(57)【要約】  κ−カラゲナンと、等張溶液である担体溶液とを含む組成物、および上気道の疾患または状態の治療においてその使用方法。【選択図】図１Ａ
2019505538.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
κ−カラゲナンおよび担体溶液を含む組成物であって、前記担体溶液が等張溶液である、組成物。
【請求項２】
第２の活性薬剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記κ−カラゲナンの量が、約０．０１重量／容量％〜約１５重量／容量％である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記κ−カラゲナンの量が、約０．１２重量／容量％である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記担体溶液の量が、約５０ｍＬ〜約３５０ｍＬである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記担体溶液が、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記担体溶液が、乳酸カルシウム五水和物、重炭酸ナトリウム、グルコース、キシリトールまたはエリスリトールのうちの１種または複数種をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記担体溶液が、低イオン強度を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２の活性薬剤が、上気道の疾患または状態の治療に使用される薬剤、薬物または剤を含む群から選択される、請求項２〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第２の活性薬剤が、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤および抗酸化剤を含む群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
上気道の疾患または状態の治療方法であって、等張担体溶液中に治療有効量のκ−カラゲナンを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
前記κ−カラゲナンの量が、約０．０１％〜約１５％である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記κ−カラゲナンの量が、約０．１２％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、第２の活性薬剤をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の活性薬剤が、上気道の疾患または状態の治療に使用される薬剤、薬物または剤を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
治療されるべき前記疾患または状態が、非アレルギー性鼻炎、アレルギー性鼻炎、急性副鼻腔炎、アレルギー性と非アレルギー性との両病因による鼻副鼻腔炎および慢性鼻副鼻腔炎を含む群から選択される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
キットであって、粉末状の治療量のκ−カラゲナン、等張担体溶液を調製するために再構成される粉末、およびそれらの使用説明書を含む、キット。
【請求項１８】
陽性洗浄装置をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
上気道の疾患または状態の治療のための薬剤の調製における、治療有効量のκ−カラゲナンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
鼻および副鼻腔使用用のκ−カラゲナンを含む組成物とその使用方法。
【背景技術】
【０００２】
背景技術に関する以下の考察は、本発明だけの理解を容易にすることを目的とする。この考察は、参照された材料のいずれも本出願の優先日時点で技術常識の一部である、または一部であったことの容認または承認ではない。
【０００３】
カラゲナンは、特定の種類の紅藻由来の天然起源の直鎖硫酸化ガラクトース系多糖類の一種である。カラゲナンの従来の使用は、食品におけるゲル化剤としてであった。しかし、つい最近、カラゲナンは医薬品産業において、および生体材料の生産において使用するために試験され、徐放製剤などの薬物製剤の改善との関連を示した。しかし、カラゲナンは、血液凝固の阻害などの有害反応および免疫系への悪影響にも関連していた。したがって、医薬組成物および医薬製剤におけるカラゲナンの使用を限定してきた医薬品産業において、カラゲナンの使用に関連するリスクが多少ある。
【０００４】
海草から抽出される既知のカラゲナンは少なくとも１０の異なる種類があるが、産業上使用されてきたのは、ι−カラゲナン、κ−カラゲナンおよびλ−カラゲナンを含む３つの主な種類である。これらのカラゲナンは、その構造および硫酸基の数の両方でそれぞれ異なる。
【０００５】
食品グレードのカラゲナンは長い間使用されてきた。カラゲナンは、カリウムイオンおよびカルシウムイオンと接触して配置されると、ゲル化する特性を有するので、製品の粘度を向上させるために多くの食品で使用されてきた。カラゲナンは経口投与後、消化管からあまり吸収されず、したがって、一般に安全と考えられている。しかし、最近の研究では、薬物送達システムまたは組織再生足場などの医薬品および生体材料においてカラゲナンの使用が免疫系および血液凝固に向けて有害活性をもたらし得ることが示された。最近の総説は、カラゲナンの有害な生物学的作用についての考察を提示している（Ｌｉｕら，（２０１５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  １２１：２７−３６）。
【０００６】
ι−カラゲナンは、ライノウイルス感染症を治療するための抗ウイルス剤として使用することが最近検討されている。しかし、κ−カラゲナンを単独で、または他のカラゲナンとの組み合わせのいずれかで使用することについては、ほとんどわかっていない。
【０００７】
上気道疾患の治療のための鼻腔用スプレーまたは点鼻剤などの製品は、これらのデバイスによって送達される投与量が治療すべき領域に達するには不十分であるので、副鼻腔病状の治療において効果がないことが多い。副鼻腔疾患の治療で遭遇するさらなる問題は、薬物が治療効果のある十分な時間にわたって領域と接触していないということである。
【０００８】
上気道の疾患および状態はいくつかあり、例えば、鼻炎、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、鼻副鼻腔炎および慢性鼻副鼻腔炎がある。慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）は、鼻および副鼻腔に影響を及ぼす慢性炎症をもたらす免疫不全によって特徴付けられる。この症状は、鼻閉塞、大量の濃厚な緑色粘液の産生、副鼻腔痛、頭痛、嗅覚の損失、咽喉痛および咳として症候的に現れる。
【０００９】
慢性鼻副鼻腔炎にはいくつかの表現型があり、各表現型は好ましい治療プロトコールがある。いずれにしても、すべての表現型は、症状を和らげるために、鼻腔および副鼻腔から過剰な粘液および炎症性メディエーターを除去するように、毎日、陽圧下で大量の溶液で鼻腔および副鼻腔を洗浄する必要がある。疾患の一部の形態は、洗浄液に混入された局所薬物の投与を必要とする。そのような局所療法としては、ブデソニドもしくはモメタゾンのような局所ステロイド薬および／または局所抗生剤が挙げられる。
【００１０】
ＣＲＳは、それによって粘膜線毛の機能および構造が悪影響を受けている組織学的異常によっても特徴付けられる。これは、粘液停滞をもたらし、それによって粘液は濃くなり、濃縮され、結果として感染の発生率の増加になる。粘膜の「漏出」もあり、それによって炎症性変化が粘膜と細菌の完全性に悪影響を与え、炎症性物質は粘膜下組織に浸透することができる。
【００１１】
上述の様式で局所療法を行うことに関する問題は、洗浄後、副鼻腔内に残存する薬剤の濃度が極めて低いことである。処置後、使用される洗浄液の９７．５％が無くなるので、これが起こる。したがって、わずか２．５％が残存し、この液体の量は、わずかに微量の局所治療薬物を含み得る。
【００１２】
本発明が開発されたのは、この背景に対してである。本発明は、上記の従来技術の１つまたは複数の欠陥を克服する、あるいは少なくとも改善する、または有用な選択肢もしくは商業的な選択肢を消費者に提供することを追求する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、副鼻腔洗浄液中に治療有効量のカラゲナンを含む組成物と、その使用方法とに関する。より詳しくは、カラゲナンはκ−カラゲナンである。
【００１４】
本発明の一態様において、担体溶液中にκ−カラゲナンを含む組成物が提供され、該担体溶液は、細胞外液と等張溶液である。
【００１５】
本発明の一実施形態において、担体溶液は、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む。担体溶液は、以下の成分のうちの１種または複数種も含み得る：乳酸カルシウム五水和物、重炭酸ナトリウム、グルコース、キシリトール、またはエリスリトールと他のポリオール−糖類を含む他のいかなる５炭素糖分子（糖アルコール）。担体溶液は、低イオン強度を有し得る。
【００１６】
本発明の第２の態様において、等張担体溶液中にκ−カラゲナンを含み、第２の活性薬剤をさらに含む組成物が提供される。第２の活性薬剤は、上気道の疾患または状態の治療に使用される薬剤、薬物または剤の形態であり得る。
【００１７】
本発明の第３の態様において、等張担体溶液中に治療有効量のκ−カラゲナンを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、上気道の疾患または状態の治療方法が提供される。
【００１８】
本発明の第４の態様において、粉末状の治療量のκ−カラゲナン、担体溶液を調製するために再構成される粉末、およびそれらの使用説明書を含むキットが提供される。本発明のキットは、同じまたは同様の治療効果を達成するように溶液を投与する陽圧洗浄装置もしくは他の装置も含み得る。
【００１９】
本発明の第５の態様において、上気道の疾患または状態の治療のための薬剤の調製における、κ−カラゲナンの使用が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる特徴は、そのいくつかの非限定的な実施形態について以下の説明でさらに十分に説明する。この説明は、本発明を例示するためにだけ含まれる。上述のように、本発明の広範な概要、開示または説明に対する制限として理解されてはならない。添付する図面を参照して、以下の通りに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中の乳酸脱水素酵素の発現を示すグラフである。対照培地（対照培地＝１）と比較した倍率変化として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中の乳酸脱水素酵素の発現を示すグラフである。溶媒のみの対照（溶媒対照＝１）と比較した倍率変化として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図２Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ−２の発現を示すグラフである。総量（ｎｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図２Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ−２の発現を示すグラフである。溶媒のみの対照（溶媒のみ＝１００％）のパーセンテージ（％）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図３Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中のインターロイキン−６の発現を示すグラフである。総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図３Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中のインターロイキン−６の発現を示すグラフであり、溶媒のみの対照を示す。総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図４Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンに２４時間曝された気相液相界面のヒト鼻上皮細胞の細胞緩衝液中で測定された初期の経上皮電気抵抗のパーセンテージを表すグラフである。
【図４Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中でκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の経上皮細胞抵抗の変化を示すグラフである。測定値は、細胞培地およびカラゲナン溶液中で、ベースライン、１２時間および２４時間で採取した。
【図４Ｃ】ＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の経上皮細胞抵抗の変化を示すグラフである。測定値は、細胞培地およびカラゲナン溶液中で、ベースライン、１２時間および２４時間で採取した。
【図５Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の傍細胞透過性を示すグラフであり、対照培地（対照培地＝１）と比較した倍率変化として表す。
【図５Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の傍細胞透過性を示すグラフであり、溶媒対照（溶媒対照＝１）の倍率変化として表す。
【図６】アクチンの細胞質染色の写真を示す。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中での０．１２％κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの２４時間曝露の、ヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物のアクチン細胞骨格に対する効果を示す。Ｆ−アクチンをファロイジン（緑色）で、および細胞核をＤＡＰＩ（青色）で可視化した。
【図７】ＦＬＯ  ＣＲＳ中での０．１２％κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの２４時間曝露の、ヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物のアクチン細胞骨格に対する効果を示す写真である。Ｆ−アクチンをファロイジン（緑色）で、および細胞核をＤＡＰＩ（青色）で可視化した。
【図８Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の線毛運動周波数を示すグラフである。測定値は、５分、１０分、１５、分、２０分、６時間および１２時間の時点にわたる平均（Ｈｚ）を表す。
【図８Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の線毛運動周波数を示すグラフである。測定値は、５分、１０分、１５、分、２０分、６時間および１２時間の時点でのベースライン（％；ＣＢＦｔ＝ｘ／ＣＢＦベースライン）からの平均変化を表す。
【図９】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞培養物の線毛表面構造を示す走査電子顕微鏡写真（１００００ｘ）である。
【図１０】ＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞培養物の線毛表面構造を示す走査電子顕微鏡写真（１００００ｘ）である。
【図１１】好ましい洗浄装置の一例を示す。
【図１２Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンへの２４時間曝露後のＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物からの乳酸脱水素酵素の放出を示すグラフである。細胞生存率（Ｐ＞０．０５）として表す。
【図１２Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンへの２４時間曝露後の非ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物からの乳酸脱水素酵素の放出を示すグラフである。細胞生存率（Ｐ＞０．０５）として表す。
【図１３Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンへの２４時間曝露後のＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣの上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ−２の分泌を示すグラフである。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。
【図１３Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンへの２４時間曝露後の非ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣの上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ−２の分泌を示すグラフである。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。
【図１４Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンに２４時間曝されたＣＲＳ患者由来のヒト鼻上皮細胞の上清中のインターロイキン−６のレベルを示すグラフである。総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１４Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンに２４時間曝された非ＣＲＳ患者由来のヒト鼻上皮細胞の上清中のインターロイキン−６のレベルを示すグラフである。総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１５Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに２４時間曝され、ＣＲＳ患者由来の細胞緩衝液中で測定されたヒト鼻上皮細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示すグラフである。
【図１５Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに２４時間曝され、非ＣＲＳ患者由来の細胞緩衝液中で測定されたヒト鼻上皮細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示すグラフである。
【図１６Ａ】ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層の傍細胞透過性を示すグラフである。ＦＩＴＣ−デキストランの通過は、ＣＲＳｗＮＰ患者由来のＨＮＥＣ単層中でκ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を適用してから２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図１６Ｂ】ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層の傍細胞透過性を示すグラフである。ＦＩＴＣ−デキストランの通過は、非ＣＲＳ対照患者由来のＨＮＥＣ単層中でκ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を適用してから２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図１７Ａ】κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅとＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の、ＣＲＳ患者のＨＮＥＣ単層のＺｏｎａ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）免疫局在性に対する効果を示す。ＤＡＰＩを用いて、核を染色（青色染色）した。白色バーは２０μｍである。共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて２０Ｘ倍率。
【図１７Ｂ】κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅとＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の、ＣＲＳ患者のＦ−アクチンに対する効果を示す。ＤＡＰＩを用いて、核を染色（青色染色）した。白色バーは２０μｍである。共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて２０Ｘ倍率。
【図１８】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝された気相液相界面のヒト鼻上皮細胞の線毛運動周波数を示すグラフである。測定値は、５分、１０分、２０分、６時間および２４時間の時点にわたる平均（Ｈｚ）を表す。値は、ｎ＝３について平均値±ＳＥＭとして示される。
【図１９Ａ】処置の細胞移動に対する効果を示すグラフである。創傷治癒移動アッセイは、ＣＲＳｗＮＰ患者由来のＨＮＥＣ単層中でκ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  ＣＲＳと陰性対照（培地）を適用してから２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図１９Ｂ】処置の細胞移動に対する効果を示すグラフである。創傷治癒移動アッセイは、非ＣＲＳ対照患者由来のＨＮＥＣ単層中でκ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  ＣＲＳと陰性対照（培地）を適用してから２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図２０Ａ】ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中で送達されたκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの炎症促進反応を弱める効果を示すグラフである。ＣＲＳ患者においてポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷで刺激されたが、ＨＮＥＣ／ＡＬＩに対する、カラゲナンκ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳ、カラゲナンι／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンι／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの効果。ブデソニドは抗炎症の標準ケアコントロールとして使用された。陰性対照は未処置細胞（培地）である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。
【図２０Ｂ】ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中で送達されたκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの炎症促進反応を弱める効果を示すグラフである。非ＣＲＳ患者においてポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷで刺激されたが、ＨＮＥＣ／ＡＬＩに対する、カラゲナンκ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳ、カラゲナンι／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンι／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの効果。ブデソニドは抗炎症薬の標準ケアコントロールとして使用された。陰性対照は未処置細胞（培地）である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一般的説明
文脈上別段の解釈を要する場合を除き、本明細書全体を通して、「含む」という語、または「含んでいる」もしくは「含むこと」などのその変化形は、述べられた整数または整数の群を包含するが、他のいかなる整数または整数の群も排除しないことを意味すると理解される。
【００２３】
当業者は、本明細書に記載の本発明が具体的に記述されたもの以外の変更および修正に影響されやすいことを理解するであろう。本発明は、すべてのそのような変更および修正を包含する。本発明は、本明細書に参照される、または指示されるステップ、特徴、製剤および化合物を個別にまたは集合的に含む、およびステップまたは特徴の任意およびすべての組み合わせ、またはいずれか２つ以上の組み合わせも含む。
【００２４】
本文で引用された各文書、参考文献、特許出願または特許は、全体として参照によって本明細書に明白に取り込まれる。これは、本文の一部として読者に読まれ、考慮されなければならないことを意味する。本文で引用された文書、参考文献、特許出願または特許が本文で繰り返されないのは、単に簡潔さの理由によるものである。
【００２５】
本明細書または参照によって本明細書に組み込まれるいずれの文書に記載のいずれの製品についてのいずれのメーカーの説明書、発明の詳細な説明、製品仕様書および製品シートは、ここに参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施に際して利用することができる。
