(57)【要約】本発明は、金ナノ粒子、ならびに当該金ナノ粒子の医療および化粧品における使用に関する。さらに、本発明は、植物抽出物および金塩の水溶液から前述の金ナノ粒子を調製する環境に優しい方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性かつ安定な金ナノ粒子を調製するための環境に優しい方法であって、前記方法は、
ａ．  少なくとも１種のフラボノイド豊富な植物抽出物を調製する工程と、
ｂ．  前記植物抽出物の少なくとも１種を、少なくとも１種の金塩の水溶液と混合する工程と
を含み、前記フラボノイド豊富な植物抽出物は、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの抽出物であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フラボノイド豊富な植物抽出物は、前記植物の全粗製抽出物、または前記植物のフラボノイドトータムであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物抽出物は、ルチン、ケルセチン、ヒペロシド、およびイソケルセチン、またはそれらの少なくとも２種の組み合わせから選択されるフラボノイドを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ粒子は、５ｎｍと１００ｎｍとの間の直径を有することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ナノ粒子は球状であり、および植物のフラボノイドトータムを、少なくとも１種の金塩の水溶液と混合することによって得られることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子は異方性かつ花型であり、および前記花型の金ナノ粒子は、全粗製植物抽出物を、少なくとも１種の金塩の水溶液と混合することによって得られることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
金と、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの粗製抽出物とを含むことを特徴とする異方性で花型の金ナノ粒子。
【請求項８】
透過型電子顕微法により測定される際に、４０ｎｍと８０ｎｍとの間に含まれる直径を有すること特徴とする、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、タンパク質、特に抗体、ポリマー、または糖によって機能化されていることを特徴とする請求項７または８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
医薬製品としての使用のための、請求項７から９のいずれかに記載のナノ粒子、または請求項１から６のいずれかに記載の方法によって得ることができるナノ粒子。
【請求項１１】
癌の治療に使用するための、請求項１０に記載の使用のための、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
治療される癌が、肝臓癌、肺癌、および腎臓癌から選択される、請求項１１に記載の使用のための、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
診断手段またはイメージング手段としての、請求項７から９のいずれかに記載のナノ粒子、または請求項１から６のいずれかに記載の方法によって得ることができるナノ粒子の使用。
【請求項１４】
請求項７から９のいずれかに記載のナノ粒子、または請求項１から６のいずれかに記載の方法によって得ることができるナノ粒子を含む診断用組成物および／または治療用組成物。
【請求項１５】
請求項７から９のいずれかに記載のナノ粒子、または請求項１から６のいずれかに記載の方法によって得ることができるナノ粒子を含む化粧用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金ナノ粒子およびその医療用および化粧用の使用に関する。さらに、本発明は、植物抽出物および金塩の水溶液から前記ナノ粒子を調製するための環境に優しい方法に関する。
【０００２】
本発明の方法を用いて得られるナノ粒子を、いくつかの用途、特に医療および化粧分野、たとえば、触媒、センサ、電子顕微法のためのマーカー、遺伝子治療、有効成分ベクター、診断、放射線療法、温熱療法およびイメージングなどとして用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
医療および化粧品において、ナノ粒子はますます使用されてきている。それらは、本質的に金属性であっても、金属性でなくてもよく、それらの寸法は数百ナノメートルを超えない。ナノ粒子の特質は、以下の具体的特性を提供する。
【０００４】
金ナノ粒子は、ナノ医療において高度に興味深い。それらは、独特の表面プラズモン共鳴の利点を提供し、医療（診断、治療、研究など）において特に興味深いものとされている。さらに、それらは、酸化せず、かつ、不活性および生体適合性である。また、金ナノ粒子は、抗体、ペプチドまたはその他のような生体分子と結合することができ、あるいは、無機分子とさえも結合することができる。
【０００５】
慣用的には、金属ナノ粒子は、反応剤または反応生成物が毒性である恐れがある化学的方法により合成される。一般的に用いられる還元剤は、クエン酸である（Turkevich, 1951、非特許文献３、非特許文献２３）。これらの方法は、毒性の剤を排除することを試みるために、ナノ粒子の洗浄を必要とする。それらの合成方法のために、これらナノ粒子は、安定性、反応性、生体適合性の問題を起こす恐れがあり、あるいは、生体分子の不活性化をもたらす合成反応剤により、生体分子との共役に適さなくなる恐れがある。
【０００６】
より環境に優しく、かつ金ナノ粒子の生体適合性、安定性および反応性を向上させる、新規の合成法を開発することが必要となっている。
【０００７】
そして、植物抽出物を用いて金塩を還元する環境に優しい方法が、従来技術において知られている。
【０００８】
国際出願公開第２００５／０９５０３１号は、１５℃と１００℃との間の温度における異なる植物部分の還元性抽出物と金属塩の反応により、異なる形状および寸法を有する１種および２種の金属のナノ粒子を合成する方法を開示している（特許文献１）。この特許出願の植物は、たとえば、種々のニッケイ、レモン、ジャスミン、カミツレおよびバラなどである。
【０００９】
米国特許第８３３３９９４号明細書は、ポリフェノール豊富な植物抽出物またはフラボノイド豊富な植物抽出物、あるいは植物化学的反応性化合物によって安定される生体適合性金ナノ粒子を開示している（特許文献２）。この特許において、金塩を含有する水溶液を、ポリフェノール豊富な植物抽出物またはフラボノイド豊富な植物抽出物と混合する。たとえば、金塩の溶液は、紅茶、ウコンまたはシナモンと混合される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際出願公開第２００５／０９５０３１号
【特許文献２】米国特許第８３３３９９４号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】N. Cujic, K. Savikin, T. Jankovic, D. Pljevljakusic, G. Zdunic, S. Ibric, 2016. "Optimization of polyphenols extraction from dried chokeberry using maceration as traditional technique", Food Chemistry, 194, 135-142.
