(57)【要約】  限られた数の定義された細菌種を使用して、胃腸の腸内菌共生バランス失調を治療する組成物及び方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の生存可能個体群を含む組成物であって、前記生存可能個体群が、表３のＤＢＣ１、ＤＢＣ２、ＤＢＣ３、ＤＢＣ４、ＤＢＣ５、ＤＢＣ６、ＤＢＣ７、ＤＢＣ８、もしくはＤＢＣ９、または表４のＤＢＣ  Ｓ１、ＤＢＣ  Ｓ２、ＤＢＣ  Ｓ４、ＤＢＣ  Ｓ５、ＤＢＣ  Ｓ６、ＤＢＣ  Ｓ７、ＤＢＣ  Ｓ８、ＤＢＣ  Ｓ９、ＤＢＣ  Ｓ１０、ＤＢＣ  Ｓ１１、ＤＢＣ  Ｓ１２、ＤＢＣ  Ｓ１３、ＤＢＣ  Ｓ１４、ＤＢＣ  Ｓ１５、ＤＢＣ  Ｓ１６、ＤＢＣ  Ｓ１７、ＤＢＣ  Ｓ１８、ＤＢＣ  Ｓ１９、ＤＢＣ  Ｓ２０、ＤＢＣ  Ｓ２１、ＤＢＣ  Ｓ２２、ＤＢＣ  Ｓ２３、もしくはＤＢＣ  Ｓ２４の細菌種を含有する、前記組成物。
【請求項２】
前記ＤＢＣ中の各細菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡが、図１−１〜図１−６２の少なくとも１つの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と少なくとも９７％の同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、ＤＢＣ１、ＤＢＣ２、ＤＢＣ３、ＤＢＣ４、ＤＢＣ５、ＤＢＣ６、ＤＢＣ７、ＤＢＣ８、ＤＢＣ９、ＤＢＣ  Ｓ１、ＤＢＣ  Ｓ２、ＤＢＣ  Ｓ４、ＤＢＣ  Ｓ５、ＤＢＣ  Ｓ６、ＤＢＣ  Ｓ７、ＤＢＣ  Ｓ８、ＤＢＣ  Ｓ９、ＤＢＣ  Ｓ１０、ＤＢＣ  Ｓ１１、ＤＢＣ  Ｓ１２、ＤＢＣ  Ｓ１３、ＤＢＣ  Ｓ１４、ＤＢＣ  Ｓ１５、ＤＢＣ  Ｓ１６、ＤＢＣ  Ｓ１７、ＤＢＣ  Ｓ１８、ＤＢＣ  Ｓ１９、ＤＢＣ  Ｓ２０、ＤＢＣ  Ｓ２１、ＤＢＣ  Ｓ２２、ＤＢＣ  Ｓ２３、またはＤＢＣ  Ｓ２４の細菌種の生存可能個体群からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＢＣ中の各細菌種の前記１６Ｓ  ｒＤＮＡが、図１−１〜図１−６２の少なくとも１つの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と少なくとも９７％の同一性を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
細菌種の前記個体群が、図４−１〜図４−５に列挙される炭素源の少なくとも９０％を利用することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも５種の生存可能細菌の個体群を含む組成物であって、前記種の前記個体群のうちの少なくとも１つが、（ｉ）病原微生物によって利用される１つ以上の炭素源の利用、（ｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤の産生、（ｉｉｉ）インドールまたは他のトリプトファン代謝物の産生、及び（ｉｖ）胆汁酸制御において機能する酵素の産生からなる群から選択される１つ以上の特徴を有する、前記組成物。
【請求項７】
前記病原微生物が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅであり、前記個体群が、少なくとも５つの異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源を利用することができる１つ以上の種の生存可能細菌を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源が、タウロコール酸、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、及びデオキシコール酸からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記個体群が、酪酸、イソ吉草酸、イソ酪酸、プロピオン酸、及び２−メチル−酪酸からなる群から選択されるＨＤＡＣ阻害剤を産生する１つ以上の種の生存可能細菌を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記個体群が、胆汁酸塩加水分解酵素（ＢＳＨ）、３−α−水酸化ステロイド脱水素酵素（３−α−ＨＳＤＨ）、７−α−水酸化ステロイド脱水素酵素（７−α−ＨＳＤＨ）、及び１２−α−水酸化ステロイド脱水素酵素（１２−α−ＨＳＤＨ）からなる群から選択される１つ以上の酵素を産生する１つ以上の種を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
クレード８６、９０、１０１、１３９、１９５、１９７、２０６、２３３、２３８、２４１、２４４、及び２９０の各々に由来する少なくとも１つの種と、任意でクレーム２０２に由来する種と、を含む、組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種の細菌を含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細菌の少なくとも７５％が、芽胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、製剤。
【請求項１５】
前記薬学的に許容される賦形剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはカカオバターを含む、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
前記製剤が、カプセル剤または錠剤中にある、請求項１４または１５に記載の製剤。
【請求項１７】
腸内菌共生バランス失調のリスクにあるか、またはそれを有すると診断された対象において、腸内菌共生バランス失調を予防または治療するための、薬学的有効量の請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
前記組成物中の細菌の総濃度が、１０ｅ１〜１０ｅ９である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記組成物の前記細菌が、１、２、３、４、または５つのカプセル剤中に提供される、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２０】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を治療するため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を予防するため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の再発を予防するための、治療有効量の請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示されるのは、例えば、ヒトにおける腸内菌共生バランス失調の治療に有用な細菌組成物である。
【背景技術】
【０００２】
腸内菌共生バランス失調は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及び薬物耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓによる感染症などの感染症を含むいくつかの疾患、ならびに糖尿病などの代謝疾患に関係付けられている。腸内菌共生バランス失調関連病態の治療方法は、胃腸管（ＧＩ）に微生物を提供することができる糞便マイクロバイオーム移植（ＦＭＴ）を含んでいる。しかしながら、糞便移植は、安全性及び送達方法（一般に診療所内での手順を必要とする鼻−十二指腸、トランス内視鏡、または浣腸に基づく方法など）に関連する問題を含むいくつかの問題を提示し、有害事象を導入する可能性がある。ＦＭＴを使用する治療は、移植用の糞便を提供する個体間の可変性のため、本質的に不一致である可能性を有する。ＦＭＴ法はまた、原材料中のウイルス、細菌、真菌、及び原生生物を含む病原微生物による感染症のリスクを導入する。更に、例えば、細菌種の生存に関する、提供された糞便の安定性及び保管に関する問題が存在し得る。カプセル剤中に送達される糞便細菌を使用するいくつかの治療は、患者が大量のカプセル剤を服用することを必要としており、これは、ＧＩ疾病を有する者にとっては困難であり得、完全な治療への服薬遵守を低減し得る。したがって、腸内菌共生バランス失調または腸内菌共生バランス失調関連病態（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症）を有効に治療する、例えば、感染症を予防もしくは阻害する、または感染症の再発を予防もしくは阻害するのに十分な複合性である培養細菌を含有する一貫した産生物を送達する、組成物に対する必要性が存在する。本明細書で使用される場合、治療及び予防は、疾患の徴候または症状の低減を含み得る。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、腸内菌共生バランス失調の治療に有用である細菌組成物、例えば、定義された細菌型の共同体を含有する細菌芽胞組成物の発見に関する。そのような共同体は、本明細書において設計された細菌組成物（ＤＢＣ）と呼ばれる。
【０００４】
したがって、第１の態様において、本発明は、細菌の生存可能個体群を含む組成物であって、生存可能個体群が、表３のＤＢＣ１、ＤＢＣ２、ＤＢＣ３、ＤＢＣ４、ＤＢＣ５、ＤＢＣ６、ＤＢＣ７、ＤＢＣ８、もしくはＤＢＣ９、または表４のＤＢＣ  Ｓ１、ＤＢＣ  Ｓ２、ＤＢＣ  Ｓ４、ＤＢＣ  Ｓ５、ＤＢＣ  Ｓ６、ＤＢＣ  Ｓ７、ＤＢＣ  Ｓ８、ＤＢＣ  Ｓ９、ＤＢＣ  Ｓ１０、ＤＢＣ  Ｓ１１、ＤＢＣ  Ｓ１２、ＤＢＣ  Ｓ１３、ＤＢＣ  Ｓ１４、ＤＢＣ  Ｓ１５、ＤＢＣ  Ｓ１６、ＤＢＣ  Ｓ１７、ＤＢＣ  Ｓ１８、ＤＢＣ  Ｓ１９、ＤＢＣ  Ｓ２０、ＤＢＣ  Ｓ２１、ＤＢＣ  Ｓ２２、ＤＢＣ  Ｓ２３、もしくはＤＢＣ  Ｓ２４の細菌種を含有する、組成物を提供する。任意で、ＤＢＣ中の１つ以上の（例えば、各）細菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、図１−１〜図１−６２の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と少なくとも９７％（例えば、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の同一性を有する。
【０００５】
特定の実施形態において、本組成物は、本明細書に定義されるＤＢＣ１、ＤＢＣ２、ＤＢＣ３、ＤＢＣ４、ＤＢＣ５、ＤＢＣ６、ＤＢＣ７、ＤＢＣ８、ＤＢＣ９、ＤＢＣ  Ｓ１、ＤＢＣ  Ｓ２、ＤＢＣ  Ｓ４、ＤＢＣ  Ｓ５、ＤＢＣ  Ｓ６、ＤＢＣ  Ｓ７、ＤＢＣ  Ｓ８、ＤＢＣ  Ｓ９、ＤＢＣ  Ｓ１０、ＤＢＣ  Ｓ１１、ＤＢＣ  Ｓ１２、ＤＢＣ  Ｓ１３、ＤＢＣ  Ｓ１４、ＤＢＣ  Ｓ１５、ＤＢＣ  Ｓ１６、ＤＢＣ  Ｓ１７、ＤＢＣ  Ｓ１８、ＤＢＣ  Ｓ１９、ＤＢＣ  Ｓ２０、ＤＢＣ  Ｓ２１、ＤＢＣ  Ｓ２２、ＤＢＣ  Ｓ２３、またはＤＢＣ  Ｓ２４の細菌種の生存可能個体群からなる。任意で、ＤＢＣ中の１つ以上の（例えば、各）細菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、図１−１〜図１−６２の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と少なくとも９７％（例えば、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の同一性を有する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、細菌種の個体群は、図４−１〜図４−５に列挙される炭素源の少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％）を利用することができる。
【０００７】
別の態様において、本発明は、少なくとも５（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）種の生存可能細菌の個体群を含む組成物であって、種の個体群のうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）が、（ｉ）病原微生物によって利用される１つ以上の炭素源の利用、（ｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤の産生、（ｉｉｉ）インドールまたは他のトリプトファン代謝物の産生、及び（ｉｖ）胆汁酸制御において機能する酵素の産生からなる群から選択される１つ以上（例えば、１、２、３、または４つ）の特徴を有する、組成物を提供する。
【０００８】
様々な例において、病原微生物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅであり、個体群は、少なくとも５つ（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源を利用することができる１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の種の生存可能細菌を含む。例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源は、タウロコール酸、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、及びデオキシコール酸を含み得るか、またはそれらからなる群から選択され得る。
【０００９】
更なる例において、個体群は、ＨＤＡＣ阻害剤、例えば、酪酸、イソ吉草酸、イソ酪酸、プロピオン酸、及び２−メチル−酪酸からなる群から選択されるＨＤＡＣ阻害剤を産生する１つ以上の（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）種の生存可能細菌を含む。
【００１０】
追加の例において、個体群は、胆汁酸制御において機能する、例えば、胆汁加水分解酵素（ＢＳＨ）、３−α−水酸化ステロイド脱水素酵素（３−α−ＨＳＤＨ）、７−α−水酸化ステロイド脱水素酵素（７−α−ＨＳＤＨ）、及び１２−α−水酸化ステロイド脱水素酵素（１２−α−ＨＳＤＨ）からなる群から選択される、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の酵素を産生する１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の種を含む。
【００１１】
更なる一態様において、本発明は、クレード８６、９０、１０１、１３９、１９５、１９７、２０６、２３３、２３８、２４１、２４４、及び２９０の各々に由来する少なくとも１つの種と、任意でクレーム２０２に由来する種とを含む組成物を提供する。様々な例において、本発明の組成物は、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種の細菌を含む。更に、様々な例において、本組成物の細菌の少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％）は、芽胞の形態にある。
【００１２】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される組成物と、薬学的に許容される賦形剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはカカオバターを含む薬学的に許容される賦形剤）とを含む製剤を提供する。本製剤は、任意で、例えば、経口送達のために、カプセル剤または錠剤中にあってもよい。
【００１３】
本発明は、腸内菌共生バランス失調のリスクにあるか、またはそれを有すると診断された対象において、腸内菌共生バランス失調を予防（例えば、可能性の低下）または治療するための、薬学的有効量の本明細書に記載される組成物の使用を更に提供する。様々な例において、本組成物中の細菌の総濃度は、１０ｅ１〜１０ｅ９である。更に、本組成物の細菌は、１、２、３、４、または５つのカプセル剤中に提供されてもよい。
【００１４】
加えて、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を治療するため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を予防（例えば、その可能性を低下）するため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の再発を予防（例えば、その可能性を低下）するための、治療有効量の本明細書に記載される組成物の使用を提供する。
【００１５】
本発明はまた、本明細書に記載される薬学的有効量の組成物または製剤を対象に投与することを伴う、腸内菌共生バランス失調のリスクにあるか、またはそれを有すると診断された対象における、腸内菌共生バランス失調の予防または治療方法も提供する。様々な例において、本組成物中の細菌の総濃度は、１０ｅ１〜１０ｅ９である。更に、本組成物の細菌は、任意で、１、２、３、４、または５つのカプセル剤中に提供されてもよい。
【００１６】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の治療方法、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の予防方法、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の再発の予防方法であって、本明細書に記載される治療有効量の組成物または製剤を投与することを含む方法もまた、本発明に含まれる。
【００１７】
本方法のいくつかの実施形態において、本組成物は、感染症、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の再発の予防に有用である。いくつかの実施形態において、本組成物は、病原体の胃腸保因、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ保因またはバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ保因の低下に有用である。
【００１８】
定義
本明細書に記載される「治療有効量」の設計された細菌組成物（ＤＢＣ）は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの要因、ならびにＤＢＣが個体において所望される応答、例えば、ある障害の少なくとも１つの徴候または症状の寛解を誘発する能力（ならびに任意で、投与される任意の追加の薬剤の効果）によって異なり得る。いくつかの実施形態において、治療有効量のＤＢＣは、ある障害の少なくとも１つの徴候または症状のリスクを予防または低減することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＤＢＣは、腸内菌共生バランス失調に関連する感染症の再発のリスクを低減することができる。腸内菌共生バランス失調は、コロニー形成耐性、感染症からの保護、免疫ホメオスタシスの制御、代謝機能、必須代謝物及びビタミンの合成、腸運動もしくは神経機能の調節、またはマイクロバイオーム及び腸内バリアの維持に現在関連付けられている任意の数の他の特性を非限定的に含む、健康なマイクロバイオームが宿主に与える機能の喪失を含み得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果がその組成物のいかなる有毒または有害効果も凌ぐ量である。本明細書に記載される組成物は一般に、治療有効量で投与される。
【００１９】
「保因」とは、対象の体内または体上に微生物を抱える状態、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅなどの病原体の保因を意味する。
