【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年2月21日(2007.2.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】抗ＮＧＦ抗体およびそれらを使用する方法
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００２年１２月２４日に提出された米国仮特許出願番号６０／４３６，９０５；２００３年１月２８日に提出された米国特許出願番号第６０／４４３，５２２；および２００３年１０月８日に提出された米国特許出願番号第６０／５１０，００６に対して優先権を主張する。これら全ては、引用によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、抗ＮＧＦ抗体（例えば、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）に関する。本発明はさらに、外科手術後の痛み、関節リウマチの痛み、および変形性関節症の痛みを含む痛みの処置および／または予防において、このような抗体および／またはポリヌクレオチドを使用することに関する。
【０００３】
連邦政府により支援された研究または開発に関する状況
適用せず。
【背景技術】
【０００４】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢神経および中枢神経の両方の発達および生存におけるその役割は十分に特徴付けられている。ＮＧＦは、抹消交感神経および胚の感覚ニューロン、ならびに前脳基底部のコリン作動性ニューロンの発達に重要な生存および維持因子であることが示されている。Ｓｍｅｙｎｅ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：３４６−２４９（１９９４）およびＣｒｏｗｌｅｙ等，Ｃｅｌｌ  ７６：１００１−１０１１（１９９４）。ＮＧＦは感覚ニューロン中で神経ペプチドの発現をアップレギュレートさせ（Ｌｉｎｄｓａｙ  ａｎｄ  Ｈａｒｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：３６２−３６４（１９８９））、そしてその活性は、２つの異なる膜結合受容体であるＴｒｋＡ受容体およびｐ７５共通ニューロトロフィン受容体（それぞれ、「高親和性」および「低親和性」ＮＧＦ受容体と呼ばれる場合もある）によって媒介される。Ｃｈａｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：５１８−５２１（１９８６）。ＮＧＦの概要については、Ｈｕａｎｇ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：６７７−７３６（２００１）；Ｂｉｂｅｌ等，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：２９１９−２９３７（２０００）を参照のこと。ＮＧＦ、およびｔｒｋＡ受容体と複合体を形成したＮＧＦの結晶構造が明らかにされている。Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：４１１（１９９１）；Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：１８４−１８８（１９９６）を参照のこと。
【０００５】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢神経および中枢神経の両方の発達および生存におけるその役割は十分に特徴付けられている。ＮＧＦは、抹消交感神経および胚の感覚ニューロン、ならびに前脳基底部のコリン作動性ニューロンの発達に重要な生存および維持因子であることが示されている。Ｓｍｅｙｎｅ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：３４６−２４９（１９９４）およびＣｒｏｗｌｅｙ等，Ｃｅｌｌ  ７６：１００１−１０１１（１９９４）。ＮＧＦは感覚ニューロン中で神経ペプチドの発現をアップレギュレートさせ（Ｌｉｎｄｓａｙ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：３６２−３６４（１９８９））、そしてその活性は、２つの異なる膜結合受容体であるＴｒｋＡチロシンキナーゼ受容体およびｐ７５受容体によって媒介される。ｐ７５受容体は、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの他のメンバーと構造的に関係している（Ｃｈａｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：５１８−５２１（１９８６））。
【０００６】
神経系におけるその作用に加えて、ＮＧＦは神経系の外側でのプロセスにも大きく関係している。例えば、ＮＧＦは、血管の透過性を高めること（Ｏｔｔｅｎ等，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０６：１９９−２０１（１９８４））、Ｔ細胞およびＢ細胞免疫応答を高めること（Ｏｔｔｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００５９−１００６３（１９８９））、リンパ球の分化および肥満細胞の増殖を誘導し、肥満細胞からの可溶性の生物学的シグナルの放出を生じること（Ｍａｔｓｕｄａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：６５０８−６５１２（１９８８）；Ｐｅａｒｃｅ等，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７２：３７９−３９３（１９８６）；Ｂｉｓｃｈｏｆｆ等，Ｂｌｏｏｄ  ７９：２６６２−２６６９（１９９２）；Ｈｏｒｉｇｏｍｅ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４８８１−１４８８７（１９９３））が示されている。外部から添加されたＮＧＦはこれらの作用の全てを有することができることが示されているが、内因性のＮＧＦが生体内でのこれらのプロセスの全てにおいて重要であることは極まれにしか示されていないことに注目することが重要である（Ｔｏｒｃｉａ等，Ｃｅｌｌ．８５（３）：３４５−５６（１９９６））。したがって、たとえ存在するとしても、内因性のＮＧＦの生体活性のその効果が何によって阻害されているかは明らかではない。
【０００７】
ＮＧＦは、肥満細胞（Ｌｅｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３７３９−３７４３（１９９４））、Ｂリンパ球（Ｔｏｒｃｉａ等，Ｃｅｌｌ  ８５：３４５−３５６（１９９６）、角質細胞（Ｄｉ  Ｍａｒｃｏ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８３８−２２８４６））、平滑筋細胞（Ｕｅｙａｍａ等，Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１１：１０６１−１０６５（１９９３））、線維芽細胞（Ｌｉｎｄｈｏｌｍ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：７９５−８０１（１９９０））、気管支上皮細胞（Ｋａｓｓｅｌ等，Ｃｌｉｎ，Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３１：１４３２−４０（２００１））、腎臓のメサンギウム細胞（Ｓｔｅｉｎｅｒ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｆ７９２−７９８（１９９１））、および骨格筋の筋管（Ｓｃｈｗａｒｔｚ等，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ６６：１９５−２００（２００２））を含む多数の細胞型によって生産される。ＮＧＦ受容体は、神経系の外側の種々の細胞型の上に見出されている。例えば、ＴｒｋＡは、ヒトの単球、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、ならびに肥満細胞上で見出されている。
【０００８】
高濃度のＮＧＦと種々の炎症症状との間の関係が、ヒト患者において、さらにはいくつかの動物モデルにおいても観察されている。これらには、全身性エリテマトーデス（Ｂｒａｃｃｉ−Ｌａｕｄｉｅｒｏ等，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ４：５６３−５６５（１９９３））、多発性硬化症（Ｂｒａｃｃｉ−Ｌａｕｄｉｅｒｏ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４７：９−１２（１９９２））、乾癬（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ等，Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ．ｌ’ｅｎｅｒｅｏｌ．７８：８４−８６（１９９８））、関節炎（Ｆａｌｃｉｍ等，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５：７４５−７４８（１９９６））、間質性膀胱炎（Ｏｋｒａｇｌｙ等，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  １６１：４３８−４４１（１９９９））および喘息（Ｂｒａｕｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２４０−３２５１（１９９８））が含まれる。
【０００９】
抹消組織での高濃度のＮＧＦには一貫して痛覚過敏と炎症が伴い、これは、多数の関節炎の形態において観察されている。関節リウマチに罹患してる患者の滑膜は、高いレベルでＮＧＦを発現するが、炎症を起こしていない滑膜においては、ＮＧＦは検出できないことが報告されている（Ａｌｏｅ等，Ａｒｃｈ．Ｒｈｅｕｍ．３５：３５１−３５５（１９９２））。同様の結果が、実験用に関節リウマチを誘導されたラットにおいても見られた（Ａｌｏｅ等，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１０：２０３−２０４（１９９２））。高濃度のＮＧＦは、トランスジェニックである関節炎のマウスにおいても報告されており、これには、肥満細胞の数の増加が伴った（Ａｌｏｅ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ−Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ａｓｐｅｃｔｓ  １５：１３９−１４３（１９９３））。ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０９６４５８には、炎症症状（例えば、関節リウマチ）のような種々のＮＧＦに関係している障害を処置することにおいて、特定の性質の抗ＮＧＦ抗体を使用することが開示されている。精製された抗ＮＧＦ抗体を、ヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）遺伝子を有している関節炎のトランスジェニックマウスに注射すると、肥満細胞の数の減少、さらには関節炎のマウスの滑膜内のヒスタミンおよびサブスタンスＰの濃度の低下が生じることが報告されている（Ａｌｏｅ等，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．１４：２４９−２５２（１９９５））。ＮＧＦ抗体の外部からの投与により、関節炎のマウスを生じる高濃度のＴＮＦ−αが低下することが示されている（Ｍａｎｎｉ等，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．１８：９７−１０２（１９９８））。
【００１０】
また、ＮＧＦおよび高親和性ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）の発現の増大が、ヒトの変形性関節症の軟骨細胞において観察された（Ｉａｎｎｏｎｅ等，Ｔｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４１：１４１３−１４１８（２００２））。
【００１１】
齧歯類の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が報告されている。例えば、Ｈｏｎｇｏ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（２００２）１９（３）：２１５−２２７；Ｒｕｂｅｒｔｉ等（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１３（５）：５５９−５６８を参照のこと。しかし、齧歯類の抗体をヒトにおいて治療的に使用すると、ヒト抗マウス抗体応答が、処置した個体のかなりの数において生じる。さらに、マウス抗体のエフェクター機能は、ヒトの状況においては効果が低いことが証明されている。したがって、ヒト化抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を含む抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が本格的に必要とされている。
【００１２】
本明細書中に開示される全ての参考文献、刊行物、および特許出願は、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書中に開示される発明は、神経成長因子に対する抗体に関する。
【００１４】
別の態様においては、本発明は、ヒト化された親和性成熟抗体Ｅ３である。これは、ヒトおよび齧歯類の神経成長因子（「ＮＧＦ」）に特異的に結合する。Ｅ３の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、図１Ａ（配列番号１）および１Ｂ（配列番号２）にそれぞれ示される。抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲとＫａｂａｔ  ＣＤＲを含む）は、図１Ａおよび１Ｂに図示される。Ｅ３の重鎖および軽鎖、ならびに個々の伸張型ＣＤＲのアミノ酸配列もまた、以下に示される（以下の「抗体配列」を参照のこと）。
【００１５】
別の態様においては、本発明は、抗体Ｅ３（本明細書中では同義的に「Ｅ３」とも呼ばれる）の断片または領域を含む抗体である。１つの実施形態においては、断片は、図１Ｂに示されるような抗体Ｅ３の軽鎖である。別の実施形態においては、断片は、図１Ａに示されるような抗体Ｅ３の重鎖である。さらに別の実施形態においては、断片には、抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖に由来する１つ以上の可変領域が含まれる。さらに別の実施形態においては、断片には、図１Ａおよび１Ｂに示されるような、抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００１６】
別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有している宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖を含む抗体である。別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有している宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖を含む抗体である。別の態様においては、本発明は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３を有している宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖；および（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有している宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖（本明細書中では便宜上、寄託された宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチド（単数または複数）を、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４、ＰＴＡ−４８９３、およびＰＴＡ−４８９５を有するという）を含む抗体である。別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３を有する宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖の軽鎖可変領域を含む抗体である。別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有する宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖の重鎖可変領域を含む抗体である。別の態様においては、本発明は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３を有する宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖の軽鎖可変領域、および（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有する宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖の重鎖可変領域を含む抗体である。なお別の態様においては、本発明は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有する宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチド；および／または（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有する宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる１つ以上のＣＤＲ（単数または複数）を含む抗体である。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、抗体には、ヒトの重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域が含まれる。いくつかの実施形態においては、抗体には、ヒトの軽鎖κ定常領域が含まれる。いくつかの実施形態においては、抗体には、修飾された定常領域、例えば、免疫学的に不活性である、例えば、補体媒介性の溶解を誘発しないか、または抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域のような、修飾された定常領域が含まれる。他の実施形態においては、定常領域が、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願番号９８０９９５１．８に記載されているように修飾される。なお他の実施形態においては、抗体には、以下の変異を含むヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域が含まれる：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に関するアミノ酸のナンバリング）。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４。
【００１８】
別の態様においては、本発明により、以下のいずれか１つ以上を含むポリペプチド（抗体であっても抗体でなくてもよい）が提供される：ａ）図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３の１つ以上のＣＤＲ（単数または複数）；ｂ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖に由来するＣＤＲ  Ｈ３；ｃ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖に由来するＣＤＲ  Ｌ３；ｄ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖に由来する３つのＣＤＲ；ｅ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖に由来する３つのＣＤＲ；およびｆ）図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３の、軽鎖に由来する３つのＣＤＲと重鎖に由来する３つのＣＤＲ。本発明によりさらに、以下のいずれか１つ以上を含むポリペプチド（抗体であっても抗体でなくてもよい）が提供される：ａ）図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３に由来する１つ以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のＣＤＲ（単数または複数）；ｂ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖に由来するＣＤＲ  Ｈ３に由来するＣＤＲ；および／またはｃ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖に由来するＣＤＲ  Ｌ３に由来するＣＤＲ。いくつかの実施形態においては、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、またはＫａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの結合体（本明細書中では「伸張型」ＣＤＲまたは「結合型」ＣＤＲと呼ばれる）である場合もある。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、抗体）はＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）に結合する。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、本明細書中に記載されるＣＤＦ立体構造（結合体、変異体などを含む）のいずれかが含まれる。
【００１９】
１つの態様においては、本発明により、配列番号９を含む重鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｉ３４はＳ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；Ｎ３５はＮ、Ｔ、またはＳで置換される。本明細書中では便宜上、本発明の状況において、あるいはアミノ酸についての言及される場合は、「置換された」または「である」は、所定の位置についてのアミノ酸（単数または複数）の選択をいう。明らかであるように、置換または選択は、配列番号または図に示されるアミノ酸である場合もある。
【００２０】
別の態様においては、本発明により、配列番号１０を含む重鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｍ５０はＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２はＡまたはＳであり；Ｌ６３はＬまたはＶである。
【００２１】
別の態様においては、本発明により、配列番号１１を含む重鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＤ、Ｎ、またはＧであり；Ｙ１１０はＹ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、またはＴである。
【００２２】
別の態様においては、本発明により、配列番号１１を含む重鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。
【００２３】
別の態様においては、本発明により、配列番号１１を含む重鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｇ９８はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｇ９９はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。
【００２４】
別の態様においては、配列番号１２を含む軽鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｓ２６はＳまたはＦであり；Ｄ２８はＤ、Ｓ、Ａ、またはＹであり；Ｈ３２はＨ、Ｎ、またはＱである。
【００２５】
別の態様においては、配列番号１３を含む軽鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｉ５１はＩ、Ｔ、Ｖ、またはＡであり；Ｓ５６はＳまたはＴである。
【００２６】
別の態様においては、本発明により、配列番号１４を含む軽鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｓ９１はＳまたはＥであり；Ｋ９２はＫ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり；Ｙ９６はＹまたはＲである。
【００２７】
別の態様においては、本発明により、配列番号１４を含む軽鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｓ９１はＳまたはＥであり；Ｋ９２は任意のアミノ酸であり；Ｔ９３は任意のアミノ酸であり；Ｙ９６はＹまたはＲである。
【００２８】
１つの態様においては、本発明により、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｉ３４はＳ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；Ｎ３５はＮ、Ｔ、またはＳである。
【００２９】
別の態様においては、本発明により、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｍ５０はＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２はＡまたはＳであり；Ｌ６３はＬまたはＶである。
【００３０】
別の態様においては、本発明により、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＤ、Ｎ、またはＧであり；Ｙ１１０はＹ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、またはＴである。
【００３１】
別の態様においては、本発明により、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。
【００３２】
別の態様においては、本発明により、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｇ９８はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｇ９９はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。
【００３３】
別の態様においては、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｓ２６はＳまたはＦであり；Ｄ２８はＤ、Ｓ、Ａ、またはＹであり；Ｈ３２はＨ、Ｎ、またはＱである。
【００３４】
別の態様においては、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｉ５１はＩ、Ｔ、Ｖ、またはＡであり；Ｓ５６はＳまたはＴである。
【００３５】
別の態様においては、本発明により、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｓ９１はＳまたはＥであり；Ｋ９２はＫ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり；Ｙ９６はＹまたはＲである。
【００３６】
別の態様においては、本発明により、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、Ｓ９１はＳまたはＥであり；Ｋ９２は任意のアミノ酸であり；Ｔ９３は任意のアミノ酸であり；Ｙ９６はＹまたはＲである。
【００３７】
別の態様においては、本発明により、配列番号９のＣＤＲ１領域であって、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；Ｎ３５がＮ、Ｔ、またはＳである領域；配列番号１０のＣＤＲ２領域であって、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２がＡまたはＳであり；Ｌ６３がＬまたはＶである領域；および配列番号１１のＣＤＲ３領域であって、Ｙ１００がＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１がＹまたはＷであり；Ｇ１０３がＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４がＴまたはＳであり；Ｓ１０５がＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６がＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７がＹまたはＦであり；Ｆ１０８がＦまたはＷであり；Ｄ１０９がＤ、Ｎ、またはＧであり；Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、またはＴである領域を含む重鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、ヒト化抗体を含む抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、重鎖可変領域には、配列番号１１のＣＤＲ３領域が含まれる。ここでは、Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。他の実施形態においては、重鎖可変領域には、配列番号１１のＣＤＲ３領域が含まれる。ここでは、Ｇ９８はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｇ９９はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）にはさらに、抗体の軽鎖可変領域が含まれる。
【００３８】
別の態様においては、本発明により、配列番号１２のＣＤＲ１領域であって、Ｓ２６がＳまたはＦであり；Ｄ２８がＤ、Ｓ、Ａ、またはＹであり；Ｈ３２がＨ、Ｎ、またはＱである領域；配列番号１３のＣＤＲ２領域であって、Ｉ５１がＩ、Ｔ、Ｖ、またはＡであり；Ｓ５６がＳまたはＴである領域；および配列番号１４のＣＤＲ３領域であって、Ｓ９１がＳまたはＥであり；Ｋ９２がＫ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり；Ｙ９６がＹまたはＲである領域を含む軽鎖可変領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、軽鎖可変領域には、配列番号１４のＣＤＲ３領域が含まれる。ここでは、Ｓ９１はＳまたはＥであり；Ｋ９２は任意のアミノ酸であり；Ｔ９３は任意のアミノ酸であり；Ｙ９６はＹまたはＲである。いくつかの実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）にはさらに、抗体の重鎖が含まれる。
【００３９】
別の態様においては、本発明により、（ａ）配列番号９のＣＤＲ１領域であって、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；Ｎ３５がＮ、Ｔ、またはＳである領域；配列番号１０のＣＤＲ２領域であって、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２がＡまたはＳであり；Ｌ６３がＬまたはＶである領域；および配列番号１１のＣＤＲ３領域であって、Ｙ１００がＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１がＹまたはＷであり；Ｇ１０３がＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４がＴまたはＳであり；Ｓ１０５がＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６がＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７がＹまたはＦであり；Ｆ１０８がＦまたはＷであり；Ｄ１０９がＤ、Ｎ、またはＧであり；Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、またはＴである領域を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号１２のＣＤＲ１領域であって、Ｓ２６がＳまたはＦであり；Ｄ２８がＤ、Ｓ、Ａ、またはＹであり；Ｈ３２がＨ、Ｎ、またはＱである領域；配列番号１３のＣＤＲ２領域であって、Ｉ５１がＩ、Ｔ、Ｖ、またはＡであり；Ｓ５６がＳまたはＴである領域；および配列番号１４のＣＤＲ３領域であって、Ｓ９１がＳまたはＥであり；Ｋ９２がＫ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり；Ｙ９６がＹまたはＲである領域を含む軽鎖可変領域を含む、ポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、軽鎖可変領域には、配列番号１４のＣＤＲ３領域が含まれる。ここでは、Ｓ９１はＳまたはＥであり；Ｋ９２は任意のアミノ酸であり；Ｔ９３は任意のアミノ酸であり；Ｙ９６はＹまたはＲである。いくつかの実施形態においては、重鎖可変領域には、配列番号１１のＣＤＲ３領域が含まれる。ここでは、Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。他の実施形態においては、重鎖可変領域には、配列番号１１のＣＤＲ３領域が含まれる。ここでは、Ｇ９８はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｇ９９はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、抗体の軽鎖が含まれる。
【００４０】
別の態様においては、本発明により、配列番号９に示されるアミノ酸配列であって、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；Ｎ３５がＮ、Ｔ、またはＳであるアミノ酸配列；配列番号１０に示されるアミノ酸配列であって、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２がＡまたはＳであり；Ｌ６３がＬまたはＶであるアミノ酸配列；および配列番号１１に示されるアミノ酸配列であって、Ｙ１００がＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１がＹまたはＷであり；Ｇ１０３がＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４がＴまたはＳであり；Ｓ１０５がＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６がＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７がＹまたはＦであり；Ｆ１０８がＦまたはＷであり；Ｄ１０９がＤ、Ｎ、またはＧであり；Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、またはＴであるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、ヒト化抗体を含む抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号１１に示されるアミノ酸配列が含まれる。ここでは、Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。他の実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号１１に示されるアミノ酸配列が含まれる。ここでは、Ｇ９８はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｇ９９はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）にはさらに、抗体の軽鎖可変領域が含まれる。
【００４１】
別の態様においては、本発明により、配列番号１２に示されるアミノ酸配列であって、Ｓ２６がＳまたはＦであり；Ｄ２８がＤ、Ｓ、Ａ、またはＹであり；Ｈ３２がＨ、Ｎ、またはＱであるアミノ酸配列；配列番号１３に示されるアミノ酸配列であって、Ｉ５１がＩ、Ｔ、Ｖ、またはＡであり；Ｓ５６がＳまたはＴであるアミノ酸配列；および配列番号１４に示されるアミノ酸配列であって、Ｓ９１がＳまたはＥであり；Ｋ９２がＫ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり；Ｙ９６がＹまたはＲであるアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号１４に示されるアミノ酸配列が含まれる。ここでは、Ｓ９１はＳまたはＥであり；Ｋ９２は任意のアミノ酸であり；Ｔ９３は任意のアミノ酸であり；Ｙ９６はＹまたはＲである。いくつかの実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）にはさらに、抗体の重鎖可変領域が含まれる。
【００４２】
別の態様においては、本発明により、（ａ）配列番号９に示されるアミノ酸配列であって、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；Ｎ３５がＮ、Ｔ、またはＳであるアミノ酸配列；配列番号１０に示されるアミノ酸配列であって、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２がＡまたはＳであり；Ｌ６３がＬまたはＶであるアミノ酸配列；および配列番号１１に示されるアミノ酸配列であって、Ｙ１００がＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１がＹまたはＷであり；Ｇ１０３がＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４がＴまたはＳであり；Ｓ１０５がＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６がＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７がＹまたはＦであり；Ｆ１０８がＦまたはＷであり；Ｄ１０９がＤ、Ｎ、またはＧであり；Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、またはＴであるアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列であって、Ｓ２６がＳまたはＦであり；Ｄ２８がＤ、Ｓ、Ａ、またはＹであり；Ｈ３２がＨ、Ｎ、またはＱであるアミノ酸配列；配列番号１３に示されるアミノ酸配列であって、Ｉ５１がＩ、Ｔ、Ｖ、またはＡであり；Ｓ５６がＳまたはＴであるアミノ酸配列；および配列番号１４に示されるアミノ酸配列であって、Ｓ９１がＳまたはＥであり；Ｋ９２がＫ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり；Ｙ９６がＹまたはＲであるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号１４に示されるアミノ酸配列が含まれる。ここでは、Ｓ９１はＳまたはＥであり；Ｋ９２は任意のアミノ酸であり；Ｔ９３は任意のアミノ酸であり；Ｙ９６はＹまたはＲである。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号１１に示されるアミノ酸配列が含まれる。ここでは、Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。他の実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号１１に示されるアミノ酸配列が含まれる。ここでは、Ｇ９８はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｇ９９はＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、またはＴであり；Ｙ１００はＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１はＹまたはＷであり；Ｇ１０３はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４はＴまたはＳであり；Ｓ１０５はＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６はＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７はＹまたはＦであり；Ｆ１０８はＦまたはＷであり；Ｄ１０９はＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＧであり；Ｙ１１０は任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、抗体の軽鎖可変領域が含まれる。
【００４３】
別の態様においては、本発明により、以下を含む重鎖可変領域：（ａ）配列番号９のＣＤＲ１領域であって、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；Ｎ３５がＮ、Ｔ、またはＳで置換されている領域；（ｂ）配列番号１０のＣＤＲ２領域であって、Ｍ５０がＩ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２がＡまたはＳであり；Ｌ６３がＬまたはＶである領域；および（ｃ）配列番号１１のＣＤＲ３領域であって、Ｙ１００がＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１がＹまたはＷであり；Ｇ１０３がＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４がＴまたはＳであり；Ｓ１０５がＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６がＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７がＹまたはＦであり；Ｆ１０８がＦまたはＷであり；Ｄ１０９がＤ、Ｎ、またはＧであり；Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、またはＴである領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、上記抗体は、ＮＧＦに結合する。
【００４４】
別の態様においては、本発明により、以下を含む軽鎖可変領域：（ａ）配列番号１２のＣＤＲ１領域であって、Ｓ２６がＳまたはＦであり；Ｄ２８がＤ、Ｓ、Ａ、またはＹであり；Ｈ３２がＨ、Ｎ、またはＱである領域；（ｂ）配列番号１３のＣＤＲ２領域であって、Ｉ５１がＩ、Ｔ、Ｖ、またはＡであり；Ｓ５６がＳまたはＴである領域；および（ｃ）配列番号１４のＣＤＲ３領域であって、Ｋ９２がＫ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり；Ｙ９６がＹまたはＲである領域；を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、上記抗体は、ＮＧＦに結合する。
【００４５】
別の態様においては、本発明により、（ａ）以下を含む重鎖可変領域：（ｉ）配列番号９のＣＤＲ１領域であって、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＩであり；Ｎ３５がＮ、Ｔ、またはＳで置換されている領域；（ｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ２領域であって、Ｍ５０がＩ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、またはＬであり；Ａ６２がＡまたはＳであり；Ｌ６３がＬまたはＶである領域；および（ｉｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ３領域であって、Ｙ１００がＹ、Ｌ、またはＲであり；Ｙ１０１がＹまたはＷであり；Ｇ１０３がＧ、Ａ、またはＳであり；Ｔ１０４がＴまたはＳであり；Ｓ１０５がＳ、Ａ、またはＴであり；Ｙ１０６がＹ、Ｒ、Ｔ、またはＭであり；Ｙ１０７がＹまたはＦであり；Ｆ１０８がＦまたはＷであり；Ｄ１０９がＤ、Ｎ、またはＧであり；Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、またはＴである領域；ならびに（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：（ｉ）配列番号１２のＣＤＲ１領域であって、Ｓ２６がＳまたはＦであり；Ｄ２８がＤ、Ｓ、Ａ、またはＹであり；Ｈ３２がＨ、Ｎ、またはＱである領域；（ｉｉ）配列番号１３のＣＤＲ２領域であって、Ｉ５１がＩ、Ｔ、Ｖ、またはＡであり；Ｓ５６がＳまたはＴである領域；および（ｉｉｉ）配列番号１４のＣＤＲ３領域であって、Ｓ９１がＳまたはＥであり；Ｋ９２がＫ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり；Ｙ９６がＹまたはＲである領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。ここでは、上記抗体は、ＮＧＦに結合する。
【００４６】
他の場所で明確に示されていない限りは、１つの位置でのアミノ酸の選択（例えば、置換）は、任意の他の位置でのアミノ酸の選択とは無関係に選択される。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチド（例えば、抗体）は、ＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）に結合する。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、本明細書中に記載されるＣＤＲ立体構造（結合体、変異体などを含む）のいずれかが含まれる。
【００４８】
本明細書中の記載から明らかであるように、本明細書中で使用される可変領域のナンバリングは、連続的なナンバリングである。多数の抗体のナンバリングシステム（例えば、例えば、ＫａｂａｔナンバリングまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリング）が存在すること、および別のナンバリングシステム、例えば、ＫａｂａｔナンバリングまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリングの連続的なナンバリングに変換する方法は、当業者に容易に理解される。
【００４９】
別の態様においては、本発明により、配列番号４６または５０から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ３配列）を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号３、４、５、６、７、および８に示されるアミノ酸配列の１つ以上が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示されるアミノ酸配列の１つ以上が含まれる。
【００５０】
別の態様においては、本発明により、（ａ）配列番号２８および／または２９；（ｂ）配列番号３０および／または３１；（ｃ）配列番号３２および／または３３；（ｄ）配列番号３４および／または３５；（ｅ）配列番号３６および／または３７；（ｆ）配列番号３８および／または３９；ならびに（ｇ）配列番号４０および／または４１から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｈ１および／またはＣＤＲ  Ｈ２領域のようなＣＤＲ領域）を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｈ１領域）が含まれる。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、および４１から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｈ２領域）が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号３、４、５、６、７、および８に示されるアミノ酸配列の１つ以上が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示されるアミノ酸配列の１つ以上が含まれる。
【００５１】
別の態様においては、本発明により、（ａ）配列番号１８および／または１９；（ｂ）配列番号２０および／または２１；ならびに（ｃ）配列番号２２および／または２３から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｌ１および／またはＣＤＲ  Ｌ２領域のようなＣＤＲ領域）を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号１８、２０、および２２から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｌ１領域）が含まれる。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号１９、２１、および２３から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｌ２領域）が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号３、４、５、６、７、８に示されるアミノ酸配列の１つ以上が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示されるアミノ酸配列の１つ以上が含まれる。
【００５２】
別の態様においては、本発明により、（ａ）配列番号５１および／または５２；（ｂ）配列番号５５および／または５６；（ｃ）配列番号５７および／または５８；（ｃ）配列番号５９および／または６０；（ｄ）配列番号６１および／または６２；（ｅ）配列番号６３および／または６４から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｌ３および／またはＣＤＲ  Ｈ３領域のようなＣＤＲ領域）を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号５１、５５、５７、５９、６１、および６３から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｌ３領域）が含まれる。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号５２、５６、５８、６０、６２、および６４から選択されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ  Ｈ３領域）が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号１８、１９、３０、および３１の１つ以上に示されるアミノ酸配列が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号３、４、５、６、７、および８に示されるアミノ酸配列の１つ以上が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチドにはさらに、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５に示されるアミノ酸配列の１つ以上が含まれる。
【００５３】
別の態様においては、本発明により、配列番号６１、６３、１８、１９、３０、および３１に示されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ領域）の１つ以上を含むポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。
【００５４】
１つの態様においては、本発明により、高い親和性でＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）に結合する抗ＮＧＦ抗体（例えば、アンタゴニスト抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、高い親和性とは、（ａ）約２ｎＭ未満のＫＤ（例えば、約１ｎＭ、８００ｐＭ、６００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、またはそれ未満のいずれか）、および／または約６×１０−５ｓ−１より遅いｋｏｆｆでのＮＧＦの結合；ならびに／あるいは（ｂ）約２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）でのマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性の阻害（低下および／またはブロック）；および／または（ｃ）約５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）でのマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性の阻害（低下および／またはブロック）；ならびに／あるいは（ｄ）約１５０ｐＭ、１２５ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）でのマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存的生存性の阻害（低下および／またはブロック）；および／または（ｅ）約３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）でのマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存的生存性の阻害（低下および／またはブロック）；ならびに／あるいは（ｆ）ｔｒｋＡ受容体よりも高い親和性でのＮＧＦの結合である。
【００５５】
