(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチドのナノポア配列決定のための光学に基づく方法であって、（ｉ）ポリヌクレオチドをナノポアのボアを通してあるトランスロケーション速度でトランスロケーションさせるステップであって、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、自由溶液中でヌクレオチドの蛍光標識が実質的に消光されるように蛍光標識で標識され、検出可能な蛍光シグナルが実質的にそこで発生しないようにボア内の蛍光標識が拘束される、ステップと；（ｉｉ）ナノポアを出て、先行する相互消光蛍光標識または消光剤で消光する前に、各ヌクレオチドの蛍光標識を励起するステップと；（ｉｉｉ）ナノポアを出る蛍光標識によって発生した蛍光シグナルを測定するステップであって、測定された蛍光シグナルが実質的に単一の蛍光標識からの蛍光を含むようにトランスロケーション速度が選択される、ステップとを含む方法を対象とする。
2019528776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
ポリヌクレオチドをナノポアのボアを通してあるトランスロケーション速度でトランスロケーションさせるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、自由溶液中でヌクレオチドの蛍光標識が実質的に消光されるように蛍光標識で標識され、かつ検出可能な蛍光シグナルが実質的に前記ボアで発生しないように前記ボア内の蛍光標識が拘束される、ステップと；
前記ナノポアを出て、先行する相互消光蛍光標識または消光剤で消光する前に、各ヌクレオチドの前記蛍光標識を励起するステップと；
前記ナノポアを出る蛍光標識によって発生した蛍光シグナルを測定するステップであって、前記測定された蛍光シグナルが実質的に単一の蛍光標識からの蛍光を含むように前記トランスロケーション速度が選択される、ステップと；
測定された蛍光シグナルの配列から前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記トランスロケーションさせるステップが粘度を有する反応緩衝液中で行われ、かつ前記トランスロケーション速度が前記反応緩衝液の前記粘度を調整することにより選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粘度が、前記反応緩衝液中のグリセロールの濃度百分率によって調整される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスロケーションさせるステップがイオン濃度を有する反応緩衝液中で行われ、かつ前記トランスロケーション速度が前記反応緩衝液の前記イオン濃度を調整することにより選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
ポリヌクレオチドをナノポアのボアを通してあるトランスロケーション速度でトランスロケーションさせるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、自由溶液中でヌクレオチドの蛍光標識が実質的に消光されるように蛍光標識で標識され、かつ検出可能な蛍光シグナルが実質的に前記ボアで発生しないように前記ボア内の蛍光標識が拘束される、ステップと；
前記ナノポアを出て、先行する相互消光蛍光標識または消光剤で消光する前に、各ヌクレオチドの前記蛍光標識を励起するステップと；
前記ナノポアを出る蛍光標識によって発生した蛍光シグナルを測定するステップであって、出て行くヌクレオチドの蛍光標識が前記ナノポアからヌクレオチド間距離を超えて進む前に消光されるように前記トランスロケーション速度が選択される、ステップと；
測定された蛍光シグナルの配列から前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項６】
前記測定するステップが、複数の光学的検出チャネル間に分布した蛍光強度の相対値に基づいて前記トランスロケーション速度を選択することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の光学的検出チャネルが、各蛍光標識の最大発光のための少なくとも１つのチャネルを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）あるトランスロケーション速度でナノポアを通して一本鎖ポリヌクレオチドをトランスロケーションさせるステップであって、前記一本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、隣接するヌクレオチドの蛍光標識が自由溶液中で消光状態になるように蛍光標識で標識され、かつ前記ナノポアが、前記ナノポア内の前記蛍光標識を強制的に拘束状態にして、検出可能なシグナルが実質的に発生しない、ステップと；
（ｂ）前記ナノポアを出て、隣接するヌクレオチドと消光状態を形成する前に、ヌクレオチドの前記蛍光標識を励起するステップと；
（ｃ）前記ナノポアを出る前記蛍光標識によって発生した蛍光シグナルを測定し、前記測定された蛍光シグナルから、単一の蛍光標識が前記測定された蛍光シグナルに寄与するか、または複数の蛍光標識が前記測定された蛍光シグナルに寄与するかを各ナノポアで決定するステップと；
（ｄ）前記測定された蛍光シグナルが複数の蛍光標識によって発生するときはいつでも、前記トランスロケーション速度を所定の値だけ減少させるステップと；
（ｅ）前記トランスロケーション速度が実質的に単一の蛍光標識からの蛍光を含む実質的にあらゆる測定された蛍光シグナルに対応するまでステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップと；  
（ｆ）測定された蛍光シグナルから前記トランスロケーションするポリヌクレオチドのヌクレオチドを同定するステップと
を含む、方法。
【請求項９】
前記減少させるステップが、前記ナノポアを横切る電圧電位を低下させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、ＦＲＥＴ対の第２のメンバーで標識され、各第２のメンバーは、それが結合しているヌクレオチドを示すＦＲＥＴシグナルを生成し、かつ前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、前記ナノポアに隣接して位置する前記ＦＲＥＴ対の第１のメンバーの側を、各第２のメンバーが前記ナノポアを出たときに前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーのＦＲＥＴ距離内を通過するように順番に通過し；そして
前記励起するステップが、前記ＦＲＥＴ距離内で前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが起きるように前記第１のメンバーを第１の波長の励起エネルギーに曝露して、前記ナノポアを出るヌクレオチドを示す第２の波長のＦＲＥＴシグナルを発生することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノポアが固相膜内に配置され、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが前記ナノポアに隣接して前記固相膜に結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノポアがタンパク質ナノポアであり、前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが前記タンパク質ナノポアに結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーがドナーであり、前記ＦＲＥＴ対の前記第２のメンバーがアクセプターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ドナーが量子ドットである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アクセプターが蛍光有機色素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
ポリヌクレオチドをナノポアのボアを通してあるトランスロケーション速度でトランスロケーションさせるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、自由溶液中で隣接するヌクレオチドの蛍光標識が実質的に消光されるように蛍光標識で標識され、かつ検出可能な蛍光シグナルが実質的に前記ボアで発生しないように前記ボア内の蛍光標識が拘束される、ステップと；
前記ナノポアを出て、先行する蛍光標識で消光する前に、各ヌクレオチドの前記蛍光標識を励起するステップと；
前記ナノポアを出る蛍光標識によって発生した蛍光シグナルを測定するステップであって、前記測定された蛍光シグナルが実質的に単一の蛍光標識からの蛍光を含むように前記トランスロケーション速度が選択される、ステップと；
測定された蛍光シグナルの配列から前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、ＦＲＥＴ対の第２のメンバーで標識され、各第２のメンバーは、それが結合しているヌクレオチドを示すＦＲＥＴシグナルを生成し、かつ前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、前記ナノポアに隣接して位置する前記ＦＲＥＴ対の第１のメンバーの側を、各第２のメンバーが前記ナノポアを出たときに前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーのＦＲＥＴ距離内を通過するように順番に通過し；そして
前記励起するステップが、前記ＦＲＥＴ距離内で前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間でＦＲＥＴが起きるように前記第１のメンバーを第１の波長の励起エネルギーに曝露して、前記ナノポアを出るヌクレオチドを示す第２の波長のＦＲＥＴシグナルを発生することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノポアがタンパク質ナノポアであり、かつ前記ＦＲＥＴ対の前記第１のメンバーが前記タンパク質ナノポアに結合したドナーであり、かつ前記ＦＲＥＴ対の前記第２のメンバーがモノマーに結合したアクセプターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ドナーが量子ドットであり、かつ前記アクセプターが相互消光セットから選択される蛍光有機色素である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／４０６，２１０号の優先権の利益を主張し、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｕｂｅｒらは、ナノポアを慎重に選択することによって、トランスロケーションするポリヌクレオチドのフルオロフォア標識ヌクレオチドからの蛍光シグナルを検出不能にさせることができ、ナノポアから出ると検出能を回復し得ることを発見した。この現象は、他の現象；即ち、消光剤、または自由溶液（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で互いに消光する、ポリヌクレオチド上の相互消光蛍光標識の使用と関連して実際に利用され得る。これらの現象の適用は、ナノポアにより課された拘束から解放されたナノポアを出て行くヌクレオチドが、それがナノポアを通過する前のヌクレオチドの蛍光標識による消光の直前のインターバルにわたり、検出可能なシグナルの励起および放出が可能であるポリヌクレオチド配列決定アプローチをもたらす。Ｈｕｂｅｒら、米国特許公開第２０１６／００７６０９１号およびＨｕｂｅｒ、米国特許公開第２０１６／０１２２８１２号。数ある要因の中でもとりわけ、インターバルの持続時間およびトランスロケーション速度が、各シグナル収集サイクルの測定シグナルにいくつの標識が蛍光を寄与し得るかを決定する。
各シグナル収集サイクルの測定された蛍光シグナルが実質的に単一の標識からの蛍光からなるようにこれらのシステムパラメーターを制御することができれば、光学に基づくナノポア配列決定は進歩し、塩基呼び出しは非常に単純化される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１６／００７６０９１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１６／０１２２８１２号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、マイクロ流体デバイスおよび／またはナノ流体デバイスにおける、ポリヌクレオチドなどのポリマーの光学的検出および分析のための方法、キットおよびシステムを対象とする；特に、本発明は、核酸のヌクレオチド配列を決定するためにナノポアを使用する方法およびシステムを含む。
【０００５】
一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法であって、（ａ）ポリヌクレオチドをナノポアのボアを通してあるトランスロケーション速度でトランスロケーションさせるステップであって、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、自由溶液中でヌクレオチドの蛍光標識が実質的に消光されるように蛍光標識で標識され、検出可能な蛍光シグナルが実質的にそこで発生しないようにボア内の蛍光標識が拘束される、ステップと；（ｂ）ナノポアを出て、先行する相互消光蛍光標識または消光剤で消光する前に、各ヌクレオチドの蛍光標識を励起するステップと；（ｃ）ナノポアを出る蛍光標識によって発生した蛍光シグナルを測定するステップであって、測定された蛍光シグナルが実質的に単一の蛍光標識からの蛍光を含むようにトランスロケーション速度が選択される、ステップと；（ｄ）測定された蛍光シグナルの配列からポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む方法を対象とする。
【０００６】
本発明は、多くの実施および適用で例示されており、その一部は、以下におよび明細書の全体にわたって概説される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、異なる速度でナノポアをトランスロケーションする標識ポリヌクレオチド、および異なるトランスロケーション速度が測定された蛍光シグナルに及ぼす影響を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、異なる速度でナノポアをトランスロケーションする標識ポリヌクレオチド、および異なるトランスロケーション速度が測定された蛍光シグナルに及ぼす影響を示す。
【０００８】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、トランスチャンバー、シスチャンバー、ならびにシスチャンバーおよびトランスチャンバーの両方において消光剤を利用する本発明の実施形態を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、トランスチャンバー、シスチャンバー、ならびにシスチャンバーおよびトランスチャンバーの両方において消光剤を利用する本発明の実施形態を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、トランスチャンバー、シスチャンバー、ならびにシスチャンバーおよびトランスチャンバーの両方において消光剤を利用する本発明の実施形態を示す。
【０００９】
【図３】図３は、バックグラウンドまたはＦＲＥＴ励起でのＴＩＲを低減させるための、タンパク質ナノポアおよびナノポアアレイ上の金属層での落射照明を使用する本発明の実施形態を示す。
【００１０】
【図４】図４は、共焦点落射照明システムの基本的な構成要素を示す。
【００１１】
【図５】図５は、ＦＲＥＴシグナル発生を伴わない、ナノポアアレイ内またはナノポアアレイの近傍における光学標識の励起のためのＴＩＲＦシステムの要素を示す。
