【手続補正書】
【提出日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドおよび治療用の薬剤、レポーター遺伝子もしくは診断用の薬剤をカプセル化する陽イオン性リポソームを含む安定な細胞標的化複合体を作製するための方法であって、
リガンドおよび治療用の薬剤、レポーター遺伝子もしくは診断用の薬剤をカプセル化する陽イオン性リポソームを含む複合体を提供すること；
当該リポソーム複合体を安定化する量のショ糖を含む溶液と混合すること；および
リポソーム複合体およびショ糖の当該溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を得ること：を含み、
そこでは、再構成時に、当該製剤はその凍結乾燥前の活性の少なくとも約８０％を保持する、
方法。
【請求項２】
再構成時に当該製剤がその凍結乾燥前の活性の少なくとも約８５％を保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
再構成時に当該製剤がその凍結乾燥前の活性の少なくとも約９０％を保持する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
再構成時に当該製剤がその凍結乾燥前の活性の少なくとも約９５％を保持する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
当該複合体がショ糖の溶液と約１％〜約８０％のショ糖の最終濃度に混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
当該複合体がショ糖の溶液と約１％〜約５０％のショ糖の最終濃度に混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
当該複合体がショ糖の溶液と約１％〜約２０％のショ糖の最終濃度に混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
当該複合体がショ糖の溶液と約５％〜約１０％のショ糖の最終濃度に混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
当該複合体がショ糖の溶液と約１０％のショ糖の最終濃度に混合される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
当該リガンドが、標的細胞上で差次的に発現される受容体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
当該リガンドが、トランスフェリン、フォレート、抗体もしくは抗体フラグメントを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
当該リガンドが、トランスフェリンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
当該リガンドが、抗−ＴｆＲモノクローナル抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
当該リガンドが、抗体の単鎖Ｆｖフラグメントを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
当該抗体フラグメントが、抗−ＴｆＲモノクローナル抗体に基づくｓｃＦｖを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
当該リポソームが、少なくとも一つの陽イオン性脂質および少なくとも一つの中性もしくはヘルパー脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
当該陽イオン性脂質がリン酸ジオレオイルトリメチルアンモニウム(ＤＯＴＡＰ)もしくは臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム(ＤＤＡＢ)を含み、そして当該中性またはヘルパー脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)もしくはコレステロール(ｃｈｏｌ)を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
当該リポソームがＤＯＴＡＰおよびＤＯＰＥの混合物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
リポソームが少なくとも約１０個のアミノ酸のペプチドに結合し、そこでは当該ペプチドが約５〜１００％のヒスチジンおよび０〜９５％の非−ヒスチジン残基から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
当該ペプチドの当該非−ヒスチジン残基の少なくとも１０％がリシン残基である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
当該ペプチドが5'-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3'の構造を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
当該治療用の薬剤が遺伝子、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
約−８０℃〜８℃の範囲内の温度で少なくとも６ヶ月の間に少なくとも約８０％の活性を保持しながら安定である、リガンドおよび治療用の薬剤、レポーター遺伝子もしくは診断用の薬剤をカプセル化する陽イオン性リポソームの複合体を含む凍結乾燥製剤であって、当該製剤が当該複合体および当該複合体の安定性を増加させるための有効量のショ糖を含む、凍結乾燥製剤。
【請求項２４】
約１％〜約８０％のショ糖を含む、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２５】
約１％〜約５０％のショ糖を含む、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２６】
約１％〜約２０％のショ糖を含む、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２７】
約５％〜約１０％のショ糖を含む、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２８】
約１０％のショ糖を含む、請求項２７に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２９】
再構成時にその凍結乾燥前の活性の少なくとも約８０％を保持する、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３０】
再構成時にその凍結乾燥前の活性の少なくとも約８５％を保持する、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３１】
再構成時にその凍結乾燥前の活性の少なくとも約９０％を保持する、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３２】
再構成時にその凍結乾燥前の活性の少なくとも約９５％を保持する、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３３】
当該リガンドが、標的細胞上で差次的に発現される受容体を含む、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３４】
当該リガンドが、トランスフェリン、フォレート、抗体もしくは抗体フラグメントを含む、請求項３３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３５】
当該抗体フラグメントが、抗体の単鎖Ｆｖフラグメントを含む、請求項３４に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３６】
当該治療用の薬剤が遺伝子、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡを含む、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３７】
当該リポソームが、少なくとも一つの陽イオン性脂質および少なくとも一つの中性もしくはヘルパー脂質を含む、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３８】
