(57)【要約】  サンプルにおいてＢＣＭＡの発現を測定することにより、患者の多発性骨髄腫の予後を決定するための方法が提供される。また、サンプルにおいてＢＣＭＡの発現を測定することおよび有効量の、ＢＣＭＡと結合する抗原結合タンパク質を投与することにより、多発性骨髄腫を処置するための方法も提供される。また、サンプルにおいてＢＣＭＡ発現を測定するためのキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において多発性骨髄腫の予後を決定するための方法であって、
（ａ）前記対象からサンプルを得る工程；および
（ｂ）前記サンプルのＢＣＭＡ発現のレベルを試験する工程
を含んでなり、前記対象が高レベルのＢＣＭＡ発現を有すれば、その患者の多発性骨髄腫の予後は不良である、方法。
【請求項２】
ＢＣＭＡ発現のレベルがフローサイトメトリーを用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＣＭＡ発現のレベルが、ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合を測定することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合が６０％を超える場合に高い、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
形質細胞がＢＬＩＭＰ１発現により同定される、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合が、ＢＣＭＡ＋でもあるＢＬＩＭＰ＋細胞の割合を計算することにより決定されるＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアを用いて計算される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアが４より大きい場合に高い、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象由来のサンプルにおいて高レベルのＢＣＭＡ発現を特徴とする、不良な予後を有すると分類された対象における多発性骨髄腫の処置において使用するための、ＢＣＭＡと特異的に結合する抗原結合タンパク質。
【請求項９】
脱フコシル化されている、請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
ＴＡＣＩと結合しない、請求項８または請求項９に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号３または配列番号３の変異体のＣＤＲＨ３を含んでなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１のＣＤＲＨ１；配列番号２のＣＤＲＨ２；配列番号４のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；および／または配列番号６のＣＤＲＬ３のうちの少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
ｉ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ３
ｉｉ）配列番号１に示されるＣＤＲＨ１；および
ｉｉｉ）配列番号２に示されるＣＤＲＨ２
を含んでなる、請求項１２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
ｉ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ３
ｉｉ）配列番号１に示されるＣＤＲＨ１
ｉｉｉ）配列番号２に示されるＣＤＲＨ２
ｉｖ）配列番号４に示されるＣＤＲＬ１
ｖ）配列番号５に示されるＣＤＲＬ２；および
ｖｉ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ３
を含んでなる、請求項１３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号１１または配列番号１３または配列番号１５のいずれか１つによりコードされる重鎖可変領域を含んでなる、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号１７または配列番号１９のいずれか１つによりコードされる軽鎖可変領域を含んでなる、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号１１によりコードされる重鎖可変領域および配列番号１７によりコードされる軽鎖可変領域を含んでなる、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
ヒト化モノクローナル抗体である、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
キメラ抗原受容体である、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
抗体がＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離されたＶＨ、および単離されたＶＬから選択されるフラグメントである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＣＤＲを含んでなる抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
ＢＣＭＡと１５０ｐＭより強い親和性で結合する、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
細胞傷害性薬剤をさらに含んでなる、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
細胞傷害性薬剤にリンカーを介して連結された、請求項２３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
細胞傷害性薬剤がオーリスタチンおよびドロスタチンから選択される、請求項２３または２４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
細胞傷害性薬剤がＭＭＡＥおよびＭＭＡＦから選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
細胞傷害性薬剤が前記抗原結合タンパク質に共有結合される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２８】
前記リンカーが切断可能リンカーである、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２９】
前記リンカーが非切断可能リンカーである、請求項２４〜２７のいずれかに一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３０】
リンカーが６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）から選択される、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３１】
対象において多発性骨髄腫を治療する方法であって、
（ａ）高レベルのＢＣＭＡ発現を有する対象を同定すること；および
（ｂ）前記対象に治療上有効な量の請求項８〜３０に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含んでなる、方法。
【請求項３２】
ＢＣＭＡ発現のレベルがフローサイトメトリーを用いて決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＢＣＭＡ発現のレベルがＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合を測定することにより決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合が６０％を超える場合に高い、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
形質細胞がＢＬＩＭＰ１発現により同定される、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合が、ＢＣＭＡ＋でもあるＢＬＩＭＰ＋細胞の割合を計算することにより決定されるＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアを用いて計算される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアが４を超える場合に高い、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象において多発性骨髄腫を処置する方法であって、
（ａ）対象からサンプルを得る工程；
（ｂ）前記サンプルにおけるＢＣＭＡ発現のレベルを決定する工程；
（ｃ）ＢＣＭＡ発現のレベルが高ければ、治療上有効な量の請求項８〜３０に記載の抗原結合タンパク質を投与する工程
を含んでなる、方法。
【請求項３９】
ＢＣＭＡ発現のレベルがフローサイトメトリーを用いて決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＢＣＭＡ発現のレベルがＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合を測定することにより決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合が６０％を超える場合に高い、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
形質細胞がＢＬＩＭＰ１発現により同定される、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合が、ＢＣＭＡ＋でもあるＢＬＩＭＰ＋細胞の割合を計算することにより決定されるＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアを用いて計算される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアが４を超える場合に高い、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
サンプルにおいてＢＣＭＡの発現レベルを測定するための試薬を含んでなる、対象においてＢＣＭＡ発現を決定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮出願第６２／２４８５９５号および２０１５年１１月２日に出願された米国仮出願第６２／２６１９５７号の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、ＢＣＭＡ関連障害の予後および処置におけるＢＣＭＡ発現レベルの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９またはＴＮＦＲＳＦ１７）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。それはリガンドＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬに対する内在性膜受容体である。ＢＣＭＡのリガンドはまた、さらなる受容体：ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦと結合するＴＡＣＩ（膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド相互作用因子）；ならびにＢＡＦＦに制限された高い親和性を示すＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ受容体またはＢＲ３）にも結合し得る。全体として、これらの受容体およびそれらの対応するリガンドは、体液性免疫、Ｂ細胞発達およびホメオスタシスの種々の側面を調節する。
【０００４】
ＢＣＭＡの発現は一般にＢ細胞系譜に限られ、最終的なＢ細胞分化を増加させることが報告されている。ＢＣＭＡは、ヒト形質芽球、扁桃、脾臓および骨髄由来の形質細胞によって、また、扁桃記憶Ｂ細胞によって、およびＴＡＣＩ−ＢＡＦＦＲ低表現型を有する胚中心Ｂ細胞によっても発現される(Darce et al., 2007)。ＢＣＭＡは、ナイーブＢ細胞および記憶Ｂ細胞には実質的に存在しない(Novak et al., 2004)。ＢＣＭＡ抗原は細胞表面に発現され、従って、抗体に接近可能であり、また、ゴルジでも発現される。その発現特性によって示唆されるように、一般にＢ細胞の生存および増殖に関連したＢＣＭＡのシグナル伝達は、Ｂ細胞分化の後期、ならびに長期生存型骨髄形質細胞(O’Connor et al., 2004)および血漿芽細胞(Avery et al., 2003)の生存に重要である。さらに、ＢＣＭＡはＡＰＲＩＬと高い親和性で結合するので、ＢＣＭＡ−ＡＰＲＩＬシグナル伝達軸はＢ細胞分化の後期に優勢となることが示唆され、おそらく生理学上最も関連のある相互作用である。
【０００５】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄（ＢＭ）中の悪性形質細胞の蓄積を特徴とする癌であり、英国において２番目に多い血液性の悪性腫瘍である。プロテアソーム阻害剤および免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は多くの患者の見通しを改善してきたが、疾患再発は避けがたく、大多数がその癌で死に至る(Kumar et al., 2012; Kumar et al., 2008)。従って、新たな療法が差し迫って必要とされるが、それらの開発はこの疾患の臨床的および遺伝的不均質性によって妨げられる。形質細胞に限定された発現を持つ表面受容体は、免疫に基づく療法の魅力的な標的である(Danylesko et al., 2012)。ＢＣＭＡ  ｍＲＮＡは非造血系組織では発現されず、ＢＣＭＡはナイーブＢ細胞に存在もしないが、Ｂ細胞の、形質芽細胞およびＢＭ形質細胞（ＰＣ）への分化の際にアップレギュレートされる(Laabi et al., 1994; Laabi et al., 1992)。ＢＣＭＡ−／−動物はこれらの細胞の生存の減少を示したが、それ以外の点では正常な表現型を示した(O'Connor et al., 2004)ので、ＢＣＭＡはまた、ＢＭ  ＰＣの生存にも必須であると思われる。さらに、これまでに、ＡＰＲＩＬは初代ＭＭ細胞において増殖を誘導することが示されており(Quinn et al., 2011)、免疫組織化学により、ＡＰＲＩＬはＭＭ骨髄微小環境中に存在し、そこでそれは骨髄細胞によって産生されることが確認されている(Belnoue et al., 2012; Matthes et al., 2011)。よって、ＢＣＭＡは、そのＰＣに限定された発現のためだけでなく、ＭＭ細胞の生存および成長におけるその役割のためにも治療戦略の良好な潜在的標的である。
【０００６】
ＢＣＭＡ発現（転写産物およびタンパク質の両方）は、ＭＭにおける疾患進行と相関があることが報告されている。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを用い、多発性骨髄腫細胞（ＭＭＣ）ではそれらの正常対応物に比べてＴＡＣＩおよびＢＣＭＡ遺伝子が過剰発現されていたことが示された(Moreaux et al., 2004)。ヒト骨髄腫細胞と、ＭＧＵＳ患者および正常骨髄から精製された形質細胞ならびにＢ細胞系譜白血病由来の初代腫瘍細胞とを比較するためには、遺伝子発現分析が使用された(Bellucci et al., 2005)。ＢＣＭＡ遺伝子は、総ての骨髄腫サンプルで発現が高かった。ＭＧＵＳ患者から精製された形質細胞はより低いＢＣＭＡ発現を示したが、正常な形質細胞または骨髄腫細胞で見られる発現に比べて有意差は無かった。これに対し、ＢＣＭＡ発現は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、プレＢ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）およびＴ細胞ＡＬＬ（Ｔ−ＡＬＬ）では有意に低かった。
【０００７】
ＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬをトランスジェニックに過剰発現するマウスモデルは、Ｂ細胞リンパ腫の有意な増加を示す(Batten et al., 2004 - BAFF; Planelles et al., 2004 - APRIL)。ヒトでは、複数のＢ細胞腫瘍、ならびに他のＢ細胞障害を有する患者の血清および微小環境で過剰なＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬが検出されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、当技術分野には、適当な処置コースが選択されるための多発性骨髄腫患者の予後を決定する必要がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明者らは、高いＢＣＭＡレベルが不良な転帰と関連していることを見出し、標準的なリスク遺伝学を有する、より早期の再発およびより短い生存を有する患者のサブグループを同定した。この寄与により患者のサブグループの予後が可能となりこれにより、より侵襲的な処置計画のための患者のサブグループが同定可能となる。
【００１０】
本発明の第１の態様は、対象において多発性骨髄腫の予後を決定するための方法であって、
（ａ）前記対象からサンプルを得る工程；および
（ｂ）前記サンプルのＢＣＭＡ発現のレベルを試験する工程
