(57)【要約】  本発明は、DNA-白金架橋を可視化するための新たな化合物、並びにシスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチン等の白金化化合物と組み合わせて使用すべき候補薬物を特定するための調査ツールとしての、またスクリーニング法における、その使用に関する。式(I)、(II)、又は(III)。本出願に至る事業は、European Union's Horizon 2020 research and innovation program (認可同意番号[647973])のもとで、European Research Council (ERC)より財政的支援を受けている。2019501909.tif 000026
2019501909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)、(II)、又は(III)の化合物
【化１】
2019501909.tif 000025
[式中、nは、0〜3の整数であり、Rは、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、カルボキシル、グアニジニル、-COOR'、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-COR'、-CONHR'、-NHCOR'、リン酸、C(1〜6)アルキル、C(2〜6)アルケニル、C(1〜6)アルコキシ基からなる群から独立に選択され、前記(1〜6)アルキル、C(2〜6)アルケニル、及びC(1〜6)アルコキシは、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、カルボキシル、グアニジニル、-COOR'、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-COR'、-CONHR'、-NHCOR'、場合によりメトキシ又はヒドロキシで置換されているアリールから選択される1つ又はいくつかの基で場合により置換されており、R'、R''、及びR'''は、独立に、H又はC(1〜6)アルキルである]。
【請求項２】
nが1であり、Rが、N3に対してメタ位にある、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
Rが、中性pHで電荷を有する基、好ましくは正電荷を有する基である、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
Rが、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、グアニジニル、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-CONHR'、又は場合によりヒドロキシル若しくはメトキシで置換されているアリールから選択される基で置換されているC(1〜6)アルキルである、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
nが0であり、式が(I)である、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
nが0であり、式が(II)である、請求項1に記載の化合物。
【請求項７】
請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物と、アルキン基を有する標識、好ましくは、蛍光標識又はビオチン化標識とを含むキット。
【請求項８】
請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物又は請求項7に記載のキットの、特に、細胞における白金化DNA架橋を可視化する、又は白金結合DNAを回収するための調査ツールとしてのin vitroでの使用。
【請求項９】
白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせることができる分子を特定若しくはスクリーニングするため、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物又は請求項7に記載のキットのin vitroでの使用。
【請求項１０】
患者において白金薬物に対する感受性又は抵抗性を予測するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物又は請求項7に記載のキットのin vitroでの使用。
【請求項１１】
細胞における白金化DNA架橋を可視化するためのin vitroの方法であって、
-  細胞を、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物と接触させる工程と、
-  前記細胞を、場合により銅の存在下で、アルキン基を有する標識、好ましくは蛍光標識と接触させる工程と、
-  前記細胞において標識、好ましくは蛍光標識を検出する工程と
を含む方法。
【請求項１２】
前記細胞をアルキン基を有する標識と接触させる工程の前に、前記細胞を透過処理し、次いで固定する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
患者における腫瘍の白金薬物に対する抵抗性又は感受性を予測するためのin vitroの方法であって、
-  請求項11又は12に記載の方法を、患者由来の腫瘍試料からの細胞を用いて実施する工程と、
-  標識化を測定し、場合により、標識化を基準レベルと比較する工程と、
-  患者における腫瘍の白金薬物に対する抵抗性又は感受性を、標識化の強度に基づいて決定する工程であり、感受性が、標識化の強度に比例する、工程と
を含む方法。
【請求項１４】
白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせることができる分子を特定若しくはスクリーニングするため、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するためのin vitroの方法であって、
-  細胞を、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物、及び候補分子と接触させる工程であり、前記化合物との接触が、候補分子との接触の後でもよいし、それと同時でもよいし、又はその前でもよい、工程と、
-  前記細胞を、場合により銅の存在下で、アルキン基を有する標識、好ましくは蛍光標識と接触させる工程と、
-  標識化を測定する工程と、
-  場合により、候補分子の存在下と非存在下での標識化の強度を比較する工程と、
-  候補分子の非存在下での標識化の強度と比べたとき、候補分子の存在下で、標識化の強度が増大している、及び/又はフォーカスの形態が異なっている場合、候補分子を選択する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学及び実験室用ツールの分野に関する。本発明は、白金化DNA架橋を可視化するのに適する新たな化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスプラチンは、最も有効な広域スペクトル抗がん薬の1つである。シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン等の化合物の白金化は、依然として最前線の臨床治療であり、頭頸部、睾丸、卵巣、子宮頸部、肺、結腸直腸、及び再発リンパ腫を含む多くの種類のがんを有する患者の治療投薬計画の一端をなしている。
【０００３】
白金薬物は、グアニン残基と安定した共有結合を形成して、DNA架橋を生じさせる。これらの損傷は、複製及び転写の妨げとなり、それによって、DNA破壊及び細胞死をもたらす。シスプラチンに対する細胞応答は、多面的であり、本質的に複雑である。たとえば、白金化DNA損傷(DNA-Pt)は、ヌクレオチド除去修復(NER)、塩基除去修復(BER)、及びファンコーニ貧血経路が関与するDNA架橋修復を含む、多様な修復機序によってプロセシングされる場合があり、これらはすべて、DNA配列及びクロマチンの特色によって左右されうる。或いは、白金化DNA損傷の存在下での複製の継続を可能にする、損傷乗り越え合成(TLS)として知られる機序によって、低忠実度DNAポリメラーゼにより、鎖内損傷が迂回される場合もある。
【０００４】
患者は通常、シスプラチンに基づく化学療法に対して良好な初期応答を有するが、後天性又は内因性いずれかのシスプラチン抵抗性の発生によって、その臨床的有効性が著しく低下するため、後に再発する。
【０００５】
Dingら(2013、Angew Chem Int Ed Engl、52、3350〜54頁)は、アルキン-フルオロフォアとのクリック反応による白金-アクリジンハイブリッドの後標識化を使用することによって、無細胞DNA及びがん細胞全体で、DNAを標的とする白金を探査する方法を開発した。しかし、白金-アクリジンハイブリッドは、シスプラチンとは構造が異なる。二本鎖DNA介入物(すなわち、アクリジン)の存在によって、この二量体によるゲノム標的化が支配されて、シスプラチンに比べて異質なゲノム応答が誘発される可能性があることは、注目に値する。また、DNAとの架橋形成後におけるアジド含有アクリジンの転位は、DNA-Ptとは対照的に、アクリジンそれ自体の細胞局在化を反映する化学標識化を生じることが予想される。更に、このハイブリッドは、シスプラチン(500倍に上る細胞傷害性)と同じ細胞傷害性を示さない。したがって、以下に示すとおりの白金-アクリジンハイブリッドは、臨床的に関連した薬物シスプラチンの要点を再現しない。
【０００６】
【化１】
2019501909.tif 000003
【０００７】
式中Rは、(CH2)2CONH(CH2)2N3である。
【０００８】
Whiteら(2013、J Am Chem Soc、135、11680〜11683頁)は、アジド含有白金(II)誘導体であるピカゾプラチン(picazoplatin)を開示している。著者らは、白金錯体の細胞標的を特定し、in vitroで可視化するためにこの誘導体を開発した。著者らは、ピコプラチン薬物にアジド部分を付加した。ピカゾプラチンは、アルキン-フルオロフォアとのクリック反応によって標識化される。
【０００９】
【化２】
2019501909.tif 000004
【００１０】
Wirthら(2015、J Am Chem Soc、137、15169〜75頁)及びMoghaddamら(2015、Dalton Trans、44、3536〜3538頁)は、アジド又はアルキンのいずれかが付加された、シスプラチンの他の誘導体を開示している。この論文において、著者らは、次の2種の化合物を比較している。
【００１１】
【化３】
2019501909.tif 000005
【００１２】
著者らは、化合物(1)は、立体的接触容易性の増加のために、更におそらくはアミド結合の存在のために、化合物(5)より高い反応性を示すと結論付けている。
【００１３】
しかし、これらの新たな開発にもかかわらず、白金薬物で起こるDNA-白金架橋の要点を再現するのに適する分子が依然として強く求められている。実際に、単一細胞レベルでDNA-Pt架橋が高分解能で視覚的に検出(及びプルダウン)されれば、損傷部位にあるタンパク質をモニターし、シスプラチンによる標的化を変調する傾向を有する分子を偏りなく特定する手段がもたらされうる。加えて、重要な課題は、無機白金基体を、DNAに対する金属の反応性を変更することなく、有機部分で官能化することと、場合により、許容される生物学的活性を維持することとからなる。
【００１４】