【００１２】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、２つおよび３つの蛍光標識を使用する実施形態を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、２つおよび３つの蛍光標識を使用する実施形態を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、２つおよび３つの蛍光標識を使用する実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、様々な修正および代替形態を受け得るが、それらの詳細を図面に例として示しており、これより詳細に記述する。しかし、本発明を、記述される特定の実施形態に限定しようとするものではないことを理解すべきである。それどころか、本発明の精神および範囲内に入る全ての修正例、均等物、および代替例を包含するものである。例えば、本発明の特定のナノポアのタイプおよび数、特定の標識、ＦＲＥＴ対、検出スキーム、製作手法は、例示の目的で示される。しかし本開示は、その他のタイプのナノポア、ナノポアのアレイ、およびその他の製作技術を利用して本明細書で論ずるシステムの様々な態様を実現することができるので、この点に限定するものではないことを理解すべきである。本発明の態様に関する指針は、その関連ある部分が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｃａｏ，Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ＆Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｒｅｓｓ，２００４）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＳＰＩＥ  Ｐｒｅｓｓ，２００５）；Ｄｏｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉ，  Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００７）；Ｓａｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５）；Ｂａｒｄ  ａｎｄ  Ｆａｕｌｋｎｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ，２０００）；Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００６）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００８）；などを含む、当業者に周知の多くの入手可能な参考文献および論文に見出される。
【００１４】
一態様では、本発明は、蛍光標識されたポリヌクレオチド分析物のヌクレオチドを順次に同定するためのナノポア、蛍光消光、および蛍光シグナリングの使用に関する。ポリヌクレオチド分析物のそのような分析は、例えば、ナノポアのアレイを使用することによって、単一のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドに対して同時に並行して行うことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに結合している間、以下の少なくとも３つの状態であることが可能である蛍光標識で、ヌクレオチドを標識する：（ｉ）実質的に消光した状態であって、すぐ隣りのモノマー上の蛍光標識によって、または消光剤との相互作用によって結合蛍光標識の蛍光が消光される状態；例えば、本発明に従ったポリヌクレオチドに結合した蛍光標識は、標識されたポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの研究および操作のための従来の水溶液または緩衝液中で遊離しているときに、実質的に消光している。（ｉｉ）立体的に拘束された状態であって、標識されたポリヌクレオチドが、自由溶液の運動または結合した蛍光標識のアライメントが破壊または限定され、蛍光標識から発生する検出可能な蛍光シグナルがほとんどまたは全くないようにナノポアをトランスロケーションしている状態。（ｉｉｉ）遷移状態であって、蛍光標識のヌクレオチドがナノポアを出て行くときに（「遷移インターバル」または「インターバル」中）、ポリヌクレオチドに結合した蛍光標識が立体的に拘束された状態から消光状態に遷移する状態。部分的には、本発明は、遷移インターバル中に（他の方法で実質的に完全に標識および自己消光されたまたは消光されたポリヌクレオチド上の）蛍光標識が検出可能な蛍光シグナルを発生することができること、および測定されたシグナルに寄与している出て行く標識の数は、標識ポリヌクレオチドのトランスロケーション速度を制御することによって（少なくとも部分的に）制御され得るという発見の適用である。トランスロケーション速度（例えば、１ミリ秒当たりにナノポアを出て行くヌクレオチド）が遷移速度（シグナル可能から消光への、即ち消光速度）より速い場合、測定された蛍光シグナル、またはシグナル試料は、２つ以上の標識からの寄与を含み得る。この状況はシグナル分析をより困難にし、配列決定はおそらくより不正確となる。一部の実施形態によれば、この問題は、実質的に一度に１つの蛍光標識のみが測定された蛍光シグナルに蛍光を寄与するようにトランスロケーション速度を調整することによって、例えばトランスロケーション速度を低下させることによって改善され得る。
【００１５】
この発見の根底にある理論によって制限されることを意図しないが、遷移インターバル中に発生した蛍光シグナルは、ナノポアから出てくる蛍光標識の１つまたは複数の自由に回転可能な双極子の存在によるものであると考えられ、それにより蛍光標識が、例えば、直接励起後またはＦＲＥＴを介した励起を介して蛍光シグナルを発生することができるようになる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの一本鎖ポリヌクレオチドであるが、特に一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドがナノポアを通ってトランスロケーションするときに蛍光標識が一度に１つずつナノポアを出ることにより発生するシグナルを記録することによってポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。トランスロケーション速度は、測定された蛍光シグナルが実質的に単一の標識のみからの蛍光を含む可能性を最大にするように選択され、そのような選択は、操作中に制御可能なパラメーター（ナノポアを横切る電圧、温度など）のリアルタイム調整または所定の機器設定（例えば、反応緩衝液の粘度、イオン濃度など）によってなされ得る。出て行くときに、結合した各蛍光標識は、ナノポア内の拘束状態から自由溶液中のポリヌクレオチド上の消光状態への遷移インターバル中に遷移する。遷移インターバル中、標識は測定可能な蛍光シグナルを発生することができる。言い換えれば、一部の実施形態では、本発明の方法のステップは、ナノポア内の拘束状態から自由溶液中のポリマー上の消光状態に遷移するときに各蛍光標識を励起するステップを含む。上記のように、この遷移インターバルまたは期間の間に、蛍光標識はそれが結合しているヌクレオチドを示す検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。
【００１６】
一部の実施形態では、上記で使用される「実質的に消光される」とは、蛍光標識が、隣接する相互消光標識がないが同じ条件下で発生するシグナルから少なくとも３０パーセント減少した蛍光シグナルを発生することを意味する。一部の実施形態では、上記で使用される「実質的に消光される」とは、蛍光標識が、隣接する相互消光標識がないが同じ条件下で発生するシグナルから少なくとも５０パーセント減少した蛍光シグナルを発生することを意味する。
【００１７】
上記の概念は、ナノポア（１００２）を通ってトランスロケーションする標識ポリヌクレオチド（１０００）を概略的に示す図１Ａ〜１Ｂに示される。標識ポリヌクレオチド（１０００）は、２つの標識「ａ」および「ｂ」を含む（例えば、ｄＣが「ａ」で標識され、ｄＡ、ｄＧおよびｄＴが「ｂ」で標識されていることなどに対応し得る）。ナノポア（１００２）から遊離しているヌクレオチドの標識は、他の標識との相互作用（１０１１）または消光剤の作用（示さず）のいずれかによって消光される。ナノポア（１００２）内部のヌクレオチドの標識は、ナノポアを通る全てまたは一部の通過の間に検出可能なシグナルを生成しないように拘束および／または配向（１０１４）される。標識ポリヌクレオチド（１０００）のヌクレオチドがナノポア（１００２）の出口（１０１５）から現れると、それらは励起ビーム（１０１０）によって励起され、消光される前のインターバルにわたり検出可能なシグナルを発生することが可能になる。トランスロケーション速度Ｖ１が速い場合、消光前にヌクレオチドが進んだ距離（１００８）は、ポリヌクレオチド（１０００）のヌクレオチド間距離を超える可能性があり、２つ以上の標識（図１Ａに示す）が検出器（１０１８）によって収集された蛍光シグナル、即ち測定された蛍光シグナルに蛍光を寄与する。トランスロケーション速度Ｖ２が遅い場合、消光前にヌクレオチドが進んだ距離（１００８）は、ポリヌクレオチド（１０００）のヌクレオチド間距離にほぼ等しいかそれより小さくなり得るので、１つ以下の標識（図１Ｂに示す）が検出器（１０１８）によって収集された蛍光シグナル、即ち測定された蛍光シグナルに蛍光を寄与する。隣接する標識間の距離は励起光（１０１０）の回折限界を下回るので、標識の順序に関する情報は得られないが、特殊なアルゴリズムを使用してそのような情報を推測するためのアプローチがある；例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国仮特許出願第６２／３２２３４３号；Ｔｉｍｐら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．、１０２巻：Ｌ３７−Ｌ３９頁（２０１２年）；Ｃａｒｓｏｎら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６巻：０７４００４頁（２０１５年）。明瞭な発光帯（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｂａｎｄ）を有する蛍光標識を使用する光学的検出の場合、測定された蛍光シグナルは、例えば、複数の標識からの蛍光の相対的寄与を評価するために、バンドパスフィルターを使用して、２つまたはそれよりも多いチャネルに分離され得る。しかしながら、蛍光を寄与する蛍光標識の数が、例えば３、４、またはそれよりも多く増加するにつれて、ヌクレオチドの正しい順序を決定することの困難さが増す。例えば２つの蛍光標識の最大発光に対応する、２つのチャネルのシグナル強度は、２つの蛍光標識が１つの測定シグナルに寄与する図１Ａ（１０３１および１０３２）および単一の蛍光標識が１つの測定シグナルに寄与する図１Ｂ（１０４１および１０４２）に例示されている。実線で表された強度値、例えば１０３３は、標識「ａ」からのものであり、破線で表された強度値、例えば１０３６は、は標識「ｂ」からのものである。図１Ａの両チャネルにおける実線および破線の存在は、蛍光標識の重なり合う発光帯を反映しており、測定さ��た強度の量は両方の標識からのものであるため、共に集めると分析が複雑になる。単一の蛍光標識のみが測定シグナルに寄与する図１Ｂにおいて、強度値は他の標識の発光帯の重なり合いによる寄与を含まず、それによって標識（したがってヌクレオチド）の決定をより容易にする。
【００１８】
トランスロケーション速度の制御
ナノポアを通るポリヌクレオチドのトランスロケーション速度の役割およびその制御の必要性は、トランスロケーションする分析物を同定するために電流の変化が使用されるナノポア技術の分野において認識されている。顕著な困難を伴わずにリアルタイムで調整することができる方法（例えば、ナノポアを横切る電圧電位、温度など）ならびに困難を伴い操作中にのみ調整することができる方法（反応緩衝液の粘度、タンパク質ナノポアのボア内の荷電側鎖の有無、反応緩衝液のイオン組成および濃度、ポリヌクレオチド分析物に結合またはハイブリダイズした速度遅延基、分子モーターなど）の両方を含む多種多様な方法が、トランスロケーション速度を制御するために使用されている。例えば、Ｂａｔｅｓら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．、８４巻：２３６６〜２３７２頁（２００３年）；Ｃａｒｓｏｎら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６巻（７号）：０７４００４頁（２０１５年）；Ｙｅｈら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、３３巻（２３号）：５８〜６５頁（２０１２年）；Ｍｅｌｌｅｒ、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｏｎｄ．  Ｍａｔｔｅｒ、１５巻：Ｒ５８１〜Ｒ６０７頁（２００３年）；Ｌｕａｎら、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ、４巻（４号）：１０６８〜１０７７頁（２０１２年）；Ｋｅｙｓｅｒ、Ｊ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、８巻：１３６９〜１３７８頁（２０１１年）などで、これらは参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本発明の方法が実行されている間にトランスロケーション速度を能動的に制御するための、例えば、電圧電位、温度など、１つまたは複数のステップが含まれる；他の実施形態では、本発明の方法が実行されている間に能動的に制御または変更されない、例えば、反応緩衝液の粘度、イオン濃度など、トランスロケーション速度を決定する１つまたは複数のステップが含まれる。後者に関して、一部の実施形態では、トランスロケーション速度は、１〜６０パーセントの範囲の濃度のグリセロールまたは同等の試薬を有する反応緩衝液を提供することによって選択される。
【００１９】
（リアルタイムのトランスロケーション速度調整を用いた）以前の実施形態に関して、１つまたは２つ以上の標識が測定シグナルに蛍光を与えているかどうかの尺度は、蛍光が収集される複数のチャネル間の蛍光強度の分布に基づき得る。典型的には、複数のチャネルは、典型的には、例えば異なる種類のヌクレオチドを標識するために使用される蛍光標識の発光帯に対応する２、３、または４つのチャネルを含む。ナノポアの出口に隣接する領域から発する蛍光の測定試料において、単一の標識のみが測定シグナルに寄与する場合、異なるチャネル（例えば４つのチャネル）間のシグナル強度の相対分布は理想的には（１，０，０，０）；（０，１，０，０）；（０，０，１，０）または（０，０，０，１）のように表すことができる。一方、測定された蛍光シグナルに２つ以上の標識が寄与している場合、相対分布には２つ以上のチャネルでゼロ以外の値が含まれ、最悪の場合は４つの異なる標識が等しく寄与し、上記の表現で（．２５，．２５，．２５，．２５）のように見えるであろう。相対強度分布（１，０，０，０）；（０，１，０，０）；（０，０，１，０）または（０，０，０，１）に対応する最大値と相対強度分布（．２５，．２５，．２５，．２５）に対応する最小値の間で単調に変化する尺度をリアルタイムトランスロケーション速度の制御に使用することができる。例えば、初期トランスロケーション速度は、その最小値に近いそのような尺度の値に基づいて低下させることができる。そのような低下は、例えば、ナノポアを横切る電位電圧を所定量を低下させることによって実行することができ、その後、尺度を再計算することができる。そのようなステップは、例えば、収集されたシグナルが単一の標識のみから発せられる測定値の割合を最大とするようにプロセスが最適化されるまで繰り返すことができる。
【００２０】
