【手続補正書】
【提出日】平成19年4月23日(2007.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2006519842.tif 000001
［式中、
ｎは、３〜７を表し；
ｍは、１〜２を表し；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり、但し、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上であり；または
Ｒ1およびＲ2は、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子であるか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表すか、またはＲ3およびＲ4が窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基を表す］
で示される化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を含む、白血病、癌、黒色腫、および／または肉腫の治療剤。
【請求項２】
該Ｒ3またはＲ4の少なくとも一つがアルキルを含む、請求項１の治療剤。
【請求項３】
Ｒ3およびＲ4が独立して水素原子または１以上および３以下の炭素原子を有する直鎖アルキルを表すか；または
Ｒ3およびＲ4が窒素と一緒になって、５〜８員の複素環基を形成する、請求項１の治療剤。
【請求項４】
さらに、化学治療剤または増強剤を含む、請求項１〜３のいずれかの治療剤。
【請求項５】
化学療法剤または増強剤が、トリプロリジンまたはそのシス−異性体、プロコダゾール、１Ｈ−ベンズイミダゾール カーバメート−２−プロパン酸；
プロパゾール、モネンシン、ブロモデオキシウリジン、ジピリダモール、インドメタシン、メトクロプラミド、７−チア−８−オキソグアノシン、Ｎ−ソラネシル−Ｎ，Ｎ’−ビス（３，４−ジメトキシベンジル）エチレンジアミン、ロイコボリン、ヘパリン、Ｎ−［４−［（４−フルオロフェニル）スルホニル］フェニル］アセトアミド、ヘパリン硫酸塩、シメチジン、ビタミンＡ、２’−デオキシコホルマイシン、またはジメチルスルホキシドから選択される、請求項４の治療剤。
【請求項６】
該化合物が、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン、またはその医薬的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物である、請求項１〜５のいずれかの治療剤。
【請求項７】
該治療剤が経口投与用である、請求項１〜６のいずれかの治療剤。
【請求項８】
該治療剤が非経口投与用である、請求項１〜６のいずれかの治療剤。
【請求項９】
該化合物を一日あたり約０．０５〜約１００ｍｇ／キログラム（体重）の用量で投与することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの治療剤。
【請求項１０】
Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩を含む、癌の治療剤。
【請求項１１】
以下の式（Ｉ）：
【化２】
2006519842.tif 000002
［式中、
ｎは、３〜７を表し；
ｍは、１〜２を表し；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり、但し、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上であり；または
Ｒ1およびＲ2は、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子であるか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表すか、またはＲ3およびＲ4が窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基を表す］
で示される化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物を含む、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞種、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、初期の血小板増多症、初期のマクログロブリン血症、小細胞肺癌、初期の脳腫瘍、胃癌、大腸癌、悪性膵臓膵島細胞腺種、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性の皮膚障害、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞種、食道癌、尿路生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮体癌、副腎皮質癌、または前立腺癌の治療剤。
【請求項１２】
以下の式（Ｉ）：
【化３】
2006519842.tif 000003
［式中、
ｎは、３〜７を表し；
ｍは、１〜２を表し；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または、置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり、但し、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上であり；または
Ｒ1およびＲ2は、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子を表すか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表すか、またはＲ3およびＲ4が窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基を表す］
で示される化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を含む、癌または腫瘍における血管新生の抑制剤または遅延剤。
【請求項１３】
以下の式（Ｉ）：
【化４】
2006519842.tif 000004
［式中、
ｎは、３〜７を表し；
ｍは、１〜２を表し；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり、但し、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上であり；または
Ｒ1およびＲ2は、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子であるか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表すか、またはＲ3およびＲ4が窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基を表す］
で示される化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を含む、癌細胞に処置して癌細胞におけるアポトーシスの速度を速める薬剤。
【請求項１４】
以下の式（Ｉ）：
【化５】
2006519842.tif 000005
［式中、
ｎは、３〜７を表し；
ｍは、１〜２を表し；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり、但し、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上であり；または
Ｒ1およびＲ2が、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子を表すか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表すか、またはＲ3およびＲ4が窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基を表す］
で示される化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を含む、癌細胞に処置して癌細胞の増殖を阻害する薬剤。
【請求項１５】
以下の式（Ｉ）：
【化６】
2006519842.tif 000006
［式中、
ｎは、３〜７を表し；
ｍは、１〜２を表し；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または、置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり、但し、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上であり；または
Ｒ1およびＲ2は、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子を表すか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表すか、またはＲ3およびＲ4が窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基を表す］
で示される化合物、またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を含む、癌細胞に処置して癌細胞におけるＶＥＧＦの分泌を減少させる薬剤。
【請求項１６】
以下の式（Ｉ）：
【化７】
2006519842.tif 000007
［式中、
ｎは、３〜７を表し；
ｍは、１〜２を表し；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または、置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり、但し、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上であり；または
Ｒ1およびＲ2は、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子を表すか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表すか、またはＲ3およびＲ4が窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基を表す］
で示される化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物、および投薬説明書を含む、癌を治療するためのキット。
【請求項１７】
該化合物が、分割される用量で提供される、請求項１６のキット。
【請求項１８】
該キットが、ヒトに投与するために設計される、請求項１６のキット。
【請求項１９】
該説明書が、ある種の癌に特定した注釈を与える、請求項１６のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】アザスピラン化合物による癌治療法
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、２００３年３月１０日に出願した米国仮出願第60/452951号および２００３年６月３日に出願した米国仮出願第60/474929号の優先権を主張し、またそれらは、本明細書全体に参照によって引用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、癌の治療をするための治療法として、特定のアザスピランの使用に関する。特に、本発明は、例えば、本明細書に定義される特定のアザスピランを投与することにより、血管新生および／またはアポトーシスの調整または制御をすることにより、ヒトを含む哺乳類の癌を治療する事に関する。
【０００３】
（背景技術）
癌は、動物およびヒトにおける主要な死因である。癌の正確な原因はわからないが、例えば、喫煙または発癌性物質への暴露のような特定の活性化とある種の癌の発病率との関連は、多くの研究者によって示されてきた。
【０００４】
多くのタイプの化学療法剤は、癌に対して有効性が示されてきたが、全てのタイプの癌にこれらの薬剤が適用されるとは限らない。不幸にも、これらの薬剤の多くは、通常細胞も破壊する。これらの化学療法剤の作用についての正確な機構は、必ずしもわかってない。
【０００５】
癌治療の分野における進歩にかかわらず、現在のところ、主要な治療は、外科、放射線および化学療法である。化学療法は、転移する癌と闘うか、または特に癌に対して攻撃的であると言われる。当該細胞破壊剤または細胞増殖抑制剤は、大きな成長因子（すなわち、細胞がすぐに分裂する成長因子）を有する癌に最も有効に作用する。現在のところ、ホルモン、特にエストロゲン、プロゲステロンおよびテストステロン、ならびにある種の微生物によって生産される抗生物質、アルキル化剤、および代謝拮抗剤は、腫瘍学者が入手可能な治療の大半を形成する。
【０００６】
有力な証拠は、血管新生が癌の成長および転移の両方ならびに、例えば、糖尿病性網膜症、関節リウマチおよび乾癬等の人に起こる他の病気にも役割を果たし得ることと関係している。血管新生は、生物が既存の脈管構造から新しい血管を形成するのに使用する多段階工程である。これらの段階は、成長因子およびサイトカインによって血管形成の刺激によって活性化される。参照：Folkman, J. What is the Evidence that Tumors are Angiogenesis-Dependent? J. Natl. Cancer Inst. 1991, 82, 4-6; Folkman, J. Angiogenesis in Cancer, Vascular, Rheumatoid and Other Disease. Nat. Med 1995, 1, 27-31; McDonnell, C.O.; Hill, A.D.K.; McNamara, D.A.; Walsh, T.N.; Bouchier-Hayes, D.J. Tumor Micrometastases: The Influence of Angiogenesis. Eur. J. Surg. Oncol. 2000, 26, 105-115; Li, W. Tumor Angiogenesis: Molecular Pathology Therapeutic Targeting, and Imaging. Acad Radiol. 2000, 7, 800-811; Kerbel, R.S. Tumor Angiogenesis: Past, Present and the Near Future. Carcinogenesis 2000, 21, 505-515; Carmeliet, P.; Jam, R.K. Angiogenesis in Cancer and Other Diseases. Nature 2000, 407, 249-257.
