(57)【要約】【課題】眼の硝子体網膜界面に尿素を送達するためのリポソーム構築物を提供する。【解決手段】前記リポソーム構築物は、小さなラメラ小胞（ＳＵＶ）の凝集体であり、前記硝子体液よりも高い密度を有し、そのため、それらは、前記硝子体全体に分散するのではなく、眼の後ろに沈降する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム構築物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
前記リポソーム構築物は、小単層小胞（ＳＵＶ）の凝集体を含み、
前記ＳＵＶは、前記ＳＵＶ内にカプセル化した尿素を含み、
前記ＳＵＶは、約１．０５より大きい比重、約２２０ｎｍより小さいｚ平均直径、及び約０．１５０より小さい多分散性指数値（ＰｄI）を有する前記医薬組成物。
【請求項２】
前記ＳＵＶが、約２００ｎｍ未満のｚ平均直径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＳＵＶが、１つ以上のリン脂質を含み、コレステロールを含まないラメラを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＳＵＶが、１つ以上のリン脂質及び１〜９ｍｏｌ％のコレステロールを含むラメラを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＳＵＶが、１つ以上のリン脂質及び４２〜６９ｍｏｌ％のコレステロールを含むラメラを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＳＵＶが、１つ以上のコレステロール、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、及びパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を含むラメラを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＳＵＶが本質的に以下：
ａ．５８ｍｏｌ％のＤＰＰＣ、及び４２ｍｏｌ％のコレステロール
ｂ．５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ、及び４２ｍｏｌ％のコレステロール
ｃ．５８ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、及び４２ｍｏｌ％のコレステロール
ｄ．２９ｍｏｌ％のＤＰＰＣ、４２ｍｏｌ％のコレステロール、及び２９ｍｏｌ％のＤＰＰＧ
ｅ．８０ｍｏｌ％のＰＯＰＣ、及び２０ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰ
ｆ．６７ｍｏｌ％のＤＭＰＣ、及び３３ｍｏｌ％のＤＭＰＧ、または
ｇ．３３ｍｏｌ％のＤＰＰＣ、１３ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、３２ｍｏｌ％のＤＯＰＣ、１７ｍｏｌ％の１８：２ＰＣ、５ｍｏｌ％の２０：４ＰＣ
からなるラメラを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＳＵＶが、本質的に５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロールからなるラメラを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＳＵＶが、表面修飾基を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記表面修飾基が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＳＵＶが、少なくとも２０％のカプセル化効率を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＳＵＶの充填されたペレットが、充填されたペレット１ｍＬ当たり少なくとも約１００ｍｇのカプセル化した尿素を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記薬学的に許容される担体が、尿素を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
エマルジョンまたは懸濁液の形態である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記硝子体網膜界面に尿素を送達するための方法であって、
前記方法は、対象の前記硝子体に請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項１６】
黄斑または網膜の疾患または障害を有するかまたは罹患しやすい対象において、後部硝子体剥離（ＰＶＤ）を誘発する方法であって、
前記方法は、前記対象の前記硝子体に、請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項１７】
対象における糖尿病性網膜症または硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象の前記硝子体に、請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項１８】
前記投与が、硝子体内への注射によるものである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、前記医薬組成物の投与中に仰向けに位置する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象の前記眼において、後部硝子体剥離（ＰＶＤ）を誘発するための、請求項１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
対象の前記眼の前記硝子体網膜界面に尿素を送達するための、請求項１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２２】
糖尿病性網膜症または硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）を治療するための請求項１に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、すべての目的のために、その内容全体が参照によって本願に組み込まれる、２０１６年８月１８日に出願された米国仮特許出願番号６２／３７６，８６２号の利点を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
眼は、球体の中や周りに血液や他の液体の一定した大量の循環を有する、非常に活発な器官である。網膜は、眼の後ろを覆う神経の層で、光を感知する桿体及び錐体と呼ばれる特殊な光受容細胞を含む。網膜は、視神経を通して、光信号を脳の視覚野に送る。錐体細胞は、黄斑と呼ばれる網膜の小さな領域に最も集中している。脈絡膜は、網膜と眼の白い外層である強膜との間の、高度に血管性の構造である。脈絡膜は、網膜への酸素及び栄養素の供給源、ならびに前眼房からの房水の排出システムの両方として作用する。眼は、硝子体と呼ばれるゲル状の物質、または硝子体で満たされている。硝子体は、かなりの濃度のヒアルロナン及びコラーゲン、さらに少量の他の様々なタンパク質を含む、大部分が水の球形構造である。硝子体の後部は、網膜と直接接触している。原線維鎖の網状組織は網膜から延び、それを網膜に付着させるために硝子体に挿入する。Ｓｅｂａｇ，Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２２５：８９−９３（１９８７）を参照されたい。
【０００３】
網膜の病理のために現在承認されている薬物の標準的な投与は、２６〜３０ゲージの針を使用して、１００マイクロリットル用量の硝子体内への注射であり、眼の中間層、扁平部の平らな構造を通して送達され、硝子体の中央部分に放出される。硝子体内に注射された薬物は、数時間以内に眼の外側の組織に散逸し、２４時間後に完全に除去されることが薬物動態学的解析により確立されている。典型的な１００マイクロリットルの注射は、小さな濃度が最も重要な領域である黄斑に移動する前に、５０倍から１倍まで希釈される。
【０００４】
眼に送達され得る薬物の量は器官の大きさによって制限され、また、眼科用製剤は硝子体に導入されると比較的急速に消散するので、黄斑及び隣接組織への治療量の薬物の送達及び維持は、眼科用薬品の開発者及び臨床医にとって大きな課題であった。例えば、糖尿病性網膜症のような慢性疾患の治療のために、治療上有効量の、特に、尿素のような水溶性の高い活性剤を、長期間にわたって眼の背部に送達することができる眼科用製剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態の主な態様のいくつかを以下に要約する。追加の態様は、発明を実施するための形態、実施例、図面、及び特許請求の範囲のセクションに記載されている。本開示の各セクションにおける説明は、他のセクションと併せて読まれることを意図している。さらに、本開示の各セクションに記載されている様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わされ得、そのようなすべての組み合わせは、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【０００６】
本開示は、リポソーム構築物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供し、ここで、前記リポソーム構築物は、小さい単層小胞（ＳＵＶ）の凝集体を含み、前記ＳＵＶは、前記ＳＵＶ内にカプセル化した尿素を含み、前記ＳＵＶは、約１．０５より大きい比重、約２２０ｎｍより小さいｚ平均直径、及び約０．３０より小さい多分散性指数値（ＰｄI）を有する。いくつかの実施形態において、ｚ平均直径は、約２００ｎｍ未満である。薬学的に許容される担体は、任意に尿素を含み得る。
【０００７】
１つの実施形態において、医薬組成物はエマルジョンまたは懸濁液の形態である。
【０００８】
ＳＵＶは、中央区画を囲む脂質二重層（すなわち、ラメラ）を有する。１つの態様において、ラメラは、１つ以上のリン脂質を含み、コレステロールを含まない。別の態様において、ラメラは、（ｉ）１つ以上のリン脂質、及び（ｉｉ）約７０ｍｏｌ％未満のコレステロール、または１〜９ｍｏｌ％のコレステロール、または３４〜６９ｍｏｌ％のコレステロール、または４２〜６９ｍｏｌ％のコレステロール、または１０〜２０ｍｏｌ％のコレステロール、または２０〜３０ｍｏｌ％のコレステロール、または３０〜４０ｍｏｌ％のコレステロール、または４０〜５０ｍｏｌ％のコレステロール、または５０〜６０ｍｏｌ％のコレステロール、または６０〜６９ｍｏｌ％のコレステロールを含む。特定の実施形態において、ラメラは、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、及びパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）のうちの１つ以上を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、ラメラは、本質的に、５８ｍｏｌ％のＤＰＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロール、５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロール、５８ｍｏｌ％のＰＯＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロール、２９ｍｏｌ％のＤＰＰＣ、４２ｍｏｌ％のコレステロール及び２９ｍｏｌ％のＤＰＰＧ、８０ｍｏｌ％のＰＯＰＣ及び２０ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰ、６７ｍｏｌ％のＤＭＰＣ及び３３ｍｏｌ％のＤＭＰＧ、または、３３ｍｏｌ％のＤＰＰＣ、１３ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、３２ｍｏｌ％のＤＯＰＣ、１７ｍｏｌ％の１８：２ＰＣ、５ｍｏｌ％の２０：４ＰＣからなる。好ましい態様において、ラメラは、本質的に、５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロールからなる。
【００１０】
特定の態様において、ＳＵＶは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの表面修飾基を含む。
【００１１】
ＳＵＶは、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％のカプセル化効率を有し得る。いくつかの実施形態において、ＳＵＶは、少なくとも約２０％のカプセル化効率を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＳＵＶの充填されたペレットは、充填されたペレット１マイクロリットル当たり少なくとも約０．１ｍｇ、好ましくは、少なくとも約０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４５ｍｇ、または０．５ｍｇのカプセル化した尿素を含む。カプセル化した尿素の量は、送達に対して所望の投与量に依存するであろう。
