(57)【要約】  本開示は、カルノシン−マグネシウム錯体を含む組成物に関する。該組成物は、皮膚に適用するように設計され、体内のカルノシンレベルの増大を引き起こす。カルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物は、アスリートの身体能力を改善する効果を有し、様々な医学的状態の治療に効果的であり得る。カルノシン−マグネシウム錯体を作製する方法も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性量のカルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物。
【請求項２】
前記カルノシン−マグネシウム錯体の生理活性量が、前記局所組成物の０．５ｗｔ％〜５ｗｔ％のカルノシン−マグネシウム錯体の量である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カルノシン−マグネシウム錯体が以下の式を有する、請求項１又は２に記載の組成物：
【化１】
2019505556.tif 000012
【請求項４】
ゲル、クリーム、溶液、軟膏、ペースト、ローション、パッチ、噴霧剤又はフォームの形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項５】
１，２−ペンチレングリコール、エトキシジグリコール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ミリスチルアルコール、ラウリルアルコール及びオクチルアルコール、サリチル酸オクチル、並びにミリスチン酸イソプロピルからなる群から選ばれる皮膚吸収促進剤構成要素を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項６】
潤滑剤、担体、増粘剤、保存料、界面活性剤、水、保湿剤及び皮膚軟化剤を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項７】
前記潤滑剤がシリコーン油、カプリル酸プロピルヘプチル、炭酸ジカプリリル、ジカプリリルエーテル、ヤシ脂肪酸エチルヘキシル、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、アジピン酸ジプチル及びアジピン酸イソプロピル、並びにそれらの混合物を含む群から選択され、前記担体が二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛、アクリレートコポリマー及びそれらの混合物を含む群から選択され、前記増粘剤がスクレロチウムガム、キサンタンガム、グアーガム、ペクチン、寒天、エトキシエチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸及びそれらの混合物を含む群から選択され、前記保存料がフェノキシエタノール、エチルヘキシルグリセリン、安息香酸、安息香酸塩、安息香酸エステル、ソルビン酸、ソルビン酸塩、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸塩及びそれらの混合物を含む群から選択され、前記界面活性剤が第四級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキルポリグルコシド及びコカミドプロピルベタインを含む群から選択される、請求項６に記載の局所組成物。
【請求項８】
ニコチン酸メチル、ニコチン酸エチル、ニコチン酸ヘキシル、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸トコフェロール、トウガラシオレオレジン、クスノキ樹皮油、サリチル酸メチル及びそれらの混合物を含む群から選択されるウォーミング剤を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項９】
ニコチネートが前記組成物中に存在する場合、該組成物の０．０５ｗｔ％〜０．１ｗｔ％存在し、トウガラシオレオレジンが前記組成物中に存在する場合、該組成物の０．５ｗｔ％〜１ｗｔ％存在し、クスノキ樹皮油が前記組成物中に存在する場合、該組成物の１ｗｔ％〜１０ｗｔ％存在し、サリチル酸メチルが前記組成物中に存在する場合、該組成物の１ｗｔ％〜１０ｗｔ％存在する、請求項８に記載の局所組成物。
【請求項１０】
皮膚下層、好ましくは表皮におけるカルノシンの濃度を増大させるための請求項１〜９のいずれか一項に記載の局所組成物の使用。
【請求項１１】
アスリートの身体能力を改善するための請求項１〜９のいずれか一項に記載の局所組成物の使用。
【請求項１２】
前記アスリートの身体能力が運動の継続、スピード及び筋肉の回復である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
糖尿病、メタボリックシンドローム、統合失調症における認知障害、自閉症スペクトラム障害、関節リウマチ、線維筋痛、アルツハイマー病等の認知症、老化、癌及び心血管疾患からなる群から選択される医学的状態の治療、改善及び／又は予防に使用される、請求項１〜９のいずれか一項に規定のカルノシン−マグネシウム錯体。
【請求項１４】
化学量論量の硫酸マグネシウム又は塩化マグネシウム又はクエン酸マグネシウム又は乳酸マグネシウムを、カルノシンの水溶液に添加する工程を含む、請求項１に規定のカルノシン−マグネシウム錯体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ゲル−クリーム製品等の局所使用のための組成物、特に栄養素及び／又は他の物質を、皮膚を通して送達するための局所経皮組成物及び方法に関する。特に、本開示は、局所使用のためのカルノシン−マグネシウム錯体に関する。該カルノシン−マグネシウム錯体は、皮膚を通して吸収されることができ、特にアスリートの身体能力を改善する効果を有し得る。さらに、ｐＨの低下又は病理学的酸化が起こる幾つかの疾患を改善することができる。
【背景技術】
【０００２】
カルノシン（β−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）は、最も豊富な供給源である骨格筋を含む多くの動物組織に見られる天然のヒスチジン含有化合物である。カルノシンは、分子量２２６．２３Ｄａの多機能ジペプチドである。カルノシンは非常に親水性が高く、分配係数（ｌｏｇ  Ｐ）は−２．９７２±０．４３６である（非特許文献１）。
【０００３】
カルノシンの分子構造を下記に示す：
【化１】
2019505556.tif 000002
【０００４】
カルノシンは、幾つかの潜在的結合部位：２つのイミダゾール窒素原子、１つのカルボン酸基及び１つのアミノ基を有する多座配位子である。カルノシンは、様々な金属イオン、例えばＮｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋及びＭｇ２＋と金属錯体を形成することが可能である。
【０００５】
Ｍｇ２＋と錯体を形成するためには、カルノシンを水溶液中に入れ、カルノシンのカルボキシル官能基を脱プロトン化して（ｐＫ＝２．６）（非特許文献２）、負に帯電したアニオン種を形成する：
【化２】
2019505556.tif 000003
【０００６】
マグネシウム塩の存在下で、カルボキシル官能基及びイミダゾール環のＮ１窒素の相互作用によりマグネシウムの配位が起こり、安定度定数がおよそ１０３の１：１カチオン性カルノシン−マグネシウム錯体が形成される（非特許文献２、非特許文献３）：
【化３】
2019505556.tif 000004
