(57)【要約】本開示は、概して、目的の分子の産生に好適なウイルスベースの発現系に関する。本開示は、改変された５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を含み、かつ任意選択的に、構造タンパク質をコードするその元々のウイルス配列のうちの少なくとも一部が欠失されている改変レプリコンＲＮＡを含有する発現ベクターなどの核酸構築物に関する。また、目的のポリペプチドを産生するための方法も開示される。一態様では、改変レプリコンＲＮＡを含む核酸分子が本明細書に開示され、改変レプリコンＲＮＡは、改変された５’−ＵＴＲを含み、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。
2019530466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変レプリコンＲＮＡを含む核酸分子であって、前記改変レプリコンＲＮＡが、改変された５’−ＵＴＲを含み、かつウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている、核酸分子。
【請求項２】
前記改変レプリコンＲＮＡが、改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡが、改変アルファウイルスゲノムを含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記改変された５’−ＵＴＲが、１、２、４位、又はこれらの組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチド置換を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つが、前記改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換である、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記改変された５’−ＵＴＲの２位における前記ヌクレオチド置換が、Ｕ−＞Ｇ置換である、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記改変レプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分を欠いている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
１つ以上の発現カセットを更に含み、前記発現カセットのそれぞれが、異種核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記改変レプリコンＲＮＡが、トガウィルス科のアルファウイルス属に属するウイルスの改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群、又はＳＦ群、又はＳＩＮ群に属するアルファウイルスのものである、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、異種調節エレメントに操作可能に連結されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸分子であって、前記核酸分子が、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、前記５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、かつウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている、核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸分子が、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸分子であって、前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、配列番号２〜１８のうちの少なくとも１つの核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲ、及び前記５’−ＵＴＲの２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている、核酸分子。
【請求項１７】
前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、配列番号２〜１８のうちの少なくとも１つの核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲを含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分を欠いている、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組み換え細胞。
【請求項２１】
前記組み換え細胞が、原核細胞又は真核細胞である、請求項２０に記載の組み換え細胞。
【請求項２２】
前記組み換え細胞が、動物細胞である、請求項２０に記載の組み換え細胞。
【請求項２３】
目的のポリペプチドを産生するための方法であって、改変レプリコンＲＮＡを含む核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含み、前記改変レプリコンＲＮＡが、改変された５−’ＵＴＲを含み、かつウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている、方法。
【請求項２４】
前記対象において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、改変レプリコンＲＮＡを含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変レプリコンＲＮＡが、改変された５−’ＵＴＲを含み、かつウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている、方法。
【請求項２５】
前記対象が、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、ウシ、豚類、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、又はバッファローである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記改変レプリコンＲＮＡが、改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡが、改変アルファウイルスゲノムを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記改変された５’−ＵＴＲが、１、２、４位、又はこれらの組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチド置換を含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つが、前記改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記改変された５’−ＵＴＲの２位における前記ヌクレオチド置換が、Ｕ−＞Ｇ置換である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記改変レプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分を欠いている、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上の発現カセットを更に含み、前記発現カセットのそれぞれが、異種核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記改変レプリコンＲＮＡが、トガウィルス科のアルファウイルス属に属するウイルスの改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群、又はＳＦ群、又はＳＩＮ群に属するアルファウイルスのものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、異種調節エレメントに操作可能に連結されている、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸分子が、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲ、及び前記５’−ＵＴＲの２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸分子が、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸分子が、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、配列番号２〜１８のうちの少なくとも１つの核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲ、及び前記５’−ＵＴＲの２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、ウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項４１】
前記改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡが、配列番号２〜１８のうちの少なくとも１つの核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の方法によって産生される組み換えポリペプチド。
【請求項４３】
請求項４２に記載の組み換えポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項４４】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項４５】
請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の組み換え細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４０９２２８号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表の組み込み
【０００２】
添付の配列表中の物質は、参照により本出願に組み込まれる。添付の配列リストのテキストファイル、名称ＳＧＩ０１１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔは、２０１７年１０月３日に作成され、３４ＫＢである。
【０００３】
本開示は、改変ウイルスレプリコンを含む核酸分子、及び細胞培養物中又は生体内の好適な宿主細胞における所望の生成物の産生のためのかかる核酸分子の使用を含む、分子生物学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
近年、動物ウイルスのいくつかの異なる群は、相同組み換えによって、又はそれらのゲノムの直接的な編集のいずれかによって、遺伝子操作を受けてきた。ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスの両方の逆遺伝学系の利用可能性は、例えば、ワクチン、発現ベクター、抗腫瘍剤、遺伝子治療ベクター、及び薬物送達ビヒクルとして組み換えウイルスを使用するための新たな観点を生み出した。
【０００５】
例えば、多くのウイルスベースの発現ベクターが、培養された組み換え細胞における異種タンパク質の発現のために利用されている。特に、宿主細胞における遺伝子発現のための改変されたウイルスベクターの用途は、拡大し続けている。この点での近年の進展としては、マルチサブユニットタンパク質複合体を産生するための技術及び系の更なる開発、並びに異種タンパク質産生を改善するためのタンパク質修飾酵素の共発現が挙げられる。ウイルス発現ベクター技術に関する他の近年の進歩としては、遺伝子発現を制御するための多くの高度なゲノム編集用途、ウイルスベクターの調製、インビボ遺伝子治療用途、及びワクチン送達ベクターの作成が挙げられる。
【０００６】
しかしながら、組み換え発現系において目的の遺伝子を発現させるための、より効率的な方法及び系に対する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このセクションは、本出願の概略的な要約を提供し、その完全な範囲又はその特徴の全てを網羅するものではない。
【０００８】
一態様では、改変レプリコンＲＮＡを含む核酸分子が本明細書に開示され、改変レプリコンＲＮＡは、改変された５’−ＵＴＲを含み、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。本開示の本態様及び他の態様の様々な実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、改変レプリコンＲＮＡは、改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡである。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡは、改変アルファウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲは、１、２、４位、又はこれらの組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換は、Ｕ−＞Ｇ置換である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分を欠いている改変レプリコンＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。
【００１０】
本開示の本態様及び他の態様の様々な実施形態では、核酸分子は、１つ以上の発現カセットを更に含み、発現カセットのそれぞれは、異種核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットのうちの少なくとも１つのプロモーターは、２６Ｓサブゲノムプロモーターであるか、又はそれを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発現カセットのうちの少なくとも１つの異種核酸配列は、目的の遺伝子（gene  of  interest、ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、及びレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫調節因子、及びサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの特定の実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現するように最適化される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、トガウィルス科のアルファウイルス属に属するウイルスの改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む改変レプリコンＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群、又はＳＦ群、又はＳＩＮ群に属するアルファウイルスのものである。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern  equine  encephalitis  virus、ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan  equine  encephalitis  virus、ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（Everglades  virus、ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（Mucambo  virus、ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（Pixuna  virus、ＰＩＸＶ）、ミドルバーグウイルス（Middleburg  virus、ＭＩＤＶ）、チクングンヤウイルス（Chikungunya  virus、ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（O'Nyong-Nyong  virus、ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ross  River  virus、ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（Barmah  Forest  virus、ＢＦ）、ゲタウイルス（Getah  virus、ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（Sagiyama  virus、ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（Bebaru  virus、ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（Mayaro  virus、ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（Una  virus、ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（Sindbis  virus、ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（Aura  virus、ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（Whataroa  virus、ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（Babanki  virus、ＢＡＢＶ）、キジラガッチウイルス（Kyzylagach  virus、ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Western  equine  encephalitis  virus、ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（Highland  J  virus、ＨＪＶ）、フォートモルガンウイルス（Fort  Morgan  virus、ＦＭＶ）、ヌドゥム（Ndumu、ＮＤＵＶ）、及びバギークリーク（Buggy  Creek）ウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である。
