(57)【要約】      （修正有）【課題】色素、金属イオン、ヒトタンパク質、宿主タンパク質、アルブミンの断片、アルブミンの重合体または凝集物とウイルスを極端に低レベルで含むかまたは本質的に含まず、本質的にグリケート化されていなくて、遊離チオールについて比較的高く、完全なＣ末端を有した、アルブミンの製造方法の提供。【解決手段】ポジティブモード陽イオン交換と、その後でポジティブモード陰イオン交換クロマトグラフィーにアルブミンを通す。他のステップ、例えば限外ロ過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アルブミンを結合させるアフィニティクロマトグラフィーと混入物質を結合させるアフィニティクロマトグラフィーも用いてよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンモニウムイオンがアルブミンから離されて、溶液から除去されうるように、溶液をカウンターイオンの溶液に暴露させることを含む、アルブミン溶液を精製する方法。
【請求項２】
カウンターイオン溶液がアルブミン溶液に加えられて、アンモニウムイオンが透析により除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カウンターイオン溶液が半透膜によりアルブミン溶液から分離されて、アンモニウムイオンがダイアフィルトレーションにより除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アンモニウムイオンがゲル浸透クロマトグラフィーにより溶液から除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
カウンターイオン溶液がナトリウムイオンを含む溶液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アルブミン溶液を精製する方法であって、アンモニウムイオンを含有した緩衝液中でクロマトグラフィー材料に該溶液を暴露させ、その後で、場合により更に精製または処方ステップ後に、請求項１〜５のいずれか一項に記載された方法によりアンモニウムイオンを除去して、精製したアルブミン生成物を得ることを特徴とする方法。
【請求項７】
クロマトグラフィー材料が固定化されたホウ酸イオンを含んでいる、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血清から抽出されたタンパク質ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはヒト血清アルブミンのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドコード配列で微生物を形質転換することにより製造される組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）を精製することに関する。この明細書において、“アルブミン”という用語は一般的にＨＳＡおよび／またはｒＨＡのことを指す。
【０００２】
アルブミンは重篤な熱傷、ショックまたは失血のある患者を治療するために用いられる。しかも、それは高等真核細胞を増殖させるために用いられる培地を補うためと、治療用タンパク質の処方で賦形剤として用いられる。現在、製品としての要求は、ヒト血液から抽出されたアルブミンで満たされている。抽出および分離技術の例には：陽イオン交換剤の使用に関するＪＰ０３／２５８７２８；陰イオン交換に続いて陽イオン交換の適用に関するＥＰ４２８７５８；加熱、塩分添加およびダイアフィルトレーションの適用に関するＥＰ４５２７５３で開示されたものがある。
【０００３】
微生物によるｒＨＡの生産はＥＰ３３０４５１およびＥＰ３６１９９１に開示されている。ｒＨＡの精製技術は、マトリックス由来色素の除去に関するＷＯ９２／０４３６７；酵母由来着色の除去に関するＥＰ４６４５９０；アルカリ沈降の後で、アルブミンに特異的親和性を有する親油相へのｒＨＡの適用に関するＥＰ３１９０６７に開示されている。
【０００４】
本発明は高度に精製されたアルブミンを提供する。
【０００５】
本発明の一面では、アルブミンを精製するための方法であって、アルブミンが特異的親和性を有していないクロマトグラフィー材料に比較的不純なアルブミン溶液を適用してアルブミンがその材料に結合し、アルブミンに特異的親和性を有する化合物の溶液を適用することによりその材料から結合アルブミンを溶出させるステップを含む方法を提供する。好ましくは、クロマトグラフィー物質は、後で例２に示されるようなＳＰ‐Sepharose ＦＦ、ＳＰ‐Spherosilなどのような陽イオン交換体である。アルブミンに特異的親和性を有する化合物は、オクタノエート（例えば、オクタン酸ナトリウム）、他の長鎖（Ｃ６〜Ｃ２２）脂肪酸、サリチレート、オクチルスクシネート、Ｎ‐アセチルトリプトファンまたはこれらのうち２種以上の混合物がある。
【０００６】
本発明の第二面では、アルブミンを精製するための方法であって、アルブミンが陽イオン交換物質に結合される陽イオン交換クロマトグラフィーと、アルブミンが陰イオン交換物質に結合されるその後の陰イオン交換クロマトグラフィーにアルブミン溶液を付すステップを含む方法を提供する。
【０００７】
陽イオン交換物質から溶出されたアルブミンは、その後で、上記陰イオン交換クロマトグラフィーに付される前に、１回以上のアフィニティクロマトグラフィー、限外ロ過およびゲル浸透により処理してもよい。このため、好ましい態様において、その方法は：
（ａ）アルブミンがマトリックスと結合するような条件下で、アルブミン溶液を陽イオン交換マトリックスに通す；
（ｂ）アルブミン含有陽イオン交換溶出液を上記マトリックスから溶離させる；
（ｃ）アルブミン結合性化合物を含んでなるアフィニティマトリックスに上記溶出液を通す；
（ｄ）上記マトリックスからアルブミン含有アフィニティマトリックス溶出液を溶離させる；
（ｅ）場合により限外ロ過後に、上記溶出液をゲル浸透マトリックスに通してアルブミンに富むフラクションを得る；
（ｆ）アルブミンがマトリックスと結合するような条件下で、上記のアルブミンに富むフラクションを陰イオン交換マトリックスに通す；および
（ｇ）上記陰イオン交換マトリックスから、精製されたアルブミン含有産物を溶離させる、
ステップを含む。
【０００８】
一方、陽イオン交換物質から溶出されたアルブミンは、（希釈以外の）いかなる中間処理もなしに、上記陰イオン交換物質に適用してもよい。このため、第二の好ましい態様では：
（ａ）アルブミンがマトリックスと結合するような条件下で、アルブミン溶液を陽イオン交換マトリックスに通す；
（ｂ）アルブミン含有陽イオン交換溶出液をそのマトリックスから溶離させる；
（ｃ）アルブミンがマトリックスと結合するような条件下で、陽イオン交換溶出液を陰イオン交換マトリックスに通す；
（ｄ）陰イオン交換マトリックスからアルブミン含有陰イオン交換溶出液を溶離させる；
（ｅ）アルブミン結合性化合物を含んでなるアフィニティマトリックスに陰イオン交換溶出液を通す；
（ｆ）そのアフィニティマトリックスからアルブミン含有アフィニティマトリックス溶出液を溶離させる；
（ｇ）そのアフィニティマトリックス溶出液をゲル浸透マトリックスに通してアルブミンに富むフラクションを得る、
ステップを含む、アルブミンを精製するための方法を提供する。
【０００９】
好ましくは、陽イオン交換ステップ前に、アルブミン溶液は、オクタノエートおよび／または他のアルブミン安定剤（例えば、ナトリウムアセチルトリプトファネート）をそれに約１〜１０ｍＭの最終濃度まで加えて、ｐＨを約４．０〜５．０に調整することにより調節される（conditioned）。
【００１０】
有利には、陽イオン交換ステップに留められたアルブミンは、溶離される前に、高塩溶液（例えば、１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜４０ｍＭ、例えば２７ｍＭ酢酸ナトリウムでｐＨ４．０に緩衝化された０．５〜２．０Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄される。
【００１１】
好ましくは、陽イオン交換溶出液が陰イオン交換体に直接通されるプロセスにおいて、アルブミンは、アルブミンに特異的親和性を有した化合物、特に酸またはその塩、例えばオクタノエートまたはいずれか他の長鎖（Ｃ６‐Ｃ２２）脂肪酸、サリチレート、オクチルスクシネートまたはＮ‐アセチルトリプトファンを含有した緩衝液を用いて、陽イオン交換ステップで溶離される。
【００１２】
適切には、アルブミンは、高レベル（例えば、少くとも５０ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭ、例えば８０〜１５０ｍＭ）のホウ酸塩、例えばテトラホウ酸ナトリウムまたはカリウムを含有した緩衝液で陰イオン交換体から溶離される。
次いで、本発明により精製されたアルブミンは、中間プロセスステップと共にまたはそれなしで、複合糖質および糖類、例えばアミノフェニルボロン酸（aminophenylboronic acid）（ＰＢＡ）と選択的に結合する固定された化合物を含有する樹脂でクロマトグラフィーに付される。
【００１３】
アフィニティクロマトグラフィーを伴う本発明のいかなるプロセスにおいても、アフィニティクロマトグラフィーでは、好ましくはα，ω‐ジアミノ置換を有したスペーサー、例えば１，４‐ジアミノブタン、またはＣ１‐８、好ましくはＣ１‐６、例えばＣ１‐５、最も好ましくはＣ４長の別なスペーサーを介して、好ましくは樹脂に固定化された、Cibacron Blueタイプの色素のような、固定されたアルブミン特異性色素を含んでなる樹脂を用いることが好ましい。意外にも、本発明者らは、このような色素が全長アルブミン分子よりも、実際にはＨＡ分泌微生物の培養で生産することができる４５ｋＤアルブミン断片の方に大きな親和性を有していることを見出した。４５ｋＤ断片は典型的には１‐４０３〜１‐４０９領域からなり、Sleep et al (1990) Bio/Technology 8,42-46 およびＷＯ９５／２３８５７に開示されている。
【００１４】
本発明の方法により調製された精製アルブミン溶液は、その意図した用途に従い更に加工処理してもよい。例えば、それは少くとも約８０ｇアルブミン／ｌのアルブミン濃度を有する限外ロ過保留液（retentate）を得るために限外ロ過膜で限外ロ過し、限外ロ過保留液は保留液の少くとも５倍相当の水に対してダイアフィルトレーションしてもよい。あるクロマトグラフィーステップ、例えば固定化されたアミノフェニルボロネートを使うステップには、アンモニウムイオンを含有させておくことが有利である。意外にも、本発明者らはこのようなアンモニウムイオンが比較的強くアルブミンに結合されることを発見した。このようなアンモニウムイオンはアルブミンから除去されることが好ましく、本発明者らはこれがカウンターイオン（counter-ion）の使用により果たせることを発見した。アルブミンをカウンターイオンに暴露させたいという望みは、従来のプロセスではアンモニウムイオンが関与していないことから当業者に生じるはずがなく、アンモニウムイオンがアルブミンにより結合されると思いつく理由はなかった。
【００１５】
したがって、本発明の別な面では、アンモニウムイオンがアルブミンから離されて、溶液から除去されるように、カウンターイオンの溶液にアルブミン溶液を暴露させることを含む、アルブミン溶液を精製するための方法を提供する。
【００１６】
カウンターイオン（好ましくは、ナトリウムイオンのような金属イオン）がアルブミン溶液に加えられて、アンモニウムイオンは透析により除去されるか、またはアンモニウムイオンはカウンターイオンの溶液からアルブミンを分離させる半透膜でダイアフィルトレーションされるか、またはそれらはゲル浸透クロマトグラフィーにより除去することができる。保留液の少くとも５倍容量の５０ｍＭ塩化ナトリウムに対するダイアフィルトレーションが通常適切である。
【００１７】
得られたアルブミンは、着色料（colorant）、乳酸（lactate）、クエン酸（citrate）、金属、ヒトタンパク質、例えば免疫グロブリン、プレカリクレインアクチベーター、トランスフェリン、α１‐酸糖タンパク質、ヘモグロビンおよび血液凝固因子、原核性タンパク質、アルブミンの断片、アルブミン凝集物またはポリマー、内毒素、ビリルビン、ヘム、酵母タンパク質およびウイルスが極端に低レベルであるか、または本質的に含まないことがわかった。“本質的に含まない”とは、検出可能レベル未満を意味する。本明細書で用いられる“着色料”という用語は、アルブミンを着色する任意の化合物を意味する。例えば、色素（pigment）は組換えアルブミンを製造するために用いられる生物、特に酵母から生じる着色料であるが、染料（dye）はアルブミンを精製するクロマトグラフィーステップから生じる着色料である。本発明のプロセスにより精製されたアルブミン調製物中において、少くとも９９重量％、好ましくは少くとも９９．９重量％のタンパク質はアルブミンである。このような高純度アルブミンが有害な副作用を引き起こす見込みは少ない。
【００１８】
本発明のプロセスにより生産された本発明アルブミンは、還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによると少くとも９９．５％モノマー、好ましくは実質的に１００％モノマーであることがわかり、下記特徴のうち１または２以上で特徴付けられる。それは、１５０ｎｇ未満、好ましくは１００ｎｇ未満のアルミニウムイオン含量；３，０００ｎｇ未満、好ましくは１，０００ｎｇ未満の鉄イオン含量；１０，０００ｎｇ未満、好ましくは５，０００ｎｇ未満の銅イオンレベル；３，０００ｎｇ未満、好ましくは１，５００ｎｇ未満のマグネシウムイオンレベル；５，０００ｎｇ未満、好ましくは３，０００ｎｇ未満の亜鉛イオンレベル；５０ｎｇ未満のマンガンイオンレベル（すべてアルブミン１ｇに対して）；ヘキソース０．６未満、好ましくは０．１５未満（更に好ましくは０．０５未満)モル／モルタンパク質のグリケーション(glycation)レベル；後記例９のように測定すると、２０Ｖ.sec未満、好ましくは１０Ｖ.sec未満の低分子量混入物質（contaminants）レベル；キャピラリーゾーン電気泳動図で単一ピーク；完全な（intact）、即ち同質の（homogeneous）Ｃ末端およびＮ末端；少くとも０．８５モルＳＨ／モルタンパク質の遊離チオール含量；および０．３mol/mol以下のＣ１０〜Ｃ２０脂肪酸を有していて、実質的にＣ１８またはＣ２０脂肪酸を有しない。
【００１９】
