【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年10月26日(2006.10.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  マイナス鎖ＲＮＡウィルス検出のための遺伝子工学的に改変された細胞であって、
・ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドと；
・上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに作動可能に連結されたマイナス鎖ＲＮＡウィルスのミニゲノムおよびミニアンチゲノムを含むｃＤＮＡと；ここで上記ミニアンチゲノムはレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、上記レポーター遺伝子産物の発現は上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスの存在に依存する、
・上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスの各ヌクレオカプシドたんぱく質をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と；ここで該ヌクレオチド配列は上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡの複製に必要かつ十分である、
を含む、前記細胞。
【請求項２】  上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項３】  上記ポリヌクレオチドが、核内に組込まれ、上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたポリメラーゼＩＩプロモーターを含む、請求項２記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項４】  上記ポリヌクレオチドが細胞非障害性のプラス鎖ウィルスのレプリコンを含む、請求項２記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項５】  上記細胞非障害性のプラス鎖ウィルスのレプリコンが、細胞非障害性のフラビウィルス（flavivirus）のレプリコン、細胞非障害性のアルファウィルス（alphavirus）のレプリコン、細胞非障害性のノダウィルス（nodavirus）のレプリコン、もしくは細胞非障害性のアストロウィルス（astrovirus）のレプリコンを含む、請求項４記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項６】  上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスが、オルソミクソウィルス（orthomyxovirus）、パラミクソウィルス（paramyxovirus）、ラブドウィルス（rhabdovirus）、フィロウィルス（filovirus）、もしくはバンヤウィルス（bunyavirus）である、請求項５記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項７】  上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスが下記のグループ：ヒトパラインフルエンザウィルス１型（human parainfluenza virus type1）、ヒトパラインフルエンザウィルス２型（human parainfluenza virus type2）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（human parainfluenza virus type3）、ヒトパラインフルエンザウィルス４型（human parainfluenza virus type4）、ヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）、ヒト呼吸器系多核性ウィルス（human respiratory syncytial virus,ＲＳＶ）、はしかウィルス(measles virus)、おたふくウィルス（mumps virus）、狂犬病ウィルス（rabies virus）、エボラウィルス（ebola virus）およびハンタウィルス（hanta virus）からなる群から選択される、請求項６記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項８】  上記レポーター遺伝子産物が、β―ガラクトシダ―ゼ（β―galactosidase）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chloramphenical acetyl transferase）、ルシフェラーゼ（luciferase）、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase）、緑色蛍光たんぱく質（green fluorescent protein）、もしくはβ―グルクロニダーゼ（βーglucuronidase）である、請求項７記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項９】  上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスがＲＳＶであり、上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、上記レポーター遺伝子産物がβ―ガラクトシダ―ゼであり、および上記ミニゲノムの複製に必要かつ十分な上記ヌクレオカプシドたんぱく質が、３つのＴ７発現プラスミドによりコードされる上記ＲＳＶたんぱく質Ｎ，Ｐ，およびＬである、請求項８記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項１０】  サンプル中のマイナス鎖ＲＮＡウィルスの検出方法であって、
（ａ）遺伝子工学的に改変された細胞を提供する工程；ここで該細胞は下記を含む、
・ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド、
・上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに作動可能に連結されたマイナス鎖ＲＮＡウィルスのミニゲノムおよびミニアンチゲノムを含むｃＤＮＡ（ここで上記ミニアンチゲノムはレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、上記レポーター遺伝子産物の発現は上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスの存在に依存する）、
・上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスの各ヌクレオカプシドたんぱく質をコードする1つ以上のヌクレオチド配列（ここで該ヌクレオチド配列は上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡの複製に必要かつ十分である）、
（ｂ）ミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡを合成し、上記ヌクレオチドカプシドたんぱく質を発現するのに充分な時間、前記細胞を培養する工程と；
（ｃ）サンプルと共に前記細胞を培養する工程と；
（ｄ）上記レポーター遺伝子産物の発現を検出する工程と；
を含む、前記方法。
【請求項１１】  上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】  上記ポリヌクレオチドが、核内に組込まれ、上記ポリヌクレオチドの転写を引き起こすことができるポリメラーゼＩＩプロモーターを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】  上記ポリヌクレオチドが細胞非障害性プラス鎖ウィルスのレプリコンの転写物を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】  上記細胞非障害性のプラス鎖ウィルスのレプリコンが細胞非障害性のフラビウィルス（flavivirus）のレプリコン、細胞非障害性のアルファウィルス（alphavirus）のレプリコン、細胞非障害性のノダウィルス（nodavirus）のレプリコン、もしくは細胞非障害性のアストロウィルス（astrovirus）のレプリコンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】  上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスが、オルソミクソウィルス（orthomyxovirus）、パラミクソウィルス（paramyxovirus）、ラブドウィルス（rhabdovirus）、フィロウィルス（filovirus）、もしくはバンヤウィルス（bunyavirus）である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】  上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスが下記のグループ：ヒトパラインフルエンザウィルス１型（human