【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年8月2日(2007.8.2)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
本発明の文脈において、驚くべきことに、ＣｌＣ−７タンパク質（塩素チャンネルＣｌＣ−７）タンパク質をコードする核酸配列において突然変異が生起すると、非機能的タンパク質が発現されることになるか、又はかかるタンパク質の発現が完全に抑制されるので、その結果マウスにおいて重篤な大理石骨病を惹起することが見出されたのである。これらの驚くべき結果に基づいて、重篤な若年性大理石骨病の患者もまた、ＣｌＣ−７遺伝子の突然変異を持っていることが見出されたのである。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
特定の塩素チャンネルに対する作用の特異性を試験するには、一方では当該物質を発見する目的のために上記したように、試験する細胞間コンパートメント内にかかる特定の塩素チャンネルを主として又は専ら含む細胞株を使用するか、又はかかる細胞株から誘導した上記調製物を使用する。これらの細胞株又は誘導させた調製物で期待通利の作用を示した物質は、次いで当該チャンネルを有さない細胞株又はその誘導調製物について試験する。かかる物質が特異的である場合は、この細胞株には影響を一切及ぼさない。さらに特異性の高い測定法を、対象チャンネルに応じて引き続いて行う。例えばＣｌＣ−７チャンネルに及ぼす影響・効果が骨粗しょう症に関連する場合、培養した野生型（ＷＴ）の破骨細胞を“pit assay"（報文（５２）乃至（５８）を参照）明確な、ぞうげ質、骨又はその他の適当な基質について試験し、また例えば基質内での孔の形成について検討を行うか、又は吸収骨小腔の酸性化について適当な色素（例えば、アクリジンオレンジなど）を用いて検討すればよい（報文（５９）乃至（６１）を参照）。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
シナプス小胞の塩素チャンネル（例えばＣｌＣ−３など）の阻害が目的であれば、精製した懸濁状態のシナプス小胞の酸性化を次の工程で色素を用いて測定すればよい（報文（６２）乃至（６４）を参照）。当該チャンネルの阻害は、酸性化速度の抑制として現れるので、その特異性は、相当するＫＯマウスからシナプス小胞を単離することによってチェックすることが出来る。当該物質は、これらマウスから単離したシナプス小胞の酸性化速度には一切影響を及ぼすべきではない。更なる別の工程においては、特定タイプのシナプス小胞に対する特異性は、当該物質の存在下又は不存在下でシナプス小胞における神経伝達物質（例えば放射性標識化した）の取り込みを測定することによって試験すればよい。相当する方法は、当業者にとっては充分に公知である（例えば報文（６６）乃至（６８）を参照）。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
具体的には、これらの細胞株はさらに、直接的又は間接的に当該測定法の指示薬として機能するタンパク質を発現する適当な遺伝子構築物をトランスフェクトさせることによって試験システムとして開発することが出来る。例えば、特定のタンパク質配列シグナルに基いて特異的に特定のコンパートメント内に移動させられるキメラタンパク質を発現させることも可能である。かかるキメラユニットの他の部分は、例えば特定のＧＦＰ変異物（例えば報文（４４）乃至（４６）を参照）などｐＨ感受性の蛍光タンパク質などの適当な指示薬タンパク質か、又は指示薬物質、例えば抗体（報文（４９）を参照）、又はビオチン結合色素（報文（４７）を参照）などをこれらのコンパートメント内に移動させるための結合部位を含有する（報文（４４）乃至（５１）を参照）。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
既述したように、一つの変法は、細胞内小器官のｐＨを直接測定するか又はｐＨの変化の結果生じる細胞影響を測定することから成る。幾つかの方法が、ｐＨ測定を行うために実行可能である。例えば、色素の蛍光がｐＨ依存性であるか又は細胞を色素又はその前駆体と一緒に培養した場合特定のｐＨ値でコンパートメント内に選択的に濃縮されるような色素がいくつかある（例：アクリジンオレンジ、Lysotrackerやその他の色素、Molecular Probes, Eugene, Oregon, USAから販売）。特定のコンパートメントに対する特異性を上げるのは、例えば色素の細胞内取り込みによて実現することが出来る（取り込み時間、速いか又は遅いかに応じて、リソソームコンパートメントに到るまで細胞内取り込みコンパートメントを染色すること；例えば報文（７１）、（７５）、（７６）を参照）。更に特異性を上げることは、色素を結合分子基（例えば特異的抗体又はビオチンなど）を介して特定の標的分子に結合させることによって実現出来るが、かかる標的分子は、大量に又は専ら特定のコンパートメント内において存在する、即ち該細胞株において発現されている（例えば永久トランスフェクションによって）ものであり、かかる細胞株を当該色素と接触させるのである。