(57)【要約】  本開示は、骨関節炎を処置し、骨関節炎の１つまたは複数の症候を改善し、かつ骨関節炎成分を有する障害を処置するための、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において骨関節炎を処置する方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
対象において軟骨成長を増大させる方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項３】
対象において軟骨変性を遅延させる方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項４】
骨関節炎を患う対象において骨関節炎の症候を改善する方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項５】
骨関節炎患者において運動技術（または運動能）を向上させる方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６】
骨関節炎患者において運動能の退化を阻害する方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項７】
骨関節炎を患う対象の罹患関節において可動域を拡大させる方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項８】
骨関節炎を患う対象の罹患関節において硬直を軽減する方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項９】
対象において滑膜炎を軽減する方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
対象において骨関節炎の開始を予防する方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１１】
対象において骨増殖体の成長を減少させる方法であって、ＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１２】
前記ＣＮＰ変異体は、
2019505486.tif 000044
2019505486.tif 000045
2019505486.tif 000046
2019505486.tif 000047
からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＮＰ変異体は、
2019505486.tif 000048
からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨関節炎は、原発性骨関節炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨関節炎は、続発性骨関節炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＮＰ変異体は、軟骨変性が生じた後に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＮＰ変異体は、関節の損傷または外傷に応じて投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＮＰ変異体は、関節の損傷または外傷から１ヵ月以内に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＮＰ変異体を含む組成物は、関節内に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＮＰ変異体を含む組成物は、皮下に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＮＰ変異体を含む組成物は、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、または２週間に１回投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
軟骨成長の前記増大または軟骨変性の前記遅延は、前記対象の関節において観察される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項２３】
前記関節は、膝、肩、肘、指、手、手首、股、首、脊柱、および背下部からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
軟骨の損傷または成長は、軟骨細胞の死／損失、プロテオグリカン（ＰＧ）の損失、またはコラーゲンの損失もしくはフィブリル化によって分析される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＮＰ変異体を含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物は、ｐＨが約４から約６であるクエン酸／クエン酸バッファーまたは酢酸／酢酸バッファーを含む調合物から調製された凍結乾燥剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第２の剤の投与をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の剤は、抗炎症剤、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、およびヒアルロン酸からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記罹患関節の可動域は、股関節の屈曲、股関節の伸展、股関節の外転、股関節の内転、膝の屈曲、または膝の伸展を測定することによって判定される、請求項７に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象は、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルが増大していると同定されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーは、ＣＮＰ、ｃＧＭＰ、コラーゲンＩＩ型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンＩＩ型およびそのフラグメント、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびそのフラグメント、コラーゲンＩ型およびそのフラグメント、ならびにコンドロイチン硫酸アグリカンからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の分野
本開示は、骨関節炎を処置し、骨関節炎の１つまたは複数の症候を改善し、かつ骨関節炎成分を有する障害を処置するための、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景
骨関節炎（ＯＡ）は、関節の変性疾患である。これは、６０歳を超える男性の推定１０％および女性の推定１８％に生じる、最も多く見られる関節疾患である。実際に、ＯＡは、老化過程にある成人における、痛みおよび障害の主要な原因の１つである。これは、原因が１つであるのではなく、関節の外傷、年齢、および肥満を含む多くの素因の最終エンドポイントである複雑な疾患である。ＯＡ関節における最も共通した病理学的変化は、関節軟骨の分解、滑膜の炎症、軟骨下骨の深さの増大、および骨増殖体の成長である。ＯＡの現在の薬学的治療は、疾患の炎症局面を標的としており、関節の根本的な変性または構造変化を標的としていない。これらの抗炎症性の処置は、一時的な痛みの緩和しかもたらさない。それに対して、関節の変性を減少させ、または逆転すると考えられる処置は、患者の痛みおよび運動能に、より長い、永続的かつ有利な効果を有すると思われる。したがって、ＯＡ患者において関節変性を減少させることができ、かつ／または関節軟骨および関節構造を修復することができる薬学的剤が必要とされている。
【０００３】
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）（ＣＮＰ前駆体タンパク質ＮＰＰＣについて、GenBankアクセッション番号NP_077720）は、（最も顕著には、中枢神経系、生殖器官、骨、および血管の内皮によって）広く発現される小さな単鎖ペプチドである。ＣＮＰは、２つの別個の受容体：ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）およびナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）に結合する。ＮＰＲ−Ｂは、膜結合したグアニリルシクラーゼ多重遺伝子ファミリのメンバーであり、ＣＮＰ結合によって活性化されると、第２のメッセンジャ環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を生成する。それに対して、ＮＰＲ−Ｃは、いかなる細胞内シグナル伝達ドメインも有しておらず、その代わりとして、細胞外空間からナトリウム利尿ペプチドを一掃するよう機能する。ゆえに、ＣＮＰがＮＰＲ−Ｃに結合すると、受容体は内在化して、ＣＮＰをリソソームに送達し、そこでＣＮＰが分解される。これによって、ＣＮＰの有効細胞外濃度を低くする。
【０００４】
ＣＮＰは、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）遺伝子から、１２６個のアミノ酸のプレ−プロポリペプチドとして最初に生成される。シグナルペプチドの除去により、プロＣＮＰが生じ、そしてエンドプロテアーゼフーリンによる更なる切断により、生物学的に活性な５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−５３）が生じる。これが分泌されてさらにプロセシングされて、成熟した２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−２２）が生じる。ＣＮＰ−５３およびＣＮＰ−２２は、それらの分布が異なる。ＣＮＰ−５３は、主に組織中に見出される一方、ＣＮＰ−２２は主に、血漿および髄液中に見出される。軟骨中での主たるＣＮＰ形態は、現在公知でない。ＣＮＰ−５３およびＣＮＰ−２２は双方とも、類似した動態でＮＰＲ−Ｂに結合して、双方ともｃＧＭＰ産生を用量依存的に誘導する。ｃＧＭＰによって媒介される下流シグナル伝達は、軟骨内骨形成を含む多種多様な生物学的プロセスに影響する。したがって、この経路におけるいずれかの成分のレベルの増大または減少により、異常な骨成長または軟骨成長が導かれる虞がある。例えば、マウスモデルにおけるＣＮＰまたはＮＰＲ−Ｂのいずれかのノックアウトにより、長骨および脊柱がより短い萎縮性表現型の動物が生じる。また、ＣＮＰシグナル伝達を阻止するヒトＮＰＲ−Ｂの突然変異により、矮小発育症となる。それに対して、高いレベルのＣＮＰを産生するように操作されたマウスは、長い長骨および脊柱を示す。
【０００５】
ＣＮＰの治療的可能性は、その短い半減期によって制限される。ＣＮＰは、２つの機構：１）ＣＮＰを迅速に分解する、膜結合中性エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）の作用を介するもの、および２）ＣＮＰを、これが分解されるリソソームに向ける結合ＮＰＲ−Ｃを介するものによって一掃される。これらの２つのクリアランス機構が、ＣＮＰの短い半減期（約２．６分）の原因である。ＣＮＰ濃度を、ヒト血漿中で典型的に見出されるレベル（約５ｐＭ）を超えて増大させるには、連続的な注入が必須であった。これが、その治療的可能性を厳しく制限している。この問題を克服するために、半減期がより長いＣＮＰ変異体が開発されている。軟骨成長を刺激する潜在的役割を考えると、ＣＮＰ変異体は、より長い永続的な緩和をＯＡ患者にもたらす新規のクラスの治療薬を代表する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の要約
本開示は、原発性骨関節炎もしくは続発性骨関節炎、または１つもしくは複数の骨関節炎関連症候を処置するためのＣＮＰ変異体の使用に関する。ＣＮＰ変異体の投与により、処置動物において、罹患関節の可動域が拡大し得、かつ軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨への骨関節炎関連損傷が遅延または低下し得ることが、本明細書において開示される。種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７である。
【０００７】
種々の態様において、本開示は、原発性骨関節炎もしくは続発性骨関節炎、または１つもしくは複数の骨関節炎関連症候を処置する方法であって、ＣＮＰ変異体またはＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含み、当該投与工程は、原発性骨関節炎もしくは続発性骨関節炎、または疾患の前記１つもしくは複数の症候を処置する、方法を提供する。また、意図されるのは、対象において軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の成長を増大させる方法であって、ＣＮＰ変異体またはＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法である。本開示はまた、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の骨関節炎関連変性を遅延させ、予防し、または阻害する方法であって、ＣＮＰ変異体またはＣＮＰ変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を意図する。また、本開示は、骨関節炎によって影響を受けた関節において、可動域を拡大させ、または硬直を軽減する方法であって、ＣＮＰ変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。さらに、本開示は、骨関節炎によって影響を受けた関節において、骨増殖体の成長を減少させる方法であって、ＣＮＰ変異体を、骨関節炎を患う対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、以下からなる群より選択される：
2019505486.tif 000002
2019505486.tif 000003
2019505486.tif 000004
2019505486.tif 000005
【０００９】
種々の態様において、軟骨、石灰化した軟骨、もしくは軟骨下骨の成長の増大、または軟骨、石灰化した軟骨、もしくは軟骨下骨の変性の遅延が、対象の膝、肩、肘、指、手、手首、股、首、足首、脊柱、および／または対象の背下部において観察される。種々の態様において、軟骨の損傷または成長が、軟骨細胞の死／損失、プロテオグリカン（ＰＧ）の損失、およびコラーゲンの損失またはフィブリル化によって分析される。
【００１０】
また、提供されるのは、骨関節炎の対象において関節の可動域を拡大させる方法であって、ＣＮＰ変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法である。種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、股関節の屈曲、股関節の伸展、股関節の外転、股関節の内転、膝の屈曲、または膝の伸展によって測定される可動域を、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％拡大させる。また、詳細な説明においてさらに詳細に記載されるもの等の、種々の患者および痛みの尺度で評価される、骨関節炎を含む関節炎の症候が、ＣＮＰ変異体の投与により向上すると考えられる。種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７である。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、哺乳類において骨増殖体の成長または形成を予防し、阻害し、または遅延させる方法であって、ＣＮＰ変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。種々の態様において、骨増殖体の形成または成長は、対象において、骨関節炎と関連している。骨増殖体の形成または成長、およびその形成または成長の予防または阻害は、経時的に、そしてＣＮＰ変異体の処置レジメン中に、骨増殖体のサイズの物理的測定によって判定され得る。種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７である。
【００１２】
本発明の別の態様は、哺乳類において軟骨下骨または骨端小柱骨の異常な成長を予防し、阻害し、または遅延させる方法であって、ＣＮＰ変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。一局面において、軟骨下骨または骨端骨の異常な成長は、骨の肥厚によって明示される。別の局面において、軟骨下骨または骨端小柱骨の異常な成長は、骨関節炎、骨粗鬆症、または骨硬化症と関連している。種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７である。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、哺乳類において滑膜炎（すなわち滑膜炎）を予防し、阻害し、または遅延させる方法であって、ＣＮＰ変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。一局面において、滑膜炎は、少なくとも、罹患関節中への単核細胞の浸潤によって、明示される。別の局面において、滑膜炎は、骨関節炎と関連している。種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７である。
【００１４】
一態様において、ＣＮＰ変異体は、関節内に投与される。また、ＣＮＰ変異体は、他の経路によって投与されることも意図される。例示的な投与経路として、以下に限定されないが、皮下、関節内、静脈内、動脈内、腹膜内、筋肉内、皮内、腹膜内、筋肉内、皮内、髄腔内、局所的、経皮、または経粘膜投与が挙げられる。
【００１５】
別の態様において、ＣＮＰ変異体は、関節の外傷または損傷に応じて投与される。更なる態様において、ＣＮＰ変異体は、関節の外傷または損傷の１ヵ月以内に投与される。別の態様において、ＣＮＰ変異体は、関節の外傷または損傷から１週以内に投与される。他の態様において、ＣＮＰ変異体は、軟骨変性が生じた後に投与される。
【００１６】
種々の態様において、本開示は、骨関節炎を患う対象において、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルに対するＣＮＰ変異体の作用を評価する方法であって、ＣＮＰペプチドまたはＣＮＰ変異体を投与した、骨関節炎を患う対象に由来する生体サンプル中の少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイすることを含む方法を提供する。一態様において、ＣＮＰ変異体は、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイする前に、対象に投与される。
【００１７】
種々の態様において、本明細書において意図されるのは、骨関節炎、または１つもしくは複数の骨関節炎関連症候もしくは徴候を処置する方法であって、ＣＮＰ変異体を対象に投与することを含み、対象は、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルが高いと同定された、方法である。種々の態様において、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーは、ＣＮＰ、ｃＧＭＰ、コラーゲンＩＩ型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンＩＩ型およびそのフラグメント、シンデカン−３、アネキシンＶＩ、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびそのフラグメント、コラーゲンＩ型およびそのフラグメント、ならびにコンドロイチン硫酸アグリカンからなる群より選択される。
【００１８】
種々の態様において、本開示は、ＣＮＰ変異体を含む組成物の使用を提供する。一態様において、組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤を含む。一態様において、組成物は、ｐＨが約４から約６であるクエン酸／クエン酸バッファーまたは酢酸／酢酸バッファーを含む製剤から調製された凍結乾燥剤である。
【００１９】
また、意図されるのは、第２の剤の投与をさらに含む、本明細書中に記載される処置の方法である。種々の態様において、第２の剤は、抗炎症剤、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、およびヒアルロン酸からなる群より選択される。
【００２０】
種々の態様において、本方法に用いられるＣＮＰ変異体は、疎水性の酸に取り付けられていてよく、または１つもしくは複数の疎水性の酸に取り付けられていてよい。疎水性の酸の非限定的な例として、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和Ｃ５〜Ｃ１２カルボン酸（例えば、ペンタン酸、ヘプタン酸等）および天然の脂肪酸が挙げられる。疎水性の酸は、１つまたは複数のアミノ酸残基のＮ末端、Ｃ末端、および／または側鎖に取り付けられていてよい。一態様において、疎水性の酸は、Ｎ末端に結合されている。
【００２１】
さらに別の態様において、本方法に用いられるＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ変異体、および切断可能ペプチドもしくは切断可能タンパク質、またはペプチドタグを含むキメラまたは融合タンパク質である。例示的な切断可能タンパク質または切断可能ペプチドとして、以下に限定されないが、ヒスチジン（例えばヘキサＨｉｓ）タグ；ＴＡＦ１２：ヒト転写因子ＴＡＦ１２；ＫＳＩ：ケトステロイドイソメラーゼ；ＭＢＰ：マルトース結合タンパク質；β−Ｇａｌ：β−ガラクトシダーゼ；ＧＳＴ：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；Ｔｒｘ：チオレドキシン；ＣＢＤ：キチン結合ドメイン；ＢＭＰＭ：ＢＭＰ−２突然変異、ＳＵＭＯ、ＣＡＴ、ＴｒｐＥ、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌タンパク質、デンプン−結合タンパク質、エンドグルカナーゼＡのセルロース結合ドメイン、エキソグルカナーゼＣｅｘのセルロース結合ドメイン、ビオチン結合ドメイン、ｒｅｃＡ、Ｆｌａｇ、ｃ−Ｍｙｃ、ポリ（Ｈｉｓ）、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ａｓｐ）、ポリ（Ｇｌｎ）、ポリ（Ｐｈｅ）、ポリ（Ｃｙｓ）、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体エピトープ、およびそれらのフラグメントが挙げられる。
【００２２】
種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、モノマーであってもダイマーであってもよい。関連する態様において、二量体ＣＮＰ変異体のモノマーは、リンカーを介して、もしくはリンカーなしでＮ末端がＮ末端に、リンカーを介して、もしくはリンカーなしでＮ末端がＣ末端に、またはリンカーを介して、もしくはリンカーなしでＣ末端がＣ末端に取り付けられ得る。
【００２３】
本明細書中に開示される態様のいずれかにおいて、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ−２２と実質的に同じ、またはそれよりも良好な生物学的活性を有し得る。例えば、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ−２２の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上を保持し得、または例えば、ｃＧＭＰの生成を刺激する、ＮＰＲ−Ｂとの相互作用に関して、ＣＮＰ−２２よりも大きな活性を有し得る。代わりに、または加えて、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ−２２の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上を保持し得、または、以下に限定されないが、軟骨細胞増殖、軟骨細胞分化、分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ／ＭＥＫ（Ｒａｆ−１）キナーゼシグナル伝達経路の阻害、および軟骨内骨化の促進を含む、軟骨内骨成長および軟骨細胞活性の調整に関して、ＣＮＰ−２２よりも大きな活性を有し得る。本明細書中に記載される態様のいずれかにおいて、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ−２２のアミノ酸６〜２２または１〜２２と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含み得る。
【００２４】
種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、任意で、例えばＮ末端および／またはＣ末端にて、軟骨標的を促進し、腎クリアランスを減少させ、かつ／またはＮＥＰ分解に対する耐性を増大させるための結合または伸長を有し得る。そのような結合または伸長は、例えば、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｕ、軟骨標的ペプチド、シアロタンパク質、ＰＥＧ、炭水化物、疎水性の酸、ＮＰＰＣ、もしくは非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド、またはそれらの組合せから形成され、またはこれらに由来する分子または配列を含み得る。
【００２５】
ＣＮＰ変異体は、疎水性のポリマー部分または非ポリマー部分、例えばヘプタン酸、ペンタン酸、または脂肪酸に結合され得ることがさらに意図される。疎水性部分は、以下に限定されないが、リジン、セリン、システイン、もしくはトレオニンを含むアミノ酸残基の側鎖に結合され得、またはＣＮＰ変異体のＮ末端および／もしくはＣ末端に取り付けられ得る。
【００２６】
種々の態様において、本方法に有用なＣＮＰ変異体は、ｐＩが約８から約１０．５、または約８．５から約１０の範囲にある。
【００２７】
種々の態様において、本開示は、ＣＮＰ変異体、任意で別の生物学的に活性な剤、および任意で薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤を含む薬学的組成物の使用を提供する。種々の態様において、組成物は、非経口投与に適した滅菌薬学的組成物である。一部の態様において、組成物は、実質的に純粋な、例えば少なくとも約９０％または９５％純粋なＣＮＰ変異体を含む。一部の態様において、組成物は、約５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％未満の混入物、例えば、他のヒトタンパク質、ブタタンパク質、または（所望のＣＮＰ変異体以外の）ＣＮＰ−５３もしくはそのフラグメントを含有する。特定の態様において、滅菌組成物は、本明細書中に開示されるＣＮＰ反応性の任意の症状または障害を処置または予防するために、対象に投与される。
【００２８】
本明細書において有用なＣＮＰ変異体は、有利には、ＣＮＰ活性を保持し、かつ血清半減期の増大を示す。ＣＮＰ活性の保持は、例えば、所望のインビボ生物学的効果の保持、または同じ濃度（例えば、ＣＮＰペプチド１μＭ、またはＥＤ８０を超える）の下での、ＣＮＰ−２２のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは少なくとも約１００％の保持として、示され得る。一部の態様において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ−２２と比較して、血清半減期の少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、または４０倍の増大を示す。
【００２９】
関連する態様において、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ−２２と比較して、ＮＥＰ耐性が増大し、そして半減期の増大を示す。一態様において、ＣＮＰ変異体の半減期は、野生型ＣＮＰ−２２と比較して、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％増大する。
【００３０】
特定の態様において、本方法に用いられる、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ−２２と比較して、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、またはそれ以上、ｃＧＭＰ産生をインビトロで増大させ、ｃＧＭＰ産生をインビボで増大させ、軟骨もしくは骨の形成もしくは成長と関連した１つもしくは複数のバイオマーカーのレベルをインビボで増大させ、ＮＥＰ切断に対する耐性をインビトロで増大させ、血漿半減期もしくは血清半減期をインビボで増大させ、生体利用性をインビボで増大させ、または軟骨の成長もしくは再生をインビボで増大させ、あるいはそのような増大を組み合わせてもたらす。
【００３１】
種々の態様において、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、約５または１０ｎｍｏｌ／ｋｇから約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または約２０ｎｍｏｌ／ｋｇから約２００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲の用量にて投与される。一部の態様において、ＣＮＰ変異体は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、もしくは２０００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量、または処置医師によって適切であると考えられた他の用量にて投与される。他の態様において、ＣＮＰ変異体は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００μｇ／ｋｇ、もしくは約１ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇの用量、または処置医師によって適切であると考えられた他の用量にて投与される。
【００３２】
種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、単回処置で、または複数回投与で投与される。複数回投与は、処置の経過の全体にわたって毎日施されても、複数回投与で施されてもよい。種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、単回投与で、または複数回投与で、毎日、隔日、３日毎、１週あたり２回、１週あたり３回、毎週、隔週、３週毎、毎月、６週毎、２ヵ月毎、３ヵ月毎、または処置医師によって適切であると考えられるように投与されることが意図される。
【００３３】
特定の態様において、ＣＮＰ変異体の投与は、予防的処置または治療的処置の期間に続く、回復期間も見越すように調整される。例えば、ＣＮＰ変異体は、関節内に、皮下に、静脈内に、または別のモードによって、しばらくの間、毎日または１週あたり複数回投与されてから、処置なしの期間が続いてよく、そしてサイクルが繰り返される。一部の態様において、処置の初期の期間（例えば、毎日、または１週あたり複数回のＣＮＰ変異体が投与される）は、３日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、または１２週間である。関連する態様において、処置なしの期間は、３日間、１週間、２週間、３週間、または４週間続く。特定の態様において、ＣＮＰ変異体の投薬レジメンは、３日間、毎日に続いて３日オフ；または１週間、毎日もしくは１週あたり複数回に続いて３日もしくは１週オフ；または２週間、毎日もしくは１週あたり複数回に続いて１週もしくは２週オフ；または３週間、毎日もしくは１週あたり複数回に続いて１週、２週、もしくは３週オフ；または４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、もしくは１２週間、毎日もしくは１週あたり複数回に続いて１週、２週、３週、もしくは４週オフである。
【００３４】
付加的な態様において、本開示は、骨関節炎関連症候がある骨関節炎または障害を処置する方法であって、ＣＮＰ変異体を対象に投与することと、対象において（例えば、対象由来の生体サンプルにおいて）少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルをモニタすることとを含み、軟骨関連バイオマーカーのレベルの増大または減少が、対象に対するＣＮＰ変異体の治療的効果を示す、方法を提供する。一部の態様において、バイオマーカーのレベルが、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の形成または成長に関連して増大する場合、当該バイオマーカーのレベルの増大は、対象に対するＣＮＰ変異体の治療的効果を示す。他の態様において、バイオマーカーのレベルが、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の形成または成長に関連して減少する場合、当該バイオマーカーのレベルの減少は、対象に対するＣＮＰ変異体の治療的効果を示す。
【００３５】
