(57)【要約】単離されたキメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物、または単離されたキメラIL-6Rα結合タンパク質を発現する細胞が、開示される。単離されたIL-6Rαキメラ結合タンパク質およびそのタンパク質を発現する細胞は、癌を処置する方法、およびサイトカイン放出症候群のリスクを低下させるための方法において使用され得る。2019530440.tif 000062
2019530440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む、キメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質。
【請求項２】
scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'、またはF(ab)2である、キメラIL-6Rα結合タンパク質。
【請求項３】
1個のポリペプチドである、請求項1記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
【請求項４】
1個のポリペプチドが単鎖可変断片（scFv）である、請求項3記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
【請求項５】
重鎖可変領域が軽鎖可変領域のN末端側にある、請求項1記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
【請求項６】
軽鎖可変領域が重鎖可変領域のN末端側にある、請求項1記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
【請求項７】
リンカーが、アミノ酸配列
2019530440.tif 000058
を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
【請求項８】
リーダーペプチドをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
【請求項９】
単離タグをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
【請求項１０】
リーダーペプチド、
CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域
を含む、キメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質であって、
該異種リンカーが、アミノ酸配列
2019530440.tif 000059
を含み、該IL-6Rα結合タンパク質が単鎖抗体断片（scFv）である、前記キメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質を発現する、T細胞。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか一項記載のキメラIL-6Rα結合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項１３】
キメラIL-6R結合タンパク質の発現を制御するプロモーターをさらに含む、請求項12記載の核酸分子。
【請求項１４】
プロモーターが構成性である、請求項13記載の核酸分子。
【請求項１５】
プロモーターが、少なくとも1種のサイトカインまたはT細胞活性化に陽性に応答する、請求項13記載の核酸分子。
【請求項１６】
少なくとも1種のサイトカインが、IL-6、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-8、もしくはIL-10であるか、またはプロモーターが、NFAT-1もしくはNFκBに陽性に応答する、請求項15記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項12〜16のいずれか一項記載の核酸分子を含む、発現構築物。
【請求項１８】
ウイルスベクターである、請求項14記載の発現構築物。
【請求項１９】
プラスミドである、請求項14記載の発現構築物。
【請求項２０】
請求項17〜19のいずれか一項記載の核酸発現構築物を含む、組換えT細胞。
【請求項２１】
リーダーペプチド、
CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域
を含むIL-6受容体α単鎖可変断片をコードする異種発現構築物を含む、T細胞であって、
該異種リンカーが、アミノ酸配列
2019530440.tif 000060
を含む、前記T細胞。
【請求項２２】
発現構築物が、サイトカイン応答性プロモーターまたはT細胞が活性化された場合に発現を増加させるプロモーターを含む、請求項21記載のT細胞。
【請求項２３】
プロモーターが、NFAT-1、NFκB、IL-6、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-8、およびIL-10のうちの1種または複数種に陽性に応答する、請求項22記載のT細胞。
【請求項２４】
単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、サイトカイン放出症候群のリスクを有する患者へ投与する工程
を含む、サイトカイン放出症候群のリスクを低下させるための方法。
【請求項２５】
患者が癌を有する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
患者が、養子T細胞治療を受容しているかまたは受容する予定である、請求項24または25記載の方法。
【請求項２７】
患者が、リンパ球枯渇を受容しているかまたは受容する予定である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
患者が自己免疫疾患を有する、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
単離されたIL-6Rα結合タンパク質が、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む、請求項24〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
IL-6Rα結合タンパク質が、scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'、またはF(ab)2である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
重鎖可変領域が軽鎖可変領域のN末端側にある、請求項24〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
軽鎖可変領域が重鎖可変領域のN末端側にある、請求項24〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
単離されたIL-6Rα結合タンパク質が、アミノ酸配列
2019530440.tif 000061
を含むリンカーを含む、請求項24〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
単離されたキメラIL-6Rα結合タンパク質が、リーダーペプチドを含む、請求項24〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
単離されたキメラIL-6Rα結合タンパク質が、単離タグを含む、請求項24〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
患者が、IL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含むT細胞を投与される、請求項24〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
T細胞が自己由来である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
異種核酸分子が、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含むキメラIL-6Rα結合ポリペプチドをコードする、請求項24〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
核酸分子が、キメラIL-6R結合タンパク質の発現を制御するプロモーターを含む、請求項24〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
プロモーターが構成性である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
プロモーターが、少なくとも1種のサイトカインまたはT細胞活性化に陽性に応答する、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
プロモーターが、NFAT-1、NFκB、IL-6、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-8、またはIL-10に応答性である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
核酸分子が発現構築物である、請求項24〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
発現構築物がウイルスベクターである、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
発現構築物がプラスミドである、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
抗ヒスタミン剤、副腎皮質ステロイド、ステロイド、アセトアミノフェン、フロセミド、および/または静脈内輸液を、患者へ投与する工程をさらに含む、請求項24〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
患者が、サイトカイン放出症候群の一つまたは複数の症状を有する、請求項24〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、患者へ投与する工程
を含む、癌患者における養子細胞治療の毒性を低下させるための方法。
【請求項４９】
単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、患者へ投与する工程
を含む、患者における自己免疫疾患を処置するための方法。
【請求項５０】
単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、患者へ投与する工程
を含む、癌患者を処置するための方法であって、該患者が免疫治療によって処置されたことがあるかまたは処置される予定である、前記方法。
【請求項５１】
免疫治療が養子細胞治療である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
患者がサイトカイン放出症候群の症状を有する、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域
を含む単離されたIL-6Rα結合タンパク質を含む単鎖可変断片を含む、有効量の組成物を、自己免疫疾患もしくは自己免疫状態を有する患者または免疫治療によって処置される患者へ投与する工程
を含む、1種または複数種のサイトカインの毒性を低下させるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2016年9月2日に出願された米国仮特許出願第62/383,237号、2016年12月30日に出願された米国仮特許出願第62/440,991号、および2017年1月6日に出願された米国仮特許出願第62/443,509号に基づく恩典を主張する。これらの出願の内容全体が、参照によって本明細書中に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌、微生物感染、および自己免疫疾患を含む多様な疾患および状態の処置のため、新たな有効な治療を利用するため、T細胞と相互作用する抗体を使用することの見込みは、発展し続けている。しかしながら、サイトカイン放出症候群（CRS）を含む、副作用および毒性が、起こり得る。CRSは、患者に、低血圧、発熱、および高熱の発症に類似した悪寒（体温上昇を伴う戦慄を含む突然の冷感）を経験させ得る。T細胞誘導（T-cell engaging）治療からの副作用および毒性を防止するかまたは軽減する処置が、必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
単離され改変されたキメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む方法、組成物、医療機器、およびキットの形態の態様が提供される。
【０００４】
組成物、医療機器、およびキットは、以下のうちの一つもしくは複数を含む治療用組成物または少なくとも1種の治療用組成物を有するキットを含む：単離されたキメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質、キメラIL-6Rα結合タンパク質をコードする核酸、キメラIL-6Rα結合タンパク質を発現する1個もしくは複数個の細胞、またはキメラIL-6Rα結合タンパク質をコードする核酸を有する1個もしくは複数個の細胞。
【０００５】
いくつかの態様において、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む、キメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質が存在する。いくつかの態様において、キメラIL-6Rα結合タンパク質は、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、および/またはCDR6のうちの一つまたは複数に、少なくともまたは多くとも1個、2個、3個、4個、5個、または6個のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有する。他の態様において、キメラIL-6Rα結合タンパク質は、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、および/もしくはCDR6のアミノ酸配列、または重鎖可変ドメイン（SEQ ID NO:3）、または軽鎖可変ドメイン（SEQ ID NO:4）、またはVL-VH単鎖可変断片（scFv）（SEQ ID NO:1）、またはVH-VL scFv（SEQ ID NO:2）との60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％（またはそれらから派生する任意の範囲）の配列同一性を有する。ある種の態様において、キメラIL-6Rα結合タンパク質は、単離されかつ/または精製されている。いくつかの態様において、IL-6Rα結合タンパク質は、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2を含む。さらなる態様は、本質的にSEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:2であるかまたはSEQ ID NO:1もしくSEQ ID NO:2を含むscFvに関する。
【０００６】
いくつかの態様において、キメラIL-6Rα結合タンパク質は、scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'、またはF(ab)2である。いくつかのケースにおいて、scFv部分は、SEQ ID NO:1〜10の全部または一部を含む。ある種の態様において、タンパク質は、1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のポリペプチドである。具体的な態様において、IL-6Rα結合タンパク質は、1個のポリペプチドである。他の具体的な態様において、キメラIL-6Rα結合タンパク質は、融合タンパク質である。いくつかの態様において、融合タンパク質は、1個のポリペプチドである。
【０００７】
ある種の態様は、単鎖可変断片（scFv）であるキメラIL-6Rα結合タンパク質に関する。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含有している単一のポリペプチドを含む態様において、これらの可変領域の両方の方向が意図される。いくつかのケースにおいて、重鎖可変領域が軽鎖可変領域のN末端側にあり、即ち、重鎖可変領域がポリペプチドのN末端により近い。SEQ ID NO:2は、この配置の例である。他のケースにおいて、軽鎖可変領域が重鎖可変領域のN末端側にあり、即ち、軽鎖可変領域が重鎖可変領域よりポリペプチドのN末端に近い。SEQ ID NO:1は、この構造の例である。
【０００８】
いくつかの態様において、キメラIL-6Rα結合タンパク質は、リンカーを含む。いくつかのケースにおいて、リンカーは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間（またはその逆）にある。リンカーは、いくつかの態様において、アミノ酸配列
2019530440.tif 000003
を含むか、またはSEQ ID NO:11の配列に由来する10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、もしくは18個の連続アミノ酸を有する。他の態様において、リンカーは、アミノ酸配列がSEQ ID NO:11と80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である。
【０００９】
いくつかのキメラIL-6Rα結合タンパク質は、ポリペプチドのN末端にまたはN末端の近くに、リーダーペプチドまたはシグナルペプチドも有する。リーダーペプチドまたはシグナルペプチドとは、そのポリペプチドの分泌を促進するかまたは可能にするための、ポリペプチドのN末端に存在する短い（5〜30アミノ酸長）ペプチドをさす。
【００１０】
具体的な態様において、キメラIL-6Rα結合タンパク質は、単離タグを含んでいてよく、単離タグとは、タンパク質またはポリペプチドを単離するかまたは精製するために使用されるペプチドタグをさす。タグは、切断等によって除去可能であってもよいしまたは除去可能でなくてもよい。タグは、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、（His×6のような）Hisタグであり得る。いくつかの場合において、単離タグは、特定の分離技術における異なる分解を与えるため、タンパク質のクロマトグラフィ特性を変更するために使用されるクロマトグラフィタグである。これの例は、ポリ陰イオン性アミノ酸の連続であるDYKDDDDKのようなFLAGタグである。もう一つの単離タグは、エピトープタグであってよく、エピトープタグとは、抗体と共に使用され得る短いペプチド配列をさす。エピトープタグには、V5タグ、c-mycタグ、HAタグ、またはNEタグが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００１１】
いくつかの態様は、リーダーペプチド、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む、単離されたキメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含み、ここで、異種リンカーは、アミノ酸配列
2019530440.tif 000004
を含み、IL-6Rα結合タンパク質は、単鎖可変断片（scFv）である。態様は、特別に含まれない限り、ActemraおよびRoActemraの商品名で販売されているヒト化モノクローナル抗体である（アトリズマブとしても公知の）トシリズマブを含まない。具体的な態様において、IL-6Rα結合タンパク質は、T細胞からの1種または複数種のサイトカインの発現を低下させる。いくつかの態様において、T細胞は、T細胞を活性化するキメラ抗原受容体またはもう一つのタンパク質を発現する。ある種の態様において、IL-6Rα結合タンパク質は、以下のサイトカインのいずれかの発現を低下させる：TNFα、IL-6、IL-2、IL-4、およびGM-CSF（またはそれらの任意の組み合わせ）。いくつかの場合において、IL-6Rα結合タンパク質は、IL-6Rα結合タンパク質に曝されていない細胞と比較して、10％、20％、30％、40％、もしくは50％（もしくはそれらから派生する任意の範囲）、少なくとも10％、20％、30％、40％、もしくは50％（もしくはそれらから派生する任意の範囲）、または多くとも10％、20％、30％、40％、もしくは50％（もしくはそれらから派生する任意の範囲）、それらのサイトカインのうちの1種または複数種の発現を低下させる。いくつかの態様において、IL-6Rα scFvは、以下のサイトカインのいずれかの発現を低下させる：TNFα、IL-6、IL-2、IL-4、およびGM-CSF（またはそれらの任意の組み合わせ）。いくつかの場合において、IL-6Rα scFvは、トシリズマブに曝された細胞と比較して、10％、20％、30％、40％、もしくは50％（もしくはそれらから派生する任意の範囲）、少なくとも10％、20％、30％、40％、もしくは50％（もしくはそれらから派生する任意の範囲）、または多くとも10％、20％、30％、40％、もしくは50％（もしくはそれらから派生する任意の範囲）、それらのサイトカインのうちの1種または複数種の発現を低下させる。他の態様において、IL-6Rα scFvは、トシリズマブより大きく1種または複数種のサイトカインの発現を低下させる。方法は、同様に、トシリズマブより大きく1種または複数種のサイトカインの発現を低下させるIL-6Rα scFvを含み得る。ある種の態様において、方法は、トシリズマブより大きくTNFα、IL-6、IL-2、IL-4、および/またはGM-CSFの発現を低下させるIL-6Rα scFvを含む。いくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインの発現を低下させるIL-6受容体α単鎖可変断片は、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む。他のパラグラフに記述された他のIL-6Rα scFvも、本明細書中に記載されるサイトカインの発現を低下させることができる。
【００１２】
「キメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質」とは、IL-6受容体αに特異的に結合し、少なくとも2個のアミノ酸領域（各領域は少なくとも10個の連続アミノ酸であり、異なる遺伝子に由来する）を含有している、自然界に見出されないタンパク質をさす。いくつかの態様において、キメラIL-6Rαタンパク質は、単一のポリペプチドである。キメラIL-6Rα結合タンパク質は、自然界に見出されるIL-6Rα抗体をささない。「単離された」とは、他のタンパク質または細胞の1種もしくは複数種の他の成分のいずれかからのタンパク質の分離または精製をさす。
【００１３】
他の局面は、キメラIL-6Rα結合タンパク質を発現する細胞に関する。細胞は、キメラIL-6Rα結合タンパク質を表面上に発現してもよいし、またはキメラIL-6Rα結合タンパク質を発現し分泌してもよい。ある種の態様において、T細胞は、キメラIL-6Rα結合タンパク質を発現する。T細胞は、他の血液細胞の中に存在してもよいし、または濃縮されたT細胞のプールの中に存在してもよい。T細胞は、ナイーブ表現型、セントラルメモリー表現型、エフェクターメモリー表現型、もしくはエフェクター表現型の従来のT細胞であってもよいし；または天然の表現型もしくは誘導された表現型の調節性T細胞であってもよい。いくつかのケースにおいて、T細胞は、以下のマーカーのうちの1種または複数種を発現する：CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD57、CD62L、CD69、CD95、CD127、CCR7、IL-7Rα、またはFoxp3。いくつかの態様において、T細胞は、CD4+T細胞である。いくつかの態様において、T細胞は、CD8+T細胞である。
【００１４】
いくつかの態様において、キメラIL-6Rα結合タンパク質をコードする核酸分子が存在する。ある種の態様は、キメラIL-6R結合タンパク質の発現を制御するプロモーターも含む核酸分子を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、構成性である。他の態様において、プロモーターは、少なくとも1種のサイトカインに陽性に応答するか、またはサイトカインがアップレギュレートされた場合に発現もしくは活性がアップレギュレートされる1種もしくは複数種の転写因子に応答性である。プロモーターは、以下のサイトカインのうちの1種または複数種に陽性に応答し得る：IL-6、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-8、またはIL-10。他の態様において、プロモーターは、T細胞が活性化された場合に増加する転写因子に応答性であり；NFAT-1が、そのような転写因子であり、NFκBも同様である。
