(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、とりわけ、ニワトリのとさかから得られた自家細胞でそのニワトリを免疫するための方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、ニワトリのとさかからの初代線維芽細胞の培養物を得ることと、外因性核酸をその細胞に導入して、ニワトリにとって外来性の抗原の提示または分泌をもたらすことと、その細胞でニワトリを免疫することと、を含み得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリのとさかに由来する初代線維芽細胞の培養物であって、前記培養物中の前記線維芽細胞が、前記ニワトリにとって外来性の抗原を提示または分泌する、培養物。
【請求項２】
前記抗原が、前記細胞から分泌される、請求項１に記載の培養物。
【請求項３】
前記抗原が、前記細胞の表面に提示される、請求項１に記載の培養物。
【請求項４】
前記抗原が、前記細胞の前記表面につながれている、請求項３に記載の培養物。
【請求項５】
前記抗原が、内在性膜タンパク質である、請求項３に記載の培養物。
【請求項６】
前記抗原が、細胞表面受容体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項７】
前記抗原が、Ｇタンパク質共役型受容体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項８】
前記抗原が、イオンチャネルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項９】
ニワトリを自家免疫するための方法であって、
ニワトリのとさかからの線維芽細胞を使用して、請求項１〜８のいずれか一項に記載の初代線維芽細胞の培養物を作製することと、
前記細胞で前記ニワトリを免疫することと、を含む、方法。
【請求項１０】
前記方法が、
（ａ）前記ニワトリのとさかからの初代線維芽細胞の培養物を得ることと、
（ｂ）外因性核酸を前記細胞に導入することであって、前記外因性核酸が、前記ニワトリにとって外来性の抗原の提示または分泌をもたらす、導入することと、
（ｃ）前記細胞で前記ニワトリを免疫することと、を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ニワトリが、孵化したばかりのニワトリである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫後に前記ニワトリからポリクローナル抗体を得ることをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
免疫後に前記ニワトリからＢ細胞を得ることをさらに含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法によって作製されたニワトリからの、単離されたＢ細胞またはそのハイブリドーマ。
【請求項１５】
前記ニワトリのとさかに由来する初代線維芽細胞の培養物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４０５，６２２号の優先権を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
立体配座エピトープを認識する抗体は、治療的、診断的および研究的用途においてしばしば求められる。しかしながら、いくつかのクラスの抗原、特にイオンチャネルおよびＧタンパク質共役受容体のような細胞膜タンパク質は、それらの生理学的立体配座を保持する形で抗原として調製するのが難しい。ある場合には、ウイルス様粒子およびリポソームなどの膜結合調製物を使用して、この問題を回避することができるが、この解決法は全ての細胞膜包埋タンパク質に利用可能ではなく、利用可能であっても時間がかかる。ＤＮＡ免疫化を使用することができるが、典型的には、免疫応答は遅くかつ弱い。細胞ベースの免疫化は、生理学的立体配座で抗原を提示し、ほとんどの抗原がインビトロで一般的に使用される細胞株において発現され得るので魅力的である。しかしながら、細胞ベースの免疫化は、２つの理由で複雑である。第一に、非自家細胞が生成する免疫応答は、特異的免疫応答の発生を妨げる、免疫化動物から細胞を迅速に排除する移植片対宿主反応を誘導する。移植片対宿主反応は、より長い半減期を有する自家細胞を使用して回避することができる。したがって、目的の抗原を発現するトランスフェクトした自家細胞は、長期間持続する免疫応答を誘発する。第二に、非自家細胞に応答して産生される抗体の大部分は、非自家細胞の表面に発現され、かつ宿主動物によって共有されない内因性抗原を認識する。例えば、目的の抗原を発現するＣＨＯ細胞でのニワトリの免疫化は、主にＣＨＯ細胞上の表面タンパク質を目標とする免疫応答を誘導する。ＣＨＯ細胞表面抗原に対する抗体の圧倒的な集団から目的の標的に対する希少な抗体を単離することは、このアプローチの有用性を大きく制限する。細胞表面上の標的外の抗原に対する抗体の産生は、同じ種に由来する細胞を使用することによって減少する。例えば、ニワトリのＳＣ株由来のＡＬＶ形質転換Ｂ細胞であるＤＴ４０細胞を使用して、同じ株由来のニワトリを免疫することができる。しかしながら、個々のニワトリ間の違いにより、多型タンパク質に対する多数の抗ハプロタイプ抗体が誘導される。目的の標的を発現する自家細胞が使用される場合、抗ハプロタイプ抗体が排除される。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書で提供されるのは、とりわけ、ニワトリのとさかに由来する自家細胞でそのニワトリを免疫するための方法である。いくつかの実施形態では、方法は、ニワトリのとさかからの初代線維芽細胞の培養物を得ることと、外因性核酸を細胞に導入して、ニワトリにとって外来性の抗原の提示または分泌をもたらすことと、その細胞でニワトリを免疫することと、を含み得る。
【０００４】
性的に成熟した鳥においてこの付属物への損傷を防ぐために、とさかの除去（家禽産業では「ダビング」と称される）が慣例的に行われる。とさかの除去は、鳥に対する任意の副次的な損傷または外傷なしに数秒で実行される。初代線維芽細胞を、細胞培養技術を使用して各とさかから調製して、数週間以内に自家線維芽細胞の大きな集団を生成することができる。次いで、線維芽細胞は、目的の遺伝子でトランスフェクトされてもよく、抗原を、細胞表面上にその天然の立体配座で、または可溶性タンパク質として発現させてもよい。トランスフェクトされた線維芽細胞の集団を、標的に対する特異的な抗原応答を誘導するために、とさかの起源である鳥に静脈内注射してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
本発明のいくつかの態様は、添付の図面と併せて読むと以下の詳細な説明から最もよく理解され得る。一般的な慣例に従って、図面の種々の特徴は縮尺通りではないことを強調する。実際は、種々の特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小される。図面には以下の図が含まれる。
【０００６】
【図１】左：孵化時にニワトリのとさかから分離した初代線維芽細胞の明視野像。右：ＧＦＰの発現を示す同じ画像。
【図２】抗ＦＬＡＧ抗体、続いてロバ抗マウスＡＰＣ二次抗体で標識した線維芽細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図３】免疫前の血漿は、ＧＦＰ陽性またはＧＦＰ陰性細胞のいずれにも結合せず、一方で免疫後の採血１または採血２からの血漿は、ＧＦＰ陰性細胞に結合しなかったが、ＧＦＰ陽性細胞の細胞表面に結合したことを示す。このデータは、ニワトリの血清中に、ＣＣＲ５に特異的な抗体が存在することを示している。
【０００７】
定義
