(57)【要約】  本発明は、安全性向上のための自己制限Ｃａｓ９回路網（ＳＬｉＣＥＳ）を記載し、ＳＬｉＣＥＳは、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）用の発現ユニット、第１のＣａｓ９自己標的化ｓｇＲＮＡおよび選択されたゲノム遺伝子座を標的化する第２のｓｇＲＮＡからなる。Ｃａｓ９レベルを制御することによる自己制限回路は、ゲノム編集特異性の向上をもたらす。そのインビボ利用のために、ウイルス粒子産生を達成するための回路阻害によってＳＬｉＣＥＳをレンチウイルス送達系（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ）に組み込んだ。標的細胞へのその送達に続いて、ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ回路をオンにして意図するゲノム遺伝子座を編集し、それと同時にＳｐＣａｓ９不活性化によるそれ自体の中和を促進する。標的細胞を残留ヌクレアーゼ活性から保護することによって、本発明のヒットアンドゴー系はゲノム編集のための安全域を増加させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の安全性向上のための自己制限Ｃａｓ９回路網（Ｓｅｌｆ−Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｃａｓ９  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓａｆｅｔｙ：ＳＬｉＣＥＳ）プラスミドであって、
Ｃａｓ９分子用の発現カセット、
前記Ｃａｓ９分子を標的化するｓｇＲＮＡ（抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および
選択されたゲノム遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡ（標的ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、を含み、
少なくとも１つのイントロンが前記Ｃａｓ９分子用の前記発現カセットのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に存在して、２つ以上のエクソンに分割された発現カセットを形成し、かつ／または少なくとも１つのイントロンが、前記抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡの成熟転写物をコードする前記ヌクレオチド配列中に存在し、前記イントロンが、２つ以上のエクソンに分割された発現カセットをコードする転写配列中に存在し、かつ／あるいは
前記Ｃａｓ９分子用の前記発現カセットおよび／または抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列に、誘導性プロモーターを含む配列が先行する、プラスミド。
【請求項２】
前記抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡが、１７〜２３ヌクレオチドの配列によってコードされ、好ましくはＧで始まる、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡコード配列が、配列番号１〜６からなる群において選択される配列と少なくとも６０％の相同性を有する配列である、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項４】
前記Ｃａｓ９分子用の発現カセットおよび／または前記抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が少なくとも１つのイントロンを含み、かつ
前記Ｃａｓ９分子用の発現カセットおよび／または前記抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡをコードする配列に、誘導性プロモーターを含む配列が先行する、請求項１から３のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項５】
前記Ｃａｓ９分子用の発現カセットおよび前記抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡをコードする配列の両方に、誘導性プロモーターを含む配列が先行する、請求項１から４のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドを含む遺伝子改変微生物。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドをトランスフェクトした細胞。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドを含む人工送達系またはウイルス送達系。
【請求項９】
薬物として使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドまたは請求項８に記載の人工送達系またはウイルス送達系。
【請求項１０】
単一遺伝子疾患、高コレステロール、抗トリプシン欠乏症、癌、糖尿病、感染性細菌性およびウイルス性疾患の治療において使用される、請求項９に記載のプラスミドまたはウイルスもしくは人工系。
【請求項１１】
ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現またはバイオテクノロジーにおける、請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドまたは請求項８に記載のウイルスもしくは人工系のインビトロでの使用。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドまたは請求項８に記載のウイルスもしくは人工系および少なくとも別の製薬上許容される成分を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項８に記載のウイルス送達系を調製するためのプロセスであって、
請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドで細菌を形質転換するステップであって、前記細菌が、前記イントロンの存在によって、または前記誘導性プロモーターに特異的なリプレッサーの発現によって、またはＣａｓ９および／またはｓｇＲＮＡ発現を阻止するために適した別の系によって、Ｃａｓ９および／またはｓｇＲＮＡの発現が阻止されるステップ、ならびに／あるいは
請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドを細胞にトランスフェクトするステップであって、前記細胞が前記誘導性プロモーターに特異的なリプレッサーを発現しているかまたは前記細胞がＣａｓ９および／または抗Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ発現を調節するための別の系を含んでいるステップ
を含む、プロセス。
【請求項１４】
細菌において毒性転写物の成熟発現を阻止するための方法であって、前記方法が、前記毒性転写物をコードするヌクレオチド配列中に少なくとも１つのイントロンを導入するステップであって、前記イントロンを２つ以上のエクソンに分割された発現カセットをコードする転写配列に入れるステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記毒性転写物がヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡの一部として機能する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｃａｓ９ゲノム編集配列の再標的化を防止するための方法であって、前記方法が請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドを使用することを含む、方法。
【請求項１７】
インビトロ培養細胞またはインビボ動物モデルにおいてＣａｓ９オフターゲットを検出するための方法であって、前記方法が請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミドを使用することを含み、前記プラスミドが直接に、または非組み込みベクターの形で導入される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のための発現ユニットおよび関連するレンチウイルス粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のインビボ適用は、依然として望ましくないＣａｓ９ゲノム切断によって制限されている。Ｃａｓ９の長期発現は、ヌクレアーゼによって非特異的に切断されるゲノム遺伝子座の数を増加させる。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によるゲノム編集は、その単純さ、標的設計の柔軟性、および多重標的化能力のために、基礎適用および臨床適用の両方に対して非常に大きな可能性を秘めている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９利用における主な制限は、意図する標的とは異なる部位で誘導される突然変異である。望ましくない変更は好ましくない臨床成績を引き起こし得るので、これはインビボ適用にとって極めて重要である。
【０００４】
オフターゲット修飾の数に影響を与える重要な要素は、標的細胞におけるＳｐＣａｓ９発現の量および持続性である。高濃度のヌクレアーゼは、オフサイト切断を増加させると報告されているが、ＳｐＣａｓ９の量を減らすと特異性は増加する。組換えＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体の標的細胞への直接送達によって得られる特異性の増強によって（Ｋｉｍ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１４，２４，１０１２−１０１９；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１４，２４，１０２０−１０２７；Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３，７３−８０）、あるいは、インテインによって活性化したＳｐＣａｓ９変異体を使用することによって（Ｄａｖｉｓ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１１，３１６−３１８）実証されるように、一過性ＳｐＣａｓ９発現は、実際に標的ゲノム遺伝子座を永久的に修飾してオフターゲット活性を低下させるのに十分である。標的遺伝子座が編集された後に存在するどんなＣａｓ９タンパク質も、さらなる部位を修飾する実質的な確率を有する可能性がある。たとえＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の直接送達がオフターゲット効果を低下させるとしても、それは非常に非効率的であり、インビボアプローチに不適である。
【０００５】
Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６，３５１，８４−８８）は、改良された特異性を有する合理的に操作されたＣａｓ９ヌクレアーゼを記載している。
【０００６】
ウイルスベクターは最適なデリバリーツールであるが、これらは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の適用には必ずしも有益でない、導入因子の安定発現を生じる。Ｃａｓ９の量および持続性がオフターゲットの蓄積をもたらすこと、および、レンチウイルス系を介して永久的に送達されるＣａｓ９がオフターゲット部位でインデルの一貫した一時的増加をもたらすことは公知である。
【０００７】
Ｃａｓ９活性を制御することを目的としたアプローチが、最近、様々な誘導系を利用することによって開発された（Ｎｕｎｅｚ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１６，１１，６８１−６８８）。それにもかかわらず、これまでに報告されたアプローチには、ヌクレアーゼ分割（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．２０１５，２９１  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２，２９８４−２９８９）または化学修飾（Ｄａｖｉｓ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１１，３１６−３１８）によって生じる編集活性の低下から、バックグラウンド活性（Ｎｉｈｏｎｇａｋｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３，７５５−７６０）または誘導に必要な時間の延長（Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３，１３９−１４２）にまで及ぶ、多数の制限がある。
【０００８】
Ｋｉａｎｉ  Ｓ．，ら（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５，１２（１１）：１０５１−１０５４）は、Ｃａｓ９関連ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の長さを変えることにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を制御し、単一のＣａｓ９タンパク質でゲノム編集と転写調節を同時に行うことが可能であることを開示した。
【０００９】
国際公開第２０１５／０７００８３号は、Ｃａｓ９分子をコードする核酸配列を標的化するｇＲＮＡ分子（抗Ｃａｓ  ｇＲＮＡ）を記載している。また、ａ）支配的ｇＲＮＡ分子をコードする第１の核酸配列、およびｂ）Ｃａｓ９分子をコードする第２の核酸配列を含む核酸も記載され、該支配的ｇＲＮＡ分子はＣａｓ９分子標的化ｇＲＮＡ分子（抗Ｃａｓ  ｇＲＮＡ）を含む。
【００１０】
残留Ｃａｓ９活性から標的細胞を保護することが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の安全域をそのインビボ研究での実施に向けて改善するための、差し迫った必要条件になりつつある。
【００１１】
本発明の目的は、Ｃａｓ９発現を下方調節するためのヌクレオチド配列を提供することである。本発明のさらなる目的は、ゲノム編集後にＣａｓ９発現が不活性化される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のための発現ユニットを提供することである。本発明のもう一つの目的は、ウイルスに基づく送達の効率を達成し、同時に形質導入およびウイルス組み込み後のＳｐＣａｓ９の量を制限する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のためのレンチウイルス系を提供することである。本発明の目的は、細菌中および／またはパッケージング細胞中で機能性Ｃａｓ９またはｇＲＮＡの発現を阻止するための方法を提供することである。また、本発明の目的は、形質導入後の限られた量のＳｐＣａｓ９を用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の完全に機能的なウイルス送達をもたらすための方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書に記載されるのは、「ヒットアンドゴー」Ｃａｓ９アプローチによるゲノム編集を可能にする新しい技術であり、これを本発明者らは「安全性向上のための自己制限Ｃａｓ９回路網（Ｓｅｌｆ−Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｃａｓ９  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓａｆｅｔｙ：ＳＬｉＣＥＳ）」と命名した。
【００１３】
本発明の主題は、
Ｃａｓ９分子用の発現カセット、
Ｃａｓ９分子を標的化するｓｇＲＮＡ（抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ）をコードする第１のヌクレオチド配列、および
選択されたゲノム遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡ（標的ｓｇＲＮＡ）をコードする第２のヌクレオチド配列、を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の安全性向上のための自己制限Ｃａｓ９回路網（ＳＬｉＣＥＳ）プラスミドであり、