【００１５】
さらなる態様において、IL-6Rα結合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現構築物が存在する。いくつかの態様は、ウイルスベクターである発現構築物に関し、他の態様は、プラスミドである発現構築物を含む。
【００１６】
ある種の態様は、IL-6Rα結合タンパク質をコードする核酸構築物を含有している1個または複数個の細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は、T細胞である。具体的な態様において、細胞は、発現構築物によってトランスフェクトされているかまたは感染しており、発現構築物は、1個または複数個の宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよいしまたは組み込まれていなくてもよい。いくつかのケースにおいて、リーダーペプチド、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む、IL-6Rα scFvをコードする異種発現構築物を含むT細胞が存在し、ここで、異種リンカーは、アミノ酸配列
2019530440.tif 000005
を含む。いくつかの態様において、IL-6Rα結合タンパク質は、単鎖抗体断片（scFv）である。いくつかの態様において、発現構築物は、サイトカイン応答性プロモーターを含み、即ち、プロモーターは、サイトカインが増加した場合に増加した発現を有する。いくつかの態様において、サイトカインは、T細胞が活性化される場合に増加する。いくつかの態様において、サイトカインは、T細胞活性化が全身性免疫応答を誘発した場合に増加する。いくつかの態様において、サイトカインは、腫瘍細胞溶解が全身性免疫応答を誘発した場合に増加する。
【００１７】
他の態様は、IL-6Rα結合タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸分子、またはそのようなタンパク質を発現する細胞を作成するかまたは使用する方法に関する。ある種の態様において、サイトカイン放出症候群（CRS）のリスクを低下させるための方法、IL-6Rαを阻害するための方法、癌を処置するための方法、自己免疫疾患を処置するための方法、1種または複数種のサイトカインの毒性を低下させるための方法、T細胞活性化の毒性を低下させるための方法、およびIL-6Rα治療用組成物を製造するための方法が存在する。態様は、サイトカイン放出症候群の処置、癌の処置、および/または自己免疫疾患の処置のためのキメラIL-6Rα結合タンパク質の使用にも関する。
【００１８】
いくつかの態様において、方法は、単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、サイトカイン放出症候群のリスクを有する患者へ投与する工程を含む。いくつかのケースにおいて、患者は、癌および/または自己免疫疾患を有する。いくつかの状況において、患者は、養子T細胞治療を受容しているかまたは受容する予定である。いくつかの場合において、患者は、養子T細胞移入の後に組成物を投与される。いくつかの場合において、患者は、養子T細胞移入と共に組成物を投与される。いくつかのケースにおいて、患者は、リンパ球枯渇を受容しているかまたは受容する予定である。患者は、IL-6Rα結合タンパク質を含む治療用組成物の受容の1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、もしくは24時間、または1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、もしくは24日（またはその中から派生する任意の範囲）以内に養子T細胞治療を受容することができ、または受容したことがあってもよい。他の態様において、患者は、自己免疫疾患を有する。
【００１９】
いくつかの態様において、患者は、IL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含むT細胞を投与される。さらなる態様において、患者は、自己由来であるT細胞を投与される。
【００２０】
さらなる態様において、方法は、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ステロイド、ステロイド、アセトアミノフェン、フロセミド、および/もしくは静脈内輸液、またはT細胞誘導治療に関連したサイトカイン放出症候群もしくはその他の毒性もしくは副作用のために使用される他の処置を患者へ投与する工程も含む。いくつかのケースにおいて、患者は、サイトカイン放出症候群の一つまたは複数の症状を有する。
【００２１】
いくつかの態様において、単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を患者へ投与する工程を含む、癌患者における養子細胞治療の毒性を低下させるための方法が存在する。付加的な態様には、単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を患者へ投与する工程を含む、患者における自己免疫疾患を処置する方法が含まれる。他の態様は、単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を患者へ投与する工程を含む、癌患者を処置する方法に関し、ここで、患者は、免疫治療によって処置されたことがあるかまたは処置される予定である。いくつかの態様において、患者は、抗T細胞抗体によって処置されたことがあるかまたは処置される予定である。抗T細胞抗体の非限定的な例には、抗胸腺細胞グロブリン、ムロモナブ-CD3、TGN1412、抗CD20、抗CD19、リツキシマブ、およびチサゲンレクロイセルが含まれる。いくつかの態様において、免疫治療は、養子細胞治療である。いくつかの態様において、本開示の方法は、IL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子および腫瘍ターゲティング受容体を含む細胞を含む組成物を患者へ投与する工程を含む。他の態様は、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む、単離されたIL-6Rα結合タンパク質を含む単鎖可変断片を含む、有効量の組成物を、自己免疫疾患もしくは自己免疫状態を有する患者または免疫治療によって処置される患者へ投与する工程を含む、1種または複数種のサイトカインの毒性を低下させるための方法に関する。
【００２２】
本明細書中に記載されたポリペプチドは、SEQ ID NO:1〜11のいずれかの少なくともまたは多くとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個、125個、126個、127個、128個、129個、130個、131個、132個、133個、134個、135個、136個、137個、138個、139個、140個、141個、142個、143個、144個、145個、146個、147個、148個、149個、150個、151個、152個、153個、154個、155個、156個、157個、158個、159個、160個、161個、162個、163個、164個、165個、166個、167個、168個、169個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個、180個、181個、182個、183個、184個、185個、186個、187個、188個、189個、190個、191個、192個、193個、194個、195個、196個、197個、198個、199個、200個、201個、202個、203個、204個、205個、206個、207個、208個、209個、210個、211個、212個、213個、214個、215個、216個、217個、218個、219個、220個、221個、222個、223個、224個、225個、226個、227個、228個、229個、230個、231個、232個、233個、234個、235個、236個、237個、238個、239個、240個、241個、242個、243個、244個、245個、246個、247個、248個、249個、250個、300個、400個、500個、550個、1000個、またはそれ以上の連続アミノ酸、またはそれらから派生する任意の範囲の中に、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、またはそれ以上のバリアントアミノ酸を含んでいてもよい。
【００２３】
本明細書中に記載された方法の一つの態様において、対象は、ヒト対象である。交換可能に本明細書中で使用される「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、ネズミ科（例えば、ラット、マウス）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ科、ネコ科、有蹄類（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）等を含むが、これらに限定されるわけではない哺乳類をさす。
【００２４】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載された具体的な態様に限定されず、従って、当然、変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書中で使用される用語法は、具体的な態様を記載するためのものに過ぎず、限定的なものではないことも理解されたい。
【００２５】
値の範囲が提供される場合、前後関係がそうでないことを明白に指示しない限り、下限値の単位の10分の1まで、その範囲の上限と下限との間の各中間値、およびその明示された範囲の中の他の明示された値または中間値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立に含まれていてよく、それらも、本発明に包含されるが、明示された範囲の中の特別に排除された限度に従う。明示された範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度の一方または両方を排除する範囲も、本発明に含まれる。
【００２６】
本明細書中に記載された態様が排除されてもよいことが、具体的に意図される。範囲が記載される場合、ある種の範囲が排除されてもよいことが、さらに意図される。
【００２７】
本明細書中で使用されるように、「1個の（a）」または「1個の（an）」は、1または複数を意味し得る。特許請求の範囲において使用されるように、「含む」という単語と共に使用された場合、「1個の（a）」または「1個の（an）」という単語は、1または複数を意味し得る。
【００２８】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみをさすか、または選択肢が相互に排他的であることをさすと明示的に示されない限り、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は選択肢のみおよび「および/または」をさす定義を支持する。本明細書中で使用されるように、「もう一つ」は、少なくとも第2またはそれ以上を意味し得る。
【００２９】
本願の全体において、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために利用されるデバイス、方法に固有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、この詳細な説明から、発明の本旨および範囲の範囲内で、様々な変化および修飾が、当業者に明白になるため、詳細な説明および具体例は、発明の好ましい態様を示すが、例示のために与えられているに過ぎないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある種の局面をさらに証明するために含まれる。本発明は、本明細書中に提示された具体的な態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの一つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】抗IL-6Rα scFvはHepG2細胞におけるIL-6シグナリングを阻害する。HepG2ヒト肝細胞癌細胞を12穴プレートに播種し、3時間、示された量のscFvと共にインキュベートした。その後、示されたウェルを、4ng/mlのIL-6によって処理し、さらに30分間インキュベートした後、細胞を採集した。IL-6シグナリング経路の主要なシグナリング分子であるリン酸化STAT3（pSTAT3）の存在を、GAPDH（負荷対照）と共に、ウエスタンブロットによって探索した。
【図２】抗IL-6Rα scFvは初代ヒトT細胞におけるIL-6シグナリングを阻害する。初代ヒトCD4+T細胞および初代CD8+T細胞を12穴プレートに播種し、図1について記載されたように処理した。VL-VH scFv（SEQ ID NO:1）を示された量で添加し、IL-6を示されたウェルへ添加した。pSTAT3およびGAPDH（負荷対照）を、ウエスタンブロットによって検出した。
【図３】抗IL-6Rα scFvの構成性発現は初代ヒトT細胞による炎症性サイトカインの産生を有意に低下させる。抗IL-6Rα scFvの構成性発現を有するか（「抗IL-6Rα scFv」、中央バー）または有しない（「scFvもmAbもなし」；左バー）抗CD19キメラ抗原受容体（CAR）を発現する初代ヒトCD4+T細胞を、同一ドナー由来の末梢血単核細胞（PBMC）＋野生型（CD19+）Rajiリンパ腫細胞と共に、1:1:1比で、12時間コインキュベートした。90μg/mlのモノクローナル抗体トシリズマブによって処理された非scFv発現CD19 CAR-T細胞を、対照試料として含めた（「トシリズマブ」；右バー）。培養培地中のサイトカインレベルを、サイトメトリックビーズに基づくアッセイによって定量化した。示された値は、3回の技術的反復の平均値であり、エラーバーは、±1標準偏差を示す。統計的有意性は、両側等分散スチューデントt検定によって評価された；＊p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊＊p＜0.001。示された結果は、2人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した2回の独立した実験の代表的なものである。
【図４】抗IL-6Rα scFvの構成性発現はCD4+T細胞におけるT細胞増殖または細胞傷害を阻害しない。抗IL-6Rα scFvを有するかまたは有しない抗CD19 CARを構成性発現する初代ヒトCD4+T細胞を、野生型（WT；CD19+）Rajiリンパ腫細胞またはCD19-変異体Rajiリンパ腫細胞と共に、2:1のエフェクター標的（E:T）比でコインキュベートした。生存しているT細胞およびRaji細胞の数を2日毎にフローサイトメトリーによって得た。いずれのRaji細胞株も、フローサイトメトリー分析におけるT細胞からの分離を可能にするため、EGFPを安定的に発現する。8日目の細胞計数の後に、WT Rajiと共にコインキュベートされたT細胞を採集し、2:1のE:T比で、新鮮なWT Raji細胞によって再チャレンジした。第2のチャレンジ中、さらに12日間、生存細胞数をモニタリングした。示された値は、3回の技術的反復の平均値であり、エラーバーは、±1標準偏差を示す。示された結果は、2人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した4回の独立した実験の代表的なものである。
【図５】抗IL-6Rα scFvの構成性発現はCD4+T細胞における抗原刺激時のT細胞亜型分化を変更しない。図4に示された同一の実験において、T細胞亜型を決定するため、CD4+初代ヒトT細胞を、CCR7、CD45RA、およびCD57に対する抗体によって表面染色した。TE/EM：CCR7-/CD45RA-/CD57-；TE/Exh：CCR7-/CD45RA-/CD57+；TEMRA：CCR7-/CD45RA+；Tcm：CCR7+/CD45RA-；Tナイーブ：CCR7+/CD45RA+。示された値は、3回の技術的反復の平均値であり、エラーバーは、±1標準偏差を示す。示された結果は、2人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した4回の独立した実験の代表的なものである。
【図６】抗IL-6Rα scFvの構成性発現はCD8+T細胞におけるT細胞増殖または細胞傷害を阻害しない。抗IL-6Rα scFvを有するかまたは有しない抗CD19 CARを構成性発現する初代ヒトCD8+T細胞を、野生型（WT；CD19+）Rajiリンパ腫細胞またはCD19-変異体Rajiリンパ腫細胞と共に、2:1のエフェクター標的（E:T）比でコインキュベートした。生存しているT細胞およびRaji細胞の数を2日毎にフローサイトメトリーによって得た。いずれのRaji細胞株も、フローサイトメトリー分析におけるT細胞からの分離を可能にするため、EGFPを安定的に発現する。示された値は、3回の技術的反復の平均値であり、エラーバーは、±1標準偏差を示す。示された結果は、2人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した3回の独立した実験の代表的なものである。
【図７】抗IL-6Rα scFvの構成性発現はCD8+T細胞における抗原刺激時のT細胞亜型分化を変更しない。図1に示されたのと同一の実験において、T細胞亜型を決定するため、CD8+初代ヒトT細胞を、CCR7、CD45RA、およびCD57に対する抗体によって表面染色した。TE/EM：CCR7-/CD45RA-/CD57-；TE/Exh：CCR7-/CD45RA-/CD57+；TEMRA：CCR7-/CD45RA+；Tcm：CCR7+/CD45RA-；Tナイーブ：CCR7+/CD45RA+。示された値は、3回の技術的反復の平均値であり、エラーバーは、±1標準偏差を示す。示された結果は、3人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した4回の独立した実験の代表的なものである。
【図８】抗IL-6Rα scFvの構成性発現は抗原刺激時の初代ヒトT細胞における消耗マーカー発現を変更しない。抗IL-6Rα scFvを有するかまたは有しない抗CD19 CARを構成性発現する初代ヒトT細胞を、WT Raji細胞と共に、2:1のE:T比でコインキュベートした。PD-1、TIM-3、およびLAG-3の発現レベルを、2日毎に表面抗体染色およびフローサイトメトリーによって定量化した。全部で7回の独立した実験のため、3回の試験をCD8+T細胞で実施し、4回の試験をCD4+T細胞で実施した。各試験は、1条件当たり3回の技術的反復を含んでいた。プロットの各データ点は、1回の試験からの3回反復の平均値を表す。各時点についての7回の試験の平均値が、黒色の水平バーによって示される。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
例示的な態様の説明
本明細書中に開示された態様には、IL-6の炎症効果をモジュレートする、IL-6Rαと結合するポリペプチドが含まれる。さらなる態様には、IL-6Rα結合ポリペプチドを発現する細胞が含まれ、とりわけ、癌治療、自己免疫治療、および抗炎症治療において、細胞およびポリペプチドを使用する方法も含まれる。本発明のこれらおよびその他の非限定的な局面は、以下のセクションにおいてさらに詳細に記述される。
【００３２】
I.定義
本明細書中に開示された態様には、T細胞またはその他の免疫細胞型によって発現され得るキメラ抗原受容体（CAR）が含まれ得る。CARは、任意の特異性を免疫エフェクター細胞に移植する改変型受容体である。典型的には、これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をT細胞に移植するために使用される。これらの受容体は、異なる起源に由来する部分から構成されているため、キメラと呼ばれる。
【００３３】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物をさす場合、交換可能に本明細書中で使用される。
【００３４】
「相同性」、「同一性」、または「類似性」とは、2種のペプチドの間または2種の核酸分子の間の配列類似性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化されていてもよい各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列の位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占有される場合、それらの分子は、その位置において配列同一性を共有している。配列間の同一性の程度は、配列によって共有される一致する位置または相同の位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同の」配列は、本開示の配列のうちの一つと40％未満の同一性または25％未満の同一性を共有している。
【００３５】
「アミノ部分」、「N末端」、「アミノ末端」等の用語は、本明細書中で使用されるように、ポリペプチドの領域の順序をさすために使用される。さらに、何かが、ある領域のN末端にある場合、それは、必ずしもポリペプチド全体の末端（または末）にはなく、領域またはドメインの末端にあってもよい。同様に、「カルボキシ部分」、「C末端」、「カルボキシ末端」等の用語は、本明細書中で使用されるように、ポリペプチドの領域の順序をさすために使用され、何かが、ある領域のC末端にある場合、それは、必ずしもポリペプチド全体の末端（または末）にはなく、領域またはドメインの末端にあってもよい。
【００３６】
「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、交換可能に本明細書中で使用され、脊椎動物、例えば、霊長類、哺乳類、好ましくは、ヒトをさす。哺乳類には、ウマ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、サル、ヒト、家畜、競技動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３７】
「異種成分不含有（XF）」または「動物成分不含有（ACF）」または「動物不含有」という用語は、培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して使用される場合、不均一な動物由来成分を本質的に含まない培地、細胞外マトリックス、または培養条件をさす。ヒト細胞の培養については、マウスのような非ヒト動物のタンパク質が、異種成分になるであろう。ある種の局面において、異種成分不含有マトリックスは、非ヒト動物由来成分を本質的に含まず、従って、マウスフィーダー細胞またはMatrigel（商標）を排除する。Matrigel（商標）は、ラミニン（主成分）、コラーゲンIV、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン/ナイドジェンを含む細胞外マトリックスタンパク質が豊富な腫瘍、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム（Engelbreth-Holm-Swarm）（EHS）マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物である。いくつかの態様において、本明細書中に記載された組成物または本開示の細胞は、異種成分不含有もしくは動物成分不含有もしくは動物不含有の培地において培養され、かつ/またはそのような培地において/そのような培地を用いて調製される。
【００３８】
本明細書中で使用されるように、細胞が、血清、シグナリング阻害剤、動物成分またはフィーダー細胞、外来性の遺伝要素またはベクター要素のような、ある種の試薬または要素を「実質的に含まない」のは、要素の10％未満を有する場合であり、ある種の試薬または要素を「本質的に含まない」のは、要素の1％未満を有する場合である。しかしながら、全細胞集団の0.5％未満または0.1％未満が外来性の遺伝要素またはベクター要素を含む細胞集団が、さらに望ましい。
【００３９】
