(57)【要約】免疫細胞であり、免疫細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、任意選択で、ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を組換え発現する細胞が本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞などの免疫賦活性細胞である。ある特定の実施形態では、免疫細胞は、免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などである。ウイルス抗原を認識し、それに感作される免疫細胞であって、免疫細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する免疫細胞も本明細書に開示される。細胞は、ウイルス抗原である抗原に感作させることができる。そのような細胞を使用して、ウイルス感染の処置を必要とする対象におけるウイルス感染を処置する方法がさらに提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞である細胞であって、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および（ｂ）前記免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、前記ＣＡＲがウイルス抗原に結合する、細胞。
【請求項２】
免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞の集団であって、該細胞集団は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および（ｂ）前記免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、前記ＣＡＲがウイルス抗原に結合する細胞を含む、集団。
【請求項３】
前記免疫賦活性細胞がＴ細胞である、請求項１または２に記載の細胞または細胞集団。
【請求項４】
前記前駆体細胞が、造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５】
前記免疫賦活性細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１または２に記載の細胞または細胞集団。
【請求項７】
前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１または２に記載の細胞または細胞集団。
【請求項８】
前記細胞がメモリーＴ細胞である、請求項１または２に記載の細胞または細胞集団。
【請求項９】
前記メモリーＴ細胞が、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項８に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０】
ウイルス抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞であって、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、Ｔ細胞。
【請求項１１】
免疫賦活性である、請求項１０に記載のＴ細胞。
【請求項１２】
ＣＤ４＋である、請求項１０または１１に記載のＴ細胞。
【請求項１３】
ＣＤ８＋である、請求項１０または１１に記載のＴ細胞。
【請求項１４】
ウイルス抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞の集団であって、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現するＴ細胞を含むＴ細胞の集団。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞が免疫賦活性である、請求項１４に記載の集団。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋である、請求項１４または１５に記載の集団。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋である、請求項１４または１５に記載の集団。
【請求項１８】
ヒトに由来する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１９】
前記ウイルス抗原が、ヒト病原体であるウイルスの抗原である、請求項１８に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２０】
前記ウイルス抗原が、前記ウイルスに感染したヒト対象における免疫応答を引き出すことができる、請求項１から１９のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２１】
前記ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）抗原、アデノウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原からなる群から選択される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２２】
前記ウイルス抗原が、群特異的抗原（ｇａｇ）タンパク質、ｐ５５、ｐ２４、ｐ１８、エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、逆転写酵素（ｐｏｌ）、ｐ６６、およびｐ３１からなる群から選択されるＨＩＶ抗原である、請求項２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２３】
前記ウイルス抗原が、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｍ、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｌ、およびＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ、ＭまたはＬのＳドメインからなる群から選択されるＨＢＶ抗原である、請求項２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２４】
前記ウイルス抗原が、コアタンパク質、エンベロープタンパク質Ｅ１、エンベロープタンパク質Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５からなる群から選択されるＨＣＶ抗原である、請求項２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２５】
前記ウイルス抗原が、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＣ、ｇＧ、ｇＫ、ｇＭ、およびｇＥの細胞外ドメインからなる群から選択されるＨＳＶ抗原である、請求項２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２６】
前記ウイルス抗原が、ｇＥおよびｇＩからなる群から選択されるＶＺＶ抗原である、請求項２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２７】
前記ウイルス抗原が、ヘキソンタンパク質およびペントンタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルス抗原である、請求項２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２８】
前記ウイルス抗原が、ｐｐ６５、前初期（ＩＥ）抗原、およびＩＥ１からなる群から選択されるＣＭＶ抗原である、請求項２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項２９】
前記ウイルス抗原が、潜伏期膜タンパク質２（ＬＭＰ２）、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）、およびＢＺＬＦ１からなる群から選択されるＥＢＶ抗原である、請求項２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項３０】
前記細胞媒介性免疫応答の阻害剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項３１】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）、およびＣＤ１６０からなる群から選択される、請求項３０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項３２】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１である、請求項３１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項３３】
前記細胞媒介性免疫応答の阻害剤が、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）受容体である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項３４】
前記細胞が、自殺遺伝子をさらに組換え発現する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項３５】
前記自殺遺伝子が、誘導性カスパーゼ９を含む、請求項３４に記載の細胞または細胞集団。
【請求項３６】
ウイルス抗原を認識し、それに感作される調節性Ｔ細胞であって、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、調節性Ｔ細胞。
【請求項３７】
ウイルス抗原を認識し、それに感作される調節性Ｔ細胞の集団であって、該細胞の集団が、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現するＴ細胞を含む、集団。
【請求項３８】
前記調節性Ｔ細胞が、慢性ウイルス感染を有する対象から単離される、請求項３６または３７に記載の細胞または細胞集団。
【請求項３９】
ウイルス感染を有する対象から単離された調節性Ｔ細胞であって、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、調節性Ｔ細胞。
【請求項４０】
ウイルス感染を有する対象から単離された調節性Ｔ細胞の集団であって、該細胞の集団が、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する調節性Ｔ細胞を含む、集団。
【請求項４１】
ヒトに由来する、請求項３９または４０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項４２】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項４１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項４３】
前記ウイルス感染が慢性ウイルス感染である、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項４４】
前記ウイルス感染が、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項４５】
ウイルス感染を有する対象から単離され、免疫抑制細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、免疫抑制細胞。
【請求項４６】
ウイルス感染を有する対象から単離された免疫抑制細胞の集団であって、該細胞の集団が、免疫抑制細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する免疫抑制細胞を含む、集団。
【請求項４７】
ヒトに由来する、請求項４５または４６に記載の細胞または細胞集団。
【請求項４８】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項４７に記載の細胞または細胞集団。
【請求項４９】
前記ウイルス感染が、慢性ウイルス感染である、請求項４５から４８のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５０】
前記免疫抑制細胞が、調節性Ｔ細胞である、請求項４５または４６に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５１】
前記免疫抑制細胞が、前記ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原を認識し、それに感作される、請求項４５から４９のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５２】
前記免疫抑制細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を組換え発現し、前記ＣＡＲが、前記ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原に結合する、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５３】
前記調節性Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞である、請求項３６から４４または５０から５２のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５４】
前記調節性Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋Ｔ細胞である、請求項３６から４４または５０から５２のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５５】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋であり、ウイルス抗原に感作され、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、ヒト調節性Ｔ細胞のポリクローナル集団。
【請求項５６】
前記ヒト調節性Ｔ細胞が、ＣＤ１２７ｌｏ／−である、請求項５５に記載の細胞のポリクローナル集団。
【請求項５７】
ヒトに由来する、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５８】
前記ウイルス抗原が、ヒト病原体であるウイルスの抗原である、請求項５７に記載の細胞または細胞集団。
【請求項５９】
前記ウイルス抗原が、前記ウイルスに感染したヒト対象における免疫応答を引き出すことができる、請求項３６から３８または５１から５８のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６０】
前記ウイルス抗原が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）抗原、アデノウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原からなる群から選択される、請求項３６から３８または５１から５９のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６１】
前記ウイルス抗原が、コアタンパク質、エンベロープタンパク質Ｅ１、エンベロープタンパク質Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５からなる群から選択されるＨＣＶ抗原である、請求項６０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６２】
前記ウイルス抗原が、群特異的抗原（ｇａｇ）タンパク質、ｐ５５、ｐ２４、ｐ１８、エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、逆転写酵素（ｐｏｌ）、ｐ６６、およびｐ３１からなる群から選択されるＨＩＶ抗原である、請求項６０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６３】
前記ウイルス抗原が、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｍ、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｌ、およびＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ、ＭまたはＬのＳドメインからなる群から選択されるＨＢＶ抗原である、請求項６０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６４】
前記ウイルス抗原が、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＣ、ｇＧ、ｇＫ、ｇＭ、およびｇＥの細胞外ドメインからなる群から選択されるＨＳＶ抗原である、請求項６０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６５】
前記ウイルス抗原が、ｇＥおよびｇＩからなる群から選択されるＶＺＶ抗原である、請求項６０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６６】
前記ウイルス抗原が、ヘキソンタンパク質およびペントンタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルス抗原である、請求項６０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６７】
前記ウイルス抗原が、ｐｐ６５、前初期（ＩＥ）抗原、およびＩＥ１からなる群から選択されるＣＭＶ抗原である、請求項６０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６８】
前記ウイルス抗原が、潜伏期膜タンパク質２（ＬＭＰ２）、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）、およびＢＺＬＦ１からなる群から選択されるＥＢＶ抗原である、請求項６０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項６９】
前記細胞媒介性免疫応答の阻害剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項３６から６８のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項７０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）、およびＣＤ１６０からなる群から選択される、請求項６９に記載の細胞または細胞集団。
【請求項７１】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１である、請求項７０に記載の細胞または細胞集団。
【請求項７２】
前記細胞媒介性免疫応答の阻害剤が、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）受容体である、請求項３６から６８のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項７３】
前記細胞が、自殺遺伝子をさらに組換え発現する、請求項３６から７２のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項７４】
前記自殺遺伝子が、誘導性カスパーゼ９を含む、請求項７３に記載の細胞または細胞集団。
【請求項７５】
免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞である細胞であって、
（ａ）ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、
（ｃ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）前記ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態と
を組換え発現する細胞。
【請求項７６】
免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞の集団であって、該細胞の集団が、
（ａ）ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、
（ｃ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）前記ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態と
を組換え発現する細胞を含む、集団。
【請求項７７】
前記第２のドミナントネガティブ形態の共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項７５または７６に記載の細胞または集団。
【請求項７８】
前記ＣＡＲが、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項７５から７７のいずれか一項に記載の細胞または集団。
【請求項７９】
前記第２のドミナントネガティブ形態の共刺激シグナル伝達ドメインが、前記ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインと異なる、請求項７８に記載の細胞または集団。
【請求項８０】
前記ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項７８または７９に記載の細胞または集団。
【請求項８１】
前記免疫賦活性細胞がＴ細胞である、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項８２】
前記前駆体細胞が、造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項７５から８１のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項８３】
前記免疫賦活性細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である、請求項７５から８２のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項８４】
前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項８５】
前記細胞がメモリーＴ細胞である、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項８６】
前記メモリーＴ細胞が、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項８５に記載の細胞または細胞集団。
【請求項８７】
ウイルス感染を有する対象から単離された免疫抑制細胞であって、
（ａ）前記ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（ｂ）前記免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、
（ｃ）前記免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）前記ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態と
を組換え発現する、免疫抑制細胞。
【請求項８８】
ウイルス感染を有する対象から単離された免疫抑制細胞の集団であって、該細胞の集団が、
（ａ）前記ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（ｂ）前記免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、
（ｃ）前記免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）前記ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態と
を組換え発現する、免疫抑制細胞を含む、集団。
【請求項８９】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項８７または８８に記載の細胞または集団。
【請求項９０】
前記ＣＡＲが、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項８７から８９のいずれか一項に記載の細胞または集団。
【請求項９１】
前記第２のドミナントネガティブ形態の共刺激シグナル伝達ドメインが、前記ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインと異なる、請求項９０に記載の細胞または集団。
【請求項９２】
前記ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項９０または９１に記載の細胞または集団。
【請求項９３】
ヒトに由来する、請求項８７から９２のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項９４】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項９３に記載の細胞または細胞集団。
【請求項９５】
前記ウイルス感染が、慢性ウイルス感染である、請求項８７から９４のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項９６】
前記免疫抑制細胞が、調節性Ｔ細胞である、請求項８７から９５のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項９７】
前記調節性Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞である、請求項９６に記載の細胞または細胞集団。
【請求項９８】
前記調節性Ｔ細胞が、ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋Ｔ細胞である、請求項９６に記載の細胞または細胞集団。
【請求項９９】
免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞である細胞であって、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および（ｂ）前記免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、前記ＣＡＲが病原体の抗原に結合する、細胞。
【請求項１００】
免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞の集団であって、該細胞集団は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および（ｂ）前記免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、前記ＣＡＲが病原体の抗原に結合する細胞を含む、集団。
【請求項１０１】
前記免疫賦活性細胞がＴ細胞である、請求項９９または１００に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０２】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋である、請求項１０１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０３】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋である、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０４】
前記前駆体細胞が、造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項９９または１００に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０５】
前記免疫賦活性細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である、請求項９９から１００のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０６】
前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項９９または１００に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０７】
前記細胞がメモリーＴ細胞である、請求項９９または１００に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０８】
前記メモリーＴ細胞が、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１０７に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０９】
病原体の抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞であって、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、Ｔ細胞。
【請求項１１０】
免疫賦活性である、請求項１０９に記載のＴ細胞。
【請求項１１１】
ＣＤ４＋である、請求項１０９または１１０に記載のＴ細胞。
【請求項１１２】
ＣＤ８＋である、請求項１０９または１１０に記載のＴ細胞。
【請求項１１３】
病原体の抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞の集団であって、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現するＴ細胞を含むＴ細胞の集団。
【請求項１１４】
前記Ｔ細胞が免疫賦活性である、請求項１１３に記載の集団。
【請求項１１５】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋である、請求項１１３または１１４に記載の集団。
【請求項１１６】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋である、請求項１１３または１１４に記載の集団。
【請求項１１７】
ヒトに由来する、請求項９９から１１６のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１１８】
前記病原体が、ヒト病原体である、請求項１１７に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１１９】
前記病原体の抗原が、前記病原体に感染したヒト対象における免疫応答を引き出すことができる、請求項９９から１１８のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１２０】
前記病原体が、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項９９から１１９のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１２１】
前記細胞媒介性免疫応答の阻害剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項９９から１２０のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１２２】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）、およびＣＤ１６０からなる群から選択される、請求項１２１に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１２３】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１である、請求項１２２に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１２４】
前記細胞媒介性免疫応答の阻害剤が、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）受容体である、請求項９９から１２０のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１２５】
前記細胞が、自殺遺伝子をさらに組換え発現する、請求項９９から１２４のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１２６】
前記自殺遺伝子が、誘導性カスパーゼ９を含む、請求項１２５に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１２７】
治療有効量の、請求項１、３から１３または１５から３５のいずれか一項に記載の細胞；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１２８】
治療有効量の、請求項２から９または１４から３５のいずれか一項に記載の細胞の集団；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１２９】
治療有効量の、請求項３６、３８、３９、４１から４４、５０、５３、５４または５７から７４のいずれか一項に記載の調節性Ｔ細胞；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３０】
治療有効量の、請求項３７、３８、４０から４４、５０または５３から７４のいずれか一項に記載の調節性Ｔ細胞の集団；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３１】
治療有効量の、請求項４５、４７から４９、５１または５２のいずれか一項に記載の免疫抑制細胞；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３２】
治療有効量の、請求項４６から４９、５１または５２のいずれか一項に記載の免疫抑制細胞の集団；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３３】
治療有効量の、請求項７５または７７から８６のいずれか一項に記載の免疫賦活性細胞；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３４】
治療有効量の、請求項７６から８６のいずれか一項に記載の免疫賦活性細胞の集団；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３５】
治療有効量の、請求項８７または８９から９８のいずれか一項に記載の免疫抑制細胞；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３６】
治療有効量の、請求項８８から９８のいずれか一項に記載の免疫抑制細胞の集団；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３７】
治療有効量の、請求項９９、１０１から１１２または１１７から１２６のいずれか一項に記載の細胞；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３８】
治療有効量の、請求項１００から１０８または１１３から１２６のいずれか一項に記載の細胞の集団；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３９】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項１から３５のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、前記ウイルス感染に関連する抗原である、方法。
【請求項１４０】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項１２７または１２８に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、前記ウイルス感染に関連する抗原である、方法。
【請求項１４１】
前記対象が、ヒトである、請求項１３９または１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ウイルス感染が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である、請求項１３９から１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ドミナントネガティブ形態の発現が、ウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進する、請求項１３９から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項３６から４４、５０または５３から７４のいずれか一項に記載の調節性Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞の集団の治療有効量を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、前記ウイルス感染に関連する抗原である、方法。
【請求項１４６】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項１２９または１３０に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、前記ウイルス感染に関連する抗原である、方法。
【請求項１４７】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項４５から４９、５１または５２のいずれか一項に記載の免疫抑制細胞または免疫抑制細胞の集団の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１４８】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に請求項１３１または１３２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１４９】
前記対象が、ヒトである、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ウイルス感染が、慢性ウイルス感染である、請求項１４５から１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ウイルス感染が、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である、請求項１４５から１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、
（ａ）前記対象からウイルス特異的Ｔ細胞を単離するステップと
（ｂ）前記細胞においてＰＤ−１のドミナントネガティブ形態を発現させるステップと、
（ｃ）前記細胞を前記対象に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１５４】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、
（ａ）前記対象からウイルス特異的Ｔ細胞を単離するステップと、
（ｂ）前記細胞においてＰＤ−１のドミナントネガティブ形態を発現させるステップであって、前記ＰＤ−１のドミナントネガティブ形態の発現が、ウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進するステップと、
（ｃ）前記細胞を前記対象に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１５５】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、
（ａ）慢性ウイルス感染を有する対象から調節性Ｔ細胞を単離するステップと、
（ｂ）前記細胞においてＰＤ−１のドミナントネガティブ形態を発現させるステップと、
（ｃ）前記細胞を前記対象に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１５６】
前記対象が、ヒトである、請求項１５３から１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ウイルス感染が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である、請求項１５３から１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ウイルス感染が、ＨＩＶによる感染である、請求項１５３、１５６または１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ウイルス感染が、ＨＢＶによる感染である、請求項１５４、１５６または１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ウイルス感染が、ＨＣＶによる感染である、請求項１５５から１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記投与するステップが、胸膜内投与、静脈内投与、皮下投与、結節内投与、肝内投与、くも膜下腔内投与、腹腔内投与、頭蓋内投与、または胸腺への直接投与による、請求項１３９から１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記細胞が、体重１キログラム当たり細胞１０４〜１０１０個の範囲の用量で投与される、請求項１３９から１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記用量が、体重１キログラム当たり細胞３×１０５〜３×１０６個の範囲である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記細胞または細胞集団が前記対象にとって自己由来である、請求項１３９から１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項７５から８６のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、前記ウイルス感染に関連する抗原である、方法。
【請求項１６７】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項１３３または１３４に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、前記ウイルス感染に関連する抗原である、方法。
【請求項１６８】
前記対象が、ヒトである、請求項１６６または１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記ウイルス感染が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である、請求項１６６から１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記第１のドミナントネガティブ形態の発現が、前記対象におけるウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進する、請求項１６６から１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項８７から９８のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、前記ウイルス感染に関連する抗原である、方法。
【請求項１７３】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項１３５または１３６に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、前記ウイルス抗原が、前記ウイルス感染に関連する抗原である、方法。
【請求項１７４】
前記対象が、ヒトである、請求項１７２または１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記ウイルス感染が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である、請求項１７２から１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記第１のドミナントネガティブ形態の発現が、前記対象におけるウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進する、請求項１７２から１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、
（ａ）免疫賦活性細胞であり、（ｉ）ウイルス感染に関連する抗原であるウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）前記免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（Ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（Ｂ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、ドミナントネガティブ形態とを組換え発現する第１の細胞または前記第１の細胞の第１の集団；ならびに
（ｂ）免疫賦活性細胞であり、（ｉ）ウイルス感染に関連する抗原であるウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）前記免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態であって、（Ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（Ｂ）膜貫通ドメイン、および（Ｃ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、ドミナントネガティブ形態とを組換え発現する第２の細胞または前記第２の細胞の第２の集団
の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１７９】
前記対象が、ヒトである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記ウイルス感染が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である、請求項１７８から１８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、前記対象に、
（ａ）免疫抑制細胞であり、（ｉ）ウイルス感染に関連する抗原であるウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）前記免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（Ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（Ｂ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、ドミナントネガティブ形態とを組換え発現する第１の細胞または前記第１の細胞の第１の集団；ならびに
（ｂ）免疫抑制細胞であり、（ｉ）ウイルス感染に関連する抗原であるウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）前記免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態であって、（Ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（Ｂ）膜貫通ドメイン、および（Ｃ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインとの融合を含むポリペプチドである、ドミナントネガティブ形態とを組換え発現する第２の細胞または前記第２の細胞の第２の集団
の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１８３】
前記対象が、ヒトである、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記ウイルス感染が、ヒト病原体であるウイルスによる感染である、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記ウイルス感染が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である、請求項１８２から１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記細胞または細胞集団が前記対象にとって自己由来である、請求項１６６から１８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
病原体によって引き起こされる感染の処置を必要とする対象において病原体によって引き起こされる感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項９９から１２６のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、ＣＡＲが結合するまたはＴ細胞が感作される前記病原体の抗原が、前記感染を引き起こす病原体の抗原である、方法。
【請求項１８８】
病原体によって引き起こされる感染の処置を必要とする対象において病原体によって引き起こされる感染を処置する方法であって、前記対象に、請求項１３７または１３８に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが結合するまたはＴ細胞が感作される前記病原体の抗原が、前記感染を引き起こす病原体の抗原である、方法。
【請求項１８９】
前記対象が、ヒトである、請求項１８７または１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記感染を引き起こす病原体が、ヒト病原体である、請求項１８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年８月３０日に出願された米国仮出願番号第６２／３８１，２１９号、および２０１７年３月８日に出願された米国仮出願番号第６２／４６８，８８１号の利益を主張しており、これら各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
２．電子的に提出された配列表への言及
本出願は、本出願と共に、配列表を、２０１７年８月２２日に作成され、サイズが５９，３７８バイトである「１３５４２−０３８−２２８＿ＳＬ．ＴＸＴ」という表題のＡＳＣＩＩテキストファイルとして参照により組み込む。
【０００３】
３．分野
本発明は、一般に、ウイルス感染の処置、より詳細には、ウイルス感染を処置するための免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．背景
ウイルス感染は、広範囲の疾患を引き起こすことが公知である。急性ウイルス感染は、ウイルス複製、蔓延、二次複製、組織損傷およびシェディングを特徴とする(Virginら、Cell  138(1):30-50  (2009))。感染した対象が急性ウイルス感染にもかかわらず生存している場合、宿主免疫系により感染が一掃されたか、または感染が持続しているかである。
【０００５】
持続性ウイルス感染は、個体から一掃されておらず、個体の細胞において残存または持続しているウイルス感染であると特徴付けられる（Boldoghら、“Persistent  Viral  Infections”，  Medical  Microbiology,  第4版,  編者Baron,  第46章,  The  University  of  Texas  Medical  Branch  at  Galveston  (1996);  Virginら、Cell  138(1):30-50  (2009)を参照されたい）。持続性ウイルス感染は、潜伏感染、慢性感染、または遅発性感染に分類することができる（Boldoghら、上記、１９９６年）。
【０００６】
潜伏感染は、再発疾患のエピソード間に実証可能な感染性ウイルスを欠く。慢性感染では、一次感染に続いて感染性ウイルスが継続して存在し、慢性疾患または再発疾患を含み得る。遅発性感染は、長期にわたる潜伏期間を伴い、その後に進行性疾患が続く（Boldoghら、上記、１９９６年）。潜伏感染および慢性感染とは異なり、遅発性感染は、必ずしもウイルス増殖の急性期間で始まらない。持続感染の間、ウイルスゲノムは、細胞内ＤＮＡに安定に組み込まれ得るまたはエピソームとして維持され得る（Boldoghら、上記、１９９６年を参照されたい）。
【０００７】
いくつものウイルス感染が持続感染になる傾向がある。そのようなウイルス感染の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染が挙げられる。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染はまた、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連する医学的状態にも至る可能性がある(Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,  第20版,  pp.  1837-1891,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996);  Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1791-1856,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998))。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染は、主に肝臓に影響を及ぼし、肝硬変を伴う進行性慢性肝疾患、および一部の場合では肝細胞癌に至る可能性がある(Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,  第20版,  pp.  762-767,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996);  Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,  第14版,  pp.  1677-1681,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998))。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染は、同じく主に肝臓に影響を及ぼし、同じく肝硬変を伴う進行性慢性肝疾患、および一部の場合では肝細胞癌に至る可能性がある(Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,  20th  ed.,  pp.  762-764,  767-769,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996);  Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,  第14版,  pp.  1677,  1681-1682,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998))。そのようなウイルス感染は持続感染に至る可能性がある。
【０００８】
他のウイルス感染としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）による感染、水痘帯状疱疹ウイルスまたは（ＶＺＶ）による感染、アデノウイルスによる感染、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）による感染、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）による感染が挙げられる。ＨＳＶによる感染は、通常ＨＳＶ−１によって引き起こされる歯肉口内炎、例えば口唇単純ヘルペス（口唇ヘルペス）に至る可能性がある(Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  1770-1774,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996);  Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1080-1086,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998))。ＨＳＶによる感染はまた、最も一般的にはＨＳＶ−２によって引き起こされる性器ヘルペス；通常ＨＳＶ−１によって引き起こされ、結膜炎を伴うことも多い角膜ヘルペス；通常ＨＳＶ−２によって引き起こされる新生児ＨＳＶ感染；および通常ＨＳＶ−１によって引き起こされる単純ヘルペス脳炎も引き起こす可能性がある。ＨＳＶによる感染は潜伏感染になる可能性がある(Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  1770-1774,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996);  Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,  第14版,  pp.  1080-1086,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998))。
【０００９】
ＶＺＶによる感染は、水痘を引き起こす可能性がある（Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine、第２０版、１７６３〜１７６５頁、W.B.  Saunders、Philadelphia  PA（１９９６年）；Fauciら、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１４版、１０８６〜１０８９頁、McGraw-Hill、San  Francisco  CA（１９９８年））。潜伏感染は、通常は感覚神経節内に潜伏しているＶＺＶの再活性化によって引き起こされる帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）（帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ））に発展する可能性がある(Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,  第20版,  pp.  2093-2095,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996);  Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1086-1089,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998))。アデノウイルスによる感染は、眼を含めた種々のヒト上皮組織における疾患（咽頭結膜熱；流行性角結膜炎）、上気道疾病（急性咽頭炎；滲出性扁桃炎）および下気道疾病（肺炎）を含めた気道の疾病、泌尿器疾患（出血性膀胱炎）、ならびに胃腸疾患（胃腸炎）を引き起こす可能性がある(Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  1757-1759,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996);  Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1104-1105,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998))。
【００１０】
ＣＭＶによる感染は、伝染性単核球症および先天性感染を引き起こす可能性がある（Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine、第２０版、１７７４〜１７７６頁、W.B.  Saunders、Philadelphia  PA（１９９６年）；Fauciら、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１４版、１０９２〜１０９５頁、McGraw-Hill、San  Francisco  CA（１９９８年））。ＥＢＶによる感染は、慢性単核球症または慢性疲労症候群を含めた伝染性単核球症を引き起こす可能性があり、また、ＥＢＶ潜伏感染は、免疫抑制された患者におけるＢリンパ腫に関連付けられている(Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,  第20版,  pp.  1776-1779,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996);  Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1089-1091,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998))。
