【手続補正書】
【提出日】平成19年4月13日(2007.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  グラム陽性菌由来の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素であって、該酵素がソーティングシグナルを有するタンパク質のカルボキシル末端をグラム陽性菌のペプチドグリカンに共有架橋結合させる反応に触媒作用を及ぼし、該ソーティングシグナルがＬＰＸ3Ｘ4Ｇモチーフを有し、該ＬＰＸ3Ｘ4Ｇモチーフの第４と第５残基の間での切断によってソーティングが生じることを特徴とする酵素。
【請求項２】  前記グラム陽性菌が、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ソブリヌス、枯草菌、エンテロコッカス・ファエカリス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびリステリア・モノサイトゲネスより成る群から選択される種であることを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素。
【請求項３】  前記グラム陽性菌が、黄色ブドウ球菌であることを特徴とする請求項２記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素。
【請求項４】  約２３，５３９ダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項１記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素。
【請求項５】  前記ソーティングシグナルが：（２）前記モチーフのカルボキシル側の少なくとも３１アミノ酸から成る実質的疎水性領域；ならびに（３）該実質的疎水性領域のカルボキシル側の少なくとも２つの陽電荷残基を有する荷電末端領域；をさらに含み、ここで、該２つの陽電荷残基の内、少なくとも１つはアルギニンであり、該２つの陽電荷残基は前記モチーフから３１−３３残基の位置にあり、Ｘ3は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択されることを特徴とする請求項４記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素。
【請求項６】  （１）配列番号３の配列；および（２）配列番号３の配列に、１つ以上の保存的アミノ酸置換を加えた配列より成る群から選択されたアミノ酸配列を含み、
前記保存的アミノ酸置換が：（１）イソロイシン、ロイシンおよびバリンの間での置換；（２）アスパラギン酸とグルタミン酸間での置換；（３）グルタミンとアスパラギン間での置換；ならびに（４）セリンとトレオニン間での置換；の何れかであることを特徴とする請求項１記載の酵素。
【請求項７】  前記アミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項６記載の酵素。
【請求項８】  請求項６または７記載の酵素をコードする核酸配列。
【請求項９】  グラム陽性菌由来の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素をコードする核酸配列であって、該酵素が、約２３,５３９ダルトンの分子量を有し、かつソーティングシグナルを有するタンパク質のカルボキシル末端をグラム陽性菌のペプチドグリカンに共有架橋結合させる反応に触媒作用を及ぼし、ここで該ソーティングシグナルが：（１）ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ；（２）該モチーフのカルボキシル側の少なくとも３１アミノ酸から成る実質的疎水性領域；ならびに（３）該実質的疎水性領域のカルボキシル側の少なくとも２つの陽電荷残基を有する領域；を含み、該２つの陽電荷残基の内、少なくとも１つはアルギニンであり、該２つの陽電荷残基はそのモチーフから３１−３３残基の位置にあり、Ｘ３は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択され、ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフの第４と第５残基の間での切断によってソーティングが生じ、
該核酸配列が、（１）配列番号２の配列；および（２）配列番号２の配列に相補的である配列；より成る群から選択される配列を含むか、あるいは（３）配列番号２の配列；および（４）約１５％以下の不一致で配列番号２の配列に相補的である配列；より成る群から選択される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする核酸配列。
【請求項１０】  前記不一致が約５％以下であることを特徴とする請求項９記載の核酸配列。
【請求項１１】  前記不一致が約２％以下であることを特徴とする請求項９記載の核酸配列。
【請求項１２】  核酸配列の発現または調節を制御する少なくとも１つの制御配列に作動可能に結合した請求項８から１１いずれか１項記載の核酸配列を包含するベクター。
【請求項１３】  請求項１２記載のベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項１４】  実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素を作成する方法であって：
（a）宿主細胞がコードされたソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素を発現するような条件下において請求項１３記載の宿主細胞を培養し；さらに
（b）発現された酵素を精製して、実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素を作成する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】  請求項１４記載の方法によって作成された実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素。
【請求項１６】  抗ソーターゼ−トランスアミダーゼ活性について化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）請求項１から７および１５いずれか１項記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素を提供し；
（ｂ）化合物の存在下および不在下において、ソーターゼ−トランスアミダーゼの測定法を実施し；さらに