更なる態様において、治療方法はさらに、ＣＮＰ変異体の投与の量（または用量）または頻度を調整することを含み：
（ｉ）ＣＮＰ変異体の投与の量（もしくは用量）もしくは頻度は、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルであって、軟骨の形成もしくは成長に関連して増大するバイオマーカーのレベルが、標的レベル未満であるならば、増やされ；または
（ｉｉ）ＣＮＰ変異体の投与の量（もしくは用量）もしくは頻度は、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルであって、軟骨の形成もしくは成長に関連して増大するバイオマーカーのレベルが、標的レベルを超えるならば、減らされ；または
（ｉｉｉ）ＣＮＰ変異体の投与の量（もしくは用量）もしくは頻度は、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルであって、軟骨の形成もしくは成長に関連して減少するバイオマーカーのレベルが、標的レベルを超えるならば、増やされ；または
（ｉｖ）ＣＮＰ変異体の投与の量（もしくは用量）もしくは頻度は、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルであって、軟骨の形成もしくは成長に関連して減少するバイオマーカーのレベルが、標的レベル未満であるならば、減らされる。
【００３６】
バイオマーカーの標的レベルが、対象における治療的効果、および／または障害の症候もしくは症状を緩和もしくは改善するのに有益な効果と関連するバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲を指すことが意図される。特定の態様において、標的レベルを上回る、または下回るバイオマーカーのレベルが、対象にとって有害であり得る。
【００３７】
他の態様において、本開示は、ＣＮＰ変異体の投与の、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の形成または成長に対する効果を評価する方法を意図する。一態様において、本方法は、ＣＮＰ変異体が投与された対象において少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定して、ＣＮＰ変異体の、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨のインビボ形成およびインビボ成長に対する効果を評価することを実現する。関連する態様において、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルの増大は、ＣＮＰ変異体の投与が、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の形成または成長に正の効果を有しており、骨関節炎、およびＣＮＰ活性の減少と関連した他の軟骨関連疾患または障害に有用な処置であることを示し得る。例示的な軟骨関連バイオマーカーとして、以下に限定されないが、ＣＮＰ（例えば、ＣＮＰ−２２またはＣＮＰ−５３の内因性レベル）、ｃＧＭＰ、コラーゲンＩＩ型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンＩＩ型およびそのフラグメント、シンデカン−３、アネキシンＶＩ、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびそのフラグメント、コラーゲンＩ型およびそのフラグメント、ならびにコンドロイチン硫酸アグリカンが挙げられる。
【００３８】
更なる態様において、本開示は、ＣＮＰ変異体の、対象における少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルに対する効果を評価する方法であって、ＣＮＰ変異体が投与された対象由来の生体サンプル中で軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定することを含む方法を意図する。一部の態様において、本方法はさらに、軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定する前に、ＣＮＰ変異体を対象に投与することを含む。
【００３９】
軟骨関連バイオマーカーに関係する方法（例えば、治療方法、診断方法、およびアッセイ方法）の一部の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７であり、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７とも呼ばれ、または本明細書中に記載されるＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体のいずれかであり、本明細書中に示されるＣＮＰ変異体を含む。そのような方法の特定の態様において、ＣＮＰペプチドまたはＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ−２２でもＣＮＰ−５３でもない。特定の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７である。
【００４０】
骨関節炎、および骨関節炎に伴う、本明細書中に記載される症候または他の生理学的徴候の処置用の医薬の調製における、本明細書中に記載される上述のＣＮＰ変異体のいずれかの使用もまた意図される。上述のペプチドまたはポリペプチドのいずれかを、任意で、適切な使用説明書と共に含むシリンジ、例えば単回使用シリンジもしくは予め充填されたシリンジ、滅菌シールコンテナ、例えばバイアル、ボトル、ベッセル、および／またはキットもしくはパッケージもまた意図される。
【００４１】
本明細書中に記載される各特徴は、本開示の局面のいずれかの非限定的な解説用の例であり、したがって、本明細書中に記載される他のいかなる特徴とも組合せ可能であることが意図されていると理解される。例えば、特徴が、「一態様」、「特定の態様」、「一部の態様」、「更なる態様」、「特定の例示的な態様」、および／または「別の態様」等の文言と共に記載されている場合、これらの特徴はそれぞれ、本明細書中に記載される他のいかなる特徴とも組み合わせられてよく、考えられる組合せが全て一覧にされている必要はない。範囲に収まる値の例が開示されている場合、これらの例はいずれも、範囲の考えられるエンドポイントとして意図され、そのようなエンドポイント間のあらゆる全ての数値が意図され、そして上下のエンドポイントのあらゆる全ての組合せが想定されている。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、低い用量（３５．５μｇ）または高い用量（１１０μｇ）でのＧｌｙ−ＣＮＰ−３７投与が、脛骨における軟骨変性の有意な減少を示したことを示している。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図２】図２は、深さ比がＧｌｙ−ＣＮＰ−３７処置群において向上していたことを示している。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図３】図３は、いずれかの変性によって影響を受けた軟骨の幅が、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置群において向上していたことを示すグラフである。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図４】図４は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置動物が大幅な脛骨軟骨変性の５０％超の向上を示したことを示している。
【図５】図５は、１１０μｇでのＧｌｙ−ＣＮＰ−３７が、総関節スコア（大腿骨を含まない）を有意に減少させたことを示している。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図６】図６は、大腿骨スコアが計算に含まれる場合の、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置動物についての総関節スコアを表すグラフである。
【図７】図７は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置動物および未処置対照動物における内側および外側の成長板の厚さを示すグラフである。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図８】図８は、外側の厚さを内側の厚さから減算して、２つの間の差異を判定した、図７のデータを表すグラフである。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図９】図９は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置ラットまたは未処置対照ラットにおける歩行スコアの経過を表している。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図１０】図１０は、図９の歩行スコアの曲線下面積（ＡＵＣ）を表すグラフである。全ての値が、ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについてｐ≦０．０５である。
【図１１】図１１は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物についての総軟骨変性幅の測定値を示している。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図１２】図１２は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物についての大幅な軟骨変性幅の測定値を示している。ビヒクルＳＣに対するｔ検定について†ｐ＜０．０５。
【図１３】図１３は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物についての平均内側脛骨骨増殖体スコアを示している。ビヒクルＳＣに対するｔ検定について†ｐ＜０．０５。
【図１４】図１４は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物についてのマイクロメートルの平均成長板厚さを示している。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。ビヒクルＳＣに対するｔ検定について†ｐ＜０．０５。
【図１５】図１５は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物についての平均総関節スコア（マイナス大腿骨）を示している。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。ビヒクルＳＣに対するｔ検定について†ｐ＜０．０５。
【図１６】図１６は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物についての平均滑膜炎スコアを示している。
【図１７】図１７は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物についての体重の平均変化を示している。ビヒクルに対するＡＮＯＶＡについて＊ｐ≦０．０５。
【図１８】図１８は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物についての平均歩行スコアを示している。値は、ビヒクルＳＣに対するｔ検定についてｐ＜０．０５である。
【図１９】図１９は、各試験群についての、関節内経路または皮下経路を介したＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の投与後の、動物におけるＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の平均血漿濃度についての時間的経過を示している。各線について、対応する試験群の数を、対応するデータ線の直ぐ上に示している。
【図２０】図２０は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で（関節内（「ＩＡ」）、そして皮下（「ＳＣ」））処置した動物についての平均総脛骨軟骨変性幅を示している（処置投与は、外科手術後２１日目に始めて、データを４０日目に収集した）。
【図２１】図２１は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で（関節内（「ＩＡ」）、そして皮下（「ＳＣ」））処置した動物についての平均の大幅な脛骨軟骨変性幅を示している（処置投与は、外科手術後２１日目に始めて、データを４０日目に収集した）。
【図２２】図２２は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で（関節内（「ＩＡ」）、そして皮下（「ＳＣ」））処置した動物について（外科手術の２１日後に処置投与を開始）、３つのゾーンのそれぞれおよび合計についての平均脛骨軟骨変性スコアを示している。各ＩＡまたはＳＣビヒクル（４０日目）対照に対するＫ−Ｗ検定（Dunnの事後）について＊ｐ＜０．０５。ＩＡビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について†ｐ＜０．０５。ＳＣビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について‡ｐ＜０．０５。
【図２３】図２３は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で（関節内（「ＩＡ」）、そして皮下（「ＳＣ」））処置した動物について（外科手術の２１日後に処置投与を開始）、３つのゾーンのそれぞれおよび平均についての平均脛骨軟骨変性深さ比を示している。各ＩＡまたはＳＣビヒクル（４０日目）対照に対するＫ−Ｗ検定（Dunnの事後）について＊ｐ＜０．０５。ＩＡビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について†ｐ＜０．０５。ＳＣビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について‡ｐ＜０．０５。
【図２４】図２４は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で（関節内（「ＩＡ」）、そして皮下（「ＳＣ」））処置した動物について（外科手術の２１日後に処置投与を開始）、３つのゾーンのそれぞれおよび平均についての大腿骨ありの総関節スコアを示している。ＩＡビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について†ｐ＜０．０５。ＳＣビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について‡ｐ＜０．０５。
【図２５】図２５は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で（関節内（「ＩＡ」）、そして皮下（「ＳＣ」））処置した動物について（外科手術の２１日後に処置投与を開始）、３つのゾーンのそれぞれおよび平均についての大腿骨なしの総関節スコアを示している。ＩＡビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について†ｐ＜０．０５。ＳＣビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について‡ｐ＜０．０５。
【図２６】図２６は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で（関節内（「ＩＡ」）、そして皮下（「ＳＣ」））処置した動物について、骨増殖体スコアを示している（外科手術の２１日後に処置投与を開始、４０日目にデータを収集）。
【図２７】図２７は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で（関節内（「ＩＡ」）、そして皮下（「ＳＣ」））処置した動物について（外科手術の２１日後に処置投与を開始）、体重の変化を示している。各ＩＡまたはＳＣビヒクル（４０日目）対照に対するＫ−Ｗ検定（Dunnの事後）について＊ｐ＜０．０５。ＩＡビヒクル（４０日目）に対するＭ−Ｗ検定について†ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本開示の詳細な説明
本開示は、ＣＮＰ変異体を用いて骨関節炎、骨関節炎の１つまたは複数の症候、および骨関節炎が関連する症候または成分を有する他の障害を処置する方法に関する。
【００４４】
Ａ．定義
特に明記されない限り、明細書および特許請求の範囲を含む本出願において用いられる以下の用語は、以下で与えられる定義を有する。
【００４５】
用語「約」または「おおよそ」は、当技術分野の当業者によって判定された特定の値についての許容可能な誤差を意味する。これは、部分的に、値がどのように測定または判定されたかによって決まる。特定の態様において、用語「約」または「おおよそ」は、１、２、３、または、４標準偏差以内であることを意味する。特定の態様において、用語「約」または「おおよそ」は、所定の値または範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．０５％以内であることを意味する。用語「約」または「おおよそ」は、一連の２つ以上の数値における第１の数値に先行する場合はいつでも、その一連の数値のそれぞれに当てはまることが理解される。
【００４６】
標準的な化学用語の定義が、Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition, Vols. A and B (Plenum Press, New York 1992)を含む参考資料中に見出され得る。本開示の実行には、特に明記されない限り、当技術分野における範囲内の、合成有機化学、質量分析、分取分析クロマトグラフィ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、および薬学の特定の従来方法が使用されてよい。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4th Edition, 2004)；Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania:Mack Publishing Company, 1990)参照。
【００４７】
前掲されるか以下にあるかに拘らず、本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４８】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合またはペプチド結合イソスターを介して連結された、アミノ酸残基、その関連の、天然に存在する構造変異体および天然に存在しない合成類似体で構成されるポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、産物の最小の長さに限定されない。
【００４９】
ポリペプチド配列を表現するのに、従来の表記が本明細書において用いられる：ポリペプチド配列の左端は、アミノ末端である；ポリペプチド配列の右端は、カルボキシル末端である。
【００５０】
「保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の、機能的に、構造的に、または化学的に類似した天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸との置換を指す。一態様において、以下の群はそれぞれ、互いとの置換が保存的である天然のアミノ酸を含有する：
（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５１】
別の態様において、以下の群はそれぞれ、互いとの置換が保存的である天然のアミノ酸を含有する：
（１）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；および
（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）。
【００５２】
更なる態様において、アミノ酸は、以下に記載されるようにグループ化されてもよい。
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）骨格の配向性に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【００５３】
一態様において、本方法に有用な、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ変異体をコードするポリヌクレオチドを用いて、組換え手段を介して生成される。そのようなポリヌクレオチドによって発現されるＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で、培地中で宿主細胞を増殖させることと、発現産物を宿主細胞または培地から単離することとを含む方法によって生成され得る。実際の発現産物は、翻訳後の任意のプロセシングに応じて、コードされたタンパク質産物から僅かに変化し得る。
【００５４】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位で構成されるポリマーを指す。ポリヌクレオチドとして、天然に存在する生体ポリマー（分子型に関してであり、必ずしも生体ポリマー配列に関してではない）、例えばデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）、ならびに核酸類似体が挙げられる。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的な、またはこれと同一の、一本鎖の形態または二本鎖の形態のＤＮＡを指す。
【００５５】
「発現制御配列」は、これに機能的に連結されたヌクレオチド配列の発現を調節するヌクレオチド配列を指す。「機能的に連結された」は、一方の部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が、他方の部分への作用（例えば、配列の転写）をもたらす、２つの部分間の機能的関係を指す。発現制御配列として、例えば、限定されないが、プロモーター（例えば、誘導可能プロモーターまたは構成プロモーター）、３’ＵＴＲ、エンハンサ、転写ターミネータ、開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンについてのスプライシングシグナル、および終止コドンの配列が挙げられ得る。
【００５６】
「組換えポリヌクレオチド」は、天然では結合されない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅され、またはアセンブルされた組換えポリヌクレオチドが、適切なベクター中に含まれてよく、そしてベクターが、適切な宿主細胞を形質転換するのに用いられ得る。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。遺伝子はその後、例えば「組換えポリペプチド」を生成するために、組換え宿主細胞中で発現される。組換えポリヌクレオチドは、同様に、非コーディング機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位等）を果たし得る。
【００５７】
本明細書において用いられる「キメラ」は、少なくとも２つの異種起源のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列（すなわち、異なるソースに由来するか、または、天然に存在する配列として互いに関連しない）を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指し、これらは、当技術分野において一般的に公知の技術、例えば、組換え発現または化学架橋を用いて、直接的に、または間接的に取り付けられ、または連結される。一態様において、異種起源の配列は、ＣＮＰ変異体に直接的に、または間接的に連結されるタンパク質またはペプチドを含んでよく、ＣＮＰ変異体から切断可能であるタンパク質またはペプチドを含む。関連する態様において、ＣＮＰ変異体は、本明細書中に記載されるようなキメラである。
【００５８】
特定の態様において、キメラとして、切断可能なキャリアタンパク質またはペプチドタグを含むＣＮＰ融合タンパク質が挙げられる。用語「切断可能なキャリアタンパク質」または「切断可能なペプチドタグ」は、異種起源のポリペプチド配列に直接的に、またはリンカーを介して間接的に融合され得、そして異種起源のポリペプチドまたはタンパク質から切断可能なペプチドまたはポリペプチドを切断または分離する剤を用いて、異種起源の配列から取外し可能であるペプチド配列またはポリペプチド配列を指す。一部の態様において、切断可能なキャリアタンパク質またはペプチドタグは、融合タンパク質または異種起源のポリペプチドの生成、精製、および／または検出を向上させる。例示的な切断可能なキャリアタンパク質およびペプチドタグとして、以下に限定されないが、ヒト転写因子ＴＡＦ１２（ＴＡＦ１２）、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、キチン−結合ドメイン（ＣＢＤ）、ＢＭＰ−２突然変異（ＢＭＰＭ）、ＳＵＭＯ、ＣＡＴ、ＴｒｐＥ、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌タンパク質、デンプン結合タンパク質、エンドグルカナーゼＡのセルロース結合ドメイン、エキソグルカナーゼＣｅｘのセルロース結合ドメイン、ビオチン結合ドメイン、ｒｅｃＡ、ＦＬＡＧ（登録商標）、ｃ−Ｍｙｃ、ポリ（Ｈｉｓ）、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ａｓｐ）、ポリ（Ｇｌｎ）、ポリ（Ｐｈｅ）、ポリ（Ｃｙｓ）、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体エピトープ、およびそれらのフラグメントが挙げられる。
【００５９】
「可動域」が意味するのは、関節の完全な移動可能性、典型的には屈曲および／または伸展の範囲である。可動域は典型的に、ゴニオメータを用いて測定されて、弧度で示される。当業者に公知の任意の測定方法が、対象の関節の可動域を測定するのに用いられ得る。関節の可動域を測定する１つの実例となる方法が、例えば、Norkin, C.C. and White D.J., Measurement of joint motion: a guide to goniometry (F.A. Davis Company, 2nd ed. Philadelphia) (1995)によって提供される。
【００６０】
「関節硬直」が意味するのは、関節を動かす困難さの感覚、または関節の可動域の明らかな損失である。
【００６１】
「切断剤」は、例えば、異種起源のポリペプチドまたはタンパク質から切断可能なペプチドまたはポリペプチドを切断または分離するのに有用な剤である。切断剤として、以下に限定されないが、パラジウム、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ギ酸、ヒドロキシルアミン、クロストリパイン、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）、Ｋｅｘ２プロテアーゼ、Ｏｍｐ  Ｔプロテアーゼ、因子Ｘａプロテアーゼ、サブチリシン、ｐｒｏＴＥＶ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ライノウィルスプロテアーゼ、フリリシンプロテアーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ、ヒトＰａｃｅプロテアーゼ、コラゲナーゼ、Ｎｉａプロテアーゼ、ポリオウィルス２Ａｐｒｏプロテアーゼ、ポリオウィルス３Ｃプロテアーゼ、ゲネナーゼ、フーリン、エラスターゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、レンニン（キモシン）、微生物アスパラギン酸プロテアーゼ、パパイン、カルパイン、キモパパイン、フィシン（フィカイン）、ブロメライン（ブロメラーゼ）、カテプシンＢ、カスパーゼ、サーモリシン、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、カリクレイン、およびプラスミンが挙げられる。
【００６２】
２つ以上のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一の」およびパーセント「同一性」は、対応が最大となるように比較かつアラインされた場合に、同じである、または特定のパーセンテージのヌクレオチドもしくはアミノ酸残基が同じである、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００６３】
２つの核酸またはポリペプチドの文脈におけるフレーズ「実質的に相同の」または「実質的に同一の」は概して、包括的にアラインされた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性が少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％である２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００６４】
比較用の配列の包括的アラインメントが、EMBOSS Needleプログラム（例えば、ウェブインターフェイスを介してEMBL-EBIによって実行される）を用いて、デフォルトパラメータ（タンパク質について：マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップイクステンド＝０．５、アウトプットフォーマット＝ペア、エンドギャップペナルティ＝フォールス、エンドギャップオープン＝１０、エンドギャップイクステンド＝０．５；ヌクレオチドについて、マトリックス＝ＤＮＡフル、ギャップオープン＝１０、ギャップイクステンド＝０．５、アウトプットフォーマット＝ペア、エンドギャップペナルティ＝フォールス、エンドギャップオープン＝１０、エンドギャップイクステンド＝０．５）を用いて行われる。
【００６５】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に相同または同一であるという更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。ゆえに、ポリペプチドは典型的に、例えば、２つのポリペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、本明細書中に記載されるように、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００６６】
「実質的に純粋な」または「単離された」は、対象種が、存在する主たる種である（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）こと、そして実質的に精製された画分が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベース）を対象種が構成する組成物であることを意味する。種々の態様において、対象となる種は、モルベースまたは重量ベースで、組成物中に存在する高分子種の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を構成する。混入（contaminant）高分子種が従来の検出方法によって組成物中に検出され得ないならば、対象種は「本質的な均一性」となるまで精製されている。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定化剤（例えばＢＳＡ）、および元素イオン種は、この定義の目的で考慮される高分子種ではない。一態様において、本開示の化合物は、実質的に純粋であり、または単離されている。別の態様において、本開示の化合物は、その生産に用いられる高分子出発材料に対して、実質的に純粋であり、または単離されている。さらに別の態様において、本開示の薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤と、そして任意で別の生物学的に活性な剤と混合された、実質的に純粋な、または単離されたＣＮＰ変異体を含む。
【００６７】
「野生型」（ｗｔ）は、種におけるポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質の天然の形態（配列を含む）を指す用語である。野生型形態は、遺伝的突然変異から生じるポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質の突然変異形態から区別される。
【００６８】
一態様において、第２のポリペプチドの「類似体」または「変異体」または「誘導体」である第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドとの配列同一性が少なくとも約５０％、６０％、または７０％であるが、配列同一性が１００％未満であるポリペプチドである。そのような類似体、変異体、または誘導体は、限定されないが、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミン、およびノルバリンを含む、天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸残基で構成されてよい。そのような類似体、変異体、または誘導体は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基で構成されてもよく、そしてまた、ペプチド模倣体またはペプチド結合イソスター、例えば２つ以上のアミノ酸残基間またはペプチド模倣残基間の非ペプチド結合を含有してもよい。別の態様において、第１のポリペプチドが、第２のポリペプチドの公知の切断産物でないならば、または第２のポリペプチドの公知の前駆体でないならば、たとえ第１のポリペプチドが、第２のポリペプチドに対する配列同一性が１００％であり、または野生型配列を有するとしても、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドの「類似体」、「変異体」、または「誘導体」である。
