【手続補正書】
【提出日】平成19年1月10日(2007.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  非侵襲経皮予防接種
【特許請求の範囲】
【請求項１】  経皮ワクチンであって、
（ａ）浸透剤である経皮担体であって、水性溶媒に懸濁または分散されており、その形状は凝集傾向にある少なくとも２種の異なる物質または２種の異なる形状の物質からなる１層ないし数層の膜様コーティングにより取囲まれた微小液状小滴であり、当該物質または形状の物質が好ましくは水性液状媒体における溶解性において少なくとも１０倍異なっており、その結果、高溶解性の物質または形状の物質のホモ凝集体の平均直径または当該物質と当該形状の物質両方からなるヘテロ凝集体の平均直径が低溶解性の物質または形状の物質のホモ凝集体の平均直径よりも小さく、および／またはその場合に高溶解性の成分が浸透性小滴を可溶化する傾向にあり、かつ、その場合にかかる成分の内容物は該小滴を可溶化するのに必要な濃度の９９モル％までに等しいか、または非可溶化小滴の飽和濃度の９９モル％までに相当するかのいずれか高いほうであり、および／またはその場合に膜様コーティング周辺の小滴の弾性変形エネルギーが、赤血球細胞の変形エネルギー、または液状脂肪族鎖をもつリン脂質二重層の変形エネルギーよりも少なくとも５倍低く、より好ましくは少なくとも１０倍低く、また、理想的には１０倍以上低い経皮担体；
（ｂ）サイトカインまたは抗サイトカイン活性を特異的に放出するか、または特異的に誘発するか、またはかかる活性それ自体を発揮する化合物；および
（ｃ）抗原、アレルゲン、抗原混合物および／またはアレルゲン混合物；
を含んでなるワクチン。
【請求項２】  サイトカインまたは抗サイトカイン活性を示すかまたは誘発する該化合物および該抗原が浸透剤と会合している請求項１記載のワクチン。
【請求項３】  該低溶解性自己凝集分子が極性脂質であり、かつ該高溶解性成分が本発明の目的のために充分に可溶性である界面活性剤または界面活性剤様分子またはかかる形状の極性脂質である請求項１または２記載のワクチン。
【請求項４】  浸透剤の平均直径が３０ｎｍないし５００ｎｍ、好ましくは４０ｎｍないし２５０ｎｍ、さらにより好ましくは５０ｎｍないし２００ｎｍ、取分け好ましくは６０ｎｍないし１５０ｎｍである請求項１ないし３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】  ヒトまたは動物皮膚に使用する製剤の小滴総重量が、総質量の０.０１重量％（ｗ％）ないし４０重量％、特に０.１ｗ％ないし３０ｗ％、最も好ましくは５ｗ％ないし２０ｗ％である請求項１ないし４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】  総抗原濃度が総浸透剤質量の０.００１ｗ％ないし４０ｗ％、取分け０.０１ｗ％ないし３０ｗ％、さらに好ましくは０.１ｗ％ないし２０ｗ％、最も好ましくは０.５ｗ％ないし１０ｗ％である請求項１ないし５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】  さらに、
（da）低分子量化学刺激剤；および／または
（db）病原体からの抽出物または化合物またはそのフラグメントまたは誘導体；
を含んでなる請求項１ないし６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】  サイトカイン活性を示す化合物が、ＩＬ−４、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＴＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＴＮＦ、ＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−β、ＩＬ−５またはＩＬ−１０、Ｉ型インターフェロン、好ましくはＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである請求項１ないし７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】  抗サイトカイン活性を示す化合物が、抗サイトカイン抗体または対応する活性フラグメント、その誘導体または類似体である請求項１ないし８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】  抗原が病原体由来のものである請求項１ないし９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】  当該病原体が、スタヒロコッカスおよびストレプトコッカスなどの膿形成性球菌を包含する細胞外細菌、メニンゴコッカスおよびゴノコッカス種などのグラム陰性細菌、ナイセリアの種、大腸菌、サルモネラ、シゲラ、シュードモナス、ジフテリア、ボルデテラ・ペルツッシス（百日咳菌）などの腸内菌体を包含するグラム陰性細菌、およびグラム陽性細菌（例、バシラス・ペスティス、ＢＣＧ）、取分け、クロストリジウム種（例、クロストリジウム・テタニ（破傷風菌）、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・セプチカム）などの嫌気性菌、マイコバクテリア（例、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌））およびリステリア・モノサイトゲネス、肝炎ウイルス、（ヒト）免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、痘瘡（水痘）、インフルエンザ、麻疹、流行性耳下腺炎およびポリオウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルスなどを包含するレトロウイルスおよびアデノウイルスを含んでなる宿主細胞内で生存し、複製する細菌およびウイルス、および宿主細胞内部で繁殖し得る真菌類、原虫および蠕虫などの動物寄生虫を包含する寄生虫、およびマダニおよびダニなどの外部寄生虫、またはブルセラ種菌（例、ブルセラ・メリテンシス（マルタ熱菌）、ブルセラ・アボータス（ウシ流産菌）、ブルセラ・スイス（ブタ流産菌）、ブルセラ・カニス、ブルセラ・ネオトメ、ブルセラ・オビス）、コレラ原因作用因子（例、ビブリオ・コレレ）、ヘモフィルス・アクチノミセテムコミタンス、ヘモフィルス・プリゥロニュウモニエなどのヘモフィルス種、並びにパラチフス、ペスト、狂犬病、破傷風および風疹などの疾患の引き金となる病原体、および種々の新形成、自己免疫疾患の原因となるか、または必ずしも病原体感染の結果ではない動物または人体の他の病的状態に関係している病原体から選択されるものである請求項１０記載のワクチン。
【請求項１２】  アレルゲンが微生物、動物または植物由来の異種または内因性起源のもの、または人工的および／または刺激性無機物質の群に属するもの、または人体の免疫系により間違って処理されたか、暴露された人体のかかる部分または成分に属するものである請求項１ないし１１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１３】  使用するサイトカイン活性提示化合物のそれぞれの濃度が、抗原用量と選択した免疫アジュバントについて、製剤を注射するかまたは生体外テストを実施することにより遂行した対応するテストにおいて確立された最適濃度よりも１０００倍まで高い濃度に選択されるが、該濃度は、好ましくは１００倍までであり、より多くの場合５０倍までであり、さらに良好には２０倍までの高さである請求項１ないし１２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１４】  病原体抽出物または化合物がリポ多糖、コードファクター（トレハロース・ジミコール酸）、ムラミルジペプチド、または病原体膜の免疫学的活性部分に同じか、または類似している他の（多）糖または（ポリ）ペプチドであり；病原体抽出物が細菌性外来および内毒素、好ましくはコレラ毒素および大腸菌の熱不安定毒素、Ａ鎖誘導体、ＡＤＰリボシル化活性を有する成分、ペプチドグリカン、クロストリジウム属毒素、または結核菌（M.tuberculosis）の精製タンパク質誘導体、ＬＴ−Ｒ１９２Ｇ、ストレプトコッカス・ピロゲネス（化膿連鎖球菌）のフィブロネクチン結合タンパク質Ｉ、またはＢ群ナイセリア・メニンジティディス（髄膜炎菌）（ＧＢＯＭＰ）の外膜タンパク質；または非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドなどの細菌性またはウイルス性核酸である請求項７ないし１３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１５】  当該リポ多糖がリピドＡまたはその誘導体および修飾体、例えば、モノホスホリルリピドＡ、またはその類似体、例えば、サッカロースの脂肪酸誘導体などである請求項１４記載のワクチン。
【請求項１６】  病原体由来の病原化合物の濃度が、同様の抗原を使用する対応する注射製剤で使用するよりも１０倍より低く、かつ１０００倍までの高さであり、皮膚上に投与した免疫アジュバント濃度は多くの場合、注射での免疫アジュバント濃度とは０.５ないし１００倍、より好適には１ないし５０倍、最善には２ないし２５倍異なっている請求項７ないし１３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１７】  当該低分子量刺激剤が、アレルゲン性金属イオン、酸、塩基、刺激性液体、（脂肪族）アルコール、（脂肪族）アミン、（脂肪族）エーテル、（脂肪族）硫酸エステル、−リン酸エステルなどのクラス、または他の適当な溶媒または両性溶媒などから、またはしばしば皮膚浸透上昇能力を有する界面活性剤様分子並びにその誘導体または組合わせから選択される請求項７ないし１６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１８】  当該低分子量刺激剤の濃度は、かかる刺激剤のテストに共通に用いられる方法と基準により評価した場合、同一または同等の被験者での独立したテストにおいて局所刺激に受け容れ難いと思われる濃度の少なくとも２倍、より多くの場合５倍、さらに好適には１０倍またはそれ以上低い濃度で選定される請求項７ないし１７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１９】  アレルゲンが吸入性アレルゲンのクラスに属し、これらに限定されるものではないが、種々の花粉、胞子、動物毛髪、皮膚、羽毛、天然および合成繊維の小片、コムギ、ダニを含む（ハウス）ダストなどを包含し；さらに食物および医薬アレルゲン；接触アレルゲン；注射、侵襲またはデポアレルゲン、例えば、種々の（胃腸管居住）蠕虫、エキノコックス、旋毛虫など、インプラントの一部などである請求項７ないし１６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２０】  抗原の適用用量が他の方法で免疫化過程において注射しなければならない用量と０.１ないし１００倍異なるが、多くの場合、ファクターが０.５ないし５０の範囲にあり、より好適には１ないし２０、理想的には注射にて使用されるよりも１０倍未満高い請求項１ないし１９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２１】  適用される刺激剤用量が、０.１ｍｇ／ｃｍ２ないし１５ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに多くの場合０.５ｍｇ／ｃｍ２ないし１０ｍｇ／ｃｍ２の範囲であり、好ましくは１ｍｇ／ｃｍ２ないし５ｍｇ／ｃｍ２である請求項１ないし２０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２２】  当該抗原が純粋なまたは精製した抗原である請求項１ないし２１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２３】  ビン詰めまたはそれ以外の包装形態で、請求項１ないし２２のいずれかに記載のワクチンの少なくとも１用量を含んでなるキット。
【請求項２４】  請求項１１に特定した抗原または請求項１２に特定したアレルゲンの少なくとも１注射可能用量を含んでなる請求項２３記載のキット。
【請求項２５】  請求項１ないし２２のいずれかに記載のワクチンにより哺乳動物に予防接種することを含んでなる当該哺乳動物に防御免疫応答を生じさせる方法。
【請求項２６】  適用した免疫原用量と治療的予防接種の結果を制御するために、異なる治療部位を選択する請求項２５記載の方法。
【請求項２７】  抗原不含浸透剤懸濁液に抗原を負荷し、投与前日中に、好ましくは得られる製剤を皮膚上に投与する３６０分前、より好ましくは６０分前、さらにより好ましくは３０分前にそれと会合させる請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】  免疫アジュバント操作により器官を前処理した後、請求項１ないし２２のいずれかに記載のワクチンを皮膚上に塗布する方法であって、当該操作が、例えば、皮膚の摩擦、押し付け、加熱、電気的または機械的、例えば、超音波の場に暴露すること、または非免疫原製剤（ヒスタミンなど）を皮膚に注射することを含んでなるが、ただし、かかる処理のいずれかが免疫アジュバント化合物を皮膚または他の末梢免疫活性組織から放出させるか、または望む予防接種に対するアンタゴニストの濃度／作用持続時間を低減させる請求項２５ないし２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】  免疫原が非閉塞性パッチにて適用する請求項２５ないし２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】  少なくともワクチン１用量を投与することを特徴とする請求項２５ないし２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】  当該ワクチンを追加刺激予防接種として投与する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】  一次免疫処置を侵襲的に、一般には皮下注射またはある種他の適切な皮膚障壁穿孔／破壊方法を用いて実施し、その場合、引続く追加刺激免疫処置を非侵襲的に実施する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】  ワクチンは、非アレルゲン性抗原を使用する場合、２ないし１０回、好ましくは２ないし７回、さらにより好ましくは５回まで、最も好ましくは３回まで投与するか、あるいはアレルゲンの場合には、適切な評価方法に従って決定される免疫寛容を達成するために、または努力が不首尾と思われるために必要とされる回数投与する請求項２５ないし３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】  引続く予防接種の時間間隔が２週間ないし５年、多くの場合１ヵ月ないし３年まで、より多くの場合２ヵ月ないし１.５年であるように選定される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】  輪郭の明瞭な障壁の様々な穿孔に免疫原を通過させ運搬する浸透剤の流れが、障壁を通過作用する適切な推進力または圧力の関数として測定され、そのデータを特性曲線によって簡便に記述し、その曲線を使用して製剤化またはさらなる適用を最適化する請求項２５ないし３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】  防御または寛容原性免疫応答を誘発するワクチンを調製するための前記請求項のいずれかに定義した経皮担体、サイトカインもしくは抗サイトカイン活性を特異的に放出するかまたは特異的に誘発するか、またはかかる活性を発揮する化合物、抗原またはアレルゲン、および選択肢として微生物からの抽出物もしくは化合物またはそのフラグメントもしくは誘導体、および／または低分子量化学刺激剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は予防用または治療用予防接種を目的とする超変形性担体と会合した抗原の非侵襲経皮性投与用新規ワクチンに関する。該ワクチンは、（ａ）浸透剤である経皮担体であって、水性溶媒に懸濁または分散されており、その形状は凝集傾向にある少なくとも２種の異なる物質または２種の異なる形状の物質からなる１層ないし数層の膜様コーティングにより取囲まれた微小液状小滴であり、当該物質または形状の物質が好ましくは水性液状媒体における溶解性において少なくとも１０倍異なっており、その結果、高溶解性の物質または形状の物質のホモ凝集体の平均直径または当該物質と当該形状の物質両方からなるヘテロ凝集体の平均直径が低溶解性の物質または形状の物質のホモ凝集体の平均直径よりも小さく、および／またはその場合に高溶解性の成分が浸透性小滴を可溶化する傾向にあり、かつ、その場合にかかる成分の内容物は該小滴を可溶化するのに必要な濃度の９９モル％までに等しいか、または非可溶化小滴の飽和濃度の９９モル％までに相当するかのいずれか高いほうであり、および／またはその場合に膜様コーティング周辺の小滴の弾性変形エネルギーが、赤血球細胞の変形エネルギー、または液状脂肪族鎖をもつリン脂質二重層の変形エネルギーよりも少なくとも５倍低く、より好ましくは少なくとも１０倍低く、また、理想的には１０倍以上低い経皮担体；（ｂ）サイトカインまたは抗サイトカイン活性を特異的に放出するか、または特異的に誘発するか、またはかかる活性それ自体を発揮する化合物；および（ｃ）抗原またはアレルゲン；を含んでなる。本発明はさらに哺乳動物の対応する治療的または予防的予防接種方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
