(57)【要約】  ピロロベンゾジアゼピンは、喘息における気道過敏及び炎症の治療での使用のために、アルファ−４及びアルファ−５ＧＡＢＡＡ受容体を標的とする。化合物は、末梢分画に選択的に分配され、ＣＮＳ作用を低減した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2019528267.tif 000023
［式中：
Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸等価体、又はカルボン酸エステル等価体であり；
Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＣＦ３、又はＮであり；
Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、Ｈ、Ｄ、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルであるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって、置換されていてもよい環を形成し；並びに
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、ＯＨ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルであるが；
但し、
Ｒ１がカルボン酸エステル又はカルボン酸エステル等価体である場合、Ｒ３は、ＯＨであり；
Ｒ３が−Ｃ≡ＣＨである場合、Ｒ１は、カルボン酸アミド、カルボン酸チオエステル、
【化２】
2019528267.tif 000024
ではなく、ここで、Ｒ１０及びＲ１１は、独立して、Ｈ又はＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３が−Ｃ≡ＣＨである場合、Ｒ１は、ＣＯＯＨではなく；及び
Ｒ２及びＲ２’の両方がＨであり；Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｂｒ、又はＣ−Ｉであり；並びにＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＢｒである場合、Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、又はカルボン酸チオエステルではない］
の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
Ｘが、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、又はＮである、請求項１に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項３】
Ｘが、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、又はＮである、請求項２に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項４】
Ｒ２及びＲ２’が、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルであるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって環を形成する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項５】
Ｒ２及びＲ２’が、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、若しくはＣＣｌ３であるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって環を形成する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項６】
Ｒ２及びＲ２’が、各々独立して、Ｈ、Ｄ、ＣＨ３、ＣＤ３、ＣＦ３、若しくはシクロプロピルであるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって、Ｃ３−６シクロアルキルを形成する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項７】
Ｒ３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項８】
Ｒ３が、ＯＨである、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項９】
Ｒ３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＣＨ３、又は−Ｃ≡ＣＨである、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１０】
式（Ｉ−Ａ）：
【化３】
2019528267.tif 000025
［式中、Ｒ２は、Ｄ、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、又はシクロプロピルである］
である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１１】
Ｒ２が、Ｄ、ＣＨ３、ＣＤ３、ＣＦ３、又はシクロプロピルである、請求項１０に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１２】
式（Ｉ−Ｂ）：
【化４】
2019528267.tif 000026
［式中、Ｒ２’は、Ｄ、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、又はシクロプロピルである］
である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１３】
Ｒ２’が、Ｄ、ＣＨ３、ＣＤ３、ＣＦ３、又はシクロプロピルである、請求項１２に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１４】
式（Ｉ−Ｃ）：
【化５】
2019528267.tif 000027
である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１５】
Ｘが、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、又はＮであり；
Ｒ２が、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、又はシクロプロピルであり；
Ｒ２’が、Ｈ又はＤであり；及び
Ｒ３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである、
請求項１に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１６】
Ｒ２が、Ｃ１−４アルキルである、請求項１５に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１７】
式（ＩＩ）：
【化６】
2019528267.tif 000028
［式中、
Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸等価体、又はカルボン酸エステル等価体であり；
ｎは、１又は２であり；及び
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、ＯＨ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルであるが；
但し、Ｒ１がＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、又はカルボン酸チオエステルである場合、Ｒ３は、ＯＨである］
の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１８】
Ｒ３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである、請求項１７に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項１９】
Ｒ３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである、請求項１７に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２０】
Ｒ３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＣＨ３、又は−Ｃ≡ＣＨである、請求項１７に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２１】
Ｒ３が、ＯＨである、請求項１７に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２２】
式（ＩＩ−Ａ）：
【化７】
2019528267.tif 000029
である、請求項１７乃至２１のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２３】
式（ＩＩ−Ｂ）：
【化８】
2019528267.tif 000030
である、請求項１７乃至２１のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２４】
Ｒ１が、カルボン酸等価体である、請求項１乃至２３のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２５】
Ｒ１が、
【化９】
2019528267.tif 000031
であり、ここで、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、独立して、−Ｈ、−Ｄ、又はＣ１−６直鎖状若しくは環状の飽和若しくは置換アルキル基から選択される、請求項１乃至２３のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２６】
Ｒ１が、
【化１０】
2019528267.tif 000032
である、請求項２５に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２７】
Ｒ１が、
【化１１】
2019528267.tif 000033
であり、
Ｒ１０及びＲ１１が、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルから選択される、請求項２５に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２８】
（Ｒ）−８−エチニル−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸；
（Ｒ）−８−ブロモ−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸；
（Ｒ）−８−シクロプロピル−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸；
（Ｒ）−８−クロロ−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸；
（Ｒ）−８−ブロモ−４−メチル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸；
（Ｒ）−８−エチニル−４−メチル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸；
（Ｓ）−７−メトキシ−１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−９−オン；
（Ｓ）−Ｎ，７−ジメトキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシアミド；
（Ｓ）−Ｎ−シアノ−７−メトキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシアミド；
エチル（Ｓ）−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシレート；
（Ｓ）−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボン酸；
（Ｓ）−７−ヒドロキシ−１−（オキサゾール−５−イル）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−９−オン；及び
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシレート；
から成る群より選択される化合物又はその医薬的に許容される塩。
【請求項２９】
請求項１乃至２８のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１乃至２８のいずれか一項に記載の化合物若しくはその医薬的に許容される塩、又は請求項２９に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、気道狭窄を低減する方法。
【請求項３１】
請求項１乃至２８のいずれか一項に記載の化合物若しくはその医薬的に許容される塩、又は請求項２９に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺炎症を低減する方法。
【請求項３２】
請求項１乃至２８のいずれか一項に記載の化合物若しくはその医薬的に許容される塩、又は請求項２９に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺炎症に関連するリスク因子を有する対象における疾患の発症を低減する方法。
【請求項３３】
請求項１乃至２８のいずれか一項に記載の化合物若しくはその医薬的に許容される塩、又は請求項２９に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、肺疾患を治療する方法。
【請求項３４】
気道狭窄の低減、肺炎症の低減、肺炎症に関連するリスク因子の発現の低減、又は肺疾患の治療のための医薬の製造に使用するための、請求項１乃至２９のいずれか一項に記載の化合物若しくは医薬組成物、又は前記化合物の医薬的に許容される塩。
【請求項３５】
気道狭窄の低減、肺炎症の低減、肺炎症に関連するリスク因子の発現の低減、又は肺疾患の治療に使用するための、請求項１乃至２９のいずれか一項に記載の化合物若しくは医薬組成物、又は前記化合物の医薬的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全内容が参照により本明細書に援用される２０１６年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３７５，６９４号及び２０１６年１１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／４２７，７７１号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、ＮＩＨ助成金番号Ｒ０１ＨＬ１１８５６１、Ｒ０１ＭＨ０９６４６３、Ｒ０１ＧＭ０６５２８１、及びＲ０１ＨＬ１２２３４０の下、米国政府の支援によって行われた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
気管支収縮性疾患は、世界的な主たる健康問題である。これらには、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び気管支肺異形成症（ＢＰＤ）が含まれ、β−アドレナリン作動薬、吸入コルチコステロイド、及び吸入抗コリン作動薬などの既存の治療薬があるにも関わらず、気管支収縮性疾患は、広く蔓延したままである。喘息だけで、世界中で３億人の患者が罹患している。喘息は、患者を重篤な急性気道狭窄に罹患し易くすることから、気道平滑筋弛緩を促進することができる新規な治療機構があれば、臨床的価値があるであろう。
【０００４】
したがって、気管支収縮性疾患に対して有効な治療剤及び予防剤が継続的に求められている。これらの疾患を治療するための新規な薬理学的手法は限られている。治療上の限界は、β−アドレナリン受容体作動薬及び抗コリン作動薬が、依然として急性気道狭窄の治療に用いられる現時点で唯一の薬物クラスであることから、急性の気道平滑筋弛緩を促進する薬物療法において特に明らかである。
【０００５】
ＧＡＢＡＡ受容体（ＧＡＢＡＡＲ）は、その中枢神経系（ＣＮＳ）における抑制効果でよく知られているリガンド開口型塩化物イオンチャネルである。ＧＡＢＡＡＲは、１９の異なるサブユニット（α１−６、β１−３、γ１−３、δ、ε、π、θ、ρ１−３）から組み立てられたヘテロペンタマーである。古典的なＧＡＢＡＡＲは、２つのα、２つのβ、及び１つのγ、δ、ε、θ、又はπのサブユニットから成る。ＧＡＢＡＡＲの機能の有効性を変化させる化合物は、中枢神経系の障害に対する医薬として広く用いられてきた。神経細胞に加えて、ＧＡＢＡＡＲサブユニットは、気道平滑筋、気道上皮、及び免疫／炎症細胞にも識別されている。気道平滑筋細胞、上皮細胞、及び免疫細胞上の別々のＧＡＢＡＡＲサブタイプに対して選択的に反応する化合物は、気管支収縮性疾患を治療するためのこれまでにない新規な手法において重要である。α４β３γ２ＧＡＢＡＡＲ又はα５β３γ２ＧＡＢＡＡＲに対する選択性を有する化合物が、記載される喘息モデルにおいて薬理学的に活性であるとして識別された。
【発明の概要】
【０００６】
１つの態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩を提供し、
【０００７】
【化１】
2019528267.tif 000002
【０００８】
式中：
Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸等価体、又はカルボン酸エステル等価体であり；
Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＣＦ３、又はＮであり；
Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、Ｈ、Ｄ、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルであるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって、所望に応じて置換されていてもよい環を形成し；及び
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、ＯＨ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。
【０００９】
本発明の別の態様は、式（ＩＩ）の化合物又はその医薬的に許容される塩を提供し、
【００１０】
【化２】
2019528267.tif 000003
【００１１】
式中：
Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸等価体、又はカルボン酸エステル等価体であり；
ｎは、１又は２であり；並びに
Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、ＯＨ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。
【００１２】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、又はその医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、組成物は、経口又はエアロゾル調合物である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又は組成物、又はその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、気道狭窄を低減する方法を提供する。ある実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、治療用量でのジアゼパムと比較して、対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用を低減した。
【００１４】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又は組成物、又はその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺炎症を低減する方法を提供する。ある実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、治療用量でのジアゼパムと比較して、対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用を低減した。
【００１５】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又は組成物、又はその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺炎症に関連するリスク因子を有する対象における疾患の発症を低減する方法を提供する。ある実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、治療用量でのジアゼパムと比較して、対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用を低減した。
【００１６】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又は組成物、又はその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺疾患を治療する方法を提供する。ある実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、治療用量でのジアゼパムと比較して、対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用を低減した。
【００１７】
ある態様では、本発明の化合物は、ＧＡＢＡＡＲのα４及びα５サブユニットを選択的に標的とする。ある態様では、本発明の化合物は、ＧＡＢＡＡＲ上のα４及びα５ベンゾジアゼピンアロステリック調節部位に対して選択的であるＧＡＢＡＡＲのアロステリックモジュレーターである。ある態様では、本発明の化合物の血液脳関門不透過性が、限定的であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１Ａは、ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプα１β３γ２、α２β３γ２、α３β３γ２、α４β３γ２、及びα５β３γ２を発現するアフリカツメガエル卵母細胞上でのＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸によるＧＡＢＡ誘導電流の用量依存的調節を示す。図１Ｂは、α１β３γ２又はα４β３γ２ＧＡＢＡＡ受容体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたＲＪ−０２−５０による自動パッチクランプを示す。
【図２】図２は、ロータロッド試験における感覚運動協調に対する化合物の効果を示す。
【図３−１】図３Ａは、モルモットの気管軟骨輪（tracheal rings）における気道平滑筋の収縮力に対するＲＪ−０２−５０及びＲＪ−０３−３０の効果を示す。図３Ｂは、モルモットの気管軟骨輪における気道平滑筋の収縮力に対するＲＪ−０３−５７の効果を示す。
