(57)【要約】  本発明は、医学および免疫学の分野に関する。特に、本発明は、アッシャー症候群ＩＩ型および／またはＵＳＨ２Ａ関連非症候性網膜変性の処置、予防および／または遅延に使用することができる新規のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおいてエクソン１３をスキップするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、生理的条件下において、配列番号１２、１３、もしくは１４の配列、またはその一部と結合する、かつ／またはそれと相補的であるＡＯＮ。
【請求項２】
ヒトＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおいてエクソン１３をスキップするためのＡＯＮであって、配列番号５、６、または７の配列を含むか、またはそれからなるＡＯＮ。
【請求項３】
前記ＡＯＮは、オリゴリボヌクレオチドである、請求項１または２に記載のＡＯＮ。
【請求項４】
前記ＡＯＮは、２’−Ｏ−メチル修飾糖などの２’−Ｏアルキル修飾を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
【請求項５】
前記ＡＯＮのすべてのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾されている、請求項４に記載のＡＯＮ。
【請求項６】
前記ＡＯＮは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
【請求項７】
前記ＡＯＮのすべてのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を保有する、請求項６に記載のＡＯＮ。
【請求項８】
前記ＡＯＮは、２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含むオリゴリボヌクレオチドである、請求項４または６に記載のＡＯＮ。
【請求項９】
前記ＡＯＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
【請求項１０】
すべての連続したヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって互いに連結されている、請求項９に記載のＡＯＮ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物は、硝子体内投与用であり、各眼当たり合計ＡＯＮが０．０５ｍｇから５ｍｇの範囲の量で投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物は、硝子体内投与用であり、各眼当たり合計ＡＯＮが約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇなど、各眼当たり合計ＡＯＮが０．１から１ｍｇの範囲の量で投与される、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１または２に記載のＡＯＮを発現させるウイルスベクター。
【請求項１５】
薬剤として使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
アッシャー症候群ＩＩ型などのＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節する必要があるＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置、予防または遅延のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のウイルスベクター。
【請求項１７】
薬剤の調製のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項１８】
アッシャー症候群ＩＩ型などのＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節する必要があるＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置、予防または遅延のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項１９】
細胞におけるＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節するための方法であって、前記細胞を、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のウイルスベクターと接触させることを含む方法。
【請求項２０】
ＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする個体の、それを必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置のための方法であって、前記個体の細胞を、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載のウイルスベクターと接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学および免疫学の分野に関する。特に、本発明は、眼疾患、好ましくは、アッシャー症候群ＩＩ型および／またはＵＳＨ２Ａ関連網膜変性の処置、予防および／または遅延に使用するための単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
アッシャー症候群（ＵＳＨ、または単に「アッシャー」）および非症候性網膜色素変性（ＮＳＲＰ）は、網膜の変性疾患である。アッシャーは、臨床的および遺伝学的に不均一であり、ヒトの遺伝性盲聾の群を抜いて一般的なタイプである（６，０００人に１人；Kimberling et al. 2010. Frequency of Usher syndrome in two pediatric populations: implications for genetic screening of deaf and hard of hearing children. Genet Med 12:512-516）。アッシャー患者の難聴は、たいてい安定で、先天性であり、補聴器または人工内耳によって部分的に補うことができる。ＮＳＲＰは、アッシャーよりも一般的で、４，０００人に１人生じる（Hartong et al. 2006. Retinitis pigmentosa. Lancet 368(9549):1795-1809）。アッシャーおよびＮＳＲＰにおける視細胞の変性は、進行性であり、生涯の３０年から４０年の間に完全な失明に至る場合が多く、そのために、治療的介入のための時間が残っている。
【０００３】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異が、アッシャーの最もよくある原因であり、世界中のすべてのアッシャー患者の最大５０％を説明し（オランダにおいて±１３００患者）、ＭｃＧｅｅらによって示されるとおり（2010. Novel mutations in the long isoform of the USH2A gene in patients with Usher syndrome type II or non-syndromic retinitis pigmentosa. J Med Genet 47(7):499-506）、米国おけるＮＳＲＰの最も一般的な原因でもあり、網膜色素変性のすべての症例の１２〜２５％を占める可能性がある（オランダにおいて±６００患者）。突然変異は、７２のＵＳＨ２Ａエクソンおよびその隣接イントロン配列全体に点在し、ナンセンスおよびミスセンス突然変異、欠失、重複、大きな再構成、およびスプライシングバリアントからなる。エクソン１３は、２つの創始者変異を含む、群を抜いて最も高い頻度で突然変異するエクソンである（ＵＳＨ２患者におけるｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｅ７６７ＳｆｓＸ２１）およびＮＳＲＰ患者におけるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｃ７５９Ｆ））。エクソン５０に関して、１５の病的突然変異が報告されており、その少なくとも８つは明らかにタンパク質短縮である。最近、ＵＳＨ２Ａのイントロン４０における最初のディープイントロン突然変異（ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ）が報告された（Vache et al. 2012. Usher syndrome type 2 caused by activation of an USH2A pseudo exon: implications for diagnosis and therapy. Human Mutation 33(1):104-108）。この突然変異は、イントロン４０に隠れた高品質のスプライスドナー部位を作り出し、この結果、突然変異ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡに１５２ｂｐの異常なエクソン（偽エクソン４０またはＰＥ４０）が含まれ、翻訳の未成熟終止を引き起こす。
【０００４】
エクソン１３に見出されるｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異はフレームシフトをもたらして、未成熟終止コドンを生じさせ、ナンセンス変異依存分解に至ると推定される。Ｌｅｎａｓｓｉら（2014. The effect of the common c.2299delG mutation in USH2A on RNA splicing. Exp Eye Res 122:9-12）は、アッシャー患者では、突然変異がスプライシングの間にエクソン１２＋エクソン１３二重スキッピングを導くのに対し、一部の患者では、エクソン１３のみのスキップと、エクソン１２／エクソン１３二重スキッピングの間の組合せが見つかったことを示した。エクソン配列改変が異常なスプライシングの原因となることはまれなことではない。生物情報学的ツールは、ｃ．２２９９ｄｅｌＧがエクソンスプライシングエンハンサーを妨害し、エクソン１３内にエクソンスプライシングサイレンサーを作り出すよう変化させることを予想した。配列解析は、突然変異を保有する異常なエクソン１３のみをスキップすることが、結果としてフレームシフト突然変異をなくさせ、エクソン１２とエクソン１４の間のインフレーム連結ももたらすことを示した。エクソン１２およびエクソン１３の二重スキッピングは、エクソン１１がエクソン１４と連結されるとき、アウトオブフレーム欠失をもたらす。したがって、（ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異を保有している場合）エクソン１３のスキッピングは望ましいが、エクソン１２は保持されることが好ましい。
【０００５】
アッシャーおよびその他の網膜ジストロフィーは、長い間、不治の障害と考えられてきた。遺伝子増強療法を使用したいくつかの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、ＲＰＥ６５（Bainbridge et al. 2008. Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med 358, 2231-2239）およびＭＹＯ７Ａ（Hashimoto et al. 2007. Lentiviral gene replacement therapy of retinas in a mouse model for Usher syndrome type 1B. Gene Ther 14(7):584-594）遺伝子に突然変異を有するＬＣＡ／ＲＰ／ＵＳＨ患者の選択された群で有望な結果に至った。不運にも、多くの利用可能なベクター（アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスベクターなど）の現在のカーゴサイズの制約のために、コード配列のサイズ（１５，６０６ｂｐ）ならびにＵＳＨ２Ａ遺伝子およびｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングがそれぞれ、遺伝子増強療法を阻む。
【０００６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）ベースの療法の広い臨床的可能性にもかかわらず、脊椎動物の眼には頻繁に使用されていない。ＡＯＮは、一般に、配列が標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子の配列と相補的であるため、スプライシングを妨げることができる小さなポリヌクレオチド分子（１６から２５ｍｅｒ）である。想起されるメカニズムは、相補的なＡＯＮの標的配列への結合時に、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内の標的とされる領域がスプライシング因子に対してもはや利用できなくなり、ひいては標的とされるエクソンのスキッピングをもたらすようなメカニズムである。治療的に、この方法論は、ａ）突然変異が隠れたスプライシング部位を活性化する遺伝子の正常なスプライシングを再び指示するため、およびｂ）ｍＲＮＡの読み枠が完全なままであり、（部分的に）機能的なタンパク質が産生されるような形で突然変異を保有するエクソンをスキップするための２つの方法に使用することができる。両方法は、既に重度の遺伝性障害を有する患者に首尾よく適用されている（Scaffidi and Misteli. 2005. Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Nat.Med 11(4):440- 445；Cirak et al. 2011. Restoration of the Dystrophin-associated Glycoprotein Complex after Exon Skipping Therapy in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther 20:462-467；Cirak et al. 2011. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet 378(9791):595-605；Goemans et al. 2011. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med 364(16):1513-1522）。ＵＳＨ２Ａ遺伝子に関して、７２の示されたエクソンのうちの２８は、場合によっては、エクソン１３のスキップ（エクソン１２は保持されたままである）を含め、転写物の全体的な読み枠を乱すことなくスキップされる場合がある。