【００２６】
本発明は、本明細書に記載のいずれの具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。これらの実施形態は、例示の目的のみを意図している。機能的に同等の製品、製剤および方法は、明らかに本明細書に記載の本発明の範囲内である。
【００２７】
本明細書に記載の本発明は、１つまたは複数の値の範囲（例えば、サイズ、移動および場の強度など）を含み得る。ある範囲の値は、範囲内のすべての値、例えば、範囲を定める値、およびその範囲への境界を定めるその値にすぐ隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果を引き起こす、その範囲に隣接する値を包含することが理解される。
【００２８】
本明細書に用いる選択された用語の他の定義は、本発明の発明を実施するための形態に見出すことができ、全体を通して適用することができる。別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての他の科学用語および技術用語は、一般的に本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００２９】
「活性薬剤」という用語は、１種の活性薬剤を意味することもあり、または２種以上の活性薬剤を包含し得る。「活性薬剤」という用語は、それが投与される対象において何らかの有益な変化をもたらすことに役立つ化合物を指す。例えば、この定義の範囲内の「活性薬剤」としては、κ−カラゲナン、ステロイド、抗生物質、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤および抗炎症剤が挙げられる。
【００３０】
「有効量」または「治療量」という用語は、対象において所望の変化をもたらすのに十分なその量を指す。活性薬剤の有効量を決定することは、当業者の知識および技術の範囲内である。
【００３１】
本明細書で用いる場合「治療」という用語は、動物（ヒトを含む）での疾患のどのような治療も網羅し、（ｉ）疾患の発症を予防すること、（ｉｉ）その発症を抑制するなどの疾患を阻止すること、（ｉｉｉ）疾患を軽減する、例えば、疾患の退縮を生じさせること、および／または（ｉｖ）通常の生物活性を改変することを含む。
【００３２】
本明細書で用いる場合「疾患」、「障害」または「状態」という用語は、どのような内科疾患／障害／状態、例えばこれらに限定されないが、鼻腔および副鼻腔内の過剰な粘液の蓄積を生じさせ得る慢性鼻副鼻腔炎および他の疾患を網羅する。さらなる疾患／障害／状態としては、非アレルギー性副鼻腔疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患および嚢胞性線維症が挙げられる。鼻腔および副鼻腔内の粘液蓄積も、内視鏡的副鼻腔手術などの手術から生じることもあり得る。
【００３３】
「等張性」という用語は、細胞外液と等張である担体溶液を指す。
【００３４】
１種または複数種の塩類を含むどのような溶液でも、イオン強度または電荷を有する。溶液中の塩または異なる塩類の量は、その濃度（ｍＭまたはｍＭｏｌ）によって定めることができる。例えば、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液は、２１ｍＭのイオン強度を有する。生理食塩水は、９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムの濃度および１５４ｍＭのイオン強度を有する。市販されている洗浄液は、しばしばいくつかの異なる塩類から構成され、１３０ｍＭから５００ｍＭを超える範囲でイオン強度を有すると推定されている。０から３５ｍＭの間のイオン強度は、送達溶液として使用される場合、超低イオン強度または極めて低いイオン強度の溶液であると考えられる。極めて低いイオン強度は、約３１ｍＭ未満のイオン強度を有する溶液を意味する。
【００３５】
本発明の医薬品は、任意の哺乳動物に投与されることができる。好ましくは、哺乳動物類はヒトである。
【００３６】
発明を実施するための形態
本発明の組成物および方法は、鼻孔、鼻腔および副鼻腔を含む上気道の治療に有用である。副鼻腔は、副鼻腔口を経て鼻腔に連結する。外科手術の術後、合併症、感染または疾患の結果、副鼻腔、鼻腔および副鼻腔口は、ブロックされることもあり得る。当業者は、本発明の組成物によって治療することができる上気道に関連する他の疾患および状態を認識しているであろう。
【００３７】
本発明の組成物は、等張担体溶液中にκ−カラゲナンを含む。組成物は、かなりの量（例えば１００〜２００ｍＬ）の担体溶液中で投与されるのが好ましい。さらなる薬剤、薬物または活性薬剤は、上気道と関連した疾患または状態の治療を補助するために、κ−カラゲナン組成物に組み入れられてもよい。
【００３８】
κ−カラゲナン
今まで、κ−カラゲナンは、医薬品において他のカラゲナンの存在なしで単独で使われなかったと思われる。すなわち、ι−カラゲナンおよび／またはλ−カラゲナンは医薬品産業において活性薬剤を送達するうえでそれらの効果について研究の対象であったが、他のカラゲナンの１つの存在なしで使用されるκ−カラゲナンについて対応する研究は存在しない。
【００３９】
κ−カラゲナンは、任意の市販の供給源からでも入手することができる。例えば、天然グレードのカラゲナンまたは濾過されたカラゲナンは、供給元から入手できる。κ−カラゲナンは、粉末、ゲルまたは液体の形態であり得る。好ましくはκ−カラゲナンは、粉末状である。
【００４０】
ι−カラゲナンが出血を誘発することがあり得、λ−カラゲナンが非常に炎症促進性であることを研究は示しており、激痛を誘発するための疼痛モデル実験で用いられている。一方では、κ−カラゲナンは、これらの３つのカラゲナンの中で、悪影響がなく、かつ局所薬物の送達において重要な利点を発揮することができる唯一のカラゲナンである。
【００４１】
理論に束縛されることなく、κ−カラゲナンを使用する利点は、少なくとも部分的にはその強力な粘膜付着特性にある。等張担体溶液とともにκ−カラゲナンを使用することは、鼻および副鼻腔粘膜上で用いられるとき、炎症促進性ではなく、非常に安全であることが示されている。加えて、本発明の組成物は、薬剤／薬物を保有するために単純な生理食塩水を使用する場合よりもかなり長い間、薬剤または薬物を粘膜表面に保持するのを助けることができる。
【００４２】
理論に束縛されることなく、本出願者は、本発明の副鼻腔溶液中にκ−カラゲナンを用いると粘膜層の水分補給となり、自然免疫機能および線毛運動性が改善されると考えている。加えて、洗浄液および局所薬剤が粘膜層上で保持されるので、治療レジメンの臨床転帰が改善される。
【００４３】
さらに、κ−カラゲナンは吸湿性であり、極めて効果的に水を保持する。したがって、本発明の組成物は、上気道の疾患または状態を治療することに理想的である。
【００４４】
治療有効量のκ−カラゲナンは、担体液剤中に提供される。担体溶液に存在するκ−カラゲナンの量は、約０．０１重量／容量％と約１５重量／容量％との間、より好ましくは約０．０５重量／容量％と約０．５％重量／容量％との間の範囲に及ぶ。本発明の一実施形態において、担体溶液中に存在するκ−カラゲナンの量は、約０．１２重量／容量％である。
【００４５】
κ−カラゲナンは、担体溶液に加えられる粉末または溶液として提供されてよい。一実施形態において、一定量のκ−カラゲナンは、担体溶液の粉末形状に加えられるように提供される。担体溶液は、説明書に従って粉末から調製されてもよく、使用前に、κ−カラゲナンを加えてよい。あるいは、κ−カラゲナンは粉末形状の担体溶液とともに粉末形状で提供され、水を補って適切な量にする。
【００４６】
このように、非常に好ましい一実施形態において、本発明は、副鼻腔手術直後の術後期における患者の処置（副鼻腔洗浄）のため、ならびに治療が単純な洗浄または副鼻腔の炎症もしくは感染症を処置するための治療薬の包含のいずれかを含む、副鼻腔のすべての炎症性疾患の継続的な副鼻腔洗浄処置のための副鼻腔洗浄溶液中にκ−カラゲナンを含む組成物を提供する。
【００４７】
本発明の組成物は、上気道の二次感染の有無にかかわらず、どのような炎症状態の存在下でも鼻および副鼻腔の使用に有用である。
【００４８】
加えて、本発明の組成物は、他の局所治療薬、薬剤または薬物、例えば、これらに限定されないが抗生物質、抗真菌剤または抗炎症剤との組み合わせで使用することができる。
【００４９】
本発明の好適な実施形態において、κ−カラゲナンは、１００ｍＬと２００ｍＬとの間の副鼻腔溶液の量で送達される。好ましくは、副鼻腔溶液は、低イオン強度溶液である。副鼻腔溶液は、キシリトールまたはエリスリトール（または任意の他の５炭素糖もしくはポリオール）および多少低い濃度のＫＣｌとＮａＣｌの両方を含んでもよい。
【００５０】
担体溶液
本発明の組成物は、等張担体液剤（「等張溶液」とも称する）中に治療有効量のκ−カラゲナンを混合することによって調製することができる。κ−カラゲナンとともに使用する適切な副鼻腔溶液は、当業者には周知である任意の希釈剤または担体を含む。どのような等張担体溶液でもκ−カラゲナンと組み合わせて使用することができるが、最良の結果は、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む等張溶液を使用して達成される。
【００５１】
好ましくは、κ−カラゲナンと組み合わせて使用することができる等張溶液は、ＦＬＯ（登録商標）Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ（登録商標）ＣＲＳ溶液を含み、市販されている。
【００５２】
ＦＬＯ（登録商標）Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅは等張溶液であり、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、乳酸カルシウム五水和物、重炭酸ナトリウムおよびグルコースを含む。この溶液は粉末として提供されることができ、メーカーの説明書に従って容量を調製することができ、そして治療量のκ−カラゲナンと混合することができる。あるいは、治療量のκ−カラゲナンの送達を確実にするために、κ−カラゲナンは粉末形状の担体溶液に加え、所要量にすることができる。
【００５３】
好適な実施形態において、粉末形状のκ−カラゲナンは、等張担体の粉末と混合され、次いで水を補って所要量にする。混合成分を調製し、粉末形状でパッケージされてもよい。
【００５４】
いくつかの状況では、例えば慢性鼻副鼻腔炎の患者の場合、低イオン強度溶液はこれらの患者において自然免疫機能に悪影響を与えないので、低イオン強度溶液が好ましい。この例では、低イオン強度を有し、キシリトール、ＫＣｌおよびＮａＣｌを含む、ＦＬＯ（登録商標）ＣＲＳ溶液を使用することが好ましい。
【００５５】
好ましくは、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅは、以下の組成物を有する：０．７７２重量／容量％のＮａＣｌ、０．０４２重量／容量％のＫＣｌ、０．０３２重量／容量％の乳酸カルシウム、０．０１５重量／容量％のＮａＨＣＯ３、０．０８５重量／容量％の無水グルコース、およびＦＬＯ  ＣＲＳは、以下の濃度を有する：ＮａＣｌ＝０．７５ｍｇ／Ｌ、ＫＣｌ＝０．９ｍｇ／ｍＬおよびキシリトール＝３７０ｍｇ／ｍＬ。
【００５６】
その治療を必要とする患者に投与される組成物の量は、治療有効量のκ−カラゲナンを上気道に達成するのに十分な量である。一実施形態において、担体溶液の量は、５０ｍＬ〜３５０ｍＬの範囲である。非常に好ましい一実施形態において、量は１００ｍＬと２００ｍＬとの間である。非常に好ましい一実施形態において、量は１００ｍＬと２５０ｍＬとの間である。
【００５７】
本発明の組成物は、顔のどちらかの側または両側の鼻腔または副鼻腔通路に適用することができる。鼻腔および副鼻腔を治療するために必要とされる担体溶液の量は、陽圧洗浄装置を用いて投与することができる。任意の陽圧洗浄装置を使用して、本発明の組成物を送達することができる。非常に好ましい実施形態において、装置は、柔らかい圧搾ＬＤＰＥプラスチック瓶、ディップチューブ、および終点が鼻中隔と接触しないように特別に設計された上部を有する円錐形である。装置の画像を図１１に示す。
【００５８】
陰圧装置は、約１００ｍＬの溶液が１つの鼻孔から鼻腔および副鼻腔に放出され、反対側の鼻孔から出てくるまでボトルを単純に圧搾することによって操作される。次いで、この方法を反対側の鼻孔に繰り返すことができる。
【００５９】
本発明の方法および組成物は、組織炎症および／または急性もしくは慢性疾患の過程から生じる粘液の蓄積を治療することができ、または鼻ポリープに関連する、または関連しない急性もしくは慢性副鼻腔疾患を患っている患者において副鼻腔の通気を容易にするために行われる鼻および副鼻腔手術に起因する粘液、乾燥血液、切除した組織および血液凝固を取り除くために治療することができる。
【００６０】
さらなる薬剤、薬物または治療薬
さらに、本発明の組成物は、これに限定されないがステロイドおよび抗生物質を含む、１種または複数種の局所薬剤を含むこともできる。さらなる局所薬物は副鼻腔疾患の局所治療に必要となることがある。
【００６１】
本発明の組成物の調製で有用な他の化合物としては、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤または抗炎症剤および抗酸化剤が挙げられる。
【００６２】
疾患または状態
本発明の組成物を用いて、上気道に関連した任意の数の疾患または状態を治療することができる。本発明の組成物を用いて治療することができる疾患または状態としては、非アレルギー性鼻炎、アレルギー性鼻炎、急性副鼻腔炎、アレルギーおよび非アレルギーの両病因による鼻副鼻腔炎、慢性鼻副鼻腔炎が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００６３】
上記のように、これらの疾患または状態は、治療有効量の本発明の組成物を、その治療を必要とする患者に投与することによって治療することができる。
【００６４】
例えば、本発明の組成物のかなりの量（例えば１００ｍＬ〜２００ｍＬ）を陽圧装置によって患者の上気道に鼻孔を通して投与することができる。κ−カラゲナンは、患部組織を水和させ、局所薬物を長時間にわたって粘膜表面と接触させて保持するために上気道に残留するのに十分な量で提供される。
【００６５】
実施例
上気道の疾患および状態の治療としてのカラゲナンの安全性を判定するように実験を設計した。加えて、κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンによる治療後、線毛の機能と構造を調べるために実験を行った。
【００６６】
副鼻腔組織へのその効果に関してκ−カラゲナンの作用としては、線毛安全性、密着結合効果、抗炎症作用およびゲル化が挙げられ、検討した。カラゲナンを含有する送達溶液は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ（乳酸リンゲル剤）またはＦＬＯ  ＣＲＳ（ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む細胞外液と等張のキシリトール）であった。
【００６７】
この時点で結果は、κ−カラゲナンが副鼻腔組織上で使用するのに極めて安全な生成物であり、通常の生理的プロセスのいずれにも干渉しないことを示している。これらの実験および結果を以下に述べる。
【００６８】
１．実験設計
１．１  初代ヒト鼻上皮細胞培養
健康志願者から細胞学的鼻ブラッシングを収集する倫理的承認は、Ｔｈｅ  Ｑｕｅｅｎ  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから付与された。除外基準は能動喫煙、１８歳未満の年齢、全身性疾患、最近の上気道感染症罹患、および慢性鼻副鼻腔炎またはアレルギー性鼻炎の症状／徴候を含み、鼻ブラッシングを同意する参加者から収集した。
【００６９】
滅菌細胞診ブラシを使用して、志願者の鼻腔から採取した鼻ブラッシングを直ちに気管支上皮細胞増殖培地（ＢＥＧＭ）（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ）に移し、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心（１７００ｒｐｍで５分間）して、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｂ−ＡＬＩ（商標）増殖培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ）に再懸濁させた。次いで、抗ＣＤ６８（Ｄａｋｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で被覆した直径１００ｍｍの培養プレート中で細胞試料は、２０分間マクロファージを枯渇させた（Ｍａｌｉｋら，（２０１５）Ｆｏｒｕｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｒｈｉｎｏｌ．５（６）：５５１−５５６）。
【００７０】
培養プレートから細胞試料を取り出して、１型コラーゲンを被覆したＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に直接播種した。８０％コンフルエントになるまで細胞を増殖させ、次いで収集し、コラーゲンを被覆した、０．４μｍ細孔を有する６．５ｍｍの透過性トランスウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上にウェル当たり５×１０４細胞の密度で播種した（Ｌｏｎｚａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，２０１１）。
【００７１】
Ｂ−ＡＬＩ（商標）増殖培地を用い、５％ＣＯ２、３７℃の細胞インキュベーター内で細胞培養物を３〜４日間維持した。次いで、頂端培地を除去し、基底培地をＢ−ＡＬＩ（商標）分化培地と交換した。培地は一日おきに取り替えた。ヒト鼻上皮培養物を密着結合の発生のために気相液相界面（ＨＮＥＣ−ＡＬＩ）で最低１４日間、および線毛生成のために２８日間維持した（Ｌｅｅ  Ｍ−Ｋら，（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．１２（５）：３０５−３１１；Ｆｕｌｃｈｅｒら，（２００５）Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｐａｇｅｓ  １８３−２０６）。
【００７２】
１．２  カラゲナン副鼻腔溶液
κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンは、Ｍａｒｉｎｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨによる指示通りに滅菌ＭｉｌｌｉＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に溶解させ、８０℃で２時間加熱することによって０．２４％の濃度にした。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳを２倍濃度で滅菌ＭｉｌｌｉＱに懸濁させた。各々の溶液をろ過滅菌し、次いで、１：１の割合で混合して、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中０．１２％のκ−カラゲナン、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中０．１２％のι−カラゲナン、ＦＬＯ  ＣＲＳ中０．１２％のκ−カラゲナン、およびＦＬＯ  ＣＲＳ中０．１２％のι−カラゲナンを得た。
【００７３】
次いでこれらの溶液を室温で保存した。次いで、（ｉ）細胞生存率と炎症、（ｉｉ）粘膜バリア、および（ｉｉｉ）線毛機能と構造への効果を判定するために、最高２４時間まで、細胞培養の頂端コンパートメントに副鼻腔溶液を加えた。
【００７４】
２．細胞生存率と炎症
２．１  方法
２４時間の曝露後、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ処置した側底コンパートメントから上清を収集し、細胞生存率と炎症マーカーの測定まで−２０℃で保存した。細胞生存率を判定するために、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ，ＣＡ）を用いて乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定した。調製した試料の吸光度は４９０ｎｍの波長で記録し、陰性対照（未処置細胞）のＬＤＨを用いて、相対生存率を算出した。総マトリックスメタロペプチダーゼ−２（ＭＭＰ−２）分泌を、＜０．１ｎｇ／ｍＬの最小検出レベルを用いてＭＭＰ−２ヒトＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して算出した。調製した試料を４５０ｎｍで、マイクロタイタープレートリーダーで読み取った。結果をｎｇ／ｍＬで表し、溶媒対照と比較してパーセンテージとして示す（式１を参照されたい）。インターロイキン６（ＩＬ−６）をラット抗ヒトＩＬ−６抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて測定し、ヒトＩＬ−６標準（（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）と比較した。試料を４５０ｎｍで、マイクロタイタープレートリーダーで測定し、結果を総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表し、対照培地または溶媒のみの対照と比較した。
【００７５】
【数１】
2019505538.tif 000003
【００７６】
２．２  結果：乳酸脱水素酵素アッセイ
平均（±ＳＤ）値を示す陰性対照として、対照培地に対する倍率変化として表したＬＤＨ測定：図１Ａに示すように、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ（ＦＬＯ）１．１２２（±０．１２８３）、ＦＬＯ＋０．１２％κ−カラゲナン（ＦＬＯ＋κ）０．９５１２（±０．１６７９）、ＦＬＯ＋０．１２％ι−カラゲナン（ＦＬＯ＋ι）１．００３（±０．１５８２）、ＦＬＯ  ＣＲＳ  ０．９４６（±０．１５２６）、ＦＬＯ  ＣＲＳ＋０．１２％κ−カラゲナン（ＣＲＳ＋κ）１．００１（±０．１５８５）、ＦＬＯ  ＣＲＳ＋０．１２％ι−カラゲナン（ＣＲＳ＋ι）０．９７３１（±０．１５４）。
【００７７】
ＬＤＨを溶媒のみの対照（ＦＬＯまたはＣＲＳ）と比較したとき、倍率変化の平均（±ＳＤ）値は以下の通りであった：図１Ｂに示すように、ＦＬＯ＋κ０．８６５２（±０．２３１４）、ＦＬＯ＋ι０．９１１５（±０．２３０４）、ＣＲＳ＋κ１．０５８（±０．０１７９３）およびＣＲＳ＋ι１．０２９（±０．０１２１８）。
【００７８】
２．３  結果：マトリックスメタロペプチダーゼ−２ＥＬＩＳＡ
基底ＭＭＰ−２  ＥＬＩＳＡ測定は、平均（±ＳＤ）ｎｇ／ｍＬ値を示した：図２Ａに示すように、対照培地６．５３１ｎｇ／ｍＬ（±５．１３８）、ＦＬＯ  ７．９２４ｎｇ／ｍＬ（±７．５１３）、ＦＬＯ＋κ  ７．９０７ｎｇ／ｍＬ（±６．９７４）、ＦＬＯ＋ι５．２４７ｎｇ／ｍＬ（±４．５０３）、ＣＲＳ  ６．３ｎｇ／ｍＬ（±６．９６１）、ＣＲＳ＋κ４．６２６ｎｇ／ｍＬ（±３．８３６）、ＣＲＳ＋ι４．０５４（±３．３０９）。
【００７９】
ＭＭＰ−２を溶媒のみの対照のパーセンテージと比較したとき、平均（±ＳＤ）値は以下の通りであった：図２Ｂに示すように、ＦＬＯ＋κ１０４．７％（±１２．６４）、ＦＬＯ＋ι７１．７５％（±６．０９２）、ＣＲＳ＋κ９３．１７％（±２４．１８）およびＣＲＳ＋ι８６．５％（±３８．５１）。
【００８０】
２．４  結果：インターロイキン−６ＥＬＩＳＡ
基底ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ測定は、平均（±ＳＤ）ｐｇ／ｍＬ値を示した：図３Ａおよび３Ｂに示すように、対照培地３１．４２ｐｇ／ｍＬ（±２７．８９）、ＦＬＯ５０．２８ｐｇ／ｍＬ（±３３．３９）、ＦＬＯ＋κ５．６２６ｐｇ／ｍＬ（±９．７４５）、ＦＬＯ＋ι９０．３９ｐｇ／ｍＬ（±１７．０４）ｍ  ＣＲＳ４１．１２ｐｇ／ｍＬ（±７１．２１）ｍ  ＣＲＳ＋κ８７．１６ｐｇ／ｍＬ（±８７．９）、ＣＲＳ＋ι６３．４９ｐｇ／ｍＬ（±５８．６９）。
【００８１】
結論として、溶媒のみの対照と比較したとき、炎症マーカーＭＭＰ−２（ゼラチナーゼ）およびＩＬ−６（サイトカイン）の発現はカラゲナンへの曝露後、増加せず、カラゲナンが炎症促進性でないことを示唆した。
【００８２】
さらに、κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンのいずれも、細胞生存率を減少させなかった。
【００８３】
最終的に、使用した細胞培養は健康なヒト鼻上皮をモデル化したものであったので、カラゲナンが抗炎症性であるかどうかを確認するために、本研究の設計に基づき、さらなる実験が必要とされる。通常の細胞培養物の炎症性刺激を用いることによって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持される炎症マーカーにおいて測定できる増加を有する患者の新たなコホートを規定するために今後の研究を計画する。
【００８４】
３．粘膜バリア機能
３．１  方法
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）をＥＶＯＭ２上皮電圧抵抗計（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＦＬ）を用いて測定し、結果を、生の値、すなわち初期測定値への相対的な変化としてオームで表した。ＴＥＥＲ値は、＞４００オーム／ｃｍ２（０．３３ｃｍ２のトランスウェル膜において＞１２００オームに等しい）を示す培養物から採取したものだけであった。ＴＥＥＲは、最初に、細胞培地とともにすべてのＨＮＥＣ−ＡＬＩトランスウェル試料上で頂端部および基底部を測定し、これに続いて、頂端培地を除去し、対応する対照培地または処置培地と取り替えた。
【００８５】
