(57)【要約】本発明は、キノリンフォルダマーである新規化合物を提供する。そのようなフォルダマーは膵島アミロイドポリペプチド（IAPP）を安定化し、かつこれに結合する。一定の態様において、本発明のキノリンフォルダマーは可溶性であり、かつ細胞の補助なしに生体膜を通過する。本発明は、少なくとも1種の本発明のキノリンフォルダマーの有効量を対象に投与することによって、糖尿病の予防または処置を、それを必要としている対象において行う新規方法をさらに提供する。本発明は、少なくとも1種の本発明のキノリンフォルダマーの有効量を対象に投与することによって、ミスフォールディングしたおよび/または構造不定のタンパク質によって引き起こされる神経変性疾患の予防または処置を、それを必要としている対象において行う新規方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはN-オキシド、およびそれらの任意の組み合わせ：
2019501111.tif 000021
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され；
R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテレオアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく；
R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく；またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し；
R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく；
mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり；
kは1〜5の範囲の整数であり；かつ
式（I）の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。
【請求項２】
R1の少なくとも1つの存在が-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
R1の少なくとも1つの存在が-O(CH2)mCOOHである、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
R1の少なくとも2つの存在が-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
R1の少なくとも2つの存在が独立して-O(CH2)mC(=O)OHである、請求項4記載の化合物。
【請求項６】
（I）中の1つおきのキノリン基が、-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択されるR1をそれぞれの環の4位に有する、請求項1記載の化合物。
【請求項７】
（I）中の所与のキノリン基が-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より選択されるR1を環の4位に有する場合、該所与のキノリン基が共有結合しているキノリン基は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-OC(=O)R5、-NH2、および-SHからなる群より独立して選択されるR1置換基を対応する環の4位に有し、ここでR5はHではない、請求項6記載の化合物。
【請求項８】
kが3である、請求項1記載の化合物。
【請求項９】
R1の各存在が-OCH2CH3および-OCH2COOHからなる群より独立して選択され；NR3R4が-NO2であり；R2が-OMeであり；かつkが3である、請求項1記載の化合物。
【請求項１０】
共有結合しているいかなる2つのキノリン基も同じR1置換基を有さない、請求項9記載の化合物。
【請求項１１】
式（III）または（IV）の化合物である、請求項10記載の化合物：
2019501111.tif 000022
。
【請求項１２】
生理的pHにおいて、式（I）の化合物が、-1、-2、-3、-4、-5、および-6からなる群より選択される正味の負電荷を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項１３】
式（II）の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはN-オキシド、およびそれらの任意の組み合わせ：
2019501111.tif 000023
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され；
（i）R2は-X1-LINKER-CARGOであるか、または（ii）R3は-X2-LINKER-CARGOであり；
X1は結合、-NH-、-O-または-S-であり；
X2は-C(=O)-または-C(=S)-であり；
LINKERは-(CH2)n-、-(CH2CH2O)n-および-(AA)n-からなる群を含み、ここでnの各存在は独立して1〜10の範囲の整数であり、かつAAの各存在は独立して天然アミノ酸であり、さらに-X-LINKERはジスルフィド結合をさらに含んでもよく；かつ
CARGOはオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドから選択される分子であり；
R2が-X1-LINKER-CARGOである場合、R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく；またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し；ならびに
R3が-X2-LINKER-CARGOである場合、R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく；かつR4はHであり；
R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく；
mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり；
kは1〜5の範囲の整数であり；かつ
式（II）の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。
【請求項１４】
CARGOが検出可能な標識を含む、請求項13記載の化合物。
【請求項１５】
生理的pHにおいて、CARGOが無い場合の式（II）の化合物が、-1、-2、-3、-4、-5、および-6からなる群より選択される正味の負電荷を有する、請求項13記載の化合物。
【請求項１６】
水溶性である、請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１７】
細胞膜を受動的に透過することができる、請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１８】
式（II）の化合物がCARGOよりも高い細胞膜透過性を有する、請求項13〜15のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１９】
X1-LINKERまたはX2-LINKERが細胞内で切断される、請求項13〜15および18のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２０】
検出可能な標識とさらに連結される、請求項1〜19のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２１】
検出可能な標識が放射性同位体、安定同位体、フルオロフォア、高電子密度の金属、ビオチン、DNA、RNA、抗体エピトープ、スピン標識、反応性ペプチドタグ、量子ドットおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項20記載の化合物。
【請求項２２】
少なくとも1種の請求項1〜21のいずれか一項記載の化合物および少なくとも1種の薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
少なくとも1種の追加の治療剤をさらに含む、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
それを必要としている対象において糖尿病を予防または処置する方法であって、少なくとも1種の請求項1〜21のいずれか一項記載の化合物の治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２５】
糖尿病を処置または予防する少なくとも1種の追加の治療剤を前記対象に投与する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物および前記少なくとも1種の追加の治療剤を前記対象に同時投与する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物および前記少なくとも1種の追加の治療剤が共製剤化される、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
糖尿病がI型またはII型糖尿病である、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
前記対象がヒトである、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
ミスフォールディングしたまたは構造不定のタンパク質によって引き起こされる神経変性疾患を予防または処置する方法であって、少なくとも1種の請求項1〜21のいずれか一項記載の化合物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３１】
神経変性疾患を処置または予防する少なくとも1種の追加の治療剤を前記対象に投与する段階をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物および前記少なくとも1種の追加の治療剤を前記対象に同時投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物および前記少なくとも1種の追加の治療剤が共製剤化される、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質がα-シヌクレイン、タウまたはAβを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
神経変性疾患がパーキンソン病またはアルツハイマー病を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３６】
前記対象がヒトである、請求項30記載の方法。
【請求項３７】
分子CARGOの細胞膜透過性を高める方法であって、CARGOがオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドからなる群より選択され、方法が、CARGOを誘導体化して請求項13記載の化合物を形成する段階を含む、方法。
【請求項３８】
前記化合物が細胞内で切断されて、CARGOまたはその誘導体を遊離し、CARGOの誘導体がCARGOと本質的に同じ生物活性を有する、請求項37記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、35 U.S.C. § 119(e)の下で2015年10月28日提出の米国特許仮出願第62/247,572号に対する優先権を主張し、その開示は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府支援による研究開発に関する言明
本発明は、国立衛生研究所により授与されたGM094693の下、政府支援により行った。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
バイオポリマーは、特定の構造にフォールディングすることを可能にする、前駆体の特定の配列の存在によって人工ポリマーから区別される。前駆体の極めて少ないセット（DNA/RNAでは4つ、およびタンパク質では20）が幅広いフォールディングを生み出し、生命に必須の機能を生み出す。これに対して、合成ポリマーは本質的に無制限の一連の前駆体変種が利用できる；しかしながら、配列制御の欠如および独特の立体配座の結果、機能の幅は生物学によってせばめられる。
【０００４】
合成フォルダマーは、これら2つの世界の最良のものを連結しようとするものである。特定可能な配列を有する新しい骨格は、フォールディングされた機能的構造をうまく設計することを可能にする。例えば、アリールアミド、β-ペプチド、α/β-ペプチドおよびペプトイドのオリゴマーに基づくフォルダマーが、それぞれ抗菌剤、GLP-1受容体のアゴニスト、HIV細胞融合の阻害剤およびVEGF受容体2のアンタゴニストとなるように設計されている。これらの小分子の達成可能な特異性はバイオポリマーに匹敵する。
【０００５】
立体配座選択などの動的な結合様式は、抗癌剤グリベックなどの、タンパク質-リガンド相互作用においてしばしば観察される。グリベックはSrcおよびそのホモログであるAblの構造的に同じ部位に結合する。それにもかかわらず、＞1,000倍の結合親和性の差があり、これはタンパク質動力学における差によって説明することができる。リガンドの内部自由度も同様に利用可能であろうことは理にかなっている。しかし、リガンド動力学は、結合後のエントロピー損失の結果、都合悪いと見なされる。フォルダマー構造の非共有結合性の可逆的安定化は、動的結合の機会および潜在的利益を犠牲にすることなく、タンパク質結合後のエントロピー損失を制限する機会を提供する。
【０００６】
哺乳動物の疾患を処置するために用い得る新規フォルダマーが、当技術分野において必要とされている。本発明は、この満たされていない必要性に取り組むものである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、化合物を提供する。本発明は、少なくとも1種の本発明の化合物と少なくとも1種の薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物をさらに提供する。本発明は、それを必要としている対象において糖尿病を予防または処置する方法をさらに提供する。本発明は、ミスフォールディングしたまたは構造不定のタンパク質によって引き起こされる神経変性疾患を予防または処置する方法をさらに提供する。本発明は、分子CARGOの細胞膜透過性を高める方法をさらに提供し、ここでCARGOはオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドからなる群より選択される。一定の態様において、化合物は式（I）の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはN-オキシド、およびそれらの任意の組み合わせである：
2019501111.tif 000002
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され；R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテレオアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく；R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく；またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し；R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく；mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり；kは1〜5の範囲の整数であり；かつ式（I）の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。一定の態様において、化合物は式（II）の化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはN-オキシド、およびそれらの任意の組み合わせである：
2019501111.tif 000003
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され；（i）R2は-X1-LINKER-CARGOであるか、または（ii）R3は-X2-LINKER-CARGOであり；X1は結合、-NH-、-O-または-S-であり；X2は-C(=O)-または-C(=S)-であり；LINKERは-(CH2)n-、-(CH2CH2O)n-および-(AA)n-からなる群を含み、ここでnの各存在は独立して1〜10の範囲の整数であり、かつAAの各存在は独立して天然アミノ酸であり、さらに-X-LINKERはジスルフィド結合をさらに含んでもよく；かつCARGOはオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドから選択される分子であり；R2が-X1-LINKER-CARGOである場合、R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく；またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し；ならびにR3が-X2-LINKER-CARGOである場合、R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく；かつR4はHであり；R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく；mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり；kは1〜5の範囲の整数であり；かつ式（II）の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。
【０００８】
一定の態様において、R1の少なくとも1つの存在は-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より選択される。他の態様において、R1の少なくとも1つの存在は-O(CH2)mCOOHである。さらに他の態様において、R1の少なくとも2つの存在は-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択される。さらに他の態様において、R1の少なくとも2つの存在は独立して-O(CH2)mC(=O)OHである。
