(57)【要約】  Ｆｃ領域の選択された部位においてシステイン置換を有する変異型抗体は、置換導入されたシステインのチオール基を介して結合されることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋａｂａｔに記載されるＥＵ指数に従って部位を番号付けした、２７１、３３７、３４０、３４１、３４３、４０２、４１３、４１５、４１９、４３９、４４０、および４４１位のいずれか１つにおいてシステイン置換を有するＦｃ領域を含む、ＩｇＧアイソタイプの変異型抗体。
【請求項２】
システイン置換が３３７、３４０、３４１、および３４３位のいずれか１つにある、請求項１に記載の変異型抗体。
【請求項３】
システイン置換が４１３および４１５位のいずれか１つにある、請求項１に記載の変異型抗体。
【請求項４】
システイン置換が４３９、４４０、および４４１位のいずれか１つにある、請求項１に記載の変異型抗体。
【請求項５】
ヒトモノクローナル抗体のＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１に記載の変異型抗体。
【請求項６】
式（ＩＩ）：
【化１】
2019505575.tif 000018
［式中、
Ａｂは請求項１に記載の変異型抗体であり、
Ｌはリンカー部位であり、
Ｄは薬物であり、
ｎは１から３０の整数であり、
ｍは１、２、３、４、５、または６であり、
Ａｂは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＣ指数に従って部位を番号付けした、Ｆｃ領域Ａの２７１、３３７、３４０、３４１、３４３、４０２、４１３、４１５、４１９、４３９、４４０、および４４１位のいずれか１つにおけるシステインを介してＬに結合する。］
で示される、抗体薬物結合体。
【請求項７】
薬物ＤがＤＮＡアルキル化剤、ツブリシン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、エンジイン、またはメイタンシノイド化合物である、請求項６に記載の抗体薬物結合体。
【請求項８】
ｎが１であり、ｍが１または２である、請求項６に記載の抗体薬物結合体。
【請求項９】
変異型抗体ＡｂがＩｇＧ１アイソタイプのヒトモノクローナル抗体である、請求項６に記載の抗体薬物結合体。
【請求項１０】
式（ＩＶ）：
【化２】
2019505575.tif 000019
［式中、
ＡｂはＫａｂａｔに記載されるＥＣ指数に従って部位を番号付けした、２７１、３３７、３４０、３４１、３４３、４０２、４１３、４１５、４１９、４３９、４４０、および４４１位のいずれか１つにシステイン置換を有するＦｃ領域を含む、ＩｇＧアイソタイプの変異型抗体であり；
Ｄは薬物であり；
Ｔは自己犠牲基であり；
ｔは０または１であり；
ＡＡａおよびそれぞれのＡＡｂは独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから成る群から選択され；
ｐは１、２、３、または４であり；
ｕは０または１であり；
ｑは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｒは１、２、３、４、または５であり；
ｓは０または１であり、
ｍは１、２、３、４、５、または６である。］
で記載される構造を有する、抗体薬物結合体。
【請求項１１】
薬物ＤがＤＮＡアルキル化剤、ツブリシン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、エンジイン、またはメイタンシノイド化合物である、請求項１０に記載の抗体薬物結合体。
【請求項１２】
ｕが１である、請求項１０に記載の抗体薬物結合体。
【請求項１３】
抗体Ａｂがヒトモノクローナル抗体のＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１０に記載の抗体薬物結合体。
【請求項１４】
リンカーがシステイン反応性官能基を有する場合に、請求項１に記載の変異型抗体をリンカー薬物化合物と反応させることを含む、抗体薬物結合体の製造方法。
【請求項１５】
リンカー薬物化合物が、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2019505575.tif 000020
［式中、
Ｄは薬物であり；
Ｔは自己犠牲基であり；
ｔは０または１であり；
ＡＡａおよびそれぞれのＡＡｂは独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択される群から選択され；
ｐは１、２、３、または４であり；
ｕは０または１であり；
ｑは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｒは１、２、３、４、または５であり；
ｓが０または１である。］
で記載される構造を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬物ＤがＤＮＡアルキル化剤、ツブリシン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、エンジイン、またはメイタンシノイド化合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｕが１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
変異型抗体がヒトモノクローナル抗体のＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
癌を患っている対象において癌を治療する方法であって、請求項６に記載の治療上の有効量の抗体薬物結合体を、そのような対象に投与することを特徴とする方法。
【請求項２０】
癌を患っている対象において癌を治療する方法であって、請求項１０に記載の治療上の有効量の抗体薬物結合体を、そのような対象に投与することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、米国仮特許出願第６２／２７０，２４５号（２０１５年１２月２１日出願）の優先権を主張し；その開示は引用によって本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本明細書に開示される核酸および／またはアミノ酸を含む、配列番号：１から配列番号：８から成る「12642WOPCT_ST25.txt」の名前の配列表の全体が、引用によって本明細書に組み込まれる。配列表はＥＦＳ−Ｗｅｂを介して、ＡＳＣＩＩテキストフォーマットで本明細書と共に提出されているため、その紙およびコンピュータの両方で読み取ることができる形式である。配列表は２０１５年１０月３０日に、ＰａｔｅｎｔＩｎ３．５を用いて最初に作成され、およそ２２ＫＢの大きさであった。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、薬物部位への部位特異的結合に適した変異型抗体、およびそのような変異型抗体から製造される抗体薬物結合体、およびそのような変異型抗体および結合体の製造並びに使用方法に関する。
【０００４】
強い関心を生み出している抗癌剤の１種は、抗体薬物結合体（ＡＤＣ、また免疫複合体とも称される）である。ＡＤＣにおいて、治療剤（薬物、ペイロードまたは弾頭とも称される）は抗体に共有結合しており、その抗原は癌細胞に発現している（腫瘍関連抗原）。抗体は抗原と結合することによって、癌部位にＡＤＣを送達する。そこで、共有結合の切断または抗体の分解によって、治療剤の放出が起こる。逆に言えば、ＡＤＣが血液系を循環している間、治療剤は抗体に共有結合しているため、不活性に保たれる。このように、ＡＤＣにおいて用いられる治療剤は、局所放出のために、通常の化学療法剤と比べてはるかに有用（すなわち、細胞毒性）でありうる。ＡＤＣの総括としては、Schrama et al． 2006を参照されたい。
