【手続補正書】
【提出日】平成19年6月6日(2007.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
【図１Ａ】プラスミドｐｗｔＬｕｃ１（レーン２）、ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９（レーン３）又はｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０（レーン４）を含むＣＨＯ細胞の溶解物、或いはプラスミドを含まないＣＨＯ溶解物（レーン５）を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ膜上に移し、ウサギ抗ホタルルシフェラーゼ及びアルカリホスファターゼと結合した抗ウサギ抗体を用いて、ルシフェラーゼ種を検出したことを示す図である。レーン１は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｅｅ  Ｂｌｕｅ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄに対応する。
【図１Ｂ】プラスミドｐｗｔＬｕｃ１（レーン１）又はｐＥＴＵｂｉｑＬｕｃ（レーン２）を使用して得たｍＲＮＡを含むか、或いは外来のｍＲＮＡを含まない（レーン３）小麦麦芽抽出物を用いて翻訳したタンパク質を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、オートラジオグラフィーによってタンパク質を目に見える状態にしたことを示す図である。
【図１Ｃ】プラスミドｐＥＴｗｔＬｕｃ１（レーン１）、ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２（レーン２）、ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１（レーン３）又はｐＴ７Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１０（レーン４）を含む、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７結合網状赤血球溶解物を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、オートラジオグラフィーによってタンパク質を目に見える状態にしたことを示す図である。
【図２】野生型ホタルルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼを含む融合タンパク質をコードするプラスミドを、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７結合網状赤血球溶解物系中で発現させたことを示す図である。比放射能は、それぞれの混合物中に蓄積した全体のルシフェラーゼ活性と、それぞれのタンパク質中に取り込まれた［３Ｈ］−ロイシンの量の間の比として測定した。
【図３】野生型ホタルルシフェラーゼ（ｐｗｔＬｕｃ１）、ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質（ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２）、又はホタルルシフェラーゼを含む融合タンパク質、及び突然変異形のＣ−ＯＤＣ（ｍＯＤＣ）（ｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０）をコードするプラスミドを用いて、一過的にトランスフェクトした細胞を、シクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）によって異なる時点で処理したことを示す図である。インキュベーションの終了時に、安定性を定義するために、細胞を溶解させ、蓄積したルシフェラーゼの活性を、ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計を使用して測定した。
【図４】ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした、ＣＨＯ（Ａ）、ＣＯＳ−７（Ｂ）、及びＨｅＬａ（Ｃ）細胞を、シクロヘキシミドによって異なる時点で処理したことを示す図である。細胞の発光を測定して、対応するタンパク質の安定性を決定した。シクロヘキシミドによって処理しなかった対照細胞を使用して、バックグラウンドルシフェラーゼ活性を測定した。
【図５】ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質の部分的アミノ酸配列を、タンパク質の半減期の測定におけるＮ末端残基の相対的な重要性を確定する際に、評価したことを示す図である。影付き／ボックス状領域は、ユビキチン及びルシフェラーゼ配列を示す。太線は欠失の位置を示す。この部分的アミノ酸配列は、具体的には以下の通りである：MEDAKNIKK (配列番号82)、KIAV (配列番号83)、MQIF (配列番号84)、GGHPRDPVTDAKNIKK (配列番号85)、GGHVTDAKNIKK (配列番号86)、GGEPRDPVTDAKNIKK (配列番号87)、GGEVTDAKNIKK (配列番号88)、GGYPRDPVTDAKNIKK (配列番号89)、GGYPRDPEDAKNIKK (配列番号90)。
【図６】ＣＨＯ（Ａ）及びＣＯＳ−７（Ｂ）細胞を、野生型ホタルルシフェラーゼ（ｐｗｔＬｕｃ１）、又は異なるＮ末端ルシフェラーゼアミノ酸残基を有する、ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドを用いて、一過的にトランスフェクトしたことを示す図である。トランスフェクション後２４時間で、細胞をシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）によって異なる時点で処理し、インキュベーションの終了時に、蓄積したルシフェラーゼの発光を測定した。