【０００９】
一定の態様において、（I）中の1つおきのキノリン基は、-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択されるR1をそれぞれの環の4位に有する。
【００１０】
一定の態様において、（I）中の所与のキノリン基が-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択されるR1を環の4位に有する場合、所与のキノリン基が共有結合しているキノリン基は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-OC(=O)R5、-NH2、および-SHからなる群より独立して選択されるR1置換基を対応する環の4位に有し、ここでR5はHではない。
【００１１】
一定の態様において、kは3である。他の態様において、R1の各存在は-OCH2CH3および-OCH2COOHからなる群より独立して選択され；NR3R4は-NO2であり；R2は-OMeであり；かつkは3である。
【００１２】
一定の態様において、共有結合しているいかなる2つのキノリン基も同じR1置換基を有さない。
【００１３】
一定の態様において、化合物は式（III）または（IV）の化合物である。
2019501111.tif 000004
2019501111.tif 000005
【００１４】
一定の態様において、生理的pHにおいて、式（I）の化合物は、-1、-2、-3、-4、-5、および-6からなる群より選択される正味の負電荷を有する。
【００１５】
一定の態様において、CARGOは検出可能な標識を含む。他の態様において、生理的pHにおいて、CARGOが無い場合の式（II）の化合物は、-1、-2、-3、-4、-5、および-6からなる群より選択される正味の負電荷を有する。
【００１６】
一定の態様において、化合物は水溶性である。他の態様において、化合物は細胞膜を受動的に透過することができる。
【００１７】
一定の態様において、式（II）の化合物はCARGOよりも高い細胞膜透過性を有する。
【００１８】
一定の態様において、X1-LINKERまたはX2-LINKERは細胞内で切断される。
【００１９】
一定の態様において、化合物は検出可能な標識とさらに連結される。他の態様において、検出可能な標識は放射性同位体、安定同位体、フルオロフォア、高電子密度の金属、ビオチン、DNA、RNA、抗体エピトープ、スピン標識、反応性ペプチドタグ、量子ドットおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００２０】
一定の態様において、薬学的組成物は少なくとも1種の追加の治療剤をさらに含む。
【００２１】
一定の態様において、方法は、少なくとも1種の本発明の化合物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。他の態様において、方法は、糖尿病を処置または予防する少なくとも1種の追加の治療剤を対象に投与する段階をさらに含む。さらに他の態様において、方法は、神経変性疾患を処置または予防する少なくとも1種の追加の治療剤を対象に投与する段階をさらに含む。
【００２２】
一定の態様において、化合物および少なくとも1種の追加の治療剤を対象に同時投与する。他の態様において、化合物および少なくとも1種の追加の治療剤は共製剤化される。
【００２３】
一定の態様において、糖尿病はI型またはII型糖尿病である。他の態様において、タンパク質はα-シヌクレイン、タウまたはAβを含む。さらに他の態様において、神経変性疾患はパーキンソン病またはアルツハイマー病を含む。さらに他の態様において、対象はヒトである。
【００２４】
一定の態様において、方法は、CARGOを誘導体化して式（II）の化合物を形成する段階を含む。他の態様において、化合物は細胞内で切断されて、CARGOまたはその誘導体を遊離し、CARGOの誘導体はCARGOと本質的に同じ生物活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
以下の本発明の具体的態様の詳細な説明は、添付の図面と共に読むことでより良く理解されるであろう。本発明を例示するために、図面中に具体的態様を示す。しかし、本発明は図面中に示す態様の正確な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
【００２６】
【図１Ａ】式（III）の化合物とも表示する、ADM 116の化学構造を示す。矢印は表面に露出した官能基を示す。
【図１Ｂ】ADM 116の3次元スティックモデル（上）および球体（下）モデルを示す。矢印は表面に露出した官能基を示す。
【図１Ｃ】C末端がアミド化されている、ヒト膵島アミロイドポリペプチド（IAPP；SEQ ID NO:1）の一次配列を示す。
【図１Ｄ】ペンタキノリンであるADM-116Iの3次元スティックモデルを示す。矢印は表面に露出した官能基を示す。
【図２】時間依存的なIAPPの取り込みおよび毒性を例示する一連の画像を含む。時刻ゼロで、100nM IAPPA594を追加の13μM非標識IAPPと共に(毒性）および追加の13μM非標識IAPPなしで（非毒性）INS-1細胞の培養液に加えた。示した時点で共焦点画像を撮影した。スケールバー＝10μm。挿入グラフ：媒体のみの対照に対する毒性条件での毒性（CTB）およびアポトーシス（カスパーゼ）の比色評価。
【図３】図3A〜3Bは、IAPP線維形成の動力学に対するリガンドの効果を示す。図3Aは、単層リポソーム（630μMモノマー単位、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPB）：ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）＝1：1、100nm）により触媒される経時的な10μM IAPPの線維形成を示す。図3Bは、IAPP：小分子＝1：1で実施した表示の小分子による阻害を示す（反応中間点t50）。挿入図はADM 116による線維形成阻害の用量依存性の統計を示す。
【図４】図4A〜4Cは、IAPPにより誘導される毒性からのINS-1細胞の救出を示す。図4Aは、時刻ゼロでINS-1細胞に適用し、48時間後にCell-Titer Blue（CTB）を用いて測定した、13μM IAPPの毒性効果の統計を示す。データはIAPP単独および等モル比の表示の小分子を1：1の比で同時添加したものについて示す。データはIAPPだけで誘導した毒性に対して再規格化している。図4Bは、ADM-3およびADM-116による毒性救出の用量依存性を示す。図4Cは、IAPPの添加と分子の添加との間で時間遅延が導入される、13μM IAPPの相対毒性を示す。図4A〜4Cの誤差バーは、別々に行った3組の実験からの標準偏差である。
【図５】図5A〜5Dは、IAPPに結合している小分子およびそれらの構造効果を示す。図5Aは、IAPPの関数としての蛍光相関分光法（FCS）による拡散を測定することにより得た、25nM ADM-116Fを用いたIAPPへのADM-116の相対結合を示す。挿入図は、それぞれ0nMおよび250nM IAPPの代表的生自動相関データ（黒）および二成分フィッティング（赤）を示す。図5Bは、等温滴定熱量測定（ITC）により測定した、表示の小分子のヒトIAPPとの結合定数を示す。ND＝検出不可能な結合。挿入図は、化学量論の関数としてプロットしたADM-116結合の代表的生データおよびフィッティングを示す。図5Cは、ITCによる、表示の化合物についての結合への自由エネルギーおよびエントロピーの寄与を示す。図5Dは、大きい単層リポソーム（LUV）（モノマー単位で1.2mM、DOPG：DOPC＝1：1、100nm）の存在下での25μM IAPPの遠紫外CDスペクトルを示す。IAPP単独の2時点（青、黒）およびt＝0で化学量論的ADM-116を添加したものを示す。IAPPなしのADM-116を対照として示す（橙）。
【図６】図6A〜6Cは、膜転移および分配を示す。図6Aは、200nM ADM-116Fまたは200nM ADM-3Fと共に12時間インキュベートしたINS1細胞の共焦点蛍光画像を示す。示した条件は、さらに15μMの非標識小分子を添加したもの、および添加していないものである。図6Bは、10μMの非標識化合物と混合した200nM ADM-116FまたはADM-3Fと共に24時間インキュベートしたINS-1細胞から調製した、巨大細胞膜由来小胞（GPMV）の共焦点蛍光画像を示す。図6Cは、3つの分子：ADM-116、ADM-116I、およびADM-3のオクタノール：水分配係数の測定値に対する計算値を示す。
【図７】図7A〜7Dは、IAPPおよびADM-116の共局在を示す。図7Aは、タンパク質およびリガンド（13μM IAPP、15μM ADM-116、100nM IAPPA594および200nM ADM-116F）の蛍光変種をドープした救出条件に曝露したINS-1細胞を示す一連の画像を含む。小分子およびIAPPを培養液に同時導入した。図7Bは、タンパク質およびリガンド（13μM IAPP、15μM ADM-116、100nM IAPPA594および200nM ADM-116F）の蛍光変種をドープした救出条件に曝露したINS-1細胞を示す一連の画像を含む。IAPPを培養液に導入した20時間後に小分子を加えた。図7Cは、タンパク質およびリガンド（13μM IAPP、15μM ADM-116、100nM IAPPA594および200nM ADM-116F）の蛍光変種をドープした救出条件に曝露したINS-1細胞を示す一連の画像を含む。救出条件は図7Bに示したものと同じであったが、非標識成分は含まず、IAPPとの初期インキュベーションは18時間実施した。共焦点蛍光画像を、供与体励起光（左）または受容体励起光（中）を用い、受容体の発光波長で収集した。FRETをこれらのチャンネルから計算し、代表的細胞のDIC画像上に白色の点で示す。0.4よりも低い値はバックグラウンドから区別不可能であるため、＞0.4のFRET効率を示す領域のみを示す。バックグラウンドFRETを、さらなる13μMの非標識IAPPを含む並行実験を用いて決定した（図14）。図7Dは、約50の関心対象領域における表示のFRET効率での全カウントを示すFRETヒストグラムである。
【図８】図8A〜8Cは、ADM-116類縁体の選択、摂動および活性を示す。図8Aは、25μM IAPP存在下での25μM ADM-116またはADM-116Iの可視CDを示す。図8Bは、ADM-116およびADM-116鏡像異性体分布に偏りを導入するよう設計された2つのキラル変種それぞれの可視CDを示す。図8Cは、ADM-116の鏡像異性体に偏りのある構築物の線維形成阻害および毒性救出活性の比較を示す。実験条件はそれぞれ図3A〜3Bおよび図4A〜4Cで用いたものと一致している。
【図９】図9A〜9Bは、IAPP自己集合の動力学的特性を示す。図9Aは、630μM LUV（DOPG：DOPC＝1：1、100nm）の存在によって触媒される10μM IAPPの標準反応についての3つの代表的動力学的特性を示す。挿入図は、反応中間点t50を導き出すために用いる代表的S字フィッティング（赤紫）を示す。図9Bは、630μM LUV非存在下（黒）および存在下（赤）での（10μM）IAPP細線維化の動力学的特性の代表的比較を示す。すべての実験は少なくとも3つ組で実施し、誤差は±1標準偏差として報告する。
【図１０】図10A〜10Bは、ADM-116により阻害された集合の画像を示す。図10Aは、10μM ADM-116非存在下でのリポソーム触媒IAPP（10μM）自己集合のネガティブ染色透過電子顕微鏡法（TEM）画像を示す。図10Bは、10μM ADM-116存在下でのリポソーム触媒IAPP（10μM）自己集合のネガティブ染色TEM画像を示す。
【図１１】選択した小分子の固有の毒性を示す。INS-1細胞を13μMの表示の小分子のそれぞれと共にインキュベートした。48時間後にCell-Titer Blue（CTB）を用いて生存度をアッセイし、担体のみの対照と比較した。誤差バーは4つの複製物の平均における標準偏差を示す。
【図１２】IAPP20-29の集合動力学に対するADM-116の効果を示す。200μMの10残基ペプチドであるIAPP20-29によるアミロイド集合の代表的動力学的特性。反応を等モル比での200μM ADM-116の非存在下および存在下で示す。
【図１３】図13A〜13Bは、IAPPおよびADM-3の共局在を示す。INS-1細胞を救出条件（200nM ADM-3Fおよび100nM IAPPA594をドープした13μM IAPPおよび15μM ADM-3）に曝露した。図13Aは、IAPPおよび小分子を培養液に同時に加えた場合の、INS-1細胞の一連の画像を含む。図13Bは、ADM-3をIAPPの添加の20時間後に加えた場合の、INS-1細胞の一連の画像を含む。
【図１４】共焦点撮像におけるバックグラウンドフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）の決定を示す。FRETのための共焦点撮像および処理を、図7A〜7Dで用いたものと一致する様式で行った。細胞の調製も、100nM IAPP594を13μM非標識IAPPで増強して、構造特異的FRETが起こるいかなる可能性も弱めた以外は、一致していた。
【図１５】小分子：ADM116、ADM-116I、ADM-I116、ADM-116P、ADM-116M、ADM-3F、ADM-3、およびADM-116Fの化学構造を示す。
【図１６】図16A〜16Bは、ADM-116によって誘導された立体配座の変化を示す。図16Aは、リポソーム（モノマー単位で630μM、DOPG：DOPC＝1：1、100nm）および25μM IAPP存在下での25μM ADM-116またはADM-116Pの可視CDスペクトルを示す。図16Bは、1：0.5（IAPP：小分子）の比でのADM-116またはADM-116I存在下での25μM IAPPの遠紫外CDスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物において膵島アミロイドポリペプチド（IAPP）に結合し、IAPPの（毒性）アミロイド状態の形成を防止する、新規キノリンフォルダマーの予想外の発見に一部関する。一定の態様において、本発明の化合物を用いて、ヒトなどの哺乳動物におけるI型および/またはII型糖尿病を処置または予防することができる。他の態様において、本発明の化合物を用いて、ミスフォールディングしたおよび/または構造不定のタンパク質に基づく神経変性疾患を処置することができる。本発明の範囲内で企図される例示的タンパク質には、α-シヌクレイン（パーキンソン病）、タウ（アルツハイマー病）および/またはAβ（アルツハイマー病）が含まれる。
【００２８】
本発明は、様々な生物活性化合物のキノリンフォルダマーコンジュゲートをさらに提供し、コンジュゲートは対応する化合物よりも改善された細胞膜透過性を有する。
【００２９】
定義
特に記載がないかぎり、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用し得るが、具体的な方法および材料を記載する。
【００３０】
本明細書において用いられる以下の用語はそれぞれ、本項においてそれに関連する意味を有する。
【００３１】
冠詞「a」および「an」は、本明細書において冠詞の1つまたは複数（すなわち、少なくとも1つ）の文法上の目的語を指すために用いられる。例として、「要素（an element)」は1つの要素または複数の要素を意味する。
【００３２】
本明細書において用いられる「約」は、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合、そのような変動が開示する方法を実施するのに適当であるような、明記された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、さらにより好ましくは±0.1％の変動を含むことが意図される。
【００３３】
「異常」なる用語は、生物、組織、細胞またはその構成要素の文脈において用いられる場合、少なくとも1つの観察可能または検出可能な特性（例えば、年齢、処置、時刻など）において「正常な」（予想される）それぞれの特性を示す生物、組織、細胞またはその構成要素と異なる、生物、組織、細胞またはその構成要素を意味する。1つの細胞型または組織型にとって正常なまたは予想される特性は、異なる細胞型または組織型にとっては異常であり得る。
【００３４】
本明細書において用いられる「ADM-118」なる用語は、以下の化合物、またはその塩、溶媒和物もしくはN-オキシドを意味する。
2019501111.tif 000006
【００３５】
疾患または障害は、疾患もしくは障害の症状の重症度、そのような症状を患者が経験する頻度、またはその両方が低減される場合に「軽減」される。
【００３６】
本明細書において用いられる「組成物」または「薬学的組成物」なる用語は、本発明の範囲内で有用な少なくとも1種の化合物と薬学的に許容される担体との混合物を意味する。薬学的組成物は化合物の患者または対象への投与を容易にする。当技術分野において、静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、眼投与、肺内投与および局所投与を含むがそれらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が存在する。
【００３７】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持することができず、疾患が改善されなければ動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００３８】
これに対して、動物の「障害」は、動物がホメオスタシスを維持することはできるが、動物の健康状態は障害がない場合よりも好ましくない、健康状態である。処置せずに放置しても、障害は必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすものではない。
【００３９】
本明細書において用いられる「有効量」、「薬学的有効量」および「治療的有効量」なる用語は、所望の生物学的結果を提供するための、作用物質の非毒性であるが十分な量を意味する。その結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因の低減および/もしくは軽減、または生物系の任意の他の所望の変化であり得る。任意の個々の症例における適切な治療的量は、当業者であれば日常的実験を用いて決定し得る。
【００４０】
本明細書において用いられる「有効性」なる用語は、アッセイ内で達成される最大の効果（Emax）を意味する。
