(57)【要約】  トラスツズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含む１つの抗原結合部位と、ペルツズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含む別の抗原結合部位とを含む、ヒト化二重特異性抗ＨＥＲ２抗体。二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、乳癌、胃癌、卵巣癌等の癌の治療に有効である。好ましい二重特異性抗ＨＥＲ２抗体は、非フコシル化抗体である。グリカン調節に影響を及ぼす変異体における唯一の機能不全遺伝子である機能不全Ｓｌｃ３５Ｃ１遺伝子を有するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）変異細胞株もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化二重特異性抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号９のアミノ酸配列を有する可変領域（第１のＶＨ）を含む第１の重鎖、
配列番号１７のアミノ酸配列を有する可変領域（第１のＶＬ）を含む第１の軽鎖、
配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変領域（第２のＶＨ）を含む第２の重鎖、および
配列番号１８のアミノ酸配列を有する可変領域（第２のＶＬ）を含む第２の軽鎖を含み、
前記第１のＶＨおよび前記第１のＶＬは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記第２のＶＨおよび前記第２のＶＬは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第２の抗原結合部位を形成する、ヒト化二重特異性抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記第１の重鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を有する定常領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記第１の重鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記第１の軽鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する定常領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記第１の軽鎖は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記第２の重鎖は、配列番号８のアミノ酸配列を有する定常領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記第２の重鎖は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記第２の軽鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する定常領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記第２の軽鎖は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体のＦｃ領域に結合した全糖類の１０％以下の量のフコースを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体の前記Ｆｃ領域に結合した全糖類の５％以下の量のフコースを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた、単離された宿主細胞または非ヒト生物。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体または抗原結合断片
ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤、および／またはアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
癌の治療方法であって、有効量の請求項１に記載の抗体または抗原結合断片を、
前記治療を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記癌は、乳癌、胃癌、
卵巣癌、食道癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、
または頭頸部癌、または前立腺癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌は、乳癌、胃癌、または卵巣癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
機能不全Ｓｌｃ３５Ｃ１遺伝子を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）変異細胞株であって、前記ＣＨＯ変異細胞株は、グリカンの調節に影響を及ぼす１つの機能不全遺伝子のみを含む、ＣＨＯ変異細胞株。
【請求項１９】
タンパク質に結合した全糖類の５％以下のフコシル化を有するタンパク質を発現する、請求項１８に記載のＣＨＯ変異細胞株。
【請求項２０】
ＣＧＭＣＣ第１４２８７の寄託番号を有する、請求項１８に記載のＣＨＯ変異細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表、表またはコンピュータープログラムへの参照
配列表は、作成日２０１７年３月１３日、サイズ３０．７キロバイトの「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名で、ＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、腫瘍学治療および分子免疫学の分野に関し、抗Ｈｅｒ２抗体、ならびにその医薬組成物および使用に関する。特に、本発明は、トラスツズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含む１つの抗原結合部位と、ペルツズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含む別の抗原結合部位とを含む、ヒト化二重特異性抗Ｈｅｒ２抗体に関する。本発明はまた、機能不全Ｓｌｃ３５Ｃ１遺伝子を有するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）変異細胞株にも関し、該変異細胞株は、フコシル化が低減したタンパク質を発現する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２、ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ２と略される）は、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。正常細胞において、Ｈｅｒ２は非常に低い発現量を有するが、Ｈｅｒ２は、胚発生の期間中に高度に発現され、細胞増殖、分化、発生、接着および遊走の調節において非常に重要である（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｃ．ａｎｄ  Ｒ．Ｓｃｈｉｆｆ，ＨＥＲ２：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ，２０１１．１３５（１）：ｐ．５５−６２．）。
【０００４】
Ｈｅｒ２はヒト上皮増殖因子受容体のファミリーに属し、このファミリーは、Ｈｅｒ１（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３およびＨｅｒ４の４つのメンバーからなる。Ｈｅｒ２は特異的リガンドを有さず、その下流経路の活性化は同種または異種二量体の形成に依存する（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ，２０１１．１３５（１）：ｐ．５５−６２．）。ヒト上皮増殖因子は、全て細胞表面上に位置し、類似の構造を有する：リガンドに結合する１つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、１つの単一膜貫通αヘリックス膜貫通ドメイン、および細胞内膜近位ドメイン、チロシンキナーゼ触媒ドメイン、ならびに制御的役割を果たすチロシンリッチＣ末端テールドメインからなる１つの細胞内領域（Ｅｃｃｌｅｓ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，２０１１．５５（７−９）：ｐ．６８５−９６．）。ヒト表上皮増殖因子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はさらに４つのサブドメイン、すなわち、領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに分けることができ、領域ＩＩおよびＩＶはシステインリッチドメインであり、受容体の二量体化および活性化に関与する。
【０００５】
Ｈｅｒ２の過剰発現は、細胞の正常機能の障害をもたらし得、通常、腫瘍の形成および発生に密接に関連している。Ｈｅｒ２の同種または異種重合は、受容体のチロシン残基のリン酸化を引き起こし、多くのシグナル経路を開始し、細胞増殖および腫瘍形成を引き起こし得る。予後および予測のためのバイオマーカーとして、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅または過剰発現は、約１５〜３０％の乳癌および１０〜３０％の胃／食道癌において起こる。Ｈｅｒ２の過剰発現はまた、卵巣、子宮内膜、膀胱、肺、結腸、および頭頚部の腫瘍等の他の腫瘍においても観察され得る。
【０００６】
乳癌において、Ｈｅｒ２は一般に予測因子および治療標的として認識されている。Ｈｅｒ２は特異的リガンドを有しないため、その抗体は通常、受容体の二量体化および活性化を阻止し、免疫系の殺傷効果を媒介することによって腫瘍細胞を抑制する。
現在、トラスツズマブおよびペルツズマブは、Ｈｅｒ２を標的とする主要な市販の治療用抗体である。
【０００７】
１９９８年に、ＦＤＡは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．社製のＨｅｒ２を標的とするヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）とも称される、ヒト化度９５％）を承認した。この抗体は、Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＶ膜近傍エピトープを認識し、その抗原親和性定数は最大０．１ｎｍｏｌ／Ｌであり得る。トラスツズマブは、セクションＩＶのＣ末端にある３つのループ（５５７−５６１、５７０−５７３および５９３−６０３）からなるエピトープを認識する。エピトープは、その二量体化パートナーの結合ドメインに近いかまたはそれと直接相互作用し得るため、トラスツズマブのエピトープへの結合は二量体化プロセスを阻害する立体障害を誘導し得る。さらに、トラスツズマブの結合は、Ｈｅｒ２受容体の細胞外ドメインを加水分解のためのプロテイナーゼによる攻撃から保護することもできる。
【０００８】
トラスツズマブの作用機序は以下を含み得る：免疫誘導性生物活性（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）およびナチュラルキラー細胞活性）、Ｈｅｒ２受容体の内在化の誘導、ＤＮＡ修復の阻害、ＰＩ３Ｋ経路の破壊、ｐ２７ｋｉｐ１によって誘導されるＧ１周期停止の活性化、癌細胞のアポトーシスの刺激、および受容体の細胞外ドメインからの細胞内ｐ９５ドメインの活性化の阻害［４、５］。その中でも、トラスツズマブが誘発する免疫媒介性の治療生理活性が報告されている。具体的には、ＢＴ４７４異種移植マウスモデルにおいて示されたように、ＡＤＣＣは重要な役割を果たし、ＦＣ受容体がノックアウトされると、癌増殖の抑制率は９６％から２９％に減少した（Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２０００，６：４４３−６）。Ｋｏｈｒｔら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０１２．１２２（３）：１０６６−７５）は、ＣＤ１３７特異的抗体によるナチュラルキラー細胞の刺激が乳癌の異種移植モデルにおけるトラスツズマブの有効性を増強することを報告している。
【０００９】
トラスツズマブは、現在、乳癌の治療のための第一選択薬として使用されており、Ｈｅｒ２過剰発現を有する転移性乳癌の治療に有効であり、単剤での第一選択治療の客観的な反映率は３０〜５０％である：しかしながら、トラスツズマブは、より低いＨｅｒ２発現を有する転移性乳癌の治療において満足のいく効果を有しておらず、抗体が１年以内は最初に有効である多くの患者において耐性が生じている。これは、腫瘍細胞におけるいくつかの遺伝子発現の変化によって引き起こされる抗原エピトープの遮蔽または受容体シグナル伝達経路の異常な活性化に関連している可能性がある。さらに、Ｈｅｒ２は、ファミリーの他のメンバー（Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ３およびＨｅｒ４）と一緒に、リガンド依存性またはリガンド非依存性の異種二量体を形成することができ、それによって下流経路を活性化し、次いで腫瘍細胞の増殖をもたらすが、一方、トラスツズマブは異種二量体の形成を阻害できないため、これが耐性の発現の理由の１つであるかもしれない。
