【手続補正書】
【提出日】平成19年10月25日(2007.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸を生産する方法であって、
培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生しない酸耐性（ＡＴ）酵母株を、第一の培養培地中で好気培養することを含み、
該ＡＴ酵母株が、ＡＴ酵母株で発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなり、
その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、
該ＡＴ酵母株が親酵母株よりも低いｐＨの最小培地で増殖し得る、
方法。
【請求項２】
ＡＴ酵母株が、Ｃ２炭素源非依存性であり、かつ、約３．５より低いｐＨで乳酸を産生し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＴ酵母株が、単一炭素源としてグルコースを含む最小培地で培養した際にグルコース１００グラム当たり約５０グラムを超える乳酸を産生し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＡＴ酵母株が、サッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセスおよびクルイベロミセスからなる群から選択される属に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＡＴ酵母株が、遺伝子型ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｕｒａ３−５２  ＹＥｐＬｐＬＤＨを有するサッカロミセス・セレビシエである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培養が、好気回分培養、好気流加培養または好気ケモスタットで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＡＴ酵母株が、Ｃ２炭素源非依存性である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第一の培養培地が、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトースおよびガラクトースからなる群から選択される少なくとも一種類の所定の炭素源を含んでなる最小培地である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＡＴ酵母株が、Ｃ２炭素源依存性であり、第一の培養培地がグルコースから本質的になる炭素源と少なくとも一種類のＣ２炭素源とを含んでなる最小培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなる少なくとも一つのプラスミドがＡＴ酵母株内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム、ウシ、ラクトバチルス・カセイ、バチルス・メガテリウム、リゾープス・オリゼまたはバチルス・ステアロサーモフィラスの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
乳酸またはその塩を回収および精製する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
精製工程が、蒸留、イオン交換、ナノフィルトレーションまたは溶媒抽出の少なくと一つを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生しない酸耐性（ＡＴ）酵母株であって、
ＡＴ酵母株で発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなり、
その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、
親酵母株よりも低いｐＨの最小培地で乳酸を産生し得る、
ＡＴ酵母株。
【請求項１５】
検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を持たない、請求項１４に記載のＡＴ酵母株。
【請求項１６】
ＡＴ酵母株の野生株が、クラブトリー陽性である、請求項１５に記載のＡＴ酵母株。
【請求項１７】
約３．５より低いｐＨで乳酸を産生し得る、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のＡＴ酵母株。
【請求項１８】
最小培地で好気培養した際に、培養液中に約５００ｍＭを超える乳酸を産生し得る、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のＡＴ酵母株。
【請求項１９】
サッカロミセス、カンジダ、シゾサッカロミセス、トルラスポラ、クルイベロミセス、ジゴサッカロミセスおよびデッケラからなる群から選択される属に属する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＡＴ酵母株。
【請求項２０】
サッカロミセス・セレビシエである、請求項１９に記載のＡＴ酵母株。
【請求項２１】
Ｃ２炭素源非依存性である、請求項１４に記載のＡＴ酵母株。
【請求項２２】
グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトースおよびガラクトースからなる群から選択される少なくとも一種類の所定の炭素源を含んでなる最小培地で増殖し得る、請求項２１に記載のＡＴ酵母株。
【請求項２３】
外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、プロモーターに機能的に連結されている、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載のＡＴ酵母株。
【請求項２４】
外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム、ウシ、ラクトバチルス・カセイ、バチルス・メガテリウム、リゾープス・オリゼ、またはバチルス・ステアロサーモフィラスの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載のＡＴ酵母株。
【請求項２５】
Ｌ−乳酸から本質的になる乳酸を産生し得る、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載のＡＴ酵母株。
【請求項２６】