上述のように、トランスロケーション速度は、ナノポアを横切る電圧差（または電界強度）およびポリヌクレオチドがナノポアに曝される（例えば、第１のチャンバーの１つの壁を構成する固相膜に配置される）第１のチャンバーの反応混合物または緩衝液中の条件に部分的に依存する。ナノポアによるポリヌクレオチド捕捉率はそのようなポリヌクレオチドの濃度に依存する。一部の実施形態では、例えば１Ｍ  ＫＣｌ（またはＮａＣｌ、ＬｉＣｌなどの等価塩）および（例えば、使用されているタンパク質、例えばタンパク質ナノポア、ヌクレアーゼなどが変性していないことを保証する）ｐＨ緩衝系のような、ナノポア配列決定のための従来の反応混合物条件を（ナノポアを横切る電圧電位を変えることによってトランスロケーション速度を制御するため）本発明に利用することができる。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝系を使用してｐＨを６．８から８．８の範囲の値に実質的に一定に保つことができる。一部の実施形態では、ナノポアを横切る電圧差は、７０から２００ｍＶの範囲内であり得る。他の実施形態では、ナノポアを横切る電圧差は、８０から１５０ｍＶの範囲内であり得る。操作に適した電圧は、従来の測定技術を用いて選択され得る。ナノポアを横切る電流（または電圧）は市販の機器を用いて容易に測定することができる。トランスロケーション速度が所望の範囲内になるように電圧差を選択することができる。一部の実施形態では、トランスロケーション速度の範囲は、毎秒１０００ヌクレオチド未満の速度を含む。他の実施形態では、トランスロケーション速度の範囲は毎秒１０から８００ヌクレオチドである；他の実施形態では、トランスロケーション速度の範囲は毎秒１０から６００ヌクレオチドである；他の実施形態では、トランスロケーション速度の範囲は毎秒２００から８００ヌクレオチドである；他の実施形態では、トランスロケーション速度の範囲は毎秒２００から５００ヌクレオチドである。同様に、トランスロケーション速度に影響を与える他の要因、例えば、温度、粘度、イオン濃度、タンパク質ナノポアのボア内の荷電側鎖などを選択して、上述の範囲のトランスロケーション速度を得ることができる。
【００２１】
一部の実施形態では、一本鎖核酸について上記の方法を実行するためのデバイスは、典型的には、ナノポア（アレイを構成し得る）を横切る電場を確立するための一組の電極を提供することを含む。一本鎖核酸は、チャンバー内に陰極を配置することによって層状膜の「シス」側として構成されている第１のチャンバー内の電解質（即ち反応緩衝液）内に配置することによって、ナノポアに曝される。電場を印加すると、負の一本鎖核酸がナノポアによって捕捉され、チャンバー内に陽極を配置することによって膜の「トランス」側として構成される層状膜の反対側の第２のチャンバーにトランスロケーションする。上述のように、トランスロケーション速度は、第１および第２のチャンバー内の電解質のイオン強度およびナノポアを横切る印加電圧に部分的に依存する。光学的検出では、トランスロケーション速度は、例えば、異なる電圧に対してナノポア当たり異なる予測速度でシグナルを発生する標識一本鎖核酸の所定の標準を用いて、予備較正測定によって選択することができる。したがって、ＤＮＡ配列決定適用のためには、そのような較正測定からのシグナル速度、ならびに上に述べた相対シグナル強度分布に基づく尺度に基づいて初期トランスロケーション速度を選択することができる。その結果、そのような測定から、例えばナノポアのアレイにわたって信頼性のあるヌクレオチド同定を可能にする、または最大にするような電圧を選択することができる。一部の実施形態では、そのような較正は、分析されるテンプレートの試料からの核酸を使用して（所定の標準配列の代わりに、またはそれに加えて）行われ得る。一部の実施形態では、そのような較正は、配列決定試行中にリアルタイムで実行することができ、印加電圧はそのような測定に基づいて、例えばヌクレオチド特異的シグナルの取得を最大にするためにリアルタイムで修正することができる。
【００２２】
相互消光標識および自己消光標識を用いる実施形態
上述のように、一部の実施形態では、ナノポアを出るヌクレオチド上の標識からの発光以外の蛍光の放出を低減するために、消光剤に加えて自己消光および相互消光蛍光標識を使用することができる。そのような蛍光標識の使用は、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０１２２８１２号に開示されている。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドに結合している間に少なくとも３つの状態であることが可能な蛍光標識で、モノマーを標識する：（ｉ）実質的に消光した状態であって、結合した蛍光標識の蛍光が、すぐ隣りのモノマーの蛍光標識消光した状態；例えば、本発明によるポリヌクレオチドに結合した蛍光標識は、標識されたポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドを研究し、操作するための従来の水溶液中で遊離しているとき、実質的に消光している。（ｉｉ）立体的に拘束された状態であって、自由溶液の運動または結合した蛍光標識のアライメントが破壊されまたは限定されて、蛍光標識から発生する検出可能な蛍光シグナルがほとんどまたは全くなくなるように、標識されたポリヌクレオチドが、ナノポアをトランスロケーションしている状態。（ｉｉｉ）遷移状態であって、ポリヌクレオチドがナノポアをトランスロケーションしながら、蛍光標識がナノポアから出て行くときに（「遷移インターバル」中）、ポリヌクレオチドに結合した蛍光標識が、立体的に拘束された状態から消光状態に遷移する状態。
【００２３】
一部では、この例は、遷移インターバル中に、通常は蛍光標識（そうでなければ実質的に完全に標識され自己消光するポリヌクレオチド上の）が検出可能な蛍光シグナルを発生することが可能であるという発見の適用である。この発見を裏付けるいかなる理論にも限定するものではないが、遷移インターバルの間に発生した蛍光シグナルは、自由に回転可能な双極子起因すると考えられる。この発見を裏付けるいかなる理論にも限定するものではないが、遷移インターバルの間に発生した蛍光シグナルは、ナノポアから出現する、蛍光標識中の自由に回転可能な双極子の存在に起因すると考えられ、そのため蛍光標識は、例えば直接励起後に、またはＦＲＥＴを介する励起を介して蛍光シグナルを発生させることが一時的に可能になる。立体的拘束された状態ならびに消光状態では、共に、双極子はその回転自由度が限定され、それによって、放出される光子の数が低減しまたは限定される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドがポリヌクレオチドであり、通常は一本鎖ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであるが、特に一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドがナノポアを通ってトランスロケーションするときに、結合した蛍光標識が１つずつナノポアから出て行くとき、その蛍光標識により発生したシグナルを記録することによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。出る際に、結合した蛍光標識のそれぞれは、ナノポアにおける拘束状態から、自由溶液中のポリヌクレオチドでの消光状態へと、遷移インターバルの間に遷移する。言い換えれば、一部の実施形態では、本発明の方法のステップは、ナノポア中の拘束状態から自由溶液中のポリヌクレオチド上での消光状態へと遷移するときに、各蛍光標識を励起することを含む。上述のように、この遷移インターバルまたは期間の間に、蛍光標識は、それが結合するヌクレオチドを示す、検出可能な蛍光シグナルを放出することが可能である。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドがナノポアを通ってトランスロケーションする間に、モノマーに結合した蛍光標識を強制的に拘束状態にして、蛍光標識が検出可能な蛍光シグナルを生成することができなくなる（または実質的にできなくなる）ように、蛍光標識およびナノポアを選択することができる、という発見の適用を含む。一部の実施形態では、ナノポアは、直径が１から４ｎｍの範囲にあるボアまたは管腔を有するように選択され；他の実施形態では、ナノポアは、直径が２から３ｎｍの範囲にあるボアまたは管腔を有するものが選択される。一部の実施形態では、そのようなボアの直径は、タンパク質ナノポアによって提供される。一部の実施形態では、そのようなナノポアは、本発明に従って、蛍光標識を強制的に拘束状態にするために使用され、したがって蛍光標識がナノポアから出るときはいつでも、蛍光シグナルを実質的に発生させることができない状態から、放出を誘発させることができる蛍光シグナルによって検出可能で識別可能な状態へと遷移する。このように、ポリヌクレオチドのモノマーの配列のそれぞれに結合した蛍光標識は、ナノポアの出口のすぐ隣りに隣接する領域で（「遷移ゾーン」または「遷移容積」または「検出ゾーン」）蛍光シグナルを突然発生させるので、逐次検出することができる。一部の実施形態では、有機蛍光色素を、上記直径のナノポアとともに蛍光標識として使用する。一部の実施形態では、少なくとも１つのそのような有機蛍光色素は、キサンタン色素、ローダミン色素、およびシアニン色素からなる組から選択される。ポリヌクレオチドのモノマー配列を決定するための一部の実施形態は、下記のステップ：（ａ）ナノポアを通ってポリマーをトランスロケーションさせるステップであって、ポリヌクレオチドのモノマーが蛍光標識で標識され、検出可能なシグナルがその中で実質的に発生しないように、ナノポアがそのボア内の蛍光標識を拘束状態に拘束するステップと；（ｂ）ナノポアから出る際、各モノマーの蛍光標識を励起するステップと；（ｃ）検出ゾーンにおいて、出て行く蛍光標識によって発生した蛍光シグナルを測定して、蛍光標識が結合するモノマーを識別するステップと；（ｄ）検出ゾーンの外で励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと：（ｄ）蛍光シグナルの配列からポリヌクレオチドのモノマー配列を決定するステップとで実施される。さらなる実施形態では、蛍光標識はＦＲＥＴ対のアクセプターであり、ＦＲＥＴ対の１つまたは複数のドナーが、出口からＦＲＥＴ距離内のナノポアに結合する。
【００２５】
一部の実施形態では、上記使用される「実質的に消光した」は、蛍光標識が、同じ条件下であるが隣接した互いに消光する標識なくして発生したシグナルから、少なくとも３０パーセント低減した蛍光シグナルを発生させることを意味する。一部の実施形態では、上記使用される「実質的に消光した」は、蛍光標識が、同じ条件下であるが隣接した互いに消光する標識なくして発生したシグナルから、少なくとも５０パーセント低減した蛍光シグナルを発生させることを意味する。
【００２６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４つの個別の反応を実施することによって決定され、これらの反応では、標的ポリヌクレオチドのコピーが、単一蛍光標識で標識された、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）のそれぞれを有する。そのような実施形態の変形例では、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４つの個別の反応を実施することによって決定され、これらの反応では、標的ポリヌクレオチドのコピーが、１つの蛍光標識で標識されたその４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）のそれぞれを有し、それと同時に、同じ標的ポリヌクレオチドのその他のヌクレオチドは第２の蛍光標識で標識される。例えば、第１の蛍光標識が、第１の反応で標的ポリヌクレオチドのＡに結合する場合、第２の蛍光標識は、第１の反応において標的ポリヌクレオチドのＣ、Ｇ、およびＴ（即ち、「非Ａ」ヌクレオチド）に結合する。同様に、この例の続きとして、第２の反応では、第１の標識は、標的ポリヌクレオチドのＣに結合し、第２の蛍光標識は、標的ポリヌクレオチドのＡ、Ｇ、およびＴ（即ち、「非Ｃ」ヌクレオチド）に結合する。以下、ヌクレオチドＧおよびＴについても同様である。
【００２７】
同じ標識スキームは、ヌクレオチド型のサブセットに関する従来の専門用語の観点から表すことができ；したがって上記例において、第１の反応では、第１の蛍光標識がＡに結合し、第２の蛍光標識がＢに結合し；第２の反応では、第１の蛍光標識がＣに結合し、第２の蛍光標識がＤに結合し；第３の反応では、第１の蛍光標識がＧに結合し、第２の蛍光標識がＨに結合し；第４の反応では、第１の蛍光標識がＴに結合し、第２の蛍光標識がＶに結合する。
【００２８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはペプチドなどのポリマーを、単一の種類のモノマーに結合させた単一蛍光標識で標識し、例えば、ポリヌクレオチドの全てのＴ（または実質的に全てのＴ）が、蛍光標識、例えばシアニン色素で標識される。そのような実施形態では、ポリヌクレオチドからの蛍光シグナルの収集または配列が、特定のポリヌクレオチドに関するシグネチャーまたはフィンガープリントを形成し得る。一部のそのような実施形態では、そのようなフィンガープリントは、決定されるべきモノマーの配列に関する十分な情報を提供してもしなくてもよい。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明の特徴は、互いに消光する組のメンバーである蛍光色素または標識による、ポリヌクレオチド分析物の実質的に全てのモノマーの標識付けである。ポリヌクレオチド分析物の標識付けに関連する「実質的に全ての」という用語の使用は、化学的および酵素標識技法が典型的には１００パーセント未満で効率的であることを認めることである。一部の実施形態では、「実質的に全ての」は、全てのモノマーの少なくとも８０パーセントに蛍光標識が結合していることを意味する。他の実施形態では、「実質的に全ての」は、全てのモノマーの少なくとも９０パーセントに蛍光標識が結合していることを意味する。他の実施形態では、「実質的に全ての」は、全てのモノマーの少なくとも９５パーセントに蛍光標識が結合していることを意味する。相互に消光する組の蛍光色素には、以下の性質がある：（ｉ）各メンバーは、全てのメンバーの蛍光を消光し（例えば、ＦＲＥＴによってまたは静止もしくは接触機構によって）、（ｉｉ）各メンバーは、励起したとき、および非消光状態にあるときに、明確な蛍光シグナルを発生する。即ち、互いに消光する組が２種の色素、Ｄ１およびＤ２からなる場合、（ｉ）Ｄ１は自己消光し（例えば、別のＤ１分子と接触消光することによって）、またＤ２によって消光し（例えば、接触消光によって）、（ｉｉ）Ｄ２は自己消光し（例えば、別のＤ２分子との接触消光によって）、またＤ１によって消光する（例えば、接触消光によって）。互いに消光する組に関して蛍光色素または標識を選択するための指針は、参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に見出すことができる：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３５巻：１７〜２９頁（２００６年）；およびＭａｒｒａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０巻：ｅ１２２（２００２年）など。一部の実施形態では、互いに消光する組のメンバーは、芳香環構造などの、相互作用を積み重ねることが可能な成分または部分である有機蛍光色素を含む。例示的な互いに消光する組の蛍光色素または標識は、ローダミン色素、フルオレセイン色素、およびシアニン色素から選択され得る。一実施形態では、互いに消光する組は、ローダミン色素、ＴＡＭＲＡ、およびフルオレセイン色素、ＦＡＭを含んでいてもよい。別の実施形態では、互いに消光する組の蛍光色素は、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＥＸ、フルオレセインイソチオシアネート、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、１つまたは複数のＢＯＤＩＰＹ色素、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、および１つまたは複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒからなる群から２種またはそれ超の色素を選択することによって形成されてもよい。代表的なＢＯＤＩＰＹ色素には、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、およびＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５が含まれる。代表的なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒには、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０、および７９０が含まれる。