当該陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰもしくはＤＤＡＢを含みそして当該中性もしくはヘルパー脂質がＤＯＰＥもしくはコレステロールを含む、請求項３７に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３９】
当該リポソームがＤＯＴＡＰおよびＤＯＰＥの混合物を含む、請求項３８に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項４０】
請求項２３に記載の凍結乾燥製剤であって、リポソームが少なくとも約１０個のアミノ酸のペプチドに結合し、そこでは当該ペプチドが約５〜１００％のヒスチジンおよび０〜９５％の非−ヒスチジン残基から成る、凍結乾燥製剤。
【請求項４１】
当該ペプチドの当該非−ヒスチジン残基の少なくとも１０％がリシン残基である、請求項４０に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項４２】
当該ペプチドが5'-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3'の構造を有する、請求項４１に記載の凍結乾燥製剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
陽イオン性リポソームは、正に荷電した脂質二重層から成り、そして生じた複合体が正味の正電荷を有するように、脂質およびＤＮＡを単に混合することにより負に荷電した、裸のＤＮＡと複合体化することができる。複合体は、中程度に良好なトランスフェクション効率で培養液中の細胞に結合してかつ細胞により取り込まれ得る。陽イオン性リポソームは、インビボの遺伝子送達に安全でかつ効率的であると立証されてきている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
リポソームを使用して、リポソームをそれらが腫瘍細胞にそれらのペイロードを選択的に送達するように修飾することにより、腫瘍細胞を標的化することができる。表面の分子を使用して、腫瘍細胞の外部を装飾する分子の型および／もしくは数が正常の細胞のそれらとは異なるので、リポソームを腫瘍細胞に標的化することができる。例えば、もしリポソームがその表面上にフォレートのもしくはトランスフェリン(Ｔｆ)の分子を有するならば、それは、正常の細胞のそれらよりさらに高いフォレートのもしくはトランスフェリンの受容体のレベルを有する、がん細胞に帰するであろう。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
腫瘍細胞上の受容体により認識されるリガンドの使用に加えて、特異的な抗体がまたリポソームの表面に付着することができて、それらを特異的な腫瘍表面抗原(限定するものではないが、受容体を含む)へ指向させることを可能にする。これらの“免疫リポソーム”は、治療用の薬物を特定の細胞集団に送達することができる。例えば、リポソームに結合した抗−ＨＥＲ−２モノクローナル抗体(Ｍａｂ)のＦａｂフラグメントは、ＨＥＲ−２を過剰発現する乳がん細胞株、Ｓ−ＢＲ−３に特異的に結合することができることが見出されてきている(Park, J.W., et al. PNAS 92:1327-1331 (1995))。免疫リポソームは効率的に内在化されることが見出されて、抗−ＨＥＲ−２のＦａｂフラグメントの固着はそれらの阻害効果を増強した。陽イオン性リポソーム―遺伝子転移および免疫リポソーム技法の組合せは、標的遺伝子治療のための前途有望なシステムであるように見える。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
以前の報告は、二成分の複合体(脂質およびＤＮＡ、しかしリガンドもしくはタンパク質を標的化しないで)は単糖類もしくは二糖類の存在下で凍結乾燥されて、それらの生物活性および遺伝子療法に適する粒子径をさらに維持することができたことを指示してきている(Li, B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89:355-364 (2000) and Molina, M.D.C. et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1445-1455 (2001); Allison, S.D., et al. Biochemical et Biophysical Acta 1468:127-138 (2000))。加えて、ＰＥＧを通してＰＥＩ−ＤＮＡポリプレックスに結合されたＴｆは、凍結および解凍後に幾らかの生物活性を保持していた(Kursa, M. et al., Bioconjugate Chemistry 14:222-231 (2003))。この複合体は凍結乾燥されないで、保存の可能な長さもしくは条件は何も指示されないで、砂糖(グルコース)が、もし含まれるならば、解凍後に加えられたことに注意することが重要である。このポリマー複合体は、ＴｆをＰＥＧ分子を通してポリマーに結合させることを必要とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
(図面の簡単な説明)
図１は、５％デキストロースもしくは５％ショ糖を含有する新鮮に作製されたおよび凍結乾燥された複合体(Ｔｆ−ＬｉｐＡ−ＬｕｃおよびＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−Ｌｕｃ)のサイズ(ｎｍ)を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
図２Ａおよび２Ｂは、ＤＵ１４５ヒト前立腺細胞の中に５％デキストロースもしくは５％ショ糖を含有する新鮮に作製されたおよび凍結乾燥された複合体(Ｔｆ−ＬｉｐＡ−ＬｕｃおよびＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−Ｌｕｃ)の、μｇタンパク質当り相対的な光単位(ＲＬＵ)として示される、インビトロのトランスフェクション効率を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
図３は、ＤＵ１４５ヒト前立腺がん細胞の中に５％のもしくは１０の％ショ糖を含有する新鮮に作製されたおよび凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−Ｌｕｃ複合体のインビトロのトランスフェクション効率(ＲＬＵ／μｇタンパク質)の比較を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
図５は、１０％ショ糖で実験室で作製されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体の腫瘍の標的化能力が凍結乾燥および２℃〜８℃で６ヶ月までの間の保存後に維持されることを、ヒト前立腺がん(ＤＵ１４５)異種移植マウスモデルにおいて立証する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
図７は、ＤＵ１４５異種移植マウスモデルにおいて１０％ショ糖で五つの異なる商業的に作製されて凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３のバッチの腫瘍の標的化およびトランスフェクション効率を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
図８は、非変性ゲル電気泳動により評価された、種々の新鮮に作製されたおよび凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体の中の複合体化されていないＴｆＲｓｃＦｖのパーセントを示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
図９は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳がん細胞の中で凍結乾燥されたおよび新鮮に作製されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ−ＨＥＲ−２複合体の間の細胞増殖阻害のインビトロでの比較を示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
