(57)【要約】  バイオコンジュゲーション反応を改善するための、タンパク質などの生化学組成物中のジスルフィド結合および関連する結合の電気化学的還元を行うための方法およびデバイスが、本明細書において開示される。【選択図】図５Ａ
2019530797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）挿入された第１の電極を含む第１のチャンバー、
（ｂ）挿入された第２の電極を含む第２のチャンバー、および
（ｃ）前記第１と第２のチャンバーを隔離し、前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとの間の電気化学的連通をもたらすように構成される多孔質膜
を含む電気化学デバイスであって、
電圧が前記第１の電極と第２の電極との間に印加されると、前記第１および第２の電極が一緒になって作用して、前記第１のチャンバーに位置する１つまたは複数の生化学組成物を電気化学的に還元するように構成されている、前記電気化学デバイス。
【請求項２】
前記第２のチャンバーの体積が前記第１のチャンバーの体積より大きい、請求項１に記載の電気化学デバイス。
【請求項３】
前記第１のチャンバーが前記第２のチャンバー内に入れられている、請求項２に記載の電気化学デバイス。
【請求項４】
前記第２のチャンバーの体積が、前記第１のチャンバーの体積よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍大きい、請求項１から３のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項５】
前記第１のチャンバーの体積が約３ｍＬであり、前記第２のチャンバーの体積が約５０ｍＬである、請求項１から４のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項６】
前記第１のチャンバーの体積が約３００μＬであり、前記第２のチャンバーの体積が少なくとも１５０ｍＬである、請求項１から４のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項７】
前記第１のチャンバーが、９６−ウェルプレート中のウェルで構成され、前記第２のチャンバーが、前記９６−ウェルプレートの底部に取り付けられた長方形チャンバーであり、前記第２のチャンバーが、各ウェルを前記長方形チャンバーから隔離する多孔質膜によって、前記９６−ウェルプレート中の各ウェルと電気化学的連通している、請求項６に記載の電気化学デバイス。
【請求項８】
生化学組成物の２つ以上の試料を平行して還元できるように、前記９６−ウェルプレートの２つ以上のウェルに第１の電極、および前記長方形チャンバーに単一の第２の電極を設けるよう構成される、請求項７に記載の電気化学デバイス。
【請求項９】
前記２つ以上の試料が、異なる生化学組成物を含む、請求項８に記載の電気化学デバイス。
【請求項１０】
前記第１のチャンバーが、１つまたは複数の生化学組成物を撹拌するように構成された磁気撹拌子を含有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項１１】
前記多孔質膜がセルロース膜である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項１２】
前記多孔質膜が、前記生化学組成物を保持するのに十分小さい細孔サイズを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項１３】
前記生化学組成物が、分子量約１５０ｋＤａのタンパク質である、請求項１２に記載の電気化学デバイス。
【請求項１４】
前記生化学組成物が、分子量約５０ｋＤａのタンパク質である、請求項１２に記載の電気化学デバイス。
【請求項１５】
前記第１の電極が負極（またはカソード）である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項１６】
前記第１の電極が作用電極である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項１７】
前記負極が白金を含む、請求項１５または請求項１６に記載の電気化学デバイス。
【請求項１８】
前記第１の電極がチタンを含まない、請求項１から１７のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項１９】
前記作用電極が直流電源に接続されている、請求項１６に記載の電気化学デバイス。
【請求項２０】
前記第２の電極が正極（またはアノード）である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項２１】
前記第２の電極が対電極である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項２２】
前記正極が炭素を含む、請求項１６に記載の電気化学デバイス。
【請求項２３】
前記生化学組成物がタンパク質である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項２４】
前記タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項２３に記載の電気化学デバイス。
【請求項２５】
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーが緩衝液を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項２６】
前記緩衝液がＰＢＳを含む、請求項２５に記載の電気化学デバイス。
【請求項２７】
前記緩衝液がグルコースおよびＥＤＴＡを含む、請求項２５に記載の電気化学デバイス。
【請求項２８】
前記第１の電極および第２の電極が前記緩衝液中に浸漬されている、請求項２５に記載の電気化学デバイス。
【請求項２９】
前記第１および第２の電極が、一緒になって作用して、前記生化学組成物のジスルフィド、硫黄−セレン結合、ジセレニド結合またはそれらの組合せを電気化学的に還元するように構成されている、請求項１から２８のいずれか一項に記載の電気化学デバイス。
【請求項３０】
生化学組成物中のジスルフィド結合、硫黄−セレン結合またはジセレニド結合を還元するための方法であって、
（ａ）生化学組成物を、
（ｉ）挿入された第１の電極を含む第１のチャンバー、
（ｉｉ）挿入された第２の電極を含む第２のチャンバー、および
（ｉｉｉ）前記第１と第２のチャンバーを隔離し、前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとの間の電気化学的連通をもたらすように構成される多孔質膜
を含む電気化学セルに入れること、
（ｂ）前記生化学組成物を磁気撹拌子により撹拌すること、
（ｃ）前記電気化学セルの前記第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加して、それにより、前記生化学組成物の前記ジスルフィド結合、硫黄−セレン結合またはジセレニド結合を還元すること
を含む、前記方法。
【請求項３１】
前記電圧が３Ｖである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記電圧が１．５Ｖである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のチャンバーの体積が、前記第１のチャンバーの体積より大きい、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のチャンバーが、前記第２のチャンバー内に入れられている、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２のチャンバーの体積が、前記第１のチャンバーの体積よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍大きい、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のチャンバーの体積が約３ｍＬであり、前記第２のチャンバーの体積が約５０ｍＬである、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のチャンバーの体積が約３００μＬであり、前記第２のチャンバーの体積が少なくとも１５０ｍＬである、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１のチャンバーが、９６−ウェルプレート中のウェルで構成され、前記第２のチャンバーが、前記９６−ウェルプレートの前記底部に取り付けられた長方形チャンバーであり、前記第２のチャンバーが、各ウェルを前記長方形チャンバーから隔離する多孔質膜によって、前記９６−ウェルプレート中の各ウェルと電気化学的連通している、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
生化学組成物の２つ以上の試料を平行して還元できるように、前記電気化学セルが、前記９６−ウェルプレートの２つ以上のウェルに第１の電極、および前記長方形チャンバーに単一の第２の電極を設けるよう構成される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記２つ以上の試料が、異なる生化学組成物を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１のチャンバーが、前記１つまたは複数の生化学組成物を撹拌するように構成された前記磁気撹拌子を含有する、請求項３０から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記多孔質膜がセルロース膜である、請求項３０から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記多孔質膜が、前記生化学組成物を保持するのに十分小さい細孔サイズを含む、請求項３０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記生化学組成物が、分子量約１５０ｋＤａのタンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記生化学組成物が、分子量約５０ｋＤａのタンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１の電極が負極（またはカソード）である、請求項３０から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１の電極が作用電極である、請求項３０から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記負極が白金を含む、請求項４６または請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１の電極がチタンを含まない、請求項３０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記作用電極が直流電源に接続されている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２の電極が正極（またはアノード）である、請求項３０から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２の電極が対電極である、請求項３０から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記正極が炭素を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記生化学組成物がタンパク質である、請求項３０から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーが緩衝液を含む、請求項３０から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記緩衝液がＰＢＳを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記緩衝液がグルコースおよびＥＤＴＡを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１の電極および第２の電極が、前記緩衝液中に浸漬されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記電圧または処理時間が、前記生化学組成物の前記ジスルフィド結合、硫黄−セレン結合またはジセレニド結合の前記還元の程度を制御するように調節される、請求項３０から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
