(57)【要約】  本出願は、新規なプロモーター、それを含むベクター、前記プロモーター又はベクターを含む微生物、及び前記微生物を用いて目的物質を生産する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３からなる群から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有する核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子及び目的遺伝子を含む、遺伝子発現カセット。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子又は請求項２に記載の遺伝子発現カセットを含む、組換えベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子又は請求項３に記載のベクターを含む、コリネバクテリウム属組換え微生物。
【請求項５】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム又はコリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
（ａ）請求項４に記載の組換え微生物を培地で培養するステップと、
（ｂ）前記微生物又は前記微生物を培養した培地から目的物質を回収するステップとを含む、目的物質を生産する方法。
【請求項７】
前記目的物質は、サイコース、タガトース又はアミノ酸である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、新規なプロモーター、それを含むベクター、前記プロモーター又はベクターを含む微生物、及び前記微生物を用いて目的物質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いて飼料、医薬品、食品などの様々な用途に使用可能なアミノ酸や有用物質などの目的物質を高力価で生産するために、生合成経路における遺伝子操作及び／又は外部遺伝子導入などの努力が続けられてきた（特許文献１）。このような方法の１つとして、微生物において目的遺伝子の過剰発現を誘導する方法があるが、そのためには高効率の遺伝子発現システムを必要とする。プロモーターは遺伝子発現システムに最も大きく関与する要素の１つであるので、有用なプロモーター開発が必須であるといえる。
【０００３】
大腸菌由来ｔａｃプロモーターは強いプロモーターとして広く知られており、コリネ型微生物においては自己遺伝子のプロモーターを改変して強いプロモーターを開発してきた（非特許文献１）。例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenesis）由来のプロモーターにおいては、従来の大腸菌に関して報告されているｔａｃプロモーターと比較して、約１０％向上したことが知られている（非特許文献２）。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の強いプロモーターとして様々な強度のＰｃｊ１〜７プロモーターが開発されており、それらはｔａｃプロモーターより１０倍以上の強力なプロモーター活性を有する（特許文献２）。さらに、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）において強いプロモーターとして活性を有するように合成したＰｏ２プロモーターが開発されている（特許文献３）。しかし、大腸菌遺伝子発現システムと比較して、コリネバクテリウム属微生物においても高い発現効率を示すシステムが求められているので、プロモーターを開発する必要性が依然として存在する現状である。
【０００４】
こうした背景の下、本発明者らは、コリネバクテリウム属微生物において遺伝子発現を強く誘導するプロモーターを見出すべく鋭意努力し、その結果、本発明の新規合成プロモーターを開発することにより、公知のプロモーターに比べて高い発現活性を確認し、本出願を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０６２００９２号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−１６３２６４２号公報
【特許文献４】韓国登録特許第１０−１５５０７９６号公報
【特許文献５】韓国特許公告第１０−１９９２−０００７４０１号公報
【特許文献６】韓国登録特許第１０−１１１７０２２号公報
【特許文献７】韓国登録特許第１０−１１８２０３３号公報
【特許文献８】韓国登録特許第１０−０１５９８１２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gene, 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996
【非特許文献２】Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003
【非特許文献３】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献４】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献５】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献６】Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981
【非特許文献７】"Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176
【非特許文献８】Biotechnology letters vol 13, No. 10, p. 721-726(1991)
【非特許文献９】Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545
【非特許文献１０】FEMS Microbiology Letters 194, 127-133, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、コリネバクテリウム属微生物において遺伝子発現を強く誘導するプロモーターを見出すべく鋭意努力し、その結果、本出願の新規合成プロモーターを開発することにより、公知のプロモーターに比べて高い発現活性を確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願は、プロモーター活性を有する新規な核酸分子、前記核酸分子及び目的遺伝子を含む遺伝子発現カセット、前記核酸分子又は前記遺伝子発現カセットを含む組換えベクター、前記プロモーター又はベクターを含む組換え微生物、並びに前記組換え微生物を用いて目的物質を生産する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の新規なプロモーターは、目的遺伝子の発現を誘導する微生物によって様々な活性を有することができる。よって、目的物質を生産する際に必要に応じて目的遺伝子の活性を調節しなければならない場合に、本発明の新規なプロモーターを用いることができるので、効率的に目的物質を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】新規なプロモーターの強度を測定したＧＦＰ ａｓｓａｙ結果を示す図である。（Ａ）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースの新規プロモーターのＧＦＰ ａｓｓａｙ結果である。（Ｂ）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ベースの新規プロモーターのＧＦＰ ａｓｓａｙ結果である。
