(57)【要約】本明細書は、リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）活性を制御するための材料および方法に関する。例えば、修飾されたリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）および／または修飾されたイオン細孔ドメイン（ＩＰＤ）を有する少なくとも１つのＬＧＩＣサブユニットを含む修飾されたＬＧＩＣが供される。修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができる外因性ＬＧＩＣリガンド、ならびに哺乳動物の細胞の膜を横切るイオン輸送を調節する方法、哺乳動物における細胞の興奮性を調節する方法、およびチャネル障害を有する哺乳動物を治療する方法も供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの修飾ＬＧＩＣサブユニットを含む修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）であって、該修飾ＬＧＩＣサブユニットが、
アミノ酸修飾を含むリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と、
イオン細孔ドメイン（ＩＰＤ）と、
を含む、修飾リガンド依存性イオンチャネル。
【請求項２】
第１のＬＧＩＣからのＬＢＤおよび第２のＬＧＩＣからのＩＰＤを含むキメラＬＧＩＣである、請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３】
前記ＬＢＤが、アルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７−ｎＡＣｈＲ）ＬＢＤである、請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項４】
前記アミノ酸修飾が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基７７、７９、１１５、１３１、１３９、１４１、１７５、２１０、２１６、２１７、および２１９からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基７７にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｗ７７ＦおよびＷ７７Ｙからなる群から選択される、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項６】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基７９にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｑ７９Ａ、Ｑ７９Ｇ、およびＱ７９Ｓからなる群から選択される、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項７】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基１１５にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｙ１１５Ｆ置換である、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項８】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基１３１にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ｍ、およびＬ１３１Ｎからなる群から選択される、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項９】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基１３９にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｑ１３９ＧおよびＱ１３９Ｌからなる群から選択される、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１０】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基１７５にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｇ１７５Ａ、Ｇ１７５Ｆ、Ｇ１７５Ｈ、Ｇ１７５Ｋ、Ｇ１７５Ｍ、Ｇ１７５Ｒ、Ｇ１７５Ｓ、およびＧ１７５Ｖからなる群から選択される、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１１】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２１０にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｙ２１０Ｆ置換である、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１２】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２１６にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｐ２１６Ｉ置換である、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１３】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２１７にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｙ２１７Ｆ置換である、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１４】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２１９にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｄ２１９Ａ置換である、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１５】
前記α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤが、Ｌ１３１Ｇアミノ酸置換、Ｑ１３９Ｌアミノ酸置換、およびＹ２１７Ｆアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１６】
前記α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤが、Ｌ１３１Ｍアミノ酸置換およびＹ１１５Ｆアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１７】
前記α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤが、Ｗ７７Ｆアミノ酸置換、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換、およびＧ１７５Ｋアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１８】
前記α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤが、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換、Ｙ１１５Ｆアミノ酸置換、およびＧ１７５Ｋアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１９】
前記α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤが、Ｙ１１５Ｆアミノ酸置換およびＧ１７５Ｋアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２０】
前記α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤが、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換および２１６Ｉアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２１】
前記ＩＰＤが、セロトニン３受容体（５ＨＴ３）ＩＰＤ、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）ＩＰＤ、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体ＩＰＤ、およびアルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７−ｎＡＣｈＲ）ＩＰＤからなる群から選択される受容体からのＩＰＤである、請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２２】
前記ＩＰＤが、残基２９８にアミノ酸置換を含む、請求項２１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２３】
前記ＩＰＤが、ＧｌｙＲ  ＩＰＤであり、かつ、前記アミノ酸置換が、Ａ２９８Ｇ置換である、請求項２２に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２４】
前記ＩＰＤが、ＧＡＢＡ  ＩＰＤであり、かつ、前記アミノ酸置換が、Ｗ２９８Ａ置換である、請求項２２に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２５】
外因性ＬＧＩＣリガンドが前記修飾ＬＧＩＣを活性化し、該外因性ＬＧＩＣリガンドが、キヌクリジン、トロパン、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナン、６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピン、および１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンからなる群から選択される合成外因性ＬＧＩＣリガンドである、請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２６】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、トロパンであり、かつ、該トロパンが、トロピセトロン、擬似−トロピセトロン、ノルトロピセトロン、化合物７２３、化合物７２５、化合物７３７、および化合物７４５からなる群から選択される、請求項２５に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２７】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、キヌクリジンであり、該キヌクリジンが、ＰＮＵ−２８２９８７、ＰＨＡ−５４３６１３、化合物０４５６、化合物０４３４、化合物０４３６、化合物０３５４、化合物０３５３、化合物０２９５、化合物０２９６、化合物０５３６、化合物０６７６、および化合物７０２からなる群から選択される、請求項２５に載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２８】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンであり、かつ、該９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンが、化合物５３６である、請求項２５に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項２９】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンであり、かつ、該６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンが、バレニクリン、化合物７６５、および化合物７７０からなる群から選択される、請求項２５に記載の修飾ＬＧＩＣ。 
【請求項３０】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンであり、かつ、該１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンが、３−（１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−４−イル）ジベンゾ［ｂ，ｄ］チオフェン５，５−ジオキシド、化合物７７３、および化合物７７４からなる群から選択される、請求項２５に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３１】
前記ＬＢＤが、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤであり、かつ、該α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤが、未修飾ＬＧＩＣへの結合よりも、少なくとも１つの修飾アミノ酸を有する別のα７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤへ選択的な結合を付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３２】
前記未修飾ＬＧＩＣが内因性ＬＧＩＣである、請求項３１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３３】
前記内因性ＬＧＩＣが内因性α７−ｎＡＣｈＲである、請求項３２に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３４】
前記選択的結合を付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２７および／または残基４１のアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含む、請求項３１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの修飾アミノ酸が、Ｒ２７Ｄ置換および／またはＥ４１Ｒ置換を含む、請求項３４に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３６】
前記ＩＰＤが、マウス５ＨＴ３  ＩＰＤであり、かつ、該マウス５ＨＴ３  ＩＰＤが、前記修飾ＬＧＩＣに増加したイオン伝導性を付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３７】
前記修飾ＬＧＩＣに増加したイオン伝導性を付与するマウス５ＨＴ３  ＩＰＤ中の少なくとも１つの修飾アミノ酸が、マウス５ＨＴ３  ＩＰＤの残基４２５、４２９、および／または４３３のアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含む、請求項３６に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３８】
少なくとも１つの修飾アミノ酸が、Ｒ４２５Ｑ置換、Ｒ４２９Ｄ置換、および／またはＲ４３３Ａ置換を含む、請求項３７に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項３９】
前記ＩＰＤが、ヒト５ＨＴ３  ＩＰＤであり、かつ、該ヒト５ＨＴ３  ＩＰＤが、前記修飾ＬＧＩＣに増加したイオン伝導性を付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項４０】
前記修飾ＬＧＩＣに増加したイオン伝導性を付与するヒト５ＨＴ３  ＩＰＤ中の少なくとも１つの修飾アミノ酸が、ヒト５ＨＴ３  ＩＰＤの残基４２０、４２４、および／または４２８のアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含む、請求項３９に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項４１】
少なくとも１つの修飾アミノ酸が、Ｒ４２０Ｑ置換、Ｒ４２４Ｄ置換、および／またはＲ４２８Ａ置換を含む、請求項４０に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項４２】
前記ＬＢＤが、内因性ＬＧＩＣリガンドとの減少した結合を有する、請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項４３】
前記内因性ＬＧＩＣリガンドが、アセチルコリン（ＡＣｈ）である、請求項４２に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項４４】
前記修飾ＬＧＩＣが、Ａｃｈについて２０μＭ超のＥＣ５０を有する、請求項４３に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項４５】
修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）に対して増加した効力を有するリガンドであって、式Ｉ：
2019530468.tif 000029
（式中、
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の各々は、独立して、ＣＨ、ＣＨ２、Ｏ、ＮＨ、またはＮＭｅであり、
各ｎは、独立して、０または１であり、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
Ａは、芳香族置換基であり、
Ｒは、Ｈまたはピリジニルメチレンである）
を含む、リガンド。
【請求項４６】
前記芳香族置換基が、１Ｈ−インドール、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、２，５−ジメトキシベンゼン、４−クロロアニリン、アニリン、５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル、６−（トリフルオロメチル）ニコチン、および４−クロロ−ベンゼンからなる群から選択される、請求項４５に記載のリガンド。 
【請求項４７】
式ＩＩ：
2019530468.tif 000030
（式中、
Ｘ３は、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
Ａは、芳香族置換基であり、
Ｒは、Ｈまたはピリジニルメチレンである）
を有するキヌクリジンである、請求項４５に記載のリガンド。
【請求項４８】
前記芳香族置換基が、１Ｈ−インドール、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−クロロベンゼン、２，５−ジメトキシベンゼン、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−クロロアニリン、アニリン、５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル、６−（トリフルオロメチル）ニコチン、３−クロロ−４−フルオロベンゼン、および１Ｈ−インドールからなる群から選択される、請求項４７に記載のリガンド。
【請求項４９】
前記キヌクリジンが、ＰＮＵ−２８２９８７、ＰＨＡ−５４３６１３、化合物０４５６、化合物０４３４、化合物０４３６、化合物０３５４、化合物０３５３、化合物０２９５、化合物０２９６、化合物０５３６、化合物０６７６、および化合物０７０２からなる群から選択される、請求項４７に記載のリガンド。
【請求項５０】
式ＩＩＩ：
2019530468.tif 000031
（式中、
Ｘ２は、ＮＨまたはＮＭｅであり、
Ｘ３は、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
Ａは、芳香族置換基である）
を有するトロパンである、請求項４５に記載のリガンド。
【請求項５１】
前記芳香族置換基が、１Ｈ−インドール、１Ｈ−インダゾール、７−メトキシ−１Ｈ−インドール、７−メチル−１Ｈ−インドール、および５−クロロ−１Ｈ−インドールからなる群から選択される、請求項５０に記載のリガンド。
【請求項５２】
前記トロパンが、トロピセトロン、擬似−トロピセトロン、ノルトロピセトロン、化合物７２３、化合物７２５、化合物７３７、および化合物７４５からなる群から選択される、請求項５０に記載のリガンド。
【請求項５３】
式ＩＶ：
2019530468.tif 000032
（式中、
Ｘ２は、ＮＨまたはＮＭｅであり、
Ｘ３は、Ｏ、ＮＨ、又はＣＨであり、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
Ａは、芳香族置換基である）
を有する９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンである、請求項４５に記載のリガンド。
【請求項５４】
前記芳香族置換基が、４−クロロ−ベンゼン、１Ｈ−インドール、１Ｈ−インダゾール、７−メトキシ−１Ｈ−インダゾールからなる群から選択される、請求項５４に記載のリガンド。
【請求項５５】
前記９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンが、化合物０５３６、化合物０７４９、化合物０７５１、化合物０７６０、および化合物０７６３からなる群から選択される、請求項５４に記載のリガンド。
【請求項５６】
修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）に対して増加した効力を有するリガンドであって、式Ｖ：
2019530468.tif 000033
（式中、
Ｒは、ＨまたはＣＨ３であり、
Ａは、Ｈまたは芳香族置換基である）
を含む、リガンド。
【請求項５７】
前記６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンが、バレニクリン、化合物０７６５、および化合物０７７０からなる群から選択される、請求項５６に記載のリガンド。
【請求項５８】
修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）に対して増加した効力を有するリガンドであって、式ＶＩ：
2019530468.tif 000034
（式中、Ｒは、Ｈ、Ｆ、またはＮＯ２である）
を含む、リガンド。
【請求項５９】
前記１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンが、３−（１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−４−イル）ジベンゾ［ｂ，ｄ］チオフェン５，５−ジオキシド、化合物０７７３、および化合物０７７４からなる群から選択される、請求項５８に記載のリガンド。
【請求項６０】
哺乳動物においてチャネル障害を治療する方法であって、
該哺乳動物において細胞に修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）を投与する段階であって、外因性ＬＧＩＣリガンドが、該修飾ＬＧＩＣに選択的に結合し、該修飾ＬＧＩＣが、少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを含み、該修飾ＬＧＩＣサブユニットが、
少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むリガンド結合ドメイン、および
イオン細孔ドメイン
を含む、段階と、
前記外因性リガンドを哺乳動物に投与する段階と、
を含む、方法。
【請求項６１】
前記チャネル障害が、バーター症候群、ブルガダ症候群、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍症（ＣＰＶＴ）、先天性高インスリン血症、嚢胞性線維症、ドラベ症候群、一過性運動失調症、先端紅痛症、全般てんかん（たとえば、熱性発作を伴うもの）、家族性片麻痺性片頭痛、線維筋痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ランバート−イートン（Lambert-Eaton）筋無力症候群、QT延長症候群（たとえば、ロマノ−ワード（Romano-Ward）症候群）、QT短縮症候群、悪性高熱症、ムコリピドーシスIV型、重症筋無力症、先天性ミオトニー、視神経脊髄炎、神経ミオトニー、非症候性難聴、先天性パラミオトニア、網膜色素変性症、チモシー症候群、耳鳴り、発作、三叉神経痛、および多発性硬化症からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
