(57)【要約】【課題】本発明は人工遺伝要素の機能性を決定するための工程に関する。【解決手段】天然遺伝要素として同等の生物学的機能を果たすように設計した人工遺伝要素を細胞内に導入し、その細胞は、高頻度トランスポゾン突然変異誘発の条件に供される。次いで、転位因子の導入部位を表すＤＮＡ配列のセットを細胞から取得し、天然遺伝要素および人工遺伝要素への転位因子の挿入頻度が決定される。前記人工機能要素に機能の可能性を割り当てることを許すトランスポゾン挿入の頻度を比較することで、トランスポゾン挿入の頻度が両要素で本質的に等しい場合は高く、トランスポゾン挿入の頻度が人工遺伝要素の方が高い場合は低いとした。【選択図】図１
2019501642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工遺伝要素の機能性を決定するための方法であって、該方法は以下の工程
ａ）第１の複数の細胞を提供する工程であって、該細胞は細胞の増殖に必須の天然遺伝要素を含む工程；
ｂ）遺伝子組み換え工程において、前記天然遺伝要素と同等の生物学的機能を果たすことが予測または設計された人工遺伝要素を前記複数の細胞に導入する工程；
ｃ）突然変異誘発工程において、前記複数の細胞を高頻度のトランスポゾン突然変異誘発の条件に供し、転位因子が前記天然遺伝要素および／または前記人工遺伝要素に挿入され、その後に
ｄ）各配列が前記複数の細胞からの前記転位因子の挿入部位を表すＤＮＡ配列のセットを得る工程
ｅ）前記転位因子の以下の要素内への挿入の頻度を決定し、該要素は
−  前記天然遺伝要素および
−  前記人工遺伝要素である、工程
ｆ）前記天然遺伝要素へのトランスポゾン挿入頻度を前記人工遺伝要素へのトランスポゾン挿入の頻度と比較する工程
ｇ）前記人工機能要素の機能性の可能性を、  
−  トランスポゾン挿入の頻度が両要素について本質的に等しい場合は高く
−  トランスポゾン挿入の頻度が人工遺伝要素内で高い場合は低い
と割り当てる工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
対照細胞として機能する前記第１の複数の細胞の一部が、前記遺伝子組み換え工程を経ることなく前記突然変異誘発工程に供され、
前記対照細胞からの前記転位因子の挿入部位を示すＤＮＡ配列の第２のセットが得られ、前記対照細胞の前記天然遺伝要素への前記転位因子の第３の挿入頻度が決定され、ただし、
ｉ．トランスポゾン挿入の第１の頻度がトランスポゾン挿入の第３の頻度より高い場合、人工機能要素が機能的である可能性が高いと割り当て、および／または
ｉｉ．トランスポゾン挿入の第１の頻度が、トランスポゾン挿入の第３の頻度と実質的に等しい場合、人工機能要素が非機能的である可能性が高いと割り当てる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列のセットは、前記転位因子の少なくとも一部及び前記天然遺伝要素または前記人工要素の少なくとも一部を含むトランスポゾン接合配列をＰＣＲにより単離することにより得られ、該ＰＣＲは
−  前記転位因子に含まれる配列と特異的にアニーリング可能な第１のプライマーと前記天然遺伝要素に含まれる配列とアニーリング可能な第２のプライマーを用いるＰＣＲ、あるいは
−  前記第１のプライマー、前記天然遺伝要素の少なくとも一部に含まれる前記配列とアニーリング可能な第２のプライマー及び前記人工遺伝要素に含まれる配列および前記天然遺伝要素に含まれる配列の両方とアニーリング可能な第３のプライマーを用いるＰＣＲである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のプライマーおよび／または第３のプライマーが前記天然遺伝要素もしくは前記人工遺伝要素の少なくとも一部上でアニールするように設計される、３’ペンタヌクレオチド配列を含むランダムプライマーまたは準任意プライマーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスポゾン突然変異誘発が前記細胞において操作可能なトランスポザーゼをコードする前記転位因子を含む遺伝子構築物により媒介される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が細菌および古細菌ならびに一倍体酵母株からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
複数の人工遺伝要素が前記複数の細胞に導入され、前記複数の人工遺伝要素の各々が前記複数の人工遺伝要素の他のいずれか一つと区別され、かつ、異なる機能を有し、および前記複数の細胞は前記複数の人工遺伝要素に機能的に対応する複数の天然遺伝要素を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
核酸分子がプラスミドまたは人工染色体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ配列のセットが（＞）１，０００より多い配列を含む、特に＞１０，０００の配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記人工遺伝要素が、プロモーター、オペレーターもしくは他の転写制御因子、リボソーム結合部位もしくは他の転写制御配列、オープン・リーディング・フレーム、オペロン、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡもしくは他のＲＮＡ遺伝子および転写ターミネーターからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
