【手続補正書】
【提出日】平成19年4月16日(2007.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも3つのペプチドを含む組成物であって、該3つのペプチドのそれぞれは15未満の長さのアミノ酸残基であり、以下よりなる群から選択される細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（CTL）エピトープおよび／または類似体を含む組成物：
RLLQETELV（配列番号2）
YLQLVFGIEV（配列番号3）
LLTFWNPPV（配列番号4）
SMPPPGTRV（配列番号5）
KLBPVQLWV（配列番号6）
KVFGSLAFV（配列番号7）
YLSGADLNL（配列番号8）
IMIGHLVGV（配列番号9）
KVAEIVHFL（配列番号10）。
【請求項２】
第4のペプチドをさらに含む請求項1の組成物であって、該第4のペプチドは15未満の長さのアミノ酸残基であり、以下よりなる群から選択される細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（CTL）エピトープおよび／または類似体を含む組成物：
RLLQETELV（配列番号2）
YLQLVFGIEV（配列番号3）
LLTFWNPPV（配列番号4）
SMPPPGTRV（配列番号5）
KLBPVQLWV（配列番号6）
KVFGSLAFV（配列番号7）
YLSGADLNL（配列番号8）
IMIGHLVGV（配列番号9）
KVAEIVHFL（配列番号10）。
【請求項３】
第5のペプチドをさらに含む請求項1の組成物であって、該第5のペプチドは15未満の長さのアミノ酸残基であり、以下よりなる群から選択される細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（CTL）エピトープおよび／または類似体を含む組成物：
RLLQETELV（配列番号2）
YLQLVFGIEV（配列番号3）
LLTFWNPPV（配列番号4）
SMPPPGTRV（配列番号5）
KLBPVQLWV（配列番号6）
KVFGSLAFV（配列番号7）
YLSGADLNL（配列番号8）
IMIGHLVGV（配列番号9）
KVAEIVHFL（配列番号10）。
【請求項４】
第6のペプチドをさらに含む請求項1の組成物であって、該第6のペプチドは15未満の長さのアミノ酸残基であり、以下よりなる群から選択される細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（CTL）エピトープおよび／または類似体を含む組成物：
RLLQETELV（配列番号2）
YLQLVFGIEV（配列番号3）
LLTFWNPPV（配列番号4）
SMPPPGTRV（配列番号5）
KLBPVQLWV（配列番号6）
KVFGSLAFV（配列番号7）
YLSGADLNL（配列番号8）
IMIGHLVGV（配列番号9）
KVAEIVHFL（配列番号10）。
【請求項５】
第7のペプチドをさらに含む請求項1の組成物であって、該第7のペプチドは15未満の長さのアミノ酸残基であり、以下よりなる群から選択される細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（CTL）エピトープおよび／または類似体を含む組成物：
RLLQETELV（配列番号2）
YLQLVFGIEV（配列番号3）
LLTFWNPPV（配列番号4）
SMPPPGTRV（配列番号5）
KLBPVQLWV（配列番号6）
KVFGSLAFV（配列番号7）
YLSGADLNL（配列番号8）
IMIGHLVGV（配列番号9）
KVAEIVHFL（配列番号10）。
【請求項６】
第8のペプチドをさらに含む請求項1の組成物であって、該第8のペプチドは15未満の長さのアミノ酸残基であり、以下よりなる群から選択される細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（CTL）エピトープおよび／または類似体を含む組成物：
RLLQETELV（配列番号2）
YLQLVFGIEV（配列番号3）
LLTFWNPPV（配列番号4）
SMPPPGTRV（配列番号5）
KLBPVQLWV（配列番号6）
KVFGSLAFV（配列番号7）
YLSGADLNL（配列番号8）
IMIGHLVGV（配列番号9）
KVAEIVHFL（配列番号10）。
【請求項７】
第9のペプチドをさらに含む請求項1の組成物であって、該第9のペプチドは15未満の長さのアミノ酸残基であり、以下よりなる群から選択される細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（CTL）エピトープおよび／または類似体を含む組成物：
RLLQETELV（配列番号2）
YLQLVFGIEV（配列番号3）
LLTFWNPPV（配列番号4）
SMPPPGTRV（配列番号5）
KLBPVQLWV（配列番号6）
KVFGSLAFV（配列番号7）
YLSGADLNL（配列番号8）
IMIGHLVGV（配列番号9）
KVAEIVHFL（配列番号10）。
【請求項８】
追加のペプチドをさらに含む請求項1〜7のいずれか1項の組成物であって、該追加のペプチドは25未満の長さのアミノ酸残基であり、ヘルパーＴ細胞リンパ球（CTL）エピトープを含む組成物。
【請求項９】
追加のペプチドはPanDR結合ペプチドである、請求項8の組成物。
【請求項１０】
該PanDR結合ペプチドはアミノ酸配列aKXVAAWTLKAAa（配列番号1）を含む、請求項9の組成物。
【請求項１１】
リポソームをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項の組成物。
【請求項１２】
脂質をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項の組成物。
【請求項１３】
抗原提示細胞をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項の組成物。
【請求項１４】
抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項13の組成物。
【請求項１５】
医薬賦形剤をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項の組成物。
【請求項１６】
医薬賦形剤はアジュバントである、請求項15の組成物。
【請求項１７】
該アジュバントはミネラル油アジュバントである、請求項16の組成物。
【請求項１８】
少なくとも3つのペプチドをコードする単離された核酸であって、該3つのペプチドは15未満の長さのアミノ酸残基であり、以下よりなる群から選択される細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（CTL）エピトープおよび／または類似体を含む核酸：