哺乳動物の細胞膜を横切るイオン輸送を調節する方法であって、
修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）を細胞に投与する段階であって、外因性ＬＧＩＣリガンドが、修飾ＬＧＩＣに選択的に結合し、該修飾ＬＧＩＣが、少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを含み、該修飾ＬＧＩＣサブユニットが、
少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むリガンド結合ドメイン、および
イオン細孔ドメイン
を含む、段階と、
前記外因性リガンドを哺乳動物に投与する段階と、
を含む、方法。
【請求項６３】
前記調節が、イオン輸送を活性化することを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記調節が、イオン輸送を阻害することを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が、ニューロン、グリア細胞、筋細胞、幹細胞、内分泌細胞、および免疫細胞からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記修飾ＬＧＩＣの細胞への投与が、インビボ投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記修飾ＬＧＩＣの細胞への投与が、エクスビボ投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
哺乳動物において細胞の興奮性を調節する方法であって、
哺乳動物由来の細胞に修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）を投与する段階であって、外因性ＬＧＩＣリガンドが、修飾ＬＧＩＣに選択的に結合し、該修飾ＬＧＩＣが、少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを含み、該修飾ＬＧＩＣサブユニットが、
少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むリガンド結合ドメイン、および
イオン細孔ドメイン
を含む、段階と、
前記外因性リガンドを哺乳動物に投与する段階と、
を含む、方法。
【請求項６９】
前記調節が、細胞の興奮性を増大させることを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記調節が、細胞の興奮性を低下させることを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞が、興奮性細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞が、ニューロン、グリア細胞、筋細胞、幹細胞、内分泌細胞、および免疫細胞からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記修飾ＬＧＩＣの細胞への投与が、インビボ投与を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記修飾ＬＧＩＣの細胞への投与が、エクスビボ投与を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
哺乳動物において細胞の活性を調節する方法であって、
細胞に修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）を投与する段階であって、外因性ＬＧＩＣリガンドが、修飾ＬＧＩＣに選択的に結合し、該修飾ＬＧＩＣが、少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを含み、該修飾ＬＧＩＣサブユニットが、
少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むリガンド結合ドメイン、および
イオン細孔ドメイン
を含む、段階と、
前記外因性リガンドを哺乳動物に投与する段階と、
を含む、方法。
【請求項７６】
前記調節が、細胞の活性を増大させることを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記調節が、細胞の活性を低下させることを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記活性が、イオン輸送、受動輸送、興奮、阻害、およびエキソサイトーシスからなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞が、ニューロン、グリア細胞、筋細胞、幹細胞、内分泌細胞、および免疫細胞からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記修飾ＬＧＩＣの哺乳動物由来細胞への投与が、インビボ投与を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記修飾ＬＧＩＣの哺乳動物由来細胞への投与が、エクスビボ投与を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記修飾ＬＧＩＣが、第１のＬＧＩＣからのＬＢＤおよび第２のＬＧＩＣからのＩＰＤを含むキメラＬＧＩＣである、請求項６０、６２、６８、または７５のいずれか一項に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項８３】
前記キメラＬＧＩＣが、ホモマーのキメラＬＧＩＣである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記修飾ＬＧＩＣの細胞への投与が、該修飾ＬＧＩＣをコードする核酸を投与することを含む、請求項６０、６２、６８、または７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記修飾ＬＧＩＣが、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：１０に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記修飾ＬＧＩＣが、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、または配列番号：１０に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記修飾ＬＧＩＣが、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１０に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記修飾ＬＧＩＣが、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１０に記載の配列を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＬＢＤが、アルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７−ｎＡＣｈＲ）ＬＢＤである、請求項６０、６２、６８、または７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ中の少なくとも１つの修飾アミノ酸が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基７７、７９、１１５、１３１、１３９、１４１、１７５、２１０、２１６、２１７、および２１９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基においてアミノ酸置換を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基７７にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｗ７７ＦおよびＷ７７Ｙからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基７９にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｑ７９Ａ、Ｑ７９Ｇ、およびＱ７９Ｓからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基１１５にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｙ１１５Ｆ置換である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基１３１にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ｍ、およびＬ１３１Ｎからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基１３９にあり、かつ、該アミノ酸置換がＱ１３９ＧまたはＱ１３９Ｌ置換である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基１７５にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｇ１７５Ａ、Ｇ１７５Ｆ、Ｇ１７５Ｈ、Ｇ１７５Ｋ、Ｇ１７５Ｍ、Ｇ１７５Ｒ、Ｇ１７５Ｓ、およびＧ１７５Ｖからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２１０にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｙ２１０Ｆ置換である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９８】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２１６にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｐ２１６Ｉである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２１７にあり、かつ、該アミノ酸置換が、Ｙ２１７Ｆである、請求項９０に記載の方法。
【請求項１００】
前記アミノ酸置換が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基２１９にあり、かつ、アミノ酸置換がＤ２１９Ａである、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＩＰＤが少なくとも１つの修飾アミノ酸を含む、請求項６０、６２、６８、または７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＩＰＤが、セロトニン３受容体（５ＨＴ３）ＩＰＤ、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）ＩＰＤ、ＧＡＢＡ受容体ＩＰＤ、およびアルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７−ｎＡＣｈＲ）ＩＰＤからなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＩＰＤがＧｌｙＲ  ＩＰＤであり、かつ、少なくとも1つの修飾アミノ酸が、修飾ＬＧＩＣの残基２９８のアミノ酸置換を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記修飾ＬＧＩＣの残基２９８におけるアミノ酸置換が、Ａ２９８Ｇ置換である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＩＰＤがＧＡＢＡ  ＩＰＤであり、かつ、ＧＡＢＡ  ＩＰＤ中の少なくとも1つの修飾アミノ酸が、修飾ＬＧＩＣの残基２９８のアミノ酸置換を含む、請求項１０２に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１０６】
前記キメラＬＧＩＣの残基２９８のアミノ酸置換が、Ｗ２９８Ａ置換である、請求項１０５に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１０７】
前記外因性ＬＧＩＣリガンドが、合成外因性ＬＧＩＣリガンドである、請求項６０、６２、６８、または７５のいずれか一項に記載の修飾ＬＧＩＣ。
【請求項１０８】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、トロパン、キヌクリジン、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナン、１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン、および６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンからなる群から選択される、請求項１０７に記載の方法。 
【請求項１０９】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、トロパンであり、かつ、該トロパンが、トロピセトロン、擬似トロピセトロン、ノルトロピセトロン、化合物７２３、化合物７２５、化合物７３７、および化合物７４５からなる群より選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、キヌクリジンであり、かつ、該キヌクリジンが、ＰＮＵ−２８２９８７、ＰＨＡ−５４３６１３、化合物０４５６、化合物０４３４、化合物０４３６、化合物０３５４、化合物０３５３、化合物０２９５、化合物０２９６、化合物０５３６、化合物０６７６、および化合物７０２からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンであり、かつ、該９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンが、化合物０５３６、化合物０７４９、化合物０７５１、化合物０７６０、および化合物０７６３からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンであり、かつ、該１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンが、３−（１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−４−イル）ジベンゾ［ｂ，ｄ］チオフェン５，５−ジオキシド、化合物０７７３、および化合物０７７４からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記合成外因性ＬＧＩＣリガンドが、６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンであり、かつ、該６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンが、バレニクリン、化合物０７６５、および化合物０７７０からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。 
【請求項１１４】
修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）に選択的に結合するリガンドを同定するための方法であって、
請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣに１つまたは複数の候補リガンドを供する段階と、
該候補リガンドと該修飾ＬＧＩＣとの間の結合を検出し、それにより修飾ＬＧＩＣに選択的に結合するリガンドを同定する段階と、
を含む、方法。
【請求項１１５】
前記修飾ＬＧＩＣが、第一のＬＧＩＣからのＬＢＤおよび第二のＬＧＩＣからのＩＰＤを含むキメラＬＧＩＣである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを含む修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）を検出する方法であって、
請求項１に記載の１つまたは複数の修飾されたＬＧＩＣサブユニットを供する段階と、
該修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する剤を供する段階と、
該修飾ＬＧＩＣと該修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する剤との間の結合を検出し、それにより修飾ＬＧＩＣを検出する段階と、
を含む、方法。
【請求項１１７】
前記修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する剤が、抗体、タンパク質、または小分子を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する剤が、検出可能な標識を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記検出可能な標識が、蛍光標識、放射性標識、および陽電子放出標識からなる群から選択される標識を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
請求項１に記載の修飾ＬＧＩＣを含む哺乳動物細胞。
【請求項１２１】
請求項１に記載の修飾されたＬＧＩＣサブユニットを発現する核酸。
【請求項１２２】
キメラＬＧＩＣサブユニットを含む、ホモマーのキメラのリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）であって、各キメラＬＧＩＣサブユニットが、
Ｑ７９Ｇアミノ酸置換を有し、かつ、Ｗ７７Ｆアミノ酸置換、Ｑ１３９Ｇアミノ酸置換、Ｙ１１５Ｆアミノ酸置換、Ｇ１７５Ｋアミノ酸置換、Ｙ２１０Ｆアミノ酸置換、Ｐ２１６Ｉアミノ酸置換、Ｒ２７Ｄアミノ酸置換、およびＥ４１Ｒアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを有する、アルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体リガンド結合ドメインと、
グリシン受容体イオン細孔ドメインと、
を含み、
ここで、トロピセトロンおよびグラニセトロンからなる群から選択されるリガンドが、キメラＬＧＩＣに選択的に結合し、かつ、該キメラＬＧＩＣが、アセチルコリン（ＡＣｈ）に最小結合する、
ホモマーのキメラのリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）。
【請求項１２３】
キメラＬＧＩＣサブユニットを含む、ホモマーのキメラのリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）であって、各キメラＬＧＩＣサブユニットが、
Ｌ１３１Ｇアミノ酸置換を有し、かつ、Ｑ７９Ｓアミノ酸置換、Ｑ１３９Ｌアミノ酸置換、Ｙ２１７Ｆアミノ酸置換、Ｒ２７Ｄアミノ酸置換、およびＥ４１Ｒアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを有する、アルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体リガンド結合ドメインと、
グリシン受容体イオン細孔ドメインおよびセロトニン３受容体イオン細孔ドメインからなる群から選択されるイオン細孔ドメインと、
を含み、
ここで、バレニクリンおよびトロピセトロンからなる群から選択されるリガンドが、キメラＬＧＩＣに選択的に結合し、かつ、該キメラＬＧＩＣが、アセチルコリン（ＡＣｈ）に最小結合する、
ホモマーのキメラのリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）。
【請求項１２４】
哺乳動物においてチャネル障害を治療する方法であって、
哺乳動物において細胞に請求項１２２または１２３に記載のＬＧＩＣを投与する段階と、
該哺乳動物にリガンドを投与する段階と、
を含む、方法。
【請求項１２５】
哺乳動物において細胞の興奮性を調節する方法であって、
哺乳動物において細胞に請求項１２２または１２３に記載のＬＧＩＣを投与する段階と、
該哺乳動物にリガンドを投与する段階と、
を含む、方法。
【請求項１２６】
哺乳動物において細胞の活性を調節する方法であって、
哺乳動物において細胞に請求項１２２または１２３に記載のＬＧＩＣを投与する段階と、
該哺乳動物にリガンドを投与する段階と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、2016年7月7日に出願された米国特許出願第62/359,534号の利益を主張し、2017年4月18日に出願された米国特許出願第62/486,779号の利益を主張する。これら先の出願の開示は、この出願の開示の一部とみなされる（そして、本願の開示において引用により組み込まれる）。
【０００２】
１．技術分野
本明細書は、リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）活性を制御するための材料および方法に関する。例えば、本明細書は、修飾リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）および／または修飾イオン細孔ドメイン（ＩＰＤ）を有する少なくとも１つのＬＧＩＣサブユニットを含む修飾ＬＧＩＣを供する。修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができる外因性ＬＧＩＣリガンドも供される。特定の場合、修飾ＬＧＩＣおよび外因性リガンドは、チャネル障害（例えば、神経チャネル障害または筋肉チャネル障害）を有する哺乳動物を治療するのに用いることができる。特定の場合、修飾ＬＧＩＣおよび外因性ＬＧＩＣリガンドは、哺乳動物の細胞の膜を横切るイオン輸送を調節（例えば、活性化または阻害）するのに用いることができる。特定の場合、修飾ＬＧＩＣおよび外因性ＬＧＩＣリガンドは、哺乳動物における細胞の興奮性を調節する（例えば、増加または減少させる）のに用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
２．背景情報
イオンチャネルは細胞内のイオンフラックスを媒介し、それはそれらの生物学的機能に深く影響を及ぼす。これの顕著な例はニューロンにあり、ここでは、イオンチャネルが生理学、感覚、行動、気分、および認知に影響を与えるためにニューロン間の電気信号伝達を制御する。
【０００４】
異なるＬＧＩＣは、明確なリガンド結合特性および特定のイオン伝導特性を有する（Hille 2001 Ion Channels of Excitable Membranes. pp. 814. Sunderland, MA: Sinauer Associates（非特許文献1）; Kandel et al 2000 Principles of Neural Science. USA: McGraw-Hill Co. 1414 pp（非特許文献2））。たとえば、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、内因性リガンドアセチルコリン（ＡＣｈ）に結合し、それがカチオンのコンダクタンスを活性化し、典型的には細胞を脱分極し、それによって細胞の興奮性を増加させる。対照的に、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）は、内因性リガンドであるグリシンに結合し、それは塩化物アニオンのコンダクタンスを活性化し、典型的には過分極および／または細胞膜抵抗の電気シャントによって細胞の興奮性を低下させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hille 2001 Ion Channels of Excitable Membranes. pp. 814. Sunderland, MA: Sinauer Associates
【非特許文献２】Kandel et al 2000 Principles of Neural Science. USA: McGraw-Hill Co. 1414 pp
