(57)【要約】本発明は、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及び１つ以上のガイド配列と細胞を接触させることによって、ＤＮＡメチル化を修飾する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾する方法であって、
ａ．メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｂ．１つ以上のガイド配列を前記細胞に誘導し、
それによって、前記細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ゲノム配列が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノム配列がＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記エフェクタードメインがＴｅｔ１を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾する方法であって、
ａ．脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｂ．１つ以上のガイド配列を前記細胞に誘導し、
それによって、前記細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾することを含む、前記方法。
【請求項６】
前記ゲノム配列が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ゲノム配列が、エンハンサーまたはプロモーターを含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲノム配列がＢＤＮＦプロモーターを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノム配列がＭｙｏＤのエンハンサーを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エフェクタードメインがＤｎｍｔ３ａを含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣａｓタンパク質である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣａｓ９タンパク質である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣｐｆ１タンパク質である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ガイド配列がリボ核酸ガイド配列である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガイド配列が、約１０塩基対〜約１５０塩基対の長さである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上のガイド配列が、２つ以上のガイド配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞内で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のゲノム配列が修飾される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、幹細胞、ニューロン、有糸分裂後細胞、または線維芽細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がマウス細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼと前記エフェクタードメインとの間に融合された１つ以上の核移行配列をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ゲノム配列のうちの１つ以上が、疾患または病態と関連している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞を非ヒト哺乳動物に導入することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
先行請求項のいずれかに記載の方法によって作製された単離修飾細胞。
【請求項２６】
細胞内の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法であって、
ａ．メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｂ．ガイド配列またはガイド配列をコードする核酸を前記細胞に誘導し、
それによって、細胞内の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節することを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記ゲノム配列が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ゲノム配列がＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記エフェクタードメインがＴｅｔ１を含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ゲノム配列が、エンハンサーまたはプロモーターを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ゲノム配列がＢＤＮＦプロモーターを含む、請求項２６〜２７または３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ゲノム配列がＭｙｏＤのエンハンサーを含む、請求項２６〜２７または３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記エフェクタードメインがＤｎｍｔ３ａを含む、請求項２６〜２７または３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣａｓタンパク質である、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣａｓ９タンパク質である、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣｐｆ１タンパク質である、請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ガイド配列がリボ核酸ガイド配列である、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ガイド配列が、約１０塩基対〜約１５０塩基対の長さである、請求項２６〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上のガイド配列が、２つ以上のガイド配列を含む、請求項２６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞内で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のゲノム配列が修飾される、請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、幹細胞、ニューロン、有糸分裂後細胞、または線維芽細胞である、請求項２６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞がマウス細胞である、請求項２６〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
先行請求項のいずれかに記載の方法によって作製された単離修飾細胞。
【請求項４５】
治療を必要とする患者の治療方法であって、前記方法が、請求項４４に記載の修飾細胞をそのような細胞を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項４６】
調節を必要とする個体において、疾患を引き起こす１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法であって、
ａ．メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ；及び
ｂ．１つ以上のガイド配列を前記個体に誘導し、
それによって、前記個体において、疾患を引き起こす１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する、前記方法。
【請求項４７】
ゲノム配列のメチル化が調節されている第１のゲノム修飾を含む修飾ゲノムを有する修飾細胞であって、
前記調節が、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及び１つ以上のガイド配列と細胞を接触させることによって起こる、前記修飾細胞。
【請求項４８】
細胞内の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法であって、前記方法は、前記細胞を、
ａ．メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸；及び
ｂ．ガイド配列またはガイド配列をコードする核酸と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４９】
前記ガイド配列は前記ポリペプチドを前記１つ以上のゲノム配列に標的化する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ゲノム配列が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法が、細胞内の少なくとも２つのゲノム配列のメチル化を調節することを含み、前記ゲノム配列が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、及びＣＴＣＦ結合部位から選択される、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記エフェクタードメインがＴｅｔ１またはＤｎｍｔ３ａを含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣａｓタンパク質である、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣａｓ９タンパク質である、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
個体の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法であって、前記方法は、前記個体に、
ａ．メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸；
ｂ．ガイド配列またはガイド配列をコードする核酸を投与することを含む、前記方法。
【請求項５６】
前記ガイド配列は前記ポリペプチドを前記１つ以上のゲノム配列に標的化する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ゲノム配列が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法が、細胞内の少なくとも２つのゲノム配列のメチル化を調節することを含み、前記ゲノム配列が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、及びＣＴＣＦ結合部位から選択される、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記エフェクタードメインがＴｅｔ１またはＤｎｍｔ３ａを含む、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣａｓタンパク質である、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが、触媒不活性なＣａｓ９タンパク質である、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
治療を必要とする患者の治療方法であって、前記方法が、
ａ．メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸；
ｂ．ガイド配列またはガイド配列をコードする核酸を、前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項６３】
細胞内の対象となる１つ以上の遺伝子の発現を調節する方法であって、メチル化可変領域が前記遺伝子の転写開始部位の５０ｋＢ以内に位置し、前記方法は、
ａ．メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸；
ｂ．ガイド配列またはガイド配列をコードする核酸を、前記細胞に接触させることを含み、前記ガイド配列は前記ポリペプチドを前記メチル化可変領域に標的化する、前記方法。
【請求項６４】
前記メチル化可変領域が前記細胞内で高メチル化されており、前記エフェクタードメインが脱メチル化活性を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記エフェクタードメインがＴｅｔ１である、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記メチル化可変領域が前記細胞内で非メチル化されており、前記エフェクタードメインがメチル化活性を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記エフェクタードメインがＤｎｍｔ３ａである、請求項６３または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が、幹細胞、有糸分裂後細胞、ニューロン、または線維芽細胞である、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞が有糸分裂後ニューロンである、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞が幹細胞である、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
対象となる遺伝子の発現にメチル化状態が影響を及ぼすゲノム配列を同定する方法であって、前記方法は、
ａ．メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸；
ｂ．ガイド配列またはガイド配列をコードする核酸（前記ガイド配列は前記ポリペプチドを候補ゲノム配列に標的化する）と細胞を接触させることと、
ｃ．前記遺伝子の発現を測定することと、を含み、
前記核酸と接触した前記細胞における前記遺伝子の発現が、前記核酸と接触していない対照細胞における前記ゲノム領域のメチル化のレベルと異なる場合に、前記ゲノム配列を、対象となる前記遺伝子の発現にメチル化状態が影響を及ぼすものであると同定する、前記方法。
【請求項７３】
前記ゲノム配列が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記方法が、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、及びＣＴＣＦ結合部位から選択される少なくとも２つのゲノム配列のメチル化を調節することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記１つ以上のゲノム配列が、前記遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の５０ｋＢ以内に位置する、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記エフェクタードメインがメチル化活性を有する、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記エフェクタードメインがＤｎｍｔ３ａである、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記エフェクタードメインが脱メチル化活性を有する、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記エフェクタードメインがＴｅｔ１である、請求項７２〜７５または７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞が、幹細胞、有糸分裂後細胞、ニューロン、または線維芽細胞である、請求項７２〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞が有糸分裂後ニューロンである、請求項７２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項７２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞が幹細胞である、請求項７２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドと前記エフェクタードメインとの間に融合された１つ以上の核移行配列をさらに含む、請求項７２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
ａ．請求項７２〜８４のいずれかに記載の方法に従って、対象となる遺伝子の発現にメチル化状態が影響を及ぼすゲノム領域を同定すること；
ｂ．細胞を試験薬剤と接触させること；及び
ｃ．前記細胞内の前記同定されたゲノム領域のメチル化を測定することを含み、
前記試験薬剤と接触した前記細胞における前記ゲノム領域のメチル化レベルが、前記試験薬剤と接触していない対照細胞における前記ゲノム領域のメチル化レベルと異なる場合に、前記試験薬剤が前記ゲノム領域のメチル化の調節因子であると同定される、方法。
【請求項８６】
前記試験薬剤が小分子である、請求項８５に記載の方法
【請求項８７】
ＤＮＡメチル化を阻害または増強する薬剤と前記細胞を接触させることをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記薬剤が小分子である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記薬剤が５−アザシチジンまたは５−アザデオキシシチジンである、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９０】
ＤＮＡメチル化を阻害または増強する薬剤を前記個体に投与することをさらに含む、請求項５５〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記薬剤が小分子である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記薬剤が５−アザシチジンまたは５−アザデオキシシチジンである、請求項９０または９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月１９日出願の米国仮出願第６２／３７７，５２０号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所が拠出する助成金番号ＨＤ０４５０２２に基づく政府支援を受けて実施された。政府は本発明において、ある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物の５−シトシンにおけるＤＮＡメチル化は、ゲノムインプリンティング、細胞運命決定、クロマチン構造の構成、細胞同一性の維持、及び遺伝子発現の調節を含め、多くの生物学的過程において重要な役割を果たす（Ｂｉｒｄ，２００２年；Ｃｅｄａｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｍａｎ，２０１２；Ｊａｅｎｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂｉｒｄ，２００３；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，２０１３）。遺伝学研究によって、ＤＮＡメチル化が哺乳動物の発生及び環境シグナルへの適応に不可欠であることが明らかになった（Ｊａｅｎｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂｉｒｄ，２００３；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，２０１３）。がん及び神経障害において異常なＤＮＡメチル化が観察されている（Ｌａｉｒｄ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，１９９６；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，２００５）。配列決定技術が進歩した結果、数多くの種類のヒト及びマウスの細胞及び組織について、単一ヌクレオチド分解能のメチル化マップが作成されている（Ｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。重要な点として、これらのマップにより、正常発生（Ｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）ならびに疾患（Ｄｅ  Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｄｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）の様々な過程でメチル化可変領域（ＤＭＲ）を塩基対分解能で同定することが可能になった。しかしながら、ＤＮＡメチル化を標的化された方法で効率的に編集できる適切な分子ツールが存在しないため、これらのＤＭＲの機能的意義の研究は依然として困難である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
哺乳動物のＤＮＡメチル化は、多くの生物学的過程において遺伝子発現ネットワークを調整するエピジェネティックなメカニズムである。しかしながら、特異的メチル化事象の機能を調べることは依然として困難である。Ｔｅｔ１またはＤｎｍｔ３ａと触媒不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）との融合が、標的化されたＤＮＡメチル化編集を可能にすることが実証されている。メチル化プロモーター配列へのｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１融合タンパク質の標的化、または非メチル化プロモーター配列へのｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ融合タンパク質の標的化はそれぞれ、内因性レポーターの活性化またはサイレンシングを引き起こした。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化は、有糸分裂後ニューロンにおけるＢＤＮＦ発現を誘導し、ＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化は、ＭｙｏＤが促進する線維芽細胞の筋芽細胞へのリプログラミングを活性化した。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＣＴＣＦループアンカー部位を標的とするｄｅ  ｎｏｖｏメチル化は、ＣＴＣＦ結合を遮断して、ＤＮＡルーピングを妨害し、隣接ループにおける遺伝子発現の変化を引き起こした。最後に、これらのツールはマウスにおいてＤＮＡメチル化を編集できることが示されており、エピジェネティック制御の機能的研究において幅広い有用性を実証している。これらのツールは、遺伝子発現、細胞運命決定、及び高次クロマチン構造の構成などの多様な生物学的過程におけるＤＮＡメチル化の機能的意義について考察を得るのに有用であろう。さらに、これらのツールは、異なるｓｇＲＮＡライブラリーと組み合わせて、機能特異的なメチル化可変領域（ＤＭＲ）を同定するスクリーニングプラットフォームを構築する際、及びトランスジェニックマウスを作製して特異的なＤＮＡメチル化事象をｉｎ  ｖｉｖｏで研究する際に有用であると考えられる。
【０００５】
本明細書では、細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾する方法であって、メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及び１つ以上のガイド配列を細胞に導入し、それによって細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾することを含む方法を開示する。
【０００６】
本明細書ではまた、細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾する方法であって、脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及び１つ以上のガイド配列を細胞に導入し、それによって細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾することを含む方法も開示する。
【０００７】
本明細書ではまた、細胞内の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法であって、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及びガイド配列またはガイド配列をコードする核酸を細胞に導入し、それによって細胞内の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節することを含む方法も開示する。
【０００８】
ある特定の態様では、ゲノム配列は、メチル化可変領域、エンハンサー（例えば、ＭｙｏＤのエンハンサー）、プロモーター（例えば、ＢＤＮＦプロモーター）、またはＣＴＣＦ結合部位を含む。いくつかの態様では、エフェクタードメインはＴｅｔ１を含む。他の態様では、エフェクタードメインはＤｎｍｔ３ａを含む。
【０００９】
いくつかの態様では、触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼは、触媒不活性なＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質）である。ガイド配列は、リボ核酸ガイド配列であってもよい。ある特定の態様では、ガイド配列は、約１０塩基対〜約１５０塩基対の長さである。１つ以上のガイド配列が、２つ以上のガイド配列を含んでもよい。
【００１０】
いくつかの実施形態では、細胞内で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のゲノム配列が修飾される。細胞は幹細胞、ニューロン、有糸分裂後細胞、または線維芽細胞であり得る。いくつかの態様では、細胞はヒト細胞またはマウス細胞である。
【００１１】
いくつかの態様では、１つ以上の核移行配列が、触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼとエフェクタードメインとの間に融合される。ある特定の態様では、ゲノム配列のうちの１つ以上は、疾患または病態と関連している。
【００１２】
ある特定の態様では、本方法はさらに、ＤＮＡメチル化を阻害または増強する薬剤と細胞を接触させることを含む。薬剤は小分子であり得る。例えば、薬剤は５−アザシチジンまたは５−アザデオキシシチジンである。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本方法は、細胞を非ヒト哺乳動物に導入することをさらに含む。非ヒト哺乳動物はマウスであり得る。
【００１４】
本明細書に記載の方法によって作製された単離修飾細胞もまた開示される。
【００１５】
本明細書ではまた、治療を必要とする患者の治療方法であって、本明細書に記載の修飾細胞を、そのような細胞を必要とする患者に投与することを含む方法も開示する。
【００１６】
また、調節を必要とする個体において、疾患を引き起こす１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法であって、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及び１つ以上のガイド配列を個体に導入し、それによって個体に疾患を引き起こす１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節することを含む方法を開示する。
【００１７】
また、ゲノム配列のメチル化が調節されている第１のゲノム修飾を含む修飾ゲノムを有する修飾細胞も開示する。ここでの調節は、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及び１つ以上のガイド配列と細胞を接触させることによって起こる。
【００１８】
本明細書ではまた、細胞内の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法であって、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸、及びガイド配列またはガイド配列をコードする核酸と細胞を接触させることを含む方法も開示する。
【００１９】
本明細書ではまた、個体内の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法であって、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸、及びガイド配列またはガイド配列をコードする核酸を個体に投与することを含む方法も開示する。
【００２０】
いくつかの態様では、ガイド配列はポリペプチドを１つ以上のゲノム配列に標的化する。このゲノム配列は、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含み得る。ある特定の態様では、この方法は、細胞内の少なくとも２つのゲノム配列のメチル化を調節することを含み、ゲノム配列がメチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、及びＣＴＣＦ結合部位から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインはＴｅｔ１またはＤｎｍｔ３ａを含む。いくつかの態様では、触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼは、触媒不活性なＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質）である。
【００２２】
ある特定の態様では、本方法はさらに、ＤＮＡメチル化を阻害または増強する薬剤を個体に投与することを含む。薬剤は小分子であり得る。例えば、薬剤は５−アザシチジンまたは５−アザデオキシシチジンである。
【００２３】
本明細書ではまた、治療を必要とする患者の治療方法であって、メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸、及びガイド配列またはガイド配列をコードする核酸を患者に投与することを含む方法も開示する。
【００２４】
また、細胞内の対象となる１つ以上の遺伝子の発現を調節する方法であって、メチル化可変領域が遺伝子の転写開始部位の５０ｋＢ以内に位置し、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸；ガイド配列またはガイド配列をコードする核酸（ガイド配列は、ポリペプチドをメチル化可変領域に標的化する）と細胞を接触させることを含む方法を開示する。
【００２５】
いくつかの態様では、メチル化可変領域は細胞内で高メチル化されており、エフェクタードメイン（例えばＴｅｔ１）は脱メチル化活性を有する。他の態様では、メチル化可変領域は細胞内でメチル化されておらず、エフェクタードメイン（例えばＤｎｍｔ３ａ）はメチル化活性を有する。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞、有糸分裂後細胞、ニューロン、または線維芽細胞である。
【００２６】
本明細書ではまた、対象となる遺伝子の発現にメチル化状態が影響を及ぼすゲノム配列を同定する方法であって、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸；ガイド配列またはガイド配列をコードする核酸（ガイド配列は、ポリペプチドを候補ゲノム配列に標的化する）と細胞を接触させることと、遺伝子の発現を測定することを含み、核酸と接触した細胞における遺伝子の発現が、核酸と接触していない対照細胞における当該ゲノム領域のメチル化のレベルと異なる場合に、そのゲノム配列を、対象となる遺伝子の発現にメチル化状態が影響を及ぼすものであると同定する方法も開示する。
【００２７】
いくつかの態様では、このゲノム配列は、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含む。ある特定の態様では、この方法は、メチル化可変領域、エンハンサー、プロモーター、及びＣＴＣＦ結合部位から選択される少なくとも２つのゲノム配列のメチル化を調節することを含む。１つ以上のゲノム配列は、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の５０ｋＢ以内に位置し得る。
【００２８】
ある特定の態様では、エフェクタードメインはメチル化活性を有する。例えば、そのエフェクタードメインはＤｎｍｔ３ａである。他の態様では、エフェクタードメインは脱メチル化活性を有する。例えば、そのエフェクタードメインはＴｅｔ１である。いくつかの態様では、細胞は幹細胞、有糸分裂後細胞、ニューロン、または線維芽細胞である。ある特定の実施形態では、１つ以上の核移行配列が、触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドとエフェクタードメインとの間に融合される。
【００２９】
本明細書ではまた、本明細書に記載の方法に従って、対象となる遺伝子の発現にメチル化状態が影響を及ぼすゲノム領域を同定すること；細胞を試験薬剤と接触させること；及び細胞内の同定されたゲノム領域のメチル化を測定することを含む方法も開示する。その場合、試験薬剤は、試験薬剤と接触した細胞におけるゲノム領域のメチル化のレベルが、試験薬剤（例えば小分子）と接触していない対照細胞における当該ゲノム領域のメチル化のレベルと異なる場合に、その試験薬剤をゲノム領域のメチル化の調節因子であると同定する。
【００３０】
本発明の上記及び他の多くの特徴ならびに付随する利点は、以下の本発明の詳細な説明を参照することによって十分に理解できるであろう。
【００３１】
本特許または本出願のファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれている。カラー図面を含む本特許公報または本特許出願公報のコピーは、請求及び必要な手数料の納付により、特許庁から入手可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−１】図１Ａ〜図１Ｆは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターの活性化を示す。図１Ａの上段パネルは、特異的配列のＤＮＡメチル化を消去するＴｅｔ１、及び特異的配列をｄｅ  ｎｏｖｏメチル化するＤｎｍｔ３ａと融合された、触媒不活性な変異体Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）の模式図を示す。下段パネルは、ｄＣａｓ９をＴｅｔ１と連結する核移行シグナル（ＮＬＳ）を有する最適化されたｄＣａｓ９−エフェクター構築物、及びｐｕｒｏ及びＣｈｅｒｒｙカセットを有するガイドＲＮＡ構築物を示す。図１Ｂは、メチル化を消去し、ＧＦＰ発現を活性化する、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＳｎｒｐｎプロモーター領域の標的化の模式図である。図１Ｃは、スクランブルｇＲＮＡ（ｓｃ  ｇＲＮＡ）またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする４つのｇＲＮＡ（標的ｇＲＮＡ）と、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とを発現するレンチウイルスに、Ｄａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のこれらの細胞のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陽性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図１Ｄ、左：１週間培養後に選別された、図１ＣのＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陽性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示したものである。図１Ｅは、図１Ｃに記載の細胞のバイサルファイトシーケンシングを示す。図１Ｆは、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＤａｚｌ遺伝子座における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図１−２】図１Ａ〜図１Ｆは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターの活性化を示す。図１Ａの上段パネルは、特異的配列のＤＮＡメチル化を消去するＴｅｔ１、及び特異的配列をｄｅ  ｎｏｖｏメチル化するＤｎｍｔ３ａと融合された、触媒不活性な変異体Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）の模式図を示す。下段パネルは、ｄＣａｓ９をＴｅｔ１と連結する核移行シグナル（ＮＬＳ）を有する最適化されたｄＣａｓ９−エフェクター構築物、及びｐｕｒｏ及びＣｈｅｒｒｙカセットを有するガイドＲＮＡ構築物を示す。図１Ｂは、メチル化を消去し、ＧＦＰ発現を活性化する、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＳｎｒｐｎプロモーター領域の標的化の模式図である。図１Ｃは、スクランブルｇＲＮＡ（ｓｃ  ｇＲＮＡ）またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする４つのｇＲＮＡ（標的ｇＲＮＡ）と、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とを発現するレンチウイルスに、Ｄａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のこれらの細胞のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陽性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図１Ｄ、左：１週間培養後に選別された、図１ＣのＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陽性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示したものである。図１Ｅは、図１Ｃに記載の細胞のバイサルファイトシーケンシングを示す。図１Ｆは、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＤａｚｌ遺伝子座における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図１−３】図１Ａ〜図１Ｆは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターの活性化を示す。図１Ａの上段パネルは、特異的配列のＤＮＡメチル化を消去するＴｅｔ１、及び特異的配列をｄｅ  ｎｏｖｏメチル化するＤｎｍｔ３ａと融合された、触媒不活性な変異体Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）の模式図を示す。下段パネルは、ｄＣａｓ９をＴｅｔ１と連結する核移行シグナル（ＮＬＳ）を有する最適化されたｄＣａｓ９−エフェクター構築物、及びｐｕｒｏ及びＣｈｅｒｒｙカセットを有するガイドＲＮＡ構築物を示す。図１Ｂは、メチル化を消去し、ＧＦＰ発現を活性化する、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＳｎｒｐｎプロモーター領域の標的化の模式図である。図１Ｃは、スクランブルｇＲＮＡ（ｓｃ  ｇＲＮＡ）またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする４つのｇＲＮＡ（標的ｇＲＮＡ）と、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とを発現するレンチウイルスに、Ｄａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のこれらの細胞のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陽性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図１Ｄ、左：１週間培養後に選別された、図１ＣのＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陽性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示したものである。図１Ｅは、図１Ｃに記載の細胞のバイサルファイトシーケンシングを示す。図１Ｆは、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＤａｚｌ遺伝子座における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｈは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターのサイレンシングを示す。図２Ａは、プロモーターをメチル化し、ＧＦＰ発現をサイレンシングする、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＳｎｒｐｎプロモーター領域の標的化の模式図を示す。図２Ｂは、スクランブルｇＲＮＡ（ｓｃ  ｇＲＮＡ）またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡ（標的ｇＲＮＡ）と、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ（ｄＣ−Ｄ）とを発現するレンチウイルスに、Ｇａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陰性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図２Ｃ、左：１週間培養後に選別された、ＢのＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陰性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。図２Ｄは、図２Ｂに記載の細胞のバイサルファイトシーケンシングを示す。図２Ｅは、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＧａｐｄｈ遺伝子座における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図２Ｆは、ドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａを有するＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陰性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図２Ｇ、左：ドキシサイクリンありまたはなしで１週間培養後に選別された、図２ＦのＣｈｅｒｒｙ陽性集団の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陰性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。図２Ｈは、図２Ｇの細胞からのＳｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＧａｐｄｈ遺伝子座における各個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図２−２】図２Ａ〜図２Ｈは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターのサイレンシングを示す。図２Ａは、プロモーターをメチル化し、ＧＦＰ発現をサイレンシングする、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＳｎｒｐｎプロモーター領域の標的化の模式図を示す。図２Ｂは、スクランブルｇＲＮＡ（ｓｃ  ｇＲＮＡ）またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡ（標的ｇＲＮＡ）と、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ（ｄＣ−Ｄ）とを発現するレンチウイルスに、Ｇａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陰性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図２Ｃ、左：１週間培養後に選別された、ＢのＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陰性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。図２Ｄは、図２Ｂに記載の細胞のバイサルファイトシーケンシングを示す。図２Ｅは、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＧａｐｄｈ遺伝子座における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図２Ｆは、ドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａを有するＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陰性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図２Ｇ、左：ドキシサイクリンありまたはなしで１週間培養後に選別された、図２ＦのＣｈｅｒｒｙ陽性集団の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陰性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。図２Ｈは、図２Ｇの細胞からのＳｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＧａｐｄｈ遺伝子座における各個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図２−３】図２Ａ〜図２Ｈは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターのサイレンシングを示す。図２Ａは、プロモーターをメチル化し、ＧＦＰ発現をサイレンシングする、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＳｎｒｐｎプロモーター領域の標的化の模式図を示す。図２Ｂは、スクランブルｇＲＮＡ（ｓｃ  ｇＲＮＡ）またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡ（標的ｇＲＮＡ）と、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ（ｄＣ−Ｄ）とを発現するレンチウイルスに、Ｇａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陰性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図２Ｃ、左：１週間培養後に選別された、ＢのＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陰性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。図２Ｄは、図２Ｂに記載の細胞のバイサルファイトシーケンシングを示す。図２Ｅは、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＧａｐｄｈ遺伝子座における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図２Ｆは、ドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域を標的とするｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａを有するＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣを感染させた場合を示す。感染３日後のフローサイトメトリー分析によってＧＦＰ陰性細胞の比率を算出し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。なお、ＧＦＰ陽性細胞の比率は、感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率で表す。図２Ｇ、左：ドキシサイクリンありまたはなしで１週間培養後に選別された、図２ＦのＣｈｅｒｒｙ陽性集団の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー：２５０ｕｍ。右：ＧＦＰ陰性コロニーの比率を定量化し、２つの生物学的複製物のＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示している。図２Ｈは、図２Ｇの細胞からのＳｎｒｐｎプロモーター領域及び隣接するＧａｐｄｈ遺伝子座における各個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図３−１】図３Ａ〜図３Ｅは、ニューロンにおいてＢＤＮＦを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化を示す。図３Ａは、メチル化を消去し、ＢＤＮＦ発現を活性化する、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）によるＢＤＮＦプロモーターＩＶの標的化の模式図である。図３Ｂは、３日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ３）で培養したマウス皮質ニューロンを、ＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とするｇＲＮＡありまたはなしでｄＣ−Ｔを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ。Ｈ１６７２Ｙ及びＤ１６７４Ａの変異を有する）とＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２日間感染させた後、ＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理してまたは処理せずに採取してＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った。バーは３つの生物学的複製物の平均±ＳＤである。図３Ｃは、図３ＢのＢＤＮＦ誘導についての代表的な共焦点画像を示す。上段パネル：６時間の５０ｍＭ  ＫＣｌ処理により、ＢＤＮＦ発現が誘導された。下段パネル：ＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域を標的とするｇＲＮＡとｄＣ−Ｔを同時発現させると、ＢＤＮＦ発現が有意に誘導された。なお、ｄＣ−ｄＴとＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとの同時発現はＢＤＮＦ発現を活性化しなかった。ＭＡＰ２（上段２枚のパネル）またはＣｈｅｒｒｙ（下段２枚のパネル）は赤、ＢＤＮＦは緑、ＤＡＰＩは青、及びｄＣａｓ９は灰色に染色されている。スケールバー：５０ｕｍ。図３Ｄは、図３Ｃのニューロンのバイサルファイトシーケンシングを示す。図３Ｅは、ＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域における各個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図３−２】図３Ａ〜図３Ｅは、ニューロンにおいてＢＤＮＦを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化を示す。図３Ａは、メチル化を消去し、ＢＤＮＦ発現を活性化する、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）によるＢＤＮＦプロモーターＩＶの標的化の模式図である。