本明細書本文全般に幾つもの文献を引用している。本明細書に引用した文献（メーカーの説明書、指示書なども含む）それぞれを出典明示により本明細書の一部とする；しかし、引用した文献のいずれもが実際に本発明の先行技術であると認めるものではない。さらに、イデアＡＧ（IDEA AG）の名称で出願され、発明の名称“高適合担体による経鼻輸送／免疫処理（Transnasal transport/immunization with highly adaptable carriers）”とする同時係属出願の全開示内容も出典明示により本明細書の一部とする。
【０００３】
皮膚は体内へ接近する最良の侵入口であるが、角質層が存在するために最も困難な入口でもある。この皮膚の角質層は進化の過程で最適化された血管壁に似る障壁であって、柔軟性の緊密に詰まった側面の重なり合った細胞からなり、それにより角質内の基底細胞タイルのモチーフが２０〜３０回繰返されている。さらに、皮膚内の細胞間接触部分は高密度に詰まり、整然と組織化された脂質の混合物で封鎖されている。従って、この角質層は生体を感染から保護するのみならず、皮膚経由の効率的な抗原取込みをも排除する。この事実は、アレルギーの観点でも有利であるが、これまで未処置皮膚経由の免疫処理または予防接種の成功を妨げてきた。
【０００４】
経皮送達器具によるもので市場にある最大の薬物は、３５０Ｄａより小さく（Cevc, G. Drug delivery across the skin（皮膚通過薬物送達), Exp. Opin. Invest. Drugs (1997) 6: 1887-1937）、これはかかる分子しか皮膚の小さな自己封鎖孔を通過できないためである。後者は通常、親水性の場合、幅が１ｎｍ未満であり、疎水性の場合はさらに狭い。従って、蠕虫などの生物は、器官に‘穴を開ける’ための生化学的機械を用いて皮膚に浸透し、体内侵入を達成する。自然に生じる微小外傷およびシャント（小包脂腺単位など）も同様に皮膚において利用し得る。しかし、それらは皮膚表面の僅か０.１％ないし０.５％を占めるだけであり、従って、細菌類が一般に局所感染のためにかかる経路を利用するという事実にもかかわらず、これらは経皮輸送にあまり寄与していない（Strange, P., Skov, L, Lisby, L., Nielsen, P.L., Baadsgard, O. Staphylococcual enterotoxin B applied on intact normal and intact atopic skin induces dermatoma（未処置正常皮膚および未処置アトピー性皮膚に塗布したブドウ球菌性エンテロトキシンＢは皮膚腫を誘発する), Arch. Dermatol. (1996) 132: 27-33）。
【０００５】
皮膚上に暴露された２〜３のハプテンのみが皮膚の免疫応答を引出す。このことは、大量の局所沈着ハプテンからの十分に小さな分子のみが、認知可能な量で皮膚内に通じる経路を見出し得ることを確認している。次いで、かかるハプテンが先ず器官を刺激し、最終的に過敏性と接触皮膚炎の原因となり得る（Kondo, S., Sauder, D.N. Epidermal cytokines in allergic contact dermatitis（アレルギー性接触皮膚炎における表皮サイトカイン). J. Am. Acad. Dermatol. (1995) 33: 786-800; Nasir, A., Gaspari, A. A. Contact dermatitis. Clinical perspectives and basic mechanisms（接触皮膚炎。臨床展望および基本メカニズム). Clin. Rev. Allergy and Immunol. (1996) 14: 151-184）。この問題は低分子量化学物質または医薬品を皮膚浸透増強剤などの皮膚刺激剤と併用したときに最も深刻である（Cevc, 1997, op. cit.)。大型分子が皮膚上でアレルギー性であることは稀であるが、それは障壁を通過するその能力が限られているからである。高度に免疫原性であるオボアルブミンに対するＴｈ２応答（Wang, L.-F., Lin, J.-Y., Hsieh, K.-H., Lin, R.-H. Epicutaneous exposure of protein antigen induces a predominant Th2-like response with IgE production in mice（タンパク質抗原の表皮暴露はマウスにおいてＩｇＥの産生とともに顕著なＴｈ２様応答を誘発する). J. Immunol. (1996) 156: 4079-4082）またはコレラ毒素に対する応答（Glenn, G.M., Rao, M. Matyas, (1998) 391: 851; Glenn, G.M., Scharton-Karsten T, Vasell R, Mallet C.P., Hale T.L. and Alving C.R. Transcutaneous Immunization with Cholera toxin Protects Mice Against Lethal Mucosal Toxin Challenge（コレラ毒素による経皮免疫処置は致死性粘膜毒素攻撃からマウスを防御する). J. Immunol. (1998) 161: 3211-3214）は大量のかかるタンパク質に表皮暴露された後にのみ可能であるが、かなり弱い。さらに、皮膚から角質層を除去することが、ヒト癌胎児性抗原またはヒトＧＭ−ＣＳＦをエンコードするアデノウイルスに対する特異抗体を、表皮処理したＣ５７ＢＬ／６マウスのそれぞれ９６％または４３％の検出可能な量産生するために必須であった（Deng, H., Qun, L., Khavari, P.A. Sustainable cutaneous gene delivery（持続性皮膚遺伝子送達). Nature Biotechnology (1997) 15: 1388-1390）。
【０００６】
上記のまたは他の表皮的に用いられる抗原に対する防御についてはこれまで報告されなかった。ジフテリアまたは破傷風トキソイドおよびウシ血清アルブミンに対する抗体は、抗原をコレラ毒素と併用してＢＡＬＢ／ｃマウスの皮膚に塗布することにより生成させたが（Glenn et al., 1998, op. cit.）、これらはアジュバントなしでは非常に弱い免疫応答に終わった。コレラ毒素（ＣＴ）の包含後でさえ、ジフテリアおよび破傷風抗原に対する平均特異抗体価は、それぞれ、約５０倍および７０倍ないし４０００倍（個々のデータポイントの算入如何に左右される）であり、コレラ毒素それ自体により引出された力価よりも低かった（Glenn et al., 1998, op. cit.）。相当するそれぞれの力価絶対値は１４±１７および８±１６であった；抗ＢＳＡ力価は約１１±１１であった（平均値＋／−標準偏差は公表された数字から計算した）。これらの低い力価については治療的または予防的効果は証明されず、単純な非侵襲予防接種に向かう道はそれ程まっすぐではないことを示している。同じグループ（Glenn et al., 1998b）が公表したより最近の報文では経鼻攻撃後のＣＴに対する防御について証明したが、経皮予防接種により得られる防御に関しては何らの結論も与えていない。
【０００７】
初期の公表文献では上記の研究におけるよりも、力価で判定して数オーダー有効なタンパク質の皮膚通過放出に関して報告し、機械的感受性および水分感受性、自動調整可能な担体を開発している（トランスファーサムス（Transfersomes））（総説、Cevc, 1997, op. cit.参照）。強力な抗原として、このものは皮下タンパク質注射により引出される抗体価に匹敵する力価を誘発した；ＢＳＡの場合には、ＩｇＧの絶対力価はいずれの場合にも大よそ２００であり（Paul, A., Cevc, G. Non-invasive administration of protein antigens. Epicutaneous immunization with the bovine serum albumin（タンパク質抗原の非侵襲投与。ウシ血清アルブミンによる表皮免疫処理). Vaccine Res. (1995) 4: 145-164）、ギャップ結合タンパク質では、１５，０００ないし１００，０００の力価が測定された（Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B.K. Transdermal Immunization with large proteins by means of ultradeformable drug carriers（超変形性薬物担体による大型タンパク質での経皮免疫処理). Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3521-3524; Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B.K. Transdermal immunization with an integral membrane component, gap junction protein, by means of ultradeformable drug carrier, Transfersomes（超変形性薬物担体による内在性膜成分、ギャップ結合タンパク質での経皮免疫処理). Vaccine (1997) 16: 188-195）。しかし、防御的免疫応答の生成は両公表文献では証明されなかった。
【０００８】
今日知られるように、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞の活性は免疫応答において重要な役割を演じている；Ｔｈ１細胞は細胞介在免疫性、食細胞介在宿主防御を主として促進するばかりでなく、マウスにおいて抗原特異的ＩｇＧ２ａの産生をも促進する。対照的に、Ｔｈ２細胞は食細胞非依存宿主応答、ＩｇＧ１、ＩｇＥおよびＩｇＡ免疫グロブリン生成を優先的に支持する傾向がある。
【０００９】
免疫応答のＴｈ１またはＴｈ２の基本、すなわち、Ｔｈ細胞サブタイプへの分化は、サイトカインおよび他の調整分子の活性に左右されるのみではない（Luger, T.A., Schwarz, T. The role of cytokines and neuro-endocrine hormones in cutaneous immunity and inflammation（皮膚免疫性と炎症におけるサイトカインと神経分泌ホルモンの役割). Allery (1995) 50: 292-302; Lohoff, M., Gessner, M., Bogdan, C., Roellinghoff, M. The Th1/Th2 paradigm and experimental murine Leishmanasis（Ｔｈ１／Ｔｈ２パラダイムおよび実験的マウス・リースマニア症). Int. Arch Allergy Immunol. (1998) 115: 191-202）；抗原提示細胞の性質と使用される抗原量は重要な役割を演じる。サイトカインは殆どすべての真核細胞により一過性に産生され、特定の細胞表面レセプターを介して作用する。事実、適切な刺激の後に、皮膚のすべての細胞はかかる（糖）タンパク質ファクターを放出するか、またはそのレセプターを発現することができる。殆どのサイトカインは多能性であり、互いを誘発するか、または関連するレセプターの発現に影響する。このことはサイトカインが、いわゆるサイトカイン・カスケードの枠組み内で相乗的に、相加的にまたはアンタゴニストとしての様式で作用することを可能とする（Luger & Schwarz, 1995; op. cit.）。
【００１０】
皮膚抗原塗布後の免疫活性化における異なる細胞の役割は未だに理解が不完全である（Luger & Schwarz, 1995; op.cit.; Lohoff et al., 1998, op.cit.)。基底上皮膚領域に位置するランゲルハンス細胞は免疫提示に主要な役割を演じていると信じられる。これらの細胞は先ず抗原に結合し、処理し、次いで、表皮からリンパ管に移行し、さらに近位排泄リンパ節に移行し、消化した抗原を搬送する。この過程で、ランゲルハンス細胞は表現型および機能的変換を受け、（リンパ球）樹状細胞に分化し、最終的に、高内皮細静脈を経てリンパ節に入っているナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞にその抗原を渡す。対照的に、皮膚内の他の２種の主型抗原提示細胞、マクロファージおよびＢリンパ球は、抗原を提示し、Ｔ細胞を刺激するために、先ず活性化を必要とする。抗体は細静脈内皮細胞により、また恐らく同様に皮膚のある種基底細胞によりＴ細胞に提示される。
【００１１】
明らかなことは、例えば、ケラチン細胞は、ＩＬ−１α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαなどの過度の前炎症性サイトカインを生ずることにより局所の炎症を増加させ得る（Pastore, S., Fanales-Belaso, E., Abbanesi, C., Chinni, L.M., Giannetti, A., Girolomoni, G. Granulocyte macrophage colony stimulating factor is overproduced by keratinocytes in atopic dermatitis; Implications for sustained dendritic cell activation in the skin(顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子がアトピー性皮膚炎においてケラチン細胞により過剰生産される；皮膚における持続性樹状細胞活性化意味). J. Clin. Invest. (1997) 99: 3009-3017)。ケラチン細胞誘導サイトカインはランゲルハンス細胞が強力な抗原提示細胞に成熟するためにも重要である（Nasir & Gaspari, 1996, op.cit.)。前者細胞がどの程度直接抗原提示に関与するのか（Kondo & Sauder, 1995, op.cit.)は未知であるが、ＩＬ−１０、非機能性ＩＬ−１２およびＴＧＦβなどの抑制性サイトカインがケラチン細胞により産生されることは確立された事実である（Nasir & Gaspari, 1996, op.cit.)。
【００１２】
皮膚中の線維芽細胞プールは抗原処理過程に関与する細胞のサブセットを含んでいる。例えば、線維芽細胞の１サブセットは強皮症の炎症部位でサイトカインにより選択的に集められる（Fries, K.M., Blieden, T., Looney, R.J., Sempowski, G.D., Silvera, M.R., Phipps, R.P. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis（線維芽細胞不均一性の証明および線維形成における線維芽細胞サブタイプの役割). Clin. Immunol. Immunopathol. (1994) 72: 283-292)。
【００１３】
表皮抗原塗布が口腔または鼻腔を介して投与するより簡便な経路と異なる免疫応答を生じることはすでに報告されている。例えば、皮膚への繰り返しの表皮の的オボアルブミン暴露後には、抗オボアルブミンＩｇＥが優勢となる（Wang et al., 1996, op.cit.)。皮膚上のモデル抗原としてウシ血清アルブミンを用い、異常に強いＩｇＡの産生が以前に観察された（Paul et al., 1997, op.cit.)が、表皮抗原提示とその結果生じる免疫応答との間の相互依存性について矛盾のない構図はこれまでに浮かび上がっていない。
【００１４】
多数の異なる細胞が経皮送達された高分子に対し免疫応答を展開する際に関与する。上に述べたように、これまでに採られた方法は防御免疫応答を生じる確かな戦略を確立するものではなかった。このことは、抗原注射などの先行技術戦略が、抗原を皮膚に塗布することによって得られる免疫応答を、目標とした防御免疫応答の案出を可能とする程度までに詳細に吟味する一助とならなかったという事実による。例えば、抗原注射は何らかの病変または他の種類の皮膚撹乱として、化学刺激剤の存在を含み、様々なサイトカインを皮膚から放出することが知られている（皮膚は身体において最も重要な器官であるばかりでなく、身体の免疫系の主要部分を作り出す）。これは皮膚免疫応答の微妙な調整を妨げるが、強度を最大とし、この免疫応答が使用した抗原の性質にも感受性である。高衝撃ワクチン送達はこの効果から利を得る。
【００１５】