を含んでなり、前記対象が高レベルのＢＣＭＡ発現を有すれば、その患者の多発性骨髄腫の予後は不良である方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、対象由来のサンプルにおいて高レベルのＢＣＭＡ発現を特徴とする、不良な予後を有すると分類された対象における多発性骨髄腫の処置において使用するための、ＢＣＭＡと特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、対象において多発性骨髄腫を処置する方法であって、高レベルのＢＣＭＡ発現を有する対象に、治療上有効な量の、ＢＣＭＡと特異的に結合する抗原結合タンパク質投与することを含んでなる方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、本明細書で定義される方法に従って計算された高レベルのＢＣＭＡ発現を有する対象において多発性骨髄腫を処置する方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、対象における多発性骨髄腫を、前記処置に好適と同定されたヒトにおいて、ＢＣＭＡと特異的に結合する抗原結合タンパク質で処置する方法を提供し、ここで、前記ヒトは、
（ａ）高レベルのＢＣＭＡ発現により；または
（ｂ）本明細書に定義される方法を用いて
前記処置に好適と同定される。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、対象において多発性骨髄腫を処置する方法であって、
（ａ）高レベルのＢＣＭＡ発現を有する対象を同定すること；および
（ｂ）前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質を投与すること
を含んでなる方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、対象において多発性骨髄腫を処置する方法であって、
（ａ）対象からサンプルを得る工程；
（ｂ）前記サンプルにおいてＢＣＭＡ発現のレベルを決定する工程；および
（ｃ）ＢＣＭＡ発現のレベルが高ければ、治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質を投与する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる態様によれば、サンプルにおいてＢＣＭＡの発現レベルを測定するための試薬を含んでなる、対象の予後を決定するためのキットが提供される。さらに別の態様では、本発明は、サンプルにおいてＢＣＭＡの発現レベルを測定するための試薬を含んでなる、対象においてＢＣＭＡ発現を決定するためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１：フローサイトメトリーによるＢＣＭＡ発現。（Ａ）ＨＭＣ（Ｈ９２９、ＭＭ１．ｓ、Ｕ２６６、ＪＩＭ３、ＪＪＮ３、ＯＰＭ２、ＲＰＭＩ８２２６、ＫＭＭ１）およびヒト非ＭＭ細胞株（ＳＵＰＴ１、ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ）をアイソタイプ対照ＩｇＧ２ａ−４８８（白ぬきのヒストグラム）または抗ＢＣＭＡ  Ｓ３０７１１８Ｇ０３−４８８（黒塗りのヒストグラム）とともにインキュベートした。数字は、ＢＣＭＡ染色細胞とアイソタイプ対照染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩｒ）の比を示す。
【図１Ｂ】図１：フローサイトメトリーによるＢＣＭＡ発現。（Ｂ）骨髄腫患者からＢＭ  ＭＮＣ中の初代ＭＭ細胞をＣＤ１３８−ＡＰＣ染色により同定し、ＢＣＭＡの特異的染色を、抗ＢＣＭＡ  Ｓ３０７１１８Ｇ０３−４８８を用いて決定し（黒塗りのヒストグラム）、対照サンプルはＩｇＧ２ａ−４８８とともにインキュベートした（白ぬきのヒストグラム）。ＣＤ１３８＋ゲート集団のヒストグラム  ＭＦＩｒを示す。
【図１Ｃ】図１：フローサイトメトリーによるＢＣＭＡ発現。（Ｃ）個々の患者のＭＦＩｒを示す（範囲：１〜６７）、Ｊ６Ｍ０−ｗｔＦｃ  ＰＥを用いたフローサイトメトリーによる患者サンプルのＢＣＭＡ発現。
【図１Ｄ】図１：フローサイトメトリーによるＢＣＭＡ発現。（Ｄ）初代骨髄腫細胞は、ＣＤ１３８に対する染色により同定し、抗ＢＣＭＡ抗体Ｊ６Ｍ０−ｗｔＦｃ  ＰＥで共染色した。細胞当たりに結合した抗体(antibodies bound per cell)（ＡＢＣ）の定量はＢＤ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズを用いて行った（範囲３４８．７〜４２６８．４  ＡＢＣ、平均：１１８１  ＡＢＣ、中央値：１０８４．９  ＡＢＣ）。
【図２Ａ】図２：ＢＣＭＡ発現および骨髄ＭＮＣ。（Ａ）ＢＭ患者のＣＤ１３８＋細胞は、ＣＤ１３８−細胞（一番上のパネル）、および他の細胞サブセット（ＣＤ４５＋ＣＤ１３８−またはＣＤ４５−ＣＤ１３８−、下のパネル）に比べて高い表面ＢＣＭＡレベルを有する。
【図２Ｂ】図２：ＢＣＭＡ発現および骨髄ＭＮＣ。（Ｂ）ＢＭ  ＭＮＣを、抗ＣＤ１３８  ＡＰＣおよび抗ＣＤ５６  ＰＥ、抗ＣＤ２０  ＰＢまたは抗ＣＤ２８  ＰＢと一緒にＦＩＴＣコンジュゲート抗ＢＣＭＡ（Ｓ３０７１１８Ｇ０３）とともにインキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。ＢＣＭＡ発現の分析のために、ＣＤ５６（ｉ）、ＣＤ２０（ｉｉ）またはＣＤ２８（ｉｉｉ）を共発現すＣＤ１３８＋細胞にゲートをかけた（右のパネル、黒塗りのヒストグラム、ＢＣＭＡ、白ぬきのヒストグラム、アイソタイプ対照）。
【図３Ａ】図３：ＩＨＣによるＢＣＭＡ発現。（Ａ）骨髄腫患者からの骨髄トレフィンのＩＨＣ染色。ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１パネルにおいて、ＢＬＩＭＰ１（核）染色は青、ＢＣＭＡ（細胞質および膜）は褐色として見える。ＧＳＫ  ８５および１１は、均一なＢＣＭＡ発現の例である。ＧＳＫ  １６は、ＢＣＭＡ陽性形質細胞（黒い矢印）およびＢＣＭＡ陰性形質細胞（白い矢印）の領域を伴うパッチ状のＢＣＭＡ発現を示す。ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアにより決定されたＢＣＭＡ発現を示す。Ｈ＆Ｅは、ヘマトキシリンおよびエオジン。
【図３Ｂ】図３：ＩＨＣによるＢＣＭＡ発現。（Ｂ）病期の異なる一連のサンプルのＢＣＭＡ発現を示す、３人の骨髄腫患者からの一連のサンプルのＩＨＣ染色。Ｄ  診断、Ｒ１  初回再発、Ｒ２  ２回目の再発、ＰＤ  進行性疾患。
【図３Ｃ】図３：ＩＨＣによるＢＣＭＡ発現。（Ｃ）髄外関与を伴う持続的ＢＣＭＡ発現を示す、肝髄外性形質細胞腫および対応する骨髄トレフィンを用いた、ＩｇＡ多発性骨髄腫の２回目の再発の患者からのＩＨＣ。
【図３Ｄ】図３：ＩＨＣによるＢＣＭＡ発現。（Ｄ）残留形質細胞上でＢＣＭＡ発現を呈する治療後骨髄腫患者からの骨髄トレフィンのＩＨＣ。λ軽鎖骨髄腫を有する一人目の患者は、ＡＳＣＴの６か月後の最初のプラトー相にあり、二人目の患者は、化学療法後の最初のプラトー相にあった。
【図４】図４：ＢＬＩＭＰ１染色はＩＨＣでＣＤ１３８と相関した。骨髄トレフィンは、慣例的にＨ＆ＥおよびＣＤ１３８で染色して形質細胞を同定した後に、ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１で二重染色した。示されたように、ＣＤ１３８とＢＬＩＭＰ１染色の間には良好な一貫した相関があった。
【図５】図５：無症候性骨髄腫を有する患者からの骨髄トレフィンのＩＨＣ。無症候性骨髄腫を有する３人の患者からのＢＭトレフィンのＩＨＣで見られた０のＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコア。
【図６】図６：Ｂ細胞悪性腫瘍のＩＨＣ。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）には不在であるが、粘膜関連リンパ系組織（ＭＡＬＴ）および古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）の形質細胞には存在するＢＣＭＡ発現、ここで、ＢＣＭＡ発現は腫瘍細胞自体には存在しないことが明らかである。
【図７】図７：新生物を含有する形質細胞のＩＨＣ。キャッスルマン病、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、およびＨＩＶ患者からの骨髄のポリクローナル形質細胞増加症では弱いＢＣＭＡ染色が見られる。
【図８】図８：正常組織のＩＨＣ。ウイルス性肝炎患者からの肝臓の（Ｈ＆ＥおよびＢＣＭＡ染色で見られる形質細胞形質細胞、黒い矢印）および小腸の粘膜固有層の形質細胞（白い矢印）においてＢＣＭＡ発現が見られる。
【図９Ａ】図９：病期および腫瘍ＢＣＭＡ発現と比較した可溶性ＢＣＭＡ。合計４２人の患者が分析に対して可溶性ＢＣＭＡ（ｓＢＣＭＡ）レベルを有した（３人が意義不明単クローン性免疫グロブリン血症を有し、１人が無症候性ＭＭを有し、３８人が症候性ＭＭを有する）。（Ａ）健常ドナー、ＭＧＵＳ、新規ＭＭ診断および再発または不応性ＭＭにおけるｓＢＣＭＡレベル（平均が示される）。健常ドナー（ｎ＝３８、平均＝９．３）、ＭＧＵＳ（ｎ＝３、平均＝１５．２）、新規診断（ｎ＝９、平均＝１３４．８．２）、再発または不応性ＭＭ（ｎ＝２９、平均＝１５４．５）。健常ドナーとＭＧＵＳまたは骨髄腫の新規診断を有する患者および再発患者の間に統計的な差は無かった（両方ともマン・ホイットニーＵによりｐ＞０．０５）。しかしながら、症候性骨髄腫を有する全患者のｓＢＣＭＡレベルは、健常ドナーより高かった（マン・ホイットニーＵによりｐ＜０．０００１）。
【図９Ｂ】図９：病期および腫瘍ＢＣＭＡ発現と比較した可溶性ＢＣＭＡ。合計４２人の患者が分析に対して可溶性ＢＣＭＡ（ｓＢＣＭＡ）レベルを有した（３人が意義不明単クローン性免疫グロブリン血症を有し、１人が無症候性ＭＭを有し、３８人が症候性ＭＭを有する）。（Ｂ）ｓＢＣＭＡとＢＭにおける％ＣＤ１３８の産生率およびＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアの間には正の相関がある（ｎ＝４０、ｒ２＝０．３７、スピアマンの順位相関によりｐ＜０．０００１）。
【図１０Ａ】図１０：ＢＣＭＡ発現の臨床相関。（Ａ）患者コホートの臨床特性の概要。Ｄ  診断、Ｒ  再発、ＲＤ  不応性疾患、ＬＣ  軽鎖、ＰＦＳ  無進行生存期間、ＯＳ  全生存間、ＣＲ  完全奏功  ＰＲ  部分奏功、ＮＡ  入手できずまたは適用できず。
【図１０Ｂ】図１０：ＢＣＭＡ発現の臨床相関。（Ｂ）（ｉ）ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアによるＰＦＳおよび（ｉｉ）ＯＳ。ＮＲ、到達せず。
【図１０Ｃ】図１０：ＢＣＭＡ発現の臨床相関。（Ｃ）（ｉ）細胞遺伝学的リスクによるＰＦＳおよび（ｉｉ）ＯＳ。
【図１０Ｄ】図１０：ＢＣＭＡ発現の臨床相関。（Ｄ）（ｉ）細胞遺伝学的リスクおよびＢＣＭＡ発現によるＰＦＳおよび（ｉｉ）ＯＳ。
【図１１Ａ】図１１：表面ＢＣＭＡの内部移行および抗体結合後の再発現の動態。（Ａ）Ｈ９２９細胞をＴ＝０に１５分間Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦでパルス処理し、洗浄し、３７℃でインキュベートした。特定の時点で、細胞のアリコートを取り出し、抗Ｆｃで染色して表面に結合した抗ＢＣＭＡを評価した。最初のパルス処理から２４時間後（Ｔ＝２４）に、細胞にＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦで再パルス処理を行い、表面に結合した抗体を上記のようにモニタリングした。
【図１１Ｂ】図１１：表面ＢＣＭＡの内部移行および抗体結合後の再発現の動態。（Ｂ）Ｈ９２９細胞を、１５分のパルス処理中に漸増用量のＪ６Ｍ０に曝し、洗い流し、表面に結合した抗体を経時的にモニタリングした。
【図１１Ｃ】図１１：表面ＢＣＭＡの内部移行および抗体結合後の再発現の動態。（Ｃ）細胞をマウス抗ＢＣＭＡ抗体（Ｓ３３６１０５Ａ０７）で１５分間パルス処理し、洗浄し、固定し、抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８（緑）とともにインキュベートし、すぐに共焦点顕微鏡によって可視化した。（ｉ）細胞のさらなるアリコートを上記のようにマウス抗ＢＣＭＡでパルス処理し、洗浄し、３７℃でインキュベートし、時間（ｉｉ−ｉｖ）または７時間（ｖ−ｖｉｉ）の時点で、Ｊ６Ｍ０で再パルス処理した。洗浄後、細胞に透過処理を施し、ウサギ抗ＥＥＡ１でインキュベートした。最後に、抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８（緑）とともにインキュベートすることで、Ｔ＝０時の最初の抗体パルスで標識された表面ＢＣＭＡを可視化したところ、抗ヒトＡｌｅｘａ  ５６８（赤）は、Ｔ＝１時間またはＴ＝７時間の２回目のパルスで検出される新たに発現したＢＣＭＡを示し、抗ウサギＡｌｅｘａ  ６３３（青）はエンドソーム中のＥＥＡを検出した。画像ｉｉ〜ｖｉｉは、これら３つの抗体からのシグナルの二重のオーバーレイである。画像ｉｉおよびｖ：初回抗ＢＣＭＡパルスと抗ＥＥＡ；ｉｉｉおよびｖｉ：２回目の抗ＢＣＭＡパルスと抗ＥＥＡ；ｉｖおよびｖｉｉ：初回と２回目の抗ＢＣＭＡパルス。
【図１１Ｄ】図１１：表面ＢＣＭＡの内部移行および抗体結合後の再発現の動態。（Ｄ）Ｈ９２９細胞を１０μｇ／ｍｌのマウス抗ＢＣＭＡ（Ｓ３０７１１８Ｇ０３）の１５分パルス（ウォッシュアウト）で処理し、洗浄し、抗マウス抗体で染色して表面ＢＣＭＡ発現を評価した。次に、細胞のアリコートを、シクロヘキシミドの不在下または存在下で６時間、３７℃でインキュベートし、その後、洗浄し、抗マウス抗体、またはＪ６Ｍ０（新たに発現した表面ＢＣＭＡを可視化するため）、次いで、ヤギ抗ヒト抗体とともにインキュベートした。ヒト抗ＢＣＭＡ抗体による２回目のパルスはＢＣＭＡ染色の増加を示し、これはシクロヘキシミドにより約２５％まで低下する。従って、２回目の抗ＢＣＭＡパルスの後に見られたＢＣＭＡ受容体の再発現の約２５％はその受容体のｄｅ  ｎｏｖｏ合成によるものであると思われる。最初の２つのバーは対照である（それぞれ非染色およびアイソタイプ抗体による染色）。
【図１２Ａ】図１２：細胞株に対するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの細胞傷害性。（Ａ）非形質導入（ＮＴ）、低ＢＣＭＡ形質導入（Ｌｏｗ）、および高ＢＣＭＡ形質導入（Ｈｉｇｈ）ＡＲＨ７７細胞を、４種類の濃度（０．０１、０．０２、０．０５および０．１μｇ／ｍＬ）のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートし、３日後にアネキシンＶ／ＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより分析した。挿入図は、Ｓ３０７１１８Ｇ０３（黒）またはアイソタイプ対照（白）およびＭＦＩｒで染色した細胞の各バッチのフローサイトメトリーのオーバーレイを示す。３回の実験の平均±ＳＥＭ。
【図１２Ｂ】図１２：細胞株に対するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの細胞傷害性。（Ｂ）高（Ｈ９２９）、中等度（ＯＰＭ２）、低（ＫＭＭ１）および陰性（ＳＵＰＴ１、Ｒａｊｉ）のＢＣＭＡ発現を有する細胞株をＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートし、２時点で上記のように生存細胞に関して分析した。一番上のパネルは４日後の生細胞を示し、用量依存的死滅を示している。一番下のパネルは、２日目および４日目に１μｇ／ｍＬのＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートした後の生細胞を示す。平均±ＳＥＭ、両方ともｎ＝３。
【図１２Ｃ】図１２：細胞株に対するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの細胞傷害性。（Ｃ）ＭＭ１．ｓ細胞を培地単独、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、またはＳ３０７１１８Ｇ０３（抗ＢＣＭＡ）の存在下で２日間、０．２μｇ／ｍｌのＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートし、生細胞を上記のように数えた。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）。
【図１２Ｄ】図１２：細胞株に対するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの細胞傷害性。（Ｄ）ＨＭＣＬを２日間、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともに培養し、バルク集団と前駆体集団の生存率を比較した。前駆体は、薬物に２日間曝した後に取り出したＭＮＣのアリコートに対してクローン原性アッセイを行うことにより数えた。ＣＦＣ、コロニー形成細胞。
【図１３】図１３：細胞株での１日目のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦにより媒介される細胞傷害性。高（Ｈ９２９）、中等度（ＯＰＭ２、ＪＩＭ３）、および陰性（ＳＵＰＴ１）のＢＣＭＡ発現を有する細胞株を０．１μｇ／ｍｌ  Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した場合の２４時間時点生存率％。データは平均２の対照培養物に対して正規化する。
【図１４Ａ】図１４：初代ＣＤ１３８＋細胞でのＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦ活性。（Ａ）中等度のＢＣＭＡ発現を有する１名の代表的患者由来のＢＭ  ＭＮＣ（ＧＳＫ  ０８７）をＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートした場合。フローサイトメトリーによるＣＤ１３８＋細胞の分析（左のパネル）およびＣＤ１３８＋画分のゲート設定（中央のパネル）、アネキシンＶ／ＰＩドットプロット（右のパネル）により得られた２日後および６日後のＣＤ１３８＋生細胞（対照に対するパーセンテージ）。