RLLQETELV（配列番号2）
YLQLVFGIEV（配列番号3）
LLTFWNPPV（配列番号4）
SMPPPGTRV（配列番号5）
KLBPVQLWV（配列番号6）
KVFGSLAFV（配列番号7）
YLSGADLNL（配列番号8）
IMIGHLVGV（配列番号9）
KVAEIVHFL（配列番号10）。
【請求項１９】
癌の治療または予防用薬剤の調製における請求項1または請求項18の組成物の使用であって、該方法は、組成物を必要な患者に投与することを含む使用。
【請求項２０】
該治療は、手術、放射線療法、または化学療法後の癌の再発を遅らせる、請求項19の使用。
【請求項２１】
該治療は原発性腫瘍の転移を予防する、請求項19の使用。
【請求項２２】
該癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、および頭および／または首の癌よりなる群から選択される、請求項19の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
MHC分子は、Ｔ細胞応答を制御する高度に多型性のタンパク質である（Schwartz, B.D. 「基礎および臨床免疫学におけるヒト主要組織適合遺伝子複合体HLA（The human major histocompatibility complex HLA in basic & clinical immunology）」、Stitesら編、ランゲメディカルパブリケーション（Lange Medical Publication）、ロスアルトス（Los Altos）、 52-64頁、第4版）。ヒトでCTLエピトープを示す種特異的MHC同族体は、ヒト白血球抗原（「HLA」）と呼ばれる。HLAクラスI分子は、同様のペプチド群に結合する能力に基づいて、いくつかのファミリーまたは「サブタイプ」に分けられる。複数のHLAサブタイプに結合するワクチン（例えばA2、A3、およびB7）は、広く人種的に偏らない集団をカバーする。表9に示すように集団のカバー範囲は種々の人種の84〜90％であり、サンプリングした人種の約87％である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のペプチドおよび対応する核酸および組成物は、CTLおよび随時HTL応答の産生（例えば治療的予防）を刺激することによりTAAに対する免疫応答を刺激するのに有用であり、免疫応答を追跡（診断と予後）するのにも有用である。天然のTAAタンパク質アミノ酸配列から直接または間接（すなわち類推により）得られるA2エピトープを含有するペプチドは、HLA分子に結合し、TAAに対する免疫応答を刺激することができる。本明細書の配列番号11〜15に記載のように分析したTAAタンパク質の完全な配列は、ジーンバンク（GenBank）から得られる。表11を参照されたい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
「優性エピトープ」は、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体またはHLA分子に認識される部位を一緒に形成する、1次、2次、および3次ペプチド構造のような分子のまとめた特徴である。あるいはエピトープは、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、またはＴ細胞に関連して、Ｔ細胞受容体および／または主要組織適合遺伝子複合体（MHC）受容体による認識に必要なアミノ酸残基のセットとして定義される。エピトープは自然に存在し、ヒトにより単離されるか、精製されるか、または調製されるか得られる。例えばエピトープは、天然の供給源から単離して調製されるか、または当該分野で公知の標準的プロトコールに従って合成することができる。合成エピトープは、人工的アミノ酸残基、「アミノ酸模倣物」、例えば天然に存在するLアミノ酸残基のD異性体または天然に存在しないアミノ酸残基（例えばシクロヘキシルアラニン）を含む。本開示を通してエピトープは、ある場合にはペプチドまたはペプチドエピトープとして記載される。本発明のエピトープと類似体を、表1に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本明細書において「HLAサブタイプまたはHLAファミリー」は、共有されたペプチド結合特異性に基づいて分類されたHLA分子のセットである。いくつかのアミノ酸モチーフを有するペプチドの同様の結合親和性をある程度共有するHLAクラスＩ分子は、かかるHLAサブタイプ中に分類される。用語HLAスーパーファミリー、HLAスーパータイプファミリー、HLAファミリー、およびHLAxx様分子（ここで「xx」は特定のタイプのHLAを示す）は同義である。例えばHLA-A2モチーフとスーパーモチーフは、表4に詳細に説明されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
「1次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとHLA分子との1次接触点を与えると理解されるペプチド配列に沿った特定の位置のアミノ酸である。規定の長さのペプチド内の1、2または3つの1次アンカー残基が最小で、ある免疫原性ペプチドについて「モチーフ」を規定する。これらの残基は、その側鎖が結合溝自体の特異的ポケットに埋められて、HLA分子のペプチド結合溝と密接に接触して適合すると理解される。HLAクラスＩモチーフのある例では、1次アンカー残基は、本発明のペプチドエピトープの位置2（アミノ末端位置から）およびカルボキシ末端位置に存在する。A2モチーフとHLAクラスＩのスーパーモチーフの1次アンカー位置は、表3、3a および4に記載される。例えばこれらのアンカー位置の特定の残基の有無を変化させることにより、類似体ペプチドを得ることができる。かかる類似体は、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むエピトープの結合親和性を調節するのに使用される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本発明の選択された具体例である式において、アミノ末端およびカルボキシル末端基（具体的に示してはいないが）は、特に明記しない場合は生理学的pH値を取るような形である。アミノ酸構造式において各残基は、標準的3文字または1文字表記で表される。アミノ酸残基のL型は、大文字の1文字または3文字記号の最初の文字の大文字で示され、D型を有するアミノ酸残基のD型は小文字の1文字または小文字の3文字記号で示される。しかし大文字無しで3文字記号または完全な名前が使用される時、これらはLアミノ酸残基を意味する。グリシンは非対称炭素原子を持たず、単に「Gly」または「G」として示される。本明細書に記載のペプチドのアミノ酸配列は一般に標準的1文字記号を使用して示される（Ａ、アラニン；C、システイン；D、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；L、ロイシン；Ｍ、メチオニン；N、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；およびＹ、チロシン）。これらの記号以外に、本明細書に記載の1文字略語の「Ｂ」は、α−アミノ酪酸を示す。ある例では、α−アミノ酪酸はシステインと交換される。