出発材料はアルブミン含有発酵培地でもよいし、または不純アルブミン溶液はこの５０年間かけて開発されてきた多数の抽出および精製技術、例えばStoltz et al (1991) Pharmaceut.Tech.Int.,June 1991, 60-65 および More & Harvey (1991) "Blood Separation and Plasma Fractionation" , Ed. Harris, Wiley- Liss,261-306に開示された任意のものにより血清から得られた溶液であってもよい。
【００２０】
特にアルブミンがプロテアーゼ欠損酵母または他の生物で生産されたｒＨＡである場合、そのプロセスには（ＥＰ４２８７５８およびＥＰ６５８５６９とは異なり）精製プロセスの一部として熱処理ステップを通常含んでいない。同様に、それが（ヒトよりむしろ）微生物から製造されるならば、最終低温殺菌ステップ（典型的には６０℃で１時間）を通常要しない。
【００２１】
最終生成物は、それに安定性を付加するように処方してもよい。好ましくは、本発明の高純粋アルブミン製品は少くとも１００ｇ、更に好ましくは１ｋｇまたは１０ｋｇのアルブミンを含有しており、これは多数のバイアルに分けてもよい。本発明の方法は血清のようないくつかの供給源による不純アルブミン溶液からもっと精製されたアルブミンを得るために利用することもできるが、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）を精製する上で特に適用しうる。本発明により生産されるアルブミンはラット、ウシまたはヒツジアルブミンのようないかなる哺乳動物アルブミンであってもよいが、好ましくはヒトアルブミンである。アルブミンをコードするＤＮＡはアルブミンを生産するために適切な宿主で発現される。従って、ＤＮＡが発現ベクターを作るために公知の技術に従い用いられ、その後でそれがアルブミンの発現および生産向けに適した宿主細胞を形質転換させるために用いられる。このような技術には、ＥＰ‐Ａ‐７３６４６、ＥＰ‐Ａ‐８８６３２、ＥＰ‐Ａ‐２０１２３９およびＥＰ‐Ａ‐３８７３１９に開示されたものがある。
細菌（例えば、E.coliおよびBacillus subtilis）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris およびKluyveromyces lactis）、糸状菌（例えば、Aspergillus）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含めた多くの発現系が知られている。好ましい微生物は酵母Saccharomyces cerevisiaeである。
【００２２】
本発明の実施にとり有用とする酵母について例示される属は、Pichia（Hansenula）、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torulopsis、Torulaspora、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、Debaromyces、Metschunikowia、Rhodosporidium、Leucosporidium、Botryoascus、Sporidiobolus、Endomycopsisなどである。好ましい属は、Pichia（Hansenula）、Saccharomyces、Kluyveromyces、YarrowiaおよびHansenulaからなる群より選択されるものである。Saccharomyces spp.の例はS.cerevisiae、S.italicusおよびS.rouxiiである。Kluyveromyces spp.の例はK.fragilisおよびK.lactisである。Pichia（Hansenula）の例はP.angusta（以前はH.polymorpha）、P.anomala、P.pastorisおよびP.capsulataである。Y.lipolyticaは適切なYarrowia種の例である。
【００２３】
１または２種以上のプロテアーゼに欠く酵母株を用いることが有利である。このような株には、Woolford et al (1993) J.Biol.Chem.268,8990-8998；Cabezon et al (1984) P.N.A.S.81,6594-6598；ＥＰ‐Ａ‐３２７７９７およびJones et al (1982)Genetics 102,665-677のように、周知のｐｅｐ４‐３変異体と、ＰＲＡ１および／またはＰＲＢ１遺伝子に変異を有する株等がある。一方、発酵培地中にあるプロテアーゼは加熱により不活化してもよい。プロテアーゼの存在は全プロセスにわたってアルブミンの収率を減少させる。
【００２４】
好ましくは、酵母はＷＯ９５／２３８５７およびＷＯ９５／３３８３３として各々発行された本発明者らの特許出願で示されているように、例えば各遺伝子を分断させた結果として、低（またはゼロ）レベルのＹａｐ３ｐプロテアーゼおよび／またはｈｓｐ１５０熱ショックタンパク質を有している。Ｙａｐ３ｐは下記の４５ｋＤアルブミン断片を形成させ、ｈｓｐ１５０は一部の分離ステップでアルブミンと同時精製されうる。
【００２５】
酵母はSaccharomyces cerevisiae２μｍプラスミドをベースにした発現プラスミドで形質転換させてもよい。酵母を形質転換させるときに、そのプラスミドは細菌複製および選択配列を含んでいて、これはＥＰ２８６４２４の開示に従い内部組換え現象により形質転換後に切り出してもよい。そのプラスミドはＥＰ４３１８８０で示されたような酵母プロモーター（例えば、Saccharomyces cerevisiae  ＰＲＢ１プロモーター）；分泌リーダーをコードする配列、例えばＷＯ９０／０１０６３で示されたような天然ＨＳＡ分泌リーダーのほとんどとS.cerevisiae α‐接合因子分泌リーダーの小さな部分とを含んだもの；ヒト遺伝子に対応するｃＤＮＡを単離するための公知方法により得ることができ、例えばＥＰ７３６４６およびＥＰ２８６４２４にも開示されたＨＳＡコード配列；および転写ターミネーター、例えばＥＰ６００５７に示されたようなSaccharomyces ＡＤＨ１からのターミネーターを含む発現カセットも含んでいてよい。
【００２６】
上記プラスミドの様々な要素の選択は、得られるアルブミン製品の純度に直接関連するとは考えられず、それらの要素は生成物の改善された収率に寄与するのであろう。
【００２７】
本発明の好ましい面は、例と添付図面により記載されており、その場合において：
図１はｒＨＡを生産するために用いられる発酵槽を概略図で示している；
図２はＣ１８ＰＴＨ逆相ＨＰＬＣカラム（Applied Biosystems Inc.）によるＵＶトレースであり、本発明のアルブミン中で低レベルの低分子量混入物質を示している；
図３は図２と同様であるが、従来技術のアルブミン中の低分子量混入物質を示している；
図４は市販アルブミンの脂肪酸含量を示したガスクロマトグラムである；
図５は図４に相当するが、本発明のアルブミンを示している；および
図６ａおよび６ｂは、本発明のアルブミンと従来のアルブミンの各々に関するエレクトロスプレー質量スペクトル分析を示している。
【００２８】
例１：不純アルブミン溶液の調製
アルブミン生産微生物の構築に関するクローニング戦略は、ＥＰ４３１８８０に開示されたとおりであった。プラスミドｐＡＹＥ３１６をHinnen et al (1978) P.N.A.S.75,1929に記載された方法で（ＭＡＴａ、ｌｅｕ２、ｐｅｐ４‐３、〔ｃｉｒ゜〕）Saccharomyces cerevisiae株中に導入した。形質転換体はロイシンを欠く最小培地（酵母窒素ベース、Difco）上で選択した。形質転換体を複合（ＹＥＰ、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトンおよび２％（ｗ／ｖ）スクロース）または規定（アミノ酸および硫酸アンモニウムのない０．１５％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベース、０．５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．１Ｍクエン酸／Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｖ）スクロース）液体培地の１０ｍｌを含有した５０ｍｌフラスコ中において３０℃、２００ｒｐｍで７２時間増殖させたとき、ｒＨＡはＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動および／またはロケットゲル免疫電気泳動により無細胞培養上澄において検出することができた。
【００２９】
規定液体培地〔Buffered Minimal Medium （ＢＭＭ）塩培地：酵母窒素ベース（アミノ酸および（ＮＨ４）２ＳＯ４なし、Difco）１．７ｇ／ｌ；クエン酸一水和物６．０９ｇ／ｌ；無水Ｎａ２ＨＰＯ４，２０．１６ｇ／ｌ、ｐＨ６．５±０．２；スクロースは２０ｇ／ｌまで加える〕中のストックマスター細胞培養物は、２０％（ｗ／ｖ）トレハロースの存在下で培養物のアリクウオットを凍結することによる振盪フラスコ培養物の調製に適したプロセス酵母のランニングストック（製造業者のワーキングセルバンク）を作るために用いる。
【００３０】
発酵
このセクションはストック培養物から最終発酵に至るまでのｒＨＡの生産に関するもので、特定の具体的装置または規模に限定されないｒＨＡ発酵プロセスの一般的規定である。
【００３１】
振盪フラスコ培養．酵母〔ｃｉｒ゜、ｐＡＹＥ３１６〕を種容器(seed vessel）の接種に生理学上適した純培養物として増殖させる。種容器のタイミングが再現性があるならば、増殖期（主要炭水化物過剰）および接種物バイオマス（培地１０リットル当たり接種物１００ｍｌを要する１２±２ｍｇ／ｌ）を規定することが必要である。１つのストックバイアルをＢＭＭ＋２％（ｗ／ｖ）スクロース１００ｍｌを含有した振盪フラスコ中に接種し、（６００ｎｍの光学密度により調べて）０．６〜１．２ｇ／ｌの細胞乾燥重量（ｃｄｗ）が得られるまで、フラスコをオービタルシェーカー（２００ｒｐｍ回転／分）にて３０℃でインキュベートする。次いでこの培養物は１２±２ｍｇ／ｌのレベルまで種発酵容器（seed fermentation vessel）に接種するために用いる。
【００３２】
種発酵．主生産発酵槽用の接種物は、種発酵槽（seed fermenter）（この例では、２０Ｌ作業容量）で、約１００ｇ／ｌの高細胞乾燥重量（ｃｄｗ）まで生産生物、好ましくはS.cerevisiae〔ｃｉｒ゜、ｐＡＹＥ３１６〕を増殖させることにより得る。フェッドバッチ（fed-batch）様式は、エタノールおよび酢酸（acetate）の蓄積を最少にして、細胞収率を最大にさせるようなものにする。各発酵の全体は、B.Braun（Germany）から入手できるMulti-Fermenter Computer System（ＭＦＣＳ）ソフトウェアのようなコンピューターコントロールシステムでモニターおよびコントロールする。
【００３３】
B.Braunにより供給されるソフトウェアはSupervisory Control and Data Acquisition Packageである；同様のパッケージは他の会社からも入手できる。供給コントロールアルゴリズムはスクロースの添加をコントロールするためのものであり、こうしてCrabtree効果を避けて、それによりエタノールおよび／または酢酸の生産を最少にすることにより、最大バイオマスが達成される。発酵容器に加温ＮａＯＨ洗浄液および無発熱物質水（ＰＦＷ）すすぎ液（rinse）を入れる。加熱滅菌容器は約１０Ｌの無菌ＭＷ１０培地（表１）バッチ塩＋微量元素を含有する。ｒＨＡ生産用培地は、内毒素を除去するために限外ロ過（１０，０００Mol.Wt.カットオフ）することができる。
【００３４】
表１
ＭＷ１０培地
成分 バッチ培地 供給培地
塩
ＫＨ２ＰＯ４                ２．７４ｇ／ｌ    １０．９ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．５８ｇ／ｌ      ２．３ｇ／ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ        ０．０６ｇ／ｌ      ０．２４ｇ／ｌ
Ｈ３ＰＯ４（８５％ｗ／ｗ）  ０．８８ｍｌ／ｌ    １．７６ｍｌ／ｌ
ビタミン
パントテン酸Ｃａ            ２０ｍｇ／ｌ        １８０ｍｇ／ｌ
ニコチン酸                  ３３．３ｍｇ／ｌ    ３００ｍｇ／ｌ
ｍ‐イノシトール            ２０ｍｇ／ｌ        １８０ｍｇ／ｌ
ｄ‐ビオチン                ０．１３３ｍｇ／ｌ  ０．８ｍｇ／ｌ
チアミン・ＨＣｌ            １６ｍｇ／ｌ          ３２ｍｇ／ｌ
微量元素ストック            １０ｍｌ／ｌ          ２０ｍｌ／ｌ
スクロース                    ０＊              ５００ｇ／ｌ
微量元素ストック成分
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            ３ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          １０ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ          ３．２ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ          ０．０７９ｇ／ｌ
Ｈ３ＢＯ３                    １．５ｇ／ｌ
ＫＩ                          ０．２ｇ／ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ      ０．５ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ          ０．５６ｇ／ｌ
微量元素は、３５ｍｌ／ｌの９８％Ｈ２ＳＯ４で酸性化された脱塩水に加える。
【００３５】
＊スクロース２０ｇ／Ｌを２０Ｌ種発酵槽（seed fermenter）段階でバッチ培地に加える。滅菌のいかなる便法も、脱発熱物質法、例えば限外ロ過のように用いてよい。ビタミンは常にフィルター滅菌する。
【００３６】
培地を容器に加えた後、３０℃の操作温度と、最小スターラー速度、典型的には４００〜５００ｒｐｍにセットする。初期ｐＨは５．７±０．２にセットされたｐＨコントローラーを用いてアンモニア溶液（比重０．９０１）で調整する。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４もｐＨ補正剤として用いる。２０ｇ／ｌまでスクロース、ＭＷ１０バッチビタミン、および０．０４ｇ／ｌまでBreox ＦＭＴ３０消泡剤を容器に加える。
