【手続補正書】
【提出日】平成19年7月11日(2007.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  被験試料中に存在する被分析体ポリヌクレオチドを定量するための、下記の工程を含む方法：
未知量の被分析体ポリヌクレオチドを含有する被験試料と予め定めた量の擬似ターゲットとを混和し；
ポリヌクレオチド増幅反応において、擬似ターゲットと前記被験試料に含有される被分析体ポリヌクレオチドがあればそれを共増幅して増幅生成物集合体を調製し、前記集合体は前記被験試料が被分析体ポリヌクレオチドを含有する場合は被分析体アンプリコンと擬似ターゲットアンプリコンの両方を含み；そして
擬似ターゲットアンプリコンの量と関係なく被分析体アンプリコンを定量し、これにより被分析体アンプリコンの量は前記被験試料に含有されていた未知量の被分析体ポリヌクレオチドと用量依存関係にある。
【請求項２】  混和工程の後であって共増幅工程の前に、さらに、前記被分析体ポリヌクレオチドおよび前記擬似ターゲットを単離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  さらに、増幅前の被分析体ポリヌクレオチド量と増幅後の被分析体アンプリコン量を関連づける標準曲線を参照する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  共増幅工程の前記ポリヌクレオチド増幅反応が、転写仲介増幅反応、ＮＡＳＢＡ反応およびポリメラーゼ連鎖反応よりなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】  ポリヌクレオチド増幅反応が転写仲介増幅反応である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】  転写仲介増幅反応に、配列番号：１および配列番号：２の配列を有する一対のオリゴヌクレオチドプライマーセットを使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】  擬似ターゲットが、配列番号：４および配列番号：９よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】  擬似ターゲットの予め定めた量が１．０×１０３〜２×１０８分子、好ましくは１．０×１０４〜２×１０８分子、さらに好ましくは、１．０×１０５〜２×１０８分子である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】  増幅前の被分析体ポリヌクレオチド量と増幅後の被分析体アンプリコン量を関連づけるための、下記の工程を含む方法：
複数のそれぞれ異なる量の被分析体ポリヌクレオチドを有する対照試料をそれぞれ、予め定めた一定量の擬似ターゲットと混和して、複数の混合対照試料を調製し；
複数のポリヌクレオチド増幅反応において、擬似ターゲットと複数の混合対照試料それぞれに存在する被分析体ポリヌクレオチドの両方を共増幅して、擬似ターゲットアンプリコンおよび被分析体アンプリコンを含有する増幅生成物集合体を調製し；
前記増幅生成物集合体中に存在する擬似ターゲットアンプリコンの量と関係なく、前記複数の増幅反応それぞれについての被分析体アンプリコンを定量し；そして
予め定めた異なる前記被分析体ポリヌクレオチド量を、前記複数の増幅反応それぞれにおいて生成した定量された前記被分析体アンプリコン量に対してプロットした標準曲線を作成し、これにより前記複数の対照試料中の増幅前の前記被分析体ポリヌクレオチド量と複数の増幅反応で合成された増幅後の被分析体アンプリコン量を関連づける。
【請求項１０】  共増幅工程における前記複数のポリヌクレオチド増幅反応が、複数の転写仲介増幅反応、複数のＮＡＳＢＡ反応および複数のＰＣＲ反応よりなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  共増幅工程における前記複数のポリヌクレオチド増幅反応が複数の転写仲介増幅反応である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】  前記擬似ターゲットの前記予め定めた一定量が１×１０３〜２×１０８分子、好ましくは１．０×１０４〜２×１０８分子、さらに好ましくは、１．０×１０５〜２×１０８分子である、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】  前記共増幅工程の前にさらに、前記被分析体ポリヌクレオチドを固体支持体に捕獲する工程を含む、請求項１〜１２いずれか１項記載の方法。
【請求項１４】  定量工程が、共増幅工程からの前記増幅生成物集合体を、被分析体アンプリコンに特異的であるが擬似ターゲットアンプリコンには特異的でない標識プローブとハイブリダイズさせ、次いで被分析体アンプリコンと特異的にハイブリダイズした標識プローブがあればそれを定量検出することを含む、請求項１〜１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】  さらに、擬似ターゲットアンプリコンを検出する工程を含む、請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】  生物試料が被分析体ポリヌクレオチドを含有するかを判定するための、下記の工程を含む方法：
生物試料を擬似ターゲットと混和して混合試料を調製し；
混合試料から核酸を単離し、これにより擬似ターゲットおよび生物試料中に存在する前記被分析体ポリヌクレオチドがあればそれを含む分子集合体が得られ；
ポリヌクレオチド増幅反応を実施し、前記分子集合体に含有される擬似ターゲットと前記被分析体ポリヌクレオチドがあればそれを共増幅して増幅生成物を調製し、これにより擬似ターゲットアンプリコンが形成され、かつ前記分子集合体が前記被分析体ポリヌクレオチドを含有する場合は被分析体アンプリコンが形成され；
前記増幅生成物中において、擬似ターゲットアンプリコンを検出せずに前記被分析体アンプリコンがあればそれを検出し；そして
増幅生成物中に前記被分析体アンプリコンが検出された場合は、生物試料が前記被分析体ポリヌクレオチドを含有すると判定する。
【請求項１７】  単離工程が、前記擬似ターゲットおよび前記被分析体ポリヌクレオチドを固体支持体に固定化することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】  増幅反応が、転写仲介増幅反応、ＮＡＳＢＡ反応およびＰＣＲ反応よりなる群から選択される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】  増幅反応が転写仲介増幅反応である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】  検出工程が、まず被分析体アンプリコンに対する結合特異性を有する標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、次いで標識ポリヌクレオチドプローブと被分析体アンプリコンの特異的結合度を測定することを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】  請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法により、ポリヌクレオチド増幅反応を実施するための、下記を含むキット：
擬似ターゲット；
擬似ターゲットと被分析体ポリヌクレオチドを共増幅するための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
ポリヌクレオチド増幅反応を実施するための試薬であって、デオキシヌクレオチド三リン酸およびＤＮＡ重合酵素を含む前記試薬；ならびに
まず増幅反応を実施し、次いで増幅反応において生成した被分析体アンプリコンのみを検出するための指示を含む印刷した説明書。
【請求項２２】  さらに、増幅反応において生成した被分析体アンプリコンがあればそれを検出するための標識プローブを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】  試薬がさらに、ヌクレオチド三リン酸およびＲＮＡ重合酵素を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】  ＤＮＡ重合酵素が逆転写酵素である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】  逆転写酵素により供給されるもの以外にＲＮａｓｅ  Ｈを使用しない、請求項２４に記載のキット。