【０００７】
一般的に、血管新生は、初期の血管新生シグナルが鎮静するとき、他のまたは２回目のシグナルは、該血管新生過程を主に遮断するように停止する。しかしながら、癌のような病状において、血管新生の局所濃度は決して減少せず、新しい血管は継続的に形成する。それ故、望まない血管新生は、定常的に癌に栄養補給を行い、癌を転移と同じくらい成長する。参照：Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other diseases. Nat. Med. 1, 27-31, 1995; Folkman J. Tumor angiogenesis: a possible control point in tumor growth. Ann Intern Med. 1975; 82:96-100; Folkman J, Watson K, Ingber D, Hanahan D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 1989;339:58-61; Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst. 1989; 82:4-6; Folkman J. Ingber DE. Angiostatic steroids: method of discovery and mechanism of action. Ann Surg. 1987; 206:374-383; Barger AC, Beeuwkes R. Lainey LL. Silverman K). 仮説: vasavasorum and neovascularization of human coronary arteries. N Engl. J. Med. 1984:310:175-177; Heistad DH, Armstrong ML. Blood flow through vasa vasorum of coronary arteries in atherosclerotic monkeys. Arteriosclerosis. 1986:6:326-331; O'Brien ER, Garvin MR. Dev R, Stewart DK, Hinohara T. Simpson, JB. Shwartz SM. Angiogenesis in human coronary atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 1994; 145:883-894; Saaristo A, Karpanen T, Alitalo K. Mechanisms of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis. Oncogene. 19, 6122-6129, 2000.
【０００８】
多くの成長因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、ＴＧＦβ、腫瘍壊死因子、血小板由来内皮増殖因子、肝細胞増殖因子、アンジオゲニン、インターロイキン−８および胎盤成長因子を含む、血管新生の強力な正の制御因子として同定されている。これらの血管形成因子のうち少なくとも二つ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦは、生体内で血管新生を誘導することができる。参照：Klagsbrun, M.; D'Amore, P.A. Regulators of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 1991, 53, 217-239; Gerwins, P.; Skoldenberg, E.; Clacsson-Welsh, L. Function of Fibroblast Growth Factors and Vascular Endothelial Growth Factors and Their Receptors in Angiogenesis. Crit. Rev, Oncol. Hematol. 2000, 34, 185-194; Liekens, S.; Clercq, E.D.; Neyts. 1. Angiogenesis Regulators and Clinical Applications. Biochem. Pharmacol. 2091, 61, 253-270; Leung, D.W.; Cachianes. C.; Kuang. W.J.; Goeddel, D.V., Ferrara, N. Vascular Endothelial Growth Factor is A Secreted Angiogenic Mitogen. Science 1989, 246, 1306-1313; Ferrara N. The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Pathological Angiogenesis. Breast Cancer Res. Treat. 1995, 36, 127-137; Ferrara N. Vascular Endothelial Growth Factor. Trends Cardivasc. Med 1993, 3, 244-250.
【０００９】
臨床的に、高循環レベルのｂＦＧＦおよびＶＥＧＦは、特定の癌の促進および進行と関連がある。ＶＥＧＦは、内皮細胞特異的分裂促進因子として作用する事がこれらの成長因子とは異なり；血管新生と関連する多種多様の症状において、ほとんど常に見出される成長因子の一つである。参照：Heistad DH, Armstrong ML. Blood flow through vasa vasorum of coronary arteries in atherosclerotic monkeys. Arteriosclerosis. 1986:6:326-331; O'Brien ER, Garvin MR. Dev R, Stewart DK, Hinohara T. Simpson, JB. Shwartz SM. Angiogenesis in human coronary atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 1994; 145:883-894; Saaristo A, Karpanen T, Alitalo K. Mechanisms of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis. Oncogene. 19, 6122-6129, 2000; Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other diseases. Nat. Med. 1, 27-31, 1995; Klagsbrun, M.; D'Amore, P.A. Regulators of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 1991, 53, 217-239; Gerwins, P.; Skoldenberg, E.; Clacsson-Welsh, L. Function of Fibroblast Growth Factors and Vascular Endothelial Growth Factors and Their Receptors in Angiogenesis. Crit. Rev, Oncol. Hematol. 2000, 34, 185-194. 良性の結腸大腸腺腫において、ＶＥＧＦタンパク質および転写レベルは、通常の大腸粘液のそれに優る。参照：Lee JC, Chow NH, Wang ST, Huang SM. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in colorectal cancer patients. Eur. J. Cancer. 2000, 36:748-753.
【００１０】
ＶＥＧＦ活性の阻害、またはそのレセプターの機能を無力化することは、多様な動物癌モデルにおける腫瘍の成長および転移の両方を阻害することを示す。例えば、ＶＥＧＦレベルは、転移性の結腸直腸癌において、かなり高い。これらの結果は、ＶＥＧＦおよびそのレセプターは、腫瘍血管新生において、重要な役割を果たしている事を示唆し、それ故病理学的な血管新生を含む、ヒトの病気の介入のために優れた標的である。参照：Brown LF, Detmar M, Claffey K, Nagy JA, Feng D, Dvorak AM, Dvorak HF. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a multifunctional angiogenic cytokine. EXS. 79, 233-269, 1997; Cascinu, S., Graziano, F., Catalano, V., Staccioli, M.P., Barni, S., Giordani, P., Rossi, M.C., Baldelli, A.M., Muretto, P., Valenti, A., and Catalano, G. Differences of vascular endothelial growth factor(VEGF) expression between liver and abdominal metastases from colon cancer. Implications for the treatment with VEGF inhibitors. Clin Exp Metastasis. 18, 651-655, 2000.
【００１１】
アポトーシス（プログラム化された細胞死）の研究は、癌の機構における見識も提供する。例えば、制御されないアポトーシスおよび不規則な増殖を通して、消化管粘膜内側にある上皮細胞の通常の代謝回転における混乱が大腸癌に導くと考えられる。この例は、結腸大腸癌の増殖指標とより高い相関がある。参照：Askling, J., Dickman, P.W., Karlen, P., Brostrom, O., Lapidus, A., Lofberg, R., and Ekbom, A. Colorectal cancer rates among first-degree relatives of patients with inflammatory bowel disease: a population-based cohort study. Lancet, 357:262-266, 2001. より具体的な証拠は、それらが陰窩の壁面に沿って移動するとき、消化管陰窩の底部に存在する幹細胞が増殖し、分化して、最終的に完全に分化された杯状細胞および吸収性の上皮細胞として機能すること事を示唆する。これらの成熟した細胞は、間質細胞に囲まれるか、または該ＧＩ内腔に流れた後、アポトーシスの該過程によって、消化管粘膜の上皮層を回復するために継続的に代謝回転する。参照：Provenzalen, D. and Onken, J. Surveillance issues in inflammatory bowel disease: Ulcerative colitis. J Clin Gastroenterol, 32:99-105, 2001.
【００１２】
アポトーシスの減少された速度は、異常成長、炎症、腫瘍性の形質転換とよく関連づけられる。例えば、ＧＩ粘膜における恒常性は、細胞の増殖およびアポトーシスを等しい速度で制御し；細胞増殖の増加および／またはアポトーシスの減少によるこの過程の混乱が腺腫の発生、およびその後腺癌へと導く。参照：Eastwood GL. Epithelial renewal in premalignant conditions of the gastrointestinal tract: a review. J Clin Gastroenterol. 14, S29-33, 1992. 従って、増殖を阻害およびアポトーシスの誘導する治療剤は、癌治療において、魅力的な候補である。
【００１３】
細胞は、特異的な細胞性プロテアーゼ（カスパーゼ）を活性化することにより、アポトーシスを開始すると考えられる。従って、カスパーゼの活性化は、アポトーシスの誘導のためのシグナルとして与えうる。それ故、アポトーシス促進性酵素（例えば、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−９）を活性化する治療剤は、抗癌剤であるとみなされる。参照：Hughes, F.M.Jr., and Cidlowski, J.A. Potassium is a critical regulator of apoptotic enzymes in vitro and in vivo. Adv. Enzyme Regul., 39:157-171, 1999; Bortner, C.D., Hughes, F.M.Jr., and Cidlowski, J.A. A primary role for K+ and Na+ efflux in the activation of apoptosis. J. Biol. Chem., 272:32436-32442, 1997.