培養物、マトリックス、または培地が、血清、シグナリング阻害剤、動物成分またはフィーダー細胞のような、ある種の試薬または要素を「本質的に含まない」のは、培養物、マトリックス、もしくは培地が、それぞれ、当業者に公知の従来の検出方法を使用して検出可能なレベルより低いこれらの試薬のレベルを有するか、または培養物、マトリックス、もしくは培地に、これらの剤が外因的に添加されていない場合である。無血清培地は、血清を本質的に含まない。
【００４０】
特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「トランスジーン」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで転写され、任意で、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドへ翻訳される核酸分子である。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAのいずれかの形態で存在し得る。DNAの形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（即ち、センス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、5'（アミノ）末端にある開始コドンおよび3'（カルボキシ）末端にある翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子には、原核生物または真核生物のmRNAに由来するcDNA、原核生物または真核生物のDNAに由来するゲノムDNA配列、および合成DNA配列が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。転写終結配列は、一般的には、遺伝子配列の3'に位置するであろう。
【００４１】
「細胞」という用語は、当技術分野における最も広い意味で本明細書中で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、外部からそれを隔離する膜構造に囲まれており、自己複製能を有し、かつ遺伝情報およびそれを発現するための機序を有する生命体をさす。本明細書中で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人為的に修飾された細胞（例えば、融合細胞、遺伝学的に修飾された細胞等）であり得る。
【００４２】
本明細書中で使用されるように、「幹細胞」という用語は、自己複製能および多能性または多分化能を有する細胞をさす。典型的には、幹細胞は、損傷を負った組織を再生させることができる。本明細書中で、幹細胞は、胚性幹（ES）細胞、誘導多能性幹細胞、または（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも呼ばれる）組織幹細胞であり得るが、これらに限定されるわけではない。
【００４３】
「胚性幹（ES）細胞」とは、初期胚に由来する多能性幹細胞である。ES細胞は、1981年に最初に確立され、1989年以降ノックアウトマウスの作製にも適用されている。1998年に、ヒトES細胞が確立され、現在、再生医療のために利用可能になりつつある。
【００４４】
ES細胞と異なり、組織幹細胞は、限定された分化可能性を有する。組織幹細胞は、組織内の特定の位置に存在し、未分化の細胞内構造を有する。従って、組織幹細胞の多能性は、典型的には、低い。組織幹細胞は、より高い核/細胞質比を有し、細胞内小器官をほとんど有しない。大部分の組織幹細胞は、低い多能性、長い細胞周期、および個体の寿命を超えた増殖能を有する。組織幹細胞は、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系等のような細胞が由来する部位に基づき、カテゴリへ分類される。皮膚系の組織幹細胞には、表皮幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。消化器系の組織幹細胞には、膵臓（共通）幹細胞、肝臓幹細胞等が含まれる。骨髄系の組織幹細胞には、造血幹細胞、間葉系幹細胞等が含まれる。神経系の組織幹細胞には、神経幹細胞、網膜幹細胞等が含まれる。
【００４５】
iPS細胞またはiPSCと一般的に略される「誘導多能性幹細胞」は、再プログラム因子と呼ばれるある種の因子を導入することによって、非多能性細胞、典型的には、成体体細胞、または線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞等のような最終分化細胞から人為的に調製された多能性幹細胞の型をさす。
【００４６】
「多能性」とは、1種または複数種の組織もしくは器官、または具体的に、3種の胚葉：内胚葉（胃内層、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、もしくは外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれかを構成する全ての細胞へ分化する可能性を有する幹細胞をさす。本明細書中で使用される「多能性幹細胞」とは、3種の胚葉のいずれかに由来する細胞へ分化することができる細胞、例えば、全能性細胞の直接の子孫または誘導多能性細胞をさす。
【００４７】
本明細書中で使用されるように、「処置」、「処置する」等の用語は、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることをさす。効果は、疾患もしくはその症状の完全もしくは部分的な防止に関して予防的であってもよいし、かつ/または疾患および/もしくは疾患に起因する悪影響の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であってもよい。「処置」には、本明細書中で使用されるように、哺乳類、例えば、ヒトにおける疾患の任意の処置がカバーされ、以下のものが含まれる：（a）疾患の素因を有する可能性があるが、未だ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患の発生を防止すること；（b）疾患を阻害すること、即ち、その発症を阻止すること；および（c）疾患を緩和すること、即ち、疾患の退縮を引き起こすこと。
【００４８】
いくつかの態様において、方法は、固形腫瘍のサイズおよび/または細胞数を低下させるために有用である。いくつかの態様において、本開示の方法は、対象における固形腫瘍のような腫瘍の成長を阻害するために有用である。
【００４９】
「抗原」という用語は、それに対する抗体を免疫系に産生させる物質、またはT細胞が応答する物質をさす。いくつかの態様において、抗原は、5〜50アミノ酸長であるか、または少なくとも、多くとも、もしくは正確に5アミノ酸、10アミノ酸、15アミノ酸、20アミノ酸、25アミノ酸、30アミノ酸、35アミノ酸、40アミノ酸、45アミノ酸、50アミノ酸、55アミノ酸、60アミノ酸、65アミノ酸、70アミノ酸、75アミノ酸、80アミノ酸、85アミノ酸、90アミノ酸、95アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、250アミノ酸、もしくは300アミノ酸、もしくはそれらから派生し得る任意の範囲であるペプチドである。
【００５０】
「抗体」という用語には、ヒト、マウス、ヒト化、キメラ、またはもう一つの種由来であり得る、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体、および抗体断片が含まれる。「モノクローナル抗体」とは、特異的な抗原性部位に対する実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体である。
【００５１】
「抗体またはその機能性断片」とは、特定の抗原もしくはエピトープに特異的に結合するかまたはそれらと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。抗体という用語には、イントラボディ（intrabodies）、ペプチボディ（peptibodies）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびにヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）、およびテトラボディ（tetrabodies））のような、免疫グロブリンの遺伝学的に改変された型またはその他の方法で修飾された型が含まれる。機能性抗体断片という用語には、例えば、Fab'断片、F(ab')2断片、Fab断片、Fv断片、rIgG断片、およびscFv断片を含む、抗体の抗原結合断片が含まれる。scFvという用語は、一本鎖が形成されるよう、伝統的な二本鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが接合された単鎖Fv抗体をさす。
【００５２】
単鎖可変断片（scFv）の使用は、特に重要である。scFvは、抗原結合ドメインをコードする免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域が単一のポリペプチドへ改変された組換え分子である。一般に、VHおよびVLの配列は、リンカー配列によって接合される。例えば、参照によって本明細書に具体的に組み入れられるAhmad(2012)Clinical and Developmental Immunology Article ID 980250を参照すること。
【００５３】
「治療的に有効な量」または「有効量」とは、疾患を処置するため、哺乳類またはその他の対象へ投与された場合に、そのような疾患の処置を達成するために十分な、剤の量または2種の剤の量の組み合わせをさす。「治療的に有効な量」は、剤、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重等に依って変動するであろう。
【００５４】
本明細書中で使用されるように、「1個の（a）」または「1個の（an）」は、1または複数を意味し得る。特許請求の範囲において使用されるように、「含む」という単語と共に使用された場合、「1個の（a）」または「1個の（an）」という単語は、1または複数を意味し得る。
【００５５】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみをさすか、または選択肢が相互に排他的であることが明示的に示されない限り、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみをさす定義および「および/または」を支持する。本明細書中で使用されるように、「もう一つ」は、少なくとも第2またはそれ以上を意味し得る。
【００５６】
本願の全体においてて、「約」という用語は、値が、その値を決定するために利用されるデバイス、方法の誤差の固有の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００５７】
II.ポリペプチド
A.IL-6Rα結合ポリペプチド
本明細書中に開示されたいくつかの態様は、ヒトIL-6Rαを含むIL-6Rαに結合するポリペプチドを含む。IL-6Rα結合タンパク質は、薬学的製剤として投与されてもよいし、または対象へ投与された細胞から発現されてもよい。いずれのケースにおいても、IL-6Rα結合タンパク質は、IL-6を含む免疫過程に影響する。IL-6Rα結合タンパク質がT細胞のような細胞によって発現される場合、IL-6Rαは、その細胞自体および/または近傍の他の細胞の免疫機能をモジュレートすることができる。いくつかの態様において、IL-6Rα結合タンパク質は、IL-6Rα結合タンパク質を発現する細胞または近傍の他の細胞による炎症誘発性サイトカインの分泌を低下させる。そのような炎症誘発性サイトカインには、TNFα、IL-6、IL-2、IL-4、GM-CSF、およびIL-1βが含まれ得る。IL-6Rα結合タンパク質を発現する細胞によるサイトカイン分泌の低下は、細胞を、養子T細胞治療のような治療において使用するため、より有効で安全なものにすることができる。IL-6Rα結合タンパク質を発現する細胞は、サイトカイン放出症候群のような有害な炎症イベントを防止しかつ/または寛解させるため、IL-6シグナリングレベルをセルフモジュレートすることができる。
【００５８】
IL-6Rα結合タンパク質は、自己免疫状態の処置においても使用され得る。いくつかの態様において、これは、望ましくない炎症応答を抑制し、自己免疫攻撃の重症度を寛解させるであろう、調節性T細胞におけるIL-6Rα結合タンパク質の発現によって達成され得る。これは、IL-6Rαを通したシグナリングをモジュレートするため、IL-6Rα結合タンパク質自体を投与することによっても達成され得る。
【００５９】
いくつかの態様において、IL-6Rα結合ポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖内に存在する抗体のVHドメインおよびVLドメインを含む単鎖Fv（scFv）である。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、scFvが抗原結合のために望ましい構造を形成することを可能にし得るペプチドリンカーを、VHドメインとVLドメインとの間にさらに含む。2種の異なるscFv構築物：（1）VL-VH scFvおよび（2）VH-VL scFvが、下記実施例セクションにおいて使用される。これらの2種の構築物は、配列の順序のみが異なる。VL-VH scFv配置は、N末端 - VL - リンカー - VH - C末端であり、VH-VL scFv配置は、N末端 - VH - リンカー - VL - C末端である（VLは軽鎖可変断片をさし、VHは重鎖可変断片をさす）。これらのscFv構築物についてのアミノ酸配列を、下記表に示す：
2019530440.tif 000006
【００６０】
SEQ ID NO:1および2の抗IL-6Rα scFvのVHおよびVLの配列を、これらの配列内のCDRの配列、およびscFv内のVH配列とVL配列との間のリンカー配列と共に、下記表に示す：
2019530440.tif 000007
【００６１】
SEQ ID NO:1および2のscFvは、SEQ ID NO:11のリンカーによってVHドメインをVLドメインと接続することによって、トシリズマブ（WO 1992019759 A1、US 5670373、US 7479543、US 8580264）および以前に開発された抗IL-6Rαモノクローナル抗体から構築される。
【００６２】
scFvに加えて、IL-6Rα結合タンパク質は、本明細書中に開示されたVH（SEQ ID NO:3）、VL、もしくはCDR（SEQ ID NO:5〜11）の配列、またはそれらの誘導体もしくは変動のうちの一つまたは複数が組み入れられた多様な形態をとることができる。例えば、結合タンパク質は、Fab'、Fab、F(ab')2、F(ab)2、(scFv)2、シングルドメイン抗体（DAB）、Fv、および抗体CDRを有するポリペプチドのような抗体断片、CDRを示す足場ドメイン（例えば、アンチカリン）、またはナノボディを含む、抗原結合領域を有する抗体様分子であり得る。例えば、ナノボディは、ラクダ科のIgG2もしくはIgG3に由来する抗原特異的VHH（例えば、組換えVHH）、またはそのようなラクダ科Ig由来のCDRを示すフレームであり得る。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製し使用する技術は、当技術分野において周知である。抗体を調製し特徴決定するための手段も、当技術分野において周知である（例えば、参照によって本明細書中に組み入れられるAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を参照すること）。
【００６３】
「ミニ抗体」または「ミニボディ（minibodies）」も、態様と共に使用されることが意図される。ミニボディとは、ヒンジ領域によってsFvから分離されたオリゴマー化ドメインをC末端に含むsFvポリペプチド鎖である。Pack et al.(1992)。オリゴマー化ドメインは、自己会合性αヘリックス、例えば、ロイシンジッパーを含み、それは、付加的なジスルフィド結合によってさらに安定化されていてよい。オリゴマー化ドメインは、ポリペプチドの機能性結合タンパク質へのインビボ折り畳みを容易にすると考えられる過程である、膜を横切る指向性（vectorial）折り畳みと適合性であるよう設計される。一般に、ミニボディは、当技術分野において周知の組換え法を使用して作製される。例えば、Pack et al.(1992)；Cumber et al.(1992)を参照すること。
【００６４】
抗体様結合ペプチド模倣体も、態様において意図される。Liu et al.(2003)は、短縮型抗体として作用するペプチドであり、より長い血清半減期およびより簡便な合成法というある種の利点を有する「抗体様結合ペプチド模倣体」（ABiP）を記載している。
【００６５】
CDRのような抗原結合ペプチドのための代替的足場も利用可能であり、態様によるIL-6Rα結合分子を生成するために使用され得る。一般に、最初の抗体から発生するCDRのうちの少なくとも1個を移植するためのタンパク質足場の型を決定する方法は、当業者に公知である。より具体的には、選択されるために、そのような足場は、以下のような最も多数の基準を満たさなければならないことが公知である（Skerra,2000）：系統発生学的に高度に保存されていること；（例えば、結晶学、NMR分光法、もしくは当業者に公知のその他の技術によって）三次元構造が既知であること；サイズが小さいこと；転写後修飾がほとんどもしくは全くないこと；ならびに/または作製、発現、および精製が容易であること。
【００６６】
そのようなタンパク質足場の起源は、フィブロネクチン、優先的には、フィブロネクチンIII型ドメイン10、リポカリン、アンチカリン（Skerra,2001）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインAのドメインBから発生するプロテインZ、チオレドキシンA、または「アンキリンリピート」（Kohl et al.,2003）、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」、および「テトラトリコペプチドリピート」のような反復モチーフを有するタンパク質：の中から選択される構造であり得るが、これらに限定されるわけではない。例えば、アンチカリンまたはリポカリンの誘導体は、様々な標的分子に対する親和性および特異性を有する結合タンパク質の型であり、標的結合分子として使用され得る。そのようなタンパク質は、参照によって本明細書中に組み入れられる米国特許公開番号20100285564、20060058510、20060088908、20050106660、およびPCT公開番号WO2006/056464に記載されている。
【００６７】
例えば、サソリ、昆虫、植物、軟体動物等に由来する毒素のような毒素に由来する足場、およびニューロンNO合成酵素（PIN）のタンパク質阻害剤も、ある種の局面において、使用され得る。
【００６８】
モノクローナル抗体（MAb）は、ある種の利点、例えば、再現性および大規模作製を有すると認識されている。態様には、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギ、およびニワトリが起源のモノクローナル抗体が含まれる。
【００６９】
ヒト定常領域ドメインおよび/またはヒト可変領域ドメインを保持しているマウス、ラット、またはその他の種に由来するキメラ抗体、二重特異性抗体、組換え改変型抗体、ならびにそれらの断片と同様に、「ヒト化」抗体も意図される。本明細書中で使用されるように、「ヒト化」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（一般的には、マウスまたはラット）免疫グロブリンに由来する1個または複数個のCDRとを含む免疫グロブリンをさす。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンのヒト化軽鎖およびヒト化重鎖を含む抗体である。いくつかの態様の抗体を記載するため、親和性として公知の、抗体分子がエピトープに結合する強度を測定することができる。抗体の親和性は、会合定数（Ka）または解離定数（Kd）を測定することによって決定され得る。ある種の態様において、有用であると見なされる抗体は、約、少なくとも約、または多くとも約106M、107M、108M、109M、もしくは1010M、またはそれらから派生する任意の範囲の会合定数を有していてよい。同様に、いくつかの態様において、抗体は、約、少なくとも約、または多くとも約10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、もしくは10-10M、またはそれらから派生する任意の範囲の解離定数を有していてよい。
【００７０】
ある種の態様において、IL-6Rαに特異的に結合するポリペプチドは、IL-6Rαを中和し、かつ/またはIL-6のIL-6Rαとの結合を防止するか、またはIL-6Rαによるシグナリングを防止することができる、。
【００７１】
B.IL-6Rα結合ポリペプチドに対する修飾
1.シグナルペプチド
IL-6Rα結合タンパク質は、リーダー（即ち、シグナル）ペプチドによってタグ付けられてもよい。「シグナルペプチド」とは、細胞内のタンパク質の、例えば、（小胞体のような）ある種の細胞小器官および/または細胞表面への輸送および局在を指向するペプチド配列をさす。シグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体へ指向する。一般に、最もアミノ末端の成分にネイティブに付着したシグナルペプチドが、使用される（例えば、軽鎖 - リンカー - 重鎖という方向を有するscFvにおいては、軽鎖のネイティブシグナルが使用される）。いくつかの態様において、タンパク質が発現細胞から分泌されるよう、マウスκ軽鎖由来のシグナルペプチドが使用される。これは、産生細胞が培養されている培地から、発現されたタンパク質を直接収集することを可能にする。当業者に公知の他のリーダー/シグナルペプチドも使用され得る。
【００７２】
いくつかの態様において、シグナルペプチドは、小胞体（ER）を通過した後に切断される、即ち、切断可能シグナルペプチドである。いくつかの態様において、制限部位が、切断を容易にするため、シグナルペプチドのカルボキシ末にある。
【００７３】
2.マーカーおよびエピトープタグ
IL-6Rα結合タンパク質は、DYKDDDDK（FLAG）エピトープ、HAタグ、もしくcMycタグ、または当技術分野において公知のその他のエピトープタグ、マーカー、およびアフィニティタグのようなマーカーによってタグ付けられてもよい。これは、IL-6Rα結合タンパク質の単離、精製、局在、および標的特異的結合を容易にすることができる。いくつかの態様において、マーカーには、GGSリンカーが隣接している。
【００７４】
3.リンカー
いくつかの態様において、本開示のポリペプチドは、（時に、リンカーとも呼ばれる）ペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーは、本明細書中に記載されたペプチドドメイン/領域のいずれかを分離するものであり得る。例として、リンカーは、シグナルペプチドと抗原結合ドメインとの間、抗原結合ドメインのVHとVLとの間、抗原結合ドメインとペプチドスペーサーとの間、ペプチドスペーサーと膜貫通ドメインとの間にあってよい。ペプチドリンカーは、多様なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。ドメインおよび領域は、一般に可動性を有するペプチドリンカーによって接合されていてよいが、他の化学結合も排除されない。リンカーは、約6〜約40アミノ酸長または約6〜約25アミノ酸長のペプチドであり得る。これらのリンカーは、タンパク質をカップリングするため、リンカーをコードする合成のオリゴヌクレオチドを使用することによって作製され得る。
【００７５】
ある程度の可動性を有するペプチドリンカーが使用され得る。適当なペプチドリンカーは、一般に、可動性のペプチドをもたらす配列を有することに留意しながら、ペプチドリンカーは、事実上任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシンおよびアラニンのような小さいアミノ酸の使用は、可動性ペプチドの作出において有用である。そのような配列の作出は、当業者にルーチンである。
【００７６】
適当なリンカーは、容易に選択され得、1アミノ酸（例えば、Gly）〜20アミノ酸、2アミノ酸〜15アミノ酸、3アミノ酸〜12アミノ酸、例えば、4アミノ酸〜10アミノ酸、5アミノ酸〜9アミノ酸、6アミノ酸〜8アミノ酸、または7アミノ酸〜8アミノ酸のような、任意の適切な異なる長さを有していてよく、1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、または7アミノ酸であり得る。
【００７７】