【００３７】
無菌ロ過空気を０．５ｖ／ｖ／ｍ（即ち、非圧縮空気０．５Ｌ／培地ｌ／分）で容器中に導入し、培地を無菌振盪フラスコ培養物から１２±２ｍｇ細胞乾燥重量／ｌまで接種して、ＭＦＣＳコンピューターシステムを始動させる。（３０分で＞１５％の溶解酸素圧（tention）増加によりシグナルが発せられる）バッチ増殖期（batch phase of growth）の完了後、供給培地の添加をＭＦＣＳシステムのコントロール下で始める。コントロール戦略は、生産発酵に関して以下で記載されるのと同様であることが有効である。発酵中に、空気流は約１ｖ／ｖ／ｍの流量を維持するために２ステップで増加させる。溶解酸素分圧（ＤＯＴ）は、スターラー速度を変えることにより、２０％空気飽和度でコントロールする。スターラー速度がもう増加しえなくなり、空気流速度がその最大値に達したら、供給コントロールアルゴリズムは発酵産物の形成を最少にするように供給割合をコントロールする。供給の最後に、培養物は生産容器に移す。
【００３８】
生産発酵．酵母〔ｃｉｒ゜、ｐＡＹＥ３１６〕の純培養物を細胞外ｒＨＡの生産のため高ｃｄｗ（＞８０ｇ／ｌ）までフェッドバッチ発酵により生産させる。生産発酵槽、この例では作業容量８０００Ｌの発酵槽に種発酵槽で増殖させた培養物を接種するが、その細胞乾燥重量は好ましくは＞８０ｇ／ｌである。種発酵槽培養物の移送に際する生産発酵槽内の初期細胞乾燥重量濃度は、好ましくは０．２５〜１．００ｇ／ｌである。１時間以内に供給を始めることが好ましいが、必要であれば遅らせてもよい。供給期の初期におけるＯＵＲおよびＣＥＲの非常に低い値と、それらの測定における必然的な誤差のせいで、ＲＱを用いた供給速度の自動コントロールは最初は不能である。供給様式は、エタノールおよび酢酸の蓄積を最少にして、細胞および産物収率を最大にさせるようにする。
【００３９】
発酵は、最適のガス溶解および容積混合（bulk mixing）を得るように考えられた、図１に示されたような発酵槽で行う。加温ＮａＯＨ洗浄液およびＰＦＷすすぎ液に付される容器は、約４０００Ｌの無菌ＭＷ１０（表１）、バッチ塩および微量元素を含有する。この培地は、加熱またはフィルター滅菌により、容器とは別に滅菌させてよい。ＭＷ１０のような発酵培地はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩または他の強い金属キレート化剤を含んでいないことが有利であり、それらの存在は生産されたアルブミン中に有意に高度の着色混入物質を生じさせるからである、と本発明によりわかった。
【００４０】
操作温度は３０℃にセットし、スターラー速度は均一溶液を維持する上で十分な、典型的には約５０ｒｐｍとなるように調節する。初期ｐＨはアンモニア溶液（ＳＧ０．９０１）で調整する（コントローラーは５．７±０．２にセットする）。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を第二のｐＨ補正剤として用いてよい。ＭＷ１０バッチビタミンは、適切な消泡剤の場合のように必要なだけ加える（例えば、Breox ＦＭＴ３０を０．１２５ｇ／ｌまで）。
【００４１】
無菌ロ過空気は、排出ガス分析の感度を最大にするために、最初は０．５ｖ／ｖ／ｍで容器に加え、ＭＦＣＳコンピューターシステムを始動させる。排出ガスは、例えば連続質量スペクトロメーター（例えば、 Fisons ＶＧガス分析器）の使用により分析する。容器にシードベッセル培養物の全体を接種する（最少０．４％ｖ／ｖ）。ＭＷ１０はバッチ容量に等しい容量で供給する。供給を開始すると、ＯＵＲおよびＣＥＲ値がコントロールを有効にする上で十分高くなるまで、ＲＱオーバーライド（override）コントロールは不能である。供給速度は、ＲＱが一貫して＞１．２となるならば、ＲＱコントロールなしにその期間中手動で調整する。供給速度は、下記アルゴリズムに従い、コンピューターコントロールを介して増加させる：
供給速度（ＦＲ）＝ｋｅμｔ
上記において、ｋは初期供給速度であり、μは指数増殖速度であり、ｔは時間である。ｋ値は、エタノールおよび酢酸（acetate）の蓄積を最少にする増殖速度を達成させる上で必要な初期供給速度として経験的に決定される。この例では、ｋはＭＷ１０供給培地０．０８ｍｌ／分／Ｌ培地の値を有するものとして決定された。μ値は、十分に呼吸性の生物の最大増殖速度、この例だと０．１／ｈである。
【００４２】
ｔは０（ゼロ）で始まるカウンター変数（counter variable）であり、ＲＱ＞１．２またはＤＯＴ＜１５％でないかぎり毎分１ずつ増加する。これらの場合だと、ｔの値は減少する。
【００４３】
容器はＯＴＲを高めるために必要に応じて過圧してもよい。培養物は供給の最後に下流プロセッシングのために保持しておく。
【００４４】
この保持時間は最小に保つべきだが、４８時間以内で、必要ならばそれを超えて延長することができる。その保持期に、培養物の温度はできるだけ最低に、典型的には４〜１５℃、好ましくは４℃に下げて、ＤＯＴを０％に落とさせる。供給を停止し、通気を止め、過圧を減らす。しかしながら、ｐＨコントロールは維持する。十分な撹拌を、細胞を懸濁させておき、冷却およびｐＨ均一性を促進するために、好ましくは約５０ｐｐｍで維持する。
【００４５】
上記操作による予想収率は：バイオマス＞８０ｇ細胞乾燥重量／Ｌ培養物；ｒＨＡ＞１．５ｇモノマー／ｌ培養物（全培養物についてＳＤＳ‐ＰＡＧＥで調べた）である。
【００４６】
アルブミンがｒＨＡであるときに、本発明による精製処理用の不純アルブミン溶液を調製するためには、微生物細胞は発酵培地から除去する。細胞は記載されたように精製プロセスの開始前に除去されることが好ましいが、例えば第一の精製ステップが流動層（bed）で行われる場合には、それはある一定の条件下で第一ステップと同時に行うことができる。保持期中に通気なしで１５℃未満に発酵槽で冷却された発酵培養物はタンクに移して、そこで１８０〜２１０ｇ／ｋｇのバイオマス濃度を示すようにそれを希釈して、必要ならば更に冷却させる。希釈された培養物は、酵母細胞沈降を防ぐために十分撹拌しながら、低減した温度で通気せずにできるだけ短時間保つべきである。
【００４７】
細胞および上澄は、一次分離ステップ、例えば５７００ｒｐｍで運動されるAlfa Laval ＢＴＵＸ５１０連続放出ノズルのような任意の適切な遠心機でミクロフィルトレーションまたは遠心に付す。こうして得られた遠心物（centrate）は、残留した全体および破壊酵母細胞と他の粒子を除去するために、例えばCunoにより供給の深層フィルター（１μｍ孔径）を用いて、ライン中でロ過してもよい。希釈培養物中に存在するｒＨＡの少くとも７５％は、単一通過遠心操作で回収する。場合により、この操作からの細胞スラリーは、水または緩衝液に再懸濁して、第二遠心物を得るために再遠心してもよく、こうして産物回収率を高めさせることができる。次いで、得られた溶液は、例２で示されたように、そこに含有されたアルブミンを精製するために本発明のプロセスにより処理する。
【００４８】
例２：本発明によるアルブミンの精製
（例１に記載されたような）発酵からの遠心物または（血漿のような）いずれか他の供給源からの不純アルブミン溶液は、（オクタノエートを含有させることにより）重合化と、（ダメージを与えるレベルのプロテアーゼがないように酵母を選択するかまたは加熱することにより）プロテアーゼ活性からアルブミンをを保護しながら、陽イオン交換マトリックスでのクロマトグラフィー用に調製または条件設定する。好ましくは、オクタン酸ナトリウムを１〜１０ｍＭ、例えば約５ｍＭの最終濃度まで加えて（クロマトグラフィー溶液１３（ＣＳ１３）‐表２）、アルブミンを安定化させる。ｐＨを酢酸（ＣＳ０９）で４．３〜４．８、好ましくは４．５０±０．１（最も好ましくは±０．０５）に調整し、導電率は＜５．５mS/cm となるようにチェックする。
【００４９】
一部の宿主株または種からの培養上澄は、後のプロセス中にｒＨＡを分解できるプロテアーゼを含有している。このような場合に、このプロテアーゼ活性はｒＨＡを含有した培養上澄の熱処理により壊すことができる。典型的には、１〜１０ｍＭオクタン酸ナトリウムであれば熱変性からｒＨＡを保護する上で十分であり、６０〜８０℃の温度で３０秒間から１０分間までであればプロテアーゼを不活化する上で十分である。その後、上澄は前記のように更にコンディショニングすることができる。プロテアーゼによる分解に会わないならば、熱処理は好ましくは省略する。
【００５０】
クロマトグラフィー
すべての操作は環境温度（２０±５℃）で行える。クロマトグラフィーカラム用のアルブミン担持量（load）（ｇアルブミン／Ｌマトリックス）は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ＳＰ‐ＦＦカラムの場合）またはＧＰ‐ＨＰＬＣ（他のすべてのカラムの場合）により、アルブミンの力価（ｇ／ｌ）から決める。各ステップの進行は、オンラインで、例えば２５４または２８０ｎｍでＵＶ吸光度を測定することによりモニターする。
【００５１】
ここで記載されたようなクロマトグラフィーステップの順序には、いくつかの面で新規かつ進歩性がある。第一精製ステップで陽イオンマトリックスを用いると、酵母発酵から得られた低分子量着色種の大部分はカラムを直接通過するが、マトリックスに結合するものは弱く結合しており、１Ｍ  ＮａＣｌのような高イオン強度塩浄化により除去できる。このため陽イオンマトリックスは、これらのタイプの分子を不可逆的に吸着させる陰イオンマトリックスとは異なり、再生して、精製の第一ステップとしてクロマトグラフィーのマルチサイクルに使うことができる。こうして、このステップでは確固たる商業的クロマトグラフィープロセス用の基礎を形成する。
【００５２】
この例で第二ステップとしてCibacron Blueタイプのカラムの使用は、その物理化学的性質、例えばサイズおよびｐＩがもとの分子と類似しているためにアルブミンから除去することが非常に困難な、アルブミンの４５ｋＤａ断片を除去するために特に用いられるという点で新規である。意外にも、その断片は全長アルブミンの場合よりも色素と強く結合するので、それらの分離を行えるのである。アルブミンの精製中に用いられるクロマトグラフィー溶液は表２に示されている。アルブミンの非常に大規模な製造と、比較的低コストの製品のために、工業規模で高純度形態で利用できて、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳまたはＭＯＰＳのような他の通常用いられる緩衝液と比較して低コストであることから、これらの緩衝塩はそのプロセスに最も適している。別の緩衝液、例えば類似ｐＫａの緩衝液（例えば、酢酸（acetate）の代わりにリンゴ酸（malate））も表２で用いられたものの代わりに使用できるが、ほとんどの場合にコストと入手性が大規模だとそれらの使用を妨げる。別な塩形態も、それらが可溶性で、工業規模で入手できて、低コストであるとするならば、用いることができる。しかしながら、ＣＳ０６およびＣＳ１０中におけるテトラホウ酸（borate）イオンの含有は、それらが高分子で炭水化物部分と複合体形成して、それらをマトリックス上の陰イオン基と強く結合させる上で特別な役割を果たすことから、特に有利である。これは溶出液中におけるアルブミンの純度を高める。
【００５３】
クロマトグラフィーは、Pharmaciaから入手できるような軸流（axial flow）カラムを用いるか、またはSepragenから入手できるような半径流カラムを用いて行うことができる。この例では、カラムはすべて軸性である。
【００５４】
緩衝溶液は下記の濃度で調製してもよいし、あるいは濃縮ストック溶液を調製して、すぐの使用のためにオンラインで混合または希釈してもよい。
【００５５】
【表１】
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陽イオン交換クロマトグラフィー．陽イオン交換クロマトグラフィーにより少くとも酵母タンパク質（アルブミンが酵母発酵からのｒＨＡであるとき）および他の抗原、低分子量混入物質と着色化合物についてアルブミンを濃縮および精製する。その方法ではＳＰ‐Sepharose ＦＦ、ＳＰ‐Spherosil、ＣＭ‐SepharoseＦＦ、ＣＭ‐Cellulose、ＳＥ‐CelluloseまたはＳ‐Spherodexのような市販陽イオン交換マトリックスを用いる。好ましくは、マトリックスは５〜２５ｃｍ、好ましくは１０〜１５ｃｍ、この例では１２．５ｃｍの層高で、アルブミン１０〜５０ｇ／ｌ、好ましくはアルブミン４０±１０ｇ／ｌマトリックスのカラム担持量（loading）にあるＳＰ‐Sepharose ＦＦ（Pharmacia）である。そのマトリックスはアルカリ貯蔵溶液を除去するために緩衝液で平衡化する；好ましくは、緩衝液はｐＨを約ｐＨ６．０に下げる上で十分な強度とすべきである。ＣＳ０１のような緩衝液はカラムから貯蔵溶液ＣＳ０７を除去するために用いる；しかしながら、ｐＨ＜６．０の任意の緩衝液を用いることができる。平衡化は、カラム流出液のｐＨが約ｐＨ６．０であるときに完了と判断される。
【００５６】
次いで、コンディショニングされた遠心物は例えば１．０〜８．０cm/min、好ましくは４．０〜７．０cm/min、この例では６．３６cm/minの流速でカラム上に担持させ、その後カラムは残留混入物質を除去するために溶液で洗浄する。この洗浄溶液は、アルブミンの溶出を防ぐために、ｐＨ＜６．０および５mS/cm未満、好ましくは３mS/cm未満の導電率を有しているべきである。適切な溶液はＣＳ０１である。先行のステップはすべて６．３６cm/minで行う；溶出とその後すべてのステップでは、溶出液の容量を減少させるために、流速を０．５〜５．０cm/min、好ましくは２．０〜４．０cm/min、この例では３．１８cm/minまで減少させる。アルブミンの溶出はイオン強度を増加させることにより行う；導電率範囲５〜１０mS/cm、好ましくは６〜８mS/cmの溶液、例えばＣＳ０２を用いる。アルブミンの収集はＵＶシグナルが１．０Ａ２８０／ｃｍを超えて上昇したときに始めて、収集はＵＶシグナルが０．６Ａ２８０／ｃｍ未満に下降するまで、または最大容量で６．５倍のカラム容量が集められるまで続ける。次いで、カラムはＣＳ０３および０４を用いて浄化させ、その後ＣＳ０７中に貯蔵する。
【００５７】
アフィニティクロマトグラフィー．このステップでは、４５ｋＤａ  Ｎ末端アルブミン断片、酵母抗原（アルブミンが酵母発酵からのｒＨＡであるとき）および色素についてアルブミンを更に精製する。アフィニティマトリックスは、アルブミンと結合するCibacron Blueタイプの色素、例えばReactive Blue ２、Procion Blue ＨＢ、Blue Sepharose、Blue Trisacrylおよび他のアントラキノンタイプ化合物を含んでいてよい。好ましくは、マトリックスは下記の“Delta Blue Agarose”マトリックスである。これはそのマトリックスにより生じるBlue浸出液のレベルを減少させ、しかもマトリックスのアルカリ安定性を高めて浄化と脱発熱物質を促進することがわかった。市販マトリックスと比較したそのマトリックスの更なる改良点は、色素（Reactive Blue ２）とマトリックス間に、スペーサー、１，４‐ジアミノブタンの組み込みである。これは溶出液アルブミン純度の面で最適長のスペーサーであることがわかった。