parainfluenza virus type1）、ヒトパラインフルエンザウィルス２型（human parainfluenza virus type2）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（human parainfluenza virus type3）、ヒトパラインフルエンザウィルス４型（human parainfluenza virus type4）、ヒトインフルエンザウィルス（human influenza virus）、ヒト呼吸器系多核性ウィルス（human respiratory syncytial virus,ＲＳＶ）、はしかウィルス(measles virus)、おたふくウィルス（mumps virus）、狂犬病ウィルス（rabies virus）、エボラウィルス（ebola virus）およびハンタウィルス（hanta virus）からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】  上記レポーター遺伝子産物が、β―ガラクトシダ―ゼ（β―galactosidase）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chloramphenical acetyl transferase）、ルシフェラーゼ（luciferase）、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase）、もしくは緑色蛍光たんぱく質（green fluorescent protein）である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】  上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスがＲＳＶであり、上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼであり、上記レポーター遺伝子産物がβ―ガラクトシダ―ゼであり、および上記ミニゲノムの複製に必要かつ十分な上記ヌクレオカプシドたんぱく質が、３つのＴ７発現プラスミドによりコードされる上記ＲＳＶたんぱく質Ｎ，Ｐ，およびＬである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】  サンプル中でマイナス鎖ＲＮＡウィルスを検出するキットであって、該キットは、遺伝子工学的に改変された細胞を供給するための容器を含み；
ここで前記細胞は、
・ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドと、
・上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに作動可能に連結されたマイナス鎖ＲＮＡウィルスのミニゲノムおよびミニアンチゲノムを含むｃＤＮＡ（ここで上記ミニアンチゲノムはレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、レポーター遺伝子産物の発現はマイナス鎖ＲＮＡウィルスの存在に依存する）と、
・上記マイナス鎖ＲＮＡウィルスの各ヌクレオカプシドたんぱく質をコードする1つ以上のヌクレオチド配列（該ヌクレオチド配列は上記ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡの複製に必要かつ十分である）と、
を含む、前記キット。
【請求項２０】  上記レポーター遺伝子産物の発現を検出するのに必要な試薬の供給物をさらに含む、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】  上記レポーター遺伝子がβ―ガラクトシダ―ゼである、請求項７記載の遺伝子工学的に改変された細胞。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の詳細な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［政府補助の照合］
この発明は、米国政府補助の下、国立保健機関に認められた認可番号ＡＩ11377によって成された発明である。したがって、米国政府は確かにこの発明における権利を所有する。
［発明の背景］
(１)発明の分野 
本発明は、一般的にウィルス学の分野における、特に生物学的試料および遺伝子工学的に改変された細胞を使用する手法において、マイナス鎖ＲＮＡウィルスの検出に使用される。
(２)関連技術の詳細な説明 
多くのマイナス鎖ＲＮＡウィルスは、人間や他の動物にとっての病因である。マイナス鎖ＲＮＡウィルスが引き起こす人間の病気の例としては、おたふくかぜ、はしか、肺炎、気管支炎、インフルエンザ、感染性クループ（infectious croup）、狂犬病、エボラ出血性熱、マルブルク出血性熱とラクロシー脳炎（LaCrosse encephalitis）がある。それゆえ、生物学的検体におけるマイナス鎖ＲＮＡウィルスの検出は、様々な研究目的に取って、臨床的に非常に重要である。
【０００２】
しかしながら、マイナス鎖ＲＮＡウィルスの相当多様化しているゲノム構造の違いや生物学的特質、およびそれらウィルス自身によるＲＮＡ複製や転写の戦略などがある。すべてのＲＮＡウィルスの特徴として、マイナス鎖ＲＮＡウィルスは、それらｍＲＮＡの転写とゲノムの複製にとっての要因としてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼと他のＲＮＡレプリカ―ゼと転写酵素の必要性がある。（Olivo,P.D.,Clin.Microb.Rev.9:321-334,1996）。マイナス鎖ウィルスのウィルス粒子中では、ＲＮＡポリメラ―ゼはヌクレオキャプシドたんぱく質とＲＮＡゲノムの複合体を形成する。いったんウィルス粒子が細胞に入り込むと、膜を溶かし始め、そのウィルス粒子はＲＮＡゲノムからゲノムの基となるｍＲＮＡを転写する。ＲＮＡポリメラ―ゼはまた、多くのマイナス鎖ＲＮＡゲノムを複写するための鋳型として、また付加的なウィルスｍＲＮＡの２次転写の鋳型として、完全長のプラス鎖の複製可能な中間産物ＲＮＡ（アンチゲノム）を合成する。
【０００３】
また、マイナス鎖ウィルスの研究は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼが唯一ウィルス特異的ヌクレオキャプシドたんぱく質と関連するＲＮＡを鋳型とし、細胞中に入った剥き出しのＲＮＡゲノムは複製しないため、複雑化している。（Burkreyev et al.,J.Virol. 70:6634-6641, 1996;Olivo,supra）。しかしながら、最近の研究では、多くの研究室において様々なマイナス鎖ウィルスの遺伝的操作が進展していることが報告されている。例えば、ヌクレオキャプシドの組み立てとＲＮＡの複製と転写に必要なウィルス性たんぱく質を含んだ細胞質中では、ｃＤＮＡゲノムから完全長のアンチゲノム転写を合成するＴ７ＲＮＡポリメラ―ゼによって、感染性狂犬病ウィルス、仙台ウィルス、水胞性口炎ウィルス、はしかウィルスと呼吸器性合胞体性ウィルス（ＲＳＶ）が復元されていることが報告されている。（Schnell et al.,EMBO J 13:4195-4203, 1994; Garcin et al.,EMBO J 14:6087-6094, 1995; Lawson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92:4477-4481, 1995; Radecke et al.,EMBO J 14:5773-5784, 1995; Whelan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92:8388-8392, 1995; Collins et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92:11563-11567, 1995;）。最近の報告では、Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼの遺伝子を含んだ組み換え体ワクシニアウィルスによって感染された細胞の細胞質に提供されることが分かっている。
【０００４】
また、他のマイナス鎖ＲＮＡウィルスの複製と転写におけるウィルス性たんぱく質機能研究調査では、‘ミニゲノム’：部分的もしくはすべてのウィルス性たんぱく質を意味する配列が複製と転写のために必要なシス活性要素が置かれたレポーター遺伝子に置換されている；がそのシステムとして採用されていることが分かってきた。参照例、Grosfeld et al.,J. of Virol.69:5677-5686,1995; Conzelmann et al.,J. Virol.68:713-719,1994; De et al., Virol.196:344-348,1993; Dimock et al.,J. Virol.67:27722-2778,1993.この研究方法によって、ミニゲノムがバクテリオファージＲＮＡポリメラ―ゼのプロモーターに作動可能に連結されたｃＤＮＡが合成され、また、ミニゲノムｃＤＮＡが細胞にトランスフェクションされ、組み換え体ワクシニアウィルスの感染によって供給されたバクテリオファージＲＮＡポリメラ―ゼによって引き起こされ、共にトランスフェクションされたプラスミドによって供給される多種のウィルス性たんぱく質が存在する中でバクテリオファージＲＮＡポリメラ―ゼによって転写されることが分かった。レポーター遺伝子発現の導入は、トランスフェクションした細胞がミニゲノムの複製と転写に必要なすべてのウィルス性たんぱく質を発現していることを示している。
