(57)【要約】  細胞保存培地、細胞回復培地及び細胞培養培地、並びにこれらの培地を利用する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞保存培地であって、以下：細胞冬眠培地（cell hibernation medium）及びＬ−グルタミン又はそのアナログ、並びに、アスコルビン酸、アルブミン、若しくはインスリンの１つ又は複数、を含む、細胞保存培地。
【請求項２】
前記細胞冬眠培地が、Hibernate（登録商標）Eを含む、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記アナログが、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む、請求項１又は２に記載の培地。
【請求項４】
前記Ｌ−グルタミン又はアナログジペプチドの濃度が、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭ又は約１ｍＭ〜約２ｍＭである、請求項１から３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項５】
前記アスコルビン酸が、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ又は約１５０〜約２００ｍＭである、請求項１から４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
前記アルブミンが、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬ又は約３００〜約４００ｍＭである、請求項１から５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項７】
前記インスリンが、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ又は約４〜約６ｍＭである、請求項１から６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項８】
細胞をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９】
前記細胞が心筋細胞である、請求項８に記載の培地。
【請求項１０】
前記細胞がｉＰＳｃ由来の心筋細胞である、請求項９に記載の培地。
【請求項１１】
細胞回復培地（cell recovery medium）であって、以下：請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞保存培地、及びＭ１９９、ＤＭＥＭ、グルコース又は他の糖に基づくエネルギー源、グルタミン又はそのアナログ、並びに、アスコルビン酸、アルブミン、若しくはインスリンの１つ又は複数、を含み、ここで、前記細胞回復培地が約４５％〜約５５％の細胞保存培地を有し、前記細胞回復培地が約１０％〜約１５％のＭ１９９及び約３５％〜約４０％のＤＭＥＭを有する、細胞回復培地。
【請求項１２】
約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ又は約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌのグルコース又は他の糖を含む、請求項１１に記載の培地。
【請求項１３】
前記細胞回復培地中のＬ−グルタミン又はアナログが、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭ又は約１ｍＭ〜約２ｍＭである、請求項１１又は１２に記載の培地。
【請求項１４】
前記細胞回復培地中のアスコルビン酸が、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ又は約１５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬである、請求項１１、１２又は１３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１５】
前記細胞回復培地中のアルブミンが、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬ又は３００μｇ／ｍＬ〜４００μｇ／ｍＬである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１６】
前記細胞回復培地中のインスリンが、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ又は４μｇ／ｍＬ〜６μｇ／ｍＬである、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１７】
細胞をさらに含む、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１８】
前記細胞が心筋細胞である、請求項１７に記載の培地。
【請求項１９】
前記細胞がｉＰＳｃ由来の心筋細胞である、請求項１８に記載の培地。
【請求項２０】
細胞培養培地であって、以下：Ｍ１９９、ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン又はそのアナログ、グルコース又は他の糖に基づくエネルギー源、並びに、アスコルビン酸、アルブミン若しくはインスリンの１つ又は複数、を含み、ここで、前記培地が、約２０％〜約３０％のＭ１９９、約７０％〜約８０％のＤＭＥＭ、及び約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌのグルコース又は他の糖を含む、細胞培養培地。