【図７】ＨｅＬａ細胞を、野生型ルシフェラーゼ（ｐｗｔＬｕｃ１）、ルシフェラーゼ及びｍＯＤＣを含む融合タンパク質（ｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０）、或いはユビキチン、ホタルルシフェラーゼ、及びｍＯＤＣを含む融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ５、ｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１２、ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ２３及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ８０）を用いて、トランスフェクトしたことを示す図である。トランスフェクション後２４時間で、細胞をシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）によって異なる時点で処理した。細胞の発光を測定して、対応するルシフェラーゼの安定性を決定した（Ａ）。シクロヘキシミドによって処理しなかった対照細胞を使用して、異なる構築体のルシフェラーゼ活性を比較した（Ｂ）。
【図８】ＣＨＯ細胞を、様々なプラスミドを用いて、一過的にトランスフェクトしたことを示す図である。トランスフェクション後２４時間で、細胞をシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）によって異なる時点で処理した。インキュベーション後、蓄積したルシフェラーゼによる発光を測定した。シクロヘキシミドによって処理しなかった対照細胞を使用して、バックグラウンドルシフェラーゼ活性を測定した。
【図９】ドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ）（Ａ）又はシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）（Ｂ）処理後の、ｔｅｔ誘導系におけるルシフェラーゼ融合タンパク質の性質の比較を示す図である。ドキシサイクリン又はシクロヘキシミドによって処理しなかった、対照細胞からの発光のデータは図Ｃに示す。
【図１０Ａ】熱ショック誘導系におけるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ａ）及びホタルルシフェラーゼ（Ｂ）の、ルシフェラーゼ融合タンパク質の性質の比較を示す図である。
【図１０Ｂ】熱ショック誘導系におけるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ａ）及びホタルルシフェラーゼ（Ｂ）の、ルシフェラーゼ融合タンパク質の性質の比較を示す図である。
【図１１】選択したベクターの概略図である。
【図１２Ａ】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼベクター、多数のＣＲＥ、ホルスコリン（１０μＭ）及びイソプロテレノール（０．２５μＭ）を用いて一過的にトランスフェクトしたＤ２９３細胞中での、発光の誘導を示す図である。
【図１２Ｂ】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼベクター、多数のＣＲＥ、ホルスコリン（１０μＭ）及びイソプロテレノール（０．２５μＭ）を用いて一過的にトランスフェクトしたＤ２９３細胞中での、発光の誘導を示す図である。
【図１３Ａ】安定及び不安定型ホタルルシフェラーゼをコードするベクターを用いて一過的にトランスフェクトした、ｈＣＧ−Ｄ２９３細胞の発光の概略を示す図である。細胞はイソプロテレノール（１μＭ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）で処理し、或いはイソプロテレノール（１μＭ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）、次にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）で処理した。矢印は、細胞培養物に化学物質を加えた、時点を示す。
【図１３Ｂ】安定及び不安定型ホタルルシフェラーゼをコードするベクターを用いて一過的にトランスフェクトした、ｈＣＧ−Ｄ２９３細胞の発光の概略を示す図である。細胞はイソプロテレノール（１μＭ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）で処理し、或いはイソプロテレノール（１μＭ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）、次にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）で処理した。矢印は、細胞培養物に化学物質を加えた時点を示す。
【図１４】不安定ベクターを用いて安定的にトランスフェクトしたＤ２９３細胞における、発光対誘導倍数を示す図である。細胞はホルスコリン（１０μＭ）を用いて７時間処理し、或いはホルスコリン無培地でインキュベートした。すべてのベクターは、ｃＡＭＰ制御プロモーターの調節下にあった。
【図１５】ＣＲＥ系において不安定化配列と共に、コドン最適化ホタルシフェラーゼ又はＲｅｎｉｌｌａシフェラーゼを用いてトランスフェクトした２９３細胞におけるイソプロテレノール及びプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）による誘導倍数を示す図である。（Ａ）〜（Ｂ）：Ｉｓｏ／Ｒｏの２４時間後にＰＧＥ１を加え；（Ｃ）〜（Ｄ）：Ｉｓｏ／Ｒｏの６時間後にＰＧＥ１を加えた。
【図１６】ＣＲＥ系において不安定化配列と共に、赤色（ＣＢＲ）（Ｂ）又は緑色（ＣＢＧ）（Ａ）コメツキムシ配列を用いてトランスフェクトした２９３細胞における、イソプロテレノールによる誘導倍数を示す図である。