【図２】サイコース生産を確認したＨＰＬＣ結果を示す図である。（Ａ）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＣＪ４−ＡＴＰＥ−２、（Ｂ）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１−ＡＴＰＥ−２、（Ｃ）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ７−ＡＴＰＥ−２を用いてフルクトース基質と反応させたものである。
【図３】タガトース生産を確認したＨＰＬＣ結果を示す図である。（Ａ）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＣＪ４−ＴＮ（ｍ）、（Ｂ）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１３−ＴＮ（ｍ）を用いてフルクトース基質と反応させたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本出願の目的を達成するための一態様として、本出願は、配列番号１〜３からなる群から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有する核酸分子を提供する。
【００１２】
本出願における「プロモーター」とは、ポリメラーゼに対する結合部位を含み、プロモーター下流の遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有する、コード領域の上流（upstream）の翻訳されない核酸配列、すなわちポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ領域を意味する。前記プロモーターは、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置する。
【００１３】
本出願における配列番号１〜３からなる群から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、配列番号２又は配列番号３のヌクレオチド配列）からなるプロモーター活性を有する核酸分子は、それぞれＳＰＬ１、ＳＰＬ７、ＳＰＬ１３と命名した。前記プロモーター活性を有する核酸分子はプロモーターともいい、本出願においては前述した用語が全て用いられてもよい。
【００１４】
本出願のプロモーターは、目的とする微生物において前記プロモーター活性を有する核酸分子と作動可能に連結された目的遺伝子の発現をもたらすことができ、汎用プロモーターとして用いられてもよい。
【００１５】
また、本出願のプロモーター配列は、従来公知の突然変異誘発法、例えば指向性進化法（direct evolution）や部位特異的突然変異法（site-directed mutagenesis）などにより改変してもよい。よって、前記プロモーターには、配列番号１、配列番号２又は配列番号３のヌクレオチド配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、一層具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示し、同等のプロモーター活性を示すヌクレオチド配列も全て含まれてもよい。さらに、このような相同性を有するヌクレオチド配列として、プロモーター活性を有するヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたヌクレオチド配列も本出願の核酸分子に含まれるものと解釈すべきである。
【００１６】
特に、前記配列番号１、２又は３のヌクレオチド配列からなるという表現は、当該プロモーターを目的遺伝子に連結して用いる場合に、制限酵素の使用のように目的遺伝子に連結する過程中に発生し得るヌクレオチドの追加、及び／又は削除、及び／又は変異などを排除するものではない。
【００１７】
具体的には、遺伝子の転写を行うためのプロモーター以外にも、その転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節するＤＮＡを含んでもよい。例えば、原核生物に好適な調節配列は、プロモーター、任意のオペレータ配列及びリボソーム結合部位を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。本出願のプロモーター活性を有する核酸分子は、当業者の必要に応じて、前述したような遺伝子発現調節のための配列を構成するものであってもよい。
【００１８】
また、１〜３からなる群から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列からなるプロモーター活性を有する核酸分子は、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ（probe）、例えば本発明の配列番号１〜３のヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより本発明のプロモーター活性を有するヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
【００１９】
本出願における「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分（moiety）間の同一性の割合を意味する。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定されてもよい。例えば、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献３、４）で決定されてもよい。
【００２０】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（例えば、非特許文献３）に具体的に記載されている。例えば、相同性の高い遺伝子同士、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられる。例えば、ヌクレオチド塩基において、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似した核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節されてもよい。ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献５参照）。
【００２１】
本出願のプロモーター活性を有する核酸分子は、標準分子生物学技術を用いて分離又は作製することができる。例えば、自動化されたＤＮＡ合成機を用いる標準合成技術を用いて作製することができるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
他の態様として、本出願は、本出願の核酸分子及び目的遺伝子を含む遺伝子発現カセットを提供する。
【００２３】
本出願の核酸分子については前述した通りである。
【００２４】