【請求項２１】
約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌのグルコース又は他の糖を含む、請求項２０に記載の培地。
【請求項２２】
前記細胞培養培地中のアスコルビン酸が、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬである、請求項２０又は２１に記載の培地。
【請求項２３】
前記細胞培養培地中のアルブミンが、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬである、請求項２０、２１又は２２のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２４】
前記細胞培養培地中のインスリンが、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬである、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２５】
前記細胞培養培地中のＬ−グルタミン又はアナログが、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭである、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２６】
細胞をさらに含む、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２７】
前記細胞が心筋細胞である、請求項２６に記載の培地。
【請求項２８】
前記細胞がｉＰＳｃ由来の心筋細胞である、請求項２７に記載の培地。
【請求項２９】
貯蔵及び出荷のために細胞を調製する方法であって、以下：
細胞を提供し；そして
前記細胞を、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞保存培地に導入すること、
を含む、方法。
【請求項３０】
細胞を培養する方法であって、以下：
細胞を、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の細胞回復培地で洗浄し；そして
洗浄した細胞を、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の培地で培養すること、
を含む、方法。
【請求項３１】
前記細胞が心筋細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がｉＰＳｃ由来の心筋細胞である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１月１２日に出願された米国特許出願第６２／２７７，８７０号明細書の出願日の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
輸送のための心筋細胞（cardiac muscle cells）（心筋細胞（cardiomyocytes））の長期安定化は、現在の細胞保存条件下でのそれら細胞の生存率の低さにより問題となっている。従来、長期輸送のための心筋細胞の調製は、液体懸濁液の形態での細胞の凍結保存を含み、これは：ｉ）細胞生存率の低下を引き起こし；ｉｉ）細胞懸濁液を生成するためのいくつかの操作ステップを必要とし、かつｉｉｉ）細胞が極低温（−８０〜−２００℃）下で貯蔵及び輸送されることを必要とする。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示はとりわけ、細胞、例えば心筋細胞が細胞生存率を維持し、かつ最大約１２０時間（５日間）の期間にわたって細胞機能を保存することを可能にする水性培地調合物を提供する。本明細書に記載の条件で維持される細胞は、標準的な宅配の取り扱いの下での輸送に成功し、非極低温、例えば約３３°Ｆ〜約７５°Ｆ、例えば約３５°Ｆ〜約７０°Ｆ又は約４℃〜約３０℃の温度の下で、完全な細胞機能及び生存率を保持することが示された。
【０００４】
一実施形態では、本開示は、細胞冬眠培地（cell hibernation medium）を含む水性細胞培地調合物を提供し、斯かる細胞冬眠培地は、長期輸送のために、幹細胞由来前駆体又は分化細胞、例えば幹細胞由来心筋細胞の安定化を支持する試薬を含む１つ又は複数の試薬で補充されている。また、輸送後に細胞の機能性の回復及び修復を促進する組成及び試薬の開示も提供される。
【０００５】
一実施形態では、補充された培地調合物の使用が提供され、斯かる培地調合物は、例えば室温又は周囲温度での細胞輸送（貯蔵）のための調合物、細胞回復のための調合物、並びにその後の薬物試験を含む細胞アッセイのための調合物を含む。
【０００６】
一実施形態では、培地調合物は、細胞、例えば幹細胞、例えば誘導された多能性幹細胞、又は幹細胞から分化した細胞、例えば幹細胞由来の心筋細胞と共に利用される。
【０００７】
本明細書に記載の調合物は、単独で又はタンデムで（連続的に）使用される場合、例えば輸送に供されない細胞と比較して、細胞生存率に対する影響を与えないか、又は最小限の影響を有し、細胞、例えば心筋細胞が、細胞培養容器に付着しながら保存されることを可能にして、細胞懸濁液を得る必要性を無効にし、及び／又は、周囲温度（例えば＋１５℃〜＋２５℃）での細胞、例えば心筋細胞の安定化、貯蔵及び輸送を提供する。
