【手続補正書】
【提出日】平成19年1月30日(2007.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアルブミンコード配列を発現する真菌細胞を培養して、該アルブミンを得ることを含んでなる、組換えアルブミンの製造方法であって、
前記細胞が組換え発現したアルブミンのマンノシル化能を少なくとも減少させる遺伝子修飾を有し、かつ、培地が少なくとも１，０００ＬであってｐＨ５．３〜６．８である、方法。
【請求項２】
前記修飾が、抑制、置換、欠失、付加、破壊、および／または突然変異による挿入を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾が、安定的に承継され、および／または非復帰性であり、および／または非漏出性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾が、遺伝子のコード領域または遺伝学の発現に関与する領域に配置されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該遺伝子がＰＭＴ遺伝子、好ましくはＰＭＴ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
真菌細胞を少なくとも５，０００Ｌ、好ましくは少なくとも７，５００Ｌの培地において培養する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
真菌細胞をｐＨ６．２〜６．７、好ましくはｐＨ６．３〜６．５で培養する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨ８．０〜９．５であって導電率が１〜７５mS・cm-1の範囲の第一のアルブミン溶液を、アルブミンに関してネガティブモードで行われ、かつ固定化したジヒドロキシボリル基を含んでなるアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィー段階に付して、それによって精製アルブミン溶液を得る段階を含んでなる、アルブミン溶液の精製方法。
【請求項９】
第一のアルブミン溶液のｐＨがｐＨ８．０〜９．０、好ましくはｐＨ８．３〜ｐＨ８．６である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第一のアルブミン溶液が、１０〜５００ｍＭ、好ましくは２５〜２００ｍＭ、更に好ましくは５０〜１５０ｍＭの濃度のグリシンと、０〜５００ｍＭ、好ましくは２５〜２００ｍＭ、更に好ましくは５０〜１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌと、５〜２５０ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２とを含んでなる緩衝液で緩衝されている、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
第一のアルブミン溶液が、約１００ｍＭのグリシンと、約１００ｍＭのＮａＣｌと、約５０ｍＭのＣａＣｌ２とを含んでなる緩衝液で緩衝されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
緩衝液の導電率が１０〜５０ｍＳ・ｃｍ−１、好ましくは１８〜２２ｍＳ・ｃｍ−１である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
第一のアルブミン溶液が少なくとも７０ｇ・Ｌ−１の濃度のアルブミンを含んでなる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
アルブミンを０．５カラム容積未満、更に好ましくは０．３５カラム容積未満で装填する、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
マトリックスが固定化したボロン酸、好ましくはアミノフェニルボロン酸を含んでなる、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
精製したアルブミン溶液を、カチオン交換クロマトグラフィーを用いて更に精製し、カチオン交換によって精製したアルブミン溶液を得る、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
精製したアルブミン溶液を、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて更に精製し、アニオン交換によって精製したアルブミン溶液を得る、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項８〜１５のいずれかに従うとき、アニオン交換によって精製したアルブミン溶液を、カチオン交換クロマトグラフィーを用いて更に精製し、カチオン交換によって精製したアルブミン溶液を得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
精製したアルブミン溶液に、緩衝液交換、濃縮、希釈、透析、透析濾過、ｐＨ調整、還元剤処理、脱色処理、加熱、冷却、またはコンディショニングの１つ以上を行う、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
カチオン交換クロマトグラフィーの後にアニオン交換クロマトグラフィー、またはアニオン交換クロマトグラフィーの後にカチオン交換クロマトグラフィーを行うことを含んでなるアルブミン溶液の精製方法であって、第二のクロマトグラフィー段階からのアルブミン溶液を最終容器に入れる前に更に精製を行わないことを特徴とする、方法。
【請求項２１】
カチオン交換段階を、アルブミンに関してネガティブモードで行う、請求項１６、１８または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
グリコシル化アルブミンがカチオン交換材料に結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
カチオン交換段階が、カチオン交換体として固定化したスルホプロピル置換基を含んでなるマトリックスを利用する、請求項１６、１８、２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
カチオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のｐＨが４．５〜６．０、更に好ましくはｐＨが５．０〜５．６、更に一層好ましくはｐＨが５．２〜５．４である、請求項１６、１８、２０、および２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
カチオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のアルブミン濃度が１０〜２５０ｇ・Ｌ−１、好ましくは２０〜７０ｇ・Ｌ−１、更に好ましくは５０±１０ｇ・Ｌ−１である、請求項１６、１８、２０、および２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
カチオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のオクタノエートイオン濃度が２〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、更に好ましくは６〜９ｍＭである、請求項１６、１８、２０、および２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
カチオン交換段階の前に、アルブミン溶液が、
(i)ｐＨ調整、
(ii)濃縮、
(iii)透析濾過、または
(iv)オクタノエートおよび／もしくは他の脂肪酸を添加することによるコンディショニング
の段階の１つ以上を行う、請求項１６、１８、２０、および２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
アニオン交換段階が、アニオン交換体として固定化ジアルキルアミノアルキル置換基を含んでなるマトリックスを用いる、請求項１７または２０に記載の方法。
【請求項２９】
アニオン交換段階を、アルブミンに関してネガティブモードで行う、請求項１７、２０または２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
アニオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のｐＨが４．０〜５．２、更に好ましくはｐＨ４．２〜４．９、更に一層好ましくはｐＨ４．５〜４．７である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
アニオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液の導電率が４．０ｍＳ・ｃｍ−１未満、好ましくは導電率が１．０±０．５ｍＳ・ｃｍ−１、更に好ましくは導電率が１．０５±０．１ｍＳ・ｃｍ−１である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
アニオン交換段階をアルブミンに関してポジティブモードで行う、請求項１７、２０または２８に記載の方法。
【請求項３３】
ポジティブモードのアニオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のｐＨが６．０〜８．０、好ましくはｐＨが６．５〜７．５、更に一層好ましくはｐＨが６．８〜７．２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポジティブモードのアニオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のアルブミンの濃度が１０〜１００ｇ・Ｌ−１、更に好ましくは２５〜７０ｇ・Ｌ−１、最も好ましくは３０〜５０ｇ・Ｌ−１である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポジティブモードのアニオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液の導電率が１．０〜１．５ｍＳ・ｃｍ−１、好ましくは１．２〜１．４ｍＳ・ｃｍ−１である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ポジティブモードのアニオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のアルブミンの濃度が１０〜１００ｇ・Ｌ−１、更に好ましくは２５〜８０ｇ・Ｌ−１、最も好ましくは４０〜６０ｇ・Ｌ−１である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３７】
ポジティブモードのアニオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液の導電率が１．０〜２．０ｍＳ・ｃｍ−１、好ましくは１．２〜１．６ｍＳ・ｃｍ−１、更に好ましくは１．３〜１．５ｍＳ・ｃｍ−１である、請求項３２、３３または３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
アルブミンに対して特異的親和性を有する化合物、好ましくは酸、を含んでなる緩衝液を用いて、アルブミンをアニオン交換体から溶出する、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
緩衝液が、リン酸塩、好ましくはリン酸ナトリウムを２０〜９０ｍＭ、好ましくは３０〜７０ｍＭ、更に好ましくは３５〜６５ｍＭ含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
アルブミンを、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の緩衝液を用いてアニオン交換体から溶出する、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
アニオン交換段階の前に、アルブミン溶液に、緩衝液交換、濃縮、希釈、透析、透析濾過、ｐＨ調整、還元剤による処理、脱色処理、加熱、冷却またはコンディショニングの１つ以上を施す、請求項２９または３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
醗酵、一次分離、セントレートコンディショニング(centrate conditioning)、カチオン交換クロマトグラフィー、好ましくはスルホプロピル置換基をカチオン交換体として用いるカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、好ましくはジエチルアミノアルキル置換基をアニオン交換体として用いるアニオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィー、好ましくは固定化アルブミン特異的色素、好ましくはCibacron Blue型の色素を含んでなるアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーの段階の１つ以上を先に行う、請求項８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
アルブミン溶液の精製方法であって、
(a)  アルブミン溶液に、アルブミンに関してポジティブモードで行うカチオン交換クロマトグラフィー段階を施し、
(b)  アルブミンを含むカチオン交換溶出物を集め、
(c)  カチオン交換溶出物に、アルブミンに関してポジティブモードで行うアニオン交換クロマトグラフィー段階を施し、
