(57)【要約】ＨＣＡｂ（重鎖のみの抗体）の第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置における天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている、ヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、抗体の軽鎖の不在下で標的抗原への結合親和性を有する、単離されたヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）であって、前記ＶＨドメインにおいて、前記ＨＣＡｂの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置の前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている、前記重鎖のみの抗体。
【請求項２】
ヒト抗体である、請求項１に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項３】
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項１に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項４】
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、請求項１に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項５】
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、請求項４に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項６】
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、請求項５に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項７】
前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項６に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項８】
１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項９】
前記ＦＲ４の第１のアミノ酸残基において前記天然のアミノ酸残基を含む対応する抗体と比較して、凝集への傾向が低下している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項１０】
その標的抗原に対して約１ｐＭ〜約１μＭの結合親和性を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項１１】
抗体の軽鎖の不在下で標的抗原に対する結合親和性を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む単離されたヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）であって、前記ＨＣＡｂが、天然のヒトＶＨアミノ酸配列の第４のＦＲ領域（ＦＲ４）における第１位のアミノ酸においてトリプトファン（Ｔ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、前記重鎖のみの抗体。
【請求項１２】
重鎖定常（ＣＨ）ドメインをさらに含み、ＣＨ１領域を欠く、請求項１１に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項１３】
ＩｇＧ１抗体である、請求項１２に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項１４】
１つ以上のＦＲ領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項１５】
前記ＦＲ４の第１のアミノ酸残基において前記天然のアミノ酸残基を含む対応する抗体と比較して、凝集への傾向が低下している、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１７】
単一のヒトＶＨドメインを含む、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、標的抗原に対する結合親和性を有し、第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域における第１のアミノ酸残基の天然のアミノ酸残基の、その位置における天然アミノ酸を含むかまたはそれに関連した表面露出疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基の置換を含む、前記単離された自律ヒト抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン。
【請求項１９】
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項１８に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
【請求項２０】
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、請求項１８に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
【請求項２１】
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、請求項２０に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
【請求項２２】
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、請求項２１に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
【請求項２３】
前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項２２に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
【請求項２４】
１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
【請求項２５】
相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、複数の抗原結合ドメインを含み、標的抗原への結合親和性を有する、多価結合タンパク質であって、前記ＶＨドメインにおいて、前記多価結合タンパク質の第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置の前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている、前記多価結合タンパク質。
【請求項２６】
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項２５に記載の多価結合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、請求項２６に記載の多価結合タンパク質。
【請求項２８】
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、請求項２７に記載の多価結合タンパク質。
【請求項２９】
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、請求項２８に記載の多価結合タンパク質。
【請求項３０】
前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項２９に記載の多価結合タンパク質。
【請求項３１】
１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の多価結合タンパク質。
【請求項３２】
非ヒト動物のゲノム中で互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域をコードする、１つ以上のヒトＶ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪ遺伝子セグメントを含む組換え重鎖のみの免疫グロブリン（Ｉｇ）座位であって、前記ヒトＪセグメントの少なくとも１つが、第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位に、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、前記組換え重鎖のみの免疫グロブリン（Ｉｇ）座位。
【請求項３３】
ＣＨ１機能性を欠く免疫グロブリン定常エフェクター領域をコードする定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントをさらに含む、請求項３２に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項３４】
２〜４０のＤ遺伝子セグメント、及び２〜２０のＪ遺伝子セグメントを含む、請求項３２または３３に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項３５】
１より多い前記ヒトＪセグメントが、前記第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の前記第１位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、請求項３４に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項３６】
全ての前記ヒトＪセグメントが、前記第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の前記第１位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、請求項３５に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項３７】
前記コードされた重鎖ＶＨ領域において、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項３６に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項３８】
前記コードされた重鎖ＶＨ領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、請求項３７に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項３９】
前記コードされた重鎖ＶＨ領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、請求項３８に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項４０】
前記コードされた重鎖ＶＨ領域が、前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項３９に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項４１】
ＷのコドンがＲによって置き換えられているＪ４遺伝子セグメントを含む、請求項４０に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項４２】
前記コードされた重鎖ＶＨ領域が、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項３２〜４１のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項４３】
前記ＶＨ領域を含むヒトまたはヒト化重鎖のみの抗体をコードする、請求項３２〜４２のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項４４】
請求項３２〜４２のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４５】
非ヒト哺乳動物である、請求項４４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４６】
げっ歯動物である、請求項４５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４７】
ラットまたはマウスである、請求項４６に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４８】
ラットである、請求項４７に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４９】
ＵｎｉＲａｔ（商標）である、請求項４８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５０】
いかなる機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子も発現せず、互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含むＶＨドメインをコードする、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のＪ遺伝子セグメント、ならびにその各々がＣＨ１機能性を含む抗体の定常エフェクター領域をコードする１つ以上の定常エフェクター領域遺伝子セグメントを含む、異種の重鎖のみのＩｇ座位を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記ＶＨドメインの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性を破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換され、前記遺伝子セグメントが、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントが組み換えられて重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）をコードする再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子座位を生じるように配置される、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５１】
前記ＶＨドメインにおいて、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項５０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５２】
前記ＶＨドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、請求項５１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５３】
前記ＶＨドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、請求項５２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５４】
前記ＶＨドメインが、前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項５３に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５５】
前記異種の重鎖のみの座位が、ＷのコドンがＲのコドンと置き換えられているＪ４セグメントを含む、請求項５４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５６】
前記コードされた重鎖のみの抗体が、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項５０〜５５のいずれか１項に記載の異種の重鎖のみの座位。
【請求項５７】
哺乳動物である、請求項５０〜５６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５８】
げっ歯動物である、請求項５７に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５９】
ラットまたはマウスである、請求項５８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６０】
ラットである、請求項５９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６１】
ＵｎｉＲａｔ（商標）である、請求項６０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式にて電子的に提出され、かつ全体が援用により本明細書に組み込まれる配列表が含まれている。２０１７年８月１１日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＴＮＯ−０００１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、２６，４０１バイトのサイズである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、改変された重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）を産生するトランスジェニック非ヒト動物に関する。特に、本発明は、凝集する傾向が少ない改変されたヒトまたはキメラＨＣＡｂを産生するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックラットまたはマウス、そのように調製された抗体、及びそれを作製及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
重鎖のみの抗体
基本的な４本鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、４本鎖単位は、一般的に約１５０，０００ダルトンである。各々のＬ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、一方で２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各々のＨ鎖及びＬ鎖はまた、規則正しい間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各々のＨ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、α及びγ鎖の各々について３つの定常ドメイン（ＣＨ）が、ならびにμ及びεアイソタイプについて４つのＣＨドメインが後に続く。各々のＬ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端の定常ドメイン（ＣＬ）が後に続く。ＶＬは、ＶＨと並列し、ＣＬは、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と並列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬの対形成は、共に単一の抗原結合部位を形成する。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドを伴って５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、したがって、１０の抗原結合部位を含むが、一方で分泌されたＩｇＡ抗体は、重合してＪ鎖と共に２〜５個の基本的な４本鎖単位からなる多価集合体を形成することができる。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．  Ｓｔｉｔｅｓ，  Ａｂｂａ  Ｉ．  Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．  Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ，１９９４の７１頁及び６章を参照できる。そのような抗体において、ＶＨとＶＬのドメインの相互作用は、抗原結合領域を形成するが、結合は、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの一部によって促進される。
【０００４】
いずれかの脊椎動物由来のＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの異なるタイプのうちの一方に割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。５つのクラスの免疫グロブリンが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる重鎖を有する。γ及びαのクラスは、ＣＨの配列及び機能における比較的軽微な相違に基づいて、サブクラスにさらに分類され、例えばヒトでは以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２。
【０００５】
標準的なＩｇＧ抗体において、重鎖と軽鎖の結合は、部分的には、軽鎖定常領域と重鎖のＣＨ１定常ドメインの間の疎水性相互作用による。重鎖フレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク４（ＦＲ４）領域において、同様にこの重鎖と軽鎖の間の疎水性相互作用に寄与するさらなる残基が存在する。
【０００６】
しかしながら、ラクダ科の動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマを含むラクダ亜目）の血清は、対になったＨ鎖のみから構成される主要タイプの抗体（重鎖のみの抗体またはＨＣＡｂ）を含むことが知られている。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ、Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ、Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ、Ｌａｍａ  ｇｕａｎａｃｏ、Ｌａｍａ  ａｌｐａｃａ、及びＬａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ）のＨＣＡｂは、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒンジ領域、ならびに、古典的抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに高い相同性を有する２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる固有の構造を有する。これらのＨＣＡｂは、定常領域（ＣＨ１）の第１のドメインを欠き、これはゲノム中に存在するが、ｍＲＮＡプロセシングの間にスプライスにより除去される。ＣＨ１ドメインの不在は、このドメインが軽鎖の定常ドメインを係留する場であるので、ＨＣＡｂ中の軽鎖の不在を説明する。このようなＨＣＡｂは、従来の抗体またはそのフラグメントからの３つのＣＤＲによって抗原結合特異性及び高い親和性を付与するように自然に進化した（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４：２７７−３０２；Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：１１１−１２４）。
【０００７】
軟骨魚類はまた、軽ポリペプチド鎖を欠き、そして完全に重鎖によって構成されている、ＩｇＮＡＲと呼ばれる独特のタイプの免疫グロブリンを進化させてきた。
【０００８】
軽鎖を欠いている重鎖のみの抗体の抗原に結合する能力は１９６０年代に確立されていた（Ｊａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。軽鎖から物理的に分離された重鎖免疫グロブリンは、四量体抗体に対して８０％の抗原結合活性を保持していた。