コンジュゲーションステップにおいて、薬物分子、検出剤、イメージング剤、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを、前記ジスルフィド結合から誘導された１つまたは複数のスルフヒドリル基にコンジュゲートすることをさらに含む、請求項３０から６０のいずれか一項に記載の方法
【請求項６２】
前記コンジュゲーションステップが、前記緩衝液を交換せずに、既に前記還元ステップで使用された緩衝液中で行われる、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]本出願は、その出願が参照により本明細書に組み込まれる２０１６年５月６日に出願の米国仮特許出願第６２／３３２，７１６号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]バイオコンジュゲーションは、少なくとも一方がバイオ分子である２つの分子間で安定な共有結合を形成することに関する。バイオコンジュゲーションは、リンカーの、バイオ分子上の化学的活性部位との化学反応により、ある程度、行われ得る。このような化学的活性部位の１つは、スルフヒドリル基（−ＳＨ）であり、この基は、アミノ酸残基であるシステイン中に存在する。バイオ分子中のスルフヒドリル基は、空間的に隣接したシステイン残基間のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）として、一般にマスクされる。これらのジスルフィド結合は、スルフヒドリル基などの化学リンカーを生成するために還元されなければならない。これまで、バイオ分子中のジスルフィド結合の還元は、ジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）などの化学還元剤により行われてきた。このような化学還元剤を使用する欠点は、反応時間が長いこと（例えば、最大２４時間）、および後のバイオコンジュゲーションのために、バイオ分子を精製して、化学還元剤またはその酸化体を除去することが困難であることを含み得る。本明細書において、上述に対処する装置および方法が提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
[0003]ある種の実施形態では、挿入された第１の電極を含む第１のチャンバー、挿入された第２の電極を含む第２のチャンバー、および第１と第２のチャンバーを隔離し、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間の電気化学的連通をもたらすように構成される多孔質膜を含む電気化学デバイスであって、電圧が第１の電極と第２の電極との間に印加されると、第１および第２の電極が一緒になって作用して、第１のチャンバーに位置する１つまたは複数の生化学組成物を電気化学的に還元するように構成されている、電気化学デバイスが、本明細書において開示される。一部の実施形態では、第２のチャンバーの体積は、第１のチャンバーの体積より大きい。一部の実施形態では、第１のチャンバーは、第２のチャンバー内部に入れられている。一部の実施形態では、第２のチャンバーの体積は、第１のチャンバーの体積よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍大きい。一部の実施形態では、第１のチャンバーの体積は約３ｍＬであり、第２のチャンバーの体積は、約５０ｍＬである。一部の実施形態では、第１のチャンバーの体積は約３００μＬであり、第２のチャンバーの体積は、少なくとも１５０ｍＬである。一部の実施形態では、第１のチャンバーは、９６−ウェルプレート中のウェルで構成され、第２のチャンバーは、９６−ウェルプレートの底部に取り付けられた長方形チャンバーであり、第２のチャンバーは、各ウェルを長方形チャンバーから隔離する多孔質膜によって、９６−ウェルプレート中の各ウェルと電気化学的連通している。一部の実施形態では、本デバイスは、生化学組成物の２つ以上の試料を平行して還元できるように、９６−ウェルプレートの２つ以上のウェルに第１の電極、および長方形チャンバーに単一の第２の電極を設けるよう構成される。一部の実施形態では、２つ以上の試料は、異なる生化学組成物を含む。一部の実施形態では、第１のチャンバーは、１つまたは複数の生化学組成物を撹拌するように構成された磁気撹拌子を含有する。一部の実施形態では、多孔質膜はセルロース膜である。一部の実施形態では、多孔質膜は、生化学組成物を保持するのに十分小さい細孔サイズを含む。一部の実施形態では、生化学組成物は、分子量約１５０ｋＤａのタンパク質である。一部の実施形態では、生化学組成物は、分子量約５０ｋＤａのタンパク質である。一部の実施形態では、第１の電極は負極（またはカソード）である。一部の実施形態では、第１の電極は、作用電極である。一部の実施形態では、負極は白金を含む。一部の実施形態では、第１の電極はチタンを含まない。一部の実施形態では、作用電極は、直流電源に接続されている。一部の実施形態では、第２の電極が正極（またはアノード）である。一部の実施形態では、第２の電極は、対電極である。一部の実施形態では、正極は炭素を含む。一部の実施形態では、生化学組成物はタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体または抗体断片である。一部の実施形態では、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは緩衝液を含む。一部の実施形態���は、緩衝液はＰＢＳを含む。一部の実施形態では、緩衝液は、グルコースおよびＥＤＴＡを含む。一部の実施形態では、第１の電極および第２の電極は緩衝液中に浸漬されている。一部の実施形態では、第１および第２の電極は、一緒になって作用して、生化学組成物のジスルフィド、硫黄−セレン結合、ジセレニド結合またはそれらの組合せを電気化学的に還元するように構成されている。
【０００４】
[0004]ある種の実施形態では、生化学組成物中のジスルフィド結合、硫黄−セレン結合またはジセレニド結合を還元するための方法であって、挿入された第１の電極を含む第１のチャンバー、挿入された第２の電極を含む第２のチャンバー、および第１と第２のチャンバーを隔離し、第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間の電気化学的連通をもたらすように構成される多孔質膜を含む電気化学セルに、生化学組成物を挿入すること、生化学組成物を磁気撹拌子により撹拌すること、電気化学セルの第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加して、それにより、生化学組成物のジスルフィド結合、硫黄−セレン結合またはジセレニド結合を還元することを含む方法が本明細書において開示される。一部の実施形態では、電圧は３Ｖである。一部の実施形態では、電圧は１．５Ｖである。一部の実施形態では、第２のチャンバーの体積は、第１のチャンバーの体積より大きい。一部の実施形態では、第１のチャンバーは、第２のチャンバー内に入れられている。一部の実施形態では、第２のチャンバーの体積は、第１のチャンバーの体積よりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍大きい。一部の実施形態では、第１のチャンバーの体積は約３ｍＬであり、第２のチャンバーの体積は、約５０ｍＬである。一部の実施形態では、第１のチャンバーの体積は約３００μＬであり、第２のチャンバーの体積は、少なくとも１５０ｍＬである。一部の実施形態では、第１のチャンバーは、９６−ウェルプレート中のウェルで構成され、第２のチャンバーは、９６−ウェルプレートの底部に取り付けられた長方形チャンバーであり、第２のチャンバーは、各ウェルを長方形チャンバーから隔離する多孔質膜によって、９６−ウェルプレート中の各ウェルと電気化学的連通している。一部の実施形態では、本電気化学セルは、生化学組成物の２つ以上の試料を平行して還元できるように、９６−ウェルプレートの２つ以上のウェルに第１の電極、および長方形チャンバーに単一の第２の電極を設けるよう構成される。一部の実施形態では、２つ以上の試料は、異なる生化学組成物を含む。一部の実施形態では、第１のチャンバーは、１つまたは複数の生化学組成物を撹拌するように構成された磁気撹拌子を含有する。一部の実施形態では、多孔質膜はセルロース膜である。一部の実施形態では、多孔質膜は、生化学組成物を保持するのに十分小さい細孔サイズを含む。一部の実施形態では、生化学組成物は、分子量約１５０ｋＤａのタンパク質である。一部の実施形態では、生化学組成物は、分子量約５０ｋＤａのタンパク質である。一部の実施形態では、第１の電極は負極（またはカソード）である。一部の実施形態では、第１の電極は作用電極である。一部の実施形態では、負極は白金を含む。一部の実施形態では、第１の電極はチタンを含まない。一部の実施形態では、作用電極は、直流電源に接続されている。一部の実施形態では、第２の電極は正極（またはアノード）である。一部の実施形態では、第２の電極は対電極である。一部の実施形態では、正極は炭素を含む。一部の���施形態では、生化学組成物はタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体または抗体断片である。一部の実施形態では、第１のチャンバーおよび第２のチャンバーは緩衝液を含む。一部の実施形態では、緩衝液はＰＢＳを含む。一部の実施形態では、緩衝液は、グルコースおよびＥＤＴＡを含む。一部の実施形態では、第１の電極および第２の電極は緩衝液中に浸漬されている。一部の実施形態では、電圧または処理時間は、生化学組成物のジスルフィド結合、硫黄−セレン結合またはジセレニド結合の還元の程度を制御するように調節される。一部の実施形態では、本方法は、コンジュゲーションステップにおいて、薬物分子、検出剤、イメージング剤、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを、ジスルフィド結合から誘導された１つまたは複数のスルフヒドリル基にコンジュゲートすることをさらに含む。一部の実施形態では、コンジュゲーションステップは、緩衝液を交換せずに、還元ステップに既に使用した緩衝液中で行われる。
