(57)【要約】  増幅反応中にプライマーをスイッチングする方法を提供する。特に、シングルプライマーのＰＣＲアンプリコンから、デュアルプライマーのＰＣＲアンプリコンに変換する方法を、提供する。
2019528788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンをデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンに変換するための方法であって、
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンを、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの５’部分を消化できる酵素で処理して、消化されたアンプリコンを形成すること；および
消化されたアンプリコンを、消化されたアンプリコンの未消化部分に相同性を有する一対のプライマーで増幅することにより、デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンを形成すること、
を含む、方法。
【請求項２】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンが、増幅条件下で、核酸とシングルＰＣＲプライマーとを接触させることにより生成され、かつ、シングルＰＣＲプライマーが消化可能な５’部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンが、ＲＮＡまたはＤＮＡに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酵素がグリコシラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グリコシラーゼが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、チミングリコールＤＮＡグリコシラーゼ、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼ、ＮｔｈＤＮＡグリコシラーゼ、ＮｅｉＤＮＡグリコシラーゼ、ＭｕｔＹ／ＭｉｇＤＮＡグリコシラーゼ、またはアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの５’部分が、少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基が、ウラシル、カルボキシルシトシン、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧ）、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ）、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵素がウラシルＤＮＡグリコシラーゼであり、かつ、少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基がウラシルである、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酵素が、５’−３’エキソヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
５’−３’エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージＴ７エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージＴ５エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ、バクテリアエキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、またはバクテリアＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンが、その５’末端から約５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの範囲内に、少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、３’−５’ホスホロチオエート結合、３’−５’ホスホロボラン結合、２’−５’ホスホジエステル結合、２’Ｏ−メチル部分、２’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
シングルＰＣＲプライマーの消化可能な５’部分が、ウラシル、カルボキシルシトシン、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧ）、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ）、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンから選択される少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
シングルＰＣＲプライマーが、消化不可能な３’部分に、または、消化可能な５’部分  と消化不可能な３’部分との境界に、少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含み、かつ、少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、３’−５’ホスホロチオエート結合、３’−５’ホスホロボラン結合、２’−５’ホスホジエステル結合、２’Ｏ−メチル部分、２’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
シングルプライマーアンプリコンが、ＤＮＡで開始して調製される請求項１に記載の方法であって：
複数の合成プライマーの存在下で、少なくとも１つのＤＮＡ分子を複製して、ＤＮＡの複数の第１鎖および第２鎖を生成すること、ここで、各合成プライマーは、（５’から３’に）場合により存在する消化可能な５’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第１タグ配列を含む内部タグ配列、および前記ＤＮＡ分子の一部に相補性を有する３’配列を含む；
１つの増幅プライマーの存在下で、複数の２本鎖ＤＮＡ産物を増幅して、ＤＮＡ産物の増幅ライブラリーを生成すること、ここで、１つの増幅プライマーは、前記複数の合成プライマーの５’配列を含む；
ＤＮＡ産物の増幅ライブラリーを、ヌクレアーゼまたはグリコシラーゼで消化すること；および 
アダプター配列を、消化したｃＤＮＡ産物のライブラリーの各５’末端に付与して、増幅ＲＮＡのライブラリーを生成すること、
を含む方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）が、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドの存在下で行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シングルプライマーアンプリコンが、ＲＮＡで開始して調製される請求項１に記載の方法であって：
複数の合成プライマーの存在下で、少なくとも１つのＲＮＡ分子を逆転写して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の複数の第１鎖および第２鎖を生成すること、ここで、各合成プライマーは、（５’から３’に）場合により存在する消化可能な５’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第１タグ配列を含む内部タグ配列、および前記ＲＮＡ分子の一部に相補性を有する３’配列を含む；
１つの増幅プライマーの存在下で、複数の２本鎖ｃＤＮＡ産物を増幅して、ｃＤＮＡ産物の増幅ライブラリーを生成すること、ここで、１つの増幅プライマーは、前記複数の合成プライマーの５’配列を含む；
ｃＤＮＡ産物の増幅ライブラリーを、ヌクレアーゼまたはグリコシラーゼで消化すること；および
アダプター配列を、消化したｃＤＮＡ産物のライブラリーの各５’末端に付与して、増幅ＲＮＡのライブラリーを生成すること、
を含む方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）が、逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド、および場合によりＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
シングルプライマーアンプリコンが、ディレクショナルなアンプリコンとなるように調製される、請求項１に記載の方法であって：
複数の第１合成プライマーの存在下で、少なくとも１つのＲＮＡ分子を逆転写して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の複数の第１鎖を生成すること、ここで、第１合成プライマーのそれぞれは、（５’から３’に）消化可能な５’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第１タグ配列を含む内部タグ配列、および前記ＲＮＡ分子の一部に相補性を有する３’配列を含む；
複数のｃＤＮＡの第１鎖を、複数の第２合成プライマーと接触させることにより、複数の２本鎖ｃＤＮＡ産物を合成すること、ここで、第２合成プライマーのそれぞれは、（５’から３’に）消化可能な５’配列、アダプタープライマー配列に相  同性を有する入れ子配列、場合により存在する第２タグ配列を含む内部タグ配列、およびｃＤＮＡの第１鎖の一部に相補性を有する３’配列を含み、ただし、各２本鎖ｃＤＮＡ産物が第１タグ配列または第２タグ配列の少なくとも１つに隣接するように、複数の第１および第２合成プライマーのいずれか一方または両方が、第１および／または第２タグ配列を含む；
１つの増幅プライマーの存在下で複数の２本鎖ｃＤＮＡ産物を増幅してｃＤＮＡ産物の増幅ライブラリーを生成すること、ここで、１つの増幅プライマーは、複数の第１および第２合成プライマーの５’配列と入れ子配列とを含む；
ｃＤＮＡ産物の増幅ライブラリーを、ヌクレアーゼまたはグリコシラーゼで消化すること；および
アダプターを、消化したｃＤＮＡ産物のライブラリーの各５’末端に付与して、ディレクショナルに増幅したＲＮＡのライブラリーを生成すること、
を含む、方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）が、逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド、および場合によりアクチノマイシンＤの存在下で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）が、複数の第２合成プライマーの存在下での複数のｃＤＮＡの第１鎖の熱変性で始まり、ステップ（ｂ）が、非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドの存在下で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）の後に、１本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼと接触させて、ハイブリダイズしていない合成プライマーを分解させる、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
場合により、ステップ（ｂ）の後に１本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼと接触させて、ハイブリダイズしていない第２鎖合成プライマーを分解させる、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
複数の合成プライマーの３’配列が、ランダムプライマー、半ランダムプライマー、または２対以上のプールされた特異的プライマーを含む、縮重ヌクレオチドを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ａ）で、複数の第１合成プライマーが、異なる内部タグを有する１つ以上のプライマーを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｂ）で、複数の第２合成プライマーが、異なる内部タグを有する１つ以上のプライマーを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
増幅が、少なくとも１つの増幅プライマーの存在下での複数の２本鎖ＤＮＡ産物の熱変性で始まり、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドの存在下で行われる、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
１つ以上の精製ステップがない、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
合成プライマーの５’部分が、少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基が、ウラシル、カルボキシルシトシン、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧ）、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ）、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
複数の合成プライマーの５’配列が、デオキシウリジンヌクレオチドを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
合成プライマーが、その５’末端から約５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの範囲内に、少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、３’−５’ホスホロチオエート結合、３’−５’ホスホロボラン結合、２’−５’ホスホジエステル結合、２’Ｏ−メチル部分、２’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
タグ配列が、少なくとも６ヌクレオチド長である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
シングルプライマーＰＣＲの増幅プライマーが、少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基が、ウラシル、カルボキシルシトシン、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧ）、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ）、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
増幅プライマーが、少なくとも１つのデオキシウリジンヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
シングルプライマーＰＣＲの増幅プライマーが、その５’末端から約５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの範囲内に、少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、３’−５’ホスホロチオエート結合、３’−５’ホスホロボラン結合、２’−５’ホスホジエステル結合、２’Ｏ−メチル部分、２’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
タグ配列が、少なくとも６ヌクレオチド長である、請求項２１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
５’から３’に、
少なくとも１つの消化可能残基を場合により含む５’配列；
アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列；
場合により存在する内部タグ配列；および
標的核酸に相補的な配列を含む３’配列
を含む、人工オリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
５’から３’に、
少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性残基を場合により含む５’配列；
アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列；
場合により存在する内部タグ配列；および
標的核酸に相補的な配列を含む３’配列
を含む、人工オリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
５’配列が、約５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、入れ子配列が、約５〜約２５ヌクレオチドの長さを有し、場合により存在する内部タグ配列が、約４〜約２０ヌクレオチドの長さを有し、かつ、３’配列が、約５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項４１または４２に記載の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
５’から３’に、
少なくとも１つの消化可能残基を含む５’配列；
場合により、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列；
場合により存在する内部タグ配列；および