【０００８】
例えば、１つの調合物は細胞保存培地を含み、斯かる細胞保存培地は、基礎培地、例えば細胞冬眠培地、及びＬ−グルタミン又はそのアナログ、並びに、アスコルビン酸、アルブミン、若しくはインスリンの１つ又は複数あるいは任意の組み合わせ、を含む。一実施形態では、細胞冬眠培地は、Hibernate（登録商標）Eを含む。一実施形態では、アナログは、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む。一実施形態では、Ｌ−グルタミン又はアナログジペプチドの濃度は、約０．５ｍＭ〜約３又は４ｍＭ又は約１ｍＭ〜約２ｍＭである。一実施形態では、アスコルビン酸は、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ又は約１５０〜約２００ｍＭである。一実施形態では、アルブミンは、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬ又は約３００〜約４００ｍＭである。一実施形態では、インスリンは、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ又は約４μｇ／ｍＬ〜約６μｇ／ｍＬである。一実施形態では、培地は細胞、例えば心筋細胞を含む。
【０００９】
また、細胞回復培地（cell recovery medium）も提供される。細胞回復培地は、約４０％〜約６０％の細胞保存培地、約１０％〜約１５％のＭ１９９、約３５％〜約４０％のＤＭＥＭ、グルコース又は他の糖に基づくエネルギー源、グルタミン又はそのアナログ、並びに、アスコルビン酸、アルブミン、及びインスリンの１つ又は複数あるいは任意の組み合わせ、を含む。一実施形態では、グルコース又は他の糖は、約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ又は約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌである。一実施形態では、細胞保存培地又は細胞回復培地中のＬ−グルタミン又はアナログは、約０．５ｍＭ〜約３又は４ｍＭ又は約１ｍＭ〜約２ｍＭである。一実施形態では、細胞保存培地又は細胞回復培地中のアスコルビン酸は、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ又は約１５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞保存培地又は細胞貯蔵培地中のアルブミンは、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬ又は３００μｇ／ｍＬ〜４００μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞保存培地又は細胞貯蔵培地中のインスリンは、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ又は４μｇ／ｍＬ〜６μｇ／ｍＬである。一実施形態では、培地は、細胞、例えば心筋細胞を含む。
【００１０】
さらに、細胞培養培地が提供され、斯かる細胞培養培地は、Ｍ１９９、ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン又はそのアナログ、グルコース又は他の糖に基づくエネルギー源、並びに、アスコルビン酸、アルブミン若しくはインスリンの１つ又は複数、を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、約２０％〜約３０％のＭ１９９を含む。一実施形態では、細胞培養培地は、約７０％〜約８０％のＬ−グルタミン含有ＤＭＥＭを含む。一実施形態では、グルコース又は他の糖は、約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ又は約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌである。一実施形態では、Ｌ−グルタミン又はアナログジペプチドの濃度は、約０．５ｍＭ〜約３又は４ｍＭ又は約１ｍＭ〜約２ｍＭである。一実施形態では、細胞培養培地中のアスコルビン酸は、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ又は約１５０〜約２００ｍＭである。一実施形態では、細胞培養培地中のアルブミンは、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬ又は約３００〜約４００ｍＭである。一実施形態では、細胞培養培地中のインスリンは、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ又は約４μｇ／ｍＬ〜約６μｇ／ｍＬである。一実施形態では、培地は、細胞、例えば、ｉＰＳｃ由来の心筋細胞を含む。
【００１１】
貯蔵及び出荷のために細胞を調製する方法が提供され、ここでは、細胞と細胞保存培地とが組み合わされる。出荷後に、細胞は細胞回復培地で洗浄され、細胞培養培地で培養される。
【００１２】
この概要は、本出願の教示のいくつかの概要であり、本主題の排他的又は網羅的な処理を意図するものではない。本主題に関するさらなる詳細は、詳細な説明及び添付の特許請求の範囲に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