【００３０】
上述のように、一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのモノマー配列は、標的ポリヌクレオチドのコピーが互いに、または自己消光する蛍光標識で標識された異なる種類のモノマーをそれぞれ有する、個別の反応を実施することによって決定される（それぞれの種類のモノマーごとに１つ）。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのモノマー配列は、標的ポリヌクレオチドのコピーが、同じ互いに消光する組から選択される、異なる互いに消光する蛍光標識で標識された異なる種類のモノマーのそれぞれを有する、個別の反応を実施することによって決定される（それぞれの種類のモノマーごとに１つ）。互いに消光する組が２種の色素のみを含む実施形態では、選択されたモノマー（即ち、モノマーＸ）は、第１の相互消光色素で標識され、他の全ての種類のモノマー（即ち、非モノマーＸ）は、同じ組からの第２の互いに消光する色素で標識される。このように、実施形態のステップは、一連の２つの異なる蛍光シグナル、モノマーＸを示すシグナルと、非モノマーＸを示す別のシグナルを発生させる。
【００３１】
一部の実施形態では、単一蛍光標識（例えば、多数の種類のモノマーを含むポリヌクレオチド中の、単一の種類のモノマーに結合させた）は、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドなど、ポリヌクレオチド上の隣接するモノマー（同じ種類の）に結合させたときに自己消光するものが使用されてもよい。例示的な自己消光蛍光標識には、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、フルオレセイン−ＥＸ、ＦＩＴＣ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹＳ、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄであって、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１１版（２０１０年）に開示されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
消光剤を利用する実施形態
図２Ａ〜２Ｃは、消光剤がナノポアデバイスに適用される場合に対応する本発明の異なる実施形態を示す図である：トランスチャンバーのみ（図２Ａ）、シスチャンバーのみ（図２Ｂ）、またはシスチャンバーとトランスチャンバーの両方（図２Ｃ）。図２Ａにおいて、標識ポリヌクレオチド（２００）が、シスチャンバー（２０２）からトランスチャンバー（２０４）へ固相膜（２０８）のナノポア（２０６）をトランスロケーションすることが示されている。トランスチャンバー（２０４）に浸漬されているのは、「Ｑ」で示される非蛍光消光剤（２０５）である。本発明の消光剤は、標識ポリヌクレオチド（２００）のトランスロケーション条件下で可溶性であり、そして同じ条件下で、消光剤は、実質的な配列特異性なく（２００）のような一本鎖ポリヌクレオチドに結合する。以下でより十分に説明されるように、非対称シアニン色素などの多くの周知の有機色素の誘導体、ならびにそのような化合物とオリゴヌクレオチドおよび／またはその類似体とのコンジュゲートを含む、多種多様な非蛍光消光剤が本発明での使用に利用可能である。この実施形態では、消光剤の種類および濃度ならびにトランスロケーション速度の選択が検出ゾーン（２１０）を画定する。一部の実施形態では、「検出ゾーン」は、蛍光シグナルが収集されて生データを形成する領域または容積（これは連続的または非連続的であり得る）を意味し、そこから標識ポリヌクレオチドについての配列情報などの情報が決定される。検出ゾーン（２１０）の外側のトランスチャンバー（２０４）内の蛍光標識は、トランスチャンバー（２０４）内の標識ポリヌクレオチド（２００）の一部に結合した消光剤（２０５）によって実質的に消光される。一部の実施形態では、消光剤は、以下に十分に記載されるように、有機色素に基づいた１つまたは複数の消光部分にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドまたは類似体を含む。図２Ａの実施形態は、例えば、シスチャンバー（２０２）内の蛍光標識が実質的に励起されないように固相膜（２０８）が不透明層であるかまたはそれを含む場合に利用することができる。
【００３３】
図２Ｂは、消光剤（２０５）がシスチャンバー（２０２）内に配置されていることを除いて、図２Ａと実質的に同じ要素を示す。この構成は、望ましくないエバネッセント波または非放射光エネルギーなどがシスチャンバー（２０２）まで広がり、収集される蛍光シグナルを発生する蛍光標識を励起する状況下では望ましい場合がある。シスチャンバー（２０２）内の標識ポリヌクレオチド（２００）に結合する消光剤（２０５）は、そのような蛍光シグナルを低減または排除する。一部の実施形態では、消光剤（２０５）およびナノポア（２０６）の断面は、消光剤（２０５）がナノポア（２０６）を通ってトランスロケーションすることから除外されるように選択される。一部の実施形態では、以下でより完全に記載されるように、これは、タンパク質ナノポアα溶血素およびオリゴヌクレオチドまたはその類似体と１つまたは複数の消光化合物とのコンジュゲートを含む消光剤を使用することによって達成することができる。
【００３４】
図２Ｃは、図２Ａおよび図２Ｂの両方の実施形態について記載した利点を提供する、消光剤（２０５）がシスチャンバー（２０２）とトランスチャンバー（２０４）の両方に存在する実施形態を示す。
【００３５】
図３は、以下の要素を含む実施形態を示す：脂質二重層（３０２）内に配置されたタンパク質ナノポア（３００）；バックグラウンド蛍光を防止または減少させるために固相膜（３０６）中に不透明層（３０８）を有する蛍光標識の落射照明；および、トランスチャンバー（３２６）内に配置された消光剤（３１０）。上記のように、蛍光標識ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド（３２０）（（３２２）と同様に標識は「ｆ」で示される）は、シスチャンバー（３２４）からトランスチャンバー（３２６）へナノポア（３００）を通ってトランスロケーションする。オリゴヌクレオチドクエンチャー（３１０）は、ナノポア（３００）から出てくるポリヌクレオチド（３２０）の部分へのオリゴヌクレオチドクエンチャー（３２８）のハイブリダイゼーションを可能にする条件下（例えば、濃度、温度、塩濃度など）でトランスチャンバー（３２６）に配置される。参照により本明細書に組み込まれるＨｕｂｅｒらの米国特許出願公開第２０１６／００７６０９１号に記載されているように、ナノポアの通過の間に蛍光標識からのシグナルが抑制されるように、ナノポア（３００）を選択され得る。したがって、標識されたヌクレオチドが領域（３２８）においてナノポア（３００）から現れると、これらは抑制されなくなり、シグナルを発生できるようになる。全てでなくとも大部分の直接照明の形態（例えば非ＦＲＥＴ）では、そのような現れた標識は、トランスチャンバー（３２６）内にさらに進む際に蛍光を放出し続け、それにより、収集されたシグナルに大きく寄与する。現れるポリヌクレオチドに結合するトランスチャンバー（３２６）内の消光剤によって、そのような発光は顕著に低減され、検出ゾーン（３２８）を画定して、そこから、収集されたシグナルを分析してポリヌクレオチド（３２０）に関するヌクレオチド配列情報を得ることができる。一部の実施形態では、標識されたポリヌクレオチドが検出ゾーンを通って動く際に、単一の蛍光標識からの蛍光シグナルが検出時間の間に検出ゾーン（３２８）から検出される。他の実施形態では、複数の蛍光シグナルが所定の時間の間に検出ゾーン（３２８）で複数の蛍光標識から収集される。一部の実施形態では、そのような検出時間は、１ミリ秒未満、または０．１ミリ秒未満、または０．０１ミリ秒未満である。一部の実施形態では、そのような検出時間は、少なくとも０．０１ミリ秒、または少なくとも０．１ミリ秒、または少なくとも０．５ミリ秒である。
【００３６】
本発明の消光剤は、ナノポア配列決定の条件下で（ｉ）実質的に非蛍光性であり、（ｉｉ）一本鎖核酸、特に一本鎖ＤＮＡに結合し、（ｉｉｉ）他の分子から非放射的に励起エネルギーを吸収し、これを非放射的に放出する任意の化合物（または化合物の組）を含む。一部の実施形態では、消光剤は一本鎖ＤＮＡに非共有結合でさらに結合する。より完全に以下に記載されるように、これだけに限らないが、シアニンおよびキサンテン色素などの一般的な合成色素の非蛍光性誘導体を含む様々な消光化合物が、本発明とともに使用するために利用可能である。消光化合物の選択のガイダンスは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３２３，３３７号、米国特許第６，７５０，０２４号などの参考文献に見出され得る。
【００３７】
一部の実施形態では、消光剤は、蛍光を消光することが知られている重原子（臭素またはヨウ素など）によって共有結合で修飾された、またはニトロ基もしくはアゾ基などの蛍光を消光することが知られている他の基によって共有結合で修飾された、一本鎖ＤＮＡ結合性色素であってもよい。一本鎖ＤＮＡに結合することが知られている色素の例には、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｚｉｐｐｅｒら、（２００４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２巻（１２号））がある。シアニンＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ構造へのニトロ基、臭素基、ヨウ素基、および／またはアゾ基の組み込みによって、ＤＮＡ上に存在するかも知れない蛍光標識を消光する一本鎖ＤＮＡ結合性基部分が得られる。
【００３８】
一部の実施形態では、消光剤は結合部分と１つまたは複数の消光部分とを含む。結合部分には、実質的な配列特異性なしに一本鎖核酸に結合する任意の化合物が含まれ得る。結合部分は、ペプチドもしくはオリゴヌクレオチドまたは修飾された連結および／もしくはモノマーのいずれかを有する類似体を含み得る。オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、二重鎖の形成を介して、または非塩基対合アプタマー結合を介して、ポリヌクレオチドへの結合を提供し得る。一部の実施形態では、結合部分は６〜６０ヌクレオチドの範囲の長さを有するオリゴヌクレオチドまたはその類似体を含む。そのようなオリゴヌクレオチドまたは類似体は、１つの消光部分または複数の消光部分にコンジュゲートしてもよい。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドまたは類似体にコンジュゲートした複数の消光部分は２または３である。結合部分にコンジュゲートした消光部分は同一でも異なっていてもよい。一部の実施形態では、結合部分がオリゴヌクレオチドまたは類似体である場合はいつも、２つの消光部分がそれにコンジュゲートしており、その１つはオリゴヌクレオチドの５’末端に、１つは３’末端にコンジュゲートしている。２〜３の消光部分を有するオリゴヌクレオチドまたは類似体は、例えば本明細書に引用した参考文献に開示されているように、従来の連結化学および合成化学を使用して合成することができる。
【００３９】
オリゴヌクレオチドまたは類似体は単一種として提供され、または異なる配列、したがって異なる結合特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドもしくは類似体の混合物として提供され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは類似体はランダム配列ポリマーである。即ち、これらは所与の長さを有するあらゆる可能な配列の混合物として提供される。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドまたは類似体は、６マーについては「ＮＮＮＮＮＮ」、または８マーについては「ＮＮＮＮＮＮＮＮ」という式で表すことができ、式中ＮがＡ、Ｃ、ＧもしくはＴ、またはその類似体であってもよい。
【００４０】
オリゴヌクレオチドに関する「類似体」は、１つまたは複数のヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを意味する。定義のセクションに記載するように、「ヌクレオチド類似体」は修飾された連結部分、糖部分、または塩基部分を有し得るヌクレオチドである。本発明とともに使用され得る例示的なオリゴヌクレオチド類似体には、これだけに限らないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）（２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、架橋された核酸（ＢＮＡ）などが含まれる。
【００４１】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合部分はユニバーサル塩基を含む；即ち、これらは、塩基対相互作用を不安定化することなしに４つの天然のヌクレオチドのいずれかを置き換えることができる１つまたは複数のヌクレオチド類似体を含有する。ユニバーサル塩基特性を有するヌクレオチド類似体は、参照により本明細書に組み込まれるＬｏａｋｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９巻（１２号）、２４３７〜２４４７頁（２００１年）に記載されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合部分は、２’−デオキシイノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、３−ニトロピロールヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチドなどを含む。
【００４２】
一部の実施形態では、消光剤には、一緒に作用して一本鎖標識ポリヌクレオチドの望ましくない蛍光シグナルを消光する２つまたはそれより多い化合物の組み合わせが含まれ得る。例えば、消光剤には、標識されたポリヌクレオチドと二重鎖を形成し得るオリゴヌクレオチド（例えばポリデオキシイノシン）と、別々に、クエンチャーである二本鎖インターカレーターとが含まれ得る。したがって、ポリデオキシイノシンが標識されたポリヌクレオチドに結合する場合にはいつも、その結果生じる二重鎖に消光性インターカレーターが結合して、ポリヌクレオチドからの蛍光シグナルを消光する。
【００４３】
標識されたポリヌクレオチドの蛍光標識の蛍光シグナルを検出可能に消光することができる任意の合成色素は、本発明の目的のための許容される消光部分である。具体的には、本発明で使用する場合、消光部分は、標識されたポリヌクレオチド上の蛍光標識の発光帯と少なくともいくつかのスペクトルの重なりを示す吸収帯を有する。この重なりは、十分なスペクトルの重なりが存在するならば、消光部分（アクセプター）の最大吸収波長よりも低い、またはより高い波長の最大発光において起こる蛍光標識（ドナー）の発光とともに起こり得る。エネルギー伝達は、ドナーの発光の、アクセプターのより高い電子状態への伝達によっても起こり得る。当業者は、使用される蛍光標識の発光スペクトルに関してその色素の励起帯を検討することによって、所与の消光部分の有用性を決定する。
【００４４】
典型的には、本発明の蛍光消光は、本発明の蛍光標識と消光部分との間の蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴまたは電荷移動錯体の形成）を通して起こる。ドナー化合物およびアクセプター化合物のスペクトル特性および電子特性は、標識されたポリヌクレオチド上の蛍光標識と消光部分との間の分離距離と同様に、観察されるエネルギー伝達の程度に強い影響を有する。分離距離が増加すると、蛍光消光の程度は減少する。