【００２０】
本明細書において言及される各特許文章及び科学論文の開示全体、ならびにそれにより引用される特許文書及び科学論文は、全ての目的のために参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００２１】
本発明の追加の特徴及び利点が、以下により具体的に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−６】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−７】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−８】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−９】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１０】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１１】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１２】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１３】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１４】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１５】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１６】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１７】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１８】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−１９】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２０】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２１】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２２】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２３】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２４】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２５】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２６】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２７】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２８】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−２９】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３０】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３１】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３２】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３３】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３４】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３５】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３６】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３７】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３８】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−３９】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４０】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４１】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４２】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４３】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４４】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４５】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４６】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４７】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４８】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−４９】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５０】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５１】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５２】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５３】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５４】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５５】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５６】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５７】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５８】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−５９】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−６０】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−６１】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図１−６２】ＤＢＣに有用な細菌に関連する、例示的な一組の完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号１〜１２４）である。
【図２】抗生物質誘導腸内菌共生バランス失調から生じるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症のマウスモデルを使用する実験設計を描写する図である。
【図３】腸内菌共生バランス失調のマウスモデルにおいて設計された細菌組成物（ＤＢＣ）を試験する実験の結果を描写する棒グラフである。データは、感染前ベースラインとの比較での、マウス実験群当たりの最小体重を描写する。
【図４−１】炭素源を有さない基本培地中でＯＤ６００に正規化した、示される炭素源を有する培地中でのＯＤ６００に基づく、選択されたＤＢＣ種の炭素源利用プロファイルを示す表である。空のセルは、陰性の結果を示す。埋まったセルは、列挙される炭素源の利用を示す。試験した５９の炭素源のうち、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用された２９のみを提示する。
【図４−２】炭素源を有さない基本培地中でＯＤ６００に正規化した、示される炭素源を有する培地中でのＯＤ６００に基づく、選択されたＤＢＣ種の炭素源利用プロファイルを示す表である。空のセルは、陰性の結果を示す。埋まったセルは、列挙される炭素源の利用を示す。試験した５９の炭素源のうち、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用された２９のみを提示する。
【図４−３】炭素源を有さない基本培地中でＯＤ６００に正規化した、示される炭素源を有する培地中でのＯＤ６００に基づく、選択されたＤＢＣ種の炭素源利用プロファイルを示す表である。空のセルは、陰性の結果を示す。埋まったセルは、列挙される炭素源の利用を示す。試験した５９の炭素源のうち、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用された２９のみを提示する。
【図４−４】炭素源を有さない基本培地中でＯＤ６００に正規化した、示される炭素源を有する培地中でのＯＤ６００に基づく、選択されたＤＢＣ種の炭素源利用プロファイルを示す表である。空のセルは、陰性の結果を示す。埋まったセルは、列挙される炭素源の利用を示す。試験した５９の炭素源のうち、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用された２９のみを提示する。
【図４−５】炭素源を有さない基本培地中でＯＤ６００に正規化した、示される炭素源を有する培地中でのＯＤ６００に基づく、選択されたＤＢＣ種の炭素源利用プロファイルを示す表である。空のセルは、陰性の結果を示す。埋まったセルは、列挙される炭素源の利用を示す。試験した５９の炭素源のうち、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用された２９のみを提示する。
【図５−１】選択されたＤＢＣ種の胆汁酸酵素活性を示す表である。
【図５−２】選択されたＤＢＣ種の胆汁酸酵素活性を示す表である。
【図６】ＰＹＧ中で成長させた純粋培養上清のＨＤＡＣアッセイ結果を示す棒グラフである。
【図７】ＧＣによるＨＤＡＣ阻害活性と酪酸濃度との比較を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
報告によれば、哺乳動物における健康な胃腸（ＧＩ）マイクロバイオームは、約３００〜１０００の異なる細菌種を有する。驚くべきことに、本出願者らは、限られた数の定義された細菌種を含有する、本明細書において「ＤＢＣ」と呼ばれる設計された細菌組成物（報告によれば、これらのいくつかは非常に低い相対量でヒトマイクロバイオーム中に存在する）が、動物のＧＩ管への侵襲からの回復または寛解、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）の回復または寛解を提供することができることを発見した。いくつかの実施形態において、そのような組成物は、例えば、感染前に腸内菌共生バランス失調によって誘導された病原微生物の保因を低減または排除することによって、腸内菌共生バランス失調に関連する感染症の再発を阻害することができる。
【００２４】
更に、本出願者らは、健康なヒトＧＩマイクロバイオーム中で非常に低いレベルで存在する（例えば、健康なヒトの糞便中に、合計細菌の２％未満、例えば、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、０．０００１％未満、または０．００００１％未満で検出される）新たな種を発見した。具体的な例において、新たな種は、便の１ｅ９ＣＦＵ／グラム未満、便の１ｅ６ＣＦＵ／グラム、便の１ｅ５ＣＦＵ／グラム未満、便の１ｅ４ＣＦＵ／グラム未満、または便の１ｅ３ＣＦＵ／グラム未満の量で存在し得る。驚くべきことに、これらの種は、ヒトマイクロバイオーム中でのそれらの非常に低いレベルにも関わらず、ＤＢＣ、例えば、治療的に有効なＤＢＣの治療または予防有用性に寄与することができる。ＤＢＣは、例えば、ヒトの糞便に直接由来する調製物を使用する、腸内菌共生バランス失調の治療方法の改善を提供する。例えば、ヒトは可変性のＧＩマイクロバイオームを有するため、ヒトの糞便に由来する調製物中に存在する生物の数または割合において一貫性に関する問題が存在し得る。更に、そのような調製物は、そのような治療を受ける患者に病原体を感染させるリスクを有する。本出願者らのＤＢＣは、幅広い患者にわたってコロニー形成耐性を促進するのに必要な機能的特徴を提供する可能性を増加させる、系統的に多様な生物の治療組成物中への包含によって、患者の多様性の問題に対処する。
【００２５】
本明細書に記載されるＤＢＣは、腸内菌共生バランス失調の治療に関するこれらの問題、及び腸内菌共生バランス失調関連障害の治療に関する他の問題に対する解決策を提供する。
【００２６】
組成物
組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２５、または３０の細菌型を含む。細菌型は、科、属、クレード、種、または株であり得る。一例において、組成物は、クレード８６、９０、１０１、１３９、１９５、１９７、２０６、２３３、２３８、２４１、２４４、及び２９０の各々に由来する少なくとも１つの種と、任意でクレード２０２とを含み、これらの例を下記の表２に提供する。いくつかの実施形態において、本組成物は、クレード８６、９０、１０１、１３９、１９５、１９７、２０２、２０６、２３３、２３８、２４１、２４４、及び２９０の各々に由来する少なくとも１つの種からなる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、組成物は、Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｒｉｃｈａｃｅａｅ科、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ科、及びＦｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ属の各々に由来する少なくとも１つの種の細菌を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、組成物中の種は、表１及び／または表２に特定される種から選択される。クレードは、進化的に関連しているため、機能的特徴を共有する可能性が高い細菌種である。クレードは、系統学の当業者であれば精通している最尤法を使用して、完全長１６Ｓ配列から構築される系統樹の形態に基づいて定義される。クレードは、所与のクレードにおける全てのＯＴＵが、（ｉ）互いに特定の数以内のブートストラップ支持ノードにあり、かつ（ｉｉ）５％以内の遺伝的類似性にあることを確実にするように構築される。同一のクレード内にあるＯＴＵは、１６Ｓ−Ｖ４配列データに基づいて、異なるクレード内のＯＴＵとは遺伝的かつ系統的に異なるものとして区別することができる一方で、同一のクレード内にあるＯＴＵは、密接に関連している。同一のクレード内にあるＯＴＵは、進化的に密接に関連している。同一のクレードのメンバーは、それらの進化的関連性のために、ヒトの腸内に見出されるもののような微生物の生態において、類似した機能的役割を果たす。１つの種を同一のクレードに由来する別の種で置換する組成物は、保存された生態学的機能を有する可能性が高いため、本発明において有用である。いくつかの実施形態において、本組成物は、表１または表２の各クレードに由来する１、２、または３つの種を含む。
【００２９】
組成物の一例は、表１及び／または表２から選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０種の細菌を含む組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、表１及び／または表２から選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の細菌からなる。いくつかの実施形態において、細菌種は、１６Ｓ  ｒＤＮＡに対する相同性によって特定される。そのような１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の一例示的な一覧表を、図１−１〜図１−６２に提供する。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
【表２】
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【００３２】
表１に列挙される細菌種を使用する組成物の非限定的な例を、表３に提供する。
【表３】
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【００３３】
追加のＤＢＣ組成物（ＤＢＣ  Ｓ１〜ＤＢＣ  Ｓ２４）を、以下の表４に列挙する。表４は、ＤＢＣ  Ｓ１〜ＤＢＣ  Ｓ２４の細菌組成物を示し、試験した条件下でのＤＢＣ  Ｓ１〜ＤＢＣ  Ｓ２４の特徴を示す。特徴は、以下の通りである。クラスターＩＶ：いずれの種もＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌクラスターＩＶにはない；クラスターＩＶまたはＸＩＶａなし：いずれの種もＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌクラスターＩＶまたはＸＩＶａにはない；高度の生着、高度の一般性：健康なヒトの糞便から単離した芽胞の複合組成物による実験において、これらは高度な生着体であった細菌種（複合芽胞組成物中にあり、その後芽胞組成物を投薬した対象において検出された種）及び高度に一般的であった種（ＨＭＰデータベースにおいて一般的に見出される種）の例である；ＨＤＡＣ活性：全ての種が、ヒストン脱アセチル化酵素活性を阻害することができる短鎖脂肪酸（酪酸及び／またはプロピオン酸、及び／またはイソ酪酸、及びイソ吉草酸）を産生する；ＨＤＡＣ活性なし：いずれの種もヒストン脱アセチル化酵素活性を阻害することができる短鎖脂肪酸（酪酸及び／またはプロピオン酸及び／またはイソ酪酸及びイソ吉草酸）を産生しない；ＢＳＨ活性：全ての種が胆汁酸塩加水分解酵素活性を有する；ＢＳＨ活性なし：いずれの種も胆汁酸塩加水分解酵素活性を有さない；７α−ＨＳＤＨ活性：全ての種が７−α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有する；７−α−ＨＳＤＨ活性なし：いずれの種も７−α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有さない；３−αまたは１２−α−ＨＳＤＨ活性：全ての種が３−α／１２α−水酸化ステロイド脱水素酵素活性を有する；アミノ酸アラニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、セリン、及びバリン上での成長：全ての種がこれらのアミノ酸を炭素源として使用することができる；アミノ酸アラニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、セリン、及びバリン上での成長なし：いずれの種もこれらのアミノ酸を炭素源として使用しなかった；インドール産生：全ての種がインドールまたはインドール誘導体を産生することができる；非インドール産生：いずれの種もインドールを産生することができない；糖アルコール上での成長：全ての種が糖アルコールを炭素源として使用することができる；糖アルコール上での成長なし：いずれの種も糖アルコールを炭素源として使用することができない；フコース上での成長：全ての種がフコースを炭素源として使用することができる；フコース上での成長なし：いずれの種もフコースを炭素源として使用することができない；ＮＡＧ上での成長：全ての種がＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）を炭素源として使用することができる；ＮＡＧ上での成長なし：いずれの種もＮＡＧを炭素源として使用することができると予想されていなかった。予想は、その特定の実験／スクリーニングの結果に基づいた。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
