発現をＦＡＣＳによって評価し、プロットを示している。ＭＭ患者由来のＴ細胞は、一般に、ナイーブ細胞およびＴＳＣＭ細胞の頻度が低いがＴｅｆｆの頻度が高く、これは、逆のことが分かっている健康な正常ドナーとは異なる。異なるＭＭ患者からのナイーブおよびＴｓｃｍのインプット頻度にかかわらず、Ｐｏｓｅｉｄａ製造プロセスを使用したＰ−ＢＣＭＡ−１０１の作製により、高レベルのＣＤ８＋Ｔｓｃｍを示す産物がもたらされた（Ｅ）。これは、処置を積極的に受けたＭＭ患者にも当てはまる（赤色の三角形）。
【０１１０】
【図１０−１】図１０は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００ｘ）転移系および本開示の方法を用いて形質転換したヒト汎Ｔ細胞におけるＴ細胞およびＴＳＣＭ細胞マーカーを特徴付ける一連の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）プロットである。Ｐｏｓｅｉｄａ製造プロセスを使用したＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００ｘ）転移により、Ｔｓｃｍ表現型が主に得られる。示されている通り、ヒト汎Ｔ細胞に対して、１μｇのＳｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポゾンプラスミドまたはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドのいずれか、およびそれぞれＳＢ１００ｘまたはＳＰＢ  ｍＲＮＡを使用して転移を生じさせた。転移後、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏにおいて増大させ、全ての非転移細胞を、Ｐｏｓｅｉｄａ製造薬物選択系を使用して枯渇させた。１８日間培養した後、細胞を表現型マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ６２Ｌで染色した。幹細胞メモリー表現型（Ｔｓｃｍ）は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ二重陽性細胞によって定義され、全試料中の細胞の＞６５％を構成する。列内の全てのパネルが共通のｘ軸およびｙ軸パラメータを共有する。各行には、上から下に、（上）、２．５マイクログラム（μｇ）のＳｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＳＢ１００ｘを用いて転移を生じさせたＴ細胞からのデータ、（上から２番目）５μｇのＳＢ１００ｘを用いて転移を生じさせたＴ細胞からのデータ、（上から３番目）１０μｇのＳＢ１００ｘを用いて転移を生じさせたＴ細胞からのデータ、（下から２番目）５μｇのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンＰ−ＢＣＭＡ−１０１を用いて転移を生じさせたＴ細胞からのデータ、および一番下に、非染色対照を用いて転移を生じさせたＴ細胞からのデータが示されている。ｘ軸の第１の列および第２の列は、左から右に、前方散乱（ＦＳＣ）を、０〜２５０千（「ｋ」と省略）の単位、５０ｋきざみで示す。第３の列のｘ軸は、左から、ＣＤ８発現を示し、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する読み取りがマーキングされている。右端の列は、ＣＤ６２Ｌ発現を示し、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する読み取りがマーキングされている。第１の列のｙ軸は、側方散乱（ＳＳＣ）を、０から２５０ｋまでの単位、５０ｋきざみで示す。第２の列のｙ軸は、左から、細胞の生存能力マーカーである７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）の発現を示し、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する。第３の列のｙ軸は、左から、マーカーＣＤ４の発現を示し、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する。右側の列のｙ軸は、マーカーＣＤ４５ＲＡの発現を示し、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する。
【図１０−２】同上
【０１１１】
【図１１】図１１は、血液凝固を導くヒト凝固経路を示す概略図である。例えば内皮の損傷による接触活性化により、内在性凝固経路が活性化する。例えば外傷後に、組織因子により外来性凝固経路が活性化される。どちらの経路も、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒する、プロトロンビンのトロンビンへの変換に収束する。血小板と重合したフィブリンは血餅を形成する。第ＩＸ因子の非存在下では（丸で囲まれている）、凝固は不完全である。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損により、血友病Ａの発生がもたらされる。第ＩＸ因子（ＦＩＸ）欠損により、血友病Ｂの発生がもたらされる。血友病Ｂは、２５，０００〜３０，０００のうち約１の頻度で生じる稀な疾患である。血友病Ｂ症例の６０パーセントが重症である。血友病Ｂを有する個体の１パーセント未満が正常なＦＩＸレベルを有する。本開示の組成物および方法より以前には、血友病Ｂに対する標準の処置は、組換えＦＩＸを２〜３日ごとに注入することを伴うものであり、１年当たり費用はおよそ２５０，０００ドルであった。この標準処置選択肢とは著しく異なり、本開示のＴＳＣＭ細胞はヒトにおいて数十年維持される。
【０１１２】
【図１２】図１２は、ＦＩＸを分泌するＴ細胞を示す一連の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳプロット）である。ヒト第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするＴ細胞は、細胞のおよそ８０％がＴＳＣＭ表現型を示した。６つのパネルが左から右に記載されている。（１）ｘ軸に前方散乱（ＦＳＣ）と、それに対してｙ軸に側方散乱（ＳＳＣ）。ｘ軸は、５０ｋきざみで０〜２５０千（ｋと省略される）であり、ｙ軸は、５０ｋきざみで０から２５０ｋまでである。（２）細胞の生存能力マーカーである７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）に対してｘ軸にＦＳＣ。ｘ軸は、５０ｋきざみで０から２５０ｋまで標識されている。ｙ軸の読み取りは、上から下まで、−１０３、０、１０３、１０４、１０５である。（３）ｘ軸上にＣｙ７色素とコンジュゲートした抗ＣＤ５６−ＡＰＣ（ＣＤＣ５６−ＡＰＣ−Ｃｙ７）が０から１０５まで１０の冪ずつ増加する単位で示されている。ｙ軸には、フィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲートした抗ＣＤ３が、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する単位で示されている。（４）ｘ軸には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートした抗ＣＤ８が、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する単位で示されている。ｙ軸には、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ６５０色素（ＢＶ６５０）とコンジュゲートした抗ＣＤ４が、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する単位で示されている。（５）ｘ軸には、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１色素（ＢＶ４２１）とコンジュゲートした抗ＣＤ６２Ｌ抗体が、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する単位で示されている。ｙ軸には、ＰＥおよびＣｙ７とコンジュゲートした抗ＣＤ４５ＲＡ抗体が、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する単位で示されている。このパネルは枠で囲まれている。（６）ｘ軸には、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ７８６（ＢＶ７８６）とコンジュゲートした抗ＣＣＲ７抗体が、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する単位で示されている。ｙ軸には、ＰＥおよびＣｙ７とコンジュゲートした抗ＣＤ４５ＲＡが、０から１０５まで１０の冪ずつ増加する単位で示されている。
【０１１３】
【図１３Ａ】図１３Ａは、本開示の改変Ｔ細胞の作製中のヒト第ＩＸ因子分泌を示すグラフである。ｙ軸は、０から８０まで、２０きざみでの、１ミリリットル（ｍＬ）当たりナノグラム（ｎｇ）の第ＩＸ因子濃度である。ｘ軸には、９日目および１２日目のＴ細胞が示されている。
【０１１４】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ｔ細胞によって産生された分泌第ＩＸ因子の凝固活性を示すグラフである。ｙ軸には、ヒト血漿に対するパーセント第ＩＸ因子活性が、０から８まで、２きざみで示されている。ｘ軸は、９日目および１２日目のＴ細胞である。
【０１１５】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｅは、ＨＲまたはＭＭＥＪのいずれかおよび対応する配列を使用した、ＡＡＶＳ１部位への部位特異的組み込みについての一連のプラスミドマップである。Ａ）部位特異的（ＡＡＶＳ１）相同組換え（ＨＲ）、Ｂ）部位特異的（ＡＡＶＳ１）マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）組換えおよびＣ）ＴＴＡＡ特異的ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）転移によるヒト汎Ｔ細胞のゲノムへの安定な組み込みを試験するためのドナープラスミド。ＨＲドナープラスミドおよびＭＭＥＪドナープラスミドに関しては、ＧＦＰ−２Ａ−ＤＨＦＲ遺伝子発現カセットをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位およびＡＡＶＳ１部位組み込みのための相同性アームで挟んだ；ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）ドナープラスミドに関しては、ＧＦＰ−２Ａ−ＤＨＦＲ遺伝子発現カセットをｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポゾンエレメントで挟んだ。ＨＲプラスミドおよびＭＭＥＪプラスミドに対する相同性アームは、それぞれ５００ｂｐおよび２５ｂｐである。パネルＤおよびＥ、ならびにＦは、それぞれ配列番号４１および４２を示す。
【図１４Ｂ】同上
【図１４Ｃ】同上
【図１４Ｄ】同上
【図１４Ｅ】同上
【０１１６】
【図１５】図１５は、ヌクレオフェクションの３日後の初代ヒト汎Ｔ細胞における導入遺伝子（ＧＦＰ）発現を示すグラフである。ＨＲまたはＭＭＥＪドナープラスミドを、ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ＲＮＰ）標的試薬を伴ってまたは伴わずに、ヌクレオフェクションによって汎Ｔ細胞に共送達した。ドナープラスミドを単独で受けるＴ細胞を対照として含めた。汎Ｔ細胞を、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポゾン送達系を使用しても改変した。Ｔ細胞を０日目にＴＣＲ刺激によって活性化し、ヌクレオフェクション後３日目にＧＦＰ＋Ｔ細胞の百分率をフローサイトメトリーによって評価し、データを棒グラフに要約している。
【０１１７】
【図１６】図１６は、ヌクレオフェクションおよび選択の１１日後の初代ヒト汎Ｔ細胞における導入遺伝子（ＧＦＰ）発現を示すグラフである。導入遺伝子が安定に組み込まれた活性化Ｔ細胞を、バイシストロンＧＦＰ−２Ａ−ＤＨＦＲ組み込みカセットにコードされるＤＨＦＲ選択遺伝子を使用し、メトトレキサート添加によって選択した。ヌクレオフェクション後１１日目に、ＧＦＰ＋細胞の百分率をフローサイトメトリーによって評価し、データを棒グラフに要約している。ＧＦＰ＋細胞は、選択により、転移試薬、ＲＮＰプラスＨＲまたはＭＭＥＪドナープラスミドを受けた汎Ｔ細胞では高度に富化されたが、ドナープラスミドを単独で受けたＴ細胞では富化されなかった。
【０１１８】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｃは、ＨＲおよびＭＭＥＪによりＡＡＶＳ１部位において改変された初代ヒト汎Ｔ細胞の表現型を示す一連のグラフである。ＧＦＰ＋ＣＤ８＋汎Ｔ細胞の表現型をヌクレオフェクション後１１日目にフローサイトメトリーによって解析した。Ａ）細胞を、７ＡＡＤ（細胞の生存能力）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを用いて染色し、ＦＡＣＳプロットにゲーティング戦略を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを発現によって定義した：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋（幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ））、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋（セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ））、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−（エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ））、およびＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−（Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ））。Ｂ）各Ｔ細胞サブセットにおける総ＧＦＰ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が棒グラフに要約されている。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポゾン系、またはＨＲとＣａｓ９  ＲＮＰの組合せおよびＭＭＥＪとＣａｓ９  ＲＮＰの組合せを使用し、全ての場合においてＧＦＰ＋Ｔｓｃｍの富化集団が実現された。Ｃ）汎Ｔ細胞の総数をヌクレオフェクション後１３日目に解析し、データを棒グラフに要約している。
【図１７Ｂ】同上
【図１７Ｃ】同上
【０１１９】
【図１８】図１８Ａ〜Ｂは、ＡＡＶＳ１部位への部位特異的組み込みを示すゲル電気泳動の結果の写真の対である。各群から選択された細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲのための鋳型として使用して、Ａ）ＨＲおよびＢ）ＭＭＥＪについてのＡＡＶＳ１部位への部位特異的組み込みを確認した。２つのプライマー対により、ＡＡＶＳ１標的部位の５’末端接合部（一方のプライマーにより挿入ＥＦ１ａ−２ｒ  ＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＣＣＡＣＴ（配列番号３６）のプロモーター領域をプライミングし、他方のプライマーにより、５’末端ＡＡＶＳ−３ｒ  ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＧＴＧＡＴＧＴＣＣＴＣ（配列番号３７）の５００ｂｐホモログアームを越えてＡＡＶＳ１領域をプライミングし、それにより、ＨＲまたはＭＭＥＪのどちらに関しても０．７３ｋｂのＤＮＡ断片を得る）および３’末端接合部（一方のプライマーにより、ポリＡシグナル伝達領域ＳＶ４０ｐＡ−１ｒ  ＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧ（配列番号３８）をプライミングし、他方のプライマーにより、５００ｂｐの５’ホモログアームＡＡＶＳ−２ｆ  ＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＴＴＴＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧ（配列番号３９）を越えてＡＡＶＳ１領域をプライミングし、それにより、ＨＲまたはＭＭＥＪについて０．７６ｋｂのＤＮＡ断片を得る）を個別に増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に提示した。ＨＲ試料における非特異的なバンドは、単一ラウンドのみのＰＣＲの結果であり、追加的なラウンドを行うことで解決されている可能性が高い。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
詳細な説明
本開示は、ヒトキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用し、強力なＣＡＲ活性を有する幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）（本明細書では、ＣＡＲ−ＴＳＣＭと称される）が保存または誘導される条件下で作製するための方法を提供する。本開示の方法を使用して作製されたＣＡＲ−ＴＳＣＭを含む組成物は、≧６０％のＣＡＲ−ＴＳＣＭを含み、このＴ細胞サブセットと一致する別個の機能的プロファイルを示す。本開示の組成物中に見出される他のＴ細胞サブセットとしては、これだけに限定されないが、セントラルメモリーＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ−ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ−ＴＥＭ）、エフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ−ＴＥ）、および高分化型エフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ−ＴＴＥ）が挙げられる。ＴＮが親前駆細胞であり、ＴＳＣＭを直接生じさせ、次いで、今度はそれがＴＣＭを直接生じさせるなどの分化の直線的経路：ナイーブＴ細胞（ＴＮ）＞ＴＳＣＭ＞ＴＣＭ＞ＴＥＭ＞ＴＥ＞ＴＴＥがこれらの細胞の生成に関与し得る。本開示のＣＡＲ−ＴＳＣＭ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ−ＴＳＣＭおよび／またはＶＣＡＲ−ＴＳＣＭを含む組成物は、各親ＣＡＲ−Ｔ細胞サブセットの１つまたは複数を含み得、ＣＡＲ−ＴＳＣＭが最も豊富である（例えば、ＴＳＣＭ＞ＴＣＭ＞ＴＥＭ＞ＴＥ＞ＴＴＥ）。各親Ｔ細胞サブセットの絶対的な分量／存在量および相対的な割合は、患者血液の試料および天然に存在する細胞集団の間で変動し得、天然に存在する細胞集団はＴＳＣＭの存在量および／または割合が高い可能性があり、疾患およびがんに対する患者の処置では天然に存在しないＣＡＲ−ＴＳＣＭを含む本開示の組成物がより強力かつ効果的である。
【０１２１】
キメラ−抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞を使用する免疫療法は、がん療法に関する刺激的な治療手法として浮上しつつある。腫瘍関連抗原（Ａｇ）を標的とする自己由来ＣＡＲ−改変Ｔ細胞により、頑強な腫瘍死滅をもたらすことでき、一部の場合では、ＣＤ１９＋血液悪性腫瘍の完全寛解がもたらされる。従来の生物学的製剤および化学療法薬とは異なり、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ａｇが認識されると急速に再生する能力を有し、それにより、処置を繰り返す必要性が潜在的になくなる。これを実現するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、最初に腫瘍破壊を駆動するだけでなく、潜在的ながん再発を予防するために患者において生存可能なメモリーＴ細胞の安定な集団として持続されなければならない。したがって、Ａｇ非依存性（トニック）シグナル伝達を通じたＴ細胞疲弊を引き起こさないＣＡＲ分子、ならびに、初期メモリー細胞、特に、幹細胞メモリー（ＴＳＣＭ）を含有するＣＡＲ−Ｔ製品の開発に集中的な試みの焦点が当てられている。幹細胞様ＣＡＲ−Ｔは、自己再生の最大能力およびセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）およびエフェクターＴ細胞（ＴＥ）を引き出す多分化能を示し、それにより、より良好な腫瘍の根絶および長期間にわたるＣＡＲ−Ｔの生着が生じる。
【０１２２】
本開示のＣＡＲ−ＴＳＣＭは、ＣＡＲＴｙｒｉｎと称される、センチリンに基づくＣＡＲを含み得る（したがって、当該細胞は、ＣＡＲＴｙｒｉｎ−ＴＳＣＭと称することができる）。センチリンは、ヒトコンセンサステネイシンＦＮ３ドメインに基づく代替足場分子であり、ｓｃＦｖ分子よりも小さく、安定性に好都合な単量体性に関して選択することができ、また、ＣＡＲ分子におけるトニックシグナル伝達の可能性を低下させる。本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎは、不適切な遺伝子活性化またはサイレンシングを遮断することによってＣＡＲＴｙｒｉｎ発現を安定化するのに役立つように２つのシス調節性インスレーターエレメントに挟まれたＣＡＲＴｙｒｉｎをコードするプラスミドＤＮＡトランスポゾンを使用してＴ細胞に導入することができる。
【０１２３】
本開示のＣＡＲ−ＴＳＣＭは、ＶＣＡＲと称される、ＶＨＨに基づくＣＡＲを含み得る（したがって、当該細胞は、ＶＣＡＲ−ＴＳＣＭと称することができる）。本開示のＶＣＡＲは、不適切な遺伝子活性化またはサイレンシングを遮断することによってＶＨＨ発現を安定化するのに役立つように２つのシス調節性インスレーターエレメントに挟まれたＶＨＨをコードするプラスミドＤＮＡトランスポゾンを使用してＴ細胞に導入することができる。
【０１２４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、抗原特異的ＣＡＲＴｙｒｉｎまたはＶＣＡＲ（がん抗原特異的ＣＡＲＴｙｒｉｎまたはＶＣＡＲを含む）を休止状態の汎Ｔ細胞に安定に組み込むために、単一の電気穿孔反応でトランスポゾンがｍＲＮＡトランスポザーゼ酵素と共送達される（トランスポゾンとトランスポザーゼは、それらが細胞に導入されるまで別々の組成物中に含まれるにもかかわらず）、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）と称されるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用することができる。もとのままの休止状態の初代ヒト汎Ｔ細胞へのｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポゾンの送達の結果、２０〜３０％の細胞が、ＰＢにより送達された遺伝子の安定な組み込みおよび発現を伴った。予想外に、大多数のこれらの改変ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現Ｔ細胞が幹メモリーＴ細胞（ｓｔｅｍ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ）（ＴＳＣＭ細胞）に一般に関連付けられるマーカーであるＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡの発現について陽性であった。この表現型がＣＡＲ−Ｔ細胞の刺激および増大の際に保持されたことを確認するために、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡの発現について陽性の改変ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８による刺激によって活性化した。ＣＤ３およびＣＤ２８による刺激の結果として、ＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞の＞６０％が幹細胞メモリー表現型を示した。さらに、がん抗原に対して特異的なＣＡＲＴｙｒｉｎを発現したこれらの細胞は、強力な抗腫瘍エフェクター機能を発現することが十分に可能であった。
【０１２５】
ＰＢ系が幹様マーカーの発現の増強に直接寄与するか否かを決定するために、ＰＢによる転移またはレンチウイルスによる（ＬＶ）形質導入のいずれかによって生成したＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を比較した。これを行うために、ＣＡＲＴｙｒｉｎ導入遺伝子をウイルス産生のための共通のＬＶ構築物にサブクローニングすることによって新しいベクターを構築した。ＣＡＲＴｙｒｉｎをもとのままの休止状態のＴ細胞にＰＢによる転移またはＬＶによる形質導入によって導入した後、ＣＡＲＴｙｒｉｎ＋細胞を増大させ、次いで、休止状態に戻した。メモリーおよび疲弊関連マーカーの動態解析、恒常性サイトカインまたは腫瘍関連Ａｇに応答した二次的な増殖、サイトカイン産生、および標的腫瘍細胞に応答した溶解能を含めた、種々の表現型特性および機能特性を測定した。ＰＢによる転移を行ったＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞とは異なり、ＬＶによる形質導入を行ったＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞では、メモリー表現型の強化が示されなかった。さらに、ＰＢによる転移を行った細胞は、二次的な増殖および標的腫瘍細胞の死滅に関して同等またはより大きな能力を示した。まとめると、これらのデータから、ＰＢによる転移によって作製されたＣＡＲ−Ｔ細胞が、主に、ＣＡＲ−Ｔ分野で高度に望ましい製品表現型であるＴＳＣＭ細胞であることが実証される。さらに、これらのＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞は、強力な抗腫瘍活性を示し、また、トニックシグナル伝達および機能的疲弊を起こしにくい可能性がある、センチリンに基づくＣＡＲの使用に起因してｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより長く持続する細胞を生じさせることができる。
キメラ抗原受容体
【０１２６】