【００１０】
ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））は、２０１２年に米国での販売がＦＤＡにより承認されており、進行性前立腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および乳癌に対してある特定の治療効果を有するが、その治療効果は依然としてＨｅｒ２発現量に依存している。
【００１１】
ペルツズマブは、Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＩの異種二量体化のための重要な部位を認識し、それによって認識されるエピトープはＩＩサブ領域中心のセグメント２４５〜３１１に位置し、重要な残基はＨ２４５、Ｖ２８６、Ｓ２８８、Ｌ２９５、Ｈ２９６およびＫ３１１である。その中で、Ｌ２９５、Ｈ２９６は、Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３の異種二量体化を媒介するための重要な部位であり、Ｌ２９５Ａ／Ｈ２９６Ａの二重突然変異は、Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３の異種二量体化を完全に遮断することができる（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ２−ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２００４．５（４）：ｐ．３１７−２８．）。それ故、ペルツズマブは、Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３異種二量体の形成を効果的に阻害するために使用され得るが、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２異種二量体の形成に対しては明らかな阻害効果を示さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
現在、新しい抗ＨＥＲ２抗体を開発する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のヒト化二重特異性抗Ｈｅｒ２抗体の好ましい実施形態の構造を示す。
【００１４】
【図２】Ｓｌｃ３５ｃ１遺伝子をノックアウトしたＣＨＯ変異株ＣＨＯＫ１−ＡＦの調製方法のフローチャートを示す。
【００１５】
【図３】ＦＡＣＳによって決定されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａ）およびＣＨＯＫ１−ＡＦ細胞（Ｂ）のフコース発現量を示す。
【００１６】
【図４】ＭＢＳ３０１のインタクトな分子量スペクトルを示す。
【００１７】
【図５】Ｎ型糖鎖切除修飾後のＭＢＳ３０１のインタクトな分子量スペクトルを示す。
【００１８】
【図６】ＭＩＬ２０３ＡＦ、ＭＩＬ２０４ＡＦ、およびＭＢＳ３０１のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【００１９】
【図７】ＭＩＬ２０３／２０４およびＭＢＳ３０１のＮ型糖鎖種の解析結果を示す。
【００２０】
【図８】ＳＫＢＲ−３細胞に対するＡＤＣＣの作用を示す。
【００２１】
【図９】ＢＴ４７４細胞に対するＡＤＣＣの作用を示す。
【００２２】
【図１０】ＳＷ４８０細胞に対するＡＤＣＣの作用を示す。
【００２３】
【図１１】ＨＣＣ１４１９に対するＡＤＣＣの作用を示す。
【００２４】
【図１２】ＢＴ４７４細胞に対する直接殺細胞効果を示す。
【００２５】
【図１３】ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞に対する直接殺細胞効果を示す。
【００２６】
【図１４】ＳＫＢＲ−３細胞に対する直接殺細胞効果を示す。
【００２７】
【図１５】ＨＣＣ１４１９細胞に対する直接殺細胞効果を示す。
【００２８】
【図１６】ＮＣＩ−Ｎ８７細胞に対する直接殺細胞効果を示す。
【００２９】
【図１７】ＢＴ４７４細胞に対するＣＤＣの作用を示す。
【００３０】
【図１８】ヌードマウスにおけるヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３のインビボでの腫瘍増殖に対する抑制効果を示す。
【００３１】
【図１９】マウスにおけるヒト乳癌細胞ＢＴ４７４のインビボでの腫瘍増殖に対する抑制効果を示す。
【００３２】
【図２０】マウスにおけるヒト胃癌細胞ＮＣＩ−Ｎ８７のインビボでの腫瘍増殖に対する抑制効果を示す。
【００３３】
【図２１】トラスツズマブ耐性胃癌ＧＡ０５５  ＰＤＸモデルにおけるインビボでの腫瘍体積に対する抑制効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「約」は列挙された値の±１０％を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、所望の効果を得るまたは少なくとも部分的に得るための量を指す。有効量は、当業者によって決定され得る。例えば、治療使用のための有効量は、治療される疾患の重症度、患者の免疫系の全体的な状態、年齢、体重および性別等の患者の全身状態、薬物の投与方法、ならびに同時に適用される他の治療法に依存する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」は、抗原とともに送達されたときに、抗原に対する対象の免疫応答を増強し得るか、または免疫応答のタイプを変更し得る、非特異的免疫エンハンサーを指す。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント、リポ多糖類、および細胞因子を含むがこれらに限定されない、多くの種類のアジュバントが存在する。フロイントアジュバントは、現在、動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントであり、一方、水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床実験で使用されることが多い。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、通常２対のポリペプチド鎖（各対は軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリンを指す。抗体軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして分類することができ、抗体のアイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして別々に定義される。軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸を有する「Ｊ」領域を介して連結され、重鎖は、約３個以上のアミノ酸を有する「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。抗体の定常領域は、免疫グロブリンを媒介して、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子に結合させることができる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存的な領域が散在する高頻度可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）としてさらに分類することができる。これらのＶＨおよびＶＬ領域は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなる。重鎖／軽鎖の各対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、抗体結合部位を形成する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」（ＡＤＣＣ）は、細胞媒介性の免疫防御の機構であり、この機構によって、膜表面抗原が特異的抗体と結合している標的細胞を免疫系のエフェクター細胞が活発に溶解する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、全長抗体が結合するのと同じ抗原に特異的に結合するおよび／または抗原に特異的に結合するために全長抗体と競合する能力を保持する、全長抗体の断片を含むポリペプチドを指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は補体系の機能である。免疫系の抗体または細胞の関与なしにそれらの膜を損傷させることによって病原体を死滅させることは、免疫系におけるプロセスである。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「コアフコース」は、Ｎ型糖鎖のコア５糖のアスパラギンに関連してＧｌｃＮＡＣに結合したフコースを指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「ＥＣ５０」は、最大効果の５０％のための濃度、すなわち最大効果の５０％を引き起こす濃度を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「ＦｃγＲＩＩＩａ」は、２つのＣ２構造を有する、Ｉｇスーパーファミリーに属する５０〜７０ｋＤａの糖タンパク質であり、その遺伝子は染色体の１ｑ２３〜２４に位置する。ＦｃγＲＩＩＩは、ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ３に結合し、低親和性受容体である。ＦｃγＲＩＩＩは、２つのアロタイプ、ＦｃγＲＩＩＩ  ＡおよびＦｃγＲＩＩＩ  Ｂを含む。ＦｃγＲＩＩＩ  Ａ（ＡＡＨ１７８６５．１、ＧｅｎＢａｎｋ）は膜貫通構造を有し、主にマクロファージ、ＮＫ細胞および好酸球性顆粒球に分布し、マクロファージは高発現レベルのＦｃγＲＩＩＩ  Ａを有する一方で、単核細胞はより低い発現量を有する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ジスルフィド結合で連結したＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγ鎖二量体に関し、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ上のＣＤ３複合体γ鎖に関し、ＦｃγＲＩＩＩＡはＮＫ／ＬＧＬ上のζ鎖に関する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「ＦｃＲｎ」は、大きなサブユニットおよび小さなサブユニットからなる異種二量体である新生児Ｆｃ受容体（Ｐ６１７６９、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）であり、大きなサブユニットは、４５〜５３ｋＤの分子量を有し、α鎖と呼ばれ、小さいサブユニットは、β２ミクログロブリン（β２ｍ）であり、１４ｋＤの分子量を有し、β鎖と呼ばれるが、２つの鎖は非共有結合形態で一緒に結合している。生理学的ｐＨが７．４の場合、ＦｃＲｎはＩｇＧに結合しないが、エンドソーム酸性ｐＨ６〜６．５の条件下では、ＩｇＧ  Ｆｃに対するＦｃＲｎの親和性はナノモルからマイクロモルの範囲である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「Ｈｅｒ２」という用語は、全長（ＮＰ＿００４４３９．２）のＨｅｒ２、あるいはＨｅｒ２の細胞外断片またはドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶ、あるいはそれらの少なくとも１つを含む断片を指すか、あるいはＨｅｒ２細胞外断片を含む融合タンパク質を含む。しかしながら、当業者は、Ｈｅｒ２のアミノ酸配列が、その生物学的機能に影響を与えることなく、自然発生的または人工的に導入された突然変異または変異（置換、欠失および／または付加を含むがこれらに限定されない）を有し得ることを理解するであろう。したがって、本発明において、用語「Ｈｅｒ２」はこれらの配列のいずれか１つを含むべきである。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、ベクターが導入され得る細胞を指し、これは、限定されないが、例えば、大腸菌もしくは枯草菌等の原核細胞、酵母細胞もしくはアスペルギルス等の真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞もしくはＳｆ９細胞等の昆虫細胞、または線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞もしくはヒト細胞の等の動物細胞を含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「ＫＤ」は、抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために使用される、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」は、対象および活性成分に薬理学的および／または生理学的に適合する担体および／または賦形剤を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ，１９ｔｈ  ｅｄ．  