【０００５】
ＡＤＣの構造は一般に、以下：
【化１】
2019505575.tif 000002
［式中、Ａｂは抗体であり、Ｌはリンカー部位であり、Ｄは薬物である。］
のように示すことができる。結合体の製造において重要なステップは、抗体とリンカー薬物成分の間の結合形成であり、一般には結合ステップと称される。（式（Ｉ）は明確化のために単純化したものであり、抗体が複数のリンカー薬物成分に結合される、またはリンカーが複数の薬物を送達する実施態様が存在しうることが当業者には理解される。）
【０００６】
結合ステップにしばしば用いられる化学反応はマイケル反応であり、抗体上のチオール基が求核試薬として働き、リンカー薬物成分中のマレイミド基を介して付加する：
【化２】
2019505575.tif 000003
この反応は穏やかな水性条件下で容易に進行するため有利である。
【０００７】
マイケル反応を用いる上での障害は、天然の抗体に反応性チオール基が存在しないことである。抗体は多数のシステイン残基を有しているが、それらのチオール基はジスルフィド結合に用いられ、マイケル付加に用いるのは不可能である。そのため、反応性チオール基を導入するために、抗体にいくつかの修飾が必要である。
【０００８】
抗体に反応性チオール基を導入するための１つの方法は、以下に示すように、リシン残基の−（ＣＨ２）４−ＮＨ２側鎖を、反応性チオール基を有する代わりのシステインに変換するため、２−イミノチオラン（トラウト試薬）の処理を必要とする：
【化３】
2019505575.tif 000004
この方法の制限は、修飾されるリシン残基の数および位置を制御することができないことであり、そのため様々な抗体薬物比（ＤＡＲ）を有する不均一なＡＤＣ生成物を生じる。このため、この方法は無作為結合方法といわれる。
【０００９】
抗体中に反応性チオール基を生成するための別の方法は、抗体の三次構造に影響するおそれがあるが、天然のジスルフィド結合を還元することである。
【００１０】
さらに別の方法は、内因性の（天然の）アミノ酸がシステインで置換された部位特異的な変異を介して、抗体に反応性チオール基を導入することである。そのような目的のシステイン置換の例としては、Bhakta et al． 2016， Christie et al． 2016， Eigenbrot  et al． 2009， Gao et al． 2015， Geierstanger et al． 2015 and 2016， Junutula et al． 2008 and 2010， Lloyd et al． 2015， Marquette et al． 2016， McDonagh et al． 2013， Shen et al． 2012， および Stimmel et al． 2000が挙げられる。システイン置換は、そのグリコシル化状態の修飾または他の非システインアミノ酸置換などの抗体の他の修飾と両立しうる。システイン置換の部位、すなわち結合部位は、ＡＤＣの安定性および治療活性に影響する(Shen et al． 2012)。システインがあらかじめ決められた部位に導入されるため、そのような結合は部位特異的結合といわれる。
【００１１】
「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）」ヘテロ二量体化、またはＦｃγＲもしくはＦｃＲｎ結合の調節などの、結合でない目的のための部位特異的なシステイン置換もまた開示されている。例えば、Chamberlain et al． 2006 and 2012， Merchant et al． 1998， および Sondermann et al． 2007を参照されたい。
【００１２】
Ｆｃ領域における置換に関する他の文献としては、Lazar et al． 2007， 2008， and 2009 および Hansen et al． 2011が挙げられる。
【００１３】
本明細書に援用される文献の、第一著者または発明者および年による完全な引用は、本明細書の最後に列挙する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、Ｆｃ領域において内因性アミノ酸をシステインに置換し、結合に適した反応性チオールを生じる、新規な部位特異的システイン置換変異型抗体を提示する。
【００１５】
第１の実施態様において、Ｋａｂａｔに記載のＥＣ指数に従って部位を番号付けした、２７１、２８９、３３７、３４０、３４１、３４３、３６２、４０２、４１３、４１４、４１５、４１９、４３９、４４０、および４４１位のいずれか１つにおいてシステイン置換を有するＦｃ領域を含む、ＩｇＧアイソタイプの変異型抗体が提示される。好ましくは、システイン置換は２７１、３３７、３４０、３４１、３４３、４０２、４１３、４１５、４１９、４３９、４４０、および４４１位のいずれか１つにある。（抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸部位への言及は、Kabat et al．， ‘‘Sequences of proteins of immunological interest，’’ 5th ed．， Pub． No． 91−3242， U．S． Dept． Health ＆ Human Services， NIH， Bethesda， Md．， 1991；以下では「Ｋａｂａｔ」に記載されたＥＵ指数による番号付けを用いる。番号付け自体はＥＵ、ＥＵ／Ｋａｂａｔ、またはＫａｂａｔ番号におけるＥＵといわれる。）
【００１６】
第２の実施態様において、式（ＩＩ）：
【化４】
2019505575.tif 000005
［式中、
Ａｂは本発明の変異型抗体であり、
Ｌはリンカー部位であり、
Ｄは薬物であり、
ｎは１から３０（好ましくは１から５、さらに好ましくは１）の整数であり、
ｍは１、２、３、４、５、または６（好ましくは１または２）であり、
ＡｂはＫａｂａｔに記載のＥＣ指数に従って番号付けした、Ｆｃ領域Ａの２７１、３３７、３４０、３４１、３４３、４０２、４１３、４１５、４１９、４３９、４４０、および４４１位のいずれか１つにおいて、システインを介してＬに結合する。］
で示される抗体薬物結合体が提示される。好ましい実施態様において、ｎは１であり、ｍは１または２である。
【００１７】
リンカーＬは、切断可能または切断可能でない種類のいずれかでありうる。切断可能なリンカーは、標的細胞へのＡＤＣの内在化および、リンカーを切断し薬物Ｄを放出するための、内部に存在する因子または薬剤の機能に依存する。リンカーがペプチド基を含む場合、カテプシン、特にカテプシンＢの１つなどの細胞内酵素によって切断することができる。ペプチド含有リンカーの切断に用いることのできる別の酵素はレグマインである。あるいは、リンカーは標的細胞内で、例えばグルタチオンによるジスルフィド交換によって達成される切断を伴うジスルフィド基を含むことができる。あるいは、リンカーは、ＡＤＣが内在化の後に含まれるリソソームなどの細胞内小器官に存在する低ｐＨ条件において切断することができるヒドラジン基でありうる。
【００１８】
リンカーＬが切断可能でない種類である場合、変異型抗体の分解に依存して薬物Ｄが放出される。そのような場合、リンカーＬは薬物Ｄに結合したままであり、薬物Ｄの生物学的活性に干渉しないように設計されなければならない。
【００１９】
第３の実施態様において、治療上の有効量の前記の抗体薬物結合体を投与することを特徴とする、癌を患っている対象において癌を治療するための方法が提示される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の部位特異的なシステイン変異が生じるＦｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）の位置を含む、抗体の概略的な構造を示す。
