(57)【要約】【課題】抗老人性認知症活性及び抗酸化活性を有し、かつその活性が陽性対照薬よりも優れ、老人性認知症などの神経変性疾患の予防及び治療に用いることができるジカフェオイルスペルミジン環化誘導体の提供。【解決手段】  以下の構造を有することを特徴とする、ジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩。2019501975.tif 000010 【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有することを特徴とする、ジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩であって、
2019501975.tif 000008
式中、
R1、R2及びR3はヒドロキシ、メトキシ、または任意に置換されたグリコシルであり、R4およびR5はともに-CH =または-CH2-であり、R6およびR7はともに-CH =または-CH2-であり、
前記任意に置換されたのは任意に、グリコシル、グルクロニル、マンノシル、ガラクトシル、アロシル、フルクトシル、ソルボシル、フラノシル、ラムノシル、キノボシル、アラビノシル、リキソシル、キシロシル、リボシルからなる群より選ばれる単糖基、および前記単糖から形成される二糖基又は多糖基の1つ又は複数に置換される。
【請求項２】
前記薬学的に許容される塩が式（1）で示されるジカフェオイルスペルミジン環化誘導体と無機酸または有機酸から形成される塩であることを特徴とする、請求項1に記載のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記無機酸が塩酸、臭化水素酸、硫酸または硝酸であり、前記有機酸がトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、マロン酸、酪酸、乳酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、マレイン酸、安息香酸、コハク酸、ピクリン酸、酒石酸、クエン酸またはフマル酸であることを特徴とする、請求項2に記載のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
式（1）で示される化合物が
2019501975.tif 000009
であることを特徴とする、請求項1〜3の何れかに記載のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
神経変性疾患を予防及び治療する医薬品の製造のための請求項1〜4の何れかに記載のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項６】
前記神経変性疾患が老人性認知症、パーキンソン病、多発性硬化症およびハンチントン病の1種または複数種であることを特徴とする、請求項5に記載の使用。
【請求項７】
前記神経変性疾患が老人性認知症であり、前記老人性認知症がアルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症または前頭側頭型認知症であることを特徴とする、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
活性成分としての請求項1〜4の何れかに記載のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする、退行性疾患の予防及び治療のための医薬組成物。
【請求項９】
活性成分としてのジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩の含有量が医薬組成物の1重量％〜90重量％であることを特徴とする、請求項8に記載の変性疾患の予防及び治療のための医薬組成物。
【請求項１０】
（1）クコシを体積比60:40のエタノール−水で加熱還流し、毎回2時間3回抽出し、濾過後、濾液を減圧濃縮して濃縮液を得る工程、
（2）濃縮液をマクロポーラス樹脂カラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が0:100、30:70、50:50、70:30及び95:5のエタノール−水で溶出し、F1、F2、F3、F4、F5の5つの画分を得る工程、
（3）体積比30:70のエタノール−水で溶出して得た画分F2を常圧下でシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が95:5:0、90:10:1、85:15:1.5、80:20:2、70:30:3、60:40:4、50:50:5、40:60:6及び0:100:0のクロロホルム−メタノール−水で溶出し、F2.1、F2.2、F2.3、F2.4、F2.5、F2.6、F2.7、F2.8、F2.9及びF2.10合計で10の副画分を得る工程、
