(57)【要約】  本発明は、治療用化合物及び組成物、並びに神経障害の予防又は治療におけるそれらの使用のための方法に関する。より詳細には、本発明は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）アロステリックモジュレーター、及び、ＮＭＤＡＲ機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態の予防又は治療における、それらの使用のための方法に関する。本発明はまた、ＮＭＤＡＲアロステリックモジュレーターを同定する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態の予防又は治療を必要とする対象における前記予防又は前記治療のための医薬の製造における、式１の化合物又はその医薬的に許容される塩の使用：
【化１】
2019530749.tif 000033
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン（halo）、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲＲ’、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜６のアルケノキシ基又は炭素数２〜６のアルキノキシ基であり；
Ｒ１５はＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり；
Ｒ１１はＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり；
Ｇは直接結合、Ｏ、ＮＲ、Ｓ、ＯＣＲ’Ｒ”、ＳＣＲ’Ｒ”、ＮＲＣＲ’Ｒ”、ＮＲＣ（Ｏ）、ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’、ＮＲＣ（Ｏ）ＣＲ’Ｒ”又はＮＲＣ（Ｏ）ＣＲ’Ｒ”Ｏであり、Ｇはカルボニル及びＡとどちらかの方向性で結合しており；
ＡはＡ−１：
【化２】
2019530749.tif 000034
であり；
ＸはＣＲ７又はＮであり；
ＹはＣＲ８又はＮであり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１４、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲＲ’、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜６のアルケノキシ基若しくは炭素数２〜６のアルキノキシ基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８が一緒になって、若しくはＲ８及びＲ９が一緒になって、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される１〜３個のヘテロ原子を所望により含む、５員若しくは６員の飽和、部分不飽和若しくは芳香族の単環を形成していてもよく；
Ｒ１４はＨ、炭素数１〜６のアルキル基、又は、１つ若しくは複数の炭素数１〜６のアルキル基で所望により置換された炭素数５〜１０のアリール基であり；
Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、各存在箇所において、独立にＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり； 且つ
前記アルキル基、前記アルケニル基、前記アルキニル基、前記アルコキシ基、前記アルケノキシ基及び前記アルキノキシ基は、それぞれ、ＯＨ及びハロゲンからなる群より選択される１つ又は複数の基で所望により置換されている。
【請求項２】
Ｇは直接結合、ＮＭｅＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２、ＮＨＣＨ２、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ又はＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｘ及びＹが同時にＮであることはない、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１１及びＲ１５は共にＨであり；
Ｒ４はＨ、ハロゲン、ＮＯ２、又は炭素数２〜４のアルケニル基であり；
Ｒ５はＨ又はハロゲンであり；
Ｒ６はＨ又は炭素数１〜４のアルキル基であり；且つ
Ｒ１０はＨ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基である、
請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１はＨ、ＯＨ、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数２〜４のアルキノキシ基であり；
Ｒ２はＨ、ＯＨ、炭素数１〜４のアルコキシ基又はハロゲンであり；
Ｒ３はＨ又はＯＨであり；且つ
ハロゲンはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを表し、好ましくはＣｌ又はＢｒを表す、
請求項４に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ７はＨ、ＯＨ、ハロゲン若しくは炭素数１〜４のアルキル基であり、
Ｒ８はＨ、ＯＨ、ハロゲン、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基若しくはＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１４であり、ここでＲ１４は炭素数１〜４のアルキル基で置換されたフェニル基であり、
Ｒ９はＨ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ２若しくは炭素数１〜４のアルキル基であるか；
又は、
Ｒ７及びＲ８は一緒になってフェニルを形成しているか；
又は、
Ｒ８及びＲ９は一緒になって１，４−ジオキサニルを形成しており；且つ、
ハロゲンはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを表す、
請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記化合物が
【化３】
2019530749.tif 000035
【化４】
2019530749.tif 000036
【化５】
2019530749.tif 000037
【化６】
2019530749.tif 000038
【化７】
2019530749.tif 000039
【化８】
2019530749.tif 000040
【化９】
2019530749.tif 000041
【化１０】
2019530749.tif 000042
【化１１】
2019530749.tif 000043
【化１２】
2019530749.tif 000044
からなる群より選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記化合物がＮＭＤＡＲアロステリックモジュレーターである、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記化合物が含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲ（GluN2A-containing NMDAR）に対して選択的なポジティブモジュレーターである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記障害又は前記状態が興奮毒性に関連する神経障害である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記障害又は前記状態が、学習及び記憶障害、片頭痛、てんかん、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳外傷、脳卒中などの急性脳損傷、統合失調症、神経因性疼痛、うつ病、並びに薬物依存からなる群より選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
【化１３】
2019530749.tif 000045
【化１４】
2019530749.tif 000046
【化１５】
2019530749.tif 000047
【化１６】
2019530749.tif 000048
【化１７】
2019530749.tif 000049
からなる群より選択される化合物、又はその医薬的塩。
【請求項１３】
請求項１２に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩、及び
医薬的に許容される担体又はアジュバント
を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）における、ＧｌｕＮ１サブユニットとＧｌｕＮ２Ａサブユニットとの間の界面の標的部位に、特異的に結合する化合物であって、前記標的部位が、少なくとも、ＧｌｕＮ１のアミノ酸残基１３５並びにＧｌｕＮ２Ａのアミノ酸残基７９、１１１、１１５、１７７及び１７８のうちの１つ又は複数により画定される、化合物。
【請求項１５】
前記標的部位が、少なくとも、ＧｌｕＮ１のＬ１３５と、ＧｌｕＮ２ＡのＰ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８のうちの１つ又は複数と、により画定される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記標的部位が、少なくとも、ＧｌｕＮ１のＬ１３５並びにＧｌｕＮ２ＡのＰ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８により画定される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、標的部位内の、ＧｌｕＮ１のアミノ酸残基１３５並びにＧｌｕＮ２Ａのアミノ酸残基７９、１１１、１１５、１７７及び１７８のうちの１つ又は複数と相互作用する、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
前記モジュレーターが、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲ（GluN1/GluN2A-containing NMDAR）を特異的に増強（potentiate）する、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１９】
ｉ）ＮＭＤＡＲ受容体のＮ末端ドメインにおいて、ＧｌｕＮ１とＧｌｕＮ２Ａとの間の界面の結合ポケットに、候補化合物の構造体をドッキングさせるステップであって、前記結合ポケットが、少なくとも、ＧｌｕＮ１サブユニットのアミノ酸残基１３５並びにＧｌｕＮ２Ａサブユニットのアミノ酸残基７９、１１１、１１５、１７７及び１７８のうちの１つ又は複数により画定される、ステップと、
ｉｉ）含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強し得る候補化合物を同定するステップと、
を含み、コンピューターに支援される、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強する化合物を同定する方法。
【請求項２０】
前記結合ポケットが、少なくとも、ＧｌｕＮ１のＬ１３５と、ＧｌｕＮ２ＡのＰ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８のうちの１つ又は複数と、により画定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合ポケットが、少なくとも、ＧｌｕＮ１のＬ１３５並びにＧｌｕＮ２ＡのＰ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８により画定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
同定された候補化合物を合成すること又は得ること、及び
前記化合物が含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強するかを判断すること
をさらに含む、請求項１９〜請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用化合物及び組成物、並びに神経障害の予防又は治療におけるそれらの使用のための方法に関する。より詳細には、本発明は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）アロステリックモジュレーター、及び、ＮＭＤＡＲ機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態の予防又は治療における、それらの使用のための方法に関する。本発明はまた、ＮＭＤＡＲアロステリックモジュレーターを同定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）は、学習及び記憶などの脳機能の媒介(Tang, Y.P. et al. Nature (1999) 401(6748): 63-69)と、アルツハイマー病(Paoletti, P. et al. Nat Rev Neurosci (2013) 14(6): 383-400)、ハンチントン病（Fan, M. & Raymond, L. Prog Neurobiol (2007) 81(5-): 272-293）、及びパーキンソン病(Schmidt, B.J. Ann NY Acad Sci (1998) 860: 189-202)などの慢性脳変性疾患、並びに脳外傷を含む障害(Shohami, E. & Biegon, A. CNS Neurol Disord Drug Targets (2014) 13(4): 567-573)、及び脳卒中などの急性脳損傷(Liu, Y. et al. J Neurosci (2007) 27(11): 2846-2857)の発病との双方において、重要な役割を果たす、脳内のイオンチャネル型グルタミン酸受容体の亜科である。
【０００３】
脳卒中は、重度の長期能力障害の主因である(Mozaffarian, D. et al. Circulation (2015) 131(4): e29-322)。さらに、すべての脳卒中のうちの８７％は、虚血性脳卒中であり、その原因は、脳への血流を阻害する、血管内に形成された血餅である(Haast, et al. J Cereb Blood Flow Metab (2012) 32(12): 2100-2107; Mozaffarian, D. et al. Circulation (2015) 131(4): e29-322; Zhang, Y. et al. Circulation (2008) 118(15): 1577-1584)。この阻害は、最終的には、細胞への酸素供給の欠乏による脳機能の急激な喪失及び緩慢な細胞死、プログラム細胞死、フリーラジカルの形成、並びに制御不能な細胞死（壊死）を招き、そのすべてが脳に有害な影響を及ぼす(Northington, F.J. et al. Ann Neurol (2011) 69(5): 743-758)。
【０００４】
ＮＭＤＡＲサブユニットは、必須であるＧｌｕＮ１サブユニット（以前はＮＲ１として知られていた）と、ＧｌｕＮ２Ａ−Ｄ（以前はＮＲ２Ａ−Ｄとして知られていた）及び／又はＧｌｕＮ３（Ａ及びＢ）サブユニットとの組み合わせからなる、ヘテロ四量体の膜貫通チャネルを形成する(Collingridge, G.L. et al. Neuropharmacology (2009) 56(1): 2-5)。異なるＧｌｕＮ２サブユニット（ＧｌｕＮ２Ａ−Ｄ）は、受容体複合体に、別個の電気生理学的及び薬理学的な特性を付与し、それらを異なるシグナル伝達機構と結び付ける(Bliss, T. & Schoepfer, R. Science (2004) 304(5673): 973-974; Seeburg, P.H. Trends Neurosci (1993) 16(9): 359-365; Seeburg, P.H. Trends Pharmacol Sci (1993) 14(8): 297-303)。近年の証拠は、ＮＭＤＡＲが、ＧｌｕＮ２サブユニットの存在に応じて、シナプス可塑性及び細胞生存の媒介において異なる機能を発揮することを示唆している。一般に、含ＧｌｕＮ２Ｂ−ＮＭＤＡＲ（GluN2B-containing NMDAR）は、細胞死のシグナル伝達を活性化し、それによって興奮毒性による神経細胞障害を媒介し、一方、含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲ（GluN2A-containing NMDAR）は、学習、記憶及び神経細胞生存のために重要な長期増強の誘導を促進し、それによって興奮毒性による障害から神経細胞を保護する。
【０００５】
神経細胞の生存及び死における、このＮＭＤＡＲの二重機能は、近年の臨床治験においてＮＭＤＡＲモジュレーターが奏功していない理由の、少なくとも一部である可能性がある。従来のＮＭＤＡＲアンタゴニストは表面受容体を標的とし、神経細胞の細胞生存シグナル伝達経路及び細胞死シグナルの伝達経路と、受容体の通常の機能との両方を本質的に阻害するため、望ましくない副作用の原因となる。これに対して、含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲの活性増進（enhancement）は、神経細胞の生存機序を特異的に促進することにより虚血性損傷から神経細胞を守り、それによって副作用を軽減し、かつ治療の機会を広げる可能性がある。
【０００６】
虚血性脳卒中に対する現在の治療選択肢は、血管治療を介して脳卒中発症後の再灌流を行うことによって血流を回復させるか、又は神経を保護する手法により虚血性細胞死に至るシグナル伝達経路を阻害するかのいずれかに限られる（Woodruff T.M. et al. Mol Neurodegener (2011) 6(1): 11)。受容体チャネルをポジティブに調節する（positive modulation）手法を用いた、ＮＭＤＡＲの機能の薬理学的強化においては、現在まで進歩はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＮＭＤＡＲ活性を調節する化合物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
具体的には、本発明において同定される化合物は、ＮＭＤＡＲのＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａサブタイプ及び／又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂサブタイプをポジティブに調節する効果を示す。
【０００９】
本発明のある態様においては、ＮＭＤＡＲ機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態の予防又は治療を必要とする対象における、前記予防又は治療に使用するための、式１の化合物又はその医薬的に許容される塩が提供される。
【００１０】
【化１】
2019530749.tif 000002
【００１１】
