(57)【要約】検体におけるＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定する皮膚バリア機能診断用バイオマーカー組成物、キット及びこれを利用した診断方法に関して記述する。皮膚バリア機能を客観的に診断する手段を提供することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検出する試薬を含む皮膚バリア機能診断用バイオマーカー組成物。
【請求項２】
前記試薬は、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプローブ又はプライマー対；及びＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体の少なくとも一方を含む、請求項１に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項３】
前記プローブは、前記遺伝子のポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片、又は前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的なポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項４】
前記プライマー対は、前記遺伝子のポリヌクレオチドの１０〜２０個の連続ヌクレオチド断片；及び前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な１０〜２０個の連続ヌクレオチド断片を含む、請求項２に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項５】
前記抗体は、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子によってコードされるタンパク質に対するモノクローナル抗体である、請求項２に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項６】
前記遺伝子の発現量が正常値に比べて増加したとき、皮膚バリア機能に優れると診断する、請求項１に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項７】
前記遺伝子の発現量が正常値に比べて減少したとき、皮膚バリア機能が損傷されたと診断する、請求項１に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項８】
前記皮膚バリア機能改善は、表皮細胞分化の増進、皮膚保湿又は表皮細胞のタイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の改善の少なくとも一方を含む、請求項１に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のバイオマーカー組成物を含む皮膚バリア機能診断用キット。
【請求項１０】
前記キットは、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合する一つ以上のポリヌクレオチド；及び前記一つ以上のポリヌクレオチドを表面に結合させた固相支持体を含み、前記ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するポリヌクレオチドは、前記遺伝子のポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片、又は前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的なポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記キットは、検体における前記遺伝子の発現量が正常値に比べて増加したとき、皮膚バリア機能に優れると診断し、且つ前記遺伝子の発現量が正常値に比べて減少したとき、皮膚バリア機能が損傷されたと診断する、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定することを含む皮膚バリア機能診断方法。
【請求項１３】
前記方法は、検体における前記遺伝子の発現量が正常値に比べて増加したとき、皮膚バリア機能に優れると診断し、且つ前記遺伝子の発現量が正常値に比べて減少したとき、皮膚バリア機能が損傷されたと診断することを含む、請求項１２に記載の診断方法。
【請求項１４】
前記遺伝子の発現量を検定することは、対象の表皮細胞から前記遺伝子のｍＲＮＡ発現量を検出することを含む、請求項１２に記載の診断方法。
【請求項１５】
表皮細胞を試験物質で処理し；そして、前記試験物質で処理した表皮細胞から試験物質による処理前後のＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の相対的発現程度を確認することを含む、皮膚バリア機能改善物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記試験物質で処理した表皮細胞において試験物質による処理前に比べて前記遺伝子の相対的発現程度が高いとき、皮膚バリア機能改善物質と判定することをさらに含む、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記遺伝子の相対的発現程度が試験物質による処理前に比べて１．１倍以上であるとき、皮膚バリア機能改善物質と判定する、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記表皮細胞は、角化細胞又はメラニン形成細胞の少なくも一方である、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
前記皮膚バリア機能改善は、表皮細胞分化の増進、皮膚保湿又は表皮細胞のタイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の改善の少なくとも一方を含む、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、皮膚バリア機能診断用バイオマーカー組成物、皮膚バリア機能診断用キット、及び皮膚バリア機能改善物質のスクリーニング方法に関して記述する。
