(57)【要約】【課題】単量体として生理活性を示すサイトカインの活性が長時間充分に維持されることができる新しい形態のヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を提供する。【解決手段】本発明は抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の重鎖不変部位対の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域を含み、前記第１Ｆｃ領域及び／又は第２Ｆｃ領域のＮ末端及びＣ末端の一つ以上の末端にＩＬ−２１が結合されているヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成を促進するようにＣＨ３ドメインが変異されたものであることを特徴とするヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記ヘテロ二量体融合タンパク質を含む薬剤学的組成物を提供する。本発明による抗体重鎖不変部位ヘテロ二量体融合タンパク質を用いる場合、前記ヘテロ二量体融合タンパク質に含まれたＩＬ−２１の体内半減期が著しく増加することができる利点がある。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）重鎖不変部位（Ｆｃ）対の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域を含み、前記第１Ｆｃ領域及び／又は第２Ｆｃ領域のＮ末端及びＣ末端の一つ以上の末端にＩＬ−２１が結合されているヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、
前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ）の形成を促進するようにＣＨ３ドメインが変異されたものであることを特徴とする、ヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項２】
前記第１Ｆｃ領域又は第２Ｆｃ領域のＮ末端のいずれか一末端にだけＩＬ−２１が結合されている、請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域は、それぞれヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群から選択されたＦｃ領域由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の形態で含まれていることを特徴とする、請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１Ｆｃ領域又は第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの変異は次の群から選択された一つ以上の変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質（ただし、変異位置はＥＵ  ｉｎｄｅｘに従う）。
（１）第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３６０位置でのＫ３６０Ｅのアミノ酸残基の置換、
（２）第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＱ３４７位置でのＱ３４７Ｒのアミノ酸残基の置換、
（３）第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位置でのＫ４０９Ｗのアミノ酸残基の置換、及び
（４）第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位置でのＦ４０５Ｔアミノ酸残基の置換、及びＤ３９９位置でのＤ３９９Ｖのアミノ酸残基の置換。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合タンパク質を含む、薬剤学的組成物。
【請求項７】
癌治療のための、請求項６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記癌は、大膓癌、黒色腫、乳房癌、膵膓癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、小腸癌、食道癌、子宮頸部癌、肺癌、リンパ腫及び血液癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
他の抗癌剤との併用治療のための、請求項７に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）重鎖不変部位（Ｆｃ）対の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域を含み、前記第１Ｆｃ領域及び／又は第２Ｆｃ領域のＮ末端及びＣ末端の一つ以上の末端にＩＬ−２１が結合されているヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成を促進するようにＣＨ３ドメインが変異されたものであることを特徴とするヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記ヘテロ二量体融合タンパク質を含む薬剤学的組成物に関する。
【０００２】
本発明による抗体重鎖不変部位ヘテロ二量体融合タンパク質を用いる場合、前記ヘテロ二量体融合タンパク質に含まれたＩＬ−２１の体内半減期が著しく増加することができる利点がある。
【背景技術】
【０００３】
自然界に存在するヒト抗体（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）は同じアミノ酸配列を有する二つの重鎖と同じ配列を有する二つの軽鎖が組み合わせられた（ａｓｓｅｍｂｌｙ）形態で存在する。ここで、二つの同じ重鎖間のホモ二量体化（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は抗体の定常領域（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ）の最後のドメイン（ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡの場合はＣＨ３ドメイン、ＩｇＭの場合はＣＨ４ドメイン、ＩｇＥの場合はＣＨ２及びＣＨ４ドメイン）間の非共有相互作用（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）及びヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域間のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）によって誘導される。
【０００４】