図３Ｂは、３日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ３）で培養したマウス皮質ニューロンを、ＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とするｇＲＮＡありまたはなしでｄＣ−Ｔを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ。Ｈ１６７２Ｙ及びＤ１６７４Ａの変異を有する）とＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２日間感染させた後、ＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理してまたは処理せずに採取してＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った。バーは３つの生物学的複製物の平均±ＳＤである。図３Ｃは、図３ＢのＢＤＮＦ誘導についての代表的な共焦点画像を示す。上段パネル：６時間の５０ｍＭ  ＫＣｌ処理により、ＢＤＮＦ発現が誘導された。下段パネル：ＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域を標的とするｇＲＮＡとｄＣ−Ｔを同時発現させると、ＢＤＮＦ発現が有意に誘導された。なお、ｄＣ−ｄＴとＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとの同時発現はＢＤＮＦ発現を活性化しなかった。ＭＡＰ２（上段２枚のパネル）またはＣｈｅｒｒｙ（下段２枚のパネル）は赤、ＢＤＮＦは緑、ＤＡＰＩは青、及びｄＣａｓ９は灰色に染色されている。スケールバー：５０ｕｍ。図３Ｄは、図３Ｃのニューロンのバイサルファイトシーケンシングを示す。図３Ｅは、ＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域における各個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図３−３】図３Ａ〜図３Ｅは、ニューロンにおいてＢＤＮＦを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化を示す。図３Ａは、メチル化を消去し、ＢＤＮＦ発現を活性化する、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）によるＢＤＮＦプロモーターＩＶの標的化の模式図である。図３Ｂは、３日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ３）で培養したマウス皮質ニューロンを、ＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とするｇＲＮＡありまたはなしでｄＣ−Ｔを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ。Ｈ１６７２Ｙ及びＤ１６７４Ａの変異を有する）とＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２日間感染させた後、ＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理してまたは処理せずに採取してＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った。バーは３つの生物学的複製物の平均±ＳＤである。図３Ｃは、図３ＢのＢＤＮＦ誘導についての代表的な共焦点画像を示す。上段パネル：６時間の５０ｍＭ  ＫＣｌ処理により、ＢＤＮＦ発現が誘導された。下段パネル：ＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域を標的とするｇＲＮＡとｄＣ−Ｔを同時発現させると、ＢＤＮＦ発現が有意に誘導された。なお、ｄＣ−ｄＴとＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとの同時発現はＢＤＮＦ発現を活性化しなかった。ＭＡＰ２（上段２枚のパネル）またはＣｈｅｒｒｙ（下段２枚のパネル）は赤、ＢＤＮＦは緑、ＤＡＰＩは青、及びｄＣａｓ９は灰色に染色されている。スケールバー：５０ｕｍ。図３Ｄは、図３Ｃのニューロンのバイサルファイトシーケンシングを示す。図３Ｅは、ＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域における各個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｈは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換を促進させる、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化を示す。図４Ａは、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）による、ＤＭＲ−５のＭｙｏＤ遠位エンハンサー（ＤＥ）の標的化の模式図を示す。図４Ｂは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞を、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）と標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２日間感染させた場合を示す。Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図４Ｃは、図４Ｂの細胞のバイサルファイトシーケンシングである。図４Ｄは、ＭｙｏＤ  ＤＥ領域における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図４Ｅは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイにおける１４日目のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の代表的な共焦点画像を示す。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種した後、ｄＣ−ＴとＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）と標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに感染させた。感染２４時間後、細胞をビヒクル対照（ＨＥＰＥＳ緩衝液）または５−アザシチジン（１ｕＭ）で２４時間処理した後、１４日後に採取し、免疫蛍光染色した。ＭｙｏＤは緑、ＭＨＣはマゼンタ、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図４Ｆは、ｄＣ−Ｔ単独を発現するレンチウイルス、ＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとｄＣ−Ｔとを発現するレンチウイルス、及びｄＣ−ｄＴと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスによる感染１４日後のＭｙｏＤ陽性細胞比の定量化を示す。図４Ｇは、感染１４日後のＭＨＣ＋クラスターあたりの核数（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数２〜５、６〜１０、１１〜２０、及び＞２０で分類）に基づくＭＨＣ陽性細胞クラスターの分布プロファイルを示す。５−アザで処理した場合、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとの同時発現は、モック対照またはｄＣ−Ｔ単独と比較して、より成熟した大きなＭＨＣ＋クラスターの形成を有意に促進しているが、他の組み合わせの同時発現は促進していない。図４Ｈは、感染１４日後に２超または５超の核を有するＭＨＣ陽性クラスターにおける筋管密度の定量化を示す。５−アザの添加はＭＨＣ＋の筋管形成を誘導する。ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとの同時発現は、５−アザと有意に相乗作用し、核数が多く大きな筋管（核が５超であるＭＨＣ＋クラスター）を誘導する。Ｆ〜Ｈのデータは、３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。バーは平均±ＳＤを表す。
【図４−２】図４Ａ〜図４Ｈは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換を促進させる、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化を示す。図４Ａは、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）による、ＤＭＲ−５のＭｙｏＤ遠位エンハンサー（ＤＥ）の標的化の模式図を示す。図４Ｂは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞を、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）と標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２日間感染させた場合を示す。Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図４Ｃは、図４Ｂの細胞のバイサルファイトシーケンシングである。図４Ｄは、ＭｙｏＤ  ＤＥ領域における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図４Ｅは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイにおける１４日目のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の代表的な共焦点画像を示す。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種した後、ｄＣ−ＴとＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）と標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに感染させた。感染２４時間後、細胞をビヒクル対照（ＨＥＰＥＳ緩衝液）または５−アザシチジン（１ｕＭ）で２４時間処理した後、１４日後に採取し、免疫蛍光染色した。ＭｙｏＤは緑、ＭＨＣはマゼンタ、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図４Ｆは、ｄＣ−Ｔ単独を発現するレンチウイルス、ＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとｄＣ−Ｔとを発現するレンチウイルス、及びｄＣ−ｄＴと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスによる感染１４日後のＭｙｏＤ陽性細胞比の定量化を示す。図４Ｇは、感染１４日後のＭＨＣ＋クラスターあたりの核数（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数２〜５、６〜１０、１１〜２０、及び＞２０で分類）に基づくＭＨＣ陽性細胞クラスターの分布プロファイルを示す。５−アザで処理した場合、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとの同時発現は、モック対照またはｄＣ−Ｔ単独と比較して、より成熟した大きなＭＨＣ＋クラスターの形成を有意に促進しているが、他の組み合わせの同時発現は促進していない。図４Ｈは、感染１４日後に２超または５超の核を有するＭＨＣ陽性クラスターにおける筋管密度の定量化を示す。５−アザの添加はＭＨＣ＋の筋管形成を誘導する。ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとの同時発現は、５−アザと有意に相乗作用し、核数が多く大きな筋管（核が５超であるＭＨＣ＋クラスター）を誘導する。Ｆ〜Ｈのデータは、３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。バーは平均±ＳＤを表す。
【図４−３】図４Ａ〜図４Ｈは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換を促進させる、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化を示す。図４Ａは、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）による、ＤＭＲ−５のＭｙｏＤ遠位エンハンサー（ＤＥ）の標的化の模式図を示す。図４Ｂは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞を、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）と標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２日間感染させた場合を示す。Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図４Ｃは、図４Ｂの細胞のバイサルファイトシーケンシングである。図４Ｄは、ＭｙｏＤ  ＤＥ領域における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図４Ｅは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイにおける１４日目のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の代表的な共焦点画像を示す。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種した後、ｄＣ−ＴとＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）と標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに感染させた。感染２４時間後、細胞をビヒクル対照（ＨＥＰＥＳ緩衝液）または５−アザシチジン（１ｕＭ）で２４時間処理した後、１４日後に採取し、免疫蛍光染色した。ＭｙｏＤは緑、ＭＨＣはマゼンタ、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図４Ｆは、ｄＣ−Ｔ単独を発現するレンチウイルス、ＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとｄＣ−Ｔとを発現するレンチウイルス、及びｄＣ−ｄＴと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスによる感染１４日後のＭｙｏＤ陽性細胞比の定量化を示す。図４Ｇは、感染１４日後のＭＨＣ＋クラスターあたりの核数（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数２〜５、６〜１０、１１〜２０、及び＞２０で分類）に基づくＭＨＣ陽性細胞クラスターの分布プロファイルを示す。５−アザで処理した場合、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとの同時発現は、モック対照またはｄＣ−Ｔ単独と比較して、より成熟した大きなＭＨＣ＋クラスターの形成を有意に促進しているが、他の組み合わせの同時発現は促進していない。図４Ｈは、感染１４日後に２超または５超の核を有するＭＨＣ陽性クラスターにおける筋管密度の定量化を示す。５−アザの添加はＭＨＣ＋の筋管形成を誘導する。ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとの同時発現は、５−アザと有意に相乗作用し、核数が多く大きな筋管（核が５超であるＭＨＣ＋クラスター）を誘導する。Ｆ〜Ｈのデータは、３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。バーは平均±ＳＤを表す。
【図４−４】図４Ａ〜図４Ｈは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換を促進させる、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化を示す。図４Ａは、特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）による、ＤＭＲ−５のＭｙｏＤ遠位エンハンサー（ＤＥ）の標的化の模式図を示す。図４Ｂは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞を、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）と標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２日間感染させた場合を示す。Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図４Ｃは、図４Ｂの細胞のバイサルファイトシーケンシングである。図４Ｄは、ＭｙｏＤ  ＤＥ領域における個々のＣｐＧのメチル化レベルを示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図４Ｅは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイにおける１４日目のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の代表的な共焦点画像を示す。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種した後、ｄＣ−ＴとＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）と標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに感染させた。感染２４時間後、細胞をビヒクル対照（ＨＥＰＥＳ緩衝液）または５−アザシチジン（１ｕＭ）で２４時間処理した後、１４日後に採取し、免疫蛍光染色した。ＭｙｏＤは緑、ＭＨＣはマゼンタ、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図４Ｆは、ｄＣ−Ｔ単独を発現するレンチウイルス、ＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとｄＣ−Ｔとを発現するレンチウイルス、及びｄＣ−ｄＴと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスによる感染１４日後のＭｙｏＤ陽性細胞比の定量化を示す。図４Ｇは、感染１４日後のＭＨＣ＋クラスターあたりの核数（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数２〜５、６〜１０、１１〜２０、及び＞２０で分類）に基づくＭＨＣ陽性細胞クラスターの分布プロファイルを示す。５−アザで処理した場合、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとの同時発現は、モック対照またはｄＣ−Ｔ単独と比較して、より成熟した大きなＭＨＣ＋クラスターの形成を有意に促進しているが、他の組み合わせの同時発現は促進していない。図４Ｈは、感染１４日後に２超または５超の核を有するＭＨＣ陽性クラスターにおける筋管密度の定量化を示す。５−アザの添加はＭＨＣ＋の筋管形成を誘導する。ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとの同時発現は、５−アザと有意に相乗作用し、核数が多く大きな筋管（核が５超であるＭＨＣ＋クラスター）を誘導する。Ｆ〜Ｈのデータは、３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。バーは平均±ＳＤを表す。
【図５−１】図５Ａ〜図５ＩはＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図５Ａは、ｄｅ  ｎｏｖｏメチル化を誘導する特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＣＴＣＦ結合部位の標的化、ＣＴＣＦ動員の遮断、及び隣接ループでの遺伝子発現を変化させるＣＴＣＦループの開放の模式図を示す。図５Ｂは、ループ内にスーパーエンハンサー及びｍｉＲ２９０を有するＣＴＣＦ標的１（ｍｉＲ２９０遺伝子座）、左隣のループのＡＵ０１８０９１遺伝子、及び（標的ＣＴＣＦ結合部位に近接する）右隣のループのＮｌｒｐ１２遺伝子の模式図を示す。Ｍｙａｄｍ遺伝子はＮｌｒｐ１２を含むループの右隣のループにある。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万／塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。図５Ｃ〜５Ｅは、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ  ｍＥＳＣを、スクランブルｇＲＮＡまたはＣＴＣＦ標的１のｇＲＮＡを発現するレンチウイルス、及びｄＣ−ｄＴとＣＴＣＦ標的１のｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに３日間感染させた後、Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別した場合を示す。ドキシサイクリンの存在下で３日間培養した後、これらの細胞をゼラチンコートしたプレートに１時間静置し、フィーダー細胞を除去した後、採取して、図５ＣのＲＴ−ｑＰＣＲ分析、図５Ｄ及び図５Ｅのバイサルファイトシーケンシングを行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図５Ｆは、このループにスーパーエンハンサー及びＰｏｕ５ｆ１遺伝子を有するＣＴＣＦ標的２、（標的ＣＴＣＦ結合部位に近接する）左隣のループのＨ２Ｑ１０遺伝子、及び右隣のループのＴｃｆ１９の模式図を示す。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万／塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。図５Ｇ〜図５Ｉは、図５Ｃ〜図５Ｅに記載したものと同じ実験セットをＣＴＣＦ標的２について実施した場合を示し、細胞を採取して図５Ｃと同様のＲＴ−ｑＰＣＲ分析、図５Ｄ〜図５Ｅと同様のバイサルファイトシーケンシングを行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図５−２】図５Ａ〜図５ＩはＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図５Ａは、ｄｅ  ｎｏｖｏメチル化を誘導する特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＣＴＣＦ結合部位の標的化、ＣＴＣＦ動員の遮断、及び隣接ループでの遺伝子発現を変化させるＣＴＣＦループの開放の模式図を示す。図５Ｂは、ループ内にスーパーエンハンサー及びｍｉＲ２９０を有するＣＴＣＦ標的１（ｍｉＲ２９０遺伝子座）、左隣のループのＡＵ０１８０９１遺伝子、及び（標的ＣＴＣＦ結合部位に近接する）右隣のループのＮｌｒｐ１２遺伝子の模式図を示す。Ｍｙａｄｍ遺伝子はＮｌｒｐ１２を含むループの右隣のループにある。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万／塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。図５Ｃ〜５Ｅは、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ  ｍＥＳＣを、スクランブルｇＲＮＡまたはＣＴＣＦ標的１のｇＲＮＡを発現するレンチウイルス、及びｄＣ−ｄＴとＣＴＣＦ標的１のｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに３日間感染させた後、Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別した場合を示す。ドキシサイクリンの存在下で３日間培養した後、これらの細胞をゼラチンコートしたプレートに１時間静置し、フィーダー細胞を除去した後、採取して、図５ＣのＲＴ−ｑＰＣＲ分析、図５Ｄ及び図５Ｅのバイサルファイトシーケンシングを行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図５Ｆは、このループにスーパーエンハンサー及びＰｏｕ５ｆ１遺伝子を有するＣＴＣＦ標的２、（標的ＣＴＣＦ結合部位に近接する）左隣のループのＨ２Ｑ１０遺伝子、及び右隣のループのＴｃｆ１９の模式図を示す。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万／塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。図５Ｇ〜図５Ｉは、図５Ｃ〜図５Ｅに記載したものと同じ実験セットをＣＴＣＦ標的２について実施した場合を示し、細胞を採取して図５Ｃと同様のＲＴ−ｑＰＣＲ分析、図５Ｄ〜図５Ｅと同様のバイサルファイトシーケンシングを行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図５−３】図５Ａ〜図５ＩはＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図５Ａは、ｄｅ  ｎｏｖｏメチル化を誘導する特異的ｇＲＮＡを用いたｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによるＣＴＣＦ結合部位の標的化、ＣＴＣＦ動員の遮断、及び隣接ループでの遺伝子発現を変化させるＣＴＣＦループの開放の模式図を示す。図５Ｂは、ループ内にスーパーエンハンサー及びｍｉＲ２９０を有するＣＴＣＦ標的１（ｍｉＲ２９０遺伝子座）、左隣のループのＡＵ０１８０９１遺伝子、及び（標的ＣＴＣＦ結合部位に近接する）右隣のループのＮｌｒｐ１２遺伝子の模式図を示す。Ｍｙａｄｍ遺伝子はＮｌｒｐ１２を含むループの右隣のループにある。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万／塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。図５Ｃ〜５Ｅは、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ  ｍＥＳＣを、スクランブルｇＲＮＡまたはＣＴＣＦ標的１のｇＲＮＡを発現するレンチウイルス、及びｄＣ−ｄＴとＣＴＣＦ標的１のｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに３日間感染させた後、Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別した場合を示す。ドキシサイクリンの存在下で３日間培養した後、これらの細胞をゼラチンコートしたプレートに１時間静置し、フィーダー細胞を除去した後、採取して、図５ＣのＲＴ−ｑＰＣＲ分析、図５Ｄ及び図５Ｅのバイサルファイトシーケンシングを行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図５Ｆは、このループにスーパーエンハンサー及びＰｏｕ５ｆ１遺伝子を有するＣＴＣＦ標的２、（標的ＣＴＣＦ結合部位に近接する）左隣のループのＨ２Ｑ１０遺伝子、及び右隣のループのＴｃｆ１９の模式図を示す。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万／塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。図５Ｇ〜図５Ｉは、図５Ｃ〜図５Ｅに記載したものと同じ実験セットをＣＴＣＦ標的２について実施した場合を示し、細胞を採取して図５Ｃと同様のＲＴ−ｑＰＣＲ分析、図５Ｄ〜図５Ｅと同様のバイサルファイトシーケンシングを行った。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｄは、ＣＴＣＦループを操作するためのＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図６Ａは、Ｃに記載された細胞のｍｉＲ２９０遺伝子座での定量Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ（３Ｃ）解析を示す。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。矢印は、その間の相互作用頻度をアッセイした染色体位置を示す。アスタリスクは３Ｃアンカー部位を示す。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。示された染色体位置と３Ｃアンカー部位との間の相互作用頻度を、下段パネルに棒グラフ（平均±ＳＤ）で表す。ｑＰＣＲ反応は２連で実施し、スクランブルｇＲＮＡを有する細胞での平均相互作用頻度に対して、値を正規化している。（３つの領域すべてがｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定、ｎｓは有意性なしを表し、ＮＣは陰性対照を表す。）図６Ｂは、図６Ａの細胞を用いて抗ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰ実験を行い、続いて定量ＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図６Ｃは、図５Ｇに記載された細胞のＰｏｕ５ｆ１遺伝子座での定量Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ（３Ｃ）分析を示す。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。矢印は、その間の相互作用頻度をアッセイした染色体位置を示す。アスタリスクは３Ｃアンカー部位を示す。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万／塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。示された染色体位置と３Ｃアンカー部位との間の相互作用頻度を、下段パネルに棒グラフ（平均±ＳＤ）で表す。ｑＰＣＲ反応は２連で実施し、スクランブルｇＲＮＡを有する細胞での平均相互作用頻度に対して、値を正規化している。（ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定、ｎｓは有意性なしを表す。）。図６Ｄは、Ｃの細胞を用いて抗ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰ実験を行い、続いて定量ＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図６−２】図６Ａ〜図６Ｄは、ＣＴＣＦループを操作するためのＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図６Ａは、Ｃに記載された細胞のｍｉＲ２９０遺伝子座での定量Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ（３Ｃ）解析を示す。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。矢印は、その間の相互作用頻度をアッセイした染色体位置を示す。アスタリスクは３Ｃアンカー部位を示す。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。示された染色体位置と３Ｃアンカー部位との間の相互作用頻度を、下段パネルに棒グラフ（平均±ＳＤ）で表す。ｑＰＣＲ反応は２連で実施し、スクランブルｇＲＮＡを有する細胞での平均相互作用頻度に対して、値を正規化している。（３つの領域すべてがｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定、ｎｓは有意性なしを表し、ＮＣは陰性対照を表す。）図６Ｂは、図６Ａの細胞を用いて抗ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰ実験を行い、続いて定量ＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図６Ｃは、図５Ｇに記載された細胞のＰｏｕ５ｆ１遺伝子座での定量Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ（３Ｃ）分析を示す。スーパーエンハンサードメインは赤色バーで示されている。標的ＣＴＣＦ部位はボックスで強調表示されている。矢印は、その間の相互作用頻度をアッセイした染色体位置を示す。アスタリスクは３Ｃアンカー部位を示す。ＣＴＣＦ（黒）及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（スーパーエンハンサー）（赤）についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイル（リード／１００万／塩基対）、ならびにＤＭＲ（青）を付記したメチル化トラック（黄）もまた示されている。示された染色体位置と３Ｃアンカー部位との間の相互作用頻度を、下段パネルに棒グラフ（平均±ＳＤ）で表す。ｑＰＣＲ反応は２連で実施し、スクランブルｇＲＮＡを有する細胞での平均相互作用頻度に対して、値を正規化している。（ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定、ｎｓは有意性なしを表す。）。図６Ｄは、Ｃの細胞を用いて抗ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰ実験を行い、続いて定量ＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｈは、サイレンシングされたＧＦＰレポーターを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１による標的化されたｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのＤＮＡメチル化編集を示す。図７Ａは、マウス線維芽細胞において、サイレンシングされたＧＦＰレポーターをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化する実験手順を表す模式図を示す。マウス尾部の線維芽細胞は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３遺伝子座に父性ＩＧ−ＤＭＲ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ対立遺伝子（ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ）をもつ遺伝子改変マウス株に由来するものであった。父性対立遺伝子上のＩＧ−ＤＭＲ−Ｓｎｒｐｎプロモーターは高メチル化されているので、ＧＦＰレポーターは構成的にサイレンシングされている。培養した線維芽細胞をｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターに感染させて、Ｓｎｒｐｎプロモーターを脱メチル化し、ＧＦＰレポーターを活性化した。細胞はイメージング及びＦＡＣＳ分析にかける。図７Ｂは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とｓｃ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、不活性形態のｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、またはｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ線維芽細胞の代表的な免疫組織化学画像を示す。Ｃｈｅｒｒｙは赤、ＧＦＰは緑、核はＤＡＰＩで染色されている。スケールバー：１００ｕｍ。留意点として、Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰメチル化レポーターをオンにするには、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１と標的ｇＲＮＡ両方のレンチウイルスベクターが同じ細胞に形質導入される必要がある。したがって、本実験では、Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞（標的ｇＲＮＡ）の数はＧＦＰ陽性細胞（Ｓｎｒｐｎプロモーターの脱メチル化）の数よりも多いと予想される。図７Ｃは、Ｃｈｅｒｒｙ（ｇＲＮＡ）陽性細胞のうち、ＧＦＰ活性化を伴うＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス線維芽細胞の比率の定量化を示す。Ｓｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡの発現を有する細胞の約８０％は、ＧＦＰ発現をオンにした。ｄＣ−Ｔとｓｃ  ｇＲＮＡ、及び不活性形態のｄＣ−Ｔ（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡは、ＧＦＰレポーター発現をオンにすることができない。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図７Ｄは、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス脳において、ＧＦＰレポーターをｉｎ  ｖｉｖｏで活性化する実験手順を表す模式図を示す。ｄＣ−Ｔ及びｓｃ  ｇＲＮＡ、ｄＣ−ｄＴ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡ、ならびにｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを定位固定マイクロインジェクション法で送達した。脳を薄切し、免疫組織化学法により分析した。図７Ｅは、ｄＣ−Ｔ及びｓｃ  ｇＲＮＡ、ｄＣ−ｄＴ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡ、ならびにｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡに感染させたＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス脳についての代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。標的ｇＲＮＡを付加したｄＣ−ＴのみがＧＦＰ発現を活性化した。スケールバー：１００ｕｍ。図７Ｇ〜７Ｈは、脳（図７Ｇ）及び皮膚表皮（図７Ｈ）でのｉｎ  ｖｉｖｏレンチウイルス送達実験において、Ｃｈｅｒｒｙ（ｇＲＮＡ）陽性���胞のうち、ＧＦＰ活性化を伴うＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ細胞の比率の定量化を示す。Ｓｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡの形質を発現するニューロンの約７０％及び皮膚真皮細胞の８５％が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＦＰ発現をオンにした。対象的に、ｄＣ−ＴとスクランブルｇＲＮＡ、及び不活性形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡは、ＧＦＰレポーター発現をオンにしなかった。バーは２匹の動物からの４枚超の代表的な画像の平均±ＳＤを表す。
【図７−２】図７Ａ〜図７Ｈは、サイレンシングされたＧＦＰレポーターを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１による標的化されたｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのＤＮＡメチル化編集を示す。図７Ａは、マウス線維芽細胞において、サイレンシングされたＧＦＰレポーターをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化する実験手順を表す模式図を示す。マウス尾部の線維芽細胞は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３遺伝子座に父性ＩＧ−ＤＭＲ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ対立遺伝子（ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ）をもつ遺伝子改変マウス株に由来するものであった。父性対立遺伝子上のＩＧ−ＤＭＲ−Ｓｎｒｐｎプロモーターは高メチル化されているので、ＧＦＰレポーターは構成的にサイレンシングされている。培養した線維芽細胞をｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターに感染させて、Ｓｎｒｐｎプロモーターを脱メチル化し、ＧＦＰレポーターを活性化した。細胞はイメージング及びＦＡＣＳ分析にかける。図７Ｂは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とｓｃ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、不活性形態のｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、またはｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ線維芽細胞の代表的な免疫組織化学画像を示す。Ｃｈｅｒｒｙは赤、ＧＦＰは緑、核はＤＡＰＩで染色されている。スケールバー：１００ｕｍ。留意点として、Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰメチル化レポーターをオンにするには、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１と標的ｇＲＮＡ両方のレンチウイルスベクターが同じ細胞に形質導入される必要がある。したがって、本実験では、Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞（標的ｇＲＮＡ）の数はＧＦＰ陽性細胞（Ｓｎｒｐｎプロモーターの脱メチル化）の数よりも多いと予想される。図７Ｃは、Ｃｈｅｒｒｙ（ｇＲＮＡ）陽性細胞のうち、ＧＦＰ活性化を伴うＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス線維芽細胞の比率の定量化を示す。Ｓｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡの発現を有する細胞の約８０％は、ＧＦＰ発現をオンにした。ｄＣ−Ｔとｓｃ  ｇＲＮＡ、及び不活性形態のｄＣ−Ｔ（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡは、ＧＦＰレポーター発現をオンにすることができない。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図７Ｄは、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス脳において、ＧＦＰレポーターをｉｎ  ｖｉｖｏで活性化する実験手順を表す模式図を示す。ｄＣ−Ｔ及びｓｃ  ｇＲＮＡ、ｄＣ−ｄＴ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡ、ならびにｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを定位固定マイクロインジェクション法で送達した。脳を薄切し、免疫組織化学法により分析した。図７Ｅは、ｄＣ−Ｔ及びｓｃ  ｇＲＮＡ、ｄＣ−ｄＴ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡ、ならびにｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡに感染させたＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス脳についての代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。標的ｇＲＮＡを付加したｄＣ−ＴのみがＧＦＰ発現を活性化した。スケールバー：１００ｕｍ。図７Ｇ〜７Ｈは、脳（図７Ｇ）及び皮膚表皮（図７Ｈ）でのｉｎ  ｖｉｖｏレンチウイルス送達実験において、Ｃｈｅｒｒｙ（ｇＲＮＡ）陽性���胞のうち、ＧＦＰ活性化を伴うＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ細胞の比率の定量化を示す。Ｓｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡの形質を発現するニューロンの約７０％及び皮膚真皮細胞の８５％が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＦＰ発現をオンにした。対象的に、ｄＣ−ＴとスクランブルｇＲＮＡ、及び不活性形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡは、ＧＦＰレポーター発現をオンにしなかった。バーは２匹の動物からの４枚超の代表的な画像の平均±ＳＤを表す。
【図７−３】図７Ａ〜図７Ｈは、サイレンシングされたＧＦＰレポーターを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１による標的化されたｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのＤＮＡメチル化編集を示す。図７Ａは、マウス線維芽細胞において、サイレンシングされたＧＦＰレポーターをｅｘ  ｖｉｖｏで活性化する実験手順を表す模式図を示す。マウス尾部の線維芽細胞は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３遺伝子座に父性ＩＧ−ＤＭＲ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ対立遺伝子（ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ）をもつ遺伝子改変マウス株に由来するものであった。父性対立遺伝子上のＩＧ−ＤＭＲ−Ｓｎｒｐｎプロモーターは高メチル化されているので、ＧＦＰレポーターは構成的にサイレンシングされている。培養した線維芽細胞をｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターに感染させて、Ｓｎｒｐｎプロモーターを脱メチル化し、ＧＦＰレポーターを活性化した。細胞はイメージング及びＦＡＣＳ分析にかける。図７Ｂは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とｓｃ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、不活性形態のｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、またはｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ線維芽細胞の代表的な免疫組織化学画像を示す。Ｃｈｅｒｒｙは赤、ＧＦＰは緑、核はＤＡＰＩで染色されている。スケールバー：１００ｕｍ。留意点として、Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰメチル化レポーターをオンにするには、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１と標的ｇＲＮＡ両方のレンチウイルスベクターが同じ細胞に形質導入される必要がある。したがって、本実験では、Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞（標的ｇＲＮＡ）の数はＧＦＰ陽性細胞（Ｓｎｒｐｎプロモーターの脱メチル化）の数よりも多いと予想される。図７Ｃは、Ｃｈｅｒｒｙ（ｇＲＮＡ）陽性細胞のうち、ＧＦＰ活性化を伴うＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス線維芽細胞の比率の定量化を示す。Ｓｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡの発現を有する細胞の約８０％は、ＧＦＰ発現をオンにした。ｄＣ−Ｔとｓｃ  ｇＲＮＡ、及び不活性形態のｄＣ−Ｔ（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡは、ＧＦＰレポーター発現をオンにすることができない。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図７Ｄは、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス脳において、ＧＦＰレポーターをｉｎ  ｖｉｖｏで活性化する実験手順を表す模式図を示す。ｄＣ−Ｔ及びｓｃ  ｇＲＮＡ、ｄＣ−ｄＴ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡ、ならびにｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを定位固定マイクロインジェクション法で送達した。脳を薄切し、免疫組織化学法により分析した。図７Ｅは、ｄＣ−Ｔ及びｓｃ  ｇＲＮＡ、ｄＣ−ｄＴ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡ、ならびにｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡに感染させたＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス脳についての代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。標的ｇＲＮＡを付加したｄＣ−ＴのみがＧＦＰ発現を活性化した。スケールバー：１００ｕｍ。図７Ｇ〜７Ｈは、脳（図７Ｇ）及び皮膚表皮（図７Ｈ）でのｉｎ  ｖｉｖｏレンチウイルス送達実験において、Ｃｈｅｒｒｙ（ｇＲＮＡ）陽性���胞のうち、ＧＦＰ活性化を伴うＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔ細胞の比率の定量化を示す。Ｓｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡの形質を発現するニューロンの約７０％及び皮膚真皮細胞の８５％が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＦＰ発現をオンにした。対象的に、ｄＣ−ＴとスクランブルｇＲＮＡ、及び不活性形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡは、ＧＦＰレポーター発現をオンにしなかった。バーは２匹の動物からの４枚超の代表的な画像の平均±ＳＤを表す。
【図８−１】図８Ａ〜図８Ｅは、哺乳動物ゲノムの５−シトシンＤＮＡメチル化を編集するための改変ＣＲＩＳＰＲシステムを示す。図８Ａは、核移行シグナル（ＮＬＳ）が異なる位置に配置されたｄＣａｓ９−エフェクター構築物、及びＣＭＶ駆動ｐｕｒｏ−Ｔ２Ａ−Ｃｈｅｒｒｙカセットを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または拡張型ガイドＲＮＡ（Ｅ−ｇＲＮＡ）の設計を示す。Ｕｂ：ヒトユビキチンＣプロモーター。図８Ｂは、これらの構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に２日間トランスフェクションした後に抗Ｃａｓ９抗体を用いてイムノブロッティングすることにより、ｄＣａｓ−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１の発現を分析した場合を示す。α−チューブリンを負荷対照として使用した。図８Ｃは、ＭｙｏＤ遺伝子座の同じ位置を標的とするｇＲＮＡまたはＥ−ｇＲＮＡの同時発現を伴うまたは伴わないＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１の細胞移行の比較を示す。ｓｇＲＮＡが存在しない場合、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１は大部分が核区画から排除され、ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１はトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に弱い核移行を示す。ｇＲＮＡまたはＥ−ｇＲＮＡいずれかの同時発現は、これら２つのタンパク質の細胞質から核への転座を誘導した。マージされた画像では、ｄＣａｓ９は緑、Ｃｈｅｒｒｙは赤、ＤＡＰＩは青に染色されている。最初の２枚のパネルの赤い破線は、ＧＦＰ強度を定量化する画像断面を示している。スケールバー：１０ｕｍ。図８Ｄは、ｇＲＮＡまたはＥ−ｇＲＮＡの非存在下または存在下でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１の核−細胞質比の定量化を箱ひげ図で示す。定量化には、Ｃに図示する断面線に沿った細胞質ドメイン及び核ドメインの平均ｄＣａｓ９強度を使用した。「＋」は、各群の２０のデータポイントの平均値を示す；箱は、極端なデータポイント（上と下のバー）、２５〜７５％区間（箱）、中央値（中央の線）を示す。図８Ｅは、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１についての誘導指数（ｓｇＲＮＡなしの値で正規化した、ｓｇＲＮＡを用いた核−細胞質比で規定される）の定量化を示す。ｇＲＮＡ及びＥ−ｇＲＮＡはそれぞれ、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１では３．１７倍と３．２２倍、ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１では１．７３倍と１．７７倍の核移行を誘導した。本発明者らは、誘導指数が最大である組み合わせが、標的化されたＤＮＡメチル化編集に関して最善のシグナル対ノイズ比をもたらすであろうと推察した。