合成生物学は困難な大規模な問題を解決するために有望であると考えられる。特に興味深いものは、再生可能資源から食品、燃料または化合物を製造するための経路および微生物細胞全体のバイオシステムの設計である。近年、大規模な生合成経路および全染色体の合成コピーでさえも組み立てに成功している。これらの成果にもかかわらず、大部分の大規模合成の取り組みは野生種鋳型からの遺伝子構成および配列を維持している。しかしながら、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成の実際の可能性は、生物学的対応物を欠損している完全にリファクタリングされたＤＮＡ分子合成にある。
【０００２】
合成生物学の主な挑戦は、より有効な経路における設計−組立−試験サイクルを進めることである。今日においても、合成ＤＮＡモジュールのエラー診断とデバッグは未だ非常に困難であり、モジュールを包含するより多くのコンポーネントの取得をより困難にしている。ゲノムスケールのリファクタリングがＤＮＡにコード化された命令の機能にどのように影響するかについての知識は、合成ゲノム構築物の機能を調べるための迅速で費用効果の高い試験方法が利用できないために限られている。機能性に対するＤＮＡリファクタリングの影響の多くは明白でなく、予測が困難である。一塩基置換は中立、またはコードされた生物学的機能を完全に破壊することができるので、ＤＮＡ配列の変化が許容されるものと、コードされた遺伝的機能を消去するものとを区別することは困難である。また、コードされたＤＮＡ機能性を解読する（すなわち、遺伝子が細胞系内でその機能を保存することができるかどうかを決定する）ことは、ＤＮＡ配列決定よりはるかに困難である。結果として、機能的な忠実度よりもシーケンスやシーケンス値の忠実度を変更することを躊躇している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、合成ＤＮＡ部分の大規模並列機能試験を可能にする手段および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本目的は、独立請求項の主題により達成される。本発明は、ゲノム規模に対しリファクタリングされたバイオシステム工学を活用し、トランスポゾンに基づくサーキット・テスティング・ストラテジー（以下、Ｔｎｃｉｔｅともいう）を介して合成ゲノム設計の部分機能性を評価することで達成される。
【発明の効果】
【０００５】
Ｔｎｃｉｔｅを介し、個々のＤＮＡにコード化された部分の機能性は、塩基対の分解能と並行して試験することができる。該方法は、ｉ）中心的な細胞機能を付与する、もしくはｉｉ）条件的に必須である、もしくはｉｉｉ）特定の成長条件または環境に対して高い適合性を有する、もしくはｉｖ）最終産物が重要であるまたは陽性選択マーカーに遺伝子的に結合することができる生合成経路などの生物学的構成成分をコードする任意の遺伝的部分に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、Ｔｎｃｉｔｅ部分試験法のワークフローを示す。
【図２】図２は、トランスポゾン挿入部分のマッピングに関するＤＮＡ部分の機能解析を示す。
【図３】図３は、合成生物学の設計−構築−試験サイクル中へのＴｎｃｉｔｅの導入を示す。
【図４】図４は、Ｔｎｃｉｔｅにより試験された必須合成ゲノムセグメントの環状マップを示す。
【図５】図５は、Ｔｎｃｉｔｅにより試験された必須合成ゲノムセグメントの直鎖上マップを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
表１−９は、８種の２０ｋｂの合成試験セグメントの機能的評価を示す。
【０００８】
Ｔｎｃｉｔｅの部分試験法は３段階の過程に基づく（図１）。
【０００９】
第１段階：必須あるいは高適応度の遺伝子機能（合成ＤＮＡ部分コピー）を包含する合成ＤＮＡ構築物（人工ゲノム全体までの大きさ）が、等価遺伝子機能の染色体またはエピソームのコピー（先祖または天然部分のコピー）を有する細胞に導入される。
【００１０】
合成および先祖部分が類似の配列を有する場合、中立の再コード化（ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｃｏｄｉｎｇ）あるいは他の塩基対置換は、対応する先祖部分配列から合成配列を明確に区別するために、合成部分中に透かし（ｗａｔｅｒｍａｒｋｓ）を導入するための設計プロセスおいて使用される。
【００１１】
第２段階：細胞はハイスループットのトランスポゾン突然変異誘発を受け、選択的な増殖条件下で培養される。
【００１２】
第３段階：Ｔｎ（トランスポゾン）挿入部位はハイスループットシークエンス（トランスポゾンシークエンス）を用い先祖または合成部分コピー中にマップされる。各部分で確認されたトランスポゾン挿入の数は、部分機能性のための正確な尺度となる。
【００１３】
合成部分が完全に機能を有していれば、同等のトランスポゾン挿入頻度は先祖および対応する合成部分コピーの両方で観察される（図２）。合成部分が機能しない場合、先祖部分のコピーは、破壊的なトランスポゾンの挿入を全く含まないまたは非常にわずかしか含まない（先祖部分の機能は合成部分コピーにより補完されないため）（図２）。
【００１４】
本明細書に記載のＴｎｃｉｔｅ法は、試験される部分の配列および機能の事前知識には依存しない。特に、本方法は、数百から数千の遺伝子部分からなるコンビナトリアル部分ライブラリーと同様に、シークエンシング無しで検証された合成ＤＮＡ構築物（コンストラクト）の機能的プロファイリングを可能にする。これは、合成ＤＮＡ構築物の配列が、部分的な機能性情報を得ることに加えて、トランスポゾン配列データから直接回収され、再構築されることができるという事実による。これにより、大規模な遺伝子部分ライブラリーおよび合成経路または合成ゲノム全体をコードする数キロ塩基長の合成ＤＮＡ構築物の効果的かつ高度に並列化された機能性試験が可能となる。要約すると、本発明は合成ゲノム構築および生合成経路工学における設計−構築−試験サイクルを劇的に促進するために合成生物学に広く適用する。
【００１５】
