(57)【要約】  リパーゼ酵素、並びに焼成産物（baked product）の体積、安定性、耐性を改善するために焼成（baking）において該リパーゼを使用する、並びに／又はDATEMを減少させる、及びDATEMの使用を減少させる若しくは除去する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)生地を提供すること；
(b)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるリパーゼを提供すること；
(c) (b)のリパーゼを(a)の生地と組み合わせて、この組み合わせ物を焼成して増加した体積を有する焼成産物を生成すること
を含む、焼成産物の体積を増加させる方法。
【請求項２】
前記生地が粉、食塩、水及び酵母を含む組成物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記粉が、アーモンド粉、ココナッツ粉、チアフラワー、コーンフラワー、大麦粉、スペルト粉、大豆粉、麻粉（hemp flour）、ジャガイモ粉、キノア、テフ粉、ライ麦粉、アマランサ粉、葛粉（arrowroot flour）、ヒヨコマメ（ガルバンゾ）粉、カシュー粉、フラックスミール、マカダミア粉、キビ粉、ソルガム粉、米粉、タピオカ粉及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記酵母が、パン酵母、クリーム酵母、圧搾酵母、固形酵母（cake yeast）、活性乾燥酵母、インスタント酵母、耐浸透圧性酵母、急速酵母、不活性化酵母、栄養酵母、ビール酵母、蒸留及びワイン酵母からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記リパーゼがバリアントポリペプチドであり、該バリアントポリペプチドは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11のアミノ酸配列に示されるポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％同一であり、且つ該バリアントポリペプチドはリパーゼ活性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記リパーゼが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12の核酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされるポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第2の酵素の追加をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記第2の酵素が、第2のリパーゼ、アルファ-アミラーゼ；グルカン1,4-アルファ-マルトテトラオヒドロラーゼ；エクソ-マルトテトラオヒドロラーゼ；G4-アミラーゼ；グルカン1,4-アルファ-マルトヒドロラーゼ；マルトジェニックアルファ-アミラ-ゼ；シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；CGTase；グルコアミラーゼ；エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ；キシラナーゼ；セルラーゼ；酸化還元酵素；ホスホリパーゼA1；ホスホリパーゼA2；ホスホリパーゼC；ホスホリパーゼD；ガラクトリパーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アラビノフラノシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、プロテアーゼ又はその任意の組み合わせを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記リパーゼがpH4.0〜pH12.0の範囲で活性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記リパーゼが20℃〜60℃の温度範囲で活性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
(a)生地を提供すること；
(b)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるリパーゼを提供すること；
(c) DATEMを添加しないで(b)のリパーゼを(a)の生地と組み合わせて、この組み合わせ物を焼成して増加した体積を有する焼成産物を生成すること
を含む、DATEMを添加しないで焼成産物の体積を増加させる方法。
【請求項１２】
前記生地が粉、食塩、水及び酵母を含む組成物である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記粉が、アーモンド粉、ココナッツ粉、チアフラワー、コーンフラワー、大麦粉、スペルト粉、大豆粉、麻粉(hemp flour)、ジャガイモ粉、キノア、テフ粉、ライ麦粉、アマランサ粉、葛粉（arrowroot flour）、ヒヨコマメ（ガルバンゾ）粉、カシュー粉、フラックスミール、マカダミア粉、キビ粉、ソルガム粉、米粉、タピオカ粉及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記酵母が、パン酵母、クリーム酵母、圧搾酵母、固形酵母（cake yeast）、活性乾燥酵母、インスタント酵母、耐浸透圧性酵母、急速酵母、不活性化酵母、栄養酵母、ビール酵母、蒸留及びワイン酵母からなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記リパーゼが、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記リパーゼがバリアントポリペプチドであり、該バリアントポリペプチドは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％同一であり、且つ該バリアントポリペプチドはリパーゼ活性を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記リパーゼが、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされるポリペプチドである、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
第2の酵素の追加をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
前記第2の酵素が、第2のリパーゼ、アルファ-アミラーゼ；グルカン1,4-アルファ-マルトテトラオヒドロラーゼ；エクソ-マルトテトラオヒドロラーゼ；G4-アミラーゼ；グルカン1,4-アルファ-マルトヒドロラーゼ；マルトジェニックアルファ-アミラ-ゼ；シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；CGTase；グルコアミラーゼ；エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ；キシラナーゼ；セルラーゼ；酸化還元酵素；ホスホリパーゼA1；ホスホリパーゼA2；ホスホリパーゼC；ホスホリパーゼD；ガラクトリパーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アラビノフラノシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、プロテアーゼ又はその任意の組み合わせを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記リパーゼがpH4.0〜pH12.0の範囲で活性を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項２１】