【背景技術】
【０００２】
表皮の最表層である角質層は、外的な湿度・温度の変化、紫外線及び微生物のような外的要素による皮膚バリアの損傷防止や皮膚中の水分が外に蒸発することを抑えるバリア機能を担う。皮膚バリアを細分化すると、角質層バリア（ｂａｒｒｉｅｒ）と角質層の下の細胞間結合による水分蒸発を抑えるタイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）部とに分けられる。アトピー患者の皮膚水分量の減少は、表皮分化異常による角質層の細胞間脂質減少及びクローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）の減少によるタイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の弱化に関連することが知られている（非特許文献１）。したがって、表皮分化異常やタイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に対する評価法は皮膚バリア（ｂａｒｒｉｅｒ）の損傷を評価する代表的な方法である。
【０００３】
近年、鼻に存在する嗅覚受容体は、各種の臓器をはじめとして皮膚にも存在することが知られている。このとき、鼻ではなく臓器や皮膚に存在する嗅覚受容体の機能は鼻にあるときとは異なると知られているが、鼻以外の部位における機能が明らかにされていない種々の嗅覚受容体の具体的な機能の全てについては知られておらず、それは各受容体によって相違するものと予想される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】De Benedetto A, et al., “Tight junction defects in patients with atopic dermatitis.”, J Allergy Clin Immunol. 2011 Mar;127(3):773-86
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一観点において、本発明が解決しようとする課題は、皮膚バリア機能を客観的に診断する手段を提供することである。
【０００６】
他の観点において、本発明が解決しようとする課題は、表皮細胞分化の増進の有無を客観的に評価する手段を提供することである。
【０００７】
また他の観点において、本発明が解決しようとする課題は、皮膚保湿の増進の有無を客観的に評価する手段を提供することである。
【０００８】
また他の観点において、本発明が解決しようとする課題は、タイトジャンクションの改善の有無を客観的に評価する手段を提供することである。
【０００９】
また他の観点において、本発明が解決しようとする課題は、皮膚バリア改善物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【００１０】
また他の観点において、本発明が解決しようとする課題は、表皮細胞分化物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【００１１】
また他の観点において、本発明が解決しようとする課題は、皮膚保湿増進物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【００１２】
また他の観点において、本発明が解決しようとする課題は、タイトジャンクション改善物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一観点において、本発明は、検体におけるＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定することを含む皮膚バリア機能の診断方法に関する。
【００１４】
他の観点において、本発明は、検体におけるＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定する皮膚バリア機能診断用バイオマーカー組成物に関する。
【００１５】
また他の観点において、本発明は、検体におけるＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定する皮膚バリア機能診断用キットに関する。
【００１６】
また他の観点において、本発明は、表皮細胞を試験物質で処理し；そして、前記試験物質で処理した表皮細胞から試験物質による処理前後のＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の相対的発現程度を確認することを含む皮膚バリア機能改善物質のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
一観点において、本発明は、皮膚バリア機能を客観的に診断する手段を提供することができる。
【００１８】
他の観点において、本発明は、表皮細胞分化の増進の有無を客観的に評価する手段を提供することができる。
【００１９】
また他の観点において、本発明は、皮膚保湿の増進の有無を客観的に評価する手段を提供することができる。
【００２０】
また他の観点において、本発明は、タイトジャンクションの改善の有無を客観的に評価する手段を提供することができる。
【００２１】
また他の観点において、本発明は、皮膚バリア改善物質をスクリーニングする方法を提供することができる。
【００２２】
また他の観点において、本発明は、表皮細胞分化物質をスクリーニングする方法を提供することができる。
【００２３】
また他の観点において、本発明は、皮膚保湿増進物質をスクリーニングする方法を提供することができる。
【００２４】
また他の観点において、本発明は、タイトジャンクション改善物質をスクリーニングする方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】角化細胞における経時的（２日目、４日目、及び６日目）なＯＲ６Ｍ１遺伝子とＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現量を確認した図である。
【図２】角化細胞から紫外線（ＵＶＢ  ２５ｍＪ／ｃｍ２）を照射した後のＯＲ６Ｍ１遺伝子とＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現量を確認した図である。