いくつかの実施形態において、ＤＢＣ中の全ての生物は、ｏｂｌｉｇａｔｅ  ａｎａｅｒｏｂｅｓである。いくつかの実施形態において、組成物中の細菌は、インビトロで培養して、芽胞を形成することができる種であり、そのような芽胞は、インビトロで発芽することができる。いくつかの実施形態において、組成物中の細菌は、芽胞である。いくつかの実施形態において、組成物中の細菌は、増殖型形態である。細菌芽胞の組成物または増殖型細菌の組成物とは、大部分の細菌が特定の形態（すなわち、芽胞または増殖型）である一方で、少数が異なる形態であり得ること、例えば、芽胞の場合、組成物中のいくつかの細胞は増殖型であり得る一方で、増殖型細菌の場合、いくつかの細胞は芽胞の形態であり得ることを意味することが理解される。例えば、本組成物は、少なくとも１００％、少なくとも９９％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％芽胞であっても、本組成物は、少なくとも１００％、少なくとも９９％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％増殖型細菌であってもよい。いくつかの実施形態において、個々の種は、例えば、７４：２６、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、及び２６：７４などの比率の、増殖型細菌と芽胞との混合物として存在する。典型的には、比率は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を使用して評価されるが、当該技術分野において既知である他の方法が使用されてもよい。増殖型または芽胞特異的形態における細菌のパーセントの評価は、剤形での組成物の調製日時点、または剤形の投与日時点で言及され得る。
【００３６】
他の実施形態において、ＤＢＣは、表１の少なくとも２つの生物と、以下、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａ４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ５  １  ５７ＦＡＡ、及びＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔａｒｉｓのうちの１つ以上とを含む。
【００３７】
組成物の別の例は、以下の種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｙｌｅｍｏｎａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｓｐｏｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｍ、Ｍｕｒｉｍｏｎａｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａ４、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ１１０４１、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｏｒｏｔｉｃｕｍのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個を含有する組成物である。
【００３８】
驚くべきことに、本出願者らは、健康なマイクロバイオームの割合または別様に天然に見出される割合を反映する割合で生物を提供することが必須ではないことを見出し、本出願者らは、本組成物が天然に存在する割合で生物を含有しない場合でも、およそ同一の数の各種の細菌（例えば、同一の数のインビトロ発芽可能芽胞）を含有するＤＢＣの用量が有効であることことを見出した。更に、本出願者らは、表３及び４に提供されるＤＢＣのうちのいずれにおいても、検出可能なレベルの全ての生物を有するいかなる個々のヒトの報告も認識しておらず、すなわち、本出願者らは、本組成物が天然に存在しないものであると考えている。
【００３９】
本出願者らはまた、治療に有効な細菌の総数は、健康なヒトの胃腸管内の生物の総数よりもずっと少ないことに留意し、すなわち、組成物中に提供される種の多様性の観点だけではなく、生物の総数の観点においても、治療効果を達成するために完全な健康なマイクロバイオームを投与することは必須ではない。
【００４０】
これらの例において、「からなる」は、組成物中に存在する細菌型を指すことが理解される。細菌製剤は、１つ以上の賦形剤（例えば、１つ以上のカプセル剤を含む）、水性または非水性培地（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、カカオバター、水、及び／または緩衝液）、ならびに１つ以上のプレバイオティクスまたは小分子薬物などの追加の非細菌材料を含有してもよい。
【００４１】
組成物中で使用される種
一般に、ＤＢＣ中で使用される種は、それらの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（例えば、完全長配列、または１つ以上の可変領域配列（Ｖ１〜Ｖ９、例えば、Ｖ４配列、もしくはＶ６配列））に基づいて、選択されたクレード内にあるものとして特定される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ＤＢＣ中で有用な種は、参照種、例えば、表１または表２に特定される種の１６Ｓ  ｒＤＮＡと少なくとも９５％配列同一性（「同一性」）を有する完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する種である。いくつかの実施形態において、ＤＢＣ中で有用な種は、参照種、例えば、表１または表２の種の１６Ｓ  ｒＤＮＡと少なくとも９７％配列同一性（「同一性」）を有する完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する種である。いくつかの実施形態において、有用な種は、参照種、例えば、表１または表２に特定される種の１６Ｓ  ｒＤＮＡのＶ４領域と９５％の同一性を有するＶ４領域１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。いくつかの実施形態において、有用な種は、参照種、例えば、表１または表２に特定される種の１６Ｓ  ｒＤＮＡのＶ４領域と９７％の同一性を有するＶ４領域１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。いくつかの実施形態において、有用な種は、参照種、例えば、表１または表２に特定される種の完全長ゲノムＤＮＡと少なくとも９５％の同一性を有するゲノム配列を有する。いくつかの実施形態において、有用な種は、参照種、例えば、表１または表２に特定される種の完全長ゲノム配列と少なくとも９７％の同一性を有するゲノム配列を有する。ある配列（例えば、Ｖ４配列）が本明細書に提供されていない場合、そのような配列を特定するための方法は当該技術分野において周知である。図１−１〜図１−６２は、参照配列として使用することができる完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の非限定的な例を提供する。一般に、参照種との同一性または同一性パーセントとは、ある生物において見出される少なくとも１つの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列との同一性または同一性パーセントを意味する。
【００４３】
場合によっては、ある発明において有用な細菌種（例えば、本明細書に開示される種）の株は、ＡＴＣＣ（ａｔｃｃ．ｏｒｇ）、ＤＳＭＺ（ｄｓｍｚ．ｄｅ）、またはＲｉｋｅｎ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｅｎ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ）などの公的生物学資料センターから得ることができる。種または本発明の他の態様の特定に有用な１６ｓ  ｒＤＮＡ配列は、公的データベース、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＨＭＰ）ウェブサイトまたはＧｅｎＢａｎｋから得ることができる。
【００４４】
配列同一性の決定方法は当該技術分野において既知であり、例を下記に提供する。
【００４５】
種／命名情報
細菌の名称及び分類は変更の可能性があり、これは文献には反映されていない可能性がある。便宜上、本明細書において、いくつかの細菌種の代替名を提供するが、これらは包括的な代替名の組であることは意図されない。いくつかの実施形態において、種は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の全てまたは一部分の配列同一性、例えば、少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性によって特定される。
【００４６】
同一性の決定
いくつかの実施形態において、クレード、動作可能分類学単位（ＯＴＵ）、種、及び株は、それらの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列によって特定される。クレード、ＯＴＵ、種、及び株の関連性は、クレード、ＯＴＵ、種、及び株間の同一性パーセントによって決定することができる。参照配列と問い合わせ配列との間の同一性パーセントは、当該技術分野において既知である方法を使用して決定することができる。そのような決定のための方法の非限定的な例を、以下に提供する。本明細書で使用される場合、２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「同一性」パラメータによって記載される。
【００４７】
一実施形態において、問い合わせ配列と参照配列との間の配列同一性の程度は、１）デフォルトスコア化マトリックス及びデフォルトギャップペナルティを使用する好適な整列プログラムによって２つの配列を整列させ、２）完全一致の数（完全一致とは、整列プログラムが、整列中、所与の位置上で２つの整列された配列において同一のヌクレオチドを特定したものである）を特定し、３）完全一致の数を参照配列の長さで除することによって決定される。
【００４８】
別の実施形態において、問い合わせ配列と参照配列との間の配列同一性の程度は、１）デフォルトスコア化マトリックス及びデフォルトギャップペナルティを使用する好適な整列プログラムによって２つの配列を整列させ、２）完全一致の数（完全一致とは、整列プログラムが、整列中、所与の位置上で２つの整列された配列において同一のヌクレオチドを特定したものである）を特定し、３）完全一致の数を２つの配列のうちで長い方の長さで除することによって決定される。
【００４９】
別の実施形態において、問い合わせ配列と参照配列との間の配列同一性の程度は、１）デフォルトスコア化マトリックス及びデフォルトギャップペナルティを使用する好適な整列プログラムによって２つの配列を整列させ、２）完全一致の数（完全一致とは、整列プログラムが、整列中、所与の位置上で２つの整列された配列において同一のアミノ酸またはヌクレオチドを特定したものである）を特定し、３）完全一致の数を「整列長さ」（整列長さとは、その配列のギャップ及びオーバーハング部分を含む整列全体の長さである）で除することによって決定される。
【００５０】
配列同一性比較は一般に、配列比較プログラムの助けを借りる。これらの商業的または公的に利用可能なコンピュータプログラムは、複雑な比較アルゴリズムを使用して、２つ以上の配列間の差異（複数可）をもたらしている可能性のある進化的事象を最良に反映する２つ以上の配列を整列させる。したがって、これらのアルゴリズムは、同一または類似したアミノ酸の整列に報酬を与え、ギャップの挿入、ギャップ延長、及び類似していないアミノ酸の整列にペナルティを与えるスコア化システムによって動作する。比較アルゴリズムのスコア化システムは、
ｉ）ギャップが挿入される度毎のペナルティスコアの割り当て（ギャップペナルティスコア）、
ｉｉ）既存のギャップが追加の位置によって延長する度毎のペナルティスコアの割り当て（延長ペナルティスコア）、
ｉｉｉ）同一のアミノ酸の整列時の高いスコアの割り当て、及び
ｉｖ）非同一のアミノ酸の整列時の可変スコアの割り当てを含む。
【００５１】
一般に、配列比較には整列プログラムのデフォルト値が使用される。同一性の決定に有用である好適なコンピュータプログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）が挙げられる。
【００５２】
本発明の一実施形態において、整列プログラムは、完全長の選択された配列、例えば、完全長、Ｖ４またはＶ６  １６Ｓ  ｒＤＮＡ配列にわたって整列を最適化する。例えば、グローバル整列プログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ４８：４４３−５３）に基づく。そのようなプログラムの非限定的な例は、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／で入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅプログラム及びＥＭＢＯＳＳ  Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒプログラムである。
【００５３】
一実施形態において、配列は、グローバル整列プログラムによって整列され、配列同一性は、プログラムによって特定される完全一致の数を特定し、「整列長さ」（整列長さとは、その配列のギャップ及びオーバーハング部分を含む整列全体の長さである）で除することによって計算される。更なる一実施形態において、グローバル整列プログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用し、配列同一性は、プログラムによって特定される完全一致の数を特定し、「整列長さ」（整列長さとは、その配列のギャップ及びオーバーハング部分を含む整列全体の長さである）で除することによって計算される。
【００５４】
依然更なる一実施形態において、グローバル整列プログラムは、ＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ及びＥＭＢＯＳＳ  Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒからなる群から選択され、配列同一性は、プログラムによって特定される完全一致の数を特定し、「整列長さ」（整列長さとは、その配列のギャップ及びオーバーハング部分を含む整列全体の長さである）で除することによって計算される。
【００５５】
ソフトウェアが整列を産生した時点で、類似性パーセント（％）及び配列同一性パーセントを計算することが可能である。
【００５６】
候補ＤＢＣの試験方法
インビボ方法
候補ＤＢＣは、腸内菌共生バランス失調に関連する疾患の動物モデルを使用して試験することができる（例えば、Ｈｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３５２：１４０−１４９）、Ｂｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ３：１４５−１６７）、及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１３５：１９８４−９２））。１つのそのようなモデルの使用は、下記の実施例に記載される。そのようなモデルにおいて徴候または症状を改善する候補ＤＢＣは、例えば、ヒトにおける腸内菌共生バランス失調の治療のためのＤＢＣとして有用である。
【００５７】
組成物の特徴
本明細書に記載されるように、ＤＢＣは一般に、インビボ及び／またはインビトロで、病原微生物の成長を阻害する能力、病原微生物を殺滅する能力、病原微生物の影響を予防もしくは寛解する能力、または他のそのような好適な活性について試験される。いくつかの実施形態において、ＤＢＣ中の細菌は、組成物中、部分組成物中、または個々の細菌としてのいずれかで、それらが呈する特徴について選択される。そのような特徴の例としては、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害する能力、胆汁酸を代謝する能力、栄養源（例えば、標的とする病原微生物によって使用される栄養源）を利用する能力、及びトリプトファンを代謝してインドール及び他のトリプトファン代謝物を産生する能力が挙げられる。これらの特徴の詳細を、以下の通り、及び以下の実施例において明記する。
【００５８】
ヒストン脱アセチル化酵素活性
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）は、真核細胞内のＤＮＡクロマチン構造の部分であるヒストンのＮ末端の特定の部位からアセチル残基を除去することができる酵素の科である（Ｄａｖｉｅにおいて概説される）。ヒストンアセチル化の定常状態は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）酵素によるアセチル化と、ＨＤＡＣによる脱アセチル化との平衡の結果である。ＨＤＡＣは阻害されるが、ＨＡＴ活性は継続するとき、ヒストンは高アセチル化され、故に高次のクロマチン構造を破壊し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写を刺激する。哺乳動物遺伝子の２％のみがＨＤＡＣ阻害によって影響される過ぎないため、遺伝子発現におけるＨＤＡＣ阻害の効果は一般化されていない。
【００５９】
ヒト腸内マイクロバイオームによって産生されるいくつかの短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、ＨＤＡＣ阻害剤である。特に、酪酸は、インビトロ及びインビボで、高アセチル化ヒストンＨ３及びＨ４の蓄積をもたらすＨＤＡＣ阻害剤として特定されている（Ｃａｎｄｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．１９７８Ｃｅｌｌ１４：１０５−１１３、Ｂｏｆｆａ  ｅｔ  ａｌ．１９７８Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２５３：３３６４−３３６６、Ｖｉｄａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９７８Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ７５：２２３９−２２４３、Ｄａｖｉｅ．２００３Ｊ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ１３３：２４８５Ｓ−２４９３Ｓ）。他のＳＣＦＡ、プロピオン酸、イソ酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、乳酸、及び酢酸もまた、ヒストン脱アセチル化を阻害するが、報告によれば、酪酸ほど有効ではない（Ｓｅａｌｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｋｌｅｙ．１９７８Ｃｅｌｌ１４：１１５−１２１、Ｌａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ４０：４７９４−４８０３、Ｗａｌｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ１９：５８７−５９３）。報告によれば、酪酸の特定の治療効果は、少なくとも部分的にはＨＤＡＣの阻害によって媒介される。そのような研究は、治療領域にわたるＨＤＡＣの重要な役割を明らかに実証し、ヒトマイクロバイオームによって産生されるＳＣＦＡ酪酸及びプロピオン酸を、ＨＤＡＣ阻害を介した望ましい機能的結果へと直接的に繋げる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＤＢＣへの割り当てが考慮される細菌のＨＤＡＣ活性が、アッセイされる。そのような細菌は、治療的結果を達成するためにＨＤＡＣ阻害が望ましいＤＢＣ中、またはＳＣＦＡの役割が特定されているＤＢＣ中で、有用である。そのような選択のための方法の例を、実施例に提供する。