【発明の概要】
【０００６】
概要
ＡＣｈなどの内因性ＬＧＩＣアゴニストのレベルは、容易には制御されない。
本明細書は、ＬＧＩＣ活性を制御する（例えば、外因性リガンドに対するＬＧＩＣの感度を高める、および／またはＡＣｈなどの内因性リガンドに対する感度を低下させる）ための材料および方法を供する。例えば、本明細書は、ＬＢＤおよびＩＰＤを有し、かつ、少なくとも１つの修飾されたアミノ酸（例えば、アミノ酸置換）を有する、少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを含む、修飾されたＬＧＩＣを供する。修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができる外因性ＬＧＩＣリガンドも供される。特定の場合には、修飾ＬＧＩＣおよび外因性リガンドは、チャネル障害（例えば、神経チャネル障害または筋肉チャネル障害）を有する哺乳動物を治療するのに用いることができる。特定の場合、修飾ＬＧＩＣおよび外因性ＬＧＩＣリガンドは、哺乳動物の細胞の膜を横切るイオン輸送を調節（例えば、活性化または阻害）するのに用いることができる。特定の場合、修飾ＬＧＩＣおよび外因性ＬＧＩＣリガンドは、哺乳動物における細胞の興奮性を調節する（例えば、増加または減少させる）のに用いることができる。
【０００７】
ＬＧＩＣ活性を制御する能力を有することは、細胞内のイオン輸送の制御を達成するためのユニークでまだ実現されていない機会を提供する。たとえば、１つまたは複数の外因性ＬＧＩＣリガンドに対して増加された感度を有する修飾ＬＧＩＣは、外因性ＬＧＩＣリガンドの送達に基づいてイオン輸送および／または細胞興奮性の時間的および空間的制御を提供するのに用いることができる。たとえば、内因性ＬＧＩＣリガンドに対して低下された感度を有する修飾ＬＧＩＣは、修飾ＬＧＩＣの望ましくない活性化を防ぎ、外因性リガンドによる修飾ＬＧＩＣに対する選択的制御を可能にする。さらに、修飾ＬＧＩＣに対して増強された効力を有する外因性ＬＧＩＣリガンドは、内因性イオンチャネルに対する修飾ＬＧＩＣの標的化の選択性を改善する。したがって、本明細書で供される修飾ＬＣＩＧおよび外因性ＬＧＩＣリガンドは、意図しない標的に対する小分子からの副作用を軽減しながら治療効果を達成するのに有用である。
【０００８】
本明細書中に記載されるように、修飾ＬＧＩＣにおける１つまたは複数の変異は、外因性ＬＧＩＣリガンドに対する効力を増強することができる。 残基Ｌ１３１でのα７−ＧｌｙＲのα７  ＬＢＤの突然変異（例えば、ＬｅｕをＧｌｙまたはＡｌａで置換する）は、バレニクリン（１６倍）およびトロピセトロン（３．６倍）について効力を増加させながら、α７−ＧｌｙＲに対するＡＣｈ効力（−６．４倍）を減少させた。残基Ｇ１７５（例えば、Ｇ１７５Ｋ）またはＰ２１６（例えば、Ｐ２１６Ｉ）でのα７−ＧｌｙＲのα７  ＬＢＤの突然変異は、ＡＣｈ、ニコチン、トロピセトロン、バレニクリン、ならびに他のキヌクリジンおよびトロパンアゴニストに対する効力を増強した。残基Ｇ１７５Ｋでの変異を内因性アゴニストＡＣｈの効力を低下させる変異（例えば、Ｙ１１５Ｆ）と組み合わせると、トロピセトロンに対する効力が上昇し（５．５倍）、ＡＣｈからの効力が低下する（−８倍）α７−ＧｌｙＲ  Ｙ１１５Ｆ  Ｇ１７５Ｋが生成された。さらに、これらのキメラチャネルにおける残基７７（例えば、ＴｒｐをＰｈｅまたはＴｙｒに置換する）および／または７９（例えば、ＧｌｎをＧｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒに置換する）および／または１３１（例えばＬｅｕをＧｌｙまたはＡｌａに置換する）および／または１４１（例えば、ＬｅｕをＰｈｅまたはＰｒｏに置換する）におけるα７  ＬＢＤにおける変異を、残基Ｇ１７５（例えば、Ｇ１７５Ｋ）またはＰ２１６（例えば、Ｐ２１６Ｉ）における効力を増強する変異と組み合わせると、異なるリガンドに対する効力を高め、および／またはＡＣｈ効力を低下させる。例えば、残基７９の突然変異（例えばＧｌｎをＧｌｙに置換）、残基１１５の突然変異（例えばＴｙｒをＰｈｅに置換）、および残基１７５の突然変異（例えばＧｌｙをＬｙｓに置換）を有するα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（α７  ＬＢＤ）を有するキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣは、外因性トロパンＬＧＩＣリガンド化合物７２３（トロパン）に対して１００倍を超える増加した感度を有し、未修飾キメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣに対して減少したＡＣｈ感度（−１５倍）を有する。さらに、残基７９に突然変異を有する（例えば、ＧｌｎをＡｌａ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒに置換する）α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（α７  ＬＢＤ）、および残基２９８に突然変異を有する（例えば、ＡｌａをＧｌｙに置換する）ＧｌｙＲ  ＩＰＤを有する少なくとも１つのキメラＬＧＩＣサブユニットを含む修飾ＬＧＩＣは、キヌクリジンまたはトロパンのような外因性ＬＧＩＣリガンドに対してほぼ２０倍増加した感度を有する。α７  ＬＢＤの残基２７（例えば、ＡｒｇをＡｓｐに置換する）および４１（例えば、ＧｌｕをＡｒｇに置換する）におけるさらなる変異は、修飾キメラＬＧＩＣと未修飾イオンチャネルとの会合を減少させた。α７  ＬＢＤの残基１１５（例えば、ＴｙｒをＰｈｅに置換する）、１３９（例えば、ＧｌｎをＧｌｙまたはＬｅｕに置換する）、２１０（例えば、ＴｙｒをＰｈｅに置換する）、２１７（例えば、ＴｙｒをＰｈｅに置換する）、および／または２１９（例えば、ＡｓｐをＡｌａで置換する）におけるさらなる変異は、内因性リガンドＡＣｈに対するキメラＬＧＩＣの感受性を低下させた。これらのキメラＬＧＩＣは、哺乳動物における内因性シグナル伝達系との交差反応性を最小にしながら、哺乳動物の細胞における細胞機能に対する高度に選択的な制御を可能にする。
【０００９】
概して、本明細書の一態様は、アミノ酸修飾を有するＬＢＤとＩＰＤとを含む少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを有する修飾されたＬＧＩＣであって、外因性ＬＧＩＣリガンドが修飾されたＬＧＩＣを活性化する、修飾されたＬＧＩＣを特徴とする。その修飾ＬＧＩＣは、第一のＬＧＩＣからのＬＢＤおよび第二のＬＧＩＣからのＩＰＤを有するキメラＬＧＩＣであり得る。ＬＢＤは、アルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７−ｎＡＣｈＲ）ＬＢＤであり得る。α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ中の少なくとも１つの修飾アミノ酸が、α７−ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの残基７７、７９、１３１、１３９、１４１、１７５、および２１６からなる群から選択されるアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の修飾ＬＧＩＣ。アミノ酸置換は、α７  ＬＢＤの残基７９であり得、アミノ酸置換は、Ｑ７９Ａ、Ｑ７９Ｇ、またはＱ７９Ｓであり得る。例えば、α７  ＬＢＤの残基７９におけるアミノ酸置換は、Ｑ７９Ｇであり得る。ＩＰＤは、セロトニン３受容体（５ＨＴ３）ＩＰＤ、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）ＩＰＤ、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体ＩＰＤ、またはα７−ｎＡＣｈＲ  ＩＰＤであり得る。ＩＰＤはＧｌｙＲ  ＩＰＤであり得、ＧｌｙＲ  ＩＰＤはキメラＬＧＩＣの残基２９８にアミノ酸置換（例えば、Ａ２９８Ｇ置換）を含み得る。ＩＰＤはＧＡＢＡ  ＩＰＤであり得、ＧＡＢＡ  ＩＰＤは修飾ＬＧＩＣの残基２９８にアミノ酸置換（例えば、Ｗ２９８Ａ置換）を含み得る。修飾ＬＧＩＣは、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換を有するα７  ＬＢＤ、およびＡ２９８Ｇアミノ酸置換を有するＧｌｙＲ  ＩＰＤを含むキメラＬＧＩＣであり得る。外因性ＬＧＩＣリガンドは、キヌクリジン、トロパン、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナン、６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピン、および１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンからなる群から選択される合成外因性ＬＧＩＣリガンドであり得る。合成外因性ＬＧＩＣリガンドがトロパンである場合、トロパンは、トロピセトロン、擬似トロピセトロン、ノルトロピセトロン、化合物７２３、化合物７２５、化合物７３７、または化合物７４５であり得る。合成外因性ＬＧＩＣリガンドがキヌクリジンである場合、キヌクリジンは、ＰＮＵ−２８２９８７、ＰＨＡ−５４３６１３、化合物０４５６、化合物０４３４、化合物０４３６、化合物０３５４、化合物０３５３、化合物０２９５、化合物０２９６、化合物０５３６、化合物０６７６、または化合物７０２であり得る。合成外因性ＬＧＩＣリガンドが６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンである場合、リガンドは化合物７６５または化合物７７０であり得る。合成外因性ＬＧＩＣリガンドが１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンである場合、リガンドは化合物７７３または化合物７７４であり得る。特定の場合において、ＬＢＤはα７  ＬＢＤであり得、α７  ＬＢＤはまた、非修飾ＬＧＩＣへの結合に勝る、少なくとも１つの修飾アミノ酸を有する別のα７  ＬＢＤへの選択的結合を付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸を含み得る。未修飾ＬＧＩＣは、内因性ＬＧＩＣ（例えば、内因性α７−ｎＡＣｈＲ）であり得る。非修飾ＬＧＩＣへの結合の減少をもたらすα７  ＬＢＤ中の少なくとも１つの修飾アミノ酸は、残基２７（例えばＲ２７Ｄ置換）および／または残基４１（例えばＥ４１Ｒ置換）でのアミノ酸置換を含み得る。場合によっては、ＩＰＤは５ＨＴ３  ＩＰＤであり得、５ＨＴ３  ＩＰＤは、修飾ＬＧＩＣに増大したイオン伝導性（コンダクタンス）を付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸を含み得る。修飾ＬＧＩＣにイオン伝導度の増加を付与する５ＨＴ３  ＩＰＤ中の少なくとも１つの修飾アミノ酸は、残基４２５（例えば、Ｒ４２５Ｑ置換）、４２９（例えば、Ｒ４２９Ｄ置換）、および／または４３３（例えば、Ｒ４３３Ａ置換）のアミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含み得る。
【００１０】
別の態様では、本明細書は、少なくとも１つの修飾アミノ酸を有するＬＢＤおよびＩＰＤを含む少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを有する修飾ＬＧＩＣを特徴とし、ここで、ＬＢＤ中の少なくとも１つの修飾アミノ酸は内因性ＬＧＩＣリガンドとの結合を低減させる。修飾ＬＧＩＣは、第一のＬＧＩＣからのＬＢＤおよび第二のＬＧＩＣからのＩＰＤを有するキメラＬＧＩＣであり得る。内因性ＬＧＩＣリガンドはＡＣｈであり得る。修飾ＬＧＩＣは、Ａｃｈに対して２０μＭを超えるＥＣ５０を有し得る。少なくとも１つの修飾アミノ酸は、残基１１５、１３９、２１０、２１７、および／または２１９でのアミノ酸置換を含み得る。少なくとも１つの修飾アミノ酸が残基１１５でのアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換はＹ１１５Ｆ置換であり得る。少なくとも１つの修飾アミノ酸が残基１３９にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換はＱ１３９ＧまたはＱ１３９Ｌ置換であり得る。少なくとも１つの修飾アミノ酸が残基２１０にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換はＹ２１０Ｆ置換であり得る。少なくとも１つの修飾アミノ酸が残基２１７にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換はＹ２１７Ｆ置換であり得る。少なくとも１つの修飾アミノ酸が残基２１９にアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換はＤ２１９Ａ置換であり得る。
【００１１】
別の態様では、本明細書は、修飾されたリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）に対して増加した効力を有するリガンドを特徴とし、ここで、そのリガンドは式Ｉ：
2019530468.tif 000002
（式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３のそれぞれは、独立して、ＣＨ、ＣＨ２、Ｏ、ＮＨ、またはＮＭｅであり得、各ｎは独立して０または１であり得、ＹはＯまたはＳであり、Ａは芳香族置換基であり、ＲはＨまたはピリジニルメチレンである）
を含む。芳香族置換基は、１Ｈ−インドール、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、２，５−ジメトキシベンゼン、４−クロロアニリン、アニリン、５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル、６−（トリフルオロメチル）ニコチン（nicotinic）、または４−クロロベンゼンであり得る。
【００１２】
特定の場合、ＬＧＩＣリガンドはキヌクリジンであり得、式ＩＩ：
2019530468.tif 000003
（式中、Ｘ３は、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、Ｙは、ＯまたはＳであり、Ａは芳香族置換基であり、ＲはＨまたはピリジニルメチレンである）
に示される構造を有し得る。芳香族置換基は、１Ｈ−インドール、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−クロロベンゼン、２，５−ジメトキシベンゼン、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−クロロアニリン、アニリン、５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル、６−（トリフルオロメチル）ニコチン、３−クロロ−４−フルオロベンゼン、または１Ｈ−インドールであり得る。キヌクリジンは、ＰＮＵ−２８２９８７、ＰＨＡ−５４３６１３、化合物０４５６、化合物０４３４、化合物０４３６、化合物０３５４、化合物０３５３、化合物０２９５、化合物０２９６、化合物０５３６、化合物０６７６、または化合物７０２であり得る。
【００１３】
特定の場合、ＬＧＩＣリガンドトロパンであり得、式ＩＩＩ：
2019530468.tif 000004
（式中、Ｘ２はＮＨまたはＮＭｅであり、Ｘ３はＯ、ＮＨ、またはＣＨ２であり、ＹはＯまたはＳであり、Ａは芳香族置換基である）
に示す構造を有し得る。芳香族置換基は、１Ｈ−インドール、７−メトキシ−１Ｈ−インドール、７−メチル−１Ｈ−インドール、５−クロロ−１Ｈ−インドール、または１Ｈ−インダゾールであり得る。トロパンは、トロピセトロン、擬似トロピセトロン、ノルトロピセトロン、化合物７２３、化合物７２５、化合物７３７、または化合物７４５であり得る。
【００１４】
特定の場合、ＬＧＩＣリガンドは、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンであり得、そして式ＩＶ：
2019530468.tif 000005
（式中、Ｘ１はＣＨであり得、Ｘ２はＮＨまたはＮＭｅであり得、Ｘ３はＯ、ＮＨ、またはＣＨであり得、ＹはＯまたはＳであり得、Ａは芳香族置換基であり得る）
に示される構造を有し得る。芳香族置換基は、４−クロロ−ベンゼンであり得る。９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンは化合物０５３６であり得る。
【００１５】
別の態様では、本明細書は、修飾されたリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）に対して増大した効力を有するリガンドを特徴とする。ここで、そのリガンドは、６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンであり得、式Ｖ：
2019530468.tif 000006
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３であり得、ＡはＨまたは芳香族置換基であり得る）
に示す構造を有し得る。６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンは、バレニクリン、化合物０７６５、または化合物０７７０であり得る。
【００１６】
別の態様では、本明細書は、修飾リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）に対して増大した効力を有するリガンドを特徴とする。ここで、そのリガンドは、１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンであり得、式ＶＩ：
2019530468.tif 000007
（式中、ＲはＨ、Ｆ、またはＮＯ２であり得る）
に示す構造を有し得る。１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンは、３−（１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−４−イル）ジベンゾ［ｂ、ｄ］チオフェン５，５−ジオキシド、化合物０７７３、または化合物０７７４であり得る。
【００１７】
別の態様では、本明細書は、哺乳動物においてチャネル障害を治療する方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物において細胞に修飾ＬＧＩＣを投与することを含み、または本質的にそれからなり、ここで、外因性ＬＧＩＣリガンドは修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する。修飾ＬＧＩＣは、少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むＬＢＤおよびＩＰＤを含む少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを有する。そして外因性リガンドが哺乳動物に投与される。チャネル障害は、バーター症候群、ブルガダ症候群、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍症（ＣＰＶＴ）、先天性高インスリン血症、嚢胞性線維症、ドラベ症候群、一過性運動失調症（episodic ataxia）、先端紅痛症、全般てんかん（たとえば、熱性発作を伴うもの）、家族性片麻痺性片頭痛、線維筋痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ランバート−イートン（Lambert-Eaton）筋無力症候群、QT延長症候群（たとえば、ロマノ−ワード（Romano-Ward）症候群）、QT短縮症候群、悪性高熱症、ムコリピドーシスIV型、重症筋無力症、先天性ミオトニー、視神経脊髄炎、神経ミオトニー、非症候性難聴、先天性パラミオトニア、網膜色素変性症、チモシー症候群、耳鳴り、発作、三叉神経痛、および多発性硬化症であり得る。
【００１８】
別の態様において、本明細書は、哺乳動物の細胞膜を横切るイオン輸送を調節する方法を特徴とする。この方法は、修飾ＬＧＩＣを細胞に投与することを含むか、または本質的にそれからなり、ここで、外因性ＬＧＩＣリガンドは修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する。修飾ＬＧＩＣは、少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むＬＢＤおよびＩＰＤを含む少なくとも１つの修飾ＬＧＩＣサブユニットを有する。そして、外因性リガンドは哺乳動物に投与される。調節は、イオン輸送を活性化または阻害することを含み得る。細胞は、ニューロン、グリア細胞、筋細胞、幹細胞、内分泌細胞、または免疫細胞であり得る。細胞への修飾ＬＧＩＣの投与は、インビボ投与またはエクスビボ投与であり得る。修飾ＬＧＩＣの細胞への投与は、修飾ＬＧＩＣをコードする核酸の投与を含み得る。
【００１９】
別の態様において、本明細書は、哺乳動物において細胞の興奮性を調節する方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物由来の細胞に修飾ＬＧＩＣを投与することを含むか、または本質的にそれからなり、ここで、外因性ＬＧＩＣリガンドは修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する。修飾ＬＧＩＣは、少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むＬＢＤおよびＩＰＤを含む少なくとも１つの修飾ＬＧＩＣサブユニットを有する。そして、外因性リガンドが哺乳動物に投与される。調節は、細胞の興奮性を増加させること、または細胞の興奮性を減少させることを含み得る。細胞は興奮性細胞であり得る。細胞は、ニューロン、グリア細胞、筋細胞、幹細胞、内分泌細胞、または免疫細胞であり得る。細胞への修飾ＬＧＩＣの投与は、インビボ投与またはエクスビボ投与であり得る。修飾ＬＧＩＣの細胞への投与は、修飾ＬＧＩＣをコードする核酸の投与を含み得る。
【００２０】
別の態様において、本明細書は、哺乳動物において細胞の活性を調節する方法を特徴とする。この方法は、修飾ＬＧＩＣを細胞に投与することを含むか、または本質的にそれからなり、ここで、外因性ＬＧＩＣリガンドは修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する。修飾ＬＧＩＣは、少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むＬＢＤおよびＩＰＤを含む少なくとも１つの修飾ＬＧＩＣサブユニットを有する。そして、外因性リガンドが哺乳動物に投与される。調節は、細胞の活性を増加させることまたは細胞の活性を減少させることを含み得る。活性は、イオン輸送、受動輸送、興奮、阻害、またはエキソサイトーシスであり得る。細胞は、ニューロン、グリア細胞、筋細胞、幹細胞、内分泌細胞、または免疫細胞であり得る。細胞への修飾ＬＧＩＣの投与は、インビボ投与またはエクスビボ投与であり得る。修飾ＬＧＩＣの細胞への投与は、修飾ＬＧＩＣをコードする核酸の（例えば、アデノ関連性ウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはレンチウイルスなどのウイルスベクターを介しての）投与を含み得る。
【００２１】
他の態様では、本文献は、修飾ＬＧＩＣに選択的に結合するリガンドを同定するための方法を特徴とする。 この方法は、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに対する１つまたは複数の候補リガンドを供し、そして、候補リガンドと修飾ＬＧＩＣとの間の結合を検出し、それによって修飾ＬＧＩＣに選択的に結合するリガンドを同定することを含むか、またはそれらから本質的になる。修飾ＬＧＩＣはホモマー修飾ＬＧＩＣであり得る。
【００２２】
