(57)【要約】糞便を検出サンプルとし、SDC2遺伝子のメチル化検出試薬を含む腫瘍分子検出/診断試薬。SDC2遺伝子は、糞便において検出したメチル化レベルが結腸直腸がんの発症に極めて高い関連性を保持し、その感度が87％、特異度が98％と高く、組織での特異度よりも高い。【選択図】  図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便を検出サンプルとし、SDC2遺伝子のメチル化検出試薬を含むことを特徴とする腫瘍分子検出/診断試薬。
【請求項２】
DNA捕捉試薬をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の検出/診断試薬。
【請求項３】
前記DNA捕捉試薬は、捕捉磁気ビーズであることを特徴とする請求項2に記載の検出/診断試薬。
【請求項４】
前記捕捉磁気ビーズは、SDC2遺伝子に対する捕捉配列、好ましくは、SDC2遺伝子のCpGアイランドに対する捕捉配列を含むことを特徴とする請求項3に記載の検出/診断試薬。
【請求項５】
前記捕捉配列は、配列番号:1又は配列番号:2に示されることを特徴とする請求項3に記載の検出/診断試薬。
【請求項６】
前記SDC2遺伝子のメチル化検出試薬は、CpGアイランドに対するメチル化検出試薬であることを特徴とする請求項1に記載の検出/診断試薬。
【請求項７】
前記SDC2遺伝子のメチル化検出試薬は、増幅プライマーを含み、好ましくは、前記増幅プライマーは、配列番号:3〜24のいずれか１つに示され、より好ましくは、前記プライマーは、配列番号:3、配列番号:4に示されることを特徴とする請求項1に記載の検出/診断試薬。
【請求項８】
検出プローブをさらに含み、好ましくは、前記プローブは、配列番号:25又は配列番号:26に示され、より好ましくは、前記プローブは、配列番号:26に示されることを特徴とする請求項1に記載の検出/診断試薬。
【請求項９】
前記腫瘍は、腸がん又は前癌性腺腫であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の検出/診断試薬。
【請求項１０】
前記腫瘍は、腸がん又は前癌性腺腫であり、好ましくは、前記腸がんは、結腸直腸がんであることを特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載の検出/診断試薬。
【請求項１１】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の検出/診断試薬を含み、好ましくは、前記腫瘍は、腸がん又は前癌性腺腫であり、より好ましくは、前記腸がんは、結腸直腸がんであることを特徴とする腫瘍検出/診断キット。
【請求項１２】
糞便を検出サンプルとし、前記検出サンプルを取り、請求項1〜9のいずれか一項に記載の検出/診断試薬と混合した後、抽出して増幅し、増幅結果に基づいて検出結果を得ることを特徴とする腫瘍の検出方法。
【請求項１３】
前記増幅の標的物は腫瘍マーカーであり、前記腫瘍マーカーは、SDC2遺伝子、NDRG4遺伝子、BMP3遺伝子及びSeptin9遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項12に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記得られた検出結果は、試験サンプルと正常サンプルとを比較した増幅結果であり、前記試験サンプルと正常サンプルとの間で増幅結果に顕著な差異、又は極めて顕著な差異がある場合に、前記試験サンプルのドナーは陽性であることを特徴とする請求項12又は13に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2015年12月31日に出願された中国特許出願第201511034264.X号（発明の名称：「腫瘍分子の検出/診断試薬」）の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、生物医薬分野に属し、腫瘍分子検出/診断試薬に関し、具体的には、糞便を検出サンプルとする腫瘍分子検出/診断試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、結腸直腸がんのスクリーニングには、主に２つの慣用技術がある。
【０００４】
