(57)【要約】  本発明は、下肢末梢動脈疾患の治療又は改善における使用のための、単核細胞について富化され（細胞懸濁液中に存在する白血球（ＷＢＣ）の２５％超が単核細胞であることを意味する）、Ａ．ｉ．リンパ球の集団、ｉｉ．単球の集団、及び、ｉｉｉ．ＣＤ３４を発現する造血幹細胞の集団を含む又はそれからなるリストから選択される単核細胞（ＭＮＣ）を含み、Ｂ．顆粒球を更に含む、好ましくは腸骨稜に由来する自己又は同種異系、好ましくは自己の成体骨髄由来白血球の細胞懸濁液に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下肢末梢動脈疾患の治療又は改善における使用のための、ヒト被験体の骨髄に由来する４×１０８個〜１．２×１０９個の自己又は同種異系白血球を含む細胞懸濁液であって、４×１０８個〜１．２×１０９個の白血球の総数のうち、
ｉ．  ２０％〜５１％がリンパ球であり、３．９％〜２２．３％が単球であり、
ｉｉ．  １．４％〜１０％がＣＤ３４を発現する造血幹細胞であり、
ｉｉｉ．  白血球の総数の２５．３％〜８３．３％が単核細胞であり、
ｉｖ．  １６．７％〜７４．７％が顆粒球であり、
ｖ．  白血球の総数の５．４％〜３８．８％がＣＸＣＲ４を発現し、
ｖｉ．  白血球の総数の０．０７％〜２４．７％がＶＥＧＦＲ２を発現し、
ｖｉｉ．  ＣＤ３４を発現する造血幹細胞の総数のうち、７．７％〜５５．５％がＣＤ３８を発現しない初期非拘束造血幹細胞であり、０．７％〜１０．３％がＣＤ３４及びＣＸＣＲ４を発現する幹細胞であり、
ｖｉｉｉ．  赤血球とロイコサイト細胞との最大比が６．７であり、血小板とロイコサイト細胞との最大比が３２である、細胞懸濁液。
【請求項２】
白血球の総数のうち、３２．３％〜８０．０％がリンパ球、単球及びＣＤ３４を発現する造血幹細胞からなるリストから選択される単核細胞であり、２０．０％〜６７．７％が顆粒球である、請求項１に記載の細胞懸濁液。
【請求項３】
５×１０８個〜１．２×１０９個を含む、請求項１又は２に記載の細胞懸濁液。
【請求項４】
８×１０８個〜１．２×１０９個を含む、請求項１又は２に記載の細胞懸濁液。
【請求項５】
９×１０８個〜１．１×１０９個を含む、請求項１又は２に記載の細胞懸濁液。
【請求項６】
９．５×１０８個〜１．０５×１０９個を含む、請求項１又は２に記載の細胞懸濁液。
【請求項７】
９．８×１０８個〜１．０２×１０９個を含む、請求項１又は２に記載の細胞懸濁液。
【請求項８】
前記下肢末梢動脈疾患が重症下肢虚血である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。
【請求項９】
前記細胞懸濁液の細胞を、好ましくは約１％ＨＳＡ及び約２．５％グルコースを含む、５ｍｌ〜３０ｍｌの容量のヘパリン添加生理食塩溶液又は乳酸リンゲル液に懸濁する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞懸濁液。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に定義される細胞懸濁液であって、インフレータブルバルーンを遠位大腿又は膝窩動脈で閉塞性血管病変の近位に配置し、前記細胞懸濁液を動脈内に注入することによって最大４気圧の低圧血流を得る動脈内投与により下肢末梢動脈疾患、好ましくは重症下肢虚血を治療する方法に使用される、細胞懸濁液。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に定義される細胞懸濁液を含むシリンジ又は複数のシリンジ。
【請求項１２】
下肢末梢動脈疾患、好ましくは重症下肢虚血の治療又は改善に使用される、請求項１１に記載のシリンジ。
【請求項１３】
インフレータブルバルーンを遠位大腿又は膝窩動脈で閉塞性血管病変の近位に配置し、前記細胞懸濁液を動脈内に注入することによって最大４気圧の低圧血流を得る動脈内投与により下肢末梢動脈疾患、好ましくは重症下肢虚血を治療する方法に使用される、請求項１１に記載のシリンジ。
【請求項１４】
前記懸濁液を１回量として提供する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞懸濁液又は請求項１２若しくは１３に記載の使用のためのシリンジ。
【請求項１５】
低圧流の誘導を１分間〜６分間行い、前記細胞懸濁液の注入を２分間〜１０分間行う、請求項１０又は１３に記載の使用のための細胞懸濁液又はシリンジ。
【請求項１６】
細胞懸濁液の製造方法であって、
ａ．  ヒト被験体からの骨髄（ＢＭ）採取と、
ｂ．  全ての小さな骨片を除去し、その後の工程における閉塞を防ぐために、前記ＢＭを、好ましくは重力により濾過することと、
ｃ．  最初のＢＭ容量を、Ｓｅｐａｘ  ２．０デバイス及び付属の滅菌ディスポＳｍａｒｔＲｅｄｕｘキット（ＣＳ−４９０．１）でのＳｍａｒｔＲｅｄｕｘプログラムを用いることによって、好ましくは約５０ｍＬ〜１００ｍＬまで減少させることと、
ｄ．  次いで、工程ｃ）において得られる減容されたＢＭを、ＮｅａｔＣｅｌｌ密度勾配遠心分離を行うことによって自動化密度勾配遠心分離にかけ、続いて、好ましくは生理食塩溶液中の２％〜４％ＨＳＡ（どちらも医薬品グレード）から構成される洗浄溶液を用いた単核細胞（ＭＮＣ）懸濁液の２回の洗浄を行うことと、
ｅ．  工程ｄ）の生成物を採取し、好ましくは５０μｍフィルターに通して、滅菌ファルコンチューブに濾過することと、
ｆ．  次いで、前記ＢＭ生成物を洗浄溶液ですすぎ、濾過することで、ＭＮＣ（単核細胞）回収率を改善することと、
ｇ．  任意に、前記ＢＭ生成物の最終容量を４０ｍＬ〜６０ｍＬに調整することと、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下肢末梢動脈疾患、好ましくは重症虚血肢（ischemia limb）の治療又は改善に使用することができる成体骨髄由来細胞の細胞懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
下肢末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、下肢動脈の構造及び機能を変えるアテローム性動脈硬化過程、血栓塞栓過程及び炎症過程によって引き起こされる様々な血管疾患を含む。しかしながら、ＰＡＤの主因はアテローム性動脈硬化である。
【０００３】
症候性下肢ＰＡＤは、酸素供給不足を引き起こす不十分な血流に起因する。ＰＡＤは、心臓血管系及び脳血管系を含む他の血管床のアテローム血栓症と関連する。糖尿病（以下、ＤＭ）の存在がＰＡＤのリスクを大幅に高め、疾患の進行が加速することで、糖尿病患者は虚血性事象、血管機能の障害、罹患率及び死亡率の上昇、並びに生活の質（ＱｏＬ）の悪化の影響を受けやすくなる（Thiruvoipati et al，２０１５年）。実際に、ＰＡＤ患者は、無症候から間欠性跛行（ＩＣ）を有する患者及びＣＬＩ（重症下肢虚血）を有する患者までの不均質な患者群とみなされる。ＣＬＩは、微小循環及び組織への血流及び栄養が著しく攪乱されるまでに末梢灌流圧が低下する動脈不全状態を指す。軽度の外傷、潰瘍形成及び感染が併発する可能性があり、患部組織の代謝要求を高め、慢性非治癒性潰瘍を引き起こすことが多い。ＣＬＩは複数のレベルの疾患、共存症の高い負担及び限られた寿命を特徴とする進行性疾患である。
【０００４】
足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）がＰＡＤの診断に用いられ、ＰＡＤの重症度の指標であるが、疾患の臨床的重症度と完全には相関しない。したがって、より広範な臨床症状がＰＡＤの重症度を分類するために用いられ、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ及びＦｏｎｔａｉｎｅの２つの分類体系が実際の臨床に日常的に用いられている（Hirsch AT，２００６年）。ＰＡＤの臨床的重症度は、無症候から切断術を必要とする壊疽及び下肢虚血まで様々である。ＰＡＤは、病態の重症度が時間と共に増大する進行性疾患である。疾患の進行は、ＤＭを有する患者ではより急速である。
【０００５】
ＰＡＤの症状及びこれらの症状に関与する解剖学的病変の等級付けは、被験体を臨床的に経過観察するための客観的尺度を与え、重要なことには、臨床研究における医療及び介入治療の戦略に比べて一貫性をもたらす。
【０００６】
Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類は、ＰＡＤを表すために一般に用いられる臨床病期分類体系であり、Ｆｏｎｔａｉｎｅ分類に似ているが、血管医学の分野において最近の刊行物により一般に引用される。末梢動脈閉塞性疾患は一般に、Rene Fontaineによって１９５４年に導入されたＦｏｎｔａｉｎｅ病期のＩ期（無症候）〜ＩＶ期（潰瘍形成又は壊疽）に分類される。Rutherfordによって１９８６年に導入され、１９９７年に修正された分類は、４つの等級及び０群（無症候）から６群（重症の虚血性潰瘍又は壊疽）までの７つのカテゴリーからなる（表１）。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
ＣＬＩは複数のレベルの疾患、共存症の高い負担及び限られた寿命を特徴とする進行性疾患である。Trans-Atlantic Inter-Society Consensus (TASC) Document on Management of Peripheral Arterial Disease II, 2007（ＴＡＳＣＩＩ、２００７年）では、ＣＬＩという用語を客観的に証明された動脈閉塞性疾患に起因する慢性虚血性安静時疼痛、潰瘍又は壊疽を有する全ての被験体に対して用いるべきであると推奨されている。ＣＬＩの現在の定義には、２週間を超えて持続する肢部の重度に障害された血流に続発する下肢の安静時疼痛、潰瘍又は壊疽を有する被験体が含まれる。これは、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄの４群〜６群（それぞれ虚血性安静時疼痛、軽微な組織欠損及び大きな組織欠損）又はＦｏｎｔａｉｎｅのＩＩＩ度及びＩＶ度に相当する。
【０００９】
ＣＬＩにおける基礎疾患の唯一の治療は血行再建術である。しかしながら、集団の相当な割合（集団の５０％〜９０％と推定される）が生存血管の欠如、以前の用手血行再建術の失敗又は共存症のいずれかのために用手血行再建術（バイパス手術又は血管内手術）に適さない。ＣＬＩを有する多くの患者が、用手血行再建術を受ける妨げとなり得る複数の病態を有する。最終的に、難治性疼痛を管理すること、壊疽の進行を防ぐこと又は感染と闘うことを目的とする切断術が、これらの患者の大部分に対して残った唯一の選択肢であることが多い。したがって、新たな療法が緊急に必要とされている。
【００１０】
現在、ＣＬＩを有する患者の初期治療は通例、バイパス手術による又は血管内治療（endovascular methods）を用いた血行再建への適合性についての罹患（指標）肢の評価からなる。全ての患者が疾患の既存の症状、特に疼痛、潰瘍及び感染に対して治療を受ける。しかしながら、疼痛管理は効果がないことが非常に多く、虚血性潰瘍が殆ど治癒しないことから、創傷管理は、通常は感染制御、悪化の予防及び患肢救済に重点が置かれる。ＣＬＩの全体的な治療目標としては、以下のものが挙げられる：
疼痛制御
創傷治癒
患肢救済
歩行状態の維持を含むＱｏＬの改善
全心臓リスクの低減
【００１１】