【００１１】
Ｔ細胞の機能障害は多くのヒトウイルス感染の特性である（Dayら、Nature、４４３巻：３５０〜３５４頁（２００６年）およびそこで引用されている参考文献を参照されたい）。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞の負の調節因子であり、消耗したウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上で著しく上方調節される(Ishidaら、EMBO  J.  11:3887-3895  (1992);  Noshimuraら、Immunity  11:141-151  (1999);  Sharpeら、Nat.  Rev.  Immunol.  2:116-126  (2002);  Che,  Nat.  Rev.  Immunol.  4:336-347  (2004);  Barberら、Nature  439:682-687  (2006))。ＰＤリガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても公知）に対する抗体を使用してこの経路を遮断することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能が回復し、ウイルス負荷量が低減する(Barberら、Nature  439:682-687  (2006))。ＰＤ−１はＴ細胞上で有意に上方調節され、発現はＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞機能障害ならびに疾患の進行の予測因子と相関し、血漿中ウイルス負荷量とは正に相関し、ＣＤ４＋Ｔ細胞数とは逆に相関することが見出された(Dayら、Nature  443:350-354  (2006))。ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＰＤ−１発現は、同様に、ウイルス負荷量との正相関およびＣＤ４＋Ｔ細胞数との逆相関を示し、当該経路の遮断により、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞機能が増大した（Dayら、Nature、４４３巻：３５０〜３５４頁（２００６年））。Dayら（上記、２００６年）に記載されている結果から、免疫調節性ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路がヒトにおける持続性ウイルス感染の間作動的であり、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞機能の可逆的欠陥を定義するものであることが示される(Dayら、Nature  443:350-354  (2006))。
【００１２】
ＰＤ−１媒介性阻害性シグナル伝達は、感染の急性期のＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能を弱めるだけでなく、疾患消散後のＨＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の発生と相関する(Zhangら、J.  Hepatol.  50:1163-1173  (2009))。Ｂ型肝炎の患者に関する研究では、ＰＤ−１が有意に上方調節され、その後、ＨＢＶ特異的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的抑制が生じ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断により、ＨＢＶ特異的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生が増強された（Zhangら、上記、２００９年）。疾患消散後、ＨＢＶ特異的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞はメモリーＴ細胞に発達した。この期間中、動的ＰＤ−１減少がＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度の低下と数値的に相関し、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１２７発現の獲得と表現型的に相関し、メモリーＴ細胞の増殖およびＩＦＮ−ガンマ産生の増大と機能的に相関した（Zhangら、上記、２００９年）。
慢性ウイルス感染は、急性感染とは異なり、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の大きな増加およびそれらによるＰＤ−１の上方調節につながる（Parkら、上記、J.  Immunol.、１９４巻：５８０１〜５８１１頁（２０１５年））。慢性感染マウス由来のＴｒｅｇ細胞（慢性Ｔｒｅｇ細胞）は、ナイーブなマウスまたは急性感染マウス由来のＴｒｅｇ細胞よりも、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の両方の阻害について、およびその後のサイトカイン産生の阻害について、大きな抑制能を示した（Parkら、上記、２０１５年）。ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の強力な抑制のためにはＴｒｅｇ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の接触が必要であった。より重要なことに、抑制には、慢性Ｔｒｅｇ細胞上のＰＤ−１とＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１リガンドの細胞特異的発現および相互作用が必要であった（Parkら、上記、２０１５年）。
Ｔ細胞治療は、以前に記載されており、宿主免疫系を利用してがんまたはウイルス感染を処置または排除するものである（「T  Cell  Therapies:  An  Overview」、Catapult  Cell  and  Gene  Therapy、White  Paper  1(ct.catapult.org.uk/wp-content/uploads/2016/03/Review-of-T-cell-Receptor-Therapies-2014_v2.pdf)  (2014);  Rooneyら、Mol.  Ther.  Nucleic  Acids  1:e55,  doi:  10.1038/mtna.2012.49  (2012)を参照されたい）。そのような治療としては、遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）治療およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）治療が挙げられる（「T  Cell  Therapies：An  Overview」、Catapult  Cell  and  Gene  Therapy、White  Paper  1(ct.catapult.org.uk/wp-content/uploads/2016/03/Review-of-T-cell-Receptor-Therapies-2014_v2.pdf)(2014)を参照されたい）。がんなどの状態の処置におけるＣＡＲ治療の使用は、以前に記載されている（例えば、Sadelainら、Cancer  Discov.  3(4):388-398  (2013);  Jensenら、Immunol.  Rev.  257:127-133  (2014);  Sharpeら、Dis.  Model  Mech.  8(4):337-350  (2015);  Brentjensら、Clin.  Cancer  Res.  13:5426-5435  (2007);  Gadeら、Cancer  Res.  65:9080-9088  (2005);  Maherら、Nat.  Biotechnol.  20:70-75  (2002);  Kershawら、J.  Immunol.  173:2143-2150  (2004);  Sadelainら、Curr.  Opin.  Immunol.  21(2):215-223  (2009);  Hollymanら、J.  Immunother.  32:169-180  (2009);  WO/2015/188141を参照されたい）。
【００１３】
慢性ウイルス感染などのウイルス感染の改善された処置をもたらすための治療が必要とされている。本発明の目的は、この必要性を満たすことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１８８１４１号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Virginら、Cell  138(1):30-50  (2009)
【非特許文献２】Boldoghら、”Persistent  Viral  Infections”，  Medical  Microbiology,第4版,  編者Baron,  第46章,  The  University  of  Texas  Medical  Branch  at  Galveston  (1996)
【非特許文献３】Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  1837-1891,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996)
【非特許文献４】Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1791-1856,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998)
【非特許文献５】Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  762-767,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996)
【非特許文献６】Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1677-1681,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998)
【非特許文献７】Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  762-764,  767-769,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996)
【非特許文献８】Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1677,  1681-1682,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998)
【非特許文献９】Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  1770-1774,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996)
【非特許文献１０】Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1080-1086,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998)
【非特許文献１１】Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  1770-1774,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996)
【非特許文献１２】Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1080-1086,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998)
【非特許文献１３】Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  2093-2095,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996)
【非特許文献１４】Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1086-1089,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998)
【非特許文献１５】Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  1757-1759,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996)
【非特許文献１６】Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1104-1105,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998)
【非特許文献１７】Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine,第20版,  pp.  1776-1779,  W.B.  Saunders,  Philadelphia  PA  (1996)
【非特許文献１８】Fauciら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,第14版,  pp.  1089-1091,  McGraw-Hill,  San  Francisco  CA  (1998)
【非特許文献１９】Ishidaら、EMBO  J.  11:3887-3895  (1992)
【非特許文献２０】Noshimuraら、Immunity  11:141-151  (1999)
【非特許文献２１】Sharpeら、Nat.  Rev.  Immunol.  2:116-126  (2002)
【非特許文献２２】Che,  Nat.  Rev.  Immunol.  4:336-347  (2004)
【非特許文献２３】Barberら、Nature  439:682-687  (2006)
【非特許文献２４】Dayら、Nature  443:350-354  (2006)
【非特許文献２５】Zhangら、J.  Hepatol.  50:1163-1173  (2009)
【非特許文献２６】”T  Cell  Therapies:  An  Overview”  Catapult  Cell  and  Gene  Therapy,  White  Paper  1  (ct.catapult.org.uk/wp-content/uploads/2016/03/Review-of-T-cell-Receptor-Therapies-2014_v2.pdf)  (2014)
【非特許文献２７】Rooneyら、Mol.  Ther.  Nucleic  Acids  1:e55,  doi:  10.1038/mtna.2012.49  (2012)
【非特許文献２８】Sadelainら、Cancer  Discov.  3(4):388-398  (2013);  Jensenら、Immunol.  Rev.  257:127-133  (2014)
【非特許文献２９】Sharpeら、Dis.  Model  Mech.  8(4):337-350  (2015)
【非特許文献３０】Brentjensら、Clin.  Cancer  Res.  13:5426-5435  (2007)
【非特許文献３１】Gadeら、Cancer  Res.  65:9080-9088  (2005)
【非特許文献３２】Maherら、Nat.  Biotechnol.  20:70-75  (2002)
【非特許文献３３】Kershawら、J.  Immunol.  173:2143-2150  (2004)
【非特許文献３４】Sadelainら、Curr.  Opin.  Immunol.  21(2):215-223  (2009)
【非特許文献３５】Hollymanら、J.  Immunother.  32:169-180  (2009)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
５．発明の概要
本発明は、免疫細胞であり、免疫細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、任意選択で、ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を組換え発現する細胞に関する。
【００１７】
１つの態様では、免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞である細胞であって、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、ＣＡＲがウイルス抗原に結合する、細胞が本明細書中に提供される。別の態様では、免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞の集団であって、該細胞集団は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、ＣＡＲがウイルス抗原に結合する細胞を含む、集団が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、免疫賦活性細胞はＴ細胞である。ある特定の実施形態では、前駆体細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。特定の実施形態では、免疫賦活性細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。別の特定の実施形態では、細胞はＴ細胞である。別の特定の実施形態では、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。別の特定の実施形態では、細胞はメモリーＴ細胞である。別の特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００１８】
別の態様では、ウイルス抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞であって、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、Ｔ細胞が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は免疫賦活性である。特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋である。別の特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋である。
【００１９】
別の態様では、ウイルス抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞の集団であって、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現するＴ細胞を含むＴ細胞の集団が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は免疫賦活性である。特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋である。別の特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋である。
【００２０】
本発明のある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、ヒトに由来する。本発明のある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ヒト病原体であるウイルスの抗原である。本発明のある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ウイルスに感染したヒト対象における免疫応答を引き出すことができる。
【００２１】
本発明のある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）抗原、アデノウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原からなる群から選択される。特定の実施形態では、ウイルス抗原は、群特異的抗原（ｇａｇ）タンパク質、ｐ５５、ｐ２４、ｐ１８、エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、逆転写酵素（ｐｏｌ）、ｐ６６、およびｐ３１からなる群から選択されるＨＩＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｍ、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｌ、およびＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ、ＭまたはＬのＳドメインからなる群から選択されるＨＢＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、コアタンパク質、エンベロープタンパク質Ｅ１、エンベロープタンパク質Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４（例えば、ＮＳ４ＡまたはＮＳ４Ｂ）、およびＮＳ５（例えば、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂ）からなる群から選択されるＨＣＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＣ、ｇＧ、ｇＫ、ｇＭ、およびｇＥの細胞外ドメインからなる群から選択されるＨＳＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ｇＥおよびｇＩからなる群から選択されるＶＺＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ヘキソンタンパク質およびペントンタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルス抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ｐｐ６５、前初期（ＩＥ）抗原、およびＩＥ１からなる群から選択されるＣＭＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、潜伏期膜タンパク質２（ＬＭＰ２）、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）、およびＢＺＬＦ１からなる群から選択されるＥＢＶ抗原である。
【００２２】
本発明のある特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）、およびＣＤ１６０からなる群から選択される。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。別の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）受容体である。
【００２３】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の細胞は、自殺遺伝子をさらに組換え発現する。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ９を含む。
【００２４】
別の態様では、ウイルス抗原を認識し、それに感作される調節性Ｔ細胞であって、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、調節性Ｔ細胞が本明細書中に提供される。別の態様では、ウイルス抗原を認識し、それに感作される調節性Ｔ細胞の集団であって、該細胞の集団が、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現するＴ細胞を含む、集団が本明細書中に提供される。本発明のある特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞は、慢性ウイルス感染を有する対象から単離される。
【００２５】
別の態様では、ウイルス感染を有する対象から単離された調節性Ｔ細胞であって、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、調節性Ｔ細胞が本明細書中に提供される。別の態様では、ウイルス感染を有する対象から単離された調節性Ｔ細胞の集団であって、該細胞の集団が、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する調節性Ｔ細胞を含む、集団が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、細胞又は細胞集団は、ヒトに由来する。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は慢性ウイルス感染である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である。
【００２６】
別の態様では、ウイルス感染を有する対象から単離され、免疫抑制細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、免疫抑制細胞が本明細書中に提供される。別の態様では、ウイルス感染を有する対象から単離された免疫抑制細胞の集団であって、該細胞の集団が、免疫抑制細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する免疫抑制細胞を含む、集団が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、ヒトに由来する。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、慢性ウイルス感染である。ある特定の実施形態では、免疫抑制細胞は、調節性Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、免疫抑制細胞は、ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原を認識し、それに感作される。ある特定の実施形態では、免疫抑制細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を組換え発現し、ＣＡＲは、ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原に結合する。特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞である。別の特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋Ｔ細胞である。
【００２７】
別の態様では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋であり、ウイルス抗原に感作され、調節性Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、ヒト調節性Ｔ細胞のポリクローナル集団が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、ヒト調節性Ｔ細胞は、ＣＤ１２７ｌｏ／−である。
【００２８】
ある特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞の集団は、ヒトに由来する。ある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ヒト病原体であるウイルスの抗原である。ある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ウイルスに感染したヒト対象における免疫応答を引き出すことができる。
【００２９】
調節性Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞集団のある特定の実施形態では、ウイルス抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）抗原、アデノウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原からなる群から選択される。特定の実施形態では、ウイルス抗原は、コアタンパク質、エンベロープタンパク質Ｅ１、エンベロープタンパク質Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４（例えば、ＮＳ４ＡまたはＮＳ４Ｂ）、およびＮＳ５（例えば、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂ）からなる群から選択されるＨＣＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、群特異的抗原（ｇａｇ）タンパク質、ｐ５５、ｐ２４、ｐ１８、エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、逆転写酵素（ｐｏｌ）、ｐ６６、およびｐ３１からなる群から選択されるＨＩＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｍ、ＨＢＶエンベロープタンパク質Ｌ、およびＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ、ＭまたはＬのＳドメインからなる群から選択されるＨＢＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＣ、ｇＧ、ｇＫ、ｇＭ、およびｇＥの細胞外ドメインからなる群から選択されるＨＳＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ｇＥおよびｇＩからなる群から選択されるＶＺＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ヘキソンタンパク質およびペントンタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルス抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、ｐｐ６５、前初期（ＩＥ）抗原、およびＩＥ１からなる群から選択されるＣＭＶ抗原である。別の特定の実施形態では、ウイルス抗原は、潜伏期膜タンパク質２（ＬＭＰ２）、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）、およびＢＺＬＦ１からなる群から選択されるＥＢＶ抗原である。
【００３０】
免疫抑制細胞または調節性Ｔ細胞に関する本発明のある特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）、およびＣＤ１６０からなる群から選択される。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。本発明のある特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）受容体である。ある特定の実施形態では、免疫抑制細胞もしくは調節性Ｔ細胞またはそれらの集団は、自殺遺伝子をさらに組換え発現する。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ９を含む。
【００３１】
別の態様では、免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞である細胞であって、（ａ）ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、（ｃ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態とを組換え発現する細胞が本明細書中に提供される。
【００３２】
別の態様では、免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞の集団であって、該細胞の集団が、（ａ）ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、（ｃ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態とを組換え発現する細胞を含む、集団が本明細書中に提供される。
【００３３】
このような細胞のある特定の実施形態では、第２のドミナントネガティブ形態の共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインである。このような細胞のある特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。このような細胞のある特定の実施形態では、第２のドミナントネガティブ形態の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインと異なる。このような細胞のある特定の実施形態では、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインである。このような細胞のある特定の実施形態では、免疫賦活性細胞はＴ細胞である。このような細胞のある特定の実施形態では、前駆体細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。このような細胞のある特定の実施形態では、免疫賦活性細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。このような細胞のある特定の実施形態では、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。このような細胞のある特定の実施形態では、細胞はメモリーＴ細胞である。このような細胞のある特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３４】
別の態様では、ウイルス感染を有する対象から単離された免疫抑制細胞であって、（ａ）ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、（ｃ）免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態とを組換え発現する、免疫抑制細胞が本明細書中に提供される。
【００３５】
別の態様では、ウイルス感染を有する対象から単離された免疫抑制細胞の集団であって、該細胞の集団が、（ａ）ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、（ｃ）免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態とを組換え発現する、免疫抑制細胞を含む、集団が本明細書中に提供される。
【００３６】
このような細胞のある特定の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインである。このような細胞のある特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。このような細胞のある特定の実施形態では、請求項９０に記載の細胞または集団、第２のドミナントネガティブ形態の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインと異なる。このような細胞のある特定の実施形態では、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインである。このような細胞のある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、ヒトに由来する。このような細胞のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。このような細胞のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、慢性ウイルス感染である。このような細胞のある特定の実施形態では、免疫抑制細胞は、調節性Ｔ細胞である。このような細胞のある特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞である。このような細胞のある特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋Ｔ細胞である。
【００３７】
別の態様では、免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞である細胞であって、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、ＣＡＲが病原体の抗原に結合する、細胞が本明細書中に提供される。別の態様では、免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞の集団であって、該細胞集団は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、ＣＡＲが病原体の抗原に結合する細胞を含む、集団が本明細書中に提供される。
【００３８】
このような細胞または細胞集団のある特定の実施形態では、免疫賦活性細胞はＴ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋である。このような細胞または細胞集団のある特定の実施形態では、前駆体細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。このような細胞または細胞集団のある特定の実施形態では、免疫賦活性細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。このような細胞または細胞集団のある特定の実施形態では、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。このような細胞または細胞集団のある特定の実施形態では、細胞はメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３９】
別の態様では、病原体の抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞であって、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現する、Ｔ細胞が本明細書中に提供される。このようなＴ細胞のある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、免疫賦活性である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋である。別の特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋である。
【００４０】
別の態様では、病原体の抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞の集団であって、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現するＴ細胞を含むＴ細胞の集団が本明細書中に提供される。このようなＴ細胞の集団のある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、免疫賦活性である。
【００４１】
このようなＴ細胞またはこのようなＴ細胞の集団の特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋である。このようなＴ細胞またはこのようなＴ細胞の集団の特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋である。このようなＴ細胞またはこのようなＴ細胞の集団のある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、ヒトに由来する。このようなＴ細胞またはこのようなＴ細胞の集団の特定の実施形態では、病原体は、ヒト病原体である。特定の実施形態では、病原体の抗原は、病原体に感染したヒト対象における免疫応答を引き出すことができる。このようなＴ細胞またはこのようなＴ細胞の集団のある特定の実施形態では、病原体は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される。
【００４２】
このようなＴ細胞またはこのようなＴ細胞の集団の特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）、およびＣＤ１６０からなる群から選択される。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１である。ある特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）受容体である。
【００４３】
このようなＴ細胞またはこのようなＴ細胞の集団のある特定の実施形態では、細胞は、自殺遺伝子をさらに組換え発現する。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ９を含む。
【００４４】
別の態様では、治療有効量の本発明の免疫細胞または免疫細胞の集団；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、免疫細胞または免疫細胞の集団は、上記の免疫賦活性細胞である。ある特定の実施形態では、免疫細胞または免疫細胞の集団は、上記のＴ細胞である。ある特定の実施形態では、免疫細胞または免疫細胞の集団は、上記の免疫抑制細胞である。ある特定の実施形態では、免疫細胞または免疫細胞の集団は、上記の調節性Ｔ細胞である。
【００４５】
別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、本発明の免疫細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、ウイルス感染に関連する抗原である、方法が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、免疫細胞または免疫細胞の集団は、上記の免疫賦活性細胞である。ある特定の実施形態では、免疫細胞または免疫細胞の集団は、上記のＴ細胞である。別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、上記の免疫賦活性細胞である免疫細胞または免疫細胞の集団を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、ウイルス感染に関連する抗原である、方法が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、免疫細胞または免疫細胞の集団は、上記のＴ細胞である。当該方法のある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。当該方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブ形態の発現は、ウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進する。
【００４６】
別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、上記の調節性Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞の集団の治療有効量を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、ウイルス感染に関連する抗原である、方法が本明細書中に提供される。別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、上記の調節性Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、ウイルス感染に関連する抗原である、方法が本明細書中に提供される。
【００４７】
別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、上記の免疫抑制細胞または免疫抑制細胞の集団の治療有効量を投与するステップを含む、方法が本明細書中に提供される。別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、上記の免疫抑制細胞または免疫抑制細胞の集団を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書中に提供される。
【００４８】
調節性Ｔ細胞または免疫抑制細胞、またはその集団、またはそのような細胞もしくは細胞集団を含む医薬組成物を投与する方法のある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。調節性Ｔ細胞または免疫抑制細胞、またはその集団、またはそのような細胞もしくは細胞集団を含む医薬組成物を投与する方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。調節性Ｔ細胞または免疫抑制細胞、またはその集団、またはそのような細胞もしくは細胞集団を含む医薬組成物を投与する方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、慢性ウイルス感染である。調節性Ｔ細胞または免疫抑制細胞、またはその集団、またはそのような細胞もしくは細胞集団を含む医薬組成物を投与する方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である。
【００４９】
別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、（ａ）対象からウイルス特異的Ｔ細胞を単離するステップと、（ｂ）細胞においてＰＤ−１のドミナントネガティブ形態を発現させるステップと、（ｃ）細胞を対象に投与するステップとを含む方法が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＩＶによる感染である。別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、（ａ）対象からウイルス特異的Ｔ細胞を単離するステップと、（ｂ）細胞においてＰＤ−１のドミナントネガティブ形態を発現させるステップであって、ＰＤ−１のドミナントネガティブ形態の発現が、ウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進するステップと、（ｃ）細胞を対象に投与するステップとを含む方法が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＢＶによる感染である。別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、（ａ）慢性ウイルス感染を有する対象から調節性Ｔ細胞を単離するステップと、（ｂ）細胞においてＰＤ−１のドミナントネガティブ形態を発現させるステップと、（ｃ）細胞を対象に投与するステップとを含む方法が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＣＶによる感染である。当該方法のある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。当該方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。当該方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である。
【００５０】
本発明の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞または免疫細胞集団、または免疫細胞または免疫細胞集団を含む医薬組成物の投与は、胸膜内投与、静脈内投与、皮下投与、結節内投与、肝内投与、くも膜下腔内投与、腹腔内投与、頭蓋内投与、または胸腺への直接投与によるものである。本発明の方法のある特定の実施形態では、細胞を、体重１キログラム当たり細胞１０４〜１０１０個の範囲の用量で投与する。特定の実施形態では、用量は、体重１キログラム当たり細胞３×１０５〜３×１０６個の範囲内である。本発明の方法のある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、対象にとって自己由来のものである。
【００５１】
別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、（ａ）ウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、（ｃ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態とを組換え発現する細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、ウイルス感染に関連する抗原である、方法が本明細書中に提供される。別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、そのような細胞の医薬組成物を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、ウイルス感染に関連する抗原である、方法を提供する。
【００５２】
本発明のそのような方法のある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。そのような方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である。そのような方法のある特定の実施形態では、第１のドミナントネガティブ形態の発現は、対象におけるウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進する。
【００５３】
別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、ウイルス感染を有する対象から単離された細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、免疫抑制細胞が（ａ）ウイルス感染のウイルスのウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第１のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、第１のドミナントネガティブ形態と、（ｃ）免疫抑制細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤の第２のドミナントネガティブ形態であって、（ｉ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、第２のドミナントネガティブ形態とを組換え発現し、ウイルス抗原が、ウイルス感染に関連する抗原である、方法が本明細書中に提供される。別の実施形態では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、そのような細胞の医薬組成物を投与するステップを含み、ウイルス抗原が、ウイルス感染に関連する抗原である、方法が本明細書中に提供される。
【００５４】
本発明のこのような方法の特定の実施形態では、対象は、ヒトである。本発明のこのような方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である。本発明のこのような方法のある特定の実施形態では、第１のドミナントネガティブ形態の発現は、前記対象におけるウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進する。
【００５５】
別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、（ａ）免疫賦活性細胞であり、（ｉ）ウイルス感染に関連する抗原であるウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（Ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（Ｂ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、ドミナントネガティブ形態とを組換え発現する第１の細胞または第１の細胞の第１の集団；ならびに（ｂ）免疫賦活性細胞であり、（ｉ）ウイルス感染に関連する抗原であるウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態であって、（Ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（Ｂ）膜貫通ドメイン、および（Ｃ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、ドミナントネガティブ形態とを組換え発現する第２の細胞または第２の細胞の第２の集団の治療有効量を投与するステップを含む方法が本明細書中に提供される。このような方法のある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。このような方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である。
【００５６】
別の態様では、ウイルス感染の処置を必要とする対象においてウイルス感染を処置する方法であって、対象に、（ａ）免疫阻害性細胞であり、（ｉ）ウイルス感染に関連する抗原であるウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）免疫阻害性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態であって、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、（Ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（Ｂ）膜貫通ドメインを含むポリペプチドである、ドミナントネガティブ形態とを組換え発現する第１の細胞または第１の細胞の第１の集団；ならびに（ｂ）免疫阻害性細胞であり、（ｉ）ウイルス感染に関連する抗原であるウイルス抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）免疫阻害性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態であって、（Ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分、（Ｂ）膜貫通ドメイン、および（Ｃ）ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインとの融合を含むポリペプチドである、ドミナントネガティブ形態とを組換え発現する第２の細胞または第２の細胞の第２の集団の治療有効量を投与するステップを含む方法が本明細書中に提供される。
【００５７】
そのような方法のある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。そのような方法のある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト病原体であるウイルスによる感染である。ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶ、アデノウイルス、ＣＭＶまたはＥＢＶによる感染である。そのような方法のある特定の実施形態では、細胞または細胞集団は、対象にとって自己由来のものである。
【００５８】
別の態様では、病原体によって引き起こされる感染の処置を必要とする対象において病原体によって引き起こされる感染を処置する方法であって、対象に、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態とを組換え発現する細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、ＣＡＲが、病原体の抗原に結合し、ＣＡＲが結合する病原体の抗原が、感染を引き起こす病原体の抗原である、方法が本明細書中に提供される。別の態様では、病原体によって引き起こされる感染の処置を必要とする対象において病原体によって引き起こされる感染を処置する方法であって、対象に、細胞または細胞集団の治療有効量を投与するステップを含み、細胞が、病原体の抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞である、または、細胞集団が、病原体の抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞を含み、Ｔ細胞が、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、Ｔ細胞が感作される病原体の抗原が、感染を引き起こす病原体の抗原である、方法が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、免疫賦活性である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞ＣＤ８＋である。
【００５９】
別の態様では、病原体によって引き起こされる感染の処置を必要とする対象において病原体によって引き起こされる感染を処置する方法であって、対象に、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｂ）免疫賦活性細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態とを組換え発現する細胞または細胞集団を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ＣＡＲが、病原体の抗原に結合し、ＣＡＲが結合する病原体の抗原が、感染を引き起こす病原体の抗原である、方法が本明細書中に提供される。別の態様では、病原体によって引き起こされる感染の処置を必要とする対象において病原体によって引き起こされる感染を処置する方法であって、対象に、病原体の抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞またはＴ細胞の集団を含む医薬組成物を投与するステップを含み、Ｔ細胞が、Ｔ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、Ｔ細胞が感作される病原体の抗原が、感染を引き起こす病原体の抗原である、方法が本明細書中に提供される。
【００６０】
病原体によって引き起こされる感染を処置するための方法のある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。そのような方法のある特定の実施形態では、病原体は、ヒト病原体である。
６．図面の説明