式１中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン（halo）、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲＲ’、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜６のアルケノキシ基又は炭素数２〜６のアルキノキシ基であり；
Ｒ１５はＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり；
Ｒ１１はＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり；
Ｇは直接結合、Ｏ、ＮＲ、Ｓ、ＯＣＲ’Ｒ”、ＳＣＲ’Ｒ”、ＮＲＣＲ’Ｒ”、ＮＲＣ（Ｏ）、ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’、ＮＲＣ（Ｏ）ＣＲ’Ｒ”又はＮＲＣ（Ｏ）ＣＲ’Ｒ”Ｏであり、Ｇはカルボニル及びＡとどちらかの方向性で結合しており；
ＡはＡ−１：
【００１２】
【化２】
2019530749.tif 000003
【００１３】
であり；
ＸはＣＲ７又はＮであり；
ＹはＣＲ８又はＮであり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１４、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲＲ’、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜６のアルケノキシ基若しくは炭素数２〜６のアルキノキシ基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８が一緒になって、若しくはＲ８及びＲ９が一緒になって、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される１〜３個のヘテロ原子を所望により含む、５員若しくは６員の飽和、部分不飽和若しくは芳香族の単環を形成していてもよく；
Ｒ１４はＨ、炭素数１〜６のアルキル基、又は、１つ若しくは複数の炭素数１〜６のアルキル基で所望により置換された炭素数５〜１０のアリール基であり；
Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、各存在箇所において、独立にＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり；並びに
前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルケノキシ基及びアルキノキシ基は、それぞれ、ＯＨ及びハロゲンからなる群より選択される１つ又は複数の基で所望により置換されている。
【００１４】
本発明のさらなる態様では、対象において、ＮＭＤＡＲ機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態を予防又は治療するための方法であって、前記方法が、予防的又は治療的有効量の本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩を、前記対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる態様では、ＮＭＤＡＲ機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態を、予防又は治療することを必要とする対象において、前記予防又は治療を行うための医薬の製造における、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩の使用が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体又はアジュバントを含む、医薬組成物が提供される。前記医薬組成物は、ＮＭＤＡＲ活性を調節するために使用することができ、したがって、ＮＭＤＡＲ機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態の予防又は治療を必要とする対象において、前記予防又は治療のために使用することができる。
【００１７】
本発明のさらなる態様では、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）におけるＧｌｕＮ１サブユニットとＧｌｕＮ２Ａサブユニットとの間の界面の標的部位に特異的に結合する化合物であって、前記標的部位が、少なくとも、ＧｌｕＮ１のアミノ酸残基１３５並びにＧｌｕＮ２Ａのアミノ酸残基７９、１１１、１１５、１７７及び１７８のうちの１つ又は複数により画定（define）される、化合物が提供される。いくつかの実施形態において、前記化合物は、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲ（GluN1/GluN2A-containing NMDAR）を特異的に増強（potentiate）する。
【００１８】
本発明のさらなる態様では、
ｉ）ＮＭＤＡＲ受容体のＮＴＤにおいて、ＧｌｕＮ１とＧｌｕＮ２Ａとの間の界面の結合ポケットに、候補化合物の構造体をドッキングさせるステップであって、前記結合ポケットが、少なくとも、ＧｌｕＮ１サブユニットのアミノ酸残基１３５並びにＧｌｕＮ２Ａサブユニットのアミノ酸残基７９、１１１、１１５、１７７及び１７８のうちの１つ又は複数により画定される、ステップと、
ｉｉ）含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強し得る候補化合物を同定するステップと、
を含み、コンピューターに支援される、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強する化合物を同定する方法が提供される。
【００１９】
前記方法は、同定された候補化合物を合成すること又は得ることと、前記化合物が含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強するかを判断することと、をさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ホールセルボルテージクランプ記録を用いた最初のスクリーニングで得られた「ヒット」化合物の、増強及び抑制効果を示す図である。
【図２】図２は、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲを発現しているＨＥＫ２９３細胞及びＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ  ＮＭＤＡＲを発現しているＨＥＫ２９３細胞における、Ｎｐａｍ０２の異なる類似体による調節効果を示す図である。
【図３】図３は、Ｎｐａｍ０２が、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＡサブユニットでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、直接結合することにより、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａを介するＮＭＤＡＲ電流を増強したが、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂを介するＮＭＤＡＲ電流は変化させなかったことを示す図である。
【図４】図４は、Ｎｐａｍ０２が、培養された海馬神経細胞において神経細胞のＮＭＤＡＲ機能を強化し、この増強効果がＧｌｕＮ２Ａアンタゴニストによって阻害されたことを示す図である。
【図５】図５は、ＧｌｕＮ２Ｂサブユニットを遺伝子欠損させた皮質培養神経細胞への、Ｎｐａｍ０２の投与により、ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲを介する電流が増強されることを示す図である。
【図６】図６は、Ｎｐａｍ０２が、神経細胞培養物において、ＡＭＰＡ及びＧＡＢＡにより誘導される電流応答に影響を与えないことを示す図である。
【図７】図７は、Ｎｐａｍ０２の二次元化学構造を示す図である。
【図８】図８は、ＧｌｕＮ２ＡのＦ１７７及びＱ１１１が、ＮＭＤＡＲ受容体のＮＴＤにおいて、ＧｌｕＮ１とＧｌｕＮ２Ａとの間の界面に、Ｎｐａｍ０２の結合ポケットを形成していることを示す図である。
【図９】図９は、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲを発現しているＨＥＫ２９３細胞及びＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ  ＮＭＤＡＲを発現しているＨＥＫ２９３細胞における、Ｎｐａｍ４３による調節効果と、両発現系におけるその用量依存曲線を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｎｐａｍ４３による増強効果を減少させた、Ｎ末端ドメインにおけるＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ界面の重要なアミノ酸残基を示す図である。
【図１１】図１１は、野生型ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ、変異型ＧｌｕＮ１（Ｌ１３５Ｑ）及び変異型ＧｌｕＮ１（Ｌ１３５Ｑ）／ＧｌｕＮ２Ａ（Ｆ１１５Ｓ）を、それぞれ発現しているＨＥＫ２９３細胞における、グルタメートの用量反応性を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｎｐａｍ４３が、培養された海馬神経細胞において、含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に標的とすることを示す図である。
【図１３】図１３は、Ｎｐａｍ４３が、培養された海馬神経細胞において、ＮＭＤＡＲを介する電流を用量依存的に増強し、ＮＭＤＡアゴニストの結合を調節することを示す図である。
【図１４】図１４は、Ｎｐａｍ４３が、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを介して、細胞内のＣａ２＋を増加させることを示す図である。
【図１５】図１５は、Ｎｐａｍ４３が、よく特徴づけられた(well characterized)、細胞生存シグナル伝達活性化の指標である、ＣＲＥＢのリン酸化（ｐＣＲＥＢ）を、皮質神経細胞において増加させる（enhance）ことを示す図である。
【図１６】図１６は、Ｎｐａｍ４３が、皮質神経細胞において、ＮＭＤＡに誘導される興奮毒性を防ぐことを示す図である。
【図１７】図１７は、Ｎｐａｍ４３が、皮質神経細胞において、含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲの活性化を増加させることにより、非ＮＭＤＡ依存性の、Ｈ２Ｏ２に誘導される酸化的細胞傷害性をも防ぐことを示す図である。
【図１８】図１８は、Ｎｐａｍ４３が、海馬切片において、シナプス伝達のＧｌｕＮ２Ａ成分を強化することを示す図である。
【図１９】図１９は、Ｎｐａｍ４３が、海馬切片において、長期増強（ＬＴＰ）を促進することを示す図である。
【図２０】図２０は、Ｎｐａｍ４３が、ＮＭＤＡに誘導される電流を、野生型マウスの海馬切片のＣＡ１神経細胞においては増加させるが、ＧｌｕＮ２Ａノックアウトマウスの海馬切片のＣＡ１神経細胞においては増加させないことを示す図である。
【図２１】図２１は、Ｎｐａｍ４３が、成熟したラットから迅速に調製した海馬切片において、ｐＣＲＥＢレベルを増加させたことを示す図である。
【図２２】図２２は、成熟したラットへの静脈注射後、Ｎｐａｍ４３が血液脳関門を通過することを示す図である。
【図２３】図２３は、成熟したラットへの静脈注射後、Ｎｐａｍ４３が海馬組織及び皮質組織におけるｐＣＲＥＢレベルを増加させることを示す図である。
【図２４】図２４は、Ｎｐａｍ４３が、ｉｎ  ｖｉｖｏでマウスの虚血脳の梗塞体積を減少させることを示す図である。
【図２５】図２５は、Ｎｐａｍ４３が、脳卒中後の梗塞体積サイズを減少させることを、長期評価ポイントを使用して示す図である。
【図２６】図２６は、Ｎｐａｍ４３による脳卒中後の治療により、脳卒中の発症２８日後、ｉｎ  ｖｉｖｏでの行動パフォーマンスが向上したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
［ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲ上の新規な調節結合部位］
ＮＭＤＡＲの構造的アーキテクチャは、細胞外Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）；細孔チャンネル形成−再入ループ(channel-forming re-entrant loop)（Ｍ２）を備えた３つの膜貫通ドメイン（Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４）；ＮＴＤより遠位のセグメント（Ｓ１ドメインと称される）、及び、Ｍ３とＭ４とを連結している大きな細胞外ループ（Ｓ２ドメインと称される）により形成される、二葉のリガンド結合ドメイン；並びに、細胞内Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）を有することを特徴とする(Paoletti et al., 2013)。
【００２２】
本発明者は、三次元構造解析及び部位特異的変異誘発実験により、ＮＴＤのＧｌｕＮ１サブユニットとＧｌｕＮ２Ａサブユニットとの間の界面にある、新規なアロステリック調節結合部位を特定した。具体的には、前記結合ポケットは、ＮＭＤＡＲ受容体におけるＧｌｕＮ１のＮＴＤとＧｌｕＮ２ＡのＮＴＤとの間の界面に、（限定されないが）ＧｌｕＮ１（Ｌｅｕ１３５）及びＧｌｕＮ２Ａ（Ｐｈｅ１７７、Ｐｒｏ７９、Ｐｈｅ１１５、Ｇｌｎ１１１及びＰｒｏ１７８）を含むアミノ酸残基によって形成される。このポケットに嵌合し、ＧｌｕＮ１のＬｅｕ１３５、又はＧｌｕＮ２ＡのＰｈｅ１７７、Ｐｒｏ７９、Ｐｈｅ１１５、Ｇｌｎ１１１若しくはＰｒｏ１７８と相互作用するモジュレーターは、ＮＭＤＡＲを、例えば特異的にＧｌｕＮ２Ａ−含有ＧｌｕＮ２Ａを、増強する能力を有しうる。
【００２３】
したがって、本発明のある態様においては、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）におけるＧｌｕＮ１サブユニットとＧｌｕＮ２Ａサブユニットとの間の界面の標的部位に、特異的に結合する化合物が提供される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、前記ＧｌｕＮ１サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１で表される（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ３５４３９）。いくつかの実施形態において、前記ＧｌｕＮ２Ａサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号２で表される（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ００９５９）。
【００２５】
いくつかの実施形態において、前記標的部位は、少なくとも、ＧｌｕＮ１のアミノ酸残基１３５並びにＧｌｕＮ２Ａのアミノ酸残基７９、１１１、１１５、１７７及び１７８のうちの１つ又は複数により画定される。いくつかの好ましい実施形態において、前記標的部位は、少なくとも、ＧｌｕＮ１のＬ１３５と、ＧｌｕＮ２ＡのＰ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８のうちの１つ又は複数と、により画定される。いくつかの好ましい実施形態において、前記標的部位は、少なくとも、ＧｌｕＮ１のＬ１３５並びにＧｌｕＮ２ＡのＰ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８により画定される。いくつかの実施形態において、前記化合物は、ＧｌｕＮ１のアミノ酸残基１３５並びにＧｌｕＮ２Ａのアミノ酸残基７９、１１１、１１５、１７７及び１７８のうちの１つ又は複数と相互作用する。いくつかの実施形態において、前記化合物は、ＧｌｕＮ２Ａのアミノ酸残基Ｑ１１１及びＦ１７７と相互作用する。いくつかの実施形態において、前記化合物は、ＧｌｕＮ１のアミノ酸残基Ｌ１３５並びにＧｌｕＮ２Ａのアミノ酸残基Ｐ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８と相互作用する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記化合物は、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ含有Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）のアロステリックモジュレーターである。いくつかの実施形態において、前記モジュレーターは、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強する。
【００２７】
本発明の別の態様では、
ｉ）ＮＭＤＡＲ受容体のＮＴＤにおいて、ＧｌｕＮ１とＧｌｕＮ２Ａとの間の界面の結合ポケットに、候補化合物の構造体をドッキングさせるステップであって、前記結合ポケットが、少なくとも、ＧｌｕＮ１サブユニットのアミノ酸残基１３５並びにＧｌｕＮ２Ａサブユニットのアミノ酸残基７９、１１１、１１５、１７７及び１７８のうちの１つ又は複数により画定される、ステップと、
ｉｉ）含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強し得る候補化合物を同定するステップと、
を含み、コンピューターに支援される、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強する化合物を同定する方法
が提供される。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態において、前記結合ポケットは、少なくとも、ＧｌｕＮ１のＬ１３５と、ＧｌｕＮ２ＡのＰ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８のうちの１つ又は複数と、により画定される。いくつかの好ましい実施形態において、前記結合ポケットは、少なくとも、ＧｌｕＮ１のＬ１３５並びにＧｌｕＮ２ＡのＰ７９、Ｑ１１１、Ｆ１１５、Ｆ１７７及びＰ１７８により画定される。
【００２９】
基質、コファクター、アンタゴニスト若しくはアゴニスト、又はアロステリックモジュレーターは、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ又はＡＵＴＯＤＯＣＫなどのドッキングプログラムを使用するコンピューターモデリングを使用することにより同定しうることが、当技術分野において公知である(Dunbrack et al.. 1997)。受容体に対する候補化合物の誘引、反発及び立体障害を推測するためにも、コンピュータープログラムを使用することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、前記方法は、候補化合物を合成すること又は得ることと、前記化合物が含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強するか否かを判断することと、をさらに含む。
【００３１】