【００１３】
いくつかの実施形態は、異種調節エレメントに操作可能に連結された改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、異種調節エレメントは、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、異種調節エレメントは、転写終結配列を含む。いくつかの実施形態では、転写終結配列は、Ｔ７終結配列であるか、又はそれを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、核酸分子は、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、５’−非翻訳領域（5'-untranslated  region、５’−ＵＴＲ）の２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、かつウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、配列番号２〜１８のうちの少なくとも１つの核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲの２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、配列番号２〜１８のうちの少なくとも１つの核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲを含む。ある特定の実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的部分を欠いている。ある特定の実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。
【００１６】
一態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の核酸分子を含む組み換え細胞に関する。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は、原核細胞又は真核細胞である。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は、脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は、ウマ肺動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎臓（baby  hamster  kidney、ＢＨＫ）細胞、ウサギ腎細胞、マウス筋細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese  hamster  ovary、ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞、マウス３Ｔ３細胞、ベロ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓上皮細胞（Madin-Darby  Canine  Kidney  Epithelial  Cell、ＭＤＣＫ）、ニワトリ初代線維芽細胞、ＨｕＴ７８細胞、Ａ５４９肺細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＦＲｈＬ−２、及びＣＥＭ  Ｔ細胞からなる群から選択される。本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示される少なくとも１つの組み換え細胞を含む細胞培養物を提供する。
【００１７】
一態様では、いくつかの実施形態は、目的のポリペプチドを産生するための方法であって、改変された５’−ＵＴＲを含み、かつウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている核酸分子を含む宿主細胞を培養することを伴う、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は、脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である。
【００１８】
更なる態様では、いくつかの実施形態は、対象において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、改変された５’−ＵＴＲを含み、かつウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている核酸分子を対象に投与することを伴う、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、ウシ、豚類、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、又はバッファローである。
【００１９】
本開示による方法の実施形態の実装は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、改変レプリコンＲＮＡは、改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡである。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡは、改変アルファウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲは、１、２、４位、又はこれらの組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換は、Ｕ−＞Ｇ置換である。ある特定の実施形態では、改変レプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的部分を欠いている。ある特定の実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、１つ以上の発現カセットを更に含み、発現カセットのそれぞれは、異種核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットのうちの少なくとも１つのプロモーターは、２６Ｓサブゲノムプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットのうちの少なくとも１つのプロモーターは、アルファウイルス２６Ｓサブゲノムプロモーターを含む。好ましくは、プロモーターは、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥＶ）２６Ｓサブゲノムプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットのうちの少なくとも１つの異種核酸配列は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現するように最適化される。いくつかの実施形態では、異種核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーター配列を含む。好適な異種プロモーターとしては、脳心筋炎ウイルス（encephalomyocarditis  virus、ＥＭＣＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（Bovine  Viral  Diarrhea  Virus、ＢＶＤＶ）、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス（Foot-and-mouth  disease  virus、ＦＭＤ）、エンテロウイルス７１、又はＣ型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム進入部位（internal  ribosome  entry  site、ＩＲＥＳ）からの調節エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
いくつかの実施形態では、改変レプリコンＲＮＡは、トガウィルス科のアルファウイルス属に属するウイルスの改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群、ＳＦ群、又はＳＩＮ群に属するアルファウイルスのものである。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミデルビュルフウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングンヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バルマーフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロウイルス（ＷＨＡＶ）、バンバンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガッチウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドジェイウイルス（ＨＪＶ）、フォートモルガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、及びバギークリークウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、異種調節エレメントに操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、異種調節エレメントは、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、異種調節エレメントは、転写終結配列を含む。いくつかの実施形態では、転写終結配列は、Ｔ７終結配列であるか、又はそれを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲの２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、核酸分子は、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、配列番号２〜１８のうちの少なくとも１つの核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲの２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、配列番号２〜１８のうちの少なくとも１つの核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲを含む。
【００２４】
更なる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示される１つ以上の実施形態による方法によって産生される組み換えポリペプチドを提供する。
【００２５】
一態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組み換えポリペプチドを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、予防組成物、栄養補助組成物、医薬組成物、又はこれらの組み合わせである。
【００２６】
更なる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の核酸分子を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、予防組成物、栄養補助組成物、医薬組成物、又はこれらの組み合わせである。
【００２７】
更に他の態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組み換え細胞を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、予防組成物、栄養補助組成物、医薬組成物、又はこれらの組み合わせである。
【００２８】
前述の概要は、例示的なものにすぎず、多少なりとも限定することを意図するものではない。本明細書に記載される例示的な実施形態及び特徴に加えて、本出願の更なる態様、実施形態、目的及び特徴は、図面並びに発明を実施するための形態及び特許請求の範囲から完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】下記の代表的なアルファウイルスからの、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列アラインメントを示す：アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ；配列番号２）、チクングンヤウイルス（ＣＨＩＫＶ、配列番号３）、オニョンニョンウイルス（配列番号４、ＯＮＮＶ）、ベバルウイルス（配列番号５、ＢＥＢＶ）、セムリキ森林ウイルス（配列番号６、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ、ＳＦＶ）、マヤロウイルス（配列番号７、ＭＡＹＶ）、ゲタウイルス（配列番号８、ＧＥＴＶ）、サギヤマウイルス（配列番号９、ＳＡＧＶ）、ヌドゥムウイルス（配列番号１０、ＮＤＵＶ）、ミドルバーグウイルス（配列番号１１、ＭＩＤＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（配列番号１２、ＥＥＥＶ）、フォートモルガンウイルス（配列番号１３、ＦＭＶ）、バギークリークウイルス（配列番号１４、Ｂｕｇｇｙ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（配列番号１５、ＶＥＥＶ）、ワタロアウイルス（配列番号１６、ＷＨＡＶ）、シンドビスウイルス（配列番号１７、ＳＩＮＶ）、及びベバルウイルス（配列番号１８、ＢＥＢＶ）。図１Ａの配列アラインメントは、プログラムＭＵＳＣＬＥ  ３．６をデフォルト設定で使用して生成された。本明細書に示される配列アラインメントにおいて、最適なアライメントのためにプログラムＭＵＳＣＬＥ  ３．６によって作成されるアライメントされた配列におけるダッシュは、間隙、すなわち、その位置におけるヌクレオチドの欠如を表す。以下に詳述するように、この配列比較解析において、いくつかの保存ヌクレオチド残基が同定されている。アスタリスクは、アライメントされた配列間で同一のヌクレオチド残基を特定する。
【図１Ｂ】所与のアミノ酸を表記する文字のサイズが、モチーフを生成するために使用される異なる配列中の残基の保存に比例する（文字のサイズは、アラインメントされた配列間のその位置における残基の相対頻度を示す）重み付きコンセンサスとしてのコンセンサス配列のグラフ表現を示す。文字のサイズは、ビットで測定された情報コンテンツを反映する。
【００３０】
【図２】非限定的な例示的なベース一価ＶＥＥＶレプリコン設計のＲｅｐ−アルファの構造の概略図を示し、Ｒｅｐ−アルファは、Ｔ７プロモーター配列、本明細書に記載されるようなＵ２−＞Ｇ置換を有するＶＥＥＶ由来の５’ＵＴＲ配列、アルファウイルスゲノムの非構造ポリペプチドｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、及びｎｓｐ４のコード配列を含む。ベース一価ＶＥＥＶレプリコンＲｅｐ−アルファはまた、２６Ｓサブゲノムプロモーター配列、３’ＵＴＲ配列、Ｔ７終結配列、ポリアデニル化配列ポリＡ、及びレプリコンへの追加成分の挿入を促進するよう遺伝子操作されたいくつかの固有の制限部位を含有する。