【０００５】
参照による組み込み
[0005]本明細書において明記される刊行物、特許および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、具体的かつ個々に示されて、その全体が参照により組み込まれているかのごとく、同じ程度にその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における用語と組み込まれた参照文献における用語との間に矛盾がある事象では、本明細書における用語が優先する。
【０００６】
[0006]本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される、例示的な実施形態を説明する以下の詳細説明、および以下の添付の図面を参照することにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】[0007]図１Ａは、バイオ分子中のジスルフィド結合の化学還元、および得られたスルフヒドリル基への薬物のコンジュゲーションを例示する模式図を提示する。
【図１Ｂ】[0008]図１Ｂは、一部の実施形態による、バイオ分子中のジスルフィド結合の電気化学的還元、および得られたスルフヒドリル基への薬物のコンジュゲーションを例示する模式図を提示する。
【図２Ａ】[0009]図２Ａは、一部の実施形態による、電気化学的還元のための装置を例示する模式図を提示する。
【図２Ｂ】[0010]図２Ｂは、一部の実施形態による、電気化学的還元のための装置の画像を提示する。
【図３】[0011]図３は、一部の実施形態による、抗体のＦ（ａｂ’）２断片中のジスルフィド結合の例となる電気化学的還元を例示する模型図を提示する。
【図４Ａ】[0012]図４Ａは、一部の実施形態による、３Ｖにおいて、様々な時間をかけた、抗体のＦ（ａｂ’）２断片中のジスルフィド結合の例となる電気化学的還元のタンパク質電気泳動図の画像を提示する。
【図４Ｂ】[0013]図４Ｂは、一部の実施形態による、１．５Ｖにおいて、様々な時間をかけた、抗体のＦ（ａｂ’）２断片中のジスルフィド結合の例となる電気化学的還元の電気泳動図の画像を提示する。
【図５Ａ】[0014]図５Ａは、３ｍＬの反応チャンバー、および円錐型遠心分離管から作製した５０ｍＬの外部チャンバーを含む電気化学デバイスの１つの非限定例の図を提示する。
【図５Ｂ】[0015]図５Ｂは、９６−ウェルプレートのウェルから作製した、３００μＬの複数の反応チャンバーを含む電気化学デバイスの写真を示し、作用電極が、１つまたは複数のウェルに挿入される。ウェルの底部が除去されて、透析膜が、各ウェルの底部に貼り付けられる。対電極は、９６−ウェルプレートの下側に固定された長方形の底部チャンバーに位置する。一部の実施形態では、単一作用電極が、単一ウェルに挿入される。一部の実施形態では、２個以上の作用電極、例えば、最大９６個の作用電極が、対応する数のウェルに挿入されて、複数の生化学組成物試料中のジスルフィドまたは関連する結合の還元を行う。
【図６】[0016]図６は、２０分間、１．５Ｖ（電圧Ｂ）で還元したｍＩｇＧ２ａ試料の、および２０分間、３Ｖ（電圧Ａ）で還元したｍＩｇＧ２ａ抗体の電気泳動図を示す。
【図７】[0017]図７は、時間の関数としての、電圧Ａ（３Ｖ）、電圧Ｂ（１．５Ｖ）および電圧Ｃ（２ｍＡの一定電流で、１．５〜２．５Ｖの間の動的電圧）の条件下で還元された試料の遊離スルフヒドリル濃度のデータを示す。挿入図：ＤＴＮＢ（エルマンの試薬）を使用して、遊離スルフヒドリル基の定量に使用した標準曲線。
【図８Ａ】[0018]図８Ａは、時間の関数としての、１．５Ｖの電位での還元後の、フルオロフォアコンジュゲートしたｍＩｇＧ２ａのＨＰＬＣクロマトグラフを示す。
【図８Ｂ】[0019]時間の関数としての、１．５Ｖの電位での還元後の、全ｍＩｇＧ２ａ濃度のＨＰＬＣクロマトグラフを示す。
【図９Ａ】[0020]図９Ａは、フルオロフォア濃度を検出するための蛍光トレースと抗体濃度を検出するための吸光度トレースの両方による、電気化学的に還元された試料のＨＰＬＣクロマトグラフである。グラフ中の挿入図は、マレイミド−ＣＹ５フルオロフォアにコンジュゲートした抗体を示すグラフである。
【図９Ｂ】[0021]図９Ｂは、蛍光トレースと吸光度トレースの両方による、化学的に還元された試料のＨＰＬＣクロマトグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
[0022]一部の実施形態において、生化学組成物を含む電解質を撹拌するように構成された第１のチャンバー、第２のより大きなチャンバー、第１のチャンバーと第２のチャンバーを隔離する多孔質膜、第１のチャンバーに挿入された第１の「作用」電極、および第２のチャンバーに挿入された、第２のより大きな「対」電極を含む電気化学装置が、本明細書において提供される。多孔質膜は、装置が電解質で満たされる場合に、第１および第２のチャンバー間に電気化学的連通をもたらすよう構成され得る。一部の実施形態では、多孔質膜は、少なくとも１５０ｋＤａのタンパク質を含む、生化学組成物を保持するサイズの細孔を有する、再生セルロース膜である。第１および第２の電極は、電圧が第１の電極と第２の電極との間に印加されると、一緒になって作用して、生化学組成物の１つまたは複数の残基を電気化学的に還元するように構成され得る。
【０００９】
[0023]同様に、一部の実施形態において、第１の電極を含む第１のチャンバーに生化学組成物をロードすること、生化学組成物を撹拌すること、および第１の電極と第２の電極間に、ある時間、電圧を印加すること、および還元ステップにおいて、生化学組成物中のジスルフィド結合、硫黄−セレン結合、ジセレニド結合またはそれらの組合せを還元することを含む、電気化学的還元方法が本明細書において提供される。第１の電極は、第１のチャンバーと第２のチャンバーを隔離する多孔質膜を介して、第２のチャンバーにおける第２の電極と電気化学的連通し得る。一部の実施形態では、本方法は、コンジュゲーションステップにおいて、薬物または化学部分を、ジスルフィド結合から誘導された１つまたは複数のスルフヒドリル基にコンジュゲートすること、ここで上記コンジュゲーションステップは、緩衝液を交換せずに、既に還元ステップで使用された緩衝液中で行われる、をさらに含む。
【００１０】
[0024]本明細書において提示された概念のこのような特徴および他の特徴は、以下の図面、説明および添付の特許請求の範囲を参照しながら、よりよく理解することができる。
[0025]ある種の概念およびその一部の実施形態が、一層詳細に提示される前に、本明細書に提示された概念および実施形態が限定されないことは、当業者により理解されるべきである。例えば、本明細書において提示されたいずれの実施形態における１つまたは複数の要素は、様々となり得ることを理解すべきである。前述を考慮して、１つまたは複数の実施形態からの１つまたは複数の要素は、任意の他の実施形態の要素と組み合わせることができる、任意の他の実施形態の要素またはそれらの一部の組合せと置き換えることができる。
【００１１】
[0026]本明細書において使用される用語は、本明細書に提供された概念および実施形態を説明する目的のためのものであり、この用語は限定することを意味するものではないことをやはり理解すべきである。特に示さない限り、序数（例えば、第１の、第２の、第３のなど）は、要素の群またはステップの群という点で、それぞれ異なる要素またはステップを区別するまたは特定するために使用される。序数は、一連のまたは数値的な制限をもたらさない。例えば、「第１の」、「第２の」および「第３の」要素またはステップは、必ずしも、その順に現れる必要はなく、実施形態は、それら３つの要素またはステップに限定されることを必ずしも必要としない。特に示さない限り、「左」、「右」、「前部」、「後部」、「上部」、「底部」、「前方向」、「後ろ方向」、「時計回り」、「反時計回り」、「上方」、「下方」、または「上側」、「下側」、「後方」、「前方」、「垂直方向」、「水平方向」、「近位」、「遠位」などの他の類似用語などの表示は、例えば、任意の特定の固定した位置、配向または方向を意味することを意図するものではない。代わりに、このような表示を使用して、例えば、相対的な位置、配向または方向を示す。「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が特に明確に示さない限り、複数の「参照物」を含むことをやはり理解すべきである。
【００１２】
[0027]特に定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語はすべて、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
[0028]生化学組成物：本明細書で使用する場合、言い回し「生化学組成物」（「バイオ分子」とも称する）は、以下に限定されないが、ペプチド、タンパク質、抗体、酵素、受容体またはそれらの断片を含めた、当業者に公知の様々な生物学的分子のうちのいずれかを指すことができる。一部の好ましい実施形態では、開示される方法および装置は、抗体および抗体断片の電気化学的還元を実施するために提供され得る。
【００１３】
[0029]化学結合：本開示の方法および装置は、化学的手段により還元されやすい任意の化学結合の電気化学的還元のために利用することができる。例には、以下に限定されないが、ジスルフィド結合、硫黄−セレン結合、ジセレニド結合、炭素−酸素結合、炭素−炭素結合、炭素−硫黄結合および炭素−リン結合、ならびにハロゲン化アリルおよびハロゲン化ベンジル、またはそれらの組合せが含まれる。一部の好ましい実施形態では、開示される方法および装置は、タンパク質分子、例えば、抗体分子またはその断片中のジスルフィド結合の電気化学的還元に利用される。
【００１４】
[0030]バイオコンジュゲーション：バイオコンジュゲーションは、２つの分子であって、その少なくとも一方がバイオ分子である、２つの分子間の安定な共有結合を形成することを含む。バイオコンジュゲーションは、化学部分またはリンカー分子の、バイオ分子上の化学的活性部位との化学反応により、ある程度、行われ得る。このような化学的活性部位の１つは、スルフヒドリル基（−ＳＨ）であり、この基は、アミノ酸残基であるシステイン中に存在する。バイオ分子中のスルフヒドリル基は、空間的に隣接したシステイン残基間のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）として一般に、マスクされる。これらのジスルフィド結合は、スルフヒドリル基などの化学的反応性基を生成するために還元されなければならない。これまで、バイオ分子中のジスルフィド結合の還元は、ジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）などの化学還元剤により行われてきた。このような化学還元剤を使用する欠点は、反応時間が長いこと（例えば、最大２４時間）、および後のバイオコンジュゲーションのために、バイオ分子を精製して、化学還元剤またはその酸化体を除去することが困難であることを含み得る。本明細書において、上述に対処する装置および方法が提供される。
【００１５】