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は当業者に十分に理解されており、抗原に特異的に結合する１つ以上のポリペプチドを含有するタンパク質を指す。抗体の一形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、各対が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する２対の同一の抗体鎖からなる。各対では、軽鎖および重鎖の可変領域は一緒に抗原への結合に関与し、定常領域は抗体のエフェクター機能に関与する。
【０００８】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片を含む、抗原に対する特異的結合性を保持する抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を産生する酵素、蛍光タンパク質等を用いて検出可能なように標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分とさらに複合体化することができる。抗体はまた、限定されないが、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含む固体支持体に結合させてもよい。また、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびまたは抗原に対する特異的結合を保持する他の抗体断片も、この用語に包含される。
【０００９】
抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、ならびに二機能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を含む様々な他の形態で、また一本鎖（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）、これらは参照により本明細書に組み込まれる）として存在し得る。（一般的に、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８４）、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）を参照）。
【００１０】
本発明の方法によって設計および生成されたヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体機能に実質的に影響を及ぼさない可能性のある追加の保存的アミノ酸置換を有してもよいことを理解されたい。保存的置換は、ｇｌｙ，ａｌａ；ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ，ｇｌｕ；ａｓｎ，ｇｌｎ；ｓｅｒ，ｔｈｒ；ｌｙｓ，ａｒｇ；およびｐｈｅ，ｔｙｒなどの組み合わせを意図している。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化されてもよい。
【００１１】
「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、および「アッセイする」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書において互換的に使用され、ある要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的決定および／または定性的決定の両方を含む。評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）は、相対的または絶対的であり得る。「〜の存在を決定すること」は、存在する何かの量を決定すること、ならびにそれが存在するのかどうかを決定することを含む。
【００１２】
本明細書で互換的に使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸、すなわち２個を超えるアミノ酸、約５個を超えるアミノ酸、約１０個を超えるアミノ酸、約２０個を超えるアミノ酸、約５０個を超えるアミノ酸、約１００個を超えるアミノ酸、約２００個を超えるアミノ酸、約５００個を超えるアミノ酸、約１０００個を超えるアミノ酸、約２０００個を超えるアミノ酸、通常約１０，０００個以下のアミノ酸のポリマー形態を指し、コード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、限定されるものではないが、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基の有無にかかわらず、異種および同種のリーダー配列との融合タンパク質、免疫学的にタグ付けされたタンパク質、検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質、例えば、融合パートナーとして蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質などを含む融合タンパク質を含む。これらの用語には、細胞内で翻訳後に修飾（例えば、グリコシル化、切断、分泌、プレニル化、カルボキシル化、リン酸化など）されたポリペプチド、および二次または三次構造を有するポリペプチド、および他の部分、例えば他のポリペプチド、原子、補因子などに共有結合または非共有結合するポリペプチドもまた含まれる。
【００１３】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、例えば、インビボで、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれた場合に、（ＤＮＡの場合）転写される、（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳される核酸分子である。コード配列の境界は、典型的には、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、限定されないが、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は、コード配列の３’に位置し得る。他の「制御エレメント」もまた、コード配列と関連し得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドコード配列のＤＮＡコピーを表すために選択された細胞に好ましいコドンを使用することによって、選択された細胞における発現について最適化することができる。
【００１４】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらの通常の機能を果たすように構成されている要素の配置を指す。したがって、ポリペプチドに作動可能に連結された所与のシグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌を指示する。プロモーターの場合、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の発現を指示するであろう。プロモーターまたは他の制御エレメントは、それらがコード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列はなおコード配列に「作動可能に連結している」と見なされる得る。
【００１５】
「核酸構築物」とは、天然には一緒に見られない１つ以上の機能単位を含むように構築された核酸配列を意味する。例としては、環状、線状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージ由来のＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが含まれる。