（4）体積比40:60:6のクロロホルム−メタノール−水で溶出して得た副画分F2.9を中低圧液相ODSカラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が5:95:0.1、10:90:0.1、15:85:0.1、20:80:0.1、25:75:0.1、30:70:0.1、40:60:0.1及び100:0:0のメタノール−水−トリフルオロ酢酸で溶出し、F2.9.1、F2.9.2、F2.9.3、F2.9.4、F2.9.5、F2.9.6、F2.9.7、F2.9.8及びF2.9.9合計で9つの副画分を得る工程、
（5）体積比15:85:0.1のメタノール−水−トリフルオロ酢酸で溶出して得た副画分F2.9.6を逆相分取HPLCで調製し、流速が8 mL/min、体積比が20:80:0.1のメタノール−水−トリフルオロ酢酸で溶出して得る工程、を含むことを特徴とする、請求項1〜4の何れかに記載のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然薬物分野に属し、より詳細には、ジカフェオイルスペルミジン環化誘導体及び神経変性疾患の予防と治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、慢性進行性神経疾患の一種であり、特定の領域における遅発性神経細胞の変性病変、細胞喪失を共通特徴とし、ニューロンまたはそのミエリンの喪失に起因し、かつ経時的に悪化し、機能障害になる。神経変性疾患は、表現型によって、一般に、小脳性運動失調症、パーキンソン病などの運動に影響を及ぼすものと、記憶及びそれに関連する機能に影響を及ぼす認知症との2種に分けられる。現在、神経変性疾患の治療薬はまだ少ない。
【０００３】
老人性認知症は神経変性疾患の1つであり、多病因異質性疾患であり、進行性の認知機能障害および記憶障害を特徴とする中枢神経系の退行性疾患症候群であり、知能（記憶力、学習能力、方向認識能力、言語能力、理解力、判断力を含む）の低下に表される。この疾患は、多くの要因（生物学的および心理社会的要因を含む）の影響で発病し、家族歴、頭部外傷、甲状腺疾患、ウイルス感染など30種類余りの可能病因と仮説を有する。老人性認知症は一般的にアルツハイマー病（Alzheimer’s disease，AD）、血管性認知症（Vascular dementia，VA）、レビー小体型認知症（Dementia with Lewy bodies，DLB）および前頭側頭型認知症（Frontotemporal dementia，FTD）などをよく見かけている。全ての認知症患者において、アルツハイマー病患者は、50〜70％を占め、老人性認知症の最もよく見かけるタイプである。
【０００４】
現在、老人性認知症の治療は主として、（1）投与薬物が主にアルプラゾラム、オキサゼパム、トリアゾラムなどの抗不安薬と、プロザック、パロキセチン、セルトラリンなどの抗うつ薬と、リスペリドン、オランザピンなどの抗精神病薬を含む、付随の精神病理学的状態を制御する対症療法と、（2）投与薬物が主にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体拮抗薬（NMDA）、エストロゲン剤および脳代謝促進薬を含む知能の向上または認知機能の改善方法に分けられている。これらの薬物は、患者の認知症症状をある程度改善できるが、根本的に病状悪化を防止することや、病状を逆転させることはできない。従って、抗老人性認知症薬の研究開発が世界中の注目を集め、多くの関連の生物活性スクリーニングと評価システムがすでに確立された。 既存の多数の全動物モデルにおいて、フルーツフライは最も熟知されるモデル生物の1つであり、個体の空間占有率が非常に小さく（一般的に、1つの試薬ボトルが数千のフルーツフライを培養することができる）、飼養コストが低く、培養しやすく、繁殖速度が速く、かつ繁殖力が強く（スクリーニングスループットが高い）、サンプル消費量が低く（5〜50mg）、短ライフサイクル（約50日間、活性試験期間が短い）、年齢関連のニューロン退化が明らかであるなどの、他のモデルの動物と比較できない利点を持っており、老人性認知症などの神経変性疾患の研究及び薬物スクリーニングにとって理想的なモデルである。
【０００５】
ジカフェオイルスペルミジン誘導体は希少な植物成分であり、従来の研究が少ない。以前、ジカフェオイルスペルミジン環化誘導体に関する報告はない。本発明は、クコシからジカフェオイルスペルミジン環化誘導体を発見し、かつ分離した。フルーツフライモデルにより、それが神経変性疾患、特に老年性認知症を予防及び治療する活性を有することが証明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の1つの目的は下記の構造式で表されるジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩を提供することである。