本発明の一態様は、人工遺伝要素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の機能性を決定するための方法であって、以下の工程を含む。
ａ）第１の複数の細胞を提供する工程であって、細胞はそれらのゲノム内に含まれる天然遺伝要素（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む細胞である工程；
ｂ）遺伝子組み換え工程において、前記天然遺伝要素と同一の生物学的機能を果たすことを予測し、または設計した人工遺伝要素を、前記複数の細胞に導入する工程；  
ｃ）突然変異誘発工程において、高頻度トランスポゾン突然変異誘発の条件に前記複数の細胞を供し、転位因子（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）が前記天然遺伝要素および／または前記人工遺伝要素内に無作為に挿入される可能性がある工程、および、その後に
ｄ）シーケンシング工程において、前記複数の細胞からの前記転位因子（トランスポゾン接合部）の挿入部位を表すＤＮＡ配列のセットを得る工程；および
ｅ）以下の要素内の前記転位因子の挿入頻度を決定する工程
−  前記天然遺伝要素は、トランスポゾン挿入の第１の頻度をもたらし、および  
−  前記人工遺伝要素は、トランスポゾン挿入の第２の頻度をもたらす；
ｆ）前記天然遺伝要素内へのトランスポゾン挿入の第１の頻度を前記人工遺伝要素内へのトランスポゾン挿入の第２の頻度と比較する工程、および
ｇ）以下によって前記人工機能要素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に機能性の可能性を割り当てる工程
−  トランスポゾン挿入の頻度が両要素で本質的に等しい場合は高く、および
−  トランスポゾン挿入の頻度が人工遺伝要素内で高い場合は低い。
【００１６】
ある実施形態において、本発明で使用される細胞は、人工遺伝要素の導入前に一倍体（ｈａｐｌｏｉｄ）ゲノムを有する。人工遺伝要素の導入は細胞を部分二倍体（ｍｅｒｏｄｉｐｌｏｉｄ）にし、あるいは全ゲノムが人工的コピーに加えられる場合は二倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）にする。本発明で用いられる細胞は遺伝子レベルで実質的に不明瞭である。いくつかの実施形態において、天然遺伝要素は細胞の増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）に必須である。  
【００１７】
人工遺伝要素の配列および天然遺伝要素の配列は、基本的に異なる配列である、あるいは天然および人工配列の区別を可能にする配列の特定の部分に意図的に導入された一定の配列の違いにより、識別可能となる。
【００１８】
突然変異誘発工程の後、適応度あるいは生存率の変化が有効になるように細胞を増殖させる。多くの実施形態では、一晩の培養で十分である。
【００１９】
ある実施形態において、対照細胞または対照株（人工的な要素を有する細胞が試験細胞または試験株と標識される）とする、前記第１の複数の細胞の一部は、前記遺伝子組換え工程を経験することなく前記突然変異誘発工程に供され、前記対照細胞由来の前記転位因子の挿入部位を表すＤＮＡ配列の第２のセットが得られ、前記対照細胞の前記天然遺伝要素中の前記転位因子の挿入の第３の頻度が以下のように決定される。
ｉ．（試験株の）前記天然遺伝要素内へのトランスポゾン挿入の第１の頻度が（対照細胞株の天然遺伝要素内への）トランスポゾン挿入の第３の頻度よりも高い場合、人工機能要素が機能を有する可能性が高いと割り当て、および／または
ｉｉ．（試験細胞株の）前記天然遺伝要素内へのトランスポゾン挿入の第１の頻度が（対照細胞株の天然遺伝要素内への）トランスポゾン挿入の第３の頻度と実質的に等しい場合、人工機能要素は機能を有さない可能性が高いと割り当てる。
【００２０】
ある実施形態では、前記ＤＮＡ配列のセットは、トランスポゾン接合配列を単離または同定または配列決定することによって得られる。トランスポゾン接合配列は、転位因子の少なくとも一部、および前記転位因子が挿入されている天然遺伝要素の少なくとも一部、あるいは前記人工要素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の少なくとも一部を含む。配列はＰＣＲにより単離されたり、同定されたり、配列決定されてもよい。方法は、当該分野で公知のＤＮＡ配列の同定、配列決定または単離のための現在のＰＣＲプロトコールを含み、以下のものを用いる。
−  前記転位因子に含まれる配列に特異的にアニーリングすることができる第１のプライマーと、前記天然遺伝要素に含まれる配列にアニーリングすることができる第２のプライマー、あるいは
−  前記第１のプライマー、前記天然遺伝要素の少なくとも一部に含まれる前記配列とアニーリングすることができる第２のプライマーおよび前記人工遺伝要素を含む配列および前記天然遺伝要素に含まれる配列の両方とアニーリングすることができる第３のプライマー、あるいは
−  前記人工遺伝要素および前記天然遺伝要素に含まれる配列の両方にアニーリングすることができる第３のプライマー。
【００２１】
当業者は、増幅産物がそれら配列によって識別可能でなければならないこと、すなわち、配列プライマーはそのような識別を可能にするような態様に置かれるように選択されなければならないこと、すなわち、人工遺伝要素および天然遺伝要素の両方について同一である排他的に増幅される遺伝要素の部分につながる可能性のあるプライマーを除外する。
【００２２】
ある実施形態では、第２のプライマーおよび／または前記第３のプライマーは、前記天然遺伝要素または前記人工遺伝要素の少なくとも一部上でアニールするように設計される特定の短い３’配列を有する３’−ペンタヌクレオチド配列または同様のプライマーを含む準任意（ｓｅｍｉ−ａｒｂｉｔｒａｒｙ）プライマーまたはランダムプライマーである。
