【手続補正書】
【提出日】平成18年11月29日(2006.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  哺乳動物の体液中に存在する癌関連マーカータンパク質を検出する体外試験法であって、
(ａ)該哺乳動物の体液試料を該マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対する抗体と接触させること、および
(ｂ)該抗体と該試料中の何れかのマーカータンパク質との間で形成された何れかの複合体の存在を検出すること、
の各段階を包含し、該抗体が、該試料が得られた哺乳動物と同一種から誘導された、該癌関連マーカータンパク質に対する哺乳動物自己抗体である、方法。
【請求項２】  該試料が、前新生物または癌に対して実質的に無症候性である哺乳動物から得られている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  該試料が、癌に対して症候性である哺乳動物から得られている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  該試料が、癌の治療を受けた哺乳動物から得られている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】  該哺乳動物がヒトであり、かつ該自己抗体がヒト自己抗体である、請求項１ないし４の何れかに記載の方法。
【請求項６】  該体液が血漿、血清、全血、尿、糞、リンパ液、脳脊髄液または吸引乳である、請求項１ないし５に記載の方法。
【請求項７】  該癌関連マーカータンパク質が、リンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌または皮膚癌関連である、請求項１ないし６の何れかに記載の方法。
【請求項８】  該癌関連マーカータンパク質が乳癌関連マーカータンパク質である請求項７に記載の方法。
【請求項９】  該癌関連マーカータンパク質が修飾されたＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  該癌関連マーカータンパク質が、初期乳癌に関連する修飾されたＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】  該癌関連マーカータンパク質が、進行乳癌に関連する修飾されたＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】  該自己抗体が初期乳癌の患者から単離された単球から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】  該自己抗体が進行乳癌の患者から単離された単球から得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】  該自己抗体が不死化細胞または細胞群によって産生されている、請求項１ないし１３に何れかに記載の方法。
【請求項１５】  該自己抗体がポリクローナル抗体である、請求項１ないし１４の何れかに記載の抗体。
【請求項１６】  該自己抗体が固体表面に固定されている、請求項１ないし１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】  該自己抗体と、該試料中に存在する何れかの癌関連マーカータンパク質との間で形成された何れかの複合体が、該マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに特異的な２次抗体もしくは自己抗体を用いて検出され、該２次自己抗体が検出可能な標識を付されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】  該試料に加えて、該自己抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有する、標識された癌関連マーカータンパク質が加えられている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】  処置後に癌の再発をスクリーンし、全身的処置を監視しまたは処置を選択するための、請求項１ないし１８に何れかに記載された方法の使用。
【請求項２０】  哺乳動物の癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに特異性を有する哺乳動物自己抗体を含む診断用試薬。
【請求項２１】  体液試料中の哺乳動物癌関連マーカータンパク質の存在を検出するために使用する、請求項２０に記載の診断用試薬。
【請求項２２】  該自己抗体がヒト自己抗体であり、かつ該マーカータンパク質がヒト癌関連マーカータンパク質である、請求項２０または２１に記載の試薬。
【請求項２３】  該自己抗体が、リンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌または皮膚癌に関連する癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに特異性を有する、請求項２１または２２の何れかに記載の試薬。
【請求項２４】  該自己抗体が、乳癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに特異性を有する、請求項２３に記載の試薬。