例示的な可動性リンカーには、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー、例えば、(GS)n、(GSGGS)n、および(GGGS)n（nは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、ならびに当技術分野において公知のその他の可動性リンカーが含まれる。グリシンポリマーおよびグリシン-セリンポリマーが使用され得；GlyおよびSerは、いずれも、比較的非構造的であり、従って、成分間の中性のつなぎ鎖として機能し得る。グリシンポリマーが使用され得；グリシンは、アラニンより有意に多くファイサイ空間に接近し、より長い側鎖を有する残基よりはるかに制約が少ない。例示的なスペーサーには、GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG、GSSSG等を含むが、これらに限定されるわけではないアミノ酸配列が含まれ得る。
【００７８】
4.抗原結合ドメインに対する修飾
本開示のIL-6Rα結合タンパク質の抗原結合ドメインの可変領域は、タンパク質の1種または複数種の結合特性（例えば、親和性）を改善するため、VHおよび/またはVLのCDR領域内のアミノ酸残基を変異させることによって修飾され得る。「CDR」という用語は、B細胞およびT細胞によってそれぞれ生成される免疫グロブリン（抗体）およびT細胞受容体の可変鎖の一部に基づく相補性決定領域をさし、そこで、これらの分子は特異的な抗原に結合する。免疫グロブリンおよびT細胞受容体に関連した大部分の配列変動が、CDRに見出されるため、これらの領域は、時に、超可変領域と呼ばれる。部位特異的変異誘発またはPCRによって媒介される変異誘発によって、変異を導入することができ、抗体結合またはその他の関心対象の機能的特性に対する効果を、適切なインビトロまたはインビボのアッセイにおいて評価することができる。好ましくは、保存的修飾が導入され、典型的には、CDR領域内の多くとも1個、2個、3個、4個、または5個の残基が変更される。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であり得る。
【００７９】
例えば、1個または複数個のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列へ「復帰変異」させることによって、免疫原性を減少させるため、IL-6Rα結合タンパク質にフレームワーク修飾を施すことができる。
【００８０】
抗原結合ドメインは、同一の抗原（多価）または異なる抗原（多重特異性）のいずれかに結合するVH領域およびVL領域の対を含む抗原結合ドメインを多量体化することによって、多重特異性または多価になり得ることも意図される。
【００８１】
本明細書中で使用されるように、「親和性」という用語は、2種の剤の可逆的結合についての平衡定数をさし、解離定数（Kd）として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性より、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍、または少なくとも1000倍、またはそれ以上（またはそれらから派生する任意の範囲）大きくてよい。本明細書中で使用されるように、「アビディティ」という用語は、希釈後の解離に対する、2種以上の剤の複合体の抵抗性をさす。「免疫反応性」および「優先的に結合する」という用語は、抗体および/または抗原結合断片に関して、交換可能に本明細書中で使用される。
【００８２】
「結合」という用語は、例えば、塩橋および水ブリッジのような相互作用を含む、共有結合性相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、およびイオン性相互作用、および/または水素結合性相互作用による、2分子間の直接会合をさす。
【００８３】
5.化学的修飾
さらに、本開示のポリペプチドは、化学的に修飾されてもよい。例えば、抗原に対するポリペプチドの親和性を増加させるため、ポリペプチド配列内の1個または複数個のグリコシル化部位を修飾することによって、ポリペプチドのグリコシル化を変更することができる（米国特許第5,714,350号および第6,350,861号）。
【００８４】
本発明のポリペプチドは、1個または複数個のPEG基がポリペプチドに付着する条件の下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（PEG）またはPEGの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体と反応させることによって、生物学的半減期を増加させるため、PEG化されてもよい。ポリペプチドPEG化は、反応性PEG分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）によるアシル化反応またはアルキル化反応によって実施され得る。本明細書中で使用されるように、「ポリエチレングリコール」という用語には、モノ（C1〜C10）アルコキシ-もしくはアリールオキシ-ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミドのような、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている任意の型のPEGが包含されるものとする。タンパク質をPEG化する方法は、当技術分野において公知であり、本発明のポリペプチドに適用され得る（EP 0 154 316およびEP 0 401 384）。
【００８５】
さらに、得られる分子の半減期を増加させるため、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質にポリペプチドをコンジュゲートするかまたは融合させることによって、ポリペプチドを化学的に修飾することができる。そのようなアプローチは、例えば、EP 0322094およびEP 0 486 525に記載されている。
【００８６】
本開示のポリペプチドは、診断剤または治療剤にコンジュゲートされ得、例えば、疾患の発症または進行をモニタリングし、所定の処置計画の効力を決定するため、診断的に使用され得る。ポリペプチドの治療効果と組み合わせて、治療を提供するため、治療剤にポリペプチドをコンジュゲートすることもできる。診断剤の例には、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々なポジトロン断層撮影を使用したポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能物質は、当技術分野において公知の技術を使用して、直接、またはリンカーを通して間接的に、ポリペプチドにカップリングまたはコンジュゲートされ得る。適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適当な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれる。適当な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれる。発光材料の例には、ルミノールが含まれる。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。適当な放射性材料の例には、125I、131I、インジウム111、ルテチウム171、ビスマス212、ビスマス213、アスタチン211、銅62、銅64、銅67、イットリウム90、ヨウ素125、ヨウ素131、リン32、リン33、スカンジウム47、銀111、ガリウム67、プラセオジム142、サマリウム153、テルビウム161、ジスプロシウム166、ホルミウム166、レニウム186、レニウム188、レニウム189、鉛212、ラジウム223、アクチニウム225、鉄59、セレン75、ヒ素77、ストロンチウム89、モリブデン99、ロジウム1105、パラジウム109、プラセオジム143、プロメチウム149、エルビウム169、イリジウム194、金198、金199、および鉛211が含まれる。キレート剤は、アミティ（amities）（Meares et al.,1984 Anal.Biochem.142:68-78）；アミノ酸残基のスルフヒドリル基（Koyama 1994 Chem.Abstr.120:217262t）、および炭水化物基（Rodwell et al.1986 PNAS USA 83:2632 2636；Quadri et al.1993 Nucl.Med.Biol.20:559-570）を通して付着させられ得る。
【００８７】
ポリペプチドの治療効果と組み合わせて、治療を提供するため、治療剤にポリペプチドをコンジュゲートすることもできる。
【００８８】
付加的な適当なコンジュゲートされる分子には、リボヌクレアーゼ（RNase）、DNaseI、アンチセンス核酸、siRNA分子のような阻害性RNA分子、免疫刺激性核酸、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列（external guide sequences）が含まれる。アプタマーとは、ステムループまたはGカルテットのような明確な二次構造および三次構造へ折り畳まれる15〜50塩基長の範囲の小さい核酸であり、ATP（米国特許第5,631,146号）およびテオフィリン（米国特許第5,580,737号）のような低分子にも結合することができるし、逆転写酵素（米国特許第5,786,462号）およびトロンビン（米国特許第5,543,293号）のような大きい分子にも結合することができる。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、典型的には、標的基質を認識し、それに結合し、その後、切断することによって、核酸基質を切断する。三重鎖形成機能核酸分子は、3本のDNA鎖がワトソン・クリック塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成の両方に依って複合体を形成する三重鎖を形成することによって、二本鎖または一本鎖の核酸と相互作用することができる。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域に結合することができる。
【００８９】
機能性核酸分子は、標的分子が保有する特異的活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーター、および刺激剤として作用してもよいし、または機能性核酸分子は、他の分子に依存しない新たな活性を保有していてもよい。
【００９０】
C.IL-6Rα結合タンパク質の発現
IL-6Rα結合タンパク質は、多様な細胞型において発現され得る。IL-6Rα結合タンパク質をコードする発現構築物を、当技術分野において公知の多様な方法によって、細胞へトランスフェクトすることができる。いくつかの態様において、IL-6Rα結合タンパク質発現構築物は、構成性プロモーターの制御下にあってよい。いくつかの態様において、それは、ある種の条件の下でのみ発現を駆動する調節可能プロモーターの制御下にあってもよい。これは、例えば、増加したレベルのサイトカインが存在する場合などの、有害である可能性のある状況またはIL-6Rαを通したシグナリングを低下させることが望ましい状況に応答する必要がある場合にのみ、IL-6Rα結合タンパク質の発現を提供することができる。これを達成するためには、IL-6Rα結合タンパク質発現構築物を、IL-6、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-8、およびIL-10のようなサイトカインに応答性のプロモーターの制御下に置くことができる。いずれもT細胞活性化時に活性化され得る転写因子であるNFAT-1またはNFκBによって制御されるもののような、T細胞活性化に関連したプロモーターの制御下に、IL-6Rα結合タンパク質発現構築物を置くこともできる。IL-6Rα結合タンパク質発現の制御は、腫瘍を標的とするT細胞のようなT細胞が、周囲の情況を感知し、T細胞自体においても周囲の内在性免疫細胞においてもサイトカインシグナリングのリアルタイムのモジュレーションを実施することを可能にする。
【００９１】
III.核酸
ある種の態様において、本明細書中に記載されたタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドが存在する。意図されるポリヌクレオチド配列には、IL-6Rα結合タンパク質およびCARをコードするものが含まれる。
【００９２】
本願において使用されるように、「ポリヌクレオチド」という用語は、組換えであるかまたは全ゲノム核酸から単離されたものである核酸分子をさす。「ポリヌクレオチド」という用語には、オリゴヌクレオチド（100残基以下の長さの核酸）、組換えベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等が含まれる。ポリヌクレオチドには、ある種の局面において、天然に存在する遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離された調節配列が含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、RNA、DNA（ゲノム、cDNA、もしくは合成）、それらの類似体、またはそれらの組み合わせであり得る。付加的なコード配列または非コード配列が、ポリヌクレオチド内に存在してもよいが、存在しなくてもよい。
【００９３】
これに関して、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸」という用語は、（適切な転写、翻訳後修飾、または局在のために必要とされる配列を含む）タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする核酸をさすために使用される。当業者によって理解されるように、この用語には、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および変異体を発現するかまたは発現するよう適応し得る、ゲノム配列、発現カセット、cDNA配列、およびより小さい改変型核酸セグメントが包含される。ポリペプチドの全部または一部をコードする核酸は、そのようなポリペプチドの全部または一部をコードする連続核酸配列を含有していてよい。わずかに異なる核酸配列を有する変動を含有しているにも関わらず、同一または実質的に類似したタンパク質をコードする核酸によって、特定のポリペプチドがコードされ得ることも意図される。
【００９４】
具体的な態様において、IL-6Rαに結合するポリペプチド（例えば、抗体またはその断片）をコードする核酸配列が組み入れられた、単離された核酸セグメントおよび組換えベクターが存在する。「組換え」という用語は、ポリペプチドまたは特定のポリペプチドの名称と共に使用され得、これは、一般に、インビトロで操作された核酸分子またはそのような分子の複製産物である核酸分子から産生されたポリペプチドをさす。
【００９５】
核酸セグメントは、コード配列自体の長さに関わらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、マルチプルクローニングサイト、他のコードセグメント等のような他の核酸配列と組み合わせられてもよく、従って、その全長は相当に変動し得る。従って、ほぼ任意の長さの核酸断片が利用され得ることが意図されるが、全長は、好ましくは、意図された組換え核酸プロトコルにおける調製および使用の容易さによって限定される。いくつかのケースにおいて、核酸配列は、例えば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾、またはターゲティングもしくは効力のような治療的利益を可能にするため、付加的な異種コード配列と共に、ポリペプチド配列をコードし得る。前述のように、タグまたはその他の異種ポリペプチドが、修飾型ポリペプチドコード配列に付加されてもよく、ここで、「異種」とは、修飾型ポリペプチドと同一でないポリペプチドをさす。
【００９６】
ある種の態様において、本明細書中に開示された配列と実質的な同一性を有するポリヌクレオチドバリアントが存在する；本明細書中に記載された方法（例えば、標準的なパラメータを使用したBLAST分析）を使用して、本明細書中に提供されたポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上（中間の全ての値および範囲を含む）の配列同一性を含むもの。ある種の局面において、単離されたポリヌクレオチドは、配列の全長において、本明細書中に記載されたアミノ酸配列との少なくとも90％、好ましくは、95％およびそれ以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または単離されたポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含むであろう。
【００９７】
A.ベクター
ポリペプチドは、核酸分子によってコードされ得る。核酸分子は、核酸ベクターの形態であり得る。「ベクター」という用語は、異種核酸配列を細胞へ導入し、そこで、複製させ発現させるため、異種核酸配列を挿入することができる担体核酸分子をさすために使用される。核酸配列は、「異種」であってよく、「異種」とは、ベクターが導入される細胞またはそれが組み入れられる核酸に対して外来性の状況にあることを意味し、それは、細胞内の配列に相同であるが、通常はそれが見出されない宿主細胞内または核酸内の位置にある配列を含む。ベクターには、DNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、YAC）が含まれる。当業者は、標準的な組換え技術を通して、ベクターを構築することが十分にできるであろう（例えば、いずれも参照によって本明細書中に組み入れられるSambrook et al.,2001；Ausubel et al.,1996）。ベクターは、IL-6Rαに結合する抗体を作製するため、宿主細胞において使用され得る。
【００９８】
「発現ベクター」という用語は、転写されることができる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有しているベクターをさす。いくつかのケースにおいて、RNA分子は、次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドへ翻訳される。発現ベクターは、多様な「制御配列」を含有していてよく、「制御配列」とは、特定の宿主生物において、機能的に連結されたコード配列が転写され、おそらくは翻訳されるために必要な核酸配列をさす。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能にも役立つ、本明細書中に記載される核酸配列を含有していてもよい。
【００９９】
「プロモーター」とは、制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。それは、RNAポリメラーゼのような調節性のタンパク質および分子が結合することができる遺伝要素、ならびにその他の転写因子を含有していてよい。「機能的に位置付けられた」、「機能的に連結された」、「制御下にある」、および「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、核酸配列の転写開始および発現を制御するため、その配列に対して正確な機能的な位置および/または方向にあることを意味する。プロモーターは、「エンハンサー」と共に使用されてもよいしまたは使用されなくてもよく、「エンハンサー」とは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列をさす。
【０１００】
特異的な開始シグナルも、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接配列を含む。ATG開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルが、提供される必要があり得る。当業者は、これを決定し、必要なシグナルを提供することが容易にできるであろう。
【０１０１】
ベクターは、複数の制限酵素部位を含有している核酸領域であるマルチプルクローニングサイト（MCS）を含んでいてよく、それらの制限酵素部位のいずれかを、ベクターを消化するため、標準的な組換えテクノロジーと共に使用することができる（参照によって本明細書中に組み入れられるCarbonelli et al.,1999、Levenson et al.,1998、およびCocea,1997を参照すること）。
【０１０２】
大部分の転写された真核生物RNA分子は、一次転写物からイントロンを除去するためのRNAスプライシングを受けるであろう。ゲノム真核生物配列を含有しているベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするため、ドナースプライシング部位および/またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（参照によって本明細書中に組み入れられるChandler et al.,1997を参照すること）。
【０１０３】
ベクターまたは構築物は、一般に、少なくとも1個の終結シグナルを含むであろう。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的な終結に関与するDNA配列から構成される。従って、ある種の態様において、RNA転写物の産生を終止させる終結コドンが意図される。ターミネーターは、望ましいメッセージレベルを達成するため、インビボで必要であり得る。真核生物系において、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出させるための新しい転写物の部位特異的な切断を可能にする特異的なDNA配列も含み得る。これは、約200個のA残基のストレッチ（ポリA）を転写物の3'末に付加するよう、特殊な内在性ポリメラーゼにシグナル伝達する。このポリAテールによって修飾されたRNA分子は、より安定しており、より効率的に翻訳される。従って、真核生物を含む他の態様において、ターミネーターはRNAの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルはメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。
【０１０４】
発現、特に、真核生物発現において、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化を達成するため、ポリアデニル化シグナルが含まれるであろう。
【０１０５】
宿主細胞においてベクターを繁殖させるためには、複製が開始される特異的な核酸配列である（しばしば「ori」と呼ばれる）複製開始部位が、1個または複数個、含有されるであろう。あるいは、宿主細胞が酵母である場合には、自律複製配列（ARS）が利用され得る。
【０１０６】
B.宿主細胞
本明細書中で使用されるように、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され得る。これらの用語の全てに、全ての任意の後続世代である子孫が含まれる。計画的または偶発的な変異のため、全ての子孫が同一であるとは限らないことが理解される。異種核酸配列の発現に関して、「宿主細胞」とは、原核細胞または真核細胞をさし、それには、ベクターを複製させることができるかまたはベクターによってコードされた異種遺伝子を発現することができる形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞は、ベクターまたはウイルスのためのレシピエントとして使用され得、使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」され得、これらは、組換えタンパク質コード配列のような外来性核酸が宿主細胞へ移入または導入される過程をさす。形質転換細胞には、初代の主細胞およびその子孫が含まれる。
【０１０７】
いくつかのベクターは、原核細胞および真核細胞の両方において複製されかつ/または発現されることを可能にする制御配列を利用し得る。当業者は、前記の宿主細胞の全てをインキュベートして、それらを維持し、ベクターの複製を可能にするための条件をさらに理解するであろう。ベクターの大規模作製、ならびにベクターによってコードされた核酸、およびそれらの同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの作製を可能にする技術および条件も、理解され、公知である。
【０１０８】
C.発現系
前述の組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現系が存在する。原核生物および/または真核生物に基づく系が、核酸配列、またはそれらの同族のポリペプチド、タンパク質、およびペプチドを作製するため、態様と共に使用するために利用され得る。多くのそのような系が、広く市販されている。
