(57)【要約】  本発明は、ヒト対象における、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）のようなＴＤＰ−４３タンパク質症の治療における使用のためのタクロリムスであって、前記タクロリムスが前記対象において免疫抑制を引き起こさない治療的に有効な用量における投与のためのものである、タクロリムスを提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質症の治療における使用のためのタクロリムスであって、前記タクロリムスが前記対象において免疫抑制を引き起こさない治療的に有効な用量における投与のためのものである、タクロリムス。
【請求項２】
前記ＴＤＰ−４３タンパク質症が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤ−ＴＤＰ−４３及びＦＴＤ−ｔａｕのような）、他の認知症（アルツハイマー病及びレヴィー小体認知症のような）、パーキンソニズム（パーキンソン病、ペリー症候群及びグアム島のＡＬＳパーキンソニズム−認知症複合を含む）、ポリグルタミン病（ハンチントン病のような）、ならびにミオパチー（孤発性封入体筋炎のような）からなる群より選択される、請求項１に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項３】
前記ＴＤＰ−４３タンパク質症が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項２に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項４】
前記対象が、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子に変異を有している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項５】
前記対象が、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子に変異を有していない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項６】
前記タクロリムスが、０．０２０ｍｇ／ｋｇを超えない日用量、例えば０．０１９ｍｇ／ｋｇ、０．０１８ｍｇ／ｋｇ、０．０１７ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１４ｍｇ／ｋｇ、０．０１３ｍｇ／ｋｇ、０．０１２ｍｇ／ｋｇ、０．０１１ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、または０．００１ｍｇ／ｋｇを超えない日用量での投与のためのものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項７】
前記タクロリムスが、少なくとも０．０００５ｍｇ／ｋｇの日用量、例えば少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２ｍｇ／ｋｇ、０．０１３ｍｇ／ｋｇ、０．０１４ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０１７ｍｇ／ｋｇ、０．０１８ｍｇ／ｋｇ、または０．０１９ｍｇ／ｋｇの日用量での投与のためのものである、請求項６に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項８】
前記タクロリムスが、前記対象において少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌのタクロリムスのトラフ全血レベルをもたらすのに十分な用量での投与のためのものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項９】
前記トラフ全血レベルが少なくとも０．０７５ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも０．２ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも０．３ｎｇ／ｍｌである、請求項８に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項１０】
前記トラフ全血レベルが１．２ｎｇ／ｍｌ未満、例えば１．１ｎｇ／ｍｌ未満または１．０ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項８または９に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項１１】
前記タクロリムスが経腸投与、例えば経口、胃、または直腸投与のためのものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項１２】
前記タクロリムスが経口投与のためのもの、例えば錠剤またはカプセルの形態である、請求項１１に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項１３】
前記タクロリムスが連日投与のためのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の治療における使用のためのタクロリムス。
【請求項１４】
タクロリムスと、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含む単位剤形であって、０．０５ｍｇ〜１．３ｍｇのタクロリムスを含有する、単位剤形。
【請求項１５】
前記単位剤形が、１．２ｍｇを超えないタクロリムスの量、例えば、０．７５ｍｇ、０．６ｍｇ、または０．４ｍｇのタクロリムスを超えないタクロリムスの量を含有する、請求項１４に記載の単位剤形。
【請求項１６】
前記単位剤形が、０．０６ｍｇと等しいかまたはそれを超えるタクロリムスの量、例えば、０．１０ｍｇ、または０．１５ｍｇのタクロリムスと等しいかまたはそれを超えるタクロリムスの量を含有する、請求項１４または１５に記載の単位剤形。
【請求項１７】
経口投与に好適、例えば錠剤またはカプセルである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の単位剤形。
【請求項１８】
ヒト対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質症の治療のための医薬の調製におけるタクロリムスの使用であって、前記タクロリムスが前記対象において免疫抑制を引き起こさない治療的に有効な用量における投与のためのものである、使用。
【請求項１９】
前記ＴＤＰ−４３タンパク質症が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１８に記載の医薬の調製におけるタクロリムスの使用。
【請求項２０】
ヒト対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質症の治療のための方法であって、タクロリムスを前記対象において免疫抑制を引き起こさない治療的に有効な用量において投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記ＴＤＰ−４３タンパク質症が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項２０に記載の治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系内のＴＤＰ−４３凝集体形成に関連する神経疾患及び障害を治療するための、低用量でのタクロリムスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
しばしばルー・ゲーリック病と呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、（腕、脚及び顔におけるもののような）随意筋の制御に関与するニューロンを攻撃する、急速進行性で常に致命的な神経学的疾患である。疾患は、運動ニューロンの漸進的な変性及び死を特徴とする運動ニューロン疾患として知られている障害の群に属する。
【０００３】