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照されたい）。薬学的に許容される担体として、限定されないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が挙げられる。例えば、ｐＨ調整剤として、限定されないがリン酸緩衝液が挙げられ、界面活性剤として、限定されないがカチオン性、アニオン性、または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０が挙げられ、イオン強度増強剤として、限定されないが塩化ナトリウムが挙げられる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」は、２つの分子間の非ランダム結合反応、例えば抗体とその抗原との間の反応を指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドを挿入するために使用され得る核酸ベクターを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは発現ベクターと称される。ベクターは、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができ、そのため、ベクターによって担持される遺伝物質要素が宿主細胞において発現される。ベクターは当業者に周知であり、限定されないが、プラスミド、ファスミド、コスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、λファージまたはＭ１３ファージ等のファージ、および動物ウイルスを含む。ベクターとして使用可能な動物ウイルスとして、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、限定されないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびレポーター遺伝子を含む複数の発現制御要素を含み得る。また、ベクターは複製開始部位をさらに含んでもよい。
【００５１】
説明
本発明は、トラスツズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含む１つの抗原結合部位と、ペルツズマブの重鎖および軽鎖の可変領域を含む別の抗原結合部位とを含む、ヒト化二重特異性抗Ｈｅｒ２抗体またはその二重特異性抗原結合断片に関する。二重特異性抗体は、Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＶおよびＩＩを認識する。
【００５２】
本発明の抗Ｈｅｒ２抗体または抗原結合断片は、トラスツズマブに関連する第１の重鎖および第１の軽鎖と、ペルツズマブに関連する第２の重鎖および第２の軽鎖とを含む。
【００５３】
第１の重鎖は、アミノ酸配列が配列番号１〜３に示されるＣＤＲを有するＶＨと、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＨとを含む。一実施形態において、非ＣＤＲ領域はヒト抗体に由来する。
【００５４】
第２の重鎖は、アミノ酸配列が配列番号４〜６に示されるＣＤＲを有するＶＨと、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＨとを含む。一実施形態において、非ＣＤＲ領域はヒト抗体に由来する。
【００５５】
第１の重鎖では以下の通りである：
ＣＤＲ１：ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号１）
ＣＤＲ２：ＩＹＰＴＮＧＹＴ（配列番号２）
ＣＤＲ３：ＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ（配列番号３）。
【００５６】
第２の重鎖では以下の通りである：
ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＴＤＹＴ（配列番号４）
ＣＤＲ２：ＶＮＰＮＳＧＧＳ（配列番号５）
ＣＤＲ３：ＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号６）。
【００５７】
第１の重鎖の定常領域（配列番号７）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００５８】
第２の重鎖の定常領域（配列番号８）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００５９】
一実施形態において、第１の重鎖ＶＨは、以下に示すアミノ酸配列を有する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）
【００６０】
第２の重鎖ＶＨは、以下に示すアミノ酸配列を有する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）
【００６１】
抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、第１の軽鎖および第２の軽鎖をさらに含む。
【００６２】
アミノ酸配列が配列番号１１〜１３に示されるＣＤＲを有するＶＬを含む第１の軽鎖。一実施形態において、非ＣＤＲ領域はヒト抗体に由来する。
【００６３】
アミノ酸配列が配列番号１４〜１６に示されるＣＤＲを有するＶＬを含む第２の軽鎖。一実施形態において、非ＣＤＲ領域はヒト抗体に由来する。
【００６４】
第１の軽鎖では以下の通りである：
ＣＤＲ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号１１）
ＣＤＲ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１２）
ＣＤＲ３：ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号１３）。
【００６５】
第２の軽鎖では以下の通りである：
ＣＤＲ１：ＱＤＶＳＩＧ（配列番号１４）
ＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１５）
ＣＤＲ３：ＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号１６）。
【００６６】
本発明の一実施形態において、第１の軽鎖ＶＬは以下に示すアミノ酸配列を有する。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１７）
【００６７】
第２の軽鎖ＶＬは、以下に示すアミノ酸配列を有する。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１８）
【００６８】
本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＨ）を含む第１の重鎖、配列番号１７のアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＬ）を含む第１の軽鎖、配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＨ）を含む第２の重鎖、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＬ）を含む第２の軽鎖を含み、
第１のＶＨおよび第１のＶＬは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに特異的な第１の抗原結合部位を形成し、第２のＶＨおよび第２のＶＬは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩに特異的な第２の抗原結合部位を形成する、ヒト化二重特異性抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６９】
本発明の一実施形態において、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖ＣＨおよび／または第２の軽鎖ＣＨをさらに含む。
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）
【００７０】
本発明の一実施形態において、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する第１の重鎖を含み、下線部は重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
2019528779.tif 000002
（配列番号２２）
【００７１】
本発明の一実施形態において、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖を含み、下線部は軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
2019528779.tif 000003
（配列番号２３）
【００７２】
本発明の一実施形態において、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２５のアミノ酸配列を有する第２の重鎖を含み、下線部は重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
2019528779.tif 000004
（配列番号２５）
【００７３】
本発明の一実施形態において、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含み、下線部は軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
2019528779.tif 000005
（配列番号２６）
【００７４】
本発明の一実施形態において、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、抗体のＦｃ領域に結合した全糖類の２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、８％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１．５％以下、または１．１％以下のフコース糖鎖種を含む。フコース糖鎖種の含有量は、全てのフコース含有糖鎖種の含有量を合計することにより得られ、例えば、Ｎ型糖鎖決定法により決定される。
【００７５】
本発明の一実施形態において、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片は、約１００ｎＭ未満、例えば約１０ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ未満、またはそれ以下のＥＣ５０でＨｅｒ２タンパク質に結合する。ＥＣ５０は、Ｂｉａｃｏｒｅ法によって決定され得る。
【００７６】
本発明の二重特異性抗体は、ペルツズマブとトラスツズマブとを組み合わせ、Ｈｅｒ２媒介シグナル伝達のより完全な遮断から利益を得る。トラスツズマブは、Ｈｅｒ２ホモ二量体化の形成を阻害し、タンパク質分解的切断を受けているＨｅｒ２の細胞外ドメインが構成的に活性なｐ９５タンパク質を形成するのを防止し、ペルツズマブは、Ｈｅｒ２ヘテロ二量体形成を遮断し、次いで、Ｈｅｒ２媒介シグナル伝達を完全に遮断する。単独で使用される場合、ペルツズマブおよびトラスツズマブはＣＤＣ活性を有しない。しかしながら、本発明の二重特異性抗体は、少なくとも１つのインビトロ細胞ベースアッセイにおいて観察されるように強いＣＤＣ活性を示す。
【００７７】
本発明の二重特異性抗体は、異なるＨｅｒ２エピトープを標的とすることで、その腫瘍抑制効果を増強して相乗効果を達成し、ＡＤＣＣ機能を増強する。
【００７８】
一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃ  Ｎ−グリカン由来のコアフコース残基を欠き、低濃度で強いＡＤＣＣを示す。これは、非フコシル化抗体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＦｃガンマ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）との結合親和性を高め、したがって抗体のＡＤＣＣ活性を増大させるためである。同時に、非フコシル化抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージ細胞上のＦｃガンマ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）との結合に対する血清中のヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）からの阻害効果を抑制することができるが、それは、後者のＦｃγＲＩＩＩａとの結合親和性がはるかに弱いためである。
【００７９】