【００５８】
Reactive Blue ２は以下で表される化学構造を有している。
【００５９】
【化１】
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オルト、メタまたはパラ異性体か、あるいはそれらの任意の混合物が使用できる。好ましい異性体はオルト‐ＳＯ-３形態であるが、望ましい純度にすることは困難であるため、メタ異性体を用いる。アミノブチル‐Reactive Blue ２は、分析ＨＰＬＣにより調べて９８％全ピーク面積の最少純度まで調製する。これは、アミノブチル誘導体色素の精製を要する粗製市販色素を用いるか、または純粋な合成色素を用いることにより行える。後者の方法だと、出発色素物質は２８０ｎｍの分析ＨＰＬＣによると最低で純度９８％であるべきだ。このような物質はＡＣＬ．Isle of Manから入手できる。Reactive Blue ２は混合物を６０℃まで加熱することにより水中で１，４‐ジアミノブタンと反応させ、その後誘導色素を例えば沈降により混合物から精製する。次いで、アミノブチル‐Reactive Blue ２はマトリックス、例えばエピクロルヒドリン活性化Sepharose ＣＬ‐６Ｂ（Pharmacia,Sweden）と結合させる。Porath et al (1971) J.Chromatog.60,167-177参照。このようなDelta Blue Agarose（ＤＢＡ）マトリックスの色素分は、好ましくは５０±５mmole／ｇ乾燥重量であるべきだ。
【００６０】
Blueマトリックスの使用．この方法では１０〜３０ｃｍ、好ましくは２０〜３０ｃｍ（この例では２５ｃｍ）の層（bed）高で、ｒＨＡ７〜１４ｇ／ｌマトリックス、好ましくは８〜１２ｇ／ｌ（この例ではアルブミン１０±１ｇ／ｌマトリックス）のカラム担持量にあるＤＢＡを用いる；すべてのステップは０．３〜２．０cm/min、好ましくは１．０〜２．０cm/min、この例では１．５３cm/minの流速で行う。ＤＢＡはＣＳ０７からＣＳ０１中で平衡化させる；平衡化はカラム流出液のｐＨが約ｐＨ９．５となるときに完了である。クロマトグラフィー前に、ＳＰ‐ＦＦ溶出液はアンモニアで約ｐＨ８．５〜９．５、好ましくはｐＨ９．０に調整し、その後カラム上に担持させる。担持が完了したら、カラムは１〜５倍容量、好ましくは５倍カラム容量の１０〜３０mS/cm、好ましくは１５〜２５mS/cmの緩衝液、例えばＣＳ１２で混入物質を除去するために洗浄する。アルブミンは＞１００mS/cm、好ましくは１２５〜１６５mS/cmの高イオン強度緩衝液、例えばＣＳ０３を用いて溶出させる。溶出液収集はＵＶシグナル（Ａ２８０／ｃｍ）が０．４を超えて上がったとき開始して、シグナルが再び０．４未満に下がったとき止める。次いでカラムはＣＳ０４を用いて浄化させ、ＣＳ０７中に貯蔵する。
【００６１】
中間限外ロ過．このステップではゲル浸透クロマトグラフィー用にアルブミンを濃縮する。限外ロ過装置でセルロースタイプ膜（３０，０００以下、例えば１０，０００の公称分子量カットオフ）を用いて、ＤＢＡ溶出液をアルブミン２０〜１２０ｇ／ｌ、好ましくは８０〜１１０ｇ／ｌの保留液濃度まで濃縮させる。膜は、使用後に水か表３のＣＳ０３またはＣＳ０５で残留タンパク質を洗い出して、０．１Ｍ水酸化ナトリウムで浄化することにより処理する。次いで、膜は２０ｍＭ水酸化ナトリウム中に貯蔵してもよい。
【００６２】
ゲル浸透クロマトグラフィー．このステップでは酵母抗原（アルブミンが酵母発酵からのｒＨＡであるとき）、色素および二量体化アルブミンについてアルブミンを精製して、緩衝液交換ステップを行う。その方法ではSephadex Ｇ１００、Ｇ１５０、Ｇ２５０、Sephacryl Ｓ‐１００、Ｓ‐２００またはＳ‐３００、Toyopearl ＨＷ５０Ｓまたは Superose ６または１２のような市販ゲル浸透マトリックスを用いる。好ましくは、マトリックスは６０ｃｍを超える、好ましくは９０±ｃｍ（３×３０ｃｍ）の層高にあるSephacryl Ｓ‐２００ＨＲ(Pharmacia）である。カラムはＣＳ０５で平衡化させて、０．１〜１．５cm/min、好ましくは０．５〜１．０cm/min、この例では０．７５cm/minで行う；次いでカラムにはｐＨ９．５に達したとき中間ＵＦステップからのアルブミンを担持させる。担持容量はカラム容量の約２〜９％、好ましくは５〜８％、例えばカラム容量の７．５％に相当する。アルブミンフラクションは３部分で集める：最初の少量のアルブミンダイマーはＡ２８０／ｃｍが立ち上がり時に１０％フルスケールデフレクション（ＦＳＤ）に達するまで廃棄する；この時点でリサイクルフラクションの収集を開始して９０％ＦＳＤまで継続させ、その後アルブミンを一次産物フラクションとして集める。これはＡ２８０が５％ＦＳＤに落ちるまで続け、その後流出流は再び廃棄する。リサイクルおよび一次産物フラクションは別々に集める。このステップは、すべての物質がカラム上に担持されるまで繰り返す。
【００６３】
Ｓ‐２００ＨＲリサイクル限外ロ過．３０，０００以下、またはこの例では
１０，０００で用いられる公称分子量カットオフのセルロースタイプ膜を限外ロ過装置に用いて、プールされたリサイクルフラクションをアルブミン２０〜１２０ｇ／ｌ、好ましくは８０〜１１０ｇ／ｌの保留液濃度まで濃縮させる。膜は中間限外ロ過下で上記のように使用後処理する。
【００６４】
一方、このプロセスのいかなる限外ロ過ステップの場合にも、カットオフ≦３０，０００のポリエーテルスルホンまたはＰＶＤＦ膜をセルロースタイプ膜の代わりに用いてよい。このような膜はAmiconおよびMilliporeから入手できる。膜の貯蔵と浄化に用いられるＮａＯＨと適合する膜を用いることが好ましい。
【００６５】
Ｓ‐２００ＨＲリサイクル限外ロ過保留液の精製．リサイクル限外ロ過からの保留液は、各ピークから集められた一次Ｓ‐２００精製および産物フラクションに用いられたのと同様のカラム上に担持して、それから先に集められた一次産物フラクションと混合させる。このステップは、すべての物質がカラム上に担持されるまで繰り返す。
【００６６】
陰イオン交換クロマトグラフィー．このステップの目的は、少くとも酵母抗原（アルブミンが酵母発酵からのｒＨＡであるとき）および着色アルブミンについてアルブミンを精製することである。その方法ではＱＭＡ‐Spherosil、ＤＥＡＥ‐Spherodex、Ｑ‐Hyper Ｄ、ＤＥＡＥ‐セルロース、ＱＡＥ‐セルロース、あるいはＴＭＡＥ、ＤＭＡＥまたはＤＥＡＥ Fractogelのような陰イオン交換マトリックスを用いる。好ましくは、マトリックスは５〜２５ｃｍ、好ましくは１０〜１５ｃｍ、例えば１２．５ｃｍの範囲のいずれか好都合な層高で、アルブミン１０〜６０ｇ／ｌマトリックス、好ましくは３５±１５ｇ／ｌマトリックスのカラム担持量にある市販陰イオン交換マトリックスＤＥＡＥ Sepharose‐ＦＦ（Pharmacia）である。カラムは最初に、ｐＨを作業範囲まで速やかに下降させる強緩衝液、例えばｐＨ４．５〜６．０、好ましくは約ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム、例えばＣＳ１１で平衡化させる。濃縮緩衝液の後に、低導電率、即ち１〜４mS/cm、好ましくは２．５〜３．５mS/cmの範囲の溶液、例えばＣＳ０８を、カラムにＳ２００溶出液を担持させる前に、カラムを平衡化するために用いる。１．０〜８．０cm/min、好ましくは３．０〜７．０cm/min、この例では４．４cm/minの直線的流速を用いることができる。担持が完了したら、カラムを５〜３０ｍＭ、好ましくは１５〜２５ｍＭの範囲のテトラホウ酸ナトリウム溶液、例えばＣＳ１０で洗浄する。こうすると、アルブミンフラクションの溶出前に、炭水化物含有混入物質をカラムにより強く付着させられる。溶出は１０〜２０mS/cmの範囲の高イオン強度溶液、好ましくはＣＳ０６で行うことができる。溶出液はＡ２８０／ｃｍが０．４に達したときに集め、ピークが０．８に落ちるまで続ける。
【００６７】
このため、この例だと、精製ステップの順序は陽イオン交換、アフィニティクロマトグラフィー、限外ロ過、ゲル浸透（リサイクルフラクションの限外ロ過を含む）および陰イオン交換である。
【００６８】
ＤＥ‐ＦＦカラムからの溶出液は、１０．０mg/mlのアルブミンを含有した溶出液２５．０μｌを担持させてＴＳＫ  ＳＷ３０００ＸＬカラムを用いるＧＰ  ＨＰＬＣにより分析すると、０．１％（ｗ／ｗ）未満のアルブミン二量体（dimer）と、検出不能レベルのアルブミン多量体（polymer）または凝集物であることがわかった。
【００６９】
例３：最終製品への精製アルブミンの処方
この例では、適切な生成物、この場合には２５％（ｗ／ｖ）アルブミンへの高度精製アルブミンの濃縮、ダイアフィルトレーションおよび処方（formulation）について説明している。この操作は２段階で、即ち最終限外ロ過（ＵＦ）および処方で行う。最終ＵＦは最終ＵＦ供給容器への（リン酸でｐＨ７．０±０．３に調整された）ＤＥＡＥ溶出液の移送から始めて、保留液と洗液がもしあれば処方容器に移された後で終える。アルブミン含有プロセス流は、セルロース膜または、更に好ましくは公称分子量カットオフ限界１０，０００のポリエーテルスルホン膜を装備した限外ロ過系で、一次濃縮、ダイアフィルトレーションおよび二次濃縮に連続的に付す。最初の濃縮ステップではアルブミン濃度を約１００ｇ／ｌまで増加させ、直ちに連続的なダイアフィルトレーション段階を続けて、アルブミンを保留液容量の少くとも５倍、好ましくは少なくとも７倍相当の注入用水に対してダイアフィルトレーションする。
【００７０】
本発明の一部の精製プロセス、例えば固定化アミノフェニルボロネートを用いた例７で記載されたステップにおいて、アンモニウムイオンはこの段階に存在していてもよい。意外にも、本発明者らは、これらのアンモニウムイオンがアルブミンによりかなり強く結合されて、水に対するダイアフィルトレーションでは完全には除去できないことを発見した。本発明者らは、塩溶液に対するダイアフィルトレーションが有効であることを発見した。０．５対１０％ｗ／ｗ、例えば１．０対５．０％または約３％の塩化ナトリウム対アルブミン比が用いられ得る。その塩はアルブミン保留液に加えてもよいし、あるいは更に一般的にはダイアフィルトレーション水に加えてもよい。最終５％（ｗ／ｖ）処方の場合には、約１００ｇ／ｌの溶液をダイアフィルトレーションステップから直接回収できる。最終２５％（ｗ／ｖ）処方の場合には、約２７５〜３２５ｇ／ｌの溶液を追加の濃縮ステップ（ＵＦ）後に得る。最後に、溶液をバルク（bulk）製品処方容器に移す。
【００７１】
処方ステップでは、適切な化学的環境下において、バルク生成物無菌ロ過（０．２２μｍ親水性ポリビニリデンジフルオリド）と充填に適した適切な濃度で、アルブミンを製造する。移した溶液は、アルブミン、ナトリウムおよびオクタノエートの濃度を調べるために分析する。これらの量を考慮して、更に必要量のストック塩化ナトリウムおよびオクタン酸ナトリウム賦形剤溶液と適切なグレードの水がバルク処方仕様を満たすために加えられる。最終アルブミン濃度は２３５〜２６５ｇ／ｌ（即ち、約２５％）であり、ナトリウム濃度は１３０〜１６０ｍＭである。しかしながら、いかなる他の可能なアルブミン濃度にも、例えば少くとも４％（ｗ／ｖ）、好ましくは４〜２５％（ｗ／ｖ）の最少濃度で作ってよい。処方は、ヒトアルブミンに関してＵＳまたは欧州薬局方に記されたような適切で慣用的な薬学上許容される賦形剤の添加と水希釈後に完了する。
【００７２】
アルブミン１ｇ当たり０．０８mmoleオクタン酸ナトリウムの最終濃度が望ましい。製品は無菌かつ無発熱物質である。約１％（ｗ／ｗ）二量体アルブミンはあってもよいが、より大きなポリマーまたは凝集物はＴＳＫ  ＳＷ３０００ＸＬカラムを用いてＧＰ  ＨＰＬＣにより分析すると検出しえない。
【００７３】
例４：陽イオン交換の後の直接陰イオン交換
例２のプロセスの変法として、ステップの順序を変えて、一部の変更をプロセス条件において行なった。このため、クロマトグラフィー溶液の別表を表３として示した。加えて、ゲル浸透ステップ以外のすべてのクロマトグラフィーカラムは半径流式である。
【００７４】
【表２】
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最初の陽イオン交換ステップは本質的に例２の場合と同様であったが、但し以下の変更を加えた。層流路長は１１．０±１．０ｃｍであった。次いでクロマトグラフィーを下記のように行った。
【００７５】
ＳＰ‐ＦＦ（Pharmacia）カラムをＣＳ２０中で４倍容量の１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜４０ｍＭ、例えば３０ｍＭの酢酸（acetate）で平衡化させ、アルブミン溶液を０．０７〜０．７５倍層（bed）容量/min、好ましくは０．３〜０．６、この例では０．５倍層容量/minの流速で担持させた。カラムを８倍容量の１０〜１００ｍＭ、好ましくは３０〜７０ｍＭ、例えば５０ｍＭ酢酸（ＣＳ２１）、その後１０倍容量のＣＳ２０で洗浄し、アルブミンは、収集の開始と最後をマークするために０．６および０．３６のＡ２５４／ｃｍを用いて、酢酸（acetate）／オクタン酸（octanoate）緩衝液（例えば、ＣＳ２３中で４０〜１２０、好ましくは６０〜１００、例えば８５ｍＭ酢酸と、２〜５０、好ましくは２〜２０、例えば５ｍＭオクタン酸）で溶出および収集させる。カラムを０．２５〜３．０Ｍ塩および０．０５〜２％界面活性剤（ＣＳ２４）と、その後で０．１〜１．０Ｍ苛性アルカリ（caustic)（ＣＳ２５）で浄化し、希（１０〜５０ｍＭ）苛性アルカリ（ＣＳ２６）中に貯蔵する。この例において、平衡化、担持および洗浄ステップの流速は０．５倍層容量/minである。アルブミンの溶出では、０．０４〜０．６倍層容量/min、好ましくは０．１５〜０．３５倍層容量/min、この例では０．２５倍層容量/minの流速を用いる。ｒＨＡモノマーの予想回収率は４６〜６６％である。
【００７６】
したがって、アルブミンはオクタノエートの溶液で陽イオン交換カラムから溶出させて、陽イオン交換体からｒＨＡの新規なバイオ特異的溶出を行わせた。ｐＨはアルブミンのｐＩに近いため、オクタノエートの結合は有意の全体的荷電差を生じさせ、例えばｐＨは少くとも４．５、好ましくは約ｐＨ５．５である。
【００７７】