【００１６】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することができ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味し、これはベクターの全部もしくは一部のゲノム組み込み、または染色体外エレメントとしてのベクターの一過性もしくは遺伝的維持によって達成することができる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを含む。
【００１７】
「発現カセット」は、発現カセットのプロモーターに作動可能に連結されている、目的の遺伝子／コード配列の発現を指示することができる任意の核酸構築物を含む。そのようなカセットは、発現カセットを標的細胞に導入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、または「遺伝子導入ベクター」に構築することができる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００１８】
第１のポリヌクレオチドは、それが第２のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、その相補体の領域と同じもしくは実質的に同じヌクレオチド配列を有する場合、またはそれが上記のような配列同一性を示す場合、第２のポリヌクレオチドに「由来する」。第１のポリヌクレオチドが、例えば第２のポリヌクレオチドの増幅のための鋳型として使用される場合、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに由来し得る。
【００１９】
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入する」という用語は、「トランスフェクション」および「形質転換」、ならびに細胞に核酸を導入する他の全ての方法を含み、核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ得るか、または自律レプリコンに変換されるか、または一過性に発現され得る。
【００２０】
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ得、自律レプリコンに変換される。
【００２１】
「複数」という用語は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、もしくは少なくとも５０，０００、またはそれ以上を指す。ある特定の場合において、複数は、少なくとも１０〜５０を含む。他の実施形態において、複数は、少なくとも５０〜１，０００であり得る。
【００２２】
用語「初代線維芽細胞」は、対象から直接培養される細胞を指す。そのような細胞は老化を経験し、一般にその生存能力を保持しながら、ある特定の数の集団倍加の後に分裂を停止する。
【００２３】
組織に由来する細胞に関する文脈において、用語「〜に由来する」は、細胞培養を介して組織中の元の細胞集団から派生した細胞を指す。
【００２４】
「とさか」という用語は、ニワトリの頭の頂部の肉質の成長またはクレストを指す。ニワトリのとさかは最も一般的には赤である（しかし、特定の品種では黒または濃い紫色であり得る）。
【００２５】
抗原の提示に関する文脈において、「提示する」という用語は、細胞の外表面上の抗原の位置を指す。いくつかの実施形態では、これは、抗原を細胞の表面につなぐ膜貫通領域に抗原を連結して、細胞の外側に抗原を「示す」ことによって行うことができる。他の場合では、抗原は膜貫通タンパク質（例えば、内在性膜タンパク質）であり得、それが細胞膜に埋め込まれ、抗原の一部（例えば、抗原の外部ループ）がさらされるので、細胞が抗原を提示し得る。
【００２６】
「ニワトリにとって外来性の」という用語は、ニワトリによって発現されていない抗原を指す。ニワトリにとって外来性の抗原は、別の種に由来し得る（例えば、ヒトまたはマウスなどの哺乳動物由来）。ニワトリにとって外来性の抗原は、ニワトリには存在しないエピトープを有する。
【００２７】
用語「細胞の表面につなぐ」は、抗原を細胞の表面に固定する膜貫通領域に抗原を連結することを指す。テザーを可溶性タンパク質のＮ末端またはＣ末端に配置して、それを細胞に固定することができる。
【００２８】
用語「細胞でニワトリを免疫する」は、ニワトリから免疫応答を開始させるために、細胞がニワトリに投与されるプロトコルを指す。ある場合には、免疫化は、複数回の投与（例えば、１回以上の「追加免疫」ショット）を必要とし得る。抗原でニワトリを免疫するためのプロトコルはよく知られている。
【００２９】
「外因性核酸」という用語は、組換え型である、すなわち天然ではない方法で一緒に連結され、細胞の外側から細胞内に導入される核酸要素を含有する核酸を指す。
【００３０】
タンパク質の提示または分泌をもたらす構築物に関する文脈において、「もたらす」という用語は、少なくともタンパク質をコードする配列を有し、場合によっては必要な調節エレメントの全て（例えば、プロモーター、ターミネーター、非翻訳領域など）ならびに細胞の表面へのまたは細胞の表面からのタンパク質の発現およびつなぎまたは分泌を容易にする任意の任意選択のコード配列（例えば、分泌シグナル、膜貫通テザーなど）を有する構築物を指す。
【００３１】
「自家」という用語は、同じ個体に由来することを意味する。
【００３２】
細胞が宿主から得られたものである場合、その細胞はその宿主に「由来する」。前駆細胞の子孫は、前駆細胞と同じ宿主に由来する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、細胞に関してであり、インビトロで培養される細胞を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「培養物」は、細胞の培養物に関してであり、ａ）合成増殖培地中でインビトロで増殖し、ｂ）培地中で限られた数の細胞分裂を経験することができるか、または経験した細胞の集団を指す。
【００３５】
「培地中」という表現は、培地上での増殖ならびに培地中での増殖を包含することを意図している。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「合成」増殖培地とは、生きている多細胞生物ではない人工培地を指す。用語「合成増殖培地」は、生きている動物を明確に除外する。
【００３７】
「膜貫通受容体」という用語は、その活性がリガンドの結合または立体構造変化によって調節され得る任意の内在性膜タンパク質を指す。Ｇタンパク質共役型、イオンチャネル結合、酵素結合、キャリア輸送タンパク質、ＰＡＱＲおよびシグマ受容体は、膜貫通受容体の種類である。Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、本明細書により詳細に記載される通り、７つの膜貫通型アルファヘリックスを有する。ＧＰＣＲが活性化されると、ＧＰＣＲは関連のＧタンパク質を活性化し、次にＧタンパク質が細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する。イオンチャネル結合受容体（すなわち、リガンド依存性イオンチャネル）は、イオンチャネル型受容体としても知られている。そのようなイオンチャネルへのリガンドの結合は、チャネルを通るイオン流を増加させるためのチャネルの開放、またはイオン流を減少させるための閉鎖をもたらす。酵素結合受容体（触媒受容体としても知られる）は、細胞外リガンドの結合による活性化が、タンパク質の細胞内側での酵素活性を誘発する受容体である。キャリアタンパク質は、受動的な「促進拡散」または電気化学的勾配またはアデノシン三リン酸依存性プロセスを必要とする能動輸送機構を介して、細胞膜を横切るイオン、小分子、および高分子の輸送を受容体の立体配座変化に結び付ける。
【００３８】