本発明の細胞懸濁液はＣＬＩ患者、特にバイパス手術又は血管内治療を用いた血行再建術の選択肢を有しない、ＤＭを有するＣＬＩ患者に特に適応される。これらの患者については、基礎疾患を治療する治療選択肢がないことから、満たされていない必要性が最も高い。これらの患者に用いられる任意の治療は創傷治癒、感染制御及び疼痛管理といった対症的なものである。用手血行再建術に適さないこれらの患者については、疾患が進行するにつれ、進行性壊疽、無制御の感染又は難治性疼痛のいずれかに応じて切断術が唯一の臨床選択肢となる可能性がある。ＣＬＩを発症するＰＡＤ患者のうち、およそ２５％が１年以内に死亡する（NICE，２０１２年）。ＣＬＩの重症度に応じて、１年間の一次切断術率は５％〜４０％の範囲であり、血行再建術に適さず、神経障害を有する又は歩行不能な患者において最も高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が対処する問題は、下肢末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を患う患者、好ましくはＣＬＩ患者、より好ましくはバイパス手術又は血管内治療を用いた血行再建術の選択肢を有しない、ＤＭを有するＣＬＩ患者に対して改善された治療法の選択肢を与えることである。このような治療法の改善された選択肢は、下記に言及する態様及び好ましい実施の形態によって規定される自己又は同種異系成体骨髄由来細胞の細胞懸濁液の形態で本発明によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様では、下肢末梢動脈疾患の治療又は改善における使用のための、単核細胞について富化され（細胞懸濁液中に存在する白血球（ＷＢＣ）の２５％超が単核細胞であることを意味する）、
Ａ．
ｉ．  リンパ球の集団、
ｉｉ．  単球の集団、及び、
ｉｉｉ．  ＣＤ３４を発現する造血幹細胞の集団、
を含む又はそれからなるリストから選択される単核細胞（ＭＮＣ）を含み、
Ｂ．  顆粒球、
を更に含む、好ましくは腸骨稜（crest of the ilium (or iliac crest)）に由来する自己又は同種異系、好ましくは自己の成体骨髄由来白血球の細胞懸濁液（以下、「本発明の細胞懸濁液」）に言及する。
【００１４】
一般的には、細胞集団Ａ）及びＢ）が遊走因子ＳＤＦ１の受容体であるＣＸＣＲ４を発現する細胞集団を含み、この集団からＣＤ３４及びＣＸＣＲ４を発現する造血幹細胞の亜集団の存在を指摘することが重要であることに留意されたい。加えて、細胞集団Ａ）及びＢ）は、血管新生及び脈管形成に関与する血管新生因子ＶＥＧＦの受容体であるＶＥＧＦＲ２を発現する更なる細胞集団を含む。
【００１５】
最後に、細胞集団Ａ．のｉｉｉ）は、初期非拘束（non-committed）造血幹細胞であるＣＤ３８を発現しない細胞集団を含む。
【００１６】
単核細胞（ＭＮＣ）が本発明の細胞懸濁液の主要活性構成要素とみなされることに留意されたい。特に、本発明の細胞懸濁液の活性構成要素又は成分は、リンパ球、単球及びＣＤ３４を発現する造血幹細胞、特にＣＤ３４を発現し、ＣＤ３８を発現しない初期非拘束造血幹細胞の亜集団、ＣＸＣＲ４を発現するＳＤＦ−１媒介遊走が可能な白血球、ＣＤ３４及びＣＸＣＲ４を発現するＳＤＦ−１媒介遊走が可能な幹細胞、並びにＶＥＧＦＲ２を発現する血管新生が可能な白血球からなるリストから選択されるＭＮＣである。これらの単核細胞の全てが、好ましくは腸骨稜に由来する骨髄由来細胞である。
【００１７】
加えて、本発明の白血球懸濁液が、好中球、好酸球及び／又は好塩基球である顆粒球を更に含むことに更に留意されたい。この点で、実施例において説明される本発明の最終細胞懸濁液生成物が、ＭＮＣ白血球画分（リンパ球及び単球及び幹細胞）だけでなく、顆粒球も含む生存白血球骨髄由来細胞に基づいて投与されることに留意することが重要である。
【００１８】
本発明の第１の態様の好ましい実施の形態では、単核細胞について富化された（細胞懸濁液中に存在する白血球（ＷＢＣ）の総数のうち２５％超が単核細胞であることを意味する）最終配合物中の本発明の細胞懸濁液は、約４×１０８個〜約２×１０９個の、好ましくは腸骨稜に由来する自己又は同種異系、好ましくは自己の白血球骨髄由来細胞を含み、約４×１０８個〜約２×１０９個の白血球の総数のうち、
ｉ．  約２０％〜約５１％がリンパ球であり、約３．９％〜約２２．３％が単球であり、
ｉｉ．  約１．４％〜約１０％がＣＤ３４を発現する造血幹細胞であり、
ｉｉｉ．  白血球の総数のうち約２５．３％〜約８３．３％、好ましくは約３２．３％〜約８０．０％が、好ましくはリンパ球、単球及びＣＤ３４細胞からなるリストから選択される単核細胞であり、
ｉｖ．  約１６．７％〜約７４．７％、好ましくは約２０．０％〜約６７．７％が顆粒球であり、
ｖ．  ＣＤ３４を発現する造血幹細胞の総数のうち、約７．７％〜約５５．５％がＣＤ３８を発現しない初期非拘束造血幹細胞であり、
ｖｉ．  白血球の約５．４％〜約３８．８％がＣＸＣＲ４を発現し、
ｖｉｉ．  ＣＤ３４を発現する造血幹細胞の総数のうち、約０．７％〜約１０．３％がＣＤ３４及びＣＸＣＲ４を発現する幹細胞であり、
ｖｉｉｉ．  白血球の約０．０７％〜約２４．７％がＶＥＧＦＲ２を発現し、
ｉｘ．  赤血球とロイコサイト細胞との最大比が６．７であり、血小板とロイコサイト細胞との最大比が３２である。
【００１９】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態では、前段落において規定される最終配合物中の本発明の細胞懸濁液は、約４×１０８個〜約１．２×１０９個の白血球、より好ましくは約５×１０８個〜約２×１０９個の白血球、更により好ましくは約５×１０８個〜約１．２×１０９個の白血球、及び上に挙げた各々の値の間の全ての投与量値を含む。
【００２０】
或る特定の実施の形態は、最終配合物中の白血球のこれらの値から部分範囲として選択することができる。例えば、特定の実施の形態は、８×１０８個超〜約１．２×１０９個の白血球の最終配合物中の白血球含量として選択することができる。実施の形態において選択することができる範囲の別の例は、約９×１０８個〜約１．１×１０９個の白血球の含量の選択である。特定の実施の形態について選択することができる範囲の第３の例は、約９．５×１０８個〜約１．０５×１０９個の白血球の選択である。特定の実施の形態について選択することができる範囲の第４の例は、９．８×１０８個超〜約１．０２×１０９個の白血球等の含量の選択である。
【００２１】
選択することができる含量又は投与量（dosed）の実施の形態の範囲の他の例としては、６×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）が挙げられる。別の例は、７×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、８×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、８．５×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、９×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、９．５×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、７×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。このため、本明細書の値から当業者に理解されるように選択することができる全ての投与量範囲が本発明に包含される。
【００２２】
上述の各々の細胞集団を測定する方法は、本発明の詳細な説明において明らかに確立される。
【００２３】
かかる細胞懸濁液が薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含み得ることに留意されたい。
【００２４】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態では又はその好ましい実施の形態のいずれにおいて、下肢末梢動脈疾患は重症下肢虚血である。
【００２５】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態又はその好ましい実施の形態のいずれかにおいて、細胞を、好ましくは約１％ＨＳＡ及び約２．５％グルコースを含む５ｍｌ〜３０ｍｌの容量のヘパリン添加生理食塩溶液又は乳酸リンゲル液に懸濁する。
【００２６】
本発明の第２の態様では、インフレータブルバルーンを遠位大腿又は膝窩動脈で閉塞性血管病変の近位に配置し、上記細胞懸濁液を動脈内に注入することによって最大４気圧の低圧血流を得る動脈内投与により下肢末梢動脈疾患、好ましくは重症下肢虚血を治療する方法に使用される、本発明の第１の態様において規定される又はその好ましい実施の形態のいずれかの細胞懸濁液に言及する。
【００２７】
本発明の第３の態様では、本発明の第１の態様において規定される又はその好ましい実施の形態のいずれかの細胞懸濁液を含む１つ又は幾つかのプレフィルドシリンジに言及する。
【００２８】
本発明の第４の態様では、下肢末梢動脈疾患、好ましくは重症下肢虚血の治療又は改善における使用のための本発明の第３の態様において規定されるシリンジ（プレフィルドシリンジ）に言及する。１つ以上のプレフィルドシリンジを患者１人に用いてもよいことに留意されたい。
【００２９】
本発明の第５の態様では、インフレータブルバルーンを遠位大腿又は膝窩動脈で閉塞性血管病変の近位に配置し、上記細胞懸濁液を動脈内に注入することによって最大４気圧の低圧血流を得る動脈内投与により下肢末梢動脈疾患、好ましくは重症下肢虚血を治療する方法に使用される、本発明の第３の態様において規定されるシリンジ（プレフィルドシリンジ）に言及する。
【００３０】
本発明の第１〜第５の態様の好ましい実施の形態では、細胞懸濁液又はシリンジは１回量として提供される。
【００３１】
本発明の第２及び第５の態様の好ましい実施の形態では、低圧流の誘導を１分間〜６分間行い、上記細胞懸濁液の注入を２分間〜１０分間行う。
【００３２】
本発明の第６の態様では、以下を含む、本発明の第１の態様又はその好ましい実施の形態のいずれかにおいて規定される本発明の細胞懸濁液の製造方法に言及する：
１．  骨髄（ＢＭ）採取を、反復穿刺、好ましくは局所又は全身麻酔下での被験体の後腸骨稜からの反復穿刺によって行う。次いで、ＢＭ穿刺液を、好ましくは抗凝血剤溶液、より好ましくはクエン酸デキストロース溶液Ａ（ＡＣＤ−Ａ）の入った輸送用バッグ内に採取する。
２．  全ての小さな骨片を除去し、その後の工程における閉塞を防ぐために、ＢＭを好ましくは重力により濾過する。
３．  最初のＢＭ容量を、好ましくはＳｅｐａｘ  ２．０デバイス及び付属の滅菌ディスポＳｍａｒｔＲｅｄｕｘキット（ＣＳ−４９０．１）でのＳｍａｒｔＲｅｄｕｘプログラムを用いることによって、好ましくは約５０ｍＬ〜１００ｍＬまで減少させる。好ましくは約５０ｍＬ〜１００ｍＬのバフィーコート生成物を生じる、血漿及び赤血球（ＲＢＣ）の除去を含む本工程も最終生成物の純度に寄与する。
４．  任意に、処理される出発物質の容量に応じて１回又は２回のサイクルで減容工程を行う。容量が２２０ｍＬまでのＢＭサンプルは単一サイクルで処理し、２２０ｍＬを超えるサンプルは、同じキットを用いた２回のサイクルで処理する。単一及び２サイクルの両方の減容について、最終容量を約５０ｍＬ〜１００ｍＬに設定するのが好ましい。
５．  工程３又は工程４において確立される、減容されたＢＭの入った滅菌中間サンプルバッグを自動化密度勾配遠心分離にかけ、続いて、好ましくは生理食塩溶液中の２％〜４％ＨＳＡ（どちらも医薬品グレード）から構成される洗浄溶液を用いた単核細胞（ＭＮＣ）懸濁液の２回の洗浄を行う。およそ約４５ｍＬのＢＭ−ＭＮＣ生成物を産出バッグに採取し、他の構成要素を廃棄物バッグに除去する。好ましくは、減容されたＢＭの入った滅菌中間サンプルバッグを、ＮｅａｔＣｅｌｌ密度勾配遠心分離にかけ、続いて、好ましくは生理食塩溶液中の２％〜４％ＨＳＡ（どちらも医薬品グレード）から構成される洗浄溶液を用いた単核細胞（ＭＮＣ）懸濁液の２回の洗浄を行う。およそ約４５ｍＬのＢＭ−ＭＮＣ生成物を産出バッグに採取し、他の構成要素を廃棄物バッグに除去する。