【図３】それぞれＯＲ６Ｍ１遺伝子とＯＲ６Ｖ１遺伝子をノックダウン（Ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）させた結果を示すグラフである。
【図４】ＯＲ６Ｍ１遺伝子とＯＲ６Ｖ１遺伝子をノックダウン（Ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）させた場合の表皮分化関連遺伝子のＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＬＯＲの発現量の変化を確認した図である。
【図５】ＯＲ６Ｍ１遺伝子とＯＲ６Ｖ１遺伝子をノックダウン（Ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）させた場合の保湿関連遺伝子のＢＨ、ＦＬＧ、Ｃａｓｐａｓｅ１４の発現量の変化を確認した図である。
【図６】ＯＲ６Ｍ１遺伝子とＯＲ６Ｖ１遺伝子をノックダウン（Ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）させた場合のタイトジャンクション関連遺伝子のＯｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ１、ＴＪＰ１の発現量の変化を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施例についてより詳細に説明することにする。なお、本出願に開示された技術はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化することもできる。ここで紹介される実施例は、単に、開示された内容が徹底且つ完全になるようにし、また当業者に本出願の思想が十分に伝達できるようにするために提供されるものであるに過ぎない。また、当該分野における通常の知識を有する者であれば、本出願の技術的思想を逸脱しない範囲内で本出願の思想を多様な他の形態に具現することができるであろう。
【００２７】
本明細書において「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」とは、遺伝子の標的部位と相補的に結合することができる配列の塩基を有するオリゴヌクレオチ、その変異体、又はオリゴヌクレオチとこれに結合された標識物質を含むものを意味する。
【００２８】
本明細書において「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」とは、遺伝子の標的部位に該当する特定領域をＰＣＲを用いて増幅するために用いる遺伝子特定領域の末端に相補的に結合することができる配列の塩基を有するオリゴヌクレオチ又はその変異体のことを意味する。前記プライマーは、特定領域の末端と完全に相補的であることを要求せず、前記末端にハイブリダイズして二本鎖構造を形成するほどに相補的なものであれば用いられ得る。
【００２９】
本明細書において「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」とは、２個の一本鎖核酸が相補的な塩基配列のペアリング（ｐａｉｒｉｎｇ）によってデュープレックス構造（ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、一本鎖核酸配列間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）だけでなく、一部のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても生じ得る。
【００３０】
本明細書において「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、複数個のヌクレオチドの重合体を意味するものであり、通常的な意味の数十個のヌクレオチドの重合体であるオリゴヌクレオチドを含む広義のポリヌクレオチドのことを意味する。
【００３１】
本明細書において「正常値」とは、損傷されていない皮膚の正常な分化状態における発現量のことを意味する。
【００３２】
一実施例において、本発明は、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定することを含む皮膚バリア機能診断方法に関する。
ヒトＯＲ６Ｍ１（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｍ  ｍｅｍｂｅｒ  １）遺伝子は、嗅細胞の嗅覚受容体６Ｍ１（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ６Ｍ１）タンパク質をコードし、ＯＦ６Ｍ１遺伝子のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤはＮＭ＿００１００５３２５.１である。本発明者らは、前記遺伝子が表皮細胞から発現するときに皮膚バリア機能を改善する役割をすることを見出した。したがって、ＯＲ６Ｍ１遺伝子は、表皮細胞におけるこれらの遺伝子が皮膚バリア機能の診断、評価のためのバイオマーカーとして用いられ得、発現量の検定によって客観的な皮膚バリア機能の診断、評価が可能である。
【００３３】
ヒトＯＲ６Ｖ１（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｖ  ｍｅｍｂｅｒ  １）遺伝子は、嗅細胞衣嗅覚受容体６Ｖ１（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ６Ｖ１）タンパク質をコードし、ＯＲ６Ｖ１遺伝子のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤはＮＭ＿００１００１６６７.１である。本発明者らは、前記遺伝子が表皮細胞から発現するときに皮膚バリア機能を改善する役割をすることを見出した。したがって、ＯＲ６Ｍ１遺伝子は、表皮細胞におけるこれらの遺伝子が皮膚バリア機能の診断、評価のためのバイオマーカーとして用いられ得、発現量の検定によって客観的な皮膚バリア機能の診断、評価が可能である。
【００３４】
一例において、前記皮膚バリア機能診断方法は、検体におけるＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定することを含むものであってよい。
【００３５】
前記検体は、ヒトから分離された表皮細胞であってよく、例えば、角化細胞又はメラニン形成細胞の少なくとも一方であってよい。