他の態様では、本明細書は、修飾ＬＧＩＣを検出するための方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ＬＧＩＣサブユニットを供し、修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する剤を供し、そして、修飾ＬＧＩＣと修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する剤との間の結合を検出することによって修飾ＬＧＩＣを検出することを含むか、またはそれらから本質的になる。修飾ＬＧＩＣを選択的に結合する剤は、抗体、タンパク質（例えば、ブンガロトキシン）、または小分子（例えば、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）リガンド）であり得る。修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する剤は、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性標識、または陽電子放出標識）を含み得る。
【００２３】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本開示における使用のために本明細書に記載される。当該分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法、および例は例示にすぎず、限定することを意図しない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、その全体が引用により組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含め、本明細書が優先するであろう。
【００２４】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、そして特許請求の範囲から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、キメラＬＧＩＣの例示的なアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基７７の突然変異（例えば、Ｗ７７ＦまたはＷ７７Ｙ）は、グラニセトロンおよびトロピセトロンに対する感受性をもたらした。アミノ酸残基７９の突然変異（例えば、Ｑ７９Ｇ）は、いくつかのアゴニストに最も効果的であった。アミノ酸残基１３１の変異（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）は、バレニクリン、トロピセトロン、グラニセトロン、およびＡＣｈに対する感受性を変化させた。ＬＢＤ突然変異をＧｌｙＲまたはＧＡＢＡＣ  ＩＰＤのアミノ酸残基２９８の突然変異と組み合わせた場合、効力はかなり増強された。α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ変異をアミノ酸残基Ｇ１７５およびＰ２１６での変異と組み合わせた場合も、効力が増強された。Ａ）ヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：１）およびマウス５ＨＴ３  ＩＰＤ（配列番号：３）構成物を含む、α７−５ＨＴ３キメラ受容体のアミノ酸配列（配列番号：６）。
【図１Ｂ】図１は、キメラＬＧＩＣの例示的なアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基７７の突然変異（例えば、Ｗ７７ＦまたはＷ７７Ｙ）は、グラニセトロンおよびトロピセトロンに対する感受性をもたらした。アミノ酸残基７９の突然変異（例えば、Ｑ７９Ｇ）は、いくつかのアゴニストに最も効果的であった。アミノ酸残基１３１の変異（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）は、バレニクリン、トロピセトロン、グラニセトロン、およびＡＣｈに対する感受性を変化させた。ＬＢＤ突然変異をＧｌｙＲまたはＧＡＢＡＣ  ＩＰＤのアミノ酸残基２９８の突然変異と組み合わせた場合、効力はかなり増強された。α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ変異をアミノ酸残基Ｇ１７５およびＰ２１６での変異と組み合わせた場合も、効力が増強された。Ｂ）ヒトα７ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）構成物を含む、α７−ＧｌｙＲキメラ受容体のアミノ酸配列（配列番号：７）。
【図１Ｃ】図１は、キメラＬＧＩＣの例示的なアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基７７の突然変異（例えば、Ｗ７７ＦまたはＷ７７Ｙ）は、グラニセトロンおよびトロピセトロンに対する感受性をもたらした。アミノ酸残基７９の突然変異（例えば、Ｑ７９Ｇ）は、いくつかのアゴニストに最も効果的であった。アミノ酸残基１３１の変異（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）は、バレニクリン、トロピセトロン、グラニセトロン、およびＡＣｈに対する感受性を変化させた。ＬＢＤ突然変異をＧｌｙＲまたはＧＡＢＡＣ  ＩＰＤのアミノ酸残基２９８の突然変異と組み合わせた場合、効力はかなり増強された。α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ変異をアミノ酸残基Ｇ１７５およびＰ２１６での変異と組み合わせた場合も、効力が増強された。Ｃ）ヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：１）およびヒト５ＨＴ３  ＩＰＤ（配列番号：４）構成物を含む、α７−５ＨＴ３キメラ受容体のアミノ酸配列（配列番号：８）。
【図１Ｄ】図１は、キメラＬＧＩＣの例示的なアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基７７の突然変異（例えば、Ｗ７７ＦまたはＷ７７Ｙ）は、グラニセトロンおよびトロピセトロンに対する感受性をもたらした。アミノ酸残基７９の突然変異（例えば、Ｑ７９Ｇ）は、いくつかのアゴニストに最も効果的であった。アミノ酸残基１３１の変異（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）は、バレニクリン、トロピセトロン、グラニセトロン、およびＡＣｈに対する感受性を変化させた。ＬＢＤ突然変異をＧｌｙＲまたはＧＡＢＡＣ  ＩＰＤのアミノ酸残基２９８の突然変異と組み合わせた場合、効力はかなり増強された。α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ変異をアミノ酸残基Ｇ１７５およびＰ２１６での変異と組み合わせた場合も、効力が増強された。Ｄ）ヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）およびヒトＧＡＢＡＣ  ＩＰＤ（配列番号：９）構成物を含む、α７−ＧＡＢＡｃキメラ受容体のアミノ酸配列（配列番号：１０）。
【図１Ｅ】図１は、キメラＬＧＩＣの例示的なアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基７７の突然変異（例えば、Ｗ７７ＦまたはＷ７７Ｙ）は、グラニセトロンおよびトロピセトロンに対する感受性をもたらした。アミノ酸残基７９の突然変異（例えば、Ｑ７９Ｇ）は、いくつかのアゴニストに最も効果的であった。アミノ酸残基１３１の変異（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）は、バレニクリン、トロピセトロン、グラニセトロン、およびＡＣｈに対する感受性を変化させた。ＬＢＤ突然変異をＧｌｙＲまたはＧＡＢＡＣ  ＩＰＤのアミノ酸残基２９８の突然変異と組み合わせた場合、効力はかなり増強された。α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ変異をアミノ酸残基Ｇ１７５およびＰ２１６での変異と組み合わせた場合も、効力が増強された。Ｅ）ラットｎＡＣｈＲ配列のアミノ酸配列（配列番号１２）。
【図２】図２は、α７−５ＨＴ３キメラＬＧＩＣ、および図１に示す位置にＬＢＤ変異を有するキメラＬＧＩＣの変異体に対するトロピセトロンのＥＣ５０を示す。Ｇｌｎ７９における複数の変異は、未修飾α７−５ＨＴ３チャネルと比較して類似または改善された効力を示した（矢印）。
【図３Ａ】図３は、α７−５ＨＴ３キメラＬＧＩＣに対する既知のｎＡＣｈＲアゴニストの相対的効力を示す。Ａ）未修飾のα７−５ＨＴ３キメラチャネルに対して正規化したＥＣ５０のグラフ（対数目盛）。＊Ｐ＜０．０５、統計的に有意な効力の変化が認められる（ＡＮＯＶＡとそれに続くダン検定）。
【図３Ｂ】図３は、α７−５ＨＴ３キメラＬＧＩＣに対する既知のｎＡＣｈＲアゴニストの相対的効力を示す。Ｂ）既知のｎＡＣｈＲアゴニストの化学構造。
【図４Ａ】図４は、α７−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣに対する既知のｎＡＣｈＲアゴニストの相対的効力を示す。Ａ）未修飾α７−ＧｌｙＲキメラチャネルに対して正規化したＱ７９  ＬＢＤ突然変異体についてのＥＣ５０のグラフ（対数目盛）。
【図４Ｂ】図４は、α７−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣに対する既知のｎＡＣｈＲアゴニストの相対的効力を示す。Ｂ）未修飾α７−ＧｌｙＲキメラチャネルに対して正規化したＡ２９８Ｇ  ＩＰＤ突然変異についてのＥＣ５０のグラフ（対数目盛）。
【図４Ｃ】図４は、α７−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣに対する既知のｎＡＣｈＲアゴニストの相対的効力を示す。Ｃ）未修飾α７−ＧｌｙＲキメラチャネルに対して正規化し、二重変異体チャネルα７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇと比較した、α７−ＧｌｙＲＡ２９８ＧについてのＥＣ５０のグラフ（対数目盛）。＊Ｐ＜０．０５、統計的に有意な効力の変化が認められる（ＡＮＯＶＡとそれに続くダン検定）。
【図５Ａ】図５は、α７Ｑ７９Ｇ−５ＨＴ３およびα７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇについての効力増強と最も適合する置換パターンを有するＬＧＩＣアゴニストの概略構造を示す。Ａ）強化された効力に関連する特性を示す一般化構造。
【図５Ｂ】図５は、α７Ｑ７９Ｇ−５ＨＴ３およびα７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇについての効力増強と最も適合する置換パターンを有するＬＧＩＣアゴニストの概略構造を示す。Ｂ）（Ａ）で表される特定のファーマコフォアは、キヌクリジン、トロパン、および９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンコア構造である。
【図５Ｃ】図５は、α７Ｑ７９Ｇ−５ＨＴ３およびα７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇについての効力増強と最も適合する置換パターンを有するＬＧＩＣアゴニストの概略構造を示す。Ｃ）α７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇ、α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲ、α７Ｗ７７Ｆ、Ｑ７９Ｇ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲに対して高い効力を示す例示的合成分子。
【図６Ａ】図６は、キメラＬＣＩＧ  α７ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤと未修飾ＬＢＤとの会合を減少させる突然変異を示す。Ａ）α７−５ＨＴ３をコードする２つのエピトープタグ付き（ＨＡおよびＶ５）コンストラクト（上側）、またはα７−５ＨＴ３−ＨＡおよびα７Ｒ２１Ｄ、Ｅ４１Ｒ−５ＨＴ３−Ｖ５をコードする２つのコンストラクトのトランスフェクションの電荷反転概略ポテンシャル配置。ここで、２つの異なるエピトープタグ付きサブユニット間の会合は、サブユニット界面での電荷反転突然変異のために好ましくないであろう。
【図６Ｂ】図６は、キメラＬＣＩＧ  α７ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤと未修飾ＬＢＤとの会合を減少させる突然変異を示す。Ｂ）Ｖ５エピトープタグを有するα７Ｒ２１Ｄ、Ｅ４１Ｒ−５ＨＴ３を発現するＨＥＫ細胞における全細胞記録は、ＰＮＵ−２８２９８７に対する強力な応答を示す。
【図６Ｃ】図６は、キメラＬＣＩＧ  α７ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤと未修飾ＬＢＤとの会合を減少させる突然変異を示す。Ｃ）ＨＥＫ細胞中のα７−５ＨＴ３  ＬＧＩＣとＨＡおよびＶ５エピトープタグとの会合を、ＨＡ免疫沈降（左）または全溶解物単離、続いて抗ＨＡ（上）または抗Ｖ５抗体（下）のいずれかを用いたウエスタンブロッティングによって調べた。ＨＡおよびＶ５エピトープとチャネルを共発現する細胞において、抗ＨＡ  ＩＰとそれに続く抗Ｖ５イムノブロッティングは、各タイプの未修飾チャネルの共免疫沈降を示すが、ＬＢＤα7Ｒ２１Ｄ、Ｅ４１Ｒ−５ＨＴ３―Ｖ５における電荷反転突然変異は免疫沈降しなかった。α７−５ＨＴ３のＭＷは、約４８ｋＤである（矢印）。
【図７】図７は、キメラＬＧＩＣが外因性リガンドを用いて制御され得ることを示す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介してα７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８ＧキメラＬＧＩＣを形質導入したマウス脳からの皮質ニューロンは、３０ｎＭのトロピセトロンによって強力に抑制される４０ｐＡの電流注入（ＰＲＥ）に応答して活動電位を発火する。トロピセトロンの洗い流し（ＷＡＳＨ）後、ニューロンの発火は回復する。
【図８Ａ】図８は、Ｇ１７５Ｋ変異を有するキメラＬＧＩＣに対するアゴニストの活性を示す。Ａ）未修飾α７−ＧｌｙＲキメラチャネルに対して正規化した、既知のアゴニストに対するＱ７９Ｇ  Ｇ１７５Ｋ  ＬＢＤ変異体についてのＥＣ５０のグラフ（対数目盛）。
【図８Ｂ】図８は、Ｇ１７５Ｋ変異を有するキメラＬＧＩＣに対するアゴニストの活性を示す。Ｂ）α７−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣに変異を有するチャネルについてのＡＣｈおよびトロピセトロンについてのＥＣ５０のグラフ。トロピセトロンに対して高い効力および内因性リガンドであるアセチルコリン（ＡＣｈ）に対して低い効力を有するチャネルをもたらす突然変異が最適である（灰色の陰影）。Ｕｎｍｏｄ：未改変のα７−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣ。
【図８Ｃ】図８は、Ｇ１７５Ｋ変異を有するキメラＬＧＩＣに対するアゴニストの活性を示す。Ｃ）α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣを形質導入したマウス脳からの皮質ニューロンの活動電位。ニューロンは電流注入（ＰＲＥ）に反応して発火し、１００ｎＭトロピセトロンによって強力に抑制される。トロピセトロンの洗い流し（ＷＡＳＨ）後、ニューロンの発火は回復する。
【図９Ａ】図９は、Ｌ１３１Ｇ変異を有するキメラＬＧＩＣに対するアゴニストの活性を示す。Ａ）未修飾α７−ＧｌｙＲキメラチャネルに対して正規化した、既知のアゴニストに対するＬ１３１  ＬＢＤ変異体についてのＥＣ５０のグラフ（対数目盛）。
【図９Ｂ】図９は、Ｌ１３１Ｇ変異を有するキメラＬＧＩＣに対するアゴニストの活性を示す。Ｂ）α７Ｌ１３１Ｇ−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣに変異を有するチャネルについてのＡＣｈおよびトロピセトロンについてのＥＣ５０のグラフ。
【図９Ｃ】図９は、Ｌ１３１Ｇ変異を有するキメラＬＧＩＣに対するアゴニストの活性を示す。Ｃ）バレニクリンに対する高い効力および内因性リガンドであるアセチルコリン（ＡＣｈ）に対する低い効力を有するチャネルをもたらす突然変異が最適であることを示すグラフ（灰色の陰影）。Ｕｎｍｏｄ：未修飾のα７−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣ。
【図９Ｄ】図９は、Ｌ１３１Ｇ変異を有するキメラＬＧＩＣに対するアゴニストの活性を示す。Ｄ）α７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｙ２１７Ｆ−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣを形質導入したマウス脳由来の皮質ニューロンの活動電位。ニューロンは電流注入（ＰＲＥ）に反応して発火し、６倍を超える注入電流でも１０ｎＭバレニクリンによって強力に抑制される。トロピセトロンの洗い流し（ＷＡＳＨ）後、ニューロンの発火は回復する。
【図１０】図１０は、ＬＧＩＣアゴニストの化学構造を示す。Ａ）α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲについての効力増強と最も適合する置換パターンを有するＬＧＩＣアゴニストの化学構造。Ｂ）α７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｙ２１７Ｆ−ＧｌｙＲまたはα７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｙ２１７Ｆ−５ＨＴ３ ＨＣに対する効力増強に最も適合する置換パターンを有するＬＧＩＣアゴニストの化学構造。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本明細書は、修飾されたＬＧＩＣ、およびそれを用いる方法を供する。例えば、本明細書は、ＬＢＤおよびＩＰＤを有し、少なくとも１つの修飾アミノ酸（例えば、アミノ酸置換）を有する、少なくとも１つの修飾されたＬＧＩＣサブユニットを含む修飾ＬＧＩＣを供する。特定の場合、修飾ＬＧＩＣはキメラＬＧＩＣであり得る。例えば、キメラＬＧＩＣは、第一のＬＧＩＣからのＬＢＤおよび第二のＬＧＩＣからのＩＰＤを含み得る。特定の場合、修飾アミノ酸は修飾ＬＧＩＣに薬理学的選択性を付与することができる。例えば、修飾アミノ酸は、修飾ＬＧＩＣに外因性ＬＧＩＣリガンドの選択的結合を付与することができる。例えば、修飾アミノ酸は、修飾ＬＧＩＣに、未修飾ＬＧＩＣサブユニット（修飾を欠くＬＧＩＣサブユニットおよび／または内因性ＬＧＩＣサブユニット）の結合の減少（最小化または排除）を付与することができる。例えば、修飾アミノ酸は、内在性ＬＧＩＣリガンドの結合の減少（最小化または排除）を修飾ＬＧＩＣに付与することができる。
【００２７】
本明細書に提供される改変ＬＧＩＣは、例えば、チャネル障害（例えば、神経チャネル障害または筋肉チャネル障害）を治療するための方法において使用され得る。例えば、修飾ＬＧＩＣ、および修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができる外因性ＬＧＩＣリガンドを、チャネル障害を有する哺乳動物を治療するために使用することができる。特定の場合、修飾ＬＧＩＣおよび外因性ＬＧＩＣリガンドは、哺乳動物の細胞の膜を横切るイオン輸送を調節（例えば、活性化または阻害）するのに用いることができる。特定の場合、修飾ＬＧＩＣおよび外因性ＬＧＩＣリガンドは、哺乳動物における細胞の興奮性を調節する（例えば、増加または減少させる）のに用いることができる。
【００２８】
修飾ＬＧＩＣ
本明細書中に用いる場合、「修飾（された）」ＬＧＩＣは、少なくとも１つのＬＧＩＣサブユニットを含むＬＧＩＣである。修飾されたＬＧＩＣサブユニットは、ＬＢＤ中に少なくとも１つの改変アミノ酸（例えば、アミノ酸置換）および／またはＩＰＤ中に少なくとも１つの改変アミノ酸（例えば、アミノ酸置換）を含み得る。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、任意の適切な種（例えば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、またはサル）由来のＬＧＩＣの改変であり得る。特定の場合、修飾ＬＧＩＣは、第一のＬＧＩＣ由来のＬＢＤと第二のＬＧＩＣ由来のＩＰＤとの非自然発生的な組み合わせを有する少なくとも１つのキメラＬＧＩＣサブユニットを含み得る。
【００２９】
修飾ＬＧＩＣは、ホモマー（例えば、任意の数の同じ修飾ＬＧＩＣサブユニットを有するもの）またはヘテロマー（例えば、少なくとも１つの修飾ＬＧＩＣサブユニットおよび任意の数の異なるＬＧＩＣサブユニットを有するもの）であり得る。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、ホモマーの修飾ＬＧＩＣであり得る。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、任意の適切な数の修飾ＬＧＩＣサブユニットを含み得る。特定の場合、修飾ＬＧＩＣは、三量体、四量体、五量体、または六量体であり得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは五量体であり得る。
【００３０】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、任意の適切なＬＧＩＣの改変であり得る。ＬＧＩＣは、リガンドの結合に応答して細胞膜を通してアニオン、カチオン、またはその両方を伝導することができる。例えば、ＬＧＩＣは、リガンドの結合に応答して、細胞膜を通してナトリウム（Na+）、カリウム（K+）、カルシウム（Ca2+）、および／または塩化物（Cl-）イオンを輸送することができる。ＬＧＩＣの例としては、Ｃｙｓ−ループ受容体（例えば、ｎＡＣｈＲ（例えば、筋肉型ｎＡＣｈＲまたは神経型ｎＡＣｈＲ）などのＡＣｈＲ）、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ；例えば、ＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＡ−ρ（ＧＡＢＡｃとも呼ばれる）受容体、ＧｌｙＲ、ＧｌｕＣｌ受容体、および５ＨＴ３受容体）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ｉＧｌｕＲ、たとえば、ＡＭＰＡ受容体、カイニン酸受容体、ＮＭＤＡ受容体、およびデルタ受容体）、ＡＴＰ依存性チャネル（たとえば、Ｐ２Ｘ）、ならびにホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）依存性チャネルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣがキメラＬＧＩＣである場合、キメラＬＧＩＣは、任意の適切なＬＧＩＣから選択されたＬＢＤおよび任意の適切なＬＧＩＣから選択されたＩＰＤを含み得る。ＬＧＩＣが複数の異なるサブユニットを含む場合（例えば、ニューロン型ｎＡＣｈＲがα４、β２、およびα７サブユニットを含む場合）、ＬＢＤおよび／またはＩＰＤは任意のサブユニットから選択することができる。たとえば、ｎＡＣｈＲからのＬＢＤはα７  ＬＢＤであり得る。（ＬＢＤおよびＩＰＤの両方を含む）代表的なラットα７  ｎＡＣｈＲアミノ酸配列は以下の通りである。
2019530468.tif 000008
【００３１】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、α７  ｎＡＣｈＲ由来のＬＢＤを含み得る。α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの例としては、限定されるものではないが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ、および配列番号：１１に記載のアミノ酸配列を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤがある。特定の場合、α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤは、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：１１に記載のヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤのホモログ、オルソログ、またはパラログであり得る。特定の場合、α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤは、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：１１に対して、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の配列同一性）