【００３１】
【図３】２つの非限定的な例示的な一価ＶＥＥＶレプリコン設計の構造を図式的に示し、ここでは、ベクターに操作可能に組み込まれた目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、それぞれ、ベトナム１２０３ＨＡ遺伝子（図３）及び高感度緑色蛍光タンパク質（enhanced  green  fluorescence  protein、ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子（図４）であった。
【図４】２つの非限定的な例示的な一価ＶＥＥＶレプリコン設計の構造を図式的に示し、ここでは、ベクターに操作可能に組み込まれた目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、それぞれ、ベトナム１２０３ＨＡ遺伝子（図３）及び高感度緑色蛍光タンパク質（enhanced  green  fluorescence  protein、ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子（図４）であった。
【００３２】
【図５】改変ＶＥＥＶ−ＨＡレプリコンにおける５’ＵＴＲの２位におけるＵ２−＞Ｇ改変が、改変レプリコンの生物活性に影響を及ぼさないことを示す例示的な実験の結果をグラフで要約している。フローサイトメトリー分析（Flow  cytometry  analysis、ＦＡＣＳ）を、インフルエンザ赤血球凝集素ＨＡ遺伝子を発現している改変されたＵ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ＨＡレプリコンを用いて電気穿孔された細胞上で実施した（レプリコンの構造組織については図３も参照されたい）。野生型ＶＥＥＶ−ＨＡレプリコン（すなわち、２位にＵ残基を含有する）を対照として使用した。
【００３３】
【図６】５’ＵＴＲ中にＵ２−＞Ｇ改変を保有するアルファウイルスレプリコンからの発現が、任意の特定の目的の遺伝子（ＧＯＩ）に制限されないことを実証するために実施される例示的フローサイトメトリー分析の結果をグラフで要約する。この実験では、改変アルファウイルスレプリコンは、緑色蛍光タンパク質（green  fluorescent  protein、ＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現するよう遺伝子操作された（レプリコンの構造組織については図４も参照されたい）。改変ＶＥＥＶ−ＧＦＰレプリコンの５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ改変は、野生型対照レプリコンから検出された発現と比較して、ＧＦＰ遺伝子の発現を３倍まで向上させることが示された。
【００３４】
【図７】改変ＶＥＥＶレプリコンからの赤ホタルレポーター遺伝子の発現を評価する、更に別の例示的フローサイトメトリー分析の結果をグラフで要約する。この実験では、改変ＶＥＥＶ−ｒＦＦレプリコンの５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ改変は、野生型対照レプリコンから検出された発現と比較して、赤ホタル遺伝子の発現を２倍まで向上させることが示された。
【００３５】
【図８】非限定的な例示的なアルファウイルスゲノム構造及びゲノム発現を模式的に示す（Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｐｐ．４９１〜５６２，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９４から出典）。ＳＩＮウイルスのゲノム組織が示されている。非構造遺伝子及び構造タンパク質遺伝子の名称が与えられる。遺伝子及びタンパク質の命名法に関しては、上記Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４に見出すことができる。４９ＳゲノムＲＮＡは、その翻訳されたＯＲＦが白抜きのボックスとして示されて、中心に概略的に示されている。小さい黒色のボックスは、保存配列エレメントであり、白抜きのひし形は、漏出オパール終止コドンを示す。非構造ポリタンパク質及びその処理された産物は、上記に示されている。オパールコドンにおける終結は、その複製における主要な機能が、トランスに作用して活性ＲＮＡレプリカーゼにおけるポリタンパク質を処理するプロテイナーゼであると考えられるＰ１２３を産生する。このプロテイナーゼドメインは、ｎｓＰ２領域に見出される。オパール終止コドンのリードスルーにより、活性レプリカーゼを形成することができるＰ１２３４を産生する。２６ＳサブゲノムｍＲＮＡは、構造的ＯＲＦ及びその翻訳産物を示すために、以下に拡大される。ビリオン中に存在するポリペプチドは、網掛けされている。ｖｃＲＮＡは、ゲノムＲＮＡの負鎖相補体である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示の前述及び他の特徴は、添付の図面と併せて以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかとなるであろう。これらの図面は、本開示によるいくつかの実施形態のみを示しており、その範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解し、本開示は、添付の図面を使用して、追加の特異性及び詳細を用いて説明される。
【００３７】
本開示は、概して、組み換え細胞において、例えばワクチン及び治療用ポリペプチドなどの異種分子を発現するのに好適な、発現可能性に優れたウイルス発現系に関する。例えば、本開示のいくつかの実施形態は、改変された５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を含み、かつ任意選択的に、構造タンパク質をコードするその元々のウイルス配列のうちの少なくとも一部が欠失されている改変レプリコンＲＮＡを含有する発現構造体及びベクターなどの核酸構築物に関する。本開示のいくつかの実施形態によると、異種ポリペプチドをコードする１つ以上の発現カセットを含むウイルスベースの発現ベクターも含まれる。したがって、本明細書に開示される核酸分子のうちの１つ以上を含むように遺伝学的に改変された組み換え細胞、並びにかかる細胞由来の生体材料及び組み換え産物もまた、本出願の範囲内である。本開示の特定の態様では、本明細書に開示される分子及び／又は組み換え細胞のうちの１つ以上を含む組成物が更に提供される。
【００３８】
ＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス）に基づく自己増幅ＲＮＡ（レプリコン）を、堅牢な発現系として使用することができる。例えば、野生型ウイルス（例えば、アルファウイルス）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）への改変は、ＲＮＡ複製及びＲＮＡ転写の両方に関与するプロモーターエレメントを含む重要なＲＮＡヌクレオチドの切断を可能にすることができる。５’ＵＴＲ配列の操作による強化されたウイルス（例えば、アルファウイルス）発現系の開発は、レプリコンプラットフォーム開発における重要な進歩を表す。いかなる特定の理論にも制限されるものではないが、ウイルス発現ベクターとしてアルファウイルスを使用する非限定的な利点は、これらが組み換え宿主細胞中の多量の異種タンパク質の合成を導くことができるという点であると考えられる。具体的には、他の利点の中でも、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルファウイルスレプリコンプラットフォーム系は、アルファウイルスレプリコンから通常発現されるタンパク質の量の最大３倍発現することができる。この改善は、標準的なアルファウイルスレプリコン系に記載された既に自然に高い発現レベルを考慮すると有意であり、この能力を付与する５’ＵＴＲ変異は、アルファウイルスの複製及び転写に対するほぼ致死的な変異であると考えられた。例えば、治療用単鎖抗体などのポリペプチドは、インビボにおいて高レベルで発現される場合、最も効果的であり得る。加えて、培養物（エクスビボ）中の細胞から精製された組み換え抗体を産生するために、レプリコンＲＮＡからの高タンパク質発現は、抗体産物の全体的な収率を増加させ得る。更に、発現されるタンパク質がワクチン抗原である場合、高レベルの発現は、インビボで最も堅牢な免疫応答を誘導し得る。
【００３９】
以下の「発明を実施するための形態」では、その一部を形成する添付図面を参照する。図面において、同様の記号は、文脈がそうでない旨を指示しない限り、典型的には同様の構成要素を特定する。「発明を実施するための形態」、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な代替物は、限定することを意図するものではない。他の代替物を使用してもよく、本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の変更が行われてもよい。本明細書に概ね記載され、図面に示されるような態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、及び設計され得、これらの構成の全てが明示的に企図され、本出願の一部をなすものであることが容易に理解されるであろう。
【００４０】
別途定義のない限り、本明細書で使用される技術用語、表記用語、及び他の科学用語、又は用語は、本出願が関連する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。いくつかの場合では、一般的に理解される意味を有する用語は、明確にするため及び／又はすぐに参照できるように本明細書に定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、当該技術分野において一般的に理解されるものと実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。本明細書に記載又は参照される技術及び手順の多くは、当業者によって従来の方法を使用してよく理解され、一般的に用いられる。
いくつかの定義
【００４１】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでない旨を明確に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「細胞」は、１つ以上の細胞を含み、これらの混合物を含む。「Ａ及び／又はＢ」は、以下の選択肢：「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」、並びに「Ａ及びＢ」の全てを含むように本明細書で使用される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、その通常の意味をほぼ有する。近似の程度が文脈から別様に明らかでない場合、「約」は、提供された値のプラス若しくはマイナス１０％のいずれかを意味し、又は最も近い有意な数字に丸められていることを意味し、全ての場合において、提供された値を含む。範囲が提供される場合、それらは境界値を含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「細胞」、「細胞培養物」、「細胞株」、「組み換え宿主細胞」、「レシピエント細胞」、及び「宿主細胞」は、移入の数にかかわらず、初代対象細胞及びその任意の子孫を含む。全ての子孫は、親細胞と全く同一ではないことが理解されるべきである（意図的若しくは予期しない変異、又は環境における差異に起因する）が、このような改変された子孫は、子孫が元々形質転換された細胞と同じ機能を保持する限り、これらの用語に含まれる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「構築物」は、発現カセット、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポリヌクレオチド分子、ファージ、又は１つ以上の核酸配列が機能的操作方法で連結された核酸分子を含む、ゲノム組み込み又は自律複製が可能な任意の供給源から誘導される、直鎖若しくは円形、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド分子などの任意の組み換え核酸分子を意味するよう意図される。
【００４５】
用語「遺伝子」は、タンパク質をコードする、又は機能ＲＮＡに転写され得る核酸分子の任意のセグメントを指すために広く使用される。遺伝子は、転写されるが、最終、成熟、及び／又は機能ＲＮＡ転写物の一部ではない配列を含んでもよく、タンパク質をコードする遺伝子は、転写されるが翻訳されない配列、例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、イントロンなどを更に含んでもよい。更に、遺伝子は、任意に、それらの発現に必要な調節配列を更に含んでもよく、このような配列は、例えば、転写又は翻訳されていない配列であってもよい。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、又は既知の又は予想される配列情報からの合成を含む様々な供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。
【００４６】
用語「異種」は、ポリヌクレオチド、遺伝子、又は核酸分子に関して使用される場合、宿主種に由来しないポリヌクレオチド、遺伝子、又は核酸分子を指す。例えば、本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」又は「異種核酸配列」は、導入される宿主生物の種とは異なる種からの遺伝子又は核酸配列を指す。遺伝子調節配列、又は遺伝子配列（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列など）の発現を操作するために使用される補助核酸配列を、又はタンパク質ドメイン若しくはタンパク質局在配列をコードしている核酸配列を参照する場合、「異種」は、調節若しくは補助配列又はタンパク質ドメイン若しくは局在配列をコードする配列が、調節若しくは補助核酸配列又はタンパク質ドメイン若しくは局在化配列をコードする核酸配列がゲノム内に並置されている遺伝子とは異なる供給源からのものであることを意味する。したがって、その天然状態（例えば、遺伝子操作されていない生物のゲノムにおいて）操作可能に連結されていない遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターは、本明細書では、プロモーターが、それが連結される遺伝子と同じ種（又は場合によっては、同じ生物）から誘導され得るとしても、「異種プロモーター」と称される。例えば、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、目的の異種遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列は、その天然状態においてＥＡＶレプリコン配列に連結されていない。いくつかの実施形態では、コーディングＧＯＩ配列は、別のウイルス、細菌、真菌、ヒト細胞（例えば、腫瘍Ａｇ）、寄生虫（例えば、マラリア）などの別の生物由来である。
【００４７】
用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び核酸類似体を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む核酸分子を含むＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子の両方を指す。核酸分子は、任意の三次元構造を有することができる。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）であり得る。核酸分子の非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、核酸プローブ、及び核酸プライマーが挙げられる。核酸分子は、従来の又は改変されたヌクレオチドを含有してもよい。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド配列」及び「核酸配列」は、ポリヌクレオチド分子の配列を互換的に指す。米国特許法施行規則（３７  ＣＦＲ）第１．８２２条に記載されるヌクレオチド塩基の命名法が、本明細書で使用される。
【００４８】
核酸分子は、約３Ｋｂ〜約５０Ｋｂ、例えば、約３Ｋｂ〜約４０Ｋｂ、約３Ｋｂ〜約４０Ｋｂ、約３Ｋｂ〜約３０Ｋｂ、約３Ｋｂ〜約２０Ｋｂ、５Ｋｂ〜約４０Ｋｂ、約５Ｋｂ〜約４０Ｋｂ、約５Ｋｂ〜約３０Ｋｂ、約５Ｋｂ〜約２０Ｋｂ、又は約１０Ｋｂ〜約５０Ｋｂ、例えば、約１５Ｋｂ〜約３０Ｋｂ、約２０Ｋｂ〜約５０Ｋｂ、約２０Ｋｂ〜約４０Ｋｂ、約５Ｋｂ〜約２５Ｋｂ、若しくは約３０Ｋｂ〜約５０Ｋｂである核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない任意の長さの核酸分子であり得る。核酸分子は、例えば、５０Ｋｂ超であってもよい。
【００４９】