候補化合物が、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを特異的に増強するかを判断するために、本出願の実施例に記載される方法を使用することができる。
【００３２】
［化合物］
本発明はさらに、ＮＭＤＡＲ機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態の予防又は治療を必要とする対象において、前記予防又は治療に使用するための、式１の化合物又はその医薬的に許容される塩を提供する。
【００３３】
【化３】
2019530749.tif 000004
【００３４】
式１中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲＲ’、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜６のアルケノキシ基又は炭素数２〜６のアルキノキシ基であり；
Ｒ１５はＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり；
Ｒ１１はＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり；
Ｇは直接結合、Ｏ、ＮＲ、Ｓ、ＯＣＲ’Ｒ”、ＳＣＲ’Ｒ”、ＮＲＣＲ’Ｒ”、ＮＲＣ（Ｏ）、ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’、ＮＲＣ（Ｏ）ＣＲ’Ｒ”又はＮＲＣ（Ｏ）ＣＲ’Ｒ”Ｏであり、Ｇはカルボニル及びＡとどちらかの方向性で結合しており；
ＡはＡ−１：
【００３５】
【化４】
2019530749.tif 000005
【００３６】
であり；
ＸはＣＲ７又はＮであり；
ＹはＣＲ８又はＮであり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１４、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲＲ’、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基、炭素数２〜６のアルキニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜６のアルケノキシ基若しくは炭素数２〜６のアルキノキシ基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は一緒になって、若しくはＲ８及びＲ９は一緒になって、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される１〜３個のヘテロ原子を所望により含む、５員若しくは６員の飽和、部分不飽和若しくは芳香族の単環を形成していてもよく；
Ｒ１４はＨ、炭素数１〜６のアルキル基、又は、１つ若しくは複数の炭素数１〜６のアルキル基で所望により置換された炭素数５〜１０のアリール基であり；
Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、各存在箇所において、独立にＨ又は炭素数１〜６のアルキル基であり；且つ
前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルケノキシ基及びアルキノキシ基は、それぞれ、ＯＨ及びハロゲンからなる群より選択される１つ又は複数の基で所望により置換されている。
【００３７】
好ましい実施形態において、Ｇは直接結合、ＮＭｅＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２、ＮＨＣＨ２、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ又はＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨである。
【００３８】
好ましい実施形態においては、Ｘ及びＹが同時にＮであることはない。
【００３９】
好ましい実施形態において、Ｒ１１及びＲ１５はともにＨであり；Ｒ４はＨ、ハロゲン、ＮＯ２、又は炭素数２〜４のアルケニル基であり；Ｒ５はＨ又はハロゲンであり；Ｒ６はＨ又は炭素数１〜４のアルキル基であり；並びにＲ１０はＨ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基である。
【００４０】
好ましい実施形態において、Ｒ１はＨ、ＯＨ、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数２〜４のアルキノキシ基であり；Ｒ２はＨ、ＯＨ、炭素数１〜４のアルコキシ基又はハロゲンであり；Ｒ３はＨ又はＯＨであり；及びハロゲンはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを表し、好ましくはＣｌ又はＢｒを表す。
【００４１】
好ましい実施形態において、Ｒ７はＨ、ＯＨ、ハロゲン若しくは炭素数１〜４のアルキル基であり；Ｒ８はＨ、ＯＨ、ハロゲン、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基若しくはＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１４であり、ここでＲ１４は炭素数１〜４のアルキル基で置換されたフェニル基であり；Ｒ９はＨ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ２若しくは炭素数１〜４のアルキル基であるか；又は、
Ｒ７及びＲ８は一緒になってフェニルを形成するか；又は、
Ｒ８及びＲ９は一緒になって１，４−ジオキサニルを形成し；
ハロゲンはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを表す。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、式Ｉで表される構造を有する。
【化５】
2019530749.tif 000006
【００４３】
式Ｉ中、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＣ２Ｈ２、ＯＥｔ、ＮＨ２、ＮＥｔ２、ＮＨＥｔ、ＮＨＭｅ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、ＮＭｅ２、ＮＯ２、又はＣＯＮＨ２であり；
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＯｔＢｕ、ＯＰｒ、Ｐｒ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＯＩｓｏＰｒ、ＩｓｏＰｒ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、Ｅｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＣＨ２Ｃ２Ｈ４、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、Ｅｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＯｔＢｕ、ＯｉｓｏＰｒ、ＩｓｏＰｒ、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＭｅ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＭｅ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＣｌ３、又はＣＢｒ３であり；
Ｒ１１はＨ又はＭｅであり；
Ｒ１２は（＝Ｏ）であり；且つ
Ｒ１５は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、又はｔｅｒｔ−Ｂｕである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、式ＩＩで表される構造を有する。
【化６】
2019530749.tif 000007
【００４５】
式ＩＩ中、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＣ２Ｈ２、ＯＥｔ、ＮＨ２、ＮＥｔ２、ＮＨＥｔ、ＮＨＭｅ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、ＮＭｅ２、ＮＯ２、又はＣＯＮＨ２であり；
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＯｔＢｕ、ＯＰｒ、Ｐｒ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＯＩｓｏＰｒ、ＩｓｏＰｒ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｍｅ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、Ｅｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＣＨ２Ｃ２Ｈ４、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、Ｅｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＯｔＢｕ、ＯｉｓｏＰｒ、ＩｓｏＰｒ、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＭｅ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ１１はＨ又はＭｅであり；
Ｒ１２は（＝Ｏ）であり；
Ｒ１５は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、又はｔｅｒｔ−Ｂｕであり；
Ｒ１４は
【００４６】
【化７】
2019530749.tif 000008
【００４７】
であり；
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＭｅ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＢｒ３、又はＣＣｌ３であり；
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｍｅ、ＯＭｅ、Ｅｔ、ＯＥｔ、ＮＨＭｅ、ＮＨＥｔ、ＮＥｔ２、ＮＭｅ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ２、Ｉ、ｔＢｕ、ＣＦ３、ＣＮ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＣｌ３、又はＣＢｒ３であり；
Ｒ１５は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、又はｔｅｒｔ−Ｂｕであり；且つ
Ｇ９は、Ｏ、Ｎ、又はＳである。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、表Ａ又は表Ｂに示す化合物のうちの１つ又は複数である。
【００４９】
2019530749.tif 000009
【００５０】
2019530749.tif 000010
【００５１】
2019530749.tif 000011
【００５２】
2019530749.tif 000012
【００５３】
2019530749.tif 000013
【００５４】
2019530749.tif 000014
【００５５】
2019530749.tif 000015
【００５６】
2019530749.tif 000016
【００５７】
2019530749.tif 000017
【００５８】
2019530749.tif 000018
【００５９】
2019530749.tif 000019
【００６０】
2019530749.tif 000020
【００６１】
本発明の化合物は、ＮＭＤＡＲアロステリックモジュレーターであり、好ましくは、含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲに対して選択的なポジティブモジュレーター及び／又は含ＧｌｕＮ２Ｂ−ＮＭＤＡＲに対して選択的なポジティブモジュレーターである。
【００６２】
本明細書で使用される表現において、以下の定義が適用可能である。
【００６３】
「アルキル基」という用語は、特定の数の炭素原子を有する、分岐鎖及び直鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を指す。特に指示がない限り、「アルキル基」は、炭素数１〜６のアルキル基を指す。例えば、「炭素数１〜６のアルキル基」は、直鎖又は分岐鎖状に配置された１、２、３、４、５又は６個の炭素原子を有する基を含むと定義される。例えば、「炭素数１〜６のアルキル基」は、限定されないが、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ペンチル基、及びヘキシル基を含む。
【００６４】
「アルケニル基」という用語は、特定の数の炭素原子と、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合とを有する、分岐鎖及び直鎖両方の炭化水素基を指す。いくつかの実施形態においては、１つの炭素−炭素二重結合が存在し、最大３個までの炭素−炭素二重結合が存在していてもよい。したがって、「炭素数２〜６のアルケニル基」とは、２、３、４、５又は６個の炭素原子と、１、２又は３個の炭素−炭素二重結合とを有する、アルケニルラジカルを意味する。例えば、「炭素数２〜６のアルケニル基」は、限定されないが、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、及び２−メチルブテニル基を含む。
【００６５】
「アルキニル」という用語は、特定の数の炭素原子と、少なくとも１つの炭素−炭素３重結合とを有する、分岐鎖及び直鎖両方の炭化水素基を指す。いくつかの実施形態においては、１個の炭素−炭素３重結合が存在し、最大３個までの炭素−炭素３重結合が存在していてもよい。したがって、「炭素数２〜６のアルキニル基」とは、２、３、４、５又は６個の炭素原子と、１、２又は３個の炭素−炭素３重結合とを有するアルキニルラジカルを意味する。例えば、「炭素数２〜６のアルキニル基」は、限定されないが、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、及び３−メチルブチニル基を含む。
【００６６】
「アルコキシル基」、「アルケノキシ基」及び「アルキノキシ基」は、それぞれ、先に定義されたアルキルラジカル、アルケニルラジカル及びアルキニルラジカルであるが、利用可能な炭素原子のうちのいずれかにおいて、酸素橋を介して結合しているものを指す。したがって、例えば、「炭素数１〜６のアルコキシ基」とは、１、２、３、４、５又は６個の炭素原子を有し、かつ酸素橋を介して結合しているアルキルラジカルを意味し、限定されないが、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ペントキシ、及びヘキソキシ基を含む。
【００６７】
当業者は、本発明の化合物中のＣＯＯＨ及びＮＲＲ’が、対応するイオンの形態、例えば、それぞれカルボキシレートイオン及びアンモニウムイオンとして、存在し得るということを理解するであろう。また当業者は、イオンが存在する場合には、対イオンも存在し得るということを理解するであろう。
【００６８】
当業者は、部分（moiety）の、本明細書に記載される化合物への共有結合点は、例えば、限定されないが、特定の条件下で切断され得るということを理解するであろう。特定の条件には、例えば、限定されないが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける酵素的又は非酵素的手段が含まれ得る。前記部分の切断は、例えば、限定されないが、自発的に起こることもあり、又は他の剤、若しくは物理的パラメータや環境的パラメータ、例えば酵素、光、酸、温度若しくはｐＨなどにおける変化により、触媒作用を受けたり、誘導されたりすることもある。前記部分は、限定されないが、例えば、官能基をマスキングするように作用する保護基、１つ若しくは複数の能動的若しくは受動的輸送機序の基質として作用する基、又は、前記化合物の特性、例えば溶解度、生物学的利用率若しくは局在化などを付与若しくは強化するように作用する基であり得る。
【００６９】
本明細書に記載される化合物は、遊離形態であってもよく、その塩の形態であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物は、当技術分野で公知の、医薬的に許容される塩の形態であってもよい(Berge S. M. et al., J Pharm Sci (1977) 66(1):1-19)。
【００７０】
本明細書で使用される、医薬的に許容される塩には、例えば、親化合物の望ましい薬理学的活性を有する塩（親化合物の生物学的有効性及び／又は特性を維持し、かつ生物学的に及び／又はそれ以外の点で望ましくないものではない、塩）が含まれる。本明細書に記載される、塩を形成可能な１つ又は複数の官能基を有する化合物は、医薬的に許容される塩として形成され得る。
【００７１】
１つ又は複数の塩基性官能基を含む化合物は、例えば、医薬的に許容される有機酸又は無機酸と、医薬的に許容される塩を形成可能であり得る。医薬的に許容される塩は、例えば、限定されないが、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、酪酸、ケイ皮酸、クエン酸、樟脳酸、カンファースルホン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジエチル酢酸、ジグルコン酸、ドデシルスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプタン酸、グルコン酸、グリセロリン酸、グリコール酸、ヘミスルホン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、イソニコチン酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ニコチン酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、３−フェニルプロピオン酸、リン酸、ピクリン酸、ピメリン酸、ピバリン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、硫酸、スルファミン酸、酒石酸、チオシアン酸又はウンデカン酸に由来するものであってもよい。
【００７２】
１つ又は複数の酸性官能基を含む化合物は、医薬的に許容される塩基、例えば、限定されないが、アルカリ金属若しくはアルカリ土類金属に基づく無機塩基、又は１級アミン化合物、２級アミン化合物、３級アミン化合物、４級アミン化合物、置換アミン、天然に存在する置換アミン、環状アミン若しくは塩基性イオン交換樹脂などの有機塩基と、医薬的に許容される塩を形成可能であり得る。医薬的に許容される塩は、例えば、限定されないが、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン若しくはアルミニウムなどの医薬的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩、アンモニア、ベンザチン、メグルミン、メチルアミン、ジメチルアミン，トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン，トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、グルカミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、プロカイン、Ｎ−エチルピペリジン、テオブロミン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、又はポリアミン樹脂に由来するものであってもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物は、酸性基及び塩基性基の両方を含んでいてもよく、分子内塩又は双性イオンの形態、例えば、限定されないがベタインであってもよい。