少なくとも１つのイントロンが前記Ｃａｓ９分子用の発現カセットのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に存在して、２つ以上のエクソンに分割された発現カセットを形成し、かつ／または少なくとも１つのイントロンが、前記抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡの成熟転写物をコードするヌクレオチド配列中に存在し、前記イントロンが、２つ以上のエクソンに分割された発現カセットをコードする転写配列中に存在し、かつ／あるいは
Ｃａｓ９分子用の発現カセットおよび／または抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡをコードする配列に、誘導性プロモーターを含む配列が先行する。
【００１４】
本発明の主題はまた、上記のプラスミドを含む、ウイルスまたは人工送達系である。
【００１５】
本発明のさらなる主題は、特に遺伝子治療において薬物として使用するための上記のプラスミドまたはウイルスもしくは人工の系である。
【００１６】
本発明のさらなる主題はまた、ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現またはバイオテクノロジーにおける、上記のプラスミドまたはウイルスもしくは人工の系のインビトロでの使用である。
【００１７】
本発明の主題はまた、上記のプラスミド、またはウイルスもしくは人工の系、および少なくとも別の製薬上許容される成分を含む、医薬組成物である。
【００１８】
本発明のさらなる主題はまた、上記のようなウイルス系を調製するためのプロセスであり、該プロセスは、
上記のプラスミドで細菌を形質転換することであって、前記細菌が、イントロンの存在によって、または誘導性プロモーターに特異的なリプレッサーの発現によって、またはＣａｓ９および／またはｓｇＲＮＡ発現を阻止するために適した別の系によって、Ｃａｓ９および／またはｓｇＲＮＡの発現が阻止されること、および／または
上記のプラスミドを細胞にトランスフェクトすることであって、前記細胞が誘導性プロモーターに特異的なリプレッサーを発現しているかまたは前記細胞がＣａｓ９および／または抗Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ発現を調節するための系を含んでいて、前記細胞に好ましくはプラスミドをトランスフェクトしてウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター（すなわちΔＲ８．９、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ）を作製すること
を含む。
【００１９】
ＳＬｉＣＥＳの主な利点は、ＤＮＡ標的修飾の完了を超えて連続的なヌクレアーゼ活性を阻止する、Ｃａｓ９の一過性の性質である。その上、ＳＬｉＣＥＳは多様な利点、
・限られたオフターゲット活性、
・ウイルス系、特にレンチウイルス系による効率的な送達（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ）、
・多様なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼへの適合性。
・多様なウイルスベクターへの適合性
を提供する。
【００２０】
驚くべきことに、Ｃａｓ９レベルを制御することによる自己制限回路は、ゲノム編集特異性の向上をもたらす。それをインビボで利用するための、ウイルス粒子産生を達成するための回路阻害によるＳＬｉＣＥＳのレンチウイルス送達系への組み込み（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ）は成功した。標的細胞へのその送達に続いて、ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ回路をオンにして意図するゲノム遺伝子座を編集し、それと同時にＳｐＣａｓ９不活性化によるそれ自体の中和を促進する。標的細胞を残留ヌクレアーゼ活性から保護することによって、本発明者らのヒットアンドゴー系はゲノム編集のための安全域を増加させる。
【００２１】
全体として、ウイルス送達の実行と組み合わせた、ＳＬｉＣＥＳの「ヒットアンドゴー」の性質および新しいＣａｓ９技術へのその適合性は、Ｃａｓ９の望ましくないオフターゲット活性を制限する、より制御可能なゲノム編集手順を可能にする。
【００２２】
本発明のさらなる主題は、細菌において毒性転写物の成熟発現を阻止するための方法であり、前記方法は、前記毒性転写物をコードするヌクレオチド配列中に少なくとも１つのイントロンを導入すること、前記イントロンを２つ以上のエクソンに分割された発現カセットをコードする転写配列に入れることを含む。好ましくは、毒性転写物はヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡまたはその一部として機能する。好ましくは、ヌクレアーゼはＣａｓ９である。
【００２３】
本発明によるプラスミドは、好ましくは、少なくともイントロン、および誘導性プロモーターをコードする配列を含む。より好ましくは、イントロンは、Ｃａｓ９分子用の発現カセットのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内にあり、２つ以上のエクソンに分割された発現カセットを形成する。最も好ましくは、イントロンは１つだけである。
【００２４】
本発明によるプラスミドは、より好ましくは、Ｃａｓ９分子用の発現カセットと抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡをコードする配列の両方に、誘導性プロモーターを含む配列が先行するプラスミドである。好ましくは、ｇＲＮＡは、Ｐｏｌ−ＩＩＩ認識プロモーターによって発現する。好ましくは、ｇＲＮＡは、Ｕ６またはＨ１プロモーターによって発現する。好ましくは、ｓｇＲＮＡはヒトＵ６またはＨ１プロモーターによって発現する。ｇＲＮＡは、ｔＲＮＡプロモーターによって発現させることができる（Ｍｅｆｆｅｒｄ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，ＲＮＡ，２１，１６８３−９）。ｇＲＮＡは、Ｐｏｌ−ＩＩプロモーターによって発現させることができる（Ｎｉｓｓｉｍ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，５４，６９８−７１０）。ｓｇＲＮＡは、エキソまたはエンドＲＮＡｓｅ（すなわちＣｓｙ４）によってプロセシングされ得る。
【００２５】
本発明によれば、多様な種のＣａｓ９分子を、本明細書に記載される方法および組成物で使用することができる。本明細書中の記載の大部分は化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子を使用しているが、その他の種由来のＣａｓ９分子、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子をそれらに置き換えることができる。さらなるＣａｓ９種としては、以下が挙げられる：アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノミセス菌種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ａｌｉｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ））、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス菌種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム菌種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、カンジダタス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マツルショッティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリカム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科細菌、メチロシスティス菌種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルカンス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア菌種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス菌種、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム菌種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス菌種、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、連鎖球菌菌種、サブドリグラヌルム菌種、ティストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ菌種、またはベルミンフォロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）。
【００２６】
Ｃａｓ９分子は、その用語が本明細書中で使用されるとき、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインおよびＰＡＭ配列を含む部位に局在する（例えば、標的化するかまたは帰る）ことのできる分子を指す。Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子を切断できる。
【００２７】
例となる、天然に存在するＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３；１０：５，７２７−７３７に記載されている。
【００２８】
例となる、天然に存在するＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、化膿性連鎖球菌（例えば、ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳＩ−１株）、Ｓ．サーモフィルス（例えば、ＬＭＤ−９株）、Ｓ．シュードポルシヌス（例えば、ＳＰＩＮ  ２００２６株）、Ｓ．ミュータンス（例えば、ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５株）、Ｓ．マカカ（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、Ｓ．ガロリティカス（例えば、ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２０６９株）、Ｓ．エクインズ（例えば、ＡＴＣＣ  ９８１２、ＭＧＣＳ  １２４株）、Ｓ．ディスダラクティアエ（ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、ＧＧＳ  １２４株）、Ｓ．ボビス（例えば、ＡＴＣＣ  ７００３３８株）、Ｓ．アンギノサス（例えば、Ｆ０２１１株）、Ｓ．アガラクチア（例えば、ＮＥＭ３１６、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノキュア（Ｌ．イノキュア、例えば、Ｃｌｉｐｌ  ｌ２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、ＤＳＭ  １５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子が挙げられる。さらなる例となるＣａｓ９分子は、髄膜炎菌のＣａｓ９分子（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６）および黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子である。
【００２９】
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列または天然に存在するＣａｓ９分子配列と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性をもつかまたはそれと同一であるアミノ酸配列を含む、例えば、本明細書に列挙されるかまたはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３，１０：５，７２７−７３７；Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６に記載される種に由来するＣａｓ９分子である。
【００３０】
Ｃａｓ９はまた、最近開発された、操作されたＣａｓ９分子でもあり得る（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６．５２９，４９０−５；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６．３５１，８４−８．Ｎｕｎｅｚ  Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１６．１１，６８１−６８８；Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１５．１１２，２９８４−２９８９．Ｎｉｈｏｎｇａｋｉ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５．３３，７５５−７６０．Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５．３３，１３９−１４２）。
【００３１】
Ｃａｓ９分子はまた、ニッカーゼ（例えばＤ１０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０ＡおよびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異ドメイン）、ＤＮＡを切断できないＣａｓ９ヌクレアーゼドメインの変異体（例えばＤ１０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、およびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異ドメイン）、ヌクレアーゼドメインとの融合体（例えばＦｏｋ−Ｉ）、あるいは核酸編集ドメイン（例えばＤＮＡデアミナーゼ）であるように、変異または操作されることもできる。
【００３２】
Ｃａｓ９分子は、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１のような異なるサブタイプおよびクラスのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって置換され得、例はＳｈｍａｋｏｖ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０１５，６０，３８５−３９７に含まれている。
【００３３】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｇａｏ  Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１６．３４，７６８−７７３にゲノム編集について最近記載された、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ナトロノバクテリウム・グレゴリー・アルゴノート）で置換することができる。
【００３４】
本発明によれば、ｓｇＲＮＡは、当技術分野で公知の任意のＤＮＡ配列を標的化することができる。標的化ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子に対して異なる親和性を有するように修飾され得る。標的化ｓｇＲＮＡは、標的細胞内でより安定するように修飾され得る。標的化ｓｇＲＮＡは、化学修飾され得る（すなわち、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＲＮＡ脱アミノ化／脱アミノ反応）。標的化ｓｇＲＮＡは、その５'および３'末端でさらなるＲＮＡドメインと融合することができる（すなわちＭＳ２リピート、ＲＮＡヘアピン）。ｓｇＲＮＡは、単一分子に限定されないが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ−ＲＮＡと同様に異なるＲＮＡ分子によって形成され得るｇＲＮＡであり得る。特に好ましいのは、治療上興味深い遺伝子座を標的化する標的ｓｇＲＮＡである。標的ｓｇＲＮＡ遺伝子座は、単一の標的としてまたは組み合わせて（すなわち合成致死性）、体細胞、幹細胞または癌細胞の増殖または適応度に影響を及ぼす遺伝子または遺伝子間配列である。標的ｓｇＲＮＡは、細胞代謝に関与する遺伝子をコードすることができる。標的ｓｇＲＮＡ遺伝子座は、ウイルス感染の持続または複製に必要な遺伝子をコードすることができる。特に好ましい遺伝子座は、例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＢＢ、Ｐｒｐ、ＨＴＴ、ＰＣＳＫ９、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＬＥＤＧＦ／ｐ７５；ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＴＣＲ、ＢＣＲ、ＶＥＧＦＡ、ＺＳＣＡＮ、ＥＭＸ１、ＲＯＳＡ２６、ＡＡＶ１、β−グロビン、ＣＦＴＲであり得る。