図１０は、新鮮に作製されたかもしくは凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体によるＰＡＮＣ−１化学感作のインビトロでの比較を示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
図１１は、凍結乾燥および２℃〜８℃で６ヶ月までの間の保存の後に１０％ショ糖を含むＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２によるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳がん細胞の中でＨＥＲ−２発現のインビトロでの下方調節を示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
(発明の詳細な説明)
本発明にしたがって、リガンドおよび治療用のもしくは診断用の薬剤をカプセル化する陽イオン性リポソームの凍結乾燥された複合体の安定性を、凍結乾燥前に複合体を安定化する量のショ糖を含む水溶液と混合することにより増加させることができる。ショ糖の溶液は水中にショ糖のみであり得るか、またはＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳもしくはＴＲＩＳ／ＥＤＴＡのような、緩衝剤を含むことができる。典型的には、ショ糖の溶液は、約１％〜約８０％のショ糖、典型的には、１％〜約１０％、２０％、３０％もしくは４０％のショ糖のような、１％〜約５０％のショ糖、好ましくは約５％〜１０％のショ糖、そして最も好ましくは約１０％のショ糖、の最終濃度に複合体と混合される。凍結乾燥製剤は、約２〜８℃から約−８０℃の範囲内で少なくとも６ヶ月の期間の間に著しい活性を損失すること無しに、安定である。好ましくは、製剤は、少なくとも６〜１２ヶ月の期間の間、安定である。再構成時に、複合体は、それらの凍結乾燥前の活性の少なくとも約８０％、好ましくはそれらの凍結乾燥前の活性の少なくとも約８５％、そして最も好ましくはそれらの凍結乾燥前の活性の少なくとも約９０〜９５％、を保持する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
以前の報告は、脂質およびＤＮＡの混合物は単糖類もしくは二糖類の存在下で凍結乾燥されて、生物活性を維持することができたことを示している(Li, B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89:355-364 (2000) and Molina, M.D.C. et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1445-1455 (2001); Allison, S.D., et al. Biochemical et Biophysical Acta 1468:127-138 (2000))。しかしながら、１)抗体もしくは抗体フラグメント(例えば、抗−トランスフェリン受容体単鎖抗体フラグメント、ＴｆＲｓｃＦｖ)であるタンパク質さえも含んで、タンパク質(例えばトランスフェリン)；２)リポソームおよび３)治療用の核酸分子(例えば、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子もしくはｓｉＲＮＡ分子さえ)から成る三成分の複合体がまた、凍結乾燥されて、再構成後にそのサイズおよび生物活性を保持することができたことは予想外である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
リポソーム複合体は典型的に静脈内投与される。静脈注射のために、５０％デキストロース溶液が、５％の最終濃度にリガンド−リポソーム複合体に便利に加えられている。新鮮に作製された(即ち、長くて約１〜約２４時間経った複合体)リガンド−リポソーム複合体を、デキストロースよりむしろ、ショ糖の溶液と混合することにより、三成分の複合体(抗原標的化要素を持つそれらを含む)の凍結乾燥および再構成後の活性ならびに使用期限を著しく増加させることができることが、今や驚くべきことに見出されてきている。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
三成分の複合体を凍結乾燥前にショ糖溶液と単に混ぜることができる。典型的には、溶液は、重量で約５０〜約１００％のショ糖、好ましくは重量で約５０％のショ糖、を含む。凍結乾燥は、複合体の水分を約１.３％以下に減少させる任意の従来の手順にしたがうことができる。一つの好ましい手順は、複合体を含有する溶液を−５０℃〜−６０℃、２０〜５０ミリトール、好ましくは２５ミリトール、で１２〜６０時間、好ましくは２０〜４８時間の間、凍結乾燥し、次いで、凍結乾燥製剤を約２〜８℃から約−８０℃の間で保存することを含む。もう一つの好ましい手順において、複合体の溶液を含有するバイアルを市販型の凍結乾燥機の中に周囲温度で装填し、次いで、温度を１時間にわたり−４５℃±３℃に下げていって、その温度で三時間保持する。次いで、冷却器を−８０℃もしくはさらに低温に冷却して、真空を５０ミクロンＨｇにセットする。棚の温度を１時間にわたり−３５℃±３℃に上げていって、そこで一度この温度で約３６〜７２時間、好ましくは約４８時間保持する。次いで、棚の温度を４時間にわたり−２０℃±３℃に上げていって、この温度で約６〜約４８時間、好ましくは約１２時間保持する。この処理法の最後に、チャンバーの圧力を窒素(適切な滅菌微生物拘束フィルターを通して通過させた)で大気圧へ復元してバイアルに栓をする。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
凍結乾燥された複合体を、凍結乾燥前の溶液の容積に等しい無菌の、エンドトキシン不含有水の添加により再構成することができる。乾燥された複合体は、穏やかな揺動で迅速に溶解する。複合体のサイズもしくはゼータ電位の認められ得る変化は凍結乾燥または保存に因り何も起こらない。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
ショ糖溶液と混合し、凍結乾燥して再構成することができる適当な複合体は、疾患を処置するかもしくは診断するのに使用するための種々の型の治療用のまたは診断用の分子の細胞を標的にした、全身的送達の能力がある細胞を標的化するリガンド／リポソーム／治療用、レポーターまたは診断用分子の複合体である。標的細胞は好ましくは、がん細胞であるが、同様に非がん細胞であり得る。好ましいがん標的細胞には、前立腺の、膵臓の、乳房の、頭および首の、卵巣の、肝臓のおよび脳のがんならびに黒色腫が含まれる。限定するものではないが、上で列挙したものを含む、大抵の型のがん細胞は、トランスフェリンおよびフォレートのための受容体を過剰発現することならびにこれらの受容体はまたがん細胞の中で迅速に再利用することは、当業者に周知である(Li, H., and Qian, Z.M., Medicinal research Reviews 2(3):225-250 (2000); Qian, Z.M., et al., Pharmacological Reviews 54(4):561-587 (2002); gosselin, M.A., and Lee, P.J., Biotechnology annual Reviews 8:103-131 (2002))。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
上で言及したように、標的細胞はこれに代えて非がん細胞であり得る。好ましい非がん標的細胞には、樹状細胞、血管の内皮細胞、肺細胞、乳房細胞、骨髄細胞および肝細胞が含まれる。良性の前立腺過形成細胞、過敏性甲状腺細胞、脂肪腫細胞、ならびに、関節炎、狼瘡、重症筋無力症、扁平上皮化生、異形成症等に関与する抗体を生成するＢ細胞のような、自己免疫疾患に関連する細胞のような、望ましくないが、良性の、細胞を標的化することができる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
これに代えて、薬剤は、投与後にインビボで検出の能力のある診断用の薬剤であり得る。例示的な診断用の薬剤には、電子高密度物質、磁気共鳴造影剤および放射性医薬品が含まれる。造影に有用な放射性核種は、同位元素の６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａもしくは６８Ｇａを含む、銅、ガリウム、インジウム、レニウムおよびテクネチウムの放射性同位元素を含む。米国特許５,６８８,４８８(出典明示により本明細書の一部とする)の中でLow等により開示された造影剤は、本明細書中で説明されるリポソーム複合体において有用である。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
