(57)【要約】【課題】  ゲノム及びトランスクリプトームの配列をシーケンスされた細胞の特異的表現型に関連付けることは、困難であり、不可能なことも多い。【解決手段】  ＤＮＡバーコードデコンボリューションのための装置、組成物及び方法が本明細書に記載される。ＤＮＡバーコードを使用してビーズ特異的識別子を提供し、これはハイブリダイゼーション戦略を用いてインサイチュで検出し得るものである。ＤＮＡバーコードはシーケンシング解析による同定をもたらす。この二重検出モードは、限定はされないが遺伝子解析を含め、位置情報をアッセイ情報と関連付ける多種多様な適用において用いることができる。バーコード付きされた単一細胞のシーケンシングライブラリを作成するための方法が記載される。マイクロ流体環境中での単一細胞からの核酸の分離は、細胞特異的シーケンシングライブラリ調製の基礎を提供し得る。【選択図】図１
2019528762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
プライミング配列と；
捕捉配列と；
３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列であって、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が当該バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と、
を含み、
前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含む、
捕捉物体。
【請求項２】
前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが最も５’側のヌクレオチドと最も３’側のヌクレオチドとを含み、
前記プライミング配列が前記最も５’側のヌクレオチドに隣接するか、又はそれを含み、
前記捕捉配列が前記最も３’側のヌクレオチドに隣接するか、又はそれを含み、
前記バーコード配列が前記プライミング配列の３’側且つ前記捕捉配列の５’側に位置する、
請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項３】
前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が８〜１２ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項４】
前記バーコード配列の前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、いかなる介在オリゴヌクレオチド配列もなしにタンデムで連結されている、請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項５】
前記バーコード配列の前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が、１２〜１００個の同一でないカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットから選択される、請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項６】
前記バーコード配列の前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が、配列番号１〜４０のいずれか１つの配列を有する、請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項７】
前記バーコード配列が４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項８】
前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドがunique molecule identifier（ＵＭＩ）配列を更に含む、請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項９】
前記ＵＭＩが前記プライミング配列の３’側且つ前記捕捉配列の５’側に位置する、請求項８に記載の捕捉物体。
【請求項１０】
各捕捉オリゴヌクレオチドが、少なくとも８塩基対の認識配列を含む制限部位を更に含む、請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項１１】
前記捕捉配列が、ポリ−ｄＴ配列、ランダムヘキサマー配列、遺伝子特異的配列、又はモザイク末端配列を含む、請求項１に記載の捕捉物体。
【請求項１２】
複数の捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉物体が請求項１に記載の捕捉物体であり、前記複数のうちの各捕捉物体の前記捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が、前記複数のうちの他のいずれの捕捉物体の前記捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列とも異なる、複数の捕捉物体。
【請求項１３】
配列番号４１〜８０のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチド配列と、
蛍光標識と、
を含む、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１４】
複数のハイブリダイゼーションプローブを含む試薬であって、
前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブが請求項３２に記載のハイブリダイゼーションプローブであり、
前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブが、（ｉ）前記複数のうちの他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの前記オリゴヌクレオチド配列とも同一でないオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）前記複数のうちの他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識とも分光的に区別可能な蛍光標識を含む、
試薬。
【請求項１５】
前記複数のハイブリダイゼーションプローブが２〜４個のハイブリダイゼーションプローブからなる、請求項１４に記載の試薬。
【請求項１６】
前記複数のうちの第１のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第１のサブセットから選択される配列と、第１の蛍光標識とを含み；
前記複数のうちの第２のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第２のサブセットから選択される配列と、前記第１の蛍光標識と分光的に区別可能な第２の蛍光標識とを含み、
前記複数のうちの第３のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第３のサブセットから選択される配列と、前記第１及び第２の蛍光標識の各々と分光的に区別可能な第３の蛍光標識とを含み、
配列番号４１〜８０の前記第１、第２、及び第３のサブセットが重複のないサブセットである、
請求項１４に記載の試薬。
【請求項１７】
前記複数のうちの第４のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第４のサブセットから選択される配列と、前記第１、第２、及び第３の蛍光標識の各々と分光的に区別可能な第４の蛍光標識とを含み、
配列番号４１〜８０の前記第１、第２、第３、及び第４のサブセットが重複のないサブセットである、
請求項１６に記載の試薬。
【請求項１８】
各試薬の前記複数のハイブリダイゼーションプローブが、前記複数における他のいずれの試薬の前記ハイブリダイゼーションプローブセットとも重複のないセットを形成する、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の複数の試薬を含むキットであり、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の前記試薬を含むキット。
【請求項１９】
マイクロ流体デバイス内での１つ以上の捕捉物体のインサイチュ同定方法であって、
前記マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する１つ以上の隔離ペンの各々の分離領域の中に前記１つ以上の捕捉物体のうちの単一の捕捉物体を配置することであって、各捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
プライミング配列と；
捕捉配列と；
バーコード配列であって、当該バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と、
を含むことと；
第１のハイブリダイゼーションプローブセットを含む第１の試薬溶液を前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャの中のフロー領域に流入させることであって、前記フロー領域が前記１つ以上の隔離ペンの各々に流体接続し、及び前記第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブが、
前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかに含まれるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列であって、前記第１のセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的なオリゴヌクレオチド配列が前記第１のセット中の前記ハイブリダイゼーションプローブの他のいずれの相補的なオリゴヌクレオチド配列とも同一でない、相補的なオリゴヌクレオチド配列と；
分光的に区別可能な蛍光標識のセットから選択される蛍光標識であって、前記第１のセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記蛍光標識が前記第１のハイブリダイゼーションプローブセット中の他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの前記蛍光標識とも異なる、蛍光標識と
を含むことと；
前記第１のセットの前記ハイブリダイゼーションプローブを前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかにおける対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることと；
前記第１のハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブについて、前記１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連する対応する蛍光シグナルを検出することと；
前記１つ以上の隔離ペンのうちの１つの中に配置された各捕捉物体について、（ｉ）前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャの中での前記隔離ペンの位置と、（ｉｉ）前記第１のハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブの前記対応する蛍光シグナルと前記捕捉物体との関連性又は非関連性と、を含むレコードを生成することであって、前記関連性及び非関連性のレコードが、前記捕捉物体を前記隔離ペンと関連付けるバーコードを構成することと、
を含む方法。
【請求項２０】
第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットを含む第ｎの試薬溶液を前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に流入させることであって、前記第ｎのセットの各ハイブリダイゼーションプローブが、
前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかに含まれるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列であって、前記第ｎのセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的なオリゴヌクレオチド配列が前記第ｎのセット中及び前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に流入させる任意の他のハイブリダイゼーションプローブセット中の前記ハイブリダイゼーションプローブの他のいずれの相補的なオリゴヌクレオチド配列とも同一でない、相補的なオリゴヌクレオチド配列と；
分光的に区別可能な蛍光標識のセットから選択される蛍光標識であって、前記第ｎのセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記蛍光標識が前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセット中の他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識とも異なる、蛍光標識と
を含むことと；
前記第ｎのセットの前記ハイブリダイゼーションプローブを前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかにおける対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることと；
前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブについて、前記１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連する対応する蛍光シグナルを検出することと；
前記１つ以上の隔離ペンのうちの１つの中に配置された各捕捉物体について、前記レコードに、前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブの前記対応する蛍光シグナルと前記捕捉物体との関連性又は非関連性を補足することと、
を更に含む、請求項１９に記載の方法であって
ｎが、｛２，．．．，ｍ｝の値を有する正の整数の集合であり、
ｍが２以上の値を有する正の整数であり、
前述の前記第ｎの試薬を流入させるステップ、前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットをハイブリダイズするステップ、前記対応する蛍光シグナルを検出するステップ、及び前記レコードを補足するステップが、前記正の整数の集合｛２，．．．，ｍ｝中のｎの各値について繰り返され、
ｍが３以上及び２０以下の値を有する、方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連する前記対応する蛍光シグナルを検出することが、
ハイブリダイゼーションプローブを有しないリンス溶液を前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に流すことと；
前記１つ以上の隔離ペン内に前記リンス溶液を拡散によって平衡化させることであって、それにより前記第１のセット又は前記第ｎのセットのいずれかのうちのハイブリダイズしなかったハイブリダイゼーションプローブを拡散させて前記１つ以上の隔離ペンから出すことと、
を更に含み；
更に、前記リンス溶液を前記流すことが、前記蛍光シグナルを検出する前に実施される、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
各捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの各バーコード配列が３又は４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のハイブリダイゼーションプローブセット及び前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各々が３又は４つのハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記マイクロ流体デバイスの前記１つ以上の隔離ペンの中に１つ以上の生体細胞を配置することを更に含む、請求項１９に記載の方法であって、前記１つ以上の生体細胞の各１つずつが、前記１つ以上の隔離ペンのうちの異なる隔離ペンに配置される、方法。
【請求項２５】
前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、前記１つ以上の捕捉物体を１つ以上の隔離ペン内に配置することが誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、前記１つ以上の生体細胞を前記１つ以上の隔離ペンの中に前記配置することが誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
ゲノムデータをマイクロ流体デバイス内の生体細胞と相互に関係付ける方法であって、
捕捉物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペン内に配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
プライミング配列と；
捕捉配列と；
バーコード配列であって、当該バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と
を含み； 
前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが前記同じバーコード配列を含むことと；
前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定すること及び前記同定されたバーコード配列と前記隔離ペンとの間の関連性を記録することと；
前記生体細胞を前記隔離ペン内に配置することと；
前記生体細胞を溶解させること及び前記溶解した生体細胞から放出される核酸を、前記捕捉物体に含まれる前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドによって捕捉させることと；
前記捕捉された核酸を転写することであって、それにより、各バーコード付きｃＤＮＡが前記捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つに共有結合的に結合した相補的な捕捉核酸配列を含む複数のバーコード付きｃＤＮＡを作製することと；
前記転写核酸及び前記バーコード配列をシーケンシングすることであって、それにより前記バーコード配列のリード配列に関連する前記複数の転写核酸のリード配列を入手することと；
前記リード配列に基づき前記バーコード配列を同定することと；
前記リード配列によって同定されたバーコード配列及び前記インサイチュで同定されたバーコード配列を使用して前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記隔離ペンと関連付けること、及びそれにより前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記隔離ペン内に置かれた前記生体細胞と相互に関係付けることと、
を含む方法。
【請求項２８】
前記生体細胞の表現型を観察することと；
前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記生体細胞の前記表現型と相互に関係付けることと、
