【手続補正書】
【提出日】平成19年1月11日(2007.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】  血中脂質低下活性および抗酸化活性を有するモルホリン誘導体
【特許請求の範囲】
【請求項１】  式Ｉの化合物であって、
【化１】
2002534516.tif 000001
式中、
R1=CH2CH3, R2=CH3, R3, R4=H, R5=C6H5 (化合物1)であるか、R1= CH2CH2CH2ONO2, R2=CH3, R3, R4=H, R5=C6H5(化合物2)であるか、R1=H, R2-R3=(CH2)4, R4=H, R5=C6H5(化合物3)であるか、R1= CH2CH2CH3, R2-R3 =(CH2)4, R4=H, R5=C6H5(化合物4)であるか、R1= CH2CH2CH2ONO2, R2-R3 =(CH2)4, R4=H, R5=C6H5(化合物5)であるか、R1=H, R2=CH3, R3-R4=(CH2)4, R5=C6H5 (化合物6)であるか、R1= CH2CH2CH3, R2=CH3, R3-R4=(CH2)4, R5=C6H5(化合物7)であるか、R1= CH2CH2CH2ONO2, R2=CH3, R3-R4= (CH2)4, R5=C6H5(化合物8)であるか、R1=CH2CH2CH2ONO2, R2=CH3, R3,R4= H, R5=H(化合物9)であるか、R1=H, R2=p-NO2-C6H4-CH2CH2, R3,R4=H, R5=C6H5(化合物10)である該化合物。
【請求項２】  請求項１記載の化合物１，４または７の調製方法であって、R2, R3, R4および R5は請求項１で定義される次式で示される２−ヒドロキシ誘導体
【化２】
2002534516.tif 000002
を、
化合物１の場合はエタノールと、化合物４および７の場合はｎ−プロパノールと、酸性メジウム中で還流させながら反応させることを含む、該調製方法。
【請求項３】  請求項１記載の化合物２，５，８または９の調製方法であって、R2, R3, R4,およびR5は請求項１で定義される次式で示される２−ヒドロキシ誘導体
【化３】
2002534516.tif 000003
を、
酸性メジウム中３−ブロモプロパノールと還流して反応させ、次いで得られた２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体をアセトニトリル中で還流して硝酸銀と反応させることを含む、該調製方法。
【請求項４】  請求項１記載の化合物３，６または１０の調製方法であって、R2, R3およびR4 は請求項１で定義される次式で示されるアミノアルコール
【化４】
2002534516.tif 000004
を、
エーテルおよびアセトン中の２−ブロモ−４−フェニルアセトフェノンと室温で反応させ、次いで食塩飽和水溶液で洗浄し、炭酸カリウムで乾燥し、真空中で蒸発させ、エーテル中１０％塩酸で中和し、アセトンおよびエーテルから再結晶化させることを含む、該調製方法。
【請求項５】  高コレステロール血症の予防および治療のための薬剤の製造のための請求項１記載の化合物の使用。
【請求項６】  高脂血症の予防および治療のための薬剤の製造のための請求項１記載の化合物の使用。
【請求項７】  アテローム症の予防および治療のための薬剤の製造のための請求項１記載の化合物の使用。
【請求項８】  有効成分として請求項１のいずれかの化合物を含む、脂質過酸化反応抑制のための医薬組成物。
【請求項９】  有効成分として請求項１のいずれかの化合物を含む、コレステロールレベル減少のための医薬組成物。
【請求項１０】  有効成分として請求項１のいずれかの化合物を含む、トリグリセリドレベル抑制のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は新規なモルホリン誘導体の合成ならびにそれらの血中コレステロール低下活性、血中脂質低下活性および抗酸化活性の評価に関する。とくに、本発明は式Ｉ
【化５】
2002534516.tif 000005
［式中、