【００１４】
（発明の概要）
本発明の一態様として、以下の式（Ｉ）：
【化１】
2006519842.tif 000008
［式中、
ｎは、３〜７を表し；
ｍは、１〜２を表し；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり、但し、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上であり；または
Ｒ1およびＲ2が、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子であるか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表し；または
Ｒ3およびＲ4が窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基を表す］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物の治療上の有効量を哺乳類に投与することからなる癌治療の方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様として、癌治療の方法は、式Ｉの化合物と化学療法剤または増強剤を組み合わせて投与することにより提供される。さらに本発明の態様として、５μＭでのＣａＣｏ−２細胞の増殖におけるパーセント阻害が４５％以上、例えば、５０％、６０％、７０％または８０％以上を含む化合物を投与することによる癌の治療を含む。
【００１６】
本発明の別の態様として、癌細胞の増殖を阻害する方法を式Ｉで示される化合物を投与することにより提供する。本発明の別の態様として、治療上許容される量の式Ｉの化合物を投与することにより得られる癌細胞におけるアポトーシスの速度を促進する方法を提供する。さらに、本発明の態様は、式Ｉの化合物の治療上許容される量を投与することによって、ＶＥＧＦの分泌を阻害する方法である。本発明の別の態様は、治療上許容される量の式Ｉで示される化合物を投与することによって、血管新生を阻害またはさらに停止する方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明の目的、有利性および特長を本明細書内で説明し、一つには以下の試験において当業者に明らかとなるか、または該発明の実施によって理解されうる。本出願における公開された該発明は、特に目的、有利性および特長の一連または組合せのいずれかに限定されない。記載された目的、有利性および特長の様々な組合せが本出願で公開された発明を作り出すことを意図する。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
特に断らない限り、以下の用語を本明細書で用いるときは、以下の意味を有することを理解する。
【００１９】
「化合物」は、該化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物を意味する。例えば、「式Ｉで示される化合物」における用語「化合物」の使用は、「式Ｉで示される化合物またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物」を意味すると理解される。
【００２０】
「ＨＵＶＥＣ」は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を意味する。
【００２１】
本明細書で用いる「非経口」は、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、経腸、膣内、または腹腔内投与を含む。
【００２２】
リスクに対する利点を考慮に入れるとき、「医薬的に許容される」とは、必要以上の副作用（例えば、毒性、炎症、およびアレルギー応答等）がなく、ヒトを含む哺乳類の使用に許容される基質を意味する。
【００２３】
「癌(cancer)」は、制御されない方法で、増殖する傾向のある新生物、腫瘍および白血病を含む細胞の異常な成長を意味する。好ましくは、本発明の方法は、白血病、黒色腫、癌および肉腫の治療を含む。さらに具体的な癌として、脳、乳房、膵臓、頸部、大腸、頭頸部、腎臓、肺、肺小細胞、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮、肝臓、精巣、口腔、および髄芽腫等の癌を含む。
【００２４】
「白血病」は、造血器官の病気を広く意味し、一般的に、組織、血液および／または骨髄における白血球およびそれらの前駆体の歪んだ増殖および発達によって特徴づけられる。白血病は、一般的に臨床的には（１）該病気の持続時間および特徴−急性または慢性−；（２）骨髄球性（骨髄性）、リンパ系（リンパ向性）、または単核球性を含む細胞の型；および（３）血液白血病性または無白血病性（亜白血病性）における多くの異常細胞の数の増加または非増加に基づいて分類される。該Ｐ３８８白血病モデルは、インビボでの抗白血病活性の予測ができるとして広く受け入れられる。試験がＰ３８８アッセイにおいて正を示す化合物は、治療された白血病のタイプに関わらず、生体内での抗白血病活性のある程度のレベルを示すと一般的に考えられる。従って、本発明は、式Ｉで示される化合物の治療上許容される量を投与することによって、白血病を治療する方法を含む。例えば、本発明は、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球溶血性（leukocythemic）白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、毛様細胞白血病、血芽性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単核球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、微小骨髄球性白血病、単核球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄性単球性白血病、ナエゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血病性白血病、および未分化細胞白血病の治療方法を具体化する。
【００２５】
「肉腫」は、基質のような胎児性結合組織からなる癌性の成長を一般的に意味し、原線維または均一基質に包埋した血中血球からなる。肉腫は、式Ｉで示される化合物の治療上許容される量の投与によって治療されうる。この方法で治療されうる特定の肉腫は、例えば、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、エウィング肉腫、筋膜肉腫、繊維芽細胞肉腫、巨大細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性脱色性出血性肉腫、Ｂ細胞免疫芽細胞肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞免疫芽細胞肉腫、ジェンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉細胞肉腫、傍骨性骨肉腫、網赤血球肉腫、ラウス肉腫、血清嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および末梢血管拡張性肉腫を含む。
【００２６】
「黒色腫」は、一般的に皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる癌性の成長を意味する。黒色腫は、式Ｉで示される化合物の治療上許容される量の投与によって治療される。この方法によって治療されうる具体的な黒色腫は、例えば、末端性黒子性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング−パッシー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫等を含む。
【００２７】
「癌(carcinoma)」は、一般的に周辺組織に浸潤し、転移を生じる傾向のある上皮細胞を作り上げる癌性の成長を意味する。癌は、式Ｉで表される化合物の治療上許容される量の投与によって治療されうる。この方法で治療されうる具体的な癌は、例えば、細葉細胞癌、腺房細胞癌、腺嚢胞癌、腺様嚢胞癌、腺腫様癌（carcinoma adenomatosum）、副腎皮質癌、細気管支肺胞上皮癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌（basal cell carcinoma）、基底細胞様癌（carcinoma basocellulare）、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌、気管支肺胞癌、気管支癌、気管支原性癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛癌、膠質癌、面皰癌、子宮体癌（corpus carcinoma）、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱状癌、円柱状細胞癌、腺管癌、硬性癌腫、胚性癌腫、脳様癌、類表皮癌、腺様上皮癌、外向発育癌、潰瘍性癌、線維性癌、ゼラチン状癌、ゼラチン様癌、巨大細胞癌、巨大細胞様癌、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛基質腫、肝様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、hypemephroid癌、小児胚性癌、上皮内癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher癌、Kulchitzky細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌、レンズ様癌、脂肪腫、リンパ上皮癌、髄様癌(carcinoma medullare)、髄様癌(medullary carcinoma)、悪性黒色腫、軟口蓋癌、粘液性癌（mucinous carcinoma）、粘液性癌（carcinoma muciparum）、細胞粘液性癌、粘液性類表皮癌、粘膜癌(carcinoma mucosum)、粘膜癌(mucous carcinoma)、粘液腫様癌、鼻咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭癌、門脈周辺癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、糊状癌、腎臓の腎細胞癌、補充細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソレノイド癌、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿癌、扁平上皮癌、扁平細胞癌、弦状癌、血管拡張性癌、毛細血管拡張性癌、移行上皮癌、結節性癌、結節状癌、疣状癌、および絨毛状癌を含む。