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最初の抗原刺激時に同等のエフェクターサイトカイン分泌および増殖を示すことを示す。図１Ａ。第１世代ＣＡＲおよび第２世代ＣＡＲ。図１Ｂ。メソテリン（ＭＳＬＮ）を標的とするＣＡＲは、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で含有するか（Ｍｚ、第１世代ＣＡＲ）、またはＣＤ２８（Ｍ２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ（ＭＢＢｚ）共刺激ドメインと組み合わせて含有する（第２世代ＣＡＲ）。ＣＤ２８共刺激を有する前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）指向性ＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）ならびにＰＳＭＡを発現する標的（ＰＳＭＡ＋）を陰性対照として実験に含める。ＣＹＴ、細胞質ドメイン；ＬＳ、リーダー配列；ＬＴＲ、長い末端反復；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＳＤ、スプライスドナー；ＴＭ、膜貫通。図１Ｃ〜１Ｅ。ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。図１Ｃ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＭＳＬＮを発現する標的（ＭＳＬＮ＋）は溶解するが、ＰＳＭＡ＋標的は溶解しない。図１Ｄ。ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＳＬＮ＋細胞の共培養後にＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価された通り、４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激によりサイトカイン分泌が増強される。図１Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲにより、ＭＳＬＮ＋細胞を用いた刺激後の頑強なＴ細胞蓄積が容易になる。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す（図１Ｃ、１Ｅ）、または個々の点としてプロットされている（図１Ｄ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、共刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）と第１世代受容体（Ｍｚ）のスチューデントのｔ検定による比較；有意性は多重比較のボンフェローニ補正を使用して決定した。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最初の抗原刺激時に同等のエフェクターサイトカイン分泌および増殖を示すことを示す。図１Ａ。第１世代ＣＡＲおよび第２世代ＣＡＲ。図１Ｂ。メソテリン（ＭＳＬＮ）を標的とするＣＡＲは、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で含有するか（Ｍｚ、第１世代ＣＡＲ）、またはＣＤ２８（Ｍ２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ（ＭＢＢｚ）共刺激ドメインと組み合わせて含有する（第２世代ＣＡＲ）。ＣＤ２８共刺激を有する前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）指向性ＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）ならびにＰＳＭＡを発現する標的（ＰＳＭＡ＋）を陰性対照として実験に含める。ＣＹＴ、細胞質ドメイン；ＬＳ、リーダー配列；ＬＴＲ、長い末端反復；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＳＤ、スプライスドナー；ＴＭ、膜貫通。図１Ｃ〜１Ｅ。ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。図１Ｃ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＭＳＬＮを発現する標的（ＭＳＬＮ＋）は溶解するが、ＰＳＭＡ＋標的は溶解しない。図１Ｄ。ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＳＬＮ＋細胞の共培養後にＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価された通り、４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激によりサイトカイン分泌が増強される。図１Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲにより、ＭＳＬＮ＋細胞を用いた刺激後の頑強なＴ細胞蓄積が容易になる。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す（図１Ｃ、１Ｅ）、または個々の点としてプロットされている（図１Ｄ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、共刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）と第１世代受容体（Ｍｚ）のスチューデントのｔ検定による比較；有意性は多重比較のボンフェローニ補正を使用して決定した。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最初の抗原刺激時に同等のエフェクターサイトカイン分泌および増殖を示すことを示す。図１Ａ。第１世代ＣＡＲおよび第２世代ＣＡＲ。図１Ｂ。メソテリン（ＭＳＬＮ）を標的とするＣＡＲは、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で含有するか（Ｍｚ、第１世代ＣＡＲ）、またはＣＤ２８（Ｍ２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ（ＭＢＢｚ）共刺激ドメインと組み合わせて含有する（第２世代ＣＡＲ）。ＣＤ２８共刺激を有する前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）指向性ＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）ならびにＰＳＭＡを発現する標的（ＰＳＭＡ＋）を陰性対照として実験に含める。ＣＹＴ、細胞質ドメイン；ＬＳ、リーダー配列；ＬＴＲ、長い末端反復；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＳＤ、スプライスドナー；ＴＭ、膜貫通。図１Ｃ〜１Ｅ。ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。図１Ｃ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＭＳＬＮを発現する標的（ＭＳＬＮ＋）は溶解するが、ＰＳＭＡ＋標的は溶解しない。図１Ｄ。ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＳＬＮ＋細胞の共培養後にＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価された通り、４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激によりサイトカイン分泌が増強される。図１Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲにより、ＭＳＬＮ＋細胞を用いた刺激後の頑強なＴ細胞蓄積が容易になる。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す（図１Ｃ、１Ｅ）、または個々の点としてプロットされている（図１Ｄ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、共刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）と第１世代受容体（Ｍｚ）のスチューデントのｔ検定による比較；有意性は多重比較のボンフェローニ補正を使用して決定した。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最初の抗原刺激時に同等のエフェクターサイトカイン分泌および増殖を示すことを示す。図１Ａ。第１世代ＣＡＲおよび第２世代ＣＡＲ。図１Ｂ。メソテリン（ＭＳＬＮ）を標的とするＣＡＲは、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で含有するか（Ｍｚ、第１世代ＣＡＲ）、またはＣＤ２８（Ｍ２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ（ＭＢＢｚ）共刺激ドメインと組み合わせて含有する（第２世代ＣＡＲ）。ＣＤ２８共刺激を有する前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）指向性ＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）ならびにＰＳＭＡを発現する標的（ＰＳＭＡ＋）を陰性対照として実験に含める。ＣＹＴ、細胞質ドメイン；ＬＳ、リーダー配列；ＬＴＲ、長い末端反復；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＳＤ、スプライスドナー；ＴＭ、膜貫通。図１Ｃ〜１Ｅ。ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。図１Ｃ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＭＳＬＮを発現する標的（ＭＳＬＮ＋）は溶解するが、ＰＳＭＡ＋標的は溶解しない。図１Ｄ。ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＳＬＮ＋細胞の共培養後にＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価された通り、４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激によりサイトカイン分泌が増強される。図１Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲにより、ＭＳＬＮ＋細胞を用いた刺激後の頑強なＴ細胞蓄積が容易になる。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す（図１Ｃ、１Ｅ）、または個々の点としてプロットされている（図１Ｄ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、共刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）と第１世代受容体（Ｍｚ）のスチューデントのｔ検定による比較；有意性は多重比較のボンフェローニ補正を使用して決定した。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最初の抗原刺激時に同等のエフェクターサイトカイン分泌および増殖を示すことを示す。図１Ａ。第１世代ＣＡＲおよび第２世代ＣＡＲ。図１Ｂ。メソテリン（ＭＳＬＮ）を標的とするＣＡＲは、ＣＤ３ζエンドドメインを単独で含有するか（Ｍｚ、第１世代ＣＡＲ）、またはＣＤ２８（Ｍ２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ（ＭＢＢｚ）共刺激ドメインと組み合わせて含有する（第２世代ＣＡＲ）。ＣＤ２８共刺激を有する前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）指向性ＣＡＲ（Ｐ２８ｚ）ならびにＰＳＭＡを発現する標的（ＰＳＭＡ＋）を陰性対照として実験に含める。ＣＹＴ、細胞質ドメイン；ＬＳ、リーダー配列；ＬＴＲ、長い末端反復；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＳＤ、スプライスドナー；ＴＭ、膜貫通。図１Ｃ〜１Ｅ。ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞の抗原特異的エフェクター機能。図１Ｃ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＭＳＬＮを発現する標的（ＭＳＬＮ＋）は溶解するが、ＰＳＭＡ＋標的は溶解しない。図１Ｄ。ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＳＬＮ＋細胞の共培養後にＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価された通り、４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激によりサイトカイン分泌が増強される。図１Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲおよびＭＢＢｚ  ＣＡＲにより、ＭＳＬＮ＋細胞を用いた刺激後の頑強なＴ細胞蓄積が容易になる。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す（図１Ｃ、１Ｅ）、または個々の点としてプロットされている（図１Ｄ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、共刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｍ２８ｚまたはＭＢＢｚ）と第１世代受容体（Ｍｚ）のスチューデントのｔ検定による比較；有意性は多重比較のボンフェローニ補正を使用して決定した。
【００６２】
【図２】図２は、Ｍｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、およびＭＢＢｚ  ＣＡＲを発現させるための、ヒトＴ細胞への効率的なレトロウイルスによる形質導入を示す。（上）遺伝子移入の４日後の代表的なＦＡＣＳ分析が示されている。生／死染色により生育不能細胞を除外した後、蛍光マイナス１染色を使用して陽性ゲートを設定した。全ての実験に、ＣＡＲ形質導入効率が５０％〜７０％のＴ細胞を使用した；Ｔ細胞群間の形質導入の百分率は互いに５％以内であった。（下）ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのどちらも効率的に形質導入された。ＣＡＲ  Ｔ細胞についてのゲーティング後のＣＤ４＋の百分率およびＣＤ８＋の百分率が示されている。
【００６３】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露後に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図３Ａ。ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の６日後に、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍および脾臓から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏ抗原刺激に供した。図３Ｂ。ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激時のクロム放出アッセイにより、細胞溶解機能（Ｅ：Ｔ比１：５）がＭ２８ｚでは低下するがＭＢＢｚでは持続することが実証される。図３Ｃ。サイトカイン分泌測定により、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるエフェクターサイトカイン分泌は減少するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく分泌を保持することが可能であることが実証される。図３Ｄ。回収されたＣＡＲ  Ｔ細胞によるＧｚＢ発現、ＩＦＮ−γ発現、およびＩＬ−２発現のＲＴ−ＰＣＲ測定値は、タンパク質レベル測定値とよく相関する。データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける無刺激Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍率変化を表す。データは、条件当たり３つの個々のウェルの平均±ＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。結果は、２回の実験のそれぞれに使用したマウスの２つの別々のコホートで再現されている。図３Ｂ〜３Ｄのそれぞれにおいて、棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢＺを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露後に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図３Ａ。ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の６日後に、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍および脾臓から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏ抗原刺激に供した。図３Ｂ。ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激時のクロム放出アッセイにより、細胞溶解機能（Ｅ：Ｔ比１：５）がＭ２８ｚでは低下するがＭＢＢｚでは持続することが実証される。図３Ｃ。サイトカイン分泌測定により、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるエフェクターサイトカイン分泌は減少するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく分泌を保持することが可能であることが実証される。図３Ｄ。回収されたＣＡＲ  Ｔ細胞によるＧｚＢ発現、ＩＦＮ−γ発現、およびＩＬ−２発現のＲＴ−ＰＣＲ測定値は、タンパク質レベル測定値とよく相関する。データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける無刺激Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍率変化を表す。データは、条件当たり３つの個々のウェルの平均±ＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。結果は、２回の実験のそれぞれに使用したマウスの２つの別々のコホートで再現されている。図３Ｂ〜３Ｄのそれぞれにおいて、棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢＺを示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露後に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図３Ａ。ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の６日後に、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍および脾臓から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏ抗原刺激に供した。図３Ｂ。ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激時のクロム放出アッセイにより、細胞溶解機能（Ｅ：Ｔ比１：５）がＭ２８ｚでは低下するがＭＢＢｚでは持続することが実証される。図３Ｃ。サイトカイン分泌測定により、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるエフェクターサイトカイン分泌は減少するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく分泌を保持することが可能であることが実証される。図３Ｄ。回収されたＣＡＲ  Ｔ細胞によるＧｚＢ発現、ＩＦＮ−γ発現、およびＩＬ−２発現のＲＴ−ＰＣＲ測定値は、タンパク質レベル測定値とよく相関する。データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける無刺激Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍率変化を表す。データは、条件当たり３つの個々のウェルの平均±ＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。結果は、２回の実験のそれぞれに使用したマウスの２つの別々のコホートで再現されている。図３Ｂ〜３Ｄのそれぞれにおいて、棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢＺを示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露後に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図３Ａ。ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与の６日後に、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍および脾臓から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏ抗原刺激に供した。図３Ｂ。ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激時のクロム放出アッセイにより、細胞溶解機能（Ｅ：Ｔ比１：５）がＭ２８ｚでは低下するがＭＢＢｚでは持続することが実証される。図３Ｃ。サイトカイン分泌測定により、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるエフェクターサイトカイン分泌は減少するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく分泌を保持することが可能であることが実証される。図３Ｄ。回収されたＣＡＲ  Ｔ細胞によるＧｚＢ発現、ＩＦＮ−γ発現、およびＩＬ−２発現のＲＴ−ＰＣＲ測定値は、タンパク質レベル測定値とよく相関する。データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける無刺激Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍率変化を表す。データは、条件当たり３つの個々のウェルの平均±ＳＥＭを表す。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。結果は、２回の実験のそれぞれに使用したマウスの２つの別々のコホートで再現されている。図３Ｂ〜３Ｄのそれぞれにおいて、棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢＺを示す。
【００６４】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける反復抗原刺激時に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍再攻撃時にもエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図４Ａ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はどちらも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、反復抗原刺激時に増殖能力を保持する。また、Ｔ細胞を、細胞傷害性についてクロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌についてＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって試験した（図４Ｂ〜４Ｄ）。図４Ｂ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＣＡＲ  Ｔ細胞では第１の刺激時に同等の死滅（左側）および反復抗原刺激時に細胞溶解機能の喪失が実証されたが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく細胞溶解機能を保持することができる（丸、ＭＺ；三角形、Ｍ２８ｚ；ひし形、ＭＢＢｚ）。図４Ｃ。ＣＤ１０７ａ発現により測定される細胞傷害性顆粒放出（第３の刺激時に示された）は、クロム放出アッセイと相関する（図４Ｂ）。データは、無刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ  ＭＦＩに対する倍率変化の平均±ＳＤ（３連）を表す（棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚを示す）。図４Ｄ。サイトカイン分泌測定により、反復抗原遭遇時のＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の喪失が同様に実証される；重ねて、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよくそれらの機能を保存することができる（「Ｓｔｉｍ  １」、「Ｓｔｉｍ  ２」および「Ｓｔｉｍ  ３」の上の記号の各セットは、左から右に、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚである）。図４Ｅ。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、同等に持続性であるが、より優れた機能持続性が実証される。胸膜腫瘍根絶（ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個の単回用量）の２８日後に、ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞１×１０６個を胸膜腔内に注射した（腫瘍再攻撃）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では全てのマウスにおいて腫瘍成長が妨げられたが、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて最初に処置したマウス４匹のうち２匹で腫瘍成長および死亡が観察された。スチューデントのｔ検定を実施し、ボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３回の反復実験平均±ＳＥＭを表す、または個々の点としてプロットされている。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける反復抗原刺激時に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍再攻撃時にもエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図４Ａ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はどちらも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、反復抗原刺激時に増殖能力を保持する。また、Ｔ細胞を、細胞傷害性についてクロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌についてＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって試験した（図４Ｂ〜４Ｄ）。図４Ｂ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＣＡＲ  Ｔ細胞では第１の刺激時に同等の死滅（左側）および反復抗原刺激時に細胞溶解機能の喪失が実証されたが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく細胞溶解機能を保持することができる（丸、ＭＺ；三角形、Ｍ２８ｚ；ひし形、ＭＢＢｚ）。図４Ｃ。ＣＤ１０７ａ発現により測定される細胞傷害性顆粒放出（第３の刺激時に示された）は、クロム放出アッセイと相関する（図４Ｂ）。データは、無刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ  ＭＦＩに対する倍率変化の平均±ＳＤ（３連）を表す（棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚを示す）。図４Ｄ。サイトカイン分泌測定により、反復抗原遭遇時のＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の喪失が同様に実証される；重ねて、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよくそれらの機能を保存することができる（「Ｓｔｉｍ  １」、「Ｓｔｉｍ  ２」および「Ｓｔｉｍ  ３」の上の記号の各セットは、左から右に、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚである）。図４Ｅ。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、同等に持続性であるが、より優れた機能持続性が実証される。胸膜腫瘍根絶（ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個の単回用量）の２８日後に、ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞１×１０６個を胸膜腔内に注射した（腫瘍再攻撃）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では全てのマウスにおいて腫瘍成長が妨げられたが、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて最初に処置したマウス４匹のうち２匹で腫瘍成長および死亡が観察された。スチューデントのｔ検定を実施し、ボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３回の反復実験平均±ＳＥＭを表す、または個々の点としてプロットされている。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける反復抗原刺激時に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍再攻撃時にもエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図４Ａ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はどちらも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、反復抗原刺激時に増殖能力を保持する。また、Ｔ細胞を、細胞傷害性についてクロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌についてＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって試験した（図４Ｂ〜４Ｄ）。図４Ｂ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＣＡＲ  Ｔ細胞では第１の刺激時に同等の死滅（左側）および反復抗原刺激時に細胞溶解機能の喪失が実証されたが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく細胞溶解機能を保持することができる（丸、ＭＺ；三角形、Ｍ２８ｚ；ひし形、ＭＢＢｚ）。図４Ｃ。ＣＤ１０７ａ発現により測定される細胞傷害性顆粒放出（第３の刺激時に示された）は、クロム放出アッセイと相関する（図４Ｂ）。データは、無刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ  ＭＦＩに対する倍率変化の平均±ＳＤ（３連）を表す（棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚを示す）。図４Ｄ。サイトカイン分泌測定により、反復抗原遭遇時のＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の喪失が同様に実証される；重ねて、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよくそれらの機能を保存することができる（「Ｓｔｉｍ  １」、「Ｓｔｉｍ  ２」および「Ｓｔｉｍ  ３」の上の記号の各セットは、左から右に、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚである）。図４Ｅ。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、同等に持続性であるが、より優れた機能持続性が実証される。胸膜腫瘍根絶（ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個の単回用量）の２８日後に、ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞１×１０６個を胸膜腔内に注射した（腫瘍再攻撃）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では全てのマウスにおいて腫瘍成長が妨げられたが、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて最初に処置したマウス４匹のうち２匹で腫瘍成長および死亡が観察された。スチューデントのｔ検定を実施し、ボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３回の反復実験平均±ＳＥＭを表す、または個々の点としてプロットされている。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける反復抗原刺激時に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍再攻撃時にもエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図４Ａ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はどちらも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、反復抗原刺激時に増殖能力を保持する。また、Ｔ細胞を、細胞傷害性についてクロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌についてＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって試験した（図４Ｂ〜４Ｄ）。図４Ｂ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＣＡＲ  Ｔ細胞では第１の刺激時に同等の死滅（左側）および反復抗原刺激時に細胞溶解機能の喪失が実証されたが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく細胞溶解機能を保持することができる（丸、ＭＺ；三角形、Ｍ２８ｚ；ひし形、ＭＢＢｚ）。図４Ｃ。ＣＤ１０７ａ発現により測定される細胞傷害性顆粒放出（第３の刺激時に示された）は、クロム放出アッセイと相関する（図４Ｂ）。データは、無刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ  ＭＦＩに対する倍率変化の平均±ＳＤ（３連）を表す（棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚを示す）。図４Ｄ。サイトカイン分泌測定により、反復抗原遭遇時のＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の喪失が同様に実証される；重ねて、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよくそれらの機能を保存することができる（「Ｓｔｉｍ  １」、「Ｓｔｉｍ  ２」および「Ｓｔｉｍ  ３」の上の記号の各セットは、左から右に、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚである）。図４Ｅ。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、同等に持続性であるが、より優れた機能持続性が実証される。胸膜腫瘍根絶（ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個の単回用量）の２８日後に、ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞１×１０６個を胸膜腔内に注射した（腫瘍再攻撃）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では全てのマウスにおいて腫瘍成長が妨げられたが、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて最初に処置したマウス４匹のうち２匹で腫瘍成長および死亡が観察された。スチューデントのｔ検定を実施し、ボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３回の反復実験平均±ＳＥＭを表す、または個々の点としてプロットされている。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける反復抗原刺激時に消耗するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍再攻撃時にもエフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を優先的に保持することを示す。図４Ａ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はどちらも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、反復抗原刺激時に増殖能力を保持する。また、Ｔ細胞を、細胞傷害性についてクロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌についてＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって試験した（図４Ｂ〜４Ｄ）。図４Ｂ。クロム放出アッセイにより測定された通り、ＣＡＲ  Ｔ細胞では第１の刺激時に同等の死滅（左側）および反復抗原刺激時に細胞溶解機能の喪失が実証されたが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよく細胞溶解機能を保持することができる（丸、ＭＺ；三角形、Ｍ２８ｚ；ひし形、ＭＢＢｚ）。図４Ｃ。ＣＤ１０７ａ発現により測定される細胞傷害性顆粒放出（第３の刺激時に示された）は、クロム放出アッセイと相関する（図４Ｂ）。データは、無刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ  ＭＦＩに対する倍率変化の平均±ＳＤ（３連）を表す（棒グラフの対はそれぞれ、左から右に、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚを示す）。図４Ｄ。サイトカイン分泌測定により、反復抗原遭遇時のＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の喪失が同様に実証される；重ねて、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、よりよくそれらの機能を保存することができる（「Ｓｔｉｍ  １」、「Ｓｔｉｍ  ２」および「Ｓｔｉｍ  ３」の上の記号の各セットは、左から右に、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚである）。図４Ｅ。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、同等に持続性であるが、より優れた機能持続性が実証される。胸膜腫瘍根絶（ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個の単回用量）の２８日後に、ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞１×１０６個を胸膜腔内に注射した（腫瘍再攻撃）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では全てのマウスにおいて腫瘍成長が妨げられたが、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて最初に処置したマウス４匹のうち２匹で腫瘍成長および死亡が観察された。スチューデントのｔ検定を実施し、ボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３回の反復実験平均±ＳＥＭを表す、または個々の点としてプロットされている。
【００６５】
【図５】図５は、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、消耗の少ない、より強力な表現型を発現することを示すグラフである。４−１ＢＢ共刺激Ｔ細胞およびＣＤ２８共刺激Ｔ細胞を反復抗原刺激で増加させ、第３の刺激の２０時間後に、ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。データがＣＤ４＋非形質導入Ｔ細胞のｍＲＮＡ発現に対する倍率変化で表されている。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＥＯＭＥＳ（Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ）およびＴＢＸ２１（Ｔ−ｂｅｔ）を高レベルで発現し、ＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）およびＦＯＸＰ３（Ｆｏｘｐ３）をより低いレベルで発現する。全ての比較がＰ＜０．００１で有意であった。結果は異なるドナーを使用した３回の別々の実験において同様であった。棒グラフの群はそれぞれ、左から右に、ＵＴ（対照として使用される非形質導入Ｔ細胞）、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚを示す。
【００６６】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｆは、ＰＤ−１受容体およびそのリガンドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて上方調節されることを示すグラフである（図６Ａ〜６Ｄ、回収されたＴ細胞；図６Ｅ〜６Ｆ、腫瘍細胞）。図６Ａ。腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与の６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より低いレベルのＰＤ−１を発現する。図６Ｂ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。図６Ｃ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４サブセットおよびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１  ｍＲＮＡの相対的な発現量。データが無刺激Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１  ｍＲＮＡ発現に対する倍率変化で表されている（棒グラフの対のそれぞれ、Ｍ２８ｚ、左、ＭＢＢｚ、右について）。図６Ｄ。進行している腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。図６Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスから回収された単一細胞腫瘍懸濁液は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。図６Ｆ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した中皮腫腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体のリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αと一緒に２４時間インキュベートした後さらに上方調節される。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｆは、ＰＤ−１受容体およびそのリガンドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて上方調節されることを示すグラフである（図６Ａ〜６Ｄ、回収されたＴ細胞；図６Ｅ〜６Ｆ、腫瘍細胞）。図６Ａ。腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与の６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より低いレベルのＰＤ−１を発現する。図６Ｂ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。図６Ｃ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４サブセットおよびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１  ｍＲＮＡの相対的な発現量。データが無刺激Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１  ｍＲＮＡ発現に対する倍率変化で表されている（棒グラフの対のそれぞれ、Ｍ２８ｚ、左、ＭＢＢｚ、右について）。図６Ｄ。進行している腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。図６Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスから回収された単一細胞腫瘍懸濁液は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。図６Ｆ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した中皮腫腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体のリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αと一緒に２４時間インキュベートした後さらに上方調節される。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｆは、ＰＤ−１受容体およびそのリガンドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて上方調節されることを示すグラフである（図６Ａ〜６Ｄ、回収されたＴ細胞；図６Ｅ〜６Ｆ、腫瘍細胞）。図６Ａ。腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与の６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より低いレベルのＰＤ−１を発現する。図６Ｂ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。図６Ｃ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４サブセットおよびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１  ｍＲＮＡの相対的な発現量。データが無刺激Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１  ｍＲＮＡ発現に対する倍率変化で表されている（棒グラフの対のそれぞれ、Ｍ２８ｚ、左、ＭＢＢｚ、右について）。図６Ｄ。進行している腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。図６Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスから回収された単一細胞腫瘍懸濁液は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。図６Ｆ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した中皮腫腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体のリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αと一緒に２４時間インキュベートした後さらに上方調節される。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｆは、ＰＤ−１受容体およびそのリガンドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて上方調節されることを示すグラフである（図６Ａ〜６Ｄ、回収されたＴ細胞；図６Ｅ〜６Ｆ、腫瘍細胞）。図６Ａ。腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与の６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より低いレベルのＰＤ−１を発現する。図６Ｂ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。図６Ｃ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４サブセットおよびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１  ｍＲＮＡの相対的な発現量。データが無刺激Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１  ｍＲＮＡ発現に対する倍率変化で表されている（棒グラフの対のそれぞれ、Ｍ２８ｚ、左、ＭＢＢｚ、右について）。図６Ｄ。進行している腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。図６Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスから回収された単一細胞腫瘍懸濁液は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。図６Ｆ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した中皮腫腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体のリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αと一緒に２４時間インキュベートした後さらに上方調節される。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６Ｆは、ＰＤ−１受容体およびそのリガンドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて上方調節されることを示すグラフである（図６Ａ〜６Ｄ、回収されたＴ細胞；図６Ｅ〜６Ｆ、腫瘍細胞）。図６Ａ。腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与の６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より低いレベルのＰＤ−１を発現する。図６Ｂ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。図６Ｃ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４サブセットおよびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１  ｍＲＮＡの相対的な発現量。データが無刺激Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１  ｍＲＮＡ発現に対する倍率変化で表されている（棒グラフの対のそれぞれ、Ｍ２８ｚ、左、ＭＢＢｚ、右について）。図６Ｄ。進行している腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。図６Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスから回収された単一細胞腫瘍懸濁液は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。図６Ｆ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した中皮腫腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体のリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αと一緒に２４時間インキュベートした後さらに上方調節される。
【図６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、ＰＤ−１受容体およびそのリガンドがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて上方調節されることを示すグラフである（図６Ａ〜６Ｄ、回収されたＴ細胞；図６Ｅ〜６Ｆ、腫瘍細胞）。図６Ａ。腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの投与の６日後に阻害性受容体を発現するが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より低いレベルのＰＤ−１を発現する。図６Ｂ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＩＬ）のＰＤ−１受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。図６Ｃ。胸膜内投与の６日後の腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ４サブセットおよびＣＤ８サブセットにおけるＰＤ−１  ｍＲＮＡの相対的な発現量。データが無刺激Ｍ２８ｚ  Ｔ細胞のＰＤ−１  ｍＲＮＡ発現に対する倍率変化で表されている（棒グラフの対のそれぞれ、Ｍ２８ｚ、左、ＭＢＢｚ、右について）。図６Ｄ。進行している腫瘍から単離された腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、阻害性受容体ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬａｇ−３を発現する。図６Ｅ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスから回収された単一細胞腫瘍懸濁液は、高レベルのＰＤ−１結合性リガンドを発現する。図６Ｆ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した中皮腫腫瘍細胞は、ＰＤ−１受容体のリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）を発現し、発現は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αと一緒に２４時間インキュベートした後さらに上方調節される。
【００６７】
【図７】図７は、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＰＤ−１と他の阻害性受容体を同時発現することを示す。腫瘍浸潤性Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、胸膜腫瘍を有するマウスへの胸膜内投与の６日後に回収した。細胞を、ＰＤ−１に対する抗体およびＬＡＧ−３（左側）またはＴＩＭ−３（右側）のいずれかに対する抗体を用いて共染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプで染色した対照（上）を使用して陽性ゲートを確立した。
【００６８】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｄは、ＰＤ−Ｌ１がＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を阻害することを示すグラフである。図８Ａ。３Ｔ３線維芽細胞に、メソテリンを単独で発現するか（ＭＳＬＮ＋、左側）またはＰＤ−Ｌ１に加えてＭＳＬＮを同時発現する（ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋、右側）ように形質導入を行った。図８Ｂ〜８Ｄ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋標的を用いた刺激後に評価した。ＰＤ−Ｌ１により、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積が反復抗原刺激時に阻害され（図８Ｂ）、細胞溶解機能がＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いて２回刺激した後に阻害され（図８Ｃ）、Ｔｈ１エフェクターサイトカイン分泌が第１の刺激時に阻害される（図８Ｄ）。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｄは、ＰＤ−Ｌ１がＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を阻害することを示すグラフである。図８Ａ。３Ｔ３線維芽細胞に、メソテリンを単独で発現するか（ＭＳＬＮ＋、左側）またはＰＤ−Ｌ１に加えてＭＳＬＮを同時発現する（ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋、右側）ように形質導入を行った。図８Ｂ〜８Ｄ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋標的を用いた刺激後に評価した。ＰＤ−Ｌ１により、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積が反復抗原刺激時に阻害され（図８Ｂ）、細胞溶解機能がＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いて２回刺激した後に阻害され（図８Ｃ）、Ｔｈ１エフェクターサイトカイン分泌が第１の刺激時に阻害される（図８Ｄ）。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｄは、ＰＤ−Ｌ１がＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を阻害することを示すグラフである。図８Ａ。３Ｔ３線維芽細胞に、メソテリンを単独で発現するか（ＭＳＬＮ＋、左側）またはＰＤ−Ｌ１に加えてＭＳＬＮを同時発現する（ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋、右側）ように形質導入を行った。図８Ｂ〜８Ｄ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋標的を用いた刺激後に評価した。ＰＤ−Ｌ１により、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積が反復抗原刺激時に阻害され（図８Ｂ）、細胞溶解機能がＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いて２回刺激した後に阻害され（図８Ｃ）、Ｔｈ１エフェクターサイトカイン分泌が第１の刺激時に阻害される（図８Ｄ）。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、ＰＤ−Ｌ１がＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を阻害することを示すグラフである。図８Ａ。３Ｔ３線維芽細胞に、メソテリンを単独で発現するか（ＭＳＬＮ＋、左側）またはＰＤ−Ｌ１に加えてＭＳＬＮを同時発現する（ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋、右側）ように形質導入を行った。図８Ｂ〜８Ｄ。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能を、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋またはＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋標的を用いた刺激後に評価した。ＰＤ−Ｌ１により、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積が反復抗原刺激時に阻害され（図８Ｂ）、細胞溶解機能がＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いて２回刺激した後に阻害され（図８Ｃ）、Ｔｈ１エフェクターサイトカイン分泌が第１の刺激時に阻害される（図８Ｄ）。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。