脳内の運動神経（上位運動ニューロンと呼ばれる）からの信号は、脊髄の運動ニューロン（下位運動ニューロンと呼ばれる）に伝達され、そしてそれらから特定の筋肉にまで進む。ＡＬＳにおいて、上位運動ニューロンと下位運動ニューロンの両方が、変性又は死滅し、筋肉を刺激する能力の喪失をもたらす。機能することができずに、筋肉は徐々に弱くなり、衰弱（萎縮）し、非常に細かい痙攣（束状化と呼ばれる）を有する。結局、随意運動の開始及び制御をする脳の能力は喪失する。
【０００４】
ＡＬＳは、広範囲の障害を伴う脆弱性を引き起こす。結局、自発的な制御下にある全ての筋肉が影響を受け、個人はその力とその腕、脚、及び体を動かす能力を失う。横隔膜と胸壁の筋肉が機能しなくなるとき、人は換気補助なしに呼吸をする能力を喪失する。多くのＡＬＳを有する人は、通常、症状の発症から３〜５年以内に、呼吸不全により死亡する。しかしながらＡＬＳを有する人の約１０％が、１０年以上生き延びる。
【０００５】
ＡＬＳは、世界中で最も一般的な神経筋疾患の１つであり、全ての人種及び民族のバックグランドの人々が影響を受ける。ＡＬＳは、１００，０００人あたり２〜７人の平均的な世界的罹患率を有し、英国及び米国においては他の多くの国よりも高い（英国に関する推定では約５，０００人のＡＬＳ患者が１００，０００人あたり８人以上の罹患率を意味する）。ＡＬＳが患者及びその家族に及ぼす明らかな有害な影響とは別に、ＡＬＳはまた経済的影響を有する。これらの費用は、３つの構成要素に分割できる：直接的な費用、間接的な費用、及び無形費用。２０１０年にＬｅｗｉｎ  Ｇｒｏｕｐは、米国におけるＡＬＳの経済的影響が、中程度の罹患率モデルを用いて年間１０億３０００万ドルになると予測した。１年間の患者１人当たりの費用は６３，８４８ドル、終末期ケアの費用は約２００，０００ドルであると推定される。
【０００６】
全てのＡＬＳ症例の９０〜９５％において、疾患は明らかに無作為に発生し、明確に関連する危険因子はない。この散発型の疾患を有する個人は、ＡＬＳの家族歴はなく、その家族はそれを発症するリスクが高いとは考えられていない。
【０００７】
対照的に、全てのＡＬＳ症例の約５〜１０％は、遺伝する。この家族型のＡＬＳは、通常、疾患の原因となる遺伝子を持つ片方の親のみを必要とする遺伝パターンにより生じる。一ダース以上の遺伝子における変異が、家族性ＡＬＳを引き起こすことが見出されている。
【０００８】
この疾患の多様な病因にもかかわらず、ＡＬＳ患者の９７％は疾患に罹患した組織おける共通な表現型、すなわちＴＡＲ−ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ）−４３の沈着を示す。ＴＤＰ−４３の沈着はまた、ＡＬＳと臨床的重複を示す、特定の前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、関連する前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の主要な特徴である。
【０００９】
ＡＬＳにおけるＴＤＰ−４３の役割は、Ｓｃｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１２（２）：３５２−３６３（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）に詳細に論じられている。
【００１０】
ＴＤＰ−４３の発現及び機能
ＴＡＲＤＢＰによってコードされるＴＤＰ−４３は、普遍的に発現するＤＮＡ−／ＲＮＡ−結合タンパク質である。ＴＤＰ−４３は、２つのＲＮＡ認識モチーフ、核局在配列（ＮＬＳ）、核外搬出シグナル、及びタンパク質−タンパク質相互作用を媒介するグリシンリッチＣ末端を含む。ＴＤＰ−４３は、主に核内に存在するが、核細胞質シャトルが可能である。核内において、ＴＤＰ−４３は、ＲＮＡスプライシングの調節、及びマイクロＲＮＡ生合成の調節において重要な役割を果たす。ＴＤＰ−４３は、それ自身のｍＲＮＡの安定性を調節し、ＴＤＰ−４３のタンパク質レベルの自己調節の機構を提供する。ＴＤＰ−４３のＲＮＡに加えて、ＴＤＰ−４３は、多くの他の転写物のスプライシング及び安定性を調節し、したがって、多様な細胞プロセスに影響を及ぼす。
【００１１】
多くが核に見出されるが、約３０％までのＴＤＰ−４３タンパク質が細胞質に見出され、活性とストレスの両方によって核流出が調節される。ＴＤＰ−４３は、ニューロンにおける樹状突起及び細胞体樹状突起のＲＮＡ輸送顆粒の重要な構成要素であり、樹状突起における局所タンパク質合成を調節することによってニューロンの可塑性において重要な役割を果たす。ＴＤＰ−４３はまた、細胞質ストレス顆粒応答−生存のために不必要なｍＲＮＡを隔離するタンパク質複合体の形成−にも関与し、ＴＤＰ−４３の機能が細胞ストレス条件下で特に重要であることを意味する。
【００１２】
ＴＤＰ−４３タンパク質症
ＴＤＰ−４３タンパク質は、ＦＴＤの皮質ニューロン及びＡＬＳの脊髄運動ニューロンに沈着したユビキチン化ニューロン細胞質封入体の主要な構成要素として同定された。ＴＤＰ−４３陽性封入体は、散発性であるか家族性であるかにかかわらず、ＡＬＳ症例の９７％に共通することがその後に示されている。主な例外は、ＳＯＤ１またはＦＵＳにおける変異によって引き起こされる症例である。ＴＤＰ−４３の沈着に関連する神経変性疾患は「ＴＤＰ−４３タンパク質症」と呼ばれ、「ＴＤＰ−４３タンパク質症」はまた、疾患において生じるＴＤＰ−４３の特徴的な組織病理学的変質を言い表す。この変質は、細胞質中の界面活性剤耐性、ユビキチン化及び過剰リン酸化の凝集体としての全長及び断片化のＴＤＰ−４３タンパク質の沈着と、関連する核からのＴＤＰ−４３の除去によって裏付けられる。脊髄及び皮質運動ニューロンならびにグリアから他の皮質領域へのＴＤＰ−４３タンパク質症の領域的な広がりは、病因に関連する変質したＴＤＰ−４３タンパク質のいくつかまたは全ての特徴の指標であり、ＡＬＳ進行を段階分けするのに使用することができる。
【００１３】
いくつかの研究が、疾患におけるＴＤＰ−４３による機能の獲得又は喪失の役割を調べた。野生型ＴＤＰ−４３の過剰発現は、動物モデルの範囲においてＴＤＰ−４３タンパク質症及び疾患の表現型を再現し、疾患における有害な機能の獲得の役割を支持する。機能喪失仮説を検証する最初の研究は、マウスからのＴＤＰ−４３のノックアウトを使用し、胚性致死を生じた。これは、ＴＤＰ−４３が発生初期において重要な役割を果たすことを実証し、機能の喪失が成人期において変性性となり得ることを必ずしも実証していない。しかしながら、条件付き及び部分ノックアウトモデルは、ＴＤＰ−４３機能の喪失が、実際に、運動ニューロンの欠陥、ヒト疾患を想起させるような進行性の運動表現型、及びさらには典型的なＴＤＰ−４３タンパク質症を誘発し得ることをすぐに実証した。さらに、グリアまたは筋肉における選択的なＴＤＰ−４３の過剰発現またはノックダウンのいずれかはまた、ＡＬＳ様の表現型を再現する。したがって、ＴＤＰ−４３の機能の獲得と喪失の両方が、疾患における機構となり得、ＴＤＰ−４３のミスフォールディングはその２つを結び付け得る。
【００１４】
ＡＬＳの治療剤開発の課題
ＡＬＳの治療的に有効な治療の開発は、製薬業界にとって相当な課題を提示することが証明している（参照によってその開示を本明細書に組み入れる、Ｐｅｒｒｉｎ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ５０７：４２３−４２５を参照）。
【００１５】
過去１０年間で、約１ダースの異なる実験的治療がＡＬＳ患者の臨床治験に入った。全てが、これまでに、確立された動物モデルにおいて症状または疾患のマーカーを緩和することを示している。しかしながら、これらの実験的治療の１つを除く全てが、ヒトにおいて治療的に有益であることを示すことに失敗し、その１つ（リルゾール）において、延命効果はほんのわずかである。
【００１６】
リルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）は、現在、唯一承認されたＡＬＳに対する治療であり、中枢神経系におけるグルタミン酸作動性神経伝達を遮断し、それによって運動ニューロンのアポトーシス（プログラム細胞死）を防ぐ神経保護薬である。
【００１７】
したがって、ＡＬＳのようなＴＤＰ−４３タンパク質症の治療のための改善された治療法への必要性が存在する。効果的な治療法の開発は、疾患を有する人々の生活の質及び寿命を改善するだけでなく、そのような疾患の費用負担を軽減するのにも役立つであろう。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の第１の態様は、ヒト対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質症の治療における使用のためのタクロリムスを提供する。有利には、タクロリムスは、対象において免疫抑制を引き起こさない治療的に有効な用量における投与のためのものである。