【００４５】
標識されたポリヌクレオチドに結合した際に色素の最大発光波長が蛍光標識の最大発光波長から十分に分離されているならば、消光部分は任意選択で蛍光性であってもよい。しかし、好ましくは、オリゴヌクレオチドまたは類似体に共有結合でコンジュゲートしている場合には、消光部分は僅かに蛍光性にすぎない、または実質的に非蛍光性である。本明細書において使用する実質的に非蛍光性とは、本明細書の方法のいずれにおいても、記載されたアッセイ溶液中における消光部分の蛍光効率が５パーセント未満またはそれに等しく、好ましくは１パーセント未満またはそれに等しいことを意味する。他の実施形態では、共有結合で結合した消光部分は、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満の量子収量を示す。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの消光に伴い、蛍光標識の蛍光は、共有結合で結合した消光部分がない場合の同一の蛍光標識を伴う同一のオリゴヌクレオチドに対して、５０％を超えて消光される。別の実施形態では、蛍光標識は、標識されていないオリゴヌクレオチドに対して９０％を超えて消光される。さらに別の実施形態では、核酸染料は、標識されていないオリゴヌクレオチドに対して９５％を超えて消光される。
【００４６】
一部の実施形態では、消光部分は、ピレン、アンスラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールもしくはベンズインドール、オキサゾールもしくはベンズオキサゾール、チアゾールもしくはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリシレート、アンスラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、クマリン（ヒドロキシクマリン類およびアミノクマリン類ならびにそれらのフッ化誘導体およびスルホン化誘導体を含む）（参照により組み込まれるＧｅｅらの米国特許第５，８３０，９１２号（１９９８年）およびＷａｎｇらの米国特許第５，６９６，１５７号（１９９７年）において記載されているような）、ポリアザインダセン（例えば、全て参照により組み込まれる、Ｈａｕｇｌａｎｄらの米国特許第４，７７４，３３９号（１９８８年）、Ｋａｎｇらの米国特許第５，１８７，２８８号（１９９３年）、Ｈａｕｇｌａｎｄらの米国特許第５，２４８，７８２号（１９９３年）、Ｋａｎｇらの米国特許第５，２７４，１１３号（１９９３年）、Ｋａｎｇらの米国特許第５，４３３，８９６号（１９９５年）、Ｗｕらの米国特許第６，００５，１１３号（１９９９年））、キサンテン、オキサジンもしくはベンズオキサジン、カルバジン（参照により組み込まれるＣｏｒｅｙの米国特許第４，８１０，６３６号（１９８９年））、またはフェナレノンもしくはベンズフェナレノン（参照により組み込まれるＢａｂｂらの米国特許第４，８１２，４０９号（１９８９年））であってもよい。
【００４７】
他の実施形態では、実質的に非蛍光性の色素である消光部分には、特にアゾ色素（ＤＡＢＣＹＬまたはＤＡＢＳＹＬ色素およびそれらの構造的類似体など）、トリアリールメタン色素、例えば、マラカイトグリーンもしくはフェノールレッド、４’，５ｚ−ジエーテル置換フルオレセイン（米国特許第４，３１８，８４６号（１９８２年））、または非対称シアニン色素クエンチャー（ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９９３７，７１７号（１９９９年））が含まれる。
【００４８】
消光部分がキサンテンである実施形態では、合成色素は任意選択でフルオレセイン、ロドール（参照により組み込まれるＨａｕｇｌａｎｄらの米国特許第５，２２７，４８７号（１９９３年））、またはローダミンである。本明細書で使用するフルオレセインには、ベンゾ−もしくはジベンゾフルオレセイン類、セミナフトフルオレセイン類、またはナフトフルオレセイン類が含まれる。同様に、本明細書で使用するロドールには、セミナフトロダフルオル（ｓｅｍｉｎａｐｈｔｈｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ）類（参照により組み込まれるＨａｕｇｌａｎｄらの米国特許第４，９４５，１７１号（１９９０年））が含まれる。キサンテン類には、キサンテン色素のフッ化誘導体（参照により組み込まれる国際公開第９７／３９０６４号、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９７年））、およびキサンテン色素のスルホン化誘導体（参照により組み込まれる国際公開第９９／１５５１７号、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年））が含まれる。本明細書で使用するオキサジン類には、レゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｍ）類、アミノオキサジノン類、ジアミノオキサジン類、およびそれらのベンゾ置換類似体が含まれる。
【００４９】
さらなる実施形態では、消光部分は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３９９，３９２号に記載されている、１つまたは複数のアミノ窒素原子が芳香族または芳香族複素環系によって置換された３−および／または６−アミノキサンテンの実質的に非蛍光性の誘導体である。これらの消光色素は典型的には５３０ｎｍを超える最大吸収を有し、観察できる蛍光をほとんどまたは全く有さず、化学発光体、リン光体、または蛍光体から放出されるような広いスペクトルの発光を効率的に消光する。一実施形態では、消光色素は置換ローダミンである。別の実施形態では、消光化合物は置換ロドールである。
【００５０】
さらに他の実施形態では、消光部分は、参照により本明細書に組み込まれる以下の特許、第７，０１９，１２９号、第７，１０９，３１２号、第７，５８２，４３２号、第８，４１０，０２５号、第８，４４０，３９９号、第８，６３３，３０７号、第８，９４６，４０４号、第９，０１８，３６９号、または第９，１３９，６１０号に記載されている、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）化合物（ＢＨＱ）として公知の、１つまたは複数の非蛍光クエンチャーを含んでもよい。
【００５１】
さらなる消光部分は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９９，９７５号、第６，７９０，９４５号、および第８，１１４，９７９号に開示されている。
【００５２】
２つまたは３つの光学標識を利用する実施形態
一部の実施形態では、僅か２つの異なる種類のヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方における選択された種類のヌクレオチドについての区別できる光学シグナルを発生させる異なる光学標識で標識される。例えば、各標的ポリヌクレオチドの相補鎖のＣおよびＴを、標識された類似体によって置き換えることができ、この場合、Ｃ類似体およびＴ類似体の標識は異なる光学シグナルを発生し得る。標識された鎖がナノポアを通ってトランスロケーションすることによって、光学的シグネチャーが次いで発生し、ナノポアでは鎖のヌクレオチドが拘束されて光学検出領域を連続的に通過し、この検出領域で、その標識によって光学シグナルが発生する。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方からの光学的シグネチャーからの情報を組み合わせて、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。
【００５３】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの選択された種類のヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼを使用する伸長反応において、標識されたヌクレオチド類似体によって置き換えられる。標的ポリヌクレオチドの標識された鎖はナノポアを通ってトランスロケーションし、ナノポアでは鎖のヌクレオチドが拘束されて光学検出領域を一列で通過し、この検出領域で、ヌクレオチドは励起して光学シグナルを発生させる。個々の鎖についての光学シグナルの収集物を、本明細書では、鎖の光学的シグネチャーと呼ぶ。鎖およびその相補鎖（即ち、センス鎖およびアンチセンス鎖）が例えばヘアピンアダプターを介して連結している一部の実施形態では、単一の光学的シグネチャーには、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方のヌクレオチド上の光学標識からの光学シグナルが含まれ得る。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの異なる鎖が、２つの異なる光学的シグネチャーを個別に発生させ得、このシグネチャーが、上記のような分析のために組み合わされ得るか、または共に使用され得る。そのような個別に分析された鎖は、光学的シグネチャーの発生後に、例えば分子タグ（これは、例えば、位置、長さ、および配列パターン、ならびに容易な会合を可能にするための多様性が知られている標的ポリヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドセグメントであり得る）を使用して会合され得る。以下に記述するように、本発明の光学的シグネチャーは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｂｅｒら、米国特許出願公開第２０１６００７６０９１号によって記載されているように、各検出間隔で検出されたシグナルが、分解能限界区域または解像限界容積内での複数の光学標識の放出の寄与を含み得るという点で、即ち、それが（例えば）混合ＦＲＥＴシグナルであり得るという点で、混合光学シグナルを含み得る。
【００５４】
上記のように、一部の実施形態では、本発明の方法は、下記のステップ：（ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーして、異なる光学標識を有するヌクレオチド類似体を、少なくとも２種類のヌクレオチドについて置換して、標識された鎖を形成するステップと；（ｂ）鎖の相補鎖をコピーして、前記ヌクレオチド類似体を、同一の少なくとも２種類のヌクレオチドについて置換して、標識された相補鎖を形成するステップと；（ｃ）ナノポアを通って標識された鎖をトランスロケーションさせて、標識された鎖のヌクレオチドを検出ゾーンに一列で通過させ、検出ゾーンで光学標識が励起して光学シグナルを発生するステップと；（ｄ）検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと；（ｅ）標識された鎖がナノポアを通ってトランスロケーションすると光学標識からの時系列の光学シグナルを検出して、鎖の光学的シグネチャーをもたらすステップと；（ｆ）ナノポアを通って標識された相補鎖をトランスロケーションさせて、標識された相補鎖のヌクレオチドを励起ゾーンに一列で通過させ、励起ゾーンで光学標識が励起して光学シグナルを発生するステップと；（ｇ）検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと；（ｈ）標識された相補鎖がナノポアを通ってトランスロケーションすると光学標識からの時系列の光学シグナルを検出して、相補鎖の光学的シグネチャーをもたらすステップと；（ｉ）鎖の光学的シグネチャーおよび相補鎖の光学的シグネチャーから二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップとで実施され得る。一部の実施形態では、２種類のヌクレオチドは標識されており、それは、ＣおよびＴ、ＣおよびＧ、ＣおよびＡ、ＴおよびＧ、ＴおよびＡ、またはＧおよびＡであり得る。一部の実施形態では、ピリミジンヌクレオチドが標識される。他の実施形態では、プリンヌクレオチドが標識される。一部の実施形態では、鎖の選択された種類のヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼを使用するプライマー伸長反応において、選択された種類のヌクレオチドの標識された類似体ｄＮＴＰを組み込むことによって標識される。他の実施形態では、鎖の選択された種類のヌクレオチドが、異なる種類のヌクレオチドへの異なる標識の結合をその後の反応で可能にする直行反応性の官能性で類似体ｄＮＴＰが誘導体化される伸長反応において、選択された種類のヌクレオチドの類似体ｄＮＴＰを組み込むことによって標識される。この後者の標識アプローチは、参照により本明細書に組み込まれるＪｅｔｔら、米国特許第５，４０５，７４７号において開示されている。
【００５５】
一部の実施形態では、３種類のヌクレオチドが標識され、これには、第１の光学標識でのＣの標識、第２の光学標識でのＴの標識、ならびに第３の光学標識でのＧおよびＡの標識が含まれ得る。他の実施形態では、以下のヌクレオチド群が、以下に示すように標識され得る：それぞれ第１の光学標識および第２の光学標識でのＣおよびＧの標識、ならびに第３の光学標識でのＴおよびＡの標識；それぞれ第１の光学標識および第２の光学標識でのＣおよびＡの標識、ならびに第３の光学標識でのＴおよびＧの標識；それぞれ第１の光学標識および第２の光学標識でのＴおよびＧの標識、ならびに、第３の光学標識でのＣおよびＡの標識；それぞれ第１の光学標識および第２の光学標識でのＡおよびＧの標識、ならびに、第３の光学標識でのＴおよびＣの標識。
【００５６】
一部の実施形態では、光学標識は、ナノポアに会合するドナーからのエネルギー移動後に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルを発生する、蛍光アクセプター分子である。一部の実施形態では、さらに以下に記載するように、ドナーは、例えば、量子ドット、ナノダイヤモンドなどの、光学的に活性なナノ粒子であり得る。アクセプター分子とドナーとの特定の組み合わせの選択は、当業者にとって設計上の選択である。一部の実施形態では、その一部を以下でより完全に記載するように、単一の量子ドットをナノポアに結合させ、この量子ドットが、その波長が通常はより短い波長に（即ち、より青方の波長に）十分に分離されておりそのためアクセプターによって発生するＦＲＥＴシグナルに寄与しない励起ビームを使用することで励起して、蛍光を発する。同様に、ＦＲＥＴ相互作用を容易にするために、その発光波長が両アクセプター分子の吸収帯に重複する量子ドットが選択される。一部の実施形態では、２つのドナーがナノポアの各励起ゾーンについて使用され得、ここで、それぞれの発光波長は、アクセプター分子の異なる一方の吸収帯に最適に重複するように選択される。
【００５７】
図６Ａにおいて、二本鎖標的ポリヌクレオチド（６００）（配列番号１）はセンス鎖（６０１）および相補的アンチセンス鎖（６０２）からなり、そこに従来の方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷｅｉｓｓｍａｎら、米国特許第６，２８７，８２５号；Ｓｃｈｍｉｔｔら、米国特許出願公開第２０１５／００４４６８号を使用して「Ｙ」アダプター（６０４）および（６０６）がライゲーションされる（６０３）。アダプター（それぞれ６０４および６０６）のアーム（６０８）および（６１０）は、プライマー（６１６）および（６１８）がアニールされる（６０５）プライマー結合部位を含む。二本鎖部分（６１２）および（６１４）はタグ配列を含み得、例として、一方または両方は、例えば、鎖のそれぞれの光学的シグネチャーから配列情報を得るために鎖を後で再結合するために使用され得る、所定の長さおよび組成のランダマー（ｒａｎｄｏｍｅｒ）を含み得る。プライマー（６１６）および（６１８）をアニーリングした後、これらを、（例えば図説するように）標識されたｄＵＴＰ類似体（標識は、組み込まれたヌクレオチドにおいて白丸で示される）および標識されたｄＣＴＰ類似体（標識は、組み込まれたヌクレオチドにおいて黒丸で示される）、ならびに天然の標識されていないｄＧＴＰおよびｄＡＴＰの存在下で、核酸ポリメラーゼによって伸長することができる（６０７）（標識されていないｄＴＴＰも標識されていないｄＣＴＰも存在せず、そのため、伸長した鎖では類似体は完全に置換されている）。ＧおよびＡ上での標識の不在は、組み込まれたヌクレオチドの上のダッシュで示される。ノイズを伴わない理想的な検出システムでは、白丸、黒丸、およびダッシュのこの配列が、示されるセンス鎖およびアンチセンス鎖がナノポアの励起ゾーンを通過すると発生させる光学的シグネチャーの良好な描写であろう。