【非特許文献２】T. Stylianopoulos, and R. K. Jain "Design considerations for nanotherapeutics in oncology." Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 11(8): 1893-1907.
【非特許文献３】J. Turkevich, P. C. Stevenson and J. Hiller, Discuss. "A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold", Faraday Soc. 1951, 11, 55.
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【非特許文献２３】Turkevich, J., Stevenson, P. C, & Hillier, J. (1951). "A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold". Discussions of the Faraday Society, 11, 55-75.
【非特許文献２４】Zhao, P., Li, N., & Astruc, D. (2013). "State of the art in gold nanoparticle synthesis." Coordination Chemistry Reviews, 257(3), 638-665.
【非特許文献２５】Baffou, G., Polleux, J., Ringneault, H. & Monneret S., "Super-Heating and Micro-Bubble Generation around Plasmonic Nanoparticles under cw Illumination", J. Phys. Chem. C 2014, 118(9), 4890-4898.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
化学製品を必要とする方法は、環境に優しくないという不利益を有し、得られる金ナノ粒子は、特に、引き続く肉体への注射の際に、溶液中に金ナノ粒子を安定化する（毒性）分子の解離のために、安定性、反応性、毒性または生体適合性の問題を起こす可能性がある。これらの分子は、引き続いて、観察される副作用の原因となり得る。
【００１３】
植物抽出物を用いる従来技術の方法は、主として、水溶液中で不安定な球状の金粒子の生成をもたらす。ナノ粒子の形状が腫瘍の微環境に到達する能力、したがって治療の有効性に直接的に影響することが知られている（Stylianopoulosら、非特許文献２）。ナノ粒子の形状および寸法は、植物抽出物の抗酸化剤組成物によって影響を受ける。３つの要素が、ナノ粒子の形状および寸法を決定する：ポリフェノールの還元力、抽出物中のそれらの濃度、または安定剤の特質および濃度（Eliaら、2014、非特許文献１９）。非常に多くの場合、環境に優しい抽出法は、溶液中のナノ粒子の長期安定化を容認しない、種々の種類のポリフェノール剤（フェノール酸、カテキン、エピカテキン、アントシアニン、フラボノイド、タンニンなど）の蓄積をもたらす（Krishnaswamyら、2014、非特許文献１８）。
【００１４】
これらのナノ粒子の有効性を向上させるため、ナノ粒子が目的細胞に到達する能力およびナノ粒子の有効性を改善することの両方の還元から、生体適合性であり、かつ制御された均一な形状を有し、温熱を発生させる点においてより有効な、単分散かつ安定な金ナノ粒子を得ることを可能にする環境に優しい方法を見出すことが本質的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、生体適合性かつ安定な金ナノ粒子を調製するための環境に優しい方法によって、従来技術の欠点を解消することを目的とし、当該方法は、少なくとも１種のフラボノイド豊富な植物抽出物、特にＨｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの抽出物を用いて金属塩を還元する工程からなる。そのようにして得られる金ナノ粒子は、従来技術のナノ粒子に比較して改善された特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの葉の全粗製抽出物により還元される金塩に基づく、本発明の方法に従って得られる金ナノ粒子の透過型電子顕微法によって得られる写真を示す。得られるナノ粒子は、４０ｎｍの直径を有し、異方性かつ花型である。それらは単分散である。
【図２】Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの花のフラボノイドトータム（totum）により還元される金塩に基づく、本発明の方法に従って得られる金ナノ粒子の透過型電子顕微法によって得られる写真を示す。得られるナノ粒子は、１５ｎｍの直径を有し、球状である。それらは単分散である。
【図３】Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの花の全粗製抽出物により還元される金塩に基づく、本発明の方法に従って得られる金ナノ粒子の透過型電子顕微法によって得られる写真を示す。得られるナノ粒子は、４０ｎｍの直径を有し、異方性かつ花型である。それらは単分散である。
【図４】本発明の方法によって得られる金ナノ粒子のＵＶスペクトルを示す。
【図５】本発明の方法を用いて合成される金ナノ粒子のスキャンを示す
【図６】（Ａ）において、付着されたコロイド状ナノ粒子（特定の吸着剤凝集物に円を付した）を有するガラススライドの光学画像（明視野）を示す。（Ａ）および（Ｂ）において矢印で示す凝集物をレーザー光（９．５ｍＷ／μｍ2、５秒間）の標的とした。（Ｂ）において、ナノ粒子のレベルにて微小泡が形成される。続いて、レーザーを「Ｘ」で示される位置（コロイドなし）に照準した。この場合には泡は形成されない。
【図７】ガラスに付着され、水で取り囲まれたナノ粒子の小さい凝集物の照準中に得られるラマンスペクトル（λexc＝６６０ｎｍ、Ｐ＝２ｍＷ／μｍ2、積分時間５秒間）を示す。縦座標（ｙ）に、パルス／分の単位の強度を示し、横座標（ｘ）が波数（ｎｍ-1）を示す。
