(57)【要約】  サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１の決定のために有用なキットが開示される。当該キットは、支持体に固定化された、または支持体に固定化されることが意図された第１の抗体を含む。このキットは、第２の抗体も含む。抗体の一方は、非ヒト哺乳動物ＴＫ１のＣ末端領域由来の第１のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有し、他方の抗体は、ＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなるペプチドに対して、またはＣ末端領域由来の第２のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。【選択図】図２
2019532260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の非ヒト哺乳動物チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）タンパク質のレベルを決定するためのキットであって、
支持体に固定化されたまたは前記支持体に固定化されることが意図された第１の抗体と、
第２の抗体であって、前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方が非ヒト哺乳動物ＴＫ１のＣ末端領域由来の第１のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有しかつ前記第１の抗体および前記第２の抗体の他方がｉ）ＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなるペプチドまたはｉｉ）前記Ｃ末端領域由来の第２のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有し、前記Ｃ末端領域由来の前記第２のアミノ酸配列は前記Ｃ末端領域由来の前記第１のアミノ酸配列とは異なる、第２の抗体と
を含む、キット。
【請求項２】
前記第１の抗体および前記第２の抗体の前記一方が配列番号１、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１の抗体および第２の抗体の前記他方が配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
前記第１の抗体および前記第２の抗体の前記一方が配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有しかつ前記第１の抗体および前記第２の抗体の前記他方が配列番号２、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する、請求項１〜３の何れか１項に記載のキット。
【請求項５】
前記第１の抗体および前記第２の抗体の前記一方が配列番号１および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有しかつ前記第１の抗体および前記第２の抗体の前記他方が配列番号２、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する、請求項１〜３の何れか１項に記載のキット。
【請求項６】
前記第１の抗体および前記第２の抗体の前記一方が配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有しかつ前記第１の抗体および前記第２の抗体の前記他方が配列番号１および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する、請求項１〜３の何れか１項に記載のキット。
【請求項７】
前記キットがサンドイッチアッセイキットである、請求項１〜６の何れか１項に記載のキット。
【請求項８】
前記キットが酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットである、請求項１〜７の何れか１項に記載のキット。
【請求項９】
前記第２の抗体が共有結合されるビオチンまたは共有結合されるストレプトアビジンもしくはアビジンを有する、請求項１〜８の何れか１項に記載のキット。
【請求項１０】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、標識されたストレプトアビジンもしくはアビジンまたはＨＲＰ標識されたビオチンと、
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質および２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）基質からなる群から選択されるＨＲＰ基質と
を更に含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記支持体としてマイクロタイタープレートを更に含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載のキット。
【請求項１２】
前記支持体としてアガロースビーズまたは磁気ビーズを更に含む、請求項１〜１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質がイヌＴＫ１タンパク質、ネコＴＫ１タンパク質およびウマＴＫ１タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜１２の何れか１項に記載のキット。
【請求項１４】
前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質がイヌＴＫ１タンパク質である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定するための方法であって、
前記サンプルを請求項１〜１４の何れか１項に記載のキットの前記第１の抗体および前記第２の抗体と接触させることと、
結合した第２の抗体の量を検出することと
を含む、方法。
【請求項１６】
前記結合された第二の抗体の前記検出された量に基づいて前記サンプル中の前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非ヒト哺乳動物被験体における腫瘍疾患の再発の可能性を推定するための方法であって、
請求項１〜１４の何れか１項に記載のキットまたは請求項１５または１６に記載の方法を使用して前記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することと、
前記身体サンプル中の前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを健康な非ヒト哺乳動物被験体の集団を表す非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルとまたは前記非ヒト哺乳動物被験体において予め決定された非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルと比較することと、
前記比較に基づいて前記非ヒト哺乳動物被験体における前記腫瘍疾患の前記再発の可能性を推定することと
を含む、方法。
【請求項１８】
非ヒト哺乳動物被験体における細胞増殖を決定するための方法であって、
請求項１〜１４の何れか１項に記載のキットまたは請求項１５もしくは１６に記載の方法を使用して前記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することと、
前記身体サンプル中の前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルに基づいて前記細胞増殖を決定することと
を含む、方法。
【請求項１９】
悪性疾患に罹患している非ヒト哺乳動物被験体における増殖プロセス応答を決定するための方法であって、
請求項１〜１４の何れか１項に記載のキットまたは請求項１５もしくは１６に記載の方法を使用して前記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することと、
前記身体サンプル中の前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルに基づいて前記増殖プロセス応答を決定することと
を含む、方法。
【請求項２０】
非ヒト哺乳動物被験体における炎症、感染または腫瘍細胞増殖のレベルを決定するための方法であって、
請求項１〜１４の何れか１項に記載のキットまたは請求項１５もしくは１６に記載の方法を使用して前記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することと、
前記身体サンプル中の前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルに基づいて前記炎症、感染または腫瘍細胞増殖のレベルを決定することと
を含む、方法。
【請求項２１】
非ヒト哺乳動物被験体における悪性疾患の治療効率を評価するための方法であって、
前記悪性疾患の前記治療の開始前または開始に関連して請求項１〜１４の何れか１項に記載のキットまたは請求項１５もしくは１６に記載の方法を使用して前記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することと、
前記悪性疾患の前記治療の間または後に前記請求項１〜１４の何れか１項に記載のキットまたは前記請求項１５もしくは１６に記載の方法を使用して前記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することと、
前記悪性疾患の前記治療の開始前または開始に関連して前記身体サンプル中で決定された前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルと前記悪性疾患の前記治療の間または後に前記身体サンプル中で決定された前記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルとの比較に基づいて前記悪性疾患の前記治療の効率を評価することと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は一般に、ＴＫ１タンパク質レベルの決定に関し、特に、非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定するための抗ＴＫ１抗体の使用を含むキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌは、リンパ腫、白血病および乳腺腫瘍のような様々な新生物疾患に冒されることが多い。リンパ腫は血液腫瘍の最も一般的な形態であり、イヌの全ての癌の５％を占める。年間発生率は１０万匹あたり１３〜４０例と推定されている。イヌのリンパ腫は、疾患の進行に寄与する遺伝的および環境的要因に関して、ヒト非ホジキンリンパ腫に類似している。効果的な化学療法との組み合わせによる早期診断によって、上記の悪性腫瘍を制御できる。甲状腺リンパ腫の予後マーカとして、好銀性核小体形成領域（ＡｇＮＯＲｓ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）およびＫｉ−６７を含む幾つかの増殖マーカが研究されているが、それらの使用は免疫組織化学に限定されている。血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）もまた、イヌリンパ腫のモニタリングマーカとして研究されてきたが、ＬＤＨは悪性疾患以外の病気でもアップレギュレートされ、したがって臨床的価値は限られている（ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０００３】
ネコおよびウマなどの他の非ヒト哺乳動物もまた、様々な新生物疾患に冒される。
【０００４】
腫瘍の進行は細胞増殖に依存し、増殖マーカは早期に腫瘍疾患を検出する上で有用性が高い。チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）は、無制御の細胞増殖の間に血液中に放出されるバイオマーカの１つである。ＴＫ１はデオキシチミジン（ｄＴ）をデオキシチミジンモノホスフェート（ｄＴＭＰ）に変換し、これは最終的には増殖している細胞中のＤＮＡに取り込まれる。ＴＫ１活性は細胞周期と密接に関連しており、Ｓ期にピークに達し、Ｇ２期において急速に低下し、Ｍ期には特異的機構によって分解される。
【０００５】
血清ＴＫ１活性の測定は、ヒトの医学において、リンパ腫および白血病の診断およびモニタリングのための確立されたツールである。血清ＴＫ１活性は、幾つかの酵素アッセイ、例えばＰＲＯＬＩＦＩＧＥＮ（登録商標）などのＴＫ放射性酵素アッセイ（ＴＫ−ＲＩＡ）、またはＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）ＴＫなどのＴＫ化学発光免疫アッセイ（ＴＫ−ＣＬＩＡ）を使用することによって測定され、ここでは１２５Ｉ−ヨードデオキシウリジンまたはアジドチミジン（ＡＺＴ）のようなチミジン基質類似体が、対応するモノホスフェートへとリン酸化される。研究は、ＴＫ−ＲＥＡアッセイおよびＴＫ−ＣＬＩＡアッセイの両方が、イヌの血液腫瘍の予後および治療モニタリングのための貴重な情報を提供することを示した。基質類似体の代わりに天然の基質［３Ｈ］−ｄＴｈｄ（デオキシチミジン）を用いた最近の研究は、このアッセイが、ＴＫ−ＲＥＡおよびＴＫ−ＣＬＩＡアッセイと同等に鋭敏であり、イヌのリンパ腫のモニタリングに使用できることを示した（Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ）。
【０００６】
ヒトＴＫ１タンパク質の異なる領域に対する抗体の開発が、ＴＫ１測定の臨床的有用性を更に拡大した。抗体検出方法に基づく幾つかの臨床研究は、種々の腫瘍疾患を有する患者由来の血清中でＴＫ１タンパク質レベルが増加することを実証した。更に、ＴＫ１タンパク質アッセイは、固形腫瘍の予後および治療モニタリングのためのＴＫ１活性アッセイよりも高感度であることが見出された。ヒト医学における乳癌、血液悪性腫瘍および肺癌の検出について、ＴＫ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＴＫ−ＥＬＩＳＡ）法を開発するための幾つかの試みがなされている（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０００７】
