【手続補正書】
【提出日】平成19年8月15日(2007.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）家庭用液体界面活性剤、ポビジン(povidine)ヨウ素を添加した滅菌海水中における藻類材料の一連の処理により組織培養のための生存能力のある藻類の無菌材料を確立し、最後にその処理材料を広スペクトル抗生物質混合物および殺菌剤を含むプロバソリ(Provasoli)高含有海水（ＰＥＳ）培地で約２４時間〜９６時間インキュベートし、次いで、滅菌海水で洗浄することで抗生物質および殺菌剤の痕跡を除去し、滅菌濾紙で吸い取って無菌外植片を得て；
ｂ）カルス誘導のために無菌外殖片をＰＥＳ培地を添加した寒天プレート上で２０〜２５℃の範囲の温度にて約２０〜５０μｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で培養し；
ｃ）少なくとも４０日後外植片からカルスを切り出し、カルスを４０〜６０μｍｏｌ光量子ｍ−２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で、新鮮寒天プレートで継代培養し、分化した濃く着色した卵形または球形の微小胎芽を得て；
ｄ）着色したカルスの薄切片を、植物成長調節剤を含むプロパソリ高含有海水（ＰＥＳ）培地の寒天プレートで、４０〜６０μｍｏｌ光量子ｍ２ｓ−１照射の冷白色蛍光光下、１２：１２明暗周期で、約２０〜４０日間継代培養し、着色した繊維状カルスにおける体細胞胚形成および微小胎芽形成の増加を達成し；
ｅ）体細胞胚を含む繊維状カルスを胎芽からの多シュートを含む幼植物体の形態形成および発達のために振盪条件下液体ＰＥＳ培地に移し；
ｆ）幼植物体を、封じた有孔ポリエチレンバッグ内で成長させることによって藻類バイオマスを大スケールで培養する
工程を含んでなる、海藻類の培養のための組織培養法。
【請求項２】
組織培養の材料がEucheuma, Gigartina, Chondrus, Laminaria, Undaria, Ecklonia, Eisenia, Macrocystis, Sargassum および Turbinaria属を含む紅藻類および褐藻類海藻の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組織培養の材料がEucheuma striatum, Kappaphycus alvarezzi, Eucheuma cottonii, Eucheuma denticulatum, Eucheuma spinosum, Eucheuma alvarezii, Eucheuma procrusteanum, Gigartina intermedia, Gigartina exasparata および Chondrus crispus を含む藻類の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
無菌外植片が、直径３〜４ｍｍを有する長さ１〜６ｍｍの切片であり、藻類の上部もしくは端部から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
藻類材料を、まず０．１〜１％の家庭用液体界面活性剤で５０〜２０分間処理し、次いで０．１〜２％のポビジンヨウ素で２〜７分間処理し、最終的に１〜５％抗生物質の２４〜９６時間混合物を含むプロバソリ高含有海水で処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗生物質混合物が、１００ｍｌの蒸留水中にペニシリン、硫酸ストレプトマイシン、カナマイシン、ナイスタチンおよびネオマイシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
プロバソリ高含有海水培地を添加した０．８〜３％の寒天を含有する寒天プレートで２０〜２５℃にて２０〜５０μｍｏｌ光量子ｍ２ｓ−１の冷白色蛍光光下、２０〜２５℃での１２：１２明暗周期で無菌外植片を培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
着色カルスの薄切片を、０．３〜０．６％の寒天を含有しプロバソリ高含有海水培地からなる寒天プレート中の包埋培養として、２０〜２５℃にて２０〜５０μｍｏｌ光量子ｍ２ｓ−１の冷白色蛍光光照射下、１２：１２明暗周期で成長させることによりカルスを継代培養し、各包埋ブロックにおいて旺盛に分枝した繊維状着色カルスを得る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
植物成長調節物質が０．１〜１．０ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸ならびに各０．１ｍｇｌ−１のナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
無菌外植片を工程（ｂ）において寒天プレートで約４０〜４５日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