【００２１】
【図２】図２は本発明に記載の部位特異的なシステイン置換の位置を強調した、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のコンセンサス配列を示す。
【００２２】
【図３】図３はＣＨ２およびＣＨ３ドメインのリボン図において、部位特異的なシステイン置換の部位を示す。
【００２３】
【図４】図４は２つの異なるペイロードを有するＡＤＣの合成についての直交性化学の応用を概略的に示す。
【００２４】
【図５】図５は、結合体中のＤＡＲの平均値を計算するために用いられるクロマトグラフィートレースを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
抗体は、ジスルフィド結合で相互に結合した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。軽鎖はカッパまたはラムダ型でありうる。重鎖はそれぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）およびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つの領域またはドメインを含む重鎖定常領域を含む。ＣＨ２およびＣＨ３領域は、合わせてＦｃ領域といわれる。ＣＨ２およびＣＨ３領域は、ヒンジ領域といわれるアミノ酸配列によってＣＨ１領域と隔離している。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（軽鎖がラムダまたはカッパのいずれかであるかに応じて、ＶＬまたはＶＫ）および１つの単独ドメインＣＬを含む軽鎖定常領域を含む。ジスルフィド架橋はそれぞれの重鎖とその対の軽鎖、２つの重鎖、およびそれぞれの重鎖中の異なる部位を結合する。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順で配置している。図１は抗体の構造を概略的に示す。可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および、古典経路の補体系の第一因子（Ｃｌｑ）などの宿主組織または因子に対する抗体の結合を仲介しうる。抗体が抗原Ｘに５×１０−８Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは６×１０−９Ｍ以下、より好ましくは３×１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは２×１０−９Ｍ以下で結合する場合、抗体は抗原Ｘに「特異的に結合」すると言われる。抗体はキメラ、ヒト化、または好ましくはヒトでありうる。通常、抗体は重鎖のＮ２９７位でグリコシル化されているが、エフェクター細胞もしくは補体系との相互作用を促進もしくは減少させるため、または他のいくつかの性質を調節するため、グリコシル化の種類または範囲（任意のグリコシル化の除去など）を設計することができる。
【００２６】
ＩｇＧ−ＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３ドメインは一般に、合計２１３個のアミノ酸から成る。これらのアミノ酸のそれぞれは、インビボでの分子のフォールデング、安定性、活性、および寿命に異なる様式で関与する。これらのアミノ酸のどれが、薬物への結合に適切であるＣｙｓ置換（変異）に最も効果的な標的でありうるかを選択するために、残基の安定性、適切なタンパク質のフォールディングへの影響、発現、および安定性などの様々な因子を考慮した。例えば、新たなＣｙｓ残基をタンパク質に導入することによって、天然のＣｙｓ残基と不適切なＳ−Ｓ（ジスルフィド）結合との競合が生じ、誤ってフォールディングされた、または不安定なタンパク質を生じうる。ＣＨ２およびＣＨ３アミノ酸のそれぞれに置換を有するタンパク質を総当たりで発現、精製、性質決定するには、達成するために著しい資源、時間、および専門知識が必要である。２１３個の可能性のトリアージを用いて、その後のさらに集中的な資源を要する段階において、さらに評価を必要とする可能性の数を減少させた。
【００２７】
どのＣＨ２およびＣＨ３アミノ酸のサブセットがＣｙｓ置換に変更可能であるかを効率的に決定するために、分子モデル化および配列解析を最初のスクリーニングとして用いて、生産、精製、結合の評価を行う個々のタンパク質の数を減少させた。ＭＯＥ分子モデル化ツールを用いてモデルを構築し、結晶構造３ＷＪＪ（ＰＤＢ参照コード；以下を参照されたい）のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全ての可能性のあるＣｙｓ変異の構造の統計を集めた。それぞれの可能性のある変異部位を、結合の接近性（２０％より大きい）のための側鎖の十分な表面露出、既知の抗体結合炭化水素、抗体二重鎖、またはＣＤ３２結合領域（４．５オングストローム以内の任意の原子）へ近接していないこと、異常なＳ−Ｓ結合に関与しうる天然のＣｙｓ残基からの距離、および可能性のある原子衝突（潜在的な不安定化）の調査について、天然の構造と比較して評価した。最終的に、Ａ、Ｇ、およびＰｒｏなどの、表面露出解析において大きさが原因で排除されうる天然の残基を、Ｃｙｓ変異部位として可能性のある導入について再調査した。これらの評価を用いて、初めの２１３位は８９個に減少した。全長のＡｂタンパク質のこの数は、さらに発現による評価を行うことが技術的に可能であると考えた。これらの８９個の変異を有する配列を次いで、以下に記載されるように発現し、さらに安定性および／または結合効率について評価し、本発明の特定のＣｙｓ置換部位に到達した。
【００２８】
結晶構造３ＷＪＪはプロテインデータバンク（ＰＤＢ）からダウンロードすることができる。ファイルをダウンロードするためのＵＲＬの末端部分は「rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3wjj」であり、前に「http://www.」を挿入することによって有効なリンクに変換することができる。
【００２９】
図２は、本発明に記載のシステイン置換部位を太字および下線で強調した、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域の定常アミノ酸配列を示す。配列中のアミノ酸は、ＩｇＧ Ｆｃ領域についての慣例であるように、ＥＵ／Ｋａｂａｔ数によって特定した。さらに慣例に従い、置換されて排除される元の（内因性の）アミノ酸、ＥＵ部位の数、および置換して導入されるアミノ酸の順で、Ｐ２７１Ｃ、Ｔ２８９Ｃなどのように列挙することによって、置換を簡潔な形式で表すことができる。注目すべきは、本発明で特定された置換部位のそれぞれは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３においてグルタミン（Ｑ）であるが、ＩｇＧ４においてグルタミン酸（Ｅ）であるＥＵ４１９位以外は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソタイプにわたって保存されている。図３は、３ＷＪＪ結晶構造に基づくリボン図を用いた、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインにおける部位特異的なシステイン置換の位置を示す。
【００３０】
対応するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４ Ｆｃ配列はまた、それぞれ配列番号：１、番号：２、番号：３、および番号：４において提示される。配列番号：１は、図２に強調されるシステイン置換のそれぞれの部位において、MISC_FEATUREの注意書きによって注釈が付けられ、ＥＵ数と配列表番号の関連が示されている。配列番号：２−４はそのような注釈はないが、類似の相関は配列番号：１を参照することによって導き出すことができる。