【図８−２】図８Ａ〜図８Ｅは、哺乳動物ゲノムの５−シトシンＤＮＡメチル化を編集するための改変ＣＲＩＳＰＲシステムを示す。図８Ａは、核移行シグナル（ＮＬＳ）が異なる位置に配置されたｄＣａｓ９−エフェクター構築物、及びＣＭＶ駆動ｐｕｒｏ−Ｔ２Ａ−Ｃｈｅｒｒｙカセットを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または拡張型ガイドＲＮＡ（Ｅ−ｇＲＮＡ）の設計を示す。Ｕｂ：ヒトユビキチンＣプロモーター。図８Ｂは、これらの構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に２日間トランスフェクションした後に抗Ｃａｓ９抗体を用いてイムノブロッティングすることにより、ｄＣａｓ−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１の発現を分析した場合を示す。α−チューブリンを負荷対照として使用した。図８Ｃは、ＭｙｏＤ遺伝子座の同じ位置を標的とするｇＲＮＡまたはＥ−ｇＲＮＡの同時発現を伴うまたは伴わないＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１の細胞移行の比較を示す。ｓｇＲＮＡが存在しない場合、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１は大部分が核区画から排除され、ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１はトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に弱い核移行を示す。ｇＲＮＡまたはＥ−ｇＲＮＡいずれかの同時発現は、これら２つのタンパク質の細胞質から核への転座を誘導した。マージされた画像では、ｄＣａｓ９は緑、Ｃｈｅｒｒｙは赤、ＤＡＰＩは青に染色されている。最初の２枚のパネルの赤い破線は、ＧＦＰ強度を定量化する画像断面を示している。スケールバー：１０ｕｍ。図８Ｄは、ｇＲＮＡまたはＥ−ｇＲＮＡの非存在下または存在下でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１の核−細胞質比の定量化を箱ひげ図で示す。定量化には、Ｃに図示する断面線に沿った細胞質ドメイン及び核ドメインの平均ｄＣａｓ９強度を使用した。「＋」は、各群の２０のデータポイントの平均値を示す；箱は、極端なデータポイント（上と下のバー）、２５〜７５％区間（箱）、中央値（中央の線）を示す。図８Ｅは、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１についての誘導指数（ｓｇＲＮＡなしの値で正規化した、ｓｇＲＮＡを用いた核−細胞質比で規定される）の定量化を示す。ｇＲＮＡ及びＥ−ｇＲＮＡはそれぞれ、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１では３．１７倍と３．２２倍、ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１では１．７３倍と１．７７倍の核移行を誘導した。本発明者らは、誘導指数が最大である組み合わせが、標的化されたＤＮＡメチル化編集に関して最善のシグナル対ノイズ比をもたらすであろうと推察した。
【図９−１】図９Ａ〜図９Ｊは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によりＤａｚｌｅ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターを活性化し、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによりＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターを抑制する、標的化プロモーターのメチル化編集を示す。図９Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ遺伝子座のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。Ｄａｚｌ配列は小文字であり、Ｓｎｒｐｎ配列は大文字である。図９Ｂは、Ｓｎｒｐｎプロモーターに対する標的ｇＲＮＡの存在下または非存在下でｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１を発現するレンチウイルス（ｄＣ−Ｔ）に３日間感染させたＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣの蛍光画像を示す。スケールバー：１２０ｕｍ。図９Ｃは、スクランブルｇＲＮＡ、またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする４つのｇＲＮＡと、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とを発現するレンチウイルスに３日間感染後のＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。列記された式によって活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ二重陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。図９Ｄは、ｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＤａｚｌ−ＳｎｒｐｎマウスＥＳ細胞をＦＡＣＳで選別後のＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ＋細胞集団またはＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ−細胞集団におけるＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ領域のバイサルファイトシーケンシングを示す。図９Ｅは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ遺伝子座のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。Ｇａｐｄｈ配列は小文字であり、Ｓｎｒｐｎ配列は大文字である。図９Ｆは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ（ｄＣ−Ｄ）及びＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする３つのｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染３日後のＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。列記された式によって不活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ陽性及びＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。図９Ｇは、ｄＣ−Ｄ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＧａｐｄｈ−ＳｎｒｐｎマウスＥＳ細胞をＦＡＣＳで選別後のＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ＋細胞集団またはＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ−細胞集団におけるＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ領域のバイサルファイトシーケンシングを示す。図９Ｈは、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａカセットを安定的に組み込んだｍＥＳＣを、４８時間のドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）処理後にＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図９Ｉは、ドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｆと同様に３つのｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに３日間感染後の、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａを有するＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。下部に示すように不活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ陽性及びＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤで���した。図９Ｊ、左パネル：ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ構築物及びｇＲＮＡ−Ｃｈｅｒｒｙ構築物の模式図を示す。中央のパネル：ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染後のＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのＦＡＣＳ分析によるＢＦＰのみ陽性細胞集団、Ｃｈｅｒｒｙのみ陽性細胞集団、及び二重陽性細胞集団の比率を示す。右パネル：ＢＦＰ＋；Ｃｈｅｒｒｙ＋細胞集団のうちのＧＦＰ−またはＧＦＰ＋細胞の比率のＦＡＣＳ分析を示す。
【図９−２】図９Ａ〜図９Ｊは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によりＤａｚｌｅ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターを活性化し、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによりＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターを抑制する、標的化プロモーターのメチル化編集を示す。図９Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ遺伝子座のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。Ｄａｚｌ配列は小文字であり、Ｓｎｒｐｎ配列は大文字である。図９Ｂは、Ｓｎｒｐｎプロモーターに対する標的ｇＲＮＡの存在下または非存在下でｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１を発現するレンチウイルス（ｄＣ−Ｔ）に３日間感染させたＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣの蛍光画像を示す。スケールバー：１２０ｕｍ。図９Ｃは、スクランブルｇＲＮＡ、またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする４つのｇＲＮＡと、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とを発現するレンチウイルスに３日間感染後のＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。列記された式によって活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ二重陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。図９Ｄは、ｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＤａｚｌ−ＳｎｒｐｎマウスＥＳ細胞をＦＡＣＳで選別後のＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ＋細胞集団またはＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ−細胞集団におけるＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ領域のバイサルファイトシーケンシングを示す。図９Ｅは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ遺伝子座のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。Ｇａｐｄｈ配列は小文字であり、Ｓｎｒｐｎ配列は大文字である。図９Ｆは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ（ｄＣ−Ｄ）及びＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする３つのｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染３日後のＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。列記された式によって不活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ陽性及びＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。図９Ｇは、ｄＣ−Ｄ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＧａｐｄｈ−ＳｎｒｐｎマウスＥＳ細胞をＦＡＣＳで選別後のＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ＋細胞集団またはＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ−細胞集団におけるＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ領域のバイサルファイトシーケンシングを示す。図９Ｈは、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａカセットを安定的に組み込んだｍＥＳＣを、４８時間のドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）処理後にＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図９Ｉは、ドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｆと同様に３つのｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに３日間感染後の、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａを有するＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。下部に示すように不活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ陽性及びＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤで���した。図９Ｊ、左パネル：ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ構築物及びｇＲＮＡ−Ｃｈｅｒｒｙ構築物の模式図を示す。中央のパネル：ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染後のＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのＦＡＣＳ分析によるＢＦＰのみ陽性細胞集団、Ｃｈｅｒｒｙのみ陽性細胞集団、及び二重陽性細胞集団の比率を示す。右パネル：ＢＦＰ＋；Ｃｈｅｒｒｙ＋細胞集団のうちのＧＦＰ−またはＧＦＰ＋細胞の比率のＦＡＣＳ分析を示す。
【図９−３】図９Ａ〜図９Ｊは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によりＤａｚｌｅ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターを活性化し、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによりＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターを抑制する、標的化プロモーターのメチル化編集を示す。図９Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ遺伝子座のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。Ｄａｚｌ配列は小文字であり、Ｓｎｒｐｎ配列は大文字である。図９Ｂは、Ｓｎｒｐｎプロモーターに対する標的ｇＲＮＡの存在下または非存在下でｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１を発現するレンチウイルス（ｄＣ−Ｔ）に３日間感染させたＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣの蛍光画像を示す。スケールバー：１２０ｕｍ。図９Ｃは、スクランブルｇＲＮＡ、またはＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする４つのｇＲＮＡと、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１（ｄＣ−Ｔ）とを発現するレンチウイルスに３日間感染後のＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。列記された式によって活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ二重陽性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。図９Ｄは、ｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＤａｚｌ−ＳｎｒｐｎマウスＥＳ細胞をＦＡＣＳで選別後のＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ＋細胞集団またはＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ−細胞集団におけるＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ領域のバイサルファイトシーケンシングを示す。図９Ｅは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ遺伝子座のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。Ｇａｐｄｈ配列は小文字であり、Ｓｎｒｐｎ配列は大文字である。図９Ｆは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ（ｄＣ−Ｄ）及びＳｎｒｐｎプロモーター領域を標的とする３つのｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染３日後のＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。列記された式によって不活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ陽性及びＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤとして示した。図９Ｇは、ｄＣ−Ｄ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させたＧａｐｄｈ−ＳｎｒｐｎマウスＥＳ細胞をＦＡＣＳで選別後のＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ＋細胞集団またはＣｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ−細胞集団におけるＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ領域のバイサルファイトシーケンシングを示す。図９Ｈは、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａカセットを安定的に組み込んだｍＥＳＣを、４８時間のドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）処理後にＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図９Ｉは、ドキシサイクリン（２ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｆと同様に３つのｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに３日間感染後の、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａを有するＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。下部に示すように不活性化効率を算出し、２つの生物学的複製物のＣｈｅｒｒｙ陽性及びＧＦＰ陰性細胞の平均比率±ＳＤで���した。図９Ｊ、左パネル：ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ構築物及びｇＲＮＡ−Ｃｈｅｒｒｙ構築物の模式図を示す。中央のパネル：ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染後のＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳＣのＦＡＣＳ分析によるＢＦＰのみ陽性細胞集団、Ｃｈｅｒｒｙのみ陽性細胞集団、及び二重陽性細胞集団の比率を示す。右パネル：ＢＦＰ＋；Ｃｈｅｒｒｙ＋細胞集団のうちのＧＦＰ−またはＧＦＰ＋細胞の比率のＦＡＣＳ分析を示す。
【図１０−１】図１０Ａ〜図１０Ｇは、ＴＡＬＥ系とｄＣａｓ９系のメチル化編集の比較を示す。図１０Ａは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ及び１つのｐ１６標的ｇＲＮＡ（Ｃｈｅｒｒｙ）、またはＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａ−ＧＦＰをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合を示す。トランスフェクション陽性細胞集団（ｃｈｅｒｒｙ＋）または（ＧＦＰ＋）をトランスフェクションの４８時間後にＦＡＣＳで選別した。ｐ１６プロモーター領域の各個々のＣｐＧのメチル化レベルをバイサルファイトシーケンシングにより分析した。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａについて配列決定された合計３４の単一コロニー、及びＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａについて配列決定された３１の単一コロニーを有する２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤを示す。赤の矢印は、ｐ１６標的ｇＲＮＡの位置を示し、紫の矢印は、ＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａに対する結合部位を示す。図１０Ｂは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及び１つのＲＨＯＸＦ２標的ｇＲＮＡ（ｐｕｒｏカセットを含む）、またはプラスミドを発現するｐｕｒｏカセットを含むＴＡＬＥ−Ｔｅｔ１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした場合を示す。ピューロマイシン（２ｕｇ／ｍｌ）を培地に添加してトランスフェクション陽性細胞を選別した。選別の２日後に細胞を採取し、バイサルファイトシーケンシングによって、ＲＨＯＸＦ２プロモーター領域の個々のＣｐＧについてメチル化レベルを分析した。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１について配列決定された合計３４の単一コロニー、及びＴＡＬＥ−Ｔｅｔ１について配列決定された３８の単一コロニーを有する２つの生物学的複製物の平均パーセンテージ±ＳＤを示す。赤の矢印は、ＲＨＯＸＦ２標的ｇＲＮＡの位置を示し、紫の矢印は、ＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａに対する結合部位を示す。図１０Ｃは、Ａ及びＢでのメチル化レベル分析のまとめを示す。有効範囲は、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ１によって有意に編集された（１０％を超えるメチル化の変化）ＣｐＧのｇＲＮＡ標的部位からの距離によって決定した。分解能は１つの単一ｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ１の有効範囲で規定し、分解能が高いほど、ＤＮＡメチル化の正確な編集が可能となるｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ１の有効範囲が狭いことを指す。図１０Ｄは、図９Ｈに記載のＤｏｘ誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ発現マウスＥＳ細胞を、スクランブルｇＲＮＡまたはｍｉＲ２９０遺伝子座もしくはＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡに感染させた場合を示す。ＦＡＣＳで選別したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＤｏｘ（２ｕｇ／ｍｌ）と３日間培養した。その後、この細胞を回収して抗ｄＣａｓ９  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析を行った。以前に記載されているペアワイズピークコール手順（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を用いてピークコールし、ゲノムワイドなＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを表すマンハッタンプロットで示した。ｐ＜０．００１のピークがすべて示されている。各ドットはピークを表し、Ｘ軸はゲノム位置を示し、Ｙ軸はＭｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ（ＭＡＣＳ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）によって出力されるピーク頂点高さを示す。各ドットの大きさ���Ｙ軸の値に比例し、個々の染色体は可視化のために色分けされている。図１０Ｅは、シグナルのレベルが最大となる標的遺伝子座（ｍｉＲ２９０またはＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ）、ならびに２番目及び３番目にシグナルが大きい２つのオフターゲット遺伝子座（ｍｉＲ２９０  ｇＲＮＡではＶａｃ１４及びＴｅｎｍ４遺伝子座；Ｄａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ  ｇＲＮＡではＶｒｋ１及びＧｍ４２６１９遺伝子座）におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを以下に列挙する近接遺伝子と共に図示する。なお、４つのＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ  ｇＲＮＡは、図９Ａに記載するＤａｚｌ及びＳｎｒｐｎのプロモーター配列を認識するため、このグループのｇＲＮＡのピークを両方の遺伝子座にマッピングした。図１０Ｆは、図５Ｃで使用した細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｖａｃ１４及びＴｅｎｍ４遺伝子座のオフターゲット結合部位についてバイサルファイトシーケンシングにかけた場合を示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図１０Ｇは、図１Ｄ及び図２Ｃで使用した細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｖｒｋ１及びＧｍ４２６１９遺伝子座のオフターゲット結合部位についてバイサルファイトシーケンシングにかけた場合を示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図１０−２】図１０Ａ〜図１０Ｇは、ＴＡＬＥ系とｄＣａｓ９系のメチル化編集の比較を示す。図１０Ａは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ及び１つのｐ１６標的ｇＲＮＡ（Ｃｈｅｒｒｙ）、またはＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａ−ＧＦＰをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合を示す。トランスフェクション陽性細胞集団（ｃｈｅｒｒｙ＋）または（ＧＦＰ＋）をトランスフェクションの４８時間後にＦＡＣＳで選別した。ｐ１６プロモーター領域の各個々のＣｐＧのメチル化レベルをバイサルファイトシーケンシングにより分析した。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａについて配列決定された合計３４の単一コロニー、及びＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａについて配列決定された３１の単一コロニーを有する２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤを示す。赤の矢印は、ｐ１６標的ｇＲＮＡの位置を示し、紫の矢印は、ＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａに対する結合部位を示す。図１０Ｂは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及び１つのＲＨＯＸＦ２標的ｇＲＮＡ（ｐｕｒｏカセットを含む）、またはプラスミドを発現するｐｕｒｏカセットを含むＴＡＬＥ−Ｔｅｔ１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした場合を示す。ピューロマイシン（２ｕｇ／ｍｌ）を培地に添加してトランスフェクション陽性細胞を選別した。選別の２日後に細胞を採取し、バイサルファイトシーケンシングによって、ＲＨＯＸＦ２プロモーター領域の個々のＣｐＧについてメチル化レベルを分析した。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１について配列決定された合計３４の単一コロニー、及びＴＡＬＥ−Ｔｅｔ１について配列決定された３８の単一コロニーを有する２つの生物学的複製物の平均パーセンテージ±ＳＤを示す。赤の矢印は、ＲＨＯＸＦ２標的ｇＲＮＡの位置を示し、紫の矢印は、ＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａに対する結合部位を示す。図１０Ｃは、Ａ及びＢでのメチル化レベル分析のまとめを示す。有効範囲は、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ１によって有意に編集された（１０％を超えるメチル化の変化）ＣｐＧのｇＲＮＡ標的部位からの距離によって決定した。分解能は１つの単一ｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ１の有効範囲で規定し、分解能が高いほど、ＤＮＡメチル化の正確な編集が可能となるｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ１の有効範囲が狭いことを指す。図１０Ｄは、図９Ｈに記載のＤｏｘ誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ発現マウスＥＳ細胞を、スクランブルｇＲＮＡまたはｍｉＲ２９０遺伝子座もしくはＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡに感染させた場合を示す。ＦＡＣＳで選別したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＤｏｘ（２ｕｇ／ｍｌ）と３日間培養した。その後、この細胞を回収して抗ｄＣａｓ９  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析を行った。以前に記載されているペアワイズピークコール手順（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を用いてピークコールし、ゲノムワイドなＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを表すマンハッタンプロットで示した。ｐ＜０．００１のピークがすべて示されている。各ドットはピークを表し、Ｘ軸はゲノム位置を示し、Ｙ軸はＭｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ（ＭＡＣＳ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）によって出力されるピーク頂点高さを示す。各ドットの大きさ���Ｙ軸の値に比例し、個々の染色体は可視化のために色分けされている。図１０Ｅは、シグナルのレベルが最大となる標的遺伝子座（ｍｉＲ２９０またはＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ）、ならびに２番目及び３番目にシグナルが大きい２つのオフターゲット遺伝子座（ｍｉＲ２９０  ｇＲＮＡではＶａｃ１４及びＴｅｎｍ４遺伝子座；Ｄａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ  ｇＲＮＡではＶｒｋ１及びＧｍ４２６１９遺伝子座）におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを以下に列挙する近接遺伝子と共に図示する。なお、４つのＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ  ｇＲＮＡは、図９Ａに記載するＤａｚｌ及びＳｎｒｐｎのプロモーター配列を認識するため、このグループのｇＲＮＡのピークを両方の遺伝子座にマッピングした。図１０Ｆは、図５Ｃで使用した細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｖａｃ１４及びＴｅｎｍ４遺伝子座のオフターゲット結合部位についてバイサルファイトシーケンシングにかけた場合を示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。図１０Ｇは、図１Ｄ及び図２Ｃで使用した細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｖｒｋ１及びＧｍ４２６１９遺伝子座のオフターゲット結合部位についてバイサルファイトシーケンシングにかけた場合を示す。２つの生物学的複製物の平均比率±ＳＤとして示す。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｌは、ニューロンにおける、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化を示す。図１１Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。図１１Ｂ、左パネル：ＢＤＮＦ発現を調べるための、Ｅ１７．５マウス初代皮質ニューロンに対するＫＣｌ処理及びレンチウイルス送達実験を表す模式図を示す。なお、培養ニューロンは、グリア細胞及び神経前駆細胞における細胞分裂を停止させるために、ＤＩＶ２にＡｒａＣで処理した。右パネル：ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを５０ｍＭのＫＣｌで処理し、異なる時点で採取して、ＲＴ−ｑＰＣＲによるＢＤＮＦ発現分析を行った場合を示す。図１１Ｃは、２４時間のＫＣｌ処理過程にわたるマウス初代ニューロンのＥＤＵ標識分析を示す。ＥＤＵ陽性細胞が極少数しか観察されなかったことがわかる。ＥＤＵは赤、ＭＡＰ２は緑、核はＤＡＰＩで染色されている。スケールバー：５００ｕｍ。図１１Ｄ、上段パネル：ＫＣｌ処理過程にわたるニューロン密度の定量化を示す。有糸分裂後のニューロン密度は、時間が経過しても着実に約４．５×１０４／ｃｍ２付近を維持している。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。下段パネル：ＫＣｌ処理過程にわたるＥＤＵ陽性細胞の定量化を示す。２４時間にわたりＥＤＵ陽性の細胞は２％未満である。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｅは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１の異所性発現、及びＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする４つのｇＲＮＡのセットによるＢＤＮＦ誘導の共焦点顕微鏡写真を示す。ＢＤＮＦは緑、ＭＡＰ２はマゼンタ、Ｃｈｅｒｒｙは赤、ＤＡＰＩは青で染色されている。なお、これらのニューロンでのレンチウイルス感染効率はほぼ１００％である。スケールバー：５０ｕｍ。図１１Ｆは、Ｂ及びＥから採取したニューロンを、Ｎｐａｓ４発現についてＲＴ−ｑＰＣＲ分析にかけた場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｇは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを、ｄＣ−Ｔ単独で、またはＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする４つのｇＲＮＡもしくは個々のＢＤＮＦのｇＲＮＡと同時に感染させた後、ＢＤＮＦ発現についてｑＰＣＲ分析にかけた場合を示す。図１１Ｈ〜１１Ｉは、ニューロンのＴｅｔ支援型バイサルファイトシーケンシング（ＴＡＢ−Ｓｅｑ）分析を示す。図１１Ｈは、ｄＣ−Ｔ、またはｄＣ−ｄＴと４つのＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに、４０時間及び６０時間感染させたニューロンであり、図１１Ｉは６時間のＫＣｌ処理後のニューロンである。図１１Ｊは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンをＡＢＴ（５０ｕＭ）で６時間処理し、次いでＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理した後に採取し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｋは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを２−ヒドロキシグルタル酸（１０ｍＭ）で２時間処理し、次いでＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理した後に採取し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｌは、野生���またはＴｅｔ１ノックアウトＥ１７．５胚に由来するＤＩＶ３マウス皮質ニューロンに、経時的なＫＣｌ処理実験（６時間、９時間、及び１２時間）を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｌは、ニューロンにおける、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化を示す。図１１Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。図１１Ｂ、左パネル：ＢＤＮＦ発現を調べるための、Ｅ１７．５マウス初代皮質ニューロンに対するＫＣｌ処理及びレンチウイルス送達実験を表す模式図を示す。なお、培養ニューロンは、グリア細胞及び神経前駆細胞における細胞分裂を停止させるために、ＤＩＶ２にＡｒａＣで処理した。右パネル：ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを５０ｍＭのＫＣｌで処理し、異なる時点で採取して、ＲＴ−ｑＰＣＲによるＢＤＮＦ発現分析を行った場合を示す。図１１Ｃは、２４時間のＫＣｌ処理過程にわたるマウス初代ニューロンのＥＤＵ標識分析を示す。ＥＤＵ陽性細胞が極少数しか観察されなかったことがわかる。ＥＤＵは赤、ＭＡＰ２は緑、核はＤＡＰＩで染色されている。スケールバー：５００ｕｍ。図１１Ｄ、上段パネル：ＫＣｌ処理過程にわたるニューロン密度の定量化を示す。有糸分裂後のニューロン密度は、時間が経過しても着実に約４．５×１０４／ｃｍ２付近を維持している。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。下段パネル：ＫＣｌ処理過程にわたるＥＤＵ陽性細胞の定量化を示す。２４時間にわたりＥＤＵ陽性の細胞は２％未満である。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｅは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１の異所性発現、及びＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする４つのｇＲＮＡのセットによるＢＤＮＦ誘導の共焦点顕微鏡写真を示す。ＢＤＮＦは緑、ＭＡＰ２はマゼンタ、Ｃｈｅｒｒｙは赤、ＤＡＰＩは青で染色されている。なお、これらのニューロンでのレンチウイルス感染効率はほぼ１００％である。スケールバー：５０ｕｍ。図１１Ｆは、Ｂ及びＥから採取したニューロンを、Ｎｐａｓ４発現についてＲＴ−ｑＰＣＲ分析にかけた場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｇは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを、ｄＣ−Ｔ単独で、またはＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする４つのｇＲＮＡもしくは個々のＢＤＮＦのｇＲＮＡと同時に感染させた後、ＢＤＮＦ発現についてｑＰＣＲ分析にかけた場合を示す。図１１Ｈ〜１１Ｉは、ニューロンのＴｅｔ支援型バイサルファイトシーケンシング（ＴＡＢ−Ｓｅｑ）分析を示す。図１１Ｈは、ｄＣ−Ｔ、またはｄＣ−ｄＴと４つのＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに、４０時間及び６０時間感染させたニューロンであり、図１１Ｉは６時間のＫＣｌ処理後のニューロンである。図１１Ｊは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンをＡＢＴ（５０ｕＭ）で６時間処理し、次いでＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理した後に採取し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｋは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを２−ヒドロキシグルタル酸（１０ｍＭ）で２時間処理し、次いでＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理した後に採取し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｌは、野生���またはＴｅｔ１ノックアウトＥ１７．５胚に由来するＤＩＶ３マウス皮質ニューロンに、経時的なＫＣｌ処理実験（６時間、９時間、及び１２時間）を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図１１−３】図１１Ａ〜１１Ｌは、ニューロンにおける、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化を示す。図１１Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＢＤＮＦプロモーターＩＶ領域のゲノム配列を示す。各ｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。図１１Ｂ、左パネル：ＢＤＮＦ発現を調べるための、Ｅ１７．５マウス初代皮質ニューロンに対するＫＣｌ処理及びレンチウイルス送達実験を表す模式図を示す。なお、培養ニューロンは、グリア細胞及び神経前駆細胞における細胞分裂を停止させるために、ＤＩＶ２にＡｒａＣで処理した。右パネル：ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを５０ｍＭのＫＣｌで処理し、異なる時点で採取して、ＲＴ−ｑＰＣＲによるＢＤＮＦ発現分析を行った場合を示す。図１１Ｃは、２４時間のＫＣｌ処理過程にわたるマウス初代ニューロンのＥＤＵ標識分析を示す。ＥＤＵ陽性細胞が極少数しか観察されなかったことがわかる。ＥＤＵは赤、ＭＡＰ２は緑、核はＤＡＰＩで染色されている。スケールバー：５００ｕｍ。図１１Ｄ、上段パネル：ＫＣｌ処理過程にわたるニューロン密度の定量化を示す。有糸分裂後のニューロン密度は、時間が経過しても着実に約４．５×１０４／ｃｍ２付近を維持している。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。下段パネル：ＫＣｌ処理過程にわたるＥＤＵ陽性細胞の定量化を示す。２４時間にわたりＥＤＵ陽性の細胞は２％未満である。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｅは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１の異所性発現、及びＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする４つのｇＲＮＡのセットによるＢＤＮＦ誘導の共焦点顕微鏡写真を示す。ＢＤＮＦは緑、ＭＡＰ２はマゼンタ、Ｃｈｅｒｒｙは赤、ＤＡＰＩは青で染色されている。なお、これらのニューロンでのレンチウイルス感染効率はほぼ１００％である。スケールバー：５０ｕｍ。図１１Ｆは、Ｂ及びＥから採取したニューロンを、Ｎｐａｓ４発現についてＲＴ−ｑＰＣＲ分析にかけた場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｇは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを、ｄＣ−Ｔ単独で、またはＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする４つのｇＲＮＡもしくは個々のＢＤＮＦのｇＲＮＡと同時に感染させた後、ＢＤＮＦ発現についてｑＰＣＲ分析にかけた場合を示す。図１１Ｈ〜１１Ｉは、ニューロンのＴｅｔ支援型バイサルファイトシーケンシング（ＴＡＢ−Ｓｅｑ）分析を示す。図１１Ｈは、ｄＣ−Ｔ、またはｄＣ−ｄＴと４つのＢＤＮＦ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに、４０時間及び６０時間感染させたニューロンであり、図１１Ｉは６時間のＫＣｌ処理後のニューロンである。図１１Ｊは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンをＡＢＴ（５０ｕＭ）で６時間処理し、次いでＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理した後に採取し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｋは、ＤＩＶ３マウス皮質ニューロンを２−ヒドロキシグルタル酸（１０ｍＭ）で２時間処理し、次いでＫＣｌ（５０ｍＭ）で６時間処理した後に採取し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１１Ｌは、野生���またはＴｅｔ１ノックアウトＥ１７．５胚に由来するＤＩＶ３マウス皮質ニューロンに、経時的なＫＣｌ処理実験（６時間、９時間、及び１２時間）を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｊは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化、及び線維芽細胞から筋芽細胞への変換について示す。図１２Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＭｙｏＤ遠位エンハンサー領域のゲノム配列を示す。各ｓｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。図１２Ｂは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイの実験スキームを示す。簡潔には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種した後、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及び標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを感染させた。感染から２４時間後、細胞を必要に応じて５−アザシチジン（１ｕＭ）で２４時間処理し（赤色で標識）、１日置きに培地を変更しながら異なる時点で（１４日、１６日、及び２５日。濃青色で標識）採取し、免疫蛍光染色した。スケールバー：１００ｕｍ。図１２Ｃは、５−アザ処理後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞での筋管形成の代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。上段パネル：クローン領域に、まばらに分布する中小規模の筋管が含まれることを示している。中段パネル：クローン領域に、まばらに分布する大型の筋管が含まれることを示している。下段パネル：クローン領域に、大きさが不均一な高密度の筋管が含まれることを示している。ＭＨＣは緑、ＭｙｏＤは赤、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図１２Ｄは、５−アザ処理後の異なる時点での、ＭｙｏＤを発現するモックＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の比率を示す。ＭｙｏＤを発現する細胞の比率は、１４日目の約６％から１６日目には約１３％に増加し、２５日目には約２０％に達した。バーは平均±ＳＤを表す。図１２Ｅは、ＭＨＣ＋細胞クラスター内の核数を示す（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数１〜２及び＞２で分類）。５−アザ処理の時点から遅くなるほど、大きな筋管の形成が観察された。バーは平均±ＳＤを表す。図１２Ｄ及び図１２Ｅのデータは、群ごとに３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。図１２Ｆは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、ｄＣ−ＴとＭｙｏＤ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２４時間感染させ、５−アザで４８時間処理して、または処理せずに採取し、ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１２Ｇは、図１２Ｂに記載の線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイにおける、ｄＣ−Ｔ、及びＤＭＲ−５（ＭｙｏＤ遠位エンハンサー）を標的とするｇＲＮＡを発現するレンチウイルスによる感染１６日後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の代表的な画像を示す。ｄＣ−Ｔ及び標的ｇＲＮＡを有する細胞では、（５−アザで処理した細胞と比較して）中程度のレベルのＭｙｏＤ活性化が観察されたが、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現または筋管形成は観察されなかったことがわかる。ＭＨＣはマゼンタ、ＭｙｏＤは緑、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図１２Ｈは、ｄＣ−Ｔを単独で、またはＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡと同時に発現するレンチウイルスによる感染１６日後のＭｙｏＤ陽性細胞の比率を示す。図１２Ｉは、感染１６日後のＭＨＣ＋細胞クラスター内の核数を示��（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数２〜５、６〜１０、１１〜２０、及び＞２０で分類）。５−アザで処理した場合、ｇＲＮＡとｄＣ−Ｔとの同時発現は、モック対照またはｄＣ−Ｔ単独と比較して、より成熟した大きなＭＨＣ＋クラスターの形成を有意に促進した。図１２Ｊは、感染１６日後に２超または５超の核を有するＭＨＣ陽性クラスターの筋管密度を示す。５−アザの添加はＭＨＣ＋筋管形成を誘導する。ｄＣ−ＴとｇＲＮＡとの同時発現は、核数が多く大きな筋管（核が５超であるＭＨＣ＋クラスター）を有意に誘導する。図１２Ｈ〜図１２Ｊのデータは、３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。バーは平均±ＳＤを表す。
