(57)【要約】  本発明は、反応条件変更によるオリゴアルキレンアミンに対する脂肪酸基の導入率を調節して陽イオン性脂質を選択的に合成することができる方法に関するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式２のオリゴアルキレンアミンを化学式３の脂肪酸アルキルエステルと反応させて化学式１の陽イオン性脂質を製造する段階を含む、化学式１の陽イオン性脂質の製造方法：
【化１】
2019501915.tif 000007
【化２】
2019501915.tif 000008
【化３】
2019501915.tif 000009
上記化学式１〜３において、
ｎとｍは、それぞれ０〜１２であり、１≦ｎ＋ｍ≦１２であり、
ａとｂは、それぞれ１〜６であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素または炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基であって、Ｒ１およびＲ４のうちの少なくとも一つは炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基であり、
Ｒは、炭素数１１〜２５の飽和または不飽和炭化水素を示し、
Ｒ５は、炭素数１〜１４のアルキル基である。
【請求項２】
脂肪酸アルキルエステルに対するオリゴアルキレンアミンのモル比を１超過２０以下にして、Ｒ１およびＲ４のうちの一つは水素であり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ水素である化学式１の陽イオン性脂質を製造する、請求項１に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項３】
オリゴアルキレンアミンに対する脂肪酸アルキルエステルのモル比を１以上５以下にして、Ｒ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基であり、Ｒ２およびＲ３は水素である化学式１の陽イオン性脂質を製造する、請求項１に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項４】
オリゴアルキレンアミンに対する脂肪酸アルキルエステルのモル比を５超過２０以下にして、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基である化学式１の陽イオン性脂質を製造する、請求項１に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基であり、Ｒ２およびＲ３は水素である、請求項１に定義された化学式１の陽イオン性脂質を請求項１に定義された化学式３の脂肪酸アルキルエステルと反応させてＲ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基でありＲ２およびＲ３のうちの一つは水素である化学式１の陽イオン性脂質を製造する段階を含む、Ｒ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基でありＲ２およびＲ３のうちの一つは水素である化学式１の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項６】
化学式１の陽イオン性脂質に対する脂肪酸アルキルエステルのモル比を０．５以上２０以下にする、請求項５に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項７】
ｎとｍは独立して０〜９であり、１≦ｎ＋ｍ≦１０である、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項８】
ａおよびｂが独立して２〜４である、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の一つ以上は、それぞれ独立して炭素数１４〜２２の不飽和脂肪酸基である、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項１０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の一つ以上は、それぞれ独立してラウロイル（ｌａｕｒｏｙｌ）、ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）、ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）、アラキドイル（ａｒａｃｈｉｄｏｙｌ）、ベヘノイル（ｂｅｈｅｎｏｙｌ）、リグノセロイル（ｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）、セロトイル（ｃｅｒｏｔｏｙｌ）、ミリストレオイル（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ）、パルミトレオイル（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ）、サピエノイル（ｓａｐｉｅｎｏｙｌ）、オレオイル（ｏｌｅｏｙｌ）、リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）、アラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ）、エイコサペンタエノイル（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｙｌ）、エルコイル（ｅｒｕｃｏｙｌ）、ドコサヘキサエノイル（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｙｌ）およびセロトイル（ｃｅｒｏｔｏｙｌ）からなる群より選択されたものである、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項１１】