【００２３】
準任意プライマーおよびその使用方法はＵＳ２０１３／０１４３７４５において記載されており、本明細書において、その全体が参照により包含される。
【００２４】
ある実施形態において、トランスポゾン突然変異誘発は、前記細胞内で操作可能なトランスポザーゼをコードする前記転位因子に含まれる遺伝子構築物によって媒介される。一例は、Ｔｎ５トランスポサーゼである。ある実施形態では、転位因子は、前記細胞において操作可能なプロモーターの転写制御下にある。
【００２５】
ある実施形態において、細胞は、細菌および古細菌、ならびに一倍体酵母株からなる群から選択される。
【００２６】
ある実施形態では、天然遺伝要素は前記細胞の増殖に必須である。
【００２７】
ある実施形態において、複数の人工遺伝要素は前記複数の細胞中に導入され、前記複数の人工遺伝要素の各々は前記複数の人工遺伝要素の他のいずれか１つと区別され、異なった機能を発揮し、前記複数の細胞は、前記複数の人工遺伝要素に機能的に対応する複数の天然遺伝要素を含む。各人工要素は、細胞に必須であるか、その適応度の高い寄与を有する対応する天然要素を有する。
【００２８】
ある実施形態では、複数の人工遺伝要素は、同じ核酸分子内に含まれる前記複数の細胞中に、すなわち、１つより多くの、しばしば複数の人工要素を含む構築物の一部として、導入される。
【００２９】
ある実施形態では、核酸分子は、プラスミドまたは人工染色体である。
【００３０】
ある実施形態では、ＤＮＡ配列のセットは、（＞）１，０００より多くの配列、特に＞１０，０００の配列を含む。
【００３１】
ある実施形態において、人工遺伝要素は、プロモーター、オペレーターまたは他の転写制御要素、リボソーム結合部位または他の翻訳調節配列、翻訳領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）、オペロン、ｔＲＮＡ、リボソームまたは他のＲＮＡ遺伝子および転写ターミネーターからなる群から選択される。
【００３２】
ハイスループットシークエンシング（Ｔｎｓｅｑ）に連結した高飽和トランスポゾン突然変異誘発を用いて、本発明者らは最近、細胞周期モデル生物Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓの必須配列の全セットを同定した。これらの配列から、本発明者らは、細菌細胞の最も基本的な機能をコードする合成ゲノムを編集している。ゲノムデザインは、強力な配列リファクタリング、一部の再構成、およびすべてのＣＤＳの完全な再コード化を実施する。
【００３３】
本発明の特定の実施形態は、以下のステップを採用する：Ａ）３０〜４０個のリファクタリングされたＤＮＡ部分からなる２０種の約２０ｋｂ長の合成セグメントの合成が実行される。Ｂ）セグメントはプラスミドにクローニングされ、適切な宿主細胞（例えば、メロ二倍体試験株を生産するＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）中を往復する。それ故、プラスミド上の各リファクタリングされたＤＮＡ部分については、同義のコピーが染色体上に存在する。Ｃ）その後、試験株はハイスループットシークエンシング（Ｔｎｓｅｑ）に連結した高飽和トランスポゾン突然変異誘発に供される。Ｄ）部分機能性を評価するために、破壊的トランスポゾン挿入が、前述の必須の染色体配列内で起こるかどうかについての判定を実施する。このような事象は、プラスミド上のリファクタリングされた部分が完全に機能し、染色体部分の消失を補う場合にのみ生じる。概念研究の証明において、本発明者らは、合成ゲノム設計の２０％に相当する、（アッセイした１３５個のうち）１０８個のリファクタリングされたＤＮＡ部分について、適切な部分機能性を確認している（図４と５および表１〜８）。
【００３４】
１３６個の機能的に検証されたＤＮＡ部分は、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡ合成のために最適化された配列であり、完全な配列決定はＧｅｎｏｍｅ  Ｃａｌｌｉｇｒａｐｈｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅアルゴリズムを用いて再コード化することによって利用される配列である。ＤＮＡリファクタリング、コドン最適化およびそれらの使用方法のためのＧｅｎｏｍｅ  Ｃａｌｌｉｇｒａｐｈｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅアルゴリズムは、（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５  ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ０００８７）に記載されており、その全体が参照により本明細書に包含される。
【００３５】
１０８個の機能性ＤＮＡ部分は、経路から完全に定義された遺伝子構造を有する合理化されたプラットフォーム生物に至るまで、複雑なバイオシステム領域にモジュール的に組み込むことができる。加えて、診断された２８個の非機能性合成部品は、機能性を改善するために追加の設計−構築−試験サイクルで再設計可能である（図３）。特定の部分が機能していないのかを理解することは、合成ＤＮＡ設計の生物学的規則の改善につながり、ゲノムが生物学的機能をプログラムする方法の理解において重要なギャップを明らかにするであろう。
【００３６】