【０１０９】
いずれも参照によって本明細書中に組み入れられる米国特許第5,871,986号および第4,879,236号に記載されたような昆虫細胞/バキュロウイルス系は、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を生じることができ、例えば、INVITROGEN（登録商標）からMAXBAC（登録商標）2.0の名称で、CLONTECH（登録商標）からBACPACK（商標）BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMの名称で購入可能である。
【０１１０】
開示された発現系に加えて、他の発現系の例には、合成エクジソン誘導可能受容体を含むSTRATAGENE（登録商標）のCOMPLETE CONTROL（商標）誘導可能哺乳動物発現系、またはそのpET発現系、大腸菌発現系が含まれる。誘導可能発現系のもう一つの例は、全長CMVプロモーターを使用する誘導可能哺乳動物発現系であるT-REX（商標）（テトラサイクリンによって調節される発現）系を所有するINVITROGEN（登録商標）から入手可能である。INVITROGEN（登録商標）は、メチロトローフ酵母ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）において組換えタンパク質を高レベルに産生するよう設計されている、ピキア・メタノリカ発現系と呼ばれる酵母発現系も提供する。核酸配列またはその同族のポリペプチド、タンパク質、もしくはペプチドを作製するため、発現構築物のようなベクターを発現させる方法は、当業者に公知であろう。
【０１１１】
D.遺伝子移入の方法
組成物の発現を達成するための核酸送達のための適当な方法には、本明細書中に記載されるかまたは当業者に公知であるように、細胞、組織、または生物へ核酸（例えば、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むDNA）を導入することができる事実上任意の方法が含まれると考えられる。そのような方法には、注入（各々参照によって本明細書中に組み入れられる米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号、および第5,580,859号）、例えば、微量注入（参照によって本明細書中に組み入れられるHarland and Weintraub,1985；米国特許第5,789,215号）；電気穿孔（参照によって本明細書中に組み入れられる米国特許5,384,253号）；リン酸カルシウム沈殿（Graham and Van Der Eb,1973；Chen and Okayama,1987；Rippe et al.,1990）；DEAEデキストランに続くポリエチレングリコールの使用（Gopal,1985）；直接超音波負荷（Fechheimer et al.,1987）；リポソームによって媒介されるトランスフェクション（Nicolau and Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolau et al.,1987；Wong et al.,1980；Kaneda et al.,1989；Kato et al.,1991）；微粒子銃（各々参照によって本明細書中に組み入れられるPCT出願番号WO 94/09699および95/06128；米国特許第5,610,042号；第5,322,783号、第5,563,055号、第5,550,318号、第5,538,877号、および第5,538,880号）；シリコンカーバイドファイバーとの撹拌（各々参照によって本明細書中に組み入れられるKaeppler et al.,1990；米国特許第5,302,523号および第5,464,765号）；アグロバクテリウムによって媒介される形質転換（各々参照によって本明細書中に組み入れられる米国特許第5,591,616号および第5,563,055号）；またはプロトプラストのPEGによって媒介される形質転換（各々参照によって本明細書中に組み入れられるOmirulleh et al.,1993；米国特許第4,684,611号および第4,952,500号）；乾燥/阻害によって媒介されるDNA取り込み（Potrykus et al.,1985）によるDNAの直接送達が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらのような技術の適用を通して、小器官、細胞、組織、または生物は、安定的にまたは一過性に形質転換され得る。他の方法には、レンチウイルスまたはレトロウイルスの形質導入による遺伝子移入のようなウイルスの形質導入が含まれる。
【０１１２】
E.IL-6Rα結合タンパク質発現構築物
いくつかの態様において、IL-6Rα結合タンパク質は、以下の構造を有する発現構築物によってコードされる：マウス5'-IgGκリーダー配列-FLAGタグ-VL-scFvリンカー-VH-3'。以下のDNA配列が、そのような構築物をコードする（下線付きの配列はマウスIgGκリーダー配列およびscFvリンカー配列である）：
2019530440.tif 000008
2019530440.tif 000009
2019530440.tif 000010
【０１１３】
IV.細胞
A.細胞型
ある種の態様は、本開示のポリペプチドまたは核酸を含む細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞またはT細胞である。「T細胞」には、Tヘルパー細胞（CD4+細胞）、細胞傷害性T細胞（CD8+細胞）、T調節性細胞（Treg）、サプレッサーT細胞、およびγδT細胞を含む、CD3を発現する全ての型の免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、CD8+T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、および好中球が含まれ、これらの細胞は、細胞傷害応答を媒介することができる。いくつかの態様において、細胞は、前駆細胞または幹細胞である。いくつかの態様において、前駆細胞または幹細胞は、インビトロで免疫細胞へ分化する。いくつかの態様において、細胞はエクスビボである。免疫細胞という用語には、感染性疾患および外来材料の両方からの身体の防御に関与する免疫系の細胞が含まれる。免疫細胞には、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、B細胞およびT細胞のようなリンパ球、ならびに単球が含まれ得る。
【０１１４】
適当な哺乳動物細胞には、初代細胞および不死化細胞株が含まれる。適当な哺乳動物細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、齧歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株等が含まれる。適当な哺乳動物細胞株には、HeLa細胞（例えば、American Type Culture Collection（ATCC）No.CCL-2）、CHO細胞（例えば、ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096）、ヒト胎児由来腎臓（HEK）293細胞（例えば、ATCC No.CRL-1573）、Vero細胞、NIH 3T3細胞（例えば、ATCC No.CRL-1658）、Huh-7細胞、BHK細胞（例えば、ATCC No.CCL10）、PC12細胞（ATCC No.CRL1721）、COS細胞、COS-7細胞（ATCC No.CRL1651）、RATI細胞、マウスL細胞（ATCC No.CCLI.3）、HLHepG2細胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK細胞株（例えば、NKL、NK92、およびYTS）等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１５】
いくつかの場合において、細胞は、不死化細胞株でなく、個体から得られた細胞（例えば、初代細胞）である。例えば、いくつかのケースにおいて、細胞は、個体から得られた免疫細胞である。一例として、細胞は、個体から得られたTリンパ球である。もう一つの例として、細胞は、個体から得られた細胞傷害性細胞である。もう一つの例として、細胞は、個体から得られた幹細胞または前駆細胞である。
【０１１６】
B.養子細胞治療
いくつかの態様において、本明細書中に開示された細胞は、治療用細胞の対象への投与を含む、養子細胞治療または養子細胞移入において使用される。この治療は、腫瘍浸潤リンパ球、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）、ヘルパーT（Th）細胞、およびTreg細胞、ならびにその他の免疫細胞およびその他の型の細胞の投与を含むことができる。治療用細胞は、患者またはドナーに起因し得る。いくつかの態様において、細胞は、患者から抽出され、遺伝学的に修飾され、インビトロで培養され、同一の患者に戻される。
【０１１７】
本明細書中に開示された細胞は、例えば、癌、自己免疫疾患、感染、および炎症性障害を処置するため、対象へ投与され得る。いくつかの態様において、養子T細胞治療において使用される細胞によるIL-6Rα結合タンパク質の発現は、IL-6Rαを通したIL-6シグナリングを含むサイトカイン放出症候群およびその他の炎症状態または自己免疫状態のような、養子T細胞治療の結果として起こり得る副作用を低下させるかまたは排除することができる。さらに、治療用T細胞と共にIL-6Rα結合タンパク質を投与することによって、養子T細胞治療の副作用を排除するか、低下させるか、または和らげることができる。
【０１１８】
1.キメラ抗原受容体
a.養子細胞治療における使用
いくつかの態様において、養子細胞治療において使用される治療用細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する。CARは、一般的に、（scFvであり得る）細胞外抗原結合ドメイン、細胞外スペーサー、膜貫通ドメイン、共刺激シグナリング領域（その数は具体的なCAR設計に依って変動する）、およびCD3ζシグナリングドメイン/細胞内ドメインから構成される融合タンパク質である。T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞を含む免疫細胞が、ウイルスの形質導入、DNAヌクレオフェクション、およびRNAヌクレオフェクションを含む当技術分野において公知の多様な方法によって、CARを発現するよう改変され得る。CARの抗原標的との結合は、CARを発現するヒトT細胞を活性化することができ、それは、抗原を保持する細胞の殺傷またはその他の何らかの免疫学的応答をもたらし得る。
【０１１９】
いくつかの態様において、細胞は、癌特異的CARを含む。CARに関して「癌特異的」という用語は、癌特異的抗原のような癌特異的分子に対する抗原結合特異性を有するCARをさす。いくつかの態様において、癌特異的CARは、TGFβCARのようなもう一つの標的に対して特異的なCARと共に細胞内にある。いくつかの態様において、癌特異的CARおよびもう一つのCARは、別々のポリペプチド上にある。いくつかの態様において、CARは、癌特異的分子およびTGFβのようなもう一つの抗原に対する結抗原合を有する二重特異性CARである。例えば、二重特異性CARは、シグナリングペプチド、癌分子特異的scFvを有していてよく、任意で、ペプチドリンカー/スペーサーを有し、その後、もう一つの抗原に結合するscFvを有し、その後、スペーサー、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを有していてよい。いくつかの態様において、二重特異性CARは、本明細書中に記載された1個または複数個の付加的なペプチドセグメントを含む。
【０１２０】
いくつかの態様において、本開示のCARは、CD20 scFvを含み得る。例示的なCD20 scFvは、以下を含む：
2019530440.tif 000011
【０１２１】
いくつかの態様において、本開示のCARは、CD19 scFvを含み得る。例示的なCD19 scFvは、以下を含む：
2019530440.tif 000012
いくつかの態様において、抗CD19 CARは、以下の構造を有するDNA構築物によってコードされる：GM-CSFシグナルペプチド - HAタグ - CD19 scFv - IgG4ヒンジ - CD28 tm - 4-1BB共刺激ドメイン - CD3ζ。この構築物は、以下の配列を有する：
2019530440.tif 000013
【０１２２】
CARによって標的とされ得る（CD19およびCD20に加えての）他の癌特異的分子には、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k軽鎖、LeY、L1細胞接着分子、MAGE-A1、メソテリン、MUC1、NKG2Dリガンド、癌胎児性抗原（h5T4）、PSCA、PSMA、mAb IgEによって標的とされるTAA、TAG-72、およびVEGF-R2が含まれ得る。いくつかの態様において、癌特異的分子にはHer2が含まれる。
【０１２３】
b.シグナルペプチド
いくつかの態様において、CARは、細胞内のタンパク質の、例えば、（小胞体のような）ある種の細胞小器官および/または細胞表面への輸送および局在を指向するシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体へ指向する。受容体がグリコシル化され細胞膜に固定される場合、これは不可欠である。一般に、最もアミノ末端の成分にネイティブに付着したシグナルペプチドが、使用される（例えば、軽鎖 - リンカー - 重鎖という方向を有するscFvにおいては、軽鎖のネイティブシグナルが使用される）。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、配列
2019530440.tif 000014
を有する。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、小胞体（ER）を通過した後に切断される、即ち、切断可能なシグナルペプチドである。いくつかの態様において、切断を容易にするため、制限部位がシグナルペプチドのカルボキシ末にある。
【０１２４】
c.抗原結合ドメイン
CARの抗原結合ドメインは、標的抗原に対する抗体に基づく単鎖可変断片（scFv）のような抗原結合タンパク質である。例えば、1個または複数個のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列へ「復帰変異」させることによって、免疫原性を減少させるため、フレームワーク修飾を抗原結合ドメインに施すことができる。抗原結合ドメインは、同一の抗原（多価）または異なる抗原（多重特異性）のいずれかに結合するVH領域およびVL領域の対を含む抗原結合ドメインを多量体化することによって、多重特異性または多価になり得ることも意図される。
【０１２５】
d.ペプチドスペーサー
スペーサー領域は、抗原結合ドメインをCARの膜貫通ドメインに連結する。それは、抗原認識を容易にするため、抗原結合ドメインが異なる方向に向くことを可能にするために十分に可動性であるべきである。最も単純な型は、IgG由来のヒンジ領域である。代替的なものには、免疫グロブリンのCH2CH3領域およびCD3の一部が含まれる。いくつかの態様において、CH2CH3領域は、L235E/N297Q修飾もしくはL235D/N297Q修飾、またはCH2CH3領域の少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％のアミノ酸配列同一性を有し得る。大部分のscFvに基づく構築物について、IgGヒンジが十分である。しかしながら、最適なスペーサーは、しばしば、経験的に決定されなければならない。いくつかの態様において、スペーサーは、IgG4由来である。
【０１２６】
本明細書中で使用されるように、「ヒンジ」という用語は、構造的可動性および隣接するポリペプチド領域との間隔を提供する（本明細書中で「ヒンジ領域」または「スペーサー」とも呼ばれる）可動性のポリペプチドコネクター領域をさし、天然または合成のポリペプチドからなっていてよい。免疫グロブリン（例えば、IgG1）に由来する「ヒンジ」は、一般に、ヒトIgG1のGlu216からPro230までのストレッチングとして定義される（Burton(1985)Molec.Immunol.,22:161-206）。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（S-S）結合を形成する最初のシステイン残基および最後のシステイン残基を同一の位置に置くことによって、IgG1配列と整列し得る。ヒンジ領域は、天然に存在するものであってもよいし、または天然に存在しないものであってもよく、米国特許第5,677,425号に記載されるような改変型ヒンジ領域を含むが、これに限定されるわけではない。ヒンジ領域には、CH1ドメインのものとは異なるクラスまたはサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域が含まれ得る。「ヒンジ」という用語には、可動性および隣接する領域との間隔を提供する類似した機能を提供する、CD8およびその他の受容体に由来する領域も含まれ得る。
【０１２７】
ペプチドスペーサーは、少なくとも、多くとも、または正確に4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、20アミノ酸、20アミノ酸、25アミノ酸、30アミノ酸、35アミノ酸、40アミノ酸、45アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、110アミノ酸、120アミノ酸、130アミノ酸、140アミノ酸、150アミノ酸、160アミノ酸、170アミノ酸、180アミノ酸、190アミノ酸、200アミノ酸、201アミノ酸、202アミノ酸、203アミノ酸、204アミノ酸、205アミノ酸、206アミノ酸、207アミノ酸、208アミノ酸、209アミノ酸、210アミノ酸、211アミノ酸、212アミノ酸、213アミノ酸、214アミノ酸、215アミノ酸、216アミノ酸、217アミノ酸、218アミノ酸、219アミノ酸、220アミノ酸、225アミノ酸、226アミノ酸、227アミノ酸、228アミノ酸、229アミノ酸、230アミノ酸、231アミノ酸、232アミノ酸、233アミノ酸、234アミノ酸、235アミノ酸、236アミノ酸、237アミノ酸、238アミノ酸、239アミノ酸、240アミノ酸、241アミノ酸、242アミノ酸、243アミノ酸、244アミノ酸、245アミノ酸、246アミノ酸、247アミノ酸、248アミノ酸、249アミノ酸、250アミノ酸、260アミノ酸、270アミノ酸、280アミノ酸、290アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、もしくは400アミノ酸（またはそれらから派生し得る任意の範囲）の長さを有し得る。いくつかの態様において、ペプチドスペーサーは、免疫グロブリン由来のヒンジ領域からなるかまたはそれを含む。免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列は、当技術分野において公知である；例えば、Tan et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:162；およびHuck et al.(1986)Nucl.Acids Resを参照すること。
【０１２８】
ペプチドスペーサーの長さは、標的抗原に対する応答および/または増大の特性に対する効果を有し得る。いくつかの態様において、50アミノ酸未満、45アミノ酸未満、40アミノ酸未満、30アミノ酸未満、35アミノ酸未満、30アミノ酸未満、25アミノ酸未満、20アミノ酸未満、15アミノ酸未満、または10アミノ酸未満のような短いスペーサーは、効果的な活性化応答のために必要とされる標的抗原の濃度の減少という利点を有し得る。いくつかの態様において、少なくとも50アミノ酸、60アミノ酸、70アミノ酸、80アミノ酸、90アミノ酸、100アミノ酸、110アミノ酸、120アミノ酸、130アミノ酸、140アミノ酸、150アミノ酸、200アミノ酸、201アミノ酸、202アミノ酸、203アミノ酸、204アミノ酸、205アミノ酸、206アミノ酸、207アミノ酸、208アミノ酸、209アミノ酸、210アミノ酸、211アミノ酸、212アミノ酸、213アミノ酸、214アミノ酸、215アミノ酸、216アミノ酸、217アミノ酸、218アミノ酸、219アミノ酸、220アミノ酸、225アミノ酸、226アミノ酸、227アミノ酸、228アミノ酸、229アミノ酸、230アミノ酸、231アミノ酸、232アミノ酸、233アミノ酸、234アミノ酸、235アミノ酸、236アミノ酸、237アミノ酸、238アミノ酸、239アミノ酸、240アミノ酸、241アミノ酸、242アミノ酸、243アミノ酸、244アミノ酸、245アミノ酸、246アミノ酸、247アミノ酸、248アミノ酸、249アミノ酸、250アミノ酸、260アミノ酸、270アミノ酸、280アミノ酸、または290アミノ酸であるもののような、より長いスペーサーは、インビボまたはインビトロでの増加した増大という利点を有し得る。
【０１２９】
非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列のうちの一つを含み得る：
2019530440.tif 000015
【０１３０】
ヒンジ領域は、ヒトのIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。ヒンジ領域は、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比較して、1個または複数個のアミノ酸の置換および/または挿入および/または欠失を含み得る。例えば、ヒンジ領域が配列
2019530440.tif 000016
を含むよう、ヒトIgG1ヒンジのHis229がTyrに置換されてもよい。
【０１３１】
ヒンジ領域は、ヒトCD8に由来するアミノ酸配列を含むことができ；例えば、ヒンジ領域は、アミノ酸配列：
2019530440.tif 000017
またはそのバリアントを含み得る。
【０１３２】
e.膜貫通ドメイン
CARの膜貫通ドメインは、膜にかかる疎水性αヘリックスである。一般に、細胞内ドメインの最も膜に近い成分に由来する膜貫通ドメインが使用される。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。
【０１３３】
膜貫通ドメインは、ペプチドスペーサーと細胞内ドメインとの間に置かれる。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ペプチドスペーサーと共刺激領域との間に置かれる。いくつかの態様において、リンカーは、膜貫通ドメインと共刺激領域または細胞内ドメインとの間にある。
【０１３４】
真核生物（例えば、哺乳動物）細胞の細胞膜へのポリペプチドの挿入を提供する膜貫通ドメインが、使用するために適当である。一つの非限定的な例として、膜貫通配列
2019530440.tif 000018
を使用することができる。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD8β由来：
2019530440.tif 000019
；CD4由来：
2019530440.tif 000020
；CD3ζ由来：
2019530440.tif 000021
；CD28由来：
2019530440.tif 000022
；CD134（OX40）由来：
2019530440.tif 000023
；またはCD7由来：
2019530440.tif 000024
である。
【０１３５】
f.細胞内ドメイン
抗原認識の後、受容体がクラスタ形成し、シグナルが細胞内ドメインおよび/または共刺激ドメインを通して細胞に伝達される。いくつかの態様において、本明細書中に記載された共刺激ドメインは、細胞内ドメインの一部である。最も一般的に使用される細胞内ドメイン成分は、3個のITAMを含有しているCD3ζである。これは、抗原が結合した後、T細胞に活性化シグナルを伝達する。CD3ζは、完全に有能な活性化シグナルを提供しなくてもよく、付加的な共刺激シグナリングが必要とされる。例えば、キメラのCD28およびOX40が、増殖/生存シグナルを伝達するため、CD3ζと共に使用されてよく、3種全てが共に使用されてもよい。
【０１３６】