本出願における「遺伝子発現カセット」とは、プロモーターと目的遺伝子とを含み、プロモーター下流に作動可能に連結された目的遺伝子を発現させることのできる単位カセットを意味する。このような遺伝子発現カセットの内部又は外部には、前記目的遺伝子の効率的な発現をサポートする様々な因子が含まれてもよい。通常、前記遺伝子発現カセットは、前記目的遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター（promoter）以外に、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。
【００２５】
本出願における「目的遺伝子」とは、微生物において発現させようとするタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【００２６】
例えば、糖類（例えば、サイコース又はタガトース）、Ｌ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシン、Ｌ−バリン）、有機酸、酵素及びそれらの組み合わせからなる群から選択される産物の生産に関与する遺伝子であってもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、目的遺伝子は、糖類変換酵素、アミノ酸生合成関連酵素をコードする遺伝子、還元力関連酵素をコードする遺伝子、有機酸生合成関連酵素をコードする遺伝子、目的産物排出関連タンパク質をコードする遺伝子であってもよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、サイコースエピメラーゼをコードする遺伝子、タガトースエピメラーゼをコードする遺伝子、タガツロネートエピメラーゼをコードする遺伝子、ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、又は分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
前記サイコースエピメラーゼとは、ＡＴＰＥと表記され、フルクトースをサイコースに変換する活性を有するサイコース−３−エピメラーゼを意味する。また、タガツロネートエピメラーゼ又はタガトースエピメラーゼ（特許文献４のヘキスロン酸Ｃ４−エピメラーゼ）とは、ＵｘａＥと表記され、フルクトース酸をタガトース酸に変換する活性、又はフルクトースをタガトースに変換する活性を有する酵素を意味する。前記ＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼとは、ＧａｐＮと表記され、グリセルアルデヒド−３−リン酸（glyceraldehyde 3 phosphate）を基質として３−ホスホグリセリン酸（3-phosphoglycerate）に変換する活性を有する酵素を意味する。前記分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain amino-acid aminotransferase）とは、ＩｌｖＥと表記され、分枝鎖アミノ酸の生合成経路の最終段階の酵素を意味する。前記ＡＴＰＥをコードする遺伝子、ＵｘａＥをコードする遺伝子、ＧａｐＮをコードする遺伝子、ＩｌｖＥをコードする遺伝子の配列は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから当業者が容易に入手することができる。前記ＡＴＰＥをコードする遺伝子、ＵｘａＥをコードする遺伝子、ＧａｐＮをコードする遺伝子、ＩｌｖＥをコードする遺伝子は、本出願のプロモーター活性を有する核酸分子に作動可能に連結される目的遺伝子の１つとして単に例示したものにすぎず、本出願のプロモーターは汎用プロモーターであり、微生物から発現する遺伝子であれば、制限なく目的遺伝子として用いることができる。本出願における「作動可能に連結」（operatively linked）とは、本発明のプロモーター活性を有する核酸配列が目的遺伝子の転写を開始及び媒介するように、前記遺伝子配列とプロモーター配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は当該技術分野において公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野の切断及び連結酵素などを用いて作製することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
さらに他の態様として、本出願は、本出願の核酸分子又は本出願の遺伝子発現カセットを含む組換えベクターを提供する。
【００２９】
前記核酸分子及び前記遺伝子発現カセットについては前述した通りである。
【００３０】
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で目的遺伝子を発現させることができるように、遺伝物質を保有する人為的ＤＮＡ分子であり、具体的には好適な調節配列に作動可能に連結された遺伝子のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始する本出願のプロモーター以外に、その転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本出願に用いられるベクターは宿主細胞内で発現するものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターを用いて宿主細胞を形質転換することができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＬＢ３、λＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。本出願において使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。また、宿主細胞内の染色体挿入用ベクターにより、染色体内の内在性プロモーターを本出願のプロモーター活性を有する核酸分子に置換することができる。前記核酸分子の染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。例えば、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＣＥＳ２０８、ｐＸＭＪ１９ベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本出願のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されるので、前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換した細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否か確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーを用いることができる。選択剤（selective agent）で処理された環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換した細胞を選択することができる。
【００３２】