ＦｃγＲＩＩＩａとの抗体親和性を増加させるためのコアフコシル化の除去は、ＡＤＣＣを増加させるための最も有効な方法の１つである。現在市販されているほとんどの治療用抗体は高度にフコシル化されているが、それは、それらの抗体が生成物のＦｃ  Ｎ−グリカンのコアフコシル化を担う固有の酵素活性を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞株によって産生されるためである。本発明は、グリカンのフコシル化を厳密に調節するＧＤＰ−フコーストランスポーターＳＬＣ３５Ｃ１をコードする機能不全Ｓｌｃ３５Ｃ１遺伝子を有するＣＨＯ変異株を提供する。本発明のＣＨＯ変異株は、グリカンの調節に影響を及ぼすＣＨＯ由来の１つの機能不全遺伝子のみを含み（すなわち、Ｓｌｃ３５Ｃ１遺伝子がノックアウトされている）、ＣＨＯ変異株は、グリカンの調節に影響を及ぼす他の機能不全遺伝子を含まない。例えば、ＣＨＯ変異株は、シアル酸の産生に影響を及ぼす機能不全遺伝子を含まない。本発明のＳＬＣ３５Ｃ１欠損ＣＨＯ細胞は、抗体のＦｃ領域に結合した全糖類の約１０％以下、８％以下、６％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１．５％以下、または１．１％以下のフコース含有量を有する抗体を産生する。
【００８０】
本発明は、変異型ＳＬＣ３５Ｃ１欠損ＣＨＯ細胞を産生する方法を提供する。本方法は、宿主ＣＨＯ細胞において重要なフコース修飾タンパク質ＧＦＴ（ＧＤＰ−フコーストランスポーター）をノックアウトするためにジンクフィンガー酵素ノックアウト技術を使用し、産生される抗体のフコシル化レベルを効果的に減少させる。この方法は、フコシル化の古典的経路および代償経路の両方を遮断することができるため、本方法はフコシル化を低減するのに有効である。本方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を用いて、ＧＦＴ遺伝子Ｓｌｃ３５ｃ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＥ１６１７３．１）のための２つのＧＦＴジンクフィンガーヌクレアーゼを設計することを含む：２つのジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡに別々に結合するように設計される。ＧＦＴのための２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ配列をクローニングして２つの発現ベクターを構築する。２つの発現ベクターは、当業者に既知の適切な方法によって、例えばエレクトロトランスフェクション技術によって、標的ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトされる。トランスフェクション後、トランスフェクトした細胞を培養し、継代および増幅を行う。フコシル化修飾されていないクローンは、複数回のネガティブ分離およびクローン培養により選択される。ある特定の方法を図２に例示する。
【００８１】
本発明は、抗体のＡＤＣＣ効果を高める、二重特異性抗体のコアフコシル化を除去する方法を提供する。本発明の方法において、二重特異性抗体は、１．５％未満のコアフコースレベルをもたらす機能不全Ｓｌｃ３５Ｃ１遺伝子、例えばＣＨＯＫ１−ＡＦを有するＣＨＯ変異株を用いて生成される。本特許のＭＢＳ３０１は、コアフコース単位を除去しないＭＩＬ２０３／２０４と比較して、ＡＤＣＣ活性において１０倍の増加を有する。
【００８２】
本発明の二重特異性抗体、例えばＭＢＳ３０１は、Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＶおよびＩＩに対して結合するように設計され、各抗体を単独で使用するよりも高い、マウスにおける直接殺細胞活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性および腫瘍抑制能力を有する。ＭＢＳ３０１は、インビトロ細胞株活性試験においてトラスツズマブおよびペルツズマブの併用と比較した場合、より高い直接殺細胞活性、より高いＡＤＣＣ活性を示すが、ＣＤＣ活性はトラスツズマブおよびペルツズマブの併用と同様である。
【００８３】
一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、異種半抗体の対合を容易にするためにＣＨ３領域内に修飾アミノ酸配列を有する「ノブ・イン・ホール」抗体である。例えば、第１の重鎖の定常領域は、ヒトＦｃ由来の３つの突然変異を有する：該突然変異は、配列番号７のＴ３６９Ｓ、Ｌ３７１Ａ、およびＹ４１０Ｖである。第２の重鎖の定常領域は、ヒトＦｃ由来の１つの突然変異を有する：該突然変異は、配列番号８のＴ３６８Ｗである。「ノブ・イン・ホール」構造抗体は、通常の抗体構造およびサイズを維持し、二機能活性を提供する。
【００８４】
一実施形態において、本発明は、本発明のＨｅｒ２抗体の第１および第２の重鎖ならびに第１および第２の軽鎖をコードすることができる単離された核酸分子に関する。
【００８５】
別の態様において、本発明は、本発明の単離された核酸を含むベクターに関する。
【００８６】
別の態様において、本発明は、本発明の単離された核酸分子または本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、宿主細胞はＣＨＯＫ１−ＡＦ細胞である。好ましくは、宿主細胞において、ＧＦＴの遺伝子（フコース修飾経路における重要なタンパク質）は、部位直接的にノックアウトされる。好ましくは、ノックアウトはジンクフィンガーヌクレアーゼ技術によって行われる。好ましくは、ＧＦＴの遺伝子中のＳＬＣ３５ｃ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＡＥ１６１７３．１）は、部位直接的にノックアウトされる。本発明の一実施形態において、フコースはコアフコースである。
【００８７】
別の態様において、本発明は、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片およびカップリング部分を含むコンジュゲートに関し、抗Ｈｅｒ２抗体は、本発明の項目のいずれか１つによる抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片であり、好ましくは、カップリング部分は、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、着色物質または酵素である。
【００８８】
別の態様において、本発明は、本発明による抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片を含むか、または本発明のコンジュゲートを含むキットに関する。キットは、抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含んでもよく、任意選択的に、二次抗体は、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、着色物質または酵素等の検出可能な標識をさらに含む。
【００８９】
別の態様において、本発明は、キットの製造における本発明による抗Ｈｅｒ２抗体もしくはその抗原結合断片または本発明のコンジュゲートの使用に関し、キットは、試料中のＨｅｒ２またはＨｅｒ２のレベルを検出するために使用される。
【００９０】
別の態様において、本発明は、本発明の抗Ｈｅｒ２抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートを含み、任意選択的に、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含み、任意選択的に、１つ以上の化学療法薬または細胞毒性薬をさらに含む、医薬組成物に関する。化学療法薬または細胞毒性薬は、以下から選択され得る：（１）ＤＮＡ化学構造に作用する薬物：メクロレタミン、ニトロソ尿、メチルスルホン酸エステル等のアルキル化剤；シス−白金、カルボプラチン、およびオキサリプラチン等の白金化合物；マイトマイシン（ＭＭＣ）；（２）核酸の合成に影響を与える薬剤：メトトレキサート（ＭＴＸ）およびアリムタ等のジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤；フルオロウラシル（５ＦＵ、ＦＴ−２０７、カペシタビン）等のチミジンシンターゼ阻害剤；６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）および６−ＴＧ等のプリンヌクレオシドシンターゼ阻害剤；ヒドロキシウレア（ＨＵ）等のヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）およびＧｅｍｚ等のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤；（３）核酸転写に作用する薬物：アクチノマイシンＤ、ルビドマイシン、アドリアマイシン、エピルビシン、アクラシノマイシン、ミトラマイシン等の、ＤＮＡテンプレートに選択的に作用し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを阻害することによってＲＮＡ合成を阻害する薬物；（４）主に微小管合成に作用する薬剤：パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチナム、ビノレルビン、ポドフィロトキシン、ホモハリングトニン；（５）他の細胞毒性薬：主にタンパク質合成を阻害するアスパラギナーゼ；ホルモン：抗エストロゲン剤：タモキシフェン、ドロロキシフェン、エキセメスタン等；アロマターゼ阻害剤：アミノグルテチミド、レンタロン、レトロゾール、Ａｒｉｍｉｄｅｘ等；抗アンドロゲン剤：フルタミドＲＨ−ＬＨアゴニスト／アンタゴニスト：ゾラデックス、エナントン等；生物学的応答調節剤：主に身体の免疫機能を介して腫瘍を抑制するインターフェロン；インターロイキン−２；チモシン；モノクローナル抗体：リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ）；セツキシマブ（Ｃ２２５）；ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）；トレチノイン等の細胞分化誘導剤；細胞アポトーシス誘導剤。本発明によって開示される二重特異性抗体およびその組成物は、前述の抗腫瘍薬のうちの１つ以上との薬物の組み合わせで使用することができる。
【００９１】
別の態様において、本発明は、癌の予防および／または治療および／または診断のための薬物の製造における、本発明の抗Ｈｅｒ２抗体もしくはその抗原結合断片または本発明のコンジュゲートの使用に関する：癌は、乳癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、頭頸部癌、および前立腺癌から選択され、例えば、前立腺癌は進行性前立腺癌であり、乳癌は転移性乳癌である。
【００９２】
本発明は、さらに癌の治療方法に関する。方法は、有効量の本発明の抗Ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合断片を、治療を必要とする対象に投与する工程を含む。癌は、乳癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、頭頸部癌、および前立腺癌を含む。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、全身投与または局所投与により適用することができる。全身投与は、経口、非経口（静脈内、筋肉内、皮下、または直腸等）、および他の全身投与経路を含む。全身投与において、活性化合物は、最初に血漿に到達し、次いで標的組織に分布する。
【００９４】
組成物の投薬は、癌の程度および各患者の個々の反応に基づいて異なり得る。全身投与の場合、送達される活性化合物の血漿濃度は様々であり得るが、一般的には１×１０−１０−１×１０−４モル／リットルであり、好ましくは１ｘ１０−８−１×１０−５モル／リットルである。
【００９５】
当業者は、多種多様な送達機構もまた本発明に適していることを認識するであろう。
【００９６】
本発明は、ヒト、ウマ、およびイヌ等の哺乳動物対象を治療するのに有用である。本発明は、ヒトを治療するのに特に有用である。
【００９７】
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００９８】
実施例で使用される略語／用語は以下の通りである。
【００９９】
ＭＩＬ４０：ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）アミノ酸配列と一致する、本発明者らによって調製されたＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）試料。
【０１００】
ＭＩＬ４１：ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）のアミノ酸配列と一致する、本発明者らによって調製されたＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）試料。
【０１０１】
ＭＩＬ２０３：重鎖および軽鎖のアミノ酸配列が実施例１として設計された不完全抗体（半抗体）。
【０１０２】
ＭＩＬ２０３ＡＦ：フコースノックアウト操作細胞株（ＣＨＯＫ１−ＡＦ）において発現されること以外はＭＩＬ２０３と同一のアミノ酸配列。そのＮ型糖鎖修飾された糖鎖種において、コアフコースを含まない糖鎖種の比率は９８．５以上％であり、すなわち、コアフコースは１．５％未満である。
【０１０３】
ＭＩＬ２０４：重鎖および軽鎖のアミノ酸配列が実施例１として設計された不完全抗体（半抗体）。