したがって、シスプラチン抵抗性を予測若しくは研究する、又はシスプラチン抵抗性を克服しうる分子を特定するのに有用な、任意の新たな方法又はツールが、この点について目的のものになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第6,413,953号
【特許文献２】WO2013/057253
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Dingら(2013、Angew Chem Int Ed Engl、52、3350〜54頁)
【非特許文献２】Whiteら(2013、J Am Chem Soc、135、11680〜11683頁)
【非特許文献３】Wirthら(2015、J Am Chem Soc、137、15169〜75頁)
【非特許文献４】Moghaddamら(2015、Dalton Trans、44、3536〜3538頁)
【非特許文献５】Sletten及びBertozzi (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009、48(38):6974〜6998頁
【非特許文献６】Baskinら、2007、Proc Natl Acad Sci USA、104、16793〜16797頁
【非特許文献７】Jewettら、2010、Chem Soc Rev、39、1272〜1279頁
【非特許文献８】Liangら、2005、J Cell Physiol, 202、635〜641頁
【非特許文献９】Qiaoら、2014、Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry 19、415〜426頁
【非特許文献１０】Christman, J.K.、2002、Oncogene 21、5483〜5495頁
【非特許文献１１】Marks, P.A. & Breslow, R.、2007、Nature biotechnology 25、84〜90頁
【非特許文献１２】Rodriguez, R. & Miller, K.M. Nature reviews. Genetics 15、783〜796頁(2014)
【非特許文献１３】Rodriguez, R.ら、Nature chemical biology 8、301〜310頁(2012)
【非特許文献１４】Larrieu, D.ら、Science 344、527〜532頁(2014)
【非特許文献１５】Purification of Laboratory Chemicals (Armarego, W.L.F.、Chai, C.L.L.、第5版)
【非特許文献１６】Comba, P.ら、Inorg. Chem. 52、6481〜6501頁(2013)
【非特許文献１７】Brunner, H.及びSchellerer, K.-M.、Inorg. Chim. Acta 350、39〜48頁(2003)
【非特許文献１８】Britton, S.ら、J. Cell Biol. 202、575〜579頁(2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者らは、白金薬物の効果を模倣し、検出可能なDNA-白金架橋を生じさせ、それによって、細胞における白金化DNA損傷の検出を可能にする、白金薬物の類似体である新たな化合物を開発した。この化合物は、白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせる、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するために、白金薬物と組み合わせて使用すべき分子をスクリーニング又は特定するための方法において使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
したがって、本発明は、式(I)、(II)、又は(III)の化合物に関する。
【００１９】
【化４】
2019501909.tif 000006
【００２０】
式中、nは、0〜3の整数であり、Rは、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、カルボキシル、グアニジニル、-COOR'、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-COR'、-CONHR'、-NHCOR'、リン酸、C(1〜6)アルキル、C(2〜6)アルケニル、C(1〜6)アルコキシ基からなる群から独立に選択され、前記(1〜6)アルキル、C(2〜6)アルケニル、及びC(1〜6)アルコキシは、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、カルボキシル、グアニジニル、-COOR'、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-COR'、-CONHR'、-NHCOR'、場合によりメトキシ又はヒドロキシで置換されているアリールから選択される1つ又はいくつかの基で場合により置換されており、R'、R''、及びR'''は、独立に、H又はC(1〜6)アルキルである。
【００２１】
nは、1であり、Rは、N3に対してメタ位にあることが好ましい。
【００２２】
Rは、好ましくは、中性pHで電荷を有する基、好ましくは正電荷を有する基である。
【００２３】
Rは、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、グアニジニル、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-CONHR'、又は場合によりヒドロキシル若しくはメトキシで置換されているアリールから選択される基で置換されているC(1〜6)アルキルであることがより好ましい。
【００２４】
或いは、nは0であり、式は(I)である。
【００２５】
別の代替形態では、nは0であり、式は(II)である。
【００２６】
本発明はまた、本発明による化合物と、アルキン基を有する標識、好ましくは、蛍光標識又はビオチン化標識とを含むキットに関する。
【００２７】
本発明は更に、本発明による化合物又は本明細書で開示するとおりのキットの、特に、細胞における白金化DNA架橋を可視化する、又は白金結合DNAを回収するための調査ツールとしての、in vitroでの使用に関する。加えて、本発明は、白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせることができる分子を特定若しくはスクリーニングするため、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するため、又は患者において白金薬物に対する感受性若しくは抵抗性を予測するための、本発明による化合物又は本明細書で開示するとおりのキットのin vitroでの使用に関する。
【００２８】
本発明は、細胞における白金化DNA架橋を可視化するためのin vitroの方法であって、
-  細胞を、本発明による化合物と接触させる工程と、
-  前記細胞を、場合により銅の存在下で、アルキン基を有する標識、好ましくは蛍光標識と接触させる工程と、
-  前記細胞において標識、好ましくは蛍光標識を検出する工程と
を含む方法に関する。
【００２９】
前記細胞をアルキン基を有する標識と接触させる工程の前に、前記細胞を透過処理し、次いで固定することが好ましい。
【００３０】
本発明は、患者における腫瘍の白金薬物に対する抵抗性又は感受性を予測するためのin vitroの方法であって、
-  本明細書で開示するとおりの、細胞における白金化DNA架橋を可視化するための方法を、患者由来の腫瘍試料からの細胞を用いて実施する工程と、
-  標識化を測定し、場合により、標識化を基準レベルと比較する工程と、
-  患者における腫瘍の白金薬物に対する抵抗性又は感受性を、標識化の強度に基づいて決定する工程であり、感受性が、標識化の強度に比例する、工程と
を含む方法に関する。
【００３１】
本発明は、白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせることができる分子を特定若しくはスクリーニングするため、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するためのin vitroの方法であって、
-  細胞を、本発明による化合物、及び候補分子と接触させる工程であり、化合物との接触が、候補分子との接触の後でもよいし、それと同時でもよいし、又はその前でもよい、工程と、
-  前記細胞を、場合により銅の存在下で、アルキン基を有する標識、好ましくは蛍光標識と接触させる工程と、
-  標識化を測定する工程と、
-  場合により、候補分子の存在下と非存在下での標識化の強度を比較する工程と、
-  候補分子の非存在下での標識化の強度と比べたとき、候補分子の存在下で、標識化の強度が増大している、及び/又はフォーカスの形態が異なっている場合、候補分子を選択する工程と
を含む方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明において、本発明者らは、細胞において白金薬物の類似体を化学的に標識化する独創的な戦略を報告する。より詳細には、白金薬物の類似体は、細胞において、白金薬物と同様の方法でDNA-白金化架橋を形成することができ、in situで容易に標識化することができる。本技術は、首尾よく実施されて、細胞における白金化DNA架橋が可視化された。更に、本技術をがん細胞で用いて、白金薬物、特にシスプラチンによるゲノム標的化に影響を及ぼす可能性のある小分子についてスクリーニングした。この戦略を実施することにより、本発明者らは、ヒストン脱アセチル化酵素の公知の阻害剤である臨床承認薬ボリノスタットを、特定のゲノム座位への白金の過積載を誘発した小分子であると特定し、これらの損傷のクラスターが、損傷乗り越え合成要素と共局在化し、この経路を活性化させたことを発見し、損傷乗り越え合成は、もはや迂回路/抵抗性機序として働かず、その代わりとして、シスプラチンとHDACi(ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤)による同時治療後のアポトーシスを促進したことを見出した。本研究は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害によって、局所的な白金積載を増大させ、損傷が、損傷乗り越え合成に対する障害物として作用し、これがアポトーシスの引き金となる、新たなモデルを導き出した。
【００３３】
したがって、本発明は、白金薬物に対する細胞応答を研究し、理解するための調査ツールとして有用な新たな化合物を提供する。この化合物は、白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせる、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するために、白金薬物と組み合わせて使用すべき分子を特定するためのスクリーニングツールとしても有用である。
【００３４】
白金薬物類似体
本発明は、白金薬物類似体として有用な化合物に関する。
【００３５】
「白金薬物」は、がんを治療するため使用される化学療法剤である、一部類の白金系抗新生物薬を意味する。こうした薬物は、白金の配位錯体である。網羅的でないが、この部類の薬物には、シスプラチン、シス白金、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、及びトリプラチン(triplatin)が含まれる。
【００３６】
化合物は、次式(I)、(II)、又は(III)のうちの1つを有する。
【００３７】
【化５】
2019501909.tif 000007
【００３８】