【図８】金ナノ粒子を受容したマウスの組織の断面のＴＥＭによって得られる写真を示す。ナノ粒子は黒点として見える。（Ａ）は、ナノ粒子で処置されていない肝臓を示し、（Ｂ）は、ナノ粒子で処理された肝臓（１７ｍｇ、２４時間）を示す。
【図９】金ナノ粒子を受容したマウスの組織の断面のＴＥＭによって得られる写真を示す。ナノ粒子は黒点として見える。（Ａ）は、ナノ粒子で処置されていない肝臓（２７ｍｇ、２４時間）を示し、（Ｂ）は、ナノ粒子で処理された肝臓（３７ｍｇ、２４時間）を示す。
【図１０】金ナノ粒子を受容したマウスの組織の断面のＴＥＭによって得られる写真を示す。ナノ粒子は黒点として見える。（Ａ）は、ナノ粒子で処置されていない肺を示し、（Ｂ）は、ナノ粒子で処理された肺（７ｍｇ、２４時間）を示す。
【図１１】金ナノ粒子を受容したマウスの組織の断面のＴＥＭによって得られる写真を示す。ナノ粒子は黒点として見える。（Ａ）は、ナノ粒子で処置されていない腎臓（７ｍｇ、２４時間）を示し、（Ｂ）は、ナノ粒子で処理された腎臓（２７ｍｇ、２４時間）を示す。
【図１２】金ナノ粒子を受容したマウスの組織の断面のＴＥＭによって得られる写真を示す。ナノ粒子は黒点として見える。ナノ粒子で処理された腎臓（３７ｍｇ、２４時間）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第１の態様は、生体適合性かつ安定な金ナノ粒子を調製するための環境に優しい方法に関し、当該方法は、
（ａ）少なくとも１種のフラボノイド豊富な植物抽出物の調製
（ｂ）少なくとも１種の前記植物抽出物の、少なくとも１種の金塩の水溶液との混合
を含み、フラボノイド豊富な植物抽出物が、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの抽出物であることを特徴とする。Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａは、レユニオン島およびモーリシャスに固有の種である。この小さい灌木は、レユニオン島に特に豊富であり、高度１０００ｍと２０００ｍとの間に主として見出される。この植物は、幼児の胃腸炎を治療するハーブティーとして、または皮膚の問題（紅色汗疹、湿疹、火傷、掻痒症、創傷、炎症など）を治療する煎じ薬として、レユニオン島の伝統的医療において用いられる。また、この植物は、胃潰瘍に対する特性、ヘルペスおよびポリオウィルスに対する抗ウイルス特性を有するともいわれている。
【００１８】
Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍは、セイヨウオトギリソウから分枝した、レユニオン島に固有の種である。それは、黄花（fleur jaune）という名前でも知られている。これは、赤道ギニアからタンザニアにかけてのアフリカにおいても見出される。この植物の花の精油は、ハーブ医薬として用いられる。この植物は、ハーブティーの形態で、レユニオン島の伝統的医療jにおいて、胃炎の緩和、泌尿器感染に対して、痛みを伴う月経期の緩和および調整、また発熱に対して用いられる。その抗ラジカル特性および抗酸化剤特性は証明されている。
【００１９】
本発明の別の実施形態によれば、フラボノイド豊富な植物抽出物は、前記植物の全粗製抽出物であってもよく、前記植物のフラボノイドの「トータム（totum）」であってもよい。具体的には、
−  Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの全粗製抽出物
−  Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの全粗製抽出物
−  Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａのフラボノイドトータム
−  Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍのフラボノイドトータム。
【００２０】
有利なことには、植物抽出物は、ルチン、ケルセチン、ヒペロシド、およびイソケルセチン、あるいは、それらの少なくとも２種の組み合わせから選択されるフラボノイドを含む。
【００２１】
特定の実施形態によれば、植物抽出物は、ルチンおよびケルセチンを含む。有利なことには、ルチンおよびケルセチンを含む植物抽出物は、フラボノイドトータムである。ルチンおよびケルセチンを含むフラボノイドトータムは、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍから抽出されるフラボノイドトータムである。
【００２２】
別の実施形態によれば、植物抽出物は、ヒペロシドおよびイソケルセチンを含む。有利なことには、ヒペロシドおよびイソケルセチンを含む植物抽出物は、フラボノイドトータムである。ヒペロシドおよびイソケルセチンを含むフラボノイドトータムは、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａから抽出されるフラボノイドトータムである。
【００２３】
有利なことには、本発明にしたがう金ナノ粒子の調製法がＨｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍから抽出されるフラボノイドトータムと金塩の溶液を混合することを含む場合、金塩に対するフラボノイドのモル比は２１である。
【００２４】
好ましい実施形態において、金ナノ粒子を調製する方法において用いられるフラボノイド豊富な植物抽出物は、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの粗製抽出物である。
【００２５】
本発明にしたがう方法は、迅速である。植物抽出物およびフラボノイドトータムは、ひとたびナノ粒子が形成されたならば、ナノ粒子の安定剤としても機能する。したがって、本発明の方法は、限定された数の段階を含む。ひとたび植物抽出物が得られたならば、本方法は１段階かつ１分以内で完了する。これは、従来技術の化学的方法に比べて遙かに速い（Frensら、1973、非特許文献２２、 Zhao、2013、非特許文献２４）。例示のために、季節的特質である他の花の種において観察される変動性にもかかわらず、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの粗製抽出物の化学組成は、高度に安定である（ヒペロシド／イソケルセチン＝３０）。主要化合物は、安定な比率を有する分子対であり、それゆえ、安定剤の添加なしに、ナノ粒子の安定化に関与する。