【００６９】
一態様において、本明細書において用いられる用語「に由来する」は、野生型の、または天然に存在するポリペプチド配列またはペプチド配列に基づき、かつ１つまたは複数の欠失、付加、および／または天然のアミノ酸、天然でないアミノ酸、もしくはペプチド模倣体との置換を有し得るポリペプチドまたはペプチド配列を指す。一態様において、派生的な配列は、野生型の、または天然に存在する配列に対して、少なくとも約４０％、５０％、６０％、または７０％、かつ１００％未満の配列同一性を共有する。別の態様において、誘導体は、ポリペプチドのフラグメントであってよく、フラグメントは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０のアミノ酸長に対して、野生型ポリペプチドと実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一）である。さらに別の態様において、ポリペプチドが、野生型ポリペプチドに存在しない部分（例えば、ＰＥＧ等のポリマー）に直接的に、または間接的に取り付けられているならば、たとえ双方のポリペプチドが、アミノ酸配列において１００％の同一性を共有するとしても、ポリペプチドは野生型ポリペプチド「に由来する」。
【００７０】
ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）ポリペプチドは、単鎖１２６アミノ酸プレ−プロポリペプチドであり、そして以下で記載されるように、プロセシング後に最終的に野生型ＣＮＰ−２２（ｗｔＣＮＰ−２２）が生じる。ＮＰＰＣからのシグナルペプチドの除去によりプロＣＮＰが生じ、そしてさらにエンドプロテアーゼフーリンによって切断されて、活性５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−５３）が生じて、これがここでも分泌かつ切断されて、成熟した２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰまたはＣＮＰ−２２）が生成される。一態様において、「ＣＮＰ変異体」は、同じ数のアミノ酸残基に対して、野生型ＮＰＰＣと少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。
【００７１】
用語「有効量」は、対象の健康状態、病理、または疾患に所望の結果をもたらすのに十分な、または診断目的に十分な投薬量を意味する。所望の結果は、投薬量のレシピエントにおける主観的または客観的な向上を含み得る。「治療的有効量」は、健康に対して意図される有益な効果をもたらすのに有効な剤の量を指す。任意の特定の患者にとっての投薬量の特定の用量レベルおよび頻度は、変化してよく、そして、使用される具体的な化合物の活性；その化合物の生体利用性、代謝安定性、排泄速度、および作用の長さ；化合物の投与のモードおよび時間；患者の年齢、体重、健康状態、性別、および食事；ならびに特定の症状の重篤度を含む種々の要因によって決まると考えられることが理解されよう。
【００７２】
「処置」は、予防的処置または治療的処置または診断的処置を指す。特定の態様において、「処置」は、治療目的、予防目的、または診断目的での、化合物または組成物の、対象への投与を指す。
【００７３】
「予防的」処置は、病理を進行させるリスクを低下させる目的で、疾患の徴候を示さない対象、または疾患の初期の徴候しか示さない対象に施される処置である。本開示の化合物または組成物は、病理を進行させる見込みを減少させるための、または進行したならば、病理の重篤度を最小にするための予防的処置として、与えられてよい。
【００７４】
「治療的」処置は、病理の徴候または症候を示す対象に、この徴候または症候を減弱させ、または除外する目的で施される処置である。徴候または症候は、生化学的であっても、細胞性であっても、組織学的であっても、機能的であっても、身体的であっても、主観的であっても、または客観的であってもよい。本開示の化合物は、治療的処置として、または診断のために与えられてもよい。
【００７５】
「診断」は、病状の存在、程度、および／または性質を同定することを意味する。診断方法は、その特異性および選択性の点で異なる。特定の診断方法は、症状の決定的診断を下し得ないが、当該方法が診断を補助する陽性指標を提供するならば、十分である。診断処置は、対象の診断を補助するために、本開示の化合物を投与することとなる。
【００７６】
「軟骨関連バイオマーカー」または「軟骨関連マーカー」は、増殖因子、酵素、タンパク質、核酸、または他の検出可能な生物学的物質もしくは生物学的部分を指し、これらのレベルは、例えば、軟骨代謝、軟骨形成、および／または軟骨成長に関連して増減する。そのようなバイオマーカーは、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体の投与の前、その間、かつ／またはその後に測定されてよい。例示的な軟骨関連バイオマーカーとして、以下に限定されないが、ＣＮＰ、ｃＧＭＰ、コラーゲンＩＩ型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンＩＩ型およびそのフラグメント、コラーゲンＩ型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンＩ型およびそのフラグメント、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、コンドロイチン硫酸アグリカン、シンデカン−３、ならびにアネキシンＶＩが挙げられる。軟骨関連バイオマーカーは、以下に限定されないが、組織、血液、血清、血漿、髄液、滑液、および尿を含むいずれかの適切な生体サンプル中で測定され得る。一部の態様において、バイオマーカーは、有効性／薬力学的インビボ試験を経験した動物由来の、そして／またはエクスビボ試験の馴化培地由来の血液、血漿、または血清中で測定される。
【００７７】
特定の態様において、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルが測定され、そして対象に投与されるＣＮＰ変異体の投与の量または頻度が、測定されたバイオマーカーのレベルに従って調整され得る。一部の態様において、バイオマーカーのレベルは、「標的レベル未満」、または「標的レベル超」である。バイオマーカーの標的レベルは、ＣＮＰ変異体を受け入れた対象において治療的効果が観察されるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲である。特定の態様において、骨関節炎を患う対象についてのバイオマーカーの標的レベルは、正常な、非罹患対象において観察されるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲である。種々の態様において、治療的効果を示すために、バイオマーカーの標的レベルは、正常な対象において観察されるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲に等しい必要はないが、例えば、非罹患対象において観察されるバイオマーカーの「正常な」レベルまたはレベルの範囲の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％以内であってよい。
【００７８】
例えば、バイオマーカーのレベルが、軟骨の形成または成長に関連して増大するならば、治療的効果を示すバイオマーカーの標的レベルは、ＣＮＰ変異体を投与されなかった、骨関節炎に苦しむ患者におけるバイオマーカーのレベルよりも高くなり得、そして任意で、当該障害に苦しんでいない対象におけるバイオマーカーの「正常な」レベルよりも低くなり得、約「正常な」レベルとなり得、または「正常な」レベルを超え得る。一態様において、バイオマーカーのレベルが標的レベル未満であるならば、これは不十分な治療的効果を示し、投与されるＣＮＰ変異体の投与の量または頻度の増大が必要とされてよい。関連する態様において、バイオマーカーが標的レベルを上回るならば、これは、必要とするよりも多くのＣＮＰ変異体が投与されたことを示し、投与されるＣＮＰ変異体の投与の量または頻度の減少が必要とされてよい。
【００７９】
別の例として、バイオマーカーのレベルが、軟骨の形成または成長に関連して減少するならば、治療的効果を示すバイオマーカーの標的レベルは、ＣＮＰ変異体を投与されなかった、骨関節炎に苦しむ患者におけるバイオマーカーのレベルよりも低くなり得、そして任意で、当該障害に苦しんでいない対象におけるバイオマーカーの「正常な」レベルよりも高くなり得、約「正常な」レベルとなり得、または「正常な」レベルを下回り得る。そのような場合、ＣＮＰ変異体の投与の量および頻度の、先の調整の逆が当てはめられてよい。
【００８０】
「薬学的組成物」は、ヒトおよび哺乳類を含む対象動物での薬学的用途に適した組成物を指す。薬学的組成物は、治療的有効量のＣＮＰ変異体、任意で別の生物学的に活性な剤、および任意で薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤を含む。一態様において、薬学的組成物は、活性成分を含む組成物、およびキャリアを構成する不活性成分、ならびに当該成分の任意の２つ以上の組合せ、複合体形成、もしくは凝集に直接的に、もしくは間接的に起因し、または当該成分の１つもしくは複数の分離に起因し、または当該成分の１つもしくは複数の他のタイプの反応もしくは相互作用に起因する任意の産物を包含する。したがって、本開示の薬学的組成物は、本開示の化合物と、薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤とを混合することによって製造される任意の組成物を包含する。
【００８１】
「薬学的に許容されるキャリア」は、標準的な薬学的キャリア、バッファー等、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、５％デキストロース水溶液、およびエマルジョン（例えば、油／水エマルジョンまたは水／油エマルジョン）のいずれかを指す。賦形剤の非限定的な例として、アジュバント、結合剤、充填剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、滑走剤、甘味剤、香味剤、および着色剤が挙げられる。適切な薬学的キャリア、賦形剤、および希釈剤が、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)に記載されている。好ましい薬学的キャリアは、活性剤の意図される投与モードによって決まる。典型的な投与モードとして、経腸（例えば経口）または非経口（例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、もしくは腹膜内注射；または局所投与、経皮投与、もしくは経粘膜投与）が挙げられる。
【００８２】
「薬学的に許容される塩」は、薬学的用途用の化合物中に配合され得る塩であり、以下に限定されないが、金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）、およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含む。
【００８３】
「薬学的に許容される」または「薬理的に許容される」が意味するのは、生物学的に、またはそれ以外でも、望ましくないものではない材料である。すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こすこともなければ、それが含有される組成物の成分のいずれかと、または個体の体または体内に存在する任意の成分と有害に相互作用することもなく、個体に投与され得る。
【００８４】
用語「単位剤型」は、ヒト対象および動物対象についての単位投薬量として適した、物理的に不連続な単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量と算出された本開示の化合物の所定の量を、任意で、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリア、またはビヒクルを伴って、含有する。本開示の新規の単位剤型についての規格は、使用される特定の化合物、および達成されるべき効果、ならびに宿主における各化合物と関連する薬力学によって決まる。
【００８５】
「生理学的条件」は、動物（例えばヒト）の体内の条件を指す。生理学的条件として、以下に限定されないが、体温、ならびに生理学的イオン強度、ｐＨ、および酵素の水性環境が挙げられる。
【００８６】
本明細書において用いられる用語「対象」は、ヒトおよびヒト以外の哺乳類、ならびに非哺乳類を包含し、その程度は、そのようなヒト以外の種に投与された場合に、本明細書において開示される組成物が有用である範囲に及ぶ。哺乳類の例として、以下に限定されないが、哺乳綱：ヒト、ヒト以外の霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；畜産動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；家畜動物、例えばウサギ、イヌ、およびネコ；齧歯類、例えばラット、マウス、およびモルモットを含むラボ動物等の任意のメンバーが挙げられる。非哺乳類の例として、以下に限定されないが、脊椎動物、例えば鳥類および魚類が挙げられる。当該用語は、特定の年齢または性別を意味しない。
【００８７】
用語「ポリエチレングリコール」、「ＰＥＧ」、「ポリエチレンオキシド」、および「ＰＥＯ」は、特に明記されない限り、本明細書において互換的に用いられる。アミノ基を介して、数ｎを伴う「ＰＥＯｎ」ポリマーに結合されたＣＮＰ変異体は、一般に、式：ＣＨ３−［−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−］ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＲを有し、式中、ｎは、エチレンオキシド単位の数であり、Ｒは、残りのペプチドを表す。「ＰＥＯｎ」ポリマーは、任意で、カルボニル炭素と繰り返しのエチレンオキシド単位との間にアルキレン基、（ＣＨ２）ｍを有してよく、式中、ｍは、１から５の整数である。そのような「ＰＥＯｎ」（例えば、ＰＥＯ１２またはＰＥＯ２４）ポリマーは、単分散性であり、すなわち、特定の分子量の単一の不連続なポリマーである。同様に、アミノ基を介して、数ｎＫを伴う「ＰＥＧｎＫ」ポリマーに結合されたＣＮＰ変異体は、一般に、式：ＣＨ３−［−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−］ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＲを有し、式中、ｐは、１よりも大きな整数である。「ＰＥＧｎＫ」ポリマーもまた、任意で、カルボニル炭素と繰り返しのエチレンオキシド単位との間にアルキレン基、（ＣＨ２）ｍを有してよく、式中、ｍは、１から５の整数である。しかしながら、そのような「ＰＥＧｎＫ」（例えば、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、またはＰＥＧ２０Ｋ）ポリマーは、多分散性であり、すなわち、分子量の分布を有するポリマーの混合物を含有し、数ｎＫは、ポリマー数平均分子量（Ｍｎ）をキロダルトンで表す。例えば、ＣＮＰ変異体に結合する「ＰＥＧ２Ｋ」は、ポリマー数平均分子量がおおよそ２ｋＤａである多分散性ＰＥＧポリマーを表す。
【００８８】
ポリマー（例えばＰＥＧ）の質量範囲が（例えばｋＤａの単位で）与えられる場合、当該範囲は、特に明示的に示されない限り、多分散性混合物中の複数のポリマーの分子量の範囲ではなく、ポリマー数平均分子量の範囲を指す。
【００８９】
用語「ハロゲン」、「ハライド」、または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素、および／またはヨウ素を指す。
【００９０】
用語「アルキル」は、直鎖または分枝状の飽和一価炭化水素ラジカルを指し、アルキルは、本明細書中に記載される１つまたは複数の置換基Ｑで置換されていてもよい。特定の態様において、アルキルは、１から２０（Ｃ１〜２０）、１から１５（Ｃ１〜１５）、１から１２（Ｃ１〜１２）、１から１０（Ｃ１〜１０）、もしくは１から６（Ｃ１〜６）個の炭素原子を有する直鎖飽和一価炭化水素ラジカル、または３から２０（Ｃ３〜２０）、３から１５（Ｃ３〜１５）、３から１２（Ｃ３〜１２）、３から１０（Ｃ３〜１０）、もしくは３から６（Ｃ３〜６）個の炭素原子の分枝状飽和一価炭化水素ラジカルである。本明細書において用いられる直鎖Ｃ１〜６アルキル基および分枝状Ｃ３〜６アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。アルキル基の例として、以下に限定されないが、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピルを含む全ての異性体形態を含む）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルを含む全ての異性体形態を含む）、ペンチル（全ての異性体形態を含む）、およびヘキシル（全ての異性体形態を含む）が挙げられる。例えば、Ｃ１〜６アルキルは、１から６個の炭素原子の直鎖飽和一価炭化水素ラジカルまたは３から６個の炭素原子の分枝状飽和一価炭化水素ラジカルを指す。
【００９１】
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指す。特定の態様において、アルコキシ基は、本明細書中に記載される１つまたは複数の置換基Ｑで置換されていてもよい。
【００９２】
用語「ハロアルキル」は、１つまたは複数のハライド原子で置換されているアルキル基を指す。特定の態様において、ハロアルキル基は、１、２、３、４、５、または６個のハライド原子で置換されている。特定の態様において、ハロアルキル基は、本明細書中に記載される１つまたは複数の付加的な置換基Ｑで置換されていてもよい。
【００９３】
用語「シクロアルキル」は、本明細書中に記載される１つまたは複数の置換基Ｑで置換されていてもよい、環状飽和架橋一価炭化水素ラジカルおよび／または非架橋一価炭化水素ラジカルを指す。特定の態様において、シクロアルキルは、３から２０（Ｃ３〜２０）、３から１５（Ｃ３〜１５）、３から１２（Ｃ３〜１２）、３から１０（Ｃ３〜１０）、もしくは３から７（Ｃ３〜７）個の炭素原子を有する。シクロアルキル基の例として、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカリニル、およびアダマンチルが挙げられる。
【００９４】
用語「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、少なくとも１つの非芳香族環を含有する単環式非芳香族環系または多環式環系を指し、非芳香族環原子の１つまたは複数は、Ｏ、Ｓ、またはＮより独立して選択されるヘテロ原子であり、残りの非芳香族環原子は、炭素原子である。特定の態様において、ヘテロシクリル基または複素環基は、３から２０、３から１５、３から１０、３から８、４から７、または５から６個の環原子を有する。特定の態様において、ヘテロシクリルは、単環式、二環式、三環式、または四環式の環系であり、これらとして縮合環系または架橋環系が挙げられ得、そして窒素原子または硫黄原子は、酸化されていてもよく、窒素原子は、四級化されていてもよく、一部の環は、部分的に、または完全に飽和されていても、芳香族であってもよい。ヘテロシクリルは、任意のヘテロ原子または炭素原子にて主構造に取り付けられていてよく、これにより安定した化合物が生じる。複素環基の例として、以下に限定されないが、アクリジニル、アゼピニル、ベンズイミダゾリル、ベンズインドリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンズイソキサジニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾピラニル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオピラニル、ベンゾオキサジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロマニル、クロモニル、シンノリニル、クマリニル、デカヒドロイソキノリニル、ジベンゾフラニル、ジヒドロベンズイソチアジニル、ジヒドロベンズイソキサジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、ジオキソラニル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジオキソラニル、１，４−ジチアニル、フラノニル、フラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、イソクロマニル、イソクマリニル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、イソキサゾリジニル、イソオキサゾリル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、オキサジアゾリル、オキサゾリジノニル、オキサゾリジニル、オキサゾロピリジニル、オキサゾリル、オキシラニル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナトロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、プテリジニル、プリニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリドピリジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソ���ノリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチエニル、テトラゾリル、チアジアゾロピリミジニル、チアジアゾリル、チアモルホリニル、チアゾリジニル、チアゾリル、チエニル、トリアジニル、トリアゾリル、および１，３，５−トリチアニルが挙げられる。特定の態様において、複素環基は、本明細書中に記載される１つまたは複数の置換基Ｑで置換されていてもよい。
【００９５】
用語「アリール」は、少なくとも１つの芳香族炭化水素環を含有する単環式芳香族基または多環式一価芳香族基を指す。特定の態様において、アリールは、６から２０（Ｃ６〜２０）、６から１５（Ｃ６〜１５）、または６から１０個（Ｃ６〜１０）の環原子を有する。アリール基の例として、以下に限定されないが、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アズレニル、アントリル、フェナントリル、ピレニル、ビフェニル、およびテルフェニルが挙げられる。アリールはまた、二環式または三環式の炭素環を指し、環の少なくとも１つは、芳香族であり、その他は飽和していてもよいし、部分的に不飽和であってもよいし、芳香族、例えば、ジヒドロナフチル、インデニル、インダニル、およびテトラヒドロナフチル（テトラリニル）であってもよい。特定の態様において、アリール基は、本明細書中に記載される１つまたは複数の置換基Ｑで置換されていてもよい。
【００９６】
用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの芳香族環を含有する単環式芳香族基または多環式芳香族基を指し、少なくとも１つの芳香族環は、Ｏ、Ｓ、およびＮより独立して選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含有する。ヘテロアリール基の各環は、１もしくは２個のＯ原子、１もしくは２個のＳ原子、および／または１から４個のＮ原子を含有してよい。但し、各環中のヘテロ原子の総数が、４個以下であり、かつ各環が、少なくとも１個の炭素原子を含有する場合に限る。ヘテロアリールは、任意のヘテロ原子または炭素原子にて主構造に取り付けられてよく、これにより安定した化合物が生じる。特定の態様において、ヘテロアリールは、５から２０、５から１５、または５から１０個の環原子を有する。単環式ヘテロアリール基の例として、以下に限定さないが、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、およびトリアジニルが挙げられる。二環式ヘテロアリール基の例として、以下に限定されないが、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロモニル、クマリニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、プリニル、ピロロピリジニル、フロピリジニル、チエノピリジニル、ジヒドロイソインドリル、およびテトラヒドロキノリニルが挙げられる。三環式ヘテロアリール基の例として、以下に限定されないが、カルバゾリル、ベンズインドリル、フェナントロリニル、アクリジニル、フェナントリジニル、およびキサンテニルが挙げられる。特定の態様において、ヘテロアリール基は、本明細書中に記載される１つまたは複数の置換基Ｑで置換されていてもよい。
【００９７】
用語「置換されていてもよい」は、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールを含む基が、１つまたは複数の置換基Ｑ（一態様において、１、２、３、または４個の置換基Ｑ）で置換されていてよいことを意味することが意図され、各Ｑは、シアノ、ハロ、オキソ、ニトロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−Ｃ（ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＣ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｆ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＯＲｆ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（＝ＮＲｈ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）Ｒｆ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２Ｒｆ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＳＲｅ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｅ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇからなる群より独立して選択され、式中、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、およびＲｈは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、またはヘテロアリールであり；またはＲｆおよびＲｇは、これらが取り付けられるＮ原子と共に、ヘテロシクリルを形成する。
【００９８】
Ｂ．ＣＮＰ変異体
治療薬としてのＣＮＰ２２の使用は、血漿中での短い半減期によって制限される（J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)）。ヒト血漿中でのＣＮＰ２２の濃度は典型的に、５ピコモル未満である。ＣＮＰ２２は、ヒトにおいて、ＮＥＰおよびＮＰＲ−Ｃによって分解されて、循環系から一掃される（Growth Hormone & IGF Res., 16: S6-S14）。全身投与されるＣＮＰ２２を用いる全てのヒト試験および動物試験において、対象中でＣＮＰ２２濃度を増大させるのに、持続注入が用いられてきた。半減期がより長く、かつ官能性のレベルが少なくとも同程度であるＣＮＰペプチドが、ＣＮＰベースの治療戦略に有益であると考えられる。ＣＮＰ変異体はまた、関連する交付済み特許：米国特許第８，３７７，８８４号；米国特許第８，１９８，２４２号；および米国特許第８，５９８，１２１号に開示されている。列挙された特許はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【００９９】
本開示は、ＮＥＰおよび／またはＮＰＲ−Ｃに対する親和性が低く、かつＮＥＰによる切断に対する感受性および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスが低いが、官能性が野生型ＣＮＰ２２よりも実質的に同程度であり、または良好であるＣＮＰ変異体を提供する。ＮＥＰによる切断および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対するＣＮＰ変異体の感受性の低下により、変異体の血漿半減期または血清半減期が増大することによって、変異体が標的組織および標的部位に分配されて、所望の薬理効果を達成する機会が増大すると考えられる。特定の態様において、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、インビトロまたはインビボでの、ＮＥＰによる切断および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対する感受性が、ｗｔＣＮＰ２２と比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍低くなり、かつインビボでの血漿半減期または血清半減期が、ｗｔＣＮＰ２２と比較して、少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍増大した一方で、ｗｔＣＮＰ２２の官能性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％を保持し、またはｗｔＣＮＰ２２よりも官能性が少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍大きかった。ＣＮＰ官能性は、例えば、インビトロ試験またはインビボ試験において、軟骨の形成または成長と関連した１つまたは複数のバイオマーカー（例えばｃＧＭＰ）のレベルに関して評価することができる。また、ＣＮＰ官能性は、エクスビボ試験またはインビボ試験等において関節炎の軟骨変性の防止を判定することによって評価することができる。
【０１００】
ＮＥＰの天然の基質は小さく、ナトリウム利尿ペプチド（約２．２から約３．２ｋＤａ）は、ＮＥＰの天然の基質の中で最も大きい。Ｘ線結晶解析に従えば、ＮＥＰ活性部位は、中心の空洞の内側に深く埋められており、基質分子のサイズを約３ｋＤａ以下に効果的に制限している（Oefner et al., J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000)）。ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達研究に基づけば、ＣＮＰ−２２の変異体、例えばＣＮＰ−１７（ＣＮＰ２２の環状ドメイン、Ｃｙｓ６〜Ｃｙｓ２２のみを保持している）、およびＣＮＰ−５３（Ｎ末端にて３１個のアミノ酸伸長を有するＣＮＰ−２２）は依然として、２．２ｋＤａのｗｔＣＮＰ−２２と同様に、ＮＰＲ−Ｂに結合してこれを活性化することができる。したがって、本開示は、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端にて、天然ポリマー（例えばペプチド）および／または合成ポリマー（例えばＰＥＧ）に結合されるＣＮＰ変異体を包含し、これは、ＮＥＰ耐性の増大を示すが、ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達受容体に結合して、これを活性化する能力を保持する。
【０１０１】
一態様において、本開示は、一般式：
2019505486.tif 000006
によって表されるＣＮＰ変異体を包含し、式中：
（ｘ）および（ｚ）は、それぞれ独立して、天然のポリマー（例えば、少なくとも１つのアミノ酸を含有するペプチド配列）および／または本明細書中に記載される合成ポリマー（例えばＰＥＧ）であり、ＣＮＰ変異体の総質量は、本明細書中に一般に記載される範囲によって特徴付けられ、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲である。一態様において、Ｃｙｓ６からＣｙｓ２２の残基は、環状部分を形成する。一態様において、（ｘ）および／または（ｚ）は、ＮＰＰＣポリペプチドまたは非ＣＮＰポリペプチド（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＩｇＧ等）に由来するアミノ酸伸長を含み、当該伸長は、１から４０、１から３５、１から３１、５から３５、５から３１、または５から１５個のアミノ酸を含有する。別の態様において、ＣＮＰ変異体は、別の天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド模倣体、および／またはペプチド結合イソスターによる１つまたは複数の改変および／または置換を、ＣＮＰ２２の以下の位置の１つまたは複数にて含む：ＣＮＰ２２：Ｇｌｙ１、Ｌｙｓ４、Ｇｌｙ５、Ｃｙｓ６、Ｐｈｅ７、Ｇｌｙ８、Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１６、Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｌｅｕ２０、およびＧｌｙ２１。
【０１０２】