【００３１】
好ましい実施態様において、本発明の変異型抗体はＥＵ部位の３３７、３４０、３４１、および３４３位の１つにシステイン置換を有する。
【００３２】
別の好ましい実施態様において、本発明の変異型抗体はＥＵ部位の４１３および４１５位の１つにシステイン置換を有する。
【００３３】
さらに別の好ましい実施態様において、本発明の変異型抗体はＥＵ部位の４３９、４４０、および４４１位の１つにシステイン置換を有する。
【００３４】
さらに別の実施態様において、本発明の変異型抗体は２７１、３４０、３４１、３４３、４０２、および４３９位の１つにシステイン置換を有する。そのような部位におけるシステイン置換は、高いＤＡＲおよび／または少ない沈殿を生じる結合を得るのに有利である。
【００３５】
システイン置換部位は、互いの物理的な近さに応じて分類することができる。大まかには、図３のリボン構造によれば、Ｐ２７１およびＴ２８９位は群Ａに分類することができ；Ｓ３３７、Ｋ３４０、Ｇ３４１、Ｐ３４３、およびＧ４０２位は群Ｂに分類することができ；Ｑ３６２、Ｄ４１３、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｑ４１９、Ｋ４３９、Ｓ４４０、およびＬ４４１位は群Ｃに分類することができる。本発明の変異型抗体は、複数のシステイン置換を有することができる。そのような場合、それらの間でのジスルフィド結合形成の可能性を軽減するために、空間的に離れている部位を選択するのが好ましい。例えば、Ｐ２７１Ｃ（群Ａ）およびＫ３４０Ｃ（群Ｂ）の組み合わせは、Ｑ３６２Ｃ（群Ｃ）およびＧ４０２Ｃ（群Ｂ）の組み合わせと同様に好ましい。しかしながら、Ｑ３６２ＣおよびＤ４１３Ｃ（いずれもＣ群）の組み合わせは回避するのが好ましい場合がある。
【００３６】
ある実施態様において、それぞれの変異型抗体の重鎖は１つのシステイン置換を、好ましくはそれぞれの鎖の同じ部位に有する（例えば、いずれもＰ３４３Ｃ置換を有するか、またはいずれもＳ３３７Ｃ置換を有する）。そのような実施態様によって、論理上２のＤＡＲを有するＡＤＣが生じる。別の実施態様において、それぞれの変異型抗体の重鎖は２つのシステイン置換（例えば、それぞれがＰ２７１ＣおよびＫ３４０Ｃ置換を有する）を有し、論理上４のＤＡＲを有するＡＤＣが生じる。それぞれの重鎖がさらに多くのシステイン置換の数を有する、または均一に置換されていない変異型抗体もまた、本発明の範囲内である。
【００３７】
ヒトＩｇＧ抗体は多くのアロタイプにおいて生じる(Jefferis and Lefranc 2009)。例えば、Ｇ１ｍ３アロタイプは、図２に示されるＤ３５６およびＬ３５８の代わりに、ＣＨ３領域においてＥ３５６およびＭ３５８を有する。本発明の範囲は図２に示されるアロタイプに限定されない。むしろ、本明細書に教示されるシステイン置換を有するが、他のアロタイプであるヒトＩｇＧ抗体もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００３８】
本発明の変異型抗体は、任意のＩｇＧアイソタイプでありうるが、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプであり、さらに好ましくはＩｇＧ１アイソタイプである。抗体はキメラ、ヒト化、または好ましくはヒトでありうる。さらに好ましくは、抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの、最も好ましくは、ＩｇＧ１アイソタイプのヒトモノクローナル抗体である。
【００３９】
抗体が遺伝子組み換えによって生産される場合、重鎖のＣ末端鎖のリシン残基（図２における４４７位のアミノ酸）のいくつかは、しばしば宿主細胞での生産からの発現または酵素による精製ステップの間で除去されており、不均一な生成物を生じる（いずれのリシンも存在する、１つのリシンが除去されている、またはいずれのリシンも除去されている）。この不均一性は望ましくない。より均一な生成物を得るためには、初期生成物をさらに酵素処理するか、または組み換え発現に用いるヌクレオチド配列から重鎖のＣ末端のリシンのコドンを除去することによって、両方のリシンを意図的に除去することができる。McDonough et al．1992．重鎖のＣ末端のリシン残基を欠いた、本開示のシステイン置換を有する変位型抗体もまた、本発明の範囲内である。Ｃ末端のグリシンおよびリシンのいずれも除去された変異型抗体もまた既知であり、本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
本発明の変異型抗体は、本開示のシステイン置換に加えて、これらに限定されないが、以下に記載されるものなどの、天然型に対する他の種類の改変を有することができる。
【００４１】
ＩｇＧアイソタイプの抗体は、アスパラギン２９７（Ｎ２９７）においてグリコシル化部位を有する。グリコシド基の存在によって、抗体上のいくつかのアミノ酸へのアクセスが阻害されうる。よく知られた例において、抗体がＮ２９７でグリコシル化されている場合、グルタミン２９５（Ｑ２９５）はトランスグルタミナーゼ酵素のアミン受容体基質ではないが、酵素によって脱グリコシル化されることによって、Ｑ２９５はトランスグルタミナーゼの基質として利用可能になる(Jeger et al. 2010)。同様に、本発明に記載されるいくつかのシステイン置換部位は、一部のみであってもグリコシル基によって立体的に遮蔽されうる。そのような例において、グリコシル基の除去によって、それらはさらに結合に利用可能になりうる。脱グリコシル化は、グリコシド基を除去するＰＮＧａｓｅ Ｆ（ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ）などの酵素処理を用いた翻訳後の処理によって、またはＮ２９７Ａなどの部位特異的な置換によってＮ２９７のグリコシド化を除去することによって達成することができる。グリコシル基全体を除去する代わりに、その１つ以上の糖のユニットを除去することで立体的なかさ高さを変化させることによって、同様の効果が得られうる。
【００４２】
部位特異的な結合のための本発明の方法は、他の部位特異的な方法と組み合わせて、複数の直交性結合化学を作り出し、２つの異なる薬物を所定の相対量で送達する結合体の製造を可能にすることができる。他の部位特異的な結合方法は、直交性を作り出すために、システインのチオール以外の化学に関するものであるべきである。この概念を、直交性結合化学の例としてトランスグルタミナーゼ介在結合を用いて、図４に図示する。図示された抗体は重鎖に、トランスグルタミナーゼのアミン受容体として働くことができるグルタミン（Ｑ）と、本発明に記載されるシステイン置換（Ｃ）を有する。トランスグルタミナーゼによって触媒されるグルタミンとアミンドナーＨ２Ｎ−Ｌ１−Ｄ１［式中、Ｌ１は第一リンカー部位であり、Ｄ１は第一薬物である。］との結合によって結合が達成され、第一薬物Ｄ１を送達する中間体ＡＤＣが生じる。その後のマレイミド薬物リンカー化合物：
【化５】
2019505575.tif 000006
［式中、Ｌ２は第二リンカー部位であり、Ｄ２は薬物Ｄ１とは異なる第二薬物である。］
との結合によって結合が達成され、２つの異なる薬物、Ｄ１およびＤ２を送達する最終的なＡＤＣが生じる。（結合ステップの順番を逆にすることができることが当業者には理解される。）そのようなＡＤＣは特に、２つの異なる薬物が癌を同時に攻撃するために用いられる、組み合わせ治療に望ましい。
【００４３】
図４に図示される、トランスグルタミナーゼ介在結合は直接的または１ステップの方法である。あるいは、Innate Pharma 2013に開示されるように、間接的または２ステップの方法を用いることができる。
【００４４】