【０００５】
ＲＳＶの複製と転写の研究にこの取り組みを活用して、主なヌクレオキャプシドたんぱく質（Ｎ）、ヌクレオキャプシドに関連したりんたんぱく質（Ｐ）とポリメラ―ゼＬたんぱく質はミニゲノムの複製に必要なものであると証明された。(Grosfeld et al.,supra;Yu et al.,J.Virol.69:2412-2419,1995)。また、CATレポーター遺伝子を含むミニゲノムによるＮ，Ｐ，とＬたんぱく質の発現は、未完全なＣＡＴｍＲＮＡ種とＣＡＴの豊富な発現におけるすべてのサイズの合成結果である。（Grosfeld et al.,supra）.その反対に、完全長ｍＲＮＡの十分な合成は、ミニゲノムｃＤＮＡとＮ，ＰおよびＴ７発現ワクシニアウィルスとＲＳＶ；例えば、ミニゲノムＲＮＡとＮ，ＰとＬたんぱく質は感染性ＲＳＶの存在下にてＴ７ＲＮＡポリメラ―ゼにより合成される（Grosfeld et al.,supra）、を伴って感染するＬ発現プラスミドを細胞に含んでいるときに観察される。後の研究は付加的なＲＳＶたんぱく質の発現、および転写伸長要素Ｍ２―１は、このＴ７―発現プラスミド補足システムにおける連続した転写の完全な工程に要求されていることを論証した。(Collins et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:81-85,1996)。米国特許番号5,591,579において、遺伝子工学的細胞株とプラス鎖ＲＮＡウィルスによる検出方法が記載されている。その細胞株は安定して、ＲＮＡウィルスとレポーター遺伝子によるトランス活性酵素による複製と転写に必要なＲＮＡウィルスゲノムのシス活性配列を含んだ構造的に欠陥のあるＲＮＡウィルスゲノムのｃＤＮＡコピーと共に形質転換される。ｃＤＮＡは、構成的に寄宿細胞核中のＲＮＡポリメラ―ゼIIプロモーターからプラス鎖ＲＮＡ分子に転写されるが、ほんの少しか、もしくはほとんど、レポーター遺伝子の発現が、その細胞がシス活性配列を認識するプラス鎖ＲＮＡウィルスに感染されるまで起こらず、プラス鎖ＲＮＡ分子からマイナス鎖ＲＮＡ分子を介した重要な複製を引き起こす。
【０００６】
近年、形質転換した細胞株を検出する動物ウィルスとして推測された同様の戦略を使った記事が、細胞株を形成するためのマイナス鎖ＲＮＡウィルスの検出として使われている可能性もある（Olivo et al., supra）。その記事は、一般的にそのような細胞株は構成的にウィルス性ヌクレオキャプシドたんぱく質、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んだキメラアンチゲノムＲＮＡ分子、同じマイナス鎖ＲＮＡウィルスのレプリカ―ゼとトランスクリプターゼによる複製と転写シス活性配列を発現するであろうと述べている。このキメラＲＮＡ分子は非特異的な法則によって、非感染の細胞においてレポーター遺伝子の翻訳が起こらないように設計されているものと考えられる。キメラＲＮＡ分子の複製と転写、および翻訳可能なレポーター遺伝子のｍＲＮＡの合成は、マイナス鎖ＲＮＡウィルスの感染した仮説細胞中のレプリカ―ゼとトランスクリプターゼの複合体によって引き起こされると考えられる。しかしながら、この記事はどのようにヌクレオキャプシドたんぱく質とキメラＲＮＡ分子が構成的に発現されるか、もしくはウィルスに非感染のレポーター遺伝子の翻訳を妨げるキメラＲＮＡ分子の設計法については教示していない。それゆえマイナス鎖ＲＮＡウィルスの感染を検出するために、早く、特異的に、感受性が高く、経済的な検定方法を供給することが望まれる。
［発明の概要］
簡単に言うと、本発明は、検体におけるマイナス鎖ＲＮＡウィルスの感染を検出する新規な合成物と方法に向けられている。具体例の１つとしては、その発明はマイナス鎖ＲＮＡウィルスの感染したウィルスの存在下においてのみレポーター遺伝子産物を発現する遺伝子工学的に改変された細胞を提供する。その遺伝子工学的に改変された細胞は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼをコードするポリヌクレオチド、ミニゲノムから成るｃＤＮＡ、またＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼのプロモーターに作動可能に連結されたマイナス鎖ＲＮＡウィルスのミニアンチゲノムを構成している。そのミニアンチゲノムは、マイナス鎖ＲＮＡウィルス存在下において発現するレポーター遺伝子産物の塩基配列から成っている。
【０００７】
細胞内でのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼの発現は、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を起点とするプロモーターの配向によるｃＤＮＡからミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡへの転写をする。そのプロモーターがＯＲＦの下流に位置するときは、ＯＲＦレポーター遺伝子のマイナス鎖のコピーを翻訳できないミニゲノムＲＮＡは合成され、プロモーターがＯＲＦの上流に位置するときは、ミニアンチゲノムＲＮＡが合成される。このミニアンチゲノムはＯＲＦレポーター遺伝子のプラス鎖のコピーを含んでいるが、その翻訳は、ミニアンチゲノムがポリアデニル化されたｍＲＮＡキャップ構造を持っていないため、非常に非効率である。それゆえ、非感染ウィルスにおけるレポーター遺伝子の検出できる発現は起こらない。また、その細胞は、必要かつ十分なミニゲノムＲＮＡの複製もしくはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼによるミニアンチゲノムを合成するマイナス鎖ＲＮＡウィルスのそれぞれのヌクレオキャプシドたんぱく質をコードする１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの配列から成っている。それらのヌクレオキャプシドたんぱく質存在下にて合成され、ミニアンチゲノムの複製中にミニゲノムＲＮＡを中間産物として産生するミニゲノムＲＮＡは、レポーター遺伝子産物の検出可能な発現が無くても、安定化され増幅される。マイナス鎖ウィルスに感染した細胞は、仮形成されたミニゲノムＲＮＡの転写に必要な全てのウィルス遺伝子産物が、レポーター遺伝子産物をコードする翻訳可能なｍＲＮＡ分子を作製するように導く。
【０００８】
また、他の具体例として、この発明は上述した遺伝子工学的に改変した細胞においてミニゲノムおよびミニアンチゲノムＲＮＡもしくはヌクレオキャプシドたんぱく質を十分な時間で合成するサンプル中におけるマイナス鎖ＲＮＡウィルスの検出方法、その細胞のサンプル中での培養方法、レポーター遺伝子産物の発現の検出を提供する。その具体例において、その方法は、サンプル中に存在する感染したウィルス粒子の定量を含んでいる。
【０００９】
また、他の具体例として、遺伝子工学的に改変した細胞は対ウィルス活性化合物のふるい分けおよび人がＲＮＡウィルス感染またはＲＮＡウィルスをワクチン化時における抗体反応の測定化合物のふるい分けに使われる。
【００１０】
また、他の具体例においては、この発明は上述した遺伝子工学的に改変した細胞の供給によって成るサンプル中のマイナス鎖ＲＮＡウィルス検出キットを提供する。好ましい具体例としては、そのキットはまた、レポーター遺伝子産物の発現を検出する溶液の組合せを含んでいる。
【００１１】
本発明はまた、マイナス鎖ＲＮＡウィルスの検出ができる、遺伝子工学的に改変した細胞の作成方法を提供する。その方法は、３つの要素からなっている。（１）マイナス鎖ＲＮＡウィルスの感染に感受性がある細胞を供給する；（２）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入し、そのような配列を持つものを選別している；（３）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼのプロモーターに作動可能に連結されたマイナス鎖ＲＮＡウィルスのミニゲノムとミニアンチゲノムから構成されているｃＤＮＡを選別した細胞に導入する。ここでは、ミニアンチゲノムはレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、また、レポーター遺伝子産物の発現はマイナス鎖ＲＮＡウィルスの存在に依存する；また（３）は、マイナス鎖ＲＮＡウィルスのヌクレオキャプシドたんぱく質、ミニゲノムＲＮＡの複製およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼによるミニアンチゲノムＲＮＡの合成をコードする１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの配列を細胞を提供する。
【００１２】
現発明のいつくかの優位な点は、特にマイナス鎖ＲＮＡウィルスに感染した後のみレポーター遺伝子産物の発現をする遺伝子工学的改変細胞の供給；早くて感度の高いマイナス鎖ＲＮＡウィルスを特異的に検出する測定法の提供；マイナス鎖ＲＮＡウィルスの定量化測定方法、例えば抗ウィルス活性物質を含んだサンプル中および感染やワクチン化による抗体反応の測定など；およびマイナス鎖ＲＮＡウィルスの検出かつ定量化キットの供給である。
［好ましい具体例の詳細］