本開示のポリヌクレオチドは、核酸が別の核酸にハイブリダイズするための核酸の能力、又は転写因子及び／若しくは核酸ポリメラーゼによって認識及び結合されるポリヌクレオチド配列の能力などのいずれかの構造的な属性に対して、「生物学的に活性」であり得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「組み換え」又は「遺伝子操作された」核酸分子は、ヒトの介入により改変された核酸分子を指す。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、組み換えＤＮＡ分子であり、インビトロポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された任意の核酸分子、又はリンカーが取り付けられている任意の核酸分子であるか、又はクローニングベクター若しくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子である。非限定的な例として、組み換え核酸分子は、１）例えば、核酸分子の化学的若しくは酵素的技術を用いて（例えば、化学的核酸合成を使用することによって、又は複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ溶解性消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基改変（例えば、メチル化を含む）、又は組み換え（相同及び部位特異的組み換えを含む）に酵素を使用することによって）、インビボで合成又は改変された分子、２）本質的に結合されていない結合ヌクレオチド配列を含む分子、３）天然に生じる核酸分子配列に対して１つ以上のヌクレオチドを欠いているように、分子クローニング技術を用いて遺伝子操作された分子、及び／又は４）天然に生じる核酸配列に対して１つ以上の配列変化又は再配列を有するように、分子クローニング技術を使用して操作されている分子である。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、組み換えＤＮＡ分子であり、インビトロポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された任意の核酸分子、又はリンカーが取り付けられている任意の核酸分子であるか、又はクローニングベクター若しくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、ウイルス構造ポリペプチドをコードしている核酸配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価によるか、又はＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを用いたコンピュータ自動配列比較及び識別による（例えば、「Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９３を参照されたい）いずれかで、そのポリペプチドの推定同定を得るために、ウイルス構造ポリペプチドをコードする核酸配列の十分なものを含み得る。一般に、当業者は、既知のタンパク質又は遺伝子に相同なポリペプチド又は核酸配列を同定するために、１０個以上の連続するアミノ酸又は３０個以上のヌクレオチドの配列が必要であることを認識するであろう。更に、ヌクレオチド配列に関して、１５〜３０個の連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）及び単離（例えば、細菌コロニー又はバクテリオファージのプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）に使用することができる。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして、１０〜１５個の塩基の短いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片の特定の同定及び／又は単離をもたらすのに十分な配列を含む。本開示は、１つ以上のウイルス構造ポリペプチドをコードする部分的又は完全な核酸配列を欠いている核酸分子を提供する。本明細書に開示される配列の利益を享受する当業者は、当業者に既知の目的のために、開示される配列の全て又は実質的な部分を容易に使用することができる。したがって、本出願は、本明細書に開示される完全な配列、例えば、添付の配列表に記載されるもの、並びに上記に定義されるようなそれらの配列の実質的な部分を含む。
【００５２】
当業者には理解されるように、書面による説明を提供するという観点などのありとあらゆる目的のために、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意の及び全ての可能な部分範囲及びそれらの部分範囲の組み合わせを包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が、少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されることを十分に記述し、かつ可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で説明される各範囲は、下部３分の１、中間３分の１、及び上部３分の１などに容易に分解することができる。当業者には理解されるように、「最大で」、「少なくとも」、「〜を超える」、「未満」などの全ての言語は、列挙された数を含み、続いて上述のように部分範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は、各個々の成員を含む。したがって、例えば、１〜３個の物品を有する群は、１、２、又は３個の物品を有する群を指す。同様に、１〜５個の物品を有する群は、１、２、３、４、又は５個の物品などを有する群を指す。
【００５３】
本明細書で提供される一般的な方法の説明は、例示目的を意図しているにすぎない。他の代替的な方法及び代替物は、本出願を検討する際に当業者には明らかであり、本出願の趣旨及び意図の範囲内に含まれるものである。
アルファウイルス
【００５４】
アルファウイルスは、ウイルススパイクタンパク質を含有するエンベロープによって囲まれたヌクレオキャプシド内に封入された正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムをそれぞれが有する、少なくとも３０のメンバーを含むＩＶ群のトガウィルス科の遺伝子的、構造的、及び血清学的に関連するウイルスの属である。現在、アルファウイルス属は、とりわけ、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、及び東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）を含み、これらは全て密接に関連し、哺乳類、げっ歯類、魚類、鳥類種、並びにヒト及びウマなどのより大きな哺乳動物、並びに昆虫などの脊椎動物に感染することが可能である。種と個体との間の伝染は、主に蚊を介して発生し、アルファウイルスを、アルボウイルス又は節足動物媒介ウイルスの集団への寄与体にさせる。具体的には、シンドビスウイルス及びセムリキ森林ウイルスは広く研究されており、これらのウイルスのライフサイクル、複製様式などがよく特徴付けられている。特に、アルファウイルスは、動物細胞において非常に効率的に複製することが示されており、このことは、アルファウイルスをこのような細胞におけるタンパク質及び核酸の産生のためのベクターとして有用にする。
【００５５】
アルファウイルス粒子は包まれており、７０ｎｍの直径を有し、球状である傾向があり（わずかに多形性であるが）、約４０ｎｍのアイソメトリックヌクレオキャプシドを有する。図８は、典型的なアルファウイルスゲノム構造及びゲノム発現を示す（Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｐｐ．４９１〜５６２，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９４から出典）。アルファウイルスゲノムは、長さ約１１〜１２Ｋｂの正極性の一本鎖ＲＮＡであり、５’キャップ、３’ポリＡテール、及び酵素機能を有する非構造タンパク質をコードする第１のフレームを有する２つのオープンリーディングフレーム並びにウイルス構造タンパク質（例えば、キャプシドタンパク質Ｃ、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、Ｅ３タンパク質、及び６Ｋタンパク質）をコードする第２のフレームを含む。
【００５６】
アルファウイルスゲノムの５’の３分の２は、ウイルスＲＮＡの転写及び複製に必要な多数の非構造タンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ＲＮＡから直接翻訳され、細胞タンパク質と共に、ウイルスゲノム複製及びサブゲノムＲＮＡの転写に不可欠なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを形成する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１〜４）は、単一のポリタンパク質として生成され、未使用の複製機構を構成する。ポリタンパク質の処理は、高度に調節された方法で行われ、ゲノム複製中にＲＮＡテンプレートの使用に影響を及ぼすＰ２／３接合における切断を伴う。この部位は、狭い裂溝の基部に位置し、容易にはアクセスできない。切断されると、ｎｓＰ３は、ｎｓＰ２を取り囲むリング構造を形成する。これら２つのタンパク質は、広範囲の界面を有する。ｎｓＰ２における変異は、脂肪障害のないウイルス又はＰ２／Ｐ３界面領域における温度感受性表現型クラスターを産生する。ｎｓＰ２の細胞障害のない変異の位置と反対のＰ３変異は、Ｐ２／３の効率的な切断を防止する。これは、次には、ウイルスＲＮＡの産生レベルを変化させるＲＮＡ感染性に影響を及ぼし得る。
【００５７】
ゲノムの３’の３分の１は、ウイルス粒子を形成するために必要とされる全ての構造タンパク質の翻訳のためのテンプレートとして機能するサブゲノムＲＮＡと、コアヌクレオキャプシドタンパク質Ｃと、ヘテロ二量体と会合するエンベロープタンパク質Ｐ６２及びＥ１とを含む。ウイルス膜にアンカーされた表面糖タンパク質は、受容体認識に関与し、膜融合を介して標的細胞に進入する。サブゲノムＲＮＡは、ｎｓｐ４タンパク質をコードするＲＮＡ配列の３’末端に存在するｐ２６Ｓサブゲノムプロモーターから転写される。Ｐ６２のＥ２及びＥ３へのタンパク質分解性成熟は、ウイルス表面の変化を引き起こす。Ｅ１、Ｅ２、及び時にはＥ３、糖タンパク質「スパイク」は一緒に、Ｅ１／Ｅ２二量体又はＥ１／Ｅ２／Ｅ３三量体を形成し、ここでは、Ｅ２は中心から頂点まで延在し、Ｅ１は頂点間の空間を満たし、Ｅ３は存在する場合は、スパイクの遠位端にある。ウイルスをエンドソームの酸性度に曝露させると、Ｅ１はＥ２から解離してＥ１ホモ三量体を形成し、このＥ１ホモ三量体は、細胞及びウイルス膜を一緒に駆動させる融合工程に必要である。アルファウイルスタンパク質Ｅ１は、インフルエンザウイルス及びＨＩＶに見られるクラスＩ融合タンパク質と構造的に異なるクラスＩＩウイルス融合タンパク質である。Ｅ２糖タンパク質は、細胞質ドメインを介してヌクレオキャプシドと相互作用するように機能し、その一方で、そのエクトドメインは細胞受容体の結合に関与する。ほとんどのアルファウイルスは、周辺タンパク質Ｅ３を失い、その一方で、セムリキウイルスでは、それはウイルス表面に会合したままである。
【００５８】
アルファウイルス複製は、細胞の細胞質内で行われることが報告されている。感染性サイクルの第１の工程では、ゲノムＲＮＡの５’末端は、ゲノムＲＮＡに相補的な負鎖を生成するＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリタンパク質（ｎｓＰ１〜４）に翻訳される。第２の工程では、負鎖は、２つのＲＮＡ：（１）翻訳により、他のｎｓｐタンパク質を産生し、ウイルスに対するゲノムとして作用する、二次ウイルスのゲノムに対応する正のゲノムＲＮＡ、及び（２）感染性粒子を形成するウイルスの構造タンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡの産生のためのテンプレートとしてそれぞれ使用される。正のゲノムＲＮＡ／サブゲノムＲＮＡの比は、ポリタンパク質のｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３及びｎｓｐ４へのタンパク質分解性自己切断によって調節される。実際には、ウイルス遺伝子発現は、２つの相で行われる。第１の相では、正のゲノム鎖の主な合成及び負鎖の主な合成が存在する。第２の相中では、サブゲノムＲＮＡの合成は実質的に排他的であり、したがって大量の構造タンパク質の産生をもたらす。
【００５９】
アルファウイルスの５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の以前の詳細解析は、ＲＮＡ複製及び転写をサポートするために、最末端の５’ヌクレオチドの絶対的重要性を明らかにしている。具体的には、図１に示されるように、５’ＵＴＲ配列のヌクレオチド１位及び２位におけるＡＵジヌクレオチドの保存は、これらのヌクレオチドの重要性を示唆する全てのアルファウイルスの中でも注目される。本明細書で使用するとき、「Ａ１」は、５’ＵＴＲ（例えば、アルファウイルス５’−ＵＴＲ）のヌクレオチドの１位における保存ヌクレオチドを指し、「Ｕ２」は、５’ＵＴＲ（例えば、アルファウイルス５’−ＵＴＲ）のヌクレオチドの２位における保存Ｕヌクレオチドを指す。更に、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）については、５’の大部分の３つのヌクレオチド並びにこの配列の直後に見出されるステムループ領域の詳細な解析が行われている。具体的には、５’ＵＴＲの２位におけるＵ残基の維持の重要性は、以前に決定されている（Ｋｕｌａｓｅｇａｒａｎ−Ｓｈｙｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１７  ｐ８３２７〜８３３９，２００９ａ；及びＫｕｌａｓｅｇａｒａｎ−Ｓｈｙｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１７  ｐ８３２７〜８３３９，２００９ｂ）。具体的には、５’ＵＴＲにおける単一のＵ２−＞Ｇ変化を含有する（Ｇ２）ＶＥＥ／ＳＩＮＶと表示される完全長感染性クローンからのインビトロ転写ＲＮＡは、野生型ＶＥＥ／ＳＩＮＶ感染性クローンからのインビトロ転写ＲＮＡと比較して、感染性のほとんど３ログの喪失を示した。この報告は、２位におけるＵがＲＮＡ複製に重要であり、Ｇと置き換えることができないことを強く示唆している。しかしながら、本明細書に詳細に記載されるように、５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇの変化を有するＶＥＥＶレプリコンは、驚くべきことに、かつこの以前の報告と直接矛盾して、完全に堅牢な複製が可能であるだけでなく、２位にＵ残基を含有する野生型５’ＵＴＲと比較して、３倍のＶＥＥＶレプリコンの発現可能性をもたらす。
【００６０】
ほとんどのＲＮＡウイルスの最末端５’及び３’配列は、高度に拘束され、任意の変異が許容される場合にはわずかであり、ほとんどの改変は、ＲＮＡ複製のために、大きな損傷を与えるか、又は致死的な結果をもたらす。Ｋｕｌａｓｅｇａｒａｎ  Ｓｈｙｌｉｎｉらは、全てのアルファウイルスを代表するキメラＶＥＥＶ／ＳＩＮＶ感染性クローンのＲＮＡ複製に重要な５’ヌクレオチド配列の徹底的な分析を完了した（上記、Ｋｕｌａｓｅｇａｒａｎ  Ｓｈｙｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９ａ）。この報告は、任意の特定のアルファウイルスの５’末端で生じ得るＲＮＡ配列変異の制限を明確に裏付ける多くの研究者によって、２５年の過程で行われた分析に組み込まれた。Ｋｕｌａｓｅｇａｒａｎ−Ｓｈｙｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９ｂの論文（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１７  ｐ８３２７〜８３３９，２００９）は、５’ＵＴＲ中のヌクレオチド２位を、Ｕ残基からＧ残基に変化させると（Ｕ２−＞Ｇ）と、その感染性クローンＲＮＡの生存率を著しく低下させることを具体的に明言する／示す。すなわち、５’−ＵＴＲにおける特異的な変化は、感染性クローンＲＮＡの生物学的活性をほぼ３桁低下させた。本明細書に開示されるように、ＶＥＥＶ（ＴＣ−８３株）に組み込まれた５’−ＵＴＲにおける変化（例えば、Ｕ２−＞Ｇの変化）は、レプリコンの複製に大きな損傷を与えないだけではなく、レプリコンの生物活性を実際に増加させることができる。例えば、Ｕ２−＞Ｇ置換を含むレプリコンは、いくつかの実施形態では、同じタンパク質を発現している野生型レプリコンよりも３倍多くの目的のタンパク質の発現をもたらすことができる。この結果は驚くべきことであり、Ｕ２−＞Ｇ変化を保有するレプリコンの生物学的活性の増加は予測されなかった。この改変レプリコンは、ワクチン及び治療用途の両方を支援するために、優れたＲＮＡ発現プラットフォームである可能性を有する。
【００６１】