【請求項２５】  該マーカータンパク質が、修飾ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項２０ないし２４の何れかに記載の試薬。
【請求項２６】  該マーカータンパク質が、初期乳癌に関連する修飾ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項２４に記載の試薬。
【請求項２７】  該マーカータンパク質が、進行乳癌に関連する修飾ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項２４に記載の試薬。
【請求項２８】  該自己抗体が、初期乳癌患者から単離された単球から得られる、請求項２６に記載の試薬。
【請求項２９】  該自己抗体が、進行乳癌患者から単離された単球から得られる、請求項２７に記載の試薬。
【請求項３０】  哺乳動物癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対する自己抗体を産生し得る、固定化細胞群。
【請求項３１】  哺乳動物癌関連マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対する自己抗体を産生し得る、固定化細胞群。
【請求項３２】  該自己抗体が、リンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌または皮膚癌関連に関連する癌関連マーカータンパク質の少なくとも一つのエピトープに対するものである、請求項３０または３１の何れかに記載の固定化細胞群。
【請求項３３】  該自己抗体が、乳癌関連マーカータンパク質のエピトープに対するものである、請求項３２に記載の固定化細胞群。
【請求項３４】  該自己抗体が、修飾されたＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質に対するものである、請求項３１から３３の何れかに記載の固定化細胞群。
【請求項３５】  該自己抗体が、初期乳癌に関連する修飾ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質に対するものである、請求項３３に記載の固定化細胞群。
【請求項３６】  該自己抗体が、進行乳癌に関連する修飾ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質に対するものである、請求項３３に記載の固定化細胞群。
【請求項３７】  癌または他の新生物を有する患者または患者群から単離された単球から得られる、請求項３０から３６の何れかに記載の固定化細胞群。
【請求項３８】  該細胞集団が、初期乳癌の患者または患者群から単離された単球から得られる、請求項３５に記載の固定化細胞群。
【請求項３９】  該細胞集団が、進行乳癌の患者または患者群から単離された単球から得られる、請求項３６に記載の固定化細胞群。
【請求項４０】  (ａ)自己抗体としての同じ種由来の癌関連マーカータンパク質に対する哺乳動物自己抗体；および
(ｂ)該自己抗体と該癌関連マーカータンパク質の間の複合体の形成を検出する手段：
を含む、哺乳動物の体液に存在する癌関連マーカータンパク質の検出用キット。
【請求項４１】  該自己抗体がヒト自己抗体である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】  該自己抗体がヒト自己抗体である、請求項４０または４１のいずれかに記載のキット。
【請求項４３】  該マーカータンパク質がリンパ腫、白血病、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮内膜癌または皮膚癌に関連する癌関連タンパク質である、請求項４０から４２の何れかに記載のキット。
【請求項４４】  該マーカータンパク質が乳癌関連マーカータンパク質である、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】  該マーカータンパク質が修飾ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項４０から４４の何れかに記載のキット。
【請求項４６】  該マーカータンパク質が初期乳癌に関連する修飾ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】  該マーカータンパク質が進行乳癌に関連する修飾ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｅｒｂβ２またはＲａｓタンパク質である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】  実施例に関連して本明細書に実質的に記載の、哺乳動物の体液に存在する癌関連マーカータンパク質の検出法。
【請求項４９】  実施例に関連して本明細書に実質的に記載の、哺乳動物の体液に存在する癌関連マーカータンパク質を検出するためのキット。
【請求項５０】  実施例に関連して本明細書に実質的に記載の、診断剤。
【請求項５１】  実施例に関連して本明細書に実質的に記載の癌関連マーカータンパク質の１個以上のエピトープに対する自己抗体を産生できる、固定化細胞群。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