【発明の概要】
【０００７】
国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットは、エクソン１３、エクソン５０およびＰＥ４０のスキッピング、ならびに／またはエクソン１２の保持に向けられたＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対するエクソンスキッピングＡＯＮについて開示している。そこに開示されているとおり、いくつかのＡＯＮは、エクソン１３をスキップするために使用することができる。したがって、本発明の目的は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３にある突然変異が原因となるアッシャーおよび／またはＮＳＲＰの予防、処置または遅延に都合のよい治療法に使用することができる代替的なさらに効率的なＡＯＮを提供することである。
【０００８】
本発明は、ヒトＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおいてエクソン１３をスキップするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、生理的条件下において、配列番号１２、１３、もしくは１４の配列、またはその一部と結合する、かつ／またはそれと相補的であるＡＯＮに関する。本発明のＡＯＮは、エクソン１３スキッピングに対してプラスの効果を有する一方で、比較的高いレベルのエクソン１２／１３二重スキッピングを示した既知のＡＯＮと比較して、低量のエクソン１２および１３が共にスキップされた（二重にスキップされた）産物をもたらす。好ましくは、本発明のＡＯＮは、配列番号５、６、または７の配列を含むか、またはそれからなる。
【０００９】
本発明は、本発明によるＡＯＮを含み、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物にさらに関する。本発明はまた、好ましくは、アッシャー症候群ＩＩ型などのＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節する必要があるＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置、予防または遅延のための薬剤として使用するための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターに関する。さらに別の実施形態において、本発明は、ＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする個体の、それを必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置のための方法であって、前記個体の細胞を、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターと接触させることを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】エクソン１３プラスその隣接配列のＲＮＡ配列の一部を示す図である（太字；方向は５’から３’である）。上流および下流のイントロン配列は小文字であり、エクソン１３コード配列は大文字である。ここに示されるとおり隣接配列を伴うエクソン１３のＤＮＡ配列は配列番号１として示すのに対し、対応するｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列は配列番号２０として示す。隣接配列を伴わないエクソン１３のコード配列は配列番号２として示すのに対し、対応するｍＲＮＡ配列は配列番号２１として示す。本明細書に記載されているＡＯＮの配列および標的ＲＮＡ配列に対するそれらの位置もここに示す。ここでは共に３’から５’で示されるＡＯＮ１（配列番号３）およびＡＯＮ２（配列番号４）は、国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットからわかる。ここでも３’から５’で示されるＥｘ１３−１（配列番号５）、Ｅｘ１３−２（配列番号６）、Ｅｘ１３−３（配列番号７）、Ｅｘ１３−４（配列番号８）およびＥｘ１３−５（配列番号９）は、本明細書中で開示されるとおり新規のＡＯＮである。
【図２】Ｗｅｒｉ−Ｒｂ１細胞におけるトランスフェクション後のＡＯＮ１、ＡＯＮ２、およびＥｘ１３−１から５を使用したエクソンスキッピングの結果を示す図である。ＮＴは、トランスフェクションされていないことを意味する。ＲＴ−ＰＣＲ産物を右側に示しており、ここで、それぞれのボックスはエクソンの存在を表す。
【図３】糖部分に５つの異なる化学修飾を保有する５つの異なるＥｘ１３−３オリゴヌクレオチドでジムノシスにより(gymnotically)処理した（トランスフェクション試薬なし）Ｗｅｒｉ−Ｒｂ１細胞から得たＲＮＡに対するｄｄＰＣＲの結果を示すグラフである。（野生型のスキップされていないバックグラウンドに対する）エクソン１３スキップｍＲＮＡのパーセンテージを表す。
【図４】糖単位において２’−Ｏ−メチルにより完全に修飾されているか（Ｅｘ１３−３  ２’ＯＭｅ；左）、または糖単位において２’−Ｏ−メトキシエチルにより完全に修飾されている（Ｅｘ１３−３  ２’ＭＯＥ；右）かのいずれかの異なる濃度のＥｘ１３−３オリゴヌクレオチドによりトランスフェクションされたＷｅｒｉ−Ｒｂ１細胞から得たＲＮＡに対するｄｄＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図５】完全に２’−Ｏ−メチル修飾され、完全なホスホロチオエート化骨格を含むＥｘ１３−３オリゴヌクレオチドで処理した眼杯におけるエクソンスキッピングの結果を示す図である。対照は、健康なドナー由来の線維芽細胞から形成された眼杯およびＡＯＮによる処理を受けていないＵＳＨ２Ａ患者の線維芽細胞由来の眼杯とした。左および中央パネルの６つの個々のレーンは、示したとおり２または３カ月間分化させた未処理の眼杯（三つ組）の結果を表し、右パネルの濃度毎のＡＯＮの３つの個々のレーンは、３カ月間分化させた処理眼杯（三つ組）の結果を表し、これは、２つの異なる濃度のＥｘ１３−３  ＡＯＮとともに１カ月インキュベートした。
【図６】ＵＳＨ２患者から形成された眼杯におけるエクソン１３スキッピングの結果を示すグラフであり、ここでは、眼杯は４つの異なる濃度のＥｘ１３−３  ２’ＭＯＥオリゴヌクレオチドで処理した。対照は、処理されていない（ＮＴ）眼杯または関連のない配列を有するが、それぞれの糖部分に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾も保有する対照オリゴヌクレオチド（ｃｔｒｌ）により処理した眼杯とした。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに異常なエクソン１３が含まれるのをブロックすることができる、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。さらに具体的には、本発明は、ヒトＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおいてエクソン１３をスキップするためのＡＯＮであって、生理的条件下において、配列番号１２、１３、もしくは１４の配列、またはその一部と結合する、かつ／またはそれと相補的であるＡＯＮに関する。本発明の発明者らは、驚くべきことに、本発明の単鎖ＡＯＮの使用が先行技術において開示されている既知の単鎖ＡＯＮと比較した場合に、（アウトオブフレーム欠失をもたらす）エクソン１２および１３の望ましくない二重スキップのレベルが、（インフレームの）エクソン１３のみのスキップと比較して低減されることを発見した。本発明の目的は、大幅なエクソン１３スキッピングをもたらすと同時に、先行技術のＡＯＮを用いて観察されたのとは対照的にＡＯＮの投与がエクソン１２／１３二重スキッピングの低減をもたらす代替的な改良された単鎖ＡＯＮを提供することである。本発明の発明者らは、本明細書中で開示されるとおりのそのようなＡＯＮを特定することができた。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、ヒトＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおけるエクソン１３をスキップするためのＡＯＮであって、配列番号５、６、または７の配列を含むか、またはそれからなるＡＯＮに関する。好ましい態様において、前記ＡＯＮは、オリゴリボヌクレオチドである。さらなる好ましい態様において、本発明によるＡＯＮは、２’−Ｏ−メチル修飾糖などの２’−Ｏアルキル修飾を含む。さらに好ましい実施形態において、前記ＡＯＮのすべてのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾されている。別の好ましい態様において、本発明は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含むＡＯＮに関する。さらに好ましい実施形態において、前記ＡＯＮのすべてのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を保有する。さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルおよび少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含むＡＯＮに関する。好ましい別の実施形態において、本発明によるＡＯＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有する。別の好ましい態様において、すべての連続したヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって互いに連結されている。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、本発明によるＡＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、硝子体内投与用であり、各眼当たり合計ＡＯＮが０．０５ｍｇから５ｍｇの範囲の量で投与される。より好ましくは、医薬組成物は、硝子体内投与用であり、各眼当たり合計ＡＯＮが約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇなど、各眼当たり合計ＡＯＮが０．１から１ｍｇの範囲の量で投与される。
【００１４】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明によるＡＯＮを発現させるウイルスベクターに関する。さらに別の態様において、本発明は、薬剤として使用するための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターに関する。さらに別の実施形態において、本発明は、アッシャー症候群ＩＩ型などのＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節する必要があるＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置、予防または遅延のための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターに関する。
【００１５】
本発明はまた、薬剤の調製のための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターの使用に関する。好ましくは、前記薬剤は、アッシャー症候群ＩＩ型などのＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節する必要があるＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置、予防または遅延のためのものである。さらに別の態様において、本発明は、アッシャー症候群ＩＩ型などのＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節する必要があるＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置、予防または遅延のための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターの使用に関する。
【００１６】
本発明はまた、細胞におけるＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節するための方法であって、前記細胞を、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターと接触させることを含む方法に関する。好ましい実施形態において、本発明は、ＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする個体の、それを必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置のための方法であって、前記個体の細胞を、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターと接触させることを含む方法に関する。
【００１７】
本発明のすべての実施形態において、「スプライシングを調節すること」および「エクソンスキッピング」という用語は同義である。ＵＳＨ２Ａに関して、「スプライシングを調節すること」または「エクソンスキッピング」は、異常なエクソン１３を排除することと解釈されるべきである。さらに、好ましくは、エクソン１３がスキップされるときに、エクソン１２の保持がもたらされる。本発明の目的に対して、「異常なエクソン１３」または「異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３」という用語は、同義であると見なされ、突然変異が疾患の原因となるＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３における突然変異の存在を意味すると見なされる。
【００１８】
「エクソンスキッピング」という用語は、本明細書においてエクソンスキッピングされていない成熟ｍＲＮＡに存在するであろう特定のエクソン（この場合には、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３）を含まない成熟ｍＲＮＡの誘導、産生、または細胞内におけるその産生の増加と定義される。エクソンスキッピングは、スプライシングの酵素的プロセスを可能にするために必要とされる、例えば、（隠れた）スプライスドナー配列もしくは（隠れた）スプライシングアクセプター配列などの配列を妨害することができる分子を用いて、またはひと続きのヌクレオチドを成熟ｍＲＮＡに含まれるべきエクソンと認識するために必要とされるエクソン選択シグナルを妨害することができる分子を用いて前記成熟ｍＲＮＡのｐｒｅ−ｍＲＮＡを発現する細胞をもたらすことによって達成される。そのような分子は、本明細書においては「エクソンスキッピング分子」、「エクソン１３スキッピング分子」、または「エクソンスキッピングＡＯＮ」と呼ばれる。「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」という用語は、転写によって細胞のＤＮＡ鋳型から、例えば核内で合成される、プロセシングされていないか、または部分的にプロセシングされた前駆体ｍＲＮＡを指す。