【００５８】
図６Ｂでは、３つの標識を利用する代替的な実施形態での伸長産物（６２０）および（６２２）が示される。上記のように、組み込まれた標識されたｄＵＴＰ類似体は白丸で示され、組み込まれた標識されたｄＣＴＰ類似体は黒丸で示される。組み込まれた標識されたｄＡＴＰ類似体およびｄＧＴＰ類似体は、黒い菱形として示される。
【００５９】
標識するためのヌクレオチドの種類、それを塩基に結合させるための標識およびリンカーの種類、ならびにｄＮＴＰ類似体の存在下での伸長反応のための核酸ポリメラーゼの選択におけるガイダンスは、参照により組み込まれる以下の参考文献、Ｇｏｏｄｍａｎら、米国特許第５，９４５，３１２号；Ｊｅｔｔら、米国特許第５，４０５，７４７号；Ｍｕｅｈｌｅｇｇｅｒら、米国特許出願公開第２００４／０２１４２２１号；Ｇｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１巻（１０号）：２６３０〜２６３５頁（２００３年）；Ｔａｓａｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１巻（１０号）：２６３６〜２６４６頁（２００３年）；Ａｕｇｕｓｔｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８６巻：２８９〜３０１頁（２００１年）；Ｂｒａｋｍａｎｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５巻（１号）：１１９〜１２６頁（２００４年）などに見出すことができる。本発明とともに使用するための例示的な核酸ポリメラーゼには、これだけに限らないが、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−、Ｔａｑ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｔｇｏ  ｅｘｏ−、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−などが含まれる。一部の実施形態では、例示的な核酸ポリメラーゼには、これだけに限らないが、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−およびＫｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ−が含まれる。ｄＮＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー１、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー２、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６３５、ＭＲ１２１、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが含まれる。ｄＵＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６６５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ９０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー１、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー２、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、ＭＲ１２１、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが含まれる。ｄＣＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが含まれる。ｄＡＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎなどが含まれる。ｄＧＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎなどが含まれる。ｄＵＴＰ類似体およびｄＣＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識対には、これだけに限らないが、（ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、（Ａｔｔｏ  ６５５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ａｔｔｏ  ６５５）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、（Ｇｎｏｔｈｉｓブルー１、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、（Ｇｎｏｔｈｉｓブルー２、Ａｔｔｏ  ６５５）、（Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、Ｃｙ５）などが含まれる。
【００６０】
図６Ｃは、２つの標識が使用され、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０１５２４９２号および米国特許出願公開第２０１２／００５８４６８号において教示されているように、センス鎖およびアンチセンス鎖がヘアピンアダプター（６３０）によって連結している、実施形態を説明する。尾状（ｔａｉｌｅｄ）アダプター（６３２）およびヘアピンアダプター（６３０）は、標的ポリヌクレオチド（６００）（配列番号１）にライゲーションされる。プライマー（６３４）の変性およびアニーリングの後、伸長反応によって、セグメント（６３６）、鎖（６０１）およびセグメント（６３８）の標識された相補鎖、鎖（６０１）の標識された逆相補鎖を含む、伸長産物（６３５）が生成する。伸長産物（６３５）がナノポアを通ってトランスロケーションし、光学的シグネチャーが発生した後、標的ポリヌクレオチド（６００）（配列番号１）の配列を決定することができる。場合によって、所定のパターンの標識が伸長反応の間に組み込まれるようにヘアピン（６３０）の配列を選択してもよく、これは、例えば、どこでセグメント（６３６）が終了し、どこでセグメント（６３８）が開始するかなどを示すことによって、光学的シグネチャーの分析の補助に使用することができる。
【００６１】
ナノポアおよびナノポアアレイ
本発明とともに使用するナノポアは、固体状態のナノポア、タンパク質ナノポア、または、タンパク質ナノポアもしくは有機ナノチューブ、例えば固体状態の膜もしくは同様のフレームワーク中で構成されたカーボンナノチューブもしくはグラフェンナノチューブを含む、ハイブリッドナノポアであってもよい。ナノポアの重要な特徴には、標識されたポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド分析物を拘束し、それによりそのモノマーがシグナル発生領域（または同様に、励起ゾーン、検出ゾーンなど）を順に通過することが含まれる。即ち、ナノポアは、ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド分析物の動きを拘束し、それにより、ヌクレオチドが検出ゾーン（または励起領域）を一列で通過する。一部の実施形態では、ナノポアの追加的な機能には、（ｉ）二本鎖核酸もしくは同等に嵩高な分子を通過させずに一本鎖核酸を通過させること、および／または（ｉｉ）ヌクレオチド上の蛍光標識を拘束し、それにより、蛍光シグナル発生が抑制される、もしくは収集されないように方向付けられることが含まれる。
【００６２】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスと併せて使用されるナノポアは、平面上に規則的に配置され得るナノポアのクラスターのアレイのような、アレイの形態で提供される。一部の実施形態では、異なるクラスターのナノポアからの光学シグナルが、用いられる光学検出システムによって区別可能であるように、クラスターはそれぞれ個別の分解能限界区域内にあるが、同じクラスター内のナノポアからの光学シグナルは、用いられる光学検出システムによって、そのようなクラスター内の特定のナノポアに必ずしも割り当てることができる必要はない。
【００６３】
固体状態のナノポアは、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）および二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）などを含むがこれらに限定されない様々な材料において製作されてもよい。ＤＮＡ配列決定などの分析上の適用に関するナノポアの製作および動作は、参照により組み込まれる以下の例示的な参考文献に開示されている：Ｌｉｎｇ、米国特許第７，６７８，５６２号；Ｈｕら、米国特許第７，３９７，２３２号；Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏら、米国特許第６，４６４，８４２号；Ｃｈｕら、米国特許第５，７９８，０４２号；Ｓａｕｅｒら、米国特許第７，００１，７９２号；Ｓｕら、米国特許第７，７４４，８１６号；Ｃｈｕｒｃｈら、米国特許第５，７９５，７８２号；Ｂａｙｌｅｙら、米国特許第６，４２６，２３１号；Ａｋｅｓｏｎら、米国特許第７，１８９，５０３号；Ｂａｙｌｅｙら、米国特許第６，９１６，６６５号；Ａｋｅｓｏｎら、米国特許第６，２６７，８７２号；Ｍｅｌｌｅｒら、米国特許公開第２００９／００２９４７７号；Ｈｏｗｏｒｋａら、国際公開第２００９／００７７４３号；Ｂｒｏｗｎら、国際公開第２０１１／０６７５５９号；Ｍｅｌｌｅｒら、国際公開第２００９／０２０６８２号；Ｐｏｌｏｎｓｋｙら、国際公開第２００８／０９２７６０号；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚａａｇら、国際公開第２０１０／００７５３７号；Ｙａｎら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５巻（６号）：１１２９〜１１３４頁（２００５年）；Ｉｑｂａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２巻：２４３〜２４８頁（２００７年）；Ｗａｎｕｎｕら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７巻（６号）：１５８０〜１５８５頁（２００７年）；Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２巻：２０９〜２１５頁（２００７年）；Ｓｔｏｒｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２巻：５３７〜５４０頁（２００３年）；Ｗｕら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２９巻（１３号）：２７５４〜２７５９頁（２００８年）；Ｎａｋａｎｅら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３巻：２５９２〜２６０１頁（２００２年）；Ｚｈｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、１７巻：３０４〜３１３頁（２００７年）；Ｈｅｎｒｉｑｕｅｚら、Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｔ、１２９巻：４７８〜４８２頁（２００４年）；Ｊａｇｔｉａｎｉら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、１６巻：１５３０〜１５３９頁（２００６年）；Ｎａｋａｎｅら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｎｄｅｎｓ．Ｍａｔｔｅｒ、１５巻  Ｒ１３６５〜Ｒ１３９３頁（２００３年）；ＤｅＢｌｏｉｓら、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、４１巻（７号）：９０９〜９１６頁（１９７０年）；Ｃｌａｒｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４巻（４号）：２６５〜２７０頁（２００９年）；Ｂａｙｌｅｙら、米国特許公開第２００３／０２１５８８１号；など。
【００６４】
一部の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の光遮断層、即ち１つまたは複数の不透明層を有するナノポアアレイを含む。典型的には、ナノポアアレイはケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化アルミニウムなどの材料の薄いシートとして製造され、これらは特に使用される厚み、例えば５０〜１００ｎｍ未満で容易に光を透過する。分析物の電気的検出にはこれは問題ではない。しかし、ナノポアをトランスロケーションする標識された分子の光学に基づく検出においては、アレイを通して透過される光は意図された反応部位の外側の材料を常に励起し、それにより、例えば非特異的バックグラウンド蛍光、ナノポアにまだ入っていない分子の標識からの蛍光などからの光学的ノイズを発生させる。一態様では、本発明は、励起ビームからの光を反射および／または吸収する１つまたは複数の光遮断層を有するナノポアアレイを提供し、それによりアレイのナノポアに付随する意図された反応部位において発生する光学シグナルへのバックグラウンドノイズを低減することによって、この問題に対処する。一部の実施形態では、意図された反応部位における光学標識が直接照明によって励起されることがこれによって可能になる。一部の実施形態では、不透明層は金属層であってもよい。そのような金属層はＳｎ、Ａｌ、Ｖ、Ｔｉ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｔａ、Ｗ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含んでよい。一部の実施形態では、そのような金属層はＡｌ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含んでよい。さらに他の実施形態では、そのような金属層はアルミニウムもしくは金を含んでよく、またはアルミニウムのみを含んでもよい。不透明層の厚みは広く変化してもよく、層を構成する材料の物理的および化学的特性による。一部の実施形態では、不透明層の厚みは少なくとも５ｎｍ、または少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも４０ｎｍであってもよい。他の実施形態では、不透明層の厚みは５〜１００ｎｍの範囲であってもよく、他の実施形態では、不透明層の厚みは１０〜８０ｎｍの範囲であってもよい。不透明層は励起ビームからの光を１００パーセント遮断する（即ち反射しまたは吸収する）必要はない。一部の実施形態では、不透明層は励起ビームからの入射光を少なくとも１０パーセント遮断してもよく、他の実施形態では、不透明層は励起ビームからの入射光を少なくとも５０パーセント遮断してもよい。
【００６５】
不透明層またはコーティングは、当該技術分野で公知の種々の手法によって固体状態の膜上に製作することができる。化学蒸着法、電着、エピタキシー、熱酸化、蒸発およびスパッタリングなどの物理蒸着法、キャスティングなどの材料堆積手法を使用することができる。一部の実施形態では、原子層堆積を使用することができる。例えば参照により組み込まれる米国特許第６，４６４，８４２号；Ｗｅｉら、Ｓｍａｌｌ、６巻（１３号）、１４０６〜１４１４頁（２０１０年）。
【００６６】