本開示は、（ａ）抗原認識領域を含む外部ドメインであって、抗原認識領域が、抗原に特異的に結合する１つまたは複数の配列を含む、外部ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、二重特異性またはタンデムＣＡＲが生じるように、それぞれ抗原に特異的に結合する２つの配列を含み得る。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、三重特異性ＣＡＲが生じるように、それぞれ抗原に特異的に結合する３つの配列を含み得る。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドをさらに含み得る。その代わりに、またはそれに加えて、ある特定の実施形態では、外部ドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含み得る。それぞれが抗原に特異的に結合する配列としては、これだけに限定されないが、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、抗体の１つまたは複数の断片を含む配列（例えば、ＶＨＨ、ＣＡＲに関してはＶＣＡＲと称される）、抗体模倣物、およびセンチリン（ＣＡＲに関してはＣＡＲＴｙｒｉｎと称される）を挙げることができる。
【０１２７】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）を含むアミノ酸配列を含み得る。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）を含むアミノ酸配列またはＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ａｔｇｇｃａｃｔｇｃｃａｇｔｃａｃｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｃｇｃａｇｃｔａｇａｃｃａ（配列番号９）を含む核酸配列によりコードされ得る。
【０１２８】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含み得る。ＣＤ８α膜貫通ドメインは、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１０）を含むアミノ酸配列またはＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１０）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。ＣＤ８α膜貫通ドメインは、ａｔｃｔａｃａｔｔｔｇｇｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｃａｃａｃｔｇｔａｃｔｇｃ（配列番号１１）を含む核酸配列によりコードされ得る。
【０１２９】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、エンドドメインは、ヒトＣＤ３ζエンドドメインを含み得る。
【０１３０】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはそれらの任意の組合せを含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み得る。ＣＤ２８共刺激ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１２）を含むアミノ酸配列またはＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１２）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。ＣＤ２８共刺激ドメインは、ｃｇｃｇｔｇａａｇｔｔｔａｇｔｃｇａｔｃａｇｃａｇａｔｇｃｃｃｃａｇｃｔｔａｃａａａｃａｇｇｇａｃａｇａａｃｃａｇｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇａａｔｃｔｇｇｇｃｃｇｃｃｇａｇａｇｇａａｔａｔｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｔａａｇｃｇｇａｇａｇｇａｃｇｃｇａｃｃｃｃｇａａａｔｇｇｇａｇｇｃａａｇｃｃｃａｇｇｃｇｃａａａａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇｃａｇａａｇｇａｃａａａａｔｇｇｃａｇａａｇｃｃｔａｔｔｃｔｇａｇａｔｃｇｇｃａｔｇａａｇｇｇｇｇａｇｃｇａｃｇｇａｇａｇｇｃａａａｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔａｃｃａｇｇｇａｃｔｇａｇｃａｃｃｇｃｃａｃａａａｇｇａｃａｃｃｔａｔｇａｔｇｃｔｃｔｇｃａｔａｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｃａａｇｇ（配列番号１３）を含む核酸配列によりコードされ得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列またはＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ａａｇａｇａｇｇｃａｇｇａａｇａａａｃｔｇｃｔｇｔａｔａｔｔｔｔｃａａａｃａｇｃｃｃｔｔｃａｔｇｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃａｇａｃｔａｃｃｃａｇｇａｇｇａａｇａｃｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｔｃｇａｔｔｃｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａａｇｇｃｇｇｇｔｇｔｇａｇｃｔｇ（配列番号１５）を含む核酸配列によりコードされ得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ２８共刺激ドメインの間に位置し得る。
【０１３１】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含み得る。ヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１６）を含むヒトＣＤ８αアミノ酸配列またはＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１６）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。ヒトＣＤ８αヒンジアミノ酸配列は、ａｃｔａｃｃａｃａｃｃａｇｃａｃｃｔａｇａｃｃａｃｃａａｃｔｃｃａｇｃｔｃｃａａｃｃａｔｃｇｃｇａｇｔｃａｇｃｃｃｃｔｇａｇｔｃｔｇａｇａｃｃｔｇａｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇａｇｃｔｇｔｇｃａｃａｃｃａｇｇｇｇｃｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｃｇａｃ（配列番号１７）を含む核酸配列によりコードされ得る。
【０１３２】
本開示は、本開示のＣＡＲおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【０１３３】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むトランスポゾンを提供する。本開示のトランスポゾンは、エピソームとして維持されるまたは組換え／改変細胞のゲノム中に組み込まれる。トランスポゾンは、非ウイルス性遺伝子移入を増強するためにトランスポゾンおよびトランスポザーゼを利用する２成分ｐｉｇｇｙＢａｃ系の一部であり得る。
【０１３４】
本開示のトランスポゾンは、トランスポゾンを発現する細胞を同定、富化および／または単離するための選択遺伝子を含み得る。例示的な選択遺伝子は、細胞の生存能力および生存に必須の任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、選択遺伝子によりコードされる遺伝子産物の非存在下では細胞が感受性である（または細胞に対して致死的であり得る）薬物による攻撃に対する耐性を付与するために必須の任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、選択遺伝子の非存在下で細胞の生存能力および／または生存に必須の１つまたは複数の栄養分を欠く細胞培地中での生存能力および／または生存に必須の任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子としては、これだけに限定されないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、およびＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）が挙げられる。
【０１３５】
本開示のトランスポゾンは、例えば、本開示の抗原および選択遺伝子に特異的に結合する配列の１つまたは複数の間に位置する、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含み得る。少なくとも１つの自己切断性ペプチドは、、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号２０）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１３６】
本開示のトランスポゾンは、第１の自己切断性ペプチドおよび第２の自己切断性ペプチドを含む場合があり、第１の自己切断性ペプチドは、例えば、本開示の抗原に特異的に結合する配列の１つまたは複数の上流に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、例えば、本開示の抗原に特異的に結合する配列の１つまたは複数の下流に位置する。第１のおよび／または第２の自己切断性ペプチドは、、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号２０）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号０２３）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１３７】
本開示は、本開示のトランスポゾンを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、組成物を導入する方法は、トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドを含む組成物をさらに含み得る。トランスポザーゼ酵素をコードする配列は、ｍＲＮＡ配列であり得る。
【０１３８】
本開示のトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含み得る。本開示のトランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼまたは適合する酵素を含み得る。
【０１３９】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ベクターは、組換えベクターであり得る。
【０１４０】
本開示のウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはそれらの任意の組合せから単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含み得る。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、抗原に特異的に結合する配列の１つまたは複数の隣にシスで位置する、２つまたはそれよりも多くの末端逆位配列（ＩＴＲ）配列を含む。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、全ての血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９）を含むが、これだけに限定されない。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）および１つの血清型のゲノムおよび別の血清型のカプシドを含有するＡＡＶハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＤＪ８）を含むが、これだけに限定されない。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、ｒＡＡＶ−ＬＫ０３を含むが、これだけに限定されない。
【０１４１】
本開示のウイルスベクターは、選択遺伝子を含み得る。選択遺伝子は、細胞の生存能力および生存に必須の遺伝子産物をコードし得る。選択遺伝子は、選択的な細胞培養条件による攻撃時に細胞の生存能力および生存に必須の遺伝子産物をコードし得る。選択的な細胞培養条件は、細胞の生存能力または生存に対して有害な化合物を含み得、遺伝子産物により当該化合物に対する耐性が付与される。本開示の例示的な選択遺伝子としては、これだけに限定されないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）またはそれらの任意の組合せを挙げることができる。
【０１４２】
本開示のウイルスベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで自己切断性ペプチドは、ＣＡＲと選択遺伝子との間に位置する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで第１の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの上流に位置す、第２の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。自己切断性ペプチドは、、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号２０）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１４３】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ｍＲＮＡベクターである。ベクターは、組換えｍＲＮＡベクターであり得る。本開示のＴ細胞は、Ｔ細胞と本開示のＣＡＲを含むｍＲＮＡベクターを接触させる前に増大させることができる。次いで、ｍＲＮＡベクターを含むＴ細胞、改変Ｔ細胞を対象に投与することができる。
【０１４４】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子である。本開示の例示的なナノ粒子ベクターとしては、これだけに限定されないが、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはそれらの任意の組合せ）、アミノ酸（Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、合成アミノ酸、修飾アミノ酸、またはそれらの任意の組合せ）、ポリマー（例えば、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ））、ミセル、脂質（例えば、リポソーム）、有機分子（例えば、炭素原子、シート、線維、チューブ）、無機分子（例えば、リン酸カルシウムまたは金）またはそれらの任意の組合せが挙げられる。ナノ粒子ベクターは、細胞膜をわたって受動的にまたは能動的に輸送することができる。
【０１４５】
本開示のナノ粒子ベクターは、選択遺伝子を含み得る。選択遺伝子は、細胞の生存能力および生存に必須の遺伝子産物をコードし得る。選択遺伝子は、選択的な細胞培養条件による攻撃時に細胞の生存能力および生存に必須の遺伝子産物をコードし得る。選択的な細胞培養条件は、細胞の生存能力または生存に対して有害な化合物を含み得、遺伝子産物により当該化合物に対する耐性が付与される。本開示の例示的な選択遺伝子としては、これだけに限定されないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）またはそれらの任意の組合せを挙げることができる。
【０１４６】
本開示のナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで自己切断性ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子との間に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで第１の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで第１の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子との間に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで第１の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子との間に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの下流、例えば、ＣＡＲおよび選択遺伝子の間に位置する。自己切断性ペプチドは、、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号２０）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１４７】
本開示は、本開示のベクターを含む組成物を提供する。
ＣＡＲＴｙｒｉｎ
【０１４８】
本開示は、（ａ）抗原認識領域を含む外部ドメインであって、抗原認識領域が、少なくとも１つのセンチリンを含む、外部ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。本開示全体を通して使用される、センチリンを含むＣＡＲは、ＣＡＲＴｙｒｉｎと称される。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、二重特異性またはタンデムＣＡＲが生じるように、２つのセンチリンを含み得る。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、三重特異性ＣＡＲが生じるように、３つのセンチリンを含み得る。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドをさらに含み得る。その代わりに、またはそれに加えて、ある特定の実施形態では、外部ドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含み得る。
【０１４９】
本開示は、（ａ）抗原認識領域を含む外部ドメインであって、抗原認識領域が、少なくとも１つのタンパク質足場または抗体模倣物を含む、外部ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、二重特異性またはタンデムＣＡＲが生じるように、２つのタンパク質足場または抗体模倣物を含み得る。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、三重特異性ＣＡＲが生じるように、３つのタンパク質足場または抗体模倣物を含み得る。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドをさらに含み得る。その代わりに、またはそれに加えて、ある特定の実施形態では、外部ドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含み得る。
【０１５０】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）を含むアミノ酸配列を含み得る。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）を含むアミノ酸配列またはＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、ａｔｇｇｃａｃｔｇｃｃａｇｔｃａｃｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｃｇｃａｇｃｔａｇａｃｃａ（配列番号９）を含む核酸配列によりコードされ得る。
【０１５１】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含み得る。ＣＤ８α膜貫通ドメインは、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１０）を含むアミノ酸配列またはＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１０）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。ＣＤ８α膜貫通ドメインは、ａｔｃｔａｃａｔｔｔｇｇｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｃａｃａｃｔｇｔａｃｔｇｃ（配列番号１１）を含む核酸配列によりコードされ得る。
【０１５２】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、エンドドメインは、ヒトＣＤ３ζエンドドメインを含み得る。
【０１５３】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはそれらの任意の組合せを含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み得る。ＣＤ２８共刺激ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１２）を含むアミノ酸配列またはＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１２）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。ＣＤ２８共刺激ドメインは、ｃｇｃｇｔｇａａｇｔｔｔａｇｔｃｇａｔｃａｇｃａｇａｔｇｃｃｃｃａｇｃｔｔａｃａａａｃａｇｇｇａｃａｇａａｃｃａｇｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇａａｔｃｔｇｇｇｃｃｇｃｃｇａｇａｇｇａａｔａｔｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｔａａｇｃｇｇａｇａｇｇａｃｇｃｇａｃｃｃｃｇａａａｔｇｇｇａｇｇｃａａｇｃｃｃａｇｇｃｇｃａａａａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇｃａｇａａｇｇａｃａａａａｔｇｇｃａｇａａｇｃｃｔａｔｔｃｔｇａｇａｔｃｇｇｃａｔｇａａｇｇｇｇｇａｇｃｇａｃｇｇａｇａｇｇｃａａａｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔａｃｃａｇｇｇａｃｔｇａｇｃａｃｃｇｃｃａｃａａａｇｇａｃａｃｃｔａｔｇａｔｇｃｔｃｔｇｃａｔａｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｃａａｇｇ（配列番号１３）を含む核酸配列によりコードされ得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列またはＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ａａｇａｇａｇｇｃａｇｇａａｇａａａｃｔｇｃｔｇｔａｔａｔｔｔｔｃａａａｃａｇｃｃｃｔｔｃａｔｇｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃａｇａｃｔａｃｃｃａｇｇａｇｇａａｇａｃｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｔｃｇａｔｔｃｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａａｇｇｃｇｇｇｔｇｔｇａｇｃｔｇ（配列番号１５）を含む核酸配列によりコードされ得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ２８共刺激ドメインの間に位置し得る。
【０１５４】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含み得る。ヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１６）を含むヒトＣＤ８αアミノ酸配列またはＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１６）を含むアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一性を有する配列を含み得る。ヒトＣＤ８αヒンジアミノ酸配列は、ａｃｔａｃｃａｃａｃｃａｇｃａｃｃｔａｇａｃｃａｃｃａａｃｔｃｃａｇｃｔｃｃａａｃｃａｔｃｇｃｇａｇｔｃａｇｃｃｃｃｔｇａｇｔｃｔｇａｇａｃｃｔｇａｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇａｇｃｔｇｔｇｃａｃａｃｃａｇｇｇｇｃｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｃｇａｃ（配列番号１７）を含む核酸配列によりコードされ得る。
【０１５５】