【００１９】
「エクソン保持」という用語は、本明細書において、好ましくは、成熟ｍＲＮＡに存在すべき特定のエクソンを保持する成熟ｍＲＮＡの誘導、産生、または細胞内におけるその産生の増加と定義される。本件の場合において、残るべきエクソンは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１２である。エクソン保持は、イントロン１２の、例えば、イントロンスプライスサイレンサー部位などの配列を妨害することができるＡＯＮを用いて前記成熟ｍＲＮＡのｐｒｅ−ｍＲＮＡを発現する細胞をもたらすことによって達成され、そのようなＡＯＮは、エクソン保持ＡＯＮと呼ばれる場合もある。最も好ましいＡＯＮは、エクソン１３スキッピング（アッシャー患者に既に観察されている現象）を強く誘導するが、同時にエクソン１２の多すぎる共スキッピングはもたらさないオリゴヌクレオチドである。エクソン１３は、可能なかぎり多くスキップされるべきであるが、エクソン１２は、可能なかぎり多く残るべきである。
【００２０】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＯＮ）という用語は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子、ｈｎＲＮＡ（ヘテロ核ＲＮＡ）またはｍＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を指すものと理解される。アンチセンス配列の相補性（または実質的な相補性）の程度は、アンチセンス配列を含む分子が生理的条件下においてＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列と安定な二本鎖ハイブリッドを形成することができるような程度であることが好ましい。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「オリゴ」という用語は、本明細書では同義に使用され、標的配列に対するアンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドを指すものと理解される。
【００２１】
本文書において、およびその特許請求の範囲において、「含むこと（to comprise）」という動詞およびその活用型は、その語に引き続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目も除外しないことを意味するためにその非限定的な意味で使用される。さらに、文脈が明らかに１つおよび１つだけの要素が存在することを必要としない限り、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、１つ超の要素が存在する可能性を排除するものではない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常は「少なくとも１つ」を意味する。数値（例えば、約１０）と関連して使用される場合、「約」または「およそ」という語は、好ましくは、値が、（１０の）所与の値より０．１％大きいまたは小さい値であってもよいことを意味する。
【００２２】
一実施形態において、本明細書中で定義されるとおりのエクソン１３スキッピング分子は、特定の配列と結合する、かつ／またはそれと相補的なＡＯＮである。好ましくは、異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３と関連した特定の標的配列の１つとの結合は、当業者に既知の技術によって評価することができる。好ましい技術は、欧州特許第１６１９２４９号明細書に記載されているゲル移動度シフトアッセイである。好ましい実施形態において、エクソン１３スキッピングＡＯＮは、前記分子の標識標的配列との結合がゲル移動度シフトアッセイで検出できるとすぐに、特定の配列の１つと結合していると判断される。
【００２３】
本発明のすべての実施形態において、エクソン１３スキッピング分子は、好ましくはＡＯＮである。好ましくは、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮは、配列番号１２、１３、または１４に示されるとおりのヌクレオチド配列と相補的または実質的に相補的なＡＯＮである。
【００２４】
本発明の文脈において使用される「実質的に相補的な」という用語は、機能性、すなわち、異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３のスキッピングおよびエクソン１２の保持の誘導がなおも許容できるかぎり、アンチセンス配列にいくつかのミスマッチが許容されることを示す。好ましくは、相補性は、９０％から１００％である。一般に、これは、２０ヌクレオチドのＡＯＮに１もしくは２つのミスマッチ、または４０ヌクレオチドのＡＯＮに１、２、３もしくは４つのミスマッチ、または６０ヌクレオチドのＡＯＮに１、２、３、４、５もしくは６つのミスマッチなどを許容する。
【００２５】
本発明は、異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３のスキッピングを誘導することができるエクソン１３スキッピングＡＯＮを設計するための方法を提供する。まず、前記ＡＯＮは、エクソン１３と結合する、かつ／またはそれと相補的であるように選択され、場合によって、配列番号１（ＲＮＡに関しては配列番号２０を参照）に示される隣接イントロン配列の範囲を伴う。次に、好ましい方法において、少なくとも１つの以下の態様が前記エクソンスキッピングＡＯＮを改善する設計に対してさらに考慮されなければならない：エクソンスキッピングＡＯＮが、好ましくはＣｐＧまたはひと続きのＣｐＧを含まない；かつエクソンスキッピングＡＯＮが、許容できるＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性を有する。ＡＯＮ中のＣｐＧまたはひと続きのＣｐＧの存在は、通常、前記ＡＯＮの免疫原性の増加と関連づけられる（Dorn and Kippenberger (2008) Curr Opin Mol Ther 10(1) 10-20）。この免疫原性の増加は、処置される組織、すなわち、眼に損傷を引き起こす可能性もあるため望ましくない。免疫原性は、ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋細胞の存在ならびに／または炎症性単核球浸潤を評価することによって動物モデルにおいて評価することができる。免疫原性はまた、当業者に既知の標準的なイムノアッセイを使用して中和抗体および／または前記ＡＯＮを認識する抗体の存在を検出することによって本発明のＡＯＮにより処置された動物またはヒトの血液において評価することもできる。炎症反応、Ｉ型様インターフェロン産生、ＩＬ−１２産生および／または免疫原性の増加は、標準的なイムノアッセイを使用して中和抗体または前記ＡＯＮを認識する抗体の存在または量の増加を検出することによって評価することができる。
【００２６】
本発明は、許容できるＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性を有するＡＯＮを設計することを可能にする。ＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性は、ＡＯＮの融解温度（Ｔｍ、基礎のＴｍおよび最隣接モデルを使用して単鎖ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド特性計算機（ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／−ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ）により算出される）および／またはＡＯＮ標的エクソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン４．５を使用して）によって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎると、ＡＯＮは、あまり特異的でなくなることが予想される。許容できるＴｍおよび自由エネルギーは、ＡＯＮの配列により決まる。したがって、これらのパラメータのそれぞれに対して好ましい範囲を示すのは難しい。許容できるＴｍは、３５から７０℃の間の範囲であってもよく、許容できる自由エネルギーは、１５から４５ｋｃａｌ／ｍｏｌの間の範囲であってもよい。
【００２７】
本発明のＡＯＮは、好ましくは、許容されるレベルの機能活性を示すことができるものである。前記ＡＯＮの機能活性は、好ましくは、一定の許容されるレベルまでのエクソン１２の保持の他に、異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３のスキッピングを誘導して、個体に機能的なＵＳＨ２Ａタンパク質および／もしくはｍＲＮＡをもたらす、かつ／または異常なＵＳＨ２Ａタンパク質および／もしくはｍＲＮＡの産生を少なくとも部分的に低減することである。好ましい実施形態において、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定される異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３スキッピングパーセンテージが、ＡＯＮまたは陰性対照ＡＯＮにより処置されていない対照ＲＮＡ産物と比較して少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％であるとき、ＡＯＮは、異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３のスキッピングを誘導すると考えられる。本発明の目的は、エクソン１３スキッピングを誘導する一方で、エクソン１２および１３が共にスキップされた（二重スキップ）産物の量が低減されるＡＯＮを提供することである。したがって、ＡＯＮは、エクソン１３のみのスキップを誘導しながら、可能なかぎり限定された二重スキップしか生じさせないようであるべきである。本発明のＡＯＮは、本発明まで当該技術分野において見られたものと比較して、増加したエクソン１３のみのスキップおよび低減されたエクソン１２／１３二重スキップを示す。エクソンスキッピングおよび／またはエクソン保持を求めるためのアッセイは本明細書の実施例に記載されており、既知のＡＯＮと比較した場合に、エクソン１２／１３二重スキップの低減を判定しつつエクソン１３のみのスキップの増加が見出されるかを評価するために、当業者に既知の技術により補われてもよい。
【００２８】
好ましくは、ＵＳＨ２Ａの配列番号１（もしくはＲＮＡとして配列番号２０）に示されるとおりのヌクレオチド配列と相補的または実質的に相補的な配列を含むＡＯＮは、（実質的に）相補的な部分が、本発明によるＡＯＮの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％、またはさらにより好ましくは９８％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％、またはさらにより好ましくは１００％であるようなＡＯＮである。好ましくは、本発明によるＡＯＮは、配列番号２（または実際には配列番号２１に示されるとおりのそのＲＮＡ対応物）、より好ましくは、配列番号１２、１３、もしくは１４の一部と相補的な配列を含むか、またはそれからなる。
【００２９】
好ましい別の実施形態において、前記ＡＯＮの前記相補的な部分の長さは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２または１４３ヌクレオチドの長さである。タンパク質のＡＯＮとの結合を改変するため、またはＡＯＮの熱力学的特性を改変するため、より好ましくは、標的ＲＮＡ結合親和性を改変するために、付加的な隣接配列が使用されてもよい。
【００３０】
したがって、相補性の領域にあるすべての塩基が対向する鎖にある塩基と対形成することができることが絶対に必要とされる訳ではない。例えば、ＡＯＮを設計するとき、例えば、相補的な鎖にある塩基と塩基対にならない残基を組み込むことを望むこともできる。細胞の環境下において、ひと続きのヌクレオチドが相補的な部分と十分にハイブリダイズすることができるなら、ミスマッチは、ある程度許容される場合もある。この文脈において、「十分に」は、好ましくは、欧州特許第１６１９２４９号明細書の実施例１に記載されているとおりのゲル移動度シフトアッセイを使用して、ＡＯＮの結合が検出可能であることを意味する。
【００３１】
任意選択で、前記ＡＯＮは、患者の網膜細胞へのトランスフェクションによってさらに試験されてもよい。標的とされるエクソン１３のスキッピングおよび／またはエクソン１２の保持は、ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる（例えば、欧州特許第１６１９２４９号明細書および国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットに記載されているものなど）。相補的な領域は、組み合わされる場合、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエクソンに特異的であるよう設計されることが好ましい。そのような特異性は、この系の他の（ｐｒｅ−）ｍＲＮＡ分子にある実際の配列に依存するため、さまざまな長さの相補的な領域を用いて作り出すことができる。ＡＯＮのサイズを増加させることでＡＯＮが１つ以上の他のｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子ともハイブリダイズすることができることになるリスクは低下する。相補性の領域にミスマッチを含むが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの標的とされる領域（複数可）とハイブリダイズする能力および／または結合する能力を保持するＡＯＮを本発明に使用することができることは明らかである。しかしながら、相補的な部分にミスマッチがないＡＯＮは、一般に１つ以上の相補的な領域にそのようなミスマッチを有するＡＯＮよりも高い効率および高い特異性を有するため、少なくとも相補的な部分は、そのようなミスマッチを含まないことが好ましい。さらに高いハイブリダイゼーション強度（すなわち、対向する鎖との相互作用の数を増加させる）は、系のスプライシング機構を妨害するプロセスの効率を増加させる際に有利であると考えられる。好ましくは、相補性は、９０％から１００％である。一般に、これは、２０ヌクレオチドのＡＯＮに１もしくは２つのミスマッチ、または４０ヌクレオチドのＡＯＮに１、２、３もしくは４つのミスマッチ、または６０ヌクレオチドのＡＯＮに１、２、３、４、５もしくは６つのミスマッチなどを許容する。