【００６１】
本出願者らは、細菌種がＨＤＡＣを阻害する能力が、細菌に対して提供される栄養源によって影響されることを実証している。したがって、いくつかの適応症において、ＤＢＣの治療的使用部分としてプレバイオティクスが提供されてもよい。プレバイオティクスは、少なくとも部分的にはＤＢＣ中の細菌がプレバイオティクスを栄養源として使用して、ＳＣＦＡ産生を増加させる能力に基づいて選択される。
【００６２】
インドール及びトリプトファン代謝
インドール及びインドール誘導体は、宿主の生理機能に関係付けられている（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，２０１６Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ８：４６に概説される）。例えば、インドール及びインドール−３−アルデヒドは、報告によれば、ＩＬ−２２発現を誘導し、Ｔｈ−１７活性を増加させる、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）のアゴニストである。インドールはまた、上皮タイトジャンクション耐性、ムチン産生、及びコロニー形成耐性を増加させることが報告されている（Ｂａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ１０７：２２８−２３３）。インドール−３−酢酸、トリプタミン、及びスカトールもまた、ＡｈＲリガンドであるため（Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１５．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ４３：１５２２−３５）、宿主生物学において類似した役割を果たし得る。同様に共生細菌によるトリプトファン代謝の産生物であるインドール−３−プロピオン酸は、プレグナンＨ受容体（ＰＸＲ）のリガンドである。ＰＸＲ活性化は、ＴＮＦαを下方制御し、タイトジャンクションタンパク質を上方制御し、故に免疫ホメオスタシス及び腸内バリア機能の改善を促進する（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４１：２９６−３１０及びＲｏｍａｇｎｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１９６Ｓｕｐｐｌ．６７．１０）。更に、ＡｈＲアゴニストは、マウスモデルにおいてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の影響を寛解することが報告されている（Ｊｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｒｇ．ＰＭＩＤ２７２８０５００）。更に、健康なヒトの糞便に由来する細菌芽胞を使用して、再発性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を治療した研究において、トリプトファン代謝が増加することが観察され、トリプトファンの糞便濃度は低下し、いくつかのインドール誘導体の増加が存在した（データ示さず）。
【００６３】
したがって、本出願者らは、選択された細菌がトリプトファンを代謝することができ、したがって、ＤＢＣに対する有用な追加物であることを発見した。下記の実施例８は、そのような細菌を特定し、特性評価するための方法の一例を提供するだけでなく、そのような細菌の具体例もまた提供する。
【００６４】
炭素源の利用
病原体の存在に関連する障害の治療または予防に有用なＤＢＣの別の有用な特徴は、炭素源競合、例えば、ＤＢＣ中への、病原体、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用されるものと共通する１つ以上の炭素源を使用することができる細菌の包含である。実施例３Ａ及び３Ｂは、この特徴をいかに特定することができるかについての一例を提供し、例えば、ＣＤＩの治療または予防に有用であり、かつＤＢＣ中での使用に好適である細菌種の例を提供する。
【００６５】
製剤
いくつかの実施形態において、治療は、ＤＢＣを対象（例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症のリスクにあるか、それが最近治療されたか、またはそれを有すると診断された患者）に投与することを含み、本組成物は、ＤＢＣと、薬学的に許容される担体とを含む。いくつかの実施形態において、ＤＢＣは、経口剤形である。いくつかの実施形態において、ＤＢＣは、１つ以上の薬学的に許容される担体（賦形剤）と組み合わせて、活性構成成分として本明細書に記載される細菌の共同体を含む。本発明の組成物の作製において、ＤＢＣは典型的には、賦形剤と混合されるか、賦形剤によって希釈されるか、または例えば、カプセル剤、小袋、紙、もしくは他の容器の形態のそのような担体内に包含される。賦形剤が希釈剤としての役割を果たすとき、それは、活性構成成分のビヒクル、担体、または培地としての役割を果たす固体、半固体、または液体材料であり得る。故に、製剤は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳剤、溶液、シロップ、エアロゾル（固体として、もしくは液体培地中で）、例えば、最大１０重量％の活性構成成分を含有する軟膏剤、軟質カプセル剤、硬質カプセル剤、ジェルカプセル、錠剤、坐剤、溶液、または包装粉末の形態であり得る。好適な賦形剤としては、例えば、ＰＢＳ、グリセロール、カカオバター、またはポリエチレングリコールが挙げられる。
【００６６】
製剤の調製において、ＤＢＣは、他の成分と組み合わせる前に適切な粒径を提供するために粉砕されてもよい。
【００６７】
本組成物は、当該技術分野において既知である方法及び形態を用いることによって、例えば、結腸内での放出のために、患者に投与した後、活性構成成分の迅速な、持続した、または遅延した放出を提供するように製剤化されてもよい。
【００６８】
ＤＢＣは、単位剤形で製剤化することができ、各剤形は、約１０２〜約１０９個の芽胞、例えば、約１０４〜約１０８個の芽胞を含有する。「単位剤形」という用語は、ヒト対象及び他の哺乳動物の単位投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、好適な薬学的賦形剤と関連して、所望される治療効果を産生するように計算された所定の量の活性構成成分を含有する。場合によっては、２個以上の単位剤形が１つの用量を構成する。例えば、単回用量は、１個の単位剤形、２個の単位剤形、３個の単位剤形、４個の単位剤形、５個の単位剤形、またはそれ以上であり得る。場合によっては、単回用量を構成する単位剤形の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または３０個の単位剤形である。単回用量は、例えば、１０３〜約１０９個の芽胞、例えば、約１０４〜約１０８個の芽胞であり得る。一例において、用量は、その用量中に合計で１０ｅ２〜１０ｅ８個の芽胞を含有する１、２、３、または４個のカプセル剤である。複数の剤形を有する単回用量の場合、剤形は一般に、規定された期間以内、例えば、１時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、または２４時間以内に送達される。
【００６９】
本明細書に記載される組成物は、幅広い投薬量範囲にわたって有効であり得、一般に薬学的有効量で投与される。
【００７０】
本明細書に記載される組成物を含む錠剤または丸剤は、剤形を提供するように、例えば、（例えば、嚥下性を改善することによって）送達を容易にするように、または標的とする胃腸管の領域（結腸など）への送達を改善するように、コーティングされても、または別様に化合されてもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、錠剤または丸剤は、組成物を囲む内部構成成分と、外部構成成分とを含み、後者は、前者のエンベロープとしての役割を果たす。この２つの構成成分は、胃内での分解に対して耐性であり得、内部構成成分が無傷で十二指腸へと通過すること、またはその放出が遅延されることを可能にする腸溶コーティング層によって分離されてもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ＤＢＣを含む製剤は、内視鏡法によって、あるいは所望される部位、例えば、上部腸管（例えば、胃及び／もしくは十二指腸）もしくは下部腸管（例えば、小腸及び／もしくは大腸）での、またはその付近での他の好適な製剤の送達方法によって、経鼻胃経路を介して投与される。有効な用量は、インビトロもしくは動物モデル試験システムから、または臨床研究から導出される用量応答曲線から推定することができる。
【００７３】
更に、製剤は任意で、当該技術分野において既知である制酸剤と組み合わせて投与されてもよい。
【００７４】
腸内菌共生バランス失調の治療方法
本明細書に記載されるＤＢＣは、例えば、腸内菌共生バランス失調を予防または治療するために、治療を必要とする対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物への投与に有用である。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象は、所望されない病原体もしくは所望されない分類群（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅもしくはバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓなど）の異常成長、１つ以上の重要な細菌分類群（ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓもしくはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓなど）またはそれ（ら）の属もしくは種の提示の低減、あるいは健康な個体との比較での微生物種の多様性の低減、嫌気性菌の全体的な存在量の低減、あるいは特定の機能（例えば、胆汁酸代謝）を実行することができる細菌の全体的な存在量の低減を含むが、これらに限定されない、腸内菌共生バランス失調の１つ以上の症状を有するヒト対象である。本明細書で使用される場合、「腸内菌共生バランス失調の治療」は、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症などの腸内菌共生バランス失調関連疾患の治療、再発性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の予防、またはバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ感染症（ＶＲＥ）の治療もしくは予防を含む。予防とは、腸内菌共生バランス失調のリスクの低減を意味し得ることが理解される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、対象は、ＤＢＣの投与前に抗生物質治療を受ける。いくつかの実施形態において、対象は、抗生物質治療を受け、抗生物質治療から、ＤＢＣの投与前に、少なくとも１日、２日、３日、５日、１週間、２週間、３週間、または４週間が経過するまでＤＢＣを受けない。いくつかの実施形態において、対象は、投薬期間の適用範囲を確実にするために、複数回用量のＤＢＣを受ける。いくつかの実施形態において、対象は、ＤＢＣの投与前に腸内菌共生バランス失調の症状を有する。他の実施形態において、対象は、ＤＢＣの投与前に腸内菌共生バランス失調の症状を呈さず、例えば、ＤＢＣは、腸内菌共生バランス失調が臨床症状（例えば、病原体への感染症）をもたらすリスクを低減するために、予防的に投与される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＤＢＣは、胃腸疾患、障害、または病態、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、過敏性腸障害、または胃腸管の腸内菌共生バランス失調に関連する他の障害の影響を寛解するために投与される。いくつかの実施形態において、ＤＢＣは、例えば、再発性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、炎症性腸疾患、（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、または大腸炎によって引き起こされる、下痢または他の症状を呈する対象に投与される。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＤＢＣは、疾患、障害、または病態の改善前に一度のみ投与される。いくつかの実施形態において、治療組成物は、２日よりも大きい間隔（３日、４日、５日、もしくは６日一度など）、または１週間に一度もしくは１週間に一度よりも少ない頻度（例えば、２週間に一度、３週間に一度、４週間に一度、６週間に一度、８週間に一度、１２週間に一度、１ヶ月に一度、２ヶ月に一度、３ヶ月に一度、４ヶ月に一度、もしくは６ヶ月に一度）で投与される。場合によっては、ＤＢＣは、設定スケジュールに従って断続的に、例えば、１日に一度、１週間に一度、もしくは１ヶ月に一度、または対象が原発性疾患を再発したときに投与される。別の実施形態において、ＤＢＣは、侵襲的医療手順（手術など）を有するか、入院しているか、長期ケアもしくはリハビリテーション施設で生活するか、自らの職業のために病原体に曝露されている（家畜及び動物処理労働者）か、病原体の保因者であり得る（医師、看護師、及び他の医療関係者などの病院労働者を含む）個体を含む、これらの病原体の感染のリスクにあるか、または保因者であり得る個体に対して、長期に基づいて投与される。場合によっては、ＤＢＣは、腸内菌共生バランス失調及びその症状（抗生物質関連下痢など）の発症を予防するために、抗生物質の使用後に投与される。
【００７８】
本明細書に提供される治療組成物を使用して、代謝疾患、ならびに糖尿病、代謝症候群、肥満、心疾患、自己免疫疾患、肝疾患、及び自閉症からなる群から選択される障害もしくは病態を患うか、またはそれを発症するリスクにある対象の治療または予防方法もまた、提供される。
【００７９】
実施形態において、細菌芽胞組成物は一般に、腸管投与される。例えば、投与は、嚥下形態（例えば、丸剤、小袋、カプセル剤、もしくはシロップなど）を介した、または経口もしくは経鼻管（経鼻胃、経鼻空腸、経口胃、もしくは経口空腸を含む）による、経口投与であってもよい。他の実施形態において、投与は、（例えば、浣腸、坐剤、または大腸内視鏡法による）直腸投与を含む。ＤＢＣは、口、食道、胃、小腸、大腸、または直腸を含む、胃腸管の少なくとも１つの領域に投与され得る。ＤＢＣは、粉末、１つ以上のカプセル剤、１つ以上の錠剤、ゲル、または液体などの薬物の形態で経口投与され得る。ＤＢＣはまた、経口経路によってもしくは経鼻胃管を通してゲルもしくは液体形態で、または直腸経路によってゲルもしくは液体形態で、浣腸もしくは大腸内視鏡を通した滴下によって、または坐剤によって投与され得る。
【００８０】
対象は、ＤＢＣの投与前に結腸浄化準備を有し得る。対象を大腸内視鏡法に準備するために使用されるものなどの結腸浄化方法は、当該技術分野において既知である。また、対象は任意で、当該技術分野において既知であり、その対象に適切であると決定されるように、ＤＢＣ投与時に胃のｐＨを増加させるために、制酸剤または緩衝剤で処置されてもよい。
【００８１】
対象を評価するために、腸内菌共生バランス失調の徴候または症状を、ＤＢＣの投与の１日〜６ヶ月後の範囲で治療後に評価する。１つの評価方法は、対象から糞便材料を得ることと、例えば、１６Ｓ  ｒＤＮＡもしくはメタゲノムショットガン配列決定分析、または当該技術分野において既知である他の分析法を使用して、胃腸管内に存在する微生物を評価することとを伴う。ＤＢＣに存在する細菌種による胃腸管の個体群、及びＤＢＣ中に存在しない共生微生物による増大を使用して、腸内菌共生バランス失調の改善を示すことができる。感染症の場合、治療前の感染性主体のレベルとの比較での、ＤＢＣでの治療後の感染性主体、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのレベルの低下を使用して、ＤＢＣ治療の有効性を示すことができる。
【００８２】
本明細書における実施形態は実施形態の説明を提供し、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者であれば、多くの他の実施形態が包含されることを容易に認識する。本開示において引用される全ての論文及び特許の全体が、参照により組み込まれる。参考文献によって組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、または本明細書と一致しない程度まで、本明細書は、いかなるそのような資料にも優先するだろう。本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が先行技術であることを承認するものではない。
【００８３】
等価物
全ての技術的特徴は、そのような特徴の全ての可能な組み合わせで個々に組み合わせることができる。
【００８４】
本発明は、趣旨またはその必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができる。したがって、上述の実施形態は、全ての観点において、本明細書に記載される本発明を限定するものではなく、説明するものであると見なされるべきである。
【実施例】
【００８５】
以下の非限定的な例は、本明細書に記載される本発明の実施形態を更に説明する。
【００８６】
実施例１：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）のマウスモデル
ＣＤＩのマウス負荷モデルを使用して、試験組成物の有効性を調査した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１３５：１９８４−１９９２）。マウスＣＤＩモデルを使用して、感染症の予防を実証する。このモデルにおいて、マウスは、ＣＤＩに対する感受性を増加させる腸内での腸内菌共生バランス失調をもたらすために、抗生物質の前処置を受ける。経口投与されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞で負荷したとき、マウスは、体重減少、下痢、及び嗜眠を含むＣＤＩの症状を呈し、疾患ピークはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ接種後２〜３日目である。感染症は致命的であり得、死亡は疾患ピーク中に発生する。感染症を生存するマウスにおいて、症状は主に接種後６日目までに消散した。動物は、実験期間の間、ｂｉｏＢｕｂｂｌｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｒｏｏｍまたは同等の施設内に保管した。