2019501975.tif 000002
式中、
R1、R2及びR3はヒドロキシ、メトキシ、または任意に置換されたグリコシルであり、R4およびR5は、ともに-CH＝または-CH2-であり、R6およびR7は、ともに-CH＝または-CH2-であり、前記任意に置換されたのは任意に、グリコシル、グルクロニル、マンノシル、ガラクトシル、アロシル、フルクトシル、ソルボシル、フラノシル、ラムノシル、キノボシル、アラビノシル、リキソシル、キシロシル、リボシルなど種々の単糖基、及び前記単糖から形成される種々の二糖基および多糖基などのグリコシルの1つ又は複数に置換される。
【０００７】
本発明のもう1つの目的は、神経変性疾患を予防または治療するための医薬におけるジカフェオイルスペルミジン環化誘導体およびその薬学的に許容される塩の使用を提供することである。前記神経変性疾患は老人性認知症、パーキンソン病、多発性硬化症およびハンチントン病の1種または複数種を含むが、これらに限定されなく、好ましくは老人性認知症であり、より好ましくは、前記老人性認知症がアルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症および前頭側頭型認知症である。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、神経変性疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することであり、前記医薬組成物は活性成分としての式（I）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される賦形剤を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
下記の構造式で表されるジカフェオイルスペルミジン環化誘導体又はその薬学的に許容される塩を提供することである。
2019501975.tif 000003
式中、
R1、R2及びR3はヒドロキシ、メトキシ、または任意に置換されたグリコシルであり、R4およびR5は、ともに-CH＝または-CH2-であり、R6およびR7は、ともに-CH＝または-CH2-であり、前記任意に置換されたのは任意に、グリコシル、グルクロニル、マンノシル、ガラクトシル、アロシル、フルクトシル、ソルボシル、フラノシル、ラムノシル、キノボシル、アラビノシル、リキソシル、キシロシル、リボシルなど種々の単糖基、及び前記単糖から形成される種々の二糖基および多糖基などのグリコシルの1つ又は複数に置換される。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態において、前記式（I）で示される化合物は、好ましくは、下記の構造式を有する化合物である。
2019501975.tif 000004
【００１１】
本発明において、式（I）のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体の薬学的に許容される塩は、式（I）のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体と、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸などの無機酸、またはトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、マロン酸、酪酸、乳酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、マレイン酸、安息香酸、コハク酸、ピクリン酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸などの有機酸から形成される塩である。
【００１２】
神経変性疾患を予防または治療するための医薬におけるジカフェオイルスペルミジン環化誘導体およびその薬学的に許容される塩の使用であり、前記神経変性疾患は老人性認知症、パーキンソン病、多発性硬化症およびハンチントン病の1種または複数種を含むが、これらに限定されなく、好ましくは老人性認知症であり、より好ましくは、前記老人性認知症がアルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症および前頭側頭型認知症である。
【００１３】
前記ジカフェオイルスペルミジン環化誘導体はナガバクコ（Lycium barbarum）の果実であるクコシから分離して得られるものである。クコシは中国寧夏回族自治区中寧県から採集するものである。サンプルは曁南大学薬学院漢方薬及び天然薬物研究所（No. LYBA-2013-NX-ZN、所在地：中国広州市黄浦大道西601号、曁南大学薬学院、510632）に保管されている。