【００１３】
硝子体網膜の界面に尿素を送達するための方法もまた提供され、前記方法は、本発明の医薬組成物を対象の硝子体に投与することを含む。
【００１４】
１つの実施形態は、ＰＶＤを誘発することによって治療または予防され得る、眼の疾患または障害を有するかまたはそれらにかかりやすい対象において、後部硝子体剥離（ＰＶＤ）を誘発する方法を指向し、前記方法は、本発明のリポソーム構築物を含む医薬組成物を対象の硝子体に投与することを含む。特定の実施形態において、前記疾患または障害は、例えば、糖尿病性網膜症または硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）であり得る。
【００１５】
対象の糖尿病性網膜症またはＶＭＡを治療する方法であって、対象の硝子体に本発明の医薬組成物を投与することを含む方法がさらに提供される。
【００１６】
本発明の方法は、硝子体内への注射による本発明の医薬組成物の投与を含み得る。１つの実施形態において、硝子体内への注射は、扁平部を介して行われる。本発明の方法は、対象が仰臥位にある投与を含み得る。
【００１７】
特定の実施形態は、リポソーム構築物の放出特性を提供する。いくつかの態様において、投与後２４時間以内に少なくとも８０％の尿素がリポソーム構築物から放出される。いくつかの態様において、投与後８時間以内に少なくとも８０％の尿素がリポソーム構築物から放出される。いくつかの態様において、投与後４時間以内に少なくとも８０％の尿素がリポソーム構築物から放出される。
【００１８】
本発明の実施形態は、後部硝子体剥離（ＰＶＤ）を誘発するため、またはＰＶＤを誘発することによって治療または予防され得る眼の疾患または障害を治療または予防するための、本発明のリポソーム構築物または組成物の使用を含む。本発明の１つの実施形態は、糖尿病性網膜症または硝子体黄斑癒着（ＶＭＡ）を治療または予防するための、本発明のリポソーム構築物を含む医薬組成物の使用を含む。
【００１９】
さらなる態様は、本発明のリポソーム構築物または医薬組成物を含むキットである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ〜１Ｅは、（本明細書に開示されるように）製剤１（図１Ａ）、（本明細書に開示されるように）製剤３（図１Ｂ）、（本明細書に開示されるように）製剤８（図１Ｃ）、（本明細書に開示されるように）製剤１１（図１Ｄ）、または（本明細書に開示されるように）製剤１２（図１Ｅ）から作製された、完全な及び溶解したリポソーム構築物からの２４時間にわたるカルボキシフルオレセインの漏出を示す。製剤を表１に記載する。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、１×ＰＢＳ（図２Ａ、２Ｂ）またはウサギの硝子体液（図２Ｃ、２Ｄ）におけるカプセル化した尿素のリポソーム構築物の２４時間にわたる安定性を示す。グラフ中の製剤＃１、＃２、＃３、＃４、及び＃５は、それぞれ、表１に記載の製剤１、２、３、１２、及び１４に対応する。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、製剤２（表１に記載）から作製し、４℃（図３Ａ）、室温（図３Ｂ）、または３７℃（図３Ｃ）で保存した、尿素カプセル化リポソーム構築物の７日間にわたる安定性を示す。
【図４】図４は、カプセル化した尿素を含むリポソーム構築物を製造するための、逆相蒸発法のフローチャートを示す。
【図５】図５は、４つのバッチのリポソーム構築物についての、インビトロの尿素放出データを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、１００μＬ用量（４０％リポソームの体積／６０％尿素バッファーの体積）において、カプセル化した尿素の量とＤＯＰＣ（図６Ａ）またはコレステロール（図６Ｂ）の濃度との間の関係を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、投与直後（０日目）、及びその後の示された時点でのグループ２ａの動物の代表的な眼底写真を示す。左眼（ＯＳ）は、平衡塩類溶液の硝子体内への注射を受け、右眼（ＯＤ）は、溶液中に９６ｍｇの尿素の硝子体内への注射を受けた。右眼の血管系の濁った外観は、前記製剤の存在によるものである。４日目、７日目、及び１４日目のＯＤパネルにおける矢印は、製剤を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、示された投与後の時点でのグループ２ｂの動物の代表的な光干渉断層撮影（ＯＣＴ）の画像を示す。対応する眼底画像は、各サブパネルの左側に示され、緑色の線は、ＯＣＴの画像の位置を示す。左眼（ＯＳ）は、平衡塩類溶液の硝子体内への注射を受け、右眼（ＯＤ）には、溶液中に１９２ｍｇの尿素の硝子体内への注射を受けた。
【図９】図９は、尿素溶液のＯＤ注射１日後及び３５日後において、グループ３（２５ｍｇの尿素）、グループ４（５０ｍｇの尿素）、及びグループ５（２．５ｍｇの尿素）の動物の代表的な眼底写真を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、示された時点での、グループ３（２５ｍｇの尿素）（図１０Ａ）及びグループ４（５０ｍｇの尿素）（図１０Ｂ）の動物の代表的なＯＣＴ画像を示す。対応する眼底像は、各サブパネルの左側に示されている。ＰＶＤのいくつかの例は、矢印で示されている。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、尿素溶液のＯＤ注射の前及び３５日後の、グループ３（２５ｍｇの尿素）（図１１Ａ）及びグループ４（５０ｍｇの尿素）（図１１Ｂ）の動物の代表的なＢスキャンの画像を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、３２日目の網膜電図を示す。図１２Ａは、青色光に曝露された暗順応コントロール（上部のパネル）及びグループ８（下部のパネル）の動物のグラフを示す。図１２Ｂは、赤色光に曝露された暗順応コントロール（上部のパネル）及びグループ８（下部のパネル）の動物のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の実施形態は、網膜及び黄斑への尿素の送達のための新規製剤を提供する。本発明の実施形態のリポソーム構築物は、眼の疾患または障害を治療、予防、診断、及び／または監視するために、眼内の標的領域で尿素を選択的かつ特異的に放出し得る。
【００２２】
本発明の実施形態の実施は、特に明記しない限り、薬学、製剤科学、タンパク質化学、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を使用し、これは当業者の技術の範囲内である。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（７ｔｈ  ｅｄ．，Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，２０１２）、Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（６ｔｈ  ｅｄ．，Ｓｉｎｋｏ，２０１０）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｅｄ．，２００５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，２０１６）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｄｓ．，２０１２）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ（１１ｔｈ  ｅｄ．，Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，２０１２）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄＩＩ（２ｄ  ｅｄ．，Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ  ｅｄｓ．，１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１ｓｔ  ｅｄ．，Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．１９９３）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（６ｔｈ  ｅｄ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，２０１０）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｄ．，２０１３）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｄ  ｅｄ．，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ｅｄ．，１９９５）を参照されたい。
【００２３】
本発明の実施形態をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、本開示を通して示される。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（３ｒｄ  ｅｄ．Ｎａｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｔ  ｅｄｓ．，２０１３）、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ  ｅｄ．，２０１３）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，２００８）、及びＴｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．Ｐ−Ｓ．Ｊｕｏ，２００２）は、本明細書で使用されるいくつかの用語の一般的な定義を当業者に提供し得る。
【００２４】
本明細書に提供される任意の見出しも、本明細書全体を参照することによって得られ得る、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、すぐ下に定義されている用語は、明細書全体を参照することによって、より完全に定義されている。
【００２５】
Ｉ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）ならびに用語「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され得る。
【００２６】
さらに、「及び／または」は、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示として、他のものを伴ってまたは伴わずにとられるべきである。したがって、「Ａ及び／またはＢ」などの句で使用される用語「及び／または」は、Ａ及びＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの句で使用される用語「及び／または」は、Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）及びＣ（単独）を含むことを意図している。
【００２７】
実施形態が「含む」という言葉で記載される場合は、常に、「からなる」及び／または「から本質的になる」に関して記載された類似の実施形態が含まれる。
【００２８】
単位、接頭部、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）に承認された形式で示される。数値範囲は、範囲を定義する数を含み、本明細書に提供される任意の個々の値は、本明細書に提供される他の個々の値を含む範囲の終点として役立ち得る。例えば、１、２、３、８、９、及び１０などの一連の値は、１から１０、１から８、３から９などの範囲の数値の開示でもある。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシへの方向で左から右へ書かれ、また、核酸配列は、５’から３’への方向で左から右へ書かれる。アミノ酸は、一般的に知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されている１文字の記号で呼ばれる。ヌクレオチドも同様に、それらの一般的に認められている１文字コードによって呼ばれる。
【００２９】
「リポソーム」は、中央区画を囲む脂質二重層を有する球状小胞である。リポソームは、脂質二重層の構造に基づいて分類され得る。単層小胞は、中央区画を囲む二層を有し、一方、多層小胞（ＭＬＶ）は、中央区画を囲む二層以上を有する。リポソームはまた、小さな単層小胞（ＳＵＶ）は、典型的には直径約２０〜１００ｎｍであり、大きな単層小胞（ＬＵＶ）は、典型的には直径１００ｎｍより大きく、巨大な単層小胞（ＧＵＶ）は、典型的には直径約２５０ｎｍより大きいという、サイズに基づいて分類され得る。ＭＬＶは、典型的には直径約１００〜５００ｎｍである。