一つは糞便潜血検査である。通常、大腸がんの初期に何らの前兆もない場合があり、がん細胞が大腸の壁に数十年増殖してから他の部位に移転することもあり、症状が発症する前に、過形成した組織から少量の血液が滲出し、糞便に入って排出される。糞便潜血検査では、糞便における血液の成分(検出対象：ヘモグロビン)を検出し、複数回で持続的な陽性反応であると検出すると、消化管出血が発生したことを示し、さらなる検査を行って腸管腫瘍の発生有無を確認すべきである。該方法は、結果が出るのが速く、明らかで、半定量可能である利点を有する。しかし、該方法は以下のような欠点を有する。特異性が悪く、飲食による影響が大きい。第一鉄イオン含有食品及び薬物が結果に影響を与えることで、偽陽性率が30％に達することがある。そのため、糞便潜血検査に偽陽性が発生することを防止するために、検査前に患者に鉄剤、動物の血、肝、赤身肉、及び大量の緑の葉物野菜の摂食を3日避けるよう、歯肉出血の場合に血が混ざった唾を飲み込まないよう注意する必要がある。また、該方法は、感度が低く、出血量が>90μg/mlに達するまで検出できない。さらに、該方法には、多くの制限があり、患者の事前準備に長い時間がかかり、サンプリング部位によって、反応時間が異なり、色に対する判断が異なるので、同一の方法による検査においても誤差があるため、一般的に、検査のためには、患者の異なる日の糞便を用いて連続的に測定する必要がある。
【０００５】
もう一つは大腸内視鏡検査である。現在、大腸内視鏡検査は、腸管病変の診断にとって最も効果的で信頼性の高い方法である。早期大腸がんの患者は、殆ど内視鏡検査によって発見され診断が下されることができる。大腸内視鏡を肛門から挿入することにより、直腸、S状結腸、下行結腸、横行結腸、上行結腸、盲腸及び大腸と連結している小腸の一部(回腸末端)を検査することができる。内視鏡により、腸管病変を明確に発見できるだけでなく、いくつかの腸管病変を治療することができる。例えば、大腸ポリープ等の良性病変の場合に、直接に内視鏡的切除を行い、腸管出血の場合に、内視鏡的止血を行い、大腸異物の場合に、取り除くことができる。大腸内視鏡検査技術は、現在、他の診療手段に代替できない主要な手段である。現在、大腸内視鏡検査は、腸管病変の診断には、最も効果的で信頼性の高い診断方法である。しかし、大腸内視鏡検査には、多くの欠点が存在している。例えば、検査前の準備が必要である。具体的には、大腸内視鏡検査を行うために、検査の3日前から流動食又は半流動食を食べ始め、検査の前日に腸内洗浄のために通常2Lのマンニトール等の下剤を服用し、それから断食し、検査当日の午前に空腹を保持する必要がある。検査するときに、観察の便利上、医師が大腸内視鏡により腸腔内に一定量の気体を注入して腸管を膨張させる。結腸の構造が曲りくねるため、検査中に、被検者が異なる程度の脹痛又は引っ張り感を感じることがある。緊張しすぎる受検者又は高度な腸痙攣の受検者では、鎮静剤又は鎮痙薬を使用する必要がある。また、多動の小児では、麻酔をかける必要がある。さらに、大腸内視鏡検査は、医師の熟練度に対する要求が高く、初心者が大腸内視鏡下で病変部位を見落として診断の見逃しを引き起こしやすい場合がある。検査中に気体の注入が必要であるため、腸管内圧上昇による腸管穿孔を起こすことがある。また、検査に手間や時間がかかり、患者にある程度の痛苦を与える。そして、検査費用が高く、大規模に普及されにくい。
【０００６】
上記の方法に加えて、分子診断法は近年急速に発達している癌診断法である。現在、組織及び血液サンプルにおける130種類以上と多い結腸直腸がん分子マーカーが研究及び報道されている。
【０００７】
組織サンプリングによる創傷が大きいため、糞便サンプルにおける腸がんマーカーについてのスクリーニングを重点とする研究が存在する。例えば、伍勇らは、糞便におけるマーカーAPC、K-ras、p53を検出した上で、FOBTと併用して診断することを試した。
【０００８】
