(57)【要約】  アンモニアの生成を抑制するための方法であって、担体材料をヘッドスペースを有する容器に提供することと、細菌、酸性化剤、および臭気抑制剤を該担体材料に提供することであって、該細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉを含み、該臭気抑制剤が、アミノポリカルボン酸化合物の塩を含む、提供することと、動物排泄物を該担体材料に適用することと、を含み、担体材料および細菌を含有し、かつ臭気抑制剤を含有していない容器を含む未処理対照と比較して、ヘッドスペース中のアンモニア含有量が５〜９８パーセント改善される、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンモニアの生成を抑制するための方法であって、
ヘッドスペースを有する容器に担体材料を提供することと、
前記担体材料に、細菌、酸性化剤、および臭気抑制剤を提供することであって、前記細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉを含み、前記臭気抑制剤が、アミノポリカルボン酸化合物の塩を含む、提供することと、
動物排泄物を前記担体材料に適用することと、を含み、前記担体材料および前記細菌を含有し、かつ前記臭気抑制剤を含有しない容器を含む未処理対照と比較して、ヘッドスペース中のアンモニア含有量が５〜９８パーセント改善される、方法。
【請求項２】
添加材料を前記担体材料に提供することをさらに含み、前記添加材料が、珪藻土、クエン酸塩、タルク、石膏、炭酸カルシウム、砂、ガラス、汚れ、アルミナ、アルミナ−ケイ酸塩、ケイ酸塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記臭気抑制剤が、エチレンジアミンまたはジエチレントリアミン骨格を有するアミノポリカルボン酸化合物の塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記臭気抑制剤が、エチレンジアミン四酢酸の塩、ジエチレントリアミン五酢酸の塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸の塩、またはそれらの２つ以上の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記担体材料が、無孔質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記動物排泄物が、尿素または尿酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記臭気抑制剤が、前記酸性化剤、前記臭気抑制剤、および前記担体材料の組み合わせの１．０〜５．０重量パーセントを占める、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酸性化剤が、前記酸性化剤、前記臭気抑制剤、および前記担体材料の組み合わせの０．５〜４．０重量パーセントを占める、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記担体が、木の削り屑、干し草、わら、粉砕わら、木材チップ、のこぎり屑、ペレット化したのこぎり屑、紙、刻んだトウモロコシの穂軸、ピーナッツの外皮、ココアの外皮、籾殻、小麦草、草、亜麻、オート麦、小麦、ライ麦、細断した紙、クルミの殻、ココナッツの殻、砂、またはそれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸性化剤が、重硫酸ナトリウム、硫酸アルミニウムカリウム水和物、硫酸、硫酸第一鉄、またはリン酸である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
動物用トイレ砂は、糞便および尿の捕獲材料として使用される。これらの生物学的副産物は、悪臭化合物、特にアンモニアの放出のために強い臭気を発生し得る。アンモニアは、動物排泄物中の尿素および／または尿酸に対する微生物の作用から生じる。
【０００２】
動物用トイレ砂からの臭気は、ヒトにとって苦痛であり、十分に高いレベルでは有毒であり得る。さらに、特に家禽の家屋および馬房／馬小屋などの閉鎖された環境では、臭気が動物の快適な生活にとって悩みの種である。さらに、動物用トイレ砂からの放射は、温室効果に寄与し得る。したがって、動物用トイレ砂からの臭気を制御する方法を見出すことが望ましい。