【００４１】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される」なる用語は、化合物の生物活性または性質を抑止せず、比較的に非毒性である、担体または希釈剤などの材料を意味し、すなわち、材料は望ましくない生物効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の任意の構成要素と有害な様式で相互作用することなく、個体に投与し得る。
【００４２】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される塩」なる語句は、無機酸、有機酸、溶媒和物、水和物、またはその包接体を含む、薬学的に許容される非毒性の酸から調製した、投与化合物の塩を意味する。そのような無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、酢酸、ヘキサフルオロリン酸、クエン酸、グルコン酸、安息香酸、プロピオン酸、酪酸、スルホサリチル酸、マレイン酸、ラウリン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、アムソン酸、パモ酸、p-トルエンスルホン酸、およびメシル酸である。適切な有機酸は、例えば、有機酸の脂肪族、芳香族、カルボン酸およびスルホン酸クラスから選択されてもよく、その例は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、カンファースルホン酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、イセチオン酸、乳酸、リンゴ酸、粘液酸、酒石酸、パラ-トルエンスルホン酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フロン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、サリチル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン（パモ）酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン（ベシル）酸、ステアリン酸、スルファニル酸、アルギン酸、ガラクツロン酸などである。さらに、薬学的に許容される塩には、非限定例として、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム依存性またはカリウム）、およびアンモニウム塩が含まれる。
【００４３】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」なる用語は、本発明の範囲内で有用な化合物を、その所期の機能を実施し得るように患者の内部にまたは患者に運ぶまたは輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒またはカプセル化材料などの、薬学的に許容される材料、組成物または担体を意味する。典型的には、そのような構築物を1つの臓器、または体の部分から、別の臓器、または体の部分に運ぶまたは輸送する。それぞれの担体は、本発明の範囲内で有用な化合物を含む、製剤の他の成分と適合性であり、かつ患者に対して有害でないという意味で、「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例には：糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびショ糖；デンプン、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；界面活性剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに薬学的製剤中で用いられる他の非毒性適合性物質が含まれる。
【００４４】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」には、本発明の範囲内で有用な化合物の活性と適合性であり、かつ患者に対して生理的に許容される、任意およびすべてのコーティング、抗菌および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども含まれる。補助的活性化合物も組成物中に組み込んでもよい。「薬学的に許容される担体」は、本発明の範囲内で有用な化合物の薬学的に許容される塩をさらに含んでもよい。本発明の実施において用いられる薬学的組成物中に含まれ得る他の追加の成分は、当技術分野において公知で、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)において記載され、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４５】
「患者」、「対象」、または「個体」なる用語は、本明細書において交換可能に用いられ、インビトロまたはインサイチューのいずれであろうと、本明細書に記載の方法に適用できる、任意の動物またはその細胞を意味する。非限定的態様において、患者、対象または個体はヒトである。
【００４６】
本明細書において用いられる「効力」なる用語は、最大反応の半分を生じるのに必要な用量（ED50）を意味する。
【００４７】
本明細書において用いられる「小分子」なる用語は、＜2,000amuの分子を意味する。
【００４８】
本明細書において用いられる「処置」または「処置すること」なる用語は、本明細書において企図される状態、本明細書において企図される状態の症状、または本明細書において企図される状態を発生する可能性を治癒させる、治す、軽減する、緩和する、変える、矯正する、改善する、改良する、または影響をおよぼすことを目的として、本明細書において企図される状態、本明細書において企図される状態の症状、または本明細書において企図される状態を発生する可能性を有する患者への、治療剤、すなわち、本発明の化合物（単独または別の薬剤との組み合わせ）の適用もしくは投与、または患者から単離した組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与（例えば、診断またはエクスビボ適用のため）と定義される。そのような処置は、薬理ゲノミクスの分野から得た知識に基づき、特異的に調整または改変してもよい。
【００４９】
「治療的」処置は、病態の徴候を示す対象に、それらの徴候を減少または除去するために施される処置である。
【００５０】
本明細書において用いられる「アルキル」なる用語は、それ自体で、または別の置換基の部分として、特に記載がないかぎり、示した数の炭素原子（すなわち、C1-6は1〜6つの炭素原子）を有し、かつ直鎖、分枝鎖、または環式置換基を含む、直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、およびシクロプロピルメチルが含まれる。最も好ましいのは(C1-C6)アルキル、特にエチル、メチル、イソプロピル、イソブチル、n-ペンチル、n-ヘキシルおよびシクロプロピルメチルである。
【００５１】
本明細書において用いられる「置換アルキル」なる用語は、ハロゲン、-OH、アルコキシ、-NH2、-N(CH3)2、-C(=O)OH、トリフルオロメチル、-C≡N、-C(=O)O(C1-C4)アルキル、-C(=O)NH2、-SO2NH2、-C(=NH)NH2、および-NO2からなる群より選択される1、2または3つの置換基で置換され、好ましくはハロゲン、-OH、アルコキシ、-NH2、トリフルオロメチル、-N(CH3)2、および-C(=O)OHから選択され、より好ましくはハロゲン、アルコキシおよび-OHから選択される1または2つの置換基を含む、前述の定義のアルキルを意味する。置換アルキルの例には、2,2-ジフルオロプロピル、2-カルボキシシクロペンチルおよび3-クロロプロピルが含まれるが、それらに限定されない。
【００５２】
本明細書において用いられる「ハロアルキル」なる用語は、F、Cl、Br、およびIからなる群より選択される1、2または3つの置換基で置換された、前述の定義のアルキルを意味する。
【００５３】
本明細書において用いられる「ヘテロアルキル」なる用語は、それ自体で、または別の用語との組み合わせで、特に記載がないかぎり、示した数の炭素原子およびO、N、およびSからなる群より選択される1または2つのヘテロ原子からなる安定な直鎖または分枝鎖アルキル基を意味し、ここで窒素および硫黄原子は任意に酸化されていてもよく、かつ窒素ヘテロ原子は任意に四級化または置換されていてもよい。ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の残部とそれが連結されている断片との間を含む、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置されてもよく、同様にヘテロアルキル基の最も遠位の炭素原子に連結されてもよい。例には：-O-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-OH、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-NH-(CH2)m-OH（m＝1〜6）、-N(CH3)-(CH2)m-OH（m＝1〜6）、-NH-(CH2)m-OCH3（m＝1〜6）、および-CH2CH2-S(=O)-CH3が含まれる。例えば、-CH2-NH-OCH3、または-CH2-CH2-S-S-CH3などの、最大2つまでのヘテロ原子が連続してもよい。
【００５４】
本明細書において用いられるとおり、単独または他の用語との組み合わせで用いられる「アルコキシ」なる用語は、特に記載がないかぎり、例えば、メトキシ、エトキシ、1-プロポキシ、2-プロポキシ（イソプロポキシ）ならびにより高級のホモログおよび異性体などの、分子の残部に酸素原子を介して連結された、前述の定義の示された数の炭素原子を有するアルキル基を意味する。好ましいのは、(C1-C3)アルコキシ、特にエトキシおよびメトキシである。
【００５５】
本明細書において用いられる「ハロ」または「ハロゲン」なる用語は、単独または別の置換基の部分として、特に記載がないかぎり、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子、好ましくはフッ素、塩素、または臭素、より好ましくはフッ素または塩素を意味する。
【００５６】
本明細書において用いられる「シクロアルキル」なる用語は、単環式または多環式非芳香族基を意味し、ここで環を形成する原子（すなわち、骨格原子）はそれぞれ炭素原子である。一定の態様において、シクロアルキル基は飽和または部分不飽和である。他の態様において、シクロアルキル基は芳香環と縮合している。シクロアルキル基には、3〜10の環原子を有する基が含まれる。シクロアルキル基の実例には、以下の部分が含まれるが、それらに限定されない。
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【００５７】
単環式シクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが含まれるが、それらに限定されない。二環式シクロアルキルには、、テトラヒドロナフチル、インダニル、およびテトラヒドロペンタレンが含まれるが、それらに限定されない。多環式シクロアルキルには、アダマンチンおよびノルボルナンが含まれる。シクロアルキルなる用語は「不飽和非芳香族カルボシクリル」または「非芳香族不飽和カルボシクリル」基を含み、それらはいずれも、少なくとも1つの炭素炭素二重結合または1つの炭素炭素三重結合を含む、本明細書において定義される非芳香族炭素環を意味する。
【００５８】
本明細書において用いられる「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロシクリル」なる用語は、O、SおよびNからそれぞれ選択される1〜4つの環ヘテロ原子を含む、ヘテロ脂環式基を意味する。一定の態様において、各ヘテロシクロアルキル基は、その基の環が2つの隣接するOまたはS原子を含まないとの条件で、その環系に4〜10の原子を有する。他の態様において、ヘテロシクロアルキル基は芳香環と縮合している。一定の態様において、窒素および硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されていてもよく、かつ窒素原子は任意に四級化されていてもよい。複素環系は、特に記載がないかぎり、安定な構造を提供する任意のヘテロ原子または炭素原子に連結されていてもよい。複素環は本質的には芳香族または非芳香族であってもよい。一定の態様において、複素環はヘテロアリールである。
【００５９】
3員ヘテロシクロアルキル基の一例にはアジリジンが含まれ、それに限定されない。4員ヘテロシクロアルキル基の例には、アゼチジンおよびベータラクタムが含まれ、それらに限定されない。5員ヘテロシクロアルキル基の例には、ピロリジン、オキサゾリジンおよびチアゾリジンジオンが含まれ、それらに限定されない。6員ヘテロシクロアルキル基の例には、ピペリジン、モルホリンおよびピペラジンが含まれ、それらに限定されない。ヘテロシクロアルキル基の他の非限定例は以下のものである。
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【００６０】
非芳香族複素環の例には、アジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ピロリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、ジオキソラン、スルホラン、2,3-ジヒドロフラン、2,5-ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、チオファン、ピペリジン、1,2,3,6-テトラヒドロピリジン、1,4-ジヒドロピリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ピラン、2,3-ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、1,4-ジオキサン、1,3-ジオキサン、ホモピペラジン、ホモピペリジン、1,3-ジオキセパン、4,7-ジヒドロ-1,3-ジオキセピン、およびヘキサメチレンオキシドなどの、単環式基が含まれる。
【００６１】
本明細書において用いられる「芳香族」なる用語は、1つまたは複数の多価不飽和環を有し、芳香族特性を有する、すなわち、nが整数である(4n＋2)非局在化π（パイ）電子を有する、炭素環または複素環を意味する。
【００６２】
本明細書において用いられるとおり、単独または他の用語との組み合わせで用いられる「アリール」なる用語は、特に記載がないかぎり、1つまたは複数の環（典型的には1、2または3つの環）を含む炭素環式芳香族系を意味し、ここでそのような環は、ビフェニルのようにペンダント様式で一緒に連結してもよく、またはナフタレンのように縮合してもよい。アリール基の例には、フェニル、アントラニル、およびナフチルが含まれる。好ましい例はフェニルおよびナフチルであり、最も好ましいのはフェニルである。
【００６３】
本明細書において用いられる「アリール-(C1-C3)アルキル」なる用語は、1〜3炭素アルキレン鎖がアリール基に連結されている官能基、例えば、-CH2CH2-フェニルを意味する。好ましいのはアリール-CH2-およびアリール-CH(CH3)-である。「置換アリール-(C1-C3)アルキル」なる用語は、アリール基が置換されているアリール-(C1-C3)アルキル官能基を意味する。好ましいのは置換アリール(CH2)-である。同様に、「ヘテロアリール-(C1-C3)アルキル」なる用語は、1〜3炭素アルキレン鎖がヘテロアリール基に連結されている官能基、例えば、-CH2CH2-ピリジルを意味する。好ましいのはヘテロアリール-(CH2)-である。「置換ヘテロアリール-(C1-C3)アルキル」なる用語は、ヘテロアリール基が置換されているヘテロアリール-(C1-C3)アルキル官能基を意味する。好ましいのは置換ヘテロアリール-(CH2)-である。
【００６４】
本明細書において用いられる「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」なる用語は、芳香族特性を有する複素環を意味する。多環式ヘテロアリールは、部分飽和である1つまたは複数の環を含んでもよい。例には以下の部分が含まれる。
2019501111.tif 000009
【００６５】
ヘテロアリール基の例には、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（特に2-および4-ピリミジニル）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（特に2-ピロリル）、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル（特に3-および5-ピラゾリル）、イソチアゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,3,4-トリアゾリル、テトラゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリルおよび1,3,4-オキサジアゾリルも含まれる。
【００６６】
多環式複素環およびヘテロアリールの例には、インドリル（特に3-、4-、5-、6-および7-インドリル）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（特に1-および5-イソキノリル）、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キノキサリニル（特に2-および5-キノキサリニル）、キナゾリニル、フタラジニル、1,8-ナフチリジニル、1,4-ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、1,5-ナフチリジニル、ベンゾフリル（特に3-、4-、5-、6-および7-ベンゾフリル）、2,3-ジヒドロベンゾフリル、1,2-ベンズイソキサゾリル、ベンゾチエニル（特に3-、4-、5-、6-、および7-ベンゾチエニル）、ベンゾキサゾリル、ベンゾチアゾリル（特に2-ベンゾチアゾリルおよび5-ベンゾチアゾリル）、プリニル、ベンズイミダゾリル（特に2-ベンズイミダゾリル）、ベンゾトリアゾリル、チオキサンチニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、ピロリジジニル、およびキノリジジニルが含まれる。
【００６７】