用いられる直交性結合化学は、トランスグルタミナーゼの結合に限定されない。さらに別の結合技術は、抗体に非天然アミノ酸を導入することを含み、非天然アミノ酸は直交性結合化学のための機能を提供する。非天然アミノ酸は、Tian et al., WO 2008/030612 A2 (2008)において教示されるように、組み換え発現によって抗体を生産するために用いられるヌクレオチド配列の設計によって導入することができる。非天然アミノ酸はまた、Goerke et al., US 2010／0093024 A1 (2010) および Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400−416に教示されるように、無細胞法を用いて、抗体または他のポリペプチドに導入することができる。非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンが導入されている場合、直交性結合化学はＮＨ２基を有するリンカー薬物化合物とのオキシム形成でありうる。非天然アミノ酸ｐ−アジドフェニルアラニンが導入されている場合、直交性結合化学は、アジド基がリンカー薬物化合物上のシクロオクチン基と反応して、１，２，３−トリアゾール環を形成する、「クリックケミストリー」でありうる(Agard et al．， J． Amer． Chem． Soc． 2004， 126， 15046； Best， Biochemistry 2009， 48， 6571)。
【００４５】
直交性結合化学はまた、変異型抗体のグリコシル基の適切な修飾によっても達成することができる。ある方法では、Zhu et al．， mAbs 2014， 6， 1において教示されるように、ケト基をグリコシル基に導入して、オキシム形成の結合部位として機能させる。別の糖鎖工学のバリエーションにおいて、抗体のグリコシル基を修飾して、「クリックケミストリー」による結合のためのアジド基を導入することができる。Huang et al．， J． Am． Chem． Soc． 2012， 134， 12308 および Wang， US 8，900，826 B2 (2014) および US 7，807，405 B2 (2010)を参照されたい。
【００４６】
前記のシステイン置換に加えて、本発明の変異型抗体はさらに、他のアミノ酸部位において保存的置換を有することができる。そのような保存的に変更されたバージョンは本発明の範囲内である。「保存的な変更」または「保存的な置換」は、抗体に関しては、そのアミノ酸が、類似の側鎖を有する他のアミノ酸で置き換えられていることを意味する。同様の側鎖を有するアミノ酸群は当技術分野において既知である。そのような群としては、塩基性側鎖（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシン）、小さな側鎖（グリシン、アラニン、セリン）、鎖配向変化性側鎖（グリシン、プロリン）および芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸が挙げられる。複数の保存的置換／変更が存在しうる。好ましくは、保存的置換が存在する場合、それらは１から３個の間である。
【００４７】
本発明に記載されるように、システイン置換することのできる抗体としては、以下の抗原を認識するものが挙げられる：メソテリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４（Ｏ８Ｅとしても知られている）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、グリピカン−３、ＲＧ１、フコシル−ＧＭ１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ４４。抗体は動物（例えば、マウス）、キメラ、ヒト化、または好ましくはヒトでありうる。抗体は好ましくはモノクローナル、特にヒトモノクローナル抗体である。前記の抗原のいくつかに対するヒトモノクローナル抗体の製造は、Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，６０９，８１６ Ｂ２ （２０１３；Ｂ７Ｈ４，０８Ｅとしても知られている；特に、抗体２Ａ７，１Ｇ１１，および２Ｆ９）；Ｒａｏ−Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．， ８，０９７，７０３ Ｂ２ （２０１２；ＣＤ１９；特に、抗体５Ｇ７，１３Ｆ１，４６Ｅ８，２１Ｄ４，２１Ｄ４ａ，４７Ｇ４，２７Ｆ３，および３Ｃ１０）； Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，４８１，６８３ Ｂ２ （２０１３；ＣＤ２２； 特に、抗体１２Ｃ５，１９Ａ３，１６Ｆ７，および２３Ｃ６）；Ｋｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ７，３８７，７７６ Ｂ２ （２００８；ＣＤ３０；特に、抗体５Ｆ１１，２Ｈ９，および１７Ｇ１）；Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，１２４，７３８ Ｂ２（２０１２；ＣＤ７０；特に、抗体２Ｈ５，１０Ｂ４，８Ｂ５，１８Ｅ７，および６９Ａ７）；Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ６，９８４，７２０ Ｂ１ （２００６；ＣＴＬＡ−４；特に、抗体１０Ｄ１，４Ｂ６，および１Ｅ２）；Ｖｉｓｔｉｃａ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，３８３，１１８ Ｂ２ （２０１３，フコシル−ＧＭ１，特に、抗体５Ｂ１，５Ｂ１ａ，７Ｄ４，７Ｅ４，１３Ｂ８，および１８Ｄ５） Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，００８，４４９ Ｂ２ （２０１１；ＰＤ−１；特に、抗体１７Ｄ８，２Ｄ３，４Ｈ１，５Ｃ４，４Ａ１１，７Ｄ３，および５Ｆ４）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ２００９／０２９７４３８ Ａ１ （２００９；ＰＳＭＡ．特に、抗体１Ｃ３，２Ａ１０，２Ｆ５，２Ｃ６）；Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ７，８７５，２７８ Ｂ２ （２０１１；ＰＳＭＡ；特に、抗体４Ａ３，７Ｆ１２，８Ｃ１２，８Ａ１１，１６Ｆ９，２Ａ１０，２Ｃ６，２Ｆ５，および１Ｃ３）；Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，２２２，３７５ Ｂ２ （２０１２；ＰＴＫ７；特に、抗体３Ｇ８，４Ｄ５，１２Ｃ６，１２Ｃ６ａ，および７Ｃ８）；Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，６８０，２４７ Ｂ２ （２０１４；グリピカン−３；特に、抗体４Ａ６，１１Ｅ７，および１６Ｄ１０）；Ｈａｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ７，３３５，７４８ Ｂ２（２００８；ＲＧ１；特に、抗体Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＤ）；Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，２６８，９７０ Ｂ２ （２０１２；メソテリン；特に、抗体３Ｃ１０，６Ａ４，および７Ｂ１）； Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ２０１０／００９２４８４ Ａ１ （２０１０；ＣＤ４４；特に、抗体１４Ｇ９．Ｂ８．Ｂ４， ２Ｄ１．Ａ３．Ｄ１２，および１Ａ９．Ａ６．Ｂ９）； Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，２５��，２６６ Ｂ２ （２０１２；ＩＰ１０；特に、抗体１Ｄ４，１Ｅ１，２Ｇ１，３Ｃ４，６Ａ５，６Ａ８，７Ｃ１０，８Ｆ６，１０Ａ１２，１０Ａ１２Ｓ，および１３Ｃ４）； Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ８，４５０，４６４ Ｂ２ （２０１３；ＣＸＣＲ４；特に、抗体Ｆ７，Ｆ９，Ｄ１，およびＥ２）；並びに、Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ ７，９４３，７４３ Ｂ２ （２０１１；ＰＤ−Ｌ１；特に、抗体３Ｇ１０，１２Ａ４，１０Ａ５，５Ｆ８，１０Ｈ１０，１Ｂ１２，７Ｈ１，１１Ｅ６，１２Ｂ７，および１３Ｇ４）において開示され；これらの開示は引用によって本明細書に援用される。