測定した時点は０時間、１２時間および２４時間を含み、次いでＣＲＳ  ＦＬＯ溶液の低電解質濃度による伝導率問題を調整するために、２４時間で追加の測定として頂端処置培地を除去し、細胞培地と取り替えて行った。すべての測定値は、３７℃の段階で採取した。ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の傍細胞透過性は、２４時間のカラゲナン曝露の後、評価した。４ｋＤａのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ）を３ｍｇ／ｍＬの濃度まで頂端コンパートメントに加え、次いで２時間後、側底コンパートメントから試料を採取した。通過したデキストランの量をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ９６ウェル蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長、それぞれ４８５ｎｍと５２０ｎｍで測定した。結果は、ＦＩＴＣデキストラン移行のシンク条件を想定し、以下（式２を参照されたい）に従って算出した。（３）
【００８６】
【数２】
2019505538.tif 000004
【００８７】
Ｐａｐｐは見かけの透過係数（ｃｍ／ｓ）であり、ｄＱ／ｄｔ（ｍｇ／ｓ）は側底コンパートメントへのＦＩＴＣデキストランの移行速度であり、Ａ（ｃｍ３）はトランスウェル膜の表面積であり、Ｃ０（ｍｇ／ｍＬ）は頂端コンパートメントの開始薬物濃度である。倍率変化は、Ｐａｐｐ値（式３を参照されたい）から算出した。
【００８８】
【数３】
2019505538.tif 000005
【００８９】
カラゲナン処置試料のＰａｐｐを対照培地または溶媒対照のいずれかと比較した。
【００９０】
Ｆ−アクチン細胞骨格の免疫細胞化学は、２％パラホルムアルデヒド中で１５分間試料を固定することによって行い、次いで試料をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、乾燥させて−４□Ｃで保存した。固定した試験片を氷上で１５分間静置させながら、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。ＰＢＳで３回洗浄し、タンパク質ブロック（Ｄａｋｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を適用した。試料を再度、ＰＢＳで３回洗浄し、１：１００でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）とともに４５分間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗浄した。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）を加えて１０分後、ＰＢＳで３回洗浄し、次いでガラススライド上に載せた。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００倒立顕微鏡を使用して、共焦点顕微鏡観察を行った。ファロイジンとＤＡＰＩは、それぞれ４９５ｎｍと３６４ｎｍで励起させ、次いで５１８ｎｍと４５４ｎｍで発光させた。
【００９１】
３．２  結果：経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）
２４時間で初期ＴＥＥＲのパーセンテージとして表した処置ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は以下の平均（・｝ＳＤ）値を示した：対照培地１１６．９％（・｝１４．５９）、ＦＬＯ１０６．５％（・｝１９．１４）、ＦＬＯ＋κ１３３．５％（・｝２９．５８）、ＦＬＯ＋ι１０３．６％（・｝２５．２３）、ＣＲＳ１３７．３％（・｝５６．１６）、ＣＲＳ＋κ１８４．３％（・｝１３３．９）、ＣＲＳ＋ι１２２．３％（・｝４８．５９）（図４Ａ）。初期および２４時間の測定値は、同一の細胞緩衝液中で採取し、以下の通り算出した（式４を参照されたい）。
式４：ＴＥＥＲ（％変化）＝（ＴＥＥＲ（２４時間））／（ＴＥＥＲ（初期））×１００
【００９２】
処置溶液とともに頂端部で採取したＴＥＥＲ測定値も示す（図４Ｂおよび４Ｃを参照されたい）が、しかし抵抗を妨害するＦＬＯ  ＣＲＳ溶液の低イオン濃度のためにアーチファクトであり得る大きな変動性を示す。ＴＥＥＲは、生の値（オーム）として表す。
【００９３】
見かけの傍細胞透過性（Ｐａｐｐ）は、ＦＬＯまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンへの２４時間の曝露後に、測定した。対照培地に曝されたＨＮＥＣ−ＡＬＩのＰａｐｐと比較すると、平均（±ＳＤ）倍率変化値は以下の通りであった：図５Ａに示すように、ＦＬＯ０．６５６２（±０．６９０５）、ＦＬＯ＋ι（±０．３９６１）、ＣＲＳ０．５７５１（±０．４９７８）、ＣＲＳ＋κ０．３９１３（±０．０３８４）、ＣＲＳ＋ι０．２７５６（±０．１６９１）。
【００９４】
溶媒のみの対照と比較すると、ＨＮＥＣ−ＡＬＩのＰａｐｐは、以下のように平均（±ＳＤ）倍率変化値を示した：図５Ｂに示すように、ＦＬＯ＋κ１．００２３（±０．３７１８）、ＦＬＯ＋ι０．６６０５（±０．３３９７）、ＣＲＳ＋κ１．２０５（±１．０６７）、ＣＲＳ＋ι０．７６３８（±０．５２１１）。
【００９５】
３．３  結果：アクチン細胞骨格の免疫細胞化学
Ｆ−アクチン局在化に特異的なＨＮＥＣ−ＡＬＩの形態的特徴を、κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンに曝された培養物で評価した。アクチン細胞骨格は、細胞極性、小胞輸送の維持において重要であり、密着結合および接着結合を含む完全な細胞間結合と密接に関連している。共焦点画像解析は、アクチンケーブル、分布または細胞形態変化の無損失を示した。図６および図７に示すようにアクチンの細胞質染色において特定の増加はなかった。
【００９６】
結論として、粘膜バリア機能はカラゲナンへの曝露によって減少することがなく、健康なヒト上皮細胞においてＴＥＥＲまたはＰａｐｐによって測定したように通常のバリアに明らかな破損は見られない。しかし、罹患した患者由来の組織において、ＦＬＯ  ＣＲＳ、およびカラゲナンとともにＦＬＯ  ＣＲＳに曝された組織においてＴＥＥＲに増加が見られたが、通常のバリアへの破損は見られなかった。これらの結果は、下記の第６節に示す。
【００９７】
ι−カラゲナンがＨＮＥＣ−ＡＬＩのＰａｐｐを４ｋＤａデキストランに減少させる傾向が見られる。これは、結合バリアの成分、アクチン細胞骨格上での直接作用に関連があり得、または化合物の分子サイズが大きいことに起因し、したがって透過性が限定される。
【００９８】
Ｆ−アクチン染色の定量化はなかったが、カラゲナン、主にι−カラゲナンに曝された試験片の頂端部Ｆ−アクチン鎖の複雑性に増加があるように見える。
【００９９】
４．線毛の機能および構造
４．１  方法
ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の線毛運動周波数（ＣＢＦ）は、倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，  Ｔｏｋｙｏ）で、２０×対物レンズおよび１．５倍率を使用して評価した。ビデオは、Ｍｏｄｅｌ  Ｂａｓｌｅｒ  ａｃＡ６４５−１００μｍ  ＵＳＢ３カメラ（Ｂａｓｌｅｒ  ＡＧ，Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、毎秒１００コマ、６４０×４８０ピクセルの解像度で録画した。録画したビデオ試料は、Ｓｉｓｓｏｎ−Ａｍｍｏｎｓ  Ｖｉｄｅｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＳＡＶＡ）システム（Ｓｉｓｓｏｎら，（２００３）２１１（２）：１０３−１１１）を使用して分析した。すべての測定値は２２℃の室温で採取した。
【０１００】
ベースラインのＣＢＦは、実験条件を追加する前に採取し、最初にＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物を１００μＬのＰＢＳで洗浄し、次いで４０μＬの室温のＰＢＳを頂端コンパートメントに加えた。ベースライン測定値は、各培養から２つの別々の領域から採取した。頂端部ＰＢＳを除去し、対照培地、溶媒のみの対照のいずれか、または溶液を含有するカラゲナンを加えた。ＣＢＦのいずれの早期刺激／緩徐化を評価するために、最初の２０分間は５分毎に測定値を連続で採取した。測定値は６時間および２４時間でも採取した。
【０１０１】
結果は、平均ＣＢＦ（Ｈｚ）として、またベースラインと比較したパーセンタイル変化としても表す。走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）試験片は、リン酸緩衝液に溶解した４％のパラホルムアルデヒドおよび１．２５％のグルタルアルデヒドの溶液に固定し、４℃で保存した。試料を緩衝液で洗浄し、エタノールで連続脱水させ、続いてヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）との１：１混合液に、次いで１００％ＨＭＤＳに浸漬した。試験片を、アルミニウムスタブに載せ、カーボンで蔽った。Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ３０  Ｆｉｌｅｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｇｕｎ  ＳＥＭ（Ｐｈｉｌｉｐｓ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）  を用いて、真空下で５ｋＶの加速電圧で画像を撮った（Ｍａｌｌａｎｔｓら，（２００９），  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １６１（７）：８８３−８９０）；  Ｍｕｒｐｈｙら，（２０１５）Ｏｐｈｔｈａｌ  Ｐｌａｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．３１（５）：３９６−４００）。
【０１０２】
４．２  結果：線毛運動周波数−予備：２つの複写物に基づく
線毛運動周波数測定は、以下の生値（図８Ａ）を示した：ＦＬＯベースライン（８．０６、８．６７Ｈｚ）、５分（７．９３、５．９８Ｈｚ）、１０分（７．４２、６．８７Ｈｚ）、１５分（８．２２、６．３２Ｈｚ）、２０分（７．４６、７．５７Ｈｚ）、６時間（６．８２、６．８０Ｈｚ）、２４時間（８．１５、６．５６Ｈｚ）；ＦＬＯ＋κベースライン（８．３７、９．０５Ｈｚ）、５分（８．１６、７．７８Ｈｚ）、１０分（７．８８、７．３６Ｈｚ）、１５分（８．０８、７．６６Ｈｚ）、２０分（７．８６、７．７９Ｈｚ）、６時間（６．６、７．５９Ｈｚ）、２４時間（７．２７、６．９４Ｈｚ）；ＦＬＯ＋ιベースライン（８．１７、６．７２Ｈｚ）、５分（８．９４、６．７Ｈｚ）、１０分（８．４３、７．１５Ｈｚ）、１５分（８．１７、７．５６Ｈｚ）、２０分（９．１４、８．２３Ｈｚ）、６時間（８．０、７．０４Ｈｚ）、２４時間（７．９、７．１１Ｈｚ）；ＣＲＳベースライン（７．１、８．０５Ｈｚ）、５分（７．１８、７．５８Ｈｚ）、１０分（６．６４、７．２３Ｈｚ）、１５分（７．３２、７．９９Ｈｚ）、２０分（７．３２、７．３４Ｈｚ）、６時間（６．０５、７．３２Ｈｚ）、２４時間（６．３５、７．２９Ｈｚ）；ＣＲＳ＋κベースライン（６．９８、７．６９Ｈｚ）、５分（６．６５、６．８４Ｈｚ）、１０分（６．８９、６．１９Ｈｚ）、１５分（６．３６、６．４３Ｈｚ）、２０分（６．９３、７．２１Ｈｚ）、６時間（６．５３、６．６５Ｈｚ）、２４時間（７．１１、６．７９Ｈｚ）；ＣＲＳ＋ιベースライン（７．７５、６．４２Ｈｚ）、５分（７．１５、７．２１Ｈｚ）、１０分（７．１６、７．１Ｈｚ）、１５分（７．５５、８．０８Ｈｚ）、２０分（７．０９、７．３９Ｈｚ）、６時間（６．９５、７．２３Ｈｚ）、２４時間（８．５５、６．７８Ｈｚ）。
【０１０３】
ＣＢＦの経時変化をベースライン測定と比較すると、図８Ｂに示すように、ι−カラゲナンが２０分以内、最高２４時間までに線毛を刺激する傾向を示した。ＣＲＳを有する患者由来の細胞の線毛運動周波数に対するこれらの溶液の効果は、最初にＦＬＯ  ＣＲＳが５分でＣＢＦを減少し、２４時間で通常に戻ることを示す（以下の第６節を参照されたい）。この効果は、κ−カラゲナンを添加することで防止される。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅは患部組織培養のＣＢＦに対して同様の効果を有し、今度の場合も、κ−カラゲナンを添加することで元に戻る。これは、κ−カラゲナンが線毛生理機能を保護することを示している。結果を図１８に示し、下記の第６．１７節に記載する。
【０１０４】
線毛上皮細胞の形態学的性質は、１０，０００ｘ倍率で走査電子顕微鏡によって観察された。示したように（図９および１０を参照されたい）、通常の線毛細胞および周囲の微線毛はすべての実験条件下で観察された。広範な電界解析は、プロセシング中の細胞層のゆがみにより、今回は行わなかった。
【０１０５】
重複実験の結果に基づいて、健康な組織培養物に関する現在のデータは、ι−カラゲナンがＦＬＯ溶液またはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液のそれを超えてＣＢＦを高めることができる傾向を示している。短時間または最高２４時間の曝露では、線毛運動障害または線毛毒性は明らかに存在しない。
【０１０６】
５．κ−カラゲナンを含む組成物の投与
等張担体溶液中にκ−カラゲナンを含む組成物は、市販されている粉末形状のκ−カラゲナンを水に溶解させ、最終濃度約０．１２重量／容量％のκ−カラゲナンになるように調製した。水の量は、５０ｍＬ、１００ｍＬまたは２００ｍＬから選択することができる。しかし、所要用途に応じて、他の量も使用してよい。粉末状のκ−カラゲナンは、等張担体溶液に達するために必要とされる成分を添加する前後に水に加えてよい。
【０１０７】
κ−カラゲナンと組み合わせて任意の等張担体溶液を使用することができるが、最善の結果はＮａＣｌおよびＫＣｌを含む等張溶液を用いて達成される。例えば、担体溶液は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳから作製することができる。担体溶液をメ−カーの説明書に従って作製する。
【０１０８】
上記の組成物を用いて治療される対象は、処置の間、立っていても、座っていてもよい。対象は、鼻腔への送達後、排出される担体溶液が確実に収容されるようにシンクまたはボール上に位置することが好ましい。溶液は、約１００ｍＬの送達溶液が一方の鼻孔から鼻および副鼻腔に放出され、反対側の鼻孔から出てくるまでボトルを単純に圧搾することによって操作される陽圧洗浄装置によって鼻孔に適用される。次いで、この手順を反対側の鼻孔に繰り返す。鼻腔に溶液を送達するのを補助するために、鼻および副鼻腔の通路の洗浄のために、対象は頭を下にする、すなわち鼻において水平位置より下げてもよい。
【０１０９】
小児において使用する場合、１つの鼻孔あたり約５０ｍＬの量は同時に粘膜を洗浄して処置するのに十分であるはずである。成人において、７０〜９０ｍＬの量は、通常、粘膜を洗浄し、処置するのに十分である。
【０１１０】
陽圧洗浄装置で用いるボトルの一例は、図１１に示す。ボトルは、溶液が鼻腔および副鼻腔通路に確実に送達されるように設計されている。図１のボトルは、ボトル構成要素を完全に分解できるようにする広い口を有し、使用後にすすぎ、完全に乾燥させることができる。これは、病原菌の過剰増殖およびそれに続く副鼻腔を含む鼻腔通路の再侵襲を大幅に制限する。
【０１１１】
本明細書に記載の組成物は、特に生涯にわたり苦悩となる慢性鼻副鼻腔炎を治療するために使用される場合、継続的に用いることができる。このように、治療は、１日１回、または多くても１日２回必要であり得る。あるいは、本組成物の使用は医師の指示に従って用いられてよい。
【０１１２】
６．対照と比較したＣＲＳ患者におけるカラゲナン組成物の効果
ＣＲＳ患者の鼻ポリープおよび非ＣＲＳ対照由来の気相液相界面で増殖し、収集した初代ヒト鼻上皮細胞の線毛運動周波数（ＣＢＦ）、粘膜バリア機能、および炎症反応に対するカラゲナン（ιまたはκ）を含有する噴霧式点鼻剤の効果を試験した。
【０１１３】
６．１  初代ヒト鼻上皮細胞
慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）患者および非ＣＲＳ対照から細胞学的鼻ブラッシングを収集する倫理的承認は、Ｔｈｅ  Ｑｕｅｅｎ  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから付与された。鼻ブラッシングは、同意する参加者から収集された。除外基準には、能動喫煙、１８歳未満の年齢および全身性疾患が含まれた。
【０１１４】
Ｒａｍｅｚａｎｐｏｕｒ  Ｍ，ら，：Ｔｈ１７  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｄｉｓｒｕｐｔ  ｔｈｅ  ａｉｒｗａｙ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１６，（２０１６）に記載の方法で副鼻腔粘膜を穏やかにブラッシングすることによって、ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥＣ）を収集した。鼻ポリープを伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）キシリトールおよび非ＣＲＳ患者から抽出した細胞を気管支上皮増殖培地（ＢＥＧＭ、ＣＣ−３１７０，Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）に懸濁させ、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心分離（１７００ｒｐｍで５分間）して、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｂ−ＡＬＩ（商標）増殖培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）に再懸濁させた。
【０１１５】
次いで、抗ＣＤ６８（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を被覆した直径１００ｍｍの培養プレート中で細胞試料はマクロファージを２０分間枯渇させた。培養プレートから細胞試料を取り出し、１型コラーゲンで被覆したフラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈｍａｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に播種した。ＨＮＥＣは継代２で試験し、汎サイトケラチンおよびＣＤ４５抗体（両方とも、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に対する反応を経て、上皮系列であることを確認した。
【０１１６】
６．２  気相液相界面培養
ＨＮＥＣは、Ｒａｍｅｚａｎｐｏｕｒ  Ｍ，ら，：  Ｔｈ１７  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔ  ｔｈｅ  Ａｉｒｗａｙ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ．  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１６（２０１６）に記載のようにＬｏｎｚａ  ＡＬＩ培養方法（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）に従って、気相液相界面（ＡＬＩ）培地で維持した。８０％コンフルエントになるまで細胞を増殖させ、次いで収集し、コラーゲンを被覆した６．５ｍｍの透過性Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）上にウェル当たり７〜１０４細胞の密度で播種した。細胞培養物は、Ｂ−ＡＬＩ（商標）増殖培地とともに、３７℃、５％ＣＯ２で、細胞インキュベーター内で３〜４日間維持した。エアリフトステップにおいて、頂端培地を除去し、基底培地を５００μＬのＢ−ＡＬＩ（商標）分化培地と取り替えた。培養物は、一日おきに、Ｂ−ＡＬＩ完全分化培地を基底チャンバーに加えることによって培養した。ＨＮＥＣは、気相液相界面（ＨＮＥＣ−ＡＬＩ）で密着結合の発達のために最低１４日間、および線毛生成のために２８日間維持した。
【０１１７】
６．３  カラゲナン副鼻腔溶液
κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンは、Ｍａｒｉｎｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨによる指示通りに滅菌ＭＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に溶解させ、８０℃で２時間加熱することによって０．２４％の濃度にした。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳ（ＥＮＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を２倍濃度で滅菌ＭＱ水に懸濁させた。各々の溶液をろ過滅菌し、次いで、１：１の割合で混合して、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中０．１２％のκ−カラゲナン、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中０．１２％のι−カラゲナン、ＦＬＯ  ＣＲＳ中０．１２％のκ−カラゲナン、およびＦＬＯ  ＣＲＳ中０．１２％のι−カラゲナンを得た。次いでこれらの溶液を室温で保存し、最高２４時間まで、細胞培養の頂端コンパートメントに適用した。
【０１１８】
６．４  経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）をＥＶＯＭ２上皮電圧抵抗計（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＦＬ）を用いて測定し、結果を、生値、すなわち初期測定値への相対的な変化としてオームで表した。ＴＥＥＲ値は、＞４００オーム／ｃｍ２（０．３３ｃｍ２のトランスウェル膜において＞１２００オームに等しい）を示す培養物から採取したものだけであった。１００μＬのＢ−ＡＬＩ培地をＡＬＩ培養物の頂端チャンバーに加えて、細胞単層を横切って基底チャンバー内に電気回路を形成した。加熱プラットフォームを使用して、測定の間、培養物を３７℃で維持した。対応する処置または対照（陰性対照についてはＢ−ＡＬＩ培地、陽性対照については２％のＴｒｉｔｏｎ×１００）を各ウェルの底部チャンバーに加え、０時間および２４時間にＴＥＥＲ測定値を得た。
【０１１９】
６．５  透過性アッセイ
ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の傍細胞透過性を、カラゲナンに２４時間曝露した後、評価した。４ｋＤａのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ）を３ｍｇ／ｍＬの濃度まで頂端コンパートメントに加え、次いで２時間後に側底コンパートメントから試料を採取した。通過したデキストランの量をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ９６ウェル蛍光マイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ，  ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，  Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、励起波長と発光波長、それぞれ４８５ｎｍと５２０ｎｍで測定した。
【０１２０】
６．６  細胞毒性アッセイ
すべての処置をＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物に実施し、２４時間インキュベートした。細胞生存率を判定するために、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ，ＣＡ）を使用して乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定した。手短に言うと、各ウェルから５０ｍＬの培地を新しいプレートに移し、次いで５０ｍＬのＬＤＨ試薬を上清に加え、室温の暗所で３０分間インキュベートした。調製した試料の吸光度をＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で４９０ｎｍで記録し、相対的生存率を陰性対照（未処置細胞）のＬＤＨレベルと比較して算出した。
【０１２１】
６．７  酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
処置培養物に２４時間曝露した後、処置したＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の側底コンパートメントから上清を収集した。メーカーの説明書に従って、総マトリックスメタロペプチダーゼ−２（ＭＭＰ−２）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）タンパク質レベルをＭＭＰ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＩＬ−６ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）を用いて決定した。すべての測定は、二つ組で行った。組織試料濃度は標準曲線から算出し、タンパク質濃度について補正した。
【０１２２】
６．８  免疫蛍光顕微鏡法
試料をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のホルマリンで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、氷上で１５分間、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、続いて無血清ブロッカー（ＳＦＢ；  Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて室温で６０分間ブロックした。ＴＢＳＴ−１０％  ＳＦＢ中で５μｇ／ｍＬまで希釈した、マウスモノクローナル抗ヒトＺＯ−１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４℃で終夜加えた。過剰な一次抗体を除去し、二次抗体に結合した２μＬ／ｍＬの抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を加えて、室温で１時間インキュベートした。これらの膜をＰＢＳですすぎ、２００ｎｇ／ｍＬの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、核を分離した。膜をスライドガラスに移し、退色防止封入剤（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を１滴加えて、カバースリップを用いた。ＬＳＭ７００共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて試料を可視化した。