抗体由来のヘテロ二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ）技術は、前述した自然発生的抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）のホモ二量体化に大きく寄与する定常領域の最後のドメイン間の特定の非共有相互作用によってヘテロ二量体化が好まれ、ホモ二量体化が好まれていないか排斥される結合を有するようにエンジニアリングしてヘテロ二量体形態の重鎖不変部位を作る技術である。より詳しくは、遺伝子操作によって互いに異なる二つの抗体重鎖のＣＨ３ドメインに突然変異を誘導することで、二つの重鎖が自然発生的抗体と構造が非常に類似しており、配列において最小限の偏差を有しながらヘテロ二量体を形成するように誘導するものである（アメリカ特許登録第７，６９５，９３６号；韓国特許登録第１，５２２，９５４号）。前記ヘテロ二量体重鎖不変部位技術は二重抗体を作るための基盤技術であり、これまで知られたヘテロ二量体の形成を誘導するＣＨ３ドメイン突然変異体は大部分ＣＨ３ドメイン相互作用面に抗体の構造基盤合理的設計（ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）による非対称的突然変異対を導入することによって製造された（Ｓｐｒｅｔｅｒ  Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。先駆者的研究としては、ジェネンテック社のノブ−イントゥ−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術があり（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社のＺＷ１（Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、Ｇｅｎｅｃｏｒｅ社のＨＡ−ＴＦ（Ｍｏｏｒｅ  ＧＬ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ社のＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｄａｖｉｓ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）などの多くの多国的製薬会社で前記基盤技術を開発及び報告した。その中でも、本発明で使用したＥＷ／ＲＶＴ突然変異体は既存の前記のような突然変異体の相互作用を配列及び構造的に分析し、新しい突然変異戦略であるＣＨ３ドメイン相互作用面の選択的な静電気的結合が形成されるようにして（Ｋ３６０ＥＣＨ３Ａ−Ｑ３４７ＲＣＨ３Ｂ）、既存の静電気的結合の代わりに相互補完的な疎水性結合を形成するように（Ｋ４０９ＷＣＨ３Ａ−Ｄ３９９ＶＣＨ３Ｂ／Ｆ４０５ＴＣＨ３Ｂ）してヘテロ二量体の形成を増進させた突然変異体である（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；韓国特許登録第１０−１５２２９５４号）。
【０００５】
前記ＥＷ／ＲＶＴ突然変異体を含めて現在まで報告されたヘテロ二量体重鎖不変部位突然変異体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）はいずれもヒト抗体アイソフォームの中でも一番多い部分を占めるＩｇＧ１を基にしたものであり、ＩｇＧ１以外の他のアイソフォーム（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）に対する突然変異体は報告されたことがない。
【０００６】
これはアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）の許可を受けて市販されている治療用抗体の大部分がアイソフォームＩｇＧ１を採択しているからであり（Ｉｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、最近には抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）のような抗体固有のエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が大きく必要ではない免疫調節抗体（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は受容体作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）融合タンパク質の場合、ＩｇＧ１に比べてこのようなエフェクター機能がめっきり落ちるＩｇＧ２又はＩｇＧ４を基にした治療用タンパク質が開発されている実情である。
【０００７】
一方、生理活性タンパク質は概して大きさの小さい場合が多いため、体内での半減期が短いという問題点が存在する。このような欠点を解決するために、ＰＥＧを接合させるか、抗体由来のＦｃ（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）領域を融合させるなどの試みがあって来たが、いまだに効率的に生理活性タンパク質の活性が長時間にわたって充分に維持される形態は開発されていない実情である。特に、自然界で単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）として作動するＩＬ−２１の場合、既存のホモ二量体を形成する抗体の重鎖不変部位領域を用いては単量体の形態をそのまま形成しにくい。一つのＩＬ−２１は一つのＩＬ−２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）及び一つのγｃ−ｃｈａｉｎと結合することによって活性を有する。
【０００８】
このような技術的背景の下で、本発明者らは単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）として作動するＩＬ−２１をそのまま模写するために、抗体由来の重鎖不変部位領域を含むヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）変異体を構築し、これを用いてＩＬ−２１を前記Ｆｃ領域の末端に結合させた形態のヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）形態の新しい治療用融合タンパク質を開発した。
【０００９】
免疫細胞治療剤として使われる細胞のうちＮＫ細胞は先天免疫細胞の一つであり、多様な種類の癌細胞を殺傷することができ、抗原の有無に関係なく癌細胞を認識するから、最近に脚光を浴びている坑癌兔疫細胞治療剤である。ＮＫ細胞を坑癌免疫細胞治療剤として使うためには、坑癌能が増大した多量のナチュラルキラー細胞の生産及び生体内でナチュラルキラー細胞が長期間生存して坑癌効力を発揮することができる環境の造成が必要である。このような理由で、ＮＫ細胞の活性化調節に影響を及ぼすサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＦＮｓ）をナチュラルキラー細胞とともに生体内に投与することによってＮＫ細胞の生存能を高めるとともに坑癌活性を誘導する試みが全世界的に行われている。しかし、現在まで患者に直接投与することができるように臨床試験で市販が承認されたサイトカインはＩＬ−２が唯一である実情である。ＩＬ−２はＮＫ細胞の生存能と活性を増大させ、値段も相対的に低価であるが、免疫抑制細胞である調節Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）を活性化させて坑癌免疫機能を抑制させる欠点がある（Ｃｅｓａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６，Ｗｅｉｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７）。よって、調節Ｔ細胞を活性化させないでＮＫ細胞を活性化させるサイトカインの商用化が切実な実情である。
【００１０】