【００３６】
検体におけるＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現量が高いと、皮膚バリア機能に優れ、表皮細胞分化が促進し、皮膚保湿が増進し、角質層の下の顆粒層、有棘層の細胞間タイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を改善して表皮細胞を堅く結合させることで表皮細胞組織を堅固にすることができ、また、これによってタイトジャンクション部を介した水分蒸発を防止することができる。逆に、検体におけるＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現量が低いと、皮膚バリア機能が乏しく、表皮細胞分化が低下し、皮膚保湿が低くなり、タイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が緩んでしまい水分蒸発を有効に阻止することができず、表皮細胞組織が緩むようになる。
【００３７】
したがって、検体におけるＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現量が損傷されていない表皮の正常対照群に比べて増加したとき、皮膚バリア機能に優れ、表皮細胞分化が促進し、皮膚保湿が増進し、タイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を改善して表皮細胞を堅く結合させることで、表皮細胞組織が堅固なものと診断することができる。
【００３８】
前記ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現量の検定は、当該技術分野において周知の通常の方法を用いて行ってよく、例えば、検体におけるＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子のｍＲＮＡ、又はＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも一方の水準を測定することを含むものであってよい。
【００３９】
一具体例において、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子のｍＲＮＡの水準の測定は、当該ｍＲＮＡの全部又は一部に特異的に結合するポリヌクレオチドを用いて行うことができるが、これに制限されない。
【００４０】
例えば、前記ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子のｍＲＮＡの水準の測定は、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子のｍＲＮＡ検定用プローブを用いるか、又はＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子のｍＲＮＡを増幅させることができるプライマー対を用いて行うことができる。
【００４１】
前記プローブを用いる場合、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子のｍＲＮＡの水準の測定は、前記検体中の前記プローブとハイブリダイズした転写体の量を測定して行うことができる。
【００４２】
前記プローブは、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子に特異的に結合するポリヌクレオチドであって、前記遺伝子のポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片、又は前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的なポリヌクレオチドであってよい。
【００４３】
前記プライマー対を用いる場合、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子のｍＲＮＡの水準の測定は、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子の少なくとも一方のｍＲＮＡを増幅することができるプライマー対を用いて増幅されたポリヌクレオチドの量を測定して行うことができる。
【００４４】
前記プライマー対は、前記遺伝子のポリヌクレオチドの１０〜２０個の連続ヌクレオチド断片；及び前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な１０〜２０個の連続ヌクレオチド断片を含んでいてよい。
【００４５】
他の具体例において、前記ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子によってコードされるタンパク質の水準の測定は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて行うことができる。
【００４６】
前記抗体を用いる場合、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子によってコードされるタンパク質の水準の測定は、前記抗体とハイブリダイズしたタンパク質の量を測定して行うことができる。
【００４７】
前記抗体は、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１遺伝子の少なくとも一方の遺伝子によってコードされるタンパク質のモノクローナル抗体であってよい。
【００４８】