【０００３】
本発明によって対処される問題は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉのような臭気の原因となる細菌によるアンモニアの生成を抑制するための方法である。
【発明の概要】
【０００４】
アンモニアの生成を抑制するための方法であって、担体材料をヘッドスペースを有する容器に提供することと、細菌、酸性化剤、および臭気抑制剤を該担体材料に提供することであって、該細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉを含み、該臭気抑制剤が、アミノポリカルボン酸化合物の塩を含む、提供することと、動物排泄物を該担体材料に適用することと、を含み、担体材料および細菌を含有し、かつ臭気抑制剤を含有していない容器を含む未処理対照と比較して、ヘッドスペース中のアンモニア含有量が５〜９８パーセント改善される、方法。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
別段の指示がない限り、数値の範囲、例えば、「２〜１０」は、この範囲を定義する数値（例えば、２および１０）を含める。
【０００６】
別段の指示がない限り、比率、百分率、部などは重量による。
【０００７】
本明細書で使用されるとき、「予防する」または「抑制する」という用語は、本明細書に記載の処理がなければ動物排泄物中に形成されたであろうアンモニアの量を少なくとも部分的に減らすことを意味し、「改善パーセント」として報告される。いくつかの実施形態では、改善パーセントは、例えば比色指示薬によって測定して（例えば、実施例に記載されるようにＤｒａｇｅｒ管を用いて）、動物の実時間使用における光透過吸収法および／もしくはガスクロマトグラフィー、または尿劣化を模倣する実験室試験法によって測定して、少なくとも５０パーセント、あるいは少なくとも７０パーセント、あるいは少なくとも９０パーセント、あるいは１００パーセントである。改善パーセントは、試験環境と同じ担体材料、動物排泄物、および細菌を含有するが、本明細書に記載の処理（例えば、臭気抑制剤、酸性化剤、および任意の添加剤）を省略したシステムに関連する。
【０００８】
本明細書で使用される「動物」という用語は、概して非ヒト動物を意味する。一例では、「動物」は、鳥を指す。より具体的な例としては、家禽（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、ハト、およびガチョウ）、ネコ、ならびにウマが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
「排泄物」という用語は、細菌によってアンモニアに変換され得る化合物を含有する、あらゆる動物排泄物を指す。一例では、排泄物とは、尿素、尿酸、または両方を含有する、あらゆる動物排泄物を指す。例としては、動物の尿および排泄物（例えば、便、糞）が挙げられる。
【００１０】
本開示は、アンモニアの生成を抑制するための方法を記載する。本開示の方法は、ヘッドスペースを有する容器に担体材料、酸性化剤、細菌、および臭気抑制剤を提供することを含む。理論に制限されることなく、アンモニアは、尿素誘導体、例えば、尿素または尿酸との細菌の相互作用によって生成されると予想される。本開示の方法で使用される細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉ種の細菌である。細菌が同定された種のものであると述べられている場合、細菌は自然に進化し突然変異していることが理解され、そのようなものとして、細菌は、遺伝的構成の少なくとも９７パーセントを標的種と共有するとき、同じ種であると理解される。
【００１１】
ヘッドスペースは、容器内の担体材料の上の未充填スペースとして定義される。容器は、担体材料を保持するのに適した任意の構造として定義される。一例では、容器は、鶏舎または鶏小屋の床である。一例では、容器は、動物舎または部屋の床などの表面である。一例では、容器は、少なくとも部分的に囲まれている。一例では、容器は、周囲の領域に対して開いている。容器が周囲領域に対して開いている場合、本明細書に記載のヘッドスペース測定は、担体材料に近接して、例えば担体材料の上面から１〜１２インチ、好ましくは担体材料の上面から１〜６インチで行われる。