これらの標的分子は、分子細胞生物学の方法によって、例えば分子を細胞のある適当な装置を経由して特定のコンパートメント内に指向させる標的制御シグナルを分子生物学的方法によって相当する結合モチーフに融合させ、次いで当該物質を試験するために使用した相当する細胞株内においてかかる遺伝子構築物を発現させることによって調製することも出来る。かかる技法を用いて、検討対象のチャンネルを含むコンパートメントのみを重点的に又は極めて特異的に検査し且つ測定することが可能である。特定のｐＨである（例えば、アクリジンオレンジ又は Molecular Probes社製のLysotracker)コンパートメント内に特定物質が集積すること又はコンパートメント内でのｐＨ依存性反応を利用して指示薬物質（例えばｐＨ依存性タンパク質分解切断により）を生成させて、検出し易くした（例えば色素を用いて（報文（９５）及び（９６）を参照。尤も検出はこれにのみ限定されない）間接的試験方法もまた、更なるｐＨ測定方法として使用することが出来る。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４３】
又はその代わりに又は更には、これらコンパートメント内の膜電位は、例えば電位感受性色素（例えば報文（６７）を参照）により測定することが出来る。又はその代わりに、特異的に配向させるか又はふるい分けすることが可能である、タンパク質をコードする電位センサーもこの場合使用可能である。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
ＣＩＣ−７ノックアウトマウスの場合は、当該遺伝子構築物は、以下のようにして作製した：ラットｃＤＮＡプローブ（報文（７９）において報告されたタンパク質配列）；タンパク質及びｃＤＮＡに対するAccession No.: Z267744 GenBank)を用いて、マウス系統１２９／ＳｖのベクターλＦＩＸＩＩ(Strategene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA92037, USA)における市販のゲノムファージをプレートアウト、フィルターのストリップオフ及び放射性標識ｃＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションから成る標準方法によって走査した。ハイストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせた幾つかのファージクローンを単離し、精製し次いで制限地図作成、部分配列決定及びＰＣＲによる選択断片の増幅から成る標準方法によって解析した。エクソン２（報文（８０）を参照）を含む、ＣＩＣ−７のゲノム配列のうちサイズがほぼ１４ｋｂである一断片を含んだゲノムクローンを、この遺伝子構築物を作製するために選択した。この目的のために、かかるゲノムクローンを二種類の制限酵素、ＢｇＩＩＩ及びＢｓｒＧＩ、を用いて消化したところ、コードエクソン３，４，５，６及び７を含む配列の一部が除去された。この一部分は、ホスホグリセリン酸塩プロモータで駆動されるネオマイシン耐性カセットを含むサイズがほぼ１．６ｋｂのＤＮＡ断片で、標準操作方法を用いて適当な酵素反応により当該カセットをゲノム配列内に結合することによって置換した。この遺伝子構築物を含む相応したベクターで細菌を形質変換した後、正しい遺伝子構築物を有する細菌コロニーを単離し、次いでＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後で、チミジンキナーゼカセットをこの遺伝子構築物の５’末端に接続し、ネガティブ選択を行った。再度形質変換を行い、改めて作製した遺伝子構築物を単離してチェックした後、多能性胚性幹細胞（マウス）遺伝子構築物でエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、プレートアウトして、適当な培養条件下（分化を防止するため白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下での“feeder layers"培養）で増殖させた。得られた細胞をＧ４１８（ネオマイシン耐性カセットの存在で選別）で及びガンシクロビル（チミジンキナーゼカセットの欠落で選別）で選別した。耐性クローンを単離し、引き出しして、サザーンブロット解析法によってＣＩＣ−７遺伝子座上の相同組換えについて解析した。染色体上のＣＩＣ−７遺伝子が破壊された（即ち、エクソン３−７が、ネオマイシンカセットで置換された）正しいクローンを増殖させて、次に上記したようにマイクロマニピュレータによる顕微鏡コントロール下でマウス胚胞内に注入することによってエクスパンドさせた。それ以降の操作は、上記した通りであった。この遺伝子修飾は生殖系列を介して遺伝されたので、かくしてＣｌＣ−７ノックアウトマウスが作製されたのである。ＣｌＣ−７チャンネルタンパク質の欠落は、ＣｌＣ−７のアミノ末端ペプチドに対して産生・確立させた特異的抗体を用いて証明した。かかるＣｌＣ−７ＫＯマウスは、思いがけなくも網膜変性及び中枢神経系における幾つかの退化性変化の徴候を伴う強力な大理石骨病の表現型を示した。