【００６９】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｅは、ＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ−１  ＤＮＲ）の同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−１リガンド媒介性阻害からレスキューされることを示す。図９Ａ。（左側）内在性ＰＤ−１受容体（共阻害性シグナルを伝達する）または阻害性シグナル伝達ドメインを欠く同時形質導入されたＰＤ−１  ＤＮＲを介して腫瘍リガンドと結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの実験に関して、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に、空ベクター（ＥＶ；ＳＦＧ−ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＰＤ−１  ＤＮＲ（ＳＦＧ−２Ａ−ＰＤ−１  ＤＮＲ）のいずれかを用いて同時形質導入した。次いで、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について選別されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理されているＭＳＬＮ＋腫瘍細胞と一緒に２４時間インキュベートして、ＰＤ−１リガンドを上方調節した。Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に小さいが統計的に有意な蓄積の増強（図９Ｂ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いた第３の刺激時にクロム放出アッセイによって測定される細胞溶解機能の増強（図９Ｃ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、および最初の刺激時にＴｈ１上清サイトカインの発現の増大（図９Ｄ）が実証された。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３連の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。図９Ｅ。５×１０４個のＭ２８ｚ  ＥＶ（ｎ＝１９）またはＭ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ（ｎ＝１６）を胸膜に投与した単回用量のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を比較する、腫瘍ＢＬＩ（左側）およびカプラン・マイヤー生存分析（右側）。示されているデータは、２回の独立した実験の組合せである。
【化１−１】
2019528699.tif 000003
記号は死亡を示す。生存期間中央値が日数で示されている。ログランク検定を使用して生存曲線を分析した（Ｐ＝０．００１）。個々の実験それぞれについてのログランク検定はＰ＜０．０５レベルまで有意であった；２回の実験を例示のために組み合わせている。本実験のマウスのコホート（Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）は、反復腫瘍再攻撃にもかかわらず、４５０日を超えて生存し、これにより、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＣＡＲ  Ｔ細胞の「機能持続性」が実証される。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｅは、ＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ−１  ＤＮＲ）の同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−１リガンド媒介性阻害からレスキューされることを示す。図９Ａ。（左側）内在性ＰＤ−１受容体（共阻害性シグナルを伝達する）または阻害性シグナル伝達ドメインを欠く同時形質導入されたＰＤ−１  ＤＮＲを介して腫瘍リガンドと結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの実験に関して、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に、空ベクター（ＥＶ；ＳＦＧ−ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＰＤ−１  ＤＮＲ（ＳＦＧ−２Ａ−ＰＤ−１  ＤＮＲ）のいずれかを用いて同時形質導入した。次いで、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について選別されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理されているＭＳＬＮ＋腫瘍細胞と一緒に２４時間インキュベートして、ＰＤ−１リガンドを上方調節した。Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に小さいが統計的に有意な蓄積の増強（図９Ｂ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いた第３の刺激時にクロム放出アッセイによって測定される細胞溶解機能の増強（図９Ｃ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、および最初の刺激時にＴｈ１上清サイトカインの発現の増大（図９Ｄ）が実証された。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３連の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。図９Ｅ。５×１０４個のＭ２８ｚ  ＥＶ（ｎ＝１９）またはＭ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ（ｎ＝１６）を胸膜に投与した単回用量のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を比較する、腫瘍ＢＬＩ（左側）およびカプラン・マイヤー生存分析（右側）。示されているデータは、２回の独立した実験の組合せである。
【化１−２】
2019528699.tif 000004
記号は死亡を示す。生存期間中央値が日数で示されている。ログランク検定を使用して生存曲線を分析した（Ｐ＝０．００１）。個々の実験それぞれについてのログランク検定はＰ＜０．０５レベルまで有意であった；２回の実験を例示のために組み合わせている。本実験のマウスのコホート（Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）は、反復腫瘍再攻撃にもかかわらず、４５０日を超えて生存し、これにより、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＣＡＲ  Ｔ細胞の「機能持続性」が実証される。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｅは、ＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ−１  ＤＮＲ）の同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−１リガンド媒介性阻害からレスキューされることを示す。図９Ａ。（左側）内在性ＰＤ−１受容体（共阻害性シグナルを伝達する）または阻害性シグナル伝達ドメインを欠く同時形質導入されたＰＤ−１  ＤＮＲを介して腫瘍リガンドと結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの実験に関して、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に、空ベクター（ＥＶ；ＳＦＧ−ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＰＤ−１  ＤＮＲ（ＳＦＧ−２Ａ−ＰＤ−１  ＤＮＲ）のいずれかを用いて同時形質導入した。次いで、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について選別されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理されているＭＳＬＮ＋腫瘍細胞と一緒に２４時間インキュベートして、ＰＤ−１リガンドを上方調節した。Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に小さいが統計的に有意な蓄積の増強（図９Ｂ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いた第３の刺激時にクロム放出アッセイによって測定される細胞溶解機能の増強（図９Ｃ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、および最初の刺激時にＴｈ１上清サイトカインの発現の増大（図９Ｄ）が実証された。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３連の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。図９Ｅ。５×１０４個のＭ２８ｚ  ＥＶ（ｎ＝１９）またはＭ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ（ｎ＝１６）を胸膜に投与した単回用量のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を比較する、腫瘍ＢＬＩ（左側）およびカプラン・マイヤー生存分析（右側）。示されているデータは、２回の独立した実験の組合せである。
【化１−３】
2019528699.tif 000005
記号は死亡を示す。生存期間中央値が日数で示されている。ログランク検定を使用して生存曲線を分析した（Ｐ＝０．００１）。個々の実験それぞれについてのログランク検定はＰ＜０．０５レベルまで有意であった；２回の実験を例示のために組み合わせている。本実験のマウスのコホート（Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）は、反復腫瘍再攻撃にもかかわらず、４５０日を超えて生存し、これにより、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＣＡＲ  Ｔ細胞の「機能持続性」が実証される。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｅは、ＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ−１  ＤＮＲ）の同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−１リガンド媒介性阻害からレスキューされることを示す。図９Ａ。（左側）内在性ＰＤ−１受容体（共阻害性シグナルを伝達する）または阻害性シグナル伝達ドメインを欠く同時形質導入されたＰＤ−１  ＤＮＲを介して腫瘍リガンドと結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの実験に関して、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に、空ベクター（ＥＶ；ＳＦＧ−ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＰＤ−１  ＤＮＲ（ＳＦＧ−２Ａ−ＰＤ−１  ＤＮＲ）のいずれかを用いて同時形質導入した。次いで、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について選別されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理されているＭＳＬＮ＋腫瘍細胞と一緒に２４時間インキュベートして、ＰＤ−１リガンドを上方調節した。Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に小さいが統計的に有意な蓄積の増強（図９Ｂ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いた第３の刺激時にクロム放出アッセイによって測定される細胞溶解機能の増強（図９Ｃ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、および最初の刺激時にＴｈ１上清サイトカインの発現の増大（図９Ｄ）が実証された。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３連の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。図９Ｅ。５×１０４個のＭ２８ｚ  ＥＶ（ｎ＝１９）またはＭ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ（ｎ＝１６）を胸膜に投与した単回用量のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を比較する、腫瘍ＢＬＩ（左側）およびカプラン・マイヤー生存分析（右側）。示されているデータは、２回の独立した実験の組合せである。
【化１−４】
2019528699.tif 000006
記号は死亡を示す。生存期間中央値が日数で示されている。ログランク検定を使用して生存曲線を分析した（Ｐ＝０．００１）。個々の実験それぞれについてのログランク検定はＰ＜０．０５レベルまで有意であった；２回の実験を例示のために組み合わせている。本実験のマウスのコホート（Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）は、反復腫瘍再攻撃にもかかわらず、４５０日を超えて生存し、これにより、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＣＡＲ  Ｔ細胞の「機能持続性」が実証される。
【図９Ｅ】図９Ａ〜９Ｅは、ＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ−１  ＤＮＲ）の同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−１リガンド媒介性阻害からレスキューされることを示す。図９Ａ。（左側）内在性ＰＤ−１受容体（共阻害性シグナルを伝達する）または阻害性シグナル伝達ドメインを欠く同時形質導入されたＰＤ−１  ＤＮＲを介して腫瘍リガンドと結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの実験に関して、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に、空ベクター（ＥＶ；ＳＦＧ−ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＰＤ−１  ＤＮＲ（ＳＦＧ−２Ａ−ＰＤ−１  ＤＮＲ）のいずれかを用いて同時形質導入した。次いで、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について選別されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理されているＭＳＬＮ＋腫瘍細胞と一緒に２４時間インキュベートして、ＰＤ−１リガンドを上方調節した。Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に小さいが統計的に有意な蓄積の増強（図９Ｂ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞を用いた第３の刺激時にクロム放出アッセイによって測定される細胞溶解機能の増強（図９Ｃ；三角形、Ｍ２８ｚ  ＥＶ；四角、Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）、および最初の刺激時にＴｈ１上清サイトカインの発現の増大（図９Ｄ）が実証された。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、３連の平均±ＳＥＭを表すまたは個々の点としてプロットされている。図９Ｅ。５×１０４個のＭ２８ｚ  ＥＶ（ｎ＝１９）またはＭ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ（ｎ＝１６）を胸膜に投与した単回用量のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を比較する、腫瘍ＢＬＩ（左側）およびカプラン・マイヤー生存分析（右側）。示されているデータは、２回の独立した実験の組合せである。
【化１−５】
2019528699.tif 000007
記号は死亡を示す。生存期間中央値が日数で示されている。ログランク検定を使用して生存曲線を分析した（Ｐ＝０．００１）。個々の実験それぞれについてのログランク検定はＰ＜０．０５レベルまで有意であった；２回の実験を例示のために組み合わせている。本実験のマウスのコホート（Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）は、反復腫瘍再攻撃にもかかわらず、４５０日を超えて生存し、これにより、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＣＡＲ  Ｔ細胞の「機能持続性」が実証される。
【００７０】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＰＤ−１受容体を標的とするｓｈＲＮＡの同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１媒介性阻害からレスキューされることを示す。図１０Ａ．（左側）ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡの同時発現を伴うまたは伴わない、ＰＤ−Ｌ１を発現した腫瘍に内在性ＰＤ−１受容体を介して結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）全ての実験に、ＰＤ−１を標的とする２種のｓｈＲＮＡ（ｄｓＲＥＤレポーターを同時発現するｓｈ１またはｓｈ２）のうちの１種または細菌配列を標的とするｓｈＲＮＡ（ＫａｎＲ）を同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を含めた。図１０Ｂ。ＫａｎＲ形質導入細胞と比較して、ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡを同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、フィトヘマグルチニンを用いて刺激するとＰＤ−１受容体タンパク質発現の６０％〜７０％のノックダウンが実証された（グラフは左から右に４３０、７２２、８１３および１４１１に対応する）。細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現している３Ｔ３線維芽細胞（３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋）またはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を上方調節するためにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理した中皮腫腫瘍細胞のいずれかと一緒にインキュベートした。Ｍ２８ｚ  ＰＤ１  ｓｈＲＮＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に蓄積の増強が実証され（図１０Ｃ）、低エフェクター対標的比において、残りの生存腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性によって測定される細胞溶解機能の増強（図１０Ｄ；棒グラフ（bar  grafts）の群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）およびＴｈ１サイトカイン分泌の増加（図１０Ｅ；棒グラフの群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）が実証される。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＰＤ−１受容体を標的とするｓｈＲＮＡの同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１媒介性阻害からレスキューされることを示す。図１０Ａ．（左側）ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡの同時発現を伴うまたは伴わない、ＰＤ−Ｌ１を発現した腫瘍に内在性ＰＤ−１受容体を介して結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）全ての実験に、ＰＤ−１を標的とする２種のｓｈＲＮＡ（ｄｓＲＥＤレポーターを同時発現するｓｈ１またはｓｈ２）のうちの１種または細菌配列を標的とするｓｈＲＮＡ（ＫａｎＲ）を同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を含めた。図１０Ｂ。ＫａｎＲ形質導入細胞と比較して、ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡを同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、フィトヘマグルチニンを用いて刺激するとＰＤ−１受容体タンパク質発現の６０％〜７０％のノックダウンが実証された（グラフは左から右に４３０、７２２、８１３および１４１１に対応する）。細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現している３Ｔ３線維芽細胞（３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋）またはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を上方調節するためにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理した中皮腫腫瘍細胞のいずれかと一緒にインキュベートした。Ｍ２８ｚ  ＰＤ１  ｓｈＲＮＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に蓄積の増強が実証され（図１０Ｃ）、低エフェクター対標的比において、残りの生存腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性によって測定される細胞溶解機能の増強（図１０Ｄ；棒グラフ（bar  grafts）の群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）およびＴｈ１サイトカイン分泌の増加（図１０Ｅ；棒グラフの群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）が実証される。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＰＤ−１受容体を標的とするｓｈＲＮＡの同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１媒介性阻害からレスキューされることを示す。図１０Ａ．（左側）ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡの同時発現を伴うまたは伴わない、ＰＤ−Ｌ１を発現した腫瘍に内在性ＰＤ−１受容体を介して結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）全ての実験に、ＰＤ−１を標的とする２種のｓｈＲＮＡ（ｄｓＲＥＤレポーターを同時発現するｓｈ１またはｓｈ２）のうちの１種または細菌配列を標的とするｓｈＲＮＡ（ＫａｎＲ）を同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を含めた。図１０Ｂ。ＫａｎＲ形質導入細胞と比較して、ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡを同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、フィトヘマグルチニンを用いて刺激するとＰＤ−１受容体タンパク質発現の６０％〜７０％のノックダウンが実証された（グラフは左から右に４３０、７２２、８１３および１４１１に対応する）。細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現している３Ｔ３線維芽細胞（３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋）またはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を上方調節するためにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理した中皮腫腫瘍細胞のいずれかと一緒にインキュベートした。Ｍ２８ｚ  ＰＤ１  ｓｈＲＮＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に蓄積の増強が実証され（図１０Ｃ）、低エフェクター対標的比において、残りの生存腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性によって測定される細胞溶解機能の増強（図１０Ｄ；棒グラフ（bar  grafts）の群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）およびＴｈ１サイトカイン分泌の増加（図１０Ｅ；棒グラフの群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）が実証される。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＰＤ−１受容体を標的とするｓｈＲＮＡの同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１媒介性阻害からレスキューされることを示す。図１０Ａ．（左側）ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡの同時発現を伴うまたは伴わない、ＰＤ−Ｌ１を発現した腫瘍に内在性ＰＤ−１受容体を介して結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）全ての実験に、ＰＤ−１を標的とする２種のｓｈＲＮＡ（ｄｓＲＥＤレポーターを同時発現するｓｈ１またはｓｈ２）のうちの１種または細菌配列を標的とするｓｈＲＮＡ（ＫａｎＲ）を同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を含めた。図１０Ｂ。ＫａｎＲ形質導入細胞と比較して、ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡを同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、フィトヘマグルチニンを用いて刺激するとＰＤ−１受容体タンパク質発現の６０％〜７０％のノックダウンが実証された（グラフは左から右に４３０、７２２、８１３および１４１１に対応する）。細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現している３Ｔ３線維芽細胞（３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋）またはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を上方調節するためにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理した中皮腫腫瘍細胞のいずれかと一緒にインキュベートした。Ｍ２８ｚ  ＰＤ１  ｓｈＲＮＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に蓄積の増強が実証され（図１０Ｃ）、低エフェクター対標的比において、残りの生存腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性によって測定される細胞溶解機能の増強（図１０Ｄ；棒グラフ（bar  grafts）の群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）およびＴｈ１サイトカイン分泌の増加（図１０Ｅ；棒グラフの群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）が実証される。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＰＤ−１受容体を標的とするｓｈＲＮＡの同時形質導入により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１媒介性阻害からレスキューされることを示す。図１０Ａ．（左側）ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡの同時発現を伴うまたは伴わない、ＰＤ−Ｌ１を発現した腫瘍に内在性ＰＤ−１受容体を介して結合しているＣＤ２８共刺激Ｔ細胞の略図。（右側）全ての実験に、ＰＤ−１を標的とする２種のｓｈＲＮＡ（ｄｓＲＥＤレポーターを同時発現するｓｈ１またはｓｈ２）のうちの１種または細菌配列を標的とするｓｈＲＮＡ（ＫａｎＲ）を同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を含めた。図１０Ｂ。ＫａｎＲ形質導入細胞と比較して、ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡを同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、フィトヘマグルチニンを用いて刺激するとＰＤ−１受容体タンパク質発現の６０％〜７０％のノックダウンが実証された（グラフは左から右に４３０、７２２、８１３および１４１１に対応する）。細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現している３Ｔ３線維芽細胞（３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋）またはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を上方調節するためにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いて処理した中皮腫腫瘍細胞のいずれかと一緒にインキュベートした。Ｍ２８ｚ  ＰＤ１  ｓｈＲＮＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、反復抗原刺激時に蓄積の増強が実証され（図１０Ｃ）、低エフェクター対標的比において、残りの生存腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性によって測定される細胞溶解機能の増強（図１０Ｄ；棒グラフ（bar  grafts）の群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）およびＴｈ１サイトカイン分泌の増加（図１０Ｅ；棒グラフの群はそれぞれ、左から右に、Ｓｈ１、Ｓｈ２、ＳｈＫである）（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）が実証される。スチューデントのｔ検定を実施し、多重比較のボンフェローニ補正を使用して統計的有意性を決定した。データは、３回の反復実験の平均±ＳＥＭを表す。
【００７１】
【図１１】図１１は、ＰＤ−１  ＤＮＲの、Ｆｃドメインと融合したＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質およびＰＤ−Ｌ２組換えタンパク質への接着アッセイを示すグラフである。ｍＣｈｅｒｒｙで標識し、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＴ細胞を、Ｆｃと融合したＰＤ−Ｌ１（「ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ」）、Ｆｃと融合したＰＤ−Ｌ２（「ＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ」）、または対照アイソタイプＦｃ（「Ｉｓｏ  Ｆｃ」）でコーティングしたプレートに曝露した。ＰＤ−１抗体の存在下（「＋ＰＤ−１  Ａｂ」）または不在下で、プレートに結合したＴ細胞をｍｃｈｅｒｒｙ＋Ｔ細胞の絶対数として測定した。棒グラフは、左から右に、Ｔ細胞単独（「Ｔ細胞」）、ＰＤ−１抗体の存在下のＴ細胞（Ｔ細胞＋ＰＤ−１  ａｂ」）、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＴ細胞（「ＰＤ−１  ＤＮＲ  Ｔ細胞」）、およびＰＤ−１抗体の存在下の、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＴ細胞（「ＰＤ−１  ＤＮＲ  Ｔ細胞＋ＰＤ−１  Ａｂ」）のそれぞれでコーティングされたプレートのそれぞれについての結合を示す。
【００７２】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄは、Ｔ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介性阻害またはＰＤ−Ｌ２媒介性阻害を阻害するＰＤ−１  ＤＮＲを正の共刺激シグナルに変換することができることを示す。図１２Ａは、ＣＡＲとＰＤ−１  ＤＮＲとの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ｂは、ＣＡＲと、４−１  ＢＢとして例証されている共刺激ドメインをＰＤ−１のリガンド結合性ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合することによって共刺激構築物に変換したＰＤ−１  ＤＮＲとの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ｃは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ＤＮＲ、またはＭ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を形質導入したＴ細胞における０日目および７日目のＣＡＲ  Ｔ細胞の蓄積を示す。棒は、左から右に、それぞれ：Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＤＮＲ、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物である。図１２Ｄは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ＤＮＲまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を形質導入したＴ細胞におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のサイトカイン分泌を示す。棒は、左から右に、それぞれ：Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＤＮＲ、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物である。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｄは、Ｔ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介性阻害またはＰＤ−Ｌ２媒介性阻害を阻害するＰＤ−１  ＤＮＲを正の共刺激シグナルに変換することができることを示す。図１２Ａは、ＣＡＲとＰＤ−１  ＤＮＲとの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ｂは、ＣＡＲと、４−１  ＢＢとして例証されている共刺激ドメインをＰＤ−１のリガンド結合性ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合することによって共刺激構築物に変換したＰＤ−１  ＤＮＲとの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ｃは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ＤＮＲ、またはＭ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を形質導入したＴ細胞における０日目および７日目のＣＡＲ  Ｔ細胞の蓄積を示す。棒は、左から右に、それぞれ：Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＤＮＲ、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物である。図１２Ｄは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ＤＮＲまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を形質導入したＴ細胞におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のサイトカイン分泌を示す。棒は、左から右に、それぞれ：Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＤＮＲ、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物である。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｄは、Ｔ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介性阻害またはＰＤ−Ｌ２媒介性阻害を阻害するＰＤ−１  ＤＮＲを正の共刺激シグナルに変換することができることを示す。図１２Ａは、ＣＡＲとＰＤ−１  ＤＮＲとの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ｂは、ＣＡＲと、４−１  ＢＢとして例証されている共刺激ドメインをＰＤ−１のリガンド結合性ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合することによって共刺激構築物に変換したＰＤ−１  ＤＮＲとの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ｃは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ＤＮＲ、またはＭ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を形質導入したＴ細胞における０日目および７日目のＣＡＲ  Ｔ細胞の蓄積を示す。棒は、左から右に、それぞれ：Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＤＮＲ、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物である。図１２Ｄは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ＤＮＲまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を形質導入したＴ細胞におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のサイトカイン分泌を示す。棒は、左から右に、それぞれ：Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＤＮＲ、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物である。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、Ｔ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介性阻害またはＰＤ−Ｌ２媒介性阻害を阻害するＰＤ−１  ＤＮＲを正の共刺激シグナルに変換することができることを示す。図１２Ａは、ＣＡＲとＰＤ−１  ＤＮＲとの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ｂは、ＣＡＲと、４−１  ＢＢとして例証されている共刺激ドメインをＰＤ−１のリガンド結合性ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合することによって共刺激構築物に変換したＰＤ−１  ＤＮＲとの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ｃは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ＤＮＲ、またはＭ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を形質導入したＴ細胞における０日目および７日目のＣＡＲ  Ｔ細胞の蓄積を示す。棒は、左から右に、それぞれ：Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＤＮＲ、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物である。図１２Ｄは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ＤＮＲまたはＭ２８ｚ  ＣＡＲプラスＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を形質導入したＴ細胞におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のサイトカイン分泌を示す。棒は、左から右に、それぞれ：Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ＤＮＲ、およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ＋ＰＤ−１  ４−１ＢＢスイッチ受容体構築物である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
７．発明の詳細な説明
本発明は、ウイルス感染を処置するための組成物および方法に関する。そのようなウイルス感染としては、これだけに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染などが挙げられる。本明細書に記載の通り、免疫賦活性免疫細胞を、ドミナントネガティブ突然変異体であり、免疫細胞の活性を限定する遮断を阻害するタンパク質を内因的に発現するように遺伝子操作することができる。遮断を阻害することにより、免疫賦活性である遺伝子操作された免疫細胞がウイルス感染に対してより有効な免疫応答をもたらすことが可能になる。別の実施形態では、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞などのウイルス抗原を標的とする免疫賦活性細胞の免疫活性の免疫抑制を示す免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などを、ドミナントネガティブ突然変異体であり、免疫賦活性細胞に対する免疫抑制細胞の免疫抑制効果を阻害するタンパク質を内因的に発現するように遺伝子操作することができる。
【００７４】
７．１  細胞
一実施形態では、本発明は、免疫細胞、特に免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞であり、（ｉ）ウイルス抗原に結合するＣＡＲと、（ｉｉ）細胞媒介性免疫応答、好ましくは免疫細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態（以下「ＤＮ形態」）とを組換え発現する、細胞を提供する。そのような実施形態における免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞またはこれらの組合せであることが好ましい。別の実施形態では、本発明は、ウイルス抗原に感作される免疫細胞、例えばＴ細胞、特に免疫賦活性Ｔ細胞であって、細胞媒介性免疫応答、好ましくはＴ細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を発現する免疫細胞、例えばＴ細胞、特に免疫賦活性Ｔ細胞を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞であり、細胞媒介性免疫応答、好ましくは調節性Ｔ細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を発現する、免疫細胞を提供する。特定の実施形態では、免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などは、慢性ウイルス感染を有する対象から単離される。組換え細胞を使用して、ウイルスなどの標的に対する免疫応答を増強するまたはもたらすことができる。細胞は、ヒトに由来する（組換えを行う前のヒト起源のものである）ことが好ましい（本発明の処置方法においてヒトに投与するためにはヒト由来細胞が特に好ましい）。
【００７５】
免疫賦活性細胞である免疫細胞。
本発明の免疫細胞は、リンパ系の免疫賦活性細胞であり得る。免疫賦活性細胞は、対象における免疫応答を媒介する。免疫賦活性細胞として使用することができるリンパ系の細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、大多数の細胞がα鎖およびβ鎖を発現し、より小さな集団がγ鎖およびδ鎖を発現する。本発明の免疫賦活性細胞として有用なＴ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり得、これだけに限定されないが、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬとも称される；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ならびに、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）、およびエフェクターメモリーＴ細胞、例えばＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ（ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞を含めたメモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、およびγδＴ細胞を挙げることができる。他の例示的な免疫賦活性細胞としては、これだけに限定されないが、マクロファージ、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または免疫応答を媒介し、細胞媒介性免疫応答の阻害剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤経路受容体、例えば、ＰＤ−１を発現する任意の免疫細胞が挙げられる（機構に縛られることを意図しないが、細胞におけるＤＮ形態の発現により、細胞媒介性免疫応答の阻害剤が細胞の持続的な活性化を促進するのが阻害されることが提示される）。本発明に従って使用することができる、上記の通りＤＮ形態を組換え発現するまたはＣＡＲとＤＮ形態を同時発現する免疫賦活性細胞の前駆体細胞は、例として、造血幹細胞および／または前駆細胞である。造血幹細胞および／または前駆細胞は、骨髄、臍帯血、サイトカイン動員後の成体末梢血などから、当技術分野で公知の方法によって、次いで、ＤＮ形態を組換え発現するまたはＣＡＲとＤＮ形態を同時発現するように遺伝子操作することができる。特に有用な前駆体細胞は、リンパ系、例えば、リンパ系の造血幹細胞または前駆細胞に分化させることができるものである。
【００７６】
免疫賦活性細胞である免疫細胞およびその前駆体細胞は、商業的に入手可能な単離方法を含めた当技術分野で周知の方法によって単離することができる（例えば、Rowland-Jonesら、Lymphocytes:  A  Practical  Approach、Oxford  University  Press、New  York（１９９９年）を参照されたい）。免疫細胞またはその前駆体細胞の供給源としては、これだけに限定されないが、末梢血、臍帯血、骨髄、または他の造血細胞の供給源が挙げられる。細胞を分離して所望の免疫細胞を単離するまたは富化するために種々の技法を用いることができる。例えば、負の選択方法を使用して、所望の免疫細胞ではない細胞を取り除くことができる。さらに、正の選択方法を使用して、所望の免疫細胞またはその前駆体細胞を単離するまたは富化することもでき、正の選択方法と負の選択方法の組合せを用いることもできる。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、正の選択および負の選択の両方に関して、特定の細胞系列および／または分化の段階に関連付けられるマーカーを同定するために特に有用である。特定の細胞型、例えば、特定の型のＴ細胞を単離する場合、当技術分野で周知の通り、これだけに限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３４（造血幹細胞および造血前駆細胞に関して）などを含めた種々の細胞表面マーカーまたはマーカーの組合せを使用して細胞を分離することができる（Kearse、T  Cell  Protocols:  Development  and  Activation、Humana  Press、Totowa  NJ（２０００年）；De  Libero、T  Cell  Protocols、Methods  in  Molecular  Biology、５１４巻、Humana  Press、Totowa  NJ（２００９年）を参照されたい）。
【００７７】
ＣＡＲの組換え発現のために使用することができる免疫細胞を単離するための種々の方法は、これだけに限定されないが、末梢ドナーリンパ球の使用（Sadelainら、Nat.  Rev.  Cancer、３巻：３５〜４５頁（２００３年）；Morganら、Science、３１４巻：１２６〜１２９頁（２００６年）、および人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）または樹状細胞を用いる、選択的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増加させた抗原特異的末梢血白血球の使用（Dupontら、Cancer  Res.、６５巻：５４１７〜５４２７頁（２００５年）；Papanicolaouら、Blood、１０２巻：２４９８〜２５０５頁（２００３年））を含め、以前に記載されており、それを使用することができる。幹細胞の使用の場合では、細胞は、当技術分野で周知の方法によって単離することができる（例えば、Klugら、Hematopoietic  Stem  Cell  Protocols、Humana  Press、New  Jersey（２００２年）；Freshneyら、Culture  of  Human  Stem  Cells、John  Wiley  &  Sons（２００７年）を参照されたい）。
【００７８】
別の実施形態では、本発明は、ウイルス抗原を認識し、それに感作され、さらに、免疫細胞媒介性免疫応答、例えば、Ｔ細胞の場合ではＴ細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を組換え発現する免疫細胞、例えばＴ細胞などを提供する。そのような免疫細胞、例えばＴ細胞などは、ウイルス抗原に結合するＣＡＲを発現し得るが、必ずしも発現しなくてよく、これは、当該細胞はすでにウイルス抗原に特異的であり、したがって、それらの免疫応答（例えば、細胞傷害性）がそのようなウイルス抗原によって特異的に刺激されるからである。ウイルス抗原を認識し、それに感作される免疫細胞、例えばＴ細胞などは、公知の方法、例として、ナイーブなＴ細胞（例えば、Wolflら、Nat.  Protocols、９巻：９５０〜９６６頁（２０１４年）を参照されたい）もしくは造血前駆細胞（van  Lentら、J.  Immunol.、１７９巻：４９５９〜４９６８頁（２００７年）を参照されたい）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感作方法によって得ることができる；または、ウイルス抗原に曝露しており、それに対する免疫応答が開始されている対象、例えば、ウイルス感染を有する対象などから得ることができる（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで感作された免疫細胞）。対象から抗原特異的Ｔ細胞を単離するための方法は当技術分野で周知である。そのような方法としては、これだけに限定されないが、抗原特異的を同定し、単離するために使用することができる、抗原刺激されたＴ細胞からのサイトカインの分泌、および、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞の増加に基づくサイトカイン捕捉系またはサイトカイン分泌アッセイが挙げられる（Assenmacherら、Analyzing  T  Cell  Responses内のCytometric  Cytokine  Secretion  Assay:  How  to  Analyze  Cellular  Immune  Responses  Against  Tumor  Associated  Antigens、Nagorsenら編、第１０章、１８３〜１９５頁、Springer、The  Netherlands（２００５年）；Haneyら、J.  Immunol.  Methods、３６９巻：３３〜４１頁（２０１１年）；Bunosら、Vox  Sanguinis  DOI:10.1111/vox.１２２９１頁（２０１５年）；Montesら、Clin.  Exp.  Immunol.、１４２巻：２９２〜３０２頁（２００５年）；Adusumilliら、Sci  Transl  Med.、６巻：２６１ｒａ１５１頁（２０１４年）を参照されたい）。そのようなサイトカインとしては、これだけに限定されないが、インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子−αが挙げられる。抗原特異的Ｔ細胞は、免疫細胞を単離するための上記の周知の技法を使用して単離することができ、当該技法としては、これだけに限定されないが、フローサイトメトリー、磁気ビーズ、固相上でのパニングなどが挙げられる。抗原特異的Ｔ細胞の単離技法はまた、商業的にも入手可能であり、臨床的適用に使用するまたは適応させることができる（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫなどを参照されたい）。
【００７９】
免疫抑制細胞である免疫細胞。免疫抑制細胞である本発明の免疫細胞は、リンパ系の細胞であり得る。免疫抑制細胞として使用することができるリンパ系の細胞の非限定的な例としては、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、濾胞性調節性Ｔ細胞、調節性Ｂ細胞などが挙げられる。本発明の免疫抑制細胞は、細胞媒介性免疫応答の阻害剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤経路受容体、例えば、ＰＤ−１を発現する。
【００８０】
細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を組換え発現するように遺伝子操作することができる免疫抑制細胞は、商業的に入手可能な単離方法を含めた当技術分野で周知の方法によって単離することができる（例えば、Rowland-Jonesら、Lymphocytes:  A  Practical  Approach、Oxford  University  Press、New  York（１９９９年）を参照されたい）。その免疫抑制細胞の供給源としては、これだけに限定されないが、末梢血、臍帯血、骨髄、または他のリンパ系の細胞の供給源が挙げられる。細胞を分離して所望の免疫抑制細胞を単離するまたは富化させるために種々の技法を用いることができる。例えば、負の選択方法を使用して、所望の免疫抑制細胞ではない細胞を取り除くことができる。さらに、正の選択方法を使用して、所望の免疫抑制細胞を単離するまたは富化させることもでき、正の選択と負の選択方法の組合せを用いることもできる。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、特定の細胞系列および／または分化の段階に関連付けられるマーカーを同定するために特に有用であり、正の選択および負の選択の両方に関して試薬として使用することができる。特定の型の免疫抑制細胞を、当技術分野で周知の通り、これだけに限定されないが、正の選択のためのＣＤ４および／もしくはＣＤ８と負の選択のためのＣＤ１２７の組合せを含めた種々の細胞表面マーカーもしくはマーカーの組合せ、またはマーカーが存在しないことに基づいて単離することができる（Kearse,  T  Cell  Protocols:  Development  and  Activation,  Humana  Press,  Totowa  NJ  (2000);  De  Libero,  T  Cell  Protocols,  Vol.  514  of  Methods  in  Molecular  Biology,  Humana  Press,  Totowa  NJ  (2009);  Suら、Methods  Mol.  Biol.  806:287-299  (2012);  Bluestoneら、Sci.  Transl.  Med.  7(315)  (doi:  10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015);  Miyaraら、Nat.  Rev.  Rheumatol.  10:543-551  (2014);  Liuら、J.  Exp.  Med.  203:1701-1711  (2006);  Seddikiら、J.  Exp.  Med.  203:1693-1700  (2006);  Ukenaら、Exp.  Hematol.  39:1152-1160  (2011);  Chenら、J.  Immunol.  183:4094-4102  (2009);  Putnamら、Diabetes  58:652-662  (2009);  Putnamら、Am.  J.  Tranplant.  13:3010-3020  (2013)を参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞を、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞単離キット（Ｄｙｎａｌ  ｂｒａｎｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して単離する（Leeら、Cancer  Res.、７１巻：２８７１〜２８８１頁（２０１１年）を参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける調節性Ｔ細胞の生成（ｉＴｒｅｇ）も記載されている（例えば、Lanら、J.  Mol.  Cell.  Biol.  4:22-28  (2012);  Yamagiwaら、J.  Immunol.  166:7282-7289  (2001);  Zhengら、J.  Immunol.  169:4183-4189  (2002)を参照されたい）。ＣＡＲの組換え発現のために使用することができる免疫細胞を単離するための種々の方法は、以前に記載されている(Sadelainら、Nat.  Rev.  Cancer  3:35-45  (2003);  Morganら、Science  314:126-129  (2006);  Panelliら、J.  Immunol.  164:495-504  (2000);  Panelliら、J  Immunol.  164:4382-4392  (2000);  Dupontら、Cancer  Res.  65:5417-5427  (2005);  Papanicolaouら、Blood  102:2498-2505  (2003);  MacDonaldら、J  Clin.  Invest.  126:1413-1424  (2016)).特定の実施形態では、免疫抑制細胞、特に調節性Ｔ細胞は、ウイルス感染、例えば、慢性ウイルス感染、ＨＣＶによる慢性感染、ＨＢＶによる慢性感染またはＨＩＶによる慢性感染などを有する対象から単離される。特定の実施形態では、調節性Ｔ細���は、慢性ウイルス感染を有する患者から、患者が急性感染の寛解の状態にある時に単離される。ウイルス感染を有する患者から単離される免疫抑制細胞の場合では、免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などは、ウイルス抗原に対して抗原特異的である必要はないが、抗原特異的であってもよい。
【００８１】
任意選択で、免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などをウイルス抗原に感作させることができる。抗原特異的免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などを対象から単離するための方法は当技術分野で周知である（例えば、Noyanら、Eur.  J.  Immunol.  44:2592-2602  (2014);  Bruskoら、PLoS  One  5(7)  e11726  (doi:  10.1371)  (2010);  Bacherら、Mucosal  Immunol.  7:916-928  (2014);  Koenenら、J.  Immunol.  174:7573-7583  (2005)を参照されたい）。
【００８２】
一実施形態では、免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などは、ウイルス感染、例えば、慢性ウイルス感染を有する患者から単離される。そのような単離された細胞またはそれらの後代を、任意選択で、ウイルス感染に関与するウイルスの抗原に結合するＣＡＲを発現するように遺伝子改変することができる。
【００８３】