担体が、動物およびそれらの排泄物のための床敷または吸収材として典型的に使用される任意の材料であってもよく、例えば、木の削りくず、干し草、わら、粉砕わら、木材チップ、のこぎり屑、ペレット化したのこぎり屑、紙、刻んだトウモロコシの穂軸、ピーナッツの外皮、ココアの外皮、籾殻、小麦草、草、亜麻、オート麦、小麦、ライ麦、細断紙、クルミの殻、ココナッツの殻、砂、またはそれらの混合物が挙げられる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、動物は、家禽であり、担体材料は、木の削り屑、干し草、わら、粉砕わら、木材チップ、のこぎり屑、ペレット化したのこぎり屑、紙、刻んだトウモロコシの穂軸、ピーナッツの外皮、ココアの外皮、籾殻、小麦草、草、亜麻、オート麦、小麦、ライ麦、細断した紙、クルミの殻、ココナッツの殻、砂、またはそれらの混合物である。
【００１３】
本明細書で使用される臭気抑制剤は、アミノポリカルボン酸化合物の塩を含む。上述したように、臭気抑制剤は、臭気の原因となる化合物であるアンモニアの生成を防ぐことによって機能する。本発明の塩のための好ましいカチオンは、ナトリウムまたはカリウムを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、アミノポリカルボン酸塩の溶液は、４〜９、好ましくは４〜５．５の水中ｐＨを有する。例えば、ＶＥＲＳＥＮＥ（商標）（Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）は、４０重量パーセント水溶液として提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、臭気抑制剤は、エチレンジアミンまたはジエチレントリアミン骨格を有するアミノポリカルボン酸化合物の塩である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、臭気抑制剤は、エチレンジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩、Ｎ−ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸塩、またはそれらの２つ以上の混合物である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、臭気抑制剤は、エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸のカリウム塩、またはそれらの混合物である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、臭気抑制剤は、エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩またはそのような塩の混合物である。例えば、臭気抑制剤は、エチレンジアミン四酢酸一ナトリウム（ＮａＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｎａ２ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム（Ｎａ３ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（Ｎａ４ＥＤＴＡ）、またはそれらの２つ以上の混合物である。いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＥＤＴＡが好ましい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、臭気抑制剤は、エチレンジアミン四酢酸のカリウム塩、またはそのような塩の混合物である。例えば、臭気抑制剤は、エチレンジアミン四酢酸一カリウム（ＫＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸二カリウム（Ｋ２ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸三カリウム（Ｋ３ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸四カリウム（Ｋ４ＥＤＴＡ）、またはそれらの２つ以上の混合物である。いくつかの実施形態では、Ｋ２ＥＤＴＡが好ましい。
【００２０】