現発明にしたがって、マイナス鎖ＲＮＡウィルスの検出方法と遺伝子工学的に改変された細胞の方法を提供する。この発明は、下記に記載の（１）および（２）の発見によっている；（１）マイナス鎖ＲＮＡウィルスのミニゲノムＲＮＡはウィルス性ヌクレオキャプシドたんぱく質：細胞がマイナス鎖ウィルスに感染時において、翻訳可能なレポーター遺伝子のｍＲＮＡの転写を行いやすい；が存在し、遺伝子工学的に改変された細胞によって発現される；（２）レポーター遺伝子産物の発現はマイナス鎖ウィルスが存在しない場合、検出可能なほど発現しない。
【００１３】
この発表の文脈においては、特に説明をしない限り、次ぎに記す用語が定義づけられる。： ‘シス活性配列’はゲノムの複製および、もしくは転写を行うＲＮＡウィルスの特定のたんぱく質によるゲノミックＲＮＡの認識に必要なＲＮＡウィルスゲノムのヌクレオチド配列を意味する。；
‘異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ’は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼで、脊椎動物の細胞では、自然にコードされていない。；
‘感染性’は、ウィルスやＲＮＡ分子を表す時に使用され、宿主細胞において、ウィルスｍＲＮＡの転写を供給し自家複製するウィルスもしくはＲＮＡ分子を意味する。；
‘ミニアンチゲノム’はミニゲノムに相補的なＲＮＡ分子やＤＮＡ分子を意味する。；
‘ミニゲノム’は、１つもしくはそれ以上のウィルス性たんぱく質をコードする配列中にレポーター遺伝子の、マイナス鎖を読み取る性質を持つオープンリーディングフレームを含んだマイナス鎖ウィルスに感染した細胞における複製と転写に必要なシス活性配列を含んだマイナス鎖ウィルスのゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡアナログを意味する。；
‘マイナス鎖ＲＮＡウィルス’は、１つのマイナス鎖を読み取るＲＮＡ分子（非セグメントゲノム）かネガティブセンスのＲＮＡ分子の大多数（セグメントゲノム）とポジティヴセンスＲＮＡの中間産物を介してその複製したゲノムを持つウィルスを意味する。；
‘レプリコン’は、ウィルスの複製に必要であるが、ウィルスの組み立てには必要ではない遺伝的情報を含んでいる複製能力のあるウィルスＲＮＡを意味する。；
‘トランスフェクションした細胞’もしくは‘形質転換細胞’は、細胞の核もしくは細胞質内に、外因性の核酸を持つ細胞を意味する。；
‘安定的な形質転換細胞’は、細胞の核に、外因性の核酸を持ち、それが安定的に細胞の染色体遺伝子に合体している細胞を意味する。；
本発明による遺伝工学的に改変された細胞は、マイナス鎖ＲＮＡウィルスの感染に感受性があり、検出でき、かつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼにより認識されるプロモーターによりマイナス鎖ウィルスのミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡを合成する異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする脊椎動物の細胞である。また、その細胞は、ミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡの複製に必要なマイナス鎖ウィルスのヌクレオキャプシドたんぱく質を発現することができる。
【００１４】
もし、感染したウィルスが細胞中に入ってきて、その複製サイクル可能な状態に進み、仮形成されてからのミニゲノムＲＮＡレポーター遺伝子ｍＲＮＡの翻訳可能な合成に十分なたんぱく質を発現し始めたら、その細胞は感染に対する感受性があると言う。それは特にマイナス鎖ＲＮＡウィルスによる感染に感受性のある細胞株は感受性のある細胞株と、もしくは実験室でのみ日常的に良く知られている手順のふるい分けによって選び出された細胞株は知られている文献を探り出すことによって定義づけることができるとその技術によって理解されるであろう。マイナス鎖ＲＮＡウィルスに感受性のある細胞は、乳児ハムスター腎臓細胞に限っただけではなく、アフリカミドリザルの細胞、ウサギの皮膚線維芽細胞、３Ｔ３マウス細胞などが含まれる。乳児ハムスター腎臓細胞は、人間を含んだ哺乳類に感染するマイナス鎖ＲＮＡウィルスを検出する宿主細胞として好まれて使われる。
【００１５】
異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、自然に引き起こされたアミノ酸配列もしくはそれと同等の機能を持つ配列の構成を持った細胞により発現される。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼの機能的に同等なものは、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換体、鋳型ＤＮＡからの完全長転写の合成によるポリメラ―ゼの可変を避けられない自然なアミノ酸配列における付加もしくは除去を含んでいる。一般的に、異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７，Ｔ３，もしくはＳＰ６のようなバクテリオファージによって合成されるＲＮＡポリメラ―ゼのアミノ酸配列を含んでいる。好まれるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼは、本発明では、Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼが使用されている。
【００１６】
ひとつの具体例として、異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、細胞核に組込まれたポリヌクレオチドによりコードされ、異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしたヌクレオチド配列に作動可能に連結された宿主細胞の転写機構によって認識されるポリメラ―ゼＩＩプロモーターからなる。好ましい具体例によると、異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドは、細胞非障害性のプラス鎖ウィルスのレプリコンから成るＲＮＡ分子である。細胞非障害性レプリコンによって、宿主細胞を殺すことなく、長い期間に続けてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼの発現を可能にする。レプリコンの可変は、それらを細胞非障害性にすることが、この技術の中で知られており、成し遂げることができる、例えば、異なったウィルスの複製機構において、改造した変異を持つ異形を孤立させることによって、脊椎動物細胞の中、もしくは支配している選択マーカーを使うことによって細胞非障害性複製を持続することが可能である。（例、Frolov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:11371-11377, 1996とそれらの引用参照文献）細胞非障害性レプリコンの準備に好ましいウィルスは、以下を含んでいる；フラビウィルス属、例えば、クンジンウィルス(Kunjin virus)、シンビスウィルス(Sindbis virus)やセムリキフォレストウィルス(Semliki Forest virus)のようなアルファウィルス(Alpha virus)、フロックハウスウィルス(Flock House virus)のようなノダウィルス(Noda virus)、アストロウィルス(Astrovirus)とコロナウィルス属である。細胞非障害性レプリコンは、ポリメラ―ゼＩＩプロモーターに作動可能に連結された、および細胞核の中に組込まれたレプリコンのｃＤＮＡから転写される。また、別の選択として、レプリコンはプラスミドから抽出し、細胞質にトランスフェクションさせて、化学的もしくは試験管における転写によってもたらすことができる。
【００１７】
異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、検出されるマイナス鎖ＲＮＡのウィルスミニゲノムとミニアンチゲノムから成るｃＤＮＡ中のプロモーターを特異的に認識する。一般的に、プロモーターのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼをコードする同じ生物中にあるプロモーターの配列と同じである。しかしながら、そのプロモーターは置換体の影響によってＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼによる認識が妨げられない限り、１つもしくはそれ以上のヌクレオチド置換体をその自然に起こる配列中に持っている可能性もある。そのプロモーターは、ミニゲノムをコードしているＤＮＡ配列あるいはミニアンチゲノムをコードして直接ミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡを合成する機能にそれぞれ関連している。好ましくは、そのプロモーターは直接ミニゲノムＲＮＡを合成する。
【００１８】