【図３−２】図３Ｃは、モルモットの気管軟骨輪における気道平滑筋の収縮力に対するＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３酸及びＧＬ−ＩＩ−９３の効果を示す。
【図４】図４は、ヒト気道平滑筋の収縮力に対するＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３酸の効果を示す。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｆは、気道過敏に対する化合物の効果を示す。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｆは、気道過敏に対する化合物の効果を示す。
【図５−３】図５Ａ〜５Ｆは、気道過敏に対する化合物の効果を示す。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｄは、マウスの血液、肺、及び脳における化合物の薬物動態プロファイルを示す。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｄは、マウスの血液、肺、及び脳における化合物の薬物動態プロファイルを示す。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｃは、炎症細胞に対する化合物の効果を示す。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｃは、炎症細胞に対する化合物の効果を示す。
【図８】図８は、６００ｎＭのＧＡＢＡ及び一緒に３秒間適用された濃度を増加させた化合物の存在下、ｏｖａ ｓ／ｃ ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた電流測定を示す。
【図９】図９は、サイトカイン産生に関する化合物の抗炎症特性を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、ムチン産生に対する化合物の効果を示す。
【図１１】図１１は、ＧＬ−ＩＩ−９３による処理なし又は処理ありにおける肺細胞の増殖を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
最近の研究から、機能性ガンマ−アミノ酪酸Ａ型受容体（ＧＡＢＡＡＲ）が、喘息肺の病態生理に関与する細胞型の表面に存在することが示された。重要なことには、ＧＡＢＡＡＲのシグナル伝達は、気道平滑筋（ＡＳＭ）の収縮状態、炎症プロセス、及び気道上皮細胞（ＡＥＣ）の増殖に影響を与え得る。肺で局所的に作用するＧＡＢＡＡＲのシグナル伝達の理解が進んでいるにも関わらず、喘息治療のためにＧＡＢＡＡＲの応答を一体化し、標的とする戦略は、開発されておらず、又は治療に利用されてこなかった。したがって、本発明者らは、ＡＥＣ肥大を刺激することなくＡＳＭ及び免疫／炎症細胞に対して抑制性であるリガンドを識別するために、ヒト肺細胞型を系統的に探索することによって、新規な喘息治療法を識別することを考慮している。
【００２０】
内在性気道平滑筋ＧＡＢＡＡ受容体の活性化は、気道平滑筋のコリン作動性収縮を緩和し、気道平滑筋の分子分析から、これらのＧＡＢＡＡ受容体のα−サブユニット成分は、α４及びα５に限定されていることが分かっている。
【００２１】
本発明は、免疫／炎症細胞及び気道平滑筋で発現される特定の向イオン性（リガンド開口型）イオンチャネルに結合することができ、その結果として収縮を緩和することができる新規な化合物を提供する。この新規な知見は、気道平滑筋収縮緩和のための新しいシグナル伝達経路及びタンパク質標的を詳細に示すものであり、気道狭窄、肺炎症、並びにアレルギー性及び自己免疫性疾患に伴う炎症に対する新規な治療剤へと発展させることができる可能性がある。したがって、本発明は、中でも、気道狭窄、肺炎症、並びにアレルギー性及び自己免疫性疾患に伴う炎症に対する新規な治療オプションを提供する新規な化合物、並びに様々な疾患を治療するためにこれらの化合物を用いる方法を提供する。
【００２２】
定義
特定の官能基及び化学用語の定義を、以下でより詳細に記載する。本発明の目的のために、化学元素は、Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.の表紙裏の元素周期律表、ＣＡＳバージョンに従って識別され、特定の官能基については、一般的に、本明細書に記載されるように定義される。加えて、有機化学の一般的原理、さらには特定の官能部分及び反応性については、各々の全内容が参照により本明細書に援用されるOrganic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999；Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001；Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989；Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987に記載されている。
【００２３】
「アシル」の用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アリールカルボニル、又はヘテロアリールカルボニル置換基を意味する。ある実施形態では、アシルは、さらに置換されていてもよい（例：１又は複数の置換基により）。特に断りのない限り、アシルは、無置換である。
【００２４】
「アルキル」の用語は、示された数の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状炭化水素鎖を意味する。例えば、Ｃ１−Ｃ１２アルキルは、アルキル基が１から１２個（１及び１２を含む）の炭素原子を有し得ることを示し、Ｃ１−Ｃ４アルキルは、アルキル基が１から４個（１及び４を含む）の炭素原子を有し得ることを示す。ある実施形態では、アルキル基は、所望に応じて置換されていてもよい。Ｃ１−４アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、及びｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。特に断りのない限り、アルキルは、無置換である。
【００２５】
「アルケニル」の用語は、１又は複数の二重結合を有する直鎖状又は分岐鎖状炭化水素鎖を意味する。アルケニル基の例としては、限定されないが、アリル、プロペニル、２−ブテニル、３−ヘキセニル、及び３−オクテニル基が挙げられる。二重結合炭素のうちの一方は、所望に応じて、アルケニル置換基の結合点であってもよい。ある実施形態では、アルケニル基は、所望に応じて置換されていてもよい。特に断りのない限り、アルケニルは、無置換である。
【００２６】
「アルキニル」の用語は、１又は複数の三重結合を有する直鎖状又は分岐鎖状炭化水素鎖を意味する。アルキニル基の例としては、限定されないが、エチニル、プロパルギル、及び３−ヘキシニルが挙げられる。三重結合炭素のうちの一方は、所望に応じて、アルキニル置換基の結合点であってもよい。ある実施形態では、アルキニル基は、所望に応じて置換されていてもよい。特に断りのない限り、アルキニルは、無置換である。
【００２７】
「アリール」の用語は、芳香族炭素環式の単環式、二環式、又は三環式炭化水素環系を意味し、置換可能である環原子のいずれも置換されていてよい（例：１又は複数の置換基によって）。アリール部分の例としては、限定されないが、フェニル、ナフチル、及びアントラセニルが挙げられる。特に断りのない限り、アリールは、無置換である。
【００２８】
「アリールアルキル」の用語は、アルキル水素原子がアリール基で置き換えられているアルキル部分を意味する。アリールアルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基で置き換えられた基を含む。アリールアルキル基の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基が挙げられる。
【００２９】
「シクロアルキル」の用語は、本明細書で用いられる場合、３〜１２個の炭素（例：３、４、５、６、又は７個の炭素原子）を有する飽和環式、二環式、三環式、又は多環式炭化水素基を意味する。いずれかの環原子が置換されていてもよい（例：１又は複数の置換基によって）。シクロアルキル基は、縮合環を有していてよい。縮合環は、１又は複数の共通の炭素原子を共有する環である。単環式シクロアルキル基の例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。架橋シクロアルキルの例としては、アダマンチル及びノルボルニルが挙げられる。
【００３０】
「ハロ」又は「ハロゲン」の用語は、本明細書で用いられる場合、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素のいずれの基をも意味する。
「ハロアルキル」の用語は、本明細書で用いられる場合、１又は複数の水素原子がハロゲンで置き換えられたアルキルを意味し、すべての水素がハロゲンで置き換えられたアルキル部分を含む（例：ＣＦ３などのペルフルオロアルキル）。
【００３１】
「ヘテロアリール」の用語は、本明細書で用いられる場合、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子を、又は三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する芳香族の５〜８員環単環式、８〜１２員環二環式、又は１１〜１４員環三環式環系を意味し、前記ヘテロ原子は、独立して、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＳｉから選択される（例：炭素原子、並びに、それぞれ単環式、二環式、又は三環式の場合、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、及びＳｉから独立して選択される１〜３個、１〜６個、又は１〜９個のヘテロ原子）。いずれかの環原子が置換されていてもよい（例：１又は複数の置換基によって）。ヘテロアリール基は、１又は複数の共通の原子を共有する環である縮合環を有していていてもよい。ヘテロアリール基の例としては、限定されないが、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、フラン、チアゾール、イソチアゾール、チオフェン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、インドール、イソインドール、インドリジン、インダゾール、ベンズイミダゾール、フタラジン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、ナフチリジン、及びプリンの基が挙げられる。
【００３２】
「ヘテロ環」の用語は、本明細書で用いられる場合、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子を、又は三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する非芳香族の飽和又は部分不飽和３〜１０員環単環式、８〜１２員環二環式、又は１１〜１４員環三環式環系を意味し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、及びＰから選択される（例：炭素原子、並びに、それぞれ単環式、二環式、又は三環式の場合、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、及びＰの１〜３個、１〜６個、又は１〜９個のヘテロ原子）。いずれかの環原子が置換されていてもよい（例：１又は複数の置換基によって）。ヘテロシクリル基は、１又は複数の共通の原子を共有する環である縮合環を有していていてもよい。ヘテロシクリル基の例としては、限定されないが、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロリン、ピリミジン、ピロリジン、インドリン、テトラヒドロピリジン、ジヒドロピラン、チアントレン、ピラン、ベンゾピラン、キサンテン、フェノキサチイン、フェノチアジン、フラザン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノン等のラクタム、スルタム、並びにスルトン等の基が挙げられる。
【００３３】
「ヒドロキシ」の用語は、−ＯＨ基を意味する。「アルコキシ」の用語は、−Ｏ−アルキル基を意味する。「アリールオキシ」の用語は、−Ｏ−アリール基を意味する。「ハロアルコキシ」の用語は、−Ｏ−ハロアルキル基を意味する。
【００３４】
「置換基」の用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アリールアルキル、又はヘテロアリール基上、その基のいずれかの原子において「置換された」基を意味する。適切な置換基としては、限定されないが、アシル、アシルアミド、アシルオキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、カルボキシ、シアノ、エステル、ハロ、ヒドロキシ、イミノ、ニトロ、オキソ（例：Ｃ＝Ｏ）、ホスホネート、スルフィニル、スルホニル、スルホネート、スルホンアミノ、スルホンアミド、チオアミド、チオール、チオキソ（例：Ｃ＝Ｓ）、及びウレイドが挙げられる。実施形態では、基上の置換基は、独立して、上述した置換基のいずれか１つ、又はいずれかの組み合わせである。実施形態では、置換基自体が、上記置換基のいずれか１つで置換されていてもよい。
【００３５】
上記置換基は、本明細書において略記される場合があり、例えば、Ｍｅ、Ｅｔ、及びＰｈの略語は、それぞれ、メチル、エチル、及びフェニルを表す。有機化学者によって用いられる略語のより包括的なリストは、Journal of Organic Chemistryの各巻の第１号に記載されており、このリストは、典型的には、標準略語リスト（Standard List of Abbreviations）と題する表に示される。前記リストに含まれる略語、及び当業者である有機化学者によって用いられるすべての略語は、参照により本明細書に援用される。
【００３６】
化合物において、その基及び置換基は、選択及び置換の結果として、転位、環化、脱離などによる自発的な変換を起こすことのない化合物を例とする安定な化合物が得られるように、原子及び置換基の許容される価数に従って選択され得る。
【００３７】
置換基が、左から右に記載されるその従来の化学式によって指定される場合、それらは、所望に応じて、右から左に構造を記載することによる置換基も包含するものであり、例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、所望に応じて−ＯＣＨ２−も意味する。
【００３８】
本技術分野で用いられる慣例に従って、基：
【００３９】
【化３】
2019528267.tif 000004
【００４０】
が、本明細書中の構造式において、部分又は置換基の核又は主鎖構造との結合点である結合を示すために用いられる。
障害を治療するという意味において、「有効量」の用語は、本明細書で用いられる場合、対象への単一又は複数用量の投与によって、細胞の治療、又は対象の持つ障害の症状の治癒、軽減、緩和、若しくは改善に有効である化合物又は化合物を含む組成物の量を意味する。化合物又は組成物の有効量は、用途に応じて様々であり得る。障害を治療するという意味において、有効量は、疾患の状態、個人の年令、性別、及び体重、並びに化合物が個人に所望される応答を引き起こす能力などの因子に依存し得る。例えば、化合物の有効量は、任意のパラメータに、その化合物で治療されていない細胞（例：細胞の培養物）又は対象などのコントロールと比較して薬理学的に有用な変化を発生させる量である。
【００４１】
ベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用に対する治療ウィンドウとは、ベンゾジアゼピン型のＣＮＳ作用（例：鎮静作用）が特定の治療処置という状況で許容されるレベルである用量又は用量の範囲において、標的器官（例：肺）で所望される治療効果を有することを意味する。例えば、喘息治療という状況では、ＣＮＳ作用の許容されるレベルは、ＣＮＳ作用なし、又は軽度のＣＮＳ作用を含む。例えば、ある実施形態では、治療指数は、１０以上である。ある実施形態では、治療指数は、２０以上である。ある実施形態では、治療指数は、２４以上である。ベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用の低減は、治療用量でのジアゼパムと比較した対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用の低減を含む。例えば、ある実施形態では、ベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用は、治療用量でのジアゼパムと比較して、１０倍以上低減される。ある実施形態では、ベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用は、治療用量でのジアゼパムと比較して、２０倍以上低減される。ある実施形態では、ベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用は、治療用量でのジアゼパムと比較して、２４倍以上低減される。
【００４２】
本明細書で列挙されるいずれの数値（例：範囲）も、下限値から上限値までのすべての値を含むものと特に理解され、すなわち、列挙される最小値と最大値との間の数値の考え得るすべての組み合わせが、本出願に明白に記載されているものと見なされるべきである。例えば、濃度範囲が、１％〜５０％と記載される場合、それは、２％〜４０％、１０％〜３０％、又は１％〜３％などの値が本明細書に明白に列挙されていることを意図している。これらは、特に意図するものの単なる例である。
【００４３】
化合物
第一の態様では、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩が提供される。式（Ｉ）の実施形態は、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２’、及びＲ３、並びにこれらのいずれかの組み合わせの以下の記述を含む。
【００４４】
式（Ｉ）のある実施形態では、Ｒ１がカルボン酸エステル若しくはカルボン酸エステル等価体である場合、Ｒ３は、ＯＨであり；並びに／又はＲ３がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、若しくはシクロプロピルである場合、Ｒ１は、カルボン酸エステル若しくはカルボン酸エステル等価体ではなく；並びに／又は、Ｒ３が−Ｃ≡ＣＨである場合、Ｒ１は、カルボン酸アミド、カルボン酸チオエステル、
【００４５】
【化４】
2019528267.tif 000005
【００４６】
ではなく、ここで、Ｒ１０及びＲ１１は、独立して、Ｈ若しくはＣ１−６アルキルであり；並びに／又はＲ３が−Ｃ≡ＣＨである場合、Ｒ１は、ＣＯＯＨではなく；並びに／又は、Ｒ２及びＲ２’の両方がＨであり；Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｂｒ、又はＣ−Ｉであり；並びにＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＢｒである場合、Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、又はカルボン酸チオエステルではない。ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、（Ｒ）−８−エチニル−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸ではない。ある実施形態では、Ｒ３が−Ｃ≡ＣＨであり、Ｒ２又はＲ２’が、独立して、Ｈ又はＣ１−４アルキルである場合、Ｒ１は、ＣＯＯＨではない。
【００４７】
式（Ｉ）の実施形態では、本明細書で述べるように、Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＣＦ３、又はＮである。さらなる実施形態では、Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、又はＮである。さらなる実施形態では、Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、又はＮである。
【００４８】
式（Ｉ）の実施形態では、本明細書で述べるように、Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、Ｈ、Ｄ、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルであるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって、所望に応じて置換されていてよい環を形成する。さらなる実施形態では、Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルであるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって環を形成する。さらなる実施形態では、Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、若しくはＣＣｌ３であるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって環を形成する。なおさらなる実施形態では、Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、Ｈ、Ｄ、ＣＨ３、ＣＤ３、ＣＦ３、若しくはシクロプロピルであるか；又はＲ２及びＲ２’が一緒になって、Ｃ３−６シクロアルキル（例：シクロプロピル）を形成する。なおさらなる実施形態では、Ｒ２及びＲ２’は、一緒になって、ＣＨ３、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ３、オキソ、及びＣＦ３から成る群より独立して選択される１〜４つの置換基によって所望に応じて置換されていてもよいＣ３−６シクロアルキルを形成する。
【００４９】
式（Ｉ）の実施形態では、本明細書で述べるように、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、ＯＨ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＣＨ３、又は−Ｃ≡ＣＨである。なおさらなる実施形態では、Ｒ３は、ＯＨであり、ここで、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ２’、並びにこれらの組み合わせは、本明細書で述べる通りである。ある実施形態では、Ｒ３は、ＯＨである。
【００５０】
さらなる実施形態では、Ｒ３は、ＯＨであり；Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、又はＮであり；Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、Ｃ１−４アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルから選択されるか、又は一緒になって環を形成し；Ｒ１は、本明細書で定められる。なおさらなる実施形態では、Ｒ２及びＲ２’は、一緒になって、ＣＨ３、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ３、オキソ、及びＣＦ３から成る群より独立して選択される１〜４つの置換基によって所望に応じて置換されていてもよいＣ３−６シクロアルキルを形成する。ある実施形態では、１又は複数の水素は、重水素で置き換えられてもよい。適切には、化合物は、Ｓ−異性体であってよい。別の選択肢として、化合物は、Ｒ−異性体であってもよい。