【０１０４】
ＭＩＬ２０４ＡＦ：ＭＩＬ２０４ＡＦのＦａｂのアミノ酸配列はＭＩＬ２０４のそれと同一であるが、ＭＩＬ２０４ＡＦはフコースノックアウト操作細胞株（ＣＨＯＫ１−ＡＦ）において発現される。そのＮ型糖鎖修飾された糖鎖種において、コアフコースを含まない糖鎖種の比率は９８．５％以上であり、すなわち、コアフコースは１．５％未満である。
【０１０５】
ＭＩＬ２０３／２０４：ＭＩＬ２０３およびＭＩＬ２０４をアセンブリすることによって形成された二機能性抗体。
【０１０６】
ＭＢＳ３０１：ＭＩＬ２０３ＡＦおよびＭＩＬ２０４ＡＦをアセンブリすることによって形成された二機能性抗体。
【０１０７】
実施例１：抗体ＭＩＬ２０３およびＭＩＬ２０４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列設計および遺伝子配列最適化
（１）ＭＩＬ２０３の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
ＭＩＬ２０３の重鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。
【０１０８】
ＭＩＬ２０３の軽鎖は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する。
【０１０９】
（２）ＭＩＬ２０３の軽鎖および重鎖の核酸配列
ＭＩＬ２０３の軽鎖および重鎖をコードするために最適化された遺伝子配列は以下の通りである。
【０１１０】
ＭＩＬ２０３重鎖塩基配列は配列番号２０として示され、下線部は重鎖可変領域の塩基配列である。
2019528779.tif 000006
（配列番号２０）
【０１１１】
ＭＩＬ２０３軽鎖塩基配列は配列番号２４として示され、下線部は軽鎖可変領域の塩基配列である。
2019528779.tif 000007
（配列番号２４）
【０１１２】
（３）ＭＩＬ２０４の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
ＭＩＬ２０４の重鎖は、配列番号２５のアミノ酸配列を有する。
【０１１３】
ＭＩＬ２０４の軽鎖は、配列番号２６のアミノ酸配列を有する。
【０１１４】
（４）ＭＩＬ２０４の軽鎖および重鎖の核酸配列
ＭＩＬ２０４の重鎖の塩基配列は配列番号２１に示され、下線部は重鎖可変領域の塩基配列である。
2019528779.tif 000008
（配列番号２１）
【０１１５】
ＭＩＬ２０４の軽鎖の塩基配列は配列番号２７に示され、下線部は重鎖可変領域の塩基配列である。
2019528779.tif 000009
（配列番号２７）
【０１１６】
実施例２：２０３抗体真核生物発現ベクターおよび２０４抗体真核生物発現ベクターの構築
発現ベクターｐＴＧＳ−ＦＲＴ−ＤＨＦＲ（中国特許第ＺＬ２００５／１００６４３３５．０号）を使用し、ハイグロマイシン選択標識を除去し、ＧＳ（グルタミンシンテターゼ）発現ボックスをＰｓｈＡ１およびＸｈｏ１制限酵素切断部位を介して付加して選択マーカーとして使用した：ＧＳ  ｃＤＮＡは、ＧＳを発現した細胞株ＣＨＯからＲＴ−ＰＣＲによって得ることができた。修飾によって得られたベクターをＧＳベクターと命名した。
【０１１７】
ＧＳベクターに基づいて、完全に合成された軽鎖定常領域（定常領域配列は配列番号２４であるか、または配列番号２７の下線のない配列であった）をＢｓｉｗＩおよびＮｏｔＩ制限酵素切断部位を介して挿入し、次いで、完全に合成された２０３重鎖定常領域および２０４重鎖定常領域（定常領域配列は、配列番号２０および配列番号２１において別々に下線のない配列であった）を、Ｎｈｅ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素を介して別々に挿入し、定常領域の修飾後、２０３軽鎖定常領域および重鎖定常領域を含むＧＳ−２０３ベクターと、２０４軽鎖定常領域および重鎖定常領域を含むＧＳ−２０４ベクターとを別々に得た。
【０１１８】
２０３軽鎖可変領域および重鎖可変領域ならびに２０４軽鎖可変領域および重鎖可変領域の遺伝子（これらは、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２０および配列番号２１において別々に下線を引かれた配列であった）を完全に合成し、構築によりｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクターに挿入して、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−２０３／Ｖκベクター、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−２０４／Ｖκベクター、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−２０３／ＶＨベクター、およびｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−２０４／ＶＨベクターと別々に命名したベクターを得た。
【０１１９】
ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−２０３／ＶκおよびｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−２０４／ＶκをＣｌａＩおよびＢｓｉｗＩで別々に消化して、２０３軽鎖可変領域遺伝子および２０４軽鎖可変領域遺伝子を別々に得た。
【０１２０】
上記のようにして構築したＧＳ−２０３ベクターおよびＧＳ−２０４ベクターを１μｇの量で別々に回収し、ＣｌａＩおよびＢｓｉｗＩで別々に消化した。
【０１２１】
上記のようにして得られたＣｌａＩおよびＢｓｉｗＩで消化したＧＳ−２０３ベクターと２０３軽鎖可変領域とをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、上記のようにして得られたＣｌａＩおよびＢｓｉｗＩで消化したＧＳ−２０４ベクターと２０４軽鎖可変領域とをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。その結果得られた２０３軽鎖および２０４軽鎖を有するプラスミドを、ｐＴＧＳ−２０３ＶκベクターおよびｐＴＧＳ−２０４Ｖκベクターと別々に命名した。
【０１２２】
ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−２０３／ＶＨとｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−２０４／ＶＨとを別々に採取し、ＥｃｏＲ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉで消化して２０３重鎖可変領域遺伝子と２０４重鎖可変領域遺伝子とを別々に得た。ｐＴＧＳ−２０３ＶκベクターとｐＴＧＳ−２０４Ｖκベクターとを１μｇの量で別々に採取し、ＥｃｏＲ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉで別々に消化した。上記のようにして得られたＥｃｏＲ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉで消化したｐＴＧＳ−２０３Ｖκ、ならびに２０３重鎖可変領域遺伝子だけでなく、ｐＴＧＳ−２０４Ｖκおよび２０４重鎖可変領域遺伝子もＴ４  ＤＮＡリガーゼで別々に連結した。ｐＴＧＳ−２０３ＶκおよびｐＴＧＳ−２０４Ｖκに基づいて、抗体２０３重鎖可変領域遺伝子および抗体２０４重鎖可変領域遺伝子を別々に有するプラスミドを得、これらを２０３抗体真核生物発現ベクターおよび２０４抗体真核生物発現ベクターと別々に命名した。
【０１２３】
実施例３：宿主細胞のフコースノックアウトおよび懸濁液順化
ＡＴＣＣから購入したＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ：５８９９５５３５）を遺伝子ノックアウトに供して、それらによって発現されるタンパク質がフコシル化修飾をほとんどまたは完全に有しないようにし、得られたフコースノックアウト宿主細胞をＣＨＯＫ１−ＡＦと命名した。具体的な方法は、遺伝子工学技術により発現系を修飾することを含み、抗体発現用の宿主細胞ＣＨＯ−Ｋ１においてフコシル化修飾経路のための重要なタンパク質であるＧＦＴの部位特異的ノックアウトを行い、抗体のフコース修飾レベルを効果的に低下させた。この方法により、典型的なフコシル化機構および補完機構を同時に遮断することができ、フコシル化の完全な除去を達成した。具体的な技術的経路を図２に示すが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を用いることにより、２つのＧＦＴジンクフィンガーヌクレアーゼ配列がＧＦＴ遺伝子ＳＬＣ３５ｃ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＥ１６１７３．１）のために設計され、標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡに結合するように別々に用いられる。発現ベクタープラスミドをそれに応じて構築し、エレクトロトランスフェクション技術により２つのプラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を６ウェルプレート上で２４時間静置培養し、次いで１２５ｍＬ振盪フラスコに移し、振盪フラスコ内で継代および増幅を行うように振盪培養した。糖鎖結合性の凝集素ＬＣＡ（レンズマメ凝集素）のタンパク質フコシルに対する特異的親和性を用いて、同時トランスフェクトした細胞をビオチン−ＬＣＡで染色し、抗ビオチンマイクロビーズおよびＭＡＣｓ  ＬＤカラムを組み合わせて使用することによりネガティブ分離を行い、クローン培養をさらに行い、クローン細胞のフコースノックアウトレベルをフローサイトメトリー技術により決定し、複数回のネガティブ分離およびクローン培養によりフコシル化修飾されていないクローン１Ｇ７を得た。
【０１２４】
図３は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａ）およびＣＨＯＫ１−ＡＦ細胞（Ｂ）のフコース発現量を示す。濃い色で塗りつぶされたピークは、フコースを発現しない対照細胞を表す。黒い線のピークは、フコース単位に対して高い特異的結合親和性を有するレンズマメ凝集素（ＬＣＡ）試薬を用いてＦＣＡＳによって決定されたＣＨＯ−Ｋ１（Ａ）またはＣＨＯＫ１−ＡＦ細胞（Ｂ）のフコース発現量を表す。結果は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞が高レベルのフコースを発現し、ＣＨＯＫ１−ＡＦ細胞がフコースを発現しないことを示す。
【０１２５】
ＣＨＯＫ１−ＡＦ細胞は、２０１７年６月１４日に、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  （Ｎｏ．１  Ｗｅｓｔ  Ｂｅｉｃｈｅｎ  Ｒｏａｄ，Ｃｈａｏｙａｎｇ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ  １００１０１，Ｃｈｉｎａ）に、ＣＧＭＣＣ第１４２８７の寄託番号で寄託された。
【０１２６】
フコシル化修飾されていないクローン１Ｇ７の全ＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＧＤＰ輸送タンパク質をコードする遺伝子を取り出して配列決定し、この遺伝子が首尾よく突然変異しており、通常は発現され得ないことを確認した。
【０１２７】
さらなる順化および培養：融解後の宿主細胞ｇｍｔ４−−ＣＨＯ−Ｋ１を種培地（表１−１参照）（１０％のウシ血清を含む）中で接着培養に供し、血清を徐々に減少させ（１０％、５％、２．５％、１％、０．５％から血清を全く含まない状態まで）、振盪フラスコに移して懸濁順化させ、合計約１０回継代を行った。宿主細胞が完全に懸濁され、指数関数的に安定に増加すると、種培地で増殖することができる安定な宿主細胞が最終的に得られた。
【０１２８】
実施例４：ＭＩＬ２０３ＡＦおよびＭＩＬ２０４ＡＦ抗体を含む上清の調製
エレクトロトランスフェクション技術を用いて、実施例２で得られた２０３抗体真核生物発現ベクターおよび２０４抗体真核生物発現ベクターを別々に標的宿主細胞ＣＨＯＫ１−ＡＦにトランスフェクトし、５０μＭ  ＭＳＸ（メチオニンスルホキシン）を種培地に加え、３７℃のＣＯ２インキュベータで２〜４週間培養を行い、この培地中で生き残った細胞を選出し、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗体を発現することができる細胞を検出した。サブクローンスクリーニングを限界希釈法によって行い、６〜８週間の培養およびスクリーニングの後、ＭＩＬ２０３ＡＦおよびＭＩＬ２０４ＡＦ抗体を効率的に発現することができるモノクローナル細胞株を得た。
【０１２９】
特定の培地の調製：培地は表１−１、１−２および１−３に示す成分に従って調製した。０．２２μｍ膜を用いて滅菌条件下で濾過した後、それらを細胞培養に用いた。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【０１３０】
播種密度が０．５±０．２×１０６細胞／ｍｌである培地を用いた多段階培養によって細胞株を増幅し、２〜４日に１回継代を行い、増幅によって十分な細胞が得られたときにそれらを発酵培地（生産培地：種培地＝１：１からなる培地）に移した：発酵培地における培養期間は１２〜１４日であり、３日目、６日目、９日目に流加培地を１０％体積で加え、培養の終了後に上清を得た。このようにして、ＭＩＬ２０３ＡＦおよびＭＩＬ２０４ＡＦをそれぞれ得た。