以下の詳細な説明は、本主題が実施され得る態様及び実施形態を提供する。これら実施形態は、当業者が本主題を実施することができるように十分に詳細に記載されている。本開示における「１つの（an）」、「１つの（one）」、又は「様々な」実施形態への参照は必ずしも同じ実施形態に対するものではなく、そのような参照は複数の実施形態を企図する。以下の詳細な説明の実施形態は、例証であり、限定的な意味で解釈されるべきではない。
【００１４】
一実施形態では、細胞輸送のための保存（安定化）培地は、細胞の生存及び機能に有利な生化学的実体で補充された細胞冬眠培地（例えば、Hibernate（登録商標）E）を含む。例えば、心筋細胞保存培地は、心筋細胞の生存及び機能を向上させる試薬で補充された細胞冬眠培地（Hibernate（登録商標）E）を含み、斯かる試薬は、例えば、Ｌ−グルタミン又はそのアナログ、例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、アルブミン、例えば、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、及び／又はインスリン、例えば、ヒトインスリンである。続いて、細胞が輸送後に安定化から回復されることになる場合、細胞生存率に対する影響を最小限に抑えて休眠中の安定な状態から徐々に代謝的及び機能的活性化に移行することを支持する、培地調合物が使用される。
【００１５】
輸送のための細胞は、例えば、個別のバイアル又は他の容器又はマルチウェルプレート内にあってもよい。
【００１６】
一実施形態では、心筋細胞保存を達成するために、細胞は洗浄され、適切な容量の安定化（保存又は冬眠）培地中に入れられる。一実施形態では、安定化培地は、Hibernate（登録商標）E培地（Thermo Fisher Scientificカタログ番号Ａ１２４７６）、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭのＬ−グルタミン又はそのアナログ、例えばGlutaMax（Thermo Fisher Scientificカタログ番号３５０５０）、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬのアルブミン、例えば組み換えヒト血清アルブミン、及び／又は約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのインスリン、例えば組み換えヒトインスリン、及び任意により細胞、例えば心筋細胞、を含む。一実施形態では、安定化培地は、Hibernate（登録商標）E培地（Thermo Fisher Scientificカタログ番号Ａ１２４７６）、約０．５ｍＭ〜約３ｍＭ、例えば、０．７５ｍＭ〜約２．５ｍＭのＬ−グルタミン又はそのアナログ、例えばGlutaMax（Thermo Fisher Scientificカタログ番号３５０５０）、約１００μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬ、例えば約１２５μｇ／ｍＬ〜約２２５μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、約２００μｇ／ｍＬ〜約６００μｇ／ｍＬ、例えば、２５０μｇ／ｍＬ〜約４５０μｇ／ｍＬのアルブミン、例えば組み換えヒト血清アルブミン、及び／又は約１μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬ、例えば約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬのインスリン、例えば組み換えヒトインスリン、及び任意により細胞、例えば心筋細胞、を含む。一実施形態では、安定化培地は、Hibernate（登録商標）E培地（Thermo Fisher Scientificカタログ番号Ａ１２４７６）、約１．０ｍＭ〜約３ｍＭのＬ−グルタミン又はそのアナログ、例えばGlutaMax（Thermo Fisher Scientificカタログ番号３５０５０）、約２００μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、約４００μｇ／ｍＬ〜約６００μｇ／ｍＬのアルブミン、例えば組み換えヒト血清アルブミン、及び／又は約５μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬのインスリン、例えば組み換えヒトインスリン、及び任意により細胞、例えば心筋細胞、を含む。これらの条件下及び適切なガス交換の存在下で、心筋細胞は生存を維持することができ、かつそれらの機能性は少なくとも２日〜少なくとも５日間保持される。本主題の範囲から逸脱することなく他の時間も可能である。
【００１７】
保存後に、細胞は、約３０％〜約７０％の安定化培地、例えば上述のように約５０％の安定化培地、及び約７％〜約２０％のＭ１９９培地、例えば約１２．５％のＭ１９９培地、約２５％〜約５０％のＤＭＥＭ培地、例えば、Ｌ−グルタミン又はそのアナログを含有する約３７．５％のＤＭＥＭ培地、グルコース又は他のエネルギー源、アスコルビン酸、アルブミン及び／又はインスリン、を含有する回復溶液中で、一定期間、例えば約１〜約２４時間インキュベートされ得る。一実施形態では、回復溶液は、約４０％〜約６０％の安定化培地、例えば、上述のように約５０％の安定化培地、約７％〜約１５％のＭ１９９培地、例えば約１２．５％のＭ１９９培地、約３５％〜約４５％のＤＭＥＭ培地、例えば、Ｌ−グルタミン又はそのアナログを含有する約３７．５％のＤＭＥＭ培地、例えば約２ｍＭ〜約６ｍＭ又は約３ｍＭ〜約５ｍＭのＬ−グルタミン又はそのアナログ、例えば約４ｍＭのＬ−グルタミン又はそのアナログ、約１．０ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ又は約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌのグルコース、例えば約４．５ｇ／Ｌのグルコース、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭのＬ−グルタミン又はそのアナログ、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、例えば約１００μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬのアルブミン、例えば約２００〜約６００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのインスリン、例えば約１μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬのヒトインスリン、あるいはその任意の組み合わせ、及び任意により細胞、例えば心筋細胞、を含む。一実施形態では、回復溶液は、約３０％〜約７０％の安定化培地、例えば、上述のように５０％の安定化培地、及び約７％〜約２０％のＭ１９９培地、例えば約１２．５％のＭ１９９培地、約２５％〜約５０％のＤＭＥＭ培地、例えば、Ｌ−グルタミン又はそのアナログを含有する約３７．５％のＤＭＥＭ培地、グルコース又は他のエネルギー源、アスコルビン酸、アルブミン及び／又はインスリン、を含む。一実施形態では、回復溶液は、約４０％〜約６０％の安定化培地、例えば、上述のように約５０％の安定化培地、約７％〜約１５％のＭ１９９培地、例えば約１２．５％のＭ１９９培地、約３５％〜約４５％のＤＭＥＭ培地、例えば約３７．５％のＤＭＥＭ培地であって、Ｌ−グルタミン又はそのアナログ、例えば約２ｍＭ〜約６ｍＭ又は約３ｍＭ〜約５ｍＭのＬ−グルタミン又はそのアナログ、例えば約４ｍＭのＬ−グルタミン又はそのアナログを含有するＤＭＥＭ培地、約１．０ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ又は約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌのグルコース、例えば約４．５ｇ／Ｌのグルコース、約１００μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、約２００〜約６００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２μｇ／のインスリン、例えば約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬのヒトインスリン、あるいはその任意の組み合わせ、及び任意により細胞、例えば心筋細胞、を含む。細胞は、３７℃、５％ＣＯ2及び９８％湿度のインキュベーター内に入れられ、約１〜約４８時間、例えば約１８〜約２４時間回復され、その後、機能性を再獲得し得る。��筋細胞についての機能性は、自発的な拍動挙動によって検出可能であり得る。
【００１８】
回復後に、及び生理学的アッセイに向けた細胞の使用のための調製において、細胞は、約１０％〜約４０％のＭ１９９培地、例えば約２５％のＭ１９９培地、約６０％〜約９０％のＤＭＥＭ培地、例えば、Ｌ−グルタミン又はそのアナログを含有する約７５％のＤＭＥＭ培地、グルコース又は他のエネルギー源、アスコルビン酸、アルブミン及び／又はインスリン、を含有する培地内に入れられてもよい。一実施形態では、回復培地は、約２０％〜約３０％のＭ１９９培地、例えば約２５％のＭ１９９培地、約６５％〜約８５％のＤＭＥＭ培地、例えば、Ｌ−グルタミン又はそのアナログを含有する約７５％のＤＭＥＭ培地、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭ、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌのグルコース、例えば約４．５ｇ／Ｌのグルコース、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、例えば約１００μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬのアルブミン、例えば約２００μｇ／ｍＬ〜約６００μｇ／ｍＬのアルブミン、及び／又は約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのインスリン、例えば、約１μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬのヒトインスリン、及び任意により細胞、例えば心筋細胞を含む。一実施形態では、回復培地は、約２０％〜約３０％のＭ１９９培地、例えば約２５％のＭ１９９培地、約６５％〜約８５％のＤＭＥＭ培地、例えば、Ｌ−グルタミン又はそのアナログを含有する約７５％のＤＭＥＭ培地、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭ、約４．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌのグルコース、例えば約４．５ｇ／Ｌのグルコース、約２００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、例えば約２００μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬのアルブミン、例えば約４５０μｇ／ｍＬ〜約５５０μｇ／ｍＬのアルブミン、及び／又は約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのインスリン、例えば、約５μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬのヒトインスリン、及び任意により細胞、例えば心筋細胞を含む。細胞は３７℃、５％ＣＯ2及び９８％湿度のインキュベーター内でさらなる時間、例えば約２４〜約４８時間維持され、その後広範な細胞ベースのアッセイに使用することができる。