【００３０】
「カプセル化効率」は、上清中の活性剤に対する、洗浄されたリポソームのペレット内に捕捉されている活性剤の百分率であり、以下の式によって計算される。
カプセル化％＝１００×［（カプセル化した活性剤の量）／（充填溶液中の活性剤の初期量）］
カプセル化効率は、重量、体積、または濃度に基づいて計算され得る。
【００３１】
「カプセル化率」は、１００×［（カプセル化した活性剤の量）／（活性剤の総量）］である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「リポソーム構築物」は、ＳＵＶの凝集体を含む粒子である。本発明のリポソーム構築物は、眼の硝子体より密度の高いリポソーム構築物に自己集合する、個々のＳＵＶである。理論に縛られることなく、個々のＳＵＶは、電荷共有を特徴とする分子間力によって一緒に保持されている。予想外にも、リポソーム構築物は、投与後にそれらの球状のゲル様構造を維持し、その結果、それらは硝子体全体に送達中に分散またはバラバラにならず、代わりに前記硝子体を通して沈降し、網膜を覆うことができる。リポソーム構築物は、凝集を増強するための乳化剤または結合剤を含み得る。リポソーム構築物は、ｐＨの変化などの特定の条件下で加水分解され得る、ＳＵＶ間の直接的または間接的な二次結合を促進する表面基（例えば、ＰＥＧ）を含み得る。
【００３３】
粒径は、散乱光の強度に基づく平均直径である「ｚ平均直径」として表され得る。「多分散性指数（ＰｄI）」は、粒径分布の幅の推定値である。試料中の粒径分布は、試料中の粒子の質量パーセントに基づく「Ｄ値」で表され得る。「Ｄ９０」は、試料の質量の９０％が小さい粒子で構成されている直径である。「Ｄ５０」は、試料の質量の５０％がより小さな粒子で構成されている直径である。「Ｄ１０」は、試料の質量の１０％がより小さな粒子で構成されている直径である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「硝子体（ｖｉｔｒｅｏｕｓ）」、「硝子体（ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ｂｏｄｙ）」、「硝子体液（ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ｈｕｍｏｒ）」、及び「硝子体液（ｖｉｔｒｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）」は、レンズの後ろの、眼球の腔の約４／５を占めるゼラチン状の材料のことをいい、互換的に使用される。硝子体の後部は、「硝子体網膜界面」と呼ばれる領域で、網膜と直接接触している。リポソーム構築物の密度は、硝子体網膜界面への尿素の標的化した送達を可能にし、前記尿素が眼の他の領域に悪影響を及ぼす可能性を減少させる。
【００３５】
「単離された」分子、例えば、単離されたポリペプチドまたは単離されたポリヌクレオチドは、精製されているものを含む、天然には見られない形態のものである。いくつかの実施形態において、単離された分子は、実質的に純粋である。本明細書で使用される場合、用語「実質的に純粋な」とは、７５％を超える、好ましくは、８０％または９０％を超える、最も好ましくは、９５％を超える純度のことをいう。
【００３６】
「標識」は、「標識」分子を生成するために、分子に直接または間接的に結合され得る検出可能な化合物である。標識は、それ自体で検出可能であり得（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る（例えば、酵素標識）。
【００３７】
用語「阻害する」、「遮断する」、及び「抑制する」とは、互換的に使用され、活性の完全な遮断を含む、生物学的活性における任意の統計的に有意な減少のことをいう。例えば、「阻害」は、生物学的活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の減少のことをいい得る。
【００３８】
用語「活性剤」、「治療剤」、及び「薬物」は、疾患の予防、診断、軽減、治療、または治癒に使用される、食物以外の任意の物質のことをいうために互換的に使用される。活性剤は、保護剤及び診断剤を含む。活性剤は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）、Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ  Ｊｕｏ，Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００１）、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＵＳＡＮ  ＆  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｎａｍｅｓ（２０１４）、及びＰｈｙｓｉｃｉａｎ‘ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，７０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１６）の少なくとも１つに開示されている任意の物質を含み得る。Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，２８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）も参照されたい。
【００３９】
用語「医薬組成物」とは、活性剤が有効な形態、すなわち、生物学的に活性であり、環境において及び治療効果を生じさせる濃度で放出され得るように製剤化されている調製物のことをいい、それは、組成物が投与される対象に対して、容認できないほど毒性である追加の成分を含まない。そのような組成物は、無菌であり得、また、生理食塩水のような薬学的に許容される担体を含み得る。適切な医薬組成物は、バッファー（例えば、酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩バッファー）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール）、バイオアベイラビリティーを高めるための吸収促進剤、及び／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤のうちの１つ以上を含み得る。
【００４０】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物の対象を意味する。哺乳動物の対象には、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ）、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌｓ）、スポーツ動物、ならびに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ラット及びマウスを含むげっ歯類、ウサギなどを含む実験動物が含まれる。
【００４１】
活性剤の「有効量」は、具体的に述べられた目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的に、また、日常的な方法で決定され得る。
【００４２】
「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」または「軽減する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」または「軽減する（ｔｏ  ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」などの用語は、診断された病的状態または障害の治癒、減速、症状の軽減、及び／または進行を停止させる治療法のことをいう。したがって、治療を必要としている者には、すでに障害を有する者が含まれる。特定の実施形態において、患者が、例えば、疾患または障害に関連する症状の全体的、部分的または一過性の軽減または排除を示す場合、対象は、本明細書に提供される方法にしたがって、眼の疾患または障害について首尾よく「治療」される。
【００４３】
「予防する」または「予防」とは、標的とする病的状態または障害の発症を予防及び／または遅らせる予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）手段または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段のことをいう。したがって、予防を必要としている者には、その障害に罹患しやすい、またはかかりやすい者が含まれる。特定の実施形態において、患者が一過性または恒久的に、例えば、本発明の方法を受けていない患者よりも疾患または障害に関連するより少ないまたはより軽い症状、または疾患または障害に関連する症状のより遅い発症を発症する場合、眼の疾患または障害は、本明細書に提供される方法にしたがって、首尾よく予防される。
【００４４】
ＩＩ．リポソーム構築物
本発明の実施形態のリポソーム構築物のサブユニットであるリポソームは、天然起源または合成起源の二重層によって囲まれたコアから構成されるＳＵＶである。リポソームは、１つまたは複数のリン脂質の混合物を含み得る。リン脂質は、異なる鎖長、異なる電荷を有し得、そして飽和または不飽和であり得る。コレステロールの組み込みは、膜の剛性を向上させることによって、リポソームの安定性を高める。いくつかの実施形態において、リポソームは、コレステロール及び脂質が結合した親水性ポリマーを主成分として利用し得る。成分の選択及びそれらの相対比は、リポソームの構造安定性、それらの放出時間、カプセル化したカーゴ（すなわち尿素）の量、及びカプセル化に使用される方法に影響を与える。
【００４５】
特に、リポソームサブユニットは、コレステロール、ジアラキドノイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベレノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジル酸（ＤＭＰＡ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ−ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、モノシアロガングリオシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジスタロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、水素添加ホスファチジルコリン（ＨＰＣ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、モノオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＯＰＥ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルインシトール（ＰＩ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール（ＰＳＰＧ）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）、及び／または上記のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）共役誘導体の１つ以上を含み得る。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．７：４９−６０（２０１２）は、リポソーム製剤における多数の脂質構造を開示している。本発明の好ましい製剤を表１に提供する。
【００４６】
ＳＵＶのサイズは、重要である。ＳＵＶは、動的光散乱により測定して、好ましくは約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、好ましくは約１４０〜２２０ｎｍ、または約１００〜２００ｎｍ、または約１２０〜１９０ｎｍ、または約１５０〜２００ｎｍ、または約１６０〜１８０ｎｍ、または約１６５〜２００ｎｍのｚ平均直径を有する。理想的には、ＳＵＶは、比較的狭いサイズ分布を有する。いくつかの実施形態において、ＰｄIは、約０．０２から０．３０の間である。いくつかの実施形態において、ＰｄIは、約０．３０、０．２５、０．２０、０．１５、０．１２５、０．１０、または０．０５０未満である。いくつかの実施形態において、試料中の９０％のＳＵＶは、約３００ｎｍ、約２７０ｎｍ、約２５０ｎｍ、または約２２０ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態において、動的光散乱により測定して、１０％のＳＵＶが、約１２０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５０ｎｍ、約２０ｎｍ、または約１０ｎｍ未満の直径を有する。好ましくは、試料中の９０％、９５％、または１００％のＳＵＶは、動的光散乱により測定して、約２５０ｎｍ未満、または約２００ｎｍ未満、または約１７５ｎｍ未満、または約１５０ｎｍ未満の直径を有する。