【００１９】
タクロリムス（フジマイシン（ｆｕｊｉｍｙｃｉｎ）またはＦＫ５０６とも呼ばれる）は、例えば臓器移植を受けている患者において、及び潰瘍性大腸炎または特定の皮膚の状態の治療のための、免疫抑制剤として臨床的に使用されている。市販のタクロリムスの剤形は、０．５ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、及び５ｍｇを含有するカプセル、ならびに濃度が０．０５％〜０．１９％である皮膚の状態のための軟膏を含む。タクロリムスは、移植組織の拒絶を防ぐための免疫抑制のために、最も一般的には１日２回投与される。臨床的に使用される用量は、拒絶を防ぐことを求めるとき、少なくとも４ｎｇ／ｍＬの全血トラフ濃度をもたらすように一般的に調整される。これは、０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日〜０．２ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内にある推奨初回経口用量（２回の分割用量を１２時間毎に）を用いることによって達成され、平均的な７０ｋｇの患者に対し、２回の約２．５ｍｇ〜１４ｍｇの日用量を必要とする。
【００２０】
タクロリムスは、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）、Ａｄｖａｇｒａｆ（登録商標）及びＰｒｏｔｏｐｉｃ（登録商標）のような商品名で入手可能である。
【００２１】
タクロリムスの他の好適な製剤は、本発明の第２の態様に関連して以下に記載される。
【００２２】
裏面の式Ｉに示されるタクロリムスの化学構造は、マクロライドラクトンである。それは、１９８７年に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ細菌を含む日本の土壌サンプルの発酵ブロスから最初に発見された。
【化１】
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【００２３】
「タクロリムス」によって、上述の構造だけでなく、ＴＤＰ−４３タンパク質症の治療における上述の化合物の治療的有効性を保持している、関連するエピマー／異性体、ならびに他の密接な構造類似体及び誘導体をも含む。
【００２４】
好適なエピマー／異性体は、タクロリムスの治療的有効性を保持し、従来の技術、例えば、クロマトグラフィーまたは分別晶出法を用いることによって分離できる。様々な立体異性体は、ラセミ混合物または他の化合物の混合物を、従来の、例えば、分別晶出法またはＨＰＬＣ法の分離によって単離することができる。代替的に、所望の光学異性体は、ラセミ化またはエピマー化を引き起こさない条件下での適切な光学活性出発物質の反応によって、または例えばホモキラル酸による誘導体化と後に続く従来の手段（例えばＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー）によるジアステレオマーエステルの分離によって作製してもよい。全ての立体異性体は、本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
好適な類似体は、Ｃ１〜Ｃ１７、Ｃ１９、Ｃ２０、及びＣ２２〜Ｃ３４のタクロリムスの構造を保持するが、Ｃ１８及び／またはＣ２１における修飾が可能である。そのような修飾は、Ｃ１８またはＣ２１のいずれかにおける１個の水素のＣ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、ヒドロキシル、またはメチオキシル基による置換を可能にすることを含み、及びＣ２１プロぺニル基の水素原子、Ｃ１〜６アルキル基、他のＣ２〜６アルケニル基、ヒドロキシル基、またはメトキシル基による置き換えを含む。特定の適切な化合物は、Ｃ２１位が修飾されたタクロリムスの類似体、例えばＣ２１プロペニル基がメチル基、エチル基、またはプロピル基で置き換えられたものを含む。他の適切な化合物は、Ｃ１８水素原子がヒドロキシル基で置き換えられた類似体を含む。これらの化合物のあるものは、タクロリムスよりも劣った免疫抑制剤であり、例えば、Ｃ２１プロペニル基がメチル基で置き換えられている類似体、またはＣ１８水素がヒドロキシル基で置換されている類似体（例えば、Ｃ２１プロペニル基が不変であるか、またはメチル基、エチル基、またはプロピル基で置き換えられている）である。米国特許第５，３７６，６６３号は、タクロリムスの類似体の調製プロセスを開示する。タクロリムスのＣ２１プロペニル基はまた、２−フルオロエチル基のようなフルオロＣ１〜６アルキル基によって、または１−メチルエテニル基のような異なるプロペニル基によって置き換えられていてもよい。
【００２６】
したがって、ある実施形態において、活性治療剤は、アスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｓｉｎ）（タクロリムスのＣ２１エチル類似体）、またはジヒドロタクロリムス（タクロリムスのＣ２１−プロピル類似体）であってよい。
【００２７】
タクロリムスの好適な誘導体は、タクロリムスの３１−Ｏ−デメチル誘導体及び１３−Ｏ−デメチル誘導体のような活性代謝産物を含んでもよい（Ｉｗａｓａｋｉ，２００７，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２２（５）：３２８−３３５、及びＢａｒｂａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３（１０）：５６３−８５、ならびにそれらに引用される参照文献を参照でき、参照によりそれらの開示は本明細書に組み入れられる）。
【００２８】
タクロリムス化合物を対アニオンによって平衡させてもよいことは当業者は理解するであろう。例示的な対アニオンは、ハロゲン化物（例えば、フッ化物、塩化物、及び臭化物）、硫酸塩（例えば、デシル硫酸塩）、硝酸塩、過塩素酸塩、スルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩）、ならびにトリフルオロ酢酸塩を含むがこれらに限定されない。他の好適な対アニオンは、当業者に周知である。したがって、式Ｉの化合物の塩及び溶媒和物のような、薬学的に許容可能な誘導体は、本発明の範囲内に含まれる。挙げることができる塩としては、酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸と、カルボン酸または有機スルホン酸とで形成される塩；  塩基付加塩；  塩基で形成される金属塩、例えばナトリウム及びカリウム塩を含む。好適な溶媒和物は、水和物及びアルコラートを含む。
【００２９】
タクロリムス化合物が互変異性を示してもよいことは当業者なら理解するであろう。全てのそれらの互変異性体型及び混合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】
タクロリムス化合物は一般的に、意図する投与経路及び標準的な薬務を考慮して選択される好適な薬学的賦形剤、希釈剤または担体と混合して投与するであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，Ｅｄ．Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡを参照。）好適な投与経路は以下に論じられ、静脈内、ＩＣＶならびに経腸（例えば、経口、胃、及び直腸）投与を含む。
【００３１】
本発明は、本発明者による、タクロリムスの通常よりも低い用量が、ＴＤＰ−４３タンパク質症の新規モデルにおいて治療的な有益性をもたらすことができるという発見に由来する（以下の実施例及び参照によりその開示が本明細書に組み入れられるＭｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｃｏｍｍ．３：３６を参照）。
【００３２】