【図１２−２】図１２Ａ〜１２Ｊは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化、及び線維芽細胞から筋芽細胞への変換について示す。図１２Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＭｙｏＤ遠位エンハンサー領域のゲノム配列を示す。各ｓｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。図１２Ｂは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイの実験スキームを示す。簡潔には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種した後、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及び標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを感染させた。感染から２４時間後、細胞を必要に応じて５−アザシチジン（１ｕＭ）で２４時間処理し（赤色で標識）、１日置きに培地を変更しながら異なる時点で（１４日、１６日、及び２５日。濃青色で標識）採取し、免疫蛍光染色した。スケールバー：１００ｕｍ。図１２Ｃは、５−アザ処理後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞での筋管形成の代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。上段パネル：クローン領域に、まばらに分布する中小規模の筋管が含まれることを示している。中段パネル：クローン領域に、まばらに分布する大型の筋管が含まれることを示している。下段パネル：クローン領域に、大きさが不均一な高密度の筋管が含まれることを示している。ＭＨＣは緑、ＭｙｏＤは赤、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図１２Ｄは、５−アザ処理後の異なる時点での、ＭｙｏＤを発現するモックＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の比率を示す。ＭｙｏＤを発現する細胞の比率は、１４日目の約６％から１６日目には約１３％に増加し、２５日目には約２０％に達した。バーは平均±ＳＤを表す。図１２Ｅは、ＭＨＣ＋細胞クラスター内の核数を示す（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数１〜２及び＞２で分類）。５−アザ処理の時点から遅くなるほど、大きな筋管の形成が観察された。バーは平均±ＳＤを表す。図１２Ｄ及び図１２Ｅのデータは、群ごとに３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。図１２Ｆは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、ｄＣ−ＴとＭｙｏＤ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２４時間感染させ、５−アザで４８時間処理して、または処理せずに採取し、ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１２Ｇは、図１２Ｂに記載の線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイにおける、ｄＣ−Ｔ、及びＤＭＲ−５（ＭｙｏＤ遠位エンハンサー）を標的とするｇＲＮＡを発現するレンチウイルスによる感染１６日後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の代表的な画像を示す。ｄＣ−Ｔ及び標的ｇＲＮＡを有する細胞では、（５−アザで処理した細胞と比較して）中程度のレベルのＭｙｏＤ活性化が観察されたが、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現または筋管形成は観察されなかったことがわかる。ＭＨＣはマゼンタ、ＭｙｏＤは緑、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図１２Ｈは、ｄＣ−Ｔを単独で、またはＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡと同時に発現するレンチウイルスによる感染１６日後のＭｙｏＤ陽性細胞の比率を示す。図１２Ｉは、感染１６日後のＭＨＣ＋細胞クラスター内の核数を示��（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数２〜５、６〜１０、１１〜２０、及び＞２０で分類）。５−アザで処理した場合、ｇＲＮＡとｄＣ−Ｔとの同時発現は、モック対照またはｄＣ−Ｔ単独と比較して、より成熟した大きなＭＨＣ＋クラスターの形成を有意に促進した。図１２Ｊは、感染１６日後に２超または５超の核を有するＭＨＣ陽性クラスターの筋管密度を示す。５−アザの添加はＭＨＣ＋筋管形成を誘導する。ｄＣ−ＴとｇＲＮＡとの同時発現は、核数が多く大きな筋管（核が５超であるＭＨＣ＋クラスター）を有意に誘導する。図１２Ｈ〜図１２Ｊのデータは、３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。バーは平均±ＳＤを表す。
【図１２−３】図１２Ａ〜１２Ｊは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化、及び線維芽細胞から筋芽細胞への変換について示す。図１２Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＭｙｏＤ遠位エンハンサー領域のゲノム配列を示す。各ｓｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示されている。図１２Ｂは、線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイの実験スキームを示す。簡潔には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種した後、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及び標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを感染させた。感染から２４時間後、細胞を必要に応じて５−アザシチジン（１ｕＭ）で２４時間処理し（赤色で標識）、１日置きに培地を変更しながら異なる時点で（１４日、１６日、及び２５日。濃青色で標識）採取し、免疫蛍光染色した。スケールバー：１００ｕｍ。図１２Ｃは、５−アザ処理後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞での筋管形成の代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。上段パネル：クローン領域に、まばらに分布する中小規模の筋管が含まれることを示している。中段パネル：クローン領域に、まばらに分布する大型の筋管が含まれることを示している。下段パネル：クローン領域に、大きさが不均一な高密度の筋管が含まれることを示している。ＭＨＣは緑、ＭｙｏＤは赤、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図１２Ｄは、５−アザ処理後の異なる時点での、ＭｙｏＤを発現するモックＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の比率を示す。ＭｙｏＤを発現する細胞の比率は、１４日目の約６％から１６日目には約１３％に増加し、２５日目には約２０％に達した。バーは平均±ＳＤを表す。図１２Ｅは、ＭＨＣ＋細胞クラスター内の核数を示す（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数１〜２及び＞２で分類）。５−アザ処理の時点から遅くなるほど、大きな筋管の形成が観察された。バーは平均±ＳＤを表す。図１２Ｄ及び図１２Ｅのデータは、群ごとに３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。図１２Ｆは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、ｄＣ−ＴとＭｙｏＤ  ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに２４時間感染させ、５−アザで４８時間処理して、または処理せずに採取し、ｑＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。図１２Ｇは、図１２Ｂに記載の線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイにおける、ｄＣ−Ｔ、及びＤＭＲ−５（ＭｙｏＤ遠位エンハンサー）を標的とするｇＲＮＡを発現するレンチウイルスによる感染１６日後のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の代表的な画像を示す。ｄＣ−Ｔ及び標的ｇＲＮＡを有する細胞では、（５−アザで処理した細胞と比較して）中程度のレベルのＭｙｏＤ活性化が観察されたが、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現または筋管形成は観察されなかったことがわかる。ＭＨＣはマゼンタ、ＭｙｏＤは緑、ＤＡＰＩは青に染色されている。スケールバー：２００ｕｍ。図１２Ｈは、ｄＣ−Ｔを単独で、またはＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡと同時に発現するレンチウイルスによる感染１６日後のＭｙｏＤ陽性細胞の比率を示す。図１２Ｉは、感染１６日後のＭＨＣ＋細胞クラスター内の核数を示��（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数２〜５、６〜１０、１１〜２０、及び＞２０で分類）。５−アザで処理した場合、ｇＲＮＡとｄＣ−Ｔとの同時発現は、モック対照またはｄＣ−Ｔ単独と比較して、より成熟した大きなＭＨＣ＋クラスターの形成を有意に促進した。図１２Ｊは、感染１６日後に２超または５超の核を有するＭＨＣ陽性クラスターの筋管密度を示す。５−アザの添加はＭＨＣ＋筋管形成を誘導する。ｄＣ−ＴとｇＲＮＡとの同時発現は、核数が多く大きな筋管（核が５超であるＭＨＣ＋クラスター）を有意に誘導する。図１２Ｈ〜図１２Ｊのデータは、３〜５枚の代表的な画像から定量化したものである。バーは平均±ＳＤを表す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、ｍｉＲ２９０及びＰｏｕ５ｆ１遺伝子座のＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化のためのｇＲＮＡ設計を示す。図１３Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＣＴＣＦ標的１領域（ｍｉＲ２９０遺伝子座）のゲノム配列を示す。各ｓｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示され、予測されるＣＴＣＦ結合モチーフは青枠で強調表示されている。図１３Ｂは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＣＴＣＦ標的２領域（Ｈ２Ｑ１０−Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子座）のゲノム配列を示す。各ｓｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示され、予測されるＣＴＣＦ結合モチーフは青枠で強調表示されている。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、ｍｉＲ２９０及びＰｏｕ５ｆ１遺伝子座のＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化のためのｇＲＮＡ設計を示す。図１３Ａは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＣＴＣＦ標的１領域（ｍｉＲ２９０遺伝子座）のゲノム配列を示す。各ｓｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示され、予測されるＣＴＣＦ結合モチーフは青枠で強調表示されている。図１３Ｂは、ｇＲＮＡ配列を黄色で、及びＣｐＧを緑色で標識したＣＴＣＦ標的２領域（Ｈ２Ｑ１０−Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子座）のゲノム配列を示す。各ｓｇＲＮＡのＰＡＭは赤枠で強調表示され、予測されるＣＴＣＦ結合モチーフは青枠で強調表示されている。
【図１４−１】図１４Ａ〜図１４Ｆは、マウス皮膚細胞における、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１媒介脱メチル化によるＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔレポーターの活性化を示す。図１４Ａは、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス線維芽細胞において、サイレンシングされたＧＦＰレポーターをｅｘ  ｖｉｖｏ活性化する実験手順を表す模式図を示す。培養した線維芽細胞をｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターに感染させて、Ｓｎｒｐｎプロモーターを脱メチル化し、ＧＦＰレポーターを活性化した。図１４Ｂは、感染したＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス線維芽細胞のＦＡＣＳ分析を示す。図１４Ｃは、図１４ＢのＣｈｅｒｒｙ陽性細胞集団のうち、ＧＦＰ＋細胞の比率の定量化を示す。図１４Ｄは、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス腹側の各部位へのレンチウイルス送達法を表す模式図を示す。図１４Ｅは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｓｃ  ｇＲＮＡ、不活性形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡ、ならびにｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡに感染させたＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス皮膚についての代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。矢頭は、ｄＣ−ＴとＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡの組み合わせのみがＧＦＰ発現を活性化したことを示す。なお、表皮の左端に赤い自己蛍光がみられる。図１４Ｆは、ＧＦＰ発現を活性化するｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡがレンチウイルスで送達された毛包の代表的な２枚の共焦点顕微鏡写真を示す。
【図１４−２】図１４Ａ〜図１４Ｆは、マウス皮膚細胞における、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１媒介脱メチル化によるＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔレポーターの活性化を示す。図１４Ａは、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス線維芽細胞において、サイレンシングされたＧＦＰレポーターをｅｘ  ｖｉｖｏ活性化する実験手順を表す模式図を示す。培養した線維芽細胞をｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターに感染させて、Ｓｎｒｐｎプロモーターを脱メチル化し、ＧＦＰレポーターを活性化した。図１４Ｂは、感染したＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス線維芽細胞のＦＡＣＳ分析を示す。図１４Ｃは、図１４ＢのＣｈｅｒｒｙ陽性細胞集団のうち、ＧＦＰ＋細胞の比率の定量化を示す。図１４Ｄは、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス腹側の各部位へのレンチウイルス送達法を表す模式図を示す。図１４Ｅは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｓｃ  ｇＲＮＡ、不活性形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡ、ならびにｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡに感染させたＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔマウス皮膚についての代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。矢頭は、ｄＣ−ＴとＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡの組み合わせのみがＧＦＰ発現を活性化したことを示す。なお、表皮の左端に赤い自己蛍光がみられる。図１４Ｆは、ＧＦＰ発現を活性化するｄＣ−Ｔ及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡがレンチウイルスで送達された毛包の代表的な２枚の共焦点顕微鏡写真を示す。
【図１５】細胞型の様々な例を示す。
【図１６】ＤＮＡのメチル化を示す。
【図１７】ＤＮＡのメチル化及びＤＮＡメチル化の逆転を含むＤＮＡメチル化サイクルを示す。
【図１８】ヒト組織のＤＮＡメチル化マップの例を示す。
【図１９−１】図１９Ａ〜図１９Ｅは、メチル化活性及び脱メチル化活性の概要を示す。図１９Ａは、Ｄａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターの脱メチル化及びＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターのメチル化を示す。図１９Ｂは、ＢＤＮＦを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化を示す。図１９Ｃは、筋細胞分化転換を促進する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化を示す。図１９Ｄは、ＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図１９Ｅは、サイレンシングされたＧＦＰレポーターを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるｉｎ  ｖｉｖｏでの標的化されたＤＮＡメチル化編集を示す。
【図１９−２】図１９Ａ〜図１９Ｅは、メチル化活性及び脱メチル化活性の概要を示す。図１９Ａは、Ｄａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターの脱メチル化及びＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターのメチル化を示す。図１９Ｂは、ＢＤＮＦを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化を示す。図１９Ｃは、筋細胞分化転換を促進する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化を示す。図１９Ｄは、ＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図１９Ｅは、サイレンシングされたＧＦＰレポーターを活性化する、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるｉｎ  ｖｉｖｏでの標的化されたＤＮＡメチル化編集を示す。
【図２０】脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ−１の高メチル化の逆転を示す。脆弱Ｘ症候群を発現する細胞をｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１融合タンパク質と接触させて、ＣＣＧの高メチル化を特異的に脱メチル化し、ＦＭＲ−１を再活性化する。
【図２１】有糸分裂後ニューロンに作用するＢＤＮＦの脱メチル化案を示す。
【図２２】ｄＣ−Ｔ単独を発現するレンチウイルス、ｄＣ−Ｔと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、及びｄＣ−ｄＴと標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスによる感染後のＭｙｏＤ陽性細胞比の定量化を示す。
【図２３−１】図２３Ａ〜図２３ＣはＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図２３Ａは染色体の三次元構造を示す。図２３Ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、野生型細胞及びＣＴＣＦ部位欠失細胞における記載した遺伝子の遺伝子発現レベルを示す。図２３Ｃは、Ｃの細胞を用いて抗ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰ実験を行い、続いて定量ＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【図２３−２】図２３Ａ〜図２３ＣはＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化を示す。図２３Ａは染色体の三次元構造を示す。図２３Ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、野生型細胞及びＣＴＣＦ部位欠失細胞における記載した遺伝子の遺伝子発現レベルを示す。図２３Ｃは、Ｃの細胞を用いて抗ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰ実験を行い、続いて定量ＰＣＲ分析を行った場合を示す。バーは３つの実験複製物の平均±ＳＤを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の実施には通常、特に記載のない限り、当技術分野の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来技術を用いることになる。これらの技術のうちのいくつかに関する非限定的な説明は以下の刊行物：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、すべてＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００８年１２月現在の版；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５に記載されている。治療薬及びヒト疾患に関する非限定的な情報は、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１ｔｈ  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，２００５、Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．（ｅｄ．）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ；１０ｔｈ  ｅｄ．（２００６）または１１ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  ２００９）に記載されている。遺伝子及び遺伝性障害に関する非限定的な情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．：Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ．Ａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８（１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、または最新のオンラインデータベース：Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ，ＯＭＩＭ（商標）．ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、２０１０年５月１日現在、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．��ｏｖ／ｏｍｉｍ／、ならびに（ヒト及びマウス以外の）動物種の遺伝子、遺伝性障害、及び形質に関するデータベース、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＯＭＩＡ）、ｏｍｉａ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕ／ｃｏｎｔａｃｔ．ｓｈｔｍｌに記載されている。本明細書で言及するすべての特許、特許出願、及びその他の刊行物（例えば、科学論文、書籍、ウェブサイト、及びデータベース）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書と任意の組み込まれた参考文献との間に矛盾がある場合、本明細書（組み込まれた参考文献に基づき得る、そのいかなる修正も含む）が優先するものとする。特に指示がない限り、本明細書では標準的な技術分野で容認されている用語の意味を使用する。本明細書では、種々の用語に関して標準的な略語を使用する。
【００３４】
一態様では、本発明は、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及び１つ以上のガイド配列を細胞に導入することを含む、細胞内の１つ以上のゲノム配列の修飾または調節方法に関する。この方法は、細胞内の１つ以上のゲノム配列の修飾を生じさせることができる。記載される方法によって単離修飾細胞を作製することができる。触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼは、１つ以上のガイド配列のそれぞれに結合でき、エフェクタードメインは、ゲノム配列のメチル化または脱メチル化（例えば、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡ脱メチル化）を調節する。１つ以上のガイド配列、触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及びエフェクタードメインを細胞、接合体、胚、または非ヒト哺乳動物に導入することができる。
【００３５】
他の態様では、本発明は、細胞内の１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法に関する。この方法は、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドをコードする核酸と細胞を接触させることを含み得る。細胞をさらにガイド配列またはガイド配列をコードする核酸と接触させる。いくつかの態様では、ガイド配列はポリペプチドを１つ以上のゲノム配列に標的化する。いくつかの実施形態では、細胞の接触には細胞への直接導入を含んでもよい。他の態様では、細胞の接触は、細胞内での発現または細胞内での発現の誘導を含む。ゲノムメチル化のレポーターは、米国出願第１５／０７８，８５１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドを、細胞または対象に送達することができる様々な方法があり、例えばポリペプチドをコードする核酸の投与によるものがあり、核酸は例えばウイルスベクターであっても、または翻訳可能な核酸であってもよい（例えば、合成修飾ｍＲＮＡ。修飾ｍＲＮＡの例は、Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７（５）：６１８−３０，２０１０，Ｍａｎｄａｌ  ＰＫ，Ｒｏｓｓｉ  ＤＪ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  ８（３）：５６８−８２、米国特許公開第２０１２００４６３４６号及び／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２６７９（ＷＯ／２０１１／１３０６２４）に記載されている）。それ以外にも、多数のＰＣＴ及び米国出願、ならびにＭｏｄｅｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに与えられた特許、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６８６１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６３６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６１７、ＵＳＳＮ１４／３９０，１００（及び上記に記載されているその他の特許及び特許出願）に例が記載されている。また、ガイド配列を、ガイド配列をコードする核酸として送達することができる。例えば、投与は、組織もしくは器官（例えば、皮膚、心臓、肝臓、肺、腎臓、脳、眼、筋肉、骨、神経）または腫瘍への直接投与によって実施することができる。経路を問わず（例えば、経口、静脈内、腹腔内、胃管栄養、局所、経皮、筋肉内、経腸、皮下）投与でき、全身投与でも局所投与でもよく、任意の用量（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ）を含んでよく、単回投与または複数回投与を伴うものであってよい。核酸は、例えばリポソーム、ポリマー粒子（例えば、ＰＬＧＡ粒子）中に封入されていてもよい。
【００３７】
本明細書に記載の方法を使用して、体細胞、幹細胞、有糸分裂中もしくは有糸分裂後の細胞、ニューロン、線維芽細胞、または接合体を含む様々な細胞の１つ以上のゲノム配列を修飾または調節することができる。細胞、接合体、胚、または出生後の哺乳動物は、脊椎動物（例えば、哺乳動物）起源のものであり得る。いくつかの態様では、脊椎動物は哺乳動物または鳥類である。特定の例として、霊長類（例えばヒト）、齧歯類（例えばマウス、ラット）、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、またはトリ（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ）の細胞、接合体、胚、または出生後の哺乳動物が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞、接合体、胚、または出生後の哺乳動物は単離されている（例えば、単離細胞；単離接合体；単離胚）。いくつかの実施形態では、マウス細胞、マウス接合体、マウス胚、または出生後のマウス哺乳動物が使用される。いくつかの実施形態では、ラット細胞、ラット接合体、ラット胚、または出生後のラット哺乳動物が使用される。いくつかの実施形態では、ヒト細胞、ヒト接合体、またはヒト胚が使用される。本明細書に記載の方法を使用して、哺乳動物（例えば、マウス）の１つ以上のゲノム配列をｉｎ  ｖｉｖｏで修飾または調節する（例えば、ゲノム配列をメチル化または脱メチル化する）ことができる。
【００３８】
幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、少能性幹細胞、及び単能性幹細胞を含み得る。幹細胞の具体例として、胚性幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる（例えば、米国公開出願第２０１０／０１４４０３１号、同第２０１１／００７６６７８号、同第２０１１／００８８１０７号、同第２０１２／００２８８２１号を参照。すべて参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
体細胞は、動物から新たに単離されたものなどの初代細胞（不死化されていない細胞）であっても、または培養液中での持続増殖（例えば、３か月以上）が可能な細胞株もしくは無限増殖が可能な細胞株（不死化細胞）から誘導されてもよい。成体体細胞は、個体、例えばヒト対象から得て、当業者が利用可能な標準的な細胞培養プロトコールに従って培養することができる。本発明の態様に使用される体細胞には、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、または齧歯類（例えば、マウス、ラット）細胞などを含む。体細胞は、様々な臓器、例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、乳房、生殖器、筋肉、血液、膀胱、腎臓、尿道及び他の泌尿器など、一般に、生きた体細胞を含む任意の器官または組織から周知の方法によって得ることができる。種々の実施形態において有用である哺乳動物体細胞として、例えば、線維芽細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵臓細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球及びＴリンパ球）、マクロファージ、単球、単核球、心筋細胞、骨格筋細胞などが挙げられる。
【００４０】
いくつかの態様では、１つ以上のガイド配列には部位特異的にＤＮＡを認識する配列を含む。例えば、ガイド配列には、部位特異的にＤＮＡを認識する、ＣＲＩＳＰＲシステムによって利用されるガイドリボ核酸（ＲＮＡ）配列、またはＴＡＬＥＮもしくはジンクフィンガーシステム内の配列を含み得る。ガイド配列には、１つ以上のゲノム配列のそれぞれの一部に相補的である部分を含み、触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼに対する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、このＲＮＡ配列はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる。
【００４１】
いくつかの態様では、単一のＲＮＡ配列は、調節または修飾されるゲノム配列のうちの１つ以上（例えばすべて）に相補的であり得る。一態様では、単一のＲＮＡは単一の標的ゲノム配列に相補的である。２つ以上の標的ゲノム配列の調節または修飾を意図する特定の態様では、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のＲＮＡ配列が導入される。その場合、ＲＮＡ配列はそれぞれ、１つの標的ゲノム配列に対して相補的（特異的）である。いくつかの態様では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のＲＮＡ配列が、同じ標的配列の異なる部分に対して相補的（特異的）である。一態様では、２つ以上のＲＮＡ配列がＤＮＡの同じ領域の異なる配列に結合する。いくつかの態様では、単一のＲＮＡ配列が、ゲノム配列の少なくとも２つ以上の標的（例えば、全部）に相補的である。１つ以上のゲノム配列に相補的であるＲＮＡ配列の部分及び触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼに結合するＲＮＡ配列の部分を、単一の配列または２つ（またはそれ以上）の別々の配列として、細胞、接合体、胚、または非ヒト動物へ導入できることも当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼに結合する配列はステムループを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物において遺伝子発現を修飾するために使用されるＲＮＡ配列は、天然型ＲＮＡ配列、修飾ＲＮＡ配列（例えば、修飾塩基を１つ以上含んでいるＲＮＡ配列）、合成ＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせである。本明細書で使用される場合、「修飾ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ配列への１つ以上の修飾（例えば、骨格及び／または糖への修飾）を含むＲＮＡ（例えば、非標準塩基及び／または非天然塩基を１つ以上含んでいるＲＮＡ）である。ＲＮＡの塩基を修飾する方法は当技術分野で周知されている。そのような修飾塩基の例としては、ヌクレオシドに含まれるもの、すなわち、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、シュードウリジン（Ψ）、５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、Ｎ−６メチルアデノシン、ヒポキサンチン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、及び７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）が挙げられる。なお、種々の実施形態でＲＮＡ配列中の任意の数の塩基が置換される可能性がある。さらに、異なる修飾の組み合わせを使用してよいものと理解されるべきである。
【００４３】
いくつかの態様では、ＲＮＡ配列はモルホリノである。モルホリノは通常、約２５塩基長の合成分子であり、標準的な核酸塩基対によってＲＮＡの相補的配列に結合する。モルホリノは標準的な核酸塩基を有するが、その塩基はデオキシリボース環ではなくモルホリン環に結合しており、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基を介して結合している。モルホリノは、多くのアンチセンス構造型（例えば、ホスホロチオエート、ｓｉＲＮＡ）とは異なり、その標的ＲＮＡ分子を分解しない。代わりに、モルホリノは立体障害性によって作用し、ＲＮＡ内の標的配列に結合して、本来であればＲＮＡと相互作用できる分子を遮断する。
【００４４】
各ＲＮＡ配列の長さは、約８塩基対（ｂｐ）〜約２００ｂｐまでと多様であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列の長さは、約９〜約１９０ｂｐ、約１０〜約１５０ｂｐ、約１５〜約１２０ｂｐ、約２０〜約１００ｂｐ、約３０〜約９０ｂｐ、約４０〜約８０ｂｐ、約５０〜約７０ｂｐであり得る。
【００４５】
各ＲＮＡ配列が相補的である各ゲノム配列の部分の大きさも多様であり得る。特定の態様では、ＲＮＡが相補的である各ゲノム配列の部分は、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、８１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または１００ヌクレオチド長（連続したヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、各ＲＮＡ配列は、各ゲノム配列の一部との同一性または類似性が少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％等であり得る。いくつかの実施形態では、各ＲＮＡ配列は、各ゲノム配列と完全にまたは部分的に同一であるか、または類似している。例えば、各ＲＮＡ配列は、ゲノム配列の一部との完全な相補性が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０等のヌクレオチド単位で異なる可能性がある。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡ配列が、ゲノム配列の少なくとも約１０〜約２５（例えば、約２０）ヌクレオチドにわたって完全に相補的（１００％）である。
【００４６】
１つ以上のガイド配列（例えば、ＲＮＡ配列）は、修飾しようとする任意の様々な標的ゲノム配列の全部または一部に相補的であり得る。いくつかの態様では、標的ゲノム配列は、メチル化可変領域、エンハンサー（例えば、ＭｙｏＤ遠位エンハンサー）、プロモーター（例えば、ＢＤＮＦプロモーター）、レポーター、またはＣＴＣＦ結合部位を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの態様では、１つ以上のゲノム配列を調節する方法は、１つ以上のゲノム配列の（１つ以上の）制御領域、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；スプライシング因子）、イントロン配列、染色体領域（例えばテロメア、セントロメア）の全部または一部に相補的である１つ以上のガイド配列を細胞に導入することを含む。いくつかの態様では、ゲノム配列は、プラスミドまたは線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の全部または一部である。いくつかの態様では、１つ以上のゲノム配列が標的とする制御領域は、プロモーター、エンハンサー、及び／またはオペレーター領域である。いくつかの態様では、制御領域の全部または一部は、１つ以上のゲノム配列によって標的とされる。１つ以上のゲノム配列が標的とする領域の全部または一部は、メチル化可変領域であり得る。いくつかの態様では、メチル化可変領域は、１つ以上の遺伝子（例えば、内因性遺伝子；外因性遺伝子）または（１つ以上の）転写開始部位（ＴＳＳ）の、ちょうど約２５塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１０００塩基、１５００塩基、２０００塩基、５０００塩基、１００００塩基、２００００塩基、５００００塩基、もしくはそれ以上、上流にあるか、またはその範囲内の上流にある。いくつかの態様では、メチル化可変領域は、１つ以上の遺伝子（例えば、内因性遺伝子；外因性遺伝子）またはＴＳＳの、ちょうど約２５塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１０００塩基、１５００塩基、２０００塩基、５０００塩基、１００００塩基、２００００塩基、５００００塩基、もしくはそれ以上、下流にあるか、またはその範囲内の下流にある。当業者は理解しているであろうが、１つ以上のゲノム配列が標的とする制御領域は全体的または部分的に、遺伝子（例えば、内因性または外因性）の５’末端またはＴＳＳの位置または付近に存在することがある。遺伝子の５’末端に、非転写（フランキング）領域（例えば、プロモーターの全部または一部）及び転写領域の一部を含んでもよい。
【００４８】
当業者には明らかであろうが、１つ以上のＲＮＡ配列がさらに１つ以上の発現制御要素を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列は、細胞内での直接発現に適したプロモーターを含み、ＲＮＡ配列の一部が、その発現制御要素（複数可）に機能的に連結されている。プロモーターはウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）でも哺乳動物プロモーター（例えば、ＰＧＫプロモーター）でもよい。ＲＮＡ配列は、他の遺伝的要素、例えば転写物の発現または安定性を増強するものを含んでもよい。いくつかの実施形態では、付加的なコード領域は選択マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子）をコードする。
【００４９】
本明細書に記載されるように、１つ以上のＲＮＡ配列はまた、（１つ以上の）触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼに対する（１つ以上の）結合部位を含む。触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼは、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質であってよい。特定の態様では、１つ以上のＲＮＡ配列の１つ以上のゲノム配列へのハイブリダイゼーションの際に、触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼが１つ以上のＲＮＡ配列に結合する。
【００５０】
いくつかの態様では、１つ以上のゲノム配列を調節する方法は、細胞または接合体に導入される１つ以上のガイド配列の量（例えば、グラム、ミリグラム、マイクログラム、ナノグラム、モル、ミリモル、マイクロモル、ナノモル、化学量論量、モル比）を調整することによって１つ以上のゲノム配列の調節レベルを調整することを含む。いくつかの態様では、１つのゲノム配列の調節レベルは、同じ細胞または接合体における別のゲノム配列の調節レベルと比較して同じであるかまたは異なる。一態様では、複数のゲノム配列が調節される（例えば多重活性化）。
【００５１】
一態様では、この方法は、１つ以上の触媒不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ）核酸またはその変異体を細胞、胚、接合体、または非ヒト哺乳動物に導入することをさらに含む。いくつかの態様では、ｄＣａｓタンパク質またはその変異体は、細胞、胚、接合体、または非ヒト哺乳動物に導入される。いくつかの態様では、細胞、例えば、有糸分裂後細胞、ニューロン、線維芽細胞、幹細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）、接合体、胚、または動物に、ｄＣａｓをコードする核酸が既に取り込まれていても（構成的でも誘導的でもよい）、及び／またはｄＣａｓタンパク質が既に含まれていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、細胞、接合体、胚、または動物は、ｄＣａｓタンパク質をコードする核酸が、人為的手段を伴う工程によって導入された細胞または生物に由来するものであってもよい。
【００５２】
当技術分野で公知の種々のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子またはタンパク質を本発明の方法に使用できるが、Ｃａｓタンパク質の選択は、本方法の個々の条件（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／？ｔｅｒｍ＝ｃａｓ９）に応じて異なることになる。Ｃａｓタンパク質の具体例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９及びＣａｓ１Ｏが挙げられる。特定の態様では、本方法で使用されるＣａｓ核酸またはタンパク質はＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質は、任意の様々な原核生物種由来のものであり得る。いくつかの実施形態では、特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識する特定のＣａｓタンパク質、例えば特定のＣａｓ９タンパク質を選択することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質は、細菌または古細菌から得たものでも、または既知の方法を使用して合成したものでもよい。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に由来し得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、連鎖球菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クリプトコッカス、コリネバクテリウム、ヘモフィルス、ユーバクテリウム、パスツレラ、プレボテラ、ベイロネラ、マリノバクターに由来し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるＣａｓタンパク質または２つ以上のＣａｓタンパク質をコードする核酸を細胞、接合体、胚、または動物に導入して、例えば、同一の、類似する、または異なるＰＡＭモチーフを含む部位の認識及び修飾を可能にすることができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種またはその機能部分に由来するＣｐｆ１である。ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２タンパク質もしくはその機能部分、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６タンパク質もしくはその機能部分、またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６タンパク質もしくはその機能部分である。Ｃｐｆ１タンパク質はＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムのメンバーである。Ｃｐｆ１タンパク質は、約１３００アミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃｐｆ１はＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインのうち１つ以上を不活性化することにより生成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉドメインの１０位の残基のアミノ酸置換により、ヌクレアーゼがＤＮＡニッカーゼに変換される。例えば、１０位のアミノ酸残基のアスパラギン酸をアラニンに置換することができる（Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９−８２３）。触媒不活性なＣａｓ９タンパク質を生成する他のアミノ酸変異として、１０位の残基及び／または８４０位の残基での変異が挙げられる。１０位の残基と８４０位の残基両方での変異によって、本明細書でｄＣａｓ９と呼ばれる場合がある触媒不活性なＣａｓ９タンパク質を生成することができる。例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ  Ｃａｓ９変異体は触媒不活性である。
【００５５】