前記リパーゼが20℃〜60℃の温度範囲で活性を有する、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベーキングリパーゼに関する。
【０００２】
配列表
本出願は、以下に同定されるASC IIテキスト（.txt）ファイルにおけるコンピュータが読み取り可能な形式（CRF）のアミノ酸配列表を含み、そのすべてをあらゆる目的のために本願明細書中に参照によって組み込む。
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【背景技術】
【０００３】
パン（bread）は数千年の間ヒトの栄養の食糧であった。パンは通常、粉（小麦粉）、水、食塩、酵母、及び／又は他の食品添加物を組み合わせて生地又はペーストを作ることによって作られ；次に生地を焼成（bake）してパンを作る。酵素の焼成（baking）過程に対する効果は、代替の化学物質に類似し得るか又は代替の化学物質よりも良いものであり得るため、酵素は焼成において有用であることが公知である。数種類の異なる酵素をパン作りのために使用することができて、例えばリパーゼはパンの安定性及び体積を改善することが公知である。しかし、当業界は、体積、安定性、耐性を改善し、添加物であるモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（DATEM）を減少させるか又は除去するリパーゼを依然として必要とする。本開示は、これらの産業上の必要性を満たす又は超えるリパーゼに対して向けられている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施形態は、(a)生地を提供すること；(b)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるリパーゼを提供すること；(c) (b)のリパーゼを(a)の生地と組み合わせて、この組み合わせ物を焼成して増加した体積を有する焼成産物を生成することを含む、焼成産物の体積を増加させる方法である。
【０００５】
別の実施形態では、前記生地は粉（小麦粉）、食塩、水及び酵母を含む組成物である。
【０００６】
別の実施形態では、前記粉は、アーモンド粉、ココナッツ粉、チアフラワー、コーンフラワー、大麦粉、スペルト粉、大豆粉、麻粉(hemp flour)、ジャガイモ粉、キノア、テフ粉、ライ麦粉、アマランサ粉、葛粉（arrowroot flour）、ヒヨコマメ（ガルバンゾ）粉、カシュー粉、フラックスミール、マカダミア粉、キビ粉、ソルガム粉、米粉、タピオカ粉及びその任意の組み合わせからなる群より選択される。
【０００７】
別の実施形態では、前記酵母は、パン酵母、クリーム酵母、圧搾酵母、固形酵母（cake yeast）、活性乾燥酵母、インスタント酵母、耐浸透圧性酵母、急速酵母、不活性化酵母、栄養酵母、ビール酵母、蒸留及びワイン酵母からなる群より選択される。
【０００８】
別の実施形態では、前記リパーゼはバリアントポリペプチドであり、該バリアントポリペプチドは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11のアミノ酸配列に示されるポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％同一であり、且つ該バリアントポリペプチドはリパーゼ活性を有する。
【０００９】
別の実施形態では、前記リパーゼは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12の核酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされるポリペプチドである。
【００１０】
別の実施形態では、第2の酵素の追加をさらに含む。さらなる実施形態では、前記第2の酵素は、第2のリパーゼ、アルファ-アミラーゼ；グルカン1,4-アルファ-マルトテトラオヒドロラーゼ；エクソ-マルトテトラオヒドロラーゼ；G4-アミラーゼ；グルカン1,4-アルファ-マルトヒドロラーゼ；マルトジェニックアルファ-アミラ-ゼ；シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；CGTase；グルコアミラーゼ；エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ；キシラナーゼ；セルラーゼ；酸化還元酵素；ホスホリパーゼA1；ホスホリパーゼA2；ホスホリパーゼC；ホスホリパーゼD；ガラクトリパーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アラビノフラノシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、プロテアーゼ又はその任意の組み合わせを含む。
【００１１】
別の実施形態では、前記リパーゼはpH4.0〜pH12.0の範囲で活性を有する。
【００１２】
別の実施形態では、前記リパーゼは20℃〜60℃の温度範囲で活性を有する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、(a)生地を提供すること；(b)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9又は配列番号11のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるリパーゼを提供すること；(c) DATEMを添加しないで(b)のリパーゼを(a)の生地と組み合わせて、この組み合わせ物を焼成して増加した体積を有する焼成産物を生成することを含む、DATEMを添加しないで焼成産物の体積を増加させる方法である。
【００１４】
別の実施形態では、前記生地は粉（小麦粉）、食塩、水及び酵母を含む組成物である。
【００１５】
別の実施形態では、前記粉は、アーモンド粉、ココナッツ粉、チアフラワー、コーンフラワー、大麦粉、スペルト粉、大豆粉、麻粉(hemp flour)、ジャガイモ粉、キノア、テフ粉、ライ麦粉、アマランサ粉、葛粉（arrowroot flour）、ヒヨコマメ（ガルバンゾ）粉、カシュー粉、フラックスミール、マカダミア粉、キビ粉、ソルガム粉、米粉、タピオカ粉及びその任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１６】
別の実施形態では、前記酵母は、パン酵母、クリーム酵母、圧搾酵母、固形酵母（cake yeast）、活性乾燥酵母、インスタント酵母、耐浸透圧性酵母、急速酵母、不活性化酵母、栄養酵母、ビール酵母、蒸留及びワイン酵母からなる群より選択される。
【００１７】
別の実施形態では、前記リパーゼは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１８】
別の実施形態では、前記リパーゼはバリアントポリペプチドであり、該バリアントポリペプチドは配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％同一であり、且つ該バリアントポリペプチドはリパーゼ活性を有する。
【００１９】
別の実施形態では、前記リパーゼは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされるポリペプチドである。
【００２０】
別の実施形態では、前記方法は第2の酵素の追加をさらに含む。さらなる実施形態では、前記第2の酵素は、第2のリパーゼ、アルファ-アミラーゼ；グルカン1,4-アルファ-マルトテトラオヒドロラーゼ；エクソ-マルトテトラオヒドロラーゼ；G4-アミラーゼ；グルカン1,4-アルファ-マルトヒドロラーゼ；マルトジェニックアルファ-アミラ-ゼ；シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；CGTase；グルコアミラーゼ；エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ；キシラナーゼ；セルラーゼ；酸化還元酵素；ホスホリパーゼA1；ホスホリパーゼA2；ホスホリパーゼC；ホスホリパーゼD；ガラクトリパーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アラビノフラノシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、プロテアーゼ又はその任意の組み合わせを含む。