超変形性担体による皮膚通過物質輸送は、報告にあるように、皮膚に影響を与えるものではないため、当該高衝撃ワクチン送達方法とは全く逆である。これは、かかる水分感受性、超変形性物体−いわゆるトランスファーサムス（Transfersomes；登録商標）（Cevc, 1997, op.cit)が、細胞の形状に調整された角質細胞間の‘事実上のチャンネル’を経て角質層に浸透するためであると信じられている（Schaetzlein, A., Cevc, G. Non-uniform cellular packing of the stratum corneum and permeability barrier function of intact skin: a high-resolution confocal laser scanning microscopy study using highly deformable vesicles (Transfersomes)（角質層の不均一細胞詰込みと未処置皮膚の浸透性障壁機能；高度変形性小胞による高分解能共焦点レーザー走査顕微鏡研究（トランスファーサムス)). Br. J. Dermatol. (1998) 138: 583-592)。トランスファーサムスはその過程で皮膚細胞と細胞間脂質を、その最も弱い接合部位で優位に押し離すと提唱された。このようにして形成された通路は平均して大よそ２０〜３０ｎｍであると思われる。これは皮膚表面の数パーセント（〜４％）を被い（Schaetzlein & Cev, 1998, op.cit.)、隣接表面の排出は含まない。これは正常のシャント面積（〜０.１％）よりもかなり大きく、超変形性担体（Paul & Cevc, 1995, op.cit.）による抗原投与後、またはアジュバントとしてコレラ毒素（Glenn et al., 1998a, b, op.cit.）を用いることによる抗原投与後に測定した抗ＢＳＡ力価間の定量的差を説明する。
【００１６】
担体により開かれた皮膚の事実上のチャンネルは十分に広いと思われるので、器官を著しく撹乱することなく該担体並びに担体と会合した物質を障壁通過させる。しかし、超変形性担体による皮膚通過インシュリン送達を繰返しても、該タンパク質に対する抗体を誘発しないことが判明した（Cevc, G., Gebauer, D., Schaetzlein, A., Blume, G.、超柔軟性小胞、トランスファーサムスは非常に低い浸透抵抗性を有し、治療量のインシュリンを未処置哺乳動物皮膚から通過輸送する、Biochim. Biophys. Acta (1998) 1368: 201-215)。
【００１７】
従って、本発明の基礎となる技術上の問題は、医療上有用な経皮免疫応答を成功裏に誘発させる手段を確立することであった。当該技術上の問題解決は請求項により特徴づけられる態様を提供することにより達成される。
【００１８】
（発明の開示）
従って、本発明は、経皮ワクチンであって、（ａ）浸透剤である経皮担体であって、水性溶媒に懸濁または分散されており、その形状は凝集傾向にある少なくとも２種の異なる物質または２種の異なる形状の物質からなる１層ないし数層の膜様コーティングにより取囲まれた微小液状小滴であり、当該物質または形状の物質が好ましくは水性液状媒体における溶解性において少なくとも１０倍異なっており、その結果、高溶解性の物質または形状の物質のホモ凝集体の平均直径または当該物質と当該形状の物質両方からなるヘテロ凝集体の平均直径が低溶解性の物質または形状の物質のホモ凝集体の平均直径よりも小さく、および／またはその場合に高溶解性の成分が浸透性小滴を可溶化する傾向にあり、かつ、その場合にかかる成分の内容物は該小滴を可溶化するのに必要な濃度の９９モル％までに等しいか、または非可溶化小滴の飽和濃度の９９モル％までに相当するいずれかの高いほうであり、および／またはその場合に膜様コーティング周辺の小滴の弾性変形エネルギーが、赤血球細胞の変形エネルギー、または液状脂肪族鎖をもつリン脂質二重層の変形エネルギーよりも少なくとも５倍低く、より好ましくは少なくとも１０倍低く、また、理想的には１０倍以上低い経皮担体；
（ｂ）サイトカインまたは抗サイトカイン活性を特異的に放出するか、または特異的に誘発するか、またはかかる活性それ自体を発揮する化合物であって、そのいずれかが所望の医療上有用な免疫応答を生じるもの；および（ｃ）抗原、アレルゲン、抗原混合物および／またはアレルゲン混合物；を含んでなるワクチンに関する。
【００１９】
９９％までという上記例示の値に関しては、前者の相対濃度の５０％以下の値が多くの場合用いられるということを特に言及する。さらにより有利には、４０相対％以下の値またはさらに３０相対％前後および以下が選択され、一方、より可溶性の成分により可溶化し得ない小滴では、上記の濃度を２倍まで超過する相対濃度が好ましい。
【００２０】
本発明の文脈において、“病原体”という用語は、身体内または身体上に存在することで、病的状態に導くか病的状態を促進する要素をいい、病的状態とは原則として防御的、治癒的またはアジュバント免疫療法に応答するかまたはそこから利益を得ることのできる状態である。この病原体は微生物病の原因となる病原体、例えば、スタヒロコッカスおよびストレプトコッカスなどの膿形成性球菌を包含する細胞外細菌、メニンゴコッカスおよびゴノコッカス種などのグラム陰性細菌、ナイセリアの種、大腸菌、サルモネラ、シゲラ、シュードモナス、ジフテリア、ボルデテラ・ペルツッシス（百日咳菌）などの腸内菌体を包含するグラム陰性細菌、およびグラム陽性細菌（例、バシラス・ペスティス、ＢＣＧ）、取分け、クロストリジウム種（例、クロストリジウム・テタニ（破傷風菌）、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・セプチカム）などの嫌気性菌；宿主細胞内で生存し、複製する多くの細菌およびすべてのウイルス；この後者の群は、マイコバクテリア（例、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌））およびリステリア・モノサイトゲネス、またこれらに限定されるものではないが、肝炎ウイルス、（ヒト）免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、痘瘡（水痘）、インフルエンザ、麻疹、流行性耳下腺炎およびポリオウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルスなどを包含するレトロウイルスおよびアデノウイルス、および宿主細胞内部で繁殖し得る真菌類；原虫および蠕虫などの動物寄生虫を包含する寄生虫、およびマダニおよびダニなどの外部寄生虫を包含する。該病原体はさらにブルセラ種菌（例、ブルセラ・メリテンシス（マルタ熱菌）、ブルセラ・アボータス（ウシ流産菌）、ブルセラ・スイス（ブタ流産菌）、ブルセラ・カニス、ブルセラ・ネオトメ、ブルセラ・オビス）、コレラ原因作用因子（例、ビブリオ・コレレ）、ヘモフィルス・アクチノミセテムコミタンス、ヘモフィルス・プリゥロニュウモニエなどのヘモフィルス種、並びにパラチフス、ペスト、狂犬病、破傷風および風疹などの疾患の引き金となる病原体を包含する。さらに、本発明の病原体は、これらに限定されるものではないが、真核細胞またはその部分であって、種々の新形成、自己免疫疾患の原因となるか、また必ずしも病原体感染の結果ではない動物または人体の他の病的状態に関係している病原体を包含すると見なす。ある種の病原体の部分、取分け種々の微生物毒素はポーリン様の性質を有し、その結果、粘膜を通過する能力、または浸透している膜の柔軟性を増大させるある種の能力をもつ。
【００２１】
“放出する”または“誘発する”と併用する用語“特異的に”とは、該化合物が、サイトカイン放出または誘発のレセプター介在誘起により該サイトカインを放出し得る細胞と相互作用する事を意味する。この特異的放出または誘発は、例えば、経皮注射により得られる非特異的放出または誘発と対照的である。
【００２２】
用語“アレルゲン”を本発明にて使用するのは、内在性または異種性起源、例えば、動物または植物起源の物質であって、かかるアレルゲンに曝された身体が不所望の免疫応答を生じ、多くの場合、急性の過敏性反応を起こす物質を記載するためである。アレルギー惹起微生物またはその部分（例、ダニの部分）、植物の部分（例、花粉）または動物の部分（例、毛髪および皮膚断片）、さらに人工的物質および無機物質もこの群に属する。他方、人体の殆どすべての部分は、それが身体の免疫系により誤って処理されるか、またはそれに暴露された場合、自己免疫応答を生じて、かかる物質に対するアレルギー反応を起こす。狭い解釈では、そのように規定して使用したとき、アレルゲンとは体内で、皮膚経由の非侵襲性であったか否かにかかわりなく、免疫療法により減少させ得るかまたはさらに除去し得る即時型過敏症を引起す物質、物質群または物質の配列である。
【００２３】
本明細書の文脈において“（治療的）予防接種”という用語は、例えすでに疾患の診断が確定した後であっても、臨床的状況を改善するための、または疾患を予防する目的の、何らかの治療的予防接種を説明するものである。かかる予防接種は本発明のワクチンを単回または反復投与することからなる。治療的予防接種は病的状況を防止するか、および／または臨床的状況を改善する。予防剤として投与した場合、一般に防御的免疫応答を生じるに至る。
【００２４】
免疫処理は当該応答が治療的または非治療的であるか否かにかかわらず、ある種の免疫応答を引出すことを意味する。
【００２５】
“抗体”または“免疫グロブリン”とは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭを意味し、例えば、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのすべてのサブタイプを包含する。それらの“誘導体”とは化学的、生物学的および他の方法で得られる誘導体であって、遺伝子工学による抗体誘導体などである。フラグメントとは、例えば、一本鎖フラグメント、Ｆｃ−、Ｆａｂ−、Ｆ(ａｂ')２−およびＩｇ類の他の部分を包含し、それらが内在性、異種性、（半）合成または組換え起源であるか否かは無関係である。さらに本発明が包含するのは、２種またはそれ以上の上記抗体、誘導体またはフラグメントの複合体である。
【００２６】
“抗原”とは病原体またはアレルゲンの一部であり、天然型またはフラグメント化もしくは誘導化後のものである。より一般的には、この抗原という単語は高分子またはそのフラグメント、何らかのハプテン部分（例えば、単一の炭水化物、複合体炭水化物、多糖、デオキシリボ核酸）を意味し、要するに、系に投与されたときに、生体の抗体レパートリーにより認識され、かつ抗体を誘発し得る分子である。
【００２７】
“抗原の混合物および／またはアレルゲンの混合物”という用語は、本発明による少なくとも２種の抗原またはアレルゲンの組合わせを意味する。また、少なくとも１種の抗原と少なくとも１種のアレルゲンを含んでなる抗原とアレルゲンの混合物も本発明により使用し得る。
【００２８】
本発明にて使用される場合、“サイトカイン”という用語は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカイン、そのすべてのサブタイプ、例えば、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βなど、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−βおよび−α）、Ｉ型およびII型インターフェロン（ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α２、（ＩＦＮ−ω）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、遊走阻止因子、ＭＩＦ、ｃ−キットリガンド、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ケモカインなど、並びにこれら分子いずれかの機能的誘導体のすべてを意味する。
【００２９】
特に良好な天然免疫性を仲介するサイトカインは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および白血球誘引活性化ケモカインなどである。この過程は、取分け、抗増殖性（例、ＩＦＮによる）、前炎症性（例、ＴＮＦ、ＩＬ−１による）または補刺激性（例、ＩＬ−６による）作用によるものである。リンパ球の活性化、増殖および分化を最も良好に仲介するサイトカインはインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）などである。かかるサイトカインは結果として標的の増殖に影響を与えるばかりでなく、さらに、細胞による他のサイトカインの活性化、従って産生に影響し、最終的に治療作用において役割を果たし得る。
【００３０】
免疫介在の炎症は細胞介在応答に大きく左右されるが、この炎症を仲介するサイトカインは、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、リンホトキシン（ＴＮＦ−β、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）および、恐らく遊走阻害因子である。白血球増殖および分化は主としてインターロイキン−３（ＩＬ−３）、ｃ−キットリガンド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージもしくは顆粒球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦもしくはＧ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−７（ＩＬ−７）により影響される。
【００３１】
“免疫アジュバント”という用語は、細胞型または体液型の所望の免疫応答を支持し、増大させ、活性化し、増強し、または調整する物質を説明するものとしてここでは使用するが、特に、ある種の抗原特異免疫応答を増大させることによる予防的処理の場合、および多くの場合、細胞介在免疫性を支持することによる治療的処理の場合に使用する。これは、皮膚または他の関与する末梢組織からのサイトカイン放出に直接または間接的に寄与する場合、適当なサイトカイン、その混合物またはアンタゴニストを添加することにより、またはあまり直接的ではないが、皮膚を化学的に刺激することにより達成し得るか、あるいはかかる作用に至らしめる組織中の分子の生合成を触媒または促進することにより達成し得るが、ただし、最終の成果は使用した抗原の予防的および／または治療的作用である予防接種の成功率が上がることである。
【００３２】
有用なサイトカインプールに間接的に寄与する免疫アジュバントのクラスは、アレルゲンとしての能力を有する小型の化学要素であり、例えば、ある種のアレルゲン性（金属）イオン、例えば、これらに限定されるものではないが、ＬiＣl、ＨgＣl２、モリブデン、酸、塩基および他の刺激性化合物、例えば、ジシクロヘキシルメタン−４,４'−ジイソシアネート、ジトロカルブ（ジエチルジチオカルバメート）、２,４−ジニトロクロロベンゼン、イソプリノシン、イソホロンジイソシアネート、レバミソール、（フェニル）オキサゾロンなど、スワンソニン（Swansonine)、シゾフラン、無水フタル酸、チモペンチン、（脂肪族）アルコール、（脂肪族）アミン、（脂肪族）エーテル、リシン、または他の適切な両親媒性体、多くの界面活性剤および化学的皮膚浸透増強剤、並びにその誘導体または併用剤などである；さらに、微生物の（低分子量）フラグメントまたはそれからの誘導体、例えば、リポ多糖（ＬＰＳなど）、コードファクター（トレハロース・ジミコール酸）および膜に付着した他の多糖、充分量使用する場合、アセチルムラミル−アラニル−イソグルタミン、および微生物の大型フラグメント、例えば、細菌の外毒素および内毒素、または腸内毒素、例えば、コレラ毒素および大腸菌の熱不安定性毒素（ＨＬＴ）など、およびその高分子フラグメント、例えば、Ａ鎖誘導体（そのすべてではないにしても殆どがＡＤＰ−リボシル化活性を有すると見られる）、高活力免疫アジュバントＬＴホロトキシンなど、細胞壁骨格、ＢＣＧなどの弱毒化細菌などである。
【００３３】
あまり確立されていない例としては、ボツリヌス毒素、結核菌（M. tubercuosis)の精製タンパク質誘導体、ＬＴ−Ｒ１９２Ｇ、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyrogenes）のフィブロネクチン結合タンパク質Ｉ、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｂ群の外膜タンパク質（ＧＢＯＭＰ）、種々の他のペプチドグリカンなどである。免疫アジュバントは、換言すると、抗原の取込みまたは提示を変える分子を包含し、皮膚だけでなく他の免疫担当組織においても、抗原特異リンパ球の増殖を活性化または増大させ、または免役応答において優性制御メカニズムを妨害する。（ＡＤＰ−リボシル化細菌性腸内毒素の粘膜アジュバント活性はこのための十分に確立された既知の例である）。他方、サイトカインまたは他の免疫アジュバントの（相対）濃度を変える分子、例えば、抗免疫アジュバント抗体または免疫アジュバントのアゴニストまたはアンタゴニストなども本発明の意味において免疫アジュバントである。同じことはリンパ球のホーミングに影響を与える分子、例えば、種々のセレクチン（ＬＥＣＡＭＳ、例えば、種々のＣＤ６２−ｓ）、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ヒアルロン酸など、および他のケモカイン、例えば、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＣＰ−１などについても当てはまる。さらに、免疫アジュバントの内在性グループはヒスタミン、転移因子、タフトシンなどを包含する。上記の免疫アジュバントの多くが、過度に低い濃度または場合により過度に高い濃度で、またはそれ自体で非侵襲免疫処置をしたにもかかわらず、所望の効果を確保するための充分な効力をもたないので、本研究に用いたアジュバントの機能的限定により、体内におけるサイトカイン濃度と分布パターンの十分な調整を組込み、その結果、所望の治療的または予防的免疫応答を展開させる。もし明確にする必要があるなら、当該調整とその程度をそのための実験で決定しなければならず、その際に、例えば、特定のサイトカインレベルが決定される。
【００３４】