リガンドは、室温でおよび約１：０.００１〜１：５００(μｇ：ｎｍｏｌ)、好ましくは約１：１０〜約１：５０(μｇ：ｎｍｏｌ)の範囲のリガンド：リポソーム比でリポソームと混合される。治療用の薬剤は、室温でおよび約１：０.１〜約１：５０(μｇ：ｎｍｏｌ)、好ましくは約１：１０〜約１：２４(μｇ：ｎｍｏｌ)、の範囲の薬剤：脂質比で陽イオン性リポソームと混合される。例えば、その中でリガンドがトランスフェリンであって、治療用の薬剤がプラスミドＤＮＡである複合体では、治療用の薬剤：リポソーム：リガンドの有用な比は典型的には、約１μｇ：０.１〜５０ｎｍｏｌ：０.１〜１００μｇ、好ましくは１μｇ：５〜２４ｎｍｏｌ：６〜３６μｇ、最も好ましくは約１μｇ：１０ｎｍｏｌ：１２.５μｇの範囲内にある。もしもリガンドがＴｆＲｓｃＦｖであるならば、リガンド：リポソームの有用な比は典型的には、約１：５〜１：４０(μｇ：μｇ)、好ましくは１：３０(μｇ：μｇ)の範囲内にあり、そしてプラスミドＤＮＡ：リポソームの比は典型的には、約１：６〜１：２０(μｇ：μｇ)、好ましくは１：１４(μｇ：μｇ)の範囲内にある。もしも治療用の薬剤が、プラスミドＤＮＡよりむしろオリゴヌクレオチド(ＯＤＮ)であるならば、リガンド、リポソームおよびＯＤＮの典型的な比は、０.１ｎｍｏｌ対３６ｎｍｏｌ(ＯＤＮ：リポソーム)および０.１μｇ対１００μｇ(リガンド：リポソーム)、好ましくは０.５ｎｍｏｌ対２０ｎｍｏｌ(ＯＤＮ：リポソーム)および０.５μｇ対５０μｇ(リガンド：リポソーム)、最も好ましくは１ｎｍｏｌ対１５ｎｍｏｌ(ＯＤＮ：リポソーム)および１μｇ対３０μｇ(リガンド：リポソーム)である。もし治療用の薬剤がｓｉＲＮＡであるならば、成分の有用な比は、０.１μｇ対３０ｎｍｏｌ(ｓｉＲＮＡ：リポソーム)および０.１μｇ対１００μｇ(ＴｆＲｓｃＦｖ：リポソーム)、好ましくは、１μｇ対７ｎｍｏｌ(ｓｉＲＮＡ：リポソーム)および１μｇ対３０μｇ(ＴｆＲｓｃＦｖ：リポソーム)であり得る。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
広範ないろいろの陽イオン性リポソームが複合体の作製に有用である。公開ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２５３２０(出典明示により本明細書の一部とする)は、数個の陽イオン性リポソームの作製を記述している。望ましいリポソームの例は、リン酸ジオレオイルトリメチルアンモニウム(ＤＯＴＡＰ)ならびにジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)および／もしくはコレステロール(ｃｈｏｌ)の混合物、または臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム(ＤＤＡＢ)ならびにＤＯＰＥおよび／もしくはコレステロールの混合物を含むものを含む。脂質の比は、特定の標的細胞型に対して治療用の分子の摂取の効率を最適化するように変動され得る。リポソームは、一つもしくはそれ以上の陽イオン性脂質および一つまたはそれ以上の中性のもしくはヘルパーの脂質の混合物を含み得る。陽イオン性脂質(複数を含む)：中性もしくはヘルパー脂質(複数を含む)の望ましい比は、約１：(０.５〜３)、好ましくは１：(１〜２)(モル比)、である。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
一つの実施態様では、複合体化するために使用されるリポソームは、立体的に安定化されたリポソームである。立体的に安定化されたリポソームは、その中にＰＥＧ、ポリ(２−エチルアクリル酸)もしくはポリ(ｎ−イソプロピルアクリルアミド)(ＰＮＩＰＡＭ)のような、親水性ポリマーが組み込まれているリポソームである。そのような修飾されたリポソームは、治療用のもしくは診断用の薬剤で複合体化されるときに、それらが典型的にはそのように修飾されていない匹敵するリポソームと同じく迅速には細網内皮細胞システムにより血流から取り除かれないので、特に有用であり得る。第二の実施態様では、複合体を形成するために使用されるリポソームは、ヒスチジンおよびリシン(枝分かれのもしくは線状のいずれか)から成るペプチドにまた結合されて、そこではペプチドは、長さで少なくとも約１０個のアミノ酸、典型的には長さで約１０〜１００個のアミノ酸、であって、５〜１００％のヒスチジンおよび０〜９５％の非−ヒスチジンアミノ酸から成り；好ましくは、少なくとも１０％の非−ヒスチジンアミノ酸はリシンである。最も好ましくは、ペプチドは約三十一個のアミノ酸であり、そのおよそ２０％はヒスチジンであって、そのおよそ８０％は非−ヒスチジンである。これらの中で、少なくとも７５％はリシンであって、少なくとも一つは末端システインである。好ましいペプチドは、5'-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3'の構造を有して、リポソームの中の末端システインおよびマレイミド基を通してリポソームに共有結合的に結合され得る。そのような複合体では、成分の比は典型的には、以下のようであり得る：１：５〜１：４０のリガンド対ＨＫ−リポソーム(μｇ：μｇ)、好ましくは、１：３０そして１：１〜１：２０のＤＮＡ対ＨＫ−リポソーム(μｇ：ｎｍｏｌ)、好ましくは、１：１４。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
(実施例１)
新鮮に作製されたおよび凍結乾燥された、炭水化物との複合体の作製ならびに活性およびサイズのインビトロでの評価
初期の実験は、凍結乾燥の前後で炭水化物で作製されたリガンド−リポソーム−核酸複合体のサイズならびにインビトロでのトランスフェクション効率の両方を試験するために実施された。二つの別々なリガンド、ＴｆおよびＴｆＲｓｃＦｖ、が試験された。複合体は、米国特許出願０９／６０１,４４４ならびに公開米国特許出願０９／９１４,０４６および１０／１１３,９２７[Xu, L., et al. Human Gene Therapy 10:2941-2952 (1999); Xu, L., et al., Human Gene Therapy 13:469-481 (2002); and Xu, L., et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)をまた参照]の中に記述されている方法論を用いて作製された。それぞれの複合体では、リポソームは、本明細書中でリポソームＡ(ＬｉｐＡ)として確認される、１：１比のＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥであった。使用されるＤＮＡは、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子をコード化する遺伝子を保持するプラスミドであった。全ての場合で、炭水化物溶液を、複合体の作製で最後の工程として加えた。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
一連の８個の複合体を作製した。四つは、リガンドとしてＴｆを(１μｇ：１０ｎｍｏｌｓ：１２.５μｇのＤＮＡ：ＬｉｐＡ：Ｔｆの比で)を含有して；四つは、リガンドとしてＴｆＲｓｃＦｖを(１μｇ：１４ｎｍｏｌｓ：０.３４μｇのＤＮＡ：ＬｉｐＡ：ＴｆＲｓｃＦｖの比で)を含有した。リガンド−リポソームおよびＤＮＡを含有する溶液を一緒に混合し、１０回ゆっくりと反転させて、生じた溶液を、５％の最終濃度にデキストロースの水溶液もしくは水中のショ糖の添加の前に、室温で１５分間保持した。それぞれの生じた混合液を１０回反転させて、次いで、凍結乾燥もしくはトランスフェクションの前に、室温で１５分間保持した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