を更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体細胞の前記表現型を観察することが、
前記少なくとも１つの生体細胞の少なくとも１つの物理的特性を観察すること；又は、
前記生体細胞に関してアッセイを実施し、前記アッセイ中に生成される検出可能シグナルを観察すること
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することが、請求項１９に記載の方法を実施することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を含み、前記捕捉物体を前記隔離ペン内に配置することが、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて前記捕捉物体を動かすことを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、前記生体細胞を前記隔離ペンの中に配置することが、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて前記生体細胞を動かすことを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
複数の捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスの対応する複数の隔離ペン内に配置することと；
複数の生体細胞を前記対応する複数の隔離ペン内に配置することと、
前記複数の捕捉物体及び複数の生体細胞の各々を前記方法の前記追加的なステップに従い処理することと、
を更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
核酸ライブラリを作製するためのキットであって、
マイクロ流体デバイスであって、
エンクロージャであって、前記エンクロージャがフロー領域と前記フロー領域に通じる複数の隔離ペンとを含む、エンクロージャと；
誘電泳動（ＤＥＰ）構成と、
を含むマイクロ流体デバイスと；
複数の捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
捕捉配列と；
少なくとも３つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列であって、当該バーコード配列の各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が当該バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と；
を含み、
前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含み、
前記複数の捕捉物体が、請求項１２に記載の複数の捕捉物体である、
キット。
【請求項３５】
複数のハイブリダイゼーションプローブであって、各ハイブリダイゼーションプローブが、
前記複数の捕捉物体のいずれか１つの前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列と；
標識と
を含む、複数のハイブリダイゼーションプローブを更に含む、請求項３４に記載のキットであって
前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的な配列が異なるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的であり； 
前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブの前記標識が分光的に区別可能な標識のセットから選択される、
キット。
【請求項３６】
前記複数のうちのハイブリダイゼーションプローブの各相補的な配列が、配列番号４１〜８０のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に前記生体細胞を配置することと；
前記隔離ペンの中に捕捉物体を配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
プライマーに結合するプライミング配列と；
捕捉配列と；
バーコード配列であって、当該バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が当該バーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、バーコード配列と、
を含み；前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が同じであることと；
前記生体細胞を溶解させること及び前記溶解した生体細胞から放出される核酸を、前記捕捉物体に含まれる前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドによって捕捉させることと；
前記捕捉された核酸を転写することであって、それにより前記捕捉物体をデコレートする複数のバーコード付きｃＤＮＡを作製し、各バーコード付きｃＤＮＡが、（ｉ）前記捕捉された核酸のうちの対応する１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列、それが共有結合的に結合した（ｉｉ）前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つを含むことと、
を含む方法。
【請求項３８】
前記生体細胞が、免疫細胞、癌細胞、幹細胞、前駆細胞、又は胚である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の前記捕捉配列がオリゴｄＴプライマー配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の前記捕捉配列が遺伝子特異的プライマー配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子特異的プライマー配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードするｍＲＮＡ配列を標的にする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記捕捉物体が前記隔離ペンの中に位置する間に、前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記バーコードを前記同定することが、請求項１９に記載の方法を用いて実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、前記生体細胞を配置すること及び／又は前記捕捉物体を配置することが、前記生体細胞及び／又は前記捕捉物体上に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を印加することによって実施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出することを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
バーコード付きシーケンシングライブラリを提供する方法であって、
請求項３７に記載の方法によって入手した捕捉物体のｃＤＮＡライブラリを増幅すること；及び
前記増幅したＤＮＡライブラリをタグメンテーションすることであって、それによりシーケンシングライブラリを作製すること
を含む方法。
【請求項４７】
生物学的微小物体からバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
ゲノムＤＮＡを含む生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に配置することと；
前記生物学的微小物体の核膜を破壊する能力を有する溶解試薬を前記生物学的微小物体に接触させることであって、それにより前記生物学的微小物体のゲノムＤＮＡを放出させることと；
前記放出されたゲノムＤＮＡをタグメンテーションすることであって、それにより第１のタグメンテーション挿入配列によって定義される第１の末端と第２のタグメンテーション挿入配列によって定義される第２の末端とを有する複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片を作製することと；
前記隔離ペンの中に捕捉物体を配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
第１のプライミング配列と；
第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と；
バーコード配列であって、当該バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、バーコード配列と、
を含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が同じであることと；
前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの１つを、（ｉ）前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列、（ｉｉ）第２のタグメンテーション挿入捕捉配列、ランダム化プライマー配列、又は遺伝子特異的プライマー配列に結合した第２のプライミング配列を含む増幅オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）鎖置換酵素とポリメラーゼとを含む酵素混合物と接触させることと；
前記接触させた複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片をある期間インキュベートすることであって、それにより同時に前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの前記１つを増幅するとともに前記捕捉オリゴヌクレオチド及び前記増幅オリゴヌクレオチドを前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの前記１つの末端に付加して前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを作製することと；
前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを前記マイクロ流体デバイスから搬出することと、
を含む方法。
【請求項４８】
前記生物学的微小物体が生体細胞又は生体細胞の核である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記生体細胞が免疫細胞又は癌細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記タグメンテーションすることが、前記放出されたゲノムＤＮＡを、（ｉ）前記第１のタグメンテーション挿入配列を含む第１の二本鎖ＤＮＡ断片、及び（ｉｉ）前記第２のタグメンテーション挿入配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片を負荷したトランスポザーゼと接触させることを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列が、前記第１のタグメンテーション挿入配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み； 
前記増幅オリゴヌクレオチドの前記第２のタグメンテーション挿入捕捉配列が、前記第２のタグメンテーション挿入配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、
請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記捕捉物体が前記隔離ペンの中に位置する間に、前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することを更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記バーコード配列を前記同定することが、請求項１９に記載の方法を用いて実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、前記生物学的微小物体を配置すること及び／又は前記捕捉物体を配置することが、前記生体細胞及び／又は前記捕捉物体上に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を印加することによって実施される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
単一の生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリ及びバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に前記生体細胞を配置することと；
前記隔離ペンの中に第１の捕捉物体を配置することであって、前記第１の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
第１のプライミング配列と；
第１の捕捉配列と；
第１のバーコード配列であって、当該第１のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記第１のバーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、第１のバーコード配列と、
を含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が同じであることと；
請求項３７に記載の方法を実施することにより前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを入手することであって、前記生体細胞を溶解させることが、前記生体細胞の細胞膜が分解されて前記生体細胞から細胞質ＲＮＡが放出される一方で、前記生体細胞の核膜はインタクトなまま残るように実施され、それにより前記生体細胞の前記ＲＮＡからの前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリでデコレートされた前記第１の捕捉物体が提供されることと；
前記ｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出することと；
前記隔離ペンの中に第２の捕捉物体を配置することであって、前記第２の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、各々が、
第２のプライミング配列と；
第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と；
第２のバーコード配列であって、当該第２のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記第２のバーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、第２のバーコード配列と、
を含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が同じであることと；
請求項４７に記載の方法を実施することにより前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを入手することであって、前記生体細胞からの複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片が前記第２の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と接触し、それにより前記生体細胞の前記ゲノムＤＮＡからの前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリが提供されることと；
前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを前記マイクロ流体デバイスから搬出することと、
を含む方法。
【請求項５６】
前記第１の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することを更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２の捕捉物体の前記複数のオリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することを更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１又は前記第２の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列を同定することが、請求項１９に記載の方法を用いて実施される、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
バーコード付きＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シーケンシングライブラリを提供する方法であって、
Ｂリンパ球からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを作成することであって、前記作成することが請求項３７に記載の方法により実施され、前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリが、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉物体をデコレートし、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドがＮｏｔ１制限部位配列を含むことと；
前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅することと；
前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリからバーコード付きＢＣＲ配列を選択することであって、それによりバーコード付きＢＣＲ配列が富化されたライブラリを作製することと；
バーコード付きＢＣＲ配列が富化された前記ライブラリからの配列を環状化することであって、それにより環状化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを作製すること；
前記環状化バーコード付きＢＣＲ配列ライブラリを再び線状化して、各々がそれぞれの可変（Ｖ）サブ領域及び／又はそれぞれの多様性（Ｄ）サブ領域の３’側に前記ＢＣＲ配列の定常（Ｃ）領域を呈する再配列されたバーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを提供することと；、
シーケンシングアダプターを付加して前記Ｖサブ領域及び／又は前記Ｄサブ領域をサブ選択することであって、それによりバーコード付きＢＣＲシーケンシングライブラリを作製することと、
を含む方法。
【請求項６０】
前記ＢＣＲシーケンシングライブラリを増幅して、バーコード付きＢＣＲサブ領域配列の増幅ライブラリを提供することを更に含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＢＣＲ配列領域を選択することが、ＢＣＲ配列に選択的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、それにより前記バーコード付きＢＣＲ領域選択的増幅ＤＮＡのライブラリを作製することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