このような観点で、最近ＩＬ−２１が坑癌免疫治療で脚光を浴びている。ＩＬ−２１はＩＬ−２と同様にＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖と分化を促進するが、反対に調節Ｔ細胞の増殖には影響を及ぼさないことが報告され、坑癌免疫細胞治療剤との併用投与が期待されている（Ａｌ−Ｃｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０１６）。ＩＬ−２１がＮＫ細胞に関連して報告されたところ、１）ＩＬ−１５とともにＦｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−３（ＦＬＴ３−Ｌ）が存在するとき、ヒト由来のＣＤ３４＋  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓから由来したＮＫ細胞の増殖を促進する結果（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００）、２）栄養細胞株として使用するＫ５６２細胞にｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ｆｏｒｍ  ＩＬ−２１を発現させれば、ＮＫ細胞の体外拡張を促進させ、老化が抑制される結果（Ｌｅｅ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１２）、３）Ｃａｎｉｎｅ  ＮＫ細胞の培養時、ＩＬ−２  ｐｌｕｓ  ＩＬ−１５による増殖を促進する結果（Ｓｈｉｎｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１５）及び４）ヒトＮＫ細胞においてＳＴＡＴ３を活性化させてＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を促進させる結果（Ｚｈｕｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１４）などがある。
【００１１】
したがって、本発明は体内で長期間活性を維持することができるＦｃ−結合組み換えＩＬ−２１をヘテロ二量体工法で製造し、製造したＦｃ−ＩＬ２１単量体は水溶性ＩＬ−２１又は二量体ＩＬ−２１に比べて優れたＮＫ細胞増殖促進機能を示し、体内で小さい頻度の投与で水溶性ＩＬ−２又は二量体ＩＬ−２１に比べて卓越した抗腫瘍効果を誘導することができることを見つけた。本発明のＦｃ−ＩＬ２１単量体を含むヘテロ二量体融合タンパク質は、水溶性ＩＬ−２１又はＩＬ−２の使用時に要求される頻繁な投与の欠点を補い、既存の工法によって製造された二量体ＩＬ−２１より高い生体坑癌活性能力を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明で解決しようとする課題は単量体として生理活性を示すサイトカインの活性が長時間充分に維持されることができる新しい形態のヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を提供することである。
【００１３】
特に、本発明によるヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は単量体として生理活性を示すＩＬ−２１を自然界に存在する形態のままで模写することにより、自然界に存在するままの活性を維持することができる形態である。本発明のＦｃ−ＩＬ２１単量体は水溶性ＩＬ−２１又は二量体ＩＬ−２１に比べて優れた活性を示す。
【００１４】
また、本発明は前記ヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む薬剤学的組成物及びこれを用いた疾病、特に癌の治療のための組成物、治療方法及び用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決するために、本発明は、抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）重鎖不変部位（Ｆｃ）対の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域を含み、前記第１Ｆｃ領域及び／又は第２Ｆｃ領域のＮ末端及びＣ末端の一つ以上の末端にＩＬ−２１が結合されているヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成を促進するようにＣＨ３ドメインが変異されたものであるを特徴とするヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記ヘテロ二量体融合タンパク質を含む薬剤学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記ヘテロ二量体融合タンパク質を含む薬剤学的組成物を投与する段階を含む疾病、特に癌の治療方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、前記ヘテロ二量体融合タンパク質を含む薬剤学的組成物を疾病、特に癌の治療に使用する用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】重鎖不変部位に融合する組み換えヒトＩＬ−２１の形態を示した模式図である。
【図２】ヒトＩＬ−２１を野生型ＩｇＧ４  Ｆｃに融合したＦｃ−ＩＬ２１二量体形態を示した模式図である。
【図３】ヒトＩＬ−２１をＩｇＧ４に基づいて作られたＥＷ／ＲＶＴ変異体に融合したＦｃ−ＩＬ２１単量体の形態を示した模式図である。
【図４】ヒト抗体アイソフォーム別ヘテロ二量体の形成のためのＣＨ３ドメイン変異体の製作のために各ヒト抗体兔疫グロブリンＧアイソフォーム別ＣＨ３ドメインの配列（ＩｇＧ１：配列番号４；ＩｇＧ２：配列番号５；ＩｇＧ３：配列番号６；ＩｇＧ４：配列番号７）を羅列して比較し、潜在的突然変異の位置を選定した結果を示した図である。
【図５】ＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインの野生型及び突然変異が導入されたヘテロ二量体重鎖不変部位対の配列情報（ＩｇＧ４野生型：配列番号７；ＩｇＧ４  ＥＷ：配列番号１；ＩｇＧ４  ＲＶＴ：配列番号２）を示した図である。
【図６】Ｆｃ−ＩＬ２１二量体及びＦｃ−ＩＬ２１単量体を構築するために使用されたＩＬ−２１が融合した野生型Ｆｃ及びヘテロ二量体重鎖不変部位対の配列情報を示した図である。
【図７】図３の融合タンパク質を動物細胞で発現及び精製するためのベクターの模式図である。
【図８】図２の融合タンパク質を動物細胞で発現及び精製するためのベクターの模式図である。
【図９】図７及び図８の動物細胞発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で共同形質転換によって一時発現及び精製した後、３μｇのタンパク質を非還元性条件と還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）染色によって大きさ及び組合せ形態を分析した結果を示す図である。
【図１０Ａ】ヒトの血液からナチュラルキラー細胞を体外拡張するとき、Ｆｃ−ＩＬ２１単量体、Ｆｃ−ＩＬ２１二量体を処理して培養した実験結果で、ナチュラルキラー細胞の成長曲線及び拡張能を示した図である。
【図１０Ｂ】６人の供与者から繰り返して進めてから統計処理した結果を示す図である。
【図１１】異種移植ヒト黒色腫癌モデルを構築した後、ＮＫ細胞とＩＬ−２、Ｆｃ−ＩＬ２１単量体又はＦｃ−ＩＬ２１二量体間の併用治療効果を示した模式図で、ＮＫ細胞治療剤、ＩＬ−２及びＦｃ−ＩＬ２１の投与方法を示した図である。
【図１２Ａ】異種移植ヒト黒色腫癌モデルにおいてＮＫ細胞とＩＬ−２、Ｆｃ−ＩＬ２１単量体又はＦｃ−ＩＬ２１二量体間の併用治療効果によって腫瘍の大きさを比較した結果を示す図である。
【図１２Ｂ】異種移植ヒト黒色腫癌モデルにおいてＮＫ細胞治療のみを投与するとき、腫瘍の大きさを示した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
他に定義しない限り、本明細書で使用した全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用した命名法は当該技術分野でよく知られており、通常に使われるものである。
【００２１】