前記化学式２のオリゴアルキレンアミンはオリゴエチレンアミンである、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項１２】
前記オリゴエチレンアミンは、ジエチレントリアミン（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ）、トリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ）、テトラエチレンペンタミン（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｐｅｎｔａｍｉｎｅ）、ペンタエチレンヘキサミン（ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｘａｍｉｎｅ）、ヘキサエチレンヘプタミン（ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｐｔａｍｉｎｅ）、ヘプタエチレンオクタミン（ｈｅｐｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｃｔａｍｉｎｅ）、オクタエチレンノナミン（ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｎｏｎａｍｉｎｅ）、ノナエチレンデカミン（ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｄｅｃａｍｉｎｅ）、デカエチレンウンデカミン（ｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｕｎｄｅｃａｍｉｎｅ）、ウンデカエチレンドデカミン（ｕｎｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｄｏｄｅｃａｍｉｎｅ）、ドデカエチレントリデカミン（ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉｄｅｃａｍｉｎｅ）およびトリデカエチレンテトラデカミン（ｔｒｉｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｄｅｃａｍｉｎｅ）からなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項１３】
有機溶媒不在下に化学式２のオリゴアルキレンアミンを化学式３の脂肪酸アルキルエステルと反応させる、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項１４】
反応後に非極性有機溶媒を加えて陽イオン性脂質を未反応物から沈殿分離して精製する段階を追加的に含む、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項１５】
非極性有機溶媒は、炭素数４〜１２のアルカンまたはエーテルである、請求項１４に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【請求項１６】
非極性有機溶媒に溶解後、酸を添加して陽イオン性脂質を酸付加塩形態に有機溶媒から水相層に分離後、中和して非極性有機溶媒で抽出精製する段階を追加的に含む、請求項５に記載の陽イオン性脂質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽イオン性脂質の合成時にオリゴアルキレンアミンに導入される脂肪酸基の導入率および導入位置を調節することができるようにする合成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今までオリゴアルキレンアミンのアミン基に飽和または不飽和脂肪酸基を導入した陽イオン性脂質の合成はオリゴアルキレンアミンの両末端の１次アミンに脂質を導入させると報告されている（米国登録特許９，２２０，７７９号、米国登録特許第５，７４４，３５５号など参照）。しかし、先行技術の合成条件ではオリゴアルキレンアミンの１次および２次アミン基に非特異的に脂肪酸基が反応するため、このような従来の合成法でオリゴアルキレンアミンの末端両側または片側の１次アミン基のみに選択的に脂質を反応させることは不可能である。したがって、脂質の導入率がそれぞれ異なる混合物が合成されやすく、毎反応時ごとに陽イオン性脂質の組成が異なる混合物が合成され得る。このように合成された陽イオン性脂質混合物を導入率の同一な脂質にそれぞれ分離精製することは非常に難しく多くの工程が必要であるという問題点がある。したがって、オリゴアルキレンアミン系陽イオン性脂質を環境にやさしく経済的に製造することができ、アミン基に選択的に脂質を導入合成することができる方法が必要である。
【０００３】
このような背景下で、本発明者らはこのような陽イオン性脂質の合成において、オリゴアルキレンアミンに所望の位置と導入率で脂肪酸基を導入することができる選択的合成方法を鋭意研究した結果、反応するオリゴアルキレンアミンと脂肪酸誘導体の条件を変更する場合、予測できないように目的する脂肪酸基の導入率および位置を有する陽イオン性脂質を簡易且つ経済的であり環境にやさしい方法で収得することができるのを発見して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