【００２１】
別の実施形態では、前記リパーゼはpH4.0〜pH12.0の範囲で活性を有する。
【００２２】
別の実施形態では、前記リパーゼは20℃〜60℃の温度範囲で活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】溶液中で天然基質に対するリパーゼ特異性を示す図である。
【図２】ピストレット試験でのリパーゼ及びDATEMの用量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
パン（bread）は、以下に限定されないが、ロール、丸パン（bun）、ペストリー、ケーキ、フラットブレッド、ピザパン、ピタパン、ウエハー、パイクラストナン、ラヴァッシュ（lavish）、ピタ、フォカッチャ、サワードウ、麺類、クッキー、トルティーヤ、パンケーキ、クレープ、クルトン及びビスケットを含む。パンの焼成は一般に、材料を混合して生地を作ること、こねること、発酵、成形、焼成、冷ますこと及び貯蔵を含む。生地を作るために使用される材料は、一般に粉（小麦粉）、水、食塩、酵母、及び他の食品添加物を含む。
【００２５】
粉（flour;小麦粉）は一般的には小麦から作られ、パン、ペストリー、ケーキ、ビスケット、パスタ及び麺類を作ることなどの異なる目的のために製粉することができる。小麦粉の代わりとなるものには、以下に限定されないが、アーモンド粉、ココナッツ粉、チアフラワー、コーンフラワー、大麦粉、スペルト粉、大豆粉、麻粉（hemp flour）、ジャガイモ粉、キノア、テフ粉、ライ麦粉、アマランサ粉、葛粉（arrowroot flour）、ヒヨコマメ（ガルバンゾ）粉、カシュー粉、フラックスミール、マカダミア粉、キビ粉、ソルガム粉、米粉、タピオカ粉及びその任意の組み合わせが含まれる。
【００２６】
酵母は糖類を二酸化炭素と水に分解する。以下に限定されないが、クリーム酵母、圧搾酵母、固形酵母（cake yeast）、活性乾燥酵母、インスタント酵母、耐浸透圧性酵母、急速酵母、不活性化酵母を含む、通常出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に由来する様々なパン酵母が当業者に公知である。他の種類の酵母には、栄養酵母、ビール酵母、蒸留及びワイン酵母が含まれる。
【００２７】
甘味料には、以下に限定されないが、液糖、シロップ、白砂糖（グラニュー糖）、ブラウンシュガー（粗糖）、蜂蜜、フルクトース、デキストロース、グルコース、高フルクトースコーンシロップ、糖液（molasse）及び人工甘味料が含まれる。
【００２８】
乳化剤には、以下に限定されないが、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（DATEM）、ステアロイル乳酸ナトリウム（SSL）、ステアロイル乳酸カルシウム（CSL）、エトキシル化モノグリセリド及びエトキシル化ジグリセリド（EMG）、ポリソルベート（PS）並びにコハク酸化モノグリセリド（SMG）が含まれる。
【００２９】
本開示の方法と共に使用することができる他の食品添加物には、脂質、油、バター、マーガリン、ショートニング、バター脂、グリセロール、卵、乳製品、非乳製品代替物、増粘剤、保存料、着色剤及び酵素が含まれる。
【００３０】
酵素は、アミノ酸の配列を含む生物学的分子であって、反応を触媒することができるものである。酵素名は、国際生化学・分子生物学連合（IUBMB）の命名委員会の推奨に基づいて当業者に公知である。酵素名には、EC番号（酵素番号）、推奨名、代替名（もしあれば）、触媒活性及び他の因子が含まれる。酵素は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸配列としても公知であり、或いは配列番号によって同定される。本開示では、酵素の代替名を互換的に使用することができる。
【００３１】
アルファ-アミラーゼ（E.C. 3.2.1.1）；エキソ-マルトテトラオヒドロラーゼ、G4-アミラーゼとしても公知である、グルカン1,4-アルファ-マルトテトラオヒドロラーゼ（E.C. 3.2.1.60）；マルトジェニックアルファ-アミラ-ゼとしても公知である、グルカン1,4-アルファ-マルトヒドロラーゼ（E.C. 3.2.1.133）；エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ（E.C. 3.2.1.8）；酸化還元酵素；ホスホリパーゼA1（E.C. 3.1.1.32）；ホスホリパーゼA2（E.C. 3.1.1.4）；ホスホリパーゼC（E.C. 3.1.4.3）；ホスホリパーゼD（E.C. 3.1.4.4）；ガラクトリパーゼ（E.C. 3.1.1.26）及びプロテアーゼを含む、異なるクラスの酵素が焼成において有用であることが公知である。酵素は、食品成分、食品添加物及び／又は加工助剤として使用される。
【００３２】
リパーゼ（E.C. 3.1.1.3）は脂質中のエステル結合を切断することが公知である加水分解酵素である。リパーゼには、ホスホリパーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ及びガラクトリパーゼが含まれる。リパーゼは植物；哺乳類；及び、限定されないが、以下を含む微生物から同定されている：シュードモナス（Pseudomonas）、ビブリオ（Vibrio）、アシネトバクター（Acinetobacter）、バークホルデリア（Burkholderia）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、フサリウム・ソラニ（Fusarium solani）由来のクチナーゼ（FSC）、カンジダ・アンタークティカA（Candida antarctica A）（CalA）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）（ROL）、好熱性子嚢菌（Thermomyces lanuginosus）（TLL）、リゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）（RML）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus Niger）、フサリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）のリパーゼ。
【００３３】
さらに、多くのリパーゼ、ホスホリパーゼ、及びガラクトリパーゼが、以下に限定されないが、WO1993/000924、WO2003/035878、WO2003/089620、WO2005/032496、WO2005/086900、WO2006/031699、WO2008/036863及びWO2011/046812を含む特許及び公開特許出願に開示されている。
【００３４】
食品加工及び焼成に使用される市販のリパーゼには、以下に限定されないが、LIPOPAN（商標）、NOOPAZYME、(Novozymesから入手可能）；PANAMORE、CAKEZYME及びBAKEZYME（DSMから入手可能）；並びにGRINDAMYL EXEL 16、GRINDAMYL POWERBAKE及びTS-E 861（Dupont/Daniscoから入手可能）が含まれる。
【００３５】
本開示のリパーゼは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11のアミノ酸配列に示される単離、合成又は組換えポリペプチドである。
【００３６】
本開示のリパーゼは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12の核酸配列に示されるポリヌクレオチドによってコードされる単離、合成又は組換えポリペプチドである。