別の態様においては、本発明により、（ａ）約２ｎＭ未満のＫＤ（例えば、約１ｎＭ、８００ｐＭ、６００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、またはそれ未満のいずれか）、および／または約６×１０−５ｓ−１より遅いｋｏｆｆでＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）に結合する；ならびに／あるいは（ｂ）約２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性を阻害する；ならびに／あるいは（ｃ）約５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ未満のいずれかのＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性を阻害する；ならびに／あるいはｔｒｋＡ受容体よりも高い親和性でＮＧＦに結合するポリペプチド（例えば、抗体）が提供される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、（ａ）約２ｎＭ未満のＫＤでＮＧＦに結合する；および／または（ｂ）約１００ｐＭ未満のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性を阻害し、ここでは、ＩＣ５０は約１５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定される；および／または（ｃ）約１０ｐＭ未満のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性を阻害し、ここでは、ＩＣ５０は約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定され、ここでは、ＩＣ５０は約１５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、（ａ）約１００ｐＭ未満のＫＤでＮＧＦに結合する；および／または（ｂ）約２０ｐＭ未満のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性を阻害し、ここでは、ＩＣ５０は約１５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定される；および／または（ｃ）約２ｐＭ未満のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性を阻害し、ここでは、ＩＣ５０は約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定される。
【００５６】
本明細書中の記載から明らかであるように、マウスのモノクローナル抗体９１１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドの実施形態は、本発明から明確に排除される。Ｍａｂ  ９１１の伸張型ＣＤＲ配列は、図１Ａおよび１Ｂ、ならびに配列番号９〜１４に示される。
【００５７】
いくつかの実施形態においては、本発明により、上記のポリペプチドまたは抗体のいずれかが提供され、ここではさらに、ポリペプチド（例えば、抗体）が単離される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）は実質的に精製される。なお他の実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）は親和的に成熟させられる。他の実施形態においては、抗体はアンタゴニスト抗体である。いくつかの実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）には、ヒトのフレームワーク配列が含まれる。なお他の実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）には、１つ以上のヒト以外のフレームワーク残基が含まれる。いくつかの実施形態においては、ポリペプチド（例えば、抗体）は、２ｎＭ未満のＫＤでＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）に結合する。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、ヒト以外のアミノ酸配列（例えば、フレームワーク配列のような、ＣＤＲ配列のような、可変領域配列）と比較して１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）のヒトのアミノ酸置換が含まれる。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、もとのポリペプチドアミノ酸配列（例えば、配列番号９〜１４のいずれか１つ以上のような、抗体９１１のアミノ酸配列）と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、またはそれ以上、例えば、少なくとも３、４、５、６、またはそれ以上のアミノ酸置換が含まれる。いくつかの実施形態においては、抗体の結合親和性は、もとの抗体（例えば、Ｍａｂ  ９１１）の親和性と比較して変化（いくつかの実施形態においては、増大）させられている。なお他の実施形態においては、抗体の結合親和性は、ＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）のｔｒｋＡ受容体の結合親和性よりも低い。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態においては、抗体はヒト抗体である。他の実施形態においては、抗体はヒト化抗体である。なお他の実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態においては、抗体は親和性成熟抗体である。
【００５８】
本発明により、上記のいずれかの実施形態をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（単離されたポリヌクレオチドを含む）が提供される。
【００５９】
別の態様においては、本発明により、抗体Ｅ３の断片または領域（本明細書中では同義的に「Ｅ３」とも呼ばれる）をコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。１つの実施形態においては、断片は、図１Ｂに示されるような抗体Ｅ３の軽鎖である。別の実施形態においては、断片は、図１Ａに示されるような抗体Ｅ３の重鎖である。さらに別の実施形態においては、断片には、抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖に由来する１つ以上の可変領域が含まれる。さらに別の実施形態においては、断片には、図１Ａおよび１Ｂに示されるような抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００６０】
別の態様においては、本発明は、抗体Ｅ３をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドには、図２および３に示されるポリヌクレオチドのいずれか、あるいはそれらの両方が含まれる。
【００６１】
別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有しているＥ３軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有しているＥ３重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。さらに別の態様においては、本発明は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有しているポリヌクレオチド中でコードされる可変領域、および（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有しているポリヌクレオチド中でコードされる可変領域を含む、単離されたポリヌクレオチドである。別の態様においては、本発明は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有しているポリヌクレオチド中でコードされる１つ以上のＣＤＲ、および／あるいは（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有しているポリヌクレオチド中でコードされる１つ以上のＣＤＲを含む、単離されたポリヌクレオチドである。
【００６２】
別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載される抗体（抗体断片を含む）またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６３】
別の態様においては、本発明により、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含むベクター（発現ベクターおよびクローニングベクターを含む）および宿主細胞が提供される。
【００６４】
本明細書中の記載から明らかであるように、マウスのモノクローナル抗体９１１のポリヌクレオチド配列と同一のポリヌクレオチド配列から構成されるポリヌクレオチドの実施形態は、本発明から明確に排除される。Ｍａｂ  ９１１の伸張型ＣＤＲ配列は、図１Ａおよび１Ｂ、ならびに配列番号９〜１４に示される。
【００６５】
別の態様においては、本発明は、Ｅ３軽鎖をコードするポリヌクレオチドとＥ３重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。ここでは、Ｅ３軽鎖をコードするポリヌクレオチド（単数または複数）は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有し、Ｅ３重鎖をコードするポリヌクレオチドは、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有する。いくつかの実施形態においては、宿主細胞には、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有するポリヌクレオチド中でコードされる可変領域、および／または（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有するポリヌクレオチド中でコードされる可変領域を含むポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態においては、宿主細胞には、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有するポリヌクレオチド中でコードされる１つ以上のＣＤＲ、および／または（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有するポリヌクレオチド中でコードされる１つ以上のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
【００６６】
別の態様においては、本発明は、抗体Ｅ３が結合したＮＧＦの複合体である。別の態様においては、複合体は単離される。別の態様においては、複合体は実質的に精製される。
【００６７】
別の態様においては、本発明は、本明細書中に記載されている抗体またはポリペプチドのいずれかが結合したＮＧＦの複合体である。別の態様においては、複合体は単離される。別の態様においては、複合体は実質的に精製される。
【００６８】
別の態様においては、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド（抗体Ｅ３のような抗体を含む）またはポリヌクレオチドのいずれかを含む薬学的組成物であり、例えば、抗体Ｅ３または抗体Ｅ３の断片を含む抗体と薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物である。
【００６９】
別の態様においては、本発明は、抗体Ｅ３を作成する方法であり、この方法には、抗体Ｅ３をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を調製する段階；抗体Ｅ３を生産させる条件下で宿主細胞またはその子孫を培養する段階；および抗体Ｅ３を精製する段階が含まれる。いくつかの実施形態においては、発現ベクターには、図２および３に示されるポリヌクレオチド配列の１つまたは両方が含まれる。
【００７０】
別の態様においては、本発明は、抗体Ｅ３を作成する方法であり、この方法には、適切な細胞中で、Ｅ３軽鎖をコードするポリヌクレオチドとＥ３重鎖をコードするポリヌクレオチドを発現させる段階であって、ここでは、Ｅ３軽鎖をコードするポリヌクレオチドは寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３および／またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有しており、Ｅ３重鎖をコードするポリヌクレオチドは寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有している段階；通常はその後に、抗体を回収および／または単離する段階が含まれる。
【００７１】
別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、抗体）のいずれかを作成する方法が提供される。この方法は、適切な細胞中で抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを発現させること（これは、１つの軽鎖または重鎖として別々に発現させることができ、また、軽鎖と重鎖の両方を１つのベクターから発現させることもできる）、その後に、目的の抗体またはポリペプチドを回収および／または単離することによる。
【００７２】
別の態様においては、本発明は、本明細書中に開示されるポリペプチド（抗体Ｅ３のような抗体を含む）のいずれかを使用して、ＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）の生物学的活性をアンタゴナイズする方法である。１つの実施形態においては、この方法には、ヒトの神経成長因子を本明細書中に記載されるポリペプチド（抗体Ｅ３を含む）のいずれかと接触させる段階が含まれ、これにより、ＮＧＦ活性（例えば、ヒトの神経成長因子の活性）がアンタゴナイズされるか、低下させられるか、ブロックされるか、または抑制される。
【００７３】
別の態様においては、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド（抗体Ｅ３のような抗体を含む）のいずれかを使用して、ＮＧＦを検出する方法である。ＮＧＦの存在は、ＮＧＦと本明細書中に記載されるポリペプチドのいずれか（例えば、抗体Ｅ３）との間での複合体を検出することによって検出される。用語「検出」には、本明細書中で使用される場合は、対照と比較するまたは対照と比較することのない、定性的および／または定量的検出（濃度の測定）が含まれる。
【００７４】
別の態様においては、本発明は、抗体Ｅ３、あるいは本明細書中に記載されるポリペプチド（抗体を含む）またはポリヌクレオチドの実施形態のいずれかを含む有効量の組成物を投与することにより、痛みを処置する方法である。いくつかの実施形態においては、痛みとは、手術後の痛みである。
【００７５】
別の態様においては、本発明は、個体に有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与することによって個体における関節リウマチの痛みを予防または処置するための方法である。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体により関節リウマチに伴う痛みを阻害またはブロックできることが、本発明によって示されている。いくつかの実施形態においては、痛みは、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後約２４時間以内に緩和される。いくつかの実施形態においては、痛みは、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後約４日以内に緩和される。いくつかの実施形態においては、痛みは、個体において炎症の症状の改善が観察される前に、または炎症の症状の改善の兆候がない間に改善される。
【００７６】
別の態様においては、本発明により、個体において、関節リウマチの痛みの兆候を減らす、関節リウマチの痛みを緩和する、関節リウマチの痛みを抑える、関節リウマチの痛みを和らげる、および／または関節リウマチの痛みの開始、発症、もしくは進行を遅らせるための方法が提供される。上記方法には、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を個体に投与する段階が含まれる。
【００７７】
別の態様においては、本発明は、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を個体に投与することにより、個体における変形性関節症の痛みを予防または処置するための方法である。
【００７８】
別の態様においては、本発明により、個体における関節リウマチに伴う炎症性悪液質（体重の減少）を処置するための方法が提供される。この方法には、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与する段階が含まれる。別の態様においては、本発明により、個体において、変形性関節症の痛みの兆候を減らす、変形性関節症の痛みを緩和する、変形性関節症の痛みを抑える、変形性関節症の痛みを和らげる、および／または変形性関節症の痛みの開始、発症、もしくは進行を遅らせるための方法が提供される。上記方法には、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を個体に投与する段階が含まれる。
【００７９】
別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載される組成物のいずれか１つ以上を含むキットおよび組成物が提供される。これらのキットは、通常は適切なパッケージング中のものであり、適切な説明書とともに提供され、本明細書中に記載される方法のいずれかについて有用である。
【００８０】
本発明により、さらに、医薬品としての使用および／または医薬品の製造のための使用の状況にはかかわらず、本明細書中に記載されるいずれかの用途について記載された、組成物およびキットのいずれかも提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８１】
本明細書中で開示される本発明により、高い親和性でＮＧＦ（例えば、ヒトＮＧＦ）に結合する抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が提供される。本発明ではさらに、ＮＧＦに結合する、Ｅ３に由来する抗体およびポリペプチド、さらには、これらの抗体を作成および使用する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、本発明により、神経成長因子（「ＮＧＦ」）に結合するヒト化抗体Ｅ３、さらには、この抗体を作成および使用する方法が提供される。本発明により、ＮＧＦに結合するＥ３ポリペプチド（抗体を含む）、ならびに、Ｅ３抗体および／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
【００８２】
本明細書中で開示される本発明により、さらに、治療有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与することによる、個体における関節リウマチの痛みを予防および／または処置するための方法が提供される。
【００８３】
本明細書中に開示される本発明により、さらに、治療有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与することによる、個体における変形性関節炎の痛みを予防および／または処置するための方法が提供される。
【００８４】
本発明により、さらに、抗体の親和性を調節するための方法、およびＣＤＲ領域を特徴付けるための方法が提供される。
【００８５】
一般的な技術
本発明の実施には、他の場所で示されない限りは、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術が使用される。これらは当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編，１９９３−１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ等編，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ等編，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ならびにＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ等編，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に完全に説明されている。
【００８６】
定義
「抗体」は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に対して、免疫グロブリン分子の可変領域に存在する少なくとも１つの抗原認識部位を通じて特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用される場合は、この用語には、完全なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体だけではなく、それらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体構造も含まれる。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）のような任意のクラスの抗体、および必ずしも任意の特定のクラスである必要はない抗体が含まれる。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列によって、免疫グロブリンを種々のクラスに分けることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要な免疫グロブリンのクラスが存在する。これらのいくつかはさらに、サブクラス（イソ型）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。種々の免疫グロブリンのクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元構造は周知である。
【００８７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む抗体断片である。２本鎖のＦｖ種においては、この領域は、密接に非共有結合した１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインの二量体から構成される。単鎖Ｆｖ種においては、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインが、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合され、その結果、軽鎖と重鎖は２本鎖のＦｖ種の構造と同じような二量体構造で結合することができる。この立体構造においては、それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上での抗原結合特異性を定義している。しかし、なおも１つの可変ドメイン（または抗原に特異的なわずか３つのＣＤＲを含むＦｖの半分）は、抗原を認識してこれに結合する能力を有しているが、通常は、完全な結合部位よりも親和性が低い。
【００８８】
Ｆａｂ断片にはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）が含まれる。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む数個の残基が付加されていることによって、Ｆａｂ断片とは異なる。
【００８９】
「モノクローナル抗体」は、均質な抗体の集団をいい、ここでは、モノクローナル抗体は、抗原の選択的な結合に関与しているアミノ酸（自然界に存在しているアミノ酸および自然界には存在しないアミノ酸）から構成される。モノクローナル抗体の集団は特異性が高く、１つの抗原部位に対して向けられている。用語「モノクローナル抗体」には、完全なモノクローナル抗体と全長のモノクローナル抗体だけではなく、それらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに必要な特異性についての抗原認識部位および抗原に結合する能力を有している免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体構造も含まれる。これらは、抗体の供給源、またはそれらが作成される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関する限定とは意図されない。
【００９０】
本明細書中で使用される場合は、「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される、および／または当該分野で公知であるかもしくは本明細書中に開示されるヒト抗体を作成するための任意の技術を使用して作成されている抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有している抗体を意味する。ヒト抗体の定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチド、または少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。１つのこのような例は、マウス軽鎖ポリペプチドとヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当該分野で公知の種々の技術を使用して生産することができる。１つの実施形態においては、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、ここではファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ等，１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓ等，１９９８，ＰＮＡＳ，（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ等，１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１）。ヒト抗体はまた、トランスジェニック動物、例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作成することができる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して指向させられた抗体を生産するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製することができる（このようなＢリンパ球は個体から回収することができ、また、生体外で免疫化することもできる）。例えば、Ｃｏｌｅ等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ等，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
【００９１】
「キメラ抗体」は、重鎖と軽鎖のそれぞれのアミノ酸配列の１つの部位が、特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体中の対応している配列に相同であるが、鎖の残りの断片は別のクラスに属する抗体中の対応している配列に相同である抗体をいう。通常は、これらのキメラ抗体においては、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域とよく似ており、一方、定常部分は別の種に由来する抗体中の配列と相同である。そのようなキメラ形態の１つの明確な利点は、その可変領域が、例えばヒト細胞調製物から誘導される定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主由来の容易に入手可能なハイブリドーマまたはＢ細胞を使用して、現在公知の供給源から簡便に誘導され得ることである。可変領域は調製が容易であるという利点を有し、そして特異性はその供給源には影響されないが、ヒトのものである定常領域は、抗体が注射されるときに、非ヒト供給源由来の定常領域よりもヒト被験体による免疫応答を誘発しにくい。しかし、この定義はこの特定の例には限定されない。
【００９２】
「機能性Ｆｃ領域」は、自然界に存在している配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有している。例示的な「エフェクター機能」として、Ｃ１ｑ結合；補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＤＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能は通常、結合ドメイン（例えば、抗体の可変ドメイン）と結合するＦｃ領域に必要であり、このような抗体のエフェクター機能を評価するための当該分野で公知の種々のアッセイを使用して評価することができる。
【００９３】
「自然界に存在している配列Ｆｃ領域」には、自然界において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列が含まれる。「変異体Ｆｃ領域」には、少なくとも１つのアミノ酸の修飾により自然界に存在している配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるが、自然界に存在している配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能をなおも保持しているアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、自然界に存在している配列Ｆｃ領域またはもとのポリペプチドのＦｃ領域と比較して、例えば、自然界に存在している配列Ｆｃ領域またはもとのポリペプチドのＦｃ領域中での約１個から約１０個のアミノ酸置換による、好ましくは、約１個から約５個のアミノ酸置換による、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。本明細書中に記載される変異体Ｆｃ領域は、自然界に存在している配列Ｆｃ領域および／またはもとのポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、それらと少なくとも約９０％の配列同一性を、さらに好ましくは、それらと少なくとも約９５％の配列同一性を有することが好ましい。
【００９４】
本明細書中で使用される場合は、「抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、これに続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞によって媒介される反応をいう。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、生体外ＡＤＣＣアッセイ、例えば、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているアッセイを使用して評価することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が挙げられる。あるいは、またはこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、生体内で、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等，１９９８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６に開示されているモデルのような動物モデルにおいて評価することができる。
【００９５】
本明細書中で使用される場合は、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは自然界に存在している配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するものであり、これには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、および、ＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、これらにはこれらの受容体の対立遺伝子変異体および異なるようにスプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれる。これらは、主にその細胞質ドメインが異なる、類似しているアミノ酸配列を有している。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌ等，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａｓｓ等，１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１に概説されている。「ＦｃＲ」にはまた、新生児受容体であるＦｃＲｎも含まれ、これは、母体のＩｇＧの胎児への移動に応答する（Ｇｕｙｅｒ等，１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７；およびＫｉｍ等，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９）。
【００９６】
「補体依存性細胞傷害性」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下の標的の溶解をいう。補体活性化経路は、補体システムの第１の成分（Ｃ１ｑ）の、同種抗原と複合体を形成した分子（例えば、抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ等，Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００９７】
本明細書中で使用される場合は、用語「Ｅ３」、「３Ｅ」、および「抗体Ｅ３」は同義的に使用され、それぞれ図１Ａ（配列番号１）および１Ｂ（配列番号２）に示される重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体をいう。抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲを含む）は、図１Ａおよび１Ｂに模式的に示される。図２および３は、それぞれ、重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを示し、これには、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域が含まれる。Ｅ３の作成および特徴付けは、実施例に記載される。種々の生物学的機能がＥ３に関係しており、これには、ＮＧＦに結合し、そしてＮＧＦの生物学的活性および／またはＮＧＦによる情報伝達によって媒介される下流の経路（単数または複数）を阻害する能力；ならびにマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を阻害する能力が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で議論されるように、本発明の抗体はこれらの特徴のいずれか１つ以上を有することができる。いくつかの実施形態においては、用語「Ｅ３」は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有しているＥ３軽鎖をコードするポリヌクレオチドと、（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有しているＥ３重鎖をコードするポリヌクレオチドによってコードされる免疫グロブリンをいう。
【００９８】
本明細書中で使用される場合は、抗体の「免疫特異的」結合は、抗体の抗原結合部位と抗体によって認識される特異的抗原との間で生じる抗原特異的結合相互作用をいう（すなわち、抗体はＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてはタンパク質と反応し、関係のないタンパク質とは検出できるほどには反応しない）。
【００９９】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書中では同義的に使用される）エピトープは、当該分野で十分に理解されている用語であり、このような特異的結合または優先的結合を決定するための方法もまた当該分野で周知である。分子は、それが別の細胞または物質について行うよりも、特定の細胞または物質と、高い頻度で、より迅速に、より長い間、および／またはより高い親和性で反応または会合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体は、それが他の物質に結合するよりも、高い親和性で、高い結合活性で、より容易に、および／またはより長い間結合する場合に、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、１つのＮＦＧエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、他のＮＧＦエピトープまたはＮＧＦではないエピトープに結合するよりも高い親和性で、高い結合活性で、より容易に、および／またはより長い間このエピトープに結合する抗体である。例えば、第１の標的に特異的もしくは優先的に結合する抗体（または一部もしくはエピトープ）は、第２の標的にも特異的または優先的に結合できる場合があり、またそうでない場合もあることも、この定義を読むことにより理解される。このように、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも独占的な結合である必要はない（しかし、独占的結合も含まれる）。一般的には、結合という言及は優先的な結合を意味するが、必ずしもそうである必要はない。
【０１００】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書中では同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合体をいう。重合体は直鎖であっても分岐鎖であってもよく、これには修飾されたアミノ酸が含まれる場合もあり、そしてアミノ酸以外のものが間に入っている場合もある。この用語にはまた、自然にまたは介入によって修飾されている；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合のような任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されている、アミノ酸の重合体も含まれる。この定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、自然界には存在しないアミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の修飾も含まれる。本発明のポリペプチドは抗体をベースとするものであるので、ポリペプチドは単鎖として、または会合した鎖として存在することができることが理解される。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は本明細書中では同義的に使用され、任意の長さのヌクレオチドの重合体をいい、これにはＤＮＡとＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼにより重合体中に組み込むことができる任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドには、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体が含まれる場合がある。存在する場合には、ヌクレオチド構造の修飾は、重合体の組立の前または後に行うことができる。ヌクレオチドの配列には、ヌクレオチド以外の成分が間に存在する場合もある。ポリヌクレオチドを、例えば、標識成分との結合によって、重合後にさらに修飾することもできる。他の型の修飾としては、例えば、「キャップ付加」、類似体での１つ以上の自然界に存在しているヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、電荷を有さない連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、および電荷を有している連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を含むヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）のようなペンダント部分を含むヌクレオチド間修飾、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を含むヌクレオチド間、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属、ボラン、酸化力のある金属など）を含むヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含むヌクレオチド間修飾、修飾された連結（例えば、αアノマー核酸など）を含むヌクレオチド間修飾）、ならびにポリヌクレオチド（単数または複数）の修飾されていない形態が含まれる。さらに、通常、糖の中に存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換することができ、また標準的な保護基によって保護することもでき、また別のヌクレオチドへの別の連結を作るように活性化することもでき、また固体支持体に結合させることもできる。５’および３’末端のＯＨはリン酸化することができるか、または１から２０個の炭素原子のアミンもしくは有機キャップ基部分で置換することができる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基へと誘導することができる。ポリヌクレオチドにはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリール、２’−フルオロ、または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、および脱塩基ヌクレオシド類似体（例えば、メチルリボシド）を含む、当該分野で一般的に公知であるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似体形態も含めることができる。１つ以上のホスホジエステル結合を、別の結合基で置き換えることもできる。これらの別の結合基としては、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、��たはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられる実施形態が含まれるが、これらに限定されない。ここでは、ＲまたはＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは、状況に応じてエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む置換または未置換のアルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同じである必要はない。上記の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書中で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【０１０１】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を、単独で、または合わせてのいずれかでいう。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結された４個のフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。それぞれの鎖のＣＤＲはＦＲによって互いに接近した状態にあり、他の鎖のＣＤＲを用いて、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための技術は少なくとも２つ存在している：（１）種間の配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ等，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ，１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ））；および（２）抗原抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチ（Ｃｈｏｔｈｉａ等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７；Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ等（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。本明細書中で使用される場合は、ＣＤＲは、いずれかのアプローチによって、または両方のアプローチを組み合わせて定義されるＣＤＲを意味する。
【０１０２】
抗体の「定常領域」は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を、単独で、または合わせてのいずれかでいう。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合は、用語「神経成長因子」および「ＮＧＦ」は、ＮＧＦの生物学的活性の少なくとも一部を保持している、神経成長因子およびその変異体をいう。本明細書中で使用される場合は、ＮＧＦには、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシを含む全ての哺乳動物種の自然界に存在している配列のＮＧＦが含まれる。
【０１０４】
「ＮＧＦ受容体」は、ＮＧＦに結合されるかまたはＮＧＦによって活性化されるポリペプチドをいう。ＮＧＦ受容体には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、霊長類、またはウシを含むがこれらに限定されない全ての哺乳動物種のＴｒｋＡ受容体およびｐ７５受容体が含まれる。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合には、「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」（同義的に、「抗ＮＧＦ抗体」ともいわれる）は、ＮＧＦに結合し、そしてＮＧＦによる情報伝達によって媒介されるＮＧＦの生物学的活性および／または下流の経路（単数または複数）を阻害する抗体をいう。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体には、受容体への結合および／またはＮＧＦに対する細胞性の応答の誘発のようなＮＧＦによる情報伝達によって媒介される下流の経路を含む、ＮＧＦの生物学的活性をブロックする、アンタゴナイズする、抑制する、または低下させる（顕著なものを含む）抗体が含まれる。本発明の目的については、用語「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」には、それによりＮＧＦ自体、ＮＧＦの生物学的活性（外科手術後の痛みの任意の態様を媒介するその能力が含まれるが、これに限定されない）、または生物学的活性の結果がいくらか意味のある程度で実質的に無くなってしまう、低下させられる、または中和される、以前に同定されたもの、名称、および機能的状態、および特性の全てが含まれる。いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体はＮＧＦに結合し、そしてＮＧＦの二量体化および／またはＮＧＦ受容体（例えば、ｐ７５および／またはｔｒｋＡ）への結合を妨げる。他の実施形態においては、抗ＮＧＦ抗体はＮＧＦに結合し、そしてｔｒｋＡ受容体の二量体化および／またはｔｒｋＡの自己リン酸化を妨げる。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の例は本明細書中で提供される。
【０１０６】
ＮＧＦの「生物学的活性」は、通常、ＮＧＦ受容体に結合し、そして／またはＮＧＦ受容体による情報伝達経路を活性化する能力をいう。限定的ではないが、生物学的活性としては、以下のいずれか１つ以上が挙げられる：ＮＧＦ受容体（例えば、ｐ７５および／またはｔｒｋＡ）に結合する能力；ｔｒｋＡ受容体の二量体化および／または自己リン酸化を促進する能力；ＮＧＦ受容体情報伝達経路を活性化する能力；細胞の分化、増殖、生存、成長、ならびに（抹消ニューロンおよび中枢ニューロンを含むニューロンの場合には）ニューロンの形態の変化、シナプス形成、シナプスの機能、神経伝達物質、および／または神経ペプチドの放出および損傷後の再生を含む細胞生理学における他の変化を促進する能力；マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存性を促進する能力；ならびに外科手術後の痛みを含む痛みを媒介する能力。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合は、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％が純粋（すなわち、混入物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％が純粋、より好ましくは、少なくとも９５％が純粋、より好ましくは、少なくとも９８％が純粋、より好ましくは、少なくとも９９％が純粋である物質をいう。
【０１０８】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を組み込むためのベクター（単数または複数）についてのレシピエントであり得るかまたはレシピエントを有している、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、このような子孫は、自然に生じる突然変異、偶発的な突然変異、または熟考された上での突然変異によって、もとの親細胞と必ずしも完全に同一ではない（形態において、またはゲノムＤＮＡの相補性において）場合がある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（単数または複数）によって生体内でトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合は、「処置」は、有用な、または望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的については、有用な、または望ましい臨床結果としては、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない：急性の痛み、慢性の痛み、炎症性の痛み、神経障害性の痛み、外科手術後の痛み、関節リウマチの痛み、または変形性関節症の痛みを含む、痛みの任意の性状の痛みの改善または緩和。本発明の目的については、有用な、または望ましい臨床結果としては、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない：重篤度を下げること、任意の性状の痛みを含む痛みを伴う１つ以上の症状の緩和（例えば、痛みの期間を短くする、痛感または感覚レベルの低下）。
【０１１０】
薬剤、化合物、または薬学的組成物の「有効量」は、痛みの感覚の緩和または軽減のような臨床結果を含む、有用なまたは望ましい臨床結果を得るために十分な量である。有効量は、１回以上の投与によって投与することができる。本発明の目的については、薬剤、化合物、または薬学的組成物の有効量は、外科手術後の痛み、関節リウマチの痛み、および／または変形性関節症の痛みを含む痛みを処置する、緩和する、痛みの強さのレベルを下げる、および／または痛みを予防するために十分な量である。いくつかの実施形態においては、「有効量」により、安静時の痛みまたは無意識的に生じる痛み（運動後の痛みを含む）、あるいはそれらの両方を軽減することができ、そして有効量は、切断、切開、裂傷、もしくは損傷の前、その間、または後に、ならびに／あるいは苦痛の刺激の前、その間、または後に投与することができる。臨床状況において理解されるように、別の薬剤、化合物、または薬学的組成物との組み合わせによって、薬剤、化合物、または薬学的組成物の有効量に達するようにすることもでき、そうでなくてもよい。したがって、「有効量」を１つ以上の治療薬の投与の状況において考えることもでき、１つ以上の他の剤と組み合わせて望ましい結果となるかまたは望ましい結果が得られるようにする場合には、単一の剤を、有効量で与えるように考えることができる。
【０１１１】
痛みの「発生を減らすこと」は、重篤度を下げる（これには、例えば鎮静剤を含む、この症状に通常使用される他の薬剤および／または治療薬の必要性および／または量（例えば、照射される量）を減らすことが含まれ得る）、期間ならびに／あるいは頻度を減らす（例えば、個体における外科手術後の痛みまでの時間を遅らせるかまたは延長することが含まれる）ことのいずれかを意味する。当業者に理解されるように、個々の個体は、処置に対するそれらの反応が異なる場合があり、そして例えば、「個体における関節リウマチの痛みまたは変形性関節症の痛みの発生を減らす方法」は、そのような投与により特定の個体においてそのような発生の減少がおそらく生じるであろうという十分な期待に基づく、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与を反映する。
【０１１２】
痛み（例えば、関節リウマチの痛みまたは変形性関節症の痛み）または痛みの１つ以上の症状を「緩和すること」は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与しない場合と比較して、痛みの１つ以上の症状を弱くすることまたは症状の改善を意味する。「緩和すること」にはまた、症状の期間を短くすることまたは減らすことも含まれる。
【０１１３】
痛み（例えば、関節リウマチの痛みまたは変形性関節症の痛み）または痛みの１つ以上の症状を「和らげること」は、本発明の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体で処置した個体または個体の集団において、１つ以上の望ましくない外科手術後の痛みの臨床症状の程度を弱くすることを意味する。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合は、痛みの発生を「遅らせること」は、外科手術後の痛み、関節リウマチの痛み、または変形性関節症の痛みのような痛みの進行を延ばすこと、妨げること、遅くすること、遅延させること、安定させること、および／またはあとに延ばすことを意味する。この「遅らせること」は、処置される疾患および／または個体の病歴に応じて、種々の時間の長さであり得る。当業者に明らかであるように、十分であるか、または有意な「遅れ」には、実際には、個体が痛みを生じない場合には、予防も含まれ得る。症状の発症を「遅らせる」方法は、この方法を使用しない場合と比較して、一定の時間枠の中で症状を発症する可能性を下げる、および／または一定の時間枠の中での症状の程度を下げる方法である。このような比較は、通常は、統計学的に有意な数の被験体を使用する臨床試験に基づく。