前記ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量の検定は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ノーザンブロッティング（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ドットブロット（ｄｏｔ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、及びマイクロアレイ、例えば、アレル特異的ハイブリダイゼーション（Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を用いたＴａｑＭａｎ(商標)プローブ法、重合反応によるアレル特異的ハイブリダイゼーション（Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を用いたプローブ法、制限酵素を用いた制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、溶融温度（Ｔｍ、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を用いた動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法、重合反応を用いたパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、アレル特異的伸長（Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を用いたマイクロアレイ方法などを用いてよいが、これらに制限されない。
【００４９】
一具体例において、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量が、正常値（正常対照群の発現量）に対し、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３．０倍以上、３．１倍以上、３．２倍以上、３．３倍以上、３．４倍以上、３．５倍以上、３．６倍以上、３．７倍以上、３．８倍以上、３．９倍以上、４．０倍以上、４．１倍以上、４．２倍以上、４．３倍以上、４．４倍以上、４．５倍以上、４．６倍以上、４．７倍以上、４．８倍以上、４．９倍以上、又は５．０倍以上であり、且つ２０．０倍以下、１９．５倍以下、１９．０倍以下、１８．５倍以下、１８．０倍以下、１７．５倍以下、１７．０倍以下、１６．５倍以下、１６．０倍以下、１５．５倍以下、１５．０倍以下、１４．５倍以下、１４．０倍以下、１３．５倍以下、１３．０倍以下、１２．５倍以下、１２．０倍以下、１１．５倍以下、１１．０倍以下、１０．５倍以下、１０．０倍以下、９．５倍以下、９．０倍以下、８．５倍以下、８．０倍以下、７．５倍以下、７．０倍以下、６．５倍以下、６．０倍以下、５．５倍以下、又は５．０倍以下であってよく、例えば、１．１〜２０．０倍、例えば、１．５〜１０．０倍、例えば、２倍〜８倍であるとき、皮膚バリア機能に優れると診断することができる。
【００５０】
本発明の一実施例によると、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定する皮膚バリア機能診断用バイオマーカー組成物を提供することができる。本実施例に係る組成物を用いて、検体におけるＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定し皮膚バリア機能を診断することができる。
【００５１】
前記バイオマーカー組成物は、ｍＲＮＡに特異的に結合するプローブ又はプライマー対及びＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体の少なくとも一方を含んでいてよい。
【００５２】
前記検体、遺伝子、プローブ、プライマー対、及び抗体は、前記本発明の一実施例に係る診断方法に関して説明したところと同様であるため、これらについての記述を省略する。
【００５３】
本発明の一実施例によると、ＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定する皮膚バリア機能診断用キットを提供することができる。本実施例に係るキットを用いて、検体におけるＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検定し皮膚バリア機能を診断することができる。
【００５４】
前記キットは、前述した本発明の一実施例に係るバイオマーカー組成物を含んでいてよく、これに関しては前述したところと同様であるため、これについての記述を省略する。
【００５５】
一具体例において、前記キットは、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子に特異的に結合する一つ以上のポリヌクレオチド；及び前記一つ以上のポリヌクレオチドを表面に結合させた固相支持体を含み、
【００５６】
前記ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子に特異的に結合するポリヌクレオチドは、前記遺伝子のポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片、又は前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的なポリヌクレオチドを含んでいてよい。
【００５７】
他の具体例において、前記キットは、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子のポリヌクレオチドのｍＲＮＡを増幅することができるプライマー対を含んでいてよい。
【００５８】
また他の具体例において、前記キットは、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子からコードされるタンパク質に対するモノクローナル抗体を含んでいてよい。
【００５９】
本発明の一実施例によると、試験物質がＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を変化させることによる皮膚バリア機能改善物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【００６０】
前記スクリーニング方法は、表皮細胞を試験物質で処理し；そして、前記試験物質で処理した表皮細胞から試験物質による処理前後のＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の相対的発現程度を確認することを含んでいてよい。
【００６１】
前記試験物質による処理前後の遺伝子の相対的発現程度を比べて、試験物質による処理前よりも試験物質による処理後の前記遺伝子の相対的発現程度が高いとき、皮膚バリア機能改善物質と判定することができる。
【００６２】