【０００９】
Ｓｉｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１−７９０は、再構成されたマウスμ遺伝子からＣＨ１ドメインを除去すると、哺乳動物細胞培養において、軽鎖を欠く重鎖のみの抗体が産生されることを実証した。産生された抗体は、ＶＨ結合特異性及びエフェクター機能を保持していた。
【００１０】
ラクダ重鎖抗体の発見は、ファージディスプレイなどの人工システムにおけるヒト単一ドメイン抗体の開発への興味を刺激した。このようにして同定された初期のヒトドメイン抗体は、凝集する傾向があり、通常は軽鎖定常領域との界面に埋もれているフレームワーク領域内の露出した疎水性パッチのために溶解性の問題を有していた。ヒトＶＨドメイン抗体の結晶構造を確立した続く研究は、ヒトドメイン抗体の表面露出した残基を同定した。Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８３，３６３９−３６５４は、自律ヒトＶＨドメインの安定性及び溶解性に寄与する因子の包括的な分析を報告する。
【００１１】
クローニングされ、単離されたＶＨＨドメインは、元のＨＣＡｂの完全な抗原結合能を有する安定なポリペプチドである。ナノボディは、最小の利用可能な無傷の抗原結合フラグメント（約１２〜１５ｋＤａ）であり、軽鎖の不在下で完全に機能性である進化した重鎖抗体の元の重鎖の完全な抗原結合能を有する。これらのＶＨＨドメインは、静脈内、経口または局所の投与に適した、ナノボディと呼ばれる新世代の治療用抗体の基礎となり、高い効力及び１つ以上の標的に対する結合親和性を示す一価または多価の形態で容易に製造できる。
【００１２】
その調製方法を含む単一ドメインＶＨＨ抗体は、例えばＷＯ２００４０６２５５１に記載される。
λ（ラムダ）軽（Ｌ）鎖座位及び／またはλ及びカッパ（カッパ）Ｌ鎖座位が機能的に沈黙していたマウス及びそのようなマウスから産生される抗体は、米国特許第７，５４１，５１３号及び米国特許第８，３６７，８８８号に記載される。マウス及びラットにおける重鎖のみの抗体の組換え産生は、例えば、ＷＯ２００６００８５４８；米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３−１０１；Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７−９０；及びＺｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１−３２８３において報告されてきている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションを介したノックアウトラットの産生は、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３に記載されている。免疫グロブリン重鎖ノックアウトラットの分析は、Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４０：２９３２−２９４１に報告されている。可溶性の重鎖のみの抗体、及びそのような抗体を産生する異種の重鎖座位を含むトランスジェニックげっ歯動物は、米国特許第８，８８３，１５０号に記載されている。結合（標的化）ドメインとして単一ドメイン抗体を含むＣＡＲ−Ｔ構造は、例えば、Ｉｒｉ−Ｓｏｆｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１７：２６３０−２６４１、及びＪａｍｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１８４０：３７８−３８６に記載されている。
近年の進歩にもかかわらず、凝集の傾向が少なく、それらの意図された標的に対して高い親和性を保持する重鎖のみの抗体の産生のための改善された方法への必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６２５５１号
【特許文献２】米国特許第７，５４１，５１３号明細書
【特許文献３】米国特許第８，３６７，８８８号明細書
【特許文献４】国際公開第２００６／００８５４８号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０／０１２２３５８号明細書
【特許文献６】米国特許第８，８８３，１５０号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．  Ｓｔｉｔｅｓ，  Ａｂｂａ  Ｉ．  Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．  Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ，１９９４の７１頁及び６章
【非特許文献２】Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４：２７７−３０２；Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：１１１−１２４
【非特許文献３】Ｊａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５
【非特許文献４】Ｓｉｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１−７９０
【非特許文献５】Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２８３，３６３９−３６５４
【非特許文献６】Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３−１０１
【非特許文献７】Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７−９０
【非特許文献８】Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１−３２８３
【非特許文献９】Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３
【非特許文献１０】Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４０：２９３２−２９４１
【非特許文献１１】Ｉｒｉ−Ｓｏｆｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１７：２６３０−２６４１
【非特許文献１２】Ｊａｍｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１８４０：３７８−３８６
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、凝集への傾向が少ない重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）が、ＨＣＡｂの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位における天然のアミノ酸残基を、その位置の天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる別のアミノ酸残基に置き換えることによって調製できるという発見に少なくとも部分的に基づく。そのような疎水性パッチは、通常は、抗体の軽鎖定常領域との界面に埋もれているが、ＨＣＡｂにおいては表面露出するようになり、少なくとも部分的には、望まれない凝集及びＨＣＡｂの軽鎖結合に向かう。
【００１６】
一態様において、本発明は、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、抗体の軽鎖の不在下で標的抗原への結合親和性を有する、単離されたヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）に関し、上記ＶＨドメインにおいて、上記ＨＣＡｂの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置の天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている。
【００１７】
一実施形態において、ＨＣＡｂはヒト抗体である。
【００１８】
別の実施形態において、ＨＣＡｂ中で、ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている。
【００１９】
さらに別の実施形態において、ＨＣＡｂ中で、ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）、好ましくはアルギニン（Ｒ）のような正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている。
【００２０】
特定の実施形態において、ＨＣＡｂは、第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む。
【００２１】
全ての実施形態において、ＨＣＡｂは、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含み得る。
【００２２】
全ての実施形態において、ＨＣＡｂは、ＦＲ４の第１位のアミノ酸残基において天然のアミノ酸残基を含む対応する抗体と比較して、凝集の傾向が低下していてもよい。
【００２３】
全ての実施形態において、ＨＣＡｂは、約１ｐＭ〜約１μＭの標的抗原に対する結合親和性を有し得る。
【００２４】
別の態様において、本発明は、抗体の軽鎖の不在下で標的抗原に対する結合親和性を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む単離されたヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）に関し、ここで上記ＨＣＡｂは、天然のヒトＶＨアミノ酸配列の第４のＦＲ領域（ＦＲ４）における第１位のアミノ酸においてトリプトファン（Ｔ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む。
【００２５】
一実施形態において、ＨＣＡｂは、重鎖定常（ＣＨ）ドメインを含み、ＣＨ１領域を欠き、ＩｇＧ１抗体のようなＩｇＧ抗体であり得る。
【００２６】
別の実施形態において、ＨＣＡｂは、１つ以上のＦＲ領域において、１つ以上のさらなる変異を含む。
【００２７】
さらに別の実施形態において、ＨＣＡｂは、ＦＲ４の第１位のアミノ酸残基において天然のアミノ酸残基を含む対応する抗体と比較して、凝集の傾向が低下している。
【００２８】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるような重鎖のみの抗体を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。一実施形態において、ＣＡＲは、単一のヒトＶＨドメインを含む。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、標的抗原に対する結合親和性を有し、第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域における第１のアミノ酸残基の天然のアミノ酸残基の、その位置における天然アミノ酸を含むかまたはそれに関連した表面露出疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基の置換を含む、単離された自律ヒト抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインに関する。
【００３０】
一実施形態において、単離された自律ヒトＶＨドメイン中で、ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている。
【００３１】
別の実施形態において、ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）残基、好ましくはアルギニン（Ｒ）残基のような正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている。
【００３２】
さらなる実施形態において、単離された自律ヒトＶＨドメインは、第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む。
【００３３】
なおもさらなる実施形態において、単離された自律ヒトＶＨドメインは、１つ以上のフレームワーク領域において１つ以上のさらなる変異を含む。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、複数の抗原結合ドメインを含み、標的抗原への結合親和性を有する、多価結合タンパク質に関し、上記ＶＨドメインにおいて、上記多価結合タンパク質の第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置の天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている。
【００３５】
一実施形態において、多価結合タンパク質中で、ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている。
【００３６】
別の実施形態において、多価結合タンパク質中で、ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）残基、好ましくはアルギニン（Ｒ）残基のような正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている。
【００３７】
さらなる実施形態において、多価結合タンパク質は、第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む。
【００３８】
全ての実施形態において、多価結合タンパク質は、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含み得る。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、非ヒト動物のゲノム中で互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域をコードする、１つ以上のヒトＶ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪ遺伝子セグメントを含む組換え重鎖のみの免疫グロブリン（Ｉｇ）座位に関し、上記ヒトＪセグメントの少なくとも１つは、第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位に、その位置における天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む。
【００４０】
一実施形態において、組換え重鎖のみのＩｇ座位は、ＣＨ１機能性を欠く免疫グロブリン定常エフェクター領域をコードする定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントをさらに含む。
【００４１】
様々な実施形態において、組換え重鎖のみのＩＧ座位は、２〜４０のＤ遺伝子セグメント、及び／または２〜２０のＪ遺伝子セグメントを含む。
【００４２】
別の実施形態において、１より多いヒトＪセグメントは、第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位において、その位置における天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む。
【００４３】
さらに別の実施形態において、組換え重鎖のみのＩｇ座位で、全てのヒトＪセグメントは、第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位において、その位置における天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む。
【００４４】
さらなる実施形態において、コードされた重鎖ＶＨ領域中で、ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）、好ましくはアルギニン（Ｒ）残基のような極性アミノ酸残基によって置換されている。
【００４５】
なおもさらなる実施形態において、コードされたＶＨ領域は、第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む。
【００４６】
さらに別の実施形態において、組換え重鎖のみのＩＧ座位は、ＷのコドンがＲによって置き換えられているＪ４遺伝子セグメントを含む。
【００４７】
全ての実施形態において、組換え重鎖のみのＩｇ座位は、１つ以上のフレームワーク領域において１つ以上のさらなる変異を含むＶＨ領域をコードする。
【００４８】
さらなる実施形態において、組換え重鎖のみのＩｇ座位は、本明細書において上述されるようなＶＨ領域を含む、ヒトまたはヒト化の重鎖のみの抗体をコードする。
【００４９】
別の態様において、本発明は、本明細書において上述されるような組換え重鎖のみのＩｇ座位を含むトランスジェニック非ヒト動物に関する。
【００５０】
様々な実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト脊椎動物、げっ歯動物、マウス、またはラットのような、例えばＵｎｉＲａｔ（商標）のような、非ヒト哺乳類である。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、いかなる機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子も発現せず、互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含むＶＨドメインをコードする、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のＪ遺伝子セグメント、ならびにその各々がＣＨ１機能性を含む抗体の定常エフェクター領域をコードする１つ以上の定常エフェクター領域遺伝子セグメントを含む、異種の重鎖のみのＩｇ座位を含むトランスジェニック非ヒト動物に関し、ここで、上記ＶＨドメインの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基は、その位置における天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性を破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換され、遺伝子セグメントが、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントが組み換えられて重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）をコードする再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子座位を生じるように配置される。
【００５２】
一実施形態において、上記トランスジェニック非ヒト動物のＶＨドメイン中で、ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）残基、好ましくはアルギニン（Ｒ）残基のような極性アミノ酸残基または正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている。
【００５３】
別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物中で、ＶＨドメインは、第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む。
【００５４】
さらに別の実施形態においてトランスジェニック非ヒト動物中で、異種の重鎖のみの座位は、ＷのコドンがＲのコドンと置き換えられているＪ４セグメントを含む。
【００５５】
全ての実施形態において、コードされた重鎖のみの抗体は、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む。
【００５６】
さらなる実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物は、哺乳動物、脊椎動物、げっ歯動物、マウス、またはラットのような、例えばＵｎｉＲａｔ（商標）である。
【００５７】
全ての態様において、ある特定の実施形態では、本明細書中の重鎖のみの抗体は、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３領域を含む他のフレームワーク領域中に変異を含まない。
【００５８】
全ての態様において、ある特定の実施形態では、本明細書中の重鎖のみの抗体は、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、またはグアナコのようなラクダ科の動物中に典型的に存在する、さらなるフレームワーク変異を含まない。
【００５９】
全ての態様において、ある特定の実施形態では、本明細書中の重鎖のみの抗体は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／またはＦＲ４領域を含む、１つ以上のフレームワーク領域において、例えば、ＦＲ２領域において、またはＦＲ２及びＦＲ４領域において、１つ以上のさらなる変異を含み得る。
【００６０】
全ての態様及び実施形態において、本発明のＨＣＡｂが結合親和性を有する標的抗原は、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、ＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−α、ＣＤ２０、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＬ１−β、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＣＤ３８、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１２、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＰ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＣＤ１３７、ＯＸ−４０、及びＩＬ−３３のような、細胞表面受容体及び腫瘍抗原を非限定的に含む。
【００６１】
全ての態様及び実施形態において、ＨＣＡｂ結合ドメインは、同一の標的抗原の複数の異なるエピトープまたは１つを超える標的抗原の複数の異なるエピトープに結合する、多重特異性結合タンパク質の一部であり得る。例えば、下記の結合親和性を有する二重特異性ＨＣＡｂ構造を含む多重特異性、例えば二重特異性ＨＣＡｂが特に含まれる：上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）×ＣＤ３；ＣＤ１９×ＣＤ３；ＥｐＣａｍ×ＣＤ３；ＴＮＦ−α×ＩＬ−１７；ＩＬ−１α×ＩＬ−１β；ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ；ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）×ＨＥＲ３；ＩＬ−４×ＩＬ−１３；アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）×血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；第ＩＸａ因子×第Ｘ因子；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）×ＨＥＲ３；ＩＬ−１７Ａ×ＩＬ−１７Ｆ；ＨＥＲ２×ＨＥＲ３；がん胎児抗原×ＣＤ３；ＣＤ２０×ＣＤ３；ＣＤ１２３×ＣＤ３；ＢＣＭＡ×ＣＤ３、ＰＳＭＡ×ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＰＳＭＡ×ＣＤ３、ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＣＤ１９×ＣＤ２２×ＣＤ３、ＣＤ２２×ＣＤ３、ＣＤ３８×ＰＤ１、ＣＤ３８×ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３８×ＣＤ７３、ＣＤ３８×ＣＤ３９、ＰＤ１×ＣＤ３９×ＣＤ７３、及びＰＤ１×ＣＤ７３。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】実施例に記載されるように、重鎖のみの抗体を発現するＵｎｉＲａｔ（商標）（配列番号４１）において、第１０１位におけるＲを表すＪ４遺伝子セグメント（配列番号４０）を有するヒト導入遺伝子の図である。