「Ｇタンパク質共役型受容体」または「ＧＰＣＲ」は、７つのアルファヘリックスを形成する２２〜２４の疎水性アミノ酸の７つの領域を有し、そのそれぞれが膜にまたがる、共通の構造モチーフを共有するポリペプチドである。各スパンは、番号、すなわち、膜貫通−１（ＴＭ１）、膜貫通−２（ＴＭ２）などによって識別される。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外側、または「細胞外」側の、膜貫通−２と膜貫通−３、膜貫通−４と膜貫通−５、および膜貫通−６と膜貫通−７の間のアミノ酸の領域（それぞれ「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３）と称される）によって結合されている。膜貫通ヘリックスはまた、細胞膜の内側、または「細胞内」側の、膜貫通−１と膜貫通−２、膜貫通−３と膜貫通−４、および膜貫通−５と膜貫通−６の間のアミノ酸の領域（それぞれ「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ１、ＩＣ２およびＩＣ３）と称される）によっても結合されている。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空間に存在し、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞外の細胞外空間に存在する。ＧＰＣＲの構造および分類は、一般に当技術分野において周知であり、ＧＰＣＲのさらなる考察は、Ｐｒｏｂｓｔ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  １１：１−２０；Ｍａｒｃｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２３：６０９−６１８，１９９４、ならびに以下の書籍：Ｊｕｒｇｅｎ  Ｗｅｓｓ（Ｅｄ）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５，１９９９）、Ｋｅｖｉｎ  Ｒ．Ｌｙｎｃｈ（Ｅｄ）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｍａｒｃｈ  １９９８）ａｎｄ  Ｔａｔｓｕｙａ  Ｈａｇａ（Ｅｄ），Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２４，１９９９）、およびＳｔｅｖｅ  Ｗａｔｓｏｎ（Ｅｄ）Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ；  １９９４）に見出すことができる。
【００３９】
さらなる定義は、本開示の他の場所にあり得る。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本主題発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら、それ自体変化し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
【００４１】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明に包含されることを理解されたい。
【００４２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての公開物は、公開物が引用されるものとの関連で方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞を含み、「１つの候補薬剤（ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上の候補薬剤および当業者に既知のその等価物などへの言及を含む。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して、「唯一」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行詞として役割を果たすことを意図している。
【００４４】
本明細書に論じられる公開物は専ら、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書内のいずれのものも、先行の発明という理由によりそのような公開物に先立する権利がないという了解として解釈されるべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
【００４５】
本明細書に引用される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明によりその刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
【００４６】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、引用された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
【００４７】
上記の通り、ニワトリのとさかに由来する初代線維芽細胞の培養物が提供される。いくつかの実施形態において、培養物中の線維芽細胞は、ニワトリにとって外来性の抗原を提示または分泌し、これは、細胞が、ニワトリにとって外来性のタンパク質（例えば、非ニワトリタンパク質、例えば、別の種、例えば哺乳動物由来のタンパク質、または合成配列等）をコードする構築物を含有することを意味し、外来性のタンパク質は細胞表面から分泌されるか、細胞表面につながれるか、または細胞表面と一体化している。これらの実施形態では、タンパク質に分泌シグナルを加えることによって、抗原を細胞から分泌させることができる。あるいは、構築物は、細胞表面標的化ポリペプチドに結合している抗原を産生することによって、宿主細胞の表面への抗原の標的化を提供し得る。そのような実施形態では、抗原のコード配列は、構築物中のターゲティングポリペプチドをコードする核酸のコード配列に作動可能に連結され得、コード配列の転写およびその後の翻訳は、抗原および細胞表面ターゲティングポリペプチドを含有する融合タンパク質の産生をもたらす。このように、発現カセットは、宿主細胞の表面への抗原の標的化を提供することができ、その抗原は通常は宿主細胞の表面に提示されない。適切な細胞表面標的化ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸配列は、例えば、膜貫通セリンスレオニンまたはチロシンキナーゼ受容体のものであってもよい。適切な細胞表面標的化シグナルおよびそれらをコードする核酸配列は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）膜貫通ドメインなどの受容体膜貫通ドメインを含む（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：４１８−４２５（１９８４））。いくつかの実施形態では、細胞表面標的化配列はニワトリ由来であってもよい。細胞内のポリペプチドまたはタンパク質分泌を標的とするための戦略の例は、米国特許第６，４５５，２４７号に見出すことができる。特定の実施形態において、構築物は、発現カセット、すなわちプロモーター、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および転写ターミネーターを含有する組換えポリヌクレオチドを含有し得、この発現カセットはニワトリによるタンパク質の産生に十分である。組換え核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、またはゲノムから自律的に複製するベクター中に存在してもよい。特定の実施形態において、抗原をコードするポリヌクレオチドは、ニワトリ細胞におけるタンパク質の発現のためにコドンが最適化されていてもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、抗原は内在性膜タンパク質であり得、それ自体１つ以上の膜貫通領域を有し得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、例えば、ＧＰＣＲ、トランスポーター、またはイオンチャネルなどの任意の種類の膜貫通受容体であり得る。