【手続補正書】
【提出日】平成19年4月23日(2007.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カオトロピック剤、分解及び変性タンパク質、並びに結合タンパク質から遊離したRNA及びDNA分子を含む混合物中の核酸分子を酵素的にプロセシングするための方法であって、カオトロピック剤の濃度を0.05M未満に低減するように前記混合物を少なくとも1つの水性試薬で希釈することと、前記RNA及びDNA分子を互いから又は反応混合物の他の成分から除去又は単離せずに、前記RNA及びDNA分子の少なくとも一部を少なくとも1つの酵素的プロセスに供することとを含む方法。
【請求項２】
前記混合物が、カオトロピック剤の濃度を0.01M未満に低減するように希釈される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記混合物が、細胞溶解界面活性剤、還元剤、水混和性溶媒、キレート剤、及び中和バッファーからなる群から選択される少なくとも1つの成分を含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
希釈が、少なくとも2つの水性試薬の連続的添加によって達成される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも1つの酵素的プロセスが、指数関数的核酸増幅を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応プロセスである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも1つの酵素的プロセスが逆転写を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも1つの酵素的プロセスを行うための酵素が、前記少なくとも1つの水性試薬に含まれている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、DNアーゼ、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、及びグリコシダーゼからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記希釈と前記少なくとも1つの酵素的プロセスとが同じ容器で行われる、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記容器が、チューブ、マイクロタイタープレート、及びマイクロフルイディック装置からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合物が、タンパク質結合RNA及びDNA分子を含有する試料と、カオトロピック剤濃度が少なくとも約2Mのカオトロピック剤含有破壊試薬とをインキュベートすることによって調製される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料と破壊試薬とのインキュベーションは、加熱を含み、これによりカオトロピック剤が濃縮される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記加熱は、生成する混合物が少なくとも半乾燥になるように十分に行われる請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記生成する混合物が、使用に先だって保存される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
インキュベーションと希釈とが同じ容器で行われる、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記破壊試薬が乾燥試薬である、請求項12〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記乾燥試薬が、水混和性溶媒を含む混合物から調製される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記乾燥試薬が、細胞溶解界面活性剤、還元剤、キレート剤、及び中和バッファーからなる群から選択される少なくとも1つの成分を含む混合物から調製される、請求項17又は18に記載の方法。
【請求項２０】
前記乾燥試薬が、容器の表面に付着されている、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面が、チューブ、チューブキャップ、マイクロタイタープレートの壁、又はマイクロタイタープレートカバーの内表面である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が、1細胞から200細胞までの画分からなる、請求項12〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
破壊試薬の量が、20〜50nlの体積中に前記カオトロピック剤の濃度2M〜8Mを与えるのに十分なものである、請求項12〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質結合RNA及びDNA分子を含有する生物学的試料をプロセシングし、前記分子をタンパク質から遊離させるために使用する装置であって、容器又は容器の一部の表面に付着したカオトロピック剤を含む乾燥破壊試薬を含んでなる装置。
【請求項２５】
前記容器又は容器の一部が、チューブ、チューブキャップ、マイクロタイタープレート、及びマイクロタイタープレートの少なくとも1つのウェル用のカバーの群から選択される、請求項24に記載の装置。
【請求項２６】
前記容器又は容器の一部が、流路によって接続される複数のチャンバーを含む、請求項24又は25に記載の装置。
【請求項２７】
前記乾燥破壊試薬が、20〜50nlの水に溶解すると2M〜8Mのカオトロピック剤濃度をもたらす量のカオトロピック剤を含有する、請求項24〜26のいずれか1項に記載の装置。
【請求項２８】
前記乾燥破壊試薬が界面活性剤を含有する、請求項24〜27のいずれか1項に記載の装置。
【請求項２９】
前記乾燥破壊試薬が、還元剤、キレート剤、水混和性溶媒、及びバッファーの群からの少なくとも1つの成分を含む、請求項24〜28のいずれか1項に記載の装置。
【請求項３０】
核酸の酵素的プロセシングのために有用な少なくとも1つの試薬と、請求項24〜29のいずれか1項に記載の装置とを含むキット。
【請求項３１】
逆転写のためのプライマーと酵素とを含む請求項30に記載のキット。
【請求項３２】
DNアーゼ酵素を含む、請求項31に記載のキット。
【請求項３３】
少なくともDNAポリメラーゼと増幅用バッファーとを含んでなる核酸増幅試薬を含む、請求項30〜32のいずれか1項に記載のキット。
【請求項３４】
少なくとも一対のポリメラーゼ連鎖反応プライマーと、少なくとも1つの配列決定用プライマーとを含む、請求項33に記載のキット。
【請求項３５】
少なくとも検出試薬を含む、請求項33に記載のキット。
【請求項３６】
少なくとも1つの二重標識蛍光ハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項35に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明による方法は、少数の細胞、例えば、1細胞から200細胞までの画分若しくは1〜100細胞の画分、又はそれらと同等量の非細胞性試料材料に特に適応可能である。本発明による方法は、核酸調製と核酸増幅及び検出とを単一の容器内で行うことを含む、試料含有混合物の物理的移動を最小限にするプロセシングに特に適応可能である。本発明による方法を設計するために、逆向きに計算することが便利である。リアルタイムアッセイを、例えば、100μlアッセイ容器(現在入手可能なサーマルサイクリング機器は典型的には、実際に100μlアッセイ容量を有する200μlチューブを利用する)内で、実行する場合には、実行される希釈、即ち単一の組み合わされた希釈又は少なくとも2回そして多くの場合3回の段階希釈を考慮する。上述の段階希釈方法において、最終希釈は、増幅及び検出試薬を加えるともに、少なくとも約9:1希釈で行われる。第1の希釈は、本発明による方法の第2ステップにおいて行われ、少なくとも50:1の希釈を含む。6:1までの、好ましくは2:1以下の希釈とともに行う逆転写のような重要な中間希釈が少なくとも1つあってもよい。逆向きに計算すれば、本方法の第1ステップのための破壊試薬の適正な小さい体積に到達する。破壊試薬の量は、例えばリゾドットを調製するためのいかなる乾燥操作にも先立つ液形態の破壊試薬の量である。上述の設計原理を200μlPCRチューブと100μlアッセイを用いた本発明者らの研究に適用して、本発明者らは、破壊試薬の適正な出発体積として20〜50nlの体積を選択した。もちろん、より小さい体積でも適している。濃度2Mのグアニジンイソチオシアネートとの併用の場合、20nlの破壊試薬は約100個までの細胞で十分である。