【００３５】
ｓｇＲＮＡの標的は、ウイルス起源のＤＮＡ配列であり得る（ｖａｎ  Ｄｉｅｍｅｎ  Ｆ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１６．１２（６）：ｅ１００５７０１；Ｓｅｅｇｅｒ  ＣおよびＳｏｈｎ  Ｊ．Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１４）３，ｅ２１６）。ＳＬｉＣＥＳの適用は、ウイルスの適応度および複製に重要なウイルスの遺伝要素を標的化することにより、感染細胞からウイルスを除去することを目的とすることであり得る。特に好ましいウイルス遺伝子座は、例えば、
−ＨＩＶ−１ゲノム、優先的に保存された領域、ＬＴＲ、プロテアーゼ、インテグラーゼ、ＧａｇおよびＧａｇＰｏｌ、
−レトロウイルスゲノム、優先的に保存された領域、ＬＴＲ、プロテアーゼ、インテグラーゼ、ＧａｇおよびＧａｇＰｏｌ、
−ＨＢＶゲノム、優先的に保存された領域、ＲＴ、表面Ａｇ、コア遺伝子、
−単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム、優先的に保存された領域、
−ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ゲノム、優先的に保存された領域、
−エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノム、優先的に保存された領域、
−ヒトパピローマウイルスゲノムおよびエピソーム、優先的にはＥ６またはＥ７
であり得る。
【００３６】
ウイルス遺伝要素へのＳＬｉＣＥＳの適用は、組換えウイルスの操作を容易にすることを目的とし得る（Ｓｕｅｎａｇａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４．５８，５１３−２２；Ｂｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  １０（５）：ｅ１００４０９０）。
【００３７】
本発明のＳＬｉＣＥＳプラスミドを含むウイルス送達系は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルス、優先的にレンチウイルス、レトロウイルス、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＡＡＶ、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｒｖｉｒｕｓ）であり得る。好ましくは、本発明によれば、ウイルス送達系はレンチウイルス系（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ）である。以降、本明細書では、本発明のＳＬｉＣＥＳプラスミドを含むレンチウイルス系の例が報告される。レトロウイルス、ＳＩＶ、ＥＩＡＶに関して、系はコピーされた同一のものであってよい。ＡＡＶ、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｒｖｉｒｕｓ）に関して、系は同じ原理に基づいて適合させることができる。
【００３８】
一態様に関して、本発明は、上記のようなプラスミドを含む、遺伝子改変微生物、好ましくは細菌に関する。
【００３９】
一態様に関して、本発明は、上記のようなプラスミドをトランスフェクトした細胞、好ましくは哺乳類細胞に関する。
【００４０】
バクテリオファージは、それ自体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードすることができる（Ｓｅｅｄ  ＫＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３．２８，４８９−９１；Ｂｅｌｌａｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５．６，６５６）。バクテリオファージは、簡単な操作によって、ＳＬｉＣＥＳが特定の細菌集団における標的二重鎖切断形成のタイミングを制御し、特異性を高めるためのウイルス送達系となることができる。バクテリオファージによって送達されるＳＬｉＣＥＳ系は、例えば異種細菌集団の組成を変えるか、または特異的なファージを細菌集団から除去するために使用することができる。バクテリオファージに対して機能するため、ＳＬｉＣＥＳ系は真核生物のイントロンを含むことができなかった。それはＳＬｉＣＥＳが真核生物イントロンをプロセシングできない細菌において完全に機能的でなければならないためである。
【００４１】
細菌細胞を使用して、ＳＬｉＣＥＳ回路をその他の細菌細胞に（すなわちＳＬｉＣＥＳ  ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を送達する細菌コンジュゲ―ション）、または哺乳類細胞に（ＳＬｉＣＥＳ回路を含み、ＳＬｉＣＥＳ  ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を送達する、操作されたトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）による哺乳類細胞の感染）に送達することができた。
【００４２】
本発明のＳＬｉＣＥＳプラスミドを含む人工送達系は、例えば、有機もしくは無機媒体（人工細胞もしくは幽霊細胞、リポソーム、小胞、エキソソーム、細菌の外膜小胞、脂肪酸滴、タンパク質、ペプチド、合成化合物、金属および非金属粒子ならびにナノ粒子、フラーレン、カーボンナノチューブ）、機械装置（マイクロ流体圧搾、マイクロインジェクション、ナノマシン、マイクロマシン）、流体力学的注入、エレクトロポレーションであり得る。
【００４３】
したがって、本発明のプラスミド、ウイルスおよび人工の系は、ゲノム編集が完全に使用され得るいくつかの単一遺伝子疾患、例えば、嚢胞性線維症、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症状群）、ウィスコット・アルドリッチ症状群、血友病ＡおよびＢ、ハーラー症状群、ハンター症状群、ゴーシェ病、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、カナバン病、慢性肉芽腫症、家族性高コレステロール血症、ファンコニ貧血、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠乏症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症、白血球癒着欠乏症、ジャイラーゼ萎縮症、ファブリー病、ポンペ病、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病Ａ、Ｂ、Ｓｌｙ症状群、サンフィリポ病、マロトー・ラミー病、アスパルチルグルコサミン尿症、筋萎縮性側索硬化症、接合部型表皮水疱症、白血球粘着異常、ファーバー病、クラッベ病、ウォルマン病などの治療において有用となり得る。
【００４４】
本発明から利益を受ける可能性のあるその他の疾患は、限定されるものではないが、高コレステロール、抗トリプシン欠乏症、癌、糖尿病、感染性細菌性およびウイルス疾患であり得る。いくつかの例がＭａｅｄｅｒ  Ｍ．Ｌ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｂａｃｈ  Ｃ．Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１６，２４，４３０−４４６に含まれている。
【００４５】
ＳＬｉＣＥＳは、ＨＤＲ（相同指向修復）後の標的ＤＮＡ遺伝子座のＣａｓ９再切断を制限し、正確なＨＤＲの確率を増加させる。正確なＨＤＲは、細胞生物学および分子医学における大部分のゲノム編集適用に必須である。複雑で時間のかかる手順が、この問題に対処するために開発された（Ｐａｑｕｅｔ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１６，５３３，１２５−９）。ＳＬｉＣＥＳおよびｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳは、ドナーＤＮＡと一緒に送達されてＨＤＲを誘導することができる。Ｃａｓ９の自己不活性化は、Ｃａｓ９の再切断を阻止するために現在必要とされる追加の保護的突然変異を必要とせずに、遺伝子修正された遺伝子座のさらなる切断を阻止する。保護的突然変異は、ドナーＤＮＡと標的遺伝子座との間の誤対合であり、これはｇＲＮＡ標的化配列内またはＣａｓ９認識ＰＡＭ配列内に位置する。保護的突然変異の挿入は、標的遺伝子座の正しい機能に予想外に影響を及ぼし得るので、回避されるかまたは制限されるべきである。
【００４６】
例えばＢｒｕｎｅｌｌｏ、ＢｒｉｅおよびＧｅＣＫＯライブラリを使用するゲノム全体での遺伝子ノックアウトスクリーニングは、ＳＬｉＣＥＳおよびｌｅｎｔｉ−ＳＬｉＣＥＳを利用して、スクリーニングの正確性および再現性に影響を及ぼし得るオフターゲット効果を低減することができる。
【００４７】
本発明によれば、抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子を標的化できる任意のｓｇＲＮＡであってよい。例えば、国際公開第２０１５／０７００８３号に開示される抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡであってよい。好ましくは、本発明によれば抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡは、１７〜２３ヌクレオチドの配列によってコードされ、好ましくはＧで始まるものである。好ましくは、抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡコード配列は、配列番号１〜６からなる群において選択される配列と少なくとも６０％の相同性を有する配列である。より好ましくは、抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡコード配列は、配列番号１〜６からなる群において選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％の相同性を有する配列である。最も好ましくは、抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡコード配列は、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９分子を標的化するための配列番号１〜３からなる群において選択される配列と同一の配列であるか、またはＳ．サーモフィルスのＣａｓ９分子を標的化するための配列番号４〜６からなる群において選択される配列と同一の配列である。
【００４８】
好ましくは、本発明によるプラスミドは、抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡをコードし、かつ／または標的ｓｇＲＮＡが存在する配列に続いて隣接する、ｇＲＮＡ骨格をコードするかまたは最適化されたｇＲＮＡ骨格をコードする配列を含む。好ましくは、抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡをコードする配列は、最適化されたｇＲＮＡ骨格をコードする配列に隣接し、標的ｓｇＲＮＡをコードする配列の後にｇＲＮＡ骨格をコードする配列が続く。好ましくは、ｇＲＮＡ骨格をコードする配列は配列番号７であり、最適化されたｇＲＮＡ骨格をコードする配列は配列番号８である。
【００４９】
ＳｐＣａｓ９の発現の漏れおよび結果として生じる細菌中でのプラスミド調製中のＤＮＡの分解を避けるために、イントロンをＳｐＣａｓ９オープンリーディングフレームに導入して、２つのエクソン（エクソン１および２、図８に図式化）に分割された発現カセットを形成した。スプライシングは細菌中では起こらないので、産生された転写物は触媒的に不活性なＳｐＣａｓ９断片として細菌中で翻訳される。イントロンとして、最終ＲＮＡ産物の成熟中にＲＮＡスプライシングによって除去されるどんなヌクレオチド配列も導入することができる。適しているのは、以下の例である。
−イントロンとエクソンの境界に位置する特異的なイントロン配列（５'スプライス部位、分岐点、ポリピリミジントラクト、３'スプライス部位）を特徴とする、核ｍＲＮＡ前駆体イントロン（スプライセオソームイントロン）、
−タンパク質によって除去されるトランスファーＲＮＡ遺伝子中のイントロン（ｔＲＮＡイントロン）、
−ＲＮＡ触媒作用によって除去される自己スプライシングイントロン。
−ＲＮＡリボザイム。
【００５０】
好ましくは、イントロンは、マウス免疫グロブリン重鎖前駆体Ｖ領域イントロンに由来する。より好ましくは、配列番号９と同一のイントロンである。優先的なイントロンは、ウサギβグロビンイントロン２でもある。
【００５１】
真核生物遺伝子に存在するほとんどの異なるイントロンは、細菌におけるＣａｓ９発現を阻止するために使用され得、それらの一部は、特異的な真核生物組織に対するＣａｓ９発現を制限するためにも利用され得る。
【００５２】
イントロンは、細菌におけるｇＲＮＡ、特に自己標的化ｇＲＮＡの正しい発現を阻止するためにも使用され得る。イントロンは、ｇＲＮＡの可変部分または定常部分に導入され得る。同様に、イントロンは、ｃｒ−またはｔｒａｃｒ−ＲＮＡに導入され得る。
【００５３】
細菌におけるＣａｓ９発現の漏れを阻止するために、その発現は、Ｃａｓ９遺伝子内のイントロンの代わりに誘導性プロモーターによって調節され得る。これは、ＤＮＡプラスミドが増幅されている間、Ｃａｓ９発現を阻止することができる（特に、構成的プロモーターＰｌａｃｉｑおよびＰＮ２５によってそれぞれ駆動されるＬａｃ  ＲｅｐｒｅｓｓｏｒおよびＴｅｔ  Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒをコードする遺伝子を保有するＤＨ５α−Ｚ１）。誘導性プロモーターについては下記も参照されたい。
【００５４】
同様に、誘導性プロモーターは、細菌中のｇＲＮＡ発現、特に自己標的化ｇＲＮＡを阻止するために使用され得る（例えばＨ１−ＴｅｔＯプロモーター）。
【００５５】
細菌におけるＣａｓ９発現の漏れを阻止するために、リボスイッチ（それらの特異的リガンドに応答してシスで遺伝子発現を制御するｍＲＮＡ中のＲＮＡ要素）を、Ｃａｓ９翻訳を駆動するために用いることができ、Ｃａｓ９遺伝子内のイントロンの代わりに用いることもできる。天然に調節されているリボスイッチおよび人工のリボスイッチのおよびＩＲＥＳの両方は、優先的にリガンド（すなわち、テオフィリン、フラビンモノヌクレオチド、テトラサイクリン、ドキシサイクリンおよびスルホローダミンＢ）によって制御される場合に、細菌におけるＣａｓ９発現を阻止するために使用され得る。
【００５６】
細菌におけるＣａｓ９およびｇＲＮＡ発現は、ＲＮＡに作用するアンチセンスヌクレオチドまたはＣａｓ９遺伝子およびｇＲＮＡをコードするＤＮＡの使用によっても制御され得る。
【００５７】
レンチウイルスベクター産生中の自己切断活性を回避するために、誘導性プロモーターを導入して、好ましくはＣａｓ９および抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ発現の両方を調節した。誘導性プロモーターは、好ましくはテトラサイクリン誘導性（ＴｅｔＯ）プロモーター、ＡＡＲＥ（アミノ酸応答配列）、ＬａｃＯプロモーター、ＬｅｘＡプロモーター、熱ショックプロモーター、光誘導性プロモーター、エクジソン応答性プロモーターからなる群において選択される。
【００５８】
誘導性プロモーターは、産生細胞で発現する特異的な対応するリプレッサーによって負に調節される。ＴｅｔＯプロモーターは、特異的リプレッサー、ＴｅｔＲによって負に調節され、ＴｅｔＲは産生細胞で発現し、ドキシサイクリンの不在下で、プロモーター領域内に位置するテトラサイクリンオペレーター配列との結合によって転写を阻害する（図８のｂに図式化）。ＡＡＲＥ（アミノ酸応答配列）発現系は、１個のＥＡＡ（必須アミノ酸）が不足している食事によって急速に活性化される。パッケージング細胞は、発現を阻止するためにＥＡＡの存在下で増殖させなければならない（Ｃｈａｖｅｒｏｕｘ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１６．３４，７４６−７５１）。ＬａｃＯプロモーターは、ＬａｃＩリプレッサーによって負に調節され、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）の不在下で転写を阻害する。ＬｅｘＡオペレーターは、ＬｅｘＡリプレッサーによって負に制御され、ＲｅｃＡおよびＤＮＡ損傷が存在しない場合に転写を阻害する。熱ショックプロモーターは、「高」温でない場合に抑制される。光誘導性プロモーター。ムリステロンＡおよびポナステロンＡは、エクジソン受容体およびエクジソン応答性プロモーターの類似体であり、目的の遺伝子の発現を推進する。