用語「ＴＤＰ−４３タンパク質症」は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ−ＴＤＰ−４３及びＦＴＤ−ｔａｕのような）、他の認知症（アルツハイマー病及びレヴィー小体認知症のような）、パーキンソニズム（パーキンソン病、ペリー症候群及びグアム島のＡＬＳパーキンソニズム−認知症複合を含む）、ポリグルタミン病（ハンチントン病のような）、ならびにミオパチー（孤発性封入体筋炎のような）を含むがこれらに限定されない、ＴＤＰ−４３沈着に関連する神経変性疾患を記載するために本明細書において使用され、各々の症例において、患者の少なくとも亜集団がＴＤＰ−４３病理を示す。ＴＤＰ−４３タンパク質症のさらなる詳細は、参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、Ｇｅｎｄｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３６：９７−１１２、及びＬａｇｉｅｒ−Ｔｏｕｒｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１９（１）：Ｒ４６−Ｒ６４に記載される。
【００３３】
したがって、一実施形態において、ＴＤＰ−４３タンパク質症は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。治療すべき対象は、家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆＡＬＳ）または散発性筋萎縮性側索硬化症（ｓＡＬＳ）を有していてもよいことを当業者は理解するであろう。
【００３４】
代替的な実施形態において、ＴＤＰ−４３タンパク質症は、（ＦＴＤ−ＴＤＰ−４３または他の非ＦＴＤ−ｔａｕのような）前頭側頭型認知症である。
【００３５】
ＡＬＳのようなＴＤＰ−４３タンパク質症は、患者の部分集合においてＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子の変異と相関することが知られている。
【００３６】
筋萎縮性側索硬化症オンライン遺伝学データベース（ＡＬＳｏＤ；ｈｔｔｐ：／／ａｌｓｏｄ．ｉｏｐ．ｋｃｌ．ａｃ．ｕｋにおいて利用可能；Ａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３３：１３４５−１３５１を参照）によると、５０を超えるＴＡＲＤＢＰ遺伝子の異なる変異がＡＬＳ患者において同定されている（以下の表１を参照、ＮＣＢＩ参照ヌクレオチド配列は、ＮＭ＿００７３７５．３である）。
【表１】
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【００３７】
より初期の研究は、１つ（Ｄ１６９Ｇ）を除いて全てがＴＤＰ−４３のエクソン６にコードされるＣ末端グリシンリッチドメインに存在する、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子における２９の異なるミスセンス変異を同定した（例えば、参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、Ｐｅｓｉｒｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１８（ｒｅｖｉｅｗ  ｉｓｓｕｅ  ２）：Ｒ１５６−Ｒ１６２を参照）。Ｐｅｓｉｒｉｄｉｓらによる研究において、全てのミスセンス変異は、運動ニューロン疾患と臨床的に診断された患者において観察され、１８人のｆＡＬＳ患者（全ての研究でｎ＝１１６７の調査対象）及び３０人の散発性ｓＡＬＳ患者（全ての研究でｎ＝２８４６が調査された）を含み、コントロール個体（全ての研究でｎ＝８１１７の調査対象）において観察されなかった。全てのＴＡＲＤＢＰ変異は常染色体優性の遺伝パターンを示し、野生型（ＷＴ）と変異対立遺伝子の両方からの同量の遺伝子量を有するらしい。ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子における変異は、ｔａｕ陰性前頭側頭型認知症患者においても報告されている（参照によりその開示が組み入れられるＢｅｎａｊｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６５：４７０−４７３を参照）。
【００３８】
ＡＬＳとＦＴＤ患者の両方におけるＴＡＲＤＢＰ変異の発見は、これらの疾患が広範囲の神経変性ＴＤＰ−４３タンパク質症内で関連しているという繰り返されるテーマを反映している。そのような変異は、以下を含む多くの異なるメカニズムを介して疾患病状を導くと考えられる：
（ａ）ＴＤＰ−４３の細胞質における誤った局在化；
（ｂ）ＴＤＰ−４３の断片化；
（ｃ）ＴＤＰ−４３のミスフォールディング、凝集化、及び不溶性；ならびに／または
（ｄ）ＴＤＰ−４３のリン酸化及びユビキチン化
（参照によりその開示が組み入れられる、Ｓｃｏｔｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ，２０１５，Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１２（２）：３５２−３６３を参照）。
【００３９】
したがって、一実施形態において、本発明は、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子における変異を有する患者の治療における使用のためのタクロリムスを提供する。例えば、患者は、表１及び／またはＰｅｓｉｒｉｄｉｓら（２００９）（上述）のものから同定されるＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子における変異を有してもよい。そのような患者は家族性ＡＬＳ及びＦＴＤを有する患者を含む。
【００４０】
しかしながら、たとえＴＤＰ−４３が変異を欠いている場合であっても、異常なＴＤＰ−４３発現レベル及び細胞質内蓄積が疾患を引き起こし得、散発性ＡＬＳを生じ得ることが見出されている。研究は、（非変異の）ＴＤＰ−４３のレベル及び局在が、神経毒性を決定的に画定し得ることを示している（参照によりその開示が組み入れられるＴａｌｂｏｔ，２０１４，Ｊ  Ａｎａｔ．２２４（１）：４５−５１を参照）。
【００４１】
したがって、代替的な実施形態において、本発明は、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子における変異を有していないにもかかわらず、中枢神経系においてＴＤＰ−４３の蓄積を示す患者の治療における使用のためのタクロリムスを提供する。例えば、治療は、散発性ＡＬＳ患者のためのものであってよい。
【００４２】
ＡＬＳのようなＴＤＰ−４３タンパク質症の症状を示す患者は、本発明によるタクロリムスでの治療の開始前に、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子に変異を有するかどうかを調べるために試験することができることは当業者は理解するであろう。例えばオリゴヌクレオチドプローブを用いるインビトロハイブリダイゼーションアッセイ及び／またはＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ）遺伝子を増幅及びシークエンシングするためのＰＣＲに基づく方法のような、このような遺伝子型判定試験を実施するための好適な方法は、当該技術分野において周知である。
【００４３】
本発明の方法の重要な特徴は、ＴＤＰ−４３タンパク質症患者の治療に用いられる通常より低い用量のタクロリムスである。特に、タクロリムスは、対象において免疫抑制を引き起こさない治療的に有効な用量において患者に投与される。そのような用量のタクロリムスを、経口、局所、眼内、経鼻、肺内、頬側、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）、膣内及び直腸内を含むがこれらに限定されない異なる経路によって投与してもよいことは当業者は理解するであろう。
【００４４】
理論に拘束されることを望まないが、タクロリムスが本発明において治療効果をもたらすメカニズムは、免疫抑制を達成するメカニズムに関連しない（すなわち、それとは異なる）と信じられている。実際、従来の免疫抑制用量において（すなわち、免疫抑制の治療的に有効なレベルを達成する用量において）の使用は、ＴＤＰ−４３タンパク質症患者の治療において、最善でもほとんど効果がないと信じられている。本発明において、タクロリムスは、従来の免疫抑制用量よりも相当低い用量において治療効果を有することが見出されている。
【００４５】
用語「免疫抑制を引き起こさない用量」は、免疫抑制の主要な副作用が患者に起こらないことを指す。これは、患者においてＴＮＦαレベルを実質的に抑制しないタクロリムスの用量が使用されることに起因する。７０ｋｇの成人における一日当たり約１．３ｍｇ未満のタクロリムス用量（他の体重に対しては比例する）が免疫抑制をもたらさないと考えられると信じされている。しかし、個体差があるため、当業者は、得られる血中濃度（以下に示す）に従うことになるであろう。