式中、nは、0〜3の整数であり、Rは、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、カルボキシル、グアニジニル、-COOR'、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-COR'、-CONHR'、-NHCOR'、リン酸、C(1〜6)アルキル、C(2〜6)アルケニル、C(1〜6)アルコキシ基からなる群から独立に選択され、前記(1〜6)アルキル、C(2〜6)アルケニル、及びC(1〜6)アルコキシは、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、カルボキシル、グアニジニル、-COOR'、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-COR'、-CONHR'、-NHCOR'、リン酸、場合によりメトキシ又はヒドロキシで置換されているアリールから選択される1つ又はいくつかの基で場合により置換されており、R'、R''、及びR'''は、独立に、H又はC(1〜6)アルキルである。
【００３９】
式(I)の化合物は、シスプラチンから導かれるのに対し、式(II)及び(III)の化合物は、それぞれ、オキサリプラチン及びカルボプラチンから導かれる。
【００４０】
nは、0、1、2、又は3である場合がある。nは、0又は1であることが好ましい。好ましい一実施形態では、nは、0である。別の好ましい実施形態では、nは、1である。
【００４１】
具体的な実施形態では、化合物は、nが0である式(I)の構造を有する。この化合物は、アジドシクロプラチン(ACP)又は2-アミノメチルピリジン(ジクロロ)白金(II)アジド(APPA)と呼ばれる。
【００４２】
別の具体的な実施形態では、化合物は、nが0である式(II)の構造を有する。この化合物は、2-アミノメチルピリジン(オキサロ)白金(II)アジド(APPOA)と呼ばれる。
【００４３】
nが1であるとき、Rは、アジドN3に対してオルト又はメタ位にある場合がある。Rは、アジドN3に対してメタ位にあることが好ましい。この実施形態では、化合物は、次式(Ia)、(IIa)、又は(IIIa)のうちの1つを有する。
【００４４】
【化６】
2019501909.tif 000008
【００４５】
それぞれ、式(I)又は(Ia)の化合物は、シスプラチンの類似体であり、式(II)又は(IIa)の化合物は、オキサリプラチンの類似体であり、式(III)又は(IIIa)の化合物は、カルボプラチンの類似体である。
【００４６】
特定の実施形態では、Rは、化合物の溶解性がR基のない化合物に比べて向上するように選択される。したがって、Rは、負電荷又は正電荷を有する、中性pHで電荷を有する基でありうる。Rは、特に中性pHで、正電荷を有する基であることがより好ましい。実際に、正電荷は、DNAの負電荷を考慮に入れると、有利でありうる。
【００４７】
R'、R''、及びR'''は、好ましくは、独立に、H又はC(1〜3)アルキルである、より好ましくは、H、メチル、又はエチルである、更により好ましくは、H又はメチルである。
【００４８】
特定の実施形態では、Rは、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、グアニジニル、-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''、-CONHR'、又は場合によりヒドロキシル若しくはメトキシで置換されているアリールから選択される基で置換されているC(1〜6)アルキルである。
【００４９】
具体的な実施形態では、Rは、-(CH2)p-Aであり、Aは、-OH、-COOH、-NH2、-NHMe、-N(Me)2、-N+(Me)3、-CONH、-NHCOMe、グアニジニル、及びヒドロキシルで場合により置換されているフェニルからなる群から選択され、pは、1、2、3、又は4である。pは、2、3、又は4であることが好ましい。
【００５０】
本発明によれば、以下の用語は、次の意味を有する。
本明細書において、たとえばC1〜C3又はC1〜C6等の接頭辞を付けて言及される用語は、C1〜C2又はC1〜C5等のより少ない数の炭素原子で用いられる場合もある。たとえば、用語C1〜C3が使用される場合、この用語は、対応する炭化水素鎖が、1〜3個の炭素原子、詳細には、1、2、又は3個の炭素原子を含みうることを意味する。たとえば、用語C1〜C6が使用される場合、この用語は、対応する炭化水素鎖が、1〜6個の炭素原子、詳細には、1、2、3、4、5、又は6個の炭素原子を含みうることを意味する。
【００５１】
用語「アルキル」は、直鎖状又は分枝状の飽和脂肪族基を指す。用語「(C1〜C3)アルキル」は、より詳細には、メチル(「Me」とも呼ぶ)、エチル(「Et」とも呼ぶ)、プロピル、又はイソプロピルを意味し、用語「(C1〜C6)アルキル」は、より詳細には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル若しくはプロピル、ペンチル、又はヘキシルを意味する。
【００５２】
用語「アルコキシ」又は「アルキルオキシ」は、-O-(エーテル)結合によって分子に結合している、上文で定義したアルキル基に相当する。(C1〜C3)アルコキシには、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、及びイソプロピルオキシが含まれる。(C1〜C6)アルコキシには、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、tert-ブチルオキシ、ペンチルオキシ、及びヘキシルオキシが含まれる。用語(C1〜C6)nポリアルキルオキシは、結合し、それによって、直鎖状のポリ(C1〜C6)アルキレングリコール鎖、好ましくは、直鎖状ポリエチレングリコール鎖を形成しているn (C1〜C6)アルキルオキシに相当する。nは、1<n<6であることが好ましい。
【００５３】
用語「アリール」は、場合により置換されている、6〜12個の炭素原子を有する単環式又は二環式芳香族炭化水素である。アリールは、フェニル(「Ph」とも呼ぶ)、ビフェニル、又はナフチルである場合がある。好ましい実施形態では、アリールは、フェニルである。
【００５４】
-COOR'は、カルボキシル基を指す。-NHR'、-NR'R''、-N+R'R''R'''は、それぞれ、第二級、第三級、及び第四級アミンを指す。-COR'は、アシルを指す。-CONHR'及び-NHCOR'は、アミドを指す。
【００５５】
本発明の化合物は、当業者に公知の方法によって、特に、以下で詳述する合成スキームを使用して合成することができる。
【００５６】
本発明は、本発明の化合物を含む組成物及びキットに関する。
【００５７】
本発明の方法及びキット
本発明の化合物は、検出可能なDNA-白金架橋を形成させる、次いで、DNA-白金架橋又は白金化を受けやすいDNA部位を標識化するのに適する。したがって、本発明は、上で詳述したとおりの本発明の任意の化合物又はそれを含むキットの、特に、DNA-白金架橋を標識化する、又はDNA-白金架橋を含むゲノム部位を局在化させる、特に、細胞における白金化DNA架橋を可視化する、又は、特に配列分析のために、白金結合DNAを回収するための調査ツールとしての使用に関する。本発明はまた、白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせることができる分子を特定若しくはスクリーニングする、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するための、上で詳述したとおりの本発明の任意の化合物又はそれを含むキットの使用に関する。
【００５８】
実際に、クリックケミストリー、特に、銅を触媒とするアジド-アルキン付加環化(CuAAC)又は歪み促進型アルキン-アジド付加環化(SPAAC)を実施することにより、標識を、本発明の化合物のアジド(N3)基に共有結合することができる。この化学は、「生体直交型」又は「生体適合性」とも呼ばれ、複数の生物学的実在物の存在と適合性であり、細胞中で実施することができる。
【００５９】
銅を触媒とするアジド-アルキン付加環化(CuAAC)には、銅(I)触媒剤の存在が必要である。この触媒剤は、銅(II)前駆体を還元剤(たとえば、アスコルビン酸ナトリウム又はp-ヒドロキノン)と共に使用して、銅(I)塩によって、又は予め形成させた銅(I)錯体によって得られる場合がある。
【００６０】
代替の具体的な態様では、生体適合性又は生体直交型クリック反応は、無金属クリック反応(すなわち、金属触媒を必要としない)を包含する。シクロアルキンとの無金属クリック反応の一例を以下に示す。
【００６１】
【化７】
2019501909.tif 000009
【００６２】
クリックケミストリーを含めた生体直交型化学に関する総説については、Sletten及びBertozzi (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009、48(38):6974〜6998頁、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる)を参照することができる。
【００６３】
本発明の状況において、有利な無金属クリック反応は、アジド基と歪みアルキンの間の反応を指す、歪み促進型アルキン-アジド1,3-双極付加環化(SPAAC)である。
【００６４】
本明細書で使用するとき、「歪みアルキン」は、三重結合が立体的に歪んでいるC6〜C30アルキン、特に、歪みシクロアルキンを指す。歪みアルキンは、ハロゲン等の1つ若しくはいくつかの置換基で場合により置換されている、及び/又はヘテロ環を含めた1つ若しくはいくつかの環に縮合している場合もある、シクロオクチン骨格を含んでいてもよい。たとえば、歪みアルキンは、次の骨格の1つを含む場合がある。
【００６５】
【化８】
2019501909.tif 000010
【００６６】
前記骨格の1つを含有している歪みアルキンは、市販の試薬、たとえば、OCT、DIBO、BARAC、ALO、DIFO、MOFO、DIBAC、及びDIMACから調製することができる。
【００６７】
【化９】
2019501909.tif 000011
【００６８】
標識は、歪んでいてもいなくてもよいアルキン官能基(-C≡C)を有する(又はこれに共有結合されている)。
【００６９】
標識は、直接又は間接的に検出可能な部分であってもよい。標識は、色素、放射標識、及び親和性タグの中から選択することができる。特に、色素は、蛍光、発光、又は燐光色素、好ましくは、ダンシル、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、クマリン、BODIPY、及びシアニン色素からなる群から選択することができる。より詳細には、蛍光色素は、Alexa Fluor色素、Pacific色素、Texas Red等の、Molecular Probes社によって発売された色素、又はシアニン3、5、及び7については他の供給業者によって発売された色素の中から選択することができる。特に、CuAAC又はSPAACいずれかのための、アルキンを有する色素は、Alexa Fluor(登録商標)488、55、594、及び647、並びにTAMRA(テトラメチルローダミン)について市販されている。第2の態様では、標識は、親和性タグである場合がある。そのような親和性タグは、たとえば、ビオチン、Hisタグ、Flagタグ、strepタグ、糖、脂質、ステロール、PEGリンカー、及び補因子からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、標識は、ビオチン化標識、特に、Biotin-PEG4アルキン(Sigma Aldrich社)等のビオチン化ポリエチレングリコール標識である。アルキンに連結されたビオチンは、CuAAC及びSPAAC両方のクリックケミストリー用に、市販されている(Molecular Probes(商標)社によるBiotin DIBO Alkyne)。最後に、標識は、放射標識である場合もある。放射標識は、トリチウム、炭素11、炭素14、リン32、リン33、硫黄33、ヨウ素123、及びヨウ素125を含めた、放射性の形態の水素、炭素、リン、硫黄、及びヨウ素からなる群から選択することができる。