１つ以上のゲノム配列の調節には、１つ以上のエフェクタードメインの導入を含み得る。本明細書で使用される場合、「エフェクタードメイン」とは、ゲノム配列（例えば、遺伝子）の発現及び／または活性化を調節する分子（例えば、タンパク質）である。エフェクタードメインは、メチル化活性または脱メチル化活性（例えば、ＤＮＡメチル化活性またはＤＮＡ脱メチル化活性）を有することができる。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、ある遺伝子の、片方または両方の対立遺伝子を標的とする。エフェクタードメインは、核酸配列として及び／またはタンパク質として導入することができる。いくつかの態様では、エフェクタードメインは構成的または誘導的エフェクタードメインであり得る。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）核酸配列またはその変異体、及びエフェクタードメイン核酸配列は、キメラ配列として細胞に導入される。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、Ｃａｓタンパク質と会合する（例えば、結合する）分子と融合されている（例えば、エフェクター分子は、Ｃａｓタンパク質と結合する抗体またはその抗原結合断片と融合されている）。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質またはその変異体とエフェクタードメインとを融合または係留して、キメラタンパク質を作製し、キメラタンパク質として細胞に導入する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質とエフェクタードメインは、タンパク質−タンパク質相互作用として結合する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質とエフェクタードメインは共有結合している。いくつかの態様では、エフェクタードメインはＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質と非共有結合的に会合する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）核酸配列及びエフェクタードメイン核酸配列は、別々の配列及び／または別々のタンパク質として導入される。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質とエフェクタードメインは融合または係留されていない。
【００５６】
本明細書に示されるように、（１つ以上の）エフェクタードメインの全部または一部（例えば、その生物学的に活性な部分）と係留された触媒不活性な（Ｄ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）の融合により、キメラタンパク質を形成し、これを、１つ以上のＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）によって、特異的なＤＮＡ部位に誘導し、１つ以上のゲノム配列の活性及び／または発現を調節する（例えば、転写またはクロマチン構成にある一定の効果を及ぼす、または特定の種類の分子を特異的なＤＮＡ遺伝子座に組み込む、または局所的なヒストンまたはＤＮＡの状態のセンサーとして機能させる）ことができる。特定の態様では、エフェクタードメインの全部または一部と係留されたｄＣａｓ９の融合によりキメラタンパク質を形成し、これを１つ以上のＲＮＡ配列によって、特異的なＤＮＡ部位に誘導し、１つ以上のゲノム配列のメチル化または脱メチル化を調節または修飾することができる。本明細書で使用される場合、「エフェクタードメインの生物学的に活性な部分」とは、エフェクタードメインの機能を（例えば、完全に、部分的に、最小限）維持する部分（例えば、「最小」ドメインまたは「コア」ドメイン）である。Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）と１つ以上のエフェクタードメインの全部または一部との融合によりキメラタンパク質を形成した。
【００５７】
エフェクタードメインの例として、転写活性化ドメイン、補助活性化因子ドメイン、転写因子、転写一時停止の解除因子ドメイン、転写伸長の負の制御因子ドメイン、転写リプレッサードメイン、クロマチン形成因子ドメイン、再構成因子ドメイン、ヒストン修飾因子ドメイン、ＤＮＡ修飾ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、タンパク質相互作用入力装置ドメイン（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３  ’８（８）：’２６６３−２６７’  ５（２０１０））、及びタンパク質相互作用出力装置ドメイン（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３  ’８（８）：’２６６３〜２６７’  ５（２０１０））が挙げられる。本明細書で使用される場合、「タンパク質相互作用入力装置」及び「タンパク質相互作用出力装置」とはタンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）を指す。いくつかの実施形態では、ＰＰＩは、例えば小分子によってまたは光によって制御可能である。いくつかの態様では、不活性Ｃａｓタンパク質を使用して、結合パートナーをゲノム内の異なる部位に標的化する。結合パートナーが相互作用することにより、標的遺伝子座は近接する。タンパク質相互作用出力装置は、一般に（例えば、蛍光タンパク質を再構成することによって）ＰＰＩが発生したとき、または（例えば、カスパーゼタンパク質の再構成によるアポトーシスの誘導によって）特異的細胞応答を引き起こすと、検出可能なシグナルを生成することにより、ＰＰＩの発生を検出／監視するシステムである。これに関連して考案されたのが、「出力装置」の構成要素を用いてゲノム内の異なる部位を標的化することである。相互作用が生じると、「出力装置」はシグナルを生成する。これを使用して、標的遺伝子座の近接を決定または監視することができる。いくつかの態様では、細胞を薬剤で処理して、細胞に対する薬剤の効果を決定する。エフェクタードメインの他の例として、ヒストンマークのリーダー／インタラクター（ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ａｂｓｔｒａｃｔ／Ｓ００９２−８６７４（１０）００９５１−７）及びＤＮＡ修飾のリーダー／インタラクターが挙げられる。
【００５８】
いくつかの態様では、エフェクタードメインはＤＮＡ修飾因子である。ＤＮＡ修飾因子の具体例としては、Ｔｅｔl（ＴｅｔlＣＤ）などの５ｍＣから５ｈｍｃへの変換；Ｔｅｔl、ＡＣＩＤ  Ａ、ＭＢＤ４、Ａｐｏｂｅｃl、Ａｐｏｂｅｃ２、Ａｐｏｂｅｃ３、Ｔｄｇ、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｇａｄｄ４５ｂ、ＲＯＳ１によるＤＮＡ脱メチル化；Ｄｎｍｔl、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼＭ．ＳｓｓＩ、及び／またはＭ．ＥｃｏＨＫ３１ＩによるＤＮＡメチル化が挙げられる。特定の態様では、エフェクタードメインはＴｅｔ１である。他の特定の態様では、エフェクタードメインはＤｍｎｔ３ａである。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９がＴｅｔ１に融合されている。他の実施形態では、ｄＣａｓ９がＤｎｍｔ３ａに融合されている。
【００５９】
ＤＮＡメチル化は、２つのｄｅ  ｎｏｖｏ型ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔ３ａ／ｂ）によって確立され、Ｄｎｍｔ１によって維持される（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，２０１３）。発生期の遺伝子活性化は、プロモーター配列及びエンハンサー配列の脱メチル化と関連している。加えて、脱メチル化は、ＴＥＴ（ｔｅｎ−ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）ジオキシゲナーゼによるメチル基の酸化により５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）を形成し、その後、ＤＮＡ複製依存性希釈によって、またはＤＮＡグリコシラーゼで開始される塩基除去修復（ＢＥＲ）によって未修飾シトシンに修復することにより達成することができる。ＢＥＲは、能動的脱メチル化と呼ばれ、着床前胚などの特定の発達段階時期に、または有糸分裂後ニューロンにおいて作用することが提唱されている過程である（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  ２０１４）。
【００６０】
本発明の一態様では、ｄＣａｓ９のエフェクタードメインへの融合は、全長または部分長のエフェクターの単一コピーまたは複数／タンデムコピーの融合を意図することがある。他の融合は、エフェクタードメインの分離（機能的に相補的な）型とのものであり得る。この方法に使用されるエフェクタードメインには、以下のクラスのタンパク質のうちのいずれか１つを含む：薬物誘導性のＤＮＡルーピング及び／またはゲノム遺伝子座の接触を媒介するタンパク質、ｄＣａｓ９が結合したゲノム遺伝子座の、別のｓｇＲＮＡとの３次元近接を助けるタンパク質。
【００６１】
エフェクタードメインの他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３４３８７号及び米国出願第１４／７８５０３１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
いくつかの態様では、本発明は、エフェクタードメインの全部または一部と融合されたＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする核酸配列（例えば、それを含む組成物、本質的にそれからなる組成物、それからなる組成物）に関する。いくつかの態様では、本発明は、エフェクタードメインの全部または一部と融合されたＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質（例えば、それを含む組成物、本質的にそれからなる組成物、それからなる組成物）に関する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質の全部または一部は、核酸配列を標的化するが切断しない。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質を、エフェクタードメインのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。いくつかの態様では、エフェクタードメインの一部はゲノム配列のメチル化を調節する（例えば、ゲノム配列を脱メチル化またはメチル化する）。
【００６３】
いくつかの態様では、融合タンパク質をコードする核酸配列及び／または融合タンパク質は単離されている。本明細書で使用される場合、「単離された」核酸配列、「実質的に純粋な」核酸配列、または「実質的に純粋で単離された」核酸配列とは、（ゲノム配列におけるような）通常は遺伝子またはヌクレオチド配列に隣接する核酸から分離されたもの、及び／または（例えば、ＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーにおけるような）他の転写配列から完全にまたは部分的に精製されているものである。例えば、本発明の単離された核酸は、それが自然界で存在する複雑な細胞環境、または組換え技術によって産生される場合は培地、または化学合成される場合は化学前駆体または他の化学物質と比較して、実質的に単離されたものであってよい。本明細書で使用される場合、「単離された」タンパク質、「実質的に純粋な」タンパク質、または「実質的に純粋で単離された」タンパク質（例えば、キメラタンパク質；融合タンパク質）とは、それが自然界で存在する複雑な細胞環境、または組み換え技術によって産生される場合は培地、または化学合成される場合は化学前駆体または他の化学物質から分離されたもの、またはそれらと比較して、実質的に単離されたものである。場合によっては、単離された材料は、組成物（例えば、他の物質を含有する粗抽出物）、緩衝液系、または試薬混合物の一部を形成するであろう。他の状況では、例えばアガロースゲル電気泳動またはＨＰＬＣなどのカラムクロマトグラフィーによる測定のように、本質的に均質になるまで材料が精製される場合がある。好ましくは、単離された核酸分子は、存在する巨大分子種すべての少なくとも約５０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％（モル基準）を占める。
【００６４】
一態様では、Ｃａｓ９と１つ以上のエフェクタードメインの全部または一部との融合には、１つ以上のリンカーを含む。本明細書で使用される場合、「リンカー」は、２つ以上のエフェクタードメインを接続または融合するものである（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎを参照のこと。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。当業者は理解しているであろうが、様々なリンカーを使用することができる。一態様では、リンカーは１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、リンカーは２つ以上のアミノ酸を含む。一態様では、リンカーはアミノ酸配列ＧＳを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）と２つ以上のエフェクタードメインとの融合に、ドメイン間に点在する１つ以上のリンカー（例えば、ＧＳリンカー）を含む。いくつかの態様では、１つ以上の核移行配列は、触媒不活性なヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）とエフェクタードメインとの間に位置する場合がある。例えば、融合タンパク質には、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１またはｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｄｎｍｔ３ａを包含することができる。
【００６５】
本発明のいくつかの態様では、細胞内の１つ以上のゲノム配列を調節する方法は、エフェクター分子を導入することをさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「エフェクター分子」とは、エフェクタードメインと会合（例えば、結合；特異的に結合）して、ゲノム配列のメチル化または脱メチル化を調節する分子（例えば、核酸配列；タンパク質；有機分子；無機分子、小分子）または物理的トリガー（例えば、インデューサー分子；トリガー分子）である。エフェクター分子を細胞と接触させること、及び／または細胞に（例えば、核酸配列としてまたはタンパク質配列として）導入することができる。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は内因性である。他の実施形態では、エフェクター分子は外因性である。例えば、外因性エフェクター分子を細胞に導入することができる。いくつかの態様では、エフェクター分子はエフェクタードメインに結合する。いくつかの態様では、エフェクター分子は、核酸、タンパク質、薬物、有機小分子、及びそれらの誘導体／変異体である。本発明のいくつかの態様では、エフェクター分子は抗生物質またはその誘導体／変異体である。
【００６６】
当業者には明らかであろうが、この方法は、ゲノム配列のメチル化または脱メチル化を容易にするために他の分子または因子を細胞に導入することをさらに含み得る。ＤＮＡメチル化を阻害または増強する薬剤は、内因性ＤＮＡメチラーゼまたはＤＮＡデメチラーゼの阻害剤であり得る。例えば、ＤＮＡメチル化の阻害剤は、小分子、例えば、５−アザシチジン（アザシチジン）及び５−アザデオキシシチジン（デシタビン）などのシチジン類似体であってよい。他の方法では、ＤＮＡメチル化を阻害または増強する薬剤を個体に投与することができる。
【００６７】
本明細書に記載の方法を用いて様々なゲノム配列を調節または修飾することができるが、配列は目的とする結果に応じて異なる。一態様では、標的ゲノム配列は遺伝子配列である。特定の態様では、本明細書に記載の方法を使用して、同じ遺伝子ファミリーの２つ以上の異なる遺伝子、冗長性機能（例えば、冗長性とは、特定の表現型、例えば検出可能な表現型を産生するのに少なくとも２つの遺伝子の不活性化を必要とすることを意味する場合がある）を有する２つ以上の遺伝子、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である２つ以上の遺伝子、同じ遺伝子の２つ以上のコピー、同じ生物学的経路（例えば、シグナル伝達経路、代謝経路）の２つ以上の遺伝子、少なくとも１つの生物学的活性を共有する及び／または少なくとも１つの共通の基質に作用する及び／または同じタンパク質もしくはタンパク質−核酸複合体（例えば、ヘテロオリゴマータンパク質、スプライソソーム、プロテアソーム、ＲＩＳＣ、転写複合体、複製複合体、動原体、チャネル、トランスポーター）の一部である２つ以上の遺伝子を遺伝子修飾することができる。いくつかの態様では、２つ以上のガイド配列が、エフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼを含むポリペプチドを、ゲノム配列内に位置する異なる部位に誘導することができる。
【００６８】
「調節する」または「修飾する」は、当技術分野での使用法と矛盾なく使用される。すなわち、対象となる過程、経路、または現象において定性的または定量的な変化、変更、または修飾を引き起こすか、または促進することを意味する。限定するものではないが、そのような変化は、過程、経路、または現象の異なる構成要素または分岐の相対的な強度または活性の増加、減少、または変化であり得る。「調節因子」または「修飾因子」とは、対象となる過程、経路、または現象において、定性的もしくは定量的な変化、変更、もしくは修飾を引き起こすか、または促進する薬剤である。
【００６９】
いくつかの態様では、ゲノム配列のメチル化を「調節すること」または「修飾すること」とは、１つ以上のゲノム配列のメチル化状態に対する任意の様々な変更を指す。例えば、１つ以上のゲノム配列のメチル化を調節する方法は、ゲノム配列をメチル化または脱メチル化することを含む（例えば、ゲノム配列はメチル化されてもよく、またはゲノム配列は脱メチル化されてもよい）。
【００７０】
また、本明細書で提供される方法を使用して、胚、接合体、胎児、及び出生後の哺乳動物などの細胞組成物中に存在する細胞内の１つ以上のゲノム配列を修飾または調節することもできる。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、有糸分裂後細胞、ニューロン、線維芽細胞、幹細胞など）、接合体、胚、または出生後の哺乳動物は、本明細書に記載の方法を施す前に、すでに遺伝子改変されている（すでに１つ以上の遺伝子改変、例えばエピジェネティック修飾を有する）。例えば、細胞、接合体、胚、または出生後の動物は、人為的手段を伴う工程によって外因性核酸が導入されたものであってもよい（または人為的手段を伴う工程によって外因性核酸が導入された細胞または生物から少なくとも部分的に由来する系統であってもよい）。核酸は、例えば、細胞にとって外因性である配列を含んでいてもよく、天然の配列（すなわち、天然で細胞に見られる配列）だが自然界に存在しない配置（例えば、異なる遺伝子由来のプロモーターに連結されたコード領域）である配列、または天然配列の改変型などを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、接合体、胚、または出生後の哺乳動物は、本明細書に記載の方法を施す前に、予め遺伝子改変されていない（１つ以上の遺伝子改変を予め保有しない）。
【００７１】
いくつかの態様では、本発明は、メチル化活性または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼ、及び１つ以上のガイド配列を、接合体または胚に導入することを含む、１つ以上のゲノム配列に修飾をもつ非ヒト哺乳動物の作製方法に関する。１つ以上のゲノム配列のそれぞれの一部にガイド配列がハイブリダイズし、エフェクタードメインに融合された触媒不活性な部位特異的ヌクレアーゼがゲノム配列をメチル化または脱メチル化する条件下に接合体または胚を維持し、それによって１つ以上の修飾ゲノム配列を有する胚を作製する。１つ以上の修飾ゲノム配列を有する胚を、里親の非ヒト哺乳動物に移植することができる。１つ以上の修飾ゲノム配列を有する１匹以上の子孫を産む条件下に里親の非ヒト哺乳動物を維持し、それによって１つ以上のゲノム配列に修飾をもつ非ヒト哺乳動物を作製する。
【００７２】
当業者には明らかであろうが、非ヒト哺乳動物はまた、本明細書に記載される方法、及び／または従来の方法（例えば、米国公開出願第２０１１／０３０２６６５号を参照のこと）を用いて作製することができる。非ヒト哺乳動物胚を作製する方法は、非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞（例えば、ｉＰＳＣ）を非ヒト四倍体胚盤胞に注入すること、及びその結果得られた当該四倍体胚盤胞を胚の形成をもたらす条件下に維持し、それにより非ヒト哺乳動物胚を作製することを含み得る。いくつかの実施形態では、上記非ヒト哺乳動物細胞はマウス細胞であり、上記非ヒト哺乳動物胚はマウスである。いくつかの実施形態では、上記マウス細胞は変異型マウス細胞であり、マイクロインジェクションによって上記非ヒト四倍体胚盤胞に注入される。いくつかの実施形態では、レーザー補助マイクロマニピュレーションまたはピエゾ注入が使用される。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物胚はマウス胚を含む。
【００７３】
そのような従来技術の別の例は、胚盤胞（例えば、四倍体胚盤胞）に１つ以上の変異を含む胚性幹（ＥＳ）細胞及び／または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を導入すること、ならびに胚の発生をもたらす条件下に胚盤を維持することを含む２段階クローニングである。その後、その胚は偽妊娠の雌（例えば胚と同じ種のもの）のような適切な里親に移植する（受胎させる）。次いで里親を、１つ以上の変異を有する生きた子孫の発生をもたらす条件下に維持する。
【００７４】
別の例は四倍体相補性アッセイの使用であり、その場合、２つの哺乳動物胚の細胞を組み合わせて新しい胚を形成する（Ｔａｒｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐ，７５０：６１５６−６１６３（２００３））。このアッセイは、どの染色体も４倍存在する四倍体細胞を作製することを伴う。これは、２細胞期に胚を採取し、電流を流して２細胞を融合させることによって行われる。得られた四倍体細胞は分裂し続け、すべての娘細胞もまた四倍体となる。このような四倍体胚は通常、胚盤胞期まで成長し、子宮壁に着床することになる。四倍体相補性アッセイでは、四倍体胚（桑実胚期または胚盤胞期のいずれかにある）を、異なる生物由来の正常な二倍体胚性幹細胞（ＥＳ）と組み合わせる。胚は正常に発達する。胎児はＥＳ細胞にのみ由来し、対する胚外組織は四倍体細胞にのみ由来する。
【００７５】
非ヒト哺乳動物の作製に使用される別の従来方法として、前核マイクロインジェクションが挙げられる。受精直後の非ヒト哺乳動物卵の雄性前核にＤＮＡを直接導入する。先に記載した２段階クローニングと同様に、受精卵を偽妊娠の雌に移植する。組み込まれた導入遺伝子について子孫をスクリーニングする。その後、ヘテロ接合子孫を交配させてホモ接合動物を作製することができる。
【００７６】
本明細書に記載の方法では、様々な非ヒト哺乳動物を使用することができる。例えば、非ヒト哺乳動物は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、またはヤギであり得る。
【００７７】
いくつかの態様では、本明細書に記載の１つ以上の標的核酸配列に変異をもつ非ヒト哺乳動物を作製する方法と関連して、ヒト疾患の様々なマウス系統及びマウスモデルが使用される。当業者は、ヒト疾患のモデルとなる、多数の市販及び非市販の実験用マウスの系統を認識している。がん、心血管疾患、自己免疫疾患及び障害、炎症性疾患、糖尿病（１型及び２型）、神経系疾患、ならびに他の疾患などの疾患用のマウスモデルが存在する。市販の研究系統の例として、１１ＢＨＳＤ２マウス、ＧＳＫ３Ｂマウス、１２９−Ｅマウス  ＨＳＤ１  １Ｂ１マウス、ＡＫマウス  Ｉｍｍｏｒｔｏｍｏｕｓｅ（登録商標）、無胸腺ヌードマウス、ＬＣＡＴマウス、Ｂ６アルビノマウス、Ｌｏｘ−１マウス、Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス、Ｌｙ５マウス、Ｂ６Ｄ２Ｆ１（ＢＤＦ１）マウス、ＭＭＰ９マウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＮＩＨ−ＩＩＩヌードマウス、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、ＮＯＤマウス、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス、Ｂｌａｃｋ  Ｓｗｉｓｓマウス、ＮＳＥ−ｐ２５マウス、Ｃ３Ｈマウス、ＮＵ／ＮＵヌードマウス、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｅマウス、ＰＣＳＫ９マウス、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス、ＰＧＰマウス（Ｐ−糖タンパク質欠損）、ＣＢ６Ｆ１マウス、ｒｅｐＴＯＰ（商標）ＥＲＥ−Ｌｕｃマウス、ＣＤ−Ｉ（登録商標）マウス、ｒｅｐＴＯＰ（商標）ｍｉｔｏＩＲＥマウス、ＣＤ−Ｉ（登録商標）ヌードマウス、ｒｅｐＴＯＰ（商標）ＰＰＲＥ−Ｌｕｃマウス、ＣＤ１−Ｅマウス、Ｒｉｐ−ＨＡＴマウス、ＣＤ２Ｆ１（ＣＤＦ１）マウス、ＳＣＩＤ無毛コンジェニック（ＳＨＣ（商標））マウス、ＣＦ−１（商標）マウス、ＳＣＩＤ無毛非近交系（ＳＨＯ（商標））マウス、ＤＢＡ／２マウス、ＳＪＬ−Ｅマウス、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＣＢ  １７（商標）マウス、ＳＫＨ１−Ｅマウス、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（登録商標）ベージュマウス、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ（ＣＦＷ（登録商標））マウス、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（登録商標）マウス、ＴＡＲＧＡＴＴ（商標）マウス、ＦＶＢマウス、ＴＨＥ  ＰＯＵＮＤマウス（商標）、及びＧＬＵＴ  ４マウスが挙げられるが、それに限定されない。他のマウス系統として、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ３Ｈ、ＩＣＲ、ＣＢＡ、Ａ／Ｊ、ＮＯＤ、ＤＢＡ／１、ＤＢＡ／２、ＭＯＬＤ、１２９、ＨＲＳ、ＭＲＬ、ＮＺＢ、ＮＩＨ、ＡＫＲ、ＳＪＬ、ＮＺＷ、ＣＡＳＴ、ＫＫ、ＳＥＮＣＡＲ、Ｃ５７Ｌ、ＳＡＭＲ１、ＳＡＭＰ１、Ｃ５７ＢＲ、及びＮＺＯが挙げられる。
【００７８】
いくつかの態様では、１つ以上のゲノム配列に修飾をもつ非ヒト哺乳動物の作製方法には、１つ以上の市販及び／または非市販の非ヒト哺乳動物を、本明細書に記載の方法によって作製された１つ以上のゲノム配列に修飾をもつ非ヒト哺乳動物と交配することをさらに含む。本発明はまた、本明細書に記載の方法によって作製された非ヒト哺乳動物に関する。
【００７９】
いくつかの態様では、ゲノム配列は疾患または病態と関連性がある（例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，１２：２２４（２０１１）を参照）。対象となる遺伝子修飾の具体例として、異なる種の配列と一致させる（例えば、マウス配列を、対象となる任意の遺伝子（複数可）についてヒト配列に変更する）、タンパク質の潜在的または既知の翻訳後修飾（例：リン酸化、グリコシル化、脂質化、アシル化、アセチル化）の部位を変更する、潜在的または既知のエピジェネティック修飾の部位を変更する、潜在的または既知のタンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸相互作用の部位を変更するような配列（複数可）（例えば、遺伝子（複数可））の修飾、タグ（例えばエピトープタグ）の挿入、及び／またはスプライス部位の挿入もしくは削除が挙げられる。
【００８０】
いくつかの態様では、１つ以上のゲノム配列の一方のコピーが修飾されている。いくつかの態様では、細胞内のゲノム配列のうち１つ以上は両方のコピーが修飾されている。いくつかの態様では、修飾されている１つ以上のゲノム配列は細胞に内在する。
【００８１】
特定の態様では、ゲノム配列のうち少なくとも２つは内因性ゲノム配列である。いくつかの態様では、ゲノム配列のうち少なくとも２つは外因性ゲノム配列である。少なくとも２つのゲノム配列が存在するいくつかの態様では、ゲノム配列のうち少なくとも１つは内因性ゲノム配列であり、ゲノム配列のうち少なくとも１つは外因性ゲノム配列である。いくつかの態様では、ゲノム配列のうち少なくとも２つは内因性遺伝子である。いくつかの態様では、ゲノム配列のうち少なくとも２つは外因性遺伝子である。少なくとも２つのゲノム配列が存在するいくつかの態様では、ゲノム配列のうち少なくとも１つは内因性遺伝子であり、ゲノム配列のうち少なくとも１つは外因性遺伝子である。いくつかの態様では、ゲノム配列のうち少なくとも２つは少なくとも１ｋＢ離れている。いくつかの態様では、ゲノム配列のうち少なくとも２つは異なる染色体上にある。ゲノム配列は、タグ（例えば、エピトープタグまたは蛍光タグ）または導入遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）を含み得る。
【００８２】
本明細書で提供する方法は、細胞、胚、接合体、及び非ヒト哺乳動物における多重ゲノム編集のために提供する。本明細書に示されるように、複数の遺伝子に修飾をもつ細胞、胚、接合体、及び非ヒト哺乳動物を１工程で作製することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、本明細書記載の方法を用いて、（単一の）細胞、接合体、胚、または非ヒト哺乳動物における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０等のゲノム配列（例えば遺伝子）の修飾を可能にする。特定の態様では、（単一の）細胞、接合体、胚、または非ヒト哺乳動物において１つのゲノム配列が修飾されている。いくつかの態様では、（単一の）細胞、接合体、胚、または非ヒト哺乳動物において２つのゲノム配列が修飾されている。いくつかの態様では、（単一の）細胞、接合体、胚、または非ヒト哺乳動物において３つのゲノム配列が修飾されている。いくつかの態様では、（単一の）細胞、接合体、胚、または非ヒト哺乳動物において４つのゲノム配列が修飾されている。いくつかの態様では、（単一の）細胞、接合体、胚、または非ヒト哺乳動物などにおいて５つのゲノム配列が修飾されている。
【００８３】
当業者には明らかであろうが、核酸及び／またはタンパク質を細胞、接合体、胚、及び／または哺乳動物に導入するには、様々な方法を使用することができる。好適な方法としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、注射、及びベクター（例えば、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクター）を用いた形質導入または感染が挙げられる。いくつかの態様では、核酸及び／またはタンパク質は、例えばエンドサイトーシスによる核酸及び／またはタンパク質の取り込みを容易にするビヒクル、例えばカチオン性ビヒクルと複合体を形成している。
【００８４】
本明細書に記載の方法は、本方法によって作製された細胞または接合体を単離することをさらに含み得る。したがって、いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって作製された細胞または接合体（単離された細胞または接合体）に関する。いくつかの態様では、本開示は、修飾（複数可）を有する細胞のクローン集団、修飾（複数可）を有する細胞を含む複製培養物、及び作製された動物から単離された細胞を提供する。
【００８５】
本明細書に記載の方法は、作製された動物を、遺伝子改変を有する他の動物（場合により、背景が同系統である）及び／または対象となる１つ以上の表現型（例えば、ＮＯＤマウスなどの疾患感受性）を有する他の動物と交配することをさらに含み得る。さらに、この方法は、１つ以上の遺伝子改変を有する、及び／または対象となる１つ以上の表現型（例えば、疾患感受性）を有する株由来の細胞、接合体、及び／または動物を修飾することを含み得る。いくつかの態様では、遺伝子修飾はエピジェネティック修飾である。
【００８６】
本明細書に記載の方法は、１つ以上の標的核酸が修飾及び／または調節されているかどうかを様々な既知の方法を用いて評価することをさらに含み得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞、接合体、胚、または動物において複数の遺伝子修飾を生じさせるために使用され、その場合、遺伝子修飾の少なくとも１つは遺伝子をメチル化または脱メチル化するものであり、及び遺伝子修飾の少なくとも１つは異なる遺伝子またはゲノム位置にある。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾はエピジェネティック修飾をさらに含む。得られた細胞、接合体、胚、もしくは動物、またはそれから作製された細胞、接合体、胚、もしくは動物を分析する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾のうち少なくとも１つが条件付きであってもよい（例えば、遺伝子のメチル化または脱メチル化などの修飾の効果が、ある特定の条件下、一般的には当業者の管理下でのみ顕在化する）。いくつかの実施形態では、少なくとも出生後の段階、例えば成体期まで動物を発達させる。効果を生じさせる修飾に適した条件（「誘導条件」と呼ばれることもある）を課した後、動物の表現型を分析する。表現型は、未改変動物の表現型、または誘導条件を課す前の表現型と比較することができる。
【００８８】
分析には、当技術分野において公知のあらゆる種類の表現型分析、例えば、任意の組織、器官、もしくは器官系（または生物全体）の構造、大きさ、発達、体重、もしくは機能の検査、挙動、何らかの生物学的経路または過程の活性、任意の特定の物質または遺伝子産物のレベルなどの分析を含み得る。いくつかの実施形態では、分析には、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでの遺伝子発現分析を含む。いくつかの実施形態では、そのような分析には、例えば、マイクロアレイ（例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイ。「チップ」と呼ばれることもある）、ハイスループットシーケンシング（例えば、ＲＮＡＳｅｑ）、ＣｈＩＰ  ｏｎ  Ｃｈｉｐ分析、ＣｈＩＰＳｅｑ分析などの使用を含み得る。いくつかの実施形態では、ハイコンテントスクリーニングを使用することができ、その方法では、自動顕微鏡及び画像解析の使用を通じて、ハイスループットスクリーニングの要素を個々の細胞の分析に利用することができる（例えば、Ｚａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）．Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ｓｅｅｉｎｇ  ｉｓ  ｂｅｌｉｅｖｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２３７−２４５を参照）。いくつかの実施形態では、分析には、例えば、試験薬剤（例えば化合物）と接触したときの、個々のタンパク質、細胞骨格構造、小胞、及びオルガネラの時空間分布のような細胞成分の定量分析を含む。いくつかの実施形態では、個々のタンパク質及びタンパク質−タンパク質相互作用の活性化もしくは阻害、及び／または生物学的過程及び細胞機能の変化を評価することができる。生物学的過程、機能、及び細胞成分に応じた多様な蛍光プローブが利用可能であり、これを、例えば蛍光顕微鏡と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書の方法に従って作製された細胞または動物は、例えば、特定の遺伝子の発現または活性について報告するレポーター、例えば蛍光レポーターまたは酵素（例えば、ガウシアルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどのルシフェラーゼ）を含み得る。そのようなレポーターをタンパク質に融合することで、場合により非侵襲性の検出手段、例えば、ＰＥＴイメージング、ＭＲＩ、蛍光検出などのイメージング手段または検出手段を使用して、タンパク質またはその活性を検出可能にすることができる。本発明による多重ゲノム編集は、例えば細胞、組織、器官、または動物、例えば生きた動物において、複数のタンパク質、例えば２〜２０の異なるタンパク質を検出するためのレポーターの導入を可能にすることができる。
【００８９】
本発明による多重ゲノム編集は、機能が未知である遺伝子の生物学的役割（複数可）及び／または疾患における役割を決定または試験するのに有用であり得る。例えば、第１及び第２の遺伝子の修飾によって生じる合成効果を発見し、そのような遺伝子（複数可）またはコードされた遺伝子産物（複数可）が関与する遺伝的経路または生化学的経路を正確に特定することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＫＭＣ）（ウェブサイトはｋｎｏｃｋｏｕｔｍｏｕｓｅ．ｏｒｇ）などのプロジェクトで作製されたか、または作製された動物に由来する細胞または接合体を本明細書に記載の方法に使用することが企図される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように作製された動物を、ＩＫＭＣによって作製された動物、またはＩＫＭＣを通じて利用可能な動物と交配することが企図される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って修飾されるマウス遺伝子は、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＭＧＩ）データベースからの任意の遺伝子であり、配列及びゲノム座標をそこから入手可能である。任意の遺伝子は、例えば、マウスゲノムＢｕｉｌｄ  ３７（ＮＣＢＩ）またはＧｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＧＲＣｍ３８に対するＮＣＢＩ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、及びＶｅｇａ（Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）パイプラインによって推定されたものである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、修飾の対象となる遺伝子またはゲノム位置は、完全に配列決定されたゲノムが存在する種のゲノムに含まれている。ゲノム配列は、例えば、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から取得することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って修飾されるヒト遺伝子または配列は、ヒトゲノムＢｕｉｌｄ  ｈｇｌ９（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＮＣＢＩの遺伝子データベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ）において遺伝子ＩＤが割り当てられている任意の遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはコードされた遺伝子産物（例えば、タンパク質）配列が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）またはＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ））で利用可能なもののいずれかなどのデータベースで公開されている任意の遺伝子である。データベースとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ、Ｇｅｎｅ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｔｒｅｍｂｌなどが挙げられる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、既知のまたは疑わしいメチル化可変領域（ＤＭＲ）を遺伝子修飾することを対象とする。メチル化可変領域には様々な例がある。細胞型が異なる細胞間（例えば、筋肉細胞とニューロンまたは皮膚細胞と肝細胞）で、メチル化可変領域を差次的にメチル化することができる。メチル化可変領域はまた、罹患細胞と非罹患細胞との間（例えば、がん細胞と非がん細胞）で差次的にメチル化することができる。メチル化可変領域はまた、分化状態間（例えば、前駆細胞と最終分化細胞）で差次的にメチル化することができる。１つ以上の遺伝子（例えば、修飾から最大約．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、５００ｋｂ以内、または約１、２、５、もしくは１０ＭＢ以内）の発現に対する効果を評価することができる。配列に遺伝子修飾を行って、そのような遺伝子修飾が細胞もしくは動物の表現型を変化させるか、またはＲＮＡもしくはタンパク質の産物に影響を及ぼすか、または疾患に対する感受性を変化させるかどうかを決定することができる。遺伝子修飾には、エピジェネティック修飾を含み得る。いくつかの態様では、メチル化可変領域は、高メチル化または非メチル化され得る。
【００９３】
いくつかの態様では、異常に高メチル化されているゲノム配列を脱メチル化すること、または異常に非メチル化されているゲノム配列をメチル化することを対象とする。いくつかの態様では、異常に高メチル化された配列または異常に非メチル化されている配列は、疾患または障害において起こり得る。他の態様では、異常に非メチル化されているＣＴＣＦ部位（例えば、ＣＴＣＦ結合部位）をメチル化すること、または異常にメチル化されているＣＴＣＦ部位のメチル化を解除することを対象とする。ＣＴＣＦ部位のメチル化または脱メチル化を変更することで、異常に非メチル化されている配列もしくは領域、または異常に高メチル化されている配列もしくは領域を発現する疾患または障害を治療または予防することができる。例えば、ループの外側にある遺伝子の発現を増加させたい場合（例えば、遺伝子の発現が異常に低い場合、及び／または治療目的または他の目的のために発現の増加が望まれる場合）には、ＣＴＣＦ結合部位をメチル化してＣＴＣＦループを開き、それによって、外側の遺伝子をループの内側にあるエンハンサーの制御下に置くことができる。
【００９４】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、プロモーター配列に修飾を有する細胞の作製に使用することができる。メチル化プロモーター配列へのｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１融合タンパク質の標的化、または非メチル化プロモーター配列へのｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ融合タンパク質の標的化はそれぞれ、内因性レポーターの活性化またはサイレンシングを引き起こす。例えば、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１融合タンパク質はＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とし、そのプロモーターを脱メチル化することによって、有糸分裂後ニューロンにおけるＢＤＮＦ発現を誘導する。
【００９５】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、エンハンサー配列に修飾を有する細胞の作製に使用することができる。メチル化エンハンサー配列へのｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１融合タンパク質の標的化、または非メチル化エンハンサー配列へのｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ融合タンパク質の標的化はそれぞれ、内因性エンハンサーの活性化またはサイレンシングを引き起こす。例えば、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１融合タンパク質は、線維芽細胞のＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とし、そのエンハンサーを脱メチル化することによって、線維芽細胞の筋芽細胞へのリプログラミングを促進する。
【００９６】
他の態様では、本明細書に記載の方法は、ＣＴＣＦ結合部位に修飾を有する細胞の作製に使用することができる。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１またはｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ融合タンパク質をＣＴＣＦ結合部位に標的化すると、ＣＴＣＦ結合に影響を及ぼし、ＤＮＡルーピングを妨害することができる。例えば、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ融合タンパク質はＣＴＣＦループのアンカー部位を標的とするｄｅ  ｎｏｖｏメチル化を行い、ＣＴＣＦ結合を遮断し、ＤＮＡルーピングを妨害し、それにより隣接ループにおける遺伝子発現を変化させる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれの方法も、本明細書に記載の方法に従って作製された動物、例えば本明細書に記載のように作製された任意の遺伝子改変動物に由来する１つ以上の細胞、試料、または物質を単離することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法にはさらに、１つ以上の細胞、試料、または物質を分析することを含んでもよい。そのような分析は、例えば、本方法に従って導入された遺伝子修飾（複数可）の効果を評価することができる。遺伝子修飾には、ゲノム配列のメチル化または脱メチル化を含んでもよく、及び／またはエピジェネティック修飾を含んでもよい。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って作製された動物は、疾患を治療するための候補薬の同定、及び／または薬剤の毒性もしくは副作用の可能性についての試験に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれの方法も、本明細書に記載の方法に従って作製された動物、例えば本明細書に記載のように作製された任意の遺伝子改変動物を、試験薬剤（例えば小分子、核酸、ポリペプチド、脂質など）と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、接触は試験薬剤を投与することを含む。経路を問わず（例えば、経口、静脈内、腹腔内、胃管栄養、局所、経皮、筋肉内、経腸、皮下）投与でき、全身投与でも局所投与でもよく、任意の用量（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ）を含んでよく、単回投与または複数回投与を伴うものであってよい。いくつかの実施形態では、方法にはさらに動物を分析することを含んでもよい。そのような分析は、例えば、本方法に従って導入された遺伝子修飾（複数可）を有する動物における試験薬剤の効果を評価することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子修飾（複数可）の影響を低減または増強する試験薬剤を同定することができる。いくつかの実施形態では、試験薬剤が、その遺伝子修飾（複数可）と関連する疾患、またはそれによって引き起こされる疾患の発症を低減または抑制する（または、そのような疾患の１つ以上の症状もしくは徴候を軽減または抑制する）場合、その試験薬剤を、遺伝子修飾（複数可）と関連する疾患もしくはそれによって引き起こされる疾患、または遺伝子修飾を有する遺伝子もしくはゲノム位置に天然に存在する変異と関連する疾患、もしくはそれによって引き起こされる疾患を治療するための候補薬であると同定することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、細胞は罹患細胞であってよく、または疾患、例えば細胞または細胞を得た器官に影響を及ぼす疾患に罹患している対象に由来してもよい。いくつかの実施形態では、疾患（例えば、本明細書で言及する疾患などの、対象となる任意の疾患）に関連する細胞のゲノム領域に変異が導入される。例えば、いくつかの実施形態では、疾患の病因に関与することが知られているもしくは疑われる、及び／または疾患もしくは疾患の特定の徴候（複数可）を発症するリスクの増加もしくは減少に関与することが知られているもしくは疑われる遺伝子またはゲノム位置をメチル化または脱メチル化することを対象とする。いくつかの実施形態では、遺伝子またはゲノム位置をメチル化または脱メチル化して、そのような修飾が、疾患または疾患の１つ以上の徴候を発症するリスクを変化させる、疾患の進行を変化させる、または疾患に対する療法または候補療法への対象の反応を変化させるかどうかを決定することを対象とする。いくつかの実施形態では、異常なまたは疾患関連のヌクレオチドまたは配列を、正常であるものまたは疾患に関連していないものに変更することを対象とする。いくつかの実施形態では、これにより、１つ以上の選択部位でのみ遺伝子修飾が異なる、遺伝的に適合する細胞または細胞株（例えば、ｉＰＳ細胞または細胞株）の作製を可能にすることができる。本明細書に記載の多重ゲノム編集は、例えば、２〜２０の選択部位の遺伝子修飾に関する以外は同質遺伝子である細胞または細胞株の作製を可能にすることができる。これにより、疾患のリスク、発症、または進行に関与することが疑われるかまたは知られている複数の修飾の複合効果の研究を可能にすることができる。
【０１００】