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換したポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらが全て含まれるものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含み、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態、又はそれを含むベクターの形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記ポリヌクレオチドを含む発現カセット又はベクターは、例えば本出願の配列番号１、配列番号２又は配列番号３のヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有する核酸分子を含むものであってもよく、それに目的遺伝子が作動可能に連結されていないベクターであってもよい。その場合も、前記プロモーター活性を有する核酸分子は、宿主細胞（例えば、コリネバクテリウム属微生物）内の内在性プロモーターと相同組換えにより置換することができる。こうすることにより、宿主細胞の内在性遺伝子を発現させることができる。
【００３３】
前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
さらに他の態様として、本出願は、本出願の前記プロモーター活性を有する核酸分子、前記遺伝子発現カセット、又は遺伝子発現カセットを含む組換えベクターを含む組換え微生物を提供する。
【００３５】
前記プロモーター活性を有する核酸分子、遺伝子発現カセット及び組換えベクターについては前述した通りである。
【００３６】
前記遺伝子発現カセットと組換えベクターは、形質転換により微生物に導入されてもよい。
【００３７】
また、前記形質転換については前述した通りである。
【００３８】
本出願における「微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が向上又は低下するなどの原因により、特定機序が低下又は向上した微生物であってもよい。本出願における微生物は、本出願のプロモーター活性を有する核酸分子が導入されてプロモーターとして作動する微生物であればいかなるものでもよい。
【００３９】
具体的には、前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであってもよい。さらに具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４０】
さらに他の態様として、本出願は、（ａ）本出願の組換え微生物を培地で培養するステップと、（ｂ）前記微生物又は前記微生物を培養した培地から生産された目的物質を回収するステップとを含む、目的物質を生産する方法を提供する。
【００４１】
本出願における「目的物質」は、糖類（例えば、サイコース又はタガトース）、Ｌ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシン、Ｌ−バリン）、有機酸、酵素及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。前記「糖類」とは、甘みのある炭水化物を意味し、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、アルロース、タガトース、キシロース、ラクトース、スクロース及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
前記「アミノ酸」又は「Ｌ−アミノ酸」とは、一般にアミノ基とカルボキシ基が同じ炭素原子に結合されているタンパク質の基本構成単位を意味する。前記アミノ酸は、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、システイン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよいが、これらに限定されるものではない。前記「有機酸」とは、酸性の有機化合物であり、例えばカルボキシ基とスルホ基を有する有機化合物であってもよい。有機酸の具体的な例としては、乳酸、酢酸、コハク酸、酪酸、パルミチン酸、シュウ酸、タルタル酸、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、ヘキセン酸、カプリン酸、カプリル酸又は吉草酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記「酵素」とは、生命体内部の化学反応を媒介するタンパク質触媒であり、具体的には酵素が基質と結合して酵素−基質複合体を形成することにより、反応の活性化エネルギーを下げる触媒の役割を果たす。例えば、糖類（例えば、サイコース又はタガトース）の生産に関与する酵素が挙げられ、より具体的にはサイコースエピメラーゼ、タガトースエピメラーゼ又はタガツロネートエピメラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記目的産物は、本出願のプロモーターと作動可能に連結された目的遺伝子の発現により生産される目的物質であればいかなるものでもよく、前記例に限定されるものではない。
【００４３】
本出願における「培養」とは、微生物を人工的に調節した好適な環境条件で生育させることを意味する。本出願において、組換え微生物を用いて目的物質を生産する方法は、当該技術分野で周知の方法を用いることができる。具体的には、前記培養は、バッチプロセス又は流加もしくは反復流加プロセス（fed batch or repeated fed batch process）で連続して培養することができるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
培養に用いられる培地は、好適な方法で特定菌株の要件を満たすものでなければならない。コリネバクテリウム属又はエシェリキア属菌株の培養培地は公知である（例えば、非特許文献６）。用いることのできる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、グルコン酸、酢酸、ピルビン酸などの有機酸が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらの物質は単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、黄粉及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。窒素源も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩を含有してもよい。前記物質以外にも、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。具体的には、目的産物として酵素を生産する場合は、その基質が培地に含まれてもよい。例えば、サイコースエピメラーゼ、タガトースエピメラーゼ又はタガツロネートエピメラーゼの基質となるフルクトースが挙げられる。前述した原料は、培養過程において培養物に好適な方法でバッチ毎に又は継続して添加されてもよい。このような様々な培養方法は、例えば非特許文献７に開示されている。
