(57)【要約】本発明は、認知性または神経変性疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の式2019530647.tif 000060の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
2019530647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病を治療する方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の式
【化１】
2019530647.tif 000058
の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含み、前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、
ａ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；および
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；からなる群より選択されるものである、方法。
【請求項２】
前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群より選択される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物および前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が同時に投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法
【請求項７】
前記化合物が、前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体の投与前に投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
アルツハイマー病の治療において、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための、式
【化２】
2019530647.tif 000059
の化合物、またはその薬学的に許容される塩であって、前記Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、これらが、
ａ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；および
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；からなる群より選択される、からなる群より選択される、化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容されるである、請求項１３に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群より選択される、請求項１３または請求項１４のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項１８】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項１９】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項２０】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項２１】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項２２】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
【請求項２３】
１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体の薬学的組成物と組み合わされた、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、化合物Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、
ａ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；および
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である、からなる群より選択されるものである、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群より選択される、請求項２３または請求項２４のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＡＣＥ阻害剤と抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体との組み合わせ、およびアルツハイマー病などの特定の神経疾患を治療するためのその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の神経毒性かつ高度に凝集性のペプチドセグメントであるアミロイドβ（Ａベータ）ペプチドが関与する、アルツハイマー病ならびに他の疾患および障害の治療の技術分野のものである。アルツハイマー病は、世界中で何百万人もの患者を冒す破壊的な神経変性障害である。患者に一時的な症候的利益のみを提供する市場で現在認可されている薬剤を考慮して、アルツハイマー病の治療における満たされていない重大な必要性が存在する。
【０００３】
アルツハイマー病は、脳内でのＡベータの生成、凝集、および沈着を特徴とする。ベータ−セクレターゼ（ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素、ＢＡＣＥ）の完全または部分的阻害がマウスモデルにおけるプラーク関連およびプラーク依存性病変に重大な影響を及ぼすことが示されている。これは、Ａベータペプチドレベルのわずかな減少でさえも、プラーク負荷およびシナプス欠損の長期にわたる著しい減少をもたらし、それ故に、特にアルツハイマー病の治療において著しい治療的利益を提供し得ることを示唆する。
【０００４】
さらに、Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータを特異的に標的とする抗体が、プラークレベルをインビボで低下させることが示されている（米国特許第８，６７９，４９８号）。Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ、Ｎ３ｐＥ、またはＡベータｐ３−４２とも称されるＮ３ｐＧｌｕ  Ａベータは、プラークのみに見出されるＡベータペプチドの切断形態である。Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータペプチドが脳内に沈着したＡベータの微量構成成分であるが、研究により、Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータペプチドが攻撃的な凝集特性を有し、沈着カスケードに初期に蓄積することが実証されている。
【０００５】
ＢＡＣＥ阻害剤とＮ３ｐＧｌｕ  Ａベータペプチドに結合する抗体との組み合わせは、いずれかの薬物のみよりもより有効であり得るアルツハイマー病などのＡベータペプチド媒介障害への治療の提供に望ましい。例えば、かかる組み合わせでの治療は、各薬物を単独で使用する場合と比較して、より少ない用量でいずれかまたは両方の薬物を使用することを可能とし、潜在的には、有効性を維持しながら、より少ない副作用をもたらし得る。抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体およびＢＡＣＥ阻害剤を用いてＡベータの沈着形態の除去を標的とすることは、既存のプラーク沈着物の食作用性除去を促進し、同時にＡベータの生成を阻害することによってＡベータのさらなる沈着を低減または阻止すると考えられている。
【０００６】
米国特許第８，２７８，３３４号は、置換環状アミンＢＡＣＥ−１阻害剤を抗アミロイド抗体と共に投与することを含む、認知または神経変性疾患を治療する方法を開示している。ＷＯ２０１６／０４３９９７は、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータモノクローナル抗体と組み合わせて特定のＢＡＣＥ阻害剤を含む、Ａベータの形成および沈着を特徴とする疾患を治療する方法を開示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、認知性または神経変性疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要としている患者に、有効量の式Ｉ：
【化１】
2019530647.tif 000003
の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、Ａベータの形成および沈着を特徴とする疾患を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法も提供する。本発明はさらに、アルツハイマー病を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法も提供する。本発明はまた、軽度のアルツハイマー病を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法も提供する。本発明はさらに、軽度認知障害を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩、またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法も提供する。本発明はさらに、前駆状態のアルツハイマー病を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法も提供する。さらに、本発明は、軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法も提供する。本発明はさらに、脳血管アミロイド症（ＣＡＡ）を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法も提供する。
【０００８】
本発明はさらに、患者においてアルツハイマー病を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて投与することを含む方法を提供し、ここで、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、このＬＣＶＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらは、
ａ）ＬＣＤＲ１は配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；および
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である、からなる群より選択される。
【０００９】
さらに、本発明は、アルツハイマー病の治療において、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。さらに、本発明は、軽度のアルツハイマー病の治療において、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。さらに、本発明は、前駆状態のアルツハイマー病の治療において、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の予防において、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１０】
本発明は、アルツハイマー病の治療において、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータと同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供し、ここで、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、このＬＣＶＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらは、
ａ）ＬＣＤＲ１は配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；および
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；からなる群より選択される。
【００１１】
本発明はさらに、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体の薬学的組成物と組み合わされた、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータの薬学的組成物と組み合わされた、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を提供し、ここで、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、このＬＣＶＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらは、
ａ）ＬＣＤＲ１は配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；および
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である、からなる群より選択される。
【００１３】
加えて、本発明は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩と、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体とを含むキットを提供する。本発明はさらに、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物と、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体を含有する薬学的組成物とを含むキットを提供する。本明細書で用いられるとき、「キット」は、単一の包装中に、１つの成分が、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、もう１つの成分が、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体である、各成分の別々の容器を含む。「キット」は、各成分を組み合わせて投与するための使用説明書と共に、別々の包装中に、１つの成分が、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、もう１つの成分が、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体である、各成分の別々の容器を含んでもよい。
【００１４】
本発明はさらに、アルツハイマー病、軽度アルツハイマー病、前駆状態のアルツハイマー病の治療用、または軽度認知機能障害からアルツハイマー病への進行の予防用の薬剤の製造のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供し、この薬剤は、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と同時に、別々に、または逐次的に投与される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
組み合わせにおいては、以下の化合物
【化２】
2019530647.tif 000004
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル））ピラジン−２−カルボキサミド、およびその薬学的に許容される塩；ならびに
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド水和物；が好ましい。
【００１６】
加えて、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドが特に好ましい。
【００１７】
さらに、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドマロネート；および
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホナートが特に好ましい。
【００１８】
好ましい抗体は、ｈＥ８ＬおよびＢ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩであり、ｈＥ８ＬおよびＢ１２Ｌが特に好ましく、ｈＥ８Ｌが最も好ましい。
【００１９】
抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、このＬＣＶＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらは、
ａ）ＬＣＤＲ１は配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；および
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である、からなる群より選択される。
【００２０】
他の実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、このＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、
ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群より選択される。
【００２１】
さらなる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、このＬＣおよびＨＣは、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される。
【００２２】
さらなる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣは、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、それぞれ、配列番号３３の軽鎖（ＬＣ）および配列番号３５の重鎖（ＨＣ）を有するｈＥ８Ｌを含む。ｈＥ８Ｌは、それぞれ、配列番号３２の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および配列番号３４の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。ｈＥ８ＬのＨＣＶＲは、配列番号３６のＨＣＤＲ１、配列番号２２のＨＣＤＲ２、および配列番号３７のＨＣＤＲ３をさらに含む。ｈＥ８ＬのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１７のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、および配列番号１９のＬＣＤＲ３をさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、それぞれ、配列番号２８および配列番号２９の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有するＢ１２Ｌを含む。Ｂ１２Ｌは、それぞれ、配列番号２５および配列番号２６の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。Ｂ１２ＬのＨＣＶＲは、配列番号２０のＨＣＤＲ１、配列番号２２のＨＣＤＲ２、および配列番号２３のＨＣＤＲ３をさらに含む。Ｂ１２ＬのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１７のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、および配列番号１９のＬＣＤＲ３をさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、それぞれ、配列番号２８および配列番号３０の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有するＲ１７Ｌを含む。Ｒ１７Ｌは、それぞれ、配列番号２５および配列番号２７の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。Ｒ１７ＬのＨＣＶＲは、配列番号２１のＨＣＤＲ１、配列番号２２のＨＣＤＲ２、および配列番号２４のＨＣＤＲ３をさらに含む。Ｒ１７ＬのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１７のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、および配列番号１９のＨＣＤＲ３をさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１１の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有する抗体Ｉを含む。抗体Ｉは、それぞれ、配列番号９および配列番号８の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。抗体ＩのＨＣＶＲは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３をさらに含む。抗体ＩのＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号６のＬＣＤＲ２、および配列番号７のＬＣＤＲ３をさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、それぞれ、配列番号１３および配列番号１１の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を有する抗体ＩＩを含む。抗体ＩＩは、それぞれ、配列番号１０および配列番号８の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をさらに有する。抗体ＩＩのＨＣＶＲは、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、および配列番号３のＨＣＤＲ３をさらに含む。抗体ＩＩのＬＣＶＲは、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号７のＬＣＤＲ３をさらに含む。