【００５９】
レンチウイルスベクター産生中の自己切断活性を回避するためのパッケージング細胞中の細菌についても記載されているように、リボスイッチまたは誘導性ＩＲＥＳを導入して、好ましくはＣａｓ９またはｇＲＮＡの発現を調節することができ得る。
【００６０】
同様にアンチセンスヌクレオチドを使用して、パッケージング細胞におけるＣａｓ９およびｇＲＮＡ発現を調節して、レンチウイルスベクター産生中の自己切断活性を回避することができ得る。
【００６１】
ｇＲＮＡ発現を阻止するための記載される方法は、それらの発現が有毒／有害であり、ｌｅｎｔｉ−ＳＬｉＣＥＳベクター調製の効率または安全性を低下させる場合に優先的に、関連する非自己標的化ｇＲＮＡに拡張され得る。
【００６２】
本発明のプラスミドはさらに、ウイルス粒子もしくは形質導入細胞の選択または単離に有用であるか、または例えば以下の１以上を含む、形質導入（ｔｒａｎｄｕｃｅｄ）細胞にさらなる効果を有するヌクレオチド配列を含み得る。  その制御された遺伝子、すなわちブラストサイジン耐性遺伝子の近くのＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位、優先的にはＥＣＭＶ−ＩＲＥＳのようなウイルス起源、または非ウイルス性ＩＲＥＳ、特に興味深いのは、ＦＧＦ−２  ＩＲＥＳのような組織特異的ＩＲＥＳ、または優先的にはリガンド、すなわちテオフィリン、フラビンモノヌクレオチド、テトラサイクリン、ドキシサイクリンおよびスルホローダミンＢによって調節される人工ＩＲＥＳおよびリボスイッチ）、
−レポーター遺伝子（ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（Ｇａｌａｔｔｏｓｉｄａｓｅ））、
−操作されたアミノ酸タグ、ビオチンアクセプタータグとのタンパク質融合体）、標的細胞の増殖および生存を制御するために有用な遺伝子（特にチミジンキナーゼ）、
−形質導入細胞および非形質導入細胞の生存／適応度を増強することができるか、または生物学的効果（すなわち免疫応答、代謝作用、血管リモデリングの制御）を標的または非標的細胞に及ぼすことができる治療用タンパク質（ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、インスリン、ＶＥＧＦＡ）を発現している遺伝子。
【００６３】
本発明の実施形態によれば、本発明のプラスミドは、５'ＬＴＲ、３'ＬＴＲ−ＳＩＮ、ｈＵ６プロモーター、ｇＲＮＡ骨格、標的ｓｇＲＮＡ、ｈＨ１ＴｅｔＯプロモーター、抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ配列、最適化されたｇＲＮＡ骨格、ＣＭＶ−ＴｅｔＯプロモーター、ＦＬＡＧ−ＮＬＳＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ、イントロン、ＥＣＭＶ−ＩＲＥＳ、ブラストサイジン耐性遺伝子、ＷＰＲＥを含む。そのような配列は例えば配列番号１０である。
【００６４】
ＳＬｉＣＥＳ戦略をさらに改善するために、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ；ＩＤＬＶ）を用いて、細胞送達におけるウイルスに基づく効率を維持しながら、Ｃａｓ９発現の一過性ピークのような性質を増強することができる。
【００６５】
ＳＬｉＣＥＳをレトロウイルスベクターに導入するには、Ｌｅｎｔｉ  ＳＬｉＣＥＳに存在する導入遺伝子をレトロウイルストランスファーベクターに導入することで十分である。
【００６６】
ＳＬｉＣＥＳをＥＩＡＶベクターに導入するには、Ｌｅｎｔｉ  ＳＬｉＣＥＳに存在する導入遺伝子をＥＩＡＶトランスファーベクターに導入することで十分である。
【００６７】
ＳＬｉＣＥＳをＳＩＶベクターに導入するには、Ｌｅｎｔｉ  ＳＬｉＣＥＳに存在する導入遺伝子をＳＩＶトランスファーベクターに導入することで十分である。
【００６８】
ＳＬｉＣＥＳをＡＡＶベクターに導入するためには、その遺伝子内にイントロンを含み、かつＣａｓ９上および／または自己標的化ｇＲＮＡ上に誘導性プロモーターを有する、ＳａＣａｓ９のような小さなヌクレオチドサイズのＣａｓ９が使用され得る。
【００６９】
ＳＬｉＣＥＳをアデノウイルスベクターに導入するためには、複製可能な、複製欠損性およびヘルパー依存性ベクターを作製するための標準的な組換えまたはクローニング技術を用いて、ＳＬｉＣＥＳに存在する導入遺伝子をアデノウイルスベクターに導入することで十分である。
【００７０】
ＳＬｉＣＥＳをヘルペスベクターに導入するには、導入遺伝子挿入のための標準的な技術を用いて、ＳＬｉＣＥＳに存在する導入遺伝子をヘルペスベクターに導入することで十分である。
【００７１】
本発明の一態様に関して、主題は、配列番号１〜６からなる群において選択される核酸配列によってコードされる抗Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡでもある。
【００７２】
本開示によるパッケージング細胞には、本明細書中に記載されるように外来核酸が導入され発現され得るどんな細胞も含まれる。本明細書に記載される本開示の基本概念は細胞種によって限定されないことは当然理解される。本開示による細胞には、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、古細菌細胞（ａｒｃｈａｅｌ  ｃｅｌｌ）、真正細菌細胞などが含まれる。細胞には、酵母細胞などの真核細胞、植物細胞、および動物細胞が含まれる。特定の細胞には哺乳類細胞が含まれる。
【００７３】
好ましくは、Ｌｅｎｔｉ−ＳＬｉＣＥＳを産生するためのパッケージング細胞は哺乳類細胞、特にＨＥＫ−２９３細胞であり、これはＳＬｉＣＥＳ活性の擬似活性化を阻止するためにリプレッサーを発現するように改変され得る。逆に、パッケージング細胞は、ＳＬｉＣＥＳ活性化に必要な遺伝子を描くように操作され得る。
【００７４】
パッケージング細胞はまた、ＲＮＡタンパク質発現のための人工的な系またはインビトロの系であり得る。
【００７５】
一態様に関して、本発明は、インビトロ培養細胞またはインビボ動物モデルにおいて、ＤＮＡ切断、優先的にはＣａｓ９オフターゲットを検出するための方法に関し、前記方法は、プラスミドが直接導入されるかまたは非組み込みベクター、例えばＩＤＬＶおよびＡＡＶなどの形態で導入される、上記のようなプラスミドを使用することを含む。前記方法では、プラスミドまたは非組み込みウイルスベクターは、ＳＬｉＣＥＳ活性の活性化によって切断される。結果としてＳＬｉＣＥＳプラスミドまたはベクターは、ＤＮＡ修復機構によってゲノムＤＮＡ切断に捕捉され、このようにゲノムに組み込まれる。組み込み遺伝子座を増幅することにより、ＤＮＡ脆弱部位を検出することと、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９などで処理した細胞において、オンターゲット切断部位およびオフターゲット切断部位を検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】レンチウイルスベクターを介して送達されるＣａｓ９の長期発現はオフターゲット切断の蓄積と相関する。（ａ）ＳｐＣａｓ９を発現するレンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ）を、標的配列と完全に一致するｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ−Ｗ）かまたは標的配列とのミスマッチを１個もしくは２個含有する２つの異なるｓｇＲＮＡ（それぞれｓｇＧＦＰ−ＭおよびｓｇＧＦＰ−ＭＭ）とともに形質導入することによって得られた２９３−ｉＥＧＦＰ非蛍光細胞の百分率の時間経過曲線。無関係のｓｇＲＮＡを発現しているベクターを、対照（ｓｇＣｔｒ）として使用した。（ｂ）（ａ）と同様に、忠実度を高めたＳｐＣａｓ９変異体を発現するレンチウイルスベクターを使用する（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））。（ｃ）ＶＥＧＦＡおよびＺＳＣＡＮ内在性遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡでの長期ＳｐＣａｓ９発現後の、オンターゲット／オフターゲットインデル頻度比として定義されるＤＮＡ修飾特異性。形質導入の１週間後および２１日後に、以前に確認されたオフターゲット部位の修飾率をＴＩＤＥ分析によって定量化した。全ての実験について、非形質導入細胞を除去するために、ピューロマイシンで細胞を選択した。パネル（ａ〜ｃ）において、データは、ｎ＝２の独立した実験についての平均±標準誤差として示される。
【図２】ＳＬｉＣＥＳ回路。（ａ）ＳＬｉＣＥＳ回路のスキーム。ＳｐＣａｓ９は、自己制限活性のためのそれ自体のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および選択された標的配列に向けられるｓｇＲＮＡとともに発現する。（ｂ）ＳＬｉＣＥＳ回路によるＳｐＣａｓ９およびＥＧＦＰ標的遺伝子発現の調節。ＥＧＦＰ、ＳｐＣａｓ９、およびＥＧＦＰコード配列と完全に一致する（ｓｇＧＦＰ−Ｗ）かまたは部分的に一致する（ｓｇＧＦＰ−Ｍ）ｓｇＲＮＡを発現しているプラスミドを、示されるように、ＳｐＣａｓ９  ＯＲＦを標的化する３つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂ、−ｃ）または対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｒ）と組み合わせてコトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のウエスタンブロット分析。レーン（−）は、非標的化ｓｇＣｔｒのみを含む参照試料に対応する。トランスフェクション効率は、ｒｏＴａｇタグを付けたＭＨＣ−Ｉα発現プラスミド（Ｔｒａｎｓｆ−ｃｔｒ）を用いて標準化した。ＳｐＣａｓ９は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。下のグラフは、示されるように、ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂ、−ｃの存在下で、ｓｇＧＦＰ−Ｗ（オンターゲット）を用いて得られた低下したＥＧＦＰレベルの百分率の、ｓｇＧＦＰ−Ｍ（オフターゲット）を用いて得られた百分率に対する比を示す。（ｃ）異なるＳＬｉＣＥＳ回路を用いるＳｐＣａｓ９活性の標的特異性。オン／オフ比は、ｓｇＧＦＰ−Ｗ（オンターゲット）で単一染色体ＥＧＦＰ遺伝子コピー（２９３−ｉＥＧＦＰ細胞）を標的化した後のＥＧＦＰ陰性細胞の、ｓｇＧＦＰ−Ｍ（オフターゲット）に対する百分率から得、グラフに示されるように、異なるＳＬｉＣＥＳ回路（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂまたは−ｃ）または非標的化（ｓｇＣｔｒ）ｓｇＲＮＡと組み合わせた。（ｄ）グラフに示されるように、最適化されたｓｇＲＮＡを用いて（ｃ）と同様にオン／オフ比として表したＳｐＣａｓ９活性の標的特異性。（ｅ）遺伝子置換モデルに適用された異なる自己制限回路を用いてオン／オフ比として表したＳｐＣａｓ９活性の標的特異性。オン／オフ比は、単一変異ＥＧＦＰ遺伝子コピーを含有する２９３−ｉＹ６６Ｓ細胞において、ＤＮＡドナープラスミド（野性型ＥＧＦＰ配列を有する）と組み合わせた、ｓｇＧＦＰ−Ｗ（オフターゲット）ｓｇＲＮＡに対するｓｇＧＦＰ−Ｍ（オンターゲット）によるＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓ突然変異のＳｐＣａｓ９相同指向修復によって生成されたＥＧＦＰ陽性細胞の百分率から得た。（ｆ）ＶＥＧＦＡ、ＺＳＣＡＮ２、ＥＭＸ１遺伝子座およびそれらのそれぞれの確認されたオフターゲット部位を標的化するＳＬｉＣＥＳ回路（ｓｇＣａｓ−ａ−ｏｐｔ）によって誘導されたインデル形成。ｓｇＣｔｒに対するｓｇＣａｓａ−ｏｐｔによるオン／オフ比の増加倍数（Ｆ．Ｉ．）が、各々のオフターゲットについてのグラフの下に報告される。修飾率は、ＴＩＤＥ分析によって定量化された。エラーバーは、ｎ≧２の標準誤差を表す。
【図３】ＳＬｉＣＥＳ回路によるＳｐＣａｓ９およびＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓ発現の調節。ＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓ、ＳｐＣａｓ９、ＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓ標的配列と完全に一致するか（ｓｇＧＦＰ−Ｍ）または１個のミスマッチを含有する（ｓｇＧＦＰ−Ｗ）ｓｇＲＮＡを発現しているプラスミドを、示されるように、ＳｐＣａｓ９  ＯＲＦに特異的なｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂ、−ｃ）または対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｒ）とともにコトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット。レーン（−）は、非標的化ｓｇＣｔｒのみを含む参照試料に対応する。トランスフェクション効率は、ｒｏＴａｇタグを付けたＭＨＣ−Ｉａ発現プラスミド（Ｔｒａｎｓｆ−ｃｔｒ）を用いて標準化した。ＳｐＣａｓ９は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。下のグラフは、示されるように、ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂ、−ｃの存在下で、ｓｇＧＦＰ−Ｍ（オンターゲット）を用いて得られた低下したＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓレベルの百分率の、ｓｇＧＦＰ−Ｗ（オフターゲット）を用いて得られた百分率に対する比を示す。
【図４】ＳＬｉＣＥＳ回路によるＥＧＦＰ破壊。（ａ）異なる自己制限ＳｐＣａｓ９回路の発現後に得られた非蛍光２９３−ｉＥＧＦＰ細胞の百分率。ＥＧＦＰ  ＯＲＦと完全に一致するか（ｓｇＧＦＰ−Ｗ）または１個のミスマッチを含有する（ｓｇＧＦＰ−Ｍ）ｓｇＲＮＡを、示されるように、ＳｐＣａｓ９  ＯＲＦを標的化する３つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂ、−ｃ）または対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｒ）とともに細胞にトランスフェクトした。破線は、ＥＧＦＰ陰性細胞の平均バックグラウンドを表す。エラーバーは、ｎ＝２の標準誤差を表す。データは、ｎ＝２の独立した実験についての平均±標準誤差として示される。（ｂ）異なるＳＬｉＣＥＳ回路を発現している細胞からの代表的なＴ７エンドヌクレアーゼアッセイ。オン／オフ特異性比は、対照ｓｇＲＮＡまたはＳｐＣａｓ９  ＯＲＦを標的化する３つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂ、−ｃ）とともに、ｓｇＧＦＰ−ＷまたはｓｇＧＦＰ−Ｍの存在下で、ＥＧＦＰ遺伝子におけるインデル形成を測定することによって計算した。レーン（−）は、非標的化ｓｇＣｔｒのみを含む参照試料に対応する。（＊）は、Ｔ７エンドヌクレアーゼ活性によって得られる予想バンドを示す。
【図５】ＳＬｉＣＥＳ回路へのｓｇＲＮＡ最適化の効果。（ａ）ＥＧＦＰを標的化するｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ−Ｗまたは最適化した場合、ｓｇＧＦＰ−Ｗ−ｏｐｔ）または１個のミスマッチを有するｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ−Ｍまたは最適化した場合、ｓｇＧＦＰ−Ｍ−ｏｐｔ）とｓｇＣａｓ−ａによるＳｐＣａｓ９のトランスフェクションの後に得られた非蛍光２９３−ｉＥＧＦＰ細胞の百分率。ＳＬｉＣＥＳ  ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ−ｏｐｔ）の最適化されたバージョンを、示されるように、ＥＧＦＰを標的化する標準ｓｇＲＮＡおよび最適化ｓｇＲＮＡの両方で試験した。データは、ｎ＝２の独立した実験についての平均±標準誤差として示される。（ｂ）ｓｇＣａｓ−ｃ、または最適化した場合ｓｇＣａｓ−ｃ−ｏｐｔとともに、ＥＧＦＰを標的化するｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ−Ｗ）または１個のミスマッチを有するｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ−Ｍ）によるＳｐＣａｓ９のトランスフェクションの後に得られた非蛍光２９３−ｉＥＧＦＰ細胞の百分率。データは、ｎ＝２の独立した実験についての平均±標準誤差として示される。（ｃ）ＳｐＣａｓ９およびｓｇＣａｓ９−ａまたはｓｇＣａｓ−ａ−ｏｐｔおよびｓｇＣａｓ９−ｃまたはｓｇＣａｓ−ｃ−ｏｐｔでコトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のウエスタンブロット分析。ＳｐＣａｓ９は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。トランスフェクション効率は、ｒｏＴａｇタグを付けたＭＨＣ−Ｉα発現プラスミド（Ｔｒａｎｓｆ−ｃｔｒ）を用いて標準化した。