【図１４Ｂ】図１４：初代ＣＤ１３８＋細胞でのＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦ活性。（Ｂ）骨髄腫患者由来のＢＭ  ＭＮＣを複数の濃度のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともに培養した後の種々の時点でのＣＤ１３８＋生細胞を示す４つの代表的実験。各患者について、ヒストグラムは、対照としてＦｃブロックとともにプレインキュベートした細胞（白）と比べた場合のＣＤ１３８＋細胞（黒）に対するＪ６Ｍ０−ｗｔＦｃ  ＰＥの結合を示し、入手可能な場合には、形質細胞増殖の指標としてのＭＩＢ１（ピンク、核）およびＣＤ１３８（膜、茶）によるＩＨＣ染色を行う。
【図１５】図１５：Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートした際の初代骨髄腫細胞の生存率。患者ＢＭ  ＭＮＣを種々の濃度のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートした。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
予後の方法
本発明者らは驚くことに、患者の高いＢＣＭＡレベルがより不良の転帰に関連することを見出し、標準的なリスク遺伝学を有し、より早期の再発およびより短い生存期間を有する患者のサブグループを同定した。この発見は患者のサブグループの予後を可能とし、これにより、より侵襲的な処置計画のための患者のサブグループが同定可能となる。
【００２０】
よって、本発明は、対象において多発性骨髄腫の予後のための方法であって、
（ａ）前記対象からサンプルを得る工程；および
（ｂ）前記サンプルのＢＣＭＡ発現のレベルを試験する工程
を含んでなり、前記対象が高レベルのＢＣＭＡ発現を有すれば、その対象の多発性骨髄腫の予後は不良である方法を提供する。
【００２１】
１つの態様において、不良な予後は、再発(recurrence)／再発(relapse)リスクの上昇、生存見込みの低下、生存期間の短縮、または転移リスクの増大のうち少なくとも１つである。１つの態様において、不良な予後は、早期再発（例えば、６か月）またはより短い生存期間（例えば、１８か月）である。
【００２２】
別の態様では、ＢＣＭＡ発現のレベルは、フローサイトメトリーを用いて決定される。例えば、本明細書に記載の実施例に示されるように、ＢＣＭＡ発現は、抗ＢＣＭＡ抗体とともにフローサイトメトリーを用いて得られた平均蛍光をもちいて決定し、それを対照（例えば、アイソタイプ対照）と比較することができる。このような計算により、ＢＣＭＡ染色細胞：対照染色細胞の平均蛍光強度(mean fluorescence intensity)（ＭＦＩ）を決定することができる。
【００２３】
もう１つの態様では、ＢＣＭＡ発現のレベルは、ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合を測定することにより決定される。さらなる態様では、この割合は、免疫組織化学法を用いて決定してもよい。
【００２４】
１つの態様では、ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、その割合が６０％を超える場合に高い。さらなる態様では、その割合は、７０％を超え、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を超える。
【００２５】
ＢＬＩＭＰ１（ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１またはＰＲＤＭ１としても知られる）は、形質細胞の分化を制御し、正常および悪性形質細胞の生存に重要であると思われる転写因子である。よって、１つの態様において、形質細胞は、ＢＬＩＭＰ１発現により同定される（すなわち、形質細胞はＢＬＩＭＰ＋細胞である）。例えば、本明細書の実施例に記載されるように、ホルマリン固定パラフィン包埋組織をＢｏｎｄ−ＩＩＩ自動染色プラットフォーム（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で最適化されたプロトコールを用いて、抗ＢＬＩＭＰ１（例えば、クローンＲＯＳ１９５Ｇ、ＣＮＩＯ、マドリード、スペイン）で染色し、ＢＬＩＭＰ１の染色を、形質細胞を同定するために使用した。
【００２６】
１つの態様では、ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、ＢＣＭＡ＋でもあるＢＬＩＭＰ＋細胞の割合を計算することにより決定されるＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアを用いて計算される。さらなる態様では、ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアは次のように割り当てられる。
【００２７】
【表１】
2019501369.tif 000002
【００２８】
１つの態様では、ＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合は、ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアが４を超える、例えば４〜５である場合に高い。
【００２９】
本明細書に記載されるように、ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアは、ＦＩＳＨ結果を上回る付加的な予後情報を提供し、これにより、早期再発および全生存期間に関して患者が階層化され得る。標準的なリスク遺伝学を有する患者であっても、それらのＢＣＭＡレベルが高かった場合は、より早期の再発率およびより短い生存期間を有すると同定された。この発見は、そうでなければ低い／中等度の細胞遺伝学が存在する場合でも、不良な予後を有する患者を同定する別法を与える。よって、１つの態様では、供試対象は標準的なリスク遺伝学を有する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、ヒトサンプルなどの「サンプル」としては、限定されるものではないが、患者から採取された全血、血液抽出物、血清、骨髄サンプル、細胞抽出物またはホモジナイズ組織が含まれる。本発明で使用するためのサンプルは、所与のアッセイ、反応、実施、試験、および／または実験に使用される検体材料を意味し得る。例えば、サンプルは、採集された検体材料のアリコートを含んでよく、全検体を含んで、最大で全検体である。サンプルは、未処理サンプルであっても、または処理済みの、例えば、元の検体に対して行われた種々の処理または調製工程の後に得られたサンプルであってもよい。例えば、血液などの体液中で目的の分析物を分離または濃縮するために種々の細胞分離法、例えば、磁気活性化セルソーティングを適用してもよい。サンプルはまた、検体の希釈液、例えば、希釈血清または他の複合体および／もしくはタンパク質に富む混合物の希釈液を含んでなってもよい。例えば、いくつかの態様では、検体は、分析用の複数の連続希釈サンプルを提供するために連続希釈されてもよい。本明細書で使用する場合、用語「アッセイ」、「反応」、「実施」、「試験」および／または「実験」は、互換的に使用可能である。本発明の態様は、量的結果を得るためにサンプルの少量の開始量を用いて実施することができる。
【００３１】
上記のように、ＢＣＭＡ発現は、ＭＭにおける疾患進行と相関があることが報告される。加えて、ＢＣＭＡ発現はまた、複数の他の障害にも関連付けられている。よって、用語「ＢＣＭＡ関連障害」としては、限定されるものではないが、多発性骨髄腫(Multiple Myeloma)（ＭＭ）、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症(Monoclonal gammopathy of undetermined significance)（ＭＧＵＳ）、くすぶり型多発性骨髄腫(Smoldering multiple myeloma)（ＳＭＭ）、孤立性形質細胞腫（骨、骨髄外）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、原発性アミロイドーシス(Primary Amyloidosis)（ＡＬ）、Ｈ鎖病、全身性紅斑性狼瘡(Systemic lupus erythematosus)（ＳＬＥ）、ＰＯＥＭＳ症候群／骨硬化性骨髄腫、Ｉ型およびＩＩ型寒冷グロブリン血症、軽鎖沈着症、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病(Idiopathic thrombocytopenic purpura)（ＩＴＰ）、急性糸球体腎炎、天疱瘡および類天疱瘡症および後天性表皮水疱症、任意の非ホジキンリンパ腫および白血病が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「ＢＣＭＡ関連障害」はまた、Ｂ細胞起源の血液性腫瘍に基づく臨床症状も含む。血液性腫瘍に基づく臨床症状の具体例はとして、限定されるものではないが、慢性リンパ球性白血病および急性リンパ球性白血病などの白血病；多発性骨髄腫、ＭＧＵＳおよびワルデンストロームマクログロブリン血症などの形質細胞悪性腫瘍；非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫などのリンパ腫が含まれる。
【００３３】
用語「ＢＣＭＡ関連障害」はまた、異常な数の芽細胞、もしくは望まれない細胞増殖が存在するか、またはリンパ性および骨髄性悪性腫瘍を含む血液癌として診断される癌も含む。
【００３４】
造血系癌はまたリンパ性悪性腫瘍も含み、これらはリンパ節、脾臓、骨髄、末梢血、および／または節外部位に影響を及ぼし得る。リンパ性癌にはＢ細胞悪性腫瘍が含まれ、これには限定されるものではないが、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫(B-cell non-Hodgkin’s lymphomas)（Ｂ−ＮＨＬ）が含まれる。Ｂ−ＮＨＬは、緩徐進行性（もしくは低悪性度）、中悪性度（もしくは急速進行性）または高悪性度（超急速進行性）であり得る。緩徐進行性Ｂ細胞リンパ腫には、濾胞性リンパ腫(follicular lymphoma)（ＦＬ）；小リンパ球性リンパ腫(follicular lymphoma)（ＳＬＬ）；辺縁帯リンパ腫(marginal zone lymphoma)（ＭＺＬ）、節性ＭＺＬ、節外ＭＺＬ、脾ＭＺＬおよび有毛リンパ球随伴脾ＭＺＬを含む；リンパ形質細胞性リンパ腫(lymphoplasmacytic lymphoma)（ＬＰＬ）；および粘膜随伴リンパ系組織（ＭＡＬＴまたは節外辺縁帯）リンパ腫であり得る。中悪性度Ｂ−ＮＨＬは、白血病関与を伴うまたは伴わないマントル細胞リンパ腫(mantle cell lymphoma)（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫(diffuse large cell lymphoma)（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性大細胞（またはグレード３またはグレード３Ｂ）リンパ腫、および原発性縦隔リンパ腫(primary mediastinal lymphoma)（ＰＭＬ）を含む。高悪性度Ｂ−ＮＨＬは、バーキットリンパ腫(Burkitt’s lymphoma)（ＢＬ）、バーキット様リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫(small non-cleaved cell lymphoma)（ＳＮＣＣＬ）およびリンパ芽球性リンパ腫を含む。他のＢ−ＮＨＬは、免疫芽球性リンパ腫（または免疫細胞腫）、原発性滲出液リンパ腫、ＨＩＶ関連（またはＡＩＤＳ関連）リンパ腫、および移植後リンパ増殖性障害(post-transplant lymphoproliferative disorder)（ＰＴＬＤ）またはリンパ腫を含む。Ｂ細胞悪性腫瘍にはまた、限定されるものではないが、慢性リンパ球性白血病(chronic lymphocytic leukemia)（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病(prolymp
hocytic leukemia)（ＰＬＬ）、ワルデンストロームマクログロブリン血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)（ＷＭ）、有毛細胞白血病(hairy cell leukemia)（ＨＣＬ）、大顆粒リンパ球(large granular lymphocyte)（ＬＧＬ）白血病、急性リンパ性（またはリンパ球性またはリンパ芽球性）白血病、キャッスルマン病が含まれる。ＮＨＬはまた、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫(T-cell non-Hodgkin’s lymphoma)（Ｔ−ＮＨＬ）も含み、これには、限定されるものではないが、特定不能Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫    （ＮＯＳ）(non-Hodgkin’s lymphoma not otherwise specified)、末梢性Ｔ細胞リンパ腫(peripheral T-cell lymphoma)（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫(anaplastic large cell lymphoma)（ＡＬＣＬ）、血管免疫芽球性リンパ障害(angioimmunoblastic lymphoid disorder)（ＡＩＬＤ）、鼻腔ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／Ｔ細胞リンパ腫、γ／δリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、およびセザリー症候群が含まれる。
【００３５】
造血系癌にはまた、古典型ホジキンリンパ腫、結節硬化型ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球優位型(lymphocyte predominant)（ＬＰ）ホジキンリンパ腫、結節性ＬＰホジキンリンパ腫、およびリンパ球減少型ホジキンリンパ腫を含むホジキンリンパ腫（または病）も含まれる。造血系癌にはまた、くすぶり型ＭＭ、意義不明（または未知または不明）単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、形質細胞腫（骨、骨髄外）、リンパ形質細胞性リンパ腫(lymphoplasmacytic lymphoma)（ＬＰＬ）、ワルデンストロームマクログロブリン血症、形質細胞白血病、および原発性アミロイドーシス（ＡＬ）を含む多発性骨髄腫（ＭＭ）などの形質細胞病または癌も含まれる。造血系癌にはまた、多形核白血球（または好中球）、好塩基球、好酸球、樹状細胞、血小板、赤血球およびナチュラルキラー細胞を含むさらなる造血細胞のその他の癌も含み得る。本明細書で「造血細胞組織」と呼ばれる、造血細胞を含む組織は、骨髄；末梢血；胸腺；ならびに脾臓、リンパ節、粘膜に関連するリンパ組織（例えば、消化管関連リンパ組織）、扁桃、パイエル板および虫垂、ならびに例えば気管支内面などの他の粘膜に関連するリンパ組織といった末梢リンパ組織を含む。
【００３６】
本明細書に記載の方法は、検出されたＢＣＭＡレベルの対照との比較を必要とし得る（例えば、フローサイトメトリーを用いた方法）。定性的方法の場合には、この比較は単に、非悪性形質細胞などのＢＣＭＡ発現が無い／正常なサンプルに対してなされる。定量的方法では、この比較は対照におけるＢＣＭＡ発現のレベルとなされる。
【００３７】
対照は、ＢＣＭＡ関連障害に罹患していないことが分かっている健常なヒトから採取されたサンプルであり得る。この対照は、評価される特定のＢＣＭＡ関連障害に基づいて選択される。
【００３８】
抗原結合タンパク質
本発明のさらなる態様は、不良な予後を有すると分類された対象における多発性骨髄腫の処置において使用するためのＢＣＭＡと特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供し、前記対象は、対象由来のサンプル中の、高い割合のＢＣＭＡ発現形質細胞を特徴とする。
【００３９】
本発明の抗原結合タンパク質は、天然抗体またはその機能的フラグメントもしくは等価物の構造に形式化され得る本発明の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含んでなり得る。従って、本発明の抗原結合タンパク質は、適当な軽鎖と対合した場合の、全長抗体、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはその等価物（例えば、ｓｃＦＶ、ビ、トリまたはテトラボディ、Ｔａｎｄａｂなど）に形式化された本発明のＶＨ領域を含んでなり得る。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４；またはＩｇＭ；ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＤまたはその修飾変異体であり得る。抗体重鎖の定常ドメインは相応に選択され得る。軽鎖定常ドメインはκまたはλ定常ドメインであり得る。さらに、抗原結合タンパク質は、例えば、ＩｇＧ二量体、もはやＦｃ受容体と結合しないか、またはＣ１ｑ結合を媒介しないＦｃ突然変異体など、あらゆる種類の修飾を含んでなり得る。抗原結合タンパク質はまた、抗原結合領域および非免疫グロブリン領域を含んでなる、ＷＯ８６／０１５３３に記載のタイプのキメラ抗体であってもよい。
【００４０】
本発明の別の態様では、抗原結合タンパク質は、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、およびミニボディからなる群から選択される。
【００４１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＭＨＣ−抗原ペプチド複合体を結合する必要なくＴ細胞に新規な特異性を作り出すための人工Ｔ細胞受容体として開発された。これらの合成受容体は、単一融合分子中にフレキシブルリンカーを介して１以上のシグナル伝達ドメインと結合された標的結合ドメインを含む。標的結合ドメインは、Ｔ細胞を病的細胞の表面の特定の標的にターゲッティングするために使用され、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞の活性化および増殖のための分子機構を含む。Ｔ細胞膜を貫通する（すなわち、膜貫通ドメインを形成する）フレキシブルリンカーは、ＣＡＲの標的結合ドメインの細胞膜提示を可能とする。ＣＡＲは、Ｔ細胞を、リンパ腫および固形腫瘍を含む種々の悪性腫瘍に由来する腫瘍細胞の表面で発現される抗原に向け直すことを首尾良く可能とした(Jena et al. (2010) Blood, 116(7):1035-44)。
