【手続補正書】
【提出日】平成19年9月12日(2007.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞における細胞外融合の阻害または低減のために、非細胞傷害性毒素結合体を設計する方法であって、該方法が、
（Ａ）該標的細胞において細胞外融合を増大するアゴニストを同定する工程；ならびに
（Ｂ）剤を調製する工程であって、該剤が、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、これは、該標的細胞上の結合部位に該剤を結合させ、該結合部位は、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ、該ＴＭは、工程（Ａ）によって同定可能であるアゴニストである、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントであって、該標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせる、トランスロケーションドメイン
を含む剤である、工程
を含む、方法。
【請求項２】
標的細胞における細胞外融合の阻害または低減のために、非細胞傷害性毒素結合体を設計する方法であって、該方法が、
（Ａ）該標的細胞において細胞外融合を増大するアゴニストを同定する工程；ならびに
（Ｂ）剤を調製する工程であって、該剤が、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、これは、該標的細胞上の結合部位に該剤を結合させ、該結合部位は、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ、該ＴＭは、工程（Ａ）によって同定可能であるアゴニストである、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントをコードするＤＮＡ配列であって、該標的細胞で発現可能であり、そしてそのように発現されたとき、該標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得るプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントを提供する、ＤＮＡ配列；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをコードするＤＮＡ配列をトランスロケートさせる、トランスロケーションドメイン
を含む剤である、工程
を含む、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記アゴニストを同定する工程が、前記非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントを標的細胞にリターゲティングするのに適したアゴニストを同定する工程を含み、該方法が、
（Ａ）推定アゴニスト分子を同定する工程；
（Ｂ）該推定アゴニスト分子と該標的細胞とを接触させる工程；および
（Ｃ）該推定アゴニスト分子が、該分子が存在する場合に、該分子が存在しない場合と比較して、該標的細胞において細胞外融合が増大することを同定することにより、アゴニストであることを確認する工程
を含む、方法。
【請求項４】
前記推定アゴニスト分子またはアゴニストが、非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメント、または該プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントをコードするＤＮＡ配列と組み合わせられて、前記剤を形成できることを確認する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記推定アゴニスト分子またはアゴニストが、前記標的細胞上の結合部位に結合することを確認する工程であって、該結合部位が、レセプター媒介エンドサイトーシスを受けやすい、工程を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記推定アゴニスト分子またはアゴニストが、前記非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメント、または該プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を、標的細胞のサイトゾルに送達できることを確認する工程を含む、請求項３から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
工程（Ｃ）が、アゴニストが存在する場合に、該アゴニストが存在しない場合と比較して、前記標的細胞からの分泌が増大することを検出する工程を含む、請求項３から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出工程が、クロマトグラフィー、質量分光法、および／または蛍光を用いるアッセイによって実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出工程が、ＥＬＩＳＡ／ＥＩＡ／ＲＩＡ技術、および／または放射性トレーサー技術を用いるアッセイによって実施される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（Ｃ）が、アゴニストが存在する場合に、該アゴニストが存在しない場合と比較して、前記標的細胞の表面で発現される細胞膜タンパク質の濃度が増大することを検出する工程を含む、請求項３から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞膜タンパク質が細胞レセプタータンパク質であり、そして前記方法が、アゴニストが存在する場合に、該アゴニストが存在しない場合と比較して、前記標的細胞の表面で発現される該レセプタータンパク質の濃度が増大することを検出する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出工程が、免疫組織化学、フローサイトメトリー、単離された原形質膜細胞画分のウェスタンブロッティング、蛍光リガンド結合技術、および／または放射性リガンド結合技術を用いるアッセイによって実施される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞膜タンパク質がトランスポータータンパク質であり、そして前記方法が、アゴニストが存在する場合に、該アゴニストが存在しない場合と比較して、前記標的細胞の表面で発現される該トランスポータータンパク質の濃度が増大することを検出する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出工程が、免疫組織化学、フローサイトメトリー、単離された原形質膜細胞画分のウェスタンブロッティング、および／または輸送される物質の細胞内および細胞外測定を用いるアッセイによって実施される、請求項１０または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞膜タンパク質が膜チャネルタンパク質であり、そして前記方法が、アゴニストが存在する場合に、該アゴニストが存在しない場合と比較して、前記標的細胞の表面で発現される該膜チャネルタンパク質の濃度が増大することを検出する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出工程が、単離されたサンプル中のイオン濃度の生化学的測定、組織の電気生理、輸送される物質の細胞内および細胞外測定、免疫組織化学、フローサイトメトリー、および単離された原形質膜細胞画分のウェスタンブロッティングを用いるアッセイによって実施される、請求項１０または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテアーゼが、前記標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得る細菌タンパク質または該細菌タンパク質のフラグメントである、請求項１から１６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌タンパク質が、クロストリジウム神経毒素またはＩｇＡプロテアーゼから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
薬学的組成物であって、該組成物が剤を含み、該剤が、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、これは、標的細胞上の結合部位に該剤を結合させ、該結合部位は、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ、ここで該ＴＭは、該標的細胞において細胞外融合を増大し得るアゴニストである、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントであって、該標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせる、トランスロケーションドメイン
を含む、組成物。
【請求項２０】
薬学的組成物であって、該組成物が剤を含み、該剤が、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、これは、標的細胞上の結合部位に該剤を結合させ、該結合部位は、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ、ここで該ＴＭは、該標的細胞において細胞外融合を増大し得るアゴニストである、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントをコードするＤＮＡ配列であって、該標的細胞で発現可能であり、そしてそのように発現されたとき、該標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得るプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントを提供する、ＤＮＡ配列；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせる、トランスロケーションドメイン