ゲノム規模の合成部分の試験のためのＴｎｃｉｔｅの使用は、生物学的システム工学のための配列設計空間を拡大する新たな機会を提供する。結果として、合成生物学および合成ゲノミクスの研究は、もはや既存のＤＮＡ配列に基づく設計を構築することに限定されなくなるであろう。大規模ＤＮＡ配列の機能性を調べることに代わる試験戦略に用いれば、根底にある生物学的機能に影響を与えずに配列を根本的に変化させることが可能になるだろう。一方で、いかに速く機能的な合成ゲノム設計が達成されるかについては、はるかに大きな結果をもたらすであろう。加えて、大規模シークエンスの適応性は、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡ合成のための配列最適化、コドン使用適用性、遺伝子コード編集、ＤＮＡ部分と宿主細胞間の干渉を引き起こす重複遺伝子調節機構を消去するためのＣＤＳの再コード化を含む、劇的な配列のリファクタリングを可能にする。さらに、共調節および交換を促進するための遺伝子機能と関連させたグループ化を行うためのデフラグメンテーションが実現可能になる（例えば、脂質代謝、ゲノム複製および安定性等と関連した遺伝子またはｔＲＮＡとともにグルーピングすること）。
【００３７】
単一の分離可能な特徴の代替物が「実施形態」として本明細書に記載されている場合は、該代替物は、本明細書に開示する本発明の別個の実施形態を形成するため自由に組み合わせられると理解されるべきである。
【００３８】
本発明は、以下の実施例および図面によりさらに説明され、そこからさらなる実施形態および利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３９】
材料と方法:
合成必須ゲノム構築物の設計
Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのリッチ培地増殖に必要な必須および高適応度機能をコードするＤＮＡ配列（ＤＮＡ部分）の包括的リストを、以前に同定された必須ゲノムデータセットを用いて作成した（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、２０１１，Ｊ.Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．）。ＤＮＡ部分リストには、タンパク質、ＲＮＡおよび調節機能ならびに必須の遺伝子間の小配列をコードするＤＮＡ配列が含まれる。タンパク質をコードしている遺伝子の部分境界は、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＮＡ１０００ゲノムアノテーション（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＣ＿０１１９１６．１）および追加の５’−調節配列（プロモーター）およびターミネーター領域に従ってＣＤＳ座標に設定した。必須遺伝子の制御性上流配列の境界は、以前に同定された必須プロモーター領域に従い設定し（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、Ｊ.Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２０１１，７（１）：５２）、必要に応じ、ＲＮＡ配列により決定された強い転写開始部位を含むように拡大した。必須または高適応度遺伝子については、予測されるＲｈｏ非依存性ターミネーター配列が含まれていた。必須および高適応度のＤＮＡ部分を、野生型ゲノム上に見られるような順序および向きで連結し、７６６８２８塩基対長の合成ゲノム構築物にまとめた。遺伝子構築物はその後、３９種の２０ｋｂ長のセグメントに（図４および５を参照）、それらはさらに３〜４ｋｂのＤＮＡ構築ブロックに分割された。
【００４０】
８種の２０ｋｂ合成ゲノムセグメントの合成および配列最適化
８種の２０ｋｂの合成ゲノムセグメント（セグメント７、８、９、１０、１１およびセグメント２９、３０および３１、セグメントの概要については図４および５を参照）の配列を最適化するために、大規模ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡ合成を阻害することで知られている無効化配列パターンを消去する中立再コード化（コドン置換と同義）によりタンパク質をコードしている配列をリファクタリングした。異なるセグメントにわたる再コード化の確率は、０．１２５から１．０までに徐々に増加した。タンパク質コード配列(ＣＤＳ)の最初の４アミノ酸コドンは、潜在的翻訳および他の制御シグナルを維持するために再コード化から除外した。再コード化時に除去された無効化配列にはＢｓａｌ、Ａａｒｌ、ＢｓｐＱｌ、ＰａｃｌおよびＰｍｅｌのエンドヌクレアーゼ部が含まれていた。さらに、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓでは珍しいコドンであるＡＧＴ、ＡＴＡ、ＡＧＡ、ＧＴＡおよびＡＧＧコドンは不変コドン(再コード化時に導入も置換もされない)として設定した。アンバーストップコドンのＴＡＧおよびロイシンに対する２つのＴＴＡコドンとＴＴＧコドンは再コード化で消去された。８種の２０ｋｂ長の合成必須ゲノムセグメントを分割し、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡ合成の商業的供給業者（Ｇｅｎ９，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）から合成ｄｓＤＮＡ構築ブロックとして注文した。次いで、３ｋｂの合成ｄｓＤＮＡ構築ブロックを２０ｋｂセグメント内に会合させ、酵母組換え工学を用いた低コピープラスミドｐＭＲ１０（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＪ６０６３１２．１）内でクローン化した。会合した２０ｋｂの合成セグメントは、ＰａｃＢｉｏシークエンシングを用いて配列決定と配列検証を行った。
【００４１】
メロ二倍体試験株の構築とトランスポゾン突然変異誘発