（ｃ）化合物の存在下および不在下におけるソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素の活性を比較して、ソーターゼ−トランスアミダーゼ活性について化合物を評価する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】  抗ソーターゼ−トランスアミダーゼ活性について化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）グラム陽性菌由来のソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素の活性画分を提供し；
（ｂ）化合物の存在下および不在下において、ソーターゼ−トランスアミダーゼの測定法を実施し；さらに
（ｃ）化合物の存在下および不在下におけるソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素の活性を比較して、ソーターゼ−トランスアミダーゼ活性について化合物を評価する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】  前記ソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素の活性画分が黄色ブドウ球菌由来の特定画分であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】  前記ソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素の測定法が、親和性樹脂との相互作用による、該酵素の基質である可溶性ペプチドの捕獲をモニターすることによって成されることを特徴とする請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】  （ａ）前記可溶性ペプチドが６以上のヒスチジン残基から成る配列を含み、かつ前記親和性樹脂がニッケルを含有するか；
（ｂ）前記可溶性ペプチドがグルタチオンＳ-トランスフェラーゼの活性部位を包含し、かつ前記親和性樹脂がグルタチオンを含有するか；
（ｃ）前記可溶性ペプチドがストレプトアビジンの活性部位を包含し、かつ前記親和性樹脂がビオチンを含有するか；あるいは
（ｄ）前記可溶性ペプチドがマルトース結合タンパク質の活性部位を包含し、かつ前記親和性樹脂がアミロースを含有する；ことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】  請求項１から７および１５いずれか１項記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素に特異的に結合する抗体。
【請求項２２】  ヒスチジン残基によってそのカルボキシル末端において伸長されている請求項１から４および１５いずれか１項記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素を包含するタンパク質分子であって、該ヒスチジン残基の数が、カルボキシル末端に付加されたヒスチジン残基を介してニッケル−セファロースカラムに該タンパク質分子を特異的に結合させるのに十分な数であることを特徴とするタンパク質分子。
【請求項２３】  グラム陽性菌の表面上にポリペプチドを提示させる方法であって：
（ａ）そのカルボキシル末端にソーティングシグナルを有するポリペプチドを発現させ、ここで、該ソーティングシグナルが：（１）ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ；（２）該モチーフのカルボキシル側の少なくとも３１アミノ酸から成る実質的疎水性領域；ならびに（３）該実質的疎水性領域のカルボキシル側の少なくとも２つの陽電荷残基を有する領域；を有し、該２つの陽電荷残基の内、少なくとも１つはアルギニンであり、該２つの陽電荷残基はそのモチーフから３１−３３残基の位置にあり、Ｘ３は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択され；
（ｂ）（ｉ）前記発現ポリペプチド；（ｉｉ）請求項１から４および１５いずれか１項記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ；および（ｉｉｉ）ソーターゼ−トランスアミダーゼが結合し得るポリペプチドを含むペプチドグリカンを有するグラム陽性菌；を含有する反応混合物を形成し；さらに
（ｃ）前記ソーティングシグナルのＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ内でポリペプチドを切断しかつ該切断ポリペプチドのアミノ末端部位をペプチドグリカンに共有架橋結合させる反応をソーターゼ−トランスアミダーゼに触媒作用を及ぼさせて、グラム陽性菌の表面上に該ポリペプチドを提示させる；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】  グラム陽性菌の表面上にポリペプチドを提示させる方法であって：
（a）カルボキシル末端ソーティングシグナルを包含するクローン化キメラタンパク質を作成するために、提示されるべきポリペプチドを包含するキメラタンパク質をコードする核酸断片をグラム陽性菌中にクローニングし、ここで、該ソーティングシグナルが：（１）ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ；（２）該モチーフのカルボキシル側の少なくとも３１アミノ酸から成る実質的疎水性領域；ならびに（３）該実質的疎水性領域のカルボキシル側の少なくとも２つの陽電荷残基を有する領域；を有し、該２つの陽電荷残基の内、少なくとも１つはアルギニンであり、該２つの陽電荷残基はそのモチーフから３１−３３残基の位置にあり、Ｘ３は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択され；
（b）カルボキシル末端ソーティングシグナルを包含するキメラタンパク質を作成するために、前記クローン化キメラタンパク質を発現するように、前記核酸断片がその中にクローン化された細菌を増殖させ；さらに