【図２】実施例に記載されるように、重鎖のみの抗体を発現するＵｎｉＲａｔ（商標）において、第１０１位におけるＲを表す全てのＪセグメント（出現する順番でそれぞれ配列番号４２〜４７）を有するヒト導入遺伝子の図である。
【図３】ＵｎｉＲａｔ（商標）及びＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）におけるＪ遺伝子の使用を示し、ここで後者は、ＵｎｉＲａｔ（商標）と同一のヒトＶ遺伝子クラスターを有するが、固定されたカッパ軽鎖を発現するトランスジェニックラットである。
【図４】重鎖のみのヒト抗体における第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１のアミノ酸残基のＷ→Ｒの変異が、ラムダ軽鎖による結合を阻害することを示す。
【図５−１】同一のＣＤＲ３ファミリーにおける、重鎖抗体との遊離ラムダタンパク質の結合。図は、同一のＣＤＲ３ファミリーにおける重鎖抗体由来の１１のＶＨ配列多重配列アラインメントを示す（出現する順番でそれぞれ配列番号４８〜５８）。これらの配列の全ては第１０１位にＷを含む。
【図５−２】同一のＣＤＲ３ファミリーにおける、重鎖抗体との遊離ラムダタンパク質の結合。図は、同一のＣＤＲ３ファミリーにおける重鎖抗体由来の１１のＶＨ配列多重配列アラインメントを示す（出現する順番でそれぞれ配列番号４８〜５８）。これらの配列の全ては第１０１位にＷを含む。
【図６】本発明のヒト重鎖のみの抗体を用いるｓｃＦＶ  ＣＡＲ−Ｔ構造（パネルＡ）及びＣＡＲ−Ｔ構造（パネルＢ）を含む、ヒトＶＨ細胞外結合ドメインを用いるキメラ抗原受容体の２つの構造を示す。
【図７】ヒトＶＨ結合ドメインを含む様々な多重特異性ＨＣＡｂコンストラクトを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明の実施は、別途示されない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技術を利用するであろうが、これらは当技術分野の範囲内である。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）のような文献に完全に説明される。
【００６４】
特許出願及び刊行物を含む本明細書において引用される全ての参照文献は、参照によりその全てが組み込まれる。
【００６５】
Ｉ．  定義
本明細書において使用されるとき、本明細書において定義されるような「トランスジェニック非ヒト動物」は、第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位のアミノ酸残基が、そのような残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる別の残基と置き換えられているヒトまたはヒト化の重鎖のみの抗体を産生することのできる非ヒト動物である。一実施形態において、天然のアミノ酸残基は、正に荷電したアミノ酸残基のような荷電したアミノ酸残基によって置き換えられている。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、非限定的に、ラット、マウス、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどを含む。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、げっ歯動物、好ましくはラットまたはマウス、最も好ましくは、ＵｎｉＲａｔ（商標）である。トランスジェニック動物の選択は、本明細書において記載されるＦＲ４変異を有するヒトまたはキメラの重鎖のみのヒトまたはキメラの抗体を産生する能力によってのみ制限される。
【００６６】
本明細書において使用されるとき、「遺伝子改変」は、非ヒト動物の遺伝子配列における１つ以上の改変である。非限定的な例は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入遺伝子の挿入である。
【００６７】
本明細書において使用されるとき、「導入遺伝子」は、プロモーター、レポーター遺伝子、ポリアデニル化シグナル、及び発現を増強する他の因子（インシュレーター、イントロン）を含む外来性ＤＮＡを指す。この外来性ＤＮＡは、トランスジェニック動物が発生する１細胞胚のゲノムに組み込まれ、導入遺伝子は成熟動物のゲノムに維持される。組み込まれた導入遺伝子ＤＮＡは、卵またはマウスのゲノム中の単一または複数の場所で生じ得、導入遺伝子の単一から複数（数百）のタンデムコピーが各々のゲノムの位置に組み込まれ得る。
【００６８】
「標準的な抗体」は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各々の軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結するが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各々の重鎖及び軽鎖はまた、規則正しい間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが後に続く。各々の軽鎖は、一端における可変ドメイン（ＶＬ）とその他端における定常ドメインとを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと並列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。
【００６９】
本明細書の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１））に従ってナンバリングされる。このナンバリングに従うと、ＦＲ４領域の第１のアミノ酸残基は、アミノ酸位置１０１である。
【００７０】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列において大幅に異なり、その特定の部分が、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって、均等に分布していない。それは、軽鎖と重鎖の可変ドメインの両方における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、主としてβ−シート構造を採用し、β−シート構造を連結するループを形成し、場合によりβ−シート構造の一部を形成する３つのＣＤＲによって連結される４つのＦＲ領域を含む。各々の鎖のＣＤＲは、他の鎖由来のＣＤＲと共にＦＲ領域によってごく接近し、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ．１，ｐａｇｅｓ  ６４７−６６９（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性への参加のような様々なエフェクター機能を示す。
【００７１】
本明細書において使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集合より取得される抗体、すなわち集合を構成する個別の抗体が、少量で存在し得る可能性のある自然発生の変異を除いて同一であるものを指す。モノクローナル抗体は、高い特異性であり、単一の抗原部位を標的とする。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含む標準的な（ポリクローナル）抗体調製物と比較して、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を標的とする。
【００７２】
用語「重鎖のみの抗体」、「重鎖抗体」、及び「ＨＣＡｂ」は交換可能に使用され、最も広い意味で、標準的な抗体の軽鎖を欠く抗体を指す。ホモ二量体のＨＣＡｂが軽鎖を欠き、したがってＶＬドメインを欠くので、抗原は単一のドメイン、すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン（ラクダの重鎖可変ドメインを指すとき、ＶＨまたはＶＨＨ）によって認識される。この用語は特に、ＶＨＨ抗原結合ドメインならびにＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインを含むホモ二量体抗体またはＣＨ１ドメインの不在下のラクダ抗体；そのような抗体の機能的（抗原結合）バリアント、可溶性ＶＨバリアント、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲ）及び５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲ）のホモ二量を含むＩｇ−ＮＡＲならびにそれらの機能的フラグメント；ならびに可溶性単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディを非限定的に含む。本発明の重鎖のみの抗体は、ＦＲ４の第１位のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔナンバリングに従ってアミノ酸残基１０１）が、その残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる別の残基によって置き換えられている少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む。一実施形態において、天然のアミノ酸残基は、正に荷電したアミノ酸残基のような荷電したアミノ酸残基によって置き換えられている。本発明の重鎖のみの抗体は、好ましくは、ヒトまたはキメラの抗体であり、好ましくはアミノ酸位置１０１においてＴｒｐ（Ｗ）からＡｒｇ（Ｒ）への変異（Ｗ１０１Ｒ変異）を含む。一実施形態において、本明細書の重鎖のみの抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の結合（標的化）ドメインとして使用される。
【００７３】
用語「可溶性単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」は、最も広い意味で、定常ドメインの不在下における、重鎖抗体の、または標準的なＩｇＧの、重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを指すのに使用される。基本的なｓｄＡｂの構造は、通常、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）で中断されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）からなる。したがって、ｓｄＡｂは、以下の構造によって表すことができる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。さらなる概説については、例えば、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ，"Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ"Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３）：Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１１：４８４−４９０を参照されたい。
【００７４】
本発明の抗体は多重特異性抗体を含む。多重特異性抗体は、１つを超える結合特異性を有する。用語「多重特異性」は、特に、「二重特異性」及び「三重特異性」ならびにより高次の独立した特異的結合親和性、例えば、より高次のポリエピトープ特異性、ならびに四価の抗体及び抗体断片を含む。用語「多重特異性抗体」、「多重特異性単一鎖のみの抗体」及び「多重特異性ＨＣＡｂ」は、本明細書において、最も広い意味で、１つを超える結合特異性を有する全ての抗体を包含する。
【００７５】
本明細書において使用されるとき、用語「価」は、抗体分子における指定された数の結合部位を指す。
【００７６】
「多価」抗体は、２つ以上の結合部位を有する。したがって、用語「二価」、「三価」、及び「四価」は、それぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、及び４つの結合部位の存在を指す。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価、四価、またはそうでなくて、多価であってもよい。本発明の多重特異性単一鎖のみの抗体、例えば二重特異性抗体は、多価の単一鎖のみの抗体を含む。
【００７７】
用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、最も広い意味で、膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインへと所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体の抗原結合領域または他のリガンド）を移植して改変された受容体を指すのに本明細書において使用される。典型的には受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞上に移植して作り出すために使用される。Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，２０１５；１０８（７）：ｄｖｊ４３９；及びＪａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０−３８３。ヒトＶＨ細胞外結合ドメインを含む代表的なＣＡＲ−Ｔコンストラクトを図６に示す。
【００７８】
「組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）座位」によって、外来性Ｉｇ座位の部分を欠き、及び／または対象の哺乳動物におけるＩｇ座位に対して内在性ではない少なくとも１つのフラグメントを含むＩｇ座位を意味する。そのようなフラグメントは、ヒトまたは非ヒトのものであり得、任意のＩｇ遺伝子セグメントまたはその部分を含み得、またはＩｇ座位全体を構成し得る。組換えＩｇ座位は、好ましくは、遺伝子再構成を実施し、トランスジェニック動物において免疫グロブリンのレパートリーを産生することのいできる機能性座位である組換えＩｇ座位は、組換えＩｇ軽鎖座位及び組換えＩｇ重鎖座位を含む。宿主ゲノムに一旦組み込まれると、人工Ｉｇ座位は、組換えＩｇ座位と呼ぶことができる。
【００７９】
「トランスジェニック抗体」によって、組換えＩｇ座位によってコードされ、本発明による組換えＩｇ座位を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物によって産生されるか、またはそうでなくてもそれに由来する抗体を意味する。対象のトランスジェニック動物に由来するトランスジェニック抗体は、対象のトランスジェニック動物から取得された単離された細胞もしくは核酸を用いて、または、対象のトランスジェニック動物から取得された単離された細胞もしくは核酸に由来する細胞もしくは核酸を用いて産生されたトランスジェニック抗体を含む。好ましい実施形態において、トランスジェニック抗体は、組み込まれたドナーのポリヌクレオチドまたはその一部によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
本明細書において使用されるとき、用語「Ｉｇ遺伝子セグメント」は、非ヒト動物及びヒトの生殖細胞系列に存在し、Ｂ細胞中で集まって再構成されたＩｇ遺伝子を形成する、Ｉｇ分子の様々な部分をコードするＤＮＡのセグメントを指す。したがって、本明細書において使用されるとき、「Ｉｇ遺伝子セグメント」は、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、及びＣ領域遺伝子、ならびにその部分を指し得る。
【００８１】
本明細書において使用されるとき、用語「ヒトＩｇ遺伝子セグメント」は、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然に存在する配列、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然に存在する配列の縮重形態の両方、ならびにヒトＩｇ遺伝子セグメントの天然に存在する配列によってコードされるポリペプチドに実質的に同一なポリペプチド配列をコードする合成配列を含む。「実質的に」によって、アミノ酸配列の同一性の度合いが少なくとも約８５〜９５％であることを意味する。好ましくは、アミノ酸配列の同一性の度合いは、９０％より大きく、より好ましくは９５％より大きい。
【００８２】
本明細書において定義されるとき、用語「重鎖のみの抗体の座位」は、抗体のＦＲ４領域の第１のアミノ酸残基が性に荷電し、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のＪ遺伝子セグメントを含み、任意選択で、各々がＣＨ１ドメイン機能性を欠く抗体の定常エフェクター領域をコードする１つ以上の重鎖エフェクター領域遺伝子セグメントを含む、ＶＨドメインをコードする座位を指す。好ましくは、重鎖のみの座位は、約５〜約２０のＶ遺伝子フラグメント、約２〜約４０のＤ遺伝子フラグメント、及び約２〜約２０のＪ遺伝子フラグメントを含み、Ｖ／Ｄ／Ｊフラグメントは好ましくはヒト起源である。用語「Ｄ遺伝子セグメント」及び「Ｊ遺伝子セグメント」はまた、それらの範囲内に、誘導体、相同体、及びそのフラグメントを含み、そして生じるセグメントは、本明細書において記載されるような重鎖抗体座位の残余の構成要素と再構成して重鎖のみの抗体を生成することができる。Ｄ及びＪの遺伝子セグメントは、天然に存在する源に由来してもよく、または、それらは、当業者に周知であり、本明細書において記載される方法を用いて合成してもよい。一実施形態において、Ｊ４遺伝子セグメントにおいて、Ｗのコドン（ＴＧＧ）は、Ｒのコドン（ＣＧＧ）によって置き換えられてＦＲ４の第１のアミノ酸位置（Ｋａｂａｔナンバリングに従う重鎖のみの抗体の第１０１位）におけるＷの代わりにＲをコードするようにされる。Ｄ及びＪの遺伝子セグメントは、ＣＤＲ３の多様性を高めるために、所定の追加のアミノ酸残基、または所定のアミノ酸置換もしくは欠失のためのコドンを組み込んでもよい。用語「Ｖ遺伝子セグメント」は、ＦＲ４領域の第１の残基に正に荷電したアミノ酸残基を導入するよう改変された、例えばげっ歯動物などの非ヒト哺乳動物のような非ヒト動物由来の天然に存在するＶ遺伝子セグメントを包含する。「Ｖ遺伝子セグメント」は、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、及びＣＨ１エクソンを排除する重鎖定常領域と再構成して、核酸が発現するときに重鎖のみの抗体を生成することができるようにするべきである。
【００８３】
「ヒトイディオタイプ」によって、ヒト抗体上の免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域に存在するポリペプチド配列エピトープを意味する。本明細書において使用されるとき、用語「ヒトイディオタイプ」は、ヒト抗体の天然に存在する配列と天然に存在するヒト抗体に見られるポリペプチドと実質的に同一の合成配列との両方を含む。「実質的に」によって、アミノ酸配列の同一性の度合いが少なくとも約８５〜９５％であることを意味する。好ましくは、アミノ酸配列の同一性の度合いは、９０％より大きく、より好ましくは９５％より大きい。
【００８４】
「キメラ抗体」または「キメラ免疫グロブリン」によって、少なくとも２つの異なるＩｇ座位に由来するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン分子、例えば、ヒトＩｇ座位によってコードされる部分及びラットＩｇ座位によってコードされる部分を含むトランスジェニック抗体を意味する。キメラ抗体は、非ヒトＦｃ領域または人工のＦｃ領域を有する抗体、及びヒトイディオタイプを含む。そのような免疫グロブリンは、そのようなキメラ抗体を産生するよう改変された本発明の動物から単離することができる。
【００８５】
「結合親和性」」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書において使用されるとき、「結合親和性」は、結合対の構成員（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。本発明のＨＣＡｂのＫｄは、典型的には、約１ｐｍ〜約１μＭであり、例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ以上強くあり得る。親和性は、当該技術分野において公知の一般的な方法によって測定できる。低親和性抗体は、一般的にゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向にあるが、高親和性抗体は、一般的に迅速に抗原に結合し、結合を維持する傾向にある。
【００８６】
本明細書において使用されるとき、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、表面プラズモン共鳴アッセイ、例えば、２５℃で、工程化された抗原ＣＭ５チップと共に約１０の反応単位（ＲＵ）でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）を用いて測定された解離定数を指す。さらなる詳細は、例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。
【００８７】
「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する抗原分子表面の部位である。一般的に、抗原はいくつかのまたは多数の異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語は特に、直線状のエピトープ及び立体配座のエピトープを含む。
【００８８】
「ポリエピトープ特異性」は、同一または異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。
【００８９】
２つの抗体が同一のまたは立体的に重なるエピトープを認識するとき、抗体は参照抗体と「実質的に同一のエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一のまたは立体的に重なるエピトープに結合するかを決定するための最も広く使用される迅速な方法は、標識された抗体または標識された抗体のいずれかを用いて、全ての数の異なるフォーマットで構成することのできる競合アッセイである。通常、抗原が９６ウェルプレート上に固定され、非標識の抗体による標識された抗体の結合を阻止する能力が、放射性標識または酵素標識を用いて測定される。
【００９０】
「エピトープマッピング」は、抗体によるそれらの標的抗原上の結合部位またはエピトープを同定するプロセスである。抗体のエピトープは、直線状エピトープまたは立体配座のエピトープであり得る。直線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続した配列によって形成される。立体配座エピトープは、タンパク質配列中の不連続であるアミノ酸によって形成されるが、それはタンパク質のその三次元構造へのフォールディングの際に集まる。
【００９１】
本明細書において使用されるとき、「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、全ての新生物細胞の増殖及び増殖、ならびにすべての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。用語「腫瘍」は、固形腫瘍と血液がんの両方を含む。
【００９２】