本明細書で使用される頭字語は以下の通りである：
APC：抗原提示細胞
CD3：汎Ｔ細胞マーカー
CD4：ヘルパーＴリンパ球マーカー
CD8：細胞障害性Ｔリンパ球マーカー
CEA：癌胎児性抗原（例えば配列番号363を参照）
CTL：細胞障害性Ｔリンパ球
DC：樹状細胞。DCは、B型肝炎ウイルスから得られるモデルペプチドに特異的なCTL株からサイトカイン放出を刺激することにより強力な抗原提示細胞として機能する。HBVペプチドエピトープでエクスビボでパルスしたDCを使用したインビボ実験は、投薬経験の無いマウスへの投与後にインビボでCTL免疫応答を刺激した。
DLT：用量限定性毒性、治療に関連する有害事象
DMSO：ジメチルスルホキシド
ELISA：酵素結合免疫吸着測定法
E:T：エフェクター：標的比
G-CSF：顆粒球コロニー刺激因子
GM-CSF：顆粒球マクロファージ（単核細胞）コロニー刺激因子
HBV：B型肝炎ウイルス
HER2/neu：腫瘍関連抗原：c-erB-2は同義語である（例えば、配列番号12参照）
HLA：ヒト白血球抗原
HLA-DR：ヒト白血球抗原クラスII
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
HTC：ヘルパーＴ細胞
HTL：ヘルパーＴリンパ球、ヘルパーＴ細胞と同義語
ID：本体
IFNγ：インターフェロンガンマ
IL-4：インターロイキン-4
IV：静脈内
IU30%：100：1（E：T）比で標的細胞集団の30％の溶解を引き起こすのに必要な106個のエフェクター細胞の細胞毒性
MAb：モノクローナル抗体
MAGE：黒色腫抗原（例えば、MAGE2とMAGE3についてはそれぞれ配列番号13と14を参照）
MLR：混合リンパ球反応
MNC：単核細胞
PB：末梢血
PBMC：末梢血単核細胞
ProGP（登録商標）：プロゲニポエチン（登録商標）産物（サール（Searle）、セントルイス、ミズーリ州）、キメラflt3/G-CSF受容体アゴニスト
SC：皮下
S.E.M.：平均の標準誤差
QD：1日1回投与
TAA：腫瘍関連抗原
TNF：腫瘍壊死因子
WBC：白血球
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
本発明の単離されたエピトープと類似体は、クラスＩ結合ペプチド、すなわちCTLペプチドである。特に本発明のエピトープと類似体はA2モチーフまたはスーパーモチーフを含む。本発明のエピトープと類似体は、表1に示したものである（配列番号1〜10）。本発明のA2エピトープと類似体は、表で「エピトープ」および「類似体」と呼び、配列番号で呼ばれる。他のエピトープと類似体は本明細書において、CTLエピトープまたはCTLペプチドおよびHTLエピトープまたはHTLエピトープと呼ぶ。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
ペプチドとポリヌクレオチド。ある例では本発明は、エピトープおよび／または類似体を含むかまたはこれらからなる単離されたペプチドに関し、ここでエピトープまたは類似体は表1から選択される配列からなる（配列番号1〜10）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
好ましくはペプチドは、表1の配列からのエピトープまたは類似体を含むかまたはこれらからなる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
HTLペプチドは、合成ペプチド、例えばPanDR結合エピトープ（例えばパドレ（PADRE）（登録商標）ペプチド、エピトープ（エピミューン（Epimmune）、サンジエゴ、カリホルニア州、米国特許第5,736,142号に記載されている）を含み、例えば式aKXVAAZTLKAAa（ここで、「X」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンであり；「Z」はトリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり；および「a」はD-アラニンまたはL-アラニン（配列番号42）である）を有する。いくつかのPanDR結合エピトープはすべて「L」アミノ酸残基を含み、これらの分子は、ペプチドまたはペプチドをコードする核酸の形で得ることができる。また、米国特許第5,679,640号および6,413,935号に記載されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
一般に組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点と選択可能なマーカー、例えば大腸菌（E. coli ）のアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビッシェ（S. cerevisiae）TRP1遺伝子、および下流構造配列の直接転写のための高度に発現された遺伝子から得られるプロモーターを含むであろう。かかるプロモーターは、特に3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質から得られる。異種構造配列は、翻訳開始および停止配列との、および好ましくは細胞外媒体への周辺質スペースへの翻訳タンパク質の分泌を指令することができるリーダー配列と適切な時期に組み立てられる。場合により異種配列は、所望の特性（例えば、発現される組換え産物の安定化または簡単な精製）を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