(d)  アルブミンを含むアニオン交換溶出物を集め、
(e)  アニオン交換溶出物に、アルブミンに関してポジティブモードで行うアフィニティークロマトグラフィーを施し、
(f)  アルブミンを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出物を集め、
(g)  アフィニティークロマトグラフィー溶出物に、アルブミンに関してネガティブモードでかつ糖包合体に関してポジティブモードで行うアフィニティークロマトグラフィー段階を施し、
(h)  アルブミンを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出物を集め、
(i)  アフィニティークロマトグラフィー溶出物に、アルブミンに関してネガティブモードで行うカチオン交換クロマトグラフィー段階を施し、
(j)  アルブミンを含むカチオン交換溶出物を集め、
(k)  カチオン交換溶出物に、ネガティブモードまたはポジティブモードで行うアニオン交換クロマトグラフィー段階を施し、
(l)  アニオン交換段階をネガティブモードで行う場合にはアルブミンを含むアニオン交換溶出物を集め、またはアニオン交換段階をポジティブモードで行う場合にはアニオン交換溶出物をアニオン交換マトリックスから溶出させる、
段階を含んでなり、
必要に応じて、それぞれの精製段階のいずれかを行う前または後に、緩衝液交換、濃縮、希釈、透析、透析濾過、ｐＨ調整、還元剤による処理、脱色処理、加熱、冷却またはコンディショニングの１つ以上を行う、方法。
【請求項４４】
アルブミン溶液の精製法であって、
(a)  アルブミン溶液に、アルブミンに関してポジティブモードで行うカチオン交換クロマトグラフィー段階を施し、
(b)  アルブミンを含むカチオン交換溶出物を集め、
(c)  カチオン交換溶出物に、アルブミンに関してポジティブモードで行うアニオン交換クロマトグラフィー段階を施し、
(d)  アルブミンを含むアニオン交換溶出物を集め、
(e)  アニオン交換溶出物に、アルブミンに関してポジティブモードで行うアフィニティークロマトグラフィー段階を施し、
(f)  アルブミンを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出物を集め、
(g)  アフィニティークロマトグラフィー溶出物に、アルブミンに関してネガティブモードでかつ糖包合体に関してポジティブモードで行うアフィニティークロマトグラフィー段階を施し、
(h)  アルブミンを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出物を集め、
(i)  アフィニティーマトリックス溶出物に、アルブミンに関してネガティブまたはポジティブモードで行うアニオン交換クロマトグラフィー段階を施し、
(j)  アニオン交換段階をネガティブモードで行う場合にはアルブミンを含むアニオン交換溶出物を集め、またはアニオン交換段階をポジティブモードで行う場合には、アニオン交換マトリックスからアニオン交換溶出物を溶出させ、
(k)  アニオン交換クロマトグラフィー段階によって精製したアルブミン溶液に、アルブミンに関してネガティブモードで行うカチオン交換クロマトグラフィー段階を施し、
(l)  アルブミンを含むカチオン交換溶出物を集める
段階を含んでなり、
必要に応じて、それぞれの精製段階のいずれかを行う前または後に、緩衝液交換、濃縮、希釈、透析、透析濾過、ｐＨ調整、還元剤の添加、脱色処理、加熱、冷却またはコンディショニングの１つ以上を行う、方法。
【請求項４５】
アルブミン溶液中のニッケルイオンの濃度を減少させる方法であって、アルブミン溶液をｐＨ２．５〜７．５、好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０とし、ニッケルイオンを除去することを含んでなる、方法。
【請求項４６】
透析濾過またはゲル浸透クロマトグラフィーを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アルブミンが組換えアルブミンである、請求項８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
初期アルブミン溶液が、醗酵培地中で、アルブミンコードヌクレオチド配列で形質転換した酵母を培養し、これにより酵母がアルブミンを発現しアルブミンを培地に分泌することによって得られた酵母培養培地に由来する、請求項８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
酵母がSaccharomyces属、好ましくはSaccharomyces cerevisiaeである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
酵母がPichiaまたはKluyveromyces属である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
アルブミンの少なくとも幾つかが請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によってまたは請求項５３に記載の細胞によって産生される、請求項８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
アルブミン産物をヒトの非経口投与用に処方して、滅菌し、または最終容器に入れる、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
組換えアルブミンコード配列を含んでなるＤＮＡ配列、プラスミドまたは細胞であって、組換えアルブミンコード配列の３′末端が２個以上のインフレーム翻訳停止コドン、好ましくは３個のインフレーム翻訳停止コドンを含んでなることを特徴とする、ＤＮＡ配列、プラスミドまたは細胞。
【請求項５４】
醗酵培地中で、アルブミンコードヌクレオチド配列で形質転換したSaccharomyces cerevisiaeを培養し、これによりSaccharomyces cerevisiaeがアルブミンを発現して培地にアルブミンを分泌することによって得られたSaccharomyces cerevisiae培養培地に由来する、アルブミン溶液の精製方法であって、
(a) セントレートコンディショニングを必要に応じて行う初期段階と、
(b) アルブミンに関してポジティブモードで行われる、カチオン交換クロマトグラフィーに続いてアニオン交換クロマトグラフィー段階と、
(c) アルブミン産物の滅菌を必要に応じて行う段階と、
(d) アルブミン産物を最終容器に入れる段階
を含んでなり、
アニオン交換クロマトグラフィー段階からのアルブミン溶液を最終容器に入れる前に更に精製を行わないことを含んでなる、方法。
【請求項５５】
カチオン交換段階が、カチオン交換体として固定化したスルホプロピル置換基を含んでなるマトリックスを利用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
カチオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のｐＨが４．５〜６．０である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
アルブミン溶液を、カチオン交換マトリクスのリッター当たり１０〜５０ｇのアルブミン、好ましくはカチオン交換マトリクスのリッター当たり４０±１０ｇのアルブミンを装填する、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
カチオン交換段階の前に、アルブミン溶液が、
(i)ｐＨ調整、または
(ii)オクタノエートおよび／または他の脂肪酸を添加することによるコンディショニング
の段階の１つ以上を行う、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
カチオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液のオクタノエートイオン濃度が２〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭである、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ポジティブモードのカチオン交換段階の前に、アルブミン溶液を、オクタノエートの添加によって最終濃度約２〜１０ｍＭとし、かつｐＨを４．０〜５．０に調整する、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
アニオン交換段階が、アニオン交換体として固定化ジアルキルアミノアルキル置換基を含んでなるマトリックスを用いる、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
アニオン交換クロマトグラフィーを行うアルブミン溶液の導電率が４．０ｍＳ・ｃｍ−１未満である、請求項５４〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
アルブミン溶液を、アニオン交換マトリクスのリッター当たり３０±１０ｇのモノマー性アルブミンを装填する、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
アニオン交換段階の前に、アルブミン溶液を希釈する、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
アルブミンが、少なくとも５０ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭ、より好ましくは８０〜１５０ｍＭのホウ酸塩を含む緩衝液でアニオン交換体から溶出する、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
アニオン交換体を、１５〜２５ｍＭのテトラボレート緩衝液を含み、かつｐＨを９．２まで上昇させる緩衝液で洗浄し、次いでアルブミンをさらに濃縮したテトラボレート緩衝液で溶出する、請求項５４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
さらに濃縮したテトラボレート緩衝液が８０〜１５０ｍＭ、好ましくは１１０ｍＭのテトラホウ酸カリウムを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
酵母が、Saccharomyces属、PichiaまたはKluyveromyces属のものである、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
酵母が組換え発現したアルブミンのマンノシル化能を少なくとも減少させる遺伝子修飾を有する、請求項５４〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記修飾が、抑制、置換、欠失、付加、破壊、および／または突然変異による挿入を含んでなる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記修飾が、安定的に承継され、および／または非復帰性であり、および／または非漏出性である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記修飾が、遺伝子のコード領域または遺伝学の発現に関与する領域に配置されている、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
該遺伝子がＰＭＴ遺伝子、好ましくはＰＭＴ１である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
醗酵培地中で、アルブミンコードヌクレオチド配列で形質転換した酵母を培養し、これにより酵母がアルブミンを発現して培地にアルブミンを分泌することによって得られた酵母培養培地に由来する、アルブミン溶液の精製方法であって、
(a)  アルブミン溶液のセントレートコンディショニングを行って、ｐＨが４．０〜５．０であって、オクタノエートイオン濃度が２〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭである、アルブミン溶液を生ずる、初期段階と、
(b)  アルブミンに関してポジティブモードで、カチオン交換クロマトグラフィーを行い、ここで、カチオン交換段階が、カチオン交換体として固定化したスルホプロピル置換基を含んでなるマトリックスを利用し、
(c)  希釈によって段階(b)のアルブミン溶液を調整して、導電率４．０ｍＳ・ｃｍ−１未満のアルブミン溶液を提供し、
(d)  段階(c)より生じたアルブミン溶液を、アルブミンに関してポジティブモードで行われるアニオン交換クロマトグラフィーに付し、ここで、アニオン交換段階が、アニオン交換体として固定化ジアルキルアミノアルキル置換基を含んでなるマトリックスを用い、かつ、アニオン交換体を、１５〜２５ｍＭのテトラボレート緩衝液を含み、かつｐＨを９．２まで上昇させる緩衝液で洗浄して、次いでアルブミンを、８０〜１５０ｍＭ、好ましくは１１０ｍＭのテトラホウ酸カリウムを含むさらに濃縮したテトラボレート緩衝液で溶出し、
(e)  アルブミン産物の滅菌を必要に応じて行い、
(f)  アルブミン産物を最終容器に入れる
ことを含んでなり、
Saccharomyces cerevisiaeが、ＰＭＴ遺伝子、好ましくはＰＭＴ１遺伝子のコード領域に位置する遺伝子修飾を有するか、または、Saccharomyces cerevisiaeが組換え発現したアルブミンのマンノシル化能を少なくとも減少させる遺伝子修飾を引き起こす領域に位置する、遺伝子修飾を有し、かつ、アニオン交換クロマトグラフィー段階からのアルブミン溶液を最終容器に入れる前に更に精製を行わないことを含んでなる、方法。