現在、非ヒト哺乳動物腫瘍学研究に利用可能な免疫化学的方法は存在しない。しかしながら、最近の研究は、イヌのＴＫ１・Ｃ末端に対する抗体に基づくイムノアフィニティアッセイを用いて行われている（Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｊａｇａｒｌａｍｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これは、種々の悪性腫瘍を有するイヌ被験体における血清ＴＫ１タンパク質レベルの決定を可能にし、ＴＫ１タンパク質アッセイが、健康なイヌとイヌ固形腫瘍の区別について、ＴＫ１活性アッセイよりも高感度であると結論付けた。Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒ  ２０１０は、血清ＴＫ１の検出のための抗イヌＴＫ１抗体の産生を開示した。当該抗体は、イヌＴＫ１のアミノ酸１９６〜２２３に対応する２８アミノ酸長のペプチドを用いてウサギを免疫感作することによって産生された。
【０００８】
しかしながら、非ヒト哺乳動物被験体においてＴＫ１タンパク質レベルを測定するための、臨床的に許容される技術が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
一般的な目的は、非ヒト哺乳動物においてＴＫ１タンパク質レベルを測定するためのキットおよび方法を提供することである。
【００１０】
この目的および他の目的は、本明細書で定義される実施形態によって満たされる。
【００１１】
この実施形態の１つの態様は、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定するためのキットに関する。このキットは、支持体に固定化された、または支持体に固定化されることが意図された第１の抗体と、第２の抗体とを含む。第１の抗体および第２の抗体の一方は、非ヒト哺乳動物ＴＫ１のＣ末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。第１の抗体および第２の抗体の他方は、ｉ）ＴＫ１の活性部位由来の第１のアミノ酸配列からなるペプチド、またはｉｉ）Ｃ末端領域由来の第２のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。上記Ｃ末端領域由来の第２のアミノ酸配列は、上記Ｃ末端領域由来の第１のアミノ酸配列とは異なる。
【００１２】
当該実施形態の別の態様は、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定するための方法に関する。この方法は、サンプルを、上に定義したキットの第１の抗体および第２の抗体と接触させることを含む。この方法はまた、結合した第２の抗体の量を検出することを含む。
【００１３】
当該実施形態の更なる態様は、非ヒト哺乳動物被験体における腫瘍疾患の再発の可能性を推定するための方法に関する。方法は、上記の方法またはキットを用いて、非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定することを含む。方法はまた、上記身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを、健康な非ヒト哺乳動物被験体集団を表す非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベル、または非ヒト哺乳動物被験体において以前に測定された非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルと比較することを含む。当該方法は更に、上記比較に基づいて、非ヒト哺乳動物被験体における腫瘍疾患の再発の可能性を推定することを含む。
【００１４】
当該実施形態の更に別の態様は、非ヒト哺乳動物被験体における細胞増殖を決定するための方法に関する。この方法は、上記の方法またはキットを用いて、非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定することを含む。当該方法はまた、上記身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルに基づいて細胞増殖を決定することを含む。
【００１５】
当該実施形態の更なる態様は、悪性疾患に罹患している非ヒト哺乳動物被験体での増殖プロセス応答を決定するための方法に関する。この方法は、上記に従う方法またはキットを用いて、非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することを含む。当該方法はまた、身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルに基づいて増殖プロセス応答を決定することを含む。
【００１６】
当該実施形態の更に別の態様は、非ヒト哺乳動物被験体における炎症、感染または腫瘍細胞増殖のレベルを決定するための方法に関する。この方法は、上記に従う方法またはキットを用いて、非ヒト哺乳動物被験体由来の上記身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定することを含む。当該方法はまた、上記身体試料中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルに基づいて、炎症、感染または腫瘍細胞増殖のレベルを決定することを含む。
【００１７】
当該実施形態の更なる態様は、非ヒト哺乳動物被験体における悪性疾患の治療の効率を評価するための方法に関する。この方法は、悪性疾患の治療の開始前または開始に関連して、上記実施形態による方法またはキットを使用して、非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定することを含む。この方法はまた、悪性疾患の治療中または治療後に、実施形態による方法またはキットを使用して、非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定することを含む。この方法は更に、上記悪性疾患の治療の開始前または開始に関連して上記身体サンプル中で決定された非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルと、上記悪性疾患の治療中または治療後に上記身体サンプル中で決定された非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルとの比較に基づいて、上記悪性疾患の治療の効率を評価することを含む。
【００１８】
当該実施形態は、非ヒト哺乳動物の被験体においてＴＫ１タンパク質レベルを決定することを可能にする。当該実施形態のキットおよび方法は、既存のＴＫ１活性アッセイと同様に、実施が容易で、迅速かつ高感度であり、特異的である。当該キットおよび方法は、健康な非ヒト哺乳動物と固形腫瘍に罹患している非ヒト哺乳動物を区別する際に、ＴＫ１活性アッセイよりも遥かに鋭敏である。
【００１９】
当該実施形態は、更なる目的および利点と共に、添付の図面と併せて以下の説明を参照することによって最もよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ヒトＴＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＫＯ＿２５８２；配列番号４）、イヌＴＫ１（本明細書において犬ＴＫ１とも呼ばれる、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＸＭ＿５４０４６１；配列番号３）、ネコＴＫ１（本明細書において猫ＴＫ１とも呼ばれる、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＸＰ＿３９９７２８６．２；配列番号９）およびウマＴＫ１（本明細書では馬ＴＫ１とも呼ばれる、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＸＰ＿１４９１１３１．２；配列番号１７）の推定アミノ酸配列のアミノ酸アラインメントを図示する。ウマＴＫ１において、イヌＴＫ１およびネコＴＫ１タンパク質と同様の全長を有する組換えウマＴＫ１タンパク質を産生するために、保存されたＮ末端ペプチド（ヒト、イヌおよびネコＴＫ１中のＴＫ１中のアミノ酸１〜２７）ＭＳＣＩＮＬＰＴＶＬＰＧＳＰＳＫＴＲＧＱＩＱＶＩＬＧＰ（配列番号１８）をコードするオリゴヌクレオチド配列を付加し、ＧｅｎＢａｎｋ推定ｃＤＮＡを作製した。配列番号１０を参照されたい。イヌＴＫ１の活性部位領域（ＣＴＫ１ｐ−１６１、イヌＴＫ１におけるアミノ酸１６１〜１８３、ＡＹＴＫＲＬＧＳＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ（配列番号７））に対して、イヌＴＫ１のＣ末端領域（ＣＴＫ１ｐ−２１１、イヌＴＫ１のアミノ酸２１１〜２２５、ＶＬＶＰＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧ（配列番号１１）、ＣＴＫ１ｐ−２１５、イヌＴＫ１におけるアミノ酸２１５〜２３０、ＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧＶＲＫＬＦ（配列番号１））に対して、およびネコＴＫ１のＣ末端領域（ＦＴＫ１ｐ−２１３、ネコＴＫ１のアミノ酸２１３〜２２７、ＧＫＰＧＥＡＳＧＡＲＫＬＦＡＰ（配列番号１３））に対して、抗体が産生された。この図はまた、ヒトＴＫ１の活性部位領域（Ａｒ−４、ヒトＴＫ１のアミノ酸１６１〜１８３、ＡＹＴＫＲＬＧＴＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ（配列番号２））に対して産生されたマウスモノクローナル抗ＴＫ１抗体、およびイヌＴＫ１のＣ末端領域（ＰＡｂ−Ａｒｖ１、イヌＴＫ１のアミノ酸２１５〜２３０、ＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧＶＲＫＬＦ（配列番号１））に対するウサギポリクローナル抗体を示す。
【図２】サンドイッチＥＬＩＳＡの模式的提示図である。５つのステップは次の通りである：（１）第１の抗ＴＫ１抗体（捕捉またはコーティング抗体）によるマイクロプレートウェルのコーティング、（２）上記捕捉抗体への血清中ＴＫ１の結合、（３）血清中ＴＫ１へのビオチン化抗ＴＫ１抗体の付着、（４）ストレプトアビジン−ＨＲＰによるビオチンの検出、および（５）３，３−，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色基質の添加によりモニターされる酵素活性。
【図３】異なる５回の実施からの、４５０ｎＭでの吸光度に対する０．６〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度の組み換えイヌＴＫ１による標準曲線を示す。
【図４Ａ】健康なイヌ（●）および血液学的腫瘍を有するイヌ（■）由来の血清中のｌｏｇＳＴＫ１活性レベル（ｐｍｏｌ／分／ｍＬ）を示す。直線は中央値を表す。
【図４Ｂ】血液腫瘍を有するイヌ（ｎ＝３６）からおよび健康なイヌ（ｎ＝３０）からの、ＳＴＫ１活性アッセイ結果の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図４Ｃ】健康なイヌ（●）および血液学的腫瘍を有するイヌ（■）由来の血清中のｌｏｇＳＴＫ１タンパク質レベルを示す。直線は中央値を表す。
【図４Ｄ】健康なイヌのＳＴＫ１タンパク質レベル（ｎｇ／ｍＬ）を、血液学的腫瘍を有するイヌにおけるものと比較したＲＯＣ曲線分析を示す。
【図５Ａ】健康なイヌ（●）および固形腫瘍を有するイヌ（■）由来の血清中のｌｏｇＳＴＫ１活性レベル（ｐｍｏｌ／分／ｍＬ）を示す。直線は中央値を表す。
【図５Ｂ】固形腫瘍を有するイヌ（ｎ＝４０）および健康なイヌ（ｎ＝３０）から得たＳＴＫ１活性アッセイの結果のＲＯＣ曲線を示す。
【図５Ｃ】健康なイヌ（●）および固形腫瘍を有するイヌ（■）由来の血清中のＬｏｇＳＴＫ１タンパク質レベルを示す。直線は中央値を表す。
【図５Ｄ】固形腫瘍を有するイヌにおけるものと比較した、健康なイヌのＳＴＫ１タンパク質レベル（ｎｇ／ｍＬ）についてのＲＯＣ曲線分析を示す。
【図６】イヌの腫瘍の異なる下位群におけるｌｏｇＳＴＫ１分布を示す。（Ａ）健康なイヌ、リンパ腫を有するイヌ、白血病を有するイヌ由来の血清中のＳＴＫ１活性レベル。（Ｂ）健康なイヌ、乳腺腫瘍を有するイヌ、悪性黒色腫を有するイヌ、肥満細胞腫を有するイヌおよび他の腫瘍を有するイヌにおけるＳＴＫ１活性レベル。（Ｃ）健康なイヌ、リンパ腫を有するイヌ、白血病を有するイヌ由来の血清中のＳＴＫ１タンパク質分布。（Ｄ）健康なイヌ、乳腺腫瘍を有するイヌ、悪性黒色腫を有するイヌ、肥満細胞腫を有するイヌおよび他の腫瘍を有するイヌにおけるＳＴＫ１タンパク質分布。
【図７Ａ】リンパ腫を有するイヌの化学療法の際の、イヌ由来の血清中におけるＳＴＫ１活性レベルを示す。
【図７Ｂ】リンパ腫を有するイヌの化学療法の際の、イヌ由来の血清中のＳＴＫ１タンパク質レベルを示す。
【図８】（Ａ）ＣＴＫ１ｐ−２１５抗血清、（Ｂ）ＣＴＫ１ｐ−１６１抗血清、（Ｃ）ＣＴＫ１ｐ−２１１抗血清および（Ｄ）ＦＴＫ１ｐ−２１３抗血清とのイヌ、ネコおよびウマ組換えＴＫ１によるドットブロットイムノアッセイの結果を示す図である。
【図９】異なる抗血清との異なる濃度の（Ａ）イヌ組換えＴＫ１、（Ｂ）ネコ組換えＴＫ１および（Ｃ）ウマ組換えＴＫ１による任意単位（Ａ．Ｕ．）でのドット強度を示す。
【図１０】ＣＴＫ１ｐ−２１５コーティングおよび検出抗体としてＣＴＫ１ｐ−１６１を用いた５つの異なる実験における、０．６〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度の組換えイヌＴＫ１を用いた標準曲線を示す。