よって、本発明の一つの目的は、下記の化学式１で表記される陽イオン性脂質の合成時、脂肪酸基をオリゴアルキレンアミンの１次または２次アミン基に選択的に導入することができ、導入される脂肪酸基の導入率を調節することができる合成法を提供することである。
【０００５】
本発明の他の目的は、効率的に陽イオン性脂質を精製することができる方法を提供することである。
【化１】
2019501915.tif 000003
【０００６】
上記の式において、置換基の定義は以下で定義するとおりである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記のような目的を達成するための一つの様態として、本発明は、脂肪酸基の導入率を調節して下記の化学式１で表記される陽イオン性脂質を高純度に合成することができる方法に関するものである。
【化２】
2019501915.tif 000004
【０００８】
具体的に、本発明は下記の化学式２のオリゴアルキレンアミンを下記の化学式３の脂肪酸アルキルエステルと反応させることを特徴とする。
【化３】
2019501915.tif 000005
【化４】
2019501915.tif 000006
【０００９】
上記化学式１〜３において、
ｎとｍはそれぞれ０〜１２であり、１≦ｎ＋ｍ≦１２であり、ａとｂはそれぞれ１〜６であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素または炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基であって、Ｒ１およびＲ４のうちの少なくとも一つは炭素数１２〜２６の飽和または不飽和脂肪酸基であり、
Ｒは、炭素数１１〜２５の飽和または不飽和炭化水素を示し、
Ｒ５は、炭素数１〜１４のアルキル基である。
【００１０】
脂肪酸基の密度を高く維持し、陽イオンから誘発される細胞毒性を最少化するために、ｎとｍは前記のような数値および範囲を有するのが好ましい。
【００１１】
また、前記ＲおよびＲ１〜Ｒ４に関して、もし飽和または不飽和炭化水素の炭素数が１１より小さければ、炭化水素鎖間の疎水性相互作用の減少で陰イオン薬物と安定した剤形を形成することができない。反面、前記炭素数が２５より大きければ、炭化水素間の疎水性相互作用の増加で陰イオン性薬物と過度に安定した剤形を形成して体内で陰イオン性薬物の解離低下による効能減少を誘発させる。また、シス（ｃｉｓ）二重結合増加による炭化水素鎖の湾曲度増加で密度の低い剤形を形成し、剤形安定性が減少する。
【００１２】
好ましい一つの様態として、本発明による選択的合成方法で、化学式３の脂肪酸アルキルエステルに対する化学式２のオリゴアルキレンアミンのモル比（オリゴアルキレンアミン／脂肪酸アルキルエステル）を１超過２０以下、好ましくは３以上８以下にして、前記化学式１の中のＲ１およびＲ４のうちの一つが水素であり、Ｒ２およびＲ３が水素である陽イオン性脂質を製造することができる。
【００１３】
好ましいまた一つの様態として、本発明による選択的合成方法で、化学式２のオリゴアルキレンアミンに対する化学式３の脂肪酸アルキルエステルのモル比を１以上５以下、好ましくは１．５以上４以下にして、前記化学式１の中のＲ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の脂肪酸基であり、Ｒ２およびＲ３が水素である陽イオン性脂質を製造することができる。
【００１４】
好ましい他の一つの様態として、本発明による選択的合成方法で、化学式２のオリゴアルキレンアミンに対する化学式３の脂肪酸アルキルエステルのモル比を５超過２０以下、好ましくは６以上１０以下にして、前記化学式１の中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が炭素数１２〜２６の脂肪酸基である陽イオン性脂質を製造することができる。
【００１５】
本発明による前記のような合成方法で、前記オリゴアルキレンアミンと脂肪酸アルキルエステルの反応時、有機溶媒を使用せずに反応を行うことを特徴とする。
【００１６】
さらに、また他の一つの様態として、本発明は、Ｒ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の脂肪酸基でありＲ２およびＲ３が水素である、前記化学式１の陽イオン性脂質を前記化学式３の脂肪酸アルキルエステルと反応させて、Ｒ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の脂肪酸基でありＲ２およびＲ３のうちの一つが水素である化学式１の陽イオン性脂質を製造する段階を含む、Ｒ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の脂肪酸基でありＲ２およびＲ３のうちの一つが水素である化学式１の陽イオン性脂質の製造方法に関するものである：
【００１７】
好ましくは、ｎとｍは、独立して０〜９であり、１≦ｎ＋ｍ≦１０であってもよい。
好ましくは、ａとｂは、２〜４であってもよい。
好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して炭素数１４〜２２の不飽和脂肪酸基であってもよい。
【００１８】