【図６】ＳＬｉＣＥＳによって媒介される相同指向修復の特異性。ドナーＤＮＡプラスミド（ｗｔ−ＥＧＦＰの非蛍光断片を有する）、ＳｐＣａｓ９を、示されるように、ＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓ標的配列と一致するか（ｓｇＧＦＰ−Ｍ）または１個のミスマッチを含有する（ｓｇＧＦＰ−Ｗ）ｓｇＲＮＡ、およびＳｐＣａｓ９  ＯＲＦを標的化する３つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂ、−ｃまたはｓｇＣａｓ−ａ−ｏｐｔ）または対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｒ）とともにトランスフェクトした後に得られた蛍光２９３−ｉＹ６６Ｓ細胞の百分率。データは、ｎ＝２の独立した実験についての平均±標準誤差として示される。ｓｇＧＦＰ−ＭまたはｓｇＧＦＰ−Ｗの不在下での相同指向修復は約０．０１％であった。
【図７】ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ１／Ｃａｓ９によるＳＬｉＣＥＳの活性。（ａ）ＳＶ５−ＧＦＰに基づくＮＨＥＪレポーターの略図。目的のｓｇＲＮＡによって認識される標的配列は、ＳＶ５タグとＥＧＦＰコード配列との間に挿入され、ＥＧＦＰ  ＯＲＦは、ＳＶ５タグＯＲＦの開始ＡＴＧコドンに関してフレーム外に配置される。終止コドンは、標的配列の直後にＳＶ５フレームに付加されていて、その翻訳を停止させる。ＳｐＣａｓ９に媒介される標的配列の切断およびＮＨＥＪによる修復の後、インデル突然変異がブレークポイントに無作為に挿入され、ＳＶ５タグＯＲＦの同じフレーム内にＥＧＦＰ  ＯＲＦをシフトさせることが可能になる。ＳＶ５−ＥＧＦＰの発現は、蛍光検出またはウエスタンブロット分析によって分析される。（ｂ）ＳＬｉＣＥＳ系によって発現したＳｔ１Ｃａｓ９活性の評価。Ｓｔ１Ｃａｓ９、ｓｇＲｅｐ−ＳＶ５と完全に塩基対を形成する標的配列を有する（ＮＨＥＪ−Ｒｅｐ．Ｗ）かまたは１個のミスマッチを含む（ＮＨＥＪ−Ｒｅｐ．Ｍ）ＮＨＥＪレポーター、ｓｇＲＮＡ  ｓｇＲｅｐ−ＳＶ５およびｓｇＲＮＡを標的化する３つの異なるＳｔ１Ｃａｓ９（ｓｇＣａｓ−Ｓｔ１、−２、−３）をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のウエスタンブロット。Ｓｔ１Ｃａｓ９に媒介される切断は、（ａ）に記載されるように、ＥＧＦＰ  ＯＲＦのフレームシフトおよびＮＨＥＪレポーターによるＳＶ５−ＥＧＦＰ発現によって検出される。レーン（ｓｇＣｔｒ）は、非自己標的化ｓｇＲＮＡをトランスフェクトした試料に対応する。レーン（−）は、非標的化ｓｇＲＮＡをトランスフェクトした試料に対応する。Ｓｔ１Ｃａｓ９は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出された。ウエスタンブロットは、ｎ＝２の独立した実験の代表である。（ｃ）自己制限回路によるＳｔ１Ｃａｓ９発現の調節は、オンターゲット特異性を高める。（ｂ）のように、Ｓｔ１Ｃａｓ９標的化ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−Ｓｔ１、−２、−３）または非自己標的化ｓｇＲＮＡ  ｓｇＣｔｒと組み合わせたｓｇＲｅｐ−ＳＶ５と一緒に、ＮＨＥＪＲｅｐ．ＷまたはＮＨＥＪ−Ｒｅｐ．Ｍをトランスフェクトした細胞から得たＳＶ５−ＥＧＦＰ発現のレベルから計算したオン／オフターゲット比。データは、ｎ＝２の独立した実験についての平均±標準誤差として示される。
【図８】ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ系。（ａ）ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳウイルスベクターの図表示。（ｂ）ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳウイルスベクターの産生に必要なステップ。ＳｐＣａｓ９発現は細菌細胞において阻止され、哺乳類イントロンをＳｐＣａｓ９オープンリーディングフレーム内に導入することによってプラスミド増幅を可能にする。ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳウイルス粒子の産生は、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）を安定的に発現する細胞において得られ、Ｔｅｔ抑制性プロモーターによって駆動されるＳｐＣａｓ９およびｓｇＣａｓ自己制限ｓｇＲＮＡ発現を阻止する。標的細胞では、ＴｅｔＲが存在しないことによってｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ回路の発現が可能になり、標的ゲノム編集および同時ＳｐＣａｓ９下方調節をもたらす。
【図９】ウイルスベクターパッケージング細胞におけるｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ回路の挙動。ｓｇＧＦＰ−Ｗを有するＥＧＦＰおよび自己制限または非自己制限トランスファーベクター（それぞれ、ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ−ＷまたはｌｅｎｔｉＣｔｒ−Ｗ）、あるいは非標的化ｓｇＲＮＡ（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ−Ｃｔｒ）を有するｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳをトランスフェクトした２９３ＴＲ細胞のウエスタンブロット分析。培養物を示されるようにドキシサイクリンで処理して、ＳｐＣａｓ９および自己標的化ｓｇＣａｓ−ａの発現を上方調節した。ＳｐＣａｓ９は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。ウエスタンブロットは、ｎ＝２の独立した実験の代表である。
【図１０】ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳベクターによるゲノム編集。（ａ）ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳベクターによるＥＧＦＰノックダウン。グラフに示されるように、ｓｇＧＦＰ−Ｗ（オンターゲット）かまたはｓｇＧＦＰ−Ｍ（オフターゲット）ｓｇＲＮＡのいずれかと組み合わせた、自己標的化（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ）または非自己標的化（ｌｅｎｔｉＣｔｒ）ｓｇＲＮＡを有するレンチウイルスベクターによる形質導入後の、ＥＧＦＰ陰性２９３−ｍｕｌｔｉＥＧＦＰ細胞の百分率の時間経過曲線。（ｂ）ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳによって送達されたＳｐＣａｓ９の標的特異性。オン／オフ比を、（ａ）で報告されたＥＧＦＰ陰性細胞の百分率から計算した。グラフの下には、各時点のオン／オフ比から計算した、特異性の増加倍数（Ｆ．Ｉ．）が報告される。（ｃ）ＺＳＣＡＮおよびＶＥＧＦＡ遺伝子座での、さらにそれらの確認されたオフターゲット部位でのｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳベクターにより誘導されるインデル形成。修飾率は、形質導入およびブラストサイジンによる選択の２０日後に収集したゲノムＤＮＡについてのＴＩＤＥ分析によって定量した。値は、各オフターゲットによって得たインデルから計算したオン／オフ比を示す。（ｄ）ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳまたはｌｅｎｔｉＣｔｒによる形質導入後の指定された時点でのＳｐＣａｓ９の発現レベル。ＳｐＣａｓ９は抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出された。（ｅ）形質導入の前または２８日後に２９３−ｍｕｌｔｉＥＧＦＰ細胞でトランスフェクトされたＮＨＥＪ−レポータープラスミドによって産生されたＳＶ５−ＥＧＦＰタンパク質レベルによってモニタリングされ、示されたように、ＥＧＦＰを標的化するｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ−Ｗ）またはＥＧＦＰを標的化しない（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ−Ｃｔｒ）による形質導入の２日または３０日後に検出されたＳｐＣａｓ９活性。ＥＧＦＰを標的化する非自己制限ｌｅｎｔｉＣｔｒ−Ｗベクターの活性を、比較のために同じ時点でモニタリングした。エラーバーは、ｎ＝２の標準誤差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
実験の項
考察  ＳｐＣａｓ９の長期発現によって産生されたオフターゲット活性を評価するため、ＥＧＦＰの単一染色体コピーを有する２９３−ｉＥＧＦＰ細胞に、ＳｐＣａｓ９を発現するレンチウイルスベクターを、完全に（ｓｇＧＦＰ−Ｗ）または部分的に（ｓｇＧＦＰ−ＭまたはｓｇＧＦＰ−ＭＭ）ＥＧＦＰとアニールすることができるｓｇＲＮＡとともに形質導入した。ＥＧＦＰを切断する際の１個（ｓｇＧＦＰ−Ｍ）または２個の（ｓｇＧＦＰ−ＭＭ）ミスマッチに対するＳｐＣａｓ９の寛容性により、ヌクレアーゼ特異性の定量化が可能になる。オンターゲットｓｇＲＮＡを用いて得られたＥＧＦＰ陰性細胞の百分率は感染後１０日で急速にプラトーに達したが、２つのミスマッチｓｇＲＮＡは経時的に蓄積する非特異的ＥＧＦＰノックアウトを生じた（図１のａ）。同じｓｇＲＮＡによって誘導される最近開発されたより特異的なｅＳｐＣａｓ９（１．１）変異体（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６，３５１，８４−８８）の送達は、オフターゲット切断の時間依存的蓄積を部分的にしか逆転させない（図１のｂ）。一貫して、２つのゲノム遺伝子座（ＺＳＣＡＮおよびＶＥＧＦＡ）および関連するオフターゲット部位（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１６５２６）の分析は、オン／オフ比が経時的に減少することを示し、したがってオフターゲット切断の増加を確認した（図１のｃ）。これらの結果は、従来のレンチウイルス系によるＳｐＣａｓ９の送達がオフターゲット活性の増加と相関することを明らかに示す。これは長期のＳｐＣａｓ９発現に起因して、時間が経つとともに特に明白である。
【００７８】
本発明による標的細胞において一過性のＳｐＣａｓ９活性ピークを生成するために、安全性向上のための自己制限Ｃａｓ９回路網（ＳＬｉＣＥＳ）が開発された（図２のａに図式化）。ＳｐＣａｓ９コード配列（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂおよび−ｃ）の３つの領域を標的化する３つの異なるｓｇＲＮＡ（下記の補足説明を参照）を使用することによって自己制限ＳｐＣａｓ９回路網をＥＧＦＰ発現細胞に設定した、これはＳｐＣａｓ９と同時発現させると、ＳｐＣａｓ９レベルを効率的に下方調節することが示された（図２のｂ、上パネル）。３つの自己標的化ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂまたは−ｃ）のいずれかを、ＥＧＦＰ標的配列と完全に塩基対を形成するｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ−Ｗ）とともに同時発現させると、同じｓｇＧＦＰ−Ｗおよび対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣｔｒ）をコトランスフェクトした細胞において検出されたＥＧＦＰ含有量と同様のレベル（残留タンパク質の４〜１０％）まで細胞内ＥＧＦＰが低下した（図２のｂ）。これらの結果は、ＳｐＣａｓ９がＳＬｉＣＥＳ回路網によって不活性化されてもＤＮＡ編集活性が損なわれないことを実証する。ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列（ｓｇＧＦＰＭ）の前の最後のヌクレオチドのシード領域内に１個のミスマッチを有するＥＧＦＰを標的化するｓｇＲＮＡを用いて実施した同様の実験は、非特異的なＥＧＦＰの下方調節を示し、ＥＧＦＰ細胞内レベルはほぼ６０％低下した。この効果は、ＳｐＣａｓ９発現が自己制限Ｃａｓ９回路網（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂまたは−ｃ）によって下方調節されている細胞では、それほど顕著ではなかった（約２５〜５５％の低下）（図２のｂ）。異なるレベルの非特異的ＥＧＦＰ下方調節は、個々のｓｇＲＮＡがＳｐＣａｓ９の細胞内レベルを低下させる能力を密接に反映した。最も低い非特異的ＥＧＦＰ下方調節を生じたｓｇＣａｓ−ａは（７３％残留ＥＧＦＰ、図２のｂ）、最も高いＳｐＣａｓ９破壊活性を示した（図２のｂ、上パネル）。同様の結果が、ｓｇＧＦＰ−Ｍ配列と完全に一致する単一ヌクレオチド置換を特徴とする変異したＥＧＦＰ標的（ＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓ）を細胞に一過性にトランスフェクトした相互実験でも得られた（図３）。ＳＬｉＣＥＳによって運ばれるミスマッチｓｇＲＮＡに対する完全に一致したｓｇＲＮＡによって標的化される細胞におけるＳｐＣａｓ９活性の比によって定義される、約２〜３倍の改善された標的特異性（図１のｂ、下パネル）も、ＥＧＦＰ遺伝子の単一染色体コピーを有する２９３−ｉＥＧＦＰ細胞において確認された（５倍の改善）（図２のｃおよび図４）。ｓｇＲＮＡの最適化がオンターゲット特異性をさらに改善し得るかどうかを試験するために、ｓｇＲＮＡをそれらの転写およびＳｐＣａｓ９との相互作用を増大させるように構造的に改変した（Ｃｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１３，１５５，１４７９−１４９１）。ヌクレアーゼ除去の効率を増強する、ＳｐＣａｓ９を標的化するｓｇＲＮＡの最適化は、切断特異性において約９倍の有意な改善をもたらした（図２のｄおよび図５のａ）。一貫して、最も活性の低い自己不活性化ＳｐＣａｓ９  ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ｃ）の最適化は、ＳｐＣａｓ９細胞内レベルのさらなる低下と平行してオフターゲット活性の低下をもたらした（図５のｂおよびｃ）。逆に、標的部位（ｓｇＧＦＰ−Ｗ−ｏｐｔおよびｓｇＧＦＰ−Ｍ−ｏｐｔ）に対するｓｇＲＮＡの最適化は、ｓｇＣａｓ９−ａまたはｓｇＣａｓ９−ａ−ｏｐｔと組み合わせて特異性を増加させなかった（図２のｄおよび図５のａ）。おそらくｓｇＧＦＰ−Ｍ−ｏｐｔ  ｓｇＲＮＡによって誘導されるオフターゲット切断の増加とも相関するｓｇＧＦＰ−Ｗ−ｏｐｔによって促進されるＥＧＦＰの下方調節の増強は、両方のバージョンの自己制限ＳｐＣａｓ９  ｓｇＲＮＡによって媒介される十分に迅速なＳｐＣａｓ９の下方調節によって相殺されることができなかった（図２のｄおよび図５のａ）。  結論として、ＳＬｉＣＥＳ回路網は、目的の部位を標的化する非最適化ｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ−Ｗ／Ｍ）と組み合わせて、ＳｐＣａｓ９を効率的に下方調節するＳｐＣａｓ９に対して最適化されたｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ−ｏｐｔ）で構成される場合に、最高のオンターゲット特異性をもたらした。ＳｐＣａｓ９自己制限回路網のオンターゲット特異性を検証することを目的とした並行実験を、非蛍光ＥＧＦＰ（Ｙ６６Ｓ）の単一染色体コピーを有する細胞で実施した。これらの細胞、２９３−ｉＹ６６Ｓにおいて、野性型ＥＧＦＰの非蛍光断片を有するコトランスフェクトされたドナープラスミドの存在下、ＳｐＣａｓ９に媒介される相同指向修復によって突然変異遺伝子を野性型対立遺伝子で置換した後のＥＧＦＰ蛍光の回復によって、ＳｐＣａｓ９活性を測定した。従来のＳｐＣａｓ９アプローチ（ｓｇＣｔｒ）と比較して、ＥＧＦＰ相同性指向修復のための標的特異性は、ＳＬｉＣＥＳ回路網（ｓｇＣａｓ−ａ）を使用することによって４倍改善された（図２のｅおよび図６）。ノックアウト実験で以前に観察されたように、ｓｇＣａｓ−ａの最適化されたバージョン（ｓｇＣａｓ−ａ−ｏｐｔ）（図２のｅおよび図６）を用いて、さらなる改善（７，５倍）が得られた。
【００７９】