【００４２】
ＣＡＲの開発としては、これまでに３世代を含んいる。第１世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖またはＦｃ受容体γ鎖の細胞質領域に由来するシグナル伝達ドメインに結合された標的結合ドメインを含んでなる。第１世代ＣＡＲは、Ｔ細胞を選択された標的に首尾良くリダイレクトすることが示されたが、それらはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて長期拡大増殖および抗腫瘍活性を提供することはできなかった。第２および第３世代ＣＡＲは、修飾されたＴ細胞の生存の増進およびＣＤ２８、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの補助刺激分子を含むことによる増殖の増大に焦点を当てたものである。
【００４３】
ＣＡＲを保持するＴ細胞は、疾患状態で病的細胞を排除するために使用することができた。１つの臨床目的は、アフェレーシスおよびＴ細胞単離の後にベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を介してＣＡＲの発現構築物を含有する組換えＤＮＡで患者細胞を形質転換することであろう。Ｔ細胞の拡大増殖の後、それらを、病的標的細胞を標的とし死滅させる目的で患者に再導入する。
【００４４】
本発明の１つの態様では、抗原結合タンパク質はキメラ抗原受容体である。さらなる態様では、ＣＡＲは、結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内エフェクタードメインを含んでなる。
【００４５】
１つの態様では、膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれに由来してもよい。１つの態様では、膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成可能であり、ロイシンおよびバリンなどの主として疎水性残基を含んでなり得る。
【００４６】
例えば、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３もしくはＣＤ２８などのＣＤタンパク質の膜貫通ドメイン、α、β、γもしくはδなどのＴ細胞受容体のサブユニット、ＩＬ−２受容体のサブユニット（α鎖）、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲもしくはｐ７５）のサブユニット(submit)（β鎖もしくはγ鎖）、またはＦｃ受容体のサブユニット鎖であり得る。１つの態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含んでなる。さらなる態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４またはＣＤ８の膜貫通ドメイン（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１３９３４５．１に記載されるようなＣＤ８α鎖）を含んでなる。なおさらなる態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４の膜貫通ドメインを含んでなる。
【００４７】
細胞内エフェクタードメインまたは「シグナル伝達ドメイン」は、標的結合ドメインが標的に結合した後に細胞内シグナル伝達を担う。細胞内エフェクタードメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。ＣＡＲ足場において使用するためのエフェクタードメインの好ましい例は、抗原結合後のシグナル伝達の誘導に呼応して働く天然Ｔ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能的能力を有するこれらの配列の任意の誘導体または変異体および合成配列であり得る。エフェクタードメインは、抗原依存的な一次活性化を誘導するもの、および二次的シグナルまたは補助刺激シグナルを提供するために抗原非依存的な様式で働くものの２つのクラスに分けることができる。一次活性化エフェクタードメインは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含んでなり得る。ＩＴＡＭは、種々の受容体の細胞質内テールに共通に見られ、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能する、十分に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例には、非限定例として、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものを含み得る。１つの態様では、細胞内エフェクタードメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７としても知られる）を含んでなる。天然ＴＣＲはＣＤζシグナル伝達分子を含み、従って、このエフェクタードメインの使用が、天然に存在するＴＣＲ構築物に最も近い。
【００４８】
本発明の１つの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζエフェクタードメインである。
【００４９】
エフェクタードメインはまた、二次的シグナルまたは補助刺激シグナルも提供し得る。Ｔ細胞はさらに、例えば、増殖の活性化および分化などを増強することによりＴ細胞応答を促進するために抗原提示細胞上の同族補助刺激リガンドと結合する補助刺激分子を含んでなる。よって、１つの態様では、細胞内エフェクタードメインはさらに、補助刺激ドメインを含んでなる。さらなる態様では、補助刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ（ＣＤ９４）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）またはそれらの任意の組合せから選択される補助刺激分子の細胞内ドメインを含んでなる。なおさらなる態様では、補助刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳまたはそれらの任意の組合せから選択される補助刺激分子の細胞内ドメインを含んでなる。
【００５０】
本発明の１つの態様では、抗原結合タンパク質はヒト化またはキメラ抗体である。本発明のさらなる態様では、抗体はヒト化されている。
【００５１】
本発明の１つの態様では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００５２】
本発明の別の態様では、抗原結合タンパク質は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した場合、ヒトＢＣＭＡと高い親和性で結合し、抗原結合タンパク質は、ヒトＢＣＭＡと２０ｎＭ以下の親和性または１５ｎＭ以下の親和性または５ｎＭ以下の親和性または１０００ｐＭ以下の親和性または５００ｐＭ以下の親和性または４００ｐＭ以下、または３００ｐＭ以下、例えば、約１２０ｐＭの親和性で結合する。本発明のさらなる態様では、抗原結合タンパク質は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した場合、  ヒトＢＣＭＡと約１００ｐＭ〜約５００ｐＭの間または約１００ｐＭ〜約４００ｐＭの間、または約１００ｐＭ〜約３００ｐＭの間で結合する。本発明の１つの態様では、抗原結合タンパク質は、ＢＣＭＡと１５０ｐｍ未満の親和性で結合する。
【００５３】
本発明の１つのかかる態様では、抗原結合タンパク質の親和性はＢｉａｃｏｒｅにより測定される。
【００５４】
本発明の別の態様では、抗原結合タンパク質は、細胞中和アッセイにおいて、ヒトＢＣＭＡと結合し、リガンドＢＡＦＦおよび／またはＡＰＲＩＬの、ＢＣＭＡ受容体への結合を打ち消し、ここで、抗原結合タンパク質は、約１ｎＭ〜約５００ｎＭの間、または約１ｎＭ〜約１００ｎＭの間、または約１ｎＭ〜約５０ｎＭの間、または約１ｎＭ〜約２５ｎＭの間、または約５ｎＭ〜約１５ｎＭの間のＩＣ５０を有する。本発明のさらなる態様では、抗原結合タンパク質は、細胞中和アッセイにおいて、ＢＣＭＡと結合し、ＢＣＭＡを中和し、ここで、抗原結合タンパク質は、約１０ｎＭのＩＣ５０を有する。本発明の１つのかかる態様では、ＩＣ５０は細胞中和アッセイにより測定される。
【００５５】
脱フコシル化モノクローナル抗体は、抗体のＦｃ領域のオリゴ糖がフコース糖単位を持たないように操作されたモノクローナル抗体である。理論に縛られるものでないが、抗体依存性細胞傷害性(antibody-dependent cellular cytotoxicity)（ＡＤＣＣ）は、抗体が脱フコシル化された際に増大する。よって、本発明の１つの態様では、抗原結合タンパク質は、変更されたグリコシル化特性を有するキメラ重鎖定常領域を含んでなる。本発明の１つのかかる態様では、重鎖定常領域は、フコースとマンノースの比が例えば０．８：３以下となるように変更されたグリコシル化特性を有し、ここで、抗原結合タンパク質は完全に脱フコシル化される。
【００５６】
１つの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号３のＣＤＲＨ３または配列番号３の変異体を含んでなる。
【００５７】
本発明の１つの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１のＣＤＲＨ１；配列番号２のＣＤＲＨ２；配列番号４のＣＤＲＬ１；配列番号５のＣＤＲＬ２；および／または配列番号６のＣＤＲＬ３のうち少なくとも１つをさらに含んでなる。
【００５８】
１つの態様では、抗原結合タンパク質は、
ｉ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ３
ｉｉ）配列番号１に示されるＣＤＲＨ１；および
ｉｉｉ）配列番号２に示されるＣＤＲＨ２
を含んでなる。
【００５９】
１つの態様では、抗原結合タンパク質は、
ｉ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ３
ｉｉ）配列番号１に示されるＣＤＲＨ１
ｉｉｉ）配列番号２に示されるＣＤＲＨ２
ｉｖ）配列番号４に示されるＣＤＲＬ１
ｖ）配列番号５に示されるＣＤＲＬ２；および
ｖｉ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ３
を含んでなる。
【００６０】
１つの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１または配列番号１３または配列番号１５のいずれか１つによりコードされる重鎖可変領域を含んでなる。
【００６１】
１つの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１７または配列番号１９のいずれか１つによりコードされる軽鎖可変領域を含んでなる。
【００６２】
１つの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１によりコードされる重鎖可変領域および配列番号１７によりコードされる軽鎖可変領を含んでなる。
【００６３】
１つの態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１５によりコードされる重鎖可変領域および配列番号１７によりコードされる軽鎖可変領域を含んでなる。
【００６４】
もう１つの態様では、抗原結合タンパク質は、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００６５】
本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれかの重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列、および本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれかの軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６６】
本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列、および本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれかの軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６７】
このようなポリヌクレオチドは、等価なポリペプチド配列に相当するコード配列を表す。しかしながら、このようなポリヌクレオチド配列は開始コドン、適当なシグナル配列、および終止コドンとともに発現ベクターにクローニングされると理解される。
【００６８】
本発明の１つの態様では、抗原結合タンパク質はさらに細胞傷害性薬剤を含んでなる。好適な細胞傷害性薬剤としては、限定されるものではないが、オーリスタチン（ドバリン−バリン−ドライソロニン(dolaisoleunine)−ドラプロイン−フェニルアラニン（ＭＭＡＦ）およびモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む）ならびにエステル型のＭＭＡＥ、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルを含む）、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、およびビンカアルカロイドが含まれる。特定の細胞傷害性薬剤としては、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エチノマイシン、コンブレタスタチン(combretatstatin)、カリケアマイシン(chalicheamicin)、メイタンシン、ＤＭ−１、ＤＭ−４、ネトロプシンが含まれる。他の好適な細胞傷害性薬剤としては、抗チューブリン薬、例えば、オーリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン(cryptophysin)、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、またはドラスタチンが含まれる。抗チューブリン薬としては、ジメチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン（ＡＦＰ）、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、オーリスタチンＥ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルシミド(colcimid)、エストラムスチン、セマドチン、ディスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ−１、ＤＭ−４またはエリュテロビンが含まれる。
【００６９】
本発明の別の態様では、抗原結合タンパク質は、リンカーを介して細胞傷害性薬剤に連結される。
【００７０】
本発明のさらに別の態様では、細胞傷害性薬剤は、オーリスタチンまたはドロスタチンである。
【００７１】
本発明の１つの態様では、細胞傷害性薬剤は、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦから選択される。
【００７２】
１つの態様では、細胞傷害性薬剤は、抗原結合タンパク質に共有結合される。
【００７３】
本発明の１つの態様では、リンカーは、切断可能リンカーである。本発明のもう１つの態様では、リンカーは非切断可能リンカーである。さらなる態様では、リンカーは、６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）から選択される。
【００７４】
本明細書に記載の抗体薬物コンジュゲートは、小分子抗チューブリン薬であるモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を抗ＢＣＭＡ抗体とコンジュゲートすることにより作出され得る。ＭＭＡＥの場合、リンカーは、チオール反応性マレイミド、カプロイルスペーサー、ジペプチドバリン−シトルリン、およびｐ−アミノベンジルオキシカルボニル、自壊的断片化基(self-immolative fragmenting group)からなり得る。ＭＭＡＦの場合、プロテアーゼ耐性マレイミドカプロイルリンカーが使用可能である。このコンジュゲーションプロセスは、薬物−抗体結合の不均一性をもたらし、各抗体分子と結合する薬物の数（モル比［ＭＲ］）、および結合部位の両方を変動させる。最も優勢な種はＭＲ＝４の材料であり、劣勢な種はＭＲが０、２、６、および８である材料である。１つの態様では、全体としての平均薬物−抗体ＭＲはおよそ４である。
【００７５】
１つの態様では、抗原結合タンパク質は、脱フコシル化型で生産され、モノメチル  オーリスタチン−Ｆ（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートされたヒト化ＩｇＧ１モノクローナル（ｍＡｂ）抗ＢＣＭＡ抗体としての抗体である。この抗体の細胞傷害作用は、ＢＣＭＡ発現細胞の表面への結合、内部移行、およびリソソームへの輸送を必要とし、リソソームで抗体はタンパク質分解を受け、ｃｙｓ−ｍｃＭＭＡＦが放出される。これは、微小管を破壊することにより有糸分裂を阻害し、細胞周期をＧ２／Ｍで休止させ、その後アポトーシスに至る。特に、遊離のｃｙｓ−ｍｃＭＭＡＦは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、その細胞膜通過能を損なう(荷電Ｃ末端フェニルアラニン基のためであると思われる低い細胞傷害活性を有する(Doronina et al., 2006)。最近報告されているように、ＮＫにより媒介される溶解とマクロファージにより媒介される溶解は双方とも、ＭＭ細胞に帯するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの活性にも役割を果たす可能性がある(Tai et al., 2014)。