調節性Ｔ細胞を単離し、増加させるための方法は当技術分野で周知である（例えば、Suら、Methods  Mol.  Biol.  806:287-299  (2012);  Bluestoneら、Sci.  Transl.  Med.  7(315)  (doi:  10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015);  Miyaraら、Nat.  Rev.  Rheumatol.  10:543-551  (2014);  Liuら、J.  Exp.  Med.  203:1701-1711  (2006);  Seddikiら、J.  Exp.  Med.  203:1693-1700  (2006);  Ukenaら、Exp.  Hematol.  39:1152-1160  (2011);  Chenら、J.  Immunol.  183:4094-4102  (2009);  Putnamら、Diabetes  58:652-662  (2009);  Putnamら、Am.  J.  Tranplant.  13:3010-3020  (2013);  Leeら、Cancer  Res.  71:2871-2881  (2011);  MacDonaldら、J  Clin.  Invest.  126:1413-1424  (2016)を参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける調節性Ｔ細胞の生成（ｉＴｒｅｇ）も記載されている（例えば、Lanら、J.  Mol.  Cell.  Biol.  4:22-28  (2012);  Yamagiwaら、J.  Immunol.  166:7282-7289  (2001);  Zhengら、J.  Immunol.  169:4183-4189  (2002)を参照されたい）。一般に、本発明の調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、特にＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋である。そのような調節性Ｔ細胞は、転写因子のフォークヘッド／ウィングドヘリックスファミリーに入るＦｏｘｐ３（フォークヘッドボックスＰ３）を発現する(Bluestoneら、J.  Clin.  Invest.  125:2250-2260  (2015);  Rileyら、Immunity  30:656-665  (2009)).本発明の免疫抑制細胞である調節性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋調節性Ｔ細胞であり得る(Guillonneauら、Curr.  Opin.  Organ  Transplant.  15:751-756  (2010)).調節性Ｔ細胞を単離し、増加させるための方法は商業的にも入手可能である（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ；ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡを参照されたい）。本発明の免疫抑制細胞は、濾胞性調節性Ｔ細胞（Ｔ（ＦＲ））である場合もある(Sageら、Nat.  Immunol.  14:152-161  (2013)).特定の実施形態では、本発明の濾胞性調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋であり、Ｆｏｘｐ３を発現する（Sageら、上記、２０１３年）。
【００８４】
一部の実施形態では、本発明の免疫抑制細胞は、調節性Ｂ細胞である。調節性Ｂ細胞は、Ｂ細胞の中でインターロイキン１０（ＩＬ１０）を産生する独特の能力を有する（例えば、Lykkenら、International  Immunol.、２７巻：４７１〜４７７頁（２０１５年）；Miyagakiら、International  Immunol.、２７巻：４９５〜５０４頁（２０１５年）を参照されたい）。調節性Ｂ細胞を単離する方法は記載されている（例えば、Massonら、in  Regulatory  B  Cells:  Methods  and  Protocols,  VitaleおよびMion編,第4章,  pp.  45-52,  Humana  Press,  New  York  (2014)を参照されたい）。そのような方法は、ＣＤ２４ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈなどの細胞表面マーカーの発現、およびＩＬ１０の発現に基づく（Massonら、上記、２０１４年）。調節性Ｂ細胞についての他のマーカーとしては、ＣＤ２４ｈｉＣＤ２７＋が挙げられる（Lykkenら、上記、２０１５年を参照されたい）。
【００８５】
免疫細胞を分離するための手順としては、これだけに限定されないが、密度勾配遠心分離、細胞密度を改変する粒子とのカップリング、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー；これだけに限定されないが、補体および細胞毒を含めた、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と接合するまたは併せて使用する細胞傷害性薬剤、ならびに固体マトリックス、例えば、プレートまたはチップに付着させた抗体を用いたパニング、水簸、フローサイトメトリー、または任意の他の都合のよい技法が挙げられる（例えば、Recktenwaldら、Cell  Separation  Methods  and  Applications、Marcel  Dekker,  Inc.、New  York（１９９８年）を参照されたい）。本発明の方法において使用される免疫細胞は、実質的に純粋な細胞であってもよく、ポリクローナル集団であってもよいことが理解される。一部の実施形態では、ポリクローナル集団は、所望の免疫細胞について富化させることができる。そのような富化は、所望の通り、細胞を、ＤＮ形態、またはＣＡＲおよびＤＮ形態を発現するように遺伝子操作する前に行うこともでき、その後に行うこともできる。
【００８６】
免疫細胞またはその前駆体細胞は、本発明の処置方法においてそれらを投与される対象にとって自己由来であってもよく、非自己由来であってもよい。自己細胞は、工学的に操作された細胞を投与される対象から単離される。任意選択で、細胞は、採血した血液から白血球を選択的に取り出し、組換えを行い、次いで、ドナーに再輸注する白血球アフェレーシスによって得ることができる。あるいは、対象ではない非自己由来ドナー由来の同種異系細胞を使用することができる。非自己由来ドナーの場合では、当技術分野で周知の通り、細胞の型を決定し、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対応させて、適切な適合性のレベルを決定する。自己由来細胞および非自己細胞のどちらに対しても、任意選択で、細胞を、当技術分野で周知の方法を使用して遺伝子操作および／または対象への投与に使用する準備ができるまで凍結保存することができる。
【００８７】
免疫細胞またはその前駆体細胞を、免疫細胞またはその前駆体細胞の維持または増加が有利な条件に供すことができる（Kearse,  T  Cell  Protocols:  Development  and  Activation,  Humana  Press,  Totowa  NJ  (2000);  De  Libero,  T  Cell  Protocols,  Vol.  514,  Methods  in  Molecular  Biology,  Humana  Press,  Totowa  NJ  (2009);  Parente-Pereiraら、J.  Biol.  Methods  1(2)  e7  (doi  10.14440/jbm.2014.30)  (2014);  Movassaghら、Hum.  Gene  Ther.  11:1189-1200  (2000);  Rettigら、Mol.  Ther.  8:29-41  (2003);  Agarwalら、J.  Virol.  72:3720-3728  (1998);  Pollokら、Hum.  Gene  Ther.  10:2221-2236  (1999);  Quinnら、Hum.  Gene  Ther.  9:1457-1467  (1998);  Suら、Methods  Mol.  Biol.  806:287-299  (2012);  Bluestoneら、Sci.  Transl.  Med.  7(315)  (doi:  10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015);  Miyaraら、Nat.  Rev.  Rheumatol.  10:543-551  (2014);  Liuら、J.  Exp.  Med.  203:1701-1711  (2006);  Seddikiら、J.  Exp.  Med.  203:1693-1700  (2006);  Ukenaら、Exp.  Hematol.  39:1152-1160  (2011);  Chenら、J.  Immunol.  183:4094-4102  (2009);  Putnamら、Diabetes  58:652-662  (2009);  Putnamら、Am.  J.  Tranplant.  13:3010-3020  (2013);  Leeら、Cancer  Res.  71:2871-2881  (2011);  MacDonaldら、J  Clin.  Invest.  126:1413-1424  (2016)を参照されたい。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）などの商業的に入手可能な方法も参照されたい）。免疫細胞もしくはその前駆体細胞、またはウイルス抗原で感作された免疫細胞、例えばＴ細胞などを、任意選択で、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子操作の前またはその後に増加させることができる。細胞の増加は、対象に投与される細胞の数を増やすために特に有用である。免疫細胞を増加させるためのそのような方法は当技術分野で周知である（Kaiserら、Cancer  Gene  Therapy  22:72-78  (2015);  Wolflら、Nat.  Protocols  9:950-966  (2014);  Suら、Methods  Mol.  Biol.  806:287-299  (2012);  Bluestoneら、Sci.  Transl.  Med.  7(315)  (doi:  10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015);  Miyaraら、Nat.  Rev.  Rheumatol.  10:543-551  (2014);  Liuら、J.  Exp.  Med.  203:1701-1711  (2006);  Seddikiら、J.  Exp.  Med.  203:1693-1700  (2006);  Ukenaら、Exp.  Hematol.  39:1152-1160  (2011);  Chenら、J.  Immunol.  183:4094-4102  (2009);  Putnamら、Diabetes  58:652-662  (2009);  Putnamら、Am.  J.  Tranplant.  13:3010-3020  (2013);  Leeら、Cancer  Res.  71:2871-2881  (2011)を参照されたい）。さらに、任意選択で、細胞を、単離および／もしくは遺伝子操作、ならびに／または遺伝子操作された細胞の増加の後に凍結保存することができる（Kaiserら、上記、２０１５年を参照されたい）。細胞を凍結保存するための方法は当技術分野で周知である（例えば、Freshney、Culture  of  Animal  Cells：A  Manual  of  Basic  Techniques、第４版、Wiley-Liss、New  York（２０００年）；HarrisonおよびRae、General  Techniques  of  Cell  Culture、Cambridge  University  Press（１９９７年）を参照されたい）。
【００８８】
特定の実施形態では、免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞である、単離された免疫細胞を、ＤＮ形態およびＣＡＲの組換え発現のためにｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子操作する。特定の実施形態では、単離されたＴ細胞を、ＤＮ形態の組換え発現のためにｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子操作する。特定の実施形態では、免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などを、ＤＮ形態の組換え発現のためにｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子操作する。細胞を組換え発現のために当技術分野で周知の方法によって遺伝子操作することができる。
【００８９】
ＤＮ形態を組換え発現する、ウイルス抗原で感作された免疫細胞、例えばＴ細胞などを使用し、そのような細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける感作によって得られる実施形態では、感作は、免疫細胞をＤＮ形態を組換え発現するように遺伝子操作する前に行うこともでき、その後に行うこともできる。感作された免疫細胞、例えばＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏ供給源から単離される実施形態では、遺伝子操作はすでに感作されている免疫細胞に行われることが自明である。
【００９０】
ＤＮ形態またはＣＡＲおよびＤＮ形態を組換え発現する細胞を生成するために、ＤＮ形態またはＣＡＲおよびＤＮ形態をコードする１つまたは複数の核酸を、適切な発現ベクターを使用して免疫細胞またはその前駆体細胞に導入する。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞もしくは調節性Ｔ細胞）またはその前駆体細胞に、ＤＮ形態、またはＣＡＲおよびＤＮ形態をコードする１つまたは複数の核酸を形質導入することが好ましい。ＣＡＲおよびＤＮ形態の両方を発現させる場合では、ＣＡＲおよびＤＮ形態をコードする核酸は、所望の通り、別々のベクター上にあってもよく、同じベクター上にあってもよい。例えば、周知の分子生物学技法を使用して、本発明のＣＡＲまたはＤＮ形態をコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスベクターなどの適切なベクターにクローニングし、免疫細胞に導入することができる（Ausubelら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  and  Sons、Baltimore、MD（１９９９年）を参照されたい）。本発明の細胞、特にヒト免疫細胞またはその前駆体細胞における発現に適した任意のベクターを用いることができる。ベクターは、免疫細胞においてコードされる核酸の発現をもたらすプロモーターなどの適切な発現エレメントを含有する。レトロウイルスベクターの場合では、任意選択で、細胞を活性化して形質導入効率を上昇させることができる（Parente-Pereiraら、J.  Biol.  Methods  1(2)  e7  (doi  10.14440/jbm.2014.30)  (2014);  Movassaghら、Hum.  Gene  Ther.  11:1189-1200  (2000);  Rettigら、Mol.  Ther.  8:29-41  (2003);  Agarwalら、J.  Virol.  72:3720-3728  (1998);  Pollokら、Hum.  Gene  Ther.  10:2221-2236  (1998);  Quinnら、Hum.  Gene  Ther.  9:1457-1467  (1998)を参照されたい；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡなどの商業的に入手可能な方法も参照されたい）。調節性Ｔ細胞におけるＣＡＲなどのポリペプチドの発現に使用するための方法は、当技術分野において公知の任意のもの、例えば、Leeら、Cancer  Res.、７１巻：２８７１〜２８８１頁（２０１１年）に記載されているものであってよい。
【００９１】
一実施形態では、ベクターは、ＣＡＲまたはＤＮ形態を免疫細胞またはその前駆体細胞に導入するために用いられるレトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。細胞をＣＡＲおよび／またはＤＮ形態を発現するように遺伝子改変することに関して、形質導入のためにレトロウイルスベクターが一般に用いられる。しかし、任意の適切なウイルスベクターまたは非ウイルス送達系を使用することができることが理解される。レトロウイルスベクターと適切なパッケージング系との組合せも適切であり、その場合、カプシドタンパク質はヒト細胞への感染に関して機能的である。これだけに限定されないが、ＰＡ１２(Millerら、Mol.  Cell.  Biol.  5:431-437  (1985));  PA317  (Millerら、Mol.  Cell.  Biol.  6:2895-2902(1986))およびＣＲＩＰを含めた、種々の広宿主性ウイルス産生細胞株が公知である(Danosら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:6460-6464  (1988))。非広宿主性粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープを用いてシュードタイピングされた粒子および任意の他の当技術分野で公知のものも適切である(Relanderら、Mol.  Therap.  11:452-459  (2005))。可能性のある形質導入方法としては、細胞を産生細胞と直接共培養すること（例えば、Bregniら、Blood、８０巻：１４１８〜１４２２頁（１９９２年））、またはウイルス上清単独もしくは濃縮されたベクターストックと、適切な増殖因子およびポリカチオンを伴ってもしくは伴わずに培養すること（例えば、Xuら、Exp.  Hemat.、２２巻：２２３〜２３０頁（１９９４年）；Hughesら、J.  Clin.  Invest.、８９巻：１８１７〜１８２４頁（１９９２年）を参照されたい）も挙げられる。
【００９２】
一般に、選択されたベクターは、高効率の感染ならびに安定な組み込みおよび発現を示す（例えば、Cayouetteら、Human  Gene  Therapy  8:423-430  (1997);  Kidoら、Current  Eye  Research  15:833-844  (1996);  Bloomerら、J.  Virol.  71:6641-6649  (1997);  Naldiniら、Science  272:263  267  (1996);およびMiyoshiら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  94:10319-10323  (1997)を参照されたい）。使用することができる他のウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス由来のベクター、またはエプスタイン・バーウイルスなどのヘルペスウイルスが挙げられる（例えば、Miller,  Hum.  Gene  Ther.  1(1):5-14  (1990);  Friedman,  Science  244:1275-1281  (1989);  Eglitisら、BioTechniques  6:608-614  (1988);  Tolstoshevら、Current  Opin.  Biotechnol.  1:55-61  (1990);  Sharp,  Lancet  337:1277-1278  (1991);  Cornettaら、Prog.  Nucleic  Acid  Res.  Mol.  Biol.  36:311-322  (1989);  Anderson,  Science  226:401-409  (1984);  Moen,  Blood  Cells  17:407-416  (1991);  Millerら、Biotechnology  7:980-990  (1989);  Le  Gal  La  Salleら、Science  259:988-990  (1993);およびJohnson,  Chest  107:77S-  83S  (1995)を参照されたい）。レトロウイルスベクターが特によく開発されており、臨床的状況で使用されている（Rosenbergら、N.  Engl.  J.  Med.、３２３巻：３７０頁（１９９０年）；Andersonら、米国特許第５，３９９，３４６号）。
【００９３】
本発明のＣＡＲおよび／またはＤＮ形態を発現させるために特に有用なベクターとしては、ヒト遺伝子治療において使用されているベクターが挙げられる。非限定的な一実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。工学的に操作されたＣＡＲ  Ｔ細胞を含めたＴ細胞または他の免疫細胞における発現のためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている（Schollerら、Sci.  Transl.  Med.  4:132-153  (2012;  Parente-Pereiraら、J.  Biol.  Methods  1(2):e7  (1-9)(2014);  Lamersら、Blood  117(1):72-82  (2011);  Reviereら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  92:6733-6737  (1995)を参照されたい）。一実施形態では、ベクターは、モロニーマウス白血病に基づくレトロウイルスベクターであるＳＧＦ  γ−レトロウイルスベクターなどのＳＧＦレトロウイルスベクターである。ＳＧＦベクターは、以前に記載されている（例えば、Wangら、Gene  Therapy、１５巻：１４５４〜１４５９頁（２００８年）を参照されたい）。
【００９４】
本発明のベクターは、特定の宿主細胞における発現のために適したプロモーターを用いる。プロモーターは、誘導性プロモーターであっても構成的プロモーターであってもよい。特定の実施形態では、発現ベクターのプロモーターは、免疫細胞、例えばＴ細胞もしくはその前駆体細胞、または調節性Ｔ細胞などにおける発現をもたらす。非ウイルスベクターも、当該ベクターが免疫細胞またはその前駆体細胞における発現のために適した発現エレメントを含有する限りは、同様に使用することができる。レトロウイルスベクターなどの一部のベクターは、宿主ゲノム内に組み込むことができる。所望であれば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および／またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）などの技術を使用して、相同組換えなどにより、標的化組み込みを実行することができる(Gersbachら、Nucl.  Acids  Res.  39:7868-7878  (2011);  Vasilevaら,  Cell  Death  Dis.  6:e1831.  (Jul  23  2015);  Sontheimer,  Hum.  Gene  Ther.  26(7):413-424  (2015))。
【００９５】
ベクターおよび構築物を、任意選択で、レポーターが含まれるように設計することができる。例えば、ベクターを、ベクターまたはベクター上でもたらされる核酸、例えば、宿主染色体内に組み込まれた核酸などを含む細胞を同定するために有用であり得るレポータータンパク質を発現するように設計することができる。一実施形態では、レポーターを、ＣＡＲまたはＤＮ形態を伴うバイシストロン性発現構築物または多シストロン性発現構築物として発現させることができる。例示的なレポータータンパク質としては、これだけに限定されないが、蛍光タンパク質、例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質、例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、およびｍＫａｌａｍａ１、シアン蛍光タンパク質、例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＣｙＰｅｔ、ならびに黄色蛍光タンパク質、例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔなどが挙げられる。追加的な実施形態では、ベクター構築物は、任意選択のレポーター分子の同時発現をもたらすＰ２Ａ配列を含み得る。Ｐ２Ａは、タンパク質配列のバイシストロン性発現または多シストロン性発現のために使用することができる自己切断性ペプチド配列である（Szymczakら、Expert  Opin.  Biol.  Therapy、５巻（５号）：６２７〜６３８頁（２００５年）を参照されたい）。
【００９６】
常套的な分子生物学技法を使用してＣＡＲおよび／またはＤＮ形態の形質導入効率を決定するためにアッセイを使用することができる。蛍光タンパク質などのマーカーが構築物に組み込まれている場合、遺伝子移入効率は、形質導入された（例えば、ＧＦＰ＋）免疫細胞、例えばＴ細胞もしくはその前駆体細胞、または調節性Ｔ細胞などの分率を数量化するためのＦＡＣＳ分析によって、かつ／または定量的ＰＣＲによってモニタリングすることができる。確立された共培養系を使用して(Gadeら、Cancer  Res.  65:9080-9088  (2005);  Gongら、Neoplasia  1:123-127  (1999);  Latoucheら、Nat.  Biotechnol.  18:405-409  (2000))ウイルス抗原を発現する線維芽細胞ＡＡＰＣにより（対照と比較して）、ＣＡＲを発現する、形質導入された免疫細胞、例えばＴ細胞などからのサイトカイン放出（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳＦについての細胞上清ＬＵＭＩＮＥＸ（Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）アッセイ）、Ｔ細胞増殖（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識による）、およびＴ細胞生存（アネキシンＶ染色による）が導かれるかどうかを決定することができる。ＣＤ８０および／または４−１ＢＢＬのＴ細胞生存、増殖、および有効性に対する影響を評価することができる。Ｔ細胞をウイルス抗原陽性標的細胞による反復刺激に曝露させることができ、反復刺激によりＴ細胞増殖およびサイトカイン応答が同様のまま残るか減弱するかを決定することができる。ウイルス抗原ＣＡＲ構築物を有するまたは有さない細胞を同等のアッセイ条件下で対照比較することができる。クロム放出アッセイを使用し、多数のＥ：Ｔ比を用いた細胞傷害性アッセイを行うことができる。
【００９７】
所望であれば、本発明の細胞を遺伝子操作するためのポリペプチド、例えばＤＮ形態またはＣＡＲなどをコードする核酸を、免疫細胞またはその前駆体細胞における発現の効率が上昇するようにコドン最適化することができる。コドン最適化を使用して、所与の細胞における高レベルの発現を実現することができる。タンパク質発現の異なる段階に関与する因子としては、コドン順応性、ｍＲＮＡ構造、ならびに転写および翻訳における種々のシス−エレメントが挙げられる。当業者に公知の任意の適切なコドン最適化方法または技術を使用して、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変することができる。そのようなコドン最適化方法は、商業的に入手可能なコドン最適化サービス、例えば、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｅｎｃｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ（ＥｎＣｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｇａｉｎｓｅｖｉｌｌｅ  ＦＬ）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）などを含め、周知である。任意選択で、多数のコドン最適化を異なるアルゴリズムに基づいて実施し、最適化の結果を合わせて、ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸を生成することができる。
【００９８】
本発明の免疫細胞またはその前駆体細胞にさらなる改変を導入することができる。例えば、細胞を、免疫学的合併症および／または免疫細胞の健康または非標的組織への標的化に対処するように改変することができる。例えば、所望の場合には細胞の枯渇がもたらされるように自殺遺伝子を細胞に導入することができる。適切な自殺遺伝子としては、これだけに限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ−９）、および短縮型ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドが挙げられる。これだけに限定されないが、ｈｓｖ−ｔｋに対するガンシクロビル（ＧＣＶ）(Grecoら、Frontiers  Pharmacol.  6:95  (2015);  Bareseら、Mol.  Therapy  20:1932-1943  (2012)),ｉＣａｓｐ−９に対するＡＰ１９０３（Di  Stasiら、N.  Engl.  J.  Med.、３６５巻：１６７３〜１６８３頁（２０１１年）、およびＥＧＦＲｔに対するセツキシマブ（米国特許第８，８０２，３７４号）を含め、自殺遺伝子を含有する細胞が投与されている対象に薬剤を投与して、細胞死を促進する。一実施形態では、自殺遺伝子を活性化するように設計されたプロドラッグ、例えば、ｉＣａｓｐ−９を活性化することができるＡＰ１９０３などのプロドラッグの投与により、自殺遺伝子により活性化された細胞のアポトーシスが誘発される。一実施形態では、ｉＣａｓｐ９は、内在性カスパーゼ活性化および動員ドメインが欠失しているヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子（ＣＡＳＰ９；ＧｅｎＢａｎｋ番号、ＮＭ００１２２９（ＮＭ＿００１２２９．４、ＧＩ：４９３７９８５７７）とＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２８）リンカーを通じて接続したＦ３６Ｖ突然変異を有するヒトＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ番号、ＡＨ００２８１８（ＡＨ００２８１８．２、ＧＩ：１０３６０３２３６８））配列からなる。ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖは、別の生体不活性小分子二量体形成剤ＡＰ１９０３と高い親和性で結合する。ＡＰ１９０３の存在下では、ｉＣａｓｐ９プロ分子（ｐｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）が二量体を形成し、内因性アポトーシス経路が活性化され、細胞死に至る(Di  Stasiら、N.  Engl.  J.  Med.  365:1673-1683  (2011)).別の実施形態では、自殺遺伝子は、ＥＧＦＲｔポリペプチドである。抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えばセツキシマブを投与することによって、ＥＧＦＲｔポリペプチドにより細胞排除がもたらされ得る。自殺遺伝子は、別々のベクター上で発現させることもでき、任意選択で、ＣＡＲまたはＤＮ形態をコードするベクター内で発現させることもでき、また、ＣＡＲまたはＤＮ形態をコードする核酸と接合したバイシストロン性構築物または多シストロン性構築物であってよい。
【００９９】
７．２  キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明の細胞によって組換え発現されるＣＡＲは、ウイルス抗原に結合する抗原結合性ドメインを有する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、「第１世代」、「第２世代」または「第３世代」ＣＡＲであり得る（例えば、Sadelainら、Cancer  Discov.  3(4):388-398  (2013);  Jensenら、Immunol.  Rev.  257:127-133  (2014);  Sharpeら、Dis.  Model  Mech.  8(4):337-350  (2015);  Brentjensら、Clin.  Cancer  Res.  13:5426-5435  (2007);  Gadeら、Cancer  Res.  65:9080-9088  (2005);  Maherら、Nat.  Biotechnol.  20:70-75  (2002);  Kershawら、J.  Immunol.  173:2143-2150  (2004);  Sadelainら、Curr.  Opin.  Immunol.  21(2):215-223  (2009);  Hollymanら、J.  Immunother.  32:169-180  (2009)を参照されたい）。
【０１００】
「第１世代」ＣＡＲは、一般には、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質／細胞内ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合した細胞外抗原結合性ドメイン、例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成される。「第１世代」ＣＡＲは、一般には、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）からのシグナルの一次トランスミッターである、ＣＤ３ζ鎖に由来する細胞内ドメインを有する（図１Ａにおける例示的な第１世代ＣＡＲを参照されたい）。「第１世代」ＣＡＲは、単一の融合分子内のそれらのＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを通じて、ＨＬＡ媒介性抗原の提示とは独立して、新規の抗原認識をもたらし、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含めたＴ細胞の活性化を引き起こすことができる。本発明において使用するための「第２世代」ＣＡＲは、Ｔ細胞などの免疫細胞を活性化することが可能な細胞内シグナル伝達ドメインと融合したウイルス抗原結合性ドメイン、ならびに免疫細胞、例えばＴ細胞など、効力および持続性が増大するように設計された共刺激ドメインを含む（Sadelainら、Cancer  Discov.、３巻：３８８〜３９８頁（２０１３年））。したがって、ＣＡＲ設計では、２つの別々の複合体、ＴＣＲヘテロ二量体およびＣＤ３複合体によって生理的に生じる２つの機能である抗原認識とシグナルトランスダクションとを組み合わせることができる。「第２世代」ＣＡＲは、追加的なシグナルを細胞にもたらすために、種々の共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０などに由来する細胞内ドメインをＣＡＲの細胞質尾部に含む（図１Ａにおける例示的な第２世代ＣＡＲを参照されたい）。「第２世代」ＣＡＲでは、例えばＣＤ２８または４−１ＢＢドメインによる共刺激と、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化の両方がもたらされる。「第３の世代」ＣＡＲでは、例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢドメインの両方を含めることによって多数の共刺激、ならびに、例えば、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含めることによって活性化がもたらされる。
【０１０１】
本明細書に開示される実施形態では、ＣＡＲは、一般に、上記の通り、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインはウイルス抗原に結合する。特定の非限定的な実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０１０２】
本明細書に開示される通り、本発明の方法は、ウイルス抗原ＣＡＲおよび細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態（「ＤＮ形態」）を同時発現するように工学的に操作された細胞を投与することを含み得る。ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、通常、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または受容体もしくはそれらのリガンドに由来する。
【０１０３】
ＣＡＲの設計は当技術分野において周知である（例えば、Sadelainら、Cancer  Discov.、３巻（４号）：３８８〜３９８頁（２０１３年）；Jensenら、Immunol.  Rev.、２５７巻：１２７〜１３３頁（２０１４年）；Sharpeら、Dis.  Model  Mech.、８巻（４号）：３３７〜３５０頁（２０１５年）による総説、およびそこで引用されている参考文献を参照されたい）。所望のウイルス抗原を対象とするＣＡＲは、本明細書に記載されているものを含めた、ＣＡＲを設計するための周知の方法を使用して生成することができる。ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲであるか、第２世代ＣＡＲであるかまたは第３世代ＣＡＲであるかに関わらず、ウイルス抗原結合活性、例えば、ウイルス抗原を対象とするｓｃＦｖ抗体と、Ｔ細胞受容体細胞質／細胞内ドメインなどの免疫細胞シグナル伝達ドメインを融合することによって容易に設計することができる。上記の通り、ＣＡＲは、一般に、免疫細胞、例えばＴ細胞またはその前駆体細胞などにおける細胞シグナル伝達活性を有する細胞内ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合したｓｃＦｖなどのウイルス抗原結合活性を細胞外ドメインの少なくとも一部分として有する細胞表面受容体の構造を有する。ウイルス抗原ＣＡＲは、本明細書に記載の共刺激分子を含み得る。当業者は、本明細書に記載されており、また当技術分野で公知の適切な膜貫通ドメイン、および、免疫細胞、例えばＴ細胞またはその前駆体細胞などにおける所望のシグナル伝達能力をもたらすための細胞内ドメインを容易に選択することができる。
【０１０４】
本発明において使用するためのＣＡＲは、ウイルス抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメインを含む。抗原結合性ドメインは、標的ウイルス上の抗原、または標的細胞もしくは組織において発現するウイルス抗原に結合する。そのような抗原結合性ドメインは、一般に、抗体に由来する。一実施形態では、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖまたはＦａｂ、または任意の適切な抗体の抗原結合性断片であってよい（Sadelainら、Cancer  Discov.、３巻：３８８〜３９８頁（２０１３年）を参照されたい）。ウイルス抗原に結合する多くの抗体または抗体に由来する抗原結合性ドメインは、当技術分野で公知である。あるいは、そのような抗体または抗原結合性ドメインは、常套的な方法によって作製することができる。抗体を生成する方法は、モノクローナル抗体を作製する方法またはヒトＦａｂのライブラリーのスクリーニングを含めた、ライブラリーをスクリーニングして抗原結合性ポリペプチドを得る方法を含め、当技術分野で周知である(WinterおよびHarris,  Immunol.  Today  14:243-246  (1993);  Wardら、Nature  341:544-546  (1989);  HarlowおよびLane,  Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  (1988);  Hilyardら、Protein  Engineering:  A  practical  approach  (IRL  Press  1992);  Borrabeck,  Antibody  Engineering,  2nd  ed.  (Oxford  University  Press  1995);  Huseら、Science  246:1275-1281  (1989))。ＣＡＲのための、抗体に由来する抗原結合性ドメインは、所望の通り、ヒト、ヒト化、キメラ、ＣＤＲ移植などであってよい。例えば、ＣＡＲの抗原結合性ドメインを生成するための供給源である抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、そのような抗体を、マウス抗体のＣＤＲをヒトフレームワークに移植することによってヒト化することができ（Borrabeck、上記、１９９５年を参照されたい）、これは、ＣＡＲをヒト対象に投与することに関して有益であり得る。好ましい実施形態では、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖの生成は当技術分野において周知である（例えば、Huston,  ら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA  85:5879-5883  (1988);  Ahmadら、Clin.  Dev.  Immunol.  2012:  ID980250  (2012);米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号；ならびに米国特許公開第２００５０１９６７５４号および同第２００５０１９６７５４号を参照されたい）。
【０１０５】
ウイルス抗原結合活性を得ることに関して、当業者は、本明細書に開示される通り、ＣＡＲに特に有用なウイルス抗原に結合するｓｃＦｖの生成を含め、所望の抗原に結合する抗体を生成し、スクリーニングするための周知の方法を使用して、適切なウイルス抗原結合活性、例えば抗体などを容易に得ることができる。さらに、いくつものウイルス抗原抗体、特にモノクローナル抗体が商業的に入手可能であり、それらを、ＣＡＲを生成するためのウイルス抗原結合活性、例えばｓｃＦｖなどの供給源として使用することもできる（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ；ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ  Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ、Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪなどを参照されたい）。
【０１０６】
抗体に由来する抗原結合性ドメインを使用する代わりに、ＣＡＲ細胞外ドメインは、受容体のリガンドまたは細胞外リガンド結合性ドメインを含んでよい（Sadelainら、Cancer  Discov.、３巻：３８８〜３９８頁（２０１３年）；Sharpeら、Dis.  Model  Mech.、８巻：３３７〜３５０頁（２０１５年）を参照されたい）。この場合、受容体のリガンドまたは細胞外リガンド結合性ドメインにより、ＣＡＲに、ＣＡＲを発現する細胞を対応する受容体またはリガンドに標的化する能力がもたらされる。ウイルスの標的化の場合では、例示的な実施形態は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のｇＥ／ｇＩ糖タンパク質の使用である（Polcicovaら、J.  Virol.、７９巻：１１９９０〜１２００１頁（２００５年）を参照されたい）。ＨＳＶ  ｇＥ／ｇＩ糖タンパク質は、細胞間接合に蓄積し、ＨＳＶの細胞間拡散を媒介する（Polcicovaら、上記、２００５年）。特定の実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫細胞をＨＳＶが細胞から細胞へ拡散する細胞間接合に標的化するために、ＣＡＲ細胞外ドメインは、ＨＳＶ  ｇＥの細胞外ドメインを含む。
【０１０７】
ウイルス抗原を対象とするＣＡＲに関しては、ＣＡＲの抗原結合性ドメインを、標的ウイルスのウイルス抗原、または、ウイルスを含有する細胞、例えば、その細胞表面上にウイルス抗原を発現する感染細胞上に発現するウイルス抗原に結合するように選択する。そのようなウイルス抗原は、ウイルス上に一意的に発現し得る、または、ウイルス抗原は、ウイルス上またはウイルスが感染した組織もしくは細胞において、ウイルスが感染していない細胞もしくは組織と比べて過剰発現し得る。一般に、ウイルス抗原は、ウイルスまたはウイルスが感染した細胞もしくは組織によって一意的に発現され、感染した生物体において天然には発現しない。ＣＡＲが結合するウイルス抗原は、ウイルスが感染していない細胞または組織を越えてＣＡＲを発現する細胞の標的化がもたらされるように選択する。ウイルス感染を処置するための本発明の方法の一実施形態では、免疫細胞またはその前駆体細胞を、ウイルス感染を有する患者が、当該細胞において患者のウイルス感染の適切なウイルス抗原に結合するＣＡＲが本明細書に記載のＤＮ形態と一緒に発現することによって処置されるように、設計する。
【０１０８】
処置される対象（ウイルス感染を有する患者）によって示されるウイルス感染の型に基づいて任意の適切なウイルス抗原を選択することができる。選択されたウイルス抗原は、ウイルス抗原がＣＡＲによる結合に利用可能になるように発現されることが理解される。一般に、ＣＡＲを発現する細胞によって標的とされるウイルス抗原は、ウイルスの表面または対象のウイルスが感染した細胞または組織の表面上に発現する。しかし、ＣＡＲとの結合に利用可能な任意のウイルス抗原が、ＣＡＲ発現細胞をウイルス感染部位またはウイルスが感染した組織に標的化するのに適することが理解される。好ましいウイルスとしては、病原性、特にヒト病原体であり、ウイルス抗原特異的免疫応答を引き出すものが挙げられる。特定の実施形態では、標的とされるウイルス抗原は、ヒト病原体であるウイルスのものであり、特定の実施形態では、そのようなヒト病原体であるウイルス抗原は、ウイルスに感染したヒト患者において免疫応答を引き出し得る。標的とすることができる例示的なウイルスおよびそれらのウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、以下の表１に提示するものが挙げられる。
【表１】
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【０１０９】
ＨＢＶの場合の特定の実施形態では、Ｓ、ＭまたはＬエンベロープタンパク質のＳドメインを標的とする（Krebsら、上記、２０１３年を参照されたい）。ＨＳＶの場合の別の特定の実施形態では、ｇＥの細胞外ドメインを標的とする（Polcicovaら、上記、２００５年を参照されたい）。当業者は、本発明の免疫細胞によって標的とするのに適したウイルス抗原またはウイルス抗原のドメインを容易に決定することができることが理解される。
【０１１０】
さらに、表１に列挙されているものなどのウイルスへの言及は、同じウイルスの異なる株または型を含むことが理解される。例えば、ＨＳＶは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）および単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）として存在し、これらは、それぞれの糖タンパク質Ｇ（ｇＧ）によって区別することができる（Bennettら、Cecil  Textbook  of  Medicine、第２０版、１７７０頁、W.B.  Saunders、Philadelphia  PA（１９９６年））。特定の実施形態では、ウイルス抗原は、当該抗原が同じウイルスの異なる株もしくは型に共通するように選択することもでき、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２などの、ウイルスの特定の株または型特異的な別個の抗原になるように選択することもできる。
【０１１１】
任意の上記のウイルス抗原またはそのエピトープ、ならびに当技術分野において公知の任意のものを本発明の免疫細胞（ＤＮ形態を発現する）により、例えば、そのような抗原もしくはエピトープに結合するＣＡＲを組換え発現する免疫細胞を使用すること、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてそのような抗原もしくはエピトープに感作された免疫細胞を使用すること、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそのような抗原もしくはエピトープに感作された免疫細胞を使用することによって標的とすることができることが理解されるべきである。特定の実施形態では、ＣＡＲおよびＤＮ形態をコードする１つまたは複数の核酸を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に形質導入する。そのような実施形態では、形質導入されたＴ細胞の対象への投与により、対象においてヘルパーおよび細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の両方が生じ、その結果、持続的な抗ウイルス応答がもたらされるはずである。
【０１１２】
さらに、ウイルス感染を処置するための免疫細胞およびそのような細胞をウイルス感染を処置するために使用する方法に関する本明細書に記載の実施形態を、別の病原体、例えば、細菌、真菌、または原生動物である病原体による感染を処置するために、改変し、同様に適用することができることが理解される。一実施形態では、病原体は、ヒト病原体である。病原体の抗原を、例えば、病原体の細胞表面抗原を標的とすることによって標的とすることができることがさらに理解される。
【０１１３】
上記の通り、ＣＡＲは、ＣＡＲを発現する免疫細胞またはその前駆体細胞において機能するシグナル伝達ドメインも含有する。そのようなシグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤζまたはＦｃ受容体γに由来するものであってよい（Sadelainら、Cancer  Discov.、３巻：３８８〜３９８頁（２０１３年）を参照されたい）。一般に、シグナル伝達ドメインにより、形質導入された免疫細胞、例えばＴ細胞またはその前駆体細胞などにおける持続性、輸送および／またはエフェクター機能が誘導される(Sharpeら、Dis.  Model  Mech.  8:337-350  (2015);  Finneyら、J.  Immunol.  161:2791-2797  (1998);  Krauseら、J.  Exp.  Med.  188:619-626  (1998))。ＣＤζまたはＦｃ受容体γの場合では、シグナル伝達ドメインは、それぞれのポリペプチドの細胞内ドメイン、またはシグナル伝達のために十分な細胞内ドメインの断片に対応する。例示的なシグナル伝達ドメインについて、下により詳細に記載する。
【０１１４】
例示的なポリペプチドが本明細書にＧｅｎＢａｎｋ番号、ＧＩ番号および／または配列番号を参照して記載されている。当業者は、これだけに限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ（ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）およびＥＭＢＬ（embl.org/）を含めた配列供給源を参照することにより、相同な配列を容易に同定することができることが理解される。
【０１１５】
ＣＤ３ζ。非限定的な実施形態では、ＣＡＲは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはその前駆体細胞を活性化または刺激することができる、ＣＤ３ζポリペプチドに由来するシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ζの細胞内ドメインに由来するシグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＤ３ζは、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、抗原が結合した後、活性化シグナルを細胞、例えば、Ｔ細胞などのリンパ系の細胞に伝達する。ＣＤ３ζポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿９３２１７０（ＮＰ＿９３２１７０．１、ＧＩ：３７５９５５６５；以下を参照されたい）を有する配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。一実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、以下に提示されるＣＤ３ζポリペプチド配列のアミノ酸５２〜１６４のアミノ酸配列、またはシグナル伝達活性のために十分である、その断片を有する。例示的なＣＡＲは、Ｍｚであり、これは、以下に提示されるＣＤ３ζポリペプチド配列のアミノ酸５２〜１６４を含むＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内ドメインを有する。別の例示的なＣＡＲは、Ｍ２８ｚであり、これは、以下に提示されるＣＤ３ζポリペプチドのアミノ酸５２〜１６４を含むＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内ドメインを有する。さらに別の例示的なＣＡＲはＭＢＢｚであり、これは、以下に提示されるＣＤ３ζポリペプチドのアミノ酸５２〜１６４を含むＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内ドメインを有する。さらに別の例示的なＣＡＲはＰ２８ｚであり、これは、ＣＤ３ζポリペプチドに由来する細胞内ドメインを有する。ＣＤ３ζ内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２１；細胞外ドメイン、アミノ酸２２〜３０；膜貫通ドメイン、アミノ酸３１〜５１；細胞内ドメイン、アミノ酸５２〜１６４への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿９３２１７０を参照されたい。
【化２】
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【０１１６】
「ＣＤ３ζ核酸分子」は、ＣＤ３ζポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。一実施形態では、例示的なＣＡＲであるＭｚ、Ｍ２８ｚ、またはＭＢＢｚを含めたＣＡＲの細胞内ドメイン内に含まれるＣＤ３ζポリペプチドをコードするＣＤ３ζ核酸分子は、下記のヌクレオチド配列を含む。
【化３】
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【０１１７】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。そのような共刺激シグナル伝達ドメインにより、免疫細胞またはその前駆体細胞の活性化の増大をもたらすことができる。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ１０ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチドなどに由来するものであってよい。４−１ＢＢ、ＩＣＯＳまたはＤＡＰ−１０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含むＣＡＲは以前に記載されている（４−１ＢＢ、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ−１０の代表的な配列も記載されている、参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．７，４４６，１９０を参照されたい）。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ（Sadelainら、Cancer  Discov.、３巻（４号）：３８８〜３９８頁（２０１３年）を参照されたい）、またはＣＤ２８およびＯＸ４０、または本明細書に開示される共刺激リガンドの他の組合せなど、２つの共刺激分子を含む共刺激シグナル伝達領域を含み得る。
【０１１８】
ＣＤ２８。表面抗原分類２８（ＣＤ２８）は、Ｔ細胞活性化および生存のための共刺激シグナルをもたらす、Ｔ細胞上に発現するタンパク質である。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。例えば、本明細書に開示される通り、ＣＡＲは、ＣＤ２８の細胞内／細胞質ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインとして機能することができる細胞内／細胞質ドメインの少なくとも一部分を含み得る（図１Ｂを参照されたい）。ＣＤ２８ポリペプチドは、以下に提示されるＧｅｎＢａｎｋ番号Ｐ１０７４７（Ｐ１０７４７．１、ＧＩ：１１５９７３）またはＮＰ＿００６１３０（ＮＰ＿００６１３０．１、ＧＩ：５４５３６１１）を有する配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。所望であれば、細胞内ドメインへの追加的なＣＤ２８配列を本発明のＣＡＲに含めることができる。例えば、ＣＡＲは、ＣＤ２８ポリペプチドの膜貫通ドメインを含み得る。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８のアミノ酸１８０〜２２０に対応するＣＤ２８の細胞内ドメインを含むアミノ酸配列またはその断片を有し得る。別の実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸１５３〜１７９に対応するＣＤ２８の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列またはその断片を有し得る。Ｍ２８ｚは、例示的なＣＡＲであり、ＣＤ２８の細胞内ドメインに対応する共刺激シグナル伝達ドメインを含む（図１Ｂを参照されたい）。Ｍ２８ｚは、ＣＤ２８に由来する膜貫通ドメインも含む（図１Ｂを参照されたい）。したがって、Ｍ２８ｚは、ＣＤ２８に由来する２つのドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインおよび膜貫通ドメインを含むＣＡＲを例証する。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むアミノ酸配列を有し、かつＣＤ２８のアミノ酸１５３〜２２０を含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲによって例証され、ＣＤ２８のアミノ酸１１７〜２２０を含む。ＣＤ２８の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有する別の例示的なＣＡＲは、Ｐ２８ｚである（図１Ｂを参照されたい）。一実施形態では、ＣＡＲは、以下に提示されるＣＤ２８ポリペプチドのアミノ酸１５３〜１７９を含むＣＤ２８ポリペプチドに由来する膜貫通ドメインを含み得る。ＣＤ２８内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜１８；細胞外ドメイン、アミノ酸１９〜１５２；膜貫通ドメイン、アミノ酸１５３〜１７９；細胞内ドメイン、アミノ酸１８０〜２２０への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００６１３０を参照されたい。具体的に描写されたドメインよりも短いまたは長いＣＤ２８の配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。
【化４】
2019528699.tif 000011
【０１１９】
「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。一実施形態では、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達領域を含むＭ２８ｚのＣＤ２８ポリペプチドをコードするＣＤ２８核酸分子は、下記のヌクレオチド配列を含む。
【化５】
2019528699.tif 000012
【０１２０】