６．  ＢＭ−ＭＮＣを、好ましくは５０ｍＬ容シリンジを用いて生成物バッグから採取し、好ましくは５０μｍフィルターに通して、好ましくは滅菌ファルコンチューブに濾過する。生成物バッグを洗浄溶液ですすぎ、濾過することで、ＭＮＣ回収率を改善する。ＢＭ−ＭＮＣ原薬の最終容量を４０ｍＬ〜６０ｍＬに調整する。
【００３３】
原薬を遠心分離し、ペレットを５ｍｌ〜３０ｍｌの容量の最終配合混合物、好ましくはヘパリンを含む生理食塩水、又は好ましくは１％のＨＳＡ及び好ましくは２．５％のグルコースを含む乳酸リンゲル液に再懸濁する。
【００３４】
上に前述したように、本発明の第６の態様により得られる最終細胞懸濁液生成物が、ＭＮＣ画分だけでなく顆粒球も含む生存白血球に基づいて投与されることに留意されたい。ＭＮＣは活性構成要素であるため、最終生成物中のＭＮＣのパーセンテージは品質特性とみなされる。
【００３５】
本発明の第７の態様では、本発明の第６の態様の方法によって得られる又は得ることができる細胞懸濁液生成物又は生成物容器、好ましくは１つ又は幾つかのシリンジに言及する。かかる細胞懸濁液生成物又は生成物容器を、本発明の第１〜第５の態様のいずれかに確立されるように使用することができることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の細胞懸濁液の製造の流れ図である。
【図２】本発明の細胞懸濁液の投与の３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後のＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類（対照対治療；切断及び死亡を含む；ＬＯＣＦ）を示す図である。
【図３】本発明の細胞懸濁液の投与の３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後のＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類（３つの漸増用量の影響；切断術及び死亡を含む；ＬＯＣＦ）を示す図である。
【図４】対照群及び本発明の細胞懸濁液の３つの群（用量）についての３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月及び１２ヶ月のＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類（被験体のパーセンテージ）の改善を示す図である。
【図５】３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月及び１２ヶ月の時点での患肢における潰瘍数によって分類された被験体の割合を示す図である（左パネル：対照群；右パネル：本発明の細胞懸濁液の群）。
【図６】生じた２４例の脈管形成のうち３例の血管造影画像を図６にベースラインに対して提示する：動脈の縦成長（図６Ａ）、新生血管の外観（図６Ｂ）及びその標的皮膚に平行な横成長（図６Ｃ）。
【図７】本発明の細胞懸濁液生成物の製造方法の流れ図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
本明細書で使用される場合、「自己」は、ドナー及びレシピエントが同じ個体である細胞調製物を指すものとして理解される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「同種異系」は、ドナー及びレシピエントが同じ個体でない細胞調製物を指すものとして理解される。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「成体骨髄由来細胞」は、胚性でなく、ヒトドナーから得られる骨髄に由来する細胞を含む調製物として理解される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「細胞懸濁液」は、液体培地中に懸濁された細胞の調製物として理解される。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「成体骨髄由来細胞の細胞懸濁液」は、液体培地中に懸濁された、胚性でなく、ヒトドナーから得られる骨髄に由来する細胞の調製物として理解される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４を発現する造血幹細胞」は、表面マーカーＣＤ３４を発現し、ＣＤ３４抗体染色及びフローサイトメトリーによってＣＤ３４陽性として特定される造血幹細胞として理解される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４を発現し、ＣＤ３８を発現しない初期非拘束造血幹細胞」は、表面マーカーＣＤ３４を発現し、ＣＤ３４抗体染色及びフローサイトメトリーによってＣＤ３４陽性として特定されるが、ＣＤ３８抗体染色及びフローサイトメトリーによって表面マーカーＣＤ３８について陰性と特定される造血幹細胞として理解される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ＣＸＣＲ４を発現する白血球」は、表面マーカーＣＤ４５及びＣＸＣＲ４を発現し、ＣＤ４５及びＣＸＣＲ４抗体染色及びフローサイトメトリーによってＣＤ４５及びＣＸＣＲ４に陽性として特定される細胞として理解される。ＣＸＣＲ４は、遊走因子ＳＤＦ−１の受容体である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４及びＣＸＣＲ４を発現する幹細胞」は、表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４及びＣＸＣＲ４を発現し、ＣＤ４５、ＣＤ３４及びＣＸＣＲ４抗体染色並びにフローサイトメトリーによってＣＤ４５、ＣＤ３４及びＣＸＣＲ４に陽性として特定される細胞として理解される。ＣＸＣＲ４は、遊走因子ＳＤＦ−１の受容体である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦＲ２を発現する白血球」は、表面マーカーＣＤ４５及びＶＥＧＦＲ２を発現し、ＣＤ４５及びＶＥＧＦＲ２抗体染色並びにフローサイトメトリーによってＣＤ４５及びＶＥＧＦＲ２に陽性として特定される細胞として理解される。ＶＥＧＦＲ２は、血管新生及び脈管形成因子であるＶＥＧＦの受容体である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「単核細胞」は、円形の核を有する任意の血液又は骨髄の白血球（ロイコサイトとも称される）として理解され、そのため顆粒球は除外される。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「下肢末梢動脈疾患」は、心臓又は脳に供給を行う動脈以外の動脈の狭窄として理解される。末梢動脈疾患は一般に肢部を冒すが、他の動脈が罹患する可能性もある。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「重症下肢虚血」は、病態が客観的に証明された動脈閉塞性疾患に起因する片脚又は両脚の慢性虚血性安静時疼痛（at-rest pain）、潰瘍又は壊疽を特徴とする末梢動脈疾患の下位区分として理解される。
【００５０】
数値に関した「約」という用語は、その数値の±２０％を意味する。数値に関した「約」という用語は、その数値の±１０％も含む。数値に関した「約」という用語は、その数値の±５％も含む。数値に関した「約」という用語は、その数値の±１％も含む。
【００５１】
「含む（"comprise" and "comprising"）」という用語は包括的で、排他的でない（open）意味で用いられ、付加的な要素が含まれ得ることを意味する。「含む」という用語は、「からなる」及び「から本質的になる」という用語も包含し、これらの用語と区別なく用いられる場合もある。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「成体」という用語は、幹細胞が胚性でないことを意味する。一実施形態では、「成体」は後胚期又は「出生後」を意味する。本発明の幹細胞に関して、「成体幹細胞」という用語は、幹細胞が胚形成期より後の成長段階の動物の組織又は器官から単離されることを意味する。成体幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊という起源によって定義される胚性幹細胞とは異なる。本発明による成体幹細胞は、任意の非胚性組織から単離することができ、新生児、小児、青年及び成体被験体を含む。概して、本発明の幹細胞は非新生児哺乳動物、例えば非新生児ヒトから単離される。本発明の幹細胞は、ヒトから単離されるのが好ましい。
【００５３】
「単離された」という用語は、それが指す細胞又は細胞集団が、その自然環境にないことを示す。この細胞又は細胞集団は、周囲組織から実質的に分離されている。
【００５４】
本発明において言及される新たな細胞懸濁液生成物のマーカープロファイルは、付加的なマーカーの存在及び／又は非存在、又は存在及び非存在マーカーの組合せの特定のプロファイルによって更に規定することができる。いずれの場合にも、マーカーの特定の組合せが、細胞の集団内の特定のプロファイル及び／又は集団内の個々の細胞上のマーカーの特定のプロファイルとして存在する可能性がある。
【００５５】
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、その存在、濃度、活性又はリン酸化状態を検出し、細胞の表現型を同定するために用いることができる任意の生体分子を包含する。
【００５６】
この場合、本発明の細胞は、或る特定の表現型マーカーについて陽性であり、他のマーカーについて陰性である。「陽性」とは、マーカーが細胞内で発現されることを意味する。発現されているとみなされるためには、マーカーは検出可能なレベルで存在する必要がある。「検出可能なレベル」とは、マーカーを記載のようなＰＣＲ、ブロッティング又はフローサイトメトリー分析等の標準的な実験室的方法論の１つを用いて検出することができることを意味する。
【００５７】
「発現された」という用語は、細胞の表面上又は細胞内のマーカーの存在を表すために用いられる。発現されているとみなされるためには、マーカーは検出可能なレベルで存在する必要がある。「検出可能なレベル」とは、ＰＣＲ、ブロッティング、免疫蛍光、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析等の標準的な実験室的方法論の１つを用いてマーカーを検出することができることを意味する。「発現された」は、検出可能なタンパク質の存在、タンパク質のリン酸化状態又はタンパク質をコードするｍＲＮＡを指す場合があるが、これらに限定されない。遺伝子は、発現を３０回のＰＣＲサイクル後、好ましくは３７回のＰＣＲサイクル後に十分に検出することができる場合に（細胞１個当たり少なくとも約１００コピーの細胞中の発現レベルに相当する）、本発明の細胞又は本発明の集団の細胞によって発現されるとみなされる。「発現する」及び「発現」という用語は、対応する意味を有する。この閾値未満の発現レベルでは、マーカーは発現されているとはみなされない。
【００５８】
詳細な説明
細胞懸濁液生成物