【００５１】
式（Ｉ)の実施形態は、式（Ｉ−Ａ)の化合物を含み、
【００５２】
【化５】
2019528267.tif 000006
【００５３】
式中、Ｒ２は、Ｄ、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルであり、Ｘ、Ｒ１、及びＲ３との組み合わせは、本明細書で述べる通りである。式（Ｉ−Ａ）の実施形態のいくつかでは、Ｒ２は、Ｄ、ＣＨ３、ＣＤ３、ＣＦ３、又はシクロプロピルである。上記に従う式（Ｉ−Ａ）のある実施形態では、Ｒ３は、ＯＨである。
【００５４】
式（Ｉ）の実施形態は、式（Ｉ−Ｂ）の化合物を含み、
【００５５】
【化６】
2019528267.tif 000007
【００５６】
式中、Ｒ２’は、Ｄ、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルであり、Ｘ、Ｒ１、及びＲ３との組み合わせは、本明細書で述べる通りである。式（Ｉ−Ｂ）の実施形態のいくつかでは、Ｒ２’は、Ｄ、ＣＨ３、ＣＤ３、ＣＦ３、又はシクロプロピルである。上記に従う式（Ｉ−Ｂ）のある実施形態では、Ｒ３は、ＯＨである。
【００５７】
式（Ｉ)の実施形態は、式（Ｉ−Ｃ)の化合物を含み、
【００５８】
【化７】
2019528267.tif 000008
【００５９】
式中、Ｘ、Ｒ１、及びＲ３、並びにこれらの組み合わせは、本明細書で述べる通りである。上記に従う式（Ｉ−Ｃ）のある実施形態では、Ｒ３は、ＯＨである。
Ｘ、Ｒ２、Ｒ２’、及びＲ３のある組み合わせでは、Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、又はＮであり；Ｒ２は、Ｃ１−４アルキル、ＣＤ３、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、又はシクロプロピルであり；Ｒ２’は、Ｈ又はＤであり；並びにＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。実施形態のいくつかでは、Ｒ２は、Ｃ１−４アルキル（例：ＣＨ３）である。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＯＣＨ３、又はシクロプロピルであり、Ｒ２は、Ｃ１−４アルキルである。上述とのさらなる組み合わせでは、Ｒ１は、ＣＯＯＨである。
【００６０】
ある実施形態では、本発明は、式（Ｉ)に従う化合物を提供し、式中、Ｒ１は、カルボン酸等価体であり；Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、又はＮであり；Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルから選択されるか、又は一緒になって環を形成し；並びにＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＭｅ、−Ｃ≡ＣＨ、若しくはシクロプロピルから選択される。なおさらなる実施形態では、Ｒ２及びＲ２’は、一緒になって、ＣＨ３、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ３、オキソ、及びＣＦ３から成る群より独立して選択される１〜４つの置換基によって所望に応じて置換されていてもよいＣ３−６シクロアルキルを形成する。実施形態では、Ｒ２及びＲ２’は、Ｈ及び（Ｒ）−Ｍｅ、又はＨ及び（Ｓ）−Ｍｅであるか、又はＲ２及びＲ２’の両方がＨである。ある実施形態では、１又は複数の水素は、重水素で置き換えられてもよい。適切には、化合物は、Ｓ−異性体であってよい。別の選択肢として、化合物は、Ｒ−異性体であってもよい。
【００６１】
式（Ｉ）の別の実施形態では、Ｒ１は、ＣＯＯＨであり；Ｘは、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、又はＮであり；Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｃ１−４アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、ＣＣｌ３、若しくはシクロプロピルから選択されるか、又は一緒になって環を形成し；並びにＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＭｅ、−Ｃ≡ＣＨ、Ｂｒ、若しくはシクロプロピルから選択される。なおさらなる実施形態では、Ｒ２及びＲ２’は、一緒になって、ＣＨ３、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ３、オキソ、及びＣＦ３から成る群より独立して選択される１〜４つの置換基によって所望に応じて置換されていてもよいＣ３−６シクロアルキルを形成する。ある実施形態では、１又は複数の水素は、重水素で置き換えられてもよい。適切には、化合物は、Ｓ−異性体であってよい。別の選択肢として、化合物は、Ｒ−異性体であってもよい。
【００６２】
別の態様では、式（ＩＩ）の化合物又はその医薬的に許容される塩が提供される。式（ＩＩ）の実施形態は、Ｘ、Ｒ１、及びＲ３、並びにこれらの組み合わせの以下の記述を含む。
【００６３】
式（ＩＩ）の化合物のある実施形態では、Ｒ１がＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、又はカルボン酸チオエステルである場合、Ｒ３は、ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１がＣＯＯＨである場合、Ｒ３は、ＯＨである。他の実施形態では、Ｒ１は、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、又はカルボン酸チオエステルではない。他の実施形態では、Ｒ３が−ＯＣ１−４アルキル又はＯＨである場合、Ｒ１は、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、又はカルボン酸チオエステルではない。ある実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、エチル（Ｓ）−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシレートではない。
【００６４】
式（ＩＩ）の実施形態では、本明細書で述べるように、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、ＯＨ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＯＣＨ３、又は−Ｃ≡ＣＨである。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、−ＯＣＨ３、又は−Ｃ≡ＣＨである。なおさらなる実施形態では、Ｒ３は、ＯＨである。さらなる実施形態では、Ｒ３は、ＯＨであり、ここで、Ｘ、及びＲ１、並びにこれらの組み合わせは、本明細書で述べる通りである。
【００６５】
特定の組み合わせでは、Ｒ１は、カルボン酸等価体であり、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。他の組み合わせでは、Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸等価体、又はカルボン酸エステル等価体であり；Ｒ３は、ＯＨである。
【００６６】
式（ＩＩ)の実施形態は、式（ＩＩ−Ａ)の化合物を含み、
【００６７】
【化８】
2019528267.tif 000009
【００６８】
式中、Ｘ、Ｒ１、及びＲ３は、本明細書で述べる通りである。上記に従う式（ＩＩ−Ａ）の実施形態のいくつかでは、Ｒ３は、ＯＨである。特定の組み合わせでは、Ｒ１は、カルボン酸等価体であり、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。特定の組み合わせでは、Ｒ１は、カルボン酸等価体であり、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。他の組み合わせでは、Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸等価体、又はカルボン酸エステル等価体であり；Ｒ３は、ＯＨである。
【００６９】
式（ＩＩ)の実施形態は、式（ＩＩ−Ｂ)の化合物を含み、
【００７０】
【化９】
2019528267.tif 000010
【００７１】
式中、Ｘ、Ｒ１、及びＲ３は、本明細書で述べる通りである。上記に従う式（ＩＩ−Ｂ）の実施形態のいくつかでは、Ｒ３は、ＯＨである。特定の組み合わせでは、Ｒ１は、カルボン酸等価体であり、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨＦ２、ＣＮ、−ＯＣ１−４アルキル、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。特定の組み合わせでは、Ｒ１は、カルボン酸等価体であり、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｃ≡ＣＨ、又はシクロプロピルである。他の組み合わせでは、Ｒ１は、ＣＯＯＨ、カルボン酸エステル、カルボン酸等価体、又はカルボン酸エステル等価体であり；Ｒ３は、ＯＨである。
【００７２】
特に断りのない限り、本明細書で述べる実施形態は、Ｒ１がＣＯＯＨであるさらなる実施形態を含む。特に断りのない限り、本明細書で述べる実施形態は、Ｒ１がカルボン酸エステルであるさらなる実施形態を含む。ある実施形態では、カルボン酸エステルは、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル又は−Ｃ（Ｏ）ＯＣ３−６シクロアルキルである。特に断りのない限り、本明細書で述べる実施形態は、Ｒ１がカルボン酸等価体であるさらなる実施形態を含む。特に断りのない限り、本明細書で述べる実施形態は、Ｒ１がカルボン酸エステル等価体であるさらなる実施形態を含む。
【００７３】
本明細書で述べる実施形態には、Ｒ１が、
【００７４】
【化１０】
2019528267.tif 000011
【００７５】
であるなおさらなる実施形態が含まれ、ここで、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、独立して、Ｈ、Ｄ、又はＣ１−６直鎖状若しくは環状の飽和若しくは置換アルキル基から選択される。
【００７６】
本明細書で述べる実施形態には、Ｒ１が、
【００７７】
【化１１】
2019528267.tif 000012
【００７８】
であるなおさらなる実施形態が含まれる。上述のＲ１基のメンバーは、「カルボン酸等価体」の用語に含まれる。さらなる実施形態では、Ｒ１は、
【００７９】
【化１２】
2019528267.tif 000013
【００８０】
である。
なおさらなる実施形態及び組み合わせでは、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、独立して、Ｈ、Ｄ、Ｃ１−６アルキル、又はＣ３−６シクロアルキルである。
【００８１】
なおさらなる実施形態では、Ｒ１は、テトラゾール（例：
【００８２】
【化１３】
2019528267.tif 000014
【００８３】
）である。
上述によると、カルボン酸エステル等価体としては、
【００８４】
【化１４】
2019528267.tif 000015
【００８５】
が挙げられる。
別の態様では、本発明は：
（Ｒ）−８−エチニル−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３酸）；
（Ｒ）−８−ブロモ−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩ−９３）；
（Ｒ）−８−シクロプロピル−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩＩ−４３）；
（Ｒ）−８−クロロ−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩＩ−５４）；
（Ｒ）−８−ブロモ−４−メチル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩ−５１）；
（Ｒ）−８−エチニル−４−メチル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩ−３０）；
（Ｓ）−７−メトキシ−１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−９−オン（ＲＪ−０３−５７）；
（Ｓ）−Ｎ，７−ジメトキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシアミド（ＭＲＳ−ＩＩＩ−８７）；
（Ｓ）−Ｎ−シアノ−７−メトキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシアミド（ＭＲＳ−ＩＩＩ−９０）；
エチル（Ｓ）−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシレート（ＲＪ−０２−５０）；
（Ｓ）−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボン酸（ＲＪ−０３−９０）；
（Ｓ）−７−ヒドロキシ−１−（オキサゾール−５−イル）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−９−オン（ＲＪ−０３−３０）；及び
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシレート（ＲＪ−０２−６７）；
から成る群より選択される化合物又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【００８６】
別の態様では、本発明は：
５−（８−エチニル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）オキサゾール（ＫＲＭ−ＩＩ−８１）；
５−（８−エチニル−６−フェニル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）オキサゾール（ＫＲＭ−ＩＩ−８２）；
５−（８−エチニル−６−（２−フルオロフェニル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）オキサゾール（ＫＲＭ−ＩＩ−１８Ｂ）；
メチル（Ｒ）−８−エチニル−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボキシレート（ＭＰ−ＩＩＩ−００４）；
（Ｒ）−８−エチニル−６−（２−フルオロフェニル）−Ｎ，４−ジメチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボキシアミド（ＭＰ−ＩＩＩ−０２２）；
エチル−１，１−ｄ２８−エチニル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボキシレート（ＭＰ−ＩＩＩ−０６８）；
５−（８−エチニル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール（ＭＰ−ＩＩＩ−０８５）；
３−エチル−５−（８−エチニル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−１，２，４−オキサジアゾール（ＭＰ−ＩＩＩ−０８０）；
エチル８−エチニル−６−フェニル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボキシレート（ＸＨｅ−ＩＩ−０５３）；
エチル８−エチニル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボキシレート（ＨＺ−１６６）；及び
エチル８−エチニル−６−（２−フルオロフェニル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボキシレート（ＪＹ−ＸＨｅ−０５３）；
から成る群より選択される化合物又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【００８７】
本発明に従う化合物において、その基及び置換基は、選択及び置換の結果として、転位、環化、脱離などによる自発的な変換を起こすことのない化合物を例とする安定な化合物が得られるように、原子及び置換基の許容される価数に従って選択され得る。
【００８８】
置換基が、左から右に記載されるその従来の化学式によって指定される場合、それらは、所望に応じて、右から左に構造を記載することによる置換基も包含するものであり、例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、所望に応じて−ＯＣＨ２−も意味する。
【００８９】
本発明に従う化合物は、１又は複数の同位体濃縮原子が存在していることのみが異なる化合物を含む。例えば、化合物は、水素を重水素若しくは三重水素で置き換えたこと以外は、又は炭素を１３Ｃ−若しくは１４Ｃ−濃縮炭素で置き換えたこと以外は本発明の構造を有し得る。
【００９０】
本発明に従う化合物は、医薬的に許容される塩を例とする塩の形態であってよい。「医薬的に許容される塩」の用語は、化合物上に見出される特定の置換基に応じて、比較的無毒性である酸又は塩基を用いて作製される活性化合物の塩を含む。本発明の化合物の適切な医薬的に許容される塩としては、本発明に従う化合物の溶液を、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸、又はリン酸などの医薬的に許容される酸の溶液と混合することによって例えば形成され得る酸付加塩が挙げられる。さらに、本発明の化合物が酸性部分を有する場合、その適切な医薬的に許容される塩としては、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩、及び適切な有機リガンドと共に形成される塩、例えば四級アンモニウム塩が挙げられ得る。
【００９１】
化合物の中性の形態は、塩を塩基又は酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することによって作製され得る。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解度などのある特定の物理的特性において様々な塩の形態と異なるが、それ以外では、塩は、本開示の目的のために、化合物の親形態と同等である。
【００９２】
塩形態に加えて、本発明はまた、プロドラッグ形態の本発明に従う化合物も提供し得る。化合物のプロドラッグとは、生理学的条件下で容易に化学変化を起こして、活性化合物をもたらす化合物である。プロドラッグは、生体外環境中での化学的又は生化学的方法によって、本発明の化合物に変換され得る例えば、プロドラッグは、適切な酵素又は化学試薬と共に経皮パッチリザーバー中に置かれると、ゆっくり本発明の化合物に変換され得る。
【００９３】
本明細書で述べる化合物は、不斉（又はキラル）中心が存在する立体異性体として存在してもよい。これらの立体異性体は、キラル炭素原子を中心とする置換基の立体配置に応じて、「Ｒ」又は「Ｓ」となる。本明細書で用いられる「Ｒ」及び「Ｓ」の用語は、ＩＵＰＡＣ  １９７４  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｅ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７６，４５：１３−３０に定められる通りの立体配置である。
【００９４】
本発明に従う化合物は、例えば、本明細書で述べる立体異性体のエナンチオマー的に濃縮された異性体であってよい。エナンチオマーとは、本明細書で用いられる場合、その分子構造が互いに対して鏡像の関係にある１対の化学化合物のいずれかを意味する。例えば、化合物は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のエナンチオマー過剰率を有し得る。
【００９５】
本発明に従う化合物の製剤は、選択された立体中心に対応するＲ又はＳを例とする選択された立体化学を有する化合物の異性体について濃縮されてよい。例えば、化合物は、選択された立体中心の選択された立体化学を有する化合物に対応する、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度を有してよい。例えば、化合物は、選択された立体中心でのＲ又はＳを例とする選択された立体化学を有する構造について濃縮された本明細書で開示される化合物の製剤を含んでよい。
【００９６】
ある実施形態では、本発明に従う化合物の製剤は、その化合物のジアステレオマーである異性体（目的の異性体）について濃縮されてよい。ジアステレオマーとは、本明細書で用いられる場合、同じ化合物の別の立体異性体と鏡像関係にない２つ以上のキラル中心を有する化合物の立体異性体を意味する。例えば、化合物は、選択されたジアステレオマーを有する化合物に対応する、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度を有してよい。
【００９７】
化合物の任意の立体中心での立体配置について特に示されない場合、立体配置のいずれか１つ又は立体配置の混合物を意図している。本明細書中の式は、考え得る互変異性体の１つのみを表し得る。いずれの互変異性体及びその混合物も本明細書において包含されものとして理解されるべきであり、化合物の命名又は式の範囲内で用いられるいずれか１つの互変異性体のみに限定されるべきではない。
【００９８】
化合物は、ラセミ体として、又は立体特異的合成若しくは分割のいずれかによって個々のエナンチオマー若しくはジアステレオマーとして作製されてもよい。化合物は、例えば、標準的な技術によってその成分であるエナンチオマー又はジアステレオマーに分割されてよく、光学活性塩基を用いた塩形成によって立体異性体対の形成、並びにそれに続く分別再結晶及び遊離酸の再生などによる。化合物はまた、立体異性体のエステル又はアミドの形成、並びにそれに続くクロマトグラフィ分離、及びキラル助剤の除去によって分割されてもよい。別の選択肢として、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割されてもよい。エナンチオマーはまた、リパーゼ酵素を用いた対応するエステルのラセミ体の速度論的分割から得られてもよい。
【００９９】
本発明に従う化合物はまた、選択的生物学的特性を高めるために、適切な官能基を付加することによって修飾されてもよい。そのような修飾は、本技術分野において公知であり、任意の生物学的系（例：血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的透過率を高める、経口による利用度を高める、注射投与を可能とするために溶解度を高める、代謝を改変する、及び／又は排出速度を改変する修飾が挙げられる。これらの修飾の例としては、限定されないが、ポリエチレングリコールによるエステル化、ピバレート（pivolates）若しくは脂肪酸置換基による誘導体化、カルバメートへの変換、芳香族環のヒドロキシル化、及び芳香族環におけるヘテロ原子置換が挙げられる。