【００２８】
当業者であれば、「抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体」、ならびに特異的抗体「ｈＥ８Ｌ」、「Ｂ１２Ｌ」、および「Ｒ１７Ｌ」が、２０１４年３月２５日に発行された米国特許第８，６７９，４９８Ｂ２号、表題「Ａｎｔｉ−Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｂｅｔａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」（米国シリアル第１３／８１０，８９５号）において、当業者によってこれらの抗体を作製および使用するための方法と共に特定および開示されていることをさらに理解および認識するであろう。例えば、米国特許第８，６７９，４９８Ｂ２号の表１を参照されたい。抗体、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、およびＲ１７Ｌは、本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体として使用されてもよい。他の実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、本明細書に記載される抗体「抗体Ｉ」を含み得る。さらなる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、本明細書に記載される「抗体ＩＩ」を含み得る。
【００２９】
加えて、本発明で使用されるある特定の抗体のアミノ酸配列が以下の表Ａに提供される。
【表１】
2019530647.tif 000005
【００３０】
「ｈＥ８Ｌ」、「Ｂ１２Ｌ」、「Ｒ１７Ｌ」、「抗体Ｉ」、および「抗体ＩＩ」に関して、かかる抗体のさらなるアミノ酸配列が表Ｂに提供される。
【表２】
2019530647.tif 000006
【００３１】
本発明の抗体は、Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβに結合する。Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβの配列は、配列番号３１のアミノ酸配列である。Ａβの配列は、配列番号３８である。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む免疫グロブリン分子である。各ＬＣおよびＨＣのアミノ末端部分は、内部に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して抗原認識に関与する可変領域を含む。ＣＤＲには、フレームワーク領域と呼ばれるより保存的な領域が散在している。本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割当ては、Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３  （１９７１）；  Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２  （１９９１））のような周知のＫａｂａｔ番号付け法、およびＮｏｒｔｈ番号付け法（Ｎｏｒｔｈら、Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＤＲ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０６：２２８−２５６  （２０１１））に基づく。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、自然界には見られず、かつ細胞環境で見られる他の高分子種を含まないか、または実質的に含まないタンパク質、ペプチド、または核酸を指す。「実質的に含まない」とは、本明細書で使用されるとき、目的とするタンパク質、ペプチド、または核酸が、存在する高分子種の８０％超（モル基準）、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超を含むことを意味する。
【００３４】
本抗体の発現および分泌後、培地が浄化されて細胞が除去され、浄化された培地が多くの一般に使用されている技法のうちのいずれかを使用して精製される。精製された抗体は、非経口投与、特に皮下、髄腔内、または静脈内投与のためにタンパク質および抗体を製剤化するための周知の方法に従って薬学的組成物に製剤化され得る。本抗体は、適切な薬学的に許容される賦形剤と一緒に凍結乾燥され、その後、使用前に水性希釈剤で再構成され得る。いずれの場合にも、本抗体の薬学的組成物の保管形態および注入形態は、本抗体以外の成分である薬学的に許容される賦形剤または賦形剤を含む。成分が薬学的に許容されるかどうかは、薬学的組成物の安全性および有効性、または薬学的組成物の安全性、純度、および効力へのその影響に依存する。成分がヒトへの投与のための組成物中に使用されていないことを保証するために、その成分が安全性もしくは有効性（または安全性、純度、もしくは効力）に十分に好ましくない影響を及ぼすと判断された場合、本抗体の薬学的組成物中での使用には薬学的に許容されない。
【００３５】
「Ａβの沈着を特徴とする疾患」という用語は、脳内または脳脈管構造内のＡβ沈着物を病理学的に特徴とする疾患である。この疾患には、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症などの疾患が含まれる。アルツハイマー病の臨床診断、病期、または進行は、当業者などの担当診断医または医療従事者により、既知の技法を使用し、かつ結果を観察することによって容易に決定され得る。これは、一般に、ある種の脳プラーク想像、精神、もしくは認知評価（例えば、臨床的認知症評定−ボックスの要約（ＣＤＲ−ＳＢ）、ミニメンタルステート試験２５（ＭＭＳＥ）もしくはアルツハイマー病評価スケール−認知（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ））、または機能評価（例えば、アルツハイマー病共同研究−日常生活の活動（ＡＤＣＳ−ＡＤＬ）を含む。本明細書で使用される「臨床アルツハイマー病」とは、アルツハイマー病の診断された病期である。これには、前駆アルツハイマー病、軽度アルツハイマー病、中度アルツハイマー病、および重度アルツハイマー病と診断された状態が含まれる。「前臨床アルツハイマー病」という用語は、バイオマーカー（ＣＳＰ  Ａβ４２レベルまたはアミロイドＰＥＴにより沈着した脳プラークなど）の測定可能な変化が臨床アルツハイマー病に進行するアルツハイマーの病変を有する患者の初発兆候を示す、臨床アルツハイマー病に先行する病期である。これは通常、記憶喪失および混乱のような症状が顕著となる前である。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「治療すること」、「治療する」、または「治療」という用語は、既存の症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を抑制するか、遅延させるか、停止させるか、軽減するか、または逆転させることを含む。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、ヒトを指す。
【００３８】
用語「Ａベータペプチドの産生の阻害」は、患者におけるＡベータペプチドのインビボレベルの減少を意味するとみなされる。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、患者への単回投与または複数回投与による投与の際に、診断または治療下にある患者に所望の効果を提供する、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の量または用量、ならびにｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体の量または用量を指す。本発明の併用療法は、体内に有効なレベルの式Ｉの化合物、ならびにｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体を提供する任意の様式で、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と共に、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することにより実施されることが理解される。
【００４０】
有効量は、当業者のような担当診断医により、既知技法の使用により、および同様の状況下で得られた結果を観察することによって容易に決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、患者の種、そのサイズ、年齢、および全体的な健康状態、関与する特定の疾患または障害、疾患または障害の程度または関与または重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される製剤の生物学的利用率特性、選択された投与レジメン、付随する薬物の使用、ならびにその他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の要因が担当診断医によって考慮される。
【００４１】
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩は、本発明の組み合わせにおいて、広い投薬量範囲にわたって一般的に有効である。例えば、式Ｉ化合物の１日当たりの投薬量は、通常、約０．１ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、好ましくは、約０．１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日、最も好ましくは、約０．１ｍｇ／日〜約１００  ｍｇ／日の範囲内である。いくつかの実施形態において、式Ｉの化合物の投薬量は、約０．１ｍｇ／日〜約２５ｍｇ／日である。さらに、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体は、本発明の組み合わせにおいて、広い投薬量範囲にわたって一般的に有効である。ある場合には、前述の範囲の下限値を下回る投薬量レベルでも十分過ぎることもあり、一方で、他の場合には、許容される有害事象を伴ってさらにより多くの投薬量が用いられてもよく、それ故に、上述の投薬量範囲は、本発明の範囲を限定することを決して意図していない。
【００４２】
ＢＡＣＥ阻害剤および本発明の抗体は、好ましくは、化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される薬学的組成物として製剤化される。投与経路は、任意の形で変化し、薬物の物理的特性ならびに患者および介護人の利便性によって限定され得る。好ましくは、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体組成物は、静脈内または皮下投与などの非経口投与用である。加えて、式ＩのＢＡＣＥ阻害剤化合物、またはその薬学的に許容される塩は、静脈内または皮下投与を含む、経口、非経口投与用である。そのような薬学的組成物およびその調製方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「組み合わせて」という語句は、同時に、または任意の順序にて逐次的に、または任意の組み合わせで、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、および抗体ＩＩからなる群より選択される抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と共に、式Ｉ：
【化３】
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の化合物、またはその薬学的に許容される塩などのＢＡＣＥ阻害剤を投与することを指す。２つの分子は、同じ薬学的組成物の一部としてまたは別個の薬学的組成物としてのいずれかで投与され得る。式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩は、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体の投与前に、それと同時に、もしくはその後に、またはそれらのある組み合わせで、投与され得る。抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が繰り返し間隔で（例えば、標準の治療過程中に）投与される場合、ＢＡＣＥ阻害剤は、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体の各投与の前に、それと同時に、もしくはその後に、またはそれらのある組み合わせで投与され得るか、あるいは抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体での療法との関連で異なる間隔で、あるいは抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体での治療過程前に、その過程中の任意の時点で、もしくはその過程後に単回用量（複数可）または一連の用量（複数可）で投与され得る。
【００４４】
本発明の化合物は、当該技術分野において既知の様々な手順により調製することができ、そのいくつかを以下の調製物および実施例にて例示する。記載される各経路の具体的な合成ステップは、式Ｉの化合物、またはその塩を調製するために、様々な方法で、または異なる手順からのステップと共に組み合わされてもよい。各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、研和、および結晶化を含む、当該技術分野において周知の従来の方法により回収することができる。さらに、全ての置換基は、別途指示のない限り、以前に定義された通りである。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に入手可能である。
【００４５】
「トシラート」、「トルエンスルホン酸」、「ｐ−トルエンスルホン酸」、および「４−メチルベンゼンスルホン酸」という用語が、以下の構造の化合物を指すことは、当業者によって理解される。
【化４】
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【００４６】
本明細書で使用されるとき、「ＢＳＡ」とは、ウシ血清アルブミンを指し、「ＥＤＴＡ」とは、エチレンジアミン四酢酸を指し、「ｅｅ」とは、鏡像体過剰率を指し、「Ｅｘ」とは、実施例を指し、「Ｆ１２」とは、ハムＦ１２培地を指し、「ｈｒ」とは、時間（複数可）を指し、「ＨＲＰ」とは、西洋ワサビペルオキシダーゼを指し、「ＩＣ５０」とは、薬剤に対して可能な最大阻害応答の５０％をもたらすその薬剤の濃度を指し、「ｍｉｎ」とは、分（複数可）を指し、「ＰＢＳ」とは、リン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＰＤＡＰＰ」とは、血小板由来アミロイド前駆体タンパク質を指し、「Ｐｒｅｐ」とは、調製を指し、「ｐｓｉ」とは、１平方インチ当たりのポンドを指し、「Ｒｔ」とは、保持時間を指し、「ＳＣＸ」とは、強陽イオン交換クロマトグラフィーを指し、「ＴＨＦ」とは、テトラヒドロフランを指し、「ＴＭＢ」とは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを指す。
【化５】
2019530647.tif 000009
【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【００４７】
塩酸塩などの、本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、当該技術分野において周知の標準的な条件下、ジエチルエーテルなどの好適な溶媒中で、式Ｉの適切な遊離塩基と、塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸、またはマロン酸などの適切な薬学的に許容される酸とを反応させることによって形成することができる。さらに、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護時に同時に起こり得る。そのような塩の形成は、当該技術分野で周知であり、また理解されている。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ、”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、３３：２０１−２１７（１９８６）；Ｂａｓｔｉｎ、Ｒ．Ｊ．ら．“Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ、”を参照されたい。
【実施例】
【００４８】
以下の調製物および実施例は、本発明をさらに例示する。
【００４９】
調製１
（２Ｓ）−１−トリチルオキシブタ−３−エン−２−オール
スキーム１のステップＡ：ＴＨＦ（１２６４ｍＬ）中のヨウ化トリメチルスルホニウム（１９３．５ｇ、９４８．２ｍｍｏｌ）を周囲温度で７５分間撹拌する。混合物を−５０℃に冷却し、３０分間かけて、カニューレを介してｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５ｍｏｌ／Ｌ、３７９ｍＬ、９４８．２ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を−３０℃まで徐々に温め、６０分間撹拌する。温度を−１０℃未満に維持しつつ、（２Ｓ）−２−トリチルオキシメチルオキシラン（１００ｇ、３１６．１ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。添加が完了した後、反応混合物を室温まで温め、２時間撹拌する。反応物を飽和塩化アンモニウムに注ぎ、相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出する。有機層を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。濾過し、そして減圧下で濃縮して残渣を得る。メチルｔ−ブチルエーテル：ヘキサン（１０〜１５％勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（５６．２２ｇ、５４％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５３（Ｍ＋Ｎａ）。
【００５０】
代替的な調製物１
（２Ｓ）−１−トリチルオキシブタ−３−エン−２−オール
スキーム２のステップＡの出発物質：ジクロロメタン（８５０ｍＬ）中の（２Ｓ）−ブタ−２−エン−１，２−ジオールの溶液（ＪＡＣＳ，１９９９，１２１，８６４９のように調製）（６４．５ｇ、６３１ｍｍｏｌ）に、トリフェニルメチルクロリド（２８７ｇ、９４７．１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７．７１ｇ、６３．１ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（１４０ｇ、１３８３．５ｍｍｏｌ）を添加する。２４℃で２４時間撹拌する。１Ｎクエン酸水溶液（４２５ｍＬ）を添加する。層を分離し、有機抽出物を減圧下で濃縮乾固する。メタノール（９００ｍＬ）を添加し、１時間５℃に冷却する。濾過により固形物を回収し、５℃のメタノール（５０ｍＬ）で洗浄する。固形物を捨て、母液を減圧下で濃縮乾固する。トルエン（８００ｍＬ）を添加し、濃縮して２６８ｇの質量にし、トルエンの４８重量％溶液で表題化合物を得る（１２９ｇ、６７％）。
【００５１】
調製２
１−モルホリノ−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノン
スキーム２のステップＡ：テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（８３．２ｇ、２４５．０ｍｍｏｌ）および４−（２−クロロアセチル）モルホリン（６３８．５０ｇ、３９０２．７ｍｍｏｌ）を、０〜５℃のトルエン（５８００ｍＬ）中の１−トリチルオキシブタ−３−エン−２−オール（８３２．４、２５１９ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。水（１０４１ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（１００８．０ｇ、２５２０２ｍｍｏｌ）を添加する。０〜５℃で１９時間撹拌する。水（２５００ｍＬ）およびトルエン（２５００ｍＬ）を添加する。層を分離し、有機抽出物を水（２×３５００ｍＬ）で洗浄する。有機抽出物を減圧下で濃縮乾固する。残渣にトルエン（２５００ｍＬ）を添加し、次いでｎ−ヘプタン（７５００ｍＬ）をゆっくりと添加する。１６時間撹拌する。濾過により残留する固形物を回収し、ｎ−ヘプタン（１２００ｍＬ）で洗浄する。固形物を真空下で乾燥させて、表題化合物を得る（１０７５．７ｇ、９８％）。