【００３７】
配列番号1のアミノ酸配列を有するリパーゼは、配列番号2の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号1のアミノ酸配列をコードする配列番号2のポリヌクレオチドバリアントによってコードされる。配列番号3のアミノ酸配列を有するリパーゼは、配列番号4の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号3のアミノ酸配列をコードする配列番号4のバリアントによってコードされる。配列番号5のアミノ酸配列を有するリパーゼは、配列番号6の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号5のアミノ酸配列をコードする配列番号6のバリアントによってコードされる。配列番号7のアミノ酸配列を有するリパーゼは、配列番号8の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号7のアミノ酸配列をコードする配列番号8のバリアントによってコードされる。配列番号9のアミノ酸配列を有するリパーゼは、配列番号10の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号9のアミノ酸配列をコードする配列番号10のバリアントによってコードされる。配列番号11のアミノ酸配列を有するリパーゼは、配列番号12の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号11のアミノ酸配列をコードする配列番号12のバリアントによってコードされる。
【００３８】
本開示のリパーゼは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11を含む又はからなる群より選択されるアミノ酸配列の全長であり酵素活性を有するポリペプチドに対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％同一であるアミノ酸配列を含む、単離、合成又は組換えバリアントポリペプチドであって、該バリアントポリペプチドはリパーゼ活性を有する、バリアントポリペプチドである。
【００３９】
本開示のリパーゼは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9及び配列番号11を含む又はからなる群より選択されるアミノ酸配列の酵素活性を有するポリペプチド並びにアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失又はその任意の組み合わせを含む、単離、合成又は組換えバリアントポリペプチドであって、該バリアントポリペプチドはリパーゼ活性を有する、バリアントポリペプチドである。
【００４０】
さらなる実施形態では、アミノ酸置換を有するバリアントポリペプチドは保存的アミノ酸置換であってもよい。「保存的アミノ酸置換」は、親となるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列中の1つのアミノ酸残基を、類似した性質を有する異なるアミノ酸残基に、同じ位置で置換することを意味する。保存的アミノ酸置換のいくつかの例には、以下に限定されないが、正電荷アミノ酸残基を異なる正電荷アミノ酸残基に置換すること；極性アミノ酸残基を異なる極性アミノ酸残基に置換すること；非極性アミノ酸残基を異なる非極性アミノ酸残基に置換すること；塩基性アミノ酸残基を異なる塩基性アミノ酸残基に置換すること；又は芳香族アミノ酸残基を異なる芳香族アミノ酸残基に置換することが含まれる。
【００４１】
さらなる実施形態では、アミノ酸置換を有するバリアントポリペプチドは、1つのアミノ酸残基を任意の他のアミノ酸残基に置換するものであってもよく、ここで該バリアントポリペプチドはリパーゼ活性を有する。
【００４２】
さらなる実施形態では、リパーゼ活性を有するバリアントポリペプチドは「成熟ポリペプチド」である。成熟ポリペプチドは、任意の翻訳後修飾、糖鎖付加、リン酸化、トランケーション、N末端修飾、C末端修飾、シグナル配列欠失を含む、その最終的形態の酵素を意味する。成熟ポリペプチドは、発現系、ベクター、プロモーター、及び／又は生成過程に依存して異なる場合がある。
【００４３】
さらなる実施形態では、リパーゼは、約pH4.0〜約pH12.0の範囲内の任意の単一の点で、幅広いpHに渡って活性を有する。一実施形態では、リパーゼは、pH4.0〜pH11.0、pH4.0〜pH10.0、pH4.0〜pH9.0、pH4.0〜pH8.0、pH4.0〜pH7.0、pH4.0〜pH6.0、又はpH4.0〜pH5.0の範囲に渡って活性を有する。別の実施形態では、リパーゼは、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0、pH9.5、pH10.0、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0、及びpH12.5で活性を有する。
【００４４】
さらなる実施形態では、焼成過程の間の任意の時間に使用される幅広い温度に渡って活性を有しており、ここで該温度は約20℃〜約60℃の範囲内の任意の点である。別の実施形態では、リパーゼは20℃〜55℃、20℃〜50℃、20℃〜45℃、20℃〜40℃、20℃〜35℃、20℃〜30℃又は20℃〜25℃の温度範囲で活性を有する。別の実施形態では、リパーゼは、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃以上の温度、又はさらに高い温度以上の温度で活性を有する。「配列同一性」は、第1のアミノ酸配列の第2のアミノ酸配列への比較、又は第1の核酸配列の第2の核酸配列への比較を意味し、この比較に基づくパーセンテージとして計算される。
【００４５】
一般的に、生成されたアラインメントは、2つの異なるアプローチの1つによって配列同一性を計算するために使用することができる。第1のアプローチでは、単一位置におけるミスマッチと単一位置におけるギャップの両方が、最終的な配列同一性計算における非同一位置としてカウントされる。第2のアプローチでは、単一位置におけるミスマッチは最終的な配列同一性計算における非同一位置として計算されるが、単一位置におけるギャップは最終的な配列同一性計算における非同一位置としてカウントされない（無視される）。言い換えれば、第2のアプローチでは、ギャップは最終的な配列同一性計算において無視される。これらの2つのアプローチの間の違い（単一位置において、ギャップを非同一位置としてカウントするか、或いはギャップを無視する）は、2つの配列間の配列同一性の値における変動性をもたらし得る。
【００４６】
本開示の一実施形態では、アラインメントを生成し、最終的な配列同一性計算において単一位置におけるミスマッチと単一位置におけるギャップの両方を非同一位置としてカウントして同一性を計算するプログラムによって配列同一性が決定される。例えば、プログラムNeedle（EMBOS）は、Needleman and Wunsch（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）のアルゴリズムを実装しており、最初に第1の配列と第2の配列の間のアラインメントを生成し、次にアラインメント長に渡って同一な位置の数をカウントし、次に同一残基数をアラインメント長で割り、次にこの数に100を掛けて％配列同一性を生成することによって配列同一性を計算する［％配列同一性=（同一残基の＃／アラインメント長）x 100］。
【００４７】
本開示の別の実施形態では、両方の配列を全長に渡って示す、したがって第1の配列と第2の配列をその全長において示すペアワイズアラインメントから配列同一性を計算することができる（「グローバル配列同一性」）。例えば、プログラムNeedle（EMBOSS）はそのようなアラインメントを生成し、％配列同一性=（（同一残基の＃／アラインメント長）x 100）である。
