【手続補正書】
【提出日】平成19年8月7日(2007.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  標的核酸配列とリファレンス核酸配列との間の相違の存在を検出する方法であって、以下の工程：
(ａ)  プライマーＰ２、前記標的配列とハイブリダイズすることができる３′部分および、前記標的と相補的でない５′テール部分Ｔを有するプライマーＰ４、並びに前記プライマーＰ４の３′部分とハイブリダイズすることができる配列から３′方向のある位置で前記標的とハイブリダイズすることができるプライマーＰ５を用いてポリメラーゼ連鎖反応によって前記標的配列を増幅し、
ここで、プライマーＰ２は第一の標識をもつプライマーＰ２および第二の標識をもつプライマーＰ２の混合物であるか、またはプライマーＰ４が第一の標識をもちさらにプライマーＰ５が第二の標識をもつかのいずれかで；
(ｂ)  前記標的配列のテール付き部分的二本鎖体標的を形成し、前記二本鎖体は、前記第一の標識または前記第二の標識の１つおよび２つの非相補的領域のテールを有し、ここで第一の領域は配列Ｐ５またはその相補配列であり、第二の領域は配列Ｔまたはその相補配列であり；
(ｃ)  プライマーＰ２、前記リファレンス配列とハイブリダイズすることができる３′部分および前記リファレンスと相補的でない５′テール部分Ｔを有するプライマーＰ４、および前記プライマーＰ４の３′部分とハイブリダイズすることができるある配列と３′方向で実質的に隣接するリファレンスとハイブリダイズすることができるプライマーＰ５を用いてポリメラーゼ連鎖反応によって前記リファレンス配列を増幅し、
ここで、プライマーＰ２は第一の標識をもつプライマーＰ２および第二の標識をもつプライマーＰ２の混合物であるか、またはプライマーＰ４が第一の標識をもちさらにプライマーＰ５が第二の標識をもつかのいずれかで；
(ｄ)  前記リファレンス配列のテール付き部分的二本鎖体標的を形成し、前記部分的二本鎖体は、前記第一の標識または前記第二の標識の１つおよび２つの非相補鎖のテールを有し、第一の鎖は配列Ｐ５またはその相補配列であり、第二の鎖は配列Ｔまたはその相補配列であり；
(ｅ)  前記テール付き標的配列および前記テール付きリファレンス配列を二本鎖形として含む複合体を形成し、ここで前記複合体は少なくとも１対の前記非相補鎖を有し、さらに前記テール付き標的配列および前記テール付きリファレンス配列の各々は前記標識の１つを有し；
(ｆ)  前記複合体の部分として前記標識の会合を検出するが、前記会合は前記相違の存在と関連する；
を含む上記方法。
【請求項２】  前記標識がオリゴヌクレオチド、酵素、染料、蛍光分子、化学発光物質、補酵素、酵素基質、放射性基、小型有機分子および固体表面から成る群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項３】  前記プライマーＰ４の３′部分とハイブリダイズすることができる標的またはリファレンス上の前記配列が、プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる標的またはリファレンスのある配列のすぐ隣にある請求項１に記載の方法。
【請求項４】  前記プライマーＰ４の３′部分とハイブリダイズすることができる標的またはリファレンス上の前記配列が、プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる標的またはリファレンスのある配列と部分的にオーバーラップする請求項１に記載の方法。
【請求項５】  前記プライマーＰ４の３′部分とハイブリダイズすることができる標的またはリファレンス上の前記配列が、プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる標的またはリファレンスのある配列に隣接していない請求項１に記載の方法。
【請求項６】  前記増幅工程（ｃ）が工程（ａ）に用いられた反応媒体と同じ反応媒体中で実施される請求項１に記載の方法。
【請求項７】  前記第一の標識が第二の標識と同じである請求項１に記載の方法。
【請求項８】  一方の端に予め規定した２つの非相補的な一本鎖配列を有する部分をもつ部分的二本鎖体ＤＮＡの調製方法であって、以下の工程：
第一の組み合わせ物中で核酸、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸並びにプライマーＰ２およびＰ５を一緒にし、ここで前記プライマーＰ２は前記核酸の第一の鎖とハイブリダイズし、これに沿って伸長することができ、さらに前記Ｐ５は前記核酸の第二の鎖とハイブリダイズし、これに沿って伸長することができ;
第二の組み合わせ物中で前記核酸、前記ポリメラーゼおよび前記ヌクレオシド三リン酸、前記プライマーＰ２並びに前記第二の鎖とハイブリダイズすることができる３′部分および前記第一の鎖または前記第二の鎖と相補的でない５′テール部分Ｔを有するプライマーＰ４を一緒にし、ここで前記プライマーＰ４の３′部分は前記プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる配列から５′方向のある位置で前記第二の鎖とハイブリダイズすることができ；