しかし、糞便に多くの酵素が存在し、糞便に脱落したDNAを分解する一方、糞便の成分が複雑で、干渉成分が多いため、検出結果は通常満足のいくものではない。同じ標的遺伝子であっても、糞便サンプルでの検出感度及び特異度が組織サンプルでの感度及び特異度よりも遠く低く、結果に対する判断に重大な影響を与える。例えば、ビメンチン遺伝子は、組織において結腸直腸がんに対する感度が83.0％であるが、糞便において感度が46％に低下する(JNatlCancerInst.2005Aug3；97(15):1124-32.)。SFRP1及びSFRP2遺伝子は、組織において結腸直腸がんに対して非常に高い特異度及び感度を有し、SFRP1遺伝子は、組織では特異度が100％、感度が95.1％であるが(NatGenet.2002Jun；31(2):141-9.)、糞便では感度が52％に低下する (AdvBiomedRes.2012Dec28；1:87.) 一方、SFRP2遺伝子は、組織では結腸直腸がんに対する特異度が99％、感度が89.5％であるが(NatGenet.2002Jun；31(2):141-9.)、糞便では特異度が77％、感度降が77％に低下する(Lancet.2004Apr17；363(9417):1283-5.)。
【０００９】
従って、糞便サンプルの分子検出は、依然として臨床応用に困難がある。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、糞便での検出感度が組織に劣らない腫瘍マーカーをスクリーニングすることを目的とする。
【００１１】
上記の発明の目的を達成するために、本発明は、以下の技術解決策を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、糞便を検出サンプルとすることができる腫瘍分子検出/診断試薬を提供することを目的とする。この試薬は、結腸直腸がん又は前癌性腺腫について分子検出/診断を行うものである。この検出試薬は、糞便を検出サンプルとしても優れた感度及び特異度を得ることができる。
【００１３】
本発明は、分子マーカーを初めてスクリーニングした。該分子マーカーの糞便での検出量が結腸直腸がんの存在に非常に高い関連性がある点で他の分子マーカーと相違する。その検出結果の感度及び特異度は、組織サンプルでの検出結果に劣らない。
【００１４】
本発明は、糞便を検出サンプルとし、且つSDC2遺伝子メチル化の検出試薬を含むことを特徴とする結腸直腸がんの分子検出/診断試薬を提供する。
【００１５】
本発明でスクリーニングしたこの特殊な分子マーカーはSDC2遺伝子である。
【００１６】
SDC2遺伝子は、細胞分裂、遊走に関与し、結腸間葉細胞内で発見するタンパク質として知られている。腫瘍組織におけるSDC2標的領域のメチル化レベルが隣接する非腫瘍組織におけるSDC2標的領域よりも顕著に高いことが発見された。133例のCRC患者の原発腫瘍及びその隣接する非腫瘍組織サンプルにおけるSDC2メチル化レベルを分析することにより、SDC2遺伝子の転写調節領域において、腫瘍組織サンプルのメチル化レベルが対照となる隣接する非腫瘍組織サンプルよりも顕著に高いことが発見された。
【００１７】
SDC2遺伝子のメチル化発生サイトが相対的に一定であり、プロモーター領域のCpGアイランドに発生する場合が多い。現在、常用されているSDC2遺伝子メチル化の検出方法は、CpGアイランドこの固定サイトに対するメチル化検出である。
【００１８】
メチル化では、シトシンに１つのメチルが増加し、亜硫酸水素塩処理により、シトシンがウラシルに変換される。PCR増幅の際に、ウラシルは、チミンと類似するため、チミンとして識別される。つまり、PCR増幅配列においては、メチル化されていないシトシンはチミン(C→T)に変換され、メチル化されたシトシン(C)は変換されない。PCRによるメチル化遺伝子の検出技術は、通常MSPであり、処理されたメチル化断片(即ち、断片における変換されていないC)に対してプライマーを設計してPCR増幅を行ったところ、増幅があるとメチル化が発生したことを示し、増幅がないとメチル化が発生していないことを示す。
【００１９】
SDC2遺伝子の組織でのメチル化レベルは、結腸直腸がんの発症との関連性が非常に高い。139例の組織においてSDC2遺伝子のメチル化検出率は97.8％であり、131例の腸がん患者及び125例の正常患者に対する血液検出において、特異度が95.2％である場合に、感度は87％である(Oh,T.,etal.,TheJournalofMolecularDiagnostics,2013)。驚くべき発見は、SDC2遺伝子の糞便において検出されたメチル化レベルも結腸直腸がんの発症と非常に高い関連性を有し、その感度が87％、特異度が98％であり、組織での特異度よりも高いことである。これは、分子マーカーにとって極めてまれで、ユニークであると言える。
【００２０】
