【手続補正書】
【提出日】平成19年3月26日(2007.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物を、動物界の無細胞抽出物及びレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項２】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物を、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する動物界の細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項３】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものであるか、または該基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものであるか、または該基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項５】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）動物界の無細胞抽出物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものであるか、または該基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項６】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する化合物の同定方法であって、
（ａ）動物界の無細胞抽出物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものであるか、または該基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する化合物が同定される、上記ステップを含む、上記方法。
【請求項７】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増強する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の構造を決定するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼをコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７、Ｗｉ−３８、ＳｋＢｒ３、ジャーカット、ＣＥＭ、ＴＨＰ１、３Ｔ３およびＲａｗ２６４．７細胞からなる群より選択される、請求項２、３または４に記載の方法。
【請求項１２】
無細胞抽出物が細胞抽出物である、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（Diversomer）；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；ならびに有機小分子ライブラリを含むコンビナトリアル化合物ライブラリから選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
有機小分子ライブラリが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、またはジアゼピンジオンのライブラリである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物を細胞と接触させるステップが、緩衝液および塩の組み合わせを含む水溶液中で行われる、請求項２、３または４に記載の方法。
【請求項１６】
水溶液が生理的条件に近似するまたはそれを模倣する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
水溶液がさらに界面活性剤またはサーファクタントを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
化合物の構造を質量分析、ＮＭＲ、振動分光分析、またはＸ線結晶構造解析によって決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと直接結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
化合物が上記レポーター遺伝子から転写されたＲＮＡと結合する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が基質と結合する、請求項３、４、５または６に記載の方法。
【請求項２２】
化合物がｔＲＮＡイントロンと結合する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
化合物がｔＲＮＡとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を破壊する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
化合物がｔＲＮＡイントロンとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を破壊する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が上記核酸で安定にまたは一過性にトランスフェクトされている、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が上記核酸を含むエピソーム性発現ベクターで一過性にトランスフェクトされている、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
癌の治療もしくは予防、またはその症状の寛解のための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）化合物をレポーター遺伝子を含む核酸を含有する動物界の細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップを含み、
化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して上記レポーター遺伝子の発現を低減する化合物が（ｂ）で検出された場合には、続いて、
（ｃ）上記化合物を癌細胞または新生物細胞と接触させ、該癌細胞または新生物細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記癌細胞または新生物細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を抗増殖性化合物と同定する、上記方法。
【請求項２８】
癌の治療もしくは予防、またはその症状の寛解のための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）化合物を動物界の無細胞抽出物及びレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップを含み、
化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して上記レポーター遺伝子の発現を低減する化合物が（ｂ）で検出された場合には、続いて、
（ｃ）上記化合物を癌細胞または新生物細胞と接触させ、該癌細胞または新生物細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記癌細胞または新生物細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を抗増殖性化合物と同定する、上記方法。
【請求項２９】
癌の治療もしくは予防、またはその症状の寛解のための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものであるか、または該基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップを含み、
化合物の非存在下または対照の存在下における蛍光シグナルと比較して蛍光シグナルを低減する化合物が（ｂ）で検出された場合には、続いて、
（ｃ）上記化合物を癌細胞または新生物細胞と接触させ、該癌細胞または新生物細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記癌細胞または新生物細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を抗増殖性化合物と同定する、上記方法。
【請求項３０】
癌の治療もしくは予防、またはその症状の寛解のための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものであるか、または５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップを含み、
化合物の非存在下または対照の存在下における蛍光発光と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光を増大する化合物が（ｂ）で検出された場合には、続いて、
（ｃ）上記化合物を癌細胞または新生物細胞と接触させ、該癌細胞または新生物細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記癌細胞または新生物細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を抗増殖性化合物と同定する、上記方法。
【請求項３１】
癌の治療もしくは予防、またはその症状の寛解のための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）動物界の無細胞抽出物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ及び化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものであるか、または該基質は５’末端がクエンチャーで標識され、３’末端がフルオロフォアで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップを含み、
化合物の非存在下または対照の存在下における蛍光シグナルと比較して蛍光シグナルを低減する化合物が（ｂ）で検出された場合には、続いて、
（ｃ）上記化合物を癌細胞または新生物細胞と接触させ、該癌細胞または新生物細胞の増殖を検出するステップを含み、上記化合物が上記癌細胞または新生物細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を抗増殖性化合物と同定する、上記方法。
【請求項３２】
癌の治療もしくは予防、またはその症状の寛解のための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）動物界の無細胞抽出物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物と接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものであるか、または該基質は５’末端が蛍光アクセプター部分で標識され、３’末端が蛍光ドナー部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップを含み、
化合物の非存在下または対照の存在下における蛍光発光と比較して蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光を増大する化合物が（ｂ）で検出された場合には、続いて、
（ｃ）上記化合物を癌細胞または新生物細胞と接触させ、該癌細胞または新生物細胞の増殖を検出するステップ
を含み、上記化合物が上記癌細胞または新生物細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を抗増殖性化合物と同定する、上記方法。
【請求項３３】
（ｄ）上記化合物を癌の非ヒト動物モデルで試験するステップであって、該試験が、上記化合物を該非ヒト動物モデルに投与し、該化合物が該非ヒト動物モデルにおける癌細胞の増殖または拡大の低減に有効であることを検証することを含む、上記ステップをさらに含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
基質が成熟ドメインを含む、請求項４〜７または２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
（ｃ）化合物の細胞毒性活性を測定するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
（ｃ）化合物の細胞増殖抑制活性を測定するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
（ｃ）酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに対する化合物の効果を測定するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３〜７または２７〜３２のいずれか１項に記載の方法に従って同定される化合物またはその製薬上許容される塩の、対象における増殖性疾患またはその症状の予防、治療または寛解のための医薬製造における使用。
【請求項３９】
増殖性疾患が癌である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
対象がヒトである、請求項３８または３９に記載の使用。