例えば、商品アッセイＣＡ１５−３は、ＭＵＣ１の改変および未改変形態の両方を検出し、ＭＵＣ１の血清レベルの上昇がその特徴である、転移乳癌の診断には有用である。しかしながら、このアッセイは、新生物または初期(primary)乳癌のスクリーニングには、これらの段階においてはＭＵＣ１の血清レベルが健常者におけるそれと有意に異ならないので、使用できない(Robertson et al. (1990), Eur. J. Cancer 26: 1127-1132)。他のマーカー、例えば、癌胎児抗原(ＣＥＡ)およびマーカーＣＡ１９.９は、転移乳癌および結腸直腸癌を有する患者の血清中で上昇するが、初期癌の患者ではそうならないと報告されている(Robertson et al. (1991), Cancer Immunol.Immunother. 133: 403-410; Thomas et al. (1991) Br. J. Cancer 63: 975-976)。これらの癌マーカーの場合、また、入手可能なアッセイ商品は、タンパク質の変形形態と野生型形態とを区別できないため、使用上の制約がある。さらに、入手可能な抗体商品は、正常形態の癌関連タンパク質と交叉反応することにより、偽陽性結果を導くこともある。従って、この分野では、これらのアッセイに使用し、前癌性および早期の発癌性変化を検出するための、より鋭敏でかつ特異的な抗体が必要とされている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
(ａ)該哺乳動物の体液試料を該マーカータンパク質の少なくとも１個のエピトープに対する抗体と接触させること、および
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
(ｂ)該抗体と該試料中の何れかのマーカータンパク質との間で形成された何れかの複合体の存在を検出すること。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の方法は、特定の癌関連マーカータンパク質に対する単一の自己抗体を用い得る。あるいは、多数の癌関連マーカータンパク質を認識する自己抗体のパネルを、特定の個体に存在する癌マーカーのプロファイルを得るために使用できる。この方法は、信頼性の高い診断法であり、各個体についての最も適切な処置の選択において有用な情報を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明方法は、免疫化学の分野の当業者によく知られた免疫学的技術を用いて行い得る。例えば、ＥＬＩＳＡや放射免疫検定法などの方法を用い得る。一般的に、適当な自己抗体を固体表面に固定し、試験する試料を自己抗体に接触するようにする。自己抗体により認識される癌マーカータンパク質が試料中に存在すると、自己抗体−マーカー複合体が形成する。次いで複合体を、例えば、マーカータンパク質のエピトープを特異的に認識する標識２次抗体に配向させるか、それを用いて定量測定を行う。２次抗体は、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)やアルカリホスファターゼ(ＡＰ)などの生化学的マーカーで標識できる。そして、複合体の検出は、比色産物、化学ルミネッセンス産物あるいは蛍光産物をつくる酵素の基質を加えて完了できる。あるいは、複合体の存在は、検出可能標識、例えば、適当な酵素で標識されたマーカータンパク質を加えて測定できる。この場合、測定された酵素活性の量は、形成した複合体の量に逆比例し、試料中の抗原の存在を測定するために参照として負のコントロールを必要とする。複合体を検出する別の方法では、放射性同位元素で標識された抗体または抗原を使用し、放射活性を測定する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の方法を、サンプル中における癌マーカータンパク質の存在または非存在を測定する定性形式、またはさらに加えて、サンプル中に存在する癌マーカータンパク質の量の測定値を得ることができる定量形式で実施することができる。サンプル中に存在するマーカータンパク質の量を、上記の何れの技術を利用して測定してもよい。この場合は、アッセイを行なう前に、このアッセイで使用されるものと同じ検出反応を使用して、既知濃度の癌マーカータンパク質を含む一連の標準サンプルから、得られたシグナルの測定による標準曲線を描く必要がある。サンプル中に存在するスクリーンされる癌マーカーの量を、こうして、標準曲線に補間する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の方法を、様々な臨床的状況、例えば、癌の進展に対する個々の疾病素質の評価、無症候性患者における前新生物のまたは発癌性の改変の検出、初期または２次癌の診断、患者における疾患の進行のモニタリング、以前に癌細胞を保有すると診断され、そしてこれらの細胞の数を減少させる治療を経験している患者における発癌性改変の再発のスクリーニング、または癌を罹患する患者に対するより適切な抗癌処置の選択など、で使用することができる。本発明の方法は、上記記載の、同じ臨床状況における獣医学での使用にも適切である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
図３は、初期乳癌を有すると診断された患者に由来するＢ細胞によって産生された自己抗体の、(ａ)進行乳癌を有する患者の血清からまたは(ｂ)正常の個体の尿から単離されたＭＵＣ１タンパク質に対する結合を測定する、表面プラスモン共鳴実験の結果を示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