好ましく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の一つ以上は、ラウロイル（ｌａｕｒｏｙｌ）、ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）、ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）、アラキドイル（ａｒａｃｈｉｄｏｙｌ）、ベヘノイル（ｂｅｈｅｎｏｙｌ）、リグノセロイル（ｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）、セロトイル（ｃｅｒｏｔｏｙｌ）、ミリストレオイル（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ）、パルミトレオイル（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ）、サピエノイル（ｓａｐｉｅｎｏｙｌ）、オレオイル（ｏｌｅｏｙｌ）、リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）、アラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ）、エイコサペンタエノイル（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｙｌ）、エルコイル（ｅｒｕｃｏｙｌ）、ドコサヘキサエノイル（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｙｌ）、およびセロトイル（ｃｅｒｏｔｏｙｌ）からなる群より選択されたものであってもよい。
【００１９】
前記Ｒ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の脂肪酸基であり、Ｒ２およびＲ３のうちの一つが水素である化学式１の陽イオン性脂質の製造方法においては、Ｒ１およびＲ４が炭素数１２〜２６の脂肪酸基であり、Ｒ２およびＲ３が水素である化学式１の陽イオン性脂質に対する脂肪酸アルキルエステルのモル比を０．５以上２０以下、好ましくは０．７以上１０以下、より好ましくは１以上５以下にすることが好ましい。
【００２０】
本発明で化学式２のオリゴアルキレンアミンは具体的にオリゴエチレンアミンであり、さらに具体的に、これに制限されるものではないが、ジエチレントリアミン（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ）、トリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ）、テトラエチレンペンタミン（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｐｅｎｔａｍｉｎｅ）、ペンタエチレンヘキサミン（ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｘａｍｉｎｅ）、ヘキサエチレンヘプタミン（ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｐｔａｍｉｎｅ）、ヘプタエチレンオクタミン（ｈｅｐｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｃｔａｍｉｎｅ）、オクタエチレンノナミン（ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｎｏｎａｍｉｎｅ）、ノナエチレンデカミン（ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｄｅｃａｍｉｎｅ）、デカエチレンウンデカミン（ｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｕｎｄｅｃａｍｉｎｅ）、ウンデカエチレンドデカミン（ｕｎｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｄｏｄｅｃａｍｉｎｅ）、ドデカエチレントリデカミン（ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉｄｅｃａｍｉｎｅ）およびトリデカエチレンテトラデカミン（ｔｒｉｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｄｅｃａｍｉｎｅ）からなる群より一つ以上選択されてもよい。好ましくは、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミンおよびヘキサエチレンヘプタミンからなる群より選択される一つ以上である。
【００２１】
以上のように化学式２のオリゴアルキレンアミンと化学式３の脂肪酸アルキルエステルを前記当量比で反応させる場合、製造される陽イオン性脂質内の炭化水素導入率を調節して高純度の陽イオン性脂質を合成することができる。
【００２２】
本発明による方法によれば、低廉なオリゴアルキレンアミンと脂肪酸アルキルエステルのような脂肪酸誘導体を用いて高い収率で容易に前記陽イオン性脂質を合成することができ、環境にやさしく経済的である。さらに、前記反応を通じて合成された脂質は非極性有機溶媒で溶解度が低いため容易に沈殿され、合成物の精製工程が非常に簡単であるという長所がある。
【００２３】
したがって、他の好ましい一様態として、本発明は、前記合成方法によって製造された化学式１の陽イオン性脂質に非極性有機溶媒を加えて未反応物を沈殿、分離し陽イオン性脂質を精製する段階を追加的に含むことができる。好ましく、前記非極性有機溶媒は炭素数４〜１２のアルカンまたはエーテルであってもよく、さらに好ましくはヘキサン、ヘプタンまたはジエチルエーテルであるが、これに制限されるものではない。
【００２４】
また他の好ましい一様態として、本発明は、前記合成方法によって製造された化学式１の陽イオン性脂質を非極性有機溶媒を加えて溶解させた後、酸を添加して陽イオン性脂質を酸付加塩形態に有機溶媒から水相層に分離後、中和して非極性有機溶媒で抽出させて分離精製する段階を追加的に含むことができる。また、好ましい非極性有機溶媒はクロロホルムまたはジクロロメタンであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２５】