[0031]様々なスルフヒドリル反応性（またはチオール反応性）コンジュゲーション化学のいずれも、化学部分をスルフヒドリル基に結合させるために使用することができる。例には、以下に限定されないが、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ−チオール、および他のスルフヒドリル反応剤またはチオール反応剤の使用が含まれる。これらの基の多くが、アルキル化（例えば、チオエーテル結合の形成による）またはジスルフィド交換（例えば、ジスルフィド結合の形成による）のどちらかにより、スルフヒドリル基にコンジュゲートする。
【００１６】
[0032]様々な化学部分のいずれも、所期の用途に応じて、スルフヒドリル基にコンジュゲートされ得る。例には、以下に限定されないが、有機低分子、薬物分子、リンカー分子、放射性標識体またはタグ、蛍光性標識体またはタグ、他の検出剤またはイメージング剤、ナノ粒子、コロイド粒子、磁気ビーズ、タンパク質分子（例えば、抗体、酵素または受容体）またはその断片、およびモルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、チオエステルペプチド核酸（ｔＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、ホスホロアミダイト、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドまたは核酸分子が含まれる。
【００１７】
[0033]用途：開示される方法および装置を使用して調製されるバイオコンジュゲートは、当業者に公知の様々な用途のいずれかに使用することができる。例には、以下に限定されないが、薬物送達、インビトロまたはインビボでのイメージング、分離および精製処理、バイオ分子の定量的または定性的評価などが含まれる。プロテオミクスにおける電気化学の使用には、以下に限定されないが、ペプチドの酸化または還元、ペプチド結合開裂、ジスルフィド還元、タンパク質の脱塩、表面マッピングのタンパク質酸化、ＤＮＡの酸化、ヌクレオシドなどが挙げられる。
【００１８】
[0034]方法および装置：上で明記した通り、一部の実施形態では、装置は、生化学組成物を含む電解質を撹拌するように構成された第１のチャンバー、第２のより大きなチャンバー、第１のチャンバーと第２のチャンバーを隔離する多孔質膜、第１のチャンバーに挿入された第１の電極、および第２のチャンバーに挿入された第２のより大きな電極を含めた装置が提供される。多孔質膜は、装置が電解質で満たされる場合に、第１および第２のチャンバー間に電気化学的連通をもたらすよう構成され得る。一部の実施形態では、多孔質膜は、少なくとも１５０ｋＤａのタンパク質を含む、生化学組成物を保持するサイズの細孔を有する、再生セルロース膜である。第１および第２の電極は、電圧が第１の電極と第２の電極との間に印加されると、一緒になって作用して、生化学組成物の１つまたは複数の残基を電気化学的に還元するように構成され得る。
【００１９】
[0035]上記の通り、一部の実施形態では、第１の電極を含む第１のチャンバーに生化学組成物をロードすること、生化学組成物を撹拌すること、および第１の電極と第２の電極間に、ある時間、電圧を印加すること、および還元ステップにおいて、生化学組成物中のジスルフィド結合、硫黄−セレン結合、ジセレニド結合またはそれらの組合せを還元することを含む方法が提供される。第１の電極は、第１のチャンバーと第２のチャンバーを隔離する多孔質膜を介して、第２のチャンバーにおける第２の電極と電気化学的連通し得る。一部の実施形態では、本方法は、コンジュゲーションステップにおいて、薬物または化学部分を、ジスルフィド結合から誘導された１つまたは複数のスルフヒドリル基にコンジュゲートすること、ここで上記コンジュゲーションステップは、緩衝液を交換せずに、既に還元ステップで使用された緩衝液中で行われる、をさらに含む。
【００２０】
[0036]図１Ａは、バイオ分子中のジスルフィド結合の化学還元、および得られたスルフヒドリル基への薬物のコンジュゲーションを例示する模式図を提示する。
[0037]示される通り、ＤＴＴまたはＴＣＥＰが使用されて、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）中のジスルフィド結合を化学的に還元し、スルフヒドリル基を生成することができ、続いて、この基の１つまたは複数に対して、薬物または化学部分をコンジュゲートすることができる。ジスルフィド結合の化学的還元の欠点は、化学還元剤が高価であること、反応速度が遅いこと、規模拡大性が未知であること、ならびに余剰の化学還元剤およびその酸化形態を除去するための精製が大がかりになることを含む。
【００２１】
[0038]図１Ｂは、一部の実施形態による、バイオ分子中のジスルフィド結合の電気化学的還元、および得られたスルフヒドリル基への薬物のコンジュゲーションを例示する模式図を提示する。
【００２２】
[0039]示した通り、本明細書において提示された概念によれば、ジスルフィド結合は、ｍＡｂ（または、他のバイオ分子）において電気化学的に還元することができ、スルフヒドリル基を生成することができ、続いて、この基の１つまたは複数に、薬物（例えば、化学療法剤）をコンジュゲートして、ＡＤＣを生成することができる。一部の実施形態では、当業者に公知の様々なスルフヒドリル反応性コンジュゲーション化学のいずれかを使用して、他の化学部分、例えば放射性標識体またはタグ、タグの蛍光性標識体、ナノ粒子、コロイド粒子、磁気ビーズなどが、遊離スルフヒドリル基にコンジュゲートし得る。このようなコンジュゲートを使用して、以下に限定されないが、薬物送達、インビトロまたはインビボでのイメージング、分離および精製処理、バイオ分子などの定量的または定性的評価を含めた様々な用途に使用することができる。ジスルフィド結合の電気化学的還元の有益性としては、臨床緩衝液製剤との適合性、反応速度の迅速性、規模拡大性および電気化学的還元装置の再利用性が挙げられる。
【００２３】
[0040]図２Ａは、一部の実施形態による、電気化学的還元のための装置２００を例示する模式図を提示する。図２Ｂは、一部の実施形態による、電気化学的還元のための装置２００の画像を提示する。
【００２４】
[0041]示される通り、装置２００は、タンパク質（例えば、抗体、酵素、受容体など）などの生化学組成物中の、少なくともジスルフィド結合、硫黄−セレン結合、ジセレニド結合などを電気化学的に還元することができる、電気化学セルを含む。装置２００は、より小さいチャンバー３とより大きなチャンバー５との間の多孔質膜１を含むことができ、より小さいチャンバー３は、生化学組成物が還元される半セルに相当し、より大きなチャンバー５は、電気化学セルのもう一方の半セルに相当する。電気化学セルは、作用電極２などの負極および対電極６などの正極からの電子の自由な流れを使用する。多孔質膜１は、生化学組成物がより小さいチャンバー３の内側で還元されるのを維持すると同時に、電子の自由な流れを可能にする。より小さいチャンバー３中での拘束は、生化学組成物を、還元のための作用電極の近くに維持し、同様に、より大きなチャンバー５で生化学組成物が希釈されるのを防止する。作用電極２（例えば、Ｐｔ）は、直流（「ＤＣ」）電源の正極リード端子に取り付けることができる。作用電極２の帯電表面において、例えば生化学組成物中のジスルフィド結合が還元される。生化学組成物を含む電解質（例えば、緩衝溶液）は、電気化学的還元全体を通して、完全に撹拌または混合されることが重要であり、そうでない場合、電気化学的還元は、所望の程度まで達成されない恐れがある。磁気撹拌子４は、生化学組成物を含めた電解質を撹拌するために、より小さいチャンバー３に含まれ得る。より大きなチャンバー５の体積は、より小さいチャンバー３の体積より大きいこともやはり重要である。例えば、より大きなチャンバー５は、より小さいチャンバー３より最大で５０倍（またはそれを超えて）大きいものとなり得る。本明細書において提供される例では、例えば、より大きなチャンバー５は、５０ｍＬとすることができ、より小さいチャンバー３は、３ｍＬとすることができる。優れた結果のためには、対電極６（例えば、炭素）は、より大きなチャンバー５の電解質（例えば、緩衝溶液）中に深く浸漬されるべきであり、対電極６は作用電極２より大きくあるべきである。
【００２５】
[0042]操作では、電圧が電気化学セルの作用電極と対電極間に印加されて、例えば、生化学組成物中のジスルフィド還元を起こさせ、スルフヒドリル基を生じさせる。装置２００またはその電気化学セルは、多孔質膜１としてセルロース膜を使用し、電気化学セルのより小さいチャンバー３とより大きなチャンバー５を隔離することができる。多孔質膜１（例えば、セルロース膜）は、小さいチャンバー３中の作用電極２とより大きなチャンバー５中の対電極６との間の電子の交換を可能にすると同時に、小さいチャンバー３中の生化学組成物を維持するほど、十分に小さい細孔を有することができる。多孔質膜１のこのような細孔は、生化学組成物のバイオ分子より、約３分の１、４分の１、５分の１または６分の１の分画分子量を有することができる。一部の実施形態では、多孔質膜１は、少なくとも１５０ｋＤａのタンパク質を含む、生化学組成物を保持するサイズの細孔を有する、再生セルロース膜である。例えば、再生セルロース膜は、約５０ｋＤａの分画分子量を有することができる。
【００２６】
[0043]生化学組成物の化学的還元方法は、化学還元剤を必要とし、多くの場合、反応時間が長い。本明細書において提供される装置および方法は、化学還元剤の必要性が解消され、ＡＤＣなどのバイオコンジュゲートを生成する際に、重要な第１ステップである、ジスルフィド結合、硫黄−セレン結合、ジセレニド結合を含めた、生化学組成物の還元に必要な時間が著しく短縮される。本明細書において提供される装置および方法は、最終的に、やはり一層純粋なバイオコンジュゲートをもたらす。実験室規模では、本明細書において提供される装置および方法は、化学還元剤を精製除去する必要性なしに、複数のバイオコンジュゲートの迅速かつ容易な入手が実現する。大規模では、本明細書において提供される装置および方法は、化学的還元の大規模化に伴うコストを排除し、バイオコンジュゲートの生産速度を向上させる。
【００２７】
[0044]本明細書において開示される方法および装置は、バイオコンジュゲーションを目的とするジスルフィド結合の電気化学的還元、およびこのような還元を実施するための電気化学セルに関する。バイオコンジュゲーション法は、２つの分子を化学的に連結するための方法であって、２つの分子の一方が、バイオ分子および他の化学部分である、方法として定義される。バイオコンジュゲーションは、本開示の一部の実施形態ではスルフヒドリル（−ＳＨ）である、化学部分の活性結合部位に基づくグループに分けられる。スルフヒドリルは、通常、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）に関与し、２個の硫黄原子間の結合の還元により利用可能とされる必要があり、この実施形態は、そのようにする新規な方法である。
【００２８】