【００４５】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの基礎化合物、又はリン酸、硫酸などの酸化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には２５℃〜４０℃であってもよいが、条件に応じて変更することができ、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本出願の目的物質を生産する方法は、本出願の微生物又は前記微生物を培養した培地から目的物質を回収するステップを含んでもよく、前記微生物又は前記微生物を培養した培地から目的物質を回収する方法は、当該技術分野で公知の好適な反応を用いて目的物質を分離又は回収することができる。例えば、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、及びそれらの方法の組み合わせであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記回収ステップは精製工程を含んでもよく、当業者であれば公知の様々な精製工程から必要に応じて選択して活用することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本出願の理解を容易にするために実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本出願による実施例は様々な他の形態に変形することができ、本出願の範囲がこれらの実施例に限定されるものと解釈されてはならない。本出願の実施例は、当該技術分野における通常の知識を有する者に本出願をより完全に説明するために提供されるものである。
【実施例１】
【００４８】
新規プロモーターの目的遺伝子発現誘導活性の確認
１−１．新規プロモーター配列を含有する組換えベクターの作製
目的遺伝子の発現を誘導する新規プロモーターを合成するために、コリネバクテリウム属微生物とエシェリキア属微生物由来の様々なプロモーター配列を分析し、それらから配列番号１、２及び３のヌクレオチド配列を有するプロモーターを合成し、それらをそれぞれＳＰＬ１、ＳＰＬ７、ＳＰＬ１３と命名した。
【００４９】
合成作製したプロモーターＳＰＬ１、ＳＰＬ７及びＳＰＬ１３を鋳型とし、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶ切断部位を含む配列番号４及び配列番号５のプライマーを用いてＰＣＲ［非特許文献３］を行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の伸長反応を行った。その結果、約３００ｂｐのＳＰＬ１、ＳＰＬ７及びＳＰＬ１３が得られた。
【００５０】
ＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ（Open Reading Frame）は、ｐＧＦＰｕｖベクター（clontech社，米国）を鋳型とし、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＶ切断部位を含む配列番号６及び配列番号７のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得られた。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を３０回繰り返し、その後７２℃で７分間の重合反応を行った。その結果、約７１６ｂｐのＧＦＰ ＯＲＦを含む遺伝子断片（配列番号１４）が得られた。
【００５１】
大腸菌とコリネ型細菌において発現可能なシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１１７（非特許文献８，特許文献５）のＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ位置に、制限酵素ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＶで処理した各ＳＰＬ１、ＳＰＬ７及びＳＰＬ１３と、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶで処理したＧＦＰ遺伝子のＯＲＦをＤＮＡ結合酵素を用いて作動可能に連結することにより、最終的にＳＰＬ１、ＳＰＬ７及びＳＰＬ１３がそれぞれＧＦＰに連結された組換えベクターを作製し、それらをそれぞれｐＳＰＬ１−ＧＦＰ、ｐＳＰＬ７−ＧＦＰ、ｐＳＰＬ１３−ＧＦＰと命名した。
【００５２】
１−２．形質転換菌株の作製
ベクターｐＥＣＣＧ１１７、並びに前述したように作製した組換えベクターｐＳＰＬ１−ＧＦＰ、ｐＳＰＬ７−ＧＦＰ及びｐＳＰＬ１３−ＧＦＰと、従来の公知のプロモーターｐｃｊ４（特許文献２）を含むｐ１１７−ＣＪ４−ＧＦＰを、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２とＡＴＣＣ１３８６９に電気パルス法（非特許文献９）でそれぞれ形質転換し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有するルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天培地から形質転換菌株を得た。ＡＴＣＣ１３０３２ベースで得られた菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ７−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１３−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＣＪ４−ＧＦＰと命名した。また、ＡＴＣＣ１３８６９ベースで得られた菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ｐＥＣＣＧ１１７、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ１−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ７−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ１３−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ＣＪ４−ＧＦＰと命名した。
【００５３】
前記形質転換して得られたＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ７−ＧＦＰ、ＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１３−ＧＦＰ、ＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１−ＧＦＰ、ＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ７−ＧＦＰ、ＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ１３−ＧＦＰ及びＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ１−ＧＦＰの６種の菌株は、それぞれＣＡ０１−２３０１、ＣＡ０１−２３０２、ＣＡ０１−２３０３、ＣＡ０１−２３０４、ＣＡ０１−２３０５、ＣＡ０１−２３０６と命名し、ブダペスト条約に基づいて国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１７年２月１７日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１９７１Ｐ、ＫＣＣＭ１１９７２Ｐ、ＫＣＣＭ１１９７３Ｐ、ＫＣＣＭ１１９７４Ｐ、ＫＣＣＭ１１９７５Ｐ及びＫＣＣＭ１１９７６Ｐとして寄託した。
【００５４】
１−３．新規プロモーターの活性確認