【００１４】
前記ジカフェオイルスペルミジン環化誘導体およびその薬学的に許容される塩の製造方法は、具体的には、
（1）クコシを体積比60:40のエタノール−水で加熱還流し、毎回2時間3回抽出し、濾過後、濾液を減圧濃縮して濃縮液を得る工程、
（2）濃縮液をマクロポーラス樹脂カラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が0:100、30:70、50:50、70:30及び95:5のエタノール−水で溶出し、F1、F2、F3、F4、F5の5つの画分を得る工程、
（3）体積比30:70のエタノール−水で溶出して得た画分F2を常圧下でシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が95:5:0、90:10:1、85:15:1.5、80:20:2、70:30:3、60:40:4、50:50:5、40:60:6及び0:100:0のクロロホルム−メタノール−水で溶出し、F2.1、F2.2、F2.3、F2.4、F2.5、F2.6、F2.7、F2.8、F2.9及びF2.10合計で10の副画分を得る工程、
（4）体積比40:60:6のクロロホルム−メタノール−水で溶出して得た副画分F2.9を中低圧液相ODSカラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が5:95:0.1、10:90:0.1、15:85:0.1、20:80:0.1、25:75:0.1、30:70:0.1、40:60:0.1及び100:0:0のメタノール−水−トリフルオロ酢酸で溶出し、F2.9.1、F2.9.2、F2.9.3、F2.9.4、F2.9.5、F2.9.6、F2.9.7、F2.9.8及びF2.9.9合計で9つの副画分を得る工程、
（5）体積比15:85:0.1のメタノール−水−トリフルオロ酢酸で溶出して得た副画分F2.9.6を逆相分取HPLCで調製し、流速が8 mL/min、体積比が20:80:0.1のメタノール−水−トリフルオロ酢酸で溶出し、本発明に記載のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体を得る工程、を含む。
【００１５】
神経変性疾患を予防または治療するための医薬組成物であり、前記医薬組成物は活性成分としての式（I）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００１６】
式（I）で示される化合物は、式（II）または式（III）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩が好ましく、薬学的に許容される賦形剤は、希釈剤、潤滑剤、接着剤、崩壊剤、安定剤、溶媒などを含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の前記希釈剤はデンプン、微結晶セルロース、スクロース、デキストリン、乳糖、粉砂糖、グルコースなどを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
前記潤滑剤はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、塩化ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポロキサマーなどを含むが、これらに限定されない。
【００１９】
前記接着剤は水、エタノール、デンプンスラリー、シロップ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
前記崩壊剤は重炭酸ナトリウムおよびクエン酸、酒石酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどのデンプン発泡性混合物などを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
前記安定剤はアカシア、寒天、アルギン酸、セルロースエーテルおよびカルボキシメチルキチンなどの多糖を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
前記溶媒は水、平衡塩溶液などを含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、経口投与または注射投与であってよい。それに応じ、前記医薬組成物の剤形は固体経口製剤、液体経口製剤、注射剤などを含むが、これらに限定されない。
【００２４】
好ましくは、前記固体経口製剤は錠剤、顆粒剤、カプセル剤、滴下丸薬、散剤などを含み、液体経口製剤は経口液体、乳剤などを含み、注射剤は小水注射剤、大輸液、凍結乾燥粉末注射剤などを含む。
【００２５】
さらに好ましくは、前記錠剤は分散錠、腸溶錠などを含む。
【００２６】