【０００７】
カルノシンは、幾つかの組織の構成物質であり、多数の生物学的役割を有する。例えば、カルノシンは、酵素調節及び筋小胞体カルシウム調節に用いられる（非特許文献４）。カルノシンは、ｐＨ緩衝剤及び抗酸化剤として作用することも可能である。
【０００８】
カルノシンは、体内で骨格筋を除く殆どの組織に見られる酵素カルノシナーゼによって分解される。これにより、骨格筋に見られる高いカルノシン濃度が一部説明される。
【０００９】
ヒト骨格筋におけるカルノシンの濃度は概して、５ｍＭ〜１０ｍＭ（湿重量）又は１５ｍｍｏｌ／ｋｇ〜４０ｍｍｏｌ／ｋｇ（乾重量）の範囲である。この濃度は、一つには筋肉量の差のために動物種によって異なる。例えば、ウマがグレイハウンド犬よりも高いカルノシン濃度を有することが報告されている。
【００１０】
カルノシンレベルは通例、遅筋線維と比較して速筋線維でより高く、これは全力疾走することが多く、爆発的な逃避反応を有し、又は長時間低酸素状態での潜水に耐える動物がより高い初期カルノシン濃度を有するという観察結果と一致する。
【００１１】
短距離走者及びボディビルダー等の無酸素スポーツに関わるヒトアスリートが、同様により高い筋肉内カルノシン濃度を有することが見出されている。Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．により合計１６回のトレーニングセッションにわたって週２回スプリントトレーニングを行った６人の男性被験体で観察されたように、これらのタイプのアスリートにおいて運動トレーニングが筋肉カルノシン濃度を増大することが報告されている。筋肉サンプルをトレーニングの１週間前、更にトレーニングプロトコルの２日後に外側広筋から採取した。結果から、筋肉カルノシン含量及び平均筋出力（ｐｏｗｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ）が８週間のトレーニング後に顕著に増大することが明らかとなった（非特許文献５）。
【００１２】
カルノシンは、細胞内ｐＨ緩衝剤として１９５３年にＳｅｖｅｒｉｎらによりカエル筋組織を用いて初めて発見された（非特許文献６）。ヒト筋組織におけるこの関係を検査する後続の研究がその後に行われた。骨格筋が中程度から激しい運動に関与する場合、通常は乳酸が生成する。これが続いて乳酸イオン及びＨ＋へと解離する。プロトン（ｐｒｏｔｏｎｓ：水素イオン）の生成によりｐＨレベルが変化する可能性があり、運動時に血中で生成されるプロトンの大部分が重炭酸イオン緩衝系によって緩衝されることが知られている。この系のｐＫａは６．１であり、カルノシン（ｐＫａ  ６．８３）よりも低いため、より大きなｐＨ変化がこの系から利益を得るために必要とされる。カルノシンのｐＫａは生理的ｐＨにより近いため、この分子が高強度の運動時に主要な緩衝剤として作用する可能性がある。実際に、イミダゾール環の窒素原子の１つがプロトンを受け取るために使用され得ることから、カルノシンのヒスチジン部分のイミダゾール基により、カルノシンが緩衝剤として特に効果的となり、細胞内ｐＨに近いｐＫａ値を有する（非特許文献７）。
【００１３】
Ｓｅｗｅｌｌらによって行われた研究（非特許文献８）では、種々のウマ線維型におけるカルノシンの緩衝能が特に検査された。カルノシンがＩ型線維において約２０％、ＩＩｂ型線維において最大４６％の緩衝に寄与することが見出された。これらの知見は、Ｉ型線維では、この線維型と関連するより低い強度の筋活動から、蓄積する乳酸がより少ないという観察結果と一致する。
【００１４】
緩衝効果とは別に、カルノシンが他の生理的役割を有することが見出された。例えば、カルノシンは、酸化ストレスに対する効果的な抗酸化剤として作用することが可能である。運動時に、活性酸素種（ＲＯＳ）が呼吸の増大（電子伝達系における電子流の増大を引き起こす）、又はｐＨの低下（これにより酸素がヘモグロビンから放出され、組織中のｐＯ２が増大する）のために生成され得る。ＲＯＳの生成が活動時の筋肉疲労に関係するとも考えられている。カルノシンは、ＡＴＰ貯蔵の維持を助けるために用いられるミオシンＡＴＰアーゼの活性化に関係する酵素調節とも関連している。
【００１５】
最後に、カルノシンが骨格筋における電子収縮（Ｅ−Ｃ）カップリング（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  （Ｅ−Ｃ）  ｃｏｕｐｌｉｎｇ：興奮収縮連関）で役割を果たすことが見出されている。Ｌａｍｏｎｔ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒによる初期研究（非特許文献９）から、１５ｍＭのカルノシンの存在がヨーロッパアカガエル（Ｒａｎａ  Ｔｅｍｐｏｒａｒｉａ）の筋線維におけるＣａ２＋感度の顕著な増大をもたらすことが示された。より最近では、Ｄｕｔｋａ  ａｎｄ  Ｌａｍｂ（非特許文献１０）により、カルノシンが機能性線維において生理的条件下でＥ−Ｃカップリングに影響を及ぼすかが検査された。Ｄｕｔｋａ  ａｎｄ  Ｌａｍｂは、機械的に除膜したラットの長趾伸筋線維を使用した。結果から、カルノシンが筋小胞体からのＣａ２＋放出に影響を及ぼさないが、カルノシンが筋線維の収縮要素のＣａ２＋感度を増大することができることが示された。Ｃａ２＋感度の増大が、疲労の後期においてＣａ２＋放出が減少し始めた後に力の発生の維持を助ける可能性があることが示唆された。したがって、より高レベルのカルノシンが高強度の運動時のＣａ２＋の減少及びＨ＋イオンの蓄積を相殺するのを助ける可能性がある。
【００１６】
カルノシンがＣａ２＋及び乳酸の濃度の制御の助けとなり、加えて酸化ストレスに対する効果的な抗酸化剤として作用することを考えると、体内のカルノシンの濃度を増大する局所生成物の配合が、化粧品及び医薬品について大きな関心が持たれる可能性がある。
【００１７】
薬剤を機能させるためには、薬剤中に含有される活性成分を、特定の作用部位に効果的な濃度かつ適切な時点で送達する必要があることが十分に理解されている。これらの要件はあらゆるタイプの活性成分に当てはまるが、局所官能基を有する活性成分についての皮膚用化粧品科学において特に重要である（非特許文献１１）。
【００１８】
皮膚に局所的に適用される活性成分は、その作用部位へと必要濃度で送達される前に、最上の皮膚障壁である角質層（ＳＣ）を透過することが可能でなくてはならない。しかしながら、特定の輸送機構だけでなく、概してＳＣの親油特性のために、親水性分子は角質層を効果的に透過することができない。したがって、ペプチド又はペプチド様物質のような親水性活性物質の皮膚バイオアベイラビリティを得ることは困難である（非特許文献５）。
【００１９】
１，２−ペンチレングリコール（ＰＧ）又はエトキシジグリコール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）等の促進剤分子がペプチドの皮膚透過を増大し、そのバイオアベイラビリティを改善することができる。実際に、Ｌ−カルノシン又はＮ−アセチル−Ｌ−カルノシンを含有する調製物へのＰＧの添加が、ＳＣ内の物質の顕著な増大をもたらすことが報告されている（非特許文献５）。促進剤分子を含まない配合物と比較して、ＳＣ及び生活（ｖｉａｂｌｅ）皮膚層でおよそ６倍以上のジペプチド濃度が検出された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】ＳｃｉＦｉｎｄｅｒＳｃｈｏｌａｒ：  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （ＡＣＤ／ｌａｂｓ）  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ８．１４  ｆｏｒ  Ｓｏｌａｒｉｓ，  ＴＭ  ２００７