本発明は、一観点で、抗体（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）重鎖不変部位（Ｆｃ）対の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域を含み、前記第１Ｆｃ領域又は第２Ｆｃ領域のＮ末端及びＣ末端の一末端にＩＬ−２１が結合されているヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成を促進するようにＣＨ３ドメインが変異されたものであることを特徴とするヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に関するものである。
【００２２】
好ましくは、前記第１Ｆｃ領域又は第２Ｆｃ領域のＮ末端のいずれか一末端にだけＩＬ−２１が結合されているヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である。
【００２３】
本発明において、“Ｆｃ領域”又は“重鎖不変部位”は抗体由来のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｄｏｍａｉｎ）を含む領域を意味する。
【００２４】
本発明における“第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成を促進するように変異”されたという表現は、自然界に存在する抗体は二つのＦｃ領域が互いに同じ配列を有するホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）の形態を有し、このようなＦｃ領域の一部配列に変異を引き起こすことにより、第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域間の特定の非共有相互作用によってヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成が促進され、ホモ二量体の形成が減少するか、好ましくはほとんど形成されないように変異されたことを意味する。
【００２５】
好ましくは、本発明による第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域のヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成を促進するようにする変異は、前記抗体由来の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域に含まれたＣＨ３ドメインのそれぞれがヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成を促進するようにする変異を含むことができる。
【００２６】
本発明において、“重鎖不変部位ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ又はＦｃｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）”は第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域を含み、前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成を促進するようにＣＨ３ドメインが変異されたものであることを特徴とするヘテロ二量体を意味する。
【００２７】
本発明における前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域は、それぞれヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群から選択されたＦｃ領域由来のものであることを特徴とすることができ、好ましくは、前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はそれぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のものであることを特徴とし、また、前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域は同形（ｉｓｏｔｙｐｅ）抗体由来のものであることを特徴とすることができる。
【００２８】
他の観点で、前記ＣＨ３ドメインの変異は次の群から選択された一つ以上の変異を含むことを特徴とすることができる。本発明の全ての変異位置はＥＵ  ｉｎｄｅｘに従う。
【００２９】
（１）第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３６０位置でのアミノ酸残基の置換、及び第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＱ３４７位置でのアミノ酸残基の置換、及び／又は
（２）第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位置でのアミノ酸残基の置換、及び第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５及び／又はＤ３９９位置でのアミノ酸残基の置換。
【００３０】
好ましくは、前記第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３６０位置でのアミノ酸残基の置換はＫ３６０Ｅであり、前記第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＱ３４７位置でのアミノ酸残基の置換はＱ３４７Ｒであることを特徴とすることができ、
前記第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位置でのアミノ酸残基の置換はＫ４０９Ｗであり、前記第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位置でのアミノ酸残基の置換はＦ４０５Ｔであり、Ｄ３９９位置でのアミノ酸の置換はＤ３９９Ｖであることを特徴とすることができる。
【００３１】
最も好ましくは、前記第１Ｆｃ領域又は第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの変異は次の群から選択された一つ以上の変異を含むことを特徴とすることができる（ただし、変異位置はＥＵ  ｉｎｄｅｘに従う）。
【００３２】
（１）第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３６０位置でのＫ３６０Ｅのアミノ酸残基の置換、
（２）第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＱ３４７位置でのＱ３４７Ｒのアミノ酸残基の置換、
（３）第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位置でのＫ４０９Ｗのアミノ酸残基の置換、及び
（４）第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位置でのＦ４０５Ｔアミノ酸残基の置換及びＤ３９９位置でのＤ３９９Ｖのアミノ酸残基の置換。
【００３３】
好ましくは、本発明による抗体由来の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域に含まれたＣＨ３ドメインはそれぞれ配列番号１及び配列番号２の配列番号で表示されるアミノ酸配列からなる群から選択された配列を有することを特徴とすることができる。
【００３４】
特に、本発明による抗体由来の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はＩｇＧ４由来の表１に記載したＣＨ３ドメインの配列を有することが好ましい。
【表１】
2019530657.tif 000003