４−１ＢＢ。４−１ＢＢは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９とも称され、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとしての機能を果たし得、刺激活性を有する。一実施形態では、ＣＡＲは、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。４−１ＢＢポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｐ４１２７３（Ｐ４１２７３．１、ＧＩ：７２８７３９）またはＮＰ＿００１５５２（ＮＰ＿００１５５２．２、ＧＩ：５７３００９５）またはその断片を有する配列に対応するアミノ酸配列を有し得る。一実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸２１４〜２５５に対応する４−１ＢＢの細胞内ドメインまたはその断片を含む共刺激ドメインを有し得る。別の実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸１８７〜２１３に対応する４−１ＢＢの膜貫通ドメインまたはその断片を有し得る。例示的なＣＡＲはＭＢＢｚであり、これは、４−１ＢＢポリペプチドを含む細胞内ドメインを有する（例えば、ＮＰ＿００１５５２、配列番号５のアミノ酸２１４〜２５５）（図１Ｂを参照されたい）。４−１ＢＢ内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜１７；細胞外ドメイン、アミノ酸１８〜１８６；膜貫通ドメイン、アミノ酸１８７〜２１３；細胞内ドメイン、アミノ酸２１４〜２５５への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１５５２を参照されたい。具体的に描写されたドメインよりも短いまたは長い４−１ＢＢの配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。「４−１ＢＢ核酸分子」は、４−１ＢＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
【化６】
2019528699.tif 000013
【０１２１】
ＯＸ４０。ＯＸ４０は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４前駆体またはＣＤ１３４とも称され、受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。一実施形態では、ＣＡＲは、ＯＸ４０に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。ＯＸ４０ポリペプチドは、以下に提示されるＧｅｎＢａｎｋ番号Ｐ４３４８９（Ｐ４３４８９．１、ＧＩ：１１７１９３３）またはＮＰ＿００３３１８（ＮＰ＿００３３１８．１、ＧＩ：４５０７５７９）を有する配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。一実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸２３６〜２７７に対応するＯＸ４０の細胞内ドメインまたはその断片を含む共刺激ドメインを有し得る。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＯＸ４０のアミノ酸２１５〜２３５に対応するＯＸ４０の膜貫通ドメインまたはその断片を含むアミノ酸配列を有し得る。ＯＸ４０内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２８；細胞外ドメイン、アミノ酸２９〜２１４；膜貫通ドメイン、アミノ酸２１５〜２３５；細胞内ドメイン、アミノ酸２３６〜２７７への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００３３１８を参照されたい。具体的に描写されたドメインよりも短いまたは長いＯＸ４０の配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。「ＯＸ４０核酸分子」は、ＯＸ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
【化７】
2019528699.tif 000014
【０１２２】
ＩＣＯＳ。誘導性Ｔ細胞共刺激因子前駆体（ＩＣＯＳ）は、ＣＤ２７８とも称され、活性化Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＩＣＯＳに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。ＩＣＯＳポリペプチドは、以下に提示されるＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０３６２２４（ＮＰ＿０３６２２４．１、ＧＩ：１５０２９５１８）を有する配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。一実施形態では、ＣＡＲは、ＩＣＯＳのアミノ酸１６２〜１９９に対応するＩＣＯＳの細胞内ドメインを含む共刺激ドメインを有し得る。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＩＣＯＳのアミノ酸１４１〜１６１に対応するＩＣＯＳの膜貫通ドメインまたはその断片を含むアミノ酸配列を有し得る。ＩＣＯＳ内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２０；細胞外ドメイン、アミノ酸２１〜１４０；膜貫通ドメイン、アミノ酸１４１〜１６１；細胞内ドメイン、アミノ酸１６２〜１９９への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０３６２２４を参照されたい。具体的に描写されたドメインよりも短いまたは長いＩＣＯＳの配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。「ＩＣＯＳ核酸分子」は、ＩＣＯＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
【化８】
2019528699.tif 000015
【０１２３】
ＤＡＰ１０。ＤＡＰ１０は、造血細胞シグナル伝達因子とも称され、造血細胞における受容体の大きなファミリーに関連するシグナル伝達サブユニットである。一実施形態では、ＣＡＲは、ＤＡＰ１０に由来する共刺激ドメインを含み得る。ＤＡＰ１０ポリペプチドは、以下に提示されるＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０５５０８１．１（ＧＩ：１５８２６８５０）を有する配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。一実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸７０〜９３に対応するＤＡＰ１０の細胞内ドメインまたはその断片を含む共刺激ドメインを有し得る。別の実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸４９〜６９に対応するＤＡＰ１０の膜貫通ドメインまたはその断片を有し得る。ＤＡＰ１０内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜１９；細胞外ドメイン、アミノ酸２０〜４８；膜貫通ドメイン、アミノ酸４９〜６９；細胞内ドメイン、アミノ酸７０〜９３への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０５５０８１．１を参照されたい。具体的に描写されたドメインよりも短いまたは長いＤＡＰ１０の配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。「ＤＡＰ１０核酸分子」は、ＤＡＰ１０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
【化９】
2019528699.tif 000016
【０１２４】
ＣＡＲの細胞外ドメインを、新生タンパク質を小胞体に導き、その後の細胞表面への転位置を導くリーダーまたはシグナルペプチドと融合することができる。シグナルペプチドを含有するポリペプチドが細胞表面で発現したら、シグナルペプチドは、一般に、小胞体におけるポリペプチドのプロセシングおよび細胞表面への転位置の間にタンパク質分解により除去されることが理解される。したがって、ＣＡＲなどのポリペプチドは、一般に、細胞表面でシグナルペプチドを欠く成熟タンパク質として発現するが、当該ポリペプチドの前駆体形態はシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドまたはリーダーは、ＣＡＲをグリコシル化し、かつ／または細胞膜内に係留する場合に必須になり得る。シグナル配列またはリーダーは、一般に、新しく合成されるタンパク質のＮ末端に存在し、それらの分泌経路への進入を導くペプチド配列である。シグナルペプチドは、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインのＮ末端と融合タンパク質として共有結合により接合している。一実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号９）を含むＣＤ８ポリペプチドを含む。ＣＤ８シグナルペプチドの使用は例示的なものであることが理解される。免疫細胞における細胞表面発現をもたらすために当技術分野で周知の任意の適切なシグナルペプチドをＣＡＲに適用することができる（Gierasch  Biochem.、２８巻：９２３〜９３０頁（１９８９年）；von  Heijne、J.  Mol.  Biol.、１８４巻（１号）：９９〜１０５頁（１９８５年）を参照されたい）。特に有用なシグナルペプチドは、本明細書に開示されるポリペプチドのシグナルペプチドのいずれかを含めた、免疫細胞またはその前駆体細胞において天然に発現する細胞表面タンパク質に由来するものであり得る。したがって、任意の適切なシグナルペプチドを利用して、ＣＡＲが免疫細胞またはその前駆体細胞の細胞表面で発現するように導くことができる。
【０１２５】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域を接続するリンカー配列またはペプチドリンカーを含み得る。１つの非限定的な例では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）で示される配列を有するアミノ酸を含む。
【０１２６】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲのドメインを互いと連結するスペーサー領域または配列も含み得る。例えば、スペーサーを、シグナルペプチドと抗原結合性ドメインの間、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインの間、膜貫通ドメインと細胞内ドメインの間、および／または細胞内ドメイン内のドメイン間、例えば、刺激ドメインと共刺激ドメインの間に含めることができる。スペーサー領域は、種々のドメインの他のポリペプチドとの相互作用を可能にする、例えば、抗原結合性ドメインが抗原認識を容易にするための方向に柔軟性を有することを可能にするのに十分に柔軟であり得る。スペーサー領域は、例えば、ＩｇＧに由来するヒンジ領域、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３（定常）領域、および／またはＣＤ３（表面抗原分類３）の一部またはスペーサーとして適切ないくつかの他の配列であり得る。
【０１２７】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、一般に、膜の少なくとも一部分に及ぶ疎水性アルファヘリックスを含む。異なる膜貫通ドメインにより、異なる受容体安定性がもたらされる。抗原認識後、受容体クラスターおよびシグナルが細胞に伝達される。ある実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、免疫細胞またはその前駆体細胞において天然に発現する別のポリペプチドに由来するものであってよい。一実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に開示される他のものを含めた、膜貫通ドメインを有する免疫細胞またはその前駆体細胞において発現する、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、または他のポリペプチドに由来する膜貫通ドメインを有し得る。任意選択で、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインがＣＡＲと結合した抗原から細胞内シグナル伝達および／または共刺激ドメインへのシグナルの形質導入において機能することができる限りは免疫細胞またはその前駆体細胞において天然に発現しないポリペプチドに由来するものであってよい。ポリペプチドの膜貫通ドメインを含むポリペプチドの一部は、所望の通り、ポリペプチドに由来する追加的な配列、例えば、膜貫通ドメインのＮ末端もしくはＣ末端、またはポリペプチドの他の領域上で隣接する追加的な配列を含み得ることが理解される。
【０１２８】
ＣＤ８。表面抗原分類８（ＣＤ８）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の補助受容体としての機能を果たす膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ８は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質に対して特異的である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインを含み得る。ＣＤ８ポリペプチドは、以下に提示されるＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１１３９３４５．１（ＧＩ：２２５００７５３６）を有する配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。一実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸１８３〜２０３に対応するＣＤ８の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列またはその断片を有し得る。一実施形態では、例示的なＣＡＲはＭｚであり、これは、ＣＤ８ポリペプチドに由来する膜貫通ドメインを有する（図１Ｂを参照されたい）。別の実施形態では、例示的なＣＡＲはＭＢＢｚであり、これは、ＣＤ８ポリペプチドに由来する膜貫通ドメインを有する（図１Ｂを参照されたい）。非限定的な一実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸１８３〜２０３を含むＣＤ８ポリペプチドに由来する膜貫通ドメインを含み得る。さらに、ＣＡＲは、以下に提示されるＣＤ８ポリペプチドのアミノ酸１３７〜１８２を含むヒンジドメインを含み得る。別の実施形態では、ＣＡＲは、以下に提示されるＣＤ８ポリペプチドのアミノ酸１３７〜２０３を含み得る。さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、以下に提示されるＣＤ８ポリペプチドのアミノ酸１３７〜２０９を含み得る。ＣＤ８内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２１；細胞外ドメイン、アミノ酸２２〜１８２；膜貫通ドメイン、アミノ酸１８３〜２０３；細胞内ドメイン、アミノ酸２０４〜２３５への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１１３９３４５．１を参照されたい。アミノ酸１８３〜２０３の膜貫通ドメインを超えるＣＤ８の追加的な配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。さらに、具体的に描写されたドメインよりも短いまたは長いＣＤ８の配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。「ＣＤ８核酸分子」は、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
【化１０】
2019528699.tif 000017
【０１２９】
ＣＤ４。表面抗原分類４（ＣＤ４）は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ４とも称され、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞などの免疫細胞の表面上に見出される糖タンパク質である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ４に由来する膜貫通ドメインを含み得る。ＣＤ４は、種々のアイソフォームで存在する。所望の機能が実現されるように任意のアイソフォームを選択することができることが理解される。例示的なアイソフォームとしては、アイソフォーム１（ＮＰ＿０００６０７．１、ＧＩ：１０８３５１６７）、アイソフォーム２（ＮＰ＿００１１８１９４３．１、ＧＩ：３０３５２２４７９）、アイソフォーム３（ＮＰ＿００１１８１９４４．１、ＧＩ：３０３５２２４８５；またはＮＰ＿００１１８１９４５．１、ＧＩ：３０３５２２４９１；またはＮＰ＿００１１８１９４６．１、ＧＩ：３０３５２２５６９）などが挙げられる。例示的なアイソフォーム配列の１つ、アイソフォーム１を以下に提示する。一実施形態では、ＣＡＲは、アミノ酸３９７〜４１８に対応するＣＤ４の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列またはその断片を有し得る。ＣＤ４内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２５；細胞外ドメイン、アミノ酸２６〜３９６；膜貫通ドメイン、アミノ酸３９７〜４１８；細胞内ドメイン、アミノ酸４１９〜４５８への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０００６０７．１を参照されたい。アミノ酸３９７〜４１８の膜貫通ドメインを超えるＣＤ４の追加的な配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。さらに、具体的に描写されたドメインよりも短いまたは長いＣＤ４の配列も所望であればＣＡＲに含めることができることが理解される。「ＣＤ４核酸分子」は、ＣＤ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことも理解される。
【化１１】
2019528699.tif 000018
【０１３０】
本明細書に開示される通り、メソテリンＣＡＲは、抗原を標的とすることができるＣＡＲを例証するものであり、上記の通り、同様の方法および当技術分野で周知の他の方法を使用して他の抗原を対象とするＣＡＲを生成することができる。シグナルペプチド、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインなどの、所望の機能をもたらすために有用な、本明細書に記載のポリペプチドのドメインをＣＡＲに使用することができることが理解される。例えば、本発明のＣＡＲに特定の機能をもたらすために、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、または他のドメインなどのドメインを所望の通り選択することができる。可能性のある望ましい機能は、これだけに限定されないが、シグナルペプチドおよび／または膜貫通ドメインをもたらすことを含み得る。
【０１３１】
７．３  細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態
本発明によると、Ｔ細胞などの免疫賦活性細胞もしくはその前駆体細胞である免疫細胞、または免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などである免疫細胞を、細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態（ＤＮ形態）を発現するように工学的に操作する。
【０１３２】
免疫細胞またはその前駆体細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤とは、免疫細胞またはその前駆体細胞によってもたらされる免疫応答が阻害または抑制されるように作用する分子を指す。一実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、チェックポイント遮断とも称される免疫チェックポイント阻害剤である。
【０１３３】
一実施形態では、本発明は、免疫細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を発現する、またはＣＡＲおよび免疫細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態、例えば、免疫チェックポイント阻害剤経路において機能する受容体を同時発現する免疫細胞、例えばＴ細胞もしくはその前駆体細胞、または調節性Ｔ細胞などを提供する。免疫チェックポイント経路は、免疫細胞の免疫応答を抑制する阻害性経路である。当該経路により、負のシグナルが免疫細胞、例えばＴ細胞などに送達され、ＴＣＲ媒介性シグナルが弱まり、それにより、細胞増殖、サイトカイン産生および細胞周期進行の減少が導かれる（Pardoll、Nat.  Rev.、１２巻：２５２〜２６４頁（２０１２年）；Wuら、Int.  J.  Biol.  Sci.、８巻：１４２０〜１４３０頁（２０１２年）を参照されたい）。免疫チェックポイント阻害剤経路は、一般に、リガンド−受容体対を伴う。例示的な免疫チェックポイント阻害剤経路受容体としては、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４などが挙げられる（Chenら、Nat.  Rev.  Immunol.、１３巻（４号）：２２７〜２４２頁（２０１３年）を参照されたい）。これらの受容体に対応するリガンドとしては、例えば、ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１に対するもの）；ＰＤ−Ｌ２（ＰＤ−１に対するもの）；ＣＤ８０、ＣＤ８６（ＣＴＬＡ−４に対するもの）；ＨＶＥＭ（ＢＴＬＡに対するもの）；ガレクチン−９、ＨＭＧＢ１（ＴＩＭ−３に対するもの）；ＭＨＣ  ＩＩ（ＬＡＧ−３に対するもの）；ＨＶＥＭ（ＣＤ１６０に対するもの）；ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３（ＴＩＧＩＴに対するもの）；Ｃ１ｑ、コラーゲン（ＬＡＩＲ１に対するもの）；ＣＤ４８（２Ｂ４に対するもの）など（Chenら、上記、２０１３年）が挙げられる。免疫細胞、例えばＴ細胞またはその前駆体細胞などにおけるＤＮ形態の発現により、細胞に対して内因性であるチェックポイント阻害剤経路の阻害がもたらされる。
【０１３４】
免疫チェックポイント阻害剤経路受容体などの細胞表面受容体である細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態は、細胞内シグナル伝達が妨げられ、それにより、免疫チェックポイント経路が抑制され、免疫細胞、例えばＴ細胞などの活性化が持続するように受容体のいくつかの部分を欠失させることによって生成することができる。本発明のＤＮ形態は、（ａ）リガンド結合性領域を含む、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分と、（ｂ）膜貫通ドメインと含むポリペプチドであって、免疫チェックポイント阻害剤のドミナントネガティブ形態である、ポリペプチドである。一般に、免疫チェックポイント阻害剤経路受容体の阻害剤のＤＮ形態は、受容体の細胞外ドメインの大部分または全てを保持し、したがって、細胞外ドメインは、そのそれぞれのリガンドに結合するために十分なタンパク質相互作用活性を保持する。したがって、特定の実施形態では、ＤＮ形態をコードするポリペプチドは、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの実質的に全てを含む。細胞外ドメインの「実質的に全て」を含むポリペプチドは、細胞外ドメイン全体を含むポリペプチド、または、細胞外ドメインの残りの部分がそのそれぞれのリガンドに結合するために十分なタンパク質相互作用活性を保持する限りは、細胞外ドメインのＮ末端および／もしくはＣ末端から１個から数個のアミノ酸が欠失している、例えば、Ｎ末端および／もしくはＣ末端から１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸が欠失している細胞外ドメインの一部を含むポリペプチドを含むことが理解される。本発明のＤＮ形態は、一般に、細胞内／細胞質ドメインなどのシグナル伝達ドメインのいくつかの部分または全ても欠き、したがって、ＤＮ形態は、免疫チェックポイント経路におけるシグナル伝達に関して活性が低下しているまたは不活性である。特定の機構または理論に縛られずに、リガンドがＤＮ形態と結合することによりリガンドとインタクトな内在性受容体の結合が減少し、かつ／または、ＤＮ形態が内在性受容体を含めたシグナル伝達分子と複合体を形成し、その結果、免疫チェックポイント経路のシグナル伝達が減少する。
【０１３５】
本発明のＤＮ形態は、一般に、これだけに限定されないが、免疫細胞、例えばＴ細胞またはその前駆体細胞などの細胞表面上に発現する能力、そのそれぞれのリガンドに結合する能力、および免疫チェックポイント経路の細胞内シグナルを伝播することができないことまたはその能力が低下していることを含めた、ある特定の機能的特性を有する。当業者は、細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を、阻害剤がそのような機能的特性を有するように工学的に作製することによって容易に生成することができる。一実施形態では、ＤＮ形態を、細胞媒介性免疫応答の阻害剤の細胞外ドメイン、または少なくともリガンド結合活性を保持するのに十分な細胞外ドメインの部分が保持されるように構築する。例示的な実施形態では、ＤＮ形態は、これだけに限定されないが、本明細書に開示されるＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４の細胞外ドメインを含めた、細胞媒介性免疫応答の阻害剤の細胞外ドメインを使用して構築することができる。細胞媒介性免疫応答の阻害剤の細胞外ドメイン全体が保持される必要はないこと、ならびに、リガンド結合活性が保持される限りは細胞外ドメインのＮ末端および／またはＣ末端の欠失を導入することができることが当業者には容易に理解されよう。当業者は、そのようなＮ末端および／またはＣ末端欠失の妥当性を、リガンド結合活性をもたらすことが公知であるタンパク質モチーフを同定するための受容体配列の分析に基づいて容易に決定することができる（例えば、ＥｘＰＡＳｙ（ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）、特にＰＲＯＳＩＴＥ（ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を参照されたい）。それに加えてまたはその代わりに、ポリペプチドに欠失を導入し、それぞれのリガンドに対する結合活性を測定することにより、適切なＮ末端および／またはＣ末端欠失を経験的に決定することができる。したがって、当業者は、本発明のＤＮ形態にリガンド結合活性をもたらすために、細胞媒介性免疫応答の阻害剤の適切な配列を容易に決定することができる。
【０１３６】
ＤＮ形態に受容体の細胞外ドメイン全体を使用するか細胞外ドメインの一部を使用するかに関わらず、任意選択で、追加的な配列をＤＮ形態の細胞外ドメインに含めることができることが理解される。そのような追加的な配列はＤＮ形態の親ポリペプチドに由来するものであってもよく、追加的な配列は異なるポリペプチドに由来するものであってもよい。親ポリペプチド由来の配列と異なるポリペプチド由来の配列とを含むポリペプチドは、天然に存在しないキメラポリペプチドである。例えば、ＤＮ形態が、免疫細胞、例えばＴ細胞もしくはその前駆体細胞、または調節性Ｔ細胞などの細胞表面において発現するように、シグナルペプチドまたはリーダーペプチドが一般に含まれる。シグナルペプチドを含有するポリペプチドが細胞表面において発現したら、一般に、シグナルペプチドは小胞体におけるポリペプチドのプロセシングおよび細胞表面への転位置の間にタンパク質分解により除去されることが理解される。したがって、ＤＮ形態などのポリペプチドは、一般に、細胞表面においてシグナルペプチドを欠く成熟タンパク質として発現するが、当該ポリペプチドの前駆体形態はシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、天然に存在する受容体のシグナルペプチドであってもよく、あるいは、異なるタンパク質に由来するものであってもよい。ＣＡＲに適するものとして本明細書に記載されているものを含め、例示的なシグナルペプチドが本明細書に記載されている。細胞表面における発現をさらにもたらすために、ＤＮ形態は、一般に、細胞表面におけるＤＮ形態の保持をもたらす膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然に存在する受容体の膜貫通ドメインであってもよく、あるいは異なるタンパク質に由来するものであってもよい。特定の実施形態では、別のタンパク質に由来する膜貫通ドメインは、免疫細胞、例えばＴ細胞もしくはその前駆体細胞、または調節性Ｔ細胞などの細胞表面上に発現する別の受容体に由来する。ＣＡＲに適するものとして本明細書に記載されているものを含め、例示的な膜貫通ドメインが本明細書に記載されている。
【０１３７】
免疫チェックポイント経路受容体の場合では、一般に、シグナル伝達ドメインは、細胞内／細胞質ドメイン内に存在する。免疫チェックポイント経路受容体のシグナル伝達活性は、一般に、細胞表面受容体（複数可）および／または細胞内シグナル伝達分子とのタンパク質間相互作用によって媒介される。一実施形態では、ＤＮ形態は、細胞内ドメイン全体、または免疫チェックポイント経路のシグナルの伝搬において機能するその一部を欠く。ＤＮ形態からのシグナル伝達を阻害または低減するために十分に細胞内シグナル伝達ドメインの部分が欠失している限りは、受容体の細胞内ドメイン全体を欠失させる必要はないことが理解される。それに加えてまたはその代わりに、突然変異を細胞内シグナル伝達ドメインに導入して、ＤＮ形態からのシグナル伝達を阻害または低減することができる。それに加えてまたはその代わりに、シグナル伝達活性を有さない異種配列で受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを置換して、ＤＮ形態を生成することができる。本発明のＤＮ形態を生成するためにこれらおよび他の周知の方法を利用することができることが当業者には容易に理解されよう。
【０１３８】
免疫チェックポイント阻害剤のドミナントネガティブ形態の例示的な一実施形態は、ＰＤ−１のドミナントネガティブ形態である。ＰＤ−１のドミナントネガティブ形態は、免疫チェックポイント阻害剤を含めた細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態の例示的なものである。本明細書に開示されるＰＤ−１  ＤＮ形態は例示的なものであることが理解される。
【０１３９】
本明細書に記載の通り、細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態は、細胞内シグナル伝達が低下するまたは阻害されるように設計される。本発明のＤＮ形態は、一般に、免疫細胞、例えばＴ細胞などの活性化、例えば、細胞増殖、サイトカイン産生および／または細胞周期進行が阻害されるように機能する、免疫チェックポイント経路の受容体の阻害に基づく。本発明のＤＮ形態は、細胞内シグナル伝達ドメインまたはその一部が除去され、したがって、受容体のシグナル伝達能が低下するまたは阻害されるように設計される。ＤＮ形態はまた、内在性受容体のシグナル伝達を阻害するように機能する。特定の実施形態では、シグナル伝達の低下または阻害により、チェックポイント遮断が克服され、その結果、持続的なシグナル伝達および免疫細胞、例えばＴ細胞またはその前駆体細胞などの活性化がもたらされる。ＤＮ形態のシグナル伝達活性を完全にノックアウトすることもでき、ＤＮ形態が存在しない場合と比較して免疫細胞またはその前駆体細胞の活性化の増強をもたらす効果のために部分的な活性の低下で十分である限りでは、部分的にノックアウトすることもできることが理解される。また、ＤＮ形態により、内在性受容体からのシグナル伝達の完全な不活化がもたらされる必要はないが、内在性受容体の活性化を、チェックポイント遮断を克服し、免疫細胞、例えばＴ細胞またはその前駆体細胞などの活性化を可能にするために十分に低下させることができる。当業者は、親受容体の活性に対するＤＮ形態の効果を、本明細書に開示されるものなどのアッセイを含めた、ＤＮ形態が発現している免疫細胞の活性に対するＤＮ形態の効果を評価するための動物モデルなどのｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用するアッセイを含めた当技術分野で周知のアッセイ方法を使用して容易に決定することができる。
【０１４０】
慢性ウイルス感染を有する対象から単離された調節性Ｔ細胞を使用する場合では、免疫細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤、例えばＰＤ−１などのＤＮ形態の発現により、免疫細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤、例えばＰＤ−１を発現する調節性Ｔ細胞と、対応するリガンド、例えばＰＤ−Ｌ１を発現する免疫賦活性Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞などの相互作用の結果生じる調節性Ｔ細胞の抑制活性が阻害される。そのような場合では、リガンドを発現する免疫賦活性細胞によって媒介される免疫応答に対する調節性Ｔ細胞の抑制活性が低下し、それにより、ウイルスに対する免疫応答を促進する。
【０１４１】
本発明において使用するためのＣＡＲと同様に、特に異種配列を融合する場合に、任意選択のリンカーまたはスペーサー配列、例えば、シグナルペプチドと細胞外リガンド結合性ドメインの間のリンカーまたはスペーサーをＤＮ形態に含めることができる。リンカーまたはスペーサーはまた、任意選択で、細胞外リガンド結合性ドメインと膜貫通ドメインの間に含めることもできる。同様に、リンカーまたはスペーサーは、任意選択で、膜貫通ドメインと任意の残りの細胞内ドメインの間に含めることもできる。そのような任意選択のリンカーまたはスペーサーは、本明細書に記載されている。さらに、そのようなリンカーまたはスペーサーは、異種配列に由来するものであってよい。例えば、上記の通り、異種ポリペプチドに由来する膜貫通ドメインは、任意選択で、異種ポリペプチドに由来するＮ末端および／またはＣ末端に追加的な配列を含んでよい。そのような追加的な配列は、リンカーまたはスペーサーとして機能し得る。
【０１４２】
一実施形態では、上記の通り、ＤＮ形態は、ＤＮ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端のいかなるシグナル伝達ドメインも欠くものであってよい（すなわち、ＤＮ形態は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くものであってよい）。
【０１４３】
異なる特定の実施形態では、本発明のＤＮ形態は、任意選択で、ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含み得る。そのようなＤＮ形態は、本明細書では、「スイッチ受容体」とも称される。そのようなＤＮ形態、またはスイッチ受容体は、免疫賦活性分子の共刺激ドメイン（すなわち、細胞質シグナル伝達ドメイン）と融合した膜貫通ドメインと融合した、細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤などの細胞外領域のリガンド結合性ドメインを少なくとも含み、それにより、活性は、リガンドが結合すると、細胞免疫活性の阻害性から細胞免疫活性の刺激性に切り換えられる（例えば、Liuら、Cancer  Res.、７６巻：１５７８〜１５９０頁（２０１６年）を参照されたい）。共刺激ドメインとの融合をさらに含むＤＮ形態（すなわち、スイッチ受容体）は、免疫チェックポイント阻害剤のシグナル伝達ドメインが欠失しているので、そのような構築物のドミナントネガティブ形態としても機能する。一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含むＤＮ形態を、免疫賦活性細胞において発現させる。一実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含むＤＮ形態を、免疫抑制細胞において発現させる。別の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含むＤＮ形態を、免疫賦活性細胞においてＣＡＲと同時発現させる。別の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含むＤＮ形態を、免疫賦活性細胞においてＣＡＲと同時発現させる。
【０１４４】
ＤＮ形態の融合ポリペプチドの共刺激シグナル伝達ドメインは、例えば、これだけに限定されないが、４−１ＢＢポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ１０ポリペプチド、および２Ｂ４ポリペプチドを含めた、ＣＡＲへの使用に関して本明細書に記載されている共刺激分子などの受容体の細胞質シグナル伝達ドメインに由来するものであってよい。共刺激シグナル伝達ドメインとの融合を含むＤＮ形態では、膜貫通ドメインは、共刺激ドメインが由来するポリペプチドに由来するものであってもよく、ＤＮ形態の細胞外リガンド結合性ドメインが由来するポリペプチドに由来するものであってもよく、あるいは、ＣＡＲまたはＤＮ形態を生成するために利用することができる膜貫通ドメインの本明細書の記載と同様に、別のポリペプチド由来の膜貫通ドメインであってもよい。
【０１４５】
一実施形態では、本発明は、ＤＮ形態を組換え発現する免疫細胞（所望の通り、免疫賦活性であっても免疫抑制性であってもよい）であって、ＤＮ形態が、共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含み、共刺激シグナル伝達ドメインがＤＮ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端に融合している、免疫細胞を提供する。本発明のある特定の実施形態では、本発明の細胞または集団は、細胞の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のドミナントネガティブ形態を組換え発現し、ドミナントネガティブ形態は、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み、共刺激シグナル伝達ドメインは、ドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインと融合している（同様にこれは、ドミナントネガティブ形態のリガンド結合性領域を含有する、免疫チェックポイント阻害剤の細胞外ドメインの少なくとも一部分と融合している）。そのような細胞は、任意選択で、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くドミナントネガティブ形態を同時発現し得る。そのような細胞を使用して、本明細書に開示されるウイルス感染を処置することができる。本発明は、スイッチ受容体（すなわち、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含むＤＮ形態）の免疫細胞による組換え発現であって、スイッチ受容体が、（ｉ）少なくとも免疫チェックポイント阻害剤の細胞外リガンド結合性ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）共刺激シグナル伝達ドメインを含む、組換え発現を提供する。そのような組換え細胞は、任意選択で、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くＤＮ形態を同時発現し得る。本発明は、ＣＡＲおよびＤＮ形態の両方の免疫細胞による組換え発現であって、ＤＮ形態が、共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含み（スイッチ受容体）、ＤＮ形態が、（ｉ）少なくとも免疫チェックポイント阻害剤の細胞外リガンド結合性ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）共刺激シグナル伝達ドメインを含む、組換え発現も提供する。そのような細胞は、任意選択で、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くＤＮ形態を同時発現し得る。ＣＡＲ、および共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含むＤＮ形態（スイッチ受容体）を同時発現し、任意選択で、ＤＮ形態が細胞内シグナル伝達ドメインを欠く免疫細胞では、ＣＡＲは、処置されるウイルス感染、すなわち、同じウイルス感染のウイルスに結合することが理解される。ＣＡＲおよび共刺激シグナル伝達ドメインとの融合を含むＤＮ形態を同時発現する細胞の一実施形態では、ＤＮ形態の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインと異なる。特定の実施形態では、ＤＮ形態の共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインである。別の特定の実施形態では、ＣＡＲ、および共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含むＤＮ形態を同時発現する免疫細胞では、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインである。別の特定の実施形態では、本発明は、ＣＡＲ、および共刺激シグナル伝達ドメインとの融合をさらに含むＤＮ形態を同時発現し、任意選択で、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くＤＮ形態を同時発現する免疫細胞であって、ＤＮ形態の共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインであり、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインである、免疫細胞を提供する。
【０１４６】
免疫チェックポイント阻害剤の例示的なＤＮ形態について、下により詳細に記載する。記載されている配列から本質的になるＤＮ形態も構想されている。
【０１４７】
ＰＤ−１。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、内在性マクロファージおよび樹状細胞上に発現するその対応するリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と会合すると活性化Ｔ細胞の負の免疫調節因子になる。ＰＤ−１は、２６８アミノ酸のＩ型膜タンパク質である。ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーのメンバーである２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有する。タンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメイン、その後ろに膜貫通領域および細胞内尾部を含む。細胞内尾部は、免疫受容抑制性チロシンモチーフおよび免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｗｉｔｃｈ  ｍｏｔｉｆ）に位置する２つのリン酸化部位を含有する。ＰＤ−１は、ＴＣＲシグナルを負に調節する。リガンドと結合するとＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２ホスファターゼがＰＤ−１の細胞質尾部に結合する。ＰＤ−Ｌ１の上方調節は、腫瘍細胞が宿主免疫系を逃れるために使用する機構の１つである。前臨床試験および臨床試験において、アンタゴニスト抗体により誘導される抗腫瘍応答によるＰＤ−１遮断は、宿主内在性免疫系を通じて媒介された。
【０１４８】
ＰＤ−１ポリペプチドは、以下に提示されるＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００５００９．２（ＧＩ：１６７８５７７９２）に対応するアミノ酸またはその断片を有し得る。ＰＤ−１内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２０；細胞外ドメイン、アミノ酸２１〜１７０；膜貫通ドメイン、アミノ酸１７１〜１９１；細胞内ドメイン、アミノ酸１９２〜２８８への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５００９．２を参照されたい。「ＰＤ−１核酸分子」は、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化１２】
2019528699.tif 000019
【０１４９】
一実施形態では、本発明は、ＰＤ−１ドミナントネガティブ形態（ＤＮ形態）である細胞媒介性免疫応答の阻害剤を提供する。一実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＰＤ−１の細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＰＤ−１の細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＰＤ−１の細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＰＤ−１  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＰＤ−１細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＰＤ−１  ＤＮ形態はキメラ配列である。例えば、ＰＤ−１細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、任意選択で異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含んでよい。本明細書の実施例において例証されるＰＤ−１  ＤＮ形態はＰＤ−１の細胞外ドメインと融合した異種配列を含むが、ＰＤ−１  ＤＮ形態はＰＤ−１配列のみを含むものであってもよいことが理解される。
【０１５０】
一実施形態では、本発明は、ＰＤ−１の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＰＤ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５００９．２；配列番号１３）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸２１〜１７０を含むＰＤ−１  ＤＮ形態を提供する。そのようなＰＤ−１  ＤＮ形態を発現する細胞は、ＰＤ−１免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＰＤ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５００９．２；配列番号１３）の細胞内ドメイン、例えば、アミノ酸１９２〜２８８、またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、ＰＤ−１によって媒介される免疫チェックポイント経路の細胞内シグナル伝達が低下するまたは阻害される。ＰＤ−１のＤＮ形態のさらなる実施形態を以下に記載する。
【０１５１】
一実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＣＤ８の膜貫通ドメインおよびヒンジドメインと融合したＰＤ−１の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＰＤ−１配列（ＮＰ＿００５００９．２；配列番号１３）のアミノ酸２１〜１６５を含む。そのようなＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＰＤ−１の細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、本発明は、ＰＤ−１配列（ＮＰ＿００５００９．２；配列番号１３）のアミノ酸１〜１６５を含むＰＤ−１  ＤＮ形態（前駆体形態）またはアミノ酸２１〜１６５を含むＰＤ−１  ＤＮ形態（成熟形態）を提供する。そのようなＤＮ形態は、ＰＤ−１のシグナルペプチド、アミノ酸１〜２０、および細胞外ドメインアミノ酸２１〜１６５を含み、一方、成熟形態は、シグナルペプチドを欠く。一実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＰＤ−１配列（ＮＰ＿００５００９．２；配列番号１３）のアミノ酸２１〜１５１を含む。別の実施形態では、本発明は、ＰＤ−１配列（ＮＰ＿００５００９．２；配列番号１３）のアミノ酸１〜１５１を含むＰＤ−１  ＤＮ形態（前駆体形態）またはアミノ酸２１〜１５１を含むＰＤ−１  ＤＮ形態（成熟形態）を提供する。任意選択で、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＰＤ−１配列（ＮＰ＿００５００９．２；配列番号１３）のアミノ酸２１で始まり、アミノ酸１５１〜１６５の間のアミノ酸までの細胞外リガンド結合性ドメインを含む。別の実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＣＤ８の膜貫通ドメイン、ＣＤ８配列（ＮＰ＿００１１３９３４５．１；配列番号１１）のアミノ酸１８３〜２０３を含む。そのような実施形態は、異なる（異種）ポリペプチド由来の膜貫通ドメインを含むキメラＤＮ形態を表す。上記の通り、膜貫通ドメインなどの異種ドメインを含むＤＮ形態は、任意選択で、異種ポリペプチド由来の追加的な配列を含んでよい。そのような実施形態の１つでは、膜貫通ドメインの異種ポリペプチドＮ末端由来の追加的な配列を含むＤＮ形態が提供される。一実施形態では、ＤＮ形態は、ＣＤ８のヒンジドメインを含む。特定の実施形態では、異種配列は、ＣＤ８配列（ＮＰ＿００１１３９３４５．１；配列番号１１）のアミノ酸１３７〜１８２、または任意選択でアミノ酸１３８または１３９で始まる追加的なＮ末端配列を含む。別の実施形態では、膜貫通ドメインの異種ポリペプチドＣ末端由来の追加的な配列を含むＤＮ形態が提供される。特定の実施形態では、異種配列は、ＣＤ８配列（ＮＰ＿００１１３９３４５．１；配列番号１１）のアミノ酸２０４〜２０９由来の追加的なＣ末端配列を含む。一実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、ＣＤ８の膜貫通ドメイン、アミノ酸１８３〜２０３、任意選択でアミノ酸１３７〜１８２（もしくは任意選択でアミノ酸１３８または１３９で始まる）を含むヒンジドメイン、および／またはアミノ酸２０４〜２０９を含む追加的なＣ末端配列を含む。本発明の特定の実施形態では、ＰＤ−１配列（ＮＰ＿００５００９．２；配列番号１３）のアミノ酸１〜１６５、およびＣＤ８配列（ＮＰ＿００１１３９３４５．１配列番号１１）のアミノ酸１３７〜２０９（任意選択でアミノ酸１３８または１３９で始まる）を含むＰＤ−１  ＤＮ形態が提供される。
【０１５２】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、以下に提示される配列（下線が引かれた配列はＰＤ−１に由来するものであり、イタリック体で示されている配列はＣＤ８に由来するものである）を含むＰＤ−１  ＤＮ形態を提供する。
【化１３】
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【０１５３】
追加的な実施形態では、本発明のＤＮ形態は、任意選択で、任意選択のレポーター分子の同時発現をもたらすＰ２Ａ配列を含む。Ｐ２Ａは、タンパク質配列のバイシストロン性発現または多シストロン性発現のために使用することができる自己切断性ペプチド配列である（Szymczakら、Expert  Opin.  Biol.  Therapy、５巻（５号）：６２７〜６３８頁（２００５年）を参照されたい）。例示的なＰ２Ａ配列は、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭ（配列番号１５）である。さらなる実施形態では、本発明のＤＮ形態をレポータータンパク質と同時発現させる。特定の実施形態では、レポータータンパク質は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質である。特定の実施形態では、ｍＣｈｅｒｒｙポリペプチド配列は、以下に提示されるものである。ｍＣｈｅｒｒｙは、ただ単に例示的なものであること、および蛍光タンパク質などの任意の所望のレポーター分子を本明細書に記載の通りレポーターとして含めることができることが理解される。
【化１４】
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【０１５４】
さらなる特定の実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮ形態は、以下に提示されるポリペプチド構築物で表され、下線が引かれた配列はＰＤ−１に由来するものであり、イタリック体で示されている配列はＣＤ８に由来するものであり、Ｐ２Ａ配列に２重下線が引かれており、ｍＣｈｅｒｒｙ配列に下線が引かれ、かつイタリック体で示されている。
【化１５】
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【０１５５】
特定の実施形態では、ＰＤ−１  ＤＮＲ形態構築物をコードする核酸は以下に提示されており、下線が引かれた配列はＰＤ−１  ＤＮに由来するアミノ酸をコードし、イタリック体で示されている配列はＣＤ８に由来するアミノ酸をコードし、Ｐ２Ａコード配列に２重下線が引かれており、ｍＣｈｅｒｒｙコード配列に下線が引かれ、かつイタリック体で示されており、コザック配列は破線の下線が引かれた太字であり、制限部位Ａｇｅ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉには、それぞれ５’末端および３’末端で点線の下線が引かれている。
【化１６】
2019528699.tif 000023
【０１５６】
ＣＴＬＡ−４。細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）は、活性化Ｔ細胞によって発現される阻害性受容体であり、その対応するリガンド（ＣＤ８０およびＣＤ８６；それぞれＢ７−１およびＢ７−２）と会合すると、活性化Ｔ細胞阻害またはアネルギーを媒介する。前臨床試験および臨床試験のどちらにおいても、全身性抗体注入によるＣＴＬＡ−４遮断により、臨床的状況では有意な予測されない毒性が伴ったとはいえ、内在性抗腫瘍応答が増強された。ＣＴＬＡ−４は、細胞外Ｖドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含有する。異なるアイソフォームをコードする代替スプライスバリアントが特徴付けられている。膜結合型アイソフォームは、ジスルフィド結合によって相互接続したホモ二量体として機能し、一方、可溶性アイソフォームは、単量体として機能する。細胞内ドメインは、内因性の触媒活性を有さず、ＰＩ３Ｋ、ＰＰ２ＡおよびＳＨＰ−２に結合することができるＹＶＫＭ（配列番号２９）モチーフを１つ、ならびにＳＨ３含有タンパク質に結合することができるプロリンリッチモチーフを１つ含有するという点で、ＣＤ２８の細胞内ドメインと類似している。Ｔ細胞応答の阻害におけるＣＴＬＡ−４の１つの役割は、ＣＤ３およびＬＡＴなどのＴＣＲ近位シグナル伝達タンパク質のＳＨＰ−２およびＰＰ２Ａ脱リン酸化を介した直接的なものであると思われる。ＣＴＬＡ−４はまた、ＣＤ２８とＣＤ８０／８６結合について競合することによって間接的にもシグナル伝達に影響を及ぼし得る。ＣＴＬＡ−４は、ＰＩ３Ｋ、ＣＤ８０、ＡＰ２Ｍ１、およびＰＰＰ２Ｒ５Ａと結合する、かつ／または相互作用することも示されている。
【０１５７】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＨ６９５６６．１（ＧＩ：４６８５４８１４）またはＮＰ＿００５２０５．２（ＧＩ：２１３６１２１２）、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。ＣＴＬＡ−４内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜３５；細胞外ドメイン、アミノ酸３６〜１６１；膜貫通ドメイン、アミノ酸１６２〜１８２；細胞内ドメイン、アミノ酸１８３〜２２３への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５２０５．２を参照されたい。「ＣＴＬＡ−４核酸分子」は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化１７】
2019528699.tif 000024
【０１５８】
一実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態は、ＣＴＬＡ−４の細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態は、ＣＴＬＡ−４の細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態は、ＣＴＬＡ−４の細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ−４は、細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態は、キメラである。例えば、ＣＴＬＡ−４細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、任意選択で異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含んでよい。
【０１５９】
本発明のある実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態は、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＣＴＬＡ−４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５２０５．２；配列番号１９）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸３６〜１６１を含み得る。そのようなＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態を発現する細胞は、ＣＴＬＡ−４免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態は、ＣＴＬＡ−４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５２０５．２；配列番号１９）の細胞内ドメイン、例えば、アミノ酸１８３〜２２３、またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、ＣＴＬＡ−４によって媒介される免疫チェックポイント経路の細胞内シグナル伝達が低下するまたは阻害される。
【０１６０】
ＢＴＬＡ。Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）発現は、Ｔ細胞の活性化の間に誘導され、ＢＴＬＡは、Ｔｈ１細胞上では発現したままであるが、Ｔｈ２細胞ではそうではない。ＢＴＬＡは、Ｂ７ホモログであるＢ７Ｈ４と相互作用する。ＢＴＬＡは、細胞表面受容体のＢ７ファミリーだけでなく、腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦ−Ｒ）との相互作用によってＴ細胞阻害を示す。ＢＴＬＡは、ヘルペスウイルス進入メディエーター（ＨＶＥＭ）としても公知の腫瘍壊死因子（受容体）スーパーファミリー、メンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）のリガンドである。ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答を負に調節する。ＢＴＬＡ活性化により、ヒトＣＤ８＋がん特異的Ｔ細胞の機能が阻害されることが示されている。ＢＴＬＡは、ＣＤ２７２（表面抗原分類２７２）とも称されている。
【０１６１】
ＢＴＬＡポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＰ４４００３．１（ＧＩ：３１８８００２７）またはＮＰ＿８６１４４５．３（ＧＩ：１４５５８０６２１）、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。ＢＴＬＡ内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜３０；細胞外ドメイン、アミノ酸３１〜１５７；膜貫通ドメイン、アミノ酸１５８〜１７８；細胞内ドメイン、アミノ酸１７９〜２８９への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿８６１４４５．３を参照されたい。「ＢＴＬＡ核酸分子」は、ＢＴＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化１８】
2019528699.tif 000025
【０１６２】