用語「がん」及び「がん性」は、典型的には、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理的状態を指すかまたはそれを記載する。がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。がんのより詳細な例としては、乳がん、胃がん、扁平上皮がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、腎臓がん、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、頭頸部がん、直腸がん、結腸直腸がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん及び肺扁平上皮がんを含む肺がん、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平上皮がん）、前立腺がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がんまたは胃腸がんを含む胃がん、膵臓がん、膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む血液悪性腫瘍、多発性骨髄腫及び急性血液悪性腫瘍、子宮内膜がんまたは子宮がん、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛がん、唾液腺がん、外陰がん、甲状腺がん、食道がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、上咽頭がん、喉頭がん、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚がん、シュワン細胞腫、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路がん、甲状腺がん、ウィルムス腫瘍、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；抗悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連した異常な血管増殖、及びＭｅｉｇｓ症候群が含まれる。
【００９３】
ＩＩ．  詳細な説明
本発明のＨＣＡｂは、ＦＲ４領域の第１位（Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従ったアミノ酸位置１０１）の天然のアミノ酸残基を、その位置における天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる別のアミノ酸残基によって置換したヒトまたはキメラである。そのような疎水性パッチは、通常は、抗体の軽鎖定常領域との界面に埋もれているが、ＨＣＡｂにおいては表面露出するようになり、少なくとも部分的には、望まれない凝集及びＨＣＡｂの軽鎖結合に向かう。置換されたアミノ酸残基は、好ましくは荷電し、より好ましくは正に荷電している。生じるＨＣＡｂは、好ましくは高い抗原結合親和性、及び凝集が不在の生理的条件下の高い溶解度を有する。
【００９４】
ラクダのＶＨＨフレームワーク及び変異を欠いた重鎖のみの抗体、ならびにその機能的なＶＨ領域が特に含まれる。そのような重鎖のみの抗体は、例えば、ＷＯ２００６／００８５４８に記載されるような完全なヒト重鎖のみの遺伝子座位を含む、例えばトランスジェニックラットまたはマウスにおいて産生することができるが、ウサギ、モルモット、ラットのような他のトランスジェニック哺乳動物もまた使用することができ、ラット及びマウスが好ましい。ＶＨＨまたはＶＨの機能的フラグメントを含む重鎖のみの抗体はまた、組換えＤＮＡ技術によって、Ｅ．  ｃｏｌｉまたは酵母を含む好適な真核生物または原核生物の宿主においてコードする核酸の発現によって、産生することができる。
【００９５】
重鎖のみの抗体のドメインは、抗体と小分子薬剤の利点を組み合わせ、一価または多価であり得、低い毒性を有し、製造するための費用対効果の高い。それらの小さいサイズのために、これらのドメインは経口または局所投与を含む投与が容易であり、胃腸安定性を含む高い安定性を特徴とし、そしてそれらの半減期は所望の用途または適応症に合わせて調整することができる。さらに、ＨＣＡｂのＶＨ及びＶＨＨドメインは、費用対効果の高い方法で製造することができる。
【００９６】
一実施形態において、ＨＣＡｂのドメインは、本明細書の上述するように定義されるようなナノボディである。
【００９７】
一実施形態において、ＨＣＡｂ結合ドメインは、同一の標的抗原の複数の異なるエピトープまたは１つを超える標的抗原の複数の異なるエピトープに結合する、多重特異性結合タンパク質の一部である。一実施形態において、抗体は二重特異性抗体である。ヒトＶＨ結合ドメインを含む様々な多重特異性構造は図７に示される。多重特異性または二重特異性の、本発明のＨＣＡｂは、例えば、同一の可溶性標的上の２つ以上の部位、同一の細胞表面（受容体）上の２つ以上の部位、例えば腫瘍抗原、または、１つ以上の可溶性標的及び１つ以上の細胞表面受容体標的に結合し得る。ある特定の実施形態において、本明細書の二重特異性ＨＣＡｂ構造は、下記の結合親和性を有する：上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）×ＣＤ３；ＣＤ１９×ＣＤ３；ＥｐＣａｍ×ＣＤ３；ＴＮＦ−α×ＩＬ−１７；ＩＬ−１α×ＩＬ−１β；ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ；ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）×ＨＥＲ３；ＩＬ−４×ＩＬ−１３；アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）×血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；第ＩＸａ因子×第Ｘ因子；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）×ＨＥＲ３；ＩＬ−１７Ａ×ＩＬ−１７Ｆ；ＨＥＲ２×ＨＥＲ３；癌胎児抗原×ＣＤ３；ＣＤ２０×ＣＤ３；ＣＤ１２３×ＣＤ３；ＢＣＭＡ×ＣＤ３、ＰＳＭＡ×ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＰＳＭＡ×ＣＤ３、ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＣＤ１９×ＣＤ２２×ＣＤ３、ＣＤ２２×ＣＤ３、ＣＤ３８×ＰＤ１、ＣＤ３８×ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３８×ＣＤ７３、ＣＤ３８×ＣＤ３９、ＰＤ１×ＣＤ３９×ＣＤ７３、及びＰＤ１×ＣＤ７３。
【００９８】
好ましい実施形態において、本明細書のＨＣＡｂは、内在性の免疫グロブリン遺伝子がノックアウトされるかまたは不能にされているトランスジェニックマウス及びラット、好ましくはラットを含むトランスジェニック動物によって産生される。好ましい実施形態において、本明細書のＨＣＡｂｓは、ＵｎｉＲａｔ（商標）において産生される。ＵｎｉＲａｔ（商標）は、それらの内在性免疫グロブリン遺伝子を沈黙させており、ヒトの免疫グロブリン重鎖トランス座位を使用して多様な自然に最適化された完全なヒトＨＣＡｂのレパートリーを発現する。ラット内の内在性の免疫グロブリン座位は、様々な技術を用いてノックアウトまたは沈黙させることができるが、ＵｎｉＲａｔ（商標）においては、ジンクフィンガー（エンド）ヌクレアーゼ（ＺＮＦ）技術を使用して、内在性のラットの重鎖Ｊ座位、軽鎖Ｃκ座位、及び軽鎖Ｃλ座位を不活化した。卵母細胞へのマイクロインジェクションのためのＺＮＦコンストラクトは、ＩｇＨ及びＩｇＬノックアウト（ＫＯ）系統を産生することができる。より詳細には、例えば、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：４３３を参照でき、Ｉｇ重鎖ノックアウトラットの分析は、Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２９３２−２９４１によって報告されている。ＺＮＦ技術の利点は、数ｋｂまでの欠失を介した遺伝子または座位を沈黙させるための非相同末端結合がまた、相同組込みのための標的部位を提供することである（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：６４−６７。ＵｎｉＲａｔ（商標）のＨＣＡｂは、標準的な抗体によって攻撃することのできないエピトープに結合する。それらの高い特異性、親和性、及び小さいサイズは、それらを単一特異性及び多特異性の用途について理想的にする。
【００９９】
本発明の重鎖のみの抗体において、第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基は、その位置における天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置き換えられている。一実施形態において、置換されたアミノ酸残基は荷電している。別の実施形態において、置換されたアミノ酸残基は、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）残基、好ましくはアルギニン（Ｒ）残基のように正に荷電している。図５のアラインメントに見られるように、同一のＣＤＲ３ファミリー内の重鎖抗体由来のＶＨ配列は、全て第１０１位にＴｒｐ（Ｗ）を含み、したがって、好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック動物に由来する重鎖のみの抗体は、位置１０１においてＴｒｐからＡｒｇへの変異を含む。
【０１００】
本発明のヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体は、任意の所望の標的抗原に対して生成することができ、様々な臨床用途のための大きな可能性を有する。治療用途のための標的抗原は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、ＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−α、ＣＤ２０、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＬ１−β、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＣＤ３８、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１２、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＰ）卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＣＤ１３７、ＯＸ−４０、及びＩＬ−３３を非限定的に含む。治療適応症としては、固形腫瘍、血液腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎などの炎症性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、呼吸器系、皮膚科、中枢神経系、血液、眼／耳、肝臓の疾患の治療が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０１】
標的腫瘍には、例えば、乳がん、胃がん、扁平上皮がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、腎臓がん、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、頭頸部がん、直腸がん、結腸直腸がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん及び肺扁平上皮がんを含む肺がん、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平上皮がん）、前立腺がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がんまたは胃腸がんを含む胃がん、膵臓がん、膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む血液悪性腫瘍、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び急性血液悪性腫瘍、子宮内膜がんまたは子宮がん、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛がん、唾液腺がん、外陰がん、甲状腺がん、食道がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、上咽頭がん、喉頭がん、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚がん、シュワン細胞腫、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路がん、甲状腺がん、ウィルムス腫瘍、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；抗悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連した異常な血管増殖、及びＭｅｉｇｓ症候群が含まれる。
【０１０２】
本発明のさらなる詳細は、次の非限定的な例によって説明され、それは以下の略語を用いる。
ＢＡＣ  バクテリア人工染色体
ＹＡＣ  酵母人工染色体
ＺＦＮ  ジンクフィンガーヌクレアーゼ
Ｈ      重鎖
Ｃ      定常領域
Ｖ      可変領域
Ｄ      多様性セグメント
Ｊ      結合セグメント
【実施例】
【０１０３】
実施例１：重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）を発現する遺伝子改変されたラットの生成
予め同定され、分析され、部分的に改変されたＢＡＣ及びＹＡＣは、ヒト重鎖可変領域遺伝子及びラット定常領域遺伝子を提供する（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：１４８１−１４９０；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４００−４０１：７８−８６）。重鎖抗体の発現を可能にするために、ラットの定常領域ＢＡＣは、Ｃμの除去、及び全てのＣγにおけるＣＨ１エクソンの欠失によって改変された。重鎖のみの発現は、内在性の重鎖及び軽鎖（カッパ及びラムダ）座位の沈黙によって強化した。
【０１０４】
ＹＡＣ及びＢＡＣ上での改変されたヒトＩｇＨ座位の構築
「ヒト−ラット」ＩｇＨ座位が構築され、いくつかの部分で組み立てられた。これは、ヒトＪＨ下流でのラットＣ領域遺伝子の改変及び結合、そしてその後の、ヒトＶＨ６−Ｄセグメント領域の上流での付加を含んだ。次いで、ヒトＶＨ遺伝子の別個のクラスターを有する２つのＢＡＣ［ＢＡＣ６及びＢＡＣ３］は、ヒトＶＨ６−全てのＤ−全てのＪＨ−ラットＣγ２ａ／１／２ｂ（ΔＣＨ１）を含む、組み立てられ、改変された領域をコードするＧｅｏｒｇと呼ばれるＢＡＣと共に共注入された。
【０１０５】
ＤＮＡ配列の正確な場所での改変の導入のため、及び複数の大きなＤＮＡ領域の同時の結合のために、環状ＹＡＣ（ｃＹＡＣ）としてＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で重なる末端を有する配列を組み立て、その後に、そのようなｃＹＡＣをＢＡＣに変換するための技術を開発した。ＹＡＣの利点は、それらの大きなＤＮＡインサートを保持する能力、酵母宿主中での相同改変の容易さ、及び特に高度反復領域（例えばスイッチ領域、エンハンサー）における配列安定性の維持を含む。一方でＢＡＣは、Ｅ．  ｃｏｌｉ中で増殖し、容易な調製と大きな収量の利点を提供する。さらに、詳細な制限マッピング及び配列解析は、ＹＡＣよりもＢＡＣにおいてより良好に達成できる。２つの自己複製Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ／Ｅ．  Ｃｏｌｉシャトルベクター、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡ及びｐＣＡＵを構築した。手短にＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＥＮ４は、ｐＹＡＣ−ＲＣ（Ｍａｒｃｈｕｋ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９８８；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（１５）：７７４３）からＡｖｒＩＩフラグメントとして切り出され、ＳｐｅＩで直線状とされたｐＡＰ５９９（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７；６６（１）：１４−２５）に連結された。得られたプラスミドは、ＵＲＡ３下流にクローニングされたＣＥＮ４を含む。これから、ＡｐａＬＩ−ＢａｍＨＩのＵＲＡ３−ＣＥＮ４フラグメントが切り出され、ＡｐａＬＩ及びＢａｍＨＩで消化されたｐＢＡＣＢｅｌｏ１１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）へと連結し、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡを得た。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの自律複製配列ＡＲＳ２０９が合成され、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡの固有のＳｅｘＡＩ部位へとクローニングされ、ｐＣＡＵを得た。
【０１０６】
ヒトＪＨ４、ラットＣμ及びＣγ１領域の改変を促進するために、ヒトＪＨの約２．２ｋｂ上流からラットＣγ１コード領域の約５．５ｋｂ下流にわたる約３７ｋｂのＳａｃＩＩフラグメントをＢＡＣコンストラクトＡｎｎａｂｅｌ（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：１４８１−１４９０）から切り出し、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡの固有のＳａｃＩＩ部位にクローニングした［ｐＢｅｌｏ＋ＳａｃＩＩ、３７ｋｂ］。さらに、ラットＣγ２ｂ領域を改変するために、Ａｎｎａｂｅｌからのγ２ｂスイッチ領域の約６．９ｋｂ上流からＣγ２ｂコード領域の約２．０ｋｂ下流にわたる約１９ｋｂのＳａｃＩＩ−ＳｗａＩフラグメントを、ＳａｃＩＩ及びＨｐａＩで二重消化したｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡにクローニングした［ｐＢｅｌｏ＋ＳａｃＩＩ−ＳｗａＩ、１９ｋｂ］。両方のプラスミドを、さまざまなヒト及びラットのゲノム領域を増幅するため、ならびに必要な制限フラグメントを確立するためにテンプレートとして使用した。
【０１０７】
ヒトＪＨの約３．１ｋｂ上流から、いくらかの３’領域を有するラットＣμを含むまでにわたるＤＮＡ領域が改変され、１６．７ｋｂのＳｎａＢＩ−ＦｓｐＩフラグメントとしてｐＣＡＵへと組み立てられた。改変された領域は、Ｔ→Ｃへの点変異（Ｗ→Ｒのアミノ酸変化を生じる）がＪＨ４に導入されたことを除いて全ての真正のヒトＪＨを含み、残りのＣμコード領域と共に削除されて、ＣＨ１を欠くラットＣγ２ａ配列（ヒンジの直ぐ上流のイントロンから開始して、膜のエクソンの３’末端まで）と正確に置き換えられたＪＨからμＣＨ１までのラットの遺伝子間領域が後に続いた。このコンストラクトは、ｃＹＡＣとしての酵母内の以下に示す５つの重なり合うフラグメントの組み立てに由来し、次いでＢＡＣに転換された：プライマーＨＣ２７−１及び−２を用いて増幅された、ヒトＪＨの上流の領域から変異したＪＨ４（
【化１】
2019528295.tif 000003
で示された後者のプライマーを介して導入された点変異）までを覆う約４．３ｋｂのフラグメント、プライマーＨＣ２７−３及び−４を用いて増幅された、変異したＪＨ４（
【化２】
2019528295.tif 000004
で示される）からμスイッチ領域の上流までを覆う約３．４ｋｂのフラグメント、ｐＢｅｌｏ＋ＳａｃＩＩ３７ｋｂから切り出された、μスイッチ領域と隣接配列を包含する約５．２ｋｂのＡｆｌＩＩフラグメント、長いプライマーＨＣ２７−５及び−６を用いて増幅された、ラットＣμに隣接する配列に融合されたＣＨ１を欠くラットＣγ２ａ、ならびに、プライマーＨＣ２７−７及び−８を用いたｐＣＡＵベクターの増幅。これは、ｐＣＡＵ＋ＨｕＪ−ラットＣγ２ａ（−ＣＨ１）を生じた。全ての改変領域は、正確さを確認するために、シーケンシングによって調べた。
【０１０８】
ラットの、ＣＨ１を欠くＣγ１、及びＣＨ１を欠くＣγ２ｂはＰＣＲによって独立して生成した。ＣＨ１とヒンジの間のイントロンの５’末端に一致する３’末端を有するＣγ１コード領域のすぐ上流に位置する約１．７ｋｂのフラグメントは、プライマーＨＣ２７−９及び−１０を用いて増幅された。Ｃγ１は、プライマーＨＣ２７−１１及び１２を用いて、ＣＨ１とヒンジの間のイントロンから、コード領域の３’末端までの約３．９ｋｂのフラグメントとして増幅された。続いて、約１．７ｋｂと約３．９ｋｂのフラグメントの両方がゲル精製され、プライマーＨＣ２７−９及び−１２を用いたオーバーラップＰＣＲによって結合し、約５．６ｋｂのフラグメントを得た。同様に、ＣＨ１を有さないＣγ２ｂについて、Ｃγ２ｂコード領域上流の約０．３ｋｂのフラグメントは、プライマーＨＣ２７−１３及び−１４を用いて増幅され、ＣＨ１とヒンジの間のイントロンからコード領域の３’末端までの領域にわたる約５．４ｋｂのフラグメントは、プライマーＨＣ２７−１５及び−１６を用いて増幅され、続いてこれら２つのフラグメントは、プライマーＨＣ２７−１３及び−１６を用いるオーバーラップＰＣＲによって結合され、約５．７ｋｂのフラグメントを得た。ｐＣＡＵ＋ラットＣγ１、２ｂ（−ＣＨ１）は、以下を含んで構築された：ラットＣμの３’末端に一致する１００ｂｐの相同領域、両方のＣＨ１を除去したことを除いてゲノム構成中のＣγ１及びＣγ２ｂが後に続いた。６つの重なり合うフラグメントを使用してコンストラクトｐＣＡＵ＋ラットＣγ１、２ｂ（−ＣＨ１）を構築した：ｐＢｅｌｏ＋ＳａｃＩＩ、３７ｋｂから切り出された、３’Ｃμ相同領域と後に続くγ１スイッチ領域にわたる約１０．２ｋｂのＳｐｅＩ−ＮａｒＩフラグメント、上述されるようなＣＨ１を有さないＣγ１を含む約５．６ｋｂのＰＣＲフラグメント、プライマーＨＣ２７−１７及び−１８を用いて増幅された、Ｃγ１とＣγ２ｂの間の遺伝子間領域を覆う約７．４ｋｂのフラグメント、ｐＢｅｌｏ＋ＳａｃＩＩ−ＳｗａＩ、１９ｋｂから切り出された、ラットＣγ２ｂスイッチ領域を包含する約１１．３ｋｂのＸｈｏＩフラグメント、ＣＨ１を有さないＣγ２ｂを含む約５．７ｋｂのＰＣＲフラグメント、プライマーＨＣ２７−１９及び−２０を用いて増幅されたｐＣＡＵベクター。ｐＣＡＵ＋ラットＣγ１、２ｂ（−ＣＨ１）中のラットゲノム領域は、単一の約４０ｋｂのＦｓｐＩフラグメントとして切り出すことができる。
【０１０９】
最終的に、全ての改変を有するヒトＶＨ６−Ｄ−ＪＨ−ラットＣ領域をコードするＢＡＣ（Ｇｅｏｒｇ）が、以下の４つの重なり合うフラグメントを用いて組み立てられた：ＢＡＣ１０（ＣＴＤ−３２１６Ｍ１３，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から切り出された、ヒトＶＨ６−Ｄ領域を包含する精製された約７８．２ｋｂのＦｓｐＡＩ−ＭｌｕＩフラグメント、上述されるようなｐＣＡＵ＋ＨｕＪ−ラットＣγ２ａ（−ＣＨ１）から切り出された１６．７ｋｂのＳｎａＢＩ−ＦｓｐＩフラグメント、ｐＣＡＵ＋ラットＣγ１、２ｂ（−ＣＨ１）から切り出された約４０ｋｂのＦｓｐＩフラグメント、Ｃγ２ｂとＣεの間の遺伝子間領域、後に続くＣε、Ｃα、３’エンハンサー領域、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡベクター、及びヒトＶＨ６の上流の５’領域を含むコンストラクトＡｎｎａｂｅｌから切り出された約７７．２ｋｂのＳｗａＩ−ＳａｃＩＩフラグメント。この最終的なコンストラクトは、制限マッピング及び部分シーケンシングにより徹底的に調べた。（ヒトＶＨ６−Ｄ−ＪＨ−ラットＣ）領域は、約２０１ｋｂのＮｏｔＩフラグメントとして切り出して精製することができる。
【０１１０】
ＢＡＣ６は、ＶＨ４−３９からＶＨ３−２３までのヒトゲノム領域を含み、一方でＢＡＣ３は、ＶＨ３−１１からＶＨ６−１（最もＤに近接したＶＨ遺伝子）までの下流領域を含む。ＢＡＣ６とＢＡＣ３の間の重なりを提供するために、以前に記載されたように（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、上述）、ＢＡＣ３中のヒトＶＨ座位の５’末端に位置する１０．６ｋｂのフラグメントが、ＢＡＣ６中のＶＨ３−２３の下流に組み込まれた。ＢＡＣ６中のヒトＶＨ遺伝子は、約１８２−ｋｂのＡｓｉＳＩ−ＡｓｃＩフラグメントとして切り出された。ＢＡＣ３は改変されず、ＢＡＣ中のヒトＶＨ遺伝子は約１７３ｋｂのＮｏｔＩフラグメントとして切り出された。