バーコード付きＢＣＲ配列が富化された前記ライブラリからの配列を環状化することが、各バーコード付きＢＣＲ配列の５’末端をそのそれぞれの３’末端にライゲートすることを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記環状化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを再び線状化することが、前記環状化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリの各々を前記Ｎｏｔ１制限部位で消化することを含む、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本出願は、米国法典第３５編第１１９条（ｅ）の下、２０１６年１０月１日出願の米国仮特許出願第６２／４０３，１１６号、２０１６年１０月１日出願の米国仮特許出願第６２／４０３，１１１号、２０１７年２月１０日出願の米国仮特許出願第６２／４５７，３９９号、２０１７年２月１０日出願の米国仮特許出願第６２／４５７，５８２号、及び２０１７年３月１３日出願の米国仮特許出願第６２／４７０，６６９号（それらの開示はそれぞれその全体が参照により本明細書に援用される）に基づく利益を主張する非仮出願である。
【背景技術】
【０００２】
開示の背景
[0002]  単一細胞ゲノム増幅技術及び次世代シーケンシング法の出現は、個別生体細胞のゲノム及びトランスクリプトームをシーケンスする我々の能力の飛躍的向上をもたらした。こうした進歩にもかかわらず、ゲノム及びトランスクリプトームの配列をシーケンスされた細胞の特異的表現型に関連付けることは、依然としてきわめて困難であり、不可能なことも多い。本明細書に更に記載されるように、マイクロ流体環境内でＤＮＡバーコード等のバーコードを解読する能力は、ゲノム及びトランスクリプトームのデータと元の細胞及びその表現型との関連付けを可能にし得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
開示の概要
[0003]  単一細胞又は小クローン細胞集団からバーコード付きＲＮＡ−ｓｅｑライブラリ及び／又はゲノムＤＮＡライブラリを作製するために並びに逆にライブラリから得られる配列を個別の細胞／クローン集団に関連付けるために使用し得るバーコード付き捕捉物体に関する組成物、キット、及び方法が本明細書に記載されている。本方法は、１つ以上の隔離ペンを含むエンクロージャを有するマイクロ流体デバイスで実施される。本方法の利点の１つは、マイクロ流体デバイスの対応する隔離ペン内に細胞を選択的に配置し得ると共にその表現型をゲノム及び／又はトランスクリプトームのシーケンシング処理前に観測し得ることである。バーコード付き捕捉物体及び関連方法の重要な特徴は、マイクロ流体デバイスとゲノム／トランスクリプトームライブラリから得られるシーケンスリードとの両方でバーコードをインサイチュで「読取り」可能であるため、ゲノム／トランスクリプトームデータと観測される原細胞表現型との関連付けが可能なことである。
【０００４】
[0004]  一態様では、捕捉物体が提供される。捕捉物体は、固体担体（例えばビーズ）に共有結合された少なくとも２つ（例えば複数）の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、各捕捉オリゴヌクレオチドは、バーコード配列とプライミング配列と捕捉配列とを有する。バーコード配列は、非同一オリゴヌクレオチド配列（「サブバーコード」配列又は「ワード」とも称される）のセットを形成するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を用いて設計される。カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のユニークな組合せは、結合一体化されてユニークバーコード配列（又は「センテンス」）を形成する。標識（例えば蛍光標識）プローブを用いてカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を個別にデコードし得るので、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットに相補的なハイブリダイゼーションプローブのセットがあれば、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列の全ての可能な組合せ、したがって、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットから発生し得る全ての可能なバーコード配列をインサイチュで同定するのに十分である。
【０００５】
[0005]  他の態様では、マイクロ流体デバイス内の捕捉物体のインサイチュ同定更にはゲノム／トランスクリプトームデータと生物学的微小物体との相関付けを行う方法が提供される。本方法は、以上に又は本明細書の他の箇所に記載の通りであり得る捕捉物体をマイクロ流体デバイス内に配置することと、相補的ハイブリダイゼーションプローブのセットを用いて捕捉物体の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定／デコードすることと、を含む。インサイチュ同定が実施されるマイクロ流体デバイスは、フロー領域とフロー領域に流体接続された複数の隔離ペンとを含むエンクロージャを含み、捕捉物体は、隔離ペンの１つ内に配置される。複数の隔離ペンのそれぞれは、少なくとも１つの生物学的微小物体と少なくとも１つの捕捉物体とを保持可能である。
【０００６】
[0006]  バーコードのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を含有する１つ以上のハイブリダイゼーションプローブは、プローブを含む溶液をデバイスのフロー領域に流入させることにより隔離ペンに導入し得る。蛍光標識等の標識を含み得るこれらのハイブリダイゼーションプローブは、捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列内のそれらの標的相補的配列（すなわち、対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列）にアニールされ、その結果としてプローブ／カセット化可能オリゴヌクレオチド配列相補性に基づいて観測された標識（例えば蛍光）によりバーコード付きビーズの解読を可能にする。捕捉物体バーコードの同定は、生物学的微小物体から核酸を捕捉するプロセス及び核酸ライブラリを作製するプロセスの種々の時点で実施し得る。同定プロセスは、１つの生物学的微小物体から核酸を捕捉オリゴヌクレオチドに捕捉する前若しくは捕捉した後又は転写／逆転写後のいずれかで実施し得る。代替的に、捕捉物体の同定は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに配置する前に行い得る。デコーディングプロセスは、画像取得ユニットを含むシステムを用いて行い得る。
【０００７】
[0007]  特定の実施形態では、幾つかの生物学的微小物体（例えば、単一細胞又はクローン集団）は、捕捉物体が隔離ペン内に配置される前又は配置された後のいずれかに隔離ペンに提示し得る。隔離ペンに導入される捕捉物体及び生物学的微小物体の数は、決定論的に設定可能である。例えば、単一捕捉物体及び単一生物学的微小物体を単一隔離ペンに配置可能であるか、単一捕捉物体及び生体細胞クローン集団を単一隔離ペンに配置可能であるか、又は複数の捕捉物体及び１つ以上の生物学的微小物体を単一隔離ペンに配置可能である。隔離ペンへの導入前に、生物学的微小物体の原集団を確認可能である。
【０００８】
[0008]  隔離ペンで生物学的微小物体を溶解したら、捕捉物体は、放出された核酸を捕捉可能である。バーコードは、任意選択的にＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）と組み合わせて逆転写等の様々な機序により、捕捉された核酸の転写物／ゲノムＤＮＡ断片に共有結合された／組み込まれた状態になる。バーコード付き転写物は、更に処理してからシーケンスし得る。ゲノムデータ及び関連バーコードは、解読して特定の原隔離ペンとのマッチングを可能にし得ると共に、その結果として生物学的原微小物体及びその表現型とのマッチングを可能にし得る。
【０００９】
[0009]  捕捉オリゴヌクレオチドひいては特定の位置の捕捉物体のバーコードの同定プロセスは、自動プロセスであり得る。本明細書に記載の画像取得ユニットは、マイクロ流体デバイスの複数の隔離ペン及びフロー領域の１つ以上の画像を捕捉するように構成された撮像素子を更に含み得る。システムは、画像取得ユニットに通信接続された画像処理ユニットを更に含み得る。画像処理ユニットは、各捕捉画像を受け取って画像に示された各隔離ペンの対象領域を規定するように構成された対象領域決定エンジンを含み得る。画像処理ユニットは、各隔離ペンの対象領域内の画像領域の少なくとも一部分を解析して各隔離ペンの特定の微小物体の存在及びそれに関連する標識ハイブリダイゼーションプローブから生じるいずれかの関連シグナルの指標となるスコアを決定するように構成されたスコアリングエンジンを更に含み得る。マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの被覆表面を更に含み得る。本方法の幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、親水性ポリマー及び／又はアニオン性ポリマー等の共有結合された分子を含み得る少なくとも１つの調整された表面を含み得る。
【００１０】
[0010]  他の態様では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に位置する隔離ペン内に生体細胞を配置することと、隔離ペン内に捕捉物体を配置することであって、捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが、プライマーに結合するプライミング配列と捕捉配列とバーコード配列とを含み、バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列がバーコード配列の他の全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である、配置することと、生体細胞を溶解させて溶解させた生体細胞から放出された核酸を捕捉物体に含まれる複数の捕捉オリゴヌクレオチドにより捕捉できるようにすることと、捕捉された核酸を転写させて捕捉物体をデコレートする複数のバーコード付きｃＤＮＡを生成することであって、各バーコード付きｃＤＮＡが、（ｉｉ）複数の捕捉オリゴヌクレオチドの１つに共有結合された、（ｉ）捕捉された核酸の対応する１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む、生成することと、を含む、生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを提供する方法が提供される。
【００１１】
[0011]  幾つかの実施形態では、遺伝子特異的プライマー配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするｍＲＮＡ配列を標的とし得る。他の実施形態では、遺伝子特異的プライマー配列は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードするｍＲＮＡ配列を標的とし得る。
【００１２】
[0012]  幾つかの実施形態では、本方法は、捕捉物体が隔離ペン内に位置する間に捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定することを更に含み得る。幾つかの他の実施形態では、本方法は、前記捕捉物体又は前記複数の前記捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出することを更に含み得る。
【００１３】
[0013]  種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成体を更に含み得ると共に、生体細胞を配置すること及び／又は捕捉物体を配置することは、生体細胞及び／又は捕捉物体に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を適用することにより実施される。
【００１４】
[0014]  次いで、バーコード付きｃＤＮＡデコレート捕捉物体は、更なるライブラリ作製及びシーケンシングのために搬出し得る。バーコード及びｃＤＮＡは、シーケンスし得ると共に、ゲノムデータは、原隔離ペン番号及び個別細胞／コロニーにマッチさせ得る。このプロセスはまた、本明細書に記載されるように自動プロセスによりマイクロ流体デバイス内で実施し得る。
【００１５】
[0015]  他の態様では、ゲノムＤＮＡを含む生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に位置する隔離ペン内に配置することと、生物学的微小物体と生物学的微小物体の核膜を破壊可能な溶解試薬とを接触させて生物学的微小物体のゲノムＤＮＡを放出させることと、放出させたゲノムＤＮＡをタグメント化して、第１のタグメンテーションインサート配列により規定される第１の末端と、第２のタグメンテーションインサート配列により規定される第２の末端と、を有する複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片を生成することと、隔離ペン内に捕捉物体を配置することであって、捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが、第１のプライミング配列と第１のタグメンテーションインサート捕捉配列とバーコード配列とを含み、バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、バーコード配列の他の全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である、配置することと、複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のそれぞれと、（ｉ）捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれの第１のタグメンテーションインサート捕捉配列、（ｉｉ）第２のタグメンテーションインサート捕捉配列、ランダム化プライマー配列、又は遺伝子特異的プライマー配列に結合された第２のプライミング配列を含む増幅オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）鎖置換酵素とポリメラーゼとを含む酵素混合物と、を接触させることと、接触させた複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片をある時間にわたりインキュベートして、複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のそれぞれの増幅と、複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のそれぞれの末端への捕捉オリゴヌクレオチド及び増幅オリゴヌクレオチドの付加と、を同時に行うことによりバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを生成することと、マイクロ流体デバイスからバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを搬出することと、を含む、生物学的微小物体からバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法が提供される。
【００１６】
[0016]  幾つかの実施形態では、タグメント化することは、放出させたゲノムＤＮＡと、（ｉ）第１のタグメンテーションインサート配列を含む第１の二本鎖ＤＮＡ断片及び（ｉｉ）第２のタグメンテーションインサート配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片が装填されたトランスポザーゼと、を接触させることを含み得る。
【００１７】
[0017]  幾つかの実施形態では、第１の二本鎖ＤＮＡ断片は、第３のプライミング配列に結合された第１のモザイク末端配列を含み得ると共に、第２の二本鎖ＤＮＡ断片は、第４のプライミング配列に結合された第２のモザイク末端配列を含み得る。
【００１８】
[0018]  幾つかの実施形態では、本方法は、捕捉物体が隔離ペン内に位置する間に捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定することを更に含み得る。
【００１９】
[0019]  種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含むと共に、生物学的微小物体を配置すること及び／又は捕捉物体を配置することは、生体細胞及び／又は捕捉物体に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を適用することにより実施される。
【００２０】
[0020]  他の態様では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に位置する隔離ペン内に生体細胞を配置することと、隔離ペン内に第１の捕捉物体を配置することであって、第１の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが、第１のプライミング配列と第１の捕捉配列と第１のバーコード配列とを含み、第１のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、第１のバーコード配列の他の全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である、配置することと、本明細書に記載されるようにｃＤＮＡライブラリを得る任意の方法を実施することによりバーコード付きｃＤＮＡライブラリを得ることであって、生体細胞を溶解させることが、生体細胞の形質膜を分解するように実施される、得ることと、生体細胞の核膜をインタクトな状態で残したまま生体細胞から細胞質ＲＮＡを放出させて、生体細胞のＲＮＡからバーコード付きｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を提供することと、マイクロ流体デバイスからｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を搬出することと、隔離ペン内に第２の捕捉物体を配置することであって、第２の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、そのそれぞれが、第２のプライミング配列と第１のタグメンテーションインサート捕捉配列と第２のバーコード配列とを含み、第２のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、第２のバーコード配列の他の全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である、配置することと、本明細書に記載されるようにバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを得る任意の方法を実施することによりバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを得ることであって、生体細胞からの複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片が、第２の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれの第１のタグメンテーションインサート捕捉配列に接触されて、生体細胞のゲノムＤＮＡからバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する、得ることと、マイクロ流体デバイスからバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを搬出することと、を含む、単一生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリ及びバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法が提供される。