一実施形態では、本発明は、ＢＴＬＡ  ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、ＢＴＬＡ  ＤＮ形態は、ＢＴＬＡの細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＢＴＬＡ  ＤＮ形態は、ＢＴＬＡの細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＢＴＬＡ  ＤＮ形態は、ＢＴＬＡの細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＢＴＬＡ  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＢＴＬＡ細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＢＴＬＡ  ＤＮ形態は、キメラである。例えば、ＢＴＬＡ細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＢＴＬＡ  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、任意選択で異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含んでよい。
【０１６３】
本発明のある実施形態では、ＢＴＬＡ  ＤＮ形態は、ＢＴＬＡの細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＢＴＬＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿８６１４４５．３；配列番号２０）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸３１〜１５７を含み得る。そのようなＢＴＬＡ  ＤＮ形態を発現する細胞は、ＢＴＬＡ免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、ＢＴＬＡ  ＤＮ形態は、細胞内ドメイン、例えば、ＢＴＬＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿８６１４４５．３；配列番号２０）のアミノ酸１７９〜２８９、またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、ＢＴＬＡによって媒介される免疫チェックポイント経路の細胞内シグナル伝達が低下するまたは阻害される。
【０１６４】
ＴＩＭ−３。Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）は、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２前駆体とも称され、マクロファージの活性化を調節するＴｈ１特異的細胞表面タンパク質である。Ｔｉｍ−３は、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性１（Ｔｃ１）Ｔ細胞上に選択的に発現する分子として最初に同定された。ＴＩＭ−３は、Ｖ型のＮ末端Ｉｇドメイン、その後にムチンドメインを有する。
【０１６５】
ＴＩＭ−３ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿１１６１７１．３（ＧＩ：４９５７４５３４）、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。ＴＩＭ−３内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２１；細胞外ドメイン、アミノ酸２２〜２０２；膜貫通ドメイン、アミノ酸２０３〜２２３；細胞内ドメイン、アミノ酸２２４〜３０１への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿１１６１７１．３を参照されたい。「ＴＩＭ−３核酸分子」は、ＴＩＭ−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化１９】
2019528699.tif 000026
【０１６６】
一実施形態では、本発明は、ＴＩＭ−３  ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、ＴＩＭ−３  ＤＮ形態は、ＴＩＭ−３の細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＴＩＭ−３  ＤＮ形態は、ＴＩＭ−３の細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＴＩＭ−３  ＤＮ形態は、ＴＩＭ−３の細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＴＩＭ−３  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＴＩＭ−３細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＴＩＭ−３  ＤＮ形態は、キメラである。例えば、ＴＩＭ−３細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＴＩＭ−３  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、任意選択で異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含んでよい。
【０１６７】
本発明のある実施形態では、ＴＩＭ−３  ＤＮ形態は、ＴＩＭ−３の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＴＩＭ−３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿１１６１７１．３；配列番号２１）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸２２〜２０２を含み得る。そのようなＴＩＭ−３  ＤＮ形態を発現する細胞は、ＴＩＭ−３免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、ＴＩＭ−３  ＤＮ形態は、細胞内ドメイン、例えば、ＴＩＭ−３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿１１６１７１．３；配列番号２１）のアミノ酸２２４〜３０１またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、ＴＩＭ−３により媒介される免疫チェックポイント経路の細胞内シグナル伝達が低下するまたは阻害される。
【０１６８】
ＬＡＧ−３。リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）は、免疫細胞の負の免疫調節因子である。ＬＡＧ−３は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含有する。ＬＡＧ３遺伝子は８つのエクソンを含有する。配列データ、エクソン／イントロン組織化、および染色体局在化は全て、ＬＡＧ−３とＣＤ４の密接な関連性を示すものである。ＬＡＧ−３は、ＣＤ２２３（表面抗原分類２２３）とも称されている。
【０１６９】
ＬＡＧ−３ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＡ３６２４３．３（ＧＩ：１５６１７３４１）またはＮＰ＿００２２７７．４（ＧＩ：１６７６１４５００）、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。ＬＡＧ−３内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２２；細胞外ドメイン、アミノ酸２３〜４５０；膜貫通ドメイン、アミノ酸４５１〜４７１；細胞内ドメイン、アミノ酸４７２〜５２５への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２２７７．４を参照されたい。「ＬＡＧ−３核酸分子」は、ＬＡＧ−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化２０】
2019528699.tif 000027
【０１７０】
一実施形態では、本発明は、ＬＡＧ−３  ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、ＬＡＧ−３  ＤＮ形態は、ＬＡＧ−３の細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＬＡＧ−３  ＤＮ形態は、ＬＡＧ−３の細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＬＡＧ−３  ＤＮ形態は、ＬＡＧ−３の細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＬＡＧ−３  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＬＡＧ−３は、細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＬＡＧ−３  ＤＮ形態は、キメラである。例えば、ＬＡＧ−３細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＬＡＧ−３  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、任意選択で異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含んでよい。
【０１７１】
本発明のある実施形態では、ＬＡＧ−３  ＤＮ形態は、ＬＡＧ−３の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＬＡＧ−３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２２７７．４；配列番号２２）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸２３〜４５０を含み得る。そのようなＬＡＧ−３  ＤＮ形態を発現する細胞は、ＬＡＧ−３免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、ＬＡＧ−３  ＤＮ形態は、ＬＡＧ−３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２２７７．４；配列番号２２）の細胞内ドメイン、例えば、アミノ酸４７２〜５２５またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、ＬＡＧ−３によって媒介される免疫チェックポイント経路の細胞内シグナル伝達が低下するまたは阻害される。
【０１７２】
ＴＩＧＩＴ。ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）は、Ｔ細胞活性化を抑制する細胞表面タンパク質である。ＴＩＧＩＴは、それらのＮ末端Ｉｇドメインにおいて３つの保存された配列モチーフを共有する免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質のポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）ファミリーに属する。ＴＩＧＩＴポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿７７６１６０．２（ＧＩ：２５６６００２２８）、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列、またはその断片を有し得る。ＴＩＧＩＴ内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２１；細胞外ドメイン、アミノ酸２２〜１４１；膜貫通ドメイン、アミノ酸１４２〜１６２；細胞内ドメイン、アミノ酸１６３〜２４４への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿７７６１６０．２を参照されたい。「ＴＩＧＩＴ核酸分子」は、ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化２１】
2019528699.tif 000028
【０１７３】
一実施形態では、本発明は、ＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態は、ＴＩＧＩＴの細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態は、ＴＩＧＩＴの細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態は、ＴＩＧＩＴの細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴは、細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態は、キメラである。例えば、ＴＩＧＩＴ細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、任意選択で異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含んでよい。
【０１７４】
本発明のある実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＴＩＧＩＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿７７６１６０．２；配列番号２３）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸２２〜１４１を含み得る。そのようなＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態を発現する細胞は、ＴＩＧＩＴ免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＤＮ形態は、細胞内ドメイン、例えば、ＴＩＧＩＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿７７６１６０．２；配列番号２３）のアミノ酸１６３〜２４４、またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、ＴＩＧＩＴによって媒介される免疫チェックポイント経路の細胞内シグナル伝達が低下するまたは阻害される。
【０１７５】
ＬＡＩＲ１。白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞の細胞溶解機能に対して構成的な負の調節の役割を果たす阻害性受容体である。ＬＡＩＲは、種々のアイソフォームで存在する。所望の機能が実現されるように任意のアイソフォームを選択することができることが理解される。例示的なアイソフォームとしては、アイソフォームａ（ＮＰ＿００２２７８．２、ＧＩ：６１２４０７８５９）、アイソフォームｂ（ＮＰ＿０６８３５２．２、ＧＩ：６１２４０７８６１）、アイソフォームｃ（ＮＰ＿００１２７５９５２．２、ＧＩ：６１２４０７８６７）、アイソフォームｅ（ＮＰ＿００１２７５９５４．２、ＧＩ：６１２４０７８６９）、アイソフォームｆ（ＮＰ＿００１２７５９５５．２、ＧＩ：６１２４０７８６３）、アイソフォームｇ（ＮＰ＿００１２７５９５６．２、ＧＩ：６１２４０７８６５）などが挙げられる。例示的なアイソフォーム配列の１つ、アイソフォームａを以下に提示する。一実施形態では、ＬＡＩＲ１ポリペプチドは、ＮＰ＿００２２７８．２、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。ＬＡＩＲ１内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２１；細胞外ドメイン、アミノ酸２２〜１６５；膜貫通ドメイン、アミノ酸１６６〜１８６；細胞内ドメイン、アミノ酸１８７〜２８７への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２２７８．２を参照されたい。「ＬＡＩＲ１核酸分子」は、ＬＡＩＲ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化２２】
2019528699.tif 000029
【０１７６】
一実施形態では、本発明は、ＬＡＩＲ１  ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、ＬＡＩＲ１  ＤＮ形態は、ＬＡＩＲ１の細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＬＡＩＲ１  ＤＮ形態は、ＬＡＩＲ１の細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＬＡＩＲ１  ＤＮ形態は、ＬＡＩＲ１の細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＬＡＩＲ１  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＬＡＩＲ１は、細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＬＡＩＲ１  ＤＮ形態は、キメラである。例えば、ＬＡＩＲ１の細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＬＡＩＲ１  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、任意選択で異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含んでよい。
【０１７７】
本発明のある実施形態では、ＬＡＩＲ１  ＤＮ形態は、ＬＡＩＲ１の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＬＡＩＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２２７８．２；配列番号２４）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸２２〜１６５を含み得る。そのようなＬＡＩＲ１  ＤＮ形態を発現する細胞は、ＬＡＩＲ１免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、ＬＡＩＲ１  ＤＮ形態は、ＬＡＩＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２２７８．２；配列番号２４）の細胞内ドメイン、例えば、アミノ酸１８７〜２８７またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、ＬＡＩＲ１によって媒介される細胞内免疫チェックポイント経路のシグナル伝達が低下するまたは阻害される。
【０１７８】
２Ｂ４。ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）は、ＮＫ細胞およびＴ細胞のサブセット上で非ＭＨＣ拘束細胞死滅を媒介する。２Ｂ４−Ｓアイソフォームは活性化受容体であると考えられており、２Ｂ４−Ｌアイソフォームは免疫細胞の負の免疫調節因子であると考えられている。２Ｂ４は、その高親和性リガンドであるＣＤ４８と結合すると会合状態になる。２Ｂ４は、当該タンパク質が種々のホスファターゼと関連するのを可能にする分子スイッチであるチロシンスイッチモチーフを含有する。２Ｂ４は、ＣＤ２４４（表面抗原分類２４４）とも称されている。
【０１７９】
２Ｂ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１１６０１３５．１（ＧＩ：２６２２６３４３５）、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。２Ｂ４内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜１８；細胞外ドメイン、アミノ酸１９〜２２９；膜貫通ドメイン、アミノ酸２３０〜２５０；細胞内ドメイン、アミノ酸２５１〜３７０への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１１６０１３５．１を参照されたい。「２Ｂ４核酸分子」は、２Ｂ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化２３】
2019528699.tif 000030
【０１８０】
一実施形態では、本発明は、２Ｂ４  ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、２Ｂ４  ＤＮ形態は、２Ｂ４の細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、２Ｂ４  ＤＮ形態は、２Ｂ４の細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、２Ｂ４  ＤＮ形態は、２Ｂ４の細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明の２Ｂ４  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、２Ｂ４は、細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、２Ｂ４  ＤＮ形態は、キメラである。例えば、２Ｂ４の細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、２Ｂ４  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、任意選択で異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含んでよい。
【０１８１】
本発明のある実施形態では、２Ｂ４  ＤＮ形態は、２Ｂ４の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、２Ｂ４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１１６０１３５．１；配列番号２５）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸１９〜２２９を含み得る。そのような２Ｂ４  ＤＮ形態を発現する細胞は、２Ｂ４免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、２Ｂ４  ＤＮ形態は、２Ｂ４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１１６０１３５．１；配列番号２５）の細胞内ドメイン、例えば、アミノ酸２５１〜３７０またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、２Ｂ４によって媒介される細胞内免疫チェックポイント経路のシグナル伝達が低下するまたは阻害される。
【０１８２】
ＣＤ１６０。ＣＤ１６０は、ＨＶＥＭに結合する単一のＩｇＶ様ドメインを含有し、Ｔ細胞上の共阻害性受容体として機能するグリコシルホスファチジルイノシトール係留分子である。ＣＤ１６０ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００８９８４．１（ＧＩ：５９０１９１０）、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。ＣＤ１６０内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２６；細胞外ドメイン、アミノ酸２７〜１５９への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００８９８４．１を参照されたい。「ＣＤ１６０核酸分子」は、ＣＤ１６０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化２４】
2019528699.tif 000031
【０１８３】
一実施形態では、本発明は、ＣＤ１６０  ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、ＣＤ１６０  ＤＮ形態は、ＣＤ１６０の細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ１６０  ＤＮ形態は、ＣＤ１６０の細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＣＤ１６０  ＤＮ形態は、ＣＤ１６０の細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＣＤ１６０  ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＣＤ１６０は、細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＣＤ１６０  ＤＮ形態は、キメラである。例えば、ＣＤ１６０の細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＣＤ１６０  ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含み得る。
【０１８４】
本発明のある実施形態では、ＣＤ１６０  ＤＮ形態は、ＣＤ１６０の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＣＤ１６０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００８９８４．１；配列番号２６）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸２７〜１５９を含み得る。そのようなＣＤ１６０  ＤＮ形態を発現する細胞は、免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下しているはずである。一実施形態では、ＣＤ１６０  ＤＮ形態は、ＣＤ１６０の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、および、これだけに限定されないが、本明細書に記載の膜貫通ドメインのうちの１つを含めた異種ポリペプチドに由来する膜貫通ドメインを含む。非限定的な一実施形態では、ＣＤ１６０  ＤＮ形態は、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む。ＣＤ１６０  ＤＮ形態を発現する細胞では、ＣＤ１６０によって媒介される細胞内免疫チェックポイント経路のシグナル伝達が低下するまたは阻害されるはずである。
【０１８５】
ＴＧＦ−β  ２型受容体。ＴＧＦ−β  ２型受容体はＴＧＦ−βおよびリガンドとヘテロ四量体複合体を形成するＩ型受容体二量体に結合する。ＴＧＦ−β  ２型受容体ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１０２００１８．１（ＧＩ：６７７８２３２６）、以下に提示される配列に対応するアミノ酸配列またはその断片を有し得る。ＴＧＦ−β  ２型受容体内のドメイン、例えば、シグナルペプチド、アミノ酸１〜２２；細胞外ドメイン、アミノ酸２３〜１９１；膜貫通ドメイン、アミノ酸１９２〜２１２；細胞内ドメイン、アミノ酸２１３〜５９２への言及に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１０２００１８．１を参照されたい（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ３７１７３における注釈も参照されたい）。「ＴＧＦ−β  ２型受容体核酸分子」は、ＴＧＦ−β  ２型受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことが理解される。
【化２５】
2019528699.tif 000032
【０１８６】
一実施形態では、本発明は、ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態を提供する。一実施形態では、ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態は、ＴＧＦβ受容体の細胞外リガンド結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態は、ＴＧＦβ受容体の細胞外リガンド結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えば、成熟形態）。別の実施形態では、ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態は、ＴＧＦβ受容体の細胞外リガンド結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを含む（例えば、前駆体形態）。本発明は、本発明のＴＧＦ−β受容体ＤＮ形態のコードされるポリペプチドおよび核酸も提供する。特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体は、細胞外リガンド結合性ドメインが１つまたは複数の異種ポリペプチド配列と融合している、すなわち、ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態は、キメラである。例えば、ＴＧＦβ受容体細胞外リガンド結合性ドメインは、そのＮ末端において、本明細書に記載の種々のシグナルペプチドを含めた、任意選択で異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドと融合していてよい。さらに、ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態は、本明細書に記載の種々の膜貫通ドメインのいずれかを含めた、異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含み得る。
【０１８７】
ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態は、以前に記載されている（例えば、ＴＧＦβ受容体細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むＤＮ形態が記載されているBottingerら、EMBO  J.、１６巻：２６２１〜２６３３頁（１９９７年）；Fosterら、J.  Immunother.、３１巻：５００〜５０５頁（２００８年）；Bollardら、Blood、９９巻：３１７９〜３１８７頁（２００２年）；Wieserら、Mol.  Cell.  Biol.、１３巻：７２３９〜７２４７頁（１９９３年）を参照されたい）。本発明のある実施形態では、ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態は、ＴＧＦβ受容体の細胞外ドメインまたはそのリガンド結合性部分、例えば、ＴＧＦβ受容体（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１０２００１８．１、配列番号２７）の細胞外ドメインに対応するアミノ酸２３〜１９１を含み得る。そのようなＴＧＦβ受容体ＤＮ形態を発現する細胞は、細胞においてシグナル伝達する能力を欠くまたは能力が低下している。一実施形態では、ＴＧＦβ受容体ＤＮ形態は、ＴＧＦβ受容体（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００１０２００１８．１、配列番号２７）細胞内ドメイン、例えば、アミノ酸２１３〜５９２またはその一部の欠失を有する欠失突然変異体であり、したがって、ＴＧＦβ受容体によって媒介される細胞内シグナル伝達が低下するまたは阻害される（Bottingerら、EMBO  J.、１６巻：２６２１〜２６３３頁（１９９７年）；Fosterら、J.  Immunother.、３１巻：５００〜５０５頁（２００８年）；Bollardら、Blood、９９巻：３１７９〜３１８７頁（２００２年）；Wieserら、Mol.  Cell.  Biol.、１３巻：７２３９〜７２４７頁（１９９３年）も参照されたい）。
【０１８８】
任意選択で、第２の細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態、例えば、免疫チェックポイント阻害剤などを本発明の細胞において発現させることができることが理解される。この場合、同じ細胞において１つよりも多くの細胞媒介性免疫応答を阻害することが望ましい場合がある。したがって、細胞に、それぞれが上記のものを含めた異なる細胞媒介性免疫応答の阻害剤を対象とする２つまたはそれよりも多くのＤＮ形態を発現させることができる。例えば、所望の通り、上記のＤＮ形態のいずれかの組合せを含め、ＰＤ−１のＤＮ形態を細胞においてＴＧＦ−β受容体のＤＮ形態と同時発現させることができる、ＰＤ−１のＤＮ形態をＣＴＬＡ−４のＤＮ形態と同時発現させることができる、ＣＴＬＡ−４  ＤＮ形態をＴＧＦ−βのＤＮ形態と同時発現させることができるなどである。
【０１８９】
特定の実施形態では、ＤＮ形態をコードする核酸を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に形質導入する。そのような実施形態では、形質導入されたＴ細胞の対象への投与により、対象においてヘルパーおよび細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の両方が生じ、その結果、持続的な抗ウイルス応答がもたらされるはずである。
【０１９０】
７．４  処置の方法
本発明は、本発明の細胞または細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を使用してウイルス感染を処置する方法にも関する。一実施形態では、方法は、ウイルス抗原結合性ＣＡＲと細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態とを発現する、免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞である免疫細胞を投与するステップを含み得る。対象におけるウイルス感染が標的になるようにウイルス抗原を選択する。別の実施形態では、方法は、ウイルス抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞などのウイルス抗原特異的免疫細胞であって、細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を組換え発現する（かつ、必ずしもではないが、ウイルス抗原結合性ＣＡＲを発現し得る）細胞を投与するステップを含み得る。別の実施形態では、方法は、免疫抑制細胞、例えば調節性Ｔ細胞などである免疫細胞、特に、慢性ウイルス感染を有する対象から単離された調節性Ｔ細胞であって、細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を組換え発現する細胞を投与するステップを含み得る。
【０１９１】
本発明の方法を、ウイルス感染を処置するために使用することができる。特定の実施形態では、ウイルス感染は、これだけに限定されないが、ＨＩＶによる感染（例えば、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２）、ＨＢＶまたはＨＣＶであり得る。本発明の方法を、持続性ウイルス感染、例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶまたはＨＣＶによる潜伏感染、慢性感染または遅発性感染、例えば、持続性ウイルス感染などを処置するために使用することができる。
【０１９２】
ウイルス特異的免疫賦活性細胞の活性化の持続。一実施形態では、本発明は、ウイルス感染を処置する方法であって、患者に、ウイルス特異的であり、細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を発現する、本発明の免疫細胞、特に免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞を投与するステップを含む方法を提供する。特定の一実施形態では、免疫賦活性細胞を、ウイルス抗原に結合するＣＡＲを発現させることによりウイルス特異的にする。特定の一実施形態では、ウイルス特異的である免疫賦活性細胞は、ウイルス感染を有する対象から単離される。特定の実施形態では、ウイルス特異的免疫賦活性細胞は、ウイルス抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、ＰＤ−１である。
【０１９３】
当該方法を、ウイルス感染を処置するために使用することができる。そのようなウイルス感染としては、これだけに限定されないが、ＨＩＶによる感染、ＨＢＶによる感染またはＨＣＶによる感染が挙げられる。本発明の方法を、ウイルス負荷量もしくは持続性ウイルス感染、例えば、慢性ウイルス感染、潜伏ウイルス感染もしくは遅発性ウイルス感染などを低減もしくは排除するため、または再発または反復ウイルス感染を予防するもしくはその重症度を低下させるために使用することができる。
【０１９４】
ウイルス特異的メモリー細胞の促進。一実施形態では、本発明は、ウイルス感染を処置する方法であって、患者に、ウイルス特異的であり、細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を発現する、本発明の免疫細胞、特に免疫賦活性細胞またはその前駆体細胞を投与するステップを含む方法を提供する。そのような実施形態では、ＤＮ形態の発現により、ウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進することができる。特定の一実施形態では、免疫賦活性細胞を、ウイルス抗原に結合するＣＡＲを発現させることによりウイルス特異的にする。特定の一実施形態では、ウイルス特異的である免疫賦活性細胞は、ウイルス感染を有する対象から単離される。特定の実施形態では、ウイルス特異的免疫賦活性細胞は、ウイルス抗原を認識し、それに感作されるＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、ＰＤ−１である。
【０１９５】
当該方法を、ウイルス感染を処置するために使用することができる。そのようなウイルス感染としては、これだけに限定されないが、ＨＢＶによる感染、ＨＣＶによる感染またはＨＩＶによる感染が挙げられる。本発明の方法を、ウイルス特異的メモリー細胞の産生を促進することにより、ウイルス負荷量もしくは持続性ウイルス感染、例えば、慢性ウイルス感染、潜伏ウイルス感染もしくは遅発性ウイルス感染などを低減もしくは排除するため、または再発もしくは反復ウイルス感染を予防するもしくはその重症度を低下させるために使用することができる。
【０１９６】
免疫抑制細胞の免疫抑制活性の阻害。一実施形態では、本発明は、ウイルス感染を処置する方法であって、患者に、免疫抑制細胞、特に調節性Ｔ細胞であり、細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を発現する、免疫細胞を投与するステップを含む方法を提供する。そのような実施形態では、調節性Ｔ細胞を、対象、特に慢性ウイルス感染を有する対象から単離することができる。調節性Ｔ細胞におけるＤＮ形態の発現を使用して、調節性Ｔ細胞の免疫賦活性細胞に対する抑制効果、特に、調節性Ｔ細胞による細胞媒介性免疫応答の阻害剤の発現に関連する抑制効果を阻害することができる。ある実施形態では、抑制効果の阻害は、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される免疫応答を促進する。特定の実施形態では、細胞媒介性免疫応答の阻害剤は、ＰＤ−１である。特定の実施形態では、抑制効果の阻害は、ＰＤ−Ｌ１を発現し、ＰＤ−１を発現する調節性Ｔ細胞によって抑制されるＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される免疫応答を促進する。
【０１９７】
当該方法を、ウイルス感染を処置するために使用することができる。そのようなウイルス感染としては、これだけに限定されないが、ＨＣＶによる感染、ＨＢＶによる感染またはＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２）による感染が挙げられる。本発明の方法を、ウイルス負荷量もしくは持続性ウイルス感染、例えば、慢性ウイルス感染、潜伏ウイルス感染もしくは遅発性ウイルス感染などを低減もしくは排除するため、または再発または反復ウイルス感染を予防するもしくはその重症度を低下させるために使用することができる。機構により限定されることを意図せず、当該方法では、調節性Ｔ細胞による免疫抑制が阻害され、抑制は、細胞媒介性免疫応答の阻害剤、例えばＰＤ−１によって媒介されるものである。特定の実施形態では、ＨＣＶ、ＨＢＶまたはＨＩＶによるものなどの慢性ウイルス感染を有する対象から調節性Ｔ細胞を回収し、次いで、ＤＮ形態を発現するように遺伝子操作する。例えば、寛解の状態にあり、急性感染の徴候または症状を示さない対象から細胞を回収することができる。特定の実施形態では、当該方法を、慢性感染を処置するため、および再発して活動性感染になることを予防するために使用することができる。
【０１９８】
投与量および投与。本発明の方法では、本発明の免疫細胞を、処置を必要とする対象または患者に投与する。対象または患者は、哺乳動物、特に、ヒトであってよい。対象または患者はヒトであることが好ましい。ヒトは、小児であっても成人であってもよい。
【０１９９】
処置に関して、投与される量は、所望の効果を生じさせるために有効な量である。有効量または治療有効量とは、処置に際して有益なまたは所望の臨床結果をもたらすために十分な量である。有効量は、単回投与でもたらすこともでき、一連の投与（１つまたは複数の用量）でもたらすこともできる。有効量は、ボーラスでもたらすこともでき、連続的な灌流によってもたらすこともできる。処置に関して、有効量とは、疾患を緩和する、好転させる、安定化する、逆転させるまたはその進行を遅くする、または他の点で疾患の病理学的な結果を低下させるために十分な量である。有効量は、医師が特定の対象に関して決定することができる。一般には、有効量を実現するために適した投与量を決定する際には、いくつかの因子を考慮に入れる。これらの因子としては、対象の年齢、性別および体重、処置される状態、状態の重症度ならびに投与される本発明の細胞の形態および有効濃度が挙げられる。
【０２００】
本発明の細胞は、一般に、細胞が投与される対象の体重１キログラム当たりの細胞数（１ｋｇ当たりの細胞数）に基づく用量で投与される。一般に、細胞用量は、投与の様式および場所に応じて、体重１ｋｇ当たり細胞約１０４〜約１０１０個、例えば、１ｋｇ当たり細胞約１０５〜約１０９個、約１０５〜約１０８個、約１０５〜約１０７個、または約１０５〜１０６個の範囲である。一般に、全身投与の場合では、局部投与、本発明の免疫細胞をウイルス感染の領域またはウイルスが感染した細胞もしくは組織に投与する場合よりも高用量が使用される。例示的な用量範囲としては、これだけに限定されないが、１ｋｇ当たり細胞１×１０４〜１×１０８、２×１０４〜１×１０８、３×１０４〜１×１０８、４×１０４〜１×１０８、５×１０４〜１×１０８、６×１０４，〜１×１０８、７×１０４〜１×１０８、８×１０４〜１×１０８、９×１０４〜１×１０８、１×１０５〜１×１０８、例えば、１×１０５〜９×１０７、１×１０５〜８×１０７、１×１０５〜７×１０７、１×１０５〜６×１０７、１×１０５〜５×１０７、１×１０５〜４×１０７、１×１０５〜３×１０７、１×１０５〜２×１０７、１×１０５〜１×１０７、１×１０５〜９×１０６、１×１０５〜８×１０６、１×１０５〜７×１０６、１×１０５〜６×１０６、１×１０５〜５×１０６、１×１０５〜４×１０６、１×１０５〜３×１０６、１×１０５〜２×１０６、１×１０５〜１×１０６、２×１０５〜９×１０７、２×１０５〜８×１０７、２×１０５〜７×１０７、２×１０５〜６×１０７、２×１０５〜５×１０７、２×１０５〜４×１０７、２×１０５〜３×１０７、２×１０５〜２×１０７、２×１０５〜１×１０７、２×１０５〜９×１０６、２×１０５〜８×１０６、２×１０５〜７×１０６、２×１０５〜６×１０６、２×１０５〜５×１０６、２×１０５〜４×１０６、３×１０５〜３×１０６などが挙げられる。そのような用量範囲は、局部投与に特に有用であり得る。特定の実施形態では、細胞は、局部投与として、１ｋｇ当たり細胞１×１０５〜１×１０８個、例えば、１ｋｇ当たり細胞１×１０５〜１×１０７個、１×１０５〜１×１０６個、１×１０６〜１×１０８個、１×１０６〜１×１０７個、１×１０７〜１×１０８個、１×１０５〜５×１０６個、１×１０５〜３×１０６個または３×１０５〜３×１０６個の用量でもたらされる。例示的な用量範囲として、これだけに限定されないが、１ｋｇ当たり細胞５×１０５〜１×１０８個、例えば、１ｋｇ当たり細胞６×１０５〜１×１０８個、７×１０５〜１×１０８個、８×１０５〜１×１０８個、９×１０５〜１×１０８個、１×１０６〜１×１０８個、１×１０６〜９×１０７個、１×１０６〜８×１０７個、１×１０６〜７×１０７個、１×１０６〜６×１０７個、１×１０６〜５×１０７個、１×１０６〜４×１０７個、１×１０６〜３×１０７個なども挙げることができる。そのような用量は、全身投与に特に有用であり得る。特定の実施形態では、細胞は、全身投与として、１ｋｇ当たり細胞１×１０６〜３×１０７個の用量でもたらされる。例示的な細胞用量としては、これだけに限定されないが、１ｋｇ当たり細胞約１０４〜約１０１０個の範囲内で１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４��７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９などの用量が挙げられる。さらに、単回用量を投与するか複数回用量を投与するかの説明となるように用量を調整することもできる。何が有効用量だとみなされるかの的確な決定は、上記の通り特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重、および状態を含めた各対象の個人的な因子に基づき得る。投与量は、本明細書における開示および当技術分野における知見に基づいて当業者が容易に決定することができる。
【０２０１】
特定の実施形態では、ヒトへの投与のための投与量は、ヒトの体重１ｋｇ当たり細胞１×１０５〜１×１０８個の範囲内である。
【０２０２】
本発明の細胞は、これだけに限定されないが、胸膜投与、静脈内投与、皮下投与、結節内投与、肝内投与、くも膜下腔内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、頭蓋内投与、気管内投与、関節内投与、子宮内投与、眼内投与、鼻腔内投与、脊髄内投与、硬膜外投与、腱付着部への直接投与、および胸腺への直接投与を含めた当技術分野で公知の任意の方法によって投与することもできる。一実施形態では、本発明の細胞がウイルス感染の領域またはウイルスが感染した細胞もしくは組織が存在する場所に送達されるように、本発明の細胞を、これだけに限定されないが、肝臓または大動脈ポンプ；肢、肺または肝臓灌流；門静脈内に；静脈シャントを通じて；所望の部位などの近くの腔内または静脈内になどを含め、周知の方法を使用して所望の部位に局部的に送達することができる。例えば、細胞を潜伏ウイルス感染または慢性ウイルス感染が存在する領域または組織に送達することができる。別の実施形態では、本発明の細胞を全身的に投与することができる。好ましい実施形態では、細胞を所望の部位に局部的に投与する。当業者は、処置されるウイルス感染の型に基づいて適切な投与形式を選択することができる。細胞を注射またはカテーテルによって導入することができる。一実施形態では、細胞を静脈内注入によって投与する。任意選択で、本発明の細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの産生を増大させるために、対象に、増加および／または分化剤を、細胞の投与前、投与中、または投与後に投与することができる。
【０２０３】
本発明の細胞の増殖は、一般に、対象への投与前にｅｘ  ｖｉｖｏで行い、対象への投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで行うことが望ましい場合がある（Kaiserら、Cancer  Gene  Therapy、２２巻：７２〜７８頁（２０１５年）を参照されたい）。細胞増殖には、細胞の増加および持続性を可能にするために細胞生存が伴うべきである。細胞の単離および／または増加は、例えば、Leeら、Cancer  Res.、７１巻：２８７１〜２８８１頁（２０１１年）に記載されている通り当技術分野で公知の任意の方法を使用して行うことができる。
【０２０４】
本発明の方法は、アジュバント治療を、本発明の細胞を用いた処置と組み合わせて、その前、間、または後に、さらに含み得る。したがって、本発明の細胞治療方法は、本発明の細胞の投与と適合する、特定のウイルス感染を処置するための他の標準のケアおよび／または治療と共に使用することができる。
【０２０５】
任意選択で、本発明の細胞を投与する方法は、投与された本発明の細胞の効果を促進するための宿主の免疫調節を含む併用療法をさらに含み得る。本発明のある実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの免疫調節剤を投与するステップをさらに含み得る。免疫調節剤の非限定的な例としては、免疫賦活性細胞を投与する場合には免疫賦活剤、または免疫抑制細胞を投与する場合には免疫抑制剤が挙げられる。
【０２０６】
一実施形態では、本明細書に開示される通り細胞内シグナル伝達ドメインを欠くＤＮ形態、またはそのようなＤＮ形態およびＣＡＲを発現する本発明の免疫細胞を、ＣＡＲおよびスイッチ受容体（すなわち、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み、共刺激シグナル伝達ドメインがドミナントネガティブ形態の膜貫通ドメインに対してカルボキシ末端にある、ＤＮ形態）を同時発現する免疫細胞と同時投与することができる。そのような、細胞内シグナル伝達ドメインを含有しない（したがって共刺激ドメインを欠く）（すなわち、スイッチ受容体ではない）ＤＮ形態を発現する免疫細胞と同時投与される、ＣＡＲおよびスイッチ受容体を同時発現する免疫細胞では、ＣＡＲは、処置されるものと同じウイルス感染、すなわち、同じウイルス感染のウイルスの抗原に結合する。別の実施形態では、スイッチ受容体を、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くＤＮ形態およびＣＡＲが形質導入されるのと同じ細胞に形質導入することができ、したがって、当該細胞は、３つ全ての構築物を組換え発現する。あるいは、好ましくは、ＤＮ形態を発現する、またはＣＡＲおよびＤＮ形態の両方を発現するがスイッチ受容体は発現しない細胞との併用療法において使用することができる、スイッチ受容体およびＣＡＲの両方を発現する細胞を作製するために、スイッチ受容体を、ＣＡＲが形質導入されているがＤＮ形態は形質導入されていない細胞に形質導入する。この場合、２つの細胞型、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くＤＮ形態を発現する細胞ならびにＣＡＲおよびスイッチ受容体を発現する細胞、またはＣＡＲおよびＤＮ形態を発現する細胞ならびにＣＡＲおよびスイッチ受容体を発現する細胞のいずれかを対象に投与する。一般に、２つの細胞型は同時に投与されるが、逐次的に、例えば、所望の通り、互いと１時間もしくは２時間以内、または１日もしくは２日以内、または同じ日に投与することもできる。特定の実施形態では、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ細胞において発現させるスイッチ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインとは異なる。これにより、同じ細胞内に２つの共刺激シグナル伝達ドメインがもたらされ、細胞の免疫細胞治療に関する有効性が増強されるはずである。投与された免疫細胞が処置される対象において十分に増殖し、したがって、追加的な用量の細胞を投与する必要がないと考えられる場合では、本発明の免疫細胞を免疫細胞治療の開始時に投与することが適切であり得る。任意選択で、スイッチ受容体を発現する免疫細胞を任意選択で含めた本発明の免疫細胞を必要に応じて１回よりも多く投与することができる。
【０２０７】
細胞内シグナル伝達ドメインを欠くＤＮ形態を発現する本発明の免疫細胞との併用療法における、免疫調節剤、またはＣＡＲおよびスイッチ受容体を発現する細胞の投与は、本発明の免疫細胞投与と同時に、例えば、免疫細胞治療の開始時に行うこともでき、所望の通り免疫細胞治療の過程中の任意の時点で逐次的に行うこともできる。当業者は、本発明の細胞と、免疫調節剤、またはＣＡＲおよびスイッチ受容体を発現する細胞とを併用療法において投与するための、併用療法に使用される免疫調節剤のタイミングおよび投薬を含めた適切なレジメンを、処置される対象の必要性に基づいて容易に決定することができる。
【０２０８】
７．５  医薬組成物
本発明は、本発明の細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物は、有効量の本発明の細胞および薬学的に許容される担体を含む。本発明の細胞および細胞を含む組成物は、滅菌された液体調製物、例えば、一般には、選択されたｐＨに一般には緩衝された、細胞懸濁液との等張性水溶液として、または任意選択で、エマルション、分散液などとして都合よく提供することができる。組成物は、細胞の完全性および生存能力、ならびに細胞組成物の投与に適した担体、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などを含んでよい。
【０２０９】
滅菌注射液は、所望の通り、本発明の細胞を適量の適切な溶媒中に種々の量の他の成分と共に組み入れるによって調製することができる。そのような組成物は、細胞組成物と共に使用するため、およびヒトなどの対象に投与するための適切な薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤、例えば、滅菌水、生理学的食塩水、グルコース、ブドウ糖などを含んでよい。細胞組成物を提供するための適切な緩衝液は当技術分野で周知である。使用されるビヒクル、希釈剤、または添加剤はいずれも、本発明の細胞の完全性および生存能力の保存に適合するものである。
【０２１０】
組成物は、一般に、等張性である、すなわち、血液および涙液と同じ浸透圧を有する。本発明の細胞組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、または他の薬学的に許容される薬剤、例えば、ブドウ糖、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、または他の無機または有機溶質などを使用して実現することができる。ナトリウムイオンを含有する緩衝液には塩化ナトリウムが特に好ましい。特に有用な緩衝液の１つは、生理食塩水、例えば、通常の生理食塩水である。組成物の構成成分は、化学的に不活性であり、本発明の細胞の生存能力または有効性に影響を及ぼさず、かつ、ヒトなどの対象への投与に適合するように選択されるべきであることが当業者には理解されよう。当業者は、本発明の方法において投与される組成物中の細胞ならびに任意選択の添加剤、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができる。
【０２１１】
本発明の細胞は、任意の生理的に許容されるビヒクル中で投与することができる。投与に適した用量は本明細書に記載されている。本発明の細胞を含む細胞集団は、精製された細胞の集団を含み得る。当業者は、細胞集団内の細胞の百分率を、本明細書に記載の種々の周知の方法を使用して容易に決定することができる。本発明の遺伝子改変された細胞を含む細胞集団の純度の範囲は、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、約６５％〜約７０％、約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％；約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５〜約１００％であり得る。投与量は、当業者が容易に調整することができ、例えば、純度が低下すると、投与量を増加させる必要があり得る。
【０２１２】
本発明は、本発明の細胞を調製するためのキットも提供する。一実施形態では、キットは、ＤＮ形態を発現するまたはＣＡＲと細胞媒介性免疫応答の阻害剤のＤＮ形態を同時発現する、遺伝子操作された免疫細胞、例えばＴ細胞などまたは調節性Ｔ細胞を生成するための１つまたは複数のベクターを含む。キットを使用して、対象に由来する自己細胞から、または適合する対象に投与される非自己細胞から、遺伝子操作された免疫細胞を生成することができる。別の実施形態では、キットは、対象に投与するための、本発明の細胞、例えば、自己由来細胞または非自己細胞を含み得る。特定の実施形態では、キットは、本発明の免疫細胞を１つまたは複数の容器内に含む。
【０２１３】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない改変も本明細書に提示される本発明の定義内で提供されることが理解される。したがって、以下の実施は、本発明を例示するものであり、限定するものではない。
【実施例】
【０２１４】
８．実施例
本実施例では、ＣＡＲおよびドミナントネガティブＰＤ−１突然変異体を発現するＴ細胞の構築および使用を記載する。本実施例は、ウイルス抗原の代わりにがん抗原を対象とするＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の使用に関するが、本発明に適用することができる方法体系を記載するものである。さらに、下記の結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたものであるが、ＰＤ−１のドミナントネガティブ形態がドミナントネガティブとして機能することが可能であり、ＰＤ−１のドミナントネガティブ形態を発現するＴ細胞の活性を持続させることが可能であることを示すものである。
【０２１５】
８．１  方法および手順
実験手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）により承認されたものであった。各実験を、異なるドナーＴ細胞を使用して多数回実施した。形質導入効率に起因する差異、ドナーに関連する変動性、およびＥ：Ｔ比などの交絡変数を回避するために、データを、３つよりも多くの試料反復を用い、代表的な実験を使用して示す。
【０２１６】
細胞株。ＭＳＴＯ−２１１Ｈヒト胸膜中皮腫細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に、ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するように（ＭＳＴＯ  ＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋）レトロウイルスによる形質導入を行った。次いで、これらの細胞に、ＳＦＧレトロウイルスベクターにサブクローニングしたヒトＭＳＬＮバリアント１を形質導入して、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋  ＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋を生成した。同様に、Ａ５４９細胞および３Ｔ３マウス線維芽細胞に、ヒトＭＳＬＮバリアント１を単独で形質導入して、Ａ５４９  ＭＳＬＮ＋細胞株および３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋細胞株を生成した。３Ｔ３細胞には、ＰＤ−Ｌ１も同時形質導入して、３Ｔ３  ＭＳＬＮ＋ＰＤＬ１＋細胞を生成した。
【０２１７】
γ−レトロウイルスベクター構築およびウイルス産生。ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲを生成するために、ヒトＣＤ８リーダードメインおよびＣＤ８／ＣＤ３ζ、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ、またはＣＤ８／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζドメインと連結した、ＭＳＬＮに特異的な完全ヒトｓｃＦｖ  ｍ９１２をコードするｃＤＮＡ（Ｄ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋから提供された）（Fengら、Mol.  Cancer  Ther.、８巻（５号）：１１１３〜１１１８頁（２００９年））を以前に記載されている通り工学的に操作した（Zhongら、Mol.  Ther.、１８巻（２号）：４１３〜４２０頁（２０１０年））。対照ＰＳＭＡ特異的ＣＡＲを、以前に特徴付けられたＰＳＭＡを標的とするｓｃＦｖを使用して同様に生成した（Gadeら、Cancer  Res.、６５巻（１９号）：９０８０〜９０８８頁（２００５年））。ＰＤ−１  ＤＮＲの構築のために、商業的な遺伝子合成を使用して、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびヒンジドメインと融合したＰＤ−１受容体（アミノ酸１〜１５１）の細胞外部分をコードさせた。ＳＦＧ  γ−レトロウイルスベクター（Ｉ．Ｒｉｖｉｅｒｅ、ＭＳＫＣＣから提供された）にＣＡＲ配列を挿入し、Ｐ２Ａ配列と連結して、ＬＮＧＦＲレポーター（短縮型低親和性神経増殖因子受容体）、またはＰＤ−１  ＤＮＲの場合では、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質レポーターの同時発現を誘導した（Markleyら、Blood、１１５巻（１７号）：３５０８〜３５１９頁（２０１０年）；Papapetrouら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０６巻（３１号）：１２７５９〜１２７６４頁（２００９年））。次いで、以前に記載されている通り、ＣＡＲおよびＰＤ−１  ＤＮＲをコードするプラスミドを２９３Ｔ  Ｈ２９パッケージング細胞株にトランスフェクトして、レトロウイルスを産生させた（Hollymanら、J.  Immunother.、３２巻（２号）：１６９〜１８０頁（２００９年））。
