【手続補正書】
【提出日】平成18年11月27日(2006.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  生物においてターゲットヌクレオチド配列からの増強された発現を達成する方法であって、前記生物の細胞に、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）サプレッサータンパクと共に、プロモーターに機能的に結合したターゲットヌクレオチド配列を含むターゲット核酸構築物を、一過的に導入する工程を含む方法。
【請求項２】  構築物が複製の起点を含まない方法。
【請求項３】  生物が動物である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】  生物が植物である、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】  サプレッサータンパクがウイルス由来のものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】  ターゲット構築物が、（ａ）所望のヌクレオチド配列を植物細胞ゲノムに転移させる境界配列；（ｂ）プロモーターに機能的に結合したターゲットヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む所望のヌクレオチド配列を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】  細胞が、植物の組織に存在する体細胞である、請求項４ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】  構築物が、組織の複数の細胞に同時に導入される、請求項７記載の方法。
【請求項９】  サプレッサータンパクが、そのサプレッサータンパクをコードするヌクレオチド配列を含む核酸から発現されることによって細胞に導入される、請求項４ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】  ターゲットヌクレオチド配列を含む第一（ターゲット）核酸が、サプレッサータンパクをコードする第二（サプレッサー）核酸と共に用いられる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】  植物の組織に、ターゲットヌクレオチド配列を含む第一核酸とＰＴＧＳサプレッサータンパクをコードする第二核酸とを一過的に導入する工程を含み、前記第一および第二核酸が、単一のバイナリーベクター構築物内に含まれるか、あるいは、前記第一および第二核酸配列が、それぞれ第一バイナリーベクターおよび第二バイナリーベクター構築物内に含まれる、植物においてターゲットヌクレオチド配列の増強された発現を達成するための、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】  以下の工程：
（i）植物の組織に、ターゲットヌクレオチド配列を含む第一核酸および異種ＰＴＧＳサプレッサータンパクをコードする第二核酸を導入する工程であって、いずれもプロモーターに機能的に結合されており、ここで前記第一および第二核酸が任意に単一のバイナリーベクター構築物内に含まれている工程、
（ii）一定の期間にわたって、サプレッサーおよびターゲットタンパクの核酸からの発現を引き起こすまたは可能にする工程であって、ここで前記サプレッサーがターゲットタンパクをコードするｍＲＮＡの分解を阻害する工程、
（iii）少なくとも、ターゲットタンパクが発現された組織を回収する工程、
（iv）任意に植物からターゲットタンパクを単離する工程
を含む、ターゲットタンパクを生成する方法。
【請求項１３】  第一核酸が、二以上のターゲットヌクレオチド配列を含む、請求項１０ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】  第二核酸配列が、二以上の異なるサプレッサーをコードする、請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】  それぞれの核酸が、植物に共導入される別個のバイナリーベクター構築物中に存在する、請求項１０ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】  核酸が、単一のバイナリーベクター構築物中に存在する、請求項１０ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】  以下の工程：
（i）植物の組織に、それぞれ少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列を含む二以上のターゲット核酸、および異種ＰＴＧＳサプレッサータンパクをコードするさらなる核酸を導入する工程であって、いずれもプロモーターに機能的に結合されており、ここでこれらの核酸が任意に単一のバイナリーベクター構築物内に含まれている工程、
(ii)サプレッサーおよび第一ターゲットタンパクの核酸から発現を引き起こすまたは可能にする工程、
(iii)次いで、一定の期間、さらなるターゲットタンパクのさらなるターゲット核酸からの異所的発現を引き起こすまたは可能にする工程、
(iv)工程(iii)を任意に繰り返す工程、
(v)少なくとも、最終的なターゲットタンパクが発現された組織を回収する工程
を含む、所定の順序で生物に二以上のターゲットタンパクを生成する方法。
【請求項１８】  二以上のターゲットタンパクが、代謝または異化経路の全てまたは一部を構成する、あるいは少なくとも一つのターゲットタンパクが、さらなるターゲットタンパクの基質である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】  前記一定の期間が、約３から１５日、さらに好ましくは約３から１０日、さらに好ましくは約４から７日の間である、請求項１２、１７または１８記載の方法。
【請求項２０】  植物組織が、一枚の葉または数枚の葉である、請求項７ないし１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】  （i）植物組織において発現することが望まれるターゲットタンパクをコードするターゲットヌクレオチド配列を含む第一核酸、および（ii）ＰＴＧＳサプレッサータンパクをコードする第二核酸を含み、ここで前記第一および第二核酸は、それぞれ第一バイナリーベクター構築物および第二バイナリーベクター構築物内に含まれ、さらに任意に、（iii）植物物質への前記ベクターの共導入を促進する物質を含む組成物。
【請求項２２】  ターゲットタンパクをコードするｍＲＮＡの宿主生物による分解を阻害するＰＴＧＳの異種サプレッサーの使用であって、前記ｍＲＮＡは、プロモーターに機能的に結合したターゲットヌクレオチド配列を含むターゲット核酸構築物からの転写によって生成され、前記構築物は前記生物の細胞に一過的に導入される使用。