【０１００】
本発明に従う化合物はまた、「ソフトドラッグ」として構成されてもよい。ソフトドラッグは、その所望される治療効果を達成した後、不活性種への予測可能かつ制御可能である生体内代謝を有する生物学的活性化合物として定義され得る。すなわち、本発明の化合物は、肺又は他の標的組織中での化合物の迅速な代謝を可能とする部分を有してよい。肺では、複数のチトクロムアイソフォーム、さらにはスルホトランスフェラーゼ、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、及びフラビンモノオキシゲナーゼなどの他の生体内変換酵素が見出されている。広範囲にわたる生体内変換酵素が、不安定なエステル官能基を有する化合物を例とする広い範囲の化学的に異なる基質の代謝を可能としている。ソフトドラッグは、その部分を持たない化合物よりも短い全身半減期を有することになり、望ましくない全身作用（ＣＮＳ組織への分布など）を制限し得る。
【０１０１】
化合物の合成
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、市販の出発物質を用いて合成され得る。例示的な合成は、スキーム１〜５、及び（Cook, J.M., Zhou, H., Huang S., Sarma, P.V.V.S., Zhang, C., 2009. Stereospecific anxiolytic and anticonvulsant agents with reduced muscle-relaxant, sedative hypnotic and ataxic effects、ＰＣＴ国際公開第２００６／００４９４５（Ａ１）号、米国特許第７，６１８，９５８号）にまとめて示される。
【０１０２】
【化１５】
2019528267.tif 000016
【０１０３】
【化１６】
2019528267.tif 000017
【０１０４】
【化１７】
2019528267.tif 000018
【０１０５】
【化１８】
2019528267.tif 000019
【０１０６】
【化１９】
2019528267.tif 000020
【０１０７】
式（ＩＩ）の化合物は、市販の出発物質を用いて合成することができる。例示的な合成は、本明細書の例、及び（Jahan et al. European J. Med Chem. 2017, 126, 550-560）に示されている。
【０１０８】
本明細書における式の化合物を合成する他の方法は、当業者にとって明らかである。化合物の合成に有用である合成化学変換及び保護基による方法（保護及び脱保護）は、本技術分野において公知であり、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)；T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991)；L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；並びにL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、及びその後の版に記載のものなどが挙げられる。
【０１０９】
化合物の評価
化合物は、受容体結合実験及び生体内法を含む数多くの方法を用いて分析することができる。。
【０１１０】
例えば、化合物のＧＡＢＡＡサブユニット選択性は、例えば、競合結合アッセイを用いて評価することができる。そのようなアッセイは、（Choudhary et al. Mol Pharmacol. 1992, 42, 627-33；Savic et al. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry, 2010, 34, 376-386）に記載されている。このアッセイは、［３Ｈ］フルニトラゼパムなどのＧＡＢＡＡ受容体と結合することが知られている放射標識化合物の使用を含む。膜タンパク質を回収して放射標識化合物とインキュベートしてよく、放射標識化合物の結合を、別の非標識化合物（例：ジアゼパム）と比較することによって、非特異的結合が評価され得る。結合した放射活性は、液体シンチレーション測定によって定量され得る。膜タンパク質濃度は、市販のアッセイキット（例：Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州から）を用いて特定され得る。
【０１１１】
化合物はまた、特定のＧＡＢＡＡＲサブタイプを過剰発現するアフリカツメガエル卵母細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞中での電気生理学アッセイでも評価され得る。化合物は、ＧＡＢＡの添加前に細胞に予め適用されてよく、その後ＧＡＢＡは、ピーク応答が観察されるまで化合物と共に共適用されてよい。適用間において、脱感作からの完全な回復を確実とするために、細胞が洗浄されてよい。電流測定については、マイクロ電極を細胞に刺入してよく、電圧固定を用いて記録が行われる。
【０１１２】
本明細書で述べる化合物は、内在性気道平滑筋ＧＡＢＡＡ受容体と結合して、コリン作動性気道平滑筋収縮の緩和を強めるＧＡＢＡＡ受容体リガンドであり得る。これは、α４及びα５サブユニットでのベンゾジアゼピンアロステリック調節部位に対するターゲティングの増加に起因する。化合物は、ＧＡＢＡＡ／α４及び／又はＧＡＢＡＡ／α５アロステリック調節部位に対して、ＧＡＢＡＡ／α１、ＧＡＢＡＡ／α２、及びＧＡＢＡＡ／α３と比較して少なくとも２倍、適切には少なくとも５倍、有利には少なくとも１０倍の選択的有効性を有し得る。しかし、ＧＡＢＡＡ／α４及び／又はＧＡＢＡＡ／α５受容体上のベンゾジアゼピンアロステリック調節部位に対して選択的ではない化合物も、本発明の範囲内に包含される。そのような化合物は、望ましくは、他のＧＡＢＡＡ受容体のベンゾジアゼピンアロステリック調節部位での有効性の低下を示すことによって、機能的選択性を呈することになる。
【０１１３】
選択的又は優先的治療剤は、ＧＡＢＡＡ／α４又はＧＡＢＡＡ／α５サブユニット上のベンゾジアゼピンアロステリック調節部位と比較して、ＧＡＢＡＡ受容体上の他のベンゾジアゼピンアロステリック調節部位に対する低い結合親和性又は有効性を有する。別の選択肢として、剤は、すべてのＧＡＢＡＡ受容体上のベンゾジアゼピンアロステリック調節部位を同等の親和性で標的とするが、ＧＡＢＡＡ／α４及びＧＡＢＡＡ／α５受容体上のベンゾジアゼピンアロステリック調節部位に対して、他のＧＡＢＡＡ受容体上のベンゾジアゼピンアロステリック調節部位と比較して優先的な有効性を発揮する。本発明の選択的な剤はまた、ＧＡＢＡＡ／α２及びＧＡＢＡＡ／α３受容体と比較して、他のＧＡＢＡＡ受容体上のベンゾジアゼピンアロステリック調節部位と結合するより高い又はより低い能力も有し得る。
【０１１４】
化合物を評価するための他の方法は、当業者に公知である。化合物の望ましくない副作用（毒性）を評価するために、神経機能又は筋肉機能の障害の明白な徴候について動物がモニタリングされてよい。マウスの場合、最小限の筋肉又は神経の障害を明らかにするために、ロータロッド手順（Dunham, M. S. et al. J. Amer. Pharm. Ass. Sci. Ed. 1957, 46, 208-209）が用いられる。マウスを６回転毎分（ｒｐｍ）の速度で回転するロッド上に置くと、動物は、長時間にわたってその平衡を維持することができる。動物が、回転するロッドから１分間の間に３回落下した場合、化合物は、毒性であると見なされる。ラットの場合、最小限の運動障害は、運動失調によって示され、これは、異常でぎこちない歩行運動として現れる。個々の動物は、歩行運動、平衡、置き直し反応などに特殊性を有する場合があり、それらが試験物質に対する誤差に寄与する可能性があることから、毒性を評価するために用いられるラットは、試験薬物が投与される前に検査される。動物は、円形又はジグザグの歩行運動、異常な体位及び脚を伸ばす動き、振戦、運動亢進、探索行動の欠如、傾眠、昏迷、カタレプシー、置き直し反応の喪失、及び筋緊張の変化を呈し得る。
【０１１５】
本明細書で述べる化合物は、喘息の動物モデルにおいて気道過敏を低減し得る。したがって、マウスは、２ｍｇに乳化させた卵白アルブミン（Ｏｖａ）の２ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を、第０、７、及び１４日に合計１００μＬの体積で３回行うことによって感作され得る。加えて、マウスは、第２３〜２７日の５日間にわたって１ｍｇ／ｋｇ／日のＯｖａによって鼻腔内（ｉ．ｎ．）チャレンジされ得る。コントロールマウスは、Ｏｖａで感作され、生理食塩水でチャレンジされ得る。気道過敏の測定は、特異的気道抵抗（ｓＲａｗ）の計算を可能とする胸部チャンバーと組み合わされた鼻部チャンバーから成るＤＳＩのＢｕｘｃｏ（登録商標）ＦｉｎｅＰｏｉｎｔｅ  Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ａｉｒｗａｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ（ＮＡＭ）測定器を用いて行われ得る。処理済みの意識があり自発的に呼吸しているＯｖａ  Ｓ／Ｃマウスが、エアロゾル化されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ベースライン測定のために）又はメタコリン（１．５６２５〜１２．５ｍｇ／ｍＬ）に１分間曝露されてよく、各噴霧後の３分間にわたって測定値（ｓＲａｗ）が読み取られて平均され得る。
【０１１６】
Ｏｖａ  Ｓ／Ｃマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中における、化合物に起因する特定の免疫細胞の数の変化が調べられ得る。したがって、気管支肺胞洗浄、及び続いて赤血球細胞の溶解が行われ得る。細胞型特異的抗体をＢＡＬＦと共にインキュベートすることによって、好酸球及びＣＤ４＋Ｔリンパ球などの白血球のサイトメトリーを用いた定量が可能となり得る。
【０１１７】
化合物とＣＤ４＋Ｔ細胞との間の直接の相互作用が、電気生理学によって調べられ得る。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、喘息マウスの脾臓から単離されて、自動パッチクランプ実験の過程で化合物を用いて処理され得る。
【０１１８】
Ｏｖａ  Ｓ／Ｃマウスの肺における、化合物に起因するサイトカイン発現の変化が調べられ得る。したがって、処理済み及び未処理の喘息マウスの肺が、採取され、ホモジナイズされ、遠心分離によって透明化され得る。サイトカインは、特異的抗体及びフローサイトメトリーを用いて識別及び定量され得る。
【０１１９】
動物における化合物の薬物動態特性が調べられ得る。したがって、動物は、異なる時間間隔で化合物に曝露され得る。化合物濃度の定量は、特定の調製プロトコル、及びそれに続く質量分析を用いた定量を用いて、血液、肺、及び脳について行われ得る。
【０１２０】
化合物の細胞毒性は、ＨＥＫ２９３ヒト胚腎細胞を増加する濃度の化合物で２４〜４８時間にわたって処理し、続いてＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生細胞を定量することによって評価され得る。
【０１２１】
組成物及び投与経路
別の態様では、本発明は、医薬的に許容されるキャリアと共に本発明の１又は複数の化合物を含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、経口、非経口、鼻腔内、舌下、若しくは直腸内投与用、又は吸入若しくは吹込による投与用の錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液剤若しくは懸濁剤、定量エアロゾル若しくは液体噴霧剤、ドロップ剤、アンプル剤、自動インジェクタ装置、又は坐剤などの単位剤形であってよい。化合物が、薬物の適切な量を連続的に送達するように設計された経皮パッチに組み込まれてよいことも想定される。錠剤などの固体組成物を作製する場合、主活性成分が、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、又はガムなどの従来の打錠成分を例とする医薬キャリア、及び水を例とする他の医薬希釈剤と混合されて、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩の均質な混合物を含有する固体予備調合組成物が形成される。これらの予備調合組成物が均質であると称される場合、それは、活性成分が組成物全体に均一に分散されており、それによって、組成物が、錠剤、丸剤、及びカプセル剤などの同等に有効である単位剤形に容易に細分割することができることを意味する。次に、この固体予備調合組成物は、本発明の活性成分の０．１〜約５００ｍｇを含有している上記で述べた種類の単位剤形に細分割される。典型的な単位剤形は、１、２、５、１０、２５、５０、又は１００ｍｇを例とする１〜１００ｍｇの活性成分を含有している。新規な組成物の錠剤又は丸剤は、剤形に持続的な作用という利点を付与するために、コーティング、又はそうでなければ配合されてよい。例えば、錠剤又は丸剤は、内部用量成分及び外部用量成分を含んでいてよく、後者は、前者の上のエンベロープの形態である。これら２つの成分は、胃での崩壊に耐えるように作用し、内部成分が十二指腸へ無傷で送られるか、又は内部成分の放出が遅延されることを可能とする腸溶層によって分離されていてよい。そのような腸溶層又はコーティングには、様々な材料が用いられてよく、そのような材料としては、いくつかのポリマー酸、並びにポリマー酸とシェラック、セチルアルコール、及び酢酸セルロースなどの材料との混合物が挙げられる。
【０１２２】
経口又は注射投与のために本発明の組成物が組み込まれ得る液体としては、水溶液、適切に風味付けされたシロップ、水性若しくは油性懸濁液、並びに綿実油、ゴマ油、ヤシ油、又はピーナッツ油などの食用油による香味付けされたエマルジョン、さらにはエリキシル剤、及び類似の医薬媒体が挙げられる。水性懸濁液のための適切な分散剤又は懸濁剤としては、トラガカントガム、アラビアガム、アルギネート、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチンなどの合成及び天然のガムが挙げられる。
【０１２３】
適切な用量レベルは、１日あたり約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１日あたり約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は１日あたり約０．０５〜５ｍｇ／ｋｇである。化合物は、１日あたり１〜４回のレジメンで、又は例えば経皮パッチの使用を介した連続ベースで投与されてよい。
【０１２４】
経鼻、頬側、直腸内、舌下、又は特に、経口投与などの腸内投与のための、及び静脈内、筋肉内、皮下、硬膜周囲、硬膜外、又はくも膜下腔内投与などの非経口投与のための医薬組成物が適している。医薬組成物は、およそ１％〜およそ９５％の活性成分、又はおよそ２０％〜およそ９０％の活性成分を含む。
【０１２５】
冠動脈内、脳血管内、又は抹消血管内注射／注入を含む非経口投与の場合、サブユニット選択的ＧＡＢＡＡ受容体作動薬の溶液の使用が好ましく、また、例えば使用の直前に作られてよい懸濁液又は分散体、特に等張性の水溶液、分散体、又は懸濁液の使用も好ましい。医薬組成物は、滅菌されてよく、並びに／又は賦形剤、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤、及び／若しくは乳化剤、可溶化剤、増粘剤、浸透圧調整のための塩、及び／若しくは緩衝剤を含んでよく、従来の溶解及び凍結乾燥プロセスを例とするそれ自体公知である方法で作製される。
【０１２６】
経口医薬製剤の場合、適切なキャリアは、特には、ラクトース、サッカロース、マンニトール、若しくはソルビトールを例とする糖、セルロース製剤、及び／又はリン酸カルシウムなどの充填剤、並びにさらにはデンプン、セルロース誘導体、及び／又はポリビニルピロリドンなどのバインダーであり、並びに／又は、所望される場合、崩壊剤、流動性調節剤（flow conditioners）、及び滑沢剤、例えばステアリン酸若しくはその塩、及び／又はポリエチレングリコールである。錠剤のコアは、適切な、所望に応じて腸溶性であるコーティングを備えていてよい。例えば、識別の目的で、又は活性成分の用量の違いを示すために、染料又は顔料が、錠剤又は錠剤コーティングに添加されてもよい。経口投与用の医薬組成物はまた、ゼラチンから成るハードカプセル、及びさらにはゼラチン、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤から成るシールされたソフトカプセルも含む。カプセルは、顆粒の形態の活性成分、又は油などの適切な液体賦形剤に溶解若しくは懸濁された活性成分を含有してよい。
【０１２７】
例えば１〜２０日間の長期間にわたる投与を可能とする経皮パッチを用いることを例とする経皮投与も考慮される。
使用方法
本発明は、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又は組成物、又はその塩の有効量を投与することを含む、気道狭窄を低減する方法を提供する。ある実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、治療用量でのジアゼパムと比較して、対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用を低減した。ある実施形態では、気道狭窄は麻酔中に発生する。
【０１２８】
本発明はさらに、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又は組成物、又はその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺炎症を低減する方法も提供する。ある実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、治療用量でのジアゼパムと比較して、対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用を低減した。ある実施形態では、肺炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、嚢胞性線維症、肺線維症、気管支拡張症、線維性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症、内因性肺胞炎（intrinsic alveolitis）、又は感染症に伴う。感染症は、適切には、ウィルス、細菌、及び／又は真菌の病原体によって引き起こされる。
【０１２９】
患者の肺炎症は、肺機能の障害、息切れ、特に激しい活動若しくは運動に伴う息切れ、咳、又は努力呼吸によって明らかとなり得る。炎症性肺疾患の診断のために、胸部ｘ線、ＣＴスキャン、及び肺機能検査を含む広く様々な診断ツールが用いられる。肺機能及び運動検査は、炎症によって損なわれた肺容量を特定するために用いられ得る。より確定的な炎症の診断のためには、肺からの組織サンプルが採取され得る。これは、気管支鏡検査（経気管支生検）又は気管支肺胞洗浄又は外科的肺生検を用いて採取され得る。組織学的には、炎症は、痰及び気管支肺胞洗浄液又は肺実質又は気道におけるマクロファージ、リンパ球、又は多形核細胞の数の増加を示し得る。免疫／炎症細胞の肺への遊走及び活性化は、様々な炎症細胞及び常在細胞によって分泌されるプロテアーゼ、サイトカイン、及びケモカインを含む様々な異なるメディエーターによって制御される。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又は組成物、又はその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、肺炎症に関連するリスク因子を有する対象における疾患の発症を低減する方法を提供する。ある実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、治療用量でのジアゼパムと比較して、対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用を低減した。
【０１３１】
数多くの因子が、炎症性肺疾患発症の可能性を高め得る：低出生体重、喘息などの病状を患う血族を有すること（したがって、遺伝的素因）、特定の遺伝子変異の存在（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（cystic fibrosis transmembrane conductor regulator）（ＣＦＴＲ）遺伝子の場合など）、肥満、喫煙若しくは煙への曝露（子宮内曝露を含む）、排気ガス若しくは他の種類の環境汚染への曝露、又は工業用若しくは農業用化学物質への曝露。
【０１３２】
ある実施形態では、肺炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、嚢胞性線維症、肺線維症、気管支拡張症、線維性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症、内因性肺胞炎、又は感染症に伴う。感染症は、適切には、ウィルス、細菌、及び／又は真菌の病原体によって引き起こされる。
【０１３３】
本発明はさらに、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又は組成物、又はその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、自己免疫性疾患を患う対象において炎症を低減する方法も提供する。ある実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物は、治療用量でのジアゼパムと比較して、対象におけるベンゾジアゼピン型ＣＮＳ作用を低減した。ある実施形態では、自己免疫性疾患は、関節炎、糖尿病、ループス、及びクローン病から選択される。
【０１３４】
以下の限定されない例は、ある態様及び実施形態の単なる実例であることを意図しており、本開示に従って行われた具体的な実験を示すものである。
実施例
例１．（Ｒ）−８−エチニル−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸）の合成
化合物７（２．０ｇ、５．１６ｍｍｏｌ）をエタノール（１００ｍＬ）中で撹拌し、３Ｍの水酸化ナトリウム（２０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を加熱して１時間還流した。次に、反応溶液を室温まで冷却し、水（１００ｍＬ）で希釈した。溶液を、溶媒の残りが半分となるまで減圧下に置いた。残った反応混合物を室温で撹拌し、塩酸（１Ｍ）を、生成物が析出するまで室温で滴下した。生成物をろ過し、水でリンスし、乾燥して、純粋な酸ＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸を白色固体として得た（収率８１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．４２（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．５６（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．８，６．５Ｈｚ），７．３３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．２２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），６．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５１（ｓ，１Ｈ），１．１６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．７６，１６２．８１，１５８．１９，１４０．５７，１３６．５７，１３５．５４，１３４．７４，１３３．１８，１３２．６５，１３１．８８，１２９．８８，１２９．３５，１２５．１７，１２３．９８，１２１．０９，１１６．５３，１１６．２５，８３．４２，８２．０１，４９．７９，１５．０８；ＨＲＭＳ（ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ）Ｃ２１Ｈ１４ＦＮ３Ｏ２に対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ３６０．１１４３，実測値  ３６０．１１４０。