酸性化剤は、担体材料と臭気抑制剤との組み合わせを含む材料のｐＨを７より下に低下させるように選択される。酸性化剤の種類は、重硫酸ナトリウム、硫酸アルミニウムカリウム水和物、硫酸、硫酸第一鉄、クエン酸、およびリン酸である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、担体材料と組み合わされる任意の液体バインダー。いくつかの実施形態では、液体バインダーは、臭気抑制剤、酸性化剤、および担体材料と組み合わされると、輸送および典型的な使用中に大部分の顆粒が実質的にそれらの形状を保持するように顆粒を形成する溶液である。いくつかの例では、液体バインダーは、水、塩溶液、ＥＤＴＡ塩の溶液、グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレングリコール潤滑剤、またはそれらの組み合わせである。好ましくは、液体バインダーは、室温で液体である。好ましくは、液体バインダーは、毒性が低い。
【００２２】
臭気抑制剤および酸性化剤は、本明細書に記載のように担体材料と組み合わされる。臭気抑制剤と酸性化剤との組み合わせは、発生するアンモニアガスを抑制し、組み合わせた産生物のｐＨを所望の範囲にするように作用する。添加される臭気抑制剤または酸性化剤の量は、重量パーセントで測定される（担体材料、臭気抑制剤、酸性化剤、および添加される任意の他の化合物の組み合わせの総重量に対する、液体バインダーまたは添加剤などの担体材料の重量パーセントとして定義される）。一例では、臭気抑制剤の量は、少なくとも１．０重量パーセントである。一例では、臭気抑制剤の量は、少なくとも１．５重量パーセントである。一例では、臭気抑制剤の量は、少なくとも２．０重量パーセントである。好ましくは、臭気抑制剤の量は、少なくとも２．５重量パーセントである。一例では、臭気抑制剤の量は、少なくとも３．０重量パーセントである。一例では、臭気抑制剤の量は、最大５．０重量パーセントである。一例では、臭気抑制剤の量は、最大４．５重量パーセントである。一例では、臭気抑制剤の量は、最大４．０重量パーセントである。一例では、酸性化剤の量は、少なくとも０．５重量パーセントである。一例では、酸性化剤の量は、少なくとも１．０重量パーセントである。一例では、酸性化剤の量は、最大４．０重量パーセントである。一例では、酸性化剤の量は、最大３．０重量パーセントである。一例では、酸性化剤の量は、最大２．０重量パーセントである。好ましくは、酸性化剤の量は、０．５〜１．５重量パーセントであり、臭気抑制剤の量は、２．０〜３．０重量パーセントである。より好ましくは、酸性化剤の量は、０．７〜１．３重量パーセントであり、臭気抑制剤の量は、２．２〜２．８重量パーセントである。
【００２３】
別の態様では、本発明は、トイレ砂粒子の表面またはその近くに臭気制御剤を好適に配置することにより、尿素の劣化防止における効率を改善する。
【００２４】
本明細書に記載の方法は、動物用トイレ砂に典型的に使用される、臭気抑制剤、酸性化剤、液体バインダー、および担体材料の他に、他の添加剤を含有してもよい。これらの添加剤としては、充填剤、保湿剤、崩壊剤、臭気吸収材料（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ケイ酸質材料、オパリンシリカ、活性炭、重硫酸ナトリウム錯体、もしくはコーンスターチ）、ゼオライト、除塵剤（例えば、ガウガム、ＰＴＦＥ被覆粘土、もしくはフルオロポリマー）、ブロノポールおよび銀ベースの化合物などの抗菌剤、香料、他のキレート剤（例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））、石膏、小分子有機酸、中和能を有するポリマーもしくは酸基（例えば、セルロースアセテート、ポリカルボキシレート）、米粉、四級アミン、プロバイオティック細菌、ならびに／またはアンモニア酸化細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の担体材料は、他の臭気防止添加剤を含まず、例えば、アルカリ金属四ホウ酸塩ｎ水和物、ミョウバン、他の遷移金属塩（例えば、Ｚｎ、銅塩）、および／またはホウ素化合物のうちの１つ以上を含まない。本明細書で使用されるとき、担体材料が化合物を含まないと言われる場合、それは担体材料がその化合物を実質的に含まないことを意味し、例えば、担体材料は１００ｐｐｍ未満のその化合物を含有する。
【００２６】