【００７０】
本発明はまた、本発明による化合物と、アルキン基を有する標識又はアルキン基を含む基とを含むキットに関する。アルキン基は、歪んでいてもいなくてもよい。標識は、蛍光標識又はビオチンであることが好ましい。キットは、次の構成要素:銅(還元剤を伴う銅(II)前駆体、銅(I)塩、又は予め形成させた銅(I)錯体)、透過処理試薬、固定溶液、洗浄用緩衝液、及びキットの使用についての説明を含む折込み印刷物の1つ又はいくつかを更に含む場合もある。
【００７１】
好ましい実施形態では、銅試薬は、アスコルビン酸ナトリウムを伴う銅(II)であることが好ましい。透過処理試薬は、Triton X-100を含むCSK緩衝液、又は真核細胞膜の透過処理に適する界面活性剤を含む任意の同等な緩衝液であってもよい。固定溶液は、PFA(パラホルムアルデヒド)、又は当業者に公知の任意の同等物を含む。洗浄用緩衝液は、通常はPBSである。
【００７２】
本発明の化合物は、細胞においてDNA-白金化架橋を標識化するのに有用である。細胞においてDNA-白金化架橋を標識化するための方法は、a)細胞を本発明の化合物と接触させる工程と、b)前記細胞を、場合により銅の存在下で、アルキン基を有する標識と接触させる工程とを含む。
【００７３】
方法は、工程a)の前に、細胞を用意する追加の工程を含んでもよい。この工程は、試料、たとえば、患者からの試料を採取する工程を含みうる。
【００７４】
方法は、工程a)とb)の間に、細胞膜透過処理の工程、及び固定化の工程を含むことが好ましい。より詳細には、方法は、(たとえば、遊離化合物を除去するための)洗浄の工程と、細胞膜透過処理の工程と、洗浄の工程と、固定化の工程と、次いで洗浄の工程とを含みうる。これらの工程は、方法が、これらの工程間に追加できる追加の工程を場合により含むことがあったとしても、この順序で首尾よく実施することが好ましい。本発明者らは、固定化の工程の前に透過処理工程を実施することで、標識化の質及び分解能の向上が可能になることを観察した。固定化の前に透過処理(たとえば、CSK予備抽出処理)を使用する目的は、クロマチンに緩く結合した可溶性タンパク質及びRNAを除去して、唯一残存する染色が、DNAに結合した白金薬物類似体となるようにすることである。そのようにすることで、蛍光の基礎レベルがより低くなるために、DNAに架橋された白金薬物類似体の分解能は、より高くなる。これにより、白金薬物類似体により標的化されるフォーカスの検出が可能になる。
【００７５】
工程b)において、銅又は銅前駆体は、方法において使用されるアルキン基の種類に応じて、必要ならば加える。
【００７６】
工程b)の後、方法は、遊離の標識を除去するための追加の洗浄の工程を含んでもよい。
【００７７】
次いで、この方法の結果として、標識に共有結合されたDNA-白金化架橋を有する細胞が調製される。標識化されたDNA-白金化架橋は、いくつかの目的のために使用することができる。この標識化によって、DNA-白金化架橋の局在化、定量化、又は単離が可能になる。
【００７８】
実際に、標識化によって、核の核内領域におけるDNA-白金化架橋の検出が可能になり、それによって、核への局在化を研究すること、及び、たとえば、目的の他のタンパク質(たとえば、PCNA、RAD18、DNAポリメラーゼ、DNA傷害応答タンパク質、DNA修復因子、NER/BER/ファンコーニ架橋修復因子…)又は目的のある特定の遺伝子と共局在化させることが可能になる。したがって、本発明はまた、DNA-白金化架橋を局在化させるための方法であって、細胞においてDNA-白金化架橋を標識するための方法を、上で詳述したとおりに実施する工程と、細胞を顕微鏡で観察し、それによって、DNA-白金化架橋の局在化、より詳細にはその核内局在化を決定する工程とを含む方法に関する。
【００７９】
本発明は、細胞における白金化DNA架橋を可視化するための方法であって、
-  細胞を、本発明による化合物と接触させる工程と、
-  前記細胞を、場合により銅の存在下で、アルキン基を有する標識、好ましくは蛍光標識と接触させる工程と、
-  前記細胞において標識、好ましくは蛍光標識を検出する工程と
を含む方法に関する。
【００８０】
前記細胞をアルキン基を有する標識と接触させる工程の前に、前記細胞を透過処理し、次いで固定することが好ましい。場合により、必要時に洗浄工程を実施する。
【００８１】
代替の方法において、細胞を、本発明による化合物と接触させる前に透過処理及び/又は固定することが企図される場合もある。
【００８２】
加えて、DNA-白金化架橋を標識化することで、DNA-白金化架橋の数の定量化が可能になる。たとえば、標識が蛍光である場合、蛍光の量を測定することができ、この量は、DNA-白金化架橋の量に比例する。標識が放射性である場合には、放射能の量が測定される。好ましい実施形態では、標識は、蛍光である。したがって、本発明は、DNA-白金化架橋の数を定量化するための方法であって、細胞においてDNA-白金化架橋を標識化するための方法を、上で詳述したとおりに実施する工程と、標識によって発せられたシグナルを測定する工程とを含む方法に関する。より詳細には、標識が蛍光である場合、シグナルは、発せられた蛍光である。加えて又は或いは、本発明は、細胞においてDNA-白金化架橋を局在化させるための方法に関する。この実施形態では、方法は、細胞においてDNA-白金化架橋を標識化するための方法を、上で詳述したとおりに実施する工程と、DNA-白金化架橋を局在化させる工程とを含む。加えて、他のタンパク質又は核酸配列を更に標識化することもでき、標識化の局在化を比較して、たとえば、共局在化を研究することができる。
【００８３】
白金薬物に対する細胞の感受性は、一般に、DNA-白金化架橋の数に比例する。感受性とは、白金薬物が、アポトーシス又は任意の他の死滅過程によって、細胞を死滅させる能力を指すものである。したがって、そこで、白金薬物に対する細胞の感受性は、標識シグナルの強度、たとえば、蛍光量に比例する。そして、標識シグナルの強度が強いほど、白金薬物に対する細胞の感受性は、良好となる。逆に、標識シグナルの強度が弱いほど、白金薬物に対する細胞の感受性は低くなり、又は白金薬物治療に対する抵抗性が生じる可能性は高くなる。標識シグナルの強度は、標識シグナルの基準強度と比較することができる。たとえば、シグナルの基準強度は、白金薬物に対して感受性があることがわかっている細胞で測定された強度である。或いは、シグナルの基準強度は、白金薬物に対して抵抗性であることがわかっている細胞で測定された強度である。基準の細胞は、研究対象である細胞に最も近いことが好ましい。
【００８４】
したがって、本発明は、患者において白金薬物に対する感受性又は抵抗性を予測するための、本発明の化合物又はキットの使用に関する。より詳細には、本発明は、患者における腫瘍の白金薬物に対する抵抗性又は感受性を予測するための方法であって、
-  白金化DNA架橋を可視化するための方法を、患者由来の腫瘍試料からの細胞を用い、上で詳述したとおりに実施する工程と、
-  標識化を測定し、場合により、標識化を基準レベルと比較する工程と、
-  患者における腫瘍の白金薬物に対する抵抗性又は感受性を、標識化の強度に基づいて決定する工程であり、感受性が、標識化の強度に比例する、工程と
を含む方法に関する。
【００８５】
上で詳述したとおり、基準レベルは、白金薬物に対して感受性があることがわかっている細胞で測定された強度及び/又は白金薬物に抵抗性であることがわかっている細胞で測定された強度であってもよい。基準の細胞は、研究対象である細胞に最も近いことが好ましい。或いは、基準レベルは、同じ患者からの細胞、好ましくは、がん性でない細胞、たとえば、特に腫瘍近傍からの、対応する正常な組織学的基準組織において測定されたレベルであってもよい。そこで、方法は、患者からの腫瘍試料及び組織学的に一致した正常組織を用意する事前工程を含みうる。
【００８６】
別の代替形態では、基準細胞は、同じ患者からではあるが、白金薬物による治療前又は治療開始時の腫瘍細胞にすることもできる。そこで、この態様では、方法を使用して、患者における白金薬物に対する抵抗性の出現を追跡することができる。
【００８７】
或いは又は加えて、本発明は、患者における腫瘍の白金薬物に対する抵抗性又は感受性を予測するための方法であって、
-  白金化DNA架橋を可視化するための方法を、患者由来の腫瘍試料からの細胞を用い、上で詳述したとおりに実施する工程と、
-  標識化の局在化を決定し、場合により、標識化の局在化を基準局在化と比較する工程と、
-  患者における腫瘍の白金薬物に対する抵抗性又は感受性を、標識化の局在化に基づいて決定する工程と
を含む方法に関する。
【００８８】
白金薬物に対する抵抗性又は感受性は、標識化の局在化の変化に基づいて決定することができる。
【００８９】
加えて、本発明は、白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせることができる分子を特定若しくはスクリーニングする、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するための、本発明の化合物又はキットに使用に関する。実際に、本出願は、白金薬物に対する細胞の感受性又は抵抗性を評価するための、ハイスループットレベルで実施することができる手段を開示しているので、この手段は、分子ライブラリーを試験するのに適する方法において使用することができる。本発明は、白金薬物に対する抵抗性の出現を防ぐ若しくは遅らせることができる分子を特定若しくはスクリーニングする、又は白金薬物に対する抵抗性を克服若しくは軽減するための方法であって、
-  細胞を、本発明による化合物、及び候補分子と接触させる工程であり、化合物との接触が、候補分子との接触の後でもよいし、それと同時でもよいし、又はその前でもよい、工程と、
-  前記細胞を、銅の存在下で、アルキン基を有する標識、好ましくは蛍光標識と接触させる工程と、
-  標識化を測定する工程と、
-  場合により、候補分子の存在下と非存在下での標識化の強度を比較する工程と、
-  候補分子の非存在下での標識化の強度と比べたとき、候補分子の存在下で、標識化の強度が増大している場合、候補分子を選択する工程と
を含む方法に関する。
【００９０】
好ましい実施形態では、細胞は、白金薬物に抵抗性である細胞である。
【００９１】
或いは又は加えて、候補分子が標識化の局在化に与える影響は、白金薬物に対する感受性又は抵抗性のマーカーと考えることができる。したがって、候補分子が、フォーカスの形態に与える影響も研究することができる。
【００９２】
好ましい実施形態では、本発明の化合物は、候補分子の存在下でインキュベートした後の細胞と接触させる。細胞は、1時間〜5日、好ましくは1日〜4日、たとえば3日の間、候補分子と共にインキュベートされる。或いは、細胞は、本発明の化合物及び候補分子と共に同時にインキュベートしてもよい。最後の実施形態では、細胞は、候補分子を加える前に、本発明の化合物と共にインキュベートされる。場合により、必要時に洗浄工程を加えてもよい。
【００９３】
場合により、候補分子の効果を、白金薬物に対する細胞の感受性に効果を有することがすでにわかっている分子、たとえば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と比較してもよい。場合により、本スクリーニング法によって、候補分子の組合せを試験することもできる。