ウィルスゲノム由来のシス活性３’末端リーダーと５’末端尾配列から構成されるｃＤＮＡによってコードされているミニゲノムはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼをコードしたウィルスによる複製と転写に必要である。セグメントゲノムを持っているＲＮＡウィルスの検出にとって、どんなセグメントからのシス活性配列も機能的なミニゲノムを作成すると信じられている。そのようなシス活性配列は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼによって認識される、遺伝子開始（ＧＳ）と遺伝子終了/ポリアデニル化転写（ＧＥ）シグナルと作動可能に連結されたレポーター遺伝子ＯＲＦのネガティブセンスコピーを近傍に配置している。どんな特異なマイナス鎖ＲＮＡウィルスのリーダー、テール、ＧＳおよびＧＥ配列であっても、科学的な文献で見つけることができたり、良く知られ日常的な技術を使う熟練された職人によって特定することができる。参照、Weng et al.,Genome.Res.5:202-207, 1995; Garcia-Sastre et al.,Annu.Rev.Microbiol.47:765-790, 1993および引用参照文献。さらに、ミニゲノムは複製もしくはミニゲノムの転写、マイナス鎖ウィルス存在下でのレポーター遺伝子ｍＲＮＡの生産を壊さずに、自然に起こったリーダー、尾、ＧＳおよびＧＥの配列中の可変を含むことができる。
【００１９】
検出可能な産物をコードするどんなレポーター遺伝子も、本発明においては適切である。そのレポーター遺伝子産物は、簡単に定量できるか細胞中で検出できる好ましいものである。レポーター遺伝子産物がβ―ガラクトシダ―ゼという酵素は、特に有用であると証明されている。むしろ、バクテリアのβ―ガラクトシダ―ゼ；最も好ましく使われている大腸菌由来のβ―ガラクトシダ―ゼは、ＬａｃＺ遺伝子にコードされている。β―ガラクトシダ―ゼは、その特性やそのさまざまな検出方法が良く知られているので、好んで使用される。また、この発明中で有用な他のレポーター遺伝子産物は、一般的に以下のものを含んでいる；ハイドロレース（hydrolases）もしくはオキドリダクタ―ゼ（oxidoreductases）、および、特に酵素としてβ―グルコシダ―ゼ（β―glucosidase）、β―グルコロニダ―ゼ（β―glucuronidase）、β―へキソサニダ―ゼ（β―hexosaminidase）、ルシフェラーゼ（luciferase）、フォスフォリパーゼ（phospholipase）、フォスファターゼ（phosphatase）、などである。緑色発色性たんぱく質（ＧＦＰ）は別のレポーター遺伝子産物として、この発明において有用である。
【００２０】
β―ガラクトシダ―ゼもしくはルシフェラーゼをコードしているＯＲＦは、多く知られているそれらの酵素の発現検出法とそれらの手法が比較的高感度なため、特に好まれてこの発明において使用されている。それらの手法は肉眼もしくは顕微鏡で検出できるが、細胞の色が変わることによってβ―ガラクトシダ―ゼ活性を検出するため、色を生じたり、蛍光を生じる基質を利用する組織化学測定方法を含んでいる。ルシフェラーゼの使用は、発色もしくは蛍光によるβ―ガラクトシダ―ゼ測定法よりも高感度な酵素的測定方法を供給する。ルシフェラーゼの発現は、ルシフェリンを酵素基質として使用した場合のルミノメトリック法で知られる手法によって検出される。
【００２１】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼで合成されたミニゲノムもしくはミニアンチゲノムは複製可能な末端を持っている。これらは、当分野で公知の方法を用いて、ミニゲノムをコードするｃＤＮＡの適切な構築により生成され得る。例えば、そのｃＤＮＡはミニゲノムもしくはそのミニアンチゲノムと作動可能に連結されたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼによって認識される少なくとも１つの転写終了域を含んでいる。より好ましくは、そのｃＤＮＡは転写終了域とミニゲノムもしくはミニアンチゲノムの３’末端との間に位置する自己切断リボザイムから成っている。リボザイムの位置、例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼによって合成されるｃＤＮＡの転写などは、複製可能な３’末端を有するミニゲノムＲＮＡやミニアンチゲノムを作成するリボサイムによって切断される。同様に、そのｃＤＮＡは自己切断リボザイム配列をＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼのプロモーターとミニゲノムＲＮＡおよびミニアンチゲノムのそれぞれに対応したテールもしくはリーダー配列の間に持っている、例えば５’末端は複製可能であるような配列。多くの自己切断リボザイムのこの発明における適切な使用は技術として知られている。参照例、Grosfeld et al.,supra;Long etal.,FASEB J.7:25-30, 1993; Perrotta et al.,Nature.350:434-436, 1991。
【００２２】
また、遺伝子工学的に改変された細胞は、ｃＤＮＡから転写されたミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡの複製に必要十分なヌクレオキャプシドたんぱく質をコードした１つもしくはそれ以上の配列から成っている。ここで使われている‘複製に必要十分な’という意味は、ｃＤＮＡから合成されたミニゲノムＲＮＡもしくはミニアンチゲノムＲＮＡがそれらヌクレオキャプシドたんぱく質の存在下にあるとき、検出されるべきマイナス鎖ウィルスの非存在下において複製される一方で、レポーター遺伝子の検出可能な発現は細胞がマイナス鎖ウィルスに感染されるまでは起こらないことを意図する。また、ここで用語として使われる‘レポーター遺伝子の検出可能な発現’と‘マイナス鎖ウィルスの存在による’意味は、レポーター遺伝子産物は実際には特定の診断測定で使われる背景レベルを超えて検出可能という意味である。ここで言う背景レベルとは、感染ウィルスの非存在下での測定値、もしくはレポーター遺伝子を欠いた遺伝子工学的に改変した細胞において行われた測定値を意味する。
【００２３】
下記に説明するように、ＲＳＶミニゲノムの複製に必要十分なヌクレオキャプシドたんぱく質は、Ｎ，Ｐ，およびＬたんぱく質である。他のマイナス鎖ウィルスにおけるそれらたんぱく質の機能的な相対物は、科学的文献とこの技術の中で知られている手法によって定義付けすることができる。ヌクレオキャプシドたんぱく質の複合体は、実施例３において実施され、結論づけられたどんなマイナス鎖ウィルスのミニゲノムを複製するのにも必要十分なものである。要約すると、Ｔ７発現プラスミドはヌクレオキャプシドたんぱく質のそれぞれを発現するよう構築され、これらのプラスミドの様々な組合せは、Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼを発現し、ミニゲノムをコードするｃＤＮＡを含む脊椎動物細胞に導入される。結果として、遺伝子工学的に改変された細胞は、ミニゲノムの複製が続くのに十分な時間培養され、次いでその細胞は偽感染もしくはマイナス鎖ウィルスに感染し、レポーター遺伝子の発現が測定される。本発明におけるヌクレオキャプシドたんぱく質複合体の適切な使用は、ウィルスの非存在下において検出可能なレポーター遺伝子産物を欠いた細胞における感染前の発現結果であるが、しかしウィルスの存在下においてはレポーター遺伝子産物の十分な発現が示される。どれか、もしくはすべてのヌクレオキャプシドたんぱく質はアミノ酸の置換体もしくは欠如体を可変したたんぱく質の機能が元来のたんぱく質と同じである自然な状態の塩基配列に含んでいる可能性もあるということを意図する。
【００２４】
求めているヌクレオキャプシドたんぱく質をコードするヌクレオチドの配列は細胞にトランスフェクションしたポリヌクレオチドを分けることによって得られ、また求めるヌクレオキャプシドたんぱく質をコードする転写単位で分けたポリヌクレオチドによって得られる。ヌクレオキャプシドたんぱく質のｍＲＮＡの発現は、プロモーターと宿主細胞質で発現、もしくは宿主細胞核中のポリメラ―ゼIIによる異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識する転写終了信号によって導かれる。そのような細胞非障害性レプリコンが表現するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ―ゼの具体例において、レプリコンは整形ヌクレオキャプシドたんぱく質；例えば、異なったサブゲノミックプロモーターからのそれぞれのヌクレオキャプシドたんぱく質のｍＲＮＡを発現するレプリコン、をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。好ましい具体例において、異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７，Ｔ３，もしくはＳＰ６ＲＮＡポリメラ―ゼであり、所望のヌクレオキャプシドたんぱく質に関するヌクレオチド配列は、対応するＴ７，Ｔ３，もしくはＳＰ６プロモーターに作動可能に連結されている。
【００２５】
本発明により供給された手法に従って、前述された遺伝子工学的に改変された細胞はサンプル中におけるマイナス鎖ウィルスの存在を判断するテストに使用される。そのサンプルは、液体状になるどのような物質でもよく、もしくは液体で血液、血清、鼻咽頭スワブ、脳脊髄液のような生物学的液体を含んだ液体でも良い。
【００２６】