“免疫アジュバント操作”とは皮膚に非化学的処理を行うことを意味し、例えば、皮膚の摩擦、押し付け、加熱、電気的または機械的、例えば、超音波の場に暴露すること、または非免疫原製剤を皮膚に注射することなどであるが、ただし、かかる処理が免疫アジュバント化合物を皮膚または他の末梢免疫活性組織から放出させるか、または望む予防接種に対するアンタゴニストの濃度／作用持続時間を低減させる。しかし、本発明による“免疫アジュバント操作”とは、免疫モジュレーターおよび／またはサイトカインおよび／またはサイトカイン放出因子、取分け、ヒスタミンにより皮膚を前処理することをも意味する。
【００３５】
“免疫原”という用語は免疫学的担体と結合したハプテンまたは遊離の抗原または担体と会合した抗原を意味し、免疫応答を誘発し得るものである。
【００３６】
“免疫寛容”とは抗原に対する不所望の免疫応答が欠落しているか、またはより一般的には減少させていることを意味する。
Ｔｈ１（Ｔ−ヘルパー細胞Ｉ型）関連の抗体はＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３などである。
Ｔｈ２（Ｔ−ヘルパー細胞II型）関連の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ４およびＩｇＥのクラスを含んでなる。
【００３７】
本発明と関連して“２つの形状の物質”という用語は同一物質の２つのイオン化状態または塩の形状、かかる物質の２つの異なる複合体などを意味する。
【００３８】
“非侵襲投与”または“非侵襲送達”とは、未処置皮膚を介し本開示にて扱う生物学的適用において、未処置障壁に塗布することまたは通過輸送することを意味する。
【００３９】
“浸透性”とは比較的大きな要素が障壁を横切って非拡散的に移動することを意味する。この過程は一般に障壁のこれ以外では封鎖されている穿孔に浸透剤が適合することに依存し、また、穿孔を拡大するか、またはチャンネルを開口するなど、浸透性が誘導した障壁抵抗性の低下を伴う；しかし、この過程は一義的に障壁を横切る浸透剤濃度勾配には左右されない。
【００４０】
“浸透”とは半浸透可能な障壁を通過する拡散性の移動をいう。これについての最良の例は、障壁を通過する浸透性種の濃度勾配の影響下に分子または分子の凝集体が輸送されることである。
【００４１】
結果として、浸透剤は障壁を透過するには大きすぎる分子または分子の配列を含んでなる要素であるが、障壁のこれ以外では封鎖されている通路（穿孔）の形状および／または径に浸透剤が適合することで障壁を通過し得る。この適合性は以下の事実、例えば、浸透剤は穿孔径よりも２倍を超えて大きいが、穿孔径までフラグメント化せずに二重層を通過するということから見られる。他方、透過剤は皮膚などの半透過性障壁を透過し得る要素である。外部の場にある浸透剤は、名目上の浸透剤サイズに比例して、また適用した場に比例して自然に存在する可能性のある推進力を受ける。かかる力は未処置非閉塞皮膚上では角質層を通っている水の濃度勾配に由来すると信じられるが、もしこの力が浸透剤を変形させるか、またはサイズ排除の問題を回避するのに十分に障壁の通路を広げるか、あるいはその両方に対し十分な力であるならば、この力が皮膚などの障壁を通過する浸透剤の動きとなる。
【００４２】
さらなる定義について、取分け、複合体の変形性に関しての浸透剤、対応する作用メカニズム、対象浸透剤成分または選択した薬剤のリストなどに関しては、発行された特許または係属中の特許（ＤＥ４１ ０７ １５２、ＰＣＴ／ＥＰ９１／０１５９６、ＰＣＴ／ＥＰ９６／０４５２６、ＤＥ４４ ４７ ２８７）を参照する。製造方法および障壁を透過するには大きすぎる抗原性（高）分子および／または免役アジュバントと混合した浸透剤に関する詳細な情報については、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９８／０６７５０に見出すことができる。
【００４３】
一般に、担体を形成する凝集物質の中で溶解性の低いものは脂質または脂質様物質、取分け極性脂質であり、一方、懸濁液中により溶解性であり、かつ小滴の適合性を増大させる物質は界面活性剤に属するか、または界面活性剤様性質を有する。前者の成分は、一般に、生物起源の脂質または脂質様物質または相当する合成脂質またはその修飾体であり、かかる脂質は多くの場合以下の化学式を有する純粋なリン脂質のクラスに属する：
【化１】
2002535350.tif 000001
ただし、式中、Ｒ１およびＲ２は脂肪族鎖、典型的には、Ｃ１０−２０−アシルもしくは−アルキル、または部分的に不飽和脂肪酸残基、取分け、オレオイル、パルミトエロイル、エライドリル、リノレイル、リノレニル、リノレノイル、アラキドイル、ワクシニル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、およびステアロイル鎖である；Ｒ３は水素、２−トリメチルアミノ−１−エチル、２−アミノ−１−エチル、Ｃ１−４−アルキル、カルボキシ置換Ｃ１−５−アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ２−５−アルキル、カルボキシおよびヒドロキシ置換Ｃ２−５−アルキル、またはカルボキシおよびアミノ置換Ｃ２−５−アルキル、イノシトール、スフィンゴシン、または当該物質の塩である；当該脂質はまたグリセリド、イソプレノイド脂質、ステロイド、ステリンまたはステロール、イオウ−または炭水化物−含有脂質のもの、または他の二重層形成脂質、取分け半プロトン化液状脂肪酸を含んでなる；好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンまたは他のスフィンゴホスホリピド、グリコスフィンゴリピド（セレブロシド、セラミドポリヘキソシド、スルファチド、スフィンゴプラスマローゲンを包含する）、ガングリオシドまたは他の糖脂質または合成脂質、取分け相当するスフィンゴシン誘導体をもつもの、または他の糖脂質からなる群から選択される；それによって２つの類似のまたは異なる鎖がバックボーンにエステル化し得る（ジアシルおよびジアルケニル化合物におけるように）か、またはジアルキル脂質におけるようにエーテル結合を有するバックボーンに付着し得る。
【００４４】
使用する界面活性剤としては、通常、非イオン性、両性イオン性、アニオン性またはカチオン性、取分け、脂肪酸または脂肪族アルコール、アルキル−トリ／ジ／メチル−アンモニウム塩、硫酸アルキル塩、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸などの一価の塩、アシル−またはアルカノイル−ジメチル−アミンオキシド、取分け、ドデシル−ジメチル−アミンオキシド、アルキル−またはアルカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、３−（アシルジメチルアンモニオ）アルカンスルホネート、Ｎ−アシル−スルホベタイン、ポリエチレン−グリコール−オクチルフェニルエーテル、取分け、ノナエチレン−グリコール−オクチルフェニルエーテル、ポリエチレン−アシルエーテル、取分け、ノナエチレン−ドデシルエーテル、ポリエチレン−グリコール−イソアシルエーテル、取分け、オクタエチレン−グリコール−イソトリデシルエーテル、ポリエチレン−アシルエーテル、取分け、オクタエチレンドデシルエーテル、ポリエチレン−グリコール−ソルビタン−アシルエステル、例えば、ポリエチレングリコール−２０−モノラウレート（トゥイーン２０）またはポリエチレングリコール−２０−ソルビタン−モノオレエート（トゥイーン８０）、ポリヒドロキシエチレン−アシルエーテル、取分け、ポリヒドロキシエチレン−ラウリル、−ミリストイル、−セチルステアリル、または−オレオイルエーテル、ポリヒドロキシエチレン−４または６または８または１０または１２などの−ラウリルエーテル（ブリジ系のものとして）、または相当するエステルにおいて、例えば、ポリヒドロキシエチレン−８−ステアレート（ミルジ（Myrj）４５）のミリステート−、−ラウレート、リノレート−、リノレネート−、パルミトレート−または−オレエート型、またはポリエトキシル化カスターオイル４０におけけるソルビタン−モノアルキレート（例えば、アラセル（Arlacel）またはスパン（Span)において）、取分け、ソルビタン−モノラウレート、−ミリステート、−リノレート、−リノレノエート−、−パルミトレート−または−オレエート、アシル−またはアルカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、取分け、デカノイル−またはドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、アルキル硫酸（塩）、例えば、ラウリル−、ミリストイル−、パルミトイル−、オレオイル−、パルミトレオイル−、リノレニル−、リノレオイル−、ワクシニル−、またはエライドイル−硫酸、デオキシコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、タウリン酸ナトリウム、上記のごとき脂肪族鎖を同様に優先する脂肪酸塩、リソホスホリピド、例えば、ｎ−オクタデシレン（＝オレオイル）−グリセロホスファチジン酸、−ホスホリルグリセロール、または−ホスホリルセリン、ｎ−アシル−、例えば、ラウリル、ミリストイル、パルミトイル、オレオイル−、パルミトレオイル−、エラジル−、ワクシニル−、リノレイル−、リノレニル−グリセロ−ホスファチジン酸、−ホスホリルグリセロール、または−ホスホリルセリン、または相当する二重短鎖リン脂質、例えば、ドデシルホスファチジルコリン、その他、��面活性ポリペプチドである。しかし、極性脂質と他の両極性物との複合体はしばしば担体のコーティングにおいて界面活性剤の役割を果たし得ること、また極性脂質の異なるイオン化または塩状態がその性質において大幅に異なるとを認識することが重要である。従って、膜内で混ざり合った同じ（極性）脂質の２つの異なる理化学的性質が高度に変形可能な担体を生じ、本研究の条件を満足するのは理に適っている。
【００４５】
脂質懸濁液に関するより一般的な情報は‘リポソーム’を扱うハンドブック（Gregoriadis, G., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Fl., Vols 1-3, 1987)、書籍‘薬物担体としてのリポソーム’（Gregoriadis, G., Hrsg., John Wiley & Sons, New York, 1988）、または実験室手引書‘リポソーム。実用的方法’（New, R., Oxford-Press, 1989）に見出すことができる。生物適合性免疫浸透剤を調製するために簡便に使用し得るリン脂質の性質については‘リン脂質ハンドブック’（Cevc, G., ed., Dekker, New York, 1995）に概説されている。
【００４６】
製剤のｐＨ値は調製直後にまたはその適用直前に調節するのが便利である。かかる調節は当初のｐＨ条件下、生理的適合性を犠牲にせずに個々の系成分および／または薬物担体の劣化を防止しなければならない。浸透剤懸濁液を中和するために、生物適合性酸または塩基を用い、ｐＨ値３〜１２、多くの場合５〜９、最多には６〜８のバッファーを調製するのが合理的である。生理的に許容し得る酸は、例えば、鉱酸の希釈水溶液、例えば、塩酸、硫酸、もしくはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸などのカルボキシアルカン酸などである。生理的に許容し得る塩基は、例えば、希釈水酸化ナトリウム、適切にイオン化したリン酸などである。
【００４７】
要すれば、免疫原懸濁液は適用前に希釈または濃縮（例えば、超遠心分離または限外濾過により）することができる；添加物はこの時点で、またはその前に加えてもよい。該添加物は多くの場合、周囲のストレスに対する製剤の感受性を減少させる物質、例えば、殺微生物剤、抗酸化剤、望ましくない酵素作用のアンタゴニスト、予備的低温保存剤、濃厚化剤などから選択する。しかし、系を操作した後、担体の特性をチェックし、要すれば、再調整すべきである。
【００４８】
本発明によると、驚くべきことに、本明細書に記載した超変形性脂質凝集体（免疫浸透剤）と会合した高分子抗原は、当該浸透剤の平均直径が平均穿孔／チャンネル直径を超えているという事実にもかかわらず、人工的多孔性障壁並びに皮膚を通過し得、かつ、かかる免疫浸透剤が治療的または予防的免疫応答を引出し得るということが判明した。ただし、当該免疫浸透剤はサイトカイン活性を示す化合物、または皮膚および／または身体の他の免疫適合器官におけるサイトカインの生成および／または放出を誘発する化合物と会合している。あるいは、当該化合物はサイトカイン活性に拮抗する。この後者の態様ではそれぞれの他の経路を遮断することにより、免疫応答をＴｈ１またはＴｈ２依存性免疫応答に有利に指し向ける。本発明に記載した抗原担体はこの過程の前およびその間十分な安定性を維持する。さらに驚くべきことに、得られる免疫応答は塗布した用量に正比例せず、抗原の量を変化できる可能性のあることを示唆するものであるということが判明した。当該量は最適の効果があるように巧く選択すべきである。最適量または抗原の範囲選択は本明細書の教示を考慮すれば十分に当業者の技術範囲内にある。
【００４９】
本発明ワクチンの担体として使用される少なくとも二成分からなる免疫凝集体は高い変形性において勝っており、また殆どが多くの場合高い柔軟性膜をもつ小胞の形状をもつ。以前はかかる担体を免疫処理プロトコールに採用していたが、以前に仮定した担体の免疫アジュバント活性は、サイトカイン活性化合物またはそれに対する適切なアンタゴニスト、好ましくはＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９およびＩＬ−１３などを包含させる必要性、または所望の防御免疫応答を達成するために、Ｔ細胞レセプターの前刺激に続いて、ＩＬ−１をも包含させる必要性を排除しないということは意外であった。同じ議論によって、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびリンホトキシン（ＬＴまたはＴＮＦ−β）はＴｈ１応答を促進し、その結果、細胞介在免疫応答を介助すること、またウイルスと他の寄生虫病の治療手段、あるいは免疫寛容を促進する手段を提供するために有利に包含される。例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２およびＩＬ−４の併用、または単なるＩＬ−１２の添加はＴｈ２応答をＴｈ１型に逆戻りさせると期待される。さらに広い意味でいうと、ＩＬ−１２とＩＬ−４の相対量について前者を優先して免疫応答の開始時に増量することが、浸透剤介在免疫処理の場合にもＴｈ１応答を促進するために有用であり、またその逆の処理も有用であることが提案される一方、ＩＬ−２はＮＫおよびＢ細胞増殖を支持し、抗体合成を刺激し、さらに一般にはＴ−細胞依存性免疫応答の大きさに影響する。このように、先行技術は抗体力価が抗原と、また要すれば免疫アジュバントと組合わせた適当な担体を用いることにより誘導し得ることを証明した一方、得られる免疫応答が防御的であることは証明されなかった。
【００５０】
本発明の特徴的な利点は、本発明に記載した浸透剤の転移が皮膚内のサイトカイン成分の本質的な障害に至るものではないという驚くべき知見があったという事実にもとづいている。換言すると、これらの担体が皮膚を通過する転移はそれ自体がサイトカインの本質的な放出を誘発しない。従って、皮膚またはサイトカインを放出し得る他の器官の細胞からかかるサイトカインを特異的に誘発または放出する化合物を本発明のワクチンに包含させることにより所望の免疫応答について、今やそれを研究すること、またその引き金を引くことが可能である。このように、所望の免疫応答を微調整することが可能である。あるいは、サイトカイン活性を有するか、または示す化合物を本発明のワクチンに包含させることができる。さらに、サイトカイン活性のアンタゴニストをかかるサイトカインの作用を特異的に防止するために使用してもよい。この態様において、免疫応答は有利にＴｈ１およびＴｈ２経路に向けられる。これらの化合物は抗原の性質に依存してサイトカインを特異的に誘発または放出する。このようにこれらは、本発明によると、非特異的に、また広範に免疫応答を支持するアジュバントとは区別される。
【００５１】
結論として、本発明ワクチンの適用は従って所定の抗原に対する所望の免疫応答を微妙に調整することを可能とするが、抗原の性質は勿論所定の役割を演ずるものである。この免疫応答は、例えば、アジュバントにより始動する非特異的な免疫応答により上昇させ得る。免疫応答を微調整する選択は特にワクチン注射のみによる先行技術よりも有利であるが、その理由は注射の過程それ自体が皮膚のサイトカイン相対濃度を大きくまた非特異的に損なうからである。
【００５２】
上記の基準を考慮することは、皮膚細胞と末梢免疫系細胞に適切な種類の免疫を提示する基礎となるばかりでなく（担体による）、体内で抗原中和抗体を優先的に生成するか、細胞介在の免疫応答のもととなるか、または抗原に対する寛容を次第に発達させるに至るか、または細胞介在免疫性を特異的に促進させるかのいずれかの免疫過程を保証するものである。
【００５３】
本発明によると、非侵襲経皮予防接種の結果は免疫浸透剤（抗原担体）組成物により強く影響を受けることも判明した。異なる純度の抗原を用いると、結果として大きく異なる免疫応答が得られる。このことは、恐らく異なる最終抗原イソタイプパターンのために、同様の全体的な力価をもつ生体が多様なレベルの防御を示したという観察に反映されていた。
【００５４】