を含む、組成物。
【請求項２１】
前記アゴニストが、前記標的細胞と接触して、該アゴニストが存在しない場合と比較して、該標的細胞からの分泌を増大させ得る、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アゴニストが、前記標的細胞と接触して、該アゴニストが存在しない場合と比較して、該標的細胞の細胞表面で発現される細胞膜タンパク質の濃度を増大させ得る、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記アゴニストが、前記標的細胞と接触して、該アゴニストが存在しない場合と比較して、該標的細胞の細胞表面で発現される細胞レセプタータンパク質の濃度を増大させ得る、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アゴニストが、前記標的細胞と接触して、該アゴニストが存在しない場合と比較して、該標的細胞の表面で発現されるトランスポータータンパク質の濃度を増大させ得る、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記アゴニストが、前記標的細胞と接触して、該アゴニストが存在しない場合と比較して該標的細胞の表面で発現される膜チャネルタンパク質の濃度を増大させ得る、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記剤が請求項１から１８のいずれかの項に記載の方法によって調製されている、請求項１９から２５のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記アゴニストが請求項３から１６のいずれかの項に記載の方法によって同定されている、請求項１９から２５のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項２８】
被験体において、前記標的細胞における細胞外融合により引き起こされる臨床症状を軽減するインヒビターをさらに含む、請求項１９から２７のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記インヒビターが、前記標的細胞への前記アゴニストの結合から生じる増大した細胞外融合により引き起こされる前記臨床症状を軽減する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記インヒビターが、被験体に投与されたときに、短期作用持続期間を有する、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記プロテアーゼが、前記標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得る細菌タンパク質または該細菌タンパク質のフラグメントである、請求項１９から３０のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記細菌タンパク質が、クロストリジウム神経毒素またはＩｇＡプロテアーゼから選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
剤をコードするＤＮＡ構築物であって、該剤が、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、これは、標的細胞上の結合部位に該剤を結合させ、該結合部位は、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ、ここで該ＴＭは、該標的細胞において細胞外融合を増大し得るアゴニストである、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントであって、該標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせる、トランスロケーションドメイン
を含み、
該構築物は、該ＴＭおよび／または該トランスロケーションドメインと、該プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントとをコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項３４】
剤を調製する方法であって、該剤が、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、これは、標的細胞上の結合部位に該剤を結合させ、該結合部位は、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ、ここで該ＴＭは、該標的細胞において細胞外融合を増大し得るアゴニストである、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントであって、該標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせる、トランスロケーションドメイン
を含み、
請求項３３に記載のＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させる工程を含む、方法。
【請求項３５】
剤を調製する方法であって、該剤が、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、これは、標的細胞上の結合部位に該剤を結合させ、該結合部位は、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ、ここで該ＴＭは、該標的細胞において細胞外融合を増大し得るアゴニストである、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントであって、該標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせる、トランスロケーションドメイン
を含み、
該ＴＭおよび／またはトランスロケーションドメインと、該プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントとを共有結合で連結する工程を含む、方法。
【請求項３６】
剤を調製する方法であって、該剤が、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、これは、標的細胞上の結合部位に該剤を結合させ、該結合部位は、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ、ここで該ＴＭは、該標的細胞において細胞外融合を増大し得るアゴニストである、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントをコードするＤＮＡ配列であって、該標的細胞で発現可能であり、そしてそのように発現されたとき、該標的細胞の細胞外融合器官のタンパク質を切断し得るプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントを提供する、ＤＮＡ配列；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせる、トランスロケーションドメイン
を含み、
該ＴＭおよび／またはトランスロケーションドメインと、該プロテアーゼまたは該プロテアーゼのフラグメントをコードするＤＮＡ配列とを共有結合で連結する工程を含む、方法。
【請求項３７】
標的細胞における細胞外融合によって引き起こされる医学的疾患または医学的状態を治療するための、請求項１９から３２のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項３８】
標的細胞における細胞外融合によって引き起こされる医学的疾患または医学的状態を治療するための、請求項１９から２７のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物が、被験体に、インヒビターの前に、該インヒビターと同時に、または該インヒビターの後に投与され、そして該インヒビターが、該被験体において、細胞外融合により引き起こされる臨床症状を軽減する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記インヒビターが、前記被験体において、前記標的細胞への前記アゴニストの結合から生じる増大した細胞外融合により引き起こされる臨床症状を軽減する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記インヒビターが、前記被験体に投与されたときに、短期作用持続期間を有する、請求項３９または４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記短期作用持続期間が１〜３日間である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記短期作用持続期間が１〜２日間である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記短期作用持続期間が２４〜３６時間である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記短期作用持続期間が１〜３日間である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記短期作用持続期間が１〜２日間である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記短期作用持続期間が２４〜３６時間である、請求項４６に記載の組成物。