本発明の各製剤は医薬分野における通常のプロセスによって調製することができる。
【００２７】
本発明の医薬製剤における活性成分（即ち、本発明の化合物）の含有量は、患者の病状、医師の診断状況に応じて、具体的に適用することができる。 活性化合物の使用量又は濃度は比較的広い範囲にわたって調節され、活性化合物の含有量範囲は医薬組成物の1重量％〜90重量％である。
【発明の効果】
【００２８】
従来技術と比較し、本発明は下記のメリット及び有益効果を有する。本発明に示されるジカフェオイルスペルミジン環化誘導体は、新規なジカフェオイルスペルミジン環化誘導体であり、本発明は生物活性測定試験により、本発明のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体が抗老人性認知症活性及び抗酸化活性を有することを表し、その活性が陽性対照薬より優れ、又は陽性対照薬に匹敵し、老人性認知症患者の認知機能を著しく改善でき、老人性認知症及び神経変性疾患の予防及び治療に適する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図しており、本発明をさらに限定するものではない。本発明は、発明の開示に記載された形態のいずれかで実施することができる。
【００３０】
以下の実施例では、質量分析計はドイツFinnigan社製LCQ Advantage MAX質量分析計である。超伝導核磁気共鳴装置はBruker AV-600である。カラムクロマトグラフィーHP-20マクロポーラス樹脂は日本三菱会社の製品である。薄層クロマトグラフィー用シリカゲルGF254及びカラムクロマトグラフィーシリカゲル（200‐300メッシュ）は何れも青島海洋化工廠の製品である。逆相ODS充填材（50 μm）は日本YMC社の製品である。中低圧液体クロマトグラフは上海利穂電子科学技術有限公司の製品である。液相分離用分取クロマトグラフィーカラムはCosmosil Packed C18 column（20.0 × 250 mm, 5 μm）である。液体クロマトグラフィー用メタノールはクロマトグラフグレードであり、水は二重蒸留水であり、他の試薬が何れも分析グレードである。
【実施例】
【００３１】
（実施例1：式（II）及び式（III）で示される化合物の調製）
【００３２】
19.5 kgのクコシを100 Lのエタノール−水（60:40, v/v）で加熱還流し、毎回2時間3回抽出し、濾過後、濾液を減圧濃縮して濃縮液を得る。濃縮液をマクロポーラス樹脂カラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が0:100、30:70、50:50、70:30及び95:5のエタノール−水で溶出し、F1、F2、F3、F4、F5の5つの画分を得る。そして、体積比30:70のエタノール−水で溶出して得た画分F2に対して、70.0gのF2を取って常圧下でシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が95:5:0、90:10:1、85:15:1.5、80:20:2、70:30:3、60:40:4、50:50:5、40:60:6及び0:100:0のクロロホルム−メタノール−水で溶出し、F2.1、F2.2、F2.3、F2.4、F2.5、F2.6、F2.7、F2.8、F2.9及びF2.10合計で10の副画分を得る。そして、体積比40:60:6のクロロホルム−メタノール−水で溶出して得た副画分F2.9（3.8 g）を中低圧液相ODSカラムでクロマトグラフィーを行い、順次に体積比が5:95:0.1、10:90:0.1、15:85:0.1、20:80:0.1、25:75:0.1、30:70:0.1、40:60:0.1及び100:0:0のメタノール−水−トリフルオロ酢酸で溶出し、F2.9.1、F2.9.2、F2.9.3、F2.9.4、F2.9.5、F2.9.6、F2.9.7、F2.9.8及びF2.9.9合計で9つの副画分を得る。体積比15:85:0.1のメタノール−水−トリフルオロ酢酸で溶出して得た副画分F2.9.6（105.5 mg）を逆相分取HPLCで調製し、流速が8 mL/minのメタノール−水−トリフルオロ酢酸（20:80:0.1, v/v/v）で溶出し、式（II）で示される化合物（tR: 24.5 min, 12.3 mg，純度95%）および式（III）で示される化合物（tR: 29.2 min, 5.1 mg，純度95%）のトリフルオロ酢酸塩を得る。
【００３３】
物理化学定数は下記の通りである。