本明細書において用いられる「置換（された）」なる用語は、原子または原子群が水素を別の基に連結された置換基として置き換えていることを意味する。「置換（された）」なる用語は、そのような置換が許容される任意のレベルの置換、すなわち一、二、三、四、または五置換をさらに意味する。置換基は独立して選択され、置換は任意の化学的に可能な位置にあってもよい。一定の態様において、置換基の数は1〜4の間で変動する。他の態様において、置換基の数は1〜3の間で変動する。さらに他の態様において、置換基の数は1および2の間で変動する。
【００６８】
本明細書において用いられる「置換されていてもよい」なる用語は、参照した基が置換されていても、無置換でもよいことを意味する。一定の態様において、参照基はゼロの置換基で置換されていてもよく、すなわち、参照基は無置換である。他の態様において、参照基は、本明細書に記載の基より個別にかつ独立して選択される、1つまたは複数の追加の基で置換されていてもよい。
【００６９】
一定の態様において、置換基は、オキソ、ハロゲン、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、アルキル（直鎖、分枝および/または不飽和アルキルを含む）、置換もしくは無置換シクロアルキル、置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキル、フルオロアルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、置換もしくは無置換アルコキシ、フルオロアルコキシ、-S-アルキル、S(=O)2アルキル、-C(=O)NH[置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換フェニル]、-C(=O)N[Hまたはアルキル]2、-OC(=O)N[置換もしくは無置換アルキル]2、-NHC(=O)NH[置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換フェニル]、-NHC(=O)アルキル、-N[置換もしくは無置換アルキル]C(=O)[置換もしくは無置換アルキル]、-NHC(=O)[置換もしくは無置換アルキル]、-C(OH)[置換もしくは無置換アルキル]2、および-C(NH2)[置換もしくは無置換アルキル]2からなる群より独立して選択される。他の態様において、例として、任意の置換基は、オキソ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CF3、-CH2CF3、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCF3、-OCH2CF3、-S(=O)2-CH3、-C(=O)NH2、-C(=O)-NHCH3、-NHC(=O)NHCH3、-C(=O)CH3、および-C(=O)OHから選択される。さらに1つの態様において、置換基は、C1-6アルキル、-OH、C1-6アルコキシ、ハロ、アミノ、アセトアミド、オキソおよびニトロからなる群より独立して選択される。さらに他の態様において、置換基はC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロ、アセトアミド、およびニトロからなる群より独立して選択される。本明細書において用いられるとおり、置換基がアルキルまたはアルコキシである場合、炭素鎖は分枝、直鎖または環式であってもよく、直鎖が好ましい。
【００７０】
範囲：本開示の全体を通じて、本発明の様々な局面を範囲様式で提示することができる。範囲様式での記載は単に便宜および簡潔のためであることが理解されるべきであり、本発明の範囲に対する不動の限定と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は具体的に開示するすべての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考えるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの、具体的に開示する部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を有すると考えるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
【００７１】
説明
本発明は、哺乳動物において膵島アミロイドポリペプチド（IAPP）に結合し、IAPPの（毒性）アミロイド状態の形成を防止する、キノリンフォルダマーなどの新規化合物の予想外の発見に一部関する。本発明は、それを必要としている哺乳動物に本発明のキノリンフォルダマーの治療的有効量を投与することにより、糖尿病を処置または予防する方法にも関する。本発明は、α-シヌクレイン（パーキンソン病）、タウ（アルツハイマー病）および/またはAβ（アルツハイマー病）などの、ミスフォールディングしたおよび/または構造不定のタンパク質に基づく神経変性疾患を処置または予防する方法にも関する。
【００７２】
変性タンパク質（disordered protein）、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病の中核をなすものは、構造標的化治療設計にとって特に扱いづらい。本発明の結果は、疾患関連ペプチドにおいて構造を捕捉する、合成フォルダマーの能力を示す。オリゴキノリンアミドは、その外に向かって突き出した、誘導体化可能な部分とは無関係の、溶媒を排除するコアを伴う規定のフォールディングを有する。IAPPは、インスリンと共に膵臓β細胞中にパッケージされた37残基ペプチドである（図1C）。このペプチドのアミロイド線維への凝集がII型糖尿病で観察され、プレアミロイド状態のIAPPはβ細胞死を引き起こす毒素である。本発明の化合物は、IAPPのプレアミロイドα-ヘリックス配座を安定化するテトラキノリンを含む。本発明のポリアニオン性荷電化合物は、溶解性が高く、さらに細胞の補助なしに生体膜を通過する。いかなる理論にも限定されることを望むものではないが、これは化合物が膜透過性構造へ可逆的にフォールディングし得るために起こる可能性がある。本発明の化合物は、IAPPの細胞取込が完了したずっと後に、毒性に対抗する。これらの機能獲得は、フォルダマーがIAPPを認識するだけでなく、一時的にフォールディングしていない状態をとる能力に依存する。本発明の化合物は、細胞内IAPPと特異的にドッキングし、β細胞をアポトーシスから救出する。いかなる理論にも限定されることを望むものではないが、本発明の結果は、可塑性タンパク質の非毒性配座異性体を安定化することは、細胞毒性の救出の実行可能な戦略であり得ることを示す。
【００７３】
いかなる理論にも限定されることを望むものではないが、IAPPの作用様式は、アルツハイマー病からのAβペプチドおよびパーキンソン病からのα-シヌクレインを含む、変性疾患に関与するポリペプチドのものと類似している。これらの疾患のすべてにおいて、ポリペプチドは主に水溶液中で変性し、生体膜との相互作用後にα-へリックス転移への変性を起こす。これらの相互作用は疾患に関連する細胞毒性に関連づけられる。一定の態様において、本発明の化合物は、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む変性疾患を処置および/または予防する際に有用である。
【００７４】
化合物
本発明の化合物は、有機合成の技術分野において周知の技術を用いて合成してもよい。合成に必要な出発原料および中間体は、商業的供給元から得てもよく、または当業者には公知の方法に従って合成してもよい。
【００７５】
1つの局面において、本発明は式（I）の化合物、その塩、溶媒和物、またはN-オキシドを提供する：
2019501111.tif 000010
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され；
R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテレオアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく；
R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく；またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し；
R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく；
mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり；
kは1〜5の範囲の整数であり；
式（I）の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。
【００７６】
別の局面において、本発明は式（II）の化合物、その塩、溶媒和物、またはN-オキシドを提供する：
2019501111.tif 000011
式中、R1の各存在は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-O(CH2)mC(=O)OR5、-OC(=O)R5、-NH2、-SH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択され；
（i）R2は-X1-LINKER-CARGOであるか、または（ii）R3は-X2-LINKER-CARGOであり；
X1は結合、-NH-、-O-または-S-であり；
X2は-C(=O)-または-C(=S)-であり；
LINKERは-(CH2)n-、-(CH2CH2O)n-および-(AA)n-からなる群を含み、ここでnの各存在は独立して1〜10の範囲の整数であり、かつAAの各存在は独立してアミノ酸であり、さらに-X-LINKERはジスルフィド結合をさらに含んでもよく；かつ
CARGOはオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子およびポリペプチドから選択される分子であり；
R2が-X1-LINKER-CARGOである場合、R3およびR4はH、-(C=O)0-1(C1-C6)アルキル、-(C=O)0-1(C3-C8)シクロアルキル、-(C=O)0-1(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C=O)0-1アリール、および-(C=O)0-1ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、シクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は置換されていてもよく；またはR3およびR4は、R3およびR4が連結している窒素と一緒に-(C3-C10)ヘテロシクリルもしくは-NO2を形成し；ならびに
R3が-X2-LINKER-CARGOである場合、R2は-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-OR5、-(C3-C10)ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基は置換されていてもよく；かつR4はHであり；
R5の各存在はH、-(C1-C6)アルキル、-(C1-C6)ヘテロアルキル、-(C3-C8)シクロアルキル、-(C4-C10)ヘテロシクリル、アリール、および-(C5-C10)ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、ここでアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基は置換されていてもよく；
mの各存在は独立して1〜5の範囲の整数であり；
kは1〜5の範囲の整数であり；かつ
CARGOが無い場合の式（II）の化合物は生理的pHで正味の負電荷を有する。
【００７７】
一定の態様において、式（I）の化合物は生理的pHで-1の正味の負電荷を有する。他の態様において、式（I）の化合物は生理的pHで-2の正味の負電荷を有する。さらに他の態様において、式（I）の化合物は生理的pHで-3の正味の負電荷を有する。さらに他の態様において、式（I）の化合物は生理的pHで-4の正味の負電荷を有する。さらに他の態様において、式（I）の化合物は生理的pHで-5の正味の負電荷を有する。さらに他の態様において、式（I）の化合物は生理的pHで-6の正味の負電荷を有する。
【００７８】
一定の態様において、CARGOが無い場合の式（II）の化合物は生理的pHで-1の正味の負電荷を有する。他の態様において、CARGOが無い場合の式（II）の化合物は生理的pHで-2の正味の負電荷を有する。さらに他の態様において、CARGOが無い場合の式（II）の化合物は生理的pHで-3の正味の負電荷を有する。さらに他の態様において、CARGOが無い場合の式（II）の化合物は生理的pHで-4の正味の負電荷を有する。さらに他の態様において、CARGOが無い場合の式（II）の化合物は生理的pHで-5の正味の負電荷を有する。さらに他の態様において、CARGOが無い場合の式（II）の化合物は生理的pHで-6の正味の負電荷を有する。
【００７９】
一定の態様において、CARGOは検出可能な標識を含む。他の態様において、検出可能な標識は放射性同位体、安定同位体、フルオロフォア、高電子密度の金属、ビオチン、DNA、RNA、抗体エピトープ、スピン標識、反応性ペプチドタグ（FLASHタグなどの）、量子ドット、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００８０】
一定の態様において、R1の少なくとも1つの存在は-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より選択される。他の態様において、R1の少なくとも2つの存在は-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より独立して選択される。
【００８１】
一定の態様において、R1の少なくとも1つの存在は-O(CH2)mCOOHである。他の態様において、R1の少なくとも2つの存在は独立して-O(CH2)mCOOHである。
【００８２】
一定の態様において、（I）中の1つおきのキノリン基は、-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より選択されるR1をそれぞれの環の4位に有する。他の態様において、（I）中の所与のキノリン基が-O(CH2)mC(=O)OH、-SO3Hおよび-PO(OH)2からなる群より選択されるR1を環の4位に有する場合、所与のキノリン基が共有結合しているキノリン基は-OH、-O(C1-C6)アルキル、-O(C1-C6)ハロアルキル、-O(C1-C6)ヘテロアルキル、-OC(=O)R5、-NH2、および-SHからなる群より独立して選択されるR1置換基を対応する環の4位に有し、ここでR5はHではない。
【００８３】
一定の態様において、kは1である。他の態様において、kは2である。さらに他の態様において、kは3である。さらに他の態様において、kは4である。さらに他の態様において、kは5である。
【００８４】
一定の態様において、R1の各存在は-OCH2CH3および-OCH2COOHからなる群より独立して選択され；NR3R4は-NO2であり；R2は-OMeであり；かつk=3である。
【００８５】
一定の態様において、R1の各存在は-OCH2CH3および-OCH2COOHからなる群より独立して選択され、共有結合しているいかなる2つのキノリン基も同じR1置換基を有さない（化合物（III）および（IV）などであるが、それらに限定されない）。
【００８６】
さらに他の態様において、-NR3R4は- NO2であり、かつR2は-OMeである。
【００８７】
本発明の例示的化合物には式（III）〜（IV）が含まれる。式（III）の化合物はADM-116とも示される。式（IV）の化合物はADM-116Iとも示される。
2019501111.tif 000012
2019501111.tif 000013
【００８８】
一定の態様において、本発明の化合物は水溶性である。他の態様において、本発明の化合物は細胞膜を受動的に透過することができる。さらに他の態様において、本発明の化合物は、疎水性コアを有する細胞透過性構造へと可逆的にフォールディングする。
【００８９】
一定の態様において、式（II）の化合物はCARGO自体よりも高い細胞膜透過性を有する。他の態様において、式（II）の化合物は細胞内で切断されて、CARGOおよび/またはCARGOの誘導体を遊離し、CARGOの誘導体はCARGO自体と本質的に同じ生物活性を有する。
【００９０】
合成
本発明の化合物を、当業者には公知の合成法を用い、本明細書に記載の一般スキームによって調製してもよい。
【００９１】
本発明の化合物は、1つまたは複数の立体中心を有してもよく、各立体中心は独立して(R)または(S)配置のいずれかで存在してもよい。一定の態様において、本明細書に記載の化合物は、光学活性またはラセミ体で存在する。他の態様において、本明細書に記載の化合物は、共有結合したキラル補助基（カンフェニル基などであるが、それに限定されない）を含む。さらに他の態様において、本明細書に記載の化合物は、標的分子と相互作用し、この相互作用は標的によって駆動される偏ったフォールディング状態への化合物のフォールディングを誘導する。本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の治療的に有用な特性を有する、ラセミ体、光学活性体、位置異性体および立体異性体、またはその組み合わせを含むことが理解されるべきである。光学活性体の調製は、非限定例として、再結晶技術によるラセミ体の分割、光学活性な出発原料からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を用いてのクロマトグラフィ分離を含む、任意の適切な様式で達成される。一定の態様において、1つまたは複数の異性体の混合物を、本明細書に記載の治療化合物として用いる。他の態様において、本明細書に記載の化合物は1つまたは複数のキラル中心を含む。これらの化合物は、立体選択的合成、エナンチオ選択的合成ならびに/または鏡像異性体および/もしくはジアステレオマーの混合物の分離を含む、任意の手段によって調製する。化合物およびその異性体の分割は、非限定例として、化学的方法、酵素的方法、分別結晶、蒸留、およびクロマトグラフィを含む、任意の手段によって達成される。
【００９２】