【非特許文献２】Ｅ．  Ｊ．  Ｂａｒａｎ，  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  Ｃａｒｎｏｓｉｎｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０００，  ６５，  ７，  ７８９−７９７
【非特許文献３】Ｇ．  Ｒ．  Ｌｅｎｚ  ａｎｄ  Ａ．  Ｅ．  Ｍａｒｔｅｌｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９６４，  ３，  ７５０−７５３
【非特許文献４】Ｇ．  Ｂｅｇｕｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｐｏｒｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ２００５，  １５，  ４９３−５１４
【非特許文献５】Ａ．  Ｓ．  Ｂ．  Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ２０１２，  ２５：  ２８１−２８７
【非特許文献６】Ｓ．  Ｅ．  Ｓｅｖｅｒｉｎ，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃａｒｎｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ａｎｓｅｒｉｎｅ  ｏｎ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｇ  ｍｕｓｃｌｅｓ  −  ａｒｔｉｃｌｅ  ｉｎ  Ｒｕｓｓｉａｎ  −  Ｄｏｋｌ  Ａｋａｄ  Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ９１：６９１−６９４，  １９５３
【非特許文献７】Ａ．  Ａ．  Ｂｏｌｄｙｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ９３，  １８０３−１８４５，  ２０１３
【非特許文献８】Ｄ．  Ａ．  Ｓｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３，  ２７６−２８０，  １９９１
【非特許文献９】Ｃ．  Ｌａｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４５４，  ４２１−４３４，  １９９２
【非特許文献１０】Ｔ．  Ｌ．  Ｄｕｔｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ，  ２５，  ２０３−２１３，  ２００４
【非特許文献１１】Ｊ．  Ｗ．  Ｗｉｅｃｈｅｒｓ；  Ｓｋｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  Ｗｈａｔ  Ｉｔ  Ｉｓ  ａｎｄ  Ｗｈｙ  Ｗｅ  Ｎｅｅｄ  Ｉｔ；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｋｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
幾らかの進展にもかかわらず、体内のカルノシン濃度を増大することが可能な局所配合物が当該技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは予期せぬことに、カルノシンに配位したマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在が、皮膚への適用後に皮膚下層においてカルノシンレベルの顕著な増大をもたらすことを見出した。さらに、アスリートの皮膚に適用される生理活性量のカルノシン−マグネシウム錯体を含有する組成物が、アスリートの身体能力を大幅に改善することが見出された。
【００２３】
したがって、本開示の一態様は、生理活性量のカルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物に関する。局所組成物はゲル、クリーム、溶液、軟膏、ペースト、ローション、パッチ、噴霧剤又はフォームの形態とすることができる。局所組成物がゲルの形態であるのが好ましい。局所組成物は潤滑剤、担体、増粘剤、保存料、界面活性剤、保湿剤及び皮膚軟化剤を含む群から選択される添加物を含んでいてもよい。局所組成物は、ウォーミング剤を含んでいてもよい。
【００２４】
アスリートの身体能力を改善するための生理活性量のカルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物の使用も本開示の主題である。
【００２５】
本開示は糖尿病、メタボリックシンドローム、統合失調症における認知障害、自閉症スペクトラム障害、関節リウマチ、線維筋痛、アルツハイマー病等の認知症、老化、癌及び心血管疾患、統合失調症に見られるもののような認知障害、自閉症スペクトラム障害、アルツハイマー病を含む認知症、関節リウマチ、老化、線維筋痛、癌及び心血管疾患等の多数の医学的状態の治療、改善及び／又は予防に使用されるカルノシン−マグネシウム錯体にも関する。
【００２６】
カルノシン−マグネシウム錯体を製造する方法が本開示において更に企図される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１に記載の培地抽出物中のカルノシンレベルを示す図である。ｙ＝培地サンプル中のカルノシンレベル（ｎｇ／ｍＬ）。
【図２】実施例１に記載のホモジネート中のカルノシンレベルを示す図である。ｙ＝ＲＨＥの溶解物サンプル中のカルノシンレベル（ｎｇ／ｍＬ）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示は、皮膚への適用により身体に吸収されることができ、アスリートの身体能力を改善する効果を有し得る、生理活性量のカルノシン−マグネシウム錯体を含有するゲル製品に関する。言い換えると、マグネシウムとの錯体を形成することにより、カルノシンは皮膚を通して送達され、その作用部位、例えば骨格筋組織等に到達することができる。加えて、カルノシン−マグネシウム錯体は緩衝剤、特に細胞内及び／又は間質緩衝剤として作用することができ、ｐＨを緩衝することが可能であり、及び／又はＨ＋の蓄積を防ぐことが可能である。
【００２９】
具体的には、本開示は、生理活性量のカルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物に関する。局所組成物はゲル、クリーム、溶液、軟膏、ペースト、ローション、パッチ、噴霧剤若しくはフォームの形態、又は皮膚への適用に好適な任意の他の形態とすることができる。局所組成物がゲルの形態であるのが好ましい。
【００３０】
「生理活性量」という用語は本明細書で使用される場合、使用者が求める生物学的又は医学的応答を引き出す、カルノシン又はカルノシン−マグネシウム錯体等の活性成分の量を特に意味し得る。
【００３１】
カルノシン−マグネシウム錯体は、カルノシン−マグネシウム錯体の生理活性量に相当し得る、局所組成物の０．５ｗｔ％〜５ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。特に、カルノシン−マグネシウム錯体は、局所組成物の０．６ｗｔ％〜４．５ｗｔ％、特に０．７ｗｔ％〜４ｗｔ％、特に０．７５ｗｔ％〜３．５ｗｔ％、特に０．８ｗｔ％〜３ｗｔ％、例えば０．８５ｗｔ％〜２．８４ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００３２】