図７は、初期乳癌を有する患者のＢ細胞からの固定化された自己抗体を使用して、疾患の進行全期にわたって、進行乳癌を有する患者からの逐次血清試料におけるＭＵＣ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。平行検定においてモノクローナルＣ５９５抗体でまたは商業的ＣＡ１５−３検定で取得された結果は、比較例として含まれる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
マウスのモノクローナルＢ５５抗体(Ellisら(1984)Histopathology 8:501-516により、そして国際特許出願番号ＷＯ８９／０１１５３に記載されている通り、ＮＣＲＣ  １１としても知られている)をＣＮＢｒセファロースビーズにコンジュゲートさせた。血清または尿試料をＰＢＳで１／１０に希釈して、抗体をコンジュゲートさせたセファロースビーズと共に回転させながら４℃で一晩インキュベートした。そのビーズを遠心分離して、上清を除去した。そのビーズへ非特異的に結合した分子を全て除去するために、これらをＰＢＳで５回または洗浄用緩衝液が２８０ｎｍで吸光度を示さなくなるまで洗浄した。そのビーズをＰＢＳに再び懸濁させ、１０分間回転させ、遠心分離して、上清を除去することにより、各々の洗浄を行った。洗浄したビーズを０.２５Ｍグリシン(ｐＨ２.５)に再び懸濁させ、室温で１０分間回転させて、遠心分離した。上清を除去し、ＴＲＩＳの添加によりｐＨ７に調節して、標識した「グリシン画分」を４℃で保存した。次いで、そのビーズを２５ｍＭジエチルアミン(ＤＥＡ)(ｐＨ１１)に再び懸濁させ、室温で１０分間回転させて、遠心分離した。上清を再び除去し、ＴＲＩＳの添加によりｐＨ７に調節して、標識した「２５ＤＥＡ画分」を４℃で保存した。最後に、そのビーズを１００ｍＭＤＥＡ(ｐＨ１１)に再び懸濁させ、室温で１０分間回転させて、遠心分離した。上清を除去し、ＴＲＩＳの添加によりｐＨ７に調節して、標識した「１００ＤＥＡ画分」を４℃で保存した。モノクローナル抗体Ｂ５５またはＣ５９５(Cancer Research Campaignから入手可能な、ＮＣＲＣとしても知られている)を使用して、３つの画分におけるＭＵＣ１の存在をＥＬＩＳＡにより確認した。混入している免疫グロブリンを除去するために、画分をＤＴＴ(５０ｍＭまで)と共に３０分間インキュベートし、次いで、ヨードアセトアミド(７５ｍＭまで)と共にインキュベートした後、Ｓ３００カラムでゲル濾過にかけた。画分をＥＬＩＳＡによりＭＵＣ１含量に関してアッセイした。先のバッチと同等の吸光度が得られるよう、ＭＵＣ１を含む画分を力価測定した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
２)ＥＬＩＳＡアッセイ
上記のようにして得た、様々なＭＵＣ１調製物をＰＢＳで適当に希釈し、９６ウェルのマイクロタイターアッセイプレートに１ウェルあたり５０μｌで入れ、一晩放置して乾燥させた。次いで、そのプレートをＰＢＳ／Tweenで１回洗浄して、残留する塩の結晶を除去し、ＰＢＳ中の２％(ｗ／ｖ)ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)の新たな溶液で６０分間ブロックして、ＰＢＳ／Tweenで３回洗浄した。初期または二次乳癌と診断された患者から得られた、不死化したリンパ球の培養液上清を１ウェルあたり５０μｌで３回に分けて入れた。比較コントロールとして、マウスのモノクローナル抗ＭＵＣ１抗体Ｂ５５も３回に分けて入れた。そのプレートを振盪しながら室温で６０分間インキュベートして、ＰＮＳ／Tweenで４回洗浄した。ＨＲＰをコンジュゲートした抗ヒトまたは抗マウスの二次抗体(Ｄａｋｏから得られる)５０μｌを製造業者により推奨される希釈で各々のウェルに加えて、振盪しながら室温で６０分間インキュベートした。次いで、そのプレートを再びＰＢＳ／Tweenで４回洗浄した。テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)５０μｌを各々のウェルに加えて、そのアッセイプレートの各々のウェルに関する６５０ｎｍでの光学密度(ＯＤ)を１０分間にわたり動態学的に読取った。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
結果
図１は、該抗体を採取した同じ患者から、もしくは別の患者もしくは健康な対象から、精製したＭＵＣ１抗体を用いて、乳癌と診断された６人の患者(初期乳癌に対して１〜４、進行乳癌に対して７および１１)から得たリンパ球によって産生された自己抗体の反応性を評価するためのＥＬＳＩＡアッセイの結果を示す。この実験で使用した健康な対象は、臨床的におよび／もしくはマモグラフィー法の乳癌の形跡を示さない女性であった。モノクローナル抗ＭＵＣ−１  Ｂ５５抗体の反応性を、比較コントロールとして測定した。４人の健康な対象(Ｎ１０からＮ１４)から得たリンパ球によって産生された抗体を、負のコントロールとして使用した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
図２は、Ｂ５５の反応性と比較した異なる供給源からのＭＵＣ１タンパク質を有する初期乳癌患者から誘導された不死化Ｂリンパ球によって分泌された自己抗体の反応性を示す。異なる自己抗体の反応性プロファイルもまた、再現性が高い。自己抗体は、癌患者の血漿に存在するＭＵＣ１に関して高い特異性を示し、健康な個人から、もしくは乳癌細胞系ＺＲ７５−１から単離されたＭＵＣ１に対する親和性を殆ど示さない。さらに、初期乳癌もしくは進行乳癌どちらにも関連するＭＵＣ１タンパク質に対する自己抗体親和性は、Ｂ５５に関して測定した親和性以上に高い。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