本発明による細胞懸濁液は、改善された治療法の有用な選択肢として、下肢末梢動脈疾患の治療又は改善、特に重症下肢虚血（ＣＬＩ）の治療、特にバイパス手術又は血管内治療を用いた血行再建術の選択肢を有しない、ＤＭを有する患者における重症下肢虚血（ＣＬＩ）の治療に適した生成物である。この意味で、驚くべきことに、本発明による細胞懸濁液が、下肢末梢動脈疾患の治療又は改善において使用した場合に、ＣＬＩ  ＩＩ度（４群）又はＩＩＩ度（５群）からＩ度（１群〜３群）又は０度（０群）へのＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類の変化、潰瘍についてだけでなく、大切断術についても改善された治癒過程、並びに血管伸長及び／又は血管密度の増大等の多くの臨床的に関連した改善をもたらすことが見出された。上記の利点の全てが細胞懸濁液の単回投与であっても得ることができ、実施例２において明らかに説明される。
【００５９】
一般的には、本発明の細胞懸濁液は、
Ａ．
ｉ．  リンパ球の集団、
ｉｉ．  単球の集団、及び、
ｉｉｉ．  ＣＤ３４を発現する造血幹細胞の集団、
を含む又はそれからなるリストから選択される単核細胞（ＭＮＣ）を含み、
Ｂ．  顆粒球、
を更に含む、自己又は同種異系、好ましくは自己の成体骨髄由来の細胞、好ましくは腸骨稜由来の細胞懸濁液を指す。
【００６０】
細胞集団Ａ）及びＢ）が遊走因子ＳＤＦ１の受容体であるＣＸＣＲ４を発現する細胞集団を含み、この集団からＣＤ３４及びＣＸＣＲ４を発現する造血幹細胞の亜集団の存在を指摘することが重要であることに留意されたい。加えて、細胞集団Ａ）及びＢ）は、血管新生及び脈管形成に関与する血管新生因子ＶＥＧＦの受容体であるＶＥＧＦＲ２を発現する細胞集団を含む。
【００６１】
最後に、細胞集団Ａ．のｉｉｉ）は、初期非拘束造血幹細胞であるＣＤ３８を発現しない細胞集団を含む。
【００６２】
したがって、具体的には、本発明による懸濁液は、ｉ）ＣＤ３４を発現する造血幹細胞、ｉｉ）ＣＤ３４を発現し、ＣＤ３８を発現しない初期非拘束造血幹細胞、ｉｉｉ）遊走因子ＳＤＦ−１の受容体であるＣＸＣＲ４を発現する白血球、ｉｖ）ＣＤ３４と遊走因子ＳＤＦ−１の受容体であるＣＸＣＲ４とを発現する造血幹細胞、ｖ）ＶＥＧＦの受容体であるＶＥＧＦＲ２を発現する白血球、並びにｖｉ）単球、顆粒球及びリンパ球を含む自己又は同種異系、好ましくは自己の成体骨髄由来細胞の細胞懸濁液である。
【００６３】
本発明の最終細胞懸濁液生成物が、単核白血球画分（リンパ球及び単球及び幹細胞）だけでなく、顆粒球も含む生存白血球骨髄由来細胞に基づいて投与されることに留意することが重要である。
【００６４】
したがって、本発明の細胞懸濁液は、ｉ）ＣＤ３４を発現する造血幹細胞、ｉｉ）ＣＤ３４を発現し、ＣＤ３８を発現しない初期非拘束造血幹細胞、ｉｉｉ）遊走因子ＳＤＦ−１の受容体であるＣＸＣＲ４を発現する白血球、ｉｖ）ＣＤ３４と遊走因子ＳＤＦ−１の受容体であるＣＸＣＲ４とを発現する造血幹細胞、ｖ）血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の受容体であるＶＥＧＦＲ２を発現する白血球、並びにｖｉ）単球、顆粒球及びリンパ球を含む自己又は同種異系、好ましくは自己の成体骨髄由来細胞の細胞懸濁液を指す。
【００６５】
好ましい実施形態では、単核細胞について富化された（細胞懸濁液中に存在する白血球（ＷＢＣ）の２５％超が単核細胞であることを意味する）最終配合物中の細胞懸濁液は、
約４×１０８個〜約２×１０９個の、好ましくは腸骨稜に由来する自己又は同種異系、好ましくは自己の白血球骨髄由来細胞を含み、約４×１０８個〜約２×１０９個の白血球の総数のうち、
ｉ．  約２０％〜約５１％がリンパ球であり、約３．９％〜約２２．３％が単球であり、
ｉｉ．  １．４％〜１０％がＣＤ３４を発現する造血幹細胞であり、
ｉｉｉ．  白血球の総数のうち約２５．３％〜約８３．３％が単核細胞であり、
ｉｖ．  約１６．７％〜約７４．７％が顆粒球であり、
ｖ．  白血球の総数のうち約５．４％〜約３８．８％がＣＸＣＲ４を発現し、
ｖｉ．  白血球の総数のうち約０．０７％〜約２４．７％がＶＥＧＦＲ２を発現し、
ｖｉｉ．  ＣＤ３４を発現する造血幹細胞の総数のうち、約７．７％〜約５５．５％がＣＤ３８を発現しない初期非拘束造血幹細胞であり、約０．７％〜約１０．３％がＣＤ３４及びＣＸＣＲ４を発現する幹細胞であり、
ｖｉｉｉ．  赤血球とロイコサイト細胞との最大比が６．７であり、血小板とロイコサイト細胞との最大比が３２である。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、白血球の総数のうち、３２．３％〜８０．０％がリンパ球、単球及びＣＤ３４を発現する造血幹細胞からなるリストから選択される単核細胞であり、２０．０％〜６７．７％が顆粒球である。
【００６７】
更に別の好ましい実施形態では、前段落において規定される最終配合物中の本発明の細胞懸濁液は、約４×１０８個〜約１．２×１０９個の白血球、より好ましくは約５×１０８個〜約２×１０９個の白血球、更により好ましくは約５×１０８個〜約１．２×１０９個の白血球、及び上に挙げた各々の値の間の全ての投与量値を含む。
【００６８】
或る特定の実施形態は、最終配合物中の白血球のこれらの値から部分範囲として選択することができる。例えば、特定の実施形態は、８×１０８個超〜約１．２×１０９個の白血球の白血球含量として選択することができる。実施形態において選択することができる範囲の別の例は、約９×１０８個〜約１．１×１０９個の白血球の含量の選択である。特定の実施形態について選択することができる範囲の第３の例は、約９．５×１０８個〜約１．０５×１０９個の白血球の選択である。特定の実施形態について選択することができる範囲の第４の例は、９．８×１０８個超〜約１．０２×１０９個の白血球等の含量の選択である。
【００６９】
含量又は濃度の実施形態の選択することができる範囲の他の例としては、６×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）が挙げられる。別の例は、７×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、８×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、８．５×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、９×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。別の例は、９．５×１０８個超から約２×１０９個、好ましくは約１．２×１０９個までの白血球の範囲（その間の全ての投与量値を包含する）の選択である。このため、本明細書の値から当業者に理解されるように選択することができる全ての投与量範囲が本発明に包含される。
【００７０】
上述の各々の細胞集団を測定する方法は、本発明の詳細な説明において明らかに確立される。特に、リンパ球、単球、顆粒球、血小板及びＲＢＣの各々を測定する方法は、自動化血液セルカウンター（ＡＢＸ  Ｐｅｎｔｒａ  ６０、Horiba Medical）による総細胞計数及び分化細胞計数を用いて行われる。前駆細胞のパーセンテージ、ＣＸＣＲ４発現細胞のパーセンテージ及びＶＥＧＦＲ２発現細胞のパーセンテージを、フローサイトメーター（ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０、Miltenyi Biotec）を用いて決定した。
【００７１】
かかる細胞懸濁液が薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含み得ることに留意されたい。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、本発明の細胞懸濁液の細胞を、好ましくは約１％ＨＳＡ及び約２．５％グルコースを含む、５ｍｌ〜３０ｍｌの容量のヘパリン添加生理食塩溶液又は乳酸リンゲル液に懸濁する。
【００７３】
本発明は、上で規定される本発明の細胞懸濁液と、任意に薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。薬学的に許容可能な担体は、細胞の生存能力及び機能性を支持する培地を含んでいてもよい。かかる培地は、レシピエントにおける免疫応答の誘発を回避するために無血清とすることができる。担体は緩衝化され、パイロジェンフリーである。
【００７４】
薬学的に許容可能な担体及び希釈剤としては、生理食塩水、緩衝水溶液及び／又は分散媒が挙げられる。かかる担体及び希釈剤の使用は当該技術分野で既知である。溶液は滅菌され、投与用シリンジの使用を可能にするために十分に低粘度である。
【００７５】
薬学的に許容可能な担体とすることができる材料及び溶液の例も当該技術分野で既知である。
【００７６】
好ましい実施形態では、本明細書の実施例において説明される細胞懸濁液生成物の最終医薬配合溶液は、ヘパリン添加生理食塩水から構成されたことに留意されたい（表４を参照されたい）。２．５％グルコース及び１％ＨＳＡを添加した乳酸リンゲル液（２．７ｍｇ／１００ｍＬの塩化カルシウム二水和物、３２０ｍｇ／１００ｍＬの乳酸ナトリウム、４０ｍｇ／１００ｍＬの塩化カリウム及び６００ｍｇ／１００ｍＬの塩化ナトリウム）を使用することもできる（表２を参照されたい）。
【００７７】
本発明の実施例において説明される最終配合培地は、１０ｍＬのグルコース（２．５％）及び１ｍＬのＨＳＡ（２０％）を９ｍＬの乳酸リンゲル液に添加することによって、クラスＡ  ＢＳＣ内で各バッチについて処理日に新たに調製した。
【００７８】
【表２】
2019528325.tif 000003
【００７９】
したがって、特に好ましい賦形剤は、好ましくはグルコース及びＨＳＡを添加した、乳酸リンゲル液である。
【００８０】
別の好ましい実施形態では、本発明の細胞懸濁液又は本発明の医薬組成物は、凍結培地中で凍結することができる。−１３５℃〜−１９０℃の温度で細胞の生存能力を保つ任意の培地が凍結培地として好適である。例えば、凍結培地は２．５％〜１０％のＤＭＳＯを含み得る。より具体的には、凍結培地は５％〜１０％のＤＭＳＯを含み得る。
【００８１】
凍結培地は、本明細書に記載の培養培地又は増殖培地をベースとし、ヒト血清、又は細胞の融解後に細胞の完全性を維持することが可能な任意の他のタンパク質若しくはタンパク質の混合物を更に含んでいてもよい。
【００８２】
融解後に、本発明の細胞を洗浄して、投与又は投与溶液への再懸濁の前にＤＭＳＯ又は他の凍結培地の構成要素を除去することができる。投与溶液は、毒性なしに患者に注射することが可能な任意の生理溶液である。投与溶液は、１％〜１５％のタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含み得る。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の治療方法又は治療的使用のいずれかに用いることもできる。
【００８４】
前述のように、本発明の細胞懸濁液は、実施例２において説明されるように、新たな及び既存の血管の（再）生成を加速し、既存の血管内での血流を改善する。このため、本発明の細胞懸濁液は、下肢末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、好ましくはＣＬＩ、より好ましくはバイパス手術又は血管内治療を用いた血行再建術の選択肢を有しない患者におけるＤＭを伴うＣＬＩの治療に特に有利である。実施例２は、本発明の第１の態様において規定される本発明の細胞懸濁液の定義に含まれる特定の薬用細胞懸濁液生成物を使用することによって行った。かかる薬用細胞懸濁液生成物は、１０ｍＬ〜３０ｍＬのヘパリン添加生理食塩水中に配合したＢＭ−ＭＮＣ原薬から作製した。かかる薬用細胞懸濁液生成物を種々の投与量で使用したが、好ましい投与量は、約５×１０８個〜約１×１０９個であった。使用した最終容器は、１本〜３本の投与用シリンジであった。この細胞懸濁液生成物に関するデータを、３２個の被験体バッチについて第二相研究（ＣＭＭｏ／ＩＣＰＤ／２００８）において収集した。下記表２に、ＷＢＣ及び分化（リンパ球、単球）数を含む、それぞれの被験体についての自動化セルカウンターのデータをまとめる。ＲＢＣ及び血小板の濃度、並びに顆粒球のパーセンテージを含む生成物関連不純物も各被験体について挙げる。