【００４８】
本開示の別の実施形態では、第1の配列又は第2の配列のローカルな領域のみを示すペアワイズアラインメントから配列同一性を計算することができる（「ローカル同一性」）。例えば、プログラムBlast（NCBI）はそのようなアラインメントを生成し、％配列同一性=（（同一残基の＃／アラインメント長）x 100）である。
【００４９】
本開示の一実施形態では、リパーゼは少なくとも1つの他の酵素又は第2の酵素と組み合わせて使用することができる。別の実施形態では、第2の酵素は、アルファ-アミラーゼ；エクソ-マルトテトラオヒドロラーゼ、G4-アミラーゼとしても公知である、グルカン1,4-アルファ-マルトテトラオヒドロラーゼ；マルトジェニックアルファ-アミラ-ゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼとしても公知であるグルカン1,4-アルファ-マルトヒドロラーゼ；エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ；酸化還元酵素；ホスホリパーゼA1；ホスホリパーゼA2；ホスホリパーゼC；ホスホリパーゼD；ガラクトリパーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アラビノフラノシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、プロテアーゼ又はその任意の組み合わせを含む又はからなる群より選択される。別の実施形態では、当該酵素の組み合わせは、本明細書に開示されるリパーゼとマルトジェニックアルファ-アミラ-ゼであるか、又は当該酵素の組み合わせは本明細書に開示されるリパーゼ、マルトジェニックアルファ-アミラ-ゼ及びキシラナーゼである。
【００５０】
本開示の別の実施形態では、リパーゼは1つよりも多いリパーゼ酵素のハイブリッドであってもよい。「ハイブリッド」又は「キメラ」又は「融合タンパク質」とは、本開示の第1のリパーゼのドメインが第2のリパーゼのドメインと組み合わせられてハイブリッドリパーゼを形成し、このハイブリッドがリパーゼ活性を有することを意味する。一実施形態では、本開示のリパーゼのドメインは、LIPOPAN（Novozymesから入手可能）又はPANAMORE（DSMから入手可能）などの市販のリパーゼのドメインと組み合わせられて、ハイブリッドリパーゼを形成し、このハイブリッドはリパーゼ活性を有する。
【００５１】
産業用酵素は通常、細菌、菌類、又は酵母の発現系を使用して生成される組換えタンパク質である。「発現系」はまた、宿主微生物、発現宿主、宿主細胞、生成微生物又は生成株を意味し、これらの用語の各々は本開示のために互換的に使用することができる。発現系の例としては、以下に限定されないが、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、ハンゼヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、好熱性子嚢菌（Thermomyces lanuginosus）、フサリウム・オキシスポラム（fusarium oxysporum）、フサリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）、好ましくは枯草菌（Bacillus subtilis）、又はバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、シュードモナス（Pseudomonas）、好ましくはシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（コマガタエラ・ファフィー（Komagataella phaffii）としても公知である）、マイセリオフィソラ・サーモフィル（C1）（Myceliopthora thermophile（C1））、シゾサッカロミケス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、トリコデルマ（Trichoderma）、好ましくはトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）が含まれる。一実施形態では、本開示のリパーゼは上記に列挙された発現系を使用して生成される。
【００５２】
リパーゼは他の産業用途でも有用であることが公知である。本開示の一実施形態では、リパーゼは界面活性剤において使用される。本開示の一実施形態では、リパーゼは、コンタクトレンズ溶液などのパーソナルケア製品において使用される。別の実施形態では、本開示のリパーゼは皮革製造などの繊維製品の加工において使用される。別の実施形態では、本開示のリパーゼは、パルプ及び紙の加工において使用することができる。さらなる実施形態では、パルプ及び紙の加工はピッチ制御又は脱インキである。別の実施形態では、本開示のリパーゼはバイオディーゼルの製造のために使用することができる。別の実施形態では、本開示のリパーゼは、チーズ熟成のために使用することができる。別の実施形態では、本開示のリパーゼは肉フレーバー及び／又はアロマの調製において使用することができる。別の実施形態では、本開示のリパーゼは油＆脂肪の改変において使用することができる。別の実施形態では、本開示のリパーゼは酵素的オイル脱ガムにおいて使用することができる。別の実施形態では、本開示のリパーゼはエタノールの生成において使用することができる。
【００５３】
本明細書において使用される用語「焼成産物」は、パン、クリスピーロール、サンドイッチパン、丸パン（bun）、バゲット、チャバタ、クロワッサン、並びにドーナツ、ブリオッシュ、シュトーレン、ケーキ、マフィンなどのような細かいベーカリー商品などの焼成産物を含む。
【００５４】
本明細書において使用される用語「生地」は、粉（小麦粉）、食塩、酵母及び水の混合物であって、焼成の前に練られ、型に入れられ、成形され又はローラーで延ばされるものとして定義される。その上、糖類、マーガリン、卵、牛乳などの他の材料もまた使用してもよい。該用語は、パン、ロール、サンドイッチパン、バゲット、チャバタ、クロワッサン、甘味酵母生地（sweet yeast dough）などの焼成品の調製のために使用される生地を含む。
【００５５】
本明細書において使用される用語「パンの体積」は、体積並びに比容積を測定するためにレーザースキャナー（例えばVolscan Profiler ex Micro Stable System）を使用することによって決定される焼成品の体積である。該用語はまた、特定の焼成品の長さ、幅及び高さを測定することによって決定される体積を含む。
【００５６】
本明細書において使用される用語「含む（comprising）」は、「含む（including）」、「含有する（containing）」又は「によって特徴づけられる」と同義であり、包含的（inclusive）であるか又は制限されない（open-ended）ものであり、付加的な、記載されない要素又は方法工程を除外しない。
【００５７】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「からなる」及び／又は「実質的にからなる」ものを含むことが理解される。
【００５８】
本開示の全体を通して、様々な態様が範囲の形式で提示される。範囲の形式における記載は単に簡便のためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない制限として解されるべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内のあらゆる可能な部分範囲並びに個別の数値を具体的に開示しているものとして考えられるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、並びにその範囲の個々の数、例えば1、2、3、4、5及び6を具体的に開示しているものとして考えられるべきである。これは、範囲の幅によらず適用される。
【００５９】