【０１１５】
「痛み」は、本明細書中で使用される場合は、急性および慢性の痛み、ならびに炎症という構成要素を伴うあらゆる痛みを含む、あらゆる病因による痛みをいう。痛みの例としては、外科手術後の痛み、手術後の痛み（歯痛を含む）、偏頭痛、頭痛、および三叉神経痛、火傷、創傷、腎臓結石に伴う痛み、外傷（外傷性頭部損傷を含む）に伴う痛み、神経障害性の痛み、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、血清反応陰性（リウマチではない）関節症、非関節リウマチ、および関節周囲の障害のような筋骨格障害に伴う痛み、ならびに、ガン（「抑えきれない痛み」および末期ガンの痛みを含む）、抹消神経障害、およびヘルペス後神経痛に伴う痛みが挙げられる。（上記のいくつかに加えて）炎症という構成要素を伴う痛みの例として、リウマチの痛み、粘膜炎の痛み、および月経困難症の痛みが挙げられる。
【０１１６】
「外科手術後の痛み」（同義的に、「切開後」または「外傷後の痛み」ともいわれる）は、個体の組織の切開、穿刺、切断、裂傷、または創傷（侵襲的であるかまたは非侵襲的であるかにはかかわらず、全ての外科手術手順によって生じるものを含む）のような、外傷によって生じるまたは外部からの外傷の結果である痛みをいう。本明細書中で使用される場合は、外科手術後の痛みには、外部からの物理的な外傷を伴わずに起こる（外部からの物理的な外傷を伴わずに生じる、または外部からの物理的な外傷が原因ではない）痛みは含まれない。いくつかの実施形態においては、外科手術後の痛みは、内部または外部（周辺を含む）の痛みであり、創傷、切開、外傷、裂傷、または切断が、偶然に（外傷性創傷のように）または意図的に（外科手術による切開）生じる場合もある。本明細書中で使用される場合は、「痛み」には痛覚および痛みの感覚が含まれ、痛みは、当該分野で周知の痛みのスコアおよび他の方法を使用して客観的および主観的に評価することができる。外科手術後の痛みには、本明細書中で使用される場合には、異痛症（すなわち、通常は毒性のない刺激に対する過剰な反応）および痛覚過敏（すなわち、通常は不快であるかまたは不愉快な刺激に対する過剰な反応）が含まれ、これらは言い換えると、熱または機械的な（触感）の性質のものである。いくつかの実施形態においては、痛みは、温度感度、無意識的な感度、および／または安静時の痛みによって特徴付けられる。いくつかの実施形態においては、外科手術後の痛みには、無意識に生じた痛みまたは安静時の痛みが含まれる。他の実施形態においては、外科手術後の痛みには、安静時の痛みが含まれる。痛みは、当該分野で周知であるように、一次痛または二次痛であり得る。
【０１１７】
「生物学的試料」には、個体から得られる種々の型の試料が含まれ、これらは診断アッセイまたはモニタリングアッセイに使用することができる。この定義には、血液、および生物学的起源の他の液体試料、生検標本または組織培養物またはそれらに由来する細胞のような固体組織試料、ならびにそれらの子孫が含まれる。この定義にはまた、それらの調達後に、試薬での処理、可溶化、または特定の成分（例えば、タンパク質またはポリヌクレオチド）の濃縮、切片化の目的のための半固体または固体のマトリックス中への包埋のような、何らかの方法で操作された試料も含まれる。用語「生物学的試料」には臨床試料も含まれ、これにはまた、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、および組織試料が含まれる。
【０１１８】
「個体」は脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ）、スポーツ用動物、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類、マウス、およびラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合は、「ベクター」は、宿主細胞中に目的の１つ以上の遺伝子（単数または複数）または配列（単数または複数）を導入し、そして好ましくは発現させることができる構築物をいう。ベクターの例として、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、ファージミドベクター、陽イオン縮合剤に結合させられたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中にカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核生物細胞（例えば、生成細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合は、「発現制御配列」は、核酸の転写を導く核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター（例えば、構成性プロモーターもしくは誘導性プロモーター）またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に対して、作動するように連結される。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合は、「薬学的に許容されるキャリアー」には、有効成分と結合しても、その成分が生物学的活性を維持することができ、そして被験体の免疫系とは反応しない、任意の物質が含まれる。例として、リン酸緩衝化生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、および種々の型の湿潤剤のような、標準的な薬学的キャリアーの任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝化生理食塩水または生理食塩溶液（０．９％）である。このようなキャリアーを含む組成物は、周知の従来の方法によって処方される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００を参照のこと）。
【０１２２】
用語「Ｋｏｆｆ」は、本明細書中で使用される場合は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数をいうように意図される。
【０１２３】
用語「Ｋｄ」は、本明細書中で使用される場合は、抗体−抗原相互作用の解離定数をいうように意図される。
【０１２４】
抗体Ｅ３、Ｅ３に由来する抗体、組成物、およびその使用
Ｅ３組成物、Ｅ３に由来する組成物、および組成物を作成する方法
本発明には、薬学的組成物を含む組成物が含まれ、これには、Ｅ３抗体またはポリペプチド；およびＥ３抗体またはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。本明細書中で使用される場合は、組成物は、ＮＧＦに結合する１つ以上の抗体またはポリペプチド（これは、抗体であっても抗体でなくてもよい）、および／またはＮＧＦに結合する１つ以上の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドが含まれる。これらの組成物にはさらに、当該分野で周知の適切な賦形剤、例えば、緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤が含まれる場合がある。
【０１２５】
本発明にはまた、単離された抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドの実施形態が含まれる。本発明にはまた、実質的に純粋な抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドの実施形態も含まれる。
【０１２６】
本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特徴のいずれか（１つ以上）によって特徴付けられる：（ａ）ＮＧＦに結合する能力；（ｂ）ＮＧＦの生物学的活性および／またはＮＧＦによる情報伝達によって媒介される下流の経路（単数または複数）を低下させるおよび／または阻害する能力；（ｃ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を低下させるおよび／または阻害する能力；（ｄ）ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦに対する有意な交差反応性のいずれかの欠如；（ｅ）痛み（外科手術後の痛みを含む）を処置および／または予防する能力；（ｆ）ＮＧＦのクリアランスを高める能力；（ｇ）ｔｒｋＡ受容体の活性化を減少させるかまたは阻害する能力、これは、例えば、キナーゼ受容体活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）を使用して検出される（米国特許第６，０２７，９２７号）。
【０１２７】
もとのマウス抗ＮＧＦモノクローナル抗体９１１と比較して、高い親和性と遅い解離速度を伴ってヒトＮＧＦに結合する、抗体Ｅ３の結合特性が以下にまとめられる。Ｅ３は、もとのマウス抗体９１１よりもおよそ５０倍高い結合親和性でヒトＮＧＦに結合する。
【０１２８】
【数１】
2006525955.tif 000001
Ｅ３抗体および関連抗体はまた、生体外アッセイ（実施例２および３を参照のこと）によって評価した場合には、ヒトＮＧＦをアンタゴナイズする強い能力をも示す。例えば、抗体Ｅ３は、１５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下では約２１ｐＭのＩＣ５０で、そして１．５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下では約１．２ｐＭのＩＣ５０で、マウスＥ１３三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性をアンタゴナイズする。
【０１２９】
したがって、別の態様においては、本発明の抗体およびポリペプチドはさらに、以下によって同定され特徴付けられる：（ｈ）遅い解離速度（いくつかの実施形態においては、約２ｎＭ未満のＫＤ、および／または約６×１０−５ｓ−１より遅いＫｏｆｆを有する）でのヒトＮＧＦへの親和性の高い結合、ならびに／あるいは（ｉ）約１５ｐＭのＮＧＦ（いくつかの実施形態では、ヒトＮＧＦ）では約１００ｐＭ以下のＩＣ５０で、および／または約１．５ｐＭのＮＧＦでは約２０ｐＭ以下のＩＣ５０で、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を阻害（ブロック）する能力。
【０１３０】
いくつかの実施形態においては、抗体はヒトＮＧＦに結合し、別の脊椎動物種（いくつかの実施形態においては、哺乳動物）に由来するＮＧＦには有意には結合しない。いくつかの実施形態においては、抗体は、ヒトＮＧＦに結合し、さらに別の脊椎動物種（いくつかの実施形態においては、哺乳動物）に由来する１つ以上のＮＧＦにも結合する。さらに他の実施形態においては、抗体はＮＧＦに結合し、他のニュートロフィン（例えば、関連するニュートロフィン、ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦ）とは有意には交差反応しない。いくつかの実施形態においては、抗体はＮＧＦに結合し、さらに少なくとも１つの他のニュートロフィンにも結合する。いくつかの実施形態においては、抗体は哺乳動物種（例えば、ウマまたはイヌ）のＮＧＦに結合するが、別の哺乳動物種に由来するＮＧＦには有意には結合しない。
【０１３１】
いくつかの実施形態においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有している宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖を含む抗体である。別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有している宿主細胞によって生産されるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖を含む抗体である。本発明にはまた、種々の形態のＥ３および同等の抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要とされる特異性についての抗原（ＮＧＦ）認識部位を含むＥ３の任意の他の修飾された立体構造も含まれる。Ｅ３の抗体およびポリペプチド断片（抗体であっても抗体ではなくてもよい）を含むＥ３の同等の抗体、ならびにＥ３のポリペプチド断片を含むポリペプチドは、上記の基準のいずれか（１つ以上）によって同定され、特徴付けられる。
【０１３２】
したがって、本発明により、以下のいずれか、または以下のいずれかを含む組成物（薬学的組成物を含む）が提供される：（ａ）抗体Ｅ３；（ｂ）抗体Ｅ３の断片または領域；（ｃ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖；（ｃ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖；（ｄ）抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖に由来する１つ以上の可変領域（単数または複数）；（ｅ）図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３の１つ以上のＣＤＲ（単数または複数）（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）；（ｆ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖に由来するＣＤＲ  Ｈ３；（ｇ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖に由来するＣＤＲ  Ｌ３；（ｈ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖に由来する３つのＣＤＲ；（ｉ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖に由来する３つのＣＤＲ；（ｊ）図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３の、軽鎖に由来する３つのＣＤＲと重鎖に由来する３つのＣＤＲ；ならびに（ｋ）（ｂ）から（ｊ）のいずれか１つを含む抗体。本明細書中の記載から明らかであるように、マウスモノクローナル抗体９１１のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列によって構成されるポリペプチドの実施形態は、本発明から明確に排除される。Ｍａｂ  ９１１の伸張型ＣＤＲ配列は図１Ａおよび１Ｂに、ならびに配列番号９〜１４に示される。
【０１３３】
抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲとＫａｂａｔ  ＣＤＲを含む）は、図１Ａおよび１Ｂに図示される。これは、以下のアミノ酸配列から構成される：（ａ）重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲ  Ｈ１」）ＧＦＳＬＩＧＹＤＬＮ（配列番号３）；（ｂ）重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲ  Ｈ２」）ＩＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＶＫＳ（配列番号４）；（ｃ）重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲ  Ｈ３」）ＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号５）；（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲ  Ｌ１」）ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮ（配列番号６）；（ｅ）軽鎖ＣＤ
Ｒ２（「ＣＤＲ  Ｌ２」）ＹＴＳＲＦＨＳ（配列番号７）；および（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲ  Ｌ３」）ＱＱＥＨＴＬＰＹＴ（配列番号８）。ＣＤＲ領域の決定は当業者に周知である。いくつかの実施形態においては、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲとの結合体（「結合型ＣＤＲ」または「伸張型ＣＤＲ」ともいわれる）であり得ることが理解される。いくつかの実施形態においては、ＣＤＲにはＫａｂａｔ  ＣＤＲが含まれる。他の実施形態においては、ＣＤＲにはＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲが含まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態においては、本発明により、Ｅ３の少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つのＣＤＲに実質的に相同である（またはいくつかの実施形態においては、Ｅ３の６つ全てのＣＤＲに実質的に相同であるか、またはＥ３に由来する）少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体が提供される。他の実施形態においては、Ｅ３の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲに実質的に相同であるか、またはＥ３に由来する、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（単数または複数）を有している抗体が含まれる。本発明の目的については、結合特異性および／または全体的な活性（痛みを処置および／または予防すること、あるいはＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を阻害することに関して）は、全体として保持されているが、活性の程度はＥ３と比較して異なる（大きい場合もあり、小さい場合もある）ことが理解される。
【０１３５】
本発明により、また、以下のいずれかを有しているＥ３（図１Ａおよび１Ｂに示される）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体であっても、抗体ではなくてもよい）が提供される：Ｅ３の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも８個の連続するアミノ酸、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、少なくとも約２５個の連続するアミノ酸、少なくとも約３０個の連続するアミノ酸。ここでは、少なくとも３つのアミノ酸がＥ３の可変領域に由来するアミノ酸であり、マウスのモノクローナル抗体９１１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列から構成される実施形態が、明確に排除されることが理解される。Ｍａｂ  ９１１の伸張型ＣＤＲ配列は、図１Ａおよび１Ｂ、ならびに配列番号９〜１４に示される。１つの実施形態においては、可変領域はＥ３の軽鎖に由来する。別の実施形態においては、可変領域は、Ｅ３の重鎖に由来する。別の実施形態においては、５個（またはそれ以上）の連続するアミノ酸は、図１Ａおよび１Ｂに示されるＥ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する。
【０１３６】
別の実施形態においては、本発明により、以下のいずれかを有しているＥ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される：Ｅ３の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも８個の連続するアミノ酸、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、少なくとも約２５個の連続するアミノ酸、少なくとも約３０個の連続するアミノ酸。ここでは、Ｅ３配列には、ＣＤＲ  Ｈ１のアミノ酸残基Ｌ２９、ＣＤＲ  Ｈ２のアミノ酸残基Ｉ５０、ＣＤＲ  Ｈ３のＷ１０１、および／またはＣＤＲ  Ｈ３のアミノ酸残基Ａ１０３；ならびに／あるいは、ＣＤＲ  Ｌ１のアミノ酸残基Ｓ２８、ＣＤＲ  Ｌ１のアミノ酸残基Ｎ３２、ＣＤＲ  Ｌ２のアミノ酸残基Ｔ５１、ＣＤＲ  Ｌ３のアミノ酸残基９１Ｅ、および／またはＣＤＲ  Ｌ３のアミノ酸Ｈ９２のいずれか１つ以上が含まれ、マウスのモノクローナル抗体９１１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列から構成される実施形態が、明確に排除されることが理解される。
【０１３７】
明らかであるように、本開示から、連続しているアミノ酸のナンバリングの機構は、可変領域中のアミノ酸残基をいうように使用される（すなわち、それぞれの可変領域中のアミノ酸残基が連続してナンバリングされる）。Ｋａｂａｔおよび／またはＣｈｏｔｈｉａのナンバリングシステムが、２つの抗体またはポリペプチド、例えば、Ｅ３抗体およびＥ３変異体（またはＥ３変異体であると予想されるポリペプチド）を比較する場合に有用であることは、当該分野で周知である。所望される場合に、例えば、Ｅ３ポリペプチドと別のポリペプチドとの間で比較を行うための用途に、連続的なナンバリングをどのようにしてＣｈｏｔｈｉａおよび／またはＫａｂａｔナンバリングへと変換するかは、当該分野で十分に理解されている。図２３は、連続的なＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのナンバリングを使用してナンバリングしたＥ３可変領域を示す。さらに、比較を簡単にするためには、必ずしもそうではないが、通常はフレームワーク残基が、ほぼ同じ数の残基を含むことが、一般的に理解される。しかし、ＣＤＲは大きさは様々である（すなわち、１つ以上のアミノ酸残基の挿入および／または欠失を有する可能性がある）。Ｅ３抗体と候補のＥ３変異体を比較する場合（例えば、アラインメントされる抗体Ｅ３中のＣＤＲ領域の配列よりも長い、候補の配列に由来するＣＤＲ領域の場合）には、以下の段階が行われ得る（しかし、他の方法も当該分野で公知である）。候補の抗体配列が、Ｅ３抗体の重鎖および軽鎖の可変領域と並べられる。アラインメントは、手作業で行うことも、また、一般的に受け入れられているコンピュータープログラムを使用してコンピューターによっても行うこともできる。アラインメントは、殆どのＦａｂ配列に共通であるいくつかのアミノ酸残基を使用することによって容易に行うことができる。例えば、軽鎖および重鎖のそれぞれは、通常、２つのシステインを有し、これらは多くの場合において保存された位置に見られる。候補の変異体抗体のアミノ酸配列は長い場合もあり（すなわち、アミノ酸残基が挿入されている）、また短い場合もある（アミノ酸残基が欠失している）ことが理解される。末端には、別の残基の挿入を示す残基番号、例えば、残基３４ａｂｃが加えられている場合がある。例えば、残基３３と３５について、残基３５と並べるための候補の配列については、例えば、Ｅ３配列と並べる候補の配列についうて、残基３３と３５に関して、残基３５と並べる残基がそれらの間にない場合には、残基３５にはただ単に残基が割り当てられない。別のアプローチにおいては、種々の長さのＣＤＲを比較する場合に、構造上同等である（例えば、抗体−抗原複合体中の同じ位置）アミノ酸の間で比較を行うことができることが、一般的に周知である。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ等，前出）では、構造上の対応している位置に挿入および欠失をおくことが一般的である（しかし、全ての場合においてそうではない）。構造上の等価は、Ｘ線結晶解析、または二重変異体のサイクル分析を使用して推定、または実証することもできる（Ｐｏｎ等（１９９９）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．８：９５８−９６８を参照のこと）。
【０１３８】
ＮＧＦ（例えば、ｈＮＧＦ）に対する抗ＮＧＦ抗体の結合親和性は、約０．１０から約０．８０ｎＭ約０．１５から約０．７５ｎＭ、および約０．１８から約０．７２ｎＭであり得る。いくつかの実施形態においては、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭよりも高い。１つの実施形態においては、結合親和性は、約２ｐＭから２２ｐＭの間である。他の実施形態においては、結合親和性は、約１０ｎＭ未満であり、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭである。いくつかの実施形態においては、結合親和性は、約１０ｎＭである。他の実施形態においては、結合親和性は、約１０ｎＭ未満である。他の実施形態においては、結合親和性は、約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他の実施形態においては、結合親和性は、約０．１ｎＭ未満であるか、または約０．０７ｎＭ未満である。他の実施形態においては、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまでである。いくつかの実施形態においては、結合親和性は、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれかである。さらに他の実施形態においては、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭよりも高い。
【０１３９】
ＮＧＦに対する抗体の結合親和性は、当該分野で周知の方法を使用して決定することができる。ＮＧＦに対する抗体の結合親和性を決定する１つの方法は、実施例に記載されるような、抗体のモノクローナルＦａｂ断片の親和性を測定することによる。モノクローナルＦａｂ断片を得るためには、抗体（例えば、ＩｇＧ）をパパインで切断するか、または組み換えによって発現させることができる。抗体の抗ＮＧＦ  Ｆａｂ断片の親和性は、実施例に記載されるように、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｗａｙ  ＮＪ）によって決定することができる。このプロトコールは、ヒトＮＧＦ、別の脊椎動物（いくつかの実施形態においては、哺乳動物）のＮＧＦ（例えば、マウスＮＧＦ、ラットＮＧＦ、霊長類ＮＧＦ）を含む、あらゆる種のＮＧＦに対する抗体の結合親和性を決定するという用途に、さらには、他のニュートロフィン（例えば、関連するニュートロフィンＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦ）を用いる用途に適している。
【０１４０】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体またはペプチドは、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約８０ｐＭ、約６０ｐＭ、約４０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭのいずれか、またはそれ未満のＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性を阻害する（低下させる、および／またはブロックする）ことができる。いくつか実施形態においては、本発明の抗体またはペプチドは、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭのいずれか、またはそれ未満のＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存的生存性を阻害する（低下させる、および／またはブロックする）ことができる。いくつか実施形態においては、本発明の抗体またはペプチドは、約１５０ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１００ｐＭ、約８０ｐＭ、約６０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭのいずれか、またはそれ未満のＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存的生存性を阻害する（低下させる、および／またはブロックする）ことができる。いくつか実施形態においては、本発明の抗体またはペプチドは、約３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭのいずれか、またはそれ未満のＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存的生存性を阻害する（低下させる、および／またはブロックする）ことができる。マウスＥ１３三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性の測定のための方法は当該分野で公知であり、例えば、実施例２に記載される。
【０１４１】
本発明により、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを作成する方法も提供される。本発明の抗体は、当該分野で公知の手順によって作成することができ、そのいくつかが実施例で説明される。ポリペプチドは、上記のような組み換え方法によって（すなわち、一本鎖ポリペプチドまたは融合ポリペプチド）、または化学合成によって、抗体のタンパク質分解または他の消化によって生産することもできる。抗体のポリペプチド、特に、約５０アミノ酸までの短いポリペプチドは、化学合成によって作成することが便利である。化学合成の方法は当該分野で公知であり、市販されている。例えば、Ｅ３抗体は、固相方法を使用する自動ポリペプチド合成装置によって生産することができる。米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第６，３３１，４１５号もまた参照のこと。キメラ抗体またはハイブリッド抗体もまた、合成タンパク質化学の公知の方法を使用して生体外で調製することができる。この方法には、架橋剤が含まれる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合の形成によって構築することができる。この目的について適切な試薬の例として、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１４２】
別の方法においては、抗体を、当該分野で周知の手順を使用して組み換えによって作成することができる。１つの実施形態においては、抗体Ｅ３の可変領域および軽鎖領域（図１Ａおよび１Ｂに示される）をコードする配列を含むポリヌクレオチドが、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中での発現または増殖用のベクター中にクローニングされる。別の実施形態においては、図２および３に示されるポリヌクレオチド配列が、発現または増殖のために、１つ以上のベクターにクローニングされる。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中でベクター中に維持され、その後、宿主細胞は将来使用するために増殖させられ、凍結される。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞については、さらに本明細書中で記載される。植物または乳汁中で抗体を組み換えによって発現させるための方法は開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓ等（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｄ．Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５；およびＰｏｌｌｏｃｋ等（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７を参照のこと。抗体の誘導体（例えば、ヒト化抗体、単鎖抗体など）を作成するための方法は当該分野で公知である。
【０１４３】
本発明にはまた、本発明の抗体、例えば、Ｅ３の単鎖可変領域断片（「ＳｃＦｖ」）が含まれる。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用することによる、軽鎖および／または重鎖の可変領域の連結によって作成される。Ｂｉｒｄ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）であり、これは、１つの可変領域のカルボキシ末端と他の可変領域のアミノ末端との間のおよそ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーが設計されており、使用されている（Ｂｉｒｄ等（１９８８））。リンカーは、次いで、薬剤の結合または固体支持体への結合のような、さらなる機能のために修飾することができる。単鎖変異体は、組み換えによるか、または合成によるかのいずれかで生産することができる。ｓｃＦｖの合成による生産については、自動合成装置を使用することができる。ｓｃＦｖの組み換え生産については、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞中（酵母、植物、昆虫、もしくは哺乳動物の細胞のような真核生物細胞、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核生物細胞）に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの連結のような日常的に使用される操作によって作成することができる。得られるｓｃＦＶは、当該分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離することができる。
【０１４４】
単鎖抗体の他の形態、例えば、ダイアボディーもまた、含まれる。ダイアボディーは二価の二重特異的抗体であり、その中のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、１本のポリペプチド鎖上で、しかし、同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合するには短かすぎるリンカーを使用して、発現され、これにより、これらのドメインは別の鎖の相補ドメインと対合するように向けられ、２つの抗原結合部位が作成される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．等（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【０１４５】
抗体は、少なくとも２つの異なる抗原についての結合特異性を有しているモノクローナル抗体である、二重特異的抗体であり得る。二重特異的抗体は、本明細書中で開示される抗体を使用して調製することができる。二重特異的抗体を作成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈ等，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０を参照のこと）。伝統的には、二重特異的抗体の組み換えによる生産は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、２つの重鎖は異なる特異性を有している（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，５３７−５３９）。
【０１４６】
二重特異的抗体を作成するための１つのアプローチによれば、所望される結合特異性を有している抗体の可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させられる。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとである。融合体の少なくとも１つの中に存在する、軽鎖の結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、および所望される場合には、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別の発現ベクターに挿入され、これらは適切な宿主生物に同時にトランスフェクトされる。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の割合が等しくない場合にも最適な収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調節することにおいて、大きな柔軟性が提供される。しかし、同じ割合の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高い収率が生じるか、または割合が特に重要ではない場合には、１つの発現ベクター中に２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１４７】
１つのアプローチにおいては、二重特異的抗体は、１つのアーム中に第１の結合特異性を有しているハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他のアーム中にハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とから構成される。二重特異的分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖を有しているこの非対称な構造により、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望される二重特異的化合物の分離が容易になる。このアプローチは、１９９４年３月３日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０４６９０に記載されている。
【０１４８】
ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合された抗体を含み、これもまた本発明の範囲に含まれる。このような抗体は、望ましくない細胞に対して免疫系の細胞を標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のため（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／００３６０および同第ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９）に使用されている。ヘテロ結合体抗体は、任意の従来の架橋方法を使用して作成することができる。適切な架橋剤および技術は当該分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
【０１４９】
抗体は、例えば、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載されているような、ヒト化抗体である場合もある。
【０１５０】
抗体は、１９９９年１１月１８日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように修飾することができる。これらの抗体には、標的分子を指向する結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン全体またはその一部に実質的に相同であるアミノ酸配列を有しているエフェクタードメインが含まれる。これらの抗体は、標的の明らかな補体依存的溶解または細胞媒介性の崩壊を誘発することなく標的分子に結合することができる。エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができることが好ましい。これらは、通常、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインをベースとする。この様式で修飾された抗体は、炎症および従来の抗体療法に対する他の有害な反応を回避するために、長期的な抗体療法において使用することに適している。
【０１５１】
本発明には、抗体Ｅ３の修飾体が含まれる。これには、それらの特性に有意な影響を与えない機能的に同等の抗体、および高い活性または低い活性を有する変異体が含まれる。ポリペプチドの修飾は、当該分野で日常的に行われており、実施例でさらに説明される。修飾されたポリペプチドの例として、アミノ酸残基の置換（保存的置換を含む）、機能的活性を有意に低下させるようには変化させないアミノ酸の１つ以上の欠失または付加を含むが、あるいは化学的類似体を使用しているポリペプチドが含まれる。
【０１５２】
ポリペプチド「変異体」は、本明細書中で使用される場合は、ポリペプチドの免疫反応性を実質的に低下させることのない１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入により自然界に存在しているタンパク質とは異なるポリペプチドである。言い換えると、抗原に特異的に結合する変異体の能力は、自然界に存在しているタンパク質と比較して高くなる場合もあり、また変化しない場合もあり、さらに、自然界に存在しているタンパク質と比較して、５０％未満に、好ましくは２０％未満に低下する場合もある。ポリペプチド変異体は、同定されたポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性（本明細書中に記載されるように決定される）を示すことが好ましい。
【０１５３】
抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体ＤＮＡ中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような変異体は、例えば、本明細書中に記載されている配列番号１または２のアミノ酸配列中の残基からの欠失、および／またはそれらの残基への挿入、および／またはそれらの置換を含む。最終的な構築物が所望される特性を有する限りは、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせにより、最終的な構築物を得ることができる。アミノ酸変化によって、また、グリコシル化部位の数または位置を変化させるような、抗体の翻訳後プロセスを変化させることもできる。
【０１５４】
突然変異誘発または修飾に好ましい位置である抗体の特定の残基または領域の同定のために有用な方法は、「アラニンスキャン突然変異誘発」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって記載されている。標的残基または標的残基のグループが同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕのような電荷を有している残基）、アミノ酸の抗原との相互作用が生じるように、中性のアミノ酸または負電荷を有しているアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられる。次いで、置換に対して機能的な感受性を示すこれらのアミノ酸位置が、置換の部位に、またはその部位について、さらに変異を導入するかまたは他の変異を導入することによって再度定義される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の能力を分析するためには、ａｌａスキャンまたはランダム突然変異誘発が、標的コドンまたは領域で行われ、発現された抗体変異体が所望される活性についてスクリーニングされる。本明細書中に記載されるようなライブラリースキャン突然変異誘発もまた、突然変異誘発または修飾に適切である抗体中の位置を同定するために使用することができる。
【０１５５】
アミノ酸配列の挿入には、１残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲の、アミノ酸末端および／またはカルボキシル末端の融合、さらには、１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端の挿入の例としては，Ｎ末端にメチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合させられた抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、酵素またはポリペプチドの抗体のＮ末端またはＣ末端への融合体が挙げられ、これにより、抗体の血清半減期は長くなる。
【０１５６】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に別の残基が挿入されている。置換突然変異誘発の最大の目的部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの変更もまた想定される。保存的置換は、表１に「保存的置換」の見出しの下に示される。このような置換により生物学的活性の変化が生じる場合は、表１に「例示的な置換」と示されるか、またはアミノ酸のクラスに関して以下にさらに記載されるような、より実質的な変化を導入することができ、生成物がスクリーニングされる。
【０１５７】
【表１】
2006525955.tif 000002
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換の領域中のポリペプチドの骨格構造、例えば、シート構造またはヘリックス構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の大きさを維持することについて、それらの作用が大きく異なる置換基を選択することによって行われる。自然界に存在している残基は、共通している側鎖の特性に基づいて複数のグループに分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；ならびに
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１５８】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスで交換することによって行われる。
【０１５９】
また、抗体の適切な立体構造を維持することには関与していない全てのシステインを、通常はセリンで置き換えて、分子の酸化安定性を改善し、異所での架橋を防ぐこともできる。逆に、システイン結合（単数または複数）を抗体に付加して、特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合に、その安定性を改善することができる。
【０１６０】
アミノ酸の修飾には、１つ以上のアミノ酸を変化させるまたは修飾することから、可変領域のような１つの領域の全面的な設計までが含まれ得る。可変領域を変化させることにより、結合親和性および／または特異性を変化させることができる。いくつかの実施形態においては、わずか１個から５個の保存的アミノ酸の置換が、ＣＤＲドメイン内に作成される。他の実施形態においては、わずか１個から３個の保存的アミノ酸置換が、ＣＤＲ３ドメイン内に作成される。さらに他の実施形態においては、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３である。
【０１６１】
修飾体には、グリコシル化されたポリペプチドおよびグリコシル化されていないポリペプチド、さらには、他の翻訳後修飾（例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化）を有するポリペプチドもまた含まれる。抗体は、それらの定常領域において保存された部位でグリコシル化される（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  ＬｕｎＤ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８；Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄ等，１９９６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８；Ｗｉｔｔｗｅ  ａｎｄ  ＨｏｗａｒＤ  １９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０）、および糖タンパク質の複数の部分の間での分子間相互作用に影響を与え、これにより、立体構造に影響を与え、糖タンパク質の三次元表面を提示する（Ｈｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，前出：Ｗｙｓｓ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｈ．７：４０９−４１６）。オリゴ糖もまた、特異的な認識構造に基づいて特定の分子に対して所定の糖タンパク質を標的化するように作用する場合がある。抗体のグリコシル化が、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響を与えることもまた報告されている。具体的には、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリンによって調節される発現、グリコシルトランスフェラーゼによって触媒される二分岐のＧｌｃＮＡｃの形成を伴うＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有していることが報告されている（Ｕｍａｎａ等，１９９９，Ｍａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。
【０１６２】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合されるかまたはＯ結合のいずれかによってなされる。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合をいう。アスパラギン−Ｘ−セリン、およびアスパラギン−Ｘ−スレオニンの３ペプチドの配列（ここでは、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素結合についての認識配列である。したがって、これらの３ペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することにより、グリコシル化部位が生じる可能性が生じる。Ｏ結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸へ（最も一般的には、セリンまたはスレオニンへ）の結合をいうが、５−ヒドロキシルプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用することができる。
【０１６３】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上記の３ペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって簡単に行うことができる（Ｎ結合グリコシル化部位について）。この変化は、もとの抗体の配列に対する１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはそれらでの置換によって作成することもできる（Ｏ結合グリコシル化部位について）。
【０１６４】
抗体のグリコシル化パターンはまた、もとのヌクレオチド配列を変化させることなく変化させることもできる。グリコシル化は、抗体を発現させるために使用される宿主細胞に大きく依存する。可能性のある治療薬としての組み換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現に使用される細胞型は、稀に天然の細胞であるので、抗体のグリコシル化パターンのバリエーションを期待することができる（例えば、Ｈｓｅ等，１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０を参照のこと）。
【０１６５】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組み換え生産の間にグリコシル化に影響を与える要因として、増殖の態様、培地組成、培養密度、酸素飽和度、ｐＨ、精製方法などが挙げられる。特定の宿主生物において行われるグリコシル化パターンを変化させるための種々の方法が提案されており、これには、オリゴ糖の生産に関係している特定の酵素を導入することまたは過剰発現させることが含まれる（米国特許第５，０４７，３３５号；同第５，５１０，２６１号；および同第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、または特定の型のグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）を使用して糖タンパク質から酵素によって除去することができる。さらに、組み換え宿主細胞を、特定の型の多糖をプロセシングしないように遺伝子操作することができる。これらの技術および同様の技術は、当該分野で周知である。
【０１６６】
他の修飾方法には、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知のカップリング技術を使用することが含まれる。例えば、免疫アッセイのための標識の結合には、修飾を使用することができる。修飾されたＥ３ポリペプチドは、当該分野で確立されている手順を使用して作成することができ、当該分野で公知の標準的なアッセイを使用してスクリーニングすることができる。これらのいくつかは、以下および実施例に記載される。
【０１６７】
他の抗体修飾体としては、１９９９年１１月１８日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように修飾された抗体が挙げられる。これらの抗体には、標的分子を指向する結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン全体またはその一部に実質的に相同であるアミノ酸配列を有しているエフェクタードメインが含まれる。これらの抗体は、標的の明らかな補体依存的溶解または細胞媒介性の崩壊を誘発することなく標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態においては、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができる。これらは、通常は、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で修飾された抗体は、炎症および従来の抗体療法に対する他の有害な反応を回避するための、長期的な抗体療法での使用に特に適している。
【０１６８】