さらに、常套の低分子量免疫アジュバント、モノホスホリルリピドＡを添加すると、以前に公表された測定抗体価においてより小さな標準偏差が証明しているように、表皮での免疫処置の結果をより強固なものとしただけではなかった。免疫担体としてこの免疫アジュバントを使用すると、意外にも、またマウスで得られた以前の経験に反して、ＩｇＧ２ｂの分泌が増加し、ＩｇＧ２ａについても幾分強く増加したが、ＩｇＡの産生は上昇しなかった。Ｔｈ１様免疫グロブリンであるＩｇＧ１の存在は、破傷風毒素に対して少なくともマウスの防御にとって必須であると推論されるので、リピドＡまたは細菌抗原の役割がここで初めて明らかとなった。本発明に開示した教示を将来医学および商業上使用するためには、高い（特異）抗体価が必ずしも良好な防御結果を暗示するものではないということを認識することが重要である；所望の十分な防御を達成するためには、一定の抗体イソタイプの正しい種類と相対量が必要であり、その結果、広く信じられるように、あるべきＴｈ１またはＴｈ２型の免疫応答を与えることになる（先の考察参照）。
【００５５】
所望のゴールに到達するのに適した基本的剤形は技術上既知である；より詳細なまたは補足的情報については、例えば、ＤＥ４１ ０７ １５２、ＰＣＴ／ＥＰ９１／０１５９６、ＰＣＴ／ＥＰ９６／０４５２６、ＤＥ４４ ４７ ２８７参照。本発明のワクチンは予防的または治療的予防接種のみに有用であるだけでなく、さらに、アレルギーの治療に、またヒトおよび家畜医療においける細胞外および細胞内細菌、ウイルスおよび寄生虫などの微生物に対して免疫を得るために適用し得る。
【００５６】
上記の浸透剤と組合わせることにより、免疫活性物質などの抗原は前者と物理的または化学的複合体を形成して障壁を通過輸送される。
【００５７】
皮膚内に存在するサイトカインのプールから利を得るためには、予防接種の特に有用な方法として、上に定義した免疫アジュバントの巧みな操作により器官を前処理した後、皮膚に免疫原を塗布する方法が提案される。
【００５８】
特に有用なのは、さらなるアレルゲン投与の細部と過程を最適化するために、パッチ評価に対する上記の局所免疫応答からの読取り値を使用し、それを治療的または予防的予防接種の成果にプラスに影響させることである。かかる方法は適用したアレルゲンに対し被験者を免疫寛容に到達させるか、またはそれを改善するために有利に使用し得ると信じられる。
【００５９】
もし最初の免疫処置が、典型的に皮下注射により、またはある種他の適当な皮膚障壁穿孔／破壊方法を用いることにより侵襲的に行われるならば、高いＩｇＭレベルが得られると期待されるが、その後の追加刺激免疫処置は本発明に記載した非侵襲的方法で実施することが可能である。
【００６０】
最後に、幾つかの最適化方法として、高度に変形可能な浸透剤に基き、免疫原と予防接種を改善するために使用し得る方法が提案される。好適なのは、十分に解明された障壁の種々の穿孔を通過する免疫原と会合した浸透剤の流れを、障壁を通過する適当な推進力または作用圧の関数として決定し、次いでそのデータを特徴的な曲線により簡便に描出し、それを次いで製剤の最適化またはさらなる適用の最適化に採用するという方法である。その穿孔は適当な推進力または圧の関数として十分に解明された障壁の穿孔を通過する免疫浸透剤の流れの決定因子であり、特徴的な曲線による得られたデータの解析は、次いで、異なるデータセットとの比較に基づいて製剤の最適化またはさらなる適用の最適化に採用することができる。これは、例えば、Cevc et al., 1998, op.cit.に報告されている既知の皮膚浸透能をもつ免疫原不含浸透剤懸濁液での浸透結果との比較をも包含する。補足的な好適な態様において、免疫調整剤または免役調整手法の種々組合わせを主にＴｈ１またはＴｈ２関連サイトカイン関連産生と関連してテストし、次いでその結果を最終の治療または予防適用に向け適切に選択するために使用する。
【００６１】
予防接種は一般に外界温度で実施するが、それより低い温度でも高い温度でも適当である。これらは室温と皮膚温度またはその他の障壁温度間で堅固な合成物質を含んでなる製剤で特に意味を成す。
【００６２】
製造温度は通常０℃ないし９５℃の範囲で選択される。好ましくは、１０〜７０℃の温度範囲、最も多くの場合、１５℃ないし４５℃の温度で作業するが、あらゆる場合に、重要な製剤成分のいずれかが組成物内で、または物理的状態で不可逆的な変化を受ける可能性のある温度より低い温度で作業する。皮膚温度は通常３２℃である。他の温度範囲も可能であるが、凍結可能または非揮発性成分、低温または熱安定化製剤などを含む系については最も顕著である。
【００６３】
個々の系成分の完全さおよび所望の性質を維持することが必要な場合、担体製剤は会合した抗原を含め、または含めずに冷所（例えば、４℃）で保存することができる。不活性気相下、例えば、窒素下の製造および貯蔵が可能であり、場合により賢明である。免疫原製剤の貯蔵期限は二重結合の非常に少ない物質を使用することにより、すなわち、不飽和度を低くすること、抗酸化剤、キレート化剤、および他の安定化剤を添加することより、あるいは凍結乾燥または乾燥混合物からその場でまたは原位置で免疫浸透剤を調製することにより引き延ばすができる。
【００６４】
本発明によるワクチンの好適な態様においては、サイトカイン活性または抗サイトカイン活性を有する分子を特異的に放出するか、または特異的に誘発する化合物および抗原がこの浸透剤と会合している。
【００６５】
本発明によるワクチンのさらなる好適な態様において、溶解性の低い自己凝集性分子は極性脂質であり、より溶解性の高い成分は界面活性剤または界面活性剤様分子または本発明の目的にとって十分に可溶性であるかかる形状の極性脂質である。
【００６６】
本発明によるワクチンのさらに好適な態様において、浸透剤の平均直径は３０ｎｍないし５００ｎｍであり、好ましくは４０ｎｍないし２５０ｎｍであり、さらにより好ましくは５０ｎｍないし２００ｎｍであり、取分け好ましいのは６０ｎｍないし１５０ｎｍである。
【００６７】
さらなる好適な一態様において、本発明はワクチンに関するものであり、その場合、ヒトまたは動物の皮膚に使用する製剤における小滴の総重量は総質量の０.０１重量％（ｗ％）ないし４０ｗ％、特に０.１ｗ％ないし３０ｗ％、最も好ましくは５ｗ％ないし２０ｗ％である。
【００６８】
本発明によるワクチンのさらに好適な態様においては、総抗原濃度が総浸透剤質量の０.００１ｗ％ないし４０ｗ％、取分け０.０１ｗ％ないし３０ｗ％、さらに好ましくは０.１ｗ％ないし２０ｗ％、最も好ましくは０.５ｗ％ないし１０ｗ％である。
【００６９】
本発明によるワクチンのさらに好適な態様において、該製剤はさらに、（da）低分子量化学刺激剤、および／または（db）病原体からの低分子量化合物またはそのフラグメントまたは誘導体を含んでなる。
【００７０】
本発明によるワクチンのなおさらに好適な態様において、サイトカイン活性を示す化合物は、ＩＬ−４、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＴＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＴＮＦ、ＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１β、Ｉ型インターフェロン、好ましくはＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−β、ＩＬ−５またはＩＬ−１０である。
【００７１】
本発明によるワクチンのさらにもう一つの好適な態様において、抗サイトカイン活性を示す化合物は、抗サイトカイン抗体または対応する活性フラグメント、その誘導体または類似体である。
【００７２】
これに関連する用語“活性フラグメントまたはその誘導体”とは上記の活性が使用した物質により実質的に維持されるか、または模倣されることを意味する。
【００７３】
本発明によるワクチンのさらに好適な態様においては、抗原が病原体から誘導される。
【００７４】
本発明によるワクチンの他の特に好適な態様においては、当該病原体が、スタヒロコッカスおよびストレプトコッカスなどの膿形成性球菌を包含する細胞外細菌、メニンゴコッカスおよびゴノコッカス種などのグラム陰性細菌、ナイセリアの種、大腸菌、サルモネラ、シゲラ、シュードモナス、ジフテリア、ボルデテラ・ペルツッシス（百日咳菌）などの腸内菌体を包含するグラム陰性細菌、およびグラム陽性細菌（例、バシラス・ペスティス、ＢＣＧ）、取分け、クロストリジウム種（例、クロストリジウム・テタニ（破傷風菌）、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・セプチカム）などの嫌気性菌、マイコバクテリア（例、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌））およびリステリア・モノサイトゲネス、肝炎ウイルス、（ヒト）免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、痘瘡（水痘）、インフルエンザ、麻疹、流行性耳下腺炎およびポリオウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルスなどを包含するレトロウイルスおよびアデノウイルスを含んでなる宿主細胞内で生存し、複製する細菌およびウイルス、および宿主細胞内部で繁殖し得る真菌類、原虫および蠕虫などの動物寄生虫を包含する寄生虫、およびマダニおよびダニなどの外部寄生虫、またはブルセラ種菌（例、ブルセラ・メリテンシス（マルタ熱菌）、ブルセラ・アボータス（ウシ流産菌）、ブルセラ・スイス（ブタ流産菌）、ブルセラ・カニス、ブルセラ・ネオトメ、ブルセラ・オビス）、コレラ原因作用因子（例、ビブリオ・コレレ）、ヘモフィルス・アクチノミセテムコミタンス、ヘモフィルス・プリゥロニュウモニエなどのヘモフィルス種、並びにパラチフス、ペスト、狂犬病、破傷風および風疹などの疾患の引き金となる病原体、および種々の新形成、自己免疫疾患の原因となるか、または必ずしも病原体感染の結果ではない動物または人体の他の病的状態に関係している病原体から選択される。
【００７５】
本発明によるワクチンの好適な態様において、アレルゲンは異種または内因性起源のもの、微生物、動物または植物由来のものであって、そのアレルゲンに暴露された身体を急性の過敏性反応に導くものであり、多くのかかるアレルゲンはダニ、花粉、動物の毛髪または皮膚片、または人工的および／または刺激性無機物質の群に属するもの、または人体の免疫系により間違って処理されたか、暴露された人体のかかる部分または成分に属するものである。
【００７６】
本発明によるワクチンのさらなる好適な態様において、使用するサイトカイン活性提示化合物のそれぞれの濃度は、抗原と選択した免疫アジュバントについて、製剤を皮下注射するかまたは生体外テストを実施することにより遂行した対応するテストにおいて確立された最適濃度よりも１０００倍までの高さに選択されるが、該濃度は、好ましくは１００倍までであり、より多くの場合５０倍までであり、さらに良好には２０倍までの高さである。
【００７７】
本発明によるワクチンの異なる好適な態様において、病原体抽出物または化合物は、リポ多糖、コードファクター（トレハロース・ジミコール酸）、ムラミルジペプチド、または病原体膜の免疫学的活性部分に同じか、または類似している他の（多）糖または（ポリ）ペプチドであり；病原体抽出物が細菌性外来および内毒素、好ましくはコレラ毒素および大腸菌の熱不安定毒素（ＨＬＴ）、Ａ鎖誘導体、ＡＤＰリボシル化活性を有する成分、ペプチドグリカン、クロストリジウム属毒素、または結核菌（M.tuberculosis）の精製タンパク質誘導体、ＬＴ−Ｒ１９２Ｇ、ストレプトコッカス・ピロゲネス（化膿連鎖球菌）のフィブロネクチン結合タンパク質Ｉ、またはＢ群ナイセリア・メニンジティディス（髄膜炎菌）の外膜タンパク質（ＧＢＯＭＰ）；または非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドなどの細菌性またはウイルス性核酸である。
【００７８】
本発明の取分け好適な態様において、当該リポ多糖はリピドＡまたはその誘導体および修飾体、例えば、モノホスホリルリピドＡ、またはその類似体、例えば、サッカロースの脂肪酸誘導体などである。
【００７９】
本発明によるワクチンの他の取分け好適な態様において、病原体由来の病原化合物の濃度は、同様の抗原を使用する対応する注射製剤で使用するよりも１０倍より低く、かつ１０００倍までの高さであり、皮膚上に投与した免疫アジュバント濃度は多くの場合、注射での免疫アジュバント濃度とは０.５ないし１００倍、より好適には１ないし５０倍、最善は２ないし２５倍異なっている。
【００８０】
本発明によるワクチンのさらに他の取分け好適な態様において、低分子量刺激剤は、アレルゲン性金属イオン、酸、塩基、刺激性液体、（脂肪族）アルコール、（脂肪族）アミン、（脂肪族）エーテル、（脂肪族）硫酸エステル、−リン酸エステルなどのクラス、または他の適当な溶媒または両性溶媒などから、またはしばしば皮膚浸透上昇能力を有する界面活性剤様分子並びにその誘導体または組合わせから選択される。
【００８１】
本発明によるワクチンの好適な態様において、当該低分子量刺激剤の濃度は、かかる刺激剤のテストに共通に用いられる方法と基準により評価した場合、同一または同等の被験者での独立したテストにおいて局所刺激により受け容れ難いと思われる濃度少なくとも２倍、より多くの場合５倍、さらに好適には１０倍以上低い濃度で選定される。
【００８２】
本発明によるワクチンのさらなる取分け好適な態様において、アレルゲンは吸入性アレルゲンのクラスに属し、種々の花粉、胞子、動物毛髪、皮膚、羽毛、天然および合成繊維などの小片、コムギ、ダニを含む（ハウス）ダストなどを包含し；さらに食物および医薬アレルゲン；接触アレルゲン；注射、侵襲およびデポアレルゲン、例えば、種々の（胃腸管居住）蠕虫、エキノコックス、旋毛虫など、インプラントの一部などである。
【００８３】
本発明によるワクチンの好適な態様において、抗原の適用用量は他の方法で免疫化過程において注射しなければならない用量と０.１ないし１００倍異なるが、多くの場合、０.５ないし５０倍の範囲にあり、より好適には１ないし２０倍、理想的には注射にて使用されるよりも１０倍未満高い。
【００８４】
本発明によるワクチンの好適な態様において、適用される刺激剤用量は、０.１ｍｇ／ｃｍ２ないし１５ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに多くの場合０.５ｍｇ／ｃｍ２ないし１０ｍｇ／ｃｍ２の範囲であり、好ましくは１ｍｇ／ｃｍ２ないし５ｍｇ／ｃｍ２である。塗布免疫原用量を調節するために、容易に接近し得るか、または保護された目的の身体部位（例えば、胸部または背部、腕、頚部側面など、例えば、耳の後ろ、または頭皮部分も）において、異なる投与領域を使用するのも有利である。
【００８５】
本発明によるワクチンの異なる好適な態様において、当該抗原は純粋なまたは精製した抗原である。本発明ワクチンにおいて高度に精製した抗原の使用は、防御的免疫応答の生成にとって取分け有利であることが分かる。
【００８６】
本発明はさらにビン詰めまたはそれ以外の包装形態で、該ワクチンの少なくとも１用量を含んでなるキットに関する。
本発明による好適な態様において、該キットは上記抗原の少なくとも１注射可能用量を含んでなる。
【００８７】
本発明は、さらに上記のワクチンにより哺乳動物に予防接種することを含んでなる当該哺乳動物に防御免疫応答を生じさせる方法に関する。
【００８８】
本発明による方法の他の好適な態様においては、適用した免疫原用量と治療予防接種の結果を制御するために、異なる治療部位を選択する。
【００８９】
本発明による方法のさらに好適な一態様においては、抗原不含浸透剤懸濁液に抗原を負荷し、投与前日までに、好ましくは得られる製剤を皮膚上に投与する３６０分前、より好ましくは６０分前、さらにより好ましくは３０分前にそれと会合させる。
【００９０】
本発明による方法の異なる好適な態様においては、免疫アジュバント操作により器官を前処理した後、本発明のワクチンを皮膚上に塗付するが、当該操作が、例えば、皮膚の摩擦、押し付け、加熱、電気的または機械的、例えば、超音波の場に暴露すること、または非免疫原製剤を皮膚に注射することを含んでなる；ただし、かかる処理のいずれかが免疫アジュバント化合物を皮膚または他の末梢免疫活性組織から放出させるか、または望む予防接種に対するアンタゴニストの濃度／作用持続時間を低減させる。
【００９１】
本発明による方法の好適な態様においては、免疫原は非閉塞パッチとして適用する。この態様は浸透剤懸濁液中の表皮投与免疫原に対する皮膚反応を評価する目的でも使用し得るが、前者は少なくとも当初アレルギー性であり、例えば、生じる発赤、刺激などから見られるように、急性の局所過敏性反応を生じる。
【００９２】
本発明による方法の他の好適な態様においては、少なくとも１用量のワクチンを投与する。
本発明のこの態様は、本発明ワクチンの反復投与を包含する。反復投与は皮膚上での反復投与、または皮膚上での反復投与と、例えば、非経口投与との併用を包含する。これと関連して、本発明のキットは本発明ワクチンを含んでなる１個またはそれ以上のコンテナーまたはアンプルを含んでなるキットとして有利に使用し得る。
【００９３】
本発明による方法の取分け好適な態様においては、当該ワクチンを追加刺激予防接種として投与する。
本発明による方法の最も好適な態様においては、一次免疫処置を侵襲的に、一般には皮下注射またはある種他の適切な皮膚障壁穿孔／破壊方法を用いて実施し、引続くブースター免疫処置を非侵襲的に実施する。
【００９４】
本発明による方法の好適な態様において、ワクチンは、非アレルゲン性抗原を使用する場合、２ないし１０回、好ましくは２ないし７回、さらにより好ましくは５回まで、最も好ましくは３回まで投与するか、あるいはアレルゲンの場合には、適切な評価方法に従って決定される免疫寛容を達成するために、または努力が不首尾と思われるために必要とされる回数投与する。