【０２１８】
Ｔ細胞の単離、遺伝子移入、およびＣＤ４／ＣＤ８単離。治験審査委員会により承認されたプロトコールの下で、健康な志願者ドナーの血液から末梢血白血球を単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）での低密度遠心分離によって単離し、フィトヘマグルチニン（２μｇ／ｍＬ；Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を用いて活性化した。単離の２日後、ＰＢＭＣに、２９３Ｔ  ＲＤ１１４により産生された、ＣＡＲおよびＰＤ−１  ＤＮＲをコードするレトロウイルス粒子を用いて形質導入し、レトロネクチン（１５μｇ／ｍＬ；ｒ−フィブロネクチン、Ｔａｋａｒａ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）でコーティングしたプレート上、３０００ｒｐｍで１時間スピノキュレートした（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｅ）。１日後、形質導入されたＰＢＭＣをＩＬ−２（２０ＵＩ／ｍＬ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で維持した。形質導入効率をフローサイトメトリー分析によって決定した。ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞、またはｍＣｈｅｒｒｙ陽性ＰＤ−１  ＤＮＲを発現するＣＡＲ＋Ｔ細胞およびｍＣｈｅｒｒｙ陽性ＥＶを発現するＣＡＲ＋Ｔ細胞の純粋な集団を、フローサイトメトリーに基づく選別（ＢＤ  Ａｒｉａ  Ｓｏｒｔｅｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって得た。
【０２１９】
フローサイトメトリー。ヒトＭＳＬＮ発現を、フィコエリトリンとコンジュゲートしたまたはアロフィコシアニンとコンジュゲートした抗ヒトＭＳＬＮラットＩｇＧ２ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して検出した。腫瘍細胞上の共刺激タンパク質または阻害性タンパク質の発現を、以下の抗体を使用して分析した：４−１ＢＢＬ（ＰＥ、クローン５Ｆ４；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＨＣ  ＨＬＡ−ＤＲ（ＰＥ、クローンＬ２０３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＤ−Ｌ１（ＡＰＣ、クローンＭＩＨ１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＤ−Ｌ２（ＡＰＣ、クローンＭＩＨ１８；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびガレクチン−９（ＡＰＣ、クローン９Ｍ１３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。Ｔ細胞表現型および形質導入効率を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ６９ｍ  ＬＮＧＦＲに対するモノクローナル抗体を用いて決定した。Ｔ細胞阻害性受容体の発現を、ＰＤ１（ＡＰＣ、ｅＢｉｏＪＩＵ５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＩＭ−３（ＰＥ、クローン３４４８２３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＬａｇ−３（ＰＥ、クローンＣ９Ｂ７Ｗ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して分析した。細胞染色を、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）およびＦｌｏｗＪｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｌｏｗＪｏ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。
【０２２０】
Ｔ細胞機能アッセイ。ＣＡＲまたはベクター対照を形質導入したＴ細胞の細胞傷害性を、以前に記載されている標準の５１Ｃｒ放出アッセイによって決定した（McCoyら、National  Cancer  Institute  Monograph、３７巻：５９〜６７頁（１９７３年））。ルシフェラーゼ活性アッセイを実施するために、ＭＳＬＮおよびホタルルシフェラーゼを発現するＣＡＲ＋Ｔ細胞およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を異なるＥ：Ｔ比で１８時間インキュベートした。腫瘍細胞の数量を、ウェル当たり１００μＬのＤ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）を添加した後にＩＶＩＳ  １００／ｌｕｍｉｎａ  ＩＩを使用してＢＬＩによって決定し、腫瘍細胞単独から放出されるシグナルと比較した。エフェクター細胞および照射したＭＳＴＯ−２１１Ｈ  ＭＳＬＮ腫瘍細胞を２４ウェルプレート中、５：１の比で１８時間インキュベートした後にＣＤ１０７ａおよび細胞内染色を実施した。ＣＤ１０７ａアッセイに関しては、ＣＤ１０７ａ−ＰｅＣｙ７抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＧｏｌｇｉ  ＳＴＯＰ（４μＬ／６  ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５μＬを刺激時に添加した。細胞内染色に関しては、ゴルジプラグ（Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ）（１μＬ／１ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を刺激時に添加した。インキュベーション後、エフェクター細胞をＣＤ４、ＣＤ８、ＬＮＧＦＲ、およびＣＤ３マーカーについて染色し、次いで、製造者の指示（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って固定し、透過処理した。細胞内サイトカインについての染色を、グランザイムＢ−ＡＰＣ、パーフォリン−ＰＥ、およびＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。
【０２２１】
サイトカイン放出アッセイを、Ｔ細胞３×１０４〜５×１０３個と標的細胞を１：１〜５：１の比で、９６ウェルの丸底プレート中培地２００μＬ中、３連で共培養することによって実施した。６〜２４時間共培養した後、上清を収集した。マルチプレックスビーズＨｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを製造者の指示（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って使用してサイトカインレベルを決定した。
【０２２２】
Ｔ細胞の増殖能を分析するために、ＣＡＲ＋Ｔ細胞１×１０６個を、照射したＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞または３Ｔ３細胞上、ＭＳＬＮ発現を伴ってまたは伴わずに（および、３Ｔ３の場合では、ＰＤ−Ｌ１を伴ってまたは伴わずに）刺激した。外来性ＩＬ−２の不在下で増殖アッセイを実施した。７日毎に細胞を計数し、次いで、反復刺激のために、照射した標的細胞の上に載せた。各Ｔ細胞群について時間に対するＣＡＲ＋Ｔ細胞数をプロットした。
【０２２３】
同所性胸膜中皮腫動物モデルおよびｅｘ  ｖｉｖｏ実験。胸膜中皮腫の同所性マウスモデルを発生させるために、４〜６週齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）を使用した。全ての手順を承認されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコールの下で実施した。マウスに、吸入イソフルランおよび酸素を使用して麻酔をかけ、鎮痛のためにブピバカインを投与した。以前に記載されている通り、右胸部切開による無血清培地２００μＬ中腫瘍細胞１×１０５〜１×１０６個の直接胸膜内注射を実施して、同所性ＭＰＭ腫瘍を確立した（Adusumilliら、Science  Translational  Medicine、６巻（２６１号）：２６１ｒａ１５１頁（２０１４年）；Servaisら、Clin.  Cancer  Res.、１８巻（９号）：２４７８〜２４８９頁（２０１２年）；Servaisら、Current  Protocols  in  Pharmacology、Enna編、第１４章（ユニット１４  ２１）、John  Wiley  &  Sons（２０１１年））。全部で、形質導入されたＴ細胞３×１０４〜１×１０５個（無血清培地２００μＬ中）を、腫瘍を有するマウスに直接胸膜内注射によって胸腔内にまたは尾静脈注射によって全身的にのいずれかで養子移入した。腫瘍成長をモニタリングし、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を単回腹腔内投薬した２０分後に実施したＢＬＩによって数量化した。ＢＬＩデータを、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン２．６０；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して分析した；ＢＬＩシグナルを、腹側フラックスおよび背側フラックスの平均を表す総フラックス（１秒当たりの光子数）として報告した。ＣＡＲ  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける機能的能力を分析するために、腫瘍組織およびマウス脾臓を以下の通り処理した：組織を秤量し、氷冷ＲＰＭＩ  １６４０中に回収した。組織を、メスを用いて手動で小さく分割し、次いで、４０〜１００μｍのフィルターを通して機械的に脱凝集させた。次に、試料を表現型決定のためにＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって分析した、またはＦＡＣＳ  Ａｒｉａ選別機を使用してＣＡＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を選別し、次いで、ＩＬ−２（６０ＵＩ／ｍＬ）を伴うＲＰＭＩ中に２４時間静置し、５１Ｃｒ放出およびサイトカイン放出アッセイを上記の通り実施した。
【０２２４】
組織学的分析および免疫染色。パラフィン包埋４％パラホルムアルデヒド固定組織試料のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色後、腫瘍の病理組織学的評価を実施した。ヒトＭＳＬＮについての免疫組織化学的分析を、マウス抗ヒトＭＳＬＮ免疫グロブリンＧを用いて以前に記載されている通り実施した（Kachalaら、Clin.  Cancer  Res.、２０巻（４号）：１０２０〜１０２８頁（２０１４年）；Rizkら、Cancer  Epidemiol.  Biomarkers  Prev.、２１巻（３号）：４８２〜４８６頁（２０１２年）；Tozbikianら、PLoS  One、９巻（１２号）：ｅ１１４９００頁（２０１４年））。
【０２２５】
定量的リアルタイムＰＣＲ。ＣＤ４＋ＬＮＧＦＲ＋またはＣＤ８＋ＬＮＧＦＲ＋である選別されたＴ細胞由来のｍＲＮＡを抽出し、μＭＡＣＳ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｃＤＮＡキット（ＭＡＣＳ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒｍｉｘおよびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により設計された、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ−ＭＢＧ）で標識されたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ：Ｔｂｅｔ（Ｈｓ００２０３４３６＿ｍ１）；Ｅｏｍｅｓ（Ｈｓ００１７２８７２＿ｍ１）グランザイムＢ  Ｂ（Ｈｓ０１５５４３５５＿ｍ１）；ＩＦＮγ（Ｈｓ００９８９２９１＿ｍ１）；ＩＬ−２（Ｈｓ００１７４１１４＿ｍ１）；ＰＤ−１（Ｈｓ０１５５００８８＿ｍ１）を使用し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法を用いて実施した。目的の遺伝子の比較の閾値サイクル数（ＣＴ）を使用し、次式：ΔＣｔ（試料）＝Ｃｔ（目的の遺伝子）−Ｃｔ（β２ｍ）を使用してβ２ｍハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。次いで、２−ΔΔＣｔ法を使用して、発現の相対的な倍率変化を対照条件と比較して分析し、以下の通り算出した：２−ΔΔＣｔ＝２＾−（ΔＣｔ試料）−ΔＣｔ（対照））。
【０２２６】
統計学的方法。データを、Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）ソフトウェアを使用して分析し、図の説明文に規定されている通り、平均±ＳＥＭとして示している。結果を、対応のないスチューデントのｔ検定（両側）を使用し、適用可能な場合には多重比較のためにボンフェローニ補正を使用して分析した。生存曲線をログランク検定を使用して分析した。統計的有意性をＰ＜０．０５と定義した。全ての統計分析をＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて実施した。
【０２２７】
８．２．ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激を伴うＣＡＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最初の抗原刺激後に同等のエフェクターサイトカイン分泌および増殖を示す
ヒトＭＳＬＮ特異的ｓｃＦｖ（Fengら、Mol.  Cancer  Ther.、８巻（５号）：１１１３〜１１１８頁（２００９年））およびＣＤ３ζ、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのいずれかを組み入れた３種のＣＡＲを構築した（Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、ＭＢＢｚ）（図１Ａおよび１Ｂ）。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的であり、同種反応性および異種反応性を制御するための負のエフェクターとしての機能を果たした。ＣＤ４＋ヒト末梢血Ｔリンパ球およびＣＤ８＋ヒト末梢血Ｔリンパ球はどちらもＳＦＧ−レトロウイルスベクターを使用して有効に形質導入された（５０％〜７０％形質導入）（図２）。ＭＳＬＮが形質導入されたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＬＮ＋）およびＰＳＭＡが形質導入されたＥＬ−４マウスリンパ腫細胞（ＭＳＬＮ−）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験においてＭＳＬＮ陽性標的およびＭＳＬＮ陰性標的としての機能を果たした。Ｍｚ形質導入Ｔ細胞、Ｍ２８ｚ形質導入Ｔ細胞、およびＭＢＢｚ形質導入Ｔ細胞では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同様のＭＳＬＮ特異的溶解が実証された（図１Ｃ）。Ｐ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によりＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋細胞は溶解せず、また、ＭＳＬＮを標的とするＣＡＲによりＥＬ４  ＰＳＭＡ＋細胞は溶解せず、これにより、溶解が抗原特異的であることが実証される。共刺激シグナル伝達の機能性の検証で（Brentjensら、Clin.  Cancer  Res.、１３巻（１８号  １部）：５４２６〜５４３５頁（２００７年））、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜１５倍高いレベルのＴｈ１サイトカインを分泌し（図１Ｄ）、ＭＳＬＮ＋細胞への反復曝露で外来性ＩＬ−２の不在下のＭｚと比較して１４倍のＴ細胞蓄積が実現された（図１Ｅ）。抗原特異性が確立され、共刺激シグナル伝達ドメインの機能性が検証されたので、確立された胸膜腫瘍を有するマウスにおけるＭＳＬＮを標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞の治療的潜在性の評価を実施した。
【０２２８】
これらの結果から、ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激を伴うＣＡＲが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最初の抗原刺激時に同等のエフェクターサイトカイン分泌および増殖を示すことが実証される。
【０２２９】
８．３．メソテリンＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露後に消耗する
ＣＡＲ  Ｔ細胞の免疫阻害が進行しているかを評価するため、ならびにＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の、腫瘍媒介性免疫阻害を克服する相対的な能力を比較するために、ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０６個をＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍を有するマウスの胸膜腔内に注射し、反復抗原遭遇およびＴ細胞活性化（前方散乱および側方散乱および活性化マーカーＣＤ６９の上方調節によって確認される）に十分な時間を置き、次いで、回収されたＣＤ４またはＣＤ８  ＣＡＲ腫瘍浸潤性または脾臓Ｔ細胞のＭＳＬＮ＋標的を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ刺激を実施した（図３Ａに示されている概略図）。注射されていないｉｎ  ｖｉｔｒｏ休止Ｔ細胞（「注入前細胞」）を使用して、機能のベースラインレベル（抗原曝露前）を確立した。休止状態のＭ２８ｚ  ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＭＳＬＮ抗原に曝露したＴ細胞は、細胞溶解機能のレベルがより低かった（図３Ａ）（注入前細胞溶解、２０．５％；腫瘍浸潤性Ｔ細胞溶解、１３．１％；脾臓Ｔ細胞溶解、８．７％）。対照的に、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞溶解機能を保持した（注入前細胞溶解、１８．３％；腫瘍浸潤性Ｔ細胞溶解、３７．２％；脾臓Ｔ細胞溶解、２２．２％）。選別されたＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞では、同様のパターンの結果が実証された。
【０２３０】
腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞および脾臓ＣＡＲ  Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ刺激した際にサイトカインレベルも測定し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＭＳＬＮ＋抗原に曝露したＣＤ４＋Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞についてＴｈ１サイトカイン分泌の減少が観察された。ＣＤ４＋ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞でも、Ｔｈ１サイトカイン分泌の減少が実証されたが、これらの細胞は、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合にはサイトカイン分泌をよりよく保持することができた（図３Ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞上清は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上清と比較して有意に低いレベルのサイトカインを含有した（以前に観察された所見、Adusumilliら、Science  Translational  Medicine６巻（２６１号）：２６１ｒａ１５１頁（２０１４年））。ＣＤ８＋Ｔ細胞も、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原に曝露するとサイトカインを分泌する能力が低下した；ＣＤ８＋ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γを分泌するそれらの能力を優先的に保持した。投与の３日後に腫瘍および脾臓から回収されたＴ細胞のｍＲＮＡレベルを評価し、ＧｚＢ、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−γのｉｎ  ｖｉｖｏ発現レベルの大部分が、ＣＤ８＋サブセットにおけるＩＬ−２発現を例外として、ＣＤ４＋ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞ではＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のものよりも大きいことが見出された（図３Ｃ）。
【０２３１】
これらの結果から、メソテリンＣＡＲ  Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原曝露後に消耗することが実証される。
【０２３２】
８．４．ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて消耗の遅延を示す
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原に曝露した共刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞において細胞溶解機能およびエフェクターサイトカイン分泌がどちらも阻害されることが実証されたので、慢性感染のモデルと同様に、反復抗原刺激がＴ細胞阻害において役割を果たし得ること、および、反復抗原遭遇時に機能を保持する能力が異なることによりＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性の増強が説明されることが論証された。したがって、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、反復抗原遭遇に抵抗するそれらの能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系で試験し、７日毎にＭＳＬＮ＋抗原刺激した際に、増殖、細胞溶解機能、およびサイトカイン分泌について細胞を評価した。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、段階的なＭＳＬＮ＋刺激の際に増加する能力は同様であり、Ｍｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも１４倍大きなレベルまで増加した；これらの細胞の増加する能力は第３の刺激後に喪失した（図４Ａ）。ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はどちらも、反復抗原刺激時に細胞溶解機能が喪失したが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の方が溶解機能をよりよく保持することができた。溶解は第１の刺激時には３種のＴ細胞群の間で同等であったが、第３の刺激により、Ｍ２８ｚ溶解機能がより顕著なレベルまで阻害され、したがって、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では多数のＥ：Ｔ比において腫瘍溶解が増強された（図４Ｂ、右側）。第３の刺激時の溶解機能（ＣＤ１０７ａ発現を測定する脱顆粒アッセイによって評価される）は、クロム放出アッセイの結果と相関した（図４Ｃ）。
【０２３３】
次に、Ｔｈ１サイトカイン分泌を測定した。第１の刺激時にはＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の間で同様のレベルが認められ、各刺激と共に連続的な減少も認められた。細胞傷害性と同様に、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞ではサイトカイン分泌が優先的に保持された；サイトカイン濃度は、第１の刺激のレベルと第２の刺激時のレベルを比較すると、Ｍ２８ｚについては１／３０超低下し、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞ではたった約１／２の低下であった（図４Ｄ）。サイトカイン産生の差異を、第２の刺激時のサイトカインの細胞内レベルを測定することによって確認した。抗原刺激時のＣＡＲ  Ｔ細胞の逆転写酵素ＰＣＲ分析により、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、消耗および阻害と相関するマーカーをＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して低いレベルで発現することが明らかになった；ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＴｂｅｔおよびＥｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎを高レベルで発現し、ＰＤ１およびＦｏｘＰ３をより低レベルで発現する（図５）。すでに腫瘍抗原に曝露したＣＡＲ  Ｔ細胞を持続するｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能を試験した。定量的持続性はＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の間で同等であるが、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、腫瘍再攻撃の際に機能の増強が実証されると考えられる。確立されたＭＳＬＮ＋胸膜腫瘍を有するマウスに、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を胸膜内投与して（１×１０５個、Ｅ：Ｔ比１：３０００の用量で）、胸膜腫瘍を根絶させた（図４Ｅ）。最初のＴ細胞注射の２０日後に、ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞（１×１０６）を生存者の胸膜腔に注射することによって腫瘍再攻撃を実施した；ＢＬＩを使用して腫瘍量をモニタリングした。持続しているＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍量をよりよく制御することができた（ベースラインレベルのＢＬＩシグナルを有したがＭＢＢｚで処置したマウスでは４匹中４匹であったのに対して、Ｍ２８ｚで処置したマウスでは４匹中２匹であった）（図４Ｅ）。
【０２３４】
これらの結果から、ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおける消耗の遅延を示すことが実証される。
【０２３５】
８．５．腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１によりメソテリンＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能が阻害される
ＣＡＲ  Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍環境により阻害されること、およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、少なくとも一部において、反復抗原遭遇時に機能を保持するそれらの能力に起因してこの阻害をよりよく克服することができることが確立されたので（上記を参照されたい）、次に、このモデルにおいて阻害性受容体およびリガンド経路が果たす役割の評価に努めた。Ｍ２８ｚで処置した、腫瘍の進行を伴うマウスにおける腫瘍浸潤性Ｔ細胞を周知の阻害経路の発現について染色した。ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、およびＬＡＧ−３の高レベルの発現が見出された（図６Ａ）。投与の６日後に回収した腫瘍浸潤性ＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、阻害性受容体の上方調節も実証されたが、これらの細胞は、タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルのどちらにおいても有意に低いレベルのＰＤ−１受容体を発現した（図６Ｂ〜Ｄ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して高レベルのＰＤ−１を発現した。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はどちらも有意な画分がＰＤ−１およびＬＡＧ−３またはＰＤ−１およびＴｉｍ−３を同時発現することも観察され、これにより、多数の阻害性経路が同時に機能することが可能であることが示唆された（図７）。次に、腫瘍で発現したリガンドを評価した：ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２（ＰＤ−１のリガンド）、ガレクチン−９（Ｔｉｍ−３のリガンド）、ならびにＭＨＣクラスＩＩ（ＬＡＧ−３のリガンド）。ＰＤ−１リガンドのみが、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与後に回収された胸膜腫瘍細胞上に発現した（図６Ｅ）。他の箇所で報告されている通り（McGrayら、Mol.  Ther.、２２巻（１号）：２０６〜２１８頁（２０１４年）；Sprangerら、Science  Translational  Medicine、５巻（２００号）：２００ｒａ１１６頁（２０１３年））、腫瘍細胞とＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α（図１および４においてＴ細胞から分泌されたものと同様の濃度で）の共培養により、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現およびＰＤ−Ｌ２発現の同様のレベルの上方調節がもたらされ（図６Ｆ）、これは、免疫攻撃に抵抗するための腫瘍細胞の適応（「適応免疫抵抗」）を反映する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＤ−１受容体およびリガンドの両方の発現の独特な存在により、この経路が有意な阻害性の役割を果たす可能性があることが示唆される。
【０２３６】
ＰＤ−１による阻害を克服するために共刺激が十分であり得ることがいくつかの試験により示唆されている通り（Carterら、Eur.  J.  Immunol.、３２巻（３号）：６３４〜６４３頁（２００２年）；Freemanら、J.  Exp.  Med.、１９２巻（７号）：１０２７〜１０３４頁（２０００年）；Koehlerら、Cancer  Res.、６７巻（５号）：２２６５〜２２７３頁（２００７年））、ＰＤ−Ｌ１媒介性免疫阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（ＭＳＬＮ単独（ＭＳＬＮ＋）またはＭＳＬＮおよびＰＤ−Ｌ１の両方（ＭＳＬＮ＋ＰＤ−Ｌ１＋）のいずれかを形質導入した３Ｔ３マウス線維芽細胞を使用した）において、過剰発現したＰＤ−Ｌ１によりＣＡＲ  Ｔ細胞機能が阻害され得るかどうかを次に評価した（図８Ａ）。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のどちらにおいても、ＰＤ−Ｌ１過剰発現により、連続的な刺激の際の蓄積（図８Ｂ）およびＴｈ１エフェクターサイトカイン分泌（図８Ｄ）が減少した。腫瘍細胞溶解は最初の刺激では阻害されなかったが、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞での２回刺激後に３Ｔ３を標的として用いて実施したクロム放出アッセイにより、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のどちらにおいても、溶解機能がＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における低下よりも高い程度に低下したことが実証される（図８Ｃ）。この結果は、ＭＳＴＯ  ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞への曝露後のＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＭＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞上のＰＤ−１の示差的な上方調節に起因する可能性がある。
【０２３７】
これらの結果から、腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１によりメソテリンＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能が阻害されることが実証される。
【０２３８】
８．６．細胞内因性ＰＤ−１抵抗性によりｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能がレスキューされる
上記の結果から、ＰＤ−１経路が腫瘍媒介性免疫阻害の機能性機構であること、および反復抗原刺激後のＰＤ−１上方調節によりＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性が低下することが示される。したがって、チェックポイント遮断をＣＤ２８共刺激シグナル伝達と組み合わせた。目標は、全身投与される抗体の反復投与に依拠しないＣＡＲ  Ｔ細胞特異的チェックポイント遮断をもたらすことであったので、本試験は、免疫阻害を克服する遺伝子操作された方法に焦点を当てた。ＣＤ８膜貫通ドメインと融合した受容体の細胞外リガンド結合性ドメインを含有するＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲ）を構築した。ＰＤ−１  ＤＮＲはいかなるシグナル伝達ドメインも欠くので、十分に過剰発現した受容体により、ＰＤ−１リガンドを飽和させ、それにより、内在性ＰＤ−１受容体を通じたシグナル伝達を遮断することによってＴ細胞の有効性が増強されると考えられた。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に、Ｐ２ＡエレメントによってｍＣｈｅｒｒｙレポーターと連結したＰＤ−１  ＤＮＲ（ＰＤ−１  ＤＮＲ）またはレポーターのみを含有する空ベクター（ＥＶ）のいずれかを用いて同時形質導入した（図９Ａ）。ＰＤ−１  ＤＮＲを同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、多数のＥ：Ｔ比で、わずかであるが統計的に有意な増殖能力の利点（図９Ｂ）、細胞傷害性の増強（図９Ｃ）、ならびにＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌レベルの増大（図９Ｄ）を有した。
【０２３９】
次に、遺伝子操作されたＰＤ−１抵抗性を同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の胸膜内投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける利点がもたらされるかどうかを評価した。確立された胸膜ＭＳＬＮ＋発現腫瘍を有するマウスに、ＣＡＲ＋Ｍ２８ｚ  ＥＶ  Ｔ細胞またはＭ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ  Ｔ細胞５×１０４個の単回胸膜内用量を投与し、処置への応答を腫瘍量測定（段階的ＢＬＩを使用する）および生存期間中央値によってモニタリングした。Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスでは、腫瘍量制御および持続的な生存期間中央値が有意に増強されたが（図９Ｅ）、長期間の無腫瘍生存を有したのは一部のマウス（７／１６、４４％）のみであり、これにより、克服しなければならない余計な免疫阻害の機構が存在することが示唆される。本実験におけるマウスのコホート（Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ）は、反復腫瘍再攻撃にもかかわらず、４５０日を超えて残存し、これにより、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＣＡＲ  Ｔ細胞の「機能持続性」が実証される。これらの結果から、ＣＡＲ  Ｔ細胞５０，０００個の注射で、１５カ月よりも長くにわたって、多数の腫瘍再攻撃にもかかわらず、大きな腫瘍量が根絶しただけでなく、腫瘍の再発が予防されたことが実証される。
【０２４０】
ＰＤ−１媒介性免疫阻害を克服するための代替の遺伝学的な戦略を調査するために、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に、ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡを発現するベクターを用いて同時形質導入し（図１０Ａ）、それにより、タンパク質レベルで６０％超のＰＤ−１受容体ノックダウンが生じた（図１０Ｂ）。Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞では、ＰＤ−１  ｓｈＲＮＡの同時形質導入により、非哺乳動物遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡを用いた同時形質導入（Ｍ２８ｚ  ＫａｎＲ）と比較して、ＭＳＬＮ＋抗原刺激の際の増殖機能が増強され（図１０Ｃ）、細胞傷害性が増大し（図１０Ｄ）、中皮腫細胞またはＭＳＬＮ＋ＰＤＬ１＋３Ｔ３マウス線維芽細胞を用いた刺激の際のサイトカイン分泌が増強された（図１０Ｅ）。Ｍ２８ｚ  ＰＤ−１  ｓｈＲＮＡを形質導入されたＴ細胞では、Ｍ２８ｚ  ＫａｎＲ  Ｔ細胞よりも大きなｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍拒絶反応有効性は実現されなかったが、ｉｎ  ｖｉｖｏではｉｎ  ｖｉｔｒｏよりもノックダウンのレベルが有意に低かったことに注目すべきである。したがって、ＰＤ１  ＤＮＲがｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＲＮＡ干渉手法よりも有効な戦略であることが証明された。
【０２４１】
これらの結果から、細胞内因性ＰＤ−１抵抗性によりｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能がレスキューされることが実証される。
【０２４２】
８．７  ＰＤ−１  ＤＮＲはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のどちらにも効率的に結合する
ＰＤ−１  ＤＮＲとリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合を試験するために、ｍＣｈｅｒｒｙで標識し、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＴ細胞を、Ｆｃと融合したＰＤ−Ｌ１（「ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ」）、Ｆｃと融合したＰＤ−Ｌ２（「ＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ」）、または対照アイソタイプＦｃ（「ｉｓｏ  Ｆｃ」）でコーティングしたプレートに曝露した。ヒトＴ細胞に、基本的に節７．６に記載されている通りｍＣｈｅｒｒｙ構築物を用いて形質導入して、Ｔ細胞をｍＣｈｅｒｒｙで標識した。ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ融合物、ＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合物および対照Ｆｃは商業的に購入した。
【０２４３】
ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ融合タンパク質、ＰＤ−Ｌ２  Ｆｃタンパク質、または対照アイソタイプＦｃでコーティングしたプレートを、ｍＣｈｅｒｒｙで標識したＴ細胞単独、ＰＤ−１抗体の存在下、ｍＣｈｅｒｒｙで標識したＴ細胞、ｍＣｈｅｒｒｙで標識した、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＴ細胞、および、ＰＤ−１抗体の存在下、ｍＣｈｅｒｒｙで標識した、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＴ細胞に曝露した。
【０２４４】
図１１に示されている通り、ｍＣｈｅｒｒｙを有し、ＰＤ−１  ＤＮＲ形質導入を伴わない対照Ｔ細胞と比較して、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のどちらにも効率的に結合した。これらの結果から、ＰＤ−１  ＤＮＲがＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方に結合することが実証される。一部の腫瘍細胞は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のいずれかを発現するので、また、一部の免疫細胞（Ｔ細胞およびマクロファージなどの非Ｔ細胞）は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のいずれかを発現するので、ＰＤ−１  ＤＮＲがＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のどちらにも結合することが重要である。したがって、ＰＤ−１  ＤＮＲを形質導入したＴ細胞は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のどちらも中和することが可能である。
【０２４５】
８．８  ＰＤ−１  ＤＮＲへの細胞内４−１ＢＢシグナル伝達の付加により、ＣＡＲ  Ｔ細胞効率が改善される
Ｔ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介性阻害またはＰＤ−Ｌ２媒介性阻害を阻害するＰＤ−１  ＤＮＲを正の共刺激シグナルに変換することができる。ヒトＴ細胞に、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータドメイン（Ｍ２８ｚ）を有するメソテリン特異的（ＭＳＬＮ特異的）ＣＡＲを形質導入した（上の節７．２におけるｍ２８ｚに関する説明も参照されたい）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害を打ち消すために、細胞内因性遺伝子操作戦略を、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に、スイッチ受容体とも称される４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合したＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ−１  ＤＮＲ）を同時形質導入することによって評価した。
【０２４６】
図１２Ａは、ＣＡＲおよびＰＤ−１  ＤＮＲの同時発現を例示する概略図を示す。図１２Ａの下の部分は、図１２Ａにおいて腫瘍細胞抗原メソテリン（ＭＳＬＮ）を発現する腫瘍細胞として例証されている標的細胞上の抗原に結合するＣＡＲを発現するＴ細胞を表す。腫瘍細胞抗原特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞が腫瘍細胞抗原を発現する腫瘍細胞に結合することにより、Ｔ細胞の活性化がもたらされる。ＰＤ−１  ＤＮＲの同時発現により、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の野生型ＰＤ−１との結合によって媒介される免疫チェックポイント阻害剤経路が阻害される。図１２Ｂは、ＣＡＲおよびＰＤ−１  ＤＮＲの同時発現を例示する概略図を示し、ＰＤ−１  ＤＮＲは、４−１  ＢＢとして例証されている共刺激分子をＰＤ−１のリガンド結合性ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合することによって共刺激構築物に変換されている。そのような構築物は、本明細書においてスイッチ受容体と称される構築物の例である（Liuら、Cancer  Res.、７６巻：１５７８〜１５９０頁（２０１６年）を参照されたい）。４−１ＢＢドメインは、Ｔ細胞活性化の第２の共刺激シグナルとして作用する。
【０２４７】
ヒトＴ細胞に、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲとＰＤ−１  ＤＮＲの両方、またはＭ２８ｚ  ＣＡＲとＰＤ−１／４−１ＢＢスイッチ受容体構築物の両方を形質導入した。形質導入細胞を抗原刺激し、培養物中のＴ細胞蓄積について分析した。図１２Ｃに示されている通り、７日目にＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞蓄積が増加し、この蓄積は、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞に、ＰＤ−１  ＤＮＲまたはＰＤ−１／４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を同時形質導入した場合に増強された。
【０２４８】
図１２Ｄは、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲとＰＤ−１  ＤＮＲの両方、またはＭ２８ｚ  ＣＡＲとＰＤ−１／４−１ＢＢスイッチ受容体構築物の両方を形質導入したヒトＴ細胞におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のサイトカイン分泌を示す。サイトカイン分泌アッセイは基本的に上の節７．１に記載の通り実施した。図１２Ｄに示されている通り、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦの分泌は、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲおよびＰＤ−１／４−１ＢＢスイッチ受容体構築物を発現する細胞において、Ｍ２８ｚ  ＣＡＲを発現する細胞またはＭ２８ｚ  ＣＡＲおよびＰＤ−１  ＤＮＲを同時発現する細胞において観察されたサイトカイン分泌と比べて増強された。これらの結果から、Ｔ細胞にＰＤ−１／４−１ＢＢスイッチ受容体構築物をＭ２８ｚ  ＣＡＲと共に同時形質導入することにより、ＰＤ−Ｌ１（またはＰＤ−Ｌ２）阻害を正の共刺激シグナルに変換することができ、その結果、サイトカイン分泌およびＴ細胞蓄積が増強されることが実証される。
【０２４９】
８．９．実験結果の概要および考察
上記の通り、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療およびＰＤ−１チェックポイント遮断が固形腫瘍モデルにおける合理的な組合せであることが実証された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ刺激アッセイを実施して、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害のメソテリンＣＡＲ  Ｔ細胞機能に対する影響を評価した。ＰＤ−１媒介性阻害を直接打ち消すために、レトロウイルスベクターを使用して、ＣＡＲ媒介性共刺激とＰＤ−１  ＤＮＲを組み合わせた。このコンビナトリアル戦略（共刺激およびチェックポイント遮断）によってもたらされる最適なシグナル伝達により、腫瘍によりコードされるＰＤ−Ｌ１発現の存在下でのＴ細胞機能が増強され、その結果、単回の低用量ＣＡＲ  Ｔ細胞の後に長期間の無腫瘍生存がもたらされた。これらの試験は養子Ｔ細胞治療の診療に関連し、以下の理由から直ちに翻訳される：（１）試験した共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８および４−１ＢＢは、進行中の臨床試験（ＮＣＴ０２４１４２６９、ＮＣＴ０２１５９７１６、ＮＣＴ０１５８３６８６）において使用されている２つの共刺激ドメインであること、（２）胸膜中皮腫のモデルは、ヒト疾患を要約し、Ｔ細胞消耗の関連性を解明する大きな臨床的に意義のある腫瘍量を使用するものであること（Adusumilliら、Science  Translational  Medicine６巻（２６１号）：２６１ｒａ１５１頁（２０１４年）；Servaisら、Clin.  Cancer  Res.、１８巻（９号）：２４７８〜２４８９頁（２０１２年）；Servaisら、in  Current  Protocols  in  Pharmacology、Enna編、第１４章（ユニット１４  ２１）、John  Wiley  &  Sons（２０１１年）；Servaisら、PLoS  One、６巻（１０号）：ｅ２６７２２頁（２０１１年））、ならびに（３）遺伝子によりコードされるチェックポイント遮断によってＣＡＲ  Ｔ細胞を強化する戦略では、診療所において容易に適用することができるヒト配列が使用されること（Adusumilliら、Science  Translational  Medicine６巻（２６１号）：２６１ｒａ１５１頁（２０１４年）；Fengら、Mol.  Cancer  Ther.、８巻（５号）：１１１３〜１１１８頁（２００９年））。
【０２５０】
Ｍ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１の発現が比較的高いことにより、ＣＤ２８により刺激されるＣＡＲ  Ｔ細胞が注目される。この分析に基づいて、ＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ−１  ＤＮＲ）およびＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡを生成することなどの、ＰＤ−１阻害性シグナル伝達を打ち消すための遺伝学的戦略を探求した。ＰＤ−１  ＤＮＲは、十分なレベルで発現した場合には、内在性ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）との結合について競合する。ＰＤ−１  ＤＮＲと同時形質導入したＣＤ２８共刺激Ｔ細胞では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞機能の増強およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の有効性が実証され、これにより、ＰＤ−１シグナル伝達が、腫瘍モデルにおいて腫瘍細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞から逃れる重要な機構であることが示唆される。ＰＤ−１を標的とするｓｈＲＮＡについてはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効性だけが実証されたが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性がないことは、多数のｉｎ  ｖｉｖｏ抗原遭遇の後に誘導される高体積のＰＤ−１転写物によるｓｈＲＮＡ機構の飽和に関連する可能性があり、この結論は、ＰＤ−１ノックダウンがｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるよりも有意に低いという所見によって裏付けられる。上記の所見により、腫瘍媒介性免疫阻害に抵抗するように遺伝子操作された、養子移入Ｔ細胞の治療的有用性が指摘される。ＴＧＦ−βを標的とするＤＮＲが前臨床モデルにおいて検証されており、現在、臨床試験において試験されている（Fosterら、J.  Immunother.、３１巻（５号）：５００〜５０５頁（２００８年）；Bollardら、Blood、９９巻（９号）：３１７９〜３１８７頁（２００２年））。
【０２５１】
他者によりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞治療とＰＤ−１遮断抗体が組み合わされているが、上記の実験に記載されている共阻害性遮断に遺伝学的戦略を追加することにより、（１）抗体の反復投与に対する信頼性および（２）免疫に関連する有害事象の発生率を含めた、抗体治療を限定するいくつかの主要な障害が克服される。次いで、Ｔ細胞治療には抗体治療を超える利点があり、これは、Ｔ細胞治療により、単回投薬後に、阻害への抵抗性がプログラミングされたＴ細胞の長期間にわたる生着を確立することができるから、およびＴ細胞治療により、より広範に適用される抗体チェックポイント遮断に起因する自己免疫を限定し得る腫瘍標的化Ｔ細胞レパートリーに限定される阻害性経路の遮断がもたらされるからである。さらに、おそらくＰＤ−Ｌ１遮断抗体により、Ｍ２８ｚおよびＭ２８ｚ  ＰＤ−１  ＤＮＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性をさらに延長することができる可能性がある。
【０２５２】
上記の試験により、ＣＡＲ  Ｔ細胞が関与する阻害機構の１つが同定され、免疫阻害に抵抗するための共刺激戦略の能力の差異が強調された。他の阻害性経路もＴ細胞機能を潜在的に限定するように機能する可能性がある。腫瘍の進行により死亡した、ＰＤ−１  ＤＮＲを同時形質導入したＭ２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスの割合から、他の阻害機構の作用が示唆される。さらに、慢性感染に関する文献により、細胞内因性および細胞外因性の両方の他の阻害の機構の存在が示唆されており、腫瘍標的化Ｔ細胞治療において評価されている（Moonら、Clin.  Cancer  Res.、２０巻（１６号）：４２６２〜４２７３頁（２０１４年）；Rieseら、Cancer  Res.、７３巻（１２号）：３５６６〜３５７７頁（２０１３年））。阻害性シグナル伝達に関する追加的な試験では、腫瘍免疫回避において重要な役割を果たすことが示されている、骨髄由来サプレッサー細胞および内在性Ｔ細胞などのエレメントを含む免疫適格性モデルを使用することができる。
【０２５３】
上記の結果により、ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の腫瘍媒介性阻害の重要性が確立された。Ｔ細胞エフェクター機能の包括的分析を実施することにより、共刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞でさえ、持続性の増強が実証されているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび腫瘍微小環境のどちらにおいても、反復抗原遭遇時に阻害にさらされることが確立された。記載されている結果から、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療を使用して、阻害性シグナル伝達を打ち消すことができ、また、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療により、最適な共刺激をもたらし、ＰＤ−１などの阻害性シグナルを直接打ち消すシグナル伝達ドメインを工学的操作するための柔軟性がもたらされることが実証される。さらに、Ｔ細胞浸潤を示すが臨床応答の限定は示さない患者における、進行中のＣＡＲ  Ｔ細胞治療の臨床試験において、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療後にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断を組み合わせることを利用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の有効性を改善することができる。臨床試験から得られた知見および本明細書で提示されている戦略は、特に固形腫瘍の治療に使用されるＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した免疫療法を改善するために高度に有益である。したがって、上記の結果から、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の有効性を改善するために臨床的状況において適用することができる方法が例証される。
【０２５４】
上記の通り、低レベルの腫瘍浸潤をモデリングし、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、腫瘍細胞媒介性免疫阻害を受けやすく、その結果、Ｔ細胞機能が損なわれ、腫瘍拒絶反応が減弱する可能性があることが見出された。ＰＤ−１シグナル伝達に抵抗するように工学的に操作されたＴ細胞は、抗腫瘍効力の増強を示した。進行腫瘍に対する単回の低用量ＣＡＲ  Ｔ細胞治療後、ＣＡＲ  Ｔ細胞により分泌されるサイトカインに応答して、腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１を上方調節し、それによりＣＡＲ  Ｔ細胞阻害および腫瘍の再発が導かれることが観察された。ＰＤ−Ｌ１媒介性免疫抑制を直接克服するために、細胞内阻害性シグナル伝達ドメインを欠くＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ−１  ＤＮＲ）を設計した。ＰＤ−１  ＤＮＲとＣＡＲの同時形質導入により、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能が増強され、その結果、単回の低用量のＣＡＲ  Ｔ細胞後に長期間にわたる無がん生存がもたらされた。免疫チェックポイント経路受容体ＤＮＲとＣＡＲの同時発現は、ＤＮＲはＣＡＲ機能を阻害することも毒性を付加することもなくなく任意のＣＡＲに追加することができるので、診療所に直ちに翻訳可能である。特定の理論に縛られることを望むものではなく、ＤＮＲは、その対応するリガンド（例えば、ＰＤ−１の場合ではＰＤ−Ｌ１）によって誘導される負のシグナルに単に結合（それを消費）し、下流のシグナル伝達を回避すると考えられる。
【０２５５】
ＣＡＲおよび免疫チェックポイント阻害剤のドミナントネガティブ形態を発現する免疫細胞の効果は、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインが、ＰＤ−１などの免疫チェックポイント阻害剤の細胞外リガンド結合性ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合している、スイッチ受容体を発現させることによって増強することもできる。上記の結果から、４−１ＢＢの細胞質ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合したＰＤ−１細胞外ドメインの発現により、サイトカイン産生が増大し、ＣＡＲ  Ｔ細胞の蓄積が増大することが示される。ＣＡＲを発現する免疫細胞におけるスイッチ受容体の発現により、免疫療法に関する免疫細胞の有効性を改善することができる。あるいは、細胞においてＣＡＲを伴わずにスイッチ受容体を発現させることができる。どちらの場合でも、スイッチ受容体はドミナントネガティブとして機能する。ＣＡＲおよびスイッチ受容体を発現する免疫細胞は、そのような免疫細胞を使用した免疫療法の効果を増強するために、免疫チェックポイント阻害剤のドミナントネガティブ形態（共刺激シグナル伝達ドメインを含有しない、したがって、スイッチ受容体ではない）を発現する免疫細胞と、または、ＣＡＲおよび免疫チェックポイント阻害剤のドミナントネガティブ形態を同時発現する細胞（共刺激シグナル伝達ドメインを含有しない、したがって、スイッチ受容体ではない）と同時にまたは逐次的に投与することができる。
【０２５６】
９．引用された参考文献
本明細書において引用された全ての参考文献は、その全体が、あらゆる目的に関して、個々の刊行物または特許または特許出願が具体的にかつ個別にその全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれることが示されたものと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５７】
当業者には明らかになる通り、本発明の多くの改変および変形をその主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載されている特定の実施形態は、単に例として提供されるものであり、本発明は、添付の特許請求の範囲の条項によってのみ、そのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と併せて、限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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