【０１３５】
例２．（Ｒ）−８−ブロモ−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩ−９３）の合成
化合物４（５．１ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）に溶解し、その後、固体ＮａＯＨ（０．９ｇ、２３ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。この反応混合物を、７０℃に１時間加熱し、ＥｔＯＨを減圧除去した。残った水溶液を、０℃で１０分間にわたって撹拌し、次に１０％のＨＣｌ水溶液を、ｐＨが５（ｐＨ試験紙）となるまで溶液に滴下した。形成した淡白色の析出物を、溶液中に１０分間放置し、次にろ過によって回収した。この固体を冷水で洗浄し、水層も室温で１０時間放置して、追加の酸を得た。１つにまとめた固体を、真空オーブン中、８０℃で７時間乾燥して、純粋なＧＬ−ＩＩ−９３を白色粉末として得た（４ｇ、９．７ｍｍｏｌ、８５．２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１２（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５０−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．２５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０７−６．９９（ｍ，１Ｈ），６．７８（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），１．２７（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １６４．９４，１６２．８７，１６１．０９，１５９．０９，１４１．２８，１３５．０４，１３４．９１，１３３．５９，１３３．０８，１３２．５１，１３２．１２，１３１．３４，１３１．１１，１２９．３８，１２８．１６，１２４．５７，１２３．９１，１２０．４０，１１６．３０，１１６．１３，４９．８３，１４．９１；ＨＲＭＳ（ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ）Ｃ１９Ｈ１３Ｎ３Ｏ２ＦＢｒに対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ４１４．０２４８，実測値  ４１４．０２３５。
【０１３６】
例３．（Ｒ）−８−シクロプロピル−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩＩ−４３）の合成
化合物４（２．１ｇ、４．８ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）に溶解した。シクロプロピルボロン酸（１．０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）及び水（１．５ｍＬ）をこの混合物に添加した。還流冷却管を取り付け、混合物を、真空下、アルゴンで脱気し、このプロセスを４回繰り返した。ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（ＩＩ）アセテート（０．７２ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）及びＫ３ＰＯ４を反応混合物に添加し、アルゴン／真空による脱気をさらに４回行った。次に、反応混合物を、アルゴン下で加熱して還流し、３時間撹拌した。反応混合物を、冷水を添加することによって反応停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を１つにまとめ、塩水（２×１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を減圧除去して、褐色固体を得た。この粗固体を、カラムクロマトグラフィ（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン  ５：５）で精製して、純粋な化合物５をオフホワイト色固体として得た（１．２ｇ、３．０ｍｍｏｌ、６５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８８（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄ，Ｊ＝１３．３，５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄｄ，Ｊ＝１２．９，６．１Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｄｄ，Ｊ＝１８．９，９．９Ｈｚ，２Ｈ），６．６４（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４５−４．２５（ｍ，２Ｈ），１．９１−１．７８（ｍ，１Ｈ），１．３８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．０４−０．８８（ｍ，２Ｈ），０．５９（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １６４．１７，１６３．１２，１６１．１２，１５９．１２，１４３．８８，１４１．５８，１３４．８５，１３２．０９，１３１．６５，１３１．２１，１２９．１６，１２９．０４，１２８．４７，１２７．８７，１２４．３３，１２１．９５，１１６．０８，１１５．９１，６０．５９，５０．０５，１５．０４，１４．６４，１４．４４，９．９１，９．８９；ＨＲＭＳ（ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ）Ｃ２４Ｈ２２Ｎ３Ｏ２Ｆに対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ４０４．１７６９，実測値４０４．１７６３。
【０１３７】
ＧＬ−ＩＩＩ−４３を、前の手順でＧＬ−ＩＩ−９３に対して概略的に述べた一般手順に従って化合物５から作製し、白色固体としてＧＬ−ＩＩＩ−４３を得た（０．６２ｇ、１．７ｍｍｏｌ、７５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．３４（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５８−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｓ，１Ｈ），６．５０（ｑ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），１．９３（ｍ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），１．１３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．９５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），０．６１（ｍ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ）Ｃ２２Ｈ１８Ｎ３Ｏ２Ｆに対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ３７６．１４５６，実測値３７６．１４５３。
【０１３８】
例４．（Ｒ）−８−クロロ−６−（２−フルオロフェニル）−４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩＩ−５４）の合成
ＧＬ−ＩＩＩ−５４を、上記で報告した一般手順に従って化合物８から作製し、白色固体として得た（０．９３ｇ、２．５ｍｍｏｌ、８５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．４１（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｔ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６５−７．５２（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２７−７．１４（ｍ，２Ｈ），６．５６（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），１．１７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ）Ｃ１９Ｈ１３Ｎ３Ｏ２ＦＣｌに対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ３７０．０７５３，実測値３７０．０７５２。
【０１３９】
例５．（Ｒ）−８−ブロモ−４−メチル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩ−５１）の合成
ＧＬ−ＩＩ−５１を、上記で報告した一般手順に従って化合物９から作製し、白色固体として得た（０．８７ｇ、２．２ｍｍｏｌ、６２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．５１（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９８−７．８９（ｍ，２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｍ，２Ｈ），６．５４（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），１．１７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ）Ｃ１８Ｈ１３Ｎ４Ｏ２Ｂｒに対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ３９７．０２９５，実測値３９７．０２９９。
【０１４０】
例６．（Ｒ）−８−エチニル−４−メチル−６−（ピリジン−２−イル）−４Ｈ−ベンゾ［ｆ］イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ジアゼピン−３−カルボン酸（ＧＬ−ＩＩ−３０）の合成
ＧＬ−ＩＩ−３０を、上記で報告した一般手順に従って化合物１０から作製し、白色固体として得た（１．０６ｇ、３．１ｍｍｏｌ、６０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．５７（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄｄ，Ｊ＝２７．８，１３．９Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．３１（ｍ，１Ｈ），６．７２（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１５（ｓ，１Ｈ），１．２５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ）Ｃ２０Ｈ１４Ｎ４Ｏ２に対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ３４３．１１９０，実測値３４３．１１８８。
【０１４１】
例７．（Ｓ）−７−メトキシ−１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−９−オン（ＲＪ−０３−５７）の合成
ＤＩＢＡＬ−Ｈ（１．２Ｍ、６．２ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中のナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０．７６ｇ、７．９ｍｍｏｌ）の溶液へ、０℃で添加した。得られた混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌した。次に、化合物１５（１．５ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を、０℃で上記溶液に添加し、アルゴン雰囲気下、室温で３時間（又は１５が完全に消費されるまで）撹拌した。その後、濃ＮＨ３（２８％、２０ｍＬ）及びＩ２（４．５７ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、得られた混合物を、室温で３時間撹拌した。アルデヒド中間体が完全に消滅した後、反応混合物を、チオ硫酸ナトリウムの飽和溶液（約１０ｍＬ）で処理し、酢酸エチルで抽出した（３×３０ｍＬ）。１つにまとめた有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ（７０％、ヘキサン中の酢酸エチル）で精製して、ニトリル１７を白色固体、１．２２５ｇ、９５％として得た。この時点で、３０ｍＬのテトラヒドロフラン中のニトリル１７（０．２９５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液へ、ＺｎＢｒ２（０．３４ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）及びＮａＮ３（７８ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を、３６時間（又は１７が完全に消費されるまで）加熱して還流した。この溶液を、１ＭのＨＣｌで処理して、固体物質を溶解し、溶液のｐＨを１とした。溶液を酢酸エチルで抽出した（４×４０ｍＬ）。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を、ジクロロメタン中の７％メタノールでシリカの短パッドに通して、１９６ｍｇのＲＪ−０３−５７、５８％を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．９６−２．１４（ｍ，２Ｈ），２．２３−２．４０（ｍ，１Ｈ），３．４０−３．５０（ｍ，１Ｈ），３．５−３．６６（ｍ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．９６−４．１０（ｍ，１Ｈ），４．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３４Ｈｚ），７．３１−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．６０（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ２４．７，２７．９，４６．６，５２．３，５６．３，１１５．１，１１９．２，１２３．５，１２６．０，１２６．５，１３０．９，１３７．７，１５５．４，１５９．３，１６３．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ−Ｈ）Ｃ１６Ｈ１６Ｎ７Ｏ２に対する計算値３３６．１３６０；実測値３３６．１３５７。
【０１４２】
例８．（Ｓ）−Ｎ，７−ジメトキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシアミド（ＭＲＳ−ＩＩＩ−８７）の合成
化合物１６（０．１５ｇ）、塩化チオニル（１ｍＬ）、及び乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）の混合物を、オーブン乾燥した丸底フラスコにアルゴン下で投入した。この懸濁液を、アルゴン雰囲気下、５２℃（外側のオイルバス温度は６０℃であった）で１時間還流させた。溶液は黄色透明となった。出発物質が存在しないことを、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）（シリカゲル）で溶液を調べることによって確認した。有機溶媒及び過剰の塩化チオニルを減圧除去した。乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）によるこのフラッシュ蒸発を２回繰り返して、過剰の塩化チオニル及びいずれのＨＣｌをも除去した。得られた黄色残渣を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解し、アルゴン下で１０分間０℃に冷却した。次に、メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２．５当量）、続いてトリエチルアミン（５当量）を、０℃で反応混合物に添加し、次にこの混合物を室温に戻し、４時間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣ、シリカゲル）、溶媒を減圧除去し、アセトン（４ｍＬ）を残渣に添加した。ろ過によって塩を除去し、溶媒を減圧除去して、ＭＲＳ−ＩＩＩ−８７を収率７０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２．１４−２．２２（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．３９（ｍ，１Ｈ），３．０８−３．１０（ｍ，１Ｈ），３．５１−３．５７（ｍ，１Ｈ），３．７５−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），４．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２．７Ｈｚ），７．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），７．６９（ｓ，１Ｈ），９．８４（ｂｓ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ，相対強度（ＥＳＩ），Ｃ１７Ｈ１７Ｎ４Ｏ４に対する計算値（Ｍ−Ｈ）＋  ３４１．３５；実測値  ３４１．００。
【０１４３】
例９．（Ｓ）−Ｎ−シアノ−７−メトキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシアミド（ＭＲＳ−ＩＩＩ−９０）の合成
化合物１６（０．１５ｇ）、塩化チオニル（１ｍＬ）、及び乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）の混合物を、オーブン乾燥した丸底フラスコにアルゴン下で投入した。この懸濁液を、アルゴン雰囲気下、５２℃（外側のオイルバス温度は６０℃であった）で１時間還流させた。溶液は黄色透明となった。出発物質が存在しないことを、ＴＬＣ（シリカゲル）で溶液を調べることによって確認した。有機溶媒及び過剰の塩化チオニルを減圧除去した。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）によるこの蒸発を数回繰り返して、過剰の塩化チオニル及びいずれのＨＣｌをも除去した。得られた黄色残渣を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解し、アルゴン下で１０分間０℃に冷却した。メチルシアナミド（２．５当量）、続いてトリエチルアミン（５当量）を、０℃で反応混合物に添加し、次にこの混合物を室温に戻し、５時間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣ、シリカゲル）、溶媒を減圧除去し、アセトン（４ｍＬ）を残渣に添加した。ろ過によって塩を除去し、溶媒を減圧除去して、ＭＲＳ−ＩＩＩ−９０を収率７０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ２．１０−２．１３（ｍ，２Ｈ），３．３４−３．５８（ｍ，３Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），４．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，メジャー回転異性体８３％），４．８４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，マイナー回転異性体，１７％），７．２７−７．２９（ｍ，１Ｈ，メジャー回転異性体），７．３１−７．３３（ｍ，マイナー回転異性体），７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，メジャー回転異性体），７．４１（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，マイナー回転異性体），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，メジャー回転異性体），７．６４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，マイナー回転異性体），８．００（ｓ，１Ｈ，メジャー回転異性体），８．２１（ｓ，マイナー回転異性体），９．４９−１０．１１（ｂｓ，１Ｈ）；ＬＣＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ，相対強度（ＥＳＩ），Ｃ１７Ｈ１４Ｎ５Ｏ３に対する計算値（Ｍ−Ｈ）＋  ３３６．３３；実測値  ３３６．００。
【０１４４】
例１０．（Ｓ）−エチル−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシレート（ＲＪ−０２−５０）の合成：
オーブン乾燥した丸底フラスコに、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）を投入し、０℃に冷却した。次に、ＡｌＣｌ３（３ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）及びエタンチオール（４．５ｍｌ、６０．８ｍｍｏｌ）を、上記フラスコに０℃でゆっくり添加した。アイスバスを取り外し、反応液を室温まで戻した。ＡｌＣｌ３が完全に溶解した後、エステル１５（２．６ｇ、７．６２ｍｍｏｌ）を室温でこの混合物に添加し、Ａｒ下で２４〜３６時間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣ、シリカゲル）、溶液を氷上に注ぎ、２ＮのＨＣｌ水溶液を用いて酸性化した。溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２で５〜７回、酢酸エチルで３〜４回、別々に抽出した。１つにまとめた有機層を塩水で洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を減圧除去し、残渣を、［シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中の４％メタノール］でのフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製して、ＲＪ−０２−５０を固体（２．１ｇ）として収率８４％で得た。融点＝＞２６０℃（分解）：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １．４４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．１９−２．４２（ｍ，３Ｈ），３．５５−３．６４（ｍ，２Ｈ），３．８１−３．８９（ｍ，１Ｈ），４．４２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２．６Ｈｚ），７．２７−７．３１（ｍ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），９．２２（ｓ，１Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １４．３，２４．４，２８．４，４６．９，５３．８，６１．２，１１７．５，１２０．８，１２４．９，１２５．２，１２７．７，１２９．５，１３６．０，１３７．２，１５７．６，１６２．８，１６４．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｈ）＋  Ｃ１７Ｈ１８Ｎ３Ｏ４に対する計算値３２８．１２９２；実測値３２８．１２９３。