本明細書に記載されるように、担体材料への臭気抑制剤および酸性化剤の添加は、アンモニア生成の防止をもたらし、それによって望ましくない動物臭を著しく低減する。臭気抑制剤および酸性化剤は、例えば、固体混合（乾式ブレンドまたは同時粉砕を含む）、展着、振りかけなどを含む、当業者に知られている様々な標準的技術によって担体材料と組み合わせることができる。
【００２７】
例えば、一実施形態では、臭気抑制剤および酸性化剤を担体材料の床敷の上に振りかけてもよい。この実施形態では、担体材料の床敷をさらに撹拌または混合して、臭気抑制剤および酸性化剤を材料中により深く混合することができる。
【００２８】
別の実施形態では、臭気抑制剤および酸性化剤を担体材料と乾式ブレンドし、動物用トイレ砂として使用する前に一緒に包装することができる。好ましい実施形態では、臭気抑制剤および酸性化剤を乾式ブレンドの前に顆粒にして、顆粒および担体材料が類似のサイズおよび形状を有するようにして、分離に起因する担体からの臭気抑制剤含有粒子の偏析または層化を防ぐ。
【００２９】
臭気抑制剤および酸性化剤を調製するとき、粒子の分離の可能性を低減するために、担体材料の粒子密度ならびに形状を合わせることが望ましい場合がある。
【００３０】
他の混合技法は、材料を均等に混ぜ合わせるために担体材料、酸性化剤、および臭気抑制剤の混合物を乾式ブリケットすることを含み得る（例えば、数百ミクロンからミリメートルのサイズ範囲が適切であり得る）。
【００３１】
いくつかの実施形態では、動物がその排泄物を担体材料上に放出する前に、臭気抑制剤および酸性化剤を担体材料に適用することができる。いくつかの実施形態では、臭気抑制剤および酸性化剤は、第２世代以降の使用のために担体材料に適用または再適用されてもよい。
【００３２】
一実施形態では、臭気抑制剤および酸性化剤を担体材料と乾式ブレンドし、動物用トイレ砂として使用する前に一緒に包装することができる。好ましい実施形態では、臭気抑制剤と酸性化剤とを乾式ブレンドする前に微粉末にして、臭気抑制剤の担体材料への被覆性を高める。微粉末は、噴霧乾燥、粉砕、沈殿、またはそれらの組み合わせによって製造することができ、担体への付着を高めるために乾式ブレンドまたは液体との結合によって流動助剤と組み合わせることができる。別の好ましい実施形態では、液体バインダーを臭気抑制剤、酸性化剤および担体と混合して、臭気抑制剤および酸性化剤を担体に結合するのを助ける。
【００３３】
別の実施形態では、乾燥粒子がバインダー液によって所望の濃度で担体材料に付着するように、担体材料にバインダー液を噴霧し、次いで乾燥臭気抑制剤および酸性化剤とブレンドすることができる。同様に、担体材料を乾燥臭防止剤および酸性化剤とブレンドし、次いでバインダー液を噴霧することができ、それにより乾燥粒子をバインダー液によって所望の濃度で担体材料に付着させる。次いで、バインダー液中に場合により存在し得る水または溶媒成分を蒸発させるために、被膜された担体材料粒子を場合により乾燥させることができる。好ましくは、液体バインダーは、少なくとも部分的に水溶性である。
【００３４】
一実施形態では、添加材料が担体材料に提供される。一例では、添加材料は、珪藻土、クエン酸塩、タルク、石膏、炭酸カルシウム、ベントナイトカルシウム、砂、ガラス、汚れ、アルミナ、アルミナ−ケイ酸塩、ケイ酸塩、またはそれらの組み合わせである。好ましくは、添加材料は、本明細書に記載の方法を用いて担体材料、臭気抑制剤、および酸性化剤と組み合わされる。
【００３５】
本明細書に記載の細菌は、天然の植物相ならびに動物排泄物中に一般的に存在する、天然に存在するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉ細菌である。本明細書では、「細菌を提供する」とは、細菌が系に導入されることを意味する。好ましくは、細菌は、動物排泄物の一部として系に導入される。
【００３６】
本開示は、アンモニアの生成を抑制するための方法であって、担体材料をヘッドスペースを有する容器に提供することと、細菌、酸性化剤、および臭気抑制剤を該担体材料に提供することであって、該細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉを含み、該臭気抑制剤が、アミノポリカルボン酸化合物の塩を含む、提供することと、動物排泄物を該担体材料に適用することと、を含み、担体材料、動物排泄物、および細菌を含有し、かつ臭気抑制剤または酸性化剤を含有しない容器を含む未処理対照と比較して、ヘッドスペース中のアンモニア含有量が５〜９８パーセント改善される、方法を説明する。一例では、本明細書に記載の方法は、２５ｐｐｍ以下のアンモニア含有量をもたらす。一例では、本明細書に記載の方法は、２１日間で２５ｐｐｍ以下のアンモニア含有量をもたらす。方法ステップは、他に具体的に述べられていない限り、任意の順序で実行され得、繰り返され得ることが理解される。