【００２８】
さらに、式Ｉで表される化合物の治療上許容される量の投与によって治療される癌は、これに限らないが、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、腺癌、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、肺小細胞癌、原発性脳腫瘍、胃癌、大腸癌、悪性膵臓膵島細胞腺腫、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚障害、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、グリア芽腫、食道癌、尿路生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌を含む。
【００２９】
以下の式（Ｉ）：
【化２】
2006519842.tif 000009
［式中、
ｎは、３〜７を表し、例えば、３、４、または６であり；
ｍは、１〜２を表し、例えば、１であり；
Ｒ1およびＲ2は、独立して水素原子を表すか、または、Ｒ1およびＲ2を合わせた炭素原子の総数が５以上または５〜１２、例えば、６、８または１０である、置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のアルキルであり；または
Ｒ1およびＲ2は、一緒になって３以上、７以下の炭素原子を有する環状アルキル基を表し；
例えば、Ｒ1およびＲ2は、独立して非置換アルキル、非分枝アルキル、分枝または非分枝もしくは環状の１〜５炭素のアルキル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルであって；
Ｒ3およびＲ4は、独立して水素原子を表すか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表し；
例えば、該Ｒ3またはＲ4のうち少なくとも一つは、独立してアルキルまたは水素原子、または１以上、３以下の炭素原子を有する直鎖アルキル、メチル、エチル、プロピルを含み、またはＲ3およびＲ4は、独立して水素原子を表すか、または飽和または不飽和の置換または非置換の分枝または非分枝もしくは環状のヒドロカルビル基を表し、もしくは、Ｒ3およびＲ4は窒素と一緒になって、少なくとも４員の複素環基、例えば、６員の複素環基を含む５〜８員複素環基を表す］
で示される化合物またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物からなる本発明の方法において有用な化合物。
【００３０】
式（Ｉ）で示される化合物およびその医薬的に許容される塩、水和物および溶媒和物の製造は、米国特許第４９６３５５７号、第５７３４０６１号、第５７４４４９５号、第５９３９４５０号、および第５９５２３６５号で開示され、参照によって本明細書に引用する。
【００３１】
通常、式（Ｉ）の化合物は、目的の投与形体によって適当に選択される医薬的な溶液、増量剤、賦形剤、または担体（本明細書では、集合的に医薬的に許容される担体または担体材料を意味する）と混合して、従来の医薬的慣習に合わして投与される。該ユニットは、たいてい経口、経腸、局所、静脈内注射または非経口投与等の適当な形体である。
【００３２】
式（Ｉ）で示される化合物は、単独で投与され得るが、一般的に医薬的に許容される担体と混合される。この担体は、固体または液体であって、担体のタイプは、一般的に用いられる投与形式に基づいて選択される。本発明の経口投与形体での製剤化に用いられ得る医薬的に許容される担体および賦形剤の具体例は、１９７５年９月２日に発行されたロバートによる米国特許第３９０３２９７号に記載され、参照によって、全開示を本明細書に引用する。本発明に有用な投与形体を製造するための技術および組成物は、以下の参考文献に記載される：7 Modern Pharmaceutics, Chapters 9 and 10（Banker & Rhodes, Editors, 1979）; Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets(Lieberman et al., 1981); Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2nd Edition(1976); Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.（Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985）; Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton, Trevor Jones, Eds., 1992); Advances in Pharmaceutical Sciences Vol 7.(David Ganderton, Trevor Jones, James McGinity, Eds., 1995); Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms(Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James McGinity, Ed., 1989); Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 61(Alain Rolland, Ed., 1993); Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract(Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J.G. Hardy, S.S. Davis, Clive G. Wilson, Eds.); Modem Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 40(Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.) 参照によって、すべて本明細書に引用する。
【００３３】
錠剤は、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、香料添加剤、流動誘導剤および溶解剤を含みうる。例えば、錠剤またはカプセルの投与形体ユニットにおける経口投与を例に挙げると、活性な医薬成分は、経口で無毒な医薬的に許容され、例えばラクトース、ゼラチン、寒天、デンプン、ショ糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール等の不活性な担体と組み合わせることができる。
【００３４】
適当な結合剤は、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはベータ−ラクトースのような天然糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム等の天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ロウ等を含む。潤滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を含む、これらの形体で使用した。崩壊剤は、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等を含む。
【００３５】
さらに、そのような組成物は、化合物に加えて、医薬的に許容される担体および投与を容易にするおよび／または取り込みを増加する事が知られる他の賦形剤を含みうる。ミクロスフェア、ナノパーティクル、リポソーム、および免疫に基づく系のような他の剤形も本発明に従って使用される。他の実施例では、ポリマー（例えば、２０％ｗ／ｖ ポリエチレングリコール）またはセルロースを含む製剤、もしくは腸溶性製剤を含む。
【００３６】
さらに、医薬的に許容される担体および医薬的に許容される錠剤、カプセル、懸濁液およびキットは、米国特許第６３８４０４９号に記載されており、それらの開示を本明細書に引用する。
【００３７】
本発明の態様として、式（Ｉ）で示される該化合物は、１またはそれ以上の増強剤および／または化学療法剤と組み合わせて用いられる。これらの併用は、一緒にまたは順次投与され得る。本発明で使用される具体的な増強剤は、トリプロリジンまたはそのシス異性体を含む。トリプロリジンは、米国特許第５１１４９５１号（１９９２年）に記載され、その全体を本明細書に引用する。本発明に使用する他の適当な増強剤は、プロコダゾール、１Ｈ−ベンズイミダゾール カーバメート−２−プロパン酸；［β−（２−ベンズイミダゾール カーバメート）プロピオン酸；２−（２−カルボキシエチル）ベンズイミダゾール カーバメート；プロパゾール］を含む。プロコダゾールは、ウイルスおよび細菌感染に対して活性な非特異的免疫保護剤である。
【００３８】