本開示の他の目的、利点及び特徴は付属する図面と併せて以下の明細書から明らかになる。
【００６０】
以下の記載では、多くの具体的詳細は、本開示のより完全な理解を提供するために示される。しかし、これらの具体的詳細のうち1つ以上がなくても本開示の方法を実施することができることは、当業者であれば明らかになる。他の例においては、当業者に周知の特徴と手順が、本開示を曖昧にすることを回避するために記載されている。
【実施例】
【００６１】
〔実施例１：リパーゼの発現と精製〕
発現
該酵素は、コードするポリヌクレオチド配列を含む発現プラスミドを構築し、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（コマガタエラ・ファフィー（Komagataella phaffii））を形質転換し、結果として得られた発現株を以下の方法で生育することによって得られた。該発現株の新しいピキア・パストリス細胞は、配列確認済みである株のグリセロールストックを、ゼオシンを含有するYeast extract Peptone Dextrose（YPD）寒天プレート上に広げることによって得られた。2日後、これらのプレートに由来する細胞を使用して、この生成株のスターター種培養を100mlのBuffered Glycerol complex Medium（BMGY）培地の中に播種し、30℃且つ225〜250rpmで20〜24時間生育させた。種培養は、適切な量をバッフル付発酵槽における2〜4ＬのBMMY培地中に移すことによりスケールアップした。発酵は、30℃且つ1100rpmの撹拌（フラットブレードインペラーによって提供された）のもと、48〜72時間実施された。最初のバッチ段階の発酵の後、培養物中の溶解酸素レベルが30％を下回ったときはいつでも濾過滅菌済メタノールを餌として加えた。あるいは、開始バッチ培養物の0.5％ v/vで3時間毎に餌を加えた。最終発酵ブロスは4℃で30分7000xgで遠心して無細胞上清を得た。
【００６２】
精製
チーズクロスで濾過後、分子量カットオフが5kDの実験室規模の接線方向流濾過（TFF）システム（SpectrumLabs）を使用して無細胞上清を超遠心した。試料を最初に10-20Xで遠心し、次に50mM HEPES pH7.5に5Xで緩衝液を交換した。結果として得られた残余分を27000xgで1時間遠心し、次に0.2μmフィルターを通して濾過滅菌してあらゆる生成生物又は微粒子物質を除いた。最終試料の全タンパク質内容物をブラッドフォードアッセイを使用して決定した。リパーゼは溶液中で-20℃で維持するか、又は凍結乾燥して粉末にした。一部の場合には、リパーゼ溶液をg小麦粉当たり0.5mgリパーゼで全粒粉に噴霧し、その後40℃で乾燥した。
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【００６３】
〔実施例２：リパーゼ活性〕
人工基質
リパーゼ活性は、発色産物p-ニトロフェニル（PNP）を分光学的に検出することによって、人工基質オクタン酸p-ニトロフェニル（C8-PNP、Sigma 21742）を使用して決定された。C8-PNPは2-エトキシエタノール（Alfa Aesar）中に8mMで溶解された後、50mM Hepes pH7.5、0.1M NaCl（基質アッセイ緩衝液）中に0.4mMに希釈された。リパーゼのストックを基質アッセイ緩衝液中に終濃度0.1〜1μg/mLで加え、その直後にプレートリーダーにおいて405nm吸光度によって30℃15分PNP形成を監視した。酵素のμg当たりの酵素活性を計算するために、時間に対するA405の線形勾配と標準PNP曲線を使用した。同様に、以下の活性を測定するために同じアッセイを使用した：a)異なるpH値（4.0〜12.0）における活性（適当なpH緩衝液とそのpH値におけるPNP標準曲線を使用する）;b)異なる温度（25℃〜65℃）における活性；c)異なるコファクター又は塩濃度（Ca2+、Mg2+、Zn2+、Na+、Cl-、EDTA）の存在下における活性；d)様々な脂肪酸鎖長（C4-C18、シグマ）の異なるPNP基質についての活性。結果は下の表に示される。
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【００６４】
天然脂質基質
或いは、リパーゼ活性は、天然脂質基質と、加水分解中の遊離脂肪酸の蓄積によるpH変化を検出する蛍光発生pH指示薬とを使用して決定した。天然基質は、以下に記載されるように小麦粉から単離され（MGDG=モノガラクトシルジグリセリド、DGDG=ジガラクトシルジグリセリド及びTAG=トリアシルグリセロール）、或いはPCは大豆レシチンから単離された（PC=ホスファチジルコリン）。天然基質のストック溶液は脂質を均一に分散させるために超音波処理（1〜5分）を使用して0.25％デオキシコール酸ナトリウム中に5mM終濃度で調製された。pH7.0〜pH7.5での活性を測定するために、リパーゼを2mM基質、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、125ng/mLフルオレセイン、5mMCaCl2、0.5mM Hepes pH7.5中に0.1〜1μg/mLで希釈し、その後、30℃で15分、488nmで励起後の520nmでの蛍光放出を測定した。時間に対する蛍光の負の線形勾配を、μg酵素当たりのリパーゼ活性を計算するために使用した。pH7.5〜8.0での活性を測定するために、リパーゼを2mM基質、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、250ng/mL SNARF-1（ThermoScientific S22801）、5mM CaCl2、1mM Tris pH8.0中に0.1〜1μg/mLで希釈し、その後、30℃で15分、514nmで励起後の580nmでの蛍光放出を記録した。時間に対する蛍光の線形勾配を、μg酵素当たりのリパーゼ活性を計算するために使用した。
【００６５】
小麦粉又は大豆レシチンからの天然基質の抽出
小麦粉タイプ550（Vogtmuehlen Illertissen）（1000g）を2500mLのメタノールと共に6L四口丸底フラスコに加えた。フラスコの内容物を次に室温で機械的撹拌ブレードを使用して1.5時間撹拌した。この時期の後に、混合物を静置し、溶媒をデカントして減圧濾過によってシリカゲル／セライトパッドを通して濾過した。残りの小麦粉は次にさらなる2500mLメタノールを用いて前記の通り再抽出した。
【００６６】
抽出後、フラスコの全内容物を前記の通りシリカ／セライトを通して濾過し、メタノールで徹底的に洗浄して脂質産物の喪失を最小化した。両方の抽出物をまとめ、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮し、きつね色のシロップを得た。まとめられた抽出物は、極性成分、すなわちMGDG及びDGDGから脂質無極性成分を分離するために半融ガラス漏斗に詰めたシリカパッドを通して精製された。シリカゲルパッドは500mL半融ガラス漏斗にシリカを充填し、パッドが完全に詰められることを保証するために吸引を行うことによって調製された。次に試料の一様な分布を保証するためにパスツールピペットを使用して未加工の材料を注意深くシリカパッドに加えた。試料は次にn-ヘプタン：アセトン（1:1、2L）、n-ヘプタン：アセトン（1:4、2L）、アセトン（1L）及びアセトン-メタノール（4:1、1L）で溶出した。画分（1L）を回収し、TLC解析から、画分2は無極性成分（トリ-、ジ-、モノグリセリド）の大部分を含有し、一方、画分3〜4はMGDGを含有することが観察され、画分5〜6はDGDGを含有した。これらの画分はロータリーエバポレーターを使用して別々に濃縮され、さらに精製された。画分2の残留物（トリ-、ジ-、モノグリセリドを含有する）はフラッシュ・クロマトグラフィーを行って精製された。
【００６７】