【００９４】
本発明の方法において使用する細胞は、がん細胞であることが好ましい。がん細胞は、がん細胞系から、又は原発腫瘍由来の細胞から得ることができる。がん細胞は、白金薬物に対して抵抗性である、より詳細には、シスプラチンに対して抵抗性であるものであってもよい。白金薬物に対して抵抗性である細胞系は、市販されている(ATCC)。細胞は、哺乳動物細胞、より詳細には、ヒト細胞であることが好ましい。適切な細胞の網羅的でない例としては、A2780及びA2780cisR細胞等の卵巣細胞、たとえばOV2008、CaoV-3、OVCAR-3、SKOV-3、PEA1/A2、PEO14/23、PEO1/4/6、IGROV-1;非小細胞肺がん細胞、たとえばA549及びH292;乳がん細胞、たとえばMBA-MD-231;骨肉腫細胞、たとえばU2OS;結腸細胞、たとえばHCT-116が挙げられる。
【００９５】
最後に、本発明はまた、DNA-白金化架橋を単離する、より詳細には、DNA-白金化架橋を含むDNA配列を単離する(プルダウン法)ための、本発明の化合物又はキットの使用に関する。実際に、本発明によって、単離された配列のハイスループットシークエンシングが可能になる。全体的な戦略を図3Eに記載している。本発明は、a)細胞を本発明の化合物と接触させる工程と、b)細胞からゲノムDNAを精製又は単離する工程と、c)アルキン基を有する親和性タグを、場合により、必要なら銅の存在下で加える工程と、d)親和性タグに連結されたゲノムDNAを単離又は精製する工程とを含む方法に関する。場合により、方法は、特に工程b)の間に、RNAを除去する工程を含んでもよい。場合により、方法は、工程d)の前に、DNAを断片化する工程を含んでもよい。工程d)は、DNAを、その上で親和性タグに結合しうる分子が固定されている固形支持体、たとえばビーズと接触させることにより実施することが好ましい。方法は、工程d)の後に、たとえばチオ尿素を使用して、DNA-白金化架橋を逆転させる追加の工程を含むことが好ましい。
【００９６】
親和性タグは、ビオチンであることが好ましい。アルキンに連結されたビオチンは、CuAAC及びSPAAC両方のクリックケミストリー用に、市販されている(Sigma Aldrich社によるBiotin-PEG4アルキン、又はMolecular Probes(商標)社によるBiotin DIBO Alkyne)。ビオチンに連結されたゲノムDNAを単離又は精製するために、工程d)においてストレプトアビジンを使用することができる。当然ながら、方法は、別の親和性タグ-結合剤ペアとも容易に適合させることができる。
【００９７】
回収されたDNAは、当業者によって、任意の種類の分析に使用することができる。特に、この回収されたDNAは、シークエンシングすることができる。
【００９８】
本発明の更なる態様及び利点を以下の実施例において記載するが、実施例は、例示であり、限定するものでないとみなすべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】クリッカブルなシスプラチンプローブとしてのACPの設計、合成、及び検証を示す図である。白金薬物の分子構造。
【図１Ｂ】クリッカブルなシスプラチンプローブとしてのACPの設計、合成、及び検証を示す図である。ACPの合成経路。(i) (COCl)2、DCM、触媒DMF、室温、2時間。(ii) MeOH、室温、16時間、74%。(iii) CaCl2、NaBH4、MeOH:THF (1:1)、0℃〜室温、48時間、87%。(iv) NaN3、DMF:H2O (20:1)、85℃、14日、60%。(v) SOCl2、CHCl3、0℃〜室温、16時間、70%。(vi)カリウムフタルイミド、DMF、室温、16時間、93%。(vii) NH2NH2・H2O、THF:MeOH (1:1)、室温、16時間、36%。(viii) K2PtCl4、H2O、室温、3時間、54%。
【図１Ｃ】クリッカブルなシスプラチンプローブとしてのACPの設計、合成、及び検証を示す図である。U2OS細胞に対する白金薬物の抗増殖活性。
【図１Ｄ】クリッカブルなシスプラチンプローブとしてのACPの設計、合成、及び検証を示す図である。DNAヘアピン(hp)、1,2-GG鎖内白金DNA架橋(hp-Pt)、及びクリック標識化を使用している白金化DNA損傷の化学標識化(hp-Pt-488)の略図。明確にするために、hp-Pt-488については単一の位置異性体だけを示す。
【図１Ｅ】クリッカブルなシスプラチンプローブとしてのACPの設計、合成、及び検証を示す図である。遊離DNAヘアピン、対応する白金化DNA付加物、及びその標識化された対応物の質量分析検出。hp-Ptは、アジド断片化を伴う分子イオンピークとして観察された。
【図１Ｆ】クリッカブルなシスプラチンプローブとしてのACPの設計、合成、及び検証を示す図である。ドットブロットによるU2OS細胞からのゲノムDNA白金化の検出。
【図２】DNA-Ptの細胞局在化を示す図である。(a)クリックケミストリーによる蛍光標識化及びU2OS細胞中でのDNA-Ptの局在化。(b)細胞中のDNA-Ptの検出を強化するための戦略の略図。(c)予備抽出に供したU2OS細胞における標識化されたDNA-Ptの蛍光顕微鏡法による視覚的検出。拡大画像は、4倍である。スケールバー、10μm。
【図３Ａ】白金薬物によるゲノム標的化の調節因子としてのHDAC阻害を特定する不偏スクリーニングを示す図である。シスプラチン標的化の変調についてスクリーニングした小分子。
【図３Ｂ】白金薬物によるゲノム標的化の調節因子としてのHDAC阻害を特定する不偏スクリーニングを示す図である。表示どおりに処理したU2OS細胞における標識化されたDNA-Ptの視覚的検出。白色の矢印は、核小体標的化を示す。スケールバー、20μm。
【図３Ｃ】白金薬物によるゲノム標的化の調節因子としてのHDAC阻害を特定する不偏スクリーニングを示す図である。bの定量化。
【図３Ｄ】白金薬物によるゲノム標的化の調節因子としてのHDAC阻害を特定する不偏スクリーニングを示す図である。H4の高アセチル化を示す、表示どおりに処理した骨肉腫U2OS細胞のウエスタンブロット分析。
【図３Ｅ】白金薬物によるゲノム標的化の調節因子としてのHDAC阻害を特定する不偏スクリーニングを示す図である。白金結合DNAプルダウン法の略図。
【図３Ｆ】白金薬物によるゲノム標的化の調節因子としてのHDAC阻害を特定する不偏スクリーニングを示す図である。表示したとおりに試料からプルダウンによって回収したDNAの定量化。誤差バーは、SEM(N=3)を表す。
【図４Ａ】HDAC阻害が、TLS及びアポトーシスの促進によって、がん細胞を白金薬物に対して感作することを示す図である。SAHA/ACP処理によるTLSの活性化。表示どおりに処理したU2OS細胞におけるPCNAモノユビキチン化のウエスタンブロット分析。
【図４Ｂ】HDAC阻害が、TLS及びアポトーシスの促進によって、がん細胞を白金薬物に対して感作することを示す図である。表示どおりに処理したU2OS細胞における、DNA-PtのRAD18との共局在化。拡大画像は、3倍である。スケールバー、20μm。
【図４Ｃ】HDAC阻害が、TLS及びアポトーシスの促進によって、がん細胞を白金薬物に対して感作することを示す図である。表示どおりに処理したWT及びRAD18 KO HCT-116細胞におけるPCNAモノユビキチン化及びアポトーシスマーカーのウエスタンブロット分析。
【図４Ｄ】HDAC阻害が、TLS及びアポトーシスの促進によって、がん細胞を白金薬物に対して感作することを示す図である。表示どおりに処理したWT及びRAD18 KO HCT-116細胞におけるPCNAモノユビキチン化及びアポトーシスマーカーのウエスタンブロット分析。
【図５】予備抽出に供したU2OS細胞における標識化されたDNA-Ptの蛍光顕微鏡法での視覚的検出によるAPPAとAPPOAの比較分析を示す図である。拡大画像は、3倍である。スケールバー、20μm。
【実施例】
【０１００】
シスプラチン損傷を研究するために、本発明者らは、薬物処理後の細胞における、標的に結合した白金の化学標識化を可能にするであろう代理プローブを開発しようと努めた。単一細胞レベルでDNA-Ptを視覚的に検出することができれば、損傷部位にあるタンパク質をモニターし、シスプラチンによる標的化を変調する傾向を有する小分子を偏りなく特定する手段がもたらされる。加えて、プルダウンも、単離された白金結合DNAを、応答性細胞系と抵抗性細胞系とで比較する、確固とした技術である。
【０１０１】
結果
細胞における白金薬物の化学標識化。シスプラチン損傷を研究するために、本発明者らは、細胞におけるDNA-Pt架橋の化学標識化を可能にするであろう代理プローブを開発しようと努めた。本発明者らは、小分子の作用機序の解明における予備専門知識から、生体直交型クリックケミストリーによって白金化DNA付加物を標識化するアジド含有薬物を開発するきっかけを得た。ここで、重要な課題は、無機白金基体を、DNAに対する金属の反応性を変更することなく、有機部分で官能化すること、及び許容される生物学的活性を維持することからなっていた。本発明者らは、アジドシクロプラチン(ACP、図1a及び図1b)と名付けた、環状アジド白金含有薬物を合成した。ACPの設計は、ピコプラチン(図1a)の構造をヒントとしており、芳香族メチル置換基を利用して、Ptを有する強固な5員環を形成している。したがって、ACPは、環によって、白金にキレート化されたピリジン核の自由な回転が妨げられる、オキサリプラチンの構造を彷彿とさせる構造を示す。この構造の相違は、細胞におけるDNA-Ptのプロセシングが、これらの損傷の安定性、大きさ、及び力学に大きく依拠していることを考えると、些細なことではない。また、環状白金付加物の形成に基づく合成経路には、銀試薬が存在しないため、合成は、扱いやすくなっており、生物学的評価に適する純粋な化合物が得られた。
【０１０２】
シスプラチン及びピコプラチンと同様に、ACPは、ヒト骨肉腫U2OS細胞において抗増殖特性を示した(図1c)。本発明者らは、次に、クリックケミストリーによって、相補的なアルキン含有フルオロフォアを用い、ACPの、DNAに対する反応性及びDNA-Pt標識化能力を、in vitro及び細胞中で評価した。白金薬物と鎖内架橋を形成しやすい、単一の1,2-GGジヌクレオチドを含有している26量体ヘアピン形成DNAオリゴヌクレオチドを、ACPと共にインキュベートし、精製し、次いで、歪みアルキン含有Alexa 488と反応させた(図1d)(Baskinら、2007、Proc Natl Acad Sci USA、104、16793〜16797頁; Jewettら、2010、Chem Soc Rev、39、1272〜1279頁)。次いで、反応生成物を、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)分析を使用する質量分析によって分析し、特徴付けた。本発明者らは、未反応の遊離ヘアピン並びに標識化されていない及び蛍光標識化されたACP付加物に対応する3つのイオンピークを特定した(図1e)。これらの結果から、二官能性ACPが、in vitroで、逐次、DNAと化学選択的に交差反応し、アルキン含有タグによって標識化されうることが実証された。次に、本発明者らは、ACP、及びアジド官能基を欠く、したがってクリックケミストリーに適さない、ACPの構造的に関連する活性類似体である対照化合物シクロプラチン(CP、図1f)を使用して、同様の実験をそのまま細胞において実施した。ACPで処理した細胞から取得した標識化されたゲノムDNAは、ドットブロットによってモニターしたとき、CPで処理した細胞から集めた等量のDNAに比べて、より高いレベルの蛍光を示した(図1f)。総合して、これらのデータによって、ACPがDNAと反応したこと、並びにin vitro及び細胞中でDNA-Pt架橋を標識化できたことが実証された。