[0045]化学還元剤およびその方法に対する、本明細書において提供される装置および方法の利点には、以下に限定されないが、反応速度の向上、強刺激性化学物質（ｈａｒｓｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）の不使用、再利用性、調節性（ｔｕｎａｂｉｌｉｔｙ）（および特異性）、およびある種の標準法との一体化が含まれる。反応速度の向上に関すると、例えば、ジスルフィド結合の電気化学的還元は、化学的還元の場合の数時間に対して、数分かかり得る。強刺激性化学物質の不使用に関すると、例えば、電気化学的還元は、化学還元剤の必要性を排除する。再利用性に関すると、例えば、電気化学的還元は電極の表面で起こるので、電極表面を単に清浄して再利用することができる。調節性（および特異性）に関すると、例えば、電気化学的還元は、部分的に電圧に基づくため、電圧は、各タイプのタンパク質、ならびに各タイプのタンパク質内の特定のジスルフィド結合、硫黄−セレン結合またはジセレニド結合に対してカスタマイズされ得る。ある種の標準法との一体化に関すると、例えば、電気化学的還元は、電解質用の標準製剤緩衝液を利用することができる。さらに、化学的還元の方法は、タンパク質が、コンジュゲーション中に、最終製剤中の緩衝条件とは異なる緩衝条件に供されることを必要とする。これは、不安定性および沈殿をもたらし得る。本明細書において提供される装置および方法は、抗体などのタンパク質が、電気化学的過程の期間、およびバイオコンジュゲーションを通じて、安定な緩衝液製剤中にあることを可能にする。
【００２９】
[0046]バイオコンジュゲーションは多数の形態をとり、通常、バイオ分子の化学的活性部分（内因性または人工的に生成されたかのどちらか）の使用、およびバイオ分子の領域と反応して、バイオ分子を化学部分につなぎとめることができる化学リンカーの生成を含む。このような化学的活性部分の１つは、バイオ分子中のスルフヒドリル基（−ＳＨ）であり、このような基を有する唯一のアミノ酸は、システインである。大部分のバイオ分子中のシステインスルフヒドリルは、別のシステインスルフヒドリルと一緒になって、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）で占められており、２つの基の間の結合は、バイオコンジュゲーションの化学連結のために還元されなければならない。これまで、これは、ＤＴＴまたはＴＣＥＰなどの還元剤を用いて行われてきたが、本方法は、結局、バイオコンジュゲーション工程からこれらの化学剤を排除し、この標準的なバイオコンジュゲーション工程よりもさらなる利点をもたらす。その標準的な工程では、コンジュゲーション前の還元のために１時間〜２４時間かかり、最終混合物は、化学還元剤を除去するために精製される。以下は、開示される方法および装置のいくつかの利点である：
１．還元速度：コンジュゲーションのためのジスルフィド結合の還元に、数時間に対して数分となる。
２．強刺激性化学物質の不使用：電気化学の使用により、化学還元剤の必要性が解消される。
３．還元試薬の再利用性：還元は電極表面で起こるので、電極を各反応のために洗浄し、再使用することができる。
４．調節性：還元は電圧に基づくので、値を設定することができ、タンパク質毎にカスタマイズすることができる。
５．標準製剤緩衝液を使用して作用する：現在の還元戦略は、コンジュゲーション中に、最終製剤とは異なる緩衝条件にタンパク質が供されることを必要とし、不安定化および沈殿の可能性が残る。本発明者らの方法は、タンパク質が、コンジュゲーション工程の間、その安定な緩衝液製剤中にあることを可能にする。
【００３０】
[0047]一例では、開示された方法は、臨床的使用および非臨床的使用のための抗体のバイオコンジュゲーションに使用するために提供され得るが、ジスルフィド還元が必要とされる、任意のコンジュゲーションに使用することもできる。この方法は、薬物を作製する工程において、還元化学物質の必要性が解消されるので、臨床分野においてとりわけ有用である。これは、コストを低下させて、安全性を高め、これらは、どちらも、医薬の開発に有益である。
【００３１】
[0048]開示された方法は、ジスルフィド還元のための電極に電圧を印加するために電気化学セルを使用する。電気化学セルのさらなる改変は、電気化学セルのチャンバーを隔離するセルロース膜を使用する。この膜は多孔質であるが、その細孔は、小さい体積中の金属電極とより大きな体積中の炭素電極との間の電子の交換を可能にしながら、小さい体積の容器中にタンパク質が入れられたままにするのに十分小さい。現行の標準法は、タンパク質、化学部分および還元剤を混合するための容器のみを必要とする。
【００３２】
[0049]小規模では、この方法は、還元を実施するために電気化学セルを必要とするので、現在の方法よりも多数の作業を使用することができるが、より大きな臨床的規模では、これら２種の方法の物質的特徴（physicality）は、非常に類似している。
【００３３】
[0050]この方法は、用途の規模および処理量に関して適合可能である。この方法は、規模拡大可能な現象である電子の流れを利用し、非常に迅速でもあり、このことは、高速処理用途にそれ自体を役立たせる。「規模」は、反応全体の体積を含む。
【００３４】
[0051]現在の方法は、化学物質とタンパク質との間の連結を行うための化学物質および時間を必要とする。本実施形態は、化学還元剤の必要性を排除し、タンパク質の化学結合を生成する際の重要な第１のステップとなる、タンパク質のジスルフィドを還元するために必要な時間を著しく短縮し、最終的に、よりきれいな最終バイオコンジュゲートを生成する。小規模では、これは、還元剤を精製除去することを必要としないで、複数のバイオコンジュゲートを生成するための迅速かつ容易な方法をもたらす。大規模では、この実施形態は、ジスルフィド還元の大規模化に伴うコストを排除し、最終バイオコンジュゲートの生産速度を向上させる。
【００３５】
[0052]図２Ａおよび図２Ｂは、本文書に記載される本発明の方法を行うことができる電気化学セルの一例を図示するが、他の類似装置であって、同様に可能であるが、略図に表示される数種の重要な構成要素から利益を受ける、他の類似装置を作製することができる。図２Ａ中の表示１は、３と記される、より小さいチャンバーと、５と記される、より大きなチャンバーとの間にある多孔質膜を指す。電気化学セルは、負の「作用」電極（２と記される）および正の「対」電極（６と記される）からの電子の自由な流れを使用し、この膜は、還元されているタンパク質をより小さい容器３内に維持しながらこの過程が起こることを可能にする。この閉じ込めは、タンパク質が希釈されるのを防ぎ、還元過程のために、２と記される電極の近くに維持される。図２Ａ中の２と記される白金電極は、ＤＣ電源の正のリード端子に取り付けられ、ジスルフィド結合はその帯電表面において還元されるが、溶液が、４と記される磁気撹拌子により過程全体を通して十分に混合されることが非常に重要であり、そうでない場合、還元はほとんどまたはまったく起こらない。電気化学セルにとって、５と記される容器の体積が、３と記される容器よりも大きく、この場合、約１７倍大きい（５０ｍｌ対３ｍｌ）こと、および６と記される炭素電極が容器５の緩衝液に深く浸漬されて、２と記される白金電極２よりも大きいことが重要である。
【００３６】
[0053]この方法は、図２Ａにおいて５と記されるチャンバーを、還元されることになるタンパク質が存在する同一の緩衝液を充填することにより開始し、第２のチャンバー（同じ図中の３と記される）が、より大きなチャンバーの上につるされ、中央に穴を有するキャップがねじ止めされる。この試料用緩衝液は、グルコースまたはスクロースのような、プロトン供与性化学物質を必要とする場合もあるし、または必要としない場合もある。磁気撹拌子（図２Ａ中で４と記される）は、図２Ａにおいて３と記されるチャンバーに、緩衝液中のタンパク質と一緒に添加される。白金電極（図２Ａ中、２と記される）は、３と記されるチャンバーに挿入され、そうして、チャンバーの底の真上に存在する。次に、２と記される電極は、ＤＣ電源の正極端子または赤色端子に取り付けられ、６と記される炭素電極は、同一のＤＣ電源の黒色端子または負極端子に取り付けられる。ＤＣ電源は、８分間、１．５ボルトに設定され、それと同時に、装置全体のとなりに置かれた磁気撹拌用プレートにより、磁気撹拌子が回転して、３と記されるチャンバー中の溶液（４と記される）を撹拌する。２〜８分後、ＤＣ電源および磁気撹拌用プレートの電源を切る。３と記されるチャンバーからタンパク質溶液を取り出して、新しい容器に移送し、この容器で、化学コンジュゲートを加えて、コンジュゲーション反応を行う。
【００３７】
[0054]チャンバー設計：上記の通り、本開示の電気化学装置は、様々なフォーマットおよび幾何学形状で構成することができる。一部の実施形態では、例えば、デバイスの第１および第２のチャンバーは、円筒型幾何学形状を含むことができ、同心的または非同心的のどちらかで並べることができる。図５Ａは、例えば、円錐型遠心分離管から作製された、３ｍＬの反応チャンバーおよび５０ｍＬの外部チャンバーを含む電気化学デバイスの非限定例の１つであり、この場合、２個のチャンバーは、断面が円筒形であり、同心的に並んでいる。
【００３８】
[0055]他のチャンバーの幾何学形状も可能である。例えば、一部の実施形態では、第１または第２のチャンバーの三次元幾何学形状は、球形、円筒形、楕円形、円錐形、半球形、立方体形、長方形または多面体とすることができ、または不規則な三次元幾何学形状を有してもよい。一部の実施形態では、第１および第２のチャンバーの三次元幾何学形状は、同一とすることができる。一部の実施形態では、第１および第２のチャンバーの三次元幾何学形状は、異なっていてもよい。
【００３９】
[0056]一部の実施形態では、第１または第２のチャンバーの体積は、約０．０１ｍＬ〜約１０００ｍＬの範囲であり得る。一部の実施形態では、第１または第２のチャンバーの体積は、少なくとも０．０１ｍＬ、少なくとも０．１ｍＬ、少なくとも１ｍＬ、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも１００ｍＬ、１０００ｍＬまたはそれより大きくてもよい。一部の実施形態では、第１または第２のチャンバーの体積は、最大でも２００ｍＬ、最大でも１００ｍＬ、最大でも１０ｍＬ、最大でも１ｍＬ、最大でも０．１ｍＬ、最大でも０．０１ｍＬまたはそれ未満であり得る。この段落に記載される下限値および上限値のいずれかが組み合わされて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、第１または第２のチャンバーの体積は、約０．１ｍＬ〜約１０ｍＬの範囲であり得る。当業者は、第１または第２のチャンバーが、この範囲内の任意の値、例えば約２．７ｍＬを有し得ることを認識する。
【００４０】
[0057]一般に、第２のチャンバーの体積は、第１のチャンバーの体積より大きい。一部の実施形態では、第２のチャンバーの体積は、第１のチャンバーの体積よりも、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍大きい。当業者は、第２のチャンバーの体積と第１のチャンバーの体積との比が、この範囲内の任意の値を有してもよく、例えば、第２のチャンバーの体積が、第１のチャンバーの体積よりも約１２倍大きくてもよいことを認識する。
【００４１】
[0058]開示される電気化学装置のチャンバーは、当業者に公知の様々な作製技法のうちのいずれを使用しても作製することができる。好適な作製技法の例には、従来的な機械加工、ＣＮＣ機械加工、射出成形、３Ｄ印刷、レーザーもしくはダイカットポリマーフィルムの１つまたは複数の層からなる整列体および積層体、あるいはフォトリソグラフィおよび湿式化学エッチング、乾式エッチング、深堀り反応性イオンエッチングまたはレーザーマイクロ機械加工などのいくつかのマイクロ作製技法のいずれかが含まれる。