【００１９】
例えば、細胞保存培地は、細胞冬眠培地、例えばHibernate（登録商標）E、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭ又は約１ｍＭ〜約２ｍＭでのＬ−グルタミン又はそのアナログジペプチドの濃度、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ又は約１５０〜約２００ｍＭでのアスコルビン酸の濃度、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬ又は約３００〜約４００ｍＭでのアルブミンの濃度、及び約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ又は約４〜約６ｍＭでのインスリンの濃度を含み得る。細胞、例えば心筋細胞、例えばｉＰＳｃ由来の心筋細胞は、保存培地と組み合わされる。輸送後に、細胞は細胞回復培地と組み合わされる。例えば、細胞回復培地は、細胞保存培地、Ｍ１９９、ＤＭＥＭ、グルコース又は他の糖に基づくエネルギー源、グルタミン又はそのアナログ、並びに、アスコルビン酸、アルブミン、若しくはインスリンの１つ又は複数、を含み、ここで、細胞回復培地は約４５％〜約５５％の細胞保存培地を有し、細胞回復培地は約１０％〜約１５％のＭ１９９及び約３５％〜約４０％のＤＭＥＭを有する。細胞回復培地は、約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ又は約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌのグルコース又は他の糖のグルコースの濃度、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭ又は約１ｍＭ〜約２ｍＭのＬ−グルタミン又はアナログの濃度、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ又は約１５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸の濃度、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬ又は３００μｇ／ｍＬ〜４００μｇ／ｍＬのアルブミンの濃度、及び約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ又は４μｇ／ｍＬ〜６μｇ／ｍＬのインスリンの濃度を含み得る。その後、細胞は細胞培養培地で培養される。細胞培養培地は、Ｍ１９９、ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン又はそのアナログ、グルコース又は他の糖に基づくエネルギー源、並びに、アスコルビン酸、アルブミン若しくはインスリンの１つ又は複数、を含み、ここで斯かる培地は、約２０％〜約３０％のＭ１９９、約７０％〜約８０％のＤＭＥＭ、及び約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌのグルコース又は他の糖を含む。細胞培養培地中のグルコース又は他の糖の濃度は約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌであり、アスコルビン酸の濃度は約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬであり、アルブミンの濃度は約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬであり、インスリンの濃度は約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬであり、そしてＬ−グルタミン又はそのアナログの濃度は約０．５ｍＭ〜約４ｍＭである。
【００２０】
以下は組成及び方法の非限定的な例である。
【実施例】
【００２１】
実施例
ｉＰＳｃ由来の心筋細胞を３８４ウェルマイクロプレートに充填し、約２ｍＭのGlutamax、約２１５μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、約５００μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン、及び約１０μｇ／ｍＬのヒトインスリンを有する保存培地（冬眠培地）の培地中に入れた。プレートを酸素及び二酸化炭素両方のガス交換が可能な蓋で密閉した。次いで、プレートを保護発泡体で裏打ちされた輸送用封筒に包装し、続いてFedEx輸送用ボックスに包装した。次いで、プレート及び冬眠中の細胞を、カリフォルニア州サンディエゴからテキサス州ヒューストンに３日間のサービスを利用して輸送した。到着時に、輸送コンテナの損傷を検査し、すぐに翌日配送でサンディエゴに返送した。輸送試験の合計期間は４日間であった。到着時に、プレートを取り出し、蓋をはがし、そしてマイクロプレートウェル内の培地を標準増殖培地と交換した。心筋細胞は培地交換後１時間以内に拍動を開始し、これによりシステムを検証した。