を有し得る。
2019530468.tif 000009
【００３２】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、５ＨＴ３受容体由来のＩＰＤを含み得る。５ＨＴ３  ＩＰＤの例としては、限定されないが、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有するマウス５ＨＴ３  ＩＰＤ、および配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するヒト５ＨＴ３  ＩＰＤが挙げられる。特定の場合、５ＨＴ３  ＩＰＤは、配列番号：３または配列番号：４に記載の５ＨＴ３  ＩＰＤのホモログ、オルソログ、またはパラログであり得る。特定の場合、５ＨＴ３  ＩＰＤは、配列番号：３または配列番号：４に対して、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の配列同一性）を有し得る。
2019530468.tif 000010
【００３３】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、ＧｌｙＲ由来のＩＰＤを含み得る。ＧｌｙＲ  ＩＰＤの例としては、限定されないが、配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するマウスＧｌｙＲ  ＩＰＤが挙げられる。特定の場合、ＧｌｙＲ  ＩＰＤは、配列番号：５に記載のヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤのホモログ、オルソログ、またはパラログであり得る。特定の場合、ＧｌｙＲ  ＩＰＤは、配列番号：５に対して、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の配列同一性）を有し得る。
2019530468.tif 000011
【００３４】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、ＧＡＢＡ受容体由来のＩＰＤ（例えば、ＧＡＢＡＡ−ρ、ＧＡＢＡｃとも呼ばれる）を含み得る。ＧＡＢＡＡ−ρ  ＩＰＤの例としては、限定されないが、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有するヒトＧＡＢＡＡ−ρ  ＩＰＤが挙げられる。特定の場合において、ＧＡＢＡＡ−ρ  ＩＰＤは、配列番号：９に記載のヒトＧＡＢＡＡ−ρ  ＩＰＤのホモログ、オルソログ、またはパラログであり得る。特定の場合において、ＧＡＢＡＡ−ρ  ＩＰＤは、配列番号：９に対して、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の配列同一性）を有し得る。
2019530468.tif 000012
【００３５】
配列同一性の割合（パーセント）を計算する場合、２つの配列を整列させ、そして、２つの配列間のアミノ酸残基の同一の一致の数を決定する。同一の一致の数を整列した領域の長さ（すなわち整列させたアミノ酸残基の数）で割って、１００を掛けて配列同一性の割合の値を得る。整列させる領域の長さは、最も短い配列の全長サイズまでの一方または両方の配列の一部であり得ることが理解されよう。単一の配列が２つ以上の他の配列と整列し得、したがって、各整列領域にわたって異なる配列同一性の割合の値を有し得ることもまた理解される。配列同一性の割合を決定するための２つまたはそれを超える配列のアラインメントは、クエリーと１つまたは複数の対象配列との間の最良の一致を計算し、そして同一性、類似性および相違が決定できるようにそれらを整列させる、コンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷおよびデフォルトパラメーターを用いて行うことができる。例えば、Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500を参照のこと。
【００３６】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットがキメラＬＧＩＣサブユニットである場合、キメラＬＧＩＣサブユニットは同じ種由来のＬＢＤおよびＩＰＤ、または異なる種由来のＬＢＤおよびＩＰＤを含み得る。特定の場合、キメラＬＧＩＣサブユニットは、ヒトＬＧＩＣタンパク質由来のＬＢＤおよびヒトＬＧＩＣタンパク質由来のＩＰＤを含み得る。例えば、キメラＬＧＩＣサブユニットは、ヒトα７  ＬＢＤおよびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤを含み得る。特定の場合、キメラＬＧＩＣサブユニットは、ヒトＬＧＩＣタンパク質由来のＬＢＤおよびマウスＬＧＩＣタンパク質由来のＩＰＤを含み得る。例えば、キメラＬＧＩＣサブユニットは、ヒトα７  ＬＢＤおよびマウス５ＨＴ３  ＩＰＤを含み得る。
【００３７】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットがキメラＬＧＩＣサブユニットである場合、キメラＬＧＩＣサブユニットは、ＬＢＤが異なるＩＰＤと融合してキメラチャネルサブユニットを形成したときにＬＢＤ中のアミノ酸の数が異なり得るように、ＬＢＤとＩＰＤを接続する様々な融合点を含み得る。例えば、５ＨＴＳ  ＩＰＤを有するキメラＬＧＩＣサブユニットを形成するのに用いられるα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの長さは、ＧｌｙＲ  ＩＰＤを有するキメラＬＧＩＣサブユニットを形成するのに用いられるα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤの長さとは異なる（例えば、図１Ａおよび図１Ｃを図１Ｂと比較のこと）。
【００３８】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、少なくとも１つの修飾アミノ酸を有するＬＢＤおよび／または少なくとも１つの修飾アミノ酸を有するＩＰＤを含み得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２に対して少なくとも７５％の配列同一性、ならびに、アミノ酸残基２７、４１、７７、７９、１３１、１３９、１４１、１７５、２１０、２１６、２１７、および／または２１９においてアミノ酸置換を有するα７  ＬＢＤを含み得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：５に記載の配列と少なくとも７５％の配列同一性、および、α７−ＧｌｙＲキメラ受容体（例えば、配列番号：７）のアミノ酸残基２９８のアミノ酸置換を有するＧｌｙＲ  ＩＰＤを含み得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、かつ、α７−ＧＡＢＡｃキメラ受容体（例えば、配列番号：１０）のアミノ酸残基２９８においてアミノ酸置換を有するＧＡＢＡｃ  ＩＰＤを含み得る。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、１を超える（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ超）のアミノ酸修飾を含み得る。修飾はアミノ酸置換であり得る。特定の場合、修飾アミノ酸は、修飾ＬＧＩＣに薬理学的選択性を付与することができる。例えば、修飾アミノ酸は、修飾ＬＧＩＣに外因性ＬＧＩＣリガンドの選択的結合を付与することができる。例えば、修飾アミノ酸は、修飾ＬＧＩＣに、未修飾ＬＧＩＣサブユニット（修飾を欠くＬＧＩＣサブユニットおよび／または内因性ＬＧＩＣサブユニット）の結合の減少（最小化または排除）をもたらすことができる。例えば、修飾アミノ酸は、内因性ＬＧＩＣリガンドの結合の減少（最小化または排除）を修飾ＬＧＩＣに付与することができる。
【００３９】
特定の態様では、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、修飾ＬＧＩＣに外因性ＬＧＩＣリガンドとの選択的結合（例えば、増強された結合または増強された効力）を付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸を含み得る。外因性ＬＧＩＣリガンドとの結合は、内因性ＬＧＩＣリガンドとの結合よりも選択的であり得る。外因性ＬＧＩＣリガンドとの選択的結合を有する修飾ＬＧＩＣサブユニットは、任意の適切なＬＤＢ（例えば、α７  ＬＢＤ）を含み得る。特定の態様では、修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２に記載のα７  ＬＢＤを含み得、アミノ酸修飾は、残基７７、７９、１３１、１３９、１４１、１７５、および／または２１６における置換であり得る。特定の場合において、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基７７のトリプトファンは、疎水性アミノ酸残基、たとえば、フェニルアラニン（例えば、Ｗ７７Ｆ）、チロシン（例えば、Ｗ７７Ｙ）、またはメチオニン（例えば、Ｗ７７Ｍ）で置換することができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２に示され、かつＷ７７Ｆ置換を有する、α７  ＬＢＤを含み得る。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基７９のグルタミンは、アラニン（例えば、 Q79A）、グリシン（例えば、Q79G）、またはセリン（例えば、Q79S）などのアミノ酸残基で置換することができる。例えば、本明細書に記載の改変ＬＧＩＣサブユニットは、Ｑ７９Ｇ置換を有するα７  ＬＢＤを含み得る。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基１３１のロイシンは、アラニン（例えば、Ｌ１３１Ａ）、グリシン（例えば、Ｌ１３１Ｇ）、メチオニン（例えば、Ｌ１３１Ｍ）、アスパラギン（例えば、Ｌ１３１Ｎ）、グルタミン（例えば、Ｌ１３１Ｑ）、バリン（例えば、Ｌ１３１Ｖ）、またはフェニルアラニン（例えば、Ｌ１３１Ｆ）などのアミノ酸残基で置換することができる。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基１７５位のグリシンは、リジン（例えば、G175K）、アラニン（例えば、G175A）、フェニルアラニン（例えば、G175F）、ヒスチジン（例えば、G175H）、メチオニン（例えば、G175M）、アルギニン（例えば、G175R）、セリン（例えば、G175S）、バリン（例えば、G175V）などのアミノ酸残基で置換することができる。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基２１６のプロリンは、イソロイシン（例えば、P216I）などのアミノ酸残基で置換することができる。外因性ＬＧＩＣリガンドとの選択的結合を有する修飾ＬＧＩＣサブユニットは、任意の適切なＩＰＤ（例えば、ＧｌｙＲ  ＩＰＤまたはＧＡＢＡＡ−ρＩＰＤ）を含み得る。特定の態様では、修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：５に記載のＧｌｙＲ  ＩＰＤを含み得、そのアミノ酸修飾は、α７−ＧｌｙＲキメラ受容体（例えば、配列番号：７）のアミノ酸残基２９８での置換であり得る��特定の場合、配列番号：７のアミノ酸残基２９８のアラニンは、グリシン（例えば、Ａ２９８Ｇ）などのアミノ酸残基で置換することができる。特定の態様では、修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：９に記載のＧＡＢＡＡ−ρＩＰＤを含み得、そのアミノ酸修飾は、α７−ＧＡＢＡＡ−ρキメラ受容体（例えば、配列番号：１０）のアミノ酸残基２９８での置換であり得る。特定の場合、配列番号：１０のアミノ酸残基２９８のトリプトファンは、アラニン（例えば、Ｗ２９８Ａ）などのアミノ酸残基と置換することができる。
【００４０】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれを超える数）のアミノ酸修飾を含み得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：７に対して少なくとも７５パーセントの配列同一性を有し得、そして、Ｑ７９Ｇ置換およびＡ２９８Ｇ置換を含み得る。修飾ＬＧＩＣに外因性ＬＧＩＣリガンドの選択的結合を付与することができる修飾のさらなる例には、他に記載されている修飾が含まれる（例えば、米国特許第８，４３５，７６２号参照）。
【００４１】
内因性（例えば、標準的な（canonical））ＬＧＩＣリガンドよりも外因性ＬＧＩＣリガンドに選択的に結合する（例えば、結合の増強または効力の増加）修飾ＬＧＩＣサブユニットは、外因性リガンドの増強された効力を有するとしても記述され得る。特定の場合、外因性ＬＧＩＣリガンドに選択的に結合する本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、外因性リガンドに対して、少なくとも４倍（例えば、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、または少なくとも２０倍）の増強された効力を有し得る。特定の場合、外因性ＬＧＩＣリガンドに選択的に結合する本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、外因性リガンドに対して、約４倍〜約２００倍（例えば、約４倍〜約２００倍、約５倍〜約１８０倍、約６倍〜約１７５倍、約７倍〜約１５０倍、約８倍〜約１２５倍、約９倍〜約１００倍、約１０倍〜約９０倍、約１１倍〜約７５倍、約１２倍〜約６５倍、約１３倍〜約５０倍、約１４倍〜約４０倍、または約１５倍〜約３０倍）の増強された効力を有し得る。例えば、外因性ＬＧＩＣリガンドに選択的に結合する本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、外因性リガンドに対して約１０倍〜約１００倍の増強された効力を有し得る。例えば、外因性ＬＧＩＣリガンドに選択的に結合する本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、外因性リガンドに対して、約１０倍〜約２０倍の増強された効力を有し得る。
【００４２】
特定の態様では、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、改変されていないＬＧＩＣサブユニットとの減少した（例えば、最小化または排除された）結合を修飾ＬＧＩＣに付与する少なくとも１つの改変アミノ酸を含み得る。同じ修飾を有する修飾ＬＧＩＣサブユニットとの結合は、非修飾ＬＧＩＣサブユニットとの結合よりも選択的であり得る。未修飾ＬＧＩＣサブユニットは、修飾ＬＧＩＣに未修飾ＬＧＩＣサブユニットとの結合の減少を付与する修飾を欠如するＬＧＩＣサブユニットであり得るか、または未修飾ＬＧＩＣは、内因性ＬＧＩＣサブユニットであり得る。修飾ＬＧＩＣに未修飾ＬＧＩＣサブユニットとの結合の減少を付与する修飾は、電荷反転修飾であり得る。非修飾ＬＧＩＣサブユニットとの結合が減少した修飾ＬＧＩＣサブユニットは、任意の適切なＬＢＤ（例えば、α７  ＬＢＤ）を含み得る。特定の態様では、修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２に記載のα７  ＬＢＤを含み得、アミノ酸修飾は、アミノ酸残基２７および／または４１における置換であり得る。例えば、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基２７のアルギニンは、アスパラギン酸（例えば、Ｒ２７Ｄ）で置換されていてもよい。例えば、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基４１のグルタミン酸は、アルギニン（例えば、Ｅ４１Ｒ）で置換することができる。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、Ｒ２７Ｄ置換およびＥ４１Ｒを有するα７  ＬＢＤを含み得る。
【００４３】
特定の態様では、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、内因性ＬＧＩＣリガンドの結合の減少（例えば、最小化または排除）を修飾ＬＧＩＣに付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸を含み得る。内因性ＬＧＩＣリガンドはＡＣｈであり得る。内因性ＬＧＩＣリガンドの結合が減少した修飾ＬＧＩＣサブユニットは、任意の適切なＩＰＤ（例えば、ＧｌｙＲ  ＬＢＤ）を含み得る。例えば、修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２に示されるα７  ＬＢＤを含み得、アミノ酸修飾は、アミノ酸残基１１５、１３１、１３９、２１０、２１７、および／または２１９における置換であり得る。特定の場合において、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基１１５のチロシンは、フェニルアラニン（例えば、Ｙ１１５Ｆ）で置換され得る。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基１３１のロイシンは、アラニン（例えば、Ｌ１３１Ａ）、グリシン（例えば、Ｌ１３１Ｇ）、メチオニン（例えば、Ｌ１３１Ｍ）、アスパラギン（例えば、Ｌ１３１Ｎ）、グルタミン（例えば、Ｌ１３１Ｑ）、バリン（例えば、Ｌ１３１Ｖ）、またはフェニルアラニン（例えば、Ｌ１３１Ｆ）などのアミノ酸残基で置換することができる。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基１３９のグルタミンは、グリシン（例えば、Ｑ１３９Ｇ）またはロイシン（例えば、Ｑ１３９Ｌ）で置換することができる。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基２１０のチロシンは、フェニルアラニン（例えば、Ｙ２１０Ｆ）で置換することができる。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基２１７のチロシンは、フェニルアラニン（例えば、Ｙ２１７Ｆ）で置換することができる。特定の場合、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号：１２のアミノ酸残基２１９のアスパラギン酸は、アラニン（例えば、Ｄ２１９Ａ）で置換することができる。
【００４４】
特定の態様では、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、イオンコンダクタンスの増加を修飾ＬＧＩＣに付与する少なくとも１つの修飾アミノ酸を含み得る。特定の場合、修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：３に示される５ＨＴ３  ＩＰＤを含み得、アミノ酸改変は、アミノ酸残基４２５、４２９、および／または４３３での置換であり得る。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、Ｒ４２５Ｑ置換、Ｒ４２９Ｄ置換、およびＲ４３３Ａ置換を有する５ＨＴ３  ＩＰＤを含み得る。特定の場合、修飾ＬＧＩＣサブユニットは、配列番号：４に示される５ＨＴ３  ＩＰＤを含み得、アミノ酸修飾は、アミノ酸残基４２０、４２４、および／または４２８での置換であり得る。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、Ｒ４２０Ｑ置換、Ｒ４２４Ｄ置換、およびＲ４２８Ａ置換を有する５ＨＴ３  ＩＰＤを含み得る。
【００４５】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換およびＹ１１５Ｆアミノ酸置換を伴うヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：１）、およびマウス５ＨＴ３  ＩＰＤ（配列番号：３）を有する少なくとも１つのキメラα７−５ＨＴ３  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：６）を含み得る。
【００４６】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換およびＱ１３９Ｇアミノ酸置換を伴うヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：１）、およびマウス５ＨＴ３  ＩＰＤ（配列番号：３）を有する少なくとも１つのキメラα７−５ＨＴ３  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：６）を含み得る。
【００４７】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換およびＹ１１５Ｆアミノ酸置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびＡ２９８Ｇアミノ酸置換を有するヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。 
【００４８】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換およびＱ１３９Ｇアミノ置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびＡ２９８Ｇアミノ酸置換を有するヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００４９】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、Ｒ２７Ｄアミノ酸置換、Ｅ４１Ｒアミノ酸置換、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換、およびＹ１１５Ｆアミノ酸置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、ならびにＡ２９８Ｇアミノ酸置換を有するヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００５０】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１に置換（たとえば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００５１】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１（たとえば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）およびＹ１１５（たとえば、Ｙ１１５Ｆ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００５２】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１（たとえば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）、および１３９（例えば、Ｑ１３９Ｌ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００５３】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１（たとえば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）および２１７（たとえば、Ｙ２１７Ｆ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００５４】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）、１３９（例えば、Ｑ１３９Ｌ）、および２１７（例えば、Ｙ２１７Ｆ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００５５】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、 またはＬ１３１Ｎ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒト５ＨＴ３  ＩＰＤ（配列番号：４）を有する少なくとも１つのキメラα７−５ＨＴ３  ＬＧＩＣサブユニットを含み得る。