【００４６】
一実施形態において、タクロリムスは、０．０２０ｍｇ／ｋｇを超えない日用量、例えば０．０１９ｍｇ／ｋｇ、０．０１８ｍｇ／ｋｇ、０．０１７ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１４ｍｇ／ｋｇ、０．０１３ｍｇ／ｋｇ、０．０１２ｍｇ／ｋｇ、０．０１１ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、または０．００１ｍｇ／ｋｇを超えない日用量での投与（例えば経口）のためのものである。
【００４７】
関連する実施形態において、タクロリムスは、少なくとも０．０００５ｍｇ／ｋｇの日用量、例えば少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２ｍｇ／ｋｇ、０．０１３ｍｇ／ｋｇ、０．０１４ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０１７ｍｇ／ｋｇ、０．０１８ｍｇ／ｋｇ、または０．０１９ｍｇ／ｋｇの日用量での投与（例えば経口）のためのものである。
【００４８】
タクロリムスの用量は、患者に治療的な有益性をもたらすのに適切であるべきであることは当業者は理解するであろう。必要とされる正確な用量は、例えば、体重、代謝速度のような要素によって患者ごとに異なり得るが、対象における少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌのトラフ全血レベルのタクロリムスをもたらすのに十分な用量でタクロリムスが投与されるべきであると一般的に考えられる。一実施形態において、タクロリムスは、対象において、少なくとも０．０７５ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも０．２ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも０．３ｎｇ／ｍｌのタクロリムスのトラフ全血レベルをもたらすのに十分な用量で投与されてもよい。
【００４９】
関連する実施形態において、タクロリムスは、対象において、１．２ｎｇ／ｍｌ未満、例えば１．１ｎｇ／ｍｌ未満または１．０ｎｇ／ｍｌ未満のタクロリムスのトラフ全血レベルをもたらすのに十分な用量で投与されるべきである。
【００５０】
好都合なことに、タクロリムスは、腸内投与、すなわち経口、胃及び／または直腸の投与のために製剤化される。例えば、タクロリムスは、錠剤、カプセル、または他の個別の単位用量のように、経口投与のために製剤化されてよい。
【００５１】
典型的には、タクロリムスは、例えば１日に、１回、２回または３回（すなわち、１日に１回のみ、１日に２回のみなど）のような連日投与のためのものである。しかしながら、治療的に有益な結果はまた、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日またはそれ以上ごとに１回のような１日１回未満の頻度による投与によっても得られ得る。毎日以外で患者の使用の容易さのために特に好適な間隔は、１日おき、週に１回、１０日に１回、１ヶ月に３回、２週間に１回、または１ヶ月に１回を含み得る。
【００５２】
本発明の第２の態様は、タクロリムスと、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを包含する単位剤形であって、０．０５ｍｇ〜１．３ｍｇのタクロリムスを含有する、単位剤形を提供する。
【００５３】
一実施形態において、単位剤形は、１．２ｍｇを超えないタクロリムスの量、例えば、０．７５ｍｇ、０．６ｍｇ、または０．４ｍｇのタクロリムスを超えないタクロリムスの量を含有する。
【００５４】
関連する実施形態において、単位剤形は、０．０６ｍｇと等しいかまたはそれを超えるタクロリムスの量、例えば、０．１０ｍｇ、または０．１５ｍｇのタクロリムスと等しいかまたはそれを超えるタクロリムスの量を含有する。
【００５５】
タクロリムスは、溶媒和物、例えば水和物またはアルコラートであってよい。例えば、タクロリムスは、一水和物のような水和物として使用されてもよい（本明細書において重量を指すとき、それらは溶媒和分子の重量を含まない）。
【００５６】
所望の場合、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）のような既存の市販品を購入してもよく、その内容物を分割して所望の用量を作製し、次いでこれを経口投与のための硬ゼラチンカプセルに導入することができる。
【００５７】
単位剤形は、例えば容器中の溶液または懸濁液のような液体であってもよいが、単位用量が非液体であることが好ましいと考えられる。好適な固体の単位剤形は、錠剤及びカプセルを含み、そのうちでカプセルがより適切である。
【００５８】
好都合なことに、単位剤形は経口投与に好適であり、例えば錠剤またはカプセルである。
【００５９】
ある場合、単位剤形は、好適なビヒクル中の懸濁液でタクロリムスを含み得る。経口投与のためのビヒクルの非限定的な例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水中５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）及びシロップを含む。単位剤形は、貯蔵及び投与の期間にわたり用量の均一性を安定させるように製剤化され得る。ある場合において、単位剤形は、任意で許容可能な可溶化剤を含有する、水、生理食塩水、及び緩衝液のような希釈剤に溶解したタクロリムス溶液を含有し得る。好ましい形態において、組成物は固体剤形を含む。ある場合において、固体剤形は、カプセル、カプレット、ロゼンジ、サシェ、または錠剤を含む。ある場合において、固体剤形は、液体充填剤形である。ある場合において、固体剤形は、固体充填剤形である。ある場合において、固体剤形は、固体充填錠剤、カプセル、またはカプレットである。ある場合において、固体充填剤形は、粉末充填剤形である。ある場合において、固体剤形は、微粉化した粒子、顆粒、またはマイクロカプセル化剤の形態の化合物を含む。ある場合において、組成物は、界面活性剤を含んでもよいエマルションを含有する。ある場合において、固体剤形は、ラクトース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微晶質セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、薬学的に許容可能な賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、担体及び結合剤の１種以上を含有する。ある場合において、固体剤形は、固体剤形または香味剤の製造、加工、または安定性を促進する１つ以上の物質を含有する。
【００６０】
好適なタクロリムス製剤の例は、参照によりその開示が本明細書に組み入れられるＷＯ２００５／０２０９９３、ＷＯ２００５／０２０９９４、及びＷＯ２００８／０１４５１４３、及びＷＯ２０１０／００５９８０に開示される。
【００６１】
一実施形態において、単位剤形は、ビヒクル及び安定化化合物（安定化剤とも呼ばれる）を含む分散媒体中のタクロリムスの固体分散物を含む。
【００６２】
本発明の単位剤形が、経口、局所、眼内、経鼻肺内、頬側、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）、膣内及び直腸内を含むがこれらに限定されない異なる経路のために製剤化してもよいことは当業者は理解するであろう。さらに、移植片からの投与も可能である。好適な製剤の形態は、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、エマルション、マイクロエマルション（水、油及び界面活性剤からなる光学的等方性の熱力学的に安定な系として定義される）、液晶相（長距離秩序であるが短距離無秩序であることによって特徴付けられる系として定義され；例は、層状、六方晶及び立方体の相を含み、水または油の連続のいずれかを含む）またはそれらの分散した対応物であるゲル、軟膏、分散液、懸濁液、クリーム、エアロゾル、アンプル形態の液滴もしくは注射用溶液、ならびに活性化合物の持続放出を伴う調製物であって、その調製において賦形剤、希釈剤、アジュバントまたは担体が一般的に使用される調製物を含む。
【００６３】