【０１２３】
６．９  線毛の機能と構造
ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の線毛運動周波数（ＣＢＦ）は、倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０，Ｔｏｋｙｏ）に２０Ｘ対物レンズおよび１．５倍率を使用して評価した。ビデオは、Ｍｏｄｅｌ  Ｂａｓｌｅｒ  ａｃＡ６４５−１００μｍ  ＵＳＢ３カメラ（Ｂａｓｌｅｒ  ＡＧ，Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、毎秒１００コマ、６４０×４８０ピクセルの解像度で録画した。録画したビデオ試料は、Ｓｉｓｓｏｎ−Ａｍｍｏｎｓ  Ｖｉｄｅｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＳＡＶＡ）  システムを使用して分析した。すべての測定値は、室温で採取した。ベースラインのＣＢＦは、実験条件を追加する前に採取した。最初に、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物を１００μＬのＰＢＳで洗浄し、次いで４０μＬのＰＢＳを頂端コンパートメントに加えた。ベースライン測定値は、各培養から２つの別々の領域から採取した。頂端部ＰＢＳを除去し、対照培地、溶媒のみの対照、または溶液を含有するカラゲナンのいずれかを加えた。ＣＢＦのいずれの早期刺激／緩徐化を評価するために、最初の２０分間は５分毎に測定値を連続で採取した。測定値は６時間および２４時間でも採取した。結果は、平均ＣＢＦ（Ｈｚ）として、またベースラインと比較したパーセンタイル変化としても表す。
【０１２４】
６．１０  統計分析
データは、平均値±ＳＥＭとして示す。ＴＥＥＲ実験は、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者からの３回の複製を用いて行い、０時間で患者からの平均値に対して値を正規化した。ＴＥＥＲ統計分析は、ｔ検定を用いて行い、他のすべての分析は分散分析の後に、ＳＰＳＳ（第２２版）を使用してＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定を行った。
【０１２５】
結果
６．１１  結果：乳酸脱水素酵素アッセイ
細胞生存率は、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物からのＬＤＨ放出を測定することによって評価した。ＦＬＯ  ＣＲＳまたはＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中のκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンの２４時間曝露は、ＣＲＳ患者（図１２Ａ）および非ＣＲＳ対照（図１２Ｂ）のいずれの処置でも、ＬＤＨ放出において有意な増加を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０１２６】
図１２Ａおよび１２Ｂを参照すると、グラフは、ＣＲＳ患者（図１２Ａ）由来および非ＣＲＳ対照患者（図１２Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の適用から２４時間後の生存率をＬＤＨアッセイによって決定された無処置対照細胞と比較して示す。細胞生存率は、陰性対照として未処置細胞と比較して算出した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【０１２７】
６．１２  結果：マトリックスメタロペプチダーゼ−２  ＥＬＩＳＡ
κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの適用は、２４時間後、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ対照患者においてＨＮＥＣの上清中のＭＭＰ−２の分泌に変化がなかった。
【０１２８】
ＣＲＳ患者（図１３Ａ）および非ＣＲＳ対照患者（図１３Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳおよび陰性対照（培地）に２４時間曝されたＨＮＥＣによるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ２）分泌を総ＭＭＰ２レベル（ｎｇ／ｍＬ）として表す。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。
【０１２９】
６．１３  結果：インターロイキン−６  ＥＬＩＳＡ
Ｆｌｏ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中のκ−カラゲナンを２４時間適用すると、ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ単層の上清中のＩＬ−６タンパク質濃度が大幅に低下した（ｐ＝０．０３７）。
【０１３０】
ＣＲＳ患者（図１４）および非ＣＲＳ対照患者（図１４Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層においてκ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳおよび陰性対照（培地）に２４時間曝されたＨＮＥＣの上清中のインターロイキン−６タンパク質レベルを合計（ｐｇ／ｍＬ）として表す。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【０１３１】
６．１４  結果：経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）
カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  ＣＲＳは、ＨＮＥＣ  ＡＬＩ培養物のＴＥＥＲを増加させた。ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物を６人のドナー（ＣＲＳｗＮＰ３人および対照３人）から確立した。κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の効果は、２４時間後にＣＲＳｗＮＰ患者および対照からのＨＮＥＣ単層を横切るＴＥＥＲを測定することによって調べた。ＣＲＳ患者において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．０４）およびＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．０２）は、２４時間のインキュベーション後、ＴＥＥＲが大幅に増加した。他の処置は、ＣＲＳ患者または対照においてＴＥＥＲに対して何ら有意な効果を示さなかった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。
【０１３２】
ＴＥＥＲ値は、処置前の測定値（図１５Ａおよび１５Ｂにおいて黒色バーとして示す）と、ＣＲＳｗＮＰ患者（Ａ）および非ＣＲＳ対照患者（Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の適用から２４時間後（灰色バー）の測定値とに対して正規化した。値は、ｎ＝３について平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５、ｔ検定を用いる。
【０１３３】
６．１５  結果：傍細胞透過性−デキストランアッセイ
ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳにおいてκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンは、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の傍細胞透過性を増加させなかった。κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの適用は、ＣＲＳ患者および対照由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層において傍細胞透過性に有意な効果を及ぼさなかった（図１６Ａおよび１６Ｂ）（Ｐ＞０．０５）。陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）（低透過性）および陰性対照（培地）（高透過性）は、予想された透過性値を示した。
【０１３４】
ＣＲＳｗＮＰ患者（図１６Ａ）および非ＣＲＳ対照患者由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の適用から２４時間後に測定したＦＩＴＣ−デキストランの通過を図１６Ｂに示す。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【０１３５】
６．１６  結果：アクチン細胞骨格  免疫細胞化学
ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳにおいてκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンは、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層におけるＺＯ−１およびＦ−アクチンの局在化に影響を及ぼさなかった。処置の適用から２４時間後に、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳのＺＯ−１とＦ−アクチンの局在化に対する効果を、免疫蛍光法と共焦点レーザー走査微鏡法とを用いて調べた。未処置細胞において、ＺＯ−１またはＦ−アクチンは、予想通り、単層の頂端側の周辺に位置していた。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおけるκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンの共焦点画像解析は、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ対照患者においてＺＯ−１またはＦ−アクチンの局在化に変化を示さなかった。
【０１３６】
ＣＲＳ患者および対照患者のＨＮＥＣ単層におけるＺＯ−１およびＦ−アクチンの免疫局在を調べた。κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅとＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の、ＣＲＳ患者（図１７Ａ）およびＦ−アクチンＣＲＳ患者（図１７Ｂ）のＨＮＥＣ単層のＺｏｎａ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）免疫局在性に対する効果。ＤＡＰＩを用いて、核を染色（青色染色）した。白色バーは２０μｍである。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、２０Ｘ倍率。
【０１３７】
６．１７  結果：線毛運動周波数
ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ中のκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンは、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層おいて２４時間後に線毛運動周波数に影響を及ぼさなかった。線毛運動周波数は、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物において異なる時点（０分、５分、１０分、２０分、６時間および２４時間）で評価した。ＦＬＯ  ＣＲＳまたはＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中のκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンの２４時間の曝露は、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者におけるいずれの処置によるＣＢＦにおいても有意差を示さなかった。測定値は、５分、１０分、２０分、６時間および２４時間の時点にわたる平均（Ｈｚ）を表す。値は、ｎ＝３について平均値±ＳＥＭとして示される（図１８）。
【０１３８】
６．１８  結果：細胞移動−対照患者に対する治療効果
対照患者の細胞移動に対する処置効果を調べた。陰性対照と比較して、κ（０．４ｍｇ／ｍＬ）＋ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．４６１）およびＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．０９５）処置による移動速度において有意差はなかった。移動速度は陰性対照よりも遅く、各処置はκ（１．２ｍｇ／ｍＬ）＋ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．０１５）、ι（１．２ｍｇ／ｍＬ）＋ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．００１）およびι（０．４ｍｇ／ｍＬ）＋ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ  ＝０．００３）であった。結果を図１９Ａおよび図１９Ｂに示す。線形回帰分析で比較した移動速度のデータは、平均値±ＳＤである。ｐ≦０．０５の場合、差は有意であるとみなされる。
【０１３９】
創傷治癒移動アッセイは、ＣＲＳｗＮＰ患者（図１９Ａ）および非ＣＲＳ対照患者（図１９Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  ＣＲＳおよび陰性対照（培地）の適用から２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【０１４０】
６．１９  結果：炎症反応
ＦＬＯ Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ中のκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンは、ＣＲＳ患者のＨＮＥＣ／ＡＬＩにおけるＩＬ−６の炎症促進性反応を阻害しなかった。これまでの研究は、ポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷがＨＮＥＣ／ＡＬＩ単層によってＩＬ−６とＴＮＦ−ａを含む炎症性サイトカイン分泌を一貫して誘導することを示した。炎症促進性反応を弱めるカラゲナンιおよびκの可能性を判定するために、ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅの両方中のカラゲナンを、ポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ（１０μｇ／ｍＬ）の非存在下または存在下で、でＣＲＳ患者および非ＣＲＳ対照患者由来のＨＮＥＣ／ＡＬＩ単層に適用した。ブデソニドは抗炎症の標準ケアコントロールとして使用された。ＩＬ−６サイトカインの分析により、カラゲナンによる以下の処置、κ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳ、カラゲナンι／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンι／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳがＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者において炎症促進性反応を抑制しないことが、明らかになった。
【０１４１】
ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中で送達されたκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの炎症促進性反応を弱める効果を調べ、その結果を図２０Ａおよび２０Ｂに示す。ＣＲＳ患者（図２０Ａ）および非ＣＲＳ患者（図２０Ｂ）においてポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷで刺激されたが、ＨＮＥＣ／ＡＬＩに対する、カラゲナンκ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳ、カラゲナンι／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンι／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの効果。ブデソニドは抗炎症の標準ケアコントロールとして使用された。陰性対照は、未処置細胞（培地）である。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示す。
【０１４２】
考察
欠損した上皮密着結合（ＴＪ）バリア機能は、上気道の炎症性疾患の発症における病原因子であることが示されている。上述の本研究において、κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの効果をＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおいて、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ（対照）患者から収集した初代ヒト鼻上皮細胞の粘液線毛機能およびバリア構造と機能について評価した。
【０１４３】
本研究は、これらの処置が有毒でなく、上皮バリア機能に対して有害作用がないことを示した。むしろ、κ−カラゲナンの有無にかかわらず、ＦＬＯ  ＣＲＳ（等張溶液）の適用により、２４時間後、ＣＲＳ患者由来のヒト鼻上皮細胞単層のＴＥＥＲが大幅に高まった。陰性対照と比較して、ＴＥＥＲの変化は傍細胞透過性の変化と関連してなく、異なる処置の適用時に、蛍光標識ビーズの同等の傍細胞通過によって明白に示された。これらの調査結果は、κ−カラゲナンの有無にかかわらず、ＦＬＯ  ＣＲＳが、主にＣＲＳ患者におけるなどの炎症状態において粘膜バリア機能を離散的に強化し得ることを示している。溶液のイオン強度がＴＥＥＲ測定値に直接影響することはよく知られており、陰性対照溶液と比較して、ＴＥＥＲ測定値の増加がこれらの溶液のイオン構成の相違によって少なくともある程度説明することができる。ともかく、複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞分裂が起こった後でも、観察された効果がドナー依存性であるという考えは、ＣＲＳおよび対照のＨＮＥＣの生理機能の違いを示している。
【０１４４】
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、重要な炎症促進性サイトカインあり、慢性アレルギー性気道炎症において重要な役割を果たす。ＩＬ−６は急性期反応を生じさせ、炎症を調節する細胞内シグナル伝達カスケードを誘発する。特定のカラゲナン変異体が炎症を誘発し、生物を感染症から保護することは知られている。しかし、保護の程度は、異なる種類のカラゲナン間で異なる多糖の構造に依存する。実際、λ−カラゲナンはＩＬ−６分泌を効果的に誘発することができるが、κ−ラナゲナンはＩＬ−６誘発にわずかな影響を及ぼす。カラゲナン（エステル硫酸基の数によって決定される）の分子量は、それらの分子の免疫刺激特性において重要な役割を果たす。欧州委員会は、どのような安全性リスクでも回避するために食品添加物として使われるカラゲナンについて５０ｋＤａを超える分子量を勧告した。
【０１４５】
本研究で使用するκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンの分子量は、それぞれおよそ２００ｋＤａおよび５００ｋＤａである。結果は、ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層の上清中のＩＬ−６タンパク質レベルがＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいて希釈されたκ−カラゲナンの存在下で減少したことを示す。これらの結果は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいて希釈されると、κ−カラゲナンは、抗炎症特性を示し得ることを示している。上清中のＩＬ−６タンパク質レベルの減少がＨＮＥＣ−ＡＬＩ細胞によるＩＬ−６の産生および分泌の減少に起因するかどうか、あるいはＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいてκ−カラゲナンが上清内のＩＬ−６タンパク質と部分的に複合体を形成し得るかどうかは不明である。それにもかかわらず、κ−カラゲナンは、抗炎症特性を有することが本研究で示された。
【０１４６】
観察された効果がＩＬ−６に特異的であるかどうか、または他のサイトカイン、例えば、ＦＧＦ−２、フラクタルカイン、ＧＲＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１ａ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−ａ２もＦＬＯ  Ｓｏｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいてκ−カラゲナンの存在に影響を受け得るかどうかを決定することも興味深い。
【０１４７】
ＩＬ−６の結果を考慮して、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ／ＡＬＩ培養物における炎症促進性反応の阻害に対するκ−カラゲナンの影響を調べた。κ−カラゲナンの存在下でポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷで刺激されたＨＮＥＣ／ＡＬＩ培養物は、ＩＬ−６の炎症促進性反応を弱めなかった。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおいて他のポリマーι−カラゲナンは、ＩＬ−６の産生を減少させなかった。
【０１４８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）は、呼吸上皮内で組織修復および再構築において主要な役割を果たす。高レベルのＭＭＰ−２は、これまでに鼻ポリープで見つかっている。本研究において、ＭＭＰ−２は、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層の上清中に低レベルで存在し、κ−カラゲナン溶液またはι−カラゲナン溶液はＭＭＰ−２タンパク質レベルに影響を及ぼさないことが判明した。
【０１４９】
アクチン細胞骨格は、細胞極性、小胞輸送を維持する上で重要であり、密着結合と接着結合およびデスモソームを含む細胞間結合複合体に本質的に関連している。密着結合は、細胞膜を頂端ドメインと側底ドメインに分化するフェンスとして役立ち、また隣接する細胞間のイオンおよび溶質の傍細胞通路を制御するゲートとしても役立つ。密着結合形成において、ＺＯ−１は、膜貫通タンパク質オクルディン、クローディンと接合部接着分子（ＪＡＭ）の間の必須タンパク質であり、接着結合と密着結合との間にベルトを形成する細胞質成分である。本調査結果は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおいてκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンはＺＯ−１またはアクチンの局在化に影響を及ぼさなかったことを示し、これらのカラゲナンは粘膜バリア構造を損なわなかったことを示している。
【０１５０】
要約すると、本研究の結果は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおいて、κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンがＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層に対して細胞毒性でなく、炎症促進性反応を誘発することはなく、かつ粘膜バリア構造または機能を損なわなかったことを示している。κ−カラゲナンの有無にかかわらずＦＬＯ  ＣＲＳはＴＥＥＲを増加させたが、分泌されたＩＬ−６レベルはＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいてκ−カラゲナンの存在下で減少した。このデータとともに、ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいて希釈されたι−カラゲナンおよびκ−カラゲナンは粘膜バリア構造および機能に関して有益な特性を有し、局所に適用されると炎症を軽減し得ることを示す。
【図１Ａ】
2019505538.tif 000006
【図１Ｂ】
2019505538.tif 000007
【図２Ａ】
2019505538.tif 000008
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2019505538.tif 000010
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2019505538.tif 000012
【図４Ｂ】
2019505538.tif 000013
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
2019505538.tif 000018
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2019505538.tif 000022