次いで、陽イオン交換体からの溶出液は、ｐＨ４．５〜６．５、好ましくは約５．５で、１．５〜５．０mS/cm、例えば２．５±０．５mS/cm（mS.cm-1）の範囲の導電率の陰イオン交換樹脂上に直接（即ち、例２のようなアフィニティおよびゲル浸透クロマトグラフィー後、好ましくは希釈後の代わりに）担持させる。これにより、陽イオン交換クロマトグラフィー中に形成された任意の二量体アルブミンが陰イオン交換クロマトグラフィーの条件下でモノマーアルブミンに逆変換されることがわかった。アルブミンモノマーについて約１１０％の収率がこのステップで達成された。
【００７８】
更に詳しくは、ＤＥＡＥ‐Sepharose Fast Flow （Pharmacia）の１１．０±１．０ｃｍ層流路長カラムを陽イオン交換溶出緩衝液（ＣＳ２３）で前平衡化させ、その後酢酸緩衝液（例えば、ＣＳ２０）で平衡化させてから、モノマーアルブミン３０．０±１０．０ｇ／Ｌマトリックスで担持させる。
【００７９】
次いで、カラムを例２の場合（ＣＳ２７）のようにホウ酸溶液で洗浄し、例２の場合（ＣＳ０６）のように溶出させて、すべて陽イオン交換カラムの場合のように塩／界面活性剤（ＣＳ２４）、苛性（ＣＳ２５）で浄化し、希苛性アルカリ（ＣＳ２６）中で貯蔵する。全ステップの流速は０．０７〜０．７５倍層容量／min、好ましくは０．３〜０．６、この例では０．５倍層容量／minである。
【００８０】
陰イオン交換樹脂（例えば、ＤＥ‐ＦＦ）からの溶出液は、不純物をなお含有しているため、その後でアフィニティマトリックス（例えば、例２に記載されたようなDelta Blue Agarose）に直接適用する。層高を例２の２５ｃｍから１１．０±１．０ｃｍに下げて、標準操作圧力内で高い流速にさせた。したがって、１１．０ｃｍの層高が好ましく、アルブミンの回収率またはアルブミン純度に悪影響を与えない。カラムを酢酸アンモニウム（ＣＳ２９中でのように１００〜３００ｍＭ、好ましくは２００〜２７５、例えば２５０ｍＭ）で平衡化させ、アルブミンを７．０〜１４．０ｇ／ｌ、好ましくは８．０〜１２．０ｇ／ｌ、この例では１０．０±〜１．０ｇ／ｌマトリックスで適用した。平衡化、担持および洗浄ステップは、０．０５〜０．３０倍層容量/min、好ましくは０．１５〜０．２７、この例では０．２５倍層容量/minの流速で行った。他のすべてのステップは、０．０４〜０．３０、好ましくは０．１〜０．２５、この例では０．２０倍層容量/minで行った。層高の減少で促進される流速の増加は大規模プラントデザインにとり有利な４倍まで処理量を改善して、ＤＢＡの最大操作能力に近かった。この増加した流速はアルブミンの回収率またはアルブミン純度に悪影響を与えないようであったため、このようにより高い流速を利用することが好ましい。
【００８１】
カラムを５倍カラム容量の酢酸アンモニウム緩衝液（ＣＳ２９）で洗浄し、アルブミンを強塩およびリン酸溶液（ＣＳ３０中でのように１．０〜３．０Ｍ  ＮａＣｌ、例えば１．５〜２．５Ｍまたは２．０Ｍ  ＮａＣｌと、５〜１００ｍＭ、例えば５０ｍＭリン酸（phosphate））で溶出させた。
【００８２】
プロセスのこの変法における溶離液のｐＨは、ｐＨ９．２からｐＨ７．０に変化させた。そのため、緩衝液を５０ｍＭ酢酸アンモニウムから５０ｍＭリン酸ナトリウムに変えたが、これはｐＨ７．０でのその緩衝化とその相対的コストのために好ましかった。低ｐＨ溶離液は、ＤＢＡ溶出液アルブミンモノマー回収率の増加に寄与していた。７．０未満のｐＨは断片のレベルを増加させ、ｐＨ７．０を超えるとアルブミンモノマー回収率は減少した。したがって、ｐＨは５．５〜９．０範囲で可能だが、好ましくはｐＨ７．０である。カラムを浄化し、上記のように苛性アルカリ（ＣＳ２５、ＣＳ２６）中で貯蔵した。
【００８３】
次いで、（８０〜１１０ｇ／ｌのアルブミンを得るために、場合によりセルロースタイプ膜（公称カットオフＭＷ３０，０００）で限外ロ過後の）ＤＢＡ溶出液をゲル浸透樹脂、例えばＳ‐２００（ＨＲ）に適用した。Ｓ‐２００ランニング緩衝液は４０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０に変えた。オクタン酸ナトリウムはコストの理由でこの緩衝液から省略し、その代わりダイアフィルトレーション前に溶液に加えた（１〜２０ｍＭ、好ましくは５ｍＭの濃度まで加えた）。リン酸は純度を改善するランニング緩衝液に高い導電率を付与した。高塩濃度は導電率を増加させるために用い得るが、溶液を緩衝化させておくことがなお好ましい。ｐＨ７．０が処方上望ましいｐＨであることから好ましかった。
【００８４】
このため、この例だと、精製ステップの順序は陽イオン交換（アルブミンにより特異的に結合された分子と共に溶出する）、陰イオン交換、アフィニティクロマトグラフィーおよびゲル浸透である。
【００８５】
処方前のダイアフィルトレーションステップは、ｐＨ７．０でアルブミンから出発することにより助けてもよい。アルブミンは例２のプロセスでよりも最終溶出液でもっと濃縮させて、処方（例３）前に最終限外ロ過ステップを助けた。
【００８６】
例５：陽イオン交換体での高塩洗浄
プロセスの別な変法において、例２または４のプロセスを下記のように変更して行う。陽イオン交換カラム（例えば、ＳＰ‐Sepharose ＦＦ、Pharmacia）へのアルブミンの担持後に、カラムをＣＳ２１（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ
３．９〜４．１、０．６〜０．８mS/cm）で洗浄してから、ＣＳ２０での最終洗浄前に、酢酸ナトリウム緩衝液（例えば、１０〜５０ｍＭ酢酸ナトリウム、好ましくは約２７ｍＭ、ｐＨ３．５〜４．５、好ましくはｐＨ４．０）中に１〜３Ｍ  ＮａＣｌ、好ましくは２Ｍ  ＮａＣｌを含有した高塩緩衝液で更に洗浄した。この一層厳密な洗浄操作が低レベルの非アルブミンタンパク質を含有した溶出液にしており、アルブミンが酵母発酵からのｒＨＡであるならば特に有用と思われる。アルブミンは例４に記載されたように溶出させた。高塩洗浄前にｐＨを低下させるとその洗浄中にカラムにアルブミンを留める上で役立ち、最終洗浄もアルブミン回収率を最大にする。どのステップも、回収されたアルブミンの純度に大きな影響を有しないと思われる。
【００８７】
例６：陰イオン交換体からの濃ホウ酸（borate）溶出
この例では、例２または４のプロセス（例５の変更と共にまたはなしに）を下記のように変更した。陽イオン交換カラムからの溶出液を１０mS/cm未満、好ましくは５mS/cm未満に希釈し、その後陰イオン交換マトリックス（例えば、ＤＥＡＥ Sepharose  ＦＦ、Pharmacia ）に担持させた。次いで陰イオン交換マトリックスは約９．２までｐＨを上げる効果を有する希テトラホウ酸緩衝液（例えば、１５〜２５ｍＭテトラホウ酸カリウムまたはテトラホウ酸ナトリウム）で洗浄し、その後アルブミンを更に濃縮テトラホウ酸緩衝液（例えば、８０〜１５０ｍＭテトラホウ酸カリウム、好ましくは１１０ｍＭテトラホウ酸カリウム）で溶出させた。例２および４では、アルブミンを２０ｍＭテトラホウ酸（borate）、１００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出させた；８０〜１５０ｍＭテトラホウ酸（例えば、３３．６ｇ／ｌ）での溶出は、これらの条件下で陰イオン交換マトリックスに対するこれら種の親和性増加のために、炭水化物含有混入物質、例えば酵母糖タンパク質の含有率がより低い溶出液を生じる。テトラホウ酸カリウムは、室温でその高い溶解度のために、テトラホウ酸ナトリウムよりも優先して用いられる。陰イオン交換マトリックスからの溶出液は例２または４のように処理した。例えば、例４プロセスにおいて、それはアフィニティマトリックス、例えばDelta Blue Agarose（ＤＢＡ）に直接担持させて、例４に記載されたように行った。
【００８８】
次いで、ゲル浸透ステップを例２または４のように行う。
【００８９】
例７：固定化アミノフェニルボロネート
ＤＢＡマトリックスからの溶出液は、塩化ナトリウム（２０〜２０００ｍＭ、好ましくは約１００ｍＭ）およびオクタノエート（１〜２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭオクタノエート、ｐＨ９．０〜９．５、好ましくは９．２）を含有した酢酸アンモニウム緩衝液（例えば１０〜１００ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭ）で平衡化されたゲル浸透媒体、例えばSephacryl Ｓ‐２００（ＨＲ）（Pharmacia）に適用してもよい。この緩衝液は、以下で更に詳細に記された、最終クロマトグラフィーステップに適した溶液中にアルブミンを効果的に交換する。
【００９０】
Ｓ‐２００ステップは次のように行なう。Ｓ‐２００は９０．０±３ｃｍ（例えば、直列で３×３０ｃｍ）の最小層高で行なう。（ａ）中間限外ロ過からの保留液をカラム上に担持させる。リサイクルおよび産物フラクションを集める。このステップはすべての物質がカラム上に担持されるまで繰り返す。（ｂ）プールされたリサイクルフラクションを上記のように限外ロ過でｒＨＡ８０〜１１０ｇ／ｌまで濃縮させる。（ｃ）リサイクル限外ロ過からの保留液を同様のカラム上に担持させ、産物フラクションを各ピークから集める。このステップはすべての物質がカラム上に担持されるまで繰り返す。（ｄ）一次および二次ゲル浸透クロマトグラフィーステップ（（ａ）および（ｃ））からの産物フラクションはＳ‐２００溶出液としてプールする。
【００９１】
最終ステップは、糖タンパク質および糖脂質と多、オリゴおよび単糖のような複合糖質を除去するアフィニティステップからなる。このステップでは、リガンドとして固定されたアミノフェニルボロン酸（boronic acid）（ＰＢＡ）を用いる。ＵＳ特許第４，５６２，２５１号（引用により本明細書に包含される）ではジボロトリアジンアガロースまたはモノボロトリアジンアガロースを作る上で適した方法について記載している：（１）トリアジンは最初にアガロースにＯ結合させ、その後第二反応で３‐アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）と結合させる。トリアジン上のＸが塩素に代えられると、二置換樹脂が得られる。（２）トリアジンは、モノまたはジボロトリアジンを作るために、まずＡＰＢＡと反応させる。次いでこれらは、一または二置換アガロースを作るために、トリアジン上の遊離塩素を介して‐ＯＮａ活性化アガロースにＯ結合させる。この特許におけるすべての例および記載では、Ｏ‐結合を生じる‐ＯＮａ活性化アガロースを用いる。
それより先のＵＳ特許第４，２６９，６０５号では、本発明で好ましい、アガロースのエピクロロヒドリン活性化を含めた様々なマトリックス活性化法について考えられている。市販マトリックスには、Amicon's ＰＢＡ３０およびSigma'sアクリルビーズ化アミノフェニルボロネートなどがある。
【００９２】
Ｓ‐２００カラムから集められたアルブミンは、Ｓ‐２００ランニング緩衝液（前記参照）で前平衡化されたＰＢＡマトリックスでクロマトグラフィーに付した；これらの条件下で、アルブミンはマトリックスにあまり結合しないが、炭水化物ベースの混入物質はカラムを通過するときにアルブミンから分離させうるように十分に遅れてくる。このため、クロマトグラフィーはアルブミンに関してネガティブモードにある。それ以上の詳細は下記のとおりであった。
フェニルボロネートマトリックスは１１．０±１．０ｃｍの流路長を有しており、アンモニウムイオン（１０〜５０ｍＭ）、酢酸（１０〜５０ｍＭ）および１．０〜１０．０ｍＭオクタン酸（例えば、ＣＳ３６‐後記表参照）を含有した緩衝液で平衡化させた。次いで、カラムを３５±１５ｇ／ＬマトリックスのｒＨＡで担持させた。ＰＢＡはネガティブステップとして行ない、したがって集められた産物は、担持とその後の平衡緩衝液での洗浄中におけるフロースルー（flow through）である。すべてのクロマトグラフィーステップは０．００５〜０．３倍層容量/min範囲の流速で行える。好ましくは、カラムの平衡化および浄化はアルブミン溶液の担持および収集よりも高い流速、例えば０．１９倍層容量/minで行い、好ましくは０．０１〜０．０５、好ましくは０．０２５倍層容量/minで行う。次いで、カラムはホウ酸緩衝液（ＣＳ３７でのように）、塩（ＣＳ３８）および苛性アルカリ（ＣＳ２５）で浄化し、その後ホウ酸緩衝液（ＣＳ３７）に貯蔵する。
【００９３】
集められたフロースルーおよび洗液のｐＨは、リン酸溶液（ＣＳ３５）で７．０±０．１に調整する。
【００９４】
用いられる緩衝液は下記のとおりである。
【００９５】
表４：例７のクロマトグラフィー溶液
溶  液              成    分        濃度（g/l）  ｐＨ    導電率(mS/cm) 
No.     名称                                                             
CS36    PBA            CH3COONH4       2.31
平衡/洗液      NaOH(27%(w/w))  2.55      9.0‐9.4   12.0‐15.0
NaCl            5.84
オクタン酸      0.721                           
CS37    ホウ酸浄化     K2B4O7・4H2O    33.6      9.2‐9.5   15.0‐18.0  
CS38    塩浄化         CH3COOH         1.62
NaOH(27%(w/w))  1.19      3.9‐4.1   125.0‐165.0
NaCl            117.0                           
ＰＢＡ緩衝液中におけるアンモニウムイオンの使用のために、上記例３に記されたような最終限外ロ過ステップでは塩を用いることが有利である。
【００９６】
特に好ましいプロセスにおいて、ステップの順序は下記のとおりである：
（１）例１のような酵母発酵
（２）例２のような遠心物コンディショニング
（３）例５のような高塩洗浄での陽イオン交換（ＳＰ‐ＦＦ）と、例４のようなアルブミン特異性化合物での溶出
（４）例６のような、希釈と濃テトラホウ酸（tetraborate）溶出での陰イオン交換
（５）例４のようなアフィニティクロマトグラフィー（ＤＢＡ）
（６）例７のような、中間限外ロ過、その後ゲル浸透（Ｓ‐２００）、およびリサイクル限外ロ過
（７）例７のような固定ホウ酸（immobilised borate）上でのクロマトグラフィー
（８）例３のような最終限外ロ過および処方
例８：固定化フェニルボロネートの早期使用
固定フェニルボロネートを使うステップは、そのプロセスで、例えばステップの順序が陽イオン交換体‐陰イオン交換体‐アフィニティ物質‐限外ロ過／ダイアフィルトレーション‐固定フェニルボロネート‐ゲル浸透であるプロセスで早期に用いることができる。