【０１１１】
オリゴヌクレオチド：
ＨＣ２７−１：ＧＴＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧ（配列番号１）
ＨＣ２７−２：
【化３】
2019528295.tif 000005
（配列番号２）
ＨＣ２７−３：
【化４】
2019528295.tif 000006
（配列番号３）
ＨＣ２７−４：ＧＡＡＴＣＣＴＡＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＧ（配列番号４）
ＨＣ２７−５：ＣＣＡＴＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＴＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＧＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣ（配列番号５）
ＨＣ２７−６：ＧＣＡＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＴＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＴＧＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＡＴＣＡＴＧＴＴＣ（配列番号６）
ＨＣ２７−７：ＧＡＡＴＴＴＴＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧ（配列番号７）
ＨＣ２７−８：ＧＡＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡＣＴＴＧＴＧＣＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＡＧＡＧ（配列番号８）
ＨＣ２７−９：ＧＧＡＧＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧ（配列番号９）
ＨＣ２７−１０：ＣＣＴＣＧＴＣＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＧＣＧＴＧＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣ（配列番号１０）
ＨＣ２７−１１：ＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧ（配列番号１１）
ＨＣ２７−１２：ＧＴＣＣＡＣＡＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧ（配列番号１２）
ＨＣ２７−１３：ＧＡＣＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣ（配列番号１３）
ＨＣ２７−１４：ＣＣＴＣＧＴＣＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴＣＣＴＣＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣ（配列番号１４）
ＨＣ２７−１５：ＡＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧＧＧＣＴＣ（配列番号１６）
ＨＣ２７−１６：ＧＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＡＴＴＧＴＡＴＧＴＡＧＧ（配列番号１７）
ＨＣ２７−１７：ＣＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣＡＣ（配列番号１８）
ＨＣ２７−１８：ＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＴＣＧ（配列番号１９）
ＨＣ２７−１９：ＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＴＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＴＧＣＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧ（配列番号２０）
ＨＣ２７−２０：ＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＣＡＡＴＴＧＧＴＧＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＡＣＡＴＡＣＡＡＴＧＣＣＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＣＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＡＧＡＧ（配列番号２１）
【０１１２】
Ｇｅｏｒｇ  ＩＩの構築
「ヒト−ラット」ＩｇＨ座位が構築され、いくつかの部分で組み立てられた。これは、各々がＷ→Ｒをコードする点変異を含む変異したヒトＪＨ１−ＪＨ６の下流でのラットＣ領域遺伝子の改変及び結合、そしてその後の、ヒトＶＨ６−１−Ｄセグメント領域の上流での付加を含んだ。このＢＡＣはＧｅｏｒｇ  ＩＩと名付けられた。
【０１１３】
最終的に、変異したヒトＪＨ１−ＪＨ６は、２．３ｋｂのＳｃａＩフラグメントで合成した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、以下を参照）。
【０１１４】
２番目に、変異したヒトＪＨ１−ＪＨ６を、ヒトＪＨ上流の約３．１ｋｂのＤＮＡ領域、及びコード領域がラットＣγ２ａコード領域と置き換えられているが、ＣＨ１を欠く、ＪＨの直ぐ下流のラット配列からラットＣμまでにわたる約１１．４ｋｂの領域と結合して、ｐＣＡＵ＋ＨｕＪ（Ｗ−Ｒ）−ラットＣγ２ａ（−ＣＨ１）と呼ばれるＢＡＣとした。このＢＡＣ中の改変領域全体は、１６．７ｋｂのＳｎａＢＩ−ＦｓｐＩフラグメントとして切り出すことができる。このＢＡＣは、ｃＹＡＣとしての酵母内の以下に示す４つの重なり合うフラグメントの組み立てに由来し、次いでＢＡＣに転換された：プライマーＨＣ３２−１及び−２を用いて増幅された、ヒトＪＨの上流の領域を覆う約２．７ｋｂのフラグメント、２．３ｋｂの変異したヒトＪＨ１−ＪＨ６−ＳｃａＩフラグメント、プライマーＨＣ３２−３及び−４を用いて増幅された、ラットのＪＨの直ぐ下流の領域を覆う、約２．１ｋｂのフラグメント、ｐＣＡＵ＋ＨｕＪ−ラットＣγ２ａ（−ＣＨ１）から切り出された約１８．４ｋｂのＭｌｕＩ−ＨｐａＩフラグメント（ＣＨ１を欠くラットＣγ２ａコード領域によって置き換えられたコード領域を有するラットＣμ座位及び「ＨＣ２７構築方法」に記載されるｐＣＡＵベクターを含む）。全ての改変領域は、正確さを確認するために、シーケンシングによって調べた。
【０１１５】
最終的に、ヒトＶＨ６−１−Ｄ−変異したＪＨ−改変したラットＣ領域をコードするＧｅｏｒｇ  ＩＩが、以下の４つの重なり合うフラグメントを用いて組み立てられた：ＢＡＣ１０（ＣＴＤ−３２１６Ｍ１３，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から切り出された、ヒトＶＨ６−１−Ｄ領域を包含する精製された約７８．２ｋｂのＦｓｐＡＩ−ＭｌｕＩフラグメント、上述されるようなｐＣＡＵ＋ＨｕＪ（Ｗ−Ｒ）−ラットＣγ２ａ（−ＣＨ１）から切り出された１６．７ｋｂのＳｎａＢＩ−ＦｓｐＩフラグメント、ｐＣＡＵ＋ラットＣγ１、２ｂ（−ＣＨ１）（「ＨＣ２７構築方法」に記載される）から切り出された約４０ｋｂのＦｓｐＩフラグメント、Ｃγ２ｂとＣεの間の遺伝子環領域、後に続くＣε、Ｃα、３’エンハンサー領域、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡベクター、及びヒトＶＨ６−１の上流の５’領域を含むコンストラクトＡｎｎａｂｅｌから切り出された約７７．２ｋｂのＳｗａＩ−ＳａｃＩＩフラグメント。この最終的なコンストラクトは、制限マッピング及び部分シーケンシングにより徹底的に調べた。（ヒトＶＨ６−１−Ｄ−変異したＪＨ−改変したラットＣ）領域は、約２０１ｋｂのＮｏｔＩフラグメントとして切り出して精製することができる。
【０１１６】
ＨＣ３２及びＨＣ３３トランスジェニックラットを生成するためのマイクロインジェクション
ＢＡＣ６は、ＶＨ４−３９からＶＨ３−２３までのヒトゲノム領域を含み、一方でＢＡＣ３は、ＶＨ３−１１からＶＨ６−１（最もＤに近接したＶＨ遺伝子）までの下流領域を含む。ＢＡＣ６とＢＡＣ３の間の重なりを提供するために、以前に記載されたように（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：１４８１−１４９０）、ＢＡＣ３中のヒトＶＨ座位の５’末端に位置する１０．６ｋｂのフラグメントが、ＢＡＣ６中のＶＨ３−２３の下流に組み込まれた。ＢＡＣ６中のヒトＶＨ遺伝子は、約１８２−ｋｂのＡｓｉＳＩ−ＡｓｃＩフラグメントとして切り出された。ＢＡＣ３は改変されず、ＢＡＣ中のヒトＶＨ遺伝子は約１７３ｋｂのＮｏｔＩフラグメントとして切り出された。両方のフラグメントは精製され、Ｇｅｏｒｇ  ＩＩからの約２０１ｋｂのＮｏｔＩフラグメントと共にラット胚へと共注入され、ＨＣ３２を構築した。
【０１１７】
ＢＡＣ９は、ＶＨ３−７４からＶＨ３−５３由来のヒトゲノム領域を含む。ＢＡＣ（１４＋５）は、ＶＨ３−５３からＶＨ３−１３由来の下流領域を含み、ＶＨ６−１の直ぐ上流の６．１ｋｂの領域がその３’に付加され、Ｇｅｏｒｇ  ＩＩに対するオーバーラップを提供した。ＢＡＣ９中のヒトＶＨ領域は約１８５ｋｂのＮｏｔＩフラグメントとして切り出され、ＢＡＣ（１４＋５）からのものは、約２０９ｋｂのＢｓｉｗＩフラグメントとして切り出された。両方のフラグメントは精製され、Ｇｅｏｒｇ  ＩＩからの約２０１ｋｂのＮｏｔＩフラグメントと共にラット胚へと共注入され、ＨＣ３３を構築した。
【０１１８】
ＤＮＡ精製
直線状のＹＡＣ、環状のＹＡＣ及び消化後のＢＡＣフラグメントは、標準的に泳動した０．８％アガロースゲルまたはパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）から切り出されたストリップから、Ｅｌｕｔｒａｐ（商標）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を用いる電気抽出によって精製された（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．，１９９２，２４：４５−５０）。ＤＮＡ濃度は通常、約１００μｌの容量中で数ｎｇ／μｌであった。約２００ｋｂまでのフラグメントについて、ＤＮＡは沈殿され、マイクロインジェクション緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８及び１００ｍＭのＮａＣｌであるが、スペルミン／スペルミジンを含まない）中に所望の濃度で再溶解された。
【０１１９】
酵母からの環状ＹＡＣの精製は、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸシリカ系アニオン交換樹脂（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施された。手短に、スフェロプラストを、ザイモリアーゼまたはリチカーゼを用いて作製し、ペレット化した（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＹＡＣｓ．Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｊ．  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，  Ｈ．Ｒ．  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｊ．  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ｅｄｓ．  ＩＲＬ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｕ．Ｋ．，  ｐ．５９−７６）。次いで、細胞をアルカリ溶解し、ＡＸ１００カラムに結合させ、低コピープラスミドについてＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ法に記載の通りに溶出した。混入する酵母染色体ＤＮＡを、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて加水分解し、続いてＳｕｒｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いる最終精製ステップを実施した。次いで、ＤＨ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のアリコートを環状ＹＡＣで形質転換してＢＡＣコロニーを得た。マイクロインジェクションのためのインサートＤＮＡ、約１０ｋｂのＢＡＣベクターＤＮＡからの１５０〜２００ｋｂの分離のために、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−ＣＬによるろ過ステップを使用した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，１５；８５９−８６５）。
【０１２０】
ゲル解析
精製したＹＡＣ及びＢＡＣのＤＮＡは、制限消化、及び標準的な０．７％アガロースゲル上での分離によって解析された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１）。より大きなフラグメント、５０〜２００ｋｂは、ＰＦＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｃｈｅｆ  Ｍａｐｐｅｒ（商標））によって、８℃で、０．５％のＴＢＥ中０．８％のＰＦＣアガロースを用いて、２〜２０秒のスイッチ時間で１６時間、６Ｖ／ｃｍ、１０ｍＡで分離された。精製は、配列解析より得られる予測されたサイズを有する生じるフラグメントの直接的な比較を可能にした。改変はＰＣＲ及びシーケンシングによって解析した。
【０１２１】
マイクロインジェクション
非近交系ＳＤ／Ｈｓｄ系統動物は、実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって認可された動物施設において承認された動物ケアプロトコールの下で標準的なマイクロアイソレーターケージに収容された。ラットは１４〜１０時間の明／暗周期で飼料及び水を自由に摂取させながら維持した。４〜５週齢のＳＤ／Ｈｓｄメスラットに２０〜２５ＩＵのＰＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射し、続いて４８時間後に２０〜２５ＩＵのｈＣＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射し、近交系ＳＤ／Ｈｓｄオスと交配させた。その後のマイクロインジェクションのために受精した１細胞期胚を採取した。操作された胚を偽妊娠ＳＤ／Ｈｓｄメスラットに移し、分娩に至らせた。
【０１２２】
組換え免疫グロブリン座位をコードする精製したＤＮＡを、１０ｍＭスペルミン及び１０ｍＭスペミジンを含むマイクロインジェクション緩衝液に再懸濁した。ＤＮＡを０．５〜３ｎｇ／μｌの様々な濃度で受精卵母細胞に注入した。
【０１２３】
ラット免疫グロブリン遺伝子に特異的なＺＦＮをコードするプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡを、０．５〜１０ｎｇ／μｌの様々な濃度で受精卵母細胞に注入した。
【０１２４】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
ラット免疫グロブリン遺伝子に対して特異的なＺＦＮが生成された。
ラットＣカッパに特異的なＺＦＮは以下の結合部位を有した：ＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣｔｃｇｔｔｇＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡＡ（配列番号２２）
ラットＪ−座位配列に特異的なＺＦＮは以下の結合部位を有した：
ＣＡＧＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣａｇｃｔｇａＧＴＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧ（配列番号２３）
及び
ＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡｇｃａｇｃＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴ（配列番号２４）
ラットＣγ−座位配列に特異的なＺＦＮは以下の結合部位を有した：
ＡＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＧｃａｇａｃｃＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡ（配列番号２５）
及び
ＴＴＣＴＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＡＴＧａｃａｇｔｇＧＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴ（配列番号２６）
【０１２５】
トランス座位を有するラット。
未再構成の構成にある人工重鎖免疫グロブリン座位を担持するトランスジェニックラットを作製した。トランスジェニックラットのＲＴ−ＰＣＲ及び血清解析（ＥＬＩＳＡ）は、トランスジェニック免疫グロブリン座位の生産的な再構成及び血清中の様々なアイソタイプの重鎖のみの抗体の発現を明らかにした。トランスジェニックラットの免疫は、高親和性抗原特異的重鎖のみの抗体の産生をもたらした。
【０１２６】
新規のジンクフィンガーヌクレアーゼノックアウト技術。
トランスジェニックラットにおける重鎖のみの抗体産生のさらなる最適化のために、不活性化した内在性ラット免疫グロブリン座位を有するノックアウトラットを作製した。
【０１２７】
ラット重免疫グロブリン重鎖発現及びラットλ軽鎖発現の不活化のために、ＺＦＮを１細胞ラット胚にマイクロインジェクションした。続いて、胚を偽妊娠メスラットに移し、分娩に至らせた。変異した重鎖及び軽鎖の座位を有する動物をＰＣＲによって同定した。そのような動物の分析は、変異動物におけるラット免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現の不活性化を実証した。
【０１２８】
実施例２：ラットにおける抗原特異的重鎖のみの抗体の生成
ラットにおける抗原特異的重鎖のみの抗体の生成のために、実施例１に記載されたもののような重鎖のみの抗体を発現する遺伝子改変ラットが様々な方法で免疫される。
【０１２９】
不活化ウイルスによる免疫
様々な異なる赤血球凝集素及びノイラミニダーゼ遺伝子を有するインフルエンザウイルスは、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂｒａｎｃｈ，  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  ＣＤＣ，  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡにより提供される。ウイルスストックを１０日齢の孵化鶏卵の尿膜腔内で増殖させ、超遠心分離により１０％〜５０％スクロース勾配により精製する。ウイルスをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、４℃で２週間、０．０５％ホルマリンで処理することにより不活性化する。不活性化ウイルスとアラム溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を３：１の比率で混合し、免疫の前に室温で１時間インキュベートする。重鎖のみの抗体を発現する遺伝子改変ラットは全ての不活性物で免疫される。
【０１３０】
タンパク質またはペプチドによる免疫
典型的には免疫原（ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖、ヒトＩｇＭまたはＩｇＧ重鎖、ヒト血清アルブミン、タンパク質−ペプチドコンジュゲートのようなタンパク質またはペプチド）を滅菌生理食塩水で０．０５〜０．１５ｍｌに希釈し、アジュバントと組み合わせて０．１〜０．３ｍｌの最終容量とする。多くの適切なアジュバントが利用可能である（すなわち、熱不活性化Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、水酸化アルミニウムゲル、Ｑｕｉｌ  Ａまたはサポニン、細菌リポ多糖または抗ＣＤ４０）が、いずれも完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）の活性を有さない。タンパク質及びペプチドなどの可溶性免疫原の濃度は、最終調製物中で５μｇ〜５ｍｇの間で変動し得る。ＣＦＡ中の免疫原による初回免疫（プライミング）は、腹腔内及び／または皮下及び／または筋肉内に投与される。無傷の細胞が免疫原として使用される場合、それらは最良では、腹腔内及び／または静脈内に注射される。細胞を生理食塩水で希釈し、１回の注入につき１００万〜２０００万個の細胞を投与する。ラット中で生き延びる細胞は、最良の免疫結果をもたらす。ＣＦＡ中の免疫原による初回免疫の後、ＩＦＡ（追加免疫）中の２回目の免疫が通常４週間後に送達される。この一連のものは、高親和性抗体を産生するＢ細胞の発生をもたらす。免疫原が弱い場合、強い体液性応答が達成されるまで追加免疫を２週間ごとに投与する。免疫原濃度は、追加免疫においてより低くなり得、そして静脈内経路が使用され得る。体液性応答を測定するために、２週間毎にラットから血清を採取する。
【０１３１】
脂質ＩＩペンタペプチド、ペニシリン結合タンパク質、βラクタマーゼ、ソルターゼ、及び他の原核生物の膜タンパク質による免疫は、上に概説したように行われる。
【０１３２】
脂質、糖脂質、炭水化物ポリマーによる免疫
ポリ−Ｎ−アセチル−β−（１−６）−グルコサミン（ＰＮＡＧ）及び他の炭水化物ポリマーによる免疫
精製されたｄＰＮＡＧ、ＰＮＡＧ、または他の炭水化物ポリマーは、還元的アミノ化によってジフテリア毒素、アルブミンまたは他の担体タンパク質にコンジュゲートされる。アルデヒド基は最初にグルタルアルデヒドで処理することにより担体タンパク質の表面に導入される。続いて、活性化担体タンパク質を、還元剤ナトリウムＮａＣＮＢＨ３の存在下でその遊離アミノ基を介してｄＰＮＡＧ（または他の炭水化物ポリマー）と反応させる。動物を０日目に皮下または足蹠でＰＮＡＧ及びｄＰＮＡＧ−ＤＴコンジュゲートで免疫し、その後の週に完全フロインドアジュバントまたは他のアジュバント中の０．１５〜１００μｇの用量のコンジュゲートされたＰＮＡＧまたはｄＰＮＡＧで追加免疫する。ブースト免疫は、好ましくは不完全フロインド中である。血液を毎週採取し、特異的抗体価をＥＬＩＳＡにより決定する。Ｂ細胞は排出リンパ節または脾臓から回収され、そして標準的な方法を用いてハイブリドーマを生成する。代替的に、酵母細胞を用いて抗原結合抗体またはフラグメントを選択する。
【０１３３】
脂質ＩＩによる免疫
Ｃ５５以下の脂質尾部を有する精製脂質ＩＩをＴｉｔｅｒｍａｘ、リポソーム、Ｒｉｂｉアジュバントまたは他のアジュバントと混合する。さらに、ＫＬＨまたはオボアルブミンなどのタンパク質、及び脂質Ａまたは完全フロインドアジュバントなどの免疫刺激化合物を混合物に添加する。初回免疫は、０日目に足蹠または皮下で０．１〜１ｍｇの脂質ＩＩで実施し、その後の週に完全フロインドアジュバントまたは他のアジュバント中の０．１５〜１００μｇの用量のコンジュゲートされたＰＮＡＧまたはｄＰＮＡＧで追加免疫する。追加免疫は、好ましくは不完全フロインド中である。血液を毎週採取し、特異的抗体価をＥＬＩＳＡにより決定する。Ｂ細胞は排出リンパ節または脾臓から回収され、そして標準的な方法を用いてハイブリドーマを生成する。代替的に、酵母細胞を用いて抗原結合抗体またはフラグメントを選択する。
【０１３４】
脂質Ａによる免疫