新鮮なおよび凍結乾燥された複合体をまた、ヒトの前立腺腫瘍細胞株ＤＵ１４５におけるそれらのトランスフェクション効率について評価した。再構成時の凍結乾燥された複合体(ＴｆおよびＴｆＲｓｃＦｖを持つ)および同一の複合体の相当する新鮮に作製された溶液のトランスフェクション効率を比較した。凍結乾燥の前のおよび後のトランスフェクション効率の結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。リガンドがＴｆであったときには、効率は凍結乾燥後に、５％デキストロースを含有する製剤のために新鮮に作製された複合体のそれの約６０％に低下したのに対して、５％ショ糖を含有する凍結乾燥製剤はその最初の活性の約８０％を保持した。パターンはＴｆＲｓｃＦｖリガンドで同様であった。５％デキストロースを含有する凍結乾燥された複合体は新鮮な活性の約５０％に低下したのに対して、約９０％の活性が、５％ショ糖を使用したときに、保持された(図２Ｂ)。かくして、ショ糖はデキストロースよりさらに多く効率的な安定化剤である。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
砂糖／複合体比を、安定性を改良して粒子形を維持するためにさらに最適化した。５％および１０％ショ糖での複合体を比較した。プラスミドＤＮＡの量をまた２０μｇ、下で議論されるインビボでの試験で単回注射に慣習的に使用される量に増加した。上述のような凍結乾燥の後では、１０％ショ糖を含有する複合体のトランスフェクション効率は５％デキストロース溶液で従来の方式で作製された新鮮な複合体で見られるものの約９５％であった。図３は、５％および１０％ショ糖で作製された複合体の間のトランスフェクション効率の比較を示す。インビトロでのトランスフェクション効率は、１０％ショ糖を含有する凍結乾燥された複合体で最良であった。これは、タンパク質もしくは抗体フラグメントが標的化リガンドとして使用されたか否かに無関係に真実であると見出された。１０％ショ糖を含有する複合体のサイズを上で示した条件で凍結乾燥前後に評価した。５％デキストロースで従来の新鮮に作製された複合体と比較して、凍結乾燥前後のいずれかで、１０％ショ糖で作製された複合体のサイズの間に著しい差は何も無かった。ここでまた、これは、標的化リガンドと無関係な場合であると見出された。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
(実施例２)
２〜８℃で一週間保存後の凍結乾燥された複合体によるインビボでのヒト前立腺腫瘍の標的化
１０％ショ糖でのリポソーム複合体(新鮮に作製されたかもしくは凍結乾燥されて、２〜８℃で１週間保存された)のインビボでの腫瘍の標的化を、複合体の中でレポーター遺伝子として増強緑蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)を用いて試験した。複合体は、リポソームＡがＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ(１：１)である、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム  Ａ−ｐＥＧＦＰであった。三つの成分の比は０.３μｇ：１４ｎｍｏｌｓ：１μｇ(ＴｆＲｓｃＦｖ：リポソーム：ＤＮＡ)であった。複合体を、実施例１で上述したように、作製して凍結乾燥した。凍結乾燥後に、複合体を２〜８℃で一週間冷蔵して保存した。試料を、実施例１で記述されたように、凍結乾燥前の容積に等しい容積にエンドトキシン不含有水の添加により再構成した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
少なくとも５０ｍｍ３のＤＵ１４５異種移植腫瘍を持つマウスを、種々の複合体(全てがＴｆＲｓｃＦｖを標的化リガンドとして、５％デキストロースで新鮮に作製された製剤；１０％ショ糖で新鮮に作製された製剤および再構成前に２〜８℃で１週間冷蔵して保持されてきていた再構成された、１０％ショ糖での凍結乾燥製剤)で２４時間にわたり３回静脈注射した。４８時間後に、動物を屠殺し、腫瘍および肝臓を切除し、タンパク質を分離して、ウエスタン分析を抗−ＥＧＦＰ  Ａｂ(ＣＯＶＡＮＣＥ)を用いて実施した。図４Ａに示すように、１０％ショ糖で凍結乾燥されて再構成された複合体は、新鮮に作製された複合体のいずれに比較して、匹敵するレベルの遺伝子発現を有した。さらに有意義には、高レベルの外因性遺伝子発現が腫瘍で明白であった一方で、殆どのＥＧＦＰは何もマウスの肝臓で発現されなかったことで、複合体の腫瘍特異性性質、ならびにこの腫瘍標的特異性が凍結乾燥、２〜８℃で少なくとも一週間の保存および再構成の後で維持されたことを立証する。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
(実施例３)
−８０℃で一ヶ月間保存後の凍結乾燥された複合体によるインビボでのヒト膵臓腫瘍の標的化
凍結乾燥された複合体の安定性をまた、膵臓がん異種移植腫瘍への標的化により−８０℃で一ヶ月保存後に試験した。複合体(実施例２で上述したのと同一の複合体および比)を１０％ショ糖で作製し、そして、実施例１で記述したように、凍結乾燥した。凍結乾燥の後に、試料を−８０℃で一ヶ月間保存し、次いで、実施例１で記述したように、エンドトキシン不含有水で再構成した。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
図４Ｂに示すように、２４時間の期間にわたり３回静脈注射された(上の実施例２におけるように)マウスからの腫瘍は、新鮮に作製された複合体での注射後に見出されたよりもなおさらに高いレベルのＥＧＦＰ遺伝子発現を示した。一方、非常に僅少かな発現が肝臓で見られたか、もしくは見られなかった。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
(実施例４)
サイズおよびインビトロでのトランスフェクション効率により評価されたように、２〜８℃で保存された凍結乾燥複合体の長期安定性
実行可能な臨床治療剤として我々のＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム−ＤＮＡ複合体の潜在能力を増加させるために、その安定性を増加させる手段を開発して、かくしてその腫瘍の標的化能、および使用期限を維持した。我々の試験の幾らかは、添加物として１０％ショ糖で凍結乾燥された複合体は、−２０℃、−８０℃もしくは２〜８℃のいずれかで、成功裏に保存されることができたことを示している。診療所での使用の便利性のために、好ましい保存方法は２〜８℃である。時間の長さを決定するために、凍結乾燥された複合体を２〜８℃で生物活性の損失無しに保存することができて、凍結乾燥されて、１，４および６ヶ月間２〜８℃で保存された複合体のインビトロでのトランスフェクション効率を評価した。複合体は、リポソームＡがＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ(１：１)である、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム  Ａ−ｐ５３であった。三つの成分の比は、０.３４μｇ：１０μｇ：１μｇと同等である０.３μｇ：１４ｎｍｏｌｓ：１μｇ(ＴｆＲｓｃＦｖ：リポソーム  Ａ：ＤＮＡ)であった。１０％ショ糖を添加物として使用した。複合体の中のＤＮＡは、ヒト野生型ｐ５３をコード化する約１．７ＫｂのｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドベクターであった。複合体を作製し、凍結乾燥して、実施例１で記述したように、２〜８℃で保存後の適切な時に再構成した。サイズ(数のパラメーター)およびゼータ電位をMalvern 3000H Zetasizerを用いて測定した。機能性活性をルシフェラーゼ共トランスフェクションアッセイを用いて評価した。ヒト前立腺がんＤＵ１４５細胞を、ＢＰ１００プラスミドＤＮＡでおよび複合体で共トランスフェクトした。ＢＰ１００プラスミドは、ｗｔｐ５３誘導性プロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を保持する。かくして、トランスフェクトされた細胞の中の機能性ｐ５３のレベルは、ルシフェラーゼ活性のレベルにより反映される。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を溶菌して、ルシフェラーゼ活性を、Promegaルシフェラーゼ試薬を用い製造プロトコルにしたがって、アッセイした。表１に示すように、複合体のルシフェラーゼ活性、サイズおよびゼータ電位は、新鮮に作製された複合体および凍結乾燥されて、２〜８℃で６ヶ月までの間に保存された複合体との間で一貫している。
【表１】
2006526658.tif 000001