【００２２】
例示的な実施形態
一実施形態では、細胞保存培地が提供され、以下：細胞冬眠培地及びＬ−グルタミン又はそのアナログ、並びに、アスコルビン酸、アルブミン、若しくはインスリンの１つ又は複数、を含む。一実施形態では、細胞保存培地は、Hibernate（登録商標）E（カルシウム、マグネシウム、リン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びピルビン酸ナトリウムを含むが、無血清、グルタミン酸フリー、グルタミンフリー、抗生物質フリー、かつＨＥＰＥＳフリーである）、を含む。一実施形態では、アナログはＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む。一実施形態では、Ｌ−グルタミン又はアナログジペプチドの濃度は、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭである。一実施形態では、アスコルビン酸は約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬである。一実施形態では、アルブミンは約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬである。一実施形態では、インスリンは約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞保存培地は、Hibernate（登録商標）E、２ｍＭのGlutamax、２１３μＭのアスコルビン酸、５００μＭの組み換えヒト血清アルブミン、及び１０μＭの組み換えヒトインスリンを含む。
【００２３】
また、細胞回復培地も提供され、斯かる細胞回復培地は、細胞貯蔵培地、及びＭ１９９（アール塩（Earle’s salts）を含む）、ＤＭＥＭ、グルコース又は他の糖に基づくエネルギー源、グルタミン又はそのアナログ、並びに、アスコルビン酸、アルブミン、及びインスリンの１つ又は複数を含む。一実施形態では、細胞貯蔵培地中のＬ−グルタミン又はアナログは、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭである。一実施形態では、細胞貯蔵培地中のアスコルビン酸は、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞貯蔵培地中のアルブミンは、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞貯蔵培地中のインスリンは約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞回復培地は、Hibernate（登録商標）E、２ｍＭのGlutamax、２１３μＭのアスコルビン酸、５００μＭの組み換えヒト血清アルブミン、及び１０μＭの組み換えヒトインスリンを有する５０％の細胞保存培地と、１２．５％のＭ１９９、３７．５％のＬ−グルタミン（４ｍＭ）含有ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌのグルコース、２１３μＭのアスコルビン酸、５００μＭの組み換えヒト血清アルブミン、及び１０μＭの組み換えヒトインスリンとを含む。
【００２４】
さらに、細胞培養培地が提供され、斯かる細胞培養培地は、以下：Ｍ１９９、ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン又はそのアナログ、グルコース又は他の糖に基づくエネルギー源、並びに、アスコルビン酸、アルブミン若しくはインスリンの１つ又は複数、を含む。一実施形態では、細胞貯蔵培地中のアスコルビン酸は、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞貯蔵培地中のアルブミンは、約２００μｇ／ｍＬ〜約７００μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞貯蔵培地中のインスリンは、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬである。一実施形態では、細胞貯蔵培地中のＬ−グルタミン又はアナログは、約０．５ｍＭ〜約４ｍＭである。一実施形態では、細胞培養培地は、２５％のＭ１９９、７５％のＬ−グルタミン（４ｍＭ）含有ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌのグルコース、２１３μＭのアスコルビン酸、５００μＭの組み換えヒト血清アルブミン、及び１０μＭの組み換えヒトインスリンを含む。
【００２５】
本明細書における主題は例により説明され、主題を実施する異なる方法が記載されている。しかしながら、本願によってカバーされている主題は、１つの特定の実施形態又は用途あるいはそれらの等価物に限定されない。その後の薬物投与により細胞マイクロアレイを作製するための方法の特定の実施形態が記載されているが、本発明及び添付の特許請求の範囲から逸脱することなく変更及び改変が成され得ることが、当業者により理解されるであろう。
【国際調査報告】
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