本明細書に記載の方法および製剤は、本発明の任意の化合物の構造を有する化合物のN-オキシド（適切な場合）、結晶型（多形としても公知）、溶媒和物、非晶層、および/または薬学的に許容される塩、ならびに同じ種類の活性を有するこれらの化合物の代謝物および活性代謝物の使用を含む。溶媒和物には水、エーテル(例えば、テトラヒドロフラン、メチルtert-ブチルエーテル）またはアルコール（例えば、エタノール）溶媒和物、アセテートなどが含まれる。一定の態様において、本明細書に記載の化合物は、水、およびエタノールなどの薬学的に許容される溶媒による溶媒和型で存在する。他の態様において、本明細書に記載の化合物は非溶媒和型で存在する。
【００９３】
一定の態様において、本発明の化合物は、互変異性体として存在してもよい。すべての互変異性体は本明細書において提示する化合物の範囲内に含まれる。
【００９４】
一定の態様において、本明細書に記載の化合物をプロドラッグとして調製する。「プロドラッグ」とは、インビボで親化合物に変換される作用物質を意味する。一定の態様において、インビボ投与後に、プロドラッグは化合物の生物学的、薬学的または治療的活性型へと化学的に変換される。他の態様において、プロドラッグは、1つまたは複数の段階または工程により、化合物の生物学的、薬学的または治療的活性型へと酵素的に代謝される。
【００９５】
一定の態様において、例えば、本発明の化合物の芳香環部分上の部位は、様々な代謝反応に感受性である。芳香環構造上に適切な置換基を組み込むことで、この代謝経路を低減、最小化または除去し得る。一定の態様において、芳香環の代謝反応に対する感受性を低減または除去するのに適した置換基は、例示にすぎないが、重水素、ハロゲン、またはアルキル基である。
【００９６】
本明細書に記載の化合物には、1つまたは複数の原子が同じ原子番号を有するが、天然で通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子で置き換えられている、同位体標識化合物も含まれる。本明細書に記載の化合物中に含められるのに適した同位体の例には、2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P、および35Sが含まれるが、それらに限定されない。一定の態様において、同位体標識化合物は、薬物および/または基質の組織分布試験において有用である。他の態様において、重水素などのより重い同位体による置換は、より高い代謝的安定性（例えば、インビボ半減期の延長または必要投薬量の低減）を提供する。さらに他の態様において、11C、18F、15O および13Nなどの、陽電子放射同位体による置換は、基質の受容体占有を調べるための陽電子放射トポグラフィー（PET）試験において有用である。同位体標識化合物は、それ以外で用いる非標識試薬の代わりに、適切な同位体標識試薬を用いて、任意の適切な方法または工程により調製する。
【００９７】
一定の態様において、本明細書に記載の化合物を、発色団もしくは蛍光部分、生物発光標識、または化学発光標識の使用を含むが、それらに限定されない、他の手段によって標識する。
【００９８】
本明細書に記載の化合物、および異なる置換基を有する他の関連化合物を、本明細書に記載の技術および材料を用いて、ならびに、例えば、Fieser & Fieser's Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-17 (John Wiley and Sons, 1991)；Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989)；Organic Reactions, Volumes 1-40 (John Wiley and Sons, 1991)、Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989)、March, Advanced Organic Chemistry 4th Ed., (Wiley 1992)；Carey & Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4th Ed., Vols. A and B (Plenum 2000,2001)、およびGreen & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Ed., (Wiley 1999)（そのすべてはそのような開示について参照により本明細書に組み入れられる）に記載のとおりに合成する。本明細書に記載の化合物調製のための一般法は、本明細書において提供する式中で見出される様々な部分を導入するために、適切な試薬および条件の使用によって改変される。
【００９９】
本明細書に記載の化合物を、商業的供給元から入手可能な、または本明細書に記載の手順を用いて調製した化合物から出発して、任意の適切な手段を用いて合成する。
【０１００】
一定の態様において、ヒドロキシル、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基などの反応性基を、反応におけるそれらの望まれない関与を避けるために保護する。保護基を用いて、反応性部分のいくつか、またはすべてをブロックし、保護基が除去されるまで、そのような基が化学反応に関与するのを防止する。他の態様において、各保護基は異なる手段で除去可能である。まったく異なる反応条件下で切断される保護基は、異なる除去の要件を満たす。
【０１０１】
一定の態様において、保護基を酸、塩基、還元条件（例えば、水素化分解などの）、および/または酸化条件によって除去する。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタールおよびt-ブチルジメチルシリルなどの基は酸に不安定で、水素化分解によって除去可能なCbz基および塩基に不安定なFmoc基で保護されたアミノ基存在下、カルボキシおよびヒドロキシ反応性部分を保護するために用いる。カルボン酸およびヒドロキシ反応性部分は、t-ブチルカルバメートなどの酸に不安定な基、または酸および塩基の両方に安定であるが、加水分解により除去可能なカルバメートでブロックしたアミン存在下、メチル、エチル、およびアセチルなどであるが、それらに限定されない、塩基に不安定な基でブロックする。
【０１０２】
一定の態様において、カルボン酸およびヒドロキシ反応性部分を、ベンジル基などの加水分解により除去可能な保護基でブロックする一方、酸と水素結合可能なアミン基をFmocなどの塩基に不安定な基でブロックする。カルボン酸反応性部分を、アルキルエステルへの変換を含む、本明細書において例示する単純なエステル化合物への変換により保護するか、または2,4-ジメトキシベンジルなどの酸化的に除去可能な保護基でブロックする一方、共存するアミノ基を、フッ化物に不安定なシリルカルバメートでブロックする。
【０１０３】
アリルブロッキング基は、安定で、後に金属またはπ酸触媒により除去されるため、酸および塩基保護基存在下で有用である。例えば、アリルブロックしたカルボン酸を、酸に不安定なt-ブチルカルバメートまたは塩基に不安定なアセテートアミン保護基存在下、パラジウム触媒反応によって脱保護する。保護基のさらに別の形態は、化合物または中間体を連結する樹脂である。残基が樹脂に連結しているかぎり、その官能基はブロックされ、反応しない。いったん樹脂から遊離されれば、官能基は反応に利用可能となる。
【０１０４】
典型的にはブロッキング/保護基は以下から選択され得る。
2019501111.tif 000014
【０１０５】
他の保護基、ならびに保護基の作製およびそれらの除去に適用可能な技術の詳細な説明は、Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999、およびKocienski, Protective Groups, Thieme Verlag, New York, NY, 1994に記載され、それらはそのような開示について参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
組成物
本発明は、少なくとも1種の本発明の化合物を含む薬学的組成物を含む。一定の態様において、組成物は、糖尿病を処置または予防する少なくとも1種の追加の治療剤をさらに含む。
【０１０７】
一定の態様において、化合物または薬学的組成物と少なくとも1種の追加の治療剤とを対象に同時投与する。他の態様において、化合物または薬学的組成物と少なくとも1種の追加の治療剤とは共製剤化される。
【０１０８】
方法
本発明は、それを必要としている対象において糖尿病を処置または予防する方法を含む。本発明は、パーキンソン病および/またはアルツハイマー病などの、ミスフォールディングしたおよび/または構造不定のタンパク質に基づく神経変性疾患を処置または予防する方法をさらに含む。
【０１０９】
方法は、任意で薬学的組成物中の、少なくとも1種の本発明の化合物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。一定の態様において、方法は、糖尿病を処置または予防する追加の治療剤を対象に投与する段階をさらに含む。
【０１１０】
一定の態様において、糖尿病はI型および/またはII型糖尿病である。他の態様において、対象は哺乳動物である。さらに他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【０１１１】
方法は、分子の細胞膜透過性を高める方法をさらに含み、ここで分子はオリゴヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、小分子（＜2,000amuを有すると定義される）およびポリペプチドからなる群より選択され、方法は、分子を誘導体化して式（II）の化合物を形成する段階を含む。一定の態様において、式（II）の化合物は細胞内で切断されて、分子を遊離する。他の態様において、式（II）の化合物は細胞内で切断されて、分子自体と本質的に同じ生物活性を有する、分子の誘導体を遊離する。
【０１１２】
併用療法
本発明の方法の範囲内で有用な化合物を、糖尿病を処置するために有用な1つまたは複数の追加の治療剤との組み合わせで用いてもよい。これらの追加の治療剤は、市販の化合物または当業者には合成的に入手可能な化合物を含んでもよい。これらの追加の治療剤は、糖尿病の症状を処置、予防、または低減するために公知である。
【０１１３】
非限定例において、本発明の範囲内で有用な化合物を、インスリン製剤、インスリン誘導体、インスリン様アゴニスト、インスリン分泌促進物質、インスリン増感剤、ビグアナイド、糖新生阻害剤、糖吸収阻害剤、腎グルコース再取り込み阻害剤、β3アドレナリン受容体アゴニスト、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-1の類縁体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、食欲抑制剤およびリパーゼ阻害剤からなる群より選択される作用物質の少なくとも1つの種類との組み合わせで用いてもよい。それらを、インスリン製剤、インスリン誘導体、インスリン様アゴニスト、インスリン分泌促進物質、インスリン増感剤、ビグアナイド、糖新生阻害剤、糖吸収阻害剤、腎グルコース再取り込み阻害剤、β3アドレナリン受容体アゴニスト、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-1の類縁体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3阻害剤およびグリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤からなる群より選択される作用物質の少なくとも1つの種類と組み合わせることもさらに可能であり；それらを、インスリン製剤、インスリン誘導体、インスリン様アゴニスト、インスリン分泌促進物質、インスリン増感剤、ビグアナイド、糖新生阻害剤、糖吸収阻害剤および腎グルコース再取り込み阻害剤からなる群より選択される作用物質の少なくとも1つの種類と組み合わせることも可能である。これらの中でも、特定の非限定例はインスリン；スルホニル尿素剤である、グリクラジド、グリメピリドおよびグリベンクラミド；メグリチニドである、ナテグリニド、レパグリニドおよびミチグリニド；グリタゾンである、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン；ビグアナイドである、メトホルミン、フェンホルミンおよびブホルミン；ならびにα-グルコシダーゼ阻害剤である、アカルボース、ボグリボースおよびミグリトールである。
【０１１４】
相乗効果を、例えば、シグモイドEmax式（Holford & Scheiner, 1981, Clin. Pharmacokinet. 6:429-453）、Loewe相加式（Loewe & Muischnek, 1926, Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114:313-326）および半有効式（Chou & Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55）などの適切な方法を用いて計算してもよい。前述の各式を実験データに適用して、薬物併用の効果を評価する際に役立つ対応するグラフを生成してもよい。前述の式に関連する対応するグラフは、それぞれ、濃度-効果曲線、アイソボログラム曲線および組み合わせ指数曲線である。
【０１１５】
投与/投薬量/製剤
投与レジメンは、有効量を構成するものに影響をおよぼし得る。治療用製剤を、疾患または障害の発症前または発症後のいずれかに対象に投与してもよい。さらに、いくつかの分割投薬量ならびに時差（staggered）投薬量を毎日もしくは逐次投与してもよく、または用量を持続的に注入してもよいしもしくはボーラス注射であってもよい。さらに、治療用製剤の投薬量は治療的または予防的状況の緊急性によって指示されるように比例的に増加または減少させてもよい。
【０１１６】
患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの本発明の組成物の投与は、公知の手順を用いて、患者の疾患または障害を処置するのに有効な投薬量および期間で実施してもよい。治療効果を達成するのに必要な治療化合物の有効量は、患者の疾患または障害の状態；患者の年齢、性別、および体重；ならびに患者の疾患または障害を処置する治療化合物の能力に応じて変動し得る。投薬レジメンは、最適な治療反応を提供するように調節してもよい。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または用量は治療的状況の緊急性によって指示されるように比例的に減少させてもよい。本発明の治療化合物の有効用量範囲の非限定例は、約1〜5,000mg/kg体重/日である。当業者であれば関連する因子を試験し、過度の実験を行うことなく治療化合物の有効量に関する決定を行うことができるであろう。
【０１１７】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために、変動してもよい。
【０１１８】
特に、選択される投薬量レベルは、用いる特定の化合物の活性、投与の時間、化合物の排出速度、処置の期間、化合物と組み合わせて用いる他の薬物、化合物または材料、処置中の患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および以前の病歴、ならびに医学の分野において周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存する。
【０１１９】
当業者である医学博士、例えば、医師または獣医師は、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医師または獣医師は、薬学的組成物中で用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることができるであろう。
【０１２０】
特定の態様において、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、化合物を単位剤形に製剤化することは特に有利である。本明細書において用いられる単位剤形とは、処置する患者のための単位投薬量として適切な、物理的に別々の単位を意味し；各単位は、必要な薬学的媒体と共に、所望の治療効果を生じるために計算された治療化合物の所定の量を含む。本発明の単位剤形は、（a）治療化合物の特有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（b）患者の疾患または障害の処置のためにそのような治療化合物を配合/製剤化する技術分野に固有の制限によって規定され、それらに直接依存する。
【０１２１】
一定の態様において、本発明の組成物を、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて製剤化する。一定の態様において、本発明の薬学的組成物は、治療的有効量の本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む。
【０１２２】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持してもよい。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成してもよい。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、またはマンニトールおよびソルビトールなどのポリアルコールを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含むことによりもたらしてもよい。
【０１２３】
一定の態様において、本発明の組成物を、1日に1〜5回以上の範囲の投薬量で患者に投与する。他の態様において、本発明の組成物を、1日に1回、2日に1回、3日に1回から1週間に1回、および2週間に1回を含むがそれらに限定されない投薬量の範囲で患者に投与する。当業者には、本発明の様々な組み合わせ組成物の投与の頻度は、年齢、処置する疾患または障害、性別、全般的健康、および他の因子を含むがそれらに限定されない、多くの因子に依存して、個体ごとに変動することが容易に明らかである。したがって、本発明は、任意の特定の投薬法に限定されると解釈されるべきではなく、任意の患者に投与する正確な投薬量および組成物は、医師が患者についてのすべての他の因子を考慮して決定する。
【０１２４】