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
(実施例５)
２〜８℃で保存後に全身的に投与された凍結乾燥複合体のインビボでの腫瘍特異的標的化
新鮮なならびに作製され、１，４もしくは６ヶ月間２〜８℃で保存されて、次いで実施例４に記載された試験のために再構成された凍結乾燥複合体を、全身的な(静脈)投与後にヒト前立腺異種移植腫瘍に到達してトランスフェクトするそれらの能力についてインビボでまた試験した。少なくとも１００ｍｍ３の皮下ヒト前立腺腫瘍細胞株ＤＵ１４５異種移植腫瘍を持つ無胸腺ヌードマウスを、０.８ｍＬの最終容積で注射当り４０μｇのＤＮＡと同等な量で、複合体(新鮮なもしくは凍結乾燥されて、再構成された)で２４時間にわたり３回静脈注射した。最後の注射の４８時間後に、動物を人道的に安楽死させ、器官を取り出し、タンパク質を単離して、発現をXu, L. et al., Tumor Targeting 4:92-104 (1999)により記述されたようにウエスタン分析により測定した。当分野で普通に知られている他の方法を、これに変えて使用することができた。全タンパク質溶菌液８０μｇを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのレーン上に装填した。ゲルを操作した後に、タンパク質をニトロセルロース膜へ転移しそして抗−ｐ５３マウスモノクローナル抗体(Oncogene Research製品)のプローブと反応させた。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
マウス中のインビボでの腫瘍の標的化の結果を図５に示す。ｐ５３発現のレベルは、新鮮に作製された複合体を受領する動物からの腫瘍の中のレベルおよび凍結乾燥後６ヶ月さえの凍結乾燥された複合体のそれぞれを受領する動物からのそれらとの間で同様であった。全ての腫瘍の中のｐ５３発現のレベルは、肝臓中のそれらより著しくさらに高かったことで、静脈投与後の腫瘍特異性が２〜８℃で６ヶ月保存後でさえ維持されることを立証する。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
新鮮に作製されたかもしくは凍結乾燥されたかのいずれかの複数のＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ｐ５３複合体の機能的発現を前立腺がんＤＵ１４５細胞の中で評価した。インビトロでの活性をＢＰ１００プラスミドおよびルシフェラーゼアッセイを、実施例４に上記されたように、用いて評価した。５つの異なる日に、少なくとも二つの独立した試料を作製して、凍結乾燥した。２〜８℃で２週間保存された後に、試料を実施例１のように再構成して、インビトロおよびインビボで試験した。インビトロでは、ルシフェラーゼ活性(ＲＬＵ／μｇ：細胞中のタンパク質のμｇ当り相対的な光単位)を、Promegaルシフェラーゼ試薬を用い製造プロトコルに記載されたように、アッセイして、そしてそれぞれのバッチのゼータ電位および粒子径(数のパラメーター)をMalvern 3000H Zetasizer上でまた測定した。表２に示すように、数のパラメーターにより、製剤の大多数のサイズは、４００〜７００ｎｍの範囲の中に収まって、ゼータ電位は正の範囲に全てある。かくして、異なる日に作製された異なる複合体は一貫した行動を有する。
【表２】
2006526658.tif 000002
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
試料はまた、実施例５で記述されたように、ＤＵ１４５異種移植を持つ無胸腺ヌードマウスにおいてインビボで評価されてきている。標的化要素としてＴｆＲｓｃＦｖを使用するリガンド−リポソーム−ＤＮＡ複合体が腫瘍特異性を維持していることを立証するために、ウエスタン分析を使用した(図６)。ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体のこれらの独立したバッチを、ＤＵ１４５ヒト前立腺皮下異種移植マウスモデルにおいて試験した。約５０〜１００ｍｍ３のＤＵ１４５腫瘍を保持するヌードマウスを、複合体(４０μｇＤＮＡ／注射)で２４時間の期間にわたり３回静脈注射した。最後の注射の二十四時間後に、動物を屠殺して、腫瘍および肝臓を取り出した。タンパク質を分離した。全タンパク質溶菌液８０μｇを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのレーン上に装填した。ゲルを操作した後に、タンパク質をニトロセルロース膜へ転移し、そして抗−ｐ５３マウスモノクローナル抗体(Oncogene Research製品)のプローブと反応させた。等しい装填を立証するために、膜をＧＡＰＤＨレベルについて引き続いてプローブと反応させた。高度のｐ５３発現レベルは、種々のバッチのそれぞれを含有する複合体を受領するマウスからの腫瘍において明白である(図６)。ｐ５３発現の同様なレベルが、新鮮に作製されたかもしくは凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ複合体のいずれかとの腫瘍の中で観察された。対照的に、非常に低いｐ５３発現が、複合体で処置されていないマウス中で観察される。瘍腫の特異性は、肝臓中の非常に低い発現レベルにより立証される。全ての例において、腫瘍と肝臓との発現に５〜１０倍の相違がある。非処置の腫瘍の中のｐ５３のレベルに比較して、全ての製剤は、処置されたマウスの腫瘍の中で強いｐ５３シグナルを示したが、同一のマウスの相当する肝臓の中には示さなかった。それ故に、これらの試験は、完全な複合体の凍結乾燥が実行可能であって、安定性および使用期限の問題を克服することが可能であり得る。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
(実施例７)
商業的製造業者による凍結乾燥：インビトロおよびインビボでの試験
ヒトの患者を処置するのに有用である凍結乾燥された複合体については、１０％ショ糖の存在下における複合体の作製の加工法が、移行されて、商業的製造実体により大規模で成功裏に実施されることができたことを示すことが必要である。複合体を、委託および秘密保持の合意の下に、Cardinal Health, Albuquerque, NMによって攪拌により作製した。ＤＮＡ溶液を、渦巻きが溶液の中に３０秒〜１分の間丁度形成しつつあった、速度で攪拌する一方で、ＴｆＲｓｃＦｖ：リポソーム溶液に加えた。この溶液を室温で１０〜２０分間保持した後で、５０％ショ糖の水溶液を３０秒〜１分の間上のように攪拌しながら１０％の最終濃度に加えて、室温で１０〜２０分間保持した。商業的に作製されたバッチは、５０〜１０００ｍｌのサイズに分布した。この商業的施設でHull凍結乾燥機を用いる凍結乾燥プロトコルは以下のようであった：
・１０％ショ糖での複合体５ｍＬをそれぞれ含有する、１０ｍＬのバイアルを環境温度で装填した。
・棚の温度を１時間にわたり−４５℃に下げていった。一旦棚の温度が−４５±３℃に達すると、生成物を３時間保持した。
・この点で、冷却器を−５５℃もしくはさらに低温に冷却して、真空を５０ミクロンＨｇにセットした。
・次いで、棚の温度を１時間にわたり−３５℃に上げていった。
・一旦棚の温度が−３５℃に達すると、生成物を４８時間保持した。
・棚の温度を４時間にわたり２０℃に上げていって、生成物を１２時間保持した。
・このサイクルの最後に、チャンバーの圧力を窒素で大気圧に復元し、適切な滅菌微生物拘束フィルターを通してＮＦろ過した。
・生成物に栓をし、ラベルを貼って、２〜８℃で保存した。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
五つの異なるバッチのＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体を商業的実体により作製した。代表的な商業的に作製されたバッチのインビトロでのルシフェラーゼ活性、サイズおよびゼータ電位を表３に示す。商業的に作製されて、凍結乾燥された複合体のサイズ、ゼータ電位およびルシフェラーゼ活性は、実験室で新鮮に作製された複合体のそれらと匹敵した。
【表３】
2006526658.tif 000003
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