【００４７】
ＳＵＶは、それらの中にカプセル化した尿素を含む、すなわち、前記尿素は、前記ＳＵＶの中央区画内の「カーゴ」である。
【００４８】
本発明の様々な実施形態のＳＵＶは、硝子体液よりも大きい比重を有する。好ましい実施形態において、ＳＵＶは、約１．０５、約１．０６、約１．０７、約１．０８、約１．０９、約１．１、約１．１５、または約１．２より大きい比重を有する。
【００４９】
ゼータ電位は、分散液または溶液中の類似電荷の粒子間の静電反発力を測定する。ゼータ電位の大きさは、隣接する同様に荷電した粒子間の静電反発度を示す。ゼータ電位が低い場合、粒子間の引力が反発力を上回り、その結果、より多くの凝集が生じる。ゼータ電位が高い場合、粒子は凝集に抵抗する。いくつかの実施形態において、ＳＵＶは、電気泳動光散乱を使用して計算したときに、約−７０ｍＶ〜約７０ｍＶのゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、ゼータ電位は、ゼロｍＶ以下である。いくつかの実施形態において、ゼータ電位は、０±５ｍＶである。いくつかの実施形態において、ゼータ電位は、約−７０、−６５、−６０、−５５、−５０、−４５、−４０、−３５、−３０、−２５、−２０、−１５、−１０、−５、−４、−３、−２、−１、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｍＶである。ゼータ電位は、塩の添加及び／またはｐＨの調整などの、当技術分野で公知の方法を使用して調整され得る。
【００５０】
１つの実施形態において、リポソーム構築物は、凝集を増強するための乳化剤または結合剤を含む。例示的な乳化剤としては、限定されないが、アラビアゴム、モノオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ソルビタンオレエート、ソルビタンパルミテート、ソルビタンステアレート、トリエタノールアミンオレエートなどが挙げられる。
【００５１】
ＳＵＶ／リポソーム構築物は、表面修飾基及び／または表面抗原を含み得る。いくつかの実施形態において、前記表面修飾基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。リポソーム表面のペグ化のレベルは、例えば、１ｍｏｌ％から２０ｍｏｌ％、またはそれ以上に変化し得る。いくつかの実施形態において、前記表面抗原は、ローダミンである。
【００５２】
リポソームの安定性は、表面電荷、サイズ、表面水和、及び脂質二重層の流動性などの様々な特性に依存する。表面電荷は、リポソームと眼膜との相互作用を決定する。リポソーム膜は、正電荷、負電荷、または無電荷（中性）を有し得る。同様に、ＳＵＶのラメラを構成する個々の脂質は、それぞれ、正味の正電荷、正味の負電荷、または正味の中性電荷を有し得る。正味電荷が中性である場合でも、局所的な電荷領域は、ＳＵＶの特性に影響を与え得る。
【００５３】
リポソーム構築物は、ｐＨ、温度、光、酸化、酵素分解、放射線、またはそれらの組み合わせなどの刺激に反応され得る。
【００５４】
本発明の実施形態のリポソーム構築物は、充填したリポソーム構築物ペレット１μＬ当たり、少なくとも約０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、または１ｍｇの尿素を含有し得る。充填したリポソーム構築物ペレットは、リポソーム構築物を含有する試料を約９０，０００ｇで約５分間超遠心分離し、そして上清をデカントすることによって調製される。
【００５５】
本発明の実施形態のリポソーム構築物は、硝子体網膜界面における尿素の滞留時間を延長することができ、そして、所望の速度でそれらのカーゴを放出するように最適化することができる。例えば、本発明の実施形態のリポソーム構築物（例えば、徐放性ドラッグデリバリーシステム）は、少なくとも約２時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、４８時間、もしくは７２時間、または単回投与後少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、もしくは６週間にわたって、尿素を放出し得る。１つの実施形態において、リポソーム構築物は、投与後４〜８時間で、約１０％以下のカプセル化した尿素を放出し得る。１つの実施形態において、リポソーム構築物は、投与後８〜１２時間でカプセル化した尿素の約５０％以下を放出し得る。１つの実施形態において、リポソーム構築物は、投与後１時間で、少なくとも約７５％のカプセル化した尿素を放出し得る。１つの実施形態において、リポソーム構築物は、投与後８時間で、少なくとも約８０％のカプセル化した尿素を放出し得る。１つの実施形態において、リポソーム構築物は、投与後２４時間で、少なくとも約８０％のカプセル化した尿素を放出し得る。放出速度は、リポソーム構築物の製剤を変えることによって、所望の投与量に応じて変えられ得る。
【００５６】
いくつかの態様において、リポソーム構築物を含む組成物が、段階的に放出プロファイルを有することが望ましいかもしれない。これらの実施形態において、いくらかの尿素は注射直後に放出されるが、いくらかの尿素は注射後の様々な時点で、例えば６時間ごと、１２時間ごと、毎日、２日ごと、３日ごと、週ごと、月ごとなどに放出されると考えられ得る。したがって、前記組成物は、ＳＵＶの混合集団を含み得て、ここで、前記ＳＵＶは、サイズ、電荷、脂質二重層（複数可）の組成、脂質二重層（複数可）の修飾（複数可）、またはそれらの組み合わせなどの１つ以上の異なる特性を有し、それによって尿素の放出速度を変える。
【００５７】
リポソーム構築物は、網膜または黄斑の細胞において発現される、抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み得る。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ミュラー細胞、網膜神経節細胞、網膜軸索細胞、内境界膜細胞、網膜色素上皮細胞、または網膜星状細胞である。いくつかの実施形態において、抗原は、細胞の表面に発現される。いくつかの実施形態において、抗原は、ミュラー細胞の表面に特異的に発現される。いくつかの実施形態において、抗原は、ビメンチン、グルタミンシンテターゼ、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、線維芽細胞増殖因子受容体９（ＦＧＦＲ９）、ヘパリン結合増殖因子、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＣＤ１６、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、インターロイキン１（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、及びレチナールデヒド結合タンパク質からなる群から選択される。抗体は、リポソームの表面に付着させ得る。いくつかの実施形態において、抗体は、リポソームの表面上のＰＥＧに結合している。
【００５８】
III．リポソーム構築物の調製
ＳＵＶは、溶媒蒸発、逆相蒸発、脱水−再水和、界面活性剤透析、薄膜水和（Ｂａｎｇｈａｍ法）、界面活性剤除去、溶媒（例えば、エーテル／エタノール）注入、エマルジョン法、濃密ガス法、超臨界流法などの、当該技術分野で公知の方法によって製造され得る。例えば、脂質混合物を有機溶媒に溶解し、次いで、乾燥して脂質フィルムを形成され得る。次いで、乾燥した脂質フィルムを、例えば、孔径を減少させるオリフィスを通して、それらを押し出すことによって水和及びサイズ調整することができ、その結果、ユニラメラリポソームからなり、標準化された均一直径を有するリポソーム構築物が得られる。
【００５９】
尿素を含むリポソーム構築物を調製するために、脂質フィルムがリポソーム構築物を形成するＳＵＶの内部にカプセル化されるように、脂質フィルムは、尿素の溶液で水和され得る。捕捉されていない尿素をカラムクロマトグラフィーまたは透析を用いて除去した後、リポソームは、上記のようにサイズ決めされ得る。好ましくは、尿素は、飽和溶液または過飽和溶液中にある。
【００６０】
尿素を含むリポソーム構築物を調製する代替方法は、リポソームの水性内部がリポソーム構築物を囲む外部媒体よりも低いｐＨを有するｐＨ勾配法を用いて、尿素を予め形成されたＳＵＶに充填することである。尿素は、移動してリポソーム構築物内に濃縮する。リポソーム構築物の内部に尿素を充填する他の方法は、硫酸アンモニウム勾配法を使用する。
【００６１】
当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である、活性物質をリポソーム構築物中に充填する多くの異なる方法がある。
【００６２】
ＩＶ．リポソーム構築物を含む組成物及び使用方法
過去においては、活性剤が送達直後に硝子体内に分散し、十分な濃度が眼の裏側に到達しないので、活性剤を網膜の表面に投与することは非常に困難であった。尿素などの水溶性薬物は、この点に関して特別な課題を提起している。本発明の医薬組成物は、それらの物理的特性のために、この問題を解決する。特に、ＳＵＶは、それらが無菌濾過されることができるほど十分小さいが、それでもなお、治療有効量の尿素を捕捉することができる。それらは、注射時に十分に凝集し、投与されるとそれらは硝子体液全体に分散するのではなく、リポソーム構築物中に一緒にとどまり、それらは硝子体よりも密になり、網膜表面上に定着して覆うことができる。「空の」ＳＵＶ（すなわち、カプセル化した尿素を含まない）は、硝子体内への注射後に凝集するが、それらは、硝子体液を穏やかに撹拌しながら容易に分散する。しかしながら、カプセル化した尿素を有する同じＳＵＶは、硝子体内への注射後に凝集し、そして硝子体液の穏やかな撹拌下では分散しないリポソーム構築物を形成する。本発明の複数の異なる尿素を含有するリポソーム構築物は、硝子体液の穏やかな撹拌に耐える集塊を示し、これにより、硝子体全体に分散した位置からではなく、硝子体内で空間的に集塊から放出される。したがって、本発明の医薬組成物は、硝子体網膜界面に活性剤を効果的に送達するための新規製剤を提供する。
【００６３】
本発明のリポソーム構築物は、ＳＵＶの集塊を形成し、その集塊は、ＳＵＶ内の尿素のカプセル化によって安定化される。前記組成物の密度は、それを硝子体液中に沈降させ、それは必要に応じて仰臥位で対象に送達することにより促進され、その結果、眼全体ではなく、網膜界面への標的送達及び網膜界面での尿素の放出がもたらされる。したがって、本開示は、対象の網膜の尿素への曝露を増加させる方法を提供し、その方法は、前記対象の眼に尿素を含むリポソーム構築物を投与することを含む。
【００６４】
特定の態様において、本開示は、上記のようなリポソーム構築物を含み、任意にさらに１つ以上の担体、希釈剤、賦形剤、または他の添加剤を含む組成物を提供する。前記組成物は、約５．０〜約８．５のｐＨであり得、好ましくは、前記ｐＨは、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、または８．５である。そのような組成物は、尿素を含むリポソーム構築物を含み得る。
【００６５】
ＳＵＶ内にカプセル化されることに加えて、尿素もまた、リポソーム構築物を含む担体またはバッファー中に存在され得る。担体またはバッファー中のカプセル化されていない尿素の濃度は、組成物の所望の特性に応じて変わり得る。例えば、組成物は、カプセル化した尿素の濃度とカプセル化されていない尿素との間の平衡を維持するように処方され得、それにより、カプセル化した尿素の濃度は安定したままである。さらに、貯蔵担体またはバッファー中のカプセル化されていない尿素の濃度は、投与される組成物中のその濃度とは異なり得る。例えば、投与時に初期ボーラス用量が望ましい場合、担体またはバッファーは、高濃度のカプセル化していない尿素を含み得る。
【００６６】
組成物は、溶液、微粒子、ナノ粒子、ヒドロゲルなど、またはそれらの組み合わせなどの様々な形態であり得る。いくつかの実施形態において、リポソーム構築物は、ゲルに分散させる。好ましい実施形態において、前記リポソーム構築物は、エマルジョンまたは懸濁液の形態である。
【００６７】
本明細書中で考察されるように、リポソーム構築物中にカプセル化した尿素は、網膜の疾患または障害、特に、糖尿病性網膜症のインビボの治療のために、治療有効量で投与され得る。これに関して、開示されたリポソーム構築物は、投与を容易にし、また、尿素の安定性を促進するように処方され得ることが理解される。したがって、本発明の実施形態のリポソーム構築物は、医薬組成物中で投与され得る。
【００６８】
本発明による医薬組成物は、生理食塩水、無毒性のバッファー、防腐剤などの薬学的に許容される無毒性の滅菌担体を含み得る。本出願の目的のためには、「治療有効量」の尿素は、例えば、ＰＶＤを誘発するために利益を達成するのに十分な量を意味する。
【００６９】