コア−脂質Ａは、Ｂｏｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５５：４，８９９−９０８の方法に従って調製する。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＡＴＣＣ１９６０６または他のグラム陰性細菌がＬｕｒｉａブロス中で培養され、遠心分離により回収され、凍結乾燥培地に１０９ＣＦＵ／ｍＬの細胞密度になるように懸濁し、予め秤量したアンプルまたはガラスバイアルに入れて１／３を超えない容量で充填する。滅菌の綿またはグラスウールをアンプルの首に挿入するか、栓をバイアルに挿入する。試料を超低温冷凍庫でゆっくり凍結させ、次いで一次乾燥のために一晩真空を適用した。二次乾燥は、数時間温度を２０℃まで上げることによって実施した。凍結乾燥サンプルを４℃で保存する。１０ｍｇの凍結乾燥細胞を４００μＬのイソ酪酸及び１Ｍの水酸化アンモニウム（５：３、ｖ／ｖ）に懸濁し、スターラーバーを含むスクリューキャップ試験管において１００℃で２時間インキュベートする。試料を氷水中で冷却し、そして２０００×ｇで１５分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、等量の水で希釈し、凍結乾燥した。試料を４００μＬのメタノールで２回洗浄し、２０００×ｇで１５分間遠心分離し、底部有機層とそれらの界面を保存し、窒素流下で乾燥させる。次いで、５ミリグラムの脂質Ａを５ｍｌの０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリエチルアミド（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ．）中に懸濁し、その後、５ｍｇの酸処理細菌を添加する。混合物を室温でゆっくり３０分間撹拌し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ遠心分離機を用いて真空乾燥した。
【０１３５】
脂質Ａコート細胞は、腹腔内または足蹠で動物を免疫するために使用される。１回の注入あたり５０μｌの用量のコアＬＰＳコート細胞の懸濁液を、フロインド不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と１：１の混合物で使用した（Ｄｅ  Ｋｉｅｖｉｔ  ＆  Ｌａｍ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃ．１９９４，ｐ．７１２９−７１３９）。動物は、０日目、４日目、９日目、１４日目、及び２８日目に免疫する。ハイブリドーマ細胞株は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び異なる供給源から精製されたＬＰＳ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ａｌａｂａｓｔｅｒ，  Ａｌａ）によって抗ＬＰＳ抗体の産生についてスクリーニングされる。上清はまた、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ．、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｉｔｅｎｏｂａｃｔｅｒ  Ｂａｕｍａｎｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａのような、加熱殺傷したかまたは生きているグラム陰性細菌で試験された。広い反応性の抗体が選択され、そしてポリミキシンＢとの競合アッセイを実施する。
【０１３６】
ＨＣＡｂの最低阻止濃度（ＭＩＣ）
抗菌剤に対する細菌のインビトロ感受性を測定するために様々な実験室的方法を使用することができる。所与の細菌分離株に対する抗菌剤のインビトロ活性を定量的に測定するために、ブロス希釈法または寒天希釈法のいずれを使用してもよい。試験を実施するために、一連のチューブまたはプレートを、様々な濃度の抗菌剤を添加したブロスまたは寒天培地を用いて調製する。次いで、試験生物の標準化された懸濁液をチューブまたはプレートに接種する。３５±２℃での一晩のインキュベーションの後、試験を実施して最低阻止濃度（ＭＩＣ）を決定する。最終的な結果は方法論に大幅に影響され、再現性のある結果（実験室内及び実験室間）を達成するべき場合には、それを慎重に管理する必要がある。希釈試験を用いて得られたＭＩＣは、感染生物を阻害するのに必要とされる抗菌剤の濃度を示す。しかしながら、ＭＩＣは絶対値を表さない。「真の」ＭＩＣは、生物の増殖を阻害する最低試験濃度（すなわち、ＭＩＣ測定値）と次に低い試験濃度との間のいずこかにある。例えば、２倍希釈が使用され、ＭＩＣが１６μｇ／ｍＬである場合、「真の」ＭＩＣは、１６〜８μｇ／ｍＬの間であろう。管理された最善の条件下であっても、希釈試験を実行する各々の時に同一の終点が得られない場合がある。一般に、試験の許容可能な再現性は、実際の終点の２倍希釈以内である。
【０１３７】
抗体またはそのフラグメント及び比較用抗生物質（バンコマイシン、ポリミキシン、セファロスポリン、または他のベータラクタム）のインビトロ活性は、標準ＣＬＳＩ方法論（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．２００３．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  ｇｒｏｗ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ．  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍ７−Ａ７）に従ってブロス微量希釈ＭＩＣアッセイによって試験されるであろう。
【０１３８】
抗体またはそのフラグメントの活性は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して試験される。ＭＩＣは以下のように決定される：
１．  細菌接種材料の調製。新鮮なプレート（１週未満）から各系統のシングルコロニーを選び、５ｍｌの陽イオンを調整したＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（ＣＡＭＨＢ）に移す。３７℃の撹拌機で一晩インキュベートする。
２．  次の日の朝、一晩培養の１：１００希釈を実施する（５０ｕｌを５ｍｌに入れる）。３７℃の撹拌機で２〜４時間インキュベートする。
３．  ２〜４時間後（６００ｎｍでの吸光度約０．３〜０．５）、細菌を遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分）し、ＰＢＳに再懸濁し、培養物をＭａｃＦａｒｌａｎｄ０．５に調整し、５０ｕｌの調整培養物を９９５０ｕｌのＣＡＭＨＢに移し、ボルテックスすることにより混合する。
４．  ２〜４時間後（６００ｎｍでの吸光度約０．３〜０．５）、細菌を遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分）し、ＰＢＳに再懸濁し、培養物をＭａｃＦａｒｌａｎｄ０．５に調整し、５０ｕｌの調整培養物を９９５０ｕｌの１．１×ＣＡＭＨＢ（陽イオンを調整したＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ）に移し、ボルテックスすることにより混合する。
５．  マザープレートの調製［１枚のマザープレートを１０枚のドータープレートとし、１系統あたり１枚のドータープレート］：（細菌が増殖している間に準備する、ステップ５）：ディープウェルプレートの最初のウェルに２００ｕｌの化合物ストックを添加し、他のすべてのウェルに１００ｕｌのＤＭＳＯを添加する。ウェル２〜１１で化合物の２倍連続希釈を行う（１から２に１００ｕｌを移し、ピペッティングにより４回混合し、２から３に１００ｕｌを移し、混合するなどをし、ウェル１１から１００ｕｌを廃棄する）。ウェル１２はＤＭＳＯのみの対照である。
９００ｕｌの滅菌蒸留水を各ウェルに添加し、ピペッティングにより混合する。
６．  ＭＩＣプレート調製：マザープレートの各ウェルから１０ｕｌを、ドータープレートの対応するウェルに移す。９０ｕｌの細菌接種材料を各ウェルに加え、ピペッティングにより混合する。
７．  ３７℃で２４時間インキュベートし、そして増殖について採点する。増殖は、濁ったウェル、明らかなペレット、またはウェル内に存在する細菌の＞３のピンポイントのいずれかと見なされる。増殖を示さない化合物の最低濃度をＭＩＣとして採点する。
【０１３９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するバンコマイシンのＭＩＣは、標準ブロス微量希釈ＭＩＣアッセイを用いて０．１ｕｇ／ｍｌ〜１０ｕｇ／ｍｌの間で変動する。Ｓｔａｐｈ．  ａｕｒｅｕｓに対する無傷のＨＣＡｂｓのＭＩＣは、０．０２５ｕｇ／ｍｌ〜２５ｕｇ／ｍｌで変動する。可変領域フラグメントまたはナノボディが使用される場合、Ｓｔａｐｈ．  ａｕｒｅｕｓに対するＭＩＣは０．００８ｕｇ／ｍｌ〜８ｕｇ／ｍｌで変動する。
（Ｓｔａｐｈ．  ＡｕｒｅｕｓのバンコマイシンのＭＩＣ：０．２５〜４ｕｇ／ｍｌ、ＭＲＳＡのバンコマイシンのＭＩＣ：１〜１３８ｕｇ／ｍｌ、バンコマイシン分子量は１４５０ダルトン、ＨＣＡｂの分子量は８０，０００ダルトン、ＨＣＡｂはバンコマイシンより約５０倍重い、脂質ＩＩに対するバンコマイシンの親和性は５０ｎＭ、ＨＣＡｂの親和性は、０．５〜１０ｎＭであろう。ＨＣＡｂは、０．０２５〜２５ｕｇ／ｍｌのＭＩＣを有するであろう）。
（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６，４４（１１）：３８８３．  ＤＯＩ：Ａ．  Ｂｒｕｃｋｎｅｒ  Ｇｕｉｑｉｎｇ  Ｗａｎｇ，  Ｊａｎｅｔ  Ｆ．  Ｈｉｎｄｌｅｒ，  Ｋｅｖｉｎ  Ｗ．  Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ＭＩＣｓ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ５−Ｙｅａｒ  Ｐｅｒｉｏｄ）
【０１４０】
免疫グロブリン、補体、及び食細胞の存在下でのＨＣＡｂのＭＩＣ
オプソニン化食作用アッセイ（ＯＰＡ）は、米国特許第８，４１０，２４９号に記載されるように実施された。ＯＰＡは、抗体、補体、及び食細胞の存在下での細菌の殺傷を測定する。ヒトの補体及び細胞が一般的に使用される。ＨＣＡｂまたはフラグメントは、０．０１ｕｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で試験された。細菌の殺傷は、全ての成分とのインキュベーションの前後にコロニー形成単位を決定することによって測定される。オプソニン化も顕微鏡下で可視化される。ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）または分化したＨＬ６０前骨髄球性白血病（ＨＬ６０）細胞のいずれかがエフェクター細胞として使用される。ヒト血清または子ウサギ血清中の補体が補体の供給源として使用される。簡潔に、ＨＣＡｂまたは他の標本をハンクス平衡塩類溶液で、９６ウェルマイクロタイタープレート中で２倍の段階で連続希釈し、次いで細菌（ウェル当たり約２，０００ＣＦＵ）及び補体と共に、軌道式振盪機上において３７℃で３０分間インキュベートする。非特異的な殺傷または過剰増殖を最小限に抑えるために、最適な振盪速度が各細菌系統に対して決定される。新たに単離したヒトＰＭＮまたは分化したＨＬ６０細胞（エフェクター細胞）を細菌（標的）−補体−血清混合物に４００：１の比率で添加し、混合物を３７℃で４５分間インキュベートする。ＯＰＡ力価は、ＨＣＡｂまたはそのフラグメントを除くすべての試薬を含む対照ウェルからのＣＦＵと比較して、ＣＦＵの５０％減少（殺傷）を引き起こす血清希釈度である。ＨＣＡｂは１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌでバクテリアを殺傷する。
【０１４１】
細胞による免疫
細胞で免疫する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗ＣＤ３ｅ抗体の発現のために、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を組織培養中で増殖させる。所望のヒト抗体の発現は、Ｊｕｒｋａｔ細胞とモノクローナル抗体ＯＫＴ３とのインキュベーションによって分析される。続いて、細胞の洗浄により未結合のＯＫＴ３を除去し、そして結合したＯＫＴ３をフルオレセインとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ及びフローサイトメトリー分析により検出する。
【０１４２】
ラットＴ細胞ハイブリドーマ細胞に、記載（Ｔｒａｎｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１９（５）：９４７−５０）のようにヒトＣＤ３をコードする真核生物発現プラスミドを、エレクトロポレーションによりトランスフェクトする。ヒトＣＤ３を発現するトランスフェクタントはＦＡＣＳによって濃縮され、そして組織培養において増殖される。
【０１４３】
重鎖のみ（ＨＣＯ）の抗体を発現する遺伝子改変ラットを、腹腔内に３０×１０（６）個のＪｕｒｋａｔ細胞を注射することによって免疫する。一次免疫の４及び８週間後、ラットを、ヒトＣＤ３を発現するラットＴ細胞で免疫する。抗ヒトＣＤ３ｅ重鎖のみの抗体を発現する動物はモノクローナル重鎖のみの抗ＣＤ３ｅ抗体の単離のために使用する。
【０１４４】
ＤＮＡに基づく免疫のプロトコール
遺伝子ワクチン、または免疫するための抗原をコードするＤＮＡの使用は、ラットにおける強い抗体応答の発生に対する代替的アプローチを表す。
【０１４５】
ＤＮＡ接種の経路は一般に皮膚、筋肉及び抗原のトランスフェクション及び発現を支持する他の経路である。インフルエンザウイルス血球凝集素糖タンパク質または他のヒトもしくはウイルス抗原などの抗原を発現するように設計されている精製プラスミドＤＮＡが使用される。ＤＮＡ接種の経路は以下のものを含む：静脈内（尾静脈）、腹腔内；筋肉内（大腿四頭筋両方）、鼻腔内、皮内（足蹠など）、及び皮下（首筋など）。一般に、接種部位あたり１００μｌの生理食塩水中の１０〜１００μｇのＤＮＡを投与するか、またはＤＮＡを金粒子または細胞の取り込み及びトランスフェクションを促進する特定の製剤（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｅｌｌａｒｔ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐａｇｅ＝ｇｅｎｅｔｉｃ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ＆ｍｅｎｕ＝３．３）などの適切なビヒクルと共に投与する。免疫スキームは、上述のプロトコールと類似し；一次免疫後に追加免疫が続く。
【０１４６】
重鎖のみの抗体の精製
抗体を精製するために、免疫したラットから血液を採取し、遠心分離によって血清または血漿を得て、それによって凝固した細胞ペレットを、血清抗体を含む液体上相から分離する。血漿の血清からの抗体は標準的な手順により精製される。そのような手順には、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、及び／またはアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。ＩｇＧの精製のためにプロテインＡまたはプロテインＢを使用できる（Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩ，１４２，３１４５，１９８９）。
【０１４７】
実施例３：ラットからの抗体発現Ｂ細胞の単離
脾臓、リンパ節、または末梢血からのＢ細胞の単離
単一細胞懸濁液は、免疫ラットの脾臓またはリンパ節から調製される。赤血球を除去した後、またはＢ細胞、メモリーＢ細胞、抗原特異的Ｂ細胞、または形質細胞を単離した後、細胞をさらに濃縮することなく使用することができる。濃縮するとより良い結果が得られる可能性があり、最小限の赤血球除去が推奨される。メモリーＢ細胞は、不要な細胞の枯渇とそれに続くポジティブセレクションによって単離される。不要な細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、血小板、及び赤血球細胞は、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２３、ＣＤ３６、ＣＤ４３、及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）に対する抗体のカクテルを使用して除去される。ＩｇＧまたはＣＤ１９に特異的な抗体を用いたポジティブセレクションにより、高度に濃縮されたＢ細胞をもたらす（５０％〜９５％）。抗原特異的Ｂ細胞は、蛍光マーカー及び／または磁気ビーズで標識された抗原（複数可）に対して細胞を曝露することによって取得される。続いて、蛍光色素及び／または磁気ビーズでタグ付けされた細胞を、（フローサイトメトリーまたは蛍光標示式細胞分取器［ＦＡＣＳ］）ＦＡＣＳ分取器及び／または磁石を用いて分離する。形質細胞はほとんど表面Ｉｇを発現し得ないので、細胞内染色が適用され得る。
【０１４８】
蛍光標識細胞分取によるＢ細胞の単離
ＦＡＣＳに基づく方法はそれらの個々の特性によって細胞を分離するために使用される。細胞が単一細胞懸濁液中にあることが重要である。免疫化ラットの末梢血、脾臓、または他の免疫器官から調製された単一細胞懸濁液を、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７、またはＩｇＧなどのＢ細胞マーカーに特異的な蛍光色素標識抗体と混合する。代替的に、細胞を蛍光色素タグ付き抗原と共にインキュベートする。細胞濃度は、ＰＢＳなどの適切な緩衝液中で１００万〜２０００万細胞／ｍｌである。例えば、メモリーＢ細胞は、ＣＤ２７陽性及びＣＤ４５Ｒ陰性の細胞を選択することによって単離することができる。形質細胞は、ＣＤ１３８陽性及びＣＤ４５Ｒ陰性の細胞を選択することによって単離することができる。細胞をＦＡＣＳ装置に載せ、ゲートされた細胞を、培地を含む９６ウェルプレートまたはチューブに入れる。必要に応じて、各蛍光色素に対する陽性対照を実験に使用し、これによりバックグラウンドを差し引いて補正を計算することが可能になる。
【０１４９】
骨髄からのＢ細胞の単離
骨髄形質細胞（ＢＭＰＣ）は、記載（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，９６５−９６９）のように免疫動物から単離される。筋肉と脂肪組織は採取した脛骨と大腿骨から除去される。脛骨と大腿骨の両方の端を外科用ハサミで切り、骨髄を２６ゲージのインスリン注射器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  ＢＤ）で洗い流す。骨髄を滅菌ろ過した緩衝液第１番（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中に回収する。骨髄細胞を、細胞こし器（ＢＤ）を通して機械的に破砕しながらろ過することによって回収し、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５０ｍｌのチューブ（Ｆａｌｃｏｎ，  ＢＤ）に回収する。骨髄細胞を、４℃において、３３５ｇで１０分間遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットを３ｍｌの赤血球溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁し、２５℃で５分間穏やかに振とうする。細胞懸濁液を２０ｍｌのＰＢＳで希釈し、そして４℃において３３５ｇで１０分間遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットを１ｍｌの緩衝液第１番で再懸濁する。
【０１５０】
骨髄細胞懸濁液は、ビオチン化の抗ＣＤ４５Ｒ及び抗ＣＤ４９ｂ抗体と共にインキュベートする。次いで、細胞懸濁液を４℃で２０分間回転させる。これに続いて４℃において９３０ｇで６分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを１．５ｍｌの緩衝液第１番中に再懸濁する。ストレプトアビジンコンジュゲートＭ２８磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を洗浄し、製造元のプロトコールに従って再懸濁する。磁気ビーズ（５０ｕｌ）を各細胞懸濁液に添加し、混合物を４℃で２０分間回転させる。次いで、細胞懸濁液をＤｙｎａｂｅａｄマグネット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に置き、上清（陰性画分、ビーズに結合していない細胞）を回収し、ビーズに結合した細胞を廃棄する。
【０１５１】
予め洗浄したストレプトアビジンＭ２８０磁気ビーズを、２５ｕｌの磁気ビーズ混合物当たり０．７５ｕｇの抗体を含むビオチン化抗ＣＤ１３８と共に４℃で３０分間インキュベートする。次にビーズを製造元のプロトコールに従って洗浄し、緩衝液第１番に再懸濁する。上述のように回収した陰性細胞画分（ＣＤ４５Ｒ＋及びＣＤ４９ｂ＋細胞を枯渇させた）を５０ｕｌのＣＤ１３８コンジュゲート磁気ビーズと共にインキュベートし、懸濁液を４℃で３０分間回転させる。ＣＤ１３８＋結合細胞を有するビーズを磁石で単離し、緩衝液第１番で３回洗浄し、そしてビーズに結合していない陰性（ＣＤ１３８−）細胞を廃棄する。陽性ＣＤ１３８＋ビーズ結合細胞を回収し、さらに処理するまで４℃で保存する。
【０１５２】
代替的に、Ｏｕｉｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，１７：３，１−１７に記載の方法を使用することができる。
【０１５３】
実施例４：ハイブリドーマの生成
記載（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）されているように、単離されたＢ細胞をＸ６３またはＹＢ２／０細胞のような骨髄腫細胞との融合により不死化する。ハイブリドーマ細胞を選択培地中で培養し、抗体産生ハイブリドーマ細胞を限界希釈法または単一細胞選別法により作製する。
【０１５４】
実施例５：  重鎖のみの抗体をコードするｃＤＮＡの単離
単離した細胞からのｃＤＮＡ配列の生成
単離された細胞を４℃において９３０ｇで５分間遠心分離する。細胞をＴＲＩ試薬で溶解し、Ｒｉｂｏｐｕｒｅ  ＲＮＡ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ）の製造元のプロトコールに従って全ＲＮＡを単離する。製造元のプロトコールに従って、オリゴｄＴ樹脂とＰｏｌｙ（Ａ）ｐｕｒｉｓｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離する。ｍＲＮＡ濃度はＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で測定される。
【０１５５】
単離されたｍＲＮＡは、マロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いた逆転写による第一鎖ｃＤＮＡ合成に使用される。ｃＤＮＡ合成は、Ｒｅｔｒｏｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ）の製造元のプロトコールに従って、５０ｎｇのｍＲＮＡテンプレートとオリゴｄＴプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲプライミングによって実施される。ｃＤＮＡ構築の後、ＰＣＲ増幅を実施して、重鎖のみの抗体を増幅する。プライマーの表は表１に示す。
【０１５６】
【表１】
2019528295.tif 000007
【０１５７】
５０μｌのＰＣＲ反応は、０．２ｍＭのフォワード及びリバースプライマー混合物、５ｕｌのＴｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（ＮＥＢ）、２ｕｌの未精製ｃＤＮＡ、１ｕｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、及び３９ｕｌの二重蒸留Ｈ２Ｏからなる。ＰＣＲサーモサイクルプログラムは、９２℃で３分間；４サイクル（９２℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間）；４サイクル（９２℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間）、２０サイクル（９２℃で１分間、６３℃で１分間、７２℃で１分間）；７２℃で７分間、４℃保存である。ＰＣＲ遺伝子産物をゲル精製し、ＤＮＡをシーケンシングする。