【０１４５】
例１１．（Ｓ）−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボン酸（ＲＪ−０３−９０）の合成
ＲＪ−０２−５０（１．５２ｇ，４．６ｍｍｏｌ）を、エタノール（４ｍＬ）及びＨ２Ｏ（３ｍＬ）の混合物に溶解し、その後、固体ＮａＯＨ（１．０ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加した。この反応混合物を、５０℃に１５分間加熱し、エタノールを減圧除去した。残った水溶液を、０℃で１０分間にわたって撹拌し、次に濃ＨＣｌを、ｐＨが３〜４（ｐＨ試験紙）となるまで溶液に滴下した。形成された淡黄色析出物を溶液中に残したままとし、この混合物を、室温で２時間撹拌した。析出物を、ろ過によって回収し、冷水（２〜５ｍＬ）で洗浄し、水層も室温で１０時間放置して、追加のＲＪ−０３−９０を得た。１つにまとめた固体を、真空オーブン中、８０℃で７時間乾燥して、純粋なＲＪ−０３−９０を収率６５％で得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ２．１４−２．２９（ｍ，３Ｈ），３．５０−３．６３（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．７８（ｍ，１Ｈ），４．９５（ｄ，１Ｈ，溶媒ピークと重複），７．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，３．０Ｈｚ），７．３８−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７６Ｈｚ），８．４８（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ２４．０，２７．７，４６．２，５３．４，１１６．２，１１９．８，１２４．５，１２５．４，１２８．４，１３０．２，１３６．２，１３７．５，１５８．２，１６２．５，１６４．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｈ）＋  Ｃ１５Ｈ１４Ｎ３Ｏ４に対する計算値３００．０９７９；実測値３００．０９９０。
【０１４６】
例１２．（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−７−ヒドロキシ−９−オキソ−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−１−カルボキシレート（ＲＪ−０２−６７）の合成：
火炎乾燥した丸底フラスコに、乾燥テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）を投入し、リチウム棒（過剰量、小片に切断）を添加した。乾燥ｔｅｒｔ−ブタノール（２．６ｍＬ、２７．１ｍｍｏｌ）を、室温で上記フラスコに添加し、得られた混合物を、Ａｒ下、ｔｅｒｔ−ブタノールが完全に反応するまで４５〜５０℃に加熱した。この調製したばかりのリチウムｔｅｒｔ−ブトキシド溶液を、ＲＪ−０２−５０（１．０ｇ、２．７１ｍｍｏｌ）を投入した別の火炎乾燥した丸底フラスコに、カニューレを用いて注意深く移し、Ａｒ下、５０℃で３０分間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣ、シリカゲル）、フラスコを室温まで冷却し、テトラヒドロフランを減圧除去した。氷水（１０ｍＬ）を残渣に添加し、次にこれを酢酸エチルで抽出した。有機層を、水（２×１０ｍＬ）及び塩水（１５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を減圧除去し、残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ［シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン（７：３）］によって精製して、ＲＪ−０２−６７を固体（０．７２ｇ）として収率６５％で得た。融点＝１７４〜１７５℃：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １．６３（ｓ，９Ｈ），２．０９−２．３４（ｍ，３Ｈ），３．５０−３．６２（ｍ，２Ｈ），３．７７−３．８５（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），７．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２．２Ｈｚ），７．２３−７．２８（ｍ，１Ｈ），７．７７（ｂｓ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），９．７５（ｂｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２４．４，２８．２，２８．３，４６．９，５３．７，８２．０，１１７．４，１２０．７，１２４．９，１２５．１，１２９．１，１２９．６，１３５．８，１３６．２，１５７．７，１６２．３，１６４．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｈ）＋  Ｃ１９Ｈ２２Ｎ３Ｏ４に対する計算値３５６．１６０５；実測値３５６．１６１５。
【０１４７】
例１３．（Ｓ）−７−ヒドロキシ−１−（オキサゾール−５−イル）−１１，１２，１３，１３ａ−テトラヒドロ−９Ｈ−ベンゾ［ｅ］イミダゾ［５，１−ｃ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−９−オン（ＲＪ−０３−３０）の合成：
ＤＩＢＡＬ−Ｈ（１Ｍ、２０．４ｍＬ、２０．４ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中のナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２．０２ｇ、２１．０２ｍｍｏｌ）の溶液へ、０℃で添加した。得られた混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌した。次に、化合物１５（４ｇ、１１．７２ｍｍｏｌ）を、０℃で上記溶液に添加し、アルゴン雰囲気下、室温で３時間（又は１５が完全に消費されるまで）撹拌した。反応の完了後、メタノール（約１５ｍＬ）、続いて５％ＨＣｌ水溶液（２０〜３０ｍＬ）を０℃で注意深く添加することによって過剰のＤＩＢＡＬ−Ｈを失活させた。この後、得られた混合物を室温に戻した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（２×５０ｍＬ）。１つにまとめた有機層を塩水で洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を減圧除去して、粗アルデヒドを得た。この残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（２：１  酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、純粋なジアゼピンアルデヒド１８を白色固体として得た（３．３２５ｇ、９３％）。
【０１４８】
トルエンスルホニルメチルイソシアニド、ＴｏｓＭＩＣ（３．２８ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）を、乾燥二口丸底フラスコに入れ、アルゴン雰囲気下、乾燥メタノール（４０ｍＬ）に溶解した。Ｋ２ＣＯ３（４．６４ｇ、３３．５７ｍｍｏｌ）を、さらにはアルデヒド１８（３．３２５ｇ、１１．１８ｍｍｏｌ）を室温で反応混合物に添加し、これを加熱して３時間還流した。ＴＬＣ（シリカゲル  酢酸エチル）によって示される反応の完了後、反応混合物を冷水で反応停止した。この後、溶媒の１／３を減圧除去し、酢酸エチルで抽出した（３×２０ｍＬ）。１つにまとめた有機層を水及び塩水で順に洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。次に、溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィによって精製して、純粋なオキサゾール１９を白色固体として得た（２．８３ｇ、７５％）。
【０１４９】
オーブン乾燥した丸底フラスコに、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を取り、０℃に冷却した。次に、ＡｌＣｌ３（３．３３ｇ、２４．９７ｍｍｏｌ）及びエタンチオール（５．０ｍｌ、６７．５２ｍｍｏｌ）を、上記フラスコに０℃でゆっくり添加した。アイスバスを取り外し、反応液を室温まで戻した。ＡｌＣｌ３が完全に溶解した後、１９（２．８ｇ、８．３２ｍｍｏｌ）を室温でこの混合物に添加し、Ａｒ下で２４〜３６時間撹拌した。反応の完了後（ＴＬＣ、シリカゲル）、溶液を氷に注ぎ、２ＮのＨＣｌ溶液を用いて酸性化した。溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２で５〜７回、酢酸エチルで３〜４回、別々に抽出した。１つにまとめた有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を減圧除去し、残渣を、［シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中の４％メタノール］でのフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製して、ＲＪ−０３−３０を固体（２．３６ｇ）として収率８８％で得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １．９７−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．２５−２．３５（ｍ，１Ｈ），２．６５−２．７３（ｍ，１Ｈ），３．６３−３．７１（ｍ，１Ｈ），３．７６−３．８４（ｍ，１Ｈ），４．８４−４．８８（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６，２．２Ｈｚ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．４０（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ），７．９５（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），９．８５（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２３．９，２７．８，４７．２，５２．８，１１７．６，１２０．８，１２３．５，１２４．７，１２５．３，１２６．２，１２９．３，１３１．９，１３６．５，１４５．４，１５０．９，１５７．５，１６４．８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｍ＋Ｈ）＋  Ｃ１７Ｈ１５Ｎ４Ｏ３に対する計算値３２３．１１３９；実測値３２３．１１３０。
【０１５０】
例１４．ＧＡＢＡＡＲサブタイプ選択性の特定
α４及びα５−ＧＡＢＡＡＲに対して選択的活性バイアスを有する化合物を識別することができる。パッチクランプアッセイを用いて、単一のα−サブユニットを含有するＧＡＢＡＡＲのアゴニズムに起因する塩化物イオン流に誘導される内向き電流を定量する。これらの結果から、ＧＡＢＡＡＲ受容体−リガンド相互作用の機能的活性を微細に区別可能であることを実証することができる。アフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学実験では（Ramerstorfer et al. European journal of pharmacology 2010, 636, 8-27）、成体の雌アフリカツメガエル（Ｎａｓｃｏ、フォートアトキンソン、ウィスコンシン州、米国）を、氷冷した０．１７％のＴｒｉｃａｉｎ（エチル−ｍ−アミノベンゾエート）バス中で麻酔し、その後、断頭し、このカエルの卵巣をＮＤ９６培地（９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．５）に移した。１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）中で３０分間のインキュベーションに続いて、ステージ５から６の卵母細胞を卵巣から選び出し、白金ワイヤループを用いて濾胞除去した。卵母細胞を、１００Ｕ・ｍＬ−１のペニシリン、１００μｇ・ｍＬ−１のストレプトマイシン、及び２．５ｍＭのピルビン酸塩を添加したＮＤＥ培地（９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２；ｐＨ７．５）中に１８℃で保存し、インキュベートした。卵母細胞にｍＲＮＡの水溶液を注入した。卵母細胞あたり合計で２．５ｎｇのｍＲＮＡを注入した。サブユニット比は、αｘβ３γ２（ｘ＝１、２、３、５）受容体の場合は１：１：５、α４β３γ２受容体の場合は３：１：５であった。注入された卵母細胞は、電気生理学記録の前に、少なくとも３６時間インキュベートした。卵母細胞を、ＮＤＥ培地のバス中のナイロングリッド上に置いた。電流測定のために、２ＭのＫＣｌを充填した２つのマイクロ電極（２〜３ＭΩ）を卵母細胞に刺入した。卵母細胞を、ＧＡＢＡ及び／又は薬物を含有するＮＤＥに切り替え可能である６ｍＬ・分−１のＮＤＥ流によって洗浄し続けた。薬物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液からＮＤＥ中に希釈し、０．１％ＤＭＳＯの最終濃度とした。ｍＲＮＡ注入卵母細胞で測定された最大電流は、すべての受容体サブタイプにおいてマイクロアンペアの範囲であった。化合物によるＧＡＢＡ誘導電流の変化を試験するために、個々の卵母細胞の対応する最大ＧＡＢＡ誘導電流の３〜５％（ＥＣ３〜５）を引き起こすように滴定されたＧＡＢＡ濃度を、様々な濃度の試験化合物と一緒に細胞に適用した。記録はすべて、Ｗａｒｎｅｒ  ＯＣ−７２５Ｃ  ＴＥＶ（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ハムデン、コネチカット州、米国）、又はＤａｇａｎ  ＣＡ−１Ｂ  Ｏｏｃｙｔｅ  Ｃｌａｍｐ、又はＤａｇａｎ  ＴＥＶ−２００Ａ  ＴＥＶ（Ｄａｇａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を用い、−６０ｍＶの保持電位において室温で行った。データは、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａ又は１５５０データ取得システム（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ユニオンシティ、カリフォルニア州、米国）を��いてデジタル化し、Ｃｌａｍｐｅｘ  １０．５ソフトウェアを用いて記録し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア州、米国）、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  １０．５及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ラホヤ、カリフォルニア州、米国）を用いて分析した。濃度−応答データを、Ｈｉｌｌ方程式を用いてフィッティングした。データは、２つのバッチの少なくとも３つの卵母細胞から、平均±ＳＥＭで得られる。別の選択肢として、化合物のα４及びα５−ＧＡＢＡＡＲに対する選択性は、自動パッチクランプアッセイによって識別することもできる。したがって、パッチクランプアッセイでは：α１β３γ２  ＧＡＢＡＡＲ又はα４β３γ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔを、１０％（体積／体積）のウシ胎仔血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で維持した（Forkuo et al., Molecular Pharmaceutics 2016, 13, 2026-38）。簡潔に述べると、ＩｏｎＦｌｕｘのプレートレイアウトは、１２ウェルのユニットから成り、２つのウェルは、細胞内液（ＩＣＳ、１４０ｍＭのＣｓＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有、ＣｓＯＨによりｐＨ７．２）を含有し、１つのウェルは、細胞外液（ＥＣＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＤ−グルコース一水和物、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有、ＮａＯＨによりｐＨ７．４）に希釈した細胞を含有し、８つのウェルは、０．１％ＤＭＳＯでのＧＡＢＡ（ＥＣ２０濃度）の存在下、異なる濃度の１を含有する。ウェル１は、廃液回収用である。細胞は、陰圧を掛けることによって、懸濁液からアンサンブル記録アレイの微細チャネルに捕捉される。アレイがすべて占有されると、掛けられた陰圧が捕捉した細胞の膜を破壊し、ホールセル電圧固定が確立される。化合物の適用については、適切な化合物ウェルに圧力が掛けられ、それが、細胞上を高速で流れている細胞外液中に化合物を導入する。ＧＡＢＡＡＲ誘導電流の記録については、細胞アレイを、−８０ｍＶの過分極保持電位で電圧固定した。自動パッチクランプでの使用の前に、細胞を３８０ｇで５分間遠心分離し、ＥＣＳに緩やかに再懸濁させた。これをさらに２回繰り返した後、細胞をプレートに分配した。化合物の適用はすべて３秒間で行い、続いて５秒間の洗浄を行った。
【０１５１】
図１Ａ及び１Ｂは、ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプ選択性を示す。図１Ａでは、ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプα１β３γ２、α２β３γ２、α３β３γ２、α４β３γ２、及びα５β３γ２を発現するアフリカツメガエル卵母細胞上でのＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸によるＧＡＢＡ（ＥＣ３〜５濃度）誘導電流の用量依存的調節。データ点は、化合物の非存在下におけるコントロール電流（１００％）に対して標準化した２バッチからの２〜８つの卵母細胞からの平均±ＳＥＭを表す。ＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸は、正のα５β３γ２選択的ＧＡＢＡＡ受容体モジュレーターである。図１Ｂは、ＲＪ−０２−５０を用いた自動パッチクランプを示す。α１β３γ２又はα４β３γ２ＧＡＢＡＡＲを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた、ＥＣ２０濃度のＧＡＢＡ及び一緒に３秒間適用された増加する濃度の化合物１の存在下における濃度依存的な負の電流応答。負の電流読み取りは、１００％（ｎ＝１６）に設定したＥＣ２０濃度のＧＡＢＡ応答に対して標準化した。ＲＪ−０２−５０は、正のα４β３γ２選択的ＧＡＢＡＡ受容体モジュレーターである。
【０１５２】
例１５．化合物の細胞毒性の特定
生体外細胞毒性アッセイを用いて、増加した細胞毒性を有する化合物を識別することができる。したがって、ヒト胚性腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株を購入し（ＡＴＣＣ）、７５ｃｍ２フラスコ（ＣｅｌｌＳｔａｒ）で培養した。細胞を、非必須アミノ酸（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３０２３８．０１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３０２２３７．０１）、５×１０６ユニットのペニシリン及びストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＶ３００１０）、並びに１０％の熱失活ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２１４７）を添加したＤＭＥＭ／高グルコース（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３０２４３０１）培地で増殖させた。０．０５％のトリプシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３０２３６０１）を用いて細胞を回収した。細胞生存アッセイは、ルシフェラーゼ及びＡＴＰ以外のそのすべての基質を含有するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光細胞生存アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウィスコンシン州）を用いて評価した。用いた細胞毒性アッセイのコントロールは、（Ｅ）−１０−（ブロモトリフェニルホスホラニル）デシル４−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）−４−オキソブタ−２−エノエート（ＤＭＳＯ中の４００μＭ、ポジティブコントロール）及びＤＭＳＯ（ネガティブコントロール）とした。発光の読み取りはすべて、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００プレートリーダーを用いて行った。少量の移送は、１００ｎＬピンツール移送装置（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯリキッドハンドリングシステムで行った。９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３３６５）で段階希釈を行い、アッセイは、３８４ウェル白色オプティカルボトムプレートで行った。アッセイは、４つの反復サンプルで、３回の独立した実験で行った。データは、コントロールに対して標準化し、可能である場合は、非線形回帰によって分析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）。
【０１５３】
【表１】
2019528267.tif 000021
【０１５４】