【００７４】
本明細書に記載される塩は、当業者に公知の従来の方法により調製してもよく、例えば、限定されないが、前記遊離形態の化合物を、有機酸、無機酸、若しくは塩基と反応させることにより、又は他の塩からの陰イオン交換若しくは陽イオン交換により、調製してもよい。当業者は、前記化合物の単離及び精製の際に、塩がその場で調製され得ること、又は、単離及び精製された化合物を個別に反応させることにより、塩が調製され得るということを、理解するであろう。
【００７５】
いくつかの実施形態において、化合物及びそのすべての異なる形態（例えば、遊離形態、塩、多形体、異性体形態など）は、溶媒を添加した形態、例えば、溶媒和物であってもよい。溶媒和物は、前記化合物又はその塩と物理的に会合している、化学量論量又は非化学量論量のいずれかの溶媒を含む。前記溶媒は、例えば、限定されないが、医薬的に許容される溶媒であり得る。例えば、前記溶媒が水である場合は水和物が形成され、前記溶媒が又はアルコールである場合はアルコラートが形成される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物及びそのすべての異なる形態（例えば、遊離形態、塩、溶媒和物、異性体形態など）は、結晶形及び非晶形、例えば、多形体、擬多形体、立体配座多形体、非晶形、又はそれらの組み合わせを含み得る。多形体は、ある化合物の同じ元素組成の、異なる結晶充填配置を含む。多形体は通常、異なるＸ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学的特性、電気的特性、安定性、及び／又は溶解度を有する。当業者は、再結晶溶媒、結晶化速度及び保管温度を含む様々な要因が、ある一つの結晶形が優位を占める原因となり得ることを、理解するであろう。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物及びそのすべての異なる形態（例えば、遊離形態、塩、溶媒和物、多形体など）は、異性体、例えば、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体、個々のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ラセミ体、ジアステレオマーの混合物、及びそれらの組み合わせなどを含むものであって、便宜上例示される化学式の記載に限定されるものではない。
【００７８】
［医薬組成物及び製剤］
本発明は、本明細書に記載される化合物又はその医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、ＮＭＤＡＲ活性を調節するために、例えば、含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲなどのＮＭＤＡＲを特異的に増強するために有用である。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、ＮＭＤＡＲ活性を調節するために前記組成物を使用するための説明書を含む、商用パッケージの形態で提供され得る。
【００８０】
医薬製剤は、注射、吸入、局所投与、灌流、又は選択された治療に好適な他の様式によるものであろうとなかろうと、典型的に、前記製剤の投与様式に許容される、１つ又は複数の担体、賦形剤又は希釈剤を含む。好適な担体、賦形剤又は希釈剤（以下、互換可能に使用される）は、そのような投与様式に使用するために、当技術分野で公知のものである。
【００８１】
好適な医薬組成物は、当技術分野で公知の手段により製剤化してもよく、それらの投与の様式及び用量は、当業者により決定され得る。非経口投与の場合は、化合物を滅菌水若しくは生理食塩水、又は、非水溶性化合物の投与に使用される医薬的に許容されるビヒクル、例えばビタミンＫの投与に使用されるものなどに、溶解してもよい。経腸投与の場合は、前記化合物を、錠剤、カプセル、又は液体状に溶解した形態で投与してもよい。前記錠剤又はカプセルは、腸溶性コーティング製剤、又は徐放用製剤であってもよい。放出する化合物を包んだポリマー微粒子若しくはタンパク質微粒子、軟膏、ペースト、ゲル、ハイドロゲル、又は溶液を含む、多くの好適な製剤が知られており、これらを、化合物を局所的又は局在的に投与するために使用することができる。長期間にわたる放出を実現するために、徐放パッチ又はインプラントを使用してもよい。当業者に公知の多くの技術が、Remington: the Science & Practice of Pharmacy by Alfonso Gennaro, 20th ed., Lippencott Williams & Wilkins, (2000)に記載されている。非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、又は水添ナフタレンを含んでいてもよい。生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーを用いて、前記化合物の放出を制御してもよい。調節性化合物のための、有用な可能性のある他の非経口送達系としては、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な注入系、及びリポゾームが挙げられる。吸入用の製剤は、例えばラクトースなどの賦形剤を含んでいてもよく、例えばポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル、グリココレート及びデオキシコレートなどを含む水溶液であってもよく、点鼻薬の形態で投与するための油性溶液であってもよく、又はゲルであってもよい。
【００８２】
本明細書に記載されるか又は本明細書に記載される使用のための、化合物又は医薬組成物は、例えばインプラント、移植片、人工補綴物、ステントなどの医療機器又は器具により、投与され得る。また、そのような化合物又は組成物を含み、放出するよう意図されたインプラントを考案してもよい。一例としては、前記化合物を長期間にわたって放出するように構成された、高分子材料で作られたインプラントが挙げられる。
【００８３】
本明細書に記載される医薬組成物の「有効量」には、治療的有効量（therapeutically effective amount）が含まれる。「治療的有効量」とは、必要な投与量及び期間で、望ましい治療結果、例えば梗塞サイズの縮小、神経細胞損傷の減少、行動パフォーマンスの向上、寿命の延長又は平均余命の延長などを達成するために有効な量を指す。化合物の治療的有効量は、対象の脳損傷又は疾患の状態、年齢、性別及び体重、並びに前記対象において望ましい反応を誘導する前記化合物の能力などの要因に応じて、変化し得る。
【００８４】
投与計画は、最適な治療反応をもたらすために、調整され得る。治療的有効量はまた、前記化合物のいかなる有毒な又は有害な影響にも勝る、治療的に有益な効果が得られる量でもある。「予防的有効量（prophylactically effective amount）」とは、必要な投与量及び期間で、望ましい予防結果、梗塞サイズの縮小、神経細胞損傷の減少、行動パフォーマンスの向上、寿命の延長又は平均余命の延長を達成するために有効な量を指す。典型的に、予防的用量は、予防的有効量が治療的有効量未満となり得るように、疾患前又は疾患の早期にある対象において用いられる。
【００８５】
なお、投与量の値は、緩和対象となる状態の重症度に応じて変化し得る。いかなる特定の対象、特定の投与計画についても、個々の必要、及び組成物の投与者又は投与の監督者の専門的な判断に基づいて、時間経過とともに調整され得る。本明細書に記載される投与量の範囲は、単に例示的なものであり、医師により選択され得る投与量の範囲を限定するものではない。組成物中の活性化合物の量は、対象の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの要因に応じて変化し得る。投与計画は、最適な治療反応をもたらすために調整され得る。例えば、単回ボーラス投与を行ってもよく、時間をかけて、複数回に分割された用量を投与してもよく、又は治療状況の緊急性に応じて、用量を比例的に低減若しくは増加させてもよい。投与の簡便性と投与量の均一性のために、用量単位剤形の非経口組成物を製剤化することは、有利であり得る。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物及びそのすべての異なる形態は、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳外傷、及び脳卒中などの急性脳損傷からなる群より選択されるが、これらに限定されない、少なくとも１つの徴候のための他の治療方法と組み合わせて使用し得る。例えば、本明細書に記載される化合物及びそのすべての異なる形態は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又は他の療法とともに、ネオアジュバント療法（治療前）、補助療法（治療中）、及び／又はアジュバント療法（治療後）として使用し得る。
【００８７】
［医療的使用］
本発明は、哺乳類の細胞に、本明細書に記載される化合物若しくはその医薬的に許容される塩、又は本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、ＮＭＤＡＲ活性を調節する方法、例えば、含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲなどのＮＭＤＡＲを特異的に増強する方法、を提供する。
【００８８】
あるいは、本発明は、本明細書に記載される化合物若しくはその医薬的に許容される塩、又は本明細書に記載される医薬組成物を必要とする対象に、前記化合物、前記塩又は前記医薬組成物を投与することを含む、ＮＭＤＡＲ活性を調節する方法、例えば、含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲなどのＮＭＤＡＲを特異的に増強する方法、を提供する。
【００８９】
本発明の化合物及び組成物は、ＮＭＤＡＲ活性を調節することにより、ＮＭＤＡＲ機能障害に起因するか又は関連する障害又は状態の予防又は治療のために用い得る。特に、前記障害又は状態は：学習及び記憶障害、片頭痛、てんかん、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳外傷、脳卒中などの急性脳損傷、統合失調症、神経因性疼痛、うつ病、並びに薬物依存からなる群より選択される、少なくとも１つであり得る。例えば、前記障害又は状態は、脳卒中、特に虚血性脳卒中である。本発明の化合物及び組成物を、学習、認知又は記憶を向上させるためにも使用することもできる。
【００９０】
前記哺乳類の細胞は、ヒト細胞であり得る。前記細胞は、神経細胞であり得る。
【００９１】
前記対象は、神経病理学的状態又は神経変性疾患を有するか又はそのリスクを有すると疑われる対象であり得る。前記神経病理学的状態は、脳卒中を含む急性脳損傷又は外傷性脳障害であり得る。前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は統合失調症、不安及びうつ病などの精神疾患であり得る。
【００９２】
一般に、本明細書に記載される化合物は、実質的な毒性を引き起こすことなく使用されるべきである。本明細書に記載される化合物の毒性は、標準的な技術を用いて、例えば、細胞培養物又は実験動物で試験して治療指数を決定することにより、判断することができる。治療指数とは、ＬＤ５０（個体群の５０％に致死的な用量）と、ＬＤ１００（個体群の１００％に致死的な用量）との比率である。しかしながら、重篤な疾患状態などの、いくつかの状況においては、実質的過剰量の前記組成物を投与することが適切である場合もある。本明細書に記載されるいくつかの化合物は、いくつかの濃度においては、有毒であり得る。毒性濃度及び非毒性濃度を決定するために、滴定実験を行ってもよい。毒性は、特定の化合物又は組成物の特異性を、複数の細胞株にわたって調べることにより評価し得る。前記化合物が、他の組織に何らかの効果をもたらすか否かの徴候を得るために、動物実験を行ってもよい。
【００９３】
本明細書に記載される化合物は、対象に投与することができる。本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどであり得る。前記対象は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、若しくは精神疾患などの神経変性疾患、又は外傷性脳障害、若しくは脳卒中などの急性脳損傷などの神経病理学的状態を有するか、そのリスクを有すると疑われる対象であり得る。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、精神疾患、外傷性脳障害、又は脳卒中などの急性脳損傷などの、様々な神経病理学的及び神経変性状態のための診断方法が、当業者に知られている。
【００９４】
本発明の様々な代替的実施形態及び実施例を、本明細書において説明する。これらの実施形態及び実施例は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９５】
一般的な方法及び材料
１．  Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏパイプライン
１．１  ＺＩＮＣライブラリからの化合物の選択
様々な分子記述子に基づいて、ＺＩＮＣライブラリから、鉛様化合物のサブセットをフィルタリングした。次いで、カルボキシル基を含まず、ペプチド結合様構造を含まず、極性表面積が６０〜８０Ａ２の間にあり、かつ少なくとも１個の窒素原子、１個の酸素原子及び１個の芳香環を有することを含む、付加的な化学的特性を加えたＣＮＳ化合物を開発するために、リピンスキーの法則、ルール・オブ・スリーを用いて、前記鉛様化合物のサブセットをさらにフィルタリングした(Pajouhesh & Lenz, 2005)。すべての候補化合物を、化学的モチーフ又は公知のトキシコフォアを含んでいるか否かに基づいてフィルタリングした。微量成分（塩）を除去するとともに水素を添加し、強酸を脱プロトン化し、かつ強塩基をプロトン化することにより、得られたデータベースを完成させた。最終的に、フィルタリングされたデータベースの化合物のエネルギー最小化を行って、当該化合物の、最低エネルギー状態での３次元構造を得た。完成した、最適化された構造は、その時点で、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａヘテロ二量体のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）の隙間界面にドッキングできる状態であった。
【００９６】
１．２  相同性モデル
ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂの結晶構造に基づいて、相同性モデルを作成した。ＮＲ１／ＮＲ２Ａ受容体の、ラットＮＭＤＡＲ  Ｎ末端細胞外ドメインの相同性モデルを、類似のＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＢのＮ末端ドメイン（ＰＤＢコード：３ＱＥＫ）のＸ線構造を用いて構築した。ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ受容体は、四量体受容体であるが、前記相同性モデルは、ＧｌｕＮ１のサブユニット１つ及びＧｌｕＮ２Ａのサブユニット１つのみからなる、１つの二量体として構築した。ＧｌｕＮ２ＡのＮＴＤとＧｌｕＮ２ＢのＮＴＤとは、７２％の配列同一性を示し、かつ配列アライメントにおける８２％の相同性を示した。
【００９７】
１．３  含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲの選択的モジュレーターの仮想スクリーニング（ドッキング）
本発明者らは、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲのポジティブアロステリック調節（ＰＡＭ：positive allosteric modulation）が可能であり得る、特定の結合物質を同定するために、既述の、コンセンサスベースのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技法(Axerio-Cilies et al., 2011; Lack et al., 2011)を用いて、鉛様ＺＩＮＣ化学物質ライブラリ(Irwin & Shoichet, 2005)からあらかじめフィルタリングされた(Axerio-Cilies et al., 2009; Pajouhesh & Lenz, 2005)２００，０００種の購入可能な化学物質の仮想スクリーニングを実施した。このマルチパラメータによるアプローチの各段階から得られた結果を集計し、コンセンサススコアリングの手順を用いて、スクリーニングされた化合物をランク付けした。上位にランクされた約１０，０００種の化合物を可視化し、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ界面に結合する可能性が高いと予測された最初の２００種の候補を、実証試験のために選択した。
【００９８】
１．４  類似体の検索
化学物質の大きなプールを得、それから構造−活性関係（ＳＡＲ）を導き出すために、類似体の検索を実施した。分子フィンガープリントに基づく類似性検索を使用し、活性化合物（Ｎｐａｍ０２）をテンプレート／クエリとして用いて、化学物質のデータベースの検索を実施した。ある分子にある特徴が存在する場合、ビットを「１」と設定し、その特徴が存在しない場合、ビットを「０」と設定することにより、各化学構造について、特有かつ独自のフィンガープリントプロファイルが形成される。２つの分子間の類似性は、分子のビット文字列を比較することにより特定され、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数（Ｔｃ）(Bajusz, Racz, & Heberger, 2015)として定量化される。この検索によって得られた化合物を、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計された、化学的に合成された化合物と組み合わせて、皮質神経細胞におけるホールセルボルテージクランプ記録(whole-cell voltage clamp recording：全細胞の電位固定による電流記録）により試験してＳＡＲを得ることができる、一連の化合物を得た。
【００９９】
１．５  Ｎｐａｍ化合物の化学合成
Ｎｐａｍ化合物の化学合成は、適切な置換ベンズアルデヒドを適切な置換ヒドラジドと反応させることにより、又は、適切な置換ベンズアルデヒドをヒドラジンと反応させ、その後その生成物を適切なハロゲン化アシルと反応させることにより、実施した。プロトン核磁気共鳴１Ｈ−ＮＭＲ及びエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を実施して、各化合物の構造及び純度を確認した。