【０１５８】
実施例６：組換え重鎖のみの抗体のクローニング及び発現
ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにサブクローニングする。真核細胞における発現のために、重鎖のみの抗体をコードするｃＤＮＡを記載（Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；３２９（１−２）：１１２−１２４）のように発現ベクターにクローニングする。
【０１５９】
代替的に、重鎖のみの抗体をコードする遺伝子を、記載（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８．１２（２０１０）：１２８７−１２８９）のようにミニサークル産生プラスミドにクローニングする。
【０１６０】
代替的に、重鎖のみの抗体をコードする遺伝子は、修正熱力学的平衡インサイドアウト核形成ＰＣＲを用いてオーバーラップオリゴヌクレオチドから合成され（Ｇａｏ  ａｔ  ａｌ．，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．；３１（２２）：ｅ１４３）、真核生物発現ベクターにクローニングされる。
【０１６１】
代替的に、重鎖のみの抗体をコードする遺伝子を合成してプラスミドにクローニングする。
【０１６２】
人工染色体中の様々な重鎖のみの抗体をコードする多重発現カセットを組み立てるために、多重発現カセットを互いに連結し、続いて細菌中で増殖するＢＡＣベクターにクローニングする。トランスフェクションのために、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞を使用する（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／１８２９００１５．ｐｄｆ）。代替的に、連結された発現カセットは、酵母細胞で増殖する酵母人工染色体アームとさらに連結される（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，上述）。
【０１６３】
プラスミド精製
約５ｍｌ（またはより多くの）一晩の細菌培養からのプラスミド単離のために、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）プラスミドミニプレップキットが使用される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｉｏｌｏｇｙ／ｄｎａ−ａｎｄ−ｒｎａ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ−ｋｉｔ．ｈｔｍｌ）。これは遠心分離とそれに続くアルカリ溶解によるバクテリア細胞の収穫を含む。次いで、ＤＮＡをカラムに結合させ、洗浄して溶出し、消化またはシークエンシングをする準備を整える。
【０１６４】
ＢＡＣ精製
ＣｌｏｎｔｅｃｈのＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＢＡＣ１００は、ＢＡＣ精製のために設計されたキットである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ｔａｂｎｏ＝２＆ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｉｄ＝１８６８０２）。このために、細菌は２００ｍｌの培養から回収され、改良アルカリ／ＳＤＳ手順を使用することによって溶解する。細菌溶解物を濾過により清澄化し、そして平衡化カラムにロードし、そこでプラスミドＤＮＡは陰イオン交換樹脂に結合する。続く洗浄ステップの後、精製されたプラスミドＤＮＡを高塩濃度緩衝液中に溶離し、そしてイソプロパノールで沈殿させる。プラスミドＤＮＡをさらなる使用のためにＴＥ緩衝液中で再構成する。
【０１６５】
ＹＡＣ精製
直線状のＹＡＣ、環状のＹＡＣ及び消化後のＢＡＣフラグメントは、標準的に泳動した０．８％アガロースゲルまたはパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）から切り出されたストリップから、Ｅｌｕｔｒａｐ（商標）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を用いる電気抽出によって精製される（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、上述）。精製したＤＮＡを沈殿させ、そして緩衝液に所望の濃度に再溶解する。
【０１６６】
酵母からの環状ＹＡＣの精製は、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸシリカ系アニオン交換樹脂（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施する。手短に、スフェロプラストを、ザイモリアーゼまたはリチカーゼを用いて作製し、そしてペレット化する（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、上述）。次いで、細胞をアルカリ溶解し、ＡＸ１００カラムに結合させ、低コピープラスミドについてＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ法に記載の通りに溶出する。混入する酵母染色体ＤＮＡを、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存性ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて加水分解し、続いてＳｕｒｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いる最終精製ステップを実施する。次いで、ＤＨ１０エレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のアリコートを環状ＹＡＣで形質転換してＢＡＣコロニーを得る（上述を参照）。インサートＤＮＡ、約１０ｋｂのＢＡＣベクターＤＮＡからの１５０〜２００ｋｂの分離のために、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−ＣＬによるろ過ステップを使用する（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、上述）。
【０１６７】
プラスミドまたはＢＡＣ  ＤＮＡによる細胞のトランスフェクション
組換え重鎖のみの抗体の発現のために、真核生物細胞を記載（Ａｎｄｒｅａｓｏｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ，１９８９，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０（２）：２６９−７５；Ｂａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｔｔｅｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５（１０）：１９５０−６；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ／ｃｂ３／ｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌ）されるようにトランスフェクトする。重鎖のみの抗体を発現する細胞は、様々な選択方法を用いて単離される。単一細胞の単離には限界希釈法または細胞選別法が使用される。クローンを重鎖のみの抗体発現について分析する。
【０１６８】
実施例７：ＵｎｉＲａｔ（商標）及びＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）におけるＪ遺伝子使用
図１は、重鎖のみの抗体を発現するためにＵｎｉＲａｔ（商標）において使用されるヒト導入遺伝子を示す。ＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）は、ＵｎｉＲａｔと同一のヒトＶ遺伝子クラスターを使用するが、固定されたκ軽鎖を発現しない。
【０１６９】
図２は、上述の実施例に記載されるような、全てのＪ遺伝子が第１０１位においてアルギニンを発現する重鎖のみの抗体を発現するためにＵｎｉＲａｔ（商標）において使用されるヒト導入遺伝子を示す。
【０１７０】
ＵｎｉＲａｔ（商標）及びＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）の発現する抗体レパートリーは、免疫動物からのリンパ節由来のＢ細胞から単離されるｍＲＮＡの全てのＶＨ領域の次世代シークエンシングによって決定される。発現する抗体からの全てのＶＨ配列は、ヒトＩＧＨＶとＩＧＨＪの生殖細胞系列の配列とアラインメントされた。Ｊ遺伝子使用の頻度は、少なくとも６の独立したＵｎｉＲａｔ（商標）及びＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）動物から計算された。図３は、ＵｎｉＲａｔ（商標）が、野生型ＩＧＨＪ４配列を有するＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）よりも高い頻度でＷ１０１Ｒ変異を含むＩＧＨＪ４を使用することを示す。ＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）はまた、ＵｎｉＲａｔ（商標）よりもはるかに高い頻度でＩＧＨＪ６を使用する。
【０１７１】
実施例８：Ｗ１０１変異はλ結合を阻害する
１０５８の重鎖抗体の大きなコレクションに対するラムダ結合を標準的なＥＬＩＳＡによって測定した。１０５８の全重鎖抗体のうち、８５９が第１０１位にＲを含み、１９９が第１０１位にＷを含んだ。図４は、Ｒ１０１重鎖抗体の２．７％のみが、バックグラウンドシグナルの１０倍以上のＥＬＩＳＡシグナルとして決定される、遊離ラムダタンパク質との顕著な結合を示したことを示す。対照的に、Ｗ１０１重鎖抗体の３１．２％が、同様の基準を用いて遊離ラムダタンパク質との顕著な結合を示した。これらの結果は、Ｗ１０１Ｒ変異がラムダ結合に対して高度に防御的であり、Ｗ１０１重鎖抗体は、Ｒ１０１よりもはるかに高いラムダとの結合する可能性を有することを示す。
【０１７２】
実施例９：同一のＣＤＲ３ファミリーにおける、重鎖のみの抗体との遊離λタンパク質の結合。
図５は、同一のＣＤＲ３ファミリーにおける重鎖抗体由来の１１のＶＨ配列多重配列アラインメントを示す。これらの配列の全ては第１０１位にＷを含む。アラインメントにおける上部の７の配列は全て、ＥＬＩＳＡによって測定されるラムダ結合について陽性であった。アラインメントにおける下部の４の配列は全て、同様にＥＬＩＳＡによって測定されるラムダ結合について陰性であった。このＶＨ配列のファミリーは、ラムダポジティブ配列とラムダネガティブ配列とを区別する位置ａ及びｂにさらなる変異を示す。位置ａまたはｂのいずれかにあるＳｅｒまたはＧｌｕは、ラムダ結合を排除する。しかしながら、他のＣＤＲ３ファミリー中のこれらの位置におけるＳｅｒまたはＧｌｕは、ラムダ結合による同一の結合を有さない。このファミリーからの結果は、ラムダ結合を妨げるＷ１０１のＶＨ配列に代償性変異があることを示唆しているが、これらの代償性変異はＣＤＲ３ファミリーに特異的であることを示唆している。
【０１７３】
実施例１０：Ｄ−Ｊ接合部の多様性は、ＩＧＨＪ６が使用されるとき、ＵｎｉＲａｔ（商標）とＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）で異なる
実施例６で示されるように、ＵｎｉＲａｔ（商標）と比べてＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）において、ＩＧＨＪ６が３倍以上高い頻度で使用される。さらに、図３に示されるように、ＩＧＨＪ６がＵｎｉＲａｔ（商標）で使用されるとき、生殖細胞系列のＩＧＨＪ６において見られる５つのＴｙｒ残基のストレッチは、最も高頻度で、１つのＴｙｒに短くなっている。対照的にＩＧＨＪ６が使用されるとき、４つのＴｙｒ残基のストレッチが、ＯｍｎｉＦｌｉｃ（商標）中で最も一般的な長さである。これは、ＩＧＨＪ６が使用されるとき、Ｗ１０１を含む重鎖抗体において生殖細胞系列のＩＧＨＪ６配列中に存在する５つのＴｙｒ残基のストレッチを短くするための選択的圧力が存在することを示唆する。
【０１７４】
実施例１１：ヒトＶＨ細胞外結合ドメインを用いるキメラ抗原受容体
初代培養Ｔ細胞でのキメラ抗原受容体の発現は、細胞外抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一のキメラタンパク質の発現を必要とする。単一鎖Ｆｖフラグメントは、典型的に抗原結合ドメインとして使用される。ｓｃＦｖキメラ抗原受容体の例は、図６のパネルＡに示される。代替的に、単一のヒトＶＨ結合ドメインが、細胞外結合ドメインとして使用される（パネルＢまたは図６）。単一のヒトＶＨを使用することは、発現するためのより小さくより複雑でないタンパク質であるという利点を有し、そして免疫原性がより低い。
【０１７５】
本明細書においては本発明の好ましい実施形態を示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換に想到するであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、そしてこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
【図１】
2019528295.tif 000008
【図２】
2019528295.tif 000009
【図３】
2019528295.tif 000010
【図４】
2019528295.tif 000011
【図５−１】
2019528295.tif 000012
【図５−２】
2019528295.tif 000013
【図６】
2019528295.tif 000014
【図７】
2019528295.tif 000015
【配列表】
2019528295000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月19日(2019.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物のゲノム中で互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域をコードする、１つ以上のヒトＶ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪ遺伝子セグメントを含む組換え重鎖のみの免疫グロブリン（Ｉｇ）座位であって、前記ヒトＪセグメントの少なくとも１つが、第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位に、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基をコードするコドンを含む、前記組換え重鎖のみの免疫グロブリン（Ｉｇ）座位。
【請求項２】
ＣＨ１機能性を欠く免疫グロブリン定常エフェクター領域をコードする定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項３】
２〜４０のＤ遺伝子セグメント、及び２〜２０のＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１または２に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項４】
１より多い前記ヒトＪ遺伝子セグメントが、前記第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の前記第１位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基をコードするコドンを含む、請求項３に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項５】
全ての前記ヒトＪ遺伝子セグメントが、前記第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の前記第１位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基をコードするコドンを含む、請求項４に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項６】
前記コードされたＶＨ領域において、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項５に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項７】
前記コードされたＶＨ領域において、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、請求項５に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項８】
前記コードされたＶＨ領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、請求項７に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項９】
前記コードされたＶＨ領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、請求項８に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項１０】
前記コードされたＶＨ領域が、前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項９に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項１１】
ＷのコドンがＲによって置き換えられているＪ４遺伝子セグメントを含む、請求項１０に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項１２】
前記コードされた重鎖ＶＨ領域が、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項１３】
前記ＶＨ領域を含むヒトまたはヒト化重鎖のみの抗体をコードする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１５】
非ヒト哺乳動物である、請求項１４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
げっ歯動物である、請求項１５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１７】
ラットまたはマウスである、請求項１６に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１８】
ラットである、請求項１７に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１９】
ＵｎｉＲａｔ（商標）である、請求項１８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２０】
いかなる機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子も発現せず、互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含むＶＨドメインをコードする、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のＪ遺伝子セグメント、ならびにその各々がＣＨ１機能性を含む抗体の定常エフェクター領域をコードする１つ以上の定常エフェクター領域遺伝子セグメントを含む、異種の重鎖のみのＩｇ座位を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記ＶＨドメインの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性を破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換され、前記遺伝子セグメントが、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントが組み換えられて重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）をコードする再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子座位を生じるように配置される、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２１】
前記ＶＨドメインにおいて、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項２０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２２】
前記ＶＨドメインにおいて、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、請求項２０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２３】
前記ＶＨドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、請求項２２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２４】
前記ＶＨドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、請求項２３に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２５】
前記ＶＨドメインが、前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項２４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２６】
前記異種の重鎖のみの座位が、ＷのコドンがＲのコドンと置き換えられているＪ４セグメントを含む、請求項２５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２７】
前記コードされた重鎖のみの抗体が、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２８】
哺乳動物である、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２９】
げっ歯動物である、請求項２８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３０】
ラットまたはマウスである、請求項２９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３１】
ラットである、請求項３０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３２】
ＵｎｉＲａｔ（商標）である、請求項３１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３３】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位を含む、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）であって、前記ＨＣＡｂが、請求項１４〜３２のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物によって産生される、ＨＣＡｂ。
【請求項３４】
相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク（ＦＲ）領域を含む重鎖可変（ＶＨ）領域を含む組換え重鎖のみのＩｇ座位を含む、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）であって、前記ＨＣＡｂが、