【００４２】
[0059]チャンバーは、当業者に公知の様々な物質を使用して作製することができる。一般に、チャンバーを作製するために使用される１種または複数の物質は、非導電性であるべきであり、タンパク質または他のバイオ分子の非特異的な吸着に対して耐性もあるべきである。さらに、使用される物質の選択は、多くの場合、使用される作製技法の選択に依存し、その逆もある。好適な物質の例には、以下に限定されないが、ケイ素、ヒューズドシリカ、ガラス、様々なポリマーのいずれか、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；エラストマー）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリイミド、環式オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環式オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、光学的接着剤（ＮＯＡ）、エポキシ樹脂、非接着性物質（ｔｅｆｌｏｎ（ＰＴＦＥ）など）、またはこれらの物質の組合せが含まれる。一部の実施形態では、チャンバーの様々な構成要素を、様々な物質から作製することができる。
【００４３】
[0060]一部の実施形態では、本開示の電気化学装置は、多重化フォーマットを含んでもよく、すなわち、それらの装置は、１つよりも多い生化学組成物試料の電気化学的還元を平行して実施するように構成され得る。図５Ｂは、９６−ウェルプレートのウェルから作製した、３００μＬの複数の反応チャンバーを含む電気化学デバイスを例示しており、作用電極が、これらのウェルの１つまたは複数に挿入される。ウェルの底部が除去されて、透析膜が、各ウェルの底部に貼り付けられる。対電極は、９６−ウェルプレートの下側に固定された長方形の底部チャンバーに位置する。一部の実施形態では、単一作用電極が、単一ウェルに挿入される。一部の実施形態では、２個以上の作用電極、例えば、最大９６個の作用電極が、対応する数のウェルに挿入されて、複数の生化学組成物試料中のジスルフィド結合または関連する結合の還元を行う。これらの実施形態では、複数の生化学組成物試料は、同一の電気化学的還元緩衝液中に好ましくは懸濁され、同じ電圧設定および実施時間の処理パラメータを使用して処理される。一部の実施形態では３８４−ウェルプレートまたは１５３６−ウェルプレートのフォーマットで、同様の電気化学装置が構成され得る。
【００４４】
[0061]電極設計：開示される電気化学装置の第１および第２の電極は、様々な幾何学形状および寸法で構成され得るが、一般に、第２の電極は、第１の電極よりも好ましくは大きく、多孔質膜を経由する効率的な電子移動を促進して、第２の電極（すなわち、対電極）に起こる半反応が、作用電極に起こる還元過程を制限しないよう、十分に迅速に起こることを確実とする（それにより、第１のチャンバーに位置する生化学組成物の効率的な電気化学的還元が促進される）。
【００４５】
[0062]例えば、一部の実施形態では、電極は、円筒形（例えば、ワイヤ様またはロッド様）の幾何学形状を含むことができる。一部の実施形態では、電極は、長方形断面の幾何学形状を含むことができ、棒様またはプレート様の三次元幾何学形状を含むことができる。一部の実施形態では、電極は、メッシュまたはブラシ様幾何学形状を含むことができる。一部の実施形態では、電極は、回転盤幾何学形状を含むことができる。一部の実施形態では、第１の電極および第２の電極は、同じ幾何学的形状を有してもよい。一部の実施形態では、第１の電極および第２の電極は、異なる幾何学的形状を有してもよい。
【００４６】
[0063]本開示の電極は、当業者に公知の様々な作製技法のうちのいずれかを使用して、様々な物質のいずれかから作製することができる。
[0064]例えば、開示される電気化学装置の第１の電極（すなわち、作用電極であり、これは、負極またはカソードである）は、ワイヤ様、ロッド様またはプレート様の三次元幾何学形状を一般に有することができ、以下に限定されないが、白金、金、銀、チタン、酸化チタンなど、またはそれらの任意の組合せなどの、電気化学的に不活性な金属から、通常、作製することができる。一部の実施形態では、第１の電極は、チタンまたは酸化チタンを優先的に含まない。
【００４７】
[0065]開示される電気化学装置の第２の電極（すなわち、対電極であり、これは正極またはアノードである）は、ワイヤ様、ロッド様、プレート様、メッシュ様または回転盤の幾何学形状を一般に有することができ、炭素、金、白金、または当業者に公知の電気化学的に不活性な類似の物質から作製することができる。一部の実施形態では、第２の電極は炭素から優先的に作製され、平面、円筒形、または渦巻き型幾何学形状の炭素メッシュを含むことができる。一部の実施形態では、第２の電極は、網目状のガラス質炭素電極（すなわち、多孔質炭素電極）とすることができる。
【００４８】
[0066]一部の実施形態では、作用電極は炭素であり、対電極は白金である。
[0067]第１および第２の電極の寸法は、電気化学装置の構成、ならびに第１および第２のチャンバーの幾何学的形状および寸法に従い、様々となろう。例えば、円筒形、棒様またはプレート様の幾何学的形状を有する第１または第２の電極の場合、最大の断面寸法（例えば、円筒形電極の場合の直径、または棒様もしくはプレート様電極の場合、長さまたは幅）は、約０．１ｍｍ〜約２０ｍｍの範囲であり得る。一部の実施形態では、第１または第２の電極の最大の断面寸法は、少なくとも０．１ｍｍ、少なくとも０．５ｍｍ、少なくとも１ｍｍ、少なくとも２ｍ、少なくとも３ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも９ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、またはそれより長くてもよい。一部の実施形態では、第１または第２の電極の最大の断面寸法は、最大でも２０ｍｍ、最大でも１５ｍｍ、最大でも１０ｍｍ、最大でも９ｍｍ、最大でも８ｍｍ、最大でも７ｍｍ、最大でも６ｍｍ、最大でも５ｍｍ、最大でも４ｍｍ、最大でも３ｍｍ、最大でも２ｍｍ、最大でも１ｍｍ、最大でも０．５ｍｍ、最大でも０．１ｍｍ、またはそれより短くてもよい。この段落に記載される下限値および上限値のいずれかが組み合わされて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、第１または第２の電極の最大の断面寸法は、約１ｍｍ〜約９ｍｍの範囲であり得る。当業者は、第１または第２の電極の最大の断面寸法が、この範囲内の任意の値、例えば約７．５ｍｍを有し得ることを認識する。
【００４９】
[0068]一部の実施形態では、第１または第２の電極の長さ（または、最長の非断面寸法）は、約１ｍｍ〜約１００ｍｍの範囲であり得る。一部の実施形態では、第１または第２の電極の長さは、少なくとも１ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも３０ｍｍ、少なくとも４０ｍｍ、少なくとも５０ｍｍ、少なくとも６０ｍｍ、少なくとも７０ｍｍ、少なくとも８０ｍｍ、少なくとも９０ｍｍ、少なくとも１００ｍｍ、またはそれより長くてもよい。一部の実施形態では、第１または第２の電極の長さは、最大でも１００ｍｍ、最大でも９０ｍｍ、最大でも８０ｍｍ、最大でも７０ｍｍ、最大でも６０ｍｍ、最大でも５０ｍｍ、最大でも４０ｍｍ、最大でも３０ｍｍ、最大でも２０ｍｍ、最大でも１０ｍｍ、最大でも５ｍｍ、最大でも１ｍｍ、またはそれより短くてもよい。この段落に記載される下限値および上限値のいずれかが組み合わされて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、第１または第２の電極の長さは、約５ｍｍ〜約８０ｍｍの範囲であり得る。当業者は、第１または第２の電極の長さが、この範囲内の任意の値、例えば約８８ｍｍを有し得ることを認識する。
【００５０】
[0069]多孔質膜：開示される電気化学装置の第１および第２のチャンバーを隔離するために使用される多孔質膜は、当業者に公知の様々な膜または膜様物質のいずれかを含むことができる。例には、以下に限定されないが、透析膜（例えば、セルロースまたはセルロースエステル膜、ポリエチレン膜、ポリプロピレン膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、エッチドポリカーボネート膜またはコラーゲン膜）、多孔質ガラス（例えば、細孔制御グラス）などが含まれる。一部の好ましい実施形態では、多孔質膜はセルロース膜である。
【００５１】
[0070]多孔質膜は、平均細孔サイズよりも大きなバイオ分子を保持しながら、電子およびイオンが通過することを可能にする。一部の実施形態では、多孔質膜の平均細孔径は、約１０オングストローム〜約２００オングストロームの範囲であり得る。一部の実施形態では、平均細孔径は、少なくとも１０オングストローム、少なくとも２０オングストローム、少なくとも３０オングストローム、少なくとも４０オングストローム、少なくとも５０オングストローム、少なくとも６０オングストローム、少なくとも７０オングストローム、少なくとも８０オングストローム、少なくとも９０オングストローム、少なくとも１００オングストローム、少なくとも１２０オングストローム、少なくとも１４０オングストローム、少なくとも１６０オングストローム、少なくとも１８０オングストローム、少なくとも２００オングストローム、またはそれより大きくてもよい。一部の実施形態では、多孔質膜の平均細孔径は、最大でも２００オングストローム、最大でも１８０オングストローム、最大でも１６０オングストローム、最大でも１４０オングストローム、最大でも１２０オングストローム、最大でも１００オングストローム、最大でも９０オングストローム、最大でも８０オングストローム、最大でも７０オングストローム、最大でも６０オングストローム、最大でも５０オングストローム、最大でも４０オングストローム、最大でも３０オングストローム、最大でも２０オングストローム、最大でも１０オングストローム、またはそれより小さくてもよい。この段落に記載される下限値および上限値のいずれかが組み合わされて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、平均細孔径は、約３０オングストローム〜約１２０オングストロームの範囲であり得る。当業者は、平均細孔径が、この範囲内の任意の値、例えば約９５オングストロームを有し得ることを認識する。
【００５２】
[0071]一部の実施形態では、多孔質膜の分画分子量は、約１０ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲であり得る。一部の実施形態では、分画分子量は、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａ、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１２５ｋＤａ、少なくとも１５０ｋＤａ、少なくとも１７５ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａ、またはそれより大きくてもよい。当業者は、多孔質膜の分画分子量は、この範囲内の任意の値、例えば約６６ｋＤａを有し得ることを認識する。