その手法を実行するため、遺伝子工学的に改変された細胞は、最初に、ミニゲノムもしくはミニアンチゲノムＲＮＡの合成とヌクレオキャプシドたんぱく質の発現に十分な一定の時間培養する。この培養工程は、進入ウィルスの複製または転写機能によるレポーター遺伝子産物の効率的な発現を推進する包膜化形態（encapsidated form）においてミニゲノムＲＮＡを供給すると信じられている。一般的には、この最初の培養工程は１６から２４時間かかるが、機能的な包膜化（encapsidated）ミニゲノムＲＮＡを生み出すのに培養時間は短すぎても長すぎてもいけなく、特定の測定法における適切な培養時間は、実験上経験的に決められる。
【００２７】
培養前の細胞は、適切な培養培地を持ったサンプルと共に目的のＲＮＡウィルスが進入して、感染するに十分な時間培養される。もし、目的のウィルスが検体中に存在すれば、それがレポーター遺伝子産物の発現を検出するのに必要な要素を生み出す。一般的に、この培養時間は２４時間から４８時間であり、しかしながら、どれか特別なマイナス鎖ＲＮＡウィルスの適当な時間は、実験上経験的に決めるべきである。レポーター遺伝子産物の発現は、細胞中、培養培地中、もしくは細胞抽出物中で決められる。
【００２８】
また、本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウィルス検出のキットを供給する。そのキットは、本発明にしたがって、多くの回数および測定を行うのに十分な上述の遺伝子工学的に改変された細胞を容器に入れて供給される。好ましくは、そのキットはレポーター遺伝子産物の検出に十分な溶液をそれぞれの容器にて供給される。説明仕様書もキットの中に含まれる。
【００２９】
その手法と発明の細胞は、下記の系統群に属すマイナス鎖ＲＮＡウィルス検出に有用である；ラプドウィルス科（Rhabdoviriddae）, フィロウィルス科（Filoviridae）, パラミクソウィルス科（Paramyxoviridae）, オルソミクソウィルス科（Orthomyxoviridae）, バンヤウィルス科（Bunyaviridae）, およびアレナウィルス科（Arenaviridae）である。
【００３０】
本発明における下記の実施例は、図によって提出されているので、限られた感覚で考えるだけではない。
【００３１】
実施例１ 
この実施例は、Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼが乳児ハムスターの腎臓細胞においてシンビスウィルス（Sindbis virus）レプリコンによる発現が機能していることを示している。
【００３２】
上述したように、マイナス鎖ＲＮＡウィルスにおける複製と転写の研究は、Ｔ７プロモーターの制御下において、求められる遺伝子の転写をする細胞間Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼを供給するワクシニアウィルス/Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼシステムが使われている。しかしながら、ワクシニアウィルスとインフェクションを要求するＲＮＡ検出手法は、医療診断上の目的において実践的でないと思われる。それゆえ、この発明者は、簡単に操作できて、より広く浸透できる方法として、安定的に形質転換した細胞を使用してシステムが発展することを願った。
【００３３】
近年、細胞非変質シンビス（Sindbis）ウィルスレプリコンはシンビス（Sindbis）サブゲノミックＲＮＡプロモーター(SR19/pac)の制御下におけるプロマイシン耐性遺伝子（pac）を含んで発展してきた。（Frolov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:11371-11377, 1996）。SR19/pacレプリコンのｃＤＮＡから試験管内で転写したＲＮＡとトランスフェクションしたＢＨＫ細胞は一群のプロマイシン耐性細胞を生じ、構造的な細胞非障害性レプリコンの複製と転写の結果、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼの発現を生じる（図１Ａ）。付加的な外来遺伝子と作動可能に連結された二次的サブゲノミックＲＮＡプロモーターを発現するＳＲ１９/pacレプリコンの改変は達成された。（Lindenbach et al.,J.Viro.71:9608-9617, 1997）。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼ(SR19/T7/Pol/pac)を発現するレプリコンを含んでいる細胞は、遺伝子のトランスフェクションを導くＴ７プロモーターの制御下において転写できる（Agapov,E., et al.,Proc.Natl.Sci.USA95:12989-12994, 1998）。
【００３４】
もしSR19/T7/Pol/pacシステムがＢＨＫ細胞において機能的なＴ７ＲＮＡポリメラ―ゼが発現する作用を使えるのであれば、ＳＲ６ＲＮＡポリメラ―ゼによるSR19/pacとSR19/T7/Pol/pac ｃＤＮＡプラスミド由来のレプリコンＲＮＡは試験管の中で転写される。（図１Ａ，１Ｂ）（Eugene AgapovとCharles Riceのご好意による、Washington University School of Medicine, St.Louis,MO）。そのレプリコンＲＮＡはＢＨＫ―２１細胞（ＡＴＣＣ）にエレクトロポレーションされ、レプリコンを含んでいる細胞群はLindebach et al.,supraに記されているプロマイシン耐性法により選別された。SR19/pacとSR19/T7/Pol/pacの形質転換細胞は、Ｔ７発現ベクターpTM1（Bernard Mossのご好意による NIAID Bethesda MD）、および大腸菌LacZ遺伝子をpTM1プラスミドのNcoI-BamHI部位にクローニングして生じたpTM1-LacZにトランスフェクションした。それゆえ、LacZ遺伝子はＴ７プロモーターの制御下にある。組み換え細胞の４つのグループはプロマイシンを含んでいる培地で２４時間置かれ、それらの細胞から用意されたライセート中でβ―ガラクトシダ―ゼ活性を下記のように行う。
【００３５】
β―ガラクトシダ―ゼ活性は基質としてのchlorophenolred-β-D-galactopyranoside（ＣＰＲＧ，Boehringer Mannheim, Indianapolis,IN）（終濃度５ミリ規定）（0.2規定の硫酸カリウムバッファーにて1ミリ規定の塩化マグネシウムにてpH7.8に調製）を使って測定された。ライセートは、１％のトリトンＸ−１００と1ミリ規定のジチオチレイトール（dithiothreitol）を含んだバッファーの中で作られた。５０マイクロリットルのライセートはマイクロタイタプレートウェル中で５０マイクロリットルの基質と混合された。３０分から１２０分の室温での培養後、波長が５６２ナノメートル（ＯＤ５６２）の光学濃度をＴＨＥＲＭＯmaxマイクロプレートリーダーにＳＯＦＴmaxソフトウェア（Molecular Devices, Sunnyvale,CA）を使用して測定した。この測定結果は、3.0のＯＤ５６２値まで直線で示された。
【００３６】
細胞の４つの異なったグループのβ―ガラクトシダ―ゼ活性の量は、図２に示されている。（示された量は２回行ったうちの中間値である）。β―ガラクトシダ―ゼ活性の高いレベルは、SR19/T7/Pol/pacレプリコンとpTM1-LacZプラスミドを共に含んでいる細胞で検出され、Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼもしくはLacZ遺伝子を欠如しているコントロール細胞においては検出されなかった。（図２）。それゆえ、機能的なＴ７ＲＮＡポリメラ―ゼはSR19/T7/Pol/pacＲＮＡとトランスフェクションされたＢＨＫ細胞の中で発現される。
【００３７】
実施例２ 
この実施例は、SR19/T7/Pol/pacとトランスフェクションされたＢＨＫ細胞がマイナス鎖ウィルスＲＳＶによる感染に対する感受性、およびそのようなＲＳＶ感染細胞がＲＳＶミニゲノムの複製と転写を助けていることを示している。
【００３８】
SR19/T7/Pol/pac ＢＨＫ細胞は、偽感染もしくは１つのＲＳＶ細胞に対して、１０個のプラークを形成する感染（菌株Ａ２）で、増殖され、前述したようにHEp-2細胞にて希釈された。（Grosfeld et al.,supra）。４５分後、その細胞は試験管内で合成され、すべてのウィルス性たんぱく質のオープンリーディングフレーム中に位置するバクテリアCAT遺伝子を含んだ、RSV-CATミニゲノムＲＮＡの0.5-1.5マイクログラムを使い、３時間以上かけてトランスフェクションされた。（Collins et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:9663-9667, 1991）.そのミニゲノムＲＮＡは直線状HgaIのRSV-CAT cDNA（Collins et al.,1991）のＴ７ポリメラーゼによって生み出された９３５塩基長の転写産物である。唯一ＲＳＶ感染細胞はレポーター遺伝子発現を示した（データ未記載）、SR19/T7/Pol/pac ＢＨＫ細胞はＲＳＶミニゲノムの複製、および発現と同様に、ＲＳＶ感染に寛容であることが示された。
【００３９】