必須ゲノム設計の異なる２０ｋｂ長の合成ＤＮＡ配列を有し、配列検証を行ったｐＭＲ１０プラスミドを大腸菌Ｓ１７−１から野生型Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＮＡ１０００に接合させ、８種のメロ二倍体試験株のセットを作製した。超飽和トランスポゾンライブラリーを作製するために、以前に記載されているとおりに（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、２０１０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１０；１０７（１０）：４６８１−８６）、接合に基づく突然変異誘発法を用いた。簡潔には、トランスポゾンの内部バーコード配列を有するＴｎ５トランスポゾン誘導体を、大腸菌Ｓ１７−１ドナー株から、ｐＭＲ１０プラスミド上の異なる２０ｋｂ長の合成ＤＮＡセグメントを有するメロ二倍体Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ試験株に接合させた。加えて、空のｐＭＲ１０プラスミドのみを有する対照株もまたＴｎ突然変異誘導法に供した。Ｔｎｃｉｔｅ実験を多重化するために、異なる４塩基長の内部バーコード配列を有するＴｎ５トランスポゾンを、異なる試験株の突然変異誘発に使用した。キシロースを補充したペプトン酵母プレート（ＰＹＥ）で一晩培養した後、各接合フィルターからの細胞を採取し、８００μｌのＰＹＥで再懸濁し、１００μｌアリコートをゲンタマイシン、ナリジクス酸、カナマイシンおよびキシロースを含有するＰＹＥプレートに播種した。プレートは３０℃で３日間培養し、各プレートからのトランスポゾン変異ライブラリーをプールした。
【００４２】
準任意ＰＣＲによるトランスポゾン接合部の並列増幅
イルミナシークエンシングに適合した末端アダプターを有するトランスポゾン接合部の増幅は、先に報告された方法（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、２０１１，Ｊ.Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．）を用いて実施した。第１および第２ラウンドのＰＣＲのために、Ｔａｑポリメラーゼミックス（ＢｉｏＭｉｘ  Ｒｅｄ，Ｂｉｏｌｉｎｅ，ＵＳＡ）を使用した。ＰＣＲ増幅は、サーマルサイクラー装置（Ｃ１０００  ｔｏｕｃｈ，バイオラド，クレッシア，スイス）上の３８４ウェルのＰＣＲプレート内で１０μｌの反応容量で行った。第１ラウンドのＰＣＲのために、Ｍ１３プライマーを先に記載されたとおりに（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、２０１１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１；７（１）：５２）、任意のＰＣＲプライマーとともに用いた。第１ラウンドのＰＣＲ増幅は次のＰＣＲプログラムにより実施した：（１）９４℃で３分、（２）９４℃で３０秒、（３）４２℃で３０秒  −１℃／サイクル勾配、（４）７２℃で１分、（５）ステップ（２）から（４）を６回、（６）９４℃で３０秒、（７）５８℃で３０秒、（８）７２℃で１分、（９）ステップ（６）から（８）を２５回、（１０）７２℃で３分、（１１）１２℃保温。第１ラウンドＰＣＲ産物を鋳型として１μｌ使用し、イルミナペアエンドプライマー＃１２８および＃１２９を用い、第２のネステッドＰＣＲステップにより第１ラウンドのＰＣＲ生成物をさらに増幅した。増幅は次のサーマルサイクル条件で実施した：（１）９４℃で３分、（２）９４℃で３０秒、（３）６４℃で３０秒、（４）７２℃で１分、（５）ステップ（２）から（４）を３０回、（６）７２℃で３分および（７）１２℃で保温。
【００４３】
ＤＮＡライブラリーの精製とイルミナ配列決定
各Ｔｎｃｉｔｅ実験からのＰＣＲ産物を統合し、ＤＮＡライブラリーを２％アガロースゲル上での電気泳動によりサイズ選択した。ＤＮＡ断片は２００ｂｐと７００ｂｐの間で分離し、カラムで精製した（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。各試料のＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）で定量し、種々の変異体ライブラリーからの試料を統合した。次世代シーケンシングおよびクラスター生成は、標準的なイルミナペアエンドフローセル（イルミナＨｉＳｅｑケミストリーｖ４）およびイルミナＨｉＳｅｑクラスターキットｖ４プロトコールに従った設定内で実施した。ＤＮＡサンプルは、ＨｉＳｅｑフローセルレーンあたり約２×１０８個のクラスターを生成するように滴定した。ＤＮＡ試料は、イルミナシークエンシングケミストリーバージョンｖ４と配列決定プライマーＰＥ１．０およびＰＥ．２．０を用いたＨｉｓｅｑイルミナ装置により両末端から１２５塩基でペアエンドで配列決定した。生画像からの標準的な塩基呼び出しは、ゲノムアナライザソフトウェアスイートＯＬＢ（イルミナ）に従って行った。ｐｈｉＸリファレンススパイクインを使用し、クロストークマトリックスを計算し、位相調整パラメータを較正した。配列決定はＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｚｕｒｉｃｈで行った。
【００４４】
配列解析およびトランスポゾン挿入部位のマッピング