【００７６】
処置の方法
上記の本発明の使用および方法は、ＢＣＭＡ関連障害に罹患しているヒトの予後を可能とする。ひと度同定されれば、障害は処置可能である。よって、本発明は、対象において多発性骨髄腫を処置する方法であって、ＢＣＭＡと特異的に結合する抗原結合タンパク質の治療上有効な量を対象に投与することを含んでなる方法を提供し、前記対象は、高い割合のＢＣＭＡ発現形質細胞を有する。
【００７７】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に記載の予後方法に従って計算された高い割合のＢＣＭＡ発現形質細胞を有する対象において多発性骨髄腫を処置する方法が提供される。
【００７８】
本発明の別の態様によれば、対象において多発性骨髄腫を処置する方法であって、高レベルのＢＣＭＡ発現を有する対象を同定することおよび前記対象に本明細書に記載の治療上有効な量の抗原結合タンパク質を投与することを含んでなる方法が提供される。ＢＣＭＡ発現のレベルは、本明細書に記載の予後方法に従って計算することができる。
【００７９】
本発明のさらなる態様では、対象において多発性骨髄腫を処置する方法であって、ｉ）対象からサンプルを採取する工程；ｉｉ）前記サンプルにおけるＢＣＭＡ発現のレベルを決定する工程、およびｉｉｉ）ＢＣＭＡ発現のレベルが高ければ、治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質を投与する工程を含んでなる方法が提供される。ＢＣＭＡ発現のレベルは、本明細書に記載の予後方法に従って計算することができる。
【００８０】
本出願の発明者らは、これまでには重大なリスクがある患者として同定されていなかったであろう標準的なリスク遺伝学を有する患者であっても、より短い無病生存期間が高いＢＣＭＡ発現レベルと関連していたという驚くべき所見を得た。よって、このサブセット内に同定された（すなわち、不良な予後を有する）患者は、侵襲的処置計画により好適となるであろう。
【００８１】
このような処置計画は、本明細書に記載の本発明の抗原結合タンパク質のより頻繁な投与、より高用量または併用療法を必要とし得る。
【００８２】
上記のＢＣＭＡ関連障害を有するヒトを処置するいくつかの方法は、高い割合のＢＣＭＡ発現形質細胞を有すると同定されたヒトを処置することを含む。同定は処置のすぐ前に行ってよく、すなわち、ヒトが同定された後、同定後１週間以内に、すなわち、同定の７、６、５、４、３、２、または１日後に処置される。この同定はまた以前に行われていてもよい。例えば、ヒトは、処置の１週間より以前、すなわち、ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質の投与の１週間を超える、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または１００週間前に、ＢＣＭＡを発現する高い割合の形質細胞を有すると同定されていてもよい。両態様とも、本発明の処置の方法内に含まれる。
【００８３】
本発明を提供した当業者は、新たな、明確に異なる患者のサブグループ（高レベルのＢＣＭＡ発現を示す）が今や多発性骨髄腫に関して処置可能であることを認識する。よって、本発明は、このサブグループの処置を可能とする方法および使用の総ての組合せを含む。例えば、本発明は、ヒトにおいて多発性骨髄腫を処置する方法であって、（ａ）ヒトから得られたサンプルが高い割合のＢＣＭＡ発現形質細胞を含有することを決定する工程；および（ｂ）高い割合（例えば、高いＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコア）が検出されれば、治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質などのＢＣＭＡ抗原結合タンパク質を投与する工程を含んでなる方法を提供する。
【００８４】
さらに、本発明の方法および使用における特定の工程を組み合わせてもよい。例えば、（ａ）ヒトサンプルを得る工程；および（ｂ）前記サンプルをＢＣＭＡ発現形質細胞の割合に関して試験する工程を組み合わせて、（ａ’）ヒトサンプルをＢＣＭＡ発現形質細胞の割合に関して試験する単一の工程としてもよい。これらの方法および使用は総て、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００８５】
本発明の治療薬の投与様式は、薬剤を宿主に送達するいずれの好適な経路であってもよい。本発明の抗原結合タンパク質は、非経口投与、すなわち、皮下（ｓ．ｃ．）、くも膜下腔内、腹膜内、筋肉内（ｉ．ｍ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）に特に有用である。１つのかかる態様では、本発明の抗原結合タンパク質は、静脈または皮下投与される。
【００８６】
本発明の治療薬は、有効成分としての有効量の本発明の抗原結合タンパク質を薬学的に許容可能な担体中に含有する医薬組成物として調製され得る。本発明の１つの態様では、本発明の治療薬は、抗原結合タンパク質を注射準備の整った形態で含有する水性懸濁液または溶液である。別の態様では、懸濁液または溶液は、生理学的ｐＨで緩衝させる。１つの態様では、非経口投与用の組成物は、薬学的に許容可能な担体に溶解させた本発明の抗原結合タンパク質の溶液またはカクテルを含んでなる。１つの態様では、担体は水性担体である。限定されるものではないが、０．９％生理食塩水および０．３％グリシンを含む、種々の水性担体が使用可能である。これらの溶液は、無菌、および一般に粒子物質不含とされてよい。これらの溶液は、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）により除菌してよい。本組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤などの生理学的条件に近づけるために必要とされれば、薬学的に許容可能な補助物質を含有し得る。このような医薬処方物中の本発明の抗原結合タンパク質の濃度は広く、すなわち、約０．５％未満から、通常、約１％または少なくとも約１％、多くは約１５または２０重量％まで変更可能であり、選択された特定の投与様式に従い、主として流体容量、粘度などに基づいて選択される。
【００８７】
よって、静注用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの無菌リンゲル液、およびリンゲル液１ｍｌ当たり約１〜約３０または５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗原結合タンパク質を含有するように作製することができる。非経口的投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知であるか、または当業者に自明であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Science, 第15版, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにさらに詳細に記載されている。静脈投与可能な本発明の抗原結合タンパク質処方物の調製については、Lasmar and Parkins, (2000) Pharma. Sci. Tech. Today, 3: 129-137; Wang (1999) Int. J. Pharm. 185: 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992); Akers (2002) J. Pharm. Sci. 91: 2283-2300; Imamura, K et al., (2003) J. Pharm. Sci. 92: 266-274; Izutsu and Kkojima (2002) J. Pharm. Pharmacol, 54: 1033- 1039; Johnson (2002) J. Pharm. Sci, 91: 914-922; and Ha et al., (2002) J. Pharm. Sci, 91, 2252-2264を参照、これらの全内容は引用することにより本明細書の一部とされ、読者に特に参照される。
【００８８】
１つの態様では、本発明の治療薬は、医薬製剤中の場合、単位用量形で存在する。適当な治療上有効な用量は、当業者により容易に決定される。好適な用量は、患者に対して患者の体重に従って計算することができる。例えば、好適な用量は、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇまたは例えば約１〜約１５ｍｇ／ｋｇ、例えば約１０〜約１５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。ヒトにおいてＭＭ、ＳＬＥまたはＩＰＴなどの病態を効果的に処置するためには、好適な用量は約０．１〜約１０００ｍｇ、例えば約０．１〜約５００ｍｇ、例えば約５００ｍｇ、例えば約０．１〜約１００ｍｇ、または約０．１〜約８０ｍｇ、または約０．１〜約６０ｍｇ、または約０．１〜約４０ｍｇ、または例えば約１〜約１００ｍｇ、または約１〜約５０ｍｇの本発明の抗原結合タンパク質の範囲内であり得、これは、非経口、例えば、皮下、静脈内または筋肉内投与され得る。このような用量は、必要に応じて、医師により適当であると選択された適当な時間感覚で繰り返してもよい。
【００８９】
用量および処置期間は、ヒト循環中での本発明の分子の相対的持続時間に関し、処置される病態および患者の健康状態に応じて当業者により調整可能である。最大治療効力を達成するために長期間（例えば、４か月〜６か月）にわたる反復投与（例えば、１週間に１回または２週間ごとに１回または３週間ごとに１回）が必要とされ得ることが想定される。
【００９０】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、保存のために凍結乾燥させ、使用前に好適な担体で再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、技術分野で公知の過酸化および再構成技術が使用可能である。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、ヒトにおいて多発性骨髄腫を処置する方法であって、
（ａ）高い割合のＢＣＭＡ発現形質細胞を有するヒトにより、または
（ｂ）本明細書に記載の予後方法を用いて
前記処置に好適として同定されたヒトにおいて、ＢＣＭＡと特異的に結合する抗原結合タンパク質をヒトに投与することよる方法を提供する。
【００９２】
キット
別の態様では、本発明は、対象の予後を決定するためのキットであって、ＢＣＭＡの発現レベルを測定するための試薬を含んでなるキットを提供する。さらに別の態様では、本発明は、対象においてＢＣＭＡ発現を決定するためのキットであって、サンプルにおけるＢＣＭＡの発現レベルを測定するための試薬を含んでなるキットを提供する。
【００９３】
１つの態様では、ＢＣＭＡの発現レベルは、（例えば本明細書に記載されるＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアを用いて）サンプルにおいてＢＣＭＡを発現する形質細胞の割合を決定することにより測定される。別の態様では、形質細胞を検出するための手段は抗ＢＬＩＭＰ１抗体であり、ＢＣＭＡの発現レベルを測定するための手段は抗ＢＣＭＡ抗体である。別の態様では、これらの試薬は、フローサイトメトリーによりＢＣＭＡの発現レベルを測定するために好適なものである（例えば、本明細書に記載の実施例で使用される試薬）。
【００９４】
別の態様では、本発明は、ＢＣＭＡの発現レベルを測定するための試薬を使用説明書とともに含んでなるパーツキットが提供される。
【００９５】
本明細書内に開示される総ての特許および参照文献は、明示的にかつ完全に、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００９６】
定義
用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、ヒトＢＣＭＡと結合してそれを中和することができる、抗体、抗体フラグメント、およびキメラ抗原受容体などのその他のタンパク質構築物を意味する。
【００９７】
用語Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２は、それらの標準的な意味で使用される（例えば、Harlow et al., 1988参照）。
【００９８】
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含する。
【００９９】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、個々の抗体は、微量に存在し得る潜在的な天然の突然変異以外は同一の集団を含んでなる。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原結合部位にリダイレクトされている。さらに、一般に、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。
【０１００】
「ヒト化抗体」は、本明細書で使用する場合、そのＣＤＲが非ヒトドナー免疫グロブリンに由来し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つの（または複数の）ヒト免疫グロブリンに由来する操作抗体の一種を意味する。加えて、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するために変更されてよい（例えば、Queen et al., (1989) PNAS USA, 86:10029-10032, Hodgson et al., (1991) Biotechnology, 9:421参照）。好適なヒトアクセプター抗体は、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（登録商標）データベース、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースからドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性により選択されるものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸ベース）を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適であり得る。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を供与し得る好適なアクセプター抗体も同様にして選択され得る。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体に起源する必要はないことに留意されたい。従来技術はこのようなヒト化抗体を作製するいくつかの方法を記載している−例えば、ＥＰ０２３９４００参照。
【０１０１】
用語「特異的に結合する」とは、本明細書を通じて本発明の抗原結合タンパク質に関して使用される場合、抗原結合タンパク質が、他のヒトタンパク質と全くまたは有意に結合せずに、ヒトＢＣＭＡ（ｈＢＣＭＡ）と結合することを意味する。この用語は、しかしながら、本発明の抗原結合タンパク質が他の形態のＢＣＭＡ、例えば、霊長類ＢＣＭＡとも交差反応し得るという事実を排除するものではない。例えば、本発明の１つの態様では、抗原結合タンパク質は、ＴＡＣＩまたはＢＡＦＦ−Ｒと結合しない。
【０１０２】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変ドメインである、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。よって「ＣＤＲ」は、本明細書で使用する場合、３つ総ての重鎖ＣＤＲ、または３つ総ての軽鎖ＣＤＲ（または適切な場合、３つ総ての重鎖ＣＤＲと総ての軽鎖ＣＤＲの両方）を意味し得る。
【０１０３】
ＣＤＲは、抗原またはエピトープへの抗体の結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明で対象とするＣＤＲはドナー抗体重鎖可変および軽鎖配列に由来し、天然ＣＤＲの類似体を含み、これらの類似体もまた、それらが由来したドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を共有または保持する。
【０１０４】
抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム(Kabat et al., (1987) Sequences of proteins of Immunological Interest NIH)により決定することができ、あるいはそれらはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステム(Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948)、ｃｏｎｔａｃｔ定義法(MacCallum et al., (1996), J Mol Biol, 262(5), 732-745)または抗体の残基をナンバリングしＣＤＲを決定するための、当業者に公知の他のいずれかの確立された方法を用いて決定することができる。
【０１０５】
当業者に利用可能なＣＤＲ配列の他のナンバリング慣行には、「ＡｂＭ」（バース大学）および「ｃｏｎｔａｃｔ」（ユニバーシティー・カレッジ・ロンドン）法が含まれる。「最小結合単位」を提供するためＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびｃｏｎｔａｃｔ法のうち少なくとも２つを用いてに最小オーバーラッピング領域を決定することができる。最小結合単位はＣＤＲの下位部分であり得る。
【０１０６】
本明細書を通じて、抗体配列のアミノ酸残基はＫａｂａｔスキームに従ってナンバリングされる。同様に、用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」は、Kabat et al., (1987)に示されるＫａｂａｔナンバリングシステムに従う。