HLA分子の対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドに結合するHLA-A2スーパータイプ）は、少なくとも以下よりなる：A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*0209、A*0214、A*6802、A*6901。A2スーパーファミリーのメンバーであると予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子を、表4と6に示す。詳細に後述されるように、個々の対立遺伝子特異的HLA分子のそれぞれへの結合は、1次アンカーおよび／または2次アンカー位置の置換により、好ましくはスーパーモチーフについて特定される各残基を選択することにより、調節することができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
すなわち、HLA-A*0201モチーフは、2位に1次アンカー残基としてL、I、V、M、A、T、またはQを有し、エピトープのC末端位置に1次アンカー残基としてL、I、V、M、A、またはTを有するペプチドリガンドを含む。このモチーフ−スーパーモチーフ関係について、HLA-A*0201モチーフの1次アンカー位置を特徴付ける好適な、およびあまり好適ではなく／許容される残基は、A2スーパーモチーフを記載する残基と同一である（del Guercioら、J. Immunol. 154:685-693 (1995)；Ruppertら、Cell 74:929-937, 1993；Sidneyら、Immunol. Today 17:261-266, 1996；SetteとSidney, Curr. Opin in Immunol. 10:478-482, 1998参照）。A*0201モチーフを特徴付ける2次アンカー残基は、さらに規定されている（例えば、Ruppertら、Cell 74:929-937, 1993参照）。これらの2次アンカーは、表4に示される。HLA-A*0201に結合したペプチドは、1次アンカー位置および／または2次アンカー位置の置換により、好ましくはモチーフについて特定される各残基を選択することにより調節することができる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
簡単に説明すると、類似体化法は、いくつかのHLA分子への結合と相関するモチーフまたはスーパーモチーフを利用する。類似体ペプチドは、1次アンカー、2次アンカー、または1次と2次アンカー位置で、アミノ酸残基を置換することにより作成される。一般に類似体は、すでにモチーフまたはスーパーモチーフを有するペプチドについて作成される。本明細書に記載のように、HLA-A2クラスＩ結合ペプチドのスーパーモチーフとモチーフの好適な1次および2次活性残基を表3、3aと4に示される。本発明の多くのモチーフまたはスーパーモチーフについて、各モチーフまたはスーパーモチーフに結合する対立遺伝子特異的HLA分子またはHLAサブタイプのメンバーに結合するのに有害な残基が規定される（表4）。従って結合に有害なかかる残基の除去は、本発明に従って行われる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
ワクチン（ペプチドベースまたは核酸ベースの調製物）に含めるためのエピトープおよび／または類似体を選択する時に、好ましくは以下の原理が使用される。TAA関連疾患を治療または予防するためにワクチン中で使用されるエピトープと類似体の例は、表14に記載される。選択を行うために、以下のそれぞれの原理をバランスさせる。ワクチン中で複数のエピトープが使用される時、このエピトープは、特に限定されないが、そこからエピトープが得られる天然の配列で連続的である。かかる複数のエピトープは、個々のペプチドまたはマルチエピトープペプチド中で使用される、ペプチド内のエピトープの順序、または同じ領域からのエピトープの選択でもよい。
1)投与することにより、TAA発現腫瘍の予防またはクリアランスと相関することが観察されている免疫応答を模倣する、エピトープおよび／または類似体が選択される。HLAクラスＩについてこれは一般に、少なくとも1つのTAAからの3〜4個のエピトープおよび／または類似体を含む。
2)免疫原性と相関することが確立された必要な結合親和性を有するエピトープおよび／または類似体が選択される：HLAクラスＩについて500nMまたはそれ以下のIC50、クラスIIについて1000nMまたはそれ以下のIC50。HLAクラスＩについて、200nMまたはそれ以下のIC50を有するペプチドを選択することが好ましく、これは、免疫応答の誘導のみでなく、インビトロの腫瘍細胞死滅にも相関すると考えられているためである。HLA A1とA24について、IC50が100nMまたはそれ以下のペプチドを選択することが好ましい。
3)広い人口をカバーするために、スーパーモチーフを有するエピトープおよび／または類似体、または対立遺伝子特異的モチーフを有するエピトープおよび／または類似体が選択される。一般に、少なくとも80％の人口をカバーすることが好ましい。モンテカルロ解析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、人口カバー率を評価することができる。
4)癌関連抗原について、患者は天然のエピトープに対する寛容が出現しているため、エピトープの代わりにまたは以外に、類似体を選択することが好ましい。
5)特に関連するものは「ネステッドエピトープ（nested epitope）」である。ネステッドエピトープは、あるペプチド配列で少なくとも2つのエピトープが重複する時に起きる。例えばネステッドエピトープは、重複する複数のエピトープを含有する領域からの抗原の断片、または別のものに完全に包含される1つのエピトープでもよく、例えばA2ペプチドMAGE3.159とMAGE3.160はネステッドである。「超越（transcendent）ネステッドエピトープ」は、その中にHLAクラスＩとHLAクラスIIエピトープの両方を有するペプチドである。ネステッドエピトープを提供する時、提供する配列当たり最大数のエピトープを有する配列を提供することが好ましい。好ましくはペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープ中のカルボキシル末端より長いペプチドを提供することは避ける。ネステッドエピトープを含む配列を提供する時、病原性または他の有害な生物学的性質を持たないことを確実にするために、配列を評価することが重要である。これは、感染性生物に関するワクチンについて特に重要である。