Ｃ２炭素源依存性であり、グルコースから本質的になる炭素源と少なくとも一種類のＣ２炭素源とを含んでなる最小培地で増殖し得る、請求項１４に記載のＡＴ酵母株。
【請求項２７】
Ｃ２炭素源非依存性である（ＣＩ）、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の耐酸性酵母株であって、
そのＣＩ酵母株が親株より低いｐＨの第一の最小培地で乳酸を産生し得る、
酵母株。
【請求項２８】
少なくとも一つのプラスミドが、２ミクロンプラスミドである、請求項２７に記載のＣＩ酵母株。
【請求項２９】
最小培地で培養した際にグルコース１００グラム当たり約５０グラムを超える乳酸を産生し得る、請求項２７に記載のＣＩ酵母株。
【請求項３０】
グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトースおよびガラクトースからなる群から選択される少なくとも一種類の所定の炭素源を含んでなる第二の最小培地で増殖し得る、請求項２７に記載のＣＩ酵母株。
【請求項３１】
組換え酵母株において発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなるゲノムを有する組換え酵母株であって、
その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、
単一炭素源としてグルコースを含んでなる最小培地で増殖させた際に、グルコース１００グラム当たり少なくとも約５０グラムの乳酸を産生することができ、
約３．５より低いｐＨで増殖可能である、
組換え酵母株。
【請求項３２】
約２．８より低いｐＨで乳酸を産生し得る、請求項３１に記載の組換え酵母株。
【請求項３３】
乳酸を生産する方法であって、
組換え酵母株で発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなるゲノムを有する組換え酵母株を、第一の培養培地で好気培養することを含んでなり、その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、その組換え酵母株が、単一炭素源としてグルコースを含んでなる最小培地で増殖させた際にグルコース１００グラム当たり少なくとも約５０グラムの乳酸を産生することができ、かつ、その組換え酵母株が約３．５より低いｐＨで増殖可能である、
方法。
【請求項３４】
（ａ）第一の酵母株を第一の好気培養物として増殖させること、ここで、この第一の好気培養は、第一の最小培地に、培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生しない第一の酵母株を接種することにより始め、この第一の酵母株は、第一の酵母株で発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなり、その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、第一の好気培養物の増殖中にその培養物のｐＨが低下すること、
（ｂ）第一の酵母株が第一の最小培地中でなお増殖し得る最低付近のｐＨを決定すること、および
（ｃ）第一の好気培養物がなお増殖し、かつ、ｐＨが最低付近であるときに、第一の好気培養物から少なくとも一つの第二の酵母株を回収すること
を含んでなる選択プロセスにより回収される、酸耐性（ＡＴ）酵母株。
【請求項３５】
選択プロセスが、
（ｄ）第二の好気培養物を増殖させること、ここで、この第二の好気培養は新鮮な最小培地に、回収した第二の酵母株を接種することにより始め、第二の好気培養物の増殖中にその培養物のｐＨが低下する工程、および
（ｅ）第二の好気培養物がなお増殖し、かつ、そのｐＨが第一の好気培養物の最低付近のｐＨよりも低いときに、第二の好気培養物から少なくとも一つの第三の酵母株を回収する工程
をさらに含んでなる、請求項３４に記載のＡＴ酵母株。
【請求項３６】
選択プロセスが工程（ｄ）と（ｅ）を少なくとも一度繰り返すことをさらに含み、それが前の工程から回収した酵母株を新鮮な最小培地に接種することを含んでなる、請求項３５に記載のＡＴ酵母株。
【請求項３７】
その工程の、ＡＴ酵母株が増殖している好気培養物の最低付近のｐＨが、その前の工程の、ＡＴ酵母株が増殖している好気培養物の最低付近のｐＨよりも低い、請求項３６に記載のＡＴ酵母株。
【請求項３８】
（ａ）培養培地中で培養した際にエタノールを本質的に産生せず、かつ、グルコースが最小培地における唯一の他の炭素源である場合にＣ２炭素源を要求する第一の酵母株を最小培地に接種すること、ここで、その酵母株のゲノムが、発現可能な外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでなり、その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、その酵母は、グルコースとＣ２炭素源を含んでなる第一の最小培地中、好気条件下で培養した際に乳酸またはその塩を産生することができ、かつ、第一の酵母株はその親株よりも低いｐＨの第一の最小培地で増殖することができること、
（ｂ）その第一の酵母株を第二の最小培地を用いて一連の好気回分培養で培養し、ここで、その回の最初の時点で、第二の最小培地は単一炭素源としてグルコースとＣ２炭素源とを、酵母培養物を増殖させるの十分な濃度で含み、このＣ２炭素源の濃度はその回の回分培養中に低下し、各連続回分培養に前回の回分培養で増殖させた酵母を接種すること、および
（ｃ）Ｃ２炭素源を用いずに、単一炭素源としてグルコースを用いて増殖し得る、その回の回分培養物から少なくとも一つのＣＩ酵母株を回収すること
を含んでなる選択プロセスにより回収される、酸耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＣＩ）酵母株。
【請求項３９】
第一の酵母株が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素活性またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素活性の少なくとも一方を欠損している、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項４０】
第一の酵母株の野生型酵母が、クラブトリー陽性である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項４１】
寄託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−３０６９６またはＮＲＲＬ  Ｙ−３０６９８を有する、酵母株。