別の態様において、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば、約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲によって特徴付けられ、ＮＥＰ分解に対する耐性が増大するように設計されているＣＮＰ変異体が、一般式：
2019505486.tif 000007
によって表され、式中：
（ｘ）は、合成もしくは天然のポリマー基、またはそれらの組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例として、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）があり、天然のポリマー基の非限定的な例として、１から３５個のアミノ酸を含有し、かつＮＰＰＣまたはその、置換および／もしくは欠失を有する変異体、ＡＮＰ、ＢＮＰ、または他の非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド、例えば、血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリン、または線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）に由来するアミノ酸配列があり；
（ｚ）は、不在であってもよいし、合成もしくは天然のポリマー基、またはそれらの組合せであってもよく、合成ポリマー基の非限定的な例として、ＰＥＧがあり、天然ポリマー基の非限定的な例として、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰ、またはＢＮＰ）、または非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧ）に由来するアミノ酸配列があり；かつ
（ｂ）および（ｈ）は、独立して、その位置にて野生型Ｌｙｓであってもよいし、保存的アミノ酸置換基、あるいは以下に限定されないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＳｅｒを含む、任意の天然もしくは非天然のアミノ酸、または側鎖上に反応性第一級アミンを有していないペプチド模倣体で置換されていてもよい。一態様において、（ｂ）はＡｒｇである。別の態様において、ＮＥＰ耐性の向上のために、（ｂ）はＧｌｙでない。
【０１０３】
さらに別の態様において、（ｈ）はＡｒｇでない。
ＮＰＰＣまたはその変異体に由来するアミノ酸配列の非限定的な例として、以下が挙げられる：
2019505486.tif 000008
非ＣＮＰポリペプチド、例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ、血清アルブミン、およびＩｇＧに由来するアミノ酸配列の非限定的な例として、以下が挙げられる：
2019505486.tif 000009
【０１０４】
一態様において、本明細書中に記載される、（ｘ）基および／または（ｚ）基を有するＣＮＰ変異体のいずれかのＮ末端（ｘ）基および／またはＣ末端（ｚ）基は、独立して、もしあれば、少数の、酸性の天然または非天然のアミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を含有するアミノ酸配列を含む。別の態様において、（ｘ）および／または（ｚ）は、ＣＮＰ２２のｐＩ（ｐＩ８．９）と同程度のアルカリ性ｐＩを保つために、塩基性の天然または非天然のアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＨｉｓ）が富化されている。一態様において、ＣＮＰ変異体のｐＩは、約８から約１０．５の範囲にあり、ＣＮＰ変異体が、関節炎の関節の軟骨細胞を包囲する細胞外マトリックスを通ってより容易に拡散することができるように設計されている。より厳密な態様において、ＣＮＰ変異体のｐＩは、約８．５から約１０．５、または約８．５から約１０、または約９から約１０である。
【０１０５】
さらに別の態様において、（ｘ）および／または（ｚ）は、極性のある天然または非天然のアミノ酸が富化されており、水性溶解度が増大するように設計されている。さらに別の態様において、（ｘ）および／または（ｚ）は、もしあれば、少数の、疎水性の天然または非天然のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔ）を含有する。
【０１０６】
更なる態様において、ＣＮＰ変異体のＮ末端は、少なくとも１つのグリシン残基で終わり、血清半減期が増大するように設計されている。関連する態様において、ピログルタミン形成を防止するために、普通であればグルタミンで終わるＣＮＰ変異体のＮ末端は、グリシン残基で終わる。一態様において、（ｘ）基は、Ｎ末端が少なくとも１つのグリシン残基で終わるアミノ酸伸長を含有する。別の態様において、（ｘ）および／または（ｚ）は、２つの隣接する塩基性の天然または非天然のアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ−ＬｙｓまたはＡｒｇ−Ａｒｇ）を含有せず、プロテアーゼフーリンによる切断に対する感受性を減少させるように設計されている。一態様において、（ｘ）は、ＣＮＰ２２のＧｌｙ１に対応する位置の直ぐ前に、２つの隣接する塩基性アミノ酸を含有しない。
【０１０７】
さらに別の態様において、ＣＮＰ変異体の（ｘ）基および／または（ｚ）基は、ＮＰＰＣに由来する（例えばＣＮＰ５３に由来する）アミノ酸配列を含む。一態様において、（ｘ）は、ＡＮＰまたはＢＮＰのＮ末端尾部に由来するアミノ酸配列を含む。別の態様において、（ｚ）は、ＡＮＰまたはＢＮＰのＣ末端尾部に由来するアミノ酸配列を含む。更なる態様において、（ｘ）および／または（ｚ）は、非ナトリウム利尿ポリペプチド、例えば、ＩｇＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、ＦＧＦ−２、および骨標的タンパク質（例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシン、およびシアロタンパク質）に由来するアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
ＣＮＰ２２またはその変異体が、Ｎ末端（ｘ）基および／またはＣ末端（ｚ）基を有してよい、本明細書中に記載される任意の態様において、（ｘ）および／または（ｚ）は、独立して、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の機能ドメインに由来するアミノ酸配列を含有してよい。ＢＭＰの機能ドメインに由来するＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸伸長が、ＣＮＰ変異体の総質量を、本明細書中に一般に記載される範囲、例えば、約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲に特徴づけられるように増大させることによって、ＣＮＰ変異体のＮＥＰ耐性、そしてそれ故に血清半減期を増大させることができる。また、特定のＢＭＰが、骨および軟骨の形成を誘導する成長因子およびサイトカインであるので、ＢＭＰの機能ドメインに由来するフラグメントが、ＣＮＰ２２またはその変異体の環状ドメインによるＮＰＲ−Ｂのグアニリルシクラーゼ機能の活性化と異なる機構によって、軟骨細胞、軟骨、または骨の成長を促進することができる。骨の形成および発達、軟骨の形成および発達、ならびに／または骨芽細胞の分化を促進するＢＭＰの非限定的な例として、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ８ａが挙げられる。一態様において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、独立して、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、またはＢＭＰ８ａのＣ末端部分における最後の１４０個のアミノ酸に由来するアミノ酸配列に結合される。
【０１０９】
一態様において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ１７のＮ末端および／またはＣ末端にて、以下に限定されないが、
2019505486.tif 000010
を含むアミノ酸伸長を含有する。
【０１１０】
別の態様において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の位置４にて、Ｋ４Ｒ置換を有する。ＣＮＰ（Ｋ４Ｒ）変異体の非限定的な例として、以下が挙げられる：
2019505486.tif 000011
【０１１１】
更なる態様において、ＣＮＰ変異体は、アミノ酸の付加、欠失、および／または置換を有するＣＮＰ２２またはその変異体、ならびに、ＣＮＰペプチドのＮ末端に対する、ＣＮＰ以外のポリペプチドもしくはタンパク質に由来するペプチドフラグメント、または非ＣＮＰポリペプチドもしくはタンパク質全体を含むキメラであり、ＣＮＰ２２またはその変異体は、１つまたは複数のアミノ酸残基のＮ末端アミノ酸伸長を有してもよい。特定の態様において、ＣＮＰキメラは、１つまたは複数のアミノ酸残基のＮ末端アミノ酸伸長を有するＣＮＰ２２またはその変異体を含む。特定の態様において、ＣＮＰキメラは、ＣＮＰ２２またはその変異体の第１の位置（ＣＮＰ２２の場合、Ｇｌｙ）の直ぐ前に、リジン−リジン（ＫＫ）残基またはＧＡＮＫＫ残基を含有する。他の態様において、ＣＮＰキメラは、リジン−リジンと異なる１または２個の残基を、ＣＮＰ２２またはその変異体の第１の位置の直ぐ前に含有する。ＣＮＰ２２またはその変異体の第１の位置に直ぐ先行し得る残基の非限定的な例として、ＫＰ、ＰＫ、ＰＲ、ＰＱ、ＱＫ、ＱＱ、ＲＲ、ＳＳ、ＧＡＮＫＰ、ＧＡＮＰＫ、ＧＡＮＰＲ、ＧＡＮＰＱ、ＧＡＮＱＫ、ＧＡＮＱＱ、ＧＡＮＲＲ、およびＧＡＮＳＳが挙げられる。
【０１１２】
別の態様において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２およびＮ末端ペプチドフラグメントを含むキメラであり、以下に限定されないが、
2019505486.tif 000012
を含む。
【０１１３】
さらに別の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端ペプチドフラグメント、およびアルギニンがＣＮＰ２２のＬｙｓ４に置換されているＣＮＰ２２（「ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）」）を含むキメラであり、以下に限定されないが、
2019505486.tif 000013
を含む。
【０１１４】
ＩｇＧおよびＣＮＰ２２またはその変異体を含むキメラは、とりわけ、ＮＥＰ分解に対する耐性の増大および血清アルブミンへの結合の減少のために設計されている。ＨＳＡの表面フラグメントを含むＣＮＰキメラは、とりわけ、免疫原性の減少、および血清アルブミンへの結合の減少のために設計されている。Ｎ末端にてカチオン、ヒスチジンリッチ、非リジン、非アルギニン配列を含有するＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２およびＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラは、とりわけ、プロテアーゼに対する安定性の増大のために設計されている。オステオクリンフラグメントを含有するキメラは、プロテアーゼ（例えばフーリン）切断直後に、骨成長板にてオステオクリンフラグメントを放出するように設計されており、そこでフラグメントは、クリアランス受容体ＮＰＲ−Ｃを阻害すると考えられる。ＦＧＦ２ヘパリン結合フラグメントを含むキメラに関して、フラグメントへのヘパリン結合は、キメラを分解から保護することによって、より長い血清半減期を実現するように設計されている。フィブロネクチン、フィブリノゲン、または亜鉛フィンガーフラグメントを含有するキメラが、いくつかある特徴の中で特に、血清アルブミンへの結合の減少のために設計されている。
【０１１５】
理論によって拘束されることを意図するものではないが、ｗｔＣＮＰ２２と比較して、ＮＥＰ分解に対する耐性が増大し、かつ官能性（例えば、ＮＰＲ−Ｂへの結合およびｃＧＭＰシグナル伝達の刺激）が同程度であり、または向上した、分子量が約２．６または２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａのＣＮＰ変異体は、血漿タンパク質、例えば血清アルブミンに強固に結合しないならば、より効果的であり得る。血漿タンパク質（例えば血清アルブミン）に強固に結合しないＣＮＰ変異体は、軟骨を通って拡散して、関節炎の関節の軟骨細胞に到着して、ｃＧＭＰシグナル伝達のためにＮＰＲ−Ｂに結合してこれを活性化するのに、より効果的であり得る。一態様において、血漿タンパク質（例えば血清アルブミン）への結合の減少のために設計されているＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはその変異体およびＩｇＧ由来のペプチドフラグメントを含むキメラである。別の態様において、血漿タンパク質への結合の減少のために設計されているＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）およびポリペプチド（例えば、ＩｇＧ、ＨＳＡ、フィブロネクチン、フィブリノゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド等）由来のフラグメントを含むキメラである。さらに別の態様において、血漿タンパク質への結合の減少のために設計されているＣＮＰ変異体は、親水性または水溶性のポリマーに結合されたＣＮＰ２２またはその変異体を含む。一態様において、親水性または水溶性のポリマーは、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。別の態様において、親水性または水溶性のポリマー（例えばＰＥＧ）は、生理学的条件下で、ポリマーに負の電荷を与える１つまたは複数の官能基、例えば、カルボキシル基、硫酸基、もしくはリン酸基、またはそれらの組合せにより官能化される。
【０１１６】
更なる態様において、本開示のＣＮＰ変異体として、ヒトＣＮＰ−１７（ｈＣＮＰ−１７）からヒトＣＮＰ−５３（ｈＣＮＰ−５３）に及び、かつｈＣＮＰ−５３に由来する野生型アミノ酸配列を有する切断型（truncated）ＣＮＰペプチドが挙げられる。そのような切断型ＣＮＰペプチドとして、以下が挙げられる：
2019505486.tif 000014
2019505486.tif 000015
【０１１７】
特定の態様において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ−１７、ＣＮＰ−２２、またはＣＮＰ−５３を含まない。
【０１１８】
別の態様において、ｈＣＮＰ−１７からｈＣＮＰ−５３に及ぶ切断型ＣＮＰペプチドは、特定の切断型ＣＮＰペプチドのアミノ酸位置の任意の１つまたは複数にて、本明細書中に記載される、アミノ酸の付加、欠失、および／または天然もしくは非天然のアミノ酸もしくはペプチド模倣体（例えばペプチド結合イソスター）との置換を含有してよい。さらに別の態様において、野生型配列、またはアミノ酸の付加、欠失、および／もしくは置換を有する切断型ＣＮＰペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部の部位にて、本明細書中に記載される部分のいずれかに結合されてよく、これらとして、以下に限定されないが、滑膜標的部分または軟骨標的部分（例えば、ビスホスホネート、骨標的ペプチド配列または軟骨標的ペプチド配列（例えば、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｕ）、骨タンパク質（例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質）の骨標的ドメインに由来するペプチド配列）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ）の機能ドメインに由来するペプチド配列、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＡＮＰ、ＢＮＰ）に由来するペプチド配列、非ナトリウム利尿起源のポリペプチド（例えば、血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、ＦＧＦ−２、オステオクリン）に由来するペプチド配列、腎クリアランスを減少させる部分（例えば、負に帯電したＰＥＧ部分）、親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）、炭水化物（例えば、関節炎の関節内の細胞の表面上の受容体によって認識される炭水化物）、疎水性の酸（例えば、Ｃ５〜Ｃ１２カルボン酸、天然の脂肪酸）、リン脂質、およびそれらの組合せが挙げられる。一態様において、野生型配列、またはアミノ酸の付加、欠失、および／もしくは置換を有し、かつ任意で、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部の部位にて１つまたは複数の部分に結合されている切断型ＣＮＰペプチドは、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲によって特徴付けられる。
【０１１９】
更なる態様において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ３７の誘導体であり、これは、
2019505486.tif 000016
である。ＣＮＰ３７変異体は、ＣＮＰ３７の３７の位置の任意の１つまたは複数にて、アミノ酸の付加、欠失、および／または天然もしくは非天然のアミノ酸もしくはペプチド模倣体（例えばペプチド結合イソスター）との置換を含有してよい。ＣＮＰ２２のナンバリングに基づいて、ＣＮＰ３７においてなされ得る置換の非限定的な例として、Ｋ４Ｒ、Ｇ５Ｓ、ＧＳＲ、Ｇ８Ｓ、Ｋ１０Ｒ、Ｇ１５Ｓ、Ｓ１６Ｑ、Ｍ１７Ｎ、Ｇ１９Ｒ、およびそれらの組合せが挙げられる。一態様において、ＣＮＰ３７誘導体は、Ｍｅｔ１７の、天然（例えばアスパラギン）または非天然のアミノ酸またはペプチド模倣体への置換を含有し、部分的にメチオニンの硫黄原子の酸化を回避するように設計されている。別の態様において、ＣＮＰ３７変異体は、Ｌｙｓ８、Ｌｙｓ１０、Ｌｙｓ１４、および／またはＬｙｓ１５（ＣＮＰ３７のＮ末端からのナンバリングに基づく）の、非塩基性の天然または非天然のアミノ酸またはペプチド模倣体への置換を含有し、部分的にアルブミン結合を減少させるように設計されている。
【０１２０】
アミノ酸の付加、欠失、および／もしくは置換に加えて、またはそれらの代わりに、ＣＮＰ３７誘導体は、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部の部位にて、以下に限定されないが、骨標的部分または軟骨標的部分（例えば骨標的ペプチドドメイン）、腎クリアランスを減少させる部分（例えば、負に帯電したＰＥＧ部分）、親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）、１つまたは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列（例えば、オステオクリン「ＮＰＲ−Ｃインヒビター」フラグメント）、炭水化物（例えば、骨成長板の細胞の表面上の受容体によって認識される炭水化物）、疎水性の酸（例えば、Ｃ５〜Ｃ１２カルボン酸および天然の脂肪酸）、およびそれらの組合せを含む、本明細書中に記載される部分のいずれかに結合されてよい。
【０１２１】
一態様において、ＣＮＰ変異体は、フーリン切断部位（下線が引かれている）にて突然変異／置換を有して、フーリンプロテアーゼに対するインビボ耐性を向上させるように設計されており、かつ／またはＮ末端にてグリシン（下線が引かれている）を含有して、血漿安定性を向上させて、ピログルタミン形成を防止するように設計されている改変ＣＮＰ３７ペプチドである。そのようなＣＮＰ３７変異体として、以下に限定されないが、
2019505486.tif 000017
が挙げられる。
【０１２２】
更なる態様において、本開示のＣＮＰ変異体として、本明細書中に記載される融合タンパク質プロセスによって生成され得るＣＮＰペプチドおよびその変異体が挙げられる。化学切断もしくはタンパク質分解切断またはタンパク質自己切断を用いて、本明細書中に記載される融合タンパク質プロセスによって生成され得るＣＮＰ変異体の非限定的な例として、以下が挙げられる：
2019505486.tif 000018
2019505486.tif 000019
【０１２３】
融合タンパク質の化学切断またはタンパク質分解切断の意図された部位が、標的ＣＮＰ変異体自体のアミノ酸配列内に存在していない限り、他のＣＮＰ変異体（ｈＣＮＰ−１７からｈＣＮＰ−５３に及び、かつ野生型配列またはアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を有する、切断型ＣＮＰペプチドを含む）も、本明細書中に記載される融合タンパク質プロセスによって生成され得る。非限定的な例として、本明細書中に記載される融合タンパク質プロセスは、ギ酸切断を用いて切断型ｗｔＣＮＰ３４を生成するために使用され得る。
【０１２４】
付加的な態様において、アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）残基および／またはグルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）残基を有する、本明細書中に記載されるＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体のいずれかについて、これらが野生型配列を有するか非天然のアミノ酸配列を有するかに拘らず、任意のＡｓｎ残基および／または任意のＧｌｎ残基が独立して、ＡｓｎからＧｌｎ等の保存的置換を含む、任意の他の天然または非天然のアミノ酸で置換されていてよい。そのような置換は部分的に、アスパラギンおよび／またはグルタミンの、可能性があるいかなる脱アミドも最小にし、または回避するように設計されている。任意のＡｓｎ残基および／または任意のＧｌｎ残基が独立して、任意の他の天然または非天然のアミノ酸で置換されていてよい（ＡｓｎからＧｌｎ等の保存的置換を含む）、ＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体の非限定的な例として、ｗｔＣＮＰ３４、ｗｔＣＮＰ３７、Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７、Ｐｒｏ−ｗｔＣＮＰ３７、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７、ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、Ｐｒｏ−ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）、およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）が挙げられる。特定の態様において、本明細書中に記載されるＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体のアスパラギン残基は、グルタミン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸で置換されていない。特定の態様において、本明細書中に記載されるＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体のグルタミン残基は、アスパラギン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸で置換されていない。
【０１２５】
非限定的な例として、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７
2019505486.tif 000020
のアスパラギン残基７および／または１５は独立して、アスパラギン残基の、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸への可能性があるいかなる脱アミドも回避するために、グルタミンを含む任意の他の天然または非天然のアミノ酸で置換されていてよい。特定の態様において、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７のアスパラギン残基７および／または１５は、グルタミン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸で置換されていない。
【０１２６】
しかしながら、本開示は、脱アミドまたは脱アミド様反応（例えば異性化）に感受性の任意の１つまたは複数の、最大全ての残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、変換される残基あたり任意の程度、最大１００％の変換まで、他の残基に変換されていてよいＣＮＰ変異体を包含することが理解される。特定の態様において、本開示は：（１）任意の１つまたは複数、最大全てのアスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）残基が、脱アミドを介して、アスパラギン酸もしくはアスパルテートに、かつ／またはイソアスパラギン酸もしくはイソアスパルテートに変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり；（２）任意の１つまたは複数、最大全てのグルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）残基が、脱アミドを介して、グルタミン酸もしくはグルタメートに、かつ／またはイソグルタミン酸もしくはイソグルタメートに変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり；（３）任意の１つまたは複数、最大全てのアスパラギン酸またはアスパルテート（Ａｓｐ／Ｄ）残基が、脱アミド様反応（異性化とも呼ばれる）を介して、イソアスパラギン酸またはイソアスパルテートに変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり；（４）任意の１つまたは複数、最大全てのグルタミン酸またはグルタメート（Ｇｌｕ／Ｅ）残基が、脱アミド様反応（異性化とも呼ばれる）を介して、イソグルタミン酸またはイソグルタメートに変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり；あるいは（５）上記のものが組み合わされている、ＣＮＰ変異体を包含する。
【０１２７】
非限定的な例として、本開示は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７
2019505486.tif 000021
の任意の１つまたは複数、最大全てのアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、および／またはグルタミン酸残基が、先に記載されるように、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／もしくはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）グルタミン酸／グルタメートおよび／もしくはイソグルタミン酸／イソグルタメート、（３）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、ならびに／または（４）イソグルタミン酸／イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、ＣＮＰ変異体を包含する。
【０１２８】
更なる例として、本開示は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７
2019505486.tif 000022
の任意の１つまたは複数、最大全てのアスパラギンおよび／またはアスパラギン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／もしくはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、ならびに／または（２）イソアスパラギン酸／イソアスパルテートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、ＣＮＰ変異体を包含する。
【０１２９】
別の例として、本開示は、Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７
2019505486.tif 000023
の任意の１つまたは複数、最大全てのアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、および／またはグルタミン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／もしくはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）グルタミン酸／グルタメートおよび／もしくはイソグルタミン酸／イソグルタメート、（３）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、ならびに／または（４）イソグルタミン酸／イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、ＣＮＰ変異体を包含する。
【０１３０】
さらに別の例として、本開示は、ｗｔＣＮＰ３７
2019505486.tif 000024
の任意の１つまたは複数、最大全てのアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、および／またはグルタミン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／もしくはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）グルタミン酸／グルタメートおよび／もしくはイソグルタミン酸／イソグルタメート、（３）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、ならびに／または（４）イソグルタミン酸／イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、ＣＮＰ変異体を包含する。
【０１３１】
更なる例として、本開示は、ＨＳＡ−ｗｔＣＮＰ２７キメラ、
2019505486.tif 000025
の任意の１つまたは複数、最大全てのアスパラギン、アスパラギン酸、および／またはグルタミン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／もしくはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、ならびに／または（３）イソグルタミン酸／イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、ＣＮＰ変異体を包含する。
【０１３２】
更なる例として、本開示は、Ｐｒｏ−ＨＳＡ−ｗｔＣＮＰ２７キメラ、
2019505486.tif 000026
の任意の１つまたは複数、最大全てのアスパラギン、アスパラギン酸、および／またはグルタミン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／もしくはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、ならびに／または（３）イソグルタミン酸／イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、ＣＮＰ変異体を包含する。
【０１３３】
また、本開示は、任意の１つまたは複数、最大全てのメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）残基が、任意の化学的に実行可能な酸化型（例えば、スルホキシドおよび／またはスルホン）に酸化されていてよく、転化は、酸化される残基あたり最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である、ＣＮＰ変異体を包含する。
【０１３４】
別の態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端にて、細胞膜または細胞バリアの全体にわたって変異体の転座を促進する部分に結合されるＣＮＰ２２またはその変異体を含む。一態様において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端にて、細胞膜または細胞バリアの全体にわたって変異体の輸送を促進する（活性ペプチドトランスポータを介することを含む）ペプチド配列に結合される。
【０１３５】
更なる態様において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、化学部分、例えば、天然ポリマーおよび／または合成ポリマーに結合されて、改変ＣＮＰペプチドの総質量が、本明細書中に一般に記載される範囲、例えば、約２．６または２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲に増大する。一態様において、化学部分は、生体適合性の、親水性または水溶性の天然ポリマー（例えば、ペプチド、炭水化物）または合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ（またはＰＥＯ））である。
【０１３６】