本発明にはまた、本発明の抗体（例えば、Ｅ３）またはポリペプチドに由来する１つ以上の断片または領域を含む融合タンパク質が含まれる。１つの実施形態においては、図１Ｂに示される可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸、および／または図１Ａに示される可変重鎖領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態においては、融合ポリペプチドには、図１Ａおよび１Ｂに示されるような、Ｅ３の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が含まれる。別の実施形態においては、融合ポリペプチドには、Ｅ３の１つ以上のＣＤＲ（単数または複数）が含まれる。さらに他の実施形態においては、融合ポリペプチドには、抗体Ｅ３のＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３が含まれる。別の実施形態においては、融合ポリペプチドには、ＣＤＲ  Ｈ１のアミノ酸残基Ｌ２９、ＣＤＲ  Ｈ２のアミノ酸残基Ｉ５０、ＣＤＲ  Ｈ３のＷ１０１、および／またはＣＤＲ  Ｈ３のアミノ酸残基Ａ１０３；ならびに／あるいは、ＣＤＲ  Ｌ１のアミノ酸残基Ｓ２８、ＣＤＲ  Ｌ１のアミノ酸残基Ｎ３２、ＣＤＲ  Ｌ２のアミノ酸残基Ｔ５１、ＣＤＲ  Ｌ３のアミノ酸残基９１Ｅ、および／またはＣＤＲ  Ｌ３のアミノ酸Ｈ９２のいずれか１つ以上が含まれる。本発明の目的のためには、Ｅ３融合タンパク質には、１つ以上のＥ３抗体と、自然界に存在する分子においては結合していない別のアミノ酸配列、例えば、別の領域に由来する異種配列または相同配列とが含まれる。例示的な異種配列として、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグのような「タグ」が挙げられるがこれらに限定されない。タグは当該分野で周知である。
【０１６９】
Ｅ３融合ポリペプチドは、例えば、合成によるかまたは組み換えにより、当該分野で公知の方法によって作成することができる。通常は、本発明のＥ３融合タンパク質は、本明細書中に記載される組み換え方法を使用してそれらをコードするポリヌクレオチドを調製し、発現させることによって作成されるが、これらはまた、例えば、化学合成を含む、当該分野で公知の他の手段によって調製することもできる。
【０１７０】
本発明により、また、固体支持体（例えば、ビオチンまたはアビジン）への結合体化を促進する試薬に結合させられた（例えば、連結させられた）Ｅ３抗体またはポリペプチドを含む組成物も提供される。簡単にするために、これらの方法が、本明細書中に記載されるＮＧＦの結合の実施形態の全てに対して適応されることを理解して、Ｅ３または抗体に関しての一般的な言及を行う。結合は、一般的には、本明細書中に記載されるこれらの成分を連結することをいう。連結（通常は、少なくとも投与のために、隣接して会合させてこれらの成分を固定させること）は、任意の多数の方法で行うことができる。例えば、それぞれが互いに反応することができる置換基を有している場合には、試薬と抗体との間での直接の反応が可能である。例えば、一方の上のアミノ基またはスルフヒドリル基のような求核基は、他方の上のカルボニルを含む基（例えば、無水物または酸ハロゲン化物）と、または良好な脱離基を含むアルキル基と反応することができる。
【０１７１】
本発明の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子、または当該分野で公知の任意の他の標識のような標識試薬に連結することができる。標識は当該分野で公知であり、これらは通常、（直接または関節的のいずれかで）シグナルを提供する。したがって本発明には、標識された抗体およびポリペプチドが含まれる。
【０１７２】
本発明の抗体およびポリペプチドの能力、例えば、ＮＧＦに結合する能力；ＮＧＦの生物学的活性を低下させるかまたは阻害する能力；ＮＧＦによって誘導されるＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存性を低下させる、および／またはブロックする能力は、当該分野で公知の方法を使用して試験することができ、それらのいくつかが実施例に記載される。
【０１７３】
本発明により、また、抗体Ｅ３を含む組成物（薬学的組成物を含む）およびキットが提供され、そして本開示により、本明細書中に記載される抗体および／またはポリペプチドのいずれかまたは全てが明らかになる。
【０１７４】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明により、また、本発明の抗体およびポリペプチド（図１Ａおよび１Ｂに示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む抗体を含む）をコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供される。
【０１７５】
したがって、本発明により、以下のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（または薬学的組成物を含む組成物）が提供される：（ａ）抗体Ｅ３；（ｂ）抗体Ｅ３の断片または領域；（ｃ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖；（ｄ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖；（ｅ）抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖に由来する１つ以上の可変領域（単数または複数）；（ｆ）図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３の１つ以上のＣＤＲ（単数または複数）（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）；（ｇ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖に由来するＣＤＲ  Ｈ３；（ｈ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖に由来するＣＤＲ  Ｌ３；（ｉ）図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖に由来する３つのＣＤＲ；（ｊ）図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖に由来する３つのＣＤＲ；（ｋ）図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３の、軽鎖に由来する３つのＣＤＲと重鎖に由来する３つのＣＤＲ；ならびに（ｌ）（ｂ）から（ｋ）のいずれかを含む抗体。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドには、図２および３に示されるポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方が含まれる。
【０１７６】
別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有しているＥ３軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。別の態様においては、本発明は、寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有するＥ３重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドである。さらに別の態様においては、本発明は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有するポリヌクレオチド中でコードされる可変領域、および（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有するポリヌクレオチド中でコードされる可変領域を含む、単離されたポリヌクレオチドである。別の態様においては、本発明は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９４を有するポリヌクレオチド中でコードされる１つ以上のＣＤＲ、および／または（ｂ）寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４８９５を有するポリヌクレオチド中でコードされる１つ以上のＣＤＲを含む、単離されたポリヌクレオチドである。
【０１７７】
別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載される抗体（抗体断片を含む）およびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の手順によって作成することができる。
【０１７８】
別の態様においては、本発明により、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物（例えば、薬学的組成物）が提供される。いくつかの実施形態においては、組成物には、本明細書中に記載されるＥ３抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。他の実施形態においては、組成物には、本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。さらに他の実施形態においては、組成物には、図２および３に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方が含まれる。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書中でさらに記載される。
【０１７９】
別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを作成する方法が提供される。
【０１８０】
任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。ポリヌクレオチドは一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）である場合も、また二本鎖である場合もあり、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成のもの）である場合も、ＲＮＡ分子である場合もある。ＲＮＡ分子には、ＨｎＲＮＡ分子（これは、イントロンを含み、一対一の様式でＤＮＡ分子に対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）が含まれる。別のコード配列または非コード配列も、本発明のポリヌクレオチド中に存在する場合があるが、必ずしもそうである必要はなく、ポリヌクレオチドを他の分子および／または支持物質に連結させることもできるが、必ずしもそうである必要はない。
【０１８１】
ポリヌクレオチドは、自然界に存在している配列（すなわち、抗体またはその一部をコードする内因性の配列）を含む場合があり、また、そのような配列の変異体を含む場合もある。ポリヌクレオチド変異体には、自然界に存在している免疫反応性分子と比較して、コードされるポリペプチドの免疫反応性が小さくならないような、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入が含まれる。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、通常、本明細書中に記載されるように評価することができる。変異体は、自然界に存在している抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性を示すことが好ましい。
【０１８２】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大の一致となるように並べられた場合に、同じである場合に、「同一」であると言われる。２つの配列の間での比較は、通常、局所的な領域の配列の類似性を同定および比較するための比較ウィンドウ全体について配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用される場合は、少なくとも約２０個の連続する位置、通常は、３０個から約７５個、４０個から約５０個の連続する位置の断片をいい、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、その中の配列が、連続する位置の同じ番号の対照配列に対して比較され得る。
【０１８３】
比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、デフォルトパラメーターを用いて行うことができる。このプログラムには、以下の参考文献に記載されているいくつかのアラインメント方法が統合されている：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｏｎｓｈｉｐｓ．  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，第５巻，Ｓｕｐｐｌ．ｐｐ．３，３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：７２６−７３０。
【０１８４】
好ましくは、「配列同一性の割合」は、少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウ全体にわたって最適に並べられた２つの配列を比較することによって決定される。ここでは、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分には、２つの配列の最適なアラインメントについて対照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％またはそれ未満の、通常は、５から１５％、または１０から１２％の、付加または欠失（すなわち、ギャップ）が含まれ得る。割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在している位置の数を決定して適合した位置の数を得、適合した位置の数を対照配列中の位置の総数（すなわち、ウィンドウの大きさ）で割り算し、そして結果に１００を掛けて配列同一性の割合（％）
を得ることによって計算される。
【０１８５】
変異体もまた、または別の方法で、自然界に存在している遺伝子、またはその一部もしくは相補物に対して実質的に相同である場合がある。このようなポリヌクレオチド変異体は、自然界に存在している抗体をコードする自然界に存在しているＤＮＡ配列（または相補性配列）に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【０１８６】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；その後の、０．１％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、および０．２×ＳＳＣのそれぞれでの、６５℃で２０分間の洗浄が含まれる。
【０１８７】
本明細書中で使用される場合は、「ストリンジェントの高い条件」または「高ストリンジェンシーの条件」は以下である：（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍの塩酸ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を使用する；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤、例えばホルムアミド（例えば、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５））を含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド）、を４２℃で使用する；あるいは（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％のホルムアミド（５５℃）中で４２℃で洗浄し、その後、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣにより構成される高ストリンジェンシーの洗浄を５５℃で行う。当業者は、プローブの長さなどの要因に対応させることが必要である場合には、温度、イオン強度などを調節する方法を認識している。
【０１８８】
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が複数存在することは、当業者に明らかである。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の自然界に存在している遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を示す。それにもかかわらず、コドン使用の差によって異なるポリヌクレオチドが、本発明によって特に意図される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの１つ以上の変異、例えば、欠失、付加、および／または置換の結果として変化している内因性遺伝しである。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、別の構造または機能を有している場合もあるが、必ずしもそうである必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較）を使用して同定することができる。
【０１８９】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組み換え方法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチドの合成方法は当該分野で周知であり、本明細書中に詳細に記載される必要はない。当業者であれば、所望されるＤＮＡ配列を生じるように、本明細書中で提供される配列と市販のＤＮＡ合成装置を使用することができる。
【０１９０】
組み換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するためには、さらに本明細書中で議論されるように、所望される配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクター中に挿入し、その後、複製および増幅のために、ベクターを適切な宿主細胞中に導入することができる。ポリヌクレオチドを、当該分野で公知の任意の手段によって宿主細胞中に挿入することもできる。細胞は、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合、またはエレクトロポレーションによって、外因性のポリヌクレオチドを導入することにより、形質転換される。一旦導入されると、外因性のポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクターとして細胞中で維持され得る（例えば、プラスミド）か、または宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）を参照のこと）。
【０１９１】
あるいは、ＰＣＲによってＤＮＡ配列を再生することができる。ＰＣＲ技術は当該分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号、および同第４，６８３，２０２号、ならびに、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓ等編，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載されている。
【０１９２】
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離されたＤＮＡを使用し、適切な宿主細胞中に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡへと転写されると、ＲＮＡを、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）に示されているように当業者に周知である方法を使用して単離することができる。
【０１９３】
適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができ、また、当該分野で利用することができる多数のクローンニングベクターから選択することもできる。選択されるクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞に応じて変化するが、有用なクローニングベクターは、通常、自己複製する能力を有しており、特定の制限エンドヌクレアーゼについての標的を１つ有し、そして／またはベクターを含むクローンの選択に使用することができるマーカー遺伝子を有している。適切な例としては、プラスミドおよび細菌のウイルス（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８のようなシャトルベクターが挙げられる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、およびＩｎｖｔｒｏｇｅｎのような商業的な販売業者によって市販されている。
【０１９４】
発現ベクターは通常、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物を複製することができる。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡに組み込まれた部分としてのいずれかで、宿主細胞中で複製できなければならないことが意味される。適切な発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含む）、コスミド、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２に開示されている発現ベクター（単数または複数）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクター成分には、通常、以下の１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：シグナル配列；複製起点；１つ以上のマーカー遺伝子；適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーター）。発現（すなわち、翻訳）のためには、通常は１つ以上の翻訳制御エレメント（例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終結コドン）もまた、必要とされる。
【０１９５】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、多数の適切な手段のいずれかにより宿主細胞中に導入することができる。これには、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸化リスイム、ＤＥＡＥデキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション、および感染（例えば、ベクターがワクチンウイルスのような感染原である場合）が含まれる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する方法の選択は、多くの場合には、宿主細胞の性質に依存する。
【０１９６】
本発明により、また、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞が提供される。異種ＤＮＡを過剰発現することができるあらゆる宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用することができる。哺乳動物宿主細胞の限定的ではない例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２もまた参照のこと。適切な哺乳動物以外の宿主細胞として、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ））、および酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；またはクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））が挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、それが宿主細胞中に存在する場合には、目的の対応する内因性の抗体またはタンパク質のものよりも約５倍、より好ましくは１０倍、さらにより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。ＮＧＦへの特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって行うことができる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
【０１９７】
Ｅ３およびＥ３に由来する抗体を使用する方法
ＮＧＦに結合する抗体Ｅ３を使用して、ＮＧＦを同定、またはそれが存在するかどうかを検出することができる。簡単にするために、これらの方法が、本明細書中に記載されるＮＧＦの結合の実施形態（例えば、ポリペプチド）の全てに対して適応されることを理解して、Ｅ３または抗体に関しての一般的な言及を行う。検出には、一般的には、生物学的試料を、ＮＧＦに結合する本明細書中に記載される抗体と接触させること、およびＮＧＦとＮＧＦに特異的に結合する抗体（例えば、Ｅ３）との間での複合体の形成が含まれる。このような複合体の形成は、生体外または生体内で行うことができる。用語「検出」は、本明細書中で使用される場合には、対照と比較するまたは対照と比較することのない、定性的および／または定量的検出（レベルの測定）が含まれる。
【０１９８】
任意の種々の公知の方法を検出のために使用することができ、これには、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫法（ＲＩＡ）などによる、ポリペプチドに結合する抗体を用いる免疫アッセイ；ならびに、コードされるポリペプチドについての機能的アッセイ、例えば、結合活性または酵素活性が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、抗体は検出できるように標識される。
【０１９９】
Ｅ３および誘導体の診断的使用
本発明の抗体およびポリペプチドは、ＮＧＦの発現が変化しているか、または異常なＮＧＦ発現（いくつかの実施形態においては、正常な試料と比較してＮＧＦの発現が増大しているかまたは減少していること）、および／または不適切な発現（例えば、通常はＮＧＦが発現されない組織（単数または複数）および／または細胞（単数または複数）中で発現があること、あるいは、通常はＮＧＦの発現がある組織（単数または複数）または細胞（単数または複数）でのＮＧＦ発現がないこと）に関係している疾患、症状、または障害を検出、診断、およびモニターすることにおいて使用することができる。本発明の抗体およびポリペプチドはさらに、例えば、ＮＧＦに対する感度もしくは反応性が変化しているか、または異常な感度もしくは反応性に関係している疾患におけるＮＧＦの発現の検出に有用である。いくつかの実施形態においては、ＮＧＦの発現は、ＮＧＦの発現に対する感度もしくは反応性が変化しているか、またはＮＧＦの発現に対する異常な感度または反応性を特徴とするか、あるいはそれらに関係している疾患、障害（例えば、ＮＧＦが増殖およびまたは転位を促進するガン）を有していると疑われる個体に由来する試料中で検出される。
【０２００】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明により、ＮＧＦの発現が変化しているかまたは異常なＮＧＦの発現が疑われる個体の標本（試料）を、本発明の抗体またはポリペプチドと接触させる段階、およびＮＧＦのレベルが対照または比較標本のレベルと異なるかどうかを決定する段階を含む方法が提供される。いくつかの実施形態においては、個体は、不整脈、アルツハイマー病、および／または自律神経機能障害を有する。
【０２０１】
他の実施形態においては、本発明により、個体の標本（試料）を接触させる段階と、ＮＧＦ発現のレベルを決定する段階を含む方法が提供される。いくつかの実施形態においては、個体は、ＮＧＦ発現に対する感度もしくは反応性が変化しているか、またはＮＧＦ発現に対する異常な感度もしくは反応性を特徴とするか、それらに関係している疾患、障害を有すると疑われる。いくつかの実施形態においては、個体は小細胞性肺ガン、乳ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、肝細胞ガン、または黒色腫を有する。
【０２０２】
診断適用については、抗体は通常、放射性同位元素、蛍光標識、および種々の酵素−基質標識を含むがこれらに限定されない検出可能な部分で標識される。標識を抗体に結合させる方法は当該分野で公知である。本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は標識される必要はなく、その存在を、本発明の抗体に結合する標識された抗体を使用して検出することができる。
【０２０３】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接または間接的なサンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイのような任意の公知のアッセイ方法において使用することができる。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。
【０２０４】
抗体はまた、生体内画像化のような生体内での診断アッセイに使用することもできる。通常、抗体は、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、または３Ｈ）で標識され、これにより目的の細胞または組織を免疫シンチオグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して局在化させることができる。
【０２０５】
抗体はまた、当該分野で周知の技術にしたがって、病理学において染色試薬として使用することもできる。
【０２０６】
治療目的のためにＥ３および誘導体を使用する方法
抗体Ｅ３は、ＮＧＦの生物学的活性を低下させるおよび／またはブロックするために有効である。このアンタゴニスト活性は、痛みのような内因性のＮＧＦの生産に関係している臨床症状の処置に有用であると考えられている。一般的には、これらの実施形態においては、有効量が個体に投与される。したがって、１つの態様においては、本発明により、本明細書中に開示されるポリペプチド（抗体Ｅ３のような抗体を含む）のいずれかを使用して、ヒトＮＧＦの生物学的活性をアンタゴナイズする方法が提供される。１つの実施形態においては、この方法には、ヒト成長因子を本明細書中に記載されるポリペプチド（抗体Ｅ３を含む）のいずれかと接触させ、それによってヒト成長因子の活性をアンタゴナイズする、低下させる、ブロックする、または抑制する段階が含まれる。さらに別の実施形態においては、痛み（例えば、外科手術後の痛み、または関節リウマチの痛み）を有している個体にＥ３での処置が施される。
【０２０７】
簡単にするために、これらの方法が、本明細書中に記載されるＥ３変異体抗体およびポリペプチドの全てに対して適応されることを理解して、Ｅ３または抗体に関しての一般的な言及を行う。
【０２０８】
種々の形態のＥ３またはＥ３の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要とされる特異性についての抗原（ＮＧＦ）認識部位を含むＥ３の任意の他の修飾された立体構造を、投与のために使用することができる。いくつかの実施形態においては、Ｅ３抗体またはそのＥ３の種々の処方物を、手際よく投与することができる。他の実施形態においては、Ｅ３またはそのＥ３の種々の処方物（本明細書中に記載される全ての組成物の実施形態を含む）と、薬学的に許容される賦形剤が投与され、これらは種々の処方物であり得る。薬学的に許容される賦形剤は当該分野で公知であり、これらは、薬理学的に有効である物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、所定の形態であるかまたは一定の濃度であり得るか、あるいは希釈剤としての役割を果たすこともできる。適切な賦形剤としては、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、および皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。非経口および経口による薬物送達のための賦形剤および処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ編（２０００）に示されている。
【０２０９】
いくつかの実施形態においては、これらの試薬は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために処方されるが、他の投与形態（例えば、経口、粘膜、吸入による、舌下など）もまた使用することができる。したがって、Ｅ３抗体およびその等価物は、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液などのような薬学的に許容されるビヒクルと混合されることが好ましい。特定の投与レジュメ、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の固体、および個体の医学的な病歴に応じて変化する。一般的には、以下の用量のいずれかを使用することができる：少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも７５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重；またはそれ未満が投与される。数日間またはそれより長期間にわたる反復投与には、症状に応じて、所望される疾患の症状の抑制が生じるまで処置が維持される。例示的な投与レジュメには、約２ｍｇ／ｋｇの初回用量の投与、その後の約１ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体の毎週の維持量の投与、または隔週の約１ｍｇ／ｋｇの維持量の投与が含まれる。しかし、医師が望む薬物動態的な崩壊のパターンに応じて、他の投与レジュメが有用である場合もある。半減期のような経験的な考慮が、通常、投与量の決定の一因となる。この治療の進行は、従来技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０２１０】
いくつかの個体においては、１回以上の用量が必要とされる場合もある。投与頻度は、治療経過のはじめから終わりまでにわたって決定することができ、調節することができる。例えば、投与頻度は、処置される痛みの型および重篤度、試薬が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴、および試薬に対する反応、ならびに主治医の判断に基づいて決定、または調節することができる。通常は、所望される結果が得られる投与量に達するまで、医師が抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体（例えば、Ｅ３）を投与する。いくつかの場合においては、Ｅ３抗体の連続的な徐放処方物が適切である場合もある。徐放を行うための種々の処方物およびデバイスは当該分野で公知である。
【０２１１】
１つの実施形態においては、Ｅ３抗体（またはポリペプチド）の投与量は、１回以上の投与（単数または複数）が与えられた個体において経験的に決定することができる。個体には、Ｅ３の増分量が与えられる。Ｅ３または他の同等の抗体の効力を評価するためには、疾患の症状（例えば、痛み）のマーカーをモニターすることができる。
【０２１２】
本発明の方法による抗体（例えば、Ｅ３）またはポリペプチドの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与目的が治療的であるかまたは予防的であるか、および熟練した医師に公知である他の要因に応じて、連続的でも断続的でもあり得る。抗体の投与は、本質的には、あらかじめ選択された期間にわたって連続的であり得るが、間隔のあいた用量（例えば、痛みが発生する前、間、もしくは後のいずれか）で順次行われる場合もある。投与は、創傷、切開、外傷、外科手術、および外科手術後の痛みをおそらく生じるであろう任意の他の事象の前、間、および／または後に行うことができる。
【０２１３】
他の処方物として、当該分野で公知の適切な送達形態が挙げられ、これには、リポソームのようなキャリアーが含まれるが、これに限定されない。例えば、Ｍａｈａｔｏ等（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９を参照のこと。リポソーム調製物として、サイトフェクチン、多重膜小胞、および単層膜小胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１４】
いくつかの実施形態においては、１つ以上の抗体またはポリペプチドが存在する場合もある。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもあり得る。このような組成物には、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる抗体が含まれる場合がある。抗体の混合物は、それらは当該分野において頻繁に記載されているので、広い範囲の個体の集団を処置することにおいて特に有用であり得る。
【０２１５】
本発明の抗体またはポリペプチド（例えば、抗体Ｅ３）のいずれかをコードするポリヌクレオチドはまた、所望される細胞中に本発明の抗体またはポリペプチド（例えば、抗体Ｅ３）のいずれかを送達するため、またはその中で発現させるために使用することもできる。発現ベクターを、Ｅ３抗体またはポリペプチドを直接発現させるために使用できることは、明らかである。発現ベクターは、当該分野で公知の任意の手段によって、例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、心室内、経口、腸、非経口、鼻内、皮膚、舌下、または吸入によって投与することができる。例えば、発現ベクターの投与には、局所投与または全身投与が含まれ、これには、注射、経口投与、パーティクルガン、またはカテーテルによる投与、および局部投与が含まれる。当業者は、生体内で外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与について十分に認識している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照のこと。
【０２１６】
本発明の抗体またはポリペプチド（例えば、抗体Ｅ３）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的化された送達もまた、使用することができる。受容体媒介性のＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ等，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕ等，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）；Ｗｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含む治療用組成物は、遺伝子治療プロトコールにおける局所投与については、約１００ｎｇから約２００ｍｇの範囲で投与される。約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコールに使用することができる。本発明の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルとは、ウイルスまたは非ウイルスの起源のものであり得る（一般的には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。このようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、構成的であるかまたは調節することができるかのいずれかであり得る。
【０２１７】
所望されるポリヌクレオチドの送達および所望される細胞中での発現のためのウイルスをベースとするベクターは当該分野で周知である。例示的なウイルスをベースとするビヒクルとして、組み換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０７９３６；同ＷＯ９４／０３６２２；同ＷＯ９３／２５６９８；同ＷＯ９３／２５２３４；同ＷＯ９３／１１２３０；同ＷＯ９３／１０２１８；同ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０号；同第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０，３４５，２４２号を参照のこと）、αウイルスをベースとするベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６４９、同ＷＯ９３／０３７６９；同ＷＯ９３／１９１９１；同ＷＯ９４／２８９３８；同ＷＯ９５／１１９８４、および同ＷＯ９５／００６５５を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されているような、死滅させられたアデノウイルスに連結させられたＤＮＡの投与もまた使用することができる。
【０２１８】
ウイルス以外の送達ビヒクルおよび送達方法もまた使用することができ、これには、死滅させられたアデノウイルスのみに連結させられたポリ陽イオン性縮合ＤＮＡ、または連結されていないポリ陽イオン性縮合ＤＮＡを単独で（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照のこと）；リガンドに連結させられたＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照のこと）；真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０７９９４；同ＷＯ９６／１７０７２；同ＷＯ９５／３０７６３；および同ＷＯ９７／４２３３８を参照のこと）、および核電荷の中和、または細胞膜との融合が含まれるが、これらに限定されない。裸のＤＮＡもまた使用することができる。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１３７９６；同ＷＯ９４／２３６９７；同ＷＯ９１／１４４４５；および欧州特許第０，５２４，９６８号に記載されている。別のアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
【０２１９】
本明細書中に記載される全ての方法に関して、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体についての言及には、１つ以上のこれらの試薬を含む組成物も含まれる。これらの組成物にはさらに、当該分野で周知の緩衝液を含む、薬学的に許容される賦形剤のような適切な賦形剤が含まれる場合もある。本発明は、単独で使用することができ、また他の従来の処置方法と組み合わせて使用することもできる。
【０２２０】
関節リウマチの痛みを処置または予防するために抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を使用する方法
いくつかの態様においては、本発明により、ヒトおよびヒト以外の両方である哺乳動物を含む個体における関節リウマチの痛みを処置および／または予防するための方法が提供される。したがって、１つの態様においては、本発明により、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与する段階を含む、個体における関節リウマチの痛みを処置する方法が提供される。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は当該分野で公知であり、本明細書中に記載されている。
【０２２１】
別の態様においては、本発明により、個体における関節リウマチの痛みの発生を減らす、痛みを緩和する、抑える、和らげる、および／またはその開始、発症もしくは進行を遅らせるための方法が提供される。したがって、いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、関節リウマチを有している個体において痛みの発症の前に、または痛みの症状の発現の前に投与される。
【０２２２】
別の態様においては、本発明により、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与する段階を含む、個体における関節リウマチに伴う炎症性悪液質（体重の減少）を処置するための方法が提供される（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ等，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４０（３）：５３４−９（１９９７）Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３（６）：２３７９−８６（１９９４））。
【０２２３】
関節リウマチの痛みの診断または評価は、当該分野で十分に確立されている。評価は、種々の痛みについての尺度を使用する患者の痛みの特徴付けのような、当該分野で公知の測定に基づいて行うことができる。例えば、Ｋａｔｚ等，Ｓｕｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．（１９９９）７９（２）：２３１−５２；Ｃａｒａｃｅｎｉ等，Ｊ  Ｐａｉｎ  Ｓｙｍｐｔｏｍ  Ｍａｎａｇｅ（２００２）２３（３）：２３９−５５を参照のこと。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＡＣＲ）（Ｆｅｌｓｏｎ等，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９３）３６（６）：７２９−７４０）、ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＨＡＱ）（Ｆｒｉｅｓ等，（１９８２）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９：７８９−７９３）、Ｐａｕｌｕｓ  Ｓｃａｌｅ（Ｐａｕｌｕｓ等，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９０）３３：４７７−４８４）、およびｔｈｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｍｅａｓｕｒｅ  Ｓｃａｌｅ（ＡＩＭＳ）（Ｍｅｅｎａｍ等，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（１９８２）２５：１０４８−１０５３）のような、疾患状態を測定するために一般的に使用される尺度もまた、存在する。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、任意の適切な経路を通じて個体に投与することができる。種々の投与経路の例は本明細書中に記載されている。
【０２２４】
鎮痛は、緩和の時間経過によって特徴付けることができる。したがって、いくつかの実施形態においては、鎮痛は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後、約２４時間以内に観察される。他の実施形態においては、鎮痛は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後、約３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、または４日以内に観察される。さらに他の実施形態においては、鎮痛は、関節リウマチに伴う炎症症状の改善の兆候が観察される前に、観察される。いくつかの実施形態においては、痛みの頻度および／または強さが低下し、そして／または疾患に罹患している被験体の生活の質が向上する。
【０２２５】
これらの方法のための抗ＮＧＦ抗体を作成し、使用することは、以下のセクション（「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」；「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の同定」；「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与」）に記載される。
【０２２６】
変形性関節症の痛みを処置または予防するために抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を使用する方法
いくつかの態様においては、本発明により、ヒトおよびヒト以外の両方である哺乳動物を含む個体における変形性関節症の痛みを処置および／または予防するための方法が提供される。したがって、１つの態様においては、本発明により、有効量の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を投与する段階を含む、個体における変形性関節症の痛みを処置する方法が提供される。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は当該分野で公知であり、本明細書中に記載されている。
【０２２７】
別の態様においては、本発明により、個体における変形性関節症の痛みの発生を減らす、痛みを緩和する、抑える、和らげる、および／またはその開始、発症、もしくは進行を遅らせるための方法が提供される。したがって、いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、変形性関節症を有している個体において痛みの発症の前に、または痛みの症状の発現の前に投与される。
【０２２８】
変形性関節症の痛みの診断または評価は、当該分野で十分に確立されている。評価は、種々の痛みについての尺度を使用する患者の痛みの特徴付けのような、当該分野で公知の測定に基づいて行うことができる。例えば、Ｋａｔｚ等，Ｓｕｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．（１９９９）７９（２）：２３１−５２；Ｃａｒａｃｅｎｉ等，Ｊ  Ｐａｉｎ  Ｓｙｍｐｔｏｍ  Ｍａｎａｇｅ（２００２）２３（３）：２３９−５５を参照のこと。例えば、ＷＯＭＡＣ  Ａｍｂｕｌａｔｉｏｎ  Ｐａｉｎ  Ｓｃａｌｅ（痛み、凝り、および身体機能を含む）、および１００ｍｍ  Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｓｃａｌｅ（ＶＡＳ）を、痛みを評価するため、および処置に対する応答を評価するために使用することができる。
【０２２９】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、任意の適切な経路を通じて個体に投与することができる。種々の投与経路の例は本明細書中に記載されている。
【０２３０】
鎮痛は、緩和の時間経過によって特徴付けることができる。したがって、いくつかの実施形態においては、鎮痛は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後、約２４時間以内に観察される。別の実施形態においては、鎮痛は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与後、約３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、または４日以内に観察される。いくつかの実施形態においては、痛みの頻度および／または強さが低下し、そして／または疾患に罹患している被験体の生活の質が向上する。
【０２３１】
これらの方法のための抗ＮＧＦ抗体を作成し、使用することは、以下のセクション（「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体」；「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の同定」；「抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与」）に記載される。
【０２３２】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体
本発明の方法（関節リウマチの痛みおよび変形性関節症の痛みに関する）では、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が使用される。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体とは、ＮＧＦによる情報伝達（例えば、受容体の結合および／またはＮＧＦに対する細胞性の応答の誘発）によって媒介される下流の経路を含むＮＧＦの生物学的活性をブロックする、抑制する、または低下させる（顕著なものを含む）あらゆる抗体分子をいう。
【０２３３】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、以下の特徴のいずれか１つ以上を示さなければならない：（ａ）ＮＧＦに結合し、そしてＮＧＦの生物学的活性および／またはＮＧＦによる情報伝達機能によって媒介される下流の経路（単数または複数）を阻害する；（ｂ）関節リウマチの痛みまたは変形性関節症の痛みの任意の態様を予防、緩和、または処置する；（ｃ）ＮＧＦ受容体の活性化（ＴｒｋＡ受容体の二量体化および／または自己リン酸化を含む）をブロックするかまたは低下させる；（ｄ）ＮＧＦのクリアランスを高める；（ｅ）ＮＧＦの合成、生産、または放出を阻害するかまたは減少させる。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は当該分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７８６９８、同ＷＯ０１／６４２４７、米国特許第５，８４４，０９２号、同第５，８７７，０１６号、および同第６，１５３，１８９号；Ｈｏｎｇｏ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１９：２１５−２２７（２０００）；Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１３：５５９−５６８（１９９３）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３９６０８、Ｕ３９６０９、Ｌ１７０７８、またはＬ１７０７７を参照のこと。
【０２３４】