五つのバッチを比較するために、ＤＵ１４５異種移植を持つマウスを、実施例５で記述されたように(０.８ｍＬの中で４０μｇのＤＮＡ／注射で)、処置した。それぞれのマウスは、２４時間にわたり三回の静脈注射を受領した。最後の注射の四十八時間後に、動物を屠殺して、器官を収穫した。全ての五つのバッチは、新鮮に作製された複合体のそれと匹敵して、非処置の腫瘍もしくは肝臓のいずれかの中で観察されたものより著しくさらに高い、ウエスタン分析による高レベルのｐ５３発現を示す(図７)。それ故に、この技術は商業的製造業者に成功裏に移行されることができる。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
(実施例８)
凍結乾燥された複合体における未完のＴｆＲｓｃＦｖレベルのパーセントの一貫性
凍結乾燥された複合体の安定性をさらに評価するために、複合体化されていないリガンドの量を２〜８℃で６ヶ月までの間保存後に測定した。ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体の中の複合体化されていないＴｆＲｓｃＦｖの量を評価するために、４％〜２０％グラジエントの非変性のかつ非還元のポリアクリルアミドゲル電気泳動に引き続くウエスタン分析を当業者に普通に知られる方法を用いて使用した(図８)。ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質に対するポリクローナルウサギ抗体を第一の抗体(Animal Pharm, Healdsburg, CAにより製造された)として使用して、ＨＲＰ−標識マウス抗−ウサギモノクローナル抗体(Sigma)を二次抗体として使用した。それぞれの中にＴｆＲｓｃＦｖ１３４ｎｇを含有する、新鮮に作製されたかもしくは凍結乾燥された複合体を、実施例１で記述されたように、作製して凍結乾燥した。凍結乾燥された試料を２〜８℃で１、４、もしくは６ヶ月の間保存した後に、それらを、実施例１でのように、再構成した。一旦リポソームに複合体化されると、ＴｆＲｓｃＦｖタンパク質はＰＡＧＥゲルには入ることができないであろう。それ故に、複合体化されていない遊離のＴｆＲｓｃＦｖのみが検出されるであろう。非変性のかつ非還元の条件下では、遊離のＴｆＲｓｃＦｖの単量体の量を正確に測定することは困難である。かくして、１３.４ｎｇ(複合体のそれぞれの中のものの１０％)、２６.８ｎｇ(２０％)もしくは４０.２ｎｇ(３０％)の単一薬剤のＴｆＲｓｃＦｖを含有する、複合体化されていない試料を、試験複合体のそれぞれの中の複合体化されていないＴｆＲｓｃＦｖの量の粗い評価のための濃度標準として同一のゲルの中でまた操作した。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
凍結乾燥される複合体を、５％デキストロースもしくは１０％ショ糖のいずれかを含有するように作製して、１０％ショ糖を含む新鮮に作製された匹敵する複合体製剤と比較した。複合体を、実施例１で記述されたように、凍結乾燥し、２〜８℃で一夜保存して、実施例１で記述されたように、エンドトキシン不含有水中に再構成した。５×１０３のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を、９６穴プレートのウエルの中に接種した。２４時間後に、細胞を、新鮮に作製されたかもしくは凍結乾燥され、再構成された複合体のいずれかでトランスフェクトした。細胞生存度ＸＴＴベースの細胞毒性アッセイ(ＸＴＴ＝３'−(１−フェニル−アミノ−カルボニル)−３,４−[テトラゾリウム]−ビス(４−メトキシ−６−ニトロ)ベンゼンスルホナート)をトランスフェクションの４８時間後に三つ組（triplicate）で実施した。図９に示すように、０.２５μＭ以上のＡＳ−ＨＥＲ−２ＯＤＮ濃度において、１０％ショ糖を含有する凍結乾燥されて、再構成された複合体は、細胞致死への最大の効果を有した。さらに高いＯＤＮ濃度において、新鮮なおよび再構成された１０％ショ糖を含有する複合体の両方は、５％デキストロースでのより格段に優れていて、そして凍結乾燥は、複合体に含有されたＨＥＲ−２アンチセンスＯＤＮの細胞致死能力への悪影響を何も有しなかった。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
１０％ショ糖の存在下での凍結乾燥および再構成が複合体の有効性に有害でなかったことを確認するために、ヒト膵臓がん(ＰＡＮＣ)１細胞の中でジェムザールに対する化学感作のレベルを評価するＸＴＴアッセイを実施して、新鮮に作製された複合体を、実施例１で記述されたように、凍結乾燥されて、再構成された匹敵する複合体に対して比較した。複合体の中の成分の比は、１ｎｍｏｌ：１５ｎｍｏｌ(ＯＤＮ：リポソーム)および１μｇ：３０μｇ(ＴｆＲｓｃＦｖ：リポソーム)であった。４×１０３のＰＡＮＣ−１細胞を、９６穴プレートのウエルの中に接種して、２４時間後に、新鮮に作製されたかもしくは１０％ショ糖を与えるようにショ糖と混合されて、凍結乾燥され、終夜２〜８℃で冷蔵して保存されて、再構成されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２(０.２５μＭ  ＯＤＮ)複合体とトランスフェクトした。化学療法薬のジェムザールを２４時間後に加えた。細胞生存度ＸＴＴベースのアッセイを薬物添加の７２時間後に三つ組で実施した。結果を図１０に図示する。示されるように、試料の生存曲線は事実上同一であった。加えて、複合体のＩＣ５０(５０％の細胞を致死する薬物の濃度)値は、５％デキストロースで新鮮に作製された複合体を用いて以前に測定されたより、さらに低くないとしても、同一である。かくして、本発明の作製および保存方法はまた、標的遺伝子が処理法に対して無関係であるので、任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの使用に適している。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
ゼータ電位は、６ヶ月保存後で−４３.８(新鮮な)および−４７.７(凍結乾燥された)であった。１０％ショ糖で凍結乾燥された複合体のトランスフェクション効率を、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２のインビトロでのＨＥＲ−２発現を下方調整する能力を評価することにより、測定した。作製、凍結乾燥（実施例４におけるように）、および−２０℃で６ヶ月までの間の保存の後で、二つの異なる濃度(０.３もしくは０.６μＭ)における複合体のＡＳ  ＨＥＲ−２ＯＤＮまたは０.６μＭにおけるＳＣ−ＯＤＮを使用して、ヒト乳がん細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞をトランスフェクトした。ＡＳ  ＨＥＲ−２もしくはＳＣ−ＯＤＮを保持する新鮮に作製された複合体を対照として用いた。ＳＣ−ＯＤＮは凍結乾燥の前後のいずれでも何も効果を有しなかった。しかしながら、−２０℃で６ヶ月の保存後でさえ、新鮮に作製されたおよび凍結乾燥された複合体(図１１)の両方による、ＡＳ  ＨＥＲ−２ＯＤＮ用量依存性のＨＥＲ−２発現の下方調整があった。ＳＣ−ＯＤＮは何も効果を有しなかったので、観察された下方調整は、複合体の凍結乾燥に因るいずれの一般的な細胞毒性の結果でなかった。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
(実施例１２)
ペプチド−リポソームで作製された複合体の凍結乾燥後のサイズの維持
本発明の一般的な性質をさらに立証するために、修飾リポソームを含んだ複合体をまた作製した。複合体を形成するために使用されたリポソームをペプチドに結合した。ペプチドは、ヒスチジンおよびリシンを含んで、長さで３１個のアミノ酸の枝分かれしたペプチドであって、構造(5’-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3’)を持つヒスチジンおよび非−ヒスチジンアミノ酸の組合せから成った。この試験におけるリポソームはＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ(１：１)から成った。ＨＫペプチドは、末端システインおよびリポソーム中のマレイミド基を介してリポソームに共有結合で結合された。複合体は、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＨＫ−リポソーム−ＤＮＡから成って、そこでは成分の比は以下のようであった：１μｇ：３０μｇのＴｆＲｓｃＦｖ対ＨＫ−リポソーム(μｇ：μｇ)および１μｇ：１４ｎｍｏｌのＤＮＡ対ＨＫ−リポソーム(μｇ：ｎｍｏｌ)であった。使用されたＤＮＡは、複合体の全容積３００μＬについて１８μｇのｐ５３ＤＮＡ(実施例４を参照)であった。１０％ショ糖は最終の複合体の中に含まれた。複合体を、実施例１で記述されたように、作製して、凍結乾燥した。凍結乾燥の後に、複合体を２〜８℃で３日間保存して、次いで、実施例１で記述されたように、再構成した。凍結乾燥の前のおよび２〜８℃で三日間保存後の複合体のサイズをMalvern Zetasizer 3000H上で測定した。凍結乾燥の前には、サイズ(数平均)は６０１ｎｍであった。保存および再構成の後では、それは５８８であった。かくして、もう一度、１０％ショ糖を用いる複合体の凍結乾燥は、ＨＫペプチドの包含をもってしても、複合体のサイズに如何なる著しい変化をもたらさなかった。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