タクロリムスの薬剤送達のための製剤戦略は、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２（４）：１６９−１７５（参照によりその開示は本明細書に組み入れられる）に詳述される。
【００６４】
一実施形態において、単位剤形のｐＨは７未満であり（例えば、組成物の水中の再分散液によって測定される）、例えばｐＨは、３．０〜３．６の範囲であってよい。ｐＨは、安定化剤によって提供されてよく、かつ／または、無機酸もしくは有機酸またはそれらの混合物によって調整されてもよい。
【００６５】
本発明の組成物中での使用に好適な安定化化合物及び安定化剤は、無機酸、無機塩基、無機塩、有機酸、有機塩基、及びそれらの薬学的に許容可能な塩を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
有機酸は好ましくは、モノ−、ジ−、オリゴ−またはポリカルボン酸である。有用な有機酸の非限定的な例は、酢酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、アクリル酸、安息香酸、リンゴ酸、マレイン酸、シュウ酸、及びソルビン酸、ならびにそれらの混合物である。好ましい有機酸は、シュウ酸、酒石酸、及びクエン酸からなる群より選択される。
【００６７】
有機酸または無機酸の薬学的に許容可能な塩は、好ましくは、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である。それらの塩の好ましい例は、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素カリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、コハク酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カルシウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸カルシウム、グルコン酸亜鉛、及び硫酸亜鉛である。
【００６８】
好適な無機塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムを含むがこれらに限定されない。
【００６９】
タクロリムスの安定化された製剤は、参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１１／１００９７５に記載される。
【００７０】
本発明の関連する、第３の態様は、ヒト対象における（ＡＬＳのような）ＴＤＰ−４３タンパク質症の治療のための医薬の調製におけるタクロリムスの使用であって、タクロリムスが対象において免疫抑制を引き起こさない治療的に有効な用量における投与のためのものである、使用を提供する。
【００７１】
本発明の関連する第４の態様は、ヒト対象における（ＡＬＳのような）ＴＤＰ−４３タンパク質症の治療のための方法であって、タクロリムスを対象において免疫抑制を引き起こさない治療的に有効な用量において投与することを含む、方法を提供する。
【００７２】
「ＴＤＰ−４３タンパク質症の治療」によって、ＴＤＰ−４３タンパク質症の症状の、全体的または部分的な緩和を含む。例えば、ＡＬＳの場合、治療は、患者における運動機能の低下の減速または停止を生じ得る。用語「治療的に有効な」は、それに応じて解釈される。
【００７３】
本発明の第３及び第４の態様の好ましい実施形態は、本発明の第１及び第２の態様に関連して上述される通りである。
【００７４】
本発明の所与の態様、特徴またはパラメータに対する好ましさ及び任意の選択は、文脈が他を示さない限り、本発明の他のすべての態様、特徴及びパラメータの、任意の及びすべての、好ましさ及び任意の選択と組み合わせて開示されているとみなすべきである。
【００７５】
本明細書で明らかに先に出版された文献のリストまたは議論は、その文献が当該技術分野の最高水準の一部であるか、または一般的な知識であるということの承認として取られるべきではない。
【００７６】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい、非限定的な例は、次の図への参照とともにここで議論される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１（Ａ）】体壁筋においてＧＦＰまたはＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（ＣＴＦ）を発現するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ系統の生存を示す。ヒトＴＤＰ−４３のＣ末端断片の発現は、コントロール系統と比べて寿命の有意な短縮を引き起こす（ｐ＜０．００５）。（ｎ＝２５８  ＧＦＰ、ｎ＝２４１  ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（ＣＴＦ））
【図１（Ｂ）】コントロールとＴＤＰ−４３発現Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ系統の、タクロリムスの存在及び非存在における生存を示す。ＮＧＭ寒天中の１０μｇ／ｍｌの濃度でのタクロリムスは、各々の系統に対するビヒクル処理コントロールと比較して、コントロール（ＧＦＰ発現）ワームとＴＤＰ−４３Ｃ末端断片を発現するワームの両方の寿命の有意な延長を引き起こす。（ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（ＣＴＦ）のＤＭＳＯ対タクロリムスについてｐ＜０．００５、ＧＦＰのＤＭＳＯ対タクロリムスについてｐ＜０．０１）（ｎ＝２５８  ＧＦＰ  ＤＭＳＯ、ｎ＝２５３  ＧＦＰ  タクロリムス、ｎ＝２４１  ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（ＣＴＦ）ＤＭＳＯ、ｎ＝２２７  ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（ＣＴＦ）タクロリムス）
【図２】６０週（３週齢で開始）にわたる、ＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ）マウス（水で処理した陰性コントロール群）のロータロッド滞在時間の、非トランスジェニックコントロールマウス（ＮＴｇ）のものとの比較を示す。変異（Ｑ３３１Ｋ）ヒトＴＤＰ−４３のみを発現するマウスは、研究の経過を通じて継続するロータロッド滞在時間の緩やかであるが漸進的な低下を生じる。対照的に非トランスジェニックコントロールマウスのロータロッド能力は安定なままである。（４９週までｎ＝１５  ＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ）水処理コントロール（「水」）（その後、交互の繁殖ラウンドのために数が減少する）、６０週までｎ＝１６非トランスジェニックコントロール（「非Ｔｇ」））
【図３】６０週（３週齢で開始）の、１日当たり０．２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）、１日当たり１．２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）、または１日当たり２．５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）のタクロリムスで処理したＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ）マウスの、ビヒクル処理コントロール群と比較したロータロッド滞在時間を示す。タクロリムス処理は、試験された３つの用量において、ロータロッド能力における低下の進行を遅延する。２つのより高い用量においてこの効果はより高い。中間統計解析（時間及び処理を変数として伴う二元配置ＡＮＯＶＡ）は、この効果が有意であることを示す。（ｎ＝２１ビヒクル、ｎ＝２７  ０．２５ｍｇ／ｋｇタクロリムス、ｎ＝２７  １．２５ｍｇ／ｋｇタクロリムス、ｎ＝１９  ２．５ｍｇ／ｋｇタクロリムス、全て６０週まで）
【図４】６０週まで１０ｍｇ／ｋｇリルゾール（ｐ．ｏ．、１日当たり）で処理したＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ）マウスの、水のみで処理したコントロール群と比較したロータロッド滞在時間を示す。１０ｍｇ／ｋｇリルゾールによる処理は、ロータロッド能力における低下の進行を遅延する。中間統計解析（時間及び処理を変数として伴う二元配置ＡＮＯＶＡ）は、リルゾールの効果が有意であることを示す。（４９週までｎ＝３０  １０ｍｇ／ｋｇリルゾール、４９週までｎ＝１５水処理コントロール（その後、交互の繁殖ラウンドのために数が減少する））