本発明の治療方法において、式（Ｉ）で示される化合物と一緒に用いられ得る他の増強剤、および適宜他の化学療法剤は、モネンシン、ＲＡＤ５１遺伝子のアンチセンス阻害剤、ブロモデオキシウリジン、ジピリダモール、インドメタシン、モノクローナル抗体、抗トランスフェリンレセプター免疫毒素、メトクロプラミド、７−チア−８−オキソグアノシン、Ｎ−ソラネシル−Ｎ，Ｎ’−ビス（３，４−ジメトキシベンジル）エチレンジアミン、ロイコボリン、ヘパリン、Ｎ−［４−［（４−フルオロフェニル）スルホニル］フェニル］アセトアミド、硫酸ヘパリン、シメチジン、放射線感受性増強物質、化学増感剤、低酸素細胞毒性剤、ムラミールジペプチド、ビタミンＡ、２’−デオキシコホルマイシン、ビス−ジケトピペラジン誘導体、およびジメチルスルホキシドを含む。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物、および適宜増強剤と一緒に用いられる適当な化学療法剤は、一般的にＤＮＡ−相互作用剤、代謝拮抗剤、チューブリン相互作用剤、ホルモン剤およびアスパラギナーゼまたはヒドロキシウレアのような群である。本発明に用いられ得る化学療法剤およびそれらの投与方法の詳細な議論は、Dorr, et al, Cancer Chemotherapy Handbook, 2nd edition, pages 15-34, Appleton & Lange(Connecticut, 1994) を、本明細書に引用する。
【００４０】
適当なＤＮＡ−相互作用剤は、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、アルトレタミン）；ブレオマイシンのようなＤＮＡ鎖切断剤；インターカレートするトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ダクチノマイシンおよびドキソルビシン）；エトポシドおよびテニポシドのようなインターカレートしないトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；およびＤＮＡマイナーグルーブ結合剤であるプリカマイシン等を含む。
【００４１】
アルキル化剤は、細胞内ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質分子ならびにより小さなアミノ酸、グルタチオンおよび同様の化学物質と共有結合での化学付加物を形成する。一般的に、これらのアルキル化剤は、核酸、タンパク質、アミノ酸、またはグルタチオン中のアミノ、カルボキシ、リン酸、スルフヒドリル基のような細胞成分中の求核原子と反応する。癌治療におけるこれらのアルキル化剤の機構および役割は、良く理解されていない。適当なアルキル化剤は、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；チオテパのようなアジリジン；ブスルファンのようなメタンスルホネートエステル；カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンのようなニトロソウレア；シスプラチンまたはカルボプラチンのような白金錯体；マイトマイシン、およびプロカルバジンのような生体内還元性アルキル化剤；ダカルバジンおよびアルトレタミンを含む。
【００４２】
適当なＤＮＡ鎖切断剤は、ブレオマイシンを含む。
【００４３】
適当なＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、以下のもの：アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロンのようなインターカレーター；エトポシドおよびテニポシドのような非インターカレーターを含む。適当なＤＮＡマイナーグルーブ結合剤は、プリカマイシンを含む。
【００４４】
代謝拮抗剤は、１または他の２つの主要な機構による核酸の生成物を妨害する。該薬剤のいくつかは、ＤＮＡ合成の中間体前駆体であるデオキシリボヌクレオシド三リン酸の生成物を阻害し、それ故、ＤＮＡ複製を阻害する。該化合物のうちのいくつかは、同化したヌクレオチド経路で、それらと置換することができるくらいプリンまたはピリミジンと充分相似する。次いで、これらのアナログは、それらの通常の対応物と代わって、ＤＮＡおよびＲＮＡに置換され得る。本明細書で有用な代謝拮抗剤は、メトトレキサートおよびトリメトレキサートのような葉酸拮抗剤；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジンおよびフロクスウリジンのようなピリミジン拮抗剤；メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチンのようなプリン拮抗剤；シタラビンおよびフルダラビンのような糖修飾アナログ；およびヒドロキシウレアのようなリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤を含む。
【００４５】
チューブリン相互作用剤は、細胞性微小管を形成するために重合するタンパク質であるチューブリンの特定部位に結合することによって作用する。微小管は、重要な細胞構造ユニットである。該相互作用剤が該タンパク質に結合するとき、該細胞は、微小管を形成することができない。適当なチューブリン相互作用剤は、コルヒチン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンのような両方のアルカロイド、ならびにパクリタキセルおよびサイトキサンを含む。
【００４６】
ホルモン剤は、癌および腫瘍の治療にも有用である。それらは、ホルモンの影響を受けやすい癌に使用され、通常、天然資源から得られる。本発明の方法で使用される適当なホルモン剤は、エストロゲン、共役されたエストロゲンおよびエチニルエストラジオールならびにジエチルスチルベステロール、クロルトリアニセンおよびイデネストロール；ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸塩、メドロキシプロゲステロン、およびメゲストロールのようなプロゲスチン類；およびテストステロン、テストステロンプロピオン酸塩のようなアンドロゲン；フルオキシメステロン、メチルテストステロンを含む。
【００４７】
副腎皮質ステロイドは、天然副腎コルチゾールまたはヒドロコルチゾンから生じる。それらは、抗炎症作用および有糸分裂の阻害ならびにＤＮＡ合成を停止する能力のために使用される。本発明の方法に有用である適当な副腎皮質ステロイドは、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンを含む。
【００４８】
黄体形成ホルモン放出剤またはゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニストは、前立腺癌の治療の初期に用いられる。本発明の方法に使用する適当な成分は酢酸ロイプロリドおよび酢酸ゴセレリンを含む。
【００４９】
適当な抗ホルモン抗原は、タモキシフェンのような抗エストロゲン剤、フルタミドのような抗アンドロゲン剤；およびミトタンおよびアミノグルテチミドのような抗副腎剤を含む。
【００５０】
酵素であるリボヌクレオチドレダクターゼの阻害を通じて最初に作用するように思われる、ヒドロキシウレアも本発明の方法で組み合わせて用いられ得る。
【００５１】
アスパラギナーゼは、アスパラギンを機能しないアスパラギン酸に変換する酵素であり、それ故、腫瘍でのタンパク質合成を妨害する酵素である。アスパラギナーゼは、本発明の方法において、式（Ｉ）の化合物と組み合わせても用いられ得る。
【００５２】
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬的に許容される塩または水和物もしくは溶媒和物は、ヒトを含む哺乳類に、該哺乳類の癌を治療するために投与される。投与方法は、例えば、経口または非経口が含まれうる。
【００５３】
式（Ｉ）で示される化合物の最適な個別の投与量および間隔が、治療される症状の性質および程度、投与の形式、経路および部位、ならびに治療される特定の患者によって決定されること、および当該最適化が、従来技術によって決定されることは当業者によって認識される。同様に治療の最適な過程は、すなわち日数で定義される期間の一日に付き与えられる式（Ｉ）の化合物の投与数は、治療定量試験の従来の過程を用いて当業者によって確定される。具体的な一日の投与計画は、約０．０５〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約０．１〜約８０ｍｇ／体重ｋｇ、または約０．５〜約５０ｍｇ／体重ｋｇ、もしくは約１〜約１０ｍｇ／体重ｋｇを含みうる。
【００５４】
式（Ｉ）で示される化合物を用いる治療方法は、毎日生じない、例えば、１週間に数回、週２回、週１回、月２回、または月１回の投薬計画も含む。さらに治療は、例えば、月１回の注射を含む長期間注射を含み得る。本発明の方法における投薬期間は、例えば、治療目的および患者の健康を含む多様な要因に依存する。本発明の方法についての具体的な投与期間は、例えば、一治療から１５年程度の治療まで、最大６年間程度される一治療、または３ヶ月から最大３年まで継続する治療を含む。投薬計画は、本明細書に記載される具体的な投薬に従って、生命維持の投薬も含み得る。
【００５５】
１日に１回短時間で投与されるボーラスは、簡便な投与計画である。代替的に、１日に１回の投与は、例えば、１日に２回〜１２回の投与目的に応じて投薬を数回に分けられ得る。医薬組成物中の活性成分の投薬レベルは、患者、特に発癌部位およびその周辺における該化合物の過渡または持続濃度に達するため、および所望の応答を生じるために変化されうる。
【００５６】
本発明の製剤の投与は、所望の効果に達するように、および所望の効果に達するまで徐々に投薬を増やす必要のないレベルで、式（Ｉ）で示される化合物の初期投与によるものである。特定の課題のいずれかにおける特異的な投与レベルが、体重、健康全般、食事、病気の自然経過、投与経路および計画、１またはそれ以上の薬剤の組合せ、および病気の重症度を含む、多様な要因に依存することを理解される。
【００５７】
式（Ｉ）で示される化合物を他の治療剤を組み合わせて用いるとき、他の治療剤に対する式（Ｉ）で示される化合物の比は、所望の治療効果、観察される併用の副作用、または医薬技術における通常の知識を有する者に公知の他の考察に従う必要があるなら、変化され得る。例えば、他の治療剤（例えば、増強剤および／または化学療法剤）に対する式（Ｉ）で示される化合物の比が、式（Ｉ）で示される化合物の約０．５〜９９．５重量％から１〜５０重量％または１〜２０重量％の範囲を含みうる。