【００８５】
また、同じ生成物の表現型分析を、以下の細胞型の分析を含めて表３に示す：
ＣＤ３４＋                                  造血幹細胞
ＣＤ３４＋ＣＤ３８−                        初期非拘束ＨＳＣ
ＣＤ１３３＋                                内皮前駆細胞を含有する細胞集団
ＣＤ９０＋                                  初期造血幹細胞
ＣＸＣＲ４＋                                ＳＤＦ−１受容体を発現する細胞
ＶＥＧＦＲ２＋                              血管内皮成長因子受容体２を発現する細胞
ＣＤ３１＋ＣＤ１４６＋ＣＤ１３３−          成熟内皮細胞
ＣＤ３４＋ＶＥＧＦＲ２＋ＣＤ１３３＋        後期増殖内皮前駆細胞
ＣＤ３４−ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７３＋  ＭＳＣ
【００８６】
原薬から収集したデータを表２及び表３に示す。
【００８７】
【表３】
2019528325.tif 000004
【００８８】
【表４】
2019528325.tif 000005
【００８９】
上記表２及び表３において説明される、３２個の被験体バッチについて第二相研究（ＣＭＭｏ／ＩＣＰＤ／２００８）において収集された結果に基づき、本発明の細胞懸濁液生成物の特性評価を行った。
【００９０】
本発明が本発明の細胞懸濁液を含む１本〜３本の（プレフィルド）シリンジを更に包含することに留意されたい。
【００９１】
加えて、必要に応じて、本発明の細胞懸濁液の細胞は例えば、限定されるものではないが、それらのゲノムにおける遺伝子導入、欠失又は挿入のプロセス等を含む任意の従来の方法によって遺伝子操作されていてもよい。
【００９２】
細胞懸濁液生成物の製造方法
本発明の細胞懸濁液生成物は、多数の方法で製造することができるが、製造方法がＢＭ穿刺液中のＭＮＣ画分を血漿、血小板、ＲＢＣ及び顆粒球の除去によって富化することを意図した密度、粒径及び重力に基づく分離工程のみからなることから、本発明の細胞懸濁液が最小限に操作されたＢＭ−ＭＮＣ（骨髄−単核細胞）生成物であるとみなすことができるように、実施例１において詳述されるように製造するのが好ましい。
【００９３】
実施例１に記載される製造方法は、以下のように簡潔にまとめられる：
工程０．  骨髄（ＢＭ）採取を、反復穿刺、好ましくは局所麻酔下での被験体の後腸骨稜からの反復穿刺によって行う。次いで、ＢＭ穿刺液を、好ましくはクエン酸デキストロース溶液Ａ（ＡＣＤ−Ａ）抗凝血剤の入った輸送用バッグ内に採取する。
工程１：濾過  −  全ての小さな骨片を除去し、その後の工程における閉塞を防ぐために、ＢＭを、好ましくは重力により濾過する。
工程２：ＳｍａｒｔＲｅｄｕｘ減容  −  最初のＢＭ容量を、好ましくはＳｅｐａｘ  ２．０デバイス及び付属の滅菌ディスポＳｍａｒｔＲｅｄｕｘキット（ＣＳ−４９０．１）でのＳｍａｒｔＲｅｄｕｘプログラムを、製造業者の取扱説明書に従って用いることによって約５０ｍＬ〜１００ｍＬまで減少させる。約５０ｍＬ〜１００ｍＬのバフィーコート生成物を生じる、血漿及び赤血球（ＲＢＣ）の除去を含む本工程も最終生成物の純度に寄与する。
減容工程は、処理される出発物質の容量に応じて１回又は２回行う。容量が２２０ｍＬまでのＢＭサンプルは単一サイクルで処理し、２２０ｍＬを超えるサンプルは、同じキットを用いた２回のサイクルで処理する。
単一及び２サイクルの両方の減容について、最終容量を約５０ｍＬ〜１００ｍＬに設定する。
工程３及び工程４：ＮｅａｔＣｅｌｌ密度勾配  −  減容されたＢＭの入った滅菌中間サンプルバッグを、密度勾配遠心分離にかけ、続いて、好ましくは生理食塩溶液中の２％〜４％ＨＳＡ（どちらも医薬品グレード）から構成される洗浄溶液を用いた単核細胞（ＭＮＣ）懸濁液の２回の洗浄を行う。およそ約４５ｍＬのＢＭ−ＭＮＣ生成物を産出バッグに採取し、他の構成要素を廃棄物バッグに除去する。
工程５：ＢＭ−ＭＮＣ濾過  −  ＢＭ−ＭＮＣを、５０ｍＬ容シリンジを用いて生成物バッグから採取し、５０μｍフィルターに通して滅菌ファルコンチューブに濾過する。生成物バッグを洗浄溶液ですすぎ、濾過することで、ＭＮＣ回収率を改善する。ＢＭ−ＭＮＣ原薬の最終容量を４０ｍＬ〜６０ｍＬに調整する。
【００９４】
最終工程（工程６）は、本発明の最終細胞懸濁液生成物の調製からなる。かかる最終生成物を、ＭＮＣ画分だけでなく顆粒球も含む生存白血球に基づいて投与する。ＭＮＣは活性構成要素であるため、最終生成物中のＭＮＣのパーセンテージは品質特性とみなされる。この意味で、最終生成物の品質特性に影響を及ぼし得る幾つかのプロセスパラメーターが存在する。この点で、生成物の製造に重要であると考えられる、最終生成物中のＭＮＣのパーセンテージに影響を及ぼす可能性がある工程を表５に示す。
【００９５】
【表５】
2019528325.tif 000006
【００９６】
ＳｍａｒｔＲｅｄｕｘ工程  −  本工程は、最初のＢＭ容量をＮｅａｔｃｅｌｌ手順で処理するのに十分に少ない容量まで減少させることを意図したものである（ＮｅａｔＣｅｌｌの最大投入容量は１２０ｍＬである）。加えて、ＳｍａｒｔＲｅｄｕｘ工程はＲＢＣ、血漿及びバフィーコート生成物への分画を含み、ＮｅａｔＣｅｌｌ生成物の純度に寄与する。
【００９７】
本工程と関連する重要なパラメーターは、ＢＭ穿刺液からのＭＮＣの回収率に直接影響を及ぼすことから、遠心分離の速度及び時間である。
【００９８】
ＮｅａｔＣｅｌｌ工程  −  用いられる自動化ＭＮＣ富化方法は製造業者によって設計及び標準化され、ＢＭ穿刺液をＭＮＣについて富化することを意図し、したがって重要である。ＮｅａｔＣｅｌｌ出発物質のＨｃｔは、ＭＮＣ精製の効率に影響を及ぼすことから、重要な物質特性である。遠心分離の速度及び時間、並びにフィコール密度及び容量を含む重要なプロセスパラメーターは、ＮｅａｔＣｅｌｌプログラムでは一定である。
【００９９】
ＭＮＣコンパートメントにおいては、複数の細胞集団が最終生成物の作用様式において重要な役割を果たすと考えられる。したがって、これらの細胞の存在及び機能性が考慮すべき（considered）品質特性（ＣＱＡ）である。
【０１００】
フィコール密度勾配遠心分離後に得られるＭＮＣ画分は、フィコールよりも低い密度を有し、したがって遠心分離中にフィコール層に浸透するのに十分に高密度ではない細胞を含有する。結果として、この方法に用いられるフィコールの密度がＭＮＣ集団の組成に直接影響を及ぼすため、重要なプロセスパラメーターと考えられる。用いられる密度は１．０７７ｇｒ／ｍｌである。
【０１０１】
製造は連続プロセスであり、任意の活性化工程、又はＭＮＣ画分中の特定の細胞集団の機能性に影響を及ぼす可能性がある、細胞の他の大規模な操作を含まない。プロセス時間が細胞の機能性に影響を及ぼす可能性があり、したがって、待機時間はプロセスに組み込まれず、プロセス全体がクリーンルーム環境において４時間〜５時間以内に完了するのが好ましい。機能性は、被験体の疾患状態及び被験体の全身の生理的変動に影響を受ける可能性もある。
【０１０２】
上記に基づき、本発明の更なる態様では、以下を含む、本発明の細胞懸濁液の製造方法に言及する：
１．  骨髄（ＢＭ）採取を、反復穿刺、好ましくは局所又は全身麻酔下での被験体の後腸骨稜からの反復穿刺によって行う。次いで、ＢＭ穿刺液を、好ましくは抗凝血剤溶液、より好ましくはクエン酸デキストロース溶液Ａ（ＡＣＤ−Ａ）の入った輸送用バッグ内に採取する。
２．  全ての小さな骨片を除去し、その後の工程における閉塞を防ぐために、ＢＭを、好ましくは重力により濾過する。
３．  最初のＢＭ容量を、好ましくはＳｅｐａｘ  ２．０デバイス及び付属の滅菌ディスポＳｍａｒｔＲｅｄｕｘキット（ＣＳ−４９０．１）でのＳｍａｒｔＲｅｄｕｘプログラムを用いることによって、好ましくは約５０ｍＬ〜１００ｍＬまで減少させる。好ましくは約５０ｍＬ〜１００ｍＬのバフィーコート生成物を生じる、血漿及び赤血球（ＲＢＣ）の除去を含む本工程も最終生成物の純度に寄与する。
４．  任意に、処理される出発物質の容量に応じて１回又は２回のサイクルで減容工程を行う。容量が２２０ｍＬまでのＢＭサンプルは単一サイクルで処理し、２２０ｍＬを超えるサンプルは、同じキットを用いた２回のサイクルで処理する。単一及び２サイクルの両方の減容について、最終容量を約５０ｍＬ〜１００ｍＬに設定するのが好ましい。
５．  工程３又は工程４において確立される、減容されたＢＭの入った滅菌中間サンプルバッグを密度勾配遠心分離にかけ、続いて、好ましくは生理食塩溶液中の２％〜４％ＨＳＡ（どちらも医薬品グレード）から構成される洗浄溶液を用いた単核細胞（ＭＮＣ）懸濁液の２回の洗浄を行う。およそ約４５ｍＬのＢＭ−ＭＮＣ生成物を産出バッグに採取し、他の構成要素を廃棄物バッグに除去する。より好ましくは、減容されたＢＭの入った滅菌中間サンプルバッグを、ＮｅａｔＣｅｌｌ密度勾配遠心分離にかけ、続いて、好ましくは生理食塩溶液中の２％〜４％ＨＳＡ（どちらも医薬品グレード）から構成される洗浄溶液を用いた単核細胞（ＭＮＣ）懸濁液の２回の洗浄を行う。およそ約４５ｍＬのＢＭ−ＭＮＣ生成物を産出バッグに採取し、他の構成要素を廃棄物バッグに除去する。
６．  ＢＭ−ＭＮＣを、好ましくは５０ｍＬ容シリンジを用いて生成物バッグから採取し、好ましくは５０μｍフィルターに通して、滅菌ファルコンチューブに濾過する。生成物バッグを洗浄溶液ですすぎ、濾過することで、ＭＮＣ回収率を改善する。ＢＭ−ＭＮＣ原薬の最終容量を４０ｍＬ〜６０ｍＬに調整する。
【０１０３】
本発明の細胞懸濁液の製造が好ましくは単核細胞の富化を含む連続プロセスであり、プロセスが再処理の選択肢を含まないことに留意することも重要である。
【０１０４】
原薬の調製に続いて、ＭＮＣの遠心分離を７６０×ｇで１０分間にわたって室温で行うのが好ましい。細胞を最終配合物（好ましくは２．５％グルコース及び１％ＨＳＡを添加し、滅菌パイロジェンフリー（non pyrogenic）プラスチックシリンジ（複数の場合もある）に滅菌条件下で移したヘパリン添加生理食塩水又は乳酸リンゲル液）に再懸濁する。
【０１０５】
最終生成物のうち、２ｍＬ〜３ｍＬを任意に品質管理（ＱＣ）試験のためにバイアルに移してもよく、８ｍＬ〜１２ｍＬを各々の滅菌パイロジェンフリープラスチックシリンジに滅菌条件下で移すのが好ましい。次いで、汚染を防ぐために閉鎖コーンを備えるシリンジを、被験体への投与のための関連する画像下治療ユニットへの輸送のために滅菌使い捨てプラスチックジッパーバッグ及び輸送箱で梱包する。
【０１０６】
製造方法の概要を図面に示す。
【０１０７】
細胞懸濁液生成物の適用性
実施例２において明らかに示される結果から、本発明の細胞懸濁液の投与後最初の１２ヶ月間で、被験体が、僅か２人（１３％）の被験体が応答した対照群と好都合に比較される、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄの１群〜３群（１度）への分類の低下（２９人（６４％）の被験体）によって実証される臨床的に関連した応答を達成したことが示された。
【０１０８】