標的核酸に相補的な配列を含む３’配列
を含む、人工オリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
５’から３’に、
ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む５’配列；
場合により、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列；
場合により存在する内部タグ配列；および
標的核酸に相補的な配列を含む３’配列
を含む、人工オリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
５’配列が、約５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、場合により存在する入れ子配列が、約５〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、請求項４１または４２に記載の人工ヌクレオチド。
【請求項４７】
消化可能残基が、グリコシラーゼ感受性塩基である、請求項４１または４４に記載の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基が、ウラシル、カルボキシルシトシン、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧ）、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ）、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンである、請求項４７に記載の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
５’配列が、デオキシウリジンヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
５’配列が、３’−５’ホスホロチオエート結合、３’−５’ホスホロボラン結合、２’−５’ホスホジエステル結合、２’Ｏ−メチル部分、２’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含むヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む、請求項４４に記載の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
５’配列が、約５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、場合により存在する入れ子配列が、約５〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、請求項４４または４５に記載の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
それぞれが、（５’から３’に）少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により含む５’配列；アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および標的核酸に相同な配列を含む３’配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドを含む、複数の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
複数の合成プライマーの５’配列が、グリコシラーゼ（ｇｌｙｃｏｓｏｌａｓｅ）感受性残基またはヌクレアーゼ耐性残基を含む、請求項５２に記載の複数の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
３’末端が、２つ以上の鋳型配列を標的とする、請求項５２または５３に記載の複数の人工オリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するためのキットであって、
それぞれの第１合成プライマーが、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により有する５’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および鋳型ターゲティング３’配列を含む、複数の合成プライマー；および
少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基と、場合によりアダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列とを含む合成プライマーの、５’配列を含む、少なくとも１つの増幅プライマー、
を含むキット。
【請求項５６】
さらに、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、１本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ウリジンＤＮＡグリコシラーゼ、および／または５’−３’エキソヌクレアーゼを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
ＲＮＡをディレクショナルに増幅するためのキットであって、
それぞれの第１合成プライマーが、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により有する５’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および鋳型ターゲティング３’配列を含む、複数の第１合成プライマー；
それぞれの第２合成プライマーが、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により有する５’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および鋳型ターゲティング３’配列を含む、複数の第２合成プライマー；および
少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基と、場合によりアダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列とを含む、合成プライマーの５’配列を含む、少なくとも１つの増幅プライマー、
を含むキット。
【請求項５８】
ＲＮＡをディレクショナルに増幅するためのキットであって、
それぞれの第１合成プライマーが、少なくとも１つの消化可能残基を有する５’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第１タグ配列を含む内部タグ配列、および鋳型ターゲティング３’配列を含む、複数の第１合成プライマー；
それぞれの第２合成プライマーが、非相補的ヌクレオチドおよび少なくとも１つのデオキシウリジン残基を含む５’配列、アダプター配列に相補性を有する入れ子配列、場合により存在する第２タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダムまたは半ランダムの３’配列を含む、複数の第２合成プライマー、ただし、複数の第１および第２合成プライマーのいずれか一方または両方が、第１および／または第２タグ配列を含む；および、
第１および第２合成プライマーの５’配列を含む少なくとも１つの増幅プライマー、
を含むキット。
【請求項５９】
さらに、逆転写酵素、非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、３’−５’デオキシリボヌクレアーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ウリジンＤＮＡグリコシラーゼまたは５’−３’エキソヌクレアーゼ、および／またはアクチノマイシンＤを含む、請求項５７または５８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の分野
本開示は、増幅反応中に、アンプリコン末端をスイッチングする方法に関する。特に、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンをデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンに変換することに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅反応は、多くの用途において広く使用されている。例えば、ＤＮＡシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）用のライブラリーを調製するためにＤＮＡまたはＲＮＡが増幅され得る。全ゲノム増幅（ＷＧＡ）または全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）は、シングルプライマーＰＣＲを含み、これはデュアルプライマー生成アンプリコンを必要とする用途には直接適合しない可能性がある。これは、アダプターをＷＧＡまたはＷＴＡアンプリコンに直接連結することによって、またはＷＧＡ／ＷＴＡプライマー配列を切除した後に、通常達成される。ＰＣＲ中のプライマーをスイッチングするための迅速かつ効率的な手段が必要とされている。
【０００３】
次世代シーケンシング用のライブラリー調製の一般的なワークフローには、鋳型断片化、末端修復、アダプターライゲーションおよびＰＣＲ増幅が含まれる。増幅を成功させるために不可欠なのは、アダプターをＤＮＡ断片の両末端に連結することである。ライゲーションは一般的に非定量的であるため、ほとんど無いに等しい少量の核酸がシーケンシングされる場合、このワークフローは困難になる。これらの方法は一般的に、（増幅前に）アダプター除去のために２つ以上の精製ステップを必要とし、増幅後のライブラリー表現に影響を与える可能性がある。
【０００４】
アダプター配列を導入するための別の一般的に高収率の選択肢は、プライマー伸長によるものである。ＷＧＡ／ＷＴＡの場合、これは、一部のＲＮＡ種の場合には、鋳型にハイブリダイズした、テイル縮重（ｔａｉｌｅｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーまたはポリＡプライマーを伸長することを包含する。プライマーダイマー増幅物（ｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｍｅｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は一般的に、縮重末端の５’側に異なるフォワードテイルとリバーステイルを使用する場合に、最も一般的な産物である。縮重塩基の５’側に、単一の共通プライミング配列を使用すると、プライマーダイマーは効果的に最小化される。これは、増幅が非常に非効率的である、短いプライマーダイマーヘアピンの形成によるものである。より長いアンプリコンもまたヘアピンを形成するが、小さいプライマーよりもはるかに安定性が低い。プライマー「ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）」プライマーダイマー構造（ステムに対して非常に小さいループ）は、より効率的な増幅を可能にする。
【０００５】
核酸ライブラリーでは、鋳型に対する、ライブラリー・アンプリコンの「ディレクショナリティ（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）」、すなわち方向性を知ることが、しばしば重要である。少量のＲＮＡをディレクショナルに増幅するように設計された１つのプライマー伸長ベースのＷＴＡ法は、「鋳型スイッチング」の使用を包含するものであり、本明細書中に記載される「プライマースイッチング」の概念と混同されるべきではない。別のディレクショナルＲＮＡ増幅方法は、ライゲーション（および複数の精製ステップ）を使用する。このアプローチは、第２鎖ｃＤＮＡ合成の間のｄＵＴＰ取り込み、続くシーケンスアダプター（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒ）のライゲーションおよび第２鎖のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ消化、さらに続く得られたアンチセンスｃＤＮＡライブラリーのデュアルプライマーＰＣＲ増幅に依存する。
【０００６】
それゆえ、低いインプット量および／または低い品質（ＦＦＰＥ）に適用可能な、精製ステップが無い、かつ増幅産物の撚り（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）を示すことができる、核酸増幅方法が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の様々な局面のうちの１つは、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンをデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンに変換するための方法の提供である。本方法は、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンを、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの５’部分を消化できる酵素で処理して、消化されたアンプリコンを形成すること、および、消化されたアンプリコンを、消化されたアンプリコンの未消化部分に相同性を有する一対のプライマーで増幅することにより、デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンを形成することを含む。
【０００８】
本開示の他の局面および反復（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）は、ＤＮＡまたはＲＮＡからの増幅を含む。ＲＮＡには、ディレクショナルおよび非ディレクショナルな増幅の選択肢がある。本方法はまた、マルチプレックス増幅にも適用することができ、ここでは、第１プライマーの３’縮重度が、完全に、または部分的に縮重した混合物ではなく、標的アンプリコンの予め決められたセットを含むように、減少している。すべての場合において、プライマーダイマー増幅物は、最初の増幅にシングルＰＣＲプライマーを使用することによって、抑制される。
【０００９】
ＤＮＡの増幅には、シングルＰＣＲプライマー配列を５’末端に付加した鋳型ターゲティングプライマーを用いた、複製ライブラリーの合成と、それに続くＰＣＲが必要である。鋳型ターゲティングプライマーをアニーリングし、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、次いでシングルプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。非ディレクショナルＲＮＡ増幅は、同様に行う。鋳型ターゲティングプライマーをアニーリングし、鎖置換型逆転写酵素／ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、次いでシングルＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅する（図４および図５参照）。ディレクショナルＲＮＡ増幅は、非鎖置換条件下で、第１鎖合成と第２鎖合成を順次行うことにより達成される。ディレクショナリティは、第１および／または第２鎖鋳型ターゲティングプライマー中に設計されたディレクショナルタグを用いてモニターする（図２１、２２、および２３参照）。分子同一性は、合成プライマー中に設計されたタグによって同様にモニターすることができる。
【００１０】
シングルプライマーアンプリコンからデュアルプライマーアンプリコンへの変換は、デュアルプライマーの、シングルプライマーアンプリコンへのハイブリダイゼーションを必要とする。デュアルプライマーが、シングルプライマーの全部ではないがいくつかと相同である場合、分子間および分子内アンプリコンハイブリッドの安定性は、デュアルプライマーハイブリダイゼーションと効果的に競合する（図６参照）。この効果は、消化可能な残基、または、エキソヌクレアーゼ耐性残基を、シングル増幅プライマー中に設計することによって、場合により鋳型ターゲティングプライマーの配列中に設計することによって、軽減される。消化は、分子間および分子内アンプリコンハイブリッドの安定性を低下させ、デュアルプライマーによる効率的なプライミングを可能にする。消化可能残基には、当業界で周知の、グリコシラーゼ感受性（ｇｌｙｃｏｌａｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）部分およびヌクレアーゼ耐性部分が含まれる。好ましい実施形態は、鎖間／鎖内ハイブリダイゼーションを不安定化するために、ウラシル残基とウラシルＤＮＡグリコシラーゼとを組み合わせる（図４および図５参照）。
【００１１】
ワークフローは、一般的にまとめることができる：プライマーは、ハイブリダイズした第１プライマーを伸長させ、その後(該当する場合)第２プライマーを伸長させ、シングルプライマーで増幅し、５’アンプリコン末端を消化し、その後、デュアルプライマーで増幅する。デュアルプライマーアンプリコンは、（限定されないが）次世代シーケンシングなどの下流の用途に好適である。第１および第２プライマーは、一般的に、３’ランダムプライマーから定方向プライマー対のプールにわたる、複数のプライマーであり得、数個から数百万の特有のアンプリコンを生産する（図１４、１５および１６参照）。
【００１２】