発明者が研究した多くの分子マーカーの全ては、糞便サンプルの検出感度又は特異度が組織サンプルよりも大幅に低下する。例えば、NDRG4遺伝子のような結腸直腸がん分子マーカーは、組織での検出感度が81％であるが、糞便での検出感度が65.2％に低下する。BMP3遺伝子は、組織での検出感度が66％であるが、糞便での検出感度が39.0％に低下する。Septin9遺伝子は、組織での検出特異度が90％であるが、糞便での検出特異度が43％に低下する。研究により、多くの腸がんマーカーについて、組織のみにおいて良好な検出感度及び特異度を示す一方、糞便サンプルにおいて、如何に抽出方法、検出プライマー等を設計及び最適化したとしても、感度又は特異度は依然として大幅に低下し、腸がんの診断に重大な影響を与えることが発見された。
【００２１】
それに対して、SDC2遺伝子は、糞便サンプルにも87％と高い感度及び98％と高い特異度を保持することができる。それによって、このような遺伝子は、極めて特殊的に、糞便サンプルにおける信頼性の高い腸がんマーカーとして使用できる。
【００２２】
さらに、本発明は、糞便におけるSDC2遺伝子の抽出及び検出の簡単な方法を提供する。
【００２３】
磁気ビーズ捕捉法は、磁気ビーズを固相吸着担体とし、特別に設計した試薬系及び抽出プロセスを採用する方法である(Journal of China Medical University磁気ビーズ法による尿における遊離メチル化DNAの検出、抽出；2015,(10))。
【００２４】
磁気ビーズ捕捉配列は、SDC2遺伝子に対して設計することができる。本発明において、例示的な捕捉配列は、例えば、配列番号:1又は配列番号:2に示される。磁気ビーズ捕捉の方式により、糞便におけるSDC2遺伝子を抽出及び富化することができる。
【００２５】
糞便の処理方式について、必要に応じて、糞便を緩衝液に均一に混合し、遠心分離した後、上清を取り別の試験管に移し、特定の相補的オリゴヌクレオチド捕捉プローブ(例えば、配列番号:1であるAGCCCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCG)付きの磁気ビーズを上清に加え、インキュベーション及びハイブリダイゼーションした後、磁石で磁気ビーズを管壁の一側に吸着し、繰り返し洗浄した後、緩衝液で標的遺伝子DNAを溶出することができる。この方法によれば、標的遺伝子を捕捉することができ、富化に約2時間がかかる。
【００２６】
捕捉したDNAを重亜硫酸塩処理により修飾した後、後続の蛍光定量PCRの検出に用いる。
【００２７】
さらに、本発明は、メチル化の発生が多い且つ一定のプロモーターに対してCpGアイランドを除去することでプライマー及びプローブを設計する。例示的なプライマーは、配列番号:3、配列番号:4；配列番号:5、配列番号:6；配列番号:7、配列番号:8；配列番号:9、配列番号:10；配列番号:11、配列番号:12；配列番号:13、配列番号:14；配列番号:15、配列番号:16；配列番号:17、配列番号:18；配列番号:19、配列番号:20；配列番号:21、配列番号:22；又は配列番号:23、配列番号:24に示される。
【００２８】
好ましい実施例において、用いられるプライマーは、配列番号:3、配列番号:4である。
【００２９】
結果の表示をさらに便利にするために、本発明は、検出プローブを設計する。例示的なプローブ配列は、配列番号:25又は配列番号:26に示される。本発明の好ましい実施例において、プローブ配列は、配列番号:26に示される。
【００３０】
本発明は、上記検出/診断試薬を含む腫瘍検出/診断キットをさらに提供する。好ましくは、上記腫瘍は腸がん又は前癌性腺腫であり、より好ましくは、上記腸がんは結腸直腸がんである。
【００３１】
本発明は、糞便を検出サンプルとし、上記検出サンプル及び本発明が提供する検出/診断試薬を取り混合した後、抽出して増幅し、増幅結果に応じて検出結果を得る腫瘍の検出方法をさらに提供する。
【００３２】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記検出方法では、増幅の標的は腫瘍マーカーであり、上記腫瘍マーカーは、SDC2遺伝子、NDRG4遺伝子、BMP3遺伝子又はSeptin9遺伝子からなる群より選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記検出方法では、得られた検出結果は、試験サンプルと正常サンプルを比較した増幅結果であり、上記試験サンプルと正常サンプルとの間で増幅結果に顕著な差異又は極めて顕著な差異がある場合に、上記試験サンプルのドナーは陽性である。