Ｐｙｔｈｏｎ、Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎ、ｂｗａ、およびＭａｔｌａｂルーティンに基づくカスタム配列解析パイプラインを用いて、生データ処理、配列アライメントおよびゲノム挿入部位解析を実施した。低スコアのｐｈｒｅｄによって識別された低品質の読み取りデータは破棄された。Ｔｎ５トランスポゾン末端配列[‘ＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ’]に対し完全に一致する１５ｂｐ長のトランスポゾンの読み取りデータを選択した。対となる末端配列の最初の読み取りデータは、トランスポゾン末端配列を除去するためにトリミングした。対となる読み取りデータは任意のＰＣＲプライマーに対応する５’−配列を除去するためにトリミングした。異なるＴｎｃｉｔｅ実験内の脱多重化は、トランスポゾン末端に隣接する４ｂｐ長の内部トランスポゾンバーコード配列に従って実施した。イルミナＰＥ．２．０アダプターおよび任意のＰＣＲプライマー配列に対応するアダプター配列は、各ペアエンド読み取り対の最初の読み取りデータの３’末端からトリミングした。同様に、Ｔｎ５トランスポゾン末端配列の逆相補的配列を２回目の読み取りデータの３’末端からトリミングした。アダプター配列は、Ｐｙｔｈｏｎストリングと１５ｂｐの検索ウィンドウとの比較を用い検出した。各対の末端読み取りデータからのゲノム挿入物のサイズは、読み取りデータ１配列と読み取りデータ２配列との間の重複する読み取りデータの末端配列を試験することによって推測した。１５塩基対より大きいゲノム挿入を有する読み取りデータ対のみを選択した。読み取りデータは、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＮＡ１０００の参照ゲノムＮＣ＿０１１９１６と２０ｋｂ長の合成ＤＮＡカセットを有するプラスミドの対応配列上でｂｗａ−０７．１２（ＬｉおよびＤｕｒｂｉｎ，２００９，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９．Ｊｕｌ．１５；２５（１４）：１７５４−６０）を用い整列させた。適切なペアエンドアラインメントを有する読み取りデータと各読み取り末端の最初の１５ｂｐ内にミスマッチがないことが読み出された。ゲノムに明確にマップされ、５００塩基未満の挿入サイズを有する、対末端読み込みデータの少なくとも１種を有する特徴的なマッピング部位が、後の解析のために考慮された。標的ＤＮＡへの挿入の結果、Ｔｎ５転位は９塩基対長の重複を産生し、この結果は次の挿入部位解析で検討した。トランスポゾン挿入が与えられた位置は、トランスポゾンＩ末端外で読み上げられた直後に検出された第１の参照塩基のゲノム位置として定義され、この位置は外向きのＰｘｙｌプロモーターを含んでいる（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、２０１１，Ｊ.Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．同上）。カスタムのＭａｔｌａｂスクリプトを使用して大規模挿入統計を分析し、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＮＡ１０００ゲノムと対応するプラスミドの各注釈付きＧｅｎＢａｎｋ特徴部内のトランスポゾン挿入の発生および分布を計算した。Ｍａｔｌａｂ分析のアウトプットは、各ＧｅｎＢａｎｋ特徴部についての挿入マトリクスリスティング、確認されたトランスポゾン挿入の総数、およびトランスポゾン挿入の分布、方向およびリーディングフレームに関する追加情報からなる。この分析に適用されるメトリックおよびルーティンは、以前に記載されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、２０１１，Ｊ.Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．）。
【００４５】
合成ＤＮＡ部分の並列機能解析
トランスポゾン挿入数は異なる試料間でマップされた大規模のトランスポゾン挿入部位における違いを説明するため正規化した。各試験株について、合成ＤＮＡ部分および先祖（天然）部分コピー内の特徴的なトランスポゾン挿入の数を決定した。加えて、先祖部分コピー内のトランスポゾン挿入数を空のｐＭＲ１０プラスミドのみを有する対照株について決定した。合成部分は次のルールに則り分類した。合成ＤＮＡ部分が有意なレベルの挿入を示すが、対応する先祖部分が僅かしか挿入を有していない場合、合成部分は非機能性として分類される。合成および先祖部分の両方が、ほぼ同数のトランスポゾン挿入数を示し、および／または、対照株の先祖部分が有意に少数の挿入を示す場合は、合成ＤＮＡ部分は機能的として分類される（表１−９）。各ＤＮＡ部分の相対的適合度の値は、ゲノムに沿った無作為な転位事象と中立的な適応度の代償を仮定し、観察および予測されたトランスポゾンの挿入のヒット数間の比率により決定した。対照株とメロ二倍体試験株の先祖部分との適合度の差は、合成ＤＮＡ部分の機能性レベルの定量化に用いられた。Ｔｎｃｉｔｅ分析に基づいて割り当てられた適合度の値の例は、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ合成ゲノムの異なるセグメントのＴｎｃｉｔｅ部位機能性評価を記載する表１〜９に示されている。
【００４６】
表の先頭行の意味を以下に示す:
名称：合成ＤＮＡ部分の遺伝子座名
[ｂｐ]：塩基対における合成ＤＮＡ部のコード配列の長さ 
ＣＯＮ：対照株＝ＰＹＥリッチ培地条件下でのＣ.ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ ＮＡ１０００ 野生型
ＴＥＳＴ：Ｔｎｃｉｔｅ機能性解析に供された必須および高適合性遺伝子部分を有する、２０．６ｋｂ（セグメント７ａ、７ｂ）、１９．３ｋｂ（セグメント８）、２１．４ｋｂ（セグメント９）、２０．４ｋｂ（セグメント１０）、２０．８ｋｂ（セグメント１１）、１９．０ｋｂ（セグメント２９）、１９．４ｋｂ（セグメント３０）および２０．２ｋｂ（セグメント３１）長の合成ＤＮＡセグメントを含むｐＭＲ１０プラスミドを用いた合成試験株のＣ.ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＮＡ１０００ 
ＦＵＮＣＴ：  Ｔｎｃｉｔｅ機能性（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔ．：非機能性）
【００４７】