【実施例】
【００７８】
実施例１−ＴＤＰ−４３Ｃ末端断片を発現するＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるタクロリムスの影響
物質及び方法
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ系統
ＴＤＰ−４３のＣ末端断片は、ＡＬＳ及びＦＴＤ患者の病状と相関する。特に、Ａｒｇ２０８におけるタンパク質分解的切断は、病原性のＣ末端断片を作製すると報告されている（参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８（１３）：９０４９−５７及びＩｇａｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（１３）：８５１６−２４を参照）。したがって、体壁筋において、ＧＦＰタグのＣ末端へと短いリンカー領域を介して融合したヒトＴＤＰ−４３のＣ末端断片（ＣＴＦ）（ａａｓ２０８〜４１４）を発現するトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ系統を作製した。発現はｍｙｏ−３プロモーターの制御下にある。
【００７９】
ＧＦＰレポーターのみをｍｙｏ−３プロモーターの制御下で発現する、同一のバックグランドのコントロールＣ．ｅｌｅｇａｎｓ系統を作製した。
【００８０】
これらの系統を、薬物感受性を与えるｂｕｓ−５遺伝子に変異を有するワームと交雑させ、ＧＦＰ単独（「ＧＦＰ」）を発現するか、またはＧＦＰ−ＴＤＰ−４３ＣＴＦ融合タンパク質（「ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（ＣＴＦ）」）を発現する、薬剤感受性系統を作製した。
【００８１】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ寿命アッセイ
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ培養は、漂白剤耐性成熟卵を除く全てのものを殺滅するための塩基性次亜塩素酸ナトリウム溶液中で非同期の培養を培養することによって同期させた。約３００個の卵を寒天プレート上に添加し、次いで、試験化合物（またはビヒクル）及び細菌の食物源の存在下で孵化させて生育した（約２００個のワームを産生する）。ワームが最後から２番目の幼虫期に達したとき（Ｌ４；次世代の成熟卵の発生の直前）、約１５０のワームを、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦＵＤＲ）及び試験化合物（またはビヒクル）を含有する新鮮な生育プレートに、細菌の食物源とともに移した。後続のワームの世代の発生による干渉を防ぐため、さらなる卵の成熟及び孵化を防ぐためのＦＵＤＲを添加した。その後、ワームを、試験化合物／ビヒクル及びＦＵＤＲの存在下で成長させた。この時点から、各々の成長集団を毎日検査し、死亡ワームの数を数えて生存率を評価した。
【００８２】
各々の集団に対する死亡ワームの累積数を使用して、経時寿命（ＣＬＳ）を決定する生存／生存率プロットを作成した。生存は、Ｏｎｌｉｎｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ（ＯＡＳＩＳ；ｈｔｔｐ：／／ｓｂｉ．ｐｏｓｔｅｃｈ．ａｃ．ｋｒ／ｏａｓｉｓを参照）を使用してカプラン・マイヤー対数順位生存解析法を用いて解析した。解析法の原理は、各々の日の死亡ワームの集団が、研究が継続するとワームの数として減少する、「リスク」集団のサイズ（すなわち残りの生存ワームの数）と相関するものである。処理群において「観察される」死亡ワームの数を、「リスク」群（処理＋コントロール群を、「リスク」群の最良推定値として組み合せた）において「予測される」死亡ワームの数に対して比較することによって、カイ二乗検定を用いて「観察された」死亡と「予測される」死亡との間の差異の有意性を決定することが可能である。研究の全日程にわたる累積カイ二乗確率は、コントロール群と処理群との間に有意差があるかどうかを示す（カイ二乗ｐ値＜０．０５が有意な効果として受け入れられる）。カプラン・マイヤー法の予測精度は、処理群及びコントロール群において少なくとも１００の対象（ワーム）を有することに依存する。この条件が満たされていることを確実にするために、約１５０のワームを各々の複製アッセイプレートに移した。さらに、個々のアッセイプレートを比較した後、複製アッセイプレートからのデータを組み合わせて、試験の予測精度を高めた。
【００８３】
結果及び結論
ＴＤＰ−４３Ｃ末端断片はＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける寿命を短縮する。
ＧＦＰのみ（「ＧＦＰ」）、またはヒトＴＤＰ−４３のＣ末端（ａａｓ２０８〜４１４）のＮ末端へと融合したＧＦＰ（「ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（ＣＴＦ）」）を発現するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ系統の生存曲線を図１（Ａ）に示す。ヒトＴＤＰ−４３のＣ末端断片の発現は、ＧＦＰタグのみの発現と比較して寿命の有意な短縮を引き起こす。
【００８４】
ＴＤＰ−４３のＣ末端断片は、ＡＬＳ及びＦＴＤ患者の病状と相関する。病原性のＴＤＰ−４３Ｃ末端断片を発現するワームにおける寿命の短縮の観察は、線虫モデルに対する毒性効果の解釈と一致し、Ｃ末端断片の毒性を緩和するかもしれない薬剤の同定及び試験のためのプラットホームを提供する。
【００８５】
タクロリムスはＴＤＰ−４３発現Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける寿命を延長する。
図１（Ｂ）は、１０μｇ／ｍｌタクロリムスの存在下及び非存在下における、コントロール（ＧＦＰ発現）ワーム及びＴＤＰ−４３のＣ末端断片（ＧＦＰ−ＴＤＰ−４３（ＣＴＦ））を発現するワームの生存曲線を示す。この濃度において、タクロリムスは、両方の系統に対し有意な効果を有し、コントロール系統と病原性のＴＤＰ−４３断片を発現する系統の両方の寿命を延長する。
【００８６】
したがって、タクロリムスはＴＤＰ−４３のＣ末端断片の寿命短縮効果を緩和することができ、これらのワームにおける寿命の欠損を部分的に救う。
【００８７】
実施例２−ＷＴ及び／またはＱ３３１ＫのＴＤＰ−４３を発現するマウスにおけるタクロリムスの効果
物質及び方法
マウス
野生型ヒトＴＤＰ−４３または点変異（Ｑ３３１Ｋ）を有するヒトＴＤＰ−４３を発現するトランスジェニックマウスは、Ｓｈａｗ研究室によって開発され、記載される（参照によりその開示が本明細書に組み入れられる、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０（８）：Ｅ７３６−４５、及びＭｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．３（１）：３６を参照）挿入されるコンストラクトはＮ末端にｍｙｃでタグ付けされた、野生型または変異ＴＤＰ−４３のためのｃＤＮＡをマウスプリオンプロモーターの制御下に配置し、ＣＮＳにおける発現を生じる。コンストラクトは、ヒトＴＤＰ−４３遺伝子の３’ＵＴＲを含まないため、ＴＤＰ−４３のｍＲＮＡレベルは自己調節されず、したがって、トランスジェニック系統におけるＴＤＰ−４３レベルは、内在性レベルの２〜３倍上に到達する。
【００８８】
各々のコンストラクトに対する半接合体系統が確立され（それぞれＴＤＰ−４３（ＷＴ）及びＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ））、それらの系統を交雑して、複合半接合体動物を作製した（ＴＤＰ−４３（ＷＴ×Ｑ３３１Ｋ）。
【００８９】