【図１１】
2019505538.tif 000023
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
2019505538.tif 000034
【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
2019505538.tif 000037
【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月4日(2018.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
鼻および副鼻腔使用用のκ−カラゲナンを含む組成物とその使用方法。
【背景技術】
【０００２】
背景技術に関する以下の考察は、本発明だけの理解を容易にすることを目的とする。この考察は、参照された材料のいずれも本出願の優先日時点で技術常識の一部である、または一部であったことの容認または承認ではない。
【０００３】
カラゲナンは、特定の種類の紅藻由来の天然起源の直鎖硫酸化ガラクトース系多糖類の一種である。カラゲナンの従来の使用は、食品におけるゲル化剤としてであった。しかし、つい最近、カラゲナンは医薬品産業において、および生体材料の生産において使用するために試験され、徐放製剤などの薬物製剤の改善との関連を示した。しかし、カラゲナンは、血液凝固の阻害などの有害反応および免疫系への悪影響にも関連していた。したがって、医薬組成物および医薬製剤におけるカラゲナンの使用を限定してきた医薬品産業において、カラゲナンの使用に関連するリスクが多少ある。
【０００４】
海草から抽出される既知のカラゲナンは少なくとも１０の異なる種類があるが、産業上使用されてきたのは、ι−カラゲナン、κ−カラゲナンおよびλ−カラゲナンを含む３つの主な種類である。これらのカラゲナンは、その構造および硫酸基の数の両方でそれぞれ異なる。
【０００５】
食品グレードのカラゲナンは長い間使用されてきた。カラゲナンは、カリウムイオンおよびカルシウムイオンと接触して配置されると、ゲル化する特性を有するので、製品の粘度を向上させるために多くの食品で使用されてきた。カラゲナンは経口投与後、消化管からあまり吸収されず、したがって、一般に安全と考えられている。しかし、最近の研究では、薬物送達システムまたは組織再生足場などの医薬品および生体材料においてカラゲナンの使用が免疫系および血液凝固に向けて有害活性をもたらし得ることが示された。最近の総説は、カラゲナンの有害な生物学的作用についての考察を提示している（Ｌｉｕら，（２０１５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  １２１：２７−３６）。
【０００６】
ι−カラゲナンは、ライノウイルス感染症を治療するための抗ウイルス剤として使用することが最近検討されている。しかし、κ−カラゲナンを単独で、または他のカラゲナンとの組み合わせのいずれかで使用することについては、ほとんどわかっていない。
【０００７】
上気道疾患の治療のための鼻腔用スプレーまたは点鼻剤などの製品は、これらのデバイスによって送達される投与量が治療すべき領域に達するには不十分であるので、副鼻腔病状の治療において効果がないことが多い。副鼻腔疾患の治療で遭遇するさらなる問題は、薬物が治療効果のある十分な時間にわたって領域と接触していないということである。
【０００８】
上気道の疾患および状態はいくつかあり、例えば、鼻炎、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、鼻副鼻腔炎および慢性鼻副鼻腔炎がある。慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）は、鼻および副鼻腔に影響を及ぼす慢性炎症をもたらす免疫不全によって特徴付けられる。この症状は、鼻閉塞、大量の濃厚な緑色粘液の産生、副鼻腔痛、頭痛、嗅覚の損失、咽喉痛および咳として症候的に現れる。
【０００９】
慢性鼻副鼻腔炎にはいくつかの表現型があり、各表現型は好ましい治療プロトコールがある。いずれにしても、すべての表現型は、症状を和らげるために、鼻腔および副鼻腔から過剰な粘液および炎症性メディエーターを除去するように、毎日、陽圧下で大量の溶液で鼻腔および副鼻腔を洗浄する必要がある。疾患の一部の形態は、洗浄液に混入された局所薬物の投与を必要とする。そのような局所療法としては、ブデソニドもしくはモメタゾンのような局所ステロイド薬および／または局所抗生剤が挙げられる。
【００１０】
ＣＲＳは、それによって粘膜線毛の機能および構造が悪影響を受けている組織学的異常によっても特徴付けられる。これは、粘液停滞をもたらし、それによって粘液は濃くなり、濃縮され、結果として感染の発生率の増加になる。粘膜の「漏出」もあり、それによって炎症性変化が粘膜と細菌の完全性に悪影響を与え、炎症性物質は粘膜下組織に浸透することができる。
【００１１】
上述の様式で局所療法を行うことに関する問題は、洗浄後、副鼻腔内に残存する薬剤の濃度が極めて低いことである。処置後、使用される洗浄液の９７．５％が無くなるので、これが起こる。したがって、わずか２．５％が残存し、この液体の量は、わずかに微量の局所治療薬物を含み得る。
【００１２】
本発明が開発されたのは、この背景に対してである。本発明は、上記の従来技術の１つまたは複数の欠陥を克服する、あるいは少なくとも改善する、または有用な選択肢もしくは商業的な選択肢を消費者に提供することを追求する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、副鼻腔洗浄液中に治療有効量のカラゲナンを含む組成物と、その使用方法とに関する。より詳しくは、カラゲナンはκ−カラゲナンである。
【００１４】
本発明の一態様において、担体溶液中にκ−カラゲナンを含む組成物が提供され、該担体溶液は、細胞外液と等張溶液である。
【００１５】
本発明の一実施形態において、担体溶液は、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む。担体溶液は、以下の成分のうちの１種または複数種も含み得る：乳酸カルシウム五水和物、重炭酸ナトリウム、グルコース、キシリトール、またはエリスリトールと他のポリオール−糖類を含む他のいかなる５炭素糖分子（糖アルコール）。担体溶液は、低イオン強度を有し得る。
【００１６】
本発明の第２の態様において、等張担体溶液中にκ−カラゲナンを含み、第２の活性薬剤をさらに含む組成物が提供される。第２の活性薬剤は、上気道の疾患または状態の治療に使用される薬剤、薬物または剤の形態であり得る。
【００１７】
本発明の第３の態様において、等張担体溶液中に治療有効量のκ−カラゲナンを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、上気道の疾患または状態の治療方法が提供される。
【００１８】
本発明の第４の態様において、粉末状の治療量のκ−カラゲナン、担体溶液を調製するために再構成される粉末、およびそれらの使用説明書を含むキットが提供される。本発明のキットは、同じまたは同様の治療効果を達成するように溶液を投与する陽圧洗浄装置もしくは他の装置も含み得る。
【００１９】
本発明の第５の態様において、上気道の疾患または状態の治療のための薬剤の調製における、κ−カラゲナンの使用が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる特徴は、そのいくつかの非限定的な実施形態について以下の説明でさらに十分に説明する。この説明は、本発明を例示するためにだけ含まれる。上述のように、本発明の広範な概要、開示または説明に対する制限として理解されてはならない。添付する図面を参照して、以下の通りに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中の乳酸脱水素酵素の発現を示すグラフである。対照培地（対照培地＝１）と比較した倍率変化として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中の乳酸脱水素酵素の発現を示すグラフである。溶媒のみの対照（溶媒対照＝１）と比較した倍率変化として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図２Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ−２の発現を示すグラフである。総量（ｎｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図２Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ−２の発現を示すグラフである。溶媒のみの対照（溶媒のみ＝１００％）のパーセンテージ（％）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図３Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中のインターロイキン−６の発現を示すグラフである。総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図３Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の上清中のインターロイキン−６の発現を示すグラフであり、溶媒のみの対照を示す。総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図４Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンに２４時間曝された気相液相界面のヒト鼻上皮細胞の細胞緩衝液中で測定された初期の経上皮電気抵抗のパーセンテージを表すグラフである。
【図４Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中でκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の経上皮細胞抵抗の変化を示すグラフである。測定値は、細胞培地およびカラゲナン溶液中で、ベースライン、１２時間および２４時間で採取した。
【図４Ｃ】ＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の経上皮細胞抵抗の変化を示すグラフである。測定値は、細胞培地およびカラゲナン溶液中で、ベースライン、１２時間および２４時間で採取した。
【図５Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の傍細胞透過性を示すグラフであり、対照培地（対照培地＝１）と比較した倍率変化として表す。
【図５Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに２４時間曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の傍細胞透過性を示すグラフであり、溶媒対照（溶媒対照＝１）の倍率変化として表す。
【図６】アクチンの細胞質染色の写真を示す。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中での０．１２％κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの２４時間曝露の、ヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物のアクチン細胞骨格に対する効果を示す。Ｆ−アクチンをファロイジン（緑色）で、および細胞核をＤＡＰＩ（青色）で可視化した。
【図７】ＦＬＯ  ＣＲＳ中での０．１２％κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの２４時間曝露の、ヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物のアクチン細胞骨格に対する効果を示す写真である。Ｆ−アクチンをファロイジン（緑色）で、および細胞核をＤＡＰＩ（青色）で可視化した。
【図８Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の線毛運動周波数を示すグラフである。測定値は、５分、１０分、１５、分、２０分、６時間および１２時間の時点にわたる平均（Ｈｚ）を表す。
【図８Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞の気相液相界面培養物の線毛運動周波数を示すグラフである。測定値は、５分、１０分、１５、分、２０分、６時間および１２時間の時点でのベースライン（％；ＣＢＦｔ＝ｘ／ＣＢＦベースライン）からの平均変化を表す。
【図９】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞培養物の線毛表面構造を示す走査電子顕微鏡写真（１００００ｘ）である。
【図１０】ＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝されたヒト鼻上皮細胞培養物の線毛表面構造を示す走査電子顕微鏡写真（１００００ｘ）である。
【図１１】好ましい洗浄装置の一例を示す。
【図１２Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンへの２４時間曝露後のＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物からの乳酸脱水素酵素の放出を示すグラフである。細胞生存率（Ｐ＞０．０５）として表す。
【図１２Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンへの２４時間曝露後の非ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物からの乳酸脱水素酵素の放出を示すグラフである。細胞生存率（Ｐ＞０．０５）として表す。
【図１３Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンへの２４時間曝露後のＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣの上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ−２の分泌を示すグラフである。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。
【図１３Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でカラゲナンへの２４時間曝露後の非ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣの上清中のマトリックスメタロペプチダーゼ−２の分泌を示すグラフである。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。
【図１４Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンに２４時間曝されたＣＲＳ患者由来のヒト鼻上皮細胞の上清中のインターロイキン−６のレベルを示すグラフである。総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１４Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンに２４時間曝された非ＣＲＳ患者由来のヒト鼻上皮細胞の上清中のインターロイキン−６のレベルを示すグラフである。総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１５Ａ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに２４時間曝され、ＣＲＳ患者由来の細胞緩衝液中で測定されたヒト鼻上皮細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示すグラフである。
【図１５Ｂ】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかの溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに２４時間曝され、非ＣＲＳ患者由来の細胞緩衝液中で測定されたヒト鼻上皮細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示すグラフである。
【図１６Ａ】ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層の傍細胞透過性を示すグラフである。ＦＩＴＣ−デキストランの通過は、ＣＲＳｗＮＰ患者由来のＨＮＥＣ単層中でκ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を適用してから２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図１６Ｂ】ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層の傍細胞透過性を示すグラフである。ＦＩＴＣ−デキストランの通過は、非ＣＲＳ対照患者由来のＨＮＥＣ単層中でκ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を適用してから２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図１７Ａ】κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅとＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の、ＣＲＳ患者のＨＮＥＣ単層のＺｏｎａ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）免疫局在性に対する効果を示す。ＤＡＰＩを用いて、核を染色（青色染色）した。白色バーは２０μｍである。共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて２０Ｘ倍率。
【図１７Ｂ】κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅとＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の、ＣＲＳ患者のＦ−アクチンに対する効果を示す。ＤＡＰＩを用いて、核を染色（青色染色）した。白色バーは２０μｍである。共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて２０Ｘ倍率。
【図１８】ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンに曝された気相液相界面のヒト鼻上皮細胞の線毛運動周波数を示すグラフである。測定値は、５分、１０分、２０分、６時間および２４時間の時点にわたる平均（Ｈｚ）を表す。値は、ｎ＝３について平均値±ＳＥＭとして示される。
【図１９Ａ】処置の細胞移動に対する効果を示すグラフである。創傷治癒移動アッセイは、ＣＲＳｗＮＰ患者由来のＨＮＥＣ単層中でκ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  ＣＲＳと陰性対照（培地）を適用してから２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図１９Ｂ】処置の細胞移動に対する効果を示すグラフである。創傷治癒移動アッセイは、非ＣＲＳ対照患者由来のＨＮＥＣ単層中でκ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  ＣＲＳと陰性対照（培地）を適用してから２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図２０Ａ】ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中で送達されたκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの炎症促進反応を弱める効果を示すグラフである。ＣＲＳ患者においてポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷで刺激されたが、ＨＮＥＣ／ＡＬＩに対する、カラゲナンκ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳ、カラゲナンι／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンι／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの効果。ブデソニドは抗炎症の標準ケアコントロールとして使用された。陰性対照は未処置細胞（培地）である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。
【図２０Ｂ】ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中で送達されたκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの炎症促進反応を弱める効果を示すグラフである。非ＣＲＳ患者においてポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷで刺激されたが、ＨＮＥＣ／ＡＬＩに対する、カラゲナンκ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳ、カラゲナンι／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンι／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの効果。ブデソニドは抗炎症薬の標準ケアコントロールとして使用された。陰性対照は未処置細胞（培地）である。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一般的説明
文脈上別段の解釈を要する場合を除き、本明細書全体を通して、「含む」という語、または「含んでいる」もしくは「含むこと」などのその変化形は、述べられた整数または整数の群を包含するが、他のいかなる整数または整数の群も排除しないことを意味すると理解される。
【００２３】
当業者は、本明細書に記載の本発明が具体的に記述されたもの以外の変更および修正に影響されやすいことを理解するであろう。本発明は、すべてのそのような変更および修正を包含する。本発明は、本明細書に参照される、または指示されるステップ、特徴、製剤および化合物を個別にまたは集合的に含む、およびステップまたは特徴の任意およびすべての組み合わせ、またはいずれか２つ以上の組み合わせも含む。
【００２４】
本文で引用された各文書、参考文献、特許出願または特許は、全体として参照によって本明細書に明白に取り込まれる。これは、本文の一部として読者に読まれ、考慮されなければならないことを意味する。本文で引用された文書、参考文献、特許出願または特許が本文で繰り返されないのは、単に簡潔さの理由によるものである。
【００２５】
本明細書または参照によって本明細書に組み込まれるいずれの文書に記載のいずれの製品についてのいずれのメーカーの説明書、発明の詳細な説明、製品仕様書および製品シートは、ここに参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施に際して利用することができる。
【００２６】
本発明は、本明細書に記載のいずれの具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。これらの実施形態は、例示の目的のみを意図している。機能的に同等の製品、製剤および方法は、明らかに本明細書に記載の本発明の範囲内である。
【００２７】
本明細書に記載の本発明は、１つまたは複数の値の範囲（例えば、サイズ、移動および場の強度など）を含み得る。ある範囲の値は、範囲内のすべての値、例えば、範囲を定める値、およびその範囲への境界を定めるその値にすぐ隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果を引き起こす、その範囲に隣接する値を包含することが理解される。
【００２８】
本明細書に用いる選択された用語の他の定義は、本発明の発明を実施するための形態に見出すことができ、全体を通して適用することができる。別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての他の科学用語および技術用語は、一般的に本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００２９】
「活性薬剤」という用語は、１種の活性薬剤を意味することもあり、または２種以上の活性薬剤を包含し得る。「活性薬剤」という用語は、それが投与される対象において何らかの有益な変化をもたらすことに役立つ化合物を指す。例えば、この定義の範囲内の「活性薬剤」としては、κ−カラゲナン、ステロイド、抗生物質、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤および抗炎症剤が挙げられる。
【００３０】
「有効量」または「治療量」という用語は、対象において所望の変化をもたらすのに十分なその量を指す。活性薬剤の有効量を決定することは、当業者の知識および技術の範囲内である。
【００３１】
本明細書で用いる場合「治療」という用語は、動物（ヒトを含む）での疾患のどのような治療も網羅し、（ｉ）疾患の発症を予防すること、（ｉｉ）その発症を抑制するなどの疾患を阻止すること、（ｉｉｉ）疾患を軽減する、例えば、疾患の退縮を生じさせること、および／または（ｉｖ）通常の生物活性を改変することを含む。
【００３２】
本明細書で用いる場合「疾患」、「障害」または「状態」という用語は、どのような内科疾患／障害／状態、例えばこれらに限定されないが、鼻腔および副鼻腔内の過剰な粘液の蓄積を生じさせ得る慢性鼻副鼻腔炎および他の疾患を網羅する。さらなる疾患／障害／状態としては、非アレルギー性副鼻腔疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患および嚢胞性線維症が挙げられる。鼻腔および副鼻腔内の粘液蓄積も、内視鏡的副鼻腔手術などの手術から生じることもあり得る。
【００３３】
「等張性」という用語は、細胞外液と等張である担体溶液を指す。