本発明の目的については、抗体は、ＮＧＦを阻害する、および／またはＮＧＦの情報伝達機能によって媒介される下流の経路を阻害する様式で、ＮＧＦと反応する。いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ヒトＮＧＦを認識する。なお他の実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ヒトＮＧＦに特異的に結合する。いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ＮＴ−３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦのような関連するニュートロフィンには有意には結合しない。さらに他の実施形態においては、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦに結合して、ＮＧＦのそのＴｒｋＡ受容体および／またはｐ７５受容体への生体内での結合を効率よく阻害し、そして／またはＮＧＦがそのＴｒｋＡおよび／またはｐ７５受容体を活性化することを効率よく阻害することができる。さらに他の実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体である。さらに他の実施形態においては、抗ＮＧＦ抗体はヒト化抗体（例えば、本明細書中に記載されている抗体Ｅ３）である。いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦ抗体はヒト抗体である。１つの実施形態においては、抗体は、ヒトＮＧＦ上の１つ以上のエピトープを認識するヒト抗体である。別の実施形態においては、抗体は、ヒトＮＧＦ上の１つ以上のエピトープを認識するマウスまたはラットの抗体である。別の実施形態においては、抗体は、以下からなる群より選択されるＮＧＦ上の１つ以上のエピトープを認識する：霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ。さらに別の実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、原則的に、以下のいずれか１つ以上から選択される抗体と同じＮＧＦエピトープ６に結合する：Ｍａｂ  ９１１、Ｍａｂ  ９１２、およびＭＡｂ  ９３８（Ｈｏｎｇｏ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：２１５−２２７（２０００）を参照のこと。）他の実施形態においては、抗体は、Ｍａｂ  ９１１と同じエピトープに結合する。別の実施形態においては、抗体には、免疫学的に不活性である（例えば、補体媒介性溶解または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発しない）定常領域が含まれる。ＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号に開示されている方法を使用して評価することができる。いくつかの実施形態においては、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願番号９８０９９５１．８に記載されているように修飾される。
【０２３５】
いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、ＮＧＦアンタゴニストである、抗体「Ｅ３」と呼ばれるヒト化マウス抗ＮＧＦモノクローナル抗体、本明細書中に記載されるＥ３関連抗体のいずれか、またはそれらの断片のいずれかである。
【０２３６】
本発明において有用な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異的抗体、ヘテロ結合体抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、および抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合により修飾された変異体を含む、必要とされる特異性についての抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体構造が含まれ得る。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源のもの（キメラまたはヒト化抗体を含む）である場合もある。
【０２３７】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のＮＧＦ（例えば、ｈＮＧＦ）に対する結合親和性は、約０．１０ｎＭから約０．８０ｎＭ、約０．１５ｎＭから約０．７５ｎＭ、および約０．１８ｎＭから約０．７２ｎＭであり得る。１つの実施形態においては、結合親和性は、約２ｐＭから２２ｐＭの間である。いくつかの実施形態においては、結合親和性は約１０ｎＭである。他の実施形態においては、結合親和性は、約１０ｎＭ未満である。他の実施形態においては、結合親和性は、約０．１ｎＭから約０．０７ｎＭである。他の実施形態においては、結合親和性は、約０．１ｎＭ未満、または約０．０７ｎＭ未満である。他の実施形態においては、結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまでである。いくつかの実施形態においては、結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、または、約５０ｐＭ未満のいずれかである。いくつかの実施形態においては、結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭのいずれか未満である。さらに他の実施形態においては、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭであるか、または約４０ｐＭより大きい。
【０２３８】
ＮＧＦに対する抗体の結合親和性を決定する１つの方法は、抗体の単官能性Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することによる。単官能性Ｆａｂ断片を得るためには、抗体（例えば、ＩｇＧ）をパパインで切断することができ、また、組み換えによって発現させることもできる。抗体の抗ＮＧＦ  Ｆａｂ断片の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｗａｙ  ＮＪ）によって決定することができる。ＣＭ５チップは、供給業者の説明書にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させることができる。ヒトＮＧＦ（または任意の他のＮＧＦ）は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で希釈して、０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で活性化したチップ上に注入することができる。個々のチップチャンネルを通過させるフロー時間を変化させることにより、２つの抗原密度の範囲に達するようにできる：詳細な速度論の研究については１００〜２００反応単位（ＲＵ）、そしてスクリーニングアッセイについては５００〜６００ＲＵ。チップは、エタノールアミンでブロックすることができる。再生の研究は、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）と４ＭのＮａＣｌの混合物（２：１）により２００回の注入全てについてチップ上でｈＮＧＦの活性を維持したまま、結合したＦａｂが効率よく除去されたことを示した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５  ＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２９）は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイの泳動緩衝液として使用される。精製されたＦａｂ試料の段階希釈物（０．１〜１０×概算のＫＤ）を、１００μＬ／分で１分間かけて注入し、２時間までの解離時間とした。Ｆａｂタンパク質の濃度は、標準として既知の濃度（アミノ酸分析によって決定される）Ｆａｂを使用して、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定される。動的会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕｔｉｏｎプログラムを使用して１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｓｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９−１１０）にデータをフィットさせることによって同時に得られる。平衡解離定数（ＫＤ）の値は、ｋｏｎ／ｋｏｆｆとして計算される。このプロトコールは、ヒトＮＧＦ、別の脊椎動物のＮＧＦ（いくかの実施形態においては、哺乳動物）を含むあらゆるＮＧＦ（例えば、マウスＮＧＦ、ラットＮＧＦ、霊長類ＮＧＦ）に対する抗体の結合親和性を決定することにおける使用に、さらには、関連するニュートロフィンＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦのような他のニュートロフィンを伴う使用に適している。
【０２３９】
いくつかの実施形態においては、抗体はヒトＮＧＦに結合し、別の脊椎動物種（いくつかの実施形態においては、哺乳動物）に由来するＮＧＦには有意には結合しない。いくつかの実施形態においては、抗体はヒトＮＧＦに結合し、さらに別の脊椎動物種（いくつかの実施形態においては、哺乳動物）に由来する１つ以上のＮＧＦにも結合する。さらに他の実施形態においては、抗体はＮＧＦに結合し、他のニュートロフィン（例えば、関連するニュートロフィン、ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦ）とは有意には交差反応しない。いくつかの実施形態においては、抗体はＮＧＦに結合し、さらに少なくとも１つの他のニュートロフィンにも結合する。いくつかの実施形態においては、抗体は哺乳動物種（例えば、ウマまたはイヌ）のＮＧＦに結合するが、別の哺乳動物種に由来するＮＧＦには有意には結合しない。
【０２４０】
エピトープ（単数または複数）は、連続的であっても、連続的ではなくてもよい。１つの実施形態においては、抗体は、本質的に、Ｈｏｎｇｏ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：２１５−２２７（２０００）に記載されているような、Ｍａｂ  ９１１、Ｍａｂ  ９１２、およびＭＡｂ  ９３８からなる群より選択される抗体と同じｈＮＧＦピトープに結合する。別の実施形態においては、抗体は、本質的に、Ｍａｂ  ９１１と同じエピトープに結合する。さらに別の実施形態においては、抗体は、本質的に、ＭＡｂ  ９０９と同じエピトープに結合する。Ｈｏｎｇｏ等，前出。例えば、エピトープには、以下の１つ以上が含まれる場合もある：ｈＮＧＦの可変領域１（アミノ酸２３〜３５）内の残基Ｋ３２、Ｋ３４、およびＥ３５；ｈＮＧＦの可変領域４（アミノ酸８１〜８８）内の残基Ｆ７９およびＴ８１；可変領域４内の残基Ｈ８４およびＫ８８；ｈＮＧＦの可変領域５（アミノ酸９４〜９８）とｈＮＧＦのＣ末端（アミノ酸１１１〜１１８）との間の残基Ｒ１０３；ｈＮＧＦの前可変領域１（アミノ酸１０〜２３）内の残基Ｅ１１；ｈＮＧＦの可変領域２（アミノ酸４０〜４９）とｈＮＧＦの可変領域３（アミノ酸５９〜６６）との間のＹ５２；ｈＮＧＦのＣ末端内の残基Ｌ１１２およびＳ１１３；ｈＮＧＦの可変領域３内の残基Ｒ５９およびＲ６９；あるいはｈＮＧＦの前可変領域１内の残基Ｖ１８、Ｖ２０、およびＧ２３。さらに、エピトープは、ｈＮＧＦの可変領域１、可変領域３、可変領域４、可変領域５、Ｎ末端領域、および／またはＣ末端領域の１つ以上を含むことができる。さらに別の実施形態においては、抗体は、ｈＮＧＦの残基Ｒ１０３の溶媒露出度を有意に低下させる。上記のエピトープはヒトＮＧＦに関して記載したが、当業者であれば、ヒトＮＧＦを他の種のＮＧＦの構造と並べることができ、これらのエピトープにおそらく対応する部分を同定することができる。
【０２４１】
１つの態様においては、ＮＧＦを阻害することができる抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体）を、ＮＧＦの全長または部分的な配列を発現する免疫原を使用して作成することができる。別の態様においては、ＮＧＦを過剰発現する、免疫原を含む細胞を使用することができる。使用することができる別の免疫原の例は、全長のＮＧＦを含むＮＧＦタンパク質またはＮＧＦタンパク質の一部である。
【０２４２】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、当該分野で公知の任意の方法によって作成することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、一般に、本明細書中にさらに記載されるように、抗体の刺激および生産のための確立された従来技術と一致する。ヒトおよびマウス抗体の生産のための一般的な技術は当該分野で公知であり、本明細書中に記載されている。
【０２４３】
ヒトを含む任意の哺乳動物被験体またはそれらに由来する抗体を生産する細胞は、ヒトハイブリドーマ細胞株を含む、哺乳動物の生産についての基準となるように操作することができる。通常は、宿主動物には、本明細書中に記載されているものを含む一定量の免疫原が、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底、および／または皮内から接種される。
【０２４４】
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．等，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１８：３７７−３８１（１９８２）によって変更が加えられた体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して、リンパ球および固定化された骨髄腫細胞から調製することができる。利用できる骨髄腫細胞株としては、Ｘ−６３−Ａｇ８．６５３が挙げられるがこれらに限定されず、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡによるものを、ハイブリダイゼーションに使用することもできる。一般的には、この技術には、ポリエチレングリコールのような融合誘導因子を使用して、または当業者に周知の電気的手段によって骨髄腫細胞とリンパ球とを融合させる段階が含まれる。融合後、細胞は融合培地から分離され、選択的な増殖培地、例えば、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地中で増殖させられて、ハイブリダイズしていないもとの細胞が除かれる。血清を含むかまたは含まない、本明細書中に記載される任意の培地を、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用することができる。細胞融合技術の別の代替えとしては、ＥＢＶ固定化Ｂ細胞を、本発明の抗ＮＧＦモノクローナル抗体を生産させるために使用することもできる。ハイブリドーマは、所望される場合には、増殖させられ、サブクローニングされ、上清が、従来の免疫アッセイ手順（例えば、放射免疫法、酵素免疫法、または蛍光免疫法）によって抗免疫原活性についてアッセイされる。
【０２４５】
抗体の供給源として使用することができるハイブリドーマには、ＮＧＦに特異的なモノクローナル抗体またはその一部を生産する、もとのハイブリドーマの全ての誘導体、子孫細胞が含まれる。
【０２４６】
このような抗体を生産するハイブリドーマは、生体外または生体内で、公知の手順を使用して増殖させることができる。モノクローナル抗体は、所望される場合には、培養培地または体液から、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過のような従来の免疫グロブリン精製手順によって単離することができる。存在する場合には、望ましくない活性を、例えば、固相に結合させた免疫原により構成される吸着剤の上に調製物を流し、免疫原から所望される抗体を溶出または解離させることによって除去することができる。ヒトＮＧＦ、または免疫化される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害因子）に結合させられた標的アミノ酸配列を含む断片での、二官能性試薬または誘導試薬（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここでは、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である））を用いる宿主動物の免疫化により、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団を得ることができる。
【０２４７】
所望される場合は、目的の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列決定することができ、その後、ポリヌクレオチド配列を発現または増殖のためのベクター中にクローニングすることができる。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中でベクターの中に維持することができ、次いで、宿主細胞を増殖させて、後で使用するために凍結することができる。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化」するため、または親和性もしくは抗体の他の特性を改善するための、遺伝子操作に使用することもできる。例えば、定常領域を、抗体が臨床試験およびヒトの処置に使用される場合には、免疫応答を回避するために、より似ているヒト定常領域になるように操作することができる。ＮＧＦに対するより高い親和性、およびＮＧＦを阻害することにおけるより高い効率を得るためには、抗体配列を遺伝子操作することが望まれる場合もある。１つ以上のポリヌクレオチドの変化によって、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体とし、なおそのＮＧＦに対する結合能力を維持することができることは、当業者に明らかである。
【０２４８】
モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的な段階が存在する。これらは（１）出発抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を決定する段階、（２）ヒト化抗体を設計する段階、すなわち、ヒト化プロセスの間に使用するための抗体フレームワーク領域を推定する段階、（３）実際のヒト化方法／技術、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；同第５，８０７，７１５号；同第５，８６６，６９２号；同第６，３３１，４１５号；同第５，５３０，１０１号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５８５，０８９号；および同第６，１８０，３７０号を参照のこと。
【０２４９】
ヒト以外の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含む多数の「ヒト化」抗体分子が記載されており、これには、齧歯類の、または修飾された齧歯類のＶ領域と、ヒト定常ドメインに融合されたそれに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体が含まれる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１），Ｌｏｂｕｇｌｉｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４２２０−４２２４（１９８９），Ｓｈａｗ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７）、およびＢｒｏｗｎ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７）を参照のこと。他の参考文献には、適切なヒト抗体の定常ドメインと融合させる前に、ヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に接続された齧歯類のＣＤＲが記載されている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、およびＪｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）を参照のこと。別の参考文献には、組み換えにより貼り付けられた齧歯類のフレームワーク領域によって支持されている齧歯類のＣＤＲが記載されている。例えば、欧州特許公開番号０５１９５９６を参照のこと。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエント中のそのような部分の治療的適用の期間および有効性を制限する、齧歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小にするように設計されている。例えば、抗体の定常領域は、それが免疫学的に不活性である（例えば、補体媒介性溶解を誘発しない）ように操作することができる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；英国特許出願番号９８０９９５１．８を参照のこと。抗体（それらもまた利用することができる）をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２４７１−２４７６（１９９１）、ならびに米国特許第６，１８０，３７７号；同第６，０５４，２９７号；同第５，９９７，８６７号；同第５，８６６，６９２号；同第６，２１０，６７１号；および同第６，３５０，８６１号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２７１６０に開示されている。
【０２５０】
なお別に、完全なヒト抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている、市販により入手することができるマウスを使用して得ることができる。より所望される（例えば、完全なヒト抗体）またはより強い免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の作成に使用することができる。このような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）、ならびに、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）である。
【０２５１】
あるいは、抗体は、当該分野で公知の任意の方法を使用して組み換えによって作成し、発現させることができる。別の方法では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって組み換えにより作成することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；および同第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、免疫化されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子のレパートリーにより、ヒト抗体および抗体断片を生体外で生産させることができる。この技術により、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３またはｆｄの主要なまたは主要ではないコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上の機能性抗体断片として提示される。繊維状粒子にはファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーが含まれるので、抗体の機能的特性に基づく選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択もまたできる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかに類似した特性を示す。ファージディスプレイは、種々の形式で行うことができる。概要については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子断片のいくつかの供給源は、ファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムな組み合わせライブラリーから、多数の異なるオキサゾロン抗体を単離した。免疫化されていないヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多数の異なる抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、原則としてＭａｒｋ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されている技術にしたがって単離することができる。自然な免疫応答においては、抗体遺伝子は、高い割合で変異を重ねている（体細胞超変異）。導入されている変異のいくつかは、高い親和性を与え、親和性の高い表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞が優先的に複製され、その後の抗原でのチャレンジの間に差が出てくる。この自然界に存在しているこのプロセスは、「鎖シャッフリング」として知られている技術を使用して真似ることができる。Ｍａｒｋｓ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３（１９９２））。この方法においては、ファージディスプレイによって得られた「最初の」ヒト抗体の親和性を、免疫化されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の自然界に存在している変異体のレパートリー（レパートリー）で、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を連続して置換することによって改��することができる。この技術により、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有している抗体、および抗体断片の生産が可能になる。極めて大きなファージ抗体のレパートリー（「全てのライブラリーのもと（ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」としても知られている）を作成するための方法は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載されている。遺伝子シャッフリングもまた、齧歯類の抗体からヒト抗体へと誘導するために使用することができる。ここでは、ヒト抗体は、出発齧歯類抗体に対して同様の親和性と特異性を有している。「エピトープ刷り込み（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）」とも呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術によって得られた齧歯類抗体の重鎖および軽鎖Ｖドメイン遺伝子が、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられ、これにより齧歯類−ヒトキメラが作成される。抗原の選択により、機能的な抗原結合部位を回復することができるヒト可変領域の単離ができる、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（刷り込む）。このプロセスが齧歯類のＶドメインを置き換えるために繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０６２１３を参照のこと）。ＣＤＲの接続による齧歯類抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術により、齧歯類に起源するフレームワークまたはＣＤＲ残基を有さない完全なヒト抗体が提供される。
【０２５２】
上記の議論はヒト化抗体に関して行ったが、議論された一般的な原理を、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシでの使用のために抗体をカスタマイズするために適応できることは、明らかである。さらに、本明細書中に記載される抗体のヒト化の１つ以上の態様を、例えば、ＣＤＲの接続、フレームワークの変異、およびＣＤＲの変異と組み合わせることもできることが明らかである。
【０２５３】
抗体は、最初に、宿主動物から抗体と抗体を生産する細胞を単離すること、遺伝子配列を得ること、そして宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で抗体を組み換えによって発現させるように遺伝子を使用することによって、組み換えにより作成することができる。使用することができる別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニック乳中で抗体配列を発現させることである。植物または乳中で抗体を組み換えにより発現させるための方法は、開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓ等，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６（２００１）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｄ．Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５（１９９５）；およびＰｏｌｌｏｃｋ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７（１９９９）を参照のこと。抗体の誘導体（例えば、ヒト化抗体、単鎖抗体など）を作成するための方法は当該分野で公知である。
【０２５４】
免疫アッセイおよびフローサイトメトリー選別技術（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））もまた、ＮＧＦに特異的な抗体を単離するために使用することができる。
【０２５５】
抗体は、多くの異なるキャリアーに結合させることができる。キャリアーは、活性であっても、また不活性であってもよい。周知のキャリアーの例として、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然のおよび修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトが挙げられる。キャリアーの性質は、本発明の目的については、可溶性であっても不溶性であってもいずれでもよい。当業者であれば、抗体を結合させるための他の適切なキャリアーを認識しており、また、日常的に行われる実験を使用してそれを確認することができる。いくつかの実施形態においては、キャリアーには、心筋を標的とする部分が含まれる。
【０２５６】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２で開示されている発現ベクター）中に置かれ、次いでこれは、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされ、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成が得られる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２を参照のこと。ＤＮＡはまた、例えば、相同であるマウスの配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンではないポリペプチドのコード配列全体またはその一部に、免疫グロブリンコード配列を共有結合させることによって、修飾することもできる。そのような様式で、本明細書中に記載される抗ＮＧＦモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０２５７】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、当該分野で周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、それに結合するエピトープを同定すること、すなわち、「エピトープマッピング」である。タンパク質のエピトープの位置をマップし、特徴付けるための多くの方法が当該分野で公知であり、これには、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９のＣｈａｐｔｅｒ  １１に記載されているような、抗体−抗原複合体の結晶構造の解析、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイが含まれる。さらなる例においては、エピトープマッピングを使用して、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、種々の業者、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５，８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。エピトープは、直鎖状のエピトープ、すなわち、アミノ酸の１つのストレッチに含まれる）であっても、また、必ずしも単一のストレッチに含まれる必要のないアミノ酸の三次元相互作用によって形成される立体構造を有するエピトープであってもよい。種々の長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドを単離または合成（例えば、組み換えによって）することができ、そして抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が結合するエピトープを、ＮＧＦ配列から導いた重複ペプチドを使用し、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体による結合を決定することによって、系統的スクリーニングにおいて決定することができる。遺伝子断片の発現アッセイにより、ＮＧＦをコードするオープンリーディングフレームは、ランダムに、または特異的な遺伝子構造によってのいずれかで断片化され、発現させられたＮＧＦの断片の、試験される抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲによって生産することができ、これは次いで、放射性アミノ酸の存在下で、生体内で転写されてタンパク質に翻訳される。その後、放射標識されたＮＧＦ断片に対する抗体の結合が、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。特定のエピトープはまた、ファージ粒子（ファージライブラリー）の表面上に提示されるランダムなペプチド配列の大きなライブラリーを使用して同定することができる。あるいは、重複しているペプチド断片の定義されたライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて試験抗体への結合について試験することができる。さらなる例においては、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメイン交換実験、およびアラニンスキャン突然変異誘発を行って、エピトープの結合に必要とされる、十分な、および／または必須の残基を同定することができる。例えば、ドメイン交換実験は、近縁関係にあるが抗原性が異なるタンパク質（例えば、ニューロトロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバー）に由来する配列で、種々のＮＧＦポリペプチドの断片が置き換えられている（交換されている）、変異体ＮＧＦを使用して行うことができる。変異体ＮＧＦに対する抗体の結合を評価することにより、抗体結合に関する特定のＮＧＦ断片の重要性を評価できる。
【０２５８】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を特徴付けるために使用することができるなお別の方法は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するための、同じ抗原に結合すること、すなわち、ＮＧＦ上の種々の断片に結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを使用することである。競合アッセイは当業者に周知である。本発明の競合アッセイに使用することができる抗体の例として、Ｈｏｎｇｏ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：２１５−２２７（２０００）に記載されているＭａｂ  ９１１、Ｍａｂ  ９１２、Ｍａｂ  ９３８が挙げられる。
【０２５９】
発現ベクターを、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を発現させるために使用することができる。当業者は、生体内で外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与について十分に認識している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照のこと。発現ベクターの投与には、局所投与または全身投与が含まれ、注射、経口投与、パーティクルガン、またはカテーテルによる投与が含まれ、さらに、局部投与も含まれる。別の実施形態においては、発現ベクターは、直接、交感神経幹またはガングリオンに、あるいは、冠状動脈、心房、心室、または心膜に投与される。
【０２６０】
発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的化された送達も使用することができる。受容体媒介性のＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ等，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕ等，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）；Ｗｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含む治療用組成物は、遺伝子治療プロトコールにおける局所投与については、約１００ｎｇから約２００ｍｇの範囲で投与される。約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコールに使用することができる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルとは、ウイルスまたは非ウイルスの起源のものであり得る（一般的には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。このようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、構成的であるかまたは調節することができるかのいずれかであり得る。
【０２６１】
所望されるポリヌクレオチドの送達および所望される細胞中での発現のためのウイルスをベースとするベクターは当該分野で周知である。例示的なウイルスをベースとするビヒクルとして、組み換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０７９３６；同ＷＯ９４／０３６２２；同ＷＯ９３／２５６９８；同ＷＯ９３／２５２３４；同ＷＯ９３／１１２３０；同ＷＯ９３／１０２１８；同ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０号；同第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０，３４５，２４２号を参照のこと）、αウイルスをベースとするベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６４９、同ＷＯ９３／０３７６９；同ＷＯ９３／１９１９１；同ＷＯ９４／２８９３８；同ＷＯ９５／１１９８４、および同ＷＯ９５／００６５５を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されているような、死滅させられたアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた使用することができる。
【０２６２】
ウイルス以外の送達ビヒクルおよび方法もまた使用することができ、これには、死滅させられたアデノウイルスのみに連結させられたポリ陽イオン性縮合ＤＮＡ、または連結さていないポリ陽イオン性縮合ＤＮＡが単独で（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照のこと）；リガンドに連結させられたＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照のこと）；真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０７９９４；同第ＷＯ９６／１７０７２；同ＷＯ９５／３０７６３；および同ＷＯ９７／４２３３８を参照のこと）、および核酸電荷の中和、または細胞膜との融合が含まれるが、これらに限定されない。裸のＤＮＡもまた使用することができる。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１３７９６；同ＷＯ９４／２３６９７；同ＷＯ９１／１４４４５；および欧州特許第０，５２４，９６８号に記載されている。別のアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
【０２６３】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の同定
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、当該分野で公知の方法を使用して同定する、または特徴付けることができる。それによると、ＮＧＦの生物学的活性の低下、緩和、中和が検出および／または測定される。例えば、米国特許第５，７６６，８６３号、および同第５，８９１，６５０号に記載されているキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイは、抗ＮＧＦ試薬を同定するために使用することができる。このＥＬＩＳＡ型アッセイは、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（本明細書中以後、「ｒＰＴＫ」とする）、例えば、ＴｒｋＡ受容体のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することによるキナーゼの活性化を定量的または定性的な測定に、さらには、選択されたｒＰＴＫ、例えば、ＴｒｋＡについての可能性のあるアンタゴニストの同定および特徴付けに適している。アッセイの最初の段階には、キナーゼ受容体（例えば、ＴｒｋＡ受容体）のキナーゼドメインのリン酸化が含まれる。ここでは、受容体は、真核生物細胞の細胞膜中に存在する。受容体は、内因性受容体であっても、受容体をコードする核酸であっても、または受容体構築物であってもよく、細胞中に形質転換することができる。通常は、第１の固相（例えば、第１のアッセイプレートのウェル）が、実質的に均質なこのような細胞の集団（通常は、哺乳動物細胞株）でコーティングされ、それにより、細胞が固相に付着させられる。多くの場合は、細胞は粘着性があり、それによって第１の固相に対して自然に付着する。「受容体構築物」が使用される場合は、これには通常、キナーゼ受容体とフラッグポリペプチドとの融合体が含まれる。フラッグポリペプチドは、アッセイのＥＬＩＳＡ部分において、捕捉試薬（多くの場合は、捕捉抗体）によって認識される。候補の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のような分析物が、次いで、細胞が付着しているウェルに対してＮＧＦと共に添加され、それにより、チロシンキナーゼ受容体（例えば、ＴｒｋＡ受容体）がＮＧＦと分析物に曝される（またはそれらと接触させられる）。このアッセイにより、そのリガンドであるＮＧＦによるＴｒｋＡの活性化を阻害する抗体を同定することができる。ＮＧＦと分析物に曝された後、付着している細胞は、溶解緩衝液（これは、その中に可溶性の界面活性剤を含む）と穏やかな攪拌を使用して溶解させられ、それによって細胞溶解物を遊離させ、これを、細胞溶解物の濃縮または明澄化の必要なく、直接アッセイのＥＬＩＳＡ部分に供することができる。
【０２６４】
このように調製された細胞溶解物は、その後すぐにアッセイのＥＬＩＳＡ段階に供される。ＥＬＩＳＡ段階の第１の工程として、第２の固相（通常は、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル）、が、チロシンキナーゼ受容体に、または受容体構築物の場合は、フラッグポリペプチドに特異的に結合する捕捉試薬（多くの場合、捕捉抗体）でコーティングされる。第２の固相のコーティングは、捕捉試薬が第２の固相に付着するように行われる。捕捉試薬は、通常、モノクローナル抗体であるが、本明細書中の実施例に記載されるように、ポリクローナル抗体を使用できる場合もある。その後、得られた細胞溶解物が付着している捕捉試薬に曝されるかまたは捕捉試薬と接触させられ、その結果、受容体または受容体構築物が第２の固相に付着させられる（あるいは、第２の固相中に捕捉される）。次いで、結合していない細胞溶解物をとり除くための洗浄工程が行われ、それによって捕捉された受容体または受容体構築物が残される。付着しているかまたは捕捉された受容体または受容体構築物は、その後、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化されたチロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に曝されるか、またはそれと接触させられる。１つの実施形態においては、抗ホスホチロシン抗体は、放射活性のない発色試薬の色の変化を触媒する酵素に（直接または間接的に）結合させられる。したがって、受容体のリン酸化は、その後の試薬の色の変化によって測定することができる。酵素は、抗ホスホチロシン抗体に直接結合させることができるか、または結合分子（例えば、ビオチン）を、抗ホスホチロシン抗体に結合させて、その後、酵素を結合分子を介して抗ホスホチロシン抗体に結合させることができる。最後に、抗ホスホチロシン抗体の捕捉された受容体または受容体構築物への結合は、例えば、発色試薬の色の変化によって測定することができる。
【０２６５】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、候補の因子をＮＧＦとともにインキュベートし、以下の特徴のいずれか１つ以上をモニターすることによって同定することができる：（ａ）ＮＧＦに結合し、そしてＮＧＦの生物学的活性および／またはＮＧＦによる情報伝達機能によって媒介される下流の経路を阻害する；（ｂ）ＮＧＦ受容体の活性化を阻害するか、ブロックするか、または低下させる（ＴｒｋＡ受容体の二量体化および／または自己リン酸化を含む）；（ｃ）ＮＧＦのクリアランスを高める；（ｄ）関節リウマチの痛みまたは変形性関節症の痛みの任意の態様を処置または予防する；（ｅ）ＮＧＦの合成、生産、または放出を阻害する（または減少させる）。いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、候補の因子をＮＧＦとともにインキュベートし、さらに、結合、および／またはそれに伴うＮＧＦの生物学的活性の低下または中和をモニターすることによって同定される。結合アッセイは、精製されたＮＧＦポリペプチド（単数または複数）を用いて、またはＮＧＦポリペプチド（単数または複数）を生まれつき発現する細胞もしくはＮＧＦポリペプチド（単数または複数）を発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて、行われる場合もある。１つの実施形態においては、結合アッセイは競合結合アッセイであり、これにより、候補の抗体がＮＧＦ結合について既知の抗ＮＧＦアンタゴニストと競合する能力が評価される。このアッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含む種々の形式で行うことができる。他の実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、候補の因子をＮＧＦと共にインキュベートすること、さらに、結合、ならびにそれに付随するｔｒｋＡ受容体の二量体化および／または自己リン酸化の阻害をモニターすることによって同定される。
【０２６６】
最初の同定の後、候補の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の活性化を、標的とされた生物学的活性を試験するための公知の生体アッセイによってさらに確認、および絞り込むことができる。あるいは、生体アッセイは、候補を直接スクリーニングするために使用することができる。例えば、ＮＧＦは応答性の細胞中の多数の形態学的に認識することができる変化を促進する。これには、ＰＣ１２細胞の分化の促進、およびこれらの細胞からの神経突起の成長の増強（Ｇｒｅｅｎｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３（７）：２４２４−８，１９７６）、応答性の知覚神経節および交感神経節の外植片からの神経突起の成長の促進（（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：５３４−５６９，１９６８）、およびＮＧＦ依存性のニューロン（例えば、胚性後根ガングリオン、三叉神経ガングリオン、または交感神経ガングリオンニューロン）の生存性の促進（例えば、Ｃｈｕｎ  ＆  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７５：７０５−７１１（１９９７）；Ｂｕｃｈｍａｎ  ＆  Ｄａｖｉｅｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：９８９−１００１（１９９３））が含まれるがこれらに限定されない。したがって、ＮＧＦの生物学的活性の阻害についてのアッセイには、ＮＧＦと分析物（例えば、候補の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体）と共にＮＧＦ応答性細胞を培養することが必然的に伴う。適切な時間の後、細胞応答（細胞の分化、神経突起の成長、または細胞の生存性）がアッセイされる。
【０２６７】
候補の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の、ＮＧＦの生物学的活性をブロックまたは中和する能力はまた、Ｈｏｎｇｏ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：２１５−２２７（２０００）に記載されているような、胚性ラットの後根ガングリオンの生存性についての生体アッセイにおいてＮＧＦ媒介性の生存性を阻害する候補の因子の能力をモニターすることによって評価することもできる。
【０２６８】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、任意の適切な経路を介して個体（関節リウマチおよび変形性関節症）に投与することができる。本明細書中に記載されている実施例が限定ではなく、利用できる技術の例示であることは、当業者に明らかなはずである。したがって、いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、静脈内投与のような既知の方法によって、例えば、ボーラスとして、または一定期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、舌下、滑液内、送気、随腔内、経口、吸入、または局所経路によって、個体に投与される。投与は全身的（例えば、静脈内投与）であっても、また局所的であってもよい。市販されている液体処方物用のネブライザー（ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む）は、投与に有用である。液体処方物は直接噴霧することができ、凍結乾燥させられた粉末は再構成の後、噴霧することができる。あるいは、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、過フッ化炭化水素処方物と定量吸入器を使用してエアロゾルとすることができるか、または凍結乾燥させた破砕粉末として吸入することができる。
【０２６９】
１つの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、部位特異的送達技術または標的化させられた局所送達技術によって投与される。部位特異的送達技術または標的化させられた局所送達技術の例として、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の種々の移植可能なデポー供給源、または局所送達用カテーテル（例えば、注入カテーテル、留置カテーテル、または針状カテーテル）、人工血管移植、外膜ラップ（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ  ｗｒａｐｓ）、シャント、およびステント、あるいは他の移植することができるデバイス）、部位特異的キャリアー、直接の注射、あるいは直接の塗布が挙げられる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５３２１１、および米国特許第５，９８１，５６８号を参照のこと。
【０２７０】
種々の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体処方物を投与のために使用することができる。いくつかの実施形態においては、種々の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体処方物を、手際よく投与することができる。いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体と、薬学的に許容される賦形剤が、種々の処方物中で投与される。薬学的に許容される賦形剤は当該分野で公知であり、これらは、薬理学的に有効である物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、所定の形態であるかまたは一定の濃度であり得るか、あるいは希釈剤としての役割を果たすこともできる。適切な賦形剤としては、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、および皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。非経口および経口による薬物送達のための賦形剤および処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ編（２０００）に示されている。
【０２７１】
いくつかの実施形態においては、これらの試薬は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために処方される。したがって、これらの試薬を、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液などのような薬学的に許容されるビヒクルと混合することができる。特定の投与レジュメ、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の固体、および個体の医学的な病歴に応じて変化する。
【０２７２】