この研究のために、単一のトランスジェニックマウスを既存のマウス系統から作製し、３週齢に到達する前に（尻尾先端試料より抽出したＤＮＡのＰＣＲによって）遺伝子型決定した。両方の導入遺伝子（ＴＤＰ−４３（ＷＴ×Ｑ３３１Ｋ））を共発現するマウスを、単一のＷＴ、Ｑ３３１Ｋ、及び非トランスジェニック（ＮＴｇ）の同腹子と共に作製するために、ＴＤＰ−４３（ＷＴ）とＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ）の若い繁殖ペア（約６〜８週齢）を確立した。単一のＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ）及び二重（ＴＤＰ−４３（ＷＴ×Ｑ３３１Ｋ））のトランスジェニック動物をこの研究に必要とした。しかしながら、二重（ＴＤＰ−４３（ＷＴ×Ｑ３３１Ｋ））のトランスジェニック動物は、疾患表現型を急速に進行させ（これまでに記載される通り、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．３（１）：３６を参照）、投薬を開始するのに十分に長期間生存しなかった。したがって、単一（ＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ））トランスジェニック動物のみを、タクロリムスまたはリルゾールの有効性を試験するために使用した。
【００９０】
処理群当たり十分な数の動物を達成するために複数の繁殖ラウンドが必要であり、したがって投薬／試験を交互にした。遺伝子型決定のために尻尾先端検査をし、２週齢において同定のために耳パンチをした。各々の処理群で同数のオスとメスを達成することを目的として、可能な場合には、各々の処理群に同腹仔を無作為に分配した（下記参照）。
【００９１】
交互に投薬／試験をする必要のため、及び研究の長さのため、現在のデータセットは全ての動物のデータに関して最大４９週までしか含んでいないことに留意されたい。５０週以降、いくつかのグループにおいて、後の繁殖ラウンドの動物が研究を通して進行し続けるため、ｎ値が減少する。
【００９２】
薬物処理
尻尾先端検査後の２日間の回復期間の後、５日間、毎朝、マウスをポリプロピレン強制経口投与（水のみを送達）で馴化した。３週齢（５日間の馴化期間に続いて）において、薬物投与を開始した。投与は、以下の処置群を用いて強制経口投与によって週に６日実施した：
●水、陰性コントロール
●ビヒクル（２０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＲＨ４０；８０％無水エタノール（ｗ／ｖ））、陰性コントロール
●タクロリムス（２．５ｍｇ／ｋｇ）
●タクロリムス（１．２５ｍｇ／ｋｇ）
●タクロリムス（０．２５ｍｇ／ｋｇ）
●リルゾール（水中１０ｍｇ／ｋｇ）、陽性コントロール
投与は少なくとも６０週間継続した。
【００９３】
薬物動態学的分析に基づいて、マウスにおける２ｍｇ／ｋｇ／日のタクロリムス用量は、７０ｋｇのヒトの場合、約０．３３〜０．４４ｍｇ／日経口のヒト経口用量に対応すると考えられる。
【００９４】
リルゾールは、現在、ＡＬＳの治療のための唯一のＦＤＡ承認薬であり、したがって、モデルの妥当性を確認するための陽性コントロールとして使用した。
【００９５】
行動及び表現型アッセイ
強制経口投与馴養の３日後（投与開始の２日前）にマウスを体重測定し、その後０日目（投与開始前日）から開始する週単位で体重を測定した。
【００９６】
マウスは、週単位でロータロッド試験によって評価した。各々の動物は、最初に５ｒｐｍで基本的な２分間の馴化を受け、次いで２〜２０ｒｐｍの加速パラダイムを用いて２×５分の訓練セッションを受けることによって、投与開始の２日前にロータロッドに馴化され、そして訓練された。翌日（投与開始の前日、０日目）に、各々の動物を５分間２〜３０ｒｐｍのパラダイムを用いて試験し、ベースラインの結果を得た。その後、１回の５分２〜３０ｒｐｍのパラダイムを用いて、週単位（７日目、１４日目など）で試験を実施した。テストは各々の午後に同じ時間に実施した。
【００９７】
一般的な動物の健康と福祉を投与期間を通して監視し、全ての異常な表現型または行動を記録した。
【００９８】
結果及び結論
タクロリムスは、ＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ）マウスにおける運動機能の低下を遅延する。
ＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ）のみを発現するマウスは、異常な後肢の開き及び振戦を伴う、運動機能における緩やかであるが漸進的な低下をもたらす。しかしながら、この変異は、非トランスジェニックまたはＴＤＰ−４３（ＷＴ）動物と比較して、早期死を引き起こすようには見えない（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、上述を参照）。この研究において、この表現型は、ロータロッドの滞在時間の漸進的な低下として現れている（図２）。この低下は、研究の開始時から連続的に起こり、少なくとも１年齢まで安定なままでいる非トランスジェニックコントロールのロータロッド能力と対照的である（図２）。
【００９９】
０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、及び２．５ｍｇ／ｋｇでのタクロリムスによる処理は、運動の低下の進行を遅延する（図３）。効果は、０．２５ｍｇ／ｋｇよりも１．２５ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇにおいてより顕著であった。中間統計解析（時間及び処理を変数として伴う二元配置ＡＮＯＶＡ）は、この効果が有意であることを示す。
【０１００】
１０ｍｇ／ｋｇリルゾールによる処理は、運動機能の喪失における同様の遅延をもたらす（図４）。（リルゾールは、タクロリムスに使用されるＣｒｅｍｏｐｈｏｒ／エタノールビヒクルよりもむしろ水中で投与されるので、適切なコントロールは水のみで処理される群であることに留意されたい）。したがって、現在ＦＤＡで承認されている唯一のＡＬＳ治療薬はこのモデルにおいても有効である。
【０１０１】
変異ＴＤＰ−４３を発現する従前のマウスモデルは、それらの表現型の因子において、ヒト疾患の疾患病状と実質的に異なっている（参照によりその開示が組み入れられる、Ｐｅｒｒｉｎ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ５０７（７４９３）：４２３−５、及びＳｃｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１２（２）：３５２−６３を参照）。しかしながら、本研究において使用されるモデルは、以下を含む、ヒトの疾患の重要な態様をより忠実に再現する：運動機能における遅発性、年齢関連性の、漸進性の低下；不溶性ＴＤＰ−４３封入体の細胞質蓄積；小神経膠細胞症及びアストログリア増殖症を伴う運動ニューロン及び皮質ニューロン喪失；筋繊維の解体及び神経筋接合部の変性（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、上述）。我々の知る限り、これは、ＴＤＰ−４３マウスモデルにおいて、ＡＬＳの唯一の認可治療薬であるリルゾールの有意な効果を示す最初の研究である。これは、このモデルの妥当性をさらなる支持を与え、タクロリムスについて観察された肯定的な効果をヒトの病状に外挿することができることを示している。
【０１０２】
実施例３−例示的な本発明の単位剤形
硬ゼラチンカプセルを次の組成物で満たした。
【表２】
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【０１０３】
０．３ｍｇタクロリムスを含有する上述の１カプセルを、連続する３日間、健康なヒトボランティアに毎日投与した。投与の結果としての血中ＴＮＦ−αレベルの有意な変化は起こらなかった。同様に、０．６ｍｇのタクロリムスの健康なボランティアに対する毎日の投与の結果として、ＴＮＦ−αレベルの変化は起こらなかった。タクロリムスの平均トラフレベル（各々の用量の投与の２４時間後のレベル）は、約２２０ｐｇ／ｍＬであると観察された。観察されるタクロリムスの平均ピークレベルは、約３７００ｐｇ／ｍＬであり、曲線下平均面積は、概算でＡＵＣ  Ｏ＿ｔ＝２３５００（ｈ＊ｐｇ／ｍＬ）であった。
【０１０４】
上述のカプセルは、本明細書に上述される治療を提供するのに使用してもよい。
【０１０５】
０．６ｍｇの単一の用量を提供するための２つのそのようなカプセルの同時使用は、約４４０ｐｇ／ｍＬのトラフレベルをもたらすと予想できるであろう。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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