【０１０３】
DNA-Pt架橋の細胞局在化。このプローブが成功裏に開発及び検証されたところで、本発明者らは、次に、この技術について更に詳しく説明しようと努めて、細胞におけるDNA-Ptの局在化を評価した。この目的のために、細胞をACPで処理し、ホルムアルデヒドで固定してから、銅触媒作用に供して、DNA損傷を標識化した。標識化された薬物付加物は、拡散した細胞質及び核の染色を示し(図2a)、報告されているシスプラチン誘導体の細胞における分布についての以前の観察と一致した(Dingら、前掲書;Liangら、2005、J Cell Physiol, 202、635〜641頁; Qiaoら、2014、Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry 19、415〜426頁)。DNA-薬物付加物を選択的に検出する手段として、本発明者らは、さもなければこれらの損傷を必要な分解能で特定する妨げとなりかねない、クロマチンに会合した核タンパク質及び白金薬物のRNA基質を除去するための予備抽出プロトコールを開発した(図2b)。このプロトコールによって、核におけるDNA-Ptの検出が可能になり、いくつかの核内領域は、蛍光強度の増大を示した(図2c)。興味深いことに、標識化されたDNA-Pt損傷は、白金薬物がrRNAを標的化にするという考えと一致して、核小体タンパク質フィブリラリンと共局在化した。まとめると、これらのデータによって、ACPは、ゲノム標的化及び白金薬物に対する応答の研究に用いられる、機能的クリッカブルなシスプラチンプローブとして検証された。
【０１０４】
加えて、本発明者らは、APPOAを更に試験しており、結果を図5に示す。
【０１０５】
検討中のこの最適化された技術を用い、本発明者らは、次に、ACP染色を読み出し情報として使用して、シスプラチンによるゲノム標的化の小分子モジュレーターを探索した。そうして、本発明者らは、クロマチンのレベルで作動する、又はがん治療においてシスプラチンと併せて使用される、限定された一式の小分子をスクリーニングした(図3a、Table 1(表1))。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
U2OS細胞を、独立してそれぞれの小分子とACPとで同時に処理し、次いでクリック標識化に供した。標識化されたDNA-Ptを共焦点顕微鏡法によって分析した。目視検査によって、ほとんどの小分子は、ACP染色に対して識別可能な効果を有さなかったが、臨床承認薬5-Aza (Christman, J.K.、2002、Oncogene 21、5483〜5495頁)及びボリノスタット(SAHA) (Marks, P.A. & Breslow, R.、2007、Nature biotechnology 25、84〜90頁)で事前処理すると、DNA-Ptのフォーカスが出現し、これらの部位におけるプリン残基のクラスターの存在が示された(図3b及び図3c)。これらのデータは、SAHA処理の結果として起こるクロマチン弛緩によって、ACPの新規DNA標的が現れたという見解と一致した。実際に、本発明者らは、SAHAによって、オープンクロマチンの十分に確立されたマーカーである、ヒストンH4のヒストン高アセチル化が誘発されたことを確認した(図3d)。SAHAで処理した細胞で生じるACP損傷は、CENPA(すなわち、セントロメア)又はTRF1(すなわち、テロメア)と共局在化せず、1,2-プリン残基に富んだ反復配列を含有しているこれらの座位が、主要なACP標的として除外されたことは、注目すべきである。対照として、RNA-Seq分析によって、SAHAによる影響をほとんど受けないままであった、ACPによって上方又は下方調節された遺伝子の小規模の亜集団が特定され、SAHAによるACP積載の増加が、薬物に応じた一般の転写変更とは無関係に生じたという考えが支持された。この結果を裏付けるために、本発明者らは、ACPのDNA標的を細胞から単離するプロトコールを開発した(図3e)。細胞をACP又はSAHA/ACPのいずれかで処理し、他の小分子について本発明者らが以前に報告したとおりに親和性プルダウンに供した(Rodriguez, R. & Miller, K.M. Nature reviews. Genetics 15、783〜796頁(2014); Rodriguez, R.ら、Nature chemical biology 8、301〜310頁(2012); Larrieu, D.ら、Science 344、527〜532頁(2014))。ACP及びSAHA/ACPで処理した細胞からプルダウンされたDNAの量は、統計的に相似しており、SAHAは、単にDNA標的それ自体の数を増加させることにより作用するのではなく、むしろ、特定の部位において白金によるゲノム標的化を増強するという考えと一致した(図3f)。これらのデータによって、クロマチン弛緩が、ゲノムのACPへの接近容易性を増大させたという見解が支持され、SAHAがシスプラチンを含めた遺伝毒性化合物に対して細胞をどのように感作するのか、更なる見通しが得られた。
【０１０８】
損傷乗り越え合成(TLS)をアポトーシスの引き金に変える。本発明者らは、SAHA処理後のACPフォーカスの存在をきっかけとして、DNA-Ptのクラスターが、TLSにこれらの損傷を迂回するように求める複製障害物として作用しうるかどうかを決定した。TLS活性化は、TLSの重要なマーカーである、増殖性細胞核抗原(PCNA、図4a)のモノユビキチン化によって明確になったとおり、SAHA/ACPで同時処理したU2OS細胞において容易に検出された。注目すべきことに、DNA-Ptのフォーカスは、PCNAのモノユビキチン化を媒介するE3ユビキチンリガーゼであるTLS因子RAD18と共局在化した(図4b)。印象的なことに、結腸HCT116、骨肉腫U2OS、及び卵巣A2780を含めたいくつかのがん細胞系において、それぞれPARPの切断及びカスパーゼ3の活性化によって明確になったとおり、SAHAとACPでの同時処理によって、より高いレベルのDNA傷害(すなわち、γH2AX)及びアポトーシスが誘発された(図4c)。これらのデータから、HDAC阻害の結果として生じるDNA-Ptが、TLS及びアポトーシスを活性化させたことが示された。TLSが、これらの条件下でアポトーシスシグナル伝達に直接関与したのかどうかを評価するために、本発明者らは、マッチドHCT116 RAD18ノックアウト(KO)細胞を用いて同様の実験を実施した。ウエスタンブロッティングにおいて、RAD18を欠く細胞は、SAHA/ACP処理に応じたPCNAモノユビキチン化を示さなかったが、WT細胞ではこれが観察されたことが示された(図4c)。興味深いことに、ACPフォーカスは、SAHAとACPで同時処理したWT細胞及びRAD18 KO細胞において同様に形成したにもかかわらず、アポトーシスのマーカーは、HCT-116 RAD18 KO細胞において検出されなかった(図4c)。これらの結果から、これらの細胞におけるRAD18に依存的なPCNAモノユビキチン化が確認され、SAHA及びACPに応じたアポトーシスの開始へのTLSの関与が示唆された。シスプラチン処理したWT細胞及びRAD18 KO細胞でも同様の結果が観察され、これらの薬物に対する全般的な応答が実証された(図4d)。TLSによるアポトーシスの促進は、シスプラチンに対する抵抗性におけるこの機構の十分に確立された役割のせいで、直観に反する可能性がありうるとはいえ、HDAC阻害は、抵抗性がん細胞を、この薬物に対して再び感作することが示された。この結果は、RAD18発現細胞において、白金薬物及びSAHA処理に応じたアポトーシスシグナル伝達のレベルがより高いのは、TLSがDNA-Ptクラスターを効率よく迂回できないためであることを示唆している。これらの結果は、DNA-Pt架橋及び関連するタンパク質を高い分解能で視覚的に検出する能力に直接起因する。
【０１０９】
考察
本発明者らは、新規なシスプラチン類似体及び予備抽出プロトコールに基づく汎用性のある戦略を開発し、これにより、シスプラチンによるゲノム標的化の小分子モジュレーターの偏りのない特定、及びDNA-Pt架橋の部位におけるTLS活性化の直接的な可視化が可能になった。複製機構にシスプラチン損傷が関与する結果、ゲノムの不安定性及び細胞死を促進する過程であるフォーク失速及び崩壊が起こる。しかし、細胞は、モノユビキチン化PCNAへの特殊化された低忠実度ポリメラーゼの補充を伴うDNA傷害耐性経路を用い、損傷の迂回を可能にすることができる。この経路を通してこれらの損傷に耐える適性は、シスプラチンに対する抵抗性という、診療室におけるこれらの薬物の使用にとっての重大な障害において、肝要な役割を果たすことが示されている。これらの制限を克服するために、よりかさ高な配位子を含有しているシスプラチン類似体、又は他の薬物との併用療法が研究されている。たとえば、ヒストン脱アセチル化酵素又はDNAメチル化阻害剤を同時投与すると、がん細胞は、DNA傷害剤に対して感作され、HDAC阻害は、抵抗性がん細胞を、シスプラチンに対して再び感作することが示されている。本発明者らは、細胞をシスプラチン類似体ACP及びSAHAで処理した結果、DNA-Ptの部位において、これらの部位におけるPCNAユビキチン化及びRAD18局在化の増加によって確認されるとおり、TLSが活性化されたことを発見した(図4)。興味深いことに、この処理は、TLSが新規白金化損傷を迂回するのを可能にせず、それよりも、TLS依存的なアポトーシスの引き金となった。したがって、これらのデータによって、クロマチン再構築を介した白金薬物のゲノム標的化の変化によって、損傷乗り越え合成の活発な過程が阻害されることが実証され、これに関連して、TLS機能の再編成が示唆される。これらの発見によって、クロマチン変化が、ある特定の薬物に対するがん細胞の内因性及び獲得性の抵抗性をどのように回避しうるのかについての新たな見通し、すなわち、がんの臨床管理のために活用し、更に開発することができる知見が得られる。この研究結果は、TLS迂回を回避することができるこれらの特定の損傷の特徴付け、及びこれらの損傷がどのようにプログラム細胞死の引き金になるかを明確にすることを含めて、更なる調
査に値するいくつかの新たな疑問を提起している。
【０１１０】
このデータは、クロマチンが、ゲノムの小分子への接近容易性を変更しうるモデルと一致するが、接近容易性は、これらの薬物に対する細胞応答に影響を与える。ゲノム及びエピゲノム標的化薬物は、治療薬及び分子生物学試薬として使用される、広範な部類の化合物である。ここに記載した方法によって、クロマチン再構築がどのようにがん細胞をシスプラチンに対して感作するのかについての思いがけない見通しが得られ、小分子に依拠する基礎研究及びトランスレーショナルリサーチのための強力な実験プラットフォームが確立された。
【０１１１】
材料及び方法
合成
出発材料はすべて、市販品供給元から購入し、それ以上精製せずに使用し、又はPurification of Laboratory Chemicals (Armarego, W.L.F.、Chai, C.L.L.、第5版)に従って精製した。溶媒は、標準条件下で乾燥させた。反応は、TLCシリカゲルコーテッドアルミニウムプレート60F-254 (Merck社)を使用する薄層クロマトグラフィー(TLC)によってモニターした。カラムクロマトグラフィーは、Merckシリカゲル60、0.040〜0.063mm (230〜400メッシュ)を使用して実施した。NMR分光法は、凍結探針を備え付けたBruker 300、500MHz装置で実施した。スペクトルは、別段記載しない限り、CDCl3中で、又は298KにてDMF-d7中で実施した。分子構造は、1H-及び13C-NMRスペクトル(1D及び2D実験)を含めた総合的なデータセットを使用して特徴付けた。1H化学シフトは、残留非重水素化溶媒を内標準(CDCl3 1H、7.26ppm)及び(DMF-d7 1H、8.03、2.92、2.75ppm)として使用して、ppmで表示する。次の略語を使用する: s、一重線; d、二重線; dd、二重二重線; t、三重線; td、三重線二重線; q、四重線; m、多重線; bs、ブロード一重線。13C化学シフトは、残留非重水素化溶媒を内標準(CDCl3 13C、77.16ppm)及び(DMF-d7 13C、163.15、34.89、29.76ppm)として使用して、ppmで表示する。正確な質量は、ESIイオン化源及びTOF検出器を備え付けたLCT Premier XE (Waters社)、及びQ-TOF 6540 (Agilent社)で記録した。