ＳＬｉＣＥＳ方法論が他のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに容易に移行可能であることを実証するために、特異的なｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−Ｓｔ１−１、−２および−３）を用いることによって、ＳＬｉＣＥＳをストレプトコッカス・サーモフィルス由来のＣａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）に適合させてＳｔ１Ｃａｓ９の下方調節を誘導した（図７）。次に、内在性配列に対する従来のＳｐＣａｓ９およびＳＬｉＣＥＳ回路（ｓｇＣａｓ−ａ）の標的特異性を比較分析した。各ｓｇＲＮＡについて、４つのゲノム部位（ＶＥＧＦＡ、ＺＳＣＡＮおよびＥＭＸ１遺伝子座の２つの標的）および２つの以前に確認されたオフターゲット部位（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１６５２６）を、分解によるインデルの追跡（ＴＩＤＥ）によって分析し（Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｅ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４，４２，ｅ１６８）、ＳＬｉＣＥＳアプローチが切断特異性を約１．５〜２．５倍改善したことが明らかになった（図２のｆ）。
【００８０】
次に、最良に選択された自己制限ｓｇＲＮＡ（ｓｇＣａｓ−ａ−ｏｐｔ）を有する自己制限ＳｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ回路網をレンチウイルス系（図８）に移してｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳを生成した。ＳｐＣａｓ９の発現の漏れおよび結果として生じる細菌中でのプラスミド調製中のＤＮＡの分解を避けるために、イントロンをＳｐＣａｓ９オープンリーディングフレームに導入して、２つのエクソン（エクソン１および２、図８に図式化）に分割された発現カセットを形成した。スプライシングは細菌中では起こらないので、産生された転写物は触媒的に不活性なＳｐＣａｓ９断片として細菌中で翻訳される。次に、レンチウイルスベクター産生中の自己切断活性を回避するために、テトラサイクリン誘導性（ＴｅｔＯ）プロモーターを導入して、ＳｐＣａｓ９と自己標的化ｓｇＲＮＡ発現の両方を調節した。ＴｅｔＯプロモーターは、特異的リプレッサー、ＴｅｔＲによって負に調節され、ＴｅｔＲは産生細胞で発現し、ドキシサイクリンの不在下で、プロモーター領域内に位置するテトラサイクリンオペレーター配列との結合によって転写を阻害する（図８のｂに図式化）。ドキシサイクリンを用いる自己制限回路網の活性化によって観察される、産生細胞におけるＳｐＣａｓ９細胞内レベルの低下は、変化しないｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ粒子を得るためのウイルス産生ステップの抑制性プロモーターの厳格な要件を示す（図９）。ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳのオン／オフターゲット活性を評価するため、ＥＧＦＰ陰性２９３−ｍｕｌｔｉＥＧＦＰ細胞の百分率を、特異的なｓｇＲＮＡ  ｓｇＧＦＰ−Ｗ（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ−Ｗ）かまたはミスマッチｓｇＧＦＰ−Ｍ（ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ−Ｍ）のいずれかを有する自己制限レンチウイルスベクターによる形質導入後の異なる時点で追跡し、ＥＧＦＰに対して同じｓｇＲＮＡを有する非自己制限レンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉＣｔｒ−Ｗまたは−Ｍ）によって得られた効果と比較した。ｌｅｎｔｉＣｔｒ−ＷとｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ−Ｗの両方は、３週間の期間内の全ての時点で同様の安定したオンターゲット活性を示した（図１０のａ）。逆に、ｓｇＧＦＰ−Ｍによって非特異的に標的化されたＥＧＦＰ細胞の百分率は、ｌｅｎｔｉＣｔｒ送達系に合わせて増加した。この事象は、３週間の期間中ずっとｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳによって送達された同じｓｇＲＮＡでは観察されなかった（図１０のａ）。そのため、ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳは、時間内にオフターゲットの蓄積を生じなかった（７日目と２１日目を比較、図１０のｂ）。一貫して、エンドポイントでは、本発明者らは、ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ（オン／オフ比  約５）かまたはｌｅｎｔｉＣｔｒ系（オン／オフ比  約２）のいずれかによって送達されたｓｇＧＦＰ−Ｍに対する、ｓｇＧＦＰ−Ｗによって得たＥＧＦＰ陰性細胞の比率間の最大差を観察した（図１０のｂ）。これらの結果と一致して、内在性配列（ＺＳＣＡＮおよびＶＥＧＦＡ遺伝子座）に対するｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳの標的特異性は、非自己制限ｌｅｎｔｉＣｔｒと比較して有意な改善を示した（約２〜４倍）（図１０のｃ）。
【００８１】
これらのデータは、ＳＬｉＣＥＳ回路によって得られたＳｐＣａｓ９の発現低下が編集特異性を改善することを示唆する。実際に、早期の時点（形質導入後２日）で、ＳｐＣａｓ９タンパク質は既にｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳで処理した細胞中に、非自己制限レンチウイルス対照（ｌｅｎｔｉＣｔｒ）で処理した細胞中よりもはるかに少ない量で存在していた（図１０のｄ）。特に、ｌｅｎｔｉＣｔｒ処理細胞では、ＳｐＣａｓ９のレベルは安定したままであり、その後のどの時点でもヌクレアーゼが検出されなかったｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ処理細胞よりも高かった。ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳによって送達されるＳｐＣａｓ９活性のレベルを機能的に評価するため、標的化されたヌクレアーゼ活性に対してＥＧＦＰと融合したサルウイルス−５タグ（ＳＶ５−ＥＧＦＰ）を発現する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）レポータープラスミド（ＮＨＥＪ−Ｒｅｐ．Ｗ）（図７のａに図式化）を用いた。ＮＨＥＪ−Ｒｅｐ．Ｗにより、ｌｅｎｔｉＣｔｒによって送達されたＳｐＣａｓ９は形質導入後の全ての時点で活性であり、一方ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳによって運ばれるＳｐＣａｓ９の活性は形質導入の２日後に検出されたが、その後の時点（３０日）で観察することができなかったことが明らかになった（図１０のｅ）。
【００８２】
インビボでのＳｐＣａｓ９適用の制限は、レンチウイルス系によって送達される長期ヌクレアーゼ発現が望ましくない切断の蓄積をもたらすことを示す本発明のデータから明らかに浮上する。この有害作用は、最近開発された、より特異的なＳｐＣａｓ９ 変異体、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）によってさえも克服することができなかった（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６，３５１，８４−８８）。本発明の自己制限回路網戦略、ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳは、ウイルスに基づく送達の効率を利用し、同時に形質導入およびウイルス組み込み後のＳｐＣａｓ９の量を制限する。Ｃａｓ９発現の時間および存在量を制限することにより、ＳＬｉＣＥＳは、その代わりに従来のＣａｓ９送達アプローチを使用することによって観察されるオフターゲット切断の蓄積を回避する。ＳＬｉＣＥＳ戦略をさらに改善するために、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）（Ｃｈｉｃｋ，Ｈ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１２，２３，１２４７−１２５７）を用いて、細胞送達におけるウイルスに基づく効率を維持しながら、Ｃａｓ９発現の一過性ピークのような性質を増強することができる。多様なＣａｓ９の応用、例えば転写活性化ドメインとの組み合わせによって得られる遺伝子発現の調節など（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５，５１７，５８３−５８８；Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，３１，８３３−８３８；Ｈｉｌｔｏｎ，Ｉ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３，５１０−５１７）は、それらをｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳに適応させることで有意に改善されるかもしれない。実際に、これらのアプローチならびに遺伝子のキルスイッチ回路（Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５，４３，１２９７−１３０３；Ｋｉａｎｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１５，１２，１０５１−１０５４）によって得られる遺伝子発現の洗練された調節は、Ｃａｓ９に媒介される標的細胞プロモーターの誘導を時間内に制限するための調節可能な自己制限アプローチによって増強され得る。最後に、ＳＬｉＣＥＳは、持続的なヌクレアーゼ活性の影響を受けやすい一部の最近開発されたＣａｓ９ゲノム工学手順を大幅に改善し得る。例えば、ゲノム配列を効率的に置換するための現在の技術は、相同指向修復の割合を増加させるためにＣａｓ９を使用する。それにもかかわらず、これらの技術は、Ｃａｓ９による新たに置換されたゲノム配列の連続的な再切断によってしばしば制限され（Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１６，５３３，１２５−１２９）、これはヌクレアーゼ不活性化によって容易に克服され得る。
【００８３】
補足説明  原核細胞に由来するＣａｓ９は、ヒトコドン最適化の後でさえ、いくつかの可能性のある非反復ｓｇＲＮＡを（ｓｇＣａｓ−ａ、−ｂ、−ｃとして）容易に選択することを可能にし、真核生物ゲノムへのオフターゲットの可能性は非常に少ない。これは、第２のｓｇＲＮＡが存在すると考えて潜在的な新たなオフターゲットを生成する可能性はほとんど無視できると考えられることを意味する。
【００８４】
自己制限回路内に組み込まれたＳｔ１Ｃａｓ９を用いて得られた改善された性能によって実証されるように、ＳＬｉＣＥＳは、より安全なゲノム編集のために、ヌクレアーゼの新たに出現する変異体（Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，１０，１１１６−１１２１；Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１５，１６３，７５９−７７１；Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５，５２０，１８６−１９１；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１６５２６；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６，３５１，８４−８８）およびｓｇＲＮＡ（Ｆｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４，３２，２７９−２８４）に容易に適応することが証明されている。
【００８５】
ＳＬｉＣＥＳ系は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを送達するために使用される他のウイルスベクターにも適用され得る可能性があり、異なる送達系によってゲノム編集の特異性を向上させることができる。一例は、ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳのために開発された技術を単に移転することによってオールインワンＡＡＶ−ＳＬｉＣＥＳアプローチが想像できる、小さなＣａｓ９変異体（ＳａＣａｓ９など）に利用されるＡＡＶベクターである（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１５，１６，２５７）。感染多重度の高い細胞に形質導入するＡＡＶベクターの強い傾向（Ｒｕｏｚｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５，６，７３８８）を考慮して、２種のＡＡＶ（１つはヌクレアーゼだけを送達するためのもの、もう一つは自己制限ｇＲＮＡおよび標的化ｇＲＮＡを有するベクター）の混合物に基づいて、大きいサイズのヌクレアーゼ、例えばＳｐＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９またはＡｓＣｐｆ１などのＳＬｉＣＥＳ系のための送達戦略を設計することが可能である。このアプローチは、図２に提示される多重プラスミド系と同様であろう。
【００８６】
方法  プラスミドおよびオリゴヌクレオチド。  ３ＸＦＬＡＧタグを付けた化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９をｐＸ−Ｃａｓ９プラスミドから発現させた。これはｐＸ３３０からのｓｇＲＮＡ発現カセットを含むＮｄｅＩ断片（Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ氏より寄贈、Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃４２２３０）の除去によって得た（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３，３３９，８１９−８２３）。ｓｇＲＮＡを、ｐｘ３３０由来のＵ６プロモーター駆動カセットから転写し、ｐＵＣ１９にクローニングした。ｓｇＲＮＡオリゴは、以前に公表されたクローニング戦略（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３，３３９，８１９−８２３）によりｓｇＲＮＡ定常部分の前に挿入された二重ＢｂｓＩ部位を用いてクローニングされた。ＦＬＡＧタグを付けたＳ．サーモフィルスＣａｓ９（ｐＪＤＳ２４６−ＣＭＶ−Ｓｔ１−Ｃａｓ９）およびＳ．サーモフィルスｇＲＮＡ（ｐＭＬＭ３６３６−Ｕ６−＋１０３ｇＲＮＡ＿Ｓｔ１Ｃａｓ９）を発現しているプラスミドは、Ｃｌａｕｄｉｏ  Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ氏より寄贈された（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１６，２４，６３６−６４４）。Ｓ．サーモフィルスｓｇＲＮＡオリゴを、ＢｓｍＢＩを用いてｐＭＬＭ３６３６−Ｕ６−＋１０３ｇＲＮＡ＿Ｓｔ１Ｃａｓ９にクローニングし、Ｕ６プロモーターから転写した。この研究で用いたｓｇＲＮＡおよび標的部位のリストは表１で利用可能である。
【表１】
2019530467.tif 000002
表１．ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列および相対的な標的部位の配列
（＊）小文字は一致しない追加の５'ｇを示す。
（＊＊）ミスマッチは灰色で強調表示され、ＰＡＭは太字で表示される。標的部位の周りのコンテキストシーケンスは小文字で示される。
【００８７】
ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ＥＧＦＰプラスミドは、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導された、既に公表されたベクター中のｐＥＧＦＰ−Ｎ１からＥＧＦＰをサブクローニングすることによって得た（Ｖｅｃｃｈｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７，２０００７−２００１５）。ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓは、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ＥＧＦＰの部位特異的突然変異誘発によって得た。ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ＥＧＦＰプラスミドの部位特異的突然変異誘発によって得られた、ｓｇＲＮＡ抵抗性の非蛍光末端切断型ＥＧＦＰ断片（１−Ｔ２０３Ｋ−ｓｔｏｐ）をＰＣＲによって増幅し、ＥＧＦＰの代わりにｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ＥＧＦＰプラスミドに挿入し、ドナーｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ｒＥＧＦＰ（１−Ｔ２０３Ｋ−ｓｔｏｐ）プラスミドを得た。