例えば、前記遺伝子の相対的発現程度が、試験物質による処理前に比べ、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３．０倍以上、３．１倍以上、３．２倍以上、３．３倍以上、３．４倍以上、３．５倍以上、３．６倍以上、３．７倍以上、３．８倍以上、３．９倍以上、４．０倍以上、４．１倍以上、４．２倍以上、４．３倍以上、４．４倍以上、４．５倍以上、４．６倍以上、４．７倍以上、４．８倍以上、４．９倍以上、又は５．０倍以上であり、且つ２０．０倍以下、１９．５倍以下、１９．０倍以下、１８．５倍以下、１８．０倍以下、１７．５倍以下、１７．０倍以下、１６．５倍以下、１６．０倍以下、１５．５倍以下、１５．０倍以下、１４．５倍以下、１４．０倍以下、１３．５倍以下、１３．０倍以下、１２．５倍以下、１２．０倍以下、１１．５倍以下、１１．０倍以下、１０．５倍以下、１０．０倍以下、９．５倍以下、９．０倍以下、９．０倍以下、８．５倍以下、８．０倍以下、７．５倍以下、７．０倍以下、６．５倍以下、６．０倍以下、５．５倍以下、又は５．０倍以下であってよく、例えば、１．１〜２０．０倍、例えば、１．５〜１０．０倍、例えば、２〜８倍であるとき、皮膚バリア機能改善物質と判定することができる。
【００６３】
以下、実施例、比較例、及び試験例を参照して本発明を詳しく説明する。なお、これらは単に本発明をより具体的に説明するために例示したものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例、比較例及び試験例によって制限されないことは当業者にとって自明であろう。
【００６４】
［試験例１］表皮細胞からの嗅覚受容体遺伝子の発現様相の確認
新生児の正常ヒト表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ：Ｐ９８８、ロンザ）を、角化培地（ＫＧＭ）を用いて６０ｍｍ細胞培養ディッシュ（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ）に１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの密度で分注した後、３７℃、５％のＣＯ２培養器で８０％程度の培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで培養した。次いで、６日間培養しながら経時的な嗅覚受容体の発現変化を確認し、その結果を図１に示した。発現変化は、細胞成長培地を除去しトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍｌを添加し、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＲＮＡ分離法によってＲＮＡを分離してから、紫外線検定器（ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ）を用いて２６０ｎｍでＲＮＡを定量した後、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。各サンプルに対するＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１に係る遺伝子分析のためにｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ（Ｈｓ０２３３９２８６＿ｓ１、Ｈｓ０１０７３０３０＿ｓ１）を用い、相補的な遺伝子であるＲＰＬ１３Ａを基準に補正した。
【００６５】
図１の結果から、ＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１遺伝子は培養日が経過するにつれて発現が増加し、６日目までも増加した発現量で存在しており、表皮細胞の分化によって発現が増加する遺伝子であることを確認した。
【００６６】
［試験例２］紫外線の照射による表皮細胞からの嗅覚受容体遺伝子の発現
新生児の正常ヒト表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ：Ｐ９８８、ロンザ）を、角化培地（ＫＧＭ）を用いて６０ｍｍ細胞培養ディッシュ（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ）に１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの密度で分注した後、３７℃、５％のＣＯ２培養器で８０％程度の培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで培養した。培養した細胞を紫外線（ＵＶＢ  ２５ｍＪ／ｃｍ２）で処理し、２日間培養してから発現変化を確認し、その結果を図２に示した。発現変化は、前記試験例１と同様な方法にて測定した。対照群としては、赤外線無処理群を用いた。
【００６７】
図２の結果から、紫外線の照射によってＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現量は顕著に低下したことを確認することができる。
【００６８】
［試験例３］嗅覚受容体（ＯＲ６Ｍ１、ＯＲ６Ｖ１）遺伝子のノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）
ＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１の遺伝子機能を表皮細胞から確認するために、実施例１と同様な方法にて細胞を培養した後、ＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１遺伝子のそれぞれに対するｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ、ダーマコン社から購入、商品名：ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ｓｉＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）とリポフェクトアミンを用いて角化細胞にトランスフェクションし、選択的にＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１をノックダウンさせた後、２日後に二つの遺伝子のノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）程度を、ノックダウンさせていないもの（Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ；非ターゲット）と比較し、その結果を図３に示す。