CARにおいて使用するために適当なさらなる細胞内ドメインには、抗原の抗原結合ドメインとの結合による活性化に応答して、明瞭な検出可能シグナル（例えば、細胞による1種または複数種のサイトカインの産生の増加；標的遺伝子の転写の変化；タンパク質の活性の変化；細胞挙動の変化、例えば、細胞死；細胞増殖；細胞分化；細胞生存；細胞シグナリング応答のモジュレーション；等）を提供する所望のシグナリングドメインが含まれる。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、本明細書中に記載される少なくとも1個（例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個等）のITAMモチーフを含む。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、DAP10/CD28型シグナリング鎖を含む。
【０１３７】
CARにおいて使用するために適当な細胞内ドメインには、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）含有細胞内シグナリングポリペプチドが含まれる。ITAMモチーフは、YX1X2(L/I)（X1およびX2は独立に任意のアミノ酸である）（SEQ ID NO:39）である。いくつかのケースにおいて、細胞内ドメインは、1個、2個、3個、4個、または5個のITAMモチーフを含む。いくつかのケースにおいて、ITAMモチーフは、細胞内ドメインにおいて2回繰り返され、第1および第2のITAMモチーフは、相互に6〜8アミノ酸分離されており、例えば、(YX1X2(L/I))(X3)n(YX1X2(L/I))（nは6〜8の整数であり、6〜8個のX3は各々任意のアミノ酸であり得る）（SEQ ID NO:40）である。
【０１３８】
適当な細胞内ドメインは、ITAMモチーフを含有しているポリペプチドに由来するITAMモチーフ含有部分であり得る。例えば、適当な細胞内ドメインは、ITAMモチーフ含有タンパク質由来のITAMモチーフ含有ドメインであり得る。従って、適当な細胞内ドメインは、それが由来するタンパク質全体の完全配列を含有している必要はない。適当なITAMモチーフ含有ポリペプチドの例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：DAP12；FCER1G（Fcε受容体Iγ鎖）；CD3D（CD3δ）；CD3E（CD3ε）；CD3G（CD3γ）；CD3Z（CD3ζ）；およびCD79A（抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖）。
【０１３９】
いくつかのケースにおいて、細胞内ドメインは、（TYROBP；TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；KARAP；PLOSL；DN AX活性化タンパク質12；KAR関連タンパク質；TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質等としても公知の）DAP12に由来する。例えば、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、
2019530440.tif 000025
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４０】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、全長DAP12アミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。従って、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、
2019530440.tif 000026
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４１】
いくつかの態様において、細胞内ドメインは、（FCRG；Fcε受容体Iγ鎖；Fc受容体γ鎖；fcεRIγ；fcRγ；fceRIγ；高親和性免疫グロブリンε受容体サブユニットγ；免疫グロブリンE受容体、高親和性、γ鎖；等としても公知の）FCER1Gに由来する。例えば、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、
2019530440.tif 000027
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４２】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、全長FCER1Gアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。従って、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、
2019530440.tif 000028
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４３】
いくつかの態様において、細胞内ドメインは、（CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原、δサブユニット；CD3δ；CD3d抗原、δポリペプチド（TiT3複合体）；OKT3、δ鎖；T細胞受容体T3δ鎖；T細胞表面糖タンパク質CD3δ鎖；等としても公知の）T細胞表面糖タンパク質CD3δ鎖に由来する。例えば、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（2種のアイソフォーム）のいずれかの約100アミノ酸〜約110アミノ酸（aa）、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、または約150aa〜約170aaの連続ストレッチとの少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019530440.tif 000029
【０１４４】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、全長CD3δアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。従って、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、
2019530440.tif 000030
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４５】
いくつかの態様において、細胞内ドメインは、（CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4ε鎖、T細胞表面糖タンパク質CD3ε鎖、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等としても公知の）T細胞表面糖タンパク質CD3ε鎖に由来する。例えば、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の約100アミノ酸〜約110アミノ酸（aa）、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、または約150aa〜約205aaの連続ストレッチとの少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019530440.tif 000031
【０１４６】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、全長CD3εアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。従って、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、
2019530440.tif 000032
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４７】
いくつかの態様において、細胞内ドメインは、（CD3G、T細胞受容体T3γ鎖、CD3-GAMMA、T3G、γポリペプチド（TiT3複合体）等としても公知の）T細胞表面糖タンパク質CD3γ鎖に由来する。例えば、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の約100アミノ酸〜約110アミノ酸（aa）、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、または約150aa〜約180aaの連続ストレッチとの少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019530440.tif 000033
【０１４８】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、全長CD3γアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。従って、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、
2019530440.tif 000034
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４９】
いくつかの態様において、細胞内ドメインは、（CD3Z、T細胞受容体T3ζ鎖、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等としても公知の）T細胞表面糖タンパク質CD3ζ鎖に由来する。例えば、適当な細胞内シグナリングドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（2種のアイソフォーム）のいずれかの約100アミノ酸〜約110アミノ酸（aa）、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、または約150aa〜約160aaの連続ストレッチとの少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019530440.tif 000035
【０１５０】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、全長CD3ζアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。従って、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列のいずれかとの少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019530440.tif 000036
【０１５１】
いくつかの態様において、細胞内ドメインは、（B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖；CD79a抗原（免疫グロブリン関連α）；MB-1膜糖タンパク質；igα；膜結合型免疫グロブリン関連タンパク質；表面IgM関連タンパク質；等としても公知の）CD79Aに由来する。例えば、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（2種のアイソフォーム）のいずれかの約100アミノ酸〜約110アミノ酸（aa）、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約150aa、約150aa〜約200aa、または約200aa〜約220aaの連続ストレッチとの少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019530440.tif 000037
【０１５２】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、全長CD79Aアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。従って、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019530440.tif 000038
【０１５３】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインは、DAP10/CD28型シグナリング鎖を含み得る。DAP10シグナリング鎖の例は、アミノ酸配列：
2019530440.tif 000039
である。いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインは、アミノ酸配列
2019530440.tif 000040
の全長との少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
CD28シグナリング鎖の例は、アミノ酸配列
2019530440.tif 000041
である。いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインは、アミノ酸配列
2019530440.tif 000042
の全長との少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
本開示のポリペプチドにおいて使用するために適当なさらなる細胞内ドメインには、ZAP70ポリペプチド、例えば、以下のアミノ酸配列の約300アミノ〜約400アミノ酸、約400アミノ酸〜約500アミノ酸、または約500アミノ酸〜619アミノ酸の連続ストレッチとの少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる：
2019530440.tif 000043
【０１５６】
g.検出ペプチド
CARは検出ペプチドを含んでいてよい。適当な検出ペプチドには、赤血球凝集素
2019530440.tif 000044
等が含まれる。他の適当な検出ペプチドは、当技術分野において公知である。
【０１５７】
h.ペプチドリンカー
いくつかの態様において、CARは、（時に、リンカーとも呼ばれる）ペプチドリンカーも含んでいてよい。ペプチドリンカーは、本明細書中に記載されたペプチドドメイン/領域のいずれかを分離するものであり得る。例として、リンカーは、シグナルペプチドと抗原結合ドメインとの間、抗原結合ドメインのVHとVLとの間、抗原結合ドメインとペプチドスペーサーとの間、ペプチドスペーサーと膜貫通ドメインとの間、共刺激領域の隣、または共刺激領域のN領域もしくはC領域、および/または膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間にあってよい。ペプチドリンカーは、多様なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。ドメインおよび領域は、一般に、可動性を有するペプチドリンカーによって接合され得るが、他の化学結合も排除されない。リンカーは、約6〜約40アミノ酸長または約6〜約25アミノ酸長のペプチドであり得る。これらのリンカーは、タンパク質をカップリングするためのリンカーをコードする合成オリゴヌクレオチドを使用することによって作製され得る。
【０１５８】
ある程度の可動性を有するペプチドリンカーが使用され得る。適当なペプチドリンカーは、一般に、可動性のペプチドをもたらす配列を有することに留意しながら、ペプチドリンカーは、事実上任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシンおよびアラニンのような小さいアミノ酸の使用は、可動性ペプチドの作出において有用である。そのような配列の作出は、当業者にルーチンである。
【０１５９】
適当なリンカーは、容易に選択され得、1アミノ酸（例えば、Gly）〜20アミノ酸、2アミノ酸〜15アミノ酸、3アミノ酸〜12アミノ酸、例えば、4アミノ酸〜10アミノ酸、5アミノ酸〜9アミノ酸、6アミノ酸〜8アミノ酸、または7アミノ酸〜8アミノ酸のような、任意の適切な異なる長さを有していてよく、1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、または7アミノ酸であり得る。
【０１６０】
例示的な可動性リンカーには、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー、例えば、(GS)n、(GSGGS)n（SEQ ID NO:71）、および(GGGS)n（SEQ ID NO:72）（nは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、ならびに当技術分野において公知のその他の可動性リンカーが含まれる。グリシンポリマーおよびグリシン-セリンポリマーが使用され得；GlyおよびSerは、いずれも、比較的非構造的であり、従って、成分間の中性のつなぎ鎖として機能し得る。グリシンポリマーが使用され得；グリシンは、アラニンより有意に多くファイサイ空間に接近し、より長い側鎖を有する残基よりはるかに制約が少ない。例示的なスペーサーには、
2019530440.tif 000045
等を含むが、これらに限定されるわけではないアミノ酸配列が含まれ得る。
【０１６１】
i.共刺激領域
CARにおける適当な共刺激領域の非限定的な例には、4-1BB（CD137）、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR、およびHVEMに由来するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１６２】
共刺激領域は、少なくとも、多くとも、または正確に20アミノ酸、25アミノ酸、30アミノ酸、35アミノ酸、40アミノ酸、50アミノ酸、60アミノ酸、70アミノ酸、80アミノ酸、90アミノ酸、100アミノ酸、150アミノ酸、200アミノ酸、もしくは300アミノ酸、またはそれらから派生する任意の範囲の長さを有し得る。いくつかの態様において、共刺激領域は、（TNFRSF9；CD137；4-1BB；CDw137；ILA；等としても公知の）膜貫通タンパク質4-1BBの細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000046
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１６３】
いくつかの態様において、共刺激領域は、（Tp44としても公知の）膜貫通タンパク質CD28の細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000047
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１６４】
いくつかの態様において、共刺激領域は、（AILIM、CD278、およびCVID1としても公知の）膜貫通タンパク質ICOSの細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000048
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１６５】
いくつかの態様において、共刺激領域は、（TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX40、TXGP1Lとしても公知の）膜貫通タンパク質OX-40の細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000049
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１６６】
いくつかの態様において、共刺激領域は、（BTLA1およびCD272としても公知の）膜貫通タンパク質BTLAの細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000050
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１６７】
いくつかの態様において、共刺激領域は、（S152、T14、TNFRSF7、およびTp55としても公知の）膜貫通タンパク質CD27の細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000051
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１６８】
いくつかの態様において、共刺激領域は、（TNFRSF8、D1S166E、およびKi-1としても公知の）膜貫通タンパク質CD30の細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000052
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１６９】
いくつかの態様において、共刺激領域は、（TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357、およびGITR-Dとしても公知の）膜貫通タンパク質GITRの細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000053
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１７０】
いくつかの態様において、共刺激領域は、（TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR、およびTR2としても公知の）膜貫通タンパク質HVEMの細胞内部分に由来する。例えば、適当な共刺激領域は、
2019530440.tif 000054
との少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１７１】
V.方法
本開示の局面は、状態を処置する方法、免疫応答を刺激する方法、免疫応答を調節する方法、免疫応答を抑制する方法、およびサイトカイン放出症候群のような有害な免疫応答のリスクを低下させるための方法に関する。これらの措置は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで行われ得る。いくつかの態様において、方法は、癌細胞の存在下で免疫応答を刺激することができる細胞に関する。方法は、一般に、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターもしくはRNA（例えば、インビトロで転写されたRNA）によって哺乳動物細胞を遺伝学的に修飾するか、またはポリペプチドを直接細胞に移入することを含む。細胞は、免疫細胞（例えば、Tリンパ球またはNK細胞）、幹細胞、前駆細胞細胞等であり得る。いくつかの態様において、細胞は、本明細書中に記載された細胞である。
【０１７２】
いくつかの態様において、遺伝学的修飾は、エクスビボで実施される。例えば、Tリンパ球、幹細胞、またはNK細胞（または本明細書中に記載された細胞）が、個体から得られ；個体から得られた細胞が、本開示のポリペプチドを発現するよう遺伝学的に修飾される。いくつかのケースにおいて、遺伝学的に修飾された細胞は、エクスビボで活性化される（即ち、エクスビボで標的抗原が細胞と接触させられる）。他のケースにおいて、遺伝学的に修飾された細胞が個体（例えば、その細胞が得られた個体）へ導入され；遺伝学的に修飾された細胞が、インビボで（即ち、内在的に産生された標的抗原によって）活性化される。
【０１７３】
いくつかの態様において、方法は、二重特異性T細胞誘導剤（bi-specific T cell engager）（BITE）のような付加的な治療剤の投与をさらに含む。そのような治療剤は、ペプチドの形態で患者へ投与されてもよいし、またはIL-6Rα結合タンパク質を含む細胞のような本開示の細胞において発現されてもよい。BITEは、当技術分野において公知のかつ/または本明細書中に記載された癌抗原/癌分子に対する抗原特異性を有していてよく、CD3のようなT細胞分子に対する抗原特異性を有していてもよい。
【０１７４】
いくつかの態様において、方法は、癌の処置のための、または癌を有する者への投与のための、本明細書中に記載された細胞またはペプチドの投与に関する。いくつかの態様において、癌は、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、子供もしくは成人における脳/CNS腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭下咽頭癌、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔の癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔もしくは中咽頭の癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、肉腫、基底細胞癌、皮膚有棘細胞癌、黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、またはウィルムス腫瘍である。
【０１７５】