本開示のセンチリンは、タンパク質足場を含み得、足場は、抗原に特異的に結合することが可能である。本開示のセンチリンは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含むタンパク質足場を含み得、足場は、抗原に特異的に結合することが可能である。少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインは、ヒトタンパク質に由来するものであり得る。ヒトタンパク質は、テネイシン−Ｃであり得る。コンセンサス配列は、ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１）またはＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号２）を含み得る。コンセンサス配列は、ａｔｇｃｔｇｃｃｔｇｃａｃｃａａａｇａａｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｔｃｔｃａｔｇｔｇａｃａｇａｇｇａｔａｇｔｇｃｃａｇａｃｔｇｔｃａｔｇｇａｃｔｇｃｔｃｃｃｇａｃｇｃａｇｃｃｔｔｃｇａｔａｇｔｔｔｔａｔｃａｔｃｇｔｇｔａｃｃｇｇｇａｇａａｃａｔｃｇａａａｃｃｇｇｃｇａｇｇｃｃａｔｔｇｔｃｃｔｇａｃａｇｔｇｃｃａｇｇｇｔｃｃｇａａｃｇｃｔｃｔｔａｔｇａｃｃｔｇａｃａｇａｔｃｔｇａａｇｃｃｃｇｇａａｃｔｇａｇｔａｃｔａｔｇｔｇｃａｇａｔｃｇｃｃｇｇｃｇｔｃａａａｇｇａｇｇｃａａｔａｔｃａｇｃｔｔｃｃｃｔｃｔｇｔｃｃｇｃａａｔｃｔｔｃａｃｃａｃａ（配列番号３）を含む核酸配列によりコードされ得る。コンセンサス配列は、（ａ）コンセンサス配列の１３〜１６位のアミノ酸残基ＴＥＤＳを含む、またはそれからなるＡ−Ｂループ；（ｂ）コンセンサス配列の２２〜２８位のアミノ酸残基ＴＡＰＤＡＡＦを含む、またはそれからなるＢ−Ｃループ；（ｃ）コンセンサス配列の３８〜４３位のアミノ酸残基ＳＥＫＶＧＥを含む、またはそれからなるＣ−Ｄループ；（ｄ）コンセンサス配列の５１〜５４位のアミノ酸残基ＧＳＥＲを含む、またはそれからなるＤ−Ｅループ；（ｅ）コンセンサス配列の６０〜６４位のアミノ酸残基ＧＬＫＰＧを含む、またはそれからなるＥ−Ｆループ；（ｆ）コンセンサス配列の７５〜８１位のアミノ酸残基ＫＧＧＨＲＳＮを含む、またはそれからなるＦ−Ｇループ；または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の組合せ内の１つまたは複数の位置で改変されていてよい。本開示のセンチリンは、少なくとも５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、少なくとも１０個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインまたは少なくとも１５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含み得る。足場は、抗原に、１０−９Ｍよりも小さいまたはそれと同等、１０−１０Ｍよりも小さいまたはそれと同等、１０−１１Ｍよりも小さいまたはそれと同等、１０−１２Ｍよりも小さいまたはそれと同等、１０−１３Ｍよりも小さいまたはそれと同等、１０−１４Ｍよりも小さいまたはそれと同等、および１０−１５Ｍよりも小さいまたはそれと同等のＫＤから選択される少なくとも１つの親和性で結合し得る。ＫＤは、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。
【０１５６】
本開示は、本開示のＣＡＲおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【０１５７】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むトランスポゾンを提供する。本開示のトランスポゾンは、エピソームとして維持されるまたは組換え／改変細胞のゲノム中に組み込まれる。トランスポゾンは、非ウイルス性遺伝子移入を増強するためにトランスポゾンおよびトランスポザーゼを利用する２成分ｐｉｇｇｙＢａｃ系の一部であり得る。
【０１５８】
本開示のトランスポゾンは、トランスポゾンを発現する細胞を同定、富化および／または単離するための選択遺伝子を含み得る。例示的な選択遺伝子は、細胞の生存能力および生存に必須の任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、選択遺伝子によりコードされる遺伝子産物の非存在下では細胞が感受性である（または細胞に対して致死的であり得る）薬物による攻撃に対する耐性を付与するために必須の任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、選択遺伝子の非存在下で細胞の生存能力および／または生存に必須の１つまたは複数の栄養分を欠く細胞培地中での生存能力および／または生存に必須の任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子としては、これだけに限定されないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、およびＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）が挙げられる。
【０１５９】
本開示のトランスポゾンは、例えば、本開示のタンパク質足場の１つまたは複数、センチリンまたはＣＡＲＴｙｒｉｎと本開示の選択遺伝子の間に位置する、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含み得る。少なくとも１つの自己切断性ペプチドは、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号２０）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１６０】
本開示のトランスポゾンは、第１の自己切断性ペプチドおよび第２の自己切断性ペプチドを含む場合があり、第１の自己切断性ペプチドは、例えば、本開示のタンパク質足場、センチリンまたはＣＡＲＴｙｒｉｎの１つまたは複数の上流に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、例えば、本開示のタンパク質足場、センチリンまたはＣＡＲＴｙｒｉｎの１つまたは複数の下流に位置する。第１のおよび／または第２の自己切断性ペプチドは、、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号２０）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１６１】
本開示は、本開示のトランスポゾンを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、組成物を導入する方法は、トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドを含む組成物をさらに含み得る。トランスポザーゼ酵素をコードする配列は、ｍＲＮＡ配列であり得る。
【０１６２】
本開示のトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含み得る。本開示のトランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼまたは適合する酵素を含み得る。
【０１６３】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ベクターは、組換えベクターであり得る。
【０１６４】
本開示のウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはそれらの任意の組合せから単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含み得る。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、本開示のタンパク質足場、センチリンまたはＣＡＲＴｙｒｉｎをコードする配列の隣にシスで位置する、２つまたはそれよりも多くの末端逆位配列（ＩＴＲ）配列を含む。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、全ての血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９）を含むが、これだけに限定されない。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）および１つの血清型のゲノムおよび別の血清型のカプシドを含有するＡＡＶハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＤＪ８）を含むが、これだけに限定されない。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスは、ｒＡＡＶ−ＬＫ０３を含むが、これだけに限定されない。
【０１６５】
本開示のウイルスベクターは、選択遺伝子を含み得る。選択遺伝子は、細胞の生存能力および生存に必須の遺伝子産物をコードし得る。選択遺伝子は、選択的な細胞培養条件による攻撃時に細胞の生存能力および生存に必須の遺伝子産物をコードし得る。選択的な細胞培養条件は、細胞の生存能力または生存に対して有害な化合物を含み得、遺伝子産物により当該化合物に対する耐性が付与される。本開示の例示的な選択遺伝子としては、これだけに限定されないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）またはそれらの任意の組合せを挙げることができる。
【０１６６】
本開示のウイルスベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで自己切断性ペプチドは、ＣＡＲと選択遺伝子との間に位置する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで第１の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。自己切断性ペプチドは、、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号２０）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１６７】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ｍＲＮＡベクターである。ベクターは、組換えｍＲＮＡベクターであり得る。本開示のＴ細胞は、Ｔ細胞と本開示のＣＡＲを含むｍＲＮＡベクターを接触させる前に増大させることができる。次いで、ｍＲＮＡベクターを含むＴ細胞、改変Ｔ細胞を対象に投与することができる。
【０１６８】
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子である。本開示の例示的なナノ粒子ベクターとしては、これだけに限定されないが、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはそれらの任意の組合せ）、アミノ酸（Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、合成アミノ酸、修飾アミノ酸、またはそれらの任意の組合せ）、ポリマー（例えば、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ））、ミセル、脂質（例えば、リポソーム）、有機分子（例えば、炭素原子、シート、線維、チューブ）、無機分子（例えば、リン酸カルシウムまたは金）またはそれらの任意の組合せが挙げられる。ナノ粒子ベクターは、細胞膜をわたって受動的にまたは能動的に輸送することができる。
【０１６９】
本開示のナノ粒子ベクターは、選択遺伝子を含み得る。選択遺伝子は、細胞の生存能力および生存に必須の遺伝子産物をコードし得る。選択遺伝子は、選択的な細胞培養条件による攻撃時に細胞の生存能力および生存に必須の遺伝子産物をコードし得る。選択的な細胞培養条件は、細胞の生存能力または生存に対して有害な化合物を含み得、遺伝子産物により当該化合物に対する耐性が付与される。本開示の例示的な選択遺伝子としては、これだけに限定されないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）またはそれらの任意の組合せを挙げることができる。
【０１７０】
本開示のナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで自己切断性ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子との間に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで第１の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで第１の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子との間に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの下流に位置する。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断性ペプチドを含んでもよく、ここで第１の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲとナノ粒子との間に位置し、第２の自己切断性ペプチドは、ＣＡＲの下流、例えば、ＣＡＲおよび選択遺伝子の間に位置する。自己切断性ペプチドは、、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列、またはＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチドは、ｇｇａｔｃｔｇｇａｇａｇｇｇａａｇｇｇｇａａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｃｃｃａｇｇａｃｃａ（配列番号２０）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列、またはＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチドは、ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２２）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列、またはＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２３）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチドは、ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列、またはＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２５）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列、またはＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２６）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１７１】
本開示は、本開示のベクターを含む組成物を提供する。
足場タンパク質
【０１７２】
センチリンは、本開示のタンパク質足場の１つの例である。本開示のＣＡＲの抗原認識領域は、少なくとも１つのタンパク質足場を含み得る。
【０１７３】
本開示のタンパク質足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質、コードするまたは相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、組合せ、製剤、デバイス、およびそれらを作出し、使用する方法から引き出すことができる。好ましい実施形態では、タンパク質足場は、ヒトテネイシン−Ｃ（以下「テネイシン」）由来の多数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列で構成される。さらに好ましい実施形態では、本発明のタンパク質足場は、１５種のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列である。本開示のタンパク質足場は、種々の分子、例えば、細胞標的タンパク質に結合するように設計することができる。好ましい実施形態では、本開示のタンパク質足場を、抗原の野生型および／またはバリアント形態のエピトープに結合するように設計することができる。
【０１７４】
本開示のタンパク質足場は、追加的な分子または部分、例えば、抗体のＦｃ領域、アルブミン結合性ドメイン、または半減期に影響を及ぼす他の部分を含み得る。さらなる実施形態では、本開示のタンパク質足場を、タンパク質足場をコードし得る核酸分子に結合させることができる。
【０１７５】
本開示は、多数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づく少なくとも１つのタンパク質足場を宿主細胞において発現させるための少なくとも１つの方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を、少なくとも１つのタンパク質足場が検出可能なおよび／または回収可能な量で発現する条件下で培養するステップを含む方法を提供する。
【０１７６】
本開示は、（ａ）本明細書に記載の多数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づくタンパク質足場および／またはコードする核酸；ならびに（ｂ）適切かつ／または薬学的に許容される担体または希釈剤を含む少なくとも１つの組成物を提供する。
【０１７７】
本開示は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質、好ましくは多数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列、より好ましくはヒトテネイシン由来の多数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づくタンパク質足場のライブラリーを生成する方法を提供する。ライブラリーは、足場の一部の特定の部分、例えば、ループ領域内の分子内のアミノ酸またはアミノ酸の数を変更すること（突然変異により）によって足場の連続的な世代を作出することによって形成される。ライブラリーは、単一のループのアミノ酸組成を変更することまたは多数のループもしくは足場分子の追加的な部分を同時に変更することによって生成することができる。変更されるループは、適宜延長または短縮することができる。そのようなライブラリーは、各位置において可能性がある全てのアミノ酸が含まれるように生成することもでき、アミノ酸のサブセットを設計することもできる。ライブラリーメンバーを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはＣＩＳディスプレイ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソームディスプレイなど）、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、およびファージディスプレイなどのディスプレイによるスクリーニングのために使用することができる。
【０１７８】
本開示のタンパク質足場は、生物物理学的性質の増強、例えば、還元条件下での安定性および高濃度での溶解性などをもたらすものであり、これらを、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物系において、酵母などの真核生物系において、およびウサギ網状赤血球溶解物系などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において発現およびフォールディングさせることができる。
【０１７９】
本開示は、これだけに限定することなく、哺乳動物由来の足場を含めた、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質のコンセンサス配列に基づく単離された組換えおよび／または合成タンパク質足場、ならびに、コンセンサスＦＮ３配列に基づくタンパク質足場をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物およびコードする核酸分子を提供する。本開示は、これだけに限定されないが、診断用および治療用組成物、方法およびデバイスを含めた、そのような核酸およびタンパク質足場を作出し、使用する方法をさらに含む。
【０１８０】
本開示のタンパク質足場により、従来の治療薬を超える利点、例えば、局所的に、経口的に、または血液脳関門を渡って投与できること、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、それにより、哺乳動物細胞の発現能力に対して、リソースに応じたタンパク質の発現を増大できること、工学的に操作して多数の標的または同じ標的の多数のエピトープに結合する二重特異性またはタンデム分子にできること、薬物、ポリマー、およびプローブとコンジュゲートできること、高濃度で製剤化できること、ならびに、そのような分子が患部組織および腫瘍に有効に透過できることなどがもたらされる。
【０１８１】
さらに、タンパク質足場は、抗体の可変領域を模倣するそれらのフォールディングとの関連で、抗体の性質の多くを有する。この配向性により、ＦＮ３ループが抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）と同様に露出することが可能になる。タンパク質足場は、細胞標的に結合することができるべきであり、ある特定の結合または関連する性質を改善するために、ループを変更すること、例えば、親和性成熟させることができる。
【０１８２】
本開示のタンパク質足場の６つのループのうち３つは抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）、すなわち抗原結合性領域に位相幾何学的に対応するが、残りの３つのループは、抗体ＣＤＲと同様の様式で表面に露出している。これらのループは、配列番号１の残基１３〜１６または残基１３〜１６付近、残基２２〜２８または残基２２〜２８付近、残基３８〜４３または残基３８〜４３付近、残基５１〜５４または残基５１〜５４付近、残基６０〜６４または残基６０〜６４付近、および残基７５〜８１または残基７５〜８１付近に及ぶ。残基２２〜２８または残基２２〜２８付近、残基５１〜５４または残基５１〜５４付近、および残基７５〜８１または残基７５〜８１付近のループ領域を結合特異性および親和性に関して変更することが好ましい。これらのループ領域の１つまたは複数を、それらの配列を骨格部分として維持する他のループ領域および／または他の鎖とランダム化してライブラリーに追加し、特定のタンパク質標的に対する高親和性を有する強力な結合物質をライブラリーから選択することができる。ループ領域の１つまたは複数は、抗体ＣＤＲのタンパク質との相互作用と同様に標的タンパク質と相互作用し得る。
【０１８３】
本開示の足場は、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含み得る。本開示の単鎖抗体は、抗体の３つの軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲを含み得る。ある特定の実施形態では、本開示の単鎖抗体は、抗体の３つの軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲを含み、単鎖抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト配列である。本開示は、（ａ）抗原認識領域を含む外部ドメインであって、抗原認識領域が、少なくとも１つの単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含む、外部ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、二重特異性またはタンデムＣＡＲが生じるように、２つの単鎖抗体（例えば、２つのｓｃＦｖ）を含み得る。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、三重特異性ＣＡＲが生じるように、３つの単鎖抗体（例えば、３つのｓｃＦｖ）を含み得る。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドをさらに含み得る。その代わりに、またはそれに加えて、ある特定の実施形態では、外部ドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含み得る。
【０１８４】
本開示の足場は、抗体の１つまたは複数の断片を含む配列（例えば、ＶＨＨ）を含み得る。本開示の抗体の１つまたは複数の断片を含む配列は、抗体の２つの重鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、配列は、抗体の２つの重鎖可変領域を含み、ＶＨＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト配列である。本開示の足場は、抗体の１つまたは複数の断片を含む配列（例えば、ＶＨＨ）を含み得る。本開示は、（ａ）抗原認識領域を含む外部ドメインであって、抗原認識領域が、抗体の１つまたは複数の断片を含む少なくとも１つの配列（例えば、ＶＨＨ）を含む、外部ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、二重特異性またはタンデムＣＡＲが生じるように、抗体の１つまたは複数の断片を含む２つの配列（例えば、２つのＶＨＨ）を含み得る。ある特定の実施形態では、抗原認識領域は、三重特異性ＣＡＲが生じるように、抗体の１つまたは複数の断片を含む３つの配列（例えば、３つのＶＨＨ）を含み得る。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドをさらに含み得る。その代わりに、またはそれに加えて、ある特定の実施形態では、外部ドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含み得る。
【０１８５】
本開示の足場は、抗体模倣物を含み得る。
【０１８６】
この非共有結合的連結は、例えば、抗体模倣物を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「抗体模倣物」は、標的配列を特異的に結合し、天然に存在する抗体とは別個の構造を有する有機化合物を記載するよう意図される。抗体模倣物は、タンパク質、核酸または小分子を含み得る。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は、抗原であり得る。抗体模倣物は、優れた溶解度、組織透過、熱および酵素に対する安定性（例えば、酵素的分解に対する耐性）ならびにより低い産生コストが含まれるが、これらに限定されない、抗体を超える優れた特性を提供し得る。例示的な抗体模倣物には、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、およびアビマー（アビディティマルチマー（ａｖｉｄｉｔｙ  ｍｕｌｔｉｍｅｒ）としても公知）、ＤＡＲＰｉｎ（デザインされたアンキリンリピートタンパク質）、フィノマー、クニッツドメインペプチド、ならびにモノボディが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
本開示のアフィボディ分子は、いかなるジスルフィド架橋も伴わない、１つまたは複数のアルファヘリックスを含むまたはそれらからなるタンパク質足場を含む。好ましくは、本開示のアフィボディ分子は、３つのアルファヘリックスを含むまたはそれらからなる。例えば、本開示のアフィボディ分子は、免疫グロブリン結合ドメインを含み得る。本開示のアフィボディ分子は、プロテインＡのＺドメインを含み得る。
【０１８８】