５’の大部分の２つのヌクレオチドの保存は、アルファウイルスサブタイプのゲノムＲＮＡの全てにわたって観察されている。保存ＡＵジヌクレオチド（Ａ１及びＵ２）はまた、ＲＮＡ複製には、非常に必要とされることが示されている（上記、Ｋｕｌａｓｅｇａｒａｎ−Ｓｈｙｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９ａ及び２００９ｂ）。最末端の５’末端にＡＧジヌクレオチドを保有するアルファウイルスレプリコンＲＮＡが完全に機能的であるだけでなく、生物学的活性の増強を示すことの実証は、驚くべきことであり、本分野の教義には全く反している。
【００６２】
本明細書に開示されるように、単遺伝子型又は多遺伝子型アルファウイルス発現系は、例えば、改変された５’−ＵＴＲを含有するレプリコンＲＮＡなどの発現／翻訳促進活性を有する改変レプリコンＲＮＡを使用することによって生成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウイルス（例えば、アルファウイルス）発現系は、１つ以上のウイルス構造タンパク質のコード領域の一部又は全体を更に欠いている。例えば、アルファウイルス発現系は、ウイルスキャプシドタンパク質Ｃ、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、Ｅ３タンパク質、及び６Ｋタンパク質のうちの１つ以上に対するコード配列の一部又は全体を欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）５’ＵＴＲ配列のｃＤＮＡコピー中の２位のヌクレオチドの、チミン（Ｔ）ヌクレオチドからグアニン（Ｇ）ヌクレオチドへの改変（Ｔ２−＞Ｇ変位）は、レプリコンＲＮＡに関して、野生型５’ＵＴＲ配列を有するＶＥＥＶレプリコンと比較して、有意に高いタンパク質発現能力を有するレプリコンを与える。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変レプリコンＲＮＡの発現及び／又は翻訳促進活性のレベルは、対応する未改変レプリコン、例えば、野生型５’ＵＴＲを有するレプリコンから検出される発現レベルに対して、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２（２倍）、３、４、５、６、７、８倍以上である。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、翻訳の向上は、翻訳に利用可能である転写の増加したレベルをもたらす転写の向上に起因する場合があり、及び／又は転写とは無関係であり、例えば、リボソーム結合の増強に起因する場合がある。活性のレベルの増強は、転写物レベル、タンパク質の量、タンパク質活性などが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の便利な方法及び技術によって測定することができる（例えば、以下の実施例１、３〜５を参照されたい）。
核酸分子
【００６４】
一態様では、改変レプリコンＲＮＡを含む新規の核酸分子が本明細書に開示される。例えば、改変レプリコンＲＮＡは、親レプリコンＲＮＡの元々のゲノム領域（例えば、オープンリーディングフレーム（open  reading  frame、ＯＲＦ）及び／又は非コード領域（例えば、プロモーター配列））のうちの１つ以上に変異（複数可）、欠失（複数可）、置換（複数可）、及び／又は挿入（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態では、改変レプリコンＲＮＡは、改変５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲは、１、２、４位、又はこれらの組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変された５’−ＵＴＲの１位におけるヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変された５’−ＵＴＲの４位におけるヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換は、Ｕ−＞Ｇ置換である。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換は、Ｕ−＞Ａ置換である。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換は、Ｕ−＞Ｃ置換である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「レプリコンＲＮＡ」は、許容細胞内でそれ自体の増幅又は自己複製を誘導するために必要な遺伝情報の全てを含有するＲＮＡを指す。ＲＮＡ分子は、それ自体の複製を指示するために、１）ポリメラーゼ、レプリカーゼ、又はウイルス若しくは宿主細胞由来タンパク質、核酸、又はリボ核酸と相互作用してＲＮＡ増幅プロセスを触媒し得る他のタンパク質をコードし、及び２）サブゲノムレプリコンコード化ＲＮＡの複製及び転写に必要なシスに働くＲＮＡ配列を含有する。これらの配列は、自己コード化タンパク質、又は非自己コード化細胞由来タンパク質、核酸若しくはリボ核酸タンパク質、又はこれらの構成成分のいずれかの間の複合体への複製プロセス中に結合されてもよい。本開示の目的のために、アルファウイルス由来のレプリコンＲＮＡ分子は、典型的には、以下の順序のエレメント：複製のためにシスに必要とされる５’ウイルス又は欠陥干渉ＲＮＡ配列（複数可）、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４）、複製のためにシスに必要とされる３’ウイルス配列、及びポリアデニル酸経路を含有する。更に、レプリコンＲＮＡという用語は、一般に、正極性、又は「メッセージ」センスの分子を指し、レプリコンＲＮＡは、任意の既知の天然に生じるアルファウイルスとは異なる長さであってもよい。本開示のいくつかの実施形態では、レプリコンＲＮＡは、構造ウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つの配列を含有しない。構造遺伝子をコードする配列は、異種配列で置換され得る。レプリコンＲＮＡが組み換えアルファウイルス粒子にパッケージ化される場合、それは、粒子形成につながるアルファウイルス構造タンパク質との相互作用を開始する役割を果たす１つ以上の配列、いわゆるパッケージングシグナルを含有しなければならない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「サブゲノムＲＮＡ」は、それが由来するゲノムＲＮＡよりも小さい長さ又はサイズのＲＮＡ分子を指す。アルファウイルスサブゲノムＲＮＡは、その配列がゲノムＲＮＡ又はその相補体内に存在する内部プロモーターから転写されるべきである。アルファウイルスサブゲノムＲＮＡの転写は、宿主細胞コード化タンパク質、リボ核酸タンパク質、又はこれらの組み合わせと関連するウイルスコード化ポリメラーゼ（複数可）によって媒介され得る。本開示のいくつかの実施形態では、サブゲノムＲＮＡは、本明細書に開示されるような改変レプリコンＲＮＡから産生され、１つ以上の目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコード又は発現する。天然のサブゲノムプロモーターの代わりに、サブゲノムＲＮＡは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤ）、エンテロウイルス７１、又はＣ型肝炎ウイルスに由来する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下に置かれてもよい。
【００６７】
したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルス構造タンパク質に対するコード配列の一部又は全体は、本明細書に開示される核酸分子中で存在しない、及び／又は改変される。したがって、いくつかの特定の実施形態では、本明細書に開示される改変レプリコンＲＮＡは、改変された５’−ＵＴＲを含み、かつ１つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いており、例えば、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の最初の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、構造ポリペプチドＥ１、Ｅ２、Ｅ３、６Ｋ、及びキャプシドタンパク質Ｃのうちの１つ以上をコードする配列の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上を欠くことができる。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、構造ポリペプチドＥ１、Ｅ２、Ｅ３、６Ｋ、及びキャプシドタンパク質Ｃのうちの１つ以上をコードする配列の実質的な部分又は全配列を欠いている。本明細書で使用される場合、ウイルス構造タンパク質をコードしている核酸配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価によるか、又はＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを用いたコンピュータ自動配列比較及び識別による（例えば、上記、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．１９９３を参照されたい）のいずれかで、そのタンパク質の推定同定を得るために、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の十分なものを含む。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、構造ポリペプチドＥ１、Ｅ２、Ｅ３、６Ｋ、及びキャプシドタンパク質Ｃのうちの１つ以上をコードする全配列を欠いている。
【００６８】
本出願のいくつかの特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含む改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、核酸分子は、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、かつウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１の核酸配列と１００％の配列同一性を示す。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含み、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、本明細書に開示される少なくとも１つの５’−ＵＴＲの核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲ及び５’−ＵＴＲの２位におけるＵ−＞Ｇ置換を含み、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ウイルス構造タンパク質をコードする配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、配列番号２〜１８に記載の配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、配列番号２〜１８に記載される配列のうちの少なくとも１つと、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、配列表の配列番号２〜１８に記載の配列のうちの少なくとも１つと１００％の配列同一性を示す５’−ＵＴＲを含む。
【００７０】
本明細書に開示される５’ＵＴＲの核酸配列と高度の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）を有する核酸分子は、本明細書で特定される配列（例えば、配列番号１〜１８）、又は任意の他のアルファウイルス５’ＵＴＲ（これらは当該技術分野において既知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ登録番号Ｊ０２３６３、ＮＣ＿００１５４７、Ｕ３８３０５、Ｌ０４６５３、ＮＣ＿００１４４９、Ｕ３８３０４、Ｘ０４１２９、ＮＣ＿００３２１５を有する配列）、及びＴＲ３３９ゲノム配列（Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３５７，１９８８；ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１９８１，１９９６）を使用し、ゲノム配列解析、ハイブリダイゼーション及び／又はそれぞれのアルファウイルスゲノムにおいて同定された配列からの縮重プライマー若しくは遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、同定及び／又は単離することができる。本明細書で使用される場合、「配列同一性」とは、２つの最適にアライメントされたポリヌクレオチドが、例えばヌクレオチドなどの構成要素のアライメントの窓を通して不変である程度を指す。試験配列及び参照配列のアライメントされたセグメントに対する「同一性画分」は、参照配列セグメント内の構成成分の総数、例えば、参照配列全体又は参照配列のより小さい定義された部分によって分割された、２つのアライメントされた配列によって共有される同一の構成要素の数である。
【００７１】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、改変レプリコンＲＮＡを含む核酸分子に関し、改変レプリコンＲＮＡは、例えば、翻訳促進活性を有する５’ＵＴＲなどの改変アルファウイルス塩基配列を含む。このような改変レプリコンＲＮＡを使用して、所望の産物をコードする異種核酸配列（例えば、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）の発現レベルの向上を達成することができる。いくつかの実施形態では、改変レプリコンＲＮＡを使用して、例えば細胞培養中の細胞であってもよく、又は生体内の細胞であってもよい細胞内に改変レプリコンを導入した後に、所望の産物をコードする異種核酸配列（例えば、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）の発現レベルの向上を達成する。
【００７２】
加えて、いくつかの実施形態では、核酸分子は、ウイルス操作及び／又は投与の安全性を高めるために、１つ以上の弱毒化変異を含有する改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを含むことができる。本明細書で使用される場合、語句「弱毒化変異」とは、その変異が、置換変異であるか、又はインフレーム欠失あるか、又は挿入変異であるかの当該技術分野における標準的な用語に従って、その宿主において疾患確率の減少をもたらすような変異の観点からのヌクレオチド変異又はコードされたアミノ酸を意味する。弱毒化変異は、アルファウイルスゲノムのコード領域又は非コード領域（例えば、５’−ＵＴＲ）内にあり得る。当業者に既知のように、語句「弱毒化変異」は、ウイルスに対して致死的である変異又は変異の組み合わせを除外する。更に、当業者であれば、一部の弱毒化変異は、第２のサプレッサ変異の非存在下で致死的であり得ることを理解するであろう。
【００７３】
これらの新規核酸分子が構築され、特徴付けられた分子技術及び方法は、本出願の実施例において、より完全に記載される。実施例の項では、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）が、本明細書に開示される組成物及び方法を例示するために使用されている。
【００７４】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、組み換え核酸分子である。本明細書で使用される場合、用語「組み換え」は、任意の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド）を意味し、すなわち、間接的ではあるが、ヒトの操作からもたらされる。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、組み換えＤＮＡ分子であり、インビトロポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された任意の核酸分子、又はリンカーが取り付けられている任意の核酸分子であるか、又はクローニングベクター若しくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子である。非限定的な例として、組み換え核酸分子は、１）例えば、核酸分子の化学的若しくは酵素的技術を用いて（例えば、化学的核酸合成を使用することによって、又は複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ溶解性消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基改変（例えば、メチル化を含む）、又は組み換え（相同及び部位特異的組み換えを含む）に酵素を使用することによって）、インビボで合成又は改変された分子、２）本質的に結合されていない結合ヌクレオチド配列を含む分子、３）天然に生じるヌクレオチド配列に対して１つ以上のヌクレオチドを欠いているように、分子クローニング技術を用いて遺伝子操作された分子、及び／又は４）天然に生じるヌクレオチド配列に対して１つ以上の配列変化又は再配列を有するように、分子クローニング技術を使用して操作されている分子である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、組み換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニングなど）又は化学合成を使用して産生される。本明細書に開示される核酸分子としては、天然の核酸分子及びそのホモログが挙げられ、これらには、天然の対立遺伝子変異体、１つ以上のヌクレオチド残基が挿入され、欠失され、及び／又は置換される（このような改変が、本明細書に記載されるような生物活性をもたらすことで所望の特性を提供するような方法で）改変核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