その発明者は、次ぎに、SR19/T7/Pol/pac ＢＨＫ細胞中の試験管内で転写されたミニゲノムＲＮＡは機能的であるかを調査した。SR19/T7/Pol/pac ＢＨＫ細胞は、偽感染もしくは１つの細胞につき１０個のプラークが形成されたＲＳＶ（菌株Ａ２）によって感染しており、４５分間に、ハンマーヘッド型のリボザイム配列およびコードされた転写物のＴ７転写終了３’末端を含むインターアリア（inter alia）を持ち、RSV-CAT cDNAの派生物としてのpC2CATとトランスフェクションした（Grosfeld et al.,1995,supra）。Ｔ７が合成したpC2CATの転写のリボザイム自己切断は、１つの非ＲＳＶ３’末端特異的リン酸化ウラシル残基を３’末端に残している（Grosfeld et al.,1995,supra）。それらの条件下において、ＲＳＶ感染細胞は偽感染した細胞と比べて、著しいＣＡＴ活性を示した（データ未掲載）。
【００４０】
それら実験の結果は、ＲＳＶ感染したSR19/T7/Pol/pac ＢＨＫ細胞はミニゲノムＲＮＡもしくは結果として細胞にトランスフェクションしたミニゲノムｃＤＮＡ由来の機能的なＲＳＶミニゲノムが合成可能なことを示している。
【００４１】
実施例３ 
この実施例は、ＲＳＶ感染後、仮形成されたミニゲノムＲＮＡがＲＳＶヌクレオキャプシドたんぱく質をその活性に必要であることを示している。
【００４２】
始めに、この測定は、結果としてＲＳＶに感染した後、複製され、転写されたＲＳＶミニゲノムＲＮＡの構造的な発現を含んだ培養細胞中におけるＲＳＶ検出を発明者は創造した。このプロトコールの可能性をテストするために、下記の実験を行った。
【００４３】
SR19/T7/Pol/pac細胞はpMP210；緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）の遺伝子のネガティブセンスコピーを含むＲＳＶのミニゲノムのｃＤＮＡ、とトランスフェクションされ、6時間から24時間後にその細胞は１０pfuのＲＳＶに感染された。pMP210は、前述のpC2CAT構成物のＣＡＴ遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置き換えたpC2Luc cDNAから構成された（Collins et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:81-85, 1996）。遺伝子の起点（ＧＳ）と遺伝子の終点（ＧＥ）信号が横に並んで位置して、グリーンランターンたんぱく質（Green Lantern Protein）遺伝子（Life Technologies, Gaithesburg, MD）を含んだＰＣＲ産物は、ｐＣ２Ｌｕｃのリーダー中のBstXI部位に挿入されて、ルシフェラーゼ遺伝子は欠如された。さらに、特異的なAvrII部位に先導された5’ハンマーヘッド型リボザイム（Altschuler etal.,Gene 122:85-90,1992）は配列尾の直前に挿入された。そのｐＣ２3’ハンマーヘッド型リボザイム（Perrotta et al.,Nature 350:434-436,1991）は特異的なXhoI部位に続いている。
【００４４】
そのような状況下において、ＲＳＶ依存性ＧＦＰ発現は全く観察されなかった。それらの陰性結果は、ミニゲノムＲＮＡはＢＨＫ細胞に非感染の場合か、近づいてはいかないがある法則によってか、外来性ＲＳＶレプリカ―ゼおよび、もしくはトランスクリプターゼの認識によって非常に短い半減期を持っていると推察される。それゆえ、ＲＳＶミニゲノムを使ってＲＳＶ感染検出の実行可能な測定方法は、ミニゲノムＲＮＡを安定させ、および、またはそれを複製能力可能にする戦略を必要とする。
【００４５】
ＲＳＶ Ｎ，Ｐ，とＬたんぱく質はＲＳＶミニゲノムの複製を必要かつ十分なものとし、Ｎ，Ｐ，とＬたんぱく質の発現は完全長のｍＲＮＡを必要とはしないが、ＲＳＶｍＲＮＡの転写を導くと示されている（Grosfeld etal.,supra;Yu etal.,supra）。さらに、唯一Ｎ、ＰおよびＬたんぱく質の発現はＲＮＡミニゲノムの包膜化（encapsidation）を導き、これは、Ｌたんぱく質の付加条件下において１０から５０倍ほど増加する（Atreya et al.,J.Virol. 72:1452-1461,1998）。これらの結果に基づき、発明者はその細胞がＲＳＶに感染している時、Ｎ，Ｐ，とＬたんぱく質の存在下におけるミニゲノムの発現はレポーター遺伝子のｍＲＮＡの転写に影響を受けやすい可能性を確認する調査をした。
【００４６】
SR19/T7/Pol/pac細胞もしくはSR19/pac細胞はlacZを含んでいるミニゲノムｃＤＮＡを持つ１マイクログラムのpMP210LacZとGrosfeld et al.,supraに記載のＴ７発現プラスミドであるpTM1-N、pTM1―PおよびPTM1-L（それぞれ0.2マイクログラム）を含む場合と含まない場合でそれぞれトランスフェクションのされた。pMP210LacZは特異的なXbaIとXmaI部位を使って、pMP210内のＧＦＰのＯＲＦをlacZのＯＲＦに置換して作成された。トランスフェクションして20時間後の細胞は、トリプシナイズ（trypsinized）され、２４ウェルのプレートに分配され、6時間後にＲＳＶ（５pfu/cell）と感染したか、偽感染させた。感染36時間後、その細胞は溶解して、β―ガラクトシダ―ゼが前述のように測定された。その結果として、2回行った測定の中間値を図３Ａに示した。
【００４７】
ＲＳＶ感染によるβ―ガラクトシダ―ゼ活性の重要な引導は、Ｔ７ポリメラーゼとＮ，Ｌ，およびＰのＲＳＶヌクレオキャプシドたんぱく質の発現が起こっている細胞の中で観察された。それらの細胞は、図７に示されている。とりわけ、偽感染した細胞と一致するβ―ガラクトシダ―ゼ活性は、Ｔ７を欠いた偽感染した細胞のβ―ガラクトシダ―ゼ活性、もしくはＮ，ＬとＰを欠いた偽感染した細胞よりそれほど高くはない。
【００４８】
比較的要求されるそれぞれのヌクレオキャプシドたんぱく質に近づくために、Ｎ，ＬとＰ発現プラスミド（0.2マイクログラム）の様々な複合体は、ミニゲノムｃＤＮＡ（１グラムのpMP210LacZ）を持ったSR19/T7/Pol/pac細胞とトランスフェクションされ、その測定は前述したように行った。その結果として、3回行った測定値の平均値に標準偏差を加え、図３Ｂに示した。ＲＳＶが引き出されたβ―ガラクトシダ―ゼ活性は、唯一すべて３つのヌクレオキャプシドたんぱく質の存在下において重要だった。さらに、その活性量は、それらミニゲノム発現細胞の10継代を測定しても変らなかった。
【００４９】
米国特許5,418,132に記載の組織化学の染色による評価は、β―ガラクトシダーゼ陽性の感染細胞は唯一ヌクレオキャプシドたんぱく質の存在下において観察された。１つのウェルに対し、染色されたＮ単独か、もしくはＮとＰ感染細胞は、ほとんど見られなかった一方で、Ｎ，ＰおよびＬがすべて発現されている時、染色された多くの感染細胞が継続的に見られた（データ未掲載）。かなりはっきりと、ヌクレオキャプシドたんぱく質があっても無くても、ＲＳＶの非存在下においては、染色された細胞は見られることはなかった。この測定における全て３つのヌクレオキャプシドたんぱく質の要求において、ミニゲノムＲＮＡの包膜化（encapsidation）と複製は外来性ＲＳＶによる効率的なレポーター遺伝子の発現にとって必要であることを示唆している。さらに、全て３つのヌクレオキャプシドたんぱく質を発現して、β―ガラクトシダ―ゼ活性の欠損した偽感染細胞の状態は、検出可能なβ―ガラクトシダーゼの発現は、ＲＳＶ感染により供給されるいくつかの要素に依存していることを示している。そのうちの1つは、おそらくM2―1たんぱく質である。
【００５０】
実施例４
この実施例は、ミニゲノムレポーター遺伝子の発現は取り込んだＲＳＶ濃度に依存していることを表している。
【００５１】
6個の9.5平方センチメートルのウェル中にあるおおよそ２ｘ１０６個のSR19/T7/Pol/pac細胞はｐＭＰ２１０ＬａｃＺ（１グラム）とpTM1-N、ＰとＬ（それぞれ0.2マイクログラム）にトランスフェクションしている。18時間後、そのトランスフェクションした細胞はトリプシナイズ（trypsinized）され、集められて４８ウェルプレート上のすべてのウェルに配分された。６時間後、おおよそ１０５の細胞が（Ａ）のＲＳＶ保存液（力価 2x107pfu/mlＨＥｐ２細胞にて測定）から２倍希釈して増えたものと感染され、β―ガラクトシダーゼ活性を36時間後に測定された（Ｂ）0.5マイクロリットル（低い感染の増殖力；ＬＭＯＩ）か、25マイクロリットル（高い感染の増殖力；ＨＭＯＩ）の同じく保存してあったウィルスと感染され、感染後に示された時間でβ―ガラクトシダーゼ活性を測定した。その用量反応測定の結果は、図４Ａに示し、（同じサンプルを3回行い、その平均値を表示し、標準偏差を表した）時間曲線測定の結果は図４Ｂに示した（3回行った平均値）。
【００５２】
その測定は比較的直線なＲＳＶの用量反応を示し、１log１０以上を示した。（図４Ａ）。そのＲＳＶが誘引された発現はおおよそ0.6pfu/細胞（ＨＥｐ２細胞由来）の感染の増幅が接種時と同等のプラトー効果を示している。これらの結果、この測定はプラークアッセイにてＲＳＶ保存の量が測定できる可能性を示唆している。
【００５３】
感染後の時間の経過にしたがって、ミニゲノム発現細胞中のβ―ガラクトシダーゼを測定したら、ＬＭＯＩ感染（0.2pfu/細胞）に続いて起こるβ―ガラクトシダーゼ活性は、ＨＭＯＩ感染（10pfu/細胞）に続いて起こる場合と同じレベルに約48時間の遅れで到達した（図４Ｂ）。これはＲＳＶ複製して、それらの細胞培地中に拡散する感染回路の持続はおよそ48時間であることを示唆する。
【００５４】
実施例５ 
この実施例は、ミニゲノムレポーター遺伝子のＲＳＶによって誘発される発現はリバビリンに感受性があることを示している。
