【手続補正書】
【提出日】平成19年2月15日(2007.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ＬＸ３と名付けられた Klebsiella 属の細菌単離体。
【請求項２】  ＬＸ２１と名付けられた Klebsiella 属の細菌単離体。
【請求項３】  配列番号２のアミノ酸配列を含む Klebsiella イソマルツロース・シンターゼ（ＫＩＳ）をコードしている、核酸。
【請求項４】  配列番号２のアミノ酸配列を含む Klebsiella イソマルツロース・シンターゼ。
【請求項５】  配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項３の核酸。
【請求項６】  配列番号１のヌクレオチド配列２１４から２００７を含む、請求項３の核酸。
【請求項７】  発現ベクターが原核および真核細胞で増殖する、請求項３の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】  請求項７の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞。
【請求項９】  植物中でイソマルツロースを産生するための方法であって、該植物の細胞中に、スクロースをイソマルツロースに転換する酵素をコードする核酸を、該細胞が該核酸配列を発現し得るように、導入することを含む方法。
【請求項１０】  核酸が配列番号２のアミノ酸配列を含む Klebsiellaイソマルツロース・シンターゼ（ＫＩＳ）をコードしている、請求項９の方法。
【請求項１１】  核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】  核酸が配列番号１のヌクレオチド２１４から２００７を含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】  核酸が膜接着ドメインコード配列の組み込みを有する、配列番号２のアミノ酸配列を含む Klebsiella イソマルツロース・シンターゼ（ＫＩＳ）をコードしている核酸を含む、請求項９の方法。
【請求項１４】  核酸が、シグナルペプチドをコードしている核酸に３’で融合された配列番号２のアミノ酸配列を含む Klebsiella イソマルツロース・シンターゼ（ＫＩＳ）をコードしている核酸を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１５】  シグナルペプチドが、液胞標的シグナルペプチドである、請求項１４の方法。
【請求項１６】  核酸がシグナルペプチドをコードする核酸に３’で融合される、請求項１２の方法。
【請求項１７】  植物がサトウキビ、トウモロコシ、スイカ、サトウダイコンよりなる群から選択される、請求項９の方法。
【請求項１８】  請求項３の核酸を単離する機能的なクローニング法であって、
下記の工程：
（ａ）適当な宿主生物中にイソマルツロースのバイオ合成活性を有するタンパク質をコードする核酸を含有するドナー生物からクローンの遺伝子バンクをつくること、
（ｂ）所望のクローンを遺伝子バンクから、その還元糖含量の増加によりスクリーニングすること、
（ｃ）イソマルツロース・バイオ合成活性を有するタンパク質をコードする核酸を含有するクローンを単離すること、
を含む方法。
【請求項１９】  E. coli が宿主生物である、請求項１８の方法。
【請求項２０】  遺伝子バンクをつくり、クローンをスクリーニングし、クローンを単離する工程を、有意の量の還元糖を産生しない E. coli 株において行う、請求項１９の方法。
【請求項２１】  シグナルペプチドをコードする核酸に３’で融合された、請求項６の核酸を含む、核酸。
【請求項２２】  シグナルペプチドが液胞標的シグナルペプチドである、請求項１６の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
図６（Ａ）は、Klebsiella singaporensis のKIS遺伝子のヌクレオチド配列である。上流およびターミネーター領域のＤＮＡ配列を太文字で、ＯＲＦ中のＤＮＡ配列を通常の字体で表す。推定のリボソーム結合部位（ＳＤ）に下線を引く。上流における推定スクロース誘発領域に二重下線を引く。ヘリックス−ループ−ヘリックス結合部位に相同の配列を箱に囲む。太字は下流における因子非依存性終了部位を表す。図６（Ｂ）は、KISタンパク質の推定アミノ酸配列を示す。推定スクロース結合部位に下線を引く。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明のイソマルツロース・シンターゼは、細菌、植物、哺乳動物、昆虫、真菌の細胞などいかなる細胞においても発現せしめ得る。本発明は、KISを発現するために形質転換された真核細胞および原核細胞を含む。ひとつの好ましい実施態様において、E. coli などの細菌の細胞中に通常の方法で入れ、その中でKIS酵素を発現せしめる。このような形質転換細菌細胞を使用して、発酵培養物中にイソマルツロースをつくり得る。他の好ましい実施態様において、kis遺伝子を植物細胞中に入れる。このような形質転換植物を用いて、培養物中にイソマルツロースをつくる。あるいは、組織中でkis遺伝子を発現するトランスジェニック植物中に通常の方法により再生せしめ、スクロースの転換によるイソマルツロースの産生に導く。このような植物は、イソマルツロースを多く含む。この実施態様における好ましい植物は、サトウキビ、トウモロコシ、スイカ、サトウダイコンである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