藻類バイオマスを工程（ｆ）において海中のロングフローティングラインに取り付けた６０×４５ｃｍのポリエチレンバッグ内で成長させ、約６０日後に収穫物を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
幼植物体工程（ｆ）においてを２２．５℃〜２８．５℃の範囲の年間海水温度、７．８１〜８．２６のｐＨ、２４．０‰〜３４．０％の塩度、７．８４ｍｌ／ｌ〜１５．６８ｍｌ／ｌの溶存酸素、０．０２μｍｏｌ〜３．２３μｍｏｌのリン酸塩、０．１５μｍｏｌ〜２．５８μｍｏｌの硝酸塩および０．０１μｍｏｌ〜０．８５μｍｏｌの亜硝酸塩を用いて有孔ポリエチレンバッグ内で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
微小胎芽を工程（ｄ）において着色繊維状カルスの体細胞胚形成を介してクローン増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
幼植物体を、工程（ｆ）においてフローティングロングラインに取り付けて沈めた有孔の透明ポリエチレンバッグ内で、少なくとも６０日間海中での保護培養にて成長させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
着色カルスの体細胞胚形成を介する体細胞胚の形成のプロセスをα−ナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンなどの植物成長調節物質の添加によってさらに促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも６０日の収穫期間が、より高いバイオマスを生じ得るか、またはバイオマス収量を一定に維持でき、かつ培養期間を短縮できる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
着色カルスからの微小胎芽形成により、生成物収量（カラギーナン）およびゲル強度の変化なしに、対照親植物に対して２倍の成長増加（新鮮重量）が達成される、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
カッパフィカスおよびキリンサイの商業的栽培および加工に関してはいくつかの論文が発表されている(J.R. Lim and H. Porse. Proc. of the Intl. Seaweed Symp. 10, 601-606, 1981; H. Adnan and H. Porse, Hydrobiologia, 151/152, 355-358, 1987; R. Azanza-Corrales and P. Sa-a, Hydrobiologia, 204/205, 521-525, 1990; G. P. B. Samonte, A.Q. Hurtado-Ponce and R. Caturao, Aquaculture, 110, 1-11, 1993)。G.C. Trono(Seaweed cultivation and Mrine Ranching, M. Ohno and A.T. Critchley(eds.), JICA Publication, Japan, 75-88, 1993)は固定オフボトムモノライン法およびフローティングラフトまたはロングライン法などの２種の栽培法を記載しており、これらはキリンサイの栽培に広く用いられている。いずれの方法でも、豊富な分枝を有する選択したキリンサイ先端切片（５０〜１００ｇ）を軟プラスチック固定材料を用いて２５〜３０ｃｍ間隔で栽培ロープにつなぎ（フィリピンではtie-tie法として知られている）、１キログラム以上に成長させた後収穫する。作物は成長速度にもよるが６０〜９０日毎後に収穫する。モノライン法およびフローティングラフトまたはロングライン法双方に共通するいくつかの制限および欠点がある。それらは（ｉ）胎芽／種苗材料が、材料全体を食害して、その後の作物生産に悪影響を及ぼし得る草食動物に直接さらされること、（ii）植え付けたものが保護されていないので、不利な海洋条件によっては材料が栽培ロープから洗い流されてしまう場合があること、（iii）不利な海洋条件の際の着生植物よび異物の付着により目的産物の所望の品質を確保するために煩雑で時間のかかる海草の洗浄が必要となり得ることである。
O.P. Mairh et al. (Indian J. Marine Sciences, 24, 24-31, 1995)は屋外条件における実験規模でのユーケウマ・ストリアツムのバッグ栽培の実行可能性を実証することに成功した。しかしながら、この方法の主な欠点として、ポリエチレンバッグを用いない開放水域においてそれらが成長するのと比較して日間成長率が低下してしまうということがある。本発明はin vitro組織培養技術によって従来の海草からバッグ内でも、開放水域で親植物が成長するのとおよそ同程度の成長能を示す、成長の速い系統を開発することによって、バッグ内で成長が低下するという欠点を克服する。