【手続補正書】
【提出日】平成19年2月21日(2007.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
a)細菌性細胞溶解素を発現する細胞の培養物を増殖させるステップ；
b)細菌性細胞溶解素を含む培養物から抽出物を調製するステップ；
c)抽出物中に含まれる可溶性の凝集した細菌性細胞溶解素を、界面活性剤の存在下で、高塩（好ましくは0.6〜2Mの塩）条件下で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料と結合させるステップ；
d)界面活性剤の存在下で、低塩（好ましくは0〜0.2Mの塩）条件下で、細菌性細胞溶解素を溶出させるステップ、
を含む、細菌性細胞溶解素の精製方法。
【請求項２】
以下のステップ：
e)細菌性細胞溶解素から界面活性剤を除去するステップ；
f)変性剤を添加することにより細菌性細胞溶解素を可溶化するステップ；
g)細菌性細胞溶解素からその変性剤を除去するステップ、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌性細胞溶解素が肺炎球菌ニューモリシンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップb)が、細胞を機械的に破壊することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップb)が、界面活性剤での処理を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップc)およびd)において同じ界面活性剤が存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップb)、c)およびd)において同じ界面活性剤が存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
界面活性剤が0.1〜5％（w/v）の濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップb)が、破壊した細胞性物質の遠心分離、およびステップc)の抽出物としての上清の回収を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップc)で用いられる疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が芳香族基を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
疎水性クロマトグラフィー材料がフェニル-セファロースである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップc)および／またはステップd)で用いられる溶液中に存在する界面活性剤が脂肪族界面活性剤である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
界面活性剤がラウロイルサルコシン酸ナトリウムである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップc)の高塩条件が0.6M〜2Mの塩を含むものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップc)および／またはd)で用いられる溶液が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸マグネシウム、リン酸アンモニウムからなる群から選択される塩を含有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップc)および／またはステップd)で用いられる条件がpH６〜８、好ましくは約pH７である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップd)で用いられる条件が0〜0.1Mの塩を含有するものである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップd)で用いられる条件が0〜40mMの塩を含有するものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップe)が、透析濾過または透析による界面活性剤の除去を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
透析濾過／透析がpH８〜１０、好ましくは約pH９の低塩緩衝液に対するものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップf)が、変性剤を添加することにより細菌性細胞溶解素を変性させることを含み、ステップg)が、その変性剤を徐々に除去することにより細菌性細胞溶解素をリフォールディングすることを含む、請求項２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップf)で用いられる変性剤が塩酸グアニジンである、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
５〜８Mの塩酸グアニジンが用いられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップf)の間に細菌性細胞溶解素を５〜９Mの尿素と接触させる、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップf)が、細菌性細胞溶解素を５〜８Mの塩酸グアニジンと接触させ、続いてその塩酸グアニジンを５〜９Mの尿素に交換することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
少なくともステップf)およびg)部分において還元剤が存在する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
還元剤が0.1〜10mMのDTT、好ましくは約1mMのDTTである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップg)が透析濾過または透析による変性剤の除去を含む、請求項２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
透析濾過または透析がpH７〜９の溶液に対するものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細菌性細胞溶解素を架橋試薬を用いた化学的処理により無毒化するさらなるステップを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
化学的処理がアミン基およびスルフヒドリル基と反応性である架橋剤の使用を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
架橋試薬が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびGMBSからなる群から選択される１種以上の化学物質を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
細菌性細胞溶解素を細菌莢膜多糖とコンジュゲートさせるさらなるステップを含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
細菌性細胞溶解素を薬学的に許容される賦形剤と共にワクチン組成物へと製剤化するさらなるステップを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
細菌性細胞溶解素がコリン結合プロテインＡまたはその免疫原性断片と共に製剤化される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細菌性細胞溶解素がPhtA、PhtB、PhtDもしくはPhtEまたはそれらの免疫原性断片の１種以上と共に製剤化される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
細菌性細胞溶解素が不定型ヘモフィルス・インフルエンザ（Hemophilus influenzae）（NtHi）由来の抗原と共に製剤化される、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
細菌性細胞溶解素がモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）由来の抗原と共に製剤化される、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
細菌性細胞溶解素がRSV由来の抗原と共に製剤化される、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
細菌性細胞溶解素がパラインフルエンザウイルス由来の抗原と共に製剤化される、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
細菌性細胞溶解素がインフルエンザウイルス由来の抗原と共に製剤化される、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
細菌性毒素を無毒化する方法であって、毒素を、第一級アミン基と反応性である化合物で処理することを含み、ここで、50％を超えるその毒素が、SDS-PAGEで評価した場合、処理後に、その元の分子量の20％以内の分子量を保持している、前記方法。
【請求項４３】
請求項３１に記載の方法により精製された細菌性細胞溶解素。
【請求項４４】
ニューモリシンである、請求項４３に記載の細菌性細胞溶解素。
【請求項４５】
細菌性多糖とコンジュゲートされて、細菌性細胞溶解素-多糖コンジュゲートまたはニューモリシン-多糖コンジュゲートを形成する、請求項４３または４４に記載の細菌性細胞溶解素。
【請求項４６】
請求項４４または４５に記載のニューモリシンまたはニューモリシン-多糖コンジュゲートを含む、免疫原性組成物。
【請求項４７】
コリン結合プロテインＡまたはその免疫原性断片をさらに含む、請求項４６に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
PhtA、PhtB、PhtDもしくはPhtEまたはそれらの免疫原性断片の１種以上をさらに含む、請求項４６または４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
不定型ヘモフィルス・インフルエンザ（Hemophilus influenzae）（NtHi）由来の抗原をさらに含む、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）由来の抗原をさらに含む、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
RSV由来の抗原をさらに含む、請求項４６〜５０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
パラインフルエンザウイルス由来の抗原をさらに含む、請求項４６〜５１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
インフルエンザウイルス由来の抗原をさらに含む、請求項４６〜５２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５４】
請求項４４または４５に記載のニューモリシンまたはニューモリシン-多糖コンジュゲートと薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチン。
【請求項５５】
請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物と薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチン。
【請求項５６】
ストレプトコッカス・ニューモニエ感染を治療または予防するためのワクチンの調製における、請求項４４または４５に記載のニューモリシンまたはニューモリシン-多糖コンジュゲートの使用。