通常、適切な医薬組成物は、１つ以上のバッファー（例えば、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）、及び／または塩（例えば、酸付加塩、塩基付加塩）を含み得る。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態及び特徴は、それが組み合わされるべき活性成分の量、及び他の周知の変数によって決定され得る。本明細書で提供される医薬組成物に用いられ得る適切な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には特定の粒径の維持によって、また、界面活性剤の使用によって維持され得る。
【００７０】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの補助剤も含み得る。微生物の存在の防止は、滅菌処置、及び様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方によって確実にされ得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤も組成物に添加され得る。また、長期の吸収注射用医薬形態は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらすことができる。
【００７１】
本明細書で提供される医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が含まれる。
【００７２】
したがって、本開示は、眼の疾患または障害、例えば、糖尿病性網膜症を治療する方法を提供し、前記方法は、それを必要とする対象に、本明細書で提供されるカプセル化した尿素のリポソーム構築物を含む医薬組成物を投与することを含み、前記尿素の十分な量は、前記疾患を治療するのに十分な期間、及び／またはＰＶＤを誘発するなどの所望の終点に達するのに十分な期間、網膜に到達し、網膜と接触したままである。そのために、本発明の実施形態の方法は、リポソーム構築物組成物の眼の後部への移動を容易にするために、対象を仰臥位、すなわち仰向けに配置することをさらに含み得る。リポソーム構築物は、硝子体より密度が高いので、このようにして対象を配置することは重力を利用して、リポソーム構築物を眼の後ろに位置する網膜に「沈降させ」、それによって網膜への標的化の送達を達成する。
【００７３】
本明細書で提供されるリポソーム構築物は、黄斑を含む、網膜への尿素の送達によって対処され得る任意の疾患または障害の治療または予防に有用である。本発明の実施形態のリポソーム構築物及び方法を用いて治療または予防することができる疾患または障害の例には、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、分枝または中心網膜静脈閉塞症、中心漿液性脈絡網膜症、脈絡膜剥離、先天性Ｘ連鎖再狭窄、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、網膜上膜、家族性滲出性硝子体網膜症、感染性網膜炎、黄斑浮腫、黄斑円孔、黄斑パッカー、持続性胎児血管系、推定眼ヒストプラスマ症症候群、残存水晶体断片、網膜芽細胞腫、網膜の涙または剥離、網膜色素変性症、未熟児網膜症、河川盲目症（オンコセルカ症）、硝子体癒着（ＶＭＡ）、硝子体黄斑牽引症候群、及び湿性黄斑変性の１つ以上が含まれる。いくつかの例において、眼内に、例えば、ＰＶＤのような状態を誘発することが望ましいかもしれない。網膜を病的な血管新生から保護し得るＰＶＤを誘発することによって、多数の病状が予防または改善され得る。
【００７４】
リポソーム構築物の投与に対する臨床反応は、標準的なスクリーニング技術、例えば、光干渉断層法（ＯＣＴ）、眼底写真法、またはフルオレセイン血管造影法を用いて評価され得る。臨床反応は、疾患または障害に関連した症状の改善によっても評価され得る。いくつかの実施形態において、リポソーム構築物の標的化は、リポソーム構築物の上または中の蛍光マーカーを観察することによって解析され得る。
【００７５】
リポソーム構築物またはリポソーム構築物を含む組成物を対象の硝子体に投与する方法は、当業者に周知であるか、または当業者によって容易に決定され得る。例えば、投与は、硝子体内への注射、硝子体内への移植、イオン導入法、または微小電気機械装置を介し得る。好ましくは、投与は、例えば、１８〜３１ゲージの針を介するなどの、硝子体内への注射を介する。いくつかの例において、投与は、２７ゲージの針または３０ゲージの針を介する。硝子体注射を介して典型的に送達される体積は、約５０μＬ〜約１５０μＬ、好ましくは、約１００μＬである。
【００７６】
剤形を製造するために、担体材料と組み合わせられ得る本発明の実施形態のリポソーム構築物の濃度は、尿素のカプセル化効率、治療が予防的なものか治療的なものか、その他の投薬方法、また、患者がヒトか動物かなど、多くの異なる要因に応じて変わる。投与されるリポソーム構築物の量は、この開示を考慮すれば、過度の実験をすることなく、当業者によって容易に決定される。安全性及び有効性を最適化するために、当業者に公知の日常的な方法を用いて、治療用量を滴定され得る。
【００７７】
リポソーム構築物を含む組成物は、単回投与または複数回投与として投与され得る。組成物は、ＰＶＤの誘発などの標的とするエンドポイントを達成するのに必要な回数だけ投与され得る。注射間隔は、異なってもよい。例えば、組成物は、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、もしくは７２時間ごと、１週間、２週間、３週間、もしくは４週間ごと、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、もしくは４８ヶ月ごとに投与され得る。投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療的または予防的反応）を提供するように調整され得る。
【００７８】
医薬組成物はまた、併用療法で及び／または他の薬剤と組み合わせて投与され得る。
【００７９】
本開示は、網膜または黄斑の疾患または障害を治療または予防するための、本明細書に記載の尿素をカプセル化したリポソーム構築物を含む医薬組成物の使用を提供する。本開示はまた、網膜または黄斑の疾患または障害を治療または予防するための医薬の製造における、本明細書に記載の尿素を含むリポソーム構築物の使用を提供する。本開示は、眼の疾患、障害、または損傷に関連する１つ以上の症状の予防、管理、治療または改善のための、単独でまたは他の療法と組み合わせた、尿素を含むリポソーム構築物を含む医薬組成物の使用をさらに包含する。
【００８０】
ＶＩＩ．キット
また、本開示の範囲内には、本明細書に提供されるリポソーム構築物及び／または組成物、ならびに使用説明書を含むキットがある。前記キットは、少なくとも１つの追加の試薬、または１つ以上の追加のリポソーム構築物をさらに含み得る。キットは通常、キットの内容物の意図された使用を示すラベルを含む。用語「ラベル」は、キットの上にまたはキットと共に供給されるか、そうでなければキットに付随する任意の筆記または記録された資料を含む。
【００８１】
本開示はさらに、本明細書に記載の方法を実施するために使用され得る１つ以上のリポソーム構築物を含むキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、１つ以上の容器中に、少なくとも１つの種類の本発明のリポソーム構築物を含む。いくつかの実施形態において、前記キットは、すべてのコントロール、アッセイを実施するための指示、ならびに解析及び結果を提示するために必要なソフトウェアを含む、検出アッセイを実施するために必要及び／または十分な構成要素をすべて含む。当業者は、開示されたリポソーム構築物が当該分野でよく知られている確立されたキットのフォーマットのうちの１つに、容易に組み込まれ得ることを容易に認識する。
【００８２】
本開示に引用された文献のすべては、ここにその全体が参考として援用される。さらに、本明細書で引用または言及されている任意の製品に関する任意の製造業者の説明書またはカタログは、参照により組み込まれる。本明細書中に参考として援用される文書、またはその中の任意の教示は、本発明の実施において使用され得る。本明細書中に参考として援用される文書は、先行技術であると認められない。
【実施例】
【００８３】
本発明の実施形態は、本発明の特定のリポソーム構築物の調製、及び本発明のリポソーム構築物を使用する方法を詳細に記載する以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに定義され得る。本開示の範囲から逸脱することなく、材料及び方法の両方に対して多くの修正を実施できることが当業者には明らかである。
【００８４】
実施例１．候補製剤の試験
本発明者らは、最初に表１に示すいくつかのリポソーム製剤を検討した。
【表１−１】
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【表１−２】
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【００８５】
すべての脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から入手した。製剤１、製剤３、製剤８、製剤１１、及び製剤１２は、カルボキシフルオレセインを用いて調製した。簡単に説明すると、１００ｍＭのカルボキシフルオレセイン溶液を１×ＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）カタログ番号ＳＨ０２５６，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）において調製し、ｐＨを１％のＮａＯＨで６．５〜７．５に調整した。この溶液を濾過し、そして自己消光性リポソームを調製するために使用した。脂質フィルムを窒素流下で乾燥し、続いて、最低２時間真空にし、そして１００ｍＭのカルボキシフルオレセイン溶液で再水和した。再水和したリポソームを０．２μｍのフィルター膜（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標），ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通して押し出した。前記リポソームを、カプセル化されていないカルボキシフルオレセインから、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５カラム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した。
【００８６】
各製剤を、２４時間にわたって、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、及びウサギ硝子体液において、リポソーム安定性及びカルボキシフルオレセイン漏出速度について試験した。ＰＢＳ、ＨＢＳＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）カタログ番号ＳＨ３０２５６，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）またはウサギ硝子体液（ＢＴＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡまたはＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＰ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）のいずれかに混合したリポソームから、カルボキシフルオレセイン漏出の時間経過を決定するために、ＰＢＳまたはＨＢＳＳのいずれかの３つ組の８０μＬのアリコートを自動ピペットでＥＬＩＳＡストリップ（カタログ番号４４６４７３，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に加え、硝子体液の３連の１００μＬのアリコートを滅菌１ｍＬのピペットで加えた。２０μＬのリポソーム製剤を各流体の上に３連で添加した。１０μＬのＲＩＰＡバッファー（カタログ番号８９９０１，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を同一試料に３連で添加して、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、及び硝子体液において最大蛍光発光を決定した。１００μＬのＰＢＳ、８０μＬのＨＢＳＳ＋２０μＬのＰＢＳ、または１００μＬの硝子体液＋２０μＬのＰＢＳを用いたネガティブコントロールを含めた。プレートを自己接着性プラスチックフィルムで密封し、蛍光発光を測定する前に、ＶＭａｘ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）において、３サイクルについて激しく振とうした。時間０で、ＰＢＳ及びＲＩＰＡバッファーを有するリポソームを含有するウェルにおいて、５０％の最大発光を生じるのに必要とされるゲインから決定されるように、ゲインを８００に設定した。
【００８７】