一実施形態では、局所組成物は、皮膚吸収促進剤構成要素を含んでいてもよい。皮膚吸収促進剤は担体、特にカルノシン−マグネシウム錯体用の担体と称される場合もあり、皮膚を通したカルノシン−マグネシウム錯体の輸送を促進することができる。
【００３３】
皮膚吸収剤（ｓｋｉｎ  ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）又は担体はエーテルアルコール、脂肪族アルコール若しくはエステル、又はそれらの混合物、特にエーテルアルコール又はエーテルアルコールの混合物を特に含み得る。特に、担体は２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、３−（３−プロポキシプロポキシ）−１−プロパノール、２−（２−プロポキシエトキシ）エタノール、１−（１−メチル−２−プロポキシエトキシ）プロパン−２−オール、１−（２−エトキシプロポキシ）−２−プロパノール、１，２−ペンチレングリコール、プロピレングリコール、短鎖及び長鎖アルコール、例えばエチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ミリスチルアルコール、ラウリルアルコール及びオクチルアルコール、並びにエステル、例えばサリチル酸オクチル及びミリスチン酸イソプロピルからなる群から選択される１つ以上の化合物を含み得る。好ましくは、皮膚吸収剤又は担体は、エトキシジグリコール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）とも称される２−（２−エトキシエトキシ）エタノールを特に含み得る。皮膚吸収構成要素は、局所組成物の０．５ｗｔ％〜４ｗｔ％、特に０．７５ｗｔ％〜３．５ｗｔ％、例えば１．０ｗｔ％〜３ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。更なる実施形態では、局所組成物は潤滑剤、担体、増粘剤、保存料、界面活性剤、水、保湿剤及び皮膚軟化剤を含む群から選択される１つ以上の構成要素を含んでいてもよい。
【００３４】
潤滑剤はシリコーン油、カプリル酸プロピルヘプチル、炭酸ジカプリリル、ジカプリリルエーテル、ヤシ脂肪酸エチルヘキシル、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、アジピン酸ジプチル及びアジピン酸イソプロピル、並びにそれらの混合物を含む群から選択することができる。
【００３５】
潤滑剤は、局所組成物の１ｗｔ％〜２０ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００３６】
担体は二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛及びアクリレートコポリマー、並びにそれらの混合物を含む群から選択することができる。
【００３７】
担体は、局所組成物の０．２ｗｔ％〜６ｗｔ％の範囲の量、好ましくは局所組成物の０．４ｗｔ％〜０．２ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００３８】
増粘剤はスクレロチウムガム（ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｇｕｍ）、キサンタンガム、グアーガム、ペクチン、寒天、エトキシエチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸及びそれらの混合物を含む群から選択することができる。
【００３９】
増粘剤は、局所組成物の０．１ｗｔ％〜４ｗｔ％の範囲の量、好ましくは局所組成物の０．２ｗｔ％〜２ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００４０】
保存料はフェノキシエタノール、エチルヘキシルグリセリン、安息香酸、安息香酸塩、安息香酸エステル、ソルビン酸及びソルビン酸塩、デヒドロ酢酸及びデヒドロ酢酸塩、並びにそれらの混合物を含む群から選択することができる。
【００４１】
保存料は、局所組成物の０．１ｗｔ％〜１．５ｗｔ％の範囲の量、好ましくは局所組成物の０．４ｗｔ％〜０．８ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００４２】
界面活性剤は、第四級アンモニウム塩等のカチオン界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤、アルキルポリグルコシド等の非イオン界面活性剤、又はコカミドプロピルベタイン等の両性界面活性剤を含む群から選択することができる。
【００４３】
界面活性剤は、局所組成物の０．０５ｗｔ％〜２ｗｔ％の範囲の量、好ましくは局所組成物の０．１ｗｔ％〜１ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００４４】
保湿剤（ｍｏｉｓｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）はグリセリン、ペンチレングリコール、ヒアルロン酸、トレハロース、イノシトール及びそれらの混合物を含む群から選択することができる。
【００４５】
保湿剤は、局所組成物の０．５ｗｔ％〜５ｗｔ％の範囲の量、好ましくは局所組成物の１ｗｔ％〜３ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００４６】
皮膚軟化剤は甘扁桃油、アロエベラ、シアバター（ｂｕｔｙｒｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｐａｒｋｉｉ  ｂｕｔｔｅｒ）、オリーブ（ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐｅａ）油、アルガン油、アボカド（ｐｅｒｓｅａ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）油、ヤシ油及びそれらの混合物を含む群から選択することができる。
【００４７】
皮膚軟化剤は、局所組成物の１ｗｔ％〜１０ｗｔ％の範囲の量、好ましくは局所組成物の２ｗｔ％〜４ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００４８】
水は、局所組成物の６０ｗｔ％〜９５ｗｔ％の範囲の量、好ましくは局所組成物の８０ｗｔ％〜９５ｗｔ％の範囲の量で局所組成物中に存在することができる。
【００４９】
本開示の局所組成物は、適用時に皮膚を温かくする効果を有する構成要素を導入することで改良することができる。この構成要素は、ウォーミング剤と称される。
【００５０】
したがって、本開示の局所組成物は、ウォーミング剤を含んでいてもよい。ウォーミング剤は、当該技術分野で既知の任意の好適なウォーミング剤から選ぶことができる。本開示の局所組成物に用いることができるウォーミング剤の例としては、ニコチン酸メチル、ニコチン酸エチル、ニコチン酸ヘキシル、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸トコフェロール、トウガラシ（ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）オレオレジン、クスノキ（ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ）樹皮油、サリチル酸メチル及びそれらの混合物を含む群から選択されるウォーミング剤が挙げられる。