例１６．化合物によって誘導されたＣＮＳ作用を特定するためのロータロッドアッセイ
血液脳関門を透過して、マウスの感覚運動技能を調節するＣＮＳ作用を誘導する能力を有する化合物を、ロータロッドを用いて識別することができる。雌のスイスウェブスターマウスを、ロータロッド装置（Ｏｍｎｉｔｅｃｈ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ノバスコシア、カナダ）上で１５ｒｐｍの一定速度でバランスを保つように、マウスが３回の連続する時間点で３分間行うことができるまで訓練した。マウスの別々の群に、媒体（１０％ＤＭＳＯ、４０％プロピレングリコール、及び５０％ＰＢＳ）中の化合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、又は媒体（２％ヒドロキシプロピルメチルセルロース及び２．５％ポリエチレングリコール）中での強制経口投与（ｐ．ｏ．）を、適切な体積である１００μｌで施した。各注射の１０分後、３０分後、及び６０分後に、マウスを３分間ロータロッドに置いた。３分間の前にマウスがロータロッドから落下した場合は、その時間を記録し、マウスの群で平均した。独立ｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１における有意差を判定した。図２は、感覚運動協調に対する化合物の効果を示す。スイスウェブスターマウスを、化合物曝露の１０分後、３０分後、及び６０分後に、１５ｒｐｍで３分間のロータロッドで試験した。マウス（Ｎ＝１０）に、試験化合物の単一注射（ｉ．ｐ．又はｐ．ｏ．）を施した。３分までに落下した場合は、落下時間を記録した。データは、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝１０）で表す。スチューデントｔ検定を用いて、有意差：媒体処理マウスと比較した有意差＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、又は＊＊＊（ｐ＜０．００１）、を算出した。調べた化合物はいずれも、試験した濃度において感覚運動障害をまったく誘導しなかった。
【０１５５】
例１７．化合物のミクロソーム安定性
生体内での化合物の代謝安定性を、肝臓ミクロソームの存在下での化合物の安定性によって推定することができる。したがって、最終濃度１０μＭの試験化合物の１ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液の４μＬを、デジタルヒーティングシェイキングドライバス（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）上において、２８２μＬの水、８０μＬのリン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ  ７．４）、２０μＬのＮＡＤＰＨ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）、及び４μＬのＮＡＤＰＨ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンノゼ、カリフォルニア州）を含有する混合物中の合計体積３９１．２μＬで、３７℃で５分間予備インキュベートした。予備インキュベーションの後、０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度のヒト肝臓ミクロソーム（ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ、サンノゼ、カリフォルニア州）又はマウス肝臓ミクロソーム（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックフォード、イリノイ州）のいずれかの８．８μＬを添加することによって反応を開始した。０分（ミクロソームなし）、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、及び６０分の時間間隔で５０μＬのアリコートを取った。各アリコートを、１μＭのベラパミルＨＣｌを内標準として含有する１００μＬの冷アセトニトリル溶液に添加した。続いて、１０秒間の超音波処理、及び１００００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。上澄の１００μＬをＳｐｉｎ−Ｘ  ＨＰＬＣフィルターチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ニューヨーク州）に移し、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ろ液を、１００倍に希釈し、続いて、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳ  ８０４０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コロンビア、メリーランド州）を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。内標準及び試験化合物のピーク面積比を、すべての時間点で算出し、その比の自然対数を時間に対してプロットして、直線の傾き（ｋ）を特定した。代謝速度（ｋ＊Ｃ０／Ｃ）、半減期（０．６９３／ｋ）、及び内部クリアランス（Ｖ＊ｋ）を算出し、ここで、ｋは、傾き、Ｃ０は、試験化合物の初期濃度、Ｃは、ミクロソームの濃度、及びＶは、ｍｇ単位のミクロソームタンパク質あたりのμＬ単位のインキュベーション体積である。実験はすべて、３つの反復サンプルで２回繰り返した。
【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
例１８．モルモット気道平滑筋の化合物による緩和
すべての実験は、コロンビア大学ＩＡＣＵＣの承認後に行った。成体の雄ハートレーモルモットを、腹腔内ペントバルビタール投与（１００ｍｇ／ｋｇ）によって安楽死させた。気管を外科切除し、２つの軟骨輪を含有する断面に切断した。軟骨輪を、少なくとも５回緩衝液を交換して１時間にわたって洗浄し、ペントバルビタールをすべて除去する。上皮をコットンスワブで除去した後、軟骨輪を４ｍＬのジャケット付きオルガンバス（Ｒａｄｎｏｔｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に２本のシルク糸で吊るし、筋張力を連続的にデジタル記録するために、一方の糸を、Ｂｉｏｐａｃハードウェア及びＡｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅ７．３．３ソフトウェア（Ｂｉｏｐａｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を介してコンピュータと結合されたＧｒａｓｓ  ＦＴ０３力変換器（Ｇｒａｓｓ−Ｔｅｌｅｆａｃｔｏｒ）に取り付けた。軟骨輪を、１０μＭのインドメタシン（ＤＭＳＯ媒体最終濃度０．０１％）を含む４ｍｌのＫＨ緩衝溶液（ｍＭ単位での組成：１１８  ＮａＣｌ、５．６  ＫＣｌ、０．５  ＣａＣｌ２、０．２  ＭｇＳＯ４、２５  ＮａＨＣＯ３、１．３  ＮａＨ２ＰＯ４、５．６  Ｄ−グルコース）に浸漬し、ｐＨ７．４、３７℃で、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２によって連続的にバブリングした。軟骨輪を、新しいＫＨ緩衝液を１５分毎に添加しながら、１ｇの等張性張力で１時間平衡化した。すべての軟骨輪を、１０μＭのＮ−バニリルノナンアミド（カプサイシン類似体）により、次に累積的に増加する濃度のアセチルコリン（０．１〜１００μＭ）のサイクル２回を、サイクル間及び２サイクル後に充分に緩衝液洗浄し静止張力を１．０ｇにリセットして行うことにより、予備収縮させた。テトロドトキシン（１μＭ）及びピリラミン（１０μＭ）をバス中の緩衝液に添加して、気道神経及びヒスタミン受容体の交絡的影響を除去した。１．０ｇの静止張力での安定なベースラインが確立された後、気管軟骨輪を１μＭの物質Ｐで収縮させた。ピーク収縮に到達した後、示した濃度の化合物又は媒体（０．１％  ＤＭＳＯ）をバスに添加した。化合物曝露後の示した時間点で残留する初期収縮のパーセントを、媒体処理組織での残留収縮力のパーセントとして表し、群間で比較した。図３Ａ〜３Ｃは、モルモットの気管軟骨輪における気道平滑筋の収縮力を示す。気管軟骨輪を１ｍＭの物質Ｐで収縮させ、次に５０ｍＭの化合物又は媒体コントロール（０．１％ＤＭＳＯ）で処理した。残留収縮力のパーセントを様々な時間点で測定し、初期物質Ｐ誘導収縮力に対するパーセントとして表した。（Ｎ＞６）２元配置ＡＮＯＶＡを用いて、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、又は＊＊＊（ｐ＜０．００１）での有意差を算出した。ｐ−値は各条件に対して与えられる。ＲＪ−０３−５７以外の調べた化合物はすべて、１５分後に、少なくとも６０分間にわたって気道平滑筋の狭窄を低減した。
【０１５８】
例１９．ヒト気道平滑筋の化合物による緩和
ヒト気道平滑筋条片を、肺移植に伴う健康なドナー肺から得たヒト気管から切除した。実験は、コロンビア大学治験審査委員会（ＩＲＢ）によるレビューを受け、ヒトを対象とする研究ではないと見なされた。条片を、上記のように、酸素添加ＫＨ緩衝液中、３７℃、静止張力１．５ｇでオルガンバスに吊るした。１５分毎に緩衝液を交換しながらの１時間の平衡化後、条片を、増加する濃度のアセチルコリン（１００ｎＭ〜１ｍＭ）のサイクルを３回、これらの予備収縮チャレンジの間及び後の充分な緩衝液交換と共に行うことで収縮させた。ＭＫ５７１（１０μＭ）、ピリルアミン（１０μＭ）、及びテトロドトキシン（１μＭ）を緩衝液に添加し、その後、各条片を、その個々に算出したアセチルコリンのＥＣ５０濃度に対して収縮させた。収縮力の増加が横ばい状態に達した時点で（典型的には１５分）、１００μＭの化合物又はその媒体（０．２％  エタノール）を緩衝液に添加し、収縮力の維持を１時間にわたって連続的に測定した。１５分、３０分、４５分、及び６０分での残留収縮力を、初期アセチルコリン誘導収縮力に対するパーセントとして表した。図４は、ヒト気道平滑筋における気道平滑筋収縮力を示す。ヒト気管気道平滑筋条片を、ＥＣ５０濃度のアセチルコリン（Ａｃｈ）で収縮させ、続いて１００μＭのＳＨ−０５３−２Ｆ’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸又は媒体０．２％のエタノールで処理した。筋力は、化合物の添加後１５分、３０分、４５分、及び６０分に測定した。データは、初期Ａｃｈ誘導収縮力に対するパーセントとして表す。少なくとも７人のヒトからの個々の筋肉条片を用いた。２元配置ＡＮＯＶＡを用いて、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、又は＊＊＊（ｐ＜０．００１）での有意差を算出した。ｐ−値は各条件に対して与えられる。ＳＨ−０５３−２Ｆ’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸は、１５分後に、少なくとも６０分間にわたってヒト気道平滑筋の狭窄を低減した。
【０１５９】
例２０．アレルゲン誘導マウス喘息モデルに対する化合物の効果
薬物処理プロトコル：２％のヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）及び２．５％のポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）中の化合物の経口投与用滅菌溶液を、生物学的安全キャビネットで調製した。この混合物を乳鉢と乳棒を用いて粉砕することによって、微細な懸濁液を得た。薬物を、２０Ｇ強制経口投与針（Ｋｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、トリントン、コネチカット州）を用いた強制経口投与（２００ｕｌ）によって、ｏｖａ  ｓ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃの群に、ｏｖａチャレンジ期間の５日間にわたり１日２回、個々に１００ｍｇ／ｋｇで投与した。マウスは、気道パラメータ測定の直前に、化合物の単一のｐ．ｏ．投与を受けた。１０％のＤＭＳＯ、４０％のプロピレングリコール、及び５０％のＰＢＳ中のｉ．ｐ．注射用の化合物を調製し、１００ｕｌ注射として与えた。薬物投与後、マウスを毎日モニタリングした。気道過敏の評価：意識があり自発的に呼吸している動物におけるメタコリンに対する気道過敏を、ＤＳＩのＢｕｘｃｏ（登録商標）ＦｉｎｅＰｏｉｎｔｅ  Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ａｉｒｗａｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ（ＮＡＭ）測定器によって測定した。測定を行う前に、マウスを、毎日１５分間、５日間にわたってチャンバーに順応させた。加えて、卵白アルブミン感作及びチャレンジプロトコルは、２ｍｇのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）に乳化させた卵白アルブミン（Ｏｖａ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）の２ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、第０、７、及び１４日に合計１００μＬの体積で３回感作された無作為化雄ＢＡＬＢ／ｃマウスから成る。次に、マウスを、第２３〜２７日の５日間にわたって１ｍｇ／ｋｇ／日のＯｖａによって鼻腔内（ｉ．ｎ．）チャレンジした。コントロールマウスは、Ｏｖａで感作し、生理食塩水によってチャレンジした。データ収集の前には、チャンバーの校正も毎回行った。簡潔に述べると、胸部チャンバーと組み合わされた鼻部チャンバーにより、特異的気道抵抗（ｓＲａｗ）の計算が可能となる。ＦｉｎｅＰｏｉｎｔｅソフトウェアは、ＮＡＭ分析器によって得られた他のすべての呼吸パラメータを用いて、特異的気道抵抗（ｓＲａｗ）の計算を行う。マウスを、エアロゾル化されたＰＢＳ（ベースライン測定のため）又はメタコリン（１．５６２５〜１２．５ｍｇ／ｍＬ）に１分間曝露し、各噴霧後の３分間にわたって値を読み取り、平均した。得られたデータを、エアロゾル生成に用いたメタコリン濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対するｓＲａｗとして示した。図５Ａ〜５Ｆは、気道過敏に対する化合物の効果を示す。特異的気道抵抗（ｓＲａｗ）を、ＤＳＩのＢｕｘｃｏ  ＦｉｎｅＰｏｉｎｔｅ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｉｒｗａｙ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ測定器により、増加する用量のメタコリンで測定した。Ｏｖａ  ｓ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃマウスに、強制経口投与を介して、１００ｍｇ／ｋｇのすべての化合物を、１日２回、５日間にわたって投与した。データは、各���の１０体のマウスからの平均±ＳＥＭを表す。＊、＊＊、及び＊＊＊は、それぞれ、媒体処理したｏｖａ  ｓ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較した、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１での有意差を示す。化合物ＲＪ−０３−５７、ＲＪ−０３−３０、及びＧＬ−ＩＩＩ−４３は、気道過敏を軽減することができなかった。しかし、化合物ＳＨ−０５３−２Ｆ’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸、ＧＬ−ＩＩ−９３、及びＲＪ−０２−５０は、１又は複数の濃度のメタコリンでの気道過敏を低減した。
【０１６０】
例２１．化合物の薬物動態分析
マウスでの薬物動態パラメータの特定．雌のスイスウェブスターマウスに、２％ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液及び２．５％ポリエチレングリコールに調合した媒体又は化合物の胃内強制投与を２５ｍｇ／ｋｇの用量で施した。１０分、２０分、４０分  ６０分、１２０分、２４０分、４８０分、及び１４４０分に、血液（ヘパリン処理チューブに採取）、肺、及び脳を採取し、サンプルは、分析まで液体窒素中に保存した。サンプル調製及びＬＣ／ＭＳ：血液サンプルを氷上で解凍し、１０秒間ボルテックス撹拌し、１００μＬのアリコートを取り、［１００ｎＭ  ４，５−ジフェニルイミダゾール、１００ｎＭ  ＨＺ−１６６、ＲＪ−０２−５０、又はＳＨ−０５３−２’ＲＣＨ３−酸］内標準（Ｉ．Ｓ．）を含有する４００μＬの冷アセトニトリルに添加した。サンプルを３０秒間ボルテックス撹拌し、１００００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。次に、上澄層を清浄なチューブに移し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ濃縮装置を用いて蒸発させた。残渣を４００μＬの移動相で再構成し、０．２２μｍのナイロン遠心フィルターユニット（Ｃｏｓｔａｒ）を通してスピンろ過した。再構成後、サンプルを適切に希釈し、ベラパミル又は４，５−ジフェニルイミダゾールを添加し、サンプルの５μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入した。脳及び肺組織のサンプルを解凍し、秤量し、Ｃｏｌｅ  Ｐａｌｍｅｒ  ＬａｂＧｅｎ  ７Ｂホモジナイザーを用いて、Ｉ．Ｓ．を含有する４００μＬのアセトニトリル中に直接ホモジナイズした。サンプルを、１００００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。次に、上澄を回収し、血液サンプルと同様にしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に調製した。高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２  ＬＣ３０ＡＤシリーズポンプ（島津製作所、京都、日本）を用いて行った。分析物を、Ｒｅｓｔｅｋ  Ｐｉｎｎａｃｌｅ  ＩＩ  Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、粒子サイズ５μｍ、Ｒｅｓｔｅｋ、カリフォルニア州、米国）により、０．５ｍＬ／分（ＳＨ−０５３−２’Ｒ−ＣＨ３−酸）、０．４ｍＬ／分（ＲＪ−０２−５０）、及び０．６ｍＬ／分（ＲＪ−０３−５７及びＧＬ−ＩＩ−９３）の流速での勾配溶出下で分離した。移動相は、アセトニトリル又はメタノール及び水（いずれも０．１％ギ酸を含有）とした。時間プログラム：カラム温度：４０℃で、２０％Ｂ→７０％Ｂ（３分間）→９９％Ｂ（５分間）、９９％Ｂで保持（８分間）、１０％Ｂに戻す（９分間）、保持（９．５分間）（ＳＨ−０５３−２’Ｒ−酸）、７０％Ｂ→７０％Ｂ（６分間）（ＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸に対して定組成）、２０％Ｂ→７０％Ｂ（２分間）→９９％Ｂ（４分間）、９９％Ｂで保持（４．５分間）、２０％Ｂに戻す（４．７５分間）、保持（５分間）（ＲＪ−０３−５７）、及び２０％Ｂ→７０％Ｂ（２分間）→９９％Ｂ（５分間）、９９％Ｂで保持（５．５分間）、２０％Ｂに戻す（５．７５分間）、保持（６分間）（ＧＬ−ＩＩ−９３）。分析物は、ポジティブモード下、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ８０４０三連四重極型質量分析計（島津製作所、京都、日本）により、エレクトロスプレーイオン化及び大気圧イオン化をデュアル（ＤＵＩＳ）モードで行ってモニタリングした。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで以下のトランジションをモニタリングする。ＲＪ−０２−５０に対するイオン対は、ｍ／ｚ  ３２７．８５＞２８１．９５、ｍ／ｚ  ３２７．８５＞２６４．０５、ｍ／ｚ  ３２７．８５＞２５４．１０、ｍ／ｚ  ３２７．８５＞２３６．８０、及びｍ／ｚ  ３２７．８５＞２１２．７５である。ＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸に対するトランジションイオン対は、ｍ／ｚ  ３６０．０＞３４２．１０、ｍ／ｚ  ３６０．０＞３１６．００、ｍ／ｚ  ３６０．０＞３０１．１０、ｍ／ｚ  ３６０．０＞２４９．０５、及びｍ／ｚ  ３６０．０＞２１９．９０である。ＨＺ−１６６に対するトランジション対は、ｍ／ｚ  ３５６．９０＞３１１．１５、ｍ／ｚ  ３５６．９０＞２８３．１５、及びｍ／ｚ  ３５６．９０＞２８２．１５である。４，５−ジフェニルイミダゾールに対するトランジション対は、ｍ／ｚ  ２２０．８０＞１９３、ｍ／ｚ  ２２０．８０＞１６７、ｍ／ｚ  ２２０．８０＞１５１．９５、及びｍ／ｚ  ２２０．８０＞１１５であり、ベラパミル（内標準）に対するトランジション対は、ｍ／ｚ  ４５４．７０＞１６５．０５、ｍ／ｚ  ４５４．７０＞１５０、及びｍ／ｚ  ４５４．７０＞３０３．０である。ＲＪ−０３−５７に対するトランジション対は、ｍ／ｚ  ３３７．８５＞２６５．９５、ｍ／ｚ  ３３７．８５＞２５２．０５、ｍ／ｚ  ３３７．８５＞２３８．０、３３７．８３＞２２４．９５、及びｍ／ｚ  ３３７．８５＞２０９．８５である。ＧＬ−ＩＩ−９３に対するトランジション対は、ｍ／ｚ  ４１３．９０＞３９６、ｍ／ｚ  ４１３．９０＞３６８、ｍ／ｚ  ４１３．９０＞３５５．０５、ｍ／ｚ  ４１３．９０＞３０２．９５、ｍ／ｚ  ４１３．９０＞３２６．８０、ｍ／ｚ  ４１３．９０＞２７６．０５、及びｍ／ｚ  ４１３．９０＞２４８．２０である。衝突エネルギーを各トランジションに対して最適化して、最適感度を得る。質量分析計は、ヒートブロック温度を４００℃、乾燥ガス流量を１５Ｌ／分、脱溶媒管温度を２５０℃、霧化ガス流量を１．５Ｌ／分、並びに針電圧及びインターフェイス電圧をいずれも４．５ｋＶとして運転した。応答の取得は、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアを用いて行った。標準曲線を、線形回帰によってフィッティングし、確認サンプルは、その日の検量線から逆算した。平均及び変動係数（ＣＶ）を、それに応じて算出した。精度を、算出濃度を対応する公称値と比較することによって算出した。薬物動態パラメータを、ＰＫ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ２．０を用いて算出し、以下の式に当てはめた：ｃ＝Ａ・ｅ−ａｔ＋Ｂ・ｅ−ｂｔ＋Ｃ・ｅ−ｃｔ。図６Ａ〜６Ｄは、マウスの血液、肺、及び脳における化合物の薬物動態プロファイルを示す。強制経口投与を介して２５ｍｇ／ｋｇで投与された化合物の時間依存的全身分布。ＲＪ−０２−５０、ＳＨ−０５３−２Ｆ’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸、及びＧＬ−ＩＩ−９３は、マウスにおける非常に優れた生体利用度を呈するが、一方ＲＪ−０３−５７は、中程度の吸収及び素早いクリアランスを有する。
【０１６１】
例２２．化合物によるマウスＢＡＬＦ中の炎症細胞数の変化