用語「疾患」、「障害」、または「病態」は同義に使用され、生物の健康状態及び／または正常な機能からの何らかの変化、例えば患っている個体に疼痛、不快感、機能不全、苦痛、変性、または死を引き起こす身体または精神の異常を指すことがある。疾患には、当業者に公知のあらゆる疾患が含まれる。いくつかの実施形態では、疾患は慢性疾患であり、例えば、それは通常、少なくとも３〜６か月以上、例えば１、２、３、５、１０年以上、または無期限に持続するものであるか、または持続している。疾患は、その疾患に罹患している個体に一般的に起こる特徴的な症状群及び／または徴候群を有する場合がある。疾患及びその診断方法及び治療方法は、Ｌｏｎｇｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，２０１１及び／またはＧｏｌｄｍａｎ’ｓ  Ｃｅｃｉｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ；２４  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｇｕｓｔ  ５，２０１１）などの標準的な医学教科書に記載されている。ある特定の実施形態では、疾患は多遺伝子性疾患（複合疾患、多因子性疾患、または多遺伝子疾患とも呼ばれる）である。そのような疾患は、時には環境因子（例えば、特定の物理的もしくは化学的作用物質、またはウイルスなどの生物学的作用物質への曝露、食事、喫煙などのライフスタイル要因）と併せ、複数の遺伝子の影響と関連することがある。多遺伝子性疾患とは、複数の遺伝子（例えば、そのような遺伝子の特定の対立遺伝子、そのような遺伝子における特定の多型）が、疾患を発症するリスクに寄与し得ること、及び／または疾患の出現方法（例えば、疾患の重症度、発症年齢、進行速度など）に寄与し得ることが知られているか、または疑われる何らかの疾患であり得る。いくつかの実施形態では、多遺伝子性疾患とは、家族集積（一般集団よりも特定の家族において頻繁に起こる）が認められるような遺伝子構成要素を有するが、メンデルの遺伝法則に従わない疾患であり、例えば、この疾患は、優性、劣性、Ｘ連鎖、またはＹ連鎖の遺伝パターンには明らかに従わない。いくつかの実施形態では、多遺伝子性疾患は、（メンデル遺伝障害の場合のように）単一遺伝子において影響の大きい変異体によって通常は制御されない。いくつかの実施形態では、多遺伝子性疾患は家族形態で、及び散発的に発生する場合がある。例としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び様々な種類のがんが挙げられる。多遺伝子性疾患の例として、高血圧、真性糖尿病（例えば、ＩＩ型真性糖尿病）、心血管疾患、がん、及び脳卒中（虚血性、出血性）などの多くの一般的な疾患が挙げられる。いくつかの実施形態では、疾患、例えば多遺伝子性疾患は、精神疾患、神経疾患、神経発達疾患、神経変性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、がん、代謝性疾患、または呼吸器疾患である。いくつかの実施形態では、家族形態の多遺伝子性疾患に少なくとも１つの遺伝子が関与している。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、疾患はがんであり、この用語は一般に、１つ以上の腫瘍、例えば１つ以上の悪性腫瘍または潜在的悪性腫瘍を特徴とする疾患を指す際に同義に使用される。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」には、細胞の異常増殖を含む異常な成長を包含する。当技術分野で知られているように、腫瘍は通常、適切に制御されない（例えば、通常なら増殖を制限するであろう生理学的影響及びシグナルに正常に応答しない）過剰な細胞増殖を特徴とし、以下の特性の１つ以上を示す可能性がある：異形成（例えば、正常な細胞分化の欠如、それにより未成熟細胞の数または割合の増加をもたらす）；無形成症（例えば、分化のより多くの欠如、構造組織のより多くの消失、細胞多形性、大型の過染性核、高核細胞質比、異型有糸分裂などの異常）；隣接組織の浸潤（例、基底膜の破裂）；及び／または転移。悪性腫瘍は持続的に増殖する傾向があり、拡散能力、例えば局所的に浸潤する及び／または局部に及び／または遠位に転移する能力があるが、良性腫瘍は起源部位に限局したままであることが多く、増殖に関しては自己限定的である場合が多い。用語「腫瘍」には、悪性固形腫瘍、例えば、癌腫（上皮細胞から生じるがん）、肉腫（間葉系起源の細胞から発生するがん）、及び検出可能な固形腫瘍塊が存在しない可能性がある悪性増殖（例えば、ある種の血液腫瘍）を含む。がんには以下が含まれるがこれらに限定されない：乳癌；胆道癌；膀胱癌；脳腫瘍（例、膠芽腫、髄芽腫）；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮体癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病を含む血液腫瘍；Ｔ細胞性急性リンパ性白血病／リンパ腫；有毛細胞白血病；慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫；成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；ボーエン病及びパジェット病を含む上皮内腫瘍；肝臓癌；肺癌；ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；黒色腫、扁平上皮細胞癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞、及び間葉細胞から発生する卵巣癌を含む卵巣癌；神経芽細胞腫、膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；血管肉腫、胃腸間質腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び骨肉腫を含む肉腫；腎細胞癌及びウィルムス腫瘍を含む腎臓癌；基底細胞癌及び扁平上皮癌を含む皮膚癌；精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛癌）、間質性腫瘍、及び胚細胞性腫瘍などの生殖細胞腫瘍を含む精巣癌；甲状腺腺癌及び髄様癌を含む甲状腺癌。ある特定の器官に様々な異なる種類の腫瘍が発生する可能性があり、これらは、例えば臨床的及び／または病理学的特徴及び／または分子マーカーに関して異なっている可能性があることは理解されるであろう。様々な異なる器官に発生する腫瘍については、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＩＡＲＣ）による、ＷＨＯ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｓｅｒｉｅｓ，４ｔｈ  ｅｄまたは３ｒｄ  ｅｄ（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｓｅｒｉｅｓ），ＷＨＯ  Ｐｒｅｓｓ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄで考察されており、全巻が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実��形態では、がんは、特定の遺伝子の変異または過剰発現が、がんの発生、進行、再発などに関与することが知られているか、または疑われているものである。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子は、本明細書に記載の方法による遺伝子修飾の標的である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、がん遺伝子、がん原遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子である。用語「がん遺伝子」には、発現すると、がんの初発または進行の可能性を高めるかまたはそれに寄与し得る核酸を包含する。正常な細胞配列（「がん原遺伝子」）が、変異及び／または異常な発現によって活性化されて、がん遺伝子になる可能性がある（「活性化がん遺伝子」と呼ぶ場合もある）。種々の実施形態において、がん遺伝子には、遺伝子産物に対する完全なコード配列か、または完全な配列または融合タンパク質をコードする配列のうち、発がん能を少なくとも部分的に維持する部分を含み得る。発がん性変異は、例えば、タンパク質活性の変化（例えば増加）、適正な制御の欠如、またはＲ  Ａもしくはタンパク質レベルの変化（例えば増加）をもたらす可能性がある。異常な発現は、例えば、エンハンサーなどの制御要素への並置をもたらす染色体再配列、エピジェネティックなメカニズム、または増幅に起因して起こる場合があり、その結果、がん原遺伝子産物量の増加または不適切な細胞型での産生をもたらす可能性がある。がん原遺伝子は、多くの場合、細胞増殖、分化、及び／またはアポトーシスを制御する、またはそれらに関与するタンパク質をコードする。このようなタンパク質には、例えば、種々の転写因子、クロマチン再構成因子、成長因子、成長因子受容体、シグナル伝達物質、及びアポトーシス制御因子が含まれる。ＴＳＧは、その遺伝子の発現産物の機能消失または機能低下が、がんの初発または進行の可能性を高めるかまたはそれに寄与し得る何らかの遺伝子であり得る。機能消失または機能低下は、例えば変異またはエピジェネティックなメカニズムによって起こる可能性がある。多くのＴＳＧは、正常時に、細胞増殖を抑制もしくは負に制御する、及び／またはアポトーシスを促進するように機能するタンパク質をコードする。例示的ながん遺伝子として、例えば、ＭＹＣ、ＳＲＣ、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＢ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＡＢＬ、ＡＬＫ、ＡＫＴ、ＴＲＫ、ＢＣＬ２、ＷＮＴ、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、ＥＧＦＲ、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＭＤＭ２、ＣＤＫ４、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＩＧＦ２、ＴＰ５３などが挙げられる。例示的なＴＳＧとして、例えば、ＲＢ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＮＦ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、ＣＤＫ阻害タンパク質（例えば、ｐ１６、ｐ２１）、ＰＴＣＨ、ＷＴ１などが挙げられる。これらのがん遺伝子及びＴＳＧの名前のいくつかは、複数のファミリーメンバーを包含し、他の多くのＴＳＧが知られていることは理解されるであろう。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、疾患は心血管疾患、例えば、動脈硬化性心疾患または血管疾患、うっ血性心不全、心筋梗塞、脳血管疾患、末梢動脈疾患、心筋症である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、疾患は精神疾患、神経性疾患、または神経発達疾患、例えば、統合失調症、鬱病、双極性障害、てんかん、自閉症、依存症である。神経変性疾患として、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症が挙げられる。いくつかの実施形態では、疾患は自己免疫疾患であり、例えば急性播種性脳脊髄炎、円形脱毛症、抗リン脂質症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌腺症候群ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、I型糖尿病（例、若年発症糖尿病）、多発性硬化症、強皮症、強直性脊椎炎、サルコイド、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、乾癬、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、ベーチェット症候群、ライター病、ベルジェ病、皮膚筋炎、多発性筋炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎（例えば、多発血管炎を伴う肉芽腫症（別名ウェゲナー肉芽腫症）、顕微鏡的多発血管炎、及びチャーグ−ストラウス症候群）、強皮症、シェーグレン症候群、抗糸球体基底膜疾患（グッドパスチャー症候群を含む）、拡張型心筋症、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎（例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病）、横断性脊髄炎、及びギラン・バレー症候群である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、疾患は呼吸器系疾患、例えば呼吸器系に影響を及ぼすアレルギー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺高血圧症、肺線維症、及びサルコイドーシスである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、疾患は腎疾患、例えば多発性嚢胞腎、ループス、腎症（ネフローゼまたは腎炎）、または糸球体腎炎（種類は問わない）である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、疾患は、例えば、加齢に伴う失明または難聴である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、疾患は感染性疾患、例えばウイルス、細菌、真菌、または寄生虫を原因とする任意の疾患である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、疾患は、ゲノム配列に高メチル化（例えば、異常な高メチル化）または非メチル化（例えば、異常な非メチル化）を発現している。例えば、脆弱Ｘ症候群はＦＭＲ−１の高メチル化を発現している。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１融合タンパク質を使用して、ＣＣＧの高メチル化を特異的に脱メチル化して、ＦＭＧ−１を再活性化し、それによって脆弱Ｘ症候群を治療することができる。本明細書に記載の方法は、異常なメチル化（例えば、高メチル化または非メチル化）を発現する疾患または障害の治療または予防に使用することができる。
【０１０９】
本明細書の疾患の分類は限定を意図していないものと理解されるであろう。当業者は、種々の疾患を複数の異なる群に適切に分類できることを理解しているであろう。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、疾患は、少なくとも１つのゲノムワイド関連（ＧＷＡ）解析（ＧＷＡＳ）が実施されているものである。いくつかの実施形態では、ＧＷＡＳにより、ゲノム全体またはその相当な部分（例えば、ゲノムの少なくとも８０％、９０％、９５％、またはそれ以上）にわたり位置する、数千〜数百万、例えば１００万以上、例えば１００万〜５００万以上の対立遺伝子（例えば、一塩基多型）について、複数の「症例」（対象となる疾患またはその特定の症状を有する対象）及び「対照」（疾患または症状を有さない対象）を分類する。対照のデータは履歴データから取得できることが理解されるであろう。ジェノタイピングは、マイクロアレイまたは他の方法を使用して実施することができる。疾患（または特定の症状）のリスクの上昇（または低下）と（例えば、統計的に有意に）関連する対立遺伝子をそれによって同定することができる。例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、複数の仮説検定に従って統計結果を補正できることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、約１０−７、１０−８、または１０−９未満のｐ値が、関連性の証拠とみなされる。いくつかの実施形態では、遺伝子または対立遺伝子または多型は、少なくとも１つのＧＷＡＳにおいて、疾患のリスクまたは重症度に寄与すると同定されている。例えば、種々の疾患に関連するＧＷＡＳ研究及び遺伝子変異（対立遺伝子、多型）の例については、ｇｅｎｏｍｅ．ｇｏｖ／ｇｗａｓｔｕｄｉｅｓを参照のこと。いくつかの実施形態では、遺伝子（または任意の配列）は、対立遺伝子または多型が、その対立遺伝子または多型をもたない個体と比較して、疾患を発症するリスクの上昇または低下と、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、７．５、１０、またはそれ以上関連しているものである。いくつかの実施形態では、対立遺伝子または多型は、その対立遺伝子または多型をもたない個体と比較して、疾患を発症するリスクの上昇または低下と、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、７．５、１０、またはそれ以上関連している。寿命、体重、感染抵抗性、種々の治療薬に対する反応またはその欠如、毒素または感染性因子（例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫）などの潜在的に有害な物質に対する抵抗性または感受性などの、対象となる任意の表現型形質の一因となり得る遺伝子、対立遺伝子、多型、または遺伝子座を対象とする。表現型形質は、身体的徴候（血圧など）、生化学マーカーであってよく、生化学マーカーは、いくつかの実施形態では、例えば血液、唾液、尿、涙などの体液中において検出可能であり得るもの、例えば、代謝産物レベル、ＬＤＬなどである。その場合、マーカーのレベルの異常な低さまたは高さが、疾患に罹患しているか、していないか、または疾患に対する感受性もしくは疾患からの防御性と相関する可能性がある。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ゲノムに挿入される配列はタグをコードする。その配列を遺伝子の適切な位置に挿入することで、タグを含む融合タンパク質を産生することができる。用語「タグ」は広義に使用され、多種多様なポリペプチドのいずれをも包含する。いくつかの実施形態では、タグは、ポリペプチドを精製、発現、可溶化、及び／または検出するのに有用な配列を含む。いくつかの実施形態では、タグは複数の機能を果たすことができる。いくつかの実施形態では、タグは比較的小さいポリペプチドであり、例えば、数アミノ酸長〜約１００アミノ酸長までの範囲である。いくつかの実施形態では、タグは１００アミノ酸長を超え、例えば最大約５００アミノ酸長、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、少し例を挙げれば、タグには、ＨＡ、ＴＡＰ、Ｍｙｃ、６ＸＨｉｓ、Ｆｌａｇ、Ｖ５、またはＧＳＴタグを含む。利用可能である（例えば、市販されている）か、または当技術分野で公知である抗体、例えばモノクローナル抗体に対するエピトープを含むタグ（例えば、前述のタグのうちのいずれか）を「エピトープタグ」と呼ぶ場合がある。いくつかの実施形態では、タグには、溶解性向上タグ（例えば、ＳＵＭＯタグ、ＮＵＳ  Ａタグ、ＳＮＵＴタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、またはバクテリオファージＴ７のＯｃｒタンパク質の単量体変異体）を含む。例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｄ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ＤＫ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ；１７（４）：３５３−８（２００６）を参照のこと。いくつかの実施形態では、タグは切断可能であるため、タグの少なくとも一部を、例えばプロテアーゼによって除去することができる。いくつかの実施形態では、例えばタグの機能的部分に隣接するまたは連結されたプロテアーゼ切断部位をタグに含めることによって、これを実現する。例示的なプロテアーゼとして、例えば、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、「自己切断型」タグが使用される。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０５／０５７６３を参照のこと。いくつかの実施形態では、タグは、蛍光ポリペプチド（例えば、ＧＦＰ、または増感ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）などのその誘導体）、または基質に作用して検出可能なシグナル、例えば蛍光シグナルまたは比色シグナルを生成することができる酵素を含む。ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、またはガウシアルシフェラーゼ）は、そのような酵素の例である。蛍光タンパク質の例として、ＧＦＰ及びその誘導体、異なる色の光を発する発色団を含むタンパク質、例えば赤色、黄色、及びシアンの蛍光タンパク質などが挙げられる。タグ、例えば蛍光タンパク質は単量体であり得る。ある特定の実施形態では、蛍光タンパク質は、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ｍＵｋＧ１、ｍＡＧ１、ＡｃＧＦＰ１、ＴａｇＧＦＰ２、ＥＧＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＥｍＧＦＰ、ＴａｇＹＰＦ、ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、ＳＹＦＰ２、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＫＯ、ｍＫ０２、ｍＯｒａｎｇｅ���ｍＯｒａｎｇｅ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｎｉＮｅｐｔｕｎｅ、ｍＴｏｍａｔｏ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ｍＫｅｉｍａである。ＧＦＰ及び他の多数の蛍光または発光タンパク質については、例えば、Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｋａｉｎ，ＳＲ（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，ｖ．４７）．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．，２００６及び／またはＣｈｕｄａｋｏｖ，ＤＭ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．９０（３）：１１０３−６３，２０１０を参照のこと。いくつかの実施形態では、タグは、小分子（例えば、代謝産物）もしくはイオン（例えばカルシウムイオン、塩化物イオン）のセンサー、または細胞内電位、ｐＨもしくは他の条件のセンサーに結合する及び／またはそれに作用するドメインを含み得る。遺伝子でコード可能な任意のセンサーを使用してもよく、そのようなセンサーのいくつかは当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴ系のセンサーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、異なるタグを組み込むように種々の遺伝子を修飾することにより、遺伝子によってコードされるタンパク質が識別可能に標識される。例えば、２〜２０個の異なったタグを導入することができる。いくつかの実施形態では、タグは異なった発光及び／または吸収スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、タグは、赤外領域または近赤外領域の光を吸収及び／または放射することができる。タグをコードする任意の核酸配列は、それを導入しようとする細胞、接合体、胚、または動物の発現に合わせてコドン最適化できることが理解されるであろう。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブに作用し得るタンパク質の断片またはドメイン、例えばタンパク質の正常な機能または相互作用を阻害し得るタンパク質の断片またはドメインを発現させることを対象とする場合がある。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、対象となる遺伝子がコードするタンパク質は、その集積が、タンパク質ミスフォールディング疾患と呼ばれることがある１つ以上の疾患と関連する。例としては、例えば、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病及び関連障害）、アミロイドベータまたはタウ（アルツハイマー病）、ＴＤＰ−４３（前頭側頭型認知症、ＡＬＳ）が挙げられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、対象となる遺伝子は、転写因子、転写コアクチベーターまたはコリプレッサー、酵素、シャペロン、熱ショック因子、熱ショックタンパク質、受容体、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、ヒストン（例えば、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）、末梢膜タンパク質、可溶性タンパク質、核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、成長因子、サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−３３のいずれか）、インターフェロン（例えば、アルファ、ベータ、またはガンマ）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣ、ＣＸ３Ｃ、Ｃ（またはＸＣ）、またはＣＸ３Ｃケモカイン）をコードする。ケモカインは、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１もしくはＸＣＬ２、またはＣＸＣ３Ｌ１であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コロニー刺激因子、ホルモン（例えば、インスリン、甲状腺ホルモン、成長ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン）、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン）、モータータンパク質（例えば、ダイニン、ミオシン）、細胞接着分子、主要またはマイナー組織適合性（ＭＨＣ）遺伝子、トランスポーター、チャネル（例えば、イオンチャネル）、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー（ＩｇＳＦ）遺伝子（例えば、抗体をコードする遺伝子、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体）、腫瘍壊死因子、ＮＦ−カッパＢタンパク質、インテグリン、カドヘリンスーパーファミリーメンバー（例えば、カドヘリン）、セレクチン、凝固因子、補体因子、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子をコードする。成長因子としては、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ；ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、例えばＦＧＦ１〜ＦＧＦ２２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、または神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリーのメンバーが挙げられる。前述のタンパク質ファミリーは複数のメンバーを含むことが理解されるであろう。種々の実施形態において、そのようなメンバーのいずれを使用してもよい。いくつかの実施形態では、成長因子は１つ以上の造血細胞型の増殖及び／または分化を促進する。例えば、成長因子は、ＣＳＦ１（マクロファージコロニー刺激因子）、ＣＳＦ２（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭ−ＣＳＦ）、またはＣＳＦ３（顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ）であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子は、神経栄養因子、すなわち神経系統細胞（本明細書で使用される用語には、神経前駆細胞、ニューロン、及びグリア細胞、例えばアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアを含む）の生存、発達及び／または機能を促進する因子をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は神経突起伸長を促進する因子である。いくつかの実施形態では、タンパク質は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、対象となる遺伝子は、複数のサブユニットからなる任意のタンパク質のサブユニットであるポリペプチドをコードする。
【０１１６】
酵素は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）により酵素番号（ＥＣ番号）が割り当てられている反応種を触媒する任意のタンパク質であり得る。酵素には、例えば、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼが挙げられる。例として、例えば、キナーゼ（プロテインキナーゼ、例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ、Ｔｙｒキナーゼ）、脂質キナーゼ（例えば、ホスファチジルイノシタイド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼまたはＰＩ３Ｋ））、ホスファターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、デメチラーゼ、リパーゼ、チトクロームＰ４５０、グルクロニダーゼ、リコンビナーゼ（例えば、Ｒａｇ−１、Ｒａｇ−２）が挙げられる。酵素は、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、タンパク質、神経伝達物質、生体異物（例、薬物）、または他の巨大分子の生合成、修飾、または分解に関与し得る。
【０１１７】
哺乳動物ゲノムは少なくとも約５００の異なるキナーゼをコードする。キナーゼは、一般的な基質の性質に基づいて分類することができ、これには、プロテインキナーゼ（すなわち、１つ以上のタンパク質（複数可）にリン酸を転移するキナーゼ）、脂質キナーゼ（すなわち、１つ以上の脂質（複数可）にリン酸基を転移するキナーゼ）、ヌクレオチドキナーゼなどを含む。プロテインキナーゼ（ＰＫ）は、本発明のある特定の態様において特に対象となるものである。ＰＫは、基質選択性に基づいて、セリン／スレオニンキナーゼ（Ｓ／ＴＫ）またはチロシンキナーゼ（ＴＫ）と呼ばれる場合が多い。セリン／スレオニンキナーゼ（ＥＣ２．７．１１．１）はセリン残基及び／またはスレオニン残基をリン酸化し、一方のＴＫ（ＥＣ２．７．１０．１及びＥＣ２．７．１０．２）はチロシン残基をリン酸化する。セリン／スレオニン残基及びチロシン残基の両方をリン酸化することができる「二重特異性」キナーゼ（ＥＣ２．７．１２．１）がいくつか知られている。ヒトプロテインキナーゼファミリーは、配列類似性／構造的類似性に基づいてさらに以下の群に分類することができる：（１）ＡＧＣキナーゼ−ＰＫＡ、ＰＫＣ、及びＰＫＧが含まれる；（２）ＣａＭキナーゼ−カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼが含まれる；（３）ＣＫ１−カゼインキナーゼ１群が含まれる；（４）ＣＭＧＣ−ＣＤＫ、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３及びＣＬＫキナーゼが含まれる；（５）ＳＴＥ−酵母Ｓｔｅｒｉｌｅ  ７、Ｓｔｅｒｉｌｅ  １１、及びＳｔｅｒｉｌｅ  ２０キナーゼの同族体が含まれる；（６）ＴＫ−チロシンキナーゼが含まれる；（７）ＴＫＬ−チロシン−キナーゼ様群のキナーゼが含まれる。さらに「非定型タンパク質キナーゼ」と呼ばれる群には、他の群との配列相同性はないが、キナーゼ活性を有することが知られているかまたは予測され、場合によっては定型キナーゼと同様の構造折り畳みを有すると予測されるタンパク質が含まれる。
【０１１８】
受容体としては、例えば、Ｇタンパク質共役型受容体、チロシンキナーゼ受容体、セリン／スレオニンキナーゼ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、核内受容体、免疫細胞表面受容体が挙げられる。いくつかの実施形態では、受容体は、本明細書で言及するホルモン、サイトカイン、成長因子、または分泌タンパク質のいずれかに対する受容体である。多数のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が当技術分野において公知である。例えば、Ｖｒｏｌｉｎｇ  Ｂ，ＧＰＣＲＤＢ：ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｊａｎ；３９（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３０９−１９．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｎｏｖ  ２を参照のこと。ＧＰＣＲＤＢは、ｇｐｃｒ．ｏｒｇ／７ｔｍ／にてオンラインで閲覧することができる。Ｇタンパク質共役受容体としては、例えば、アドレナリン受容体、カンナビノイド受容体、プリン受容体、神経ペプチド受容体、嗅覚受容体が挙げられる。転写因子（ＴＦ）（配列特異的ＤＮＡ結合因子と呼ばれる場合もある）は特異的なＤＮＡ配列に結合し、（単独でまたは他のタンパク質との複合体として）転写を制御、例えば転写を活性化または抑制する。例示的なＴＦは、例えば、ＴＲＡＮＳＦＡＣ（登録商標）データベース、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ｇｅｎｅｏｎｌｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）、またはＤＢＤ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ．ｏｒｇ）（Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ，ＤＢＤ−ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ  ｂｒｏａｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ：ｎｅｗ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００８  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍ９６４）に列挙されている。ＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の構造に基づいて分類することができる。例えば、ある特定の実施形態では、ＴＦは、ヘリックス−ループ−ヘリックス、ヘリックス−ターン−ヘリックス、翼状らせん、ロイシンジッパー、ｂＺＩＰ、ジンクフィンガー、ホメオドメイン、または副溝接触タンパク質を有するβ−足場因子である。転写因子として、例えば、ｐ５３、ＳＴＡＴ３、ＰＡＳファミリー転写因子（例えば、ＨＩＦファミリー：ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ２Ａ、ＨＩＦ３Ａ）、アリール炭化水素受容体が挙げられる。
【０１１９】
細胞または非ヒト哺乳動物の核酸を修飾または調節する他の方法は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３４３８７号及び米国出願第１４／７８５０３１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
目的を達成し、言及された結果及び利点、ならびにそれらに固有のものを得るのに、本発明が十分適していることを当業者は容易に理解できる。本明細書の説明及び実施例の詳細は、ある特定の実施形態を代表し、例示するものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。本発明の変形例及び他の用途を当業者は考案できるであろう。このような改変例は本発明の趣旨の範囲内に包含される。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に対して、様々な置き換え及び改変がなされ得ることは当業者には容易に明らかであろう。
【０１２１】
本明細書及び特許請求の範囲において、本明細書で使用される冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、これに反する記載のない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。ある群の１つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記載内容は、それに反する記載のない限り、または文脈から特に明らかでない限り、１つ、２つ以上、またはすべての群要素が所与の生成物または工程に存在する、用いられる、またはそれ以外の方法で関連する場合に満たされるとみなされる。本発明には、その群のちょうど１つの要素が所与の生成物または工程に存在するか、使用されるか、またはそれ以外の方法で関連する実施形態を含む。本発明にはまた、その群の２つ以上またはすべての要素が所与の生成物または工程に存在するか、使用されるか、またはそれ以外の方法で関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、特に記載のない限り、または齟齬もしくは矛盾が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、列挙された請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項（または、関連する場合には、他の任意の請求項）に従属する別の請求項で提起される、あらゆる変形例、組み合わせ、及び置き換えが可能であるものと理解されるべきである。本明細書に記載のすべての実施形態は、適切な場合には本発明の異なる態様すべてに適用可能であることが企図される。適切な場合はいつでも、実施形態または態様のうちのいずれかを、１つ以上の他のそのような実施形態または態様と自由に組み合わせできることも企図される。要素が列挙事項として提示されている箇所、例えばマーカッシュ群または同様の形式では、要素の各部分群も開示され、任意の要素（複数可）を群から除外できるものと理解されるべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むものとして言及されている場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様はそのような要素、特徴などからなる、または本質的にそれからなるものと理解されるべきである。簡潔にするために、これらの実施形態はいずれによらず、本明細書でそれほど多くの語数を費やして具体的に説明しているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様は、具体的な排除事項が本明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲から明示的に除外できることもまた理解されるべきである。例えば、任意の１つ以上の核酸、ポリペプチド、細胞、生物の種または種類、障害、対象、またはそれらの組み合わせを除外することができる。
【０１２２】
請求項または記載内容が組成物、例えば核酸、ポリペプチド、細胞、または非ヒトトランスジェニック動物に関する場合、特に記載のない限り、または齟齬もしくは矛盾が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される方法のうちのいずれかに従って組成物を作製または使用する方法、及び本明細書に開示される目的のいずれかに組成物を使用する方法が、本発明の態様であると理解されるべきである。請求項または記載内容が方法に関するものである場合、特に記載のない限り、または齟齬もしくは矛盾が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、例えば、その方法を実施するのに有用な組成物を作製する方法、及びその方法に従って作製された生成物が本発明の態様であると理解されるべきである。
【０１２３】
本明細書で範囲が指定されている場合、本発明には、端点を含む実施形態、両方の端点を除いた実施形態、及び一方の端点が含まれ他方が除外される実施形態が包含される。特に記載のない限り、両方の端点が含まれると想定されるべきである。さらに、特に記載のない限り、または文脈及び当業者の知見から明らかでない限り、範囲として表される値は、本発明の別の実施形態で指定された範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈から特に明示されない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１までと想定できるものと理解されるべきである。また、一連の数値が本明細書に指定されている場合、本発明は、任意の中間値または一連の任意の２つの値によって規定される範囲と近似的に関連する実施形態、及び下限値を最小値とし上限値を最大値とし得る実施形態を含むものと理解される。本明細書で使用される場合、数値はパーセンテージとして表される値を含む。数値の前に「約」または「ほぼ」が付されている本発明のどの実施形態についても、本発明は、正確な値を列挙している実施形態を包含する。数値の前に「約」または「ほぼ」が付されていない本発明のどの実施形態についても、本発明は、数値の前に「約」または「ほぼ」が付されている実施形態を包含する。「ほぼ」または「約」は、一般に、特に記載のない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が許容値の１００％を、許容できないほど超える場合を除いて）、ある数のいずれかの方向に（その数より大きいか、または小さい）１％の範囲内、またはいくつかの実施形態では、ある数の５％の範囲内、またはいくつかの実施形態では、ある数の１０％の範囲内に入る数を含む。それに反する明示のない限り、本明細書で特許請求される複数の動作を含む任意の方法において、方法の動作の順序は必ずしも方法の動作が列挙されている順序に限定されないが、本発明はその順序がそのように限定される実施形態を含むものと理解されるべきである。また、特に記載のない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載の任意の生成物または組成物は「単離された」とみなし得るものと理解されるべきである。
【０１２４】
これらの方法の具体例を実施例に記載する。
【実施例】
【０１２５】
この研究において、本発明者らは、ｄＣａｓ９とＴｅｔ１酵素ドメインまたはＤｎｍｔ３ａ酵素ドメインとの融合により、それぞれＤＮＡメチル化の標的化した消去または確立が可能になることを実証する。原理証明として、最初にマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）に２つの合成メチル化レポーターを組み込み、ＤＮＡメチル化への改変を誘導した。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１を利用して、ＤＮＡメチル化分野での長年にわたる疑問を再検討した。本発明者らの結果は、ＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化はマウス皮質ニューロンにおけるその発現を活性化するのに十分であり、またＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化は筋芽細胞への線維芽細胞のリプログラミングを促進し、筋管形成を促進することを示している。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａでは、ＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化により、ＣＴＣＦの動員を遮断し、標的ループ内の隔離されたスーパーエンハンサーとの相互作用頻度を増加させることによって、近接ループ内の遺伝子の発現を変化させることができる。さらに、標的ｇＲＮＡを付加したｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１をマウスにレンチウイルス送達し、そのプロモーターの脱メチル化によってメチル化レポーターのｉｎ  ｖｉｖｏ活性化を可能にした。このように、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａは、ＤＮＡメチル化の機能的意義を遺伝子座特異的に調べるための強力なツールとなる。
【０１２６】
ＤＮＡメチル化を編集するための改変ＣＲＩＳＰＲシステム
ＤＮＡメチル化の標的化された編集を実現するため、ｄＣａｓ９を、メチル化／脱メチル化経路の酵素と融合させた（図１Ａ）。特異的ＣｐＧを標的とするＴＡＬＥシステムを使用した以前の研究（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に基づいて、本発明者らのシステムでは、Ｔｅｔ１及びＤｎｍｔ３ａをエフェクターとして選択した。配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の同時発現は、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１またはｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａを特異的遺伝子座に標的化し、ＤＮＡ配列を変化させずにＤＮＡのメチル化状態の修飾を媒介することが期待される。このキメラＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９−エフェクターシステムを最適化するために、核移行シグナル（ＮＬＳ）を異なる位置に有する２種類のｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１レンチウイルス構築物：ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１及びＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１を試験した（図８Ａ及び８Ｂ）。また、ｇＲＮＡと呼ばれる広く使用されているキメラシングルガイドＲＮＡ（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）と、Ｅ−ｇＲＮＡと呼ばれる、意図するゲノム遺伝子座にＣａｓ９を誘導する能力を増強した修飾ガイドＲＮＡ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）という、２種類のｇＲＮＡレンチウイルス構築物を試験した。いずれのｇＲＮＡ構築物にも、レンチウイルス形質導入後のｇＲＮＡ発現細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を可能にする、独立したＣＭＶプロモーターによって駆動されるｐｕｒｏ選択カセット及びＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質カセットが含まれている（図８Ａ）。これらの構築物を特性決定したところ、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１構築物において頑強なｇＲＮＡ誘導性の核転座を示した（図８Ｃ〜８Ｅ）。したがって、ＤＮＡの非特異的修飾を最小限にするため、全試験においてこの構築物を選択した。２種類のｇＲＮＡは同様に挙動したため（図８Ｃ〜８Ｅ）、互換的に使用した。
【０１２７】
ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａは、ＣｐＧメチル化状態の標的化された変化を可能にする
ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ融合構築物がそれぞれ、特異的配列の脱メチル化またはｄｅ  ｎｏｖｏメチル化を誘導するかどうかを評価するため、以前に本発明者らの研究室で開発したメチル化レポーターシステムを利用した（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。このレポーターシステムは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を制御する合成メチル化感知プロモーター（インプリント遺伝子のプロモーター由来の保存配列要素、Ｓｎｒｐｎ）からなる。このレポーター構築物をゲノム遺伝子座に挿入すると、隣接配列のメチル化状態を正確に報告することが示された（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ、２０１５）。
【０１２８】
特異的ＣｐＧの脱メチル化：規定した配列を脱メチル化できるかどうかを試験するために、Ｄａｚｌプロモーターに挿入されたＳｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターを標的とする、ｇＲＮＡと組み合わせたｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１構築物を導入した（図１Ｂ及び図９Ａ）。Ｄａｚｌは生殖細胞特異的遺伝子で、高メチル化されており、ＥＳ細胞では活性ではないため、ＧＦＰレポーターを発現しない。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によるＧＦＰ発現を活性化するために、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域内の１４個のＣｐＧすべてを標的とする４個のｇＲＮＡを設計した。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及び４個のｇＲＮＡを同時発現するレンチウイルスベクターに３日間感染させた後、ｇＲＮＡ構築物から発現するＣｈｅｒｒｙ陽性シグナルが表れたいくつかの感染陽性細胞が、ＧＦＰのオンを示し始めた（図９Ｂ）。標的ｇＲＮＡを付加したｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１による活性化効率を評価するために、ＦＡＣＳを用いて両方のウイルスに感染した細胞を分析した。Ｃｈｅｒｒｙ陽性集団のうち、標的ｇＲＮＡでは細胞の約２６％がＧＦＰを活性化したが、スクランブルｇＲＮＡでは細胞の１％のみがＧＦＰ陽性であった（図１Ｃ及び図９Ｃ）。これらのＣｈｅｒｒｙ陽性の単一細胞をさらに培養し、ＥＳ細胞コロニーを形成させた。標的ｇＲＮＡを用いた細胞はＧＦＰを発現したが、スクランブルｇＲＮＡでは発現しなかった（図１Ｄ）。これらの細胞におけるＧＦＰの活性化がＳｎｒｐｎプロモーターの脱メチル化によって引き起こされることを確認するために、これらの試料から得たゲノムＤＮＡのバイサルファイトシーケンシングを行った。図１Ｅ〜図１Ｆに示すように、標的ｇＲＮＡを用いた細胞からの試料は、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域でのみ頑強な脱メチル化を示したが、隣接するＤａｚｌ遺伝子座では示さなかった。また、スクランブルｇＲＮＡを用いた細胞からの試料は非感染（モック）対照と同様のメチル化状態を示した。感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のうちのＧＦＰ陽性集団及びＧＦＰ陰性集団をさらに分析した。図９Ｄに示すように、二重陽性細胞（Ｃｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ＋）では、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域の方が頑強な脱メチル化が観察された。これらの結果は、増殖性細胞において、ｇＲＮＡを付加したｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１がＤＮＡメチル化の消去を標的化できることを裏付けている。
【０１２９】
特異的ＣｐＧのｄｅ  ｎｏｖｏメチル化：ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ融合タンパク質が、プロモーター配列のｄｅ  ｎｏｖｏメチル化及び遺伝子発現のサイレンシングを可能にするかどうかを評価するために、ＧａｐｄｈプロモーターにＳｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーターを有する細胞を使用した。Ｇａｐｄｈはメチル化されずＥＳ細胞で発現するため、これらの細胞はＧＦＰ陽性である（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。Ｇａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ＥＳＣを、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａと、Ｓｎｒｐｎプロモーターを標的とするｇＲＮＡまたはスクランブルｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスに感染させた後（図２Ａ及び図９Ｅ）、ＦＡＣＳ分析を行った。感染陽性（Ｃｈｅｒｒｙ陽性）集団のうち、標的ｇＲＮＡでは細胞の約１２％がＧＦＰを不活性化したが、スクランブルｇＲＮＡでは細胞の２％のみがＧＦＰ陰性であった（図２Ｂ及び図９Ｆ）。Ｃｈｅｒｒｙ陽性細胞が培養液中で増殖したとき、標的ｇＲＮＡを用いた細胞のＧＦＰ発現はオフのままであり、一方のスクランブルｇＲＮＡを用いた細胞及びモック対照はＧＦＰ陽性のままであった（図２Ｃ）。さらに、バイサルファイトシーケンシングによると、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／ｇＲＮＡの形質導入は、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域にはＤＮＡメチル化の有意な増加をもたらすが、隣接するＧａｐｄｈ領域には引き起こさないことを示した（図２Ｄ〜２Ｅ）。感染したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のうち、ＧＦＰ陽性集団及びＧＦＰ陰性集団をさらに分析したところ、Ｃｈｅｒｒｙ＋；ＧＦＰ−細胞ではＳｎｒｐｎプロモーター領域の方が頑強なメチル化を示した（図９Ｇ）。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ及びｇＲＮＡ両方のレンチウイルスの同時形質導入効率の低さによって生じ得る限界を解消するために、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムを使用することによって、ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ発現カセットをＧａｐｄｈ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰ  ｍＥＳ細胞株に組み込んだ（図９Ｈ）。同じグループの標的ｇＲＮＡの送達後のＦＡＣＳ分析によると、ＧＦＰ不活性化効率が２５％に増加することを示した（図２Ｆ及び図９Ｉ）。選別したＣｈｅｒｒｙ陽性細胞は、ドキシサイクリン処理時にＧＦＰ発現の消失を示し（図２Ｇ）、Ｓｎｒｐｎプロモーター領域でのメチル化が頑強であった（図２Ｈ）。本発明者らはまた、ＦＡＣＳによるｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ発現細胞の単離を可能にするｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰの新しい構築物を作製した。この構築物をｇＲＮＡと共にレンチウイルス送達した後、ＦＡＣＳで選別した二重陽性細胞（ＢＦＰ＋；Ｃｈｅｒｒｙ＋）において、約７０％のＧＦＰ不活性化効率が達成された（図９Ｊ）。
【０１３０】
要約すると、本発明者らの結果は、特異的ガイドＲＮＡによって標的化すると、分裂細胞において、上記のｄＣａｓ９融合構築物がそれぞれ効率的に、メチル化配列を脱メチル化（ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１）する、または非メチル化配列をｄｅ  ｎｏｖｏメチル化（ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ）することを示している。