R1=CH2CH3, R2=CH3, R3, R4=H, R5=C6H5 (化合物1)であるか、R1= CH2CH2CH2ONO2, R2=CH3, R3, R4=H, R5=C6H5(化合物2)であるか、R1=H, R2-R3=(CH2)4, R4=H, R5=C6H5(化合物3)であるか、R1= CH2CH2CH3, R2-R3 =(CH2)4, R4=H, R5=C6H5(化合物4)であるか、R1= CH2CH2CH2ONO2, R2-R3 =(CH2)4, R4=H, R5=C6H5(化合物5)であるか、R1=H, R2=CH3, R3-R4=(CH2)4, R5=C6H5 (化合物6)であるか、R1= CH2CH2CH3, R2=CH3, R3-R4=(CH2)4, R5=C6H5(化合物7)であるか、R1= CH2CH2CH2ONO2, R2=CH3, R3-R4= (CH2)4, R5=C6H5(化合物8)であるか、R1=CH2CH2CH2ONO2, R2=CH3, R3, R4= H, R5=H(化合物9)であるか、R1=H, R２=p-NO2-C6H4-CH2CH2, R3,R4=H, R5=C6H5(化合物10)である]のモルホリン誘導体の合成およびそれらの医薬的評価に関する。
【０００２】
アテローム症の病因は多くの因子に関連することがよく知られているが、それらの中でもとくに重要な因子は、
−低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化的修飾、
−血中のコレステロールおよびＬＤＬ−コレステロールレベルの上昇、
−血中トリグリセライドレベルの上昇、
−血中ＨＤＬ−コレステロールレベルの低下、
−血栓形成、内皮損傷および血行力学的因子
である。とくに、ＬＤＬの酸化的修飾は最も危険なアテローム症の発生過程と考えられ、これは炎症およびアポトーシス（apoptotic）機構を誘発し、最終的には泡沫細胞および脂肪線条を形成する。
【０００３】
この分野の研究において、合成化合物の大部分は血中コレステロールもしくは血中脂質低下活性または抗酸化活性を有する。血中の総コレステロール、トリグリセライドおよびＬＤＬ−コレステロールを低下させることが可能で、同時に抗酸化活性を有する化合物は報告されていない。
【０００４】
以上を考慮すると、血中コレステロール低下活性、血中脂質低下活性および抗酸化活性を有する化合物を設計し、合成し、評価することには興味がもたれる。
【０００５】
本発明において報告される新規な誘導体は血漿中の総コレステロールレベルを有意に低下させることができる。また、これらの新規な誘導体は血漿中のトリグリセライドおよびＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させることができる。
【０００６】
これらの新規な誘導体は、それらの血中脂質低下活性のほかに、強力な抗酸化活性をも有する。血中脂質低下活性と抗酸化活性の組み合わせが、アテローム症のより有効な予防および治療には必要であると考えられる。
【０００７】
本発明は一般構造式（Ｉ）の新規モルホリン誘導体の合成ならびに抗酸化活性、血中コレステロール低下活性、および血中脂質低下活性の評価に関する。
【０００８】
方法
合成
２−ヒドロキシモルホリン誘導体３，６および１０は、エーテルおよびアセトン中適当なアミノアルコール（２２ｍｍｏｌ）および２−ブロモ−４−フェニルアセトフェノンまたは２−ブロモアセトフェノン（１０ｍｍｏｌ）を室温で１５時間反応させ、食塩飽和溶液で洗浄し、炭酸カリウムで乾燥し、真空中で蒸発させ、ついでエーテル中１０％塩酸で中和し、得られた２−ヒドロキシ誘導体をアセトンおよびエーテルから再結晶して合成される。
【０００９】
２−アルコキシ誘導体１，４および７はそれぞれの２−ヒドロキシ誘導体を酸性メジウム中で適当なアルコールと還流して反応させて合成する。
【００１０】
化合物２，５，８および９はそれぞれの２−ヒドロキシ誘導体を酸性メジウム中で３−ブロモプロパノールと還流して反応させ、２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体をついでアセトニトリル中硝酸銀と還流下に反応させることにより合成される。
【化６】
2002534516.tif 000006
ａ）室温、エーテル中ＨＣｌ；
ｂ）３−ブロモプロパノール、３時間還流；
ｃ）ＡｇＮＯ3，アセトニトリル、２時間還流；
ｄ）エタノール、プロパノール、１，３−プロパンジオールまたはｐ−ニトロフェニルエチルアルコール、１５時間還流
反応図１：モルホリン誘導体の合成経路
【００１１】
抗酸化活性の評価
［方法］