【００４８】
以下に繰り返される式（ＩＩ）における下付文字ｎは、リンカーに結合する薬物Ｄの数を示す。しばしば、承認されたＡＤＣのＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）、ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）、およびＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）によって例示されるように、１つの薬物Ｄがそれぞれのリンカーに結合する、すなわちｎは１である。しかしながら、複数の薬物Ｄが単一のリンカーに結合するように分岐リンカーを用いることができる（すなわち、ｎは１より大きい）。分岐リンカーの例としては、King et al． 2004 および Yurkovetsky 2015を参照されたい。
【化６】
2019505575.tif 000007
【００４９】
本発明の変異型抗体の結合に用いるための薬物（治療剤）は一般に、標的細胞を死滅させることのできる細胞毒性剤である。例として、以下の種類の化合物、およびそれらの類似体、および誘導体が挙げられる：
（ａ）カリケアマイシン（例えば、Lee et al．， J． Am． Chem． Soc． 1987， 109， 3464 and 3466を参照されたい）およびウンシアラマイシン（例えば、Davies et al．， WO 2007／038868 A2 (2007)； Chowdari et al．， US 8，709，431 B2 (2012)；および Nicolaou et al．，WO 2015／023879 A1 (2015)を参照されたい）などのエンジイン；
（ｂ）ツブリシン（例えば、Domling et al．， US 7，778，814 B2 (2010)； Cheng et al．， US 8，394，922 B2 (2013)； および Cong et al．， US 8，980，824 B2 (2015)を参照されたい）；
（ｃ）ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンの類似体（例えば、Boger， US 6，5458，530 B1 (2003)； Sufi et al．， US 8，461，117 B2 (2013)；および Zhang et al．， US 8，852，599 B2 (2014)を参照されたい）などのＤＮＡアルキル化剤；
（ｄ）エポチロン類（例えば、Vite et al．， US 2007／0275904 A1 (2007) および US RE42930 E (2011)を参照されたい）；
（ｅ）オーリスタチン（例えば、Senter et al．，US 6，844，869 B2 (2005) および Doronina et al．，US 7，498，298 B2 (2009)を参照されたい）；
（ｆ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体（例えば、Howard et al．， US 2013／0059800 A1(2013)； US 2013／0028919 A1 (2013)；および WO 2013／041606 A1 (2013)を参照されたい）；並びに
（ｇ）ＤＭ１およびＤＭ４（例えば、Chari et al．， US 5,208,020 (1993) および Amphlett et al．， US 7，374，762 B2 (2008)を参照されたい）などのメイタンシノイド。
【００５０】
好ましくは、薬物は、
【化７】
2019505575.tif 000008
【化８】
2019505575.tif 000009
などのＤＮＡアルキル化剤、ツブリシン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、エンジイン、またはメイタンシノイド化合物である。
【００５１】
結合が達成される官能基は、前記の最初の５つの薬物の場合にはアミン（−ＮＨ２）基であり、最後の２つの薬物の場合にはメチルアミン（−ＮＨＭｅ）基である。
【００５２】
抗体に薬物を結合させるため、リンカー基が必要である。薬物をリンカーと組み合わせて、リンカー薬物化合物を生成し、これを次いでアドネクチンに結合させる。そのため、抗体薬物結合体は、本発明の変異型抗体を、リンカーがマレイミド基であるリンカー薬物化合物と反応させることによって製造することができる。
【００５３】
好ましいリンカー化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化９】
2019505575.tif 000010
［式中、
Ｄは薬物であり；
Ｔは自己犠牲基であり；
ｔは０または１であり；
ＡＡａおよびそれぞれのＡＡｂは独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから成る群から選択され；
ｐは１、２、３、または４であり；
ｕは０または１であり
ｑは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｒは１、２、３、４、または５であり；
ｓは０または１である。］
で表すことができる。
【００５４】
式ＩＩにおいて、−ＡＡａ−[ＡＡｂ]p−は、長さがｐの値によって決定されるポリペプチドを表す（ｐが１の場合、ジペプチド、ｐが３の場合、テトラペプチドなど）。ＡＡａはポリペプチドのカルボキシ末端にあり、そのカルボキシ基は薬物Ｄ（または存在する場合、自己犠牲基Ｔ）のアミン窒素とペプチド（アミド）結合を形成する。逆に、最後のＡＡｂはポリペプチドのアミノ末端であり、そのα−アミノ基はｓが１であるか、または０であるかによって、それぞれ
【化１０】
2019505575.tif 000011
とペプチド結合を形成する。好ましいポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、およびＡｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｉｔであり、Ｈ２Ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ２Ｈのように、従来のＮからＣの方向で記載する。さらに好ましくは、ポリペプチドはＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、またはＶａｌ−Ａｌａである。好ましくは、ポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、標的（癌）細胞内に存在する酵素、例えばカテプシン、および特にカテプシンＢによって切断可能である。
【００５５】