ｉ）トランスジェニック非ヒト動物を、免疫原で免疫するステップであって、前記トランスジェニック非ヒト動物が、
ａ）いかなる機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子も発現せず；
ｂ）互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含むＶＨドメインをコードする、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のＪ遺伝子セグメント、ならびにその各々がＣＨ１機能性を含む抗体の定常エフェクター領域をコードする１つ以上の定常エフェクター領域遺伝子セグメントを含む、異種の重鎖のみのＩｇ座位を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記ＶＨドメインの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性を破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換され、前記遺伝子セグメントが、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントが組み換えられて重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）をコードする再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子座位を生じるように配置される、ステップと；
ｉｉ）前記免疫したトランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞から、前記ＨＣＡｂをコードする核酸配列を単離するステップと；
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において単離された前記核酸配列から前記ＨＣＡｂを産生するステップ
を含む方法によって産生される、ＨＣＡｂ。
【請求項３５】
前記ＶＨドメインにおいて、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、請求項３４に記載のＨＣＡｂ。
【請求項３６】
前記ＶＨドメインにおいて、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、請求項３４に記載のＨＣＡｂ。
【請求項３７】
前記ＶＨドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、請求項３６に記載のＨＣＡｂ。
【請求項３８】
前記ＶＨドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、請求項３７に記載のＨＣＡｂ。
【請求項３９】
前記ＶＨドメインが、前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、請求項３８に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４０】
前記異種の重鎖のみの座位が、ＷのコドンがＲのコドンと置き換えられているＪ４セグメントを含む、請求項３９に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４１】
前記コードされた重鎖のみの抗体が、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４２】
前記トランスジェニック非ヒト動物が、哺乳動物である、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４３】
前記哺乳動物が、げっ歯動物である、請求項４２に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４４】
前記げっ歯動物が、ラットまたはマウスである、請求項４３に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４５】
前記げっ歯動物が、ラットである、請求項４４に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４６】
前記ラットが、ＵｎｉＲａｔ（商標）である、請求項４５に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４７】
前記ＨＣＡｂが、ヒトＨＣＡｂである、請求項３３〜４６のいずれか１項に記載のＨＣＡｂ。
【請求項４８】
請求項３３〜４７のいずれか一項に記載のＨＣＡｂを含む、医薬組成物。
【請求項４９】
疾患の治療のための、請求項３３〜４７のいずれか一項に記載のＨＣＡｂを含む組成物、または疾患の治療のための、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
疾患の治療のための医薬の調製における、請求項３３〜４７のいずれか１項に記載のＨＣＡｂの使用。
【請求項５１】
疾患の治療において使用するための、請求項３３〜４７のいずれか１項に記載のＨＣＡｂを含む組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
全ての態様及び実施形態において、ＨＣＡｂ結合ドメインは、同一の標的抗原の複数の異なるエピトープまたは１つを超える標的抗原の複数の異なるエピトープに結合する、多重特異性結合タンパク質の一部であり得る。例えば、下記の結合親和性を有する二重特異性ＨＣＡｂ構造を含む多重特異性、例えば二重特異性ＨＣＡｂが特に含まれる：上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）×ＣＤ３；ＣＤ１９×ＣＤ３；ＥｐＣａｍ×ＣＤ３；ＴＮＦ−α×ＩＬ−１７；ＩＬ−１α×ＩＬ−１β；ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ；ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）×ＨＥＲ３；ＩＬ−４×ＩＬ−１３；アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）×血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；第ＩＸａ因子×第Ｘ因子；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）×ＨＥＲ３；ＩＬ−１７Ａ×ＩＬ−１７Ｆ；ＨＥＲ２×ＨＥＲ３；がん胎児抗原×ＣＤ３；ＣＤ２０×ＣＤ３；ＣＤ１２３×ＣＤ３；ＢＣＭＡ×ＣＤ３、ＰＳＭＡ×ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＰＳＭＡ×ＣＤ３、ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＣＤ１９×ＣＤ２２×ＣＤ３、ＣＤ２２×ＣＤ３、ＣＤ３８×ＰＤ１、ＣＤ３８×ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３８×ＣＤ７３、ＣＤ３８×ＣＤ３９、ＰＤ１×ＣＤ３９×ＣＤ７３、及びＰＤ１×ＣＤ７３。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、抗体の軽鎖の不在下で標的抗原への結合親和性を有する、単離されたヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）であって、前記ＶＨドメインにおいて、前記ＨＣＡｂの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置の前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている、前記重鎖のみの抗体。
（項目２）
ヒト抗体である、項目１に記載の重鎖のみの抗体。
（項目３）
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目１に記載の重鎖のみの抗体。
（項目４）
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、項目１に記載の重鎖のみの抗体。
（項目５）
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、項目４に記載の重鎖のみの抗体。
（項目６）
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、項目５に記載の重鎖のみの抗体。
（項目７）
前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、項目６に記載の重鎖のみの抗体。
（項目８）
１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
（項目９）
前記ＦＲ４の第１のアミノ酸残基において前記天然のアミノ酸残基を含む対応する抗体と比較して、凝集への傾向が低下している、項目１〜８のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
（項目１０）
その標的抗原に対して約１ｐＭ〜約１μＭの結合親和性を有する、項目１〜９のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
（項目１１）
抗体の軽鎖の不在下で標的抗原に対する結合親和性を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む単離されたヒトまたはキメラの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）であって、前記ＨＣＡｂが、天然のヒトＶＨアミノ酸配列の第４のＦＲ領域（ＦＲ４）における第１位のアミノ酸においてトリプトファン（Ｔ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、前記重鎖のみの抗体。
（項目１２）
重鎖定常（ＣＨ）ドメインをさらに含み、ＣＨ１領域を欠く、項目１１に記載の重鎖のみの抗体。
（項目１３）
ＩｇＧ１抗体である、項目１２に記載の重鎖のみの抗体。
（項目１４）
１つ以上のＦＲ領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、項目１１〜１３のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
（項目１５）
前記ＦＲ４の第１のアミノ酸残基において前記天然のアミノ酸残基を含む対応する抗体と比較して、凝集への傾向が低下している、項目１１〜１４のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれか１項に記載の重鎖のみの抗体を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目１７）
単一のヒトＶＨドメインを含む、項目１６に記載のキメラ抗原受容体。
（項目１８）
相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、標的抗原に対する結合親和性を有し、第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域における第１のアミノ酸残基の天然のアミノ酸残基の、その位置における天然アミノ酸を含むかまたはそれに関連した表面露出疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基の置換を含む、前記単離された自律ヒト抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン。
（項目１９）
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目１８に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
（項目２０）
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、項目１８に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
（項目２１）
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、項目２０に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
（項目２２）
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、項目２１に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
（項目２３）
前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、項目２２に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
（項目２４）
１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、項目１８〜２３のいずれか１項に記載の単離された自律ヒトＶＨドメイン。
（項目２５）
相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、複数の抗原結合ドメインを含み、標的抗原への結合親和性を有する、多価結合タンパク質であって、前記ＶＨドメインにおいて、前記多価結合タンパク質の第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置の前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換されている、前記多価結合タンパク質。
（項目２６）
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目２５に記載の多価結合タンパク質。
（項目２７）
前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基によって置換されている、項目２６に記載の多価結合タンパク質。
（項目２８）
前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、項目２７に記載の多価結合タンパク質。
（項目２９）
前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、項目２８に記載の多価結合タンパク質。
（項目３０）
前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、項目２９に記載の多価結合タンパク質。
（項目３１）
１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、項目２５〜３０のいずれか１項に記載の多価結合タンパク質。
（項目３２）
非ヒト動物のゲノム中で互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域をコードする、１つ以上のヒトＶ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪ遺伝子セグメントを含む組換え重鎖のみの免疫グロブリン（Ｉｇ）座位であって、前記ヒトＪセグメントの少なくとも１つが、第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位に、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、前記組換え重鎖のみの免疫グロブリン（Ｉｇ）座位。
（項目３３）
ＣＨ１機能性を欠く免疫グロブリン定常エフェクター領域をコードする定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントをさらに含む、項目３２に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目３４）
２〜４０のＤ遺伝子セグメント、及び２〜２０のＪ遺伝子セグメントを含む、項目３２または３３に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目３５）
１より多い前記ヒトＪセグメントが、前記第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の前記第１位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、項目３４に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目３６）
全ての前記ヒトＪセグメントが、前記第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の前記第１位において、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性パッチを破壊することのできる非天然のアミノ酸残基をコードするコドンを含む、項目３５に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目３７）
前記コードされた重鎖ＶＨ領域において、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目３６に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目３８）
前記コードされた重鎖ＶＨ領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、項目３７に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目３９）
前記コードされた重鎖ＶＨ領域において、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、項目３８に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目４０）
前記コードされた重鎖ＶＨ領域が、前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、項目３９に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目４１）
ＷのコドンがＲによって置き換えられているＪ４遺伝子セグメントを含む、項目４０に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目４２）
前記コードされた重鎖ＶＨ領域が、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、項目３２〜４１のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目４３）
前記ＶＨ領域を含むヒトまたはヒト化重鎖のみの抗体をコードする、項目３２〜４２のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位。
（項目４４）
項目３２〜４２のいずれか１項に記載の組換え重鎖のみのＩｇ座位を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
（項目４５）
非ヒト哺乳動物である、項目４４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目４６）
げっ歯動物である、項目４５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目４７）
ラットまたはマウスである、項目４６に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目４８）
ラットである、項目４７に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目４９）
ＵｎｉＲａｔ（商標）である、項目４８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目５０）
いかなる機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子も発現せず、互いに組み換えられるとき、親和性成熟に続いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含むＶＨドメインをコードする、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のＪ遺伝子セグメント、ならびにその各々がＣＨ１機能性を含む抗体の定常エフェクター領域をコードする１つ以上の定常エフェクター領域遺伝子セグメントを含む、異種の重鎖のみのＩｇ座位を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記ＶＨドメインの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）の第１位の天然のアミノ酸残基が、その位置における前記天然のアミノ酸残基を含むかまたはそれに関連した表面露出した疎水性を破壊することのできる異なるアミノ酸残基によって置換され、前記遺伝子セグメントが、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメントが組み換えられて重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）をコードする再構成された親和性成熟した重鎖のみの遺伝子座位を生じるように配置される、前記トランスジェニック非ヒト動物。
（項目５１）
前記ＶＨドメインにおいて、前記ＦＲ４の第１位の天然のアミノ酸残基が、極性アミノ酸残基によって置換されている、項目５０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目５２）
前記ＶＨドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される、項目５１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目５３）
前記ＶＨドメインにおいて、前記正に荷電したアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）である、項目５２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目５４）
前記ＶＨドメインが、前記第４のフレームワーク（ＦＲ４）領域中の前記第１のアミノ酸残基において、トリプトファン（Ｗ）からアルギニン（Ｒ）への置換を含む、項目５３に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目５５）
前記異種の重鎖のみの座位が、ＷのコドンがＲのコドンと置き換えられているＪ４セグメントを含む、項目５４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目５６）
前記コードされた重鎖のみの抗体が、１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上のさらなる変異を含む、項目５０〜５５のいずれか１項に記載の異種の重鎖のみの座位。
（項目５７）
哺乳動物である、項目５０〜５６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目５８）
げっ歯動物である、項目５７に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目５９）
ラットまたはマウスである、項目５８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目６０）
ラットである、項目５９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
（項目６１）
ＵｎｉＲａｔ（商標）である、項目６０に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【国際調査報告】
2019528295.tif 000016
2019528295.tif 000017
2019528295.tif 000018
2019528295.tif 000019