【００３５】
さらに他の観点で、本発明は本発明によるヘテロ二量体融合タンパク質を含む薬剤学的組成物に関するものである。本発明による薬学組成物の用途は生理活性タンパク質としてＩＬ−２１を含むヘテロ二量体融合タンパク質を含む癌治療のための薬剤学的組成物を提供する。
【００３６】
前記ＩＬ−２１を含むヘテロ二量体融合タンパク質を含む癌治療のための薬剤学的組成物で治療可能な癌は、大膓癌、黒色腫、乳房癌、膵膓癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、小腸癌、食道癌、子宮頸部癌、肺癌、リンパ腫及び血液癌からなる群から選択されることができるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
本発明による薬剤学的組成物は、追加的に製薬上許容される担体を含むことができる。“製薬上（薬学的に）許容される担体”は製剤を製剤化するかあるいは安定化させることを助けるために活性成分に付け加わることができる物質であり、患者に有意な有害な毒性効果を引き起こさない。
【００３８】
前記担体は患者を刺激しないとともに本発明によるヘテロ二量体融合タンパク質の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を言う。液状溶液から製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適したもので、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して使うことができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は精製に製剤化することができる。他の担体は、例えば文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）］に記載されている。
【００３９】
製薬上許容される担体は滅菌注射可能な溶液剤又は分散液剤を即時投与用（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）に製造するための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末を含む。製薬活性物質のためのこのような媒質及び作用剤の使用は当該分野に公知となっている。組成物は、好ましくは非経口注射用に製剤化される。組成物は、溶液剤、マイクロエマルジョン剤、リポソーム剤、又は高い薬物濃度に適したその他の注文された構造物に製剤化されることができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適した混合物を含む溶媒又は分散媒質であり得る。場合によって、組成物に、等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムを含むことができる。滅菌注射可能な溶液剤は、所要量のヘテロ二量体融合タンパク質を、必要によって、前記記載した成分のうち１種又はこれらの調合物とともに適切な溶媒中に混入させた後、滅菌精密濾過を行うことによって製造されることができる。一般に、分散液剤は、活性化合物を基本的な分散媒質及び前記記載のものからのその他の必要な成分を含む滅菌ビークルに混入させることによって製造される。滅菌注射可能な溶液剤を製造するための滅菌粉末の場合、一部の製造方法は活性成分及び任意の追加の所望成分の粉末を予め滅菌及び濾過させた溶液から生成する真空乾燥及び冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
【００４０】
また、本発明による薬剤学的組成物は、疾病に苦しむ患者の重症度によって変わる投与量及び頻度で経口又は非経口で投与されることができる。組成物は、必要によって、ボーラスで又は連続注入によって患者に投与されることができる。さらに他の形態として、本発明による薬剤学的組成物は、直腸内に、静脈内に（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、子宮内に（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｌｙ）又は脳血管内に（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）投与されることができる。
【００４１】
また、前記ＩＬ−２１を含むヘテロ二量体融合タンパク質を含む癌治療のための薬剤学的組成物は他の抗癌剤との併用治療のための用途に使われることができ、前記他の抗癌剤は細胞毒性Ｔ細胞及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ：Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞であることが好ましいが、これに限定されるものではなく、他の当該技術分野で使用可能な全ての抗癌剤が併用治療のために使われることができる。
【００４２】
特に、ＩＬ−２１を含むヘテロ二量体融合タンパク質を含む癌治療のための薬剤学的組成物を細胞毒性Ｔ細胞及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ：Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞との併用治療のために使用する場合、
１）試験管内でＩＬ−２１によって誘導されるナチュラルキラー細胞の増殖能を保存、
２）生体内でナチュラルキラー細胞との併用投与時、ＩＬ−２１単独処理群に比べて卓越した坑癌活性増大の誘導、又は
３）ＩＬ−２１及び他のγ鎖サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５など）の短い半減期のために要求される頻繁な生体投与の代替を特徴とすることができる。
【００４３】
前記のような癌治療のための薬剤学的組成物をナチュラルキラー（ＮＫ：Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞と併用して投与する場合、単量体ＩＬ−２１を含むヘテロ二量体融合タンパク質は水溶性ＩＬ−２１又は二量体ＩＬ−２１に比べて著しく優れた活性を示す。
【００４４】
さらに他の観点で、本発明は、本発明によるヘテロ二量体融合タンパク質を含む薬剤学的組成物を治療されるべき患者に投与する段階を含む疾病の治療方法を提供する。
【００４５】
好ましくは、本発明によるヘテロ二量体融合タンパク質内に含まれた生理活性タンパク質がＩＬ−２１の場合、より好ましくは、単量体ＩＬ−２１の場合、癌患者の治療、特に大膓癌、黒色腫、乳房癌、膵膓癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、小腸癌、食道癌、子宮頸部癌、肺癌、リンパ腫及び血液癌からなる群から選択される癌を病んでいる患者の治療方法を提供する。
【００４６】
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はただ本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないというのは当該分野で通常の知識を有する者に明らかであろう。
【００４７】
実施例１：ヒト抗体アイソフォーム別ヘテロ二量体の形成のためのＣＨ３ドメイン変異体の考案（配列分析）