本開示のさらなる局面は、（ａ）それぞれが（５’から３’に）、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により含む５’配列；アダプタープライマー（ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）配列に相同性を有する入れ子配列（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ディレクショナルな、および／または分子同一性の（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＩＤ）増幅のためのタグ配列を含む、場合により存在する内部タグ配列、ランダム配列、半ランダム（ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ）配列、またはプールされた標的特異的配列を含む３‘配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドを含む、複数の人工オリゴヌクレオチドを提供する（図３Ａ参照）。ディレクショナルな増幅については、それぞれが（５’から３’に）、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により含む５’配列；第２タグ配列アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列；場合により存在する第２タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、またはプールされた標的特異的配列を含む３’配列を含む、複数の第２オリゴヌクレオチドが提供され、だたし、ディレクショナルな増幅については、複数の第１および第２オリゴヌクレオチドの一方または両方が、第１および／または第２タグ配列を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡから出発するかどうかにかかわらず、かつ、ディレクショナルまたは非ディレクショナルにかかわらず、さらなる局面は、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を含む人工オリゴヌクレオチドである（図３Ｂ参照）。
【００１３】
本開示のさらに別の局面は、ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するためのキットを包含する。キットは、（ａ）それぞれの合成プライマーが、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により含む５’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、およびランダムまたは半ランダムの３’配列を含む、複数の合成プライマーを場合により含み；および（ｂ）それぞれの第２合成プライマーが、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により含む５’配列、アダプター配列に相補性を有する入れ子配列、場合により存在する第２タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダムまたは半ランダムの３’配列を含む、複数の第２合成プライマーを場合により含む。ディレクショナルな増幅については、複数の第１および第２合成プライマーのいずれか一方または両方が、第１および／または第２タグ配列を含む。さらに、キットは、合成プライマーの５’配列、および、少なくとも１つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を含む、少なくとも１つの増幅プライマーを含む。消化可能残基は、好ましい実施形態において、ウラシルである。
【００１４】
本開示の他の局面および反復を、以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより、官庁により提供されるであろう。
【００１６】
【図１】図１は、シングルおよびデュアルプライマーＰＣＲの、プライマーおよび鋳型配列を図示している。
【００１７】
【図２】図２は、シングルプライマーＰＣＲ中の、ヘアピン鋳型形成とプライマー伸長の優位性に影響を与える変数を図示している。
【００１８】
【図３】図３は、プライマーデザインを図示している。Ａ．合成プライマー。タグは、ディレクショナリティ、分子バーコーディング、または両方のためであり得る。Ｂ．本明細書で開示されるシングルプライマーＰＣＲプライマー。Ｃ．デュアルプライマーＰＣＲプライマーを図示している。同じ色で示されているように、デュアルプライマーの３’領域は、合成プライマーと、場合により増幅プライマーと、配列相同性を有する。
【００１９】
【図４】図４は、５’消化可能部分が、グリコシラーゼ感受性塩基（例えば、ウラシル残基）を含む、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの例を表す。ここでは、アンプリコンをグリコシラーゼで消化した後、アダプタープライマーでアニーリング／伸長して、デュアルプライマーＰＣＲを行う。アダプタープライマー配列を含む低Ｔｍステム構造は、場合により存在する。つまり、赤いアダプター部分は、相補的である必要はない。
【００２０】
【図５】図５は、５’消化可能部分がヌクレアーゼ耐性塩基を含む、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの例を図示している。ここでは、アンプリコンを５’−３’エキソヌクレアーゼで消化した後、アダプタープライマーでアニーリング／伸長して、デュアルプライマーＰＣＲを行う。アダプタープライマー配列を含むステム構造は、場合により存在する。
【００２１】
【図６】図６は、未消化のシングルプライマーＰＣＲアンプリコンの、デュアルプライマーＰＣＲプライマーによる非効率的なプライミングを示す。
【００２２】
【図７】図７は、例示的なウラシル含有シングルおよびデュアルプライマーＰＣＲ増幅のプライマーを図示している。
【００２３】
【図８】図８は、例示的なエキソヌクレアーゼ耐性シングルおよびデュアルプライマーＰＣＲ増幅のプライマーを図示している。
【００２４】
【図９】図９は、５’末端付近にウラシル塩基を含むシングルプライマーＰＣＲアンプリコンのＵＤＧによる処理あり／なし後の、デュアルプライマーＰＣＲのバイオアナライザーのトレースが、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの５’末端消化がない場合に、アニーリング（およびＰＣＲ）が非常に非効率的であることを示すことを、表す。
【００２５】
【図１０】図１０は、デュアルプライマー選択を図示する。一対のフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーによる増幅は、単一のフォワードまたはリバースプライマーとは対照的に、より効率的である。
【００２６】
【図１１】図１１は、示したような、シングルプライマーまたはデュアルプライマーの組み合わせの存在下でＰＣＲを行った、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンのＵＤＧ消化後のデュアルプライマーＰＣＲのバイオアナライザーのトレースを示す。様々な組み合わせのサイクル閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）（Ｃｔ）もまた示す。
【００２７】
【図１２】図１２は、短鎖または長鎖デュアルプライマーＰＣＲプライマーの存在下でＰＣＲが行われた、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンのＵＤＧ消化後の、デュアルプライマーＰＣＲのバイオアナライザーのトレースを、表す。
【００２８】
【図１３】図１３は、本明細書に開示される、シングルプライマーからデュアルプライマーへのスイッチング法を用いた、単一細胞由来の全ゲノム増幅を示す。
【００２９】
【図１４】図１４は、典型的なＤＮＡ増幅ワークフローを図示している。
【００３０】
【図１５】図１５は、典型的なＲＮＡ増幅ワークフローを図示している。
【００３１】
【図１６】図１６は、典型的なディレクショナルＲＮＡ増幅ワークフローを図示している。
【００３２】
【図１７】図１７は、Ｙアダプターシステムに用いられる例示的なプライマーデザインを示している。図３に記載されるようなプライマーセグメントの合成。
【００３３】
【図１８】図１８は、ペアードアダプターシステムに用いられる例示的なプライマーデザインを示している。図３に記載されるようなプライマーセグメントの合成。
【００３４】
【図１９】図１９は、１本鎖核酸における、プライミングおよび鎖置換型プライマー伸長を示す。
【００３５】
【図２０】図２０は、図１９由来のプライマー伸長産物における、プライミングおよびプライマー伸長を示す。
【００３６】
【図２１】図２１は、１本鎖核酸における、ディレクショナルな、第１鎖プライミングおよびプライマー伸長を示す。
【００３７】
【図２２】図２２は、図２１由来のプライマー伸長産物における、ディレクショナルな、鎖プライミングおよびプライマー伸長を示す。
【００３８】
【図２３】図２３は、プライマー伸長および増幅した鋳型における、シングルおよびデュアルプライマー増幅のプライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本開示は、プライマースイッチングのための方法を提供する。さらに具体的には、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンをデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンに変換するための方法が、本明細書で提供される。定義によると、シングルプライマーＰＣＲは、５’−３’相補的なアンプリコンを作製する（図１参照）。これらのアンプリコンの変性および冷却により、３’−５’融解温度（Ｔｍ）がプライマー配列によって決定される、分子間および分子内５’−３’ハイブリッドの混合物が作製される。これらのシングルプライマーアンプリコンを、デュアルプライマーアンプリコンに変換すること（ここでは、デュアルプライマーの３’部分が、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの３’部分に相補的である）は、デュアルプライマーの１本鎖（すなわち、変性）シングルプライマーアンプリコンへのアニーリングを必要とする。しかしながら、デュアルプライマーのＴｍは、シングルプライマーのＴｍよりも、必ず低いものである。このように、シングルプライマーＰＣＲアンプリコン分子間/分子内ハイブリッドは、デュアルプライマーハイブリダイゼーションに必要とされるよりも高い温度でアニールし、それ故、デュアルプライマーのアニーリングおよびプライマー伸長を、阻害するか、または、それらと不利に競合するであろう。本明細書で開示される方法は、アンプリコンの５’末端の消化を可能にするシングルプライマーＰＣＲ用のプライマーを使用することにより、この問題を解決する。従って、５’消化末端と３’相補的末端との間の相互作用は安定性が低く、それによって異なるプライマーへのアニーリングが可能になる。
【００４０】
本明細書ではまた、シングルプライマーからデュアルプライマーへのスイッチングの改変法もまた提供される。例えば、異なるシングルＰＣＲプライマー間のスイッチには、同様の方法を用いることができる。別の例として、アダプター配列をＰＣＲアンプリコンに付けるために同様の方法を用いることができる。
【００４１】
（Ｉ）シングルプライマーアンプリコンからデュアルプライマーアンプリコンへのスイッチング
本開示の一局面は、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンをデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンに変換するための方法を包含する。本方法は、以下を含む：標的核酸を、場合により消化可能な５’末端と、完全にまたは部分的に縮重した３’末端とを含み、その間を、デュアルプライマーＰＣＲプライマー配列に相同な一連の塩基と、場合により任意のタグ配列とによって区切られた複数の合成プライマーと接触させることにより、シングルプライマーＰＣＲ鋳型を形成すること；シングルプライマーＰＣＲ鋳型を、増幅をサポートする条件下で、消化可能な５’部分と、場合により消化不可能な３’部分とを含むプライマーと、接触させること（以下に記載のステップＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）；
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンを、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの５’部分を消化できる酵素で処理して、消化されたアンプリコンを形成すること（以下に詳述のステップＩＶ）；および、消化されたアンプリコンの未消化部分に相同性を有する一対のＰＣＲプライマーで、消化されたアンプリコンを増幅し（以下に詳述のステップＶ）、それにより、デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンを形成すること。
【００４２】
ステップＩ:シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの形成
本方法の第１のステップは、プライマー伸長条件下で、標的核酸を合成プライマーと接触させることにより、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンを形成することを含む。
【００４３】
（ａ）合成プライマーおよびシングルプライマーＰＣＲプライマー
本明細書で用いられる合成プライマーは、少なくとも３つの部分を含む：シングルプライマーＰＣＲプライマーと相同な５’部分、デュアルプライマーＰＣＲプライマーの３’末端に場合により相同な入れ子部分、および３’鋳型ターゲティング配列である。５’部分は、場合により消化可能である。３’部分は、完全にランダムな配列、準ランダム（ｑｕａｓｉ  ｒａｎｄｏｍ）な配列、またはプールされたターゲティングプライマー配列の合計であり得る。いくつかの実施形態において、合成プライマーは、合成方向および／または分子同一性をモニターするのに有用な、タグ配列（本明細書では、バーコードまたはインデックス配列とも呼ばれる）を含み得る。シングルプライマーＰＣＲプライマーは、少なくとも合成プライマーの第１の５’部分を含み、消化可能である。いくつかの実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、２つの異なる部分である、消化可能な５’部分および消化不可能な３’部分を含む（図３Ｂ参照）。いくつかの実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーの消化可能な５’部分は、少なくとも１つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む。他の実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、シングルプライマーＰＣＲプライマーの消化可能な５’部分と消化不可能な３’部分との境界に、少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む。消化可能部分の配列は、場合により、以下に詳述したデュアルプライマーＰＣＲプライマーの３’部分に相同である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、合成プライマーは、増幅条件で用いてよい。
【００４５】
ある実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーの５’部分は、１つ以上のグリコシラーゼ感受性塩基を含む（図３Ｂ参照）。好適なグリコシラーゼ感受性塩基の非限定的な例には、ウラシル、５−カルボキシルシトシン（５−ｃａＣ）、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧ）、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ）、５−ホルミルシトシン（ｆＣ）、５−ホルミルウラシル（ｆＵ）、５−ヒドロキシシトシン（ｈｏＣ）、５−ヒドロキシウラシル（ｈｏＵ）、６−ヒドロキシウラシル、５，６−ジヒドロキシウラシル、５−ジヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）、５−ヒドロキシメチルウラシル（ｈｍＵ）、ヒポキサンチン、３−メチルアデニン（３−ｍＡ）、３−メチルシトシン（３−ｍＣ）、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）、８−オキソアデニン（８−ｏｘｏＡ）、８−オキソグアニン（８−ｏｘｏＧ）、チミングリコール（Ｔｇ）、ウレア、またはキサンチンが含まれる。特定の実施形態において、グリコシラーゼ感受性塩基はウラシルである。
【００４６】
一般に、シングルプライマーＰＣＲプライマーの消化可能な５’部分に存在する塩基の少なくとも４０％が、グリコシラーゼ感受性塩基である。いくつかの実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーの消化可能な５’部分に存在する塩基の、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも約１００％が、グリコシラーゼ感受性塩基である。別の実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のグリコシラーゼ感受性塩基を含有し得る。
【００４７】