【００５２】
調製３
１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノン
スキーム２のステップＢ：ＴＨＦ中の塩化イソプロピルマグネシウム塩化リチウム錯体（３０７９ｍＬ、２０００ｍｍｏｌ）の１．３Ｍ溶液を、トルエン（２５００ｍＬ）中の４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨードベンゼン（６７３．２ｇ、２２３７．５ｍｍｏｌ）の溶液に、反応温度を５℃未満に維持する速度で添加する。１時間撹拌する。得られたグリニャール溶液（５１５０ｍＬ）を、トルエン（５０００ｍＬ）中の１−モルホリノ−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノン（５００ｇ、１０９３ｍｍｏｌ）の溶液に、反応温度を５℃未満に維持する速度で添加する。温度を５℃未満に維持しつつ、３時間撹拌する。さらに調製したグリニャール溶液（４２９ｍＬ）を添加し、１時間撹拌する。１Ｎのクエン酸水溶液（５０００ｍｌ）を、温度を５℃未満に維持する速度で添加する。層を分離し、有機抽出物を水（５０００ｍＬ）で洗浄する。溶液を減圧下で濃縮乾固する。残渣にメタノール（２０００ｍＬ）を添加し、濃縮して、残渣として表題化合物をもたらす（７９３ｇ、７３．４％有効性、８３％）。
【００５３】
調製物４
１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノンオキシム
スキーム２のステップＣ：ヒドロキシルアミンヒドロクロリド（９８．３ｇ）およびメタノール（３８００ｍＬ）中の酢酸ナトリウム（１７４ｇ）を、１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノン（４５０ｇ、７０７ｍｍｏｌ）に添加する。溶液を２時間５０℃に加熱する。２４℃に冷却し、濃縮する。残留物に水（１０００ｍＬ）およびトルエン（１５００ｍＬ）を添加する。層を分離し、トルエン（５００ｍＬ）で水相を抽出する。有機抽出物を混合し、水（２×４００ｍｌ）で洗浄する。溶液を減圧下で濃縮して、残渣として表題化合物をもたらす（５６７ｇ、６１．４％有効性、８８％）。
【００５４】
調製５
ｔｅｒｔ−ブチル２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］アセテート
スキーム１のステップＢ：（２Ｓ）−１−トリチルオキシブタ−３−エン−２−オール（７４．６７ｇ、２２６．０ｍｍｏｌ）を、トルエン（３７６ｍＬ）中のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムサルフェート（１３．２６ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。水（１１９ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（５０質量％）、続いてｔｅｒｔ−ブチル−２−ブロモアセテート（１１０．２０ｇ、５６５．０ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。水に注ぎ、相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出する。有機層を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。混合物を濾過し、減圧下で濃縮して表題化合物をもたらす（７７．８６ｇ、７７％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６７（Ｍ＋Ｎａ）。
【００５５】
調製６
（１Ｅ）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］アセトアルデヒドオキシム
スキーム１のステップＣ：ジクロロメタン（５８２．２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］アセテート（７７．６６ｇ、１７４．７ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却する。ヘキサン中の水素化ジイソブチルアルミニウムの溶液（１ｍｏｌ／Ｌ、１７４．７ｍＬ）を３５分間かけて滴下して添加し、温度を−７０℃未満に維持する。−７８℃で５時間撹拌する。温度を−６０℃に維持しつつ、反応混合物に、水中の塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ、１９２．１ｍｌ）を滴下して添加する。反応を室温まで徐々に温め、６０分間撹拌する。有機抽出物を分離し、飽和重炭酸ナトリウムで洗浄する。硫酸マグネシウム上で溶液を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して残渣をもたらす。残渣をジクロロメタンに溶解する。酢酸ナトリウム（２８．６６ｇ、３４９．３ｍｍｏｌ）、続いてヒドロキシルアミンヒドロクロリド（１８．２１ｇ、２６２．０ｍｍｏｌ）を添加する。室温で１８時間撹拌する。水に注ぎ、相を分離し、ジクロロメタンで水相を抽出する。有機層を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。混合物を濾過し、減圧下で濃縮して表題化合物をもたらす（６８．３８ｇ、１０１％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８６（Ｍ−Ｈ）。
【００５６】
調製物７
（３ａＲ，４Ｓ）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール
スキーム１のステップＤ：ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル  （７１７  ｍＬ）中の（１Ｅ）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］アセトアルデヒドオキシム（５５．５７ｇ、１４３．４ｍｍｏｌ）の溶液を５℃に冷却する。温度を１０℃未満に維持しつつ、次亜塩素酸ナトリウム（水中５％、５９１ｍＬ、４３０．２ｍｍｏｌ）を滴下して添加する。１０℃で３０分間撹拌する。反応物を１５℃まで温める。１５℃で１８時間撹拌する。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウムで洗浄する。相を分離し、有機相を５％の亜硫酸水素ナトリウム溶液およびブラインで洗浄する。硫酸マグネシウム上で溶液を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して残渣をもたらす。５０％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ジクロロメタン：ヘキサン（２０〜２７％勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（３５．８４ｇ、６５％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４０８（Ｍ＋Ｎａ）。
【００５７】
調製物８
（３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール
スキーム１のステップＥ：ＴＨＦ（１４４．５ｍＬ）およびトルエン（１４４５ｍＬ）中の４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨード−ベンゼン（８６．９４ｇ、２８８．９ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却する。温度を−７０℃未満に維持しつつ、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５  Ｍ、１２０ｍＬ、２８８．９ｍｍｏｌ）を滴下して添加する。−７８℃で３０分間撹拌する。温度を−７０℃未満に維持しつつ、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（３６．５ｍＬ、２８８．９ｍｍｏｌ）を滴下して添加する。溶液を−７８℃で３０分間撹拌する。−６５℃未満の温度を維持しつつ、ＴＨＦ（４８２ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（５５．６９ｇ、１４４．５ｍｍｏｌ）の溶液を反応物に３０分間かけて滴下して添加する。−７８℃で９０分間撹拌する。−６０℃未満の温度を維持しつつ、飽和塩化アンモニウムを急速に添加する。ブラインに注ぎ、酢酸エチルで水相を抽出する。有機抽出物を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。濾過し、そして減圧下で濃縮して残渣を得る。１０〜１５％ジエチルエーテル：ヘキサン（０〜７０％勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（３６．５２ｇ、４５％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）５６０／５６２［Ｍ＋Ｈ］。
【００５８】
代替的な調製物８
スキーム２のステップＤ：トルエン（４０００ｍＬ）中の１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−［（１Ｓ）−１−（トリチルオキシメチル）アリルオキシ］エタノンオキシム（４５８ｇ、５０２ｍｍｏｌ）およびヒドロキノン（５６．３ｇ  ５１１ｍｍｏｌ）の溶液を窒素下で２７時間加熱還流する。溶液を２４℃に冷却し、炭酸ナトリウム水溶液（８００ｍｌ）を添加する。層を分離し、トルエン（３００ｍＬ）で水相を抽出する。有機抽出物を混合し、水（２×５００ｍｌ）で洗浄する。溶液を減圧下で濃縮して残渣をもたらす。イソプロピルアルコール（１５００ｍＬ）を添加して、加熱還流する。２４℃に冷却し、濾過により固形物を回収する。固形物を真空下で乾燥させて、表題化合物を得る（２１２ｇ、７５％）。
【００５９】
調製物９
１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−１−イル］エタノン
スキーム２のステップＥ：５℃未満の内部温度を維持しつつ、窒素下で、ジクロロメタン（７２０ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（２３５．３ｇ、４２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５．１３ｇ、４２．０ｍｍｏｌ）、およびピリジン（６６．４５ｇ、８４０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アセチル（３５．５６ｇ、５０３．９ｍｍｏｌ）を添加する。１時間撹拌し、次いで水（３００ｍＬ）および１Ｍ硫酸（３００ｍＬ）を添加する。混合物を１０分間撹拌し、層を分離させる。有機抽出物を回収し、飽和炭酸ナトリウム（５００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）で洗浄する。溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、灰色の固形物として１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−１−イル］エタノンをもたらす（２３５ｇ、９３％）。
【００６０】
調製１０
１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−１−イル］エタノン
スキーム３のステップＡ：２０Ｌのジャケット付き反応器中において、１０℃未満の内部温度を維持しつつ、窒素下で、ジクロロメタン（１０Ｌ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（１９９６ｇ、３３８４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５６．０ｇ、４５８ｍｍｏｌ）、ピリジン（５００ｍＬ、６１８０ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アセチル（２９０ｍＬ、４０７５ｍｍｏｌ）を添加する。添加の完了（１時間）後、２０℃に温め、一晩撹拌する。反応が完了していない場合は、塩化アセチル、ＤＭＡＰ、ピリジン、およびジクロロメタンを反応の完了が観察されるまで添加する。反応混合物を０℃に冷却し、水（５Ｌ）をゆっくりと添加し、１０℃で３０分間反応混合物を撹拌し、層を分離する。有機抽出物を回収し、水性物をジクロロメタン（１Ｌ）で洗浄する。合わせた有機抽出物を１Ｎの塩酸水溶液（２×４Ｌ）で洗浄し、水性物をジクロロメタン（２×１Ｌ）で抽出する。合わせた有機抽出物を水（４Ｌ）で洗浄し、溶媒を減圧下で除去して、約５Ｌの総容量をもたらす。９０％のギ酸（１８００ｍＬ）を添加し、周囲温度で３日間放置する。２時間、４０℃に温め、次いで減圧下で溶媒を除去する。残渣をメタノール（４Ｌ）で希釈し、飽和炭酸ナトリウム水溶液（３Ｌ）をゆっくりと添加する。固体炭酸ナトリウム（３７５ｇ）を添加してｐＨを８〜９に調整する。４５℃で１時間撹拌し、次いで、周囲温度まで冷却する。濾過により固形物を除去し、メタノール（４×５００ｍＬ）で洗浄し、次いで２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で処理し、周囲温度で１時間放置する。濾過により固形物を除去し、メタノール（２×１００ｍＬ）で洗浄する。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル（５Ｌ）と水（２Ｌ）との間で分離する。水性物を酢酸エチル（２Ｌ）で抽出し、混合した有機抽出物をブライン（２×１Ｌ）で洗浄する。溶媒を減圧下で除去し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２．５Ｌ）を添加し、蒸発乾固する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４Ｌ）を添加し、６５℃で１時間撹拌し、周囲温度に冷却し、濾過によって固形物を回収し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３×５００ｍＬ）で洗浄する。真空下でベージュ色の固形物になるまで乾燥させる。トルエン（７．５Ｌ）中のこの固形物を１１０℃に加熱して、完全に溶解させ、１時間かけて１８℃に冷却し、この温度で１時間撹拌する。４０℃に加熱し、沈殿物が形成されるとき、もう１度１８℃に冷却する。４５分間撹拌し、次いで濾過により固形物を回収し、トルエン（２×５００ｍＬ）で洗浄する。固形物を真空下で乾燥させて、表題化合物を得る（４４３．１ｇ、３６％、ＬＣＭＳによる純度９５％）。濾液を真空下で蒸発させて残渣をもたらす。残渣を、イソヘキサン中の２０％〜１００％酢酸エチルで溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製する。生成物を含有する画分をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）中、６０℃で３０分間懸濁し、周囲温度に冷却し、濾過によって固形物を回収し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×２００ｍＬ）で��浄する。固形物を真空下で乾燥させて、ベージュ色の結晶性固形物として表題化合物をもたらす（３０４ｇ、２４％、ＬＣＭＳによる純度８８％）。濾液を真空下で蒸発させて残渣をもたらす。イソヘキサン中２０％〜１００％の酢酸エチルで溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製して、表題化合物をもたらす（５７．８ｇ、５％、ＬＣＭＳによる純度８８％）。ＥＳ／ＭＳ：  ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３６０．０／３６２．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００６１】
代替的な調製物１０
スキーム３のステップＡ：１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−１−イル］エタノン（６９ｇ、１１４．５ｍｍｏｌ）を、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（２．２ｇ、１１．４５ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（２８０ｍＬ）、およびメタノール（７００ｍＬ）の１５℃の溶液に添加する。１８時間撹拌し、次いで減圧下で溶媒を除去する。残渣をジクロロメタン（３５０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（１４０ｍＬ）および水（１４０ｍＬ）を添加する。層を分離し、減圧下で有機層を蒸発させる。残渣にトルエン（３５０ｍＬ）を添加し、１時間加熱還流する。１０℃／時間の速度で１０〜１５℃に冷却する。濾過により固形物を回収し、トルエン（７０ｍＬ）で洗浄する。固形物を真空下で乾燥させて、灰色の固形物として表題化合物を得る（３０ｇ、６５％）。
【００６２】
調製１１
（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−４−カルボン酸
スキーム３のステップＢ：２０Ｌのジャケット付き反応器中において、アセトニトリル（４．５Ｌ）中の１−［（４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−１−イル］エタノン（８０４．９ｇ、２１７７ｍｍｏｌ）、ＴＥＭＰＯ（４０．０ｇ、２５１ｍｍｏｌ）の懸濁液に水（２Ｌ）を添加し、５℃の内部温度に冷却する。（ジアセトキシヨード）ベンゼン（１６９３ｇ、４９９３．４３ｍｍｏｌ）を３０分間かけて少しずつ添加する。反応器の冷却を利用して発熱を制御し、ＬＣＭＳが反応の完了を示すまで２０℃で保持する。２５℃未満の内部温度を維持しつつ、周囲温度で、水（３００ｍＬ）中の亜硫酸水素ナトリウムの懸濁液（７０ｇ、６７２．６８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加する。３０分間撹拌し、その後、５℃に冷却する。水（２Ｌ）を添加し、次いで、１０℃未満の内部温度を維持しつつ、４７重量％の水酸化ナトリウム水溶液（７８０ｍｌ）を１時間かけてゆっくりと添加する。酢酸エチル（２Ｌ）およびイソヘキサン（５Ｌ）を添加し、激しく撹拌し、層を分離する。二相性有機層を水（１Ｌ）で抽出し、混合した水性物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２．５Ｌ）で洗浄する。水性抽出物を５℃に冷却し、内部温度を約５℃に維持しつつ、３７％の塩酸（１．４Ｌ）を３０分間かけてゆっくりと添加する。酢酸エチル（５Ｌ）を添加し、層を分離し、ブライン（３×１Ｌ）で有機物を洗浄する。混合した水性抽出物を酢酸エチル（２．５Ｌ）で抽出し、混合した有機物をブライン（１Ｌ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過する。有機物をヘプタン（２．５Ｌ）で希釈し、減圧下で蒸発乾固する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１．５Ｌ）およびヘプタン（１．５Ｌ）を添加し、蒸発乾固させる。ヘプタン（２．５Ｌ）を添加し、２回蒸発乾固する。ヘプタン（５００ｍＬ）およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（５００ｍＬ）を添加し、４０℃で３０分間撹拌し、次いで、沈殿物を濾過により回収し、ヘプタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１：１、１Ｌ）、次いで、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３×３００ｍＬ）で洗浄し、風乾して、ベージュ色の結晶性固形物として表題化合物をもたらす（７７９ｇ、９１％）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３７４．０／３７６．０［Ｍ＋Ｈ］。
［α］Ｄ２０＝−１９．０°（Ｃ＝１．００４、クロロホルム）。
【００６３】
代替的な調製物１１
スキーム３のステップＢ：１−［（４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−１−イル］エタノン（３０ｇ、７３．３ｍｍｏｌ）、ＴＥＭＰＯ（１．１４ｇ、７．３０ｍｍｏｌ）、および（ジアセトキシヨード）ベンゼン（５１．９ｇ、１６１ｍｍｏｌ）に、水（１５０ｍＬ）およびアセトニトリル（１５０ｍＬ）を添加する。１５℃に冷却し、２時間撹拌する。周囲温度で、水（１５０ｍＬ）中のチオ硫酸ナトリウム（２１ｇ）および炭酸カリウム（２２ｇ）をゆっくりと添加する。１時間撹拌し、次いでメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１５０ｍＬ）を添加する。層を分離し、濃硫酸で水層のｐＨを２〜３に調整する。酢酸エチル（１５０ｍＬ）を添加し、層を分離する。減圧下で有機層を蒸発乾固させる。ｎ−ヘプタン（９０ｍＬ）を添加し、１時間加熱還流する。１５℃に冷却し、次いで、濾過によって沈殿物を回収し、ｎ−ヘプタン（９０ｍＬ）で洗浄する。真空下で乾燥させて、白色の固形物として表題化合物をもたらす（２７ｇ、９８％）。
【００６４】
調製１２
（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルテトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−４−カルボキサミド