【００５１】
本開示の一実施形態では、ニコチネート（ｎｉｃｏｔｉｎａｔｅ：ニコチン酸エステル）は、局所組成物の０．０５ｗｔ％〜０．１ｗｔ％の量で局所組成物中に存在することができる。
【００５２】
本開示の別の実施形態では、トウガラシオレオレジンは、局所組成物の０．５ｗｔ％〜１ｗｔ％の量で局所組成物中に存在することができる。
【００５３】
本開示の更なる実施形態では、クスノキ樹皮油は、局所組成物の１ｗｔ％〜１０ｗｔ％の量で局所組成物中に存在することができる。
【００５４】
別の実施形態では、サリチル酸メチルは、局所組成物の１ｗｔ％〜１０ｗｔ％の量で局所組成物中に存在することができる。
【００５５】
一実施形態では、局所組成物はクレアチン及び／又はカルニチン、特にクレアチン−マグネシウム錯体及び／又はカルニチン−マグネシウム錯体を更に含んでいてもよい。言い換えると、局所組成物は、アスリートの身体能力を改善する特定の顕著な効果、又は更には相乗効果をもたらし得る、カルノシン−マグネシウム錯体とクレアチン−マグネシウム錯体及び／又はカルニチン−マグネシウム錯体との組合せを含んでいてもよい。クレアチンは、細胞外緩衝剤として作用することができ、カルノシンと組み合わせることで、細胞内緩衝剤及び細胞外緩衝剤の両方を提供することによって相乗効果を有し、運動能力を改善する。カルニチンは、エネルギー産生及び自閉症スペクトラム障害の治療におけるその役割により、カルノシンと相乗作用を示し得る。
【００５６】
一実施形態では、局所組成物は、強酸性のＬ−カルニチンＬ−酒石酸塩を緩衝し、細胞外緩衝剤としての付加的な利益を与えることができる重炭酸ナトリウムを更に含んでいてもよい。特に、重炭酸ナトリウムは、細胞外緩衝剤として働くことができ、カルノシンと組み合わせた場合に水素を軽減するカルノシンの能力を改善し、この細胞外非重炭酸塩緩衝は、非重炭酸塩緩衝剤の逆滴定から生じるＨ＋イオンの放出を軽減することによって重炭酸ナトリウムの有効性を改善し得る。
【００５７】
一実施形態では、局所組成物は、オキシトリプタンとしても知られる５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）を更に含んでいてもよい。５−ＨＴＰは天然アミノ酸であり、神経伝達物質セロトニンの生合成における化学的前駆体及び代謝中間体である。このため、既知の細胞質神経ペプチドであるカルノシンは、５−ＨＴＰの送達を局所的に助ける可能性がある。
【００５８】
一実施形態では、局所組成物は、クエン酸カリウム又は炭酸水素カリウムを含むが、これらに限定されない形態でカリウムを更に含んでいてもよい。かかる配合物は、中程度から激しい運動の際に間質ｐＨの低下を遅らせる助けとなり得る。細胞外ｐＨ環境の改善は、Ｋ＋バランスを改善し、疲労の発生時の血流量の低下を防ぐ可能性がある。
【００５９】
一実施形態では、局所組成物は、Ｄ−リボースを更に含んでいてもよい。Ｄ−リボースは、心臓及び骨格筋における細胞エネルギー合成を増大することが示されており、カルノシンを添加することで、線維筋痛及び慢性疲労症候群に影響を与えるために使用することができる。
【００６０】
一実施形態では、局所組成物は、コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）を更に含んでいてもよい。ＣｏＱ１０は、ミトコンドリアの呼吸鎖において必須の電子伝達体であり、強い抗酸化剤であり、ミトコンドリアの機能を変化させる。その欠乏は、活性酸素種（ＲＯＳ）生成の増大につながる。ＣｏＱ１０が線維筋痛患者の単核細胞において欠乏していることが示されている。ＣｏＱ１０は親油性であるため、局所配合物が既に存在するが、皮膚を透過するＣｏＱ１０とカルノシンとの抗酸化剤の組合せは、カルノシンが親水性であることから不可能であった。この組合せは、線維筋痛のような病態を治療するためのフリーラジカルの低減に効果的であり得る。
【００６１】
ゲルとして提供される局所組成物の例示的な組成は、以下の成分（重量パーセント単位）によって与えられる。
【００６２】
成分                                  濃度
水                                    残余
グリセリン                            ２．２０％〜４．１０％
エトキシジグリコール                  ０．８１％〜３．１５％
カルノシン−マグネシウム錯体          ０．８５％〜２．８４％
ＰＶＰ                                ０．７６％〜１．８７％
ヒドロキシプロピルセルロース          ０．７２％〜１．８２％
フェノキシエタノール                  ０．１２％〜１．４３％
【００６３】
カルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物は、カルノシナーゼによる加水分解を回避することができ、ｐＨ緩衝剤として働くことができる。
【００６４】
本開示のカルノシン−マグネシウム錯体はマグネシウム塩、水溶液及びカルノシンを組み合わせることによって調製することができる。カルノシンを含有する水溶液にマグネシウム塩を添加するのが好ましい。化学量論量のマグネシウム塩を使用するのが好ましい。
【００６５】
好適なマグネシウム塩としては、硫酸マグネシウム又は塩化マグネシウム又はクエン酸マグネシウム又は乳酸マグネシウムが挙げられる。マグネシウム塩が硫酸マグネシウムであるのが好ましい。水溶液が水であるのが好ましい。
【００６６】
水溶液中のマグネシウム塩の濃度は、１重量％〜１０重量％の範囲、好ましくは１重量％〜５重量％の範囲である。
【００６７】
水溶液中のカルノシンの濃度は、１重量％〜１０重量％の範囲、好ましくは１重量％〜５重量％の範囲である。
【００６８】
カルノシン及びマグネシウム塩を室温にて水溶液中で互いに接触させた後、ほぼ即座にカルノシン−マグネシウム錯体が形成する。
【００６９】
形成後にカルノシン−マグネシウム錯体を使用して、局所組成物を調製することができる。局所組成物は、種々の構成要素を撹拌することによって調製することができる。
【００７０】
カルノシン−マグネシウム錯体は、皮膚下層におけるカルノシンの濃度を増大するために使用することができる。かかる皮膚層としては、例えば表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）が挙げられる。
【００７１】
本開示のカルノシン−マグネシウム錯体は、運動の継続（ｅｆｆｏｒｔ  ｄｕｒａｔｉｏｎ）、スピード及び筋肉の回復等の被験体の運動能力を増大するために使用することができる。
【００７２】
本開示のカルノシン−マグネシウム錯体は糖尿病、メタボリックシンドローム、統合失調症における認知障害、自閉症スペクトラム障害、関節リウマチ、線維筋痛、アルツハイマー病等の認知症、老化、癌及び心血管疾患等の多数の医学的状態の治療、改善及び／又は予防に使用することができる。本開示のカルノシン−マグネシウム錯体は、特にｐＨの低下又は病理学的酸化が起こる多くの医学的状態を改善することができる。
【００７３】
表皮等の皮膚下層におけるカルノシンの濃度を増大するためのカルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物の使用も本開示の主題である。
【００７４】
本開示の局所組成物は、被験体の運動（身体）能力を増大するために使用することもできる。
【００７５】