【０１３１】
ｄＣａｓ９系とＴＡＬＥ系のメチル化編集の比較
ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／Ｄｎｍｔ３ａによるメチル化編集の有効性及び有効範囲をＴＡＬＥ系の方法と比較するために、以前に報告された、ＴＡＬＥ系の方法（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）によって編集された２つの遺伝子座を選択し、ＴＡＬＥ−Ｔｅｔ１／Ｄｎｍｔ３ａの結合部位と同じ部位にｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／Ｄｎｍｔ３を標的化する単一ｇＲＮＡを設計した。図１０Ａ及び図１０Ｃに示すように、ｐ１６遺伝子座を標的とする１つの単一ｇＲＮＡを付加したｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａは、ｐ１６プロモーターの３２０ｂｐ領域内で平均２５％のメチル化の増加を誘導したが、ＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａは６５０ｂｐ領域内で１３％しか増加を誘導しなかった。同様に、ＲＨＯＸＦ２遺伝子座を標的とする１つの単一ｇＲＮＡを付加したｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１は、ＲＨＯＸＦ２プロモーターの１５０ｂｐ領域内で平均２８％のメチル化の減少を誘導したが、ＴＡＬＥ−Ｔｅｔ１は２００ｂｐ領域内で１４％しか減少を誘導しなかった（図１０Ｂ〜図１０Ｃ）。これらの結果は、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／Ｄｎｍｔ３ａシステムがＴＡＬＥ系の方法よりもメチル化編集に対して高い有効性及び分解能を有することを示唆している。
【０１３２】
ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／Ｄｎｍｔ３ａを媒介したメチル化編集の特異性を評価するために、ｄＣａｓ９のＣｈＩＰ−ｓｅｑアッセイを実施し、図９Ａに記載のＤａｚｌ−Ｓｎｒｐｎ領域を標的とするｇＲＮＡの存在下で９つの結合部位を同定し、ｍｉＲ２９０遺伝子座に隣接するＣＴＣＦ結合部位を標的とするｇＲＮＡの存在下で１８の結合部位を同定した（以下の図１３Ａを参照）。図１０Ｄは、各群のｇＲＮＡについて同定された結合部位のうち、標的遺伝子座（Ｄａｚｌ−ＳｎｒｐｎまたはｍｉＲ２９０）がｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ（表Ｓ１）に対して最高レベルの結合を示したことを示す。各標的遺伝子座に対する２番目及び３番目に強い結合部位を図１０Ｅに示した。また、これらの遺伝子座のバイサルファイトシーケンシング分析によると、ごくわずかしかメチル化レベルの変化を示さなかったが（図１０Ｆ〜１０Ｇ）、おそらくこれは、標的遺伝子座と比較して、これらのオフターゲット遺伝子座ではｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ１の結合親和性が有意に低いことに起因する。これらの結果は、ｄＣａｓ９系のエピジェネティック編集が非常に特異的であり得ることを示している。
【０１３３】
ＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする脱メチル化はニューロンにおいてＢＤＮＦを活性化する
ＤＮＡ複製非依存性の能動的脱メチル化は有糸分裂後ニューロンにおいて作用することが提唱されている（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。有糸分裂後のニューロンにおいて能動的脱メチル化を誘導できるかどうかを試験するために、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１システムを応用し、ＢＤＮＦ遺伝子の制御を試験した。ＢＤＮＦの発現は、そのプロモーターＩＶの脱メチル化を伴う神経活動によって誘導される可能性がある（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。本発明者らは、ＢＤＮＦプロモーターＩＶの１１個のＣｐＧを標的とする４個のｇＲＮＡを設計し（図１１Ａ）、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１が、このプロモーターの脱メチル化を誘導することによってＢＤＮＦを活性化できるかどうかを決定した（図３Ａ）。初代ニューロン培養物を作製するための十分に確立された実験手順に従って（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、マウス皮質ニューロンをＥ１７．５の胚から単離し、２日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した（ＤＩＶ２）。図１１Ｂ及び図１１Ｄに示すように、ＫＣｌ処理により、検出可能な細胞増殖が認められない、これらのニューロンにおいてＢＤＮＦ発現を誘導した。培養３日目（ＤＩＶ３）のニューロンを、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１を発現するレンチウイルスベクター（４個のｇＲＮＡありまたはなし）にほぼ１００％の形質導入効率で感染させた（図１１Ｅ）。感染から４８時間後、培養物の一部をＫＣｌで処理してニューロン活性を誘導した。図３Ｂ〜図３Ｃに示すように、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ｇＲＮＡはＢＤＮＦ発現を約６倍誘導したが、ｇＲＮＡの非存在下ではｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１はわずかな誘導（２倍未満）しか示さず、触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）は誘導を示さなかった。重要な点として、同じ群のｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ｇＲＮＡは、別のニューロン活性誘導遺伝子（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）であるＮｐａｓ４の発現を誘導しなかった（図１１Ｆ）。ＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする各個々のｇＲＮＡとのｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１の同時形質導入は、２〜３倍のＢＤＮＦの誘導を示した（図１１Ｇ）。バイサルファイトシーケンシングを実施して、ＢＤＮＦプロモーターＩＶのメチル化状態を調べた。図３Ｄ〜図３Ｅに示すように、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ｇＲＮＡはｇＲＮＡ陰性対照とは対照的にこの領域のメチル化を有意に減少させたが、ＫＣｌ処理もまた、（転写開始部位を基準として）−１４８位、−６６位及び１９位でＣｐＧの脱メチル化を誘導した。
【０１３４】
本発明者らの結果は、ＢＤＮＦプロモーターＩＶの脱メチル化をｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ｇＲＮＡによって誘導することができ、その脱メチル化がＢＤＮＦ発現を活性化するのに十分であることを実証している。これらの実験には有糸分裂後のニューロンを使用したため、メチル化の消失は能動的脱メチル化に起因すると思われた。この結論をさらに裏付けるために、Ｔｅｔ支援型バイサルファイトシーケンシング（ＴＡＢ−ｓｅｑ）分析によって、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１が誘導する脱メチル化過程の経時的なＢＤＮＦプロモーターＩＶの５−ｈｍＣレベルを調べた。図１１Ｈに示すように、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｇＲＮＡレンチウイルスによる感染から４０時間後に５−ｈｍＣが検出され、６０時間後に減少した。同様に、５−ｈｍＣはＫＣｌ処理後にも検出された（図１１Ｉ）。バイサルファイトシーケンシング法では、非メチル化５−シトシン（５−Ｃ）と、５−ｈｍＣから生成される５−ホルミルシトシン／５−カルボキシルシトシン（５−ｆＣ／５−ｃａＣ）が区別されないため、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ｇＲＮＡによる標的化後に、一部のＣｐＧが５−ｆＣ／５−ｃａＣ修飾された可能性がある。しかしながら、ＡＢＴ−８８８（ＰＡＲＰの阻害剤）での処理による塩基除去修復経路の阻害は、ＫＣｌ処理によるＢＤＮＦの活性化を減少させ（図１１Ｊ）、ＢＤＮＦプロモーターＩＶの脱メチル化がＢＤＮＦ活性化に寄与することを示唆している。
【０１３５】
内因性Ｔｅｔ活性がニューロン活性刺激時にＢＤＮＦ発現を制御するのに必要であるかどうかを試験するために、Ｔｅｔ酵素を含むα−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼに対する競合阻害剤（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、２−ヒドロキシグルタル酸でＤＩＶ３ニューロンを処理した。図１１Ｋに示すように、Ｔｅｔ酵素活性の薬理学的阻害は、ＫＣｌ処理によるＢＤＮＦ発現の誘導を完全に無効にした。さらに、Ｔｅｔ１ヌル変異体をもつマウス初代皮質ニューロンは、ＢＤＮＦの活性化動態の有意な減弱を示したが（図１１Ｌ）、このことはニューロン活性の誘導に対する内因性Ｔｅｔの役割を裏付けている。
【０１３６】
ＭｙｏＤ遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化は、線維芽細胞の筋原性リプログラミングを促進する
ＭｙｏＤが主な制御因子として筋発達に果たす役割は、５−アザ（５−アザ−２’−デオキシシチジン）処理による線維芽細胞内のＤＮＡの脱メチル化がＭｙｏＤの活性化及びそれに続く筋芽細胞の変換と筋管形成をもたらすという観察によって初めて明らかにされた（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｌａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。図４Ａに示すように、ＭｙｏＤ遺伝子の５０ｋｂ上流領域内にある６つの筋特異的ＤＭＲが記載されており（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、ＤＭＲ−５は、ＭｙｏＤの公知の遠位エンハンサーと重複している（Ｂｒｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。線維芽細胞においてＤＭＲ−５の脱メチル化がＭｙｏＤを活性化するかどうかを試験するために、このＤＭＲを標的とする４つのｇＲＮＡを設計した（図１２Ａ）。５−アザを媒介したＭｙｏＤの活性化に以前に使用されたマウス胚性線維芽細胞からのサブクローン（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）であるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞における、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１のこれらのｇＲＮＡとの同時発現は、図４Ｂに示すように中程度（３倍）のＭｙｏＤ発現の誘導をもたらした。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ＭｙｏＤ  ＤＭＲ−５  ｇＲＮＡと５−アザ処理との組み合わせは、図１２Ｆに示すように、ＭｙｏＤの高誘導をもたらした。バイサルファイトシーケンシングでは、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及び標的ｇＲＮＡレンチウイルスで形質導入された選別感染陽性細胞のＤＭＲ−５領域においてメチル化の実質的な減少を示したが、触媒休止Ｔｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）またはスクランブルｇＲＮＡでは示さなかった（図４Ｃ〜図４Ｄ）。ＭｙｏＤ遠位エンハンサー領域の脱メチル化が線維芽細胞を筋細胞へとリプログラミングできるかどうかを調べるために、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びｇＲＮＡを発現するレンチウイルスにＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を感染させた。細胞を１４日間培養し、ＭｙｏＤ及びＭＨＣ（ミオシン重鎖、筋管特異的マーカー）の発現について分析した。図４Ｅ〜図４Ｆに示すように、ＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとのｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１の同時発現は、中程度の発現レベルのＭｙｏＤを誘導したが、５−アザ処理しない場合には筋管形成を誘導するには不十分であった。
【０１３７】
次に、筋管形成の誘導にとって、ＤＭＲ−５を標的とする脱メチル化が５−アザ処理と相乗作用を及ぼすかどうかを調べた（図１２Ｂ）。５−アザ処理後の筋管形成の過程を追跡するために、経時的実験を実施した。大きさの不均一な多核筋管（ＭＨＣ陽性）が処理後１４日で形成され始め、ＭｙｏＤ陽性細胞比と、筋管の密度及び大きさのいずれもがその後２５日目まで増加した（図１２Ｃ〜図１２Ｅ）。ＭｙｏＤ  ＤＭＲ−５を標的とするｇＲＮＡとのｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１の同時発現は、著しく成熟した多核ＭＨＣ＋クラスター（ＭＨＣ＋クラスターあたりの核数が２個超）によって証明されるように、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１のみ、またはＭｙｏＤ  ＤＭＲ−５  ｇＲＮＡを付加したｄＣ−ｄＴを発現する細胞と比較して、処理後１４日の筋管形成を促進した（図４Ｅ、図４Ｇ〜図４Ｈ）。処理後のより遅い時点（１６日）で細胞を分析したときにも同様の観察がなされた（図１２Ｇ〜１２Ｊ）。本発明者らの結果は、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ｇＲＮＡによるＭｙｏＤ遠位エンハンサーの脱メチル化が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において５−アザと相乗作用し、筋芽細胞の変換及び筋管形成を実質的に促進することを示唆している。
【０１３８】
ＣＴＣＦ結合部位を標的とするｄｅ  ｎｏｖｏメチル化は、ＣＴＣＦ媒介クロマチンループを変化させる
ＣＴＣＦは、クロマチン構造の全体的な構成において主要な役割を果たす高度に保存されたジンクフィンガータンパク質である（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ，２００９）。転写エンハンサーは通常、ＤＮＡループの形成を介してそれらの標的遺伝子と相互作用する（Ｇｉｂｃｕｓ  ａｎｄ  Ｄｅｋｋｅｒ，２０１３；Ｇｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｋａｇｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＤＮＡループは通常、隔離区域（ｉｎｓｕｌａｔｅｄ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）と呼ばれるより大きなＣＴＣＦ媒介ループ内に拘束され（Ｄｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｃｒｅｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、それにより、位相関連ドメイン（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ：ＴＡＤ）に寄与するループのクラスターを形成することができる（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｎｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。隔離区域のＣＴＣＦループアンカー部位が欠失すると、エンハンサーがループの外側に位置する遺伝子と不適切に相互作用し、その結果、外部遺伝子の発現を増加させる可能性がある（Ｄｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。興味深いことに、ＣＴＣＦのＤＮＡ認識部位のメチル化はＣＴＣＦ結合を遮断することが報告されている（Ｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，２０００；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。特異的ＣＴＣＦ部位のメチル化がＣＴＣＦ媒介クロマチンループを変化させることができるかどうかを試験するために、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａシステムを標的ＣＴＣＦアンカー部位に適用した（図５Ａ）。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａを２つのＣＴＣＦ部位に標的化する特異的ｇＲＮＡ（図１３）を設計し、ｄｅ  ｎｏｖｏメチル化がＣＴＣＦのルーピング機能を妨害するかどうかを調べた（図５Ｂ及び図５Ｆ）。ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ  ｍＥＳ細胞（図９Ｈ）を、ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させ、以降の分析に備え、形質導入細胞をＦＡＣＳで選別した。
【０１３９】
スーパーエンハンサーを保有するｍｉＲ２９０ループに隣接するＣＴＣＦ結合部位へのｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａの標的化（図５Ｂ）は、この部位でのＣｐＧのｄｅ  ｎｏｖｏメチル化を誘導した（図５Ｄ〜図５Ｅ）。形質導入細胞の遺伝子発現分析は、このスーパーエンハンサーを含む隔離区域の外側にあり、かつ標的ＣＴＣＦ部位の隣にあるＮｌｒｐ１２遺伝子の有意な上昇を示したが、ｍｉＲ２９０ループの内側に位置する遺伝子、またはＡＵ０１８０１及びＭｙａｄｍを含む他の隣接ループ内の遺伝子の発現には影響を及ぼさなかった（図５Ｃ）。同様に、別のスーパーエンハンサーを保有するＰｏｕ５ｆ１遺伝子ループに隣接するＣＴＣＦ結合部位へのｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａの標的化（図５Ｆ）は、ＣＴＣＦ結合配列でのＣｐＧのメチル化を誘導し（図５Ｈ〜図５Ｉ）、隣接ループ内に位置し、かつ標的ＣＴＣＦ部位の隣にあるＨ２Ｑ１０の発現を増加させたが、他の隣接ループ内のＰｏｕ５ｆ１遺伝子自体またはＴｃｆ１９遺伝子の発現には影響を及ぼさなかった（図５Ｇ）。いずれの標的ＣＴＣＦ部位についても、触媒不活性なＤｎｍｔ３ａ型（ｄＣ−ｄＤ）は、ｄＣ−Ｄによる場合と同様、メチル化レベルの変化または遺伝子発現を誘導しなかった（図５Ｃ〜図５Ｅ及び図５Ｇ〜図５Ｉ）。こうした観察は、これらのＣＴＣＦ部位が欠失するときに得られた結果（Ｄｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）と一致し、ＣＴＣＦ結合部位のメチル化がそのインシュレーター機能を妨害するという見解を裏付けるものである。
【０１４０】
ＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化が、隔離されたスーパーエンハンサーと活性化遺伝子との間の相互作用頻度を増加させるかどうかを試験するために、これらの遺伝子座でＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ（３Ｃ）アッセイを実施した。図６Ａに示すように、ｍｉＲ２９０ループ内のスーパーエンハンサーと隣接ループ内の新たに活性化された遺伝子（Ｎｌｒｐ１２）との間の相互作用頻度は有意に増加したが、Ｎｌｒｐ１２とＭｙａｄｍ遺伝子との間の相互作用は同じままであることから、この標的ＣＴＣＦループの立体構造が開放型であることを示す。相互作用頻度の増加がＣＴＣＦのアンカーの遮断によるものであることを確認するために、ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰアッセイを実施した。標的ゲノム部位へのＣＴＣＦの結合は、スクランブルｇＲＮＡ、他のＣＴＣＦ結合部位を標的とするｇＲＮＡ、またはｍｉＲ２９０標的ｇＲＮＡを付加した触媒不活性なｄＣ−ｄＤを用いた試料と比較して、ｍｉＲ２９０標的ｇＲＮＡを用いた試料において有意に減少し（図６Ｂ）、ＤＮＡメチル化がＣＴＣＦのアンカーを遮断し、それによってＣＴＣＦループの立体構造を変化させるという見解を裏付けた。第２のＣＴＣＦループ（Ｐｏｕ５ｆ１ループ）についても同様の実験群を実施し、隔離されたスーパーエンハンサーと新たに活性化される遺伝子（Ｈ２Ｑ１０）との間の相互作用頻度の増加、及びＣＴＣＦ結合部位を標的とするメチル化後のＣＴＣＦ結合の減少を実証した（図６Ｃ〜図６Ｄ）。
【０１４１】
要約すると、本発明者らの結果は、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａシステムを使用して、特異的ＣＴＣＦアンカー部位のメチル化状態を変化させることができ、それによってＣＴＣＦルーピング機能を妨害できることを実証している。
【０１４２】
ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１による遺伝子活性化のための内因性遺伝子座のｉｎ  ｖｉｖｏ脱メチル化
ｄＣａｓ９媒介ＤＮＡメチル化編集ツールを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでメチル化を変化させることができるかどうかを試験するために、以前に作製されたメチル化感受性レポーターマウスを利用した（図７Ａ、参考文献：Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｅｎｔ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ、編集者による審査中）。これらのトランスジェニックマウスにおいて、メチル化感受性Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰカセットをＤｌｋ１−Ｄｉｏ３遺伝子座に挿入して、その遺伝子間メチル化可変領域（ＩＧ−ＤＭＲ）のメチル化状態を報告した。この遺伝子座のＩＧ−ＤＭＲは精子形成期に父方のメチル化を獲得するため、ＧＦＰレポーター（ＩＧ−ＤＭＲＧＦ／Ｐａｔ）は、父方のＳｎｒｐｎ−ＧＦＰ対立遺伝子をもつヘテロ接合マウスで恒常的に抑制される（以下の参考文献を参照：Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｅｎｔ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ、編集者による審査中）。上記に示すように、Ｄａｚｌ遺伝子座のＧＦＰレポーターは、ｍＥＳ細胞において、標的プロモーターの脱メチル化によって活性化された（図１）。分化細胞において、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３遺伝子座ＧＦＰレポーターをｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によって活性化できるかどうかを評価するために、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔトランスジェニックマウスの尾部から成体マウス皮膚線維芽細胞を得て、さらにこれをｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡもしくはスクランブルｇＲＮＡとを発現するレンチウイルス、または触媒休止形態のＴｅｔ１（ｄＣ−ｄＴ）とＳｎｒｐｎ標的ｇＲＮＡとを発現するレンチウイルスによって形質導入した（図７Ａ）。図７Ｂ〜図７Ｃの結果から、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡ両方のレンチウイルスによって形質導入された場合に限り、約８０％のＣｈｅｒｒｙ（ｇＲＮＡ）陽性線維芽細胞でＧＦＰレポーターの活性化がみられる。さらにこの細胞のＦＡＣＳ分析により、この見解が裏付けられた（図１４Ａ〜図１４Ｃ）。
【０１４３】
ＤＮＡメチル化状態をｉｎ  ｖｉｖｏで修飾できるかどうかを調べるために、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔトランスジェニックマウスの腹側表皮部位３箇所をｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡに感染させた（図１４Ｄ）。細胞は低密度に感染し、いくつかの毛包にのみＣｈｅｒｒｙの発現がみられた。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡは、約８５％の感染皮膚真皮細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏでＧＦＰレポーター発現を活性化することができたが、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とスクランブルｇＲＮＡ、またはｄＣ−ｄＴとＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡは活性化できなかった（図７Ｈ、図１４Ｅ〜図１４Ｆ）。加えて、定位固定装置を用いて、ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔトランスジェニックマウスの脳にレンチウイルスベクターを感染させ、脳切片での標的化されたＤＮＡメチル化に対する効果を共焦点顕微鏡により分析した。起こり得る個体間変動を排除するために、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター、ならびに２つの陰性対照ベクターの組み合わせを同じ脳の異なる領域に注射した（図７Ｄ）。図７Ｅ〜図７Ｆに示すように、Ｃｈｅｒｒｙの発現によって示される３つすべてのレンチウイルスの組み合わせによる感染後、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターのみが、約７０％の活性化効率でＧＦＰレポーターを活性化したが、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とｓｃ  ｇＲＮＡまたはｄＣ−ｄＴとＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡを発現するベクターでは活性化しなかった（図７Ｇ）。
【０１４４】
考察
本研究では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをゲノム配列のメチル化状態の編集に転用した。触媒不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）をＴｅｔ１の触媒ドメイン（ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１）またはＤｎｍｔ３ａの触媒ドメイン（ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ）のいずれかに融合させ、標的配列のエピジェネティック状態を予測通りに変化させた。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によって標的化すると、メチル化及びサイレンシングされたＤａｚｌ遺伝子のプロモーター領域に挿入されたＧＦＰレポーターが脱メチル化及び活性化され、一方、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａによって標的化すると、能動的な非メチル化Ｇａｐｄｈ遺伝子のプロモーター領域に挿入されたＧＦＰレポーターがｄｅ  ｎｏｖｏメチル化及びサイレンシングされた。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１が有糸分裂後ニューロンの不活性ＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とする場合、プロモーターは脱メチル化され、活性化された。重要な点として、このツールは制御領域のメチル化状態と活性を予測通りに変化させた。すなわち、ＭｙｏＤの不活性遠位エンハンサーを標的とする脱メチル化はＭｙｏＤ遺伝子を活性化させ、筋肉分化を促進し、ＣＴＣＦアンカー部位を標的とするメチル化は、ＣＴＣＦ結合を阻害して、クロマチンループ間のインシュレーターとしての機能を妨害した。最後に、この編集ツールは制御配列のメチル化状態をｉｎ  ｖｉｖｏで変化させることができ、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１と標的ｇＲＮＡのレンチウイルスベクターをトランスジェニックマウスの真皮または脳に注入すると、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３インプリント遺伝子座のメチル化Ｓｎｒｐｎプロモーターが脱メチル化され、メチル化感知ＧＦＰレポーターが活性化された。
【０１４５】
動的ＤＮＡメチル化は、神経活動の解読に提唱されている（Ｓｗｅａｔｔ，２０１３）。例えば、ＫＣｌによるニューロンの処理は、ＢＤＮＦのプロモーターＩＶを脱サイレンシングし、プロモーター領域において、メチル化ＣｐＧの一部の脱メチル化に関連するＢＤＮＦ発現を誘導することが示されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１によってＢＤＮＦプロモーターＩＶを標的とした場合、メチル化ＣｐＧの広範な脱メチル化が観察され、培養物をＫＣｌで処理した場合と同程度にＢＤＮＦが活性化された。ニューロンは有糸分裂後であるため、プロモーター配列のｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１媒介脱メチル化は、以前に提唱されているように能動的脱メチル化の結果である可能性が高い（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，２０１４）。ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ｇＲＮＡによる標的化後、ＢＤＮＦプロモーターの一部のＣｐＧを５−ｆＣ／５−ｃａＣ修飾することが可能であるが、ＢＥＲ経路を阻害して５−ｆＣ／５−ｃａＣの非メチル化シトシンへの修復を阻止するとＢＤＮＦの発現は減少した。このことは、ＢＤＮＦプロモーターＩＶの脱メチル化がＢＤＮＦの活性化に寄与することを示唆した。重要な点として、本発明者らの結果は、ＢＤＮＦプロモーターＩＶの脱メチル化と遺伝子活性化との間の因果関係を立証している。
【０１４６】
細胞系統間の障壁としてのＤＮＡメチル化の役割が、５−アザを用いた処理による線維芽細胞中のＤＮＡの脱メチル化がＭｙｏＤを活性化し、筋管形成を媒介することができるという以前の観察（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｌａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）と一致する。線維芽細胞において、ＭｙｏＤのメチル化遠位エンハンサーにｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１を標的化すると、ＣｐＧの脱メチル化を誘導し、ＭｙｏＤの中程度の活性化をもたらしたが、筋芽細胞を形成することはできなかった。しかしながら、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１／ｇＲＮＡレンチウイルス形質導入を５−アザ処理と組み合わせると、５−アザ処理単独と比較して、筋芽細胞及び筋管形成の有意な増強が観察された。さらにＭｙｏＤの上流にある別のＤＭＲが同定されており（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、遠位エンハンサーと組み合わせた、これらの部位の脱メチル化は、線維芽細胞から筋芽細胞への効率的な変換の誘導に必要とされる可能性があると考えられる。
【０１４７】
哺乳動物の染色体構造の最近の研究により、クロマチンは、コヒーシン及びＣＴＣＦなどのクロマチン構造タンパク質が介在する位相関連ドメイン及び遺伝子ループで構成されていることが明らかにされている（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｓｅｉｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｏｆｕｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｚｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。新たに明らかになったデータによれば、高次クロマチン構造は発生期にエピジェネティックな情報を与え、がんでは頻繁に変化することが示唆されている（Ｆｌａｖａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｎａｒｅｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＣＴＣＦの認識配列がメチル化されるとＣＴＣＦの結合が阻害されることが報告されている（Ｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，２０００；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。２つのＣＴＣＦ結合部位へのｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａの標的化は、ＣＴＣＦ結合部位でＣｐＧのｄｅ  ｎｏｖｏメチル化を誘導して、標的ループ内の隔離されたスーパーエンハンサーと隣接ループ内の遺伝子との間の相互作用頻度の増加によって証明されるタンパク質のインシュレーター機能を妨害し、隣接ループ内の遺伝子の上方制御を引き起こした。これは、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａシステムが、クロマチン構造を操作し、かつ発生期及び疾患状況における機能的意義を評価するのに有用なツールであることを示唆している。
【０１４８】
本発明者らの結果は、エピジェネティックなエフェクターＴｅｔ１及びＤｎｍｔ３ａと融合されたｄＣａｓ９が、特異的ゲノム配列のＤＮＡメチル化を編集するための強力なツールボックスであることを示している。こうしたツールは、ＴＡＬＥ系の方法と比較すると、メチル化編集に対する有効性と分解能が高く、またｄＣａｓ９のＣｈＩＰ−ｓｅｑと、それに続く潜在的なオフターゲット結合遺伝子座のバイサルファイトシーケンシングにより、メチル化レベルのわずかな変化が明らかであり、適切に設計されたｇＲＮＡを用いて高度な特異性を達成できることを示唆した。これらのｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ１ツールは、遺伝子発現、細胞運命決定、及び高次クロマチン構造の構成などの多様な生物学的過程におけるＤＮＡメチル化の機能的意義について考察を得るのに有用であろう。
【０１４９】
実験手順
プラスミドの設計及び構築
ｐＪＦＡ３４４Ｃ７（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４９２３６）由来のＰＣＲ増幅Ｔｅｔ１触媒ドメイン、ＭＬＭ３７３９（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４９９５９）由来のＴｅｔ１不活性触媒ドメイン、またはｐｃＤＮＡ３−ｈＤＮＭＴ３Ａ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：３５５２１）由来のＤｎｍｔ３ａを、ＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位をもつ修飾ｐｄＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４４２４６）にクローニングした。次いで、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１またはｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｄｎｍｔ３ａをＰＣＲ増幅し、ＡｓｃＩ及びＥｃｏＲＩをもつＦＵＷベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：１４８８２）にクローニングしてレンチウイルスをパッケージングした。アニーリングしたオリゴ（ＮＬＳ）を、ＸｂａＩ及びＡｓｃＩをもつＦＵＷ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１に挿入することによってＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１をクローニングした。アニーリングしたオリゴを、ＡａｒＩ部位をもつｐｇＲＮＡプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４４２４８）に挿入することによって、ｇＲＮＡ発現プラスミドをクローニングした。ＦＵＷ構築物からＰＣＲ増幅したｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｔｅｔ１またはｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｄｎｍｔ３ａを、ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩをもつ改変型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）とライゲーションすることにより、ＰｉａｇｇｙＢａｃ−ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及びＰｉａｇｇｙＢａｃ−ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａをクローニングした。構築物はすべてトランスフェクション前に配列決定した。ｇＲＮＡの設計及び構築の際のプライマー情報を補足表Ｓ２に列挙する。関連プラスミドはＡｄｄｇｅｎｅプラスミドデータベースに寄託されている。ｐ１６遺伝子座を標的とするＴＡＬＥ−Ｄｎｍｔ３ａ構築物は、Ｋｌａｕｓ  Ｋａｅｓｔｎｅｒ博士から寄贈されたものであり、ＲＨＯＸＦ２遺伝子座を標的とするＴＡＬＥ−Ｔｅｔ１はＡｄｄｇｅｎｅ（プラスミド＃４９９４３）からのものである。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ及びｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１ＣＤならびにそれらの変異体の全長タンパク質配列を補足表Ｓ６に列挙する。
【０１５０】
細胞培養、レンチウイルスの作製、及び安定細胞株の生成
マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）を、標準ＥＳＣ培地を用いて、放射線照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養した。標準培地は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０ｕｇの組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び１％の非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（５００ｍｌ）であった（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手）。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、１０％ＦＢＳを含む標準ＤＥＭＥ培地で培養した。標準パッケージングベクター（ｐＣＭＶ−ｄＲ８．７４及びｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ）と共にＦＵＷ構築物またはｐｇＲＮＡ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、超遠心分離により濃縮することによって、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ、及びｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを作製した。ウイルス力価（Ｔ）は２９３Ｔ細胞に対する感染効率に基づいて、Ｔ＝（Ｐ＊Ｎ）／（Ｖ）により算出した。ここで、Ｔ＝力価（ＴＵ／ｕｌ）、Ｐ＝蛍光マーカーによる感染陽性細胞の％、Ｎ＝形質導入時の細胞数、Ｖ＝使用されたウイルスの総量である。なお、ＴＵは形質導入単位の略語である。ドキシサイクリン誘導性ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１またはｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ導入遺伝子が組み込まれた安定細胞株を生成するために、供給業者のプロトコールに従って、ＰｉｇｇｙＢａｃ−ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１またはＰｉｇｇｙＢａｃ−ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ構築物を、トランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドと共に、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に導入するか、またはＸｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｍＥＳＣ細胞に導入した。１０日間、Ｇ４１８（４００ｕｇ／ｍｌ）で処理して、安定導入された細胞を選別した。成体マウス線維芽細胞をＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／ＰＡＴレポーターマウスの尾部から得た。簡潔には、父性遺伝したＩＧ−ＤＭＲ−Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰメチル化レポーターをもつ３か月齢のマウスから、約２ｃｍ長のマウス尾部を得て、７０％ＥｔＯＨで滅菌した。約２ｍｍ×２ｍｍに切片化した尾部片を１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中にて５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶにより、３７℃で９０分間消化した。５ｍｌのＭＥＦ培地をチューブに添加して消化を停止させた。シリンジプラグを使用して穏やかに粉砕しながら、解離細胞を４０ｕｍセルストレーナーを通して押し出した。次に細胞を回収して培養し、ウイルス感染させた。本試験では感染後３日目に細胞を分析した。
【０１５１】
マウス株及び生殖戦略
Ｔｅｔ１変異型マウスは本発明者らの研究室で以前に作成した（Ｄａｗｌａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。本試験のＴｅｔ１  ＫＯマウスは、１２９及びＣ５７ＢＬ／６背景の混合マウスを継続して用いた。Ｔｅｔ１  ＫＯマウスを得るため、Ｔｅｔ１に関してヘテロ接合性である雄マウスと雌マウスを交配した。野生型マウスの初代皮質ニューロンを得るため、雄と雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを交配した。ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔメチル化レポーターマウス株を記載のように作製した（参考文献：Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｅｎｔ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ、編集者による審査中）。ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔレポーター対立遺伝子をもつ雄マウスをＣ５７ＢＬ／６の雌と交配させ、父性遺伝した対立遺伝子をもつ成体の子孫を作製し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡメチル化編集を分析した。マウスは施設のガイドラインに従って取り扱い、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＡＣ）及びＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＤＣＭ）による承認を受けた。
【０１５２】
マウスのウイルス感染及び組織試料の調製
マウスは施設のガイドラインに従って該当するレンチウイルスカクテルに感染させ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＡＣ）及びＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＤＣＭ）による承認を受けた。具体的には、マウスの皮膚に感染させるため、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とｓｃ  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルス、ｄＣ−ｄＴの不活性変異体と標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルス、及びｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１と標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを、ハミルトンシリンジによって、父性ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰレポーター対立遺伝子をもつ、深麻酔したマウス腹側の複数の真皮部位に送達した（図１４Ｄ）。マウスの脳に感染させるため、種々のレンチウイルス混合物を、定位固定装置（Ｌｅｉｃａ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、Ｍａｎｕａｌ  Ｆｉｎｅ  Ｄｒｉｖｅ搭載ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）によって、父性ＩＧ−ＤＭＲＧＦＰ／Ｐａｔレポーター対立遺伝子をもつ、深麻酔したマウスの以下の場所（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ａｎｄ  Ｐａｘｉｎｏｓマウス脳アトラスと関連）に送達した（図７Ｄ）：ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とｓｃ  ｇＲＮＡ（Ａ−Ｐ  ０．７０ｍｍ、Ｍ−Ｌ  １．５０ｍｍ、Ｄ−Ｖ  １．５０ｍｍ）、ｄＣ−ｄＴの不活性変異体とＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡ（Ａ−Ｐ  −１．９０ｍｍ、Ｍ−Ｌ  −１．５０ｍｍ、Ｄ−Ｖ  １．５０ｍｍ）、及びｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１とＳｎｒｐｎ  ｇＲＮＡ（Ａ−Ｐ  −１．９０ｍｍ、Ｍ−Ｌ  １．５０ｍｍ、Ｄ−Ｖ  １．５０ｍｍ）。ｄＣ−Ｔ／ｄＣ−ｄＴ及びｇＲＮＡレンチウイルスの力価は、それぞれ１．２×１０４  ＴＵ／ｕｌ及び１．２×１０５  ＴＵ／ｕｌである。感染から３日後にマウスを屠殺した。４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを用いた経心灌流によって動物を固定した。固定した皮膚パッド及び脳試料を切開し、４℃で一晩、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳで後固定した。脳試料をビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１１００）で厚さ１５０ｕｍに薄切し、皮膚試料をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ）で厚さ１０ｕｍに薄切した後、免疫組織化学分析を行った。ビブラトームで薄切するため、組織を３％アガロースゲルに包埋した。凍結薄切のため、最適切断温度（ＯＣＴ）コンパウンドに包埋する前に、組織を３０％スクロース／ＰＢＳで平衡化した。
【０１５３】
免疫組織化学分析、顕微鏡検査、及び画像解析
ニューロン、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、マウスＥＳ細胞、及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で、室温にて１０分間固定した。細胞をＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた１倍ＰＢＳ溶液）で透過処理した後、ＰＢＳＴ中の１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）でブロックした。次に、細胞を、５％ＮＤＳを加えたＰＢＳＴで適切に希釈した一次抗体と、室温で１時間または４℃で１２時間インキュベートし、室温にてＰＢＳＴで３回洗浄した後、５％ＮＤＳ及びＤＡＰＩを加えたＴＢＳＴ中で望ましい二次抗体とインキュベートし、核を対比染色した。細胞をＰＢＳＴで３回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を用いてスライドにマウントした。組織切片の免疫染色手順は以前に記載されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ａ）。簡潔には、切片を室温にて１時間、ＰＢＳＴ（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた１倍ＰＢＳ溶液）で透過処理した後、ＰＢＳＴ中の１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）でブロックした。次に、切片を、５％ＮＤＳを加えたＰＢＳＴ中で望ましい一次抗体と４℃で２４時間インキュベートし、室温にてＰＢＳＴで３回洗浄した後、５％ＮＤＳ及びＤＡＰＩを加えたＴＢＳＴ中で二次抗体とインキュベートし、核を対比染色した。切片をＰＢＳＴで３回洗浄した後、スライドにマウントした。本試験には、以下の抗体を使用した：ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ）、マウス抗Ｃａｓ９（７Ａ９、１：１０００、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＢＤＮＦ（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、ニワトリ抗ＭＡＰ２（１：１０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、マウス抗Ｔｕｊ１（１：１０００、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、ウサギ抗ＭｙｏＤ（Ｃ−２０、１：１０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウス抗ＭＨＣ（ＭＦ２０、１：１０００、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、マウス抗ＭｙｏＧ（Ｆ５Ｇ、１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡で画像を取得し、Ｚｅｎソフトウェア、ＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉ、及びＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで処理した。イメージングに基づく定量化については、特に指定しない限り、３〜５枚の代表的な画像を定量化し、データをＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈｐａｄを用いて平均±ＳＤでプロットした。
【０１５４】
ＦＡＣＳ分析