特定の態様において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーに結合されて、本明細書中に一般に記載される、例えば約２．６または２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲によって特徴付けられる総質量となる。ＣＮＰ２２またはその変異体のペグ化が、とりわけ、腎クリアランスを減少させ、かつプロテアーゼ耐性を増大させることによって、免疫原性を減少させて半減期を向上させるように設計されている。ＰＥＧ部分が、ＣＮＰ２２、または、以下に限定されないが、ＣＮＰ−１７（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６〜Ｃｙｓ２２環化部分）、ＣＮＰ３７、ならびにＮ末端および／もしくはＣ末端のアミノ酸伸長、アミノ酸置換、および／もしくはアミノ酸欠失を有するＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２、もしくはＣＮＰ３７の変異体を含む、本明細書中に記載される任意の変異体のＮ末端および／またはＣ末端に取り付けられていてよい。一態様において、ＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２、もしくはＣＮＰ３７、またはそれらの変異体のＬｙｓ４残基および／またはＬｙｓ１０残基は、天然または非天然のアミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＣｉｔ）または側鎖上に反応性第一級アミンを含有しないペプチド模倣体で置換されて、これらのリジン残基の、可能性があるいかなるペグ化も排除している。一態様において、ＣＮＰペプチドのＬｙｓ４残基および／またはＬｙｓ１０残基は、Ａｒｇで置換されている。別の態様において、Ｌｙｓ１０残基は、Ａｒｇで置換されていない。
【０１３７】
更なる態様において、Ｎ末端にＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分およびアミノ酸伸長を有するＣＮＰ変異体（ＣＮＰ２２およびその変異体を含む）は、ＣＮＰ２２のＧｌｙ１に対応する位置の直ぐ前の位置にアルギニンを含有する。そのようなペグ化ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ分解に対する耐性の増大、血清アルブミンへの結合の減少、およびＣＮＰ機能活性の増強（例えば、ｃＧＭＰシグナル伝達の活性化）のために設計されている。ペグ化ＣＮＰ変異体の非限定的な例として、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＱＱ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）、ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）、ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）、ＰＥＯ２４−ＥＲ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）、ＰＥＯ１２−ＥＲ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）、ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）、ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）、ＰＥＯ２４−Ｒ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）、およびＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）が挙げられ、ＰＥＯ２４は、単分散性の１．２ｋＤａのＰＥＧポリマーであり、ＰＥＯ１２は、単分散性の０．６ｋＤａのＰＥＧポリマーである。一態様において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーは、ＣＮＰ変異体のＮ末端に結合されている。
【０１３８】
本開示は、タイプ（例えば、ホモポリマーまたはコポリマー；ランダムコポリマー、交互コポリマー、またはブロックコポリマー；直鎖または分枝状；単分散性または多分散性）、結合（例えば、加水分解性の結合または安定した結合、例えば、アミド、イミン、アミナール、アルキレン、またはエステル結合）、結合部位（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端であり、好ましくは、ＣＮＰの環化領域（ＣＮＰ２２の残基６〜２２に対応する）中のいかなる残基でもない）、および長さ（例えば、約０．２、０．４、または０．６ｋＤａから約２、３、４、または５ｋＤａ）が異なり得る親水性ポリマーまたは水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）の使用を意図する。親水性ポリマーまたは水溶性ポリマーは、当技術分野において公知のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）系もしくはアルデヒド系の化学物質、または他の化学物質によって、ＣＮＰペプチドに結合されていてよい。そのようなＣＮＰ変異体は、例えば、ｗｔＣＮＰ２２（２．２ｋＤａ）、ｗｔＣＮＰ２２の環化領域（残基６〜２２）のみを保持するＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２もしくはＣＮＰ１７のＮ末端および／もしくはＣ末端にてアミノ酸伸長を有するＣＮＰ変異体、またはアミノ酸の置換、付加、および／もしくは欠失を有する変異体、例えば、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）、ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、Ｒ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、ＥＲ−ＣＮＰ２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、およびＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）を用いて生じさせることができる。一態様において、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば約２．６または２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲によって特徴付けられるＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に、ＮＨＳもしくはアルデヒド系の化学物質を介して結合した単分散性の直鎖ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分、またはＮ末端および／もしくはＣ末端に、ＮＨＳ系の化学物質を介して結合した２腕もしくは３腕の分枝状ＰＥＧ部分を含有する。本開示はまた、腎クリアランスの減少のために設計されている、負に帯電したＰＥＧ−ＣＮＰ変異体を包含し、以下に限定されないが、カルボキシル化された化合物、硫酸化された化合物、およびリン酸化された化合物を含む（Caliceti, Adv. Drug Deliv. Rev., 55: 1261-77 (2003)；Perlman, J. Clin. Endo. Metab., 88: 3227-35 (2003)；Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo., 29: 440-444 (1986)；Vehaskari, Kidney Intl, 22: 127-135 (1982)）。一態様において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分は、カルボキシル基、硫酸基、および／またはリン酸基を含有する。
【０１３９】
別の態様において、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部の部位に結合されるＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分は、生理学的条件下で正に帯電する１つまたは複数の官能基を含有する。そのようなＰＥＧ部分は、とりわけ、軟骨組織へのそのようなペグ化ＣＮＰ変異体の分布を向上させるように設計されている。一態様において、そのようなＰＥＧ部分は、１つまたは複数の一級アミノ基、二級アミノ基、もしく三級アミノ基、四級アンモニウム基、および／または他のアミン含有（例えば尿素）基を含有する。
【０１４０】
一態様において、本開示は、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのＰＥＧ（またはＰＥＯ）に、ＮＨＳ系またはアルデヒド系の化学物質を介して結合されたＣＮＰ２２またはその変異体を包含し、式中、ｎは、約６から約１００の整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．３ｋＤａから約５ｋＤａである。別の態様において、ｎは、約１２から約５０の整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．６ｋＤａから約２．５ｋＤａである。さらに別の態様において、ｎは、約１２から約２４であり、ＰＥＧポリマーは、約０．６ｋＤａから約１．２ｋＤａである。さらに別の態様において、ＰＥＧポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基でキャッピングされている。特定の態様において、エンドキャッピング基は、アルキル基、例えば、メチル等の低級アルキル基である。
【０１４１】
更なる態様において、本開示は、中立エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）を含むペプチダーゼによる切断に対する感受性を減少させた、１つまたは複数のペプチド結合またはペプチド結合イソスターを有するＣＮＰ変異体を提供する。ＮＥＰは、大きな疎水性残基のアミノ末端にて基質ペプチド結合を切断する、膜結合亜鉛依存性エンドペプチターゼである。ゆえに、ＮＥＰの切断部位にあたるペプチド結合の、非天然ペプチドまたは非ペプチド結合への改変は、ＮＥＰ切断の効率を排除し得、または低下させ得る。
【０１４２】
ＡＮＰおよびＣＮＰについて、最初に環化領域内のＣｙｓ６−Ｐｈｅ７結合にて、その後構造の残りの全体を通じて他の場所にて、ＮＥＰ切断が起こることが報告されている。ＢＮＰについて、切断は、最初にペプチドＮ末端にて、その後環状構造内で起こることが報告されている。ＣＮＰ上の第一のＮＥＰ切断部位は、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合であることが報告されているが、ｗｔＣＮＰ２２がインビトロで２．５分間ＮＥＰ消化に曝された場合に、全ての考えられる部位が予想外に加水分解され、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７ペプチド結合およびＧｌｙ８−Ｌｅｕ９ペプチド結合が、僅かであるが最も不安定であった。
【０１４３】
ＮＥＰの基質特異性は主に、２つの基質−結合亜部位、Ｓ１’およびＳ２’によって判定される（Oefner et al., J. Mol. Biol. 296:341-349 (2000)）。Ｓ１’部位は、Ｎ末端ペプチド結合が加水分解に曝される大きな疎水性Ｐ１’残基（例えば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびＭｅｔ）を受け入れる。Ｓ２’部位は一般に、Ｐ２’（例えば、ＧｌｙまたはＳｅｒ）と呼ばれる、より小さな残基を好む。ＣＮＰの場合、Ｐｈｅ７が、ＮＥＰ  Ｓ１’部位にとって好ましいＰ１’残基であることが報告されている一方、Ｇｌｙ８が、Ｓ２’部位にとって好ましいＰ２’残基である。これらの２つの亜部位は、特定の総側鎖サイズしか一緒に収容することができないので、ＣＮＰのＰ１’−Ｐ２’残基の総サイズの任意の増大が、ＮＥＰ結合を潜在的に破壊することができる。例えば、Ｐ１’Ｐｈｅ７芳香環の３−位置でのクロリド原子の付加（すなわち、３−Ｃｌ−Ｐｈｅ７）により、例えばＳ１’亜部位にて、ＣＮＰとＮＥＰ切断部位間の相互作用を潜在的に改変する（例えば、不安定にする）ことができる。より小さなＰ２’残基Ｇｌｙ８への三級ブチル基の付加（すなわち、ｔＢｕ−Ｇｌｙ８）により、ＣＮＰとＳ２’亜部位間の相互作用を潜在的に破壊することができる。
【０１４４】
したがって、一態様において、本開示のＣＮＰ変異体として、Ｐ１’−Ｐ２’残基、例えばＰｈｅ７−Ｇｌｙ８のサイズが増大して、活性部位での基質認識に干渉することによって、ＮＥＰ切断に対する感受性が減少しているＣＮＰが挙げられる。天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、および／またはペプチド模倣体部分が、以下に限定されないが、Ｐｈｅ７、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｍｅｔ１７、およびＬｅｕ２０を含む１つもしくは複数の大きなＰ１’疎水性残基に、かつ／または、以下に限定されないが、Ｃｙｓ６、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１６、およびＧｌｙ１９を含む１つもしくは複数のより小さなＰ２’残基に、置換されている。
【０１４５】
本開示は、少なくとも１つの改変アミノ酸および／または少なくとも１つの改変ペプチド結合を含むＣＮＰ変異体を包含し、少なくとも１つの残基が、ＮＥＰによる基質認識および／または切断に関わり、改変アミノ酸および改変ペプチド結合は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド模倣体、および／またはペプチド結合イソスターであってよい。一態様において、Ｃｙｓ６とＰｈｅ７間のＣＮＰ上のＮＥＰ切断部位は、改変されている。関連する態様において、Ｃｙｓ６とＰｈｅ７間のペプチド結合（−−Ｃ（＝Ｏ）−−ＮＨ−−）は、以下のペプチド結合イソスターの１つで置換されている：
−−ＣＨ２−−ＮＨ−−、
−−Ｃ（＝Ｏ）−−Ｎ（Ｒ）−−（式中、アミド基は、以下のＲ基のいずれかでアルキル化されている：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）、
−−Ｃ（＝Ｏ）−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、
−−ＣＨ２−−Ｓ−−、
−−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）ｎ−−（式中、ｎは、１または２である）、
−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、
−−ＣＨ＝ＣＨ−−、
−−Ｃ（＝Ｏ）−−ＣＨ２−−、
−−ＣＨ（ＣＮ）−−ＮＨ−−、
−−ＣＨ（ＯＨ）−−ＣＨ２−−、
−−Ｏ−−Ｃ（＝Ｏ）−−ＮＨ−−、または
−−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−−。
【０１４６】
別の態様において、ＣＮＰ変異体は、式：
2019505486.tif 000027
によって表され、式中：
（ｘ）および（ｚ）は、独立して、不在であってもよいし、合成骨標的化合物、例えば、ビスホスホネート；関節標的または軟骨標的に有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕ；骨タンパク質、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、およびシアロタンパク質の骨標的ドメインに由来するアミノ酸配列（Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev., 57: 1049-76 (2005)）；腎クリアランスを減少させるポリマー分子および非ポリマー分子、例えば、負に帯電したＰＥＧ；ならびに、ＣＮＰ変異体の総質量を、本明細書中に一般に記載される、例えば約２．６または２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲に増大させることによってＮＥＰ分解に対するＣＮＰ変異体の耐性を増大させる、天然のポリマー（例えば、アミノ酸、脂肪酸、および／または炭水化物を含有するもの）および合成ポリマー（例えばＰＥＧ）からなる群より選択されてもよく；
（ｂ）および（ｃ）は、野生型Ｃｙｓ６およびＰｈｅ７であっても、別の天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸であってもよいし、ＮＥＰ切断に対する耐性を増大させるために本明細書中に記載されるペプチド結合イソスターを含有してもよく；そして
（ｄ）は、野生型Ｇｌｙ８であってもよいし、ＮＥＰへの結合を減少させるために、より大きな天然のアミノ酸もしくは非天然のアミノ酸（例えばｔ−Ｂｕ−Ｇｌｙ）、またはペプチド模倣体であってもよい。
【０１４７】
一態様において、そのようなＣＮＰ変異体は、（ｂ）、（ｃ）、および／または（ｄ）にて少なくとも１つの改変アミノ酸を含有する。
【０１４８】
Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１、Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４、Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７、およびＧｌｙ１９−Ｌｅｕ２０結合を含む、ＣＮＰ内の他のペプチド結合は、たとえＣＮＰ２２またはその変異体が、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７にて、ＮＥＰ耐性を示すペプチド結合またはペプチド結合イソスターを有するとしても、切断され得る。したがって、本開示は、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合に加えて、１つまたは複数の他のＮＥＰ切断部位にてペプチド結合イソスターを有するＣＮＰ変異体を包含し、ペプチド結合イソスターとして、本明細書中に記載されるものを含む。
【０１４９】
別の態様において、本開示は、Ｃｙｓ６および／またはＣｙｓ２２にて、以下に限定されないが、ホモシステイン、ペニシラミン、２−メルカプトプロピオン酸、および３−メルカプトプロピオン酸を含むシステイン類似体を有するＣＮＰ変異体を包含する。一態様において、そのようなＣＮＰ変異体は、野生型Ｃｙｓ６または類似体とＣｙｓ２２または類似体間のジスルフィド結合によって形成される環状ドメインを有する。さらに別の態様において、ＣＮＰ２２またはその変異体の１つまたは複数の残基、最大全ての残基が、Ｄ−アミノ酸で置換されている。Ｌ−アミノ酸の、Ｄ−アミノ酸との置換は本質的に、側鎖をその元の位置から約１２０度移動させることによって、ＮＥＰへのＣＮＰペプチドの結合を潜在的に破壊する。特定の態様において、Ｐｈｅ７のＬ−Ｐｈｅは、そのＤ−エナンチオ異性体、Ｄ−Ｐｈｅで置換されている。
【０１５０】
さらに別の態様において、ベータ−アミノ酸、例えば、３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸（または２−フェニル−ベータ−アラニン）が、野生型アルファ−アミノ酸Ｐｈｅ７を置換している。ベータ−アミノ酸の使用により、ペプチド骨格長は１メチレン単位で実際上増大する。プロテアーゼ耐性は、基質構造の変化、またはアミノ酸側鎖間距離の増大に起因し得る。
【０１５１】
非天然のアルファ−アミノ酸、ベータ−アミノ酸、またはペプチド結合イソスターを有するＣＮＰ２２の変異体の非限定的な例として、以下が挙げられる：
2019505486.tif 000028
【０１５２】
更なる態様において、ＣＮＰ変異体は、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば約２．６または２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲によって特徴付けられ、ＮＥＰ分解に対する耐性の増大のために設計されており、そして以下の式によって表され：
2019505486.tif 000029
式中：
（ｘ）および（ｚ）は、独立して、不在であってもよいし、合成骨標的化合物、例えば、ビスホスホネート；骨標的または軟骨標的に有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕ；骨タンパク質、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、およびシアロタンパク質の骨標的ドメインに由来するアミノ酸配列；腎クリアランスを減少させるポリマー部分および非ポリマー部分、例えば、負に帯電したＰＥＧ；例えば、アミノ酸、疎水性の酸、および／または炭水化物を含有するポリマー；ならびに合成親水性ポリマー、例えばＰＥＧからなる群より選択されてもよく；
（ａ）は、その位置にて野生型Ｌｙｓであってもよいし、保存的アミノ酸置換基、あるいは以下に限定されないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕを含む、天然もしくは非天然のアミノ酸、または側鎖上に反応性第一級アミンを有していないペプチド模倣体で置換されていてもよく、一態様において、（ａ）はＡｒｇであり；
（ｂ）は、Ｃｙｓ、およびＣｙｓ６とＰｈｅ７間のペプチド結合イソスター、例えばＣｙｓ−ＣＨ２−−ＮＨからなる群より選択され；
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体（Ｎ−アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルである）；およびＰｈｅ類似体（Ｐｈｅ類似体のベンゼン環の１つまたは複数のオルソ位置、メタ位置、および／もしくはパラ位置は、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、直鎖状もしくは分枝状のＣ１〜６アルキル、直鎖状もしくは分枝状のＣ１〜６アルコキシ、直鎖状もしくは分枝状のハロ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、およびヘテロアリール（例として、以下に限定されないが、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含む）からなる群より選択される１つもしくは複数の置換基で置換され、または、Ｐｈｅ類似体のベンゼン環は、別のアリール基（非限定的な例として、１−および２−ナフチルアラニンを含む）で、もしくはヘテロアリール基（非限定的な例として、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、およびフリルアラニンを含む）で置換されていてよい）からなる群より選択され；
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、およびＡｓｎからなる群より選択され；
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびペプチド結合イソスター、例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕからなる群より選択され；
（ｆ）は、その位置にて野生型Ｌｙｓであってもよいし、保存的アミノ酸置換基、あるいは以下に限定されないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕを含む、天然もしくは非天然のアミノ酸、または側鎖上に反応性第一級アミンを有していないペプチド模倣体で置換されていてもよく、一態様において、（ｆ）はＡｒｇでなく；
（ｇ）は、Ｌｅｕおよびペプチド結合イソスター、例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕからなる群より選択され；
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−Ｇｌｙ、およびペプチド結合イソスター、例えばＮ−Ｍｅ−Ｉｌｅからなる群より選択され；
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群より選択され；そして
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、およびペプチド結合イソスター、例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕからなる群より選択される。
【０１５３】
別の態様において、ＣＮＰ変異体は、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば約２．６または２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲によって特徴付けられ、ＮＥＰ切断に対する耐性の増大のために設計されており、そして以下の式によって表され：
2019505486.tif 000030
式中：
（ｘ）および（ｚ）は、独立して、不在であってもよいし、合成骨標的化合物、例えばビスホスホネート；骨標的または軟骨標的に有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕ；骨タンパク質およびその誘導体の骨標的ドメイン、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列に由来するアミノ酸配列；以下に限定されないが、親水性ポリマーまたは水溶性ポリマー、例えば、帯電したＰＥＧ分子を含む、腎クリアランスを減少させる部分；ならびに、例えば、ＰＥＧ、アミノ酸、炭水化物、および／または疎水性の酸を含む部分からなる群より選択されてもよく；
（ａ）は、その位置にて野生型Ｌｙｓであってもよいし、保存的アミノ酸置換基、あるいは以下に限定されないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕを含む、天然もしくは非天然のアミノ酸、または側鎖上に反応性第一級アミンを有していないペプチド模倣体で置換されていてもよく、一態様において、（ａ）はＡｒｇであり；
（ｂ）は、Ｃｙｓ、およびＣｙｓ６とＰｈｅ７間のペプチド結合イソスター、例えばＣｙｓ−ＣＨ２−−ＮＨからなる群より選択され；
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体（Ｎ−アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルである）；およびＰｈｅ類似体（Ｐｈｅ類似体のベンゼン環の１つまたは複数のオルソ位置、メタ位置、および／もしくはパラ位置は、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、直鎖状もしくは分枝状のＣ１〜６アルキル、直鎖状もしくは分枝状のＣ１〜６アルコキシ、直鎖状もしくは分枝状のハロ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール（例として、以下に限定されないが、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含む）からなる群より選択される１つもしくは複数の置換基で置換され、または、Ｐｈｅ類似体のベンゼン環は、別のアリール基（非限定的な例として、１−および２−ナフチルアラニンを含む）で、もしくはヘテロアリール基（非限定的な例として、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、およびフリルアラニンを含む）で置換されていてよい）からなる群より選択され；
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、およびＡｓｎからなる群より選択され；
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびペプチド結合イソスター、例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕからなる群より選択され；
（ｆ）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、およびＳｅｒからなる群より選択され；
（ｇ）は、Ｌｅｕ、Ａｓｎおよびペプチド結合イソスター、例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕからなる群より選択され；
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ａｓｎ、およびペプチド結合イソスター、例えばＮ−Ｍｅ−Ｉｌｅからなる群より選択され；
（ｉ）は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＡｓｎからなる群より選択され；
（ｊ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群より選択され；そして
（ｋ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、およびペプチド結合イソスター、例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕからなる群より選択される。
【０１５４】
ＣＮＰ変異体の、関節関連障害（例えば骨関節炎）の標的部位への送達を向上させるために、ＣＮＰ変異体は、（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端にて）骨標的部分または軟骨標的部分に取り付けられてよい。骨標的部分または軟骨標的部分の非限定的な例として、ビスホスホネート；ヒドロキシアパタイト；グルコサミン；コラーゲン（例えばＸ型コラーゲン）；ポリＡｓｐ；ポリＧｌｕ；および骨タンパク質、例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシン、およびシアロタンパク質の骨標的ドメインに由来するアミノ酸配列が挙げられる。
【０１５５】
ＮＥＰ切断にあまり感受性でないことに加えて、ＣＮＰ変異体は潜在的に、ＮＰＲ−Ｃクリアランス受容体に対する親和性が低い一方で、ＣＮＰ官能性を保持している。ＮＥＰ媒介分解の他に、ＣＮＰ２２の半減期は、クリアランス受容体、ＮＰＲ−Ｃによって影響され、これは、ＮＰＲ−Ｂの細胞外ペプチド結合ドメインとの５８％の配列相同性を共有する。ＣＮＰ２２は、ＮＰＲ−Ｂにだけでなく（７〜３０のｐＭ親和性）、ＮＰＲ−Ｃ（１１〜１４０ｐＭ）にも強固に結合する（Bennett, B. D. et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-67 (1991)；Koller, K. J. & Goeddel, D. V., Circulation, 86: 1081-88 (1992)；Suga, S. et al., Endocrinology, 130: 229-39 (1992)）。ＮＰＲ−Ｂ結晶構造はまだ報告されていないが、ＮＰＲ−ＣとＮＰＲ−Ａの結晶構造間の配列相同性および類似性（He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001)；Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004)；He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)）は、ＮＰＲ−Ｂがおそらく、全体的な構造的折畳みが類似するとみなされることを示唆している。
【０１５６】
したがって、ＮＰＲ−Ｂ相同モデルを、以下の関連する系の構造ベースの配列アラインメントおよび結晶構造に基づいて構築した：ＮＰＲ−Ｃに結合したＣＮＰ、ＮＰＲ−Ａに結合したＡＮＰ、およびＮＰＲ−Ｃに結合したＡＮＰ（He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001)；Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004)；He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)）。受容体が、結合したペプチド構造を決定すると思われ、そしてＮＰＲ−Ｂが、一次構造および機能特性に関してＮＰＲ−Ａに最も近いという観察に基づいて、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰ相同性モデルを、モデルとしてのＮＰＲ−Ａ／ＡＮＰ結晶構造で構築した。ＣＮＰ変異体の公開されているシグナル伝達データ（米国特許第５，４３４，１３３号および米国特許出願公開第２００４／０１３８１３４Ａ１号）、およびＮＰＲ−Ｃにもはや結合しない機能的ＡＮＰ変異体の公開されているシグナル伝達データ（Cunningham, EMBO 13(11) 2508-15, 1994）を用いて、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰモデルを洗練して解釈した。
【０１５７】