前記のように、本発明による合成方法によって製造された化学式１の陽イオン性脂質はそれ自体が低い溶解度を示し、容易に沈殿され均一な導入率を示すため、このような点を用いた本発明の精製方法は従来の陽イオン性脂質の精製方法に比べて経済的、環境にやさしいながらも簡易であるという長所を有する。
【００２６】
本発明によって合成および／または精製された前記化学式１の陽イオン性脂質は、正常的な生体内環境の中性領域の水素イオン濃度（ｐＨ）でオリゴアルキレンアミンのアミン基が正電荷の形態に存在するので、細胞内で正電荷の荷電状態を保有する。したがって、前記陽イオン性脂質は生体内のような中性ｐＨで負電荷を帯びている核酸を含む陰イオン性薬物と複合体を形成することを可能にするだけでなく、生体内で相対的に負電荷を帯びる標的細胞膜との接触を増加させるのに役立つ。従って、本発明の陽イオン性脂質は核酸伝達用途のリポゾーム、ミセル、エマルジョンおよびナノ粒子など多様な形態の陰イオン性薬物の伝達体剤形を製造するために用いることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明による陽イオン性脂質の合成方法は、既存方法とは異なり、合成条件調節のみでオリゴアルキレンアミンに対する脂肪酸基の導入率調節が可能である。したがって、合成時に脂質導入率が互いに異なる陽イオン性脂質混合物が合成される既存方法とは異なり、常に高純度に均一な導入率を有する陽イオン性脂質を合成することができ、高難易度の精製過程が不必要である。また、合成および精製工程が簡便で大量生産時の経済性が高く、核酸または陰イオン性活性物質のような陰イオン性薬物と共にこれらの体液内安定性を高めることができる細胞内伝達用複合体を形成させるか、リポゾーム、ミセル、エマルジョンおよびナノ粒子伝達体を形成させることができる陽イオン性脂質を製造することにおいて非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】脂質導入数変化による分子量変化測定結果（ＧＰＣ）を示したものである。
【図２】１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドの水素核磁気共鳴分光器（１Ｈ  ＮＭＲ）で分析した結果を示したものである。
【図３】テトラオレオイルトリエチレンテトラミドの水素核磁気共鳴分光器（１Ｈ  ＮＭＲ）で分析した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を下記の実施例に基づいてより詳しく説明するが、これらは本発明を説明するためのものに過ぎず、これらによって本発明の範囲が何らかの形でも制限されるのではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１．１−モノオレオイルトリエチレンテトラミド（１−ｍｏｎｏｌｅｏｙｌ  ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｄｅ）の合成
５．００ｇ（３３．４４ｍｍｏｌ）トリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ）と２．００ｇ（６．６９ｍｍｏｌ）オレイン酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）を丸底フラスコに入れ、窒素充填下に６５℃で５日間マグネチックバーで攪拌しながら反応させた。
【００３１】
反応終了後、１５０ｍＬのジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）に反応物を溶解させた後、分液漏斗で３０ｍＬの１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液に塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を入れ、３回洗浄して未反応トリエチレンテトラミンを除去した。分液漏斗上部の有機溶媒層を蒸留濃縮装置で加温、減圧蒸留した。
【００３２】
最終的に得られた生成物をＨＰ１１００シリーズゲルクロマトグラフィー（ｇｅｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）でＳｈｏｄｅｘ  ＫＦ−８０１とＫＦ−８０２カラムを用いて０．５％ｖ／ｖトリエチルアミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）−テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）移動相で１ｍＬ／ｍｉｎ流速で分析した。その結果を図１に示した。また、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＤＰＸ４００水素核磁気共鳴分光器（１Ｈ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で重水素化クロロホルム（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）でオレオイル基の導入程度を分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６４６  Ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄ質量分析器（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いてＭｅＯＨ：５ｍＭ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｆｏｒｍａｔｅ−０／２５％  ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ（７０：３０）条件で合成された陽イオン性脂質の分子量を分析した。前記分析を通じてトリエチレンテトラミンの一側末端にオレオイル基が導入されたことを確認した。収率は７３．８％であり、１．１当量のオレオイル基がトリエチレンテトラミンに導入された。純度はＧＰＣから９６．７％と確認した。