【０１３１】
ＭＩＬ２０３およびＭＩＬ２０４の調製方法は、宿主細胞がＡＴＣＣから購入したＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ：５８９９５５３５）であり、フコースノックアウトを行わなかった以外は、本実施例におけるＭＩＬ２０３ＡＦおよびＭＩＬ２０４ＡＦの調製方法を参照した。
【０１３２】
実施例５：ＭＢＳ３０１二重特異性抗体のアセンブリ
１．半抗体の捕捉
実施例４で得られた細胞発酵ブロスの上清を０．２μｍ膜で濾過し、プロテインＡカラムを用いて捕捉を行った。最初に、低塩トリス、ｐＨ７．５緩衝液でカラムを平衡化し、次いで上清を充填し、次いで低塩トリス、ｐＨ７．５緩衝液でカラムを溶出し、高塩リン酸カリウム、ｐＨ６．０緩衝液でカラムをさらに溶出し、次いで低塩トリス、ｐＨ７．５緩衝液でカラムを平衡化し、最後に低ｐＨ酢酸緩衝液で溶出して半抗体を得た。半抗体溶液をトリス塩基溶液でｐＨ５．５に調整し、適量のＡｒｇを加えて保存した。
【０１３３】
２．アセンブリ
分光光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度で半抗体の濃度を決定した。半抗体を１：１のモル比で混合し、トリス塩基緩衝液でｐＨ８．０に調整し、一定量の還元剤ＧＳＨを加え、２５℃で一晩低速撹拌して反応させた。脱塩カラム（または限外濾過）により還元剤を除去し、反応を終了させた。
【０１３４】
３．アニオン（ＱＳＦＦ）
アセンブリし、置き換えた試料を８．０のｐＨ、３．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有するように調整し、０．２２μｍ膜で濾過した。最初に、アニオンクロマトグラフィーカラムを低塩トリス、ｐＨ８．０緩衝液で平衡化し、次いで試料をアニオンクロマトグラフィーカラムに充填し、漏出成分を回収し、次いで、ＵＶ２８０がベースラインになるまで低塩トリス、ｐＨ８．０緩衝液を溶出に用いた。回収した漏出試料を酢酸溶液でｐＨ５．５に調整した。
【０１３５】
４．カチオン（５０ＨＳ）
アニオン手順で回収した試料を０．２２μｍ膜で濾過した。試料を５０ＨＳカラムに充填し、次いで低濃度酢酸、ｐＨ５．５緩衝液で平衡化し、０〜１００％高濃度酢酸、ｐＨ５．５、２０ＣＶで直線勾配様式で溶出し、溶出した成分を回収した。
【０１３６】
得られたＭＢＳ３０１抗体を以下の実施例に用いた。
【０１３７】
実施例６：質量スペクトルによる分子量の決定
１．実験方法
脱糖試料の調製：５００μｇのＭＢＳ３０１抗体を１０ｋＤ限外濾過チューブで脱塩し、１０μＬのＧ７消化緩衝液、３μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆを加え、超純水で１００μＬに希釈し、均一に混合して密封フィルムで密封し、３７℃の水浴中に一晩置いた。
【０１３８】
ＬＣ−ＭＳ分析：ＭＢＳ３０１または脱糖試料を２．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＰＬＲＰ−Ｓクロマトグラフィーカラムで脱塩した：９５％移動相Ａ（０．１％ＦＡ水）、５％移動相Ｂ（０．１％ＦＡアセトニトリル）から９５％移動相Ｂへの１０分間勾配を用いて１０分間維持し、逆クロマトグラフィーカラムで脱塩した後、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ４６００（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて質量分析を行い、データをＡｎａｌｙｓｔ  ＴＦ１．６を用いたデコンボリューション解析に供した。
【０１３９】
２．実験結果
ＭＢＳ３０１のインタクトなタンパク質分子量の質量分析結果を図４に示した：ＭＢＳ３０１は、異なる糖鎖種に対応する異なる分子量を有する複数の分子からなり、フコースはこれらの糖鎖種には見られなかった。
【０１４０】
Ｎ型糖鎖修飾の除去後、ＭＢＳ３０１の分光分析結果を図５に示した：そのインタクトなタンパク質分子量１４５，１５４は理論的分子量と一致しており、ＭＩＬ２０３ＡＦおよびＭＩＬ２０４ＡＦのアセンブリが成功したことが示唆された。
【０１４１】
実施例７：分子排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
１．実験方法
移動相：０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液、０．２５ｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、ｐＨ６．２±０．１
試料の調製：試験する試料を移動相で２ｍｇ／ｍＬに希釈した。
クロマトグラフィー条件：試料注入器温度は６℃、試料サイズ：２５μｌ、流速：０．５ｍｌ／分、シグナル：２８０ｎｍ、カラム温度：３０℃、均一濃度溶離３０分間であった。
【０１４２】
２．実験結果
アセンブリ前のＭＩＬ２０３ＡＦ、ＭＩＬ２０４ＡＦおよびアセンブリ後のＭＢＳ３０１のＳＥＣスペクトルを図６に示した。アセンブリ前に、ＭＩＬ２０３ＡＦは多くの半抗体（４４．７％）および巨大分子を有していたことが分かる：アセンブリ前に、ＭＩＬ２０４ＡＦは広いモノマーピークパターンを有しており、それらの分子サイズが均一に分布していないことが示唆されたが、ＭＢＳ３０１のアセンブリ後、分子サイズ分布パターンが整い、モノマー純度は９９．１％であった。
【０１４３】
実施例８：Ｎ型糖鎖種分析
１．実験方法：
５００μｇの抗体を１０ｋＤ限外濾過チューブで脱塩し、１０μＬのＧ７消化緩衝液、３μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆを加え、超純水で１００μＬに希釈し、均一に混合して密封フィルムで密封し、３７℃の水浴中に一晩置いた。消化した試料を３００μＬの予冷エタノールに加え、均一に混合し、３０分間静置し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採取し、真空下で濃縮および乾燥した。ＤＭＳＯと酢酸とを３５０μＬ：１５０μＬの比で混合し、５ｍｇの２−ＡＢ、６ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを１００μＬのＤＭＳＯおよび酢酸の混合溶液に溶解し、１０μＬの混合溶液を採取して６５℃のオーブンに入れ、３時間誘導した後、８０％アセトニトリルと水との混合溶液２００μＬを加え、２分間遠心分離し、上清を回収した。
【０１４４】
クロマトグラフィーカラム：ＷＡＴＥＲＳ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  １．７μｍ、２．１×５０ｍｍカラム
カラム温度：４０℃
励起波長：λｅｘ＝３３０ｎｍ、λｅｍ＝４２０ｎｍ
試料サイズ：１０μＬ
クロマトグラフィーカラムを２０％移動相Ａ（１００ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．５）、８０％移動相Ｂ（１００％アセトニトリル）で平衡化し、試料を充填した後、相Ａの割合を３６分後に４０％に増加させた。
【０１４５】
２．実験結果：
アセンブリしたＭＩＬ２０３／２０４、ＭＢＳ３０１は、図７に示すような糖鎖種スペクトルを有していた。図７ならびに表２および３において、ＭＩＬ２０３／２０４と比較して、ＭＢＳ３０１は有意に減少したフコース含有量を有しており、フコース含有糖鎖種Ｇ０Ｆの割合はわずか１．１％であったことが分かる。
【表２】
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【表３】
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【０１４６】
実施例９：抗体に対するＨｅｒ２結合活性の分析
１．実験方法：
ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液を用いてＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物（１：１）、ＭＩＬ２０３／２０４、およびＭＢＳ３０１の試料をそれぞれ０．１μｇ／ｍｌに希釈してリガンドを形成した。ＨＥＲ２（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、１０００４−Ｈ０８Ｈ）をＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液で４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌおよび０．１２５μｇ／ｍｌに希釈して分析物を形成した。リガンド（抗体）を間接捕捉法によって固定し、２５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢＲ１００８３９、ＧＥ）をアミノカップリング共有結合を介してＣＭ５チップの表面に最初に結合させ、次いでリガンドと分析物を結合させた。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（生体分子の相互作用を自動的に測定し調査するための分析器）Ｗｉｚａｒｄモード下で、リガンドとしてＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物、およびＭＢＳ３０１の試料を別々に使用し、分析物としてＨＥＲ２を使用することにより、マルチサイクルモードで親和性分析実験を行った。各試料の分析は、３つの開始試料、１つのゼロ濃度対照試料、６つの勾配濃度試料、および１つの繰り返し濃度試料を含み、各サイクルの終了後に、３Ｍ  ＭｇＣｌ２再生溶液でチップを再生した。分析物の各濃縮サイクルの捕捉時間は９０秒に設定し、リガンド溶液の流速は１０μｌ／分であった：リガンドと分析物との結合時間は１８０秒、分析物溶液の流速は３０μｌ／分であり、解離時間は１２００秒であった。元のデータをＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘ１００分析ソフトウェアに導入し、ゼロ濃度対照を差し引き、体積効果を排除するために参照チャネルを差し引き、１：１結合モードのＫｉｎｅｔｉｃｓ解析法をフィット曲線に使用し、データを照合した。
【０１４７】
２．実験結果：
【表４】
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【０１４８】
結合動力学定数によれば、ＭＢＳ３０１およびＭＩＬ２０３／２０４は、Ｈｅｒ２結合活性においてＭＩＬ４１よりも優れており、ＭＩＬ４０、およびＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物（１：１）と実質的に同等であることがこの表から分かる。
【０１４９】
実施例１０：ＦｃγＲＩＩＩａ結合活性の分析
１．実験方法：
ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、１０３８９−Ｈ０８Ｃ１）をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で０．２μｇ／ｍｌに希釈してリガンドを形成した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて、ＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物（１：１）、ＭＩＬ２０３／２０４、およびＭＢＳ３０１の試料を、３６０μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、１３．３μｇ／ｍｌ、４．４μｇ／ｍｌに別々に希釈して分析物を形成した。リガンドＦｃγＲＩＩＩａを間接捕捉法によって固定し、５０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ  ＩｇＧをアミノカップリング共有結合を介してＣＭ５チップの表面に最初に結合させ、次いでリガンドと分析物とを結合させた。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｗｉｚａｒｄモード下で、リガンドとしてＦｃγＲＩＩＩａを使用し、分析物としてＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物、およびＭＢＳ３０１の試料をそれぞれ別々に使用することにより、マルチサイクルモードで親和性分析実験を行った。各試料の分析は、３つの開始試料、１つのゼロ濃度対照試料、５つの勾配濃度試料、および１つの反復濃度試料を含み、各サイクルの終了後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５再生溶液でチップを再生した。分析物の各濃縮サイクルの捕捉時間は６０秒に設定し、リガンド溶液の流速は１０μｌ／分であった。リガンドと分析物との結合時間は１８０秒、分析物溶液の流速は３０μｌ／分であり、解離時間は１８０秒であった。抗Ｈｉｓ  ＩｇＧとカップリングさせたＣＭ５チップをスロットに入れ、試料を試験して分析した。元のデータをＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｘ１００分析ソフトウェアに導入し、ゼロ濃度対照を差し引き、参照チャネルを差し引いて体積効果を排除し、親和性分析法の恒常性モデル評価をフィット曲線に使用し、データを照合した。