前記第一および第二の組み合わせ物を温度サイクリングに付して前記プライマーを伸長させ；
前記第一の組み合わせ物を前記第二の組み合わせ物と一緒にして、Ｔまたはその相補配列の非相補的一本鎖配列およびＰ５またはその相補配列の非相補的一本鎖配列を有する部分的二本鎖体ＤＮＡを形成する；
を含む上記方法。
【請求項９】  前記第一の組み合わせ物および前記第二の組み合わせ物が、前記組み合わせ物を温度サイクリングに付す前に一緒にされる請求項８の方法。
【請求項１０】  プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる前記配列がプライマーＰ４の前記３′部分とハイブリダイズすることができる配列のすぐ隣にある請求項８に記載の方法。
【請求項１１】  プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる前記配列がプライマーＰ４の前記３′部分とハイブリダイズすることができる配列とオーバーラップする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】  プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる前記配列がプライマーＰ４の前記３′部分とハイブリダイズすることができる配列と隣接していない請求項８に記載の方法。
【請求項１３】  プライマーＰ２が第一の標識をもつプライマーＰ２および第二の標識をもつプライマーＰ２の混合物であるか、またはプライマーＰ５が第一の標識をもちさ
らにプライマーＰ４が第二の標識をもつかのいずれかである請求項８の方法。
【請求項１４】  前記標識がオリゴヌクレオチド、酵素、染料、蛍光分子、化学発光物質、補酵素、酵素基質、放射性基、小型有機分子および固体表面から成る群から選ばれる請求項１３の方法。
【請求項１５】  第一の標識が第二の標識と同じである請求項１３の方法。
【請求項１６】  標的核酸配列中の変異の存在を検出する方法であって、以下の工程：
(ａ)  反応容器中で、
(１)  変異を有すると考えられる標的配列、
(２)  前記標的の第一の鎖とハイブリダイズすることができるプライマーＰ２、
(３)  前記標的の第二の鎖とハイブリダイズすることができるプライマーＰ５、
(４)  前記標的の第二の鎖とハイブリダイズすることができる３′領域、および前記標的の第二の鎖と相補的でない５′テール領域Ｔを有するプライマーＰ４、ここでＰ４の３′領域とハイブリダイズすることができる第二の鎖上の領域はＰ５とハイブリダイズすることができる第二の鎖の領域の５′方向に位置している、
(５)  ポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸
を一緒にして標的混合物を作製し；
(ｂ)  前記プライマーを前記標的配列に沿って伸長させ；
(ｃ)  ２つの非相補的配列のテールを有する部分的二本鎖体標的を形成し、ここで前記非相補的配列はＰ５およびＴまたはＰ５およびＴの相補配列で；
(ｄ)  反応容器中で、
(１)  前記標的内の変異が存在する可能性があることを除いて前記標的配列と実質的に同一であるリファレンス核酸配列、
(２)  前記プライマーＰ２、
(３)  前記プライマーＰ５、
(４)  前記プライマーＰ４、および
(５)  ポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸
を一緒にしてリファレンス混合物を作製し；
(ｅ)  前記プライマーをリファレンス配列に沿って伸長させ；
(ｆ)  ２つの非相補的配列のテールを有する部分的二本鎖体リファレンスを形成し、ここで前記非相補的配列はＰ５およびＴまたはＰ５およびＴの相補配列で;
(ｇ)  前記部分的二本鎖体標的を前記部分的二本鎖体リファレンスと一緒にし;
(ｈ)  前記部分的二本鎖体標的の非相補的テール配列を前記部分的二本鎖体リファレンスの非相補的テール配列とハイブリダイズさせて４分子複合体を形成し;
(ｉ)  前記４分子複合体を鎖交換の条件に付し、この場合前記標的と前記リファレンスとの間に相違が存在するならば、鎖の交換は停止し、相違が存在しないならば、鎖の交換は完全な鎖交換が完了するまで持続し；
(ｊ)  前記複合体の存在を検出するが、その存在は変異の存在と関連する；
を含む上記方法。
【請求項１７】  プライマーＰ２が第一の標識をもつプライマーＰ２および第二の標識をもつプライマーＰ２の混合物であるか、またはプライマーＰ４が第一の標識をもちさらにプライマーＰ５が第二の標識をもつかのいずれかであり、前記複合体の存在は前記標識の会合を測定することにより検出される請求項１６の方法。
【請求項１８】  前記標識がオリゴヌクレオチド、酵素、染料、蛍光分子、化学発光物質、補酵素、酵素基質、放射性基、小型有機分子および固体表面から成る群から選ばれる請求項１７の方法。
【請求項１９】  前記標識の会合が誘発ルミネセンスアッセイによって検出される請求項１７の方法。