【００６９】
図３の結果から、ＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１の遺伝子の発現量は、いずれも５０％以下に減少したことを確認することができる。
【００７０】
［試験例４］嗅覚受容体（ＯＲ６Ｍ１、ＯＲ６Ｖ１）遺伝子の機能喪失による表皮分化への影響
前記試験例３と同様な方法にてＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１の遺伝子のそれぞれをノックダウンさせた角化細胞において、表皮分化マーカーであるｋｅｒａｔｉｎ  １（ＫＲＴ１、Ｈｓ０１５４９６１４＿ｇ１）、ｋｅｒａｔｉｎ  １０（ＫＲＴ１０、Ｈｓ０１０４３１１４＿ｇ１）及びｌｏｒｉｃｒｉｎ（ＬＯＲ、Ｈｓ０１８９４９６２＿ｓ１）遺伝子の発現量をＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１の遺伝子をノックダウンさせていない場合（Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ；非ターゲット）と比較した。これらの遺伝子の発現量の確認はＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて試験例１と同様に施して確認し、その結果を図４に示す。
【００７１】
図４の結果から、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現抑制によってｋｅｒａｔｉｎ  １、ｋｅｒａｔｉｎ  １０及びｌｏｒｉｃｒｉｎ遺伝子の発現が顕著に低下したことを確認することができ、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の機能が表皮分化に大きく影響を及ぼすことが分かる。
【００７２】
［試験例５］嗅覚受容体（ＯＲ６Ｍ１、ＯＲ６Ｖ１）遺伝子の機能喪失による角質層の保湿因子への影響
前記試験例３と同様な方法にてＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１の遺伝子をそれぞれノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）させた角化細胞において、角質層の保水（ｗａｔｅｒ  ｈｏｌｄｉｎｇ）代謝因子であるブレオマイシンヒドロラーゼ（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）（ＢＬＭＨ；ＢＨと略称し、Ｈｓ００１６６０７１＿ｍ１）、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）（ＦＬＧ、Ｈｓ００８５６９２７＿ｇ１）及びカスパーゼ１４（ｃａｓｐａｓｅ  １４）（ＣＳＡＰ１４、Ｈｓ００２０１６３７＿ｍ１）遺伝子の発現量を、ＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１の遺伝子をノックダウンさせていない場合（Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ；非ターゲット）と比較した。これらの遺伝子の発現量の確認は、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて試験例１と同様に施して確認し、その結果を図５に示す。
【００７３】
図５の結果から、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現抑制によってブレオマイシンヒドロラーゼ（ＢＨ）、フィラグリン（ＦＬＧ）及びカスパーゼ１４遺伝子の発現が５０％以下に低下したことを確認することができ、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の機能低減によって最表層の角質層の変形を誘発し、保湿代謝機能低減を生じさせることが分かる。
【００７４】
［試験例６］嗅覚受容体（ＯＲ６Ｍ１、ＯＲ６Ｖ１）遺伝子の機能喪失によるタイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の変化
前記試験例３と同様な方法にてＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１の遺伝子のそれぞれをノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）させた角化細胞において、タイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）関連因子であるオクルディン（ｏｃｃｕｌｄｉｎ）（ＯＣＬＮ、Ｈｓ００１７０１６２＿ｍ１）、クローディン１（ｃｌａｕｄｉｎ１（ＣＬＤＮ１、Ｈｓ００２２１６２３＿ｍ１）及びＴＪＰ１（Ｈｓ０１５５１８６１＿ｍ１）遺伝子の発現量を、ＯＲ６Ｍ１とＯＲ６Ｖ１の遺伝子をノックダウンさせていない場合（Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ；非ターゲット）と比較した。これらの遺伝子の発現量の確認は、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて試験例１と同様に施して確認し、その結果を図６に示す。
【００７５】
図６の結果から、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１遺伝子の発現抑制によってオクルディン、クローディン１及びＴＪＰ１遺伝子の発現が５０％以下に低下したことを確認することができ、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の機能低減によって角質層の下の顆粒層、有棘層の細胞間接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）に変形を誘発することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月29日(2019.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