ＳＰＬ１、ＳＰＬ７及びＳＰＬ１３プロモーターの活性を確認するために、実施例１−２で得られた形質転換菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＣＪ４−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ７−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１３−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ｐＥＣＣＧ１１７、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ＣＪ４−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ１−ＧＦＰ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ７−ＧＦＰ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９／ＳＰＬ１３−ＧＦＰを次の方法で培養し、ＧＦＰ活性を測定した。
【００５５】
培地（グルコース２０ｇ，硫酸アンモニウム５ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４７・Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１５０μｇ，チアミン塩酸塩１．５ｍｇ，パントテン酸カルシウム３ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ(蒸留水１Ｌ中)，ｐＨ７．２）２５ｍｌを入れたフラスコに、形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株をそれぞれ接種し、３０℃で２０時間振盪培養した。培養液から遠心分離（５，０００ｒｐｍ，１５分）により菌体を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で２回洗浄し、その後同緩衝液に懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビーズ（glass bead）を添加し、その後ビードビーター（bead beater）を用いて菌体を６分間破砕し、次いで遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，２０分）により上清を回収し、ブラッドフォード方法によりタンパク質濃度を定量した。同一量の菌体抽出物に対して、Ｌａｕｒｅ Ｇｏｒｙらの方法（非特許文献１０）により、４８８ｎｍの励起光を照射し、５１１ｎｍの発光をＬＳ−５０Ｂ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Perkin-Elmer）装置を用いて測定することにより、ＧＦＰ遺伝子の発現の程度を測定した（表１）。
【００５６】
【表１】
2019528075.tif 000003
【００５７】
表１から分かるように、ＳＰＬ１、ＳＰＬ７及びＳＰＬ１３は全て２種のコリネバクテリウム・グルタミカムにおいてプロモーター活性を示し、コリネバクテリウム・グルタミカムにおける強いプロモーターとして公知のｐｃｊ４より高い蛍光強度を示した。前記結果から、ＳＰＬ１、ＳＰＬ７、ＳＰＬ１３は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて目的遺伝子を発現させることのできる非常に強力なプロモーターであることが分かる。
【実施例２】
【００５８】
目的物質生産能の評価
２−１．サイコース生産能の評価
（１）ＳＰＬ１及びＳＰＬ７プロモーター配列を含むＡＴＰＥ発現用ベクター及び形質転換菌株の作製
ＳＰＬ１及びＳＰＬ７を用いて、ＡＴＰＥ（アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴＣＣ３３９７０由来のサイコースエピメラーゼ）の発現が増加したコリネバクテリウム菌株用ベクターを作製した。ｐＥＴ２４−ＡＴＰＥ−２ベクター（配列番号８）を鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマーでＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を３０回）を行い、ＡＴＰＥ遺伝子のＯＲＦ（Open Reading Frame）を増幅した。増幅したＡＴＰＥ遺伝子と実施例１で作製したコリネバクテリウム菌株用ベクターｐＳＰＬ１−ＧＦＰ及びｐＳＰＬ７−ＧＦＰを制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＰｓｔＩで処理し、その後前記ＰＣＲにより得られたＡＴＰＥ−２をＢＤ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｋｉｔで作動可能に連結することにより、最終的にコリネバクテリウム菌株用ベクターｐＳＰＬ１−ＡＴＰＥ−２及びｐＳＰＬ７−ＡＴＰＥ−２を作製した。
【００５９】
前述したように作製したｐＳＰＬ１−ＡＴＰＥ−２ベクターとｐＳＰＬ７−ＡＴＰＥ−２ベクターをＡＴＣＣ１３０３２菌株にエレクトロポレーションで導入し、ＳＰＬ１−ＡＴＰＥ−２及びＳＰＬ７−ＡＴＰＥ−２菌株を作製した。
【００６０】
（２）形質転換菌株のサイコース生産能の評価
前記過程を経て作製した菌株を実施例１と同じ組成の培地で培養し、その後ＡＴＰＥの活性を測定した。ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７菌株及びＡＴＣＣ１３０３２／ＣＪ４−ＡＴＰＥ−２菌株は対照群として用いた。
【００６１】
３０℃の培養器にてＬＢ固体培地で一晩培養した各菌株を２５ｍＬ培地に接種し、次いでこれを３０℃の培養器で２４時間振盪培養し、培養後に遠心分離により上清を除去し、ＥＰＰＳ溶液（ｐＨ８．０）で得られた菌体を洗浄し、確保したペレットをＥＰＰＳ溶液（ｐＨ８．０）に溶解し、その後１ｍｇ／ｍｌのＰＯＥＳＡを添加し、室温で１時間反応させて遠心分離した。次に、遠心分離して得られたペレットをＥＰＰＳ溶液（ｐＨ８．０）に溶解し、基質である３５０ｇ／Ｌフルクトース溶液を添加して５０℃で３時間反応させ、その後熱処理により反応を停止させた。その後、遠心分離により上清を回収し、ＨＰＬＣ分析によりサイコース生成量を測定した（図１の(Ａ)、(Ｂ)及び(Ｃ)）。反応後のサイコース生成量を表２に示す。
【００６２】
【表２】
2019528075.tif 000004
【００６３】
表２に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１−ＡＴＰＥ−２及びＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ７−ＡＴＰＥ−２は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＣＪ４−ＡＴＰＥ−２に比べて、サイコース生産性がそれぞれ３２１％、２５８％向上することが確認された。よって、本出願のプロモーターＳＰＬ１及びＳＰＬ７を用いると、ＡＴＰＥをコードする遺伝子の発現量が増加し、ＡＴＰＥ活性が大幅に増加することが確認された。
【００６４】
２−２．タガトース生産能の評価
（１）ＳＰＬ１３プロモーター配列を含むＵｘａＥ発現用ベクター及び形質転換菌株の作製
