(57)【要約】  固相ペプチド合成における脱保護の改善点を開示する。該方法は、高濃度および少量の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加するステップであって、その前のサイクルのカップリングステップと後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液ステップがなく；カップリング溶液を少なくとも３０℃の温度とするステップ、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相ペプチド合成における脱保護方法であって、前記方法の改善点として、
高濃度で少量の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること、
前記前のサイクルのカップリングステップと、前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に何ら排液ステップがないこと、および
前記カップリング溶液を少なくとも３０℃とすること、を含む、方法。
【請求項２】
前記脱保護組成物が、有機塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脱保護溶液が少なくとも５０体積％の有機塩基の濃度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記脱保護組成物を前記カップリング溶液の体積の１／３未満の量で添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
固相ペプチド合成における脱保護方法であって、前記方法の改善点として、
高濃度で少量の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること、
前記前のサイクルのカップリングステップと、前記前のサイクルのカップリング溶液の体積の少なくとも５０％を除去する前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に、何ら排液ステップがないこと、および
前記カップリング溶液を少なくとも３０℃の温度とすること、を含む、方法。
【請求項７】
前記脱保護組成物が、有機塩基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記脱保護溶液濃度を少なくとも５０体積％にする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記脱保護組成物を前記カップリング溶液の体積の１／３未満の量で添加する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１０月２１日出願の「Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題する米国特許出願第１５２９９９３１号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
Ｂｒｕｃｅ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相ペプチド合成の先駆的な開発により、ステップ間で試薬を除去する濾過の使用によるペプチド鎖合成の有用な方法が作り出された。この方法は、各ステップの中間での洗浄と濾過を伴うカップリングおよび脱保護を含む反復サイクルを必要とした（図１）。
【０００３】
一般に、前に使用された薬剤を完全に除去し、これらに次のステップに望ましくない関与をさせないために、各ステップ間で洗浄が必要であると考えられている。これは通常、追加のアミノ酸の組み込みを意味する「挿入」を必要とする。これは、最後にカップリングし、それにより第２のアミノ酸の「挿入」を可能とするアミノ酸の保護基（Ｆｍｏｃ）を除去する残留塩基を介するか；または脱ブロックされた部位にカップリングし、それにより、追加のアミノ酸を前のステップから「挿入」し得るその後の脱保護ステップ中に後に残された残留活性化アミノ酸を介して行われると考えられる。しかし、最近、ペプチドの合成に成功するためには、カップリングステップ後の洗浄は、必要ではないことが示された。この研究では、カップリングステップが排液され、その後、脱保護溶液が容器に加えられた（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｇ．Ｖａｎｉｅｒ，”Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＨＥ−ＳＰＰＳ），”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４）（図２）。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、固相ペプチド合成における脱保護方法であり、この方法の改善点は、高濃度および少量の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること；およびその前のサイクルのカップリングステップと後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液ステップがないこと；およびカップリング溶液を少なくとも３０℃とすることを含む。
【０００５】
別の態様では、本発明は、固相ペプチド合成における脱保護方法であり、この方法の改善点は、高濃度および小量の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること；およびその前のサイクルのカップリングステップと、その前のサイクルのカップリング溶液の少なくとも５０体積％が取り出される後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に排液ステップがないこと；およびカップリング溶液を少なくとも３０℃の温度とすることを含む。
【０００６】
本発明の上述のおよび他の目的および利点、ならびにそれらを達成する方法は、添付の図面と併せて、以下の詳細な記載により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】従来のＳＰＰＳサイクルを示す図である。
【図２】高効率固相ペプチド合成（ＨＥ−ＳＰＰＳ）のためのより最近のＳＰＰＳサイクルを示す図である。
【図３】固相ペプチド合成のためのインサイツ溶媒リサイクル法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は同一溶媒中でカップリングと脱保護のステップが行なわれる新規方法を提供する。この方法では、カップリングを行なうための目的の期間の後、濃塩基をレジンカップリング溶液に直接添加する。塩基が添加されると、直ちに、脱保護ステップが開始する。したがって、脱保護ステップの開始は、何ら時間の遅延がないカップリングステップ直後である。