ベースライン来院時に、本発明の細胞懸濁液の注入を受けた治療群の２５人（５６％）の被験体が非治癒性虚血性潰瘍を示したが、投与の１２ヶ月後の経過観察来院までに、１８人（７５％）の被験体にもはや潰瘍が存在せず（１人が大切断術）、２４人（６０％）の被験体が、信頼性の高い治癒の予測因子（prediction）であるＴｃＰＯ２≧４０ｍｍＨｇの増大を示した。脈管形成を本発明の細胞懸濁液の投与の６ヶ月後に評価した。本発明の細胞懸濁液で治療した被験体では、脈管形成が２６人（６２％）の被験体、それぞれ最低用量群、中用量群、最高用量群の７人、８人及び９人の被験体に見られた。
【０１０９】
経過観察中の治療時に被験体に予期せぬ重篤な有害反応の疑い（Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction；ＳＵＳＡＲ）は認められなかった。３例のＡＥが投与経路に関連すると考えられ、軽微な注射部位反応であった。ＡＥの結果として試験を途中で中断した被験体はなく、被験体に本発明の細胞懸濁液に関連するＡＥは認められなかった。Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与前にＳＡＥは生じず、Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与後最初の２４時間にＳＡＥは生じなかった。対照群の１７例のＳＡＥ（９人の被験体）及びＲｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔ治療群の２４例のＳＡＥ（１４人の被験体；低用量  １×１０８個のＢＭ−ＭＮＣ：４人の被験体；中用量  ５×１０８個のＢＭ−ＭＮＣ：４人の被験体；最高用量  １×１０９個のＢＭ−ＭＮＣ：６人の被験体）の合計４１例のＳＡＥが経過観察期間（１２ヶ月）中に２３人の被験体によって記録された。２人の被験体が心血管疾患の結果として死亡した。
【０１１０】
このため、本発明の細胞懸濁液は、下肢末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、好ましくはＣＬＩ、より好ましくはバイパス手術又は血管内治療を用いた血行再建術の選択肢を有しない患者におけるＤＭを伴うＣＬＩの治療に特に有利であることが明らかである。
【０１１１】
したがって、本発明の更なる態様では、好ましくはヒト被験体における、下肢末梢動脈疾患の治療又は改善における使用のための「細胞懸濁液生成物」と題されたセクションに規定される細胞懸濁液、プレフィルドシリンジ又は医薬組成物に言及する。
【０１１２】
下肢末梢動脈疾患は重症下肢虚血であることが好ましい。
【０１１３】
より好ましくは、「細胞懸濁液生成物」と題されたセクションに規定される細胞懸濁液、プレフィルドシリンジ又は医薬組成物は、インフレータブルバルーンを遠位大腿又は膝窩動脈で閉塞性血管病変の近位に配置し、上記細胞懸濁液を動脈内に注入することによって最大４気圧の低圧血流を得る動脈内投与により下肢末梢動脈疾患、好ましくは重症下肢虚血を治療する方法に使用される。
【実施例】
【０１１４】
実施例１．  材料及び方法
１．  細胞懸濁液及びその作製方法
本発明を説明するために、幾つかの成熟細胞型及び造血前駆細胞から構成されるＢＭ−ＭＮＣの自己細胞懸濁液で作製される本発明による細胞懸濁液を以下の実施例で使用した。最終生成物の配合は、存在する生存ＷＢＣの数に基づくものであった。
【０１１５】
本発明の細胞懸濁液の特性評価は、自動化血液セルカウンター（ＡＢＸ  Ｐｅｎｔｒａ  ６０、Horiba Medical）による総細胞計数及び分化細胞計数を用いて行った。前駆細胞のパーセンテージ、及び遊走因子ＳＤＦ−１受容体ＣＸＣＲ４を発現するＷＢＣ（ＣＤ４５＋細胞）、又は血管新生因子ＶＥＧＦ受容体２を発現するＷＢＣを、フローサイトメーター（ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０、Miltenyi Biotec）を用いて決定した。
【０１１６】
３２個の臨床バッチの白血球（ＷＢＣ）の濃度、リンパ球、単球、顆粒球及び前駆細胞の割合、並びにＣＸＣＲ４又はＶＥＧＦＲ２を発現する総ＷＢＣを表６に提示する。
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
本発明の細胞懸濁液をＧＭＰ条件下で製造した。全てのプロセス工程をクラスＢクリーンルーム内で行い、半閉鎖式操作（スパイク接続及びルアーロック接続）及び開放式操作はクラスＡ  ＢＳＣ内で行った。
【０１１９】
簡潔に述べると、骨髄を無菌濾過して骨片を除去し、続いて自動化減容工程を行い、更に処理するのに十分に少ない容量を得た。
【０１２０】
次に、細胞を、洗浄工程を含む自動化フィコール密度勾配遠心分離に供した。生成物を濾過することで５０ｍＬのＢＭ−ＭＮＣ画分を得て、これを原薬とした。
【０１２１】
原薬製造方法全体が、スパイク及びルアーロックの接続以外は閉鎖式であった。細胞分離工程は、この方法の標準化を確実にするために自動化システム内で行った。
【０１２２】
本発明の細胞懸濁液の製造方法の流れ図を図１に提示する。加えて、製造方法を下に詳細に記載する：
工程０：骨髄（ＢＭ）採取を、ＢＭ穿刺装置に接続した５ｍＬ容シリンジを用いた局所麻酔下での被験体の後腸骨稜からの反復穿刺によって行った。ＢＭ穿刺液を、およそ２５０ｍＬ〜３５０ｍＬの容量に達するまでクエン酸デキストロース溶液Ａ（ＡＣＤ−Ａ）抗凝血剤の入った６００ｍＬ容の輸送用バッグに採取した。新鮮ＢＭの入った輸送用バッグを取扱説明書に従って梱包し、発送の準備をする。ＢＭを室温（１５℃〜２１℃）でRexgeneroへ即時処理のために１回の発送で発送する。
工程１：濾過  −  全ての小さな骨片を除去し、その後の工程における閉塞を防ぐために、ＢＭを重力により２００μｍインラインフィルターに通して濾過した。濾過後に、サンプルをインプロセス試験のために採取し、採取バッグを秤量し、質量を体積に換算することで、細胞処理の設定における投入容量を得た。
工程２：ＳｍａｒｔＲｅｄｕｘ減容  −  およそ３００ｍＬの最初のＢＭ容量を、Ｓｅｐａｘ  ２．０デバイス及び付属の滅菌ディスポＳｍａｒｔＲｅｄｕｘキット（ＣＳ−４９０．１）でのＳｍａｒｔＲｅｄｕｘプログラムを、製造業者の取扱説明書に従って用いることによって５０ｍＬまで減少させた。５０ｍＬのバフィーコート生成物を生じる、血漿及び赤血球（ＲＢＣ）の除去を含む本工程も最終生成物の純度に寄与する。減容工程は、処理される出発物質の容量に応じて１回又は２回行った。容量が２２０ｍＬまでのＢＭサンプルは単一サイクルで処理し、２２０ｍＬを超えるサンプルは、同じキットを用いた２回のサイクルで処理した。単一及び２サイクルの両方の減容について、最終容量を５０ｍＬに設定した。
工程３及び工程４：ＮｅａｔＣｅｌｌ密度勾配  −  減容されたＢＭの入った滅菌中間サンプルバッグをＮｅａｔｃｅｌｌキット（ＣＳ−９００．２）に接続し、製造業者の取扱説明書に従ってＳｅｐａｘ  ２．０デバイスでのＮｅａｔＣｅｌｌプログラムを用いて処理した。本工程は、フィコール１０７７での密度勾配遠心分離に続く、生理食塩溶液中の２．５％又は４％ＨＳＡ（どちらも医薬品グレード）から構成される洗浄溶液を用いた単核細胞（ＭＮＣ）懸濁液の２回の洗浄からなっていた。およそ４５ｍＬのＢＭ−ＭＮＣ生成物を産出バッグに採取し、他の構成要素を廃棄物バッグに除去した。
工程５：ＢＭ−ＭＮＣ濾過  −  ＢＭ−ＭＮＣを、５０ｍＬ容シリンジを用いて生成物バッグから採取し、５０μｍフィルターに通して滅菌ファルコンチューブに濾過した。生成物バッグを洗浄溶液ですすぎ、濾過することで、ＭＮＣ回収率を改善した。ＢＭ−ＭＮＣ原薬の最終容量を５０ｍＬに調整した。
【０１２３】
２．  研究集団の選択
平均年齢６４．３（±９．５）歳（範囲：４６歳〜８０歳）の外科的又は血管内血行再建術を受けることができないＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ＩＩ度（４群）又はＩＩＩ度（５群）のＣＬＩ及びＤＭを有する合計６０人の被験体（男性５０人（８３％）及び女性１０人（１７％））を登録し、１：１：１：１比で無作為に割り当て、標準ケアに加えて本発明の細胞懸濁液の単回投与を行うか（３つの用量レベル：１×１０８個、５×１０８個又は１×１０９個のＢＭ−ＭＮＣのうち１つ；１治療群当たり１５人の被験体）、又は標準ケア単独に従って治療した（１５人の被験体）。本発明の細胞懸濁液は単回注入で動脈内に投与した。この試験のために、層別ランダム化を適用し、Transatlantic Inter-Society Consensus Document on Management of Peripheral Arterial Disease（ＴＡＳＣ  ＩＩ）によれば血管内又は外科的血行再建術の選択肢を有しないＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ＣＬＩ  ＩＩ度及びＩＩＩ度（４群及び５群）について層を構成した。ＣＬＩが両脚に見られる場合には、既に足指より上の脚部に外科的切断術を受けていない限りにおいて、より進行した／重症の疾患を有すると担当医師によって決定された脚に注入を行った。試験被験体はベースライン来院時（来院１）、Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与の２４時間後及び１ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後、１２ヶ月後（それぞれ来院３、来院４、来院５、来院６、来院７及び来院８）に評価した。対照群に割り当てられた被験体は、来院２及び来院３に来る必要はなかった。
【０１２４】
３．  組み入れ基準
被験体は、以下の組み入れ基準の全てを満たす場合に試験組入れの対象であった：
１．  １８歳以上かつ８０歳以下の男女の被験体。
２．  Ｉ型又はＩＩ型ＤＭの治療を受けている被験体。
３．  ＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄによるＣＬＩ  ＩＩ度及びＩＩＩ度（４群及び５群）。
４．  ＴＡＳＣ  ＩＩによって推奨されるように、外科的又は血管内血行再建術が不可能であること。
５．  ２年を超える余命。
６．  組入れ後１２ヶ月間に肢部の大切断術が予期されないこと。
７．  ロイコサイト≧３０００個／ｍＬ、好中球≧１５００個／ｍＬ、血小板≧１０００００個／ｍｍ３、ＡＳＴ／ＡＬＴ≦標準範囲の２．５倍、クレアチニン≦２．５ｍｇ／ｄＬによって規定される正常な生化学的パラメーター。
８．  被験体が試験への参加の書面によるインフォームドコンセントを提出していること。
９．  出産可能な女性は、試験への組入れ時に行われる各病院の標準手順に従う妊娠検査について陰性結果を有しており、試験中に医学的に認められた避妊法の使用に取り組む必要がある。
【０１２５】
４．  除外基準
被験体は、以下の除外基準のいずれかを満たす場合に試験への参加から除外された：
１．  新生物又は血液疾患（骨髄増殖性疾患、白血病又は骨髄異形成症候群）の既往歴。
２．  管理不良高血圧（２回以上の１８０ｍｍＨｇ／１１０ｍｍＨｇを超える血圧と規定される）を有する被験体。
３．  重症の心不全（ニューヨーク心臓協会ステージＩＶ）。
４．  悪性心室性不整脈又は不安定狭心症を有する被験体。
５．  スクリーニング前３ヶ月以内の深部静脈血栓症の診断。
６．  Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与が計画される日と同日に見られる活動性感染又は壊疽。
７．  高圧酸素療法、血管作動物質、Ｃｏｘ−ＩＩ阻害剤を含む併用療法。
８．  ＢＭＩ＞４０ｋｇ／ｍ２。
９．  組入れ時にアルコール依存症の診断を有する被験体。