【００２６】
本発明の方法を用いて得ることができるナノ粒子は、５ｎｍと１００ｎｍとの間、遊離には１０ｎｍと５０ｎｍとの間の直径を有する。
【００２７】
調製法に用いる植物抽出物の特質に依存して、２種のナノ粒子が得られる。
【００２８】
植物フラボノイドトータムと少なくとも１種の金塩の水溶液と混合することによって得られるナノ粒子は、球状である。有利なことには、これらの球状ナノ粒子は、１５ｎｍの直径を有する。
【００２９】
全粗製植物抽出物と少なくとも１種の金塩の水溶液と混合することによって得られるナノ粒子は、異方性かつ花型を有する。有利なことには、これらの花型のナノ粒子は、４０〜８０ｎｍの直径を有する。
【００３０】
本発明の方法に従って得られる２種のナノ粒子は、従来技術に記載されたナノ粒子に対して、改善された特性を有する。
【００３１】
本発明の第２の態様は、金と、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの粗製抽出物とを含む、異方性の花型の金ナノ粒子に関する。
【００３２】
この独特な「花型」形状は、同時に、金塩の還元、３軸に沿った（ｘ、ｙ、ｚ、言い換えると３次元的な）空間におけるナノ粒子の核生成および成長、およびそれらの安定化の原因となるポリフェノールの重合に起因する。本発明者らは、赤外線にさらされた際にこれらの花型のナノ粒子が生成する熱の量が、従来技術に記載された球状ナノ粒子、ならびに、本発明の態様である方法によって生成される球状ナノ粒子よりも大きいことを示した。この特性は、明確に、入射ビームと花型のナノ粒子の異なる表面プラズモンとの電磁気的相互作用の結果であり、放出される熱の増大を可能にする。したがって、これらの花型を有するナノ粒子の有効性は、同一線量に関して増大する。従来技術のナノ粒子と比較したそれらの増大した反応性は、より良好な治療有効性を示唆する。さらに、これらのナノ粒子は、安定かつ単分散である。本発明者らは、それらの生体分布を研究し、その初期結果は、それらが種々の組織、特に肝臓、肺および腎臓に蓄積できることを示す。
【００３３】
グリーンケミストリーの方法によって得られる本発明の花型のナノ粒子は、化学プロセスによって得られる従来技術に記載されるナノ粒子と異なり、いかなる痕跡量の毒性粒子も含有しないという利点を有する。
【００３４】
前述のように、これら花型のナノ粒子は、植物抽出物がＨｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの粗製抽出物である場合に、本発明の方法によって得られる。
【００３５】
本発明の第３の態様は、化粧品用途、診断用途、および治療用途における、本発明の方法に従って得ることができるナノ粒子の使用である。
【００３６】
実施例パートで概説するように、本発明の方法によって得られるナノ粒子は、特に反応性が高く、高熱の媒介物質であり、診断用途および治療用途における興味深い生体分布を提供する。
【００３７】
化粧品においては、それらは、肌用、髪用および爪用の化粧品製品の配合中に含まれてもよい。
【００３８】
さらに、本発明の態様である方法を用いて得ることができるナノ粒子は、水に可溶性であり、かつ、ナノセラノスティクス（すなわち、診断薬および／または治療薬として使用できる）である。
【００３９】
本発明の方法によって得ることができるナノ粒子は、癌を発生させる可能性のある特定の組織中に存在する。よって、それらは、医療または獣医学イメージング技術、または医療または獣医学治療方法（たとえば、光線療法による温熱）の両方において使用され得る。
【００４０】
有利なことには、これらのイメージングまたは診断方法において標的とされる細胞は、肝臓、肺および腎臓の細胞である。
【００４１】
それらの特性のために、本発明の態様である方法を用いて得ることができるナノ粒子は、癌の治療に特に適当である。
【００４２】
一般的にいって、金ナノ粒子は、生体適合性であり、それらの医療分野における使用を可能にする光学的性質を有する（Jabeen F.ら、2014、非特許文献４; Jiang Y.ら、2015、非特許文献５; Shanmugam V.ら、2014、非特許文献６）。超音波を用いるin vivoイメージングにおけるナノ粒子の使用の可能性は、既に例証されている（Arifin DR,ら、2011、非特許文献７）。ナノ粒子は、赤外線による温熱癌治療の一部としても利用され、このアプローチの価値は、その最小限に侵襲的な態様および実施の容易性にある（Song J.ら、2016、非特許文献８）。
【００４３】
特に、金ナノシェルをポリマーと組み合わせることにより、または金ナノシェルを乳酸と組み合わせることにより、光熱効果およびイメージングを用いるナノセラノスティクナノ粒子を得るための試験が実施されてきた（Ke H.ら、2014、非特許文献９）。現在、それらのプラズモン共鳴に関連する光感受性のため、全ての形状および寸法を有する金ナノ粒子が温熱治療においてしばしば用いられる（Huang, X.ら、2011、非特許文献１０）。癌の治療において、この特性から利点が得られてきている。腫瘍部位に位置するナノ粒子に対するレーザーの適用は、熱の局地的増大をもたらす。これは、ナノ粒子のごく近くの周囲のタンパク質および細胞膜の変性をもたらし、癌細胞の死をもたらす（Shibu E.S.ら、2013、非特許文献１２）。
【００４４】
癌組織の温熱治療における金ナノ粒子の使用の利点は、赤外光に応答して、吸収および引き続く放出を行う金属の能力である。この種の治療アプローチを実施するためには、適切な放射線ならびに必要かつ許容可能な温度を画定するために、処置される腫瘍の周囲状況を研究する必要がある。近年、細胞および組織中のナノ粒子の光熱効果をモデル化するために、数学分野で研究がされてきている（Nabil, M.ら、2015、非特許文献１３; Peeters, S.ら、2012、非特許文献１４）。問題となるナノ粒子の関数としての温度範囲で観測される差異は、アレニウスの式の変形をもたらす（Li, D .ら、2014、非特許文献１５; Clark, C.D.ら、2011、非特許文献１６）。これは、適切な温熱を誘起するナノ粒子の寸法および放射線の波長のより良好な選択を可能にする。