【００２１】
[0021]  幾つかの実施形態では、本方法は、第１の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、第１の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することは、隔離ペンに生体細胞を配置する前、生体細胞のＲＮＡからバーコード付きｃＤＮＡライブラリを得る前、又はマイクロ流体デバイスからバーコード付きｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を搬出する前に実施し得る。幾つかの実施形態では、本方法は、第２の捕捉物体の複数のオリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することを更に含み得る。
【００２２】
[0022]  更に他の態様では、Ｂリンパ球からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを作製することであって、作製することが、本明細書に記載されるようにバーコード付きｃＤＮＡを作製する任意の方法に従って実施され、バーコード付きｃＤＮＡライブラリが、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉物体をデコレートし、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれがＮｏｔ１制限部位配列を含む、作製することと、バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅することと、バーコード付きｃＤＮＡライブラリからバーコード付きＢＣＲ配列を選択してバーコード付きＢＣＲ配列が富化されたライブラリを作製することと、バーコード付きＢＣＲ配列が富化されたライブラリからの配列を環化して環化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを作製することと、環化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを再線状化して再構成バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを提供することであって、そのそれぞれがそれぞれの可変（Ｖ）サブ領域及び／又はそれぞれの多様性（Ｄ）サブ領域の３’側にＢＣＲ配列の定常（Ｃ）領域を提示する、提供することと、シーケンシングアダプターの付加並びにＶサブ領域及び／又はＤサブ領域のサブ選択を行ってバーコード付きＢＣＲシーケンシングライブラリを作製することと、を含む、バーコード付きＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シーケンシングライブラリを提供する方法が提供される。
【００２３】
[0023]  種々の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるようにバーコードをインサイチュで同定する任意の方法を用いて捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、同定することは、バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅する前に実施し得る。他の実施形態では、同定することは、バーコード付きｃＤＮＡライブラリを作製する間に実施し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】[0024]本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器で用いられるシステムの例を例示する。
【図１Ｂ】[0025]本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。
【図１Ｃ】[0025]本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。
【図２Ａ】[0026]本開示の幾つかの実施形態による分離ペンを例示する。
【図２Ｂ】[0026]本開示の幾つかの実施形態による分離ペンを例示する。
【図２Ｃ】[0027]本開示の幾つかの実施形態による詳細な隔離ペンを例示する。
【図２Ｄ】[0028]本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。
【図２Ｅ】[0028]本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。
【図２Ｆ】[0028]本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。
【図２Ｇ】[0029]本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。
【図２Ｈ】[0030]本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスのコーティング表面を例示する。
【図３Ａ】[0031]本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器で用いられるシステムの例を例示する。
【図３Ｂ】[0032]本開示の幾つかの実施形態による撮像デバイスを例示する。
【図４Ａ】[0033]捕捉物体のインサイチュ検出可能バーコード配列と、生体細胞からの核酸のシーケンシングデータと、の関係を例示する。この場合、核酸は、マイクロ流体環境内にある間に捕捉され、搬出後にシーケンスされる。
【図４Ｂ】[0034]本開示の実施形態に従って捕捉物体のインサイチュ検出可能バーコード配列を用いた可能な様々な核酸ワークフローの模式図である。
【図５】[0035]本開示の捕捉物体の捕捉オリゴヌクレオチドの実施形態の模式図である。
【図６】[0036]カセット化可能配列の様々な組合せから生じる１０，０００のバーコード多様性を有してバーコード配列を形成する、本開示の捕捉物体の捕捉オリゴヌクレオチドの実施形態の模式図である。
【図７Ａ】[0037]本開示の一実施形態に従って捕捉物体のバーコードのインサイチュ検出を行うプロセスの模式図である。
【図７Ｂ】[0038]本開示の一実施形態に従って捕捉物体のバーコード配列のインサイチュ検出を行う方法の写真図である。
【図７Ｃ】[0038]本開示の一実施形態に従って捕捉物体のバーコード配列のインサイチュ検出を行う方法の写真図である。
【図８Ａ】[0039]本開示の他の実施形態に従って捕捉物体のバーコード配列のインサイチュ検出を行う方法の模式図である。
【図８Ｂ】[0039]本開示の他の実施形態に従って捕捉物体のバーコード配列のインサイチュ検出を行う方法の模式図である。
【図８Ｃ】[0039]本開示の他の実施形態に従って捕捉物体のバーコード配列のインサイチュ検出を行う方法の模式図である。
【図８Ｄ】[0040]本開示の他の実施形態に従って捕捉物体のバーコード配列の２つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のインサイチュ検出を行う方法の写真図である。
【図８Ｅ】[0040]本開示の他の実施形態に従って捕捉物体のバーコード配列の２つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のインサイチュ検出を行う方法の写真図である。
【図８Ｆ】[0040]本開示の他の実施形態に従って捕捉物体のバーコード配列の２つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のインサイチュ検出を行う方法の写真図である。
【図９】[0041]本開示の一実施形態に従って単一細胞ＲＮＡ捕捉、ライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの模式図を例示する。
【図１０Ａ】[0042]本開示の一実施形態に従って外側細胞膜の溶解後にＲＮＡ捕捉を行うプロセスの一実施形態の写真図である。
【図１０Ｂ】[0042]本開示の一実施形態に従って外側細胞膜の溶解後にＲＮＡ捕捉を行うプロセスの一実施形態の写真図である。
【図１０Ｃ】[0042]本開示の一実施形態に従って外側細胞膜の溶解後にＲＮＡ捕捉を行うプロセスの一実施形態の写真図である。
【図１０Ｄ】[0042]本開示の一実施形態に従って外側細胞膜の溶解後にＲＮＡ捕捉を行うプロセスの一実施形態の写真図である。
【図１１Ａ】[0043]本開示の実施形態に従ってＲＮＡライブラリを提供するワークフローの一部分の模式図である。
【図１１Ｂ】[0044]本開示の実施形態に従ってシーケンシングライブラリ品質を解析するグラフ図である。
【図１１Ｃ】[0044]本開示の実施形態に従ってシーケンシングライブラリ品質を解析するグラフ図である。
【図１２Ａ】[0045]本開示の実施形態に従って単一細胞溶解、ＤＮＡライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの絵図である。
【図１２Ｂ】[0045]本開示の実施形態に従って単一細胞溶解、ＤＮＡライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの絵図である。
【図１２Ｃ】[0045]本開示の実施形態に従って単一細胞溶解、ＤＮＡライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの絵図である。
【図１２Ｄ】[0045]本開示の実施形態に従って単一細胞溶解、ＤＮＡライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの絵図である。
【図１２Ｅ】[0045]本開示の実施形態に従って単一細胞溶解、ＤＮＡライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの絵図である。
【図１２Ｆ】[0045]本開示の実施形態に従って単一細胞溶解、ＤＮＡライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの絵図である。
【図１２Ｇ】[0046]単一細胞ＤＮＡライブラリ作製の模式図である。
【図１３Ａ】[0047]単一細胞Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）捕捉、ライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの模式図である。
【図１３Ｂ】[0047]単一細胞Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）捕捉、ライブラリ作製、及びシーケンシングを行うワークフローの模式図である。
【図１４Ａ】[0048]本開示に従って捕捉物体のバーコード配列のインサイチュ検出を行う方法の実施形態の写真図である。
【図１４Ｂ】[0049]本開示の実施形態に従ってｃＤＮＡでデコレートされた捕捉物体の搬出を行う写真図である。
【図１４Ｃ】[0050]本開示の実施形態に従ってシーケンシングライブラリ品質の分析を行うグラフ図である。
【図１４Ｄ】[0050]本開示の実施形態に従ってシーケンシングライブラリ品質の分析を行うグラフ図である。
【図１５Ａ】[0051]本開示の実施形態により作製されたライブラリからのシーケンシングリードのグラフ図である。
【図１５Ｂ】[0051]本開示の実施形態により作製されたライブラリからのシーケンシングリードのグラフ図である。
【図１６Ａ】[0052]本開示の実施形態に従って作製されたｃＤＮＡシーケンシングライブラリから得られたシーケンシング結果のグラフ図である。
【図１６Ｂ】[0052]本開示の実施形態に従って作製されたｃＤＮＡシーケンシングライブラリから得られたシーケンシング結果のグラフ図である。
【図１６Ｃ】[0052]本開示の実施形態に従って作製されたｃＤＮＡシーケンシングライブラリから得られたシーケンシング結果のグラフ図である。
【図１６Ｄ】[0052]本開示の実施形態に従って作製されたｃＤＮＡシーケンシングライブラリから得られたシーケンシング結果のグラフ図である。
【図１７】[0053]捕捉物体送達のランダム化を試験する実験全体を通じて検出されたバーコード配列のセットの変動のグラフ図である。
【図１８】[0054]本開示の方法の実施形態での１回の実験当たりのバーコード配列リードの回収のグラフ図である。
【図１９】[0055]本開示の実施形態でのマイクロ流体デバイス内のＴ細胞の写真図である。
【図２０Ａ】[0056]本開示の実施形態に従って培養、抗原染色、及びインサイチュバーコード配列検出を行ったときの特異的細胞の写真図である。
【図２０Ｂ】[0056]本開示の実施形態に従って培養、抗原染色、及びインサイチュバーコード配列検出を行ったときの特異的細胞の写真図である。
【図２１Ａ】[0057]本開示の実施形態に従って培養、抗原染色、及びインサイチュバーコード配列検出を行ったときの特異的細胞の写真図である。
【図２１Ｂ】[0057]本開示の実施形態に従って培養、抗原染色、及びインサイチュバーコード配列検出を行ったときの特異的細胞の写真図である。
【図２２Ａ】[0058]本開示の実施形態に従って培養、抗原染色、及びインサイチュバーコード配列検出を行ったときの特異的細胞の写真図である。
【図２２Ｂ】[0058]本開示の実施形態に従って培養、抗原染色、及びインサイチュバーコード配列検出を行ったときの特異的細胞の写真図である。
【図２３】[0059]本開示の実施形態に従って活性化細胞、活性化抗原陽性細胞、及び活性化抗原陰性細胞全体にわたりシーケンシングを行った結果のグラフ図である。
【図２４】[0060]本開示の実施形態に従って実質的に単一分布させた細胞の写真図である。
【図２５】[0061]本開示の実施形態に従って溶解及び核ＤＮＡ放出を行うプロセスの写真図である。
【図２６Ａ】[0062]本開示の実施形態に従って溶解を行う前及び行った後の染色細胞の写真図である。
【図２６Ｂ】[0062]本開示の実施形態に従って溶解を行う前及び行った後の染色細胞の写真図である。
【図２７】[0063]本開示の実施形態に従ってシーケンシングライブラリ中のゲノムＤＮＡの分布を示すグラフ図である。
【図２８】[0064]サンプルゲノムＤＮＡ中の染色体の予想長さのグラフ図であり、本開示の一実施形態に従って各染色体で観測された実験カバレッジを更に含む。
【図２９Ａ】[0065]本開示の実施形態に従ってゲノムＤＮＡライブラリ品質を示すグラフ図である。
【図２９Ｂ】[0065]本開示の実施形態に従ってゲノムＤＮＡライブラリ品質を示すグラフ図である。
【図２９Ｃ】[0065]本開示の実施形態に従ってゲノムＤＮＡライブラリ品質を示すグラフ図である。
【図２９Ｄ】[0065]本開示の実施形態に従ってゲノムＤＮＡライブラリ品質を示すグラフ図である。
【図３０Ａ】[0066]本開示の実施形態に従って単一細胞からＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方のシーケンシングライブラリを得る方法の写真図である。
【図３０Ｂ】[0066]本開示の実施形態に従って単一細胞からＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方のシーケンシングライブラリを得る方法の写真図である。
【図３０Ｃ】[0066]本開示の実施形態に従って単一細胞からＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方のシーケンシングライブラリを得る方法の写真図である。
【図３０Ｄ】[0066]本開示の実施形態に従って単一細胞からＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方のシーケンシングライブラリを得る方法の写真図である。
【図３０Ｅ】[0066]本開示の実施形態に従って単一細胞からＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方のシーケンシングライブラリを得る方法の写真図である。
【図３０Ｆ】[0066]本開示の実施形態に従って単一細胞からＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方のシーケンシングライブラリを得る方法の写真図である。
【図３１Ａ】[0067]本開示の実施形態に従って捕捉物体上のバーコード配列を検出する方法の写真図である。
【図３１Ｂ】[0067]本開示の実施形態に従って捕捉物体上のバーコード配列を検出する方法の写真図である。
【図３２】[0068]本開示の実施形態に従ってインサイチュで決定されたバーコード配列とバーコード及びゲノムデータを決定するシーケンシング結果との相関を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
[0069]  本明細書には、本開示の例示的な実施形態及び適用が記載されている。しかし、本開示は、これらの例示的な実施形態及び適用、例示的な実施形態及び適用を行う方式、又はそれについて本明細書に記載される方式に限定されない。更に、図は、簡略図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、誇張されるか又は他に比例していないことがあり得る。加えて、「上」、「付着される」、「接続される」、「結合される」という用語又は類似語が本明細書で使用される場合、一方の要素が直接他方の要素上にあるか、それに付着されるか、それに接続されるか、若しくはそれに結合されるか、又は一方の要素と他方の要素との間に１つ以上の介在要素があるかにかかわらず、一方の要素（例えば、材料、層、基板等）は、他方の要素「上」にあるか、それに「付着される」か、それに「接続される」か、又はそれに「結合される」。また、文脈上特に規定されない限り、方向（例えば、上、下、頂、底、側、上向き、下向き、下方、上方、上側、下側、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）は、提供された場合、相対的なものであり、単なる例として説明及び考察が容易になるように提供され、限定を目的としたものではない。加えて、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照される場合、かかる参照は、列挙された要素のいずれか１つのみ、列挙された要素の全てに満たない任意の組合せ、及び／又は列挙された要素の全ての組合せを含むことが意図される。本明細書でのセクション分割は、概説を容易にすることのみを目的とし、考察される要素のいずれの組合せにも限定されない。
【００２６】
[0070]  マイクロ流体フィーチャの寸法が幅又は面積を有するものとして記載されている場合、寸法は、典型的には、マイクロ流体デバイスの基板及び／又はカバーに平行な平面内にいずれも位置するｘ軸方向及び／又はｙ軸方向の寸法に対して記載されている。マイクロ流体フィーチャの高さは、マイクロ流体デバイスの基板及び／又はカバーに平行な平面に垂直なｚ軸方向に対して記載されている。幾つかの場合、チャネル又は通路等のマイクロ流体フィーチャの断面積は、ｘ軸方向／ｚ軸方向、ｙ軸方向／ｚ軸方向、又はｘ軸方向／ｙ軸方向の面積に対するものである。