【００３３】
実施例２．１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（１，６−ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｄｅ）の合成
０．５０ｇ（３．３４ｍｍｏｌ）トリエチレンテトラミンと２．００ｇ（６．６９ｍｍｏｌ）オレイン酸メチルを丸底フラスコに入れ、窒素充填下に６５℃で５日間マグネチックバーで攪拌しながら反応させた。
【００３４】
反応終了後、反応物に１５ｍＬのヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）を添加して１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドを析出させ未反応オレイン酸メチルを抽出する過程を３回反復した。析出された脂質を遠心分離で核酸から沈殿分離させて回収後、真空乾燥した。
【００３５】
精製された陽イオン性脂質の分子量およびオレオイル基の導入程度を実施例１と同様にゲルクロマトグラフィー、水素核磁気共鳴分光器、質量分析器を用いて確認した。ゲルクロマトグラフィーと水素核磁気共鳴分光器結果をそれぞれ図１と図２に示した。収率は７９．９％であり、２．０６当量のオレオイル基がトリエチレンテトラミンに導入された。純度はＧＰＣから９５．７％と確認した。
【００３６】
実施例３．１，３，６−トリオレオイルトリエチレンテトラミド（１，３，６−ｔｒｉｏｌｅｏｙｌｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｄｅ）
実施例２で合成された１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドにオレイン酸メチルを追加的に反応させて１，３，６−トリオレオイルトリエチレンテトラミドを合成した。詳しくは、４００ｍｇ（５７８．３μｍｏｌ）の１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドと１７３．２ｍｇ（５７８．３μｍｏｌ）のオレイン酸メチルを１００ｍＬのジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）に溶解させた後、窒素充填下に９０℃で還流させながら５日間攪拌しながら反応させた。
【００３７】
反応終了後、反応物を真空乾燥してジメチルホルムアミドを除去後、５０ｍＬのヘキサンを添加して未反応１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドを沈殿させた後、遠心分離した。その後、分離した上層液を真空乾燥した。ここに１０ｍＬの１Ｍ塩化水素（ＨＣｌ）を添加して合成された１，３，６−トリオレオイルトリエチレンテトラミドを一塩化水素塩（１，３，６−ｔｒｉｏｌｅｏｙｌ  ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｄｅ・１ＨＣｌ）形態に変換させた後、５０ｍＬのクロロホルムを添加して分液漏斗で未反応メチルオレオイルを抽出して除去した。陽イオン性脂質が溶解されている酸性水溶液を水酸化ナトリウムで中和後、クロロホルムで脂質を抽出して真空乾燥した。
【００３８】
精製された最終的に得られた生成物の分子量およびオレオイル基の導入程度を実施例１と同様にゲルクロマトグラフィー、水素核磁気共鳴分光器、質量分析器を用いて確認した。ゲルクロマトグラフィー結果を図１に示した。収率は４７．５％であり、２．９４当量のオレオイル基がトリエチレンテトラミンに結合されていることを確認した。純度はＧＰＣから９４．３％と確認した。
【００３９】
実施例４．テトラオレオイルトリエチレンテトラミド（ｔｅｔｒａｏｌｅｏｙｌ  ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｄｅ）
０．５０ｇ（３．３４ｍｍｏｌ）トリエチレンテトラミンと８．００ｇ（２６．７６ｍｍｏｌ）オレイン酸メチルを丸底フラスコに入れ、窒素充填下に６５℃で５日間マグネチックバーで攪拌しながら反応させた。
【００４０】
反応終了後、反応物に１５ｍＬのヘキサンを添加してテトラオレオイルトリエチレンテトラミドを析出させ未反応オレイン酸メチル抽出過程を３回反復した。精製されたテトラオレオイルトリエチレンテトラミド脂質を遠心分離でヘキサンから沈殿分離させて回収後、真空乾燥した。
【００４１】
精製された陽イオン性脂質の分子量およびオレオイル基の導入程度を実施例１と同様にゲルクロマトグラフィー、水素核磁気共鳴分光器、質量分析器を用いて確認した。ゲルクロマトグラフィーと水素核磁気共鳴分光器結果をそれぞれ図１と図３に示した。収率は８９．１％であり、４．０５当量のオレオイル基がトリエチレンテトラミンに導入された。純度はＧＰＣから９９．４％と確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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