投与のための本発明の化合物は、約1μg〜約10,000mg、約20μg〜約9,500mg、約40μg〜約9,000mg、約75μg〜約8,500mg、約150μg〜約7,500mg、約200μg〜約7,000mg、約3050μg〜約6,000mg、約500μg〜約5,000mg、約750μg〜約4,000mg、約1mg〜約3,000mg、約10mg〜約2,500mg、約20mg〜約2,000mg、約25mg〜約1,500mg、約30mg〜約1,000mg、約40mg〜約900mg、約50mg〜約800mg、約60mg〜約750mg、約70mg〜約600mg、約80mg〜約500mg、およびそれらの間のありとあらゆる全増分値または部分増分値の範囲であってもよい。
【０１２５】
いくつかの態様において、本発明の化合物の用量は約1mgから約2,500mgである。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物中で用いる本発明の化合物の用量は、約10,000mg未満、または約8,000mg未満、または約6,000mg未満、または約5,000mg未満、または約3,000mg未満、または約2,000mg未満、または約1,000mg未満、または約500mg未満、または約200mg未満、または約50mg未満である。同様に、いくつかの態様において、本明細書に記載の第二の化合物の用量は、約1,000mg未満、または約800mg未満、または約600mg未満、または約500mg未満、または約400mg未満、または約300mg未満、または約200mg未満、または約100mg未満、または約50mg未満、または約40mg未満、または約30mg未満、または約25mg未満、または約20mg未満、または約15mg未満、または約10mg未満、または約5mg未満、または約2mg未満、または約1mg未満、または約0.5mg未満、およびそれらのありとあらゆる全増分値または部分増分値である。
【０１２６】
一定の態様において、本発明は、本発明の化合物の治療的有効量を、単独でまたは第二の薬剤との組み合わせで保持する容器；および患者の疾患または障害の1つまたは複数の症状を処置、予防、または低減するための化合物の使用説明書を含む、包装された薬学的組成物に関する。
【０１２７】
製剤を、通常の賦形剤、すなわち、経口、非経口、鼻腔、静脈内、皮下、腸内、または当技術分野において公知の任意の他の適切な投与様式に適した、薬学的に許容される有機または無機担体物質との混合物で用いてもよい。薬学的製剤は、滅菌してもよく、望まれる場合には補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響をおよぼす塩、緩衝剤、着色、着香および/または芳香物質などと混合してもよい。製剤は、望まれる場合には、他の活性作用物質、例えば、他の鎮痛剤と組み合わせてもよい。
【０１２８】
本発明の任意の組成物の投与経路には、経口、鼻腔、直腸、腟内、非経口、口腔、舌下または局所が含まれる。本発明において用いるための化合物は、経口または非経口投与、例えば、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）口腔、（経）尿道、腟（例えば、経膣および膣周囲）、鼻腔（内）および（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、くも膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、および局所投与などの、任意の適切な経路による投与のために製剤化してもよい。
【０１２９】
適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット、丸剤、ジェルキャップ、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ、経皮パッチ、ゲル剤、散剤、ペレット、マグマ、ロゼンジ、クリーム、ペースト、硬膏剤、ローション、ディスク、坐剤、鼻腔または経口投与用の液体噴剤、吸入用のドライパウダーまたはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物および製剤などが含まれる。本発明において有用な製剤および組成物は、本明細書に記載の特定の製剤および組成物に限定されないことが理解されるべきである。
【０１３０】
経口投与
経口適用のために、特に適しているのは、錠剤、糖衣錠、液剤、滴剤、坐剤、またはカプセル剤、カプレットおよびジェルキャップである。経口使用が意図される組成物を、当技術分野において公知の任意の方法に従って調製してもよく、そのような組成物は、錠剤の製造に適した不活性非毒性薬学的賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の作用物質を含んでもよい。そのような賦形剤には、例えば、ラクトースなどの希釈剤；コーンスターチなどの造粒および崩壊剤；デンプンなどの結合剤；ならびにステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤が含まれる。錠剤はコーティングしていなくてもよく、またはエレガンスのため、もしくは活性成分の放出を遅延させるために、公知の技術によってコーティングしてもよい。経口使用のための製剤は、活性成分が不活性希釈剤と混合されている、ゼラチン硬カプセルとして提供してもよい。
【０１３１】
経口投与のために、本発明の化合物は、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、コーンスターチ、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの、薬学的に許容される賦形剤と共に、通常の手段により調製された錠剤またはカプセル剤の形であってもよい。望まれる場合、錠剤を適切な方法およびColorcon, West Point, Paから入手可能なOPADRY(商標)フィルムコーティングシステム(例えば、OPADRY(商標) OY Type、OYC Type、Organic Enteric OY-P Type、Aqueous Enteric OY-A Type、OY-PM TypeおよびOPADRY(商標) White、32K18400）などのコーティング材料を用いてコーティングしてもよい。経口投与のための液体製剤は液剤、シロップ剤または懸濁剤の形であってもよい。液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール）；および保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの、薬学的に許容される添加剤と共に、通常の手段により調製してもよい。
【０１３２】
活性成分の出発粉末または他の微粒子材料を改変するための、造粒技術は薬学の技術分野において周知である。粉末を、典型的には結合剤材料と混合して、より大きい永久流動性凝集体または顆粒とし、これを「造粒」と呼ぶ。例えば、溶媒使用「湿式」造粒法は、一般には、粉末を結合剤材料と混合し、水または有機溶媒により湿性造粒塊の形成をもたらす条件下で湿らせ、次いでこれから溶媒を蒸発させなければならないことで特徴付けられる。
【０１３３】
溶融造粒は、一般には、本質的に添加水または他の液体溶媒の非存在下で、粉末または他の材料の造粒を促進するために、室温で固体または半固体の（すなわち、比較的低い軟化点または融点範囲を有する）材料の使用からなる。低融点の固体は、融点範囲の温度まで加熱すると、液化して結合剤または造粒媒質として作用する。液化した固体はそれが接触している粉末材料の表面全体にそれ自体を拡げ、冷却後、最初の材料が一緒に結合した固体の顆粒化した塊を形成する。次いで、得られた溶融顆粒を経口剤形の調製のために錠剤プレスに提供してもよく、またはカプセル化してもよい。溶融造粒は、固体分散体または固溶体を形成することにより、活性物質（すなわち、薬物）の溶解速度およびバイオアベイラビリティを改善する。
【０１３４】
米国特許第5,169,645号は、改善された流動特性を有する直接圧縮可能なワックス含有顆粒を開示している。ワックスを溶融物中で一定の流動改善添加剤と混合し、続いて冷却し、混合物を造粒すると、顆粒が得られる。一定の態様において、ワックスおよび添加剤の溶融組み合わせ中、ワックス自体だけが溶融し、他の場合には、ワックスおよび添加剤の両方が溶融する。
【０１３５】
本発明は、Gタンパク質受容体関連疾患または障害の処置のための、本発明の1つまたは複数の化合物の遅延放出を提供する層、および薬剤の即時放出を提供するさらなる層を含む、多層錠も含む。ワックス/pH感受性ポリマー混合物を用いて、活性成分が捕捉されて、その遅延放出を確実にする、胃不溶性組成物を得てもよい。
【０１３６】
非経口投与
非経口投与のために、本発明の化合物を注射または注入用に、例えば、静脈内、筋肉内もしくは皮下注射もしくは注入用に、またはボーラス用量での投与および/もしくは持続注入用に製剤化してもよい。任意に懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤などの他の製剤用作用物質を含む、油性または水性媒体中の懸濁剤、液剤または乳剤を用いてもよい。
【０１３７】
追加の投与形態
本発明の追加の剤形には、米国特許第6,340,475号；第6,488,962号；第6,451,808号；第5,972,389号；第5,582,837号；および第5,007,790号に記載の剤形が含まれる。本発明の追加の剤形には、米国特許出願第20030147952号；第20030104062号；第20030104053号；第20030044466号；第20030039688号；および第20020051820号に記載の剤形も含まれる。本発明の追加の剤形には、PCT出願国際公開公報第03/35041号；国際公開公報第03/35040号；国際公開公報第03/35029号；国際公開公報第03/35177号；国際公開公報第03/35039号；国際公開公報第02/96404号；国際公開公報第02/32416号；国際公開公報第01/97783号；国際公開公報第01/56544号；国際公開公報第01/32217号；国際公開公報第98/55107号；国際公開公報第98/11879号；国際公開公報第97/47285号；国際公開公報第93/18755号；および国際公開公報第90/11757号に記載の剤形も含まれる。
【０１３８】
制御放出製剤および薬物送達系
一定の態様において、本発明の製剤は、短期放出製剤、急速オフセット（rapid-offset）製剤、ならびに制御放出製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤およびパルス放出製剤であってもよいが、それらに限定されない。
【０１３９】
持続放出なる用語は、その通常の意味で用いられて、長期間にわたって薬物を徐々に放出し、かつ必須ではないが、長期間にわたって薬物の実質的に一定の血中レベルをもたらし得る、薬物製剤を意味する。期間は1ヶ月以上の長さであってもよく、ボーラス形態で投与した同じ量の作用物質よりも長い放出であるべきである。
【０１４０】
持続放出のために、本化合物を、本化合物に持続放出特性を提供するポリマーまたは疎水性材料を用いて製剤化してもよい。したがって、本発明の方法で用いるための化合物を、微粒子の形で例えば注射により、またはウエハーもしくはディスクの形で植え込みにより投与してもよい。
【０１４１】
本発明の1つの態様において、本発明の化合物を、単独でまたは別の薬剤との組み合わせで、持続放出製剤を用いて患者に投与する。
【０１４２】
遅延放出なる用語は、本明細書においてその通常の意味で用いられて、薬物投与に続くいくらかの遅延後に薬物の初期放出を提供し、かつ必須ではないが、約10分から最大約12時間までの遅延を含み得る、薬物製剤を意味する。
【０１４３】
パルス放出なる用語は、本明細書においてその通常の意味で用いられて、薬物投与後に薬物のパルス状の血漿プロファイルを生じるような様式で薬物の放出を提供する薬物製剤を意味する。
【０１４４】
即時放出なる用語は、その通常の意味で用いられて、薬物投与の直後に薬物の放出を提供する薬物製剤を意味する。
【０１４５】
本明細書において用いられる短期とは、薬物投与後約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分およびそれらのありとあらゆる全増分値または部分増分値までの、ならびにそれらを含む、任意の期間を意味する。
【０１４６】
本明細書において用いられる急速オフセットとは、薬物投与後約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、ならびにそれらのありとあらゆる全増分値または部分増分値までの、ならびにそれらを含む、任意の期間を意味する。
【０１４７】
投薬
本発明の化合物の治療的有効量または用量は、患者の年齢、性別および体重、患者の現在の医学的状態、ならびに処置中の患者の疾患または障害の進行に依存する。当業者であれば、これらおよび他の因子に応じて適切な投薬量を決定することができる。
【０１４８】
本発明の化合物の適切な用量は、1日に約0.01mg〜約5,000mg、例えば、1日に約0.1mg〜約1,000mg、例えば、約1mg〜約500mg、例えば、約5mg〜約250mgの範囲であってもよい。用量は1日に1回の投薬または複数回の投薬、例えば、1〜4回以上で投与してもよい。複数回の投薬を用いる場合、各投薬の量は同じでも異なってもよい。例えば、1mgの1日用量を、約12時間の間隔で2回の0.5mg用量として投与してもよい。
【０１４９】
1日に投与する化合物の量を、非限定例において、毎日、隔日、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、または5日ごとに投与し得ることが理解される。例えば、隔日の投与では、5mgの1日用量を月曜日に開始し、引き続く第1の5mgの1日用量を水曜日に投与し、引き続く第2の5mgの1日用量を金曜日に投与し、その後も同様であってもよい。
【０１５０】
患者の状態が改善する場合、医師の判断で、本発明の阻害剤の投与を任意に持続的に投与し；または、投与中の薬物の用量を一定期間、一時的に減少させるもしくは一時的に停止する（すなわち、「休薬」）。休薬の長さは、例にすぎないが、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、12日、15日、20日、28日、35日、50日、70日、100日、120日、150日、180日、200日、250日、280日、300日、320日、350日、または365日を含む、2日から1年の間で任意で変動する。休薬中の用量減少は、例にすぎないが、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％を含む、10％〜100％を含む。
【０１５１】
患者の状態の改善が起これば、必要であれば維持用量を投与する。その後、投薬量もしくは投与頻度、またはその両方を、疾患の改善が保持されるレベルまで下げる。一定の態様において、患者は症状および/または感染の任意の再発後、長期の間欠的処置を必要とする。
【０１５２】
本発明の方法において用いるための化合物を、単位剤形で製剤化してもよい。「単位剤形」なる用語は、処置を受けている患者のための単位投薬量として適切な、物理的に別々の単位を意味し、各単位は、任意に適切な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された活性材料の所定の量を含む。単位剤形は、1日1回用量用、または1日複数回用量（例えば、1日に約1〜4回以上）のうちの1回用であってもよい。1日複数回用量を用いる場合、単位剤形は各投与で同じであっても異なってもよい。
【０１５３】
そのような治療レジメンの毒性および治療的有効性は、LD50（集団の50％に対して致死的である用量）およびED50（集団の50％で治療的に有効な用量）の決定を含むがそれらに限定されない、細胞培養または実験動物において任意で決定される。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、LD50とED50との間の比で表す。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトにおいて用いるための投薬量の範囲を策定するために任意で用いる。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、最小限の毒性を伴うED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は任意で、用いる剤形および用いる投与経路に依存して、この範囲内で変動する。
【０１５４】
当業者であれば、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載の特定の手順、態様、特許請求の範囲、および実施例に対する多くの等価物を理解するかまたは確認し得るであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であり、添付の特許請求の範囲に含まれると考えられた。例えば、反応時間、反応サイズ/量、ならびに溶媒、触媒などの実験試薬、圧力、雰囲気条件、例えば、窒素雰囲気、および還元剤/酸化剤を含むがそれらに限定されない反応条件の、当技術分野において認められる代替物による、および日常的実験だけを用いた改変は、本出願の範囲内であることが理解されるべきである。
【０１５５】
本発明において値および範囲が提供される場合はいつでも、これらの値および範囲に含まれるすべての値および範囲は、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。さらに、これらの範囲内に入るすべての値、ならびに値の範囲の上限または下限も、本出願によって企図される。
【０１５６】
以下の実施例は、本発明の局面をさらに例示する。しかし、これらは決して本明細書において示す本発明の教示または開示を限定するものではない。
【実施例】
【０１５７】
本発明をここで、以下の実施例に関連して記載する。これらの実施例は例示のために提供するにすぎず、本発明は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書において提供する教示の結果明らかになる任意およびすべての変形を含むと解釈されるべきである。
【０１５８】
方法および材料
材料