【００３４】
１種または複数種の塩類を含むどのような溶液でも、イオン強度または電荷を有する。溶液中の塩または異なる塩類の量は、その濃度（ｍＭまたはｍＭｏｌ）によって定めることができる。例えば、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液は、２１ｍＭのイオン強度を有する。生理食塩水は、９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムの濃度および１５４ｍＭのイオン強度を有する。市販されている洗浄液は、しばしばいくつかの異なる塩類から構成され、１３０ｍＭから５００ｍＭを超える範囲でイオン強度を有すると推定されている。０から３５ｍＭの間のイオン強度は、送達溶液として使用される場合、超低イオン強度または極めて低いイオン強度の溶液であると考えられる。極めて低いイオン強度は、約３５ｍＭ未満のイオン強度を有する溶液を意味する。
【００３５】
本発明の医薬品は、任意の哺乳動物に投与されることができる。好ましくは、哺乳動物類はヒトである。
【００３６】
発明を実施するための形態
本発明の組成物および方法は、鼻孔、鼻腔および副鼻腔を含む上気道の治療に有用である。副鼻腔は、副鼻腔口を経て鼻腔に連結する。外科手術の術後、合併症、感染または疾患の結果、副鼻腔、鼻腔および副鼻腔口は、ブロックされることもあり得る。当業者は、本発明の組成物によって治療することができる上気道に関連する他の疾患および状態を認識しているであろう。
【００３７】
本発明の組成物は、等張担体溶液中にκ−カラゲナンを含む。組成物は、かなりの量（例えば１００〜２００ｍＬ）の担体溶液中で投与されるのが好ましい。さらなる薬剤、薬物または活性薬剤は、上気道と関連した疾患または状態の治療を補助するために、κ−カラゲナン組成物に組み入れられてもよい。
【００３８】
κ−カラゲナン
今まで、κ−カラゲナンは、医薬品において他のカラゲナンの存在なしで単独で使われなかったと思われる。すなわち、ι−カラゲナンおよび／またはλ−カラゲナンは医薬品産業において活性薬剤を送達するうえでそれらの効果について研究の対象であったが、他のカラゲナンの１つの存在なしで使用されるκ−カラゲナンについて対応する研究は存在しない。
【００３９】
κ−カラゲナンは、任意の市販の供給源からでも入手することができる。例えば、天然グレードのカラゲナンまたは濾過されたカラゲナンは、供給元から入手できる。κ−カラゲナンは、粉末、ゲルまたは液体の形態であり得る。好ましくはκ−カラゲナンは、粉末状である。
【００４０】
ι−カラゲナンが出血を誘発することがあり得、λ−カラゲナンが非常に炎症促進性であることを研究は示しており、激痛を誘発するための疼痛モデル実験で用いられている。一方では、κ−カラゲナンは、これらの３つのカラゲナンの中で、悪影響がなく、かつ局所薬物の送達において重要な利点を発揮することができる唯一のカラゲナンである。
【００４１】
理論に束縛されることなく、κ−カラゲナンを使用する利点は、少なくとも部分的にはその強力な粘膜付着特性にある。等張担体溶液とともにκ−カラゲナンを使用することは、鼻および副鼻腔粘膜上で用いられるとき、炎症促進性ではなく、非常に安全であることが示されている。加えて、本発明の組成物は、薬剤／薬物を保有するために単純な生理食塩水を使用する場合よりもかなり長い間、薬剤または薬物を粘膜表面に保持するのを助けることができる。
【００４２】
理論に束縛されることなく、本出願者は、本発明の副鼻腔溶液中にκ−カラゲナンを用いると粘膜層の水分補給となり、自然免疫機能および線毛運動性が改善されると考えている。加えて、洗浄液および局所薬剤が粘膜層上で保持されるので、治療レジメンの臨床転帰が改善される。
【００４３】
さらに、κ−カラゲナンは吸湿性であり、極めて効果的に水を保持する。したがって、本発明の組成物は、上気道の疾患または状態を治療することに理想的である。
【００４４】
治療有効量のκ−カラゲナンは、担体液剤中に提供される。担体溶液に存在するκ−カラゲナンの量は、約０．０１重量／容量％と約１５重量／容量％との間、より好ましくは約０．０５重量／容量％と約０．５％重量／容量％との間の範囲に及ぶ。本発明の一実施形態において、担体溶液中に存在するκ−カラゲナンの量は、約０．１２重量／容量％である。
【００４５】
κ−カラゲナンは、担体溶液に加えられる粉末または溶液として提供されてよい。一実施形態において、一定量のκ−カラゲナンは、担体溶液の粉末形状に加えられるように提供される。担体溶液は、説明書に従って粉末から調製されてもよく、使用前に、κ−カラゲナンを加えてよい。あるいは、κ−カラゲナンは粉末形状の担体溶液とともに粉末形状で提供され、水を補って適切な量にする。
【００４６】
このように、非常に好ましい一実施形態において、本発明は、副鼻腔手術直後の術後期における患者の処置（副鼻腔洗浄）のため、ならびに治療が単純な洗浄または副鼻腔の炎症もしくは感染症を処置するための治療薬の包含のいずれかを含む、副鼻腔のすべての炎症性疾患の継続的な副鼻腔洗浄処置のための副鼻腔洗浄溶液中にκ−カラゲナンを含む組成物を提供する。
【００４７】
本発明の組成物は、上気道の二次感染の有無にかかわらず、どのような炎症状態の存在下でも鼻および副鼻腔の使用に有用である。
【００４８】
加えて、本発明の組成物は、他の局所治療薬、薬剤または薬物、例えば、これらに限定されないが抗生物質、抗真菌剤または抗炎症剤との組み合わせで使用することができる。
【００４９】
本発明の好適な実施形態において、κ−カラゲナンは、１００ｍＬと２００ｍＬとの間の副鼻腔溶液の量で送達される。好ましくは、副鼻腔溶液は、低イオン強度溶液である。副鼻腔溶液は、キシリトールまたはエリスリトール（または任意の他の５炭素糖もしくはポリオール）および多少低い濃度のＫＣｌとＮａＣｌの両方を含んでもよい。
【００５０】
担体溶液
本発明の組成物は、等張担体液剤（「等張溶液」とも称する）中に治療有効量のκ−カラゲナンを混合することによって調製することができる。κ−カラゲナンとともに使用する適切な副鼻腔溶液は、当業者には周知である任意の希釈剤または担体を含む。どのような等張担体溶液でもκ−カラゲナンと組み合わせて使用することができるが、最良の結果は、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む等張溶液を使用して達成される。
【００５１】
好ましくは、κ−カラゲナンと組み合わせて使用することができる等張溶液は、ＦＬＯ（登録商標）Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ（登録商標）ＣＲＳ溶液を含み、市販されている。
【００５２】
ＦＬＯ（登録商標）Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅは等張溶液であり、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、乳酸カルシウム五水和物、重炭酸ナトリウムおよびグルコースを含む。この溶液は粉末として提供されることができ、メーカーの説明書に従って容量を調製することができ、そして治療量のκ−カラゲナンと混合することができる。あるいは、治療量のκ−カラゲナンの送達を確実にするために、κ−カラゲナンは粉末形状の担体溶液に加え、所要量にすることができる。
【００５３】
好適な実施形態において、粉末形状のκ−カラゲナンは、等張担体の粉末と混合され、次いで水を補って所要量にする。混合成分を調製し、粉末形状でパッケージされてもよい。
【００５４】
いくつかの状況では、例えば慢性鼻副鼻腔炎の患者の場合、低イオン強度溶液はこれらの患者において自然免疫機能に悪影響を与えないので、低イオン強度溶液が好ましい。この例では、低イオン強度を有し、キシリトール、ＫＣｌおよびＮａＣｌを含む、ＦＬＯ（登録商標）ＣＲＳ溶液を使用することが好ましい。
【００５５】
好ましくは、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅは、以下の組成物を有する：０．７７２重量／容量％のＮａＣｌ、０．０４２重量／容量％のＫＣｌ、０．０３２重量／容量％の乳酸カルシウム、０．０１５重量／容量％のＮａＨＣＯ３、０．０８５重量／容量％の無水グルコース、およびＦＬＯ  ＣＲＳは、以下の濃度を有する：ＮａＣｌ＝０．７５ｍｇ／ｍＬ、ＫＣｌ＝０．９ｍｇ／ｍＬおよびキシリトール＝３７０ｍｇ／ｍＬ。
【００５６】
その治療を必要とする患者に投与される組成物の量は、治療有効量のκ−カラゲナンを上気道に達成するのに十分な量である。一実施形態において、担体溶液の量は、５０ｍＬ〜３５０ｍＬの範囲である。非常に好ましい一実施形態において、量は１００ｍＬと２００ｍＬとの間である。非常に好ましい一実施形態において、量は１００ｍＬと２５０ｍＬとの間である。
【００５７】
本発明の組成物は、顔のどちらかの側または両側の鼻腔または副鼻腔通路に適用することができる。鼻腔および副鼻腔を治療するために必要とされる担体溶液の量は、陽圧洗浄装置を用いて投与することができる。任意の陽圧洗浄装置を使用して、本発明の組成物を送達することができる。非常に好ましい実施形態において、装置は、柔らかい圧搾ＬＤＰＥプラスチック瓶、ディップチューブ、および終点が鼻中隔と接触しないように特別に設計された上部を有する円錐形である。装置の画像を図１１に示す。
【００５８】
陰圧装置は、約１００ｍＬの溶液が１つの鼻孔から鼻腔および副鼻腔に放出され、反対側の鼻孔から出てくるまでボトルを単純に圧搾することによって操作される。次いで、この方法を反対側の鼻孔に繰り返すことができる。
【００５９】
本発明の方法および組成物は、組織炎症および／または急性もしくは慢性疾患の過程から生じる粘液の蓄積を治療することができ、または鼻ポリープに関連する、または関連しない急性もしくは慢性副鼻腔疾患を患っている患者において副鼻腔の通気を容易にするために行われる鼻および副鼻腔手術に起因する粘液、乾燥血液、切除した組織および血液凝固を取り除くために治療することができる。
【００６０】
さらなる薬剤、薬物または治療薬
さらに、本発明の組成物は、これに限定されないがステロイドおよび抗生物質を含む、１種または複数種の局所薬剤を含むこともできる。さらなる局所薬物は副鼻腔疾患の局所治療に必要となることがある。
【００６１】
本発明の組成物の調製で有用な他の化合物としては、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤または抗炎症剤および抗酸化剤が挙げられる。
【００６２】
疾患または状態
本発明の組成物を用いて、上気道に関連した任意の数の疾患または状態を治療することができる。本発明の組成物を用いて治療することができる疾患または状態としては、非アレルギー性鼻炎、アレルギー性鼻炎、急性副鼻腔炎、アレルギーおよび非アレルギーの両病因による鼻副鼻腔炎、慢性鼻副鼻腔炎が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００６３】
上記のように、これらの疾患または状態は、治療有効量の本発明の組成物を、その治療を必要とする患者に投与することによって治療することができる。
【００６４】
例えば、本発明の組成物のかなりの量（例えば１００ｍＬ〜２００ｍＬ）を陽圧装置によって患者の上気道に鼻孔を通して投与することができる。κ−カラゲナンは、患部組織を水和させ、局所薬物を長時間にわたって粘膜表面と接触させて保持するために上気道に残留するのに十分な量で提供される。
【００６５】
実施例
上気道の疾患および状態の治療としてのカラゲナンの安全性を判定するように実験を設計した。加えて、κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンによる治療後、線毛の機能と構造を調べるために実験を行った。
【００６６】
副鼻腔組織へのその効果に関してκ−カラゲナンの作用としては、線毛安全性、密着結合効果、抗炎症作用およびゲル化が挙げられ、検討した。カラゲナンを含有する送達溶液は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ（乳酸リンゲル剤）またはＦＬＯ  ＣＲＳ（ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む細胞外液と等張のキシリトール）であった。
【００６７】
この時点で結果は、κ−カラゲナンが副鼻腔組織上で使用するのに極めて安全な生成物であり、通常の生理的プロセスのいずれにも干渉しないことを示している。これらの実験および結果を以下に述べる。
【００６８】
１．実験設計
１．１  初代ヒト鼻上皮細胞培養
健康志願者から細胞学的鼻ブラッシングを収集する倫理的承認は、Ｔｈｅ  Ｑｕｅｅｎ  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから付与された。除外基準は能動喫煙、１８歳未満の年齢、全身性疾患、最近の上気道感染症罹患、および慢性鼻副鼻腔炎またはアレルギー性鼻炎の症状／徴候を含み、鼻ブラッシングを同意する参加者から収集した。
【００６９】
滅菌細胞診ブラシを使用して、志願者の鼻腔から採取した鼻ブラッシングを直ちに気管支上皮細胞増殖培地（ＢＥＧＭ）（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ）に移し、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心（１７００ｒｐｍで５分間）して、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｂ−ＡＬＩ（商標）増殖培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ）に再懸濁させた。次いで、抗ＣＤ６８（Ｄａｋｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で被覆した直径１００ｍｍの培養プレート中で細胞試料は、２０分間マクロファージを枯渇させた（Ｍａｌｉｋら，（２０１５）Ｆｏｒｕｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｒｈｉｎｏｌ．５（６）：５５１−５５６）。
【００７０】
培養プレートから細胞試料を取り出して、１型コラーゲンを被覆したＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に直接播種した。８０％コンフルエントになるまで細胞を増殖させ、次いで収集し、コラーゲンを被覆した、０．４μｍ細孔を有する６．５ｍｍの透過性トランスウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上にウェル当たり５×１０４細胞の密度で播種した（Ｌｏｎｚａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，２０１１）。
【００７１】
Ｂ−ＡＬＩ（商標）増殖培地を用い、５％ＣＯ２、３７℃の細胞インキュベーター内で細胞培養物を３〜４日間維持した。次いで、頂端培地を除去し、基底培地をＢ−ＡＬＩ（商標）分化培地と交換した。培地は一日おきに取り替えた。ヒト鼻上皮培養物を密着結合の発生のために気相液相界面（ＨＮＥＣ−ＡＬＩ）で最低１４日間、および線毛生成のために２８日間維持した（Ｌｅｅ  Ｍ−Ｋら，（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．１２（５）：３０５−３１１；Ｆｕｌｃｈｅｒら，（２００５）Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｐａｇｅｓ  １８３−２０６）。
【００７２】
１．２  カラゲナン副鼻腔溶液
κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンは、Ｍａｒｉｎｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨによる指示通りに滅菌ＭｉｌｌｉＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に溶解させ、８０℃で２時間加熱することによって０．２４％の濃度にした。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳを２倍濃度で滅菌ＭｉｌｌｉＱに懸濁させた。各々の溶液をろ過滅菌し、次いで、１：１の割合で混合して、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中０．１２％のκ−カラゲナン、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中０．１２％のι−カラゲナン、ＦＬＯ  ＣＲＳ中０．１２％のκ−カラゲナン、およびＦＬＯ  ＣＲＳ中０．１２％のι−カラゲナンを得た。
【００７３】
次いでこれらの溶液を室温で保存した。次いで、（ｉ）細胞生存率と炎症、（ｉｉ）粘膜バリア、および（ｉｉｉ）線毛機能と構造への効果を判定するために、最高２４時間まで、細胞培養の頂端コンパートメントに副鼻腔溶液を加えた。
【００７４】
２．細胞生存率と炎症
２．１  方法
２４時間の曝露後、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ処置した側底コンパートメントから上清を収集し、細胞生存率と炎症マーカーの測定まで−２０℃で保存した。細胞生存率を判定するために、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ，ＣＡ）を用いて乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定した。調製した試料の吸光度は４９０ｎｍの波長で記録し、陰性対照（未処置細胞）のＬＤＨを用いて、相対生存率を算出した。総マトリックスメタロペプチダーゼ−２（ＭＭＰ−２）分泌を、＜０．１ｎｇ／ｍＬの最小検出レベルを用いてＭＭＰ−２ヒトＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して算出した。調製した試料を４５０ｎｍで、マイクロタイタープレートリーダーで読み取った。結果をｎｇ／ｍＬで表し、溶媒対照と比較してパーセンテージとして示す（式１を参照されたい）。インターロイキン６（ＩＬ−６）をラット抗ヒトＩＬ−６抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて測定し、ヒトＩＬ−６標準（（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）と比較した。試料を４５０ｎｍで、マイクロタイタープレートリーダーで測定し、結果を総ＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）として表し、対照培地または溶媒のみの対照と比較した。
【００７５】
【数１】
2019505538.tif 000041
【００７６】
２．２  結果：乳酸脱水素酵素アッセイ
平均（±ＳＤ）値を示す陰性対照として、対照培地に対する倍率変化として表したＬＤＨ測定：図１Ａに示すように、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ（ＦＬＯ）１．１２２（±０．１２８３）、ＦＬＯ＋０．１２％κ−カラゲナン（ＦＬＯ＋κ）０．９５１２（±０．１６７９）、ＦＬＯ＋０．１２％ι−カラゲナン（ＦＬＯ＋ι）１．００３（±０．１５８２）、ＦＬＯ  ＣＲＳ  ０．９４６（±０．１５２６）、ＦＬＯ  ＣＲＳ＋０．１２％κ−カラゲナン（ＣＲＳ＋κ）１．００１（±０．１５８５）、ＦＬＯ  ＣＲＳ＋０．１２％ι−カラゲナン（ＣＲＳ＋ι）０．９７３１（±０．１５４）。
【００７７】
ＬＤＨを溶媒のみの対照（ＦＬＯまたはＣＲＳ）と比較したとき、倍率変化の平均（±ＳＤ）値は以下の通りであった：図１Ｂに示すように、ＦＬＯ＋κ０．８６５２（±０．２３１４）、ＦＬＯ＋ι０．９１１５（±０．２３０４）、ＣＲＳ＋κ１．０５８（±０．０１７９３）およびＣＲＳ＋ι１．０２９（±０．０１２１８）。
【００７８】
２．３  結果：マトリックスメタロペプチダーゼ−２ＥＬＩＳＡ
基底ＭＭＰ−２  ＥＬＩＳＡ測定は、平均（±ＳＤ）ｎｇ／ｍＬ値を示した：図２Ａに示すように、対照培地６．５３１ｎｇ／ｍＬ（±５．１３８）、ＦＬＯ  ７．９２４ｎｇ／ｍＬ（±７．５１３）、ＦＬＯ＋κ  ７．９０７ｎｇ／ｍＬ（±６．９７４）、ＦＬＯ＋ι５．２４７ｎｇ／ｍＬ（±４．５０３）、ＣＲＳ  ６．３ｎｇ／ｍＬ（±６．９６１）、ＣＲＳ＋κ４．６２６ｎｇ／ｍＬ（±３．８３６）、ＣＲＳ＋ι４．０５４（±３．３０９）。
【００７９】
ＭＭＰ−２を溶媒のみの対照のパーセンテージと比較したとき、平均（±ＳＤ）値は以下の通りであった：図２Ｂに示すように、ＦＬＯ＋κ１０４．７％（±１２．６４）、ＦＬＯ＋ι７１．７５％（±６．０９２）、ＣＲＳ＋κ９３．１７％（±２４．１８）およびＣＲＳ＋ι８６．５％（±３８．５１）。
【００８０】
２．４  結果：インターロイキン−６ＥＬＩＳＡ
基底ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ測定は、平均（±ＳＤ）ｐｇ／ｍＬ値を示した：図３Ａおよび３Ｂに示すように、対照培地３１．４２ｐｇ／ｍＬ（±２７．８９）、ＦＬＯ５０．２８ｐｇ／ｍＬ（±３３．３９）、ＦＬＯ＋κ５．６２６ｐｇ／ｍＬ（±９．７４５）、ＦＬＯ＋ι９０．３９ｐｇ／ｍＬ（±１７．０４）ｍ  ＣＲＳ４１．１２ｐｇ／ｍＬ（±７１．２１）ｍ  ＣＲＳ＋κ８７．１６ｐｇ／ｍＬ（±８７．９）、ＣＲＳ＋ι６３．４９ｐｇ／ｍＬ（±５８．６９）。
【００８１】
結論として、溶媒のみの対照と比較したとき、炎症マーカーＭＭＰ−２（ゼラチナーゼ）およびＩＬ−６（サイトカイン）の発現はカラゲナンへの曝露後、増加せず、カラゲナンが炎症促進性でないことを示唆した。
【００８２】
さらに、κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンのいずれも、細胞生存率を減少させなかった。
【００８３】
最終的に、使用した細胞培養は健康なヒト鼻上皮をモデル化したものであったので、カラゲナンが抗炎症性であるかどうかを確認するために、本研究の設計に基づき、さらなる実験が必要とされる。通常の細胞培養物の炎症性刺激を用いることによって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持される炎症マーカーにおいて測定できる増加を有する患者の新たなコホートを規定するために今後の研究を計画する。
【００８４】
３．粘膜バリア機能
３．１  方法
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）をＥＶＯＭ２上皮電圧抵抗計（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＦＬ）を用いて測定し、結果を、生の値、すなわち初期測定値への相対的な変化としてオームで表した。ＴＥＥＲ値は、＞４００オーム／ｃｍ２（０．３３ｃｍ２のトランスウェル膜において＞１２００オームに等しい）を示す培養物から採取したものだけであった。ＴＥＥＲは、最初に、細胞培地とともにすべてのＨＮＥＣ−ＡＬＩトランスウェル試料上で頂端部および基底部を測定し、これに続いて、頂端培地を除去し、対応する対照培地または処置培地と取り替えた。
【００８５】
測定した時点は０時間、１２時間および２４時間を含み、次いでＣＲＳ  ＦＬＯ溶液の低電解質濃度による伝導率問題を調整するために、２４時間で追加の測定として頂端処置培地を除去し、細胞培地と取り替えて行った。すべての測定値は、３７℃の段階で採取した。ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の傍細胞透過性は、２４時間のカラゲナン曝露の後、評価した。４ｋＤａのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ）を３ｍｇ／ｍＬの濃度まで頂端コンパートメントに加え、次いで２時間後、側底コンパートメントから試料を採取した。通過したデキストランの量をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ９６ウェル蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長、それぞれ４８５ｎｍと５２０ｎｍで測定した。結果は、ＦＩＴＣデキストラン移行のシンク条件を想定し、以下（式２を参照されたい）に従って算出した。（３）
【００８６】
【数２】
2019505538.tif 000042
【００８７】
Ｐａｐｐは見かけの透過係数（ｃｍ／ｓ）であり、ｄＱ／ｄｔ（ｍｇ／ｓ）は側底コンパートメントへのＦＩＴＣデキストランの移行速度であり、Ａ（ｃｍ３）はトランスウェル膜の表面積であり、Ｃ０（ｍｇ／ｍＬ）は頂端コンパートメントの開始薬物濃度である。倍率変化は、Ｐａｐｐ値（式３を参照されたい）から算出した。
【００８８】
【数３】
2019505538.tif 000043
【００８９】
カラゲナン処置試料のＰａｐｐを対照培地または溶媒対照のいずれかと比較した。
【００９０】
Ｆ−アクチン細胞骨格の免疫細胞化学は、２％パラホルムアルデヒド中で１５分間試料を固定することによって行い、次いで試料をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、乾燥させて−４□Ｃで保存した。固定した試験片を氷上で１５分間静置させながら、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。ＰＢＳで３回洗浄し、タンパク質ブロック（Ｄａｋｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を適用した。試料を再度、ＰＢＳで３回洗浄し、１：１００でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）とともに４５分間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗浄した。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）を加えて１０分後、ＰＢＳで３回洗浄し、次いでガラススライド上に載せた。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００倒立顕微鏡を使用して、共焦点顕微鏡観察を行った。ファロイジンとＤＡＰＩは、それぞれ４９５ｎｍと３６４ｎｍで励起させ、次いで５１８ｎｍと４５４ｎｍで発光させた。
【００９１】
３．２  結果：経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）