【０１０７】
用語「変異体」は、本明細書で使用する場合、配列における少なくとも１つ、２つまたは３つのアミノ酸変化を意味する。これらのアミノ酸変化は欠失、置換または付加であり得るが、好ましくは置換である。１つのかかる態様では、これらの置換は保存的置換である。もう１つの態様では、変異体配列は、正準な抗原結合タンパク質を保持しつつ少なくとも１つの置換を含む。
【０１０８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２は、有限数の主鎖立体配座の１つを構造上示す傾向がある。ＣＤＲの特定の正準構造クラスは、ＣＤＲの長さ、およびＣＤＲとフレームワーク領域の両方においてキーポジションに位置する残基（構造決定残基(structurally determining residues)またはＳＤＲ）により決定されるループパッキングの両方により定義される。Martin and Thornton(J Mol Biol (1996) 263: 800-815)は、「キー残基」正準鋳型を定義するための自動法を作出している。クラスター分析がＣＤＲセットの正準クラスを定義するために使用され、次に、正準鋳型が埋没疎水基、水素結合残基、および保存されたグリシンを分析することにより同定される。抗体配列のＣＤＲは、配列をキー残基鋳型と比較し、同一性または類似性マトリックスを用いて各鋳型をスコア化することによって正準クラスに割り付けることができる。
【０１０９】
用語「ＶＨ」および「ＶＬ」は、抗体のそれぞれ重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを意味して本明細書で使用される。
【０１１０】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という句は、本明細書で使用する場合、異なるＶ領域またはドメインとは独立に抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を意味する。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の異なる可変領域または可変ドメインを伴う形式（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在することができ、ここで、前記他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、付加的な可変ドメインとは独立に抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、この用語が本明細書で使用される場合、抗原に結合し得る「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインはヒト抗体可変ドメインであり得るが、齧歯類（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示される通り）、テンジクザメおよびラクダ科動物ＶＨＨ  ｄＡｂなどの他種由来の単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科動物ＶＨＨは、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準的技術に従ってヒト化してもよく、このようなドメインも本発明により「ドメイン抗体」となお見なされる。本明細書で使用する場合、「ＶＨ」にはラクダ科動物ＶＨＨドメインが含まれる。ＮＡＲＶは、テンジクザメを含む軟骨魚類で同定された免疫グロブリン単一可変ドメインのもう１つの種である。これらのドメインは、新規な抗原受容体可変領域（一般にＶ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと略される）としても知られる。さらなる詳細については、Shao et al., (2006) Mol. Immunol. 44, 656-665およびＵＳ２００５／００４３５１９を参照。
【０１１１】
用語「キメラ抗原受容体」（「ＣＡＲ」）は、本明細書で使用する場合、細胞外標的結合ドメイン（通常、モノクローナル抗体に由来する）、スペーサー領域、膜貫通領域、および１以上の細胞内エフェクタードメインからなる操作受容体を意味する。ＣＡＲはまた、キメラＴ細胞受容体またはキメラ免疫受容体（ＣＩＲ）とも呼ばれている。ＣＡＲは一般に、所望の細胞表面抗原に特異性をリダイレクトするために、Ｔ細胞などの造血細胞に導入される。
【０１１２】
用語「対象」および「患者」は、本明細書では互換的に使用され、多発性骨髄腫（ＭＭ）に罹患している、またはそれを有する疑いのある、そのリスクがある、またはそれに素因がある哺乳動物などの動物、特に、ヒトを意味する。この用語はまた、ウマ、ウシ、ヒツジ、家禽、魚、ブタ、ネコ、イヌ、および動物園動物、ヤギ、無尾猿（例えば、ゴリラまたはチンパンジー）、ならびにラットおよびマウスなどの齧歯類を含む、食物、競技のため、またはペットとして飼育された飼い動物を含む。
【０１１３】
用語「診断」とは、本明細書で使用する場合、その徴候および症状、または遺伝学的分析、病理学的分析、組織学的分析などによる疾患の認識を意味する。
【０１１４】
「予後」は、本明細書で使用する場合、多発性骨髄腫などの疾患の経過の予測を意味する。予測には、対象の、急速進行性、再発性疾患を発症する尤度、特定の期間生存する誘導（例えば、対象が１、２、３、４、または５年生存する尤度または疾患再発の尤度を決定する）、特定の療法（例えば、モノクローナル抗体療法）に奏効する尤度またはそれらの組合せを決定することを含み得る。
【０１１５】
以下、本発明を下記の実施例を参照してさらに説明する。
【実施例】
【０１１６】
実施例１．ヒト骨髄腫細胞株
ヒト骨髄腫細胞株（ＨＭＣＬ）を、ＳＴＲプロファイリングを用いて真正であることを証明するか、またはＡＴＣＣから購入し、ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で培養した。
【０１１７】
細胞は、特に断りのない限り、ＲＰＭＩ（Ｌｏｎｚａ）／１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）／１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＢＣＭＡ発現ＡＲＨ−７７細胞は、各Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベットに２μｇのプラスミドＤＮＡ：ｐＣＤＮＡ３．１  Ｅ５１  ｈＢＣＭＡ、ＢｉｏＣａｔ：１２８１９２、２×１０６  ＡＲＨ−７７細胞（ＧｅｎＭａｂ）および１００μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖを加え、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ＩＩ（総てＬｏｎｚａ）にてプログラムＯ−０１７でエレクトロポレーションを行うことによって作出した。２４時間から、ジェネティシン（Ｇ４１８、１ｍｇ／ｍｌ）を増殖培地に加えた。拡大培養後、１０×１０６のこれらのバルクトランスフェクト細胞を１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲートラット抗ＢＣＭＡ抗体（Ｖｉｃｋｙ−１、Ｅｎｚｏ）で標識し、次いで、最高１％および最低５％の蛍光染色細胞を選別するＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ高速ソーター（ＢＤ）にて単細胞を選別した。
【０１１８】
実施例２−ＢＣＭＡ抗体
親抗ＢＣＭＡ抗体は、ＦＵＴ８欠損産生細胞を利用するＢｉｏｗａＴＭ技術を用いた脱フコシル化によりＦｃを強化し、Ｊ６Ｍ０とした。このＦｃ強化抗体を、プロテアーゼ耐性マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカーを介して微小管破壊剤ＭＭＡＦとコンジュゲートし、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦを作出した。Ｊ６Ｍ０を共焦点顕微鏡およびフローサイトメトリー受容体内部移行および再循環試験のために使用した。野生Ｆｃ型のＪ６Ｍ０（Ｊ６Ｍ０−ｗｔＦｃ）を可溶性ＢＣＭＡの定量のために使用し、患者細胞のフローサイトメトリーのためにＰＥをコンジュゲートした。免疫組織化学のために、Ｊ６Ｍ０のマウスリバースキメラを作製した（Ｊ６Ｍ０  ｍｕＩｇＧ２ａ）。２つのその他のマウスモノクローナルを使用した：フローサイトメトリーにはＦＩＴＣをコンジュゲートしたＳ３０７１１８Ｇ０３を使用し、共焦点顕微鏡ではＳ３３６１０５Ａ０７）。使用した抗体の詳細を表１にまとめる。
【０１１９】
【表２】
2019501369.tif 000003
【０１２０】
実施例３−患者および骨髄の処理
ＵＣＬ／ＵＣＬＨヒト研究倫理委員会により承認されたプロトコールを用い、患者から完全なインフォームドコンセントを得た。ＢＭ穿刺液からの単核細胞（ＭＮＣ）を、密度勾配遠心分離（フィコール・パーク、ＧＥ  ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって得た。総ての患者で骨髄採取時にＣＤ１３８選択細胞に対してＦＩＳＨ分析を行った。有害遺伝学はｔ（４；１４）、ｔ（１４；１６）、ｔ（１４；２０）、１ｑ獲得、１３ｑ喪失、１ｐ喪失および／またはｄｅｌ（１７ｐ）（＞５０％）として定義された。
【０１２１】
実施例４−フローサイトメトリーによる患者細胞におけるＢＣＭＡ発現
細胞をＦＩＴＣコンジュゲートＳ３０７１１８Ｇ０３またはＰＥコンジュゲートＪ６Ｍ０−ｗｔＦｃとともに４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、分析した（ＢＤ  Ｆａｃｓｖｅｒｓｅ）。ＭＦＩ比は、アイソタイプ対照に比べた場合の特異的抗体による平均細胞蛍光を意味する。
【０１２２】
表面ＢＣＭＡ発現の評価のために、マウス抗ＢＣＭＡ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートしたクローンＳ３０７１１８Ｇ０３）、およびＰＥにコンジュゲートしたヒト化抗体Ｊ６Ｍ０−ｗｔＦｃを並行して使用した。初代ＭＭ細胞の場合には、腫瘍細胞を同定するために、抗ＣＤ１３８  ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用い、１００μｌのＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）／０．５％ＢＳＡ（ＰＡＡ）中で骨髄（ＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）に対して染色を行った。関連のあるアイソタイプ対照を使用したが、Ｊ６Ｍ０−ｗｔＦｃ  ＰＥの場合には、Ｊ６Ｍ０−ｗｔＦｃ  ＰＥの添加前に１０分間、Ｆｃ受容体に対する非特異的結合を遮断するために細胞を１０分間、Ｂｉｏｗａ  ｈｕＩｇＧ１とともにプレインキュベートした。抗ＣＤ２０パシフィックブルー（ＰＢ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２８  ＰＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＣＤ５６  ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）も使用した。抗体とのインキュベーションは総て４°で３０分間行い、その後、細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄し、Ｃｙａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＢＤ  Ｆａｃｓ  Ｖｅｒｓｅに流した。Ｓｕｍｍｉｔソフトウエアを用いてデータを分析した。ＭＭ細胞におけるＢＣＭＡ表面発現の半定量的測定値を、抗ＢＣＭＡのＭＦＩとアイソタイプ対照で染色されたサンプルの比（ＭＦＩ比）から得た。
【０１２３】
抗原発現を定量するために、５０μｌ  ＰＥ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ）を同時に流し、細胞当たりに結合した抗体を製造者の説明書に従って計算した。
【０１２４】
実施例５−免疫組織化学によるＢＣＭＡ発現
ホルマリン固定パラフィン包埋組織を、Ｂｏｎｄ−ＩＩＩ自動染色プラットフォーム（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で最適化されたプロトコールを用い、Ｊ６Ｍ０  ｍｕＩｇＧ２ａ単独または抗ＢＬＩＭＰ１（クローンＲＯＳ１９５Ｇ、ＣＮＩＯ、マドリード、スペイン）で染色した。形質細胞を同定するためにＢＬＩＭＰ１に対する染色を用いた。ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアは、ＢＣＭＡ＋でもあるＢＬＩＭＰ＋細胞の割合を意味する（スコア０〜５はそれぞれ０％、１〜１０％、１０〜４０％、４０〜６０％、６０〜８０％および＞８０％と相関する）。
【０１２５】
まず、精製された非コンジュゲート型のＪ６Ｍ０  ｍｕＩｇＧ２ａ（２ｍｇ／ｍｌ）を、Ｂｏｎｄ−ＩＩＩ自動染色プラットフォーム（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ、ＵＫ）にて、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）材料中の標的タンパク質の検出に関してその反応性および特異性を試験した。対照材料は、種々の量のＢＣＭＡが導入されたＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽細胞株ＡＲＨ−７７のＦＦＰＥ細胞ペレットの形態を採った。次に、２〜３μｍ厚の切片を帯電スライド上にとり、排水し、６０℃で１時間ベークした後、最初の自動脱ワックス処理および３〜４％（ｖ／ｖ）過酸化水素を用いた内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行った。希釈曲線を、一定の範囲のエピトープ賦活化法；前処理無し；プロテアーゼ消化；またはクエン酸系（ｐＨ６．０）およびＥＤＴＡ系（ｐＨ９．０）賦活化溶液を用いた熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）で作成し、陰性対照は周囲温度とした。一次抗体を１５分間インキュベートし、ボンドポリマーリファイン検出キット（ＤＳ９８００）を、標準的なプロトコールによるＤＡＢ増強剤（ＡＲ９４３２）およびヘマトキシリン対比染色とともに用いてシグナルを可視化した。Ｂｏｎｄ−ＩＩＩでの免疫組織化学（ＩＨＣ）に関する試薬は総てＬｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ニューカッスル・アポン・タイン、ＵＫから購入した。染色した切片を水中で洗浄し、段階的アルコール／キシレンに順次通した後、キシレン系永久封入剤に封入した。これらのスライドを検査し、バックグラウンドフリーの選択的細胞標識の基準に基づいて最適な条件を選択した。１／４００希釈の患者組織サンプルに対し、２０分間のクエン酸系（ｐＨ６．０）賦活化溶液を用いたＨＩＥＲ、１５分の一次抗体インキュベーションで、Ｊ６Ｍ０  ｍｕＩｇＧ２ａの使用を進めた。
【０１２６】
ＢＣＭＡおよびＢＬＩＭＰ−１（クローンＲＯＳ１９５Ｇ）（ＣＮＩＯ、マドリード、スペイン）に対する二重染色もＢｏｎｄ−ＩＩＩプラットフォームで行った。ＢＣＭＡのＩＨＣは、ヘマトキシリン対比染色を省略し、単一染色について行った。ＢＣＭＡの可視化の直後に、ＥＤＴＡ系（ｐＨ９．０）溶液を用いた２０分間の付加的ＨＩＥＲ工程を行い、その後に２×４５分間、１／４希釈の抗ＢＬＩＭＰ−１上清を適用した。シグナルは、ボンドポリマーリファインレッド検出キット（ＤＳ９３９０）を用いて検出し、およそ５分間インキュベートするベクターブルーアルカリ性ホスファターゼ基質キット（ＳＫ−５３００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ピーターバラ、ＵＫ）で可視化した。スライドをボンドウォッシュおよび蒸留水中で洗浄した後、クリーングレーデッドアルコールで脱水し、風乾し、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ永久封入剤（Ｈ−５０００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ピーターバラ、ＵＫ）で封入した。
【０１２７】
実施例６−抗体結合後の受容体動態の調査
共焦点顕微鏡を用い、内部移行された抗体を可視化した。Ｈ９２９細胞のアリコートをＳ３３６１０５Ａ０７とともにインキュベートし、洗浄し、種々の時点までインキュベートした後、新たに発現した表面ＢＣＭＡを検出するためにＪ６Ｍ０とともにインキュベートした。次に、細胞に透過処理を施し、二次抗体とともにインキュベートした後、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  Ｍｅｔａ共焦顕微鏡で画像を得た。表面ＢＣＭＡの変化を評価するために、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦおよびＪ６Ｍ０を用いるフローサイトメトリーを使用した。
【０１２８】
共焦点顕微鏡    Ｈ９２９細胞を２００μｌのＲＰＭＩ  １６４０／１％ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍｌマウス抗ＢＣＭＡ抗体（ＧＳＫ、Ｓ３３６１０５Ａ０７）中、３７℃で１５分間インキュベートし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１２ｍｍ円形ポリＬリシンコーティングカバーガラス（ＢＤ）上に拡げ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）で１０分間固定した後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μｇ／ｍｌで室温（ＲＴ）にて１時間二次染色を行った。拡げた細胞を次にＰＢＳ中で洗浄し、ＤＡＰＩ含有Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で封入し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  Ｍｅｔａ共焦顕微鏡で画像を得た。