【００５６】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１７５（たとえば、Ｇ１７５Ｋ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００５７】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、 またはＬ１３１Ｎ）および１３９（例えば、Ｑ１３９Ｌ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、ならびにＲ４２０Ｑ置換、Ｒ４２４Ｄ置換、およびＲ４２８Ａ置換を有するヒト５ＨＴ３  ＩＰＤ（配列番号：４）を有する少なくとも１つのキメラα７−５ＨＴ３  ＬＧＩＣサブユニットを含み得る。
【００５８】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）および１３９（例えば、Ｑ１３９Ｌ）および２１７（例えば、Ｙ２１７Ｆ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、ならびにＲ４２０Ｑ置換、Ｒ４２４Ｄ置換、およびＲ４２８Ａ置換を有するヒト５ＨＴ３  ＩＰＤ（配列番号：４）を有する少なくとも１つのキメラα７−５ＨＴ３  ＬＧＩＣサブユニットを含み得る。
【００５９】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１７５（例えば、Ｇ１７５Ｋ）および１１５（例えば、Ｙ１１５Ｆ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、ならびにヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００６０】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１７５（例えば、Ｇ１７５Ｋ）および１１５（例えば、Ｙ１１５Ｆ）および７９（例えば、Ｑ７９Ｇ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、ならびにヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００６１】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１７５（例えば、Ｇ１７５Ｋ）および７７（例えば、Ｗ７７Ｆ）および７９（例えば、Ｑ７９Ｇ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、ならびにヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００６２】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基２１６（例えば、Ｐ２１６Ｉ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００６３】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基２１６（例えば、Ｐ２１６Ｉ）および７９（例えば、Ｑ７９Ｇ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：７）を含み得る。
【００６４】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、アミノ酸残基１３１（例えば、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ｍ、Ｌ１３１Ｎ、Ｌ１３１Ｑ、Ｌ１３１Ｖ、またはＬ１３１Ｆ）に置換を有するヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、およびヒトＧＡＢＡｃ  ＩＰＤ（配列番号：９）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：１０）を含み得る。
【００６５】
ＬＢＤおよび／またはＩＰＤが本明細書に記載の配列（例えば、配列番号：１〜５および／または９）のホモログ（相同体）、オルソログ、またはパラログである場合、特定の修飾アミノ酸残基への言及は、ホモログ、オルソログ、またはパラログにおける対応するアミノ酸にシフトすることができることが理解される。例えば、配列番号：３に記載のマウス５ＨＴ３  ＩＰＤの残基４２５、４２９、および４３３は、配列番号：４に記載のヒト５ＨＴ３  ＩＰＤにおける残基４２０、４２４、および４２８に対応し、マウス５ＨＴ３  ＩＰＤにおけるＲ４２５Ｑ、Ｒ４２９Ｄ、およびＲ４３３Ａの置換は、ヒト５ＨＴ３  ＩＰＤにおけるＲ４２０Ｑ、Ｒ４２４Ｄ、およびＲ４２８Ａの置換に対応する。
【００６６】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットを得るために任意の方法を使用することができる。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットを作製するためにペプチド合成法を用いることができる。ペプチド合成の方法の例としては、液相ペプチド合成、および固相ペプチド合成が挙げられるが、これらに限定されない。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットを作製するためにタンパク質生合成法を用いることができる。タンパク質生合成の方法の例としては、限定されないが、本明細書に提供されるリン酸化模倣ペプチドをコードする核酸の転写および／または翻訳が挙げられる。類似する修飾ＬＧＩＣサブユニット（例えば、本質的に同じ修飾を有するおよび／または本質的に同じアミノ酸配列を有する、修飾サブユニット）は、ＬＢＤ間の相互作用を通して自己集合して修飾ＬＧＩＣを形成するであろう。
【００６７】
本明細書はまた、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットをコードする核酸、ならびに、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットをコードする核酸を発現するための構築物（例えば、プラスミド、非ウイルスベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはレンチウイルスベクターなど））も提供する。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットをコードする核酸は、任意の適切なプロモーターに作用可能に連結することができる。プロモーターは、天然（すなわち最小）プロモーターまたは複合プロモーターであり得る。プロモーターは、偏在性（すなわち、構成的）プロモーターまたは調節プロモーター（例えば、誘導性、組織特異的、細胞型特異的（例えば、ニューロン特異的、筋肉特異的、グリア特異的）、および神経サブタイプ特異的）であり得る。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットをコードする核酸の発現を駆動するために使用することができるプロモーターの例には、これらに限らないが、シナプシン、ＣＡＭＫＩＩ、ＣＭＶ、ＣＡＧ、エノラーゼ、ＴＲＰＶ１、ＰＯＭＣ、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、ＭＣＨ、およびオレキシンプロモーターが含まれる。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットをコードする核酸は、ニューロン特異的プロモーターに作用可能に連結することができる。
【００６８】
本明細書はまた、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣを有する細胞（例えば、哺乳動物細胞）も提供する。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣを有する哺乳動物細胞は、任意の適切な方法によって得ることができる。特定の場合、予め組み立てられた修飾ＬＧＩＣを細胞に提供することができる。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットをコードする核酸は、修飾ＬＧＩＣサブユニットが翻訳される条件下および複数（例えば、３、４、５、６、またはそれ超）の修飾ＬＧＩＣサブユニットを本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに組み立てることができる条件下で細胞に提供することができる。
【００６９】
ＬＧＩＣリガンド
本明細書はまた、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができるＬＧＩＣリガンドを提供する。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、外因性または内因性であり得る。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、自然発生のものでも合成のものでもよい。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合し活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、標準的（canonical）または非標準的（non-canonical）であり得る。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。特定の場合、ＬＧＩＣリガンドは外因性ＬＧＩＣアゴニストである。ＬＧＩＣリガンドの例には、これらに限らないが、ＡＣｈ、ニコチン、エピバタチン、シチシン、ＲＳ５６８１２、トロピセトロン、ノルトピセトロン、ＰＮＵ−２８２９８７、ＰＨＡ−５４３６１３、化合物０３５３、化合物０３５４、化合物０４３６、化合物０６７６、化合物７０２、化合物７２３、化合物７２５、グラニセトロン、イベルメクチン、メキタジン、プロマジン、バレニクリン、化合物７６５、化合物７７０、３−（１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−４−イル）ジベンゾ［ｂ、ｄ］チオフェン５，５−ジオキシド、化合物７７３、および化合物７７４が含まれる（例えば、図３Ｂ、図５Ｃ、図１０Ａ、および図１０Ｂ参照）。
【００７０】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに対して選択的結合（例えば、増強された結合または増加された効力）を有し得る。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、内因性受容体に結合せず、活性化しない。非修飾ＬＧＩＣリガンドに対するよりも本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに対して選択的に結合し活性化するＬＧＩＣリガンド（例えば、修飾ＬＧＩＣに薬理学的選択性を付与する少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する修飾ＬＧＩＣ）は、修飾ＬＧＩＣのための増強された効力を有するものとして記述され得る。特定の場合、外因性ＬＧＩＣリガンドに選択的に結合する本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットは、修飾ＬＧＩＣに対して、少なくとも５倍（例えば、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２５倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、または少なくとも３００倍）の増強された効力を有し得る。例えば、修飾ＬＧＩＣに選択的に結合し活性化するＬＧＩＣリガンドは、修飾ＬＧＩＣに対して、約１０倍〜約３００倍（例えば、約１０倍〜約２５０倍、約１０倍〜約２００倍、約１０倍〜約１５０倍、約１０倍〜約１００倍、約２５倍〜約３００倍、約５０倍〜約３００倍、約１００倍〜約３００倍、約２００倍〜約３００倍、約２５倍〜約２５０倍、約５０倍〜約２００倍、または約１００倍〜約１５０倍）の増強された効力を有し得る。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化するＬＧＩＣリガンドは、２５ｎＭ未満（例えば、２２ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１７ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１３ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１１ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、または１ｎＭ未満）のリガンド効力を有し得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化するＬＧＩＣリガンドは、１５ｎＭ未満のリガンド効力を有し得る。特定の場合、ＬＧＩＣリガンドは、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットに対して、２５ｎＭ未満（例えば、２２ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１７ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１３ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１１ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満）のＥＣ５０を有し得る。例えば、ＬＧＩＣリガンド（例えば、トロピセトロン）は、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニット（例えば、α７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇ）について約１１ｎＭのＥＣ５０を有し得る。例えば、ＬＧＩＣリガンド（例えば、ノルトロピセトロン）は、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニット（例えば、α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇ）について約１３ｎＭのＥＣ５０を有し得る。特定の場合、ＬＧＩＣリガンドは、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットについて、２０μＭ超（例えば、２２μＭ超���２５μＭ超、３５μＭ超、５０超、６５μＭ超、８０μＭ超、または１００μＭ超）のＥＣ５０を有し得る。例えば、ＬＧＩＣリガンド（例えば、ＡＣｈ）は、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニット（例えば、α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇ）について１００μＭを超えるＥＣ５０を有し得る。
【００７１】
特定の態様では、ＬＧＩＣリガンドは、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができる合成リガンドとすることができ、キヌクリジン、トロパン、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナン、または２−フェニル−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６Ｈ−６，１０−メタノアゼピノ［４，５−ｇ］キノキサリンとすることができる。 
【００７２】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合し活性化し得るＬＧＩＣリガンドは、式Ｉ：
2019530468.tif 000013
（式中、Ｘ１およびＸ２は独立してＣＨ、ＣＨ２、Ｏ、ＮＨ、またはＮＭｅであり得；各ｎは独立して０または１であり得；ＹはＯまたはＳであり得；Ａは芳香族置換基であり得；ＲはＨまたはピリジニルメチレンであり得る）
を有し得る。芳香族置換基の例には、限定するものではないが、４−クロロ−ベンゼン、１Ｈ−インドール、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−クロロベンゼン、２，５−ジメトキシベンゼン、４−クロロアニリン、アニリン、５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル、６−（トリフルオロメチル）ニコチン、および４−クロロ−ベンゼンが含まれる。
【００７３】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、キヌクリジンであり得る。キヌクリジンは式ＩＩ：
2019530468.tif 000014
（式中、Ｘ３は、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり得；ＹはＯまたはＳであり得；Ａは芳香族置換基であり得；ＲはＨまたはピリジニルメチレンであり得る）
の構造を有し得る。芳香族置換基の例には、限定するものではないが、１Ｈ−インドール、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−クロロベンゼン、２，５−ジメトキシベンゼン、４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、４−クロロアニリン、アニリン、５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル、６−（トリフルオロメチル）ニコチン、３−クロロ−４−フルオロベンゼン、４−クロロ−ベンゼン、および１Ｈ−インドールが含まれる。キヌクリジンの例としては、限定されないが、化合物ＰＮＵ−２８２９８７、ＰＨＡ−５４３６１３、０４５６、０４３４、０４３６、０３５４、０３５３、０２９５、０２９６、および０６７６が挙げられる（例えば、図５Ｃ、表３、および表６を参照）。
【００７４】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、トロパンであり得る。トロパンは式ＩＩＩ：
2019530468.tif 000015
（式中、Ｘ２はＮＨまたはＮＭｅであり得；Ｘ３は、Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２であり得；ＹはＯまたはＳであり得；Ａは芳香族置換基であり得る）
の構造を有し得る。芳香族置換基の例には、これらに限定されないが、１Ｈ−インドール、７−メトキシ−１Ｈ−インドール、７−メチル−１Ｈ−インドール、５−クロロ−１Ｈ−インドール、および１Ｈ−インダゾールが含まれる。トロパンの例には、これらに限定されないが、トロピセトロン、疑似トロピセトロン、ノルトロピセトロン、化合物７３７、および化合物７４５が含まれる（例えば、図５Ｃ、表３、および表６を参照）。
【００７５】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンであり得る。９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンは式ＩＶ：
2019530468.tif 000016
（式中、Ｘ１はＣＨであり得、Ｘ２はＮＨまたはＮＭｅであり得、Ｘ３はＯ、ＮＨ、またはＣＨであり得；ＹはＯまたはＳであり得；Ａは芳香族置換基であり得る）
の構造を有し得る。芳香族置換基の例は、限定されないが、４−クロロ−ベンゼンである。９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンの例としては、化合物０５３６、化合物０７４９、化合物０７５１、化合物０７６０、および化合物０７６３が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、図５Ｃ、表３、および表６を参照）。
【００７６】
特定の場合、ＬＧＩＣリガンドは、６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンゾアゼピンであり得、式Ｖ：
2019530468.tif 000017
（式中、ＲはＨまたはＣＨ３であり、ＡはＨまたは芳香族置換基である）
に示される構造を有し得る。６，７，８，９−テトラヒドロ−６，１０−メタノ−６Ｈ−ピラジノ（２，３−ｈ）ベンズアゼピンの例としては、バレニクリン、化合物０７６５、および化合物０７７０が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、図１０Ａ、表３、および表９を参照）。
【００７７】
特定の場合、ＬＧＩＣリガンドは１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンであり得、式ＶＩ：
2019530468.tif 000018
（式中、Ｒ＝Ｈ、Ｆ、ＮＯ２）
に示される構造を有し得る。１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンの例には、３−（１，４−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−４−イル）ジベンゾ［ｂ、ｄ］チオフェン５，５−ジオキシド、化合物０７７３、および化合物０７７４が含まれるが、これらに限定されない（例えば、図１０Ｂ、表６、および表９を参照）。
【００７８】
使用の方法
本明細書はまた、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを用いる方法も供する。修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、リガンドの送達に基づく時間的および／または空間的制御とともに、修飾ＬＧＩＣを活性化するために用いることができる。
【００７９】
特定の態様では、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに選択的に結合するリガンドを同定するのに用いることができる。例えば、そのようなスクリーニング方法は、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに１つまたは複数の候補リガンドを提供し、候補リガンドと修飾ＬＧＩＣとの間の結合を検出することを含み得る。
【００８０】
候補リガンドと修飾ＬＧＩＣとの間の結合を検出するために任意の適切な方法を使用することができ、修飾ＬＧＩＣの活性を検出するために任意の適切な方法を使用することができる。例えば、リガンドが修飾ＬＧＩＣに結合して活性化する能力は、これらに限定されないが、膜電位（ＭＰ）アッセイ（例えば、蛍光ＭＰアッセイ）、放射性結合アッセイ、および／またはピーク電流および持続電流の電圧クランプ測定を含むアッセイによって測定することができる。
【００８１】
特定の態様では、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、チャネル障害（例えば、神経チャネル障害または筋肉チャネル障害）を有する哺乳動物を治療するために使用することができる。例えば、チャネル障害を有する哺乳動物は、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣを投与し、次いで、修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを投与することによって治療することができる。例えば、チャネル障害を有する哺乳動物は、（例えば、Ｒ２７Ｄアミノ酸置換、Ｅ４１Ｒアミノ酸置換、Ｑ７９Ｇアミノ酸置換、およびＹ１１５Ｆアミノ酸置換を伴うヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（配列番号：２）、ならびにＡ２９８Ｇアミノ酸置換を有するヒトＧｌｙＲ  ＩＰＤ（配列番号：５）を有する少なくとも１つのキメラα７−ＧｌｙＲ  ＬＧＩＣサブユニット（配列番号：６）を含む）本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣを投与し、次に、トロピセトロンを投与することによって治療することができる。例えば、チャネル障害を有する哺乳動物は、Ｌ１３１アミノ酸置換（例えば、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｍ、またはＬ１３１Ｎ）、ならびに、任意に、Ｑ７９Ｓアミノ酸置換、Ｑ１３９Ｌアミノ酸置換、および／またはＹ２１７Ｆアミノ酸置換を伴う、修飾ヒトα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ（例えば、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１１、または配列番号１２）を含む本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣを投与し、次に、バレニクリン、トロピセトロン、および／または化合物７６５を投与することにより治療することができる。