他の実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、ＰＣＲプライマーの３’部分内に、または、消化可能な５’部分とＰＣＲプライマーの３’部分との境界に、少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む（図３Ｂ参照）。例えば、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、その５’末端から約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドの間に少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含み得る。好適なヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドの例には、３’−５’ホスホロチオエート結合，３’−５’ホスホロボラン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｂｏｒａｎｅ）結合、２’−５’ホスホジエステル結合、２’Ｏ−メチル部分、２’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含むものが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドは、３’−５’ホスホロチオエート結合、３’−５’ホスホロボラン結合、または２’−５’ホスホジエステル結合ヌクレアーゼ、並びに、２’フルオロ部分、および／またはプロピン塩基アナログを含み得る。いくつかの実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーの消化不可能な３’部分、または消化可能な５’部分と消化不可能な３’部分との境界は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む。
【００４８】
シングルプライマーＰＣＲプライマーの長さは、変化し得る。一般に、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、約１４ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。様々な実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、約１４、１５、１６、１７、１８、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、消化可能な５’部分は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長であり得、消化不可能な３’部分は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、消化可能な５’部分は、約８〜約１４ヌクレオチドの長さの範囲であり得、消化可能な３’部分は、約１０〜約１４ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、合成プライマーは、さらに、３’末端に縮重領域を含む。縮重ヌクレオチドは、２倍の縮重度を有し得（すなわち、２つのヌクレオチドのうちの１つであり得）、３倍の縮重度を有し得（すなわち、３つのヌクレオチドのうちの１つであり得）、または４倍の縮重度を有し得る（すなわち、４つのヌクレオチドの１つ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴであり得る）。３倍の縮重度を有するヌクレオチドには、「Ｂ」（ＣまたはＧまたはＴであり得る）、「Ｄ」（ＡまたはＧまたはＴであり得る）、および「Ｖ」（ＡまたはＣまたはＧであり得る）が含まれる。２倍の縮重度を有するヌクレオチドには、「Ｋ」（ＧまたはＴであり得る）、「Ｍ」（ＡまたはＣであり得る）、「Ｒ」（ＡまたはＧであり得る）、「Ｙ」（ＣまたはＴであり得る）、「Ｓ」（ＣまたはＧであり得る）、および「Ｗ」（ＡまたはＴであり得る）が含まれる。縮重領域は、約４〜約１８ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。ある実施形態において、縮重領域は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチド長であり得る。これらの縮重度は、混合塩基合成法（ｍｉｘｅｄ  ｂａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）または個々に合成されたオリゴヌクレオチドをプールすることにより、生じることができる。
【００５０】
一般に、合成プライマーおよびシングルプライマーＰＣＲプライマーは、ＤＮＡ合成をプライミングするために、１本鎖であり、３’末端にヒドロキシル基を有する。増幅プライマーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含み得る。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン／ウリジン）またはヌクレオチドアナログであり得る。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基および／または修飾されたリボソーム部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然のヌクレオチド（例えば、イノシン）、または非天然のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、並びに、該塩基の炭素および窒素原子の他の原子との置換（例えば、７−デアザプリン）が含まれる。ヌクレオチドアナログにはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルフォリノも含まれる。
【００５１】
合成プライマーおよび増幅プライマーのデザインは、意図される用途およびアダプタープライマーデザインに依存するだろう。
【００５２】
一般に、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、約４０〜６０％の平均GC含有量と、約５０℃〜約８０℃の平均融解温度（Ｔｍ）を有するであろう。ある実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、または約７５℃のＴｍを有し得る。
【００５３】
合成プライマーおよび増幅プライマーのデザインは、下流のアダプターシステムに依存する。全ての場合において、合成プライマーは、増幅プライマーの全部または一部に相同な消化可能なセグメント、アダプタープライマー配列の全部または一部に相同な入れ子の消化不可能なセグメント、ディレクショナルなおよび／または分子バーコーディングに用いられる場合により存在するタグ配列、および３’鋳型プライミングセクションを含むであろう（図３Ａおよび図３Ｂ参照)。鋳型プライミングセグメントは、完全な縮重か（全てＮ）、または、特異的プライミング配列と、その間の任意の構成のプールであり得る。Ｙアダプター用途については、１つの消化可能なセグメント＋１つの入れ子の消化不可能なセグメントが存在し得る（図１７参照）。入れ子の消化不可能なセグメントは、Ｙアダプターステムの配列と相同であろう。ペアードアダプター用途については、２つの合成プライマー：１つの消化可能な増幅プライマー＋２つの入れ子のアダプタープライマーセグメント、が存在するだろう。増幅プライマーは、Ｙアダプター用途については、消化可能なおよび消化不可能なセグメントを含み、一方で、ペアードアダプター用途については、消化可能なセグメントのみ含むであろう（図１８参照）。
【００５４】
シングルプライマーＰＣＲプライマーは、市販のプライマーデザインソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ  Ｔｏｏｌ、ＮＰｐｒｉｍｅｒ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｒｉｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎなど）を使ってデザインすることができ、標準的なオリゴヌクレオチド化学合成法を用いて合成することができる。
【００５５】
（ｂ）オリゴヌクレオチド
本開示の一局面は、ランダム３’配列、半ランダム３’配列、または特異的３’配列のプール、固定の５’配列、場合により存在する内部タグ配列、並びに５’配列と内部タグおよび／または３’鋳型ターゲティング配列との間の入れ子配列を含む、人工オリゴヌクレオチドを包含する（図３Ａ参照）。さらなる局面は、ＲＮＡのディレクショナルな増幅に用いられ得る、複数の第１オリゴヌクレオチドおよび複数の第２オリゴヌクレオチドを含む、複数の人工オリゴヌクレオチドを提供する。複数の第１オリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドは、ランダム３’配列、半ランダム３’配列、または特異的３’配列のプール、少なくとも１つの消化可能残基を場合により含む固定の５’配列、アダプター配列に相同な入れ子配列、および場合により、第１タグ配列を含む内部タグ配列を含む。複数の第２オリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドは、ランダム３’配列、半ランダム３’配列、または特異的３’配列のプール、少なくとも１つのデオキシウリジン残基を含む固定の５’配列、アダプター配列に対応する入れ子配列、および場合により、第２タグ配列を含む内部タグ配列を含むが、ただし、複数の第１および第２オリゴヌクレオチドの一方または両方は、第１および／または第２タグ配列を含む（図２１および図２２参照）。
【００５６】
一般に、オリゴヌクレオチドは１本鎖である。該ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、ｄＵ、など）並びにヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基および／または修飾されたリボソーム部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然のヌクレオチド（例えば、イノシン）、または非天然のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、並びに、該塩基の炭素および窒素原子の他の原子との置換（例えば、７−デアザプリン）が含まれる。ヌクレオチドアナログにはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルフォリノも含まれる。オリゴヌクレオチドの主鎖は、ホスホジエステル結合、並びに、ホスホチオエート、ホスホラミダイト、またはホスホロジアミデート結合を含むことができる。
【００５７】
（ｉ）３’配列
【００５８】
複数のオリゴヌクレオチドにおける各オリゴヌクレオチドは、ランダム３’配列、半ランダム３’配列、または特異的３’配列のプールを含む（図３Ａ参照）。ランダムまたは半ランダム配列は、一般的に、オリゴヌクレオチドの３’配列が標的ＲＮＡ（またはｃＤＮＡ産物）とハイブリダイズするように、標的核酸に十分な相補性を有する。いくつかの実施形態において、３’配列は、ランダムであり得、４倍縮重ヌクレオチド（すなわち、Ｎ）から成り得る。例えば、３’配列はポリＮであり得る。他の実施形態において、３’配列は、半ランダムであり得、少なくとも１つの２倍、３倍、または４倍縮重ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、３’配列は、２倍縮重ヌクレオチド（すなわち、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、および／またはＳ）、３倍縮重ヌクレオチド（すなわち、Ｂ、Ｄ、Ｈ、および／またはＶ）、４倍縮重ヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態において、３’配列は、ＮおよびＫ（すなわち、ＧおよびＴ）縮重ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。例えば、３’配列は、任意の順序で並んだ約同数のＮおよびＫヌクレオチドを含み得る。好適な「ＮＫ」配列の例には、５’−ＫＮＮＮＫＮＫＮＫ−３’，５’−ＮＮＮＫＮＫＫＮＫ−３’、および５’−ＮＫＮＮＫＮＮＫＫ−３’が含まれる。さらなる実施形態において、３’配列は、非縮重および縮重ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。例えば、３’配列は、３’末端に、ポリｄＴ 配列および縮重ヌクレオチドを含み得る。これらの配列の例には、ポリｄＴ−ＮＮ、ポリｄＴ−ＶＮなどが含まれる。よりさらなる実施形態において、３’配列は、前述の配列のいずれかの組み合わせを含み得る。例として、５’−ＫＮＮＮＫＮＫＮＫ−３’、５’−ＮＮＮＫＮＫＫＮＫ−３’、５’−ＮＫＮＮＫＮＮＫＫ−３’、およびポリｄＴ１４−ＶＮの組み合わせが、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｗｈｏｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＷＴＡ２）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにおいて利用可能である。
【００５９】
３’配列の長さは変化し得るものであり、実際に変化する。一般に、３’配列は約５ヌクレオチド長から約３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。ある実施形態において、３’配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、３’配列は、約６から約２０ヌクレオチド長さの範囲であり得る。
【００６０】
（ｉｉ）５’配列
【００６１】
各オリゴヌクレオチドは、固定の５’配列を含む（図３Ａおよび３Ｂ参照）。いくつかの実施形態において、５’配列は、非相補的ヌクレオチドを含み、それにより、各オリゴヌクレオチド内の分子内相互作用、および／または、複数のオリゴヌクレオチドにおけるオリゴヌクレオチドの５’配列間の分子内相互作用を低減させる。非相補的ヌクレオチドの例には、Ｋ（すなわち、ＧおよびＴ）、Ｍ（すなわち、ＡおよびＣ）、Ｒ（すなわち、ＡおよびＧ）、またはＹ（すなわち、ＣおよびＴ）が含まれる。さらに、非相補的ヌクレオチドは、少なくとも１つのチミジン残基が、デオキシウリジン残基で置換され得るように、選ばれる。従って、５’配列は、Ｋ（すなわち、ＧおよびＴ）またはＹ（すなわち、ＣおよびＴ）ヌクレオチドを含み得、１つ以上のチミジン残基が、デオキシウリジン（ｄＵ）で置換されている。特定の実施形態において、５’配列は、ＧおよびｄＵ残基を含み得る。いくつかの実施形態において、５’配列は、１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれを超えるｄＵ残基を含有し得る。
【００６２】
固定の５’配列の長さは、変化し得るものであり、実際に変化する。一般に、固定の５’配列は、約５ヌクレオチド長から約４０ヌクレオチド長の範囲であり得る。ある実施形態において、固定の５’配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド長で有り得る。特定の実施形態において、固定の５’配列は、約６から約１８ヌクレオチド長の範囲であり得る。
【００６３】
（ｉｉｉ）入れ子配列
【００６４】
各オリゴヌクレオチドさらに、固定の５’配列の３’末端に、入れ子配列を含む（図３Ａ参照）。入れ子配列は、アダプター配列のある領域に相同性を有する。例えば、入れ子配列は、アダプター配列の２本鎖領域に相同性を有し得る（例えば、Illumina（登録商標） (San Diego, CA)由来）。入れ子配列は、当業界で知られる他のアダプターのある領域に、相同性を有し得る。
【００６５】
入れ子配列の長さは、変化し得るものであり、実際に変化する。一般に、入れ子配列は、約５ヌクレオチド長から約２５ヌクレオチド長の範囲であり得る。ある実施形態において、５’配列は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、入れ子配列は、約８から約１５ヌクレオチド長の範囲であり得る。
【００６６】
（ｉｖ）内部タグ配列
【００６７】
各オリゴヌクレオチドはまた、場合により存在する内部タグ（またはバーコード）
配列を含み得る（図３A参照）。一般に、タグ配列は、（固定の５’配列の３’末端の）入れ子配列と、ランダム３’配列、半ランダム３’配列、または特異的３’配列のプールとの間に存在する。タグ配列は、出発ＲＮＡ分子の方向および／または分子同一性に関してｃＤＮＡ産物をタグ付けするのに役立つ。オリゴヌクレオチドが、場合により存在するタグ配列を含有する場合、タグ配列は、ＲＮＡの３’末端の方向性を示す働きをする第１タグ配列、または、ＲＮＡの５’末端の方向性を示す働きをする第２タグ配列であり得る。
【００６８】
タグ配列のヌクレオチド配列は、変化し得るものであり、実際に変化する。一般に、タグ配列は、標的ＲＮＡ分子には存在しない、人工配列である。人工タグ配列中のヌクレオチドの含有量は、Ｇ／ＴおよびＣ／Ａの多様性を提供するためにバランスをとることができる。さらに、第１および第２オリゴヌクレオチドは、標的核酸へのプライマーアニーリング中に生じる偏りに対処するために、ワトソン−クリック塩基対ごとにバランスをとることができる。
【００６９】
一般に、タグ配列は、約４ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。様々な実施形態において、タグ配列は、約５ヌクレオチド長から約１５ヌクレオチド長、約６ヌクレオチド長から約１２ヌクレオチド長、または約７ヌクレオチド長から約１０ヌクレオチド長の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、タグ配列は、少なくとも６ヌクレオチド長である。他の実施形態において、タグ配列は、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、または９ヌクレオチド長である。
【００７０】
（ｃ）標的核酸