抗ＮＧＦ抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）を含む任意の適切な方法を使用して投与することができる。抗ＮＧＦ抗体はまた、本明細書中に記載されているように、吸入によって投与することもできる。一般的には、抗ＮＧＦ抗体の投与については、最初の候補のなる投与量は約２ｍｇである。本発明の目的については、典型的な毎日の投与量は、上記の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇから３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇから３００μｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、あるいはそれ以上の範囲である。例えば、抗ＮＧＦ抗体は、約１μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇで投与することができる。数日間またはそれ以上の期間にわたる反復投与については、症状に応じて、処置は、所望される症状が抑えられるまで、または痛みを減少させるための十分な治療レベルに達するまで、継続される。例示的な用量レジュメには、約２ｍｇ／ｋｇの初回用量の投与、その後の約１ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体の毎週の維持量の投与、または隔週の約１ｍｇ／ｋｇの維持量の投与が含まれる。しかし、医師が望む薬物動態的な崩壊のパターンに応じて、他の投与レジュメが有用である場合もある。例えば、いくつかの実施形態においては、１週間に１回から４回までの投与が想定される。この治療の進行は、従来技術およびアッセイによって容易にモニターされる。投与レジュメ（使用されるＮＧＦアンタゴニスト（単数または複数）を含む）は経時的に変化し得る。
【０２７３】
本発明の目的については、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の適切な投与量は、使用される抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体（またはその組成物）、処置される痛みの型および重篤度、試薬が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴、および試薬に対する反応、および主治医の判断によって変化する。通常は、所望される結果が得られる投与量に達するまで、医師が抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体（例えば、Ｅ３）を投与する。用量および／または頻度は処置の経過全体を通じて変化し得る。
【０２７４】
半減期のような経験的な考慮が、通常、投与量の決定の一因となる。例えば、ヒトの免疫系と適合する抗体（例えば、ヒト化抗体または完全なヒト抗体）が、抗体の半減期を長くするために、宿主免疫系による攻撃から抗体を防ぐために、使用される場合もある。投与頻度は、治療の経過全体を通じて決定し、調整することができ、通常は、痛みの処置、および／または抑制、および／または緩和、および／または遅延に基づくが、必ずしもそうではない。あるいは、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の連続的な徐放が適切である場合もある。徐放を行うための種々の処方物およびデバイスは当該分野で公知である。
【０２７５】
１つの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与量は、１回以上の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与（単数または複数）が行われた個体において経験的に決定することができる。個体には、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の増分量が投与される。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体または他の同等の抗体の効力を評価するために、痛み指標を追跡することができる。
【０２７６】
本発明の方法による抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与目的が治療的であるかまたは予防的であるか、および熟練した医師に公知である他の要因に応じて、連続的でも断続的でもあり得る。抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与は、本質的には、あらかじめ選択された期間にわたって連続的に行われる場合も、また、間隔のあいた用量（例えば、痛みが発生する前、間、もしくは後のいずれか）で順次行われる場合もある。
【０２７７】
いくつかの実施形態においては、１つ以上の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が存在する場合もある。少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる抗体、あるいはそれ以上の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が存在し得る。通常は、これらの抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する。
【０２７８】
本発明に従って使用される抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の治療用処方物は、所望される純度の抗体を、任意に選択される薬学的に許容されるキャリアー、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００））と混合することによって、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容されるキャリアー、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに対して毒性はなく、これには、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸）；塩（例えば、塩化ナトリウム；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンズエトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖、ニ糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が含まれる場合もある。
【０２７９】
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体を含むリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されているような、当該分野で公知の方法によって調製される。循環時間が長いリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリンコレステロールおよびＰＥＧから誘導されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる、逆相蒸発法によって作成することができる。リポソームは、所望される直径のリポソームとなるように、決められた孔の大きさのフィルターを通じて押し出される。
【０２８０】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセル）、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、それぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロカプセル、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマイクロエマルジョン中に、捕捉することもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ編（２０００）に開示されている。
【０２８１】
徐放調製物を調製することもできる。徐放調製物の適切な例として、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような成型された粒子の形態である。徐放マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７−エチル−Ｌ−グルタミンのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル共重合体、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドから構成される注射することができるマイクロスフェア）、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２８２】
生体内投与に使用される処方物は滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌の濾過膜を通過させる濾過によって容易に行われる。治療用の抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体組成物は、通常、滅菌された接続口を有している容器（例えば、静脈内溶液バッグ、または皮下注射用の注射針によって孔を空けることができるストッパーを有しているバイアル）に入れられる。
【０２８３】
本発明の組成物は、経口、非経口、または直腸投与、あるいは吸入または送気による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、または坐剤のような単位投与量形態である場合もある。
【０２８４】
錠剤のような固形の組成物の調製については、主な有効成分が薬学的キャリアー、例えば、従来の錠剤成分（例えば、トウモロコシ澱粉、乳糖、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、またはガム）および他の薬学的希釈剤（例えば、水）と混合され、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容される塩の均質な混合物の均質な混合物を含む固形の予備処方組成物が形成される。これらの予備処方組成物を均質であるという場合には、有効成分が組成物全体に均一に分散させられており、その結果、組成物を錠剤、丸剤、およびカプセル剤のような等しい有効単位投与量形態に容易に分割することができることを意味する。その後、この固形の予備処方組成物は、０．１から約５００ｍｇまでの本発明の有効成分を含む上記の型の単位投与量形態へと分割される。新規の組成物の錠剤または丸剤はコーティングすることができ、また、別の方法で、持続性の作用の利点を与える投与量形態を生じるように調合することもできる。例えば、錠剤または丸剤には、内部投与量成分と外部投与量成分とを含ませることができ、後者は、前者の覆う外皮の形態である。２つの成分を、胃での分解には抵抗性があり、内部性分を完全なまま十二指腸へと通過させるか、または放出を遅らせるように作用する腸層によって分離することができる。重合性の酸、およびシェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との重合性の酸の混合物のメンバーを含む材料のような種々の材料を、このような腸層およびコーティングに使用することができる。
【０２８５】
適切な界面活性剤として、具体的に、非イオン性試薬（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０、６０、８０、または８５）、および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、４０、６０、８０、または８５）が挙げられる。界面活性剤を含む組成物は、０．０５％から５％の間の界面活性剤を含むことが便利であり、０．１から２．５％の間であり得る。必要である場合には、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容されるビヒクルを添加することもできることは明らかである。
【０２８６】
適切なエマルジョンは、Ｉｎｔｒａｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（登録商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｍ（登録商標）のような、市販されている脂肪乳剤を使用して調製することができる。有効成分は、予め混合したエマルジョン組成物中に溶解させることができるか、あるいは、有効成分は、油（例えば、大豆油、ベニバナ油、菜種油、胡麻油、コーン油、またはアーモンド油）中に溶解させるかのいずれかができ、また、リン脂質（例えば、卵のリン脂質、大豆リン脂質、または大豆レシチン）と水の混合の際にエマルジョンを形成させることもできる。エマルジョンの弾力性を調節するために他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを添加することもできることは明らかである。適切なエマルジョンは、通常、２０％までの油、好ましくは、５％から２０％の間の油を含み得る。脂質エマルジョンは、０．１から１．０μｍの間、具体的には、０．１から０．５μｍまでの間の脂質の液滴を含み、５．５から８．０までの範囲のｐＨを有する。
【０２８７】
エマルジョン組成物は、神経成長因子抗体を、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）またはその成分（大豆油、卵のリン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製されたものであり得る。
【０２８８】
吸入または送気のための組成物としては、薬学的に許容される水性溶媒または有機溶媒中の溶液および懸濁液、またはそれらの混合物、ならびに粉末が挙げられる。液体または固体の組成物には、上記に示されたような適切な薬学的に許容される賦形剤を含めることができる。いくつかの実施形態においては、組成物は、局所または全身的な効果のために、経口または鼻腔の呼吸経路によって投与される。好ましくは、滅菌の薬学的に許容される溶媒中のものである、組成物は、気体を使用することによって噴霧することができる。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接吸い込むことができ、また、噴霧デバイスを、フェイスマスク、テント、もしくは間欠型陽圧呼吸器に取り付けることもできる。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、適切な様式で処方物を送達するデバイスから、好ましくは、経口または鼻腔内に投与される場合もある。
【０２８９】
治効は、当該分野で周知の方法によって評価することができる。
【０２９０】
本発明の抗体およびポリヌクレオチドを含むキット
本発明により、また、検出および／または治療における使用のための、抗体またはポリペプチドを含むキットが提供される。したがって、いくつかの実施形態においては、キットには、抗体Ｅ３が含まれる。いくつかの実施形態においては、キットには、本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれかが含まれる。
【０２９１】
他の態様においては、キットは、例えば、痛みを有している個体（外科手術後の痛み、関節リウマチの痛み、および変形性関節症の痛みを含む）を処置することを含む、本明細書中に記載される方法のいずれかのために使用することができる。本発明のキットは、適切なパッケージの中に存在し、必要に応じて、緩衝液のような別の成分、および本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて抗体を使用するための説明書が提供される場合もある。いくつかの実施形態においては、キットには痛みを処置するための説明書が含まれる。いくつかの実施形態においては、キットには、本明細書中に記載されている抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体と、個体における関節リウマチの痛みを処置および／または予防するための説明書が含まれる。他の実施形態においては、キットには、本明細書中に記載されている抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体と、個体における変形性関節症の痛みを処置および／または予防するための説明書が含まれる。いくつかの実施形態においては、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体は抗体Ｅ３である。
【０２９２】
別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載されるＥ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むキットが提供される。いくつかの実施形態においては、キットにはさらに、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいてポリヌクレオチドを使用するための説明書が含まれる。
【０２９３】
抗体の親和性を調節するための方法およびＣＤＲを特徴付けるための方法
本発明者らは、抗体のＣＤＲを特徴付けるため、および／または「ライブラリースキャン突然変異誘発」と呼ばれる、抗体のようなポリペプチドの結合親和性を変化させる（例えば、改善する）ための方法を開発した。通常、ライブラリースキャン突然変異誘発は以下のような作業である。ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸位置が、当該分野で認識されている方法を使用して、２つ以上のアミノ酸（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個）のアミノ酸で置き換えられる。これにより、クローンの小さいライブラリー（いくつかの実施形態においては、分析される全てのアミノ酸位置についてのもの）が生じ、それぞれが２つ以上のメンバーの複雑さを有する（全ての位置で２つ以上のアミノ酸によって置換される場合）。一般的には、ライブラリーには、自然界に存在している（置換されていない）アミノ酸を含むクローンも含まれる。それぞれのライブラリーに由来する少数のクローン（約２０〜８０個のクローン）（ライブラリーの複雑さによって異なる）が、標的ポリペプチドに対する結合親和性についてスクリーニングされ、高い結合、同じ結合、低い結合を有しているか、または結合しない候補が同定される。結合親和性を決定するための方法は当該分野で周知である。いくつかの実施形態においては、結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を使用して決定される。これにより、約２倍またはそれ以上の結合親和性の差が検出される。ＢＩＡｃｏｒｅは、出発抗体がすでに比較的高い親和性、例えば、約１０ｎＭまたはそれ未満のＫＤで結合する場合に、特に有用である。ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を使用するスクリーニングは、本明細書中の実施例に記載される。
【０２９４】
他の実施形態においては、結合親和性は、Ｋｉｎｅｘａ  Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ，シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫アッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光転移、および／または酵母でのディスプレイを使用して決定される。他の実施形態においては、結合親和性は、適切な生体アッセイを使用してスクリーニングされる。
【０２９５】
いくつかの実施形態においては、ＣＤＲ中の全てのアミノ酸位置が、当該分野で認識されている突然変異誘発方法（その一部は本明細書中に記載される）を使用して２０個全ての自然界に存在しているアミノ酸で（いくつかの実施形態においては、一度に）置き換えられる。これにより、クローンの小さいライブラリー（いくつかの実施形態においては、分析される全てのアミノ酸位置についてのもの）が生じ、それぞれが、２０のメンバーの複雑さを有する（全ての位置について、２０個の全てのアミノ酸で置換される場合）。
【０２９６】
いくつかの実施形態においては、スクリーニングされるライブラリーには、２つ以上の位置に置換が含まれ、それらは同じＣＤＲの中にある場合もあり、また２つ以上のＣＤＲの中にある場合もある。したがって、いくつかの実施形態においては、ライブラリーには、１つのＣＤＲ中の２つ以上の位置に置換が含まれる。他の実施形態においては、ライブラリーには、２つ以上のＣＤＲの中の２つ以上の位置に置換が含まれる。さらに他の実施形態においては、ライブラリーには、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の位置に置換が含まれ、上記の位置は、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ中に見られる。いくつかの実施形態においては、置換は、縮重度の低いコドンを使用して調製される。例えば、Ｂａｌｉｎｔ等，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９−１８の表２を参照のこと。
【０２９７】
いくつかの実施形態においては、ＣＤＲは、ＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３である。他の実施形態においては、ＣＤＲは、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、および／またはＣＤＲ  Ｈ３の１つ以上である。いくつかの実施形態においては、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、または伸張型ＣＤＲである。
【０２９８】
改善された結合を有する候補を配列決定することができ、それにより、改善された親和性を生じるＣＤＲ置換変異体（「改良された」置換体とも呼ばれる）を同定することができる。例えば、実施例１に示されるように、この方法を使用することにより、同じアミノ酸位置でのおよそ１８個の他の置換体によっては結合が生じない（すなわち、抗体機能がない）場合であっても、結合が改善された１つの置換体を同定することができる。結合する候補をまた配列決定することもでき、それによって結合を保っているＣＤＲ置換体を同定することができる。
【０２９９】
いくつかの実施形態においては、複数回のスクリーニングが行われる。例えば、結合が改善された候補（それぞれが、１つ以上のＣＤＲの１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む）はまた、それぞれの改善されたＣＤＲ位置（すなわち、その位置での置換変異体が改善された結合を示す、ＣＤＲ中のアミノ酸位置）に、少なくとも、もとのアミノ酸と置換されたアミノ酸を含む、第２のライブラリーの設計にも有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択は、以下でさらに議論される。
【０３００】
ライブラリースキャン突然変異誘発によっては、また、改善された結合、同じ結合、低下した結合を有するかまたは結合しないクローンの頻度によってもまた、抗体−抗原複合体の安定性についてのそれぞれのアミノ酸位置の重要性に関する情報が提供される限りは、ＣＤＲを特徴付けるための手段も提供される。例えば、ＣＤＲの１つの位置が、２０個の全てのアミノ酸に変更された場合にも結合を保持している場合には、その位置は、抗原結合におそらく必要のない位置として同定される。逆に、ＣＤＲの１つの位置が、ごく少ない割合の置換体においてしか結合を保持できない場合には、その位置は、ＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。したがって、ライブラリースキャン突然変異誘発方法により、多くの異なるアミノ酸（２０個の全てのアミノ酸を含む）に変化させることができるＣＤＲ中の位置、および変化させることができないかまたは少数のアミノ酸にのみ変化させることができるＣＤＲ中の位置に関する情報が得られる。この態様は、実施例１で議論され、説明される。
【０３０１】
いくつかの実施形態においては、改善された親和性を有している候補が、第２のライブラリー中で混合される。これには、その位置に、改良されたアミノ酸、もとのアミノ酸が含まれ、さらに、所望されるライブラリーの複雑さに応じて、または所望されるスクリーニング方法もしくは選択方法を使用して許容されるライブラリーの複雑さに応じて、別の置換がその位置に含まれる場合もある。さらに、所望される場合には、隣接するアミノ酸位置をランダムにして、少なくとも２つ以上のアミノ酸にすることもできる。隣接するアミノ酸をランダムにすることにより、変異体ＣＤＲ中にさらに立体構造上の可撓性を提供することができ、これにより次いで、多数の改良性の変異の導入が可能に、または容易になる場合もある。いくつかの実施形態においては、ライブラリーには、初回のスクリーニングにおいては改善された親和性を示さなかった位置にも置換が含まれる。
【０３０２】
第２のライブラリーは、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を使用するスクリーニング、ならびに、ファージディスプレイ、酵母によるディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む選択のための当該分野で公知の任意の方法を使用する選択を含む、当該分野で公知の任意の方法を使用して、改善された結合親和性および／または変更された結合親和性を有しているライブラリーのメンバーについてスクリーニングまたは選択される。
【０３０３】
抗体の親和性を調節するため、およびＣＤＲを特徴付けるための方法の利点
これらの方法は、結合を改善するかまたは結合を保持するアミノ酸置換を同定するための、ＣＤＲアミノ酸位置の予備スクリーニングに有用である。重要な残基、結合を改善する置換および／または抗体機能を保持する置換の予備同定により、親和性成熟ライブラリーの効率のよい設計およびスクリーニングが可能になる。
【０３０４】
この方法はまた、ＣＤＲを特徴付けるためにも有用であり、これにより、抗原に対する結合についてＣＤＲ中のそれぞれのアミノ酸位置の重要性に関する総合的な情報が提供される。この方法はまた、結合を改善する置換を同定するためにも使用することができる。
【０３０５】
それぞれの位置を（いくつかの実施形態においては、同時に）ランダムにすることができる小さいライブラリーを使用することにより、ＢＩＡｃｏｒｅのような感度の高い方法を使用して置換変異体をスクリーニングすることができる。これにより、詳細な速度論情報が提供される。スクリーニング方法は、大きなライブラリーがスクリーニングされる場合には、一般的に実用的ではない。その代わりに、ファージディスプレイ、酵母によるディスプレイ、およびリボソームディスプレイのような選択方法が、結合を保持しているクローンを同定するために一般的に使用される。ファージディスプレイおよびＥＬＩＳＡアッセイは、クローンから調製されたタンパク質試料の濃度に大きく依存する場合があり、したがって、高い結合親和性を有しているクローンを同定するよりもむしろ、発現が増大した、安定性が向上した、または毒性が低下したクローンに大きく偏る傾向にある。さらに、クローンの発現レベルの差は、結合親和性の小さな改善を隠してしまう場合がある。これらの欠点は、高い結合親和性を有している抗体が出発材料として使用される場合には、特に深刻である。なぜなら、充分にストリンジェントであるスクリーニングのためには、非常に低いレベルの抗原を使用しなければならないからである。
【０３０６】
対照的に、本発明の方法、例えば、それぞれの位置（いくつかの実施形態においては、一度に１つの位置）でランダムにすることによって、例えば、所定の位置について２０個の全てのアミノ酸の置換を導入し、その効果を特徴付けることが可能になる。この分析により、所定の位置でどれほど多くの置換が寛容であるか（すなわち、抗体結合を維持できるか）についての情報が提供され、次いで、抗体機能についてのそれぞれのアミノ酸の重要性に関する情報が提供される。さらに、所定の位置での置換の多くまたはほとんどによって機能性ではない（結合しない）抗体が生じる状況であっても、結合の改善を生じる置換を同定することができる。反対に、アラニンスキャン突然変異誘発（これは、通常、重要なＣＤＲ位置を同定するために使用される）によっては、アラニンの置換により結合が可能になるかまたは結合が妨げられるかに関する情報が提供される。一般的には、アラニン置換によって結合が妨げられる位置は、親和性成熟ライブラリーから除かれる。しかし、多くの場合においては、アラニンはＣＤＲ位置ではほとんどない置換であり得る。
【０３０７】
この方法によって、単一のＣＤＲ変異の効果を同定し、特徴付けることもできる。反対に、ファージディスプレイのような方法によっては、多くの変異が同時に導入され、選択され、それによってポジティブな変異が特定のクローン中に存在する不利な変異の存在によって隠されてしまう危険性が増大する可能性がある。
【０３０８】
この方法はまた、この方法によって改善された結合親和性を生じる少数の変異（例えば、１つのＣＤＲ中の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの変異）の同定が可能である限りは、元の（出発）抗体の結合特異性を保ったまま、親和性を改善するために有用である。反対に、ファージディスプレイのような方法によっては、通常は、一度に複数の変異を使用して結合親和性が改善される。これによっては、抗体の特異性がシフトし、そして／または望ましくない交差反応性が増大する場合がある。
【０３０９】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、これらに限定されることはない。
【実施例】
【０３１０】
（実施例１）
マウスのアンタゴニスト抗ＮＧＦ抗体９１１のヒト化および親和性成熟
Ａ．一般的方法
以下の一般的方法を、本実施例において使用した。
【０３１１】
ライブラリーの作成
ライブラリーは、Ｋａｙ等（１９９６），Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ｐｇ２７７−２９１を参照のこと）に記載されているような、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲカセット突然変異誘発によって作成した。ドーピングコドンＮＮＫを使用して、１つのアミノ酸位置を２０個の可能なアミノ酸を含むようにランダムにした。１つのアミノ酸位置を特異的な特性を有しているアミノ酸のセットのみを含むようにランダムにするために、ドーピングコドンを、Ｂａｌｉｎｔ等（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９−１８に記載されているように使用した。部位特異的突然変異誘発を、Ｉｎｎｉｓ等（１９９０）ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ｐｐ．１７７−１８３を参照のこと）に記載されているように、組み換えＰＣＲを使用して行った。
【０３１２】
少量のＦａｂの調製
９６ウェルプレート中での少量の発現を、Ｆａｂライブラリーをスクリーニングするために最適化した。Ｆａｂライブラリーで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から出発して、コロニーを採取して、マスタープレート（寒天ＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコース）と、作業プレート（２ｍｌ／ウェル、９６ウェル／プレート、１．５ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコースを含む）の両方に植菌した。両方のプレートを３０℃で８〜１２時間増殖させた。マスタープレートを４℃で保存し、作業プレートに由来する細胞を、５０００ｒｐｍでペレットにし、１ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭのＩＰＴＧとともに再懸濁して、Ｆａｂの発現を誘導した。細胞を、３０℃で５時間の発現時間の後、遠心分離によって回収し、その後、５００μＬの緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０、３ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。ＨＢＳ−ＥＰに再懸濁した細胞の溶解を、１サイクルの凍結（−８０℃）とその後の３７℃での融解によって行った。細胞溶解物を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、Ｆａｂを含む上清から細胞の破片を分離した。その後、上清をＢＩＡ  ｃｏｒｅプラズモン共鳴装置に注入して、それぞれのＦａｂについての親和性の情報を得た。Ｆａｂを発現するクローンをマスタープレートから取り出して、以下に記載するように、ＤＮＡを配列決定し、大量のＦａｂを生産させ、詳細に特徴付けた。
【０３１３】
大量のＦａｂの調製
詳細な速度論パラメーターを得るために、Ｆａｂを、大量の培養物から発現させ、精製した。２００ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコースを含む三角フラスコに、選択したＦａｂを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンの一晩培養物５ｍＬを植菌した。クローンを、３０℃で、ＯＤ５５０ｎｍが１．０に達するまでインキュベートし、その後、２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭのＩＰＴＧに培地を交換することによって誘導した。３０℃で５時間の発現時間の後、細胞を遠心分離によってペレットにし、その後、１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ８）に再懸濁した。細胞の溶解を、２サイクルの凍結／融解（それぞれ、−８０℃および３７℃）によって行った。細胞溶解物の上清を、ＰＢＳ（ｐＨ８）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡスーパーフローセファロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）カラムにロードし、その後、５倍のカラム容量のＰＢＳ（ｐＨ８）で洗浄した。個々のＦａｂを、ＰＢＳ（ｐＨ８）＋３００ｍＭのイミダゾールで種々の画分中に溶出させた。Ｆａｂを含む画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、その後、ＥＬＩＳＡによって定量した後、親和性を特徴付けた。
【０３１４】
抗体全体の調製
抗体全体を発現させるために、重鎖および軽鎖可変領域を、２つの哺乳動物発現ベクター（軽鎖についてはＥｂ．９１１．Ｅ３またはＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅ、および重鎖についてはＥｂ．９１１．３Ｅ；本明細書中に記載されている）中にクローニングし、リポフェクタミンを使用して、一時的発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。抗体を、標準的な方法を使用し、プロテインＡを使用して精製した。
【０３１５】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
抗ＮＧＦ  Ｆａｂとモノクローナル抗体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｗａｙ  ＮＪ）を使用して決定した。ＣＭ５チップを、供給業者の説明書にしたがって、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させた。ヒトＮＧＦを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で希釈して、０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で活性化したチップ上に注入した。個々のチップチャンネルを通過させるフロー時間を変化させることをもちいて、２つの抗原密度の範囲に到達させた：詳細な速度論の研究については１００〜２００反応単位（ＲＵ）、そしてスクリーニングアッセイについては５００〜６００ＲＵ。チップをエタノールアミンでブロックした。再生の研究は、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と４ＭのＮａＣｌの混合物（２：１）により２００回の注入全てについてチップ上でｈＮＧＦの活性を維持したまま、結合したＦａｂが効率よく除去されたことを示した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５  ＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２９）を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイの泳動緩衝液として使用した。
【０３１６】
スクリーニングアッセイ
スクリーニングＢＩＡｃｏｒｅアッセイを、ライブラリーからＦａｂクローンの親和性を決定するために最適化した。少量の培養溶解物の上清を、５０μｌ／分で２分間かけて注入した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いた１つの指数的な解離速度（ｋｏｆｆ）の決定のためには、１０から１５分間の解離時間を使用した。ライブラリーを作成するために使用した温度と同じ範囲のｋｏｆｆ速度を示した試料（クローン８Ｌ２−６Ｄ５、ｋ０ｆｆ１×１０−３ｓ−１）を確認のために注入し、４５分までの解離時間によって良好なｋｏｆｆ値を得た。改善された（より遅い）ｋｏｆｆ値を示すクローンを大量に発現させて、全ての速度論パラメーターであるｋｏｎおよびｋｏｆｆを精製したタンパク質について決定した。このアッセイによって、およそ２倍またはそれ以上の親和性の差を検出することができた。
【０３１７】
親和性決定アッセイ
精製したＦａｂ試料の段階希釈物（０．１〜１０×推定のＫＤ）を１００μＬ／分で１分間かけて注入し、２時間までの解離時間とした。Ｆａｂタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、既知の濃度のＦａｂを標準物（アミノ酸分析によって決定した）として使用して決定した。動的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｒｏｏｓ，Ｈ．，Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９−１１０）に対して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用してデータをフィットさせることによって同時に得た。平衡解離定数（ＫＤ）値をｋｏｎ／ｋｏｆｆとして計算した。
【０３１８】
Ｂ．マウスのアンタゴニスト抗ＮＧＦ抗体９１１のヒト化および親和性成熟
マウスのアンタゴニスト抗ＮＧＦ抗体である９１１（Ｈｏｎｇｏ等（２０００），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９（３）：２１５−２２７を参照のこと）を、ヒト化および親和性成熟のために選択した。Ｍａｂ  ９１１は、ヒトおよびラットのＮＧＦに対して高い親和性で結合し、そしてニューロトロフィンＮＴ３、ＮＴ４／５、またはＢＤＮＦとは有意な交差反応性は示さない。Ｈｏｎｇｏ（同文献）を参照のこと。マウスＭａｂ  ９１１のパパインで切断したＦａｂ断片の親和性を、上記のようなＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して決定した。マウスＭａｂ  ９１１のパパインで切断したＦａｂ断片は、およそ１０ｎＭのＫＤでヒトＮＧＦに結合した。
【０３１９】
ヒト化および親和性成熟は、以下のようにいくつかの段階にわけて行った：
（１）ＣＤＲ接続鋳型の調製。抗体９１１の軽鎖の伸張型ＣＤＲ（すなわち、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ領域とＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ領域の両方を含む）を、ＪＫ２を有しているヒトの生殖系アクセプター配列Ｏ８に接続させ、抗体９１１の重鎖の伸張型ＣＤＲを、ＪＨ４を有しているヒトの生殖系アクセプター配列ＶＨ４−５９に接続させた。ヒトの生殖系のアクセプター配列のアミノ酸配列は、図１Ａおよび１Ｂに示す。アミノ酸のナンバリングは連続的である。上記に示したタンパク質フレームワークを使用して、マウスＣＤＲを有しているヒトフレームワークをコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列を設計した。これらのヒト化重鎖および軽鎖可変ドメインを、それぞれ、ｈＶＨおよびｈＶＬと呼ぶ。コドンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびハムスターでの使用法について最適になるようにした。それぞれの鎖について２つの短い隣接プライマーを有している全長のｈＶＬおよびｈＶＨにまで伸びるいくつかの重複オリゴヌクレオチド（６９〜９０塩基の長さ）を使用して、原則としてＰｒｏｄｒｏｍｏｕ等（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ５（８）：８２７−９に記載されているように、回帰ＰＣＲ（ｒｅｃｕｌｓｉｖｅ  ＰＣＲ）によって２つの遺伝子を別々に合成した。得られた正確な長さのＤＮＡ断片をゲル精製し、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の２シストロン性発現プラスミド（アンピシリン耐性）にクローニングした。抗体の発現は、Ｂａｒｂａｓ（２００１）Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＣｏｍｂ３Ｘ、ｐｇ．２．１０を参照のこと）に記載されているものと同様のＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＺプロモーターの制御下にあるが、修飾によって以下の別のドメインの付加および発現を含めた：ヒトκ軽鎖定常ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ０９１８１を参照のこと）およびＩｇＧ２ａヒト免疫グロブリンのＣＨＩ定常ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０１８５９）。
【０３２０】
８Ｌ２−４Ｄ５と呼ばれるＣＤＲ接続型抗体（「鋳型」とも呼ぶ）の可変領域のアミノ酸配列もまた、図１Ａおよび１Ｂに示す。８Ｌ２−４Ｄ５の親和性を、上記のＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して決定した。８Ｌ２−４Ｄ５は、およそ３８ｎＭのＫＤでヒトＮＧＦに結合した。
【０３２１】
（２）フレームワーク配列への点変異の導入。Ｖ７１Ｋ置換を、Ｉｎｎｉｓ等（１９９０）ＰＣＲ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されているように、組み換えＰＣＲ部位特異的突然変異誘発を使用してＣＤＲ接続重鎖の中に導入した。この置換によって、ヒトのフレームワーク残基を対応するマウスのフレームワーク残基で置き換えた。得られた抗体を８Ｌ２−６Ｄ５と呼び、８Ｌ２−６Ｄ５の重鎖可変領域のアミノ酸配列を図１Ａに示す。８Ｌ２−６Ｄ５の親和性を、上記のＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して決定した。８Ｌ２−６Ｄ５のＦａｂ断片は、およそ１５ｎＭのＫＤでヒトＮＧＦに結合した。８Ｌ２−６Ｄ５を親和性成熟のための鋳型として選択した。
【０３２２】
（３）ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２のヒト化および親和性成熟。ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２をヒト化し、そして親和性成熟させた。ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２中の、ＣＤＲの構造に必須ではないアミノ酸位置を、Ｃｈｏｔｈｉａの基準構造（Ａｌ−Ｌａｚａｋａｎｉ等（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３（４）：９２７−４８を参照のこと）に基づいて同定し；以下のようにランダムにした。表２に示した軽鎖の変異または重鎖の変異を含む２つのライブラリーを調製し、それぞれ、Ｂａｌｉｎｔ等，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９−１８に記載されているドーピングコドンを使用して、Ｋａｙ等（１９９６），Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されているように、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲカセット突然変異誘発を使用して接続型（マウス）ＣＤＲ  Ｌ３またはＣＤＲ  Ｈ３とした。一般的には、アミノ酸残基を、抗体９１１の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列の、ヒトの生殖系の抗体配列とのアラインメントに基づいて、ヒト抗体においてより一般的である残基に変更した。メチオニンであるＣＤＲ  Ｈ２の残基５０を除いて野生型である（置換されていない）アミノ酸残基もまた、ライブラリー中に提示した。ここでは、野生型のメチオニンはライブラリー中には提示されなかった。メチオニン残基は酸化される；したがって、この残基の置換は、得られる抗体の安定性を改善すると予想した。Ｆａｂのライブラリーを、上記のベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ＋ヒトＣＨ１およびＣκ領域にクローニングした。
【０３２３】
【表２】
2006525955.tif 000003
親和性スクリーニング実験のために、それぞれのライブラリーをさらに、対応するＣＤＲ接続型軽鎖または重鎖と対合させ（例えば、Ｈ１／Ｈ２ライブラリーをＣＤＲ接続型軽鎖と対合させた）、抗体を発現させ、個々のクローンのヒトＮＧＦに対する親和性を、製造業者の説明書に従い、上記のようにＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｗａｙ  ＮＪ）を使用してスクリーニングした。ｋｏｆｆ、Ｋｏｎ、およびＫＤを決定した。抗体クローンをｋｏｆｆ速度に基づいてランク分けした。なぜなら、通常、親和性のほとんどのバリエーションはＫｏｆｆ速度において見られるからであり、さらには、ｋｏｆｆ速度は抗体濃度とは無関係であるからである。
【０３２４】
結合したクローンの配列を決定し、結合したクローンの配列を表３に示す
【０３２５】
【表３】
2006525955.tif 000004
2006525955.tif 000005
2006525955.tif 000006
以下の置換を含むＣＤＲは結合を保持した：
ＣＤＲ−Ｈ１
Ｉ３４：Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＡは結合した。
【０３２６】
Ｎ３５：Ｎ、Ｔ、およびＳは結合した。
【０３２７】
ＣＤＲ−Ｈ２
Ｍ５０：Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｌは結合した。
【０３２８】
Ａ６２：ＡおよびＳは結合した。
【０３２９】
Ｌ６３：ＬおよびＶは結合した。
【０３３０】
ＣＤＲ−Ｌ１
Ｓ２６：ＳおよびＦは結合した。
【０３３１】
Ｄ２８：Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｙは結合した。
【０３３２】
Ｈ３２：Ｈ、Ｎ、Ｑは結合した。
【０３３３】
ＣＤＲ−Ｌ２
Ｙ５０：Ｙは結合した。
【０３３４】
Ｉ５１：Ｉ、Ｔ、Ｖ、Ａは結合した。
【０３３５】
Ｆ５４：Ｆは結合した。
【０３３６】
Ｓ５６：ＳおよびＴは結合した。
【０３３７】
以下の置換を含むＣＤＲを、結合親和性に基づいて一般的に選択し、単一のクローンとなるように組み合わせ、これをＨ１９−Ｌ１２９と呼ぶ：
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｉ３４Ｌ；Ｎ３５Ｎ（変化なし）
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｍ５０Ｉ；Ａ６２Ａ（変化なし）；Ｌ６３Ｖ
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｓ２６Ｓ（変化なし）；Ｄ２８Ｓ；Ｈ３２Ｎ
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｙ５０Ｙ（変化なし）；Ｉ５１Ｔ；Ｆ５４Ｆ（変化なし）；Ｓ５６Ｓ（変化なし）。
【０３３８】
これらの変異を組み合わせて（ＰＣＲによってＨ鎖とＬ鎖を増幅し、ＰＣＲ産物とベクター（ｐＲＮ８）を制限酵素で切断し、３つの断片の連結を行うことにより）、１つのクローンとし、これをＨ１９−Ｌ１２９と呼ぶ。これには、接続型のＨ３およびＬ３  ＣＤＲも含まれる。Ｈ１９−Ｌ１２９の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列は、図１Ａおよび１Ｂに示す。表４は、ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２のアミノ酸配列を示す。Ｈ１９−Ｌ１２９は、本明細書中に記載したＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して決定すると、およそ１ｎＭのＫＤでＮＧＦに結合した。
【０３３９】
【表４】
2006525955.tif 000007
（４）Ｈ３およびＬ３  ＣＤＲの親和性成熟。Ｈ３およびＬ３  ＣＤＲの親和性成熟を、２段階で行った。最初に、「ライブラリースキャン突然変異誘発」と呼ばれるプロセスにおいて、Ｈ３およびＬ３中のそれぞれのアミノ酸残基を、その位置での変異によってヒトＮＧＦに対して増大した結合親和性を生じるアミノ酸位置を同定するために、個々に事前にスクリーニングした。ライブラリースキャン突然変異誘発（「小さいライブラリーのランダム化分析とも呼ばれる）の結果に基づいて、Ｈ３およびＬ３のアミノ酸位置のサブセットを、親和性成熟ライブラリーの調製のために選択し、親和性成熟ライブラリーを、本明細書中に記載したＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用してヒトＮＧＦに対する親和性についてスクリーニングした。これらの技術が広く適用できることは明らかである。
【０３４０】
（ａ）ライブラリースキャン突然変異誘発
Ｈ３  ＣＤＲおよびＬ３  ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸位置を、ヒトＮＧＦに対して増大した結合親和性を生じる置換について、個々に事前にスクリーニングした。任意の所定の位置において改善された結合、同じ結合、低下した結合を生じるか、または結合しないアミノ酸置換の頻度により、多くの異なるアミノ酸（２０個の全てのアミノ酸を含む）に変化させることができるＣＤＲ中の位置、および変化させることができないか、または数個のアミノ酸にしか変化させることができないＣＤＲ中の位置に関する情報が得られた。増大した結合親和性を生じるアミノ酸置換もまた同定した。これらのスクリーニングの結果に基づいて、ＣＤＲ  Ｈ３およびＣＤＲ  Ｌ３中のアミノ酸位置のサブセットを、親和性成熟ライブラリーの調製のために選択した。
【０３４１】
Ｌ３  ＣＤＲおよびＨ３  ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸を、２０個の全てのアミノ酸になるように、１つずつランダムにした個々のＦａｂライブラリーを調製し、これによっていくつか（軽鎖については５個のライブラリー、および重鎖については１３個のライブラリー）の小さいライブラリーを得た。それぞれは、各アミノ酸位置において２０アミノ酸の可能性の複雑さを有する。全ての場合において、自然界に存在している（変化させていない）アミノ酸もライブラリー中に存在させた。ライブラリーを、ドーピングコドンＮＮＫを使用して、Ｋａｙ等（１９９６），Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されている縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＴカセット突然変異誘発によって、１つのアミノ酸位置についてランダムにして２０個の可能なアミノ酸を含むように調製した。８Ｌ２−６Ｄ５（ＣＤＲ接続型抗体、フレームワーク変異Ｖ７１Ｋを有している）を、ライブラリーの構築のための鋳型とした。なぜなら、ＣＤＲ接続型抗体の低い親和性によって、スクリーニングの間にＨ３変異体およびＬ３変異体における親和性の差を容易に検出できるからである。したがって、ライブラリーの各メンバーには、１つのアミノ酸置換を有しているＣＤＲ３（Ｈ３またはＬ３のいずれか）と５つの接続させられたＣＤＲを含めた。
【０３４２】
それぞれの小さいライブラリーに由来する２０〜８０個のクローンを、本明細書中に記載したＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用してスクリーニングした。試料を、ＢＩＡｃｏｒｅによって、ＢＩＡｃｏｒｅチップの１つのチャンネルの中でＮＧＦに対する結合親和性について、およびセンサーチップの別のチャンネルにおいては５ｈｉｓタグ抗体に対する結合によってＦａｂの存在について同時に分析して、重鎖のＣ末端のｈｉｓタグを検出した。発現されたタンパク質を同じ親和性、低下した親和性、良好な親和性を有するか、または結合しないとして、分類用のｋｏｆｆを使用して分類した。この分析の結果を表５に示す。
【０３４３】
【表５】
2006525955.tif 000008
親和性が改善された全てのクローンの配列を決定した。これにより、親和性の増大を生じたアミノ酸置換の頻度および実体が明らかになった。さらに、置換によって必ずしも結合親和性が増大しない場合であってもなお、所定の位置で許可されたアミノ酸置換であることを確認するために、８Ｌ２−６Ｄ５クローンと同様の親和性を保持していたいくつかのクローンをそれぞれのライブラリーから選択した。この分析の結果を表６にまとめる。
【０３４４】
【表６】
2006525955.tif 000009
いくつかの変異体は高い結合親和性を生じた。少なくとも以下の変異によって、８Ｌ２−６Ｄ５鋳型と比較して、明らかに高い結合親和性が生じた（Ｈ＿Ｙ１０１Ｗ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＷＹＧＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号４６））；Ｈ＿Ｓ１０５Ａ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＧＴＡＹＹＦＤＹ（配列番号４７））；Ｈ＿Ｓ１０５Ｔ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＧＴＴＹＹＦＤＹ（配列番号４８））；Ｈ＿Ｇ１０３Ａ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＡＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号４９））；およびＬ＿Ｓ９１Ｅ（ＣＤＲ配列番号ＱＱＥＫＴＬＰＹＴ（配列番号５０））。
【０３４５】
これらの実験結果を使用して、親和性成熟ライブラリーを作成するためのアミノ酸位置の選択の指針とした。
【０３４６】