本開示は、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰ複合体の相同性ベースの構造モデルに基づいて、ＮＰＲ−Ｂ選択性の向上のために設計されたＣＮＰ変異体を包含する。種々の受容体に結合されたナトリウム利尿ペプチドの実験的コンピュータ構造データを、公開されている機能データと組み合わせることで、ＮＰＲ−Ｂに結合し続けるが、ＮＰＲ−Ｃクリアランス受容体への親和性を潜在的に減少させることができるＣＮＰ変異体が生成された。例えば、ＮＰＲ−Ｃは、ペプチド結合部位におけるループ構造内に特有の挿入を有しており、そのループ残基を、ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｂにおけるそれぞれのループ残基と比較して、ＣＮＰ  Ｇｌｙ８（またはＡＮＰ  Ｇｌｙ９）のようなペプチド残基のより近くに置いている。以前の研究は、ＡＮＰ中のＧ９Ｔ突然変異が、ＮＰＲ−Ｃに対する親和性を減少させることによって、ＮＰＲ−Ａ選択性を向上させるのに寄与していることを示した（Cunningham, EMBO J., 13(11): 2508-15 (1994)）。したがって、対応するＧｌｙ８残基を、より大きな残基（Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、またはＡｓｎ）と置換して、ＮＰＲ−Ｂへの結合に影響を及ぼすことなく、ＮＰＲ−ＣへのＣＮＰ結合を破壊したＣＮＰ変異体が作成された。さらに、１つまたは複数の突然変異を、Ｇｌｙ１５からＧｌｙ２１を包含するＣＮＰのＣ末端に導入した。これは、受容体／ペプチド複合体の詳細な構造分析に基づいて、受容体特異的残基と相互作用すると予測される。例えば、ＣＮＰ２２におけるＧ１９Ｒ突然変異は、ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達活性を大きく損失しない。しかしながら、この突然変異は、隣接残基の構造を変更することなく、ＮＰＲ−Ｃ／ＣＮＰの有効な結晶構造にモデル化され得ない。これらの観察は、Ｇ１９Ｒ突然変異が、特定の受容体、例えばＮＰＲ−ＣへのＣＮＰの結合を選択的に破壊し得ることを示唆している。
【０１５８】
一態様において、ＣＮＰ変異体は、位置１、５、８、１５、１９、および２１の１つまたは複数のＧｌｙ部位にて置換を有して、立体配座自由度を減少させることによって、受容体特異性を増大させている。ＮＰＲ−ＣおよびＮＰＲ−Ａに結合したＡＮＰの結晶構造の比較分析（Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279: 28625-31 (2004)；He, X.-L., J. Mol. Biol., 361: 698-714 (2006)）は、ＡＮＰの立体配座自由度が、受容体選択性の決定に重要な役割を果たし得ることを示している。
【０１５９】
一態様において、ＮＰＲ−Ｃに対する親和性が潜在的に減少しているＣＮＰ機能変異体は、以下のアミノ酸置換の１つまたは複数を有する：Ｇ１Ｒ、Ｇ１Ｅ、ＧＳＲ、Ｇ５Ｑ、Ｇ５Ｓ、Ｆ７Ｙ、Ｇ８Ｔ、Ｇ８Ｓ、Ｇ８Ｖ、Ｇ８Ｎ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ｋ１０Ｃｉｔ、Ｋ１０Ｑ、Ｋ１０Ｓ、Ｉ１４Ｎ、Ｇ１５Ｒ、Ｇ１５Ｓ、Ｇ１５Ｎ、Ｇ１５Ｃｉｔ、Ｓ１６Ｑ、Ｍ１７Ｖ、Ｍ１７Ｎ、Ｇ１９Ｓ、Ｇ１９Ｒ、Ｇ１９Ｎ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２０Ｓ、Ｇ２１Ｓ、Ｇ２１Ｔ、およびＧ２１Ｒ。一態様において、ＣＮＰ変異体は、位置１、５、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１９、２０、および／または２１にて多点置換を有し、そして任意で、変異体のペプチド配列中の他の位置のいずれかにて改変を有してもよい。
【０１６０】
更なる態様において、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、部分に結合されて、最大総質量は、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部の部位にて、本明細書中に一般に記載される、例えば約２．６または２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲によって特徴付けられて、関節／軟骨標的を促進し、ＮＰＲ−Ｃおよび腎クリアランスを減少させ、ＮＥＰ分解に対する耐性を増大させ、かつ／またはＣＮＰ官能性を向上させ得る。一態様において、ＣＮＰ変異体は、環状領域（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６からＣｙｓ２２に対応する）内の部位のポリマー部分に結合されない。ＣＮＰ変異体に結合され得るポリマー部分または非ポリマー部分の非限定的な例として、合成骨標的化合物、例えばビスホスホネート；骨／軟骨標的ペプチド配列、例えばポリＡｓｐおよびポリＧｌｕ；骨タンパク質、例えばオステオポンチン、オステオカルシン、およびシアロタンパク質の骨標的ドメインに由来するペプチド配列；骨形成タンパク質、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ８ａの機能ドメインに由来するペプチド配列；ナトリウム利尿起源、例えば、ＮＰＰＣ、ＡＮＰ、およびＢＮＰのポリペプチドに由来するペプチド配列；他の天然のポリマー部分または非ポリマー部分、例えば、炭水化物、脂肪酸、およびリン脂質；生体適合性の合成親水性ポリマー、例えばＰＥＧ（またはＰＥＯ）；疎水性ポリマー部分または非ポリマー部分、例えばヘプタン酸およびペンタン酸；ならびにそれらの組合せが挙げられる。
【０１６１】
本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、例えば、ｃＧＭＰ産生およびシグナル伝達の刺激に関して、機能活性がＣＮＰ２２と実質的に同程度であり得、またはＣＮＰ２２よりも良好であり得る。一態様において、ＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば１μＭ）下で産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生を、インビトロまたはインビボで刺激する。特定の態様において、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ２２のインビトロまたはインビボのｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を保持する。別の態様において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２と比較して、ｃＧＭＰ刺激活性が向上している。特定の態様において、ＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２（例えば１μＭ）の同じ濃度下で産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、またはそれ以上の産生を、インビトロまたはインビボで刺激する。
【０１６２】
Ｃ．ＣＮＰ変異体の合成および精製
一部の態様において、本明細書において有用なＣＮＰ変異体は、特定の態様において、当技術分野において公知の特定の技術を用いて、組換え発現によって生成される。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D. N. Glover, Ed. (1985)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)参照。
【０１６３】
特定の態様において、ＣＮＰ変異体は、培地中で、切断可能なペプチドまたはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに連結されたＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、ポリヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチドの発現をもたらす条件下で培養することを含む組換えプロセスによって生成され、融合ポリペプチドは、切断可能なペプチドまたはタンパク質に、直接的に連結され、またはリンカーを介して間接的に結合されたＣＮＰ変異体ポリペプチドを含む。一部の態様において、宿主細胞は、切断可能なペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結されたＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されている。特定の態様において、融合ポリペプチドは、可溶性のタンパク質として、または包含体として発現される。発現された融合ポリペプチドは、宿主細胞または培地から単離され得、単離された融合ポリペプチドは、切断剤と接触して、ＣＮＰ変異体を放出し得る。
【０１６４】
ＣＮＰ変異体を生成する方法は、参照により本明細書に組み入れられている米国特許第８，１９８，２４２号、米国特許第８，３７７，８８４号、および米国特許第８，５９８，１２１号に記載されている。
【０１６５】
Ｄ．化学的に改変したＣＮＰ変異体
ＣＮＰ変異体の化学的改変は潜在的に、改変されたＣＮＰペプチドに、有利な特性、例えば安定性および半減期の増大、ならびに免疫原性の減少をもたらし得る（治療用タンパク質の化学的改変の一般的な考察について、Pharmazie, 57(1): 5-29 (2002)参照）。ペグ化、グリコシル化、および他の化学誘導体化の手順に加えて、例えば、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化による改変、ならびに酸付加塩、アミド、エステル、およびＮ−アシル誘導体の作成もまた潜在的に、免疫原性領域および／またはタンパク質分解感度の高い領域を覆い隠し（mask）得る（Science, 303: 480-482 (2004)）。
【０１６６】
化学的改変の例として、限定されないが、安定性およびプロテアーゼ耐性を向上させ、かつ免疫原性を減少させるための、Bednarsakiのポリマー付加方法およびAltus Corporationの架橋方法が挙げられる。Bednarsakiは、ポリマー付加がタンパク質の温度安定性を向上させ得ることを示し（J. Am. Chem. Soc., 114(1): 378-380 (1992)）、Altus Corporationは、グルタルアルデヒド架橋が酵素安定性を向上させ得ることを見出した。
【０１６７】
ポリペプチドの化学的改変は、非特異的に実行されてもよいし（誘導体化された種の混合物となる）、部位特異的に実行されてもよいし（例えば、部位指向性の突然変異誘発および化学的改変の組合せを用いた、野生型巨大分子反応性指向性の誘導体化および／または部位選択性の改変に基づく）、代わりに、発現されたタンパク質のライゲーション方法（Curr. Opin. Biotechnol., 13(4): 297-303 (2002)）を用いて実行されてもよい。
【０１６８】
ペグ化ＣＮＰ変異体
一態様において、安定性の増大のために、ＣＮＰ変異体（アミノ酸の付加、置換、および／または欠失を有するものを含む）は、親水性の天然ポリマーまたは合成ポリマーに結合される。一態様において、親水性ポリマーは水溶性であるので、これに結合されるＣＮＰペプチドは、水性（例えば生理学的）環境中で析出しない。さらに、親水性ポリマーは、生体適合性である、すなわち、損傷も、毒性も、免疫学的反応もインビボで引き起こさない。親水性ポリマーは、分枝状であっても分枝状でなくてもよい。一態様において、親水性ポリマーは分枝状でない。
【０１６９】
ＣＮＰ変異体の、親水性ポリマーへの種々の結合部位が考えられ、以下に限定されないが：（１）Ｎ末端のみ；（２）Ｃ末端のみ；（３）内部の部位（例えばＬｙｓ４）のみ；（４）Ｎ末端およびＣ末端の双方；（５）Ｎ−末端および内部の部位；ならびに（６）Ｃ末端および内部の部位を含む。一態様において、ＣＮＰ変異体は、親水性ポリマーにＮ末端のみにて結合されている。別の態様において、結合は、内部の部位（例えばＬｙｓ４）のみにてなされる。さらに別の態様において、結合は、Ｎ−末端および内部の部位（例えばＬｙｓ４）にてなされる。さらに別の態様において、より良好な官能性のために、ＣＮＰ変異体は、親水性ポリマーに、環状ドメイン（ＣＮＰ−２２のＣｙｓ６からＣｙｓ２２に対応する）内の部位（例えばＬｙｓ１０）にて結合されない。親水性ポリマーへの結合がＣＮＰ変異体上の反応性の一級アミノ基との結合形成に基づくならば、内部の部位（例えば、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０）での結合は、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０の、側鎖上に反応性の一級アミノ基を含有しない天然もしくは非天然のアミノ酸またはペプチド模倣体、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはシトルリン（Ｃｉｔ）との置換によって妨げられ得る。特定の態様において、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０は、Ａｒｇと置換されている。別の態様において、Ｌｙｓ１０はＡｒｇと置換されていない。
【０１７０】
親水性ポリマーの非限定的な例として、カルボン酸を有するモノマー（例えば、メタクリル酸（ＭＡ）およびアクリル酸（ＡＡ））から形成されるポリマー、ポリビニルアルコール、ヒドロキシル基を有するモノマー（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、および３−トリメチルシリルプロピルメタクリレート（ＴＭＳＰＭＡ））から形成されるポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、モノ−Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ−ＰＥＧ（例えばモノメトキシ−ＰＥＧ）、トレシルモノメトキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧアクリレート（ＰＥＧＡ）、ＰＥＧメタクリレート、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ、２−メタクリロイルオキシエチル−ホスホリルコリン（ＭＰＣ）およびＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）のコポリマー、ヒドロキシ官能ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ＳＩＳ−ＰＥＧ（ＳＩＳは、ポリスチレン−ポリイソブチレン−ポリスチレンブロックコポリマーである）、ポリスチレン−ＰＥＧ、ポリイソブチレン−ＰＥＧ、ＰＣＬ−ＰＥＧ（ＰＣＬは、ポリカプロラクトンである）、ＰＬＡ−ＰＥＧ（ＰＬＡは、ポリ乳酸である）、ＰＭＭＡ−ＰＥＧ（ＰＭＭＡは、ポリ（メタクリル酸メチル）である）、ＰＤＭＳ−ＰＥＧ（ＰＤＭＳは、ポリジメチルオキサノンである）、ＰＶＤＦ−ＰＥＧ（ＰＶＤＦは、ポリフッ化ビニリデンである）、PLURONIC（商標）界面活性剤（ポリプロピレンオキシド−コ−ポリエチレングリコール）、ポリ（テトラメチレングリコール）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−エチレングリコール）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ヒアルロン酸）（ＰＬＬ−ｇ−ＨＡ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ホスホリルコリン）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＣ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ビニルピロリドン）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＶＰ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−エチレングリコール）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＥＧ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ヒアルロン酸）（ＰＥＩ−ｇ−ＨＡ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ホスホリルコリン）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＣ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ビニルピロリドン）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＶＰ）、ＰＬＬ−ｃｏ−ＨＡ、ＰＬＬ−ｃｏ−ＰＣ、ＰＬＬ−ｃｏ−ＰＶＰ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＥＧ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＨＡ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＣ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＶＰ、セルロースおよびその誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、デキストラン、デキストリン、ヒアルロン酸およびその誘導体（例えばヒアルロン酸ナトリウム）、エラスチン、キトサン、アクリルサルフェート、アクリルスルホネート、アクリルスルファメート、メタクリルサルフェート、メタクリルスルホネート、メタクリルスルファメート、それらのポリマーおよびコポリマー、ならびにそれらの組合せのポリマーおよびコポリマーが挙げられる。
【０１７１】
特定の態様において、親水性ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）とも呼ばれるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。本明細書において用いられる用語「ＰＥＧ」または「ＰＥＯ」は、ＰＥＧの分枝状および非分枝状の全ての形態を包含し、これらは、限定されないが、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧおよびアリールオキシ−ＰＥＧを含むポリペプチドを誘導体化するのに用いられ得る。
【０１７２】
一態様において、ＰＥＧ−ＣＮＰ結合型は、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーを含み、式中、ｎは、約６から約１００の整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．３ｋＤａから約５ｋＤａである。別の態様において、ｎは、約１２から約５０の整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．６ｋＤａから約２．５ｋＤａである。さらに別の態様において、ｎは、約１２から約２４であり、ＰＥＧポリマーは、約０．６ｋＤａから約１．２ｋＤａである。更なる態様において、ＰＥＧポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基でキャッピングされている。特定の態様において、エンドキャッピング基は、アルキル基、例えばメチル等の低級アルキル基であるので、ＰＥＧポリマーはアルコキシ基で終わる。一態様において、ＰＥＧポリマーは、分枝状でない。別の態様において、ＣＮＰ−２２またはその変異体は、Ｎ末端のみにてＰＥＧポリマーに結合されている。
【０１７３】
ＰＥＧおよびＰＥＯとして潜在的に、分子量の分布を有する分子、すなわち、調製される方法に応じて、潜在的に多分散性である分子が挙げられる。ポリマー調製のサイズ／質量分布は、その重量平均分子量（Ｍｗ）およびその数平均分子量（Ｍｎ）によって統計学的に特徴付けられ得、その比率は多分散指数（Ｍｗ／Ｍｎ）と呼ばれる。ＭｗおよびＭｎは、質量分光法によって測定され得る。１．５ｋＤａよりも大きいＰＥＧ部分に結合したＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、親ＰＥＧ分子の多分散性に起因して、広範な分子量を示し得る。例えば、mPEG2K（Sunbright ME-020HS, NOF Co.）の場合、ＰＥＧ分子の分子質量は、約１．５ｋＤａから約３ｋＤａの範囲にわたって分布し、多分散指数は１．０３６である。それに反して、Pierce Biotechnology（Rockford, Illinois）のMS(PEG)n試薬（ｎ＝４、８、１２、または２４、例えば、「ＰＥＯ１２」または「ＰＥＯ２４」として表される）を用いると、ＣＮＰ−２２またはその変異体に結合したＰＥＧは、単分散性であり、鎖長は不連続であり、分子量が定義される。
【０１７４】
ＰＥＧ部分を含むポリペプチドを生成する方法は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，８２４，７８４号参照）。ペグ化ＣＮＰペプチドを調製する方法は一般に、（ａ）ＰＥＧをＣＮＰペプチドに（例えばＮ末端にて）取り付けるのに適した条件下で、ＣＮＰ−２２またはその変異体をペグ化試薬と反応させる工程と、（ｂ）反応産物を得る工程とを含む。ＣＮＰペプチドをペグ化することで、ＮＰＲ−Ｂへの結合は、ＰＥＧ部分のサイズおよびペグ化の位置に応じて大きく変わり得るので、様々な種類のＰＥＧおよびペグ化反応条件が探究され得る。ＣＮＰペプチドのペグ化に用いられ得る化学作用として、メトキシＰＥＧ（Ｏ−［（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）のＮＨＳ−エステルを用いた、ペプチドの反応性第一級アミンのアシル化が挙げられる。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳまたはメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡとのアシル化により、アミド結合が生じて、元の第一級アミンのいかなる電荷も除外される。符号「ＰＥＯ１２」または「ＰＥＯ２４」で指定されるＰＥＧ−ＣＮＰ変異体、ならびに符号「ＰＥＧ１Ｋ」、「ＰＥＧ２Ｋ」、「ＰＥＧ５Ｋ」、または「ＰＥＧ２０Ｋ」で指定されるＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、ペプチド上の一級アミノ基の、ＮＨＳエステルで活性化された、メトキシエンドキャッピングされたＰＥＧ試薬との反応を介して、ペグ化されている。ＰＥＧ−ＣＮＰ変異体はまた、他の方法によって、例えば、ペプチド上の一級アミノ基およびＰＥＧアルデヒド、例えば、ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド、またはモノ−Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体が関与する還元アミノ化を介して調製されてもよい（米国特許第５，２５２，７１４号参照）。
【０１７５】
リボソームタンパク質の合成とは異なり、合成ペプチドの合成は、Ｃ末端からＮ末端に進む。したがって、Ｂｏｃ−ＰＥＧ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含有する）は、ＰＥＧをペプチドのＣ末端に取り付ける一方法である（R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85(14): 2149-2154 (1963)）。これ以外にも、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）化学物質が使用され得る（E. Atherton and R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, IRL Press (Oxford, England (1989)）。
【０１７６】
ＰＥＧ−ＣＮＰ変異体を調製する方法は、ポリマー−タンパク質結合型の、実質的に同質の混合物を提供する。精製後の不連続なＰＥＧ−ＣＮＰ調製物は、生物学的特性のインビトロ試験およびインビボ試験にとって十分に純粋である。ペグ化の性質および程度は、例えば、ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ分析を用いて判定され得る。特定の態様において、ＣＮＰ変異体の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、Ｎ末端にてモノペグ化されている。ＣＮＰの生物学的特性に対するペグ化の有益な効果を最適化するために、ＰＥＧ部分のポリマー長、構造（例えば、分枝状または直鎖状）および／または官能化（例えば、負に帯電した基の付加）が変えられてよい。ペグ化ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ耐性、薬物動態、および生物活性（例えば、ＮＰＲ−Ｂに結合して、ｃＧＭＰの生成を刺激する能力）について試験される。ＮＥＰ耐性の向上、およびＣＮＰ−２２のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも約５０％を示すペグ化ＣＮＰ変異体はさらに、例えば、ラット軟骨肉腫細胞ベースの軟骨形成不全モデルにおいてインビトロで、そしてマウス軟骨形成不全動物モデルにおいてインビボで試験され得る。
【０１７７】
Ｅ．ＣＮＰ変異体を用いる方法、ＣＮＰ変異体の薬学的組成物、および投与経路
ＣＮＰ変異体を用いる方法
以下の実施例に記載されるように、ここで報告される実験は、本明細書中に開示されるＣＮＰ変異体が、骨関節炎の処置に有用であるという証拠を提供する。したがって、本発明の態様は、骨関節炎と診断された対象にＣＮＰ変異体を投与することを含む。結果として、対象における軟骨変性の割合は、低下し得、そして場合によっては、逆転され得る（すなわち、軟骨は、再生するように誘導され得る）。したがって、骨関節炎と関連した種々の症候およびバイオマーカーは、向上し得る。実施例は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の有用性を示すが、本明細書において開示される他の変異体もまた有効性について試験されて、同じように用いられ得る。特に、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７は、軟骨成長、運動能、および運動技術の劇的な向上、ならびに軟骨変性の顕著な減少の兆候を示す。
【０１７８】
骨関節炎は、先に記載されるように、患者からの徴候および症候の報告に基づいて、同様に特定の関節における軟骨損傷を判定するための医用画像に基づいて、診断され得る。撮像の方法として、放射線写真撮影法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）、および超音波（ＵＳ）が挙げられる（Gold et al., Bone J. 51:278-88, 2012）。撮像により、多くの場合、関節の狭小化、関節領域における骨増殖体および軟骨下嚢胞、関節軟骨の薄化、退行性の軟骨下骨髄変化、ならびに骨融合が検出され得る。種々の態様において、本明細書において考えられるＣＮＰ変異体の投与は、関節領域における軟骨変性、軟骨成長、患者の運動能、関節狭小化、骨増殖体、および軟骨下嚢胞、関節軟骨の薄化、退行性の軟骨下骨髄変化、ならびに骨融合だけでなく、当技術分野において公知の他のものを含む、本明細書中に記載される骨関節炎の１つまたは複数の症候を向上させる。
【０１７９】
特定の例において、骨関節炎は、原発性骨関節炎と続発性骨関節炎に分けられた（Stacy et al., Primary Osteoarthritis Imaging, 2012）。一次性関節炎は、多くの場合より年老いた個体において、そして以前に無傷の関節において、明らかな開始因子なく起こる特発性現象を指す。続発性骨関節炎は、一部の素因的状態に起因する滑膜関節の変性疾患、通常、罹患関節の関節軟骨および／または軟骨下骨に悪影響が及んだ外傷を指し得る。続発性骨関節炎は、比較的若い個体に起こり得る。原発性骨関節炎および続発性骨関節炎の双方の処置が、本明細書において意図される。
【０１８０】
関節炎の重篤度は、Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index （WOMAC）（Kirkley et al., N Engl J Med 359:1097-1107, 2008）、Short Form-36（SF-36）Physical Component Summary（Ware et al., Med Care 30:473-483, 1992）、およびArthritis Self-Efficacy Scale（ASES）（Lorig et al., Arthritis Rheum 32:37-44, 1989）でスコア化され得る。Ｘ線撮影法の重篤度は、改変Kellgren-Lawrence分類（Kellgren et al., Ann Rheum Dis 1957; 16:494-502；Blackburn et al., J Rheumatol; 21:675-679, 1994）によって評価され得る。
【０１８１】
骨関節炎は、以下に限定されないが、膝、肩、肘、指、手、手首、股、足首、首、脊柱、および／または背下部を含む関節中の軟骨に影響を及ぼし得る。関節炎が背中のものであるならば、骨関節炎の症候として、関節の痛み、関節の硬直、関節の腫れ、可動域の減少、ならびに腕および脚の虚弱または麻痺が挙げられる。現在、骨関節炎の新規の有効な処置の、満たされていないニーズがある。軟骨細胞のマトリックス生産ならびに成長および分化を促進することによって、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、ＦＧＦ−２の望ましくない影響に対処するために、および骨関節炎を含む関節炎に苦しむ対象においてマトリックス合成を増大させることによって骨関節炎を含む関節炎を処置するために、有用であることが示される。
【０１８２】
種々の態様において、軟骨の損傷または成長は、軟骨細胞の死／損失、プロテオグリカン（ＰＧ）の損失、およびコラーゲンの損失またはフィブリル化によって分析される。処置後の軟骨の損傷および向上はまた、本明細書中に記載される少なくとも１つの軟骨特異的バイオマーカーのレベルを測定することによって評価され得る。運動能の向上は、本明細書中に記載され、かつ当技術分野において公知の任意の運動能尺度および評価尺度によってモニタされ得る。
【０１８３】
骨関節炎の処置として、多くの場合、抗炎症薬、例えばアスピリン、ナプロキセンまたはイブプロフェンを含むＮＳＡＩＤＳ、アセトアミノフェン、グルココルチコイド、ステロイド、およびヒアルロン酸を用いる痛み管理が挙げられる。関節炎の中程度から重度の形態はまた、罹患関節を置換し、または痛みを引き起こすこととなり得る一部の軟骨を除去する外科手術により処置され得る（Kirkey et al., N Engl J Med 359:1097-1107, 2008）。本明細書中のＣＮＰ変異体は、本明細書中に記載され、または処置医師に公知の、骨関節炎を処置するのに一般的に用いられる別の処置と共に施されてよい。
【０１８４】
ＣＮＰ変異体の薬学的組成物
付加的な態様において、本開示は、ＣＮＰ変異体、ならびに１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、キャリアおよび／または希釈剤を含む薬学的組成物の使用を意図する。特定の態様において、組成物はさらに、１つまたは複数の他の生物学的に活性な剤（例えば、プロテアーゼ、受容体チロシンキナーゼ、および／またはクリアランス受容体ＮＰＲ−Ｃのインヒビター）を含む。
【０１８５】
一部の態様において、組成物は、所望のＣＮＰ変異体を、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の純度で含む。特定の態様において、組成物は、高分子混入物、例えば他の哺乳類（例えばヒト）タンパク質および他のＣＮＰ変異体を、約１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％未満含有する。
【０１８６】
賦形剤、キャリア、および希釈剤の非限定的な例として、ビヒクル、液体、バッファー、等張剤、添加物、安定化剤、防腐剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、湿潤剤、アジュバント等が挙げられる。組成物は、液体（例えば、水、エタノール）；種々のバッファー内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、リン酸、酢酸バッファー、クエン酸バッファー）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例えば、Polysorbate 20、Polysorbate 80）；抗酸化剤（例えば、メチオニン、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）；防腐剤（例えば、Thimerosol、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール）；ならびに増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース）を含有してよい。薬学的組成物の配合における賦形剤、希釈剤、およびキャリアの使用は、当技術分野において公知である；例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, pages 1435-1712, Mack Publishing Co.（Easton, Pennsylvania (1990)）参照。この文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８７】