本開示のアフィリン分子は、例えば、ガンマ−Ｂクリスタリンまたはユビキチンのいずれかの曝露されたアミノ酸の改変によって産生されたタンパク質足場を含む。アフィリン分子は、抗原に対する抗体の親和性を機能的に模倣するが、抗体を構造的には模倣しない。アフィリンを作製するために使用される任意のタンパク質足場では、適切に折り畳まれたタンパク質分子中の、溶媒または可能な結合パートナーにアクセス可能なアミノ酸が、曝露されたアミノ酸とみなされる。これらの曝露されたアミノ酸のうちの任意の１つまたは複数は、標的配列または抗原に特異的に結合するように改変され得る。
【０１８９】
本開示のアフィマー分子は、特異的標的配列に対する高親和性結合部位を提供するペプチドループをディスプレイするように操作された高度に安定なタンパク質を含むタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、シスタチンタンパク質またはその三次構造に基づくタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、アンチパラレルベータ−シートの上部に存在するアルファ−ヘリックスを含む共通の三次構造を共有し得る。
【０１９０】
本開示のアフィチン分子は、人工タンパク質足場を含み、その構造は、例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来し得る。本開示のアフィチンは、抗原の全体または部分であり得る標的配列を選択的に結合する。本開示の例示的なアフィチンは、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合表面上の１つまたは複数アミノ酸配列をランダム化し、得られたタンパク質をリボソームディスプレイおよび選択に供することによって、製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、例えば、ゲノム中、またはペプチド、タンパク質、ウイルスもしくは細菌の表面上で見出され得る。本開示のある特定の実施形態では、アフィチン分子は、酵素の特異的阻害剤として使用され得る。本開示のアフィチン分子は、耐熱性タンパク質またはその誘導体を含み得る。
【０１９１】
本開示のアルファボディ分子は、細胞透過性アルファボディ（ＣＰＡＢ）とも呼ばれ得る。本開示のアルファボディ分子は、種々の標的配列（抗原を含む）に結合する小さいタンパク質（典型的には、１０ｋＤａ未満のもの）を含む。アルファボディ分子は、細胞内標的配列に到達および結合することが可能である。構造的に、本開示のアルファボディ分子は、単鎖アルファヘリックス（天然に存在するコイルドコイル構造と類似）を形成する人工配列を含む。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するように改変された１つまたは複数のアミノ酸を含むタンパク質足場を含み得る。分子の結合特異性に関わらず、本開示のアルファボディ分子は、正確なフォールディングおよび熱的安定性を維持する。
【０１９２】
本開示のアンチカリン分子は、タンパク質または小分子のいずれか中の標的配列または部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリン由来の人工タンパク質を含み得る。本開示のアンチカリン分子は、例えば、モノクローナル抗体またはその断片の代わりに使用され得る。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体またはその断片よりも優れた組織透過および熱的安定性を実証し得る。本開示の例示的なアンチカリン分子は、およそ２０ｋＤａの質量を有する、約１８０アミノ酸を含み得る。構造的に、本開示のアンチカリン分子は、ループおよび結合されたアルファヘリックスによって対で接続されたアンチパラレルベータ−鎖を含むバレル構造を含む。好ましい実施形態では、本開示のアンチカリン分子は、ループおよび結合されたアルファヘリックスによって対で接続された８つのアンチパラレルベータ−鎖を含むバレル構造を含む。
【０１９３】
本開示のアビマー分子は、標的配列（これは抗原であってもよい）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同じ標的内または別個の標的内の複数の結合部位を認識し得る。本開示のアビマーが１つよりも多い標的を認識する場合、このアビマーは、二重特異性抗体の機能を模倣する。人工タンパク質アビマーは、各々およそ３０〜３５アミノ酸の２つまたはそれ超のペプチド配列を含み得る。これらのペプチドは、１つまたは複数のリンカーペプチドを介して接続され得る。アビマーのペプチドのうちの１つまたは複数のアミノ酸配列は、膜受容体のＡドメイン由来であり得る。アビマーは、ジスルフィド結合および／またはカルシウムを任意選択で含み得る強固な構造を有する。本開示のアビマーは、抗体と比較して、より高い熱安定性を実証し得る。
【０１９４】
本開示のＤＡＲＰｉｎ（デザインされたアンキリンリピートタンパク質）は、標的配列に対する高い特異性および高い親和性を有する、遺伝子操作された、組換えの、またはキメラのタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＤＡＲＰｉｎは、アンキリンタンパク質由来であり、任意選択で、アンキリンタンパク質の少なくとも３つのリピートモチーフ（反復構造単位とも呼ばれる）を含む。アンキリンタンパク質は、高親和性のタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは、大きい標的相互作用表面を含む。
【０１９５】
本開示のフィノマーは、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する、抗体と等しい親和性および等しい特異性で標的配列および分子に結合するように操作された、小さい結合性タンパク質（約７ｋＤａ）を含む。
【０１９６】
本開示のクニッツドメインペプチドは、クニッツドメインを含むタンパク質足場を含む。クニッツドメインは、プロテアーゼ活性を阻害するための活性部位を含む。構造的に、本開示のクニッツドメインは、ジスルフィド−リッチなアルファ＋ベータフォールディング構造（ｆｏｌｄ）を含む。この構造は、ウシ膵トリプシン阻害剤によって例証される。クニッツドメインペプチドは、特異的タンパク質構造を認識し、競合的プロテアーゼ阻害剤として機能する。本開示のクニッツドメインは、エカランチド（ヒトリポタンパク質関連凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）由来）を含み得る。
【０１９７】
本開示のモノボディは、単鎖抗体と匹敵するサイズの小さいタンパク質（約９４アミノ酸を含み、約１０ｋＤａの質量を有する）である。これらの遺伝子操作されたタンパク質は、抗原を含む標的配列を特異的に結合する。本開示のモノボディは、１つまたは複数の別個のタンパク質または標的配列を特異的に標的化し得る。好ましい実施形態では、本開示のモノボディは、ヒトフィブロネクチンの構造を模倣する、より好ましくは、フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造を模倣する、タンパク質足場を含む。フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメイン、ならびにそのモノボディ模倣物は、バレルを形成する７つのベータシートおよび抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する各側の３つの曝露されたループを含有する。抗体の可変ドメインの構造とは対照的に、モノボディは、金属イオンのためのあらゆる結合部位、ならびに中心のジスルフィド結合を欠く。多特異性モノボディは、ループＢＣおよびＦＧを改変することによって最適化され得る。本開示のモノボディは、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）を含み得る。
足場タンパク質の産生および生成
【０１９８】
本開示の少なくとも１つの足場タンパク質は、任意選択で、当技術分野で周知の細胞株、混合細胞株、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団により産生させることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８７−２００１）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）；  Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ  （１９９４−２００１）；  Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９９７−２００１）を参照のこと。
【０１９９】
足場タンパク質由来のアミノ酸を変更する、付加する、および／または欠失させて、免疫原性を低下させる、または、結合性、親和性、会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、結合活性、特異性、半減期、安定性、溶解性もしくは当技術分野で公知の任意の他の適切な特性を低下、増強もしくは改変することができる。
【０２００】
任意選択で、抗原に対する高親和性および他の好都合な生物学的性質を保持する足場タンパク質を工学的に操作することができる。この目標を実現するために、任意選択で、足場タンパク質を、親配列ならびに親配列および工学的に操作された配列の３次元モデルを使用して種々の概念的な工学的に操作された産物の解析のプロセスによって調製することができる。３次元モデルは、一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補配列の推定３次元コンフォメーション構造を例示し、表示し、また、可能性がある免疫原性を測定することができるコンピュータプログラムが入手可能である（例えば、Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｒｏｖｉａ、Ｃａｌｉｆ．のＩｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ）。これらの表示を検査することにより、候補配列の機能性における残基の可能性がある役割の解析、すなわち、候補足場タンパク質のその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析が可能になる。このように、所望の特性、例えば、標的抗原（単数または複数）に対する親和性などが実現されるように、親配列および参照配列から残基を選択し、組み合わせることできる。上記の手順の代わりに、またはそれに加えて、他の適切な工学的操作方法を使用することができる。
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系
【０２０１】
本開示の方法では、本開示の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を導入するために使用される方法にかかわらず、本開示の改変ＴＳＣＭがもたらされる。本開示の方法では、有効性がより大きな本開示の改変ＴＳＣＭ、および／または、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系を使用して本開示の抗原受容体または治療用タンパク質を初代ヒトＴ細胞に導入した際の本開示の改変ＴＳＣＭのより大きな存在量、割合、収率がもたらされる。本開示のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系は、本開示の抗原受容体を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含み得る。初代ヒトＴ細胞は、本開示の抗原受容体を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンおよび本開示のトランスポザーゼが細胞に導入される前に、トランスポゾンおよびトランスポザーゼと同時に（または時間的に非常に近く、例えば、初代ヒトＴ細胞、トランスポゾンおよびトランスポザーゼが同じ容器（例えば、キュベットなど）内に含有される）と接触するが、これらは細胞の非存在下では相互作用できないことが好ましい。初代ヒトＴ細胞は、本開示の抗原受容体を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンおよび本開示のＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼが細胞に導入される前に、トランスポゾンおよびトランスポザーゼと同時に接触することが好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼは、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ配列である。
【０２０２】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンおよびＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼに関する追加的な開示は、その内容全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０９９２９６、米国特許第８，３９９，６４３号、米国特許第９，５４６，３８２号、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，５５１，８２５号、米国特許第６，９６２，８１０号、および米国特許第７，１０５，３４３号において見ることができる。
【０２０３】
本開示は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入する方法を提供する。好ましくは、導入するステップは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系によって媒介される。
【０２０４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、２つのシス調節性インスレーターエレメントに隣接する抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。ある特定の実施形態、特に、トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである実施形態では、トランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。
【０２０５】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、
【化９】
2019528760.tif 000017
に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率同一なアミノ酸配列を含んでもよいし、からなってもよい。
【０２０６】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列
【化１０】
2019528760.tif 000018
の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位の１つまたは複数にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の配列の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの２またはそれより多くにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の配列の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの３またはそれより多くにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の配列の以下の３０位、１６５位、２８２位、および５３８位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むかまたはからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、配列番号４の配列の３０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の配列の１６５位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の配列の２８２位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４の配列の５３８位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）による置換である。
【０２０８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼ酵素は、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態では、本開示のＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の配列のアミノ酸配列を含んでもよいし、からなってもよく、３０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）による置換であり、１６５位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）による置換であり、２８２位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換であり、５３８位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のアスパラギン（Ｎ）による置換である。ある特定の実施形態では、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、
【化１１】
2019528760.tif 000019
に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率同一なアミノ酸配列を含んでもよいし、からなってもよい。
【０２０９】
トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位および５９１位の１つまたは複数におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、４６位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８５位、５０３位、５５２位および５７０位の１つまたは複数におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４６位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアラニン（Ａ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４６位のアミノ酸置換は、トレオニン（Ｔ）のアラニン（Ａ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の８２位のアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のイソロイシン（Ｉ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１０３位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１１９位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のアルギニン（Ｒ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１２５位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のシステイン（Ｃ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１２５位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のシステイン（Ｃ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１７７位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のチロシン（Ｙ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１７７位のアミノ酸置換は、ヒスチジン（Ｈ）のチロシン（Ｙ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８０位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８０位のアミノ酸置換は、イソロイ��ン（Ｉ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８５位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１８７位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２００位のアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２０７位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２０９位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２２６位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２３５位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２４０位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２４１位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２４３位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のプロリン（Ｐ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２５８位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９６位のアミノ酸置換は、トリプトファン（Ｗ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９６位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９６位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９８位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９８位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の２９８位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３１１位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のプロリン（Ｐ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３１１位のアミノ酸置換は、バリンのプロリン（Ｐ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３１５位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のアルギニン��Ｒ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３１９位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のトレオニン（Ｔ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３２７位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のチロシン（Ｙ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３２８位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のチロシン（Ｙ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３４０位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のシステイン（Ｃ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３４０位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のシステイン（Ｃ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４２１位のアミノ酸置換は、ヒスチジン（Ｈ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４３６位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４５６位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４７０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４８５位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５０３位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５０３位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５５２位のアミノ酸置換は、リシン（Ｋ）のバリン（Ｖ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５７０位のアミノ酸置換は、トレオニン（Ｔ）のアラニン（Ａ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５９１位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５９１位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）による置換である。