【００３７】
この方法は、添加材料を担体材料に提供することをさらに含み、該添加材料が、クエン酸塩、タルク、石膏、炭酸カルシウム、砂、ガラス、汚れ、アルミナ、アルミナ−ケイ酸塩、ケイ酸塩、またはそれらの組み合わせを含む。添加材料は、好ましくは、動物排泄物を適用する前に添加される。
【００３８】
ここで、本発明のいくつかの実施形態を、以下の実施例において詳細に説明する。
【実施例】
【００３９】
実施例１、２、３、および４。
研究室実験：
合成家禽尿の調製。これらの実施例では、合成尿は、必要とされる各１００ｇの合成家禽尿について以下のように調製された。その量は、必要に応じて増減させることができる。以下の成分を滅菌した瓶に添加した：尿素（ＵＳＰグレード）：０．４３ｇ、アンモニア：０．４６ｇ、Ｋ３ＰＯ４（ＵＳＰグレード）：６．８ｇ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水：８３．５２ｇ。瓶に蓋をして周囲温度で１〜３時間瓶ローラー上に置いた。溶液のｐＨを測定して、ｐＨが１３〜１４であることを確認した。７．５ｇの合成尿を試料（実施例１および２）に添加するために、０．６６ｇのＵＳＰグレードの尿酸および６．８４ｍＬの調製された溶液を、５０ｍＬの遠心分離管に添加し、１５秒間高い設定でボルテックス混合した。試料（実施例３および４）に１０グラムの合成尿を添加するために、０．８８ｇのＵＳＰグレードの尿酸および９．１２ｍＬの調製された溶液を５０ｍＬの遠心分離管に添加し、１５秒間高い設定でボルテックス混合した。両方の場合において、混合物のｐＨは１１〜１２の間であろう。
【００４０】
細菌の調製。これらの実施例では、使用されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉ／Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓ細菌株は、それぞれ家禽糞尿およびネコトイレ砂からの環境単離体であった。本明細書中で使用されるとき、「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉ／Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓ」とは、ＤＮＡ配列決定を通してＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓの両方に遺伝的に類似していることが同定されたネコの糞便からの環境単離体である細菌株を指す。同定は、属の信頼水準を用いて外部研究室でＤＮＡ配列決定により決定された。
【００４１】
細菌株を無菌トリプシン大豆寒天プレート上で単離し、３０℃のインキュベータ中で２日間増殖させ、冷蔵庫で保存した。新鮮なプレートを２週間ごとに調製した。
【００４２】
実験開始の前日に、１０μＬのループで寒天プレートから一杯の細菌を取り出し、それを容器の半分を満たしている１０ｍＬの無菌トリプシン大豆ブロスに浸すことによって、細菌を増殖させた。実施例で使用される全ての細菌は好気性であり、それゆえ増殖培地の上に空気が必要である。バイアルを振とうインキュベータ中、１００ｒｐｍで２４時間、３０℃でインキュベートした。増殖培地中の細菌の数を、連続希釈法によって決定した。この場合、無菌緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中での増殖培地の１０回の連続希釈を、毎回１０倍希釈で実施する。各プレートについて１００μＬの増殖培地を使用して、各希釈物を２回プレーティングした。コロニー数は、３０〜３００コロニー形成単位（ＣＦＵ）を上に有する希釈プレート上で数えた。次いで、元の増殖培地中のコロニー形成単位の数を希釈数を逆算することによって決定した。これらの実験で使用されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｃｏｈｎｉｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ−ｘｙｌｏｓｕｓ細菌株の一晩増殖溶液は、それぞれ〜５．２ＣＦＵ／ｍＬおよび９．９ＣＦＵ／ｍＬであった。これらの実験に使用した全てのピペット、容器、チップ、スプーンなどの装置は、他の細菌による汚染を防ぐために無菌であった。合成尿を調製するために使用したトイレ砂、処理剤、および化学薬品は、滅菌せずにそのまま使用した。