（c）前記ポリペプチドがリガンドに接近できるようにグラム陽性菌の表面上に提示されるように、ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ内でキメラタンパク質を切断すると共に、グラム陽性菌によって発現されたソーターゼ−トランスアミダーゼの酵素活性によって、細胞壁に該ポリペプチドを共有結合させる；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】  ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフの切断によって生じたＬＰＸ３Ｘ４のアミノ酸配列の共有結合によってグラム陽性菌の表面上に提示されたポリペプチドであって、Ｘ３は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択され、該ポリペプチドがリガンドに接近できるようにグラム陽性菌の表面上に提示されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２６】  共有結合複合体であって：
（ａ）請求項２５記載のポリペプチド；および
（ｂ）前記ポリペプチドに共有架橋結合した抗原またはハプテン；を含むことを特徴とする共有結合複合体。
【請求項２７】  抗原またはハプテンが前記ポリペプチドに共有架橋結合していることを特徴とする請求項２６記載の共有結合複合体。
【請求項２８】  請求項２５記載の提示されたポリペプチド、あるいは請求項２６または２７記載の共有結合複合体を含む、動物を免疫して提示されたポリペプチドに対する免疫反応を誘起させるためのワクチン組成物。
【請求項２９】  クローン化ポリペプチドの発現をスクリーニングする方法であって：
（ａ）そのカルボキシル末端にソーティングシグナルを有するキメラタンパク質としてクローン化ポリペプチドを発現させ、ここで、該ソーティングシグナルが：（１）ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ；（２）該モチーフのカルボキシル側の少なくとも３１アミノ酸から成る実質的疎水性領域；ならびに（３）該実質的疎水性領域のカルボキシル側の少なくとも２つの陽電荷残基を有する領域；を有し、該２つの陽電荷残基の内、少なくとも１つはアルギニンであり、該２つの陽電荷残基はそのモチーフから３１−３３残基の位置にあり、Ｘ３は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択され；
（ｂ）（ｉ）前記発現キメラタンパク質；（ｉｉ）請求項１から７および１５いずれか１項記載の実質的に純粋なソーターゼ−トランスアミダーゼ酵素；および（ｉｉｉ）ソーティングシグナルを介してソーターゼ−トランスアミダーゼが結合し得るポリペプチドを含むペプチドグリカンを有するグラム陽性菌；を含有する反応混合物を形成し；
（ｃ）前記ポリペプチドがリガンドに接近できるようにグラム陽性菌の表面上に提示されるように、ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ内でキメラタンパク質を切断すると共に、グラム陽性菌によって発現されたソーターゼ−トランスアミダーゼの酵素活性によって、細胞壁に該ポリペプチドを共有結合させ；さらに
（ｄ）提示されたポリペプチドを標識特異的結合パートナーと反応させて、該標識特異的結合パートナーとの反応性についてキメラタンパク質をスクリーニングする；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】  クローン化ポリペプチドの発現をスクリーニングする方法であって：
（ａ）カルボキシル末端ソーティングシグナルを包含するクローン化キメラタンパク質を作成するために、その発現についてスクリーニングすべきポリペプチドを包含するキメラタンパク質をコードする核酸断片をグラム陽性菌中にクローニングし、ここで、該ソーティングシグナルが：（１）ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ；（２）該モチーフのカルボキシル側の少なくとも３１アミノ酸から成る実質的疎水性領域；ならびに（３）該実質的疎水性領域のカルボキシル側の少なくとも２つの陽電荷残基を有する領域；を有し、該２つの陽電荷残基の内、少なくとも１つはアルギニンであり、該２つの陽電荷残基はそのモチーフから３１−３３残基の位置にあり、Ｘ３は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択され；
（ｂ）カルボキシル末端ソーティングシグナルを包含するキメラタンパク質を作成するために、クローン化キメラタンパク質を発現するように、前記核酸断片がその中にクローン化された細菌を増殖させ；
（ｃ）前記ポリペプチドがリガンドに接近できるようにグラム陽性菌の表面上に提示されるように、ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ内でキメラタンパク質を切断すると共に、グラム陽性菌によって発現されたソーターゼ−トランスアミダーゼの酵素活性によって、細胞壁に該ポリペプチドを共有結合させ；さらに
（ｄ）提示されたポリペプチドを標識特異的結合パートナーと反応させて、該標識特異的結合パートナーとの反応性についてキメラタンパク質をスクリーニングする；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】  グラム陽性菌によって生じた細菌感染症を診断または治療するための組成物であって：
カルボキシル末端ソーティングシグナルを包含するタンパク質に抗生物質または検出試薬を結合させて得られた結合物を含み、ここで、該カルボキシル末端ソーティングシグナルが：（１）ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ；（２）該モチーフのカルボキシル側の少なくとも３１アミノ酸から成る実質的疎水性領域；ならびに（３）該実質的疎水性領域のカルボキシル側の少なくとも２つの陽電荷残基を有する領域；を有し、該２つの陽電荷残基の内、少なくとも１つはアルギニンであり、該２つの陽電荷残基はそのモチーフから３１−３３残基の位置にあり、Ｘ３は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択され；さらに
該組成物が、感染症を治療または診断するために、前記結合体を細菌の細胞壁に局在化および共有架橋結合させるように、グラム陽性菌に感染した生物に導入されることを特徴とする組成物。