【００３２】
本発明のエクソンスキッピングＡＯＮは、好ましくは、（標的）対応物配列の非存在下の単離された単鎖分子である。本発明のエクソンスキッピングＡＯＮは、好ましくは、配列番号１２、１３、もしくは１４から選択される配列と相補的であるか、または生理的条件下において、それと結合し、最も好ましくは、配列番号１４の配列と相補的であるか、または生理的条件下において、それと結合する。
【００３３】
本発明の好ましいエクソン１３スキッピングＡＯＮは、８から１４３ヌクレオチド、より好ましくは１０から４０ヌクレオチド、より好ましくは１２から３０ヌクレオチド、より好ましくは２０から３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２もしくは１４３ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。
【００３４】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号５、６、または７からなる群から選択されるエクソン１３スキッピングＡＯＮを提供する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号７に示されるとおりの配列を含むか、または好ましくは、それからなる、エクソン１３スキッピングＡＯＮを提供する。この分子は、異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３のスプライシングを調節する際に極めて有効であると同時に、先行技術のＡＯＮよりも良好にエクソン１２の保持をもたらすのに極めて有効なようであることがわかった。本発明のＡＯＮは、エクソン１２／１３二重スキップを生じさせる際にはあまり有効でないが、「エクソン１３のみの」スキップを生じさせる際には極めて有効であることも言えるであろう。配列番号７に示されるとおりの本発明のこの好ましいエクソン１３スキッピングＡＯＮ（多すぎるエクソン１２／１３二重スキップを生じさせないか、またはそれが非常に低いレベル）は、好ましくは、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２または１４３ヌクレオチドを含む。
【００３５】
本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮは、１つ以上のＲＮＡ残基、もしくは１つ以上のＤＮＡ残基、および／または本明細書の下でさらに詳述されることになる１つ以上のヌクレオチドアナログもしくは等価物を含んでもよい。本発明のエクソン１３スキッピングＡＯＮは、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、および／または標的配列に対するＡＯＮの親和性を高めるために修飾された１つ以上の残基を含むことが好ましい。ゆえに、好ましい実施形態において、本ＡＯＮ配列は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾塩基、および／または修飾骨格、および／または非天然のヌクレオシド間結合あるいはこれらの修飾の組合せを有する残基と定義される。
【００３６】
好ましい実施形態において、本ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾骨格を含む。そのような骨格の例は、モルフォリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル（riboacetyl）骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、およびアミド骨格によって提供される。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、アンチセンス薬剤として以前に調査された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環で置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換された無荷電骨格を有する。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に耐性があり、ＲＮａｓｅ  Ｈを活性化することよりむしろ翻訳を阻止すること、またはｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングを妨げることによってアンチセンス薬剤として働くようである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって首尾よく組織培養細胞に送達され、こうしたいくつかの方法を比較した研究の１つは、スクレープローディング（scrape loading）が最も効率的な送達の方法であることを見出したが、モルフォリノ骨格は荷電していないため、カチオン性脂質は、細胞へのモルフォリノオリゴヌクレオチド取り込みの有効なメディエーターではない。最近の報告は、モルフォリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成を実証し、非イオン性骨格のため、モルフォリノオリゴヌクレオチドがマグネシウムの非存在下において三重鎖を形成することができることをこれらの研究は示した。
【００３７】
骨格の残基間の結合がリン原子を含まないことがさらに好ましく、例えば、短鎖アルキルによって形成される結合またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１つ以上の短鎖ヘテロ原子結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合である。
【００３８】
好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500）。ＰＮＡベースの分子は、塩基対の認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣物である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成され、ヌクレオベースは、メチレンカルボニル結合によって骨格と連結される。代替的な骨格は、炭素１つ伸長したピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Govindaraju and Kumar (2005) Chem Commun 495-497）。ＰＮＡ分子の骨格は荷電したリン酸基を含まないため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、通常、それぞれＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定している（Egholm et al. (1993) Nature 365:566-568）。さらに好ましい骨格は、モルフォリノヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環（6-membered morpholino ring）で置換されている。最も好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環で置換されており、隣接するモルフォリノ環間のアニオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合によって置換されている。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホジエステル結合にある１つの非橋架酸素の置換を含む。この修飾は、塩基対合をやや不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する著しい耐性を付加する。好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネートおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸またはボラノリン酸を含む。
【００４０】
本発明のさらに好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、例えば、−ＯＨ；−Ｆ；１つ以上のヘテロ原子の割り込みがあってもよい置換または非置換、直鎖または分岐の低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、またはアラルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；ジメチルアミノオキシエトキシ；および−ジメチルアミノエトキシエトキシにより２’、３’および／または５’位において一置換または二置換された１つ以上の糖部分を含む。糖部分は、ピラノースもしくはその誘導体、またはデオキシフラノースもしくはその誘導体、好ましくは、リボースもしくはその誘導体またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってもよい。好ましい誘導体化糖部分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、その中の２’−炭素原子が糖環の３’または４’炭素原子と連結され、それにより二環式の糖部分を形成する。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン−架橋化核酸を含む（Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242）。これらの置換は、ヌクレオチドアナログまたは等価物をＲＮａｓｅ  Ｈおよびヌクレアーゼ耐性にし、標的ＲＮＡに対する親和性を高める。
【００４１】
別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、１つ以上の塩基修飾または置換を含む。修飾塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび当該技術分野において知られているか、または知られることになるピリミジ塩基およびプリン塩基の他の−アザ、デアザ、−ヒドロキシ、−ハロ、−チオ、チオール、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、チオアルキル誘導体などの合成および天然の塩基を含む。
【００４２】
ＡＯＮのすべての位置が均一に修飾されている必要はないことが当業者に理解される。さらに、上記のアナログまたは等価物の１つ超が、１つのＡＯＮまたはさらにはＡＯＮ内の１つの位置に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、本発明のＡＯＮは、少なくとも２つの異なる種類のアナログまたは等価物を有する。本発明による好ましいエクソンスキッピングＡＯＮは、２’−Ｏアルキルホスホロチオエート化アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’−Ｏ−エチル修飾リボース、２’−Ｏ−プロピル修飾リボース、および／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体を含む。本発明による有効なＡＯＮは、（好ましくは完全な）ホスホロチオエート化骨格を伴う２’−Ｏ−メチル−リボースを含む。
【００４３】
効率的な異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３のスキッピングのために、異なるＡＯＮが混ぜ合わされてもよいことも当業者は理解するであろう。好ましい実施形態において、２、３、４、または５つの異なるＡＯＮなどの少なくとも２つのＡＯＮの組合せが本発明の方法に使用される。したがって、本発明はまた、少なくとも１つの本発明によるＡＯＮを含み、任意選択で、本明細書中で開示されているか、もしくはエクソン１２保持に関連するさらに良好な実施物の１つのようである国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットに開示されているＡＯＮ４ａなどの先行技術において開示されているＡＯＮをさらに含む、１組のＡＯＮに関する。
【００４４】
上で極めて詳細に示したとおり、エクソン１３における突然変異の存在は、エクソン１３のスキッピングおよびエクソン１２の共スキッピングを誘導する。当該技術は、エクソン１３のスキッピングを生じさせるＡＯＮを使用すると、（一定のレベルまで）望ましくないエクソン１２スキッピングが同時に起こることを示してきた。したがって、エクソン１２を保持しながら有効なエクソン１３スキッピングをもたらすＡＯＮを使用することが好ましい。１つのＡＯＮが一方で適切なエクソン１３スキッピングおよび他方でエクソン１２の保持をもたらすことが最も好ましい。図２からわかるとおり、先行技術のＡＯＮの使用は、エクソン１３単独のスキップよりも著しく高いレベルのエクソン１２／１３二重スキップをもたらす（バンドの強度を参照）。エクソン１２／１３二重スキップと比較して、少なくとも同程度のエクソン１３単独のスキップをもたらすＡＯＮを使用することが好ましく、これは、およそ５０／５０になるであろう。図２は、本発明のＡＯＮが少なくとも５０／５０の比をもたらすことができたが、Ｅｘ１３−３は、エクソン１２／１３二重スキップを超えて単独のエクソン１３スキップをもたらすことによってさらにより有効であったことを示している。比は、通常の定量ＰＣＲ技術を使用して当業者が求めることができ、本発明は、本明細書の例によって示されるとおりに比を求めるための少なくとも１つの方法を提供する。ここでは、Ｅｘ１３−１（配列番号５）、Ｅｘ１３−２（配列番号６）、およびＥｘ１３−３（配列番号７）と言及される本明細書中のＡＯＮ、または少なくとも配列番号１２、１３、もしくは１４と結合する、かつ／またはそれと相補的なＡＯＮが少なくとも５０／５０の比（エクソン１３単独のスキップ／エクソン１２／１３二重スキップ）を有する要件を満たすと考えられる。本発明のＡＯＮは、先行技術のＡＯＮより性能が優れている。
【００４５】