この実験によっては、また、表５に示したように、改善された結合、同程度の結合、低下した結合を生じたか、または結合しなかった任意の所定の位置でのアミノ酸置換の頻度に関する情報も提供された。この情報により、多くの異なるアミノ酸（２０個の全てのアミノ酸を含む）に変化させることができるＣＤＲ中のアミノ酸位置、および数個のアミノ酸または極少数のアミノ酸にしか変化させることができない（いくつかの実施形態においては、いずれのアミノ酸にも変化させることができない）ＣＤＲ中の位置の同定が可能になった。これらの結果もまた、結合親和性を増大させるアミノ酸置換を明らかにした。
【０３４７】
（ｂ）親和性成熟
次に、小さいライブラリーのランダム化分析（上記）の結果を使用して、Ｈ３  ＣＤＲおよびＬ３  ＣＤＲの親和性成熟のためのＨ３およびＬ３ライブラリーを生産するために残基を選択した。ＣＤＲ  Ｈ３の残基Ｙ１０１およびＧ１０３、ならびにＣＤＲ  Ｌ３の残基Ｓ９１およびＫ９２を、Ｈ３  ＣＤＲおよびＬ３  ＣＤＲの親和性成熟のためのＨ３およびＬ３ライブラリーを生産するために選択した。
【０３４８】
このライブラリーは、ＣＤＲ接続型クローン８Ｌ２−６Ｄ５においては同時に、そしてＨ１９−Ｌ１２９の骨格中では別々に、Ｈ３およびＬ３中の突然変異を持ち合わせており、８０個の異なるクローンの多様性を有している。表７は、置換のために選択したアミノ酸残基と、それぞれの位置で置換したアミノ酸を示す。
【０３４９】
【表７】
2006525955.tif 000010
それぞれのポリペプチドをＦａｂとして発現させ、９６個の個々のクローンのヒトＮＧＦに対する親和性を、製造業者の説明書に従って、上記のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用してそれぞれのライブラリーについてスクリーニングした。この分析の結果を表８に示す。
【０３５０】
【表８】
2006525955.tif 000011
2006525955.tif 000012
結合親和性に基づいて、最良のクローンであるＥ３（同義的に「３Ｅ」とも呼ばれる）および３Ｃをさらなる特徴付けのために選択した。Ｅ３には、以下のＣＤＲ置換：ＣＤＲ−Ｈ３：Ｙ１０１Ｗ、Ｇ１０３Ａ；およびＣＤＲ−Ｌ３：Ｓ９１Ｅ、Ｋ９２Ｈが含まれる。これらは、単一のクローンの中に組み合わせられており、これにはまた、以下のＬ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２変異も含まれる：
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｉ３４Ｌ；
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｍ５０Ｉ；Ｌ６３Ｖ；
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｄ２８Ｓ；Ｈ３２Ｎ；
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｉ５１Ｔ。
【０３５１】
Ｅ３の重鎖および軽鎖の可変領域の配列は、１Ａおよび１Ｂに示されている。３Ｃには、以下のＣＤＲ置換：ＣＤＲ−Ｌ３：Ｓ９１Ｅ；Ｋ９２Ｒ；ＣＤＲ−Ｈ３：Ｙ１０１Ｗ；Ｇ１０３Ａが含まれてる。これらは、単一のクローンの中に組み合わせられており、これにはまた、クローン３Ｅについて記載されたＬ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２変異も含まれている。
【０３５２】
３Ｅおよび３Ｃの配列を、Ｆａｂおよび抗体全体の生産のために哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡまたはプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。純粋なタンパク質をアミノ酸分析によって正確に定量した。
【０３５３】
Ｆａｂ  Ｅ３およびＦａｂ  ３ＣのヒトＮＧＦに対する結合親和性を、１００ＲＵのＮＧＦを再結合作用を防ぐためにチップ上で使用したことを除いて、製造業者の説明書にしたがって上記のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して測定した。簡単に言うと、いくつかの濃度の抗体（Ｆａｂ）を、１００ＲＵのヒトＮＧＦをその上に固定したＣＭ５チップ上に２分間かけて注入し、１８００秒かけて解離させた。マウス抗体９１１（Ｆａｂ）を対照として分析した。データを製造業者の説明書にしたがってＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して分析した。抗体Ｅ３および９１１の分析の結果を図９および１０に示す。Ｅ３は、およそ０．０７ｎＭのＫＤでヒトＮＧＦに結合した（約６．０ｅ５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ、および約４．２ｅ−５ｓ−１のｋｏｆｆを有した）。３Ｃは、およそ０．３５ｎＭのＫＤでヒトＮＧＦに結合した（約１．４Ｅ−５のｋｏｆｆを有した）。対照的に、マウス抗体９１１は、３．７ｎＭのＫＤ、８．４×１０−５ｓ−１のｋｏｆｆ、および２．２×１０４Ｍｓ−１のｋｏｎでＮＧＦに結合した。
【０３５４】
抗体Ｅ３（同義的に３Ｅとも呼ばれる）を、高い結合親和性に基づいてさらなる分析のために選択した。ＮＧＦのＮＧＦ受容体であるｔｒｋＡおよびｐ７５との相互作用を妨げるＥ３の能力を試験するために、２．５ｎＭのヒトＮＧＦを０〜５０ｎＭの抗体Ｅ３（Ｆａｂ）と予め混合し、１時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を２６０ＲＵのｐ７５（チャンネル２）および６００ＲＵのｔｒｋＡ（チャンネル３）を含むＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ上に１０μｌ／分で注入し、結合の割合（％）を決定した。この分析の結果を図１１に示す。高濃度のＦａｂ  Ｅ３は、シグナルの低下によって示される（ＲＵについて測定した）ように、ｐ７５とｔｒｋＡの両方とのＮＧＦの相互作用をブロックした。このことは、Ｆａｂ  Ｅ３がｔｒｋＡとｐ７５の両方とのヒトＮＧＦの相互作用をブロックすることを示している。抗体Ｅ３（Ｆａｂ）濃度がＮＧＦ濃度と等しい（約２．５ｎＭのＮＧＦ濃度で）場合には、ＮＧＦの結合は観察されなかった（ゼロのシグナルによって示される）。ＮＧＦの濃度が抗体３Ｅの濃度と等しい場合に起こるゼロパーセントのＮＧＦ−受容体結合は、２．５ｎＭのＮＧＦが、ＮＧＦについてのＥ３のＫＤよりも少なくとも１０倍高く、平衡状態にあることを示唆している。
【０３５５】
（実施例２）
マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存性アッセイを用いた抗ＮＧＦ抗体のＮＧＦブロック能力の評価
Ｆａｂ  Ｅ３または抗体Ｅ３全体のＮＧＦ活性をブロックする能力を、生体外でのマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を阻害する抗体の能力の測定によって評価した。三叉神経ガングリオンは、顔の領域に神経を分布させる皮膚の感覚ニューロンから構成される。マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存性は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のＮＧＦをブロックする活性を評価するための感度の高いアッセイである。なぜなら、ＮＧＦはこれらのニューロンの生存性をサポートするために必要であるからである。例えば、ＮＧＦの飽和濃度では、生存性は培養物中で４８時間まで１００％に近い。対照的に、ＮＧＦが存在しない場合には、４８時間までのニューロンの生存性は５％に満たない。
【０３５６】
生存性アッセイは以下のように行った：交尾した（ｔｉｍｅ−ｍａｔｅｄ）妊娠しているＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ雌性マウスを、ＣＯ２の吸入によって安楽死させた。子宮角を取り出し、胚段階のＥ１３．５の胚を摘出し、その頭部を切り落とした。三叉神経ガングリオンを、電解によって研いだタングステン針を使用して解剖した。その後、ガングリオンをトリプシン処理し、機械によって解離させ、ポリ−Ｌ−オルニチンとラミニンでコーティングした９６ウェルプレート中の定義された血清を含まない培地中に１ウェルあたり２００〜３００細胞の密度でプレートした。
【０３５７】
抗ＮＧＦ  Ｆａｂまたは抗体のブロッキング活性を、抗ＮＧＦ抗体Ｍａｂ  ９１１（Ｆａｂ）、８Ｌ２−６Ｄ５；Ｈ１９−Ｌ１２９；Ｅ３および３Ｃ；ならびにヒトまたはラットのＮＧＦの種々の用量を、以下の濃度で三叉神経ニューロンに対して添加することによって評価した：０．４ｎｇ／ｍｌ（約１５ｐＭ；この濃度は、生存性のためのＮＧＦの飽和濃度を示す）および０．０４ｎｇ／ｍｌ（約１．５ｐＭ；この濃度はほぼＩＣ５０である）。培養物中で４８時間の後、細胞を、以下のようにＢｉｏｍｅｋ  ＦＸ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で行った自動免疫細胞化学プロトコールに供した：４％のホルムアルデヒド、５％のスクロース、およびＰＢＳを使用した固定；ＰＢＳ中の０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した透過化；ＰＢＳ中の５％の正常なヤギ血清、０．１１％のＢＳＡを使用した非特異的結合部位のブロック；ならびにニューロンを検出するための一次抗体および二次抗体との連続的なインキュベーション。一次抗体は、タンパク質遺伝子産物８９．５（ＰＧＰ９．５，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（確立されているニューロンの表現形マーカー）に対するウサギポリクローナル抗体である。二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であり、培養物中に存在する全ての細胞の核を標識するために核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に使用した。画像の獲得と画像分析は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−Ｉ／ＧｅｎＩＩ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で行った。画像は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２についての２つの波長で自動的に獲得し、核染色をＩｍａｇｅｒの画像に基づく自動焦点システムの標点として使用した。なぜなら、核染色は全てのウェル中に存在するからである。適切な倍率、およびウェルあたりの撮影する部位の数を選択して、それぞれのウェルの表面全体をカバーできるようにした。自動画像分析を、抗ＰＧＰ９．５抗体でのそれら特異的な染色に基づいて、培養物中での４８時間後にそれぞれのウェル中に存在するニューロンの数をカウントするように設定した。画像の注意深い閾値化、ならびに形態および蛍光強度に基づく選択フィルターの適用によって、ウェルあたりのニューロンの正確な数を得た。
【０３５８】
この実験の結果は、Ｆａｂ  Ｅ３が高い親和性を有してＮＧＦ活性をブロックしたことを明らかにした。結果を、図４〜６、および表９に示す。
【０３５９】
図４は、種々の濃度のヒトＮＧＦおよびラットＮＧＦの存在下でのＥ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を示すグラフである。
【０３６０】
図５は、０．０４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（およそ１．５ｐＭ；下のパネルに示す）または０．４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（およそ１５ｐＭ；上のパネルに示す）のいずれかの存在下での種々のＦａｂのＮＧＦブロック効果を比較するグラフである。１．５ｐＭのＮＧＦは生存性を促進するＮＧＦのほぼＥＣ５０であり、一方、１５ｐＭはＮＧＦの飽和濃度を示す。種々の濃度のＦａｂ  Ｅ３；マウス９１１  Ｆａｂ；およびＦａｂ  Ｈ１９−Ｌ１２９、ならびにＦａｂ  ８Ｌ２−６Ｄ５中でのＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存性を上記のように評価した。ＩＣ５０（ｐＭ）をそれぞれの濃度で各Ｆａｂについて計算した。これを表９に示す。Ｆａｂ  Ｅ３は、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存性を強くブロックし、１５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下ではＩＣ５０はおよそ２１ｐＭのＩＣ５０、１．５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下ではＩＣ５０はおよそ１．２ｐＭであった。Ｆａｂ  ３ＣおよびＨ１９−Ｌ１２９もまた、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存性を強くブロックした。
【０３６１】
図６は、０．０４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（およそ１．５ｐＭ；下のパネルに示す）または０．４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（およそ１５ｐＭ；上のパネルに示す）のいずれかの存在下での種々のＦａｂのＮＧＦブロック効果を比較するグラフである。１．５ｐＭのＮＧＦはほぼＥＣ５０であり、一方、１５ｐＭはＮＧＦの飽和濃度を示す。種々の濃度のＦａｂ  Ｅ３；マウスＦａｂ  ９１１；ならびにＦａｂ  Ｈ１９−Ｌ１２９、および８Ｌ２−６Ｄ５中でのＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存性を上記のように評価した。ＩＣ５０（ｐＭ）をそれぞれの濃度で各Ｆａｂについて計算した。これを表９に示す。Ｆａｂ  Ｅ３は、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存性を強くブロックし、１５ｐＭのラットＮＧＦの存在下ではＩＣ５０はおよそ３１．６ｐＭ、１．５ｐＭのラットＮＧＦの存在下ではＩＣ５０はおよそ１．３ｐＭであった。Ｆａｂ  ３ＣおよびＨ１９−Ｌ１２９もまた、ラットＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存性を強くブロックした。
【０３６２】
【表９】
2006525955.tif 000013
種々の実験において、本発明者らは、０．４ｎｇ／ｍｌ（飽和濃度）のヒトＮＧＦの存在下でＥ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を阻害する、抗体Ｅ３全体およびＦａｂ  ３Ｅの能力を比較した。分析の結果を図１２に示す。抗体Ｅ３全体、およびＦａｂ  ３Ｅは、抗体全体およびＦａｂの濃度をＮＧＦ結合部位の数に対して標準化した場合には、同様のレベルの三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性の阻害を示した（Ｆａｂは１つの結合部位を有し、抗体全体は２つの結合部位を有する）。これらの結果は、ＮＧＦ二量体に対しては、抗体全体の結合による親和力の作用はないことを示している。
【０３６３】
別の実験において、本発明者らは、種々の濃度（２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４、０．００１２８、および０．０ｎＭ）の抗体Ｅ３、抗体９１１、およびｔｒｋＡ受容体免疫付着因子（免疫グロブリンＦｃドメインであるＣＨ２−ＣＨ３と融合させたＮＧＦ受容体ｔｒｋＡの細胞外ドメインからなる）の、０．４ｎｇ／ｍｌ（飽和濃度）の存在下でＥ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を阻害する能力を比較した。これらの結果を図１３に示す。これらの結果は、抗体Ｅ３が、抗体９１１またはｔｒｋ免疫付着因子のいずれよりも良好にＮＧＦをブロックすることを明らかにした。
【０３６４】
（実施例３）
マウス三叉神経の生存性アッセイおよび結節ニューロンの生存性アッセイを用いた抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の特異性の評価
ＮＧＦ活性を特異的にブロックする抗体Ｅ３の能力を、飽和濃度のＮＧＦ、ＮＧＦに関係しているニュートロフィンＮＴ３、またはＮＧＦとは無関係な神経栄養因子、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）の存在下で、生体外でのマウスＥ１７／１８三叉神経ニューロンの生存性を阻害する抗体の能力の測定によって評価した。マウスＥ１７／１８三叉神経ニューロンの生存性は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のＮＧＦブロック活性を評価するための感度の高いアッセイである。なぜなら、ＮＧＦはＥ１３．５  ＴＧニューロンの生存性をサポートするために必要なＮＧＦのレベルよりも高い濃度を、これらのニューロンの生存性をサポートするために必要とするからである。これらのニューロンの生存性はまた、ＮＴ３またはＭＳＰによってもサポートされ、したがって、これらのニューロンの生存性はまた、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体がＮＴ３またはＭＳＰをもまたブロックするかどうかを評価するための感度の高いアッセイでもある。
【０３６５】
ＮＧＦ活性を特異的にブロックする抗体Ｅ３の能力をまた、飽和濃度のＢＤＮＦまたはＮＴ４／５の存在下でのマウスの結節Ｅ１７ニューロンの生存性を阻害する抗体の能力の測定によって評価した。結節ニューロンの生存性は、ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５によってサポートされ、したがって、これらのニューロンの生存性は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体のＢＤＮＦまたはＮＴ４／５をブロックする能力を評価するための感度の高いアッセイである。
【０３６６】
生存性アッセイは以下のように行った：交尾した（ｔｉｍｅ−ｍａｔｅｄ）妊娠しているＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ雌性マウスを、ＣＯ２の吸入によって安楽死させた。子宮角を取り出し、胚（１７日目または１８日目の胚）を摘出し、その頭部を切り落とした。三叉神経ガングリオンおよび結節ガングリオンを、解剖し、洗浄した。その後、ガングリオンをトリプシン処理し、機械によって解離させ、ポリ−Ｌ−オルニチンとラミニンでコーティングした４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の定義された血清を含まない培地中に１ウェルあたり１００〜３００細胞の密度でプレートした。
【０３６７】
Ｅ１７／１８三叉神経ニューロンを、新経栄養因子を加えずに（陰性対照）、または飽和濃度のヒトＮＧＦ（４００ｐＭおよび１５ｐＭ）（陽性対照）；ＮＴ３（４００ｐＭ）；またはＭＳＰ（６００ｐＭ）の存在下のいずれかで成長させた。種々の濃度のＥ３および９１１  Ｆａｂおよび抗体全体を含む２連の培養物を準備した。Ｆａｂおよび抗体全体の濃度は、結合部位について示す（例えば、抗体全体は２つの結合部位を含み、一方、Ｆａｂは１つの結合部位を含む）。
【０３６８】
Ｅ１７結節ニューロンを、新経栄養因子を加えずに（陰性対照）、または飽和濃度のＢＤＮＦ（４００ｐＭ）（陽性対照）またはＮＴ４／５（４００ｐＭ）、またはＮＧＦとは無関係な成長因子ＩＬＦ（インターロイキン阻害因子）の存在下のいずれかで成長させた。高濃度のニューロトロフィンを、抗体の特異性を試験するための本実験の目的として使用した。再び、抗体Ｅ３および９１１を含まない、およびそれらを添加したことの変化を含ませた２連の培養物を準備した。培養物中で４８時間のあと、各条件下のそれぞれのウェル中で生存しているニューロンの総数を、位相差顕微鏡を使用して手作業でカウントすることによって確認した。
【０３６９】
これらの実験の結果は、Ｅ３と９１１抗体が、Ｅ１８三叉神経ニューロンに対するＮＧＦの生存性を促進する作用を完全にブロックしたことを明らかにした。対照的に、Ｅ３および９１１抗体は、ＮＴ３またはＭＳＰによって促進される三叉神経ニューロンの生存性、あるいは、ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５またはＬＩＦによって促進される結節ニューロンの生存性に対しては全く効果はなかった。これらの結果は、抗体Ｅ３がＮＧＦについて選択的特異性を有していることを明らかにした。なぜなら、ＮＧＦをブロックするために有効な濃度よりも１０００倍から１０，０００倍高い濃度では、これらの抗体と他のＮＧＦに関係しているニュートロフィン（ＮＴ３、ＮＴ４／５、ＢＤＮＦ）との間には相互作用は検出されなかったからである。さらに、これらの結果は、抗体またはＦａｂ  Ｅ３を添加した際に、ＮＧＦ依存性ニューロンのＮＧＦを補充した培養物中で見られる神経細胞死は、これらの抗体とＮＧＦとの間での特異的相互作用に原因があり、一般的な毒性作用が原因ではないことを明らかにした。マウス抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１についてもまた試験し、同様の結果が観察された。使用したニューロトロフィンが高濃度だったことに起因して、抗体Ｅ３および９１１の両方がそれらの滴定状態に非常に近づき、ＮＧＦに対するこれらの抗体の結合親和性の差がこれらの条件下ではあまり明らかにはならなかったことが原因で、同様のレベルでＮＧＦに結合したと予想されたことに留意すべきである。
【０３７０】
これらの実験の結果を図１４、１５、１６、および１７に示す。データは、各実験についての陽性対照において観察された生存性（例えば、それぞれ、飽和ＮＧＦ濃度の存在下で成長させた三叉神経ニューロンの１００％の生存性、および飽和ＢＤＮＦ濃度の存在下で成長させた結節ニューロンの１００％の生存性）と比較した、４８時間の培養後の生存性の平均の割合を示す（±平均の標準誤差、それぞれのデータ点についてｎ＝３）。図１４〜１５は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３またはＦａｂ  Ｅ３が、２００ｎＭのような高い抗体濃度でもなお、ＮＴ３およびＭＳＰによって促進される生存性を阻害しなかったことを示すグラフである。対照的に、２０ｎＭの抗体Ｅ３またはＦａｂ  ３Ｅ、およびＦａｂ  ９１１は、ＮＧＦによって誘発される生存性を完全にブロックした。マウスの抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１もまた試験し、同様の結果が観察された。具体的には、図１４は、種々の濃度（２０ｎＭ、２ｎＭ、または０．２ｎＭ）のＥ３  Ｆａｂ（図中では「３Ｅ」と表示される）およびマウス抗体９１１  Ｆａｂの、ニュートロフィンを加えずに（「対照」と表示される）、４００ｐＭのＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭ」と表示される）、１０ｎＭのＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭ」と表示される）、または６００ｐＭのＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭ」と表示される）の存在下でのＥ１８三叉神経ニューロンの生存性に対する効果の比較を示すグラフである。図１５は、種々の濃度（２００ｎＭおよび８０ｎＭ）のＥ３  Ｆａｂおよび抗体全体、ならびにマウス抗体９１１抗体全体およびＦａｂの、ニュートロフィンを加えずに（「因子なし」と表示される）、４００ｐＭのＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭ」と表示される）、１０ｎＭのＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭ」と表示される）、または６００ｐＭのＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭ」と表示される）の存在下でのＥ１７三叉神経ニューロンの生存性に対する効果の比較を示すグラフである。
【０３７１】
図１６〜１７は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３またはＦａｂ  Ｅ３は、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５、またはＬＩＦによって促進されるＥ１７結節ニューロンの生存性を阻害しなかったことを示すグラフである。マウス抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１もまた試験し、同様の結果を観察した。具体的には、図１６は、種々の濃度（２００ｎＭおよび８０ｎＭ）の抗体Ｅ３全体（図中では「３Ｅ」と表示される）、Ｆａｂ  ３Ｅ、抗体９１１全体、またはＦａｂ  ９１１の、ニュートロフィンを加えずに（「因子なし」と表示される）、４００ｐＭのＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭ」と表示される）、４００ｐＭのＮＴ４／５（「ＮＦ４／５−４００ｐＭ」と表示される）、または２．５ｎＭのＬＩＦ（「ＬＩＦ−２．５ｎＭ」と表示される）の存在下での、Ｅ１７結節ニューロンの生存性に対する効果の比較を示すグラフである。図１７は、種々の濃度（２００ｎＭ、２０ｎＭおよび２ｎＭ）のＦａｂ  ３Ｅ（図中では「３Ｅ」と表示される）またはＦａｂ  ９１１の、ニュートロフィンを加えずに（「対照」と表示される）、４００ｐＭのＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭ」と表示される）、４００ｐＭのＮＴ４／５（「ＮＦ４／５−４００ｐＭ」と表示される）、または２．５ｎＭのＬＩＦ（「ＬＩＦ−２．５ｎＭ」と表示される）の存在下でのＥ１７結節ニューロンの生存性に対する効果の比較を示すグラフである。
【０３７２】
（実施例４）
哺乳動物発現ベクターの調製および哺乳動物細胞中での抗体Ｅ３の発現
哺乳動物細胞中での抗体Ｅ３の発現における使用のために、３つの哺乳動物発現ベクターを設計し、構築した。
【０３７３】
ベクターＤｂ．９１１．３Ｅは、Ｅ３抗体の重鎖可変領域とヒトＩｇＧ２ａ定常領域を含む発現ベクターであり、重鎖の一時的または安定な発現に適している。Ｄｂ．９１１．３Ｅは以下の領域に対応するヌクレオチド配列から構成される：マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）；合成のイントロン（ヌクレオチド６１９〜１５０７）；ＤＨＦＲコード領域（ヌクレオチド７０７〜１２６７）；ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１５２５〜１６０２）；抗体３Ｅ重鎖可変領域（ヌクレオチド１６０３〜１９６５）；以下の変異を含むヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に関するアミノ酸のナンバリング；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照のこと）；ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド２９７４〜３２１７）；ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド３２１８〜３４６３）；ファージｆ１領域（ヌクレオチド３５５１〜４００６）、およびβラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド４４４３〜５３００）。Ｄｂ．９１１．３Ｅは２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４８９５が与えられた。
【０３７４】
ベクターＥｂ．９１１．３Ｅは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域とヒトκ鎖定常領域を含む発現ベクターであり、軽鎖の一時的な発現に適している。Ｅｂ．９１１．３Ｅは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列から構成される：マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）；ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１９〜１１４２）；ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１１７３〜１１５０）；抗体Ｅ３軽鎖可変領域（ヌクレオチド１２５１〜１５７１）；ヒトκ鎖定常領域（ヌクレオチド１５７２〜１８９２）；ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１９１０〜２１５３）；ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド２１５４〜２３９９）；ファージｆ１領域（ヌクレオチド２４８７〜２９４２）、およびβラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド３３７９〜４２３６）。Ｅｂ．９１１．３Ｅは２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４８９３が与えられた。
【０３７５】
ベクターＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域とヒトκ定常領域を含む発現ベクターであり、軽鎖の安定な発現に適している。Ｅｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列から構成される：マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）；ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１９〜１７５８）；ｐａｃ遺伝子（ピューロマイシンＲ）コード領域（ヌクレオチド７３９〜１２３５）；ヒトｈｓｐ７０の５’ＵＴＲ領域（ヌクレオチド１７７１〜１９７３）；ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１９８５〜２０６２）；抗体Ｅ３軽鎖可変領域（ヌクレオチド２０６３〜２３８３）；ヒトκ鎖定常領域（ヌクレオチド２３８４〜２７０４）；ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド２７２２〜２９６５）；ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド２９６６〜３２１１）；ファージｆ１領域（ヌクレオチド３２９９〜３６５４）、およびβラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド４１９１〜５０４８）。Ｅｂ．ｐｕｒ．９１１．Ｅ３は２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４８９４が与えられた。
【０３７６】
一時的な細胞発現を以下のように行った：１５０ｍｍの皿の中のＣＨＯおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２５μｇの各プラスミド（すなわち、重鎖を含む１つのプラスミド、および軽鎖を含む１つのプラスミド）で一時的に同時にトランスフェクトした。ＤＮＡを製造業者の説明書にしたがって１００μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。ＤＮＡ−脂質複合体を、血清または抗生物質を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で５時間、細胞と接触させた。このインキュベーションの後、２日間、培地を添加物を全く含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと、発現のために交換した。抗体を含む細胞上清を４回まで連続して回収し、その後培地を置き換えた。上清をＭａｐＳｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７−５１９９−０２）を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。抗体を、０．３Ｍのグリシン、０．６ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８）中でプロテインＡ樹脂に結合させ、その後、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３）で溶出させた。抗体を含む画分を１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で直ちに中和した。その後、抗体画分をＰＢＳ中で透析し、濃縮した。
【０３７７】
（実施例５）
抗ＮＧＦ抗体Ｅ３は外科手術後の痛みの処置に有効である
本発明者らは、抗体Ｅ３での治効を評価するために、外科手術後の痛みを再現する痛みのモデルを使用した。抗体Ｅ３は、以下の変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２ａ配列に関するアミノ酸のナンバリング；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４を参照のこと）を含むヒトの重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域；ヒトの軽鎖κ定常領域；ならびに、表１Ａおよび１Ｂに示した重鎖および軽鎖可変領域から構成される。
【０３７８】
動物。２２０〜２４０ｇの間の体重の雄性のＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットをＨａｒｌａｎ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から購入し、外科手術の前に１週間、動物施設に順応させた。
【０３７９】
外科手術。外科手術は、Ｂｒｅｎｎａｎ等，Ｐａｉｎ  ６４：４９３−５０１（１９９６）に記載されている手順に従った。動物を、空気混合中の２％のイソフルランで麻酔し、これは、ノーズコーンを通じて外科手術の間維持した。右後足の足底面を、ポビドンヨードパッドを用いて準備し、１ｃｍの中心の長さの切開を、皮膚と筋膜を貫通するように行い、これは、踵の端から０．５ｃｍで開始してつま先に向かって延ばした。測定を、屈曲位に保った足に定規を用いて行った。足底筋を曲線状の鉗子を使用して持ち上げ、縦方向に切開した。筋肉を、基点から差し込み部分までの間、その深さを貫通するように切開した。出血は、ガーゼパッドを通じて圧迫することによって、外科手術の間中、コントロールした。創傷は、２本の刺し縫い縫合（５−０エチロンブラックモノフィラメント糸）で閉じた。これらの縫合糸は５〜６回結び、最初の結び目はゆるく結んだ。創傷部位をバシトラシン溶液で消毒した。動物を回復させ、行動試験を開始する前に２時間以上、清潔なケージの中で休ませた。
【０３８０】
安静時の痛みの評価。累積的な痛みのスコアを、体重負荷に関係する痛みを評価するために使用した。動物を、土台を高くした（ｈ：１８’’）清潔なプラスチックのケージの中のプラスチックメッシュ（格子：８ｍｍ２）の上におき、彼らの前足の底面を検診した。２０分の環境順応時間の後、体重負荷を０から２のスケールで評価した。０のスコアは、前足が白くなっていたか、またはメッシュに対して押し付けられていた場合に与え、これは完全な体重負荷を示している。１のスコアは、前足が、メッシュにちょうど触れている皮膚をかばっており、皮膚が白くなっていないかまたは圧痕がない場合に、与えた。２のスコアは、前足がメッシュから完全に離れて保たれている場合に与えた。ラットがまだ休んでいる場合には、躊躇無く、前足を２とみなした。それぞれの動物を、３０分間にわたって５分おきに１分間観察した。１／２時間の間に得れらた６つのスコアの和（０〜１２）を使用して、切開した足の痛みを評価した。２のスコアの頻度もまた計算し、重度の痛みの発生率、または動物による前足の全体的な保護を評価するために使用した。それぞれの動物を、外科手術前の２４時間（ベースライン）、ならびに、手術後２時間、２４時間、４８時間、および７２時間試験した。この実験の結果を図１に示す。これは、３５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦマウス抗体９１１で処置した動物において観察される累積の安静時の痛みのスコアを示す。これらの結果は、抗ＮＧＦ抗体での処置によって、外科手術後の安静時の痛みが明らかに減ったことを示している。体重負荷は、動物がどれぐらい肢を使用する意思があるかとかなり相関し、したがって、痛みの緩和の効率のよい測定である。
【０３８１】
Ｅ３抗体を、種々の濃度の抗体（動物の体重１ｋｇあたり、０．００４、０．０１、０．０２、０．１、０．６、および１ｍｇ）を、切開の１５時間前に腹腔内（ｉ．ｐ．）で注射した。陰性対照のグループには、抗体は投与せずに生理食塩溶液をｉ．ｐ．注射した。０．０１ｍｇ／ｋｇのフェンタニルを、外科手術の２４時間後の試験を開始する３０分前に、陽性対照としてｉ．ｐ．注射した。それぞれの実験には、各条件について８匹の動物（１グループあたりｎ＝８）を含め、対照グループは５６匹の動物とした。外科手術を行い、累積の痛みのスコアを上記のように測定した。安静時の痛みを、外科手術の２４時間後に評価した。
【０３８２】
図７に示すように、ヒト化抗ＮＧＦ抗体Ｅ３は、０．０２ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した場合には、外科手術後の安静時の痛みを大きく軽減した（ｐ＜０．０５）。「＊」は、対照との明らかな差（ｐ＜０．０５）を示す。０．０２ｍｇ／ｋｇでの処置によって、０．０１ｍｇ／ｋｇのフェンタニルでの処置と少なくとも同じぐらい効果的に、痛みの行動は軽減した。このフェンタニルの用量は、この強力なオピオイドの通常のヒトへの用量の１０倍である。
【０３８３】
別の実験においては、外科手術後に投与した場合に外科手術後の痛みを軽減することにおけるＥ３抗体の効力を試験した。抗体Ｅ３（０．５ｍｇ／ｋｇ）を、外科手術の２時間後に静脈内（ｉ．ｖ．）で注射した。対照グループには、抗体は投与せずに生理食塩溶液をｉ．ｖ．注射した。外科手術を行い、安静時の痛みを累積の痛みのスコアとして、外科手術後２４時間で評価した。図８に示すように、抗ＮＧＦ抗体での処置により、抗体を外科手術の２時間後に投与した場合には、切開の２４時間後の安静時の痛みは大きく軽減した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、Ｅ３抗体が、外科手術後に投与した場合に、外科手術後の痛みを効率よく緩和したことを示した。
【０３８４】
（実施例６）
関節リウマチのラットモデルにおける抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１の鎮痛効果の評価
完全なフロイトのアジュバント（ＣＦＡ）によって誘導したラットの慢性関節炎における抗ＮＧＦ抗体９１１（Ｈｏｎｇｏ等，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９（３）：２１５−２２７（２０００））の鎮痛効果を、対照物質として使用したインドメタシンと比較して、発声試験を使用して研究した。
【０３８５】
実験期間の開始時に１５０ｇから２２０ｇまでの体重である、５０匹の雄性のＬｅｗｉｓラット（ＬＥＷＩＳ  ＬＥＷ／Ｃｒｌ  Ｉｃｏ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、この研究に含めた。全ての動物を、実験の前に少なくとも５日間飼育し、研究の間中は、濾過した水道水と標準的なペレット状の研究室用の食餌（Ｕ．Ａ．Ｒ．，Ｆｒａｎｃｅ）を無制限に摂取できるようにして、一定の温度（１９．５〜２４．５℃）、相対湿度（４５〜６５％）で、１２時間の明／暗のサイクルに制御した室内で飼育した。動物を尾で個々に識別した。
【０３８６】
０日目（Ｄ０）に、関節炎を、ミネラルオイル（１０ｍｇ／ｍｌ）中のウシ型結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）の懸濁液０．０５ｍｌを、尾に皮内注射することにより、ラットにおいて誘導した。１４日目（Ｄ１４）に、関節炎のラットを、後足の軽い屈曲の際に声を発する彼らの能力にしたがって、および後足および前足のそれぞれについての炎症スコアを使用して評価した彼らの関節炎指数にしたがって、本研究に含めた（Ｋｕｚｕｎａ等，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）２３：１１８４−１１９１（１９７５）；Ｐｅａｒｓｏｎ等，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２：４４０−４５９（１９５９）を参照のこと）。動物を、以下の基準に基づいてスコアした：スコア０：正常な挙動；スコア１：紅斑；スコア２；わずかな浮腫を伴う紅斑；スコア３：硬直は伴わない強い炎症；スコア４：硬直。軽い屈曲の際に声を発することができ、２または３のスコアを示した動物のみを、研究に含めた。
【０３８７】
１０匹のラットの４つのグループを本研究に含めた。グループ１（ビヒクル）については、１４日目（Ｄ１４）に、選択の後、ラットにビヒクル（生理食塩水）を静脈内投与した。１８日目（Ｄ１８）に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ２（４日）については、１４日目（Ｄ１４）に、選択の後、ラットに９１１を静脈内投与した（１０ｍｇ／ｋｇ）。１８日目（Ｄ１８）に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ３（２４時間）については、ＣＦＡの注射後１７日目に、ラットに９１１を静脈内投与した（１０ｍｇ／ｋｇ）。２４時間後に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ４（インドメタシン）については、１８日目（Ｄ１８）に、インドメタシンの経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ）の１時間後に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価した。発声のレベルの強さもまた個々の動物について記録した。試験物質は５ｍｌ／ｋｇの容量で静脈内経路によって、盲目的なランダム形式で投与したが、インドメタシンは、１０ｍｌ／ｋｇの容量で経口経路によって投与した。
【０３８８】
抗ＮＧＦ抗体９１１の鎮静効果を表１０に示す。結果を、それぞれの動物についてｍＶ（平均±標準誤差）で記録した発声のレベルの強さとして評価した侵害刺激反応の強さとして、およびビヒクルで処置したグループの平均値から計算した侵害刺激反応の強さの変量の割合（％）として、それぞれのグループについて表示した。処置グループとビヒクルグループとの間での統計学的差を、一元配置分散分析後の残差分散を使用するダネット検定を用いて決定した（ｐ＜０．０５）。
【０３８９】
【表１０】
2006525955.tif 000014
結果は、平均±標準誤差として表す
１グループあたりｎ＝１０匹のラット
０日目（Ｄ０）：ＣＦＡの投与による慢性関節炎の誘導
ビヒクル：生理食塩水
９１１（１０ｍｇ／ｋｇ）を１４日目（Ｄ１４）または１７日目（Ｄ１７）に静脈内投与し、痛みの測定を１８日目（Ｄ１８）に行った。
【０３９０】
インドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ）を１８日目（Ｄ１８）に経口投与し、痛みの測定を投与の１時間後に行った。
ダネット検定：＊は、ビヒクルで処置したグループと比較した有意な差を示す（ｐ＜０．０５）。
【０３９１】
表１０に示すように、抗ＮＧＦ抗体９１１は、１回の抗体の投与後２４時間または４日で、関節リウマチのラットモデルにおいて痛みを明らかに軽減させた。
【０３９２】
（実施例７）
関節リウマチのラットモデルにおける抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３および９１１の薬理効果
抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３および９１１の薬理効果（坑炎症効果および鎮静効果）を、内部陽性対照物質として使用したインドメタシンと比較して、完全なフロイトのアジュバント（ＣＦＡ）によって誘導したラットの慢性関節炎のモデルにおいて研究した。Ｅ３および９１１の鎮静効果は、侵害刺激反応の測定によって評価した。抗炎症効果は、足の容積、関節炎指数（炎症スコア）、体および後足の重量によって評価した。足のサイトカイン濃度（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−β１）、血清中の循環しているＲＧＦ−β１、Ｅ３、および９１１の血漿濃度、生物学的パラメーター、およびＸ線検査を、実験の最後に行った。
【０３９３】
実験プロトコール
１．研究計画
５週齢の８０匹の雄性Ｌｅｗｉｓラット（ＬＥＷＩＳ  Ｌｅｗ／Ｉｃｏ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、本研究に含めた。彼らを、研究の間中、濾過した水道水と標準的なペレット状の研究室用の食餌（ＳＡＦＥ，Ｆｒａｎｃｅ）を無制限に摂取できるようにして、一定の温度（１９．５〜２４．５℃）、相対湿度（４５〜６５％）で、１２時間の明／暗のサイクルに制御して飼育した。動物を設備に収容する際に、彼らを、１つのケージあたり５匹ずつ収容し、全ての試験の前に、１０日間の環境順応期間について観察した。動物を尾で個々に識別した。
【０３９４】
それぞれ１０匹の動物の５つのグループ（５週齢の雄性のＬｅｗｉｓラット−ＬＥＷＩＳ  Ｌｅｗ／Ｉｃｏ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−Ｂｅｌｇｉｕｍによる）を、本研究に含めた：グループ１：関節炎ではないラット／生理食塩水（ビヒクル）、ｉ．ｖ．ボーラス、ｎ＝１０；グループ２；関節炎のラット／生理食塩水（ビヒクル）、ｉ．ｖ．ボーラス、ｎ＝１０；グループ３；関節炎のラット／インドメタシン３ｍｇ、１０日間にわたって毎日ｐ．ｏ．、ｎ＝１０；グループ４：関節炎のラット／Ｅ３、１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ボーラス、ｎ＝１０；グループ５：関節炎のラット／９１１、１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．ボーラス、ｎ＝１０。用量は、遊離の活性物質（ｍｇ／ｋｇ）に関して示した。Ｅ３および９１１は、所望される濃度になるように、ストック溶液から生理食塩水中で即座に調製した。Ｅ３  １ｍｇ／ｋｇ：３．４１ｍＬのストック溶液（０．８８ｍｇ／ｍｌ）ｑ．ｓ．ｐ．１５ｍＬの生理食塩水。９１１  １０ｍｇ／ｋｇ：１２ｍＬのストック溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）ｑ．ｓ．ｐ．１５ｍＬの生理食塩水。全ての希釈した溶液（ｉ．ｖ．注射の前）を、０．２０μｍの滅菌フィルターユニットを使用して滅菌した。希釈した溶液のｐＨおよび浸透圧の値を、それぞれのｉ．ｖ．注射の前に測定した。最初のｉ．ｖ．注射の前は、生理食塩水、Ｅ３、および９１１についての浸透圧（ｍｏｓｍ／Ｌ）は、それぞれ、２７８、２６９、および３０８であり；生理食塩水、Ｅ３、および９１１についてのｐＨは、それぞれ、５．９３、６．７６、６．７１であった。２回目のｉ．ｖ．の前は、生理食塩水、Ｅ３、および９１１についての浸透圧（ｍｏｓｍ／Ｌ）は、それぞれ、２８０、２７０、および３０９であり；生理食塩水、Ｅ３、および９１１についてのｐＨは、それぞれ、５．８６、６．７２、６．５９であった。
【０３９５】
コード化された順序およびランダムな順序で関節炎を誘導した後、１４日目および１９日目に、Ｅ３または９１１または生理食塩水を、５ｍＬ／ｋｇの容量でｉ．ｖ．ボーラス注射によって投与した。関節炎ではないグループには、１４日目および１９日目に、５ｍＬ／ｋｇの容量で生理食塩水のｉ．ｖ．ボーラス注射を投与した。インドメタシンを、１％のメチルセルロース中で即座に調製した。インドメタシンは、コード化された順序およびランダムな順序で関節炎を誘導した後、１４日目から２３日目までの１０日間にわたって１日１回、経口経路（ｐ．ｏ．）によって１０ｍＬ／ｋｇの容量で投与した。
【０３９６】
２．関節炎の誘導
０日目（Ｄ０）に、０．０５ｍｌのウシ型結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）の懸濁液を尾に皮内注射することにより、７０匹のラットにおいて関節炎を誘導した。１つのグループの１０匹のラットには、皮内注射を全く行わなかった（関節炎ではないラット）。１４日目（Ｄ１４）に、関節炎のラットを以下の基準を使用して研究に含めた：関節炎ではないグループにおける平均の足の容積（左足と右足の容積の平均）と比較して、少なくとも０．３０ｍｌの平均の足の容積（左足と右足の容積の平均）の増加を示した全てのラットを含めた（以下に記載するような足の容量の測定）；軽い屈曲の際に声を発した全てのラットを含めた（以下に記載するような侵害刺激反応の測定）；ならびに、それぞれの後足について２〜３の関節炎指数のスコアを示した全てのラットを含めた（以下に記載するような関節炎指数の測定）（０、１、または４のスコアを有している動物は廃棄した）。
【０３９７】
３．体重
動物を、０日目から２４日目まで、１日１回、体重を測定した（処置前の週末の日を除く：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０）。全ての測定を、１４日目（Ｄ１４）（７：３０〜９：００ａｍ）および２４日目（Ｄ２４）（７：３０〜８：００ａｍ）を除いて、９：００から１２：００ａｍまでの間に行った。
【０３９８】
３．足の容積の測定
それぞれのラット（関節炎のラットおよび関節炎ではないラット）の右および左の後足の容積を、足容積測定装置を使用して測定した。測定は、以下の時間に行った（関節炎の誘導後）：１４日目（ｉ．ｖ．ボーラスまたはｐ．ｏ．投与の前）；および２４日目（最後のｉ．ｖ．ボーラス注射の５日後、または最後のｐ．ｏ．投与の２４時間後）。全ての測定を、９：００から１２：００ａｍの間に行った。全てのデータを回収し、ＷｉｎＤａｓソフトウェアによって保存した。
【０３９９】
４．関節炎指数
関節炎指数は、それぞれの後足および前足（関節炎のラット）についての炎症スコアを使用して評価した：スコア０：正常な挙動；スコア１：紅斑；スコア２；わずかな浮腫を伴う紅斑；スコア３：硬直は伴わない強い炎症；スコア４：硬直。この評価を以下の時間に行った（関節炎の誘導後）：１４日目（ｉ．ｖ．ボーラスまたはｐ．ｏ．投与の前）；および２４日目（最後のｉ．ｖ．ボーラス注射の５日後、または最後のｐ．ｏ．投与の２４時間後）。全ての測定を、２：００から３：００ｐｍの間に（１４日目（Ｄ１４））、８：００から９：００ａｍの間に（２４日目（Ｄ２４））行った。全てのデータを回収し、ＷｉｎＤａｓソフトウェアによって保存した。
【０４００】
５．侵害刺激反応の測定（発声試験）
侵害刺激反応を、オペレーターの指で４から５秒の間隔で２回繰り返して右および左の後足を軽く屈曲させることによって評価した（関節炎のラット）。発声のレベルの強さを、それぞれの後足に関して各動物について記録した（２回：右後足について：ｓ１およびｓ３；２回：左後足について：ｓ２およびｓ４）。この評価を、以下の時間に行った：（関節炎の誘導後）：１４日目（ｉ．ｖ．ボーラスまたはｐ．ｏ．投与の前）；１８日目（２回目のｉ．ｖ．ボーラス注射の前、またはｐ．ｏ．投与の１時間後）；および２４日目（最後のｉ．ｖ．ボーラス注射の５日後、または最後のｐ．ｏ．投与の２４時間後）。全ての測定を、１４日目（Ｄ１４）（７：３０〜９：００ａｍ）および２４日目（Ｄ２４）（７：３０〜９：００ａｍ）を除いて、９：００から１２：００ａｍの間に行った。
【０４０１】
６．Ｅ３または９１１濃度、および循環しているＴＧＦ−β１、および血液学的パラメーターの測定のための採血
２４日目（足容積と関節炎指数の測定、ならびに侵害刺激反応試験の後）に、イソフルラン（酸素と亜酸化窒素の混合気体）を使用した全身麻酔下で、血液試料（約８００〜１０００μｌ）を、眼窩洞（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）からマイクロピペットを用いて毛管現象によって回収した。
【０４０２】
Ｅ３または９１１濃度の測定（グループ２、４、および５）：血液試料の一部を、Ｌｉ−ヘパリンを含むチューブ（氷上で維持した）に回収し、２５００〜３０００ｇで１０分間遠心分離した。血漿試料（少なくとも１００μＬ）を得、これを液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。１つの試料は、わずかに溶血した（ビヒクルで処置した関節炎のラット＃３６）。
【０４０３】
循環しているＴＧＦ−β１の測定（グループ１−２−３−４−５）：血液試料の一部を、室温で血清を調製するためにマイクロチューブに回収した。サンプルの回収後、血液を混合し、遠心分離の前に３０分間、血餅を形成させた。チューブを約６０００ｇで３分間遠心分離した。それぞれの血清試料（少なくとも１００μＬ、ラット＃５２および＃５３を除く）を等分し、ＴＧＦ−β１分析のために試料を活性化させるまで、−２０℃で保存した。これらのアリコート（５０個のバイアル）を、研究の始めから終わりまで６ヶ月間維持した。いくつかの試料は、わずかに溶血した（ビヒクルで処置した関節炎ではないラット：＃２、＃５、＃９、＃１０；ビヒクルで処置した関節炎のラット：＃５３、＃６３；Ｅ３で処置した関節炎のラット：＃３１、＃５１；９１１で処置した関節炎のラット：＃５２、＃６２、＃６４）。ＴＧＦ−β１の濃度を、ヒトＴＧＦ−β１  ＥＬＩＳＡキット（ｒｅｆ．ＤＢ１００、Ｂａｔｃｈ  ２１２２５８および２１３６１０，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｆｒａｎｃｅ）を使用して測定した。
【０４０４】
血液学的パラメーターのための採血（グループ１−２−３−４−５：５０個のバイアル）：血液試料の一部を、Ｋ３−ＥＤＴＡを含むチューブに回収した（少なくとも１００μＬ）。パラメーターの決定は、採血した日に行い、試料は保存しなかった。赤血球、白血球、血小板、ヘモグロビン、ヘマトクリットを含む血液学液パラメーターを、血球計測装置で測定した（２４日目（Ｄ２４））。いくつかの血液学的パラメーターは、試料が凝血したことが原因で測定できなかった（ビヒクルで処置した関節炎ではないラット：＃１０；Ｅ３で処置した関節炎のラット：＃５９、＃６７；９１１で処置した関節炎のラット：＃１６）。
【０４０５】
７．足のサイトカイン濃度
２４日目（最後のｉ．ｖ．ボーラス注射の５日後、または最後のｐ．ｏ．投与の２４時間後）（Ｘ線検査後）に、それぞれのマウスの後足（関節炎のラット、および関節炎ではないラット）の重さを量り、ラベルをつけたポリエチレンバイアルに回収した。組織試料を液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０４０６】