【０１００】
［５．１  Ｎｐａｍ４３の合成］
【０１０１】
【化８】
2019530749.tif 000021
【０１０２】
工程Ｉ：２，３−ジクロロ−５−エトキシ−６−ヒドロキシ−ベンズアルデヒド（中間体−１）
２−ヒドロキシ−３−エトキシベンズアルデヒド（１．０ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を酢酸（２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）（１．４ｇ、１１ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応混合物を一晩８０℃で撹拌し、その後室温まで冷却した。次いで水及びＣＨ２Ｃｌ２を添加し、相を分離し、水相をさらにＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）により精製し、黄色の固体である、純粋な生成物（１．２ｇ、８９％）を得た。
【０１０３】
工程ＩＩ：（Ｅ）−２−ブロモ−Ｎ’−（２，３−ジクロロ−５−エトキシ−６−ヒドロキシベンジリデン）ベンゾヒドラジド（Ｎｐａｍ４３）
等モル量の２−ブロモベンゾヒドラジド（０．３０ｍｍｏｌ）及び中間体−１（０．３０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（０．５Ｍ溶液）に溶解する。２等量のＭｇＳＯ４を添加し、還流するまで１時間加熱する。生成物が沈殿する場合もある。沈殿しない場合は、中間体−１の消費を確かめるためにＴＬＣ又はＮＭＲにより反応を確認した。生成物が沈殿した場合は、沈殿物をろ過により回収し、水で洗浄（２ｍｌで２回）して、残留ＭｇＳＯ４を取り除いた。生成物が沈殿しない場合は、生成物が沈殿するまで、反応混合物を水で希釈した。残留ヒドラジンを除去するために、前記混合物を希塩酸でｐＨ３まで酸性化し、続いて濾過し、必要に応じて再結晶化した。得られた化合物は、高融点の固体（ｍｐ：２１０〜２１２℃）である。抽出はしなかった。沈降が観察されなかった場合、溶媒を真空中で蒸発させ、前記化合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１０４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．５９（ｓ、１Ｈ）、１０．４１（ｓ、１Ｈ）、８．８９（ｓ、１Ｈ）、７．６１−７．３４（ｍ、４Ｈ）、７．０８（ｓ、１Ｈ）、４．１１（ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．４１（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）。
ＭＳ（ＥＩ）：（Ｃ１６Ｈ１３ＢｒＣｌ２Ｎ２Ｏ３＋Ｈ）＋の計算値：４３３．０、実測値：４３３．０；（Ｃ１６Ｈ１３ＢｒＣｌ２Ｎ２Ｏ３＋Ｎａ）の計算値：４５５．０、実測値：４５５．０。
【０１０５】
［５．２  他のＮｐａｍ化合物の合成］
以下の化合物を同様の方法で合成した。
【０１０６】
2019530749.tif 000022
【０１０７】
2019530749.tif 000023
【０１０８】
2019530749.tif 000024
【０１０９】
2019530749.tif 000025
【０１１０】
2019530749.tif 000026
【０１１１】
2019530749.tif 000027
【０１１２】
2019530749.tif 000028
【０１１３】
２．  化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ同定
２．１  ＨＥＫ２９３細胞の培養及びプラスミドのトランスフェクション
各々がラット組換え型（ＧｌｕＮ２ＡＷＴ、ＧｌｕＮ１ＷＴ、ＧｌｕＮ２ＢＷＴ）サブユニットのうちの１つを発現している、ｐｃＤＮＡ３−ＣＭＶ発現ベクターの組み合わせで、細胞をトランスフェクトした。自動化ＤＮＡ塩基配列決定法により、すべてのプラスミドの配列を確認した。ヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（インビトロジェン社）中で培養した。ＨＥＫ２９３細胞が９０％コンフルエンスに達したとき、ＧｌｕＮ１とＧｌｕＮ２Ａの組み合わせ、又はＧｌｕＮ１とＧｌｕＮ２Ｂの組み合わせのいずれかのプラスミドを、製造者の指示に従い、リポフェクタミン２０００（１１６６８０１９；インビトロジェン社）を使用して、前記細胞に同時導入した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｏ２９５％、ＣＯ２５％、３７℃に保たれたインキュベーター中に４８時間維持し、その後実験に使用した。前記ＮＭＤＡＲサブユニットの組み合わせのトランスフェクション比率は、すべて１：１（ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ、又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ）であった。
【０１１４】
２．２  皮質神経細胞の初代培養
１８日齢のスプラーグドーリーラットの胚から、ラット皮質神経細胞の解離培養物を、先に記載される通りに調製した。神経細胞を富化した混合皮質培養物を得るために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養日数（ＤＩＶ）３日目に、ウリジン（１０μＭ）及び５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（１０μＭ）を培地に添加して４８時間維持し、培養物を通常の培地に戻す前に、非神経細胞の増殖を抑制した。成熟した神経細胞（１１〜１４ＤＩＶ）を、実験に使用した。ヘテロ接合体ＧｌｕＮ２Ａ＋／−又はＧｌｕＮ２Ｂ＋／−の交配により得られた、交配後１８日の同腹の胚を用いて、マウスの皮質培養物を調製した。ホモ接合型及び野生型（ＷＴ）同腹子の対照神経細胞培養物を得るために、個々の胚から得た皮質細胞を別個にプレートに撒いた。各胚から採取したテールサンプル(tail sample)を用いて、先に記載したとおりに、遺伝子型決定を実施した。神経細胞のアポトーシスを誘導するために、Ｍｇ２＋を含まない細胞外液（ＥＣＳ）（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３３ｍＭ  グルコース、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、及び１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む；ｐＨ：７．３５及びモル浸透圧濃度：３２０〜３３０ｍＯｓｍ）中で、皮質培養物をＮＭＤＡ（５０μＭ）及びグリシン（１０μＭ）で２０分間、又はＳＴＳ（１００ｎＭ）で１時間、刺激した。シナプスのＮＭＤＡ受容体の特異的阻害は、Ｍｇ２＋を含まないＥＣＳ中、ビククリン（５０μＭ）の存在下で、（＋）−５−メチル−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプタン−５，１０−イミンマレエート（ＭＫ−８０１）（１０μＭ）で１０〜１５分間処理し、その後１ｍＭのＭｇＣｌ２（正常ＥＣＳ）を含むＥＣＳで洗浄して残留ＭＫ−８０１を除去することにより行った。ＧｌｕＮ２Ａ−特異的ＮＶＰ−ＡＡＭ０７７（０．４μＭ；ノバルティスファーマ株式会社（スイス、バーゼル）、ＹＰ  Ａｕｂｅｒｓｏｎ氏からの寄贈）、又はＧｌｕＮ２Ｂ−特異的アンタゴニストであるＲｏ  ２５−６９８１（０．５μＭ）を、処理の１０分前及び処理の間中、ベース培地(bath medium)に添加した。
【０１１５】
２．３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの電気生理
ホールセルパッチクランプ記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器又は１Ｄパッチクランプ増幅器（モレキュラーデバイス社）を使用し、ボルテージクランプ（電位固定）モードで行った。特に断りがない限り、ホールセル（全細胞）電流は、保持電位−６０ｍＶで記録し、信号を２ｋＨｚでフィルタリングし、１０ｋＨｚでデジタル化した（Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａ）。記録ピペット（３〜５ＭΩ）に、細胞内液（ＣｓＣｌ  １４０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、Ｍｇ−ＡＴＰ  ４ｍＭ、ＱＸ−３１４  ５ｍＭを含む；ｐＨ：７．２０、モル浸透圧濃度：２９０〜２９５ｍＯｓｍ）を満たした。ＢＡＰＴＡ（１０ｍＭ）を前記細胞内液に添加した（特に指示がない限り）。カバーガラスを、細胞外液（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ５．４ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  １．３ｍＭ、グルコース  ２０ｍＭを含む；ｐＨ：７．４、モル浸透圧濃度：３０５〜３１５ｍＯｓｍ）で、連続的に灌流した。ＮＭＤＡに誘導される電流は、ＮＭＤＡにより、パーフュージョン・ファストステップ(perfusion fast-step)（ワーナーインスツルメンツ社）を介して印加した。ＮＭＤＡの投与は、パーフュージョン・ファストステップ・システムにより、２角バレル(two-square barrel)ガラス管を用い、かつ培養された神経細胞の年齢に応じて行われ、ＣＮＱＸ（１０μＭ）、ＴＴＸ（０．５μＭ）又はＢＩＣ（１０μＭ）を前記細胞外液に添加することにより、イオンチャネル型グルタミン酸受容体及び電位依存性ナトリウムチャネルの活性化をそれぞれ最少化した。すべての実験は室温で行った。すべての活性化合物について、少なくとも６個のＨＥＫ２９３細胞／神経細胞からの記録をとった。ＨＥＫ２９３細胞又は一次神経細胞のデータをプールし、複合用量反応性のデータを、以下の方程式に当てはめた。
反応率（％）＝１００×相対効果／［１＋（ＥＣ５０／濃度）ｎＨ］
式中、ＥＣ５０は半最大応答を生じるアゴニストの濃度であり、相対効果はグルタメートの最大応答に対する最大有効濃度での応答であり、ｎＨはＨｉｌｌ勾配である。
【０１１６】
２．４  ｅｘ  ｖｉｖｏでの電気生理
ホールセルパッチクランプ記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器  又は１Ｄパッチクランプ増幅器（モレキュラーデバイス社）を使用し、ボルテージクランプモードで行った。特に断りがない限り、ホールセル電流は、保持電位−６０ｍＶで記録し、信号を２ｋＨｚでフィルタリングし、１０ｋＨｚでデジタル化した（Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａ）。記録ピペット（３〜５ＭΩ）に、前記細胞内液（ＣｓＣｌ  １４０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、Ｍｇ−ＡＴＰ  ４ｍＭ、ＱＸ−３１４  ５ｍＭを含む；ｐＨ：７．２０、モル浸透圧濃度：２９０〜２９５ｍＯｓｍ）を満たした。ＢＡＰＴＡ（１０ｍＭ）を前記細胞内液に添加した（特に指示がない限り）。カバーガラスを、前記細胞外液（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ５．４ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  １．３ｍＭ、グルコース  ２０ｍＭを含む；ｐＨ：７．４、モル浸透圧濃度：３０５〜３１５ｍＯｓｍ）で、連続的に灌流した。ＮＭＤＡ、ＧＡＢＡ又はＡＭＰＡに誘導される電流は、ＮＭＤＡ、ＧＡＢＡ、ＡＭＰＡのいずれかにより、パーフュージョン・ファストステップ（ワーナーインスツルメンツ社）を介して印加した。ＮＭＤＡの投与は、パーフュージョン・ファストステップ・システムにより、２角バレル（two-square barrel）ガラス管を用い、かつ培養された神経細胞の年齢に応じて行われ、ＣＮＱＸ（１０μＭ）及びＴＴＸ（０．５μＭ）を前記細胞外液に添加することにより、イオンチャネル型グルタミン酸受容体及び電位依存性ナトリウムチャネルの活性化をそれぞれ最少化した。すべての実験は室温で行った。すべての活性化合物について、少なくとも６個のＨＥＫ２９３細胞／神経細胞からの記録をとった。ＨＥＫ２９３細胞又は一次神経細胞のデータをプールし、複合用量反応性のデータを、以下の方程式に当てはめた。
反応率（％）＝１００×相対効果／［１＋（ＥＣ５０／濃度）ｎＨ］
式中、ＥＣ５０は半最大応答を生じるアゴニストの濃度であり、相対効果はグルタメートの最大応答に対する最大有効濃度での応答であり、ｎＨはＨｉｌｌ勾配である。
【０１１７】
２．５  切片記録：
６〜８週齢のＣ５７／Ｂｌ６マウス又はラットを頚椎脱臼させ、続いて断頭した。脳を直ちに、以下１ｍＭ  １２０  ＮＭＤＧ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、７．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．４ｍＭ  Ｎａ−ピルベート、１．３ｍＭ  Ｎａ−アスコルベート、及び２０ｍＭ  Ｄ−グルコースからなり、塩酸でｐＨを７．３５に調整した、氷冷のＮＭＤＧ−ベースの切断溶液に移した（特に断りがない限り、すべての化学物質及び薬剤は、シグマ社、又はカナダ、ビオショップ(BioShop)社から購入した）。海馬を切開して取出し、手動のティッシュチョッパー（ストールティング社、米国、イリノイ州、ウッドデール）を用いて、海馬の横断切片（４００μｍ）を得た。ＡＣＳＦを入れた、加熱された（３０℃）培養チャンバーで、切片を１時間回復させた。当該ＡＣＳＦは、１２４ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３及び１５ｍＭ  Ｄ−グルコースからなり、そこにカルボゲン（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）を連続的に通気したものである（ｐＨ：７．３になるまで）。さらに３０分間室温で保持したのち、浸漬記録チャンバーに切片を移し、カルボゲン化されたＡＣＳＦで、連続的に灌流した（２〜３ｍｌ／分）。マルチクランプ７００Ｂ増幅器を用いて、「盲検法」により、ＣＡ１錐体神経細胞のホールセル記録を実施した。ＳＣ経路を刺激することにより、ＥＰＳＣ（興奮性シナプス後電流）を誘導した。ＮＭＤＡＲ電流を分離するために、細胞を＋４０ｍＶに電圧固定した。記録ピペットに溶液（１２２．５ｍＭ  Ｃｓ−メタンスルホネート、１７．５ｍＭ  ＣｓＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  ＡＴＰ（Ｋ）、及び５ｍＭ  ＱＸ−３１４を含む；ＣｓＯＨでｐＨを７．２に調整）を満たした。ＧＡＢＡ受容体を介する抑制性シナプス電流を阻害するために、ビククリンメチオダイド（１０μＭ；アブカム社）を用い、ＡＭＰＡＲを介する電流を阻害するために、ＣＮＱＸ（１０μＭ；アブカム社）を用いて、さらにＮＭＤＡＲ電流を分離した。ＮＭＤＡＲ電流のＮＲ２Ａ成分及びＮＲ２Ｂ成分を明確に分離するために、ＮＶＰ又はイフェンプロジルを添加して、これらの受容体をそれぞれ抑制した。実験の終盤に、ＡＰＶを投与することにより、残留シナプス電流がＮＭＤＡＲによるものだということを確認した。ＷｉｎＬＴＰを用いて、ＥＰＳＣを記録及び解析した。統計解析は、グラフパッド・インスタット（GraphPad InStat）を用いて完了した。各処理間の違いを判断するために、各種薬剤カクテルに応答したＮＭＤＡＲ電流を比較するＡＮＯＶＡ分析と、Ｔｕｋｅｙの事後検定を行った。統計的有意性の基準はｐ＜０．０５とし、細胞数＝ｎとした。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。細胞外記録（ｆＥＰＳＰ）については、ホールセルの調製に用いたものと同様のスライス条件を用いた。刺激電極はＳＣ経路中に配置し、記録電極はＣＡ１の放線層に配置した。ＷｉｎＬＴＰを用いて記録を取り、解析した。最初のｆＥＰＳＰの勾配を測定して、シナプス強度を定量化した（Johnston and Wu, 1995）。スチ���ーデントのｔ検定を使用して、各群間のｆＥＰＳＰの平均勾配を統計的に比較した。すべての示される値は平均値±ＳＥＭであり、切片数＝ｎである。
【０１１８】
２．６  ｅｘ  ｖｉｖｏでの電気生理（ＧｌｕＮ２Ａ−ノックアウトマウス）
２０〜２５日齢の、雄性及び雌性の、野生型マウス又はＧｌｕＮ２Ａノックアウトマウスを、イソフルランで麻酔し、素早く断頭した。脳を取出し、冷たい（２〜４℃）切断溶液（９２ｍＭ  ＮＭＤＧ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、５ｍＭ  Ｎａ−アスコルベート、３ｍＭ  Ｎａ−ピルベート、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）に３０秒間浸した。溶かした３％寒天−Ａ（ＣＡＳ番号：９００２−１８−０、ビオ・ベーシック・カナダ社（Bio Basic Canada Inc.））中で脳をブロッキングし、次いで、スライスプラットフォーム上に密着させ、通気された（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）冷たい（２〜４℃）切断溶液を入れたビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ  １０００Ｓ）で、厚さ３２０μｍの冠状に切断した。前頭前皮質を含んだ切片を、連続的にカルボゲン化され、予め加温（３２〜３４℃）された切断溶液に移し、初期回復のために１２分間保持した。次いで前記切片を、カルボゲン化された室温の保持溶液（１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１２．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、５ｍＭ  Ｎａ−アスコルベート、３ｍＭ  Ｎａ−ピルベート、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）に移し、記録の前に、少なくとも３０分間回復させた。
【０１１９】