【００９７】
各ステップの条件は例４〜７のとおりであるが、但し下記のようにする。ＤＢＡ溶出液をアルブミン８０〜１１０ｇ／ｌに濃縮し、ｐＨを例７で用いられた種類の酢酸アンモニウムに対してダイアフィルトレーション（５倍容量）することにより９．２に調整する。次いで濃縮ＤＢＡ溶出液をＰＢＡでクロマトグラフィーに付し、フロースルーを集めて、ゲル浸透（例えば、Ｓ２００）カラムに直接適用する。ゲル浸透ステップがここでは最後のステップであるため、処方ステップに適した緩衝液、例えば２０〜１３０ｍＭ（好ましくは、５０〜１００ｍＭ）ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で行なってもよい。
【００９８】
例９：本発明により生産されたアルブミンの特徴
この例では、本発明に従い精製されたアルブミンの純度を確認するために行われる分析について示している。他で指摘されないかぎり、すべてのアッセイは、最終産物を得るために例３に記載されたように処方されたアルブミンで行う。
【００９９】
ｒＨＡのグリケーション（glycation）
グリケートされたタンパク質のマイクロアッセイでは、本発明により精製された（ｒＨＡ）が非酵素グリコシル化（グリケーション）により修飾されていないことを示した。マイクロアッセイでは、過ヨウ素酸（periodate）によるＡＰのＣ‐１ヒドロキシル基の酸化により、安定なアマドリ産物（ＡＰ）形のグリケート化タンパク質を測定する。過ヨウ素酸酸化により放出されたホルムアルデヒドは、アンモニア中でアセチルアセトンとの反応による、発色団ジアセチルジヒドロルチジン（ＤＤＬ）への変換により定量する。次いで、ＤＤＬは４０５ｎｍで比色分析により検出する。
【０１００】
アルブミンバッチ      モルヘキソース／モルタンパク質
Ａ                      ０．０９２
Ｂ                      ０．１１６
Ｃ                      ０．０９０
Ｄ                      ０．１３２
Ｅ                      ０．０６０
Ｇ                      ０．０４
Ｈ                      ０．０１
Ｉ                      ０．０７
Ｊ                      ０．０７
Ｋ                      ０．０５
Ｌ                      ０．７４０
Ｍ                      ０．７０
Ｎ                      ０．９６
Ｏ                      ０．７８
バッチＡ〜Ｋは例２により精製されたｒＨＡであった。バッチＬ〜Ｏは異なる供給元からの市販ヒト血清アルブミンのサンプルであった。例７により精製されたｒＨＡの８バッチは、ＨＳＡ（０．３８７±０．０１２）と比較して、無視しうるグリケーションレベル（０．０４２±０．０１８モル／モル）であった。
【０１０１】
低分子量混入物質アッセイ
原理‐このアッセイの目的は、酸性有機溶媒を用いてｒＨＡおよびＨＳＡから非共有結合低分子量混入物質（ＬＭＣ）を除去することである。その後ＨＰＬＣ“指紋”クロマトグラムが、サンプルの比較のために生成されうる。
【０１０２】
方法‐１００μｌの最終産物（２０ｍｇ；ｒＨＡまたはＨＳＡ）にギ酸（９８％ｖ／ｖ）５０μｌ、クロロホルム１００μｌおよびエタノール５０μｌを順次加えて、各添加後に撹拌する。サンプルを規則的に混合しながら室温で５分間保つ。次いでタンパク質をアセトン１ｍｌの添加により沈降させる（３０分間、−２０℃）。タンパク質サンプルを遠心によりペレット化し、上澄をデカントし、真空下でロータリーエバポレーションにより乾燥させる。乾燥サンプルを２５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸に再懸濁する。次いで、ＬＭＣは０．１％トリフルオロ酢酸中直線１０％〜９０％アセトニトリル勾配を用いてＡＢＩ  ＰＴＨ  Ｃ１８逆相カラム（２２０×２．１ｍｍ）で分離させる（流速＝３００μｌ/min）。サンプルは ShimadzuＵＶモニターを用いて２１４ｎｍでモニターした。
【０１０３】
結果‐ヒト血清アルブミンの市販バッチと本発明に従い精製されたｒＨＡのバッチとの比較を行った。２つの主な有意のＡ２１４ｎｍピークが本発明のサンプルでみられる（Ｒｔ＝各々３１．１および４２．８min‐図２および表９参照）。２．１５minのピークはカラムを通過する不溶性または部分可溶性物質のためであると思われ、５６．５minの大きなピークは水ブランクのトレース中にも存在しているため、人工産物と思われる。
【０１０４】
表５：ピーク結果

＃      保持時間              面  積                高  さ
(min)               (uV.sec)               (uV)      
１      ０．８００          ３４５９６８６      ２１９１２２
２      １．６６７            ４１８６０６        ３３５６９
３      ２．１５０        ７７８８３３３５    １９６３６３０
４      ３．０００          ６２９３２５８      １２２２９５
５    ２０．４３３            ２９７６０８        １４４２４
６    ２２．９００            ２０５８２２        １４６０１
７    ２７．５６７            １５０８５１        １０８３５
８    ３１．１１７          ２２１３８８３      １７０９３８
９    ３７．９８３            １６４７１０        １５０８８
１０    ３９．２６７            ３４７９４６        ２９８７９
１１    ４１．７５０            １０７５１５          ８４０２
１２    ４２．７８３          ２３０３０２４      １９２９１１
１３    ４３．２１７            １３９７４４        １４１４１
１４    ４３．４５７            ２５４５２１        ２３９７９
１５    ５０．４６７            １５２８０５        １３２２６
１６    ５０．９５０            １６２３６４        １２５７７
１７    ５６．５３３          ５７５３７９６        ８３６７４    
他方、市販ＨＳＡは更に多くのピークを有している（図３および表６参照）。
【０１０５】
表６：ピーク結果

＃          保持時間            面積                高さ        
(min)           (uV.sec)             (uV)        
１            ０．３５０          ２４４３８５        ２３９５７
２            ０．６３３          ６０７８８０        ４５３１０
３            ０．７８３        ３２３９７３０      ２４３４７７
４            ０．９８３        １０７２０３３      １５８１４６
５            ２．２３３      ７６７７３５６９    ２０３８０２８
６            ２．９３３        ６６３４０８９      １８２３６３
７            ３．７３３        ２８１２６８８        ９５４５９
８          １２．４８３          ８１８５４０        ２０１８５
９          １２．６５０          ２１８７４８        ２２７５０
１０        １４．１５０        ５４２３７１５        ９８３３６
１１        １６．３３３          ４２３４０３        １７４６０
１２        １６．６３３          ６８８５２５        ２４５３８
１３        １７．５５０        ２３０１３０９        ８４７８１
１４        １８．０３３        １１４５０４５        ４７８０６
１５        １９．７５０          ６７２７２１        ２１５６２
１６        ２０．２３３            ８７７９９          ９７６０
１７        ２０．７００          ２７２１７１        １３００３
１８        ２１．１００          ８６２１４６        ５５７９２
１９        ２１．９６７          １６６４７１          ８９２８
２０        ２２．８８３        １３８１４４５        ９７６６０
２１        ２３．５８３        １１１２６３２        ８９８５１
２２        ２４．０００        ４７４０３４７      ４１９７８０
２３        ２４．４１７          ３５２４８６        ２６３７４
２４        ２４．９１７          １７１２７９        １４６２５
２５        ２５．１３３            ９９７３４        １１４７３
２６        ２５．２６７          １３３９１１        １０５１５
２７        ２５．６６７          ２２３５５６        １１８５４
２８        ２５．９６７          ２５７２９５        １７３５１
２９        ２６．６００            ９３９０６          ７６５７
３０        ２６．８１７          ２２３１１３        １８３２６
３１        ２７．２５０          ３０３８３１        ２９４６１
３２        ２７．５３３          １２４２１８        １２７１０
３３        ２７．７８３        ５７４７０９１      ５６１６２９
３４        ２８．５５０        １３８３７６１      １１９７７２
３５        ２９．０３３          ３９０９８６        ３３４５５
３６        ２９．４１７          １８２１３１        １２７１３
３７        ２９．８３３          １８１３３３        １２５８４
３８        ３０．１８３          ４７８３２０        ３０１５５
３９        ３０．５８３        １０４８９４５        ５８４６５
４０        ３１．０６７        ３４５４４２５      ２１４４８９
４１        ３１．９８３          １６８２７５          ８６６３
４２        ３２．７１７          ６５１４０６        ４３１６１
４３        ３３．１５０        １１４２２２１      １０２５８８
４４        ３４．０１７          ４２０７５６        ２３８８３
４５        ３５．１００          １１５７０４        １０００８
４６        ３７．０３３          １６６５８８          ９４６８
４７        ３８．２６７          １４５７３１          ８０７８
４８        ３８．９８３          ７８１２０９        ５４０２９
４９        ４１．８００            ８６９６７          ８８６８
５０        ４８．８８３            ９５４１６          ８５２２
５１        ５０．２６７          １７４１５９        １６７３７
５２        ５０．４８３          １７６１１５        １５５７３
５３        ５１．２６７          １５８７２７        １３７０１
５４        ５２．１８３          ２９７２７８        ２５７９５
５５        ５６．５３３        ５８４６６４５        ８５７１０  
非共有結合ＬＭＣに関する本発明のアルブミンの品質は、臨床用ＨＳＡの場合よりも明らかに優れている。数値で表すと、本発明のアルブミンについて１０分と５５分の間の全ピーク面積は約６．４Ｖ.secであり、市販物質について同じ２つの時間の間における全ピーク面積は約３９．７Ｖ.secであった。
【０１０６】
同様の分析は２８０ｎｍでの検出により行い、そこでは本発明に従い精製されたアルブミンのピーク面積は０．５６Ｖ.secであり、ＨＳＡの場合は１４．９Ｖ.secであった。
【０１０７】
蛍光低分子量混入物質の分析（２８０ｎｍで励起、３５０ｎｍで検出）でも、本発明の方法により精製されたアルブミンについて、ＨＳＡの場合の１０％未満の全ピーク面積を表す。
【０１０８】
ｒＨＡおよびＨＳＡのキャピラリーゾーン電気泳動
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、本発明の精製ｒＨＡと市販ＨＳＡを定性的に比較するために、標準ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの代わりとして用いる。ＣＥは高分解能電気泳動技術であり、ほんの小さな差異がみられると、同様のタンパク質のサブ集団（sub-populations）を分離することができる。
【０１０９】
方法‐ＨＳＡ（Armour）および本発明に従い精製されたｒＨＡのサンプルを
２０ＫｅＶおよび３０℃で２０ｍＭ  ＰＯ４／Ｂ４Ｏ７緩衝液、ｐＨ＝７．４により分離し、ＡＢＩ２７０ＣＥで電気泳動に付した。本発明のｒＨＡは電気泳動図で単一ピークを与え、その均一性を示した。逆に、他のピークが市販ＨＳＡサンプルで観察された。これらのピークは、例えば遊離チオール基がブロックされたかまたはアミノ末端が分解したアルブミン分子の存在を示すと考えられる。
【０１１０】
Ｃ末端の分析
組換えタンパク質の質的コントロールの重要な面は、予備決定される一次構造の確立と安定性である。
【０１１１】
材料および方法