【００５８】
式（Ｉ）で示される化合物は、癌または他の病気の治療の前または後に、他の治療剤を投与されるとき、式（Ｉ）で示される化合物および他の治療剤のそれぞれの投与量および投薬法を変化しうる。該補助的または併用療法は、連続的であり、すなわち最初に１剤で治療し、次いで２剤目で治療するか、２またはそれ以上の薬剤をほとんど同時に投与される併用治療である。連続的な治療は、２回目の治療が始まる前の最初の治療が完了した後の妥当な時間内に行われる。同時に両方の薬剤を用いる治療は、同日に１回か、または分割投与される。例えば、治療は１日目に１剤目を用いて、２日目に他の薬剤を用いる。正確な投薬計画は、治療される病気、該病気の重症度および治療に対する応答に依存する。
【００５９】
特定の作用機構を必要とせず、式（Ｉ）で示される化合物を用いる治療は、癌細胞のアポトーシスによって死に至らし得るか、または至らし得ない。大腸癌に関しては、本治療が腸細胞の対象の分布において、増殖およびアポトーシスの健康バランスも保ちうる。
【００６０】
キットは、式（Ｉ）で示される化合物からなる癌の治療および投薬説明書を提供しうる。さらに、該キットは、該化合物の個別の量ならびに特定の癌または上記に記載したような癌の治療における化合物の投与の仕方の記載／推奨を含みうる。
【００６１】
さらに、式（Ｉ）で示される化合物の投与は、サイトカインの生成および癌の持続的な成長および進行にとって重要である成長因子も阻害しうる。
【００６２】
（実施例）
さらに詳述がなければ、当業者は前記の説明を用いて、本発明を最大の範囲で利用することができると考える。従って、以下の実施例は、単に説明として解釈されるが、いずれにせよ本発明の範囲をせいげんするものと解釈されない。
【００６３】
実施例１：Ｔ８４およびＣａＣｏ−２大腸癌細胞増殖の阻害
ヒト大腸癌細胞であるＴ８４およびＣａＣｏ−２の増殖に対するＮ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）の効果を以下の方法で評価した。細胞増殖は、バイオビジョン（カリフォルニア州）から入手した該増殖キットを用いて、ホルマザンへのＷＳＴ−１色素変換アッセイによって測定した。用いた手順は、製品の取扱説明書に記載と実質的に同様であった。つまり、細胞を半集密的単層が形成するまで、７日間成長させた。７日目に、細胞をトリプシン処理して、約４００００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートにて再懸濁し、３７℃で２４時間成長させた。
【００６４】
その後、図１に示した通り、濃度が増加した化合物１を含む新鮮な培地を加え、さらにアッセイプレートを続けて２４時間インキュベートした。ウェル当たり５μＬのＷＳＴ−１色素の溶液を加えて、４時間後にプレートを、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４４０および６００ｎｍで読み取った。４４０ｎｍでの吸収から６６０ｎｍでの吸収を引いた値は、増殖細胞の数に正比例する。全サンプルを三回測定して、結果は三回の定量の平均として表した。
【００６５】
図１に示す通り、化合物１は、ＩＣ50値が０．６２５〜１．２５μＭの範囲で、ＣａＣｏ−２およびＴ８４細胞の両方の増殖を阻害した。
【００６６】
実施例２：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖の阻害
内皮細胞増殖、遊走およびアポトーシスは、血管新生過程の重要な要素である。それ故、実施例１のＴ８４およびＣａＣｏ−２細胞についての記載と同一の手順を用いて、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖およびアポトーシスにおける、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）の効果を評価した。
【００６７】
図２に示すとおり、化合物１は、ＩＣ50値が１．２５〜２．５μＭの範囲で、ＨＵＶＥＣの増殖を阻害した。
【００６８】
実施例３：ＣａＣｏ−２、Ｔ８４およびＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシス誘導
Ｔ８４、ＣａＣｏ−２およびＨＵＶＥＣ細胞はそれぞれ、半集密的に達するまで１００ｍｍ皿で７〜９日間成長させ、ＨＵＶＥＣの培養液はＥＧＭ−２（Clonetics, BioWhitaker社)を用いた。次いで、細胞単層は、それぞれ１２時間（ＣａＣｏ−２およびＴ８４）および１６時間（ＨＵＶＥＣ）、培養液中でＮ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）の表示された濃度で処理した。細胞をトリプシン処理して回収し、該アポトーシスのＤＮＡを該ＤＮＡフラグメンテーション分析キット（ベーリンガーマンハイム株式会社、インディアナポリス、インディアナ州）の該説明書に従い、これらの細胞から単離した。該アポトーシスのＤＮＡは１．５％アガロースゲル電気泳動を用いて評価し、続いて臭化エチジウムで染色した。Ｍは、ＤＮＡの分子量マーカーを含むレーンを示す。
【００６９】
図３に示した通り、ＣａＣｏ−２およびＴ８４細胞をそれぞれ化合物１で処理することにより、投与量依存的にＤＮＡラダーの形成を生じた。ＤＮＡラダー形成は、アポトーシスを受けた細胞において、確立された顕著な特徴である。参照：Reed, J.C. Mechanisms of apoptosis avoidance in cancer. Current. Opin. Oncology 11:68-75, 1999. Seymore, M. Colorectal cancer: Treatment of advanced disease. Cancer Treat. Rev., 24:119-131, 1998. Wyllie, A.H. Apoptosis and carcinogenesis. Eur. J. Cell Biol., 73:189-197, 1997. Naik, P., Karrim, J., and Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes & Dev. 10:2105-2116, 1996. ＤＮＡラダーの形成は、癌細胞がアポトーシス促進性化合物および抗癌化合物で処理されるときに通常観察される。参照：Pasricha P.J., Bedi. A., O'Connor K., Rashid, A., Akhtar, A.J., Zahurak, M.L., Piantadosi, S., Hamilton, S.R., and Giardiello, F.M., The Effect of sulindac on colorectal proliferation and apoptosis in familial adenomatous polyposis. Gastroenterology 109: 994-998, 1995. Thompson WJ, Piazza GA, Li H, Liu L, Fetter J, Zhu B, Sperl G, Ahnen D, Pamukcu R. Exisulind induction of apoptosis involves guanosine 3',5'-cyclic monophosphate phosphodiesterase inhibition, protein kinase G activation, and attenuated beta-catenin. Cancer Res. 60:3338-3342, 2000. Rice PL, Goldberg RJ, Ray EC, Driggers LJ, Ahnen DJ. Inhibition of extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation and induction of apoptosis by sulindac metabolites. Cancer Res. 61:1541-1547, 2001. Hughes, F.M. Jr., and Cidlowski, J.A. Pottasium is a critical regulator of apoptotic enzymes in vitro and in vivo. Adv. Enzyme Regul., 39:157-171, 1999.
【００７０】
Ｔ８４細胞のアポトーシスの開始は、０．５〜１μＭの濃度範囲で観察された。同程度のアポトーシスはＣａＣｏ−２細胞において、１．５〜２．０μＭの濃度範囲で達した。
【００７１】
図４は、ＨＵＶＥＣ細胞を化合物１で処理することにより、化合物１の濃度がおよそ０．６２５〜１．２５μＭで達成されるアポトーシスの開始によって、用量依存的にＤＮＡラダーの形成を生じたことも示す。
【００７２】
実施例４：Ｔ８４大腸癌細胞におけるカスパーゼ活性
カスパーゼ−３およびカスパーゼ−９の活性は、比色試験キット（バイオビジョン、カリフォルニア州）を用いて測定した。用いた該手順は、製品の取扱説明書に記載と実質的に同じであった。つまり、１００ｍｍ皿でのＴ８４細胞の７日後の単層は、ベヒクル（コントロールとして）またはＮ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）のどちらかで表示されたそれぞれの濃度で１０時間処理した。処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、該細胞抽出液を、キット内で供給される溶解緩衝液の２００μＬ（〜１０8細胞）で細胞を再懸濁することによって調製した。細胞残屑は、１００００×ｇで３０分間遠心分離することにより除去した。上清（５０〜１００μｇのタンパク質）は、１０ｍＭのジチオスレイトール、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％ショ糖、０．１％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７．５）で、プレインキュベートし、該反応液に１００μＭの適当な基質（カスパーゼ−３については、ＤＥＶＤ−ｐＮＡであり、カスパーゼ−９については、ＬＥＨＤ−ｐＮＡ）の付加によって開始した。該アッセイプレート（９６ウェル）を３７℃で２時間インキュベートし、ｐＮＡの放出で生じる黄色は、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４０５ｎｍで測定した。サンプルは３回繰り返し実施して、結果は３回の定量値の平均として表した。