処理後のＧＦＰ陽性細胞及び／またはＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率を評価するために、処理細胞をトリプシンで解離させ、増殖培地中で単細胞懸濁液を調製し、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅにて製造業者のプロトコールに従ってＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターにかけた。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。
【０１５５】
マウス初代皮質ニューロン培養物、ＥＤＵ標識、及び神経誘導
解離したＥ１７．５皮質ニューロン培養物を、以前に記載されているような（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）野生型またはＴｅｔ１  ＫＯマウス胚から作製した。簡潔には、１倍ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ：１５１４０１２２）、１倍ピルビン酸塩（Ｇｉｂｃｏ：１１３６００７０）及び３０ｍＭグルコースを含有する氷冷した１倍ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ  １４１８５−０５２）でＥ１７．５皮質を解離させた。組織を約１ｍｍ３に切片化し、製造業者の指示に従ってパパイン神経組織解離システム（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で解離させた。ＮＭ５培地（５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２％Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ  １７５０４０４４）、１倍ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及び１倍ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ３５０５０−０６１））に細胞を再懸濁した。ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングした６ウェルプレートの各ウェルに１×１０６個の細胞を播種した。ＤＩＶ２で、細胞を２．５ｕＭのＡｒａＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−６６４５）で一晩処理して、有糸分裂アストロサイト及び神経前駆細胞の過剰な細胞分裂を排除した。ＤＩＶ３で培養物に新鮮なＮＭ５培地を供給し、続いて５０ｍＭ  ＫＣｌで膜脱分極するか、または好ましいレンチウイルスを感染させた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の最初から処理を始めたので、ＫＣｌ処理前に、培養中の基礎活性をサイレンシングするＡＰ５及びＴＴＸ（テトロドトキシン）の処理工程は省略した。ＥＤＵ標識については、初代神経細胞培養物を最終濃度１０ｕＭのＥＤＵで２４時間処理した後、製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってＣｌｉｃｋ−ｉｔ  ＥＤＵ標識手順を行った。細胞を固定して免疫組織化学分析を行うか、Ｔｒｉｚｏｌで溶解して全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲを行うか、または溶解してＤＮＡを抽出し、バイサルファイトシーケンシング分析を行った。
【０１５６】
線維芽細胞から筋芽細胞への変換アッセイ
筋芽細胞変換アッセイは以前に記載されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。簡潔には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚性線維芽細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種した後、ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１及び標的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させた。感染から２４時間後、細胞をビヒクル対照（ＨＥＰＥＳ緩衝液）または５−アザシチジン（１ｕＭ）で２４時間処理し、異なる時点で採取した後、分析した。マウスＭｙｏＤ遺伝子の上流のＤＭＲはヒト／マウスゲノム相同性に基づいて規定した（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１５７】
ウェスタンブロット
製造業者のプロトコールに従って、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９試薬によって、種々の構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、プロテイナーゼ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＩＰＡ緩衝液によって細胞を溶解し、標準的な免疫ブロット分析を行った。マウス抗Ｃａｓ９（１：１０００、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）及びマウスα−チューブリン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）抗体を使用した。
【０１５８】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
製造業者の指示に従って、Ｔｒｉｚｏｌ、続いてＤｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して細胞を回収した。第１鎖ｃＤＮＡの合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。定量ＰＣＲ反応物を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製し、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  ＡＢＩ装置で反応を実施した。ＲＴ−ｑＰＣＲのプライマー情報を補足表Ｓ３に列挙する。
【０１５９】
ＣｈＩＰアッセイ
ＣｈＩＰ実験は、以前に記載されている通りに実施した（Ｄｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。簡潔には、室温で１０分間、培地中１％ホルムアルデヒドによって細胞を架橋した後、０．１２５Ｍグリシンを５分間添加することにより反応を停止した。回収した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、３．５ｍｌの超音波処理緩衝液に再懸濁した。超音波処理は、氷水混合物中にて２４ワットで０．５分間のパルスオンと１分間の休止というサイクルを１０回実施した。次に、細胞溶解物を４℃、１４，０００ｘ  ｒｐｍで１０分間遠心した。５０ｕｌの上清をｇＤＮＡのインプットとして保存した。１０ｕｌの抗ＣＴＣＦ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：０７７２９）または抗Ｃａｓ９抗体（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を加え、４℃で一晩インキュベートした。５０ｕｌのプロテインＧダイナビーズを抗体−細胞溶解物の混合物に添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に、超音波処理緩衝液、高塩濃度（５００ｍＭ  ＮａＣｌ）の超音波処理緩衝液、ＬｉＣｌ洗浄緩衝液、及びＴＥ緩衝液でビーズを洗浄した。結合したタンパク質−ＤＮＡ複合体を６５℃のオーブンで１５分間インキュベートすることによってビーズから溶出させ、次いで６５℃で一晩リバースクロスリンクした。結合したＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製した後、ｑＰＣＲ分析または配列決定を行った。
【０１６０】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ解析
配列決定データを以前に報告された方法で分析した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ｂ）。リードをデマルチプレックスし、ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用して、最初の２５塩基をマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングし、１つのミスマッチを許容するユニークマッピングを求める。マッピングされたリードを折りたたみ、シーケンシングの深さに合わせて、各試料からランダムに同じ数のリード（約１５００万）をサンプリングする。ＭＡＣＳ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）をデフォルト設定で使用してピークを検出する。各試料に関して、他の５つの試料がそれぞれ対照として使用され、５つの対照すべてを上回って検出されたピークのみが候補ピークと規定される。バックグラウンドに対するエンリッチメントの倍率によって候補ピークをフィルタリングし、閾値を選択して、４つの対照試料（インプット、モックＩＰ、ｄＣａｓ９単独、及びスクランブルｇＲＮＡ）に、この閾値を超えるピークがないようにする。留意点として、４５Ｓ  ｒＲＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡにマッピングされたインプットでは、６つの候補ピークが分析から除外される。生データは次のリンクから入手可能である：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ｔｏｋｅｎ＝ｋｔｏｈｓｋｍｇｎｈｕｄｈｕｄ＆ａｃｃ＝ＧＳＥ８３８９０。
【０１６１】
バイサルファイト変換、ＰＣＲ、及び配列決定
製造業者の指示に従ってＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡのバイサルファイト変換を確立した。得られた修飾ＤＮＡを、第１ラウンドのネステッドＰＣＲ、続いて遺伝子座特異的ＰＣＲプライマー（補足表Ｓ３）を用いた第２ラウンドによって増幅した。第１ラウンドのネステッドＰＣＲは以下の通り実施した：９４℃で４分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ１〜３を１回繰り返す；９４℃で１分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ５〜７を３５回繰り返す；７２℃で５分間；１２℃に保つ。第２ラウンドのＰＣＲは以下の通りであった：９５℃で４分間；９４℃で１分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ２〜４を３５回繰り返す；７２℃で５分間；１２℃に保つ。得られた増幅産物をゲル精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングして配列決定した。バイサルファイトシーケンシングのプライマー情報を補足表Ｓ４に列挙する。
【０１６２】
遺伝子座特異的ＴＡＢ−ｓｅｑ
ＴＡＢ−Ｓｅｑは、以前に記載されている通りに実施した（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。簡潔には、処理したマウス皮質ニューロンから得たゲノムＤＮＡ１ｕｇを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｎｇ／ｍｌのモデルＤＮＡ、２００ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇｌｃ、及び１ｍＭ  ｂＧＴを含有する溶液中にて３７℃で１時間グルコシル化した。反応後、ＤＮＡをカラム精製した。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）、１ｍＭ  α−ケトグルタル酸、２ｍＭアスコルビン酸、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、１５ｎｇ／ｍｌグルコシル化ＤＮＡ、及び３ｍＭ組換えｍＴｅｔ１を含有する溶液中で酸化反応を行った。反応物を３７℃で１時間インキュベートした。プロテイナーゼＫで処理後、ＤＮＡをカラム精製し、次いで供給者の指示に従ってＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にかけた。得られた修飾ＤＮＡを、第１ラウンドのネステッドＰＣＲ、続いて遺伝子座特異的ＰＣＲプライマー（補足表Ｓ３）を用いた第２ラウンドによって増幅した。得られた増幅産物をゲル精製し、ｐＪＥＴクローニングベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングして配列決定した。バイサルファイトシーケンシングのプライマー情報を補足表Ｓ４に列挙する。
【０１６３】
ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＣａｐｔｕｒｅ（３Ｃ）アッセイ
５×１０６のｍＥＳＣを１％ホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定し、０．１２５Ｍグリシンによって反応物を室温で５分間クエンチした。架橋細胞を回収し、１ｍｌの氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを５５０μｌの溶解緩衝液（ｐＨ８．０を有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、及びプロテイナーゼ阻害剤を含む０．２％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ６３０）で再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした。次に、細胞ペレットを１倍ＮＥＢ緩衝液２（ＮＥＢ、Ｂ７００２Ｓ）で２回洗浄した後、５０μｌの０．５％ＳＤＳと６２℃で１０分間インキュベートした。加熱後、１４５μｌのＨ２Ｏ及び２５μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。２５μｌの１０倍ＮＥＢ緩衝液２及び１００ＵのＢｇｌＩＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４４Ｓ）を添加してクロマチンを３７℃で一晩消化した。消化反応物を６２℃で２０分間インキュベートすることにより不活性化した。次に、７１３μｌのＨ２Ｏ、１２０μｌの１０倍Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ、Ｂ０２０２）、１００μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１２μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、及び５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２）を添加し、１６℃で２２時間インキュベートした。クロマチンをリバースクロスリンクし、ＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ、Ｐ３８０３）抽出により精製した。ｍｉＲ２９０及びＰｏｕ５ｆ１遺伝子座における３Ｃ相互作用（図６Ａ及び図６Ｃ）を、カスタムのＴａｑｍａｎプローブを使用した定量リアルタイムＰＣＲによって分析した。ｑＰＣＲ反応中のＤＮＡの量は、Ａｃｔｂ遺伝子座を標的とするカスタムのＴａｑｍａｎプローブを使用して、３Ｃライブラリーにわたり正規化した。プライマー及びプローブの配列を補足表Ｓ５に列挙する。
【０１６４】
補足表
補足表Ｓ１：ｄＣａｓ９  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ（配列番号１〜３５）
【表１】
2019528068.tif 000003
【０１６５】
補足表Ｓ２：ガイドＲＮＡを構築するためのプライマー配列
【表２−１】
2019528068.tif 000004
【表２−２】
2019528068.tif 000005
【表２−３】
2019528068.tif 000006
【表２−４】
2019528068.tif 000007
【０１６６】
補足表Ｓ３：ｑＰＣＲプライマー
【表３−１】
2019528068.tif 000008
【表３−２】
2019528068.tif 000009
【０１６７】
補足表Ｓ４：バイサルファイトシーケンシングのプライマー
【表４−１】
2019528068.tif 000010
【表４−２】
2019528068.tif 000011
【０１６８】
補足表Ｓ５：３Ｃアッセイのプライマー
【表５−１】
2019528068.tif 000012
【表５−２】
2019528068.tif 000013
【０１６９】
補足表Ｓ６：ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ／Ｔｅｔ及び変異体の全長タンパク質配列
ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ（ｄＣ−Ｄ）（配列番号１５７）
【化１】
2019528068.tif 000014
【０１７０】
ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ＿ＩＭ（ｄＣ−ｄＤ、Ｄｎｍｔ３ａの不活性変異体型）（配列番号１５８）
【化２】
2019528068.tif 000015
【０１７１】
ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１ＣＤ（ｄＣ−Ｔ）（配列番号１５９）
【化３】
2019528068.tif 000016
【０１７２】
ｄＣａｓ９−Ｔｅｔ１ＣＤ＿ＩＭ（ｄＣ−ｄＴ、Ｔｅｔ１の不活性変異体型）（配列番号１６０）
【化４−１】
2019528068.tif 000017
【化４−２】
2019528068.tif 000018
【０１７３】
ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ（配列番号１６１）
【化５−１】
2019528068.tif 000019
【化５−２】
2019528068.tif 000020
参考文献（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）：
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Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｃｈａｎｇ，Ｑ．，Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．，Ｗｅｓｔ，Ａ．Ｅ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｅ．Ｃ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．（２００３）．Ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢＤＮＦ    ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ    ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ    ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｅＣＰ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２，８８５−８８９．
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Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．Ｂ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３．
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Ｄｏｉ，Ａ．，Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ．，Ｗｅｎ，Ｂ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｐ．，Ａｒｙｅｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｉｒｉｚａｒｒｙ，Ｒ．，Ｈｅｒｂ，Ｂ．，Ｌａｄｄ−Ａｃｏｓｔａ，Ｃ．，Ｒｈｏ，Ｊ．，Ｌｏｅｗｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｓｈｏｒｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４１，１３５０−１３５３．
Ｄｏｗｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｆａｎ，Ｚ．Ｐ．，Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ｒｅｎ，Ｇ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．Ｎ．，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａ．Ｓ．，Ｓｃｈｕｉｊｅｒｓ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，Ｚｈａｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｇｅｎｅｓ  ｏｃｃｕｒｓ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌａｔｅｄ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ  １５９，３７４−３８７．
Ｅｂｅｒｔ，Ｄ．Ｈ．，Ｇａｂｅｌ，Ｈ．Ｗ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．，Ｋａｓｔａｎ，Ｎ．Ｒ．，Ｈｕ，Ｌ．Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．，Ｎａｖａｒｒｏ，Ａ．Ｊ．，Ｌｙｓｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｋｉｅｒｔ，Ｒ．，Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｅＣＰ２  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ３０８  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＮＣｏＲ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，３４１−３４５．
Ｆｌａｖａｈａｎ，Ｗ．Ａ．，Ｄｒｉｅｒ，Ｙ．，Ｌｉａｕ，Ｂ．Ｂ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｖｅｎｔｅｉｃｈｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｓｔｅｍｍｅｒ−Ｒａｃｈａｍｉｍｏｖ，Ａ．Ｏ．，Ｓｕｖａ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．（２０１６）．Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＩＤＨ  ｍｕｔａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２９，１１０−１１４．
Ｇｉｂｃｕｓ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｊ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３Ｄ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４９，７７３−７８２．
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｍｏｒｓｕｔ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｂｒａｒ，Ｇ．Ａ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．，Ｂｒａｎｄｍａｎ，Ｏ．，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｅ．Ｈ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  １５４，４４２−４５１．
Ｇｏｒｋｉｎ，Ｄ．Ｕ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｅｎ，Ｂ．（２０１４）．Ｔｈｅ  ３Ｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １４，７６２−７７５．
Ｇｕｏ，Ｊ．Ｕ．，Ｓｕ，Ｙ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｃ．，Ｍｉｎｇ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｈ．（２０１１）．Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｂｙ  ＴＥＴ１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｃｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ．Ｃｅｌｌ  １４５，４２３−４３４．
Ｈｉｌｔｏｎ，Ｉ．Ｂ．，Ｄ’Ｉｐｐｏｌｉｔｏ，Ａ．Ｍ．，Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｇ．Ｅ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．（２０１５）．Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３，５１０−５１７．
Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．，Ｂｅａｒｄ，Ｃ．，Ｇａｏ，Ｑ．，Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ，Ｍ．，ＤｅＫｅｌｖｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｋａｔｉｂａｈ，Ｇ．Ｅ．，Ａｍｏｒａ，Ｒ．，Ｂｏｙｄｓｔｏｎ，Ｅ．Ａ．，Ｚｅｉｔｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｉｌｅｎｔ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＥＳＣｓ  ａｎｄ  ｉＰＳＣｓ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７，８５１−８５７．
Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｋｉａｎｉ，Ｓ．，Ｌａｉ，Ｃ．Ｓ．，Ｇａｏ，Ｑ．，Ｃａｓｓａｄｙ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｙ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，７３１−７３４．
Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｉｒｄ，Ａ．（２００３）．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｈｏｗ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３３  Ｓｕｐｐｌ，２４５−２５４．
Ｊｉ，Ｘ．，Ｄａｄｏｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｂ．Ｅ．，Ｆａｎ，Ｚ．Ｐ．，Ｂｏｒｇｅｓ−Ｒｉｖｅｒａ，Ｄ．，Ｓｈａｃｈａｒ，Ｓ．，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ａ．Ｓ．，Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ｐｅｇｏｒａｒｏ，Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．３Ｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １８，２６２−２７５．
Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．，Ｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．（２０１２）．Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１．
Ｋａｇｅｙ，Ｍ．Ｈ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｉｌｏｄｅａｕ，Ｓ．，Ｚｈａｎ，Ｙ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｄ．Ａ．，ｖａｎ  Ｂｅｒｋｕｍ，Ｎ．Ｌ．，Ｅｂｍｅｉｅｒ，Ｃ．Ｃ．，Ｇｏｏｓｓｅｎｓ，Ｊ．，Ｒａｈｌ，Ｐ．Ｂ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｍｅｄｉａｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏｈｅｓｉｎ  ｃｏｎｎｅｃｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６７，４３０−４３５．
Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｓｏｎｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｙｕｎ，Ｊ．，Ｊｅｏｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｐ．，Ｈａｎ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｔ．Ｙ．（２０１５）．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴＣＦ／ｃｏｈｅｓｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｏｒｄｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＰＴＧＳ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３４，５６７７−５６８４．
Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｍ．Ｄ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．，Ｂａｒｃｅｎａ，Ｃ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，５８３−Ｕ３３２．
Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（１９９６）．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３０，４４１−４６４．
Ｌａｎｄａｕ，Ｄ．Ａ．，Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｋ．，Ｚｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｏｙｌｅ，Ｐ．，Ｆａｎ，Ｊ．，Ｇｕ，Ｈ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｋ．，Ｓｏｕｇｎｅｚ，Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｌｏｃａｌｌｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍｓ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ  ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２６，８１３−８２５．
Ｌａｓｓａｒ，Ａ．Ｂ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．（１９８６）．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｌｏｃｕｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  １０Ｔ１／２  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  ４７，６４９−６５６．
Ｌｉ，Ｅ．，Ｂｅｓｔｏｒ，Ｔ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（１９９２）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  ６９，９１５−９２６．
Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｂｌｏｏｄｇｏｏｄ，Ｂ．Ｌ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｐａｎ，Ａ．Ｄ．，Ｋｏｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｔ．Ｋ．，Ｈｕ，Ｌ．Ｓ．，Ｍａｌｉｋ，Ａ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．（２００８）．Ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｎｐａｓ４．Ｎａｔｕｒｅ  ４５５，１１９８−１２０４．
Ｌｉｓｔｅｒ，Ｒ．，Ｍｕｋａｍｅｌ，Ｅ．Ａ．，Ｎｅｒｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｕｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｐｕｄｄｉｆｏｏｔ，Ｃ．Ａ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．，Ｌｕｃｅｒｏ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｄｗｏｒｋ，Ａ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，６２９−＋．
Ｌｉｓｔｅｒ，Ｒ．，Ｐｅｌｉｚｚｏｌａ，Ｍ．，Ｄｏｗｅｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｄ．，Ｈｏｎ，Ｇ．，Ｔｏｎｔｉ−Ｆｉｌｉｐｐｉｎｉ，Ｊ．，Ｎｅｒｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｌ．，Ｙｅ，Ｚ．，Ｎｇｏ，Ｑ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓ  ａｔ  ｂａｓｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｈｏｗ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６２，３１５−３２２．
Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ａｎｇｓｔｍａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｌｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｃａｓｃｉｏ，Ｖ．Ｍ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，Ｈｏ，Ｑ．Ｈ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＴＡＬＥ−ＴＥＴ１  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，１１３７−１１４２．
Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｇｕｅｌｌ，Ｍ．，ＤｉＣａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．，Ｎｏｒｖｉｌｌｅ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．（２０１３）．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６．
Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｃｈ，Ｋ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｄ．，Ｗｕ，Ｈ．，Ｆｏｕｓｅ，Ｓ．，Ｈｅ，Ｆ．，Ｈｕ，Ｙ．，Ｆａｎ，Ｇ．，ａｎｄ    Ｓｕｎ，Ｙ．Ｅ．（２００３）．ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＢＤＮＦ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２，８９０−８９３．
Ｎａｒｅｎｄｒａ，Ｖ．，Ｒｏｃｈａ，Ｐ．Ｐ．，Ａｎ，Ｄ．，Ｒａｖｉｒａｍ，Ｒ．，Ｓｋｏｋ，Ｊ．Ａ．，Ｍａｚｚｏｎｉ，Ｅ．Ｏ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．（２０１５）．ＣＴＣＦ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｈｏｘ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４７，１０１７−１０２１．
Ｎｏｒａ，Ｅ．Ｐ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｅ．Ｇ．，Ｇｉｏｒｇｅｔｔｉ，Ｌ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｓｅｒｖａｎｔ，Ｎ．，Ｐｉｏｌｏｔ，Ｔ．，ｖａｎ  Ｂｅｒｋｕｍ，Ｎ．Ｌ．，Ｍｅｉｓｉｇ，Ｊ．，Ｓｅｄａｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓｐａｔｉａｌ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｘ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８５，３８１−３８５．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｃｒｅｍｉｎｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｓａｕｒｉａ，Ｍ．Ｅ．，Ｓａｎｙａｌ，Ａ．，Ｇｅｒａｓｉｍｏｖａ，Ｔ．Ｉ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｂｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，Ｏｎｇ，Ｃ．Ｔ．，Ｈｏｏｋｗａｙ，Ｔ．Ａ．，Ｇｕｏ，Ｃ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ｓｈａｐｅ  ３Ｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  １５３，１２８１−１２９５．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ，Ｖ．Ｇ．（２００９）．ＣＴＣＦ：ｍａｓｔｅｒ  ｗｅａｖｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  １３７，１１９４−１２１１．
Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｉｍ，Ｗ．Ａ．（２０１３）．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １５２，１１７３−１１８３．
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｋ．Ｄ．（２００５）．ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ６，５９７−６１０．
Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｍ．Ｄ．，Ｈｅ，Ｙ．，Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｈａｒｉｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｍｕｋａｍｅｌ，Ｅ．Ａ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．，Ｒａｊａｇｏｐａｌ，Ｎ．，Ｎｅｒｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｕｒｉｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｈｕｍａｎ  ｂｏｄｙ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ  ｍａｐｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２３，２１２−２１６．
Ｓｅｉｔａｎ，Ｖ．Ｃ．，Ｆａｕｒｅ，Ａ．Ｊ．，Ｚｈａｎ，Ｙ．，ＭｃＣｏｒｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｂ．Ｒ．，Ｉｎｇ−Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｅ．，Ｌｅｎｈａｒｄ，Ｂ．，Ｇｉｏｒｇｅｔｔｉ，Ｌ．，Ｈｅａｒｄ，Ｅ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｃｏｈｅｓｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎａｂｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２３，２０６６−２０７７．
Ｓｍｉｔｈ，Ｚ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．（２０１３）．ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １４，２０４−２２０．
Ｓｏｆｕｅｖａ，Ｓ．，Ｙａｆｆｅ，Ｅ．，Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｕ，Ｄ．，Ｖｉｅｔｒｉ  Ｒｕｄａｎ，Ｍ．，Ｍｉｒａ−Ｂｏｎｔｅｎｂａｌ，Ｈ．，Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｃｈｒｏｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｔａｎａｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｈａｄｊｕｒ，Ｓ．（２０１３）．Ｃｏｈｅｓｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｒｇａｎｉｚｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ３２，３１１９−３１２９．
Ｓｔｅｌｚｅｒ，Ｙ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ，Ｃ．Ｓ．，Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．，Ｍａｒｋｏｕｌａｋｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１５）．Ｔｒａｃｉｎｇ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １６３，２１８−２２９．
Ｓｗｅａｔｔ，Ｊ．Ｄ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ８０，６２４−６３２．
Ｔａｎｇ，Ｚ．，Ｌｕｏ，Ｏ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｚａｌａｊ，Ｐ．，Ｔｒｚａｓｋｏｍａ，Ｐ．，Ｍａｇａｌｓｋａ，Ａ．，Ｗｌｏｄａｒｃｚｙｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｚｃｚｙｃｋｉ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．ＣＴＣＦ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ３Ｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １６３，１６１１−１６２７．
Ｖｏｊｔａ，Ａ．，Ｄｏｂｒｉｎｉｃ，Ｐ．，Ｔａｄｉｃ，Ｖ．，Ｂｏｃｋｏｒ，Ｌ．，Ｋｏｒａｃ，Ｐ．，Ｊｕｌｇ，Ｂ．，Ｋｌａｓｉｃ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｚｏｌｄｏｓ，Ｖ．（２０１６）．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４，５６１５−５６２８．
Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｍａｕｒａｎｏ，Ｍ．Ｔ．，Ｑｕ，Ｈ．，Ｖａｒｌｅｙ，Ｋ．Ｅ．，Ｇｅｒｔｚ，Ｊ．，Ｐａｕｌｉ，Ｆ．，Ｌｅｅ，Ｋ．，Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｔ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｍ．，Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ＣＴＣＦ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２，１６８０−１６８８．
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｃｏａｔｅｓ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｅ，Ａ．Ｌ．，Ｊｒ．（２００７）．ＰｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５，１３９−１４５．
Ｗｕ，Ｈ．，Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｈ．，Ｒａｔｔｎｅｒ，Ａ．，Ｍｏ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ，Ｐ．Ｍ．，Ｅｒｌａｎｇｅｒ，Ｂ．，Ｗｈｅｅｌａｎ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｊ．（２０１４ａ）．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｎ  ８１，１０３−１１９．
Ｗｕ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｙ．（２０１４）．Ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  １５６，４５−６８．
Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｋｒｉｚ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈｉｕ，Ａ．Ｃ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｄａｄｏｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４ｂ）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃａｓ９  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２，６７０−６７６．
Ｘｕ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｉｔｏ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．，Ｘｉａｏ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９，１７−３０．
Ｘｕ，Ｘ．，Ｔａｏ，Ｙ．，Ｇａｏ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｚｏｕ，Ｗ．，Ｒｕａｎ，Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｘｕ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｕ，Ｒ．（２０１６）．Ａ  ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２，１６００９．
Ｙｕ，Ｍ．，Ｈｏｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｓｚｕｌｗａｃｈ，Ｋ．Ｅ．，Ｓｏｎｇ，Ｃ．Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｋｉｍ，Ａ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｄａｉ，Ｑ．，Ｓｈｅｎ，Ｙ．，Ｐａｒｋ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｂａｓｅ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  １４９，１３６８−  １３８０．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｔ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｅｅｃｋｈｏｕｔｅ，Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｕｓｂａｕｍ，Ｃ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ（ＭＡＣＳ）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ９，Ｒ１３７．
Ｚｕｉｎ，Ｊ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｒｅｉｊｄｅｎ，Ｍ．Ｉ．，Ｙｅ，Ｚ．，Ｋｏｌｏｖｏｓ，Ｐ．，Ｂｒｏｕｗｅｒ，Ｒ．Ｗ．，ｖａｎ  ｄｅ  Ｃｏｒｐｕｔ，Ｍ．Ｐ．，ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｒｋｅｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｋｎｏｃｈ，Ｔ．Ａ．，ｖａｎ，Ｉ．Ｗ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｃｏｈｅｓｉｎ  ａｎｄ  ＣＴＣＦ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１１，９９６−１００１．
２０１４年４月１６日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３４３８７号及び２０１６年３月２３日出願の米国出願第１５／０７８，８５１号
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月22日(2019.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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