スキーム３のステップＣ：１０Ｌのジャケット付き反応器中において、ジクロロメタン（７．０Ｌ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−４−カルボン酸（７７１ｇ、２０１９ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素下で０℃に冷却し、ＣＤＩ（４００ｇ、２４２１ｍｍｏｌ）を４０分間かけて少しずつ添加する。反応器のジャケットを−２０℃に冷却し、１時間撹拌し、次いで、約３０分間かけてＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２６０．０ｇ、２６１２ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。−２０℃で１時間撹拌し、０℃で２時間撹拌し、次いで、１０℃で７時間撹拌する。ＣＤＩ（１７５ｇ、１０５８ｍｍｏｌ）を添加し、１０℃で一晩撹拌する。１０℃でＣＤＩ（１８０ｇ、１０８８ｍｍｏｌ）をさらに添加し、１時間撹拌し、次いで、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１４０ｇ、１４０７ｍｍｏｌ）を添加し、１０℃で撹拌し続ける。反応が不完全である場合、完全な反応が観察されるまで、ＣＤＩ、続いてＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンヒドロクロリドのさらなる充填を実施することができる。反応混合物を５℃に冷却し、１Ｎの塩酸水溶液（５Ｌ）、次いで、２Ｎの塩酸水溶液（５Ｌ）で洗浄する。混合した水溶液をジクロロメタン（１Ｌ）で抽出し、有機抽出物を混合し、水（２．５Ｌ）、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２．５Ｌ）、および水（２．５Ｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて残渣をもたらす。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３Ｌ）を添加し、減圧下で蒸発させる。さらに、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２Ｌ）を添加し、５０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却し、３０分間撹拌する。生じる固形物を濾過して回収し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×５００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させ、白色固形物として表題化合物をもたらす（７６０ｇ、８８％）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４１７．０／４１９．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００６５】
代替的な調製物１２
スキーム３のステップＣ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１３５ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−４−カルボン酸（２７ｇ、７０．７ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素下で０℃に冷却し、ＣＤＩ（１４．９ｇ、９１．９ｍｍｏｌ）を添加する。１時間撹拌し、次にＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンヒドロキシクロリド（９．０ｇ、９２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１４．３ｇ、１４１ｍｍｏｌ）を添加する。１５℃で１６時間撹拌する。反応混合物を０℃に冷却し、０．５Ｍの硫酸水溶液（６７５ｍｌ）を添加する。１時間撹拌する。生じる固形物を濾過により回収する。固形物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（９０ｍＬ）中で１時間スラリー化する。濾過によって固形物を回収し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄する。真空下で乾燥させて、固形物として表題化合物をもたらす（２３ｇ、７８％）。
【００６６】
調製物１３
１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−４−イル］エタノン
スキーム３のステップＤ：２０Ｌのジャケット付き反応器中において、ＴＨＦ（１０Ｌ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルテトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−４−カルボキサミド（６５４．０ｇ、１５３６ｍｍｏｌ）の溶液を−６０℃に冷却し、内部温度を−４０℃未満に維持しつつ、２−メチルテトラヒドロフラン（６６０ｍＬ、２１１０ｍｍｏｌ）中の臭化メチルマグネシウムの３．２Ｍの溶液を滴下して添加する。反応混合物を−４０℃で３０分間撹拌し、次いで、−５０℃に冷却し、内部温度を−３８℃に維持しつつ、ＴＨＦ（２Ｌ）中の１Ｎの塩酸水溶液（２Ｌ）の溶液を添加する。１０℃に温度を上昇させ、酢酸エチル（５Ｌ）および水（１Ｌ）を添加し、撹拌し、内部温度を５℃に到達させ、層を分離する。水層を酢酸エチル（１Ｌ）で抽出し、有機抽出物を混合する。有機抽出物を水（２Ｌ）で洗浄し、水層を酢酸エチル（１Ｌ）で抽出する。有機抽出物を混合し、ブライン（３×２Ｌ）で洗浄し、次いで硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて残渣をもたらす。シクロヘキサン（２．５Ｌ）を添加し、６０℃で１時間撹拌し、次いで、２０℃で３０分間撹拌し、濾過によって固形物を回収し、シクロヘキサン（５００ｍＬ）で洗浄する。固形物を真空下で乾燥させて、白色固形物として表題化合物を得る（５６５ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３７２．０／３７４．０［Ｍ＋Ｈ］、［α］Ｄ２０＝−５８．０°（Ｃ＝１．０００、クロロホルム）。
【００６７】
代替的な調製物１３
スキーム３のステップＤ：ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルテトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−４−カルボキサミド（４．０ｇ、９．５９ｍｍｏｌ）の溶液を−５℃に冷却し、内部温度を−５〜０℃に維持しつつ、２−メチルテトラヒドロフラン（５．０ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）中の臭化メチルマグネシウムの３．０Ｍの溶液を滴下して添加する。反応混合物を−５〜０℃で６０分間撹拌し、次いで、飽和塩化アンモニウムの溶液（２０ｍＬ）を添加する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４０ｍｌ）を添加し、内部温度を５℃に到達させ、層を分離する。有機層を減圧下で蒸発させて、残渣をもたらす。ｎ−ヘプタン（５０ｍＬ）を添加し、撹拌し、濾過によって固形物を回収する。固形物を真空下で乾燥させて、固形物として表題化合物を得る（３．０ｇ、７７％）。
【００６８】
調製物１４
１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−１−イル］エタノン
スキーム３のステップＥ：１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−４−イル］エタノン（５．０８ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）を、０〜５℃で、無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のＸｔａｌＦｌｕｏｒ−Ｍ（登録商標）（１０．０２ｇ、３９．１８ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液へ、一度に添加する。混合物を１０分間撹拌し、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（４．５ｍＬ、２７ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下する。反応混合物を氷浴中で８時間撹拌し、次いで周囲温度に温め、一晩撹拌する。飽和炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）を添加し、１時間撹拌する。層を分離し、ジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で水性物を抽出する。有機抽出物を混合し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）、２Ｎ塩酸水溶液（２×１００ｍＬ）、およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄する。蒸発乾固させて、淡褐色固形物を得、６０℃でメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３００ｍＬ）に溶解する。高温の溶液を濾過し、濾液を蒸発させて、褐色の固形物を得（５．３ｇ、８１％、ＬＣＭＳによる純度８２％）、これをさらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３９３．８／３９５．８［Ｍ＋Ｈ］。
【００６９】
代替的な調製物１４
スキーム３のステップＥ：ＸｔａｌＦｌｕｏｒ−Ｍ（登録商標）（１．２１ｋｇ、４．７３ｍｏｌ）を、−１４℃で、無水ジクロロメタン（５Ｌ）中の１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−１−アセチル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−４−イル］エタノン（５６５ｇ、１．５１ｍｏｌ）の撹拌溶液に一度に添加する。混合物を１０分間撹拌し、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（５５０ｇ、３．３４ｍｏｌ）を２０分かけて滴下する。反応混合物を−１０℃で約１０時間撹拌し、次いで、周囲温度に温め、一晩撹拌する。内部温度を１０℃未満に維持しつつ、５０％の水酸化ナトリウム水溶液（７５０ｍｌ）をゆっくりと添加し、次いで、水（１．５Ｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１Ｌ）を添加し、３０分間撹拌する。層を分離し、ジクロロメタン（１Ｌ）で水性物を抽出する。有機抽出物を合わせ、ブライン（３Ｌ）、２Ｎの塩酸水溶液（５Ｌ）、およびブライン（３Ｌ）で洗浄する。蒸発させて残渣をもたらし、イソヘキサン中５０〜１００％ジクロロメタン、次いでジクロロメタン中１０％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで溶離する、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、次いで、白色粉末として表題化合物を得る（４６７ｇ、７３％、ＬＣＭＳによる純度９４％）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３９３．８／３９５．８［Ｍ＋Ｈ］。
【００７０】
調製物１５
（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−フロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール
スキーム３のステップＦ：１０Ｌのジャケット付き反応器中において、１，４−ジオキサン（５Ｌ）中の１−［（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−フロ［３，４−ｃ］［１，２］オキサゾール−１−イル］エタノン（５７０ｇ、１．４５ｍｏｌ）の溶液に、３７重量％の塩酸水溶液（１．３Ｌ、１６ｍｏｌ）を添加し、１００℃で約３時間、またはＬＣＭＳが反応の完了を示すまで撹拌する。反応混合物を１０℃に冷却し、水（１Ｌ）で希釈し、内部温度を２０℃未満に維持しつつ、混合物に５０重量％の水酸化ナトリウム水溶液（８００ｍＬ）および水（１Ｌ）をゆっくりと添加する。酢酸エチル（２．５Ｌ）を添加し、激しく撹拌し、層を分離し、有機相をブライン（２Ｌ）、さらにブライン（１Ｌ）、および水（１Ｌ）で洗浄する。硫酸マグネシウム上で溶液を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固して残渣をもたらす。シクロヘキサン（２．５Ｌ）を加え、蒸発乾固して、褐色の油状物として表題化合物を得る（５２７ｇ、８９％、ＬＣＭＳによる純度８６％）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３５１．８／３５３．８［Ｍ＋Ｈ］。
【００７１】
調製物１６
［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール
スキーム３のステップＧ：室温で、酢酸（１００ｍＬ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−フロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（５．０６ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）の溶液に、亜鉛粉末（６．０ｇ、９２ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌する。混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）および水（３００ｍＬ）で希釈し、炭酸ナトリウム（９７ｇ、９１５ｍｍｏｌ）を添加しつつ激しく撹拌する。層を分離し、有機層をブライン（２×２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して残渣をもたらす。イソヘキサン中０％〜１００％のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製して、ワックス状固形物として表題化合物をもたらす（４．６７ｇ、８９％、ＬＣＭＳによる純度９０％）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３５４．０／３５６．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００７２】
代替的な調製物１６
スキーム３のステップＧ：２０℃で、酢酸（２Ｌ）および水（２Ｌ）中の（３ａＲ，４Ｓ，６ａＳ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（１，１−ジフルオロエチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−フロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（３０４ｇ、７５％の純度、６４７ｍｍｏｌ）の溶液に、亜鉛粉末（２００ｇ、３．０６ｍｏｌ）を少しずつ添加し、次いで、４０℃に温め、一晩撹拌する。混合物を水（２Ｌ）で希釈し、炭酸ナトリウム（４ｋｇ、４３．４ｍｏｌ）を添加しつつ激しく撹拌し、次いで炭酸ナトリウムでｐＨ８〜９に調整する。酢酸エチル（５Ｌ）および水（２．５Ｌ）を添加し、３０分間撹拌し、珪藻土を通して濾過し、２：１のアセトニトリル／水で洗浄する。層を分離し、酢酸エチル（２×２．５Ｌ）で水性物を抽出し、混合した有機抽出物をブライン（２×２．５Ｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して残渣をもたらす。残渣をＳＦＣカラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（５）、５０×２５０ｍｍ、溶離液：１２％エタノール（ＣＯ２中の０．２％ジエチルメチルアミン、流速：３４０ｇ／分、ＵＶ２２０ｎｍ）によりで精製し、白色固形物として表題化合物をもたらす（１９７．７ｇ、８４％）。［α］Ｄ２０＝−６．９３°（Ｃ＝０．６７８、クロロホルム）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３５４．０／３５６．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００７３】
調製物１７
［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−（トリチルオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール
スキーム１のステップＦ：（３ａＲ，４Ｓ，６ａＲ）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（トリチルオキシメチル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロフロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（３１．３０ｇ、５５．９ｍｍｏｌ）を酢酸（１８６ｍＬ）に添加し、懸濁液をもたらす。亜鉛（２５．６ｇ、３９１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を激しく１８時間撹拌する。反応物をトルエンで希釈し、珪藻土を通して濾過する。濾液を減圧下で濃縮する。残渣を酢酸エチルで可溶化し、ブラインおよび飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄する。相を分け、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物をもたらす（３１．３５ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）５６２／５６４［Ｍ＋Ｈ］。
【００７４】
調製１８
Ｎ−［［（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（トリチルオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］カルバモチオイル］ベンズアミド
スキーム１のステップＧ：［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−２−（トリチルオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール（３１．３５ｇ，５５．７３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５５７ｍＬ）中に溶解させ、５℃に冷却する。ベンゾイルイソチオシアナート（９．７４ｍＬ、７２．４５ｍｍｏｌ）を添加する。添加が完了した後、反応混合物を室温まで温め、２時間撹拌する。飽和炭酸水素ナトリウムに注ぎ、相を分離し、ジクロロメタンで水相を抽出する。有機抽出物を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して表題化合物をもたらす（４２．９５ｇ、１０６％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）７４７／７４９［Ｍ＋Ｎａ］。
【００７５】
調製物１９
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
スキーム３のステップＨ：周囲温度で１時間、またはＬＣＭＳが反応の完了を示すまで、ベンゾイルイソチオシアネート（１．８０ｍＬ、１３．３ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール（４．６７ｇ，、１１．９ｍｍｏｌ）の溶液へ添加する。反応混合物を減圧下で蒸発させて、残渣をもたらす。シクロヘキサン（５０ｍＬ）を添加し、６０℃に温め、沈殿物が完全に溶解するまでメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加する（１００ｍＬ）。熱い溶液を濾過し、室温に冷却し、白色沈殿物が形成されるまで減圧下でゆっくり蒸発させる。溶媒を減圧下で除去し、残渣を無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、ピリジン（２．４ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、溶液を−２５℃に冷却する。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２．２ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下して添加し、１時間０℃に温める。反応混合物を水（２５ｍＬ）、２Ｎの塩酸水溶液（２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）、および水（２５ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮乾固させた。ジクロロメタン中５％のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製して、淡黄色泡状物質としての表題化合物をもたらす（５．０ｇ、７６％、ＬＣＭＳによる純度９０％）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４９９．０／５０１．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００７６】