【００８７】
簡潔には、−１４〜−６日目、動物（雌のＣ５７ＢＬ／６マウス、生後９〜１０週間）は、それらの飲料水中、１％のグルコース、カナマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（０．０４４ｍｇ／ｍＬ）、コリスチン（１０６２．５Ｕ／ｍＬ）、メトロニダゾール（０．２６９ｍｇ／ｍＬ）、シプロフロキサシン（０．１５６ｍｇ／ｍＬ）、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、及びバンコマイシン（０．０５６ｍｇ／ｍＬ）からなる抗生物質カクテルを受けた。−３日目、動物は、経口経管栄養法によって１０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシンの用量を受けた。−１日目、試験物品、ヒトの糞便に由来する芽胞調製物（研究有効性対照、ＨＢＳ）、及びＦＳＶ（ヒトＦＭＴ対照）を氷上で解凍し、１２，１００ＲＣＦで５分間遠心分離し、傾瀉して上清を除去し、無菌ＰＢＳ中で再懸濁した。試験物品（ＤＢＣ）は、設計された細菌の共同体であった。試験物品接種材料の対照は、無菌ＰＢＳであった。経口経管栄養法によって、動物に０．２ｍＬの体積の適切な治療を投薬した。図２は、研究設計の略図を提供する。
【００８８】
０日目、マウスを、経口経管栄養法を介して、約４．５ｌｏｇ１０個のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの芽胞または無菌ＰＢＳ（未処置対照群）の投与によって負荷した。感染症及びその結果を、死亡率、体重減少、ならびに臨床徴候及び症状（臨床スコア；嗜眠、毛づくろい、湿った尾部／腹部、及び低体温のスコア化）の日々の評価によって評価した。
【００８９】
実施例２：試験物品
本出願者らは、約１００の異なるＤＢＣを試験した。そのような実験の一例において、実施例１に記載されるマウスモデルを使用して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）を治療／予防するための、経口投与される様々な微生物芽胞調製物の有効性を評価した。９つの組成物を、組成物中、１つの個々の種当たり１ｅ２〜１ｅ５の範囲の推定用量で試験した。細菌の数の推定は、芽胞コロニー形成単位（ＳＣＦＵ）アッセイ（すなわち、プレート上で原材料から成長した芽胞由来コロニーの数）に基づいた。典型的には、その種が成長するのに適切な発芽を含む、そのようなアッセイの実行方法は、当該技術分野において既知である。試験したいくつかの組成物を、表３（上記）に提供する。陰性対照は、ＰＢＳ単独での治療、及び未処置の動物（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染していない）を含んだ。陽性対照は、健康なヒトの糞便（ＦＳＶ）のスラリーでの治療、及びヒトの糞便に由来する細菌芽胞（ＨＢＳ）の個体群での治療を含んだ。
【００９０】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅで負荷した未治療のマウス群の死亡率は、少なくとも２０％であった。驚くべきことに、いくつかの試験組成物が、マウスモデルにおいてＣＤＩを阻害／予防する上で、健康なヒトの糞便から調製された組成物またはヒトの糞便に由来する細菌芽胞調製物（ＨＢＳ）と少なくとも同等に有効であることが見出された。一般に、試験した組成物は、それらがマウスモデルにおいてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の影響（例えば、治療前ベースライン（図３）からの最大体重低下、致死、臨床徴候）を寛解する能力が異なった。いくつかの組成物は、幅広い濃度範囲（１匹のマウス当たり、１種の組成物当たり１ｅ２〜１ｅ５のＳＣＦＵ）にわたって有効であることが観察された。有効な組成物の例としては、ＤＢＣ４、ＤＢＣ６、及びＤＢＣ９が挙げられる。
【００９１】
更なる実施形態において、ＤＢＣが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅで負荷したＰＢＳ治療マウスと比較して、ＣＤＩ関連死亡率を予防し、ＣＤＩ関連症状を予防し、体重の負の変化を有意に低下することができることが実証された。
【００９２】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、ＤＢＣは、ＣＤＩ感染症によって引き起こされる様々な特徴（例えば、体重減少、下痢、及び死亡率のうちの１つ以上）を有効に予防または阻害することができる。
【００９３】
これらのデータは、マウスモデルにおけるＣＤＩの治療によって実証されるように、比較的限られた数の特定の細菌種を含有する設計された細菌組成物を、腸内菌共生バランス失調の予防のための治療として使用することができることを実証する。
【００９４】
実施例３Ａ：炭素利用
抗生物質は、腸細菌叢を破壊し、コロニー形成耐性の喪失をもたらし、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含む病原体による感染症の土台を作ることが周知である（Ｋｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１４Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｊｕｎｅ２，２０１４．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｍｉｃｒｏ−０９１３１３−１０３４５６に概説される）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによるコロニー形成耐性に対する栄養競合の寄与は、初期の実験において、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を、他の腸生物による異化のために入手が限定的であるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源として特定した連続フローモデルにおいて示唆された（Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｎｉ，１９８８Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５６：２６１０−１４）。より最近では、マウスモデルにおいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによるシアル酸利用が、より高いＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅレベルに関連付けられた（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３Ｎａｔｕｒｅ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１，２０１３）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２５０３）。したがって、ＤＢＣの有用な特徴は、１つ以上のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株（例えば、毒素産生性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株）によって使用される炭素源と重複する炭素源を利用する能力を有する細菌である。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物の選択は、標的とする病原体によって使用される少なくとも１つの炭素源を利用する株、ＯＴＵ、または種の選択を含む。これを実証するために、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の阻害または予防に有効なＤＢＣ中で使用される種を、本明細書において「Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源」と称するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用される炭素源の利用について試験した。これらの実施形態において、ＤＢＣ中の株の炭素源利用プロファイルを決定した。培養物の光学密度を測定することによって、９６ウェルプレート形式で５９の炭素源のパネル上での成長をアッセイした。簡潔には、５９の炭素源の１％の溶液を調製し、濾過無菌化した。深型９６ウェルプレートを、１ウェル当たり０．４ｍＬの２×ＭＣＢ基本培地で充填した（組成物１×：１０ｇ／Ｌの牛肉抽出物、３ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、６．８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｎＣｌ２、０．２５ｇ／Ｌのシステイン（接種前に添加、下記参照）、１０ｍｇ／Ｌのヘミン、１ｍｇ／Ｌのメナジオン、１０．５ｇ／ＬのＭＯＰＳ、ｐＨ７）。各炭素源を３つのウェルに添加した。各株について２つのプレートを調製した。各プレートは、２９の炭素源、グルコース、及び基本培地のみを有する３つのウェルを含有した。接種前に、８μＬの２．５％のシステイン溶液を各ウェルに添加した。
【００９６】
接種に使用する細菌株は、凍結原材料からブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）プレート上に画線し、３７℃で２４時間インキュベートした。白金耳量の細胞材料を５ｍＬの前還元ＰＢＳ中に移し、再懸濁した。
【００９７】
８μＬの接種材料を、各プレートの９５のウェルに添加した。各プレートの１つのウェルは、いかなる細胞も受けない対照であった。プレートを通気性膜で被覆し、ジップロックパック内、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウェルから０．２ｍＬを透明の９６ウェル平底プレートに移し、ＯＤ６００（６００ｎｍの波長での光学密度）を分光光度計で測定した。各ウェルのＯＤ６００を、基本培地のみを有する接種したウェルの値について補正した。各株の各炭素源の平均ＯＤ６００を計算した。結果は、平均補正ＯＤ６００が所与の株について記録された最大補正ＯＤ６００の１５％以上である場合に、陽性であると見なした。
【００９８】
各株は、複数の炭素源（１０〜３０の範囲の炭素源）上で成長した。全ての株が、試験した２９のうち１０〜２４の異なる糖または糖アルコールを使用して糖分解され、例外は、パネル内の３つの糖のみを使用する１つの株であった。グルコースは、全ての株によって使用された。７つの株は、（試験した１５のうち）少なくとも１つのアミノ酸を炭素源として使用することができた。これらの実験からのデータを図４−１〜図４−５に示す。
【００９９】
選択されるＤＢＣ株は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌによって使用される２９の試験した炭素源のうち２６（９０％）を利用することができることが示され、これには、１９の試験した炭水化物及びカルボン酸のうち１９（１００％）が含まれた。したがって、いくつかの実施形態において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの治療に有用なＤＢＣは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによっても使用される炭素源、例えば、本明細書に開示される炭素源のパネルのうちの少なくとも９０％を使用することができる細菌型を含む。
【０１００】
したがって、いくつかの実施形態において、ＤＢＣは、アミノ酸ならびに他の材料（例えば、糖、糖アルコール、炭水化物、及びカルボン酸）を炭素源として利用することができる非病原性細菌を含む。
【０１０１】
実施例３Ｂ：追加の炭素利用
実施例３Ａに記載される実験を補う実験を実行して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株によって使用され得る炭素源、及びＤＢＣ中で有用であり得る細菌の炭素利用のレパートリーについての知識を広げた。
【０１０２】
炭素源のパネルを使用して、３つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株及び１２の非Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌株をプロファイル評価した。本明細書で使用される場合、別段示されない限り、炭素源は、本明細書の実験において成長基質として試験した全ての供給源を含む。３つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ９６８９、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３５９３、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３２５５であり、これらの全ては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である。
【０１０３】
９６ウェルプレート形式で８７の異なる炭素源上での株の成長を試験した。パネルは、アミノ酸、単糖、二糖、三糖、及び多糖、グルコシド、ならびに糖アルコールを含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる利用が文献に報告されている３４の炭素源を含有した（Ｈａｆｉｚ  ａｎｄ  Ｏａｋｌｅｙ．１９７６Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ９：１２９−３６．、Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｎｉ．１９８８Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５６：２６１０−１４、Ｂｅｒｇｅｙ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔ．Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９４、Ｓｅｂａｉｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．２００６Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３８：７７９−７８６）。炭素源を、０．５％で３つの異なる基本培地（基本培地１  ＳＳＮＣ組成物：牛肉抽出物１ｇ／Ｌ、酵母抽出物２ｇ／Ｌ、ｂａｃｔｏ  ｓｏｙｔｏｎｅ６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５．４４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４２ｍＭ、ＣａＣｌ２１ｍＭ、ＭｎＣｌ２０．１ｍＭ、システイン塩酸塩０．２５ｇ／Ｌ、ヘミン１０ｍｇ／Ｌ、メナジオン１ｍｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ６．３ｇ／Ｌ、ｐＨ７；基本培地２  ＳＰＯＳＣＲ組成物：牛肉抽出物１ｇ／Ｌ、酵母抽出物２ｇ／Ｌ、ｂａｃｔｏ  ｓｏｙｔｏｎｅ６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５．４４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４２ｍＭ、ＣａＣｌ２１ｍＭ、ＭｎＣｌ２０．１ｍＭ、システイン塩酸塩０．２５ｇ／Ｌ、ヘミン１０ｍｇ／Ｌ、メナジオン１ｍｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ８．４ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３０．４％、ｐＨ７；基本培地３  ＹＣＦＡ：カジトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物２．５ｇ／Ｌ、システイン塩酸塩１ｇ／Ｌ、ヘミン１０ｍｇ／Ｌ、ＡＴＣＣビタミン溶液１０ｍＬ／Ｌ、ＡＴＣＣ微量元素溶液１０ｍＬ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．４５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．４５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４０．９ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ９０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２９０ｍｇ／Ｌ、酢酸３３ｍＭ、プロピオン酸９ｍＭ、イソ酪酸１ｍＭ、イソ吉草酸１ｍＭ、吉草酸１ｍＭ、ｐＨ７）に添加した。
【０１０４】
６００ｎｍでの光学密度を測定し、それを、炭素源を追加していない基本培地中の成長と比較することによって、正の成長をスコア化した。２つについては、各培養物からの消費された培地と混合したｐＨ指示薬フェノールレッドの５５８ｎｍでの光学密度を測定することによって、基本培地酸産生もまたスコア化した。
【０１０５】
３つ全てのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株が、様々な炭素源を代謝し、試験した８７の炭素源のうち５３が、少なくとも１つの株によって使用された（表５）。３つ全ての株が、異なる糖または糖アルコールを使用して糖分解され、３つ全ての株が、アミノ酸を炭素源として使用した（表５及び表６）。上述のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる利用が報告されている炭素源のうち４つは、このアッセイにおいて試験した３つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株（デンプン、スクロース、グリコーゲン、及びズルシトール）についていかなる的中も有さず、パネル内の他の２３の炭素源は、３つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株のうちの少なくとも１つについて少なくとも１つの的中を有し、検出されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源の総数は５３となった。
【０１０６】
このアッセイにおいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用される５３の炭素源のうち、試験した個々の細菌株は、少なくとも１つの基本培地中、１６〜２９を使用した。非Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の炭素源利用パターンは、３０〜５５％の範囲の重複する炭素源を有するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の炭素源利用パターンとは異なった。試験した全ての細菌株は合わせて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって使用される５３の炭素源のうち５２（９８％）を利用することができる。これらのデータは、非Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌株が、複数のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源を利用することができることを実証する。複数の炭素源について病原体と競合することができる細菌のこの特徴は、例えば、ＤＢＣ中への、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによっても使用され得る複数の炭素源を利用することができる細菌の包含により、ＤＢＣの設計に有用である。