下付文字ｓが１である場合、薬物リンカー（Ｉ）は、薬物リンカー（Ｉ）の溶解度を有利に向上させ、水性溶媒中で行われるステップである、抗体への結合を促進させることのできる、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基を含む。また、ＰＥＧ基は抗体とペプチドＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−とのスペーサーとしても働くことができるため、抗体の大部分はペプチド切断酵素の作用に立体的に干渉しない。
【００５６】
下付文字ｔが０または１であることによって示されるように、自己犠牲基Ｔは適宜存在する。自己犠牲基はＡＡａまたはＡＡｂから切断可能なものであり、場合によっては、連続する反応を開始させることによって、自己犠牲基を薬物Ｄから切り離し、後者を遊離させ、その治療的機能を発揮させる。存在する場合、自己犠牲基Ｔは好ましくは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）基であり、その構造は以下：
【化１１】
2019505575.tif 000012
［式中、アスタリスク（＊）は薬物Ｄのアミン窒素に結合したＰＡＢＣの末端を示し、破線
【化１２】
2019505575.tif 000013
はポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−に結合した末端を示す。］
に示す。
【００５７】
用いることのできる他の自己犠牲基は置換チアゾールであり、これはFeng， US 7,375,078 B2 (2008)に開示される。
【００５８】
下付文字ｕが０である場合、リンカーはポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−または自己犠牲基Ｔのいずれかを含まず、切断可能でない種類のものである。
【００５９】
式（ＩＩＩ）におけるマレイミド基は、前記のようにマイケル付加反応を介して、抗体中の反応性チオール基に結合するための反応性官能基として働く。マレイミドと本発明の変異型抗体中のシステインチオールとを介した結合によって、式（ＩＶ）：
【化１３】
2019505575.tif 000014
［式中、
Ａｂは、２７１、３３７、３４０、３４１、３４３、４０２、４１３、４１５、４１９、４３９、４４０、および４４１位の１つにシステイン置換を有するＦｃ領域を含む、ＩｇＧアイソタイプの変異型抗体であり、部位の番号付けはＫａｂａｔに記載されるＥＵ指数に従って行い；
Ｄは薬物であり；
Ｔは自己犠牲基であり；
ｔは０または１であり；
ＡＡａおよびそれぞれのＡＡｂは独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから成る群から選択され；
ｐは１、２、３、または４であり；
ｕは０または１であり；
ｑは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｒは１、２、３、４、または５であり；
ｓは０または１であり
ｍは１、２、３、４、５、または６（好ましくは１または２）である。］
に記載の抗体薬物結合体を生じる。
【００６０】
抗体Ａｂは置換導入されたシステイン（ＥＵ２７１、３３７、３４０、３４１、３４３、４０２、４１３、４１５、４１９、４３９、４４０、または４４１）のチオール基を介して、マレイミド二重結合にチオールが付加することによってリンカー薬物化合物に結合する。置換導入されたシステインのそれぞれにおける遊離のチオール基（重鎖ごとに１つ）がマレイミド基リンカーと反応する場合、添え字ｍは２である。場合によっては、チオール基の１つのみが反応し、１つのリンカー薬物部位のみが結合した、すなわちｍが１である抗体薬物結合体を生じる。
【００６１】
本発明の実施は、以下の実施例を参照することによってさらに理解することができ、それらは例示のために提示され、限定するものではない。
【００６２】
実施例１−変異型抗体の合成
本発明のシステイン置換を有する変異型抗体は、ＭＳＮ−Ａとして設計された抗メソテリン抗体および／またはＣＤ７０−Ａとして設計された抗ＣＤ７０抗体を用いて合成する。抗体ＭＳＮ−Ａの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：５および配列番号：６に示される。抗体ＣＤ７０−Ａの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：７および配列番号：８に示される。
【００６３】
ＭＳＮ−ＡおよびＣＤ７０−ＡのＶＨおよびＶＫフラグメントは、ＩｇＧ１抗体の発現の定常領域を含む、様々な哺乳動物の発現ベクターにクローン化した。これらの発現ベクターはまた、抗体産生のための安定な遺伝子導入を可能にするために、ピューロマイシンまたはネオマイシン耐性遺伝子を含む。さらに、これらの発現ベクターは重鎖のＣＨ３ドメインの後にイントロンおよび膜貫通ドメインを含む、哺乳類ディスプレイベクターを含み、可溶性および表面結合性抗体発現の両方を、同じ遺伝子導入細胞から同時に発現することが可能になる。
【００６４】
重鎖ＣＨ２およびＣＨ３における初期セット８９Ｃｙｓ置換を、前記のように、それらの３Ｄ構造に基づいて選択した。これらのＣｙｓ変異を含むＤＮＡフラグメントを合成し、前記の哺乳動物発現ベクターをクローニングして、野生型フラグメントを置き換えた。これらの構築物をクローニングする分子は、インフュージョンクローニング技術またはＤＮＡライゲーション、および大腸菌形質転換により得た。これらのＣｙｓ置換を有する構築物はサンガー法を用いたＤＮＡシーケンシングによって確認した。
【００６５】
これらの構築物はＣＨＯ−Ｓ細胞に遺伝子導入され、安定なプールまたはクローンをピューロマイシンおよび／またはネオマイシンを補充した培地で発生させた。異なるＣｙｓ変異を有する変異型抗体の発現のための哺乳動物ディスプレイベクターによって遺伝子導入した安定なプールを、ＦＡＣＳ試験において、ＰＥ結合抗ヒトカッパおよびＡＰＣ結合ＣＤ６４で染色した。さらなる研究のために、ＣＤ６４結合を保持し、十分に発現され、プロテインＡによって精製されうる変異体を選択した。
【００６６】
実施例２−変異型抗体の結合
以下の方法は一般に、本発明の変異型抗体の結合のために用いることができる。
【００６７】
変異型抗体はＣＨＯ細胞中で発現され、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。精製した抗体を次いで、緩衝水溶液（ｐＨ７−９）中で過剰（１０−１００モル当量）の還元剤ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で、３７℃で０．５−３時間処理した。ＴＣＥＰは、還元した変異型抗体をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通すことによって除去した。精製した還元抗体を次いで、緩衝水溶液中（ｐＨ４−９）で、ＣｕＳＯ４（硫酸銅（ＩＩ））、ｄｈＡＡ（デヒドロアスコルビン酸）、空気、Ｈ２Ｏ２（過酸化水素）、Ｎ−ＣＳ（Ｎ−クロロスクシンイミド）、またはＯ２（酸素分子）などのジスルフィド形成試薬の過剰量（１０−１００モル当量）で、４−３７℃で０．５−２４時間にわたって処理した。再酸化された抗体を、イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーのいずれかで精製した。抗体に対する遊離のチオールの比を、２８０ｎｍにおけるタンパク質溶液の吸光度からタンパク質濃度を、およびタンパク質とＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、エルマン試薬）との反応からチオール濃度を決定することによって推定した。
【００６８】