態様は、多数の免疫によって媒介される疾患、炎症性疾患、または自己免疫炎症性疾患、例えば、アレルギー、喘息、糖尿病（例えば、1型糖尿病）、移植片拒絶等を処置するかまたは寛解させるために使用され得る。そのような疾患または障害の例には、関節炎（急性関節炎、慢性関節リウマチのような関節リウマチ、痛風または痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎（degenerative arthritis）、II型コラーゲン関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スチル病、脊椎関節炎、および全身型若年性関節リウマチ、骨関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎（arthritis deformans）、慢性一次性多発性関節炎、反応性関節炎、および強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿胞性乾癬、および爪の乾癬のような乾癬、花粉症およびヨブ症候群のようなアトピー性疾患を含むアトピー、接触性皮膚炎、慢性接触性皮膚炎、剥離性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状湿疹、脂漏性皮膚炎、非特異性皮膚炎、一次刺激性接触性皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、X連鎖高IgM症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹のような蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、（全身性硬皮症を含む）硬皮症、全身性硬化症のような硬化症、視神経脊髄型MS、一次性進行型MS（PPMS）、および再発寛解型MS（RRMS）のような多発性硬化症（MS）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、びまん性硬化症、失調性硬化症、視神経脊髄炎（NMO）、炎症性腸疾患（IBD）（例えば、クローン病、自己免疫性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis）、潰瘍性大腸炎(colitis ulcerosa）、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン大腸炎、ポリープ様大腸炎、壊死性腸炎、および貫壁性大腸炎のような大腸炎、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患）、腸炎症、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人型呼吸促迫症候群または急性呼吸促迫症候群（ARDS）を含む呼吸促迫症候群、髄膜炎、ブドウ膜の全部または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ性脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎等における脳神経傷害、妊娠性疱疹、妊娠性類天疱瘡、陰嚢そう痒症、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫状態による突発性難聴、アナフィラキシーならびにアレルギー性鼻炎およびアトピー性鼻炎のようなIgEによって媒介される疾患、ラスムッセン脳炎ならびに辺縁系脳炎および/または脳幹脳炎のような脳炎、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎のようなブドウ膜炎、一次性GN、免疫性GN、膜性GN（膜性腎症）、特発性膜性GNまたは特発性膜性腎症、I型およびII型を含む膜性増殖性GN（MPGN）、ならびに急速進行性GNのような慢性または急性の糸球体腎炎のようなネフローゼ症候群を伴う糸球体腎炎（GN）およびネフローゼ症候群を伴わないGN、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌機能不全、形質細胞亀頭炎を含む亀頭炎、亀頭包���炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、限局性神経皮膚炎、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、前悪性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー性の状態および応答、アレルギー反応、アレルギー性湿疹またはアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、異汗性湿疹、および水疱性掌蹠湿疹を含む湿疹、気管支喘息（asthma bronchiale）、気管支喘息（bronchial asthma）、および自己免疫性喘息のような喘息、T細胞の浸潤および慢性炎症性応答を含む状態、妊娠中の胎児A-B-O血液型のような外来抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球粘着不全症、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループスおよび円板状エリテマトーデス、脱毛ループス（alopecia lupus）、皮膚SLEまたは亜急性皮膚SLEのような全身性エリテマトーデス（SLE）、新生児ループス症候群（NLE）、ならびに播種性エリテマトーデスを含むループス、小児インスリン依存性糖尿病（IDDM）を含む若年発症型（I型）糖尿病、ならびに成人発症型糖尿病（II型糖尿病）、ならびに自己免疫性糖尿病も含まれるが、これらに限定されるわけではない。サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性過敏症および遅延型過敏症に関連した免疫応答、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎、（リウマチ性多発筋痛および巨細胞性（高安）動脈炎を含む）大型血管炎、（川崎病および結節性多発動脈炎/結節性動脈周囲炎を含む）中型血管炎、顕微鏡的多発動脈炎、免疫血管炎（immunovasculitis）、CNS血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎のような壊死性血管炎、およびチャーグ・シュトラウス血管炎または症候群（CSS）およびANCA関連小型血管炎のようなANCA関連血管炎、側頭動脈炎を含む血管炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームズ陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、溶血性貧血、または自己免疫性溶血性貧血（AIHA）を含む免疫性溶血性貧血、アジソン病、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外漏出を含む疾患、CNS炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、敗血症、外傷、または出血による二次性の多臓器損傷症候群を含む多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体によって媒介される疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病/症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡および皮膚類天疱瘡のような類天疱瘡、（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜類天疱瘡（pemphigus mucus-membrane pemphigoid）、および紅斑性天疱瘡を含む）天疱瘡、自己免疫性多腺性内分泌障害、ライター病または症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体腎炎のような免疫複合体障害、抗体によって媒介される腎炎、多発ニューロパチー、IgM多発ニューロパチーまたはIgMによって媒介されるニューロパチーのような慢性ニューロパチー、慢性または急性のITPを含む特発性血小板減少性紫斑病（ITP）のような自己免疫または免疫によって媒介される血小板減少症、特発性角���強膜炎、後部強膜炎のような強膜炎、自己免疫性の精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎のような甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、多腺性自己免疫症候群（または多腺性内分泌障害症候群）のような多腺性症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群またはイートン・ランバート症候群のような腫瘍随伴神経症候群を含む腫瘍随伴症候群、スティフ・マン症候群または全身硬直症候群、アレルギー性脳脊髄炎（allergic encephalomyelitis）またはアレルギー性脳脊髄炎（encephalomyelitis allergica）および実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、実験的自己免疫性脳脊髄炎のような脳脊髄炎、胸腺腫関連重症筋無力症のような重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌス、または眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群（OMS）、および感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎、または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球様間質性肺炎（LIP）、閉塞性細気管支炎（非移植）対NSIP、ギラン・バレー症候群、ベルジェ病（IgA腎症）、特発性IgA腎症、線状IgA皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変および肺硬変のような硬変、自己免疫性腸症症候群、セリアック病、セリアックスプルー（グルテン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ALS；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（AIED）のような自己免疫性耳疾患、自己免疫性難聴、難治性または再発型または再発性の多発性軟骨炎のような多発性軟骨炎、肺胞蛋白症、コーガン症候群/非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スイート病/症候群、酒さ自己免疫、帯状疱疹関連疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、単クローン性B細胞リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症および意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、MGUS）を含む一次性リンパ球増加症、末梢ニューロパチー、腫瘍随伴症候群、てんかん、片頭痛、不整脈、筋肉障害、聴覚障害、失明、周期性麻痺、およびCNSのチャネル病のようなチャネル病、自閉症、炎症性ミオパチー、巣状または分節性または巣状分節性の糸球体硬化症（FSGS）、内分泌眼症、網膜ぶどう膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓障害、線維筋痛症、多発性内分泌機能不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期認知症、自己免疫性脱髄疾患および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーのような脱髄疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症、前頭脱毛症、クレスト症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道蠕動低下、強指症、および毛細血管拡張症）、男性および女性の自己免疫性不妊症、例えば、抗精子抗体による自己免疫性不妊症、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、鳥飼病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、���レルギー性肺胞炎および線維性肺胞炎のような肺胞炎、間質肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、皮膚リーシュマニア症、トリパノソーマ症、住血吸虫症、回虫症のような寄生虫症、アスペルギルス症、サムター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質肺線維症、間質肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性もしくは慢性）、またはフックス毛様体炎のような毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染、SCID、後天性免疫不全症候群（エイズ）、エコーウイルス感染、敗血症、内毒血症、膵炎、甲状腺中毒症、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、予防接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタイン・バーウイルス感染、耳下腺炎、エバンス症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓血管炎、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞性多発性筋痛、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型ネフローゼ、良性家族性および虚血再灌流損傷、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道/肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、精子形成不全症（asperniogenese）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性内眼球炎、アレルギー性腸炎、癩性結節性紅斑、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ熱、ハンマン・リッチ病、感音難聴、発作性ヘモグロビン尿症、性腺機能低下症、限局性回腸炎、白血球減少症、伝染性単核細胞症、横断性脊髄炎、一次性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルヴァン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑、トキシックショック症候群、食中毒、T細胞の浸潤を含む状態、白血球粘着不全症、サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性過敏症および遅延型過敏症に関連した免疫応答、白血球血管外遊出を含む
疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体によって媒介される疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、卵巣炎、一次性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多腺性内分泌不全、自己免疫性多腺性症候群I型、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（AOIH）、拡張型心筋症のような心筋症、後天性表皮水疱症（EBA）、血色素沈着症、心筋炎、ネフローゼ症候群、一次性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性の副鼻腔炎、急性または慢性の副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎、または蝶形骨洞炎、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増多筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増加症、気管支肺炎性アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含有している肉芽腫のような好酸球関連障害、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブルトン症候群、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病に関連した自己免疫障害、リウマチ、神経疾患、リンパ節炎、血圧応答の低下、血管機能障害、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏症、腎臓虚血、脳虚血、および血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏障害、糸球体腎炎、再灌流損傷、虚血性再灌流障害、心筋またはその他の組織の再灌流損傷、リンパ腫性気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を伴う皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎またはその他の中枢神経系炎症性障害、眼および眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカインによって誘導された毒性、ナルコレプシー、急性重篤炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、移植片対宿主病、接触過敏症、喘息性気道過敏、および子宮内膜症も意図される。
【０１７６】
いくつかの態様において、患者は、特定の前記適応症を有しない者である。例えば、いくつかの態様において、患者は、関節リウマチを有しておらず、かつ/または関節リウマチを有すると診断されていない。いくつかの態様において、患者は、慢性自己免疫状態を有していない。慢性という用語は、長期間持続するかまたは絶えず再発する疾病をさす。
【０１７７】
VI.薬学的組成物
本開示は、それを必要とする対象において免疫応答をモジュレートする方法を含む。本開示は、免疫応答を誘導するかまたは修飾するために使用され得る薬学的組成物の形態をとっていてよい細胞およびタンパク質を含む。
【０１７８】
本開示による組成物の投与は、典型的には、任意の一般的な経路を介してなされるであろう。これには、非経口、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、または静脈内への注射が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１７９】
典型的には、本発明の組成物は、投薬製剤と適合性の様式で、治療的に有効な、免疫を修飾するような量で投与される。投与される量は、処置される対象に依る。投与されることが必要とされる活性成分の正確な量は、実務者の判断に依る。
【０１８０】
適用の様式は、広く変動し得る。細胞成分を含む薬学的組成物の投与のための従来の方法のいずれかが、適用可能である。薬学的組成物の投薬量は、投与ルートに依り、対象のサイズおよび健康によって変動するであろう。
【０１８１】
多くの場合において、多くとも約または少なくとも約3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、またはそれ以上の複数回投与を行うことが望ましいであろう。投与は、2日〜12週間隔、より一般的には、1〜2週間隔の範囲であり得る。投与の課程の後、アロ反応性免疫応答およびT細胞活性についてのアッセイを行うことができる。
【０１８２】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトへ投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、またはその他の不都合な反応を生じない分子エンティティおよび組成物をさす。本明細書中で使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、全ての任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的活性を有する物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が、活性成分と非適合性でない限り、免疫原性組成物および治療用組成物において使用されることが意図される。本開示の薬学的組成物は、薬学的に許容される組成物である。
【０１８３】
本開示の組成物は、非経口投与のために製剤化され得、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはさらには腹腔内経路を介した注射のために製剤化され得る。典型的には、そのような組成物は、注射可能物として、液状の溶液または懸濁液のいずれかとして調製され得；注射前に液体の添加によって溶液または懸濁物を調製するために使用するために適当な固体の形態が調製されてもよく；それらの調製物は乳化されていてもよい。
【０１８４】
注射可能な使用のために適当な薬学的形態には、無菌の水性の溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤が含まれる。それらはまた、製造および保管の条件の下で安定しているべきであり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。
【０１８５】
無菌の注射可能溶液は、必要に応じて、前掲の様々な他の成分と共に、必要とされる量の活性成分（即ち、本開示の細胞）を適切な溶媒に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基本の分散媒および前掲のものからの必要とされる他の成分を含有している無菌媒体へ、様々な滅菌された活性成分を組み入れることによって調製される。
【０１８６】
組成物の有効量は、意図された目標に基づき決定される。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象において使用するために適当な物理的に不連続の単位をさし、各単位は、その投与、即ち、適切な経路および計画に関連して、本明細書中に記述された所望の応答を生じるよう計算された、予定された量の組成物を含有している。処置の回数および単位用量の両方に依る、投与される量は、所望の結果および/または保護に依る。組成物の正確な量は、実務者の判断にも依り、各個体に特有である。用量に影響する因子には、対象の身体的および臨床的な状態、投与経路、処置の意図された目標（症状の軽減であるか治癒であるか）、ならびに特定の組成物の効力、安定性、および毒性が含まれる。製剤化によって、溶液は、投薬製剤と適合性の様式で、治療的にまたは予防的に有効であるような量で投与されるであろう。製剤は、前記の型の注射可能溶液のような多様な剤形で容易に投与される。
【実施例】
【０１８７】
VII.実施例
以下の実施例は、本発明の態様を証明するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、本発明の実施のための好ましいモードを構成すると見なされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、本開示を考慮すれば、開示される具体的な態様に多くの変化を施しても、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似した結果を得ることが可能であることを、当業者は認識するべきである。
【０１８８】
実施例1
抗IL-6Rα scFv構築物はIL-6シグナリングを阻害する
本開示は、IL-6Rαに結合する単鎖可変断片（scFv）を記載する。この実施例において、2種の異なる抗IL-6Rα scFv構築物：VHVL構築物（SEQ ID NO:2）およびVLVH構築物（SEQ ID NO:1）が使用される。これらの構築物は、VHおよびVLの配列の位置が切り替わっている点でのみ異なる。