天然に生じる核酸配列の変異体を含む核酸分子は、当業者に既知の数多くの方法を使用して生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。核酸分子の配列は、限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発、変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素開裂、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択された領域のＰＣＲ増幅及び／又は変異誘発、組み換えクローニング、並びに、オリゴヌクレオチド混合物の化学合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、伝統的な突然変異誘発技術及び組み換えＤＮＡ技術が挙げられる様々な技術を用いて、その核酸分子の配列が誘導される天然に生じる配列に対して改変され得る。核酸分子ホモログは、核酸分子によってコードされるタンパク質若しくはレプリコンの機能をスクリーニングすることによって、及び／又は野生型遺伝子若しくはその断片とのハイブリダイゼーションによって、又は標的若しくは野生型核酸分子あるいは配列と相同性を有するプライマーを使用するＰＣＲによって、改変された核酸分子の混合物から選択することができる。
【００７７】
本明細書に開示される様々な実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、改変レプリコンＲＮＡは、改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡである。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスレプリコンＲＮＡは、改変アルファウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、改変された５’−ＵＴＲは、１、２、４位、又はこれらの組み合わせにおける１つ以上のヌクレオチド置換を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換である。いくつかの特定の実施形態では、改変された５’−ＵＴＲの２位におけるヌクレオチド置換は、Ｕ−＞Ｇ置換である。
【００７８】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、異種調節エレメントに操作可能に連結される。本明細書で使用するとき、「調節エレメント」、「調節配列」、又は「調節エレメント配列」は、例えば、ポリペプチドコード配列又は機能ＲＮＡコード配列などのコード配列の上流（５’）に、その内部に、又は下流（３’）に位置するヌクレオチド配列を指す。コード配列の転写及び／又はコード配列の転写から生じるＲＮＡ分子の翻訳は、典型的には、調節エレメントの存在又は非存在によって影響を受ける。これらの調節エレメントは、プロモーター、シス−エレメント、エンハンサー、ターミネーター、又はイントロンを含んでもよい。当業者であれば、本明細書に記載される調節エレメントが、キメラ又はハイブリッド調節発現エレメント内に存在し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、異種調節エレメントは、プロモーター配列であるか、又はこれを含む。異種プロモーター配列は、任意の異種プロモーター配列、例えば、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター、若しくはＴ７プロモーター、又はこれらの組み合わせであり得る。いくつかの特定の実施形態では、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列を含む。
【００７９】
更に、いくつかの実施形態では、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、１つ以上の異種転写終結シグナル配列を含み得る。本明細書で互換的に使用される用語「転写終結シグナル」、「ターミネーター」、又は「ターミネーター配列」若しくは「転写ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を停止させる遺伝子配列の調節部分を指す。異種転写終結シグナル配列は、一般に、任意の異種転写終結シグナル配列、例えば、ＳＰ６終結シグナル配列、Ｔ３終結シグナル配列、Ｔ７終結シグナル配列、又はこれらの変異体であり得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態による核酸分子は、ＳＰ６終結シグナル配列、Ｔ３終結シグナル配列、Ｔ７終結シグナル配列、又はこれらの変異体からなる群から選択される１つ以上の異種転写終結シグナル配列のうちの少なくとも１つを含むことができる。いくつかの特定の実施形態では、転写終結配列は、Ｔ７終結シグナル配列を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、１つ以上の発現カセットを含むことができる。原則として、本明細書に開示される核酸分子は、任意の個数の発現カセットを含むことができる。いくつかの特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの発現カセットを含むことができる。本明細書で使用される場合、用語「発現カセット」は、コード配列と、インビボ及び／又はエクスビボにおいてレシピエント細胞内のコード配列の適切な転写及び／又は翻訳を指示するのに十分な調節情報とを含有する遺伝物質の構築物を指す。発現カセットは、所望の宿主細胞及び／又は対象に標的化するためにベクターに挿入されてもよい。更に、発現カセットという用語は、用語「発現構築物」と互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、用語「発現カセット」は、例えば、プロモーター及び／又は終結シグナルなどの調節エレメントに、並びに任意に、遺伝子の転写又は翻訳に影響を及ぼす他の核酸配列のいずれか、又はそれらの組み合わせに操作可能に連結された、タンパク質又は機能ＲＮＡをコードする遺伝子を含む核酸構築物を指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「操作可能に連結された」は、２つ以上の配列間の機能的連結を示す。例えば、目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の操作可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。この意味で、用語「操作可能に連結された」は、調節領域が目的のコード配列の転写又は翻訳を調節するのに有効であるように転写される調節領域及びコード配列の位置決めを指す。本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、用語「操作可能に連結された」は、制御配列が、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ポリペプチド、及び／又は機能ＲＮＡの発現若しくは細胞局在を指示又は調節するように、調節配列がポリペプチド又は機能ＲＮＡをコードする配列に対して適切な位置に配置される構成を意味する。したがって、プロモーターが、核酸配列の転写を媒介することができる場合、プロモーターは核酸配列と操作可能に連結している。操作可能に連結されたエレメントは、連続的であっても非連続的であってもよい。
【００８２】
２つ以上のＤＮＡの配列を互いに操作可能に連結する基本的な技術は、当業者によく知られており、このような方法は、標準的な分子学的操作のための数多くの文献に記載されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；及びＧｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：３４３〜４５，２００９を参照されたい）。
【００８３】
したがって、本明細書で提供される核酸分子は、例えば、異種核酸配列に操作可能に連結された調節エレメントを含む場合、異種核酸配列の発現に影響を及ぼし得る発現ベクターとして使用することができる。いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現するように最適化される。いくつかの実施形態では、参照コード配列は、最適化されていない配列である。いくつかの実施形態では、ＧＯＩコード配列の最適化は、配列最適化を含むことができる。ヌクレオチド配列の配列最適化に関して、遺伝子コードの縮重は、変更される遺伝子から産生されたポリペプチドのアミノ酸配列を生じさせることなく、異なる塩基で遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を置換する可能性を提供する。したがって、本出願の核酸分子はまた、遺伝子コードの縮重による置換によって本明細書に開示される任意のポリヌクレオチド配列から変更された任意の塩基配列を有してもよい。コドン使用について説明する参考文献は、容易に公的に入手可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列変異体は、例えば、特定の宿主の発現を最適化する（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、又はサルなどの他の生物によって好ましいものに、アルファウイルスｍＲＮＡ中のコドン使用を変更する）ために、様々な理由で産生され得る。
【００８４】
ＧＯＩによりコードされるポリペプチドは、一般に任意のポリペプチドであってよく、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、又は工業用酵素であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫調節因子、及びサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、所望の特性のために最適化される。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現するように最適化される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、トガウィルス科のアルファウイルス属に属するウイルス種のゲノム又はレプリコンＲＮＡなどのゲノム又はレプリコンＲＮＡである。いくつかの実施形態では、改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群、又はＳＦ群、又はＳＩＮ群に属するアルファウイルスのものである（検討用に、例えば、Ｓｔｒａｕｓｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：３  ｐ４９２〜５６２，１９９４を参照されたい）。ＳＦ群アルファウイルスの非限定的な例としては、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ミドルバーグウイルス、チクングンヤウイルス、バーマフォレストウイルス、ゲタウイルス、マヤロウイルス、サギヤマウイルス、ベマルウイルス、及びウナウイルスが挙げられる。ＳＩＮ群のアルファウイルスの非限定的な例としては、シンドビスウイルス、ガードウッド（Ｇｉｒｄｗｏｏｄ）Ｓ．Ａ．ウイルス、南アフリカアルボウイルス（Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ）Ｎｏ．８６、オケルボ（Ｏｃｋｅｌｂｏ）ウイルス、アウラウイルス、ババンキウイルス、ワタロアウイルス、及びキジラガッチウイルスが挙げられる。ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群アルファウイルスの非限定的な例としては、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミッドバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングンヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルスＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベマルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、及びウナウイルス（ＵＮＡＶ）が挙げられる。
【００８７】
アルファウイルス種の非限定的な例としては、アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングンヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガッチウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドジェイウイルス（ＨＪＶ）、フォートモルガンウイルス（ＦＭＶ）、ヌドゥムウイルス（ＮＤＵＶ）、及びバギークリークウイルスが挙げられる。毒性及び非毒性アルファウイルス株は、両方とも好適である。いくつかの特定の実施形態では、改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、又は東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）のものである。いくつかの実施形態では、改変ゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のものである。
組み換え細胞
【００８８】
一態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、動物細胞、本明細書で提供される核酸分子を動物細胞などの宿主細胞に導入することと、形質転換された細胞を選択又はスクリーニングすることと、を含む、細胞を形質転換する方法に関する。用語「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」は、本明細書において互換的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫又は可能性のある子孫を指すことが理解される。突然変異又は環境影響のいずれかにより後続世代において特定の改変が生じ得るため、このような子孫は、実際には親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書で使用される用語の範囲内になお含まれる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、電気穿孔法又は遺伝子銃処置によって宿主細胞に導入される。
【００８９】
関連する態様では、いくつかの実施形態は、組み換え宿主細胞、例えば、本明細書に記載の核酸分子を含む組み換え動物細胞に関する。核酸分子は、宿主ゲノムに安定的に組み込まれてもよく、又は安定的若しくは一過的発現のためのミニサークル発現ベクターとして組み換え宿主細胞内に存在してもよい。したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、核酸分子は、エピソームユニットとして組み換え宿主細胞内で維持され、複製される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、組み換え細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。安定な組み込みは、古典的なランダムゲノム組み換え技術を使用して、又はガイドＲＮＡ依存性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、又はＤＮＡ誘導エンドヌクレアーゼゲノム編集ＮｇＡｇｏ（硬度好塩菌（Natronobacterium  gregoryi）のアルゴノート）、若しくはＴＡＬＥＮゲノム編集（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）の使用などのより正確なゲノム編集技術を用いて、安定な組み込みを完了することができる。いくつかの実施形態では、組み換え宿主細胞中に存在する核酸分子は、安定な発現又は一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして存在する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、例えば、宿主細胞は、例えば、宿主細胞のゲノムの一部に相同な核酸配列を含む相同組み換えのためのベクターであり得るか、又は目的の遺伝子のいずれか、若しくはそれらの組み合わせの発現のための発現ベクターであり得る、本出願のベクター構築物を用いて遺伝子操作（例えば、形質導入又は形質転換若しくはトランスフェクト）され得る。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドを発現させるためのベクターは、例えば、相同組み換えによって宿主への組み込みのために設計することができる。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、例えば、改変アルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ、並びに任意選択的に選択マーカー又はレポーター遺伝子を含む核酸分子を用いて、適切な宿主細胞を形質転換することができる。