【０１５０】
２．実験結果：
表５から、ＭＢＳ３０１が最も低いＫＤ値を示したことが分かり、それがＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物、ＭＩＬ２０３／２０４のものよりも明らかに強いＦｃγＲＩＩＩａに対する最も強い結合活性を有していたことが示唆され、これによってグリコシル化修飾されたＭＢＳ３０１の優位性が示された。
【表５】
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【０１５１】
実施例１１：ＡＤＣＣ活性の分析
１．実験方法：
標的乳癌細胞ＳＫＢＲ−３（ＡＴＣＣから購入、ＣＲＬ−２３２６）、エフェクター細胞ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ（Ｈｕａｂｏ  Ｂｉｏから購入）を１２００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を廃棄し、ＡＤＣＣ実験培地を用いて細胞を再懸濁し、次いで１２００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を廃棄し、ＡＤＣＣ実験培地を用いて細胞を再懸濁した：細胞生存率は細胞計数によれば９０％以上であるはずである。ＳＫＢＲ−３の細胞密度を１．２５×１０５／ｍｌに調整し、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａの細胞密度を６．２５×１０５／ｍｌに調整した。
【０１５２】
異なる濃度の抗体を別々に加えて、０．０００００１μｇ／ｍｌ、０．００００１μｇ／ｍｌ、０．０００１μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの最終濃度をそれぞれ達成し、次いで、エフェクター細胞および標的細胞（エフェクター−標的比は５：１）を加え、３７℃で６時間インキュベートし、１００μＬ／ウェルのＬＤＨ現像液を加え、室温で２０分間遮光した。測定はＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３を用いて行った。
【０１５３】
標的乳癌細胞ＢＴ４７４（ＡＴＣＣから購入、ＣＲＬ−２３２６）、結腸癌ＳＷ４８０（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、ＴＣＨＵ１７２）に関して、標的細胞に対するＡＤＣＣエフェクター細胞の比は１０：１であった：すなわち、標的細胞密度は１．２５×１０５／ｍｌであり、エフェクター細胞密度は１．２５×１０６／ｍｌであった。他の方法はＳＫＢＲ−３の場合と同じであった。
【０１５４】
標的乳癌細胞ＨＣＣ１４１９（トラスツズマブ耐性、ＡＴＣＣから購入、ＣＲＬ−２３２６）に関して、ＡＤＣＣ作用方法はＳＫＢＲ−３の場合と同じであった。
【０１５５】
殺傷率の計算：
背景群：培地群
最小放出群：標的細胞群
最大放出群：標的細胞＋溶解液群
実験群：標的細胞＋エフェクター細胞
殺傷率（％）＝［（実験群−最小放出群）／（最大放出群−最小放出群）］×１００
【０１５６】
２．実験結果：
図８〜１１は、異なる標的細胞に対するＭＢＳ３０１のＡＤＣＣ活性が、ＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、併用投与（１：１）したＭＩＬ４０およびＭＩＬ４１、ならびにＭＩＬ２０３／２０４より有意に優れており、殺傷効果が抗体投与量に依存するという結果を示す。
【０１５７】
実施例１２：直接殺細胞活性の分析
１．実験材料
ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞（ＡＴＣＣから購入、ＨＴＢ−２０）。
【０１５８】
ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞（ＡＴＣＣから購入、ＨＴＢ−２５）。
【０１５９】
ヒト乳癌ＳＫＢＲ−３細胞（ＡＴＣＣから購入、ＨＴＢ−３０）。
【０１６０】
ヒト乳癌ＨＣＣ１４１９細胞（ＡＴＣＣから購入、ＣＲＬ−２３２６）。
【０１６１】
ヒト胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、ＴＣＨＵ１３０）。
【０１６２】
これらの細胞のうち、ＢＴ４７４は三重陽性細胞で、Ｈｅｒ−２高発現であり、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＳＫＢＲ−３はＨＥＲ−２陽性で、ＢＴ４７４と比較して低発現であり、ＨＣＣ１４１９はＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）耐性株であった。
【０１６３】
２．実験方法：
対数増殖期にあるヒト乳癌ＢＴ４７４細胞（ＡＴＣＣから購入、ＨＴＢ−２０）を計数し（生存率＞９０％）、６．７×１０４細胞／ｍｌの細胞密度を有するように調整し、均一に混合し、細胞培養プレートに１５０μｌ／分の量で接種した。抗体薬ＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、併用投与したＭＩＬ４０／ＭＩＬ４１、ＭＩＬ２０３／２０４、ＭＢＳ３０１を希釈し、次いで、予め細胞を広げておいた９６ウェル培養プレートに５０μｌ／ウェルの量で加え、各抗体薬につき、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０．３１３μｇ／ｍｌ、０．１５６μｇ／ｍｌ、０．０７８μｇ／ｍｌ、０．０３９μｇ／ｍｌ、０．０２０μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌの９種の濃度を設定し、各濃度について反復ウェルを設定し、さらに、薬物不含対照群および細胞培地ブランク対照群も設定した。培養プレートを細胞インキュベータに入れて１２０時間インキュベートし、次いで１０μｌのＣＣＫ−８溶液を各ウェルに加え、振盪した後、培養プレートをインキュベータに入れて３〜５時間インキュベートし、ＯＤ４５０値をＥＬＩＳＡにより決定した。細胞に対する薬物の抑制率は以下の式により算出した：抑制率＝（１−（薬物群ＯＤ４５０−ブランク群ＯＤ４５０）／（対照群ＯＤ４５０−ブランク群ＯＤ４５０））×１００％。
【０１６４】
対数増殖期にあるヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞（ＡＴＣＣから購入、ＨＴＢ−２５）を計数し（生存率＞９０％）、１×１０５細胞／ｍｌの細胞密度を有するように調整し、均一に混合し、細胞培養９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルの量で接種した。各抗体医薬について、５００μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、３１．２５μｇ／ｍｌ、５．２０８μｇ／ｍｌ、０．８６８μｇ／ｍｌ、０．１４５μｇ／ｍｌ、０．０２４１μｇ／ｍｌ、０．００４０２μｇ／ｍｌ、０．０００６７０μｇ／ｍｌ、０．０００１１２μｇ／ｍｌの１０種の濃度を設定した。培養プレートを細胞培養インキュベータに入れて７２時間インキュベートし、他の方法はＢＴ４７４細胞の場合と同じであった。
【０１６５】
対数増殖期にあるヒト乳癌ＳＫＢＲ−３細胞（ＡＴＣＣから購入、ＨＴＢ−３０）を計数し（生存率＞９０％）、１×１０５細胞／ｍｌの細胞密度を有するように調整し、均一に混合し、細胞培養用の９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルの量で接種した。各抗体薬物について、１００μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ、０．３９μｇ／ｍｌ、０．０９８μｇ／ｍｌ、０．０２４４μｇ／ｍｌ、０．００６１μｇ／ｍｌ、０．００１５μｇ／ｍｌの９種の濃度を設定した。培養プレートを細胞培養インキュベータに入れて１２０時間インキュベートし、他の方法はＢＴ４７４細胞の場合と同じであった。
【０１６６】
対数増殖期にあるヒト乳癌ＨＣＣ１４１９細胞（ＡＴＣＣから購入、ＣＲＬ−２３２６）を計数し（生存率＞９０％）、５×１０４細胞／ｍｌの細胞密度を有するように調整し、均一に混合し、細胞培養用の９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルの量で接種した。各抗体薬物について、１００μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ、０．３９μｇ／ｍｌ、０．０９８μｇ／ｍｌ、０．０２４４μｇ／ｍｌ、０．００６１μｇ／ｍｌ、０．００１５μｇ／ｍｌの９種の濃度を設定した。培養プレートを細胞培養インキュベータに入れて１２０時間インキュベートし、他の方法はＢＴ４７４細胞の場合と同じであった。
【０１６７】
対数増殖期にあるヒト胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、ＴＣＨＵ１３０）を計数し（生存率＞９０％）、５×１０４細胞／ｍｌの細胞密度を有するように調整し、均一に混合し、細胞培養用の９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルの量で接種した。各抗体医薬について、１０μｇ／ｍｌ、３．３３μｇ／ｍｌ、１．１１μｇ／ｍｌ、０．３７μｇ／ｍｌ、０．１２３μｇ／ｍｌ、０．０４１μｇ／ｍｌ、０．０１３７μｇ／ｍｌ、０．００４５μｇ／ｍｌ、０．００１５μｇ／ｍｌの９種の濃度を設定した。培養プレートを細胞培養インキュベータに入れて７時間インキュベートし、他の方法はＢＴ４７４細胞の場合と同じであった。
【０１６８】
３．実験結果：
図１２に示すように、ＭＩＬ２０３／２０４、ＭＢＳ３０１は、ＭＩＬ４０、ＭＩＬ４０／ＭＩＬ４１混合物のものよりも高いＢＴ４７４細胞に対する抑制率を有し、ＭＩＬ４１が最も弱い抑制活性を示した。
【０１６９】
図１３に示すように、ＭＩＬ２０３／２０４、ＭＢＳ３０１は、ＭＩＬ４０のものより有意に高く、かつＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０／ＭＩＬ４１混合物（１：１）の抑制率に非常に近い、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞に対する抑制率を有していた。
【０１７０】
図１４に示すように、ＭＩＬ２０３／２０４、ＭＢＳ３０１は、ＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０／ＭＩＬ４１混合物のものより高いＳＫＢＲ−３細胞に対する抑制率を有していた。
【０１７１】
図１５に示すように、ＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１は、乳癌細胞ＨＣＣ１４１９に対して有意な抑制効果を示さず、併用投与（１：１）したＭＩＬ４０／ＭＩＬ４１は、細胞増殖を抑制することができ、ＭＩＬ２０３／２０４およびＭＢＳ３０１は、最も高い抑制率を示し、それらの活性は併用投与（１：１）したＭＩＬ４０およびＭＩＬ４１（１：１）よりも有意に優れていた。
【０１７２】
図１６に示すように、併用投与（１：１）したＭＩＬ４０およびＭＩＬ４１は、ＭＩＬ４０よりも優れた胃癌細胞ＮＣＩ−Ｎ８７に対する抑制効果を示し、ＭＩＬ４１は、有意な抑制効果を示さなかった：ＭＩＬ２０３／２０４およびＭＢＳ３０１は、最も高い抑制率を示し、それらの活性は併用投与（１：１）したＭＩＬ４０およびＭＩＬ４１よりも有意に優れていた。
【０１７３】
実施例１３：ＣＤＣ活性
１．実験方法：
標的細胞ＢＴ４７４を１２００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を１％ＦＢＳ培地で再懸濁し、計数した：細胞生存率は９０％以上であるはずである。ＢＴ４７４細胞の細胞密度を、２×１０５／ｍｌ（ウェル当たり５０μｌ）に調整した。
【０１７４】
異なる濃度の抗体を別々に加え、それらの最終濃度をそれぞれ１００μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ、０．３９μｇ／ｍｌ、０．０９８μｇ／ｍｌ、０．０２４４μｇ／ｍｌ、０．００６１μｇとし、５０μｌのウサギ補体（１：２０希釈）を加え、３７℃で２時間インキュベートし、８０μＬ／ウェルのＬＤＨ現像液を加え、室温で２０分間遮光した。測定はＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３を用いて行った。
【０１７５】
殺傷率の計算：
背景群：培地分
最小放出群：標的細胞群
最大放出群：標的細胞＋溶解液群
実験群：標的細胞＋補体
殺傷率（％）＝［（実験群−最小放出群）／（最大放出群−最小放出群）］×１００
【０１７６】
２．実験結果：
図１７から、標的細胞ＢＴ４７４に別々に作用したＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１はＣＤＣ活性を示さなかったが、それらを併用投与した場合はＣＤＣ効果を示したこと、二機能性抗体ＭＩＬ２０３／２０４、ＭＢＳ３０１は、併用投与したＭＩＬ４０およびＭＩＬ４１のものより有意に強いＣＤＣ活性を有し、抗体用量依存性のＣＤＣ殺傷効果を示したことが分かる。
【０１７７】
実施例１４：抗体ＦｃＲｎ結合活性の分析
１．実験方法