【００４５】
本発明にしたがうナノ粒子は、癌を処置するのに特に適当であるように見える。実際、これらの金ナノ粒子は、何らの毒性化合物も含まない。いわゆる「グリーンケミストリー」の合成方法で誘導される。さらに、本発明の態様である方法に従って得られる金ナノ粒子は、その中に痕跡量の毒性生成物も有さない。したがって、他のナノ粒子とは異なり、これらのナノ粒子の注射には、体内への痕跡量の毒性物質の注射さえも付随しない。したがって、それらは非常に安全である。
【００４６】
癌標的を特異的目標としない現状のナノセラノスティク剤とは異なり、本発明の態様である方法に従って得られる金ナノ粒子は、しばしば癌が存在する組織である肺、肝臓および腎臓中、特に肝臓中に優先的に見出される。さらに、以前から提案されているように、それらは、関心のある癌組織の抗原性標的に特異的な抗体を用いて機能化することができる（Xu L.ら、2017、非特許文献１７）。それらは、目標組織に特異的ではないが、前記目標組織に対するナノ粒子のアドレシングを促す分子によって機能化してもよい。これらの非特異的分子は、具体的には、前記目標組織の細胞の固有の代謝中に含まれる分子であってもよい。
【００４７】
最後に、本発明の態様である方法にしたがって得られる金ナノ粒子は、高い温熱ポテンシャルを示し、高い温熱ポテンシャルは、それらに比例して、加えられる放射線の線量が少なくなるという事実のために、有利である。
【００４８】
これら全ての特性のために、本発明の態様である方法に従って得られる金ナノ粒子は、抗癌用途の重要な候補である。
【００４９】
よって、１つの特定の実施形態において、本発明は、癌を治療するための、本発明の態様である方法を用いて得ることができるナノ粒子の使用に関する。有利なことには、これらのナノ粒子を用いて治療される癌は、肝臓癌、肺癌および腎臓癌である。
【００５０】
別の実施形態において、本発明の態様であるナノ粒子は、臓器、組織または具体的な細胞型においてそれらの標的化を可能にする任意の種類の分子（具体的にはタンパク質、具体的には抗体、ポリマーまたは糖を用いる）によって機能化されてもよい。
【００５１】
または、本発明は、以下の段階
−  本発明の態様である方法を用いて得ることができるナノ粒子を投与する段階、
−  適当な線量の電磁放射線、たとえば赤外光を、目標細胞または組織に照射する段階、
−  前記ナノ粒子を含む、放射を受けた細胞または組織の検出および／または破壊
を含む診断および／または治療方法に関する。
【００５２】
有利なことには、目標細胞または組織は、癌細胞または癌組織である。
【００５３】
有利なことには、これらの方法に用いられるナノ粒子は、異方性かつ花型である。
【００５４】
本方法で得られるナノ粒子は単分散である。それらは、たとえば、口または静脈経路を介して、ヒトまたは動物に投与することができる。それらをタグ付けまたは機能化して、目標細胞または組織のアドレシングを向上させることができる。それらを、電磁波を含む技術（たとえばＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＳＥＲＳ  ＲＡＭＡＮ）と組み合わせて、異なる種類の癌を含む種々の疾病の検出および／または治療および／または進展の監視を行うことができる。
【００５５】
以下の実施例を参照して、本発明をより良好に理解できるであろう。
【実施例】
【００５６】
（実施例１：Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａおよびＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの植物抽出物の調製）
本発明においては、２つの植物種を用いる。第１は、レユニオン島に固有の灌木であるＨｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａである。第２は、レユニオン島に固有である、セイヨウオトギリソウから分枝した種であるＨｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａである。これらの植物は、両方ともに、フラボノイドが特に豊富であり、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの場合はルチンおよびケルセチンを含み、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの場合にはイソケルセチンおよびヒペロシドを含む。
【００５７】
ａ）  全粗製植物抽出物の調製
新鮮な収穫された植物を脱イオン水中で洗浄する。３ｇを５０ｍＬの脱イオン水と混合し、引き続いて混合物を５分間にわたって６０℃に加熱し、植物細胞の溶解により、生体材料を放出させる。引き続いて、上澄みを周囲温度に冷却し、次いで１０分間にわたって氷で冷却する。引き続いて、冷却した上澄みを、グレード２細孔サイズのフィルターで濾過する。
【００５８】
出発材料がＨｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの場合、得られる抽出物は緑色である。
出発材料がＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの場合、得られる抽出物は褐色である。
この調製において、有機溶媒を使用しない。
【００５９】
ｂ）  植物フラボノイドトータムの単離
用いる抽出方法は、冷却浸軟法である。１０ｍｍの孔径を有するスクリーン上で植物を破砕し、周囲温度における２０時間にわたる１５０ｒｐｍでの攪拌の下で浸軟させたままにする。フェノール性化合物の最高の可能な収率を得るために、等部の水およびエタノールの混合物を添加し、１：２０の固体／溶媒比率の混合物とする（Cujic N.ら、非特許文献１）。抽出の後に、浸軟物を濾過し、低圧下で乾燥させ（最高浴温度：４５℃、５０バールと１５０バールとの間の圧力）、引き続いて４８時間にわたって凍結乾燥させる。
【００６０】
これらの条件下における、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａに関する抽出収率は、ほぼ５０％である。
【００６１】