カラムクロマトグラフィーを最初にn-ヘプタンを使用して行い、続いてn-ヘプタン（n-hepane）：アセトン（4:1）及びn-ヘプタン（n-hepane）：アセトン（1:1）を使用して行った。カラムクロマトグラフィーの進行をTLC解析によって監視し、溶出に使用される溶媒系の極性をそれに従って増加させた。トリ-、ジ-、モノグリセリドの純粋な試料を生じるためにどの画分をまとめられるかを評価するために、カラムから回収された画分を次にTLC解析に供した。まとめられた画分はロータリーエバポレーターを使用して濃縮された。画分3〜4（MGDG含有画分）の残留物はフラッシュ・クロマトグラフィーを行って精製された。カラムクロマトグラフィーを最初にn-ヘプタンを使用して行い、続いてn-ヘプタン（n-hepane）：アセトン（1:1）を使用して行った。カラムクロマトグラフィーの進行をTLC解析によって監視し、溶出に使用される溶媒系の極性をそれに従って増加させた。濃縮前にどの画分をまとめられるかを評価するために、カラムから回収された画分を次にTLC解析に供した。画分5〜6（DGDG含有画分）の残留物はフラッシュ・クロマトグラフィーを行って精製された。カラムクロマトグラフィーをn-ヘプタン（n-hepane）：アセトン（1:1）、n-ヘプタン：アセトン（1:4）を使用して、そして最後にアセトンのみを使用して行った。カラムクロマトグラフィーの進行をTLC解析によって監視し、溶媒系をそれに従って変化させた。濃縮前にどの画分をまとめられるかを評価するために、カラムから回収された画分を次にTLC解析に供した。
【００６８】
リン脂質を精製し、アセトン抽出によって大豆レシチンからトリグリセリド及び遊離脂肪酸を除去した。大豆レシチン（10g）を50ml管の中でアセトン（30ml）と混合し、10分混合した。結果として得られたスラリーを4000xgで5分遠心し、アセトン相を除去し捨てた。不溶性リン脂質を新しいアセトンでさらに3回抽出した。
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【００６９】
HPLCによって評価された、生地中の脂質分解活性
いくつかの基質に対するリパーゼの活性を一度に、望ましい条件下で試験するために簡易生地が使用された。生地は10g小麦粉（パンのための米国King Arthur小麦粉）、200mg食塩及び5.9ml水から調製され、生地当たり4又は40μgのいずれかで酵素を追加した。生地を磁気混合によって10分混合し、次に30℃で合計60分湿度制御チャンバー内でインキュベートした。解析用試料は、各々の生地から10分と60分で取得した。脂質解析には、2ml 0.1N HCl及び10ml 1-ブタノールを含むバイアルに2g湿生地試料を加えた。30秒の剪断均質化（VWR 250 Homogenizer、20x200mmプローブ）によって、脂質を抽出するために生地を溶媒中に分散した。次に溶解しない固形分を室温で5分、4000xgで遠心によって分離した。有機相を遠心蒸発（Savant SpeedVac SC210A & Trap RVT5105）によって除去し蒸発させ、結果として得られた固形分を解析のための当初の体積の1/10でイソオクタン：アセトン：イソプロパノール（2:1:1）中に再溶解した。シリカゲルカラム（Chromolith Performance Si 100-4.6mm、Merck）を用いたHPLC（Agilent 1100 series）によって脂質を分離し、ELSD（Agilent 1260 Infinity）によって解析した。
【００７０】
脂質分離のためのクロマトグラフィー法は、Gerits, et al. “Single run HPLC separation coupled to evaporative light scattering detection unravels wheat flour endogenous lipid redistribution during bread dough making” LWT-Food Science and Technology, 53 (2013) 426-433に由来した。個別の脂質クラスが酵素処理の結果として増加したか、減少したか、又は変化を示さなかったかを決定するために、各々の酵素の4つの試料、すなわち2つの時点及び2つの酵素用量を使用した。以下の表と図１に示すように、試験された酵素のいくつかが幅広い範囲の脂質クラスに対する活性を示す。
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【００７１】
〔実施例４：焼成トライアルピストレット試験〕
PANAMORE GOLDEN2.2、LIPOPAN F、LIP62、LIP61、LIP24、LIP49乾燥リパーゼ酵素、及びDATEM（LAMETOP 552）の焼成性能、また溶液中のPANAMORE GOLDEN2.2、LIPOPAN F、LIP62、LIP61、LIP24、LIP49、LIP88リパーゼ酵素、及びDATEM（LAMETOP 552）の焼成性能を、迅速でストレートな生地系であるピストレット試験で試験した。小麦粉タイプ550（Vogtmuehlen Illertissen）（2000g）、120g圧搾酵母、40g食塩、30gグルコース、22g小麦のでんぷん、120ppmアスコルビン酸、5ppm Nutrilife（登録商標）AM 100（菌性アルファ-アミラーゼ）、200ppm Nutrilife（登録商標）CS 30（菌性キシラナーゼ、セルラーゼ、菌性アルファ-アミラーゼ）及び1180g水をKemper SP 15スパイラルミキサーでスピード1で5.5分、スピード2で0.5分、28℃の最終生地温度まで混合した。12分の静置後、生地を計りとって1500gの一片とし、丸めて、さらに12分発酵させた。その後、自動生地分割機及び丸め機を使用することによって、生地を分割して丸めて各々50gの30片とした。次に生地片を85％の相対湿度にて35℃で35分（通常発酵）及び45分（延長発酵）発酵させた。12分の発酵時間の後、V字型の刻み目を生地片の中央にプレスした。発酵した生地片は、15秒の水蒸気添加と共に240℃で12分デッキオーブンにおいて焼成した。
【００７２】
生地の性質に対する、及び最終焼成品に対する効果を、陰性対照に、及び0.4％（小麦粉重量に基づく）DATEM（Lametop（登録商標）552）を含有する参照に比較した。PANAMORE GOLDEN2.2は14ppmで与え、LIPOPAN Fは40ppmで与えた。
【００７３】
15ロールの長さ、幅及び高さの測定によって、重量との関連で体積効果を決定した。陰性対照を0％と規定した。生地の性質は、熟練のパン職人（master baker）によって手作業で評価され、陰性対照に対する比較で記述された。
【００７４】
乾燥リパーゼ及び溶液中のリパーゼの結果を以下の表に示す。
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【００７５】
〔実施例５：焼成トライアル-バゲット〕
PANAMORE GOLDEN 2.2、LIPOPAN F、LIP62酵素及びDATEM（Lametop 552）の焼成性能をフランスバゲットで試験した。焼成トライアルの前に、各々の酵素を活性について試験し（活性は異なる酵素の間で異なり得る）、次に各々の酵素をその酵素の最適な用量を決定するために試験し、最後に酵素を最適な用量で加えた。小麦粉（小麦粉の種類については下記を参照されたい）（1000g）、25g圧搾酵母、20g食塩、60ppmアスコルビン酸、3ppm Nutrilife（登録商標）AM 100（菌性アルファ-アミラーゼ）、150ppm Nutrilife（登録商標）CS 30（菌性キシラナーゼ、セルラーゼ、菌性アルファ-アミラーゼ）及び650g水をKemper SP 15スパイラルミキサーでスピード1で8分、スピード2で4分、27℃の最終生地温度まで混合した。35分の静置後、生地を350g片に分割し、丸めて、15分発酵させた。その後、生地片を型に入れ、75％の相対湿度にて27℃で120分（通常発酵）及び150分（延長発酵）発酵させた。発酵した生地片に切り込みを入れて、255℃で25分デッキオーブンにおいて焼成し、30秒後に水蒸気を与えた。
【００７６】