【００２７】
[0071]  本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図された目的で機能するのに十分であることを意味する。そのため、「実質的に」という用語は、当業者によって予想されるような、ただし全体性能にそれほど影響を及ぼさない、絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からのわずかな有意でない変動を許容する。数値又は数値として表現され得るパラメータ若しくは特性に対して用いられる場合、「実質的に」は、１０パーセント以内を意味する。
【００２８】
[0072]  「１つ」という用語は、２つ以上を意味する。
【００２９】
[0073]  本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超え得る。
【００３０】
[0074]  本明細書で使用される場合、μｍとはマイクロメートルを意味し、μｍ３とは立方マイクロメートルを意味し、ｐＬとはピコリットルを意味し、ｎＬとはナノリットルを意味し、且つμＬ（又はｕＬ）とはマイクロリットルを意味する。
【００３１】
[0075]  本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内に「位置決めされる」を包含し、また、「配置する」という用語は、その意味内に「位置決めする」を包含する。
【００３２】
[0076]  本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」は、流体を保持するように構成された１つ以上の離散マイクロ流体回路（各マイクロ流体回路は、限定されるものではないが、領域、流路、チャネル、チャンバ及び／又はペンをはじめとする流体相互接続回路要素を含む）と、マイクロ流体デバイスに対して流体（及び任意選択的に流体中に懸濁された微小物体）の流入及び／又は流出を可能にするように構成された少なくとも１つのポートとを含むデバイスである。典型的には、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、マイクロ流体チャネルを含むフロー領域と少なくとも１つチャンバとを含み、約１ｍＬ未満、例えば約７５０μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約２００μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約２５μＬ未満、約２０μＬ未満、約１５μＬ未満、約１０μＬ未満、約９μＬ未満、約８μＬ未満、約７μＬ未満、約６μＬ未満、約５μＬ未満、約４μＬ未満、約３μＬ未満又は約２μＬ未満の体積の流体を保持するであろう。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１〜２μＬ、約１〜３μＬ、約１〜４μＬ、約１〜５μＬ、約２〜５μＬ、約２〜８μＬ、約２〜１０μＬ、約２〜１２μＬ、約２〜１５μＬ、約２〜２０μＬ、約５〜２０μＬ、約５〜３０μＬ、約５〜４０μＬ、約５〜５０μＬ、約１０〜５０μＬ、約１０〜７５μＬ、約１０〜１００μＬ、約２０〜１００μＬ、約２０〜１５０μＬ、約２０〜２００μＬ、約５０〜２００μＬ、約５０〜２５０μＬ又は約５０〜３００μＬを保持する。マイクロ流体回路は、マイクロ流体デバイスの第１のポート（例えば、流入口）に流体接続された第１の端と、マイクロ流体デバイスの第２のポート（例えば、流流出口）に流体接続された第２の端とを有するように構成され得る。
【００３３】
[0077]  本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約１μＬ未満、例えば約７５０ｎＬ未満、約５００ｎＬ未満、約２５０ｎＬ未満、約２００ｎＬ未満、約１５０ｎＬ未満、約１００ｎＬ未満、約７５ｎＬ未満、約５０ｎＬ未満、約２５ｎＬ未満、約２０ｎＬ未満、約１５ｎＬ未満、約１０ｎＬ未満、約９ｎＬ未満、約８ｎＬ未満、約７ｎＬ未満、約６ｎＬ未満、約５ｎＬ未満、約４ｎＬ未満、約３ｎＬ未満、約２ｎＬ未満、約１ｎＬ以下の体積の流体を保持するように構成された少なくとも１つの回路要素を含有するマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個又はそれを超える）を含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約１００ｐＬから１ｎＬ、約１００ｐＬから２ｎＬ、約１００ｐＬから５ｎＬ、約２５０ｐＬから２ｎＬ、約２５０ｐＬから５ｎＬ、約２５０ｐＬから１０ｎＬ、約５００ｐＬから５ｎＬ、約５００ｐＬから１０ｎＬ、約５００ｐＬから１５ｎＬ、約７５０ｐＬから１０ｎＬ、約７５０ｐＬから１５ｎＬ、約７５０ｐＬから２０ｎＬ、約１から１０ｎＬ、約１から１５ｎＬ、約１から２０ｎＬ、約１から２５ｎＬ又は約１から５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約２０ｎＬから２００ｎＬ、約１００から２００ｎＬ、約１００から３００ｎＬ、約１００から４００ｎＬ、約１００から５００ｎＬ、約２００から３００ｎＬ、約２００から４００ｎＬ、約２００から５００ｎＬ、約２００から６００ｎＬ、約２００から７００ｎＬ、約２５０から４００ｎＬ、約２５０から５００ｎＬ、約２５０から６００ｎＬ又は約２５０から７５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。
【００３４】
[0078]  マイクロ流体デバイス又はナノ流体デバイスは、本明細書では、「マイクロ流体チップ」若しくは「チップ」又は「ナノ流体チップ」若しくは「チップ」として参照され得る。
【００３５】
[0079]  本明細書で使用される「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、水平寸法及び垂直寸法の両寸法よりも有意に長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を意味する。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれかの長さの少なくとも５倍、例えばその長さの少なくとも１０倍、その長さの少なくとも２５倍、その長さの少なくとも１００倍、その長さの少なくとも２００倍、その長さの少なくとも５００倍、その長さの少なくとも１，０００倍、その長さの少なくとも５，０００倍であり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、介在する任意の値を含めて約１００，０００μｍ〜約５００，０００μｍである。幾つかの実施形態では、水平寸法は、約１００μｍ〜約１０００μｍ（例えば、約１５０〜約５００μｍ）であり、及び垂直寸法は、約２５μｍ〜約２００μｍ（例えば、約４０〜約１５０μｍ）である。フローチャネルは、マイクロ流体デバイス内で多様な空間構成を有し得るため、完全に線状の要素に制限されないことに留意されたい。例えば、フローチャネルは、以下の構成：カーブ、ベンド、スパイラル、傾斜、下降、フォーク（例えば、複数の異なる流路）及びそれらの任意の組合せを有する１つ以上のセクションであり得るか又はそれらを含み得る。加えて、フローチャネルは、その中に所望の流体フローを提供するように、その通路に沿って異なる断面積、拡幅及び狭窄を有し得る。フローチャネルは、バルブを含み得、バルブは、マイクロフルイディクス技術分野で公知の任意のタイプであり得る。バルブを含むマイクロ流体チャネルの例は、米国特許第６，４０８，８７８号及び同第９，２２７，２００号（それぞれその全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。
【００３６】
[0080]  本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの２つの異なる領域間又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分な大きさのバンプ又は類似のタイプの構造物を意味する。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離ペンの接続領域及び分離領域であり得る。
【００３７】
[0081]  本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの回路要素（又は２つの回路要素間のインタフェース）の幅の狭小化を意味する。狭窄は、例えば、本開示のマイクロ流体隔離ペンの分離領域と接続領域との間のインタフェースに位置し得る。
【００３８】
[0082]  本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、光が通過する際に光を実質的に変化させることなく可視光を透過させる材料を意味する。
【００３９】
[0083]  本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本開示に従って分離及び／又は操作され得る任意の微視的物体を意味する。限定されるものではないが、微小物体の例としては、無生物微小物体、例えばマイクロ粒子、マイクロビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）、磁気ビーズ、マイクロロッド、マイクロワイヤ、量子ドット等、生物学的微小物体、例えば細胞、生物オルガネラ、ベシクル又は複合体、合成ベシクル、リポソーム（例えば、合成又は膜調製物由来）、脂質ナノラフト等、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞付着マイクロビーズ、リポソームコーティングマイクロビーズ、リポソームコーティング磁気ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、共有結合又は非共有結合で結合された部分／分子、例えば検出可能な標識、タンパク質、炭水化物、抗原、低分子シグナリング部分又はアッセイで使用可能な他の化学的／生物学的種を含み得る。脂質ナノラフトは、例えば、Ritchie et al.(2009) “Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,” Methods Enzymol., 464:211-231に記載されている。
【００４０】
[0084]  本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、「生体細胞」という用語と同義的に使用される。限定されるものではないが、生体細胞の例としては、真核細胞、植物細胞、動物細胞、例えば哺乳動物細胞、爬虫動物細胞、トリ細胞、サカナ細胞等、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞等、組織、例えば筋肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経の組織等から解離させた細胞、免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等、胚（例えば、接合体）、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞系細胞、癌細胞、感染細胞、トランスフェクト及び／又はトランスフォーム細胞、レポーター細胞等が挙げられる。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長動物等に由来し得る。
【００４１】
[0085]  コロニー中の複製可能な生細胞の全てが単一の親細胞に由来する娘細胞である場合、生体細胞のコロニーは、「クローン」である。特定の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、１０回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、１４回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、１７回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの全ての娘細胞は、２０回以下の分裂によって単一の親細胞から派生される。「クローン細胞」という用語は、同一のクローンコロニーの細胞を意味する。
【００４２】
[0086]  本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、２個以上の細胞（例えば、約２〜約２０、約４〜約４０、約６〜約６０、約８〜約８０、約１０〜約１００、約２０〜約２００、約４０〜約４００、約６０〜約６００、約８０〜約８００、約１００〜約１０００個の細胞又は１０００個超の細胞）を意味する。
【００４３】
[0087]  本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞の生存及び／又は増殖を続けるのに必要な条件を提供する、流体及び気体の両方の成分と任意選択的に表面とを含む環境を提供することを意味する。
【００４４】
[0088]  本明細書で使用される場合、細胞を参照するときの「増殖させる」という用語は、細胞数が増加することを意味する。
【００４５】
[0089]  流体培地の「成分」は、溶媒分子、イオン、低分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝物等をはじめとする培地中に存在する任意の化学分子又は生化学分子である。
【００４６】
[0090]  本明細書で使用される場合、「捕捉部分」は、微小物体に対する認識部位を提供する化学的若しくは生物学的種、官能基又はモチーフである。所定のクラスの微小物体は、インサイチュで生成された捕捉部分を認識し得、インサイチュで生成された捕捉部分に結合し得るか又はそれに対して親和性を有し得る。限定されるものではないが、例としては、抗原、抗体及び細胞表面結合モチーフが挙げられる。
【００４７】
[0091]  本明細書で使用される場合、単一ヌクレオチドを表すために用いられる「Ｂ」は、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、及びＴ（チミジン）のヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであるが、Ａ（アデニン）を含まない。
【００４８】
[0092]  本明細書で使用される場合、単一ヌクレオチドを表すために用いられる「Ｈ」は、Ａ、Ｃ、及びＴから選択されるヌクレオチドであるが、Ｇを含まない。
【００４９】
[0093]  本明細書で使用される場合、単一ヌクレオチドを表すために用いられる「Ｄ」は、Ａ、Ｇ、及びＴから選択されるヌクレオチドであるが、Ｃを含まない。
【００５０】
[0094]  本明細書で使用される場合、単一ヌクレオチドを表すために用いられる「Ｖ」は、Ａ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチドであるが、Ｔを含まない。
【００５１】
[0095]  本明細書で使用される場合、単一ヌクレオチドを表すために用いられる「Ｎ」は、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴから選択されるヌクレオチドである。
【００５２】
[0096]  本明細書で使用される場合、単一ヌクレオチドを表すために用いられる「Ｓ」は、Ｇ及びＣから選択されるヌクレオチドである。
【００５３】
[0097]  本明細書で使用される場合、単一ヌクレオチドを表すために用いられる「Ｙ」は、Ｃ及びＴから選択されるヌクレオチドである。
【００５４】
[0098]  本明細書で使用される場合、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇに続く「＊」は、そのヌクレオチドのリン酸結合のホスホロチオエート（phosophorothioate）置換を意味する。
【００５５】
[0099]  本明細書で使用される場合、ＩｓｏＧはイソグアノシンであり、ＩｓｏＣはイソシチジンであり、ＩｓｏｄＧはイソグアノシンデオキシリボヌクレオチドであり、且つＩｓｏｄＣはイソシチジンデオキシリボヌクレオチドである。イソグアノシン及びイソシチジンのリボ−又はデオキシリボ−ヌクレオチド（nuleotides）のそれぞれは、通常はＲＮＡ又はＤＮＡにそれぞれ組み込まれたグアニンヌクレオ塩基又はシトシンヌクレオ塩基に対する異性体のヌクレオ塩基を含有する。
【００５６】
[00100]  本明細書で使用される場合、ｒＧとは、それ以外はデオキシリボヌクレオチドを含有する核酸に含まれるリボヌクレオチドを意味する。全てリボヌクレオチドを含有する核酸は、各ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す表示を含まないかもしれないが、文脈上明らかにされる。
【００５７】
[00101]  本明細書で使用される場合、「プライミング配列」とは、より大きなオリゴヌクレオチドの一部であると共にプライミング配列が遊離３’末端を含むようにより大きなオリゴヌクレオチドから分離されたときにＤＮＡ（又はＲＮＡ）重合反応でプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド配列のことである。
【００５８】
[0102]  本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）を意味し、これは、霊長動物化（例えば、ヒト化）、ネズミ、マウス−ヒト、マウス−霊長動物、並びにキメラのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含み、且つインタクト分子、そのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ファブ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２フラグメント）、或いはインタクト分子及び／又はフラグメントのマルチマー若しくはアグリゲートであり得、天然に存在し得るか、又は免疫化、合成、遺伝子工学等によって生成され得る。「抗体フラグメント」は、本明細書で使用される場合、抗原に結合し、且つ幾つかの実施形態ではガラクトース残基の導入等によってクリアランス及び取込みを促進する構造特徴部を呈するように誘導体化され得る、抗体に由来する又は関連するフラグメントを意味する。これは、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）及びそれらの組合せを含む。
【００５９】
[00103]  本明細書でいう抗原とは、Ａｇ特異的受容体等の他の分子に特異的に結合可能な分子又はその一部分のことである。抗原は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等）等の生物内で免疫反応を誘導可能であり得るが、抗原は、かかる免疫反応を単独で誘導するには不十分なこともあり得る。抗原は、コンフォメーショナルエピトープや線状分子断片等の分子の任意の一部分であり得ると共に、多くの場合、適応免疫系のきわめて多様な抗原受容体（Ｂ細胞受容体又はＴ細胞受容体）により認識可能である。抗原は、ペプチド、多糖、又は脂質を含み得る。抗原は、抗体の可変Ｆａｂ領域への結合能により特徴付けられ得る。異なる抗体は、抗原表面上に存在する異なるエピトープを区別する潜在能力を有し、その構造は、低分子であり得るハプテンの存在によりモジュレートされ得る。
【００６０】
[00104]  幾つかの実施形態では、抗原は癌細胞関連抗原である。癌細胞関連抗原は単純型又は複合型であり得る。また、抗原は、タンパク質、炭水化物基若しくは炭水化物鎖、タンパク質や炭水化物以外の生物学剤若しくは化学剤、又はそれらの任意の組合せ上のエピトープであり得ると共に、エピトープは、リニア又はコンフォメーショナルであり得る。