糖尿病、メタボリックシンドローム、統合失調症における認知障害、自閉症スペクトラム障害、関節リウマチ、線維筋痛、アルツハイマー病等の認知症、老化、癌及び心血管疾患からなる群から選択される医学的状態の治療、改善及び／又は予防に使用される本明細書に記載のカルノシン−マグネシウム錯体も本開示の主題である。
【００７６】
糖尿病及びメタボリックシンドローム：グルコースによる不可欠な酵素及び他のタンパク質の破壊的変化（糖化プロセス）は、老化及び糖尿病の主な原因の１つである。このプロセスは、糖尿病では常に上昇したグルコースレベルのために加速する。したがって、第一に糖化を防ぐことができる物質、又は既存のタンパク質糖化を逆転させることができる物質が糖尿病の治療における強力な治療剤となり得る。カルノシンは、糖尿病における糖化産物の損傷効果に対して赤血球膜を安定化させることができる。付加的に、カルノシンは、ヒトＬＤＬコレステロールを酸化及び糖化の両方から保護する。このため、本明細書に記載の局所組成物を糖尿病の治療に使用することができる。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、四肢に適用することである。
【００７７】
統合失調症における認知の改善：グルタミン酸機能障害の標的化は、統合失調症における認知障害を改善する絶好の機会をもたらす。治療アプローチの１つは、グルタミン酸作動性シナプスでの不適切な抗酸化防御を標的としている。動物及びヒトのデータから、ＮＭＤＡアンタゴニストが実行認知制御を悪化させ、例えば固執応答を増大し、セットシフティングを損なうことが示唆される。グルタミン酸と共に共局在化し、放出される抗酸化剤及び抗糖化剤であるＬ−カルノシンが、グルタミン酸と関連する認知領域の実行機能不全を改善するという仮説を試験するために予備研究を行った。７５人の慢性統合失調症を有する症状が安定した成人を、二重盲検法で３ヶ月にわたる補助治療としてのＬ−カルノシン（２ｇ／日）又は対応プラシーボに無作為に割り当てた。戦略的ターゲット検出テストでは、Ｌ−カルノシン群がプラシーボと比較して顕著に改善された戦略的効率を示し、固執的誤りがより少なかった。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、四肢に適用することである。
【００７８】
自閉症スペクトラム障害：小児自閉症評定尺度、ギリアム自閉症評定尺度、表出及び受容一単語絵画語彙テスト（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｉｖｅ  Ｏｎｅ−Ｗｏｒｄ  Ｐｉｃｔｕｒｅ  Ｖｏｃａｂｕｌａｒｙ  ｔｅｓｔｓ）、並びに変化の臨床全般印象を測定した。プラシーボ群の小児は、統計的に有意な変化を示さなかった。８週間にわたるＬ−カルノシン投与後に、小児はギリアム自閉症評定尺度（総スコア、並びに行動、社会化及びコミュニケーションのサブスケール）及び受容一単語絵画語彙テストで統計的に有意な改善を示した（全てＰ＜０．０５）。改善傾向が他の転帰尺度で確認された。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、四肢に適用することである。
【００７９】
関節リウマチ：関節リウマチ（ＲＡ）の治療に使用されるカルノシンの治療可能性が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で調査され、大いに奏功している。細胞内酸化剤レベルの抑制が、関節を酸化ストレスから保護し、更なる分解を停止させる全身的抗炎症活性と共に観察された。自己免疫疾患におけるカルノシンの抗炎症能は、かかる研究において認められ始めたばかりである。この新規の治療法の唯一の制限は、カルノシンの経口送達であり、経口カルノシン摂取に対して大きな非応答者率が見られる。本開示による局所組成物は、かかる制約を克服するため、関節リウマチを治療する治療可能性を有する。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、四肢に適用することである。
【００８０】
線維筋痛：酸化ストレスは、線維筋痛における疲労の症状と関連する。酸化ストレスを軽減する本開示による局所組成物の能力は、線維筋痛の症状及び／又は進行に対処する大きな可能性を有する。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、四肢に適用することである。
【００８１】
アルツハイマー病（ＡＤ）を含むが、これに限定されない認知症：カルノシンは、アミロイド−βペプチド毒性を抑制し、酸素フリーラジカルの生成を阻害し、ヒドロキシルラジカル及び反応性アルデヒドを除去し、タンパク質糖化を抑制することができる。糖化タンパク質は、ＡＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に蓄積する。ヒトＣＳＦ中のホモカルノシンレベルは、加齢に伴って激減する。ＣＳＦの組成及び代謝回転は、カルノシン及びホモカルノシンの特異的輸送体を保有する脈絡叢によって制御される。カルノシンはタンパク質カルボニルと反応し、糖化タンパク質の反応性を抑制する。炭酸脱水酵素（ＣＡ）活性は、ＡＤ患者の脳において減少している。ＣＡ活性化因子の投与は、動物における学習を改善する。カルノシンはＣＡ活性化因子である。タンパク質架橋が、ＡＤ脳の神経原線維濃縮体（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）中に存在する。カルノシンは、培養筋細胞及び老化培養線維芽細胞におけるタンパク質分解を刺激する。これらの観察結果から、カルノシン及び関連構造をＡＤ及び他の神経変性障害に対する治療可能性について探索すべきであることが示唆される。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、四肢に適用することである。
【００８２】
老化防止：老化は、正確な基本的機構が不明確である生理的過程であるが、ＤＮＡ損傷及びテロメア短縮化、遺伝子発現の変化、酸化ストレスの誘発、ＡＴＰ合成の障害、並びに変性タンパク質の蓄積を含み得る。細胞培養物、動物及びヒトを用いる実験的研究において観察された多くの生理的効果がカルノシンに割り当てられている。この状況では、カルノシンが抗酸化、二価金属イオンキレート化、筋肉プロトン緩衝、抗架橋及び反応性カルボニルスカベンジャー活性を含む、その推定され得る生化学的特性のために老化プロセスに関連する幾つかの機構に対抗すると考えられる。ヒトＣＳＦ中のホモカルノシンレベルは、加齢に伴って激減する。本開示による局所組成物は、カルノシンの送達に効果的である。この局所組成物は、老化によるカルノシンレベルの自然な低下を補う可能性を有する。最近の研究から、カルノシンが老化に伴うテロメア短縮速度及びテロメアＤＮＡの損傷の低減に大きく寄与し得ると示唆されている。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、四肢に適用することである。
【００８３】
癌：抗酸化剤として、カルノシンは、培養細胞における癌性形質転換を引き起こし得るＤＮＡ損傷の阻止を助け、実験室内で若年被験体から培養された細胞の寿命を延ばす。カルノシンはまた、腸細胞における炎症性サイトカインの放出を防ぎ、結腸癌の重大なリスクを低下させる。新たな転移を阻害し、癌細胞のエネルギー代謝を妨げるその能力は、カルノシンを潜在的抗癌栄養素として更に魅力的なものとしている。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、患部及び四肢に適用することである。
【００８４】