【０１０７】
表６のデータは、ＤＢＣの有用な特徴が、特に異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株による炭素源使用の可変性を考慮して、共に様々な炭素源を利用することができる細菌の封入であることを示す。
【０１０８】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる利用が報告されているが、この実験では陰性であった炭素源は各々、非Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株のうちの少なくとも４つによって利用される。したがって、ある病原体の複数の株が炭素源利用を特徴とする場合でも、試験Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株によって使用されないいくつかの供給源さえも網羅する幅広い炭素利用プロファイルを有するＤＢＣが、望ましくあり得る。
【０１０９】
これらのデータは、選択される細菌株が、単糖、二糖、三糖、及び多糖、糖アルコール、グリコシド、カルボン酸、アルコール、胆汁酸塩、ならびにアミノ酸を含む複数のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ炭素源を利用することができることを示す。シアル酸などのマイクロバイオータ遊離宿主糖は、感染症の動物モデルにおいてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を促進することが報告されている。エタノールアミンは、病原体にＧＩ環境内での競合上の利点を与え得る化合物に由来する別の宿主であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、エタノールアミン利用のためのオペロンを有する（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１，２０１３）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２５０３、Ｇａｒｓｉｎ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０Ａｐｒ；８（４）：２９０−５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ２３３４）。これらの例において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、シアル酸及びエタノールアミンの両方を代謝することが確認された。したがって、場合によっては、例えば、シアル酸及び／またはエタノールアミンを利用することができるＤＢＣ株が有用である。１２の選択される株のうち８つ及び３つの株もまた、それぞれシアル酸及びエタノールアミンを利用することができた。これらのデータは、炭素源競合が、シアル酸及びエタノールアミンを利用する能力を有する細菌を含むＤＢＣのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する有効性の機構に寄与し得るモデルを支持する。
【０１１０】
【表５】
2019501136.tif 000023
【０１１１】
【表６】
2019501136.tif 000024
2019501136.tif 000025
2019501136.tif 000026
【０１１２】
実施例４：胆汁酸代謝／薄層クロマトグラフィー分析
二次及び三次胆汁酸の産生は、特定の細菌酵素によって触媒される一連の反応を通した一次胆汁酸の連続修飾から生じる（例えば、Ｒｉｄｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ４７：２４１−２５９）。疾患を引き起こすために、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞はまず宿主ＧＩ管内で発芽し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞の発芽は特定の胆汁酸によって促進され得る。加えて、増殖型Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ成長は、特定の胆汁酸代謝物によって制限される。したがって、ＤＢＣの有用な機能的特徴は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ発芽を促進する胆汁酸プールを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの発芽を促進しないかつ／または発芽もしくは過成長を阻害しないプールに変換するのを触媒する能力である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ促進胆汁酸を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ発芽を促進しない胆汁酸に変換する酵素を発現し得る細菌が、ＤＢＣ中に含まれる。そのような細菌を含む組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の治療または予防、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の再発の予防に有用である。一例において、ＤＢＣに選択された細菌は、胆汁酸制御において重要である少なくとも１つ、２つ、または３つの酵素活性、例えば、胆汁酸塩加水分解酵素（ＢＳＨ）、水酸化ステロイド脱水素酵素（７、３、または１２α−ＨＳＤＨ）、及び７α−デヒドロキシラーゼを発現し得る。そのような細菌の特定方法を、下記の非限定的な例に提供する。
【０１１３】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用する、胆汁酸塩加水分解酵素（ＢＳＨ）活性スクリーニング
抱合胆汁酸の脱抱合は、ヒトＧＩ管及び動物ＧＩ管から単離されたいくつかの細菌種によって発現される、胆汁酸塩加水分解酵素（ＢＳＨ）によって触媒される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉと同等に多様な細菌種は、機能的ＢＳＨを発現し得る。脱抱合は、ＧＩマイクロバイオームによる抱合胆汁酸の更なる処理のために必要なステップであるため、ＧＩ管の胆汁酸組成物の形成において重要な役割を果たす。いくつかの抱合胆汁酸は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞発芽を促進することが示されており、故にそれらの濃度を低下させることが有益であり得る。
【０１１４】
候補ＤＢＣ細菌がＢＳＨ活性を実証する能力についての、それらの能力を試験するための実験において、細菌を２４〜４８時間成長させて、十分なバイオマスを生成した。選択された細菌株について、試験する株によって、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天またはＢｒｕｃｅｌｌａ血液寒天（ＢＢＡ）上に画線プレートを生成した。細菌菌叢をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁して、均一な懸濁液を作製し、その後これをＢＳＨアッセイに使用した。ＢＳＨ活性をアッセイするために、細菌懸濁液を、４つの異なる抱合胆汁酸（各胆汁酸は５ｍｇ／ｍＬの濃度）とともに別々にインキュベートした。株を、嫌気条件下、それぞれの胆汁酸とともに３７℃で４時間インキュベートした。このアッセイで試験した胆汁酸は、グリコ−コール酸（ｇｌｙｃｏ−ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（グリココール酸、ｇＣＡ）、タウロコール酸（ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（タウロコール酸、ｔＣＡ）、グリコ−ケノデオキシコール酸（ｇｌｙｃｏ−ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（グリコケノデオキシコール酸、ｇＣＤＣＡ）、及びタウロ−ケノデオキシコール酸（ｔａｕｒｏ−ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（タウロケノデオキシコール酸、ｔＣＤＣＡ）を含む。
【０１１５】
インキュベーション後、プレートを沈降させて細菌をペレット化し、各ウェルの上清をシリカコーティングＴＬＣプレート上に充填した。試料を緩衝液（ベンゼン：イソプロパノール：酢酸、３０：３０：１）中でクロマトグラフィーし、当該技術分野において既知の方法を使用して、ｐ−アニスアルデヒド染色で展開した。ＴＬＣプレート上に追加のバンドとして現れる脱抱合胆汁酸産生物の形成によって、ＢＳＨ活性を決定した。各ＴＬＣプレート上で並行して実行した既知の標準物との比較によって、胆汁酸を検証した。
【０１１６】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用する、水酸化ステロイド脱水素酵素（ＨＳＤＨ）活性スクリーニング
細菌酵素によって触媒される反応を通して、脱抱合二次胆汁酸を、三次胆汁酸とも呼ばれるものへと、更に修飾する。これは、７−、３−、または１２−ヒドロキシル基に特異的な細菌ＨＳＤＨ酵素の活性を通して、胆汁酸をそれらのケト形態へと酸化することを含む。ＨＳＤＨ酵素は、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｉ、及びＥｇｇｅｒｔｈｅｌｌａを含む、いくつかの腸細菌種内に存在し得る（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ８２：２５３０−２５３５、Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｂａｃｔ１７３：４５５９−４５６９）。
【０１１７】
ＴＬＣを使用する、７α−ＨＳＤＨ活性アッセイ
ＤＢＣ中への包含のために選択された細菌候補を、上記のように成長させ、再懸濁した。７α−ＨＳＤＨ活性をアッセイするために、細菌懸濁液を、コール酸（ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（コール酸、ＣＡ）またはケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ケノデオキシコール酸、ＣＤＣＡ）（いずれも２００μＭの濃度）のいずれかとともに３７℃で４時間好気的にインキュベートした。各胆汁酸を、各株によって別々に試験した。
【０１１８】
インキュベーション後、プレートを沈降させて細菌をペレット化し、各ウェルの上清をシリカコーティングＴＬＣプレート上に充填した。試料を緩衝液（ベンゼン：ジオキサン：酢酸、７０：２０：４）中でクロマトグラフィーし、当該技術分野において既知の方法を使用して、セリウム−アンモニウム−モリブデン酸染色で展開した。ＴＬＣプレート上に追加のバンドとして現れた、予想される７−オキソ−胆汁酸産生物の形成によって、ＨＳＤＨ活性を決定した。各ＴＬＣプレート上で並行して実行した既知の標準物との比較によって、胆汁酸を検証した。結果を図５−１〜図５−２に説明する。
【０１１９】
ＴＬＣを使用する、３α−ＨＳＤＨ活性アッセイ
細菌を適切な培地プレート上で２４または４８時間成長させて、十分なバイオマスを生成した。候補細菌株について、ＢＨＩ寒天上に画線プレートを成長させた。細菌菌叢をＰＢＳ中に再懸濁して、均一な懸濁液を作製し、その後これをＨＳＤＨアッセイに使用した。３α−ＨＳＤＨ活性をアッセイするために、細菌懸濁液を、コール酸、デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（デオキシコール酸、ＤＣＡ）、またはケノデオキシコール酸（いずれも１００μＭの濃度）のいずれかとともに３７℃で１８〜２４時間好気的にインキュベートした。各胆汁酸を、各株によって別々に試験した。
【０１２０】
インキュベーション後、プレートを沈降させて細菌をペレット化し、各ウェルの上清をシリカコーティングＴＬＣプレート上に充填した。試料を緩衝液（ベンゼン：ジオキサン：酢酸）中でクロマトグラフィーし、当該技術分野において既知の方法を使用して、まずリンモリブデン酸染色で展開して、オキソ−胆汁酸産生物の形成を検出した。その後、ＨＳＤＨ活性を示した候補株を、新鮮なＴＬＣプレート上での第２の実行を使用して、３−オキソＨＳＤＨ活性について具体的に試験した。第２のプレートの組を、ｐ−アニスアルデヒド染色で展開して、３−オキソ胆汁酸（ピンク色に染色）を他のバンドから区別した（Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ＤＯＩ：１−．１０３８／ＮＣＨＥＭＢＩＯ．１８６４）。ＴＬＣプレート上に追加のバンドとして現れた、予想される３−オキソ−胆汁酸産生物は、株内の３α−ＨＳＤＨ活性の存在を確認した。各ＴＬＣプレート上で並行して実行した既知の標準物との比較によって、胆汁酸を検証した。結果を図５−１〜図５−２に説明する。
【０１２１】
結果
全体として、胆汁酸活性アッセイにおいて試験した１２の細菌種のうちの１０が、ＴＬＣによって、胆汁酸代謝活性の３つのクラス（すなわち、ＢＳＨ、７α−ＨＳＤＨ、または３α−ＨＳＤＨ活性）のうちの少なくとも１つを示した（図５−１〜図５−２）。図５−１〜図５−２において、暗色欄は、示される特定の基質を代謝する活性についての陽性結果を表す。明色欄は、この方法の使用での、検出可能な陽性結果の不在を表す。本出願者らは、下記の実施例５に実証されるように、ＬＣＭＳなどのより感受性の高い方法を使用することが、更により低いレベルの活性を明らかにし得ることに留意する。
【０１２２】
驚くべきことに、これらのデータはまた、各酵素活性型内に異なる基質特異性が存在し得ることも示す。例えば、Ｔ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓのみが、試験した４つ全ての抱合胆汁酸を脱抱合する能力を実証し、Ｍ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｉは、試験した３つ全ての胆汁酸での３α−ＨＳＤＨ活性を実証する試験した唯一の種であった。
【０１２３】
これらのデータは、高いレベルの１つ以上の胆汁酸代謝活性を提供し、それによりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ発芽の促進またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ発芽もしくは成長の阻害のために利用可能である胆汁酸のプールを変更する、ＤＢＣ中に含まれる細菌の共同体を選択するために使用することができる方法を実証する。
【０１２４】
胆汁酸活性の他の評価方法、例えば、ＬＣＭＳ法が使用されてもよい。
【０１２５】
実施例５：胆汁酸代謝／ＬＣ−ＭＳを使用してアッセイ
ＴＬＣ法と比較して、胆汁酸代謝に関連する酵素活性の検出の感受性を改善するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用する方法を使用した。胆汁酸及び他の小分子は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）に基づくアプローチを使用して、正確に特定し、定量化することができる（Ｋａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ５５：９７８−９９０）。ほとんどの胆汁酸について、ＴＬＣアッセイは１０〜５０μＭ範囲内の検出下限を実証する一方で、ＬＣ−ＭＳアプローチはこの検出下限を５０〜１００ｎＭまで広げ、多くの場合、感受性を１００倍以上増加させる。
【０１２６】
ＧＩマイクロバイオーム内の二次胆汁酸代謝の評価
胆汁酸塩加水分解酵素（ＢＳＨ）活性のＬＣ−ＭＳスクリーニング
二次及び三次胆汁酸の産生は、特定の細菌酵素によって触媒される一連の反応を通した一次胆汁酸の連続修飾から生じる。一次胆汁酸からグリシンまたはタウリン基を除去して、遊離非抱合胆汁酸の放出をもたらすこのプロセスの第１のステップは、脱抱合と呼ばれる。一次胆汁酸の脱抱合は、胆汁酸塩加水分解酵素（ＢＳＨ）によって触媒される。脱抱合は、腸マイクロバイオームによる二次胆汁酸の更なる処理のために必要なステップであるため、腸の胆汁酸組成物の形成において重要な役割を果たす。
【０１２７】
アッセイを実行するために、簡潔には、細菌を許容寒天培地プレート上で２４〜４８時間成長させて、アッセイを実行するのに十分なバイオマスを生成した。細菌菌叢をＰＢＳ中に再懸濁して、均一な懸濁液を作製し、その後これをＢＳＨアッセイに使用した。ＢＳＨ活性をアッセイするために、細菌懸濁液を、嫌気条件下、４つの異なる抱合胆汁酸の２つの別々の混合物（各々は１５０μｇ／ｍｌの濃度）とともに３７℃で４時間インキュベートした。その後、反応混合物を等体積のアセトニトリルで抽出し、沈降させて細菌をペレット化し、０．２μＭのフィルターを通して上清を濾過して、ＬＣ−ＭＳ分析用の試料を生成した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｍｐａｃｔ  ｑＴＯＦ  ＭＳに接続したＡｇｉｌｅｎｔ１２６０ＨＰＬＣを使用して、胆汁酸を決定した。試料を、アセトニトリル：水緩衝液系を使用する二座Ｃ１８カラム上で実行して、胆汁酸を分離し、その後これを陰性モードでイオン化し、ｑＴＯＦ−ＭＳを使用して特定した。必要に応じて標準曲線を使用して、既知の標準物との比較によって検証し、定量化した脱抱合胆汁酸産生物の形成によって、ＢＳＨ活性を決定した。このアッセイにおいて試験した一次胆汁酸は、グリコ／タウロ−コール酸、グリコ／タウロ−ケノデオキシコール酸、及びグリコ／タウロ−ムリコール酸を含んだ。
【０１２８】
水酸化ステロイド脱水素酵素（ＨＳＤＨ）活性のＬＣ−ＭＳスクリーニング
細菌酵素によって触媒される反応を通して、脱抱合二次胆汁酸を三次胆汁酸へと更に修飾する。これは、７−、３−、または１２−ヒドロキシル基に特異的な細菌ＨＳＤＨ酵素の活性を通して、胆汁酸をそれらのケト形態へと酸化することを含む。
【０１２９】
ＨＳＤＨ活性をアッセイするために、ＬＣ−ＭＳ  ＢＳＨアッセイについて上述されるように細菌懸濁液を調製した。ＨＳＤＨ活性をアッセイするために、細菌懸濁液をまず、嫌気条件下、コール酸と、ケノデオキシコール酸と、デオキシコール酸と、リトコール酸（各７５μｇ／ｍｌ）との混合物とともに３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。その後、アッセイプレートを嫌気性チャンバから除去し、３７℃で４時間好気的にインキュベートして、胆汁酸の酸化を促進した。インキュベーションが完了した時点で、反応混合物を等体積のアセトニトリルで抽出し、沈降させて細菌をペレット化し、０．２μＭのフィルターを通して上清を濾過して、ＬＣ−ＭＳ分析の準備ができた試料を生成した。試料中の胆汁酸を、ＬＣ−ＭＳ  ＢＳＨアッセイについて上述されるようにアッセイした。必要に応じて標準曲線を使用して、既知の標準物との比較によって検証し、定量化したケト−胆汁酸産生物の形成によって、ＨＳＤＨ活性を決定した。
【０１３０】
７α−脱ヒドロキシル化（７α−ＯＨ）活性のＬＣ−ＭＳスクリーニング
酸化に加えて、二次胆汁酸は、７α位のヒドロキシル基の除去によっても修飾することができ、これは、三次胆汁酸の生成をもたらす。これは、コール酸のデオキシコール酸への変換、及びケノデオキシコール酸のリトコール酸への変換を含む。７α−脱ヒドロキシル化反応は、特性評価されていないいくつかの酵素を含む複数ステッププロセスによって触媒される。