【０００９】
さらに、それにはカップリング反応から残存する溶媒を使用できるので、少量の塩基しか必要としない。これは、正しく非常に小量（０．５ｍＬ）の塩基を迅速に送達するための高性能試薬送達システムを必要とする。一般に、溶媒中２０％の塩基（ピペリジン）溶液が脱保護ステップに用いられる。過剰な塩基濃度は塩基触媒副反応を増大させる可能性があり、したがって多量の溶媒が必要である。これは、濃厚な塩基をカップリング溶媒に添加することによるこのプロセスによって、大切な溶媒を節約できることを意味する。
【００１０】
この新規方法の有効性を立証するために、各サイクル中でインサイツ溶媒リサイクルステップを行なうように改良された自動ペプチド合成装置を用いて、２４種のペプチドのバッチを作成した。
【００１１】
材料および方法：
自動インサイツ溶媒リサイクルおよび蒸発ベースの洗浄を可能とするＬＩＢＥＲＴＹ  Ｂｌｕｅ（商標）ＰＲＩＭＥ（商標）システム（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて全てのペプチドを合成した。１０当量のアミノ酸に対して、０．０５ｍｍｏｌの規模で、ＣａｒｂｏＭＡＸ（商標）カップリングを用いて、アミノ酸／カルボジイミド／エチル  ２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）アセテート（ＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ）（１：２：１）ベースの活性化により、９０℃で１００秒間、ペプチドを合成した（Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｎ．Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，Ｅ．Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ａｎｄ  Ｂ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，”Ｒａｃｅｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ，Ｕｒｅｔｈａｎｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｐ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，ｐｐ．３３６−３３７，１９８１）。Ｒｉｎｋ  ＡｍｉｄｅリンカーまたはＣｌ−ＴＣＰ（Ｃｌ）リンカーのいずれかを用い、第１アミノ酸をＤＩＥＡと共に非活性化充填を行い、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）テクノロジーに基づくＰｒｏＴｉｄｅレジン（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、９０℃で５分間合成した。脱保護ステップは９５℃で５０秒間実施し、０．５ｍＬの５０％ピロリジンをカップリング溶液に直接添加することにより開始した。ただ１回の１ｘ４ｍＬの洗浄を、脱保護ステップとカップリングステップの間で用いた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン／水／２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタンチオール（ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ）（９２．５：２．５：２．５：２．５）を用いて、３８℃で３０分間、ＲＡＺＯＲ（商標）切断システム（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．）を使用してペプチドを切断した。
【化１】
2019530659.tif 000002
Ｃｌ−ＴＣＰ（Ｃｌ）−ＰｒｏＴｉｄｅ    ＲＡ−ＰｒｏＴｉｄｅ
【００１２】
結果および考察：
【表１−１】
2019530659.tif 000003
【表１−２】
2019530659.tif 000004
【００１３】
表１で合成したすべてのペプチドにより、目的のターゲットが主ピークとして標準サイクル時間２分５８秒で得られた。インサイツ溶媒リサイクル法により、０．５ｍＬの濃ピロリジン（沸点８７℃）溶液をカップリングステップの終了時に添加することが可能となった（排液なしで）。この設定の利点は、カップリング溶液が既に９０℃であったので、脱保護が目的の温度（９５℃）にきわめて近い温度で直ちに進行したことであった。脱保護プロセス中に真空を適用し、ピロリジンを蒸発させ、その後、廃液槽内で凝縮させた。これにより、脱保護ステップの終了時にただ１回の洗浄ステップ（１ｘ４ｍＬ）しか必要としなかった。
【００１４】
全バッチのための総合成時間：３２．６時間
この新規方法は、下記の理由により標準サイクル時間の著しい短縮をもたらした（２分５７秒）：（ａ）−カップリング排液時間の排除、（ｂ）−ステップ間の脱保護剤送達時間の排除、および（ｃ）−脱保護ステップのための昇温時間の排除と、それによるより短い脱保護時間の使用が可能になった。さらに、著しい溶媒節約が可能であり、各サイクル中の脱保護溶媒が完全に除去された。
【００１５】
図面および明細書に本発明の好ましい態様を述べ、特定の用語を用いたが、それらは一般的で、また説明的な意味で用いたにすぎず、限定のためのものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲で定められる。
【図１】
2019530659.tif 000005
【図２】
2019530659.tif 000006
【図３】
2019530659.tif 000007
【配列表】
2019530659000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月1日(2019.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バッチ固相ペプチド合成における脱保護方法であって、前記方法の改善点として、
塩基脱保護組成物を、その前のカップリング工程からの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること、
ここで、前記脱保護溶液が少なくとも５０体積％の塩基の濃度を有し、前記脱保護組成物は、前記カップリング溶液の体積の１／３未満である量で、その前のカップリング工程からの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加される、