【０１２９】
ＢＣＭＡの内部移行および再発現を経時的に評価するために、まずマウス抗体で染色したＨ９２９細胞のアリコートを洗浄し、次に、ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳに再懸濁させ、種々の時点までインキュベートし、Ｊ６Ｍ０（１０μｇ／ｍｌ）で染色し、固定した。０．１％トリトン（Ｓｉｇｍａ）による透過処理およびＰＢＳ／１％ＢＳＡによるブロッキングの後、細胞を０．５μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ  ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および４μｇ／ｍｌウサギ抗ＥＥＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の混合物とともに１時間室温でインキュベートした。最後に、洗浄後、細胞を０．５μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  ６３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１時間室温でインキュベートし、洗浄し、封入した。報告された時点は、第１の抗体から、概略を示したように細胞を調製するまでの時間を考慮して固定までの期間を意味し、アリコートは、それぞれ１時間および７時間の時点で最初にマウス抗体がＢＣＭＡを評価した後０時間または６時間培養される。
【０１３０】
フローサイトメトリー    １×１０６  Ｈ９２９細胞は、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中、１０μｇ／ｍｌのＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦまたはＪ６Ｍ０の１用量を１５分間、または０および２４時間の時点で２用量を受容した。細胞を２回洗浄し、増殖培地に再懸濁させ、ある時点でインキュベート細胞のアリコートを１％ＰＦＡ中で固定し、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ  ＡＰＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で染色した。ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成の、表面ＢＣＭＡの再発現への寄与を評価するために、シクロヘキシミド（１０または１００μｇ／ｍｌ）をインキュベーション中に含め、その後、二次染色を行った。
【０１３１】
実施例７−可溶性ＢＣＭＡレベルの測定
可溶性ＢＣＭＡ（ｓＢＣＭＡ）のレベルはＭｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）イムノアッセイにより測定した。簡単に述べれば、９６ウェルのハイバインドプレート（ＭＳＤ、Ｌ１５ＸＢ−３）を、ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬ  Ｊ６Ｍ０−ｗｔＦｃモノクローナル抗体（Ｇｉｂｃｏ）２５μＬ／ウェルで溶液コーティングし、２〜８℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％ツィーン２０の３×１７５μＬ／ウェルで洗浄し、６００毎分回転数(revolutions per minute)（ｒｐｍ）に設定したシェーカー上、室温で３０間、２５μｌ／ウェルの希釈剤＃２（ＭＳＤ、Ｒ５１ＢＢ）でブロッキングした。ＢＣＭＡ枯渇プールヒト血清（ＧＳＫ）中、０．１〜１００ｎｇ／ｍＬのヒトＢＣＭＡ細胞外ドメイン（１−５３）タンパク質（ＧＳＫ）を用いてＢＣＭＡ標準曲線を作成した。２５マイクロリットル／ウェルの標準品または血清サンプルをプレートに加え、従前に記載したように１時間インキュベートした。
【０１３２】
プレートを上記のように洗浄した後、２５μＬ／ウェルの、ＰＢＳ１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）中、３μｇ／ｍＬビオチン化ポリクローナルヤギ抗ＢＣＭＡ抗体（Ｒ＆Ｄ）および３μｇ／ｍＬスルホ−ＴＡＧストレプトアビジン（ＭＳＤ）を加えた。プレートを上記のように１時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、ＭＱ水で希釈した１×ＭＳＤリードバッファーＴ（ＭＳＤ）１５０μＬ／ウェルを加えた。１５分以内に、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００で読み取った。
【０１３３】
実施例８−細胞傷害性アッセイ
ＨＭＣＬをＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともに培養し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ（ＢＤ）、およびＦｌｏｗ−Ｃｈｅｃｋ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いるフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｆａｃｓｖｅｒｓｅ）を使用して生細胞数を決定した。初代ＢＭ  ＣＤ１３８＋細胞については、ＭＮＣ全体をＲＰＭＩおよび２０％プール骨髄腫患者血漿(Quinn et al., 2011)中、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートし、生ＭＭ細胞を、上記のように、ＣＤ１３８−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ）染色とその後のアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩを用いるフローサイトメトリーにより数えた。ＭＭ前駆細胞の死滅を評価するために、ＨＭＣＬをＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともに培養し、クローン原性アッセイのためにアリコートをメトセルロース（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に取り出した。３７℃で１４日の培養の後、コロニーを数えた。
【０１３４】
統計学的検定
Ｐ値＜０．０５は有意と見なされた。統計学的検定は示された通りに使用し、Ｐｒｉｓｍバージョン６．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｄｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算した。
【０１３５】
実施例９−悪性形質細胞におけるＢＣＭＡの発現
ＨＭＣＬは種々のレベルの表面ＢＣＭＡを発現し、ＫＭＭ１での低レベル発現に比べ、Ｈ９２９、ＭＭ１．ｓおよびＪＩＭ３では高レベルであった。フローサイトメトリーによれば非ＭＭ細胞株は陰性（ＳｕｐＴ１、Ｒａｊｉ）または低かった（Ｄａｕｄｉ）（図１Ａ）。６４人の患者からのＢＭ  ＭＮＣをＢＣＭＡ発現に関し、フローサイトメトリーによりＣＤ１３８＋集団にゲートをかけて評価した。初代ＭＭ細胞でもまたそれらの表面抗原レベルは、均一に高いから低／陰性発現まで様々であった（図１Ｂ）。ＢＣＭＡ  ＭＦＩ比は１〜６７の範囲であった（図１Ｃ）。３９人の患者の細胞当たりに結合した抗体の数（ＡＢＣ）を評価するためにＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ）を用いた。これらの結果から受容体密度の変動が確認される（中央値１０８４．９、範囲３４８．７〜４２６８．４  ＡＢＣ、図１Ｄ）。ＢＭ中のＣＤ１３８−細胞はＢＣＭＡを発現しなかった（図２Ａ）。本発明者らは、表面ＢＣＭＡと、ＣＤ２８、ＣＤ２０、およびＣＤ５６を含む他のＭＭ抗原との共発現は、ＭＭ表面表現型との相関が見られないことを見出した（図２Ｂ）。
【０１３６】
発明者らのコホートにおいて７０人の患者のうち、６４人の患者が免疫組織化学（ＩＨＣ）に利用可能なＢＭトレフィンを有していた。ＰＣを同定するためにＢＬＩＭＰ１に対する二重染色を用いた（図３Ａ−Ｄ）。ＢＬＩＭＰ１は、形質細胞分化を制御し(Honey, 2003)、正常および悪性ＰＣの生存のために重要と思われる(Lin et al., 2007)転写因子である。さらに、ＢＬＩＭＰ１に対する染色は、ＭＭ骨髄中のＣＤ１３８＋形質細胞コンパートメントを識別する（図４）(Cattoretti et al., 2005)。この抗原の核局在は細胞質および膜のＢＣＭＡの可視化を容易にする。総ての場合で表面および細胞内両方のタンパク質が示されたが、抗原密度ならびにＢＣＭＡ陽性ＰＣの割合にはいくらかの変動が見られた（図４Ａ）。骨髄サンプルには、上記で詳説されるように、ＢＣＭＡ陽性染色のＭＭ細胞の割合に従って０〜５のＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアが与えられた。ＩＨＣスコアとフローサイトメトリーで決定されるＭＦＩ比との間には幅広い相関が見られた（表２）。
【０１３７】
【表３】
2019501369.tif 000004
【０１３８】
一連のＢＭサンプルを有する小系列の患者において、本発明者らは、ＢＣＭＡ発現は数回の再発を通して持続したことを見出した（図３Ｂ）。高いＢＣＭＡ発現が髄外性形質細胞腫に見られ、髄質腫瘍のレベルと相関する（図３Ｃ）。自己幹細胞移植(autologous stem cell transplant)（ＡＳＣＴ）または化学療法後に安定なプラトー相にある患者において、残存するＭＭ細胞はＢＣＭＡ陽性を維持した（図３Ｄ）が、くすぶり型／無症候性のＭＭを有する患者からの腫瘍細胞は低レベル／陰性発現を有したことも見出された（図５）。対照的に、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むほとんどのＢ細胞リンパ腫は、ＢＣＭＡの発現を示さなかった（図６）。例外は、弱い染色しか示さなかったキャッスルマン病、およびＣＤ１３８＋細胞は弱いＢＣＭＡ陽性であったがＣＤ２０＋細胞はそうではなかったリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）のＰＣであった（図７）。
【０１３９】
ＢＣＭＡ発現を非腫瘍性形質細胞増加症で調べたところ、ＨＩＶ陽性患者からのＢＭ  ＰＣは低レベルのＢＣＭＡ発現を示した（図７）。非造血系組織におけるＢＣＭＡ発現の分布を理解するために、多数の正常組織を染色したところ、心臓、肺、腎臓、扁桃および胎盤ではＢＣＭＡ発現が見られなかった。胃腸管では、ＢＣＭＡ発現は小腸の粘膜固有層のＰＣに限られていた（図８）。ウイルス性肝炎患者からの肝臓切片のＰＣもまたＢＣＭＡを発現していた（図８）。
【０１４０】
実施例１０−可溶性ＢＣＭＡレベル
患者のサブセットは、可溶性ＢＣＭＡ（ｓＢＣＭＡ）測定に利用可能な血清を有していた。ＭＭ患者では、循環ＢＣＭＡレベルは３．８〜１０６２ｎｇ／ｍｌの範囲であった（図９）。ＭＭ血清はまた、正常対照に比べて（ｐ＜０．０００１）高レベルのＢＣＭＡを含有しており、新規診断患者と再発疾患を有する患者の間には、骨髄中のＣＤ１３８＋細胞のパーセンテージに関して補正した場合でも、差は見られなかった（図９Ａ）。骨髄ＢＣＭＡ発現と循環可溶性抗原の相関を調べるために、骨髄形質細胞増加症（％ＣＤ１３８＋細胞）とＢＣＭＡ発現レベル（ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコア）の合成スコアを使用した。ｓＢＣＭＡと骨髄トレフィンの両方が利用可能な４０人の患者において、血清ＢＣＭＡレベルは、ＢＭにおける％ＣＤ１３８＋細胞の生産およびＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアと正の相関があった（ｒ２＝０．３７、図９Ｂ）。
【０１４１】
実施例１１−ＢＣＭＡ発現と疾患特徴の相関
表３に要約される患者コホートにおいて、簡単にするために、ＩＨＣスコア（ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコア）を用い、ＭＭ細胞でのＢＣＭＡ発現と臨床および疾患パラメーターとの可能性のある関連を調べた。ＢＣＭＡ発現と患者の人口統計、病期（すなわち、新規診断と再発）、細胞遺伝学的リスク、疾患アイソタイプまたは第二選択治療に対する奏効との相関は無かった（表２）。
【０１４２】
【表４】
2019501369.tif 000005
【０１４３】
ＢＭ生検時からたどる中央値は２４か月（範囲：１〜３８）であった。中央無進行生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）は、４〜５の高いＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアを有する患者では短かった（１３か月に比べてそれぞれ６か月と１８か月および中央値はＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰスコア１〜３に到達しなかった、図１０Ｂ）。この差は統計的に有意でなかった（ログランクによりＰＦＳではｐ＝０．５２およびＯＳでは０．１９）。
【０１４４】
ＰＦＳおよびＯＳを遺伝学的リスクにより分析した場合、予想されたように、有害なＦＩＳＨを有する患者では有意に短い無病生存期間および全生存期間が見られた（中央ＰＦＳが標準リスク群の１４か月に対して７か月、ログランク検定によりｐ＜０．０５、および中央ＯＳがＮＲに対して１５か月、ｐ＜０．００１、図１０Ｃ）。ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアは、ＦＩＳＨ結果を超える付加的予後情報を提供すると思われ、その結果、患者は早期再発および全生存期間に関してリスクの階層化が可能であった。重要こととして、同時に存在する高いＢＣＭＡレベル（ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコア４〜５）は、より早期の再発およびより短い生存期間を有した標準的なリスク遺伝学の患者の小サブグループを同定した。標準的なリスク遺伝学と低いＢＣＭＡ（ＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコア１〜３）、標準的なリスク遺伝学と高いＢＣＭＡ、有害な遺伝学と低いＢＣＭＡ、または有害な遺伝学と高いＢＣＭＡを有する患者は、それぞれ６８％、５０％、３６％、２０％の１２か月ＰＦＳ（ログランク検定によりｐ＜０．０５）および２８、１５、１６か月のＮＲのＯＳ（ログランク検定によりｐ＜０．０１）を有した（図１０Ｄ）。
【０１４５】
実施例１２−ＢＣＭＡ表面受容体動態および再発現
患者間での表面抗原密度の変動および細胞内ＢＣＭＡの証明を考慮して、表面受容体が内部移行され、新たなまたは再循環受容体が細胞表面に発現されるという可能性を検討した。Ｈ９２９ＭＭ細胞を飽和量のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦで１５分間パルス処理し、洗浄し、複数の時点で残存する表面結合抗体を抗ヒトＦｃ染色によりモニタリングし、表面ＢＣＭＡ／抗体複合体は、２４時間までに検出不能なレベルに達する時間依存的な様式で低下した。２４時間の時点で２回目のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの飽和パルスを適用すると、これは同様に急速な低下を示した（図１１Ａ−Ｂ）。
【０１４６】
共焦点顕微鏡を用い、抗体結合により可視化される細胞会合ＢＣＭＡを追跡した。Ｓ３３６１０５Ａ０７による初回パルスの後、表面ＢＣＭＡは１時間までに著しく減少し、７時間まで減少し続けた。１時間から、この表面ＢＣＭＡ（緑）の少なくとも一部は内部移行され、抗ＥＥＡで標識されたエンドソームと共局在することが明らかであった。並行して、その後の間隔を置いたＪ６Ｍ０による染色から、１時間から細胞表面に新たに発現される受容体が明らかになった（図１１Ｃ、赤）。新たに発現される表面ＢＣＭＡの少なくとも一部は、シクロヘキシミドを用いた実験により示されるように、合成に依存するタンパク質である（図１１Ｄ）。再循環／新規合成タンパク質の細胞表面での再発現を伴う結合抗体の内部移行は、低レベルの抗原発現に関するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦ活性の機構を提供する。この仮説はまた、表面ＢＣＭＡが低い腫瘍細胞は、最適な細胞傷害性のために抗体−薬物複合体へのより長い暴露を必要とするであろうことも予測する。
【０１４７】
実施例１３−ＨＭＣＬに対するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの細胞傷害性
次に、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦをＨＭＣＬおよび非ＭＭ細胞株で試験した。細胞傷害性は時間依存的であり、また、様々な表面密のＢＣＭＡを発現するように形質導入された改変型ＡＲＨ−７７細胞で明らかとなったように、表面ＢＣＭＡ発現レベルとの相関もあった（図１２Ａ）。
【０１４８】