トリプシン消化：ＨＳＡ（市販源から‐１つのサンプルは−２０℃で貯蔵し、１つは３０℃で１２週間貯蔵する）、本発明に従い精製されたｒＨＡ（４℃および３０℃で６月間貯蔵する）およびＤｅｓ‐Ｌｅｕ  ｒＨＡ（Ｃ末端ロイシンのないｒＨＡの切欠形）（各１ｍｇ）を３７℃で１２０分間かけて５ｍＭジチオトレイトール（Calbiochem）により還元させ、その後０．５Ｍ Tris ＨＣｌ  ｐＨ８．０中６ＭグアニジンＨＣｌ中３７℃で９０分間かけて１０ｍＭヨードアセトアミド（Sigma）でアルキル化した。
【０１１２】
次いで、サンプルをＨ２Ｏで１対３希釈し、３７℃で４８時間かけてトリプシンで消化した（SigmaのＴＰＣＫ処理トリプシン、１mg/ml溶液の３×１０μｌアリコットを４８時間にわたって加える）。
【０１１３】
ペプチドマッピング：トリプシン消化物は、２５ｃｍ Pharmacia SuperPac Pep-Sカラム（５μｍ  Ｃ２／Ｃ１８）を用いて、Gilson ＨＰＬＣ系による逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣでマッピングした。用いられた溶離剤は、Ａ．水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（ＡＢＩ）；Ｂ．７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（Fisons Scientific）中０．０９％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ‐６０分間、０．５ml/minの直線勾配であった。２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶ検出。
【０１１４】
Ｎ末端配列決定：ＡＢＩ４７７Ａタンパク質シーケンサーで行う
高速原子衝突‐質量スペクトル分析：ＦＡＢ‐ＭＳをＭ‐Scan Limited，Ascot，ＵＫによりＶＧ Autospecで行った。
【０１１５】
ペプチド合成：全長Ｃ末端トリプシン処理ペプチドＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （質量１０１２）をＡＢＩ，Warrington，ＵＫにより合成した；切欠き体ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ（質量８９９）をDepartment of Biochemistry，University of Nottingham，Nottingham，ＵＫにより合成した。
【０１１６】
結果
全長Ｃ末端トリプシン処理ペプチド（質量１０１２）は、合成マーカーペプチドを用いると、ＲＰ‐ＨＰＬＣで３７．５minで溶出することが示された。このピークを集め、ＨＳＡおよびｒＨＡからＮ末端配列決定およびＦＡＢ‐ＭＳにより同定した。
【０１１７】
Ｃ末端ロイシンの除去は切欠きＣ末端ペプチド（質量８９９）を生じ、これは２８．５分で溶出することが示され、合成マーカーペプチドを用いて確認した。このピークはＤｅｓ‐Ｌｅｕ  ｒＨＡのトリプシン消化物から単離して、Ｎ末端配列決定およびＦＡＢ‐ＭＳにより同定した。他の２つのペプチドは２８．５分ピーク、ＡＷＡＶＡＲ（質量６７３）およびＤＬＧＥＥＮＦＫ（質量９５０）に存在することが示された。
【０１１８】
２８．５分ピークをＨＳＡのトリプシン消化物、３０℃で１２週間貯蔵されたＨＳＡ、Ｄｅｓ‐Ｌｅｕ  ｒＨＡ、４℃で６月間貯蔵された本発明のｒＨＡおよび３０℃で６月間貯蔵された本発明のｒＨＡからＲＰ‐ＨＰＬＣで集めた。
【０１１９】
各消化物からのピークは、その後で合成マーカーペプチドと一緒に、Ｎ末端配列決定およびＦＡＢ‐ＭＳにより分析した。
【０１２０】
表７．Ｎ末端配列決定により２８．５min ピークに存在するペプチド

サンプル                          配列                      
Ｄｅｓ‐Ｌｅｕ  ｒＨＡ            ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ
ＡＷＡＶＡＲ
ＤＬＧＥＥＮＦＫ                
ＨＳＡ標準                        ＡＷＡＶＡＲ
ＤＬＧＥＥＮＦＫ
＋約５％ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ    
３０℃で１２週間のＨＳＡ          ＡＷＡＶＡＲ
ＤＬＧＥＥＮＦＫ                
４℃で６月間のｒＨＡ              ＡＷＡＶＡＲ
ＤＬＧＥＥＮＦＫ                
３０℃で６月間のｒＨＡ            ＡＷＡＶＡＲ
ＤＬＧＥＥＮＦＫ                
ＦＡＢ‐ＭＳによると、２８．５分ピークに存在する主シグナル（（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオン）は表８に示されたとおりであった。
【０１２１】
表８．  ２８．５min ピーク中の（Ｍ＋Ｈ）＋イオン

合成全長および切欠Ｃ末端          １０１３‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
ペプチドの混合物                    ９００‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ    
Ｄｅｓ‐Ｌｅｕ  ｒＨＡ              ６７３‐ＡＷＡＶＡＲ
９００‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ
９５１‐ＤＬＧＥＥＮＦＫ
１０２８‐  ？
１１４０‐  ？                    
ＨＳＡ標準                          ６７３‐ＡＷＡＶＡＲ
９００‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ
９５１‐ＤＬＧＥＥＮＦＫ
１０２８‐  ？
１１４０‐  ？                    
３０℃で６月間のｒＨＡ              ６７３‐ＡＷＡＶＡＲ
９００‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ
１０２８‐  ？
１１４０‐  ？
９５１‐シグナルなし            
１０２８および１１４０でのシグナルは断片イオンと思われる；それらは配列分析により検出できるペプチドではなかった。
【０１２２】
結論
Ｄｅｓ‐Ｌｅｕ  Ｃ末端トリプシン処理ペプチドは約５〜１０％（定量ではない）で市販ＨＳＡに検出されたが、本発明のｒＨＡでは３０℃で６月間後であっても検出できなかった。Ｄｅｓ‐Ｌｅｕペプチドは３０℃で１２週目にＨＳＡで検出できず、全長Ｃ末端ペプチドで３７．５分のピーク（単離されないが）は他のサンプルと比較して非常に減少しており、おそらくこれがＣ末端分解を更に受けたことを示している。
【０１２３】
これらの結果は、本発明に従い精製されたｒＨＡが安定な完全長カルボキシ末端を有しているが、市販源から既に入手できるＨＳＡは比較してみると不均質（heterogeneous）と思われることを示している。
【０１２４】
精製ヒトアルブミン中の遊離チオールに関する比色分析アッセイ
序文‐エルマン試薬、５，５′‐ジチオビス（２‐ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）はＣｙｓ‐ＳＨのような遊離チオール基を検出する特異的な高感度手段である。その反応の後で４１２ｎｍの吸光度をモニターでき、その値を用いてｒＨＡの分子当たり１残基未満のレベルまで遊離Ｃｙｓ‐ＳＨを計算することができる。下記の溶液、試薬をアッセイで利用する：
５，５′‐ジチオビス（２‐ニトロ安息香酸）ＤＴＮＢ，Sigma Product Ｎｏ  Ｄ８１３０
TRIS PRE-SET pH結晶ｐＨ８．０，Sigma Product Ｎｏ  Ｔ４７５３
ＥＤＴＡ・二ナトリウム，Sigma Product Ｎｏ  ＥＤ２ＳＳ
リン酸二水素ナトリウム・二水和物，Analarグレード
リン酸水素二ナトリウム・二水和物，Analarグレード
緩衝液１：０．１Ｍ（１２．１ｇ）Tris‐ＨＣｌ：０．０１Ｍ（３．７２ｇ）ＥＤＴＡ  Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ，ｐＨ８．０。PRE-SET pH結晶。水５００ｍｌに溶解して、正確に１リットル容量に調整する。室温で１月間安定。
【０１２５】
緩衝液２：０．０５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（５．４５ｇ）、３．０４ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ。水５００ｍｌに溶解して、正確に１リットル容量に調整する。室温で１月間安定。
【０１２６】
試薬：リン酸緩衝液中０．０１Ｍ（３９．４ｍｇ）ＤＴＮＢ。緩衝液２の１０ｍｌに溶解する。各々の日に新たに調製する。
【０１２７】
サンプル：アルブミンを緩衝液１で約１０．３μＭ（０．６６mg/ml）まで希釈する。
【０１２８】
操作
１）分光光度計セルホルダーサーモスタットを２５℃にセットする。２）１つのキュベット中のサンプル１．２５ｍｌと、他の１０ｍｍ減容量キュベット中の緩衝液の１．２５ｍｌとをサンプルおよびレファレンス位置に各々入れる。３）４１２ｎｍで計器をゼロ調整する。吸光度を０．１ＡＵフルスケールにセットする。４）ＤＴＮＢ試薬５０μｌをレファレンスキュベットに加え、きれいなプラスチックスターラーを用いてしばらく混合する。５）ＤＴＮＢ試薬５０μｌをサンプルキュベットに加え、上記のように混合する。６）直ちにデータ捕捉を始める  （またはチャートレコーダーを始動させて、１０分まで反応を追跡する）。７）値を同じく３回にわたり得るために、各サンプルについて繰り返す。８）安定した吸光度減衰からゼロ時間に逆外挿して、４１２ｎｍで吸光度（δＡ４１２）を読み取る（図１）。９）モル吸光係数ε４１２＝１３．９cm2/mMを用いてスルフヒドリル含有量を計算する。
【０１２９】
結果
いくつかの市販ＨＳＡサンプルを遊離チオール含有量についてアッセイし、結果は以下にまとめた：
ＨＳＡ 遊離チオール（モルＳＨ／モルＨＳＡ）
１                  ０．２９
２                  ０．２２
３                  ０．３５
４                  ０．０５
５                  ０．０８
６                  ０．４６
７                  ０．３６
これらの値は、０．８５〜０．９モルＳＨ／モルｒＨＡでルーチンに分析された、上記例に従い作られたアルブミンの値よりも有意に低い。
【０１３０】
グラファイトファーネス(furnace)スペクトル分析によるヒトアルブミン中の金属イオン混入の測定
標準およびサンプルをパイロコート（pyrocoat）されたグラファイト管から原子化する。サンプルの原子吸光は下記条件を用いて検出する：

金属イオン        波長ｎｍ        原子化温度℃    
Ｚｎ            ２１３．９        １８００
Ｃｕ            ３２７．４        ２３００
Ｆｅ            ２４８．８        ２４００
Ａｌ            ３０９．８        ２５００
Ｍｎ            ２７９．８        ２２００      
アルミニウムはPerkin Elmer Ｍ２１００原子吸収スペクトル分析器、Perkin Elmer ＨＧＡ‐７００グラファイトファーネス、サンプルカップ付きPerkin Elmer ＡＳ‐７０オートサンプラーおよびアルミニウム中空カソードランプを用いて測定した。試薬はＡＲグレード硝酸マグネシウム、アルミニウム標準溶液（１０００ｐｐｍ）およびＡＲグレード濃硝酸であった。１．００％ｗ／ｖ硝酸マグネシウム溶液はMilli-Ｑ水で調製した。アルミニウム標準溶液１５μｌをピペットでオートサンプラーに入れ、０．２０％硝酸溶液で１５００μｌまで希釈した。操作は、得られた溶液１５μｌと、その後に得られた溶液１５０μｌで繰返して、１０ｐｐｂ（μｇ／ｌ）アルミニウム溶液を得る。
【０１３１】
アルブミンサンプルを０．２０％硝酸溶液で希釈して、検量線図の限界内でアルミニウム濃度を得る。１：２希釈で通常十分である。
【０１３２】
マグネシウムも同様にPerkin Elmer ＡＳ‐５１フレームオートサンプラーおよびマグネシウム中空カソードランプを用いて測定する。１０００ｐｐｍのマグネシウム標準溶液をMilli-Ｑ水で希釈して、０．１、０．２、０．５および１．０ｐｐｍ標準溶液を得る。サンプルの原子吸光は２８５．２ｎｍで検出する。
【０１３３】
銅、鉄、マンガンおよび亜鉛もアルミニウムと同様に測定するが、亜鉛の場合は１．０ｐｐｂ（μｇ／ｌ）標準溶液を１０ｐｐｂ溶液の代わりに用いる。金属イオンの濃度はｎｇ／Ｌで測定し、その後アルブミンの濃度に関連させる（金属イオンｎｇ／ｇアルブミン）。これらのデータは表９に掲載している。
【０１３４】
【表３】
2006342169.tif 000006
すべての結果は全金属イオン濃度として表示してある。
【０１３５】
表１０は市販ＨＳＡ中における金属イオンの対応レベルを示している。
【０１３６】
【表４】
2006342169.tif 000007
本発明の製品中におけるアルミニウムの平均レベルは約６０ｎｇ／ｇであり、市販品は１５５〜３１９０ｎｇ／ｇであることがわかる。同様に、本発明の製品は平均約９４８ｎｇ／ｇの鉄（比較従来物質では１８５０〜４１，２００ｎｇ／ｇ）、平均２９９０ｎｇ／ｇの銅（従来物質では５８０〜２３，８４０ｎｇ／ｇ）、平均１１２０ｎｇ／ｇのマグネシウム（従来物質では５００〜５４，０００ｎｇ／ｇ）、平均２３９０ｎｇ／ｇの亜鉛（従来物質では９３０〜７２３０ｎｇ／ｇ）および平均４８ｎｇ／ｇのマンガン（従来物質では６５〜９４０ｎｇ／ｇ）を有していた。
【０１３７】
中および長鎖脂肪酸の分析
本発明によるアルブミンと市販ＨＳＡの脂肪酸プロフィールは、Ｃ１７：０内部標準を用いて、遊離脂肪酸の酸性溶媒抽出とガスクロマトグラフィーにより分析した。
【０１３８】
装置：フレームイオン化検出器装備のガスクロマトグラフ（例えば、Shimadzu ＧＣ９Ａ）；オートインジェクター（例えば、Shimadzu ＡＯＣ１４）；インテグレーター／プリンター（例えば、Shimadzu ＣＲ４Ａ）；ＨＰ‐ＦＦＡ３０×０．５３ｍｍ、１．０μｍ相カラム（Hewlett Packard Ltd.）；直接注入ライナー装備Megabore Installationキット（ＧＣ９Ａ用のＪ＆Ｗ Scientific ２２０‐１１５０）