【０２１０】
トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９および５７０の１つまたは複数におけるアミノ酸置換を含んでもよいし、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素はこれをさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、本開示の方法のある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位および５７０位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多くにおけるアミノ酸置換を含んでもよいし、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素はこれをさらに含んでもよい。トランスポザーゼが３０位、１６５位、２８２位および／または５３８位の上記変異を含む実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位および５７０位のアミノ酸置換を含んでもよく、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素はこれをさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１０３位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の１９４位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３７２位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のアルギニン（Ｒ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の３７５位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のリシン（Ｋ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の４５０位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５０９位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）による置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４または配列番号５の５７０位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）による置換である。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の１９４位におけるバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換を含み得る。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素が配列番号４の１９４位におけるバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換を含み得る実施形態を含め、ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４または配列番号５の配列の３７２位、３７５位および４５０位におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の１９４位におけるバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換、配列番号４の３７２位におけるアラニン（Ａ）のアルギニン（Ｒ）による置換および配列番号４の３７５位におけるアラニン（Ａ）のリシン（Ｋ）による置換を含み得る。ある特定の実施形態では、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号４の１９４位におけるバリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）による置換、配列番号４の３７２位におけるアラニン（Ａ）のアルギニン（Ｒ）による置換、配列番号４の３７５位におけるアラニン（Ａ）のリシン（Ｋ）による置換および配列番号４の４５０位におけるアスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換を含み得る。
【０２１１】
「導入すること」とは、植物にポリヌクレオチド構築物を当該構築物が宿主細胞の内部に進入する様式でもたらすことを意図している。本発明の方法は、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入することに関して、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部に進入しさえすれば、特定の方法に依存しない。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、真菌および動物に導入するための方法は、これだけに限定されないが、安定な形質転換方法、一過性の形質転換方法、およびウイルス媒介性の方法を含め、当技術分野で公知である。
【０２１２】
本開示全体を通して使用される「内因性」という用語は、標的遺伝子またはそれが導入される宿主細胞と天然に関連する核酸またはタンパク質配列を指す。
【０２１３】
「安定な形質転換」とは、植物に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノムに組み込まれ、その後代に遺伝することが可能であることを意図している。
【０２１４】
「一過性の形質転換」とは、宿主に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノムには組み込まれないことを意図している。
【０２１５】
好ましい実施形態では、外因性配列を初代ヒトＴ細胞に安定な形質転換によって導入して改変ＴＳＣＭまたはＴＣＭを生成するために、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系を使用する。
追加的なトランスポゾン系
【０２１６】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。
【０２１７】
本開示は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）または改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体または治療用タンパク質を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、改変Ｔ細胞は、改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）または改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現し、それによって改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）または改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。本開示は、複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）または複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を作製する方法を提供し、この方法は、複数の改変Ｔ細胞を作製するために、（ａ）抗原受容体を含むトランスポゾンを含むトランスポゾン組成物、および（ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする配列を含むトランスポザーゼ組成物を複数の初代ヒトＴ細胞に導入するステップを含み、ここで、複数の改変Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率は幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）またはセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の細胞表面マーカーの１つまたは複数を発現し、それによって複数の改変幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）または複数の改変セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が作製される。
【０２１８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。
【０２１９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ酵素は、
【化１２】
2019528760.tif 000020
に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率同一なアミノ酸配列を含む。
【０２２０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、過剰活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポザーゼ酵素は、
【化１３】
2019528760.tif 000021
に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれらの間の任意の百分率同一なアミノ酸配列を含む。
【０２２１】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼにより、約３０００〜３６００万年前に活性であったコウモリゲノム由来の古来のエレメントであるＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンが移動する。本開示の例示的なＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンとしては、
【化１４−１】
2019528760.tif 000022
【化１４−２】
2019528760.tif 000023
【化１４−３】
2019528760.tif 000024
を含む核酸配列を含むＨｅｌｉｂａｔ１が挙げられる。
【０２２２】
他のトランスポザーゼとは異なり、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、ＲＮａｓｅ−Ｈ様触媒ドメインを含有しないが、その代わりに、複製開始ドメイン（Ｒｅｐ）およびＤＮＡヘリカーゼドメインで構成されるＲｅｐＨｅｌモチーフを含む。Ｒｅｐドメインは、ヌクレアーゼのＨＵＨスーパーファミリーのヌクレアーゼドメインである。
【０２２３】
本開示の例示的なＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、
【化１５】
2019528760.tif 000025
を含むアミノ酸配列を含む。
【０２２４】
Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移では、トランスポゾンの３’末端の近くのヘアピンがターミネーターとして機能する。しかし、このヘアピンは、トランスポザーゼによって迂回され、それによって、隣接する配列の形質導入がもたらされ得る。さらに、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移により、共有結合により閉じた環状中間体が生じる。さらに、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移は、標的部位重複を欠き得る。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ配列では、トランスポザーゼは、ＬＴＳおよびＲＴＳと称される左末端配列および右末端配列に挟まれている。これらの配列は、保存された５’−ＴＣ／ＣＴＡＧ−３’モチーフで終結する。ヘアピン終結構造が形成される潜在性がある１９ｂｐのパリンドローム配列はＲＴＳの１１ヌクレオチド上流に位置し、配列ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧＴＧＣＡＣＣＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧ（配列番号２９）からなる。
【０２２５】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼである。Ｔｏｌ２トランスポゾンは、メダカのゲノムから単離するまたは引き出すことができ、ｈＡＴファミリーのトランスポゾンと類似したものであり得る。本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポゾンは、約４．７キロベースを含む配列によりコードされ、４つのエクソンを含有する、Ｔｏｌ２トランスポザーゼをコードする遺伝子を含有する。本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポザーゼは、以下：
【化１６】
2019528760.tif 000026
を含むアミノ酸配列を含む。
【０２２６】
逆方向反復、末端近くの配列およびＴｏｌ２トランスポザーゼを含む本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポゾンは、以下：
【化１７−１】
2019528760.tif 000027
【化１７−２】
2019528760.tif 000028
【化１７−３】
2019528760.tif 000029
を含む核酸配列によりコードされる。
相同組換え
【０２２７】
本開示の方法のある特定の実施形態では、本開示の改変ＣＡＲ−ＴＳＣＭまたはＣＡＲ−ＴＣＭを、抗原受容体を本開示の初代ヒトＴ細胞に相同組換えによって導入することによって作製する。本開示のある特定の実施形態では、相同組換えを、本開示のゲノム編集組成物または構築物によって誘導される一本鎖切断または二本鎖切断によって誘導する。本開示の相同組換え方法は、配列内の少なくとも１つの切断を誘導するため、およびゲノム配列内に外因性ドナー配列組成物の進入点をもたらすために、本開示のゲノム編集組成物または構築物をゲノム配列に接触させることを含む。本開示のドナー配列組成物は、誘導された進入点において細胞のネイティブなＤＮＡ修復機構によってゲノム配列に組み込まれる。
【０２２８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、相同組換えにより、本開示の抗原受容体をコードする配列および／またはドナー配列組成物が「ゲノムセーフハーバー」部位に導入される。ある特定の実施形態では、哺乳動物ゲノム配列は、ゲノムセーフハーバー部位を含む。ある特定の実施形態では、霊長類ゲノム配列は、ゲノムセーフハーバー部位を含む。ある特定の実施形態では、ヒトゲノム配列は、ゲノムセーフハーバー部位を含む。
【０２２９】
ゲノムセーフハーバー部位により、新しい遺伝子材料の組み込みを、新しく挿入された遺伝子エレメントが確実に機能し（例えば、治療的に有効な発現のレベルで発現し）、かつ、宿主生物体に対するリスクを引き起こすような宿主ゲノムに対する有害な変更が引き起こされないことを確実にする様式で適応させることができる。潜在的なゲノムセーフハーバーとしては、これだけに限定されないが、ヒトアルブミン遺伝子、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、１９番染色体上に天然に存在するＡＡＶウイルス組み込み部位、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子の部位およびマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログの部位のイントロン配列が挙げられる。
【０２３０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、相同組換えにより、本開示の抗原受容体をコードする配列および／またはドナー配列組成物を内因性Ｔ細胞受容体または主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の１つまたは複数の構成成分をコードする配列に導入する。ある特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体またはＭＨＣをコードするゲノム配列内で相同組換えを誘導することにより、内因性遺伝子を妨害し、任意選択で、内因性遺伝子のコード配列の一部を本開示のドナー配列組成物で置き換える。ある特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体またはＭＨＣをコードするゲノム配列内で相同組換えを誘導することにより、内因性遺伝子を妨害し、任意選択で、内因性遺伝子のコード配列全体を本開示のドナー配列組成物で置き換える。本開示の方法のある特定の実施形態では、本開示の抗原受容体またはドナー配列組成物をコードする配列の相同組換えによる導入により、抗原受容体が内因性Ｔ細胞プロモーターに作動可能に連結される。本開示の方法のある特定の実施形態では、本開示の抗原受容体またはドナー配列組成物をコードする配列の相同組換えによる導入により、抗原受容体または治療用タンパク質が転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。本開示の方法のある特定の実施形態では、本開示の抗原受容体またはドナー配列組成物をコードする配列の相同組換えによる導入により、抗原受容体または治療用タンパク質が転写調節エレメントに作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、転写調節エレメントは、内因性Ｔ細胞５’ＵＴＲを含む。
【０２３１】
相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物を複数のＴ細胞の少なくとも１つの初代Ｔ細胞のゲノム配列と接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物を複数のＴ細胞の初代Ｔ細胞の一部のゲノム配列と接触させる。ある特定の実施形態では、初代Ｔ細胞の一部は、複数のＴ細胞内の初代Ｔ細胞の総数の少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれらの間の任意の百分率である。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物を複数のＴ細胞の各初代Ｔ細胞のゲノム配列と接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物により一本鎖切断が誘導される。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物により二本鎖切断が誘導される。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、導入ステップは、ドナー配列組成物をさらに含む。ある特定の実施形態では、ドナー配列組成物は、抗原受容体をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、ドナー配列組成物は、抗原受容体をコードする配列、５’ゲノム配列および３’ゲノム配列を含み、ここで、５’ゲノム配列は、ゲノム編集組成物によって誘導される切断点に対して５’側にある、初代Ｔ細胞のゲノム配列と相同または同一であり、３’ゲノム配列は、ゲノム編集組成物によって誘導される切断点に対して３’側にある、初代Ｔ細胞のゲノム配列と相同または同一である。ある特定の実施形態では、５’ゲノム配列および／または３’ゲノム配列は、少なくとも５０ｂｐ、１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００、または少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐの長さまたは終点を含めたその間の任意の長さの塩基対（ｂｐ）を含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物およびドナー配列組成物をゲノム配列と同時にまたは逐次的に接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物およびドナー配列組成物をゲノム配列と逐次的に接触させ、ゲノム編集組成物を最初にもたらす。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物は、ＤＮＡ結合性ドメインをコードする配列およびヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物は、ＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはその配列を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、不活性Ｃａｓ９（配列番号３３、１０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換（Ｄ１０Ａ）および８４０位におけるアラニン（Ａ）のヒスチジン（Ｈ）による置換（Ｈ８４０Ａ）を含む）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、短い不活性Ｃａｓ９（配列番号３２、１０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン酸（Ｄ）による置換（Ｄ１０Ａ）および５４０位におけるアラニン（Ａ）のアスパラギン（Ｎ）による置換（Ｎ５４０Ａ）を含む）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むかまたはこれをさらに含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１を含む。ある特定の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＴＡＬＥＮまたはそのヌクレアーゼドメインを含むかまたはこれをさらに含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮまたはそのヌクレアーゼドメインを含むかまたはこれをさらに含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物によりゲノム配列内の切断を誘導し、初代Ｔ細胞の内因性ＤＮＡ修復機構を使用してドナー配列組成物を挿入する。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態では、ドナー配列組成物の挿入によりゲノム編集組成物のＤＮＡ結合性部位が排除され、それにより、ゲノム編集組成物のさらなる活性が妨げられる。
【０２３２】
本開示の相同組換えの方法のある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物または構築物のヌクレアーゼドメインは、初代ヒトＴ細胞のゲノム配列内の定義された場所に切断を導入することができるものであり、さらに、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであり得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むエフェクター分子を含めたエフェクター分子は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインまたはその断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであり得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、触媒として不活性であるまたは「不活化」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、触媒として不活性であるまたはＣａｓ９の「不活化」ヌクレアーゼドメインである。ある特定の実施形態では、ｄＣａｓ９は、本明細書では「低分子」ｄＣａｓ９またはｄＳａＣａｓ９と称される、全長の触媒として不活化したＣａｓ９に由来するより短い配列によりコードされる。
【０２３３】
ある特定の実施形態では、不活化した低分子Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）は、活性ヌクレアーゼと作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび分子ヌクレアーゼを含む、それから本質的になる、またはそれからなる融合タンパク質であって、ヌクレアーゼが、低分子不活化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む、融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本開示のｄＳａＣａｓ９は、触媒部位を不活化する突然変異Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ（下線が引かれており、太字になっている）を含む。ある特定の実施形態では、本開示のｄＳａＣａｓ９は、
【化１８】
2019528760.tif 000030
のアミノ酸配列を含む。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、本開示のｄＣａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されたまたは引き出されたｄＣａｓ９を含む。ある特定の実施形態では、ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活化する、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列の１０位および８４０位の置換を有するｄＣａｓ９を含む。ある特定の実施形態では、これらの置換は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａである。ある特定の実施形態では、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列は、
【化１９】
2019528760.tif 000031
の配列を含む。
【０２３５】