生地の性質に対する、及び最終焼成品に対する効果を、陰性対照に、及び0.4％（小麦粉重量に基づく）DATEM（Lametop（登録商標）552）を含有する参照に比較した。他の対照はPANAMORE GOLDEN2.2（14ppm）及びLIPOPAN F（40ppm）であった。LIP62は60ppm又は1.26μgリパーゼ／g小麦粉の用量で与えた。
【００７７】
レーザースキャナー（Micro Stable Systems Volscan）によりパンローフを測定することによって体積効果を決定した。陰性対照は0％と規定される。生地の性質は、熟練のパン職人（master baker）によって手作業で評価され、陰性対照に対する比較で記述された。
【００７８】
ドイツの小麦粉（タイプ550 Vogtmuehlen Illertissen）及びトルコの小麦粉を使用するバゲットの焼成トライアルの結果を以下の表に示す。
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【００７９】
〔実施例６：焼成トライアル-甘味酵母生地（sweet yeast dough）〕
PANAMORE GOLDEN 2.2、LIPOPAN F、LIP62酵素、及びDATEM（Lametop 552）の焼成性能を甘味酵母生地（sweet yeast dough）において試験した。焼成トライアルの前に、各々の酵素を活性について試験し（活性は異なる酵素の間で異なり得る）、次に各々の酵素をその酵素の最適な用量を決定するために試験し、最後に酵素を最適な用量で加えた。小麦粉タイプ550（Vogtmuehlen Illertissen）（2000g）、140g圧搾酵母、30g食塩、200g糖、200gマーガリン、100g卵、50ppmアスコルビン酸、200ppm Nutrilife（登録商標）CS 30（菌性キシラナーゼ、セルラーゼ、菌性アルファ-アミラーゼ）及び900g水をKemper SP 15スパイラルミキサーでスピード1で6.5分、スピード2で1.5分、26℃の最終生地温度まで混合した。25分の静置後、生地を計りとって1500gの一片とし、丸めて、さらに20分発酵させた。その後、自動生地分割機及び丸め機を使用することによって、生地を分割して丸めて各々50gの30片とした。次に8個の生地片をパン型（baking tin）に入れ、85％の相対湿度にて35℃で50分発酵させた。発酵した生地片は、15秒の水蒸気添加と共に、210℃／255℃の下側及び上側の熱で、デッキオーブンで35分焼成した。
【００８０】
生地の性質に対する、及び最終焼成品に対する効果を、陰性対照に、及び0.4％（小麦粉重量に基づく）DATEM（Lametop（登録商標）552）を含有する参照に比較した。他の対照はPANAMORE GOLDEN 2.2（4ppm）又はLIPOPAN F（25ppm）であった。LIP62は25ppm（0.52μgリパーゼ／g小麦粉）の用量で与えた。
【００８１】
レーザースキャナー（Micro Stable Systems Volscan）によりパンローフを測定することによって体積効果を決定した。陰性対照は0％と規定される。生地の性質は、熟練のパン職人（master baker）によって手作業で評価され、陰性対照に対する比較で記述された。
【００８２】
甘味生地及びスポンジ＆生地焼成トライアルの結果を以下の表に示す。
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【００８３】
〔実施例７：焼成トライアル-スポンジ＆生地〕
PANAMORE GOLDEN 2.2、LIPOPAN F、LIP62酵素、及びDATEM（Lametop 552）の焼成性能をスポンジ＆生地法で試験した。焼成トライアルの前に、各々の酵素を活性について試験し（活性は異なる酵素の間で異なり得る）、次に各々の酵素をその酵素の最適な用量を決定するために試験し、最後に酵素を最適な用量で加えた。小麦粉タイプ550（Vogtmuehlen Illertissen）（1000g）、5g圧搾酵母及び1000g水を混合し、4℃又は室温のいずれかで16時間保存した。その後、1000gの小麦粉タイプ550（Vogtmuehlen Illertissen）、55g圧搾酵母、40g食塩、40g糖、40gマーガリン、60ppmアスコルビン酸、150ppm Nutrilife（登録商標）CS 30（菌性キシラナーゼ、セルラーゼ、菌性アルファ-アミラーゼ）及び160g水をKemper SP 15スパイラルミキサーでスピード1で5.5分、スピード2で0.5分、27℃の最終生地温度まで混合した。15分の静置後、生地を450g片に分割し、丸めて、10分発酵させた。その後、生地片を型に入れ、パン型（baking tin）に入れ、85％の相対湿度にて35℃で80分発酵させた。発酵した生地片は、15秒の水蒸気添加と共に、240℃／250℃の下側及び上側の熱で、デッキオーブンで30分焼成した。
【００８４】
生地の性質に対する、及び最終焼成品に対する効果を、陰性対照に、及び0.4％（小麦粉重量に基づく）DATEM（Lametop（登録商標）552）を含有する参照に比較した。他の対照はPANAMORE GOLDEN 2.2（7ppm）又はLIPOPAN F（50ppm）であった。LIP62は1.2μgリパーゼ／g小麦粉の用量で与えた。
【００８５】
レーザースキャナー（Micro Stable Systems Volscan）によりパンローフを測定することによって体積効果を決定した。陰性対照は0％と規定される。生地の性質は、熟練のパン職人（master baker）によって手作業で評価され、陰性対照に対する比較で記述された。
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【００８６】
〔実施例８：焼成トライアル-チョーリーウッド製パン法〕
PANAMORE GOLDEN 2.2、LIPOPAN F、LIP62酵素、及びDATEM（Lametop 552）の焼成性能をチョーリーウッド製パン法において試験した。焼成トライアルの前に、各々の酵素を活性について試験し（活性は異なる酵素の間で異なり得る）、次に各々の酵素をその酵素の最適な用量を決定するために試験し、最後に酵素を最適な用量で加えた。UK小麦粉（Heygates Standard）（3000）、240g圧搾酵母、45g食塩、60g改良剤（小麦粉、硫酸カルシウム、大豆粉、アスコルビン酸、細菌性キシラナーゼ、菌性アルファアミラーゼ）及び2010g水を、58.3kW/hのエネルギー入力に達するまで、30℃の最終生地温度まで減圧ミキサー（Pentagon K5）の中で混合した。静置時間なしで生地を450g片に分割し、丸めて、2分発酵させた。その後、生地片を型に入れ、2つのパン型（baking tin）に入れ、85％の相対湿度にて35℃で55分発酵させた。焼成の前にパン型（baking tin）の1つを落下試験（パン型（baking tin）を規定の高さから落下させた）に使用した。その後、発酵した生地片は、15秒の水蒸気添加と共に、255℃／240℃の下側及び上側の熱で、デッキオーブンで25分焼成した。
【００８７】
生地の性質に対する、及び最終焼成品に対する効果を、陰性対照に、及び0.4％（小麦粉重量に基づく）DATEM（Lametop（登録商標）552）を含有する参照に比較した。他の対照はPANAMORE GOLDEN 2.2（18ppm）又はLIPOPAN F（30ppm）であった。LIP62は40ppm又は0.8μgリパーゼ／g小麦粉の用量で与えた。
【００８８】
レーザースキャナー（Micro Stable Systems Volscan）によりパンローフを測定することによって体積効果を決定した。陰性対照は100％と規定される。生地の性質は、熟練のパン職人（master baker）によって手作業で評価され、陰性対照に対する比較で記述された。
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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