【０１３１】
ＬＣ−ＭＳ  ＢＳＨスクリーニングについて上述されるように細菌懸濁液を調製した。脱ヒドロキシル化活性をアッセイするために、細菌懸濁液をまず、嫌気条件下、コール酸と、ケノデオキシコール酸（各１５０μｇ／ｍＬ）との混合物とともに３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。このステップは、反応に関与する酵素の誘導のために必要である。その後、アッセイプレートを嫌気性チャンバから除去し、３７℃で４時間好気的にインキュベートして、胆汁酸の脱ヒドロキシル化を促進した。インキュベーションの完了後、反応混合物を等体積のアセトニトリルで抽出し、沈降させて細菌をペレット化し、０．２μＭのフィルターを通して上清を濾過して、ＬＣ−ＭＳ分析の準備ができた試料を生成した。上述されるＬＣ−ＭＳを使用して、胆汁酸をアッセイした。既知の標準物との比較によって検証し、必要に応じて標準曲線を使用して定量化したデオキシコール酸及びリトコール酸の形成によって、７α−ＯＨ活性を決定した。
【０１３２】
結果
表７及び８は、様々な細菌株による胆汁酸産生についてのＬＣ−ＭＳ分析の結果を提供する。表７は、表９で言及される株のサブセットのＬＣ−ＭＳ胆汁酸分析の結果を列挙し、これは、ＬＣ−ＭＳに基づくアッセイによって利用可能な感受性及び適用範囲の増加を実証する。表８は、ＬＣ−ＭＳによる分析に基づく、いくつかの追加の株の胆汁酸活性を記載する。これらの表において、「＋」は、産生物胆汁酸のレベルの５０倍超の増加（強い活性を示唆）を示し、「＋／−」は、産生物胆汁酸レベルの５０倍以下の変化（弱い活性を示唆）を示す一方で、「−」は、試験した条件下での活性の完全な欠如を示す。既知／公表済みの活性を有する株を対照として使用して、各反応型を監視した。
【０１３３】
一般に、細菌種による胆汁酸の代謝を分析するために、ＬＣ−ＭＳを使用して生成したデータは、ＴＬＣを使用して得たデータと一貫した。しかしながら、ＬＣ−ＭＳ法の感受性の増加は、追加の活性を明らかにし、例えば、Ｃ．ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍは、ＴＬＣによって、ｇＣＤＣＡに対していかなるＢＳＨ活性も有さないことが実証されたが、ＬＣ−ＭＳ分析の分解能の増加は、この細菌がｇＣＤＣＡに対するＢＳＨ活性を保持することを示した。加えて、ＬＣ−ＭＳアプローチは、以前はＴＬＣによる分解が困難であった追加の活性、７α−脱ヒドロキシル化の特性評価を可能にした。
【０１３４】
これらのデータは、細菌種の胆汁酸代謝活性を特定する上でのＬＣ−ＭＳアッセイの使用が、細菌組成物の設計（幅広い胆汁酸代謝活性を有するＤＢＣの設計など）時により大きな正確性を提供することを実証する。例えば、このＤＢＣでの治療は、Ｃ．ｄｉｆｆ発芽を促進する一次胆汁酸のレベルを低下させながら、同時にＣ．ｄｉｆｆ成長を阻害する二次胆汁酸を増加させることができる。ＤＢＣ中でのこれらの活性を最大化する株を優先的に選択することは、Ｃ．ｄｉｆｆ感染症の治療のための組成物の有効性を増加させることができる。場合によっては、ＬＣ−ＭＳアッセイまたは同等の感受性を有する他のアッセイの使用は、感受性がより低いアッセイを使用した場合に組成物中に使用されるよりも少ない種によって様々な胆汁酸代謝活性を網羅する、細菌組成物の設計を促進することができる。組成物中の種の数の最小化は有用な特徴であり得るが、その理由は、例えば、それが、送達が必要な細菌の数を低減し得、（例えば、経口剤形としての）用量の送達をより容易にし、かつより少ない別々の発酵の実行が必要となるため、製造及び組成物費用にとってより効率的であり得るためである。加えて、インビトロでアッセイされる場合、細菌の混合物は、個々の株が示さない胆汁代謝活性を示し得る。これは、個々の株が有さない活性を混合物が有し得るため、組成物及び組成物サイズの調節を可能にすることができる。
【０１３５】
【表７】
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2019501136.tif 000028
【０１３６】
【表８】
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【０１３７】
実施例６：機能的特徴について選択された細菌組成物
実験設計
ＤＢＣの機能性を更に調査するために、選択された特徴を有するか、または有さない追加のＤＢＣを設計した。本質的には上記のＣＤＩのマウス負荷モデルを使用して、追加の試験組成物の有効性を調査した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１３５：１９８４−１９９２）。マウスＣＤＩモデルを使用して、感染症の予防を実証する。このモデルにおいて、マウスは、ＣＤＩに対する感受性を増加させる腸内での腸内菌共生バランス失調をもたらすために、抗生物質の前処置を受ける。経口投与されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞で負荷したとき、マウスは、体重減少、下痢、及び嗜眠を含むＣＤＩの症状を呈し、疾患ピークはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ接種後２〜３日目である。感染症は致命的であり得、死亡は疾患ピーク中に発生する。感染症を生存するマウスにおいて、症状は主に接種後６日目までに消散した。動物は、実験期間の間、ｂｉｏＢｕｂｂｌｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｒｏｏｍまたは同等の施設内に保管した。
【０１３８】
簡潔には、これらの実験において、−１４〜−６日目、動物（雌のＣ５７ＢＬ／６マウス、生後９〜１０週間）は、それらの飲料水中、１％のグルコース、カナマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（０．０４４ｍｇ／ｍＬ）、コリスチン（１０６２．５Ｕ／ｍＬ）、メトロニダゾール（０．２６９ｍｇ／ｍＬ）、シプロフロキサシン（０．１５６ｍｇ／ｍＬ）、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、及びバンコマイシン（０．０５６ｍｇ／ｍＬ）からなる抗生物質カクテルを受けた。−３日目、動物は、経口経管栄養法によって１０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシンの用量を受けた。−１日目、試験物品を１２，１００ＲＣＦで５分間遠心分離して細菌をペレット化し、傾瀉して上清を除去し、無菌ＰＢＳ中で再懸濁した。試験物品は、ＦＳＶ（ヒトＦＭＴ対照）、ＳＣ（研究にわたる研究有効性を比較するためのヒト由来微生物芽胞組成物）、及び設計された細菌の共同体（ＤＢＣ）を含んだ。試験物品の接種材料の対照は、無菌ＰＢＳであった。経口経管栄養法によって、動物に０．２ｍＬの体積の適切な治療を投薬した。図２は、研究設計の略図を提供する。
【０１３９】
０日目、マウスを、経口経管栄養法を介して、約４．５ｌｏｇ１０個のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの芽胞または無菌ＰＢＳ（未処置対照群）の投与によって負荷した。感染症及びその結果を、死亡率、体重減少、ならびに臨床徴候及び症状（臨床スコア；嗜眠、毛づくろい、湿った尾部／腹部、及び低体温のスコア化）の日々の評価によって評価した。
【０１４０】
試験物品
実施例２に記載されるように、本出願者らは、上記の実施例１及び２に記載されるマウスモデルを使用して追加のＤＢＣを試験して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）を治療／予防するための、経口投与される様々な微生物芽胞調製物の有効性を評価した。組成物中、１つの個々の種当たり１ｅ５個の芽胞コロニー形成単位（ＳＣＦＵ）の推定用量で、２４の追加の組成物をこの実施例に記載されるように試験した。これらの組成物のうち２０を、１０対の各々において、一方の組成物中の株全てが選択された表現型を共有する一方で、対応する組成物中で全ての株がその表現型を欠如するように、選択した。試験したいくつかの組成物を、表４に提供する。陰性対照は、ＰＢＳ単独での治療、及び未処置の動物（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染していない）を含んだ。陽性対照は、健康なヒトの糞便（ＦＳＶ）のスラリーでの治療、及び１匹のマウス当たり１Ｅ４〜１Ｅ７個のＳｐｏｒＱの用量での、ヒトの糞便に由来する細菌芽胞（ＳＣ）の個体群での治療を含んだ。
【０１４１】
結果
この実験の結果を表９に提示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅで負荷した未治療のマウス群の死亡率は２０％であり、それらの平均最小相対体重は０．８１であった。驚くべきことに、いくつかの試験組成物が、マウスモデルにおいてＣＤＩを阻害／予防する上で有効であることが見出され、いくつかは、健康なマウスの糞便から調製された組成物または健康なヒトの糞便から調製された細菌芽胞調製物（ＳＣ）と少なくとも同等に有効であった。一般に、試験した組成物は、それらがマウスモデルにおいてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の影響（例えば、最小体重の変化、致死、臨床徴候）を寛解する能力が異なった。いくつかの実施形態において、ＣＤＩの治療または予防に有効なＤＢＣは、０．０００１未満のＰＢＳ対照に対する最小相対体重Ｐ値を有するＤＢＣである。そのような組成物の非限定的な例としては、ＤＢＣ  Ｓ１、ＤＢＣ  Ｓ２、ＤＢＣ  Ｓ４、ＤＢＣ  Ｓ６、及びＤＢＣ  Ｓ７が挙げられる。他の実施形態において、ＣＤＩの治療または予防に有効なＤＢＣは、０．０５未満のＰＢＳ対照に対する最小相対体重Ｐ値を有するＤＢＣである。他の実施形態は、一般に低い累積死亡率スコアを有する特定の特徴を有するＤＢＣ（例えば、健康なヒトの便に由来する複合微生物芽胞調製物を受ける多重再発性ＣＤＩ対象のＰｈ１ｂ／２研究において、高い生着率、及び健康なヒトのマイクロバイオータ（ＨＭＰコホート）において、高度な一般性を有することが報告されている細菌種で構成されるＤＢＣ  Ｓ６）を含む。いくつかの実施形態において、特定の特徴、及びその特徴を欠如するＤＢＣと比較して低い累積死亡率を有する有用なＤＢＣ、例えば、ＤＢＣ  Ｓ１９（糖アルコール上での成長の特徴について選択）及びＤＢＣ  Ｓ１７（インドール産生の特徴について選択）、ＤＢＣ  Ｓ７（ＳＣＦＡ産生を示すＨＤＡＣ活性について選択）、ならびにＤＢＣ  Ｓ４（ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌクラスターＸＩＶａにおける株）。
【０１４２】
場合によっては、対照的な特徴を有するように設計された対がともに有効である。例えば、ＤＢＣ  Ｓ２１及びＤＢＣ  Ｓ２２はそれぞれ、フコースを栄養源として使用する能力を有するように、及びフコースを栄養源として使用することができないように設計されている。本出願者らは、ある特徴を欠如する組成物が有効である能力が、その特徴が有用ではないことを示さないが、単に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を寛解する表現型をもたらす、それらの種にとって利用可能な代替機能及び経路が存在し得ること示すことに留意する。いくつかの実施形態において、そのような複数の能力を有するＤＢＣのための種の選択は、例えば、複数の機能を提供するのに必要とされる細菌型（例えば、種）の数を制限するのに有用である。
【０１４３】
不調和な結果を有した組成物の対の一例は、ＤＢＣ  Ｓ１９の全てのメンバーが試験した糖アルコールを利用することができ、ＤＢＣ  Ｓ２０の全てのメンバーがそれらの糖アルコールを利用することができないように設計された、ＤＢＣ  Ｓ１９及びＤＢＣ  Ｓ２０であった。この場合、ＤＢＣ  Ｓ１９はＣＤＩの症状の予防に有効であったが、ＤＢＣ  Ｓ２０は有効ではなく、２つのＤＢＣの比較は、それらが最小相対体重（ｐ＜０．０００１）に関して互いに統計学的に異なることを示した。したがって、ある組成物、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の治療または予防のための組成物中の糖アルコールを利用することができる１つ以上の細菌種を含めることが有利であり得る。
【０１４４】
不調和なＤＢＣの対の別の例は、ＤＢＣ  Ｓ１７（インドール産生）及びＤＢＳ  Ｓ１８（非インドール産生）である。この対からのデータは、ＤＢＣ、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の治療または予防のための組成物中への少なくとも１つのインドール産生細菌の包含が、組成物中で有用であることを示す。ＨＤＡＣ活性対ＨＤＡＣ活性なしの対の結果は、下記の実施例７に提供されるデータと一貫する。しかしながら、ＨＤＡＣプラス細菌（活性）及びインドール産生細菌は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連体重減少の予防に有効であった（ＨＤＡＣ陽性かつインドール陽性ＤＢＣの最大体重減少は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅで負荷していないＰＢＳ対照と有意には異ならない）。同様に、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａの株の包含は、そのような組成物の有用な特徴であり得る。いくつかほどは効果が頑強ではない（ＢＳＨなしと比較して、ＢＳＨのＰ＝０．８２）ものの、ＢＳＨ活性の存在は有利な結果をもたらし、したがって、ＢＳＨ活性を有する１つ以上の細菌の包含は有用であり得る。本出願者らは、これらが、ＤＢＣの設計において細菌の包含に対する有用な指針ではあるが、そのような特徴を有さない細菌を除外するための基礎と解釈されるべきではないことに留意する。
【０１４５】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、特定の定義された特徴を有するＤＢＣは、ＣＤＩ感染症に関連する様々な特徴（例えば、体重減少、下痢、及び死亡率のうちの１つ以上）を有効に治療または予防することができる。場合によっては、選択された表現型は、有効な組成物と有効ではない組成物とを識別する一方で、更に他の実施形態において、対照的な表現型を有する株を含有する組成物の対は、ともに有効である。
【０１４６】
これらのデータは、マウスモデルにおけるＣＤＩの治療によって実証されるように、比較的限られた数の特定の細菌種を含有する設計された細菌組成物を、腸内菌共生バランス失調の予防のための治療として使用することができることを実証する。
【０１４７】
更に、特定の特徴について選択され、所望される活性（例えば、ＣＤＩの寛解）を有することが示される、そのようなＤＢＣ組成物を、追加の細菌種（追加の選択された特徴を有するものを含む）が付加されるより複雑な組成物の基礎として使用することができる。ＤＢＣ４、ＤＢＣ６、及びＤＢＣ９、ならびに本明細書に開示され、本明細書に提供される指針を使用して構築され得る他の組成物は、そのような組成物の非限定的な例である。
【０１４８】
【表９】
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2019501136.tif 000036
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【０１４９】
実施例７：ＤＢＣ種の機能的特性、ＤＢＣ種内のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性
本出願者らは、ＳＣＦＡ産生を介したヒストン脱アセチル化酵素活性の阻害を、いくつかのＤＢＣの有用な機能として特定した。したがって、本出願者らは、様々な細菌をそれらがＨＤＡＣ活性を阻害する能力についてアッセイした。
【０１５０】
ＨＤＡＣ阻害アッセイは、インビトロでＳＣＦＡを検出することができる
市販のＨＤＡＣスクリーニング系がＳＣＦＡによるＨＤＡＣ阻害の試験に有用であるかどうかを決定するために、ＨＤＡＣ−Ｇｌｏ  Ｉ／ＩＩアッセイキットＰｒｏｍｅｇａ（Ｈａｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１１Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ１６：１２２７−３５を参照されたい）を試験した。この実験では、このキットに提供されるＨｅＬａ核抽出物をＨＤＡＣ酵素源として使用した。酪酸は、ＨＤＡＣ６及びＨＤＡＣ１０を除いて、ほとんどのＨＤＡＣ  Ｉ及びＩＩ科酵素を阻害することが報告されているため、ＨＤＡＣ−Ｇｌｏ  Ｉ／ＩＩキットを選択した（Ｄａｖｉｅ２００３Ｊ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ１３３：２４８５Ｓ−２４９３Ｓ）。このアッセイにおいて、ＨＤＡＣによる提供される基質の脱アセチル化は、好適なプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｍ５）を使用して検出される発光シグナルをもたらす。ＨＤＡＣ阻害は、阻害剤なしの対照と比較して、発光シグナルを低下させる。以下の通りの製造業者の指示書に従って、実験を実行した。アッセイの緩衝液中で１：３０００に希釈した５０μＬのＨｅＬａ核抽出物を、５０μＬの阻害剤溶液と混合（アッセイ緩衝液中でのＳＣＦＡの段階希釈）し、３０分間インキュベートした。１００μＬの展開溶液を各ウェルに添加し、室温で４５分間のインキュベーション後に発光を測定した。結果（示さず）は、アッセイ条件下で、酪酸及びプロピオン酸が強力なＨＤＡＣ阻害剤である（それぞれ、０．８及び２．４ｍＭのＩＣ５０）ことを実証する。乳酸及び酢酸は、試験された最高濃度（３．７５ｍＭ）で最小ＨＤＡＣ阻害活性を有した。
【０１５１】
培養中上清での酪酸産生を測定するためのＨＤＡＣ阻害アッセイ
ＨＤＡＣアッセイとＳＣＦＡのアッセイとの間の相関性を調査するために、健康なヒトドナーに由来する１２のマイクロバイオーム細菌単離物（ＨＨＤ株）、及び酪酸を産生することが既知ではない２つの公的に入手可能な株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）を、それらがＨＤＡＣ活性を阻害する能力について、及びガスクロマトグラフィーによって酪酸産生について評価した。全ての株の培養物を、３連で、ペプトン酵母グルコース培地（ＰＹＧ、Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中、３７℃で５日間成長させた。ブランク培養物（未接種の無菌培地）及び１５ｍＭの酪酸を添加した無菌培養を、対照として含めた。５日間のインキュベーション後、遠心分離（４０００ｒｐｍで１５分間）によって微生物細胞を除去し、０．２２μＭのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して上清（細菌成長培地）を濾過した。上清を、ガスクロマトグラフィーによる酪酸の測定（ＭＲＬ，Ｗｏｂｕｒｎ  ＭＡによるＧＣ−ＦＩＤ）のために提出し、ＨＤＡＣ−Ｇｌｏ  Ｉ／ＩＩアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＨＤＡＣ阻害についてアッセイした。このアッセイについて、１０μＬの培養上清、４０μＬのアッセイ緩衝液、及び５０μＬの希釈ＨｅＬａ核抽出物（１：３０００の希釈）を、１００μＬの展開試薬の添加前に３０分間インキュベートした。室温で４５分後、発光を測定した。結果は、３つの株の培養上清及び１５ｍＭの酪酸を添加した上清が、これらの条件下でＨＤＡＣ由来の発光の有意な低減を有し、すなわち、ＨＤＡＣの阻害を実証することを示した（図６）。アッセイは、生物学的複写物間の小さな標準偏差によって示されるように頑強なものである。このアッセイはいかなる特定のＨＤＡＣ阻害剤にも特異的ではないため、それは細菌種または細菌組成物の一般的能力を決定するのに有用であり、例えば、非典型的なＨＤＡＣ阻害剤（酪酸以外）が細菌によって産生される場合でも、この能力を特定するのに有用で有り得る。