チオフラビンT（ThT）はAcros Organics（Fair Lawn、NJ）から、脂質［ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）およびジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）］はAvanti Polar Lipids, Inc.（Alabaster、AL）から、96穴プレート（黒、w/平底）はGreiner Bio-One（Monroe、NC、USA）から、シリカプレート（w/UV254、裏面アルミニウム、200ミクロン）およびシリカゲル（標準等級、粒径40〜63ミクロン、230×400メッシュ）はSorbent Technologies（Atlanta、GA、USA）から、無水溶媒はSigma Aldrich（St. Louis、MI）またはVWR（Bridgeport、NJ、USA）から、2,6-ジクロロ-3-ニトロピリジン、ヨウ化アルキル、トリエチルアミン（無水）、ヨウ化2-クロロ-1-メチルピリジニウム、ブロモ酢酸tert-ブチル、トリフルオロ酢酸（TFA）、およびトリエチルシラン（TES）はSigma Aldrich（St. Louis、MI、USA）から、ならびに膵島アミロイドポリペプチド（IAPP）はGenscript（Piscataway、NJ、USA）およびElim Biopharmaceuticals（Hayward、CA、USA）から購入した。IAPPは再精製し、組織内で以下のとおりに処理した：IAPP（約2mg）を7M塩酸グアニジニウム中で可溶化した。溶液をろ過（0.2ミクロン）し、C-18スピンカラムに移し、水で2回（各400μL）と、続いて10％アセトニトリル/水、0.1％ギ酸（v/v）で洗浄し、次いで200μLの50％アセトニトリル/水、0.1％ギ酸（v/v）中に溶出した。IAPPの濃度を280nm（ε＝1400M-1.cm-1）で計算した。IAPP溶液をいくつかの一定量（20〜50μL、1〜2mM）に分割し、凍結乾燥し、白色固体として-80℃で保存した。各実験のために、凍結乾燥した一定量からIAPPの新鮮保存溶液を水中で調製した。Alexa-594標識IAPPを調製した（Magzoub, et al., FASEB J. 2012, 26, 1228-1238）。
【０１５９】
単層リポソーム
特に記載がないかぎり、この作業で用いたLUVはDOPG/DOPCの1：1混合物から調製した。凍結乾燥混合物を100mM KCl、50mMリン酸ナトリウム、およびpH7.4中で20分間水和した。緩衝液中の脂質の20mg/mL溶液を、ポリカーボネート膜（細孔径＝100nm）を21回通過させた。最終材料のリン脂質含有量を、全リンアッセイを用いて計算した（Chen, et al., Anal. Chem. 1956, 28, 1756-1758）。
【０１６０】
動力学アッセイ
アミロイド反応を、黒色96穴プレート中、リポソーム（630μM脂質）および20μM ThTを含む緩衝液中で実施した。この後、DMSOに溶解した小分子（最終DMSO濃度＝0.5％（v/v））を加えた。線維形成を、IAPP保存溶液の添加により開始した。各ウェルの最終量は200μLであった。細線維化の動力学を、FluoDia T70蛍光プレート（Photon Technology International、Edison、NJ、USA）を用いてThT蛍光（Ex 450nmおよびEm 485nm）によりモニターした。データは、ブランクを差し引き、IAPPだけを含む反応の最大強度に対して再規格化した。各動力学トレースをシグモイド式にフィッティングした：
2019501111.tif 000015
式中、Iは蛍光強度であり、tは時間であり、かつb、m、およびτは従属フィッティング変数である。すべての試料を少なくとも三つ組で実行し、文中に示す誤差バーは±1の標準偏差を表す。
【０１６１】
透過電子顕微鏡法
10μM IAPPを630μM LUVを含む緩衝液（100mM KCl、50mMリン酸ナトリウム、pH7.4）中、IAPP：小分子＝1：1の存在下および非存在下でインキュベートした。一定量を、グロー放電（25mAおよび30秒）し、カーボンコーティングした300メッシュ銅格子上で60秒間インキュベートした。乾燥後、格子を酢酸ウラン（2％、w/v）で60秒間ネガティブ染色した。顕微鏡写真をPhillips Tecnai 12透過電子顕微鏡（Hillsboro、Oregon、USA）により120kV加速電圧で撮影した。この作業における画像から得たすべての結論は、画像を調製および分析した研究者に試料同一性を知らせなかった、少なくとも1回の繰り返しを含む。
【０１６２】
等温熱量滴定（ITC）
ITC実験をNANO-ITC（TA instruments、New Castle、DE、USA）で実施した。小分子の溶液（1mM KCl、20mM Tris、pH7.4中100μM）を、10μM IAPP（1mM KCl、20mM Tris、pH7.4中250μL）を含む等温試料セル中に300rpmの撹拌速度で逐次滴定（ロータリーシリンジにより50μL注入）した。10秒注入を240秒間隔で分配した。各注入（オリゴキノリン：IAPP）に関連する熱を、NanoAnalyzeソフトウェア（New Castle、DE、USA）を用いて、それぞれの曲線下面積を積分することにより導き出した。IAPPに結合している小分子の熱を、緩衝液中へのオリゴキノリン注入の熱を差し引くことにより補正した。最終の補正した熱をモル比（オリゴキノリン：IAPP）の関数としてプロットし、one binding siteモデルによりフィッティングした。
【０１６３】
円二色性
100mM KClおよび50mMリン酸ナトリウム、pH7.4中、1200μM LUVと混合した25μM IAPPについて、CDスペクトルをAVIV MODEL 215（AVIV Instruments, Inc. Lakewood、NJ、USA）で収集した。データを、10秒の平均時間で平均4回くり返し、0.5nm間隔で200〜260nmから収集した。オリゴキノリン存在下でのCDスペクトルを、1：1（オリゴキノリン：IAPP）の化学量論比で200〜500nmから収集した以外は、前述のとおりに記録した。
【０１６４】
小分子特徴付け
小分子精製の最終段階を、VYDAC逆相カラム（4.6×100mm、1mL/分、分析用；10×100mm、3mL/分、半調製用）を備えたVarian ProStarを用いてHPLCにより実施した。移動相はA：5％ACN、95％H2O、0.1％TFA（v/v）ならびにB：95％ACN、5％H2O、および0.08％TFA（v/v）からなった。小分子の溶液NMRスペクトルを400、500、および600MHz Agilent分光計で記録した。O-tertブチルエステル保護および脱保護（O-COOH）オリゴキノリンのために用いた重水素化溶媒は、それぞれCDCl3および(CD3)2SOであった。解釈が難しい分裂パターンを多重線（m）または広幅（b）と示す。質量スペクトルを、MALDI-TOF Voyager DE Pro（Yale University、CBIC center）またはUniversity of Illinois Mass Spec. Facilityのいずれかを用いて得た。高分解能エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを、Waters Synapt G2-Si ESI MS質量分析計（Milford、MA、USA）を用いて得た。
【０１６５】
蛍光相関分光法
FCS測定を、以前にMiddleton, et al., Effects of Curvature and Composition on α-Synuclein Binding to Lipid Vesicles (Biophys. J. 2010, 99, 2279-2288)に記載された通りに、Olympus IX71顕微鏡（Olmpus、東京、日本）を用いて倒立顕微鏡の周りに基礎を置く研究室で作製した装置で行った。簡単に言うと、連続発光488nmダイオードポンプ式固体50mWレーザーを5〜20mWの出力電力に設定し、顕微鏡に入る直前にニュートラルデンシティフィルターで18μWの電力にさらに調節した。蛍光を対物レンズを通して収集し、Z488rdcロングパスダイクロイックおよびHQ600/200mバンドパスフィルター（Chroma、Bellows Falls、VT、USA）を用いて励起レーザーから分離した。蛍光を、アバランシェフォトダイオード（Perkin Elmer、Waltham、MA、USA）に連結した50μm光ファイバーの開口上に集中させた。デジタル相関器（Flex03LQ-12；Correlator.com、Bridgewater、NJ、USA）を用いて、自己相関曲線を生成した。
【０１６６】
プラズマ処理し、続いてポリリジン結合ポリエチレングリコール（PEG-PLL）でプレコーティングして、ADM-116および/またはIAPPがチャンバー表面に吸着するのを防止した、8ウェルチャンバースライド（Nunc、Rochester、NY、USA）中で測定を行った。低密度PEGコーティングを、ポリ-L-リジン臭化水素酸塩（Sigma Aldrich、St. Louis、MI、USA）中のPEG（MW＝2KDa、NANOCS、Boston、MA、USA）の100mg/ml溶液を調製することにより実施した。反応を暗所、室温で6時間行い、続いて終夜透析した。チャンバーをPEG-PLL溶液と終夜インキュベートし、ミリポア水で十分に洗浄し、使用まで水中で保存した。測定前に、すべての試料を緩衝液（20mM Tris、pH7.4、10mM NaCl）中で1時間インキュベートした。ADM-116Fの一定濃度（25nM）を維持し、漸増濃度のIAPPを加えながら、滴定を実施した。自己相関曲線を一定間隔（10分）で収集し、各自己相関曲線を10秒間収集し、30回くり返した。
【０１６７】
自己相関曲線をMatlab（The MathWorks、Nattick、MA、USA）を用いてフィッティングし、さらなる網羅的解析をIgorPro（ADInstruments、Colorado Springs、CO、USA）で実施した。ADM-116について、三重項状態で3Dブラウン拡散を起こす一元拡散種のモデルを式2で示す。
2019501111.tif 000016
【０１６８】
ここで、Nは検出体積中のADM-116F分子の数であり、Tは三重項状態の分子の割合であり、かつτ三重項は三重項状態緩和時間である。拡散粒子の特徴的な並進拡散時間をτd,1で示す。
【０１６９】
IAPP存在下で、二成分分析のモデルは下記によって与えられる：
2019501111.tif 000017
式中、rは拡散時間τd,1で急速拡散する成分の割合であり、一方τd,2は遅延成分の拡散時間である。構造因子、sは、遊離Alexa Fluor 488ヒドラジド色素の溶液の自由パラメーターとして決定し、次いで続くすべてのフィッティングのために、0.17の実験的に決定した値に固定した。IAPP存在下での実験のために、ADM-116の拡散係数、三重項拡散時間、および振幅のあらかじめ決定した値を固定することにより、網羅的解析を実施した。IAPP結合および非結合ADM-116の三重項状態は同じと考えた。
【０１７０】
共焦点顕微鏡法
画像を、20000〜25000細胞/ウェルで播種した8ウェルNUNCチャンバー（Thermo Scientific、Rochester、NY、USA）中で得た。48時間培養した後、培地を実施する実験に従った成分を含む培地で置き換えた。IAPPの時間依存的局在化実験のために、培地は100nM IAPP594、13μM非標識ペプチドを含み、指定の時点インキュベートした。ADM-116FおよびADM-3F存在下での実験のために、さらなるフルオレセイン標識および非標識小分子、それぞれ200nMおよび13μMを培地中に導入した。小分子の遅延添加実験のために、培地を二回除去し、小分子を含む培地で置き換えた。48時間の全インキュベーション時間の後、画像を取得した。撮像をYale Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology撮像施設で、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡により、DIC能力を有する×63 Plan-Apo/1.4-NA油浸対物レンズ（Carl Zeiss、Oberkochen、Germany）を用いて実施した。標識IAPPの取り込みに対して報告するすべての実験について、レッドチャンネルのゲイン設定は試料どうし一定に維持した。画像取得および処理はZeiss Efficient Navigation（ZEN）およびImage Jソフトウェアを用いて達成した。
【０１７１】
FRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）撮像
次いで、INS-1成長培地を、100nM IAPP594を含む培地で置き換え、18時間インキュベートした。次いで、培地を200nM ADM-116Fを含む培地で二回置き換えた。5時間のインキュベーション後、画像を撮った。バックグラウンドFRETを、100nM IAPP594を最初にさらなる13μMの非標識IAPP存在下のセル中で18時間インキュベートする並行実験を用いて決定した。次いで、培地を200nM ADM-116Fを含む培地で置き換えた。撮像を、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡により、DIC能力を有する×100 Plan-Apo/1.4-NA油浸対物レンズ（Carl Zeiss、Oberkochen、Germany）を用いて実施した。ADM-116Fのために、フルオレセインを488nm Argon2レーザーで励起し、505〜550nm発光フィルターを通して検出した。IAPP594を561 Argon2レーザーで励起し、590〜630nm発光フィルターを通して検出した。すべての実験のために、ピンホールを各フィルターチャンネルのZ-スリック厚に対して一定に維持した。単細胞画像を供与体単独、受容体単独、および供与体-受容体融合チャンネルについて取得した。画像取得および処理はZeiss Efficient Navigation（ZEN）およびImage Jソフトウェアを用いて達成した。Image Jプラグイン、RiFRETを用いて、各チャンネルについてブリードスルーを計算して除去し、ピクセルでのFRET効率を計算した。次いで、FRET距離を下記を用いて計算した：
2019501111.tif 000018
式中、EはFRETエネルギー移動の効率計算値であり、R0はフェルスター距離（フルオレセイン-Alexa594対では60Å）であり、rは供与体と受容体との間の距離である。
【０１７２】
細胞培養
ラットインスリノーマINS-1細胞（832/13、Dr. Gary W. Cline、Department of Internal Medicine、Yale University）を、10％ウシ胎仔血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Life Technologies、Carlsbad、CA、USA）、および2％INS-1保存溶液（500mM HEPES、100mM L-グルタミン、100mMピルビン酸ナトリウム、および2.5mMβ-メルカプトエタノール）を補足した、フェノールレッドを含まないRPMI 1640培地中、37℃および5％CO2で培養した。細胞を約95％コンフルエンスに達した後に継代し（0.25％トリプシン-EDTA、Life Technologies）、増殖させ、および/または実験で用いた。実験で用いる細胞をペレット化し、トリプシン-EDTAを含まない新鮮培地中に再懸濁した。
【０１７３】
巨大細胞膜小胞（GPMV）単離
GPMVをINS-1細胞から単離した（Schlamadinger et al., Biophys. J. 2014, 107, 2559-2566, Kendhale et al., J. Org. Chem. 2011, 76, 195-200）。簡単に言うと、細胞を35mmの皿に播種し、48時間培養した。細胞を10mM HEPES、150mM NaCl、2mM CaCl2（pH＝7.4）で2回洗浄し、次いで10mM N-エチルマレイミド（NEM、Sigma Aldrich、St. Louis、MI、USA）に2時間曝露した。次いで、回収した試料を、孔径400-HRのサイズ排除Sephacrylマトリックス（Sigma Aldrich、St. Louis、MI、USA）を含む重力流動カラムを通過させて、残存細胞デブリからGPMVを精製した。
【０１７４】
GPMV撮像
画像を、250μlのGMPV保存溶液を含む8ウェルNUNCチャンバー（Thermo Scientific、Rochester、NY、USA）中で得た。ADM-116FまたはADM-3F存在下での実験のために、200nMの小分子をGMPV溶液中、室温で24時間インキュベートした。撮像を、Yale Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology撮像施設で、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡により、DIC能力を有する×63 Plan-Apo/1.4-NA油浸対物レンズ（Carl Zeiss、Oberkochen、Germany）を用いて実施した。すべての実験について、グリーンチャンネルのゲイン設定は試料どうし一定に維持した。画像取得および処理はZeiss Efficient Navigation（ZEN）およびImage Jソフトウェアを用いて達成した。
【０１７５】
細胞生存度
細胞生存度を、Cell-Titer Blue（CTB、Promega、Madison、WI、USA）フルオレセインベースのアッセイを用いて比色法により測定した。細胞を96穴プレート（BD Biosciences、San Diego、CA）中、5000細胞/ウェルの密度で播種した。48時間の培養後、各ウェルにペプチドを直接導入し、次いでさらに48時間インキュベートした。時間依存的実験のために、細胞をペプチドと共に指定の時点インキュベートした。インキュベーション期間の後、20μL CTB試薬を各ウェルに加え、37℃および5％CO2で2.5〜3.5時間インキュベートした。レゾルフィン生成物の蛍光をFluoDia T70蛍光プレートリーダー（Photon Technology International、Birmingham、NJ、USA）で測定した。試料ウェルに加えたペプチドの異なる濃度を明らかにするために、すべてのウェルは同じ量の水を含んだ。水媒体を含むが、ペプチドを含まないウェルを陰性対照（毒性0％）とし、10％DMSOを含むウェルを陽性対照（毒性100％）とした。毒性パーセントを以下の式を用いて計算した。
2019501111.tif 000019
【０１７６】
各独立変数は、陰性対照（＜N＞）、陽性対照（＜P＞）、および試料（＜S＞）からの8つのプレート重複測定物の平均である。生存度実験で提示した結果は、異なる日に別々に行った3つのそのような実験の平均である。誤差バーは平均の標準誤差を示す。