【００７３】
実施例５：種々の癌細胞株における抗腫瘍効果のインビトロでの測定
公知の癌細胞株の成長を阻害するＮ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）の能力を試験するインビトロアッセイは、標準的手順に従い、国立癌研究所で実施した。参照：Lin, Z.X., Hoult, J.R., and Raman, A. Sulphorhodamine B assay for measuring proliferation of a pigmented melanocyte cell line and its application to the evaluation of crude drugs used in the treatment of vitiligo. J Ethnopharmacol. 66: 141-150, 1999. つまり、選択された腫瘍細胞株は化合物１の５種類の異なった濃度を含んだ培養液中で培養した。４８時間暴露を継続した後、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを光学的な測定を用いて、細胞の生存または成長を評価するのに用いた。これらのデータは、以下のように報告される：表１ａおよび１ｂは、化合物１の濃度に対する機能として、光学密度を示す。
【表１】
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【表２】
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【００７４】
該測定から、以下の値を定量した：１）腫瘍細胞成長阻害の５０％（コントロールと比較して）が生じる化合物１の濃度（ＧＩ５０）、２）全く成長が起こらない（全成長阻害、ＴＧＩ）化合物１の濃度、および３）該腫瘍細胞密度がコントロールの半分である化合物１の濃度（ＬＣ５０）。表２は、Ｌｏｇ10でのこれらのデータを報告する。図６は、読み取った腫瘍細胞株の化合物１濃度の機能としての腫瘍細胞の成長をグラフに図示する。
【表３】
2006519842.tif 000012
【表４】
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【００７５】
実施例６：抗血管新生ＣＡＭアッセイ
１０日間インキュベートした白色レグホーン種の卵は、表３で示した通り化合物１の量を用いて投与した。該投与は、４０μＬの指示溶液を１３ｍｍ丸底Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）カバースリップにピペットで入れて、それを風乾させた。該原料を乾燥した後、該乾燥試験品とＣＡＭの接触を保証するように、該カバースリップを各々卵の絨毛尿膜（ＣＡＭ）に置いた。投与後、該卵を約４８時間インキュベーターに戻した。
続いて４８時間の暴露時間に続き、該卵をインキュベーターから除き、生存を観察してカバースリップの下の暴露領域を、脈管構造の損失を求めるのに試験した。この実験からのデータは、表３に報告する。
【表５】
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【００７６】
実施例７：インビボでの生存ラットへの化合物１の投与
９１ｕＣｉ／ｍｇの特異的な活性を持つ［14Ｃ］Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物ＩＩ）は、化学純度が＞９９％であり、放射標識していないＮ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）は、化学純度が＞９８％であり、それぞれこの研究に用いた。化合物ＩＩ中の放射性炭素の標識部位は、式ＩＩ中の星印で記載される。放射標識していない材料は、参考目的で用いた。放射標識した材料は約−８０℃、暗中で保存し、放射標識していない材料は、約−２０℃、暗中で保存した。化合物ＩＩの放射線化学純度をＴＬＣで確認し、９８．０％であることを確認した（６０Ｆ２５４シリカゲルプレート；塩化メチレン：メタノール：アンモニア＝８０：１８：２で溶離して；Ｉｓｏｍｅｓｓ ＩＭ−３０１６放射線−ＴＬＣ分析機または Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ＳＦで検出した）。
【化３】
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【００７７】
約８〜９週齢で、投与時の体重２３７〜２５５ｇの３匹の健康な雄のスプラーグ−ダーレイ（Sprague Dawley）ラット（Crl:CD(SD)BR）は、チャールズリバー社（英国）から調達した。該動物を使用前８日間この動物種に適した保存ケージに棲ませた。ＳＤＳラットおよびマウス（Maintenance Diet No.1）(Special Diets Services, Witham Essex)、および品質水は、任意に入手した。該動物に供給される食事および水は、定期的に品質を分析して、問題は検出されなかった。保存および研究領域は、光循環および温度を自動にコントロールした。該研究の間に測定した温度の実際の範囲は１７〜２５℃で、相対湿度は６０％であった。
【００７８】
該投薬は、投与の日に経口投与用に調製した。化合物ＩＩの適当な量を、蒸留水に溶解し、１ｍｇf.b./ｍＬの目的濃度にした。投与に続いて、放射線化学純度のチェックを上記のＴＬＣ法を用いて、投与製剤で実施し、該放射線化学純度は、＞９７％を示した。この事は投与期間中、該放射標識化合物の分解は無視できることを示した。
【００７９】
各々のラットにおいて、投与溶液のアリコートは、チューブによる栄養補給によって経口投与された。投与物は、胃管栄養針を取り付けた５．０ｍＬのガラス製注射器を用いて、１０ｍＬ／ｋｇの表示用量で投与された。それぞれの投与量において、投与物および注入装置の合わせた重量は、投与前に記録され、放出した注入装置は投与後の重さを量った。投与溶液のそれぞれにおける放射性材料の濃度も定量した。これらのデータから、該動物が受けた実際の投与量を定量し、表４に示す。
【表６】
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【００８０】
投与の後すぐに、該ラットを排泄物および呼気の定量回収に適した硝子製の代謝物測定ケージに移した。全サンプルを個別に、特定のラベルをした容器に集めた。
【００８１】
投与後、０〜６、６〜２４、２４〜４８、４８〜７２、７２〜９６、９６〜１２０、１２０〜１４４、および１４４〜１６８時間間隔で、尿を回収した。回収した該容器を投与後から４８時間ドライアイスで冷却した。
【００８２】
糞は、投与後０〜２４、２４〜４８、４８〜７２、７２〜９６、９６〜１２０、１２０〜１４４および１４４〜１６８時間間隔で回収した。回収容器を最初の４８時間ドライアイスで冷却した。
【００８３】
それぞれ糞回収の時間に、それぞれケージを水（約７５０ｍＬ）で洗浄し、該洗浄液は放射アッセイのために保存した。投与後０〜２４時間および２４〜４８時間で、呼気は、ＣＯ2の除去を行うために、エタノールアミン：エトキシエタノール（３：７，ｖ／ｖ）を含んだ２連続のトラップを通した。該トラップの溶媒は、各々採集した期間の最後に放射アッセイのため、サンプリングした。
【００８４】
投与後１６８時間で、それぞれの動物は、ＣＯ2麻酔および頸椎脱臼により殺した。消化管を死骸から除去し、放射アッセイの準備のために別々に保持した。
【００８５】
全ての尿および糞のサンプルは、分析前後において、冷凍（約２０℃）で保存した。ケージの洗浄液は、分析が完了するまで、室温で保存し、次いで廃棄した。全ての死骸および消化管は、分析前まで約−２０℃で冷凍保存した。
【００８６】
尿（約０．３ｍＬ）およびケージの洗浄液（約１ｍＬ）の一対のアリコートを分けて、（もし必要なら）蒸留水で１ｍＬに希釈し、クイックジント(Quickzint)１シンチレーション流体（１０ｍＬ；Zinsser Analytic Maidenhead, 英国）と混合した。
【００８７】
糞は、該サンプルと１〜２倍量の水でホモジネートし、ホモジネート重量を記録した。一対のアリコート（約０．３）をそれぞれのサンプルから採取し、燃焼コーン（キャンベラパッカード社、Pangbourne, 英国）に含まれた燃焼パッド上に分配した。乾燥時、これらのサンプルは、パッカード トリ−カルボ(Packard Tri-Carb)３０６ 自動サンプルオキシダイザー(Automatic Sample Oxidiser)を用いて燃焼させた。結果として生じた14ＣＯ2をＣａｒｂｏ−Ｓｏｒｂ（登録商標）（８ｍＬ；キャンベラパッカード社）に吸収させて回収し、それにｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｅ+シンチレーション流体（１０ｍＬ；キャンベラパッカード社）を加えた。
【００８８】
標準液の燃焼［Ｓｐｅｃ−Ｃｈｅｃ（登録商標）−14Ｃ；キャンベラパッカード社］は、回収効率が最初から最後まで９７％以上であったことを示したので、該結果は直接用い、％有効性を補正しなかった。
【００８９】
それぞれのラットについて、内容物を含む死骸および消化管をＳｏｌｕｅｎｅ３５０（キャンベラパッカード）で可溶化した。溶解したとき、消化物の一部（約０．１ｍＬ）を液体シンチレーション分光法のために採取した。メタノールを加えて、容積を１ｍＬまでにし、次いで、１０ｍＬのクイックジント(Quickzint)を加えて、該サンプルを他の液体サンプルと同様に測定した。
【００９０】