ＡＯＮは、細胞、好ましくは、網膜細胞へのＡＯＮの取り込みを高める部分に連結されてもよい。そのような部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、細胞透過性ペプチドであり、以下に限定されるものではないが、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータンおよびオリゴアルギニン、ポリアルギニン、オリゴリジンまたはポリリジンなどの正電荷アミノ酸、抗体によってもたらされるものなどの抗原結合ドメイン、抗体のＦａｂフラグメント、またはラクダ類のシングルドメイン抗原結合ドメインなどの単鎖抗原結合ドメインが挙げられる。
【００４６】
本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮは、当該技術分野において既知の適した手段を使用して間接的に投与されてもよい。例えば、前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする発現ベクターの形態で個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器に与えられてもよい。発現ベクターは、好ましくは細胞、組織、臓器または個体に遺伝子送達媒体により導入される。好ましい実施形態において、本明細書において特定されるＡＯＮの発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセット（transcription cassette）を含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、エクソンスキッピングＡＯＮの発現を促す条件下に置かれたときに本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮを発現させるウイルスベクターを提供する。プラスミドによるＡＯＮ発現またはアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベースのベクターによってもたらされるウイルス発現によって、異常なＵＳＨ２Ａエクソン１３の極めて効率的なスキッピングをもたらす必須の配列を妨害することができるエクソンスキッピング分子を細胞に与えてもよい。発現は、Ｕ７プロモーターなどのポリメラーゼＩＩ−プロモーター（Ｐｏｌ  ＩＩ）またはＵ６  ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーターによって駆動されてもよい。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターなどである。また、プラスミド、人工染色体、標的相同組み換えおよび細胞のヒトゲノムへの組み込みに使用可能なプラスミドが、本明細書中で定義されるオリゴヌクレオチドの送達に適切に利用されてもよい。転写がＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターから行われ、かつ／または転写物がＵ１またはＵ７転写物との融合物の形態であるそうしたベクターが本発明に好ましく、これが小さな転写物の送達に関して良好な結果をもたらす。適した転写物を設計することは技術のある技術者の範囲内にある。Ｐｏｌ  ＩＩＩによる転写物が好ましく、Ｕ１またはＵ７転写物との融合転写物の形態が好ましい。そのような融合物は、記載されているとおりに作り出すことができる（Gorman et al., 1998。Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 95(9):4929-34；Suter et al. 1999. Double-target antisense U7 snRNAs promote efficient skipping of an aberrant exon in three human beta-thalassemic mutations. Hum Mol Genet 8(13):2415-23）。
【００４７】
エクソン１３スキッピングＡＯＮは、そのまま送達されてもよい。しかしながら、エクソン１３スキッピングＡＯＮはまた、ウイルスベクターによってコードされてもよい。一般に、これは、転写物の一部に本発明によるオリゴヌクレオチドの配列を含むＲＮＡ転写物の形態である。本発明によるＡＡＶベクターは組み換えＡＡＶベクターであり、本明細書中の別の場所で示したＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質のタンパク質の殻に包まれた本発明によるコード化エクソン１３スキッピングＡＯＮを含むＡＡＶゲノムの部分を含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの部分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびその他などのアデノ随伴ウイルス血清型由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含んでもよい。カプシドタンパク質から構成されるタンパク質の殻は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、８、９およびその他などのＡＡＶ血清型由来のものであってもよい。タンパク質の殻は、カプシドタンパク質の殻と呼ばれる場合もある。ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つまたは好ましくはすべてが除去されていてもよいが、依然として機能的なＩＴＲ核酸配列を含んでもよい。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキューおよびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、機能的なままである限り、野生型配列であってもよく、または野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、もしくは１００％の配列同一性を有してもよく、または例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって改変されていてもよい。この状況において、機能性とは、カプシドの殻へのゲノムのパッケージングを指示し、その結果、感染した宿主細胞または標的細胞における発現を可能にさせる能力を指す。本発明の状況において、カプシドタンパク質の殻は、ＡＡＶベクターゲノムＩＴＲと異なる血清型のものであってもよい。したがって、本発明によるＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質の殻、すなわち、正二十面体のカプシドから構成されてもよく、それが、１つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）を含み、一方、ＡＡＶ５ベクターに含まれるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含む任意の上記のＡＡＶ血清型であってもよい。したがって、「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質の殻を含み、それにより、どちらも本発明による任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲを包んでもよい。好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９に由来する。そのようなＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８、またはＡＡＶ９／９ベクターと呼ばれる。
【００４８】
より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型５に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型８に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／８ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型９に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／９ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型２に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／２ベクターと呼ばれる。最適な核酸配列によって表される本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮをコードする核酸分子は、好ましくは、上で特定したＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列、例えば、コード配列と機能可能に連結された発現調節エレメントおよび３’終結配列を含む発現コンストラクトの間に挿入される。「ＡＡＶヘルパー機能」とは、一般に途中でＡＡＶベクターに与えられるＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる対応するＡＡＶの機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶの機能を補完するが、（ＡＡＶベクターゲノムによってもたらされる）ＡＡＶ  ＩＴＲがない。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域またはそれらの機能的な実質的に同一の配列を含む。Ｒｅｐ領域およびＣａｐ領域は、当該技術分野において周知である。ＡＡＶヘルパー機能が、ＡＡＶヘルパーコンストラクトに与えられてもよく、これは、プラスミドであってもよい。
【００４９】
ヘルパーコンストラクトの宿主細胞への導入は、例えば、本明細書において特定されるＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムの導入の前またはそれと同時のトランスフォーメーション、トランスフェクション、またはトランスダクションによって行われてもよい。したがって、本発明のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、一方でＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の殻に関して、他方で前記ＡＡＶベクター複製およびパッケージングにおいて存在するＡＡＶゲノムに関して血清型の所望の組合せをもたらすように選択されてもよい。「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる付加的な機能を提供する。
【００５０】
適したＡＡＶヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型および２型など）およびワクチニアウイルスが挙げられる。参照によって本明細書に組み込む米国特許第６，５３１，４５６号明細書に記載されているとおり、ヘルパーウイルスによってもたらされる付加的な機能も、ベクターにより宿主細胞に導入することができる。好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）遺伝子またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含まない。ＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子あるいは当該技術分野において既知の化学的に、酵素的にもしくは別の方法で検知可能なおよび／または選択可能な産生物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）などのマーカー遺伝子あるいはレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。好ましくは、本発明によるＡＡＶベクターは、構築され、本明細書の実施例の方法に従って作製される。本発明による好ましいＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／２ベクターであり、配列番号１２、１３、または１４に示されるとおりのヌクレオチド配列と相補的または実質的に相補的な配列を含むか、または好ましくは、それからなる本発明によるＵＳＨ２Ａエクソン１３スキッピングＡＯＮを発現させる。本発明によるさらに好ましいＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／２ベクターであり、配列番号５、６、または７を含むか、または好ましくは、それからなる本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮを発現させる。
【００５１】