【００８２】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを用いて、任意のタイプの哺乳動物を治療することができる。例えば、ヒト、およびサルなどの他の霊長類は、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを使用して治療することができる。特定の場合、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、およびラットを、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを使用して治療することができる。
【００８３】
任意の適切な方法を、チャネル障害を有する哺乳動物および／またはチャネル障害を発症する危険性がある哺乳動物を同定するのに用いることができる。例えば、遺伝子検査は、チャネル障害を有する哺乳動物および／またはチャネル障害を発症する危険性がある哺乳動物を同定するのに用いることができる。
【００８４】
チャネル障害および／またはチャネル障害を発症する危険性がある哺乳動物を有すると同定されたならば、その哺乳動物には、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣが投与され、または自己投与するように指示され、次に、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドが投与され、または自己投与するように指示され得る。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、一緒に投与することができ、または別々に投与することができる。
【００８５】
本明細書に記載の材料および方法を用いて、チャネル障害を有する哺乳動物および／またはチャネル障害を発症する危険性がある哺乳動物を治療する場合、チャネル障害は任意のチャネル障害であり得る。本明細書中で使用される場合、チャネル障害は、異常なイオンチャネル機能および／または異常なリガンド機能によって引き起こされるか、または調節されたイオンチャネル機能および／または改変された細胞イオンフラックス（例えば、カルシウムイオンフラックス）によって軽減され得る、任意の疾患または障害であり得る。チャネル障害は、先天性または後天性であり得る。チャネル障害の例としては、限定はしないが、バーター症候群、ブルガダ症候群、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）、先天性高インスリン血症、嚢胞性線維症、ドラベ症候群、一過性運動失調症、先端紅痛症、全般てんかん（たとえば、熱性発作を伴うもの）、家族性片麻痺性片頭痛、線維筋痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ランバート−イートン筋無力症候群、QT延長症候群（例えば、ロマノ−ワード症候群）、QT短縮症候群、悪性高熱症、ムコリピドーシスIV型、重症筋無力症、先天性ミオトニー、視神経脊髄炎、神経ミオトニー、非症候性難聴、先天性パラミオトニア、網膜色素変性症、チモシー症候群、耳鳴り、発作、三叉神経痛、および多発性硬化症が含まれる。あるいは、またはさらに、本明細書に記載の材料および方法は、これらに限らないが、疼痛治療、癌細胞治療、食欲制御、痙縮治療、筋ジストニア治療、振戦治療、および運動障害治療を含む他の用途に使用することができる。
【００８６】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、細胞の活性を調節するのに用いることができる。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを使用して調節される細胞の活性は、任意の細胞活性であり得る。細胞の活性の例としては、限定されないが、能動輸送（例えば、イオン輸送）、受動輸送、興奮、阻害、イオンフラックス（例えば、カルシウムイオンフラックス）、およびエキソサイトーシスが挙げられる。細胞活性は増加または減少し得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、細胞の膜を通過するイオン輸送を調節する（例えば増加させる）のに用いることができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合してそれを活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、細胞の興奮性を調節する（例えば増加させる）のに用いることができる。
【００８７】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ、および本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、哺乳動物における任意のタイプの細胞の活性を調節するために使用することができる。細胞は、ニューロン、グリア細胞、筋細胞、免疫細胞（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球）、内分泌細胞、または幹細胞（例えば、胚性幹細胞）であり得る。特定の場合、細胞は興奮性細胞であり得る。細胞はインビボまたはエクスビボであり得る。
【００８８】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、任意の適切な方法により投与することができる。修飾ＬＧＩＣは、修飾ＬＧＩＣサブユニットとして、または予め組み立てられた修飾ＬＧＩＣとして投与することができる。修飾ＬＧＩＣは、修飾ＬＧＩＣをコードする核酸として投与することができる。修飾ＬＧＩＣは、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットをコードする核酸として投与することができる。例えば、核酸は、裸の核酸として、または任意の適切なベクター（例えば、組換えベクター）を用いて送達することができる。ベクターは、ＤＮＡベースのベクター、ＲＮＡベース、またはそれらの組み合わせであり得る。ベクターは、分裂細胞または非分裂細胞において核酸を発現することができる。組換えベクターの例としては、これらに限らないが、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスベクター）、コスミド、および人工染色体（例えば、酵母人工染色体または細菌人工染色体）が挙げられる。特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣサブユニットをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルスベクターによって発現させることができる。
【００８９】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣは、任意の適切な方法によって（例えば、細胞内でのその存在を確認するために）検出することができる。特定の場合、修飾ＬＧＩＣを選択的に結合する剤を、修飾ＬＧＩＣを検出するのに用いることができる。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合するために使用することができる剤の例としては、これらに限らないが、抗体、タンパク質（例えば、ブンガロトキシン）、および小分子リガンド（例えば、ＰＥＴリガンド）が挙げられる。修飾ＬＧＩＣに選択的に結合する作用物質は、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性標識、陽電子放出標識、および酵素標識）を含み得る。細胞内のＬＧＩＣ発現を検出するための方法は、蛍光イメージング、オートラジオグラフィー、機能的ＭＲＩ、ＰＥＴ、およびＳＰＥＣＴを含み得る。
【００９０】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、チャネル障害を治療するために用いられる１つまたは複数の追加の剤／治療法との併用療法として、チャネル障害を有するおよび／またはチャネル障害を発症するリスクがある哺乳動物に投与することができる。例えば、本明細書に記載されるようなチャネル障害を有する哺乳動物を治療するために使用される併用療法は、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを投与し、そして、アセタゾールアミド、ジクロロフェナミド、メキシリチン、グルコース、グルコン酸カルシウム、Ｌ−ＤＯＰＡ、筋肉刺激、脊髄刺激、脳刺激、および／または神経刺激で治療することを含み得る。
【００９１】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを、チャネル障害を治療するために使用される追加の剤／療法と組み合わせて使用する実施形態では、１つまたは複数の追加の剤を、同じ時間に、または独立して、投与することができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを最初に、１つまたは複数の追加の剤を次に、投与することができ、または逆を行うことができる。本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドが、チャネル障害を治療するために使用される１つまたは複数の追加の治療と組み合わせて使用される実施形態では、１つまたは複数の追加の治療は 本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドの投与と同時に、または独立して、行うことができる。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、１つまたは複数の追加の治療を行う前、その間、またはその後に投与することができる。
【００９２】
特定の場合、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドは、チャネル障害を有するまたはチャネル障害を発症する危険性のある哺乳動物への投与のための薬学的に許容可能な組成物に処方され得る。例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ（例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣをコードする核酸）および／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドの治療有効量は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体（添加剤）および／または希釈剤と一緒に処方され得る。薬学的組成物は、これらに限らないが、無菌溶液、懸濁液、徐放性製剤、錠剤、カプセル、ピル、パウダー、および顆粒を含む、固体または液体形態で投与するために製剤化することができる。
【００９３】
本明細書に記載の薬学的組成物に使用できる薬学的に許容可能な担体、充填剤、およびビヒクルとしては、これらに限らないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂肪が挙げられる。
【００９４】
本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣおよび／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化することができるＬＧＩＣリガンドを含む薬学的組成物は、経口、非経口（皮下、頭蓋内、動脈内、筋肉内、静脈内、冠動脈内、皮内、または局所投与を含む）、または吸入投与のためにデザインすることができる。経口投与する場合、治療有効量の本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ（例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣをコードする核酸）および／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合し活性化できるＬＧＩＣリガンドを含む薬学的組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態であり得る。非経口投与に適した組成物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。吸入用組成物は、例えば、吸入器、ネブライザー、および／または乾燥粉末吸入器を用いて送達することができる。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れて提供することができ、使用直前に、滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００９５】
治療有効量の本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ（例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣをコードする核酸）および／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合し活性化し得るＬＧＩＣリガンドを含む薬学的に許容可能な組成物は、局所的にまたは全身的に投与することができる。特定の場合、治療有効量の本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ（例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣをコードする核酸）および／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合し活性化し得るＬＧＩＣリガンドを含む組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）への静脈内もしくは経口投与、またはそれによる吸入によって全身的に投与することができる。特定の場合、治療有効量の本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ（例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣをコードする核酸）および／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合し活性化し得るＬＧＩＣリガンドを含む組成物は、哺乳動物（例えばヒト）の標的組織への経皮、皮下、筋肉内、頭蓋内、または開放外科的投与（例えば注射）により局所的に投与することができる。
【００９６】
有効量は、チャネル障害の重症度、投与経路、対象の年齢および一般的健康状態、賦形剤の使用、他の薬剤の使用などの他の治療的処置との併用の可能性、ならびに治療する医師の判断に応じて変わり得る。
【００９７】
投与の頻度は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じさせることなく、チャネル障害の症状を改善する任意の頻度であり得る。例えば、投与の頻度は、週に約１回から日に約３回、月に約２回から日に約６回、または週に約２回から日に約１回であり得る。投与の頻度は、一定のままであり得るか、または治療期間中可変であり得る。治療有効量の本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ（例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣをコードする核酸）および／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合し活性化することができるＬＧＩＣリガンドを含む組成物による治療の過程は休息期間を含み得る。例えば、治療有効量の本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ（例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣをコードする核酸）および／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合し活性化することができるＬＧＩＣリガンドを含む組成物は、２週間にわたって毎日、投与することができ、その後２週間の休息期間をおくことができ、そのようなレジメンは複数回繰り返すことができる。有効量と同様に、様々な要因が特定の用途に使用される実際の投与頻度に影響を及ぼし得る。例えば、有効量、治療期間、複数の治療剤の使用、投与経路、およびチャネル障害の重症度は、投与頻度の増加または減少を必要とし得る。
【００９８】
治療有効量の本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣ（例えば、本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣをコードする核酸）および／または本明細書に記載の修飾ＬＧＩＣに結合して活性化できるＬＧＩＣリガンドを含む組成物を投与する有効期間は、哺乳動物に有意な毒性を生じることなく、チャネル障害の症状を改善する任意の期間である。例えば、有効期間は、数日から数週間、数ヶ月、または数年まで変わり得る。特定の場合において、チャネル障害の治療のための有効期間は、約１ヶ月から約１０年の期間の範囲であり得る。特定の治療に使用される実際の有効期間には、複数の要因が影響する。例えば、有効期間は、投与の頻度、有効量、複数の治療剤の使用、投与経路、および治療されているチャネル障害の重症度によって異なり得る。
【００９９】
特定の例において、治療の経過およびチャネル障害について治療されている哺乳動物の症状を監視することができる。チャネル障害の症状を監視するために任意の適切な方法を使用することができる。
【０１００】
以下の例において本発明をさらに説明するが、これらの例は特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：効力増強リガンド結合ドメイン変異
ニコチン性受容体アゴニストと化学的類似性を有する５１の臨床的に使用される薬物のパネルに対して、突然変異ＬＢＤを有する４１のα７−５ＨＴ３キメラチャネルのパネルを用いてスクリーニングを実施した。突然変異は、図１で強調された残基にある。スクリーンは、既知のｎＡＣｈＲアゴニストトロピセトロンに対して効力を増強するα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ中のＧｌｎ７９における突然変異を明らかにした（図２）。これらの変異（Ｑ７９Ａ、Ｑ７９Ｇ、Ｑ７９Ｓ）はアミノ酸側鎖のサイズを減少させる。いくつかの変異型イオンチャネル−リガンドの組み合わせは、効力において最大１２倍の改善を与えた（表１、図３）。標準的なα７  ｎＡＣｈＲアゴニスト、ＡＣｈ、ニコチン、エピバチジン、および禁煙薬バレニクリンは、Ｑ７９Ａ、Ｑ７９Ｇ、またはＱ７９Ｓの変異によって有意な影響を受けなかった。しかしながら、α７  ｎＡＣｈＲアゴニストのサブセットは、いくつかの変異で増強された効力を示した。シチシン、ＲＳ５６８１２、トロピセトロン、ノルトロピセトロン、およびＰＮＵ−２８２９８７は、α７Ｑ７９Ｇ−５ＨＴ３について有意に改善された効力を示した。さらに、ノルトロピセトロンおよびＰＮＵ−２８２９８７は、それぞれ、α７Ｑ７９Ａ−５ＨＴ３およびα７Ｑ７９Ｓ−５ＨＴ３について有意に増強された効力を示した。一般に、リガンド結合ドメインの相補的結合面と相互作用する結合した芳香族構造を有するキヌクリジンまたはトロパンファーマコフォアに基づくアゴニストは、より小さいアミノ酸残基Ala、Gly、またはSerとのGln79置換で改善された効力を示した。ほとんどのアゴニストにとって、α７Ｑ７９Ｇ−５ＨＴ３が最も好ましい変異体キメライオンチャネルであった。
【０１０２】
（表１）ＨＥＫ細胞においてＧｌｎ７９で変異したキメラカチオンチャンネルに対するｎＡＣｈＲアゴニストの効力。平均ＥＣ５０、括弧内のＳＥＭ（μＭ）。
2019530468.tif 000019
【０１０３】
これらの突然変異ＬＢＤを、これらのリガンドのほとんどについて最大６倍まで増強された効力を有するα７−ＧｌｙＲキメラチャネルを生成するために用いた（図４Ａ）。α７−５ＨＴ３の変異と同様に、Ｇｌｎ７９におけるこれらの変異は、ＡＣｈ、ニコチン、エピバチジン、バレニクリン、またはシチシンの効力に有意な影響を及ぼさなかった。しかしながら、トロピセトロン、ノルトロピセトロン、およびＲＳ５６８１２は、α７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲに対して有意に増強された効力を示した。α７−５ＨＴ３に対するＬＢＤ突然変異と同様に、ノルトロピセトロンはα７Ｑ７９Ａ−ＧｌｙＲに対して有意に増強された効力を有し、ＰＮＵ−２８２９８７はα７Ｑ７９Ｓ−ＧｌｙＲに対して有意に増強された効力を示した。ほとんどのアゴニストにとって、α７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲが最も好ましい変異型キメライオンチャネルであった。
【０１０４】
小分子スクリーニングにおいて観察された別の関係は、Ｔｒｐ７７での突然変異がα７Ｗ７７Ｆ−５ＨＴ３（ＥＣ５０：１．２μＭ）、α７Ｗ７７Ｙ−５ＨＴ３（ＥＣ５０：１．１μＭ）、およびα７Ｗ７７Ｆ−ＧｌｙＲ（ＥＣ５０：０．６６μＭ）受容体で薬剤グラニセトロンに対するアゴニスト活性を与えたということであった。グラニセトロンは５ＨＴ３受容体アンタゴニスト・グラニセトロンであり、これはα７−５ＨＴ３またはα７−ＧｌｙＲを活性化しない。
【０１０５】
これらの結果は、α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ中のＱ７９の（Ａ、Ｇ、またはＳへの）変異が、既知のＬＧＩＣリガンドの修飾ＬＧＩＣへの結合を増強したことを示す。
【０１０６】
実施例２：効力増強イオン細孔ドメイン変異
全長グリシン受容体チャネルにおいて以前に確立されたＩＰＤ突然変異を有するα７−ＧｌｙＲチャネル（Ｔ２５８ＳおよびＡ２８８Ｇ、ＧｌｙＲナンバリング；α７−ＧｌｙＲナンバリングについてＴ２６８ＳおよびＡ２９８Ｇと同等）を、アロステリックアゴニストイベルメクチンについての増強された効力について検査した。α７−ＧｌｙＲＴ２６８Ｓを有するチャネルは実質的にリガンド・フリー・オープン確率を有することが見出され、それはそれらを細胞のリガンド制御の操作に不適当なものにする。全長グリシン受容体でのイベルメクチン効力を増強するために有効であったα７−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇでの突然変異は、リガンドの非存在下でオープン確率の適度な変化をもたらした。従って、このチャンネルを、既知のアゴニストのパネルに対する活性について検査した。標準アゴニストＡＣｈ、ニコチン、およびエピバチジンについて、ならびにバレニクリンおよびトロピセトロンについて、α７−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇにおいてアゴニスト効力は有意に増強されなかった。α７  ｎＡＣｈＲアゴニストのサブセットは、効力において中程度の４倍の増加までを示した：ＲＳ５６８１２、シチシン、ＰＮＵ−２８２９８７、およびノルトロピセトロンは有意により強力であった。それゆえ、ＩＰＤ  Ａ２９８Ｇ突然変異の効果はリガンド効力を改善したが、リガンド構造に依存して、ＬＢＤにおける突然変異ほど効果的ではなかった。
【０１０７】