２．７  ＧｌｕＮ２Ａ−ノックアウトマウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドの、野生型（ＷＴ）マウス及びＧｌｕＮ２Ａ−ノックアウト（ＧｌｕＮ２Ａ−／−）マウス（Sakimura et al., 1995; Townsend et al., 2003）を、２１℃に維持した居住区で、標準ケージ（１ケージあたり２〜３匹のマウス；最小限の収容密度）に収容した。食料と水を自由に摂取できるようにし、１２時間の明暗サイクルで動物を維持した。各試料（２μＬのＤＮＡ）を、以下からなるＰＣＲマスターミックス中でインキュベートした：１４．８５μＬのヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏ、２．５μＬの１０＄ＰＥ反応緩衝液、１．４μＬ（５０ｍＭ）のＭｇＣｌ２、２．０μＬ（２．５ｍＭ）のｄＮＴＰ、０．５μＬのＮＲ２Ａ１プライマー、１．０μＬのＮＲ２Ａ３プライマー、０．５μＬのＮｅｏ２Ａプライマー、及び０．２５μＬ（５Ｕ／μＬ）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン・カナダ社；カナダ、オンタリオ州、バーリントン）。以下のサイクルパラメータを使用した：最初に９４℃で４分間のサイクル、次いで、９４℃で３０秒、６０℃で４０秒、及び７２℃で６０秒のサイクルを２９回。試料を７２℃で７分間静置し、その後使用するまで４℃で保管した。使用したプライマーは、ＮＲ２Ａ１（５’−ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＴＧＣ−３’）、ＮＲ２Ａ３（５’−ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＣＣＧ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  Ｔ−３’）及びＮｅｏ２Ａ（５’−ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＡＡＴ−３’）（インビトロジェン・カナダ社；カナダ、オンタリオ州、バーリントン）である。ＰＣＲ生成物を、ＳＹＢＲ−ｓａｆｅを含む１．５％アガロースゲルで泳動し、トランスイルミネーターを使用して可視化した。
【０１２０】
２．８  脳切片の調製（ＧｌｕＮ２Ａ−ノックアウトマウス）
２０〜２５日齢の、雄性及び雌性の、野生型マウス又はＧｌｕＮ２Ａノックアウトマウスを、イソフルランで麻酔し、素早く断頭した。脳を取出し、冷たい（２〜４℃）切断溶液（９２ｍＭ  ＮＭＤＧ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、５ｍＭ  Ｎａ−アスコルベート、３ｍＭ  Ｎａ−ピルベート、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）に３０秒間浸した。溶かした３％寒天−Ａ（ＣＡＳ番号：９００２−１８−０、ビオ・ベーシック・カナダ社）中で脳をブロッキングし、次いで、スライスプラットフォーム上に密着させ、通気された（９５％Ｏ２／５％ＣＯ）冷たい（２〜４℃）切断溶液を入れたビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ  １０００Ｓ）で、厚さ３２０μｍの冠状に切断した。前頭前皮質を含んだ切片を、連続的にカルボゲン化され、予め加温（３２〜３４℃）された切断溶液に移し、初期回復のために１２分間保持した。次いで前記切片を、カルボゲン化された室温の保持溶液（１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１２．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、５ｍＭ  Ｎａ−アスコルベート、３ｍＭ  Ｎａ−ピルベート、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）に移し、記録の前に、少なくとも３０分間回復させた。
【０１２１】
２．９  ｐＣＲＥＢによるイムノブロッティングのための海馬切片の調製
４〜８週齢（１２５〜２００ｇｍ）の雄性スプラーグドーリーラットを断頭し、その脳を素早く切開し、氷冷のチョッピング食塩水(chopping saline)（１１０ｍＭ  ショ糖、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．６ｍＭ  アスコルベートを含み、９５％のＯ２／５％のＣＯ２で飽和したもの）に入れた。次いで４００μｍの横断切片を、ビブラトーム  シリーズ１０００（ペルコ；テッドペラ社（Ted Pella）、カリフォルニア州、レディング）を用いて調製した。切片を即座に、チョッピング食塩水（chopping saline）及び正常ＡＣＳＦ（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、２ｍＭＣａＣｌ２、及び１ｍＭＭｇＣｌ２を含み、９５％のＯ２／５％のＣＯ２で飽和したもの）の１：１混合物に移し、少なくとも９０分間、室温で保持した。次いで切片を、浸漬チャンバー内の３２℃のＡＣＳＦに移し、薬理学的刺激を与える前に、４５〜６０分間保持した。
【０１２２】
２．１０  電気生理学的方法（ＧｌｕＮ２Ａ−ノックアウトマウス）
脳切片を、縦型のニコンＦＮ１顕微鏡上の記録チャンバーに移し、前記チャンバーを、３２℃のカルボゲン化されたａＣＳＦ記録溶液（１２１．８５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１２．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、５ｍＭ  Ｎａ−アスコルベート、３ｍＭ  Ｎａ−ピルベート、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）で、連続的に灌流した。ＣＦＩ  ＡＰＯ  ４０Ｘ  Ｗ  ＮＩＲ対物レンズ（開口数：０．８０、作動距離：３．５ｍｍ）を使用した、ビデオモニター型の赤外微分干渉コントラスト照明顕微鏡検査（infra-red differential interference contrast illumination microscopy）により、前頭前皮質のＶ層において、錐体神経細胞を同定した。パッチピペットを使用し、抵抗を５〜８ＭΩの範囲で、ホールセルパッチクランプ記録を実施した。記録ピペットは、ホウ珪酸ガラス毛細管（１Ｂ１５０Ｆ−４、ＷＰＩ社、米国）から作製し、ピペット溶液（１３５ｍＭ  ＣｓＭｅＳＯ４、０．６ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  リン酸トリス、３ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．２ｍＭ  ＧＴＰ  トリス、及び５ｍＭ  ＱＸ３１４塩化物を含む）（２８０〜２９０ｍｏｓＭ、ｐＨ：７．４）で満たした。電流信号の電圧固定記録を、マルチクランプ７００Ｂ増幅器（モレキュラーデバイス社）を用いて増幅し、４ｋＨｚで低域フィルタリングを行い、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａデータ取得システム（モレキュラーデバイス社）を用いて１０ｋＨｚでサンプリングし、ｐＣＬＡＭＰ  １０．２取得ソフトウェア（モレキュラーデバイス社）を用いて記録した。細胞は、−６５ｍＶに保持し、液間電位差及び直列抵抗は４０％補正した。
【０１２３】
２．１１  部位特異的変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法（ストラタジーン社）を用いて、ＧｌｕＮ１サブユニット又はＧｌｕＮ２Ａサブユニットの部位特異的変異誘発を行った。ＤＮＡ塩基配列決定法により、すべての変異クローンを確認した。野生型サブユニット又は変異型サブユニットを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、電気生理学的検査を行った。各々がラット組換え型（ＧｌｕＮ２ＡＷＴ、ＧｌｕＮ１ＷＴ、ＧｌｕＮ２ＢＷＴ）サブユニットのうちの１つを発現している、ｐｃＤＮＡ３−ＣＭＶ発現ベクターの組み合わせで、細胞をトランスフェクトした。顕微鏡での可視化に資するため、高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰを同時導入した。ＰＦＵ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、部位特異的変異誘発法により、ＧｌｕＮ１ＷＴ又はＧｌｕＮ２ＡＷＴのいずれかから、ＧｌｕＮ２ＡＡ１０８Ｇ、ＧｌｕＮ２ＡＰ７９Ａ、ＧｌｕＮ２ＡＰ１７８Ｇ、ＧｌｕＮ２ＡＱ１１１Ａ、ＧｌｕＮ２ＡＦ１１５Ｙ、ＧｌｕＮ２ＡＦ１１５Ｓ、ＧｌｕＮ２ＡＦ１７７Ｓ、ＧｌｕＮ２ＡＩ１７６Ｙ、ＧｌｕＮ２ＡＭ１１２Ｉ、ＧｌｕＮ１Ｒ１１５Ｅ、ＧｌｕＮ１Ｌ１３５Ｑ各種プラスミドを構築した。自動化ＤＮＡ塩基配列決定法により、すべてのプラスミドの配列を確認した。
【０１２４】
２．１２  Ｃａ２＋感受性染料を用いた、ラット皮質培養物におけるＣａ２＋の測定
皮質全体から単離されたラットの神経細胞を、ポリ−ｄ−リジンでコーティングされた９６ウェルのプレートに撒いた。培養開始から１２〜１４日後、Ｆｌｕｏ−４  Ｎｏ  Ｗａｓｈ  カルシウムアッセイキット（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を使用し、製造者のプロトコルに従って、細胞内のカルシウムレベルをアッセイした。簡単に説明すると、神経細胞の培地を取り除き、カルシウムアッセイ緩衝剤（ＣＡＢ）（１×ＨＢＳＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ  プロベネシド及びＦｌｕｏ４−ＮＷ染料ミックスを含む（ｐＨ：７．４；サーモフィッシャー・サイエンティフィック社））と入れ替えた。その後、染料を充填するために、３７℃で４５分、次いで２５℃で１５分間、前記細胞をインキュベートした。ＮＭＤＡＲを介するカルシウムシグナルを分離するため、ＮＭＤＡ（１０μＭ）をアゴニストとして用い、２μＭのグリシンを添加した。ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲを阻害するために、アンタゴニストであるＮＶＰ−ＡＡＭ００７を用いた。ＦＬＥＸＳｔａｔｉｏｎ  ＩＩ  ベンチトップ走査蛍光光度計（モレキュラーデバイス社）による６０秒間の記録後、カルシウム蛍光測定を２５℃で行った。次いで１８０秒時点で、ＮＭＤＡＲアゴニストとしてＮＭＤＡ（１０μＭ）／グリシン（２μＭ）を添加した。励起波長：４８５ｎＭ、発光波長：５３８ｎＭ、及びカットオフ波長：５３０ｎＭを用いて、蛍光プレートの読み取りを合計３０分間継続した。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（モレキュラーデバイス社）を使用して、データを記録した。
【０１２５】
２．１３  乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）をＮＡＤＨ（還元型）に変換することができる、細胞質酵素である。ＬＤＨは、細胞膜の統合性が損なわれると、細胞から培地へと放出される。したがって、放出されたＬＤＨの量は、細胞死の程度を表す。この実験において、細胞外ＬＤＨレベルは、シグマアルドリッチ社から入手したｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒物学アッセイキット（番号：ＴＯＸ−７）を用いて測定した。このＬＤＨアッセイの原理は以下のとおりである：（１）ＬＤＨがＮＡＤをＮＡＤＨに還元する；（２）次いで、得られたＮＡＤＨを用いて、テトラゾリウム染料の化学量論的変換を行う；（３）得られた着色された化合物を、分光光度マイクロプレートリーダーにより、波長４９０ｎｍで測定する。細胞死亡率は、治療群の吸光度と対照群の吸光度との間の比率（％）として表した。
【０１２６】
２．１４  イムノブロッティング
脳組織又は培養細胞を、溶解バッファー中氷上で溶解させ、次いで、得られた溶液を４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、上清を回収し、ＢＣＡプロテインアッセイキット（２３２２７；サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を使用して、タンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質サンプルを、４倍量のサンプルバッファーと混合し、１００℃で５分間煮沸し、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドのゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。次いで、タンパク質を、イモビロン−ＰＴＭポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（１６２−０１７７；バイオ・ラッド社）に移した。前記メンブレンを、０．１％トゥイーン−２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水中の５％脱脂乳で、室温で１時間ブロッキングし、次いで一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄したのち、ＥＣＬウェスタンブロッティング基質（３２０１６；ピアース社）を使用し、バイオ・ラッド社のイメージャで、タンパク質を可視化した。ホスホＣＲＥＢの検出には、同日に調製されたサンプルを用いた。ポリビニリデンジフルオリドメンブレン（ミリポワ社、米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード）を、ホスホＣＲＥＢ（Ｓｅｒ１３３）に対する一次抗体（セルシグナリングテクノロジー社、マサチューセッツ州、ベバリー）とともにインキュベートした。全ＣＲＥＢの検出には、同じポリビニリデンジフルオリドメンブレンをストリッピングし、次いで全ＣＲＥＢに対する一次抗体（セルシグナリングテクノロジー社）で再検出を行った。各タンパク質のバンド密度をＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアにより定量化し、同じメンブレン上の総ＣＲＥＢ充填量（loading total-CREB）に対する、相対光学密度を解析した。
【０１２７】
２．１５  興奮毒性アッセイ
皮質培養物をＮｐａｍ４３で処理し、２０〜２４時間後の、ＮＭＤＡに誘導された興奮毒性を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより評価した。簡単に説明すると、細胞を７５μｍのＮＭＤＡで１．５時間処理し、その後神経細胞を、新鮮な、神経細胞用基本培地で一度洗浄し、培地を条件培地と入れ替えた。シグマアルドリッチ社から入手したｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒物学アッセイキット（番号：ＴＯＸ−７）を使用して、ＬＤＨの放出を測定した。細胞死亡率は、治療群の吸光度と対照群の吸光度との間の比率（％）として表した。
【０１２８】
２．１６  Ｈ２Ｏ２細胞傷害性アッセイ
培養された皮質神経細胞を、６００μｍのＨ２Ｏ２に１時間暴露して、神経細胞の死を誘導した。ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲに対するＮｐａｍ４３の選択性を示すために、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ選択的アンタゴニストであるイフェンプロジル（３μＭ）、又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ選択的アンタゴニストであるＮＶＰ−ＡＡＭ０７７（０．２μＭ）及びＴＣＮ−２０１（１０μＭ）で、神経細胞を処理した。
【０１２９】
２．１７  試薬
ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ及びＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏを使用してリン酸バッファー溶液を調製し、当該溶液のｐＨを、ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏの、Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏに対するモル比を変えることにより調整した。他の化学物質には、分析用グレード又はそれ以上の品質のものを使用し、実験を通してＭｉｌｌｉ−Ｑ超純水（＞１８ＭＵｃｍ）を使用した。
【０１３０】
２．１８  計測手段及びクロマトグラフィー条件
高速液体クロマトグラフィーを用いて、ＣＳＦ及び血清マトリックスからＮｐａｍ４３を単離し、電気化学的検出により定量化した。システムは、ＥＳＡ  ５８２ポンプ（マサチューセッツ州、ベッドフォード）、パルスダンパー（サイエンティフィック・システムズ社、ペンシルベニア州、ステートカレッジ）、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ  Ｉｎｅｒｔ手動インジェクター（モデル９１２５ｉ、２０μＬ注入ループ；カリフォルニア州、ローナートパーク）、東ソーバイオサイエンス社のＳｕｐｅｒ  ＯＤＳ  ＴＳＫカラム（２μｍ粒、２ｍｍ×１０ｍｍ；ペンシルバニア州、モントゴメリーヴィル）、及びアンテック・レイデン社（Antec Leyden）の、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を有するＶＴ−０３フローセルを備えたＩｎｔｒｏ電気化学検出器（Ｖａｐｐｌｉｅｄ＝＋８００ｍＶ；レイデン社、オランダ）からなる。移動相は、ｐＨ：７．０の、２０ｍＭ  リン酸バッファー−アセトニトリル（８０：２０、ｖ／ｖ）混合物であり、前記システム内を０．１ｍＬ／分で流動した。前記カラムは、分析の間中４０℃に保たれ、注入体積は８ｕＬであった。使用前に、移動相を０．２２ｍｍ膜で濾過し、真空ポンプで脱気し、実験的試験の間、ヘリウムパージ下で維持した。ＥＺＣｈｒｏｍｅ  Ｅｌｉｔｅソフトウェア（サイエンティフィック・ソフトウェア社、カリフォルニア州、プレザントン）を使用して、クロマトグラフィー・データを取得及び解析した。
【０１３１】
２．１９  試料の調製
検体のアリコットとアセトニトリルとを混合（５０：５０）することにより、サンプルを調製した。前記サンプルを混合し、周囲温度で１０分間静置し、５０００ｇで５分間遠心分離した。８マイクロリットルの上清を注入した。
【０１３２】
２．２０  ＣＳＦ及び血清の抽出及びＨＰＬＣ−ＥＣＤ解析
Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験から得たＣＳＦ及び血清のサンプルを解凍し、８μｌを個々のエッペンドルフチューブに移した。次いで、内部標準（ＩＳ）である２μｌの０．５μｇ／ｍｌ  Ｎｐａｍ５０、その後２２μｌのアセトニトリルを添加し、その後サンプルを５〜１０秒間ボルテックスし、２０，０００×ｇで５分間遠心分離して、析出したタンパク質を沈殿させた。清澄な上清を、分析のために、ＨＰＬＣバイアルに移した。ラットのブランクｃｓｆ及びブランク血清を使用して、同様の手法で標準サンプルを調製した。試料の調製及びその後のＨＰＬＣ−ＥＣＤ解析には、オプティマグレード（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）の溶媒及び１８ＭΩの水（ミリポワ社）を用いた。校正標準は０．１〜５０ｕＭ（６ポイント、ｃｓｆ同等レベル）の範囲であり、Ｒ２＞０．９９であった。検出限界は、０．８μＭを超えるＮｐａｍ４３であった。添加前後(pre- and postspiked)の血清を、純標準と比較したところ、約１０％の抑制率、及び９５％の抽出効率が示された。校正範囲外のサンプルはすべて、１０倍に希釈して再分析した。
【０１３３】
３．  化合物のＩｎ  ｖｉｖｏ解析
３．１  脳虚血