【図１１Ａ】健康なイヌ（●）および血液悪性腫瘍を有するイヌ（■）由来の血清中のｌｏｇＳＴＫ１・ＥＬＩＳＡタンパク質レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは中央値を表す。
【図１１Ｂ】血液腫瘍のイヌ（ｎ＝１５）を健康なイヌ（ｎ＝１０）と区別するための、ＳＴＫ１・ＥＬＩＳＡアッセイのＲＯＣ曲線を示す。
【図１１Ｃ】健康なイヌ（●）および固形腫瘍を有するイヌ（■）由来の血清中のｌｏｇＳＴＫ１タンパク質レベルを示す。エラーバーは中央値を表す。
【図１１Ｄ】健康なイヌにおけるＳＴＫ１タンパク質レベル（ｎｇ／ｍＬ）について、固形腫瘍（ｎ＝１０）を有するイヌにおけるものと比較したＲＯＣ曲線分析を示す。
【図１２】ＣＴＫ１ｐ−２１１コーティングおよびＣＴＫ１ｐ−２１５検出抗体を用いた５つの異なる実験からの、４５０ｎＭでの吸光度に対する０．６〜１０ｎｇ／ｍＬ範囲の異なる濃度の組み換えイヌＴＫ１を用いた標準曲線を示す。
【図１３Ａ】健康なイヌ（●）および血液学的腫瘍を有するイヌ（■）由来の血清中のｌｏｇＳＴＫ１タンパク質分布（ｎｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは中央値を表す。
【図１３Ｂ】健康な対象（ｎ＝７）と血液学的腫瘍の対象（ｎ＝１５）を識別するための、ＳＴＫ１・ＥＬＩＳＡアッセイのＲＯＣ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の実施形態は一般に、非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルの決定、特に、非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定するための抗ＴＫ１抗体の使用を含むキットおよび方法に関する。
【００２２】
ヒトＴＫ１の結晶構造は解明されており、Ｎ−末端領域を含む、酵素の大部分は、幾つかの残基を除いてヒト、イヌ、ネコおよびウマにおいて保存されている。図１、ならびにイヌＴＫ１（犬ＴＫ１）を表す配列番号３、ヒトＴＫ１を表す配列番号４、ネコＴＫ１（猫ＴＫ１）を表す配列番号９およびウマＴＫ１（馬ＴＫ１）を表す配列番号１０を参照されたい。例えば、ヒトＴＫ１配列はイヌＴＫ１と８８．５％の類似性を示すが、かなりの配列多様性（９．１％）がＣ末端領域に見出される。
【００２３】
当該実施形態の１つの態様は、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定するためのキットに関する。このキットは、支持体に固定化された、または支持体に固定化されることが意図された第１の抗体と、第２の抗体とを含む。当該実施形態によれば、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方は、非ヒト哺乳動物ＴＫ１のＣ末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方は、ｉ）ＴＫ１の活性部位由来の第１のアミノ酸配列からなるペプチド、またはｉｉ）Ｃ末端領域由来の第２のアミノ酸配列からなるペプチドに対する特異性を有する。Ｃ末端領域由来の第２のアミノ酸配列は、Ｃ末端領域由来の第１のアミノ酸配列とは異なる。
【００２４】
当該キットは、サンプル、好ましくは非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物血清ＴＫ１（ＳＴＫ１）タンパク質のレベルを決定するために特に適している。
【００２５】
Ｃ末端領域由来の第１のアミノ酸配列または第２のアミノ酸配列からなるペプチドは、好ましくは、非ヒト哺乳動物ＴＫ１のアミノ酸位置２００〜末端（イヌではアミノ酸位置２４２、ネコではアミノ酸位置２３７、ウマではアミノ酸位置２３７）の範囲に亘る非ヒト哺乳動物ＴＫ１の部分から選択されるペプチドである。特定の実施形態において、上記ペプチドは、アミノ酸位置２０５、好ましくは２１０、より好ましくは２１１〜アミノ酸位置２４０、好ましくは２３５、より好ましくは２３０の範囲に亘るＴＫ１タンパク質の部分から選択される。
【００２６】
上記ペプチドは、好ましくはＮ量体であり、ここでＮは１０〜２５、好ましくは１０〜２０の整数であり、より好ましくは１５、１６または１７である。
【００２７】
上記ペプチドは好ましくは、非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のＣ末端領域中のＮ個の連続アミノ酸からなる。
【００２８】
担体タンパク質などの、他の分子へのカップリングとして使用するために、少なくとも１つの追加のアミノ酸、例えばシステイン残基を、上記ペプチドのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端に付加してもよい。
【００２９】
一実施形態において、Ｃ末端領域由来の第１のアミノ酸配列または第２のアミノ酸配列からなる上記ペプチドは、イヌＴＫ１（図１参照）のアミノ酸位置２１５〜２３０に対応するアミノ酸配列、即ち、ＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧＶＲＫＬＦ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。付加されたＮ末端システイン残基を有する対応するアミノ酸配列は、ＣＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧＶＲＫＬＦ（配列番号５）である。
【００３０】
別の実施形態において、Ｃ末端領域由来の第１のアミノ酸配列または第２のアミノ酸配列からなるペプチドは、イヌＴＫ１（図１参照）のアミノ酸位置２１１〜２２５に対応するアミノ酸配列、即ち、ＶＬＶＰＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を有する。付加されたＮ末端システイン残基を有する対応するアミノ酸配列は、ＣＶＬＶＰＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧ（配列番号１２）である。
【００３１】
更なる実施形態において、Ｃ末端領域由来の第１のアミノ酸配列または第２のアミノ酸配列からなるペプチドは、ネコＴＫ１（図１参照）のアミノ酸位置２１３〜２２７に対応するアミノ酸配列、即ち、ＧＫＰＧＥＡＳＧＡＲＫＬＦＡＰ（配列番号１３）のアミノ酸配列を有する。付加されたＮ末端システイン残基を有する対応するアミノ酸配列は、ＣＧＫＰＧＥＡＳＧＡＲＫＬＦＡＰ（配列番号１４）である。
【００３２】
ＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなるペプチドは、好ましくは、アミノ酸位置１５０〜アミノ酸位置１９０の範囲に亘るＴＫ１部分から選択されるペプチドである。特定の実施形態において、当該ペプチドは、アミノ酸位置１５５、好ましくは１６０、より好ましくは１６１〜、アミノ酸位置１８５、好ましくは１８３の範囲のＴＫ１部分から選択される。
【００３３】
当該ペプチドは、好ましくはＭ量体であり、ここでＭは１０〜４０、好ましくは２０〜３０の整数、より好ましくは２３または２４である。
【００３４】
当該ペプチドは好ましくは、ＴＫ１タンパク質の活性部位中のＭ個の連続アミノ酸からなる。
【００３５】
ＴＫ１の活性部位を表すこの部分は、図１に示すように、ヒト、イヌ、ネコおよびウマＴＫ１間でなどの、異なる種間で非常に高レベルの相同性を示す。例えば、アミノ酸位置１５０からアミノ酸位置１９０に延びる部分内において、ヒトＴＫ１、イヌＴＫ１およびネコＴＫ１の間には、単一のアミノ酸位置における相違のみが存在する。この領域において、ヒトＴＫ１とウマＴＫ１との間にアミノ酸の相違は存在しない。
【００３６】
従って、当該ペプチドは、ヒトＴＫ１の活性部位由来の、イヌＴＫ１由来の、ネコＴＫ１由来の、ウマＴＫ１由来のまたは他の非ヒト哺乳動物ＴＫ１由来のアミノ酸配列からなり得るであろう。本明細書に示される実験データは、ヒトＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体が、イヌＴＫ１にも特異的に結合することを示す。
【００３７】
担体タンパク質などの、他の分子へのカップリングとして使用するために、少なくとも１つの追加のアミノ酸、例えばシステイン残基を、ペプチドのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端に付加してもよい。
【００３８】
一実施形態において、ＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなるペプチドは、ヒトＴＫ１（およびウマＴＫ１）のアミノ酸位置１６１〜１８３に対応するアミノ酸配列（図１参照）、即ち、ＡＹＴＫＲＬＧＴＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する。Ｎ末端システイン残基が付加された対応するアミノ酸配列は、ＣＡＹＴＫＲＬＧＴＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ（配列番号６）である。
【００３９】
別の実施形態において、ＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなるペプチドは、イヌＴＫ１のアミノ酸位置１６１〜１８３のアミノ酸に対応するアミノ酸配列（図１参照）、即ち、ＡＹＴＫＲＬＧＳＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ（配列番号７）のアミノ酸配列を有する。Ｎ末端システイン残基を付加された対応するアミノ酸配列は、ＣＡＹＴＫＲＬＧＳＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ（配列番号８）である。
【００４０】
更なる実施形態において、ＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなるペプチドは、ネコＴＫ１のアミノ酸位置１６１〜１８３に対応するアミノ酸配列（図１参照）、即ち、ＡＹＴＫＲＬＧＡＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を有する。Ｎ末端システイン残基が付加された対応するアミノ酸配列は、ＣＡＹＴＫＲＬＧＡＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ（配列番号１６）である。
【００４１】
一実施形態において、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを測定するための上記キットは、支持体に固定化された、または支持体に固定化されることが意図された第１の抗体と、第２の抗体とを含む。この実施形態において、上記第１および第２の抗体の一方は、ＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有し、上記第１の抗体および第２の抗体の他方は、ＴＫ１のＣ末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。
【００４２】
特定の実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方は、配列番号１１および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する特異性を有し、また上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方は、配列番号２、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。従って、本実施形態に従う上記第１および第２の抗体の具体的な組み合わせは、配列番号１１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号２からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号６からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号７からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号８からなるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１２からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号２からなるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１２からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号６からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１２からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号７からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１２からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異的な抗体および配列番号８からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異的な抗体を含む。
【００４３】
好ましい実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方はＣＴＫ１ｐ−２１１抗体であり、上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方はＣＴＫ１ｐ−１６１抗体である。別の好ましい実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方はＣＴＫ１ｐ−２１１抗体であり、第１の抗体および第２の抗体の他方はＡｒｖ４抗体である。
【００４４】