特定の実施形態において、膜貫通受容体はＧＰＣＲである。この方法には任意の既知のＧＰＣＲを使用することができる。２７７のＧＰＣＲ間の配列および系統学的関係の開示は、Ｊｏｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００２  ３：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００６３、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に提供され、３６７のヒトＧＰＣＲと３９２のマウスＧＰＣＲ間の系統学的関係は、Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００３  １００：４９０３−８  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｌｉｎｃ  ｗｅｂｓｉｔｅ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供される。ＧＰＣＲファミリーはまた、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３  ６３，１２５６−７２）に記載されている。ＧＰＣＲには、プリン作動性受容体、ビタミン受容体、脂質受容体、ペプチドホルモン受容体、タンパク質受容体、非ホルモンペプチド受容体、非ペプチドホルモン受容体、ポリペプチド受容体、プロテアーゼ受容体、感覚シグナル伝達物質受容体、および生体アミン受容体が含まれる。
【００４９】
天然（天然に存在する）タンパク質と改変天然（天然に存在しない）タンパク質の両方を、本明細書の抗原として使用できることが認識される。したがって、特定の実施形態では、改変天然ＧＰＣＲ（例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって改変される天然ＧＰＣＲ）が、対応する天然型ＧＰＣＲと同じリガンドに結合し、かつ／またはその結合の結果としてＧタンパク質と共役する。特定の場合において、本明細書で使用されるＧＰＣＲは、天然に存在するＧＰＣＲの少なくとも七ヘリックスドメインと、少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも９０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有し得る。本明細書で使用されるＧＰＣＲは、ＧＰＣＲのＣ末端ドメインを任意選択で含有してもよい。特定の実施形態において、天然ＧＰＣＲは、その七ヘリックスドメインを残すために、そのＮ末端および／またはそのＣ末端から「トリムバック」されてもよい。
【００５０】
対象において使用することができる例示的なＧＰＣＲとしては、限定されないが、５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ｈｔ１ｅ、５−ＨＴ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ４、５−ｈｔ５ａ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３、アルファ１Ａ−アドレナリン受容体、アルファ１Ｂ−アドレナリン受容体、アルファ１Ｄ−アドレナリン受容体、アルファ２Ａ−アドレナリン受容体、アルファ２Ｂ−アドレナリン受容体、アルファ２Ｃ−アドレナリン受容体、ベータ１−アドレナリン受容体、ベータ２−アドレナリン受容体、ベータ３−アドレナリン受容体、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５Ｌ２、ＡＴ１、ＡＴ２、ＡＰＪ、ＧＰＢＡ、ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ３、Ｂ１、Ｂ２、ＣＢ１、ＣＢ、Ｂ２  ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５Ｓ、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１、ＸＣＲ１、ＣＣＫ１、ＣＣＫ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ．ｓｕｂ．４、Ｄ５、ＥＴＡ、ＥＴＢ、ＧＰＥＲ、ＦＰＲ１、ＦＰＲ２／ＡＬＸ、ＦＰＲ３、ＦＦＡ１、ＦＦＡ２、ＦＦＡ３、ＧＰＲ４２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ｇｈｒｅｌｉｎ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、ＧｎＲＨ、ＣＧｎＲＨ２、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、ＨＣＡ１、ＨＣＡ２、ＨＣＡ３、ｋｉｓｓｐｅｐｔｉｎ、ＢＬＴ１、ＢＬＴ２、ＣｙｓＬＴ１、ＣｙｓＬＴ２、ＯＸＥ、ＦＰＲ２／ＡＬＸ、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、ＬＰＡ４、ＬＰＡ５、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、ＭＣＨ１、ＭＣＨ２、ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、ＭＣ５、ＭＴ１、ＭＴ２、ｍｏｔｉｌｉｎ、ＮＭＵ１、ＮＭＵ２、ＮＰＦＦ１、ＮＰＦＦ２、ＮＰＳ、ＮＰＢＷ１、ＮＰＢＷ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、ＮＴＳ１、ＮＴＳ２、ｄｅｌｔａ、ｋａｐｐａ、ｍｕ、ＮＯＰ、ＯＸ１、ＯＸ２、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙ１３、Ｐ２Ｙ１４、ＱＲＦＰ、ＰＡＦ、ＰＫＲ１、ＰＫＲ２、ＰＲＲＰ、ＤＰ１、ＤＰ２、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、ＦＰ、ＩＰ１、ＴＰ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ＲＸＦＰ１、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３、ＲＸＦＰ４、ｓｓｔ１、ｓｓｔ２、ｓｓｔ３、ｓｓｔ４、ｓｓｔ５、ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＴＲＨ１、ＴＡ１、ＵＴ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｂ、Ｖ２、ＯＴ、ＣＣＲＬ２、ＣＭＫＬＲ１、ＧＰＲ１、ＧＰＲ３、ＧＰＲ４、ＧＰＲ６、ＧＰＲ１２、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ２２、ＧＰＲ２５、ＧＰＲ２６、ＧＰＲ２７、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ３３、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ３７、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ４２、ＧＰＲ４５、ＧＰＲ５０、ＧＰＲ５２、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ６１、ＧＰＲ６２、ＧＰＲ６３、ＧＰＲ６５、ＧＰＲ６８、ＧＰＲ７５、ＧＰＲ７８、ＧＰＲ７９、ＧＰＲ８２、ＧＰＲ８３、ＧＰＲ８４、ＧＰＲ８５、ＧＰＲ８７、ＧＰＲ８８、ＧＰＲ１０１、ＧＰＲ１１９、ＧＰＲ１２０、ＧＰＲ１３２、ＧＰＲ１３５、ＧＰＲ１３９、ＧＰＲ１４１���ＧＰＲ１４２、ＧＰＲ１４６、ＧＰＲ１４８、ＧＰＲ１４９、ＧＰＲ１５００、ＧＰＲ１１、ＧＰＲ５１、