【０１１２】
【化１０】
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【０１１３】
ピコプラチンの合成。(i) K2PtCl4、NMP、60℃、4時間、63%。(ii) KCl (2.5N)、CH3CO2NH4、NH4OH (2.5N)、45℃、1時間、49%。
【０１１４】
K[PtCl3(2-ピコリン)] (2)。化合物2は、以前に公開された手順(米国特許第6,413,953号)に従って調製した。K2PtCl4 (300mg、0.72mmol)のN-メチル-2-ピロリドン(1.2ml)懸濁液に、市販の2-ピコリン1 (74mg、0.79mmol)のN-メチル-2-ピロリドン(0.9ml)溶液を少量ずつ加えた。加える速度は、30分毎に20%の溶液とした。最初の分を加えた後、反応混合物を油浴に浸し、60℃で4時間撹拌した。次いで、混合物を室温に到達させた後、ジクロロメタン(9ml)を加えた。沈殿剤のKCl及びK[PtCl3(2-ピコリン)]を濾過によって集めて、ジクロロメタン(3×1ml)及びジエチルエーテル(3×1ml)で洗浄した。生成物を減圧下で乾燥させて、2及びKCl (250mg、63%)を黄色の固体として得た。
【０１１５】
【数１】
2019501909.tif 000014
【０１１６】
ピコプラチン(3)。化合物3は、以前に公開された手順(米国特許第6,413,953号)に従って調製した。K[PtCl3(2-ピコリン)]/KCl (231mg、0.42mmol)をKCl溶液(0.33ml、2.5N)に溶かした溶液に、水酸化アンモニウム溶液(0.84ml、2.5N)に希釈した酢酸アンモニウム(163mg、2.12mmol)を加えた。得られた混合物を暗所にて45℃で1時間撹拌した。沈殿物を濾過によって集めて、水(2×1ml)及びアセトン(2×1ml)で洗浄した。生成物を減圧下で乾燥させて、3 (78mg、49%)を黄色の固体として得た。
【０１１７】
【数２】
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【０１１８】
4-クロロピコリン酸メチル(5)。化合物5は、手を加えた手順(WO2013/057253)に従って調製した。市販の4-クロロ-ピリジン-2-カルボン酸4 (5.0g、31.84mmol)の0℃のジクロロメタン(135ml)懸濁液に、塩化オキサリル(4.8g、38.21mmol)を加えた後、触媒量のジメチルホルムアミド(0.55ml)をゆっくりと加えた。得られた混合物を室温で2時間撹拌した。この時間経過後、混合物を減圧下で濃縮乾固した。固体残渣をメタノール(55ml)中で可溶化し、室温で更に16時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮乾固し、残渣を5%NaHCO3水溶液で再懸濁した。生成物をEtOAc (2×20ml)で抽出した。合わせた有機層をブライン(2×10ml)で洗浄し、無水MgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮乾固して、5 (4.0g、74%)をベージュ色の固体として得た。
【０１１９】
【数３】
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【０１２０】
(4-クロロピリジン-2-イル)メタノール(6)。化合物6は、手を加えた手順(Comba, P.ら、Inorg. Chem. 52、6481〜6501頁(2013))に従って調製した。メタノール(24ml)とテトラヒドロフラン(14ml)の混合物に、5 (4.1g、23.87mmol)及び塩化カルシウム(10.5g、95.48mmol)を加えた。反応混合物を0℃に冷却した。次いで、水素化ホウ素ナトリウム(1.8g、47.74mmol)を少量ずつ加えた。得られた混合物を室温で24時間撹拌した。次いで、同量のメタノール、テトラヒドロフラン、塩化カルシウム、及び水素化ホウ素ナトリウムを、同じ手順に従って加え、反応混合物を24時間撹拌した。この時間経過後、反応混合物に水(80ml)を加え、これを2時間撹拌した。生成物をEtOAc (3×180ml)で抽出した。合わせた有機層をブライン(100ml)で洗浄し、MgSO4で脱水し、減圧下で濃縮乾固して、6 (3.0g、87%)を淡白色の固体として得た。
【０１２１】
【数４】
2019501909.tif 000017
【０１２２】
(4-アジドピリジン-2-イル)メタノール(7)。6 (1.0g、6.96mmol)のジメチルホルムアミド(10.5ml)及び水(0.52ml)中の混合物に、アジ化ナトリウム(1.3g、20.89mmol)を加えた。得られた混合物を85℃で14日間撹拌した。この時間経過後、水(5ml)を加え、生成物をEtOAc (3×7ml)で抽出した。合わせた有機層をブライン(7ml)で洗浄し、無水MgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮乾固して、7 (634mg、60%)を淡黄色の固体として得た。
【０１２３】
【数５】
2019501909.tif 000018
【０１２４】
4-アジド-2-(クロロメチル)ピリジン(8)。化合物7 (398mg、2.65mmol)を0℃の乾燥クロロホルム(3ml)中で可溶化した後、塩化チオニル(946mg、7.95mmol)を滴下添加した。反応混合物を室温に到達させ、16時間撹拌した。飽和NaHCO3水溶液をゆっくりと加えてpHを8に調整した。生成物をクロロホルム(3×3ml)で抽出した。合わせた有機層をブライン(4ml)で洗浄し、無水MgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮乾固して、8 (313mg、70%)を黄色の油状物として得た。
【０１２５】
【数６】
2019501909.tif 000019
【０１２６】
2-((4-アジドピリジン-2-イル)メチル)イソインドリン-1,3-ジオン(9)。カリウムフタルイミド(378mg、2.04mmol)及び8 (313mg、1.85mmol)をジメチルホルムアミドの溶液(2ml)に懸濁させた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。この時間経過後、混合物を減圧下で濃縮乾固した。固体残渣を水(2×2ml)で洗浄し、濾過によって集めて、9 (483mg、93%)をベージュ色の固体として得た。
【０１２７】
【数７】
2019501909.tif 000020
【０１２８】
(4-アジドピリジン-2-イル)メタンアミン(10)。9 (712mg、2.55mmol)のテトラヒドロフラン(2.7ml)及びメタノール(2.7ml)溶液に、ヒドラジン水和物(140mg、2.8mmol)のメタノール(0.85ml)溶液を滴下添加した。反応混合物を室温で16時間撹拌した。この時間経過後、混合物を減圧下で濃縮乾固した。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール、95:5)によって精製して、10 (139mg、36%)を黄色の油状物として得た。
【０１２９】
【数８】
2019501909.tif 000021
【０１３０】
アジドシクロプラチン又は2-アミノメチルピリジン(ジクロロ)プラチニウム(II)アジド(11)。10 (139mg、0.93mmol)を水(9.3ml)中で可溶化し、HCl (1N)をゆっくりと加えてpHを6に調整した。得られた溶液に、K2PtCl4 (386mg、0.93mmol)の水(9.3ml)溶液を加えた。混合物を室温で3時間撹拌した。反応が起こると、黄色/橙色の沈殿物が形成され、pHが1に下がった。NaOH (1N)を加えてpHを6に調整した。反応が完了した後、沈殿物を濾過によって集めて、水(2×2ml)及びエタノール(2×2ml)で洗浄した。固体残渣をデシケーターで乾燥させて、11 (211mg、54%)を黄色〜橙色の固体として得た。
【０１３１】
【数９】
2019501909.tif 000022
【０１３２】
シクロプラチン(12)。化合物12は、以前に公開された手順(Brunner, H.及びSchellerer, K.-M.、Inorg. Chim. Acta 350、39〜48頁(2003))に従って調整した。市販の2-ピコリルアミン(78mg、0.72mmol)を水(7.2ml)中で可溶化し、HCl (1N)をゆっくりと加えてpHを6に調整した。得られた溶液に、K2PtCl4 (300mg、0.72mmol)の水(7.2ml)溶液を加えた。混合物を室温で4時間撹拌した。反応が起こると、黄色の沈殿物が形成され、pHが1に下がった。NaOH (1N)を加えてpHを6に調整した。反応が完了した後、沈殿物を濾過によって集めて、水(2×2ml)及びエタノール(2×2ml)で洗浄した。固体残渣をデシケーターで乾燥させて、12 (111mg、41%)を黄色の固体として得た。
【０１３３】
【数１０】
2019501909.tif 000023
【０１３４】
2-アミノメチルピリジン(オキサロ)白金(II)アジドAPPOA (13)。11 (10mg、0.024mmol)をアセトン(2ml)中で可溶化した。得られた溶液に、シュウ酸ナトリウム(3,2mg、0,024mmol)を加えた。混合物を40℃で5時間撹拌した。反応が完了した後、沈殿物を濾過して塩化ナトリウム塩を除去した。濾液を集め、減圧下で濃縮乾固し、HPLC (Xbridge Prep C18、5μm、30×150mm、流量: 30ml/分、線形勾配: 0;1%のTFA-H2O (A)及び0.1%のTA-CH3CN (B)、方法: 0〜50%のBを30分間、210nmで検出)によって精製して、13 (3,2mg、32%)を淡黄色の固体として得た。
【０１３５】
【数１１】
2019501909.tif 000024
【０１３６】
細胞系及び培養条件。U2OS細胞及びHCT116は、10%のウシ胎児血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、100U/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシンで補充した培地において、標準条件で培養し、37℃、5% CO2でインキュベートした。A2780細胞(シスプラチン感受性)は、Sigma-Aldrich社(#93112519)から購入し、2mMのL-グルタミン及び10%のFBSを含有するRPMI-1640培地で維持した。HCT116 RAD18ノックアウト細胞は、Junjie Chen's Lab (MD Anderson)より厚意で提供され、10%のウシ胎児血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、100U/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシンで補充したDMEM培地において成長させた。