【００４３】
粉砕わら床敷の調製。滅菌した研究室用ブレンダーにわらを入れ、１５〜４５秒間、パルスの高い設定で粉砕した。次いで、新しいわらのバッチをブレンダーに入れた。試料が過度に加熱されるのを防ぐために、ブレンダーを温めたとき、通常３０分の粉砕後に冷却した。
【００４４】
試料の調製。滅菌した１Ｌ（例えば、Ｔｒｉ−Ｐｏｕｒ（登録商標））容器に１５ｇの粉砕わらを装填した。容器を軽くたたくことによって、各試験試料中のトイレ砂を平らにした。
【００４５】
実施例１および２では、本明細書に詳述したように調製した７．５ｇの合成尿を、２．２８ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水および１ｍＬの無菌リン酸緩衝生理食塩水とボルテックスミキサーを用いて高い設定で１０秒間混合した。先に詳述したように調製した１ｍＬの一晩細菌増殖溶液を混合物に添加し、１０秒間高い設定でボルテックス混合した。
【００４６】
実施例３および４では、本明細書で詳述したように調製した２ｍＬの一晩細菌増殖溶液を、先に詳述したように調製した１０ｇの合成尿に添加し、１０秒間高い設定でボルテックス混合した。
【００４７】
合成尿と細菌の混合物を調製後直ちに試料に添加し、無菌接種ループを使用してわらと混合した。次いで、蒸気が容器から漏れるのを防ぐために、試料をアルミホイルで被覆した。ヘッドスペース中のアンモニアレベルは、接種後１日目および４日目に測定された。
【００４８】
処理を追加する：
４日目の測定後、試料上のアルミニウムホイルを開け、所望の処理を追加した。アルミニウムホイルを未処理の対照試料について同じ時間にわたって開いた。
【００４９】
いくつかの実施例の処理を以下に詳述する。表１は、どの処理が各特定の実施例に適用されるかを詳述している。
【００５０】
実施例１および２に対する処理：
１％重硫酸ナトリウム：１重量％の重硫酸ナトリウムを床敷の上に加え、無菌ループで混ぜる。
１％重硫酸ナトリウム＋２．５％Ｎａ２ＥＤＴＡ固体：１重量％の重硫酸ナトリウムおよび２．５重量％のＮａ２ＥＤＴＡを床敷の上に加え、無菌ループで混ぜる。
【００５１】
実施例３および４に対する処理：
１％重硫酸ナトリウム：１重量％の固体重硫酸ナトリウムを床敷上に適用し、無菌ループで混ぜた。
２．５％Ｋ２ＥＤＴＡ：４０％活性Ｋ２ＥＤＴＡ溶液を、２．５％活性にするために床敷に添加し、無菌ループで混ぜた。
１％重硫酸ナトリウム＋２．５％Ｋ２ＥＤＴＡ：１重量％固体重硫酸ナトリウムおよび４０％活性Ｋ２ＥＤＴＡを、２．５％活性にするために床敷に添加し、無菌ループで混ぜた。
上に振りかけた１％重硫酸ナトリウム：１重量％の固体重硫酸ナトリウムを床敷の上に振りかけた（混ぜていない）。
上に噴霧した２．５％Ｋ２ＥＤＴＡ：４０％活性Ｋ２ＥＤＴＡ溶液を床敷に噴霧し、２．５％活性を得た（混ぜていない）。
【００５２】
処理後、試料をアルミホイルで再び封止した。ヘッドスペースアンモニアレベルを、接種後５日目、７日目、および１１日目、および２１日目に本明細書に記載のように再度測定した（これらは、処理後１日目、３日目、および７日目、および１７日目に対応する）。
【００５３】
ヘッドスペースアンモニア測定。各試験容器のヘッドスペース中のアンモニアを、ＳＥＮＳＩＤＹＮＥ（登録商標）ＡＰ−２０Ｓ吸引検知管ポンプを用いてサンプリングした。低（０．２〜２０ｐｐｍ）、中１（５〜２６０ｐｐｍ）、中２（１〜２００ｐｐｍ）、または高（５０〜９００ｐｐｍ）範囲のＳＥＮＳＩＤＹＮＥ（登録商標）アンモニアガス検知管を使用して、ヘッドスペースアンモニア濃度を定量化した。各試験試料中のアンモニアの検知および定量化のために以下の手順を使用した。１．ポンプの破壊点を使用して、検知管の両端を破壊する。２．検知管の矢印マークを吸引ポンプの方に向ける。検知管を吸引ポンプのゴム管コネクタにしっかりと挿入する。３．試験ヘッドスペースをサンプリングするために、試験試料のアルミホイルカバーの中央に小さな穴を開ける。指定された測定距離まで（吸引ポンプに取り付けられた）検知管をサンプリング穴に挿入する。管をヘッドスペースに４５ｍｍ挿入する（ガス検知管の下端の青い太線と同じ）。４．４５ｍｍの測定距離でポンプを保持する。ポンプハンドルをフルストロークでロック位置まで引く。サンプリングが完了するまで１分間待つ。これはポンプの流量インジケータで確認される。必要に応じて、吸引ポンプの取扱説明書に詳細が記載されている。５．染色層の最大点（色は黄色）でスケールを読み取る。測定直後に濃度を読み取り、報告する。読み取り値がスケール外の場合、例えば、低範囲管で２０ｐｐｍの場合は、中範囲ガス検知管を使用して測定を繰り返す。中範囲管の読み取り値がスケール外の場合は、高範囲管を使用する。６．サンプリング後、アルミホイルカバーのサンプリング穴をテープで封止する。