各ＤＮＡ部分に対する相対的適合度は、無作為な転位事象と中立的な適応コストを仮定し、観察されたトランスポゾンの挿入のヒット数と予測されたトランスポゾンの挿入のヒット数との間の比率により決定される。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
セグメント−７ａは、ＰＹＥ培地における標準的な増殖に対し不可欠、あるいは高い適応性を有する１３の再コード化遺伝子セットを含む。１３遺伝子のうち２個の合成部位（１５．４％）は非機能性である。セグメント−７ａに位置する合成部分の８４．６％に相当する残りの１１個の遺伝子について、適切な部分機能性が確認されている。合計３４５’６２８のトランスポゾン挿入が試験株のセグメント−７ａにマップされた。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
セグメント−７ｂは、ＰＹＥ培地中での標準的な増殖のために不可欠、あるいは高い適応性を有する１３の再コード化遺伝子セットを含む。１３遺伝子のうち３個の合成部位（２３．１％）は、合成相補性解析による機能性テストに失敗した。セグメント−７ｂに位置する合成部分の７６．９％に相当する残りの１１個の遺伝子については、適切な部分機能性が確認されている。合計２５５’２９４のトランスポゾン挿入が試験株のセグメント−７ｂにマップされた。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
セグメント−８は、ＰＹＥ培地中での標準的な増殖のために不可欠、あるいは高い適応性を有する１９の再コード化遺伝子セットを含む。１８遺伝子のうち５個の合成部分（２７．８％）は、合成相補性解析による機能性テストに失敗した。セグメント−８に位置する合成部分の７２．２％に相当する残りの１１個の遺伝子については、適切な部分機能性が確認されている。合計２０６’８５８のトランスポゾン挿入が試験株のセグメント−８にマップされた。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
セグメント−９は、ＰＹＥ培地中での標準的な増殖のために不可欠、あるいは高い適応性を有する２０の再コード化遺伝子セットを含む。２０遺伝子のうち５個の合成部分（２５．０％）は、合成相補性解析による機能性テストに失敗した。セグメント−９に位置する合成部分の７５．０％に相当する残りの１５個の遺伝子については、適切な部分機能性が確認されている。合計３２９’９４６のトランスポゾン挿入が試験株のセグメント−９にマップされた。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
合成セグメント−１０は、ＰＹＥ培地中での標準的な増殖のために不可欠、あるいは高い適応性を有する１６のＣＤＳを含む１６の再コード化遺伝子セットを含む。セグメント−１０に位置する合成部分の１００％に相当する１６個の遺伝子全てに、適切な部分機能性が確認されている。合計２９４’４０５’５６２のトランスポゾン挿入が試験株のセグメント−１０にマップされた。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
セグメント−１１は、ＰＹＥ培地中での標準的な増殖のために不可欠、あるいは高い適応性を有する１９の再コード化遺伝子セットを含む。１９遺伝子のうち３個の合成部分（１５．８％）は、合成相補性解析による機能性テストに失敗した。セグメント１１に位置する合成部分の８４．２％に相当する残りの１６個の遺伝子については、適切な部分機能性が確認されている。合計３２９’９４６のトランスポゾン挿入が本試験株でマップされた。
【００６０】
【表７】
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【００６１】
セグメント−２９は、ＰＹＥ培地中での標準的な増殖のために不可欠、あるいは高い適応性を有するＲＮエース  Ｐ  ＲＮＡ、ｔＲＮＡ−Ｌｅｕおよび２１個のＣＤＳを含む２３の再コード化遺伝子セットを含む。２３遺伝子のうち４個の合成部分（１７．４％）は、合成相補性解析による機能性テストに失敗した。セグメント−２９に位置する合成部分の８２．６％に相当する残りの１９個の遺伝子については、適切な部分機能性が確認されている。対照株については、合計４６４’６０７のトランスポゾン挿入がマッピングされ、合成プラスミドｐＭＲ１０＿セグメント−２９内で、試験株５２７’２７５染色体と８’４００挿入がマッピングされた。
【００６２】
【表８】
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【００６３】
セグメント−３０は、ＰＹＥ培地中での標準的な増殖のために不可欠、あるいは高い適応性を有する１８の再コード化遺伝子セットを含む。１８遺伝子のうち３個の合成部分（１６．６％）は、合成相補性解析による機能性テストに失敗した。セグメント−３０に位置する合成部分の８３．３％に相当する残りの１５個の遺伝子については、適切な部分機能性が確認されている。合計２９１’７３３のトランスポゾン挿入が本試験株でマップされた。
【００６４】
【表９】
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【００６５】
セグメント−３１は、ＰＹＥ培地中での標準的な増殖のために不可欠、あるいは高い適応性を有する１６のＣＤＳのセットを含む。１６遺伝子のうち１１個の合成部分（６９％）は、合成相補性解析による機能性テストに失敗した。セグメント−３１に位置する合成部分の３１％に相当する残りの５個の遺伝子については、適切な部分機能性が確認されている。合計３０８’５６２のトランスポゾン挿入が本試験株でマップされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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