前記前のサイクルのカップリング工程と、前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に何ら排液工程がないこと、および
前記カップリング溶液を少なくとも３０℃とすること、を含む、方法。
【請求項２】
前記脱保護組成物が、有機塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バッチ固相ペプチド合成における脱保護方法であって、前記方法の改善点として、
塩基脱保護組成物を、その前のカップリングサイクル工程からの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること、 
ここで、前記脱保護組成物は、少なくとも５０体積％の塩基の濃度で、前記カップリング溶液の体積の１／３未満である量で、その前のカップリング工程からの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加される、
前記前のカップリングサイクルのカップリング工程と、前記前のカップリングサイクルのカップリング溶液の体積の少なくとも５０％を除去する前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に、何ら排液工程がないこと、および
前記カップリング溶液を少なくとも３０℃の温度とすること、を含む、方法。
【請求項５】
前記脱保護組成物が、有機塩基である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、請求項４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
結果および考察：
【表１−１】
2019530659.tif 000008
【表１−２】
2019530659.tif 000009
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の態様には、以下も含まれる。
態様１
固相ペプチド合成における脱保護方法であって、前記方法の改善点として、
高濃度で少量の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること、
前記前のサイクルのカップリングステップと、前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に何ら排液ステップがないこと、および
前記カップリング溶液を少なくとも３０℃とすること、を含む、方法。
態様２
前記脱保護組成物が、有機塩基である、態様１に記載の方法。
態様３
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、態様１に記載の方法。
態様４
前記脱保護溶液が少なくとも５０体積％の有機塩基の濃度を有する、態様２に記載の方法。
態様５
前記脱保護組成物を前記カップリング溶液の体積の１／３未満の量で添加する、態様１に記載の方法。
態様６
固相ペプチド合成における脱保護方法であって、前記方法の改善点として、
高濃度で少量の脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること、
前記前のサイクルのカップリングステップと、前記前のサイクルのカップリング溶液の体積の少なくとも５０％を除去する前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に、何ら排液ステップがないこと、および
前記カップリング溶液を少なくとも３０℃の温度とすること、を含む、方法。
態様７
前記脱保護組成物が、有機塩基である、態様６に記載の方法。
態様８
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、態様６に記載の方法。
態様９
前記脱保護溶液濃度を少なくとも５０体積％にする、態様６に記載の方法。
態様１０
前記脱保護組成物を前記カップリング溶液の体積の１／３未満の量で添加する、態様６に記載の方法。
態様１１
固相ペプチド合成における脱保護方法であって、前記方法の改善点として、
脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること、
前記脱保護組成物を、高濃度および前記混合物中のカップリング溶液の体積の１／３未満である量で、前記混合物に添加すること、
前記前のサイクルのカップリングステップと、前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に何ら排液ステップがないこと、および
前記カップリング溶液を少なくとも３０℃とすること、を含む、方法。
態様１２
前記脱保護組成物が、有機塩基である、態様１１に記載の方法。
態様１３
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、態様１１に記載の方法。
態様１４
前記脱保護溶液が少なくとも５０体積％の有機塩基の濃度を有する、態様１２に記載の方法。
態様１５
固相ペプチド合成における脱保護方法であって、前記方法の改善点として、
脱保護組成物を、その前のカップリングサイクルからの、カップリング溶液、成長しつつあるペプチド鎖、およびいずれかの過剰の活性化アミノ酸の混合物に添加すること、 
前記脱保護組成物を、高濃度および前記混合物中のカップリング溶液の体積の１／３未満である量で、前記混合物に添加すること、
前記前のサイクルのカップリングステップと、前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に、前記前のサイクルのカップリング溶液の体積の５０％以上を除去する排液ステップがないこと、および
前記カップリング溶液を少なくとも３０℃の温度とすること、を含む、方法。
態様１６
前記脱保護組成物が、有機塩基である、態様１５に記載の方法。
態様１７
Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を使用する、態様１５に記載の方法。
態様１８
前記脱保護溶液濃度を少なくとも５０体積％にする、態様１５に記載の方法。
態様１９
前記前のサイクルのカップリングステップと、前記後続サイクルのための脱保護組成物の添加との間に、前記前のサイクルのカップリング溶液の体積の９０％を除去する排液ステップがない、態様１５に記載の方法。
図面および明細書に本発明の好ましい態様を述べ、特定の用語を用いたが、それらは一般的で、また説明的な意味で用いたにすぎず、限定のためのものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲で定められる。
【国際調査報告】
2019530659.tif 000010
2019530659.tif 000011