【００５３】
[0072]電源：開示される電気化学的装置の第１および第２の電極は、電圧が第１の電極と第２の電極との間に印加されると、一緒になって作用して、第１のチャンバーに位置する１つまたは複数の生化学組成物を電気化学的に還元するように構成されている。当業者に公知の様々なＤＣ電源のいずれも使用することができる。好適なＤＣ電源の例には、以下に限定されないが、Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ２２２０／２２３０／２２３１ＤＣ電源、またはＫｅｉｔｈｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ２３００ＤＣ電源（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）が含まれる。一部の実施形態では、第１の電極は負極であってもよく、第２の電極は正極であってもよい。一部の実施形態では、第１の電極は正極であってもよく、第２の電極は負極であってもよい。一部の実施形態では、第１および第２の電極は、電圧が第１の電極と第２の電極との間に印加されると、一緒になって作用して、第１のチャンバーに位置する１つまたは複数の生化学組成物を電気化学的に酸化するように構成されている。
【００５４】
[0073]設定電圧、設定電流および処理時間：開示される方法および電気化学装置と共に使用される設定電圧および処理時間の調節により、還元工程を最適化して、反応の程度を制御することが可能となる。適切な設定電圧の例は、約０．１Ｖ〜約１０Ｖの範囲であり得る。一部の実施形態では、設定電圧は、少なくとも０．１Ｖ、少なくとも０．５Ｖ、少なくとも１Ｖ、少なくとも１，５Ｖ、少なくとも２Ｖ、少なくとも２．５Ｖ、少なくとも３Ｖ、少なくとも４Ｖ、少なくとも５Ｖ、少なくとも１０Ｖ、またはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、設定電圧は、最大でも１０Ｖ、最大でも５Ｖ、最大でも４Ｖ、最大でも３Ｖ、最大でも２．５Ｖ、最大でも２Ｖ、最大でも１．５Ｖ、最大でも１Ｖ、最大でも０．５Ｖまたは最大でも０．１Ｖであり得る。この段落に記載される下限値および上限値のいずれかが組み合わされて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、設定電圧は、約１．５Ｖ〜約４Ｖの範囲であり得る。当業者は、設定電圧が、この範囲内の任意の値、例えば約２．６Ｖを有し得ることを認識する。最適な設定電圧は、様々な実験および装置設計パラメータ、例えば、第１および第２のチャンバーの寸法、第１および第２の電極の寸法および幾何学的形状、多孔質膜の細孔サイズおよび細孔充填密度（したがって、電気抵抗）、緩衝液の導電性などに応じて、変わり得る。過度に高い設定電圧の使用は、大きなｐＨ変化および／またはバイオ分子の分解をもたらし得る。
【００５５】
[0074]一部の場合、設定電圧よりも設定電流を使用して、電気化学的工程を制御することができる。適切な設定電流の例は、約０．１ｍＡ〜約１Ａの範囲であり得る。一部の実施形態では、設定電流は、少なくとも０．１ｍＡ、少なくとも０．５ｍＡ、少なくとも１ｍＡ、少なくとも１．５ｍＡ、少なくとも２ｍＡ、少なくとも２．５ｍＡ、少なくとも３ｍＡ、少なくとも４ｍＡ、少なくとも５ｍＡ、少なくとも１０ｍＡ、少なくとも１００ｍＡ、少なくとも２００ｍＡ、少なくとも３００ｍＡ、少なくとも４００ｍＡ、少なくとも５００ｍＡ、少なくとも６００ｍＡ、少なくとも７００ｍＡ、少なくとも８００ｍＡ、少なくとも９００ｍＡ、少なくとも１Ａ、またはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、設定電流は、最大でも１Ａ、最大でも９００ｍＡ、最大でも８００ｍＡ、最大でも７００ｍＡ、最大でも６００ｍＡ、最大でも５００ｍＡ、最大でも４００ｍＡ、最大でも３００ｍＡ、最大でも２００ｍＡ、最大でも１００ｍＡ、最大でも１０ｍＡ、最大でも５ｍＡ、最大でも４ｍＡ、最大でも３ｍＡ、最大でも２．５ｍＡ、最大でも２ｍＡ、最大でも１．５ｍＡ、最大でも１ｍＡ、最大でも０．５ｍＡまたは最大でも０．１ｍＡでもよい。この段落に記載される下限値および上限値のいずれかが組み合わされて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、設定電流は、約１．５ｍＡ〜約１０ｍＡの範囲であり得る。当業者は、設定電流が、この範囲内の任意の値、例えば約２．６ｍＡを有し得ることを認識する。最適な設定電流は、様々な実験および装置設計パラメータ、例えば、第１および第２のチャンバーの寸法、第１および第２の電極の寸法および幾何学的形状、多孔質膜の細孔サイズおよび細孔充填密度（したがって、電気抵抗）、緩衝液の導電性などに応じて、様々となり得る。過度に高い設定電流の使用は、大きなｐＨ変化および／またはバイオ分子の分解をもたらし得る。
【００５６】
[0075]適切な処理時間の例は、約０．１分間〜約１００分間の範囲であり得る。一部の実施形態では、処理時間は、少なくとも０．１分間、少なくとも０．２５分間、少なくとも０．５分間、少なくとも０．７５分間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも６分間、少なくとも７分間、少なくとも８分間、少なくとも９分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、またはそれより長くてもよい。一部の実施形態では、処理時間は、最大でも１００分間、最大でも９０分間、最大でも８０分間、最大でも７０分間、最大でも６０分間、最大でも５０分間、最大でも４０分間、最大でも３０分間、最大でも２０分間、最大でも１０分間、最大でも９分間、最大でも８分間、最大でも７分間、最大でも６分間、最大でも５分間、最大でも４分間、最大でも３分間、最大でも２分間、最大でも１分間、最大でも０．５分間、最大でも０．１分間、またはそれより短くてもよい。この段落に記載される下限値および上限値のいずれかが組み合わされて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、処理時間は、約２分間〜約４分間の範囲であり得る。当業者は、処理時間が、この範囲内の任意の値、例えば約３．５分間を有し得ることを認識する。
【００５７】
[0076]電気化学的還元用緩衝液：当業者に公知の様々な緩衝液のいずれかを使用して、開示される方法を行うことができる。非限定例の１つは、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのグルコースを含む、ｐＨ７．４で緩衝化したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。グルコースは、還元反応のプロトン供与体として作用するので、重要な緩衝液の構成成分である。グルコース（または、スクロースなどの代替プロトン供与体）は、少なくとも０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１．５ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも２．５ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭまたは少なくとも２０ｍＭの濃度で含まれ得る。当業者は、電気化学的還元に使用されるグルコース濃度（または、代替的なプロトン供与体濃度）は、この範囲の任意の濃度、例えば約０．８ｍＭを有し得ることを認識する。ＥＤＴＡは、還元後のジスルフィド結合の再形成を防止し、グルコースの場合に使用される濃度と類似の濃度で使用され得る。
【００５８】
[0077]撹拌方法：開示された電気化学的還元装置の重要な特徴は、磁気撹拌子または他の撹拌機構を含むことである。還元される生化学組成物を含む第１のチャンバー中の溶液の激しい撹拌は、作用電極の表面において、生化学組成物の供給物を補充する働きをするので、効率的な還元にとって重要である。好適な撹拌機構の例（その一部は、電気化学装置それ自体に組み込まれていてもよく、その一部は、電気化学装置の外部に存在してもよい）には、以下に限定されないが、磁気撹拌子または磁気ビーズ、およびそれらの関連する磁場制御装置、シャフト推進式プラスチック製プロペラまたは羽などが挙げられる。
【実施例】
【００５９】
[0078]これらの実施例は、例示の目的のために提示されたに過ぎず、本明細書において提示される特許請求の範囲を限定するものではない。
実施例１：３ミリリットルの還元用チャンバーを備えた電気化学デバイス
[0079]この電気化学デバイスは、３ミリリットルの還元用チャンバーの体積フォーマットである。この電気化学デバイスは、外部チャンバー、内部チャンバー、作用電極、対電極、電解質およびプロトン供与剤を含む。外部チャンバーは、内部チャンバーより大きな体積を有する。外部チャンバーの体積は、５０ミリリットル（ｍＬ）である。内部チャンバーの体積は、３ｍＬである。内部チャンバーの底部は、多孔質膜である。還元される試料は、内部チャンバー内に入れられている。内部チャンバーおよび外部のチャンバーのどちらも、同一の電解質およびプロトン供与剤を含有する。作用電極は、白金であり、対電極は炭素である。電気化学デバイスの操作中、電位は、作用電極と対電極の間に印加される。内部チャンバーの多孔質膜により、内部チャンバー内に試料を維持しながら、膜間の電子の移動が可能である。図５Ａは、３ｍＬ反応チャンバーを備えた電気化学デバイスの図を示す。外部チャンバーは、５０ｍＬの円錐型遠心分離管である。対電極は、外部チャンバーの底にある穴から挿入される。内部チャンバーは、このチャンバーの上部にある外部チャンバーに挿入され、蓋を適用して、両チャンバーを覆う。作用電極は、蓋の穴から内部チャンバーに挿入される。
【００６０】
実施例２：３００マイクロリットルの還元用チャンバーを備えた電気化学デバイス
[0080]この電気化学デバイスは、３００マイクロリットル（μＬ）の還元用チャンバーの体積フォーマットである。この電気化学デバイスは、上部チャンバー、底部チャンバー、作用電極、対電極、電解質およびプロトン供与剤を含む。上部チャンバーは、３００μＬの反応体積を有する、９６−ウェルプレートのウェルである。ウェルの底は、機械式ドリル法により除去され、多孔質透析膜は、９６−ウェルプレートの下側に貼り付けられる。９６−ウェルプレートの底部の周辺に、水密性の１５０ｍｌ底部チャンバーが構築される。作用電極は、上部チャンバーに挿入される。対電極は、底部チャンバーに挿入される。図５Ｂは、３００μＬの反応チャンバーを備えた電気化学デバイスを示す。上部チャンバーは、９６−ウェルプレートのウェルの１つであり、作用電極は、このウェルに挿入される。ウェルの底部が機械式ドリル法により除去されて、透析膜が、ウェルの底部に貼り付けられる。対電極は、底部チャンバーに配置される。還元される試料は、チャンバーのウェルに加えられる。電気化学的還元中に、イオンが透析膜を通過し、試料はウェル内に維持される。
【００６１】
実施例３：モノクローナル抗体断片中のジスルフィド結合の還元
[0081]モノクローナル抗体中に存在するジスルフィド結合は、電気化学デバイス中で還元される。モノクローナル抗体断片は、二価の５０ｋＤａの抗原結合断片（Ｆ（ａｂ’）２）を含む。Ｆ（ａｂ’）２は、２つの抗原結合ドメインを結合し、軽鎖断片および重鎖断片を結合する、ジスルフィド結合を有する。図３は、抗体のＦ（ａｂ’）２断片中の抗原結合ドメインを連結するジスルフィド結合の電気化学的還元の例を説明する。