ＧＰＲ１５２、ＧＰＲ１５３、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ１６１、ＧＰＲ１６２、ＧＰＲ１７１、ＧＰＲ１７３、ＧＰＲ１７４、ＧＰＲ１７６、ＧＰＲ１８２、ＧＰＲ１８３、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＰＡＲ６、ＭＡＳ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧＰＲＤ、ＭＲＧＰＲＥ、ＭＲＧＰＲＦ、ＭＲＧＰＲＧ、ＭＲＧＰＲＸ１、ＭＲＧＰＲＸ２、ＭＲＧＰＲＸ３、ＭＲＧＰＲＸ４、ＯＰＮ３、ＯＰＮ５、ＯＸＧＲ１、Ｐ２ＲＹ８、Ｐ２ＲＹ１０、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＡＲ２、ＴＡＡＲ３、ＴＡＡＲ４、ＴＡＡＲ５、ＴＡＡＲ６、ＴＡＡＲ８、ＴＡＡＲ９、ＣＣＰＢ２、ＣＣＲＬ１、ＦＹ、ＣＴ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ、ＣＲＦ１、ＣＲＦ２、ＧＨＲＨ、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ｇｌｕｃａｇｏｎ、ｓｅｃｒｅｔｉｎ、ＰＴＨ１、ＰＴＨ２、ＰＡＣ１、ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、ＢＡＩ１、ＢＡＩ２、ＢＡＩ３、ＣＤ９７、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＬＳＲ３、ＥＬＴＤ１、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４Ｐ、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ６４、ＧＰＲ９７、ＧＰＲ９８、ＧＰＲ１１０、ＧＰＲ１１１、ＧＰＲ１１２、ＧＰＲ１１３、ＧＰＲ１１４、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１１６、ＧＰＲ１２３、ＧＰＲ１２４、ＧＰＲ１２５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１３３、ＧＰＲ１４３、ＧＰＲ１４４、ＧＰＲ１５７、ＬＰＨＮ１、ＬＰＨＮ２、ＬＰＨＮ３、ＣａＳ、ＧＰＲＣ６、ＧＡＢＡＢ１、ＧＡＢＡＢ２、ｍＧｌｕ１、ｍＧｌｕ２、ｍＧｌｕ３、ｍＧｌｕ４、ｍＧｌｕ５、ｍＧｌｕ６、ｍＧｌｕ７、ｍＧｌｕ８、ＧＰＲ１５６、ＧＰＲ１５８、ＧＰＲ１７９、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＳＭＯが含まれる。特定の実施形態において、この方法は、β２−アドレナリン受容体（β２ＡＲ）、Ａ２Ａ−アデノシン受容体（Ａ２Ａ）、Ｓ１Ｐ１、オピオイド受容体（ＯＬＲ）、例えば、ＮＯＰ１、ケモカイン受容体、例えば、ＣＸＣＲ３またはＣＣＲ５（ＣＣＲ５）、ＧＬＰ１Ｒ、ＰＴＨＲ１、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、またはＳ１Ｐ５を使用し得る。使用されるＧＰＣＲは、任意のクラス、例えば、クラスＡ（ロドプシン様）、クラスＢ（セクレチン様）、クラスＣ（代謝型グルタミン酸／フェロモン）、ｃＡＭＰ受容体鋤鼻受容体（Ｖ１ＲおよびＶ３Ｒ）、および味覚受容体Ｔ２Ｒであってもよい。評価されるＧＰＣＲとしては、限定されないが、例えば、ヒトまたはマウスなどの任意の哺乳動物種由来のオーソログを含む、クラスＡ  ＧＰＣＲ、クラスＢ  ＧＰＣＲ、クラスＣ  ＧＰＣＲ、クラスＤ  ＧＰＣＲ、クラスＥ  ＧＰＣＲ、およびクラスＦ  ＧＰＣＲが含まれる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、抗原は特定の特性を有し得、例えば、それは疾患または状態において差次的に発現し得るか、または特定の組織において発現し得、正常または異常な発生の間の特定の時間に発現されるか、または特定の活性、例えば疾患または状態に関連する活性を有するポリペプチドをコードする。
【００５２】
上記培養は、例えば、下記の方法を使用してニワトリ（典型的には孵化したばかりのニワトリ）のとさかから初代線維芽細胞の培養物を得ることと、細胞に外因性核酸を導入することと、によって行ってもよく、その外因性核酸は、ニワトリにとって外来性の抗原の提示または分泌をもたらす。線維芽細胞は、組織を小片に切断し（例えば、Ｇａｎｄｒｉｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８７  ４９：６８７−６９７を参照）、それらを培養中に置くことによって、様々な組織から得ることができる。このプロセスはまた、細胞を一緒に保持する結合組織を消化することによって回収を改善するために、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼなどの酵素解離剤を添加することを含み得る（例えば、Ｔｕａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７３：１３１１−１３２５；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，２０１０  Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：Ａ．４Ｉ．１−Ａ．４Ｉ．８）。組織解離に関する一般的な議論は、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ−Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｗｅｂｓｉｔｅに掲載されているＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅに見出すことができる。一例としては、とさかから線維芽細胞を回収するのを助けるためにトリプシンを使用することができる。他の解離剤を代わりに使用してもよい。線維芽細胞を培養するために使用することができる多数の培地配合物があり、例えば、培地１９９（Ｇａｎｄｒｉｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ｓｕｐｒａを参照）、ＤＭＥＭ（Ｆｒｏｂｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９７９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：３５−４５）、ＥＭＥＭ（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，２０１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｅｌｕａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．４４：２０３３）、およびそれ以外のものがあり、ウシ胎児血清、トリプトン、および／またはニワトリ血清などの様々な補助物質を含む（Ｇａｎｄｒｉｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ，ｓｕｐｒａ，Ｆｒｏｂｌｅ，ｅｔ  ａｌ，１９７９，ｓｕｐｒａ）。一例としては、ウシ胎児血清およびニワトリ血清を補給したＤＭＥＭを使用することができる。
【００５３】
ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ウイルスベクター送達などを含む様々な方法を使用して、細胞に核酸を導入してもよい。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）、Ｖｉｒｏｍｅｒ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、ポリエチレンイミン系試薬（例えば、ＰｏｌｙｐｌｕｓによるＰＥＩｐｒｏ）などの、細胞をトランスフェクトするための多数の試薬がある。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類および形質転換が行われる状況（すなわち、インビトロ）に依存する。これらの方法の一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５に見出すことができる。いくつかの実施形態では、外因性核酸を含有する細胞は、例えば、ＦＡＣＳによってまたは選択マーカーを使用することによって選択されてもよく、それによって少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％または少なくとも８０％の細胞が、外因性核酸を含有する培養物を生成する。いくつかの実施形態では、培養物が、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５または少なくとも１０６の細胞を含有するように、外因性物質を導入した後に、細胞を培養してもよい。
【００５４】
特定の実施形態において、培養は、極低温冷凍であってもよく、したがって、約−８０℃以下の凍結状態（例えば、液体窒素中）であってもよい。これらの実施形態では、培養物は、例えば、凍結防止剤、例えば、グリセロール、メタノールまたはＤＭＳＯ（例えば、５％〜１５％のＤＭＳＯ）を含有する液体中に懸濁された細胞を含有してもよい。凍結保護剤中の培養物を室温で含有するクライオバイアルを、特別な凍結容器、例えば、冷蔵庫温度に予備冷却したＮａｌｇｅｎｅ“Ｍｒ  Ｆｒｏｓｔｙ”容器に挿入してもよい。次いで、凍結容器は、しばらくの間−７０℃の冷凍庫内に配置させてもよい。次いで、クライオバイアルを、凍結容器から素早く取り出し、貯蔵容器に入れ、無期限の貯蔵のために液体窒素に浸してもよい。しばらくして、細胞を解凍して使用することができる。
【００５５】
細胞の培養物はニワトリを犠牲にすることなくニワトリのとさかから容易に作製することができるので、その細胞の培養物を、その由来であるニワトリ（すなわち、同じ個体のニワトリ）を免疫するために使用することができる。これらの方法では、細胞培養物の宿主細胞は、ニワトリにとって「自家のもの」であり、これは、それらが同じ個体に由来するということを意味する。いくつかの実施形態では、この方法は、ニワトリのとさかからの線維芽細胞を使用して、上記の初代線維芽細胞の培養物を作製することと、その細胞、例えば生細胞でニワトリを免疫することと、を含んでもよい。細胞は、任意の便利な方法を使用して、例えば、翼静脈への静脈内注射、胸筋注射、または皮下注射によって投与されてもよい。細胞は、ある期間（例えば、数時間、数日または数週間）血流中に存在してもよく、したがって、宿主のチェックにより、ニワトリにとって外来性であると思われるエピトープに対する免疫応答が開始されるはずであり、それによって外来性の抗原に対する抗体が産生される。いくつかの実施形態では、細胞は、外来性の抗原の高親和性アゴニストまたはアンタゴニストと組み合わされてもよく、それによって免疫前に抗原を活性状態または不活性状態に固定してもよい。
【００５６】
使用されるアジュバント、追加免疫スケジュール、注射部位などを含む、動物を免疫する方法は、当技術分野において十分に理解されており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８８）Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ，ｓｕｐｒａ）、また動物への生細胞の投与は、いくつかの哺乳動物および鳥について記載されており、例えば、ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３−８，１９８９）、Ｓｃｕｄｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ（“Ｍｅｄ．  “Ｏｎｃｏｌ．Ｔｕｍｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ２：２３３−４２，１９８５）、Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９６：２６４−７２，１９８４）、およびＤｒｅｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５４５−８，１９８４）。いくつかの実施形態において、ニワトリは、少なくとも１０４、少なくとも１０５、または少なくとも１０６の細胞で免疫されてもよい。
【００５７】
ニワトリが免疫された後、ニワトリは外来性の抗原に対する免疫応答を開始し、免疫された動物の血液は、通常、抗原に結合するポリクローナル抗血清を含有することになる（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによる）。抗原に対するポリクローナル抗血清の結合親和性は、抗原間で異なり得るが、一般に、細胞について、少なくとも約１０６Ｍ−１、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも約１０８Ｍ−１、または少なくとも約１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１の範囲であろう。ポリクローナル抗血清は、当技術分野において周知の方法を使用して、免疫されたニワトリから採取することができ、本方法において使用することができる。
【００５８】
特定の実施形態において、外来性の抗原に対するモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を、ニワトリから単離することができる。これらの細胞は、例えば、血液、脾臓または滑液由来であり得る。特定の実施形態において、細胞を任意の都合のよい融合パートナーと融合させ、従来の方法を使用してスクリーニングしてもよい。
【００５９】
本明細書に記載の方法および構成は、他の発現系では発現が困難であり、かつ／または不溶性であるタンパク質（例えば、ＧＰＣＲ、イオンチャネルなど）における立体配座エピトープを認識する抗体を産生するのに特に有用であることが分かる。外来性のタンパク質がニワトリ細胞において発現される場合、タンパク質はその天然の立体配座に折り畳まれるはずであり、免疫後、任意の立体配座エピトープがニワトリの免疫系に提示されるはずであり、結果として立体配座エピトープを認識する抗体が生じる。
【００６０】
実施形態
１．ニワトリのとさかに由来する初代線維芽細胞の培養物が提供される。いくつかの実施形態では、培養物中の線維芽細胞は、ニワトリにとって外来性の抗原を提示または分泌し得る。
２．抗原が、細胞から分泌される、実施形態１に記載の培養物。
３．抗原が、細胞の表面に提示される、実施形態１に記載の培養物。
４．抗原が、細胞の表面につながれている、実施形態３に記載の培養物。
５．抗原が、内在性膜タンパク質である、実施形態３に記載の培養物。
６．抗原が、細胞表面受容体である、実施形態４に記載の培養物。
７．抗原が、Ｇタンパク質共役型受容体である、実施形態５に記載の培養物。
８．抗原が、イオンチャネルである、実施形態６に記載の培養物。
９．ニワトリを自家免疫するための方法であって、ニワトリのとさかからの線維芽細胞を使用して実施形態１〜８のいずれかに記載の初代線維芽細胞の培養物を作製することと、その細胞でニワトリを免疫することと、を含む、方法。
１０．方法が、（ａ）ニワトリのとさかからの初代線維芽細胞の培養物を得ることと、（ｂ）外因性核酸を細胞に導入することであって、その外因性核酸が、ニワトリにとって外来性の抗原の提示または分泌をもたらす、導入することと、（ｃ）その細胞でニワトリを免疫することと、を含む、実施形態９に記載の方法。
１１．ニワトリが、孵化したばかりのニワトリである、実施形態９または１０に記載の方法。