前記の還元および酸化の後、緩衝水溶液（ｐＨ７−１０）中の抗体を、システイン反応性官能基（マレイミド、ヨードアセトアミドまたは同様の反応性）を含む、１から１０モル当量の薬物リンカーで処理した。薬物リンカーは一般に、有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＡなど）に溶解され、これを反応混合物にも加えた。反応を４−３７℃で１−４時間進行させた。その後、抗体薬物結合体を、イオン交換、サイズ排除、プロテインＡまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー、または複数の種類のクロマトグラフィーの組み合わせによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＨＩＣ、およびマススペクトロメトリーなどの分析試験を行って、設計した部位における薬物リンカーの結合を確認した。
【００６９】
実施例３−結合特性
一般に以下：
【化１４】
2019505575.tif 000015
に示されるような構造を有する薬物成分のように、ツブリシン類似体を有するマレイミド末端リンカー（例えば、Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013) および Cong et al., US 8,980,824 B2 (2013)参照されたい）を用いて、前記の方法に従って結合体を合成した。
【００７０】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用い、ピーク面積を積分することによって、結合体をその平均ＤＡＲについて解析した。Ｇ３４１Ｃ置換を有する抗体についての代表的なクロマトグラフィートレースを図５に示す。平均的なＤＡＲは統計的な平均値であり、個々の抗体分子は０、１、または２のＤＡＲ値を有しうることが当業者には理解される。結果を表Ｉに示す。
【表１】
2019505575.tif 000016
【００７１】
実施例４
前記の実施例に記載の、Ｐ３４３Ｃ置換を有する抗体ＭＳＮ−Ａと抗体ツブリシン類似体／リンカー化合物との結合体の合成を、ヒト胃癌（Ｎ８７）およびヒト中皮腫（Ｈ２２６）癌細胞に対してインビトロ試験した。３Ｈチミジン取り込みアッセイを用いた（Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013)）。ＥＣ５０値は、Ｎ８７細胞に対して０．５５ｎＭであり、Ｈ２２６細胞に対して０．３０ｎＭであった。
【００７２】
前記の本発明の詳細な説明は、本発明の特定の部分または局面と、主にまたは排他的に関係する節を含む。これは、ある特定の特徴が、開示された節の他にも関連しうること、および本明細書の開示は異なる節に存在する情報の全ての適切な組み合わせを含むことの明確化および簡潔化のためであることが当然理解される。同様に、本明細書の様々な図および記載は本発明の特定の実施態様に関連するが、具体的な特徴が特定の図または実施態様の文脈において開示されている場合、他の図または実施態様の文脈において、他の特徴と組み合わせて、または一般に本発明において、適切な範囲でそのような特徴をまた用いることができることが理解される。
【００７３】
さらに、本発明はいくつかの好ましい実施態様の観点において特に記述されているが、本発明はそれらの好ましい実施態様に限定されない。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。
【００７４】
参考文献
第一著者（または発明者）によって簡潔に引用された以下の参考文献、および本明細書よりも早い日付の全ての引用が以下に示される。これらの参考文献のそれぞれは、あらゆる目的のために参照によって本明細書に援用される。
【００７５】
Bhakta et al., US 2016/0130358 A1 (2016).
【００７６】
Chamberlain et al., US 2006/0173170 A1 (2006).
【００７７】
Chamberlain et al., EP 1817340 B1 (2012).
【００７８】
Christie et al., WO 2016/054315 A1 (2015).
【００７９】
Eigenbrot et al., US 7,521,541 B2 (2009).
【００８０】
Gao et al., WO 2015/157595 A1 (2015).
【００８１】
Geierstanger et al., WO 2015/138615 A2 (2015).
【００８２】
Geierstanger et al., US 2016/0067351 A1 (2016).
【００８３】
Hansen et al., US 2011/0123440 A1 (2011).
【００８４】
Innate Pharma, ‘‘A New Site Specific Antibody Conjugation Using Bacterial Transglutaminase,’’ presentation at ADC Summit, San Fransisco, California, Oct. 15, 2013.
【００８５】
Jefferis and Lefranc, mAbs 2009, 1 (4), 1.
【００８６】
Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995.
【００８７】
Junutula et al., Nature Biotechnol. 2008, 26 (8), 925.
【００８８】
Junutula et al., US 7723485 B2 (2010).
【００８９】
King et al., US 6,759,509 B1 (2004).
【００９０】
Lazar et al., US 2007/0237765 A1 (2007).
【００９１】
Lazar et al., WO 2008/092117 A2 (2008).
【００９２】
Lazar et al., US 2009/0010920 A1 (2009).
【００９３】
Lloyd et al., US 2015/155345 A1 (2015).
【００９４】
Marquette et al., US 2016/0008485 A1 (2016).
【００９５】
McDonagh et al., US 8,455,622 B2 (2013).
【００９６】
McDonough et al., US 5,126,250 (1992).
【００９７】
Merchant et al., Nature Biotechnol. 1998, 16, 677.
【００９８】
Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147.
【００９９】
Shen et al., Nature Biotechnol. 2012, 30 (2), 184.
【０１００】
Sondermann et al., US 2007/0111281 A1 (2007).
【０１０１】
Stimmel et al., J. Biol. Chem. 2000, 275 (39), 30445.
【０１０２】
Yurkovetsly, US 2015/0306240 A1 (2015).
【０１０３】
配列表
【表２】
2019505575.tif 000017
【図１】
2019505575.tif 000021
【図２】
2019505575.tif 000022
【図３】
2019505575.tif 000023
【図４】
2019505575.tif 000024
【図５】
2019505575.tif 000025
【配列表】
2019505575000001.app
【国際調査報告】
2019505575.tif 000026
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