式（II）で示される化合物のトリフルオロ酢酸塩：緑色油状液体、[α]D27 ‐23.8 (c 0.50, MeOH); UV (MeOH) λmax(log ε) 204 (4.33), 294 (3.95), 320 (3.92) nm; IR (KBr) vmax3375, 2933, 2873, 1679, 1508, 1432, 1287, 1200, 1132, 1077, 801, 722 cm-1; ESIMS (positive) m/z 632.6; ESIMS (negative) m/z 630.4; HRESIMS (positive) m/z 632.2820 (calcd. for C31H42N3O11, 632.2819)。この化合物（II）の分子式がC31H41N3O11であると特定された。13Cと1H NMRを表1に示す。
【００３４】
式（III）で示される化合物のトリフルオロ酢酸塩：緑色油状液体、；[α]D27‐25.0 (c 0.50, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 204 (4.29), 293 (3.85), 319 (3.82) nm; IR (KBr) vmax 3347, 2935, 2874, 1678, 1508, 1432, 1282, 1199, 1132, 1073, 801, 722 cm-1; ESIMS (positive) m/z 794.7; ESIMS (negative) m/z 792.6; HRESIMS (positive) m/z 794.3362 (calcd. for C37H52N3O16, 794.3348)。この化合物（III）の分子式がC37H51N3O16であると特定された。13Cおよび1H NMRを表1に示す。
【００３５】
【表１】
2019501975.tif 000005
【００３６】
（実施例2：ジカフェオイルスペルミジン環化誘導体が老人性認知症フルーツフライの学習記憶活性を向上する試験方法）
【００３７】
（1）老人性認知症フルーツフライの培養
w1118 (isoCJ1) は実験における対照群背景フルーツフライとして、「2U」と略記される。病原性Aβ42タンパク質を首尾よく導入したフルーツフライは（UAS- Aβ42で、「H29.3」と略記される）。この種のフルーツフライを全脳発現Gal4プロモーターフルーツフライとハイブリダイズさせることにより、elav-GAL4c155 (P35) 及びAβ42を保有するフルーツフライ種を得た。
【００３８】
（2）老人性認知症フルーツフライの投薬
実験では、健康フルーツフライの無薬対照群、疾患フルーツフライの無薬対照群及び疾患フルーツフライの投薬群という3つのグループを設ける。
被験フルーツフライの母体は何れも恒温24℃、恒湿42％RH（相対湿度）のハエ室で飼育され繁殖した。 フルーツフライが羽化した1日目に、対照群フルーツフライ、疾患群フルーツフライ及び投薬予定のフルーツフライを二酸化炭素で麻酔してから、正しいキャラクターのフルーツフライを選択し、食物含有ガラス管に入れる。投薬期間中、被験フルーツフライの全てを、恒温28℃、恒湿42％のインキュベーター内に飼育することにより、フルーツフライの食薬効率を確保する。 フルーツフライは毎日4時間投薬され、選択された2日目から8日目まで投薬された。
投与薬は、フライを選択した2日目に調製され、かつ調製日にフルーツフライに投与された。100％DMSOで10mMの濃度に溶解した。標準溶液を調製するとき、10mMの母液を4％のスクロースで100μMに希釈した。さらに、対照群フルーツフライに1％DMSOを含むスクロース水溶液を与えた。各パフォーマンス指数（Performance Index）について、それぞれが約100匹のフルーツフライを含む2本のチューブのフルーツフライ群が必要である。
実験は恒温25℃、恒湿70％の遮光行動室で行われ、方法は参考文献[1-3]に見出すことができる。
【００３９】
1）トレーニング段階に、約100匹のフルーツフライを、銅メッシュクロス電極を備えたトレーニングチューブに入れた。オクタノール（OCT）とメチルシクロヘキサノール（MCH）との2種の臭気を45秒の新鮮な空気の間隔でそれぞれ60秒導入した。第1の臭気（CS +）を導入しながら、フルーツフライに60Vのパルス電気刺激（US、パルス持続時間1.5 s、間隔3.5 s）を与える。第2の臭気（CS-）を導入するとき、電気刺激を与えない。 これにより、1つのトレーニングサイクルが完了した。
2）瞬間記憶（学習）能力試験では、1つのトレーニングサイクルを完了したフルーツフライをT-Mazeの選択点に直ちに移しながら、反対の2つの方向からCS +及びCS-に導入した。2分間選択した後、両側のフルーツフライを別々に収集し、麻酔または屠殺した後にカウントする。パフォーマンス指数（Performance Index、PI）の計算公式は、PI = [(CS-)-(CS+)]/[(CS-)+(CS+)]×100である。