１２．免疫後にニワトリからポリクローナル抗体を得ることをさらに含む、実施形態９〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．免疫後にニワトリからＢ細胞を得ることをさらに含む、実施形態９〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．実施形態９〜１３のいずれかに記載の方法によって作製されたニワトリからの、単離されたＢ細胞またはそのハイブリドーマ。
１５．ニワトリのとさかに由来する初代線維芽細胞の培養物。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を実証し、さらに例示するために提供されたものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６２】
実施例１
孵化したばかりのヒヨコからとさかを採取する
孵化時にヒヨコを個別にタグ付けし、少量の血液サンプルを採取して個体の遺伝子型を確立した。孵化後数日以内に、所望の遺伝子型を有するヒヨコのとさかをアルコール含有ワイプで拭き、ハサミで切断することにより除去し、ＰＢＳを含有するエッペンドルフチューブに入れた。
【００６３】
実施例２
自家初代線維芽細胞の培養物の確立
カミソリの刃を使用して、とさか組織を小片に切断した。断片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用してチューブに移し、ペレット化した。組織を、３００μｌの０．２５％トリプシン／０．１％ＥＤＴＡに２０分間再懸濁させた。組織を粉砕し、Ｇｌｕｔａｍａｘ、７．５％ウシ胎児血清、２．５％照射ニワトリ血清、および１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充した１ｍｌのＤＭＥＭを添加した。組織を遠心分離し、１ｍｌの同じ培地に再懸濁させ、１２ウェル皿の単一ウェルに入れた。ウェルが細胞でほぼコンフルエントになるまで培養物をインキュベートした。細胞をトリプシン処理し、６ウェル皿に再播種した。６ウェルがコンフルエントになった場合、細胞をトリプシン処理し、アリコートを培地＋１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存した。必要である場合は、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含まない同じ培地で細胞を解凍し、必要に応じて増殖させ、凍結保存した。解凍すると、細胞集団は、１２日以内に少なくとも３×１０８まで増殖した。
【００６４】
実施例３
自家初代線維芽細胞の一過性トランスフェクション
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）、Ｖｉｒｏｍｅｒ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、ポリエチレンイミン系試薬（例えば、ＰｏｌｙｐｌｕｓによるＰＥＩｐｒｏ）などの、細胞をトランスフェクトするための多数の試薬がある。この例では、Ｏｐｔｉｆｅｃｔを使用した。細胞をトリプシン処理し、計数し、１ｅ４／ｃｍ２の密度で平板培養した。翌日、ＧＦＰをコードするＤＮＡを、Ｏｐｔｉｆｅｃｔに１ｕｇ／２ｕｌの比率で添加した。混合物を２０分間インキュベートし、次いで細胞に添加した。細胞を２〜３日間インキュベートして、外因性タンパク質の最大発現を可能にした。ＧＦＰを発現する細胞の割合を、フローサイトメトリーにより定量し、約４０％の細胞が、この構築物を発現した（表１および図１を参照）。
【表１】
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【００６５】
実施例４
膜タンパク質をコードするＤＮＡによる自家初代線維芽細胞の一過性トランスフェクション
この実施例では、７．３ｅ５のニワトリの線維芽細胞を、Ｔ２５フラスコに播種した。翌日、培地を交換し、２〜４時間後に、ＧＦＰ融合タンパク質としてのＧタンパク質共役型受容体ＣＣＲ５をコードする構築物および細胞外ＦＬＡＧタグで細胞をトランスフェクトした。この実施例では、１１９μｌのＶｉｒｏｍｅｒトランスフェクション緩衝液を６．７μｌのＶｉｒｏｍｅｒトランスフェクション試薬に添加し、次いで１．１３ｍｌのＶｉｒｏｍｅｒトランスフェクション緩衝液に希釈した１２．５μｇのＤＮＡを添加した。混合物を１５分間インキュベートし、次いで細胞に添加した。翌日、細胞を、穏やかな酵素溶液（例えば、希釈Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してフラスコから持ち上げ、抗ＦＬＡＧ抗体、続いてロバ抗マウスＡＰＣ二次抗体で標識し、フローサイトメトリーで分析した（図２参照）。左側のグラフは、４４．２％の細胞がＧＦＰを発現し、細胞表面上でＦＬＡＧについて陽性であったことを示し（右上象限）、一方でまたＧＦＰ陰性細胞はＦＬＡＧについて陰性であった（左下象限）。これは、４４．２％の細胞が首尾よくトランスフェクトされたこと、およびトランスフェクトされた細胞の細胞表面でＣＣＲ５−ＦＬＡＧが発現されることを示している。左側のグラフは、対照として二次抗体のみで標識した細胞を示す。
【００６６】
実施例５
ニワトリへの自家初代線維芽細胞の注射
この実施例では、自家細胞を、２つのＴ７５フラスコのそれぞれに約２ｅ６の細胞で播種し、実施例４と同様に、ＣＣＲ５構築物でトランスフェクトし、フラスコのサイズが大きいので容量を３倍に拡大した。翌日、トランスフェクションの効率を、顕微鏡でＧＦＰの発現を観察することによって決定した（約４０％の細胞が、ＧＦＰ陽性であった）。穏やかな酵素溶液を使用して、細胞を培養容器から持ち上げ、ＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液を、とさか細胞の由来であるニワトリが６〜８週齢に達したときに、静脈内注射した。トランスフェクションおよび注射を、２週間ごとに４回、所望の免疫応答が得られるまで繰り返した。
【００６７】
実施例６
標的に対するインビボ免疫応答の発達
２回目の注射の１週間後に開始して、血清力価を評価するために、２３ゲージの針を使用して免疫された動物の翼静脈から０．５ｍｌの血液を採取した。続く各免疫化の１週間後に、別の血液試料を採取した。各採血について、血液を遠心分離し、血漿を回収し、アリコートで凍結した。免疫する前（免疫前）、自家トランスフェクト細胞の２回目の注射後（採血１）、および３回目の注射後（採血２）に採取したニワトリからの血漿を、ＣＣＲ５−ＧＦＰ  ＤＮＡ構築物でトランスフェクトしたＥＸＰＩ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にインキュベートし、続いてヤギ抗ニワトリＩｇＹ−Ａｌｅｘａ６４７二次抗体と共にインキュベートした。図３は、免疫前の血漿（赤色集団）が、ＧＦＰ陽性細胞またはＧＦＰ陰性細胞のいずれとも結合しなかったことを示す。免疫後の採血１（青色集団）または採血２（緑色集団）からの血漿は、ＧＦＰ陰性細胞に結合しなかったが、ＧＦＰ陽性細胞の細胞表面に結合し、これは、ニワトリ血清中にＣＣＲ５に特異的な抗体が存在することを示している。シグナル強度は、採血１から採血２へと増加しており、これは、継続的な免疫化がより強い応答をもたらすことを示している。
【００６８】
実施例７
標的を認識するモノクローナル抗体の単離
数回の免疫化の後、動物が良好な免疫応答を示したとき、鳥は承認された手順に従って安楽死させた。Ｃｒｙｓｔａｌの独自のＧＥＭアッセイを使用して、脾臓を摘出して処理し、目的のタンパク質に対する特異的抗体を発現するリンパ球を回収した。抗体遺伝子を選択されたリンパ球から回収し、組換え抗体として再構成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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