（実施例２：Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａ植物抽出物およびＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ植物抽出物との混合による金ナノ粒子の調製）
ａ）全粗製抽出物を用いる花型形態の金ナノ粒子の調製
頂部に還流凝縮器を取り付け、遮光された二口丸底フラスコ中、激しい攪拌の下、１ｍＭの塩化金酸（ＨＡｕＣｌ4）の水溶液５０ｍＬを還流させる。微細な滴が壁に現れた時に、全粗製植物抽出物の水溶液２０ｍＬを極めて速やかに添加する。その際、溶液は、１分以内に、速やかに暗いダークブルー色になる。引き続いて丸底フラスコを油浴から取り出し、さらなる１５分間にわたる激しい攪拌の下、溶液を維持する。最終的に、溶液を遮光して４℃で維持する。
【００６２】
そのようにして得られるナノ粒子の直径を、以下の段落ｃ）に記載されるように測定する。
得られるナノ粒子は、約４０ｎｍの、ＴＥＭにより測定される直径を有する。
【００６３】
ｂ）フラボノイドトータムを用いる球状金ナノ粒子の調製
頂部に還流凝縮器を取り付け、遮光された二口丸底フラスコ中、激しい攪拌の下、フラボノイドトータムの水溶液４ｍＬを還流させる。微細な滴が壁に現れた時に、ＨＡｕＣｌ4の水溶液４ｍＬを極めて速やかに添加する。その際、溶液は、１分以内に、速やかに赤褐色になる。引き続いて丸底フラスコを油浴から取り出し、さらなる１５分間にわたる激しい攪拌の下、溶液を維持する。最終的に溶液は、遮光して４℃で維持する。
【００６４】
そのようにして得られるナノ粒子の直径を、以下の段落ｃ）に記載されるように測定する。
得られるナノ粒子は、約１５ｎｍの、ＴＥＭにより測定される直径を有する。
【００６５】
反応剤間の具体的モル比は、球状金ナノ粒子を得ることを可能にする。この比率は、以下の通りである。
ｎ（フラボノイド）／ｎ（ＨＡｕＣｌ4）＝２１
【００６６】
ｃ）  調製方法に依存する、得られるナノ粒子のキャラクタリゼーション
＜ナノ粒子の直径＞
段落ａ）およびｂ）に記載される方法に従って得られるナノ粒子の直径を、透過型電子顕微法（ＴＥＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）および原子間力顕微法（ＡＦＭ）により測定する。
【００６７】
ＴＥＭ分析のために、電子顕微法画像を、１００ｋＶの加速電圧で動作するＪＥＯＬ製ＪＥＭ１０１１顕微鏡で記録した。−炭素および乾燥周囲温度。ＤＬＳ分析のために、粒度および分布を、ＤＬＳ粒度分析計（９０プラス粒度分析計（Brookhaven Instruments Corporation））で記録した。ＡＦＭ分析のために、試料を、「捕捉モード」用のＭＡＣ機能拡張を有するMolecular Imaging PicoScan IIで特徴付けした。
【００６８】
ＴＥＭにより得られる画像は、２種の粒子：トータムフラボノイド抽出物を用いて得られる、直径１５ｎｍの球状かつ独立した粒子、および全粗製植物抽出物を用いて得られる非球状の花型の粒子を示す。Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａまたはＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの全粗製抽出物を用いて得られる、後者の花型の粒子は、４０ｎｍと８０ｎｍとの間に含まれる直径を有する。それらは、直径１５ｎｍの良好に個別化された粒子から形成されることが観察される。最も小さいものは、フラボノイドトータムを用いて合成される。
【００６９】
２種の合成の間で観察される差異は、粗製抽出物がポリフェノールを含み、ポリフェノールが、キレーション段階において溶液中で空間的に多方向重合を受けて、花型の構造をもたらすことを示唆する。
【００７０】
ＤＬＳによって得られるデータは、ナノ粒子の主要な２つの群を示す。第１の群は、重合して第２の群（溶液中の二量体）を形成することができる、独立した粒子からなる。ＤＬＳにより得られる結果は、ＴＥＭ法およびＡＦＭ法を用いて得られる粒度よりも大きな平均ナノメートル粒度（nanometric particle size）を示す。これらの差異は、文献中で一般的に報告されている（Elia、2014、非特許文献１９）。これは、粒子を包囲する一団の生体分子（ポリフェノール）を考慮することによる流体力学的体積を測定するＤＬＳ法に起因する。
【００７１】
ＡＦＭにより得られる画像の処理は、約３３ｎｍの花型ナノ粒子の平均寸法をもたらす。個別のナノ粒子は、約１５ｎｍの平均寸法を有する。
【００７２】
異なる方法を用いて測定される異なるナノ粒子の寸法を第１表にまとめる。
【００７３】
ＡｕＮＰ＠ＥＢＨＡ＝Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの粗製抽出物を用いて得られる金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）。ＡｕＮＰ＠ＥＢＨＬ＝Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの粗製抽出物を用いて得られるＡｕＮＰ。
ＡｕＮＰ＠Ｆ２ＨＡ＝Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａのフラボノイドトータムを用いて得られるＡｕＮＰ。
【００７４】
【表１】
2019505682.tif 000002
【００７５】
＜ナノ粒子の形状＞
図１〜図３は、本発明の方法を用いて確かに得られた金ナノ粒子を示す。さらに、全粗製植物抽出物を用いる場合、ナノ粒子は、異方性かつ花型である。一方、フラボノイドトータムを用いる場合、金ナノ粒子は球状であり、かつより小さい。この方法により得られるナノ粒子は単分散である。
【００７６】
Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ抽出物のＵＶスペクトル、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ抽出物と金塩の反応により得られるナノ粒子のＵＶスペクトル、およびTurkevichの慣用の方法（非特許文献３、非特許文献２３）を用いて得られるナノ粒子のＵＶスペクトルを比較した。図４は、得られるスペクトルを示し、ａは、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ抽出物のＵＶスペクトルであり、ｂは、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ抽出物と金塩の反応により得られるナノ粒子のＵＶスペクトルであり、ｃは、Turkevichの慣用の方法（非特許文献３、非特許文献２３）を用いて得られるナノ粒子のＵＶスペクトルである。スペクトルｂにおいて、５６８ｎｍにバンドが現れ、花型の異方性金ナノ粒子の存在が確認される。
【００７７】
＜スキャナーにより研究されるナノ粒子のコントラスト＞
本発明にしたがう方法を用いて得られるナノ粒子のスキャナー（ＣＴスキャン）による検出の可能性を、断層撮影法により検証した。この目的のために、３種の試料をコンピュータ補助断層撮影法によりスキャンした。
−  試料１：Turkevichにしたがいクエン酸塩から調製した金ナノ粒子の滴。
−  試料２：上澄み（植物抽出物のみ）、
−  試料３：Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの粗製抽出物から調製した金ナノ粒子の滴。
【００７８】
スキャンは、金塩およびＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ抽出物から調製したナノ粒子の滴（試料３）を示す。超遠心分離の後に、試料２および試料１は、コントラストに有意の相違を示さない。一方、試料３は、超遠心分離管の底に黒色堆積物を示し、顕著なコントラストをしめす（図５）。８０ｋＶｐにおけるこの試料３の放射線学的コントラストは、６２１ＵＨであり、一方６ｍｇＡｕ／Ｋｇの濃度における上澄み（試料２）がわずか２５であり、すなわち、Booteらのものの１／１５である（データ非開示、非特許文献２０）。
【００７９】
Booteらは、金ナノ粒子濃度と放射線学的コントラスト（ＨＵ単位で示される）との間に、直線的関係が存在することを示す（非特許文献２０）。彼らがin vitroで実施した試験において、２０ｎｍの金ナノ粒子は、９０ｍｇＡｕ／Ｋｇの濃度に関して、８０ｋＶｐにおいて、約１０ＨＵの放射線学的コントラストを示す。マウスにて実施した試験は、肝臓中の金ナノ粒子の大多数の蓄積を示し、肝臓組織中、８０ｋＶｐにおける＋２２．３ＨＵ（吸収された金のｍｇ数／１ｃｍ3当たり）と、１４０ｋＶｐにおける＋２６．７ＨＵ（吸収された金のｍｇ数／１ｃｍ3当たり）との間のコントラスト変化を示す。脾臓に関するデータは、８０ｋＶｐにおける＋９．７ＨＵ（吸収された金のｍｇ数／１ｃｍ3）と、１４０ｋＶｐにおける＋１０．１ＨＵ（吸収された金のｍｇ数／１ｃｍ3）との間のＨＵ値の変化を示す。別のチームは、０．０１６Ｍ［Ａｕ］（すなわち、約１．５４ｇＡｕ／Ｋｇ）の濃度に関して、８０ｋＶｐにおいて約４５ＨＵの放射線学的コントラストを示した（Chandaら、非特許文献２１）。
【００８０】
他のチーム（前述）により得られた結果と、本発明にしたがうナノ粒子を用いて得られる結果との比較は、本発明の態様である方法を用いて得られるナノ粒子を用いて得られる放射線学的コントラストは、以前に開示されたものよりも著しく大きいことを示す。したがって、本発明のナノ粒子は、イメージングに特に適当である。
【００８１】
＜合成の収量＞
同一の植物から得られる全粗製植物抽出物またはトータムフラボノイド抽出物を用いる本発明の方法を用いて得られる金ナノ粒子の合成の収量を、以下の第２表に与える。
【００８２】
【表２】
2019505682.tif 000003
【００８３】
Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの全粗製抽出物を用いる合成は、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの全粗製抽出物を用いる合成よりも良好な収量を示す。
【００８４】
Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍのフラボノイドトータムを用いる合成の収量は、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａのものよりもわずかに高い。
【００８５】
金ナノ粒子の合成の収量は、フラボノイドトータムを用いた場合に、全粗製抽出物を用いるよりも高い。
【００８６】
フラボノイドトータムを用いて得られる収量を、単一のフラボノイドを用いて得られる収量と比較した。Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａのフラボノイドトータムは、支配的なヒペロシドと、少量のイソケルセチンとを含有する。本発明にしたがう方法においてＨｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａのフラボノイドトータムを使用することにより、球状の安定な金ナノ粒子が得られる。逆に、イソケルセチン単独またはヒペロシド単独と金塩の反応は、不安定な金ナノ粒子の合成、ならびに、フラボノイドトータムを用いて得られる収量よりも低い２０ｇ／Ｌの収量をもたらす。したがって、ヒペロシドおよびイソケルセチンの間に相乗的作用が存在する。
【００８７】
Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍのフラボノイドトータムは、支配的なルチンと、少量のケルセチンとを含有する。本発明にしたがう方法において後者を用いることにより、球状の安定な金ナノ粒子が得られる。逆に、ルチン単独またはケルセチン単独と金塩の反応では、金ナノ粒子の合成ができなかった。したがって、ルチンおよびケルセチンの間に相乗的作用が存在する。
【００８８】
（実施例３：in vitroにおける金ナノ粒子の光熱効果の研究）
赤外線下で熱を放出するナノ粒子の能力を、in vitroで研究した。この実験に用いたＡｕＮＰは、Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａのフラボノイドトータムを有する混合物から得た。
【００８９】
金ナノ粒子が、温熱により腫瘍を治療する高い潜在性を与えることが知られている。しかしながら、それらの有効性は、それらの寸法、形状および表面状態に依存するであろう。