【００６１】
[00105]  癌細胞関連抗原は、癌細胞（例えば、１つ以上の特定のタイプの癌細胞）を一義的に同定する又は正常細胞での発現と比較して癌細胞でアップレギュレートされる抗原であり得る。典型的には、癌細胞関連抗原は、癌細胞の表面上に存在するので、抗体により確実に認識可能である。抗原は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載の腫瘍に見いだし得る任意のタイプの癌細胞を含めて、任意のタイプの癌細胞に関連付け可能である。特に、抗原は、肺癌、乳癌、黒色腫等に関連付け可能である。本明細書で使用される場合、「癌細胞に関連付けられる」という用語は、抗原に関連して用いられるとき、抗原が癌細胞により直接産生されること又は癌細胞と正常細胞との間の相互作用により生じることを意味する。
【００６２】
[00106]  流体培地を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」又は「拡散」は、流体培地の成分が濃度勾配の下方に熱力学的に移動することを意味する。
【００６３】
[00107]  「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因する流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、点間の圧力差に起因する一方の点から他方の点への流体培地の移動を含み得る。かかるフローは、液体の連続フロー、パルスフロー、周期フロー、ランダムフロー、間欠フロー若しくは往復フロー又はそれらの任意の組合せを含み得る。一方の流体培地が他方の流体培地に流入する場合、培地の乱流及び混合を生じ得る。
【００６４】
[00108]  「実質的にフローなし」という語句は、時間平均で流体培地中への又は流体培地中での材料の成分（例えば、対象のアナライト）の拡散速度未満の流体培地の流速を意味する。かかる材料の成分の拡散速度は、例えば、温度、成分のサイズ及び成分と流体培地との間の相互作用の強度に依存し得る。
【００６５】
[00109]  マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体接続される」という語句は、異なる領域が流体培地等の流体で実質的に充填されたときに各領域内の流体が単一体の流体を形成するように接続されることを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体培地）が必ずしも同一の組成であることを意味するものではない。より正確には、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続領域内の流体は、溶質がそのそれぞれの濃度勾配の下方に移動するとき及び／又はマイクロ流体デバイスを貫流するときに流束内で異なる組成（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン、他の分子等の溶質の濃度が異なる）を有し得る。
【００６６】
[00110]  本明細書で使用される場合、「流路」は、培地のフローのトラジェクトリーを規定し且つその対象となる１つ以上の流体接続回路要素（例えば、チャネル、領域、チャンバ等）を意味する。そのため、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路の培地のフローの対象とならない流路を含む回路要素に流体接続され得る。
【００６７】
[00111]  本明細書で使用される場合、「微小物体を分離する」は、マイクロ流体デバイス内の画定領域に微小物体を閉じ込めることである。
【００６８】
[00112]  マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域と「非掃引」領域とを含み得る。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに培地のフローにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の１つ以上の流体相互接続回路要素を含む。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル及びチャンバの全部又は一部を含み得る。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに実質的に流体のフラックスなしにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の１つ以上の流体相互接続回路要素を含む。拡散を可能とするが、掃引領域と非掃引領域との間で培地が実質的にフローなしとなるように流体接続が構造化される限り、非掃引領域は、掃引領域に流体接続され得る。そのため、マイクロ流体デバイスは、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に拡散流体連通のみを可能にしつつ、掃引領域内の培地のフローから非掃引領域を実質的に分離するように構造化され得る。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは、掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（以下に更に詳細に記載される）は、非掃引領域の例である。
【００６９】
[00113]  マイクロ流体環境内における１つ以上の細胞からのｇＤＮＡシーケンシングライブラリの作製。マイクロ流体デバイス内で培養、観測、又は表現型決定が行われる細胞の物理的位置を相互参照してＤＮＡシーケンシングデータを発生させることは、現在利用可能なシーケンシングストラテジーに対するきわめて望ましい改善である。ｇＤＮＡをシーケンスする理由としては、細胞のＤＮＡ内の変異又は突然変異の特徴付け、遺伝子編集イベントのアセスメント、及びクローン性のプロセス検証が挙げられる。シーケンシングデータをＤＮＡが分離された特定の細胞に相関付ける能力は、これまで利用可能でなかった。
【００７０】
[00114]  マイクロ流体デバイス内でインサイチュでも、得られたシーケンシングデータからも、読取り可能なバーコード配列を導入する、マイクロ流体デバイス内で細胞からＤＮＡシーケンシングライブラリを作製するワークフローが本明細書に記載されている。マイクロ流体環境内でバーコードを解読できれば、ゲノムデータと細胞表現型との関連付けが可能になる。図４に示されるように、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内の隔離ペン４０５内に生体細胞４１０を配置し、そこで維持してアッセイを行い得る。アッセイ時（限定されるものではないが細胞表面マーカー４１５を検出するアッセイであり得る）、試薬４２０（例えば抗体であり得る）は、４１５と記された細胞表面に結合してそうした結合時に検出可能シグナル４２５の検出を可能にし得る。この表現型は、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列４３５を含む捕捉物体４３０で細胞４１０から放出された核酸を捕捉する本明細書に記載の方法を用いて、その特定の生体細胞４１０からのゲノムデータに結び付けることが可能である。バーコード４３５は、本明細書に記載の検出法で蛍光プローブ４４０によりインサイチュで検出可能である。捕捉物体４３０に捕捉された放出された核酸は、シーケンシングライブラリを作製するために使用可能であり、このライブラリは、シーケン時に生体細胞４０５の放出された核酸からのゲノム情報と関連バーコード４３５の配列との両方を含むシーケンシングデータ４４５を提供する。こうして表現型とゲノムデータとの相関付けが提供される。この能力は、図４Ｂに示されるワークフロー全体へのエントリーを提供する。例えば、遺伝子編集４５０、機能／表現型アッセイ又は標識アッセイ４５５を含み得る経路を通り抜ける細胞は、細胞培養４６０の前、その後、又はその時のいずれかに、バーコード付き捕捉ビーズ４７０を用いて関連付けプロセス４６５に入ってから、ＲＮＡ（４７５）及び／又はＤＮＡ（４８０）を捕捉すると共に、元の方向に原細胞に関連付けられるＲＮＡ−ｓｅｑ４８２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ｓｅｑ４８４、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）−ｓｅｑ４８６、又はＤＮＡ  ｓｅｑ（４８８）のデータを提供し得る。細胞がクローン集団の一部である場合、陽性クローン搬出４９０をもたらし得る。
【００７１】
[00115]  更に、ＲＮＡ捕捉／ライブラリ作製及びＤＮＡ捕捉／ライブラリ作製のために本明細書に記載のプロトコルを用いることにより、同一の単一細胞からＲＮＡ及びＤＮＡの両方のシーケンシング結果が得られ得ると共に、シーケンスされたＲＮＡ及びＤＮＡの特定の単一細胞源のマイクロ流体デバイス内の位置への関連付けを行い得る。
【００７２】
[00116]  図５に模式的に示されるように、蛍光を用いて個別にデコードされるカセット化可能（例えば、幾つかの実施形態では完全に互換性であり得る変更可能サブユニット４３５ａ、４３５ｂ、４３５ｃ、４３５ｄ）サブバーコード又は「ワード」を用いて設計されるＤＮＡバーコード５２５が本明細書に記載されている。バーコードの検出は、相補的蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれを検出することによりインサイチュで実施し得る。ここに示されるように、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列４３５ａは、フルオロフォアFluor1を含むハイブリダイゼーションプローブ４４０ａを用いたハイブリダイゼーションによりインサイチュで検出される。それぞれ、第２のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列４３５ｂは、ハイブリダイゼーションプローブ４４０ｂ（Fluor2を含む）により同様に検出し得るし、第３のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列４３５ｃは、Fluor3を有するハイブリダイゼーションプローブ４４０ｃにより検出し得るし、第４のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列４３５ｄは、Fluor4を有するハイブリダイゼーションプローブ４４０ｃにより検出し得る。フルオロフォアFluor1、Fluor2、Fluor3、及びFluor4のそれぞれはスペクトル識別可能であるので、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列ごとの明確な同定が可能である。
【００７３】
[00117]  図５に例示される方法では、プライミング配列５２０と共にそれぞれＤＮＡバーコード５２５を含む複数の捕捉オリゴヌクレオチド（複数の単一捕捉オリゴヌクレオチド５５０が示される）を有するビーズ５１０を含む捕捉物体４３０は、１つの細胞４１０／１つの細胞コロニー（図示せず）に対して１つの捕捉物体４３０／１つのバーコード５２５として各隔離ペン４０５に導入し得る。
幾つかの他の実施形態では、検査下の生体細胞からより大量の核酸を捕捉するために２つ以上の捕捉物体を隔離ペン内に配置し得る。
【００７４】
[00118]  プライミング配列５２０、バーコード５２５、任意選択的ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）５２５、及び捕捉配列５３５を含む捕捉オリゴヌクレオチド５５０にリンカー５１５を介して結合されたビーズ５１０を含む捕捉物体４３０により、溶解時に生体細胞４１０から放出された核酸（放出された核酸はＲＮＡ５０５であり得る）を捕捉する模式図が図５に示される。この例では、バーコード５２５は、４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列４３５ａ、４３５ｂ、４３５ｃ、及び４３５ｄを含む。この例では、捕捉オリゴヌクレオチドの捕捉配列５３５は、放出された核酸５０５のポリＡセグメントにハイブリダイズすることにより、放出された核酸５０５を捕捉する。
【００７５】
[00119]  溶解させる細胞は、ライブラリ作製及びシーケンシングのためにマイクロ流体デバイスに特定的に搬入し得るか又は任意の望ましい時間にわたり維持した状態でマイクロ流体デバイス内に存在し得るかのいずれかであり得る。
【００７６】
[00120]  捕捉物体。捕捉物体は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る。前記複数のそれぞれは、プライマー結合配列であるプライミング配列と、捕捉配列と、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列であって、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である、バーコード配列と、を含む。種々の実施形態では、捕捉物体は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る。各捕捉オリゴヌクレオチドは、最も５’側のヌクレオチド及び最も３’側のヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、プライミング配列は、前記最も５’側のヌクレオチドに隣接し得るか又はそれを含む。種々の実施形態では、捕捉配列は、前記最も３’側のヌクレオチドに隣接し得るか又はそれを含む。典型的には、バーコード配列は、プライミング配列の３’側且つ捕捉配列の５’側に位置し得る。
【００７７】
[00121]  捕捉物体組成。典型的には、捕捉物体は、負のＤＥＰ力等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いた移動に適するような組成を有する。例えば、捕捉物体は、常磁性材料、高分子材料、及び／又はガラスを含むコアを有するビーズ（又は類似の物体）であり得る。高分子材料は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合するように機能し得るポリスチレン又は任意の他のプラスチック材料であり得る。捕捉物体のコア材料は、官能化ポリマーを含み得る捕捉オリゴヌクレオチドにリンカーを付着するのに好適な材料を提供するように被覆し得るが、他の構成も可能である。捕捉オリゴヌクレオチドを捕捉物体に結合するために使用されるリンカーは、当技術分野で公知の任意の好適なリンカーであり得る。リンカーは、アミド基、エーテル基、ケト基等の官能基で置換されていなくても置換されていてもそれらが介在していても介在していなくてもよい望ましい物理化学的性質を提供し得る炭化水素鎖を含み得る。リンカーは、リンカーに結合された捕捉オリゴヌクレオチドの末端近傍のプライミング部位に処理酵素がアクセスできるように十分な長さを有し得る。捕捉オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のようにリンカーに共有結合又は非共有結合し得る。限定されるものではないがリンカーへの非共有結合の例としては、ビオチン／ストレプトアビジン対によるものが挙げられる。
【００７８】
[00122]  本明細書に記載の任意のマイクロ流体デバイスのフロー領域のフローチャネルを介する貫流及び隔離ペンに対する流出入に十分な程度に小さなものである限り、捕捉物体は任意の好適なサイズであり得る。更に、捕捉物体は、それに結合される捕捉オリゴヌクレオチドの数を十分に多くしてシーケンシングに有用な核酸ライブラリを作製するのに十分な量で核酸を捕捉し得るように選択し得る。幾つかの実施形態では、捕捉物体は、球状又は部分的に球状のビーズであり得ると共に約５μｍ超且つ約４０μｍ未満の直径を有する。幾つかの実施形態では、球状又は部分的に球状のビーズは、約５、約７、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、又は約２６μｍの直径を有し得る。
【００７９】
[00123]  典型的には、捕捉物体に結合される各捕捉オリゴヌクレオチドは同一のバーコード配列を有し、多くの実施形態では、各捕捉物体はユニークバーコード配列を有する。各捕捉ビーズ上でユニークバーコードを有する捕捉ビーズを用いて、捕捉物体が配置される隔離ペンのユニークな同定を可能にする。複数の細胞が（多くの場合１つずつ）隔離ペン内に配置される実験では、捕捉物体も複数送達され、占有隔離ペンに１隔離当たり１つの捕捉ビーズが配置される。複数の捕捉ビーズのそれぞれはユニークバーコードを有し、且つバーコードは、マイクロ流体デバイス内に存在する他のいずれの捕捉の他のいずれのバーコードとも非同一である。結果として、隔離ペン内の１つの細胞（又は幾つかの実施形態では複数の細胞）は、そのシーケンシングライブラリに組み込まれたユニークバーコード識別子を有するであろう。
【００８０】
[00124]  バーコード配列。バーコード配列は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み得ると共に、そのそれぞれは、バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である。バーコード配列のセット内のいずれか１つのバーコード配列のｎ（例えば３つ以上）のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列がバーコード配列のセット内のいずれかの他のバーコード配列のｎ’（例えば３つ以上）のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に完全にオーバーラップしない限り、バーコード配列はセット内の他のバーコード配列と非同一であり、セット内の各バーコード配列がセット内の他の全てのバーコード配列と少なくとも１つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列だけ異なる限り、部分的なオーバーラップ（例えばｎ−１まで）は許容し得る。特定の実施形態では、バーコード配列は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列からなる（又はそれらから本質的になる）。本明細書で使用される場合、「カセット化可能オリゴヌクレオチド配列」とは、オリゴヌクレオチド配列の規定のセット（例えば、１２以上のオリゴヌクレオチド配列のセット）の１つであるオリゴヌクレオチド配列のことであり、規定のセット内の各オリゴヌクレオチド配列に対して、相補的オリゴヌクレオチド配列（本明細書の他の箇所に記載されるようにハイブリダイゼーションプローブの一部であり得る）は、オリゴヌクレオチド配列の規定のセット内の他のオリゴヌクレオチド配列のいずれにも実質的にハイブリダイズしない。特定の実施形態では、規定のセット内のオリゴヌクレオチド配列は全て（又は実質的に全て）、同一の長さ（又はヌクレオチド数）を有するであろう。例えば、規定のセット内のオリゴヌクレオチド配列は全て、１０ヌクレオチドの長さを有し得る。しかし、約６ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドの範囲内の他の長さも、本発明で使用するのに好適である。そのため、例えば、規定のセット内の実質的に全てのオリゴヌクレオチド配列に対して、規定のセット内の各オリゴヌクレオチド配列は、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、又は１５ヌクレオチドの長さを有し得る。代替的に、規定のセット内の各オリゴヌクレオチド配列又は実質的に全てのオリゴヌクレオチド配列は、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１２、１２〜１４、又は１３〜１６ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００８１】