ヘテロ二量体の形成が好まれるＣＨ３ドメイン突然変異が導入されたヒト抗体重鎖不変部位ヘテロ二量体の断片を作るために、まず二量体の形成のための相互作用に主に作用するＣＨ３ドメインのヒト抗体アイソフォーム別間のアミノ酸配列の類似程度を分析した。ここで、異種のＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ（本発明において、ＣＨ３Ａ及びＣＨ３Ｂはそれぞれ第１Ｆｃ領域のＣＨ３領域及び第２Ｆｃ領域のＣＨ３領域を意味する）に誘導される突然変異対（ＥＷ／ＲＶＴ）は既存の文献又は特許に公開された重鎖不変部位ヘテロ二量体の形成を増進させるための戦略でＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂが高収率で形成されるようにする（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ、２０１３；韓国特許登録第１０−１５２２９５４号）。図４は各ヒト抗体兔疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）アイソフォーム別ＣＨ３ドメインの配列（ＩｇＧ１：配列番号４；ＩｇＧ２：配列番号５；ＩｇＧ３：配列番号６；ＩｇＧ４：配列番号７）を羅列して比較したものである。
【表２】
2019530657.tif 000004
【００４８】
配列比較結果、濃く強調したＱ３４７、Ｋ３６０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｋ４０９残基は突然変異が導入された残基であり、ヒト抗体ＩｇＧの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）にかかわらず、ほぼ類似した残基として保存されていることを確認することができる。よって、ヘテロ二量体ＣＨ３突然変異体対の形成のために誘導される突然変異はヒト抗体ＩｇＧ１に限定されないことが分かった。各アミノ酸配列はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）から確認したし、本発明における全てのアミノ酸の位置表記はＥＵ  ｉｎｄｅｘ（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）に従う。
【００４９】
実施例２：ヒトＦｃ−ＩＬ２１融合タンパク質構築
ヘテロ二量体の形成能が既存に報告されたＩｇＧ１基盤ＥＷ／ＲＶＴ重鎖不変部位ヘテロ二量体変異体と類似した程度に維持されると予想される図５のアイソフォーム別変異体のうちＩｇＧ４に基づく変異体（ＩｇＧ４−ＥＷ／ＲＶＴ、配列番号１、２）を用いてヒトＩＬ−２１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２１、配列番号３）融合タンパク質を構築した。自然界に存在するＩＬ−２１は単量体として作動するサイトカインであり、一つのＩＬ−２１が一つのＩＬ−２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）及び一つのγｃ−ｃｈａｉｎと結合することによって活性を有する。したがって、前記ＩｇＧ４−ＥＷ／ＲＶＴヘテロ二量体変異体を用い、一つのＩＬ−２１を互いに異なるヘテロ二量体Ｆｃ変異体（ＣＨ３Ａ又はＣＨ３Ｂ）の一つにだけ連結して自然界に存在するＩＬ−２１の単量体の形態を維持しようとした。
【００５０】
融合タンパク質の構築のための重鎖不変部位ヘテロ二量体変異体は、ＩｇＧ４に基づいてＥＷ／ＲＶＴ突然変異が導入されてヘテロ二量体を形成するＩｇＧ４−ＥＷ／ＲＶＴを使った。既存の報告によると、抗体とサイトカインを融合した形態である免疫サイトカイン（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ）の構築においてＩｇＧ１が有するＡＤＣＣ／ＣＤＣのような抗体固有機能がむしろ生体内除去現象（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を促進する。したがって、ＡＤＣＣ／ＣＤＣの機能がＩｇＧ１と比較したときにほとんど現れないＩｇＧ４アイソフォームを使って融合タンパク質を構築した（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００５１】
図１〜図３はＩＬ−２１の組み換えタンパク質、野生型Ｆｃを用いたＩＬ−２１二量体融合タンパク質、そしてＥＷ／ＲＶＴを用いたＩＬ−２１単量体融合タンパク質の模式図である。そのうち、図３は本発明で製作したＣＨ３突然変異体対が導入された融合タンパク質である。
【００５２】
ＣＨ３突然変異体対が導入されたＩＬ２１−Ｆｃ（ＩｇＧ４  ＥＷ）とＦｃ（ＩｇＧ４  ＲＶＴ）をＣＭＶプローモーターを有する動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にシグナル配列−ＩＬ２１成熟形態−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３又はシグナル配列−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を有するようにインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）でＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによってクローニングした。ここで使用されたＩＬ−２１はヒトＩＬ−２１（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ  ｎａｍｅ、Ｑ９ＨＢＥ４；配列番号３）であり、シグナル配列を除いた成熟形態をコーディングするＤＮＡ配列のみを使った。特に、ヒトＩＬ−２１は、ＩＬ−２１受容体との相互作用が容易であるように追加のペプチドリンカーなしに、ヒンジ領域を用いて重鎖不変部位と連結した。ここで使用したヒンジ領域は既存に多く使ったＩｇＧ１由来のヒンジを使い、二量体形成のための中心ヒンジ領域（ｃｏｒｅ  ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）内のシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）残基を除いた残りの上部ヒンジ領域（ｕｐｐｅｒ  ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のシステイン残基は、タンパク質の融合時、望まないジスルフィド結合が発生することを防ぐために、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基に置換した。
【００５３】
特に、本発明で使用した重鎖不変部位のＣＨ２ドメインはＩｇＧ２／４  ｈｙｂｒｉｄである。ＩｇＧ２／４  ｈｙｂｒｉｄはＩｇＧ２の下部ヒンジ（ｌｏｗｅｒ  ｈｉｎｇｅ）部分とＩｇＧ４のＣＨ２部分が融合した形態である。これは既存に補体Ｃ５を対象とするｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ抗体（製品名：Ｓｏｌｉｒｉｓ）から由来したドメインであり、抗体の使用目的（ＣＤＣ機能を全く無くすためである）によってＦｃ受容体に対する結合能を抑制させようと考案されたドメインである（Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００５４】
図３の比較例として野生型Ｆｃを融合したＦｃ−ＩＬ２１二量体（図２）を構築した。前記と類似した方法でヒトＩＬ−２１成熟形態をコーディングするＤＮＡ配列を野生型ＩｇＧ４  ＣＨ３が入っている動物細胞発現ベクターに図８のようなインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）でＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いてクローニングした。ここで使用したヒンジ領域及びＣＨ２ドメインもＦｃ−ＩＬ２１単量体の構築に使用した配列と同一である（図６）。
【００５５】
表３は前記融合タンパク質の構築に使用されたヒトＩＬ−２１の成熟形態に対するアミノ酸配列である。