よって、無視できる表面ＢＣＭＡしか発現しない野生型（ＷＴ）細胞には細胞死の証拠はほとんどなかったが、挿入図のＦＡＣＳプロットおよびＭＦＩ比により示されるように、形質導入細胞の死滅は表面ＢＣＭＡレベルと相関していた。非ＭＭ細胞株はＢＣＭＡを発現せず、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦにより影響を受けなかったが、ＨＭＣＬは用量および時間依存的な細胞傷害性の証拠を示した。よって、高レベルのＢＣＭＡを発現するＨ９２９細胞は、低濃度のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦ（０．０５μｇ／ｍｌ）で急速な細胞死を受けた（２４時間までに５０％、図１３）が、より低いＢＣＭＡレベルを発現するＨＭＣＬでは同等の細胞の死滅化に、より長いインキュベーションおよびより高用量のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦが必要とされる（ＯＰＭ２、ＫＭＭ１、図１２Ｂ）。死滅化はＳ３０７１１８Ｇ０３の存在下で阻害されたが、抗ＣＤ２０の存在下では阻害されず（図１２Ｃ）、このことはこの効果の抗原特異性を示す。ＨＭＣＬ  ＪＪＮ３では、前駆細胞集団は、クローン原性アッセイにより明らかにされるように、細胞のバルク集団よりも感受性が高いと思われた（図１２Ｄ）。この細胞株は低レベルのＢＣＭＡを発現し、達成可能な最大合計細胞死滅は、数日後であっても４０％前後である。しかしながら、ＭＭ前駆細胞は、コロニーアッセイにより明らかにされるようにＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦにより感受性が高いと思われ、クローン原性細胞の最大８０％が低Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦ用量で死滅する。バルク細胞とクローン原性コンパートメントの間の感受性における同様の違いがＨ９２９ＨＭＣＬでも見られたが、これは、おそらくはより高いレベルの表面ＢＣＭＡのためにあまり顕著ではない。Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦは、クローン原性アッセイで評価されるように、正常造血系ＢＭ前駆細胞に対しては無視できる効果しか持たない。
【０１４９】
実施例１４−初代骨髄腫細胞に対するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの細胞傷害性
次に、１３人の患者からの初代腫瘍細胞において、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦにより媒介される細胞傷害性を、患者からのＢＭ  ＭＮＣを種々の濃度（０．０２〜１０μｇ／ｍＬ）のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦとともにインキュベートすることにより評価した。患者におけるｉｎ  ｖｉｖｏ条件をより良く表すために、総てのアッセイを２０％ＭＭ患者血漿とともに全ＢＭ  ＭＮＣを用いて行い、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１３８＋細胞の生存を改善することが従前に証明されている(Quinn et al., 2011)。このアッセイ形式により、初代腫瘍細胞の良好な回復を伴って、培養を７日まで延長することができた。ＭＭ血漿はまた可溶性ＢＣＭＡも含有し(Sanchez et al., 2012)、これに関してＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦ活性の評価を可能とする。次に、種々の時点での標的細胞の細胞傷害性をＣＤ１３８／ＰＩ／アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーにより決定した（図１４Ａ）。予想されたように、ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞の細胞傷害性は時間依存的であったが、ＩＨＣを用いたＣＤ１３８／Ｋｉ６７二重染色により評価されるように、ＢＣＭＡの表面発現および増殖レベルとも相関が見られた。図１４Ｂは、４人の異なる患者の結果を示す：（ｉ）腫瘍細胞が中等度レベルの表面ＢＣＭＡを発現するが＞１０％という高増殖画分を有する患者０４２では、０．２μｇ／ｍｌのＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦで４日までに有意な腫瘍細胞の死滅が見られる、（ｉｉ）  他方、患者０４８からの腫瘍細胞は、低増殖画分（＜１％）、高レベルの表面ＢＣＭＡを有し、０．５μｇ／ｍｌのＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦで、培養４日までに８０％近い死滅という結果となる。腫瘍細胞が中等度のＢＣＭＡレベルを発現し、１０％前後の増殖画分を有する患者０８５（ｉｉｉ）では、高用量のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦでのみ有意な死滅（４０〜５０％）が見られる。患者０８７（ｉｖ）からはＩＨＣ用に非トレフィンサンプルが利用可能であったが、ＦＡＣＳヒストグラムに見られるように中等度のＢＣＭＡ発現に関しては６日までに有意な死滅が見られる。細胞傷害性試験は、まず低用量のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦで行い、以降の試験でより高用量範囲を採用したことから、用量の変動を示した。ＢＭサンプルが同じ範囲のＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦ用量とともにインキュベートされた３人の患者に対するデータが図１５に示され、これはＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの時間および用量依存効果を示す。
【０１５０】
考察
ＭＭの治療戦略は、現行利用可能な薬剤種の毒性、この高齢患者群の併存疾患、この疾患の固有の遺伝的不均質性、およびそれぞれ疾患の再発を有する複数のクローンの変化している優性度により損なわれる。よって、悪性ＰＣのより特異的な標的化、理想的には、これらの細胞で広く発現され、疾患を通じて安定に発現される抗原の利用、および最小の標的外毒性を有する戦略の使用が差し迫って必要である。モノクローナル抗体は、特に、多剤プロトコールから利益が得られない高齢患者において有効性と良好な忍容性を併せ持つ、他のＢ細胞腫瘍に対する療法の重要な柱として登場した(Rai, 2015)。これまでに、また現行でＭＭに標的化されている多くの抗原は、ＰＣ、例えば、ＣＤ３８、ＣＳ１には特異的でなく(Chillemi et al., 2013; Veillette and Guo, 2013)、よって、例えば、維持において、用量および長期作用に関して注意深い考慮が与えられる必要がある。ＢＣＭＡは、ＰＣ上でほとんど排他的に発現され、ＭＭ腫瘍細胞の生存および薬剤耐性において機能し得る。
【０１５１】
本明細書に記載の実施例では、疾患の様々な病期の患者からのＰＣにおける抗原発現の範囲が報告される。症候性ＭＭを有する患者で、細胞内発現および表面発現の両方の事実上総てのＰＣからのＢＣＭＡ発現が報告される。発現レベルは患者間で異なり、進行性疾患および高リスクの遺伝学的特徴を有する腫瘍ではより高いレベルである傾向があった。ＢＣＭＡは髄外腫瘍で発現され、ここでも高リスク疾患との相関および骨髄外のＭＭ細胞の生存におけるＢＣＭＡ−ＡＰＲＩＬ軸の役割が示唆される。実際に、ＡＰＲＩＬ豊富な形質細胞ニッチがいくつかの髄外組織内に仮定されている(Huard et al., 2008)。重要なこととして、診断時に腫瘍細胞が中等度のＢＣＭＡレベルを発現した患者は、その後の疾患の再活性化を通じて発現を保持すると思われる。さらに、高用量療法を含む処置後の安定疾患の期間中持続する残存腫瘍細胞は、抗原発現を保持し、ＢＣＭＡを標的とする維持戦略の原理を提供する。Ｊ６Ｍ０の、一定範囲の正常組織との反応性を調べ、ＰＣに対するこの抗体の特異性を確認したところ、胃腸管などの組織において正常なＰＣの結合がいくらか見られた。循環ＢＣＭＡレベルは、対照対象に比べてＭＭ患者で高い。
【０１５２】
抗体結合後に受容体の急速な内部移行が見られ、２４時間にわたって再発現する。よって、低い表面レベルのＢＣＭＡしか発現しない腫瘍細胞は、表面ＢＣＭＡを再発現してより多くの抗体と結合することにより、十分なｃｙｓ−ｍｃＭＭＡＦが各細胞内に蓄積されたところで、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦにより媒介される死滅化にも感受性を持つ可能性がある。Ｊ６Ｍ０において強化された脱フコシル化Ｆｃを介した抗体依存性細胞傷害性もまた役割を果たすであろうが、これは低表面ＢＣＭＡを有する腫瘍においては主要なものではあり得ない。
【０１５３】
Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦの活性を不死化細胞株および初代ＭＭ細胞の両方に対して試験した。予想されたように、ＭＭ細胞株の用量および時間依存的溶解が見られ、これはまたＢＣＭＡの表面発現にも依存していた。アネキシンＶ染色により示されるように、アポトーシスによって起こる細胞死は、異なる抗ＢＣＭＡ抗体によっては遮断されたが抗ＣＤ２０抗体によっては遮断されなかったので、ＢＣＭＡ特異的であった。特に、ＭＭ前駆細胞は、前駆細胞の細胞傷害性が供試した総ての用量でバルク細胞集団に比べて大きく、より大きな最大細胞死滅（８０％）に達したＪＪＮ３  ＭＭ細胞で見られたように、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦの効果に対してより感受性があると思われる。初代ＭＭ細胞に対するＪ６Ｍ０−ＭＭＡＦの活性を評価するために、全ＢＭ培養物を用い、従って、ＡＤＣＣのための自己ＮＫ細胞および単球／マクロファージを含んだ。加えて、ＭＭ患者血漿はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭＭ細胞生存および増殖をより良く支持することが従前に見出されていることから、ＦＣＳに代えてＭＭ患者血漿を使用した。これらの試験に関して、ＭＭ血漿は可溶性ＢＣＭＡを含有し得るので、ｉｎ  ｖｉｖｏにより近似する条件であろう。極めてわずかな細胞死滅が２日目に見られたが、４日以降は細胞傷害性の証拠が増えてきた。これらの動態はＭＭ新生物の遅い増殖速度を反映する可能性があるが、ｃｙｓ−ｍｃＭＭＡＦの細胞内濃度が有毒レベルに達するためには受容体の再発現が必要とされるという概念も支持するものであり得る。増殖速度はまた、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦ活性にも影響を及ぼす可能性がある。中等度のＢＣＭＡ発現しかないが高い増殖速度を示す腫瘍細胞では、Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦの有意な活性は比較的低濃度（０．２μｇ／ｍＬまで）で示された。
【０１５４】
興味深い所見は、高いＢＣＭＡ／ＢＬＩＭＰ１スコアに関連したより短い無病生存期間であった。ＢＣＭＡ発現スコアに遺伝学的リスクを組み込むと、より不良の転帰を有する標準的なリスク遺伝学を持つ患者のサブグループが同定できるが、このことはＢＣＭＡ発現が付加的予後情報を付与することを示唆する。診断からであってもＭＭ患者における複数のクローンの存在、ならびに薬物暴露および疾患の固有の遺伝的不安定性により駆動されるサブクローンの優性度の変化への最近の洞察は、有効な療法への挑戦を強調する(Brioli et al., 2014)。
【０１５５】
前駆細胞のレベルでのまたはバイオマーカー発現の不均質性によるプロテアソーム阻害剤およびＩＭｉＤに対する耐性は、生物学的または遺伝学的リスクに依存しない異なる作用様式を有する化合物が差し迫って必要とされることを意味する。よって、抗体に基づく治療薬がこれに関する重要な担い手として浮上してくる。ＢＣＭＡはＰＣに特異的なだけでなく、ＰＣ生理学におけるその中枢的位置を考えれば、ＭＭ細胞の生存に不可欠な役割を果たす可能性がある。
【０１５６】
要約すると、本発明者らは、初代ＢＭ  ＭＭ細胞におけるＢＣＭＡの普遍的発現を報告し、細胞内分子および表面分子の両方が継続的な再循環を呈する可能性がある。本発明者らは、ＡＳＣＴ後の低レベルの病状を含む疾病経過を通じてＢＣＭＡの継続的発現を確認している。本発明者らはまた、細胞遺伝学的リスクを組み込んだ場合の、早期再発およびＢＣＭＡ発現の潜在的な付加的予後値との関連も報告する。これらの所見は、この抗原のＰＣに対する特異性と相まって、ＢＣＭＡが新規な療法の優れた標的であることを示唆する。本発明者らはまた、微小管破壊剤にコンジュゲートされた脱フコシル化Ｆｃを有するヒト化抗ＢＣＭＡ抗体の、ＭＭ細胞株および初代ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞の両方に対する活性を確認している。Ｊ６Ｍ０−ＭＭＡＦ活性の特徴はその作用様式に一致し、この化合物の第一相治験において増殖画分とＢＣＭＡ抗原レベルの両方が重要なバイオマーカーであろうことを示唆する。
【０１５７】
本明細書で引用される限定されるものではないが特許および特許出願を含む総ての刊行物は、各個の刊行物が完全に示されるかのうように引用することにより本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示されるかのごとく引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１５８】
上記の説明は、本発明を、その好ましい態様を含めて完全に開示するものである。本明細書に具体的に開示されるこれらの態様の修飾および改良は、以下の特許請求の範囲内にある。詳述されなくても、当業者は、以上の説明を用いて本発明を最大限に利用することができる。従って、本明細書に提供される例は単に例示と解釈されるべきであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【０１５９】
［配列表］
配列番号１−ＣＡ８  ＣＤＲＨ１
ＮＹＷＭＨ
【０１６０】
配列番号２−ＣＡ８  ＣＤＲＨ２
ＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧ
【０１６１】
配列番号３−ＣＡ８  ＣＤＲＨ３
ＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮ
【０１６２】
配列番号４−ＣＡ８  ＣＤＲＬ１
ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ
【０１６３】
配列番号５−ＣＡ８  ＣＤＲＬ２
ＹＴＳＮＬＨＳ
【０１６４】
配列番号６−ＣＡ８  ＣＤＲＬ３
ＱＱＹＲＫＬＰＷＴ
【０１６５】
配列番号７−ＣＡ８  ＶＨドメイン（マウス）
【化１】
2019501369.tif 000006
【０１６６】
配列番号８−ＣＡ８  ＶＨドメイン（マウス）（ポリヌクレオチド）
【化２】
2019501369.tif 000007
【０１６７】
配列番号９−ＣＡ８  ＶＬドメイン（マウス）
【化３】
2019501369.tif 000008
【０１６８】
配列番号１０−ＣＡ８  ＶＬドメイン（マウス）（ポリヌクレオチド）
【化４】
2019501369.tif 000009
【０１６９】
配列番号１１−ＣＡ８ヒト化ＶＨ  Ｊ６
【化５】
2019501369.tif 000010
【０１７０】
配列番号１２−ＣＡ８ヒト化ＶＨ  Ｊ６（ポリヌクレオチド）
【化６】
2019501369.tif 000011
【０１７１】
配列番号１３−ＣＡ８ヒト化ＶＨ  Ｊ８
【化７】
2019501369.tif 000012
【０１７２】
配列番号１４−ＣＡ８ヒト化ＶＨ  Ｊ８（ポリヌクレオチド）
【化８】
2019501369.tif 000013
【０１７３】
配列番号１５−ＣＡ８ヒト化ＶＨ  Ｊ９
【化９】
2019501369.tif 000014
【０１７４】
配列番号１６−ＣＡ８ヒト化ＶＨ  Ｊ９（ポリヌクレオチド）
【化１０】
2019501369.tif 000015
【０１７５】
配列番号１７−ＣＡ８ヒト化ＶＬ  Ｍ０
【化１１】
2019501369.tif 000016
【０１７６】
配列番号１８−ＣＡ８ヒト化ＶＬ  Ｍ０（ポリヌクレオチド）
【化１２】
2019501369.tif 000017
【０１７７】
配列番号１９−ＣＡ８ヒト化ＶＬ  Ｍ１
【化１３】
2019501369.tif 000018
【０１７８】
配列番号２０−ＣＡ８ヒト化ＶＬ  Ｍ１（ポリヌクレオチド）
【化１４】
2019501369.tif 000019
【図１Ａ】
2019501369.tif 000020
【図１Ｂ】
2019501369.tif 000021
【図１Ｃ】
2019501369.tif 000022
【図１Ｄ】
2019501369.tif 000023
【図２Ａ】
2019501369.tif 000024
【図２Ｂ】
2019501369.tif 000025
【図３Ａ】
2019501369.tif 000026
【図３Ｂ】
2019501369.tif 000027
【図３Ｃ】
2019501369.tif 000028
【図３Ｄ】
2019501369.tif 000029
【図４】
2019501369.tif 000030
【図５】
2019501369.tif 000031
【図６】
2019501369.tif 000032
【図７】
2019501369.tif 000033
【図８】
2019501369.tif 000034
【図９Ａ】
2019501369.tif 000035
【図９Ｂ】
2019501369.tif 000036
【図１０Ａ】
2019501369.tif 000037
【図１０Ｂ】
2019501369.tif 000038
【図１０Ｃ】
2019501369.tif 000039
【図１０Ｄ】
2019501369.tif 000040
【図１１Ａ】
2019501369.tif 000041
【図１１Ｂ】
2019501369.tif 000042
【図１１Ｃ】
2019501369.tif 000043
【図１１Ｄ】
2019501369.tif 000044
【図１２Ａ】
2019501369.tif 000045
【図１２Ｂ】
2019501369.tif 000046
【図１２Ｃ】
2019501369.tif 000047
【図１２Ｄ】
2019501369.tif 000048
【図１３】
2019501369.tif 000049
【図１４Ａ】
2019501369.tif 000050
【図１４Ｂ】
2019501369.tif 000051
【図１５】
2019501369.tif 000052
【配列表】
2019501369000001.xml
【国際調査報告】
2019501369.tif 000073
2019501369.tif 000074
2019501369.tif 000075
2019501369.tif 000076
2019501369.tif 000077