[00125]  各オリゴヌクレオチド配列は、（ｉ）バーコード配列のシーケンシング及び（ｉｉ）カセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を含有するプローブ（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ）を用いたハイブリダイゼーション反応の実施の両方により検出可能なそのユニークヌクレオチド配列に基づいてバーコード配列中に存在するとして特定的に同定可能であるので、オリゴヌクレオチド配列の規定のセットから選択される各オリゴヌクレオチド配列（ひいてはバーコード配列）は、規定のセット内の他のオリゴヌクレオチド配列（ひいてはバーコード配列）と「非同一」であるといえる。
【００８２】
[00126]  幾つかの実施形態では、バーコード配列の３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、介在オリゴヌクレオチド配列を何ら含むことなくタンデムに結合される。他の実施形態では、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、カセット化可能オリゴヌクレオチドの１つとその近接カセット化可能オリゴヌクレオチドとの間に直接結合でない１つ以上の結合を有し得る。３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のいずれかの間のかかる結合は、全合成ではなくライゲーションによる合成を容易にするために存在し得る。しかし、種々の実施形態では、カセット化可能オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列には、１つ以上のプライミング配列、任意選択的インデックス配列、任意選択的ユニーク分子識別子配列、又は限定されるものではないがＮｏｔ１制限部位配列をはじめとする任意選択的制限部位を形成する他のオリゴヌクレオチド配列のいずれの他の配列も介在しない。
【００８３】
[00127]  カセット化可能オリゴヌクレオチド配列及びその相補的オリゴヌクレオチド配列（かかる相補的オリゴヌクレオチド配列の全部又は一部を含有するハイブリダイゼーションプローブを含めて）との関連で本明細書で使用される場合、「実質的にハイブリダイズする」という用語は、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列とその相補的オリゴヌクレオチド配列と間のハイブリダイゼーションのレベルが閾値レベルを超えることを意味する。ただし、閾値レベルは、相補的オリゴヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチド配列の規定のセット内のいずれの他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列との間のクロスハイブリダイゼーションのレベルよりも大きく且つそれと実験的に識別可能である。当業者であれば容易に理解されるであろうが、相補的オリゴヌクレオチド配列が特定のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に実質的にハイブリダイズするかしないかを決定する閾値は、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列の長さ、ハイブリダイゼーション反応が行われる溶液の成分、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度、及びハイブリダイゼーションを検出するために使用される標識（相補的オリゴヌクレオチド配列に結合し得る）の化学的性質をはじめとする幾つかの因子に依存する。出願人は、非同一のオリゴヌクレオチド配列の規定のセットに使用可能な例示的条件を提供したが、当業者であれば好適な追加条件を容易に同定可能である。
【００８４】
[00128]  ３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、少なくとも１２のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットから選択し得る。例えば、セットは、少なくとも１２、１５、１６、１８、２０、２１、２４、２５、２７、２８、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４０、４２、４４、４５、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５７、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８１、８４、８５、８７、８８、９０、９２、９３、９５、９６、９９、１００の、又はそれ以上を含み得る（上記の任意の間の任意の数を含めて）。
【００８５】
[00129]  表１に示される４０のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットの配列番号１〜４０は、１０マーのオリゴヌクレオチドを用いたインサイチュ検出法に使用するように設計されたものであり、検出時のフルオロフォアプローブハイブリダイゼーションを最適に行える。１０マーの少なくとも６塩基は、検出法におけるミスアニーリングを防止するために差別化される。セットは、Comai lab:(http://comailab.genomecenter.ucdavis.edu/index.php/Barcode_generator)製のバーコードジェネレーターpython scriptを用いて設計され、示された配列の更なる選択は、２８℃以上のＴｍ（融解温度）を有する配列の選択に基づくものであった。Ｔｍ計算は、IDT OligoAnalyzer 3.1(https://www.idtdna.com/calc/analyzer)を用いて実施された。
【００８６】
【表１】
2019528762.tif 000003
【００８７】
[00131]  種々の実施形態では、バーコード配列の３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、配列番号１〜４０のいずれか１つの配列を有し、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチドには同一のものはない。カセット化可能配列は、捕捉オリゴヌクレオチド内に任意の順序で提示し得ると共に、その順序は、インサイチュ検出を変化させず、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの配列は、シーケンシングリードからデコンボリューション可能である。幾つかの実施形態では、バーコード配列は４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を有し得る。
【００８８】
[00132]  幾つかの実施形態では、バーコードの第１のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１〜４０の第１のサブセットから選択される配列を有し、バーコードの第２のカセット化可能配列は、配列番号１〜４０の第２のサブセットから選択される配列を有し、バーコードの第３のカセット化可能配列は、配列番号１〜４０の第３のサブセットから選択される配列を有し、且つバーコードの第４のカセット化可能配列は、配列番号１〜４０の第４のサブセットから選択される配列を有する。
【００８９】
[00133]  幾つかの実施形態では、バーコードの第１のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１〜１０のいずれか１つの配列を有し、バーコードの第２のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１１〜２０のいずれか１つの配列を有し、バーコードの第３のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号２１〜３０のいずれか１つの配列を有し、且つバーコードの第４のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号３１〜４０のいずれか１つの配列を有する。幾つかの実施形態では、バーコードの第１のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１〜１０のいずれか１つの配列を有し、バーコードの第２のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１１〜２０のいずれか１つの配列を有し、バーコードの第３のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号２１〜３０のいずれか１つの配列を有し、且つバーコードの第４のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号３１〜４０のいずれか１つの配列を有し、第１、第２、第３、及び第４のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、バーコード配列の５’→３’方向に順に捕捉オリゴヌクレオチドの長さに沿って位置する。すなわち、第１のカセット化可能オリゴヌクレオチドは、第２のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の５’側にあり、以下順に第２は第３のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の５’側に位置し、第３は第４のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の５’側に位置するであろう。これは図６に模式的に示される。この場合、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列Ｇ１〜Ｇ１０の１つは、第１のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列位置に位置し、Ｙ１〜Ｙ１０配列の１つは、第２のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列位置に配置し、Ｒ１〜Ｒ１０配列の１つは、第３のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列位置に配置し、且つＢ１〜Ｂ１０配列の１つは、バーコードの第４のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列位置に配置する。しかし、この順序は問題ではなく、存在又は不在を決定するインサイチュ検出及びシーケンシングリードは提示された順序に依拠しない。
【００９０】
[00134]  キャプチャー配列。捕捉物体は、核酸を捕捉するように構成された捕捉配列を含む。捕捉配列は、約６〜約５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列である。幾つかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチド配列は、対象細胞から放出された核酸にハイブリダイズすることにより核酸を捕捉する。限定されるものではないが一例としては、３’末端にポリＡを有するＲＮＡ断片を捕捉可能且つそれにハイブリダイズ可能なポリＴ配列（約３０〜約４０ヌクレオチドを有する）が挙げられる。ポリＴ配列は、その３’末端に２つのヌクレオチドＶＮを更に含有し得る。捕捉オリゴヌクレオチドの他の例としては、相補的核酸にハイブリダイズするようにひいてはそれを捕捉するように混合物で使用し得るランダムヘキサマー（「ランダマー」）が挙げられる。代替的に、Ｂ細胞受容体配列やＴ細胞受容体配列等の核酸の標的化捕捉のために遺伝子特異的配列の相補体を使用し得る。
【００９１】
[00135]  他の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチド配列は、リコンビナーゼ／ポリメラーゼ指向鎖伸長を介して認識可能末端配列をシェパードして適切にタグ付けされた放出核酸を効果的に「捕捉」することによりシーケンシングアダプター、バーコード、及びインデックスを付加するように、細胞から放出された核酸を捕捉するために使用し得る。このタイプの捕捉オリゴヌクレオチド配列の例としては、当技術分野で公知のようにモザイク末端（ＭＥ）配列又は他のタグメンテーションインサート配列が挙げられる。モザイク末端インサート配列は、トランスポゾンにより容易に認識される短いオリゴヌクレオチドであり、核酸断片にプライミング／タギングを提供するために使用可能である。この目的に好適なオリゴヌクレオチド配列は、約８ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドを含有し得る。幾つかの実施形態では、ＭＥ＋追加インサート配列は、約３３ヌクレオチド長であり得ると共に、Nextera DNA Library Prep Kit、Illumina、カタログ番号15028212等の市販のタグメンテーションキットの使用により挿入可能である。この実施形態では、捕捉配列により実施される捕捉は、ハイブリダイゼーションイベントではなく、タグメント化ＤＮＡ断片を対象とした捕捉オリゴヌクレオチド、タグ付きＤＮＡ、並びにプライミング配列、バーコード配列及び任意の他のインデックス、アダプター、又は限定されるものではないがＮｏｔ１制限部位配列等の機能部位に対するリコンビナーゼ／ポリメラーゼ機構の間のシェパーディング・ダイレクティング相互作用である（以下で考察される）。シェパーディング・ダイレクティング相互作用は、放出核酸を捕捉するためにハイブリダイゼーション相互作用を用いた以上に記載のｃＤＮＡ産物と等価な産物を提供する。いずれの場合も、この時点で少なくともシーケンシングアダプター及びバーコードを含む拡張核酸断片が放出核酸から提供され、増幅更にはシーケンシングライブラリ適合化が可能になると共に、シーケンスされたバーコード及びサンプル核酸のリードの取得が可能になる。
【００９２】
[00136]  プライミング配列。捕捉物体の捕捉オリゴヌクレオチドはプライミング配列を有し、プライミング配列は捕捉オリゴヌクレオチドに隣接し得るか又はその最も５’側のヌクレオチドを含む。プライミング配列は、ジェネリック又は配列特異的プライミング配列であり得る。プライミング配列は、結合時に逆転写酵素又はポリメラーゼをプライミングするプライマーに結合し得る。幾つかの実施形態では、ジェネリックプライミング配列は、Ｐ７（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ３’（配列番号１０７））プライマー又はＰ５（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ３’（配列番号１０８））プライマーに結合し得る。
【００９３】
[00137]  他の実施形態では、ジェネリックプライミング配列は、以下：
５’−Ｍｅ−ｉｓｏｄＣ／／Ｍｅ−ｉｓｏｄＧ／／Ｍｅ−ｉｓｏｄＣ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣｒＧｒＧｒＧ３−’（配列番号１０３）、
５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’（配列番号１０４）、
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴ  ＡＣＡＣＧＡＣＧＣ−３’（配列番号１０５）、
５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣ  Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ−３’（配列番号１０６）、
５’−／５ＢｉｏｔｉｎＴＥＧ／ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＧ−ＧＣＴＣＧ＊Ｇ−３’（配列番号１０９）、
５’／５ＢｉｏｔｉｎＴＥＧ／ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＴＡＣＧＧＴＣＴＣＧＴＧ−ＧＧＣＴＣＧ＊Ｇ−３’（配列番号１１０、及び
５’−／５ＢｉｏｔｉｎＴＥＧ／ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＴＡＣＧＧＴＣＴＣＧＴＧ−ＧＧＣＴＣＧ＊Ｇ（配列番号１１１）
の配列の１つを有するプライマーに結合し得る。
【００９４】
[00138]  追加のプライミング配列及び／又はアダプター配列。捕捉オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長用ランディング部位又は大規模並列シーケンシングアレイ若しくはフローセル内に相補的ハイブリダイジングアンカー部位を固定するための部位のいずれかを提供する１つ以上の追加のプライミング／アダプター配列を任意選択的に有し得る。
【００９５】
[00139]  任意選択的オリゴヌクレオチド配列。捕捉オリゴヌクレオチドの複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を任意選択的に更に含み得る。複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、捕捉物体の他の捕捉オリゴヌクレオチドとは異なるＵＭＩを有し得ると共に、多くの増幅された配列とは対照的にユニーク捕捉の同定を可能にする。幾つかの実施形態では、ＵＭＩは、プライミング配列の３’側且つ捕捉配列の５’側に位置し得る。ＵＭＩ配列は、約５〜約２０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドであり得る。幾つかの実施形態では、ＵＭＩ配列のオリゴヌクレオチド配列は、約１０ヌクレオチドを有し得る。
【００９６】
[00140]  幾つかの実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドの各捕捉オリゴヌクレオチドはまた、Ｎｏｔ１制限部位配列（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号１６０）を含み得る。Ｎｏｔ１制限部位配列は、捕捉オリゴヌクレオチドの捕捉配列の５’側に位置し得る。幾つかの実施形態では、Ｎｏｔ１制限部位配列は、捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列の３’側に位置し得る。
【００９７】
[00141]  他の実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドの各捕捉オリゴヌクレオチドはまた、プールインデックス配列等の追加の指標を含み得る。インデックス配列は、１つの実験に属する捕捉物体のセットをユニークに同定する４〜１０オリゴヌクレオチドの配列であり、幾つかの異なる実験からのシーケンシングライブラリを組み合わせたマルチプレックスシーケンシングを行って、シーケンシングデータのデコンボリューション並びに適正実験及びそれに関連する捕捉物体への元の方向の相関付けを可能にしつつ、シーケンシングランコスト及び時間の節約を可能にする。
【００９８】