ＧＦＰが挿入されたＣＪ４−ＧＦＰと実施例１で作製したＳＰＬ１３−ＧＦＰを用いて、サーモトガ・ネアポリタナ由来のタガトースエピメラーゼ遺伝子（ＵｘａＥ）をクローニングしてコリネバクテリウム菌株用ベクターを作製した。ｐＥＴ２８ａ−ＴＮ（ｍ）ベクター（配列番号１１）を鋳型とし、配列番号１２及び１３のプライマーでＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を３０回）を行い、ＴＮ（ｍ）遺伝子のＯＲＦ（Open Reading Frame）を増幅した。増幅した遺伝子ＴＮ（ｍ）とコリネバクテリウム菌株用ベクターＣＪ４−ＧＦＰ及びＳＰＬ１３−ＧＦＰを制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＰｓｔＩで処理し、その後ライゲーションを行って最終的にコリネバクテリウム菌株用ベクターｐＣＪ４−ＴＮ（ｍ）及びｐＳＰＬ１３−ＴＮ（ｍ）を作製した。
【００６５】
前述したように作製したｐＣＪ４−ＴＮ（ｍ）ベクターとｐＳＰＬ１３−ＴＮ（ｍ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２菌株にエレクトロポレーションで導入し、ＡＴＣＣ１３０３２／ＣＪ４−ＴＮ（ｍ）及びＳＰＬ１３−ＴＮ（ｍ）菌株を作製した。
【００６６】
（２）形質転換菌株のタガトース生産能の評価
前記過程を経て作製した菌株を実施例１の培地及び培養条件と同様に培養及び前処理し、その後ＵｘａＥの活性用菌株を確保した。活性評価は実施例２−１と同様の方法で、基質量、反応温度及び時間のみ変更して行った（１００ｇ／Ｌフルクトース溶液を添加して６０℃で２時間反応）。その後、遠心分離により上清を回収し、ＨＰＬＣ分析によりタガトース生成量を測定した（図２の(Ａ)及び(Ｂ)）。反応後のタガトース生成量を表３に示す。
【００６７】
【表３】
2019528075.tif 000005
【００６８】
表３に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＳＰＬ１３−ＴＮ（ｍ）は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２／ＣＪ４−ＴＮ（ｍ）に比べて、タガトース生産性が１４３％向上することが確認された。よって、本出願のプロモーターＳＰＬ１３を用いると、ＵｘａＥをコードする遺伝子の発現量が増加し、ＵｘａＥ活性が大幅に増加することが確認された。
【００６９】
２−３．バリン生産能の評価
（１）ＳＰＬ７プロモーター配列を含むｐＥＣＣＧ１１７−ＳＰＬ７−ｉｌｖＥベクター及び形質転換菌株の作製
Ｌ−アミノ酸の代表的な一例であるＬ−バリンの生産能を確認するために、バリン生合成主要遺伝子である分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain amino-acid aminotransferase）をコードするｉｌｖＥ（Ｎｃｇｌ２１２３）の酵素活性が強化されるように、次の通りｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ７−ｉｌｖＥ及びｐＥＣＣＧ１１７−ＳＰＬ７−ｉｌｖＥベクターを作製した。具体的には、ＡＴＣＣ１４０６７染色体を鋳型（template）とし、次の配列番号１４及び配列番号１５をプライマーとして用いてＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を３０回）を行い、ＮＣｇｌ２１２３遺伝子５’末端にＥｃｏＲＶ、３’末端にＰｓｔＩ制限酵素部位を有する約１１０４ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。前述したように得られたＰＣＲ断片を精製し、ＥｃｏＲＶ及びＰｓｔＩ制限酵素で処理したｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ７−ＧＦＰとｐＥＣＣＧ１１７−ＳＰＬ７−ＧＦＰとそれぞれ混合し、インフュージョンクローニングキット（In-fusion cloning Kit）を用いて連結してベクターを作製し、それらをそれぞれｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ７−ｉｌｖＥ、ｐＥＣＣＧ１１７−ＳＰＬ７−ｉｌｖＥと命名した。
配列番号１４ ５’ ＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＴＡＧＡＧＴＴＣ ３’
配列番号１５ ５’ ＡＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＡ ３’
【００７０】
前述したように作製した組換えベクターｐＥＣＣＧ１１７−ＣＪ７−ｉｌｖＥ及びｐＥＣＣＧ１１７−ＳＰＬ７−ｉｌｖＥ、並びにｐＥＣＣＧ１１７ベクターをそれぞれバリン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献６）に電気パルス法で形質転換し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ寒天培地から形質転換菌株を得た。前述したように得られた菌株をそれぞれＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ＣＪ７−ｉｌｖＥ、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ＳＰＬ７−ｉｌｖＥと命名した。
【００７１】
（２）形質転換菌株のバリン生産能の評価
前述したように形質転換した３種の菌株のＬ−バリン生産能を次の方法で培養して分析した。
【００７２】
生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１白金耳の前記菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣ（SHIMADZU LC-20AD）を用いてＬ−バリンの濃度を分析した。
＜生産培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース５０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）２０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン２００μｇ（蒸留水１リットル中）
【００７３】
前記培養及び分析を繰り返し行った。分析したＬ−バリンの濃度を表４に示す。
【００７４】
【表４】
2019528075.tif 000006
【００７５】
表４に示すように、本出願のプロモーターが導入されたＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ＳＰＬ７−ｉｌｖＥ菌株は、公知のプロモーターが導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ＣＪ７−ｉｌｖＥに比べて、バリン生産能が２１．８％向上することが確認された。対照群であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７に比べて３９．２％向上することが確認された。前記結果から、本出願のＳＰＬ７プロモーターがｉｌｖＥ遺伝子の発現を強化し、当該遺伝子がコードする酵素活性が大幅に増加することが確認された。
【００７６】
２−４．リシン生産能の評価
（１）ＳＰＬ１３プロモーター配列を含むｐＤＺＴｎ−ＳＰＬ１３−ｇａｐＮ１ベクター及び形質転換菌株の作製