他の実施態様において、kis遺伝子をシグナルペプチド配列に融合せしめる。シグナルペプチドは、発現ペプチドを特定の局所細胞に標的化する。この細胞は、例えば液胞（Bednarek and Raikhel, 1991; Matsuoka and Nakamura, 1991)、葉緑体（Van den Broeck et al., 1985)、小胞体（Borisjuk et al., 1999)、細胞膜（Okamoto et al., 1991) である。好ましい実施態様において、kis遺伝子を液胞−標的シグナルペプチド配列に融合する。別の実施態様において、kis遺伝子を膜接着ドメインコード配列に結合せしめる。この配列は酵素の安定性に重要である（Hu et al., 1993; Okamoto et al., 1991)。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
薄層クロマトグラフィーによってイソマルツロースを導入する細菌の検出: 還元糖がＤＮＳ方法によって検出し得る培養物の上清(０.５μｌ)を、ＴＬＣプレート(Silica Gel on polyester for general-purpose, Aldrich)上にスポットし、展開した。この溶媒系はエチルアセテート−酢酸−水(４:３:０.８、重量)である。スポットをジフェニルアミン−アニリン-リン酸試薬 (Schwimmer and Bevenue, 1956)で、８０℃、５分間で視覚化した。イソマルツロースの存在は典型的な黄緑色スポットによって示される。Sigmaからのイソマルツロースを標準的対照として使用した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
物理学的および生物化学的特性を表２に示した。２つの株は、カタラーゼおよびウレアーゼ活性を示すが、オキシダーゼ活性、硝酸還元酵素およびリパーゼ活性を示さなかった。両株は、ゼラチン、デンプンおよびセルロースを加水分解し得ない。株ＬＸ３は、カゼインを加水分解し得なかった。ＬＸ２１はカゼインを分解し得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
Ｖoges-Ｐroskauer試験は陽性であったが、メチル・レッド反応は陰性であった。ＬＸ３およびＬＸ２１は通性嫌気性であり、被膜を持っていた。両者は、唯一の炭素源としてクエン酸塩およびグルコースを使用することが可能であり、グルコース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、フラクトース、マンニトール、グリセロール、イノシトール、マンノース、ガラクトースおよびソルビトールを包含する全ての試験した炭素源から酸およびガスを産生する。窒素源、例えば、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、ビーフ抽出物、カゼイン加水分解物、ＫＮＯ３、(ＮＨ４)２ＳＯ４などは、単離株の増殖を補佐し得たが、しかし、尿素は役に立たなかった。単離株の増殖要因の要件は特になかった。
【表２】
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【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
グラム陰性、通性嫌気性であり、端が円い直線棒状である。非運動性で被膜がある。内生胞子を形成しない。細胞は、０.６-０.８μmの直径、０.９-２.０μm長さの範囲であり、単一、時には対をなす。コロニーは、スクロース寒天プレートで培養した場合、環状、滑らかな、クッション状、全線で、不透明、白色で粘性である。カタラーゼおよびウレアーゼを産生し、オキシダーゼおよびリパーゼを産生しない。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６Ａ】
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【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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