【表３】
2019530657.tif 000005
【００５６】
実施例３：Ｆｃ−ＩＬ２１融合タンパク質発現／精製
図３のＦｃ−ＩＬ２１単量体融合タンパク質はヒトＩＬ−２１が融合したＩｇＧ４  ＣＨ３Ａ（ＥＷ）及びＩｇＧ４  ＣＨ３Ｂ（ＲＶＴ）の発現ベクターを１：１の比率にし、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｎｅｃｅｓ社製）の混合物をＨＥＫ２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）細胞に過渡トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が入っている振盪フラスコで培養することによって作られる。詳細な方法は次のようである。
【００５７】
振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）で２００ｍＬトランスフェクションの際、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を１．０×１０６細胞／ｍｌの密度で培地１８０ｍｌに播種し、１３０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養した。２４時間後、それぞれの重鎖不変部位変異体を含む融合タンパク質を生産するために、それによるＣＨ３Ａ及びＣＨ３Ｂプラスミドを１０ｍｌ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＣＨ３Ａ  １２５μｇ、ＣＨ３Ｂ  １２５μｇの総２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈し、ＰＥＩ  ７５０μｇを希釈した１０ｍｌの培地（７．５μｇ／ｍｌ）と混合し、室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を先に１８０ｍｌに播種した細胞に入れ、短くは５日間、長くは７日間培養すると、細胞が生産したタンパク質、すなわち重鎖不変部位変異体を含む融合タンパク質は細胞によって細胞外に分泌されて培地に積もる。よって、タンパク質は、細胞培養後に２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して採取した細胞培養上澄み液からタンパク質Ａセファロースカラム（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製した。ここで、精製方法は、タンパク質Ａカラム社で提供する標準プロトコルを参照し、精製されたタンパク質はＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）内の溶液を用いて５６２ｎｍ波長で吸光度を測定し、描かれた標準曲線によってその量を定量した。
【００５８】
前記精製されたＦｃ−ＩＬ２１単量体及び二量体融合タンパク質３μｇを１２％非還元性及び還元性の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した（図９）。非還元性の条件で、Ｆｃ−ＩＬ２１単量体は７１ｋＤａ、Ｆｃ−ＩＬ２１二量体は８６ｋＤａで観察され、還元性の条件ではＩＬ−２１が融合した野生型ＦｃのみからなっているＦｃ−ＩＬ２１二量体は４３ｋＤａで一つのバンドのみ観察され、ＩＬ−２１が融合した重鎖不変部位変異体ＣＨ３Ａ（ＥＷ）とＩＬ−２１が融合しなかった重鎖不変部位変異体ＣＨ３Ｂ（ＲＶＴ）の二つのプラスミドからなっているＦｃ−ＩＬ２１単量体の場合には４３ｋＤａ及び２８ｋＤａで二つのバンドが観察された。
【００５９】
表４は発現したＦｃ−ＩＬ２１単量体及び二量体融合タンパク質の精製収率を示したものである。結果値は独立的な実験を３回実施した後、平均標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示した。Ｆｃ−ＩＬ２１単量体の形態がＦｃ−ＩＬ２１二量体形態に比べて約１７倍高い精製収率を示すことを確認することができた。
【表４】
2019530657.tif 000006
【００６０】
実施例４：ヒトＦｃ−ＩＬ２１融合タンパク質のＮＫ細胞増殖能評価
末梢血液単核球と放射線照射されたＪｕｒｋａｔ細胞とＥＢＶ−ＬＣＬ細胞を実施例３のヒトＩＬ−２１融合タンパク質の存在の下で培養しながらＮＫ細胞の増殖及び機能向上の誘導を確認した。
【００６１】
ナチュラルキラー細胞の体外拡張は次のような方法で準備した。ヒトの血液を採血した後、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅＴＭ  ＰＬＵＳ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて２５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、軟膜（ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔ）から末梢血液単核細胞を分離した。その後、１００Ｇｙで放射線照射したＪｕｒｋａｔ細胞株とＥＢＶ−ＬＣＬ細胞株を使い、ＩＬ−２  ５００Ｕ／ｍｌの存在の下で１：０．５：０．５の比率でＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを入れたｈＲＰＭＩ培地で共培養した。このとき、ＩＬ−２１又はＦｃ−ＩＬ２１（単量体又は二量体）を１．２５μＭで処理して培養した。その後、４日ごとに一回ずつＩＬ−２が５００Ｕ／ｍｌで添加されたｈＲＰＭＩ培地に交換しながら培養した。培地の交換時、血球計数器（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で細胞数を計算し、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にして約３週間培養した（韓国特許第１６４３１６５号）。
【００６２】
その結果、ヒトの血液からナチュラルキラー細胞を体外拡張するとき、Ｆｃ−ＩＬ２１単量体及びＦｃ−ＩＬ２１二量体で処理して培養すれば、Ｆｃ−ＩＬ２１単量体及び二量体は共に水溶性ＩＬ−２１のようにナチュラルキラー細胞の拡張能が２倍以上増加することを確認することができた（図１０ａ及び表５）。また、６人の供与者から繰り返し進めたときにも、対照群に比べ、ＩＬ−２１、Ｆｃ−ＩＬ２１単量体又はＦｃ−ＩＬ２１二量体を追加して培養した場合、増殖拡張能が数等向上することを確認することができた（図１０ｂ）。
【表５】
2019530657.tif 000007
【００６３】
すなわち、ナチュラルキラー細胞治療剤の体外拡張培養時、単量体Ｆｃ−ＩＬ２１をさらに入れれば、既存の方法に比べて多量のナチュラルキラー細胞の誘導が可能であることが分かった。
【００６４】
実施例５：ヒトＦｃ−ＩＬ２１融合タンパク質の生体内腫瘍成長抑制能評価
生体内でも実施例３のヒトＩＬ−２１融合タンパク質のＮＫ細胞増殖効果が同様に現れるかを確認した。
【００６５】
図１２は動物癌モデルを用いてマウス生体内での腫瘍成長抑制活性を測定した結果である。
【００６６】
具体的に、６〜７週齢の免疫欠乏マウス（Ｎｕｄｅ）に黒色腫細胞株であるＡ３７５を皮下内に２．５×１０６で細胞注射して腫瘍を誘導した。１１日後に腫瘍が形成されれば、３日に１回でＦｃ−ＩＬ２１単量体又は二量体を同じモル濃度（〜５８０μＭ）で静脈投与し、６日に１回で１×１０７ＮＫ細胞を静脈注射した後、３日に１回で腫瘍の大きさを測定した（図１１）。ＮＫ細胞は６日に１回で静脈投与し、ＩＬ−２は１日に２回で腹腔注射し、Ｆｃ−ＩＬ２１は３日に１回で静脈投与した。対照群では、ＩＬ−２をＮＫ細胞投与日から５０００ＩＵで３日間６回投与した。動物癌モデルに投与するとき、Ｆｃ−ＩＬ２１はリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で希釈し、Ｆｃ−ＩＬ２１二量体を基準に１０ｕｇ（〜５８０μＭ）で静脈投与した。