【００９１】
本明細書に開示される方法及び組成物は、原核生物及び真核生物種を含むがこれらに限定されない、任意の種の遺伝子工学のために展開されてもよい。本開示による組成物及び方法を使用して改変される好適な宿主細胞としては、藻類細胞、細菌細胞、不等毛類（heterokonts）、真菌細胞、ツボカビ細胞、微小菌類、微小藻類、及び動物細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物細胞は、無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、脊椎動物動物細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、非形成し津転換細胞、又は少なくとも１つの核酸分子で既にトランスフェクトされている細胞のいずれかであり得る。
【００９２】
本明細書に開示される方法及び組成物は、例えば、ワクチン、医薬製品、工業製品、化学物質などの製造で使用されるポリペプチドの産生を含む、水産養殖、農業、畜産、及び／又は治療用途及び薬効用途に重要であるか、又は興味深い対象及び／又は宿主細胞と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、げっ歯類、マウス、魚類、鳥類、並びにヒト、ウマ、ブタ、サル、及び類人猿などのより大きな哺乳動物などの、アルファウイルスの天然宿主である種からの宿主細胞と共に使用することができる。特に好ましい種は、本出願のいくつかの実施形態では、脊椎動物種及び無脊椎動物種である。原則として、任意の動物種を一般に使用することができ、例えば、ヒト、イヌ、鳥、魚、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、ヤギ、ロバ、ハムスター、又はバッファローであり得る。好適な鳥種の非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、ヤギ、シチメンチョウ、ダチョウ、エミュー、ハクチョウ、クジャク、キジ、ヤマウズラ、及びホロホロチョウが挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、魚種は、サケ種である。初代哺乳動物細胞及び連続的／不死化細胞型もまた好適である。好適な動物宿主細胞の非限定的な例としては、ウマ肺動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ウサギ腎細胞、マウス筋細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞、マウス３Ｔ３細胞、ベロ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）、ニワトリ初代線維芽細胞、ＨｕＴ７８細胞、Ａ５４９肺細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＦＲｈＬ−２、及びＣＥＭ  Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は、ベビーハムスター腎細胞である。いくつかの実施形態では、ベビーハムスター腎細胞は、ＢＨＫ−２１細胞である。
【００９３】
多種多様な上記宿主細胞及び種を形質転換するための技術は、当該技術分野において既知であり、技術文献及び科学文献に記載されている。したがって、本明細書に開示される少なくとも１つの組み換え細胞を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成及び維持するのに好適な方法及び系は、当該技術分野において既知である。
ポリペプチドを産生する方法
【００９４】
本開示の宿主細胞、例えば原核生物又は真核生物宿主細胞を使用して、本明細書に開示される目的の遺伝子（ＧＯＩ）のオープンリーディングフレームにコードされたポリペプチドなどの目的の分子を産生（すなわち、発現）することができる。したがって、本出願は、例えば、本開示の宿主細胞を使用して、例えば、ポリペプチドなどの目的の分子を産生するための方法を更に提供し、この方法は、例えば、細胞培養物中の細胞であってもよく、又は生体内の細胞であってもよい。
【００９５】
したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、宿主細胞において目的のポリペプチドを産生するための方法を提供する。このような方法は、前述の態様及び実施形態のいずれか１つによる核酸分子を含む組み換え宿主細胞の培養を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、目的の分子が産生されるように、好適な培地中で、本発明の宿主細胞（目的の分子をコードする組み換え発現ベクターが導入された）を培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、目的の分子を培地又は宿主細胞から単離することを更に含む。
【００９６】
別の態様では、いくつかの実施形態は、対象において目的のポリペプチドを産生するための方法に関し、前述の態様及び実施形態のいずれか１つによる核酸分子を対象に投与することを含む。
【００９７】
本明細書に開示される方法及び組成物で使用するのに好適な宿主細胞及び／又は対象としては、原核生物種及び真核生物種が挙げられるが、これらに限定されない。本開示による組成物及び方法を使用して改変される好適な宿主細胞としては、藻類細胞、細菌細胞、不等毛類（heterokonts）、真菌細胞、ツボカビ細胞、微小菌類、微小藻類、及び動物細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物細胞は、無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、脊椎動物細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、非形質転換細胞、又は少なくとも１つの核酸分子で既にトランスフェクトされている細胞のいずれかであり得る。したがって、前述の態様及び実施形態のいずれか１つによる組み換え細胞の生体試料、バイオマス、及び子孫もまた、本出願の範囲内である。したがって、以下により詳細に記載されるように、本出願のこの態様による方法によって産生されるポリペプチドもまた、本出願の範囲内である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、組み換え細胞は、動物細胞である。小規模及び大規模での治療用タンパク質の産生は、動物細胞において産生されるタンパク質が、一般的に適切な処理、翻訳後改変を有すると考えられ、したがって生理的条件の治療に十分な活性を有すると考えられるため、医薬産業において重要な開発分野である。原則として、任意の動物種を一般に使用することができ、例えば、ヒト、イヌ、鳥、魚、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、ヤギ、ロバ、ハムスター、又はバッファローであり得る。好適な鳥種の非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、ヤギ、シチメンチョウ、ダチョウ、エミュー、ハクチョウ、クジャク、キジ、ヤマウズラ、及びホロホロチョウが挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、魚種は、サケ種である。初代哺乳動物細胞及び連続的／不死化細胞型もまた好適である。好適な動物宿主細胞の非限定的な例としては、ウマ肺動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ウサギ腎細胞、マウス筋細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞、マウス３Ｔ３細胞、ベロ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）、ニワトリ初代線維芽細胞、ＨｕＴ７８細胞、Ａ５４９肺細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＦＲｈＬ−２、及びＣＥＭ  Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組み換え細胞は、ベビーハムスター腎細胞である。いくつかの実施形態では、ベビーハムスター腎細胞は、ＢＨＫ−２１細胞である。
組み換えポリペプチド
【００９９】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載される１つ以上の実施形態による方法によって産生される組み換えポリペプチドに関する。本出願の組み換えポリペプチドは、一般に任意の組み換えポリペプチドであってよく、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、及びレポーターポリペプチドのうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調節因子、及びサイトカインのうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは、治療的又は予防的活性を有し得る。
組成物
【０１００】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組み換えポリペプチドのいずれかを含む組成物に関する。組成物は、例えば、薬学的に許容される担体を含む栄養補助用組成物、予防用組成物、医薬組成物、又はこれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、本出願の組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０１０１】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の核酸分子のいずれかを含む組成物に関する。組成物は、例えば、薬学的に許容される担体を含む栄養補助用組成物、予防用組成物、医薬組成物、又はこれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、本出願の組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０１０２】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組み換え細胞のいずれかを含む組成物に関する。組成物は、例えば、薬学的に許容される担体を含む栄養補助用組成物、予防用組成物、医薬組成物、又はこれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、本出願の組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、一般的に安全で非毒性であり、生物学的に望ましくないもの又は別途望ましくないものいずれでもない医薬組成物又は製剤を調製するのに有用である担体を意味し、獣医学的用途並びにヒトの医薬用途に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、水と同じ程度に単純であるが、例えば、生理学的塩濃度の溶液も含み得る。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、安定剤、希釈剤及び緩衝液であってもよく、又はこれらを含んでもよい。好適な安定剤は、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物（乾燥乳、血清アルブミン、若しくはカゼインなど）、又はこれらの分解産物である。好適な緩衝液は、例えば、アルカリ金属リン酸塩である。希釈剤としては、水、水性緩衝液（緩衝生理食塩水など）、アルコール及びポリオール（グリセロールなど）が挙げられる。動物又はヒトへの投与については、本出願による組成物は、とりわけ、噴霧により鼻腔内で、皮内、皮下、経エアロゾルにより経口で、又は筋肉内で投与することができる。
【０１０４】
本開示で言及された全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
本明細書に引用される任意の参考文献が先行技術を構成することを認めるものではない。参考文献の議論は、著者が主張するものを提示し、本発明者らは、引用文献の正確性及び適切性を課題とする権利を保有している。科学的な雑誌論文、特許文書、及び教科書を含む多数の情報源を本明細書で参照され、この参照は、これらの文書のいずれかが当該技術分野における常識的な一般知識の一部を形成することを認めるものではないことが明確に理解されるであろう。
【０１０６】
本明細書で提与される一般的な方法の説明は、例示目的を意図しているにすぎない。他の代替的な方法及び代替物は、本開示を検討する際に当業者には明らかであり、本出願の趣旨及び意図の範囲内に含まれるものである。
【実施例】
【０１０７】
実施例
以下の実施例において、追加の代替物が更に詳細に開示されるが、これらは、特許請求の範囲を限定することを多少なりとも意図するものではない。
実施例１
一般実験手順
インビトロ転写
【０１０８】
インビトロ転写（In  vitro  transcription、ＩＶＴ）反応は、２０μｌの反応物中で、３７℃にて１時間にわたるインキュベーションで、上記のように調製した１μｇのＤＮＡテンプレートを使用して行った（ＮＥＢカタログ番号Ｅ２０６５Ｓ）。次に、供給元によって提供された１単位のＤＮａｓｅ  Ｉを、ＩＶＴ反応物に直接添加し、３７℃で更に１５分間インキュベートした。次いで、反応物を氷上に置き、製造業者が提案する方法（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１０４）を使用して精製した。次いで、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて、精製ＲＮＡを定量化した。０．８％アガロースゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｇ５０１８−０８）を通して電気泳動によりＲＮＡを可視化し、電気泳動を進める前に、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号ＡＭ７１５０）と比較した。
【０１０９】
５０ｎｇ／ｍｌのカルバニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号ＮＣ９７３０１１６）を補充したＬＢブロス培地（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｌ８０００  ０６）中で増殖させた３００ｍＬの飽和大腸菌ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ  Ｅｐｉ３００（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号ＥＣ３００１０５）培養物からプラスミドＤＮＡテンプレートを精製した（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２１６３）。プラスミドＤＮＡを、Ｎｏｔ−Ｉ消化（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＮＥＢカタログ番号Ｒ３１８９Ｓ）により３７℃で１時間線状化した。次いで、線状化テンプレートＤＮＡを再精製し（Ｚｙｍｏカタログ番号Ｄ４００３）、市販の２ログのＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＮＥＢカタログ番号Ｎ３２００Ｓ）に対して０．８％アガロースゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｇ５０１８−０８）によって分析した。インビトロ転写に進む前に、線状ＤＮＡテンプレートの予想される断片サイズに対応する単一のバンドの存在を、各試料中で確認した。
トランスフェクション及び分析
【０１１０】