一部の実施形態では、１〜１００ｎｍのチャネルまたはアパーチャーが固体担体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、通常は平面担体、例えば、膜を通って形成されてよく、一本鎖ＤＮＡなどの分析物がそこを通ってトランスロケーションするように誘発される。他の実施形態では、２〜５０ｎｍのチャネルまたはアパーチャーが担体を通って形成され、さらに他の実施形態では、２〜３０ｎｍ、または２〜２０ｎｍ、または３〜３０ｎｍ、または３〜２０ｎｍ、または３〜１０ｎｍのチャネルまたはアパーチャーが担体を通って形成される。ナノポアを生成する固体状態の手法は、堅牢性および耐久性を提供すると同時にナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウェハー規模でナノポアの高密度アレイを製作する能力、脂質ベースの系に比べて優れた機械的、化学的および熱的特性、ならびに電子または光学的読出し技法と一体化する可能性を提供する。一方、生物学的ナノポアは、再現性のある狭いボアまたは管腔、特に１〜１０ナノメートルの範囲にあるもの、ならびに従来のタンパク質工学法によって、ナノポアの物理的および／または化学的性質を調整するための、かつＦＲＥＴドナーまたはアクセプターであってもよい蛍光標識などの基または要素を直接または間接的に付着するための技法を提供する。タンパク質ナノポアは、典型的には、機械的支持体に関する繊細な脂質二重層に依拠し、精密な寸法を持つ固体状態のナノポアの製作は、依然として難しいままである。一部の実施形態では、固体状態のナノポアは、生物学的ナノポアと組み合わされていわゆる「ハイブリッド」ナノポアを形成し、これは、これらの欠点のいくつかを克服し、そうすることで固体状態のナノポアの安定性とともに生物学的ポアタンパク質の精度を与える。光学的読出し技法では、ハイブリッドナノポアが、ナノポアの精密な場所を提供し、このことがデータ獲得を大幅に単純化する。
【００６７】
一部の実施形態では、クラスターは、アパーチャーのアレイを含有する固相膜によって支持された脂質二重層内に、タンパク質ナノポアを配置することによって形成されてもよい。例えば、そのようなアレイは、固相支持体に製作された（例えば、穿孔され、またはエッチングされるなど）アパーチャーを含んでいてもよい。そのようなアパーチャーの幾何形状は、用いられる製作技法に応じて変わってもよい。一部の実施形態では、そのようなアパーチャーのそれぞれは、個別の分解能限界区域に関連付けられ、または包含され；しかし他の実施形態では、複数のアパーチャーが同じ分解能限界区域内にあってもよい。アパーチャーの断面積は、広く様々であってもよく、異なるクラスター間と同じでもそうでなくてもよいが、そのような面積は通常、従来の製作手法の結果と実質的に同じである。一部の実施形態では、アパーチャーは、１０から２００ｎｍの範囲の最小線形寸法（例えば、円形アパーチャーの場合には直径）を有し、または約１００から３×１０４ｎｍ２の範囲の面積を有する。アパーチャーを横切って、脂質二重層が配置されてもよい。アパーチャー当たりのタンパク質ナノポアの分布は、例えば挿入ステップ中にタンパク質ナノポアの濃度を制御することによって、様々にしてもよい。そのような実施形態では、ナノポアのクラスターは、ランダムな数のナノポアを含んでいてもよい。タンパク質ナノポアがアパーチャーにランダムに挿入される一部の実施形態では、平均して１つまたは複数のアパーチャーを含有するクラスターは、ゼロよりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、そのようなクラスターは、０．２５よりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、そのようなクラスターは、０．５よりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、そのようなクラスターは、０．７５よりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、そのようなクラスターは、１．０よりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有する。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスは、ＳｉＮ膜などの固相膜を含み、それを通るアパーチャーのアレイを有して、第１のチャンバーと第２のチャンバー（場合によっては、「シスチャンバー」および「トランスチャンバー」とも呼ぶ）との間に連通を設け、第２のまたはトランスチャンバーに面する表面に脂質二重層を支持する。一部の実施形態では、そのような固相膜内のアパーチャーの直径は、１０から２００ｎｍの範囲または２０から１００ｎｍの範囲にあってもよい。一部の実施形態では、そのような固相膜は、そのような二重層がトランスチャンバーに面する表面のアパーチャーに跨る領域で、脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアをさらに含む。一部の実施形態では、そのようなタンパク質ナノポアは、本明細書に記述される技法を使用して、固相膜のシス側から挿入される。一部の実施形態では、そのようなタンパク質ナノポアは、軸に沿ってバレルまたはボアを含み、かつ一端に「キャップ」構造を有し他端に「ステム」構造をするという点で（Ｓｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：１８５９〜１８６６頁（１９９６年）からの専門用語を使用する）、α−溶血素と同一のまたは類似の構造を有する。そのようなタンパク質ナノポアを使用する一部の実施形態では、脂質二重層への挿入は、そのキャップ構造がシスチャンバーに対して露出し、かつそのステム構造がトランスチャンバーに対して露出するように配向するタンパク質ナノポアをもたらす。
【００６９】
一部の実施形態では、本発明は、特にポリヌクレオチドの光学ベースのナノポア配列決定のための、クラスターにおいてハイブリッドナノポアを用いてもよい。そのようなナノポアは、固体状態のオリフィスまたはアパーチャーを含み、その中に、タンパク質ナノポアなどのタンパク質バイオセンサーを安定して挿入する。荷電したポリヌクレオチドは、従来のタンパク質工学技術によってタンパク質ナノポア（例えば、アルファ溶血素）に付着されてもよく、その後、印加電場が、タンパク質ナノポアを固体状態の膜のアパーチャー内に案内するのに使用されてもよい。一部の実施形態では、固体状態の担体におけるアパーチャーは、タンパク質よりも僅かに小さくなるように選択され、これによってタンパク質がアパーチャーをトランスロケーションすることを妨げる。代わりに、タンパク質は、固体状態のオリフィスに埋め込まれることになる。
【００７０】
固体状態または合成によるナノポアは、上記引用した参考文献に例示されるような様々な方法で調製され得る。一部の実施形態では、例えば参照により本明細書に組み込まれるＹａｎｇら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ、２２巻：２８５３１０頁（２０１１年）に開示されるように、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して様々な材料に合成ナノポアを穿孔してもよい。自立型膜に加工された薄膜材料、例えば窒化ケイ素の１つまたは複数の領域を支持するチップを、ヘリウムイオン顕微鏡（ＨＩＭ）チャンバーに導入する。顕微鏡を低倍率に設定しながら、ＨＩＭモーター制御を使用して自立型膜をイオンビームの経路に導く。焦点および非点補正（ｓｔｉｇｍａｔｉｏｎ）を含むビームパラメーターを、自立型膜に隣接するが固体担体上にある領域で調整する。パラメーターを適正に固定したら、自立型膜領域がイオンビームスキャン領域の中心になるようにかつビームがブランクされる（ｂｌａｎｋ）ように、チップ位置を動かす。ＨＩＭの視野を、予想されるナノポアパターン全体を含有するのに十分な、かつ将来の光学読出しにおいて有用であるのに十分な（即ち、光学倍率、カメラ解像度などに依存する）寸法（単位μｍ）に設定する。次いでイオンビームを、画素ドウェル時間で全視野を通して１回ラスター処理し、その結果、膜自己蛍光の全てまたはほとんどを除去するのに十分な全イオン線量が得られる。次いで視野を、適正な値（上記にて使用された場合よりも小さい）に設定して、単一ナノポアまたはナノポアのアレイのいずれかの、リソグラフィーにより画定されたミリングを行う。パターンの画素ドウェル時間は、試料加工前に較正試料の使用を通して決定された、１つまたは複数の所定の直径のナノポアをもたらすように設定する。この全プロセスを、単一チップ上でそれぞれ所望の領域で、および／またはＨＩＭチャンバーに導入されたチップごとに、繰り返す。
【００７１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチドなど）を分析するための上記の方法を実施するためのデバイスは、典型的には、層状膜とナノポアとを横断する電場を確立するための一組の電極を含む。一本鎖核酸は、チャンバー内に陰極を配置することによって層状膜の「シス」側として構成された第１のチャンバー内の電解質の中に配置することによってナノポアに曝される。電場を印加すると、負に荷電した一本鎖核酸はナノポアに捕捉され、チャンバー内に陽極を配置することによって膜の「トランス」側として構成された層状膜の他方の側の第２のチャンバーにトランスロケーションする。トランスロケーション速度は、第１および第２のチャンバー内の電解質のイオン強度ならびにナノポアを横断して印加された電圧に部分的に依存する。光学に基づく検出においては、トランスロケーション速度は、異なる電圧でナノポア当たりの予想される異なる速度でシグナルを発生する標識された一本鎖核酸の所定の標準を例えば使用する、予備的較正測定によって選択され得る。したがって、ＤＮＡ配列決定適用では、トランスロケーション速度は、そのような較正測定からのシグナル速度に基づいて選択され得る。したがって、そのような測定から、例えばナノポアのアレイにわたって信頼できるヌクレオチドの同定が可能になるか最大化される電圧が選択され得る。一部の実施形態では、そのような較正は（所定の標準配列の代わりに、またはそれに加えて）、分析されるテンプレートの試料からの核酸を使用して行うことができる。一部の実施形態では、そのような較正は配列決定ランの間にリアルタイムで行ってもよく、印加する電圧は、例えばヌクレオチド特異的シグナルの取得を最大化するために、そのような測定に基づいてリアルタイムで改変してもよい。
【００７２】
光学シグナルの検出
一部の実施形態では、ポリマー分析物上の標識またはナノポア上のドナーを直接照明するために、励起ビームの送達と光学シグナルの収集が単一の対物レンズを通して起こる落射照明システムが使用され得る。本発明とともに使用する共焦点落射照明システムの基本的な構成要素を図４に示す。励起ビーム（４０２）は二色性ミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃ）（４０４）に向けられて対物レンズ（４０６）上に達し（４１２）、対物レンズ（４０６）は励起ビーム（４０２）を層状膜（４００）上に集中させ（４１０）、ここで標識は、直接励起されて蛍光シグナルなどの光学シグナルを放出するか、またはＦＲＥＴ相互作用を介して間接的に励起されて光学シグナルを放出する。そのような光学シグナルは対物レンズ（４０６）によって収集され、光学シグナル（４１１）の光は透過するが励起ビーム（４０２）の光は反射するように選択された二色性ミラー（４０４）に向けられる。光学シグナル（４１１）はレンズ（４１４）を通過し、このレンズは、光学シグナルをピンホール（４１６）に通して検出器（４１８）に集中させる。光学シグナル（４１１）が複数の蛍光標識からの蛍光シグナルを含む場合、さらなる光学的構成要素、フィルター、ビームスプリッター、モノクロメーターなどが、異なる蛍光標識からの異なる蛍光シグナルをさらに分離するために提供され得る。
【００７３】
一部の実施形態では、ヌクレオチド上の標識は、参照により本明細書に組み込まれるＳｏｎｉら、Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、８１巻：０１４３０１頁（２０１０年）、および米国特許出願公開第２０１２／０１３５４１０号において記載されている、図５で示すものに類似の装置を使用して、エバネッセント場によって励起され得る。この装置では、ナノポアまたはナノポアアレイのトランス側の非常に狭い第２のチャンバーによって、エバネッセント場が、ナノポアの入口および出口の両方で検出ゾーンを確立するための下にあるガラススライドの表面から延在することが可能になり、それにより、ナノポアを伴うそれぞれの光学的測定値が、複数の標識されたヌクレオチドからの寄与を含有する。アパーチャーのアレイ（５００）（これは、脂質二重層内に挿入されたタンパク質ナノポアを含み得る）は、２０〜１００ｎｍの範囲の厚みを有し得る窒化ケイ素層（５０２）内に形成され得る。窒化ケイ素層（５０２）は、ケイ素支持層（５０３）上に形成され得る。第２のチャンバー（５０６）は、窒化ケイ素層（５０２）、第２のチャンバー（５０６）の高さを決定する二酸化ケイ素層（５０４）、およびガラススライド（５１０）の表面（５０８）から形成され得る。二酸化ケイ素層（５０４）は、５０〜１００ｎｍの範囲の厚みを有し得る。表面（５０８）から窒化ケイ素層（５０２）を横切って延在する所望のエバネッセント場（５０７）は、ガラススライド（５１０）に対して適切な角度で光ビーム（５１２）を向けてＴＩＲを生じさせることによって、確立され得る。標識されたポリヌクレオチド分析物をアレイ（５００）を通して駆動させるために、シス（−）状態が第１のチャンバー（５１６）内で確立され得、およびトランス（＋）状態が第２のチャンバー（５０６）内で確立され得、電極が操作可能に第１および第２のチャンバー（５０６および５２１）に接続される。
【００７４】
定義
「エバネッセント場」は、非伝播性の電磁場を意味し、即ち、これは、ポインティング・ベクトルの平均値がゼロである電磁場である。
【００７５】
「ＦＲＥＴ」または「Ｆｏｒｓｔｅｒまたは蛍光共鳴エネルギー移動」は、励起されたドナーフルオロフォアから基底状態のアクセプターフルオロフォアへの非放射性双極子−双極子エネルギー移動メカニズムを意味する。ＦＲＥＴ相互作用におけるエネルギー移動の速度は、ドナーの放出スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとのスペクトルの重なりの程度、ドナーの量子収率、ドナーおよびアクセプターの遷移双極子の相対的な配向、ならびにドナー分子とアクセプター分子との間の距離に依存し、Ｌａｋｏｗｉｔｚ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、第３版、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００６年）がある。特定の目的のＦＲＥＴ相互作用は、アクセプターに伝達され、次にそのドナーを励起する光の周波数よりも低い周波数で、光子としてアクセプターにより放出される、エネルギーの一部をもたらすものである（即ち、「ＦＲＥＴシグナル」）。「ＦＲＥＴ距離」は、ＦＲＥＴ相互作用を引き起こすことができ、かつ検出可能なＦＲＥＴシグナルがＦＲＥＴアクセプターによって生成される、ＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターとの間の距離を意味する。
【００７６】
「キット」は、本発明の方法を行うために材料または試薬を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの文脈では、そのような送達システムは、１つの位置から別の位置への反応試薬（例えば蛍光標識、例えば、適切な容器内の、相互消光蛍光標識、蛍光標識連結剤、酵素など）、ならびに／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための文書による指示など）の保存、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する１つまたは複数の外装（例えば箱）を含む。そのような内容物は、目的のレシピエントに、共にまたは個別に送達することができる。例えば、第１の容器はアッセイで使用するための酵素を含有していてよく、一方、第２のまたはさらなる容器は、相互消光蛍光標識を含有する。
【００７７】