試料を３７℃で２時間インキュベートし、毎分発光量を読み取った。次いで、試料をさらに２２〜２４時間１５分ごとに読み取った。リポソームをＲＩＰＡバッファーで溶解し、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、及びウサギ硝子体液において最大蛍光発光について２４時間にわたって試験した。試験したリポソーム製剤は、すべて２４時間にわたって安定であった。溶解したリポソーム試料は、２４時間にわたって蛍光発光を増加させ、完全なリポソームがカルボキシフルオレセインをうまくカプセル化したことを実証した（図１Ａ〜１Ｅ）。
【００８８】
実施例２．尿素カプセル化及び安定性試験
尿素は、中等度から重度の糖尿病性網膜症の患者において、後部硝子体剥離（ＰＶＤ）を誘発することが示されているが、臨床用途は、長期間にわたって、眼の後ろに十分な薬物を送達することができないことによって妨げられてきた。
【００８９】
製剤１、製剤２、製剤３、製剤１２、及び製剤１４（表１）を調製した。コレステロールを除くすべての脂質は、クロロホルム溶液中で得られ、コレステロール粉末を前記クロロホルム溶液に所望の割合で加えた。コレステロールを窒素流によって蒸発させ、続いて、クロロホルム−脂質試料を凍結乾燥で蒸発させた。得られた脂質の塊を１００μＬの１ｇ／ｍＬの尿素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５５０５０３５，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）溶液で水和し、３０分間４℃で撹拌し、０．８μｍ及び０．２μｍのフィルターを有する二段階押出し法を用いて押出した。カプセル化効率を見出すために、１ｇ／ｍＬの尿素溶液のアリコートを得て、充填バッファーにおいて尿素の質量を測定した。押出し後、リポソームを超遠心分離機（Ａｉｒｆｕｇｅ（登録商標），Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）において、９０，０００ｇで５分間室温でペレット化し、前記バッファーをデカントした。ペレットを１００μＬの脱イオン水に再懸濁し、さらなる実験及び／または解析に使用した。
【００９０】
表２に示すように、１００μＬのＰＢＳで洗浄した後の再懸濁試料体積を測定し、リポソームペレットの体積を決定するために使用した。
【表２】
2019528313.tif 000004
【００９１】
カプセル化した尿素の量、及び尿素充填（カプセル化）効率は、各製剤について決定された。０．２μｍのフィルターの押出しの後、リポソーム試料を９０，０００ｇで５分間、室温で超遠心分離（Ａｉｒｆｕｇｅ（登録商標），Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）し、充填されたリポソームペレット中のカプセル化した尿素から溶液中の遊離尿素を分離した。前記上清をデカントした。カプセル化効率の上限は、充填されたペレットの質量（１００μＬのＤＩ  Ｈ２Ｏ中に再懸濁）内に、カプセル化した尿素の量を測定し、充填バッファーにおいて尿素の質量で割ることによって見出された。各ペレットを１×ＰＢＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）を再懸濁して洗浄し、続いて、５分間９０，０００ｇで超遠心分離して、リポソーム構築物の外側に付随する尿素の画分を除去した。上清を除去し、前記ペレットを１００μＬの脱イオン水に懸濁し、５秒間煮沸し、続いて、２回の凍結融解のサイクルでリポソーム構築物を不安定化した。ペレットのデータは、３つの１μＬの試料を用いて３連に生成した。上清のデータは、３つの１μＬの試料を用いて３連に生成した。初期の充填バッファーにおいて、カプセル化した尿素（ペレット）対尿素の比は、尿素アッセイキット（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐ．カタログ番号ＫＡ１６５２，Ｔａｉｐｅｉ  Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）を使用して確立した。リポソーム粒子と会合しているが真にカプセル化されていない任意の尿素を除去するために、１００μＬのＰＢＳで充填されたペレットを２回洗浄した。（１００μＬのＤＩ  Ｈ２Ｏに再懸濁された）洗浄した充填されたペレット質量内にカプセル化した尿素の量を、充填バッファーにおける尿素の質量で割ったものが、カプセル化効率の下限を提供する。本発明者らは、充填工程の間、少なくともＸでＹ未満のカプセル化効率を達成した。
【００９２】
充填効率の下限、及びカプセル化した尿素の全体の質量を表３に示す。充填効率の上限、及びカプセル化した尿素の全体の質量を表４に示す。
【表３】
2019528313.tif 000005
【表４】
2019528313.tif 000006
【００９３】
１×ＰＢＳ及びウサギ硝子体液におけるリポソームの２４時間安定性試験（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＰ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）は、５つすべての製剤（製剤１、製剤２、製剤３、製剤１２及び製剤１４）について室温で実施した。リポソーム製剤は、上記のように調製した。１×ＰＢＳにおける安定性試験のために、表２に示すように、１００μＬの１×ＰＢＳを湿潤リポソームのペレットの体積に添加した。安定性試験のためのリポソーム試料の体積（１００μＬ）は、硝子体液において約１：１であった。試料は、室温に保った。
【００９４】
カプセル化後６時間、１２時間及び２４時間に、遊離及びカプセル化した尿素の濃度を上記のように測定した。カプセル化した尿素は、各時点で報告され、尿素の放出プロファイルを示すためにプロットされた（図２Ａ〜２Ｄ）。製剤２（５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ、４２ｍｏｌ％のコレステロール）は、１×ＰＢＳ及び硝子体液の両方において、２４時間にわたって最良の尿素の放出特性を示し、２４時間で約２５％のカプセル化した尿素を放出した。
【００９５】
実施例３．製剤２（５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ、４２ｍｏｌ％のコレステロール）のリポソーム構築物の特徴化及び最適化
粒径解析
Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）１５０装置、及びＭｉｃｒｏｔｒａｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア，バージョン１０．１．３を使用して、粒径解析を実施した。尿素を含まない製剤２の粒径解析は、９０％のリポソーム構築物が２５０ｎｍ未満であり、また、１０％が１００ｎｍ未満であることを示した。したがって、尿素を含まない製剤２のリポソーム構築物の粒径は、約１００ｎｍから約２５０ｎｍの範囲であった。カプセル化した尿素を用いた製剤２の粒径解析は、リポソーム構築物の９０％が３００ｎｍ未満でありそして１０％が９０ｎｍ未満であることを示した。したがって、カプセル化した尿素を有する製剤２のリポソーム構築物の粒径は、約９０ｎｍから約３００ｎｍの範囲であった。
【００９６】
バッファー製剤の最適化
カプセル化効率、及びリポソーム構築物の安定性について、４℃で９６時間、最適なバッファー組成物を評価した。カプセル化した尿素を有する製剤物２のリポソーム構築物を、表５に示される６つの異なるバッファー組成物を用いて作製した。
【表５】
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【００９７】
各バッファー製剤は、上記のように、乾燥した脂質の塊（製剤２）に添加され、続いて、押し出される水性水和媒体である。カプセル化した尿素の充填効率及び全体の質量を表６に示す。
【表６】
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【００９８】
脱イオン水及び尿素のバッファー組成物は、最も高い尿素のカプセル化効率を示し、尿素を含む０．５×ＰＢＳ及び１×ＰＢＳバッファーが次に最良であった。しかしながら、クエン酸（ｐＨ６．５）、１０％のスクロース、及び０．９５ｇ／ｍＬの尿素を含有するバッファーにおいてリポソーム構築物の安定性は、９６時間後に、カプセル化した尿素において変化を示さなかった。２×ＰＢＳの尿素バッファーは、安定性が最も低く、カプセル化した尿素の濃度は、約３０％低下した。
【００９９】
シリンジ安定性試験
製剤２のリポソーム構築物を使用して、より高い体積対体積濃度のリポソーム構築物を用いて、リポソーム構築物の挙動を評価した。シリンジを通して、リポソーム構築物を吸引することの効果を試験するために、ペレットを上記のように調製し、２つのペレットを合わせ、全体の体積１００μＬの０．５×ＰＢＳに再懸濁し、２７ゲージまたは３０ゲージの針を通して吸引した。カプセル化した尿素及び遊離尿素の量を上記のように決定し、また、表７に示す。
【表７】
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【０１００】
２つのペレットを組み合わせると、その量のカプセル化した尿素が増加したが、カプセル化効率は増加しなかった。２７ゲージまたは３０ゲージの針のどちらでも、リポソーム構築物の完全性の喪失は観察されなかった。しかしながら、３つのペレットを全体の体積１００μＬで合わせた場合、吸引して２７ゲージの針から分注した場合の試料の損失は、約４０％であった。
【０１０１】
温度安定性テスト
上記のように調製及び解析した、製剤２のカプセル化した尿素のリポソーム構築物について、４℃、室温、及び３７℃で、０．５×ＰＢＳにおいて温度を制御した安定性試験を７日間行った。結果を表８及び図３Ａ〜３Ｃに示し、そこでは、１００μＬの試料における全体のカプセル化した尿素（ｍｇ）を測定した。
【表８】
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【０１０２】
実施例４．カプセル化した尿素のリポソーム構築物製剤の調製及びさらなる特徴化
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）及びコレステロールを使用して、尿素の存在下でリポソームを形成して、カプセル化した尿素のリポソーム構築物を作製した。使用した材料を表９にまとめる。
【表９】
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【０１０３】
逆相蒸発、それに続くマイクロ流動化（ＭｏＤｅｌ  Ｍ１１０  ＥＨ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＭＡ）を実施して、２００ｎｍ未満の粒径を有するカプセル化した尿素のリポソーム構築物を調製した。プロセス工程を最適化するために、いくつかのバッチを作製し、最適化された方法（図４）にしたがって作製された最初のバッチである小さなバッチＦ４Ｂを特徴化した。以下に記載する標準的な一連の試験を用いて、後続のバッチを特徴化した。
【０１０４】
遠心濾過により、１００μＬの試料の水性部分の体積をペレットの体積から分離し、測定し、ペレットの体積を計算した。全体の尿素及び遊離尿素の濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定し、カプセル化した尿素の濃度及びカプセル化効率（尿素取り込みの程度）を計算するために使用した。ゼータ電位及び粒径及び分布は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、レーザー光散乱（ＬＬＳ）により測定した。３０Ｇ針による注入性は、全体の尿素の濃度及び遊離尿素の濃度を試験し、カプセル化した尿素の濃度を再度計算することによって確認した。濾過前後の試料の体積を測定することによって、０．２μｍフィルターを通して、濾過する間に失われた体積を確かめた。バッチの比重を既知の体積について重量測定法で測定し、硝子体液またはＰＢＳにおける凝集を視覚的に評価した。最後に、カプセル化した尿素のインビトロの放出を、７日間にわたって３７℃で、試料体積：バッファー体積比１００μＬ：５ｍＬで、２０ｋＤａの透析カセットを用いて測定した。全体の尿素の濃度をＨＰＬＣにより測定し、各遊離時点において、初期の遊離尿素の濃度及び全体の尿素の濃度に基づいて、放出されたカプセル化した尿素の量を計算した。
【０１０５】
バッチＦ５及びＦ５Ｂの組成は、５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロールであり、前記バッチのサイズは、１７グラム（１５００〜１６００用量）であった。６００ｍｇ／ｍＬの飽和した尿素溶液を用いて、カプセル化した尿素のリポソーム構築物を作製した。マイクロ流動化後、前記リポソームの粒径を許容可能な大きさに減少させるために、前記バッチをさらに均質化した。０．８μｍの濾過の後、前記バッチを２つの体積に等分し、それらを別々に、１０ｋＤａのカットオフ限外濾過膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号ＰＬＧＣ０４３１０）を有する撹拌セル装置（Ａｍｉｃｏｎ，５０ｍＬ，最大圧力７５ｐｓｉ）を用いて、４０％リポソーム：６０％飽和した尿素バッファー（体積／体積比）に濃縮し、滅菌濾過した。バッチＦ５の最終体積は、１０５ｍＬであり、バッチＦ５Ｂの最終体積は、５１ｍＬであった。バッチＦ１１〜Ｆ１３もまた、５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロールの組成を有していた。