２４時間で初期ＴＥＥＲのパーセンテージとして表した処置ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は以下の平均（・｝ＳＤ）値を示した：対照培地１１６．９％（・｝１４．５９）、ＦＬＯ１０６．５％（・｝１９．１４）、ＦＬＯ＋κ１３３．５％（・｝２９．５８）、ＦＬＯ＋ι１０３．６％（・｝２５．２３）、ＣＲＳ１３７．３％（・｝５６．１６）、ＣＲＳ＋κ１８４．３％（・｝１３３．９）、ＣＲＳ＋ι１２２．３％（・｝４８．５９）（図４Ａ）。初期および２４時間の測定値は、同一の細胞緩衝液中で採取し、以下の通り算出した（式４を参照されたい）。
式４：ＴＥＥＲ（％変化）＝（ＴＥＥＲ（２４時間））／（ＴＥＥＲ（初期））×１００
【００９２】
処置溶液とともに頂端部で採取したＴＥＥＲ測定値も示す（図４Ｂおよび４Ｃを参照されたい）が、しかし抵抗を妨害するＦＬＯ  ＣＲＳ溶液の低イオン濃度のためにアーチファクトであり得る大きな変動性を示す。ＴＥＥＲは、生の値（オーム）として表す。
【００９３】
見かけの傍細胞透過性（Ｐａｐｐ）は、ＦＬＯまたはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液中でκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンへの２４時間の曝露後に、測定した。対照培地に曝されたＨＮＥＣ−ＡＬＩのＰａｐｐと比較すると、平均（±ＳＤ）倍率変化値は以下の通りであった：図５Ａに示すように、ＦＬＯ０．６５６２（±０．６９０５）、ＦＬＯ＋ι（±０．３９６１）、ＣＲＳ０．５７５１（±０．４９７８）、ＣＲＳ＋κ０．３９１３（±０．０３８４）、ＣＲＳ＋ι０．２７５６（±０．１６９１）。
【００９４】
溶媒のみの対照と比較すると、ＨＮＥＣ−ＡＬＩのＰａｐｐは、以下のように平均（±ＳＤ）倍率変化値を示した：図５Ｂに示すように、ＦＬＯ＋κ１．００２３（±０．３７１８）、ＦＬＯ＋ι０．６６０５（±０．３３９７）、ＣＲＳ＋κ１．２０５（±１．０６７）、ＣＲＳ＋ι０．７６３８（±０．５２１１）。
【００９５】
３．３  結果：アクチン細胞骨格の免疫細胞化学
Ｆ−アクチン局在化に特異的なＨＮＥＣ−ＡＬＩの形態的特徴を、κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンに曝された培養物で評価した。アクチン細胞骨格は、細胞極性、小胞輸送の維持において重要であり、密着結合および接着結合を含む完全な細胞間結合と密接に関連している。共焦点画像解析は、アクチンケーブル、分布または細胞形態変化の無損失を示した。図６および図７に示すようにアクチンの細胞質染色において特定の増加はなかった。
【００９６】
結論として、粘膜バリア機能はカラゲナンへの曝露によって減少することがなく、健康なヒト上皮細胞においてＴＥＥＲまたはＰａｐｐによって測定したように通常のバリアに明らかな破損は見られない。しかし、罹患した患者由来の組織において、ＦＬＯ  ＣＲＳ、およびカラゲナンとともにＦＬＯ  ＣＲＳに曝された組織においてＴＥＥＲに増加が見られたが、通常のバリアへの破損は見られなかった。これらの結果は、下記の第６節に示す。
【００９７】
ι−カラゲナンがＨＮＥＣ−ＡＬＩのＰａｐｐを４ｋＤａデキストランに減少させる傾向が見られる。これは、結合バリアの成分、アクチン細胞骨格上での直接作用に関連があり得、または化合物の分子サイズが大きいことに起因し、したがって透過性が限定される。
【００９８】
Ｆ−アクチン染色の定量化はなかったが、カラゲナン、主にι−カラゲナンに曝された試験片の頂端部Ｆ−アクチン鎖の複雑性に増加があるように見える。
【００９９】
４．線毛の機能および構造
４．１  方法
ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の線毛運動周波数（ＣＢＦ）は、倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，  Ｔｏｋｙｏ）で、２０×対物レンズおよび１．５倍率を使用して評価した。ビデオは、Ｍｏｄｅｌ  Ｂａｓｌｅｒ  ａｃＡ６４５−１００μｍ  ＵＳＢ３カメラ（Ｂａｓｌｅｒ  ＡＧ，Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、毎秒１００コマ、６４０×４８０ピクセルの解像度で録画した。録画したビデオ試料は、Ｓｉｓｓｏｎ−Ａｍｍｏｎｓ  Ｖｉｄｅｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＳＡＶＡ）システム（Ｓｉｓｓｏｎら，（２００３）２１１（２）：１０３−１１１）を使用して分析した。すべての測定値は２２℃の室温で採取した。
【０１００】
ベースラインのＣＢＦは、実験条件を追加する前に採取し、最初にＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物を１００μＬのＰＢＳで洗浄し、次いで４０μＬの室温のＰＢＳを頂端コンパートメントに加えた。ベースライン測定値は、各培養から２つの別々の領域から採取した。頂端部ＰＢＳを除去し、対照培地、溶媒のみの対照のいずれか、または溶液を含有するカラゲナンを加えた。ＣＢＦのいずれの早期刺激／緩徐化を評価するために、最初の２０分間は５分毎に測定値を連続で採取した。測定値は６時間および２４時間でも採取した。
【０１０１】
結果は、平均ＣＢＦ（Ｈｚ）として、またベースラインと比較したパーセンタイル変化としても表す。走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）試験片は、リン酸緩衝液に溶解した４％のパラホルムアルデヒドおよび１．２５％のグルタルアルデヒドの溶液に固定し、４℃で保存した。試料を緩衝液で洗浄し、エタノールで連続脱水させ、続いてヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）との１：１混合液に、次いで１００％ＨＭＤＳに浸漬した。試験片を、アルミニウムスタブに載せ、カーボンで蔽った。Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ３０  Ｆｉｌｅｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｇｕｎ  ＳＥＭ（Ｐｈｉｌｉｐｓ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）  を用いて、真空下で５ｋＶの加速電圧で画像を撮った（Ｍａｌｌａｎｔｓら，（２００９），  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １６１（７）：８８３−８９０）；  Ｍｕｒｐｈｙら，（２０１５）Ｏｐｈｔｈａｌ  Ｐｌａｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．３１（５）：３９６−４００）。
【０１０２】
４．２  結果：線毛運動周波数−予備：２つの複写物に基づく
線毛運動周波数測定は、以下の生値（図８Ａ）を示した：ＦＬＯベースライン（８．０６、８．６７Ｈｚ）、５分（７．９３、５．９８Ｈｚ）、１０分（７．４２、６．８７Ｈｚ）、１５分（８．２２、６．３２Ｈｚ）、２０分（７．４６、７．５７Ｈｚ）、６時間（６．８２、６．８０Ｈｚ）、２４時間（８．１５、６．５６Ｈｚ）；ＦＬＯ＋κベースライン（８．３７、９．０５Ｈｚ）、５分（８．１６、７．７８Ｈｚ）、１０分（７．８８、７．３６Ｈｚ）、１５分（８．０８、７．６６Ｈｚ）、２０分（７．８６、７．７９Ｈｚ）、６時間（６．６、７．５９Ｈｚ）、２４時間（７．２７、６．９４Ｈｚ）；ＦＬＯ＋ιベースライン（８．１７、６．７２Ｈｚ）、５分（８．９４、６．７Ｈｚ）、１０分（８．４３、７．１５Ｈｚ）、１５分（８．１７、７．５６Ｈｚ）、２０分（９．１４、８．２３Ｈｚ）、６時間（８．０、７．０４Ｈｚ）、２４時間（７．９、７．１１Ｈｚ）；ＣＲＳベースライン（７．１、８．０５Ｈｚ）、５分（７．１８、７．５８Ｈｚ）、１０分（６．６４、７．２３Ｈｚ）、１５分（７．３２、７．９９Ｈｚ）、２０分（７．３２、７．３４Ｈｚ）、６時間（６．０５、７．３２Ｈｚ）、２４時間（６．３５、７．２９Ｈｚ）；ＣＲＳ＋κベースライン（６．９８、７．６９Ｈｚ）、５分（６．６５、６．８４Ｈｚ）、１０分（６．８９、６．１９Ｈｚ）、１５分（６．３６、６．４３Ｈｚ）、２０分（６．９３、７．２１Ｈｚ）、６時間（６．５３、６．６５Ｈｚ）、２４時間（７．１１、６．７９Ｈｚ）；ＣＲＳ＋ιベースライン（７．７５、６．４２Ｈｚ）、５分（７．１５、７．２１Ｈｚ）、１０分（７．１６、７．１Ｈｚ）、１５分（７．５５、８．０８Ｈｚ）、２０分（７．０９、７．３９Ｈｚ）、６時間（６．９５、７．２３Ｈｚ）、２４時間（８．５５、６．７８Ｈｚ）。
【０１０３】
ＣＢＦの経時変化をベースライン測定と比較すると、図８Ｂに示すように、ι−カラゲナンが２０分以内、最高２４時間までに線毛を刺激する傾向を示した。ＣＲＳを有する患者由来の細胞の線毛運動周波数に対するこれらの溶液の効果は、最初にＦＬＯ  ＣＲＳが５分でＣＢＦを減少し、２４時間で通常に戻ることを示す（以下の第６節を参照されたい）。この効果は、κ−カラゲナンを添加することで防止される。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅは患部組織培養のＣＢＦに対して同様の効果を有し、今度の場合も、κ−カラゲナンを添加することで元に戻る。これは、κ−カラゲナンが線毛生理機能を保護することを示している。結果を図１８に示し、下記の第６．１７節に記載する。
【０１０４】
線毛上皮細胞の形態学的性質は、１０，０００ｘ倍率で走査電子顕微鏡によって観察された。示したように（図９および１０を参照されたい）、通常の線毛細胞および周囲の微線毛はすべての実験条件下で観察された。広範な電界解析は、プロセシング中の細胞層のゆがみにより、今回は行わなかった。
【０１０５】
重複実験の結果に基づいて、健康な組織培養物に関する現在のデータは、ι−カラゲナンがＦＬＯ溶液またはＦＬＯ  ＣＲＳ溶液のそれを超えてＣＢＦを高めることができる傾向を示している。短時間または最高２４時間の曝露では、線毛運動障害または線毛毒性は明らかに存在しない。
【０１０６】
５．κ−カラゲナンを含む組成物の投与
等張担体溶液中にκ−カラゲナンを含む組成物は、市販されている粉末形状のκ−カラゲナンを水に溶解させ、最終濃度約０．１２重量／容量％のκ−カラゲナンになるように調製した。水の量は、５０ｍＬ、１００ｍＬまたは２００ｍＬから選択することができる。しかし、所要用途に応じて、他の量も使用してよい。粉末状のκ−カラゲナンは、等張担体溶液に達するために必要とされる成分を添加する前後に水に加えてよい。
【０１０７】
κ−カラゲナンと組み合わせて任意の等張担体溶液を使用することができるが、最善の結果はＮａＣｌおよびＫＣｌを含む等張溶液を用いて達成される。例えば、担体溶液は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳから作製することができる。担体溶液をメ−カーの説明書に従って作製する。
【０１０８】
上記の組成物を用いて治療される対象は、処置の間、立っていても、座っていてもよい。対象は、鼻腔への送達後、排出される担体溶液が確実に収容されるようにシンクまたはボール上に位置することが好ましい。溶液は、約１００ｍＬの送達溶液が一方の鼻孔から鼻および副鼻腔に放出され、反対側の鼻孔から出てくるまでボトルを単純に圧搾することによって操作される陽圧洗浄装置によって鼻孔に適用される。次いで、この手順を反対側の鼻孔に繰り返す。鼻腔に溶液を送達するのを補助するために、鼻および副鼻腔の通路の洗浄のために、対象は頭を下にする、すなわち鼻において水平位置より下げてもよい。
【０１０９】
小児において使用する場合、１つの鼻孔あたり約５０ｍＬの量は同時に粘膜を洗浄して処置するのに十分であるはずである。成人において、７０〜９０ｍＬの量は、通常、粘膜を洗浄し、処置するのに十分である。
【０１１０】
陽圧洗浄装置で用いるボトルの一例は、図１１に示す。ボトルは、溶液が鼻腔および副鼻腔通路に確実に送達されるように設計されている。図１のボトルは、ボトル構成要素を完全に分解できるようにする広い口を有し、使用後にすすぎ、完全に乾燥させることができる。これは、病原菌の過剰増殖およびそれに続く副鼻腔を含む鼻腔通路の再侵襲を大幅に制限する。
【０１１１】
本明細書に記載の組成物は、特に生涯にわたり苦悩となる慢性鼻副鼻腔炎を治療するために使用される場合、継続的に用いることができる。このように、治療は、１日１回、または多くても１日２回必要であり得る。あるいは、本組成物の使用は医師の指示に従って用いられてよい。
【０１１２】
６．対照と比較したＣＲＳ患者におけるカラゲナン組成物の効果
ＣＲＳ患者の鼻ポリープおよび非ＣＲＳ対照由来の気相液相界面で増殖し、収集した初代ヒト鼻上皮細胞の線毛運動周波数（ＣＢＦ）、粘膜バリア機能、および炎症反応に対するカラゲナン（ιまたはκ）を含有する噴霧式点鼻剤の効果を試験した。
【０１１３】
６．１  初代ヒト鼻上皮細胞
慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）患者および非ＣＲＳ対照から細胞学的鼻ブラッシングを収集する倫理的承認は、Ｔｈｅ  Ｑｕｅｅｎ  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから付与された。鼻ブラッシングは、同意する参加者から収集された。除外基準には、能動喫煙、１８歳未満の年齢および全身性疾患が含まれた。
【０１１４】
Ｒａｍｅｚａｎｐｏｕｒ  Ｍ，ら，：Ｔｈ１７  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｄｉｓｒｕｐｔ  ｔｈｅ  ａｉｒｗａｙ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１６，（２０１６）に記載の方法で副鼻腔粘膜を穏やかにブラッシングすることによって、ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥＣ）を収集した。鼻ポリープを伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）キシリトールおよび非ＣＲＳ患者から抽出した細胞を気管支上皮増殖培地（ＢＥＧＭ、ＣＣ−３１７０，Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）に懸濁させ、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心分離（１７００ｒｐｍで５分間）して、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｂ−ＡＬＩ（商標）増殖培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）に再懸濁させた。
【０１１５】
次いで、抗ＣＤ６８（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を被覆した直径１００ｍｍの培養プレート中で細胞試料はマクロファージを２０分間枯渇させた。培養プレートから細胞試料を取り出し、１型コラーゲンで被覆したフラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈｍａｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に播種した。ＨＮＥＣは継代２で試験し、汎サイトケラチンおよびＣＤ４５抗体（両方とも、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に対する反応を経て、上皮系列であることを確認した。
【０１１６】
６．２  気相液相界面培養
ＨＮＥＣは、Ｒａｍｅｚａｎｐｏｕｒ  Ｍ，ら，：  Ｔｈ１７  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔ  ｔｈｅ  Ａｉｒｗａｙ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ．  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１６（２０１６）に記載のようにＬｏｎｚａ  ＡＬＩ培養方法（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）に従って、気相液相界面（ＡＬＩ）培地で維持した。８０％コンフルエントになるまで細胞を増殖させ、次いで収集し、コラーゲンを被覆した６．５ｍｍの透過性Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）上にウェル当たり７〜１０４細胞の密度で播種した。細胞培養物は、Ｂ−ＡＬＩ（商標）増殖培地とともに、３７℃、５％ＣＯ２で、細胞インキュベーター内で３〜４日間維持した。エアリフトステップにおいて、頂端培地を除去し、基底培地を５００μＬのＢ−ＡＬＩ（商標）分化培地と取り替えた。培養物は、一日おきに、Ｂ−ＡＬＩ完全分化培地を基底チャンバーに加えることによって培養した。ＨＮＥＣは、気相液相界面（ＨＮＥＣ−ＡＬＩ）で密着結合の発達のために最低１４日間、および線毛生成のために２８日間維持した。
【０１１７】
６．３  カラゲナン副鼻腔溶液
κ−カラゲナンおよびι−カラゲナンは、Ｍａｒｉｎｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨによる指示通りに滅菌ＭＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に溶解させ、８０℃で２時間加熱することによって０．２４％の濃度にした。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳ（ＥＮＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を２倍濃度で滅菌ＭＱ水に懸濁させた。各々の溶液をろ過滅菌し、次いで、１：１の割合で混合して、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中０．１２％のκ−カラゲナン、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中０．１２％のι−カラゲナン、ＦＬＯ  ＣＲＳ中０．１２％のκ−カラゲナン、およびＦＬＯ  ＣＲＳ中０．１２％のι−カラゲナンを得た。次いでこれらの溶液を室温で保存し、最高２４時間まで、細胞培養の頂端コンパートメントに適用した。
【０１１８】
６．４  経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）をＥＶＯＭ２上皮電圧抵抗計（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＦＬ）を用いて測定し、結果を、生値、すなわち初期測定値への相対的な変化としてオームで表した。ＴＥＥＲ値は、＞４００オーム／ｃｍ２（０．３３ｃｍ２のトランスウェル膜において＞１２００オームに等しい）を示す培養物から採取したものだけであった。１００μＬのＢ−ＡＬＩ培地をＡＬＩ培養物の頂端チャンバーに加えて、細胞単層を横切って基底チャンバー内に電気回路を形成した。加熱プラットフォームを使用して、測定の間、培養物を３７℃で維持した。対応する処置または対照（陰性対照についてはＢ−ＡＬＩ培地、陽性対照については２％のＴｒｉｔｏｎ×１００）を各ウェルの底部チャンバーに加え、０時間および２４時間にＴＥＥＲ測定値を得た。
【０１１９】
６．５  透過性アッセイ
ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の傍細胞透過性を、カラゲナンに２４時間曝露した後、評価した。４ｋＤａのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ）を３ｍｇ／ｍＬの濃度まで頂端コンパートメントに加え、次いで２時間後に側底コンパートメントから試料を採取した。通過したデキストランの量をＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ９６ウェル蛍光マイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ，  ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，  Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、励起波長と発光波長、それぞれ４８５ｎｍと５２０ｎｍで測定した。
【０１２０】
６．６  細胞毒性アッセイ
すべての処置をＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物に実施し、２４時間インキュベートした。細胞生存率を判定するために、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ，ＣＡ）を使用して乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定した。手短に言うと、各ウェルから５０ｍＬの培地を新しいプレートに移し、次いで５０ｍＬのＬＤＨ試薬を上清に加え、室温の暗所で３０分間インキュベートした。調製した試料の吸光度をＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で４９０ｎｍで記録し、相対的生存率を陰性対照（未処置細胞）のＬＤＨレベルと比較して算出した。
【０１２１】
６．７  酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
処置培養物に２４時間曝露した後、処置したＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の側底コンパートメントから上清を収集した。メーカーの説明書に従って、総マトリックスメタロペプチダーゼ−２（ＭＭＰ−２）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）タンパク質レベルをＭＭＰ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＩＬ−６ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）を用いて決定した。すべての測定は、二つ組で行った。組織試料濃度は標準曲線から算出し、タンパク質濃度について補正した。
【０１２２】
６．８  免疫蛍光顕微鏡法
試料をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のホルマリンで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、氷上で１５分間、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、続いて無血清ブロッカー（ＳＦＢ；  Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて室温で６０分間ブロックした。ＴＢＳＴ−１０％  ＳＦＢ中で５μｇ／ｍＬまで希釈した、マウスモノクローナル抗ヒトＺＯ−１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４℃で終夜加えた。過剰な一次抗体を除去し、二次抗体に結合した２μＬ／ｍＬの抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を加えて、室温で１時間インキュベートした。これらの膜をＰＢＳですすぎ、２００ｎｇ／ｍＬの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、核を分離した。膜をスライドガラスに移し、退色防止封入剤（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を１滴加えて、カバースリップを用いた。ＬＳＭ７００共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて試料を可視化した。
【０１２３】
６．９  線毛の機能と構造
ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の線毛運動周波数（ＣＢＦ）は、倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０，Ｔｏｋｙｏ）に２０Ｘ対物レンズおよび１．５倍率を使用して評価した。ビデオは、Ｍｏｄｅｌ  Ｂａｓｌｅｒ  ａｃＡ６４５−１００μｍ  ＵＳＢ３カメラ（Ｂａｓｌｅｒ  ＡＧ，Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、毎秒１００コマ、６４０×４８０ピクセルの解像度で録画した。録画したビデオ試料は、Ｓｉｓｓｏｎ−Ａｍｍｏｎｓ  Ｖｉｄｅｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＳＡＶＡ）  システムを使用して分析した。すべての測定値は、室温で採取した。ベースラインのＣＢＦは、実験条件を追加する前に採取した。最初に、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物を１００μＬのＰＢＳで洗浄し、次いで４０μＬのＰＢＳを頂端コンパートメントに加えた。ベースライン測定値は、各培養から２つの別々の領域から採取した。頂端部ＰＢＳを除去し、対照培地、溶媒のみの対照、または溶液を含有するカラゲナンのいずれかを加えた。ＣＢＦのいずれの早期刺激／緩徐化を評価するために、最初の２０分間は５分毎に測定値を連続で採取した。測定値は６時間および２４時間でも採取した。結果は、平均ＣＢＦ（Ｈｚ）として、またベースラインと比較したパーセンタイル変化としても表す。
【０１２４】
６．１０  統計分析
データは、平均値±ＳＥＭとして示す。ＴＥＥＲ実験は、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者からの３回の複製を用いて行い、０時間で患者からの平均値に対して値を正規化した。ＴＥＥＲ統計分析は、ｔ検定を用いて行い、他のすべての分析は分散分析の後に、ＳＰＳＳ（第２２版）を使用してＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定を行った。
【０１２５】
結果
６．１１  結果：乳酸脱水素酵素アッセイ