【請求項２３】  サプレッサータンパクが、ポテトウイルスＸ(pvx)ｐ２５タンパク；アフリカキャッサバモザイクウイルス（acmv）ＡＣ２タンパク；イネ黄斑ウイルス（rymv）Ｐ１タンパク；トマトブッシー発育阻害ウイルス（tbsv）１９Ｋタンパク；ｒｇｓ ＣＡＭ、またはこれらと少なくとも約７５％の配列同一性を有するこれらのいずれか一つのバリアントからなるリストから選択される、請求項１ないし２２のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項２４】  ポテトウイルスＸ(pvx)ｐ２５タンパク；アフリカキャッサバモザイクウイルス（acmv）ＡＣ２タンパク；イネ黄斑ウイルス（rymv）Ｐ１タンパク；トマトブッシー発育阻害ウイルス（tbsv）１９Ｋタンパク；またはこれらと少なくとも約７５％の配列同一性を有するこれらのいずれか一つのバリアントからなるリストから選択される単離されたサプレッサータンパクを、細胞に導入する工程を含む、ＰＴＧＳを受けるターゲット遺伝子の細胞における発現を増強する方法。
【請求項２５】  ターゲット遺伝子が、細胞ゲノムに存在する内因性遺伝子またはトランスジーン；裸のＤＮＡとして存在する異種遺伝子；発現ベクターに存在する異種遺伝子から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】  ターゲット遺伝子が、細胞ゲノムに存在する内因性遺伝子またはトランスジーンであり、サプレッサータンパクがｐｖｘ ｐ２５またはそのバリアントである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】  植物における局部的ウイルス誘導遺伝子サイレンシングが、増強により実質的に影響を受けないように、サプレッサータンパクがＰＴＧＳの全身的シグナルの生成または伝達を特異的に抑制する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】  ターゲット遺伝子が、細胞質で複製する構築物またはウイルスベクターである発現ベクターに存在する異種遺伝子であり、かつ、サプレッサータンパクが、acmv ＡＣ２；rymv Ｐ１；tbsv １９Ｋまたはこれらのいずれか一つのバリアントから選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】  ターゲット遺伝子が葉脈において発現され、サプレッサータンパクがＴＢＳＶ１９Ｋまたはそのバリアントである、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】  単離されたサプレッサータンパクが、当該サプレッサータンパクをコードするヌクレオチド配列を含む核酸からの発現により細胞内に導入される、請求項２４ないし２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】  サプレッサータンパクが、細胞のゲノムに安定に取り込まれたトランスジーンからの発現により細胞内に導入される、請求項９または３０に記載の方法。
【請求項３２】  サプレッサータンパクが、当該サプレッサータンパクをコードするヌクレオチド配列を含むサプレッサー核酸構築物として、細胞またはその先祖に導入され、前記構築物は、前記サプレッサータンパクが誘導されたウイルスに由来するさらなるタンパクをコードせず、かつ、前記細胞は、前記構築物と植物細胞ゲノムとの間の組み換えを引き起こしまたは可能にして、本発明にかかる核酸をゲノムに導入することにより、前記構築物でトランスフォームされる植物細胞である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】  トランスフォームされた植物細胞から植物を再生する工程をさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】  サプレッサータンパクを、当該サプレッサータンパクをコードするサプレッサーヌクレオチド配列を含むサプレッサー核酸構築物として細胞内に導入し、かつ、ここで前記構築物が、ＲＮＡ分子の植物細胞における転写のために、サプレッサーヌクレオチド配列を含む（ii）ＤＮＡに機能的に結合した（i）プロモーターを含み、さらに転写後に細胞の細胞質において複製できる能力を前記ＲＮＡ分子に付与する植物ウイルス配列を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】  プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１ないし２０または２３ないし３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】  発現が、少なくとも約２５−５０％、５０−１００％、５、１０、１５または２０倍以上増強される、請求項１ないし１１または２３ないし３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】  ターゲット遺伝子またはヌクレオチド配列が、昆虫耐性タンパク；疾患耐性タンパク；除草剤耐性タンパク；哺乳動物タンパクであるターゲットタンパクをコードする、請求項１ないし２０、または２３ないし３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】  遺伝子サイレンシングのサプレッサーを同定する方法であって、植物物質に、レポーター分子をコードするバイナリーベクターである少なくとも一つの核酸構築物を、ＰＴＧＳの推定されるサプレッサーをコードするバイナリーベクターである第二核酸構築物と共に導入する工程を含む方法。
【請求項３９】  レポーター分子が、ＧＦＰまたはルシフェラーゼから選択される、請求項３８記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
ターゲット遺伝子の発現
一般的に、異種核酸は、当該技術分野で用いられるあらゆる適切なプロセスによって発現されてもよい。例えば、発現アンプリコン（以下に記載）に加えて、以下のように転写または発現されてもよい。
（i）例えば異種配列に機能的に結合したプロモーターを含む、“裸の(naked)”ＤＮＡの一過的発現。
（ii）発現ベクター、特に複製ベクターからの発現。一般に、当業者であれば、ベクターを構築し、かつ、組み換え遺伝子発現のプロトコールを設計することができる。プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニレーション配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の適切な配列を含む、適切な調節配列を含む適切なベクターを選択または構築することができる。さらに詳しくは、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrookら, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubelら. eds.,John Wiley & Sons, 1992を参照。ウイルス性発現ベクター（以下参照）は、特に好ましい。
（iii）少なくとも一過的に細胞質に存在する組み込みベクター（例えば、バイナリーベクター）からの発現。
（iv）生物、特に植物のゲノムに安定に取り込まれたトランスジーンからの発現。