【００５５】
リバビリンは、ＲＳＶも含めて試験管内で行われる多くのＲＮＡウィルスによる複製を抑制する（Sidwell et al.,Pharmacol Ther 6:123-146,1979）。使用される測定法によっては、ＲＳＶにとってリバビリンの５０％の効果的な投与（ＥＤ５０）は、1ミリリットルに対し５マイクログラムだと報告されている（Chiba et al., Biol Pharm Bull 18:1081-1083,1995）。リバビリンがミニゲノム測定によるＲＳＶの検出に影響を与えると仮定する場合、それを論証するために、SR19/T7/Pol/pac細胞は実施例３に記載のｐＭＰ２１０ＬacZ、pTM1-N,pTM1-P,およびpTM1―Lとトランスフェクションし、1ミリリットルに対し１，５，５０、もしくは２００マイクログラムのリバビリン存在下のＲＳＶ（5pfu/細胞）と感染した。図５Ａに示したように、β―ガラクトシダーゼ活性はバックグラウンドレベルに近いところまで1ミリリットルに対し１マイクログラムのリバビリンが少しずつ下がってきた（図５Ａ）。この用量反応実験は、二次的抑制濃度が０から400ng/mlリバビリンになるまで繰り返された。リバビリンのＥＤ５０は、100ng/mlよりも少ない量で決定される。（図５Ｂ）。
【００５６】
ＲＳＶｃＤＮＡプラスミドのトランスフェクションした時間からＲＳＶ感染する時間までのリバビリン（1μg/ml）を持つ細胞の扱いは、ＲＳＶ依存性β―ガラクトシダーゼ発現には全く関係ない（データ未掲載）。これは、このような測定が行われた条件下において、リバビリンはシンビス（Sindbis）レプリコンやＴ７ポリメラーゼ転写よりも、またリバビリンに対し、比較的感受性がない外来性ＲＳＶの複製以前に起こるＲＳＶたんぱく質により仲介されたどんなミニゲノム複製よりも最初にＲＳＶ複製と転写に影響を与えることを示唆している。
【００５７】
実施例６ 
この実施例は、ミニゲノム発現細胞におけるＲＳＶ引導型β―ガラクトシダーゼ活性はＲＳＶに対する中和抗体に感受性があることを示している。
【００５８】
このシステムにおけるＲＳＶ引導型β―ガラクトシダーゼ活性は感染ウィルスを必要とし、それゆえ中和抗体によって守ることができる。そこで、我々は集めたヒトガンマグロブリンのサンプルの異なった希釈でＲＳＶを培養した。ＲＳＶは、非常に流行性のある、人間に対する病原体で、ほとんどの成人が少なくとも一度は感染したことがある。（Collins et al.,Respiratory.Syncytial.Virus,pp.1313-1350 in Field Virology,B.N.Field,DM.Knipe and P.M.Howley,eds.,Lippencott-Raven,Philadelphia,1996）.それゆえ、集められたヒトガンマグロブリンはＲＳＶに対する際立って中和化活性を持っている。そのグロブリンで処理されたウィルスは、事前にpMP210LacZとpTM1-NまたはpTM1-PとpTM1―LらとトランスフェクションしたSR19/T7/Pol/pac細胞を感染するのに使用される。図６に示されているように、β―ガラクトシダーゼ活性は、ガンマグロブリンサンプルの希釈量に対し反比例する。
【００５９】
実施例７ 
この実施例は、ＲＳＶが検出された患者の検体において、ＲＳＶミニゲノム発現の特異性を示している。
【００６０】
事前にpMP210LacZとpTM1-NまたはpTM1-PとpTM1―LらとトランスフェクションしたSR19/T7/Pol/pac細胞を2つの患者の検体に培養させて、事前にＲＳＶを含むもの、もしくはインフルエンザＡ，インフルエンザＢ，とパラインフルエンザ1型と2型に決定した。β―ガラクトシダーゼ活性の引導は、組織化学的染色によって行った。
【００６１】
ＲＳＶを含んでいる検体の培養によって、著しいβ―ガラクトシダーゼが生じた一方で、他のマイナス鎖ウィルスを含んだ検体からはどんな陽性の染色された細胞は見られなかった（データ未掲載）。それゆえ、この測定はＲＳＶに特異的である。
【００６２】
この測定の感度は、β―ガラクトシダーゼ活性の測定をする前に、感染の時間を長くすることによって増幅される。感染36時間後、3000 pfu検出され、たとえ培養量が10pfuよりも少なくても、感染5日後には、バックグラウンドより高い数倍になった数値を読んだ。
【００６３】
上記からの見解として、発明のいくつかの利点が達成され、他にも有用な結果が成し遂げられたことが見られるであろう。
【００６４】
様々な変化が上述の手法に施され、構成物は発明の範囲からはかけ離れてないことは、上述の記載中において含んでいるすべてのものと、図に伴って示されるものは限られた観念ではなく、実例として解釈されることを意図する。
【００６５】
この明細におけるすべての引用文献は、参照と同じくする特許と特許技術を含んでいる。ここでの参照における議論は、それらの筆者による主張の要約と、どんな参照も既知の技術を構成することに疑いの余地もないことを意図している。出願者は引用文献の正確さと適切さに挑戦する権利を所有している。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、SR19/pac cDNAの体系的な表示であり、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）遺伝子がシンビス（sindbis）サブゲノミックプロモーターに作動可能に連結された、細胞非障害性シンビス（sindbis）ウィルスレプリコンのＤＮＡコピーに作動可能に連結されているＳＰ６プロモーターを示している。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、細胞非障害性のシンビスウィルスの複製単位が２次シンビスサブゲノミックプロモーターに作動可能に連結されたＴ７ＲＮＡポリメラ―ゼを含むこと以外は、図１ＡのｃＤＮＡと同一なSR19/T7pol/pac cDNAの体系的な表示を示したものである。
【図２】
図２は、乳児ハムスターの腎臓細胞（ＢＨＫ）におけるβ―ガラクトシダ―ゼ活性を示した棒グラフである。ここで、乳児ハムスターの腎臓細胞（ＢＨＫ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラ―ゼ（SR19/T7/pac）もしくはその母細胞複製単位（SR19/pac）を発現している非細胞変性シンビスウィルスレプリコンで形質転換されて、Ｔ７プロモーター（pTM1-LacZ）もしくは親種のＴ７発現プラスミド（pTM1）の制御下において大腸菌 lacZ 遺伝子が発現するＴ７発現プラスミドにトランスフェクションした。
【図３Ａ】
図３Ａは、偽感染もしくはＲＳＶ感染させたSR19/T7/pac-BHK細胞もしくはSR19/pac-BHK細胞のβ―ガラクトシダ―ゼ活性を測定した棒グラフである。ここで、偽感染もしくはＲＳＶ感染させたSR19/T7/pac-BHK細胞もしくはSR19/pac-BHK細胞は、lacZを含んでいるＲＳＶミニゲノム（pMP210LacZ）独自のｃＤＮＡかＲＳＶヌクレオキャプシドたんぱく質Ｎ，ＬとＰを発現するＴ７発現プラスミドにトランスフェクションした。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、偽感染もしくはＲＳＶ感染させたSR19/T7/pac-BHK細胞あるいはSR19/pac-BHK細胞のβ―ガラクトシダ―ゼ活性を示した棒グラフである。ここで、偽感染もしくはＲＳＶ感染させたSR19/T7/pac-BHK細胞あるいはSR19/pac-BHK細胞は、pMP210LacZ独自もしくはＴ７発現プラスミドのＮ，ＬとＰの様々な組合せをトランスフェクションさせた。グラフでは、＋と―表示によってそれらの組合せを示している。
【図４Ａ】
図４Ａは、SR19/T7/pac-BHK細胞のβ―ガラクトシダ―ゼ活性を示したグラフである。ここでは、SR19/T7/pac-BHK細胞はpM210LacZおよびヌクレオキャプシド発現プラスミドと共にトランスフェクションさせて、そこにＲＳＶの指定されている量を感染させた。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、図４Ａ細胞中のβ―ガラクトシダ―ゼ活性を示したグラフである。ここでは、図４Ａ細胞の感染の高い多様性（ＨＭＩＯ）もしくは感染の低い多様性（ＬＭＯＩ）をＲＳＶに感染した時間の経過によって測定したものである。
【図５】
図５はリバビリンの効果を示したものである。ここでは、ＲＳＶ感染したSR19/T7/pac-BHK細胞がpM210LacZおよびヌクレオキャプシド発現をもつプラスミドと共にトランスフェクションした時のレポーター遺伝子活性の誘導におけるリバビリンの効果を示したものであるが、リバビリンの高濃度下におけるβ―ガラクトシダ―ゼ活性を棒グラフにて示したものが図５Ａであり、二次的抑制濃度下もしくはリバビリンの発現のそのコントロール比率下におけるβ―ガラクトシダ―ゼ活性の投与に対する反応カーブとして表したものが図５Ｂである。
【図６】
図６はSR19/T7/pac-BHK細胞のβ―ガラクトシダ―ゼ活性を示したグラフである。ここで、SR19/T7/pac-BHK細胞は、集めたヒト免疫グロブリンの示された希釈にて前培養したＲＳＶと感染した後に、pMP210LacZとヌクレオキャプシド発現を持つプラスミドに共にトランスフェクションした。；
【図７】
図７は、発明中のある1つの具体例にしたがって、レポーター遺伝子産物を産じる系における組み換え体の構造と分子の流れを示した表である。