【手続補正書】
【提出日】平成19年8月24日(2007.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）以下を含む第一のアミノ酸配列領域
ｉ）生理学的条件下、標的細胞表面マーカーと特異的に結合可能なクロストリディウム神経毒重鎖を含む結合因子を含む第一のドメイン；および、
ｉｉ）小胞膜を横切るポリペプチドのトランスファーを促進可能なクロストリディウム神経毒重鎖を含む転位因子を含む第二のドメイン；ならびに、
ｂ）標的細胞の細胞質内に放出されたときに生物学的活性を有するクロストリディウム神経毒軽鎖を含む治療因子を含む第二のアミノ酸配列領域、
ｃ）該第一および第二のアミノ酸配列領域の間に、人工的なプロテアーゼ開裂部位を含み、該人工的なプロテアーゼ開裂部位が、トリプシン、キモトリプシンまたはペプシン開裂部位ではない、第３のアミノ酸配列領域、
を含む単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチド。
【請求項２】
該ポリペプチドが、結合タグの標的結合部分を含む第４のアミノ酸配列領域を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
該標的結合部分がＨｉｓ６、モノクローナル抗体、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、またはカルモジュリン結合タンパク質を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
該結合因子が、クロストリディウムボツリヌス神経毒重鎖である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
該クロストリディウムボツリヌス神経毒重鎖結合因子が、クロストリディウムボツリヌス血清型Ａ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｂ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｃ１神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｄ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｅ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｆ神経毒重鎖およびクロストリディウムボツリヌス血清型Ｇ神経毒重鎖からなる群から選択される、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
該結合因子が、クロストリディウムテタヌス神経毒重鎖である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
該転位因子が、クロストリディウムボツリヌス神経毒重鎖である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
該クロストリディウムボツリヌス神経毒重鎖転位因子が、クロストリディウムボツリヌス血清型Ａ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｂ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｃ１神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｄ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｅ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｆ神経毒重鎖およびクロストリディウムボツリヌス血清型Ｇ神経毒重鎖からなる群から選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
該転位因子が、クロストリディウムテタヌス神経毒重鎖である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
該治療因子ペプチドが、クロストリディウム神経毒軽鎖を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
該クロストリディウム神経毒軽鎖治療因子が、クロストリディウムボツリヌス神経毒軽鎖である、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
該クロストリディウムボツリヌス神経毒軽鎖治療因子が、クロストリディウムボツリヌス血清型Ａ神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｂ神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｃ１神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｄ神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｅ神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｆ神経毒軽鎖およびクロストリディウムボツリヌス血清型Ｇ神経毒軽鎖からなる群から選択される、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
該クロストリディウム神経毒軽鎖治療因子がクロストリディウムテタヌス神経毒軽鎖である、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
該プロテアーゼ開裂部位が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２２または配列番号２３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１−１４のいずれかに由来する単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１６】
単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチドを作成する方法であって、
ａ）請求項１５に記載の核酸分子を適当な宿主細胞内に挿入すること、
ｂ）宿主細胞を培養中で生育させること、および
ｃ）宿主細胞が該核酸分子によってコードされる単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチドを発現することを可能にし、あるいは誘導することを含む方法。
【請求項１７】
単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチドを精製する方法であって、
ａ）請求項１６に由来する宿主細胞を溶解し、細胞溶解物を作成すること、
ｂ）該結合タグおよび該標的化合物を含む、固定化され得る特異的結合複合体を形成するために、該細胞溶解物を標的化合物に接触させること、および
ｃ）該細胞溶解物から該結合複合体ことを解離させることを含む方法。
【請求項１８】
ａ）以下を含む第一のアミノ酸配列領域
ｉ）生理学的条件下、感覚求心神経細胞表面マーカーと選択的に結合可能なポリペプチドの少なくとも一部を含む結合因子を含む第一のドメイン；および、
ｉｉ）小胞膜を横切るポリペプチドのトランスファーを促進可能なクロストリディウム神経毒重鎖の少なくとも一部を含む転位因子を含む第二のドメイン；ならびに、
ｂ）標的細胞の細胞質内に放出されたときに生物学的活性を有するクロストリディウム神経毒軽鎖の少なくとも一部を含む治療因子を含む第二のアミノ酸配列領域
ｃ）該第一および第二のアミノ酸配列領域の間に、トリプシン、キモトリプシンまたはペプシン開裂部位ではないプロテアーゼ開裂部位を含む、第三のアミノ酸配列領域、
を含む単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチド。
【請求項１９】
該ポリペプチドが、さらに、結合タグの標的結合部分を含む、第４のアミノ酸配列領域を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
該標的結合部分がＨｉｓ６、モノクローナル抗体、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、またはカルモジュリン結合タンパク質を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
該転位因子が、クロストリディウムボツリヌス神経毒重鎖である、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
該クロストリディウムボツリヌス神経毒重鎖転位因子が、クロストリディウムボツリヌス血清型Ａ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｂ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｃ１神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｄ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｅ神経毒重鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｆ神経毒重鎖およびクロストリディウムボツリヌス血清型Ｇ神経毒重鎖からなる群から選択される、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
該転位因子が、クロストリディウムテタヌス神経毒重鎖である、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
該治療因子ペプチドが、クロストリディウム神経毒軽鎖を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
該クロストリディウム神経毒軽鎖治療因子が、クロストリディウムボツリヌス神経毒軽鎖である、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
該クロストリディウムボツリヌス神経毒軽鎖治療因子が、クロストリディウムボツリヌス血清型Ａ神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｂ神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｃ１神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｄ神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｅ神経毒軽鎖、クロストリディウムボツリヌス血清型Ｆ神経毒軽鎖およびクロストリディウムボツリヌス血清型Ｇ神経毒軽鎖からなる群から選択される、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
該クロストリディウム神経毒軽鎖治療因子がクロストリディウムテタヌス神経毒軽鎖である、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
該プロテアーゼ開裂部位が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２２または配列番号２３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１８−２８のいずれかに由来する単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項３０】
単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチドを作成する方法であって、
ａ）請求項２９に記載の核酸分子を適当な宿主細胞内に挿入すること、
ｂ）宿主細胞を培養中で生育させること、および
ｃ）宿主細胞が該核酸分子によってコードされる単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチドを発現することを可能にし、あるいは誘導することを含む方法。
【請求項３１】
単一鎖クロストリディウム神経毒ポリペプチドを精製する方法であって、
ａ）請求項３０に由来する宿主細胞を溶解し、細胞溶解物を作成すること、
ｂ）該結合タグおよび該標的化合物を含む、固定化され得る特異的結合複合体を形成するために、該細胞溶解物を標的化合物に接触させること、および
ｃ）該細胞溶解物から該結合複合体ことを解離させることを含む方法。