別の特定の実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方は、配列番号１および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有し、また得上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方は、配列番号２、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。従って、本実施形態に従う上記第１および第２の抗体の具体的な組み合わせは、配列番号１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号２からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号６からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号７からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号８からなるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号２からなるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号６からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号５からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号７からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号５からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異的な抗体および配列番号８からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異的な抗体を含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方はＣＴＫ１ｐ−２１５抗体であり、上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方はＣＴＫ１ｐ−１６１抗体である。別の好ましい実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方はＣＴＫ１ｐ−２１５抗体であり、上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方はＡｒｖ４抗体である。更に好ましい実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方はＰＡｂ−Ａｒｖ１抗体であり、上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方はＣＴＫ１ｐ−１６１抗体である。更に別の好ましい実施形態では、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方はＰＡｂ−Ａｒｖ１抗体であり、上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方はＡｒｖ４抗体である。
【００４６】
一実施形態において、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを測定するためのキットは、支持体に固定化された、または支持体に固定化されることが意図された第１の抗体と、第２の抗体とを含む。この実施形態において、上記第１および上記第２の抗体の一方は、ＴＫ１のＣ末端領域由来の第１のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有し、また上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方は、ＴＫ１のＣ末端領域由来の第２のアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。
【００４７】
上記第１および上記第２のアミノ酸配列は、ＴＫ１のＣ末端領域とは異なるアミノ酸配列である。これらの２つのアミノ酸配列は、しかしながら、例えば、ＣＴＫ１ｐ−２１１のアミノ酸配列をＣＴＫ１ｐ−２１５のアミノ酸配列と比較したときに、図１に示すように部分的に重なり得る。
【００４８】
例えば、上記第１のアミノ酸配列がＮ１アミノ酸からなり、上記第２のアミノ酸配列がＮ２アミノ酸からなる場合、これらの２つのアミノ酸配列はＰ個のアミノ酸で重複し得るであろう。Ｐは０以上であるが、Ｎ１とＮ２の最大値よりも小さく、即ち、０≦Ｐ＜ｍａｘ（Ｎ１、Ｎ２）である。
【００４９】
ＴＫ１のＣ末端領域で、少なくとも部分的に重複し得る異なるエピトープに対する特異性を有する２つの抗体が、非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定するために使用され得ることは非常に驚くべきことであった。この驚くべき知見について考えられる理由は、ＴＫ１が多価であり、組換えＴＫ１および血清ＴＫ１の両方に幾つかの抗体結合部位を有することであるかしれない。しかし、組換えＴＫ１複合体および血清ＴＫ１複合体に複数の潜在的な抗体結合部位があるにもかかわらず、交差反応性を低下させ特異性を高めるために、異なるエピトープに対して特異性を有する２つの異なる抗体を用いることが一般的に好ましい。
【００５０】
特定の実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方は、配列番号１１および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有し、かつ上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方は、配列番号１および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する。従って、本実施形態に従う上記第１および第２の抗体の具体的な組み合わせは、配列番号１１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号５からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１２からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号１からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体、配列番号１２からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体および配列番号５からなるアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異性を有する抗体を含む。
【００５１】
好ましい実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方はＣＴＫ１ｐ−２１１抗体であり、上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方はＣＴＫ１ｐ−２１５抗体である。別の好ましい実施形態において、上記第１の抗体および上記第２の抗体の一方はＣＴＫ１ｐ−２１１抗体であり、上記第１の抗体および上記第２の抗体の他方はＰＡｂ−Ａｒｖ１抗体である。
【００５２】
上記抗体（複数）は、ポリクローナル抗体（複数）、モノクローナル抗体（複数）であってよく、或いはそれらの一方がポリクローナル抗体で、他方がモノクローナル抗体であってもよい。
【００５３】
特定の実施形態において、非ヒト哺乳動物ＴＫ１のＣ末端領域由来のアミノ酸配列からなる上記ペプチドに対して特異性を有する上記抗体はポリクローナル抗体であり、ＴＫ１の活性部位由来のアミノ酸配列からなる上記ペプチドに対して特異性を有する上記抗体はモノクローナル抗体である。
【００５４】
上記抗体の一方または両方は、関連ペプチドに対する特異性を有する抗体断片であってよい。そのような場合、当該断片は、一本鎖抗体、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ｄｉ−ｓｃＦｖ断片およびＣＤＲ領域を含む。
【００５５】
抗体の特異性は、親和性および／またはアビディティに基づいて決定できる。抗原と抗体との解離の平衡定数（Ｋｄ）で表される親和性は、抗原決定基と抗体上の抗原結合部位の間の結合強度の尺度である。Ｋｄの値が小さいほど、抗原決定基と抗体の間の結合強度は強くなる。或いは、親和性は、１／Ｋｄである、親和性定数（Ｋａ）として表すこともできる。当業者に明らかなように、親和性は、目的の特異的抗原に応じて、それ自体公知の方法で決定できる。
【００５６】
アビディティは、抗体と適切な抗原の間の結合強度の尺度である。アビディティは、抗原決定基と抗体上のその抗原結合部位の間の親和性、およびモノクローナル抗体上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。
【００５７】
典型的には、抗体は、１０−５〜１０−１２モル／リットル（Ｍ）以下、好ましくは１０−７〜１０−１２Ｍ以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）、即ち、１０５〜１０１２Ｍ−１以上、好ましくは１０７〜１０１２Ｍ−１以上、より好ましくは１０８〜１０１２Ｍ−１の会合定数（Ｋａ）で、それらの抗原に結合するであろう。
【００５８】
一般に、１０−４Ｍより大きい任意のＫｄ値（または１０４Ｍ−１より低いＫａ値）は、非特異的結合を示すと一般に考えられる。
【００５９】
好ましくは、当該実施形態の抗体または断片は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満の親和性で、血清型および／または組換え型の非ヒト哺乳動物ＴＫ１に結合する。
【００６０】
特定の実施形態において、上記キットはサンドイッチアッセイキットである。これは、当該キットが、非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質の異なるエピトープに結合する抗体（複数）を使用して、上記第１の抗体および上記第２の抗体の両方が同じ非ヒト哺乳動物ＴＫ１分子または複合体に同時に結合できるようにすることを意味する。
【００６１】
特定の実施形態において、当該キットは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットであり、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡである。
【００６２】
サンドイッチＥＬＩＳＡは、上記第１の抗体が所謂捕捉抗体として結合される、固体支持体などの、支持体の表面を調製することによって、試料中の細胞および／または血清ＴＫ１タンパク質を検出するために使用できる。好ましい実施形態では、既知量の上記第１の抗体が支持体の表面に結合される。表面上の任意の非特異的結合部位は、任意ではあるが、好ましくはブロックされる。サンプルを次いで表面に適用し、その中に存在する任意の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質が、固定化された上記第１の抗体によって捕捉されるようにする。未結合の物質は好ましくは、１回または複数回の洗浄ステップによって除去される。典型的には検出抗体と称される第２の抗体を次いで添加し、上記第１の抗体によって捕捉された任意の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質に結合させる。
【００６３】
結合した上記第２の抗体の量が次いで、直接的または間接的な検出方法によって決定される。例えば、標識または酵素は、上記第２の抗体に直接的に、またはビオチン−ストレプトアビジンもしくはビオチン−アビジン結合などのリンクを介して間接的に結合されてよい。或いは、標識されまたは酵素に連結され、上記第２の抗体に特異的に結合する二次抗体を使用することも可能である。
【００６４】
従って、一実施形態において、上記第２の抗体は共有結合されるビオチンを有する。或いは、上記第２の抗体は、共有結合されるストレプトアビジンまたはアビジンを有する。
【００６５】
当該キットはまた、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン、またはＨＲＰ標識アビジンも含む。或いは、当該キットはまた、ＨＲＰ標識ビオチンも含む。キットはまた、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質または２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）基質などのＨＲＰ基質も含む。このような場合、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルは、検出可能な有色生成物へのＨＲＰによる発色基質の変換を検出する分光光度法によって決定できる。
【００６６】
一実施形態において、当該キットはまた、上記第１の抗体が固定化されるかまたは固定化されることが意図される支持体としての、マイクロタイタープレート（ＭＣＰ）を含む。図２は、一実施形態による、上記第１の抗体および上記第２の抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡの概念の概略図である。
【００６７】
当該キットは、必ずしもＥＬＩＳＡキットである必要はない。別の実施形態において、当該キットはアフィニティークロマトグラフィーを使用し、ここで上記第１の抗体が、カラム中のゲルマトリックスまたはビーズなどの、固定相に結合される。例えば、上記ゲルマトリックスまたはビーズは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）などの、アガロースでできていてよい。
【００６８】