【００９０】
細胞の光熱治療に十分な温度を達成するために必要な暴露時間に加えて、用いられるナノ粒子のプラズモン共鳴の周囲の試料のレーザー照射出力を評価する目的で、波動の連続照射の下での微小泡の発生が、Baffouら（J. Phys. Chem. C 2014, 118, 4890）により研究され、泡の発生を開始するのに必要とされる局所温度は約２２０℃である（非特許文献２５）。
【００９１】
＜結果＞
倍率８０、０．７５ＮＡのレンズを用いる光学顕微法により、ナノ粒子の小さい凝集物を視覚化した。明視野に観察される最も小さい黒点は、約２００ｎｍの寸法の凝集物に対応しそうである（図６（Ａ））。回折限界のため、個々のナノ粒子を発見することはできなかった。レーザーのスイッチをオフの状態で第１の光学画像を記録した後に、レーザー光（ｅｘｃ＝６６０ｎｍ）を固定された期間にわたって凝集物に合焦させた。引き続いて、レーザー光を停止した後に第２の光学画像を記録した。図６（Ｂ）に示すように、５秒間の暴露および９．５ｍＷ／μｍ2の照射によって、微小泡が形成された。同様の寸法を有する別の凝集物において、同じ実験を５回繰り返し、同一のレーザー照射を用いる２秒間と５秒間との間の暴露時間において、常に微小泡の形成がなされた。より強度な照射は、より大きな泡をもたらす。
【００９２】
また、負の試験を実施し、ナノ粒子の凝集物から離れたところにレーザー光を合焦させる時に、泡は形成されなかった（図６（Ａ）の位置Ｘ）。泡は、ＮＰレベルで発生し、ＮＰのプラズモン吸収に起因する。さらに、同様の凝集物に対する３０秒間にわたる５ｍＷ／μｍ2の照射は、微小泡を生成させない。泡形成の閾値（Ｔ〜２２０℃）は、５ｍＷ／μｍ2および９．５ｍＷ／μｍ2のレーザー照射の間に含まれる。高温において閾値が出現するため、細胞死を誘起するために必要な温度およびしたがって出力は、より低いことが望ましい。固定化細胞に関して以前に提唱された光熱測定に関して、＞５ｍＷ／μｍ2のレーザー照射が選択された。５秒間にわたる２ｍＷ／μｍ2を用いるＮＰ凝集物から、弱いラマン信号（−１３００ｃｍ-1および−１５５０ｃｍ-1における非晶質炭素の広いバンド）を検出することができる（図７）。この信号は、泡の形成後（すなわち加熱後）にもまだ存在するが、遙かに小さいバックグラウンドを有する。
【００９３】
本発明の金ナノ粒子のプラズモンのバンドは、６００ｎｍと７００ｎｍとの間に見出され、溶液中の個別のナノ粒子に関連して１００ｎｍを超えてオフセットされる。このオフセットは、２つの現象の結果である可能性がある。第１は、ナノ粒子の内在化中の環境の変化に相当する。この場合、ナノ粒子は、タンパク質または他の生体分子に被覆される可能性があり、それはプラズモン共鳴の赤方偏移をもたらすであろう。第２の現象は、細胞媒体中でのナノ粒子の凝集に相当し、暗視野顕微法による観察を裏付ける。ナノ粒子のプラズモン共鳴は最も長い照射波長（８０８ｎｍ）に接近し、より低エネルギーであり、したがって生体に対する破壊性がより低いとみなされる。
【００９４】
（実施例４：金ナノ粒子のin vivo体内分布の研究）
＜装置および方法＞
動物モデル：この実験プロトコルに用いるマウスは、R. Janvierから入手される、体重２０〜３０ｇ、６週齢のオスのスイスマウスである。
【００９５】
金ナノ粒子の合成：ナノ粒子は、本発明の方法に従って環境に優しく合成され、ＴＥＭ、ＤＬＳおよびＡＦＭによりキャラクタリゼーションされた。体内分布研究を実施するため得に、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）は、マウスに静脈注射された。全てのＡｕＮＰは、遠心分離後に投与され、それらは水溶液中で安定化される。
【００９６】
実験プロトコルの説明：異なる溶液の２００μＬの注射を、静脈経路を開示して実施した。約２４ｇの体重のマウスに対して２００μＬを投与した。
【００９７】
Booteら、2010（非特許文献２０）およびChandaら、2014（非特許文献２１）によって既に記述されたプロトコルにしたがって、以下の溶液を注射した。
−  ＮａＣｌ（６匹のマウス）
−  製品１（ＡｕＮＰ＠ＥＢＨＬ＝Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍの粗製抽出物を用いて得られるＡｕＮＰ）
群Ａ（６匹のマウス）＝７ｍｇ／ｍｌの１回の単一注射
群Ｂ（６匹のマウス）＝２ｍｇ／ｍｌの１回の単一注射
−  製品２（ＡｕＮＰ＠ＥＢＨＡ＿Ａ＝Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａの粗製抽出物を用いて得られるＡｕＮＰ）
群Ａ（６匹のマウス）＝７ｍｇ／ｍｌの１回の単一注射
群Ｂ（６匹のマウス）＝２ｍｇ／ｍｌの１回の単一注射
−  製品３（Ｈｕｂｅｒｔｉａ  ａｍｂａｖｉｌｌａのフラボノイドトータムを用いて得られるＡｕＮＰ＠Ｆ２ＨＡ）
群Ａ（６匹のマウス）＝７ｍｇ／ｍｌの１回の単一注射
群Ｂ（６匹のマウス）＝２ｍｇ／ｍｌの１回の単一注射
すなわち、合計４２匹のマウス。
【００９８】
引き続いて、これらのマウスは、それぞれの製品のそれぞれの濃度に関して３つの群に分離された。
【００９９】
第１の群（製品当たりおよび濃度当たり３匹のマウス、すなわち、合計２７匹のマウス）を６時間後に殺し、第２の群を２４時間後に殺した。
【０１００】
最後に、異なる製品の生体分布を研究するために、異なる組織（肝臓、脳、脾臓、肺および心臓）の試料を採取した。
【０１０１】
＜結果＞
静脈経路を介するＡｕＮＰの注射に続いて、ナノ粒子を見出すために、組織抽出物をＴＥＭにて分析した。
【０１０２】
以下の組織：肺、腎臓および肝臓に、ナノ粒子が蓄積されていることが見出された。製品３を注射されたマウスに相当する結果を、図８〜図１２に例示する。同様の生態分布が、製品１および製品２を用いて得られた（データ不図示）。
【０１０３】
これらの結果は、異なる組織中に見出されるＡｕＮＰの量が、投与された量と比例することを示す。
【図１】
2019505682.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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