【０１３７】
細胞生存度アッセイ。細胞生存度アッセイは、U2OS細胞(ウェルあたり2,000細胞)を96ウェルプレートに播くことにより実施した。細胞を該当する薬物で72時間処理し、次いで、CellTiter-Blue(登録商標) (20μL/ウェル)と共に1時間インキュベートした後、PerkinElmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Readerを使用して蛍光(560(20) Ex/590(10) Em)を記録した。
【０１３８】
薬物及び阻害剤。ピコプラチン、ACP、APPOA、及びCPは、実験室において、方法の合成のセクションに記載したとおりに調製した。スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)は、Sigma社から購入し、シスプラチンは、Tocris社から購入した。ACP、APPOA、ピコプラチン、及びシスプラチンの保存液は、DMF中に10mMの濃度で調製した。細胞画像処理及びプルダウン実験において使用するACP又はAPPOAについては、0.9%w/vのNaCl中に1mMの新鮮な保存液を新たに調製した。別段記載しない限り、細胞は、ACP (250μM)、APPOA (10μM)、又はシスプラチン(10μM)で処理した。同時処理については、ACP、APPOA、又はシスプラチンで処理する2時間前に、細胞にSAHA (2.5μM)を加えた。
【０１３９】
免疫蛍光分析及び顕微鏡観察。約70%の集密度のU2OS細胞を、ACP及び/若しくはSAHA、又はAPPOA及び/若しくはSAHAで処理した。処理後、細胞をPBSで洗浄し、CSK緩衝液(10mMのPipes、pH7.0、100mMのNaCl、300mMのスクロース、3mMのMgCl2、及び0.7%のTriton X-100)で2回、3分間予備抽出した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、2%のPFAで13分間固定した。Alexa Fluor(登録商標)488アルキン(Life Technologies社、#A10267)によるACP又はAPPOAクリック標識化を、以前に公開された手順(Britton, S.ら、J. Cell Biol. 202、575〜579頁(2013))に基づき、in celluloで実施した。細胞をブロックし、示されているとおりの一次抗体: PCNA (Abcam社、ab18197)、TRF1 (Abcam社、ab10579)、CENPA (Abcam社、ab13939)と共に室温で1時間インキュベートした。RAD18 (Abcam社、ab57447)及びフィブリラリン(Cell Signaling社、2639S)抗体は、4℃で16時間インキュベートした。一次抗体と共にインキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、各一次抗体のブロッキング溶液中で、Alexa Fluor(登録商標)647とカップリングした適切なヤギ又はウサギ二次抗体(Life Technologies社、#A-21236若しくは#A-21245)、又はAlexa Fluor(登録商標)594とカップリングしたウサギ二次抗体(Life Technologies社、#A-11037)と共にインキュベートした。PBS洗浄後、カバーガラスを水に軽く浸し、DAPI (Vector laboratories社)又はHoechst 33258を含有するCitifluor(商標)AF2 (Biovalley社)又はVectashieldを使用してスライドガラスに載せて、細胞核を可視化した。Leica SP8倒立共焦点顕微鏡又はFluoview 1000共焦点顕微鏡(Olympus社)を用いて、像を撮影した。データをImageJで分析した。
【０１４０】
ヘアピンDNAのACP及びDIBO-Alexa 488とのin vitro反応。ヘアピン(hp) DNA (5'-AAAACCAAAAATTTTTTTTTGGTTTT-3' (配列番号1))を、10mMのNa2PO4、pH 7.0、100mMのNaNO3、1mMのMg(NO3)2 (80μM)中に希釈し、90℃で5分間加熱し、次いで、室温で終夜冷ましておいた。0.9%w/vのNaCl中に640μMの濃度のACPの保存液を新たに調製し、等体積のヘアピンDNA溶液(通常は8nmol)と反応させた。hpのACPとの反応は、37℃で18時間実施した。実験室用に用意されたスピンカラム(BioRad社)において、Sephadex G-25 Mediumサイズ排除樹脂(GE Healthcare社)を使用して、結合していないACP及び塩を除去した。白金化DNA (hp-Pt)を、室温で3時間、DIBO-Alexa 488 (Life Technologies社、#C-10405、2.5μl、1.25mM)と反応させた。Sephadex G-25 Mediumサイズカラムによって未反応のDIBO-Alexa 488を除去し、C18 ZipTipsによって更なる脱塩を実現した。
【０１４１】
MALDI-TOF質量分析。ALEXA 488で標識化された白金化DNAを、マトリックス溶液(3-ヒドロキシピコリン酸(3-HPA)のアセトニトリル/水(1:1 (vol/vol)飽和溶液200μLに対して1.7mgのクエン酸アンモニウム)に希釈した(1:9)。混合物をMALDIプレートに付着させ、室温でゆっくりと乾燥させておいた。MALDI-TOF/TOF UltrafleXtreme質量分析計(Bruker Daltonics社、ブレーメン)を実験に使用した。質量スペクトルを線形陽イオンモードで取得した。すべてのデータを、FlexAnalysisソフトウェアパッケージ(Bruker Daltonics社)を使用して加工した。
【０１４２】
DNAプルダウンアッセイ。U2OS細胞を、ACP単独で又はSAHAと組み合わせて処理した。処理後、DNeasy Blood and Tissueキット(Qiagen社、#69506)を使用して、各試料の全ゲノムDNAを精製した。ゲノムDNA抽出の間に、Pure link RNaseA (Invitrogen社)を使用してRNAを除去した。Biotin-PEG4アルキン(Sigma-Aldrich社、#764213)を使用して、単離されたDNAでクリック反応を実施し、光を防いで室温で1時間インキュベートした。4mMのEDTAを使用してクリック反応を失活させた。bioruptor (Fisher Scientific社)を使用して、DNAを約100〜350bpのサイズにまで断片化し、QIAquick PCR精製キット(Qiagen社、#28106)を使用して精製した。ビオチンでタグ付けされたACP-DNA複合物を捕捉するために、各試料をDynabeads(登録商標)MyOne(商標)Streptavidin T1 (Invitrogen社、#65602)と共にインキュベートした後、1MのNaCl、5mMのTris-HCl、pH7.5、及び0.5mMのEDTAを含有する緩衝液で洗浄した。次いで、ビーズを8M尿素で洗浄した後、100mMのNaClを加えた上記洗浄用緩衝液を使用して3回洗浄した。洗浄後、ビーズを1.8Mのチオ尿素中にて37℃で48時間インキュベートした。QIAquick PCR精製キット(Qiagen社)を使用してDNAを精製し、Qubitを使用して定量化した。
【０１４３】
RNA-seq試料調製。RNeasy Mini Kit (Qiagen社、#74106)を製造者のプロトコールに従って使用して、未処理、又はACP単独、SAHA単独、若しくはSAHAとACPの組合せで処理した細胞から、全RNAを抽出した。残留するDNAを、DNase Iによってカラム消化で除去した。Nanodropを使用してRNA濃度を求め、MD Anderson Cancer CenterのNGS設備でのRNA-seqライブラリー調製及びディープシークエンシングに送った。すべてのデータセットをFastQCで分析して、シークエンシング異常がないことを確認した。アダプター汚染は検出されなかった。rRNA及びtRNA配列を濾過し、残存する配列を、Tophat2/Bowtie2を高感度パラメーターで使用して、最新のビルドのヒトゲノム(hg38)に対して整合させた。マッピング品質スコアが5未満である、又は二次であるとフラグを立てられた整合を取り出し、ファイルを仕分けし、索引付けした。HTSeqをGencode v21包括的ゲノムアノテーションと共に使用して、残りの整合から、遺伝子あたりの読出しカウントを算出し、結果を生カウント表現行列にエクスポートした。第1に、遺伝子は、試験する少なくとも1つの試料において100万の読出し毎に少なくとも1カウントの発現値を有する必要があり、第2に、示差的に発現された遺伝子は、1.5以上の絶対倍率変化、及び統計的に有意なFDR調整P値の両方を有する必要があるとしたという2つの修正点を除き、デフォルトパラメーターでedgeRを使用して、示差的に発現された遺伝子を特定した。すべての最終結果をExcelにエクスポートし、すべての下流プロッティングを、ggplot2 graphicsパッケージを使用してRを特注のスクリプトにして実施した。
【０１４４】
ドットブロットアッセイ。U2OS細胞をCP又はACPで3時間処理した。細胞から全ゲノムDNAを単離し、Alexa Fluor(登録商標)488アルキン(Life Technologies社、#A10267)を使用してクリック反応を実施した後、音波処理した。QIAquick PCR精製キット(Qiagen社、#28106)を使用してDNAを精製し、Hybondナイロン膜(GE Healthcare社)でドットブロットを実施した。試料を風乾し、Bio-Rad Molecular Imager ChemiDoc XRS+システムを使用して可視化した。
【０１４５】
細胞溶解及び免疫ブロット法。細胞をPBSで1回洗浄し、溶解緩衝液(50mMのTris-HCl、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1%のTriton X-100)中で溶解させた。ウエスタンブロットについては、試料を短い間音波処理した後、SDS試料緩衝液中で煮沸し、SDS-PAGEゲルによって分離した。タンパク質をニトロセルロース膜(GE Healthcare社)に移し、標準プロトコールに従ってウエスタンブロッティングを実施した。Bio-Rad Molecular Imager ChemiDoc XRS+システムを使用して、化学発光(GE Healthcare Amersham ECL prime)によってウエスタンブロットを検出した。ウエスタンブロッティングに使用した一次抗体: H2AX (Millipore社、#07-627)、γH2AX [pSer139] (Novus Biologicals社、NB100-384)、ヒストンH4 (Abcam社、ab7311)、アセチル-ヒストンH4 (Lys16) (Cell Signaling社、#8804)、アセチル-ヒストンH4 (Millipore社、#06-866)、PCNA (Santa Cruz Biotech社、PC10)、RAD18 (Cell Signaling社、#21000)、PARP (Cell Signaling社、#9542)、β-チューブリン(Abcam社、ab6046)。使用した二次抗体は:HRP標識抗ウサギIgG (Cell Signaling社、#7074)、HRP標識抗マウスIgG (Cell Signaling社、#7076)であった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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