そのような場合、サンプル中に存在する非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質は、固定化された上記第１の抗体への結合を介してカラム中に捕捉される。洗浄後、結合した非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質を溶出させ、上記第２の抗体を用いて検出できる。例えば、溶出された非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質の量は、ウエスタンブロッティングを用いて、および直接的または間接的な検出法を用いるＴＫ１検出のための上記第２の抗体を用いて決定できる。
【００６９】
或いは、上記支持体は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）磁気ビーズなどの、磁気ビーズであってもよいであろう。
【００７０】
当該実施形態に従って決定される非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞性および／または血清のＴＫ１タンパク質、好ましくは非ヒト哺乳動物血清ＴＫ１（ＳＴＫ１）タンパク質または分子であってよい。
【００７１】
一実施形態において、上記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質は、イヌＴＫ１タンパク質、ネコＴＫ１タンパク質およびウマＴＫ１タンパク質からなる群から選択される。従って、これらの実施形態において、ＴＫ１タンパク質は、イヌ、ネコまたはウマ由来であり得る。特定の実施形態において、上記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質はイヌＴＫ１タンパク質である。
【００７２】
本実施形態のキットは、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定する方法において使用できる。
【００７３】
当該実施形態の別の態様は、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質レベルを決定するための方法に関する。この方法は、サンプルを、上記実施形態によるキットの第１の抗体および第２の抗体と接触させることを含む。当該方法はまた、結合した第２の抗体の量を検出することを含む。
【００７４】
上記サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルが次いで、結合した上記第２の抗体の検出量に基づいて決定される。
【００７５】
結合した抗体の量を検出するための任意の先行技術を、本方法において使用できる。例えば、検出は直接的または間接的であってよく、かつ蛍光または発色信号を生成してよい。直接的な検出は典型的には、標識に結合される抗体の使用を含む。間接的な検出は、抗体の宿主種に対して生成された標識二次抗体を利用する。
【００７６】
エピトープに対する抗体の結合を視覚化するために一般に使用される標識は、蛍光発色団、および可溶性基質を発色性最終産物に変換する酵素を含む。
【００７７】
上記サンプルは好ましくは身体サンプルであり、より好ましくは、細胞サンプル、組織サンプル、血液サンプル、血清サンプル、脳脊髄液サンプル、胸膜液サンプル、滑液サンプルおよび腹腔液からなる群から選択される。好ましい実施形態において、上記身体サンプルは体液サンプルであり、好ましくは血液サンプル、血清サンプル、脳脊髄液サンプル、胸膜液サンプル、滑液サンプルおよび腹腔液サンプルからなる群から選択される。特定の実施形態において、上記身体（体液）サンプルは、血液サンプルまたは血清サンプルである。
【００７８】
従って、当該実施態様の抗体は、サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベル、即ち量を決定するために使用できる。当該実施形態の抗体は、その種々の形態、例えば二量体、四量体、およびオリゴマーの形態の非ヒト哺乳動物細胞性もしくは血清のＴＫ１に結合でき（潜在的には更なるタンパク質、補因子または分子への結合を含み）、それによって上記ＴＫ１レベルの決定を可能にすると考えられる。従って、非ヒト哺乳動物細胞および／または血清ＴＫ１タンパク質は、それによって、その様々な形態での非ヒト哺乳動物細胞および／または血清ＴＫ１を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、当該方法は、身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＳＴＫ１タンパク質レベルを決定するための方法である。
【００８０】
別の実施形態において、当該方法は、身体サンプル中の非ヒト哺乳動物細胞ＴＫ１タンパク質レベルを決定するための方法である。
【００８１】
更なる実施形態において、当該方法は、身体サンプル中の非ヒト哺乳動物細胞ＴＫ１タンパク質および非ヒト哺乳類ＳＴＫ１タンパク質のレベルを決定するための方法である。
【００８２】
当該実施形態の更なる態様は、非ヒト哺乳動物被験体、例えばイヌ、ネコまたはウマにおける腫瘍疾患の再発の可能性を推定するための方法に関する。当該方法は、上記実施形態による方法またはキットを使用して、非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することを含む。上記身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを次いで、健康な非ヒト哺乳動物被験体の集団を表す非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベル、または非ヒト哺乳動物被験体において予め測定された非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルと比較する。当該方法は更に、上記比較に基づいて、上記非ヒト哺乳動物被験体における腫瘍疾患の再発の可能性を推定することを含む。
【００８３】
健康な非ヒト哺乳動物の集団に関連したレベルよりも高い、決定されたレベルは、当該非ヒト哺乳動物被験体における腫瘍疾患の再発の増大した可能性を示す。同様に、以前の治療の後の上記非ヒト哺乳動物被験体に関連したレベルよりも高い、決定されたレベルは、上記非ヒト哺乳動物被験体における腫瘍疾患の再発の増大した可能性を示す。
【００８４】
当該実施形態の更に別の態様は、非ヒト哺乳動物被験体における細胞増殖を決定するための方法に関する。当該方法は、上記実施形態による方法またはキットを使用して、非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することを含む。当該方法はまた、上記身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルに基づいて、上記細胞増殖を決定することを含む。
【００８５】
特定の実施形態では、正常細胞または腫瘍細胞の増殖レベルを決定し、かつ非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質の決定されたレベルと比較して、上記非ヒト哺乳動物被験体が正常なもしくはベースラインの細胞増殖、または上昇した細胞増殖を有するかどうかを決定する。
【００８６】
本方法は、非ヒト哺乳動物被験体に適用される様々な治療法のモニタリングにおけるツールとして使用できる。例えば、この方法は、非ヒト哺乳動物被験体における抗増殖療法または抗腫瘍療法をモニターするために使用できる。そのような場合、当該方法は、選択された抗増殖療法または抗腫瘍療法が、上記非ヒト哺乳動物被験体における細胞増殖を減少させることにおいて所望の効果を有するかどうかを検証するために使用できる。この療法が所望の効果を有さない場合、即ち細胞増殖の有意な減少が検出されない場合には、別のまたは改変された抗増殖療法または抗腫瘍療法を、上記非ヒト哺乳動物被験体に適用できる。
【００８７】
当該実施形態の更なる態様は、悪性疾患に罹患している非ヒト哺乳動物被験体における増殖プロセス応答を決定するための方法に関する。当該方法は、上記実施形態による方法またはキットを使用して、上記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することを含む。当該方法はまた、上記身体サンプル中の上記非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルに基づいて、増殖プロセス応答を決定することを含む。そのような増殖プロセス応答の一例は、免疫反応または免疫反応応答であり得るであろう。
【００８８】
一実施形態では、増殖プロセス応答のための少なくとも１つの他のバイオマーカもまた、上記決定において使用されてよい。
【００８９】
当該実施形態の更に別の態様は、非ヒト哺乳動物被験体における炎症、感染または腫瘍細胞増殖のレベルを決定するための方法に関する。当該方法は、上記実施形態による方法またはキットを使用して、上記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することを含む。当該方法はまた、上記身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルに基づいて、炎症、感染または腫瘍細胞増殖のレベルを決定することを含む。一実施形態では、炎症、感染症または腫瘍細胞の増殖のための少なくとも１つの他のバイオマーカもまた、上記決定において使用されてよい。
【００９０】
当該実施形態の更なる態様は、非ヒト哺乳動物被験体における悪性疾患の治療効率を評価するための方法に関する。当該方法は、上記悪性疾患の治療の開始前または開始に関連して、上記実施形態による方法またはキットを使用して、上記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することを含む。当該方法はまた、上記悪性疾患の治療中または治療後に、上記実施形態による方法またはキットを使用して、上記非ヒト哺乳動物被験体由来の身体サンプル中の非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルを決定することを含む。当該方法は更に、上記悪性疾患の治療の開始前または開始に関連して上記身体サンプル中において決定された非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルと、悪性疾患の治療中または治療後に上記身体サンプル中において決定された非ヒト哺乳動物ＴＫ１タンパク質のレベルとの比較に基づいて、上記悪性疾患の治療の効率を評価することを含む。
【００９１】
上記実施形態の方法およびキットは、例えばイヌ、ネコまたはウマにおける悪性疾患の治療の効率を評価するまたは決定するために使用できる。従って、治療中または治療後に決定されたＴＫ１タンパク質レベルを、治療開始前に、または治療開始に関連して予め測定された対応するＴＫ１タンパク質レベルと比較することにより、選択された治療が非ヒト哺乳動物におけるＴＫ１タンパク質レベルを低下させる点において何らかの医療効果を有するかどうかを決定できる。従って、治療された非ヒト哺乳動物におけるＴＫ１タンパク質レベルの低下は、悪性疾患に関して効果を有する治療、即ち効率的な治療と相関すると決定される。しかしながら、治療された非ヒト哺乳動物においてＴＫ１タンパク質レベルの有意な減少が検出されなければ、その特定の治療は効率的ではなく、上記悪性疾患に関して所望の効果を有さない。
【００９２】
上記腫瘍は、好ましくは、リンパ腫または白血病などの血液腫瘍、または乳房腫瘍、組織球肉腫、肥満細胞腫、黒色腫、血管肉腫または腺癌などの固形腫瘍である。
【００９３】
Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒ  ２０１０は、イヌＴＫ１のアミノ酸１９６〜２２３に対応する２８アミノ酸長のペプチドでウサギを免疫感作することにより産生された、抗イヌＴＫ１抗体の製造を開示した。しかしながら、この抗イヌＴＫ１抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイで使用したときに低い性能を示し、高いバックグラウンドを有した。長い（２８アミノ酸）ペプチドに対するポリクローナル抗体の産生は、バッチ間での大きなバラツキを示した。これは、本実施形態および本明細書に提示される実験データとは明らかに対照的である。本実施形態の抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて高い特異性で首尾よく使用でき、健康な被験体と血液学的または固形腫瘍に罹患している被験体を識別できる。
【００９４】
実施例
実施例１
血液腫瘍および固形腫瘍を有するイヌにおける血清ＴＫ１（ＳＴＫ１）タンパク質レベルの決定のための新しいＴＫ１−ＥＬＩＳＡを開発した。健康なイヌ、白血病およびリンパ腫を有するイヌ、ならびに固形腫瘍を有するイヌ由来の血清中で、ＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質レベルの両方を測定した。更に、これらの両方のＴＫ１アッセイのモニタリング効率を試験するために、リンパ腫を有する６匹のイヌ由来の血清サンプルを治療中に追跡した。
【００９５】
材料および方法
血清サンプル
健康なイヌ、血液学的腫瘍を有するイヌおよび固形腫瘍を有するイヌ由来の血清を、スウェーデンの農業科学大学（ウプサラ、スウェーデン）の大学動物病院から集め、分析まで−２０℃で保存した。このプロジェクトは、スウェーデン動物倫理委員会の承認を受けた。この研究は、健康なイヌ（ｎ＝３０）、血液腫瘍を有するイヌ（ｎ＝３６：リンパ腫、ｎ＝３１、白血病ｎ＝５）および固形腫瘍を有するイヌ（ｎ＝４０）由来のサンプルを含んだ。平均年齢および中央年齢は、健康群で６歳（３〜１０歳に及ぶ）、血液腫瘍で８．５〜８歳（３〜１３歳に及ぶ）、固形腫瘍を有するイヌで９〜８歳（３〜１４歳に及ぶ）であった。
【００９６】