【００３４】
従来技術に比べて、本発明は、以下の有益効果を有する。
【００３５】
1.本発明が提供する結腸直腸がん診断試薬は、簡単に糞便を検出サンプルとし、結腸直腸がんを信頼的に診断することができる。本発明で使用される検出サンプルは、患者の糞便サンプルである。サンプルが入手しやすく、患者に何の痛みや不便も与えない。サンプルの使用量が極めて少なく、サンプリング過程に非常に便利であり、患者に何の影響も与えない。また、サンプルを病院に郵送したり、持って行ったりして検査することに便利である。
【００３６】
2.本発明によれば、従来の方法に存在する検出ブラインドエリアがなく、左右両側の結腸の腫瘍を発見することができる。大腸がんだけではなく、前癌性腺腫も発見することができるため、前癌性腺腫の摘除による大腸がんの予防を可能にする。
【００３７】
3.本発明が提供する試薬/キットは、メチル化レベルによりがんを検出及び診断するものである。メチル化変換が腫瘍発生過程中の早期事件であることを実証した多くの研究が報道されており、メチル化異常の検出により早期病変をより容易に発見できると考えられている。
【００３８】
本発明は、糞便を検出サンプルとし、SDC2遺伝子メチル化の検出試薬を含む。SDC2遺伝子は、糞便において検出したメチル化レベルが結腸直腸がんの発症と極めて高い関連性を有し、その感度が87％、特異度が98％と高く、組織での特異度よりも高い。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、SDC2遺伝子により結腸直腸がん(A)及び前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)(B)を検出したROC曲線である。
【図２】図２は、NDRG4遺伝子により結腸直腸がん(A)及び前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)(B)を検出したROC曲線である。
【図３】図３は、BMP3遺伝子により結腸直腸がん(A)及び前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)(B)を検出したROC曲線である。
【図４】図４は、Septin9遺伝子により結腸直腸がん(A)及び前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)(B)を検出したROC曲線である。
【図５−１５】図５−１５は、順次にSM-0〜SM-10に対するプライマーの増幅曲線である。
【図１６】図１６は、蛍光PCR検出結果(プローブ1)である。
【図１７】図１７は、蛍光PCR検出結果(プローブ2) である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、腫瘍分子検出/診断試薬を開示しており、当業者であれば、本明細書の記載に基づいてプロセスパラメータを適切に改良することにより実現することができる。なお、全ての類似的な置換及び変更は、当業者にとって自明なものであり、本発明の範囲に含まれると見なされる。本発明の方法及び使用を好適な実施例により説明したが、当業者は、本発明の内容、趣旨及び範囲内で、本明細書に記載の方法及び使用を置換、変更及び組み合わせすることにより、本発明の技術を実現及び使用することができる。
【００４１】
本発明が提供する腫瘍分子検出/診断試薬に用いられる原料及び試薬は、全て市販されている。
【００４２】
以下、具体的な実施例により本発明の技術解決策をさらに説明するが、これらの実施例は、本発明の保護範囲を制限するものではない。本発明のアイデアに基づいて加える非本質的な変更及び調整も本発明の保護範囲に含まれる。
【００４３】
実施例1  サンプル処理及びDNA抽出
【００４４】
糞便サンプルと緩衝液とを1g糞便：4ml緩衝液の割合で混合して研磨した後、遠心分離し、上清を回収し、沈殿物を捨てた。
【００４５】
8mlの上清を取り、4000rpmで5min遠心分離した後、5mlの上清を3mlの細胞溶解液が入った新しい15mlの遠心分離管に移した。
【００４６】
各遠心分離管に100ulの捕捉磁気ビーズを加えた。92℃の水浴で10minインキュベーションした。シェーカーを用いて室温、100rpmで1hインキュベーションし、短い遠心分離の後、磁気ラックに置いて5min処理し、上清を捨てた。