Ｌ−アミノ酸の代表的な一例であるＬ−リシンの生産能を確認するために、公知のストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutants）に由来するＮＡＤＰ依存的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＮ）の酵素活性が強化されるように、次の通りベクターを作製した。
【００７７】
コリネバクテリウム属微生物におけるトランスポゾン遺伝子ＮＣｇｌ２３９２に挿入されるように、米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に基づいて、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、次の配列番号１６及び配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９をプライマーとして用いてＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を３０回）を行い、ＮＣｇｌ２３９２遺伝子５’末端及び３’末端をそれぞれ含む断片を増幅した。ｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１（特許文献７）ベクターを用いて、次の配列番号２０及び２１をプライマーとして用いてＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を３０回）を行い、Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１を増幅し、ｐＥＣＣＧ１２２−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１ベクターと実施例１で作製したＳＰＬ１３−ＧＦＰベクターを用いて、次の配列番号２２及び配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２１をプライマーとして用いてＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応を３０回）を行い、ＳＰＬ１３、ｇａｐＮ遺伝子をそれぞれ増幅し、それらを前述したように作製したＮＣｇｌ２３９２遺伝子断片と共にコリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献１）にクローニングすることにより、ｐＤＺＴｎ−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１及びｐＤＺＴｎ−ＳＰＬ１３−ｇａｐＮ１ベクターを作製した。
配列番号１６ ５’ ＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣＧＴＣＣＧＴ ３’
配列番号１７ ５’ ＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧ ３’
配列番号１８ ５’ ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＡＡＴＡＡＣＣＧＧＧＣＡＧ ３’
配列番号１９ ５’ ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＣＧＡＣＴＡＣＡＣ ３’
配列番号２０ ５’ ＧＡＡＴＧＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴ ３’
配列番号２１ ５’ ＧＣＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＡＴＣＡＡＡＴＡＣＧＡ ３’
配列番号２２ ５’ ＧＡＡＴＧＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＣ ３’
配列番号２３ ５’ ＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡ ３’
配列番号２４ ５’ ＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡ ３’
【００７８】
リシン生産能が向上したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物は、ＫＦＣＣ１０８８１として公開され、ブダペスト条約に基づいて国際寄託機関に寄託番号ＫＣＣＭ１１０１６Ｐとして再寄託された。特許文献８）菌株を母菌株とし、前述したように作製したｐＤＺＴｎ−Ｐｃｊ７−ｇａｐＮ１とｐＤＺＴｎ−ＳＰＬ１３−ｇａｐＮ１の各ベクターを電気パルス法（非特許文献９）で形質転換し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地から形質転換菌株を得た。２次組換え過程（crossover）でゲノム上にｇａｐＮ１遺伝子が挿入されたコロニーを選択すべく、配列番号２０及び２１のプライマー対、配列番号２１及び２２のプライマー対を用いて、それぞれＰｃｊ７−ｇａｐＮ１とＳＰＬ１３−ｇａｐＮ１が挿入された菌株を得た。得られた菌株をそれぞれＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ＣＪ７−ｇａｐＮ１、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ＳＰＬ１３−ｇａｐＮ１と命名した。
【００７９】
（２）形質転換菌株のリシン生産能の評価
前述したように形質転換した３種の菌株のＬ−リシン生産能を次の方法で培養して分析した。
【００８０】
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。ＨＰＬＣ（SHIMADZU, LC-20AD）を用いてＬ−リシンの濃度を分析した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【００８１】
前記培養及び分析を繰り返し行った。分析したＬ−リシンの濃度を表５に示す。
【００８２】
【表５】
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【００８３】
表５に示すように、本出願のプロモーターが導入されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ＳＰＬ１３−ｇａｐＮ１菌株は、公知のプロモーターが導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ＣＪ７−ｇａｐＮ１に比べて、リシン生産能が７．２％向上することが確認された。対照群であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて２２．７％向上することが確認された。前記結果から、本出願のＳＰＬ１３プロモーターがｇａｐＮ１遺伝子の発現を強化し、当該遺伝子がコードする酵素活性が大幅に増加することが確認された。
【００８４】
前記結果を全てまとめると、本出願のＳＰＬ１、ＳＰＬ７及びＳＰＬ１３プロモーターは、従来の公知のプロモーターに比べて、組換え微生物において目的遺伝子の発現を大幅に増加させることができるので、それらを用いて効果的な発現システムを提供できるだけでなく、目的産物、例えば糖類、機能性素材及びアミノ酸を高収率で生産しようとする様々な産業分野に有用である。
【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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