個体または前記個体の細胞、組織、臓器に本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮを与える手段の改善は、これまでに既に成し遂げられた進歩を考慮して予想される。そのような将来的な改善は、当然、本発明の方法を使用したｍＲＮＡの再構築に関して言及した効果を達成するために組み込まれてもよい。本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮは、そのまま個体、前記個体の細胞、組織もしくは臓器に送達されてもよい。本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮを投与するとき、ＡＯＮを送達方法と適合した溶液に溶解させることが好ましい。水溶液にプラスミドを与えることによって網膜細胞または内耳細胞にＡＯＮ発現のためのプラスミドが与えられてもよい。あるいは、ＡＯＮまたはＡＯＮ発現のためのプラスミドに対する好ましい送達方法は、ウイルスベクターまたはナノ粒子である。好ましくは、ウイルスベクターまたはナノ粒子は、網膜細胞または内耳細胞に送達される。網膜細胞もしくは内耳細胞またはその他の関連した細胞へのそのような送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてであってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＯＮ送達に使用することができるナノ粒子および微粒子は、当該技術分野において周知である。あるいは、既知のトランスフェクション試薬を使用したトランスフェクションによってプラスミドが与えられてもよい。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内および／または室内投与に対して、溶液は生理的食塩液であることが好ましい。本発明において特に好ましいのは、本明細書中で定義される各成分の細胞へおよび／または細胞（好ましくは、網膜細胞）中への送達を助けることになる賦形剤またはトランスフェクション試薬の使用である。本明細書中で定義される複合体を形成した各成分、またはベシクルもしくはリポソームに閉じ込められた各成分を細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、ベシクルおよび／またはリポソームを形成することができる賦形剤またはトランスフェクション試薬が好ましい。こうした賦形剤の多くは、当該技術分野において知られている。適した賦形剤またはトランスフェクション試薬は、本明細書中で定義される各成分を細胞、好ましくは、網膜細胞に送達することができる粒子に自己集合することができるポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはその誘導体、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成の両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、ＤＯＴＡＰおよび／またはウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、網膜細胞を含む多種多様の培養細胞にＡＯＮを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション潜在性は、全細胞生存に関して除外された低から中程度の毒性と組み合わされる。構造変更の容易さが、さらなる変更ならびにそれらのさらなる（ｉｎ  ｖｉｖｏ）核酸運搬特性および毒性の分析を可能にするために使用されてもよい。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎは、リポソームトランスフェクション剤の例である。これは、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（メチル硫酸塩であるＤＯＴＡＰと比較）および中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の２つの脂質構成成分からなる。中性構成成分が細胞内放出を仲介する。送達システムの別のグループは高分子ナノ粒子である。ＡＯＮを、細胞膜を越えて細胞中に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化するために、ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランのようなポリカチオンが、シアノアクリル酸ブチル（ＰＢＣＡ）およびシアノアクリル酸ヘキシル（ＰＨＣＡ）と組み合わされてもよい。こうした一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンが、コロイドを用いてオリゴヌクレオチドを製剤化するための代替的なアプローチを提供する。このコロイドナノ粒子系は、いわゆる、プロティクル（proticle）を形成することができ、これは、単純な自己集合プロセスによって作製することができ、ＡＯＮをパッケージングし、ＡＯＮの細胞内放出を仲介することができる。当業者は、エクソンスキッピング分子をＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の予防、処置または遅延のために送達すべく本発明に使用するためのエクソンスキッピング分子をパッケージングおよび送達するために任意の上記またはその他の商業的に入手可能な代替的賦形剤および送達システムを選択し、適合させることができる。「ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の予防、処置または遅延」は、本明細書において、好ましくは、部分的もしくは完全な視力障害もしくは失明の進行を予防する、停止させる、止める、または反転させること、ならびにＵＳＨ２Ａ遺伝子の遺伝的欠陥に起因する部分的もしくは完全な聴覚障害もしくは聴覚消失の進行を予防する、停止させる、止める、または反転させることと定義される。
【００５２】
さらに、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮは、細胞、細胞質および／またはその核への取り込みを促進するよう設計された標的化リガンドと特異的に共有結合的または非共有結合的に連結されてもよいであろう。そのようなリガンドは、（ｉ）細胞、組織もしくは臓器に特異的な細胞取り込みを促進するエレメントを認識する（以下に限定されるものではないがペプチ（様）構造を含む）化合物ならびに／あるいは（ｉｉ）細胞への取り込みおよび／またはベシクル、例えば、エンドソームもしくはリソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学的化合物を含んでもよいであろう。したがって、好ましい実施形態において、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮは、組成物または薬剤、あるいは少なくとも、細胞への送達および／もしくはその送達デバイスのためならびに／または細胞内送達を向上させるための賦形剤および／または標的化リガンドとともに提供される組成物として製剤化される。
【００５３】
組成物が本明細書の後で定義される補助的な化合物などの付加的な成分を含む場合、組成物の各成分は、１つの単一の組合せまたは組成物または調製物として製剤化されなくてもよい。それらの素性に応じて、当業者は、どの製剤のタイプが本明細書中で定義される各成分に最も適切であるかがわかるであろう。好ましい実施形態において、本発明は、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、さらに本明細書の後で定義される補助的な化合物を含むキット・オブ・パーツの形態である組成物または調製物を提供する。必要とされる場合、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮまたは本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮを発現させるベクター、好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容される担体を添加することによって薬学的に活性な混合物に組み込まれてもよい。したがって、本発明はまた、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、好ましくは、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、１つの本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮまたはウイルスベクターを含んでもよいが、複数の異なる本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮまたはウイルスベクターを含んでもよい。そのような医薬組成物は、担体、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤を含む任意の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。そのような薬学的に許容される担体、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤は、例えば、Remington (Remington 2000. The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams Wilkins）において見つけることができる。前記組成物のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。
【００５４】
投与の好ましい経路は、水溶液または特に、眼内投与に適合した製剤の硝子体内注射による。欧州特許第２４２５８１４号明細書は、とりわけペプチドまたは核酸薬物の眼内（硝子体内）投与に適合した水中油型エマルジョンについて開示している。このエマルジョンは、硝子体液よりも密度が低いため、エマルジョンは硝子体の上部に浮かんで、注射された薬物が視野を悪くするのを回避する。
【００５５】
本発明による複数の異なるエクソン１３スキッピングＡＯＮが使用される場合、本明細書において定義される濃度または用量は、使用されたすべてのＡＯＮの合計濃度もしくは用量または使用されたか、もしくは添加されたそれぞれのエクソン１３スキッピングＡＯＮの濃度もしくは用量を指してもよい。したがって、一実施形態において、使用される本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮのそれぞれの量または合計量が、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０５から２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される組成物が提供される。適した硝子体内用量は、各眼当たり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇなど、各眼当たり０．０５ｍｇから５ｍｇの間、好ましくは０．１から１ｍｇの間であろう。
【００５６】
本発明による好ましいＵＳＨ２Ａエクソン１３スキッピングＡＯＮは、個体のＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置のためのものである。本発明のすべての実施形態において、「処置」という用語は、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の予防および／または遅延をまた含むと理解される。本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮを使用して処置することができる個体は、既にＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を有すると診断されていてもよい。あるいは、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮを使用して処置することができる個体は、まだＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を有すると診断されていなくてもよいが、固体の遺伝的背景を考慮にいれると将来的にＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を発症するリスクが高い個体であってもよい。好ましい個体はヒト個体である。好ましい実施形態において、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態は、アッシャー症候群ＩＩ型である。したがって、本発明は、ＵＳＨ２Ａのスプライシングを調節することを必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患もしくは状態を処置するための薬剤として使用するため、およびＵＳＨ２Ａ関連疾患もしくは状態の予防、処置もしくは遅延のための薬剤として使用するための本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物をさらに提供する。好ましいＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態は、アッシャー症候群ＩＩ型である。前記使用のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。
【００５７】
本発明は、ＵＳＨ２Ａのスプライシングを調節することを必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置のための本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮの使用、もしくは本発明によるウイルスベクターの使用、または本発明による組成物をさらに提供する。好ましい実施形態において、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態はアッシャー症候群ＩＩ型である。
【００５８】
本発明は、薬剤の調製のため、ＵＳＨ２Ａのスプライシングを調節する必要があるＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態を処置するための薬剤の調製のため、およびＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の予防、処置または遅延のための薬剤の調製のための、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物の使用をさらに提供する。好ましいＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態は、アッシャー症候群ＩＩ型である。したがって、別の態様において、薬剤の調製のため、ＵＳＨ２Ａのスプライシングを調節する必要がある状態を処置するための薬剤の調製のため、およびＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の予防、処置または遅延のための薬剤の調製のための、本明細書中で定義されるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、ウイルスベクターまたは組成物の使用が提供される。好ましいＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態は、アッシャー症候群ＩＩ型である。前記使用のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。
【００５９】