【００９５】
本発明による方法の取分け好適な態様において、引続く予防接種の時間間隔は２週間ないし５年、多くの場合１ヵ月ないし３年まで、より多くの場合２ヵ月ないし１.５年であるように選定される。さらに好適な態様において、反復免疫原の投与は治療的予防接種の最終効果が最大となるように実施する。非アレルゲンを使用する場合、２ないし１０回、多くの場合２ないし７回、より典型的には５回まで、最も好適には３回までの免疫処置を行うことが提案され、あるいはかかる回数は、アレルゲンの場合には、上記同様または他の適切な評価方法に従って決定される所望の免疫寛容を達成するために、または努力が不首尾と思われるために必要とされる回数である。引続く予防接種の時間間隔は、被験者が初めての免疫処置を受ける場合、２週間ないし５年、多くの場合１ヵ月ないし３年まで、より多くの場合２ヵ月ないし１.５年である。マウスおよびウサギなどのげっ歯類の場合、２週間隔で免疫処置するのが有利であり、霊長類、例えば、サルおよび多くの場合ヒトでは、３〜６ヵ月の間隔で追加刺激接種が必要である。
【００９６】
本発明による方法の好適な態様においては、輪郭の明瞭な障壁の様々な穿孔に免疫原を通過させ運搬する浸透剤の流れが、障壁を横切って作用する適切な推進力または圧力の関数として測定され、そのデータを特性曲線によって簡便に記述し、その曲線を使用して製剤化またはさらなる適用を最適化する。
【００９７】
最後に、本発明は防御または寛容原性免疫応答を誘発するワクチン調製のための前記定義どおりの経皮担体、サイトカインもしくは抗サイトカイン活性を特異的に放出するかまたは特異的に誘発するか、またはかかる活性を発揮する化合物、抗原またはアレルゲン、および選択肢として微生物からの抽出物もしくは化合物またはそのフラグメントもしくは誘導体、および／または低分子量化学刺激剤の使用に関する。
【００９８】
図は、以下のことを示す：
図１：混合ミセル対トランスファーサムス（Transfersomes）。本図は、過度に不安定化したトランスファーサムス（Transfersomes）は通常混合脂質ミセルに分解することから、精製ＴＴ負荷混合ミセルまたはトランスファーサムスにより表皮免疫処置した動物の生存率に関するデータを示し、凝集サイズ（安定性）の効果を説明する。
図２：リポソーム対トランスファーサムス。皮膚に投与した常套の脂質小胞（リポソーム）と精製ＴＴを担持する超変形可能リピド小胞（トランスファーサムス）に対する免疫応答について比較し、血清中の相当する特異抗体濃度に関する情報（吸光度として表示）を上欄パネルに示す。
図３：抗原投与効果。本図は、抗原およびモノホスホリルリピドＡ(ＬＡ)負荷SPC:NaChol(3.75:1)由来のトランスファーサムスによる表皮免疫処置の結果に及ぼす抗原用量増大の影響を説明する。結果は吸光度の変化、抗体価、または動物生存率として、相当する特異抗体イソタイプデータとともに示す。抗原用量は１０、２０、４０および８０μｇであった。Ｎｏ Ａｇ(４匹)以外、各グループあたり６匹の動物を使用した。
図４：抗原純度効果。本図は、SPC:NaChol(3.75:1)由来のトランスファーサムスの８０μg破傷風トキソイドとモノホスホリルリピドＡ(ＬＡ)による表皮免疫処置の結果に及ぼす抗原純度の影響を、動物生存率の時間依存性情報とともに強調して示す。全てのデータは、２回目の追加刺激＋７日後に得た。
図５：表皮対皮下免疫化。本図は、トランスファーサムス中のＴＴによる反復侵襲性（皮下）免疫処置と非侵襲（表皮）免疫処置の結果を、動物の生存率、血清濃度（吸光度による）、特異抗体価、および抗体分布パターン値とともに比較する。
図６：前注射効果。本図は、トランスファーサムス(SPC:Tw-80  １：１)介在皮膚通過ＴＴ(４０μｇ)送達後の免疫応答に及ぼす皮膚前処理（非特異攻撃）の影響を図示する。前注射グループのマウスに４０μｇ抗原投与２４時間前に注射をした。食塩水各０.１ml(pre-S)、１０％ＳＰＣ：ＮａＣｈ４.５：１エンプティトランスファーサムス(Pre-empty Tfs)および不完全フロイントアジュバントを前注射に使用した。本実験の全てのマウスを２回目の追加刺激７後にＬＤ５０の５０倍の毒素で攻撃した。(ｅｃ)表皮、(ｓｃ)皮下および(Ｔｆｓ)トランスファーサムスを意味する。
【００９９】
図７：アジュバンド効果：例えば、モノホスホリルリピドＡ。本図は、トランスファーサムス中のＴＴとともに未処置皮膚通過送達した比較的低分子量の免疫刺激剤、モノホスホリルリピドＡ（ＬＡ）のアジュバント効果に焦点を合わせる。
図８：アジュバント効果：例えばサイトカインＩＬ−１２。本図は、ＳＰＣ：ＮａＣｈからのトランスファーサムスによりＴＴとともに皮膚通過輸送されたサイトカイン、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の免疫アジュバント活性を証明する。
図９：免疫調整効果、例えば、サイトカイン。本図は、トランスファーサムスにおいて非侵襲的に皮膚通過送達された不純破傷風毒素(ＴＴ)抗原に対するマウス応答の種々サイトカインによる免疫調整について論じる。血清を２回目の追加刺激７日後にアッセイのために採取した。いずれのグループでも保護効果は観察されなかった。
図１０：免疫アジュバント効果：例えば、コレラ毒素(ＣＴ)。本図は、トランスファーサムス(ＳＰＣ：ＮａＣｈ３.７５：１)中のＴＴにより皮膚上処理したマウスの免疫応答刺激についての実験的証拠を提示するが、この場合には、担体も１０μｇのコレラ毒素（ＣＴ）を含んで特異抗体産生を維持し、その結果、破傷風毒素による他の場合には致死的な攻撃に対しての動物の防御をも維持する。グループあたり４−６匹の動物を使用した。アスタリスクは４匹中１匹の麻痺マウスを示す。
図１１：アジュバント効果：例えば、大腸菌から得た熱不安定毒素(ＨＬＴ)。本図は、大腸菌から得た熱不安定毒素の免疫アジュバントとしての使用について図示する。
図１２：ヒスタミン効果：抗破傷風力価および皮膚上へのトランスファーサムスによる免疫化後の生存。本図は、トランスファーサムスによる経皮抗原適用と組合わせた局所皮膚ヒスタミン前処理の免疫調整効果を図示する。
図１３：皮下初回抗原刺激：抗破傷風力価および表皮追加刺激後の生存率における効果。本図は、抗破傷風力価と表皮予防接種宿主の生存率に及ぼす皮下初回抗原刺激の影響を示す。
図１４：二価予防接種：皮膚上でトランスフォーサムスと共に投与した両方の抗原に対する抗破傷風および抗コレラ応答。本図は、抗原として使用した破傷風トキソイドとコレラ毒素による二価予防接種の効果を示す。
【０１００】
以下の実施例は本発明を説明するが、その範囲を限定するものではない。
一般的実験構成およびサンプル調製
スイス・アルビノ種マウス（１８〜２０ｇ）は国立栄養研究所（ハイデラバッド、インド）から入手した。第一回免疫処置の時点でマウスは８〜１２週令であり、通常４〜６匹の群として懸垂したケージに保持した。動物は標準の食餌と水に自由に接近できた。免疫処置の１日前、マウス背部の塗布部分の毛を注意深く剃り落した。抗原は高精密ピペットにより皮膚表面に投与し、部分的に乾燥させた。免疫原の摩耗を避けるために、動物は個々のケージに移し、各表皮物質の投与後１８時間そこに保持した。
【０１０１】
全身麻酔は試験動物にストレスを与えないためと、免疫処置時を含め操作の間、静かにさせるために使用した。この目的には、ケタベット（Ketavet）とロンパン（Rompun)混合物の腹腔内注射剤(０.００７１％ロンパン（バイエル（Bayer）、レバークゼン、ドイツ）および１４.３ｍｇ／ｍＬのケタベット（パーク−デービス（Parke-Davis)、ロチェスター、ニューヨーク）を用いた。この操作は、典型的に動物を約２時間眠らせる。
【０１０２】
免疫原
本研究にて検討した超変形性免疫担体または免役浸透剤（免疫トランスファーサムス）は一般に（オリゴ）二層小胞の形状を有していた。それらは生物適合性（リン）脂質、例えば、ホスファチジルコリンなど、および（バイオ）界面活性剤、例えば、コール酸ナトリウムまたはポリソルベート（トゥイーン８０）などを含み、高凝集変形性を保持する異なる組成物が可能であった。さらなる成分としては、多様な免疫アジュバント活性を有するモノホスホリルリピドＡ、および要求どおりで明細書記載どおりの抗原であった。
【０１０３】
常套の小胞、リポソームは大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ；ナッターマン（Nattermann）リン脂質、ローン−プーラン・ローラー（Rhone-Poulenc Rorer）、ケルン、ドイツ）を含んでなり、以下に記載のように調製した。アジュバント・モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）をＳＰＣに対し０.０４モル％で含むまたは含まない有機脂質溶液を先ず真空（１０Ｐａ、一夜）乾燥した。得られた脂質フィルムをリン酸バッファー（ｐＨ＝６.５）中、破傷風トキソイド溶液（２.０ｍｇ／ｍＬ；アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies）、ニューヨーク、アメリカ）により水和して、１０ｗｔ％脂質懸濁液を得た。脂質小胞の粗製懸濁液はポリカーボネート・メンブレン系統の８００ｎｍ、４００ｎｍおよび２００ｎｍ穿孔を有する膜から押出し、最終小胞サイズ分布を狭めた。
【０１０４】
高変形性小胞、トランスファーサムス（Transfersomes）は以前に記載どおりに調製した（Paul et al., 1995 op.cit.）。簡単に説明すると、エタノール性ＳＰＣ溶液をコール酸ナトリウム（メルク（Merck）、ダルムシュタット、ドイツ）（３.７５／１モル／モル）および、要すれば、アジュバントと混合した。この混合物を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝６.５）に分散した。これを溶液中に存在する破傷風トキソイドと混合し、要求どおり、懸濁液１ｍＬ当たり０.２５ｍｇないし２.０ｍｇのタンパク質とした。次いで、小胞懸濁液を３回凍結融解した。次いで、この製剤を加圧下に微小孔フィルター（２００ｎｍ；ポレティックス（Poretics）、カリフォルニア）に通した。小胞製造の再現性をチェックするために、各調製物について４００ｎｍでの光学濃度を測定し、略一定であることを確認した。
【０１０５】
界面活性剤／脂質比を変えることにより、小胞凝集変形性は膜が高界面活性剤濃度のために不安定となる濃度まで調節し、ミセル形状に戻した。一般にはリポソームとして知られ、少なくともトランスファーソムスよりも少なくとも１０倍柔軟性の低い、界面活性剤を添加しなかった脂質小胞は、陰性の対照として使用した。
【０１０６】
総脂質濃度は特に断りのない限り一般に１０ｗ％であった。抗原濃度は一般に１ｍｇ／ｍＬのオーダーであったが、必須ではない。殺微生物剤含有のバッファーが体積相を提供した。他の適切な組成物については、専門家は、我々研究室からの他の刊行文献および特許を積極的に参照する。
【０１０７】
免疫処置は抗原を含まない超変形性小胞含有の異なる製剤により実施した；次いで、かかる小胞は破傷風トキソイド（リピドＡ含有または不含）と遊離の免疫原を含んでいた。各製剤は特に断りのない限り６匹のマウスで試験した。
【０１０８】
皮下免疫処置の場合には、マウス１匹当たり免疫原４０μｇを注射した。非侵襲投与の場合には、異なる担体を会合させた破傷風トキソイドをマウス１匹当たり１μｇないし８０μｇの用量を上背部の未処置皮膚上に投与した。非注射製剤はすべて高精度ピペットにより塗布し、乾燥させた；この間、マウスは個々のケージに容れ、マウスが互いに背中を擦り合うために生じる塗布した物質の摩耗を最少にするようにした。動物は２週間ごと、すなわち、１４日目と２８日目に追加刺激処理した；総免疫処理は３用量から成り、初回免疫刺激と２回の追加刺激とした。
【０１０９】
動物は７日目、２１日目および３５日目に眼窩後から採血した。採取した血液は先ず血餅とした。ミクロ遠心機で簡単に遠心した後、血清を分離し、５６℃で３０分間、補体除去し、総抗体濃度と特異抗体イソタイプを決定するまで−２０℃に保存した。
吸光度測定は標準のＵＶ−ＶＩＳスペクトロメーターにより実施した。
【０１１０】
血清中破傷風トキソイド（ＴＴ）特異抗体のＥＬＩＳＡによる測定
抗破傷風抗体のレベルを通例の様式でＥＬＩＳＡにより一般的に二重測定定量した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレート（マキシソープ（maxisorp）；ヌンク（NUNC)、ドイツ）はコーティングバッファー（Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ＝９.６）中でアリコート（１０μｇのＴＴ／ｍＬ含有１００μＬ）により３７℃で３時間被覆した。ウエルを先ず２００μＬ／ウエルの洗浄バッファーで３回洗浄し、次いで、洗浄液（１０００ｍＬ当たり、８ｇのＮａＣｌ、１.４５ｇのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０.２ｇのＫＨ２ＰＯ４、０.２ｇのＫＣｌおよび０.０５％トゥイーン−２０）中２％乳により３７℃で３時間ブロックした。２００ｍＬ／ウエルの洗浄バッファーで１回洗浄した後、プレートをテスト血清の種々の希釈液（１／５０ないし１／６４００）によりインキュベートした。４℃一夜のインキュベーションの後、プレートを２００μＬ／ウエルの洗浄バッファーで３回洗浄し、１００μＬの第二抗体とインキュベートした。ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ量を定量する場合、適切な抗Ｉｇに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｒｐ）を使用した。３７℃で３時間インキュベートした後、プレートを２００μＬ／ウエルの洗浄バッファーで３回洗浄し、ｈｒｐ基質としてｏ−フェニルジアミンを用いて発色させた。この目的には、リン酸／クエン酸バッファー（ｐＨ４.５）中のｏ−フェニルジアミン０.４ｍｇ／ｍＬと１ｍＬ当たり０.４μＬのＨ２Ｏ２を使用した。２分後に、５０μＬの２Ｎ−Ｈ２ＳＯ４を添加し、反応を停止させた。４９２ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１１１】
種々のイソタイプの検出に用いた方法もＥＬＩＳＡを基本とした。この方法はＩｇＧ１（１：１０００）、ＩｇＧ２ａ（１：１０００）、ＩｇＧ２ｂ（１：１０００）、およびＩｇＧ３（１：２００）（これらはすべてＩＣＮイムノバイオロジカルス（ImmunoBiologicals）から入手した）に特異的なペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製第二抗体に依った。さらなる第二抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマ（Sigma）、ノイウルム（Neu-Ulm)、ドイツ）に結合したＩｇＡ（１：１０００）およびＩｇＭ（１：１０００）を含んでいた。対応して標識した抗マウスＩｇＥはファーミンゲン（PharMingen）（サンジエゴ、カリフォルニア）から購入した。抗原を再度テストプレートに吸着させ、過剰の抗原を洗い流した後、テスト血清とインキュベートした。次いで、適切な特異第二抗体溶液を６枚の異なるプレートの１枚に添加し、それぞれ抗ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＭを決定した。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、さらに先の記載どおりに処理した。
【０１１２】
抗原（破傷風毒素）による生体内攻撃
３５日目に試験動物に破傷風毒素のＬＤ５０の５０倍量を皮下（s.c.）注射し攻撃した。（実際のＬＤ５０値は別の実験で定め、その際に重量が釣り合う動物１６匹に毒素量を増量してs.c.攻撃し、生存数を決定した）。予防接種した動物における急性ＴＴ毒性を決めるために、かかるテストマウスの臨床的状態を最初の攻撃後、４日間記録した。
【０１１３】
非防御マウスは２４時間後に麻痺の徴候を示し、遅くとも３６時間後には死に至った。攻撃後４日間にわたり麻痺または他の異常の徴候を示さなかった動物は破傷風に対し免疫であると見なした。
長期間の免疫性は、免疫処置したマウスすべてについて、ＬＤ５０の５０倍量に相当する投与量の毒素により月１回の割合で少なくとも半年間、攻撃処理し試験した。
【０１１４】
実施例１〜２
凝集体サイズ（安定性）の影響
高度変形性小胞（トランスファーサムス（TransfersomesTM）：ＩＤＥＡ）：
８７.４ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１２.６ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.０４モル％：ＳＰＣに比例するモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ、ＬＡ）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
０.１ｍＬ：エタノール
（混合脂質）ミセル：
６５ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
３５ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.０４モル％：ＳＰＣに比例するモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
０.１ｍＬ：エタノール