体重約２００ｇの、成体の雄性スプラーグドーリーラットを麻酔し、頬骨と鱗状骨の前方接合部の１ｍｍ吻側に、開頭術によりウィンドウ（直径：２ｍｍ）を形成することにより、中大脳動脈（ＭＣＡ）を露出させた。縫合結紮法を使用して、三枝閉塞(three-vessel occlusion)を起こさせた。暴露されたＭＣＡを、１０−０ナイロン縫合糸を用いた本結びで結紮した。次に、両側総頸動脈（ＣＣＡ）を非外傷性の動脈クリップで固定した。レーザードップラー流量計（ＰＦ−５０１０、Ｐｅｒｉｆｌｕｘシステム；ペリメド社(Perimed AB)）でモニターした、局部的な大脳血流の激減により、手術の成功を確認した。虚血の９０分後、縫合糸とクリップを除去し、瞬時に再灌流を起こさせた。実験用ラットを、大腿部への静脈注射により異なる用量のＮｐａｍ４３又は生理食塩水／ビヒクル（示される通り）の投与を受ける各群に細分した。２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）を用いて、染色した脳切片における梗塞サイズを評価した。Ｎｐａｍ４３及び生理食塩水／ビヒクルのボーラス投与は、脳卒中発症の３．５時間後に実施した。最適な結果を得るために、さらに２回分のＮｐａｍ４３を、第２日目と第３日目に、それぞれ投与した。その後、追加の実験を行うまで、異なる期間、ラットを回復させた。
【０１３４】
３．２  磁気共鳴撮像
ラットを麻酔し、撮像の間加熱パッドで体温を３７．０±０．５℃に維持した。３．０Ｔ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  撮像システム（Ｒ４；ＧＥ社）により、以下のパラメータにて、Ｔ２−強調スピンエコー撮像シーケンス（Ｔ２ＷＩ）を実施した：反復回数  ４０００ｍｓ；エコー時間  １０５ｍｓ；それぞれ厚さ２ｍｍの、６〜８片の隣接する冠状切片。脳卒中の進行のこの段階（虚血後７日目）では、脳梗塞は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）上、高いシグナル（明るい白色）として現れる。非梗塞領域を、切片一枚一枚から手動で描き出し、Ｖｏｘｔｏｏｌ解析ソフトウェア（ゼネラル・エレクトリック社）を用いて、体積を測定した。対側半球の総体積から、虚血半球の非梗塞体積を減じることにより、梗塞サイズを定量化した。
【０１３５】
３．３  神経学的行動試験
虚血性損傷により損傷した神経回路の機能回復を評価するために、ＶｅｒｓａＭａｘ動物活動モニター（アキュスキャン・インスツルメンツ社(Accuscan Instruments)）を使用して、３つの自発運動（感覚運動）障害の様相を試験した：１）垂直活動（垂直センサーにおいて発生したビーム遮断の総数）；２）垂直運動の数（動物が後ろ足で立つ回数）；及び、３）垂直運動の時間（動物が後ろ足で立つ時間（秒））。昼／夜サイクルのうちの「暗」期の間に、虚血ラットを記録チャンバーに入れ、垂直運動の時間（秒）を２時間にわたり、コンピューターで自動的に記録した。垂直運動の総時間は、虚血性脳卒中により損傷した自発運動回路の回復を表す。
【０１３６】
［実施例１  ポジティブ・アロステリックモジュレーターの同定］
ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲサブタイプは、ポジティブアロステリック調節のための格好の標的である。本発明者らは、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲモジュレーターとなる可能性のある化合物を同定するために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ計算創薬方法（in silico computational drug discovery methods）を用いて、ＺＩＮＣデータベースから選ばれた購入可能な鉛様化合物（Irwin, J., et al. Abstr Pap Am Chem Soc (2005) 230:U1009）及びいくつかの合成化合物の、仮想スクリーニングを実施した。このｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法には、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａヘテロ二量体の隙間界面に対する大規模なドッキング、及び実証試験用の化合物を選択するためのコンセンサススコアリングが含まれた。ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞に一過的にトランスフェクトされたＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａを用いて、候補化合物をさらにスクリーニングし、ホールセルパッチクランプ記録により試験した。
【０１３７】
表１は、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲに対してポジティブ調節効果を有するものとして同定された、合成化合物及びＺＩＮＣデータベースの化合物を示す。
【０１３８】
【表１】
2019530749.tif 000029
【０１３９】
2019530749.tif 000030
【０１４０】
実施例２  含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを選択的に増強するモジュレーターの同定
本発明者らは、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲ又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ  ＮＭＤＡＲのいずれかを発現している、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を用い、ホールセルボルテージパッチクランプ記録により試験して、選択された化合物が薬剤のサブタイプ選択性プロファイルを制御していたかどうかを調べた。
【０１４１】
表２は、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲのポジティブ調節効果、及び／又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ  ＮＭＤＡＲの抑制効果を示した、いくつかの同定された化合物を示す。図１は、ホールセルパッチクランプ法による電気生理学的記録から得たデータを用いた、ＮＭＤＡＲを介する電流に対する、いくつかのＮｐａｍ化合物の様々な調節効果を示す。図１は、Ｎｐａｍ化合物が組換え型ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲに対するポジティブな増強効果を有する場合もあり、且つ／又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ  ＮＭＤＡＲに対する抑制効果を有する場合もあり、且つ／又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ  ＮＭＤＡＲに対してほとんど若しくは全く効果をもたらさない場合もある、ということを示す。
【０１４２】
【表２】
2019530749.tif 000031
【０１４３】
図２は、選択されたＮｐａｍ化合物の存在下での、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲの選択的増強を示す。図２は、Ｎｐａｍ０１、Ｎｐａｍ０４、Ｎｐａｍ５９と比較して、Ｎｐａｍ０２、Ｎｐａｍ５８、Ｎｐａｍ７２及びＮｐａｍ４３が、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲに対して選択的であることを示す。
【０１４４】
含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを選択的に増強する２つの化合物、Ｎｐａｍ０２及びＮｐａｍ４３を、さらに調査した。Ｎｐａｍ４３は、Ｎｐａｍ０２をベースにした、構造−活性関係（ＳＡＲ）の調査により得た。
【０１４５】
実施例３  Ｎｐａｍ０２の特徴づけ
３．１  ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＢでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における、Ｎｐａｍ０２による増強効果の評価
ホールセルパッチクランプ記録を行い、グルタメートで誘導される電流を、塩化物ベースのピペット溶液を用いて保持電位−６０ｍＶで測定した。
【０１４６】
ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ又はＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂを発現しているＨＥＫ２９３細胞において、Ｎｐａｍ０２自体が、なんらかの電流を誘導し得るという可能性を排除するために、Ｎｐａｍ０２（１００μＭ）のみを投与したところ、内向き又は外向きの電流のいずれにおいても変化は見られなかった（図３ａ、ｄ）。ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ受容体を発現しているＨＥＫ２９３細胞において、Ｎｐａｍ０２（１００μＭ）をコ・アゴニストと同時投与したところ、ＮＭＤＡを介する電流は、グルタメートのみを投与した場合（図３ａ、ｄ）と比較して、やや増加した（１００μＭ；ｎ＝６；３８．８５±３．７０％；Ｐ＜０．００１；及び（２００μＭ；ｎ＝６；７１．６９±５．０３％；Ｐ＜０．００１）（図３ｂ、ｄ）。両コ・アゴニストの存在下で、選択的ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＡアンタゴニストであるＮＶＰ−ＡＡＭ００７（０．２μＭ）を同時投与することにより、増加したＮＭＤＡＲ電流を完全に阻害することができ、ＨＥＫ２９３細胞に内在するタンパク質に起因する副次的効果はないということが確認された（図３ａ、ｄ）。これに対して、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂの組み合わせを発現しているＨＥＫ２９３細胞では、Ｎｐａｍ０２（１００μＭ）存在下において、ＮＭＤＡＲ電流の増強は見られなかった（図３ｃ、ｅ）。同様に、Ｎｐａｍ０２単独では電流を誘導せず、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ−受容体に起因するＮＭＤＡＲ電流は、ＧｌｕＮ２Ｂの特異的アンタゴニストであるイフェンプロジル（ＩＦ；３μＭ）によって、首尾よく阻害された（図３ｃ、ｅ）。
【０１４７】
３．２  野生型及びＧｌｕＮ２Ｂ欠損型の成熟皮質神経細胞におけるＮｐａｍ０２による増強効果の、ホールセルボルテージクランプ記録を用いた評価
ＧｌｕＮ２Ａ受容体が高発現されている時期の、１４〜１８日齢の成熟した皮質神経細胞において、前記化合物がＮＭＤＡＲを増強できるかどうかを試験するため、本発明者は、ＮＶＰ−ＡＡＭ００７（選択的ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａアンタゴニスト；低めの濃度で）を用いて、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ含有受容体を阻害した。図４ａに示す通り、海馬神経細胞において、コ・アゴニストであるＮＭＤＡ（５ｕＭ）及びグリシン（２μＭ）の存在下、Ｎｐａｍ０２（１００μＭ）を浴投与（bath application）したところ、ＮＭＤＡＲ電流は、ＮＭＤＡ対照群と比較していくらか調節された（ｎ＝６、４３．０４±６．５５％；Ｐ＜０．００１）。
【０１４８】
ＨＥＫ２９３細胞のデータと整合して、Ｎｐａｍ０２単独では、内向き又は外向きの電流を誘発することはできなかった（図４ａ）。さらに、ＡＰＶ（５０μＭ）の投与により、すべての電流が阻害され、これは増強がＮＭＤＡＲを介したものであり、他の内在するタンパク質に起因する副次的効果によるものではないことを示している。一方、Ｎｐａｍ０２による増強効果は、ＮＶＰの存在により阻害可能であり（０．２μＭ；ｎ＝６、０．０６±１．３６％；Ｐ＞０．０５）、これはこの増強効果が含ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲに由来することを示唆している（図４ｂ）。
【０１４９】
Ｎｐａｍ０１及びＮｐａｍ０４についても、同様の方法で試験したが、Ｎｐａｍ０２とは異なり、ＮＭＤＡＲ電流の観察可能な増強効果又は下落効果は見られなかった（図４ｃ）。この結果は、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲを発現しているＨＥＫ２９３細胞において先に観察されたＮｐａｍ０１及びＮｐａｍ０４による増強効果が、神経細胞のＧｌｕＮ１／含ＧｌｕＮ２Ｂ−ＮＭＤＡＲに対する抑制効果によりマスキングされ、それによりＮＭＤＡＲ電流における純変化がゼロになった可能性があることを示唆した。
【０１５０】
Ｎｐａｍ０２による増強効果が、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲに対して選択的であったかどうかをさらに評価するために、ＧｌｕＮ２Ｂサブユニットが欠損している神経細胞において、Ｎｐａｍ０２の試験を行った。条件付きＧｌｕＮ２Ｂ−ノックアウト神経細胞において、ＮＶＰ−ＡＡＭ００７（０．２μＭ）とＮＭＤＡ（２０μＭ）とを同時投与したところ、ＮＭＤＡＲ電流はほぼ完全に阻害された（ｎ＝４；９０．７３±１．１１％；Ｐ＜０．００１）（図５ａ、ｂ）。これは、わずかな残留電流が未だ、ＧｌｕＮ２Ｂから来ていることを示唆している。ＧｌｕＮ２Ｂ欠損マウス由来の神経細胞において、コ・アゴニストであるＮＭＤＡ（２０μＭ）及びグリシン（２μＭ）の存在下、Ｎｐａｍ０２（１００μＭ）を浴投与（bath application）したところ、ＮＭＤＡ対照群と比較して、ＮＭＤＡＲ電流に対するポジティブな調節効果が見られた（ｎ＝４；４４．７２±４．２９％；Ｐ＜０．００１）（図５ａ、ｂ）。この結果は、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを発現しているＨＥＫ２９３細胞における観察、及び野生型神経細胞において観察された増強効果と整合していた。
【０１５１】
さらに、純粋なＧｌｕＮ２Ａ成分をさらに分離するために、ＧｌｕＮ２Ｂ−アンタゴニストであるイフェンプロジル（ＩＦ）をＮｐａｍ０２と同時投与したところ、ＮＭＤＡ対照群と比較して、先に観察された増強効果と同様の効果が見られた（ｎ＝４；４２．２２±４．０３％；Ｐ＜０．００１）（図５ａ、ｂ）。
【０１５２】
最後に、ＧｌｕＮ２Ｂ−ノックアウト皮質神経細胞を使用して、Ｎｐａｍ０２が含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲに対して選択的であるか否かを判定した。選択的ＧｌｕＮ２Ａアンタゴニストを用いてＧｌｕＮ２Ａを介する電流を阻害し、前記化合物が２つのサブタイプを識別するか否かを確認した。２種のコ・アゴニストとＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲアンタゴニストであるＮＶＰ−ＡＡＭ００７（０．２μＭ）及びＮｐａｍ０２とを浴投与（bath application）したところ、Ｎｐａｍ０２によるＮＭＤＡＲ電流の増強は、ＮＭＤＡ対照と比較して抑制された（１００μＭ；ｎ＝４；８８．８７±３．４５％Ｐ＞０．００１）（図５ａ、ｂ）。これは、残留ＧｌｕＮ２Ｂ−ＮＭＤＡＲ電流が増強されなかったことを示唆する。
【０１５３】
３．３  Ｎｐａｍ０２は、成熟皮質神経細胞において、ＡＭＰＡＲ及びＧＡＢＡＲを介する電流に対する明らかな調節効果を示さなかった。
次に、本発明者は、中枢神経系（ＣＮＳ）の他の２種の主要なイオンチャネル型受容体に対する、Ｎｐａｍ０２の選択性プロファイルを評価した。その２種の受容体とは：中枢神経系（ＣＮＳ）における迅速なシナプス伝達を媒介するグルタメートに対する非ＮＭＤＡ型のイオンチャネル型膜貫通受容体として知られる、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸受容体、ＡＭＰＡＲ；及び、主要な抑制性のリガンド開口型イオンチャネル受容体である、ＧＡＢＡ受容体である。培養された海馬神経細胞において、ホールセルパッチクランプ記録を実施した。この試験により、Ｎｐａｍ０２は、ＡＭＰＡＲ（図６ａ、ｃ）を介する電流又はＧＡＢＡＲ（図６ｂ、ｃ）を介する電流のいずれにおいても、観察可能な効果を示さなかったことが明らかになった。
【０１５４】
３．４  ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａの界面部位におけるＮｐａｍ０２の結合位置
構造解析において、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ二量体の界面の大部分が、前記ポケット全体及びＮｐａｍ０２リガンドの周囲に広がる疎水性の残基（例えばＧｌｕＮ２ＡＦ１１５、ＧｌｕＮ２ＡＭ１１２、ＧｌｕＮ２ＡＰ７９、ＧｌｕＮ１Ｆ１１３、ＧｌｕＮ１Ｙ１０９、ＧｌｕＮ１Ｌ１３５、ＧｌｕＮ２ＡＦ１７７、ＧｌｕＮ２ＡＰ１７８など）により囲まれていることが観察された。実際、前記Ｎｐａｍ０２リガンドは、ＧｌｕＮ２ＡＦ１１５、ＧｌｕＮ２ＡＰ７９、ＧｌｕＮ１Ｆ１１３及びＧｌｕＮ１Ｙ１０９により描かれる疎水性の籠の中に位置する。この籠は、その側鎖中の環構造からなる残基により特徴づけられる。この特徴は、特に興味深いものである。なぜなら、理想的には、この籠内のリガンドの環は、２つのΠ系（アリール−アリール）に媒介される強固な疎水性相互作用により、それ自体をこの領域に固定することができる可能性があるからである。Ｎｐａｍ０２のアリール環（図７の位置１〜６）はこの領域内に位置し、かつＮｐａｍ０２のアリール環（図７の位置１〜６）を取り囲むすべての前述の残基に疎水的に連結しているため、Ｎｐａｍ０２は、この可能性に従っているように見える。より具体的には、ＧｌｕＮ２ＡＦ１１５の２つのΠ系（アリール−アリール）と、Ｎｐａｍ０２のアリール環（図７の位置１〜６）との間では、Ｔ字型のエッジ・トゥー・フェース(edge-to-face)構造により強力な相互作用が働き、エネルギー的に誘引性かつ有利であるように思われる。他のアリール環（図７の位置１１〜１６）がＧｌｕＮ１Ｌ１３５、ＧｌｕＮ２ＡＦ１７７及びＧｌｕＮ２ＡＰ１７８と強力に相互作用するリガンドの反対側においても、同様の効果が見られた。ＧｌｕＮ１Ｌ１３５は、エッジ・トゥー・フェース相互作用により、Ｎｐａｍ０２の第２のアリール環と直接相互作用可能であるように見え、ＧｌｕＮ２Ａの他の残基は、前記リガンドからより離れた位置にあるため、おそらくより低い程度ではあろうが、同様に疎水的に相互作用する。逆に、ＧｌｕＮ２ＡＱ１１１は、Ｎｐａｍ０２のヒドロキシル基（図７の位置１８）のプロトンとの相互作用を受け入れる、極性の水素結合を示す。
【０１５５】
３．５  Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）における予測結合部位の部位特異的変異誘発