典型的な細胞トランスフェクション実験では、レプリコンＲＮＡを、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ）のＳＦ細胞株Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットを用いて電気穿孔法によりＢＨＫ−２１細胞に導入した。０．２５％のトリプシンを用いてＢＨＫ−２１細胞を採取し、冷ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬの電気穿孔反応物当たり１×１０６個細胞の細胞密度でＳＦ緩衝液中に再懸濁させた。３マイクログラムのＲＮＡを、１６ウェルのキュベットストリップ内で細胞に３通りで電気穿孔し、室温で１０分間インキュベートした。電気穿孔された細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地を含有するプレートに回収し、続いて標準的な細胞培養条件で１６〜１８時間インキュベートした。
【０１１１】
レプリコントランスフェクション効率及びタンパク質産生の細胞内分析を、フローサイトメトリーにより実施した。トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞を、固定／透過性濃度及び透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定及び透過処理した。細胞を、Ｒ−フィコエリスリン（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合させた二本鎖ＲＮＡ産生のための抗体（Ｊ２抗ｄｓＲＮＡ  ＩｇＧ２Ａモノクローナル抗体、Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）と共にインキュベートした。抗原産生を、ＰＥ−Ｃｙ５と結合させた抗原特異的抗体（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（例えば、緑ウミシイタケ、赤ホタル、ＨＡ又はＲＳＶ−Ｆ０（Ａｂｅａｍ）に対する抗体）との更なるインキュベーションによって評価した。次いで、細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）融合細胞ソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ細胞ソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。補償対照のために、トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の単一色での染色を、試料採取の前に行った。ＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して更に分析した。初期ゲーティングを、前方散乱プロット及び側方散乱プロットを使用して実施し、死細胞及び破片を除外した。更なるゲーティングを行って、ｄｓＲＮＡ（Ｒ−ＰＥ−陽性）及びタンパク質発現（ＧＦＰ発現に対してＰＥ−Ｃｙ５−陽性又はＦＩＴＣ陽性）の両方に対して陽性であった細胞集団を同定した。周波数及び平均蛍光強度を収集し、構築物の比較及び最適化に利用した。
実施例２
５’−ＵＴＲ配列の改変
【０１１２】
この実施例は、ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡベクターでコードされた目的の遺伝子の発現を向上させるために、５’−ＵＴＲ配列が改変された実験の結果を記載する。ＶＥＥＶレプリコンベクターのｃＤＮＡコピーを含有するプラスミド上で、部位特異的変異誘発（Site  directed  mutagenesis、ＳＤＭ）を行った。ＳＤＭプライマーは、５’ＵＴＲの２位のチミン（Ｔ）残基をＧ残基に変化させるように設計した。
【０１１３】
これらの実験では、それぞれｒＦＦルシフェラーゼ遺伝子、Ｖｉｅｔｎａｍ  １２０３インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子（hemagglutinin  gene、ＨＡ）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を発現するＶＥＥＶレプリコンをテンプレートとして用いて、部位特異的突然変異誘発を行った。野生型ＶＥＥＶ（ＴＣ−８３株）配列の５’ＵＴＲ中の２位におけるヌクレオチドＴを変化させた。プライマー「ＶＥＥ５’−Ｔ−＞Ｇｎｔ２Ｆ」及び「ＶＥＥ５’−Ｔ−＞Ｇｎｔ２Ｒ」を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔからの部位特異的突然変異誘発キットを介して、ヌクレオチド２位の変化を導入した。プライマーは、Ａｇｉｌｅｎｔのウェブサイトを通して設計された。陽性クローンを同定し、ｒＦＦ、ＨＡ、及びＧＦＰを発現する代表的なクローンが完全に正しいことを配列確認した。
【０１１４】
アルファ−Ｒ−Ｔ２Ｇレプリコンを作製するためのＳＤＭプライマーは、以下のとおりである。
フォワードプライマー：ＶＥＥ５’Ｔ−＞Ｇｎｔ２Ｆ（配列番号２３）：ｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇａＧａｇｇｃｇｇｃｇｃａｔｇａｇ。
リバースプライマー：ＶＥＥ５’Ｔ−＞Ｇｎｔ２Ｒ（配列番号２４）：ｃｔｃａｔｇｃｇｃｃｇｃｃｔＣｔｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇ。
【０１１５】
ＶＥＥＶレプリコンｃＤＮＡにおけるＴ２−＞Ｇ変化の配列確認後、線状化プラスミドＤＮＡ上でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写によりＲＮＡを生成した。インビトロ転写ＲＮＡを精製し、電子穿孔されたＢＨＫ−２１細胞に使用した。複製及びＧＯＩ発現の両方を、それぞれ抗ｄｓＲＮＡ特異的抗体及びＧＯＩ特異的抗体を使用して、ＦＡＣＳによりモニターした。Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶレプリコンからの複製効率及びＧＯＩ発現を、同じＧＯＩを発現している野生型ＶＥＥＶレプリコンと直接比較した。赤ホタルレポーター遺伝子を含むアルファ−Ｒ−ｒＦＦ−Ｔ２Ｇレプリコンの配列は、Ｔ７プロモーター及び４０個のＡ残基を有するポリＡテールと共に、配列表に配列番号１９として提供されている。Ｔ７プロモーター配列後の、２位における変異ヌクレオチドも示されている。
実施例３
５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ置換は、改変ＶＥＥＶ−ＨＡレプリコンの生物活性に影響を及ぼさない
【０１１６】
この実施例は、Ｖｉｅｔｎａｍ  １２０３インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子（ＨＡ）レポーター遺伝子の発現に対する改変アルファウイルスレプリコンの５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ置換の影響を評価する実験の結果を記載する。
【０１１７】
５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化を含有するアルファウイルスレプリコンが、実際にタンパク質を発現することができることを実証するために、レプリコンＲＮＡを５’ＵＴＲ中にＵ２−＞Ｇ変化を保有するベクターからインビトロで転写した（Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ＨＡ）。発現の陽性対照として、野生型５’ＵＴＲを保有するベクターから、ＲＮＡをインビトロで転写した（ＷＴ  ＶＥＥＶ−ＨＡ）。ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞を、Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ＨＡ  ＲＮＡ又は野生型ＶＥＥＶ−ＨＡ  ＲＮＡのいずれかの３μｇで電気穿孔した。この比較についてのフローサイトメトリー分析の例を図１に示す。細胞を、ＨＡ特異性抗体を用いてＦＡＣＳにより分析して、発現されたＨＡタンパク質の存在及び細胞当たりで発現されたＨＡの相対量（平均蛍光強度、mean  fluorescence  intensity、ＭＦＩ）の両方を実証した。Ｕ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲを保有するレプリコンＲＮＡからの生物活性は、野生型５’ＵＴＲを有するレプリコンから検出された活性と比較して喪失しなかった。
【０１１８】
この実施例で提示される実験データは、Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ＨＡレプリコンが、ＨＡタンパク質を発現することができるだけでなく、発現レベルが野生型ＶＥＥＶ−ＨＡレプリコンの発現レベルと同等であることを示している。この結果は、同じＵ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲ変化を保有するＶＥＥＶ／ＳＩＮＶ感染性クローンが、生物活性におけるほぼ３ログの喪失を有していることを考慮すれば、予想外であり、本発明者らは、Ｕ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲ変化を保有するレプリコンの生物活性における減少を全く示さない。
実施例４
５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ置換は、ＧＦＰレポーターの発現を３倍まで向上させる
【０１１９】
この実施例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子の発現に対する改変アルファウイルスレプリコンの５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ置換の影響を評価する実験の結果を記載する。
【０１２０】
５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化を含有するアルファウイルスレプリコンからの発現が、任意の特定のＧＯＩに限定されないことを実証するために、ＧＦＰ遺伝子を発現しているレプリコンベクターを同様の方法で比較した。レプリコンＲＮＡを、５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化を保有するベクターから、インビトロで転写した（Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ＧＦＰ）。発現の陽性対照として、野生型５’ＵＴＲを保有するベクターから、ＲＮＡをインビトロで転写した（ＷＴ  ＶＥＥＶ−ＧＦＰ）。ＢＨＫ細胞を、Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ＧＦＰ  ＲＮＡ又は野生型ＶＥＥＶ−ＧＦＰ  ＲＮＡのいずれかの３μｇで電気穿孔した。この比較についてのフローサイトメトリー分析の例を図２に示す。細胞を、ＦＡＣＳによりＧＦＰ発現について分析して、発現されたＧＦＰタンパク質の存在及び細胞当たりで発現されたＧＦＰの相対量（平均蛍光強度、ＭＦＩ）の両方を実証した。Ｕ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲを保有するレプリコンＲＮＡからの生物活性の喪失がないばかりでなく、Ｕ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲ変化は、実際に、野生型５’ＵＴＲを有するレプリコンから検出された活性と比較して発現を３倍まで向上させた。
【０１２１】
今度も、この実施例で提示された実験データは、Ｕ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲ変化を保有するレプリコンベクターが、タンパク質（この場合ＧＦＰ）を発現することができることを示している。おそらく、単純なタンパク質発現よりも更に予想外であったことは、Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ＧＦＰレプリコンが、野生型ＶＥＥＶ−ＧＦＰレプリコンの発現よりも３倍以上のＧＦＰを発現したことである。今一度、５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化のために予期された生物活性の予想される損失は実現せず、この結果は、５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化が、実際にＧＯＩレプリコンの発現を有意に向上させることができることを実証した。
実施例５
５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ置換は、ｒＦＦレポーターの発現を２倍まで向上させる。
【０１２２】
この実施例は、赤ホタル（red  Firefly、ｒＦＦ）レポーター遺伝子の発現に対する改変アルファウイルスレプリコンの５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ置換の影響を評価する実験の結果を記載する。
【０１２３】
これらの実験では、５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化を含有するアルファウイルスレプリコンからの発現の別の例として、ｒＦＦ遺伝子を発現しているレプリコンベクターを同様の方法で比較した。レプリコンＲＮＡを、５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化を保有するベクターから、インビトロで転写した（Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ｒＦＦ）。発現の陽性対照として、野生型５’ＵＴＲを保有するベクターから、ＲＮＡをインビトロで転写した（ＷＴ  ＶＥＥＶ−ｒＦＦ）。ＢＨＫ細胞を、Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ｒＦＦ  ＲＮＡ又は野生型ＶＥＥＶ−ｒＦＦ  ＲＮＡのいずれかの３μｇで電気穿孔した。ルシフェラーゼタンパク質発現の例を図３示す。この実験では、５’ＵＴＲにおいてＵ２−＞Ｇ変化を保有するように改変されたアルファウイルスレプリコン（Ｕ２−＞ＧアルファｒＦＦ）の能力を、野生型５’ＵＴＲを有するアルファウイルスレプリコン（アルファｒＦＦ）と比較した。ＢＨＫ細胞を、レプリコンのいずれかからの等量のインビトロ転写ＲＮＡで電気穿孔した後、細胞をｒＦＦルシフェラーゼ発現について分析した。細胞毎に発現されたルシフェラーゼの量（相対発光単位（relative  light  unit、ＲＬＵ）として表される）が提示される。Ｕ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲを保有するレプリコンＲＮＡからの生物活性の喪失がないばかりでなく、Ｕ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲ変化は、実際に、野生型５’ＵＴＲを有するレプリコンから検出された活性と比較して発現をおよそ２倍まで向上させた。
【０１２４】
今度も、この実施例で提示された実験データは、Ｕ２−＞Ｇ  ５’ＵＴＲ変化を保有するレプリコンベクターが、タンパク質（この場合ｒＦＦ）を発現することができることを示している。おそらく、単純なタンパク質発現よりも更に予想外であったことは、Ｕ２−＞Ｇ  ＶＥＥＶ−ｒＦＦレプリコンが、野生型ＶＥＥＶ−ｒＦＦレプリコンの発現よりも約２倍以上のｒＦＦを発現したことである。今一度、５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化のために予期された生物活性の予想される損失は実現せず、この結果は、５’ＵＴＲにおけるＵ２−＞Ｇ変化が、実際にＧＯＩレプリコンの発現を有意に向上させることができることを実証した。
実施例６
多価のＶＥＥＶレプリコンの設計
【０１２５】
本実施例は、多価ＶＥＥＶレプリコンを構築及び評価するために実施される実験を記載し、この実験は、続いて、組み換え細胞中の少なくとも２つの異なるポリペプチドの発現のために展開される。いくつかの実験では、多価ＶＥＥＶレプリコンは、５’から３’の順序で（ｉ）非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、（ｉｉ）ＶＥＥＶ非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４、（ｉｉｉ）それぞれが異種核酸配列に操作可能に連結された少なくとも２つのプロモーターであって、異種核酸配列が、ＶＥＥＶ構造タンパク質遺伝子のうちの１つ又は全てを置換する、少なくとも２つのプロモーター、（ｉｖ）非構造的タンパク質媒介増幅に必要な３’配列、及び（ｖ）ポリアデニル酸塩経路を含む。
【０１２６】
本開示の特定の代替物が開示されてきたが、様々な修正及び組み合わせが可能であり、添付の特許請求の範囲の真の趣旨及び範囲内で想到されることを理解されたい。したがって、本明細書に提示される正確な要約及び開示に限定することを意図するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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