細胞生存率は、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物からのＬＤＨ放出を測定することによって評価した。ＦＬＯ  ＣＲＳまたはＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中のκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンの２４時間曝露は、ＣＲＳ患者（図１２Ａ）および非ＣＲＳ対照（図１２Ｂ）のいずれの処置でも、ＬＤＨ放出において有意な増加を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０１２６】
図１２Ａおよび１２Ｂを参照すると、グラフは、ＣＲＳ患者（図１２Ａ）由来および非ＣＲＳ対照患者（図１２Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の適用から２４時間後の生存率をＬＤＨアッセイによって決定された無処置対照細胞と比較して示す。細胞生存率は、陰性対照として未処置細胞と比較して算出した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【０１２７】
６．１２  結果：マトリックスメタロペプチダーゼ−２  ＥＬＩＳＡ
κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの適用は、２４時間後、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ対照患者においてＨＮＥＣの上清中のＭＭＰ−２の分泌に変化がなかった。
【０１２８】
ＣＲＳ患者（図１３Ａ）および非ＣＲＳ対照患者（図１３Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳおよび陰性対照（培地）に２４時間曝されたＨＮＥＣによるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ２）分泌を総ＭＭＰ２レベル（ｎｇ／ｍＬ）として表す。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。
【０１２９】
６．１３  結果：インターロイキン−６  ＥＬＩＳＡ
Ｆｌｏ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中のκ−カラゲナンを２４時間適用すると、ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ単層の上清中のＩＬ−６タンパク質濃度が大幅に低下した（ｐ＝０．０３７）。
【０１３０】
ＣＲＳ患者（図１４）および非ＣＲＳ対照患者（図１４Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層においてκ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳおよび陰性対照（培地）に２４時間曝されたＨＮＥＣの上清中のインターロイキン−６タンパク質レベルを合計（ｐｇ／ｍＬ）として表す。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【０１３１】
６．１４  結果：経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）
カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  ＣＲＳは、ＨＮＥＣ  ＡＬＩ培養物のＴＥＥＲを増加させた。ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物を６人のドナー（ＣＲＳｗＮＰ３人および対照３人）から確立した。κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の効果は、２４時間後にＣＲＳｗＮＰ患者および対照からのＨＮＥＣ単層を横切るＴＥＥＲを測定することによって調べた。ＣＲＳ患者において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．０４）およびＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．０２）は、２４時間のインキュベーション後、ＴＥＥＲが大幅に増加した。他の処置は、ＣＲＳ患者または対照においてＴＥＥＲに対して何ら有意な効果を示さなかった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。
【０１３２】
ＴＥＥＲ値は、処置前の測定値（図１５Ａおよび１５Ｂにおいて黒色バーとして示す）と、ＣＲＳｗＮＰ患者（Ａ）および非ＣＲＳ対照患者（Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の適用から２４時間後（灰色バー）の測定値とに対して正規化した。値は、ｎ＝３について平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５、ｔ検定を用いる。
【０１３３】
６．１５  結果：傍細胞透過性−デキストランアッセイ
ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳにおいてκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンは、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物の傍細胞透過性を増加させなかった。κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの適用は、ＣＲＳ患者および対照由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層において傍細胞透過性に有意な効果を及ぼさなかった（図１６Ａおよび１６Ｂ）（Ｐ＞０．０５）。陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）（低透過性）および陰性対照（培地）（高透過性）は、予想された透過性値を示した。
【０１３４】
ＣＲＳｗＮＰ患者（図１６Ａ）および非ＣＲＳ対照患者由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の適用から２４時間後に測定したＦＩＴＣ−デキストランの通過を図１６Ｂに示す。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【０１３５】
６．１６  結果：アクチン細胞骨格  免疫細胞化学
ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳにおいてκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンは、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層におけるＺＯ−１およびＦ−アクチンの局在化に影響を及ぼさなかった。処置の適用から２４時間後に、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳのＺＯ−１とＦ−アクチンの局在化に対する効果を、免疫蛍光法と共焦点レーザー走査微鏡法とを用いて調べた。未処置細胞において、ＺＯ−１またはＦ−アクチンは、予想通り、単層の頂端側の周辺に位置していた。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおけるκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンの共焦点画像解析は、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ対照患者においてＺＯ−１またはＦ−アクチンの局在化に変化を示さなかった。
【０１３６】
ＣＲＳ患者および対照患者のＨＮＥＣ単層におけるＺＯ−１およびＦ−アクチンの免疫局在を調べた。κ−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅとＦＬＯ  ＣＲＳ、陰性対照（培地）および陽性対照（０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の、ＣＲＳ患者（図１７Ａ）およびＦ−アクチンＣＲＳ患者（図１７Ｂ）のＨＮＥＣ単層のＺｏｎａ  Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）免疫局在性に対する効果。ＤＡＰＩを用いて、核を染色（青色染色）した。白色バーは２０μｍである。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、２０Ｘ倍率。
【０１３７】
６．１７  結果：線毛運動周波数
ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ中のκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンは、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層おいて２４時間後に線毛運動周波数に影響を及ぼさなかった。線毛運動周波数は、ＨＮＥＣ−ＡＬＩ培養物において異なる時点（０分、５分、１０分、２０分、６時間および２４時間）で評価した。ＦＬＯ  ＣＲＳまたはＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中のκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンの２４時間の曝露は、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者におけるいずれの処置によるＣＢＦにおいても有意差を示さなかった。測定値は、５分、１０分、２０分、６時間および２４時間の時点にわたる平均（Ｈｚ）を表す。値は、ｎ＝３について平均値±ＳＥＭとして示される（図１８）。
【０１３８】
６．１８  結果：細胞移動−対照患者に対する治療効果
対照患者の細胞移動に対する処置効果を調べた。陰性対照と比較して、κ（０．４ｍｇ／ｍＬ）＋ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．４６１）およびＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．０９５）処置による移動速度において有意差はなかった。移動速度は陰性対照よりも遅く、各処置はκ（１．２ｍｇ／ｍＬ）＋ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．０１５）、ι（１．２ｍｇ／ｍＬ）＋ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ＝０．００１）およびι（０．４ｍｇ／ｍＬ）＋ＦＬＯ  ＣＲＳ（ｐ  ＝０．００３）であった。結果を図１９Ａおよび図１９Ｂに示す。線形回帰分析で比較した移動速度のデータは、平均値±ＳＤである。ｐ≦０．０５の場合、差は有意であるとみなされる。
【０１３９】
創傷治癒移動アッセイは、ＣＲＳｗＮＰ患者（図１９Ａ）および非ＣＲＳ対照患者（図１９Ｂ）由来のＨＮＥＣ単層において、κ−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ι−カラゲナン／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  ＣＲＳおよび陰性対照（培地）の適用から２４時間後に測定した。値は、ｎ＝３について、分散分析の後のＴｕｋｅｙのＨＳＤポストホック検定の平均値±ＳＥＭとして示される。＊＝ｐ＜０．０５。
【０１４０】
６．１９  結果：炎症反応
ＦＬＯ Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳ中のκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンは、ＣＲＳ患者のＨＮＥＣ／ＡＬＩにおけるＩＬ−６の炎症促進性反応を阻害しなかった。これまでの研究は、ポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷがＨＮＥＣ／ＡＬＩ単層によってＩＬ−６とＴＮＦ−ａを含む炎症性サイトカイン分泌を一貫して誘導することを示した。炎症促進性反応を弱めるカラゲナンιおよびκの可能性を判定するために、ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅの両方中のカラゲナンを、ポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ（１０μｇ／ｍＬ）の非存在下または存在下で、でＣＲＳ患者および非ＣＲＳ対照患者由来のＨＮＥＣ／ＡＬＩ単層に適用した。ブデソニドは抗炎症の標準ケアコントロールとして使用された。ＩＬ−６サイトカインの分析により、カラゲナンによる以下の処置、κ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、κ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳ、カラゲナンι／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンι／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳがＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者において炎症促進性反応を抑制しないことが、明らかになった。
【０１４１】
ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ中で送達されたκ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの炎症促進性反応を弱める効果を調べ、その結果を図２０Ａおよび２０Ｂに示す。ＣＲＳ患者（図２０Ａ）および非ＣＲＳ患者（図２０Ｂ）においてポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷで刺激されたが、ＨＮＥＣ／ＡＬＩに対する、カラゲナンκ／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンκ／ＦＬＯ  ＣＲＳ、カラゲナンι／ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅ、カラゲナンι／ＦＬＯ  ＣＲＳ、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅおよびＦＬＯ  ＣＲＳの効果。ブデソニドは抗炎症の標準ケアコントロールとして使用された。陰性対照は、未処置細胞（培地）である。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示す。
【０１４２】
考察
欠損した上皮密着結合（ＴＪ）バリア機能は、上気道の炎症性疾患の発症における病原因子であることが示されている。上述の本研究において、κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンの効果をＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおいて、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ（対照）患者から収集した初代ヒト鼻上皮細胞の粘液線毛機能およびバリア構造と機能について評価した。
【０１４３】
本研究は、これらの処置が有毒でなく、上皮バリア機能に対して有害作用がないことを示した。むしろ、κ−カラゲナンの有無にかかわらず、ＦＬＯ  ＣＲＳ（等張溶液）の適用により、２４時間後、ＣＲＳ患者由来のヒト鼻上皮細胞単層のＴＥＥＲが大幅に高まった。陰性対照と比較して、ＴＥＥＲの変化は傍細胞透過性の変化と関連してなく、異なる処置の適用時に、蛍光標識ビーズの同等の傍細胞通過によって明白に示された。これらの調査結果は、κ−カラゲナンの有無にかかわらず、ＦＬＯ  ＣＲＳが、主にＣＲＳ患者におけるなどの炎症状態において粘膜バリア機能を離散的に強化し得ることを示している。溶液のイオン強度がＴＥＥＲ測定値に直接影響することはよく知られており、陰性対照溶液と比較して、ＴＥＥＲ測定値の増加がこれらの溶液のイオン構成の相違によって少なくともある程度説明することができる。ともかく、複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞分裂が起こった後でも、観察された効果がドナー依存性であるという考えは、ＣＲＳおよび対照のＨＮＥＣの生理機能の違いを示している。
【０１４４】
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、重要な炎症促進性サイトカインあり、慢性アレルギー性気道炎症において重要な役割を果たす。ＩＬ−６は急性期反応を生じさせ、炎症を調節する細胞内シグナル伝達カスケードを誘発する。特定のカラゲナン変異体が炎症を誘発し、生物を感染症から保護することは知られている。しかし、保護の程度は、異なる種類のカラゲナン間で異なる多糖の構造に依存する。実際、λ−カラゲナンはＩＬ−６分泌を効果的に誘発することができるが、κ−ラナゲナンはＩＬ−６誘発にわずかな影響を及ぼす。カラゲナン（エステル硫酸基の数によって決定される）の分子量は、それらの分子の免疫刺激特性において重要な役割を果たす。欧州委員会は、どのような安全性リスクでも回避するために食品添加物として使われるカラゲナンについて５０ｋＤａを超える分子量を勧告した。
【０１４５】
本研究で使用するκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンの分子量は、それぞれおよそ２００ｋＤａおよび５００ｋＤａである。結果は、ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層の上清中のＩＬ−６タンパク質レベルがＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいて希釈されたκ−カラゲナンの存在下で減少したことを示す。これらの結果は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいて希釈されると、κ−カラゲナンは、抗炎症特性を示し得ることを示している。上清中のＩＬ−６タンパク質レベルの減少がＨＮＥＣ−ＡＬＩ細胞によるＩＬ−６の産生および分泌の減少に起因するかどうか、あるいはＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいてκ−カラゲナンが上清内のＩＬ−６タンパク質と部分的に複合体を形成し得るかどうかは不明である。それにもかかわらず、κ−カラゲナンは、抗炎症特性を有することが本研究で示された。
【０１４６】
観察された効果がＩＬ−６に特異的であるかどうか、または他のサイトカイン、例えば、ＦＧＦ−２、フラクタルカイン、ＧＲＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１ａ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−ａ２もＦＬＯ  Ｓｏｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいてκ−カラゲナンの存在に影響を受け得るかどうかを決定することも興味深い。
【０１４７】
ＩＬ−６の結果を考慮して、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ／ＡＬＩ培養物における炎症促進性反応の阻害に対するκ−カラゲナンの影響を調べた。κ−カラゲナンの存在下でポリ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷで刺激されたＨＮＥＣ／ＡＬＩ培養物は、ＩＬ−６の炎症促進性反応を弱めなかった。ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおいて他のポリマーι−カラゲナンは、ＩＬ−６の産生を減少させなかった。
【０１４８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）は、呼吸上皮内で組織修復および再構築において主要な役割を果たす。高レベルのＭＭＰ−２は、これまでに鼻ポリープで見つかっている。本研究において、ＭＭＰ−２は、ＣＲＳ患者および非ＣＲＳ患者由来のＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層の上清中に低レベルで存在し、κ−カラゲナン溶液またはι−カラゲナン溶液はＭＭＰ−２タンパク質レベルに影響を及ぼさないことが判明した。
【０１４９】
アクチン細胞骨格は、細胞極性、小胞輸送を維持する上で重要であり、密着結合と接着結合およびデスモソームを含む細胞間結合複合体に本質的に関連している。密着結合は、細胞膜を頂端ドメインと側底ドメインに分化するフェンスとして役立ち、また隣接する細胞間のイオンおよび溶質の傍細胞通路を制御するゲートとしても役立つ。密着結合形成において、ＺＯ−１は、膜貫通タンパク質オクルディン、クローディンと接合部接着分子（ＪＡＭ）の間の必須タンパク質であり、接着結合と密着結合との間にベルトを形成する細胞質成分である。本調査結果は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおいてκ−カラゲナンおよびι−カラゲナンはＺＯ−１またはアクチンの局在化に影響を及ぼさなかったことを示し、これらのカラゲナンは粘膜バリア構造を損なわなかったことを示している。
【０１５０】
要約すると、本研究の結果は、ＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  ＣａｒｅまたはＦＬＯ  ＣＲＳのいずれかにおいて、κ−カラゲナンまたはι−カラゲナンがＨＮＥＣ−ＡＬＩ単層に対して細胞毒性でなく、炎症促進性反応を誘発することはなく、かつ粘膜バリア構造または機能を損なわなかったことを示している。κ−カラゲナンの有無にかかわらずＦＬＯ  ＣＲＳはＴＥＥＲを増加させたが、分泌されたＩＬ−６レベルはＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいてκ−カラゲナンの存在下で減少した。このデータとともに、ＦＬＯ  ＣＲＳおよびＦＬＯ  Ｓｉｎｕｓ  Ｃａｒｅにおいて希釈されたι−カラゲナンおよびκ−カラゲナンは粘膜バリア構造および機能に関して有益な特性を有し、局所に適用されると炎症を軽減し得ることを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．０１重量／容量％〜約１５重量／容量％の量のκ−カラゲナンと、担体溶液とを含む組成物であって、前記担体溶液が、約３５ｍＭ未満の低イオン強度を有する等張溶液である、組成物。
【請求項２】
第２の活性薬剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物であって、前記第２の活性薬剤が、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤および抗酸化剤からなる群から選択される、組成物。
【請求項３】
前記κ−カラゲナンの量が、約０．１２重量／容量％である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記担体溶液の量が、約５０ｍＬ〜約３５０ｍＬである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記担体溶液が、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記担体溶液が、乳酸カルシウム五水和物、重炭酸ナトリウム、グルコース、キシリトール、エリスリトールまたは希釈剤のうちの１種または複数種をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
上気道の疾患または状態の治療方法であって、約３５ｍＭ未満の低イオン強度を有する等張担体溶液中に治療有効量のκ−カラゲナンを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記κ−カラゲナンが、約０．０１重量／容量％〜約１５重量／容量％の量である、方法。
【請求項８】
前記κ−カラゲナンの量が、約０．１２％である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、第２の活性薬剤をさらに含み、前記第２の活性薬剤が、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤および抗酸化剤からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
治療されるべき前記疾患または状態が、非アレルギー性鼻炎、アレルギー性鼻炎、急性副鼻腔炎、アレルギー性と非アレルギー性との両病因による鼻副鼻腔炎および慢性鼻副鼻腔炎を含む群から選択される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
キットであって、粉末状の治療量のκ−カラゲナン、約３５ｍＭ未満の低イオン強度を有する等張担体溶液を調製するために再構成される粉末、およびそれらの使用説明書を含み、前記κ−カラゲナンが、約０．０１重量／容量％〜約１５重量／容量％の量である、キット。
【請求項１２】
陽圧洗浄装置をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
治療有効量のκ−カラゲナンおよび担体溶液の使用であって、前記担体溶液が、約３５ｍＭ未満の低イオン強度を有する等張溶液であり、および前記κ−カラゲナンが、上気道の疾患または状態の治療のための薬剤の調製において約０．０１％〜約１５％の量である、使用。
【請求項１４】
約０．０１重量／容量％〜約１５重量／容量％の量のκ−カラゲナンと、担体溶液とを含む組成物であって、前記担体溶液が、約３５ｍＭ未満の低イオン強度を有する等張溶液であり、および前記担体溶液が、キシリトールをさらに含む、組成物。
【国際調査報告】
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