薬剤がＧｌｕＮ１とＧｌｕＮ２Ａとの間の二量体界面に結合するか否かを検証するために、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）のポケットの部位特異的変異誘発を行った。薬剤との直接相互作用においてきわめて重要とみなされる２つの残基を選択した。広範な誘導適合ドッキング（induced-fit docking）により、Ｎｐａｍ０２がＮＴＤの上葉（Ｒ１）間の空間を占有し利用できることが示唆された（図８ａ）。そこで本発明者らは、Ｎｐａｍ０２による含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲの増強が、前記ポケットの界面を取り囲む残基での変異により変化するか否かを試験した。この試験は、前記化合物に対する相互作用を阻むが、それ以外は全体的なタンパク質構造を攪乱しない置換用の側鎖を選択することによって行った。予想された調節部位におけるＮｐａｍ０２のドッキング後のモデルは、２つの残基ＧｌｕＮ２Ａ（Ｇｌｎ１１１）及びＧｌｕＮ２Ａ（Ｆ１７７）（図８ｂ）がＮｐａｍ０２と直接相互作用し、その際ＧｌｕＮ２Ａ（Ｇｌｎ１１１）はヒドロキシル基と水素結合を形成し（図７の位置１８）し、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｆ１７７）は芳香環（図７の位置１１〜１６）に対する疎水性の相互作用を誘導し得るということを示した。実際、野生型ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ受容体に対して観察された調節効果と比較して、両変異により、調節の程度が顕著に減少した。野生型神経細胞におけるＮｐａｍ０２（１００μＭ）による調節効果（ｎ＝７、４１．７５±２．６２％）（図８ｃ）は、ＧｌｕＮ２ＡがＧｌｎ１１１Ａｌａから変異した際に有意に減少し（ｎ＝７、３０．６９±１．６０％、Ｐ＞０．０５）（図８ｃ）、Ｐｈｅ１７７Ｓｅｒの変異により、さらに減少した（ｎ＝７、２２．８６±１．１２％、Ｐ＞０．０１）（図８ｃ）。これら２つの変異の導入、及びその後のＮｐａｍ０２による調節効果の減少は、Ｎｐａｍ０２が、この隙間界面部位に結合できたということを示唆する。
【０１５６】
［実施例４  Ｎｐａｍ４３の特徴づけ］
４．１  Ｎｐａｍ４３はトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを介する電流を選択的に増強する。
図９に示す通り、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ受容体を発現しているＨＥＫ細胞において、Ｎｐａｍ４３（１０μＭ）をコ・アゴニストと同時投与したところ、ＮＭＤＡを介する電流は、グルタメートのみを投与した場合と比較して、劇的に増加した。これは、Ｎｐａｍ４３がＮｐａｍとして作用し得ることを示唆している。これに対して、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂサブタイプを発現しているＨＥＫ細胞では、Ｎｐａｍ４３（１０μＭ）存在下において、ＮＤＭＡＲ電流の増強は見られなかった（図９）。同様に、Ｎｐａｍ４３単独では、電流を誘導しなかった。図９に示す通り、ＨＥＫ細胞におけるＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲを介する電流の増強は、コ・アゴニストのみのベースラインと比較して約３５０％で飽和に達したＮｐａｍ４３の存在下で、用量依存性の関係を示し、ＥＣ５０は、ｐＥＣ５０：−０．６１４±０．０５μＭ（０．２４±０．０５μＭ）であった。含ＧｌｕＮ２Ｂ−ＮＭＤＡＲの記録では、Ｎｍａｐ４３による用量依存性の電流の増強は観察されなかった。
【０１５７】
４．２  増強効果を減少させた、Ｎ末端ドメインにおけるＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ界面の重要なアミノ酸残基
本発明者らは、Ｎｐａｍ４３による含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲの増強が、ポケット界面を取り囲む残基での変異により変化するか否かを、前記化合物との相互作用を阻むが、それ以外は全体的なタンパク質構造を攪乱しない置換用の側鎖を選択することにより、試験した。ＧｌｕＮ１サブユニット及びＧｌｕＮ２Ａサブユニットの一次配列を図１０ａに示す。太字で示される残基は、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａの３−Ｄモデルに基づいて、部位ポケットに必要であると定義されたものである（図１０ｂ）。予想された調節部位におけるＮｐａｍ４３のドッキング後のモデルは、β−ストランド５の直前で曲がっているＧｌｕＮ１−（Ｌｅｕ１３５）（図１０ｂ）が、リガンドとの相互作用において役割を果たし得ることを示した。
【０１５８】
実際、ＧｌｕＮ１−（Ｌｅｕ１３５Ｇｌｎ）では、調節の程度は顕著に減少し、ポジティブな調節は、７０％超、有意に減少した（ｎ＝６；−７７．５±２．１２％；Ｐ＜０．００１；野生型ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＡにおけるＮｐａｍ４３の応答に対して正規化）。これは、このアミノ酸が前記化合物との疎水性接触において重要であることを示唆している（図１０ｃ）。前記モデルはまた、α−へリックス８０におけるＧｌｕＮ２Ａ−（Ｇｌｎ１１１）が、Ｎｐａｍ４３と主要な水素結合相互作用を形成するものであり（図１０ｂ）、それゆえＧｌｎ１１１がＧｌｕＮ２Ａ−（Ｇｌｎ１１１Ａｌａ）に変異したときに、増強の減少が観察された（図１０ｄ）ことも示した。この結果は、前記リガンドの結合を媒介するうえでのこの領域の役割と整合している（ｎ＝６；−３８．４±０．７８％、Ｐ＜０．００１；野生型ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＡにおけるＮｐａｍ４３の応答に対して正規化）。さらに、α−へリックス８０に位置するＧｌｕＮ２Ａ−（Ｐｈｅ１１５Ｓｅｒ）の変異は、ポジティブな調節を（ｎ＝６；−６７．４±１１．８％；Ｐ＜０．００１；野生型ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＡにおけるＮｐａｍ４３の応答に対して正規化）減少させ、これは、この位置における疎水性が必須であることを示唆する（図１０ｄ）。図１１ａは、ＧｌｕＮ１−（Ｌｅｕ１３５Ｇｌｎ）及びＧｌｕＮ２Ａ−（Ｐｈｅ１１５Ｓｅｒ）の変異が、単独でも、両方一緒でも、全体的なタンパク質構造の変化を直接反映するのではなく、むしろリガンドの結合に影響を与えたことを示す。これは、野生型ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａと比較して、これらの２つの変異に因るＬ−グルタメートの用量反応性に変化が無いことにより実証された。
【０１５９】
表３に要約し、かつ図１０ｄに示す、画定されたポケット内の別の８つの変異は、（１０〜６２％）の範囲に及ぶ、増強の有意な減少も示した。これは、前記リガンドの結合が、ＮＴＤの上葉（Ｒ１）のこの接合部において起こることを、強く示唆している。このモデルの結合部位の正確性をさらに実証するために、前記結合ポケット内の、リガンド結合に寄与しない残基として定義された４つの陰性対照変異である、ＧｌｕＮ１−（Ａｒｇ１１５Ｇｌｕ）、ＧｌｕＮ２Ａ−（Ｍｅｔ１１２Ｉｌｅ）、ＧｌｕＮ２Ａ−（Ｉｌｅ１７６Ｔｙｒ及びＧｌｕＮ２Ａ−（Ａｌａ１０８Ｇｌｙ）も変異させた（図１０ｄ）。表３中には、Ｎｐａｍ４３の結合を無効にすることができる単一点変異はなかったので、二重変異を、１つはＧｌｕＮ１（Ｌｅｕ１３５Ｇｌｎ）から、そして１つはＧｌｕＮ２Ａ（Ｐｈｅ１１５Ｓｅｒ）から構築して試験し、残留するポジティブ調節をさらに減少させることができるどうかを調べた。各変異それぞれが相互作用を阻害する、ＮＴＤの前記二重変異は、増強のさらなる減少に反映されるとおり、Ｎｐａｍ４３の結合をさらに減少させた（ｎ＝６；−９３．９±１０．３％；Ｐ＜０．００１；野生型ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＡにおけるＮｐａｍ４３の応答に対して正規化）（図１０ｅ：図１０ｆは、前記結合部位における、これらの２つの点変異、当該変異の相対位置、及び当該変異の強力な、影響力のある相互作用を強調している）。この減少が、Ｎｐａｍ４３の結合に因るものか、又は受容体の感度低下に因るものかを判断するために、グルタメート活性化に対する用量反応関係を、野生型と前記二重変異の比較により調べた。図１１ａは、グルタミンメート用量反応性において、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ野生型受容体と比較して、前記二重変異に因る有意な変化は無いことを示し、これは、この変異が、タンパク質の機能に影響を与えなかったことを示唆している。ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＴＤに使用した構造モデルの正確性を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞のＧｌｕＮ１又はＧｌｕＮ２Ａの各種変異型から観察された、Ｎｐａｍ４３による相対的増強と、ドッキング解析から予測された結合エネルギーとの間の相関関係をプロットした（図１１ｂ）。観察された増強と予測された結合エネルギーとの間に、強い相関関係：Ｒ２＝０．９３があり、これは、このモデルがこの結合ポケット内の前記化合物のモデルとして充分正確であることを示唆している（図１１ｂ）。
【０１６０】
【表３】
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【０１６１】
４．３  Ｎｐａｍ４３による含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲに対する調節は、培養されたラット海馬神経細胞においてＮＭＤＡＲを介する電流を増強する。
図１２は、海馬神経細胞において、Ｎｐａｍ４３がＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲを選択的に増強することを示す。図１２は、Ｎｐａｍ４３の存在下において、又はＮｐａｍ４３とＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂ−特異的アンタゴニストであるイフェンプロジル（ＩＦ；３μＭ）との同時投与により、増強が増加することを示す。図１２はさらに、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−特異的アンタゴニストであるＮＶＰ−ＡＡＭ０７７による処理で増強が減少し、ＮＭＤＡ遮断薬であるＡＰ５による処理で前記電流が排除されることを示す。用量反応解析により、Ｎｐａｍ４３が用量依存的にＮＭＤＡＲ電流を増加させ、ＥＣ５０は０．２５±０．１２μＭ（図１３）であり、かつ１０μＭ（ｎ＝６；対照レベルのベースラインより３２２±２７％高い）で飽和点に達することが明らかになった。さらに、図１３に示す通り、ＮＭＤＡの用量反応曲線はｐＥＣ５０＝１．４８４±０．０８２μＭ又は３０．５±１１．７μＭであり、当該用量反応曲線は、Ｎｐａｍ４３（５μＭ）の存在下では左側に移動し、したがって、ＮＭＤＡアゴニストの親和性が増加していることがわかった。
【０１６２】
４．４  Ｎｐａｍ４３は、含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを介して細胞内のＣａ２＋を増加させる。
Ｎｐａｍ４３による調節が細胞内のＣａ２＋の増加に寄与するか否か、及びこの調節効果が含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲに媒介されたものか否かを判断するために、初代培養されたラットの神経細胞を用いた細胞ベースのＣａ２＋流入アッセイを行った。ＮＭＤＡ（１０μＭ）及びグリシン（２μＭ）を細胞培養物に添加して、ＮＭＤＡＲを活性化した。培養された神経細胞へのＮｐａｍ４３の投与により、図１４に示すＣａ２＋流入蛍光シグナルが増加した。このＣａ２＋の流入が含ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ−ＮＭＤＡＲを介したものか否かを判断するために、本発明者らがＧｌｕＮ２ＡアンタゴニストであるＮＶＰ−ＡＡＭ００７７を同時投与したところ、Ｎｐａｍ４３に応答したＣａ２＋流入の顕著な減少が観察された。これは、ＧｌｕＮ２Ａ受容体が、図１４に示すカルシウム流入の増加を媒介していることを示唆している。
【０１６３】
［実施例５  Ｎｐａｍ４３の神経保護効果］
５．１  ＣＲＥＢのリン酸化（ｐＣＲＥＢ）
ＣＲＥＢのリン酸化は、細胞生存経路活性化の信頼できる指標である。図１５ａは、ＣＲＥＢのリン酸化（ｐＣＲＥＢ）が、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ｂのアンタゴニストであるイフェンプロジルの存在下又は非存在下で、Ｎｐａｍ４３での処理により増加することを示す。図１５ａはさらに、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａ特異的アンタゴニストであるＮＶＰ−ＡＡＭ００７が、陽性対照であるビククリン（ＢＩＣ；１０μＭ）と比較して、Ｎｐａｍ４３に誘導されるｐＣＲＥＢを減少させることを示す。図１５ｂは、Ｎｐａｍ４３の用量依存性の効果と、ｐＣＲＥＢの増加との関係を示す。
【０１６４】
５．２  ＮＭＤＡに誘導される興奮毒性及びＨ２Ｏ２に誘導される細胞傷害性の減少
図１６〜１７は、皮質神経細胞における、ＮＭＤＡに誘導される興奮毒性及びＨ２Ｏ２に誘導される非ＮＭＤＡＲ依存性の細胞傷害性が、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２ＡのアンタゴニストであるＮＶＰ−ＡＡＭ００７の非存在下で、Ｎｐａｍ４３による処理により減少することを示す。図１６はさらに、Ｎｐａｍ４３の用量依存性の効果と、ＮＭＤＡに誘導される興奮毒性の関係を示す。図１７は、Ｈ２Ｏ２への暴露が、神経細胞の死を増加させることを示す。図１７はさらに、Ｈ２Ｏ２に誘導される細胞傷害性が、ＧｌｕＮ１／ＧｌｕＮ２Ａアンタゴニスト（ＮＶＰ−ＡＡＭ０７７、０．２μＭ；及びＴＣＮ−２０１、１０μＭ）との同時処理の場合を除いて、Ｎｐａｍ４３の存在下で減少することを示す。
【０１６５】
［実施例６  切片におけるＮｐａｍ４３の特徴づけ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）］
６．１  シナプス伝達のＧｌｕＮ２Ａ成分及び長期増強（ＬＴＰ）の両方が強化される
電気生理学的記録を実施して、脳海馬切片におけるＮＭＤＡＲ電流に対するＮｐａｍ４３の効果を直接アッセイした。本発明者らは、ＧｌｕＮ２Ａアンタゴニスト又はＧｌｕＮ２Ｂアンタゴニスト（ＮＶＰ−ＡＡＭ００７（ＮＶＰ）：０．２μＭ；又はイフェンプロジル（ＩＦ）：３μＭ）の存在下で、シナプス伝達のＧｌｕＮ２Ａ成分及びＧｌｕＮ２Ｂ成分を、薬理学的に分離した。図１８は、Ｎｐａｍ４３が、マウス海馬切片において、ＮＭＤＡＲ電流のＧｌｕＮ２Ａ成分を選択的に増強し、ＧｌｕＮ２Ｂ  ＮＭＤＡＲには何の効果も与えなかったことを示す。ＧｌｕＮ２Ａの活性化が、シナプス可塑性に資することが示されたので、ＧｌｕＮ２Ａの増強が長期増強（ＬＴＰ）を促し、それによりシナプス強度の増進を助けることを実証するために、電気生理学的記録も実施した。図１９は、Ｎｐａｍ４３が、マウス海馬切片において、ＬＴＰの誘導を促進できることを示す。
【０１６６】
６．２  ＧｌｕＮ２Ａノックアウト（ＫＯ）マウス由来の皮質切片により実証された、Ｎｐａｍ４３によるＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲに対する増強効果
シナプスが活性化されたＮＭＤＡＲに対するＮｐａｍ４３の選択性を直接試験するために、ＧｌｕＮ２Ａノックアウト（ＫＯ）マウス由来の切片、及び野生型（ＷＴ）マウス由来の切片において記録を実施した。図２０は、ＷＴマウスにおいて、Ｎｐａｍ４３を脳切片に投与した際、ＮＭＤＡＲのＥＰＳＣの明らかな増強が観察されたことを示す。ＧｌｕＮ２ＡＫＯマウスにおいて、Ｎｐａｍ４３の投与はＮＭＤＡＲのＥＰＳＣに対して何の効果ももたらさなかった。これは、Ｎｐａｍ４３による増強効果がＧｌｕＮ２Ａ  ＮＭＤＡＲに起因することを示唆する。
【０１６７】
６．３  Ｎｐａｍ４３は海馬切片においてｐＣＲＥＢレベルを増加させた
図２１に示す通り、ＮＶＰ−ＡＡＭ０７７（０．２μＭ）の存在下及び非存在下で、ビククリン（ＢｉＣ；１０μＭ；３０分間暴露）又はＮｐａｍ４３（１０μＭ；３０分間暴露）で処理された海馬切片において、基礎レベルでの、セリン１３３のＣＲＥＢリン酸化（ｐＣＲＥＢ）の免疫細胞化学的解析を実施した。神経細胞をＢｉＣで刺激したところ、ｐＣＲＥＢレベルが増加し、この効果はｂ  ＮＶＰ−ＡＡＭ００７（０．２μＭ）により減少した。図２１に示す通り、Ｎｐａｍ４３（１０μＭ）による処理によりｐＣＲＥＢレベルが有意に増加し、この増加はＮＶＰ−ＡＡＭ０７７（０．２μＭ）の存在により完全に阻害された。
【０１６８】
［実施例７  Ｎｐａｍ４３の薬理学的プロファイリング］
成熟ラットへの静脈注射後、Ｎｐａｍ４３は、血液脳関門を通過する
Ｎｐａｍ４３のｉｎ  ｖｉｖｏでの薬理学的プロファイルを、成熟したスプラーグドーリーラット（約３００ｇ）を使用して評価した。Ｎｐａｍ４３を、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の異なる用量で各ラットに静脈注射（ｉ．ｖ）し、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血清サンプルを抽出し、高速液体クロマトグラフィー・電気化学検出アッセイ（ＨＰＬＣ−ＥＣＤ）を使用して解析した。静脈内投与後のＮｐａｍ４３の薬物動態解析により、図２２に示す通り、Ｎｐａｍ４３が効率よく血液脳関門（ＢＢＢ）を突破したこと、かつＣＳＦ及び血清中における中程度の代謝安定性を有することが実証された。注射の１時間後、注射された用量と、ＣＳＦ中の最終濃度との間に、線形関係が観察された。図２２に示す通り、Ｎｐａｍ４３の半減期は、ＣＳＦにおいて２．９５±０．６時間と推定され、これは血清中におけるＮｐａｍ４３の減衰と同様であった。
【０１６９】
［実施例８  Ｎｐａｍ４３のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性］
８．１  Ｎｐａｍ４３は、海馬組織及び皮質組織においてｐＣＲＥＢレベルを増加させる。
Ｎｐａｍ４３（１ｍｇ／ｋｇ）の静脈注射による治療の１時間後に、海馬及び皮質の脳切片を採取し、図２３に示す通り、各サンプルのｐＣＲＥＢレベル及びｔＣＲＥＢレベルを、イムノブロッティングにより調べた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイと整合して、ｐＣＲＥＢレベルが上昇していた。
【０１７０】
８．２  虚血性脳損傷後の神経細胞の損傷の減少
梗塞サイズは、発作後の脳の損傷の尺度として使用することができる。図２４〜２５は、Ｎｐａｍ４３での治療により、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）のラットモデルにおける梗塞体積が、ビヒクル／生理食塩水で治療した対照と比較して、減少したことを示す。図２４は、虚血の２４時間後の梗塞体積に対する、Ｎｐａｍ４３の用量依存性の効果を示す。図２５は、Ｎｐａｍ４３が梗塞サイズを減少させることを、ＭＲＩ走査による長期評価ポイント（７日間）を使用して示している。
【０１７１】
８．３  局所虚血性脳損傷後の行動パフォーマンスの向上
脳卒中後の神経細胞の機能回復を評価するために、神経行動学的アッセイを実施した。図２６は、脳卒中発症の２８日後、未治療の対照ラットと比較して、Ｎｐａｍ４３で治療したラットにおいて、脳卒中後の自発運動の増加が見られたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019530749.tif 000077
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