「ナノポア」は、担体が所定のまたは識別可能な順序で分析物を通る、またはポリマー分析物の場合、そのモノマー単位が所定のまたは識別可能な順序で担体を通るのを可能にする、担体に位置決めされた任意の開口を意味する。後者の場合、所定のまたは識別可能な順序は、ポリマー中のモノマー単位の一次配列であってもよい。ナノポアの例には、タンパク質様またはタンパク質ベースのナノポア、合成または固体状態のナノポア、およびタンパク質ナノポアがその内部に埋め込まれている固体状態のナノポアを含むハイブリッドナノポアが含まれる。ナノポアは、内径が１〜１０ｎｍまたは１〜５ｎｍまたは１〜３ｎｍであってもよい。タンパク質ナノポアの例には、アルファ−溶血素、電圧依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＭｓｐＡ、およびＬａｍＢ（マルトポリン）、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｈｅｅ，Ｍ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５巻（４号）（２００７年）：１７４〜１８１頁；Ｂａｙｌｅｙら（前掲）；Ｇｕｎｄｌａｃｈら、米国特許公開第２０１２／００５５７９２号などに開示されているものが含まれるが、これらに限定されない。単一核酸分子の通過を可能にする任意のタンパク質ポアを用いてもよい。ナノポアタンパク質は、ポアの外側の特定の部位で、またはポア形成タンパク質を構成する１つまたは複数のモノマー単位の外側の特定の部位で標識されてもよい。ポアタンパク質は、アルファ−溶血素、ＭｓｐＡ、電圧依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、アンスラックスポリン、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、およびＬａｍＢ（マルトポリン）などであるがこれらに限定されないタンパク質の群から選択される。固体状態のホールへのポアタンパク質の一体化は、荷電したポリマーをポアタンパク質に結合することによって実現される。電場を印加した後、荷電した複合体を、電気泳動によって固体状態のホールに引き込む。合成ナノポアまたは固体状態のナノポアは、様々な形態の固体担体中に創出されてもよく、その例には、シリコーン（例えば、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＯ２）、金属、金属酸化物（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、プラスチック、ガラス、半導体材料、およびこれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。合成ナノポアは、脂質二重層膜内に位置決めされた生物学的タンパク質ポアよりも安定と考えられる。合成ナノポアは、重合エポキシなどであるがこれに限定されない適切な担体に埋め込まれたカーボンナノチューブを使用することによって、創出されてもよい。カーボンナノチューブは、均一で十分定められた化学的および構造的性質を有することができる。１から数１００ナノメートルに及ぶ様々なサイズのカーボンナノチューブを得ることができる。カーボンナノチューブの表面電荷は、約ゼロであることが公知であり、その結果、ナノポアを通る核酸の電気泳動輸送は単純かつ予測可能になる（Ｉｔｏ，Ｔ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２巻（２００３年）：１４８２〜８３頁）。合成ナノポアの担体表面は、タンパク質ポアの共有結合による結合が可能になるようにまたは表面特性を光学ナノポア配列決定に適切なものにするように、化学修飾されてもよい。そのような表面修��は、共有結合または非共有結合にすることができる。ほとんどの共有結合による修飾は、オルガノシラン堆積を含み、それに関する最も一般的なプロトコールが記述されている：１）水性アルコールからの堆積。これはシリル化表面を調製するための最も容易な方法である。９５％エタノール−５％水の溶液を、酢酸でｐＨ４．５〜５．５に調節する。シランを、撹拌しながら添加して、２％の最終濃度が得られる。加水分解およびシラノール基形成の後、担体を２〜５分間添加する。濯いだ後、過剰な材料は、エタノール中に短時間浸漬することによってなくなる。シラン層の硬化は、摂氏１１０度で５〜１０分である。２）気相堆積。乾燥非プロトン性条件下、化学気相堆積法によって、シランを担体に付着させることができる。これらの方法は、単層堆積が容易である。閉鎖チャンバーのデザインで、５ｍｍの蒸気圧が達成されるような十分な温度に担体を加熱する。あるいは、シランの蒸発が観察されるまで、真空を印加することができる。３）スピンオン堆積。スピンオン付着は、最大源の官能化および多層堆積が好まれる加水分解条件下で、または単層堆積が好まれる乾燥条件下で行うことができる。一部の実施形態では、単一ナノポアが本発明では用いられる。他の実施形態では、複数のナノポアが用いられる。後者の実施形態のいくつかでは、複数のナノポアを、ナノポアのアレイとして用い、これらは固相膜などの平面担体に通常は堆積される。ナノポアアレイのナノポアは、規則的に、例えば直線的なパターンで、間隔を空けて配置されてもよく、またはランダムに間隔を空けて配置されてもよい。好ましい実施形態では、ナノポアは、平面状の固相担体において、直線上のパターンとして規則的に間隔を空けて配置される。
【００７８】
「ポリマー」は、直鎖状に接続された複数のモノマーを意味する。通常、ポリマーは、複数のタイプのモノマーを、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴを含むポリヌクレオチドとして、または複数の種類のアミノ酸を含むポリペプチドとして含む。モノマーは、ヌクレオシドおよびその誘導体または類似体、ならびにアミノ酸およびその誘導体および類似体を、限定することなく含んでいてもよい。一部の実施形態では、ポリマーは、ヌクレオシドモノマーがホスホジエステル結合によって接続されているポリヌクレオチド、またはその類似体である。
【００７９】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用され、それぞれヌクレオチドモノマーの直鎖状ポリマー、またはその類似体を意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対合、塩基スタッキング、またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎもしくは可逆的Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対合などの、モノマー間相互作用の規則的なパターンを経て天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能である。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間連結は、天然に生じてもよく、またはその類似体、例えば、天然に存在するか、または天然に存在しない類似体であってもよい。天然に存在しない類似体は、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、およびフルオロフォアまたはハプテンなどの標識の結合を可能にする連結基を含有する塩基などを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に際してポリメラーゼによる伸長またはリガーゼによるライゲーションなどの酵素処理を必要とするときにはいつでも、当業者には、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがそれらの場合に任意のまたはいくつかの位置でヌクレオシド間連結、糖部分、または塩基の類似体を含有しなくてもよいことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的にはそのサイズが、それらが通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合には、数モノマー単位、例えば５〜４０単位から、数千モノマー単位に及ぶ。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字（大文字または小文字）の配列によって表される場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序であり、文脈から他に指示されずまたは明らかにされない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｉ」はデオキシイノシンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すことが理解されよう。他に記述されない限り、専門用語および原子付番規則は、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９年）に開示されたものに従うことになる。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４種の天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡに関してはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンであり、またはＲＮＡに関してはそれらのリボース対応物である）を含み；しかし、それらは、例えば修飾された塩基、糖、またはヌクレオチド間の結合を含む非天然ヌクレオチド類似体を含んでいてもよい。酵素が、活性に関して特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件、例えば一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖などを有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に適切な組成物の選択は、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年）などの論文および同様の参考文献による指針により、十分に当業者の知識の範囲内にあることは、当業者には明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖の形態または二本鎖の形態（即ち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの二重鎖と、そのそれぞれの相補体）を指してもよい。どの形態が意図されるのかまたは両方の形態が意図されるのか否かは、用語の使用の文脈から、当業者には明らかであろう。
【００８０】
「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートとの二重鎖の形成に際して、核酸合成の開始点として作用することができ、その３’末端からテンプレートに沿って伸長されて、それにより伸長された二重鎖を形成することができる、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼによって行なわれる。伸長プロセスにおいて添加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲、または１８〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは種々の核酸増幅反応、例えば単一のプライマーを使用する直線的増幅反応、または２つもしくはそれより多いプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応に用いられる。特定の用途のためのプライマーの長さおよび配列の選択のガイダンスは、参照により組み込まれる以下の参考文献：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００３年）で証明されるように、当業者には周知である。
【００８１】
「分解能限界区域」は、その中では個々の特徴または発光源を光学シグナル検出システムによって区別することができない、ナノポアアレイまたはナノウェルアレイの表面の一区域である。理論に拘束されることは意図しないが、そのような分解能限界区域は、光学システムの解像限界（「回折限界」または「回折障壁」とも呼ばれることがある）によって決定される。そのような限界は、発光源の波長と光学成分とによって決定され、式中、ｄが、解像され得る最小の特徴であり、λが光の波長であり、ＮＡが光を集めるために使用される対物レンズの開口数である、ｄ＝λ／ＮＡによって定義され得る。したがって、２つまたはそれを超えるナノポアが分解能限界区域内にあり、２つまたはそれを超える光学シグナルがそれぞれのナノポアで発生する場合はいつも、光学検出システムは、どの光学シグナルがどのナノポアに由来したかを区別または決定することができない。本発明によると、ナノポアアレイの表面は、分解能限界区域に対応する、重複していない領域または実質的に重複していない領域に分割または細分され得る。分解能限界区域に対応するそのような細分化のサイズは、利用する特定の光学検出システムに依存し得る。一部の実施形態では、発光源が可視スペクトル内にある場合はいつも、分解能限界区域は３００ｎｍ２から３．０μｍ２の範囲内であり、他の実施形態では、分解能限界区域は１２００ｎｍ２から０．７μｍ２の範囲内であり、他の実施形態では、分解能限界区域は３×１０４ｎｍ２から０．７μｍ２の範囲内であり、ここで、区域の前記範囲は、ナノポアアレイまたはナノウェルアレイの表面に関してのものである。一部の実施形態では、可視スペクトルは、約３８０ｎｍから約７００ｎｍの範囲内の波長を意味する。
【００８２】
ポリヌクレオチドに言及する際の「配列決定」、「配列決定すること」または「ヌクレオチド配列を決定すること」または同様の用語は、ポリヌクレオチドの部分的ならびに完全な配列情報の決定を含む。すなわち、上記用語は、４種の天然ヌクレオチド、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの全ての組のサブセットの配列、例えば標的ポリヌクレオチドのＡおよびＣのみの配列などを含む。即ち用語は、標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの４つのタイプの１つ、２つ、３つ、または全ての同一性、順序、および場所を決定することを含む。一部の実施形態では、用語は、標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの４つのタイプの２つ、３つ、または全ての同一性、順序、および場所を決定することを含む。一部の実施形態では、配列決定は、標的ポリヌクレオチド「ｃａｔｃｇｃ．．．」内のヌクレオチドの単一タイプ、例えばシトシンの、順序および場所を識別することによって実現されてもよく、したがってその配列は、「ｃ−（非ｃ）（非ｃ）ｃ−（非ｃ）−ｃ．．．」などを表すバイナリーコード、例えば「１００１０１．．．」として表されるようになる。一部の実施形態では、用語は、標的ポリヌクレオチドのフィンガープリントとしての役割をする標的ポリヌクレオチドの配列を含んでいてもよく；即ち、一組のポリヌクレオチド内の標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスを独自に識別する配列であり、例えばセルによって表される全ての異なるＲＮＡ配列である。
【００８３】
本開示は、記述される特定の形態の範囲を限定するものではなく、本明細書に記述される変形例の代替例、修正例、および均等物を包含するものとする。さらに、本開示の範囲は、本開示に鑑み当業者に明らかになり得るその他の変形例を、完全に包含する。本発明の範囲は、添付される特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2019528776.tif 000003
【図１Ｂ】
2019528776.tif 000004
【図２Ａ】
2019528776.tif 000005
【図２Ｂ】
2019528776.tif 000006
【図２Ｃ】
2019528776.tif 000007
【図３】
2019528776.tif 000008
【図４】
2019528776.tif 000009
【図５】
2019528776.tif 000010
【図６Ａ】
2019528776.tif 000011
【図６Ｂ】
2019528776.tif 000012
【図６Ｃ】
2019528776.tif 000013
【配列表】
2019528776000001.app
【国際調査報告】
2019528776.tif 000014
2019528776.tif 000015