本方法は、プライマー伸長条件下で標的核酸を合成プライマーと接触させ、その後増幅条件下でシングルプライマーＰＣＲプライマーと接触させることにより、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンを形成することを含む。様々な標的核酸を、シングルプライマーＰＣＲで増幅することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸はゲノムＤＮＡであり得る。ゲノムＤＮＡは、核、ミトコンドリア、または色素体ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ゲノムライブラリー、すなわち、細胞または細胞集団の全ゲノムを含み得る。他の実施形態において、標的核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作動性ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ＭＴ−ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、スプライスリーダーＲＮＡ（ＳＬ  ＲＮＡ）、および／またはテロメラーゼＲＮＡ要素）から転写された、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。ある実施形態において、標的核酸は、細胞または細胞集団のトランスクリプトームに由来する、ｃＤＮＡのライブラリーであり得る。当業者は、ゲノムＤＮＡの単離、ＲＮＡの単離、および／またはＲＮＡからのｃＤＮＡの調製のための手段（例、標準的プロトコール、市販のキットなど）に精通している。
【００７１】
標的核酸は、野生型であり得、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得、複数のヌクレオチド置換を含み得、挿入および／または欠失（インデル）を含み得、および／またはエピジェネティック修飾（例えば、メチル化シトシン、他の修飾されたヌクレオチドなど）を含み得る。
【００７２】
標的核酸は、真核生物細胞、古細菌細胞、または細菌細胞に由来し得る。好適な真核生物細胞には、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、家畜、動物園の動物、げっ歯類、研究動物など）、非哺乳動物脊椎動物細胞（例えば、家禽、魚、カエルなど）、植物細胞（例えば、トウモロコシ、マメ科植物、草、アブラナなど）、無脊椎動物細胞（例えば、昆虫、虫（ｗｏｒｍ）など）、真菌細胞、単細胞生物などが、含まれる。
【００７３】
増幅反応に含まれる標的核酸の量は、約１アトグラム（ａｇ）〜約１００ナノグラム（ｎｇ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、単一（哺乳動物）細胞が、標的核酸を提供する。
【００７４】
（ｄ）増幅条件
上記に詳述したように、合成プライマーの後に、シングルプライマーＰＣＲプライマーを、増幅条件下で、上記に詳述したように、標的核酸と接触させて、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンを形成する。増幅条件は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を含む（図１４、１５および１６参照）。
【００７５】
ＰＣＲは、好適なバッファーの存在下での、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）との接触を含む。一般的に、ＰＣＲ増幅に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性を有し、場合により、３’から５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。一般に、ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ、これらの変異体、またはこれらの組み合わせ）であろう。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼは中温性（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、これらの変異体、またはこれらの組み合わせ）であり得る。
【００７６】
ＰＣＲ増幅反応は、通例のＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、高速ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ロングレンジＰＣＲなどであり得る。
あるいは、増幅反応は、多置換増幅（ＭＤＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ）増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＡＤ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、またはライゲーション媒介（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ）増幅であり得る。
【００７７】
ＰＣＲ増幅反応は、変性ステップとアニーリング／伸長ステップとの間のサイクルを含む。全サイクル数は、約１０〜約６０の範囲であり得る。アニーリング／伸長は、単一ステップの間に起こり得るか、または、アニーリング／伸長は、別々のアニーリングおよび伸長ステップの間に起こり得る。一般に、変性ステップの温度は、約９０℃〜約１００℃の範囲であり得、変性ステップの時間は、約１０秒〜約１０分の範囲であり得る。単一のアニーリング／伸長ステップは、約５０℃〜約７５℃の範囲であり得、単一のアニーリング／伸長ステップの時間は、約１分〜約１２分の範囲であり得る。あるいは、アニーリングステップの温度は、約５０℃〜約７５℃の範囲であり得、アニーリングステップの時間は、約２０秒〜約１２分の範囲であり得、伸長ステップの温度は、約６８℃〜約７５℃の範囲であり得、および伸長ステップの時間は、約２０秒〜約５秒の範囲で変化し得る。最終の伸長ステップの後に、約５分、１０分、またはそれ以上の間続く、伸長温度での最終エロンゲーション（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ステップを行うことができる。
【００７８】
それゆえ、本明細書で開示される方法の第１のステップは、消化可能な５’部分を含むシングルプライマーＰＣＲアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンは、該アンプリコンの５’末端付近に、１つ以上のグリコシラーゼ感受性塩基を含む。他の実施形態において、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンは、該アンプリコンの５’末端付近に、１つ以上のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む。２本鎖アンプリコンの変性の際に、シングルプライマーＰＣＲ反応の間に作製されたアンプリコンの５’および３’末端は相補的であるため、１本鎖アンプリコンは分子内（ヘアピン）および／または分子間構造を形成することができる（図１、図２、図４および図５参照）。
【００７９】
ステップＩＩ：ＤＮＡまたはＲＮＡの、非ディレクショナルまたはディレクショナルな増幅
【００８０】
ステップＩＩにおいて、ＤＮＡまたはＲＮＡを、以下のステップII非ディレクショナルおよびステップIIディレクショナルのセクションに、それぞれ記載したように、非ディレクショナルに、またはディレクショナルに、増幅する。
【００８１】
ステップII非ディレクショナル：ＤＮＡまたはＲＮＡの非ディレクショナルな増幅
ＤＮＡについては、非ディレクショナルな増幅ステップは、複数の合成プライマーの存在下で少なくとも１つのＤＮＡ分子を複製して、複数の２本鎖鋳型を生成することを含み、ここで、複数の合成プライマーのそれぞれが、(５’から３’に）固定の、場合により消化可能な５’配列、アダプター配列に相補性を有する入れ子配列、場合により存在するタグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、または目的のＤＮＡ分子に相補性を有する特異的３’配列のプールを含む（図１４参照）。
【００８２】
ＲＮＡについては、非ディレクショナルなプロセスは、複数の合成プライマーの存在下で少なくとも１つのＲＮＡ分子を逆転写して、複数の２本鎖ｃＤＮＡ鋳型を生成することを含み、ここで、複数の合成プライマーのそれぞれが、（５’から３’に）固定の、場合により消化可能な５’配列、アダプター配列に相補的な入れ子配列、場合により存在するタグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、または目的のＤＮＡ分子に相補性を有する特異的３’配列のプールを含む（図１５参照）。
【００８３】
非ディレクショナルなサブステップＡ−ライブラリー合成
【００８４】
非ディレクショナルな増幅プロセスの単独のステップ（ｌｏｎｅ  ｓｔｅｐ）は、複数の第１合成プライマーの存在下で、少なくとも１つのＤＮＡを複製して、または少なくとも１つのＲＮＡ分子を逆転写して、複数の２本鎖鋳型を生成することを含む（図１４、図１５、図１９および図２０参照）。
【００８５】
（ｉ）核酸
【００８６】
本明細書に開示されるプロセスを用いて、様々な異なるタイプのＲＮＡ分子を増幅することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはその断片であり得る。ｍＲＮＡはポリアデニル化されていてもよく、またはｍＲＮＡはポリアデニル化されていなくてもよい。ある実施形態において、ＲＮＡは異なるｍＲＮＡの集団であり得る。他の実施形態において、ＲＮＡは非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）であり得る。例として、ｎｃＲＮＡは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作動性ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ＭＴ−ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、スプライスリーダーＲＮＡ（ＳＬ  ＲＮＡ）、テロメラーゼＲＮＡ要素（ＴＥＲＣ）、これらの断片、またはこれからの組み合わせであり得る。よりさらなる実施形態において、ＲＮＡは、細胞または細胞集団のトランスクリプトームであり得る。ＲＮＡは真核細胞、古細菌細胞、または細菌細胞に由来し得る。
【００８７】
様々なタイプのＤＮＡ分子を増幅することができる。これには、例えば、真核生物、原核生物、古細菌、プラスミド、ファージ、合成のＤＮＡ分子が含まれ得る。
【００８８】
インプット（ｉｎｐｕｔ）核酸の量は、変化し得るものであり、実際に変化する。一般に、本明細書に開示されるプロセスは、少量または単一細胞のインプット量の核酸を増幅し得る。いくつかの実施形態において、インプット核酸の量は、少なくとも約１０フェムトグラム（ｆｅｍｐｔｏｇｒａｍ）（ｆｇ）、１００ｆｇ、５ピコグラム（ｐｇ）、少なくとも約１０ｐｇ、少なくとも約２０ｐｇ、少なくとも約５０ｐｇ、少なくとも約１００ｐｇ、少なくとも約２００ｐｇ、少なくとも約５００ｐｇ、または約５００ｐｇを超える核酸であり得る。特定の実施形態において、インプット核酸の量は、約１０ｐｇ〜約１００ｐｇの範囲であり得る。
【００８９】
核酸の品質または完全性も、変化し得る。例えば、インプットＲＮＡの品質は、低品質（すなわち、分解または断片化された）から高品質（すなわち、インタクトな）の範囲であり得る。当業者は、目的のＲＮＡの品質を推定する手段に精通している。例えば、全ＲＮＡの品質は、１８ＳｒＲＮＡに対する２８ＳｒＲＮＡの割合に基づいて、推定することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、少なくとも約２：１の２８Ｓ：１８Ｓ比、少なくとも約１：１の２８Ｓ：１８Ｓ比、約１：１未満の２８Ｓ：１８Ｓ比、または検出不可能な２８Ｓ：１８Ｓ比を有し得る。
【００９０】
（ｉｉ）２本鎖鋳型合成
【００９１】
ＲＮＡ分子を、複数の合成プライマーと接触させる（図３Ａおよび図１９参照）。合成プライマーは上記に詳述している。それぞれの合成プライマーは、（５’から３’に）場合により消化可能な固定の５’配列、アダプター配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および、ランダム３’配列、半ランダム３’配列、またはＲＮＡ分子に相補性を有する３’配列のプールを含む。
【００９２】
標的核酸との接触に際し、合成プライマーの３’配列は、該核酸の相補的領域とハイブリダイズする。ＲＮＡについては、ｃＤＮＡの第１鎖の合成は、デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰ）および好適なＲＴバッファーの存在下で、鎖置換型逆転写酵素（ＲＴ）により触媒される。第２鎖合成は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される。ポリメラーゼ活性は、単一または複数の酵素に由来し得る。ＤＮＡについては、ＤＮＡの第１鎖および第２鎖の合成は、デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰ）および好適なバッファーの存在下で、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される。当業者は、逆転写ｄｎＤＮＡ複製のための、反応物の適切な濃度および好適な反応条件に精通している。
【００９３】
逆転写酵素は、中温性または好熱性で有り得、逆転写酵素は、ＲＮＡａｓｅＨ＋またはＲＮＡａｓｅＨ−であり得る。好適な逆転写酵素の例には、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（モロニーマウス白血病ウイルス由来）、ＨＩＶ−１  ＲＴ（ヒト免疫不全ウイルスタイプ１由来）、ＡＭＶ  ＲＴ（トリ骨髄芽球症ウイルス由来）、これらの変異体、およびこれらの改変バージョンが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼは、中温性または好熱性であってよい。例には、ｐｏｌ Ｉ、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗエキソマイナスポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼなどが含まれる。
【００９４】
２本鎖鋳型が完成すると、逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼは、熱処理によって不活性化され得る。熱不活性化は、約３分間、約５分間、約１０分間、または約１５分間の間、約７０℃、約８０℃、または約９０℃の温度であり得る。一般に、不活性化温度が低いほど、加温ステップの時間は長い。
【００９５】
ステップIIディレクショナル：ＲＮＡのディレクショナルな増幅
あるいは、ステップＩＩは、ＲＮＡをディレクショナルに増幅すること、およびシーケンシングのために増幅産物を調製することを含み得る。ディレクショナルな増幅プロセスは、以下に記載される、２つのサブステップＡおよびＢを含む。
【００９６】
一般に、サブステップＡは、複数の第１合成プライマーの存在下で少なくとも１つのＲＮＡ分子を逆転写して、複数のｃＤＮＡの第１鎖を生成することを含み（図２１参照）、ここで、複数の第１合成プライマーのそれぞれは、（５’から３’に）固定の、場合により消化可能な５’配列、アダプター配列に相補性を有する入れ子配列、場合により存在する第１タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、または目的のＲＮＡ分子に相補性を有する特異的３’配列のプールを含む。好ましくはサブステップＡにおいて、逆転写は、アクチノマイシンＤの存在下で行われる。というのも、これが、レトロウイルス逆転写酵素によるｃＤＮＡの再コピーによるアンチセンスアーチファクト低減する傾向があるからである。Ruprecht et al., Biochim Biophys Acta. 1973 Jan 19; 294(2):192-203; Perocchi et al., Nucleic Acids Res. 2007; 35(19):e128参照。サブステップＢ（図２２参照）は、複数の第２合成プライマーと、好ましくは非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、複数のｃＤＮＡの第１鎖を複製して、複数の２本鎖ｃＤＮＡ産物を生成することを含み、ここで、複数の第２合成プライマーのそれぞれは、(５’から３’に) 場合により消化可能な固定の５’配列、アダプター配列に相補的な入れ子配列、場合により存在する第２タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、またはｃＤＮＡの第１鎖に相補性を有する３’配列のプールを含む。
【００９７】
ディレクショナルなサブステップＡ−第１鎖ｃＤＮＡ合成
【００９８】
ディレクショナルな増幅ステップのサブステップＡは、複数の第１合成プライマーの存在下で少なくとも１つのＲＮＡ分子を逆転写して、複数のｃＤＮＡの第１鎖を生成することを含む（図２１参照）。
【００９９】
（ｉ）ＲＮＡ
【０１００】