【請求項２０】  プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる前記領域が、プライマーＰ４の前記３′部分とハイブリダイズすることができる前記領域のすぐ隣にある
請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】  プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる前記領域が、プライマーＰ４の前記３′部分とハイブリダイズすることができる前記領域とオーバーラップする請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】  プライマーＰ５とハイブリダイズすることができる前記領域が、プライマーＰ４の前記３′部分とハイブリダイズすることができる前記領域と隣接していない請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】  前記標的混合物およびリファレンス混合物が同じ反応容器で一緒にされる請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】  前記第一の標識が第二の標識と同じである請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】  前記標的配列のテール付き部分的二本鎖体および前記リファレンス鎖のテール付き部分的二本鎖体を含む４分子複合体の存在によって検出される、標的核酸配列とリファレンス核酸配列との間の相違の存在を検出する方法であって、以下の改善：
プライマーＰ２、前記標的配列もしくはリファレンス配列とハイブリダイズすることができる３′部分および前記標的配列もしくはリファレンス配列と相補的でない５′テール部分Ｔを有するプライマーＰ４、並びにプライマーＰ４の前記３′部分とハイブリダイズすることができる配列から３′方向の位置で前記標的配列またはリファレンス配列とハイブリダイズすることができるプライマーＰ５を用いポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列およびリファレンス核酸配列を増幅させることによって、テール付き部分的二本鎖体標的およびテール付き部分的二本鎖体リファレンスを形成する；
を含む上記方法。
【請求項２６】  変異を有する二本鎖核酸標的配列および二本鎖核酸リファレンス配列の４分子複合体であって、
(ａ)  プライマーＰ２、前記リファレンス配列とハイブリダイズすることができる３′部分および前記標的配列またはリファレンス配列と相補的でない５′テール部分Ｔを有するプライマーＰ４、並びにプライマーＰ４の前記３′部分とハイブリダイズすることができる配列から３′方向の位置で前記標的配列またはリファレンス配列とハイブリダイズすることができるプライマーＰ５を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列およびリファレンス核酸配列を増幅させ；
(ｂ)  ２つの非相補的な鎖のテールを有する、前記標的配列およびリファレンス配列の部分的二本鎖体を形成し、この場合第一の鎖は配列Ｐ５またはその相補配列で、第二の鎖は配列Ｔまたはその相補配列で；
(ｃ)  前記リファレンスの部分的二本鎖体の前記テールの鎖を前記標的の部分的二本鎖体の前記テールの鎖とハイブリダイズさせて前記複合体を形成する；
ことを含む工程によって製造される上記４分子複合体。
【請求項２７】  前記複合体が前記標的およびリファレンス配列の非相補的な鎖上の標識の存在により検出でき、さらにこの場合、プライマーＰ２が第一の標識をもつプライマーＰ２および第二の標識をもつプライマーＰ２の混合物であるか、またはプライマーＰ４が第一の標識をもち、さらにプライマーＰ５が第二の標識をもつかのいずれかである、請求項２６の４分子複合体。
【請求項２８】  標識核酸中の変異を検出するためのキットであって、パッケージとして：
(ａ)  標的中に存在する変異を除いて前記標的核酸と同一の核酸配列を含むリファレンス核酸；
(ｂ)  前記標的およびリファレンスの第一の鎖に沿って伸長できるプライマーＰ２；
(ｃ)  前記標的およびリファレンスの第二の鎖に沿って伸長できるプライマーＰ５；
(ｄ)  前記リファレンスおよび標的の前記第二の鎖とハイブリダイズすることができる３′部分および、前記第一の鎖または前記第二の鎖と相補的でない５′テール部分Ｔを有するプライマーＰ４（ここで前記プライマーＰ４の３′部分は、前記プライマーＰ５とハ
イブリダイズすることができる配列から５′方向の位置で前記第二の鎖とハイブリダイズすることができる）；
を含む上記キット。
【請求項２９】  さらにポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸を含む請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】  プライマーＰ２が第一の標識をもつプライマーＰ２および第二の標識をもつプライマーＰ２の混合物であるか、またはプライマーＰ４が第一の標識をもち、さらにプライマーＰ５が第二の標識をもつかのいずれかである請求項２８に記載のキット。