【０１７７】
アポトーシスを、カスパーゼ3/7を検出する（Caspase-Glo(登録商標) 3/7 Assay、Promega、Madison、WI、USA）ことによる比色法により測定した。細胞を96穴プレート（BD Biosciences、San Diego、CA、USA）中、5000細胞/ウェルの密度で播種した。48時間の培養後、各ウェルにペプチドを直接導入し、次いでさらに本文中に指定の時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、20μLのCaspase-Glo(登録商標) 3/7試薬（カスパーゼ3/7活性のために最適化した試薬中にカスパーゼ3/7 DEVD-アミノルシフェリン基質および専用の熱安定性ルシフェラーゼの混合物を含む）を各ウェルに加え、37℃および5％CO2で2時間インキュベートした。遊離アミノルシフェリン生成物の蛍光をFluoDia T70蛍光プレートリーダー（Photon Technology International、Birmingham、NJ、USA）で測定した。タンパク質濃度依存性測定のために、担体緩衝液を適宜加えて、確実に同じ量のタンパク質を各ウェルに加えた。
【０１７８】
実施例1：IAPPの時間依存的局在化
INS-1細胞を、N-末端をAlexa-594で標識した100nM IAPP（IAPPA594）と共にインキュベートした。0μMまたは13μMの非標識IAPPの同時添加は、それぞれ非毒性および毒性状態に対応する。5時間の時点で、非毒性条件下では、IAPPは有意に内部移行しなかった（図2）。12時間までに、細胞内IAPPは容易に観察され、最大の内部移行は24時間で明白であった(図2）。この非毒性条件下のすべての時点で、IAPPは、おそらくはこれらの条件下でのエネルギー依存的細胞取込の結果、散在性の点として現れた。毒性条件下では、IAPP取り込みのわずかな上昇が5時間までに見られた。12時間までに、毒性条件で対照的な挙動が明らかに見られ、外部および内部移行した点ならびにより大きい集合体が示された。24時間までに、細胞外IAPPは全IAPPのごく一部であった。48時間の時点で、大きい細胞内凝集体が現れ、72時間まで強度は上がり続けた。この進行は、凝集が細胞内環境によって媒介されることを示唆し、培養液および細胞膜がアミロイド形成に対して阻害的であることを示す研究と一致している。
【０１７９】
一定の態様において、細胞毒性は細胞内IAPPによって媒介される。IAPP媒介性毒性の時間依存性を、撮像と並行して測定した。アポトーシスは早くも5時間で見られ、カスパーゼ3/7活性は観察の間中上がり続けた(図2）。IAPPによって影響を受けた細胞の割合は、全サイトゾルレダクターゼ活性をIAPPなしの対照と比べてモニターすることにより概算することができた。その傾向は明らかにアポトーシスと並行する。重要なことに、アポトーシス活性の持続的上昇は、細胞外IAPPがほとんど見られなかった24時間の時点のはるか後まで見られた(図2）。まとめると、これは毒性の部位が細胞内であることを示唆するものである。いかなる理論にも限定されることを望むものではないが、IAPPの小分子による調節は、内部移行され得る化合物を必要とする。
【０１８０】
実施例2：膜結合IAPPの標的化
膜結合IAPPの標的化、いくつかの溶液ベースの機能獲得の阻害、および細胞毒性救出の間には直接の相関がある。いかなる理論にも限定されることを望むものではないが、細胞内IAPPを標的とする化合物は、IAPP自己集合の膜活性阻害剤の中から見出されやすいであろう。溶液中で、10μM IAPPの線維への集合は18±1.4時間の反応中間点t50で起こった(図9）。大きい単層リポソーム（LUV）の存在下で行った同じ反応は、1.1±0.1時間のt50まで加速された（図3A）。後者を、小分子を二層の状況での活性について評価し得る、参照条件とする。
【０１８１】
ADM-116（図1A〜1B）は、LUV触媒細線維化アッセイで顕著な活性を有する小分子である。1：1（IAPP：ADM-116）で、リポソーム触媒細線維化は検出不可能（t50は対照よりも＞40倍高い）であり、1：0.1でも有意な阻害が観察された（図3）。アミロイド形成は電子顕微鏡法(図10）および遠紫外CD（図5D）で観察されなかった。これに比べて、化合物ADM-3（図15）およびADM-118はそれぞれ、2.7±0.1および3.3±0.1倍阻害した。EGCG、酸性フクシン（AF）およびレスベラトロールなどの他の天然化合物は、検出可能な効果を示さない（図3）。一定の態様において、ADM-116は官能基を含み、その立体的および物理化学的性質は脂質触媒アミロイド集合の並外れた阻害をもたらす。
【０１８２】
ADM-116はIAPPにより誘導される毒性を救出した。13μM IAPPとの48時間のインキュベーション後、INS-1生存度は78±8％低下した。1：1（IAPP：リガンド）の化学量論比でのADM-116の同時添加は、生存度を完全に救出した（図4A〜4B）。トリピリジルアミドである化合物ADM-3も、膜結合IAPPに対して活性であり、またADM-116（図4B）と同等の用量依存性で細胞生存度を救出した（図4A）。レスベラトロール、EGCGおよび酸性フクシンは、同じ条件下での毒性救出において有効でなかった。この差異の原因は、IAPPおよびこれらの小分子は、複合体の細胞培養物への添加前に＞11時間プレインキュベートする必要があることであった。これに対して、IAPPおよび小分子を細胞培養物に同時導入した。本明細書において調査した濃度で、INS-1細胞に対して固有の毒性を示す分子はなく、比色アッセイを妨害するものもなかった(図11）。
【０１８３】
ADM-116は細胞内IAPP毒性から細胞を救出したが、ADM-3は救出しなかった。本明細書における他所で示唆された毒性の細胞内の原因（図2）を考慮して、代わりに、IAPPの導入後、小分子の添加前に遅延期間をおく条件下で細胞生存度を評価した。注目すべきことに、24時間の遅延期間後でも、ADM-116はIAPP誘導性細胞毒性を47±4％救出することができた。顕著な対照をなして、ADM-3は、12時間後に添加した場合、毒性の救出において有効でなかった（図4C）。IAPPは24時間のインキュベーションによって内部移行した(図2）ため、これはADM-116救出のメカニズムは細胞膜の透過を含むことを示唆する。
【０１８４】
実施例3：結合の分子特異性
ADM-116の溶液活性および細胞活性は、IAPPとの別個の複合体の形成により可能になった。非標識IAPPを25nMフルオレセイン標識ADM-116（ADM-116F）の溶液中に滴定し、ペプチド非存在下および存在下での小分子の拡散時間を蛍光相関分光法（FCS）によりモニターした。ADM-116F単独では130±13μsのτDを示す（図5a）。IAPPによる滴定後、拡散時間τD＝約400μsの第二の成分が明らかであった。滴定の間の拡散時間の一貫性は、別個の複合体を示す。結合ADM-116Fと非結合ADM-116Fとの振幅比をフィッティングすることにより、240±60nMのKdを得た。蛍光標識したIAPP単独のτDは230±4μsであった。すべての成分が球であると仮定すると、拡散は質量により変化する。この仮定の下での複合体の化学量論は1：1であった。非標識IAPPおよびADM-116を用いた等温滴定熱量測定（ITC）は、Ka＝3.1±0.6×106M-1（Kd＝320±60nM）の、一部位結合モデルに明らかに適合する発熱特性を示した（図5bおよび表1）。したがって、ADM-116はIAPPに対する強い親和性で別個の複合体を形成した。
【０１８５】
（表１）結合親和性。示したリガンドとIAPPとの結合についてのITCから得た熱力学的パラメーター。エネルギーの単位はkJ/molである。示した誤差は少なくとも3回実施した実験からの標準偏差である。
2019501111.tif 000020
【０１８６】
ADM-116はIAPPのα-ヘリックスサブドメインを安定化した。膜結合IAPPの遠紫外CDスペクトルは、α-ヘリックス構造に特徴的な、208および222nm付近の2つの極小を示した(図5D）。この特性は、1時間以内に、アミロイドに特徴的なβ-シートのものに移行した。これに対して、IAPPは、ADM-116（1：0.5、IAPP：ADM-116）とインキュベートした場合、4時間後でも、主にα-ヘリックスのままであった。IAPPの膜結合サブドメイン内のα-ヘリックス構造は、IAPPの最初の22残基のほとんどを含む部分に対応づけられる。このストレッチの範囲内で、ラット由来のIAPPの配列変種rIAPPは、18位（H18R）でのみ異なる。ADM-116のrIAPPによる結合は検出不可能であった（図5B）。さらなる5つの残基がhIAPPとrIAPPとの間で残基23〜29にわたって異なる。全長hIAPPにおけるアミロイド核形成は、残基20〜29によって一部媒介された。200μMの10残基サブペプチドIAPP20-29によるアミロイド形成の動力学的特性は、6.6±0.3時間のt50を示した(図12）。1：1のADM-116の存在は、IAPP20-29の独立のアミロイド集合体に対する効果がほとんどない。したがって、ADM-116はヒト残基20〜29と機能的に相互作用せず、またrIAPPに検出可能に結合もしなかった。膜結合α-ヘリックス安定化の観察と併せて、これはADM-116がIAPPのα-ヘリックスサブドメインに結合することを示唆する。
【０１８７】
実施例4：細胞内結合の特異性
メカニズムに関する洞察を得るために、ADM-116をそのOCH3末端で蛍光標識し、INS-細胞に適用し、共焦点顕微鏡法により可視化した。非救出（200nM）および救出（200nM＋15μM ADM-116）濃度のフルオレセイン標識ADM-116（ADM-116F）は、細胞膜を透過することができた（図6A）。これに対して、フルオレセイン標識ADM-3（ADM-3F）は細胞内部に移る能力を示さなかった(図6A）。次いで、巨大細胞膜由来小胞（GPMV）をINS-1生細胞から調製した。ADM-116はGPMVを透過する明らかな能力を示し、ADM-3は示さなかった（図6B）。これは、前者の小分子が実際に膜を通過するだけでなく、能動的細胞プロセスからの補助なしに通過することを示している。
【０１８８】
細胞救出はタンパク質および小分子の共局在に関連していた。INS-1細胞を毒性濃度のIAPP（100nM IAPP594および13μM IAPP）で処理した。20時間後、救出濃度のADM-116（200nM ADM-116Fおよび15μM ADM-116）を加えた。救出された細胞において、IAPPはADM-116と共局在し、少ないIAPP凝集体が観察された（図7A）。IAPPおよびADM-116を同時導入する条件下では代替メカニズムが作用した。IAPPおよびADM-116は別々に細胞に侵入し得た（図2および図6A）が、一緒に加えると、これらは細胞表面上に共局在した（図7B）。同様の観察がADM-3についても得られた（図13）。これは、ADM-116またはADM-3とIAPPとの相互作用は毒性ペプチドの細胞中への侵入を妨げたことを示唆するものである。これに対して、ADM-116の遅延添加による救出は直接の相互作用によって毒性凝集体形成を妨害するようであった。
【０１８９】
細胞内救出はIAPPとADM-116との間の直接相互作用の結果であった。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）測定を生細胞中で行った。ここで、100nM IAPP594の20時間後に200nM ADM-116FをINS-1細胞に適用した。バックグラウンドよりも高いデータだけを見て、ADM-116FからIAPP594への非放射性エネルギー移動は容易に明らかであり、かつ細胞内であった（図7C）。重要なことに、FRETの統計学的評価は近い（約40Å）だけでなく、別個の、したがって特異的な相互作用に強く一致するガウス分布を明らかにした（図7D）。
【０１９０】
実施例5：ADM-116の構造、動力学および機能
ADM-116は疎水性コアを有するフォールディングした分子である。FDA承認薬物について、測定および計算したオクタノール-水分配係数は非常に類似している（図6C）。ADM-3の予測logPおよび実験logPは-0.7および-2.0で、その緩衝液中の実際的溶解性と一致している（図6C）。しかし、ADM-116では、7桁の差異がある。計算logPは7.6（コレステロールと同等）であったが、測定logPは0.6であった。この異常はADM-116のフォールディングした性質の結果であろう。全体として、ADM-116はアニオン性（-2）で水溶性であるが、なお受動的細胞膜透過が可能である。これは、小分子のフォールディング/再フォールディングがこのプロセスの中心である、細胞透過のパラダイムを示唆する。
【０１９１】
ADM-116の再フォールディングは、IAPP結合によって影響される。再フォールディングはオリゴキノリンが右-（P）および左-（M）鏡像ヘリックスの等しい混合物をとることを可能にする。水性緩衝液中のADM-116のCDスペクトルはこれら2つの手からの等しい寄与を含み、390nmで平坦な線をきたした（図8B）。著しい対照をなして、化学量論的IAPPの存在下で記録されたADM-116のCDスペクトル（図8A）は、正の楕円率を示した。結合は右手および左手ヘリックス状態の間の再フォールディング平衡を明らかにシフトさせた。
【０１９２】
IAPPはADM-116の（P）配座異性体に優先的に結合する。キラルカンフェニル基がADM-116のNO2末端に結合した、2つの類縁体を合成した（図15）。CDスペクトルにより、それぞれ390nmで正および負の特性を与える誘導体として定義されたADM-116PおよびADM-116Mによるヘリックスバイアスの誘導（図8B）が確認される。いずれの化合物でも、右/左手ヘリックス状態の比を絶対的に決定することができなかった。重要なことに、IAPP存在下でのADM-116の強度は、ADM-116Pの90％以内であった（図8Aおよび図16）。ITCにより、IAPPのADM-116Pに対するKaは0.9±0.1×106M-1で；ADM-116の3倍以内である。これに対して、ADM-116Mについて結合は検出不可能であった（図5B）。このパターンは多様なアッセイで明らかであった。脂質触媒細線維化反応に対し、ADM-116PはADM-116と同じ効力の阻害剤であったが、ADM-116Mは細線維化を弱く阻害したにすぎなかった（図8C）。細胞毒性アッセイにおいて、ADM-116PはADM-116Mよりも約2.4倍高い毒性阻害を示した（図8C）。したがって、2つの溶液生物物理学的アッセイおよび毒性救出において、IAPP：ADM-116相互作用は立体特異的であった。
【０１９３】
ADM-116へのIAPP結合は、ADM-116ヘリックスのOCH3末端との相互作用を含んでいた。オリゴキノリンにおける鏡像異性体相互変換は、長さが増えるにつれてより制限される。ここで、ADM-116をNO2（ADM-116I）、またはOCH3末端（ADM-I116）のいずれかで1サブユニット長くした、2つの分子を合成した。ADM-116IおよびADM-I116の外側面は必然的にADM-116の表面を含んでいた。IAPP：ADM-116結合がキノリンヘリックスの末端との接触を含む場合、2つの変種の一方への結合はより強く影響されるであろう。IAPP：ADM-116IのKaはADM-116（Ka＝7±1×106M-1）と同様であった。この結合はADM-116と同等の無作為コイルからα-ヘリックスへの転移を誘導した（図16B）。結合剤ADM-116PもNO2末端誘導体であった。顕著な対照をなして、ADM-I116について結合は検出されない。これは、IAPPがADM-116のOCH3末端と相互作用したことを示す。
【０１９４】
ADM-116による細胞内毒性救出は、オリゴキノリンの長さに依存した。毒性試験において、ADM-116IとIAPPとの同時添加は、IAPP単独に比べて毒性の低減をきたした（図4A）。しかし、IAPP内部移行後にADM-116IをINS-1細胞に加えた場合、救出はもはや観察されなかった（図4C）。言い換えると、ADM-116への第五のキノリンの付加は、IAPPと小分子とが細胞外環境で遭遇するとの条件で、ADM-3と同等の活性を保持する分子、すなわち、有効なアンタゴニストである化合物を生じた。
【０１９５】
いかなる理論にも限定されることを望むものではないが、ADM-116IおよびADM-116の挙動の差は、小分子の相対的なフォールディングされた安定性の変化に対応づけることができた。ADM-116IとADM-116へのIAPP結合のΔΔGは約3kJ/molであった（図5Cおよび表1）。エントロピー寄与に対する変化（ΔTΔS）は約160kJ/molであった（図5C）。IAPP：ADM-116IおよびIAPP：ADM-116界面が構造的に同じである場合、この差異は代わりにオリゴキノリンの非結合状態における差に対応づけられるであろう。大きいエントロピー寄与は疎水性効果に類似し；テトラキノリンであるADM-116はペンタキノリンであるADM-116Iよりもフォールディングしていない状態を容易にとるとの予想に一致する。テトラキノリンであるADM-116PはADM-116により類似した熱力学的特性を有するとの事実は、この主張を補足する。CDによるIAPP：ADM-116I複合体の構造評価は、数日間のインキュベーション後でさえも、IAPP：ADM-116に比べて390nmで弱い楕円率を示した（図8A）。したがって、IAPPのADM-116Iへの結合親和性はADM-116と同等であるが、鏡像異性的平衡をシフトさせる結合エネルギーの容量は低減する。まとめると、これらの観察は、ADM-116が主にそのフォールディングした状態で存在するが、部分的および完全にフォールディングしていない状態を容易にとることを示唆する。
【０１９６】
本明細書において引用するそれぞれおよびすべての特許、特許出願、および出版物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明を特定の態様に関して開示してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形が当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲はすべてのそのような態様および等価の変形を含むと解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2019501111.tif 000025
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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