本開示のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ｄＣａｓ９またはｄＳａＣａｓ９およびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。本開示のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１が挙げられるが、これらに限定されないｄＳａＣａｓ９およびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。本開示のある特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ｄＳａＣａｓ９およびＣｌｏ０５１を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。例示的なＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、
【化２０】
2019528760.tif 000032
のアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。
【０２３６】
例示的なｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、
【化２１−１】
2019528760.tif 000033
【化２１−２】
2019528760.tif 000034
のアミノ酸配列（Ｃｌｏ０５１配列に下線が引かれており、リンカーは太字のイタリック体になっており、ｄＣａｓ９配列はイタリック体になっている）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであり得る。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、初代ヒトＴ細胞のゲノムＤＮＡ内の定義された場所に切断を導入することができるヌクレアーゼは、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであり得る。本開示のゲノム編集組成物または構築物のヌクレアーゼドメインは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から単鎖された、引き出された、または組み換えられたヌクレアーゼドメインを含む、それから本質的になる、またはそれからなるものであり得る。ＴＡＬＥＮは、所定のＤＮＡ配列または個々の核酸に結合するデザイナータンパク質を創出する手段をもたらすプログラム可能なＤＮＡ結合性ドメインを有する転写因子である。転写活性化因子様（ＴＡＬ）タンパク質、または、より詳細には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）においてモジュラーＤＮＡ結合性ドメインが同定されており、それにより、目的のＤＮＡ配列に結合する合成転写因子の新規創出が可能になり、望ましい場合には、タンパク質またはポリペプチド上に存在する第２のドメインがＤＮＡに関連する活性を示すことも可能になる。ＴＡＬタンパク質は、生物ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓおよびＲａｌｓｔｏｎｉａから引き出されている。
【０２３８】
本開示のある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物または構築物のヌクレアーゼドメインは、ＴＡＬＥＮおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼから単離された、それに由来するまたはそこから組換えられたヌクレアーゼドメインを含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。本開示のある特定の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。本開示のある特定の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１（配列番号３４）を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。
【０２３９】
本開示のある特定の実施形態では、ゲノム編集組成物または構築物のヌクレアーゼドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼから単離された、それに由来するまたはそこから組換えられたヌクレアーゼドメインを含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。本開示のある特定の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩまたはＣｌｏ０５１を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。本開示のある特定の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１（配列番号３４）を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、またはからなってもよい。
【０２４０】
本開示のゲノム編集組成物または構築物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインとヌクレアーゼドメインが共有結合により連結していてよい。例えば、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含んでよい。本開示のゲノム編集組成物または構築物のある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインとヌクレアーゼドメインは非共有結合性の連結によって作動可能に連結していてよい。
改変Ｔ細胞からの分泌タンパク質
【０２４１】
本開示の組成物および方法のある特定の実施形態では、改変Ｔ細胞は、治療用タンパク質を発現する。本開示の治療用タンパク質は、分泌タンパク質を含む。治療に関しては、治療用タンパク質は、分泌ヒトタンパク質を含めたヒトタンパク質であることが好ましい。本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞によって発現または分泌された場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞とそれらから分泌された治療用タンパク質を含む組合せは、単独療法とみなすことができる。しかし、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞を第２の薬剤との併用療法として投与することもできる。本開示の改変Ｔ細胞によって発現または分泌させることができるヒト分泌タンパク質のデータベースは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｓｅａｒｃｈ／ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｃｌａｓｓ：Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ％２０ｓｅｃｒｅｔｅｄ％２０ｐｒｏｔｅｉｎｓにおいて見出され得る。例示的なヒト分泌タンパク質を表１のヒト分泌タンパク質に提示するが、これらに限定するものではない。
【０２４２】
【表１−１】
2019528760.tif 000035
【表１−２】
2019528760.tif 000036
【表１−３】
2019528760.tif 000037
【表１−４】
2019528760.tif 000038
【表１−５】
2019528760.tif 000039
【表１−６】
2019528760.tif 000040
【表１−７】
2019528760.tif 000041
【表１−８】
2019528760.tif 000042
【表１−９】
2019528760.tif 000043
【表１−１０】
2019528760.tif 000044
【表１−１１】
2019528760.tif 000045
【表１−１２】
2019528760.tif 000046
【表１−１３】
2019528760.tif 000047
【表１−１４】
2019528760.tif 000048
【表１−１５】
2019528760.tif 000049
【表１−１６】
2019528760.tif 000050
【表１−１７】
2019528760.tif 000051
【表１−１８】
2019528760.tif 000052
【表１−１９】
2019528760.tif 000053
【表１−２０】
2019528760.tif 000054
【表１−２１】
2019528760.tif 000055
【表１−２２】
2019528760.tif 000056
【表１−２３】
2019528760.tif 000057
【表１−２４】
2019528760.tif 000058
【表１−２５】
2019528760.tif 000059
【表１−２６】
2019528760.tif 000060
【表１−２７】
2019528760.tif 000061
【表１−２８】
2019528760.tif 000062
【表１−２９】
2019528760.tif 000063
【表１−３０】
2019528760.tif 000064
【表１−３１】
2019528760.tif 000065
【表１−３２】
2019528760.tif 000066
【表１−３３】
2019528760.tif 000067
【表１−３４】
2019528760.tif 000068
【表１−３５】
2019528760.tif 000069
【表１−３６】
2019528760.tif 000070
【表１−３７】
2019528760.tif 000071
【表１−３８】
2019528760.tif 000072
【表１−３９】
2019528760.tif 000073
【表１−４０】
2019528760.tif 000074
【表１−４１】
2019528760.tif 000075
【表１−４２】
2019528760.tif 000076
【表１−４３】
2019528760.tif 000077
【表１−４４】
2019528760.tif 000078
【表１−４５】
2019528760.tif 000079
【表１−４６】
2019528760.tif 000080
【表１−４７】
2019528760.tif 000081
【表１−４８】
2019528760.tif 000082
【表１−４９】
2019528760.tif 000083
【表１−５０】
2019528760.tif 000084
【表１−５１】
2019528760.tif 000085
【表１−５２】
2019528760.tif 000086
【表１−５３】
2019528760.tif 000087
【表１−５４】
2019528760.tif 000088
【表１−５５】
2019528760.tif 000089
【表１−５６】
2019528760.tif 000090
【表１−５７】
2019528760.tif 000091
【表１−５８】
2019528760.tif 000092
【表１−５９】
2019528760.tif 000093
【表１−６０】
2019528760.tif 000094
【表１−６１】
2019528760.tif 000095
【表１−６２】
2019528760.tif 000096
【表１−６３】
2019528760.tif 000097
【表１−６４】
2019528760.tif 000098
【表１−６５】
2019528760.tif 000099
【表１−６６】
2019528760.tif 000100
【表１−６７】
2019528760.tif 000101
【表１−６８】
2019528760.tif 000102
【表１−６９】
2019528760.tif 000103
【表１−７０】
2019528760.tif 000104
【表１−７１】
2019528760.tif 000105
【表１−７２】
2019528760.tif 000106
【表１−７３】
2019528760.tif 000107
【表１−７４】
2019528760.tif 000108
【表１−７５】
2019528760.tif 000109
【表１−７６】
2019528760.tif 000110
【表１−７７】
2019528760.tif 000111
【表１−７８】
2019528760.tif 000112
【表１−７９】
2019528760.tif 000113
【表１−８０】
2019528760.tif 000114
【表１−８１】
2019528760.tif 000115
【表１−８２】
2019528760.tif 000116
【０２４３】
本開示の一部の実施形態では、Ｔ細胞を、分泌タンパク質および分泌ヒトタンパク質を含めた治療用タンパク質を発現するように改変する。障害の方法の一部の実施形態では、ヒトタンパク質を発現するようにまたは分泌するように改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物を、凝固障害を処置するために使用する。血液凝固は、凝固カスケードとして公知の多段階プロセスを通じて起こる。外来性経路では、組織因子（第ＩＩＩ因子またはトロンボプラスチンとしても公知）が第ＶＩＩ因子と接触した状態になって、活性化ＶＩＩａ複合体が形成される。これにより、凝固プロテアーゼカスケードが開始され、不活性第Ｘ因子が活性なプロテアーゼ第Ｘａ因子に変換され、これが、活性化第Ｖ因子とともに、プロトロンビン（ＩＩ）からトロンビン（ＩＩａ）を生じさせる。内在性経路では、コラーゲンが高分子量キニノーゲン、プレカリクレインおよび第ＸＩＩ因子と複合体を形成し、それにより、第ＸＩＩ因子の第ＸＩＩａ因子への変換がもたらされる。第ＸＩＩａ因子により第ＸＩ因子が第ＸＩａ因子に変換され、第ＸＩａ因子により第ＩＸ因子が活性化されて第ＩＸａ因子が生じ、第ＩＸａ因子がＦＶＩＩＩａと共にテナーゼ複合体を形成し、テナーゼ複合体により、第Ｘ因子が活性化され、これにより、プロトロンビン（ＩＩ）のトロンビン（ＩＩａ）への変換が補助される。今度はトロンビンによりフィブリノーゲン（Ｉ）のフィブリンへの変換がもたらされ、フィブリンが第ＸＩＩＩａ因子と一緒になって架橋フィブリン塊を形成する。多くの凝固障害は、凝固カスケードに関与する血液中の分泌タンパク質のレベルが低いことの結果である。凝固障害は、傷害時に体から出ていく血液の量を強烈に増加させる、または皮下または生命維持に必要な臓器における出血を引き起こす可能性がある。これらの障害は、遺伝的なものである頻度が高い。凝固因子の欠損によって引き起こされる例示的であるが非限定的な疾患としては、血友病、フォン・ヴィルブランド病およびアンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣまたはプロテインＳの欠損が挙げられる。血友病ＡおよびＢはＸ連鎖であり、それぞれ凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子（ＦＩＸ）のレベルが不十分であることによって引き起こされる。血友病Ｃは、第ＸＩ因子が不十分であることによって引き起こされる。第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩ因子の欠損によっても出血障害が引き起こされる。フォン・ヴィルブランド病は、血液中のフォン・ヴィルブランド凝固因子のレベルが低いことに起因する。一部の場合では、凝固を調節する血液タンパク質の欠損により、過剰な凝固がもたらされる可能性がある。第Ｖ因子ライデンは、第Ｖ因子ライデンタンパク質が過剰に反応し、それにより、血液があまりにも頻繁にまたは過剰に血餅になる遺伝障害である。出血の調節を補助するアンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣまたはプロテインＳの欠損によっても過剰な凝固が引き起こされる可能性がある。現在、血友病などの凝固障害は、輸血または欠如した凝固因子の注入（補充療法）を用いて処置されている。しかし、補充療法の併発症として、凝固因子に対する抗体の発生、血液由来製品によるウイルス感染の罹患、および関節に対する損傷が挙げられる。したがって、追加的な療法が必要とされている。
【０２４４】
本開示の一部の実施形態では、Ｔ細胞を、分泌タンパク質および分泌ヒトタンパク質を含めた治療用タンパク質を発現するように改変する。障害の方法の一部の実施形態では、ヒトタンパク質を発現するようにまたは分泌するように改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物を酵素補充療法のために使用する。酵素補充療法は、一般には、疾患の症状を引き起こす根源的な酵素欠損症にバランスをもたらす酵素を含む組成物を治療有効量で静脈内注入することを伴う。したがって、欠如した酵素活性がこのように外因的に供給される。本開示の改変Ｔ細胞によって処置することができる例示的な疾患としては、これだけに限定されないが、リソソーム蓄積症、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ酵素）、ファブリー病、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ  Ｉ）、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ  ＩＩ、またはハンター症候群、イズロン酸−２−スルファターゼ欠損によって引き起こされる）、ムコ多糖症ＶＩ（ＭＰＳ  ＶＩ、アリールスルファターゼＢ欠損によって引き起こされる）およびポンペ病（または糖原病ＩＩ型、酸性アルファ−グルコシダーゼの欠損によって引き起こされる）が挙げられる。酵素補充療法を用いて処置可能な追加的な疾患としては、これだけに限定されないが、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損、肝臓酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ（ＮＡＧＳ）の欠損に起因する高アンモニア血症、低ホスファターゼ血症、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、モルキオ症候群Ａ型、ウォルマンＬＡＬリソソーム酸性リパーゼ欠損症、Ａ１ＡＴ（アルファ１−抗トリプシン）欠損および尿素サイクル異常症が挙げられる。酵素補充療法の間に患者に供給される酵素としては、これだけに限定されないが、アルファ１−抗トリプシン、β−グルコセレブロシダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ、−アセチルガラクトサミン−４スルファターゼおよびリソソーム酸リパーゼが挙げられる。
【０２４５】
本開示の一部の実施形態では、Ｔ細胞を、分泌タンパク質および分泌ヒトタンパク質を含めた治療用タンパク質を発現するように改変する。障害の方法の一部の実施形態では、ヒトタンパク質を発現するようにまたは分泌するように改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物を使用して、ヒト抗体を作製する。一部の実施形態では、分泌タンパク質を発現する改変Ｔ細胞によって処置される疾患は、抗体または抗体断片の静脈内注入または静脈内注射によって処置することができる疾患である。がんに加えて、関節炎および喘息、および感染などの免疫に基づく疾患、ならびに他の疾患を含めた多くの型の疾患の処置に、抗体に基づく療法を使用する。本開示の改変Ｔ細胞を用いて処置することができる疾患の例示的であるが非限定的な一覧としては、血小板凝集、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染、関節リウマチ、クローン病、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、アルツハイマー病、敗血症、多発性硬化症、高コレステロール血症、全身性エリテマトーデス、臓器移植拒絶反応の予防、ウイルス感染、喘息、重症アレルギー性障害、網膜症、骨粗鬆症、炎症性腸疾患、炎症性疾患、Ａ型インフルエンザ、発作性夜間ヘモグロビン尿症、グラム陰性菌によって引き起こされる敗血症、乾癬、浸潤性Ｃａｎｄｉｄａ感染、潰瘍性大腸炎、低コレステロール血症、呼吸器合胞体ウイルス感染、限局性分節性糸球体硬化症、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、ＨＩＶ感染症、潰瘍性大腸炎、自己免疫疾患、慢性喘息、緑内障手術後の瘢痕形成の低下、高コレステロール血症、白血球疾患、全身性強皮症、呼吸器合胞体ウイルス（予防）、エリテマトーデス、１型糖尿病、炎症、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染、黄斑変性症、炭疽、サイトメガロウイルス感染症、気道、皮膚および胃腸管の炎症、全身性エリテマトーデス、リウマチ性疾患、ぶどう膜炎、サイトメガロウイルス感染症、皮膚筋炎、多発性筋炎、線維症、脈絡膜および網膜血管新生、筋ジストロフィー、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染、ループス腎炎、濾胞性リンパ腫、慢性Ｂ型肝炎および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
養子細胞療法としての改変細胞の注入
【０２４６】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり２×１０５個から５×１０８個の間、またはそれらの任意の範囲、値または分数の細胞を含む。
【０２４７】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり０．２×１０６個〜２０×１０６個の細胞を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり０．２×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり２×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり２０×１０６個の細胞、またはそれらの間の任意の投与当たり患者の体重１ｋｇ当たりの細胞を含む。
【０２４８】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり１×１０６個の細胞または約１×１０６個の細胞を含む。
【０２４９】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり３×１０６個の細胞または約３×１０６個の細胞を含む。
【０２５０】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり０．７×１０６個〜６．７×１０６個の細胞を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり０．７×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり６．７×１０６個の細胞またはそれらの間の任意の投与当たり患者の体重１ｋｇ当たりの細胞を含む。
【０２５１】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり０．７×１０６個〜１６×１０６個の細胞を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり０．７×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり２×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり６×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり１０．７×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり１６×１０６個の細胞またはそれらの間の任意の投与当たり患者の体重１ｋｇ当たりの細胞を含む。
【０２５２】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり１．２×１０６個〜７．１×１０６個の細胞を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり１．２×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり７．１×１０６個の細胞または任意の数の投与当たり患者の体重１ｋｇ当たりの細胞を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり２×１０６個〜３×１０６個の細胞を含む。
【０２５３】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり１１０６×１０６個〜２１０６×１０６個の細胞を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり１１０６×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり２１０６×１０６個の細胞またはそれらの間の任意の投与当たり患者の体重１ｋｇ当たりの細胞数を含む。本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり０．７×１０６個〜１．３×１０６個の細胞を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり０．７×１０６個の細胞、投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり１．３×１０６個の細胞またはそれらの間の任意の投与当たり患者の体重１ｋｇ当たりの細胞数を含む。
【０２５４】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の改変細胞を患者に注射または静脈内注入によって送達する。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、単一用量または複数用量を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、分割用量を含む。ある特定の実施形態では、治療有効用量の、本開示の組成物または本開示の改変細胞を含む組成物は、初回用量および維持用量を含む。
【０２５５】
本開示のある特定の実施形態では、改変細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増大または薬学的に許容される担体を用いた製剤化のいずれかの前にＴ細胞マーカーに応じて選別することができる。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋マーカーを使用して選別することができる。