ＦｃＲｎ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、ＣＴ００９−Ｈ０８Ｈ）をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で０．２μｇ／ｍｌに希釈してリガンドを形成した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて、ＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物、ＭＩＬ２０３／２０４、およびＭＢＳ３０１の試料を、３６０μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、１３．３μｇ／ｍｌ、４．４μｇ／ｍｌに別々に希釈して分析物を形成した。リガンドＦｃＲｎ−Ｈｉｓタグを間接捕捉法によって固定し、５０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ  ＩｇＧをアミノカップリング共有結合を介してＣＭ５チップの表面に最初に結合させ、次いでリガンドと分析物とを結合させた。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｗｉｚａｒｄモード下で、リガンドとしてＦｃＲｎを別々に使用し、分析物としてＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物、およびＭＢＳ３０１の試料を使用することにより、マルチサイクルモードで親和性分析実験を行った。各試料の分析は、３つの開始試料、１つのゼロ濃度対照試料、５つの勾配濃度試料、および１つの反復濃度試料を含み、各サイクルの終了後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５再生溶液でチップを再生した。分析物の各濃縮サイクルの捕捉時間は６０秒に設定し、リガンド溶液の流速は１０μｌ／分であった：リガンドと分析物との結合時間は１８０秒、分析物溶液の流速は３０μｌ／分であり、解離時間は１８０秒であった。抗Ｈｉｓ  ＩｇＧとカップリングさせたＣＭ５チップをスロットに入れ、試料を試験して分析した。元のデータをＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｘ１００分析ソフトウェアに導入し、ゼロ濃度対照を差し引き、参照チャネルを差し引いて体積効果を排除し、親和性分析法の恒常性モデル評価をフィット曲線に使用し、データを照合した。
【０１７８】
２．実験結果：
表６から、ＭＢＳ３０１が最も低いＫＤ値を示したことが分かり、それがＭＩＬ４０、ＭＩＬ４１、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物より有意に優れた、かつＭＩＬ２０３／２０４と実質的に同等な、ＦｃＲｎに対する最も強い結合活性を有していたことが示唆された。
【表６】
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【０１７９】
実施例１５：ヌードマウスにおけるインビボ腫瘍抑制の実験
１．実験方法
６〜８週齢のＮｕ／Ｎｕヌードマウス、体重１７．０〜２２．０ｇ、雌マウス８０匹／バッチをＢｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した（動物証明書：ＳＣＸＫ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）−２０１２−０００１）。実験動物は、ケージ当たり５匹のマウスで、独立した空気供給を備えた滅菌ＩＶＣケージで飼育した。床敷材は、６０Ｃｏ放射線で滅菌したトウモロコシ穂軸床敷材（サイズ：４〜６ｍｍ）であり、マウスには、マウス用に特別に処方された滅菌飼料を供給し、自由に飲むために精製水を与えた。動物実験のための実験室では、室温を約２５℃に維持し、相対湿度を４０〜７０％に維持し、１日当たり１２時間照射した。
【０１８０】
ヌードマウスにＳＫＯ−Ｖ３を皮下接種した。腫瘍体積が約１５００〜２０００ｍｍ３まで増加したとき、腫瘍ブロックを無菌条件下で採取し、約１．０×１．０×１．０ｍｍ３片に切断し、それをヌードマウスの右前肢の腋窩に皮下接種した。皮下接種した腫瘍が１００〜３００ｍｍ３のサイズになってから、腫瘍の大きさに従ってマウスを無作為にグループ分けした。ＳＫＯ−Ｖ３細胞培養：３７℃および５％ＣＯ２の細胞インキュベータ内に配置した、１０％ウシ胎児血清（ペニシリンおよびストレプトマイシン、それぞれ１００μｌ／ｍｌを添加）を含むＤＭＥＭ細胞培地で細胞を培養し、培地を１〜２日に１回交換した。０．２５％トリプシン消化を用いて継代を行い、１０００回転／分で５分間遠心分離した後、上清を廃棄し、継代および培養のために新しい培地を加えた。
【０１８１】
皮下移植後、基準を満たす担腫瘍動物を選択し、腫瘍サイズに従ってグループ当たり約８匹の動物に無作為にグループ分けし、連続して２週間、週２回、尾静脈注射により投与を行った。
【０１８２】
実験動物を摂食、飲水および運動に関して毎日観察し、各動物の体重および腫瘍サイズを３日ごとに測定し、実験終了時に頸椎脱臼により動物を屠殺し、肉眼で見える腫瘍を剥離して秤量した。解剖によって得られた全ての組織を、従来の病理学的検出のために４％ホルムアルデヒドに入れて保存した。
【０１８３】
データはＸ±ｓで表した：腫瘍増殖抑制率＝（実験群腫瘍体積−投与群腫瘍体積）／対照群腫瘍体積×１００％、腫瘍体積＝１／２ａｂ２（ａ＝腫瘍長径、ｂ＝腫瘍短径）。
【０１８４】
２．実験結果
図１８に示すように、担腫瘍マウスの全ての腫瘍が増殖し、対照群の腫瘍は進行性の増殖を示したが、投与群の腫瘍の増殖は異なる程度まで減速するかまたは停止した。観察期間の終了時に、対照群のヌードマウスは、意気消沈、筋肉量の減少、皮膚収縮、および緩徐な動きを示した。
【０１８５】
腫瘍増殖曲線を腫瘍サイズおよび期間に従ってプロットした。ＳＫＯ−Ｖ３細胞担腫瘍マウス群では、二機能性抗体ＭＩＬ２０３／２０４、ＭＢＳ３０１、および併用投与したＭＩＬ４０／ＭＩＬ４１は、ＳＫＯ−Ｖ３腫瘍の増殖を効果的に抑制することができ、それらの腫瘍抑制能はＭＩＬ４０およびＭＩＬ４１単独よりも優れていた。
【０１８６】
実施例１６マウスにおけるヒト乳房腫瘍体積を減少させるための抗Ｈｅｒ２二重特異性抗体ＭＢＳ３０１治療
ヒト乳癌細胞株ＢＴ４７４
このヒト乳癌細胞株は、乳癌患者の乳管癌から樹立された。ＢＴ４７４細胞株を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ａｍｅｒｉｃａ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａｍｅｒｉｃａ）で日常的に培養した。
【０１８７】
マウス
雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、５〜６週齢、体重１５〜１７ｇ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を、１２時間の明期および１２時間の暗期の日常周期で、特定病原体のない条件下に維持した。到着後、新しい環境に慣れさせるためおよび観察のために、動物を動物施設の検疫部に１週間収容した。食料と水は自由に与えた。
【０１８８】
腫瘍細胞注入
注射当日に、腫瘍細胞を培養フラスコから回収した。細胞力価を１×１０８／ｍｌに調整した。注射前に、１７β−ＥＳＴＲＡＤＩＯＬペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背中に皮下移植した。腫瘍細胞懸濁液をマトリゲル（登録商標）（生物細胞培養基質）と１：１の比で注意深く混合し、次いで細胞懸濁液を５×１０ｅ７／ｍｌとし、ＢＴ４７４細胞を０．２ｍｌの体積で各マウスの右乳腺脂肪体に注射した。
【０１８９】
処置
マウスを１２５ｍｍ３の腫瘍体積について無作為化し、続いて１０ｍｌ／ｋｇの体積の静脈内注射で週２回処置した。併用治療のために、ＭＩＬ４０およびＭＩＬ４１を同時に投与した（表７参照）。
【表７】
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【０１９０】
結果を図１９に示す。ＭＢＳ３０１は、ＭＩＬ４０よりも効果的にＢＴ４７４腫瘍の増殖を抑制し、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との１：１混合物と同じくらい効果的に抑制した。
【０１９１】
実施例１７マウスにおけるヒト胃腫瘍体積を減少させるための抗Ｈｅｒ２二重特異性抗体ＭＢＳ３０１治療
ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株の転移部位に由来するこのヒト胃癌細胞を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ａｍｅｒｉｃａ）を添加した１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａｍｅｒｉｃａ）で日常的に培養した。
【０１９２】
マウス
雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、６〜７週齢、体重１８〜２２ｇ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を、１２時間の明期および１２時間の暗期の日常周期で、特定病原体のない条件下に維持した。到着後、新しい環境に慣れさせるためおよび観察のために、動物を動物施設の検疫部に１週間収容した。食料と水は自由に与えた。
【０１９３】
腫瘍細胞注入
注射当日に、腫瘍細胞を培養フラスコから回収した。細胞力価を５×１０ｅ７／ｍｌに調整した。腫瘍細胞懸濁液をマトリゲルと１：１の比で注意深く混合し、次いで細胞懸濁液を２．５×１０ｅ７／ｍｌとし、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を０．２ｍｌの体積で各マウスの右背に皮下注射した。
【０１９４】
処置
マウスを１１０ｍｍ３の腫瘍体積について無作為化し、続いて１０ｍｌ／ｋｇの体積の静脈内注射で週１回ｏを処置した。併用治療のために、ＭＩＬ４０およびＭＩＬ４１を同時に投与した（表８参照）。
【表８】
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【０１９５】
結果を図２０に示す。ＭＢＳ３０１は、ＭＩＬ４０よりも効果的にＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍の増殖を抑制し、ＭＩＬ４１と同時のＭＩＬ４０と同じくらい効果的に抑制した。
【０１９６】
実施例１６および１７のインビボ腫瘍増殖抑制試験において、ＭＩＬ４０／ＭＩＬ４１の組み合わせおよびＭＢＳ３０１の両方が腫瘍増殖を抑制し、２つの群の間に有意差はなかった。非フコシル化ＭＢＳ３０１のＡＤＣＣを介したさらなる腫瘍細胞殺傷活性は、実施例１６および１７の結果には示されなかったが、これは、ヒト化抗体がＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのＮＫ細胞およびマクロファージを活性化できないためである。しかしながら、インビトロ細胞ベースのＡＤＣＣアッセイにおいて、ＭＢＳ３０１は、ＭＩＬ４０とＭＩＬ４１との混合物と比較して、有意に高いＡＤＣＣ活性を示した（実施例１１〜１３、および図８〜１７を参照）。
【０１９７】
実施例１８ヒト胃癌ＧＡ００５５患者由来異種移植片（ＰＤＸ）ヌードマウスモデル
この腫瘍組織は、６９歳のアジア人女性の胃から樹立されたものであり、その
病理診断は胃前庭部の前壁の明細胞腺癌、潰瘍型、ＩＨＣ（免疫組織化学）結果は高ｍＲＮＡ発現量を有するＨＥＲ−２（＋）であった。
【０１９８】
マウス
雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、１２時間の明期および１２時間の暗期の日常周期で、特定病原体のない条件下に維持した。到着後、新しい環境に慣れさせるためおよび観察のために、動物を動物施設の検疫部に１週間収容した。食料と水は自由に与えた。
【０１９９】
腫瘍接種
腫瘍発生のために、各マウスの右側腹部に原発性ヒト胃癌モデルＧＡ００５５断片（直径２〜３ｍｍ）を皮下接種した。平均腫瘍サイズが１４６ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に３つの群にグループ分けした（表９を参照）。
【表９】
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【０２００】
この胃癌ＰＤＸモデルにおいて、ＭＢＳ３０１は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）よりも効果的に腫瘍の増殖を抑制した：ＭＢＳ３０１の最終的な腫瘍増殖抑制率は７７．８２％であり、一方、ハーセプチンは５０．１５％である。１８日間の処置後、図２１に示すように、ＭＢＳ３０１とハーセプチンの間には腫瘍サイズの有意差があった。
【０２０１】
上記は本発明の好ましい実施形態を説明していること、および特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく変更がなされてもよいことを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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