本明細書に開示されるプロセスを用いて、様々な異なるタイプのＲＮＡ分子を増幅することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはその断片であり得る。ＭＲＮＡはポリアデニル化されていてもよく、またはｍＲＮＡはポリアデニル化されていなくてもよい。ある実施形態において、ＲＮＡは異なるｍＲＮＡの集団であり得る。他の実施形態において、ＲＮＡは非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）であり得る。例として、ｎｃＲＮＡは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作動性ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ＭＴ−ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、スプライスリーダーＲＮＡ（ＳＬ  ＲＮＡ）、テロメラーゼＲＮＡ要素（ＴＥＲＣ）、これらの断片、またはこれからの組み合わせであり得る。よりさらなる実施形態において、ＲＮＡは、細胞または細胞集団のトランスクリプトームであり得る。ＲＮＡは真核細胞、古細菌細胞、または細菌細胞に由来し得る。
【０１０１】
インプットＲＮＡの量は、変化し得るものであり、実際に変化する。一般に、本明細書に開示されるプロセスは、少量または単一細胞のインプット量のＲＮＡを増幅し得る。いくつかの実施形態において、インプットＲＮＡの量は、少なくとも約５ピコグラム（ｐｇ）、少なくとも約１０ｐｇ、少なくとも約２０ｐｇ、少なくとも約５０ｐｇ、少なくとも約１００ｐｇ、少なくとも約２００ｐｇ、少なくとも約５００ｐｇ、または約５００ｐｇを超えるＲＮＡであり得る。特定の実施形態において、インプットＲＮＡの量は、約１０ｐｇから約１００ｐｇの範囲であり得る。
【０１０２】
ＲＮＡの品質または完全性も、変化し得る。例えば、インプットＲＮＡの品質は、低品質（すなわち、分解または断片化された）から高品質（すなわち、インタクトな）の範囲であり得る。当業者は、目的のＲＮＡの品質を推定する手段に精通している。例えば、全ＲＮＡの品質は、１８ＳｒＲＮＡに対する２８ＳｒＲＮＡの割合に基づいて、推定することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、少なくとも約２：１の２８Ｓ：１８Ｓ比、少なくとも約１：１の２８Ｓ：１８Ｓ比、約１：１未満の２８Ｓ：１８Ｓ比、または検出不可能な２８Ｓ：１８Ｓ比を有し得る。
【０１０３】
（ｉｉ）第１鎖合成
【０１０４】
ＲＮＡ分子は、複数の第１合成プライマーと接触させる（図２１参照）。第１合成プライマーは、上記に詳述している。それぞれの第１合成プライマーは、（５’から３’に）場合により消化可能な固定の５’配列、アダプター配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第１タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、またはＲＮＡ分子に相補性を有する３’配列のプールを含む。
【０１０５】
標的ＲＮＡとの接触の際に、第１合成プライマーの３’配列は、該ＲＮＡの相補的領域とハイブリダイズする。ｃＤＮＡの第１鎖の合成は、デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰ）および好適なＲＴバッファーの存在下で、逆転写酵素（ＲＴ）により触媒される（図２１参照）。当業者は、第１鎖ｃＤＮＡ合成のための、反応物の適切な濃度および好適な反応条件に精通している。
【０１０６】
逆転写酵素は中温性または好熱性で有り得、逆転写酵素はＲＮＡａｓｅＨ＋またはＲＮＡａｓｅＨ−であり得る。好適な逆転写酵素の例には、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（モロニーマウス白血病ウイルス由来）、ＨＩＶ−１  ＲＴ（ヒト免疫不全ウイルスタイプ１由来）、ＡＭＶ  ＲＴ（トリ骨髄芽球症ウイルス由来）、これらの変異体、およびこれらの改変バージョンが含まれる。
【０１０７】
上述のように、いくつかの実施形態において、第１鎖ｃＤＮＡ合成は、アクチノマイシンＤの存在下で行われ、鎖置換されたｃＤＮＡの第１鎖からの望ましくないプライミングを減少させることができる。しかしながら、いくらかの鎖置換および第２鎖伸長が起こり得、下流のバーコードに隣接するバックグラウンド産物を生成する。アクチノマイシンＤの使用は、同じバーコード配列に隣接する産物のレベルを減少させることができる。
【０１０８】
第１鎖合成反応の完了の際に、逆転写酵素を熱処理により不活性化することができる。熱不活性化は、約３分間、約５分間、約１０分間、または約１５分間の間、約７０℃、約８０℃、または約９０℃の温度であり得る。一般に、不活性化温度が低いほど、加温ステップの時間は長い。
【０１０９】
ｉｉｉ）１本鎖第１合成プライマーの除去
【０１１０】
本プロセスは、さらに、複数のｃＤＮＡの第１鎖を、１本鎖特異的３’−５’デオキシリボヌクレアーゼ（すなわち、エキソヌクレアーゼ）と接触させて、１本鎖（すなわち、ハイブリダイズしていない）第１合成プライマーを分解すること含む。２本鎖ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、好ましい３’−５’デオキシリボヌクレアーゼとの接触により、分解されない。いくつかの実施形態において、３’−５’デオキシリボヌクレアーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＸ、または哺乳動物Ｔｒｅｘ１（ＤＮａｓｅＩＩＩ）であり得る。特定の実施形態において、３’−５’デオキシリボヌクレアーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩであり得る。過剰な第１合成プライマーを分解するのに用いられるエキソヌクレアーゼの量は、サブステップＡで用いられる第１合成プライマーの開始量を含む、様々な因子に応じて、変化し得るものであり、実際に変化する。一般に、エキソヌクレアーゼとの接触は、約３５℃〜約４０℃の範囲の温度で、約５分〜約６０分の間、行われる。エキソヌクレアーゼは、本明細書に記載される熱により(例えば、約３分間、約５分間、約１０分間、または約１５分間の間、約７０℃、約８０℃、または約９０℃の温度で)、不活性化され得る。
【０１１１】
ディレクショナルなサブステップＢ−第２鎖ｃＤＮＡ合成
【０１１２】
ディレクショナルな増幅ステップのサブステップＢは、複数の第２合成プライマーの存在下で、複数のｃＤＮＡの第１鎖を複製して、複数の２本鎖ｃＤＮＡ産物を生成することを含む（図２２参照）。
【０１１３】
（ｉ）第２鎖合成
【０１１４】
それぞれの第２合成プライマーは、(５’から３’に)場合により消化可能残基を含む固定の５’配列、アダプター配列に相補的な入れ子配列、場合により存在する第２タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、またはｃＤＮＡの第１鎖に相補性を有する特異的ターゲティング３’配列のプールを含む。第１および第２合成プライマーは、いずれか一方または両方が、第１および／または第２タグ配列を含むように、選ばれる。
【０１１５】
本プロセスのこのステップは、複数の第２合成プライマーの存在下で、ステップＡの間に生成されたｃＤＮＡ／ＲＮＡ２本鎖を熱変性することから始まる。熱処理は、１本鎖ｃＤＮＡ鋳型を生成して、また、１本鎖第１合成プライマーを分解するのに用いられる３’−５’エキソヌクレアーゼを不活性化する。熱処理は、約９０°Ｃ、約９２°Ｃ、約９４°Ｃ、約９６°Ｃ、または約１００°Ｃの温度で、約１分、約２分、約５分、約１０分の時間であり得る。熱処理後、温度を反応温度まで下げ、温度が下がるにつれて、第２合成プライマーの３’配列はｃＤＮＡの第１鎖の相補的領域とハイブリダイズする（図２２参照）。
【０１１６】
ｃＤＮＡの第２鎖の合成は、デオキシリボヌクレオチドおよび好適なバッファーの存在下で、非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される（図２２参照）。非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、中温性または好熱性で有り得る。好適な非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、これらの変異体、およびこれらの改変バージョンが含まれる。当業者は、第２鎖ｃＤＮＡ合成のための、反応物の適切な濃度および好適な反応条件に精通している。それぞれの２本鎖ｃＤＮＡ産物は、第１および第２のタグ配列の少なくとも１つに隣接しており、これはインプットＲＮＡ分子に対するｃＤＮＡ産物の方向性を示す（図２２参照）。
【０１１７】
第２鎖合成は非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって促進されるが、いくらかのバックグラウンド産物もまた生成され得る。
【０１１８】
（ｉｉ）１本鎖第２オリゴヌクレオチドの場合による除去
【０１１９】
本プロセスは、場合により、本質的に上述のように第１鎖合成プライマーを除去するために、３’−５’デオキシリボヌクレアーゼ（すなわち、エキソヌクレアーゼ）と接触して、１本鎖（すなわち、ハイブリダイズしていない）第２合成プライマーを分解することをさらに含み得る。
【０１２０】
（ｉｉｉ）「シングルチューブ」プロセス
【０１２１】
本明細書に開示されるディレクショナルな増幅のサブステップＡおよびＢは、精製ステップを介さずに順次進行する。精製ステップがないことは、シングルチューブフォーマットを可能にし、材料の損失を避ける。シングルチューブフォーマットはまた、ハイスループットに適している。精製ステップの欠如は、第１および第２オリゴヌクレオチドの段階的なエキソヌクレアーゼ除去、および酵素の熱不活性化によって達成される。
【０１２２】
ステップIII：増幅
ステップII非ディレクショナルまたはステップＩＩディレクショナルにおいて、ＤＮＡ、非ディレクショナルＲＮＡ、またはディレクショナルＲＮＡ増幅プロセスが、用いられるかに関わらず、本明細書に記載される方法の次のステップは、１つ以上の増幅プライマー存在下で、複数の２本鎖ＤＮＡ産物を増幅して、ＤＮＡ産物の増幅ライブラリーを生成することを含む。
【０１２３】
（ｉ）増幅プライマー
【０１２４】
増幅プライマーは、固定の消化可能な５’配列と、適切な場合に、合成プライマーの入れ子部分に相同な３’配列とを含む。一般に、増幅プライマーは１本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドを含む。デオキシリボヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド(すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、ｄＵ、など)、並びにヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基および／または修飾されたリボソーム部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然のヌクレオチド（例えば、イノシン）、または非天然のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、並びに、該塩基の炭素および窒素原子の他の原子との置換（例えば、７−デアザプリン）が含まれる ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’-O-メチルヌクレオチド、ロックド核酸、ペプチド核酸、およびモルフォリノを含み得る。増幅プライマーの主鎖は、ホスホジエステル結合、並びに、ホスホチオエート、ホスホラミダイト、またはホスホロジアミデート結合を含むことができる（図３Ｂ参照）。
【０１２５】
（ｉｉ）増幅反応
【０１２６】
増幅は、増幅プライマーの存在下で、上述のように生成した複数の２本鎖ＤＮＡ産物を、熱変性させるステップから始まる。熱処理は、１本鎖鋳型を生成する。熱処理は、約９０°Ｃ、約９２°Ｃ、約９４°Ｃ、約９６°Ｃ、または約１００°Ｃの温度で、約１５秒、３０秒、４５秒、１分、約２分、約５分、または約１０分の時間であり得る。
【０１２７】
熱処理後、増幅プライマーのＤＮＡ鋳型鎖へのアニーリングを可能にするために、アニーリングまたはアニーリング／伸長温度まで温度を下げる。温度が下がるにつれて、短い産物の末端にある、５’−３’の相補的配列の分子内ハイブリダイゼーションが、これらの産物への増幅プライマーのアニーリングを妨げる。ディレクショナルなＲＮＡ増幅については、鎖置換配列のプライミングから生成されたバックグラウンド産物は、第１鎖および第２鎖プライミング産物よりも５’−３’相補性が高いため、仮説的な増幅効率は低くなるであろう。同じ論理で、鎖置換プライミングに由来する、上流または下流の異なるバーコードを有する産物はいずれも、より効率的に増幅するであろう。
【０１２８】
ＤＮＡ産物の増幅は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、および好適なバッファーの存在下で行われる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ（Ｖｅｎｔとしても知られる）ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、これらの変異体、およびこれらの組み合わせであり得る。サーモサイクリング反応に好適なバッファー（マグネシウムの有無にかかわらず）は、当業界で周知である。
【０１２９】
シングル増幅プライマーが用いられる実施形態において、本プロセスは、３ステップ（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）または２ステップ（すなわち、変性およびアニーリング/伸長）を含み得る。例えば、増幅プライマーの融解温度が７０℃より低い実施形態において、増幅プロセスは３ステップを含み得る。あるいは、増幅プライマーの融解温度が、７０℃と等しいかそれより高い実施形態において、増幅プロセスは２ステップを含み得る。２つ以上の増幅プライマーが用いられる実施形態において、本プロセスは、一般的に、３ステップ（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）を含む。アニーリングまたはアニーリング/伸長ステップの温度は、変化し得るものであり、実際に変化する（例えば、約５０℃〜約７５℃）。伸長またはアニーリング/伸長の温度は、約７０℃〜約７５℃の範囲、または約７２℃であり得る。増幅ステップの時間は、数秒から数分まで変化し得る。一般に、伸長またはアニーリング/伸長ステップの時間は、１〜５分の範囲であり得る（図１４、図１５および図１６のＰＣＲ１ステップ参照）。
【０１３０】
ＳＴＥＰＩＶ：消化
ステップＩＩＩの増幅の次は、消化である（図１４、図１５および図１６の消化ステップ参照）。このステップＩＶは、ＤＮＡ産物の増幅ライブラリーを消化酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、消化酵素は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である。ＵＤＧによる処理は、増幅ｃＤＮＡ産物の５’末端でウラシル塩基を加水分解し、各アンプリコンの末端塩基対形成を効果的に弱める。ＵＤＧは、細菌、酵母、または哺乳動物起源のものであり得る。いくつかの実施形態において、ＵＤＧは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来である。ｃＤＮＡ産物の増幅ライブラリーと接触するＵＤＧの量は、変化し得るものであり、実際に変化する。当業者は、適切な量および好適な反応条件 (例えば、温度、時間など)を、容易に決定することができる。プライマースイッチングの別の実施形態において、エキソヌクレアーゼによる処理は、ヌクレアーゼ耐性塩基に遭遇するまでアンプリコンから５’塩基を除去し、各アンプリコンの末端塩基対形成を効果的に排除する。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼはＴ７エキソヌクレアーゼである。ＤＮＡ産物の増幅ライブラリーと接触するエキソヌクレアーゼの量は、変化し得るものであり、実際に変化する。当業者は、適切な量および好適な反応条件 (例えば、温度、時間など)を、容易に決定することができる。
【０１３１】
（ｉ）グリコシラーゼ
【０１３２】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンが、該アンプリコンの５’末端付近に、１つ以上のグリコシラーゼ感受性塩基を含む、実施形態において、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンは、少なくとも１つのグリコシラーゼと接触させる。グリコシラーゼは、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの５’末端からグリコシラーゼ感受性塩基を加水分解または切除し、それによってアンプリコンの５’末端と３’末端との間の塩基対形成を弱める（図４参照）。
【０１３３】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンのグリコシラーゼ感受性塩基の同一性に応じて、グリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、チミングリコールＤＮＡグリコシラーゼ、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼ、ＮｔｈＤＮＡグリコシラーゼ、ＮｅｉＤＮＡグリコシラーゼ、ＭｕｔＹ／ＭｉｇＤＮＡグリコシラーゼ、またはアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼであり得る。例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼはウラシル塩基を切除し；チミンＤＮＡグリコシラーゼは5-カルボキシルシトシン塩基を切除し；チミングリコールＤＮＡグリコシラーゼはチミングリコール塩基を切除する、などである。