代替的な調製物１９
スキーム３のステップＨ：３０℃で１時間、ベンゾイルイソチオシアネート（９８ｍＬ、７２４．９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１．２Ｌ）中の［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（１，１−ジフルオロエチル）テトラヒドロフラン−３−イル］メタノール（１９７．６ｇ，、５４６．７ｍｍｏｌ）の溶液へ添加する。ＣＤＩ（１０１ｇ、６１０．４ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で３時間撹拌する。さらにＣＤＩを添加することで、チオ尿素中間体の完全な消費を確実にすることができる。４２時間９０℃に加熱し、次いで、溶液を周囲温度まで冷却する。反応混合物を、酢酸エチル（２Ｌ）および２Ｎの塩酸水溶液（２Ｌ）で希釈し、撹拌し、ブライン（１Ｌ）を添加し、層を分離する。有機層を２Ｎの塩酸水溶液（０．５Ｌ）、ブライン（２×１Ｌ）、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１Ｌ）で洗浄する。硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残渣をもたらす。イソヘキサン中０〜１００％の酢酸エチルで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製して、淡黄色固形物としての表題化合物をもたらす（２３４ｇ、８３％）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４９９．０／５０１．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００７７】
調製２０
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（トリチルオキシメチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１、３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
スキーム１のステップＨ：Ｎ−［［（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（トリチルオキシメチル）テトラヒドロフラン−３−イル］カルバモチオイル］ベンズアミド（４２．９５ｇ，５９．１８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５９１ｍＬ）中に溶解させ、−２０℃に冷却する。ピリジン（１２．０ｍＬ、１４８．０ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、無水トリフルオロメタンスルホン酸（１０．９７ｍＬ、６５．１０ｍｍｏｌ）を添加する。温度を−２０℃未満に維持しつつ、添加をモニターする。反応混合物を−２０℃で３０分間、撹拌する。反応混合物を室温に温める。飽和塩化アンモニウムに注ぎ、相を分離し、ジクロロメタンで水相を抽出する。有機抽出物を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して表題化合物をもたらす（４５．２４ｇ、１０８％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）７０７／７０９［Ｍ＋Ｈ］。
【００７８】
調製２１
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（ヒドロキシメチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１、３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
スキーム１のステップＩ：ギ酸（１６０ｍＬ）中に、Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（トリチルオキシメチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（４５．２４、６３．９３ｍｍｏｌ）を溶解し、周囲温度で１時間撹拌する。水（２９ｍＬ）を５分間かけて添加する。５０分間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮して残渣をもたらす。残渣をメタノール（６３９ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（２６．７ｍＬ、１９１．８ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で一晩撹拌する。ブラインに注ぎ、相を分離し、クロロホルムで水相を抽出する。有機抽出物を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。濾過し、そして減圧下で濃縮して残渣を得る。アセトン：ヘキサン（２５〜３８％の勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（１６．０４ｇ、５４％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４６５／４６７［Ｍ＋Ｈ］。
【００７９】
調製物２２
（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボン酸
スキーム１のステップＪ：Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（ヒドロキシメチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１６．０４ｇ、３４．４７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（１７２ｍＬ）に添加する。２−ヨードキシ安息香酸（３５．５６ｇ、１２０．７０ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で３時間撹拌する。反応混合物をクロロホルム（３００ｍＬ）で希釈し、飽和塩化アンモニウム（４００ｍＬ）へ注ぐ。有機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、残渣をもたらす。残渣を酢酸エチル（４００ｍＬ）中に溶解し、飽和塩化アンモニウム（２×２５０ｍＬ）で洗浄する。有機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残渣をもたらす。残渣を、ジクロロメタンとメタノールとの混合物に溶解し、固形物が沈殿するまでジエチルエーテルを添加する。固形物を濾過により回収し、減圧下で乾固させ、表題化合物をもたらす（５．７８ｇ、３５％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４７９／４８１［Ｍ＋Ｈ］。
【００８０】
調製物２３
（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボキサミド
スキーム１のステップＫ：（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボン酸（５．７８ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０１ｍＬ）およびＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．７６ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）中に溶解させる。トリエチルアミン（５．２９ｍＬ、３６．２ｍｍｏｌ）、次いで、ＨＡＴＵ（７．０２ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を添加する。周囲温度で３時間撹拌する。飽和塩化アンモニウムに注ぎ、相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出する。有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。濾過し、そして減圧下で濃縮して残渣を得る。アセトン：ヘキサン（０〜５０％の勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（４．１５ｇ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）５２２／５２４［Ｍ＋Ｈ］。
【００８１】
調製物２４
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−５−アセチル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
スキーム１のステップＬ：臭化メチルマグネシウム（ジエチルエーテル中３．０ｍｏｌ／Ｌ、４．８ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５７．８ｍＬ）中の（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−５−カルボキサミド（１．５１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）の−７８℃溶液に滴下して添加する。反応物を−７８℃で５分間撹拌し、次いで、周囲温度に徐々に温める。３０分間撹拌する。反応をメタノール（４ｍＬ）でクエンチし、飽和塩化アンモニウムで希釈し、酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。濾過し、そして減圧下で濃縮して残渣を得る。酢酸エチル：ヘキサン（０〜１００％の勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（１．２８ｇ、９３％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４７７／４７９［Ｍ＋Ｎａ］。
【００８２】
調製２５
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロ［３，４−ｄ］］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
スキーム１のステップＭ：ジクロロメタン（３４ｍＬ）、Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（１．５２ｍＬ、６．８８ｍｍｏｌ）、および三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（０．８９ｍＬ、６．８８ｍｍｏｌ）を一緒に添加する。周囲温度で２時間撹拌する。Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−５−アセチル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．８２１ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を一度に添加し、続いて、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１．１３ｍＬ、６．８８ｍｍｏｌ）を添加する。室温で１８時間撹拌する。飽和塩化アンモニウムに注ぎ、相を分離し、酢酸エチルで水相を抽出する。有機抽出物を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。濾過し、そして減圧下で濃縮して残渣を得る。ジクロロメタン：ヘキサン（８０〜１００％の勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（０．５５２ｇ、６４％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４９９／５０１［Ｍ＋Ｈ］。
【００８３】
調製２６
Ｎ−［（５Ｓ，７ａＳ）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−７ａ−｛２−フルオロ−５−［（トリフルオロアセチル）アミノ］フェニル｝−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
スキーム４のステップＡ：Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２３４ｇ，４５４．６ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（２Ｌ）中に溶解し、窒素気流下で、４Åモレキュラーシーブ（３７ｇ）、２，２，２−トリフルオロアセトアミド（９１ｇ、７８０．９ｍｍｏｌ）、微粉砕炭酸カリウム（１１４ｇ、８２４．９ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（１１７ｇ、７８０．６ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（１７．５ｇ、９１．９ｍｍｏｌ）、およびラセミ体のトランス−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン（２０ｇ、１４０．６ｍｍｏｌ）を添加する。３つの真空窒素スイッチを用いて容器をパージし、１８時間、１２３℃に加熱する。周囲温度に冷却し、珪藻土を通して溶液を濾過し、酢酸エチルで洗浄する。飽和塩化アンモニウム水溶液（２Ｌ）を添加し、４５分間激しく撹拌する。層を分離し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液（３×１Ｌ）、ブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、残渣をもたらす。イソヘキサン中０〜１００％の酢酸エチルで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製して、淡黄色固形物としての表題化合物をもたらす（２９７．９ｇ、９５％、８１％の純度）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ  ５３２．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００８４】
調製２７
Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド
スキーム１のステップＮ：エタノール（３０ｍｌ）中、Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．３７２ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）および（１Ｒ，２Ｒ）−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン（０．０３７ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を合わせる。アジ化ナトリウム（０．１９４ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）、続いて、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（０．６６Ｍの溶液、０．５０ｍｌ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加する。フラスコの上部に窒素をパージし、硫酸銅（０．３３Ｍの溶液、０．６８ｍｌ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を８０℃に加熱し、５時間撹拌する。反応物を冷却し、冷水を添加する。混合物を酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。濾過し、そして減圧下で濃縮して残渣を得る。残渣をエタノール（５０ｍｌ）およびＴＨＦ（１０ｍｌ）中でパラジウム（炭素上１０質量％、０．３５ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）と合わせる。混合物に窒素および水素をパージする。５０ｐｓｉの水素下で１時間、周囲温度で撹拌する。触媒を濾別し、酢酸エチルで洗浄する。溶液を減圧下で濃縮して残渣をもたらす。酢酸エチル：ジクロロメタン（０〜２０％の勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（０．２１８４ｇ、６７％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４３６（Ｍ＋Ｈ）。
【００８５】
代替的な調製物２７
スキーム４のステップＢ：メタノール（６００ｍＬ、４．２ｍｏｌ）中の７Ｎのアンモニアを、室温で、メタノール（２００ｍＬ）中のＮ−［（５Ｓ，７ａＳ）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−７ａ−｛２−フルオロ−５−［（トリフルオロアセチル）アミノ］フェニル｝−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２５０ｇ、８０％の純度、３７６．３ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に添加し、周囲温度で１８時間撹拌する。濃縮乾固して、茶色ゴムとして表題化合物をもたらす（１９０ｇ、３７５．２ｍｍｏｌ、８６％の純度）。ＥＳ／ＭＳ：  ｍ／ｚ  ４３６．０［Ｍ＋Ｈ］。
【００８６】
調製２８
（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン
スキーム４のステップＢ：ピリジン（４００ｍＬ）、エタノール（１００ｍＬ）、およびＴＨＦ（３００ｍＬ）中に、Ｎ−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２１６．４ｇ、８８％の純度、４３５．９ｍｍｏｌ）を溶解する。Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１９０ｇ、２２７５．０ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で１８時間撹拌する。２−メチルテトラヒドロフラン（１Ｌ）で希釈し、水（２×３００ｍｌ）で洗浄する。有機層を単離し、水層に、３５％の水酸化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）を添加する。２−メチルテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）で抽出し、次いで、塩化ナトリウムで飽和させ、次いで、２−メチルテトラヒドロフラン（２×３００ｍＬ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、ブライン（３００ｍＬ）で抽出し、蒸発させて残渣をもたらす。メタノール（２００ｍＬ）中に溶解し、メタノール（１００ｍＬ、７００ｍｍｏｌ）中の７Ｎのアンモニアを添加し、次いで、室温で１８時間撹拌する。トリフルオロアセトアミド不純物が残っている場合は、さらにアンモニアを添加することができる。溶媒を減圧下で除去し、残渣を２Ｎの塩酸水溶液（１．５Ｌ）中に溶解させる。ジクロロメタン（６×５００ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、溶媒を減圧下で除去して、約１Ｌの総容量をもたらす。２Ｎの塩酸水溶液（３００ｍＬ）で洗浄し、全ての水性洗浄液を合わせる。２−メチルテトラヒドロフラン（１Ｌ）を添加し、炭酸水素ナトリウムでｐＨを塩基性に調整しながら、ガスの発生が観察されなくなるまで、激しく撹拌する。層を分離し、２−メチルテトラヒドロフラン（２×５００ｍＬ）で水性物を抽出する。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、次いで、蒸発させて、褐色固形物をもたらす。ＴＨＦ中の０〜１００％のジクロロメタンで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製する。酢酸エチル／ヘプタンを用いて、生成物を含有する画分を蒸発させて、ベージュ色微細粉末として表題化合物をもたらす（１０６ｇ、７０％、９５％の純度）。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ  ３３２．０［Ｍ＋Ｈ］，［α］Ｄ２０＝＋４２．１１°（Ｃ＝０．５３２、クロロホルム）。
【００８７】
調製２９
５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸
１００℃で１５時間、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）中の５−クロロピラジン−２−カルボン酸メチル（１２４ｇ、７１８．５５ｍｍｏｌ）、１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（１９８．５ｇ、２８７４．２ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（２９７．９２ｇ、２１５５．６ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌する。周囲温度まで冷却し、水（２Ｌ）に注入する。濃縮塩酸水溶液（約５００ｍＬ）を用いて、溶液のｐＨを２〜３に調節し、３０分間撹拌する。濾過によって得られた固体を回収し、水で洗浄する。水（５００ｍＬ）およびエタノール（５００ｍＬ）を添加し、４時間、５０〜６０℃に加熱し、次いで、周囲温度に冷却する。濾過によって固体を回収し、４０℃で真空下で乾燥させて、白色固体として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ  １９０．０（Ｍ−Ｈ）。