１０．  増殖性網膜症。
１１．  余命を１年未満に短縮する合併症。
１２．  ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎。
１３．  プロトコルの全側面に従おうとしなかった又は従うことができなかった被験体。
１４．  心不全又は３０％未満の駆出率。
１５．  スクリーニング来院前３ヶ月以内の脳卒中又は心筋梗塞。
１６．  貧血（ヘモグロビン＜１０ｇ／ｄＬ）。
１７．  白血球減少症。
１８．  血小板減少症（１０００００個／ｍｍ３未満の血小板）。
１９．  妊婦又は適切な避妊法を用いていなかった出産可能年齢の女性。
２０．  本試験のスクリーニング前３ヶ月以内に臨床試験に参加していた被験体。
【０１２６】
５．  研究からの被験体の排除
被験体は、以下の理由のいずれかのために試験から排除される可能性があった：
ランダム化の結果に基づく細胞懸濁液の最適最終濃度を達成することができないこと。この場合、ＰＩが生成物を投与するか否かを決定すべきである。
インフォームドコンセントから計画投与日までの重篤有害事象（ＳＡＥ）の存在。
大きなプロトコル逸脱。被験体がプロトコル参加基準を満たすことができないか又はプロトコル要件を忠実に守らず、参加の継続が被験体の健康に受け入れ難いリスクを生じさせることのランダム化後の発覚。
参加の継続が被験体の健康に受け入れ難いリスクを及ぼすことから早期終了を必要とするＡＥ若しくは治療前事象が被験体に認められたか、又は被験体がＡＥ若しくは治療前事象のために継続を望まなかった。
任意離脱。被験体（又は被験体の法定代理人等）が試験からの離脱を望んだ。
追跡不能。被験体が臨床に戻らず、被験体と連絡を取る試みが失敗した。被験体と連絡を取る試みは文書化した。被験体が試験から離脱する場合、可能であれば早期終了来院のために予定された全手順を行った。
【０１２７】
医薬品の臨床試験の実施の基準（good clinical practice）により、試験から途中で離脱した全ての被験体に代替療法を推奨した。離脱が顕著なＡＥ（有害事象）の発生に起因する場合、被験体は責任医師により完了まで、すなわち、ＡＥが解消されるまで又はそれが恒久的な事象となることが決定されるまでモニタリングされた。試験中断の主な理由をＣＲＦに記録した。
【０１２８】
６．  実行した治療
治験薬
局所麻酔及び鎮静下で、或る容量のＢＭ（９０ｍＬ〜４２０ｍＬ）を連続穿刺により腸骨稜から収集した。ＢＭは、１：５（ＢＭ容量）の比率で抗凝血剤としてＡＣＤ−Ａ溶液の入った輸送用バッグに採取した（上記の項目１を参照されたい）。
【０１２９】
ＢＭ−ＭＮＣの懸濁液を、変更なしに又はその生物学的機能性に影響を及ぼす可能性がある任意の生成物を添加することなく、密度勾配遠心分離によって得た。
【０１３０】
本発明の細胞懸濁液を以下の１回量で投与した：
１×１０８個のＢＭ−ＭＮＣ
５×１０８個のＢＭ−ＭＮＣ
１×１０９個のＢＭ−ＭＮＣ
【０１３１】
本発明の細胞懸濁液は、動脈内カテーテルを用いて投与した。標的肢の動脈に、全ての場合において膝より下ではない可能な限り遠位に進めたオーバーザワイヤーカテーテルバルーン（膝窩径に適合する）を経大腿アプローチにより挿管し、通常は遠位大腿又は膝窩動脈で閉塞性血管病変の近位に配置した。この点で、バルーンを膨らませて血流を遮断し、本発明の細胞懸濁液を３分間（ｍｉｎ）かけてゆっくりと注入した。投与後にバルーンをしぼませ、順行性血流を回復させた。
【０１３２】
本発明の細胞懸濁液の投与は、細胞治療ユニットから直接派遣された血管専門医（画像下治療医又は血管外科医）によってＢＭ採取の３時間〜５時間後に行われた。
【０１３３】
全ての被験体を、ＴＡＳＣ  ＩＩ治療ガイドラインに記載される膝窩動脈下重症アテローム性血管疾患の現在の標準ケアにより治療した。
【０１３４】
７．  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類の変化
重症下肢虚血は、２週間超にわたって持続する患肢における重度に障害された血流に続発する下肢安静時疼痛、虚血性潰瘍又は壊疽を有する患者を含む。被験体のＰＡＤ分類は、標準的なトレッドミル運動負荷試験を行わず、軽度、中等度又は重度のＩＣを正式に識別することができなかったことから、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄのカテゴリーではなく等級を用いた血管専門医の試験により行われた。
【０１３５】
ＩＣ（Ｉ度、１群〜３群）は、運動によって引き起こされ（歩行又は筋肉活動によって生じる）、ＣＬＩを有する患者において持続する安静時の疼痛とは異なり、活動の停止により直ちに緩和される四肢の筋肉痛、不快感又は脱力として規定された。
【０１３６】
Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄの０度は、症状を有さず、又は単に冷覚を有し、又は閉塞性疾患の臨床兆候を有さず、又は僅かな脈拍減少を有する被験体を特定するために用いられた。
【０１３７】
非治癒性虚血性潰瘍は、治癒を要する炎症性応答を支持する下肢の不十分な動脈灌流が見られることを示唆する。これと関連して、通常は虚血性安静時疼痛、及びびまん性足虚血（ＣＬＩ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ＩＩＩ度〜ＩＶ度、５群〜６群）の客観的証拠が見られる。
【０１３８】
虚血性安静時疼痛は、びまん性足虚血（ＩＩ度〜ＩＶ度、４群〜６群）を示し、鎮痛薬によって容易に制御することができない。疼痛は前肢及び足指、又は限局性虚血性病変の周辺に局在化する。疼痛は肢部を挙上することによって悪化する。虚血性安静時疼痛を伴うびまん性足虚血は、一般に足関節血圧＜４０ｍｍＨｇ及びＡＢＩ＜０．８と関連する。
【０１３９】
被験体を虚血性安静時疼痛（非治癒性虚血性潰瘍を伴う又は伴わない）、運動によって引き起こされる虚血性筋肉痛（ＩＣ）又は無症候性疾患の存在に基づいて分類した。試験の被験体を分類するために、ＡＢＩ（確実に評価することができる場合）の測定により、臨床症状をびまん性足虚血の客観的証拠と組み合わせた。
【０１４０】
ベースラインから１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月及び１２ヶ月までのＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類の変化を評価した。
【０１４１】
臨床的改善は、ベースラインからの単一のＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ等級（カテゴリー）の改善として規定した。臨床的に関連した改善は、Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与の３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後又は１２ヶ月後のＣＬＩ  ４群又は５群からＩＣ  ３群以下へのＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類の変化として規定した。
【０１４２】
８．  潰瘍数及び潰瘍サイズの変化
標的下肢の最大の潰瘍のサイズ及び両脚の潰瘍の総数を症例報告書（ＣＲＦ）に記録した。ベースラインから１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月及び１２ヶ月までの潰瘍治癒及び潰瘍サイズの変化を評価した。
【０１４３】
９．  脈管形成
脈管形成は、本発明の細胞懸濁液の投与の６ヶ月後に、治療前に行われたベースライン血管造影とＲｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与の６ヶ月後に行われた血管造影とを比較することによって独立盲検評価を行う２人の画像下治療医からなる評価委員会によって評価された。
【０１４４】
既存の動脈の縦成長、既存の動脈の横成長（cross growth）、側副血管数の増加、側副血管のサイズ及び／又は密度の増加、又は主要膝窩動脈下血管のサイズ及び／又は密度の増加が見られる場合に脈管形成が生じていると考えられる。
【０１４５】
１０．  大切断術（標的肢）
大切断術は足関節より上の下肢の切断術と考えた。
【０１４６】
１１．  ＡＢＩの変化
ＡＢＩは、足関節で測定される収縮期血圧と上腕動脈で測定される収縮期血圧との比率として規定される。被験体に、温度１９℃〜２２℃の室内で５分間〜１０分間、仰臥位でリラックスし、頭部及びかかとを支えて休憩するように指示した。適切なサイズの血圧測定用カフを足関節及び腕の両方の血圧の測定に選択した。足関節及び腕の両方について、直線巻き付け（straight wrapping）法を用いてカフを肢部に巻き付けた。８ＭＨｚ〜１０ＭＨｚのドップラープローブを使用し、ドップラーゲルをセンサー上に塗布した。ドップラープローブを腕の血圧測定時の上腕血流の検出にも使用した。両腕の上腕収縮期血圧、並びに問題の肢の前脛骨及び後脛骨収縮期血圧を測定した。
【０１４７】
ベースラインから１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月及び１２ヶ月までのＡＢＩの変化を、足関節血圧を確実に評価することができる被験体において記録した。
【０１４８】
１２．  経皮酸素分圧の変化
経皮酸素測定ＴｃＰＯ２は、毛細血管から表皮を通って拡散したＯ２の量を反映する局所非侵襲的測定である。ＴｃＰＯ２は、ＴＣＭ３（Radiometer Medical ApS，Copenhagen，Denmark）を用いて測定した。
【０１４９】
ベースラインから１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月及び１２ヶ月までのＴｃＰＯ２の変化を記録した。
【０１５０】
１３．  有害事象の定義
有害事象（ＡＥ）は、治験薬に関連すると考えられるか否かを問わず、試験中に被験体に生じる任意の望ましくない経験として規定した。したがって、ＡＥは、医薬品（治験薬）に関連していたか否かを問わず、時間的に医薬品（治験薬）の使用と関連する任意の好ましくない意図せぬ兆候（異常な検査所見を含む）、症状又は疾患であり得る。これには、既存の病態若しくは事象の増悪、併発する病気、薬物間相互作用、又は特定の有効性評価下で症例報告書のどこにも記録されていない調査中の適応症の顕著な悪化が含まれていた。臨床的に顕著な増悪又は悪化を示さない研究中の疾患を含む既存の病態の予想される変動は、ＡＥとはみなさなかった。
【０１５１】
以下のデータを各ＡＥについて文書化した：
症状事象の説明。
「重篤」又は「重篤でない」の分類。
重症度：軽度（被験体が容易に耐えられるＡＥ；僅かな不快感しか引き起こさず、日常活動を妨げない）、中等度（通常の日常活動を妨げるのに十分に不快なＡＥ；介入が必要とされる場合がある）、重度（通常の日常活動を妨げるＡＥ；治療又は他の介入が通常は必要とされる）。
最初の発生の日及び解消の日（該当する場合）。
取った行動：任意の行動、試験治療の恒久的中止、併用薬の投与、非薬理学的治療の管理又は入院／長期入院（ＳＡＥ）。
因果関係。ＡＥと、もしあればＲｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔとの関係を評価するために、責任医師によりあらゆる努力が払われた。因果性は、以下のカテゴリーを用いて評価した：