【０１０６】
バッチＦ６の組成は、９１ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び９ｍｏｌ％のコレステロールであり、前記バッチのサイズは、３グラム（１５００〜１６００用量）であった。４５０ｍｇ／ｍＬの飽和した尿素溶液を用いて、カプセル化した尿素のリポソーム構築物を作製した。前記バッチを濃縮し、バッチＦ５及びＦ５Ｂについて記載したように滅菌濾過した。
【０１０７】
バッチＦ８の組成は、７０ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び３０ｍｏｌ％のコレステロールであり、前記バッチのサイズは、３グラム（１５００〜１６００用量）であった。４５０ｍｇ／ｍＬの飽和した尿素溶液を用いて、カプセル化した尿素のリポソーム構築物を作製した。前記バッチを濃縮し、バッチＦ５及びＦ５Ｂについて記載したように滅菌濾過した。
【０１０８】
バッチＦ９の組成は、４５ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び５５ｍｏｌ％のコレステロールであり、前記バッチのサイズは、３グラム（１５００〜１６００用量）であった。４５０ｍｇ／ｍＬの飽和した尿素溶液を用いて、カプセル化した尿素のリポソーム構築物を作製した。前記バッチを２０分間マイクロ流動化し、前記バッチの粒径を３分毎に測定した。２０分間のマイクロ流動化の後、前記リポソームの粒径は、１２００ｎｍに達し、２００ｎｍの標的をはるかに超えた。マイクロ流動化後に試料体積を一晩保存したときに相分離が観察された。前記試料を０．８μｍのフィルターにうまく通過させるために、ビーズビーターを用いて、５分間前記バッチの均質化を行った。前記バッチを濃縮し、バッチＦ５及びＦ５Ｂについて記載したように滅菌濾過した。０．２μｍのフィルターによる無菌濾過は非常に困難であり、大量の大きな粒子による複雑さのために、処理中に、前記バッチの体積の少なくとも１／３が失われた。
【０１０９】
バッチＦ１０の組成は、５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロールであり、約６％（ｗ／ｗ）のコレステロールが蛍光標識を有していた。上記のように、逆相蒸発、続いて、マイクロ流動化、超音波処理、及び濾過によって、前記バッチを作製した。
【０１１０】
特徴化した試験の結果を表１０に示す。粒径及び分布を表１１に示す。インビトロの放出データを表１２、表１３、及び図５に示す。
【表１０】
2019528313.tif 000012
【表１１】
2019528313.tif 000013
【表１２】
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【表１３】
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【０１１１】
製剤中のＤＯＰＣの濃度が増加するにつれて、カプセル化した尿素の量は減少する（図６Ａ）。逆に、製剤中のコレステロール濃度が増加するにつれて、カプセル化した尿素の量は増加する（図６Ｂ）。前記製剤からの尿素の放出速度は、比較的類似しており、２００分後に、最小量の尿素が一定の速度で放出される。収集したデータに基づいて、５８ｍｏｌのＤＯＰＣ及び４２ｍｏｌ％のコレステロールを含む製剤Ｆ５／Ｆ５Ｂは、持続放出性の尿素製剤について目標とされる特徴を有する。リポソーム構築物の製剤において、送達された場合の眼内の尿素の滞留時間は、純粋な尿素のそれよりも８倍長い。
【０１１２】
必要に応じて、凍結／融解サイクルを伴うエタノール注入によって、追加のリポソーム構築物のバッチを作製し、そして上記のように特徴化した。結果を表１４及び表１５に示す。
【表１４】
2019528313.tif 000016
【表１５】
2019528313.tif 000017
【０１１３】
実施例５．硝子体内へ投与された尿素の毒性及び耐容性
本実施例は、ニュージーランドホワイトラビットの眼内への硝子体内（ＩＶＴ）注射後の、カプセル化した尿素の耐容性及び毒性、ならびにＰＶＤを誘発するためのその有効性、ならびに硝子体内へ注射されたカプセル化した尿素のリポソーム構築物の沈降パターンの評価を提供する。
【０１１４】
雌のニュージーランドホワイトラビットは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏ．（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）から入手し、ＵＳＤＡ動物福祉法の規制にしたがい、また施設の動物管理使用委員会の審査及び承認の下で飼育し、世話をした。
【０１１５】
前記試験に配置する前に、各動物は、眼科検査（細隙灯顕微鏡検査及び間接検眼鏡検査）を受けた。眼の所見は、修正したマクドナルド−シャドックスコアリングシステム（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｙｅ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ，”ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｄｅｒｍａｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ａｔ  ５７９−５８２（Ｍａｒｚｕｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，１９７７））にしたがって実施した。試験への配置の合格基準は、すべての変数について「０」のスコアであった。
【０１１６】
グループ１（サブグループ１ａ、サブグループ１ｂ、サブグループ１ｃ）：急性／カプセル化した尿素のリポソーム
６匹の雌ニュージーランドホワイトラビット（サブグループ当たり２匹）に、カプセル化した尿素のリポソーム構築物（５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ、４２ｍｏｌ％のコレステロール）を硝子体内（ＩＶＴ）に両眼へ単回投与（ＯＵ）で投与した。塩酸ケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）、及びアセプロマジン（３ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内（ＩＭ）注射、続いて、酸素（１Ｌ／分）の吸入（１〜２．５％）によるイソフルランで、動物を麻酔した。外科的処置の前に、１〜２滴の局所用塩酸プロパラカイン麻酔薬（０．５％）を前記動物の眼に適用した。片眼を上にし、もう片方の眼を下に向けて、投与後３時間頭を安定させて動物を麻酔した。
【０１１７】
３時間後、臨床的な眼科検査を行い、動物を安楽死させた。硝子体液（ＶＨ）を３つの画分として回収した。瞳孔は、１０％フェニレフリン及び１％トロピカミド各１滴を用いて拡張した。２本の１８Ｇの針を３時と９時の位置で眼に挿入し、片方をレンズに向かって上向きにし、もう一方を網膜に向かって下向きにして、ＶＨに進めた。各針を通して３００μＬのＶＨを引き上げ、その後、各針を前記眼から外した。次いで、前記眼球を摘出して除核した。除核後、残りのＶＨを第３の画分として回収した。各動物の各眼由来の試料は、分離したままで、プールしなかった。眼組織の重量を記録した。個々のＶＨ画分を別々に秤量した。室温で２０〜３０分間、１６，１００×ｇでＶＨ画分を遠心分離した。上清を分離した。リポソーム構築物及び上清を含有するペレットをドライアイス上で別々に瞬間凍結し、−６０〜−８０℃で貯蔵した。これらの動物から網膜も回収し、ドライアイス上で急速冷凍し、そして−６０〜−８０℃で貯蔵した。
【０１１８】
グループ２（サブグループ２ａ、サブグループ２ｂ）：慢性／遊離尿素
２匹のさらなる動物（１サブグループにつき１匹）に、単回または２回投与量の遊離尿素の溶液ＩＶＴを右眼に（ＯＤ）、そして平衡塩溶液（ＢＳＳ）を左眼に（ＯＳ）投与した。動物を、塩酸ケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）のＩＭ注射で麻酔した。外科的処置の前に、１〜２滴の局所用塩酸プロパラカイン麻酔薬（０．５％）を前記動物の眼に適用した。
【０１１９】
投与後０〜３日目、４日目（午前と午後）、８日目（±１）、１４日目、２１日目、及び２８日目に、臨床的な眼科検査、眼底の写真撮影、及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）をこれらの動物において行った。ＯＣＴの場合、画像処理の約１０〜１５分前に、１０％のフェニレフリン及び１％のトロピカミド各１滴で瞳孔を拡張した。Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（登録商標）機器（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、画像を撮影した。
【０１２０】
前記試験のデザインを表１６に要約する。
【表１６】
2019528313.tif 000018
【０１２１】
臨床検査と観察
カプセル化した尿素のリポソームまたは遊離尿素溶液のいずれかを投与された動物では、体重に対する有害事象、及び一般的な健康に対する重度の有害事象は観察されなかった。両群の動物において、眼内刺激及び腫脹がＩＶＴ注射直後に観察され、それは、投与日を過ぎて生き残った動物において数日後に消散した。
【０１２２】
基準のスクリーニング前検査の間、すべての動物は眼の異常を示さなかった。後部硝子体剥離（ＰＶＤ）は、治療された右眼（ＯＤ）において、グループ２ａの動物（遊離尿素溶液、単回投与）及びグループ２ｂの動物（遊離尿素溶液、２回投与）の両方の２日目の検査を除いて、臨床的な眼科検査中に観察されなかった。しかしながら、ＰＶＤは、臨床的な眼科検査中には容易に見えなかった。ＯＣＴ画像処理は、臨床的な眼科検査では明らかにされなかったＰＶＤの追加の例を明らかにした。たとえ、眼科検査及び画像処理が必ずしもそれを検出しなかったとしても、投与後２日以内に、遊離尿素溶液で処置された両方の動物の眼にＰＶＤが発生し、前記試験の間持続したと結論付けることができる。グループ１の動物は、ＯＣＴ画像処理を受けていないため、カプセル化した尿素のリポソーム構築物による治療後のＰＶＤの症例は、検出されなかった可能性がある。
【０１２３】
眼底写真
サブグループ２ａ及びサブグループ２ｂの両方の動物は、０日目から３日目までの間に、ＯＤの硝子体に濁りを示した。いずれのサブグループのＯＳの硝子体においても、そのような濁りは観察されなかった。前記濁りは、ビヒクル処置をした眼には認められなかったので、前記濁りは、おそらく尿素による硝子体のタンパク質変化の影響であった。さらに、尿素で処置した眼の硝子体は、投与後３日後に透明になり始めたので、前記濁りは、おそらく感染によるものではなかった。
【０１２４】
両方の用量で毒性が観察された。３日目以降、眼底画像処理は、サブグループ２ａ及び２ｂの両方において、送達部位（下鼻硝子体分節）で、ＯＤに重度の網膜の折り畳み及び血管出血を明らかにした。繰り返しになるが、この調査結果は、ＯＳには認められなかった。折り畳み及び出血は、３日目と７日目の間にピークに達し、その後、鎮静し始めた。２９日目までに、小さいが持続する網膜の折り畳み領域がいくつかあったが、出血は、もはや眼底画像において検出されなかった。それらの選択的な局在化及び時間経過を考慮すると、網膜の折り畳み及び出血の両方は、おそらく尿素に関連していた。代表的な画像を図７Ａ〜７Ｂに示す。
【０１２５】
光コヒーレンストモグラフィー
ＯＣＴ画像処理は、３日目に、サブグループ２ａの動物の右眼（ＯＤ）にＰＶＤを示した。サブグループ２ｂの動物において、４日目（ＡＭ及びＰＭ）、７日目、及び１４日目に、ＰＶＤが観察された。他の画像処理時点で、これらの動物のＯＤにＰＶＤは認められなかった。しかしながら、ＰＶＤは不可逆的であるので、臨床的な眼科検査の間に、両動物のＰＶＤがＯＤに認められた場合、最も可能性が高いのは、これらの日におけるＯＣＴ画像処理は、ＰＶＤを示す領域をとらえていなかっことであり、２日目以降のすべての時点で、ＰＶＤが実際に両動物のＯＤに存在したと仮定され得る。いずれの動物も、任意の時点において、左眼（ＯＳ）にＰＶＤを示さなかった。
【０１２６】
ＯＣＴ画像はまた、眼底の画像処理において認められる網膜の折り畳みの領域が、網膜が神経節細胞層で、また、より少ないケースでは、内核細胞層で、大部分が剥離した領域であることを示した。前記網膜剥離は、３日目と７日目の間にピークに達し、その後、網膜の再付着によって反映されるように、鎮静し始めた。再付着後に、前記網膜にかなりの数の過蛍光細胞が観察され、これは、おそらく免疫細胞浸潤を示している。