本発明による使用または方法における処置は、少なくとも１回であり、１週間、１カ月、数カ月、１、２、３、４、５、６年またはそれ以上、例えば、一生涯続く。本発明による使用のための本明細書中で定義されるとおりのエクソン１３スキッピングＡＯＮまたはその等価物のそれぞれは、ＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または臓器へのｉｎ  ｖｉｖｏにおける直接の投与に適していてもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて直接投与されてもよい。本発明のＡＯＮ、組成物、化合物または補助的な化合物の投与の頻度は、疾患の重症度、患者の年齢、患者の突然変異、エクソン１３スキッピングＡＯＮの数（例えば、用量）、前記ＡＯＮの配合、投与の経路などのいくつかのパラメータにより左右される可能性もある。頻度は、１日１回、週に１回、２週間、もしくは３週間もしくは４週間もしくは５週間またはそれより長い期間に少なくとも１回の間で変化することもある。本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮの用量範囲は、好ましくは、厳しい手順要件が存在する臨床試験の用量漸増試験（ｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用）に基づいて設計される。本明細書中で定義されるとおりのエクソン１３スキッピングＡＯＮは、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５から２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で使用されてもよい。適した硝子体内用量は、各眼当たり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇなど、各眼当たり０．０５ｍｇから５ｍｇの間、好ましくは０．１から１ｍｇの間であろう。好ましい実施形態において、本明細書中で定義されるとおりのＡＯＮの０．１ｎＭから１μＭの範囲の濃度が使用される。好ましくは、この範囲は、網膜細胞または網膜組織などの細胞モデルにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためのものである。より好ましくは、使用される濃度は、１から４００ｎＭ、さらにより好ましくは１０から２００ｎＭ、さらにより好ましくは５０から１００ｎＭの範囲である。いくつかのＡＯＮが使用される場合、この濃度もしくは用量は、ＡＯＮの合計濃度もしくは用量または添加されたそれぞれのＡＯＮの濃度もしくは用量を指す場合もある。好ましい実施形態において、本発明による分子のための送達媒体として、本明細書の前に記載されているウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターは、１回の注射当たり１×１０９〜１×１０１７ウイルス粒子、より好ましくは、１回の注射あたり１×１０１０〜１×１０１２ウイルス粒子の範囲の用量で投与される。上で示したとおりのＡＯＮの濃度または用量の範囲は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける使用に対して好ましい濃度または用量である。当業者は、使用されるＡＯＮ、処置される標的細胞、遺伝子標的およびその発現レベル、使用される培地ならびにトランスフェクションおよびインキュベーション条件に応じて、使用されるＡＯＮの濃度または用量がさらに変化することもあり、さらに最適化される必要がある場合もあることを理解するであろう。
【００６０】
本発明による使用のための本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物は、ＵＳＨ２Ａ関連疾患もしくは状態に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または器官へのｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与に適していてもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて投与されてもよい。本発明による前記エクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物は、ＵＳＨ２Ａ関連疾患もしくは状態に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または器官へｉｎ  ｖｉｖｏにおいて直接または間接的に投与されてもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて直接または間接的に投与されてもよい。アッシャー症候群ＩＩ型は網膜および内耳細胞に顕著な形質を有するため、前記細胞が網膜細胞もしくは内耳細胞であることが好ましく、前記組織が網膜もしくは内耳であることがさらに好ましく、かつ／または前記器官が眼もしくは耳であることがさらに好ましい。
【００６１】
本発明は、細胞におけるＵＳＨ２Ａのスプライシングを調節するための方法であって、細胞、好ましくは、網膜細胞を本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることを含む方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書の前で定義されたものである。細胞を本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることは、当業者に既知の任意の方法によって行われてもよい。本明細書に記載されているエクソン１３スキッピングＡＯＮ、ウイルスベクターおよび組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触させることは、直接的または間接的であってもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてであってもよい。
【００６２】
本発明は、ＵＳＨ２Ａのスプライシングの調節を必要とする個体の、それを必要とするＵＳＨ２Ａ関連疾患または状態の処置のための方法であって、前記個体の細胞、好ましくは、網膜細胞を、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることを含む方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書の前で定義されたものである。細胞、好ましくは、網膜細胞を、本発明によるエクソン１３スキッピングＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることは、当業者に既知の任意の方法によって行われてもよい。本明細書に記載されているＡＯＮ、ウイルスベクターおよび組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触させることは、直接または間接的であってもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてであってもよい。別に指示がある場合を除いて、本明細書に記載されている各実施形態は、本明細書に記載されている別の実施形態と組み合わされてもよい。
【００６３】
本明細書で提供した配列情報は、エラーを伴って特定された塩基を含める必要があるほど狭く解釈されるべきではない。当業者は、エラーを伴って特定されたそのような塩基を特定することができ、そのようなエラーの正し方を知っている。本明細書において引用されているすべての特許および参照文献は、その全体を参照によって本明細書に組み込む。
【実施例】
【００６４】
[実施例１]
ヒトＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおける有効なエクソン１３のスキッピングのための代替的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の提供および試験。
ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３の配列を、エクソンスプライシングエンハンサーモチーフの存在についてさらに解析した。複数の部位を初めに決定し（図１を参照）、次に５つのＲＮＡ  ＡＯＮ（Ｅｘ１３−１からＥｘ１３−５）をＩＤＴから購入し、５８℃のＴｍを用いて設計した。初めに、すべてのＡＯＮを糖鎖において２’−Ｏ−メチル基で修飾し、すべてが完全なホスホロチオエート化骨格を有していた。ＡＯＮをリン酸緩衝食塩水中に溶解させたままにした。
【００６５】
培養条件、トランスフェクション、ＲＴ−ＰＣＲおよび分析プロトコルは、国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットに記載されているとおりであり、当業者に既知の一般的な方法を使用した。ヒト網膜芽細胞腫細胞（Ｗｅｒｉ−Ｒｂ１）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）、１％  １０Ｕ／μｌペニシリン、１０μｇ／μｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中において０．５×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。細胞を週に２回継代した。
【００６６】
ＡＯＮ１、ＡＯＮ２およびＥｘ１３−１からＥｘ１３−５アンチセンスオリゴヌクレオチドを、まずＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡからエクソン１３をスキップする能力について試験した。トランスフェクションに先立って、１．０×１０６のＷｅｒｉ−Ｒｂ１細胞を、６ウェルプレートの各ウェル中、合計体積が０．９ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍに播いた。トランスフェクション混合物を、所望の濃度の１μｌ  ＡＯＮを加えた５０μｌ  Ｏｐｔｉｍｅｍおよび１．２５μｌリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた５０μｌ  Ｏｐｔｉｍｅｍを混合することによって調製した。両混合物を室温で５分間インキュベートした。このインキュベーションステップの後、両混合物を一緒に徹底的に混合し、細胞への添加の前に室温でさらに２０分間インキュベートした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、１×ＰＢＳで洗浄した後、すぐにＲＮＡ単離に進んだ。製造業者のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ単離キット（Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ）を使用して全ＲＮＡをトランスフェクト細胞から単離した。次に、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用したｃＤＮＡ合成のために１μｇの全ＲＮＡを使用した。各ＰＣＲ反応に５％のｃＤＮＡを使用した。それぞれヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１１およびエクソン１５に位置する（配列番号１０として本明細書において示した）順方向プライマーおよび（配列番号１１として本明細書において示した）逆方向プライマーを使用して、ＵＳＨ２Ａ  ｃＤＮＡの一部を標準的なＰＣＲ条件下において増幅した。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルにおいて分離した。おそらく適切にスプライスされたＵＳＨ２Ａおよび異常にスプライスされたＵＳＨ２Ａを示すバンドを、ゲルから切り取り、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ単離キットを使用して精製し、確認のためにＡＢＩＰＲＩＳＭ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｖ２．０  Ｒｅａｄｙ  ＲｅａｃｔｉｏｎキットおよびＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７３０  ＤＮＡ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により両方の鎖から配列を決定した。
【００６７】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｗｅｒｉ−Ｒｂ１細胞におけるＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡの発現ならびにＡＯＮ１のトランスフェクションが結果としてエクソン１３のみのスキッピングおよびエクソン１２／１３の二重スキッピングをもたらすことを明らかにした（国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットの図５）。本明細書中で開示されるとおりの新規のＡＯＮの目的は、エクソン１３のみのスキップ産物の増加を伴い、より効率的にそれにエクソン１２を残すオリゴヌクレオチドが特定できるかどうかを見ることであった。エクソン１１に位置する順方向プライマーおよびエクソン１５の逆方向プライマーを使用してＲＴ産物を分析し、そのようなことが実際に可能であることを明らかにした。図２は、対照としてＡＯＮ１およびＡＯＮ２ならびに新たに特定したＡＯＮとしてＥｘ１３−１からＥｘ１３−５を使用した結果を示す。ＡＯＮ２は大部分がエクソン１２およびエクソン１３の二重スキップを誘導し、エクソン１３のみのスキップのシグナルがほとんどないことが明らかである。驚くべきことに、Ｅｘ１３−１、Ｅｘ１３−２およびＥｘ１３−３は、ＡＯＮ１およびＥｘ１３−４よりも単独の（エクソン１３）スキップに関してより強いシグナルをもたらしたようであるのに対し、Ｅｘ１３−５の場合はそのシグナルがほぼなかった。Ｅｘ１３−３によるトランスフェクション後、スプライスされていない産物（ゲルの上部）は、ほぼないようであった。また、Ｅｘ１３−３を使用した後の二重エクソン１２／１３スキップのシグナルの強度が、単独（エクソン１３）スキップよりも低く、これは、既知のＡＯＮを超えた著しい改善を示している。
【００６８】
[実施例２]
さまざまな化学修飾を有するＡＯＮを使用したＷｅｒｉ−Ｒｂ１細胞におけるエクソン１３スキッピング。
培養条件、トランスフェクション、ＲＴ−ＰＣＲおよび分析プロトコルは、国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットおよび上の実施例１に記載されているとおりとした。１．０×１０６のＷｅｒｉ−Ｒｂ１細胞を、インキュベーションに先立って６ウェルプレートの各ウェルに播いた。細胞を、Ｅｘ１３−３配列（配列番号７）を有するが、５つの異なる種類の化学修飾パターンを保有する（ＬＧＤ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈから購入した）合成の単離オリゴヌクレオチドとともにジムノシスにより(gymnotically)（したがって、トランスフェクション試薬を用いず）インキュベートした。
【００６９】
Ｅｘ１３−３  ２’ＯＭｅ（またはＥｘ１３−３  ＯＭｅ）＝すべての糖単位における２’−Ｏ−メチル修飾を「ｍ」（小文字）によって示し、完全なホスホロチオエート化骨格をアスタリスク（＊）によって示した：
５’−ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ｍＣ−３’
【００７０】
Ｅｘ１３−３  ２’ＭＯＥ（またはＥｘ１３−３  ＭＯＥ）＝すべての糖単位における２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を「Ｍ」（大文字）によって示し、完全なホスホロチオエート化骨格をアスタリスク（＊）によって示し、すべての２’−Ｏ−メトキシエチル修飾Ｕ’は実際には５−メチルウリジン（＝ｍ５Ｕまたはチミジン）であり、すべての２’−Ｏ−メトキシエチル修飾Ｃ’は実際には５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）である：