心血管疾患：カルノシンは、多数の驚くべき方法で虚血再灌流傷害を防ぐ。カルノシンは、興奮性神経伝達物質グルタミン酸の毒性を低減することによって脳卒中後の脳細胞を保護する。興味深いことに、カルノシンによる処理は、マウスにおいて実験的に生じさせた脳卒中に関与する脳組織の量を顕著に低減した。おそらくより印象的には、カルノシンサプリメントは、第一に動物の脳を限局性虚血から守る。この発見は、脳卒中後の実験動物の生存を増大することで高い評価を得ている。推奨投与量は、上に例示される局所組成の例示的な組成物４ｍｌ〜６ｍｌを１日４回、四肢に適用することである。
【００８５】
本開示の局所組成物は、皮膚への適用のためのものである。該局所組成物は、身体上のあらゆる皮膚に適用されるが、脚、腕、胴に適用するのが最も好適である。
【００８６】
カルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物を皮膚に適用する場合、２４時間後に、皮膚に適用されたカルノシンの０．００３３％及び０．０２％がＥｐｉＤｅｒｍ（商標）再構築ヒト表皮モデルの皮膚層を通り、培地中に見ることができる。
【００８７】
カルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物を皮膚に適用する場合、４８時間後に、皮膚に適用されたカルノシンの０．００５％〜０．０１％がＥｐｉＤｅｒｍ（商標）再構築ヒト表皮モデルの皮膚層を通り、培地中に見ることができる。
【００８８】
カルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物を皮膚に適用する場合、２４時間後に、皮膚に適用されたカルノシンの０．０３３％〜０．０１％を、ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）再構築ヒト表皮モデルの皮膚モデルのホモジネート中に見ることができる。
【００８９】
カルノシン−マグネシウム錯体を含む局所組成物を皮膚に適用する場合、４８時間後に皮膚に適用されたカルノシンの０．０５％〜０．０７％を、ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）再構築ヒト表皮モデルの皮膚モデルのホモジネート中に見ることができる。
【００９０】
複数層の局所組成物を皮膚領域に適用することができる。好ましくは１層〜５層（ｃｏａｔｓ）の局所組成物が皮膚領域に適用され、より好ましくは１層〜３層の局所組成物が皮膚領域に適用される。
【００９１】
１層以上の局所組成物を１日１回〜５回、好ましくは１日１回〜３回皮膚に適用することができる。局所組成物は、時間を問わず（ａｔ  ａｎｙ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｄａｙ：１日のうちいつでも）、また運動前、運動後又は運動中に皮膚に適用することができる。局所組成物を運動の前後に皮膚に適用するのが好ましい。
【００９２】
局所組成物は、時期を問わず（ａｔ  ａｎｙ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｙｅａｒ：１年のうちいつでも）、任意の周囲温度で皮膚に適用することができる。
【００９３】
本開示の局所組成物は必要に応じて、必要とされる限り使用することができる。
【００９４】
本開示の局所組成物は、あらゆる性別及び民族性の成人被験体に使用することができる。
【実施例】
【００９５】
実験項
材料及び方法
以下の３つのサンプルを実験に使用した：
サンプルＡ：最終ゲル配合物（下記表１に提示する配合を有する）中のカルノシン−マグネシウム錯体。
【００９６】
【表１】
2019505556.tif 000005
【００９７】
サンプルＢ：サンプルＡについての最終ゲル配合物中の遊離カルノシン。
サンプルＣ：活性成分カルノシンを含まない最終ゲル配合物。全てのサンプルがゲル配合物である。
【００９８】
実施例１
３Ｄ皮膚モデルにおけるゲル配合物中のカルノシン−マグネシウム錯体の経表皮透過の評価
記載の実験の焦点は、バイオアベイラビリティを改善することを目的とした、モノカチオン性錯体（カルノシン−マグネシウム錯体）を形成する、マグネシウムと会合したＬ−カルノシンを含有するゲル配合物によるヒト皮膚へのＬ−カルノシンの送達を調査することである。調査はカルノシンを含まない調製物を参照生成物として用いて行った（非特許文献６）。
【００９９】
ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）再構築ヒト表皮（ＲＨＥ）モデル及び処理
再構築ヒト表皮（ＲＨＥ）をヒト皮膚組織モデルとして使用した。ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）組織モデルは、ＭａｔＴｅｋ（ＭａｔＴｅｋ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ，Ｓｌｏｖａｋ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）から購入した。受け取り後に組織をＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（商標）維持培地に移し、加湿５％ＣＯ２雰囲気にて３７℃で維持した。
【０１００】
ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）再構築ヒト表皮（ＲＨＥ）モデルは、正常ヒトケラチノサイトから気液界面で成長させた三次元表皮組織からなる。このモデルは、ヒト表皮と組織学的に同様であり、全ての分化細胞層及び機能的透過障壁を有する。
【０１０１】
処理を行う前に培地を抜き取り、新鮮培地を添加した。処理のために、１０μＬの３つの異なる混合物（Ａ：カルノシン錯体、Ｂ：促進剤を含まない遊離カルノシン、Ｃ：ビヒクル）を各々、別個のＲＨＥ組織に２４時間の単回投与又は合計４８時間にわたって２４時間毎の反復適用のいずれかで局所的に適用した。対照組織は培地にのみ曝露した。対照組織について２４時間及び４８時間で適用した投与間で違いが観察されなかったため、サンプルをプールし、対照群として提示した。全ての混合物及び対照サンプルを、各群について３組のＲＨＥを用いて三連でアッセイした。
【０１０２】
２４時間又は４８時間の処理後に組織培地アリコートを採取し、１０００×ｇにて４℃で２０分間遠心分離して、不溶性不純物及び組織残屑を除去した。透明な上清を分析まで−２０℃で保管した。ＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した後、ＲＨＥ組織を１５０μｌのＰＢＳが入ったガラスポッター（ｇｌａｓｓ  ｐｏｔｔｅｒ）において氷上でホモジナイズした。次いで、ホモジネートを５０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を得て、これを分析まで−２０℃で保管した。
【０１０３】
カルノシンに対するＥＬＩＳＡ
カルノシンレベルを、異なる時点（２４時間又は４８時間）で採取したＲＨＥ培養培地及びホモジネートにおいて、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）キット（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ）を用いて決定した。手順を製造業者の指示書に従って行った。吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。検量線を、カルノシンを標準として用いて得た。全てのサンプルを二連でアッセイした。カルノシンの検出下限は、８．４３８ｎｇ／ｍＬであった。結果はｎｇ／ｍＬ単位で表す。ベースラインレベル（対照ＲＨＥ）からのカルノシンレベルの変化を、スチューデントｔ検定に基づいて比較した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【０１０４】