関節ホモジネートの調製：凍結させた後足をＢｉｏ−Ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒを使用して粉砕した。次いで、粉末状にした後足を、５０μｌの抗プロテアーゼ混合物を添加した３ｍｌのＰＢＳを含む５０ｍｌの円錐型の遠心分離管に入れ、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを使用して氷上でホモジナイズした（最大速度の５０％）。その後、ホモジネートを２０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、上清を０．２μｍのＳａｒｔｏｒｉｕｓフィルターを通過させて濾過し、等分し、−８０℃で使用するまで保存した。
【０４０７】
サイトカイン濃度の測定：ＴＮＦ−α（ラットＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡキット、ｒｅｆ．ＲＴＡ００、Ｂａｔｃｈ  ２１３７１８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＩＬ−１β（Ｒａｔ  ＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキット、ｒｅｆ．ＲＬＢ００、Ｂａｔｃｈ２１２４３５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＩＬ−６（Ｒａｔ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット、ｒｅｆ．Ｒ６０００、Ｂａｔｃｈ２１１７７３、２１４００８、および２１４３６２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、およびＴＧＦ−β１（Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β１  ＥＬＩＳＡキット、ｒｅｆ．ＤＢ１００、Ｂａｔｃｈ２１２２５８および２１３６１０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｃｅ）のサイトカイン濃度を、製造業者による手順にしたがって２連で決定した。後足のホモジネートのアリコートを−８０℃で保存した。
【０４０８】
８．Ｘ線解析
２４日目に、採血の後に動物を屠殺し、関節の病変の評価のためにＸ線写真（後足）を撮影した。Ｘ線解析は、両方の後足の関節の目減り、関節窩、骨膜の異常に焦点をあてて行った。全てのＸ線写真を、７つの異なる項目を見ることによって分析した：軟組織の損傷、奇形、脱塩、関節窩、目減り、骨形成、および骨膜の反応。それぞれの動物について、最初の６つの項目を、悪い後足を見ることによって別々に分析した。骨膜の反応は、尾を見ることによって分析した。それぞれの項目について、スコアを０（正常）から４（最大の損傷）とした。したがって、合計スコアは、０から２８までとなる。Ｘ線写真の解釈は、動物（処置したかまたは処置していない）について何も知らされていない同じ助手が行った。
【０４０９】
９．観察
１匹の動物（＃６５）は、インドメタシンの投与後２３日目（Ｄ２３）（２３日目（Ｄ２３）の投与の前）に、不明な原因によって死亡した。
【０４１０】
１０．結果の分析および表示
全ての結果を、それぞれの時点での各グループの１０匹のラットの平均±標準誤差として記録した。足の容積は、右足と左足の容積の平均値から計算し、ｍｌで示した。関節炎指数は、４本の足のそれぞれについて得られたスコアの和から計算した。侵害刺激反応は、それぞれの動物について記録した発声のレベルの強さによって、ｍＶで評価した（４つの値の平均：片方の足について２回ずつ）。侵害刺激反応の阻害の割合は、ビヒクルで処置した関節炎のグループの値の平均値から計算した［（ビヒクルで処置した関節炎のグループの平均値−処置した関節炎のグループの平均値／ビヒクルで処置した関節炎のグループの平均値）×１００］。体重は、グラムで表示した。後足（左および右）の重量はグラムで表示した。それぞれの後足のサイトカイン濃度（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−β１）は、ｐｇ／ｍｌで表示した。ＴＧＦ−β１の循環濃度は、ｐｇ／ｍｌで表示した。それぞれのパラメーター（脱塩、目減り、骨膜の反応、軟組織の損傷、関節窩、骨形成の奇形）についての放射線写真による指数と、合計の放射線写真指数（合計スコア）は、それぞれのパラメーターについて得られたスコアの和から計算した。ビヒクルで処置したグループ（関節炎のラット）の値とビヒクルで処置したグループ（関節炎ではないラット）の値との間での偏差のグループ間での有意性は、スチューデントｔ検定によって、または同じ変量の試験もしくは正常性の試験ができなかった場合にはマンホイットニーランクサム検定によって評価した。ビヒクルで処置したグループ（関節炎のラット）の値とＥ３および９１１およびインドメタシンで処置したグループの値との間での偏差のグループ間の有意性は、一元分散分析ＡＮＯＶＡ、続いて、対にしていない（ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ）ダネットｔ検定によって評価した。ｐ≦０．０５の確率を、有意であるとみなした。全ての統計分析を、Ｓｉｇｍａｓｔａｔ（登録商標）ソフトウェアによって行った。
【０４１１】
結果
１．侵害刺激反応（発声試験）
表１１および図１８に示すように、１４日目（Ｄ１４）には、侵害刺激反応は、ビヒクルで処置した、インドメタシンで処置した、Ｅ３で処置した、および９１１で処置した関節炎のグループにおいて、それぞれ、４１４７±３３１、４３８６±２３５、４６４４±３６７、および４４６８±１４３であった。インドメタシンは、３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．（１０日間）の後、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、侵害刺激反応を強力かつ有意に、１８日目（Ｄ１８）および２４日目（Ｄ２４）に、それぞれ、約−３７６８ｍＶ（％阻害：７１％）および−４３５３ｍＶ（％阻害：７４％）低下させた（１８日目（Ｄ１８）：１５１１±３９８ｍＶ対５２７９±３２６ｍＶ；２４日目（Ｄ２４）：１５５２±５０８ｍＶ対５９０５±３４５ｍＶ）。Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、侵害刺激反応を強力かつ有意に、１８日目（Ｄ１８）および２４日目（Ｄ２４）に、それぞれ、約−４１６７ｍＶ（％阻害：７９％）および−５９０５ｍＶ（％阻害：１００％）低下させた（Ｄ１８：１１１２±４０１ｍＶ対５２７９±３２６ｍＶ；Ｄ２４：０±０ｍＶ対５９０５±３４５ｍＶ）。９１１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）の２日間に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、侵害刺激反応を強力かつ有意に、１８日目（Ｄ１８）および２４日目（Ｄ２４）に、それぞれ、約−３９３２ｍＶ（％阻害：７４％）および−５３５８ｍＶ（％阻害：９１％）低下させた（１８日目（Ｄ１８）：１３４７±４９２ｍＶ対５２７９±３２６ｍＶ；２４日目（Ｄ２４）：５４７±３０７ｍＶ対５９０５±３４５ｍＶ）。
【０４１２】
【表１１】
2006525955.tif 000015
値は、平均±標準誤差としてｍＶで表す
２４日目のインドメタシン（ｎ＝９）を除き、１グループあたりｎ＝１０匹の動物
ダネットｔ検定：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ≦０．０５。
【０４１３】
２．体重
表１２および図１９に示すように、関節炎の確立が原因である体重増加の明らかな減少が、関節炎ではないラットと比較して、０日目（Ｄ０）から１４日目（Ｄ１４）までに関節炎のラットにおいて観察された。１４日目（Ｄ１４）（選択の日）に、関節炎のラットは、関節炎ではないラットと比較して、体重の明らかな減少を示した（２８９±２ｇ対２１７±４ｇ）（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。しかし、全ての関節炎のグループにおいて、体重（１４日目（Ｄ１４））に有意な差は検出されなかった（ダネットｔ検定、ｐ＞０．０５）。体重は、インドメタシンで処置したグループ（１０日間にわたって３ｍｇ／ｋｇ／日）においては、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、１７日目（Ｄ１７）から２４日目（Ｄ２４）までに穏やかかつ有意に増加し（２６１±５ｇ対２１８±３ｇ）、２４日目（Ｄ２４）に約４３ｇで最大となった。Ｅ３での処置（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）の後、体重は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、１７日目（Ｄ１７）から２４日目（Ｄ２４）までに穏やかかつ有意に増加し（２６４±５ｇ対２１８±３ｇ）、２４日目（Ｄ２４）に約４６ｇで最大となった。９１１での処置（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）の後、体重は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、１８日目（Ｄ１８）から２４日目（Ｄ２４）までに穏やかかつ有意に増加し（２６５±７ｇ対２１８±３ｇ）、２４日目（Ｄ２４）に約４７ｇで最大となった。
【０４１４】
【表１２】
2006525955.tif 000016
値は、平均±標準誤差としてグラムで表す
２３日目および２４日目のインドメタシン（ｎ＝９）を除き、１グループあたりｎ＝１０匹の動物
ダネットｔ検定：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ≦０．０５。
【０４１５】
３．足の容積
１４日目（Ｄ１４）に、足の容積の項目において均質なグループを得るためにランダムにした。表１３に示すように、１４日目（Ｄ１４）には、後足の容積（右足と左足の容積の平均）は、関節炎ではないグループよりも関節炎のグループにおいて有意に大きかった（２．１０±０．０５ｍＬ対１．４４±０．０２ｍＬ（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５））。インドメタシン（１０日間にわたって、３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、足の容積を有意に、約−０．７５ｍＬ（２４日目（Ｄ２４））減少させた（１．５９±０．０３ｍＬ対２．３４±０．０８ｍＬ）。Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、足の容積を僅かであるが有意に、約０．３７ｍＬ増大させた（２．７１±０．０９ｍＬ対２．３４±０．０８ｍＬ）。９９１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、足の容積を僅かであるが有意に、約０．３６ｍＬ増大させた（２．７０±０．１１ｍＬ対２．３４±０．０８ｍＬ）。
【０４１６】
【表１３】
2006525955.tif 000017
値は、平均±標準誤差としてｍＬで表す
２４日目のインドメタシン（ｎ＝９）を除き、１グループあたりｎ＝１０匹の動物
ダネットｔ検定：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ≦０．０５。
【０４１７】
４．関節炎指数
表１４に示すように、１４日目（Ｄ１４）には、関節炎指数は、ビヒクルで処置した、インドメタシンで処置した、Ｅ３で処置した、および９１１で処置した関節炎のグループにおいて、それぞれ、１０．１±０．８、８．７±０．６、１０．２±０．４、および９．４±０．７であった。インドメタシンは、（１０日間にわたる）３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．の後、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、最大で約−８．０まで、関節炎指数を強く、有意に低下させた（２．７±０．７対１０．７±０．６ｍＬ）。Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、関節炎指数には影響を与えなかった（１１．４±０．４対１０．７±０．６ｍＬ）。９９１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、関節炎指数には影響を与えなかった（１０．９±０．７対１０．７±０．６）。
【０４１８】
【表１４】
2006525955.tif 000018
値は、平均±標準誤差（スコア）として表す
インドメタシン（ｎ＝９）を除き、１グループあたりｎ＝１０匹の動物
ダネットｔ検定：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ≦０．０５。
【０４１９】
５．足のサイトカイン濃度
表１５に示すように、２４日目（Ｄ２４）には、左足および右足のサイトカイン濃度は、関節炎ではないビヒクルで処置したグループと比較して、関節炎のビヒクルで処置したグループにおいては、最大で約３．５倍（ＩＬ−１β）、４倍（ＴＮＦ−α）、および１．８倍（ＴＧＦ−β１）まで増大した。ＩＬ−６濃度については、２つのグループの間で、左足においても右足においても、有意な差は観察されなかった。関節炎のグループのサイトカイン濃度は、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−β１について、それぞれ、左足においても右足においても同様であった：２５９．７±３８．５ｐｇ／ｍｌ対２１９．２±３２．４ｐｇ／ｍｌ、４８０２．８±３６５．５ｐｇ／ｍｌ対４００７．１±３８０．４ｐｇ／ｍｌ、１７．８±１．６ｐｇ／ｍｌ対１８．６±１．９ｐｇ／ｍｌ、および９７３５．０±１２１９．８ｐｇ／ｍｌ対９１６１．４±８４６．１ｐｇ／ｍｌ。インドメタシンは、（１０日間にわたる）３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．の後、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、約１．３倍に、右足のＴＧＦ−β１濃度をわずかではあるが、有意に低下させたが（７０５７．４±３３５．６対９１６１．４±８４６．１）、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−１βの濃度は変化させなかった。有意ではないが同様の効果が、左足においても観察された。Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、いずれの足においても、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、またはＴＧＦ−β１の濃度には影響を与えなかった。９９１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、右足においてＩＬ−１β濃度を増大させた（６２１５．３±６６６．７対４００７．１±３８０．４）。９１１は、いずれの足おいても他のサイトカイン濃度には影響を与えなかった。
【０４２０】
【表１５】
2006525955.tif 000019
2006525955.tif 000020
値は、平均±標準誤差としてｐｇ／ｍｌで表す
関節炎ではない／ビヒクル（右足）、関節炎／ビヒクル（左足）、およびインドメタシン（ｎ＝９）を除き、１グループあたりｎ＝１０匹の動物
ダネットｔ検定：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ≦０．０５。
【０４２１】
６．循環しているＴＧＦ−β１の測定
表１６に示すように、２４日目（Ｄ２４）には、血清ＴＧＦ−β１濃度は、関節炎ではないビヒクルで処置したグループと比較して、関節炎のビヒクルで処置したグループにおいて増大した（８１７１５．７±１９８４．１対６０２６９．９±２１４２．８）。インドメタシンは、（１０日間にわたる）３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．の後、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、約１．５倍、血清ＴＧＦ−β１濃度を有意に低下させた（５７２２２．２±３１９４．１対８１７１５．７±１９８４．１）。Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）および９９１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、血清ＴＧＦ−１β濃度を有意に低下させ、その結果、Ｅ３で処置したグループと９１１で処置したグループのサイトカイン濃度は、ビヒクルで処置した関節炎ではないグループにおいて観察されたサイトカイン濃度と匹敵するものであった（６０２６９．９±２１４２．８に対して、それぞれ、６９４０８．８±３９２６．７および６７２１４．５±３６４９．４）。表１６．ラットの関節リウマチにおける血清ＴＧＦ−β１濃度に対する、ｉ．ｖ．注射（２日間：１４日目と１９日目）後のＥ３および９１１の効果
【０４２２】
【表１６】
2006525955.tif 000021
値は、平均±標準誤差としてｐｇ／ｍｌで表す
関節炎ではない／ビヒクル（右足）、関節炎／ビヒクル（左足）、およびインドメタシン（ｎ＝９）を除き、１グループあたりｎ＝１０匹の動物
ダネットｔ検定：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ≦０．０５。
【０４２３】
７．血液学的パラメーター
表１７に示すように、白血球および血小板のような血液学的パラメーターは、ビヒクルで処置した関節炎ではないラットと比較して、ビヒクルで処置した関節炎のラットにおいて高かったが（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）、赤血球、ヘモグロビン、およびヘマトクリット（スチューデントｔ検定、ｐ＞０．０５）は変化しなかった。インドメタシンは、（１０日間にわたる）３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．の後、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、血液のパラメーターには影響を与えなかった。Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、血液のパラメーターには影響を与えなかった。９９１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、血液のパラメーターには影響を与えなかった。
表１７．ラットの関節リウマチにおける血液のパラメーターに対する、ｉ．ｖ．注射（２日間：１４日目と１９日目）後のＥ３および９１１の効果（２４日目に測定）
【０４２４】
【表１７】
2006525955.tif 000022
値は、平均±標準誤差として表す
Ａｎｏｖａ分析：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ＞０．０５。
【０４２５】
７．後足の重量
表１８に示すように、左と右の後足の重量は、ビヒクルで処置した関節炎ではないラットよりも、ビヒクルで処置した関節炎のラットにおいて重かった（それぞれ、３．４３±０．１１ｇ対１．９８±０．０１ｇ、および３．３２±０．１２ｇ対１．９９±０．０２ｇ）（スチューデントｔ検定またはマンホイットニー検定、ｐ＜０．０５）。インドメタシンは、（１０日間にわたる）３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．の後、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、後足の重量を有意に減少させた（左後足：２．２３±０．０４ｇ対３．４３±０．１１ｇ；右後足：２．２０±０．０５ｇ対３．３２±０．１２ｇ）。Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、左後足の重量だけを大きく増大させた（左後足：３．８６±０．１４ｇ対３．４３±０．１１ｇ；右後足：３．７２±０．１３ｇ対３．３２±０．１２ｇ）。９９１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、右後足の重量だけを大きく増大させた（左後足：３．７３±０．１２ｇ対３．４３±０．１１ｇ；右後足：３．８３±０．１５ｇ対３．３２±０．１２ｇ）。
【０４２６】
【表１８】
2006525955.tif 000023
値は、平均±標準誤差としてグラムで表す
インドメタシン（ｎ＝９）を除き、１グループあたりｎ＝１０匹の動物
ダネットｔ検定：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ≦０．０５。
【０４２７】
８．Ｘ線解析
表１９に示すように、ビヒクルで処置した関節炎ではないラットについては、０．０±０．０の合計スコアを観察した。ビヒクルで処置した関節炎のラットは、合計スコアが１５．１±１．３であり、脱塩（２．４±０．３）、目減り（２．７±０．３）、軟組織の損傷（３．１±０．２）、および関節窩（３．３±０．２）については高いスコアを、骨膜の反応（１．０±０．３）、骨形成（０．８±０．２）、および奇形（１．８±０、２）については中程度のスコアを有していた。インドメタシン（１０日間にわたる、３ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のラットと比較して、合計スコアを大きく有意に、約１０．７低下させた（４．４±０．９対１５．１±１．３）。Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、合計スコアには影響を与えなかった（１４．２±１．３対１５．１±１．３）。９９１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は、ビヒクルで処置した関節炎のグループと比較して、合計スコアには影響を与えなかった（１５．４±１．０対１５．１±１．３）。
【０４２８】
【表１９】
2006525955.tif 000024
値は、平均±標準誤差（スコア）として表す
インドメタシン（ｎ＝９）を除き、１グループあたりｎ＝１０匹の動物
ダネットｔ検定：＊は、ビヒクルで処置した関節炎のラットに対してｐ≦０．０５。
【０４２９】
結論
上記の実験条件下では、Ｅ３（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）に、１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）および９９１（１４日目（Ｄ１４）および１９日目（Ｄ１９）の２日間に、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）は強い鎮静効果を示したが、この関節炎モデルにおいては有意な抗炎症効果は示さなかった。
【０４３０】
（実施例８）
関節リウマチのラットモデルにおける種々の用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の効果
関節炎のラットにおいて痛みの軽減を生じるＥ３の能力を、さらに、Ｅ３の投与と痛みの軽減との間での容量応答関係を試験することによって研究した。ラットを、上記のように関節炎を誘導するためにアジュバントで処置した。アジュバントを注射しなかった１０匹のラットを、関節炎ではない対照として使用した。アジュバントの注射後１４日目に、動物を、上記の基準に基づいて研究への適格性を定め、１０匹のラットの８個のグループにランダムに分け、彼らの発声の応答の強さについて試験した。その後、彼らに、１４日目に生理食塩水、あるいは、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇの上記のＥ３抗体を投与した。動物を、１６日目、１８日目、２０日目、および２４日目に、彼らの発声の応答について試験した。動物に、１８日目に発声試験後に同じ用量の生理食塩水またはＥ３を再び投与した。動物をまた、１４日目から毎日体重を測定した。したがって、動物には、１４日目と１８日目に所定の用量の抗体または生理食塩水を２回投与し、１４日目、１６日目、１８日目、２０日目、および２４日目に痛みについて５回評価した。データを、表２０〜２２、および図２０〜２２に示す。
【０４３１】
【表２０】
2006525955.tif 000025
痛みによって誘導される発声に対する種々の用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３での動物の処置の効果（データは表２０に示す）を、二元ＡＮＯＶＡを使用することによって統計分析し、ビヒクルで処置した関節炎の動物と、所定の用量の抗体Ｅ３で処置した関節炎の動物との対の間で得られた結果を比較した。試験した全てのＥ３濃度で、極めて有意な効果があった（ｐ＜０．０００１）。試験した最も低い用量（０．００３ｍｇ／ｋｇのＥ３）でもなお、発声の差は有意であった（ｐ＜０．０００１）。
【０４３２】
表２０および図２０に示すように、上記の実験と一致して、１ｍｇ／ｋｇの抗体Ｅ３での処置は、痛みの迅速で強い緩和を示した。２日（試験した最も早い時間）以内に、発声の強さは９０％下がった。より低い濃度のＥ３での処置によってもまた、痛みの強い緩和がもたらされたが、低い濃度では、痛みの緩和が生じるまでに幾分長い時間を要した。試験した全てについての（しかし最大用量を除く）２４日目の効力の明らかな低下は、被験ラットによる免疫応答に対する二次的な血漿Ｅ３濃度の実際の濃度の低下が、おそらく原因である。０．００３ｍｇ／ｋｇのような低い用量によっても、このモデルにおいては少なくとも部分的に痛みの緩和がもたらされることは明らかである。
【０４３３】
【表２１】
2006525955.tif 000026
【０４３４】
【表２２】
2006525955.tif 000027
体重に対する種々の用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３での動物の処置の効果を、二元ＡＮＯＶＡを使用することによって統計分析し、ビヒクルで処置した関節炎の動物と、所定の用量の抗体Ｅ３で処置した関節炎の動物との対の間で得られた結果を比較した。１４日目の体重に標準化したデータ（表２１）を使用すると、０．０３ｍｇ／ｋｇのＥ３の用量は、体重に有意な変化を生じた（ｐ＜０．００５）。全てのさらに高い用量のＥ３で、処置した関節炎の動物と処置していない関節炎の動物との間での差は有意であった（ｐ＝または≦０．０００１）。０日目の体重に標準化したデータ（表２２）を使用すると、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量のＥ３によって、体重に有意な変化が生じた（ｐ＜０．００２）。全てのさらに高い用量のＥ３で、処置した関節炎の動物と処置していない関節炎の動物との間での差は有意であった（ｐ＜０．０００１）。
【０４３５】
再度、先の研究と一致して、Ｅ３で処置したラットは、生理食塩水で処置した関節炎のラットよりも少ない見かけ上の体重の減少を示した（表２２および図２２）。実際には、高用量の抗体Ｅ３で処置したラットは、早い段階で体重の減少を回復し、正確には、彼らの関節炎ではない仲間よりも早く体重が増加した（表２１および図２１）。
【０４３６】
生物学的材料の寄託
以下の材料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
【０４３７】
【表２３】
2006525955.tif 000028
ベクターＥｂ．９１１．３Ｅは、Ｅ３軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、ベクターＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、Ｅ３軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、ベクターＤｂ．９１１．３Ｅは、Ｅ３重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【０４３８】
この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定のもとで行った。これにより、寄託の日から３０年間にわたり、寄託物の生存可能な培養物が確約される。寄託物は、ブダペスト条約のもとで、Ｒｉｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．およびＡＴＣＣの間での合意を条件として、ＡＴＣＣより入手することができる。これによって、該当する米国特許の発行または任意の米国もしくは外国特許出願の公報の公開のいずれか早い方がなされると、寄託物の培養物の子孫を、一般市民が永久にかつ無制限に入手することが保証され、米国特許法第１２２条およびそれに順ずるコミッショナー規則（米国特許法施行規則１．１４、特に、８８６  ＯＧ  ６３８を参照のこと）にしたがってそれらに与えられる、米国特許商標庁長官により決定されたものについて子孫を確実に利用できるようになる。
【０４３９】
特許出願の受領は、適切な条件下で培養された場合に、寄託された材料の培養物が死亡した、または失われた、崩壊した場合には、材料を同じもので直ちに置き換えられる場合に、認められる。寄託された材料の有用性は、その特許法にしたがって、任意の政府の権限にもとで与えられる違法な発明を実施するための権利としては解釈されない。
【０４４０】
抗体配列
重鎖可変領域（Ｋａｂａｔ  ＣＤＲに下線をつける：Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲは、太字のイタリックである）
【０４４１】
【表２４】
2006525955.tif 000029
軽鎖可変領域（Ｋａｂａｔ  ＣＤＲに下線をつける：Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲは、太字のイタリックである）
【０４４２】
【表２５】
2006525955.tif 000030
Ｅ３重鎖の伸張型ＣＤＲ
2006525955.tif 000031
Ｅ３軽鎖の伸張型ＣＤＲ
2006525955.tif 000032
マウスモノクローナル抗体９１１の伸張型ＣＤＲ
９１１重鎖の伸張型ＣＤＲ
2006525955.tif 000033
９１１軽鎖の伸張型ＣＤＲ
2006525955.tif 000034
Ｅ３重鎖のアミノ酸配列（全長）
【０４４３】
【表２６】
2006525955.tif 000035
３Ｅ軽鎖のアミノ酸配列（抗体全体）
【０４４４】
【表２７】
2006525955.tif 000036
３Ｅ重鎖のヌクレオチド配列（抗体全体）
【０４４５】
【表２８】
2006525955.tif 000037
３Ｅ重鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列
【０４４６】
【表２９】
2006525955.tif 000038
３Ｅ軽鎖のヌクレオチド配列（抗体全体）
【０４４７】
【表３０】
2006525955.tif 000039
３Ｅ軽鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列
【０４４８】
【表３１】
2006525955.tif 000040
本明細書中に記載された実施例および実施形態は、例示の目的のためのものにすぎず、その観点からの種々の修飾および変更が当業者に示唆され、本出願の精神と範囲に含まれることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０４４９】
【図１−１】図１Ａは、Ｅ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（「６」および「５＋親和性成熟Ｈ３」と表示される）。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲは、それぞれ、下線付きの字体、および太字のイタリックの字体によって示される。図１Ａはまた、以下の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントも示す；（１）マウス９１１抗体のＣＤＲ  Ｈ１（配列番号９）、Ｈ２（配列番号１０）およびＨ３（配列番号１１）；（２）ＶＨ４−５９ヒト生殖系アクセプター配列（「ＶＨ４−５９」または「２」と表示される）（配列番号６９）；（３）マウス抗体９１１の伸張型ＣＤＲと接続されているアクセプター配列（「ＣＤＲ接続型」または「３」と表示される）（配列番号７０）；（４）Ｖ７１Ｋ置換を含むＣＤＲ接続型アクセプター配列（「３＋１つのフレームワーク変異」または「４」と表示される）（配列番号７１）；（５）親和性が変異したＣＤＲ  Ｈ１およびＨ２を含むクローン（「５」または「４＋親和性変異Ｈ１、Ｈ２」と表示される）（配列番号７２）；ならびに、抗体Ｅ３（上記のとおり）（配列番号１）。図１Ｂは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（「５」または「４＋親和性成熟Ｌ３」と表示される）。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲは、それぞれ、下線付きの字体、および太字のイタリックの字体によって示される。図１Ｂはまた、以下の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントも示す；（１）マウス９１１抗体のＣＤＲ  Ｌ１（配列番号１２）、Ｌ２（配列番号１３）およびＬ３（配列番号１４）；（２）Ｏ８ヒト生殖系アクセプター配列（「Ｏ８」または「２」と表示される）（配列番号７３）；（３）マウス抗体９１１の伸張型ＣＤＲと接続されているアクセプター配列（「ＣＤＲ接続型」または「３」と表示される）（配列番号７４）；（４）ＣＤＲ接続型アクセプター配列（「３＋親和性変異Ｌ１、Ｌ２」または「４」と表示される）（配列番号７５）；（５）親和性が変異したＣＤＲ  Ｌ１およびＬ２を含むクローン（「５」または「４＋親和性変異Ｌ３」と表示される）；ならびに、抗体Ｅ３（上記のとおり）（配列番号２）。
【図１−２】図１Ａは、Ｅ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（「６」および「５＋親和性成熟Ｈ３」と表示される）。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲは、それぞれ、下線付きの字体、および太字のイタリックの字体によって示される。図１Ａはまた、以下の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントも示す；（２）ＶＨ４−５９ヒト生殖系アクセプター配列（「ＶＨ４−５９」または「２」と表示される）；（３）マウス抗体９１１の伸張型ＣＤＲと接続されているアクセプター配列（「ＣＤＲ接続型」または「３」と表示される）；（４）Ｖ７１Ｋ置換を含むＣＤＲ接続型アクセプター配列（「３＋１つのフレームワーク変異」または「４」と表示される）；（５）親和性が変異したＣＤＲ  Ｈ１およびＨ２を含むクローン（「５」または「４＋親和性変異Ｈ１、Ｈ２」と表示される）；ならびに、抗体Ｅ３（上記のとおり）。図１Ｂは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（「５」または「４＋親和性成熟Ｌ３」と表示される）。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲは、それぞれ、下線付きの字体、および太字のイタリックの字体によって示される。図１Ｂはまた、以下の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントも示す；（２）Ｏ８ヒト生殖系アクセプター配列（「Ｏ８」または「２」と表示される）；（３）マウス抗体９１１の伸張型ＣＤＲと接続されているアクセプター配列（「ＣＤＲ接続型」または「３」と表示される）；（４）ＣＤＲ接続型アクセプター配列（「３＋親和性変異Ｌ１、Ｌ２」または「４」と表示される）；（５）親和性が変異したＣＤＲ  Ｌ１およびＬ２を含むクローン（「５」または「４＋親和性変異Ｌ３」と表示される）；ならびに、抗体Ｅ３（上記のとおり）。
【図１−３】図１Ａは、Ｅ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（「６」および「５＋親和性成熟Ｈ３」と表示される）。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲは、それぞれ、下線付きの字体、および太字のイタリックの字体によって示される。図１Ａはまた、以下の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントも示す；（２）ＶＨ４−５９ヒト生殖系アクセプター配列（「ＶＨ４−５９」または「２」と表示される）；（３）マウス抗体９１１の伸張型ＣＤＲと接続されているアクセプター配列（「ＣＤＲ接続型」または「３」と表示される）；（４）Ｖ７１Ｋ置換を含むＣＤＲ接続型アクセプター配列（「３＋１つのフレームワーク変異」または「４」と表示される）；（５）親和性が変異したＣＤＲ  Ｈ１およびＨ２を含むクローン（「５」または「４＋親和性変異Ｈ１、Ｈ２」と表示される）；ならびに、抗体Ｅ３（上記のとおり）。図１Ｂは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（「５」または「４＋親和性成熟Ｌ３」と表示される）。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲは、それぞれ、下線付きの字体、および太字のイタリックの字体によって示される。図１Ｂはまた、以下の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントも示す；（２）Ｏ８ヒト生殖系アクセプター配列（「Ｏ８」または「２」と表示される）；（３）マウス抗体９１１の伸張型ＣＤＲと接続されているアクセプター配列（「ＣＤＲ接続型」または「３」と表示される）；（４）ＣＤＲ接続型アクセプター配列（「３＋親和性変異Ｌ１、Ｌ２」または「４」と表示される）；（５）親和性が変異したＣＤＲ  Ｌ１およびＬ２を含むクローン（「５」または「４＋親和性変異Ｌ３」と表示される）；ならびに、抗体Ｅ３（上記のとおり）。
【図２】図２は、抗体Ｅ３の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７６）を含むポリヌクレオチドを示す。
【図３】図３は、抗体Ｅ３の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７７）を含むポリヌクレオチドを示す。
【図４】図４は、種々の濃度のヒトＮＧＦおよびラットＮＧＦの存在下でのＥ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を示すグラフである。Ｘ軸はＮＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対応し、Ｙ軸はニューロンの数に対応する。
【図５】図５は、０．０４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（およそ１．５ｐＭ；下のパネルに示される）または０．４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（およそ１５ｐＭ；上のパネルに示される）のいずれかの存在下での種々のＦａｂのＮＧＦブロック効果を比較するグラフである。種々の濃度のＦａｂ  Ｅ３；マウス９１１  Ｆａｂ；およびＦａｂ  Ｈ１９−Ｌ１２９、ならびにＦａｂ  ８Ｌ２−６Ｄ５中でのＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存性を評価した。ＩＣ５０（ｐＭ）をそれぞれのＮＧＦ濃度で各Ｆａｂについて計算し、表９に示す。Ｆａｂ  Ｅ３は、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存性を強くブロックし、１５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下ではＩＣ５０はおよそ２１ｐＭ、１．５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下ではＩＣ５０はおよそ１．２ｐＭであった。Ｆａｂ  ３ＣおよびＨ１９−Ｌ１２９もまた、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存性を強くブロックした。両方のパネルにおいて、Ｘ軸は抗体濃度（ｎＭ）に対応し、Ｙ軸はニューロンの数に対応する。１．５ｐＭのＮＧＦは、ＩＣ５０前後であり、１５ｐＭはＮＧＦの飽和濃度を示す。
【図６】図６は、０．０４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（およそ１．５ｐＭ；下のパネルに示される）または０．４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（およそ１５ｐＭ；上のパネルに示される）のいずれかの存在下での種々のＦａｂのＮＧＦブロック効果を比較するグラフである。種々の濃度のＦａｂ  Ｅ３；マウス９１１  Ｆａｂ；およびＦａｂ  Ｈ１９−Ｌ１２９、ならびにＦａｂ  ８Ｌ２−６Ｄ５中でのＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存性を上記のように評価した。ＩＣ５０（ｐＭ）をそれぞれのＮＧＦ濃度で各Ｆａｂについて計算し、表９に示す。Ｆａｂ  Ｅ３は、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存性を強くブロックし、１５ｐＭのラットＮＧＦの存在下ではＩＣ５０はおよそ３１．６ｐＭ、１．５ｐＭのラットＮＧＦの存在下ではＩＣ５０はおよそ１．３ｐＭであった。Ｆａｂ  ３ＣおよびＨ１９−Ｌ１２９もまた、ラットＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存性を強くブロックした。１．５ｐＭのＮＧＦは、ＩＣ５０前後であり、１５ｐＭはＮＧＦの飽和濃度を示す。両方のパネルにおいて、Ｘ軸は抗体濃度（ｎＭ）に対応し、Ｙ軸はニューロンの数に対応する。
【図７】図７は、外科手術の２４時間後に評価した安静時の痛みを示すグラフであり、これは、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体Ｅ３での処置により痛みが軽減されることを示している。「＊」は、陰性対照との統計学的に有意な差（ｐ＜０．５）を示す。
【図８】図８は、外科手術の２４時間後に評価した安静時の痛みを示すグラフであり、これは、０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体Ｅ３での処置により、外科手術後２時間で注射した場合に、安静時の痛みが大きく（ｐ＜０．００５）軽減されることを示している。
【図９】図９は、マウス抗体９１１（Ｆａｂ）のヒトＮＧＦに対する結合親和性のＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を示すグラフである。マウス抗体９１１は、３．７ｎＭのＫＤ、８．４×１０−５ｓ−１のｋｏｆｆ、および２．２×１０４Ｍｓ−１のｋｏｎでＮＧＦに結合した。
【図１０】図１０は、抗体Ｅ３（Ｆａｂ）（「３Ｅ  Ｆａｂ」と呼ばれる）のヒトＮＧＦに対する結合親和性のＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を示すグラフである。Ｅ３は、およそ０．０７ｎＭのＫＤ（ならびに、約６．０×１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ、および４．２×１０−５ｓ−１のｋｏｆｆ）でヒトＮＧＦに結合した。
【図１１】図１１は、ＮＧＦとｔｒｋＡ（黒丸で示される）、およびＮＧＦとｐ７５（白四角で示される）の間で検出される結合の割合（％）により評価される、抗体Ｅ３が、ＮＧＦとその受容体であるｔｒｋＡおよびｐ７５との相互作用をブロックすることを示すグラフである。Ｘ軸は抗体３Ｅ（Ｆａｂ）の濃度に対応し、Ｙ軸はＮＧＦの結合（最大ＲＵに対する割合（％））に対応する。高い濃度のＦａｂ  Ｅ３は、低いシグナルによって示される（ＲＵについて測定した）ように、ＮＧＦとｐ７５およびｔｒｋＡの両方との相互作用をブロックした。抗体Ｅ３（Ｆａｂ）の濃度はＮＧＦ濃度に等しく、ＮＧＦの結合は観察されなかった（ゼロのシグナルによって示されるように）。
【図１２】図１２は、抗体Ｅ３全体、およびＦａｂ  Ｅ３のヒトＮＧＦをブロックする能力を示すグラフである。ヒトＮＧＦ、ならびに種々の濃度のＦａｂ  Ｅ３および抗体Ｅ３の存在下でのＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存性を評価した。Ｘ軸はＮＧＦ結合部位（ｎＭ）に対応し、Ｙ軸は標準化された三叉神経（ＴＧ）ニューロンの数に対応する。抗体Ｅ３全体およびＦａｂ  ３Ｅは、抗体全体およびＦａｂの濃度をＮＧＦ結合部位の数に対して標準化した場合には、同様のレベルの三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性の阻害を示した（Ｆａｂは１つの結合部位を有し、抗体全体は２つの結合部位を有する）。
【図１３】図１３は、種々の濃度（２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４、０．００１２８、および０．０ｎＭ）の抗体Ｅ３（黒三角；「３Ｅ」と表示される）、抗体９１１（黒丸）、およびｔｒｋＡ受容体免疫付着因子（斜線の入った四角；「ｔｒｋＡ−Ｆｃ」と表示される）が、０．４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦの存在下（飽和条件）でＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存的生存性を阻害する能力を示すグラフである。Ｘ軸は抗体の濃度（ｎＭ）に対応し、Ｙ集積はニューロンの数に対応する。これらの結果は、抗体Ｅ３がマウスモノクローナル抗ＮＧＦ抗体９１１またはｔｒｋＡ免疫付着因子のいずれよりも明らかに良好にＮＧＦをブロックしたことを示した。
【図１４】図１４は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３（図中では「３Ｅ」と表示される）またはＦａｂ  ９１１は、２００ｎＭのような高い抗体濃度でもなお、ＮＴ３、ＮＴ４／５、およびＭＳＰによって促進されるニューロンの生存性を阻害しなかったことを示すグラフである。データは、各実験についての陽性対照において観察された生存性（飽和ＮＧＦ濃度の存在下で成長させた三叉神経ニューロンの１００％の生存性）と比較した、４８時間の培養後の生存性の平均の割合（％）を示す。種々の濃度（２０ｎＭ、２ｎＭ、または０．２ｎＭ）のＥ３  Ｆａｂ（図中では「３Ｅ」と表示される）およびマウス抗体９１１  Ｆａｂを、ニュートロフィンを加えずに（「対照」と表示される）、４００ｐＭのＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭ」と表示される）、１０ｎＭのＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭ」と表示される）、または６００ｐＭのＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭ」と表示される）の存在下で使用した。
【図１５】図１５は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３（Ｆａｂまたは抗体全体）（図中では「３Ｅ」と表示される）またはマウス抗体９１１（Ｆａｂまたは抗体全体）は、２００ｎＭのような高い抗体濃度でもなお、ＮＴ３、ＮＴ４／５、およびＭＳＰによって促進されるニューロンの生存性を阻害しなかったことを示すグラフである。種々の濃度（２０ｎＭおよび８０ｎＭ）のＥ３  Ｆａｂおよび抗体全体、ならびにマウス抗体９１１抗体全体およびＦａｂを、ニュートロフィンを加えずに（「因子なし」と表示される）、４００ｐＭのＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭ」と表示される）、１０ｎＭのＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭ」と表示される）、または６００ｐＭのＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭ」と表示される）の存在下で使用した。
【図１６】図１６は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３またはＦａｂ  Ｅ３は、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５、またはＬＩＦによって促進されるＥ１７結節ニューロンの生存性を阻害しなかったことを示すグラフである。マウス抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体９１１もまた試験し、同様の結果を観察した。種々の濃度（２００ｎＭおよび８０ｎＭ）の抗体Ｅ３全体（図中では「３Ｅ」と表示される）、Ｆａｂ  ３Ｅ、抗体９１１全体、またはＦａｂ  ９１１を、ニュートロフィンを加えずに（「因子なし」と表示される）、４００ｐＭのＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭ」と表示される）、４００ｐＭのＮＴ４／５（「ＮＦ４／５−４００ｐＭ」と表示される）、または２．５ｎＭのＬＩＦ（「ＬＩＦ−２．５ｎＭ」と表示される）の存在下で試験した。
【図１７】図１７は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体Ｅ３またはＦａｂ  Ｅ３は、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５、またはＬＩＦによって促進されるＥ１７結節ニューロンの生存性を阻害しなかったことを示すグラフである。種々の濃度（２００ｎＭ、２０ｎＭおよび２ｎＭ）のＦａｂ  ３Ｅ（図中では「３Ｅ」と表示される）またはＦａｂ  ９１１を、ニュートロフィンを加えずに（「対照」と表示される）、４００ｐＭのＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭ」と表示される）、４００ｐＭのＮＴ４／５（「ＮＦ４／５−４００ｐＭ」と表示される）、または２．５ｎＭのＬＩＦ（「ＬＩＦ−２．５ｎＭ」と表示される）の存在下で試験した。
【図１８】図１８は、Ｄ１４（１４日目）およびＤ１９（１９日目）の抗ＮＧＦ抗体（Ｅ３および９１１）の投与後の関節炎のラット（関節リウマチモデル）における侵害刺激反応を示すグラフである。Ｅ３（１４日目および１９日目に１ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．で）、９１１（１４日目および１９日目に１０ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．で）、またはｉｎｄｏ（インドメタシン；１０日間にわたって毎日３ｍｇ／ｋｇをｐ．ｏ．で）を関節炎のマウスに投与した。発声の強さの値を、平均±標準誤差としてｍＶで示す。
【図１９】図１９は、Ｄ１４（１４日目）およびＤ１９（１９日目）の抗ＮＧＦ抗体の投与後の関節炎のラット（関節リウマチモデル）の体重に対する抗ＮＧＦ抗体の効果を示すグラフである。Ｅ３（１４日目および１９日目に１ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．で）、９１１（１４日目および１９日目に１０ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．で）、またはｉｎｄｏ（インドメタシン；１０日間にわたって毎日３ｍｇ／ｋｇをｐ．ｏ．で）を関節炎のマウスに投与した。体重の値を、平均±標準誤差としてグラムで示す。
【図２０】図２０は、Ｄ１４（１４日目）およびＤ１８（１８日目）の種々の用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３（０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇ）の投与後の関節炎のラット（関節リウマチモデル）における侵害刺激反応を示すグラフである。発声の強さの値を、平均±標準誤差としてｍＶで示す。
【図２１】図２１は、Ｄ１４（１４日目）およびＤ１８（１８日目）種々の用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇ）の投与後の関節炎のラット（関節リウマチモデル）における、１４日目の体重に対する割合についての抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の効果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、Ｄ１４（１４日目）およびＤ１８（１８日目）の種々の用量の抗ＮＧＦ抗体Ｅ３（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇ）の投与後の関節炎のラット（関節リウマチモデル）における体重の減少に対する抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の効果を示すグラフである。体重の値を０日に対して標準化した。
【図２３−１】図２３は、連続的なナンバリング、Ｋａｂａｔのナンバリング、およびＣｈｏｔｈｉａのナンバリングを使用してナンバリングした、Ｅ３重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３Ａ）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３Ｂ）を示す。
【図２３−２】図２３は、連続的なナンバリング、Ｋａｂａｔのナンバリング、およびＣｈｏｔｈｉａのナンバリングを使用してナンバリングした、Ｅ３重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３Ａ）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３Ｂ）を示す。
【図２３−３】図２３は、連続的なナンバリング、Ｋａｂａｔのナンバリング、およびＣｈｏｔｈｉａのナンバリングを使用してナンバリングした、Ｅ３重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３Ａ）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３Ｂ）を示す。
【図２３−４】図２３は、連続的なナンバリング、Ｋａｂａｔのナンバリング、およびＣｈｏｔｈｉａのナンバリングを使用してナンバリングした、Ｅ３重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３Ａ）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３Ｂ）を示す。