6)複数のエピトープまたはポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）を有するタンパク質が作成される場合、目的は、目的のエピトープを含む最も小さいペプチドを作成することである。この原理は、ネステッドエピトープを含むペプチドを選択する時、同じではなくても同様である。しかし複数のエピトープを含む人工的ペプチドでは、サイズを最小にする目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープの間のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスさせることである。スペーサーアミノ酸残基は、ジャンクションエピトープ（標的抗原上に存在しない、免疫系により認識されるエピトープ）を避けるか、またはエピトープ間の切断を促進するように導入することができ、こうしてエピトープ提示を増強する。受容者は非天然のエピトープに対する免疫応答を生じることがあるため、一般にジャンクションエピトープは避けられる。特に注意するのは「優性エピトープ」であるジャンクションエピトープである。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が小さくなるかまたは抑制されるような、激しい応答を引き起こすことがある。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
下記表7は、乳房、結腸、および肺での腫瘍抗原発現を示す。4つのTAAを標的とすることで、腫瘍細胞が腫瘍抗原を発現しない細胞に変異（癌逸脱）する可能性が低下する。好ましくは各TAAから2つ以上のエピトープを含めると、人種が異なる個体でもワクチンに応答する確率が上昇し、より広い人口をカバーできる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
表8は、表5の各タイプの癌について、米国においてこれらの腫瘍の発病率、5年生存率、および年間の予測死亡者数を示す。推定される新しい症例、予測死亡数、および5年生存率については、これらの腫瘍タイプについて多くの満たされていないニーズがある。世界的にはこれらの腫瘍の発病率ははるかに高い。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
実施例2
CTL誘導の増強のためのヘルパーエピトープとしてのパドレ（PADRE）（登録商標）分子
長期に続くCTL応答の誘導のためには、HTL活性が決定的に重要であるという証拠が増えている（Livingstonら、J. Immunol. 162:3088-3095 (1999)；Walterら、New Engl. J. Med. 333:1038-1044 (1995)；Huら、J. Exp. Med. 177:1681-1690 (1993)）。従ってHLAクラスII分子に結合しHTLを刺激する1つ以上のペプチドが本発明で使用される。従ってワクチンの好適例は、ヘルパーＴ細胞を刺激するように設計された方法でほとんどのDR分子を標的とする普遍的ヘルパーＴ細胞エピトープ（HTL）からの分子を含む。例えば式aKXVAAZTLKAAa（ここで「X」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンであり；「Z」はトリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり；「a」はD-アラニンまたはL-アラニンである）（配列番号42）を有するPanDR結合エピトープペプチドが、HLAのタイプにかかわらず、ほとんどのHLA-DR対立遺伝子に結合し、ほとんどの個体からのＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することがわかっている。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７４】
特に好適なパドレ（PADRE）（登録商標）分子は、HLA-DR結合能力とＴ細胞免疫応答の誘導を最大にするように特異的に作成した、非天然のアミノ酸残基を含有する合成ペプチドaKXVAAWTLKAAa（a＝D-アラニン、X＝シクロヘキシルアラニン）（配列番号１）である。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
別の好適なパドレ（PADRE）（登録商標）分子は合成ペプチド、
【化１】
2006526628.tif 000001
（a＝D-アラニン、X＝シクロヘキシルアラニン）である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７６】
好適例では、パドレ（PADRE）（登録商標）ペプチドはアミド化される。例えばパドレ（PADRE）（登録商標）分子の特に好適なアミド化例は、aKXVAAWTLKAAa-NH2（配列番号43）と記載される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７７】
精製HLA-DR分子による競合阻害測定法は、パドレ（PADRE）（登録商標）分子aKXVAAWTLKAAa-NH2（配列番号43）が高または中親和性（IC50≦1,000nM）で、ほとんどのHLA-DR分子の16のうちの15に結合することを示した（（Kawashimaら、Human Immunology 59:1-14 (1998)；Alexanderら、Immunity 1:751-761 (1994)）。パドレ（PADRE）（登録商標）と破傷風トキソイド（TT）ペプチド830-843のDR結合能の比較、「普遍的エピトープが公表されている（Panina-Bordignonら、Eur. J. Immunol. 19:2237-2242 (1989)）。TT830-843ペプチドは、試験した16のDR分子のうちの7つのみに結合し、一方パドレ（PADRE）（登録商標）は16のうちの15に結合した。パドレ（PADRE）（登録商標）に結合する15のDR分子のうちの少なくとも1つは、すべてのヒトの＞95％に存在すると予測される。従ってパドレ（PADRE）（登録商標）分子は、ヒト集団におけるHLA-DR分子の広範な多型にもかかわらず、ほとんどすべての患者でHTL応答を誘導すると予測される。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７８】
ライデン大学（University of Leiden）（C.J.M. Melief）で行われた第Ｉ／II相の研究者後援治験の初期のデータは、パドレ（PADRE）（登録商標）分子aKXVAAWTLKAAa（配列番号１）（おそらくアミド化されたaKXVAAWTLKAAa-NH2（配列番号43））は、ヒトにおいて極めて免疫原性であるという原理を支持する（Ressingら、J. Immunother. 23(2):255-66 (2000)）。この治験では、パドレ（PADRE）（登録商標）分子は種々のヒトパピローマウイルス（HPV）由来CTLエピトープと同時乳化され、再発性または残存性子宮頚癌患者に注入された。しかし試験患者の癌が後期であるため、これらの患者は免疫無防備状態であったと予測された。患者の免疫無防備状態は、従来の抗原でインビトロ刺激後の、インフルエンザウイルス特異的CTLの低頻度、CD3発現レベルの低下、および増殖性想起応答の低頻度により証明された。すなわちライデン大学（University of Leiden）治験では効力は期待されず、この治験の目標はことに安全性を評価することであった。実際安全性は証明された。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８４】