結果
カルノシンレベルを培地及びホモジネート中で測定し、２４時間（第１の時点）及び４８時間（第２の時点）での３つのサンプルＡ、Ｂ及びＣについての結果を下記に報告する。
【０１０５】
培地中のカルノシンレベル
処理の２４時間後の第１の時点では、サンプルＡについて最も高いカルノシンレベルが検出され、対照組織中のカルノシンレベルと比較したＰ値は０．０２８であった。サンプルＢのカルノシンレベルは対照組織よりも高かったが、このデータのＰ値は有意でなかった（ｐ＝０．０６５）。
【０１０６】
サンプルＡとサンプルＢとの比較により、サンプルＡの培地中で検出されたカルノシンレベルが、サンプルＢの培地中で検出されたカルノシンレベルよりも有意に高いことが示される（ｐ＝０．０４３）。サンプルＣの培地中で検出されたカルノシンレベルは、対照組織について記録されたカルノシンの濃度と同等であった。
【０１０７】
処理の４８時間後の第２の時点では、サンプルＡの培地中のカルノシンレベルは、対照組織中で検出されるカルノシンレベルよりも高かったが、第１の時点で検出されるレベルよりも低かった。
【０１０８】
サンプルＢ及びＣの培地中のカルノシンレベルは、第１の時点で検出されたレベルと同様であった。
【０１０９】
【表２】
2019505556.tif 000006
【０１１０】
【表３】
2019505556.tif 000007
【０１１１】
ＲＨＥ溶解物中のカルノシンレベル
第１の時点で、サンプルＡで処理した組織は、対照組織中で検出されるレベルよりも有意に低いカルノシン含量を有していた（ｐ＝０．０１９）。
【０１１２】
サンプルＢで処理した組織において、カルノシンレベルは対照組織と比較して増大したが、このデータは有意でなかった（ｐ＝０．７０８）。サンプルＣで処理した組織中で検出されるカルノシンレベルは、対照と同様であった。
【０１１３】
４８時間後の第２の時点では、検出されたカルノシンレベルは、全てのサンプルについて組織対照と同等であった。
【０１１４】
【表４】
2019505556.tif 000008
【０１１５】
【表５】
2019505556.tif 000009
【０１１６】
結論
収集されたデータによると、第１の２４時間の時点で、調製物Ａ（最終配合物中のカルノシン−マグネシウム錯体）が皮膚下層におけるカルノシンの送達の有意な増大を示したようである。実際に、調製物Ｂに対してより高レベルのカルノシンが培地に移行した。逆の証拠として、対応する組織中のカルノシンの含量は低かった。
【０１１７】
第２の４８時間の時点で、培地中で有意でないカルノシンレベルの増大が観察された。これは、４８時間後にその初期特性を失うため、信頼性が低くなる可能性があるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＨＥモデルの制約に起因し得る。
【０１１８】
最後に、カルノシン−マグネシウム錯体が３Ｄ皮膚モデルであってもカルノシン送達の増大に効果的であったと結論付けることができる。実際に、組織中に残存するカルノシンの濃度は、遊離カルノシンを含有するサンプルのほぼ半分であった。
【０１１９】
実施例２
サッカー選手におけるカルノシン−マグネシウムゲルの効果の評価。パイロット研究。
このパイロット研究の目的は、局所使用のための新たなゲル配合物中に存在するカルノシン−マグネシウム錯体のサッカー選手のパフォーマンスに対する効果を評価することであった。
【０１２０】
方法
研究は、以下の運動に対応する２部に分けた：
１）ヨーヨー間欠性回復力テスト、
２）３回反復の１０００ｍスプリントテスト（１分３０秒間隔）。
【０１２１】
テストは、各アスリートについてカルノシン−マグネシウムゲルを用いた場合及び用いない場合で行った。
【０１２２】
パフォーマンス前のウォームアップクリーム適用による準備
トウガラシを含有するウォームアップクリームを用いて、テスト前に筋肉用調製物を最適化した。このタイプのウォームアップクリームは、身体活動中に生じ得る筋性の負傷及び外傷を防ぐためにスポーツマンによって任意の身体活動の前に一般に使用されている。
【０１２３】
研究設計
１８歳〜３５歳の１１人の成人アスリート（サッカー選手）のパフォーマンスを評価した。試験期間中にわたって、アスリートはいかなる栄養補助食品も摂取せず、薬物治療を受けず、付加的なトレーニング又は試合を避けた。
【０１２４】
研究前段階中に、ウォームアップクリームを用いた場合及び用いない場合のアスリートのパフォーマンスの差を評価し、ウォームアップクリームが任意の関連効果をもたらすかを検証した。
【０１２５】
研究段階では、脚へのウォームアップクリームの適用に続いて、サンプルＡを用いたカルノシン−マグネシウムゲル局所治療を行った。研究段階中に、アスリートは任意の他のスポーツ活動又は試合を行わなかった。各タイプの運動について、ウォームアップクリームのみを適用して行った試験と、ウォームアップクリーム及びカルノシン−マグネシウムゲル（サンプルＡ）の両方を適用する試験との間は３日空けた。
【０１２６】
ヨーヨー間欠性回復力テスト
ヨーヨーテストでは、アスリートは、互いに４０メートル離れて設置されたスピードデリミタ（ｄｅｌｉｍｉｔｅｒｓ）の間を走る。スピードを規則的に増加させ、被験体がスピードを維持することができなくなった時点でテストを終了する。テスト結果は、テスト中の走破距離によって決定され、このテストは耐久力（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）テストである。
【０１２７】
１０００メートル×３回の反復テスト（各テスト間に１分３０秒間の休息）
アスリートが１０００ｍを走破するのにかかった時間を記録した。テストを３回繰り返し、各テスト間にアスリートを１分３０秒休息させた。このテストは耐久力を測定する。
【０１２８】
結果
いかなる局所クリームも適用せずに、ウォームアップクリームの適用後に、またウォームアップクリーム及びカルノシン−マグネシウムゲル（サンプルＡ）の両方の適用後に行った、それぞれのテストにおける個々のアスリートのパフォーマンスの結果を表６及び表７にまとめる。
【０１２９】
全アスリートが、運動中及び運動後の満足感及び脚の良好な感覚を報告した。局所又は全身性副作用の認識は観察されなかった。
【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
【表７】
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【０１３２】
結論
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査から、カルノシン−マグネシウムゲルの適用により、研究に参加した全アスリートのパフォーマンスに顕著な増大が見られることが示された。
【０１３３】
改善がスピード持久力（ｓｐｅｅｄ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ）及び耐久力テストの両方で観察された。
【０１３４】
アスリートは、カルノシン−マグネシウムゲル処理後にいかなる副作用も報告しなかった。
【国際調査報告】
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