腫瘍診断の手順は以前に記載された通りであった（ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。この研究には合計３５匹の品種が含められた。含められた最も一般的な品種は、ラブラドールレトリーバー（１３／１０５）、ゴールデンレトリーバー（１２／１０５）、ロットワイラー（１１／１０５）、混血品種（１１／１０５）、リッセンシュナウザー（１１／１０５）、ドイツシェパード（７／１０６）、フラットコートレトリーバー（５／１０５）、ノバススコシアレトリーバーおよびボクサー（それぞれ３／１０５）、続いてノーリッチテリア、フォックステリア、ブルテリア、ベルンマウンテンドッグ、ローディアン・リッジバック、イングリッシュ・スプリンガー・スパニエル、および混血品種（それぞれ２／１０５）、クランバー・スパニエル、スコッチテリア、ドーベルマン、ホバワート、ノーリッチテリア、ウエストハイランドテリア、シェットランド・シープ・ドッグ、スウェーデン・エルク・ハウンド、フィールド・スパニエル、レオン・バーガー、ブローダー・クーリー、グレイハウンド、コッカースパニエル、フレンチブルドッグ、ワイマラナー、パグおよびオーストラリアシェパード（１／１０５）であった。
【００９７】
ＴＫ１抗体
ポリクローナル抗体を、イヌＴＫ１のＣ末端領域中のペプチドに対し製造した。１６量体の抗体を、Ｎ末端にシステインを付加した１６アミノ酸の合成ペプチド（アミノ酸２１５〜２３０、ＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧＶＲＫＬＦ、配列番号１；ＰＡｂ−Ａｒｖ１）（図１）を用いて産生した。この１６量体のペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合し、これをウサギ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）の免疫感作のための抗原として、フロイントの完全アジュバントと混合した。抗血清を、第３回および第４回の免疫感作の後に集め、以前に記載されたように、ペプチド結合セファロース４Ｂカラム上で精製した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。２４量体の抗体を、ヒトＴＫ１の活性部位中の長円形のループ（ｌｏｎｇ  ｌａｓｓｏ  ｓｈａｐｅｄ  ｌｏｏｐ）（アミノ酸１６１〜１８３、ＡＹＴＫＲＬＧＴＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ、配列番号２；Ａｒ−４）に対して、Ｎ末端にシステインを付加して、以前に記載されたように（Ｇａｓｐａｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）製造した。２４量体ペプチドもまたＫＬＨに結合し、マウスを免疫感作し、モノクローナル抗体を先に記載したように調製した（Ｇａｓｐａｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ａｒ−４抗体は、ＡｒｏＣｅｌｌ・ＡＢ（ウプサラ、スウェーデン）により提供された。
【００９８】
Ａｒ−４のビオチン化
Ａｒ−４抗体を、製造業者の指示に従ってＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチン抗体標識化キット（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用してビオチン化した。このビオチン化Ａｒ−４抗体を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いるウエスタンブロッティングにより分析した。
【００９９】
血清ＴＫ１活性アッセイ
血清サンプル中のＴＫ１活性を、以前に記載されたように（Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ；Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、最適化された［３Ｈ］−ｄＴｈｄリン酸化アッセイを用いて決定した。簡単に言えば、１０μＬの血清を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのＡＴＰ、および５μＭの［３Ｈ］−デオキシチミジンを含有する反応混合物と３７℃で１時間インキュベートし、ＤＥ−８１濾紙ディスクに塗布した。この濾紙を次いで１ｍＭのギ酸アンモニウムで各５分ずつ２回洗浄し、結合した生成物を０．１ＭのＨＣｌおよび０．２ＭのＫＣｌ中で４５分間溶出させた。放射能を、以前に記載されたように（Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ）β−シンチレーション計数により決定した。ＴＫ１活性をｐｍｏｌ／分／ｍＬとして表した。
【０１００】
イヌ血清中のＴＫ１を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡの開発
Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ（デンマーク）タイプのＥＬＩＳＡプレートを、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１００μＬのＰＡｂ−Ａｒｖ１抗ＴＫ１ポリクローナル抗体（４μｇ／ｍＬ）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、Ｔｅｃａｎハイドロフレックスマイクロプレートウォッシャーを用い、洗浄緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎおよび１％のＢＳＡ１）で４回洗浄した。その後、全ウェルを、室温で１時間、ＴＢＳＴで希釈した５％脱脂粉乳でブロックした。５０μＬのイヌ血清サンプルを５０μＬの血清希釈緩衝液（ＡｒｏＣｅｌｌ  ＡＢ、ウプサラ）で希釈し、室温で１時間プレインキュベートした。ウェルを再度洗浄し、プレインキュベートした血清サンプルを添加した。次いでプレートを、ロッキングプラットホーム上で室温にて２時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ビオチン化Ａｒ−４抗体（洗浄緩衝液中４μｇ／ｍＬ）を添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを上記のように洗浄し、洗浄緩衝液中で１：３２，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加し、１時間インキュベートした。最終洗浄後に、ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、１５分間発色させ、次いで２ＮのＨ２ＳＯ４でクエンチした。このプレートを、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ・Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｅｒｆ、ドイツ）において４５０ｎＭで読み取った。
【０１０１】
イヌＴＫ１ＥＬＩＳＡの検証
イヌ組換えＴＫ１を以前に記載されたように精製し（Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ｂ）、標準曲線を、異なる濃度の組換えイヌＴＫ１（サンプル希釈緩衝液中で希釈した０．６〜１０ｎｇ／ｍＬ）で確立した。この標準曲線を使用することにより、異なる血清サンプルの平均吸光度に基づいて、血清サンプル中のＴＫ１濃度を算出した。検出限界を、ゼロ校正物質の値とは有意に異なる値を与える最小検体濃度として推定した。アッセイ間変動もまた、２つの異なる実験において二重に独立して試験された全ての血清サンプルの平均およびＳＤから決定した。
【０１０２】
統計解析
健康体、血液学的腫瘍および固形腫瘍中のＴＫ１活性およびＴＫ１タンパク質の分布を、Ｄ’ＡｇｏｓｔｉｎｏおよびＰｅａｒｓｏｎオムニバス正規性検定を用いて正規性について試験した。健康なイヌ、ならびに血液学的腫瘍および固形腫瘍を有するイヌにおけるＳＴＫ１活性およびタンパク質レベルは、非ガウス分布を示した。スペルマン相関係数（ｒｓ）を用いて、ＴＫ１活性とＴＫ１タンパク質レベルの間の相関を決定した。マンホイットニーのｔ検定を用いて、群間の差を評価した。感度および特異性分析およびアッセイの比較のために、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を構築した。統計解析を、Ｇｒａｐｈ・Ｐａｄ・Ｐｒｉｓｍ５．０（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。有意水準をＰ＜０．０５に設定した。
【０１０３】
結果
ＥＬＩＳＡ手順の説明
ＥＬＩＳＡの原理は、図２に示したサンドイッチ免疫酵素システムに基づいている。最初のステップは、イヌＴＫ１のＣ末端領域中のペプチドに対して産生された精製ポリクローナル抗イヌＴＫ１特異的抗体での、マイクロタイタープレートのコーティングである（ＰＡｂ−Ａｒｖ１、図１）。ＴＫ１のこの部分は、血液中で形成されるＴＫ１タンパク質複合体の露出した領域である。粉乳（５％）でウェルをブロッキングした後、健康なイヌおよび腫瘍イヌ由来のプレインキュベートした血清サンプルを、プレート上の抗体に結合させた。特異的に結合されないタンパク質を、洗浄手順によって除去する。ＴＫ１の高度に保存され且つ露出された活性部位領域に対して作製された第２の抗体Ａｒ−４を、ビオチン化し、ウェルに結合されたＴＫ１と反応させた。発色基質（ＴＭＢ）の添加によって視覚化される、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体による抗原−抗体結合複合体の検出。呈色反応の強度は、血清サンプルに存在するＴＫ１の量に比例する。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡの検出限界および精度
イヌ組換えＴＫ１を、ＴＫ１−ＥＬＩＳＡの用量応答曲線を生成するための校正物質として使用した。５つの異なる実験からの典型的な検量線を図３に示す。全ての非ゼロ校正点におけるアッセイ間の変動ＣＶｓは≦１０％であった。アッセイの検出限界（ＬＯＤ）は０．４６ｎｇ／ｍＬであり、ラン間の不正確さ（ＣＶ）は０．６３ｎｇ／ｍＬまでの濃度において＜２０％であった。血清サンプルの場合、アッセイ間変動は５〜１５％の範囲であり、アッセイ内変動は５％であった。健康なイヌ、血液悪性腫瘍を有するイヌおよび固形腫瘍を有するイヌ由来の、血清ＴＫ１活性およびＴＫ１タンパク質レベルの中央値を以下の表１に要約する。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
健康なイヌおよび血液腫瘍を有するイヌにおけるＳＴＫ１活性レベル
健康なイヌ群において、ＳＴＫ１活性は０．７〜１．４ｐｍｏｌ／分／ｍＬ（表１）の範囲であり、中央値は１．０２ｐｍｏｌ／分／ｍＬであった。血液腫瘍を有するイヌ由来の血清中のＳＴＫ１活性レベルは、０．５〜５９ｐｍｏｌ／分／ｍＬの範囲であった（表１）。健康なイヌおよび血液腫瘍を有するイヌで、ＳＴＫ１活性レベルにおいて雄および雌の間で有意差は見られなかった。Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いた統計解析は、ＳＴＫ１活性が、健康なイヌと比較して血液腫瘍群で有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、図４Ａ）ことを示した。ＳＴＫ１活性アッセイ結果のＲＯＣ曲線分析は、０．８３の曲線下面積（ＡＵＣ）（Ｐ＜０．０００１，９５％ＣＩ、０．７２〜０．９４）を示した（図４Ｂ）。１．３５ｐｍｏｌ／分／ｍＬのカットオフ値で、感度は７５％（９５％ＣＩ、０．５７８〜０．８７８）であり、特異性は９６％（９５％ＣＩ、０．８２〜０．９９）であった。
【０１０７】
健康なイヌおよび血液悪性腫瘍を有するイヌにおけるＴＫ１・ＥＬＩＳＡ測定
臨床サンプル中のＴＫ１タンパク質レベルを、異なる濃度の組換えイヌＴＫ１を標準として使用することにより決定した。健康なイヌでは、ＳＴＫ１タンパク質レベルは０．４６ｎｇ／ｍＬ未満であり、３０個の血清のうちの１つは０．４７ｎｇ／ｍＬのタンパク質値を有した。３０頭の健康なイヌに基づく正常な基準の推定上限は、０．４６ｎｇ／ｍＬであった。リンパ腫または白血病のイヌ由来の血清は一般に、＜０．４６〜４．４ｎｇ／ｍＬの範囲の、より高いＳＴＫ１タンパク質レベルを有した。健康なイヌと血液学的腫瘍のイヌの間でＳＴＫ１タンパク質レベルの中央値に有意差が見られた（Ｐ＜０．０００１、図４Ｃ）。ＲＯＣ曲線分析は、０．９４のＡＵＣを示した（Ｐ＜０．０００１、９５％ＣＩ、０．８９〜０．９９）。０．４６ｎｇ／ｍＬのカットオフ値を用いて、真陽性率は７８％（９５％ＣＩ、０．６０〜０．８９８）であり、偽陽性率は４％（９５％ＣＩ、０．８２〜０．９９）であった（図４Ｄ）。
【０１０８】
固形腫瘍を有するイヌ由来の血清中のＳＴＫ１の活性レベルおよびタンパク質レベル
固形腫瘍を有するイヌ由来の血清サンプルの大部分は、カットオフ値未満のＳＴＫ１活性を有した。ＳＴＫ１活性レベルは０．５〜２．５ｐｍｏｌ／分／ｍＬの範囲であった（中央値＝１．０２）。固形腫瘍群と健康群の間に有意差はなかった（Ｐ＝０．１９３）（図５Ａ）。ＲＯＣ曲線分析は、０．５６のＡＵＣを示した（Ｐ＝０．４３、９５％ＣＩ、０．４１〜０．６９）。１．３５ｐｍｏｌ／分／ｍＬのカットオフ値を用いて、真陽性率は２７％（９５％ＣＩ、０．１４〜０．４３）であり、偽陽性率は４％（９５％ＣＩ、０．８２〜０．９９）であった（図５Ｂ）。しかし、固形腫瘍群のイヌ由来の血清におけるＴＫ１タンパク質レベル（＜０．４６〜３．４ｎｇ／ｍＬの範囲）は、健康群と比較して有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、図５Ｃ）。更に、ＲＯＣ曲線分析は、０．８８のＡＵＣ（Ｐ＜０．０００１、９５％ＣＩ、０．８０〜０．９５）を有した（図５Ｄ）。０．４６ｎｇ／ｍＬのカットオフ値で、感度は６２％（９５％ＣＩ、０．４５８〜０．７７２）であり、特異性は９６％（９５％ＣＩ、０．８２〜０．９９）であった。これらの結果は、ＴＫ１−ＥＬＩＳＡが固形腫瘍を有するイヌと健康なイヌを区別し得ることを強く示している。
【０１０９】
全般的に、健康な、血液学的腫瘍および固形腫瘍のイヌにおけるＳＴＫ１活性アッセイ値は、ＳＴＫ１・ＥＬＩＳＡ（ｎｇ／ｍＬ）値に対して有意な相関、即ち、線形回帰分析を用いてｒ＝０．６４（Ｐ＜０．０００１）を示した。血液学的腫瘍および固形腫瘍を有するイヌ由来の血清は、リンパ腫、白血病および乳腺腫瘍、肥満細胞腫および黒色腫として更に細分類された。図６Ａおよび図６Ｂは、異なる下位分類におけるｌｏｇＳＴＫ１活性分布を示す一方、図６Ｃおよび６Ｄは、異なる下位分類におけるｌｏｇＳＴＫ１タンパク質レベルを示す。