CTLハイブリドーマとCTL細胞株のインビトロ刺激：特異的CTLエピトープの提示
CTL細胞株を刺激するProGP作成DCの能力を、ウイルス由来エピトープと対応するエピトープ応答性CTL細胞株を使用してインビトロで証明した。ヒトHLA-A2.1を発現するトランスジェニックマウスをProGPで処理した。これらのマウスから単離した脾臓DCを、B型肝炎ウイルスから得られたペプチドエピトープ（HBV Pol455）でパルスし、次に、IFNγを産生することによりHBV Pol455エピトープ／HLA-A2.1複合体に応答するCTL細胞株とインキュベートした。ProGP由来脾臓DCがHBV Pol455エピトープを提示する能力は、2つの陽性対照（GM-CSFとIL-4拡張DC培養物、または精製脾臓Ｂ細胞）集団より大きかった（図1B）。他の抗原提示細胞に対するProGP由来細胞の応答曲線中の左シフトは、レスポンダー細胞株による最大IFNγ放出を刺激するのに、ProGP由来細胞はより少ないエピトープでよいことを証明する。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８５】
実施例4
ペプチドパルスProGP由来DCはインビボのCTL応答を促進する
インビボでCTL応答を刺激するエクスビボペプチドパルスDCの能力もまた、HLA-A2.1トランスジェニックマウスモデルを使用して評価した。GM-CSFとIL-4で拡張後のProGP処理動物からのDCまたは骨髄細胞由来の対照DCを、HBV Pol455CTLエピトープでエクスビボでパルスし、洗浄し、かかるマウスに注射（静脈内）した。免疫の7日後に、脾臓を取り出し、DCとCTLを含有する脾臓細胞を、HBV Pol455ペプチドの存在下でインビトロで2回再刺激した。再刺激した脾臓細胞培養物の3つの独立した培養物のCTL活性を、ペプチド有りまたは無しでパルスした51Cr標識標的細胞を溶解するCTLの能力を測定することにより評価した。エピトープパルスProGP由来DCならびにエピトープパルスGM-CSF/IL-4 DCで免疫した動物で、激しいCTL応答が発生した（図1）。これに対して、モックパルスしたProGP作成DC（ペプチド無し）は、CTL誘導の証拠を示さなかった。これらのデータは、ProGP処理マウスから得られるDCはエクスビボでエピトープでパルスすることができ、インビボで特異的CTL応答を誘導するのに使用できることを確認する。すなわちこれらのデータは、ProGP由来DCが、ヒトMHCクラスＩ分子を示すモデルでCTL応答を促進するという原理を支持する。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８８】
患者中のProGPの血液作用が消費された（すなわち、血液像がベースラインに戻った）後に、融解した細胞生成物の注射または静脈内注入によりワクチン接種を行う。図2は、ペプチドによるDCのエクスビボパルス、DCの洗浄、DC試験、および定温保存のフローチャートを示す。この方法のより詳細な説明は以下の実施例に示される。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０５】
天然のエピトープ配列
HLA-A2スーパータイプファミリーの5つの対立遺伝子のMHC分子に結合する可能性が最も高いペプチドを予測するために、CEA、MAGE-2/3、HER-2/neu、およびp53の1次アミノ酸配列について、コンピューターベースのモチーフとアルゴリズム検索を行った（表4と6）（Sette, A.とJ. Sidney、J. Immunogenetics 50:201-212 (1999)）。次に、モチーフとアルゴリズム陽性ペプチドを合成し、精製したHLA-A2.1（ヒトで最も高頻度に発現される分子）ならびにHLA-A2スーパータイプファミリーの他のMHC分子への結合について試験した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１０】
上記のエピトープ選択プロセスを使用して、ワクチンについて9つのエピトープを選択した。これらのエピトープ（表1に示す）は、1)CTL天然配列エピトープ、固定アンカー類似体、およびヘテロクリティック類似体の混合による広い腫瘍抗原カバー；2)HLA-A1スーパータイプ対立遺伝子についての高い交差反応結合親和性；3)インビトロヒト1次CTL誘導測定法での、特に野生型、エピトープ発現腫瘍細胞に応答するCTLの生成における免疫原性；および4)利用できる場合は、正常な被験体または癌患者での1次またはワクチン接種後CTL応答を示す文献中の公表された報告、を示すことに基づいて、選択された。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１２】
選択されたエピトープの4つは、改良されたMHC結合のために修飾された固定アンカー類似体であった。1つの固定アンカー類似体は、よく解析されたHER-2/neu.369エピトープから得られ、これは癌患者で強い想起とワクチン接種後CTL応答を誘導することが証明されている（Zaks, T.Z.とRosenberg, S.A., Cancer Res. 58:4902-4908 (1998)；Knutson, K.L.ら、J. Clin. Invest. 10:477-484 (2001)）。両方のMHCアンカー残基の置換によってスーパータイプ結合を上昇させることにより、HER-2/neu.369のV2V9類似体は、HLA-A2スーパータイプ個体でより広い免疫原性を示すことが予測される。残りの固定アンカー類似体（CEA.24V9、p53.139L2B3、およびp53.149M2）は、選択プロセスで同定されたエピトープから設計され、これらはまだ臨床で試験されていない。p53.139L2B3類似体は、3位（非アンカー位置）に追加のα−アミノイソ酪酸置換を含有して、野生型エピトープ中に存在するシステイン残基の起こりうる安定性問題を回避している。野生型配列から得られるエピトープと同様に、すべての固定アンカー類似体は、腫瘍細胞株により提示される野生型エピトープと交差反応するCTLを誘導する（Keogh, E.ら、J. Immunol. 167:787-796 (2001)）。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１９】
HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスでのインビボ免疫原性試験のために、EP-2101（薬剤製造について提唱されたものと同様の乳化プロトコール（実施例17参照）により調製した）をマウスに注入し、ワクチン中のすべてのエピトープに対するCTL応答を測定し、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバント中の各CTLエピトープ単独＋パドレ（PADRE）（登録商標）エピトープで同時免疫したマウスにより得られるCTL応答と比較した。CTL応答は、インサイチュELISA（McKinney, D.M.ら、J. Immunol. Methods 237:105-117 (2000)）を使用してCTLによるIFN-γ産生を測定し、次にペプチドで免疫動物からの脾臓細胞をインビトロ刺激して測定した。図3Bに示すように、6〜10個の独立の実験でこれまで得られたデータに基づき、EP-2101ワクチンは、大半のCTLエピトープの免疫原性を示すようである。EP-2101中のCTLエピトープの半分について、IFN-γ産生の50分泌単位（SU）を超える強いCTL応答が観察された（CEA.24V9、CEA.691H5、HER-2/neu.369V2V9、MAGE-2.157、およびMAGE-3.112I5）。残りのエピトープは、中〜弱CTL応答（＜10〜50SU）を示し、これらの応答は一般に、大きな標準偏差棒により示されるように、より大きい実験的変動に関連していた。上記したように、これらの変動は、トランスジェニックマウス測定法の限界を反映する。しかし測定法の本質的な変動にもかかわらず、CTLエピトープのプールにより得られるマルチエピトープCTL応答は、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバントと同時免疫すると、各CTLエピトープ単独によりマウスで得られるCTL応答に匹敵した。すなわち全体としてこれらの実験は、EP-2101がHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスで免疫原性であることを示す。追加の実験もまた、EP-2101が、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスでパドレ（PADRE）（登録商標）エピトープに対するHTL応答を誘導でき、これはマウスH-2 I-Ab対立遺伝子により制限されることを示す（Alexander, J.ら、Immunity 1:751-761 (1994)）。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３７】
構造式
各ペプチドのアミノ酸配列を表1に示す。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４５】
個々のペプチドの溶解性
溶解性試験をペプチドについて行い、溶解性は目に見える粒子の無い清澄な溶液であるとして定義される（表15）。生理学的pHで10個のペプチドのうち6個のみが可溶性であった（1013.08、1243.08、1295.03、1323.06、1350.01、および1352.03）。従って、ペプチドをジメチルスルホキシド（DMSO）以外に種々の水性酸性溶液および水性塩基性溶液中で2〜5mg/mlで試験した。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４６】
薬剤物質の規格と分析法
表16は、薬剤物質の規格を示す。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４７】
成分と定量的組成
EP-2101の成分と定量的組成を表17に示す。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４８】
成分規格
薬剤の製造に使用される成分を表18に列挙する。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４９】
バルク薬剤と製剤の製造法
バルク薬剤を図5に示すように調製した。バルク薬剤は、各3つの溶媒中の個々のペプチドの溶解度とプールしたペプチドの溶解度に基づいて、3つの溶液（表15と19）中に調製される。簡単に説明すると、無菌処理を可能にするために、10個のペプチドを酸性溶液（0.1875M 酢酸）、塩基性溶液（0.1M 水酸化ナトリウム）、または有機溶媒DMSOに溶解する。これらの3つのペプチド含有プールをろ過滅菌する。無菌条件下で、これら3つのペプチドプールを合わせ、緩衝化し、pHを調整し、次にモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバントとともに温度制御条件下でホモジナイズして、製剤を形成する。次に製剤（安定な1：1(w:w)エマルジョン）を2mlのガラスバイアルに充填し、2〜8℃で保存する。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５０】
製剤規格と分析法
表20と21は、それぞれEP-2101バルク薬剤と製剤の規格を記載する。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５１】
ペプチド濃度（各ペプチド）
EP-2101製剤中のすべてのペプチド成分の濃度はRP-HPLCにより測定した（条件は表22に示す）。エマルジョンの一定量をDMSO中の0.1％ TFA溶液と混合して2層混合物を作成する。DMSO以外の溶媒を使用してHPLC分析用の清澄で均一な溶液を生成する試みは、うまく行かなかった。上記2相混合物のサンプリングは、シリンジまたはピペットを上部ミネラル油層から下のDMSO層に挿入して行う。HPLC用の唯一の試料はDMSO層（ここではペプチドは可溶性である）から取る。HPLCクロマトグラフィーにより、各ペプチドの顕著なクロマトグラフィーピークが得られ、これは積分して検量線と比較すると、EP-2101製剤中の個々のペプチドの濃度が得られる。試料の2相性のために、全試料容量の推定と試料の移動について変動がある。次に、試料調製と取り扱いの複雑さのために、ペプチド濃度の測定において異常に大きな誤差（最大30％）が観察された。大きな変動は、大きな分解産物の生成や試料の他の異常な物理的変化によるものでもなかったため、これは、試料調製と取り扱いの結果であると推測された。このため、放出と安定性基準として、目的濃度の±50％の規格を設定した。試料取り扱いを改善し、2相性のミネラル油−DMSO混合物を簡便化する試みは、放出と安定性規格を小さくすることを主目的として現在進行中である。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５３】