【０１５２】
上に示されるように、ＧＣを使用して、細菌上清を酪酸濃度についてアッセイした。ＨＤＡＣ阻害結果とＧＣによって測定される酪酸濃度との比較は、１２のＨＨＤ株に有意な相関性を示した（図７）。これらの結果は、記載されるように実行されるＨＤＡＣ阻害アッセイが、これらの条件下、細菌上清中で６ｍＭほど低い酪酸濃度を検出することができることを示す。本発明のいくつかの実施形態において、反応において１０μＬ超の上清が使用され、これはより低いレベル、例えば、１ｍＭ、５μＭ、または１μＭの検出をもたらす。
【０１５３】
異なる炭素源中で成長させた培養物の上清中のＨＤＡＣ阻害活性
ＨＤＡＣ阻害が細菌種にとって入手可能な炭素源の型及びレベルによって影響されるかどうかを決定するために、ＤＢＣ中で使用した選択細菌種に由来する上清によるＨＤＡＣ阻害を決定した。これらの実験において、細菌を、単糖、二糖、及び多糖、ならびにブタムチンを含む様々な炭素源中で成長させた。簡潔には、０．５％の選択炭素源で補ったペプトン／酵母抽出物培地（ＰＹ）中６００μＬの細菌培養物を、９６深ウェルプレート内で接種し、４日間成長させ、その後、遠心分離によって微生物細胞をペレット化し、上述のＨｅＬａ核抽出物によるＨＤＡＣアッセイに１５μＬの培養培地（上清）を使用した。ＨＤＡＣ活性は低ｐＨでは低減され（Ｌａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１２Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ４０：４７９４−８０３）、微生物培養物は５ほど低いｐＨを有したため、アッセイの最終ｐＨが上清の添加によって低減されないことを確実にするために、１ウェル当たり１０μＬの１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）溶液を添加して、最終Ｔｒｉｓ緩衝液濃度を７５ｍＭにした。故に、展開試薬の添加前に３０分間プレインキュベートした１５μＬの上清、１０μＬの１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、２５μＬのアッセイ緩衝液、及び５０μＬの希釈ＨｅＬａ核抽出物で、アッセイを実行した。３０分後、発光を測定した。
【０１５４】
これらの実験の結果を、以下の表１０に提供する。実験条件下、１５ｍＭの酪酸を添加した無菌上清は、６２％のＨＤＡＣ阻害をもたらした。上記のように、２５％のＨＤＡＣ阻害をカットオフ（実験条件下、１．８ｍＭの酪酸）として使用すると、グルコース培地中で成長させたとき、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓのみがＨＤＡＣ阻害活性を呈した。しかしながら、代替的な栄養源を試験したとき、４つの追加の株（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｓｐｏｒｉｃｕｍ、及びＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｍ）がＨＤＡＣ阻害について陽性であった。Ｍｕｒｉｍｏｎａｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｏｒｏｔｉｃｕｍの上清もまたＨＤＡＣ阻害を示したが、２５％のカットオフをわずかに下回った。これらのデータは、ある種がＨＤＡＣ阻害剤を産生する能力を理解するためには、様々な炭素源でのＨＤＡＣ阻害アッセイの実行が重要であることを実証する。
【０１５５】
更に、これらのデータは、幅広い炭素源を使用し、それによりＨＤＡＣの阻害が望ましい適応症の治療として投与したときに、組成物がＨＤＡＣ阻害剤を産生する可能性を増加させることができる組成物を提供することが有利であり得ることを示す。そのような適応症としては、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の治療または予防のために、短鎖脂肪酸の産生が望ましい適応症が挙げられる。これらのデータはまた、ＤＢＣ中の１つ以上の種の栄養源であるプレバイオティクスの使用の支持も提供する。
【０１５６】
【表１０】
2019501136.tif 000038
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【０１５７】
細菌株のＳＣＦＡプロファイル
上記のＨＤＡＣ阻害アッセイに使用したものと同一の細菌培養上清を、ＧＣ−ＭＳ分析に提出して、どのＳＣＦＡが観察されたＨＤＡＣ阻害の根底にあるのかを決定した。用いた方法（ＭＳＯｍｉｃｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸（２−メチル−プロピオン酸）、イソ吉草酸（３−メチル−酪酸）、吉草酸（ペンタン酸）、４−メチル−ペンタン酸、カプロン酸（ヘキサン酸）、及びヘプタン酸を測定する。ＧＣ−ＭＳ結果（表１１）は、ＨＤＡＣ阻害結果と、文献におけるＨＤＡＣ阻害に関連するＳＣＦＡの産生との間に優れた相関性が存在することを実証する。表１１内の数は、検出されたＳＣＦＡ濃度を示す。Ｂ＝酪酸、Ｐ＝プロピオン酸、ＩＢ＝イソ酪酸、及びＩＶ＝イソ吉草酸。
【０１５８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ及びＦｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉは、試験した全ての培地中で酪酸を産生した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍについて、酪酸の濃度は、基本培地中でよりもスクロース、ペクチン、及びＦＯＳ／イヌリン上で高く、これは、この株がこれらの複合多糖から酪酸を産生することができることを示した。Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉは、ＦＯＳ／イヌリン、デンプン、及びムチン上で、ならびにより少ない程度にグルコースで追加の酪酸を産生した。したがって、組成物中への両方の種の包含は、幅広い複合基質からの酪酸産生を可能にするだろう。
【０１５９】
Ｃ．ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍは、イソ吉草酸、イソ酪酸、及びプロピオン酸を産生した。イソ酪酸及びイソプロピオン酸は、分岐アミノ酸（それぞれバリン及びロイシン）の異化代謝において産生された分岐鎖脂肪酸（ＢＣＦＡ）であり、ＨｅＬａ細胞内でＨＤＡＣ阻害剤活性を呈することが示されている（Ｗａｌｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８Ｊ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ１９：５８７−５９３）。例えば、ＤＢＣ６中のように、Ｃ．ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍがバリン及びロイシンを炭素源として利用することができることが示されている（上記）唯一の株である、そのような株の包含は、故に、ＨＤＡＣ活性を調節しながら、これらの基質についてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅと競合し得る株を提供することができる。本出願者らは、イソロイシン代謝の産生物である２−メチル−酪酸が、これらの実験においてＳＣＦＡパネルの部分ではなかったことに留意する。しかしながら、Ｃ．ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍもまたイソロイシンを炭素源として使用することができ、これは炭素源パネルにおいて試験したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株も同様であった。したがって、Ｃ．ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍもまた、ＤＢＣ中で２−メチル−酪酸の供給源として使用することができる。
【０１６０】
Ｃ．ｂｏｌｔｅａｅ、Ｃ．ｄｉｓｐｏｒｉｃｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｍ、Ｍｕｒｉｍｏｎａｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｉ、及びＣ．ｏｒｏｔｉｃｕｍはプロピオン酸を産生したが、これは炭素源としてフコースが供給されたときのみであった。フコースは、腸上皮管腔内のグリカン及び粘膜分泌の重要な構成成分である。腸内フコースは、宿主−マイクロバイオーム共生の媒介物として特定されている（Ｐｉｃｋａｒｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｖｏｎｓｋｙ２０１５Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１９４：５５８８−５５９３）。したがって、ＤＢＣ中への少なくとも１つのフコース利用種の包含は、そのような細菌による宿主のコロニー形成を支持することができ、上皮表面付近のプロピオン酸利用は、上皮バリア機能において著しく有益な効果を有し得る。
【０１６１】
グルコース、ＦＯＳ／イヌリン、開始、またはムチンで補ったＰＹ（基本）中のＦ．ｐｌａｕｔｉｉの成長は、基本培地中のみで成長させた場合の産生レベルと比較して、酪酸のレベルの増加をもたらす。同様に、グルコースまたはペクチン、及びより少ない程度にスクロースまたはＦＯＳ／イヌリンで補った培地中で成長させたＣ．ｉｎｎｏｃｕｕｍは、酪酸のレベルの増加をもたらす。
【０１６２】
場合によっては、ある種は、基本培地が炭素源で補われる場合、より少ないＳＣＦＡを産生する。いかなる特定の理論にも関与するものではないが、そのような場合、細菌がそれらの代謝を追加の炭素源の使用に変え、それにより基本培地のみが成長に使用されるときにより少ないＳＣＦＡを検出させる程度まで、追加の炭素源は好ましい供給源である可能性がある。
【０１６３】
これらのデータは、選択された種を使用して、細菌がＤＢＣ中に投与されたときにＳＣＦＡが産生される可能性を増加させることができることを示す。更に、ＨＤＡＣ阻害及び様々な炭素源を使用するＳＣＦＡの産生に関するデータは、細菌によって産生されるＨＤＡＣ阻害分子（例えば、ＳＣＦＡ）または他の未特定の分子を発現させることが望ましい治療のために、単一種組成物に対して、ＤＢＣの使用を支持する。
【０１６４】
表１１：多様な炭素源中で成長させた細菌種のＳＣＦＡプロファイル数は、酪酸（Ｂ）、プロピオン酸（Ｐ）、イソ酪酸（ＩＢ）、またはイソ吉草酸（ＩＶ）の培養上清中で測定された濃度（ｍＭ）を示す。検出限界（ＬＯＤ）は、０．３ｍＭ（Ｂ）、０．２ｍＭ（Ｐ）、０．３ｍＭ（ＩＢ）、及び０．６ｍＭ（ＩＶ）であった。空のセルは、濃度がＬＯＤ未満であったことを示す。
【０１６５】
【表１１】
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2019501136.tif 000041
【０１６６】
実施例８。ＤＢＣ種の機能的特性、インドール及び他のトリプトファン代謝物の産生
実施例６に示されるように、インドールまたはインドール誘導体を産生することができる細菌組成物は、そのようなインドールを産生しない細菌組成物と比較して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の寛解に有効であった。この発見を考慮して、本出願者らは、これらの活性について細菌を試験するために使用することができるインドール及びインドール代謝物産生のためのアッセイを開発し、活性を有する細菌種を特定することができた。そのような種は、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を治療または予防するために使用することができるＤＢＣを構築するための有用な付加である。
【０１６７】
ＳＥＲ−２６２細菌上清中のインドール及びインドール代謝物産生のためのアッセイ
インドール試験について、一滴のインドール試薬（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｒｇａｎ  Ｈｉｌｌ，ＣＡ）を、２連で、８つの異なる炭素源中で成長させた細菌株の１００μＬの細菌培養物に添加した。試験した１２の株のうち、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ及びＦｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉのみが、これらの条件下、インドール試験において陽性であった（データ示さず）。実施例７で利用した８つの炭素源の各々で補ったＦ．ｐｌａｕｔｉｉ培養物は濃青色（インドールの存在の特徴である）になった。Ｃ．ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍは、グルコース、ペクチン、及びＦＯＳ／イヌリンを除く全てのＣ供給源において赤色（この試験では異なるインドール誘導体について異なる色が記載されている（Ｌｏｍｂａｒｄ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｌｌ，１９８３Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１８：６０９−６１３））になった。これらの株について、炭素源によるインドール表現型のパターンはＨＤＡＣ及びＳＣＦＡの表現型のパターンと同一であり、バイオマスとは相関せず、これは重複制御を示唆する。斑点試験を使用して、上清もまた再度アッセイした（インドール、３−メチル−インドール、インドール−３−酪酸、トリプタミン、及びインドール−３−プロピオン酸（陽性対照として）とともに、インドール試薬（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｒｇａｎ  Ｈｉｌｌ，ＣＡ）を浸した紙に、４μＬの上清の斑点を付けた）。インドール及びＦ．ｐｌａｕｔｉｉの上清は、明青色をもたらした一方で、Ｃ．ｉｎｎｏｃｕｕｍ、インドール−３−プロピオン酸、３−メチル−インドール、インドール−３−酪酸、及びトリプタミンは紫色の斑点をもたらした。これらの結果は、Ｆ．ｐｌａｕｔｉｉがインドール産生体である一方で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍがこの方法では特定することができないインドール誘導体の産生体であることを暗示する。免疫調節及び上皮バリア機能におけるインドールの役割の証拠は、文献に報告されている。これ及び本明細書に提示されるデータを考慮して、感染症、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を治療または予防するために設計されるＤＢＣ中に、これら２つの株のうちの少なくとも一方または両方を含めることが有用である。いかなる特定の理論にも関与するものではないが、本出願者らは、ＤＢＣ中へのそのような種の包含が免疫調節及び上皮バリア機能の回復に有用であると考える。
【０１６８】
実施例９：ＤＢＣ臨床試験
一次（第１の）エピソードのＣＤＩと診断されたヒト対象において、ＤＢＣを使用して臨床試験を実行する。そのような試験の一例は、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、試験番号ＮＣＴ０２８３０５４２に記載される。
【０１６９】
有効なＤＢＣは、この個体群において１つ以上のＣＤＩ徴候及び／または症状の再発を低減する。
【０１７０】
他の実施形態が、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図１−３５】
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【図１−３６】
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【図１−３７】
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【図１−３８】
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【図１−３９】
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【図１−４０】
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【図１−４１】
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【図１−４２】
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【図１−４３】
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【図１−４４】
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【図１−４５】
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【図１−４６】
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【図１−４７】
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【図１−４８】
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【図１−４９】
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【図１−５０】
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【図１−５１】
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【図１−５２】
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【図１−５３】
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【図１−５４】
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【図１−５５】
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【図１−５６】
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【図１−５７】
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【図１−５８】
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【図１−５９】
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【図１−６０】
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【図１−６１】
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【図１−６２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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