【０１３４】
グリコシラーゼは、細菌、古細菌、酵母、または哺乳動物起源のものであり得る。
グリコシラーゼは、中温性または好熱性で有り得る。シングルプライマーＰＣＲアンプリコンと接触させるグリコシラーゼの量は、例えば、グリコシラーゼ酵素の同一性、アンプリコンにおけるグリコシラーゼ感受性塩基の数などに応じて、変化し得るものであり、実際に変化する。当業者は容易に、適切な量を決定することができる。グリコシラーゼ反応ステップの温度は、約２０℃〜約８０℃の範囲であり得、グリコシラーゼ反応ステップの時間は、約５分〜約２時間の範囲であり得る。
【０１３５】
特定の実施形態において、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンにおけるグリコシラーゼ感受性塩基は、ウラシル塩基であり、グリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である。ＵＤＧは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または海洋細菌ＢＭＴＵ３３４６由来であり得る。シングルプライマーＰＣＲアンプリコンにおけるウラシル塩基を消化するのに用いられるＵＤＧの量は、約０．００１ユニット〜約２０酵素ユニットの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、１ユニット／μＬのＵＤＧ溶液の、約１０％ｖ／ｖを、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンと接触させる。消化ステップの温度は、約２５°Ｃ〜約４５°Ｃ、または約３５°Ｃ〜約４０°Ｃの範囲であり得る。消化ステップの時間は、約１０分〜約６０分の範囲であり得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、消化ステップの完了時に、グリコシラーゼを、約８５℃〜約１０５℃の温度で、約１分〜約３０分の間、熱処理することにより、不活性化することができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、グリコシラーゼは、デュアルプライマーＰＣＲ試薬と主に製剤化され得る。
【０１３８】
（ｉｉ）          ５’−３’エキソヌクレアーゼ
【０１３９】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンが、５’末端付近に、１つ以上のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む実施形態において、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンは、５’−３’エキソヌクレアーゼと接触させる。５’−３’エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドに遭遇するまで、該アンプリコンの５’末端から、ヌクレオチドを加水分解または除去する。このように、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの５’末端は除去され、その結果、アンプリコンの５’および３’末端の間の塩基対形成が弱まる（図５参照）。ヌクレアーゼ耐性プライマーの非限定的な特定の例は、図８に示している。
【０１４０】
好適な５’−３’エキソヌクレアーゼの非限定的な例には、バクテリオファージＴ７エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージＴ５エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ、バクテリアエキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、またはバクテリアＤＮＡポリメラーゼＩが含まれる。５’−３’エキソヌクレアーゼは野生型であり得、または酵素の性質（例、安定性、特異性、動態）が変わるように修飾され得る。
【０１４１】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンと接触させる５’−３’エキソヌクレアーゼの量は、例えば、エキソヌクレアーゼの同一性、アンプリコンの数などに応じて、変化し得るものであり、実際に変化する。一般に、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンと接触させる５’−３’エキソヌクレアーゼの量は、約０．０１〜約２０の酵素ユニットの範囲で変化し得る。エキソヌクレアーゼ消化ステップの温度は、約２５℃〜約４５℃、または約３５℃〜約４０℃の範囲であり得る。消化ステップの時間は、約１０分〜約６０分の範囲であり得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、消化ステップの完了時に、約７５℃〜約１００℃の温度で、約１分〜約３０分間の間、熱処理することにより、不活性化することができる。
【０１４３】
ステップＶ：アダプター配列の付与
消化の次のステップは、ＤＮＡ産物の増幅ライブラリーの５’末端に、アダプターを付与することを含む。増幅されたｃＤＮＡ産物の末端の塩基対形成は、消化のために弱められ、各産物の３’末端は、アダプターに相補的な配列を含有する。このように、アダプタープライマーは、貫入することができ、効果的に、ＤＮＡ産物にアニーリングすることができる。アダプターは、ポリメラーゼ連鎖反応の間に、ＤＮＡ産物に付与することができる。それぞれの末端にペアードアダプター配列を持つ構造のみが、効率的に増幅されるであろう。
【０１４４】
該プロセスの終わりに、過剰な増幅プライマーおよびアダプターを電気泳動、クロマトグラフィー、ビーズベースの精製（ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ｃｌｅａｎｕｐ）、または他の標準的な核酸精製法によって除去することができる。
【０１４５】
アダプターを含む増幅ｃＤＮＡライブラリーは、次世代シーケンシング、ディレクショナルディープシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング、４５４シーケンシング、イオントレント（ｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔ）シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、ナノポアシーケンシング、単一分子リードタイムシーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅａｄ  ｔｉｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などを含む、ハイスループットのシーケンシング手順を含む、様々な用途に使用され得る。増幅ＤＮＡライブラリーはまた、他の周知のＰＣＲおよびマイクロアレイに基づく用途においても使用され得る（図１４、図１５および図１６における、ＰＣＲ２ステップ参照）。
【０１４６】
（ｉ）デュアルプライマーＰＣＲプライマー
【０１４７】
上記のステップＩＶに詳述した、消化されたアンプリコンは、増幅条件下でデュアルプライマーＰＣＲプライマーと接触させることにより、デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンに変換される。デュアルプライマーＰＣＲプライマーは、フォワードまたはセンスプライマー、およびリバースまたはアンチセンスプライマーを含む。一般に、デュアルプライマーＰＣＲプライマーの３’部分は、合成プライマーの入れ子部分と相同である。合成プライマーの入れ子部分およびデュアルプライマーＰＣＲプライマーにおける相同な３’部分は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。特定の実施形態において、入れ子およびデュアルプライマーＰＣＲプライマーにおける相同な３’部分は、約１０〜約１６ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。
【０１４８】
デュアルプライマーの全長は、約１４ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、デュアルプライマーは、約１８〜約１００ヌクレオチド長の範囲であり得る。他の実施形態において、デュアルプライマー全体は、約６０〜約８０ヌクレオチド長の範囲であり得る。
【０１４９】
一般に、デュアルプライマーＰＣＲプライマーは、ＤＮＡ合成をプライミングするために、１本鎖であり、３’末端にヒドロキシル基を有する。増幅プライマーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含み得る。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン/ウリジン）またはヌクレオチドアナログであり得る。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基および／または修飾されたリボソーム部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然のヌクレオチド（例えば、イノシン）、または非天然のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、並びに、該塩基の炭素および窒素原子の他の原子との置換（例えば、７−デアザプリン）が含まれる。ヌクレオチドアナログにはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルフォリノも含まれる。
【０１５０】
一般に、デュアルプライマーＰＣＲプライマーは、約４０〜６０％の平均ＧＣ含有量と、約５０℃〜約８０℃の平均融解温度（Ｔｍ）を有するであろう。ある実施形態において、シングルプライマーＰＣＲプライマーは、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、または約７５℃のＴｍを有し得る。
【０１５１】
（ｉｉ）増幅条件
【０１５２】
消化されたシングルプライマーＰＣＲアンプリコンを、デュアルプライマーＰＣＲを介して増幅し、デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンを形成する。増幅条件は、デュアルプライマープライミングを可能にするためのアニーリング温度および時間で、少なくとも２サイクルを提供する。アニーリングが必要とするその後のサイクルは、デュアルプライマーのプライミングに十分であるだけでよい。長鎖デュアルプライマーを用いた非限定的な例には、変性（９４℃／１５秒）、アニーリング（６０℃／５分）、伸長（７０℃／１分）の２サイクルと、その後の変性（９４℃／１５秒）、アニーリング／伸長（７０℃／１分）の６〜１０サイクルが含まれる。
【０１５３】
消化されたアンプリコンの５’消化末端と３’末端との間の弱くなった、または存在しない塩基対形成は、デュアルプライマーの、消化されたアンプリコンへのアニーリングを指示する。このように、デュアルプライマーは伸長され、アンプリコンは５’消化末端を除いて複製される。指数関数的に増幅可能な鋳型は、２回の増幅サイクル後に得られる。ある実施形態において、これらのサイクルは、指数関数的増幅サイクルよりも低いアニーリング温度を有するであろう。増幅のさらなるラウンドは、デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンの形成をもたらす。
【０１５４】
デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンは、精製ステップを介さずに、後続の反応や下流の用途に直接用いられ得る。あるいは、デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンは、周知の核酸精製方法（例えば、ＰＣＲ精製キットなど）を用いてヌクレオチド、増幅プライマー、酵素、および塩から精製することができる。
【０１５５】
デュアルプライマーＰＣＲアンプリコンは、シングルからデュアルプライマーアンプリコンプライミングの間に形成される、シングルプライマー付加物（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ａｄｕｃｔ）の非効率的な増幅のために、デュアルプライマーである（図１０および１１参照）。
【０１５６】
（ＩＩ）シングルプライマーＰＣＲプライマー間のスイッチング
本開示の別の局面は、少なくとも２つの異なるシングルプライマーＰＣＲプライマー間のスイッチングのための方法を提供する。本方法は、本質的に、図４および図５における繰り返しステップを含み、ここでは、異なるシングルプライマーＰＣＲプライマーが、デュアルＰＣＲプライマーに取って代わる。特に、本方法は、増幅条件下で、標的核酸を、消化可能な５’部分を含む第１シングルプライマーＰＣＲプライマーと接触させることにより、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの第１セットを調製すること、および、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの第１セットを、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの第１セットの５’部分を消化できる酵素で処理して、消化されたアンプリコンを形成することを含む。本方法はさらに、増幅条件下で、消化されたアンプリコンの第１セットを、場合により消化可能な５’部分を含む第２シングルプライマーＰＣＲプライマーと接触させて、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの第２セットを形成すること含む。ある実施形態において、シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの第２セットを、第２シングルプライマーＰＣＲアンプリコンの５’部分を消化することができる酵素で処理して、消化されたアンプリコンの第２セットを形成し得る。いくつかの実施形態において、消化されたアンプリコンの第２セットは、上記に詳述したように、デュアルプライマーＰＣＲプライマーと接触させることができる。
【０１５７】
（ＩＩＩ）用途
本明細書に開示される方法は、ＤＮＡ増幅中に用いられ得、ここで、ＤＮＡは、染色体、ミトコンドリア、プラスミド、または細胞質のＤＮＡであり得る。本方法はまた、ＲＮＡ増幅中にも用いられ得、ここで、増幅は、ディレクショナルまたは非ディレクショナルであり得、ＲＮＡは、コードまたは非コードであり得る。
【０１５８】
シングルプライマーＰＣＲアンプリコンおよび／またはデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンは、様々な下流の用途で用いられ得る。いくつかの実施形態において、シングルまたはデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンは、次世代シーケンス（ＮＧＳ）プラットフォームを使用して、シーケンシングすることができる。ＮＧＳプラットフォームの非限定的な例には、イオントレントシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング，ゲノムアナライザーシーケンシング、４５４シーケンシング、ディレクショナルディープシーケンシング、ナノポアシーケンシング、単一分子リードタイムシーケンシングなどが含まれる。ＮＧＳ技術には、臨床診断、癌診断、分子診断テスト、癌治療、創薬、ミクロバイオーム技術、食品および農業技術、並びに基礎研究が含まれる。
【０１５９】
他の実施形態において、シングルまたはデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンは、診断、治療、製薬、工業、法医学、農業、および研究の目的のための、ＰＣＲベースのスクリーニング／検出方法、ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ハイスループットアッセイ、マイクロアレイベースの技術、ＣＨＩＰベースのアッセイ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＳＮＰジェノタイピング、ＲＦＬＰ分析などに、付すことができる。
【０１６０】
（ＩＶ）キット
本開示のさらに別の局面は、上述の方法を実施するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、シングルプライマーＰＣＲプライマーと、得られたシングルプライマーＰＣＲアンプリコンを消化するための対応する酵素（すなわち、グリコシラーゼまたは５’−３’エキソヌクレアーゼ）を含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、デュアルプライマーＰＣＲプライマーを含む。他の実施形態において、キットは、デュアルプライマーＰＣＲ、対応する酵素、および場合によりアダプター配列を含む。キットは、さらに、ＰＣＲに好適な、好適な反応バッファーおよび／またはＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオチドを含む。
【０１６１】