５’−ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＣ＊ＭＧ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ−３’
【００７１】
Ｅｘ１３−３  ＭＯＥ  ＯＭｅ＝糖単位における２’−Ｏ−メトキシエチル修飾または２’−Ｏ−メチル修飾をそれぞれ「Ｍ」（大文字）および「ｍ」（小文字）によって示し、完全なホスホロチオエート化骨格をアスタリスク（＊）によって示し、すべての２’−Ｏ−メトキシエチル修飾Ｕ’は実際には５−メチルウリジン（＝ｍ５Ｕまたはチミジン）であり、すべての２’−Ｏ−メトキシエチル修飾Ｃ’は実際には５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）である：
５’−ＭＡ＊ＭＧ＊ＭＣ＊ＭＵ＊ＭＵ＊ｍＣ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＡ＊ＭＵ＊ＭＣ−３’
【００７２】
Ｅｘ１３−３  ８ＰＳ＝すべての糖単位における２’−Ｏ−メチル修飾を「ｍ」（小文字）によって示し、骨格の８つのホスホロチオエート結合（各末端に４つ）をアスタリスク（＊）によって示した：
５’−ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ｍＵｍＣｍＧｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＵｍＵｍＡ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ｍＣ−３’
【００７３】
Ｅｘ１３−３  １１ＰＳ＝すべての糖単位における２’−Ｏ−メチル修飾を「ｍ」（小文字）によって示し、骨格上に分散した１１のホスホロチオエート結合をアスタリスク（＊）によって示した：
５’−ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵｍＵ＊ｍＣｍＧ＊ｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡ＊ｍＡｍＵ＊ｍＵｍＵ＊ｍＡｍＡ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ｍＣ−３’
【００７４】
ＡＯＮを２つの異なる濃度：５および１０μＭで細胞とともに４８時間インキュベートした。対照ＡＯＮは、完全なホスホロチオエート化骨格を含み、それぞれ糖部分に２’−Ｏ−メチル修飾を含んでいた。対照ＡＯＮは、以下の配列：５’−ＧＧＡＵＡＧＧＵＡＵＧＡＧＡＵＡＣ−３’（配列番号２２）を有し、１０μＭの濃度で使用した。インキュベーション後、細胞を回収し、１×ＰＢＳで洗浄した後、すぐにＲＮＡ単離に進んだ。全ＲＮＡを実施例１に記載されるとおりに単離した。マルチプレックスＤｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）反応は、全ＵＳＨ２Ａ発現を定量するための２つのＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃Ｈｓ０１０７１７９７＿ｍ１）およびＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ中のエクソン１３スキップパーセンテージを定量するためのアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃Ｈｓ０１０７１８００＿ｍ１）により行った。ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のエクソン１３および１４に位置する（本明細書において配列番号１７として示した）順方向プライマー、（本明細書において配列番号１８と示した）逆方向プライマーおよび（本明細書において配列番号１９として示した）６−フルオレセインアミダイト（６−ＦＡＭ）標識プローブを使用して、ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ中のエクソン１３スキップを求めた。プローブ用のスーパーミックス（ｄＵＴＰなし；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１８６−３０２５）を使用してｄｄＰＣＲミックスを調製するために製造業者のプロトコルを使用した。ｄｄＰＣＲアッセイは、ＱＸ２０００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行った。解析は、Ｑｕａｎｔａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて行った。野生型およびエクソン１３スキップＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡレベルに関して補正するために合計ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡレベルを使用した。図３は、上で概要を述べた異なる化学修飾を保有するＥｘ１３−３オリゴヌクレオチドを用いて得た結果を示す。トランスフェクション試薬を使用しないこれらの条件下において、単独または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾と組み合わせて使用される２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ；または２’−ＭＯＥ＝２’−メトキシエトキシ）修飾が２’−ＯＭｅ修飾単独、または８ＰＳもしくは１１ＰＳ修飾よりも優れていることが明らかに認識できる。したがって、本発明によるＡＯＮは、好ましくは、糖部分に２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを保有するか、または完全に２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾されている。これらのジムノシスの条件(gymnotic conditions)において、５％と同程度のエクソンスキッピングが達成された。
【００７５】
完全に２’−Ｏ−メチルおよび完全に２’−Ｏ−メトキシエチルＥｘ１３−３バージョンを、その後、ここではトランスフェクション試薬とともに再びＷｅｒｉ−Ｒｂ１細胞で用量反応実験において試験した。対照としてＥｘ１３−３  ＡＯＮのスクランブル（Ｓｃｒ）バージョンを使用して実施例１に記載されているとおりに実験を行い、ｄｄＰＣＲ分析は上記のとおりであり、エクソン１３スキップｍＲＮＡのパーセンテージを求めるために再び使用した。１０、２５、５０、１００および２００ｎＭのトランスフェクションＡＯＮの濃度を試験した。対照ＡＯＮは、２００ｎＭの最高濃度でのみ使用した。図４に結果を示す。この結果は、漸増濃度のＡＯＮを使用した場合に、エクソンスキッピング効果の増加を明らかに示し、糖部分に２’−Ｏ−メチル修飾のみを保有するＡＯＮを超えた２’−Ｏ−メトキシエチル修飾の優れた効果も明らかに示している。
【００７６】
[実施例３]
ＡＯＮはＵＳＨ２Ａ患者の線維芽細胞から形成された眼杯においてエクソン１３スキッピングを誘導する。
ＵＳＨ２Ａ  ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｌｙｓ２５３２Ｔｈｒｆｓ＊５６）およびｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ）両突然変異を複合ヘテロ接合性で保有するＵＳＨ２患者由来の線維芽細胞および健康なドナー由来の線維芽細胞を眼杯形成のために使用した。これらの個体由来の線維芽細胞を、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−Ｍｙｃを発現させる４つのレンチウイルスを使用してＲａｄｂｏｕｄ  ＵＭＣ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｒｅによってリプログラミングした（Okita et al. 2011. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods 8:409-412）。簡単に述べると、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株をフィーダー細胞（マウス胚線維芽細胞）上に形成し、次にＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ＃Ａ１５１７００１）中で維持した。３つのクローンを継代約６回で凍結保存し、免疫細胞化学によって多能性幹細胞マーカー：ＳＳＥＡ−４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１−８１およびＯｃｔ３／４の発現に関してさらに分析した。さらに、実施例１に記載されているとおりの全ＲＮＡ単離後に、多能性マーカーＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ３／４およびＳＯＸ２に関してｑＰＣＲ分析を行った。その後、ｉＰＳＣコロニーを選択し、ｍＴｅＳＲ１培地を用いて懸濁液中で培養して、凝集体形成を誘導した。凝集体を徐々に神経誘導培地に移行した。７日後に凝集体をマトリゲルコーティングしたシャーレに播き、培地を毎日変えた。分化の第４週目に、馬蹄形のＮＲ領域を、先のとがったタングステン針により手作業で分離し、懸濁液中で２または３カ月培養し、ここで、それが、徐々に三次元の眼杯を形成した（詳細に関しては、Zhong et al. 2014. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptor from human iPSCs. Nat Comm 5:4047を参照）。
【００７７】
ｉＰＳＣ由来の眼杯の形成に成功した後（３カ月の分化後）、これらを、完全に２’−Ｏ−メチル修飾され、完全なホスホロチオエート化骨格を含むＥｘ１３−３オリゴヌクレオチドで処理した。２つの異なる濃度：２μＭおよび１０μＭによる処置を１カ月続け、これは、１日おきにＡＯＮを含む培地を補給することによって行った。隣接するエクソン１１および１５に位置するプライマーを用いて成熟ｍＲＮＡにおける野生型レベル対エクソン１３スキップレベルを求めるためにＵＳＨ２Ａ転写物分析を行った。図５は、これらの分析の結果を示す（眼杯は三つ組で形成され、それぞれのレーンは、１つの眼杯を表す）。未処理の眼杯は、１２３９ｂｐの野生型バンドを示した。２μＭまたは１０μＭのいずれかのＥｘ１３−３での眼杯の処理により、５９７ｂｐのエクソン１３を伴わないバンドがもたらされた。時折、（エクソン１２およびエクソン１３の二重スキッピングを示す）４０１ｂｐのバンドが健康なドナー由来の眼杯ならびに患者由来の眼杯の両方に生じた。
【００７８】
次の実験において、ｉＰＳＣコロニーを選択し、培養して、胚様体を形成することを除いて上記のとおり、ＵＳＨ２Ａ  ｃ．２２９９ｄｅｌＧ（ｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ）突然変異をホモ接合性で有するＵＳＨ２患者の線維芽細胞から眼杯を形成した（Sangermano et al. 2016. Ophthalmology 123(6):1375-85に記載されているとおり）。簡単に述べると、胚様体を徐々に分化培地に移行した。７日後に、胚様体をマトリゲルコーティングシャーレに播き、培地を毎日変えて、眼杯を形成した。
【００７９】
形成に成功した後、その後、ＡＯＮを含む培地を１日おきに補給することによって１μＭ、２μＭ、５μＭおよび１０μＭの濃度を使用して、Ｅｘ１３−３  ２’ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例２を参照）により眼杯を１カ月処理した。対照として、完全にホスホロチオエート化骨格を有し、それぞれの糖部分に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾も保有し、以下の配列：５’−ＣＣＵＣＵＵＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＣＡ−３’（配列番号２３）を有するＡＯＮを使用した。この対照ＡＯＮにおいて、すべての２’−Ｏ−メトキシエチル修飾Ｕ’は実際には５−メチルウリジン（＝ｍ５Ｕまたはチミジン）であり、すべての２’−Ｏ−メトキシエチル修飾Ｃ’は実際には５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）である。
【００８０】
その後、ｍＲＮＡにおける野生型レベル対エクソン１３スキップレベルを求めるためにＵＳＨ２Ａ転写物分析を使用した。マルチプレックスｄｄＰＣＲ反応を、実施例２に記載されるとおりに行った。野生型およびエクソン１３ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡレベルに関して補正するために合計ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡレベルを使用した。図６は、眼杯に対してＥｘ１３−３  ２’ＭＯＥオリゴヌクレオチドを用いて得たｄｄＰＣＲの結果を示す。トランスフェクション試薬を使用しないこれらのジムノシス条件(gymnotic conditions)下において、単独で使用される２’−Ｏ−メトキシエチル修飾がＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ中のエクソン１３スキップを誘導する際に有効であることが明らかに認識できる。したがって、本発明によるＡＯＮは、好ましくは、糖部分に２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを保有するか、または好ましい別の実施形態では、完全に２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾されている。
【００８１】
これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの眼モデルに対するトランスフェクション試薬を使用しないエクソンスキッピング誘導ＡＯＮによる処理がＵＳＨ２Ａ患者材料のＵＳＨ２Ａ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおいて著しいエクソン１３のスキッピングをもたらすことを、説得力をもって示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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