【０１２７】
代表的な画像を図８Ａ〜８Ｂに示す。
【０１２８】
実施例６．硝子体内に投与された遊離尿素の耐容性及び用量反応
本実施例は、ニュージーランドホワイトラビット（非ＧＬＰ）の眼へのＩＶＴ注射後、（実施例５と比較して）減少した濃度の遊離尿素の耐容性の評価、及び様々な用量強度の各々の注射後に、ＰＶＤを誘発するのにかかる時間の決定を提供する。
【０１２９】
５匹の雌ニュージーランドホワイトラビットに、２．５、５、１０、２５及び５０ｍｇ／眼の用量で、両眼（ＯＵ）に尿素溶液ＩＶＴを単回投与した。
【０１３０】
前記試験に配置する前に、各動物は、眼科検査（細隙灯顕微鏡検査及び間接検眼鏡検査）を受けた。眼の所見は、修正したマクドナルド−シャドックスコアリングシステムにしたがってスコア付けした。試験への配置の合格基準は、すべての変数について「０」のスコアであった。
【０１３１】
すべての処置は、滅菌技術を用いて実施した。ケタミン塩酸塩（画像処理用に５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶＴ注射用に１５〜３０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）のＩＭ注射と共に、ＩＶＴ注射、ＯＣＴ、及びＢ−Ｓｃａｎ画像処理のために、動物を麻酔した。１匹の動物について、長時間の画像処理のために、基準画像の処理の間に、吸入イソフルラン（１．５〜２Ｌ／分の酸素において１〜１．５％）を介して、麻酔を延長した。別の動物については、同日の早い時点で、前記動物が基準画像の処理（ケタミン／キシラジン麻酔を含む）を受けていたので、吸入イソフルラン（１．５Ｌ／分の酸素中２％）を用いて、前記動物を麻酔した。外科的処置の前に、１〜２滴の局所用塩酸プロパラカイン麻酔薬（０．５％）を前記動物の眼に適用した。
【０１３２】
ＩＶＴ注射の前に、眼をベタジンで洗浄し、次いで、ＢＳＳですすいだ。５／８インチの針を用いて、縁から３〜４ｍｍ離して注射した。前記針を挿入してから、尿素溶液またはＢＳＳを注射した。前記針を外し、前記眼をＢＳＳですすいだ。投与直後に動物を回復させ、回復の間モニターした。回復中に、抗生物質の眼科用軟膏を前記眼に３回投与した。
【０１３３】
試験デザインを表１７に要約する。
【表１７】
2019528313.tif 000019
【０１３４】
３５（±４）日目に動物を安楽死させ、それらの眼（全球）を回収し、病理組織学的な解析にかけた。
【０１３５】
臨床検査及び観察
一般的な健康の観察を０日目から始めて毎日行い、体重を投与前及び終了前に記録した。すべての動物は、試験の過程にわたって、軽度の体重減少を経験した。体重減少は、度重なる麻酔処置、度重なる対処及び拘束からのストレス、または試験品に関連する不快感、またはこれらの要因の組み合わせから生じた可能性がある。一般的な動物の健康に対する薬物及び／または試験処置のその他の有害事象は、観察されなかった。
【０１３６】
眼科検査（細隙灯生体顕微鏡検査及び間接検眼鏡検査）を、−３日目または０日目（試験／コントロールの製品投与前の基準）、１日目、４日目、７日目または８日目、１４日目、２１日目、及び３５日目に行った。４日目の検査は、就業日の初めに行った。２１日目の検査は、グループ１、グループ２、及びグループ５でのみ行った。眼の所見は、修正したマクドナルド−シャドックスコアリングシステムにしたがってスコア付けした。基準のスクリーニング前検査の間、すべての動物は、眼の異常を示さなかった。観察には、ＰＶＤの開発及び時間経過の評価が含まれた。
【０１３７】
拡張した脈絡膜血管及び／または網膜血管は、投与後２１日までのいくつかまたはすべての臨床的な眼科検査時点で、片側または両眼内のすべての動物において観察された。前記拡張は、一般に注射部位に限られていた。この所見は、ＢＳＳのみを注射した左眼（ＯＳ）を含む、両眼で時々注目されたので、それは、尿素の効果というよりも、むしろＩＶＴ注射処置に対する反応である可能性が高い。
【０１３８】
尿素投与の翌日に観察された、グループ２（１０ｍｇ／眼の尿素）の動物における注射部位周辺の軽度の結膜腫脹、及びグループ５（２．５ｍｇ／眼の尿素）の動物における注射部位周辺の軽度の網膜出血は、おそらくＩＶＴ注射処置によるものであった。
【０１３９】
試験製品の投与後の日に、尿素で処置した右眼（ＯＤ）に認められるグループ４（５０ｍｇ／眼の尿素）の動物における後部水晶体嚢周辺の輪状の不透明性は、高濃度の尿素により、前記水晶体組織の刺激によるものであった可能性がある。
【０１４０】
任意の検査でもＰＶＤの証拠は認められなかった。臨床的な眼科検査では、ＰＶＤを視覚化するのは困難であったが、ＯＣＴの画像処理は、ＰＶＤの症例を特定することができた（以下を参照されたい）。
【０１４１】
眼底の写真
眼底の画像を、−３日目または０日目（薬物またはＢＳＳ投与前の基準）、１日目、４日目、７日目または８日目、１４日目、２１日目、及び３５日目に撮影した。４日目の画像を、就業日の初めに撮影した。２１日目の画像は、グループ１、グループ２、及びグループ５のみを撮影した。画像処理のために、動物に麻酔をかけなかった。
【０１４２】
眼底画像では、眼の異常は観察できなかった。代表的な画像を図９に示す。
【０１４３】
光コヒーレンストモグラフィー
−３日目または０日目（試験／コントロールの製品の投与前の基準）、１日目、４日目、７日目または８日目、１４日目、２１日目、及び３５日目にＯＣＴを実施した。４日目の画像は、就業日の初めに撮影した。２１日目の画像は、グループ１、グループ２、及びグループ５のみを撮影した。上記のように、動物に麻酔した。ウサギ１匹当たり／１日当たりの画像を合計８枚取得した。
【０１４４】
網膜の劣化、網膜下液、及び網膜炎の徴候は、尿素投与の翌日から開始するグループ３及びグループ４の動物のＯＣＴの画像、及び尿素投与７日後のグループ２の動物で観察された。
【０１４５】
ＯＣＴの画像処理は、表１８に記載されるように、処置された眼（ＯＤ）におけるＰＶＤを明らかにした。ＰＶＤは、無細胞の成分を伴い、下にある暗／黒領域を有する硝子体腔において、細胞成分の部分的な線として観察された。代表的な画像を図１０Ａ〜１０Ｂに示す。
【表１８】
2019528313.tif 000020
【０１４６】
より高い尿素濃度は、より早期の発症及びより頑健なＰＶＤの発症と関連していた。しかしながら、これらの濃度はまた、治療された眼において、網膜の劣化、網膜下液の蓄積、及び網膜炎の症状を引き起こした。より低い尿素濃度は網膜の完全性を維持したが、部分的かつそれほど頑強ではないＰＶＤと関連していた。ＢＳＳ処置眼（ＯＳ）にはＰＶＤも網膜病変も見られず、両方の所見は、おそらく尿素に関連していることを確認した。
【０１４７】
すべての動物は、いくつかまたはすべての時点で、硝子体液中に粒子を示した。粒子は、注入された尿素によって、網膜から硝子体液に引き出され得る。視神経乳頭中の粒子もまた、様々な時点で、ほとんどの動物に認められた。前記視神経乳頭における粒子の観察は、偶発的である可能性があり、そのような粒子は、眼の病状がない場合でも観察されることが多いが、尿素の存在は、この領域に粒子をさらに引き込むことによって、この発見をある程度悪化させ得る。
【０１４８】
Ｂスキャンの画像処理
Ｂスキャンの超音波画像を、−３日目または０日目（試験／コントロール製品の投与前の基準）、及び３５日目に撮影した。グループ４の動物の３５日目のＢスキャンの画像は、右眼（ＯＤ）にＰＶＤの証拠を示したが、左目（ＯＳ）には認められなかった。他の動物のＢスキャンの画像では、ＰＶＤは、検出されなかった。代表的な画像を図１１Ａ〜１１Ｂに示す。
【０１４９】
病理組織学的な解析
回収された組織の病理組織学的な解析は、眼に対する尿素またはＢＳＳの有害事象の証拠を全く見い出さなかった。網膜からの硝子体液の分離は、組織の取り扱い及び処理手順の間の機械的な破壊のために、容易に起こり得るので、ＰＶＤは、組織病理学的な解析の間に最終的に評価することが困難であった。
【０１５０】
実施例７．後眼部空間におけるリポソーム構築物の局在化及び効果
本実施例は、用量濃度の広範囲の硝子体内への注射直後に、後眼部空間におけるリポソーム構築物の物理的な位置の観察を、また、治療後の薬物の局所効果の評価を提供する。
【０１５１】
様々な濃度のカプセル化した尿素及び遊離尿素のリポソームを含有する組成物を硝子体内に単回投与した後（０日目）、８匹の雌ニュージーランドホワイトラビットを１日間または３２日間観察した。リポソームは、製剤２（５８ｍｏｌ％のＤＯＰＣ、４２ｍｏｌ％のコレステロール）であった。試験デザインを表１９に要約する。各グループは、１のＮを有した。
【表１９−１】
2019528313.tif 000021
【表１９−２】
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【０１５２】
前記試験の生存段階の間、明らかな薬物に関連した臨床観察、体重変化、または異常な食物摂取はなかった。定期的な眼科検査では、硝子体の濁り（１日目、７日目、及び３２日目、おそらく薬剤によるもの）、タンパク性硝子体フレア（３２日目）及び硝子体細胞（３２日目）が明らかになった。これらの眼科的変化は、一般に、用量依存的であるように思われた。
【０１５３】
Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ  Ｅｎｖｉｓｕを介してＯＣＴスキャンを行い、ＭｉｃｒｏｎＸを介して、製剤製品の位置について高解像度の眼底画像をとらえ、３２日間にわたってｉＰｈｏｎｅを使用して、投与された眼のデジタル画像を撮影した。すべての動物についての基準画像は、ＯＣＴ、ＭｉｃｒｏｎＸ及びデジタルカメラを介して得た。グループ１〜４では、ＯＳの眼の処置は、眼が上を向くようにして動物の側方にとどまり、製剤が眼の後ろに落ち着くことを可能にするだけであった。
【０１５４】
より高濃度の投与量を有するより速い反応時間で、すべての処置された眼において、ＰＶＤを観察した。４週間の試験を通して、硝子体腔内の粒子（濁り）の存在は、写真、網膜画像処理、及びＯＣＴによって、概して確認した。さらに、試験の全過程にわたってすべての用量レベルで、ＯＣＴによって、投与後、局所的で不規則な形状の網膜層（特に、内層）を観察した。網膜の変化は、密に分布した粒子を有する硝子体領域に非常に近いところで起こりやすい。
【０１５５】
最高のリポソーム及び尿素濃度を有する眼（グループ８）が、光受容体機能の低下を示している可能性がある、より低い藩王の振幅を示したことを除いて（図１２Ａ〜１２Ｂ）、３２日目の網膜電図検査（ＥＲＧ）において、明らかな異常光誘発電気反応を観察しなかった。
【０１５６】
硝子体細胞の眼科所見とほぼ一致して、病理組織学的な評価は、後房内の炎症（軽度から重度、大部分は軽度）を明らかにした。すべての実験動物の各眼について、全体の球体の少なくとも２つの完全な矢状切片を調べた。網膜、視神経、硝子体、及び前房に、特に注意を払った。関連した病変は、主に、好中球からなる急性炎症からなり、後房、一般には、前記房の後部近くに、単球様細胞、赤血球、及び遊離フィブリンが散在していた。表層網膜には、鬱血、充血、及びいくらかの炎症も見られた。硝子体の細いストランドは、すべての眼に見え、一般的に、網膜表面から剥がれているように見えた。これらの炎症性の変化は、重症度において変動し、尿素の濃度と直接相関するようには見えなかった。さらに、１日目及び３２日目の所見の間に、ほとんど差はなかった。尿素濃度の増加が炎症の重症度と相関すると仮定することは論理的であろうが、これは明白ではなかった。これは、非常に小さいグループのサイズであることが原因である可能性がある。網膜からの硝子体の分離は、すべてのグループのすべての眼において見られた。しかしながら、前記分離は、正常な組織の処理の結果であり得るので、それらが薬物に関連しているかどうかは不明である。
【０１５７】
本発明の特定の実施形態の前述の説明は、当業者の範囲内の知識を適用することによって、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、過度の実験をすることなく、特定の実施形態のような様々な用途に、容易に修正及び／または適応し得るように、本発明の一般的な性質を完全に明らかにする。したがって、そのような適応及び修正は、本明細書に提示された教示及び指針に基づいて、開示された実施形態の均等物の意味及び範囲内にあることが意図されている。本明細書の用語または表現は、教示及び手引きを考慮して当業者によって解釈されるように、説明を目的としており、限定を目的としていないことを理解されたい。本発明は、特許請求の範囲によってさらに説明される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
2019528313.tif 000035
【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
2019528313.tif 000039
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【国際調査報告】
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