本開示のさらに別の局面は、上述のオリゴヌクレオチドを含むキット、または、上記に詳述したプロセスを用いてＲＮＡを増幅するためのキットを提供する。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、キットは、（ａ）それぞれの第１合成プライマーが、(５’から３’に) 少なくとも１つのｄＵ残基を場合により含む固定の５’配列、アダプター配列に相補的な入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、または特異的３’配列のプールを含む、複数の合成プライマー、および（ｂ）少なくとも１つのｄＵ残基を含む固定の５’配列と、場合により、アダプター配列に相補的な入れ子配列とを含む、少なくとも１つの増幅プライマーを、含み得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、キットは、（ａ）それぞれの第１合成プライマーが、（５’から３’に）少なくとも１つのｄＵ残基を含む固定の５’配列、アダプター配列に相補的な入れ子配列、場合により存在する第１タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、または特異的３’配列のプールを含む、複数の第１合成プライマー、（ｂ）それぞれの第２合成プライマーが、(５’から３’に）少なくとも１つのｄＵ残基を含む固定の５’配列、アダプター配列に相補性を有する入れ子配列、場合により存在する第２タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダム３’配列、半ランダム３’配列、または特異的３’配列のプールを含む、複数の第２合成プライマー（ただし、複数の第１および第２合成プライマーのいずれか一方または両方が、第１および／または第２タグ配列を含む）、および（ｃ）少なくとも１つのｄＵ残基を含む固定の５’配列と、場合により、アダプター配列に相補的な入れ子配列とを含む、少なくとも１つの増幅プライマー、とを含み得る。
【０１６４】
キットはさらに、鎖置換型ポリメラーゼ、３’−５’デオキシリボヌクレアーゼ、非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および／またはアクチノマイシンＤを含むことができる。いくつかの実施形態において、キットはさらに、シーケンスアダプターを含むことができる。
【０１６５】
キットはさらに、逆転写酵素、３’−５’、非鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および／またはアクチノマイシンＤを含むことができる。いくつかの実施形態において、キットはさらに、シーケンスアダプターを含むことができる。
【０１６６】
いずれのキットも、デオキシリボヌクレオチドおよび１つ以上の好適なバッファー（例えば、逆転写酵素バッファー、第２鎖合成バッファー、サーモサイクリングバッファーなど）をさらに含むことができる。
【０１６７】
本明細書で提供されるキットは、一般的に、上記に詳述したプロセスを実施するための説明書を含む。キットに含まれる説明書は、包装材に貼られてもよく、添付文書として含まれてもよく、またはダウンロード可能なファイルとして含まれてもよい。説明書は、一般的に書面や印刷物であるが、それらに限定されない。これらの説明書を格納し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。これらの媒体は、電子記憶媒体（例、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光媒体（例、ＣＤ ＲＯＭ）などを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０１６８】
本発明の範囲から逸脱することなく上記のプロセスおよびキットに様々な変更を加えることができるので、上記の説明および以下に示す実施例に含まれるすべての事項は例示として解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではない。
【０１６９】
定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
【０１７０】
本開示またはその好ましい局面の要素を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、１つまたは複数の要素があることを意味することを意図している。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は包括的であり、列挙された要素以外の追加の要素があり得ることを意味することを、意図している。
【０１７１】
縮重ヌクレオチドは、２倍の縮重度を有し得（すなわち、２つのヌクレオチドのうちの１つであり得）、３倍の縮重度を有し得（すなわち、３つのヌクレオチドのうちの１つであり得）、または４倍の縮重度を有し得る（すなわち、４つのヌクレオチドのうちの１つ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴであり得る）。３倍の縮重度を有するヌクレオチドには、「Ｂ」（ＣまたはＧまたはＴであり得る）、「Ｄ」（ＡまたはＧまたはＴであり得る）、および「Ｖ」（ＡまたはＣまたはＧであり得る）が含まれる。 ２倍の縮重度を有するヌクレオチドには、「Ｋ」（ＧまたはＴであり得る）、「Ｍ」（ＡまたはＣであり得る）、「Ｒ」（ＡまたはＧであり得る）、「Ｙ」（ＣまたはＴであり得る）、「Ｓ」（ＣまたはＧであり得る）、および「Ｗ」（ＡまたはＴであり得る）が含まれる。  
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「相補的な」または「相補性」という用語は、特定の水素結合を介した塩基対形成による２本鎖核酸の対合を指す。塩基対形成は、標準的なワトソン−クリック塩基対形成であり得る（例えば、５’−ＡＧＴＣ−３’は、相補的な配列３’−ＴＣＡＧ−５’と対合する）。塩基対形成はまた、フーグスティーンまたはリバースフーグスティーン水素結合であってもよい。相補性は、２本鎖領域に関して一般的に測定され、したがって、例えば、オーバーハングを除外する。いくつかの塩基性対のみが相補的である場合、２本鎖領域の２つの鎖の間の相補性は部分的であり得、パーセンテージ（例えば、７０％）として表され得る。相補的ではない塩基は「ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）」である。２本鎖領域の塩基対がすべて相補的な場合、相補性も完全であり得る（すなわち、１００％）。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「相同な」という用語は、２つ以上の配列が同一である程度を指す。２つの配列が、定義された一連の条件の下で、同じ配列にハイブリダイズするであろう場合、２つの配列は相同であると見なす。定義された条件には、バッファー処方、温度および配列濃度が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７４】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、直鎖状または環状の立体構造、および１本鎖または２本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語はポリマーの長さに関して限定するものとして解釈されるべきではない。本用語は、天然ヌクレオチドの既知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート主鎖）が修飾されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対を形成するであろう。
【０１７５】
「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチドアナログであり得る。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基または修飾されたリボソーム部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然のヌクレオチド（例えば、イノシン）、または非天然のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、並びに、該塩基の炭素および窒素原子の他の原子との置換（例えば、７−デアザプリン）が含まれる。ヌクレオチドアナログにはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルフォリノも含まれる。
【０１７６】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は当業界において知られている。一般的に、これらの技術は、ある遺伝子についてｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もまた、この様式で決定および比較され得る。一般に、同一性とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較され得る。核酸配列であれアミノ酸配列であれ、2つの配列の同一性パーセントは、2つのアライメントされた配列間の正確な一致数を、より短い配列の長さで割って100を掛けた値である。核酸配列についてのおおよそのアラインメントは、SmithおよびWaterman（Advances in Applied Mathematics 2：482-489（1981））の局地的相同性アルゴリズム（local homology algorithm）によって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff（Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA）によって開発され、Gribskov（Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)）によって正規化されたスコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、Genetics Computer Group（Madison、WI）によって、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用新案出願において、提供されている。配列間の同一性パーセントまたは類似性を計算するための、他の好適なプログラムは、一般的に、当業界で知られており、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトのパラメーターと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよび  ＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトのパラメーターを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋのウェブサイトに掲載されている。
【実施例】
【０１７７】
以下の実施例は、本発明のある局面を例示するものである。
【０１７８】
実施例１：全ゲノム増幅−シングルプライマーからデュアルプライマーへのスイッチング
ヒトゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ）を、改良されたＤＮＡ増幅キット（ＳｅｑＰｌｅｘ（商標）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、半縮重ライブラリープライマー（５’−ＵＧＧＵＵＧＵＧＵＵＵＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＫＮＮＮＫＮＫＮＫ−３’；配列番号：７）およびＷＧＡプライマー（５’−ＵＧＧＵＵＧＵＧＵＵＵＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’（配列番号：１）を用いて、増幅した。シングルプライマーアンプリコンを、１０％ｖ／ｖのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の非存在下または存在下で、３０分間、３７℃でインキュベートした。消化／未消化アンプリコンを、フォワードプライマー（５’−ＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’；配列番号：２）およびリバースプライマー（５’ＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’；配列番号：３）を用いて、９４°Ｃ／３０秒、５０°Ｃ／１０分で２サイクル、その後、９４°Ｃ／３０秒でｘサイクル（ｘは、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎがプラトーになるまでのサイクル数）、リアルタイムで（すなわち、蛍光色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎでモニターして）増幅した。デュアルプライマーＰＣＲ増幅のバイオアナライザーのトレースを、図９に表す。約１５０〜２５０ｂｐの平均サイズを有するデュアルプライマーＰＣＲアンプリコンが、ＵＤＧで処理されたシングルプライマーアンプリコンの後に検出された。ＵＤＧ処理をしないと、はるかに大きい産物が低い収量で、検出された。
【０１７９】
実施例２: 全ゲノム増幅−プライマーの組み合わせ
実施例１で上述したように、ゲノムＤＮＡを増幅して、得られたアンプリコンをＵＤＧで処理した。消化されたアンプリコンを、実施例１由来の、シングルＷＧＡ、フォワード、および／またはリバースプライマーの、１つまたは２つの組み合わせを用いて、リアルタイムで（すなわち、蛍光色素でモニターして）増幅した。各組み合わせについてのバイオアナライザーのトレースおよびサイクル閾値(Ct)の値を、図１１に示す。フォワード/リバースの２つの組み合わせのＣｔ値は、これらのプライマー単独のいずれかよりも、約８〜９サイクル低く、これは、増幅産物の１％未満が、相補的な５’−３’末端を有することを示していた（すなわち、２−（８〜９）＜０．０１）。（図８もまた参照）。また、プライマーの、１つの組み合わせと２つの組み合わせとでは、増幅サンプルのサイズ分布に違いがあった。
【０１８０】
実施例３: 全ゲノム増幅−短鎖デュアルプライマーおよび長鎖デュアルプライマー
実施例１で上述したように、ゲノムＤＮＡを増幅して、得られたアンプリコンを、ＵＤＧで処理した。消化されたアンプリコンを、実施例１で上述したフォワードおよびリバースの（短鎖）ＰＣＲプライマーを用いて、または、上述のフォワード（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＴＡＧＣＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’；配列番号４）およびリバース（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＴＴＡＣＴＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’；配列番号：５）（長鎖）ＰＣＲプライマーを用いて、リアルタイムで（すなわち、蛍光色素でモニターして）増幅した（図７参照）。結果を図１２に表す。短鎖デュアルプライマーを用いて生成したアンプリコンの平均の長さは、約２００ｂｐであり、長鎖デュアルプライマーを用いて生成したアンプリコンの平均の長さは、約２７５ｂｐであった。
【０１８１】
実施例３：全ゲノム増幅−単一細胞
実施例１で上述したように、ゲノムを、単一ヒト細胞から、ＷＧＡの２２サイクルにより増幅して、その後ＵＤＧで消化した。消化されたアンプリコンを、実施例１で記載したデュアルプライマーを用いて、９サイクルで増幅した。図１３に示したように、本明細書に開示されるシングルプライマーからデュアルプライマーへの方法は、ごく少量の核酸を増幅するために使用することができる。
【０１８２】
実施例４：ＲＮＡのディレクショナルな増幅
ユニバーサルヒト標準（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（ＵＨＲ）ＲＮＡを、本質的に上記に詳述した（および図１６に概説した）プロセスを用いて、増幅した。本プロセスで用いた複数の第１および第２合成プライマーを、以下の表１に示す（入れ子配列はイタリック体で示し、内部タグ配列は下線を引いた）。
【表１】
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【０１８３】
増幅は、（１）バーコード配列を有さないシングルプライマー、および（２）２つ以上のヌクレオチドである上流または下流のタグ配列（バーコード）を含むマルチプルプライマー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｉｍｅｒ）タイプを用いて、リアルタイムＰＣＲにより、３連で行った。増幅プライマーの例は、表２に示す（バーコードまたはタグ配列は下線を引いた）。
【表２】
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【０１８４】
増幅をモニターし、プラトーなサイクルにて手動で停止させた。２つの増幅プライマータイプの間で、有意な違いは見られなかった。結果を表３に示す。４つのバーコード特異的プライマーで行った増幅は、第１鎖合成バックグラウンドについては約６．５〜６．９のΔＣ（ｔ）を示し、第２鎖合成バックグラウンドについては約９．６〜１０のΔＣ（ｔ）を示す。定量的バックグラウンドパーセントは、ペアードエンドシーケンシングにより、識別することができる。
【表３】
2019528788.tif 000005
【０１８５】
ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐの後、増幅産物は、プライマー、プライマーダイマー、アダプター、およびアダプターダイマーを実質的に含まないようであった。増幅産物（マイナス122 bp   Illumina（登録商標） アダプター配列）は、約８０〜１８０塩基対の範囲であり、１反応当たり１０〜１２マイクログラムの収量である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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