実施例３：表面プラスモン共鳴による自己抗体の親和性測定
方法
表面プラスモン共鳴は、Iasys Biosensor Plus (Affinity Sensor由来)で行なった。進行乳癌患者および正常な個人からのＭＵＣ１タンパク質を、使用説明書にしたがってアミノシラン被覆細胞に付着させ、該細胞を１％(ｗ／ｖ)ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)によってブロックした。１％ＰＶＰによってのみ被覆されたコントロール細胞も作った。初期乳癌患者のＢ細胞から得た異なる希釈率の培養上清の結合を、以下の実験条件を用いて測定した：
サンプリング間隔：              ０.３ｍｓｅｃ
撹拌速度    ：                  ７０ｒｐｍ
温度        ：                  ２４℃
結合時間    ：                  ３分
ＰＢＳによる分離：              ２分
２０ｍＭ  ＨＣｌによる再生：    ３分
ＰＢＳによる再平衡        ：    ５分
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
一定量のＡＢＣおよび尿ＭＵＣ１調製物をマイクロタイタープレートウェル上に、別々に等量のＮＣＲＣ−１１結合となる濃度で乾燥させた。２％ＰＶＰでブロック後、乳癌の患者から採取し、ＰＣＳで１／１００に希釈した血漿試料をウェルに添加し、血漿中の抗−ＭＵＣ１抗体を結合させた。洗浄後、結合抗体を抗−ヒトＩｇＭ−ＨＲＰおよび抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合体とプローブさせた。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
結果
図８は、乳癌患者由来の血清のＡＢＣと尿ＭＵＣ１との多数の反応性の測定の結果を示す。大多数の患者由来の血漿は、尿ＭＵＣ１と比較して、ＡＢＣ  ＭＵＣ１に大きな特異性を明らかに示す。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  乳癌を有すると診断された６人の患者(１ないし４、初期乳癌を有する、７および１１、進行乳癌を有する)に由来するＢ細胞によって産生された自己抗体の応答性を試験するためのＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。自己抗体の各群について、Ｂ細胞を取得した同じ患者から、他の患者からまたは通常の被験者から精製されたＭＵＣ１タンパク質を、固定化された抗原として使用した。平行検定において、マウスモノクローナルＢ５５抗ＭＵＣ１抗体の応答性が、比較コントロールとして含まれる。ＰＢＳまたは４人の健康な被験者(Ｎ１０、Ｎ１２、Ｎ１３およびＮ１４)に由来するＢリンパ球によって産生された抗体を、ネガティブコントロールとして使用する。０.２５ＭのグリシンｐＨ２.５を使用して、ＭＵＣ１をイムノアフィニティーカラムから抽出した。
【図２】  初期乳癌を有すると診断された患者に由来するＢ細胞から取得した自己抗体の応答性を、様々な起源のＭＵＣ１タンパク質で評価するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。Ｂ５５の応答性は、比較コントロールとして含まれる。ＰＢＳをネガティブコントロールとして使用する。
【図３】  初期乳癌を有すると診断された患者に由来するＢ細胞によって産生された自己抗体の、(ａ)進行乳癌を有する患者の血清からまたは(ｂ)正常の個体の尿から単離されたＭＵＣ１タンパク質に対する結合を測定する、表面プラスモン共鳴実験の結果を示す。
【図４】  進行乳癌を有する患者の血清からの、イムノアフィニティー精製ＭＵＣ１抗体に対して使用されたペプチドの配列を示す。
【図５】  (２)初期乳癌または(３)進行乳癌を有する患者からの固定化された自己抗体を使用して、進行乳癌を有すると診断された患者の血清からまたは健康な個体の尿から精製されたＭＵＣ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。抗ＭＵＣ１のＣ５９５抗体(１)を利用する平行の結果は、比較例として含まれる。
【図６】  初期乳癌を有する患者のＢ細胞からの固定化された自己抗体を利用して、健康な個体からまたは初期もしくは進行乳癌を有すると診断された患者からの血清試料におけるＭＵＣタンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。平行検定においてＣ５９５抗体で取得された結果は、比較例に含まれる。
【図７】  初期乳癌を有する患者のＢ細胞からの固定化された自己抗体を使用して、疾患の進行全期にわたって、進行乳癌を有する患者からの逐次血清試料におけるＭＵＣ１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。平行検定においてモノクローナルＣ５９５抗体でまたは商業的ＣＡ１５−３検定で取得された結果は、比較例として含まれる。
【図８】  乳癌患者からの血清の応答性をＡＢＣ  ＭＵＣ１および尿のＭＵＣ１で定量するいくつかの結果を示す。