(インビトロおよびインビボでの標的化)
腫瘍細胞を特異的に標的にして、凍結乾燥および２〜８℃で長期間の間の保存の後でそれらを効率よくトランスフェクトする複合体の能力を、ヒト前立腺細胞株ＤＵ１４５およびヒト膀胱がん腫細胞株ＨＴＢ−９を用いて細胞培養液の中でまた試験した。両方の細胞株を、新鮮に作製された複合体かもしくは商業的受託者により作製されて、凍結乾燥されて(実施例７)、実施例１におけるような再構成の前におよそ４ヶ月間２〜８℃で保存されてきていた複合体のいずれかを用いて、インビトロでトランスフェクトした。細胞の中のＲＢ９４タンパク質発現のレベルを、当業者に既知の標準的プロトコルを用いるウエスタン分析により測定した。新鮮に作製されたかもしくは凍結乾燥された複合体でのトランスフェクションの後に検出されたタンパク質の量の間にいずれのヒト腫瘍細胞株において著しい相違は何も無かった。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
ヒト膀胱がん腫ＨＴＢ−９異種移植腫瘍を保持するマウスを、新鮮に作製された複合体かもしくは、実施例１におけるように、攪拌により１０％ショ糖で作製されて、凍結乾燥されて(実施例７)、実施例１での再構成の前に殆ど５ヶ月間２〜８℃で保存されてきていた複合体で全身的に(尾静脈を介して静脈で)注射した。マウスは、２４時間にわたって合計三回の静脈注射(注射当り０.６７ｍＬ中でＤＮＡの４０μｇ)を受領した。最後の注射のおよそ４８時間後に、動物を人道的に屠殺し、腫瘍および肝臓を取り出し、タンパク質を得て、Xu, L., et al., tumor Targeting 4:92-104 (1999)により記述されたような普通の手順により抗−ＲＢ９４モノクローナル抗体(QED Biosciences, Inc)を用いるウエスタンブロット法により分析した。インビトロでの試験については、新鮮なもしくは凍結乾燥された複合体を受領する動物からの腫瘍の中で明白なＲＢ９４タンパク質のレベルに著しい相違は何も無かった。どちらかと言えば、発現は、凍結乾燥された複合体で注射されたマウスからの腫瘍の中でさらに高くさえあった。さらに、いずれの群で肝臓の中では事実上何の発現が無かったことで、複合体の腫瘍の標的化能力は、１０％ショ糖の存在下での凍結乾燥および２〜８℃で少なくとも５ヶ月間の保存の後で維持されたことを立証した。
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
【図１】図１は、５％デキストロースもしくは５％ショ糖を含有する新鮮に作製されたおよび凍結乾燥された複合体(Ｔｆ−ＬｉｐＡ−ＬｕｃおよびＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−Ｌｕｃ)のサイズ(ｎｍ)を示す。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
【図２Ａ】図２Ａは、ＤＵ１４５ヒト前立腺細胞の中に５％デキストロースもしくは５％ショ糖を含有する新鮮に作製されたおよび凍結乾燥された複合体(Ｔｆ−ＬｉｐＡ−Ｌｕｃ)の、μｇタンパク質当り相対的な光単位(ＲＬＵ)として示される、インビトロのトランスフェクション効率を示す。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＤＵ１４５ヒト前立腺細胞の中に５％デキストロースもしくは５％ショ糖を含有する新鮮に作製されたおよび凍結乾燥された複合体(ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−Ｌｕｃ)の、μｇタンパク質当り相対的な光単位(ＲＬＵ)として示される、インビトロのトランスフェクション効率を示す。
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
【図３】図３は、ＤＵ１４５ヒト前立腺がん細胞の中に５％のもしくは１０の％ショ糖を含有する新鮮に作製されたおよび凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−Ｌｕｃ複合体のインビトロのトランスフェクション効率(ＲＬＵ／μｇタンパク質)の比較を示す。
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
【図５】図５は、１０％ショ糖で実験室で作製されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体の腫瘍の標的化能力が凍結乾燥および２℃〜８℃で６ヶ月までの間の保存後に維持されることを、ヒト前立腺がん(ＤＵ１４５)異種移植マウスモデルにおいて立証する。
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
【図７】図７は、ＤＵ１４５異種移植マウスモデルにおいて１０％ショ糖で五つの異なる商業的に作製されて凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３のバッチの腫瘍の標的化およびトランスフェクション効率を示す。
【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
【図８】図８は、非変性ゲル電気泳動により評価された、種々の新鮮に作製されたおよび凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体の中の複合体化されていないＴｆＲｓｃＦｖのパーセントを示す。
【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【図９】図９は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳がん細胞の中で凍結乾燥されたおよび新鮮に作製されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ−ＨＥＲ−２複合体の間の細胞増殖阻害のインビトロでの比較を示す。
【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
【図１０】図１０は、新鮮に作製されたかもしくは凍結乾燥されたＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体によるＰＡＮＣ−１化学感作のインビトロでの比較を示す。
【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
【図１１】図１１は、凍結乾燥および２℃〜８℃で６ヶ月までの間の保存の後に１０％ショ糖を含むＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２によるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳がん細胞の中でＨＥＲ−２発現のインビトロでの下方調節を示す。
【手続補正５９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2006526658.tif 000004
【手続補正６０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2006526658.tif 000005
【手続補正６１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2006526658.tif 000006
【手続補正６２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
2006526658.tif 000007