【００８８】
調製３０
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド
スキーム３のステップＡ：ジクロロメタン（４ｍｌ）：ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中で、Ｎ−［（４ａｓ，５ｓ，７ａｓ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．１３９ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸（０．０８５２ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、およびＨＯＡｔ（０．０５７５ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を共に添加する。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１１ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）、続いて、ＥＤＣＩ（０．０７９ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を一度に添加する。反応混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。溶液を酢酸エチルで抽出し、水およびブラインで洗浄し、相を分離する。酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、残渣をもたらす。酢酸エチル：ジクロロメタン（０〜３０％の勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（０．１１４０ｇ、５９％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ６０９（Ｍ＋Ｈ）。
【００８９】
実施例１
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド
【化１０】
2019530647.tif 000014
スキーム３のステップＢ：ＴＨＦ（２ｍＬ）およびエタノール（２ｍＬ）中、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（０．１１４８ｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（０．１５７５ｇ、１．８８６ｍｍｏｌ）、およびピリジン（０．１５ｍｌ、１．８８６ｍｍｏｌ）の混合物を４５℃で５時間加熱する。反応混合物を周囲温度に冷却し、２時間撹拌する。溶液を減圧下で濃縮して残渣をもたらす。メタノール：ジクロロメタン中の７ＮのＮＨ３（０〜３％の勾配）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物をもたらす（０．０８６ｇ、９０％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５０５（Ｍ＋Ｈ）。
【００９０】
代替的な調製実施例１
スキーム４のステップＤ：５０℃の窒素雰囲気下、酢酸エチル（１Ｌ）中で、（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４ａ，５，７，７ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−フロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（９６．５ｇ、２９１ｍｍｏｌ）を撹拌し、次いで、この温かい溶液に、５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボン酸（８４ｇ、４３９．４５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加する。１０分間撹拌し、Ｔ３Ｐ（登録商標）（酢酸エチル中１．６７Ｍ、３５０ｍＬ、５８５ｍｍｏｌ）を添加し、５０℃で１７時間撹拌する。周囲温度に冷却し、ジクロロメタン（１Ｌ）で希釈し、炭酸ナトリウム水溶液（１２８ｇ、１Ｌ中１．２１ｍｏｌ）でクエンチしながら撹拌する。ジクロロメタン（１Ｌ）および水（２Ｌ）で希釈し、次いで、１時間激しく撹拌する。珪藻土を通して濾過し、ジクロロメタン（３×５００ｍＬ）、メタノール（５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）、および１：１のメタノール：ジクロロメタン（６×５００ｍＬ）で洗浄する。層を分離し、ジクロロメタン（３×１Ｌ）で水性物を抽出する。全ての有機相を合わせ、次いで、蒸発させて、残渣をもたらす。この残渣をジクロロメタン（１Ｌ）中で１５分間超音波処理し、次いで、濾過により固形物を回収し、ジクロロメタン（５×２００ｍＬ）で洗浄する。ｐＨ８が得られるまで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、ジクロロメタン（１Ｌ）およびメタノール（５００ｍＬ）と共に激しく撹拌する。濾過により固形物を取り出し、濾液をジクロロメタン（２×５００ｍＬ）で抽出する。固形物をジクロロメタン：メタノール（１：１、５００ｍＬ）で溶解し、この溶液を他の有機相と合わせる。減圧下で溶媒を除去し、ジクロロメタンを添加して溶液を維持し、約３００ｍＬの最終容量が得られたら、ジクロロメタン中５％の０．３Ｍのアンモニア／メタノールで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーでこの溶液を精製して、薄茶色の固形物をもたらす。固形物を熱エタノール（２．５Ｌ）中に溶解し、熱いうちに濾過し、次いで、１時間かけて周囲温度に冷却する。濾過により固形物を回収し、エタノール（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させる。濾液を蒸発乾固させ、最初に５０：１のイソヘキサン／メタノール中７Ｎのアンモニア中の６５％の酢酸エチルで溶離し、次いで、５０：１の酢酸エチル／メタノール中の７Ｎアンモニアで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによりさらに精製する。必要ならば、さらなる精製をＳＦＣにより完了することができる。カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（５μ）、５０×２５０ｍｍ、溶離液：ＣＯ２中、３５％のイソプロパノール（０．２％のジエチルメチルアミン）、流速：３００ｇ／分、ＵＶ２２０ｎｍにて。蒸発および真空乾燥後、この材料をエタノール（１．５Ｌ）中で懸濁化し、次いで、穏やかに温めながら（３６〜４５℃）２０分間撹拌する。濾過により固形物を回収し、エタノール（１００ｍＬ）で洗浄する。さらなる材料を濾液から回収することができる。蒸発乾固し、エタノール中で還流し、熱濾過により固形物を除去し、次いで、濾液を周囲温度に冷却する。濾過により固形物を回収し、エタノールで洗浄し、次いで、上記の濾過から得られた物質と合わせる。固形物を真空下、４０℃で乾燥させて、白色固形物として表題化合物（１０３．３ｇ、６８％、２．５重量％のエタノールを含有）をもたらす。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ５０５．０（Ｍ＋Ｈ），［α］Ｄ２０＝＋１４９．４°（Ｃ＝１、クロロホルム）。
【００９１】
実施例１Ａ
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホナート
アセトン（９ｍＬ）および水（１ｍＬ）中に、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（６００ｍｇ、１．１８９ｍｍｏｌ）を溶解する。得られた懸濁液を６０℃に加熱する。アセトン（１ｍＬ）中に溶解したｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４２０ｍｇ、２．２０８ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を６０℃で一晩撹拌する。混合物を室温に冷却し、固形物を真空濾過し、アセトン（１ｍＬ）で洗浄し、一晩風乾させて、表題化合物をもたらす（７４３ｍｇ、７３％）。
【００９２】
Ｘ線粉末回折（ＸＲＤ）
結晶性固形物のＸＲＤパターンは、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備え、３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動する、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ４  Ｅｎｄｅａｖｏｒ  Ｘ線粉末回折計にて得られる。試料は、０．６ｍｍの発散スリット、５．２８の固定反拡散スリット、および９．５ｍｍの検出器スリットを用いて、２θにおいて０．００９°のステップサイズ、０．５秒／ステップの走査速度で、２θにおいて４〜４０°で走査される。乾燥粉末を石英試料ホルダに充填し、ガラススライドを使用して滑らかな表面を得る。結晶形の回折パターンは、周囲温度および相対湿度で回集される。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形に関して、結晶形態および晶癖などの要因から生じる好ましい配向に起因して、回折ピークの相対強度が変化し得ることは周知である。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ♯２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ♯１８，ｐａｇｅｓ  １８４３−１８４４，１９９５を参照されたい。さらに、任意の所定の結晶形について、角度ピーク位置はわずかに変化し得ることも、結晶学技術分野において周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度の変動、試料の位置ずれ、または内部標準の有無に起因してシフトし得る。本発明の場合、２θの±０．２のピーク位置の変動は、示された結晶形の明確な同定を妨げることなくこれらの起こり得る変動として考慮される。結晶形の確認は、特徴的なピーク（°２θの単位で）、典型的にはより顕著なピークの任意の固有の組み合わせに基づいて行われ得る。周囲温度および相対湿度で回集された結晶形の回析パターンは、８．８５３および２６．７７４度の２θにあるＮＩＳＴ６７５基準ピークに基づいて調整した。
【００９３】
調製試料である結晶性Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルホナートは、ＣｕＫａ放射線を用いたＸＲＤパターンにより、以下の表に記載されるような回折ピーク（２θ値）を有するものとして特徴付けられる。具体的には、このパターンは、回折角について０．２度の許容範囲を伴って、１４．８、１２．７、および４．９からなる群より選択される１つ以上のピークと合わせて、１７．３°におけるピークを含む。
【表３】
2019530647.tif 000015
【００９４】
実施例１Ｂ
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドマロネート
９５％のエタノール−水（１５ｍＬ）中に、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（２０１ｍｇ、０．３９８ｍｍｏｌ）およびマロン酸（１０４ｍｇ、０．９９９ｍｍｏｌ）を合わせて添加する。溶液が透明な溶液になるまで、混合物を６５℃で撹拌する。数分後、濃い白色固形物が沈殿する。懸濁液を５５℃で１時間撹拌し、次いで、攪拌しながら室温まで冷却する。固形物を真空下で濾過し、２日間乾固させ、表題化合物をもたらす（４７７ｍｇ、８０％）。
【００９５】
調製試料である結晶性Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミドマロネートは、ＣｕＫａ放射線を用いたＸＲＤパターンにより、以下の表２に記載されるような回折ピーク（２θ値）を有するものとして特徴付けられる。具体的には、このパターンは、回折角について０．２度の許容範囲を伴って、１６．８、１７．２、および２４．０からなる群より選択される１つ以上のピークと合わせて、２２．７におけるピークを含む。
【表４】
2019530647.tif 000016
【００９６】
実施例１Ｃ
Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド水和物
１：１のＴＨＦ：水（２ｍＬ）中、７０℃で、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド（１１６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を懸濁させる。溶液を少なくとも２日間撹拌し、窒素気流下で乾燥して、表題化合物をもたらす。
【００９７】
調製試料であるＮ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド水和物は、ＣｕＫａ放射線を用いたＸＲＤパターンにより、以下の表３に記載されるような回折ピーク（２θ値）を有するものとして特徴付けられる。具体的には、このパターンは、回折角について０．２度の許容範囲を伴って、７．８、１０．５、１１．０、１４．９、１９．７、２１．３、および２６．９からなる群より選択される１つ以上のピークと合わせて、１３．０におけるピークを含む。
【表５】
2019530647.tif 000017
【００９８】
インビトロアッセイ手順：
ＢＡＣＥ１のＢＡＣＥ２に上回る選択性を評価するために、以下に記載されるように、試験化合物を、ＢＡＣＥ１およびＢＡＣＥ２に対する特異的な基質を用いたＦＲＥＴに基づく酵素アッセイにおいて、評価する。インビトロ酵素および細胞アッセイのために、試験化合物を、ＤＭＳＯ中で調製し、１０ｍＭ原液を作製する。原液は、ＤＭＳＯ中で段階希釈されて、インビトロ酵素および全細胞アッセイを実施する前に、９６ウェル丸底プレート中で、１０μＭ〜０．０５ｎＭの範囲の最終化合物濃度を有する、１０点希釈曲線を得る。
【００９９】
インビトロプロテアーゼ阻害アッセイ：
ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃの発現。
【０１００】
ＲＴ−ＰＣＲにより全脳ｃＤＮＡからヒトＢＡＣＥ１（受託番号：ＡＦ１９０７２５）およびヒトＢＡＣＥ２（受託番号：ＡＦ２０４９４４）をクローニングする。アミノ酸配列番号１〜４６０に対応するヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに挿入する（Ｖａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４２（１９９９））。それぞれｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃと名づけられた、この、ＢＡＣＥ１（１−４６０）またはＢＡＣＥ２（１−４６０）と、ヒトＦｃとの融合タンパク質を、ｐＪＢ０２ベクター中に構築する。ヒトＢＡＣＥ１（１−４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ）およびヒトＢＡＣＥ２（１−４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃ）は、ＨＥＫ２９３細胞内で一時的に発現する。各構築物の２５０μｇのｃＤＮＡは、Ｆｕｇｅｎｅ  ６と混合され、１リットルのＨＥＫ２９３細胞に添加される。トランスフェクションの４日後、培養上清を、精製のために採取する。ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃを、以下に記載するように、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製する。酵素は、小アリコートで−８０℃で貯蔵される。（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９１（６）１２４９−５９（２００４）を参照されたい）。
【０１０１】
ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃおよびｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃの精製。
【０１０２】
ｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃまたはｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃ  ｃＤＮＡを用いて一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の条件培地を回収する。０．２２μｍの滅菌フィルターを通じて培養上清を濾過することによって細胞残屑を除去する。５ｍＬのプロテインＡ−アガロース（ベッド体積）が４リットルの条件培地に添加される。この混合物を４℃で一晩穏やかに撹拌する。プロテインＡ−アガロース樹脂を回収し、低圧クロマトグラフィカラムに詰める。カラムは、１時間当たり２０ｍＬの流速で、２０×ベッド容量のＰＢＳで洗浄する。結合したｈｕＢＡＣＥ１：ＦｃまたはｈｕＢＡＣＥ２：Ｆｃのタンパク質を、１時間当たり２０ｍＬの流速で、５０ｍＭの酢酸、ｐＨ３．６で溶離する。溶離剤の１ｍＬの画分を、０．５ｍＬの２００ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５を用いて速やかに中和する。最終生成物の純度は、４〜２０％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける電気泳動によって評価される。酵素は、小アリコートで−８０℃で貯蔵される。
【０１０３】
ＢＡＣＥ１のＦＲＥＴアッセイ
試験化合物の段階希釈物を、上述の通り調製する。化合物を、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中でさらに２０×希釈する。１０μＬの各希釈物を、反応混合物（２５μＬの５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．６、１ｍＭのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、およびＡＰＰの配列に基づく１５μＭのＦＲＥＴ基質）を含有する対応する低タンパク質結合ブラックプレートのＡ〜Ｈ列の各ウェルに添加する（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９１（６）１２４９−５９（２００４）を参照されたい）。含有物は、１０分間プレートシェーカー上で十分に混合される。ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中の２００ｐＭのヒトＢＡＣＥ１（１−４６０）：Ｆｃ（Ｖａｓｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、７３５−７４１（１９９９）を参照されたい）１５μＬを、基質および試験化合物を含有するプレートに添加し、反応を開始させる。０時間における混合物のＲＦＵは、プレートシェーカー上での短時間の混合後、励起波長３５５ｎｍおよび放出波長４６０ｎｍで記録される。反応プレートは、アルミホイルで被覆され、１６〜２４時間室温で、暗い加湿オーブン内で保持される。インキュベーションの終わりにおけるＲＦＵは、０時間において使用された同じ励起および放出設定で記録される。０時間におけるＲＦＵとインキュベーションの終わりの差は、化合物処理下でのＢＡＣＥ１の活性を表す。ＲＦＵの差は、阻害剤濃度に対してプロットされ、曲線は、ＩＣ５０値を得るために、４パラメータロジスティック方程式に適合される。（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１，１６５０７−１６５１６（２０１１））。
【０１０４】
本明細書の実施例１の化合物は、本質的に上述の通り試験され、ＢＡＣＥ１について、１．１９ｎＭ±０．４８、ｎ＝４（平均±ＳＥＭ、ＳＥＭ＝平均値の標準誤差）のＩＣ５０を示す。このデータは、実施例１の化合物が、インビトロで、精製された組み換えＢＡＣＥ１酵素活性を阻害することを実証する。
【０１０５】
ＢＡＣＥ２  ＴＭＥＭ２７のＦＲＥＴアッセイ
膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）（受託番号ＮＭ＿０２０６６５）コレクトリンとしても既知）は、ＢＡＣＥ１ではなくＢＡＣＥ２に対する近年記載された基質である（Ｅｓｔｅｒｈａｚｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１４，３６５−３７７（２０１１））。ＢＡＣＥ２酵素活性の阻害に関して試験化合物を評価するために、ヒトＴＭＥＭ２７のアミノ酸配列に基づくＦＲＥＴペプチド（ｄａｂｃｙｌ−ＱＴＬＥＦＬＫＩＰＳ−ＬｕｃＹ）を基質として用いる（Ｅｓｔｅｒｈａｚｙら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１４、３６５−３７７（２０１１））。試験化合物の段階希釈物を、上述の通り調製する。化合物を、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中でさらに２０×希釈する。各希釈物の１０μＬを、反応混合物（２５μＬの５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．６、１ｍＭのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、および５μＭのＴＭＥＭ  ＦＲＥＴ基質）を含有する対応する低タンパク質結合ブラックプレートのＡ〜Ｈ列の各ウェルに添加する。次いで、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中の２０μＭのヒトＢＡＣＥ２（１−４６０）：Ｆｃ（Ｖａｓｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、７３５−７４１（１９９９）を参照されたい）１５μＬを、基質および試験化合物を含有するプレートに添加し、反応を開始させる。含有物は、１０分間プレートシェーカー上で十分に混合される。０時間における混合物のＲＦＵは、励起波長４３０ｎｍおよび放出波長５３５ｎｍで記録される。反応プレートは、アルミホイルで被覆され、１６〜２４時間室温で、暗い加湿オーブン内で保持される。インキュベーションの終わりにおけるＲＦＵは、０時間において使用された同じ励起および放出設定で記録される。０時間におけるＲＦＵとインキュベーションの終わりの差は、化合物処理下でのＢＡＣＥ２の活性を表す。ＲＦＵの差は、阻害剤濃度に対してプロットされ、曲線は、ＩＣ５０値を得るために、４パラメータロジスティック方程式に適合される。（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１，１６５０７−１６５１６（２０１１））。
【０１０６】
本明細書の実施例１の化合物は、本質的に上述の通り試験され、ＢＡＣＥ２について、４７９ｎＭ±２０２、ｎ＝４（平均±ＳＥＭ、ＳＥＭ＝平均値の標準誤差）のＩＣ５０を示す。ＢＡＣＥ１（ＦＲＥＴ  ＩＣ５０酵素アッセイ）のＢＡＣＥ２（ＴＭＥＭ２７  ＦＲＥＴ  ＩＣ５０アッセイ）に対する比は、約４００倍であり、ＢＡＣＥ１酵素を阻害するための機能的選択性を示す。上記のデータは、実施例１の化合物がＢＡＣＥ２よりもＢＡＣＥ１に対して選択的であることを実証する。
【０１０７】
ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ全細胞アッセイ
ＢＡＣＥ１活性の阻害の測定のための慣例的な全細胞アッセイは、ヒトＡＰＰ６９５ＷｔのｃＤＮＡを安定的に発現する、ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ２２６６）を利用する。細胞は、慣例的には継代数６代まで使用し、その後廃棄する。
【０１０８】
ＳＨ−ＳＹ５ＹＡＰＰ６９５Ｗｔ細胞は、２００μＬの培養培地（１０％ＦＢＳを含有する、５０％ＭＥＭ／ＥＢＳＳおよびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２、１×各ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ならびに重炭酸ナトリウム）中、５．０×１０４細胞／ウェルで、９６ウェル組織培養プレートで平板培養される。翌日、培地を細胞から除去し、新鮮培地が添加され、次いで、所望の濃度範囲において、試験化合物の存在／非存在下で、３７℃で２４時間インキュベートされる。
【０１０９】
インキュベーションの終わりに、培養上清を、特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによるＡベータペプチド１−４０および１−４２の分析によって、ベータ−セクレターゼ活性の実証のために分析する。Ａベータのこれらの特異的イソ型を測定するために、モノクローナル２Ｇ３を、Ａベータ１−４０のための捕捉抗体として使用し、モノクローナル２１Ｆ１２を、Ａベータ１−４２のための捕捉抗体として使用する。Ａベータ１−４０とＡベータ１−４２のＥＬＩＳＡの両方は、レポーティング抗体としてビオチン化３Ｄ６を使用する（抗体の説明について、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１５５０−１５５５（１９９７）を参照）。化合物による処理後に培養上清中に放出されたＡベータの濃度は、そのような条件下でＢＡＣＥ１の活性に対応する。１０点阻害曲線がプロットされ、４パラメータロジスティック方程式に適合されて、Ａベータ低下効果に対するＩＣ５０値を得る。実施例１の化合物は、本質的に上述したように試験され、表４に示されるようにＡベータ低下について以下の活性を示す。
【表６】
2019530647.tif 000018
【０１１０】
ベータ−セクレターゼのインビボ阻害
マウス、モルモット、イヌ、およびサルを含むいくつかの動物モデルが、化合物による処理後のインビボでのベータ−セクレターゼ活性の阻害についてスクリーニングするために使用され得る。本発明で使用される動物は、野生型、トランスジェニック、または遺伝子ノックアウト動物であってもよい。例えば、Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３、５２３−５２７（１９９５）に記載されるように作製されたＰＤＡＰＰマウスモデル、および他の非トランスジェニックまたは遺伝子ノックアウト動物は、阻害性化合物の存在下でＡベータおよびｓＡＰＰベータ産生のインビボ阻害を分析するために有用である。概して、２ヶ月齢のＰＤＡＰＰマウス、遺伝子ノックアウトマウス、または非トランスジェニック動物は、経口、皮下、静脈内、給餌、または他の投与経路を介して、トウモロコシ油、ベータ−シクロデキストリン、リン酸緩衝液、ＰＨＡＲＭＡＳＯＬＶＥ（登録商標）、または他の好適な媒体などの媒体中で製剤化された化合物が投与される。化合物の投与の１〜２４時間後、動物は屠殺され、脳はＡベータ１−ｘの分析のために除去される。本明細書で使用される場合、「Ａベータ１−ｘ」は、残基１で開始し、残基２８よりも大きいＣ末端で終端する、Ａベータ種の合計を指す。これは、Ａベータ種の過半数を検出し、しばしあば「全Ａベータ」と呼ばれる。全Ａベータペプチド（Ａベータ１−ｘ）のレベルは、モノクローナル２６６を捕捉抗体として、およびビオチン化３Ｄ６をレポーティング抗体として使用した、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される。（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１，１６５０７−１６５１６（２０１１）を参照）。
【０１１１】
急性試験のために、化合物または適切な媒体が投与され、動物は投与の約３時間後に屠殺される。脳組織は、選択された動物から得られ、Ａベータ１−ｘの存在に関して分析される。慢性投与後、より高齢のＡＰＰトランスジェニック動物の脳組織はまた、化合物処理後のベータ−アミロイドプラークの量に関して分析され得る。
【０１１２】
阻害化合物が投与された動物（ＰＤＡＰＰまたは他のＡＰＰトランスジェニックもしくは非トランスジェニックマウス）は、媒体処理された対照または０時間の対照と比較して、脳組織内でＡベータの低減を実証し得る。例えば、若齢雌ＰＤＡＰＰマウスへの、実施例１の３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇの経口投与は、脳海馬内のＡベータ１−ｘペプチドレベルを、それぞれ、２３％（有意でない）、４３％（ｐ＜０．０５）、および５８％（ｐ＜０．０１）だけ低減した。脳皮質組織において、実施例１の３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇの投与は、投与３時間後に、媒体処理されたマウスと比較して、Ａベータ１−ｘペプチドレベルを４３％、５９％、および７３％（全ての値ｐ＜０．０１）だけ低減した。
【０１１３】
インビトロでのＢＡＣＥ１酵素に対する実施例１の活性を考慮すると、これらのＡベータ低下効果は、インビボでのＢＡＣＥ阻害と一致し、実施例１のＣＮＳへの透過をさらに実証する。
【０１１４】
実施例２
操作されたＮ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体の発現および精製
本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体（抗体ＩまたはＩＩ）は、本質的に以下のように発現され、かつ精製され得る。配列番号１２または１３のＬＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列および配列番号１１のＨＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターは、電気穿孔によってチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）をトランスフェクトするために使用される。この発現ベクターは、ＳＶ初期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよトランスフェクトした後、細胞は、０〜５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でのバルク選択を受ける。その後、選択されたバルク細胞またはマスターウェルが無血清懸濁培養で増殖させて、産生で使用される。
【０１１５】
抗体が分泌された浄化培地が、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合性緩衝液で平衡化されたタンパク質Ａ親和性カラムに適用される。このカラムを１ＭのＮａＣｌで洗浄し、非特異的結合構成成分を除去する。結合した抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体は、例えば、ｐＨ（約）３．５でクエン酸ナトリウムで溶離され、次いで、この画分を１Ｍのトリス緩衝液で中和する。抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体画分がＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって検出され、その後、プールされる。本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）または１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（およそｐＨ６）中のいずれかで濃縮される。最終材料は、一般的な技法を使用して滅菌濾過され得る。抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体の純度は、９５％超である。本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）は、−７０℃で即座に凍結され得るか、または４℃で数ヶ月間保管され得る。
【０１１６】
結合親和性および動態
抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）のｐＥ３−４２  ＡβペプチドまたはＡβ  １−４０ペプチドに対する結合親和性および動態は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＣＭＳチップ上に固定化されたタンパク質Ａを介して抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体を捕捉し、２倍連続希釈で１００ｎＭから開始して３．１２５ｎＭまでｐＥ３−４２  ＡβペプチドまたはＡβ１−４０ペプチドを流すことによって測定される。これらの実験は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ１００６６９、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で、２５℃で行われる。
【０１１７】
各サイクルについて、抗体は、１０μＬ／分の流量での１０μｇ／ｍＬの濃度の抗体溶液の５μＬ注入により捕捉される。ペプチドは、５０μＬ／分での２５０μＬ注入により結合され、その後１０分間解離される。チップ表面は、１０μＬ／ｍＬの流量でグリシン緩衝液（ｐＨ１．５）の５μＬ注入で再生される。データは、１：１ラングミュア結合モデルに適合され、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを導出し、ＫＤを計算する。
本質的に上に記載される手順に従って、以下のパラメータ（表２に示される）が観察された。
【表７】
2019530647.tif 000019
【０１１８】
Ａβ  １−４０への認識できる結合は検出されず、抗体Ｉおよび抗体ＩＩがＡβ  １−４０と比較してｐＥ３−４２  Ａβペプチドに特異的に結合したことを示す。
【０１１９】
エクソビボ標的会合
固定したＰＤＡＰＰ脳由来の脳切片におけるエクスビボ標的会合を決定するために、外因的に付加された抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）を用いて免疫組織化学的分析を行う。老齢ＰＤＡＰＰマウス（２５ヶ月齢）由来のクリオスタット連続冠状切片を、２０μｇ／ｍＬの本発明の例示のＮ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）とインキュベートする。ヒトＩｇＧに特異的な二次ＨＲＰ試薬を用い、沈着したプラークをＤＡＢ−Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）で可視化する。ビオチン化マウス３Ｄ６抗体、続いて、Ｓｔｅｐ−ＨＲＰ二次抗体を陽性対照として使用する。陽性対照抗体（ビオチン化３Ｄ６）は、ＰＤＡＰＰ海馬中のかなりの量の沈着したＡβを標識し、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体（抗体Ｉまたは抗体ＩＩ）は、沈着物のサブセットを標識した。これらの組織学的研究により、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ抗体（抗体Ｉおよび抗体ＩＩ）がエクスビボで沈着したＡβ標的に会合したことが実証された。
【０１２０】
以下の実施例およびアッセイは、本明細書に概説される化合物と組み合わされた、本発明の抗体の組み合わせが、アルツハイマー病、ダウン症候群、およびＣＡＡなどのＡβの沈着を特徴とする疾患の治療に有用であり得ることを（動物モデルにおいて）検証するために、研究をどのように設計することができるかを実証する。しかしながら、以下の説明が例証として記載されており、限定するものではなく、様々な修正が当業者によって加えられ得ることを理解されたい。
【０１２１】
組み合わせ研究
ＢＡＣＥ阻害剤給餌パイロット研究
ＢＡＣＥ阻害単独による、最小ないし著しい血漿および脳Ａベータ減少をもたらす用量を決定するために、薬物動態学的および薬力学的パイロット研究を、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩などのＢＡＣＥ阻害剤を含有する固形飼料食餌を給餌されたＰＤＡＰＰマウスにおいて実施する。若齢ＰＤＡＰＰマウスに、ＢＡＣＥ阻害剤を含有する固形飼料食餌を含有する食餌を、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの「準１日２回（ｑｕａｓｉ−ｂｉｄ）」等価用量で１４日間給餌する。認定された齧歯類食餌番号８７２８ＣＭ（Ｈａｒｌａｎ  ｌａｂｓ）１グラム当たり約０．０５、０．１５、０．５、または１．５ｍｇのＢＡＣＥ阻害剤をＳｏｒｖａｌｌミキサーで１０分間混合し、次いで、Ｈｏｂａｒｔミキサーで１５分間混合した後に、ペレット化する。３２匹の若齢雌ＰＤＡＰＰマウスを、親系統によりビヒクル処理群および３つの用量のＢＡＣＥ阻害剤からなる４つの群（８匹）に無作為に分ける。マウスは、１４日間自由に餌に接近することができ、その後、屠殺される。マウスをＣＯ２で麻酔し、血液を心穿刺により回収してＥＤＴＡ被覆微小遠心分離管内に入れ、氷上で保管する。その後、血漿を１４，０００ｒｐｍで４分間の血液試料の遠心分離により室温で回集し、未処理の微小遠心分離管に移し、その後、ドライアイス上で凍結させ、分析まで−８０℃で保管する。マウスを骨頭切除術により屠殺し、脳を迅速に半分に顕微解剖し、ドライアイス上で急速凍結させ、分析まで−８０℃で保管する（半分をＡベータ分析のため、残りの半分を化合物曝露測定のため）。実質性Ａベータの分析のために、脳試料を、５．５Ｍのグアニジン−ＨＣｌ緩衝液（脳半分当たり０．５ｍＬ）中で、ｔｉｓｓｕｅ  ｔｅａｒｅｒ（モデル９８５−３７０）を速度５で用いて約１分間均質化する。均質化した脳試料を室温で一晩垂下させる。
【０１２２】
ＡベータＥＬＩＳＡ分析の場合、抽出物を回集し、カゼイン緩衝液（プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ｐ９３４０、０．０１ｍｇ／ｍＬ）を含む、０．２５％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％チメロサールを有する１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４））中に少なくとも１：１０で希釈し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。血漿Ａベータの分析の場合、ＥＬＩＳＡによる分析の前に、試料を検体緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５、０．０４％のチメロサール、０．６％のＢＳＡ）中に１：２で希釈する。血漿ヒトＡベータ１−ｘ  を、ｍ２６６．２（抗Ａベータ１３−２８）およびビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−５）を各々捕捉抗体およびレポーター抗体として使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定する。未知物質を二連でアッセイし、ｐｇ／ｍＬを、８点標準曲線から内挿することによって決定し（Ｓｏｆｔ  Ｍａｘ  Ｐｒｏ  ｖ．５．０．１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、基準曲線の４パラメータ適合を使用）、その後、希釈のために調整する。実質性Ａベータを上述のようにサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定し、値をタンパク質レベルに正規化し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ法によって二連で決定される）、ｐｇ／ｍｇ単位のタンパク質として表す。
【０１２３】
ＢＡＣＥ阻害剤の組織および血漿レベルを決定するために、以下の方法を用いる：ＢＡＣＥ阻害剤の０．１ｍｇ／ｍＬストック溶液をメタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）で連続希釈して希釈標準溶液を調製し、その後、これを使用して対照血漿および脳ホモジネートを強化して、１、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、２０００、４０００、および５０００ｎｇ／ｍＬの分析物濃度を得る。分析前に、脳試料を、超音波破砕機を用いて３体積のメタノール／水（１：４、ｖ／ｖ）中で均質化する。各研究試料のアリコート、適切な較正標準、および対照マトリックス試料を９６ウェルプレートに移し、その後、アセトニトリル含有内部標準と混合する。混合後、試料を遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化する。その後、結果として生じた上清のアリコートを清潔な９６ウェルプレートに移し、メタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈し、１０マイクロリットルのアリコートをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。分析物濃度を、較正曲線試料の重回帰により決定した応答と濃度との関係を使用して計算する。
【０１２４】
インビボ組み合わせ研究
ｈＥ８Ｌ、抗体Ｉまたは抗体ＩＩなどの抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩などのＢＡＣＥ阻害剤との組み合わせによるプラーク低下療法を評価するために、ＰＤＡＰＰマウスの大規模コホートを最初に１６〜１８月齢にする。これらの老齢ＰＤＡＰＰマウスを、性別、親系統、および月齢に基づいて５つの処理アームに無作為に分ける。処理アーム毎に２０〜３０匹の老齢ＰＤＡＰＰマウスが存在する。第１群を研究開始時ゼロ時間で屠殺し、治療的治療前の病変のベースラインレベルを決定する（死体解剖を以下に記載）。その後、残りの４つの群を以下のように処置する：第２群：プラセボ固形飼料食餌を与えられ、かつ１２．５ｍｇ／ｋｇの対照アイソタイプＩｇＧ２ａ抗体の注入を毎週受けた対照動物；第３群：１２．５ｍｇ／ｋｇの抗Ｎ３ｐＧｌｕ−Ａベータ抗体の注入を毎週受けた動物；第４群：パイロット給餌研究で予め定義された用量であるが、典型的には約３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、ＢＡＣＥ阻害剤固形飼料食餌を与えられた動物；第５群：ＢＡＣＥ阻害剤固形飼料食餌（約３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日）を与えられ、かつ１２．５ｍｇ／ｋｇの抗Ｎ３ｐＧｌｕ−Ａベータ抗体の注入を毎週受けた動物。抗Ｎ３ｐＧｌｕ−Ａベータ抗体を抗体からなる滅菌ストック溶液からＰＢＳ緩衝液中に希釈し、腹腔内注射により動物に投与する。ＢＡＣＥ阻害剤を軟固形飼料食餌（所望の用量に応じて給餌１グラム当たり約０．１５〜１．５ｍｇの化合物）と混合し、圧縮して給餌ペレットにする。動物の体重を研究開始時に記録し、その後、処理の最初の１ヶ月間にわたって毎週、その後、研究期間にわたって毎月記録する。餌摂取も本研究にわたって一定間隔で監視する。これらの動物は、合計４ヶ月にわたって研究処理を受ける。これらの動物は、最終抗体注入の１週間後に行われる死体解剖までそれぞれの食餌を続ける。死体解剖時、動物を麻酔し、ＥＤＴＡで事前にすすいだ１ｍＬのシリンジを使用して、心穿刺により、血液を得る。血液試料を氷上に回集し、血漿を標準の遠心分離により単離する。その後、動物に冷ヘパリン化生理食塩水を灌流し、脳を取り出し、左半球と右半球に解剖する。一方の脳半球を急速凍結させ、組織学的分析のために取っておく。残りの脳半球を、海馬、皮質、小脳、および中脳からなる組織切片に解剖し、その後、ドライアイス上で凍結させる。血漿試料および組織試料を分析時まで−８０℃で保管する。