例えば、キャリアとして、限定されないが、活性成分と反応しない希釈剤、ビヒクルおよびアジュバント、同様にインプラントキャリア、および不活性の、毒性のない固体または液体の充填剤、および封入材料が挙げられる。キャリアの非限定的な例として、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、水、およびエマルジョン（例えば油／水エマルジョン）が挙げられる。キャリアは、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、およびそれらの混合物を含有する溶媒であっても分散培地であってもよい。
【０１８８】
一部の態様において、組成物は、液体製剤である。特定の態様において、製剤は、ＣＮＰ変異体を、約０．１ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ、または約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で含む。
【０１８９】
更なる態様において、組成物は、ＣＮＰ含有溶液またはＣＮＰ含有懸濁液のｐＨを所望の範囲内に維持するためのバッファー溶液または緩衝剤を含む。バッファー溶液の非限定的な例として、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、およびHank緩衝生理食塩水が挙げられる。緩衝剤として、限定されないが、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびクエン酸ナトリウムが挙げられる。緩衝剤の混合物が用いられてもよい。特定の態様において、緩衝剤は、酢酸／アセテートまたはクエン酸／シトレートである。組成物中の適した緩衝剤の量は、部分的に、用いられる特定のバッファー、および溶液または懸濁液の所望のｐＨによって決まる。例えば、アセテートは、ｐＨ６よりもｐＨ５にてより有効なｐＨバッファーであるので、アセテートは、ｐＨ６よりもｐＨ５の溶液により少ない量で用いられ得る。一部の態様において、緩衝剤は、濃度が約１０ｍＭ±５ｍＭである。特定の態様において、組成物のｐＨは、約ｐＨ３から約ｐＨ７．５、約ｐＨ３．５から約ｐＨ７、約ｐＨ３．５から約ｐＨ６．５、約ｐＨ４から約ｐＨ６、もしくは約ｐＨ４から約ｐＨ５、または約ｐＨ５．０±１．０である。
【０１９０】
他の態様において、組成物は、溶液または懸濁液を注射用に等張性にし、かつより適合するようにする等張性調整剤を含有する。等張剤の非限定的な例として、ＮａＣｌ、デキストロース、グルコース、グリセリン、ソルビトール、キシリトール、およびエタノールが挙げられる。特定の態様において、等張剤は、ＮａＣｌである。特定の態様において、ＮａＣｌは、約１６０±２０ｍＭ、約１４０ｍＭ±２０ｍＭ、約１２０±２０ｍＭ、約１００ｍＭ±２０ｍＭ、約８０ｍＭ±２０ｍＭ、または約６０ｍＭ±２０ｍＭの濃度である。
【０１９１】
種々の態様において、組成物は、防腐剤を含む。防腐剤として、以下に限定されないが、ｍ−クレゾールおよびベンジルアルコールが挙げられる。特定の態様において、防腐剤は、約０．４％±０．２％、約１％±０．５％、約１．５％±０．５％、または約２．０％±０．５％の濃度である。
【０１９２】
種々の態様において、組成物は、（例えば、ＣＮＰ変異体の、ガラスまたはプラスチックへの吸着を軽減する）抗吸着剤を含有する。抗吸着剤として、限定されないが、ベンジルアルコール、Polysorbate 20、およびPolysorbate 80が挙げられる。特定の態様において、抗吸着剤は、約０．００１％から約０．５％、約０．０１％から約０．５％、約０．１％から約１％、約０．５％から約１％、約０．５％から約１．５％、約０．５％から約２％、または約１％から約２％の濃度である。
【０１９３】
種々の態様において、組成物は、安定化剤を含む。安定化剤の非限定的な例として、グリセリン、グリセロール、チオグリセロール、メチオニン、ならびにアスコルビン酸およびその塩が挙げられる。一部の態様において、安定化剤がチオグリセロールまたはアスコルビン酸もしくはその塩である場合、安定化剤は、約０．１％から約１％の濃度である。他の態様において、安定化剤がメチオニンである場合、安定化剤は、約０．０１％から約０．５％、または約０．０１％から約０．２％の濃度である。さらに他の態様において、安定化剤がグリセリンである場合、安定化剤は、約５％から約１００％（正味）の濃度である。
【０１９４】
種々の態様において、組成物は、抗酸化剤を含有する。例示的な抗酸化剤として、限定されないが、メチオニンおよびアスコルビン酸が挙げられる。特定の態様において、抗酸化剤の、ＣＮＰ変異体に対するモル比は、約０．１：１から約１５：１、約１：１から約１５：１、約０．５：１から約１０：１、約１：１から約１０：１、または約３：１から約１０：１である。
【０１９５】
薬学的に許容される塩が、組成物に用いられてよく、限定されないが、無機酸の塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩）、有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩）、およびアミン（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジエタノールアミン）の塩を含む。薬学的に許容される塩の詳細な考察が、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company（Easton, Pennsylvania (1990)）に見出される。
【０１９６】
薬学的組成物は、種々の形態、例えばタブレット、カプセル、顆粒、粉末、溶液、懸濁液、エマルジョン、軟膏、および経皮パッチで投与されてよい。組成物の剤型は、組成物の所望の投与モードに合わせて調整されてよい。経口投与用に、組成物は、例えば、タブレットまたはカプセル（軟質ゲルカプセルを含む）の形態をとってもよいし、例えば、水性溶液もしくは非水性溶液、懸濁液、またはシロップであってもよい。経口投与用のタブレットおよびカプセルは、１つまたは複数の一般的に用いられる賦形剤、希釈剤、およびキャリア、例えばマンニトール、ラクトース、グルコース、スクロース、デンプン、コーンスターチ、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、炭酸マグネシウム、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム）を含んでよい。所望される場合、香料、着色剤、および／または甘味剤が、固体製剤および液体製剤に加えられてよい。経口製剤用の他の任意の成分として、限定されないが、防腐剤、懸濁化剤、および増粘剤が挙げられる。経口製剤は、胃の酸性環境からＣＮＰ変異体を保護する腸溶コーティングを有してもよい。固体剤型および液体剤型を調製する方法が公知であり、または当業者にとって明らかであろう（例えば、先で参照したRemington’s Pharmaceutical Sciences参照）。
【０１９７】
非経口投与用の製剤が、例えば、液体溶液もしくは懸濁液として、注射前の液体培地中での可溶化もしくは懸濁に適した固体形態として、またはエマルジョンとして、調製されてよい。例えば、注射可能な滅菌溶液および懸濁液が、当技術分野において公知の技術に従って、適切な希釈剤、キャリア、溶媒（例えば、緩衝水溶液、Ringer溶液、生理食塩水）、分散剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤等を用いて配合され得る。また、滅菌固定油、脂肪酸エステル、ポリオール、および／または他の不活性成分が用いられてもよい。更なる例として、非経口投与用の製剤として、水性滅菌注射可能溶液が挙げられ、これは、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および、製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含有してよい、水性滅菌懸濁液および非水性滅菌懸濁液を含有してよい。
【０１９８】
例示的なＣＮＰ製剤が、米国特許第８，１９８，２４２号および米国特許第８，５９８，１２１号に記載されている。ｐＨが約４から約６の範囲にあるＣＮＰ製剤の使用が意図される。
【０１９９】
種々の態様において、ＣＮＰ変異体は、骨関節炎または骨関節炎の症候に罹患した対象への投与用に、薬学的キャリア中に配合されてよい。一部の態様において、ＣＮＰ変異体の液体製剤は、成分の任意の組合せに従って配合され、その量または濃度は、以下に記載される：
2019505486.tif 000031
１グリセリンは、ＣＮＰ変異体の、水による加水分解、脱アミド、異性化、または切断を最小にし、または防止するのに用いられる。凍結乾燥剤について、４〜６％または６〜２０％のマンニトールまたはスクロースが、ＮａＣｌに置換されてよい。
【０２００】
ＣＮＰ変異体を含む組成物は、凍結乾燥剤であってもよい。特定の態様において、凍結乾燥剤は、バッファーおよびバルク剤、そして任意で抗酸化剤を含む。例示的なバッファーとして、限定されないが、酢酸バッファーおよびクエン酸バッファーが挙げられる。例示的なバルク剤として、限定されないが、マンニトール、スクロース、デキストラン、ラクトース、トレハロース、およびポビドン（PVP K24）が挙げられる。特定の態様において、マンニトールは、約３％から約１０％、約４％から約８％、または約４％から約６％の量である。特定の態様において、スクロースは、約６％から約２０％、約６％から約１５％、または約８％から約１２％の量である。
【０２０１】
種々の態様において、ＣＮＰ変異体の凍結乾燥剤は、以下に記載される成分、およびそれらの量または濃度の任意の組合せに従って配合された製剤から調製される：
2019505486.tif 000032
１グリセリンは、ＣＮＰ変異体の、水による加水分解、脱アミド、異性化、または切断を最小にし、または防止するのに用いられる。
【０２０２】
種々の態様において、ＣＮＰ変異体を含む製剤は、ｐＨが約３〜７、約３〜６、約３．５〜６．５、約４〜６、約４〜５、または約４．５〜５．５である。一部の態様において、ｐＨ４〜５．５について、適切な緩衝剤は、酢酸／アセテート（例えば酢酸ナトリウム）であり、ｐＨ５．５〜６について、適切な緩衝剤は、クエン酸／シトレートである。クエン酸／シトレート（例えばクエン酸ナトリウム）は、ｐＨ３〜６またはｐＨ４〜６の範囲においても適切な緩衝剤でもある。特定の態様において、緩衝剤は、製剤中の濃度が約２〜５０ｍＭ、約２〜４０ｍＭ、約２〜３０ｍＭ、約５〜３０ｍＭ、約２〜２０ｍＭ、約５〜２０ｍＭ、または約５〜１５ｍＭである。
【０２０３】
ＣＮＰ変異体の脱アミドを最小にし、または回避するために、変異体は、薬学的に許容される有機共溶媒、例えばグリセリン、エタノール、およびプロピレングリコール中に配合されてよい。脱アミドは加水分解によって起こるので、有機共溶媒を水の代わりにして、ＣＮＰ変異体の、水との接触が最小にされる。有機水性溶媒系中の１つまたは複数の有機溶媒の濃度は、例えば、約１０％から約９９％、または、水が用いられないならば、約１００％であってよい。
【０２０４】
また、ＣＮＰ変異体の脱アミドを最小にし、または回避するために、凍結乾燥によって製剤から水が除去されてよい。一部の態様において、凍結乾燥剤は、以下の成分：バッファー：酢酸ナトリウムおよび酢酸、またはクエン酸ナトリウムおよびクエン酸；等張剤／増量剤：マンニトール（例えば、３〜１０％、２〜８％、または４〜６％）；スクロース（例えば、６〜２０％、５〜１５％、または８〜１２％）；抗酸化剤：メチオニンおよび／またはアスコルビン酸の任意の組合せを含有し、各抗酸化剤の、ＣＮＰ変異体に対するモル比は、約０．１：１から約１：１、約０．５：１から約５：１、約１：１から約１５：１、約１：１から約１０：１、または約３：１から約１０：１である。
【０２０５】
また、脱アミドは、ＣＮＰ組成物（例えば、液体製剤または凍結乾燥剤）をより低い温度、例えば約５℃、０℃、−１０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、または−１００℃にて保存することによって、最小にされ得、または回避され得る。
【０２０６】
ＣＮＰ変異体中の酸化性残基（例えばメチオニン）の酸化を最小にし、または回避するために、変異体は、１つまたは複数の抗酸化剤と共に配合されてよい。例示的な抗酸化剤として、以下に限定されないが、メチオニン、アスコルビン酸、およびチオグリセロールが挙げられる。また、例えばメチオニン残基の酸化は、（液体製剤ならば）液体培地から窒素もしくはアルゴンで酸素をパージすることによって、かつ／またはコンテナもしくは包装から窒素もしくはアルゴンで酸素をパージすることによって、最小にされ得、または防止され得る。
【０２０７】
一部の態様において、吸着（例えば、ＣＮＰ変異体の、プラスチックまたはガラスへの吸着）を最小にし、または防止するために、Polysorbate 20、Polysorbate 80、もしくはベンジルアルコール、またはそれらの組合せが、ＣＮＰ製剤に加えられる。特定の態様において、各抗吸着剤は、約０．００１％から約０．５％、約０．０１％から約０．５％、約０．１％から約１％、約０．５％から約１％、約０．５％から約１．５％、約０．５％から約２％、または約１％から約２％の濃度である。製剤中の抗吸着剤の例示的な範囲として、限定されないが、約０．００１％から約０．５％のPolysorbate 20、約０．００１％から約０．５％のPolysorbate 80、および／または約０．５％から約１．５％のベンジルアルコールが挙げられる。
【０２０８】
特定の態様において、液体ＣＮＰ製剤は、以下を含み、または凍結乾燥ＣＮＰ製剤は、以下を含む製剤から調製される：（１）約３０ｍＭ±５または１０ｍＭの濃度の緩衝剤を有し、ｐＨが約４±０．５または１である酢酸／アセテート（例えば酢酸ナトリウム）バッファー、および（２）約１％±０．５％の濃度にてベンジルアルコール（例えば、防腐剤および／または抗吸着剤として）、そして任意で（３）約１０％±５％の濃度にてスクロース。
【０２０９】
本開示はまた、例えば、液体（例えば注射可能な滅菌）製剤または固体（例えば凍結乾燥された）製剤を含むボトル、バイアル、アンプル、管、カートリッジ、および／またはシリンジを含有するキットを提供する。キットはまた、限定されないが、注射用に、または濃縮物をより低い濃度に希釈するために、凍結乾燥剤をシリンジ内で再構成することを含む、固体（例えば凍結乾燥された）製剤を投与（例えば、注射による）用の溶液または懸濁液に再構成するための、薬学的に許容されるビヒクルまたはキャリア（例えば、溶媒、溶液、および／またはバッファー）を含有することもできる。さらに、即席注射溶液および懸濁液が、例えば、ＣＮＰ含有組成物を含む滅菌粉末、顆粒、またはタブレットから調製され得る。キットはまた、分配装置、例えばエーロゾルまたは注射分配装置、ペンインジェクタ、オートインジェクタ、無針インジェクタ、シリンジ、および／または針を備えてもよい。
【０２１０】
非限定的な例として、キットは、シングルチャンバまたはデュアルチャンバを有するシリンジを備えてよい。シングルチャンバシリンジについて、シングルチャンバは、注射用の溶液もしくは懸濁液に再構成され得る、注射用に準備された液体ＣＮＰ製剤、固体（例えば凍結乾燥された）ＣＮＰ製剤、または比較的少ない量の適切な溶媒系（例えばグリセリン）中のＣＮＰ変異体の液体製剤を含有してよい。デュアルチャンバシリンジについて、一方のチャンバが、薬学的に許容されるビヒクルまたはキャリア（例えば、溶媒系、溶液、またはバッファー）を含有してよく、他方のチャンバが、注射のために、第１のチャンバのビヒクルまたはキャリアを用いて溶液または懸濁液に再構成され得る、ＣＮＰ変異体の固体（例えば凍結乾燥された）ＣＮＰ製剤、または比較的少ない量の適切な溶媒系（例えばグリセリン）中の液体製剤を含有してよい。
【０２１１】
更なる例として、キットは、１つまたは複数のペンインジェクタ装置またはオートインジェクタ装置、およびデュアルチャンバカートリッジを備えてよい。カートリッジの一方のチャンバが、薬学的に許容されるビヒクルまたはキャリア（例えば、溶媒系、溶液、またはバッファー）を含有してよく、他方のチャンバが、注射のために、第１のチャンバのビヒクルまたはキャリアを用いて溶液または懸濁液に再構成され得る、ＣＮＰ変異体の固体（例えば凍結乾燥された）ＣＮＰ製剤、または比較的少ない量の適切な溶媒系（例えばグリセリン）中の液体製剤を含有してよい。カートリッジは、所望の期間（例えば、１日、２日、３日、１週、２週、３週、４週等）にわたる投薬に十分な量のＣＮＰ変異体を含むことができる。ペンインジェクタまたはオートインジェクタは、所望の量のＣＮＰ製剤をカートリッジから投与するように調整され得る。
【０２１２】
また、ＣＮＰ変異体を含む薬学的組成物は、所望の期間、例えば１週、２週、３週、１ヵ月、２ヵ月、または３ヵ月にわたって投薬量の比較的一定のレベルを維持するための徐放系、放出制御系、または持続的放出系として製剤化されてよい。徐放製剤、放出制御製剤、および持続的放出製剤は、当技術分野において公知なように、例えば、生物分解性ポリマー系｛これは、例えば、親水性ポリマー［例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−グリコリド）］を含んでよい｝を用いて調製されてよく、そして、例えば、マイクロパーティクル、マイクロスフェア、またはリポソームの形態をとってよい。
【０２１３】
投薬量および投薬の頻度
本明細書において用いられる用語、活性剤（例えばＣＮＰ変異体）の「治療的有効量」は、患者に治療的利点をもたらす量を指す。量は、個体毎に変わってよく、患者の全体的な健康状態を含むいくつかの要因によって決定され得る。ＣＮＰ変異体の治療的有効量が、公開されている材料および手順を用いて、当業者によって容易に確認され得る。例えば、治療に用いられるＣＮＰ変異体の量は、軟骨変性の逆転、または軟骨成長の増大の許容可能な速度を与えるべきである。
【０２１４】
特定の個体についての投薬頻度は、処置されることになる障害、ならびに治療に対する個体の状態および反応を含む種々の要因に応じて変わり得る。特定の態様において、ＣＮＰ変異体を含有する薬学的組成物は、対象に、１日あたり約１回、２日あたり１回、３日あたり１回、１週あたり１回、１週あたり２回、１週あたり３回、２週毎に１回、または毎月投与される。
【０２１５】
本明細書における使用が意図されるＣＮＰ変異体は、骨関節炎、および骨関節炎関連症候がある他の症状を処置し、改善し、または予防するのに治療的に有効な用量で、患者に投与されてよい。ＣＮＰ変異体の安全性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な薬理学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を判定することによって、判定され得る。毒性の作用と治療的効果との用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を示す活性剤が通常好ましい。
【０２１６】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータが、ヒトに用いられる投薬量の範囲を定めるのに用いられ得る。投薬量は通常、毒性がほとんどないかごく僅かな、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に収まる。投薬量は、この範囲内で、使用される剤型および利用される投与経路に応じて変わってよい。治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイおよび動物実験から決定され得る。
【０２１７】
特定の態様において、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、約５または１０ｎｍｏｌ／ｋｇから約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または約２０ｎｍｏｌ／ｋｇから約２００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲の用量にて投与される。一部の態様において、ＣＮＰ変異体は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、もしくは２０００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量にて、または処置医師によって適切であると考えられた他の用量にて投与される。他の態様において、ＣＮＰ変異体は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、もしくは１０００μｇ／ｋｇ、または約１、１．２５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ／ｋｇの用量にて、あるいは処置医師によって適切であると考えられた他の用量にて投与される。本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体の用量は、限定されないが、毎日、１週あたり２または３回、毎週、２週毎、３週毎、毎月等を含む、本明細書中に記載される投薬頻度／投与頻度に従って投与されてよい。
【０２１８】
特定の対象についてのＣＮＰ変異体の投薬／投与の頻度は、処置されることになる障害、ならびに治療に対する対象の状態および反応を含む種々の要因に応じて変わってよい。ＣＮＰ変異体は、投薬あたり単回投与で投与されても複数回投与で投与されてもよい。特定の態様において、ＣＮＰ変異体は、単回投与で、または複数回投与で、毎日、隔日、３日毎、１週あたり２回、１週あたり３回、毎週、隔週、３週毎、毎月、６週毎、２ヵ月毎、３ヵ月毎、または処置医師によって適切であると考えられるように投与される。
【０２１９】
一部の態様において、ＣＮＰ変異体は、成長（例えば軟骨形成）の期間に続く、回復期間も見越して投与される。例えば、ＣＮＰ変異体は、静脈内に、皮下に、関節内に、または別のモードによって、しばらくの間、毎日または１週あたり複数回投与されてから、処置なしの期間が続いてよく、そしてサイクルが繰り返される。一部の態様において、処置の初期の期間（例えば、毎日、または１週あたり複数回のＣＮＰ変異体が投与される）は、３日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、または１２週間である。関連する態様において、処置なしの期間は、３日間、１週間、２週間、３週間、または４週間続く。特定の態様において、ＣＮＰ変異体の投薬レジメンは、３日間、毎日に続いて３日オフ；または１週間、毎日もしくは１週あたり複数回に続いて３日もしくは１週オフ；または２週間、毎日もしくは１週あたり複数回に続いて１週もしくは２週オフ；または３週間、毎日もしくは１週あたり複数回に続いて１週、２週、もしくは３週オフ；または４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、もしくは１２週間、毎日もしくは１週あたり複数回に続いて１週、２週、３週、もしくは４週オフである。
【０２２０】
投与モード
ＣＮＰ変異体、またはこれを含む薬学的組成物は、種々の経路で、例えば、皮下、関節内、静脈内、動脈内、腹膜内、筋肉内、皮内、または髄腔内注射によって、対象に投与されてよい。一態様において、ＣＮＰ変異体は、単回の皮下、関節内、静脈内、動脈内、腹膜内、筋肉内、皮内、または髄腔内注射によって、１日１回、隔日に１回、３日毎に１回、または１週につき１回投与される。
【０２２１】
ＣＮＰ変異体はまた、疾患の部位での、またはその近くへの直接注射によって投与されてもよい。さらに、ＣＮＰ変異体は、標的作用部位（例えば、異常な、または変質した関節領域または軟骨領域）でのデポーの埋込みによって投与されてよい。これ以外にも、ＣＮＰ変異体は、舌の下に舌下的に（例えば舌下錠）、肺中への吸入（例えば、インヘラまたはエーロゾルスプレー）によって、鼻腔中への送達（例えば鼻腔内スプレー）によって、眼中への送達（例えば点眼）によって、または経皮的送達によって（例えば、皮膚へのパッチによって）投与されてよい。ＣＮＰ変異体は、マイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム（電荷をもたない、または電荷をもった（例えばカチオン））、ポリマーマイクロパーティクル（例えば、ポリアミド、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−グリコリド））、マイクロエマルジョン等の形態で、経口投与されてもよい。
【０２２２】
投与の更なる方法は、浸透圧ポンプ（例えばAlzetポンプ）またはミニポンプ（例えばAlzetミニ浸透圧ポンプ）によるものであり、これらにより、所定の期間にわたるＣＮＰ変異体または薬学的組成物の制御された、連続的かつ／または徐放性の送達が可能となる。浸透圧ポンプまたはミニポンプは、皮下に、または標的部位（例えば、肢の長骨、骨端等）の近くに埋め込まれてよい。
【０２２３】
ＣＮＰ変異体またはその組成物が他のモードによっても投与され得ることは、当業者にとって明らかであろう。ＣＮＰ変異体またはその組成物の投与の最も有効なモードの決定は、当業者の技術範囲内である。
【０２２４】
ＣＮＰ変異体は、例えば、経口（口腔内および舌下を含む）、直腸、経鼻、局所的、肺、膣、もしくは非経口（筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、関節内、および静脈内を含む）投与に適した薬学的製剤として、または吸入もしくは通気による投与に適した形態で投与されてよい。意図される投与モードに応じて、薬学的製剤は、固体、半固体、または液体の剤型、例えばタブレット、坐薬、ピル、カプセル、粉末、液体、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、ローション等の形態であってよい。製剤は、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤型で提供されてよい。製剤は、有効量のＣＮＰ変異体、ならびに１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、キャリア、および／または希釈剤、そして任意で１つもしくは複数の他の生物学的に活性な剤を含む。
【０２２５】
併用療法
一態様において、ＣＮＰ変異体は、骨関節炎を処置し、改善し、または予防するのに有用な１つまたは複数の他の活性剤と併用されてよい。他の活性剤は、ＣＮＰ変異体の効果を増強することができ、かつ／またはＣＮＰ変異体の効果以外の他の薬理効果を生じることができる。本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体と併用され得る活性剤の非限定的な例として、他のナトリウム利尿ペプチド（例えばＢＮＰ）、ならびにペプチダーゼおよびプロテアーゼ（例えばＮＥＰおよびフーリン）、ＮＰＲ−Ｃおよびチロシンキナーゼ（例えばＦＧＦＲ−３）のインヒビター（例えばアンタゴニスト）がある。ＮＥＰインヒビターの例として、限定されないが、チオルファンおよびカンドキサトリルが挙げられる。ＮＰＲ−Ｃインヒビターの共使用はまた、ＮＰＲ−Ｃによる変異体のクリアランスの阻害を介して、ＣＮＰ変異体の半減期を長くし得る。
【０２２６】
ＣＮＰ変異体は、抗炎症薬または鎮痛剤、例えば抗炎症剤、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、およびヒアルロン酸と組み合わされて投与されてよい。
【０２２７】
併用療法において適切な治療的結果を達成するために、当業者であれば一般に、対象にＣＮＰ組成物および他の治療薬を、所望の治療的結果（例えば、軟骨の修復、または軟骨変性の減少）をもたらすのに有効な組合せ量で投与するであろう。このプロセスは、ＣＮＰ組成物および他の治療剤を同時に投与することを含んでよい。同時の投与は、ＣＮＰ変異体および他の治療剤の双方を含む単一の組成物または薬理学的タンパク質製剤を投与することによって達成され得る。これ以外にも、他の治療剤は、ＣＮＰ変異体の薬理学的製剤（例えば、タブレット、注射、または飲料）とほぼ同時に、別々に服用されてよい。ＣＮＰ変異体はまた、摂取に適した食品、例えばブラウニー、パンケーキ、またはケーキ中に配合されてもよい。
【０２２８】
他の選択肢において、ＣＮＰ変異体の投与は、分から時間に及ぶインターバルだけ、他の治療剤の投与に先行してもよいし、その後に続いてもよい。他の治療剤およびＣＮＰ組成物が別々に投与される態様において、当業者であれば、一般に、ＣＮＰ変異体および他の治療剤が、互いの適切な時間以内に投与されて、ＣＮＰ変異体および他の治療剤の双方が、患者に対する有益な効果を相乗的に、または相加的に生じ得ることを確実にするであろう。例えば、当業者であれば、他の治療剤の約０．５〜６時間（前または後）以内に、ＣＮＰ組成物を投与し得る。一態様において、ＣＮＰ組成物は、他の治療剤の約１時間（前または後）以内に投与される。
【０２２９】
患者集団の同定およびモニタリング
ＣＮＰ治療に適した対象を同定するプロトコルが確立され得る。例えば、関節吸引／滑液分析、Ｘ線、および／またはＭＲＩ技術を用いて、適した患者が同定され得る。所定の患者がＣＮＰ治療に反応するかを判定するプロトコルもまた確立され得る。例えば、骨関節炎の処置について、成長の指標、例えば軟骨成長測定値および運動能評価が測定され得る。
【０２３０】
一ＣＮＰシグナル伝達マーカーは、ｃＧＭＰ（グアノシン３’，５’環状モノホスフェート）である。ＣＮＰが、その同族の受容体ＮＰＲ−Ｂに結合して、これを活性化した後に、この細胞内シグナル伝達分子のレベルが増大する。ｃＧＭＰのレベルの上昇が、ＣＮＰ曝露後の細胞培養抽出物（インビトロ）、ＣＮＰ曝露後の骨外植片試験（エクスビボ）由来の馴化培地から、そして皮下、静脈内、または当技術分野において公知の他の投与経路を介したＣＮＰ投与後の数分以内の血漿（インビボ）中で、測定され得る。
【０２３１】
また、軟骨特異的分析物（または軟骨関連マーカー）が、ＣＮＰ有効性を評価するのに測定されてもよい。例えば、切断されたコラーゲンＩＩ型のフラグメントが、軟骨代謝の軟骨特異的マーカーである。コラーゲンＩＩ型は、軟骨の主要な有機構成成分であり、コラーゲンＩＩ型のフラグメント（切断されたコラーゲン）は、軟骨代謝の後に、循環系中に放出されてから、尿中に分泌される。軟骨代謝が、新しい骨形成に先行する。
【０２３２】
軟骨の形成および成長または変性についての他の潜在的バイオマーカーとして、コンドロイチン硫酸アグリカン（軟骨代謝の軟骨特異的マーカー）、コラーゲンＩＩ型のプロペプチド（軟骨形成の軟骨特異的マーカー）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、コンドロイチン硫酸アグリカン、シンデカン−３、およびアネキシンＶＩが挙げられる。軟骨関連バイオマーカーは、例えば、有効性／薬力学的インビボ試験由来の、そしてエクスビボ試験の馴化培地由来の血清中で、市販のキットを用いて測定され得る。
【０２３３】
一態様において、少なくとも１つの軟骨関連バイオマーカーのレベルが、インビボで軟骨の形成および成長に対するＣＮＰ変異体の効果をモニタするためにＣＮＰ変異体が投与された対象において、アッセイまたは測定される。例えば、少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルの増大は、ＣＮＰ変異体の投与が、骨成長に対して正の効果を有しており、骨格の形成異常、およびＣＮＰ活性の低下と関連した他の骨関連疾患もしくは軟骨関連疾患または障害の処置に有用であることを示し得る。例示的な軟骨関連バイオマーカーとして、以下に限定されないが、ＣＮＰ（例えばＣＮＰの内因性レベル）、ｃＧＭＰ、コラーゲンＩＩ型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンＩＩ型およびそのフラグメント、コラーゲンＩ型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンＩ型およびそのフラグメント、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、コンドロイチン硫酸アグリカン、シンデカン−３、ならびにアネキシンＶＩが挙げられる。
【０２３４】
種々の態様において、バイオマーカーは、ＣＮＰ変異体が投与されることとなる、投与されている、または投与された対象から生体サンプルを得ることによって測定される。バイオマーカーは、以下に限定されないが、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および酵素活性アッセイを含む、当技術分野において公知の技術を用いて測定され得る。生体サンプルは、血液、血清、尿、または他の生体液であってよい。
【０２３５】
本開示の付加的な局面および詳細が、以下の実施例から明らかとなろう。これらは、限定ではなく例証となることが意図される。
【実施例】
【０２３６】
Ｆ．実施例
実施例１
ラット骨関節炎モデル
２７５〜３００グラムのラットにおける片側の内側半月板破裂により、進行性軟骨変性が迅速に生じる（軟骨細胞およびプロテオグリカンの損失、フィブリル化、骨増殖体の形成、および軟骨細胞のクローニングによって特徴付けられる）。このモデルは、関節腔が開くと半月板が大腿骨に向けられる（reflected toward）ように、内側側副靭帯の、半月板への付着部の直ぐ下での離断によって実行される。半月板を、その最も狭い点にて（小骨から離れて）、脛骨表面に損傷を与えないように気を付けて、そして結果として生じる横断面が、別個の、自由に移動可能な前方半月板の半分および後方半月板の半分を生成することを確認して、カットする。
【０２３７】