【００４７】
以下の２本の捕捉プローブは、共に効果的であり、標的断片を捕捉することができる。
捕捉プローブ1：
配列番号:1  AGCCCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCG
捕捉プローブ2：
配列番号:2  CTCCTGCCCAGCGCTCGGCGCAGCCCGC
【００４８】
15mlの遠心分離管に500ulの洗浄液を加え、振とうして均一に混合することで管壁に付着した磁気ビーズを完全に脱落させ、短い遠心分離の後、新しい2mlの遠心分離管に移した。乾燥浴を用いて室温、900rpmで1minインキュベーションし、磁気ラックに置いて1min処理した後、上清を捨てた。上記操作を4回繰り返した。
【００４９】
55ulの溶出液を加え、短い遠心分離の後、乾燥浴を用いて92℃、900rpmで10minインキュベーションした。短い遠心分離の後、磁気ラックに置いて3min以内処理した後、50ulの溶出液を新しいEP管に移した。
【００５０】
EZmethylationkit(ZymoResearch製)を用いて、ステップ6のDNA断片をメチル化処理し、最終サンプルをPCR検出した。
【００５１】
捕捉プローブの捕捉効率分析
2本の捕捉プローブを用いて同一のサンプルを捕捉し、捕捉した断片を紫外分光光度計によりDNA濃度を測定した。結果は、以下である。
【００５２】
2019501651.tif 000003
【００５３】
2本のプローブは、共に標的断片を捕捉することができるが、配列番号:1の方は、効果がより良いため、実験に該プローブを採用することが好ましい。
【００５４】
実施例2  PCR検出プロセス
PCRシステム及び条件を表1、表2に示す。
【００５５】
表1  PCRシステム
2019501651.tif 000004
表2  PCR条件
2019501651.tif 000005
【００５６】
プライマーを設計し、その増幅効率を調査した(図3)。増幅システム及び条件を以下に示す。
【００５７】
表3  プライマー及び増幅効率
2019501651.tif 000006
【００５８】
プライマーのPCR効果をそれぞれ図5-15に示す。その結果より分かるように、配列番号:3、配列番号:4に示されるプライマーの増幅効率が最も高い。
【００５９】
増幅効率が最も高い配列番号:3、配列番号:4をプライマーペアとして採用した。
【００６０】
さらに、検出プローブを設計した。最適化した検出プローブは、以下に例示する。
【００６１】
プローブ1
配列番号:25  AGTTTCGAGTTCGAGTTTTCGAGTTTG
プローブ2
配列番号:26  CAAACTCGAAAACTCGAACTCGAAACT
【００６２】
10ウェル繰り返した。実験を2回繰り返した。PCRシステム及び条件を表1、表2示す。
【００６３】
プローブ1、プローブ2の蛍光曲線をそれぞれ図16、17に示す。
【００６４】
結果より分かるように、プローブ1及びプローブ2は、共にPCRの正常進行を保証することができる。比較的には、プローブ2で得られた蛍光値がより高く、結果に対する判断、特に陽性サンプルに対する判断により有利である。
【００６５】
実験用のサンプル検出にプローブ2を採用することが好ましい。≧
【００６６】
実施例3  サンプル検出
大腸内視鏡及び病理検査により腸がんと診断された46例の患者の糞便サンプル、大腸内視鏡及び病理検査により前癌性腺腫(ポリープ≧1cm) と診断された46例の患者の糞便サンプル、大腸内視鏡検査により正常と診断された46例の患者の糞便サンプルを臨床的に収集した。
【００６７】
実施例1の方法に従って上記糞便サンプルを処理及びDNA抽出し、実施例2のPCR検出プロセスにより138例のサンプルをPCR検出した。
【００６８】
46例の腸がん(Ca)(大腸内視鏡により腸がんと診断された)患者、46例の正常(Norm)(大腸内視鏡により正常と診断された)患者、46例の前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm，LA，大腸内視鏡によりポリープ直径≧1cmと診断された)患者を検出した。
【００６９】
MedCalcソフトウェアによりデータを処理分析した。
結果を図1、2に示す。
【００７０】