核酸分子
【０２５６】
タンパク質足場をコードする本開示の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡまたは任意の他の形態などのＲＮＡの形態であってもよく、これだけに限定されないが、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるまたは合成により作製されるゲノムＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含めた、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖または一本鎖、またはそれらの任意の組合せであってよい。ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても公知のコード鎖であってもよく、アンチセンス鎖とも称される非コード鎖であってもよい。
【０２５７】
本開示の単離された核酸分子は、任意選択で１つまたは複数のイントロン、例えば、これだけに限定されないが、少なくとも１つのタンパク質足場の少なくとも１つの指定の部分を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子；標的タンパク質に結合するタンパク質足場またはループ領域のコード配列を含む核酸分子；および上記のものとは実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝暗号の縮重に起因して、本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知のタンパク質足場、センチリン、ＣＡＲ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、トランスポゾン、および／またはトランスポザーゼをなおコードする核酸分子を含み得る。当然、遺伝暗号は当技術分野において周知である。したがって、本発明の特定のタンパク質足場をコードするそのような縮重核酸バリアントの生成は、当業者には常套的であろう。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。また、そのような核酸バリアントは本発明に包含される。
【０２５８】
本明細書に示されている通り、タンパク質足場、センチリン、ＣＡＲ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、トランスポゾン、および／またはトランスポザーゼをコードする核酸を含む本開示の核酸分子としては、これだけに限定されないが、タンパク質足場、センチリン、ＣＡＲ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、トランスポゾン、および／またはトランスポザーゼ断片のアミノ酸配列を単独でコードする核酸；タンパク質足場、センチリン、ＣＡＲ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、トランスポゾン、および／またはトランスポザーゼ全体またはその一部のコード配列；タンパク質足場、センチリン、ＣＡＲ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、トランスポゾン、および／またはトランスポザーゼ、断片または部分のコード配列、ならびに、これだけに限定されないが、転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含めたｍＲＮＡプロセシング（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合性および安定性）において役割を果たす転写された非翻訳配列などの非コード５’および３’配列を含めた追加的な非コード配列と共に、少なくとも１つのイントロンなどの上述の追加的なコード配列を有するまたは有さない、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチドのコード配列などの追加的な配列；追加的な官能性をもたらすものなどの追加的なアミノ酸をコードする追加的なコード配列を挙げることができる。したがって、タンパク質足場、センチリン、ＣＡＲ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、トランスポゾン、および／またはトランスポザーゼをコードする配列を、タンパク質足場断片または部分を含む融合したタンパク質足場、センチリン、ＣＡＲ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、トランスポゾン、および／またはトランスポザーゼの精製を容易にするペプチドをコードする配列などのマーカー配列と融合することができる。
核酸の構築
【０２５９】
本開示の単離された核酸は、当技術分野で周知の（ａ）組換え方法、（ｂ）合成技法、（ｃ）精製技法、および／または（ｄ）これらの組合せを使用して作出することができる。
【０２６０】
核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて、配列を都合よく含み得る。例えば、ポリヌクレオチドの単離を補助するために、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入することができる。また、翻訳された本開示のポリヌクレオチドの単離を補助するために、翻訳可能な配列を挿入することができる。例えば、ヘキサ−ヒスチジンマーカー配列により、本開示のタンパク質を精製するための都合のよい手段がもたらされる。コード配列を除いた本開示の核酸は、任意選択で、本開示のポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、アダプター、またはリンカーである。
【０２６１】
クローニングおよび／または発現における機能を最適化するため、ポリヌクレオチドの単離を補助するため、または細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善するために、そのようなクローニングおよび／または発現配列に追加的な配列を付加することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は当技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。
核酸を構築するための組換え方法
【０２６２】
本開示の単離された核酸組成物、例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せなどは、生物学的供給源から、任意の数の当業者に公知のクローニング方法体系を使用して得ることができる。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー内の所望の配列を同定する。ＲＮＡの単離、およびｃＤＮＡおよびゲノムのライブラリーの構築は、当業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。
ベクターおよび宿主細胞
【０２６３】
本開示は、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターを用いて遺伝子工学操作される宿主細胞、および当技術分野で周知の組換え技法による少なくとも１つのタンパク質足場の作製にも関する。例えば、それぞれが完全に参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。
【０２６４】
例えば、ＰＢ−ＥＦ１ａベクターを使用することができる。ベクターは、以下のヌクレオチド配列を含む：
【化２２−１】
2019528760.tif 000117
【化２２−２】
2019528760.tif 000118
【０２６５】
ポリヌクレオチドは、任意選択で、宿主における増殖のための選択マーカーを含有するベクターと接合することができる。一般に、プラスミドベクターを、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物、または荷電した脂質との複合体に導入する。ベクターがウイルスである場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて適切なパッケージング細胞株を使用してパッケージし、次いで、宿主細胞に形質導入することができる。
【０２６６】
ＤＮＡ挿入断片は、適切なプロモーターに作動可能に連結しているべきである。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、および、転写領域内に翻訳のためのリボソーム結合性部位をさらに含有する。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、最初に翻訳開始コドン、および翻訳されるｍＲＮＡの最後に適切に位置させた終結コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含むことが好ましく、哺乳動物または真核細胞での発現にはＵＡＡおよびＵＡＧが好ましい。
【０２６７】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましいが、任意選択である。そのようなマーカーとしては、例えば、これだけに限定されないが、真核細胞培養に関しては、アンピシリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子（Ｓｈ  ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネテシン耐性遺伝子（ｎｅｏ遺伝子）、ミコフェノール酸耐性遺伝子、またはグルタミンシンテターゼ耐性遺伝子（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号）、ブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｄ遺伝子）、ならびに、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌または原核生物の培養に関しては、アンピシリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子（Ｓｈ  ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネテシン耐性遺伝子（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ポリミキシンＢ耐性遺伝子、またはテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる（上記の特許はこれによって参照により完全に組み込まれる）。上記の宿主細胞に対する適切な培養培地および条件は、当技術分野で公知である。適切なベクターは当業者には容易に明らかになろう。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染または他の公知の方法によって実施することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１〜４章および第１６〜１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１章、第９章、第１３章、第１５章、第１６章など、当技術分野において記載されている。
【０２６８】
発現ベクターは、本開示の組成物および方法によって改変された細胞を単離するための少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含むことが好ましいが、任意選択である。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞または細胞のサブセットを別の定義された細胞のサブセットと区別する表面タンパク質、糖タンパク質、またはタンパク質の群を含む。選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物または方法によって改変された細胞と本開示の組成物または方法によって改変されていない細胞を区別するものであることが好ましい。そのような細胞表面マーカーとしては、例えば、これだけに限定されないが、「ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ」または「ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ」タンパク質（多くの場合「ＣＤ」と省略される）、例えば、短縮形態または全長形態のＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。細胞表面マーカーは、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｂら、Ｂｌｏｏｄ．、２０１４年８月２１日；１２４巻（８号）：１２７７〜８７頁）をさらに含む。
【０２６９】
発現ベクターは、本開示の組成物および方法によって改変された細胞を単離するための少なくとも１つの選択可能な薬物耐性マーカーを含むことが好ましいが、任意選択である。本開示の選択可能な薬物耐性マーカーは、野生型または突然変異Ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０２７０】
本開示の少なくとも１つのタンパク質足場を融合タンパク質などの改変形態で発現させることができ、分泌シグナルだけでなく、追加的な異種機能性領域を含めることができる。例えば、精製中、またはその後の取扱いおよび保管中の宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、追加的なアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域をタンパク質足場のＮ末端に付加することができる。また、精製を容易にするために、ペプチド部分を本開示のタンパク質足場に付加することができる。そのような領域は、タンパク質足場または少なくとも１つのその断片の最終的な調製の前に除去することができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１７．２９〜１７．４２章および第１８．１〜１８．７４章；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１６章、第１７章および第１８章などの、多くの標準の実験マニュアルに記載されている。
【０２７１】
当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸を発現させるために利用可能な多数の発現系に関する知識がある。あるいは、本開示の核酸を、本開示のタンパク質足場をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞においてオンにする（操作により）ことにより、宿主細胞において発現させることができる。そのような方法は、例えば、完全に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、および同第５，７３３，７６１号に記載されている通り、当技術分野で周知である。
【０２７２】
タンパク質足場、その指定の部分またはバリアントの作製に有用な細胞培養物の例は、当技術分野で公知の細菌細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は多くの場合に細胞の単層の形態になるが、哺乳動物細胞浮遊液またはバイオリアクターも使用することができる。インタクトなグリコシル化タンパク質を発現することができるいくつもの適切な宿主細胞株が当技術分野において開発されており、それらとして、ＣＯＳ−１細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３細胞株、ＢＨＫ２１細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１０）およびＢＳＣ−１細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられ、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞としては、骨髄腫細胞およびリンパ腫細胞などのリンパ起源の細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８５１）である。特に好ましい実施形態では、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３細胞またはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。
【０２７３】
これらの細胞に対する発現ベクターは、以下の発現制御配列、例えば、これだけに限定されないが、複製開始点；プロモーター（例えば、後期または初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター；エンハンサー、および／またはプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ  Ａｇ  ポリＡ付加部位）、および転写ターミネーター配列などの１つまたは複数を含み得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。本発明の核酸またはタンパク質の作製に有用な他の細胞は公知であり、かつ／または、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）または他の公知のまたは商業的な供給源から入手可能である。
【０２７４】
真核生物宿主細胞を使用する場合、一般には、ポリアデニル化または転写ターミネーター配列をベクターに組み入れる。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、４５巻：７７３〜７８１頁（１９８３年））。さらに、当技術分野で公知の通り、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列をベクターに組み入れることができる。
タンパク質足場の精製
【０２７５】
タンパク質足場は、これだけに限定されないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた周知の方法によって組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製のために使用することができる。例えば、それぞれが完全に参照により本明細書に組み込まれるＣｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９９７〜２００１年）、例えば、第１章、第４章、第６章、第８章、第９章、第１０章を参照されたい。
【０２７６】
本開示のタンパク質足場は、天然に精製された産物、化学合成手順の産物、ならびに、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含めた原核生物または真核生物宿主から組換え技法によって産生された産物を含む。組換え産生手順に使用される宿主に応じて、本開示のタンパク質足場はグリコシル化されたものであってもグリコシル化されていないものであってもよい。そのような方法は、全てが参照により本明細書に完全に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１７．３７〜１７．４２節；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１０章、第１２章、第１３章、第１６章、第１８章および第２０章、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、上記、第１２〜１４章などの、多くの標準の実験マニュアルに記載されている。
バリアント
【０２７７】
本開示のタンパク質足場を構成するアミノ酸は、多くの場合、略される。アミノ酸の名称は、アミノ酸を当技術分野においてよく理解されているその１文字コード、その３文字コード、名称、または３ヌクレオチドのコドン（単数または複数）で表すことによって示すことができる（Ａｌｂｅｒｔｓ，  Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年を参照されたい）。本開示のタンパク質足場は、本明細書で規定される通り、自然突然変異またはヒトによる操作のいずれかに由来する１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を含み得る。機能に不可欠な本開示のタンパク質足場のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの、当技術分野で公知の方法によって同定することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第８章、第１５章；ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年））。後者の手順では、分子内の残基毎に単一のアラニン突然変異を導入する。次いで、得られた突然変異分子を、例えば、これだけに限定されないが、少なくとも１つの中和活性などの生物学的活性について試験する。タンパク質足場の結合性に重大な部位も、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識などの構造解析によって同定することができる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２４巻：８９９〜９０４頁（１９９２年）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５巻：３０６〜３１２頁（１９９２年））。
【０２７８】
本開示全体を通して使用される「実質的に相補的」という用語は、第１の配列が、第２の配列の相補物と８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であること、または、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。
【０２７９】
本開示全体を通して使用される「実質的に同一」という用語は、第１の配列と第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０またはそれよりも多くのヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であること、または、核酸に関しては、第１の配列が第２の配列の相補物と実質的に相補的である場合を指す。
【０２８０】
本開示全体を通して使用される「バリアント」という用語は、核酸を記載するために使用される場合、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその一部の相補物；（ｉｉｉ）参照核酸もしくはその相補物と実質的に同一である核酸；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参照核酸、その相補物、またはそれと実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を指す。
【０２８１】
本開示全体を通して使用される「ベクター」という用語は、複製開始点を含有する核酸配列を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であってよい。ベクターは、ＤＮＡベクターであってもＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであってよく、ＤＮＡプラスミドであることが好ましい。
【０２８２】
本開示全体を通して使用される「バリアント」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドを記載するために使用される場合、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを指す。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。
【０２８３】
アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を同様の性質（例えば、親水性、電荷領域の程度および分布）を有する異なるアミノ酸で置き換えることは、一般には、軽微な変化を伴うと当技術分野において認められている。これらの軽微な変化は、一部において、当技術分野において理解されているアミノ酸のハイドロパシー指数を考察することによって同定することができる（Ｋｙｔｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１５７巻：１０５〜１３２頁（１９８２年））。アミノ酸のハイドロパシー指数は、疎水性および電荷の考察に基づく。ハイドロパシー指数が同様のアミノ酸は、置換することができ、それでもタンパク質機能が保持される。一態様では、ハイドロパシー指数が±２であるアミノ酸を置換する。生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするために、アミノ酸の親水性を使用することもできる。ペプチドに関しては、アミノ酸の親水性の考察により、そのペプチドの最大の局所的な平均親水性を算出することが可能になり、これは、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である。参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号。
【０２８４】
親水性値が同様のアミノ酸の置換により、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドがもたらされ得る。置換は、親水性値が互いと±２以内であるアミノ酸を用いて実施することができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性値はどちらも、そのアミノ酸の特定の側鎖による影響を受ける。この知見と一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の性質により明らかになるように、アミノ酸、特に、それらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存することが理解される。
【０２８５】
本明細書で使用される「保存的」アミノ酸置換は、以下の表Ａ、Ｂ、またはＣに記載の通り定義することができる。一部の実施形態では、融合ポリペプチドおよび／またはそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変によって導入された保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的性質およびタンパク質二次構造および三次構造への寄与に従って分類することができる。保存的置換は、１つのアミノ酸での同様の性質を有する別のアミノ酸の置換である。例示的な保存的置換を表Ａに記載する。