試薬：水（Milli-Ｑ）；ジクロロメタン超純粋溶媒（Romil Chemicals,Loughborough,Leics.）；酢酸ナトリウム・三水和物Analar（ＢＤＨ Ltd.Poole）；氷酢酸Analar（ＢＤＨ Ltd.Poole）；ヒト血清アルブミン溶液（ZenalbTM２０，Bio Products Laboratory ，Elstree,Herts.）；無水硫酸ナトリウム（分析試薬）；Sigmaからの標準脂肪酸
溶液：
０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５；酢酸ナトリウム６．１３ｇおよび酢酸３．３０ｇ／１００ｍｌ
遊離脂肪酸標準混合物．各脂肪酸５ｍｇを別々のガラスバイアル中に秤量する。各脂肪酸をジクロロメタン１ｍｌに溶解し、短鎖（Ｃ６‐Ｃ１４）、中鎖（Ｃ１６‐Ｃ１８）および長鎖（Ｃ２０‐Ｃ２２：１）脂肪酸について３つの１２ｍｌ Pyrex培養管に各々移す。窒素流下で混合物を乾燥させ、ジクロロメタン１ｍｌに溶解する。混合物を５０μｌずつ、ラベルしたガラスバイアルに移し、窒素下で乾燥させ、キャップを付して、−２０℃で貯蔵する。
【０１３９】
内部標準溶液１mg/mlヘプタデカン酸（ヘプタデカン酸２５．０ｍｇ／ジクロロメタン２５ｍｌ）
操作
１．  ６つのラベルした４０ｍｌ Pyrex管に内部標準溶液５０μｌを加える。
２．  ５％ｒＨＡの場合にはサンプル５ｍｌを加える。２５％ｒＨＡの場合にはサンプル１ｍｌおよび水４ｍｌを用いる。ブランク（水５ｍｌ）および血清アルブミンサンプル（ZenalbTM２０の１．２５ｍｌおよび水３．７５ｍｌ）を含める。すべてのサンプルを二重に調製する。
３．  酢酸ナトリウム緩衝液２．５ｍｌ、その後ジクロロメタン１０ｍｌをすべての管に加える。
４．  室温で２時間にわたり機械ローラー上にキャップ付きの管をおく。
５．  Sorvall ＲＴ６０００Ｂ遠心機中、２０℃、３０００ｒｐｍで５分間にわたりすべての管を遠心する。
６．  上方の水相を除去し、その後管の底から作業して、ラベルした１２ｍｌ Pyrex管中に下方のジクロロメタン相を慎重に移す。球状タンパク質はすべてのジクロロメタン相の除去を妨げることがある。これが生じるならば、１スパチュラ分の無水硫酸ナトリウムを加え、キャップを付して、振盪する。
７．  窒素流下でジクロロメタン相を乾燥させ、分析するまで窒素下−２０℃で貯蔵する。
８．  キャピラリーカラムを取り付けて、製造業者の説明に従いガスクロマトグラフを下記条件にセットする。
検出器：フレームイオン化；キャリアガス：窒素３０ml/min；注入容量：０．５μｌ；カラム初期温度：７０℃；保持：１．５min；勾配１：１５０℃まで２０℃/min；勾配２：２４０℃まで４℃/min；保持：７min；検出器温度：２８０℃；Shimadzu ＧＣ９Ａに特有のセッティングは：検出器レンジ（range）：１０゜；水素圧：０．５kg/cm2；空気圧：０．５kg/cm2；停止時間：５０minである。
９．  製造業者の説明に従いガスクロマトグラフからデータを集めるために、インテグレーターを調整する。
１０．  オーブン温度を２４５℃に上げ、定常ベースラインに達するまでそのままにしておく。
１１．  オーブン温度を７０℃に下げて、平衡化させる。
１２．  長、中および短鎖脂肪酸標準のアリクウオットを解凍させる。長鎖脂肪酸をジクロロメタン１ｍｌに溶解する。その溶液を中鎖脂肪酸に移して、溶解させる。短脂肪酸についても繰り返す。
１３．  脂肪酸保持時間を調べるために標準混合物を注入する。得られたクロマトグラムは非常に小さなピークテーリングを有し、平坦でゆっくり立ち上がるベースラインを有して、正確な数のよく分割されたピークを持っているべきである。カプロン酸（Ｃ６：０）は約６minの保持時間で、エルカ酸（Ｃ２２：１）は約３３minの保持時間で溶出するはずだ。例の標準クロマトグラムと比較してすべてのピークを同定する。
１４．  サンプルを注入して、データを集める。
【０１４０】
計算
１．  ブランクサンプルから内部標準ピークを同定する。これは保持時間約２３．５minの主ピークである。
２．  下記式を用いて、すべてのサンプルで、すべての積分ピークについてピーク面積比を計算する。
ピーク面積比  ＝      ピーク面積    
内部標準ピーク面積
３．  標準との比較により、保持時間に基づきｒＨＡおよびＨＳＡサンプルで脂肪酸ピークを同定する。
４．  下記ファクターを用いて、ｒＨＡおよびＨＳＡ双方のサンプルについて、すべてのピーク面積比を大体の濃度（μｇ／ｇアルブミン）に変換する：
濃度（μｇ／ｇ）＝ピーク面積比×２００
５．  脂肪酸として同定されたピークの場合には、脂肪酸の分子量と下記式を用いて、濃度をμｇ／ｇアルブミンからモル／モルアルブミンに変換する：
濃度（モル／モル）  ＝  濃度（μｇ／ｇ）×０．０６６５
脂肪酸分子量
【０１４１】
例の結果は、例２に従い得られたアルブミンのバッチ（図４）と市販ＨＳＡ（図５）について示している。異常な脂肪酸はこの方法により前者で検出されなかったが、２つのタンパク質のプロフィールは有意差を示した。予想されたように、双方とも多量の添加安定剤オクタノエート（Ｃ８：０）を示した。これとは別に、市販ＨＳＡは主にＣ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１およびＣ１８：２で特徴付けられ、本発明のアルブミンは主にＣ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１６：１で、時々Ｃ１４：０を含有していた。更なる実験では、ｒＨＡ最終製品中におけるＣ１０：０およびＣ１２：０のレベルが、精製プロセスで後の方の段階に用いられるオクタノエート中におけるこれら混入物質のレベルと相関していることを示した。
【０１４２】
例７に従い製造されたｒＨＡに関するデータは下記のとおりである：
表１１．本発明の製造法に従い精製されたｒＨＡと市販ＨＳＡとの脂肪酸組成の比較

脂肪酸含量（ mol／mol タンパク質）                
脂肪酸                  ｒＨＡ                  ＨＳＡ    
Ｃ１０：０              ０．１００              ０．００５
Ｃ１２：０              ０．０２０              ０．０１１
Ｃ１４：０              ０．００５              ０．０１７
Ｃ１６：０              ０．０１３              ０．１５２
Ｃ１６：１              ０．０６４              ０．０２３
Ｃ１８：０              ０．００２              ０．０２４
Ｃ１８：１              ０．０１２              ０．１４５
Ｃ１８：２                  ＮＤ                ０．０８９
Ｃ１８：３                  ＮＤ                ０．００６
Ｃ２０：０                  ＮＤ                ０．００１
Ｃ２０：１                  ＮＤ                ０．００１
Ｃ２０：２                  ＮＤ                    ＮＤ
Ｃ２０：４                  ＮＤ                ０．００６  
合計                ０．２１６              ０．４８０  
ＮＤ＝検出されず
好ましくは、Ｃ１８脂肪酸の全レベルはオクタノエートのレベルの１．０％（モル／モル）を超えず、好ましくはそのレベルの０．５％を超えない。更に、本発明のアルブミンにおいて、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３およびＣ２０脂肪酸のレベルは通常検出不能である。市販ＨＳＡの場合だと、典型的にはアルブミン１モル当たりＣ１０〜Ｃ２０脂肪酸約０．４モルである。本発明の生成物では、典型的にはＣ２０脂肪酸について検出不能であり、アルブミン１モル当たりＣ１８脂肪酸約０．０１〜０．０２モルにすぎない。
【０１４３】
色の分析‐１ｃｍキュベット中にある最終産物の５％（ｗ／ｖ）溶液の吸光度を３５０ｎｍ、４０３ｎｍおよび５００ｎｍで測定し、路長ｃｍ当りアルブミンｇ／ｌ当りの吸光度（即ち、ＡＬ．ｇ-1．ｃｍ-1）で計算した。本発明のアルブミンは下記値を有している：
波長                    平均吸光度（ｎ＝１０バッチ）
（ｎｍ）                      （Ｌ・ｇ-1・ｃｍ-1）
３５０                      ４．７４×１０−３
４０３                      ２．１２×１０−３
５００                      ０．５８×１０−３
通常、本発明のアルブミンは上記３つの波長で６．０×１０−３、
２．５×１０−３および０．７５×１０−３の各吸光度を超えない。
【０１４４】
いくつかの市販ＨＳＡ製剤のアッセイでは、これらの波長でもっと高い吸光度を示した（表１２参照）。
【０１４５】
表１２：従来のＨＳＡ製剤の吸光度（Ｌ．ｇ-1．ｃｍ-1）

サンプル      Ａ３５０      Ａ４０３      Ａ５００ 
１          ９．９５      ４．１０      ０．８
２          ９．２５      ５．３６      １．１
３          ７．４０      ３．２６      ０．６
４          ７．２０      ３．６０      ０．６
５          ８．６８      ４．０８      ０．８
６        １１．４５      ６．２６      １．２
７          ７．２０      ３．７０      ０．８
８          ６．８２      ４．７８      １．８      
ＳＤＳ還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動‐このアッセイは、ｒＨＡが、還元剤（β‐メルカプトエタノール）で処理されたときに、ＳＤＳ還元ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）で単一バンド（モノマー）として移動する単一ポリペプチド鎖からなることを示すために行う。
【０１４６】
アルブミンのサンプルをＳＤＳ還元緩衝液（アルブミン１mg/mlと共に２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび１０％（ｖ／ｖ）β‐メルカプトエタノールを含有した２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ  ｐＨ８．０）中で煮沸し、その後溶液１μｌの担持量を用いて、ＳＤＳ均質（homogeneous）（１２．５％）Phastgels（Pharmacia）で分離させた。タンパク質バンドをCoomassie Blue Ｒ２５０染色により検出し、Shimadzu ＣＳ９０００デンシトメーターで走査した。アルブミンの分離ではCoomassie染色の単一バンドを示して、モノマーとして存在するアルブミンの割合が少くとも９９．９％であることを示した。
【０１４７】
ゲル浸透高圧液体クロマトグラフィー
本発明のプロセスの主態様（即ち、陰イオン交換ステップが限外ロ過および処方前の最終ステップである）における陰イオン交換マトリックスからの溶出液中でアルブミンの１０mg/ml溶液２５μｌをShimadzu ＬＣ６Ａ  ＨＰＬＣでＴＳＫ３０００ＳＷＸＬカラムに注入する。製品は少くとも９９．９％モノマーであることがわかった。
【０１４８】
２５％ｗ／ｖに処方された、本発明に従い精製されたアルブミンの第二の１０mg/ml溶液２５μｌを同様に分析したところ、０．１％未満のポリマーアルブミンの含有であることがわかった。この結果は、ここに記載されたような処方が精製アルブミンのポリマー／凝集物含有率に影響を与えないことを示している。
【０１４９】
二次元ゲル電気泳動
本発明のプロセスにより得られたアルブミンのｒＨＡ２μｇを、Millipore Investigatorシステムを用いて二次元電気泳動に付した。第一の次元での分離はｐＨ３〜１０等電点電気泳動ゲルであり、その後第二の次元で１０％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルを行った。Coomassie Blueによるゲルの染色では１つだけのスポットが見え、１つだけのタンパク質種の存在を示した。
【０１５０】
電気スプレー質量スペクトル分析
電気スプレー質量スペクトル分析（ＥＳＭＳ）はＶＧ Quattro電気スプレー質量スペクトル分析器を用いて行い、ｍ／ｚ範囲９５０〜１７５０Ｄａ／ｅでウマ心臓ミオグロビン（１６９５１Ｄａ、Sigmaから入手）で較正した。市販ＨＳＡのサンプルおよび本発明に従い精製されたｒＨＡのサンプルは、トリフルオロ酢酸を含有したアセトニトリル勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣによる分析前に脱塩させた。図６ａおよびｂは、本発明のアルブミンおよび従来技術のＨＳＡに関するスペクトルを各々示している。後者はブロックされた遊離チオールおよびＮ末端分解を表したピークを示す。
【０１５１】
本発明のアルブミンはこのアッセイで実質的に均質であることがわかり、換言すればそれは約６６４４１Ｄａの質量で生じる単一の明確なピークを示す。
【０１５２】
長期安定性
２年以上、アルブミンの分解は電気泳動法で検出できず、このことはプロテアーゼ活性が存在しないことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】ｒＨＡを生産するために用いられる発酵槽を概略図で示している。
【図２】Ｃ１８ＰＴＨ逆相ＨＰＬＣカラム（Applied Biosystems Inc.）によるＵＶトレースであり、本発明のアルブミン中で低レベルの低分子量混入物質を示している。
【図３】図２と同様であるが、従来技術のアルブミン中の低分子量混入物質を示している。
【図４】市販アルブミンの脂肪酸含量を示したガスクロマトグラムである。
【図５】図４に相当するが、本発明のアルブミンを示している。
【図６ａ】本発明のアルブミンに関するエレクトロスプレー質量スペクトル分析を示している。
【図６ｂ】従来のアルブミンに関するエレクトロスプレー質量スペクトル分析を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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