OCT及びMCHをそれぞれCS+としてトレーニング及びテストを行い、得られた2つのPIの平均値を1回の試験のPIとして用いる。PI = 0は試験中のフルーツフライが2種の臭気への選択が50:50であることを示し、すなわち記憶が形成されていない。PI = 100は試験中のフルーツフライの全てが電気ショックに伴う臭気を逃れたことを示し、すなわち完璧な記憶である。活性試験を行いながら、不投薬の同遺伝背景の健康フライ（2U*H29.3）、不投薬の老人性認知症フライ（P35*H29.3）、試験薬投与の老人性認知症フライの臭覚短期記憶障害テストを行い、それらの総学習記憶パフォーマンス指数（PI）をそれぞれ算出する。試験薬投与の老人性認知症フライの学習記憶パフォーマンス指数を、不投薬の同遺伝背景の健康フライ（2U*H29.3）のパフォーマンス指数、不投薬の老人性認知症フライ（P35*H29.3）のパフォーマンス指数と比べ、試験薬の抗老人性認知症の効果を評価する。試験物を投与した老人性認知症フライの学習記憶パフォーマンス指数が相対的に高ければ高いほど、試験物の抗老人性認知症の作用が強いことを示す。One-way analysis of variance (ANOVA) で、試験物を投与した老人性認知症フライの学習記憶パフォーマンス指数と不投薬（試験薬を含まない溶媒のみを投与する）の老人性認知症フライの学習記憶パフォーマンス指数を比較し、P < 0.05が明らかな差異を有すると示し、P < 0.01が顕著な差異を有すると示し、P < 0.001が極顕著な差異を有すると示す。
データ分析とグラフ表示はGraphPad Prism 5.01によって処理される。詳細な結果を表2に示す。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
表2の実験結果は、本発明の式（II）、式（III）で示される化合物が老人性認知症フルーツフライの学習記憶機能を明らかに改善することができ、そのうち、式（III）で示される化合物が老人性認知症フルーツフライの学習記憶機能への向上は陽性対照薬より優れ、本発明のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体が老人性認知症を予防及び治療する効果がよりよいことを示した。
【００４２】
（実施例3：ジカフェオイルスペルミジン環化誘導体の抗酸化活性結果）
【００４３】
化合物の抗酸化活性はoxygen radical absorbance capacity（ORAC）実験で評価される。詳細な実験手順は以下のとおりである。0.248 gのAAPH（2,2'-アゾビスイソブチルアミジン二塩酸塩）を50 mLのリン酸緩衝系に添加し、18.3 mMのAAPH貯蔵液を調製する。20 mLのリン酸緩衝液、20 mLの検出予定試料又は標準物質Trolox溶液（濃度6.25 mM）及び20 mLの蛍光物質disodium fluorescein（FL、濃度630 nM）を順次に96ウェルプレートのウェルに加える。そして、速やかに140 mL のAAPH（濃度18.3 mM）を96ウェルプレートのウェルに加え、かつ直ちに96ウェルプレートをスイスTecan社製のGENios Luciferase-basedマイクロプレートリーダーに置き、励起波長を485 nmとし、発光波長を527 nmとし、2分ごとにその蛍光強度を測定し、合計100 分間記録する。
【００４４】
活性物質の抗酸化力の計算式はRelative ORAC value = (AUCsample - AUCblank)/(AUCtrolox- AUCblank)である。式中、AUCsampleは被験試料の蛍光減衰曲線下の積分面積を示し、AUCtroloxは標準物質Troloxの蛍光減衰曲線下の積分面積を示し、AUCblankは被験試料又は標準物質Troloxを添加しない場合の蛍光減衰曲線下の積分面積を示す。詳細な結果を表3に示す。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
表3の実験結果は本発明のジカフェオイルスペルミジン環化誘導体が明らかな抗酸化活性を有することを示している。 そのうち、式IIで示される化合物の抗酸化効果は陽性対照薬に匹敵している。
【００４７】
本発明は、保護請求する幾つかの実施形態を例示するのみであり、1つまたは複数の技術案に記載された技術的特徴は、任意の1つまたは複数の技術案と組み合わせることができ、これらの組み合わせて得られた技術案が既に本発明の開示に具体的に記載されているように、これらの組み合わせて得られた技術案も本願の保護範囲に入った。
【００４８】
（参考文献）
[1] Tully T, et al. J. Comp. Physiol. A 1985, 157, 263-277.
[2] Tully T, et al. Cell 1994, 79, 35-47.
[3] Yin JC, et al.Cell1994, 79, 49-58.
【国際調査報告】
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