【０２８６】
【表Ａ】
2019528760.tif 000119
【０２８７】
あるいは、保存的アミノ酸は、表Ｂに記載されている通り、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９７５年）、７１〜７７頁）に記載されている通り群分けすることができる。
【０２８８】
【表Ｂ】
2019528760.tif 000120
【０２８９】
あるいは、例示的な保存的置換は、表Ｃに記載されているものである。
【０２９０】
【表Ｃ】
2019528760.tif 000121
【０２９１】
本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つまたは複数の挿入、欠失、または置換、またはそれらの任意の組合せ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の改変を有するポリペプチドを含むことを意図していることが理解されるべきである。本開示のポリペプチドまたは核酸は、１つまたは複数の保存的置換を含有し得る。
【０２９２】
本開示全体を通して使用される、上述のアミノ酸置換のうちの「１つよりも多く」という用語は、記載されているアミノ酸置換のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０またはそれよりも多くを指す。「１つよりも多く」という用語は、記載されているアミノ酸置換のうちの２、３、４、または５を指し得る。
【０２９３】
本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、それらの配列全体、またはその任意の一部のいずれでも、天然に存在しないものであり得る。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、天然に存在せず、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする１つまたは複数の突然変異、置換、欠失、または挿入を含有し得る。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、１つまたは複数の重複、逆または反復配列を含有し得、それにより得られる配列は、天然に存在せず、アミノ酸配列全体が天然に存在しないものになる。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、天然に存在せず、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする修飾、人工、または合成アミノ酸を含有し得る。
【０２９４】
本開示全体を通して使用される「配列同一性」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ｆｔｐサイトから、デフォルトパラメータを使用して検索することができる２つの配列をブラスティングするための独立型の実行可能なＢＬＡＳＴエンジンプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）を使用することによって決定することができる（ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．、１９９９年、１７４巻、２４７〜２５０頁；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。「同一」または「同一性」という用語は、２つまたはそれよりも多くの核酸またはポリペプチド配列に関して使用される場合、配列のそれぞれの指定の領域にわたって同じである残基の指定の百分率を指す。百分率は、２つの配列を最適にアラインメントし、２つの配列を指定の領域にわたって比較し、両方の配列内で同一の残基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を指定の領域内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出することができる。２つの配列の長さが異なるまたはアラインメントにより１つもしくは複数の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一の配列のみが含まれる場合には、単一の配列の残基は算出の分母には含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を等価とみなすことができる。同一性は、手動で行うこともでき、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行うこともできる。
【実施例】
【０２９５】
（実施例１）
幹様改変Ｔ細胞の作製
以下は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の望ましい幹様性質が誘導または保存される条件下で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変するための１つのプロトコールの、例示的であるが非限定的な例である。
【０２９６】
０日目：Ｔ細胞のヌクレオフェクション
【０２９７】
ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ  Ｔ細胞増大培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号：１０９８１）を３７℃、５％ＣＯ２、高湿度のインキュベーター中で予め温める。反応（キュベットサイズ１００μＬ）当たりＴ細胞５×１０６個に対して、反応当たり培地３ｍＬを６ウェルプレートの単一のウェル中で温める。反応（キュベットサイズ１００μＬ）当たりＴ細胞２５×１０６個に対して、反応当たり培地２０ｍＬをＧ−Ｒｅｘ１０（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、Ｃａｔ番号：８００４０Ｓ）中で温める。
【０２９８】
Ｐ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ番号：ＰＢＰ３−０２２５０）を室温まで温め、必要であれば補充物質を添加する。
【０２９９】
４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍのコアユニット（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ番号：ＡＡＦ−１００２Ｂ）をオンにし、これにより、Ｘ−ユニット（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ番号：ＡＡＦ−１００２Ｘ）を制御する。Ｐ３緩衝液の使用が必要なヌクレオフェクションの数をプログラムする。ＥＯ−２１０をプログラムする。
【０３００】
キュベットを標識し、トランスファーピペット（Ｌｏｎｚａ  Ｐ３キットにより供給）を予め開封し、核酸の妥当な希釈物を調製した後、細胞を用いて作業する。
【０３０１】
トランスポゾンプラスミドに関して、ヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏ中０．５μｇ／μＬ溶液を作製する。
【０３０２】
収集されたＣＤ１４枯渇細胞、ＣＤ５６枯渇細胞、およびＣＤ１９枯渇細胞をＣｌｉｎｉＭＡＣｓ  Ｐｒｏｄｉｇｙを使用して計数し、必要とされる細胞数に必要な体積を算出する。
【０３０３】
Ｔ細胞をＨｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒベンチトップ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で９０ｇ、７でのブレーキを伴って１０分遠心分離する。同じ数の細胞／反応を使用して多数の反応を実施する場合、必要な細胞全てを単一の遠心管で遠心分離する。体積に応じて１５ｍＬ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号：１４−９５９−４９Ｂ）または５０ｍＬ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号：１４−９５９−４９Ａ）のいずれかの円錐管を使用することができる。遠心分離中に、Ｐ３初代細胞溶液ボックス（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ番号：ＰＢＰ３−０２２５０）を伴うキュベットの底部に核酸を直接添加する。ステップ４においてトランスポゾン合計１μｇに対して作製した０．５μｇ／μＬトランスポゾンプラスミド溶液２μＬをキュベットの底部の１つの隅に添加する。Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼｍＲＮＡ  ５μｇをキュベットの他の隅に添加する。
【０３０４】
ｍＲＮＡは急速に分解する場合があるので、ＲＮａｓｅが存在する潜在性があるので電気穿孔前に他の核酸溶液および細胞と接触する時間を最小限にすることが最適である。このような理由で、混合を防ぐために、例えば、トランスポゾンおよびトランスポザーゼをキュベットの逆の隅に送達する。さらに、核酸の総体積を総反応体積に対して１０μＬ（１０％）よりも下に保つことが最適である。
【０３０５】
トランスポゾンの量（１μｇ）とトランスポザーゼの量（５μｇ）はどちらも、反応当たりの細胞数にかかわらず、同じままにする。転移効率は、反応１００μＬ当たり細胞５×１０６個から反応１００μＬ当たり細胞２５×１０６個の間で変化しないままである。
【０３０６】
遠心分離後、細胞ペレットを妨害せずに培地を完全に吸引除去する。
【０３０７】
細胞ペレットを、反応当たり、補充物質を含有する室温のＰ３緩衝液１００μＬに浮遊させる。
【０３０８】
Ｐ３緩衝液中の細胞１００μＬを、最適には溶液中にいかなる気泡も導入されないように注意を払いながら、適切な核酸を含有するキュベットに移す。一度に最大２つのキュベットのみに細胞をローディングすべきであることが推奨される。細胞をキュベットに添加した後、直ちに作業することが最適であり、ヌクレオフェクション前のｍＲＮＡと細胞の接触時間を減らすことが効率的である。最大１０分まではＰ３緩衝液中で休止状態の細胞に関して転移効率の低下は観察されていないが、細胞をＰ３中にとどめる時間を最小限にすることが推奨される。
【０３０９】
キュベットの内容物を、数回はじくことによって混合し、最大２つのキュベットを４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘ−ユニットにローディングする。
【０３１０】
細胞をプログラムＥＯ−２１０でパルスし、機械によって記録される誤差がないことを確実にする。
【０３１１】
ヌクレオフェクトした細胞を、６ウェルプレートまたはＧ−Ｒｅｘ１０のいずれかに、Ｌｏｎｚａ  Ｐ３キットにより供給されるトランスファーピペットを使用してすぐに移す。細胞を移すために、まず、少量の予め温めた培地を６ウェルプレートまたはＧ−Ｒｅｘフラスコからトランスファーピペット中に引き込む。次いで、培地をキュベット中にピペットで入れ、ピペットを使用してキュベットの全内容物を最終的な培養皿に移す。キュベット中または最終的な培養皿中で細胞を上下にピペッティングしないことが推奨される。
【０３１２】
残りのどの反応についても、Ｐ３緩衝液中の細胞を適切な核酸を含有するキュベットに移すところから、混合し、パルスし、ヌクレオフェクトした細胞を６ウェルプレートまたはＧ−Ｒｅｘ１０中に移すところまでプロトコールを繰り返す。
【０３１３】
細胞を３７℃、５％ＣＯ２、高湿度のインキュベーターに入れる。
【０３１４】
２日目：Ｔ細胞活性化
【０３１５】
ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化因子（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号：１０９７０）２５μＬ／ｍＬをヌクレオフェクトした細胞に添加する。
【０３１６】
細胞をピペッティングによって穏やかに混合する。
【０３１７】
細胞を３７℃、５％ＣＯ２、高湿度のインキュベーターに戻す。
【０３１８】
Ｇ−Ｒｅｘフラスコ中で成長させる細胞に関して：可視の細胞凝集塊が観察されるまで培養物を妨害しないことが必須である。したがって、培地添加および交換を細胞の破壊／混合／ピペッティングと分けることが推奨される。
【０３１９】
培養培地の留意点：Ｇ−Ｒｅｘフラスコ中で細胞を成長させるためには、培地添加および／または交換をグルコースおよび他の代謝産物のレベルに基づいて行うべきである。グルコースレベル（または別の指示的な代謝産物）が決定的レベル（例えばグルコース約１００ｍｇ／ｄＬ）まで低下した場合には、予め温めたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ＸＦ  Ｔ細胞増大培地を使用して、培地体積を２倍にするおよび／または培地を半分交換することによって補給する。培地添加は、ゆっくりと実施し、細胞をできるだけ破壊しないように注意を払うべきである。培地半分の交換は、細胞を培養フラスコの底部に完全に静置させるために、細胞培養物の機械的破壊後の少なくとも１２時間後に行うべきである。
【０３２０】
細胞試料採取および破壊：細胞は、培養期間の大半の間は妨害せずにおくべきである。
【０３２１】
活性化試薬の添加後の細胞培養物の第１の破壊は、大きな可視の細胞の凝集体が形成されたら行うべきである（凝集体は、Ｇ−Ｒｅｘ膜上に見ることができる格子の３〜４マス×３〜４マスになる）。
【０３２２】
細胞凝集体が必要なサイズに到達したら、それらを、１０ｍＬの血清用ピペットを使用して機械的に破壊してもよい。この時点は、ドナーおよび転移効率に応じて１１〜１４日目になり得る。ある特定の状況、例えば、ヌクレオフェクションにマニュアルカセット、大きな体積および／または大きな細胞数を使用する場合には、この時点は、１１日目よりも１４日目に近づき得る。細胞計数、生存能力、およびフロー解析のために細胞の試料採取をこの時点で収集するべきである。この時点の培養培地の体積は使用した最初の体積（Ｇ−Ｒｅｘ１００に関しては２００ｍＬ）の２倍を超えないことが理想的である。細胞を再度妨害する必要がないように、必要とした細胞の全てを一度に収集することが推奨される。
【０３２３】
細胞を破壊したら、それらを、出発時と同じ体積の培地中で１２時間にわたって妨害せずに放置する。細胞はこの時点で再度凝集しているはずであるが、凝集体はより小さく、より多くなる。これらの凝集体はＧ−Ｒｅｘ膜の格子の１〜２マス×１〜２マスになるはずである。
【０３２４】
細胞の第１の破壊（培養物に応じて１４〜１７日目）の３日後、細胞を２回目のピペッティングを行うことができる。試料を細胞計数、生存能力、およびフローサイトメトリーのために再度取得すべきである。再度、細胞を、試料採取後少なくとも１２時間にわたって妨害せずに放置すべきである。細胞を再度妨害する必要がないように、必要とした細胞の全てを一度に収集することが推奨される。
【０３２５】
この第２の破壊後、細胞はいかなる凝集塊も形成せず、細胞の成長速度は相当に遅くなる可能性がある。
【０３２６】
細胞の採取を、培養１７日目から２０日目の間の細胞の第２の破壊の３日後に実施すべきである。
【０３２７】
フローサイトメトリー
【０３２８】
フローを５日目、Ｄ−Ｄａｙ、Ｄ−Ｄａｙ＋３、およびＤ−Ｄａｙ＋６に実施すべきである。
【０３２９】
５日目、Ｄ−Ｄａｙ、およびＤ−Ｄａｙ＋３に関しては、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＡＲＴｙｒｉｎフローパネルを使用する
【０３３０】
Ｄ−Ｄａｙ＋６に関しては、標的パネルが３つある：
ａ．パネル  １：ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ
ｂ．パネル  ２：ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、ＣＤ２５、ＣＸＣＲ４、ＰＤ−１
ｃ．パネル  ３：ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３
（実施例２）
ＣＡＲＴｙｒｉｎ＋幹メモリーＴ細胞の機能的特徴付け
【０３３１】
本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎは、不適切な遺伝子活性化またはサイレンシングを遮断することによってＣＡＲＴｙｒｉｎ発現を安定化するのに役立つように２つのシス調節性インスレーターエレメントに挟まれたＣＡＲＴｙｒｉｎをコードするプラスミドＤＮＡトランスポゾンを使用してＴ細胞に導入することができる。
【０３３２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、抗原特異的（がん抗原特異的を含む）ＣＡＲＴｙｒｉｎを休止状態の汎Ｔ細胞に安定に組み込むために、単一の電気穿孔反応でトランスポゾンがｍＲＮＡトランスポザーゼ酵素と共送達される、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）と称されるｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用することができる。もとのままの休止状態の初代ヒト汎Ｔ細胞へのｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポゾンの送達の結果、２０〜３０％の細胞が、ＰＢにより送達された遺伝子の安定な組み込みおよび発現を伴った。予想外に、大多数のこれらの改変ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現Ｔ細胞が幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）に一般に関連付けられるマーカーであるＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡの発現について陽性であった。この表現型がＣＡＲ−Ｔ細胞の刺激および増大の際に保持されたことを確認するために、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡの発現について陽性の改変ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８による刺激によって活性化した。ＣＤ３およびＣＤ２８による刺激の結果として、ＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞の＞６０％が幹細胞メモリー表現型を示した。さらに、がん抗原に対して特異的なＣＡＲＴｙｒｉｎを発現したこれらの細胞は、強力な抗腫瘍エフェクター機能を発現することが十分に可能であった。
【０３３３】
ＰＢ系が幹様マーカーの発現の増強に直接寄与するか否かを決定するために、ＰＢによる転移またはレンチウイルスによる（ＬＶ）形質導入のいずれかによって生成したＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を比較した。これを行うために、ＣＡＲＴｙｒｉｎ導入遺伝子をウイルス産生のための共通のＬＶ構築物にサブクローニングすることによって新しいベクターを構築した。ＣＡＲＴｙｒｉｎをもとのままの休止状態のＴ細胞にＰＢによる転移またはＬＶによる形質導入によって導入した後、ＣＡＲＴｙｒｉｎ＋細胞を増大させ、次いで、休止状態に戻した。メモリーおよび疲弊関連マーカーの動態解析、恒常性サイトカインまたは腫瘍関連Ａｇに応答した二次的な増殖、サイトカイン産生、および標的腫瘍細胞に応答した溶解能を含めた、種々の表現型特性および機能特性を測定した。ＰＢによる転移を行ったＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞とは異なり、ＬＶによる形質導入を行ったＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞では、メモリー表現型の強化が示されなかった。さらに、ＰＢによる転移を行った細胞では、二次的な増殖および標的腫瘍細胞の死滅に関して同等またはより大きな能力が示された。まとめると、これらのデータから、ＰＢによる転移によって作製されたＣＡＲ−Ｔ細胞が、主に、ＣＡＲ−Ｔ分野で高度に望ましい製品表現型であるＴＳＣＭ細胞であることが実証される。さらに、これらのＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞は、強力な抗腫瘍活性を示し、また、トニックシグナル伝達および機能的疲弊を起こしにくい可能性がある、センチリンに基づくＣＡＲの使用に起因してｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより長く持続する細胞を生じさせることができる。
（実施例３）
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙによる転移では主にＴＳＣＭ表現型が得られる
【０３３４】
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００ｘ）による転移では、本開示の方法を使用し、ＴＳＣＭ表現型が主に得られる。図１０に示されている通り、ヒト汎Ｔ細胞を、１μｇのＳｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポゾンプラスミドまたはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドのいずれか、およびそれぞれＳＢ１００ｘまたはＳＰＢ  ｍＲＮＡを使用して転移を生じさせた。転移後、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏにおいて増大させ、全ての非転移細胞を、薬物選択系を使用して枯渇させた。１８日間培養した後、細胞を表現型マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ６２Ｌで染色した。幹細胞メモリー表現型（ＴＳＣＭ）は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ二重陽性細胞によって定義され、全試料中の細胞の＞６５％を構成する。
（実施例４）
改変Ｔ細胞における第ＩＸ因子の発現
【０３３５】
第ＩＸ因子の遺伝学的欠損（図１１）により、血友病Ｂと称される、命にかかわる疾患がもたらされる。血友病Ｂは、２５，０００人に１人〜３０，０００人に１人に影響を及ぼす稀な疾患である。現行の血友病Ｂ処置は、組換え第ＩＸ因子タンパク質を２〜３日ごとに注入することを伴い、費用は１年当たり約２５０，０００ドルである。
【０３３６】
幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）はヒトにおいて数十年維持され、したがって、頻繁な輸血を必要とせずに、血友病Ｂ患者において欠如している第ＩＸ因子を分泌させる、第ＩＸ因子を供給する理想的なビヒクルである。Ｔ細胞を、第ＩＸ因子を分泌するようにＰｉｇｇｙＢａｃを用いて形質転換した。ヒト第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするトランスジェニックＴ細胞を、ＦＡＣＳを使用してＴ細胞マーカーおよびＴＳＣＭ細胞マーカーについて試験したところ、全細胞のおよそ８０％がＴＳＣＭ表現型を示した（図１２）。これらの改変Ｔ細胞はヒト第ＩＸ因子を分泌することができ（図１３Ａ）、この分泌第ＩＸ因子により、凝固活性がもたらされた（図１３Ｂ）。
参照による組み込み
【０３３７】
任意の相互参照されたまたは関連の特許または出願を含む、本明細書で引用される全ての文書は、明示的に排除されないか他の方法で限定されない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。任意の文書の引用は、それが、本明細書で開示もしくは特許請求された任意の発明に関して先行技術であること、またはそれが単独で、もしくは任意の他の参考文献（単数または複数）との任意の組み合わせで、任意のそのような発明を教示、示唆もしくは開示しているということの承認ではない。さらに、この文書中の用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれる文書中の同じ用語の任意の意味または定義と矛盾する範囲内では、この文書中でその用語に割り当てられた意味または定義が支配するものとする。
他の実施形態
【０３３８】
本開示の特定の実施形態が例示および説明されてきたが、種々の他の変化および改変が、本開示の精神および範囲から逸脱することなしになされ得る。添付の特許請求の範囲の範囲は、本開示の範囲内の全てのかかる変化および改変を含む。
【図１】
2019528760.tif 000122
【図２】
2019528760.tif 000123
【図３】
2019528760.tif 000124
【図４】
2019528760.tif 000125
【図５】
2019528760.tif 000126
【図６Ａ】
2019528760.tif 000127
【図６Ｂ】
2019528760.tif 000128
【図６Ｃ】
2019528760.tif 000129
【図６Ｄ】
2019528760.tif 000130
【図７】
2019528760.tif 000131
【図８Ａ】
2019528760.tif 000132
【図８Ｂ】
2019528760.tif 000133
【図９】
2019528760.tif 000134
【図１０−１】
2019528760.tif 000135
【図１０−２】
2019528760.tif 000136
【図１１】
2019528760.tif 000137
【図１２】
2019528760.tif 000138
【図１３Ａ】
2019528760.tif 000139
【図１３Ｂ】
2019528760.tif 000140
【図１４Ａ】
2019528760.tif 000141
【図１４Ｂ】
2019528760.tif 000142
【図１４Ｃ】
2019528760.tif 000143
【図１４Ｄ】
2019528760.tif 000144
【図１４Ｅ】
2019528760.tif 000145
【図１５】
2019528760.tif 000146
【図１６】
2019528760.tif 000147
【図１７Ａ】
2019528760.tif 000148
【図１７Ｂ】
2019528760.tif 000149
【図１７Ｃ】
2019528760.tif 000150
【図１８】
2019528760.tif 000151
【配列表】
2019528760000001.app
【国際調査報告】
2019528760.tif 000152
2019528760.tif 000153
2019528760.tif 000154
2019528760.tif 000155