【０１１０】
リンパ腫を有するイヌの化学療法中に追跡される血清ＴＫ１活性およびタンパク質レベル
リンパ腫を有するイヌは、しばしばドキソルビシンに基づく多剤プロトコル（ＡＤＲＩＡ−Ｐｌｕｓ）を用いて治療される。ＡＤＲＩＡ−ｐｌｕｓの各投与の前後に、６匹のイヌから血清サンプルを採取した。当初、５匹のイヌで高いＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質値が見出され、６匹のイヌのうち４匹は、最初の治療後にＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質レベルの著しい低下を示し、これはカットオフ値と同等またはそれ以下のレベルに至った（図７Ａ、図７Ｂ）。２匹の患者（番号８、９）では、３回目の治療中にＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質が増加したが、４回目の治療後にレベルは減少した。２匹の患者（患者番号５、１７）では、ＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質レベルが第１回の治療後に増加し第２回の治療後に減少したが、第３回および第４回の治療後には再び増加し、その後、第５回の治療後に減少した。１匹の患者（患者番号１９）は、２回目の治療後に明らかに完全寛解状態にあった。完全寛解状態にあったリンパ腫を有するイヌのＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質の平均値は、健康対照におけるＳＴＫ１と顕著に異ならなかった。しかしながら、２匹の患者（患者番号１１、３７）は、化学療法に対する異なる応答パターンを示した。患者番号１１は、第１回の治療後にＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質レベルの顕著な減少を示した。その後、第２回および第３回の治療後にＳＴＫ１レベルが上昇し、この患者は腫瘍再発を有し、それ以上治療には応答しなかった。しかしながら、２匹の患者（患者番号１１、３７）は、化学療法に対する異なる応答パターンを示した。患者番号１１は、第１回の治療後に、ＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質レベルの顕著な減少を示した。その後、第２回および第３回の治療後にＳＴＫ１レベルが上昇し、この患者は腫瘍再発を有し、それ以上治療には応答しなかった。患者番号３７は、第１回の治療後にＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質レベルの顕著な増加を示した。更なる治療過程に際し、第２回および第３回の治療後にはＳＴＫ１レベルに僅かな減少が見られたが、ＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質レベルは対照と比較して顕著に高かった。更に、このイヌもまた治療に応答せず、イヌは両方とも後で安楽死させた。ここに示した結果は、ＳＴＫ１活性およびＳＴＫ１タンパク質アッセイの両方が、イヌリンパ腫の予後および治療効率に関する情報を提供し得ることを強く示している。
【０１１１】
考察
以前の研究は、血清ＴＫ１活性測定値が、イヌの血液腫瘍の予後および治療モニタリングにとって有益であることを実証している。しかしながら、これらの活性アッセイは、危険で高価な放射性同位体の使用を伴うため複雑であり、従ってＴＫ１活性アッセイの臨床的有用性を制限する。ＥＬＩＳＡはほぼ全ての臨床検査室で一般的に使用されているため、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを開発することで、ＴＫ１のバイオマーカとしての臨床的有用性が大幅に向上する。ＴＫ１抗体に基づくイムノアッセイを用いるヒトの医学研究では、それらが種々の腫瘍疾患の予後およびモニタリングのための敏感なツールであることが示された。ヒト医学において抗体ベースのＴＫ１−ＥＬＩＳＡを確立するための幾つかの試みがなされてきたが、ごく最近になってやっと、ある堅牢なＥＬＩＳＡが研究用のみの製品として利用可能である（ＡｒｏＣｅｌｌ  ＡＢ、スウェーデン）。これはおそらく、ＴＫ１の血清型に対して十分な親和性を有する抗体を得るのが困難なためであった。血清中に見出されるＴＫ１オリゴマーの複雑さが、異なるタイプの抗ＴＫ１抗体との再現性のある反応性を妨げるという可能性が最も高い。
【０１１２】
１つの予備的研究で、ヒトＴＫ１の活性部位中の長円形のループ（ｌｏｎｇ  ｌａｓｓｏ  ｌｏｏｐ）（アミノ酸１６１〜１８３）に対する抗体が使用された。この領域は、イヌＴＫ１配列（図１）において高度に保存されており、Ａｒ−４（ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ  ＆  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  ２０１１）の産生にも使用された。これらの抗体が、イヌリンパ腫組織中の細胞ＴＫ１を検出したことは明らかであった。別の研究では、イヌＴＫ１のＣ末端領域由来のペプチドに対して産生された２つの抗体を用いて、イヌＴＫ１の組換え型、細胞型および血清型が検出でき特徴付けられた（Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ｂ）。幾つかの類似点があるが、特にヒトおよびイヌ血清ＴＫ１のオリゴマー構造において相違点も存在する。
【０１１３】
最近の研究は、イヌ抗ＴＫ１抗体を用いたイムノアフィニティアッセイが、血液学的腫瘍および固形腫瘍由来の血清中のＴＫ１レベルを測定できることを報告し、かつＴＫ１タンパク質アッセイがＴＫ１活性アッセイよりも感度が高いことを示した（Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒら、２０１３）。更に、研究は、固形腫瘍を有するイヌ由来の血清は、健康なイヌと比較して低いＴＫ１活性を有するが、比較的高レベルのＴＫ１タンパク質を有することを示している。
【０１１４】
イヌＴＫ１−ＥＬＩＳＡが本明細書に開示されるように開発され、それは従来のＴＫ１放射性同位元素アッセイの限界を克服できる。血液腫瘍のＲＯＣ曲線分析は、ＴＫ１−ＥＬＩＳＡおよびＴＫ１活性アッセイの両方が７５％の感度および４％の偽陽性率を有することを示した。これは、両方のアッセイが、臨床的な日常的実施のために十分正確で且つ敏感であり得ることを示す。しかしながら、ＴＫ１活性アッセイは、固形腫瘍患者と健康体を区別できず、これははるかに低い感度（２７％）のＲＯＣ曲線によって示された。ＴＫ１−ＥＬＩＳＡは、これらの群を区別でき、ＴＫ１活性アッセイよりも２倍高い感度（６２％）を有した。更に、ＴＫ１タンパク質レベルは、腫瘍寛解をもたらす化学療法後に正常（ベースラインレベル）に戻り、リンパ腫を有するイヌのＴＫ１活性レベルと同様に、再発患者ではより高いレベルに増加する。治療中の少数の患者においてＴＫ１タンパク質レベルの一時的な上昇が見られ、これは薬物毒性のために死んだ細胞からのＴＫ１放出に起因する可能性がある。
【０１１５】
更に、以前の研究からのサイズ排除分析は、血清ＴＫ１が高分子量凝集体として存在し、これはイヌリンパ腫の場合には酵素的に活性であることを示した。興味深いことに、乳房腫瘍イヌ由来の血清は、活性のあるＴＫ１高分子量凝集体の小部分を有したが、タンパク質の大部分は明らかに不活性であった（Ｊａｇａｒｌａｍｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。上記２つのアッセイの結果の間には依然として強い相関（ｒｓ＝０．６４）が見られた。これは、ＴＫ１の分子形態が、上記２つのアッセイ間で観察された全体的な相関に寄与していることを示す。新しいＥＬＩＳＡの有効性は、増殖バイオマーカとしてのＴＫ１の臨床的有用性を増加させるであろうし、また獣医学における予後および血液腫瘍のモニタリングのために価値を有するに違いない。
【０１１６】
本研究は、ＴＫ１タンパク質レベルを決定するための新しいＴＫ１−ＥＬＩＳＡを記載し、これはイヌの血液腫瘍の診断およびモニタリングのための潜在的マーカであり得る。ＴＫ１−ＥＬＩＳＡは実施が容易で、迅速であり、また既存のＴＫ１活性アッセイと同様に高感度で且つ特異的である。
【０１１７】
実施例２
以下の実験は、イヌおよびネコのＴＫ１配列の異なる領域由来のペプチドに対して生成されたイヌＴＫ１抗血清の反応性を実証した。ＴＫ１のペプチド配列の大部分は、幾つかのアミノ酸の違いを除き、ヒト、イヌ、ネコおよびウマのＴＫ１配列において保存されている。図１を参照されたい。しかし、ＴＫ１タンパク質のＣ末端において、上記複数のＴＫ１配列間に相当に大きな多様性が存在する。
【０１１８】
ＴＫ１抗血清
二つの異なるポリクローナルウサギ抗血清（ＣＴＫ１ｐ−２１１、ＣＴＫ１ｐ−２１５）が、イヌＴＫ１のＣ末端領域由来のペプチドを用いて産生され、かつ１つの抗血清（ＣＴＫ１ｐ−１６１）がイヌＴＫ１の活性部位領域から産生された。第１のイヌＴＫ１ペプチド配列抗血清（ＣＴＫ１ｐ−２１５）は、１６アミノ酸合成ペプチド（イヌＴＫ１のアミノ酸２１５−２３０；図１）にＮ末端システインが付加されたもの（ＣＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧＶＲＫＬＦ、配列番号：５）に対するものであった。第２の抗血清（ＣＴＫ１ｐ−２１１）は、１５アミノ酸ペプチド（イヌＴＫ１のアミノ酸２１１−２２５；図１）にＮ−末端システインが付加されたもの（ＣＶＬＶＰＧＫＰＧＥＧＫＥＡＴＧ、配列番号１２）を用いて産生された。ＣＴＫ１ｐ−１６１抗血清は、イヌＴＫ１の高度に保存された活性部位配列（イヌＴＫ１のアミノ酸１６１−１８３；図１）にＮ末端システインが付加されたもの（ＣＡＹＴＫＲＬＧＴＥＫＥＶＥＶＩＧＧＡＤＫＹＨＳ、配列番号８）を用いて産生された。ＦＴＫ１ｐ−２１３抗血清は、ネコＴＫ１のＣ末端領域（ネコＴＫ１のアミノ酸２１３−２２７；図１）にＮ末端システインが付加されたもの（ＣＧＫＰＧＥＡＳＧＡＲＫＬＦＡＰ、配列番号１４）に対して生成された。これらペプチドの全ては、キャリアタンパク質ＫＬＨへのカップリングのためにＮ末端に付加されたシステインを有した。ペプチドキャリア複合体を、ウサギ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）の免疫感作のための抗原として使用した。試験した抗血清を、第３回および第４回の免疫感作後に収集した。ネコおよびウマ組換えＴＫ１タンパク質のクローニングおよび発現を、イヌＴＫ１タンパク質について記載したように行った（Ｊａｇａｒｌａｍｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１１９】
ドットブロットイムノアッセイ
４つの異なるＴＫ１抗血清の全てを、ドットブロットアッセイを用いて、組換えイヌ、ネコおよびウマＴＫ１との反応性について試験した。簡単に言えば、３μＬの異なる希釈の組換えＴＫ１調製物を、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に塗布した。膜を乾燥させ、ＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０としても知られている）の混合物）で希釈した５％脱脂粉乳で室温にて１時間ブロックした。この膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、次いでＴＳＢＴ中に希釈した（１：３００）異なるＴＫ１抗血清と室温で２時間インキュベートした。洗浄手順を繰り返し、その膜をストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（希釈：ＴＢＳ中で１：２０，０００）と１時間インキュベートした。最終洗浄の後、その膜をＥＣＬ化学発光剤（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ，ウプサラ）と１分間インキュベートした。膜をＢｉｏ−Ｒａｄ社のｃｈｅｍｉ・ｄｏｃタッチシステムでスキャンした。ドットの強度を、イメージゲージ３ソフトウェアで定量した。
【０１２０】
結果および考察
図８Ａ〜８Ｄは、４つの異なるＴＫ１抗血清とのイヌ、ネコおよびウマ組換えＴＫ１によるドットブロットイムノアッセイの結果を示す。図９Ａ〜９Ｃは、４つの異なるＴＫ１抗血清との異なる濃度のイヌ、ネコおよびウマ組換えＴＫ１による任意単位でのドット強度を示す。
【０１２１】
図８および９に示すように、組換えイヌ、ネコおよびウマＴＫ１と反応する抗体の産生を誘発するための、様々なＣ末端ペプチド（ＣＴＫ１ｐ−２１５、ＣＴＫ１ｐ−２１１およびＦＴＫ１ｐ−２１３）の能力には大きな差がある。明らかに、ＣＴＫ１ｐ−２１１は、試験した全ての組換えＴＫ１タンパク質との高い反応性を有する抗体を与えたが、イヌＴＫ１に対する明確な選択性を示した。ＣＴＫ１ｐ−２１５はイヌおよびウマＴＫ１に対する抗血清を与え、一方でＦＴＫ１ｐ−２１３はウマＴＫ１と反応性の抗体を産生したのみであった。ＣＴＫ１ｐ−１６１は、３種類のＴＫ１タンパク質の全てと反応する抗体を生じ、ネコＴＫ１について優れていた。
【０１２２】
実施例３
実施例１の手順を繰り返したが、以下の違いがあった。
【０１２３】
イヌ血清中のＴＫ１を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法
Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ（デンマーク）マイクロタイタープレートを、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のＣＴＫ１ｐ−２１５抗ＴＫ１ウサギポリクローナル抗体（４μｇ／ｍＬ）１００μＬでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、Ｔｅｃａｎハイドロ・フレックス・マイクロプレート洗浄機を用いて、洗浄用緩衝液（Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  ０．３Ｍ、Ｔｗｅｅｎ０．０５％およびＢＳＡ１％）で４回洗浄した。その後、全ウェルを、室温で１時間、ＴＢＳＴで希釈した５％脱脂粉乳でブロックした。５０μＬのイヌ血清サンプルを５０μＬのサンプル希釈バッファーで希釈し、室温で１時間プレインキュベートした。プレートを再度洗浄し、プレインキュベートした血清サンプルを添加した。次いで、プレートを、ロッキングプラットホーム上にて室温で２時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ビオチン化ＣＴＫ１ｐ−１６１抗体（洗浄緩衝液中４μｇ／ｍＬ）を添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを上記のように洗浄し、洗浄緩衝液中で１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、３０分間インキュベートした。最終洗浄後に、ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、１５分間発色させ、次いで２ＮのＨ２ＳＯ４でクエンチした。このプレートを、参照波長として５４０ｎＭを使用してＩｎｆｉｎｉｔｅのＭ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｅｒｆ，ドイツ）において４５０ｎＭで読み取った。
【０１２４】
この実施例３からの結果を、図１０および図１１Ａ〜図１１Ｄに示す。より詳細には、図１０は、異なる濃度の組換えＴＫ１についての、ＣＴＫ１ｐ−２１５コーティングおよび検出抗体としてＣＴＫ１ｐ−１６１を用いた標準曲線を示す。図１１Ａは、健康なイヌおよび血液悪性腫瘍を有するイヌ由来の血清中の、ｌｏｇＳＴＫ１・ＥＬＩＳＡタンパク質レベルを示す。図１１Ｂは、血液腫瘍のイヌと健康なイヌの識別のための対応するＲＯＣ曲線を示す。図１１Ｃは、健康なイヌおよび固形腫瘍を有するイヌ由来の血清中のｌｏｇＳＴＫ１・ＥＬＩＳＡタンパク質レベルを示す。図１１Ｄは、固形腫瘍イヌと健康なイヌの識別のための対応するＲＯＣ曲線を示す。
【０１２５】
同じ手順を使用したが、抗体を変更した。ＣＴＫ１ｐ−２１１抗ＴＫ１ポリクローナル抗体をコーティングに使用し、ビオチン化ＣＴＫ１ｐ−２１５を検出に使用した。
【０１２６】
これらの抗体の結果を、図１２および図１３Ａ〜１３Ｂに示す。図１２は、異なる濃度の組換えＴＫ１についての、ＣＴＫ１ｐ−２１１コーティングおよび検出抗体としてＣＴＫ１ｐ−２１５を用いた標準曲線を示す。図１３Ａは、健康なイヌおよび血液悪性腫瘍を有するイヌ由来の血清中のｌｏｇＳＴＫ１・ＥＬＩＳＡタンパク質レベルを示す。図１３Ｂは、健康なイヌと血液学的腫瘍イヌの識別のための、対応するＲＯＣ曲線を示す。
【０１２７】
上述した実施形態は、本発明の幾つかの例示的な実施形態として理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更、組み合わせ、および変更を実施形態に加え得ることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分解決策は、技術的に可能な場合には他の構成で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定められるものである。
【０１２８】
参考文献
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Ｇａｓｐａｒｒｉ，  Ｆ．，  Ｗａｎｇ，  Ｎ．，  Ｓｋｏｇ，  Ｓ．，  Ｇａｌｖａｎｉ，  Ａ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２００９．  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｇ１  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  （ＴＭ）  ａｓｓａｙｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８８，  ７７９−７８５．
Ｊａｇａｒｌａｍｕｄｉ，  ＫＫ．，  Ｗｅｓｔｂｅｒｇ，  Ｓ．，  Ｒｏｎｎｂｅｒｇ，  Ｈ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２０１４．  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  （ＴＫ１）  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  （ＡＬＬ）  ａｎｄ  ｃａｎｉｎｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  （ＣＭＴｓ）：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＴＫ１  ａｓ  ａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ．  ＢＭＣ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １０：２２８．
Ｊａｇａｒｌａｍｕｄｉ，  ＫＫ．，  Ｈａｎｓｓｏｎ，  ＬＯ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２０１５．  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｄｉｆｆｅｒ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｓｅｒｕｍ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  （ＴＫ１）  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｏｓｅ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｎｏｒｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ＴＫ１  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ．  ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，  １５：１０７３．
Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒ，  Ｊ．，  Ｓｈａｒｉｆ，  Ｈ．，  Ｗｅｓｔｂｅｒｇ，  Ｓ．，  ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２０１３．  Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．  Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９７，  ８５４−８６０．
Ｋｉｒａｎ  Ｋｕｍａｒ．  Ｊ．，  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｎ  Ｄｏｇ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，  Ｍａｓｔｅｒ  Ｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ  ２０１０．
Ｓｈａｒｉｆ，  Ｈ．，  ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｗｅｓｔｂｅｒｇ，  Ｓ．，  Ｈｅ，  Ｅ．，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２０１２  ａ．  Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  （ＴＫ１）  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｃａｎｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９４，  ４０−４７．
Ｓｈａｒｉｆ，  Ｈ．，  Ｊａｇａｒｌａｍｕｄｉ，  Ｋ．Ｋ．，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｈｅ，  Ｅ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２０１２  ｂ．  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  ｃｅｌｌｕｌａｒ，  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １  ｆｒｏｍ  ｄｏｇｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３，  １２．
ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｏｈｒｖｉｋ，  Ａ．Ｂ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．Ｋ．，  ２００６．  Ａ  ｎｏｎ−  ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ｉｎ  ｄｏｇｓ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８０，  １７−２４．
ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｒｉｖｅｒａ，  Ｐ．，  Ａｒｏｎｓｓｏｎ，  Ａ．Ｃ．，  Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，  Ｃ．，  Ｈａｎｓｓｏｎ，  Ｌ．Ｏ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．Ｋ．，  ２００８．  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｕｍ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ａｃｔｉｖｉｔｙ  −  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ，  ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３４，  ５０５−５１０．
ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ２０１１．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｃａｎｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｖｅｔ  Ｃｏｍｐ  Ｏｎｃｏｌ，  ９：  １−１５．
Ｗｕ，  Ｃ．，  Ｙａｎｇ，  Ｒ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｊ．，  Ｂａｏ，  Ｓ．，  Ｚｏｕ，  Ｌ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．，  Ｍａｏ，  Ｙ．，  Ｗｕ，  Ｊ．，  Ｈｅ，  Ｑ．，  ２００３．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒａｉｓｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７７，  １５７−１６９．
【図１】
2019532260.tif 000004
【図２】
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【図３】
2019532260.tif 000006
【図４Ａ】
2019532260.tif 000007
【図４Ｂ】
2019532260.tif 000008
【図４Ｃ】
2019532260.tif 000009
【図４Ｄ】
2019532260.tif 000010
【図５Ａ】
2019532260.tif 000011
【図５Ｂ】
2019532260.tif 000012
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2019532260.tif 000014
【図６−１】
2019532260.tif 000015
【図６−２】
2019532260.tif 000016
【図７Ａ】
2019532260.tif 000017
【図７Ｂ】
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【図８】
2019532260.tif 000019
【図９】
2019532260.tif 000020
【図１０】
2019532260.tif 000021
【図１１Ａ】
2019532260.tif 000022
【図１１Ｂ】
2019532260.tif 000023
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
2019532260.tif 000026
【図１３Ａ】
2019532260.tif 000027
【図１３Ｂ】
2019532260.tif 000028
【配列表】
2019532260000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月1日(2019.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019532260000001.app
【国際調査報告】
2019532260.tif 000029
2019532260.tif 000030
2019532260.tif 000031
2019532260.tif 000032