新規化合物の抗酸化活性の評価は、ラット肝臓ミクロソーム膜脂質の過酸化によりインビトロで実施した。脂質の過酸化はＦｅ2+／アスコルビン酸システムで誘導した。ラット肝臓ミクロソームは熱不活性化した（９０℃で９０秒間）。トリス−塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中アスコルビン酸（０．２ｍＭ）の新鮮な溶液およびＤＭＳＯに最終濃度１ｍＭ〜０．１ｍＭに溶解した試験化合物をミクロソームに加えた。等量の緩衝液を対照サンプルに添加した。反応はＦｅＳＯ4（１０μＭ）を加えて開始させた。混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。様々な時間間隔でアリコートを採取し、脂質の過酸化を５３５ｎｍにおける２−チオバルビツール酸に反応性の物質の分光光度分析による測定で評価した。
［結果］
試験した化合物はすべて１ｍＭにおいて脂質の過酸化を１００％阻害し、この活性は０．１ｍＭにおいても維持される。
【００１２】
血中脂質低下活性の評価
［方法］
合成した化合物の血中コレステロール低下活性および血中脂質低下活性はラットにおけるトリトンＷＲ１３３９誘導高脂質血症の阻害によって実施した。腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射したトリトンＷＲ１３３９はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの誘導により作用する。１群５匹（試験群）の雄性Ｆｉｓｈｅｒラット（２３０〜２８０ｇ）を用い、２００ｍｇ／ｋｇのトリトンＷＲ１３３９溶液をｉ．ｐ．注射し、および同時に２８〜５６μｍｏｌ／ｋｇの試験化合物、水溶液に懸濁したプロブコール（比較群）をｉ．ｐ．注射した。対照群にはトリトンＷＲ１３３９および試験化合物のビヒクル１０ｍｌ／ｋｇをｉ．ｐ．処置した。２４時間後、腹腔大動脈から血液を採取し、加ヘパリン試験管に収集した。血液を１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離し、市販のキットを用いて総コレステロール（ＴＣ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）およびトリグリセライド（ＴＧ）を測定するため血漿を選択した。
［結果］
本発明者らの結果は、試験化合物が血漿中の総コレステロールレベルを５４％までも、トリグリセライドレベルを４９％までも、そしてＬＤＬ−コレステロールレベルを５１％までも低下させ、すべての化合物がプロブコールよりも強力であることを指示する（表１）。
【００１３】
上記の結果は、新化合物が抗酸化作用と、強力な血中脂質低下作用および血中コレステロール低下作用を有することを指示するものである。抗酸化性と血中脂質低下性の組み合わせはアテローム症に対して有用である。
表１  血漿中総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセライド（ＴＧ）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルに対する選択された化合物およびプロブコールの影響
【表１】
2002534516.tif 000007
α  すべての測定は少なくとも二重に行い、ＳＤは常に吸収値の±１０％以内にある。星印は統計的な有意差（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定）を以下のように示す。
**Ｐ＜０．００５， *Ｐ＜０．０５, ＮＳ 有意差なし（Ｐ＞０．１）。
【００１４】
（実施例）
化合物１の合成
２−ヒドロキシ誘導体１０ｍｍｏｌをエーテル中ＨＣｌにより酸性にしたメジウム中１００ｍｌの無水エタノールと還流した。１５時間還流後、大部分の溶媒を真空中で除去し、生成物をエーテルから結晶化した。
【００１５】
化合物２の合成
アセトン（３０ｍｌ）および酸性メジウム中２−ヒドロキシ誘導体１０ｍｍｏｌと２２ｍｍｏｌの３−ブロモプロパノールを３時間還流した。３時間後、生成物２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体をエーテルにより結晶化し、１０ｍｍｏｌの２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体を１５ｍｍｏｌの硝酸銀と反応させ、２時間還流した。溶媒を真空中で除去したのち、残留物をクロロホルムに溶解し、ろ過し、ろ液を水で洗浄し、クロロホルム層を塩化カルシウムで乾燥し、クロロホルムを真空中で除去し、エーテル中臭化水素酸で中和し、エーテルにより結晶化すると、最終生成物が得られた。