ヒトＯＲ６Ｖ１（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｖ  ｍｅｍｂｅｒ  １）遺伝子は、嗅細胞衣嗅覚受容体６Ｖ１（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ６Ｖ１）タンパク質をコードし、ＯＲ６Ｖ１遺伝子のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤはＮＭ＿００１００１６６７.１である。本発明者らは、前記遺伝子が表皮細胞から発現するときに皮膚バリア機能を改善する役割をすることを見出した。したがって、ＯＲ６Ｖ１遺伝子は、表皮細胞におけるこれらの遺伝子が皮膚バリア機能の診断、評価のためのバイオマーカーとして用いられ得、発現量の検定によって客観的な皮膚バリア機能の診断、評価が可能である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の発現量を検出する試薬を含む皮膚バリア機能診断用バイオマーカー組成物。
【請求項２】
前記試薬は、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプローブ又はプライマー対；及びＯＲ６Ｍ１又はＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体の少なくとも一方を含む、請求項１に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項３】
前記プローブは、前記遺伝子のポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片、又は前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的なポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項４】
前記プライマー対は、前記遺伝子のポリヌクレオチドの１０〜２０個の連続ヌクレオチド断片；及び前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な１０〜２０個の連続ヌクレオチド断片を含む、請求項２又は３に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項５】
前記抗体は、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子によってコードされるタンパク質に対するモノクローナル抗体である、請求項２〜４のいずれか一項に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項６】
前記遺伝子の発現量が正常値に比べて増加したとき、皮膚バリア機能に優れると診断する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項７】
前記遺伝子の発現量が正常値に比べて減少したとき、皮膚バリア機能が損傷されたと診断する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項８】
前記皮膚バリア機能改善は、表皮細胞分化の増進、皮膚保湿又は表皮細胞のタイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の改善の少なくとも一方を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオマーカー組成物を含む皮膚バリア機能診断用キット。
【請求項１０】
前記キットは、ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合する一つ以上のポリヌクレオチド；及び前記一つ以上のポリヌクレオチドを表面に結合させた固相支持体を含み、前記ＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するポリヌクレオチドは、前記遺伝子のポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片、又は前記遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド又は前記遺伝子の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的なポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記キットは、検体における前記遺伝子の発現量が正常値に比べて増加したとき、皮膚バリア機能に優れると診断し、且つ前記遺伝子の発現量が正常値に比べて減少したとき、皮膚バリア機能が損傷されたと診断する、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
表皮細胞を試験物質で処理し；そして、前記試験物質で処理した表皮細胞から試験物質による処理前後のＯＲ６Ｍ１及びＯＲ６Ｖ１の少なくとも一方の遺伝子の相対的発現程度を確認することを含む、皮膚バリア機能改善物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記試験物質で処理した表皮細胞において試験物質による処理前に比べて前記遺伝子の相対的発現程度が高いとき、皮膚バリア機能改善物質と判定することをさらに含む、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記遺伝子の相対的発現程度が試験物質による処理前に比べて１．１倍以上であるとき、皮膚バリア機能改善物質と判定する、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記表皮細胞は、角化細胞又はメラニン形成細胞の少なくも一方である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記皮膚バリア機能改善は、表皮細胞分化の増進、皮膚保湿又は表皮細胞のタイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の改善の少なくとも一方を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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