【００８８】
本願で用いたＳＶ５−ＥＧＦＰに基づくＮＨＥＪレポーター（Ｒｅｐ．ＳＶ５、ＮＨＥＪ−ＲＥＰ．ＷおよびＮＨＥＪ−Ｒｅｐ．Ｍ）は、ＮｈｅＩ／ＢｓｐＥＩ部位に、目的のｓｇＲＮＡによって認識される完全な標的配列（ＰＡＭを含む）に対応するｄｓＤＮＡオリゴをクローニングすることによって作製した。標的は、ＳＶ５タグのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始ＡＴＧコドンに対してフレーム外に位置するＥＧＦＰ配列を用いて、ＳＶ５タグとＥＧＦＰコード配列との間に挿入される。終止コドンは、標的配列の直後のＳＶ５フレームに挿入される。ｐｃＤＮＡ３  ＭＨＣ−Ｉ−ｒｏＴａｇプラスミドは、Ｐｅｔｒｉｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１４，９，ｅ９６７００に記載されている。本願において記載された実験のために作製したプラスミドＤＮＡ配列についての情報は、補足配列および配列リストに見出される。
【００８９】
細胞培養およびトランスフェクション。  ２９３Ｔ／１７細胞はＡＴＣＣより入手した。Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を構成的に発現する２９３ＴＲ細胞を、ｐＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＴｅｔＲ−Ｂｌａｓｔベクター（Ｅｒｉｃ  Ｃａｍｐｅａｕ氏より寄贈、Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１７４９２）を用いる親２９３Ｔ／１７細胞のレンチウイルス形質導入によって作製し（Ｃａｍｐｅａｕ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ２００９，４，ｅ６５２９）、５μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてプール選択した。２９３−ｍｕｌｔｉＥＧＦＰ細胞は、ｐＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシンの安定したトランスフェクションによって作製し、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。２９３−ｉＥＧＦＰおよび２９３−ｉＹ６６Ｓ細胞（Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ系；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、単一ゲノムＦＲＴ部位を有しテトラサイクリンリプレッサー（２９３Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ−Ｉｎ、１５μｇ／ｍｌブラストサイジンおよび１００μｇ／ｍｌゼオシンを含有する選択培地で培養−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を安定して発現する細胞において、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ＥＧＦＰまたはｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ＥＧＦＰ−Ｙ６６Ｓをドナープラスミドとしてそれぞれ使用して、Ｆｌｐに媒介される組換えによって作製した。２９３−ｉＥＧＦＰおよび２９３−ｉＹ６６Ｓは、１５μｇ／ｍｌブラストサイジンおよび１００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する選択培地中で培養した。２９３−ｉＥＧＦＰおよび２９３−ｉＹ６６Ｓ選択クローンを、ゼオシン耐性の喪失による組み込み特異性について調べた。全ての細胞株は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎ、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび上記の適切な抗生物質を添加したＤＭＥＭ中で培養した。
【００９０】
２９３Ｔ、２９３−ｉＥＧＦＰまたは２９３−ｉＹ６６Ｓ細胞を、製造業者の指示に従って、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を用いて２５０〜５００ｎｇのｐＸ−Ｃａｓ９および２５０〜５００ｎｇの所望のｐＵＣ１９−ｓｇＲＮＡプラスミドを用いて１２または２４マルチウェルにトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの２〜４日後または示される通りに収集した。
【００９１】
２９３−ｉＥＧＦＰおよび２９３−ｉＹ６６Ｓ細胞では、蛍光測定の前に１００ｎｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で２０時間処理することによって、ＥＧＦＰの発現を誘導した。
【００９２】
ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳベクター。  ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳは、ＥＦＳ−ＳｐＣａｓ９−２Ａ−ＰｕｒｏカセットをＣＭＶ−ＴｅｔＯプロモーターとともに、ＳｐＣａｓ９（イントロン）−ＩＲＥＳ−ブラストサイジン断片で置換することによって、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１トランスファーベクターから調製した。ＳｐＣａｓ９に導入されたイントロン（補足配列情報を参照）は、以前は異なる隣接するエクソンとともに使用されていたマウス免疫グロブリン重鎖前駆体Ｖ領域イントロン（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：Ｍ１２８８０．１）に由来する（Ｖｅｃｃｈｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７，２０００７−２００１５；Ｐｅｔｒｉｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１４，９，ｅ９６７００；Ｌｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９７，１０，７３１−７３６）。ブラストサイジン耐性遺伝子の翻訳を調節するＥＭＣＶ−ＩＲＥＳを、ＳｐＣａｓ９の下流にクローニングして、組み込まれたベクターのＣａｓ９自己切断の後のフレームシフト突然変異の生成の後でさえ、形質導入細胞の抗生物質選択を可能にした。
【００９３】
ｓｇＣｔｒ−ｏｐｔまたはｓｇＣａｓ９−ａ−ｏｐｔをｐＵＣ１９プラスミド内のＨ１−ＴｅｔＯプロモーターと組み合わせ、ＰＣＲ増幅した後、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１中の固有のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、所望の配向について選択した。選択された遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡを、標準的な手順に従って、２つのＢｓｍＢＩ部位を用いてｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１  ｓｇＲＮＡカセットにクローニングした（Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｅ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４，４２，ｅ１６８）。
【００９４】
ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳのＤＮＡ配列についての情報は、補足配列および配列リストに見出される。
【００９５】
レンチウイルスベクター産生。  レンチウイルス粒子は、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲまたはｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ産生のためにそれぞれ４×１０６個の２９３Ｔまたは２９３ＴＲ細胞を１０ｃｍディッシュに播種することによって作製した。その翌日、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を用いて、６．５μｇのｐＣＭＶ−ｄｅｌｔａＲ８．９１パッケージングベクターおよび３．５μｇのｐＭＤ２．Ｇとともに、１０μｇの各トランスファーベクターをプレートにトランスフェクトした（Ｃａｓｉｎｉ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１５，８９，２９６６−２９７１）。一晩インキュベートした後、培地を新鮮な完全ＤＭＥＭに交換し、４８時間後にウイルス粒子を含有する上清を回収し、５００ｘｇで５分間遠心沈殿し、０．４５μｍ  ＰＥＳフィルタで濾過した。
【００９６】
回収後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（Ｓｉｇｍａ）を用いてｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳウイルスベクターを濃縮した。手短に言えば、水中４０％のＰＥＧ６０００溶液を１：３の比でベクター含有上清と混合し、４℃で３時間から一晩インキュベートした。続いて、冷却遠心機において混合物を２０００ｘｇで４５分間遠心沈殿した。次に、ペレットを適量のＤＭＥＭ完全培地に再懸濁した。ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲベクターは濃縮せずに使用した。レンチウイルスベクター（逆転写酵素単位、ＲＴＵ）の力価を、生成物増強逆転写酵素（ＰＥＲＴ）アッセイを用いて測定した（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０１４，３０，７１７−７２６）。
【００９７】
感染およびＥＧＦＰ蛍光検出。形質導入の１日前に、１０５個の２９３Ｔ細胞、２９３−ｉＥＧＦＰ細胞、または２９３−ｍｕｌｔｉＥＧＦＰ細胞を２４ウェルプレートに播種した。ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳベクターについて、２ＲＴＵ／ウェルを１６℃で１６００ｘｇで２時間遠心し、次にベクターを培養物とともに一晩インキュベートすることによって細胞を形質導入した。形質導入の２４時間後以降に、必要な場合には５μｇ／ｍｌのブラストサイジンを用いて培養物を選択した。ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲベクターについては、０．５ＲＴＵ／ウェルを同じ形質導入プロトコルに従って使用し、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで細胞を選択した。
【００９８】
ゲノムＥＧＦＰ配列を標的化する場合、細胞を回収し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析して、ＥＧＦＰの喪失または誘導の百分率を定量した（遺伝子置換実験）。
【００９９】
ウエスタンブロット。細胞をＮＥＨＮ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ４０、ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した２０％グリセロール）に溶解した。細胞抽出物を、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓを標準分子量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）として使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動の後、試料を０．２２μｍのＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア）に移した。膜を、ＳｐＣａｓ９およびＳｔ１Ｃａｓ９を検出するためのマウス抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）、マウス抗α−チュブリン（Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗ＧＦＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウス抗ｒｏＴａｇ  ｍＡｂ（Ｐｅｔｒｉｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１４，９，ｅ９６７００）およびＥＣＬ検出のための適切なＨＲＰ結合ヤギ抗マウス（ＫＰＬ）またはヤギ抗ウサギ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）二次抗体とともにインキュベートした。画像を取得し、バンドをＵＶＩｔｅｃ  Ａｌｌｉａｎｃｅ検出系を用いて定量した。
【０１００】
Ｃａｓ９誘導性ゲノム突然変異の検出。ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションの７２時間後または形質導入実験に示された通りに、ゲノムＤＮＡを単離した。ゲノム遺伝子座を増幅するためのＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて行った。表２に列挙したオリゴを用いて試料を増幅した。精製したＰＣＲ産物を、配列決定しＴＩＤＥツールを適用することによるか（Ｃｈｅｎ，Ｂ．，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１３，１５５，１４７９−１４９１）、またはＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）アッセイ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によって分析した。後者の場合、ＰＣＲアンプリコンをＴ７Ｅ１で３７℃で３０分間消化する前に変性させ、再びハイブリダイズさせた。消化した材料を標準的なアガロースゲルを用いて分離し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量した。インデル形成は、以下の式に従って計算した。遺伝子修飾％＝１００×（１−（１−切断部分）１／２）。表２−ＥＧＦＰ、ゲノム遺伝子座（ＶＥＧＦ−Ａ、ＺＳＣＡＮ、ＥＭＸ）および相対的なオフターゲット部位を増幅するために使用されるオリゴの配列。
【表２】
2019530467.tif 000003
【０１０１】
補足配列  この原稿のために作製された新しいプラスミドのサブセット。  −Ｒｅｐ．ＳＶ５−ＥＧＦＰ（配列番号６７）
−ドナーｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ｒＥＧＦＰ（１−Ｔ２０３Ｋ−ｓｔｏｐ）（配列番号６８）
−ＬｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ（配列番号１０）
【０１０２】
Ｒｅｐ．ＳＶ５−ＥＧＦＰ（クローン標的配列に対するＮｈｅＩおよびＢｓｐＥＩ制限部位を下線で示し、インフレーム終止コドンを太字で示す）。  ＳＶ５、標的、リンカー、ｒＥＧＦＰ［標的配列が最初にレポーター標的領域にクローニングされた、ＥＧＦＰを標的化する特定のｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ−Ｗ、−Ｍ）に抵抗性である、このＥＧＦＰ  ＣＤＳは、標的化を阻止するために小文字の太字で示される同義変異を導入することによって得られた］  配列番号６７：  ＡＴＧＧＧＣＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＧＴＡｇｇａｇｇａｇｇａｇｇａｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｇｇａａｇｃｇｇｇＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣａＧＧａＡＡａＣＴｃＣＣｔＧＴｃＣＣｔＴＧＧＣＣａＡＣｔＣＴｇＧＴｃＡＣｔＡＣａＣＴｔＡＣａＴａＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＴＡＡ
【０１０３】
ドナーｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ−ｒＥＧＦＰ（１−Ｔ２０３Ｋ−ｓｔｏｐ）プラスミド
ｒＥＧＦＰ（１−Ｔ２０３Ｋ−ｓｔｏｐ）ドナー、相同組換え後のｓｇＲＮＡ再標的化を阻止するために用いられる同義コドンは、小文字の太字で強調され、Ｙ６６Ｓ突然変異を復帰させることによってＥＧＦＰ蛍光を回復させるために重要なヌクレオチド変化には下線が引かれている。それから、４１０ｂｐの３'−ホモロジーアーム（Ｔ２０３Ｋ−ｓｔｏｐに対応）の末端は灰色で強調されている。  ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣａＧＧａＡＡａＣＴｃＣＣｔＧＴｃＣＣｔＴＧＧＣＣａＡＣｔＣＴｇＧＴｃＡＣｔＡＣａＣＴｔＡＣａＴａＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＴＡＡ
【０１０４】
ＬｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳ
５'ＬＴＲ、ｈＵ６プロモーター、スタッファー断片、ｇＲＮＡ骨格、ｈＨ１ＴｅｔＯプロモーター、Ｃａｓ−ａスペーサー配列、最適化されたｇＲＮＡ骨格、ＣＭＶ−ＴｅｔＯプロモーター、ＦＬＡＧ−ＮＬＳＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ、イントロン、ＥＣＭＶ−ＩＲＥＳ、ブラストサイジン耐性遺伝子、ＷＰＲＥ、３'ＬＴＲ−ＳＩＮ。  ＴＴＡＡＴＧＴＡＧＴＣＴＴＡＴＧＣＡＡＴＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＴＣＴＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＴＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＴＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＴＧＣＡＴＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＡＡＧＧＴＧＧＴＡＣＧＡＴＣＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＧＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡＴＴＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＡＴＴＴＡＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＧＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＧＧＴＴＡＡＧＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＡＧＴＡＴＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＡＧＡＡＣＧＡＴＴＣＧＣＡＧＴＴＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＧＡＴＣＡＴＴＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＧＡＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＡＡＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＣＣＡＴＴＡＧＧＡＧＴＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣ��ＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＣＣＴＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣＴＣＣＴＴＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＡＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＧＴＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＧＧＴＴＴＡＡＧＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＡＡＴＡＧＡＧＴＴＡＧＧＣＡＧＧＧＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＡＴＣＧＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＴＧＴＡＡＡＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＴＧＣＴＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＣＴＴＴＡＧＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＴＡＧＴＴＴＴＡＧＴＡＡＣＴＣＧＣＧＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＴＡＡＴＡＧＣＴＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＡＡＧＣＧＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＣＴＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＴＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＣＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＴＴＣＴＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＡＡＴＧＣＡＣＣＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＡＣＣＡＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＡＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＧＡＡ��ＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＣＴＧＴＴＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＧＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＣＡＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＧＴＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧＡＣＴＴＡＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＡＧＴＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＴＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＣＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＴＧＡＴＴＴＣＡＴＴＡＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＴＡＴＧＣＡＣＣＣＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＡＴＣＴＣＴＡＧＣＴＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＴＴＡＣＡＴＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＣＣＧＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＣＴＡＣＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＡＡＣＴＣＣＡＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＧＣＣＧＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＧＣＴＡＴＴＴＡＡＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＴＣＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＣＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＴＡＡＡＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＴＡＡＣＴＧＣＧＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡＧＣＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧａａｔｔｃｔａｇｔａｇａａｔｔｇ��ｇｇｔａｃｃＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧｔＧＡＴＡＧＡＧＡＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＣｇＴＡＣＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴｃＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＴＴＧＧＧＧＧＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣｔｃｇａｇＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧ
ＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡｇｇａｔｃＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＣＧＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＧＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＴＣＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＴＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＣＧＡＧＣＧＧＡＴＧＡＣＣＡＡＣＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＡＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＧＡＧＴＧＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＣＧＧＴＴＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＡＣＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＡＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＧＣＡＴＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＧＧＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＡＴＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡＴＡＴＣＧＴＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＡＡＡＧＴＧＣＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＧＡＴＴＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＧＡＧＡＣＡＡＡＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＴＧＧＧＡＴＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＧＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＴＡＴＣＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＧＴＣＴＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＣＣＴＡＡＧＡＡＧＴＡＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＡＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＴＡＡＴＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＴＡＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＧＧＧＡＴＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＡＣＡＡＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧｃｔａｇｃＴＧＡＴＡＡＴＧＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＧＴＡＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＡＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴ
ＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＧＴＡＴＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＧＡＡＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＴＣＴＴＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＡＣＧＧＴＧＣＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＴＴＧＧＧＡＴＴＣＧＴＧＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＣＴＡＡＡＣＧＣＧＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＴＡＡＧＡＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＡＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＣＴＴＧＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧ
【０１０５】
【図１】
2019530467.tif 000004
【図２】
2019530467.tif 000005
【図３】
2019530467.tif 000006
【図４】
2019530467.tif 000007
【図５】
2019530467.tif 000008
【図６】
2019530467.tif 000009
【図７】
2019530467.tif 000010
【図８】
2019530467.tif 000011
【図９】
2019530467.tif 000012
【図１０】
2019530467.tif 000013
【配列表】
2019530467000001.app
【国際調査報告】
2019530467.tif 000014
2019530467.tif 000015
2019530467.tif 000016
2019530467.tif 000017
2019530467.tif 000018