【請求項３２】  抗生物質が前記タンパク質に結合しており、該抗生物質が、ペニシリン、アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、セファロスポリン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、パロモマイシン、トブロマイシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、リファンシピン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、およびそれら抗生物質の誘導体より成る群から選択されることを特徴とする請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】結合体を作成するためにカルボキシル末端ソーティングシグナルを包含するタンパク質に共有結合した抗生物質または検出試薬を含む結合体であって、ここで、該カルボキシル末端ソーティングシグナルが：（１）ＬＰＸ３Ｘ４Ｇモチーフ；（２）該モチーフのカルボキシル側の少なくとも３１アミノ酸から成る実質的疎水性領域；ならびに（３）該実質的疎水性領域のカルボキシル側の少なくとも２つの陽電荷残基を有する領域；を有し、該２つの陽電荷残基の内、少なくとも１つはアルギニンであり、該２つの陽電荷残基はそのモチーフから３１−３３残基の位置にあり、Ｘ３は２０の天然Ｌアミノ酸の何れかであり、かつＸ４はアラニン、セリンおよびトレオニンより成る群から選択されることを特徴とする結合体。
【請求項３４】  抗生物質が前記タンパク質に結合しており、該抗生物質が、ペニシリン、アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、セファロスポリン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、パロモマイシン、トブロマイシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、リファンシピン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、およびそれら抗生物質の誘導体より成る群から選択されることを特徴とする請求項３３記載の結合体。
【請求項３５】  （ａ）請求項３３または３４記載の結合体；および
（ｂ）薬剤的に許容される担体；を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３６】  ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号４）、アクチノマイセス・ナエスルンディ（配列番号５）、エンテロコッカス・ファエカリス（配列番号６）、ストレプトコッカス・ミュータンス（配列番号７）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（配列番号３４、配列番号３５または配列番号３６）あるいは枯草菌（配列番号８）の何れか１つ以上のアミノ酸配列と約３０％以上の配列類似性を有し、かつソーターゼ−トランスアミダーゼ活性を有することを特徴とする実質的に純粋なタンパク質。
【請求項３７】  ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号４）、アクチノマイセス・ナエスルンディ（配列番号５）、エンテロコッカス・ファエカリス（配列番号６）、ストレプトコッカス・ミュータンス（配列番号７）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（配列番号３４、配列番号３５または配列番号３６）あるいは枯草菌（配列番号８）の何れか１つ以上のアミノ酸配列との配列類似性が、約４０％以上であることを特徴とする請求項３６記載の実質的に純粋なタンパク質。
【請求項３８】  ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号４）、アクチノマイセス・ナエスルンディ（配列番号５）、エンテロコッカス・ファエカリス（配列番号６）、ストレプトコッカス・ミュータンス（配列番号７）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（配列番号３４、配列番号３５または配列番号３６）あるいは枯草菌（配列番号８）の何れか１つ以上のアミノ酸配列との配列類似性が、約５０％以上であることを特徴とする請求項３７記載の実質的に純粋なタンパク質。
【請求項３９】  ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号４）、アクチノマイセス・ナエスルンディ（配列番号５）、エンテロコッカス・ファエカリス（配列番号６）、ストレプトコッカス・ミュータンス（配列番号７）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（配列番号３４、配列番号３５または配列番号３６）あるいは枯草菌（配列番号８）の何れか１つ以上のアミノ酸配列と約１８％以上の配列同一性を有し、かつソーターゼ−トランスアミダーゼ活性を有することを特徴とする実質的に純粋なタンパク質。
【請求項４０】  ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号４）、アクチノマイセス・ナエスルンディ（配列番号５）、エンテロコッカス・ファエカリス（配列番号６）、ストレプトコッカス・ミュータンス（配列番号７）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（配列番号３４、配列番号３５または配列番号３６）あるいは枯草菌（配列番号８）の何れか１つ以上のアミノ酸配列との配列同一性が、約２０％以上であることを特徴とする請求項３９記載の実質的に純粋なタンパク質。
【請求項４１】  ストレプトコッカス・ピオゲネス（配列番号４）、アクチノマイセス・ナエスルンディ（配列番号５）、エンテロコッカス・ファエカリス（配列番号６）、ストレプトコッカス・ミュータンス（配列番号７）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（配列番号３４、配列番号３５または配列番号３６）あるいは枯草菌（配列番号８）の何れか１つ以上のアミノ酸配列との配列同一性が、約３０％以上であることを特徴とする請求項４０記載の実質的に純粋なタンパク質
【請求項４２】  請求項３６から４１いずれか１項記載の実質的に純粋なタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項４３】  核酸配列の発現または調節を制御する少なくとも１つの制御配列に作動可能に結合した請求項４２記載の核酸配列を包含するベクター。
【請求項４４】  請求項４３記載のベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項４５】  ソーターゼ−トランスアミダーゼ活性を有する実質的に純粋なタンパク質を作成する方法であって：
（ａ）宿主細胞がソーターゼ−トランスアミダーゼ活性を有するタンパク質を発現するような条件下において請求項４４記載の宿主細胞を培養し；さらに
（ｂ）発現されたタンパク質を精製して、ソーターゼ−トランスアミダーゼ活性を有する実質的に純粋なタンパク質を作成する；工程を含むことを特徴とする方法。