進行性の軟骨変性の変化が、術後３〜６週まで起こり、脛骨の軟骨変性は、脛骨の外側１／３で部分的に重度であり得、中央および内側１／３で、変性の変化の重篤度はより小さい。骨増殖体は、サイズが最終的に非常に大きくなり（内側脛骨）、そして次第に増大する。モデルは進行性であり、実質的に全てのラットで、１２ヵ月以内に総軟骨が損失する（象牙質化した骨になる）。病変は適度に一貫している。ラットに術後直ちに重量負荷を戻すと、歩行分析により、手術をされた膝の負荷力の、あったとしても僅かな変化が示唆される。ゾーン分析が、中間そして内側１／３における処置の効果を明らかにし得るが、軟骨変性の急速な進行のために、保護効果は、脛骨の軟骨の外側１／３において必ずしも明らかでない。大幅な軟骨下骨変化および骨端骨変化が、最も大きな病変重篤度の領域に対して下位の内側の脛骨で生ずる。これらは、軟骨下骨への破損が小さい、石灰化した軟骨層の好塩基性の増大から、骨の周囲が硬化した、骨端における骨吸収の領域への関節軟骨の明白な崩壊まで、大きさおよび型が変動する。したがって、このモデルは、剤の軟骨保護効果だけでなく、骨保存活性も評価する機会を提供する。モデルは比較的短い期間のものであり、動物は、外科手術に対する反応が非常に一貫している。
【０２３８】
このラットモデルを用いて、ＣＮＰ変異体の、骨関節炎における軟骨損傷の遅延または修復に対する効果を判定した。そこにはＣＮＰが、関節損傷または外傷に応じて送達されている。このモデルにおいて、破裂が半月板に導入されて、関節損傷が引き起こされ、これが軟骨変性および骨関節炎をもたらす（Janusz et al., Osteoarthritis Cartilage, 10:785-791, 2002）。雄Lewisラットに、０日目に片側の内側半月板切除術を受けさせ；対照ビヒクルまたはＣＮＰ変異体Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の投与を、７日目に始め；そして動物を、罹患関節の組織病理学的分析のために、２９日目に安楽死させた。Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７（対照ビヒクル中０．７１または２．２ｍｇ／ｍＬにて提供した）または対照ビヒクルのみを３週間、１週あたり３回（Ｍ、Ｗ、Ｆ）、関節内（ＩＡ）注射により投与した。歩行分析、および膝における軟骨細胞死／軟骨変性の組織病理学的調査によって、治療的有効性を評価した。
【０２３９】
外科手術
詳細には、外科手術動物をイソフルランで麻酔して、右の膝および下脚領域を、外科手術用に用意した。半月板破裂のために、膝の内側面を横切って皮膚切開して、内側の側副靭帯を、鈍的切開によって曝した後に、離断した。完全な破裂および閉じた創傷をシミュレートするために、内側半月板の全層をカットした。術後９０分で、動物を１％ＣＭＣ（２ｍＬ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｍｌ）中アセトアミノフェン（１００ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）の用量で処置した。後続の用量を、術後２４時間で（必要に応じて）与えた。
【０２４０】
組織病理学
組織病理学的分析のために、手術をした関節を、安楽死させたラットから回収した。５％ギ酸脱灰剤中での４〜６日後、手術をした関節を、正面でおおよそ等しい２つの半分にカットして、パラフィンに包埋する。切片を、それぞれ手術をした右膝からおおよそ１６０μｍにてカットして、トルイジンブルーで着色した。Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の、骨関節炎の進行に対する効果を評価するために、以下のパラメータを、処置した各関節について測定またはスコア化し、そしてビヒクル処置対照関節と比較した：軟骨変性、病変の深さ、病変の幅、石灰化した軟骨層および軟骨下骨への損傷、内側脛骨の軟骨下骨／骨端小柱骨の肥厚／硬化、骨増殖体の厚さ、コラーゲンの損傷、成長板の厚さ、ならびに内側側副靭帯／滑膜の修復。
【０２４１】
一部のパラメータ（注目する場合）について、脛骨プラトーにわたる領域差を、各切片を３つのゾーン（１−外側、２−中間、３−内側）に分けることによって、考慮する。
【０２４２】
データは、Studentのｔ検定またはMann-WhitneyのＵ検定（ノンパラメトリック）を用いて分析した。適しているならば、データは、一元配置の分散分析（１−方向ＡＮＯＶＡ）またはKruskal-Wallis検定（ノンパラメトリック）を、適切な多重比較事後検定と共に用いて、全群にわたってさらに分析してもよい。統計的検定は、データの正規性および分散の均一性に関するある仮説を設定して、検定がこの仮説に反するならば、更なる分析を必要としてよい。全ての検定についての有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。
【０２４３】
内側脛骨および大腿骨の一般的な軟骨変性
一般的な軟骨変性を、各関節について、軟骨細胞の死／損失、プロテオグリカン（ＰＧ）の損失、およびコラーゲンの損失またはフィブリル化の評価によって判定して、表１に示すようにスコア化した。
【０２４４】
（表１）軟骨変性の組織病理学的スコア化基準
2019505486.tif 000033
【０２４５】
各ゾーンについてデータを表すことに加えて、軟骨変性についての３つのゾーンの総計を算出した。低い用量（３５．５μｇ／用量）または高い用量（１１０μｇ／用量）にてＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置したラットは、未処置の対照ラットと比較して、脛骨における軟骨変性の有意な減少を示した（図１）。
【０２４６】
内側脛骨の病変の深さおよび幅
病変のいずれかの型の深さ（病変深さ）およびタイドマークまでの深さ（総深さ）を、脛骨プラトーの３つのゾーンのそれぞれにおける、最も大きな病変重篤度の領域において、接眼ミクロメータによって測定した。これらの測定値から、病変深さを総深さで割ることによって、深さ比を各関節について算出した。タイドマークまでの総深さは、ゾーンの中間点にて測定した場合に、同化物（anabolics）の比較用の３つのゾーンのそれぞれにおける軟骨厚さの平均測定値となり得る。図２は、深さ比が、ビヒクル処置対照と比較して、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置群で向上したことを示す。いずれかの変性（細胞の損失、プロテオグリカンの損失、またはコラーゲンの損傷）に影響を受けた、接眼ミクロメータによって測定した軟骨の幅もまた、ＣＮＰ処置群において向上した（図３）。この測定は、表面にわたって隣接する軟骨変性（外側１／３）による骨増殖体の起点から、接線方向の層および基礎となる軟骨が組織学的に正常に見える点にまで延びる。
【０２４７】
大幅な軟骨変性は、接眼ミクロメータで測定して、軟骨厚さの５０％超に延びる軟骨細胞およびプロテオグリカンの損失として定義される。典型的には、このモデルにおいて、コラーゲンの損傷は軽度（２５％までの深さと定義する）またはそれ以上である。しかしながら、軟骨細胞およびプロテオグリカンの損失は著しく、軟骨深さの少なくとも５０％またはそれ以上にまで延び、永続的な構造変化が生じた領域であることを示す。大幅な軟骨変性を示す、手術をした関節の幅を、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置動物およびビヒクル処置対照において測定して、大幅な変性を減少させるＣＮＰ変異体の能力を評価した。図４に示すように、ビヒクル処置対照は、変性幅の減少をほとんど示さなかった一方、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置動物は、大幅な脛骨軟骨変性の、５０％を超える向上を示した。
【０２４８】
石灰化した軟骨層および軟骨下骨の損傷
石灰化した軟骨層および軟骨下骨への損傷を、表２における基準を用いてスコア化した。
【０２４９】
（表２）軟骨層および軟骨下骨の損傷の組織病理学的スコア化基準
2019505486.tif 000034
【０２５０】
Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７によるより高い用量（１１０μｇ／用量）での処置は、石灰化した軟骨および軟骨下骨の損傷を、ビヒクル処置動物のおおよそ２．４のスコアから、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置動物の１．３にまで減少させた。また、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７によるより低い用量（３５．５μｇ／用量）での処置は、石灰化した軟骨および軟骨下骨の損傷を、より高い用量ほどではないにせよ、減少させた。
【０２５１】
脛骨の肥厚、骨増殖体の厚さ、および総関節スコア
内側の脛骨軟骨下骨／骨端小柱骨の肥厚／硬化を、表３に示す基準に基づいて、外側脛骨および／または正常な左内側脛骨との比較を用いて、スコア化した。
【０２５２】
（表３）骨肥厚の組織病理学的スコア化
2019505486.tif 000035
【０２５３】
結果は、本試験によって設定した有意性を示さなかったが、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７による双方の用量での処置は、ビヒクル処置対照と比較して、内側の脛骨軟骨下骨／骨端小柱骨の肥厚／硬化の観察可能な減少を示した。
【０２５４】
骨増殖体の厚さ（滑膜に向けて延びる最も遠い点までのタイドマーク）を、接眼ミクロメータで測定した。スコアを、表４における基準に従って、各切片（典型的には脛骨上に見出される）における最も大きな骨増殖体につけた。
【０２５５】
（表４）骨増殖体の厚さのスコア化
2019505486.tif 000036
【０２５６】
Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７による高い用量（１１０μｇ／用量）での処置が、脛骨増殖体測定値をおおよそ２４％減少させ（ｐ＜０．０５）、そして脛骨増殖体スコアをおおよそ３４％減少させた（ｐ＜０．０５）。骨増殖体は、ＯＡ関節において起こる骨の成長である。骨増殖体スコアデータは、ＣＮＰ変異体が、骨増殖体、すなわち骨の成長を減少させることができることを実証する。この観察は、骨成長を促進するＣＮＰおよびＣＮＰ変異体の公知の役割を考えると、驚くべきかつ予想外なことである。
【０２５７】
「総関節スコア」を、脛骨および大腿骨の軟骨変性の３つのゾーンスコアのそれぞれと骨増殖体スコア（大腿骨ありの総関節スコア）とを合計することによって、ならびに脛骨軟骨変性のみの３つのゾーンスコアのそれぞれと骨増殖体スコア（大腿骨なしの総関節スコア）とを合計することによって、各関節について算出した。図５に示すように、１１０μｇ／用量でのＧｌｙ−ＣＮＰ−３７は、大腿骨なしの総関節スコアを有意に減少させた。また、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７による、より低い３５．５μｇ／用量での処置は、より高い用量と比較して、それほどではないにせよ、大腿骨なしの総関節スコアの向上を示した。大腿骨についてのスコアを含めた場合（図６）、結果は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７が、双方の用量にて総関節スコアを、有意なレベルにではないが減少させることを示している。
【０２５８】
コラーゲンの損傷、成長板の厚さ、および靭帯／滑膜の修復
内側の脛骨プラトー（最も酷く罹患した切片の半分２つ）にわたるコラーゲンの損傷を、接眼ミクロメータ、および以下のパラメータを用いて、以下の総幅を測定することによって評価した：任意の損傷（表面から全層の損失に及ぶフィブリル化）；重度の損傷（コラーゲンの、タイドマークまでの総損失またはほぼ総損失、厚さの＞９０％）；顕著な損傷（軟骨厚さの６１〜９０％を通って延びる）；中程度の損傷（軟骨厚さの３１〜６０％を通って延びる）；軽度の損傷（軟骨厚さの１１〜３０％を通って延びる）；および軽微な損傷（非常に表面の、上部１０％のみに影響を及ぼす）。
【０２５９】
Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７による、より低い用量およびより高い用量の双方での処置により、未処置の対照と比較して、重度の変性、顕著な変性、および中程度の変性を有する領域は、より少なかった。
【０２６０】
成長板の厚さを、全ての膝において、内側および外側の骨端軟骨のおおよその中間点（切片の非接線方向の領域を仮定する）にて内側の側部および外側の側部（２つの測定値／関節）で、接眼ミクロメータを用いて測定した。Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の、１１０μｇの用量での投与は、内側の成長板の厚さを有意に減少させた。３５．５μｇの用量でのＧｌｙ−ＣＮＰ−３７は、統計分析による有意な減少ではないが、内側の厚さの減少を示した（図７）。また、層別解析でも確認した。そこでは、外側の厚さを内側の厚さから減算して、２つの間の差異を判定した。図８は、この分析を用いて、より高い用量でのＧｌｙ−ＣＮＰ−３７が成長板の厚さを有意に減少させた一方、より低い用量が、より高い用量と同程度にではないが、成長板の厚さを減少させたことを示している。
【０２６１】
また、内側の側副靭帯／滑膜修復を、接眼ミクロメータを用いて、切片の非接線方向の領域における内側の滑膜／側副靭帯の修復の厚さを測定することによって分析した。これらの測定は、処置群間でいかなる差異も示さなかった。
【０２６２】
歩行分析
歩行分析は、インクを足の腹側表面に塗布して、紙の全体にわたる移動中の体重負荷（フットプリント）を記録することによって実行した。ラットの後足にインクをつけてから、ラットを紙上に置いて、全長を歩けるようにした。歩行を、表５における基準（記載は、罹患した／冒された脚に言及する）を用いて視覚的にスコア化した。
【０２６３】
（表５）歩行分析のスコア化基準
2019505486.tif 000037
【０２６４】
Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置動物は、高い用量または低い用量のいずれにおいても、試験のおおよそ１５日目から２８日目まで、運動能および歩行の向上を示した（図９）。また、歩行スコアの曲線下面積（ＡＵＣ）も算出した。図１０は、より低い用量でのＧｌｙ−ＣＮＰ−３７が、歩行スコアを、より高いＣＮＰ用量よりも大きく減少させており、歩行スコアが、未処置の対照と比較して、双方の処置集団についてより低かったことを示している。
【０２６５】
実施例１に示される結果は、外傷直後のＧｌｙ−ＣＮＰ−３７等のＣＮＰ変異体による骨関節炎の処置が、冒された対象の、軟骨変性および運動能を含む骨関節炎の症候に対して有益な効果を有することを示している。
【０２６６】
実施例２
追加的なラット試験を、実施例１のラットモデルおよび実験方法論を用いて実行して、第２のＣＮＰ変異体、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の、骨関節炎の処置における使用を調査し、かつこれをＧｌｙ−ＣＮＰ−３７と比較した。
【０２６７】
（表６）試験設計および試験群
2019505486.tif 000038
【０２６８】
表６に要約するように、ラットの群を、ビヒクル、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７、またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した。投与経路は、関節内（ＩＡ）または皮下（ＳＣ）であった。投与スケジュールは、関節内投与を３週間（ＴＩＷｘ３Ｗ）、１週あたり３回（Ｍ、Ｗ、およびＦ）、または皮下投与をおおよそ３週間（ＱＤｘ３Ｗ）、１日１回であった。ラットは、試験０日目に外科手術を経験した；群１〜５は、群６〜７のおおよそ１週前に、外科手術を経験した（すなわち、少しずつずらして試験を行った）。ＩＡ注射を固定用量として行った一方で、ＳＣ注射を、一番最近に記録した体重に基づいて、重量あたりの所定の用量にて行った。全てのラットについて、体重を、投与前に測定した。３００グラムのラットについて、低い、中間の、そして高いレベル用の毎週のＩＡ投与レジメンは、それぞれ１５、５０、および１５０μｇ／ｋｇ／日におおよそ等しかった。ラットを、最終投与後の２５日目に安楽死させて、関節を、組織病理学的分析およびスコア化用に回収した。
【０２６９】
血漿の薬物動態学および薬力学
ＣＮＰ変異体の薬物動態学（ＰＫ）特性および薬力学（ＰＤ）特性を評価した。ＰＫ／ＰＤ分析のために、時間を定めた採血を、以下の３匹のラット／群／時点に実行した：ＩＡ群について、投薬後１５、３０、６０、および１２０分、ならびにＳＣ群について、投薬後５、１５、３０、６０、および１２０分。採血後、洗浄滑液（synovial lavage fluid：ＳＬＦ、約５０μＬ／膝）を、各ラットの左膝（正常）および右膝（手術をした）から収集した。
【０２７０】
組織病理学および免疫組織化学
膝を、組織病理学および免疫組織化学（ＩＨＣ）の分析用に保存した。主要エンドポイントは、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）用のＩＨＣを含む、膝における軟骨細胞死および軟骨変性の組織病理学的調査であった。実施例１において先に記載したように種々の組織病理学的特徴を測定して、スコア化した。特に、スコア化基準については表１〜表５を参照。
【０２７１】
任意の変性（細胞の損失、プロテオグリカンの損失、またはコラーゲンの損傷）によって影響される脛骨軟骨の総幅を、接眼ミクロメータによって測定した。図１１に示すように、中間の用量および高い用量にてＩＡにて与えたＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７は、総軟骨変性幅を有意にそれぞれおおよそ２６％および３２％減少させた。ゆえに、ＩＡでの３５．５μｇおよび１０５μｇの用量は、脛骨軟骨変性幅について、統計的有意性に達した。
【０２７２】
軟骨厚さの５０％超を通って延びる軟骨細胞およびプロテオグリカン損失によって定義される、大幅な軟骨変性に対するＣＮＰ変異体の効果を、接眼ミクロメータによって、脛骨プラトーで測定した。大幅な軟骨変性における用量反応性の減少を、関節内経路によって送達されるＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７について観察した（図１２）。３５．５μｇのＩＡ用量による幅の３２％の減少が見られ、そして１０５μｇのＩＡ用量による３６％の減少が見られた。統計学的に有意な減少が、１５０μｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７を３週間毎日皮下に与えたものについて観察された（幅の４２％の減少）。
【０２７３】
骨増殖体の厚さ（滑膜に向けて延びる最も遠い点までのタイドマーク）を、接眼ミクロメータで測定した。内側の脛骨の骨増殖体スコアにおける用量反応性の動向を、ＩＡ経路を介して投与したＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７について観察し（図１３）、３５．５μｇのＩＡでは１５％の減少が見られ、そして１０５μｇのＩＡでは１４％の減少が見られた。また、２６％の統計学的に有意な減少（ｔ検定でｐ＜０．０５）を、皮下投与したＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７について観察した。骨増殖体スコアの減少は、ＣＮＰ変異体が、ＯＡ関節における骨（骨増殖体）の異常な成長を減少させることができることを実証している。ここでも、ＣＮＰおよびＣＮＰ変異体が、長骨成長を促進することが示されたので、この観察は驚くべきであり、かつ予想外である。
【０２７４】
成長板の厚さを各群について測定した。内側および外側の成長板の厚さが、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の３５．５μｇのＩＡおよび１０５μｇのＩＡの双方でＩＡ処置した動物において、有意に大きかった（図１４）。さらにまた、内側および外側の成長板の厚さが、ビヒクルに対してＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７でＳＣ処置した動物において、より大きかった。
【０２７５】
総関節スコア（大腿骨なし）を、脛骨の軟骨変性の３つのゾーンスコアのそれぞれおよび骨増殖体スコアを合計することによって算出した。図１５において見られるように、関節スコア重篤度の有意な減少が、３５．５および１０５μｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７のＩＡ投与について、そしてまた１０５μｇのＧｌｙ−ＣＮＰ−３７について観察された。総関節スコア（マイナス大腿骨）の有意な減少が、ＳＣにて与えたＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７についても観察された。
【０２７６】
図１６は、滑膜炎スコアを示す。滑膜炎（主に、内側に濃縮された単核細胞浸潤）を、表７における基準を用いてスコア化した。
【０２７７】
（表７）滑膜炎のスコア化
2019505486.tif 000039
【０２７８】
滑膜炎スコア化重篤度の有意な増大は、全ての用量群の全体で観察されなかった。エンドトキシンは、Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７（０．７８ＥＵ／ｍＬ）を除いて、全ての製剤において定量限界未満（＜０．５ＥＵ／ｍＬ）であった。
【０２７９】
図１７は、様々な群についての−４日目から２５日目の体重（グラム）の平均変化を示す。体重増加の有意な減少が、ＩＡで３５．５および１０５μｇ／用量の双方にて与えた、そしてＳＣで１５０μｇ／ｋｇ／日用量にて与えたＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７について観察された。
【０２８０】
図１８は、群の歩行分析スコアを示す。歩行スコアは、８日目のビヒクルと比較して、皮下で送達されるＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７について、有意に減少した（４８％）。
【０２８１】
図１９および表８は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７で処置した動物（群２、群３、および群４（ＩＡ投与）ならびに群７（ＳＣ投与））についての血漿の薬物動態を示す。個々の血漿サンプルを、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＳＮＰ−３７レベルについて分析して、平均濃度対時間プロフィールを、血管外投与の非コンパートメントモデルを用いて、Phoenix WinNonlinソフトウェアで分析した。図１９において、各群についてのデータをプロットして、対応する群数のラベルを（各線上に）付した。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７は、ＩＡ注射およびＳＣ注射の双方の後に、全身の循環系において迅速に現れた。ＩＡ注射についての曝露（群２、群３、および群４）は、概して用量に比例し、ｔ１／２およびＣＬの著しい変化はなかった。曝露は、調査した最も低いＩＡ用量と同程度であったが、１日１回のＳＣ注射（群７）は、３回／週与えた２つの最も高い用量のＩＡ注射に対する有効性と同程度の反応をもたらすようであった。
【０２８２】
（表８）ＣＮＰ変異体の薬物動態
2019505486.tif 000040
【０２８３】
データは、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７（３５．５および１０５μｇ）またはＧｌｙ−ＣＮＰ−３７（１０５μｇ）による関節内処置が、ラットにおける内側半月板の破裂起因性骨関節炎の組織病理病変に対して、著しい、有益な効果を有したことを示している。
【０２８４】
１５０μｇ／ｋｇ／日のＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７による１日１回の皮下処置により、関節内処置と同程度であるかこれよりも良好な有効性がもたらされた。全体として、本試験は、軟骨保護効果の証拠を示している。
【０２８５】
実施例３
後期段階の骨関節炎のモデルを、以前から進行していた骨関節炎（すなわち、原発性骨関節炎）におけるＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の有効性を評価するのに用いた。実施例１および実施例２において先に記載したように、半月板を分離することによって、ラットの後脚に骨関節炎を誘導した。しかしながら、実施例１および実施例２と対照的に、病変病理を、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７によるＩＡ処置またはＳＣ処置の３週間前に進行させることによって、既存のＯＡ（すなわち原発性骨関節炎）をシミュレートした。全体的な試験設計を、表９において概説する。詳細には、雄Lewisラットは、試験０日目に片側内側半月板を破裂させる外科手術を受けた；対照ビヒクルまたはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７の投与を、試験２１日目に始めた；そして動物を、試験２２日目（群１〜４）または試験４０日目（群５〜１１）の最後の投与後に、予定の時点にて安楽死させた。評価した主要エンドポイントは、膝における軟骨細胞死／軟骨変性の組織病理学的調査を含んだ。
【０２８６】
（表９）後期段階の骨関節炎の試験設計および群
2019505486.tif 000041
【０２８７】
全ての動物は、予定の試験終了時点まで生き残っていた。試験終了後、ラットを安楽死させて、膝を収集して、固定して、組織病理学的分析用に切片化して、表１〜表５および表７のようにスコア化した。試験結果についての要約を、表１０に示す。
【０２８８】
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７（３５．５または１０５μｇ）投与ＩＡ、ＴＩＷｘ３Ｗによる処置、およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７（１５０μｇ／ｋｇ）投与ＳＣ、ＱＤｘ３Ｗによる処置は、後期段階のラット半月板破裂誘導骨関節炎において、膝組織病理学の評価によって判定して、僅かから著しい、有益な効果を示した。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７によるＩＡ処置の結果は、用量反応的であった。
【０２８９】
病変重篤度は、ＳＣ処置ラットにおいて減少した滑膜炎を除いて、ＩＡ対照と比較して、ＳＣ対照において僅かに増大したが、関節炎パラメータは、ビヒクル対照群の全体にわたって、概して同程度であった。体重増加は、術後４０日のＳＣビヒクル対照において、ＩＡ対照と比較して、有意に増大した。
【０２９０】
（表１０）臨床データおよび組織病理学データの要約
2019505486.tif 000042
2019505486.tif 000043
ＣＤ＝軟骨変性、ＩＡ＝関節内、ＳＣ＝皮下、ＴＩＷｘ３Ｗ＝３週間、１週あたり３回、ＱＤｘ３Ｗ＝約３週（２０日）間、毎日１回。
（ＳＥ）＝括弧内に示した標準誤差。
*ｐ＜０．０５  ＡＮＯＶＡ／Ｋ−Ｗ検定（Dunnett/Dunnの事後） 対 各ＩＡビヒクルまたはＳＣビヒクル（４０日目）対照。
†ｐ＜０．０５  Studentのt検定／Ｍ−Ｗ検定 対 ＩＡビヒクル（４０日目）。
‡ｐ＜０．０５  Studentのt検定／Ｍ−Ｗ検定 対 ＳＣビヒクル（４０日目）。
【０２９１】
３５．５μｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７でＩＡ処置したラットは、ＩＡビヒクル対照と比較して、ゾーン−２脛骨軟骨変性スコアを有意に（３１％）減少させた。脛骨軟骨変性の合計スコアおよび大幅な脛骨軟骨変性幅は、有意でないがそれぞれ２０％および３０％減少した。ゾーン−３の内側脛骨の軟骨変性スコアおよびゾーン−１の大腿骨の軟骨変性スコアは、存在する場合には病変が一般に軽微または軽度であったが、有意に増大した。
【０２９２】
１０５μｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７でＩＡ処置したラットは、ＩＡビヒクル対照と比較して、体重増加を有意に減少させた。１０５μｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７によるＩＡ処置は、ＩＡビヒクル対照と比較して、ゾーン−２の内側脛骨の軟骨変性（４４％の減少）、ゾーン−３の内側脛骨の軟骨変性（９３％）、内側脛骨の合計の軟骨変性（３１％）、および総脛骨軟骨変性幅（２８％）を有意に減少させた。大幅な脛骨軟骨変性幅は、処置によって、有意でないが（３８％）減少した。
【０２９３】
１５０μｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７でＳＣ処置したラットは、ＳＣビヒクル対照と比較して、体重増加を有意に減少させた。１５０μｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７による（ＳＣ）処置は、ＳＣビヒクル対照と比較して、総脛骨軟骨変性幅を有意に減少させた（２２％の減少）。大幅な脛骨軟骨変性幅は、処置によって、有意でないが減少した（１６％）。内側および外側の成長板の厚さは、処置によって有意に増大し、内側と外側の厚さの差異の有意な減少に寄与した。
【０２９４】
図２０において示すように、１０５μｇでのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７  ＩＡ処置、および１５０μｇ／ｋｇでのＳＣ処置は、脛骨の平均軟骨変性の減少をもたらした。しかしながら、大幅な脛骨軟骨変性は、ＩＡ処置用量および最も高いＳＣ用量の双方によって、減少した（図２１）。さらに、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７投与ＩＡは、内側脛骨の軟骨変性スコア（図２２）および内側脛骨の軟骨変性深さ比（図２３）の、統計学的に有意な減少をもたらした。
【０２９５】
実施例１および実施例２において先に記載したように、総関節スコアは、組織病理学的な分析およびスコア化によって、各関節（大腿骨あり、そしてなし）について算出した。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７投与ＩＡは、大腿骨あり関節スコアの７％（３５．５μｇ）および１９％（１０５μｇ）の減少を、そして大腿骨なしで算出した場合に、１１％（３５．５μｇ）および２１％（１０５μｇ）の減少をもたらした（図２４（大腿骨あり）および図２５（大腿骨なし））。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７投与ＳＣは、最も高い用量レベル（１５０μｇ／ｋｇ）にて、７％（大腿骨あり）および１０％（大腿骨なし）のより穏やかな減少があった（図２４および図２５）。
【０２９６】
図２６に見られるように、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置は、全ての用量および投与経路にて、骨増殖体スコアに対して穏やかな効果を有した。実施例２に記載される初期段階の骨関節炎試験と同様に、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ−３７処置は、処置動物における体重変化の減少をもたらした（図２７）。
【０２９７】
本発明は、本発明の真の範囲を逸脱しない範囲で、他の具体的な形態に体現されてよい。「本発明」へのいずれの言及も、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、本発明の例示的な態様に言及することが意図され、本発明の全ての態様に言及すると解釈されるべきでない。記載された態様は、あらゆる点で、制限ではなく例証としてのみ考慮されるべきである；多数の変形および変更が、当業者に明らかとなろう。
【図１】
2019505486.tif 000049
【図２】
2019505486.tif 000050
【図３】
2019505486.tif 000051
【図４】
2019505486.tif 000052
【図５】
2019505486.tif 000053
【図６】
2019505486.tif 000054
【図７】
2019505486.tif 000055
【図８】
2019505486.tif 000056
【図９】
2019505486.tif 000057
【図１０】
2019505486.tif 000058
【図１１】
2019505486.tif 000059
【図１２】
2019505486.tif 000060
【図１３】
2019505486.tif 000061
【図１４】
2019505486.tif 000062
【図１５】
2019505486.tif 000063
【図１６】
2019505486.tif 000064
【図１７】
2019505486.tif 000065
【図１８】
2019505486.tif 000066
【図１９】
2019505486.tif 000067
【図２０】
2019505486.tif 000068
【図２１】
2019505486.tif 000069
【図２２】
2019505486.tif 000070
【図２３】
2019505486.tif 000071
【図２４】
2019505486.tif 000072
【図２５】
2019505486.tif 000073
【図２６】
2019505486.tif 000074
【図２７】
2019505486.tif 000075
【配列表】
2019505486000001.app
【国際調査報告】
2019505486.tif 000076
2019505486.tif 000077
2019505486.tif 000078
2019505486.tif 000079
2019505486.tif 000080
2019505486.tif 000081
2019505486.tif 000082
2019505486.tif 000083
2019505486.tif 000084
2019505486.tif 000085
2019505486.tif 000086
2019505486.tif 000087