EP-2101ワクチンは、他の種ではなくヒトのHLA-A2.1制限CTL応答を特異的に刺激することを目的するため、関連する力価測定法の開発は難しい課題である。この課題を取り組む1つの方法は、HLA-A2.1をトランス遺伝子として発現するマウス（すなわち、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウス）を使用して、EP-2101のインビボ力価を測定することである。推奨されるEP-2101力価測定法は、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウス中のEP-2101 CTLエピトープの免疫原性を測定するのに使用される前臨床測定法と同様である（実施例13参照）。HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウス測定法はCTL応答の定量において限界があることを指摘しておく。具体的には：1)ヒトで免疫原性であるHLA-A2.1制限エピトープのわずかに約80％のみが、トランスジェニックマウスでもCTL応答を誘導し（Wentworth, P.A.ら、Eur. J. Immunol. 26:97-101 (1996)）、従って一部のエピトープに対するCTL応答はこのシステムでは定量できない、および；2)多くのアプローチを使用して、我々は、HLAトランスジェニックマウスで生成されたインビボCTL応答（ワクチン接種によるものでも自然の感染によるものであっても）が、動物の個体差のため、およびこの測定法に必要なプライムＴ細胞のインビトロ操作のために、実験毎に変動することを見いだした。力価測定法はインビボのバイオアッセイに共通の限界を有するが、これはEP-2101の全体的力価の測定値を与える。従ってこれは、本明細書に記載の高感度かつ定量的分析法を適切に補うものとなる。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７６】
ELISPOT測定法によるCTLとHTL誘導の測定
EP-2101に得られたCTLまたはHTL応答を測定するためのELISPOT測定法を、既に記載されているプロトコール（Lewis, JJら、Int. J Cancer 87:391 (1998)）に従って行った。簡単に説明すると、平底96ウェルニトロセルロースプレート（IP、ミリポア（Millipore））をIFN-γmAb（10μg/ml、R4-6A2、ファーミンゲン（PharMingen））を4℃で一晩インキュベートした。PBSで洗浄後、プレートをRPMI-10培地で37℃で1時間ブロックした。4×105のCD8+細胞またはCD4*細胞（EP-2101免疫脾臓細胞からミレテニイ単離システムで単離した）および5×104Jurkat細胞（CD8+細胞について）、または105γ放射線照射投薬経験の無い脾臓細胞（CD4+細胞、赤血球溶解緩衝液で処理）を各我々に加えた。ウェルに10μg/mlのCTLまたはHTLペプチドを入れて、EP-2101エピトープに対する応答の誘導についてまたは無関係のペプチドの同一の濃度について試験する。CD8 ELISPOT測定法についての無関係のペプチドは、HCVコア132ペプチド（DLMGYIPLV（配列番号17））とCD4 ELISPOT測定法についてHCV NS3.1253（GYKVLVLNPSVAATL（配列番号18））であった。インキュベーション後、プレートをPBS／0.05％ツイーン20で完全に洗浄し、各ウェルにビオチン化IFN-γ mAb（2μg/ml、コロニーXMG1.2、ファーミンゲン（PharMingen））を加えて、37℃で2〜4時間インキュベートした。PBS／0.05％ツイーン20で4回洗浄後、ベクタステイン（Vectastain）ABCペルオキシダーゼ（ベクタステインエリートキット（Vectastain Elite kit）；ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories, Inc.）、バーリンゲーム（Burlingame）、カリホルニア州、アメリカ合衆国）をウェルに加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS／0.05％ツイーン20で3回洗浄し、次にPBSで3回洗浄した。100μlのAEC溶液（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））を加えてスポットを発色させた。4〜6時間後水道水で反応を停止させた。スポットをコンピューター支援画像分析により計数した（ツァイス（Zeiss）KS ELISPOTリーダー、ジェナ（Jena）、ドイツ）。スポットの数／106 cd8+細胞またはcd4+細胞を、（関連ペプチドに対するスポットの数）−（無関係の対照ペプチドによるスポットの数）×2.5として計算した。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７７】
【表１】
2006526628.tif 000002
【表２】
2006526628.tif 000003
【表３】
2006526628.tif 000004
【表４】
2006526628.tif 000005
【表５】
2006526628.tif 000006
【表６】
2006526628.tif 000007
【表７】
2006526628.tif 000008
【表８】
2006526628.tif 000009
【表９】
2006526628.tif 000010
【表１０】
2006526628.tif 000011
【表１１】
2006526628.tif 000012
【表１２】
2006526628.tif 000013
【表１３】
2006526628.tif 000014
【表１４】
2006526628.tif 000015
【表１５】
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【表１６】
2006526628.tif 000017
【表１７】
2006526628.tif 000018
【表１８】
2006526628.tif 000019
【表１９】
2006526628.tif 000020
【表２０】
2006526628.tif 000021
【表２１】
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【表２２】
2006526628.tif 000023
【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
2006526628.tif 000030
【表３０】
2006526628.tif 000031