因果関係を示唆する証拠が殆どなかった場合（例えば、事象がＲｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与後妥当な期間内に生じなかった、又は事象の別の妥当な説明（例えば、被験体の臨床病態、他の併用治療）があった場合）、可能性が低い。考え得る因果関係を示唆する証拠がある場合（例えば、他の因子（例えば、被験体の臨床病態、他の併用治療）が事象に寄与した可能性があるが、事象がＲｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与後妥当な時間内に生じたため）、可能性がある。因果関係を示唆する証拠があり、他の因子の影響がありそうにない場合、可能性が高い。
因果関係を示唆する明らかな証拠があり、他の因子の考え得る寄与を除外することができる場合、確実である。
因果関係に関する臨床判断を行うのに不十分又は不完全な証拠がある場合、読み取り不能である。
事象の結果（不明、回復、未回復、回復したが後遺症あり、死亡（日付及び原因を報告する））。
【０１５２】
１４．  重篤有害事象の定義
ＳＡＥは、以下の深刻な結果の基準の１つ以上を満たすＡＥとして規定した：
死亡を招いた。
致命的であった。
入院患者の入院又は既存の入院の延長を必要とした。
永続的又は重大な障害又は不能を引き起こした。
先天性異常又は出生時欠損であった。
医学的及び科学的判断に基づき、被験体を危険にさらす可能性を有するか、又は上に挙げた結果の１つを防ぐために介入を必要とした重要な医療事象であった。
【０１５３】
ＡＥは、事象の時点で被験体に死亡のリスクがある場合に致命的であるとみなした。より重篤であった場合に理論上は死亡原因となった可能性がある事象とはみなさなかった。
【０１５４】
実施例２．  結果
１．  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ分類の変化
ベースライン時、並びに３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後の対照被験体及び本発明の細胞懸濁液で治療した被験体におけるＰＡＤのＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄカテゴリーの変化を下記表７に提示する。
【０１５５】
ベースライン来院時に、本発明の細胞懸濁液による治療群の被験体は、ＣＬＩ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ４群（ＩＩ度）又はＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ５群（ＩＩＩ度）（それぞれ２０人（４４％）の被験体及び２５人（５６％）の被験体）と分類された。結果から、最初の１２ヶ月間に、本発明の細胞懸濁液で治療した被験体の大部分が改善、すなわち２８人（６８％）の被験体におけるＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ０群〜３群（０度及び１度）への分類の低下によって実証される臨床的に関連した応答を達成したことが示された。
【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
投与の３ヶ月後に、本発明の細胞懸濁液で治療した１５人（３３％）の被験体、並びに中用量群及び高用量群の１２人（４０％）の被験体が、もはや安静時疼痛又は組織欠損を患わず、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ０群〜３群（０度及びＩ度）と分類され、これは投与の６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後にそれぞれ２１人（４６％）の被験体、２４人（５７％）及び２８人（６８％）まで更に増加した。中用量群及び高用量群の被験体については、これは投与の６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後にそれぞれ１３人（４３％）、１５人（５０％）及び１８人（６４％）であった。これは３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後にそれぞれ０人（０％）、１人（８％）、１人（８％）及び２人（１８％）の被験体がＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  １群〜３群（Ｉ度）まで改善された対照群と好都合に比較された。
【０１５８】
対照群に割り当てられた１人の被験体がランダム化後にインフォームドコンセントを取り下げ、１人の被験体が６ヶ月の経過観察来院前に心血管疾患によって死亡し、１人の患者が６ヶ月の経過観察来院前に大切断術を受け、１人の被験体が１２ヶ月の来院前に追跡不能となった。より低用量のＲｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔを与えた２人の被験体が投与の６ヶ月後に標的肢の大切断術を受けた。
【０１５９】
１１人の被験体のうち９人（８２％）が安静時疼痛又は非治癒性虚血性潰瘍の存在（４人（３６％）の被験体）を報告した対照群と比較して、本発明の細胞懸濁液による治療群の４５人の被験体のうち合計２８人（６２％）（中用量群及び高用量群では３０人のうち１８人（６３％））が、投与の１２ヶ月後に安静時の虚血性疼痛又は虚血性潰瘍を示さなかった。
【０１６０】
最終観測値による補完（last observation carried forward；ＬＯＣＦ）を適用した場合（肢部大切断術を受けた被験体を除外する；これらの被験体は非応答者とみなされた）、結果から、本発明の細胞懸濁液の投与後最初の１２ヶ月間に、治療した全ての被験体のうち２８人（６４％）、中用量群及び高用量群の１８人（６３％）でＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ０群〜３群（０度及びＩ度）への分類の低下により実証される臨床的に関連した応答が達成されたことが示された（表８及び図２及び図３を参照されたい）。
【０１６１】
Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与の３ヶ月後に、Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔで治療した１５人（３３％）の被験体（そのうち１２人（４０％）が中用量群及び高用量群）が、もはや安静時疼痛又は組織欠損を患わず、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ０群〜３群（０度及びＩ度）と分類され、これは治療した全ての患者について投与の６ヶ月後及び９ヶ月後にそれぞれ２１人（４６％）の被験体及び２４人（５３％）の被験体まで更に増加した。中用量群及び高用量群では、６ヶ月及び９ヶ月の時点でそれぞれ１４人（４７％）及び１５人（５０％）の被験体がＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ０群〜３群と分類された。これは３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後及び１２ヶ月後にそれぞれ僅か０人（０％）、１人（８％）、１人（７％）及び２人（１３％）の被験体がＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  １群〜３群（Ｉ度）まで改善された対照群と好都合に比較された。
【０１６２】
【表８】
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【０１６３】
図４及び表９に、全ての投与後経過観察来院時の本発明の細胞懸濁液による治療群における対照群と比較してより多くの被験体の臨床的に関連した応答を示した。Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔの投与の１２ヶ月後までに、対照群と比較して、全てのＲｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔ群の被験体の大部分が臨床的に関連した応答を示した：３４人（７６％）の被験体（最低用量、中用量、最高用量Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔ群のそれぞれ１０人、１３人及び１１人の被験体）対２人（１３％）の被験体。
【０１６４】
【表９】
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【０１６５】
２．  患肢における潰瘍数の変化
患肢における潰瘍数の変化を表１０及び図５に提示する。ベースライン来院時に、本発明の細胞懸濁液による治療群の２５人の被験体（５６％）及び対照群の９人の被験体（６０％）がＲｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ５群として分類され、非治癒性虚血性潰瘍を示した。被験体の大部分が１個の潰瘍を有し、治療群と対照群とに大きな違いは見られなかった（最低用量、中用量、最高用量の本発明の細胞懸濁液群のそれぞれ５人、７人及び６人の被験体、並びに対照群の６人の被験体）。最低用量、中用量、最高用量の本発明の細胞懸濁液による治療群の４人の被験体（それぞれ１人、１人及び２人の被験体）及び対照群の１人の被験体が３個以上の潰瘍を有していた。
【０１６６】
本発明の細胞懸濁液による治療群の被験体におけるベースライン時の平均潰瘍サイズは、対照群の被験体よりも大きかったが（治療群及び対照群のそれぞれで３９．９±２３．０ｍｍ対２６．３±２３．５ｍｍ）、潰瘍が治癒しなかった被験体では潰瘍サイズが減少し（２９．７±１３．５ｍｍ）、対照群において平均潰瘍サイズが増大した（４３．８±２９．３ｍｍ）ことが結果から示された（表１１）。
【０１６７】
【表１０】
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【０１６８】
【表１１】
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【０１６９】
３．  ＴｃＰＯ２の変化
ＴｃＰＯ２の変化を表１２に提示する。
【０１７０】
ベースライン時に、対照群の６人（４３％）の被験体と比較して、本発明の細胞懸濁液による治療群の３５人（７９％）の被験体がＴｃＰＯ２＜４０ｍｍＨｇを有していた（３つの用量群（それぞれ最低用量群、中用量群、最高用量群）で１２人、１２人及び１１人の被験体）。
【０１７１】
結果から、１２ヶ月の経過観察来院までに、対照群の５人（４６％）の被験体と比較して、Ｒｅｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔで治療した被験体の大部分（２４人（６０％）の被験体）でＴｃＰＯ２レベルが４０ｍｍＨｇ以上までに増大したことが示された。
【０１７２】
【表１２】
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【０１７３】
４．  脈管形成
脈管形成を本発明の細胞懸濁液の投与の６ヶ月後に評価した。本発明の細胞懸濁液で治療した被験体では、脈管形成が２６人（６２％）の被験体、それぞれ最低用量群、中用量群、最高用量群の７人、８人及び９人の被験体に見られた（表１３を参照されたい）。
【０１７４】
【表１３】
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【０１７５】
生じた２４例の脈管形成のうち３例の血管造影画像を図６にベースラインに対して提示する：動脈の縦成長（図６Ａ）、新生血管の外観（図６Ｂ）及びその標的皮膚に平行な横成長（図６Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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