α７−ＧｌｙＲについてのＬＢＤ中のＱ７９Ｇ変異およびＡ２９８Ｇ  ＩＰＤ変異を検査した（表２）。二重変異体キメラチャネル、α７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇは、α７  ｎＡＣｈＲアゴニストに対して、α７−ＧｌｙＲに対して最大１８倍の効力の増強を示す効力の相乗的増強をもたらした。この二重変異体チャネルからの増強は、アゴニストＲＳ５６８１２、トロピセトロン、ノルトロピセトロン、およびＰＮＵ−２８２９８７についての個々の変異からの増強よりも大きかった。この変異の組み合わせの予期されない構造的感受性をさらに強調すると、ＡＣｈ、ニコチン、エピバチジン、バレニクリン、およびシチシンなどの複数のアゴニストは、α７−ＧｌｙＲとα７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇとの間で有意に変化しなかった。したがって、ＬＢＤ突然変異Ｑ７９ＧのＩＰＤ突然変異Ａ２９８Ｇとの組み合わせは、全てではないがいくつかのニコチン性アゴニストについての効力が約１０〜２０倍まで大幅に増加した相乗効果をもたらした。
【０１０８】
（表２）変異型キメラクロライドチャネルに対するｎＡＣｈＲアゴニストの効力。キメラチャネルを発現するＨＥＫ細胞におけるアゴニスト活性についての平均ＥＣ  ５０および括弧内のＳＥＭ（μＭ）。
2019530468.tif 000020
【０１０９】
これらの結果は、α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤ中のＱ７９の（Ａ、Ｇ、またはＳへの）突然変異および／またはＧｌｙＲ  ＩＰＤ中のＡ２９８の（Ｇへの）突然変異が、修飾ＬＧＩＣへの既知のＬＧＩＣリガンドの選択的結合をさらに増強したことを示す。
【０１１０】
実施例３：増強された効力を示す分子
α７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇで増強された効力を示した既知のアゴニストの構造活性相関に基づいて、１つまたは複数の芳香族側鎖置換基を有する、キヌクリジン、トロパン、または９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンファルマコフォアのいずれかからなる種々の合成分子をテストした。さらに、既知のα７  ｎＡＣｈＲアゴニストＰＨＡ−５４３６１３（Walker et al 2006, Wishka et al 2006）もテストし、α７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇに対して例外的な効力を示した。これらの分子は一般に１０倍〜１００倍の増強された効力を示し（表３）、このことは、これらのファーマコフォアについては、特定範囲の構造的特徴がα７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇの改善された効力と両立することを示す。
【０１１１】
これらの結果は、修飾ＬＧＩＣが合成キヌクリジン含有およびトロパン含有ＬＧＩＣリガンドによって活性化され得ることを示す。
【０１１２】
（表３）キメラチャネルに対する化合物の効力。キメラチャネルを発現するＨＥＫ細胞におけるアゴニスト活性についての平均ＥＣ５０および括弧内のＳＥＭ（μＭ）。ｐａｒｔｉａｌとは、部分アゴニスト活性をいう。
2019530468.tif 000021
【０１１３】
実施例４：アセチルコリン応答性を低下させる突然変異
α７  ｎＡＣｈＲは、他のｎＡＣｈＲアイソフォームと比較してＡＣｈに対する感受性が相対的に低く、トロパンおよびキヌクリジンリガンドについての効力増強突然変異は、これらのチャネルでのアセチルコリンの効力を実質的に変化させなかった。したがって、これらのチャンネルのアセチルコリン応答性を低下させるためにキメラチャンネルをさらに修飾した。追加のＬＢＤ変異Ｙ１１５ＦおよびＱ１３９Ｇでは特定の場合にアセチルコリン応答性が１００μＭを超えてかなり低下し、α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ−５ＨＴ３、α７Ｑ７９Ｇ、Ｑ１３９Ｇ−５ＨＴ３、α７Ｑ７９Ｇ、Ｑ１３９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８、α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇについては特定のアゴニストの効力を控えめに低下させただけであった。たとえば、α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇは、ノルトロピセトロンについて１３ｎＭ、ＡＣｈについて１００μＭ超のＥＣ５０を有する（表４）。
【０１１４】
（表４）低いアセチルコリン応答性を有する変異キメラクロライドチャネルに対するｎＡＣｈＲアゴニストの効力。キメラチャンネルを発現するＨＥＫ細胞における活性についての平均ＥＣ  ５０および括弧内のＳＥＭ（μＭ）。
2019530468.tif 000022
【０１１５】
これらの結果は、α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤにおけるＹ１１５Ｆおよび／またはＱ１３９Ｇ変異が、内在性ＬＧＩＣリガンドＡｃｈの修飾ＬＧＩＣへの結合を減少させたことを示している。
【０１１６】
実施例５：内因性受容体サブユニットとの会合を減少させる突然変異
α７  ｎＡＣｈＲのアセンブリーは、ＬＢＤ間の相互作用を介する５つのホモメリックサブユニットの会合に基づく（Celie et al 2004 Neuron 41: 907-14）。内因性α７  ｎＡＣｈＲサブユニットとの望ましくない会合および／またはキメラチャネルの望ましくない会合を最小限にするために、アセチルコリン結合タンパク質の結晶構造を検査し、α７  ｎＡＣｈＲ受容体ＬＢＤ中の相同なイオン性アミノ酸も有する反対の電荷を有する近くのサブユニット間残基を同定することによって、潜在的なサブユニット間架橋を同定した。電荷反転突然変異（潜在的な塩橋の酸性のメンバーを塩基性残基に、その塩基性パートナーを酸性残基に切り替える）を、未修飾サブユニットとのサブユニット間相互作用を妨害するが、電荷反転突然変異を有するサブユニット間の相互作用を保持するようにデザインした（図６Ａ）。電荷反転変異を有するキメラＬＧＩＣサブユニットは、未修飾のチャネル、例えば、内因性α７  ｎＡＣｈＲと相互作用することなく互いに選択的に会合することができた。α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤにおけるＲ２７Ｄ、Ｅ４１Ｒの二重変異は、機能的チャネルをもたらした（図６Ｂ）。これらの電荷反転チャネルの、未修飾配列を有するα７−５ＨＴ３チャネルとの同時発現は、電荷反転サブユニットが未修飾チャネルと共免疫沈降しないことを示した（図６Ｃ）。キメラチャネルα７Ｒ２７Ｄ、Ｅ４１Ｒ、Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇを得るための効力増強変異およびアセチルコリン遮断変異との組み合わせは、いくつかのアゴニストがそれらの同族アゴニストに対して高い効力を保持していることを明らかにした（表４、右欄）。
【０１１７】
これらの結果は、α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤにおけるＲ２７ＤおよびＥ４１Ｒ変異が、修飾ＬＧＩＣサブユニットの、他の修飾および／または内因性ＬＧＩＣサブユニットとの会合を減少させたことを示している。
【０１１８】
実施例６：リガンド効力を増加させるＬＢＤ突然変異
α７−ＧｌｙＲキメラチャネル中のα７ ｎＡＣｈＲ ＬＢＤのＧｌｙ１７５およびＰｒｏ２１６における突然変異を試験した。Ｇｌｙ１７５のＬｙｓへの変異（α７Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲ）は、ＡＣｈに対する効力の増大を示した（５倍）（表５）。α７Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲについては、ニコチン効力が未修飾α７−ＧｌｙＲキメラチャネルと比較して１０倍増強されたことも見出された（表５）。Ｐｒｏ２１６のＩｌｅへの突然変異（α７Ｐ２１６Ｉ−ＧｌｙＲ）はＡＣｈ効力を実質的に変化させなかった（表５）。しかしながら、α７Ｐ２１６Ｉ−ＧｌｙＲは、未修飾α７−ＧｌｙＲと比較して４倍超まで増加したニコチン効力を示した（表５）。α７Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲおよびα７Ｐ２１６Ｉ−ＧｌｙＲにおけるこれらの効力増強突然変異はまた、３０倍までのいくつかの他のα７−ＧｌｙＲアゴニストの効力にも影響を及ぼした（表５）。α７Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲについては、臨床的に使用されている薬トロピセトロン、バレニクリン、シチシン、グラニセトロン、およびエピバチジンについて、α７−ＧｌｙＲよりも１０倍超高い効力増強が見られた。α７Ｐ２１６Ｉ−ＧｌｙＲについては、効力増強は約３倍であった（表５）。
【０１１９】
（表５）ａ７ＧｌｙＲキメラチャネルにおけるＧ１７５ＫおよびＰ２１６Ｉ変異によるアゴニスト効力増強。
2019530468.tif 000023
ｎｄ＝決定せず
【０１２０】
ＡＣｈを産生する生物における使用のため、α７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤから構成されるこれらのチャネルにおいて内因性ＡＣｈ効力を低下させることが重要である。変異G175Kは、Y115FおよびY210FなどのAChに対する感受性を低下させる他の変異とさらに組み合わせることができた。α７Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲについては、トロピセトロン、グラニセトロン、ノルトロピセトロン、ＰＮＵ−２８２９８７、およびＰＨＡ−５４３６１３について、トロパンまたはキヌクリジンコア構造に基づくアゴニストに対する高い効力が見られ、バレニクリンおよびシチシンに対する効力が大幅に低下した（表５）。α７Ｇ１７５Ｋ、Ｙ２１０Ｆ−ＧｌｙＲについて、ほとんどのアゴニストについての効力がかなり低下したが、グラニセトロンについての効力増強が観察された（表５）。
【０１２１】
低下したＡＣｈ応答性を有するが他のアゴニストに対する高い効力を有するチャネルを開発するために、α７Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲを、特定のアゴニストの効力を増加させるさらなる突然変異と組み合わせた。Ｗ７７Ｆとの組み合わせはＡＣｈ効力を減少させ、α７Ｗ７７Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲは、グラニセトロン、ノルトピセトロン、およびトロピセトロンについてα７−ＧｌｙＲよりも増加した効力を示したが、ＰＮＵ２８２−９８７、バレニクリン、シチシン、またはＰＨＡ−５４３６１３についてはそうでなかった（表５）。Ｇ１７５ＫのＱ７９Ｇとの組み合わせはＡＣｈ効力を低下させ、α７Ｑ７９Ｇ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲは、ノルトロピセトロン、ＰＨＡ−５４３６１３、およびトロピセトロンについて効力の増加を示した（表５）。しかしながら、この効力増強は、ＰＮＵ２８２−９８７、またはバレニクリンなどの他のアゴニストについては観察されなかった。α７Ｇ１７５Ｋ、Ｑ１３９Ｌ−ＧｌｙＲは、ＡＣｈ効力を減少させ、ノルトロピセトロンおよびトロピセトロンについて効力を増加させた（表５）。
【０１２２】
Ｗ７７Ｆ、Ｑ７９Ｇ、Ｌ１４１Ｆ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ、およびＹ２１０Ｆにおける変異を様々な組み合わせで組み込むことによって、トロパンおよびキヌクリジンコア構造に基づくものを含む、合成アゴニストに関して高い効力を維持しながら、ＡＣｈ効力のさらなる低下が達成された。α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲは、トロピセトロンに対する強力な応答を維持しながらＡＣｈ応答性を低下させた（表５）。これらの変異はまた、α７Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲに比較して、ならびに（内因性α７  ｎＡＣｈＲ活性を代表する）α７−５ＨＴ３と比較して、他のトロパンおよびキヌクリジンコア構造、特にキヌクリジンチオウレア７０２および７０３、ならびにトロパンエステル７２３、７２５、７２６、７３６、７３７、７３８、および７４５に対する応答性も増強した（表６）。α７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲもイベルメクチンに対して高い感受性を示した（表５）。α７Ｗ７７Ｆ、Ｑ７９Ｇ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲは、トロピセトロンおよびノルトロピセトロンに対する高い効力応答を維持しながらＡＣｈ応答性を低下させた（表５）。α７Ｗ７７Ｆ、Ｑ７９Ｇ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲはまた、化合物７２３および７２５、ならびに臨床的に使用される薬物メキタジンおよびプロマジンなどのさらなるトロパンベースのコア構造に対して増強された効力を示した（表６）。α７Ｗ７７Ｆ、Ｇ１７５Ｋ、Ｙ２１０Ｆ−ＧｌｙＲはＡＣｈ応答性を低下させたが、グラニセトロンに対する効力を著しく向上させた（表５）。α７Ｌ１４１Ｆ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲは、グラニセトロンに対する感受性を付与しながらＡＣｈ応答性を低下させた（表５）。α７Ｑ７９Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲはＡＣｈ応答性を低下させたが、ノルトロピセトロンに対して強力な応答を示した（表５）。
【０１２３】
（表６）Ｇ１７５ＫおよびＰ２１６Ｉ  α７ＧｌｙＲキメラチャネルによる、トロパン、キヌクリジンアゴニスト、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナンアゴニスト、ジアザビシクロ［３．２．２］ノナンアゴニスト、およびプロマジンの効力増強。３位に結合したインドールおよびインダゾール芳香族（Ａ）置換基。
2019530468.tif 000024
2019530468.tif 000025
ｎｄ＝決定せず；括弧：ＳＥＭ
【０１２４】
α７Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲおよびα７Ｐ２１６Ｉ−ＧｌｙＲは、Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、およびＧ１７５Ｋでの変異と共に、非会合変異Ｒ２７Ｄ、Ｅ４１Ｒ、ならびに、グラニセトロン、エピバチジン、バレニクリン、シチシン、ＰＮＵ−２８２９８７、トロピセトロン、ノルトロピセトロン、およびＰＨＡ−５４３６１３に対するリガンド効力をさらに増強したＧｌｙＲ  ＩＰＤ変異Ａ２９８Ｇとも適合した（表７）。α７Ｒ２７Ｄ、Ｅ４１Ｒ、Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋを形成するための非会合変異との組み合わせは、低いＡＣｈ応答性で、７０２、７２３、７２５、および７２６についての効力をさらに改善した（表６）。
【０１２５】
（表７）α７ＧｌｙＲキメラチャネルでのＧ１７５ＫおよびＡ２９８Ｇ変異ならびにα７ＧＡＢＡｃ（ＧＡＢＡＡ−ρとも呼ばれる）チャネルでのＷ２９８Ａによるアゴニスト効力増強。
2019530468.tif 000026
ｎｄ＝決定せず；括弧：ＳＥＭ
【０１２６】
α７Ｙ１１５Ｆ−ＧｌｙＲキメラチャネルにおけるα７  ｎＡＣｈＲ  ＬＢＤのＧｌｙ１７５でのさらなるアミノ酸置換もまた、アゴニスト効力を増強した。α７Ｙ１１５Ｆ−ＧｌｙＲキメラチャネルにおけるトロピセトロンの効力は、Ｇ１７５Ａ（７．１倍）、Ｇ１７５Ｆ（２倍）、Ｇ１７５Ｈ（２．３倍）、Ｇ１７５Ｋ（５．６倍）、Ｇ１７５Ｍ（２．６倍）、Ｇ１７５Ｒ（５．８倍）、Ｇ１７５Ｓ（９．３倍）、Ｇ１７５Ｖ（１６．７倍）を含む、追加の突然変異で増強された。
【０１２７】
（表８）α７ＧｌｙＲ  Ｙ１１５ＦキメラチャネルにおけるＧ１７５突然変異によるアゴニスト効力増強。
2019530468.tif 000027
ｎｄ＝決定せず；括弧：ＳＥＭ
【０１２８】
より小さなアミノ酸へのＬｅｕ１３１の突然変異は、標準的（カノニカル）アゴニストＡｃｈおよびニコチンの効力を低下させる一方、バレニクリン、トロピセトロンおよびいくつかの他のアゴニストの効力を著しく増加させることが見出された。α７Ｌ１３１Ａ−ＧｌｙＲおよびα７Ｌ１３１Ｇ−ＧｌｙＲは、ＡＣｈ応答性を減少させ（６倍）、そしてバレニクリン（それぞれ８倍および１７倍）およびトロピセトロン（それぞれ２．５倍および３．６倍）に対する効力を増強した（表９）。α７Ｌ１３１Ｇ−５ＨＴ３  ＨＣは、ＡＣｈ応答性を低下させ（５倍）、そしてバレニクリン（１６倍）およびトロピセトロン（２．３倍）に対する効力を増強した（図９Ａおよび表９）。α７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ−ＧｌｙＲおよびα７Ｌ１３１Ｇ、Ｙ２１７Ｆ−ＧｌｙＲは、バレニクリンについてはα７−ＧｌｙＲに対して同様の効力増強を示した（２１倍）が、ＡＣｈ感受性も減少させた（それぞれ−１１倍および−１３倍）。α７Ｑ７９Ｓ、Ｌ１３１Ｇ−ＧｌｙＲは、バレニクリン（８９倍）およびトロピセトロン（１５倍）についてα７−ＧｌｙＲよりも効力をさらに改善した。α７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｙ２１７Ｆ−ＧｌｙＲは、バレニクリンについてα７−ＧｌｙＲよりも効力の最大の改善を示し（３８７倍）、そしてまたＡＣｈ効力の減少も示した（１３倍）（図９Ｂおよび表９）。α７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｙ２１７Ｆ−ＧｌｙＲもまた、化合物７７０（０．００１μＭ）、化合物７７３（０．０００３４μＭ）、および化合物７７４（０．０００１３μＭ）について極めて高い効力を示した（図１０）。α７Ｑ７９Ｓ、Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ−ＧｌｙＲはまた、バレニクリン（３１倍）およびトロピセトロン（３倍）についてα７−ＧｌｙＲよりも効力を改善したが、ＡＣｈ効力（９倍）は低下した（図９Ｂおよび表９）。α７Ｌ１３１Ｍ−ＧｌｙＲ、α７Ｌ１３１Ｑ−ＧｌｙＲ、およびα７Ｌ１３１Ｖ−ＧｌｙＲは、ＡＣｈ力価を低下させたが、トロピセトロン、ノルトロピセトロン、ＰＨＡ−５４３６１３、およびグラニセトロンに対する効力を増強した（表９）。α７Ｌ１３１Ｆ−ＧｌｙＲは、ＡＣｈ効力を実質的に低下させることが見出されたが、他のアゴニストについての力価を改善しなかった（表８）。α７Ｌ１３１Ｇ−ＧＡＢＡｃは、ＡＣｈ効力を実質的に低下させたが、他のアゴニストについての効力を改善しなかった（表９）。α７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｙ２１７Ｆ−５ＨＴ３  ＨＣ（表９）は、α７−５ＨＴ３よりもバレニクリンの効力を１３１倍改善した（表１）。α７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｙ２１７Ｆ−５ＨＴ３  ＨＣもまた、化合物７７０（０．００７μＭ）、化合物７７３（０．００２μＭ）、および化合物７７４（０．００４μＭ）について高い効力を示した（表８）。
【０１２９】
（表９）Ｌ１３１変異を有するキメラチャネルによるアゴニスト効力増強。
2019530468.tif 000028
ｎｄ＝決定せず；括弧：ＳＥＭ
【０１３０】
実施例７：ニューロンにおけるキメラＬＧＩＣ
α７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇまたはα７Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｇ１７５Ｋ−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣをコードする核酸を含有するＡＡＶまたはＤＮＡプラスミドをマウス皮質ニューロンに形質導入した。低濃度のトロピセトロン（３０ｎＭまたは１００ｎＭ）をマウス皮質ニューロンに投与した。ニューロン活性は低濃度のアゴニストの適用により抑制された（図７および図８Ｃ）。
【０１３１】
α７Ｌ１３１Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｙ２１７Ｆ−ＧｌｙＲキメラＬＧＩＣをコードする核酸を含むＤＮＡプラスミドをマウス皮質ニューロンにトランスフェクトした。低濃度のバレニクリン（１０ｎＭ）をマウス皮質ニューロンに投与した。ニューロン活性は低濃度のアゴニストの適用により抑制された（図９Ｃ）。
【０１３２】
これらの結果は、低濃度のＬＧＩＣリガンド、トロピセトロンおよびバレニクリンを使用して、修飾ＬＧＩＣ活性がニューロンにおいて制御され得ることを示す。
【０１３３】
実施例８：治療におけるキメラＬＧＩＣ
化学遺伝学的ツールは、薬物療法と遺伝子療法を組み合わせるための魅力的な戦略を提供する。これは、薬物の投与に選択的に関与する外因的に送達されるイオンチャネルの使用により、同じイオンチャネルおよびリガンドを使用して、様々な適応症において、異なる細胞型にわたって一貫した様式で細胞機能が調節され得るためである。寛容性が高く、臨床的に使用される薬物によって開閉されるイオンチャネルの同定は、化学遺伝学をヒトの治療用途に潜在的に拡張するために特に魅力的である。
【０１３４】
薬物トロピセトロンについて、我々は、それがその治療標的である５ＨＴ ３受容体について報告されている１０ｎＭトロピセトロンのＩＣ５０と類似する、１１ｎＭのＥＣ５０でα７Ｑ７９Ｇ−ＧｌｙＲＡ２９８Ｇを活性化することを見出した（Combrink et al. 2009 Pharmacological reports: PR 61: 785-97）。
【０１３５】
他の実施形態
本開示をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改変は特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ】
2019530468.tif 000035
【図１Ｂ】
2019530468.tif 000036
【図１Ｃ】
2019530468.tif 000037
【図１Ｄ】
2019530468.tif 000038
【図１Ｅ】
2019530468.tif 000039
【図２】
2019530468.tif 000040
【図３Ａ】
2019530468.tif 000041
【図３Ｂ】
2019530468.tif 000042
【図４Ａ】
2019530468.tif 000043
【図４Ｂ】
2019530468.tif 000044
【図４Ｃ】
2019530468.tif 000045
【図５Ａ】
2019530468.tif 000046
【図５Ｂ】
2019530468.tif 000047
【図５Ｃ】
2019530468.tif 000048
【図６Ａ】
2019530468.tif 000049
【図６Ｂ】
2019530468.tif 000050
【図６Ｃ】
2019530468.tif 000051
【図７】
2019530468.tif 000052
【図８Ａ】
2019530468.tif 000053
【図８Ｂ】
2019530468.tif 000054
【図８Ｃ】
2019530468.tif 000055
【図９Ａ】
2019530468.tif 000056
【図９Ｂ】
2019530468.tif 000057
【図９Ｃ】
2019530468.tif 000058
【図９Ｄ】
2019530468.tif 000059
【図１０】
2019530468.tif 000060
【配列表】
2019530468000001.app
【国際調査報告】
2019530468.tif 000061
2019530468.tif 000062
2019530468.tif 000063
2019530468.tif 000064
2019530468.tif 000065