【００５４】
実施例１および２の処理後のヘッドスペースアンモニアレベルを表１に報告し、実施例３および４の処理後のヘッドスペースアンモニアレベルを表２に報告する。実施例３および４では、中１および高レベルのアンモニア管は利用可能でなく、ヘッドスペースアンモニアレベルは、２００ｐｐｍの最大測定閾値を有する管で測定した。２００＋として報告された結果は、ヘッドスペース中のより高いアンモニアレベルであり、測定することができなかった。
【００５５】
全ての試料は、三重に調製された。３つの複製物の平均値を報告した。ヘッドスペース中のアンモニア含有量は、改善パーセントとして報告した。改善パーセントは、臭気抑制剤および酸性化剤を省いた以外は上記の手順を使用して試験した同じ細菌株および濃度を含有する対照と比較した、ヘッドスペース中のアンモニアの減少パーセントとして算出した。対照および処理試料の両方が、２００ｐｐｍよりも大きい（２００＋）ヘッドスペースアンモニアレベルを有していた場合、これらの場合には比較を行うことができなかったため、ヘッドスペースアンモニアの改善パーセントは、「？」として報告した。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
【表２】
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【００５８】
これらの実施例は、概して、臭気抑制剤（例えば、Ｋ２ＥＤＴＡ）と酸性化剤（例えば、重硫酸ナトリウム）の組み合わせが、臭気抑制剤または酸性化剤のみの使用と比較して、改善されたアンモニア中和を与えることを説明する。
【００５９】
実施例５〜８。
バレル試験実験：
使用済みのトイレ砂（家禽の糞尿、水分、飼料残渣、および／または羽毛を含む可能性のある籾殻）は、商業用ブロイラー養鶏場から入手し、プラスチック製のバレルで輸送した。２３ｋｇのトイレ砂を、０．４ｍ２プラスチック製の桶に秤量して、桶のおよそ１０ｃｍの深さまで入れた。桶を覆っていない状態で家禽飼育施設に保管し、商業用ブロイラー舎で経験されるであろう条件（温度約３２℃）を模倣するように環境条件を管理した。
【００６０】
実施例５
比較例
桶を１重量％に相当する用量のＮａＨＳＯ４で処理した。次いで、アンモニアを３５日間測定した。
【００６１】
実施例６：
桶を２つのステップで処理した。１重量％に相当する用量のＮａＨＳＯ４を、酸性化剤として桶に添加した。２４時間後、３．２重量％に相当する用量のＮａ２ＥＤＴＡを添加し、分散させた。次いで、アンモニアを３５日間測定した。
【００６２】
実施例７：
桶を２つのステップで処理した。１重量％に相当する用量のＮａＨＳＯ４を、酸性化剤として桶に添加した。２４時間後、３．２重量％に相当する用量のＫ２ＥＤＴＡを、水溶液として添加した。次いで、アンモニアを３５日間測定した。
【００６３】
実施例８：
桶を２つのステップで処理した。１．２３重量％に相当する用量のＥＤＴＡ酸を桶に添加した。２４時間後、３．２重量％に相当する用量のＮａ２ＥＤＴＡを添加し、分散させた。次いで、アンモニアを３５日間測定した。
【００６４】
実施例５〜８の結果を表３に報告する。
【００６５】
【表３−１】
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【００６６】
【表３−２】
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【００６７】
これらの実施例は、概して、臭気抑制剤（例えばＫ２ＥＤＴＡ）と酸性化剤（例えばＮａＨＳＯ４）の組み合わせが、酸性化剤のみの使用と比較して改善されたアンモニア中和を与えることを説明する。
【国際調査報告】
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