【０１２５】
薬物動態学的評価
血漿薬物動態を死体解剖時に得られた血漿試料で決定する。プレートを抗原（Ａベータｐ３−４２）でコーティングし、その後、希釈した血漿試料、またはアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋対照マウス血漿）中の抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体の連続希釈からなる参照標準と共にインキュベートする、抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、血漿抗体レベルを決定する。プレートを洗浄した後、結合したマウス抗体を、抗マウス−ＨＲＰコンジュゲート抗体で検出し、続いて、ＴＭＢで発色させる。ＢＡＣＥ阻害剤の組織（中脳）および血漿レベルを決定するために、以下の方法を用いる：ＢＡＣＥ阻害剤の０．１ｍｇ／ｍＬストック溶液をメタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）で連続希釈して希釈標準溶液を調製し、その後、これを使用して対照血漿および脳ホモジネートを強化して、１、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、２０００、４０００、および５０００ｎｇ／ｍＬの分析物濃度を得る。分析前に、脳試料を、超音波破砕機を用いて３体積のメタノール／水（１：４、ｖ／ｖ）中で均質化する。各研究試料のアリコート、適切な較正標準、および対照マトリックス試料を９６ウェルプレートに移し、その後、アセトニトリル含有内部標準と混合する。混合後、試料を遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化する。その後、結果として生じた上清のアリコートを清潔な９６ウェルプレートに移し、メタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈し、１０マイクロリットルのアリコートをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。分析物濃度を、較正曲線試料の重回帰により決定した応答と濃度との関係を使用して計算する。
【０１２６】
薬力学的評価
実質性Ａベータ濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡによりグアニジン可溶化組織ホモジネート中で決定する。組織抽出を、凍結した組織を１ｍＬのシリコン処理したガラスビーズを含有する２ｍＬのディープウェルディッシュ中の１ｍＬの５．５Ｍグアニジン／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．５倍プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐＨ８．０）中に抽出するビーズビーター技術を用いて行う（密封プレートを３分間隔で２回振盪した）。結果として生じた組織溶解物を、Ａベータ１−４０およびＡベータ１−４２についてサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析し、ビーズビーター試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中に１：１０で希釈し、試料濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過する。試料、ブランク、標準物、品質管理試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中０．５５Ｍグアニジン／５ｍＭ  Ｔｒｉｓ中にさらに希釈した後に、試料プレートに充填する。参照標準物を試料希釈剤中に希釈する。捕捉抗体２１Ｆ１２（抗Ａベータ４２）または２Ｇ３（抗Ａベータ４０）で１５μｇ／ｍＬで被覆したプレートを試料とインキュベートし、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中に希釈したビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−ｘ）、続いて、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中１：２０Ｋ希釈ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出を達成し、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色現像する。Ａベータレベルを標準曲線から内挿し、最終組織濃度を組織１ミリグラム（湿重量）当たりのＡベータのナノグラムとして計算する。沈着したＡベータが占有した海馬および皮質の面積パーセントを組織学的決定する。クリオスタット連続冠状切片（厚さ７〜１０μｍ）を１０μｇ／ｍＬのビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−ｘ）または陰性対照マウスＩｇＧ（ビオチン化）とインキュベートする。ビオチンに特異的な二次ＨＲＰ試薬を用い、沈着したＡベータをＤＡＢ−Ｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）で可視化する。海馬または皮質内の目的とする定義された領域内の免疫反応性Ａベータ沈着を、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて捕捉した画像を分析することによって定量化する。
【０１２７】
これらの研究は、ｈＥ８Ｌ、Ｂ１２Ｌ、Ｒ１７Ｌ、抗体Ｉ、または抗体ＩＩなどの抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩などのＢＡＣＥ阻害剤との併用療法が、個々の単一療法と比較して、Ａベータ低減の強化をもたらし得ることを示し得る。
【０１２８】
配列
＜配列番号１、ＰＲＴ１、人工的＞ＨＣＤＲ１−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ
［配列表１］
2019530647.tif 000020
＜配列番号２、ＰＲＴ１、人工的＞ＨＣＤＲ２−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ
抗体Ｉおよび抗体ＩＩ  ＨＣＤＲ２（配列番号２）
［配列表２］
2019530647.tif 000021
＜配列番号３、ＰＲＴ１、人工的＞ＨＣＤＲ３−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ
［配列表３］
2019530647.tif 000022
＜配列番号４、ＰＲＴ１、人工的＞ＬＣＤＲ１−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ
［配列表４］
2019530647.tif 000023
＜配列番号５、ＰＲＴ１、人工的＞ＬＣＤＲ２−抗体ＩＩ
［配列表５］
2019530647.tif 000024
＜配列番号６、ＰＲＴ１、人工的＞ＬＣＤＲ２−抗体Ｉ
［配列表６］
2019530647.tif 000025
＜配列番号７、ＰＲＴ１、人工的＞ＬＣＤＲ３−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ
［配列表７］
2019530647.tif 000026
＜配列番号８、ＰＲＴ１、人工的＞ＨＣＶＲ−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ
［配列表８］
2019530647.tif 000027
＜配列番号９、ＰＲＴ１、人工的＞ＬＣＶＲ−抗体Ｉ
［配列表９］
2019530647.tif 000028
＜配列番号１０、ＰＲＴ１、人工的＞ＬＣＶＲ−抗体ＩＩ
［配列表１０］
2019530647.tif 000029
＜配列番号１１、ＰＲＴ１、人工的＞重鎖−抗体Ｉおよび抗体ＩＩ
［配列表１１］
2019530647.tif 000030
＜配列番号１２、ＰＲＴ１、人工的＞軽鎖−抗体Ｉ
［配列表１２］
2019530647.tif 000031
＜配列番号１３、ＰＲＴ１、人工的＞軽鎖−抗体ＩＩ
［配列表１３］
2019530647.tif 000032
＜配列番号１４、ＤＮＡ、人工的＞配列番号１１の抗体重鎖を発現するための例示的ＤＮＡ
［配列表１４］
2019530647.tif 000033
＜配列番号１５、ＤＮＡ、人工的＞配列番号１２の抗体軽鎖を発現するための例示的ＤＮＡ
［配列表１５］
2019530647.tif 000034
＜配列番号１６、ＤＮＡ、人工的＞配列番号１３の抗体軽鎖を発現するための例示的ＤＮＡ
［配列表１６］
2019530647.tif 000035
＜配列番号１７、ＰＲＴ１、人工的＞（ＬＣＤＲ１−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ／ｈＥ８Ｌ）
［配列表１７］
2019530647.tif 000036
＜配列番号１８、ＰＲＴ１、人工的＞（ＬＣＤＲ２−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ／ｈＥ８Ｌ）
［配列表１８］
2019530647.tif 000037
＜配列番号１９、ＰＲＴ１、人工的＞（ＬＣＤＲ３−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ／ｈＥ８Ｌ）
［配列表１９］
2019530647.tif 000038
＜配列番号２０、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＤＲ１−Ｂ１２Ｌ）
［配列表２０］
2019530647.tif 000039
＜配列番号２１、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＤＲ１−Ｒ１７Ｌ）
［配列表２１］
2019530647.tif 000040
＜配列番号２２、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＤＲ２−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ／ｈＥ８Ｌ）
［配列表２２］
2019530647.tif 000041
＜配列番号２３、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＤＲ３−Ｂ１２Ｌ）
［配列表２３］
2019530647.tif 000042
＜配列番号２４、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＤＲ３−Ｒ１７Ｌ）
［配列表２４］
2019530647.tif 000043
＜配列番号２５、ＰＲＴ１、人工的＞（ＬＣＶＲ−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ）
［配列表２５］
2019530647.tif 000044
＜配列番号２６、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＶＲ−Ｂ１２Ｌ）
［配列表２６］
2019530647.tif 000045
＜配列番号２７、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＶＲ−Ｒ１７Ｌ）
［配列表２７］
2019530647.tif 000046
＜配列番号２８、ＰＲＴ１、人工的＞（ＬＣ−Ｂ１２Ｌ／Ｒ１７Ｌ）
［配列表２８］
2019530647.tif 000047
＜配列番号２９、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣ−Ｂ１２Ｌ）
［配列表２９］
2019530647.tif 000048
＜配列番号３０、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣ−Ｒ１７Ｌ）
［配列表３０］
2019530647.tif 000049
Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａβ  （配列番号３１）
［配列表３１］
2019530647.tif 000050
＜配列番号３２、ＰＲＴ１、人工的＞（ＬＣＶＲ−ｈＥ８Ｌ）
［配列表３２］
2019530647.tif 000051
＜配列番号３３、ＰＲＴ１、人工的＞（ＬＣ−ｈＥ８Ｌ）
［配列表３３］
2019530647.tif 000052
＜配列番号３４、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＶＲ−ｈＥ８Ｌ）
［配列表３４］
2019530647.tif 000053
＜配列番号３５、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣ−ｈＥ８Ｌ）
［配列表３５］
2019530647.tif 000054
＜配列番号３６、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＤＲ１−ｈＥ８Ｌ）
［配列表３６］
2019530647.tif 000055
＜配列番号３７、ＰＲＴ１、人工的＞（ＨＣＤＲ３−ｈＥ８Ｌ）
［配列表３７］
2019530647.tif 000056
＜配列番号３８、ＰＲＴ１、人工的＞（Ａβ  １−４２）
［配列表３８］
2019530647.tif 000057
【配列表】
2019530647000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月15日(2019.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と組み合わせて用いられる、アルツハイマー病を治療するための薬学的組成物であって、式
【化１】
2019530647.tif 000061
の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含み、前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、
ａ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；および
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；からなる群より選択されるものである、薬学的組成物。
【請求項２】
前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群より選択される、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記化合物および前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が同時に投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記化合物が、前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体の投与前に投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用される、アルツハイマー病の治療のための医薬の製造における、式
【化２】
2019530647.tif 000062
の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用であって、前記Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、
ａ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；および
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；からなる群より選択される、使用。
【請求項１４】
前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群より選択される、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体の薬学的組成物と組み合わされた、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を伴う、化合物Ｎ−［３−［（４ａＳ，５Ｓ，７ａＳ）−２−アミノ−５−（１，１−ジフルオロエチル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）ピラジン−２−カルボキサミド、またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、これらが、
ａ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２３である；
ｂ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号２４である；
ｃ）ＬＣＤＲ１は、配列番号１７であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１８であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１９であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３７である；
ｄ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である；および
ｅ）ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ３は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ１は、配列番号１であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２であり、かつＨＣＤＲ３は、配列番号３である、からなる群より選択されるものである、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが、
ａ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２６のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号２５のＬＣＶＲおよび配列番号２７のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号３２のＬＣＶＲおよび配列番号３４のＨＣＶＲ、
ｄ）配列番号９のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、ならびに
ｅ）配列番号１０のＬＣＶＲおよび配列番号８のＨＣＶＲ、からなる群より選択される、請求項２３または２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣおよびＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、２つの軽鎖（ＬＣ）および２つの重鎖（ＨＣ）を含み、各ＬＣおよび各ＨＣが、
ａ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣ、
ｂ）配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣ、
ｃ）配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣ、
ｄ）配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、ならびに
ｅ）配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣ、からなる群より選択される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号２９のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号２８のＬＣおよび配列番号３０のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号３３のＬＣおよび配列番号３５のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１２のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ  Ａベータ抗体が、配列番号１３のＬＣおよび配列番号１１のＨＣを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【国際調査報告】
2019530647.tif 000063
2019530647.tif 000064
2019530647.tif 000065
2019530647.tif 000066