化合物の抗炎症特性の特定について、アレルゲン誘導マウス喘息モデルで調べた。分析の当日に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、１ｍＬのＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳで行った。赤血球（ＲＢＣ）を、ＢＤ赤血球溶解緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて溶解した。ＢＡＬＦを４つの異なるチューブに分け、Ｆｃ受容体との非特異的結合のブロックを、６μｇ／ｍＬの２．４Ｇ２  ｍｏｕｓｅ  ＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（商標）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて５分間行った。ＢＡＬＦ細胞の染色を、最終濃度の以下の抗体：抗マウスＣＤ４５  ＡＰＣ（１：１０００、３０−Ｆ１１、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＦＩＴＣラット抗マウスＣＤ４（１：５００、ＲＭ４−５、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）、ＰＥラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ  Ｆ（１：５００、Ｅ５０−２４４０、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）、及びマウスＣＣＲ３  ＰＥ−結合抗体（１：４０、８３１０１、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、ミネアポリス、ミネソタ州）、を含有する１００μＬのＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用い、暗所において４℃で３０分間行った。フローサイトメトリー実験を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて行い、続いて、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いてデータ分析を行った。続いて、免疫細胞に対する一般的なゲーティングを行った。合計炎症細胞カウントを、すべてのサンプルを高流量（６０μＬ／分）で１８０秒間分析することによって得た。第四チャネル（ＦＬ４）におけるゲーティングした抗マウスＣＤ４５陽性イベントを用いて、合計炎症細胞カウントを細胞／ｍＬで算出した。対応するゲートにおける好酸球の定量に用いられるＣＣＲ３＋／Ｓｉｇｌｅｃ  Ｆの頻度及びＣＤ４＋Ｔ細胞数のためのＣＤ４＋の頻度を、合計炎症細胞カウント（細胞／ｍＬ）と掛け合わせて、分画細胞数を得た。統計分析：データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて分析し、平均±ＳＥＭとして表した。複数群の統計的差異のために、ダネットの事後検定を伴う１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）又はボンフェローニの事後検定を伴う２元配置ＡＮＯＶＡを行った。図７Ａ〜７Ｃは、炎症細胞に対する化合物の効果を示す。１０体のｏｖａ  ｓ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、化合物を、１００ｍｇ／ｋｇで１日２回、５日間にわたって投与した。ＢＡＬＦを各動物から採取し、（Ａ）合計炎症細胞；（Ｂ）好酸球；（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の定量に用いた。細胞を、マウスＣＤ４５＋ＡＰＣ抗体で染色し、サンプルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて、高流量（６０μＬ／分）で１８０秒間分析した。第四チャネル（ＦＬ４）におけるゲーティングした陽性イベントを用いて、合計炎症細胞カウントを細胞／ｍｌで算出した。特���の白血球集団の定量では、（Ｂ）好酸球（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、特異的抗体で染色し、フローサイトメトリーで検出した。データは、各群の１０体のマウスからの平均±ＳＥＭを表す。＊、＊＊、及び＊＊＊は、  それぞれ、媒体処理したｏｖａ  ｓ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較した、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１での有意差を示す。化合物ＧＬ−ＩＩ−４３、ＲＪ−０３−３０、ＲＪ−０３−９０は、炎症細胞の数を調節しなかった。しかし、ＲＪ−０２−５０及びＧＬ−ＩＩ−９３は、喘息マウスの肺において、好酸球及びＣＤ４＋Ｔ細胞の数を減少させた。ＳＨ−０５３−２Ｆ’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸は、好酸球の数を減少させたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は減少させなかった。
【０１６２】
例２３．化合物の存在下でのＣＤ４＋Ｔリンパ球の電気生理学測定
リンパ球に対する化合物の効果を特定するために、Ｏｖａ  Ｓ／ＣマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、化合物とのその相互作用を、自動パッチクランプによって測定した。ｏｖａ  ｓ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞を、マウス脾細胞の調製のためのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの説明書に従って調製し、赤血球は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ（商標）溶解液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて溶解した。細胞を、１００μｇ／ｍＬの卵白アルブミンの存在下又は非存在下で、１０％（体積／体積）のウシ胎仔血清、１０μＭの２−メルカプトエタノール、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、ロックフォード、イリノイ州）中に懸濁して維持した。細胞を、５％のＣＯ２、９５％の加湿空気中、３７℃で４８時間維持した。ＩｏｎＦｌｕｘのプレートレイアウトは、１２ウェルのユニットから成り、２つのウェルは、細胞内液（ＩＣＳ、３４６ｍＭ  ＣｓＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有、ＣｓＯＨによりｐＨ７．２）を含有し、１つのウェルは、細胞外液（ＥＣＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ３４９  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  Ｄ−グルコース一水和物、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有、ＮａＯＨによりｐＨ７．４）に希釈した細胞を含有し、８つのウェルは、ＥＣＳに希釈した対象の化合物を含有し、１つのウェルは、廃液回収用である。細胞は、陰圧を掛けることによって、懸濁液からアンサンブル記録アレイの微細チャネルに捕捉される。アレイがすべて占有されると、掛けられた陰圧が捕捉した細胞の膜を破壊し、ホールセル電圧固定が確立される。化合物の適用については、適切な化合物ウェルに圧力が掛けられ、それが、細胞上を高速で流れている細胞外液中に化合物を導入する。ＧＡＢＡＡＲ誘導電流の記録については、細胞アレイを、−５０ｍＶの過分極保持電位で電圧固定した。自動パッチクランプでの使用の前に、細胞を３８０ｇで５分間遠心分離し、ＥＣＳに緩やかに再懸濁させた。これをさらに２回繰り返した後、細胞をプレートに分配した。ＧＡＢＡ及びムシモールをＥＣＳ中に適切な濃度に希釈した後、適用及びデータ記録を行った。図８は、６００ｎＭのＧＡＢＡ及び一緒に３秒間適用された濃度を増加させた化合物の存在下、ｏｖａ  ｓ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた電流測定を示す。６００ｎＭのＧＡＢＡ及び濃度を増加させた化合物の存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞の濃度依存定電流応答を、Ｎ数１６で行い、６００ｎＭのＧＡＢＡの電流応答に対して標準化した。化合物ＲＪ−０２−５０は、ＳＨ−０５３−２Ｆ’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３−酸よりもＧＡＢＡ誘導膜電流を増強した。重要なことには、ＧＬ−ＩＩ−９３及びＲＪ−０３−３０は、非常に顕著なＧＡＢＡ誘導膜電流を引き起こした。
【０１６３】
例２４．化合物による肺サイトカイン発現の生体内調節
サイトカイン産生に関する化合物の抗炎症特性を、ＡＨＲ測定後、処理及び未処理Ｏｖａ  Ｓ／Ｃマウス（Ｎ＝１０）の肺を採取することによって調べた。全肺を、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する２００μＬのＴ−ＰＥＲ（登録商標）組織タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、ロックフォード、イリノイ州）中に、ハンドヘルド組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジナイズした肺サンプルを、１００００ＲＰＭで５分間遠心分離して、細胞／組織デブリをペレット化した。組織上澄を回収し、ＢＤサイトメトリックビーズアレイマウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）を製造元の説明書に従って用いてサイトカイン分析した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて分析し、平均±ＳＥＭとして表した。複数群の統計的差異のために、ダネットの事後検定を伴う１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。図９は、マウス肺におけるサイトカインレベルの定量を示す。試験したサイトカインの中でも、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−４が、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、ｏｖａ  ｓ／ｃマウスの肺では著しく高く発現された。データは、各群の１０体のマウスからの平均±ＳＥＭを表す。＊、＊＊、及び＊＊＊は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１での有意差を示す。ｏｖａ  ｓ／ｃマウスは、正常マウスと比較して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−２をより高いレベルで発現したが、その変化は有意ではなかった。ＧＬ−ＩＩ−９３で処理したｏｖａ  ｓ／ｃマウスは、マウスの肺におけるＩＬ−１７、ＴＮＦα、及びＩＬ−４のレベルの低下を呈した。
【０１６４】
例２５．化合物による粘液分泌過多調節の非存在
粘膜産生に関する化合物の薬力学的効果を、ＡＨＲ測定後、処理及び未処理Ｏｖａ  Ｓ／Ｃマウスの肺を採取し、続いてホルマリン固定及びパラフィン包埋することによって調べた。切片を、１つの肺葉（大気道及び小気道を含む）から調製し、標準的なＨ＆Ｅ染色（一般的な組織病理学及び炎症のため）及びＰＡＳ染色（粘液細胞のため；基底膜の細胞／ｍｍとして）用に処理した。図１０Ａ〜１０Ｂは、ムチン産生に対する化合物の効果を示す：（Ａ）ムチン体積密度の形態計測定量及び（Ｂ）過ヨウ素酸蛍光シッフ染色による気道上皮（緑色）中のムチン（赤色）の例示的画像。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１００ｍｇ／ｋｇで５日間に２回化合物を投与した。データは、各群の５〜７体のマウスからの平均±ＳＥＭを表す。スケールバーは、１００μｍを表す。ＧＬ−ＩＩ−９３、ＲＪ−０２−５０、及びＳＨ−０５３−２’Ｆ−Ｒ−ＣＨ３酸は、ムチンの産生を変化させなかった。
【０１６５】
例２６化合物による肺細胞増殖の阻害
ＡＳＭ過形成を、新たに形成された細胞のＤＮＡにＥｄＵを組込むことによって特定した。ここで、卵白アルブミン感作及びチャレンジプロトコルの終了後、マウスに、１００ｍｇ／ｋｇの用量でＥｄＵ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）の単一のｉ．ｐ．注射を施した。マウスを注射の４時間後に安楽死させ、肺をホルマリン固定し、採取し、パラフィン包埋した。ホルマリン固定し、パラリン包埋した肺切片の６μｍ切片を、Ｆｉｓｈｅｒスーパーフロストプラススライドグラス上に載せた。ＥｄＵの染色を、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵイメージングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、製造元の説明書に従って行った。簡潔に述べると、肺をｈｉｓｔｏｃｌｅａｒで脱パラフィン処理し、段階的エタノールで再水和した。組織切片を、ＰＢＳ中３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２０分間透過処理した。切片を再度ＰＢＳ中３％のＢＳＡで２回洗浄し、次にＣｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）反応緩衝液、ＣｕＳＯ４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８アジド、及び反応緩衝添加剤を含有するＣｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）反応カクテルと共に、暗所で３０分間インキュベートした。切片をＰＢＳ中３％のＢＳＡでさらに１回洗浄した。ＤＮＡ染色については、切片をＰＢＳで１回洗浄し、次に５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２と共に３０分間インキュベートした。次に、スライドグラスをＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔマウント媒体でカバーグラスをかぶせた。工程はすべて室温で行った。図１１は、肺細胞の増殖を示す。未処理及びＧＬ−ＩＩ−９３処理Ｏｖａ  ｓ／ｃマウスの肺切片を、蛍光アジドによるクリックケミストリー後に可視化可能であるチミジン類似体、ＥｄＵの組み込みについて分析した。ネガティブコントロールについては、ＥｄＵの注射を行わず、視認可能な蛍光が見られない結果となった。未処理Ｏｖａ  Ｓ／Ｃマウスは、ＧＬ−ＩＩ−９３処理動物と比較して、高い増殖率を示した。核特異的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色により、図１１で比較される２つの切片間の細胞密度が同様であることが確認される。
【０１６６】
例２７．ウィルス誘導喘息モデル
慢性肺疾患におけるＧＡＢＡＡＲ化合物の有効性を、ウィルス誘導喘息モデルで実験する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜２０週齢；１０体の群）に、２×１０５ｐｆｕのＳｅＶ（菌株５２；ＡＴＣＣ）又はＵＶ不活化ＳｅＶ（ＵＶ−ＳｅＶ）（６９）を、第０日に鼻腔内接種する。マウスを、体重及び活動について毎日モニタリングし、接種後（Ｐ−Ｉ）第４９日までに、慢性疾患が充分に発症する。４つの実験群を準備し、試験化合物（又は媒体）を、第４９〜５６日Ｐ−Ｉの間にｉ．ｐ．投与する。予防実験では、治療剤を第１３〜２１日の間に投与し、続いて疾患測定を第４９〜５６日に行って、ＲＳＶ曝露後の小児治療に対応する投与レジメンの模擬実験とする（したがって、ウィルス感染後の初期の、又は感染後急性期の間の免疫調節が、その後の炎症性肺疾患の発症に影響を与え得るかどうかを調べる）。第１３、４９、及び５６日ＰＩに、すべての群において、メタコリンに応答する連続的な非侵襲的ＡＨＲ測定（ｓＲＡＷ）を行う。第５６日のＡＨＲ測定後、動物を安楽死させ、ＢＡＬＦ、血液、及び組織サンプルを採取する。ＢＡＬＦは、１ｍｌのＰＢＳ中に採取し、遠心分離し、細胞上澄を採取して、上記のようにサイトカイン分析を行う。細胞ペレットは、ＲＰＭＩに再懸濁させ、分画細胞カウント（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ）及びフローサイトメトリー用のサンプルを取る。フローサイトメトリーについては、細胞製剤を、Ｍ２マクロファージの場合はＣＤ１ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＭａｃ−３（ＢＤ）に対する、又はＮＫＴ細胞の場合はＣＤ３及びＮＫ１．１（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対するフルオロフォア標識モノクローナル抗体で染色する。抗体標識細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ測定器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて試験し、データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、アッシュランド、オレゴン州）（６９、７０、８４）を用いて行う。他のすべての肺組織及び生化学的試験、並びにデータ分析は、ＯＶＡモデルの場合と同様に行う。
【０１６７】
例２８．慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）モデル
ヒトＣＯＰＤのモデルとして、マウスにおけるリポ多糖（ＬＰＳ）肺チャレンジによって、ＧＡＢＡＡＲ化合物の有効性を実験する。ＬＰＳは、煙草の煙、大気汚染、及び有機ダスト中の汚染物として存在する炎症誘発性刺激物質である。ヒトの場合、ＬＰＳを伴うダストへの慢性的な曝露は、肺機能の低下をもたらす結果となる。急性モデルでは、ＬＰＳは、気管支肺胞液中における好中球の増加、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−１、及び他のメディエーターの増加を伴う混合炎症反応を誘導する。投与の前に、各試験化合物を、緩衝溶液媒体（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で希釈し、滅菌ろ過する。試験化合物を、示した日の各々に（したがって、３回投与）、１００ｕｌの合計体積でｉ．ｐ．投与する。最終ｉ．ｐ．化合物投与のおよそ１時間後、マウスに、非外科的手順を用いてＬＰＳを気管内投与する。ケタミン塩酸塩及びキシラジン塩酸塩溶液（カタログ番号Ｋ１１３；Ｓｉｇｍａ；５０ｍｇ／ｋｇ  ケタミンＨＣｌ）での皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、マウスをまず麻酔する。５０μＬの滅菌０．９％  ＮａＣｌに溶解したＬＰＳ（カタログ番号Ｌ２８８０；Ｓｉｇｍａ、タイプＯ５５：Ｂ５）を、カニューレ及びシリンジ（２×２５μｌ）を介して気管内（ｉ．ｔ．）に滴下注入（２０μｇ  ＬＰＳ／マウス）し、続いて１００μｌの空気を注入する。シャム処理マウスには、５０μＬの滅菌０．９％  ＮａＣｌをｉ．ｔ．で滴下注入する。ｉ．ｔ．処理の後、マウスを１０分間直立姿勢に維持して、液体が肺全体に広がるようにする。マウスを麻酔から覚めさせ、２４時間後に頸部ＣＯ２窒息（cervical CO2 asphyxiation）を用いて屠殺する。血液を、心臓穿刺によってＥＤＴＡ含有チューブに採取し、直ちに遠心分離し（２０００×ｇ、１０分間、４℃）、血漿を−８０℃で保存した。肺組織を取り出し、ＲＮＡ単離及びＭＰＯ分析のために急速冷凍する。免疫組織化学的分析については、肺組織を、１０％のリン酸緩衝ホルマリン（ｐＨ７．４）中に入れる。
【０１６８】
例２９．免疫性関節炎モデル
８〜１０体の８〜１０週齢雄ＤＢＡ／１ｊマウスの群（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーハーバー、メイン州、米国）を、５０％のフロイント完全アジュバント中の２００ｍｇのウシＩＩ型コラーゲン（ｂＣＩＩ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、レッドモンド、ワシントン州、米国）で、尾の付け根に皮内で免疫化する。２１日後に、フロイント不完全アジュバント中の１００ｍｇのｂＣＩＩでマウスを同様に追加免疫する。コントロールマウスの群は、ｂＣＩＩを含まないシャム免疫で処理する。餌及び水の消費、体重、さらには臨床的に観察可能な関節炎を、処理の期間を通して測定する。最初の免疫化後に開始して、本発明のＧＡＢＡＡ受容体剤を、週３回、８週間にわたってマウスに投与する。化合物用量は、例２２に記載のようにして決定する。個々のコントロール及び実験マウスにおける血清コラーゲン特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ａ抗体を、最終免疫化の８週間後に、マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡによって特徴付ける。ＥＬＩＳＡでは、ｂＣＩＩを、プレートウェルコーティングのための抗原として用い、アイソタイプ特異的フルオロフォア結合ウサギ抗マウス抗体を、一次抗体結合の定量に用いる。ＥＬＩＳＡプレートのウェルは、標準的な蛍光プレートリーダーを用いて読み取る。化合物の有効性は、コントロールマウスと比較した処理マウスにおける臨床的関節炎の低減及び／又はｂＣＩＩに対するＩｇＧ抗体力価の減少によって裏付けられる。
【０１６９】
例３０．自己免疫性糖尿病モデル
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、糖尿病の実験に３０年間使用されてきた。ＮＯＤマウスは、膵島炎、膵島の白血球浸潤を特徴とする。膵インスリン含量の低下は、雌の場合は約１２週齢で、雄の場合は数週間後に自然に発生する。糖尿病マウスは、低インスリン血及び高グルカゴン血であり、このことは、膵島ベータ細胞の選択的な破壊を示している。本発明の化合物を、投与経路（ＰＯ、ＩＰ、ＩＭ、ＳＣ）のうちの１つを介して、ＱＤ又はＢＩＤで２８日間にわたって投与し、コントロールマウスは、同様にして媒体の投与を受ける。用量は、例２２に記載のようにして決定する。群あたり８〜１０体のマウスを割り当てる。動物を、体重、餌の消費、水の摂取、及び血中又は尿中グルコースについて週２回モニタリングし、測定する。尿中グルコースは、一般的に入手可能な試験紙を用いて特定することができる（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｓｔｉｘ）。化合物の有効性は、コントロール群に対する処理群におけるこれらの臨床マーカーのうちの１又は複数での減少によって裏付けられる。
【０１７０】
本明細書で引用されるすべての特許、刊行物、及び参考文献は、その全内容が参照により本明細書に援用される。本開示と援用される特許、刊行物、及び参考文献との間に矛盾が生じる場合、本開示が優先するべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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