【００６７】
何も投与しなかった対照群と既存にＮＫ細胞治療効果を検証したＮＫ＋ＩＬ−２投与グループとＮＫ＋Ｆｃ−ＩＬ２１単量体及びＮＫ＋Ｆｃ−ＩＬ２１二量体投与グループを比較した。その結果、対照群に比べ、ＮＫ細胞とＩＬ−２、Ｆｃ−ＩＬ２１単量体及び二量体処理グループで癌細胞成長が鈍化していることが分かり、何よりもＦｃ−ＩＬ２１二量体に比べてＦｃ−ＩＬ２１単量体の抗腫瘍効果が優れたことが分かった（図１２ａ）。すなわち、ＮＫ細胞治療剤と単量体Ｆｃ−ＩＬ２１を異種移植皮膚癌モデル（ｈｕｍａｎ  Ａ３７５メラノマー）に併用投与するとき、ナチュラルキラー細胞の体内坑癌作用を増進させることを確認した。
【００６８】
また、ＩＬ−２を投与しなかった場合、ヒトＮＫ細胞の抗癌能は現れなかった（図１２ｂ）。よって、ＮＫ細胞の生体内で抗腫瘍効果を観察するためにはＩＬ−２の併用投与が必須であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によるヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、単量体としてＩＬ−２１を自然界に存在する形態を最大限模写することにより、自然界に存在しているままの活性を維持することができる。また、前記単量体としてＩＬ−２１は、水溶性ＩＬ−２１又は二量体ＩＬ−２１と比較して活性が優れ、ＩＬ−２１の体内での半減期が著しく伸ばされることができる利点がある。
【００７０】
また、本発明によるヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の形態は、追加的な精製過程の最適化過程なしに単量体形態のヘテロ二量体融合タンパク質を容易に製造することができるという利点も有する。
【００７１】
以上で本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を有する者にこのような具体的記述はただ好適な実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求範囲とその等価物によって定義されると言える。
【図１】
2019530657.tif 000008
【図２】
2019530657.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
2019530657.tif 000012
【図６】
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【図７】
2019530657.tif 000014
【図８】
2019530657.tif 000015
【図９】
2019530657.tif 000016
【図１０】
2019530657.tif 000017
【図１１】
2019530657.tif 000018
【図１２】
2019530657.tif 000019
【配列表】
2019530657000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月27日(2019.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）重鎖不変部位（Ｆｃ）対の第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域を含み、前記第１Ｆｃ領域及び／又は第２Ｆｃ領域のＮ末端及びＣ末端の一つ以上の末端にＩＬ−２１が結合されているヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、
前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ）の形成を促進するようにＣＨ３ドメインが変異されたものであることを特徴とする、ヘテロ二量体融合タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ−ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項２】
前記第１Ｆｃ領域又は第２Ｆｃ領域のＮ末端のいずれか一末端にだけＩＬ−２１が結合されている、請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域は、それぞれヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群から選択されたＦｃ領域由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１Ｆｃ領域及び第２Ｆｃ領域はヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の形態で含まれていることを特徴とする、請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１Ｆｃ領域又は第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの変異は次の群から選択された一つ以上の変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質（ただし、変異位置はＥＵ  ｉｎｄｅｘに従う）。
（１）第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３６０位置でのＫ３６０Ｅのアミノ酸残基の置換、
（２）第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＱ３４７位置でのＱ３４７Ｒのアミノ酸残基の置換、
（３）第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位置でのＫ４０９Ｗのアミノ酸残基の置換、及び
（４）第２Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位置でのＦ４０５Ｔアミノ酸残基の置換、及びＤ３９９位置でのＤ３９９Ｖのアミノ酸残基の置換。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合タンパク質を含む、薬剤学的組成物。
【請求項７】
癌治療のための、請求項６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記癌は、大膓癌、黒色腫、乳房癌、膵膓癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、小腸癌、食道癌、子宮頸部癌、肺癌、リンパ腫及び血液癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
他の抗癌剤との併用治療のための、請求項７に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１０】
ＮＫ細胞及び請求項１に記載のヘテロ二量体融合タンパク質を含む、免疫抗癌組成物。
【請求項１１】
ＩＬ−２をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の免疫抗癌組成物。
【請求項１２】
前記癌は、大膓癌、黒色腫、乳房癌、膵膓癌、腎臓癌、前立腺癌、卵巣癌、小腸癌、食道癌、子宮頸部癌、肺癌、リンパ腫及び血液癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の免疫抗癌組成物。
【国際調査報告】
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