図1Aは、SDC2遺伝子により結腸直腸がんを検出したROC曲線であり、図1Bは、SDC2遺伝子により前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)を検出したROC曲線である。
【００７１】
結腸直腸がんについては、SDC2遺伝子の検出感度が87％、特異度が98％、被検者の曲線下面積が0.953である。
【００７２】
前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm) については、SDC2遺伝子の検出感度が73％、特異度が96％、被検者の曲線下面積が0.882である。
【００７３】
実施例4  例示的な他の分子マーカーの検出結果
本発明の技術解決策を研究している過程において、発明者は、複数種類の腸がんマーカーについて調査した。
【００７４】
実施例1、2、3のシステム設計方法を参照して、本発明は、例えば、NDRG4遺伝子、BMP3遺伝子、Septin9遺伝子による糞便検出についても調査した。
【００７５】
これらの遺伝子についてそれぞれ最適化の検出方法により検出した後、実施例3のサンプルを用いて同様な臨床サンプル分析を行った。
【００７６】
NDRG4遺伝子により結腸直腸がん及び前癌性腺腫を検出した結果を図2に示す。
【００７７】
図2Aは、NDRG4遺伝子により結腸直腸がんを検出したROC曲線であり、図2Bは、NDRG4遺伝子により前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)を検出したROC曲線である。
【００７８】
結腸直腸がんについては、NDRG4遺伝子の検出感度が65.2％、特異度が97.8％、被検者の曲線下面積が0.826である。
【００７９】
前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)については、NDRG4遺伝子の検出感度が45.7％、特異度が97.8％、被検者の曲線下面積が0.694である。
【００８０】
BMP3遺伝子により結腸直腸がん及び前癌性腺腫を検出した結果を図3に示す。
【００８１】
図3Aは、BMP3遺伝子により結腸直腸がんを検出したROC曲線であり、図3Bは、BMP3遺伝子により前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)を検出したROC曲線である。
【００８２】
結腸直腸がんについては、BMP3遺伝子の検出感度が50.0％、特異度が89.1％、被検者の曲線下面積が0.694である。
【００８３】
前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)については、BMP3遺伝子の検出感度が26.1％、特異度が89.1％、被検者の曲線下面積が0.549である。
【００８４】
Septin9遺伝子により結腸直腸がん及び前癌性腺腫を検出した結果を図4に示す。
【００８５】
図4Aは、Septin9遺伝子により結腸直腸がんを検出したROC曲線であり、図4Bは、Septin9遺伝子により前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)を検出したROC曲線である。
【００８６】
結腸直腸がんについては、Septin9遺伝子の検出感度が82.6％、特異度が63.0％、被検者の曲線下面積が0.737である。
【００８７】
前癌性腺腫(ポリープ直径≧1cm)については、Septin9遺伝子の検出感度が13.0％、特異度が97.8％、被検者の曲線下面積が0.534である。
【００８８】
上記の実施例により本発明の好適な実施形態を示したが、本発明の実施形態は、これらの実施例に制限されず、本発明の趣旨及び原理を逸脱しない範囲内で加えた変更、修飾、置換、組合せ、簡単化は、全て本発明の保護範囲内に含まれる。
【００８９】
以上は、本発明が提供する腫瘍分子検出/診断試薬を詳しく説明した。本明細書には、具体的な例を用いて本発明の原理及び実施形態を述べたが、以上の実施例は、本発明の方法及び趣旨を理解するのを助けるためのものに過ぎない。なお、当業者であれば、本発明の原理を逸脱しない限り、本発明を改良及び修飾することができ、これらの改良及び修飾も本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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