【０１８９】
IL-6は、炎症誘発効果を有するサイトカインである。IL-6は、IL-6の細胞表面受容体のリガンド結合成分であるIL-6Rαを通してシグナル伝達する。IL-6Rαを通したIL-6シグナリングは、炎症誘発性サイトカインシグナリング過程において、例えば、サイトカイン放出症候群において役割を果たす。IL-6は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、うつ病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、前立腺癌、ベーチェット病、および関節リウマチを含む多くの疾患において、炎症過程および自己免疫過程も刺激する。
【０１９０】
両方の抗IL-6Rα scFvが、HepG2細胞におけるIL-6シグナリングの阻害において有効である。HepG2ヒト肝細胞癌細胞を12穴プレートに播種し、1μg、2μg、または5μgのscFvと共に3時間インキュベートした。その後、図1に示されるように、ウェルのいくつかを、4ng/mlのIL-6によって処理し、さらに30分間インキュベートした後に細胞を採集した。IL-6シグナリング経路における主要なシグナリング分子であるリン酸化STAT3（pSTAT3）の存在を、ウエスタンブロットによって探索した。VL-VH方向（SEQ ID NO:1）またはVH-VL方向（SEQ ID NO:2）のいずれかを有するscFvは、より高濃度のscFvがIL-6に応答してより低いpSTAT3発現レベルをもたらしたため、用量依存的に、IL-6シグナリングを阻害し得ることを、図1の結果は示している。その後の実験は、VL-VH scFv（SEQ ID NO:1）を使用して実施された。
【０１９１】
抗IL-6Rα scFvが初代ヒトT細胞においてIL-6シグナリングを阻害するか否かを決定するため、初代ヒトCD4+T細胞および初代CD8+T細胞を12穴プレートに播種し、図1のHepG2細胞について記載されたように処理した。VL-VH scFv（SEQ ID NO:1）を、示されたウェルにおいてはIL-6と共に、図2に示された濃度でウェルに添加した。pSTAT3の存在を、ウエスタンブロットによって再度探索した。図2の結果は、抗IL-6Rα scFvが、CD4+初代ヒトT細胞およびCD8+初代ヒトT細胞の両方において、用量依存的にIL-6シグナリングを阻害することを示している。
【０１９２】
これらの結果は、有効量の抗IL-6Rα scFvの対象への投与が、IL-6シグナリングが関与するCRSのような炎症状態ならびに自己免疫疾患およびその他の疾患を処置するであろうことを示す。
【０１９３】
実施例2
T細胞による抗IL-6Rα scFv構築物の発現
抗CD19キメラ抗原受容体（CAR）および抗IL-6Rα scFvを発現する初代ヒトCD4+細胞および初代ヒトCD8+細胞の調製：ヒト初代T細胞を単離し、単離の日に、CD3/CD28ダイナビーズ（dynabeads）によって刺激した。単離の2日後に、抗CD19 CAR（SEQ ID NO:88）をコードするレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、およびSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2をコードするIL-6Rα scFv構築物（または対照のためのIL-6Rα scFvなし）によって、T細胞を形質導入した。単離後9日目にダイナビーズを除去した。細胞を、抗CD19 CAR上のHAタグに基づく磁気細胞分離によって選別した。CD4 T細胞の21日目およびCD8 T細胞の14日目に、T25フラスコにおいて、25mlの完全RPMI培地において、0.5×106個のT細胞を3.5×106個の照射されたTM-LCL、50U/ml rhIL-2、および1ng/ml rhIL-15と混合するRapid Expansion Protocolによって、初代T細胞を増大させた。サイトカインは2日毎に補充される。細胞は、REPの9日目の後に実験のために使用される。
【０１９４】
本発明者らは、T細胞における抗IL-6Rα scFvの発現の効果を試験した。抗IL-6Rα scFvを構成的に発現するかまたは発現しない、抗CD19キメラ抗原受容体（CAR）を発現する初代ヒトCD4+T細胞を、CD4+T細胞と同一のドナーに由来する末梢血単核細胞（PBMC）＋野生型（CD19+）Rajiリンパ腫細胞と共に、1:1:1比で、12時間コインキュベートした。非scFv発現CD19 CAR-T細胞を、90μg/mlのモノクローナル抗体トシリズマブと共に、対照試料として含めた。図3に示されるような培養培地中のサイトカインのレベルを、サイトメトリックビーズアッセイ（cytometric bead-based assay）によって定量化した。図3に示される値は、3回の技術的反復の平均値であり、エラーバーは、±1標準偏差を示す。統計的有意性を、両側等分散スチューデントt検定によって評価した；＊p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊＊p＜0.001。示された結果は、2人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した2回の独立した実験の代表的なものである。図3の結果は、抗IL-6Rα scFvの初代ヒトT細胞による構成性発現が、T細胞による炎症性サイトカインの産生を有意に低下させることを示す。これは、抗IL-6Rα scFvを発現するT細胞を使用することによって、養子T細胞治療におけるCRSの発生率を低下させ得ることを示している。
【０１９５】
本発明者らは、次に、T細胞による抗IL-6Rα scFvの発現が、それらの増殖または細胞傷害を阻害するか否かを試験した。抗IL-6Rα scFvと共にまたはそれなしで、抗CD19 CARを構成的に発現する初代ヒトCD4+T細胞および初代ヒトCD8+T細胞を、野生型（WT；CD19+）またはCD19-変異体Rajiリンパ腫細胞と共に、2:1のエフェクター標的（E:T）比で、コインキュベートした。生存しているT細胞およびRaji細胞の数を、2日毎にフローサイトメトリーによって得た。両方のRaji細胞株が、フローサイトメトリー分析におけるT細胞からの分離を可能にするため、EGFPを安定的に発現する。8日目の細胞計数の後に、WT Rajiと共にコインキュベートされたCD4+T細胞を採集し、2:1のE:T比で、新鮮なWT Raji細胞によって再チャレンジした。2回目のチャレンジ中、さらに12日間、生存細胞数をモニタリングした。図4および6に示された値は、3回の技術的反復の平均値であり、エラーバーは、±1標準偏差を示す。図4に示される結果は、2人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した4回の独立した実験の代表的なものであり、図6の結果は、2人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した3回の独立した実験の代表的なものである。図4および6の結果は、T細胞による抗IL-6Rα scFvの構成性発現が、T細胞の増殖または細胞傷害を阻害しないことを証明しており、このことは、抗IL-6Rα scFvを発現するT細胞を使用することによって、養子T細胞治療の効力が減弱されないであろうことを示している。
【０１９６】
抗IL-6Rα scFvの発現が、抗原刺激時のT細胞亜型分化を変更するか否かを試験するため、前パラグラフに記載された実験のT細胞を、T細胞亜型を決定するため、CCR7、CD45RA、およびCD57に対する抗体によって表面染色した。亜型TE/EM：CCR7-/CD45RA-/CD57-；亜型TE/Exh：CCR7-/CD45RA-/CD57+；亜型TEMRA：CCR7-/CD45RA+；亜型Tcm：CCR7+/CD45RA-；亜型Tナイーブ：CCR7+/CD45RA+。図5および7に示される値は、3回の技術的反復の平均値であり、エラーバーは、±1標準偏差を示す。図5に示される結果は、2人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した4回の独立した実験の代表的なものであり、図7の結果は、3人の異なる健常血液ドナーに由来する細胞を使用した4回の独立した実験の代表的なものである。図5および7から分かるように、いずれの試料にも、TEMRA細胞またはTナイーブ細胞はほとんど存在しなかった。図5〜7の結果は、抗IL-6Rα scFvの構成性発現が、抗原刺激時のT細胞亜型分化を変更しないことを示し、このことから、抗IL-6Rα scFvを発現するT細胞を使用することによって、養子T細胞治療の効力が減弱されないであろうことがさらに確認された。
【０１９７】
T細胞消耗は、不十分なエフェクター機能、阻害性受容体の発現、および異なる転写状態を特徴とするT細胞機能障害の状態である。消耗は、養子T細胞治療において使用されるT細胞の効力を限定し得る。消耗のマーカーには、PD-1、TIM-3、およびLAG-3が含まれる。抗IL-6Rα scFvの発現がT細胞消耗に影響するか否かを決定するため、抗IL-6Rα scFvと共にまたはそれなしで抗CD19 CARを構成的に発現する初代ヒトT細胞を、WT Raji細胞と共に、2:1のE:T比で、コインキュベートした。PD-1、TIM-3、およびLAG-3の発現レベルを、2日毎に表面抗体染色およびフローサイトメトリーによって定量化した。全部で7回の独立した実験のため、3回の試験をCD8+T細胞で実施し、4回の試験をCD4+T細胞で実施した。各試験は、1条件当たり3回の技術的反復を含んでいた。図8のプロットの各データ点は、1回の試験からの3回反復の平均値を表す。各時点についての7回の試験の平均値が、図8において黒色の水平バーによって示される。図8の結果は、抗IL-6Rα scFvの構成性発現が、抗原刺激時の初代ヒトT細胞における消耗マーカー発現を変更しないことを示し、このことから、抗IL-6Rα scFvの発現が、養子T細胞治療の効力を減弱しないであろうことがさらに確認された。
【０１９８】
本明細書中に開示され特許請求の範囲に記載された方法は、全て、本開示を考慮すれば、過度の実験なしに作成され実施され得る。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して記載したが、本発明の概念、本旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載された方法、工程、または方法の工程の順序に変動が適用され得ることは、当業者に明白であろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連しているある種の剤に、本明細書中に記載された剤が置換されても、同一または類似の結果が達成され得ることが明白であろう。当業者に明白なそのような類似した置換および修飾は、全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の本旨、範囲、および概念に含まれると見なされる。参照、引用文献、特許刊行物、および記載されたGenBankアクセッション番号に関連した配列は、全て、参照によって事実上その全体が具体的に本明細書中に組み入れられる。
【０１９９】
参照
以下の参照は、本明細書中に示されたものを補足する例示的な手法またはその他の詳細を提供するという程度まで、参照によって具体的に本明細書中に組み入れられる。
2019530440.tif 000055
2019530440.tif 000056
2019530440.tif 000057
【図１】
2019530440.tif 000063
【図２】
2019530440.tif 000064
【図３】
2019530440.tif 000065
【図４】
2019530440.tif 000066
【図５】
2019530440.tif 000067
【図６】
2019530440.tif 000068
【図７】
2019530440.tif 000069
【図８】
2019530440.tif 000070
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月10日(2019.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
[本発明1001]
CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む、キメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質。
[本発明1002]
scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'、またはF(ab)2である、キメラIL-6Rα結合タンパク質。
[本発明1003]
1個のポリペプチドである、本発明1001のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
[本発明1004]
1個のポリペプチドが単鎖可変断片（scFv）である、本発明1003のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
[本発明1005]
重鎖可変領域が軽鎖可変領域のN末端側にある、本発明1001のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
[本発明1006]
軽鎖可変領域が重鎖可変領域のN末端側にある、本発明1001のキメラIL-6Rα結合タンパク質。
[本発明1007]
リンカーが、アミノ酸配列
2019530440.tif 000071
を含む、本発明1001〜1006のいずれかのキメラIL-6Rα結合タンパク質。
[本発明1008]
リーダーペプチドをさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかのキメラIL-6Rα結合タンパク質。
[本発明1009]
単離タグをさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかのキメラIL-6Rα結合タンパク質。
[本発明1010]
リーダーペプチド、
CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域
を含む、キメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質であって、
該異種リンカーが、アミノ酸配列
2019530440.tif 000072
を含み、該IL-6Rα結合タンパク質が単鎖抗体断片（scFv）である、前記キメラインターロイキン6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質。
[本発明1011]
本発明1001〜1010のいずれかのキメラIL-6Rα結合タンパク質を発現する、T細胞。
[本発明1012]
本発明1001〜1010のいずれかのキメラIL-6Rα結合タンパク質をコードする、核酸分子。
[本発明1013]
キメラIL-6R結合タンパク質の発現を制御するプロモーターをさらに含む、本発明1012の核酸分子。
[本発明1014]
プロモーターが構成性である、本発明1013の核酸分子。
[本発明1015]
プロモーターが、少なくとも1種のサイトカインまたはT細胞活性化に陽性に応答する、本発明1013の核酸分子。
[本発明1016]
少なくとも1種のサイトカインが、IL-6、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-8、もしくはIL-10であるか、またはプロモーターが、NFAT-1もしくはNFκBに陽性に応答する、本発明1015の核酸分子。
[本発明1017]
本発明1012〜1016のいずれかの核酸分子を含む、発現構築物。
[本発明1018]
ウイルスベクターである、本発明1014の発現構築物。
[本発明1019]
プラスミドである、本発明1014の発現構築物。
[本発明1020]
本発明1017〜1019のいずれかの核酸発現構築物を含む、組換えT細胞。
[本発明1021]
リーダーペプチド、
CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域
を含むIL-6受容体α単鎖可変断片をコードする異種発現構築物を含む、T細胞であって、
該異種リンカーが、アミノ酸配列
2019530440.tif 000073
を含む、前記T細胞。
[本発明1022]
発現構築物が、サイトカイン応答性プロモーターまたはT細胞が活性化された場合に発現を増加させるプロモーターを含む、本発明1021のT細胞。
[本発明1023]
プロモーターが、NFAT-1、NFκB、IL-6、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-8、およびIL-10のうちの1種または複数種に陽性に応答する、本発明1022のT細胞。
[本発明1024]
単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、サイトカイン放出症候群のリスクを有する患者へ投与する工程
を含む、サイトカイン放出症候群のリスクを低下させるための方法。
[本発明1025]
患者が癌を有する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
患者が、養子T細胞治療を受容しているかまたは受容する予定である、本発明1024または1025の方法。
[本発明1027]
患者が、リンパ球枯渇を受容しているかまたは受容する予定である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
患者が自己免疫疾患を有する、本発明1024の方法。
[本発明1029]
単離されたIL-6Rα結合タンパク質が、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含む、本発明1024〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
IL-6Rα結合タンパク質が、scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'、またはF(ab)2である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
重鎖可変領域が軽鎖可変領域のN末端側にある、本発明1024〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
軽鎖可変領域が重鎖可変領域のN末端側にある、本発明1024〜1030のいずれかの方法。
[本発明1033]
単離されたIL-6Rα結合タンパク質が、アミノ酸配列
2019530440.tif 000074
を含むリンカーを含む、本発明1024〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
単離されたキメラIL-6Rα結合タンパク質が、リーダーペプチドを含む、本発明1024〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
単離されたキメラIL-6Rα結合タンパク質が、単離タグを含む、本発明1024〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
患者が、IL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含むT細胞を投与される、本発明1024〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
T細胞が自己由来である、本発明1036の方法。
[本発明1038]
異種核酸分子が、CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域を含むキメラIL-6Rα結合ポリペプチドをコードする、本発明1024〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
核酸分子が、キメラIL-6R結合タンパク質の発現を制御するプロモーターを含む、本発明1024〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
プロモーターが構成性である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
プロモーターが、少なくとも1種のサイトカインまたはT細胞活性化に陽性に応答する、本発明1039の方法。
[本発明1042]
プロモーターが、NFAT-1、NFκB、IL-6、TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-8、またはIL-10に応答性である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
核酸分子が発現構築物である、本発明1024〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
発現構築物がウイルスベクターである、本発明1043の方法。
[本発明1045]
発現構築物がプラスミドである、本発明1043の方法。
[本発明1046]
抗ヒスタミン剤、副腎皮質ステロイド、ステロイド、アセトアミノフェン、フロセミド、および/または静脈内輸液を、患者へ投与する工程をさらに含む、本発明1024〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
患者が、サイトカイン放出症候群の一つまたは複数の症状を有する、本発明1024〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、患者へ投与する工程
を含む、癌患者における養子細胞治療の毒性を低下させるための方法。
[本発明1049]
単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、患者へ投与する工程
を含む、患者における自己免疫疾患を処置するための方法。
[本発明1050]
単離されたIL-6受容体α（IL-6Rα）結合タンパク質を含む組成物またはIL-6Rα結合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む細胞を、患者へ投与する工程
を含む、癌患者を処置するための方法であって、該患者が免疫治療によって処置されたことがあるかまたは処置される予定である、前記方法。
[本発明1051]
免疫治療が養子細胞治療である、本発明1050の方法。
[本発明1052]
患者がサイトカイン放出症候群の症状を有する、本発明1050の方法。
[本発明1053]
CDR4（SEQ ID NO:8）とCDR5（SEQ ID NO:9）とCDR6（SEQ ID NO:10）を含む軽鎖可変領域に異種リンカーによって付着させたCDR1（SEQ ID NO:5）とCDR2（SEQ ID NO:6）とCDR3（SEQ ID NO:7）を含む重鎖可変領域
を含む単離されたIL-6Rα結合タンパク質を含む単鎖可変断片を含む、有効量の組成物を、自己免疫疾患もしくは自己免疫状態を有する患者または免疫治療によって処置される患者へ投与する工程
を含む、1種または複数種のサイトカインの毒性を低下させるための方法。
本願の全体において、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために利用されるデバイス、方法に固有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、この詳細な説明から、発明の本旨および範囲の範囲内で、様々な変化および修飾が、当業者に明白になるため、詳細な説明および具体例は、発明の好ましい態様を示すが、例示のために与えられているに過ぎないことが理解されるべきである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
いくつかの態様において、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、全長CD3ζアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。従って、適当な細胞内ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列のいずれかとの少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019530440.tif 000075
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019530440000001.app
【国際調査報告】
2019530440.tif 000076
2019530440.tif 000077