以下の用量で使用された破傷風トキソイド（２ｍｇ／ｍＬ；アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies））：
マウス１匹と免疫処置当たり４０μｇ（２０μＬ）または８０μｇ（４０μＬ）のＴＴ
塗布領域：マウス１匹当たり４０μｇまたは８０μｇのＴＴについて上背部に１ｃｍ２または２ｃｍ２。
【０１１５】
種々の表皮投与製剤の免疫学的性質に及ぼす製剤安定性の影響を試験するために、２種の凝集体を調製した：比較的に大きな小胞（直径１００ｎｍないし２００ｎｍ）と比較的に小さな小胞（直径５０ｎｍ以下）。後者については、最適以下の条件下で（脂質崩壊または不適当な凝集体組成物のため）前者から生じる可能性のあることを期待して選択した。
【０１１６】
４９２ｎｍでの血清吸光度に反映される抗体価は、図１に示す。この図が示すのは、混合脂質ミセルが同量のＴＴを負荷した超変形性混合脂質小胞（Ｔｆｓ）よりも効果の劣る抗原担体であるということである。低強度洗浄剤（皮膚浸透増強能力が低い）を含む混合ミセルはさらに効力の低い免疫応答メディエーターであった。
動物防御データは、図１の下のパネルに見られるように、同様の傾向を示す。
【０１１７】
実施例３〜４
凝集体変形性の影響
通常の脂質小胞（リポソーム）：
１００ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
０.４モル％：ＳＰＣに比例するモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）
０.５ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
２ｍｇ／ｍＬ：破傷風トキソイド（アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies））
高度変形性小胞（トランスファーサムス（TransfersomesTM）：
８７.４ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１２.６ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.０４モル％：ＳＰＣに比例するモノホスホリルリピドＡ（ＭＬ  Ａ）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
０.１ｍＬ：エタノール
マウス１匹と免疫処置当たり４０μｇまたは８０μｇのＴＴ用量で使用した破傷風トキソイド。
塗布領域：マウス１匹、免疫処置１回当たり４０μｇまたは８０μｇのＴＴについて上背部に１ｃｍ２または２ｃｍ２。
【０１１８】
通常の小胞で得た結果は高度変形性小胞について測定したデータと違っていた：障壁の狭い穿孔を通過しない単純なリポソームは本質的な抗体価を示さない。逆に、高度に柔軟で変形性の、従ってより適合性のある膜をもつ小胞は、障壁の狭い穿孔を非常に容易に通過移動することが別に示されており、血清吸光度測定の結果によると、未処置皮膚上に塗布した場合、認識し得る量の抗体を生成する（図２参照）。
【０１１９】
実施例５〜１０
抗原用量の影響
高変形性小胞：
８６.３ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１３.７ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.０４モル％：ＳＰＣに比例するモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
０.１ｍＬ：エタノール
破傷風トキソイド（ＴＴ；アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies）、ニューヨーク、アメリカ）濃度：なし、０.２５ｍｇ／ｍＬ、０.５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬはマウス１匹、免疫処置１回当たり０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、４０μｇまたは８０μｇのＴＴに相当する。
塗布領域：上背部にマウス１匹、免疫処置１回当たり、０μｇ、１０μｇ、２０μｇ、４０μｇのＴＴについては１ｃｍ２、また８０μｇについて２ｃｍ２。
【０１２０】
この一連の実験結果を図３に示す。この図は超変形性担体中の表皮投与破傷風トキソイドの用量を増大させていくと、ＴＴに対する免疫応答も増大することを示す。このことは血清の吸光度（免疫処置１回当たり２０μｇの用量まで）、特異抗体価（免疫処置１回当たり４０μｇの用量まで）、および生存率データ（免疫処置１回当たり８０μｇまでの用量で飽和とならない）に反映されている。
【０１２１】
ＩｇＧ１（応答の飽和を強く示す）とＩｇＧ２ｂ（恐らく、免疫処置当たり４０μｇおよび８０μｇの間で飽和）以外のイソタイプの分布パターンについてはあまり分かっていない。ＩｇＭはＩｇＧ１同様の用量依存性を示す。ＩｇＧ２ａについて得られた図は区別し難い。
【０１２２】
実施例１１〜１３
抗原精製の影響
高度変形性小胞：
実施例５〜１０に記載どおり（不純ＴＴで処理した群は免疫アジュバント・リピドＡを受けなかったことは例外）。
破傷風トキソイド：２ｍｇ／ｍＬ、マウス１匹、免疫処置１回当たり８０μｇのＴＴに相当する。
塗布領域：上背部に２ｃｍ２。
【０１２３】
抗原の純度は、トキソイドを非侵襲的に皮膚に塗布した場合、破傷風毒素に対するマウスの防御レベルに強く影響する。（抗原の注射により得られた同様の結果は示していない）。
【０１２４】
上記の考察を実証するために、生体外で増殖させた破傷風菌（Clostridium tetani）培養物からの培地濾取物を未精製抗原として使用した。部分的に精製した抗原を得るために、かかる濾取物を１０ｋＤａ排除メンブレンに通し、リン酸バッファー（ｐＨ６.５）で十分に洗浄した；この工程で、培地濾取物は１５倍に濃縮された。精製トキソイドはアキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies）（ニューヨーク、アメリカ）から購入した。
【０１２５】
スイス・アルビノ・マウス（ｎ＝６）を同一の名目用量の未精製抗原、モノホスホリルリピドＡ補填の部分精製抗原、またはモノホスホリルリピドＡ添加の精製抗原により免疫処理した。該抗原は常に同じトランスファーサムスと会合させた。後者についての組成と調製方法は上記実施例記載のものと同じとした。免疫処置スケジュールの詳細、採血時間および攻撃処理並びに分析の詳細も上記と同様であった。
【０１２６】
結果を図４に示す。これらの結果は、抗原純度がＴＴに対する免疫応答の質並びに強さを確定する際に果たす役割を示している。さらに、図４に示したデータは、特異抗体価の吸光度さえも表皮予防接種の治療効果、すなわち、予防効果の信頼し得る予測因子ではないということを示している。これはもし十分に純粋な抗原を用いるなら、Ｔｈ２様ＩｇＧ１成分に比較して、実質的な割合のＴｈ１様ＩｇＧ２ｂのみを含む特異抗体イソタイプにおける大きな差によるものである（２２頁も参照）。
【０１２７】
実施例１４〜１５
表皮投与および皮下投与の比較
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）（ＩＤＥＡ）：
実施例５〜１０に記載のとおり。
破傷風トキソイド用量：
１回の表皮免疫処置当たり８０μｇのＴＴ（２ｍｇＴＴ／ｍＬと塗布面積２ｃｍ２使用）
１回の皮下注射当たり４０μｇのＴＴ（２ｍｇＴＴ／ｍＬ使用）
【０１２８】
適切なものとして、実施例１〜４に記載したと同じ手法により、抗体特異血清力価、破傷風毒素に対する動物の防御レベル、および異なる特異抗体イソタイプの相対発現率を測定した。
【０１２９】
結果を図５に示す。免疫処置依存性の血清吸光度の増大が、侵襲性および非侵襲性抗原投与後に同等であるが、後者の場合の力価は初回免疫処置後には６倍だけ幾分低く、２回目の追加免疫後には８倍低い。同様に、Ｔｈ２−指示ＩｇＧ１のＴＴ特異レベルは本実験の両方において同様であるが、他の抗体サブタイプに対する特異読取り値、取分け、ＩｇＧ２ａについて、また初期時点でもＩｇＧ２ｂについて、それぞれ２５および３倍、抗原注射後に高くなる。しかし、通常致死量の破傷風毒素を注射して、テストマウスがその後の攻撃をも生存する可能性は、少なくともこの一連の実験の枠内では、抗原の投与経路と関係ない。
【０１３０】
実施例１６〜１７
アジュバント皮膚処理（事前注射）の影響
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）（ＩＤＥＡ）：
８９.３ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１０.７ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.０４モル％：ＳＰＣに比例するモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
０.１ｍＬ：エタノール
破傷風トキソイド：２ｍｇ／ｍＬ、未精製抗原を用いる１群につき６匹のスイス・アルビノ・マウスの内、１匹、免疫処置１回当たり８０μｇのＴＴに相当する。
塗布領域：上背部に２ｃｍ２。
【０１３１】
皮膚を通過するトランスファーサムスと会合させた高分子の経皮輸送は極端に緩やかであると思われる；従って、抗原を少量で使用したり、または未精製であったりすると、Ｔｈ２様免疫応答に向けて免疫系を始動させることができない。その状況を変えるために、皮膚を（事前に）刺激して、超変形性小胞による実際の非侵襲性抗原投与に先立って、器官から相当するメッセンジャー分子を放出させることができる。この目的のために、我々は生理食塩水０.１ｍＬを塗布部位に事前注射するか、抗原担体小胞として使用する同様組成物の生物分解性物質から、その使用前日に調製した非抗原性小胞の緩和な製剤を注射した。追加の対照として、不完全フロイントアジュバントを、免疫担体を皮膚に塗布する２４時間前に、別の動物に注射した。
【０１３２】
結果の図面による例を図６に示す。この図によると、対照とした皮膚上担体製剤のマウスよりもむしろ高い特異抗体価と取分け防御の改善が、事前に注射処理したマウスにおいて明らかである。
血清吸光度または特異抗体価と、防御的ワクチン接種の効果を示す動物の生存率は相関しないことに注意すべきてある。
【０１３３】
実施例１８〜２１
低分子量アジュバント（リピドＡ）の影響
高度変形性免疫調整ＴＴ−トランスファーサムス（TransfersomesTM）（ＩＤＥＡ）：
８６.３ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１３.７ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.０４モル％：ＳＰＣに比例するモノホスホリルリピドＡ（ＬＡ）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
０.１ｍＬ：エタノール
高度変形性標準免疫小胞、ＴＴ−トランスファーサムス（TransfersomesTM）（ＩＤＥＡ）：
上記同様であるがＬＡは添加せず
破傷風トキソイド：２ｍｇ／ｍＬ：免疫処置１回当たり４０μｇまたは８０μｇのＴＴに相当する２０μＬまたは４０μＬによる。
塗布領域：上背部にそれぞれ１ｃｍ２または２ｃｍ２。
【０１３４】
所望の抗原の免疫作用を達成するためには、免疫活性の、典型的には免疫を活性化する分子が、身体に抗原を提示する際に、障壁を通過するＴＴ担体により搬送されて皮膚内に存在しなければならないと我々は信じる。この結論を実証するために、我々は周知の免疫刺激剤、例えば、生体中でＴＮＦの生成をもたらすことの知られたモノホスホリルリピドＡ（ＬＡ）を包含させた、または包含させないトランスファーサムスにより、ＴＴの非侵襲的免疫提示の結果を比較した。２種類の異なる抗原用量を用いた。両方の場合において、実質的な力価と測定可能な予防的免疫応答（部分的免疫性）に到達した。
【０１３５】
血清の吸光度は期待どおりに上昇する（図７参照）。逆に、ＬＡの影響は使用した高用量よりも低い用量で良好に見られる。これは実験の変動によるのか、または典型的な免疫処理データの用量・作用曲線の非直線性を反映している可能性がある。例えば、アジュバントは低用量範囲においてのみ有効である可能性のある一方、高用量処方では系が疑似飽和となり、アジュバントが実験設定の範囲内で免疫応答をさらに増強する可能性はほとんどない。５０倍のＬＤ５０により通常なら致死性である攻撃に対し、動物の完全な防御が、ＬＡのみと併用した高ＴＴ用量により、この一連のテストで達成された。
【０１３６】
さらに観察されたのは、Ｔｈ１−サイトカインＩｇＧ２ｂが、ＬＡを受けなかった群と比較して、ＬＡ群でより高いということである。この差は低用量で高用量に対してよりも４倍より顕著であり、高用量の場合は２倍のみの増強が観察された。Ｔｈ２−サイトカインＩｇＧ１は、ＩｇＧ２ｂが比較的寄与しているＬＡ群での低用量の場合を例外として、優位に存在した。
【０１３７】
実施例２２〜２３
高分子量アジュバント、ＩＬ−１２サイトカインの影響
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）（ＩＤＥＡ）：
実施例５〜１０に記載のとおりとし、それに免疫原懸濁液１ｍＬ当たり０.０１ｍｇのＩＬ−１２を添加した。
破傷風トキソイド：２ｍｇ／ｍＬ：マウス１匹、免疫処置１回当たり８０μｇのＴＴに相当する（実施例９〜１１に記載のように部分的に精製）。
塗布領域：スイス・アルビノ・マウスの上背部に２ｃｍ２。
【０１３８】
破傷風トキソイドによる非侵襲表皮予防接種の結果に及ぼすサイトカインの影響について検討するために、モノホスホリルリピドＡとマウス１匹あたり０.４μｇのＩＬ−１２を併用した。破傷風トキソイドとモノホスホリルリピドＡを負荷したトランスファーサムスと会合させたＩＬ−１２をマウス１匹当たり８０μｇ投与した。免疫処置スケジュールの詳細、採血間隔および破傷風毒素による最終攻撃処理は上記と同様であった。
【０１３９】
一連の実験結果は図８に示す。これらは、表皮ＴＴ投与後の免疫提示の過程で、皮膚内にプロＴｈ２サイトカインの存在することが、予防接種の結果にプラスに影響するという結論を裏付けるものである。このことは血清の吸光度、特異抗体価に、またテスト動物の生存確率に見られる。
実施例２２〜２３にて検討した影響は、ＩＬ−１２以外のサイトカインを免疫原製剤に含めることにより確証した。結果を図９に示す。
【０１４０】
実施例２４〜２５
高分子量アジュバント（ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４）の影響
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）（ＩＤＥＡ）：
実施例５〜８に記載のとおりとし、それに免疫原懸濁液１ｍＬ当たり０.０５ｍｇのＩＦＮ−γと０.００４ｍｇのＧＭ−ＣＳＦと０.００４ｍｇのＩＬ−４を添加した。
破傷風トキソイド：２ｍｇ／ｍＬ：マウス１匹、免疫処置１回当たり８０μｇのＴＴに相当する（未精製）。
塗布領域：スイス・アルビノ・マウスの上背部に２ｃｍ２。
実施例２２〜２３にて検討した影響は、異なるサイトカインの混合物でも確認された。結果を図１０に示す。
【０１４１】
実施例２８〜２９
追加刺激効果（免疫応答の成熟）
先の実施例の殆どにおいて、免疫処置の時間経過とともに吸光度を測定した場合、常に矛盾のないパターンが観察された。免疫応答は初回免疫処置後に得られた応答に比べて、各追加刺激により増大した（図３、４、５、６、７、８参照）。一次応答はＩｇＭが優勢となり、次いで最初の追加刺激の後に次第にＩｇＧが現われ、さらに２回目の追加刺激の後にさらに大量のＩｇＧが現われるが、同時にＩｇＭが消える。この典型的なイソタイプのパターンは免疫応答におけるアフィニティの成熟を意味する。この過程において、特異抗体混合物の平均アフィニティは反復免疫処置により増大する。
【０１４２】
種々の表皮予防接種実験の結果は、侵襲的初回予防接種と非侵襲的２回目の（追加刺激）免疫処置とを組合わせることが有利であることを示唆する。
【０１４３】
実施例３０〜７２
トランスファーサムスによる生体外皮膚からのサイトカイン放出
高度変形性小胞（Ｃ型トランスファーサムス）：
８７.４ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１２.６ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、５０ｍＭ、ｐＨ７.３
その２.５μＬ
高度変形性小胞（Ｔ型トランスファーサムス）：
５０ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
５０ｍｇ：ポリソルベート（トゥイーン８０）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、５０ｍＭ、ｐＨ６.５
その２.５μＬ
陽性対照Ａ：
２.５μＬ：５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
陽性対照Ｂ：
１００μＬ：リポ多糖（ＬＰＳ；１０５Ｕ／ｍＬ）
陰性対照：
２.５μＬ：リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）
産物はすべて希釈せずに試験した。
【０１４４】
細胞型：緻密角質層をもつ多層化表皮形成の正常ヒト角化細胞を用いた；組織学は生体内でのヒト表皮と著しく類似していることを明らかにした。
【０１４５】
方法：０.６３ｃｍ２のポリカーボネート・フィルター挿入物上、角化細胞を化学的に規定した補足培地に接種し、気液界面で１７日間培養した。