【００１６】
化合物３の合成
２−ヒドロキシメチルピペリジン２２ｍｍｏｌをエーテルおよびアセトン中１０ｍｍｏｌの２−ブロモ−４−フェニルアセトフェノンと室温で１５時間反応させた。食塩の飽和溶液で洗浄後、炭酸カリウムで乾燥し、真空中で蒸発させ、ついでエーテル中１０％塩酸で中和すると化合物３が得られ、これをアセトンおよびエーテルから再結晶した。
【００１７】
化合物４の合成
１０ｍｍｏｌの化合物３をエーテル中ＨＣｌによって酸性にしたメジウム中ｎ−プロパノール１００ｍｌと還流した。１５時間還流したのち、溶媒を真空中で除去し、生成物をエーテルから結晶化した。
【００１８】
化合物５の合成
アセトン（３０ｍｌ）中１０ｍｍｏｌの化合物３および３−ブロモプロパノール２２ｍｍｏｌを酸性メジウム中で３時間還流させた。３時間後、生成物の２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体をエーテルから結晶化させた。１０ｍｍｏｌの２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体を１５ｍｍｏｌの硝酸銀と反応させ、２時間還流させた。溶媒を真空中で除去したのち、残留物をクロロホルムに溶解し、ろ過し、ろ液を水で洗浄し、クロロホルム層を塩化カルシウムで乾燥し、クロロホルムを真空中で除去し、エーテル中臭化水素酸で中和し、エーテルから結晶化すると最終生成物が得られた。
【００１９】
化合物６の合成
エーテルおよびアセトン中２２ｍｍｏｌのＮ−メチルアミノ−シクロヘキサノール−２を１０ｍｍｏｌの２−ブロモ−４−フェニルアセトフェノンと室温で１５時間反応させた。食塩の飽和溶液で洗浄後、炭酸カリウムで乾燥させ、真空中で蒸発させ、エーテル中１０％の塩酸で中和すると化合物３が得られ、これをアセトン−エーテルから再結晶した。
【００２０】
化合物７の合成
１０ｍｍｏｌの化合物６を、エーテル中ＨＣｌによって酸性にしたメジウム中１００ｍｌのｎ−プロパノールと還流した。１５時間還流したのち、溶媒を真空中で除去し、生成物をエーテルで結晶化した。
【００２１】
化合物８の合成
アセトン（３０ｍｌ）および酸性メジウム中１０ｍｍｏｌの化合物６および３−ブロモプロパノール２２ｍｍｏｌを３時間還流させた。３時間後、生成物の２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体をエーテルから結晶化させた。１０ｍｍｏｌの２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体を１５ｍｍｏｌの硝酸銀と反応させ、２時間還流した。溶媒を真空中で除去したのち、残留物をクロロホルムに溶解し、ろ過し、ろ液を水で洗浄し、クロロホルム層を塩化カルシウムで乾燥し、クロロホルムを真空中で除去し、エーテル中臭化水素酸で中和し、エーテルから結晶化すると最終生成物が得られた。
【００２２】
化合物９の合成
アセトン（３０ｍｌ）および酸性メジウム中１０ｍｍｏｌの２−ヒドロキシ誘導体および３−クロロプロパノール２２ｍｍｏｌを３時間還流した。３時間後、生成物の２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体をエーテルから結晶化した。１０ｍｍｏｌの２−（３−ブロモプロポキシ）誘導体を１５ｍｍｏｌの硝酸銀と反応させ、２時間還流した。溶媒を真空中で除去したのち残留物をクロロホルムに溶解し、ろ過し、ろ液を水で洗浄し、クロロホルム層を塩化カルシウムで乾燥し、クロロホルムを真空中で除去し、エーテル中臭化水素酸で中和し、エーテルから結晶化すると、最終生成物が得られた。
【００２３】
化合物１０の合成
エーテルおよびアセトン中２２ｍｍｏｌのｐ−ニトロ−フェネチルアミノエタノールを１０ｍｍｏｌの２−ブロモ−４−フェニルアセトフェノンと１５時間室温で反応させた。食塩の飽和溶液で洗浄後、炭酸カリウムで乾燥し、真空中で蒸発させ、エーテル中１０％塩酸で中和すると化合物３が得られ、これをアセトン−エーテルから再結晶した。