シンチラントで調製された全てのサンプルは、典型的なブランクおよび標準品のバイアルと共に、外部標準比による自動クエンチ補正を有する液体シンチレーション分析機（パッカード液体シンチレーション分析機、１６００ＴＲ）を用いて、５分間分析した。可能であれば、サンプルは２回分析し、加熱させ、分析前に光安定化させた。それぞれの結果の計算前に、バックグラウンドカウント速度を決定し、各々カウント速度を求めるのに差し引いた。上記のバックグラウンドで３０ｄ．ｐ．ｍの信頼定量限界をこれらの研究室で制定した。
【００９１】
排泄物中のそれぞれの動物における全放射能、消化管および死骸の回収を、表５および６に示す。排泄物の結果の平均は、図７にグラフで記載する。
【表７】
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【表８】
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【００９２】
投与された放射能投与量は、定量的に回収された（９６．７〜１０３．２％）。放射能は、糞中に大部分が排出され、投与後１６８時間までに投与量の平均６５．５％を回収した。対照的に、放射能投与量の平均８．５％が、このときまでに尿中で回収された。放射標識した材料の脱離は、投与後１２０時間までに排泄物中に回収された投与量の約６６％とゆっくりであった。１６８時間の回収期間完了後、平均７５．０％が排泄物およびケージ洗浄液中に回収され、１６８時間において、投与量の約１２．５％および１３．５％がそれぞれ消化管および死骸に残っていた。該投与量の０．２％以下が、呼気に回収された。
【００９３】
実施例８：ＣａＣｏ−２細胞の増殖阻害
ヒト大腸癌細胞系であるＣａＣｏ−２の増殖に対するＮ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）および他のアナログ（表７に示した構造）の効果を以下の方法で評価した。細胞増殖は、バイオビジョン（カリフォルニア州）から入手した増殖キットを用いて、ホルマザンへのＷＳＴ−１色素変換アッセイによって測定した。用いた該手順は、本質的に製品の取扱説明書に記載通り使用した。つまり、細胞が半集密的単層を形成するまで、７日間成長させた。７日目、細胞をトリプシン処理し、約５００００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートで再懸濁した。その後、５μＭの試験化合物を含んだ新鮮な培地を加え、アッセイプレートをさらに続けて１２時間インキュベートした。ウェルに付きＷＳＴ−１色素１０μＬの溶液を加え、４時間後、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４４０ｎｍおよび６００ｎｍにて読み取った。４４０−６００ｎｍの吸収は、増殖細胞の数に正比例する。全サンプルは２回測定し、結果は２回の定量の平均として表した。
【表９】
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【表１０】
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【００９４】
実施例９：成長阻害アッセイ
ＨＵＶＥＣ（１．５×１０3）を１００μＬのＥＢＭ−２（Clonetic# CC3162)中、９６ウェルプレートに固定した。２４時間（０日目）後、化合物１（１００μＬ）の試験溶液をＥＢＭ−２培地中、所望の濃度（５〜７濃度レベル）の２Ｘでそれぞれのウェルに加える。０日目において、１つのプレートを２０％メタノール中、１０分間、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水でリンスし、風乾した。残りのプレートは、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、プレートは２０％メタノール中、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水でリンスし、風乾した。該染色物をエタノール：０．１Ｍクエン酸ナトリウムの１：１溶液（０日目プレートを含む）で溶離させ、吸収をＥＬＩＳＡリーダー（Dyriatech Laboratories)を用い、５４０ｎｍで測定した。０日目での吸収は、７２時間プレートから差し引き、データを増殖のコントロール（ベヒクル処理した細胞）のパーセントとしてプロットした。ＩＣ50（５０％阻害を引き起こす薬剤濃度）は、プロットしたデータから計算され、表８に報告する。プロットしたデータは、図８に示す。
【００９５】
実施例１０：コード形成アッセイ
マトリゲル（１０ｍｇ／ｍＬの６０μＬ；Collaborative Lab#35423）を氷冷した９６ウェルプレートの各ウェルに固定した。該プレートを室温で１５分間静置させ、次いで、３７℃で３０分間、マトリゲルを重合させるようにインキュベートした。一方、ＨＵＶＥＣを２×１０5細胞／ｍＬの濃度で、ＥＧＭ−２（Clonetic# CC3162）中で調製する。化合物１の試験溶液は、同一培地中、所望の濃度（５濃度レベル）の２Ｘで調製する。該細胞（５００μＬ）および２Ｘの化合物１（５００μＬ）溶液を混合し、この懸濁液の２００μＬをポリマー化したマトリゲル上に一対固定する。２４時間インキュベートした後、３通りの写真をＢｉｏｑｕａｎｔ映像分析装置を用いて、それぞれの濃度で撮った。薬剤効果（ＩＣ50）は、形成したコードの長さおよび接合の数を測定することにより、未処理のコントロールと比較して評価する。該プロットしたデータは、図９に示す。
【００９６】
実施例１１：細胞遊走アッセイ
遊走は、４８ウェルのボイデンチャンバーおよび８μｍ微細孔サイズのコラーゲン（１０μｇ／ｍＬラット尾コラーゲン；Collaborative Laboratories）でコーティングしたポリカーボネートフィルター（オスモニクス社）を用いて評価する。ボトムチャンバーウェルを、２７〜２９μＬのダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）を単独（ベースライン）、または化学誘引物質（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦまたはＳｗｉｓｓ３１３細胞で調製済みの培地）を含んだ培地で処置する。トップチャンバーを、試験化合物を含むか、含まないＤＭＥＭ＋１％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）中で調製されたＨＵＶＥＣ細胞懸濁液（１×１０6細胞／ｍＬ）の４５μＬで処置する。３７℃でインキュベーションを５時間した後、該膜は、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でリンスし、固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ溶液で染色する。該フィルターは、裏返した該遊走細胞と共にスライドガラスに置いて、上にある細胞をキムワイプで除去する。試験は、４〜６回繰り返し実施し、それぞれのウェルから５つの領域をカウントした。刺激していないコントロールの負の値を、刺激したコントロール値および薬剤で処置した値から差し引き、データを平均の遊走細胞±標準偏差としてプロットする。ＩＣ50は、プロットしたデータから計算し、表８に報告する。グラフによる結果は、図１０に示す。
【表１１】
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【００９７】
本発明の具体的な態様を記載したが、それらの多くの変更が容易に明らかであり、当業者に示唆され得ることは理解され、したがって、本発明が以下の請求の範囲の精神および範囲によってのみ制限されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）による（ａ）ＣａＣｏ−２および（ｂ）Ｔ８４細胞の増殖阻害を示すグラフである。
【００９９】
【図２】図２は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）によるＨＵＶＥＣ細胞の増殖阻害を示すグラフである。
【０１００】
【図３】図３は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）によるＴ８４およびＣａＣｏ−２細胞におけるアポトーシス誘導を示すＤＮＡ切断顕微鏡写真である。
【０１０１】
【図４】図４は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）によるＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシス誘導を示すＤＮＡ切断顕微鏡写真である。
【０１０２】
【図５】図５は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）によるカスパーゼ−３およびカスパーゼ−９の活性化を示すグラフである。
【０１０３】
【図６】図６は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）濃度の機能として腫瘍細胞成長を示すグラフの編集である。
【０１０４】
【図７】図７は、１ｍｇ遊離塩基／ｋｇの目的投与レベルで雄のラットに、［14Ｃ］Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物ＩＩ）を単独で経口投与に従った放射線の排出量の平均を示したグラフである。
【０１０５】
【図８】図８は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）濃度とコントロールを比較した機能としてＨＵＶＥＣ細胞増殖を示すグラフである。
【０１０６】
【図９】図９は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）濃度とコントロールを比較した機能としてＨＵＶＥＣコード形成を示すグラフである。
【０１０７】
【図１０】図１０は、Ｎ，Ｎ−ジエチル−８，８−ジプロピル−２−アザスピロ［４，５］デカン−２−プロパンアミン 二マレイン酸塩（化合物１）濃度とコントロールを比較した機能としてのＨＵＶＥＣ細胞遊走を示すグラフである。