【０１４６】
テスト測定：所定量の各テスト産物をマイクロピペットで沈着させ、小型の無菌器具を用いて、８個の再構成表皮の角質層表面に均一に広げた。培養物は５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間インキュベートした。４重に調製した培養物（重複してインキュベートしたＬＰＳ処理細胞は除く）を０.５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、０.５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ３００μＬ上、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３時間インキュベートした。
【０１４７】
組織の下にある培地に放出された炎症性メディエーター（ＩＬ１α、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α）を、測定すべき免疫メディエーターの各型に特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ、イギリス；クワンティカイン（Quantikine））により定量した。
【表１】
2002535350.tif 000002
トランスファーサムスＯで観察された比較的大きな標準偏差は、該産物を再構成表皮の角質層上に均一に広げることが困難であったという事実により説明し得る。
【０１４８】
ＴＮＦ−αのレベルは、細胞を確立された免疫アジュバントであるＬＰＳ含有陽性対照と接触した場合、１１３.４３ｐｇ／ｍＬのレベルに増大した。
【０１４９】
トランスファーサムスと細胞培養した後のＩＬ８濃度は、丁度、２倍だけ検出下限を超えていたが、これは一方で９５％の信頼性レベルで有意ではなく、他方でも殆ど有意ではない；しかし、いずれの場合にも１６７倍高い値を与えた免疫アジュバントＬＰＳ含有の陽性対照で観察された増加に比べて、無視し得る。
【０１５０】
非特異刺激剤ＳＤＳは皮膚細胞から大量のＩＬ−αを生体外水浴培地に放出した。可能性としては、同等量が潜在的に刺激性のオレイン酸を含むトランスファーサムスＯとインキュベートした細胞から放出されたということがあったが、確かな結論は、後のテストシステムで得られた結果に大きな標準偏差のあったことから、見送られた。
【０１５１】
Ａ型およびＢ型の他の試験したトランスファーサムスに対するＩＬ−１α濃度はバックグランドレベルの約２倍に変化した。この差は陰性対照と比較して統計的に有意であるが、ＬＰＳ含有の陽性対照で観察された増加が６０倍よりも高かったことを考慮すると、事実上無視し得る。
【０１５２】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−１０は測定可能なレベルまで上昇しなかったが、他のテスト条件でもこれらサイトカインの放出を欠如することを示唆している。
総合すると、上記の知見はトランスファーサムスが皮膚細胞からサイトカインを放出しないか、またはかかる分子の生成を誘発しないことを示唆している。このことは抗原またはアレルゲンをかかる担体により皮膚透過送達し、治療的または予防的免疫応答を引出す際に、免疫アジュバント／モジュレーターを使用する必要のあることを意味する。
【０１５３】
実施例７３〜８２
特異免疫アジュバントとしての細菌壁成分コレラ毒素：
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）：
８６.３ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１３.７ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
コレラ毒素（ＣＴ；シグマ（Sigma）、ノイウルム（Neu-Ulm)）、１０μｇ／免疫処理および要すれば破傷風トキソイド（ＴＴ、純粋；アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies））２ｍｇ／ｍＬ
【０１５４】
投与容量は、０μｇＴＴ／マウス／免疫処置（陰性対照）、１μｇＴＴ／マウス、５μｇＴＴ／マウス、１０μｇＴＴ／マウス、２０μｇＴＴ／マウス、４０μｇＴＴ／マウス（ＣＴ用法の場合）および８０μｇＴＴ／マウス（ＣＴなし）に相当する投与容量を用い、４〜６匹のスイス・アルビノ・マウスの上背部２ｃｍ２までの部分に表皮投与した；２０μｇＴＴ／マウス／免疫処置を陽性対照群の対応する部位に皮下注射した。非免疫処置マウスをもう一群の陰性対照として使用した。
【０１５５】
コレラ毒素を破傷風トキソイドと併用してテスト製剤に包含させた場合、表皮抗原投与の防御効果は卓越していた。この免疫アジュバントを含まない製剤は、４匹の内１匹（２５％）が破傷風毒素で攻撃した後に麻痺となたという事実により証明されるように、防御効果の劣るものであった。
【０１５６】
図１０に示した結果は、２０μｇ／免疫処置過剰の抗原用量が完全な防御を保証したということを明らかにするが、他の試験したアジュバントまたはアジュバント処理ではこのようにならなかった（上記実施例参照）。抗原投与量を下げると質的に同様の効果を与えたが、すべてのテストマウスの生存を保障するには不十分であった。ただし、５μｇＴＴ／免疫処置を受けたテスト群は例外であった。（これは１μｇ／免疫処置ないし１５μｇ／免疫処置のＴＴが過渡的領域に属することを意味する）。しかし、コレラ毒素の他の用量は同様にまたはさらにより有益であろう。
【０１５７】
実施例８３〜８５
大腸菌の熱不安定毒素（ＨＬＴ）は免疫アジュバントとして作用する
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）：
８６.３ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１３.７ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
熱不安定毒素（ＨＬＴ、シグマ（Sigma）、ノイウルム（Neu-Ulm)）１ｍｇ／ｍＬおよび要すれば破傷風トキソイド（ＴＴ、純粋；アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies））２ｍｇ／ｍＬ
【０１５８】
種々の相対アジュバント／抗原濃度を用い、経皮予防接種用の最も一般に用いられるＡＤＰリボシル化酵素の一つについて効果を試験した。トランスファーサムスは前記実施例に記載どおりに調製した。他の実験的詳細（動物飼育；抗原投与；力価定量）は上記のとおりである。
【０１５９】
投与容量は、２０μｇＴＴ／マウス／表皮免疫処置および１〜２μｇＨＬＴ／マウス／表皮免疫処置に相当する投与容量、および皮下注射用０.５μｇのＴＴによる陽性対照を用い、スイス・アルビノ・マウスを免疫処置した。結果を図１１に示す。
【０１６０】
抗ＴＴの力価は、アジュバントとしてＨＬＴを用いた場合、無アジュバント抗原皮下注射に比較して、または皮膚上トランスファーサムス中ＴＴの無アジュバント投与に比較して、上昇することが判明した。通常ならば致死性の破傷風毒素での攻撃に対する体液性応答および防御は用量依存性であり、抗ＴＴ力価が高く、高用量ＨＬＴのために生存率が改善されていることが判明した。測定結果（データ非開示）は、有用なＨＬＴ投与量が１００ｎｇ／用量の範囲に始まり、この一連のテストに用いる実験条件下で最も高い実際に有用な用量は約１００倍大きいことを示唆する。このことは表皮投与トランスファーサムスとともに使用すべきアジュバント用量の上限は、常套の侵襲性（s.c.）免疫処置に用いられる桁数に相当する大きさであり、高くとも１０倍であるべきである；実用的下限は、我々の見解として、典型的な皮下（s.c.）用量よりも１〜２桁数小さい。同様の関係が他の関連する免疫アジュバントについても当てはまることを提言する。
【０１６１】
実施例８６〜８７
ヒスタミンによる局所前処理
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）：
８６.３ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１３.７ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
破傷風トキソイド（ＴＴ、純粋；アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies））２ｍｇ／ｍＬ
リン酸バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６.５）中１ｍｇ／ｍＬヒスタミン溶液
【０１６２】
免疫応答調整のための代替手段の効果を試験するために、トランスファーサムス中抗原の皮膚投与直前または１５分前に、１０μｇヒスタミンの溶液をマウスの表皮免疫処置部位に注射した。期待したことは、この処置が皮膚からのサイトカイン放出を誘発するであろうこと、および／または非侵襲経皮免疫処置の結果にある種の他のプラス効果をもたらすであろうことであった。この仮説を試験するために、トランスファーサムスを上記実施例に記載どおりに調製し、本明細書の上記のスイス・アルビノ・マウスで実施した（ヒスタミンでの前処理を除く）。
【０１６３】
図１２は上記の作業仮説を確認する。これらの結果は良好な体液性応答を明らかにし、破傷風毒素の攻撃に対し妥当な防御を達成するために、ヒスタミン注射と表皮免疫処置との間に時間が必要なことを明らかにする。アジュバントを用いず表皮上トランスファーサムス中ＴＴで測定した結果と比較すると、ヒスタミン注射が動物の免役応答を追加刺激するために助けとなることを示している。
【０１６４】
実施例８８〜８９
初回および追加刺激免疫処置の異なる投与経路
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）：
８６.３ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１３.７ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
コレラ毒素（ＣＴ、シグマ（Sigma）、ノイウルム（Neu-Ulm)）、０〜１μｇ／免疫処置
破傷風トキソイド（ＴＴ、純粋；アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies））２ｍｇ／ｍＬ
【０１６５】
小胞調製および動物実験の詳細な説明は本明細書の前記実施例に見出し得る。
２０μｇのＴＴ単独および０.５μｇＴＴプラス１μｇＣＴに相当する投与容量は初回免疫処置について皮下注射したが、追加刺激免疫処置については表皮塗布した。この併用は先に暗示したように、実質的に免疫処置の効率を増加させた。
【０１６６】
抗ＴＴ力価は破傷風毒素による攻撃に対し１００％防御を生じるのに十分に高かった（図１３）。無アジュバントＴＴ−Ｔｆｓにより皮膚上に実施した前記実施例からのデータと比較すると、皮下／表皮併用免疫処置プロトコールの有用性が明瞭に証明される。
従って、このデータは、皮膚上に塗布した抗原負荷トランスファーサムス（TransfersomesTM）が侵襲抗原投与に興味ある補助手段を提供するが、それは追加刺激免疫処置の目的に取分け重要であることを示唆する。
【０１６７】
実施例９０
抗原としての破傷風トキソイドとコレラ毒素による二価予防接種
高度変形性小胞、トランスファーサムス（TransfersomesTM）：
８６.３ｍｇ：大豆からのホスファチジルコリン（ＳＰＣ）
１３.７ｍｇ：コール酸ナトリウム（ＮaＣhol）
０.９ｍＬ：リン酸バッファー、１０ｍＭ、ｐＨ６.５
コレラ毒素（ＣＴ、シグマ（Sigma）、ノイウルム（Neu-Ulm)）、１０μｇ／免疫処置
破傷風トキソイド（ＴＴ、純粋；アキュレート・アンチボディズ（Accurate Antibodies））２ｍｇ／ｍＬ
【０１６８】
コレラ毒素は抗ＴＴ応答を改善するアジュバントととして作用するのみならず（前記実施例参照）、それ自体抗原でもある。結果として、アジュバントは特定濃度で使用した場合、二次抗原の役割を果たし得る。アジュバント活性と免疫原性とは直線的に相関するものではないが、しかし、免疫処置の結果の成果を最適化する興味のある可能性を提供するものである（副作用およびアレルギー誘発に関しても）。マウスで試験したトランスファーサムス中のＣＴにつき検討し、塗布１回当たり５０ｎｇ未満と少なくとも１０μｇの間のＣＴ用量が、本出願に記載の目的に有用なことを我々は見出した。
【０１６９】
皮膚上異なる容量のテスト製剤（１０μｇＴＴと１０μｇＣＴに相当する）により処理したマウスにおいて抗コレラ毒素抗体はＣＴ抗原性を暗示している。このことは、２種以上の抗原含有トランスファーサムス（TransfersomesTM）に基く少なくとも二価ワクチンを調製するために超変形性小胞が可能であることを裏付けるものである。
図１４は同じ担体中のＴＴおよびＣＴにより先に免疫処理したマウスで測定したＴＴおよびＣＴの力価を示す。
【０１７０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  混合ミセル対トランスファーサムス（Transfersomes）。過度に不安定化したトランスファーサムス（Transfersomes）は通常混合脂質ミセルに分解することから、精製ＴＴ負荷混合ミセルまたはトランスファーサムスにより表皮免疫処置した動物の生存率に関するデータを示し、凝集サイズ（安定性）の効果を説明する。
【図２】  リポソーム対トランスファーサムス。皮膚に投与した常套の脂質小胞（リポソーム）と精製ＴＴを担持する超変形可能リピド小胞（トランスファーサムス）に対する免疫応答について比較し、血清中の相当する特異抗体濃度に関する情報（吸光度として表示）を上欄パネルに示す。
【図３】  抗原投与効果。抗原およびモノホスホリルリピドＡ(ＬＡ)負荷SPC：NaChol(3.75：1)由来のトランスファーサムスによる表皮免疫処置の結果に及ぼす抗原用量増大の影響を説明する。結果は吸光度の変化、抗体価、または動物生存率として、相当する特異抗体イソタイプデータとともに示す。抗原用量は１０、２０、４０および８０μｇであった。Ｎｏ Ａｇ(４匹)以外、各グループあたり６匹の動物を使用した。
【図４】  抗原純度効果。SPC：NaChol(3.75：1)由来のトランスファーサムスの８０μg破傷風トキソイドとモノホスホリルリピドＡ(ＬＡ)による表皮免疫処置の結果に及ぼす抗原純度の影響を、動物生存率の時間依存性情報とともに強調して示す。全てのデータは、２回目の追加刺激＋７日後に得た。
【図５】  表皮対皮下免疫化。トランスファーサムス中のＴＴによる反復侵襲性（皮下）免疫処置と非侵襲（表皮）免疫処置の結果を、動物の生存率、血清濃度（吸光度による）、特異抗体価、および抗体分布パターン値とともに比較する。
【図６】  前注射効果。トランスファーサムス(SPC：Tw-80  １：１)介在皮膚通過ＴＴ(４０μｇ)送達後の免疫応答に及ぼす皮膚前処理（非特異攻撃）の影響を図示する。前注射グループのマウスに４０μｇ抗原投与２４時間前に注射をした。食塩水各０.１ml(pre-S)、１０％ＳＰＣ：ＮａＣｈ４.５：１エンプティトランスファーサムス(Pre-empty Tfs)および不完全フロイントアジュバントを前注射に使用した。本実験の全てのマウスを２回目の追加刺激７後にＬＤ５０の５０倍の毒素で攻撃した。(ｅｃ)表皮、(ｓｃ)皮下および(Ｔｆｓ)トランスファーサムスを意味する。
【図７】  アジュバンド効果：例えば、モノホスホリルリピドＡ。トランスファーサムス中のＴＴとともに未処置皮膚通過送達した比較的低分子量の免疫刺激剤、モノホスホリルリピドＡ（ＬＡ）のアジュバント効果に焦点を合わせる。
【図８】  アジュバント効果：例えばサイトカインＩＬ−１２。ＳＰＣ：ＮａＣｈからのトランスファーサムスによりＴＴとともに皮膚通過輸送されたサイトカイン、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の免疫アジュバント活性を証明する。
【図９】  免疫調整効果、例えば、サイトカイン。トランスファーサムスにおいて非侵襲的に皮膚通過送達された不純破傷風毒素(ＴＴ)抗原に対するマウス応答の種々サイトカインによる免疫調整について論じる。血清を２回目の追加刺激７日後にアッセイのために採取した。いずれのグループでも保護効果は観察されなかった。
【図１０】  免疫アジュバント効果：例えば、コレラ毒素(ＣＴ)。トランスファーサムス(ＳＰＣ：ＮａＣｈ３.７５：１)中のＴＴにより皮膚上処理したマウスの免疫応答刺激についての実験的証拠を提示するが、この場合には、担体も１０μｇのコレラ毒素（ＣＴ）を含んで特異抗体産生を維持し、その結果、破傷風毒素による他の場合には致死的な攻撃に対しての動物の防御をも維持する。グループあたり４−６匹の動物を使用した。アスタリスクは４匹中１匹の麻痺マウスを示す。
【図１１】  アジュバント効果：例えば、大腸菌から得た熱不安定毒素(ＨＬＴ)。大腸菌から得た熱不安定毒素の免疫アジュバントとしての使用について図示する。
【図１２】  ヒスタミン効果：抗破傷風力価および皮膚上へのトランスファーサムスによる免疫化後の生存。トランスファーサムスによる経皮抗原適用と組合わせた局所皮膚ヒスタミン前処理の免疫調整効果を図示する。
【図１３】  皮下初回抗原刺激：抗破傷風力価および表皮追加刺激後の生存率における効果。抗破傷風力価と表皮予防接種宿主の生存率に及ぼす皮下初回抗原刺激の影響を示す。
【図１４】  二価予防接種：皮膚上でトランスフォーサムスと共に投与した両方の抗原に対する抗破傷風および抗コレラ応答。抗原として使用した破傷風トキソイドとコレラ毒素による二価予防接種の効果を示す。