【００６２】
[0082]電気化学デバイスは、外部チャンバーおよび内部チャンバーを含む。外部チャンバーは、管の底にある穴から挿入された炭素電極を有する５０ミリリットル（ｍＬ）円錐型遠心管である。この管は、熱接着剤により炭素電極周辺で密封される。内部チャンバーは、再生セルロース膜による、３ｍＬの透析ユニット（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）ＭＩＮＩ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）である。電気化学デバイスは、外部チャンバーに、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を充填し、内部チャンバーをＰＢＳ緩衝液、還元されるＦ（ａｂ’）２断片、プロトン供与剤および磁気撹拌子を充填することにより準備される。プロトン供与剤は、グルコース、スクロースまたは別の二糖類である。内部チャンバーは、外部チャンバーにつるされ、円錐型遠心管の蓋は、外部チャンバー上にねじ止めされて、チャンバーを固定する。外部チャンバーの蓋は穴を含む。白金電極が、穴から内部チャンバーに挿入されて、その結果、その電極の先端は、内部チャンバーの底にある、セルロース膜の真上に位置決めされる。白金電極は、ＤＣ電源の正側に取り付けられ、炭素電極は、ＤＣ電源の負側に取り付けられる。磁気撹拌子が内部チャンバー中の溶液を混合しながら、一定電圧が電気化学デバイスに供給される。１回の試験では、３ボルト（Ｖ）の電位が、３０分間、電気化学セルに供給される。別の試験では、１．５Ｖの電位が、３０分間、電気化学セルに供給される。どちらの試験でも、ジスルフィド結合が還元されたかを試験するため、２分間毎に試料を採取する。割り当て時間の後、電圧の電源を切り、還元後処理のため、ｍＡｂ断片を取り出す。
【００６３】
[0083]ｍＡｂ断片の還元は、ゲル電気泳動によって決定される。図４Ａは、３Ｖで電気化学的に還元されたＦ（ａｂ’）２の電気泳動図を示す。ゲルの一番左のレーンは、サイズ参照ラダー（ｓｉｚｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｌａｄｄｅｒ）である。その後のレーンはそれぞれ、２分間の時間間隔の間に採取された試料である。０分および２分で採取した試料は、実質的部分の５０ｋＤａのＦ（ａｂ’）２、ならびに少量部分の２５ｋＤａのＦ（ａｂ’）および１２．５ｋＤａの断片の両方を含有する。４分から３０分の間に採取した試料は、ｍＡｂ断片の完全な分解を示す。図４Ｂは、１．５Ｖで電気化学的に還元されたＦ（ａｂ’）２の電気泳動図を示す。ゲルの一番左のレーンは、サイズ参照ラダーである。その後のレーンはそれぞれ、２分間の時間間隔の間に採取された試料である。０分および２分で採取した試料は、実質的部分の５０ｋＤａのＦ（ａｂ’）２断片、ならびに少量部分の２５ｋＤａのＦ（ａｂ’）および１２．５ｋＤａの断片の両方を含有する。４分および６分で採取した試料は、Ｆ（ａｂ’）２断片の量の減少、ならびにＦ（ａｂ’）および１２．５ｋＤａの断片の量の増加を示す。８分で採取した試料は、無視できる量のＦ（ａｂ’）２、ならびにＦ（ａｂ’）および１２．５ｋＤａの断片の量のさらなる増加を示す。約２０分間後、Ｆ（ａｂ’）２は完全に分解された。
【００６４】
実施例４：電気化学的還元のための印加電圧の調節
[0084]試料の凝集または分解の増大なしにジスルフィドの還元を可能にするために、電気化学的還元中に印加電圧を調節する。還元される試料は、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ２ａ）抗体を含み、実施例１に記載される電気化学デバイスを使用して還元される。試料は、ＰＢＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４の緩衝液中で還元し、ここでは、グルコースはプロトン供与剤として作用する。１つの試料は、２０分間印加された１．５Ｖの電位により還元される。別の試料は、２０分間印加された３Ｖの電位により還元される。０、４、８および２０分で、一定分量の試料を採取する。試料の還元は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液を用いて実施した、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（ビストリス）ゲル上で、２マイクログラム（μｇ）の試料のゲル電気泳動により決定する。図６は、２０分間、１．５Ｖ（電圧Ｂ）で還元されたｍＩｇＧ２ａ試料、および２０分間、３Ｖ（電圧Ａ）で還元されたｍＩｇＧ２ａ抗体の電気泳動図である。一番左のレーンは、サイズ参照ラダーである。レーン１は、非還元ｍＩｇＧ２ａ対照である。レーン２、３、４および８は、それぞれ、０、４、８および２０分間、１．５Ｖで還元されたｍＩｇＧ２ａ試料である。レーン６、７および８は、それぞれ４、８および２０分間、３Ｖで還元されたｍＩｇＧ２ａ試料である。１．５Ｖで還元した試料は、電圧が印加された２０分間にわたり、還元されない。３Ｖで還元された試料は、約８分で部分的な分解を示し、２０分で、完全な分解を示す。
【００６５】
実施例５：電気化学的還元後の遊離スルフヒドリルの検出
[0085]還元を、電気化学的還元が行われた後の遊離スルフヒドリルの存在によって確認する。遊離スルフヒドリルを、５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｄｉｃ  ａｃｉｄ））（ＤＴＮＢ）を用いて検出する。ＤＴＮＢは、スルフヒドリル含有化合物と反応して、４１２ナノメートル（ｎｍ）において吸収を示し、ジスルフィド含有化合物と反応しない、黄色を生じる。遊離スルフヒドリルを含有するアミノ酸であるシステインを使用して、標準曲線を生成する。標準曲線は、目的試料中の測定された遊離スルフヒドリル濃度を計算するために使用される。還元される試料は、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ２ａ）抗体を含み、実施例１に記載される電気化学デバイスを使用して還元される。試料は、ＰＢＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４の緩衝液中で還元され、ここでは、グルコースはプロトン供与剤として作用する。１つの試料は、１．５Ｖの印加電位（電圧Ｂ）で還元される。１つの試料は、３Ｖの印加電位（電圧Ａ）で還元される。別の試料は、１．５Ｖ〜２．５Ｖ（電圧Ｃ）の範囲の電圧および２ミリアンペア（ｍＡ）の一定電流で還元される。８分間、１分毎に一定分量の試料を採取する。図７は、時間の関数として、電圧Ａ、電圧Ｂおよび電圧Ｃの条件下で還元された試料の遊離スルフヒドリル濃度を示す。電圧Ａの条件により還元された試料は、０〜８分間の時間の関数として、遊離スルフヒドリルの濃度が増加していることを示す。電圧Ｂおよび電圧Ｃの条件で還元された試料は、０〜８分間、遊離スルフヒドリル基濃度が変化していることを示す。
【００６６】
実施例６：電気化学的還元後のバイオコンジュゲーション効率の検出
[0086]電気化学的還元により、ジスルフィド結合が還元されて、バイオコンジュゲーション反応のためのスルフヒドリル基が遊離する。還元される試料はｍＩｇＧ２ａ抗体を含み、実施例１に記載される電気化学デバイスを使用して還元される。試料は、ＰＢＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４の緩衝液中で還元され、ここでは、グルコースはプロトン供与剤として作用する。試料は、１．５Ｖの電位で還元される。２、４、６および８分で、一定分量の試料を採取する。ｍＩｇＧ２ａ抗体中の遊離スルフヒドリルは、フルオロフォアに結合するスルフヒドリル反応性リンカーである、マレイミド−シアニン５と反応する。ＰＤ１０脱塩カラムを使用して、一定分量を精製し、過剰のマレイミド−シアニン５を除去する。疎水性相互作用カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、抗体および全抗体濃度に対するフルオロフォアのコンジュゲートを検出する。図８Ａは、時間の関数として、１．５Ｖの電位での還元後の、フルオロフォアコンジュゲートしたｍＩｇＧ２ａのクロマトグラフを示す。励起波長は６４６ｎｍであり、発光波長は６６２ｎｍである。２分で採取した一定分量分は、抗体にコンジュゲートしたフルオロフォアの最大濃度を示す。フルオロフォアがコンジュゲートした抗体の濃度は、８分間まで、各時点と共に低下する。８分で採取した一定分量分は、抗体にコンジュゲートしたフルオロフォアの最低量を示す。図８Ｂは、時間の関数として、１．５Ｖの電位での還元した後の、全ｍＩｇＧ２ａ濃度のクロマトグラフを示す。検出波長は、２１４ｎｍである。クロマトグラフからピークのシフトがないことが示され、曲線下面積がすべての時点にわたりほぼ一定であり、実質的な分解が起こらなかったことを示す。
【００６７】
実施例７：電気化学的還元および化学的還元の比較
[0087]コンジュゲーション効率および抗体分解を、電気化学的還元技法および化学的還元技法の後に比較する。実施例６において記載される通り、２分間、１．５Ｖの電気化学電位の印加により、電気化学的還元を行った。試料中の遊離スルフヒドリルを、マレイミド−シアニン５フルオロフォアと反応させる。ＰＤ１０脱塩カラムを使用して試料を精製し、コンジュゲートしていないフルオロフォアを除去する。ＨＰＬＣを使用して、コンジュゲートしたフルオロフォア濃度および抗体濃度を検出する。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とｍＩｇＧ２ａとのモル比１０：１で、３０分間、別の試料を化学還元し、次に、スルフヒドリル反応性マレイミド−シアニン５フルオロフォアを５：１のモル比で、一晩、インキュベートし、試料を、ＰＤ１０脱塩カラムを使用して精製し、過剰のフルオロフォアを除去する。図９Ａは、フルオロフォア濃度を検出するための蛍光トレースと抗体濃度を検出するための吸光度トレースの両方による、電気化学的に還元された試料のＨＰＬＣクロマトグラフを示す。図９Ｂは、蛍光トレースと吸光度トレースの両方による、化学的に還元された試料のＨＰＬＣクロマトグラフを示す。電気化学的に還元された試料は、コンジュゲートしたフルオロフォア濃度とタンパク質濃度のどちらの場合も、単一の狭いピークを示す。化学的に還元された試料は、二次濃度ピークを示し、非均一試料であることを示す。化学的に還元された試料はまた、幅広い蛍光ピークを示す。
【００６８】
[0088]上述の概念およびその実施形態は、かなり詳細に提示されているが、本明細書に提示された概念および実施形態が限定されることを本出願人は意図しない。さらなる改変および／または修飾が可能であり、一層幅広い態様において、これらの改変および／または修飾も包含される。したがって、以下の特許請求の範囲により与えられる範囲から逸脱することなく、上述の概念および実施形態から逸脱し得るが、この範囲は、適切に解釈される場合の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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