[00142]  限定されるものではないが、幾つかの例示的な捕捉物体が表２に例示される。ここでは、明確さを期して１つの捕捉オリゴヌクレオチドのみが示されている。プライミング配列と、バーコードと、ＵＭＩと、ＲＮＡを捕捉するための捕捉配列と、を含む捕捉物体は、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、又は配列番号１００を有する捕捉物体であり得る。プライミング配列と、バーコードと、ＵＭＩと、Ｎｏｔ１配列と、ＲＮＡを捕捉するための捕捉配列と、を含む捕捉物体は、配列番号１０１又は配列番号１０２を有する捕捉物体であり得る。
【００９９】
【表２】
2019528762.tif 000004
【０１００】
[00144]  複数の捕捉物体。マルチプレックス核酸捕捉に使用される複数の捕捉物体が提供される。複数の捕捉物体のそれぞれは、本明細書に記載の任意の捕捉物体に係る捕捉物体であり、複数の捕捉物体のそれぞれに対して、その捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドは、同一のバーコード配列を有し、複数の捕捉物体のそれぞれの捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列は、複数の他の全ての捕捉物体の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列とは異なる。幾つかの実施形態では、複数の捕捉物体は、少なくとも２５６の捕捉物体を含み得る。他の実施形態では、複数の捕捉物体は、少なくとも１０，０００の捕捉物体を含み得る。複数の捕捉物体の構築を示す模式図が図６に示される。捕捉物体６３０は、リンカー５１５を介して捕捉オリゴヌクレオチド５５０が付着されたビーズ５１０を有する。リンカー５１５は、捕捉オリゴヌクレオチド５５０の５’末端、特にプライミング配列５２０の５’末端に付着される。リンカー５１５及びプライミング配列５２０（ここでは３３ｂｐ長として示される）は、この例では、全ての捕捉物体の全ての捕捉オリゴヌクレオチドに共通であるが、他の実施形態では、リンカー及び／又はプライミング配列は、捕捉物体上の異なる捕捉オリゴヌクレオチドに対して異なり得るか、又は代替的にリンカー及び／又はプライミング配列は、複数の異なる捕捉物体に対して異なり得る。捕捉オリゴヌクレオチド５５０の捕捉配列５３５は、捕捉オリゴヌクレオチド５５０の３’末端に位置するか又はそれに近接する。限定されるものではないがこの例では、捕捉配列５３５は、放出させたＲＮＡをジェネリックに捕捉するポリＴ−ＶＮ配列として示される。幾つかの実施形態では、捕捉配列５３５は、複数の捕捉物体の全ての捕捉物体６３０の全ての捕捉オリゴヌクレオチド５５０に共通である。しかし、他の複数の捕捉物体では、捕捉物体６３０の複数の捕捉オリゴヌクレオチド５５０の各捕捉オリゴヌクレオチド上の捕捉配列５３５は、必ずしも同一であるとは限らない。この例では、任意選択的ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）５３０が存在し、且つ捕捉配列５３５の５’側、ただしプライミング配列５２０の３’側に位置する。この特定の例では、ＵＭＩ５３０は、捕捉オリゴヌクレオチドに沿ってバーコード配列５２５の３’側に位置する。しかし、他の実施形態では、ＵＭＩ５３０はバーコードの５’側に位置し得る。しかし、ＵＭＩ５３０は、増幅核酸産物に組み込まれるようにプライミング配列５２０の３’側に位置する。この例では、ＵＭＩ５３０は１０ｂｐ長である。ここでは、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号８４）の配列を有するＵＭＩ５３０が示される。一般に、ＵＭＩ５３０は、バーコード５２５のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列４３５ａ、４３５ｂ、４３５ｃ、４３５ｄのいずれとも同一でなくプライミング配列５２０とも同一でないことを前提条件として、任意のヌクレオチドのランダムな組合せで構成し得る。多くの実施形態では、ＵＭＩは、この場合に示されるように、捕捉配列５３５にオーバーラップする１０Ｔの配列を含まないように設計される。ＵＭＩ５３０は、各捕捉物体６３０の各捕捉オリゴヌクレオチド５５０に対してユニークである。幾つかの実施形態では、異なる捕捉物体６３０のバーコード５２５がシーケンシングリードのデコンボリューションを可能にするので、捕捉物体６３０の各捕捉オリゴヌクレオチド５５０のユニークＵＭＩ５３０は、複数の異なる捕捉物体６３０の捕捉オリゴヌクレオチド５５０内で使用し得る。
【０１０１】
[00145]  捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード５２５は、プライミング配列の３’側にあり、それぞれ１０ｂｐ長の４つのカセット化可能配列４３５ａ、４３５ｂ、４３５ｃ、及び４３５ｄを含有する。単一捕捉物体６３０上の複数の捕捉オリゴヌクレオチドの各捕捉オリゴヌクレオチド５５０は、同一のバーコード５２５を有し、複数の捕捉物体のバーコード５２５は、複数の捕捉物体６３０のそれぞれで異なる。捕捉物体のそれぞれのバーコード５２５の多様性は、以下に記載されるようにオリゴヌクレオチドの規定のセットからカセット化可能オリゴヌクレオチドの選択を行うことにより得られ得る。この例では、それぞれ１０の異なる可能な選択肢を含有するオリゴヌクレオチドの４つの規定のセットから各１つずつ選択することにより１０、０００の異なるバーコードを作製可能である。
【０１０２】
[00146]  カセット化可能オリゴヌクレオチド配列。カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載されるようにバーコード内で使用するために提供され、配列番号１〜４０のいずれか１つのオリゴヌクレオチド配列を有し得る。
【０１０３】
[00147]  バーコード配列。バーコード配列は、捕捉物体の捕捉オリゴヌクレオチド及び本明細書に記載の方法で使用するために提供され、バーコード配列は、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み得ると共に、バーコード配列の３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、配列番号１〜４０のいずれか１つの配列を有し、バーコード配列の各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である。バーコード配列は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、そのそれぞれは、バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である。特定の実施形態では、バーコード配列は、２つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列からなる（又はそれらから本質的になる）。バーコード配列のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所に記載される通りであり得る。例えば、２つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、オリゴヌクレオチド配列の規定のセット（例えば、１２以上のオリゴヌクレオチド配列のセット）の１つであり得ると共に、規定のセット内の各オリゴヌクレオチド配列に対して、相補的オリゴヌクレオチド配列は、規定のセット内の他のオリゴヌクレオチド配列のいずれにも実質的にハイブリダイズしない。特定の実施形態では、バーコード配列の２つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、６〜１５ヌクレオチド（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチド長）を含み得る。他の実施形態では、２つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、６〜１５ヌクレオチド（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５ヌクレオチド長）からなり得る（又は本質的になり得る）。更に他の実施形態では、バーコード配列の２つ以上のカセット化可能配列のそれぞれは、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、又は１３〜１５ヌクレオチドを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得る。具体的な実施形態では、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１〜４０により規定されるセットのいずれか１つであり得る。幾つかの実施形態では、バーコードは、３つ又は４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み得る。種々の実施形態では、バーコードの３つ又は４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、介在オリゴヌクレオチド配列を何ら含むことなくタンデムに結合される。他の実施形態では、３つ又は４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の１つ以上は、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列間に介在する１つ、２つ、又は３つのヌクレオチドを用いて結合一体化し得る。これはライゲーション化学を用いてカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を結合するときに有用である。幾つかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチド内の他の機能を有する他のヌクレオチド配列は、３つ又は４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の結合に介在しない。
【０１０４】
[00148]  バーコード配列のセット。セットの各バーコード配列が本明細書に記載の任意のバーコードに係る構造を有する少なくとも６４の非同一バーコード配列を含むバーコード配列のセットが提供される。本明細書で使用される場合、バーコード配列のセット内のいずれか１つのバーコード配列のｎ（例えば３つ以上）のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列がバーコード配列のセット内のいずれかの他のバーコード配列のｎ’（例えば３つ以上）のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に完全にオーバーラップしない限り、バーコード配列はセット内の他のバーコード配列と非同一であり、セット内の各バーコード配列がセット内の他の全てのバーコード配列と少なくとも１つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列だけ異なる限り、部分的なオーバーラップ（例えばｎ−１まで）は許容し得る。幾つかの実施形態では、バーコード配列のセットは、６４、８１、１００、１２５、２１６、２５６、３４３、５１２、６２５、７２９、１０００、１２９６、２４０１、４０９６、６５６１、又は１０，０００のバーコード配列から本質的になり得る。
【０１０５】
[00149]  ハイブリダイゼーションプローブ。カセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列と検出可能標識とを有するハイブリダイゼーションプローブもまた開示される。検出可能標識は、例えば、限定されるものではないが、フルオレセイン色素、シアニン色素、ローダミン色素、フェニルインドール色素、クマリン色素、アクリジン色素等の蛍光標識であり得る。限定されるものではないが幾つかの例としては、Alexa Fluor（登録商標）647、Alexa Fluor（登録商標）405、Alexa Fluor（登録商標）488等のAlexa Fluor色素、Cy（登録商標）5やCy（登録商標）7等のシアニン色素、又は当技術分野で公知の任意の好適な蛍光標識が挙げられる。各色素の蛍光シグナルが検出可能識別可能である限り、バーコードを検出するためにマイクロ流体環境に流入されるハイブリダイゼーションプローブ上に存在する識別可能フルオロフォアの任意のセットを選択し得る。代替的に、検出可能標識は、発光剤、例えば、ルシフェラーゼレポーター、ランタニドタグ又は無機フォスファー、チューナブルであり得る且つ半導体材料を含み得る量子ドットであり得る。フルオロフォア分子と共にクエンチャー分子を含み得るＦＲＥＴ標識等の他のタイプの検出可能標識を組み込み得る。ＦＲＥＴ標識としては、Black Hole Quencher（登録商標）（Biosearch）、Iowa Black（商標）、ダブシル等のダーククエンチャーが挙げられ得る。ＦＲＥＴ標識は、TaqMan（登録商標）プローブ、ヘアピンプローブ、Scorpion（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブ等のいずれかであり得る。
【０１０６】
[00150]  ハイブリダイゼーション条件の更なる詳細は以下に記載されており、一連のバーコード及びそれらのハイブリダイゼーションプローブ対の結合特異性を得るのに好適なかかる条件の他の変形形態は当業者であれば決定し得る。
【０１０７】
[00151]  ハイブリダイゼーションプローブ。配列番号４１〜８０（表１参照）のいずれか１つの配列を有するオリゴヌクレオチド配列と検出可能標識とを含むハイブリダイゼーションプローブが提供される。検出可能標識は、ローダミン、シアニン、又はフルオレセインの蛍光色素標識であり得る。種々の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチド配列は、配列番号４１〜８０のいずれか１つの配列から本質的になり、ハイブリダイゼーションプローブの他の部分を形成するヌクレオチドを有していない。
【０１０８】
[00152]  ハイブリダイゼーション試薬。複数のハイブリダイゼーションプローブを含むハイブリダイゼーション試薬が提供される。ただし、複数のハイブリダイゼーションプローブのそれぞれは、本明細書に記載のハイブリダイゼーションプローブであり、且つ複数のハイブリダイゼーションプローブのそれぞれは、（ｉ）複数の他の全てのハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチド配列と非同一のオリゴヌクレオチド配列を含むと共に、（ｉｉ）複数の他の全てのハイブリダイゼーションプローブの検出可能標識からスペクトル識別可能な検出可能標識を含む。複数（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）のハイブリダイゼーションプローブを含む試薬が更に開示される。ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書に開示されるハイブリダイゼーションプローブのいずれかであり得る。試薬は溶液等の液体であり得る。代替的に、試薬は凍結乾燥粉末等の固体であり得る。固体として提供される場合、適切量の水の添加物（又は好適な溶液）は、マイクロ流体デバイスへの導入に好適な液体試薬を発生させるように添加され得る。
【０１０９】
[00153]  幾つかの実施形態では、複数のハイブリダイゼーションプローブは、２つ〜４つのハイブリダイゼーションプローブからなる。複数のハイブリダイゼーションプローブの幾つかの実施形態では、複数のハイブリダイゼーションプローブの第１は、配列番号４１〜８０の第１のサブセットから選択される配列と第１の検出可能標識とを含み、且つ複数のハイブリダイゼーションプローブの第２は、配列番号４１〜８０の第２のサブセットから選択される配列と、第１の検出可能標識からスペクトル識別可能な第２の検出可能標識と、を含み、配列番号４１〜８０の第１及び第２のサブセットは、非オーバーラップサブセットである。
【０１１０】
[00154]  第１のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号４１〜８０に示される配列又はその配列のサブセットの１つの全部又は一部（例えば８〜１０ヌクレオチド）を含む配列を含み得る。特定の実施形態では、第１のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号４１〜８０に示される配列又はその配列のサブセットの１つの全部又は一部（例えば８〜１０ヌクレオチド）からなる（又はから本質的になる）配列を含み得る。第２のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号４１〜８０に示される配列又はその配列のサブセット（例えば、第１のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列を含まないサブセット又は第１のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列が選択されるサブセットにオーバーラップしないサブセット）の１つの全部又は一部（例えば８〜１０ヌクレオチド）を含む配列を含み得る。特定の実施形態では、第２のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号４１〜８０に示される配列又はその配列のサブセット（例えば、第１のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列を含まないサブセット又は第１のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列が選択されるサブセットにオーバーラップしないサブセット）の１つの全部又は一部（例えば８〜１０ヌクレオチド）からなる（又はから本質的になる）配列を含み得る。第３のハイブリダイゼーションプローブ（存在する場合）は、配列番号４１〜８０に示される配列又はその配列のサブセット（例えば、第１及び第２のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列を含まないサブセット又は第１及び第２のハイブリダイゼーションプローブに存在す配列が選択されるサブセットにオーバーラップしないサブセット）の１つの全部又は一部（例えば８〜１０ヌクレオチド）を含む配列を含み得る。特定の実施形態では、第３のハイブリダイゼーションプローブ（存在する場合）は、配列番号４１〜８０に示される配列又はその配列のサブセット（例えば、第１及び第２のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列を含まないサブセット又は第１及び第２のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列が選択されるサブセットにオーバーラップしないサブセット）の１つの全部又は一部（例えば８〜１０ヌクレオチド）からなる（又はから本質的になる）配列を含み得る。第４のハイブリダイゼーションプローブ（存在する場合）は、配列番号４１〜８０に示される配列又はその配列のサブセット（例えば、第１、第２、及び第３のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列を含まないサブセット又は第１、第２、及び第３のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列が選択されるサブセットにオーバーラップしないサブセット）の１つの全部又は一部（例えば８〜１０ヌクレオチド）を含む配列を含み得る。特定の実施形態では、第４のハイブリダイゼーションプローブ（存在する場合）は、配列番号４１〜８０に示される配列又はその配列のサブセット（例えば、第１、第２、及び第３のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列を含まないサブセット又は第１、第２、及び第３のハイブリダイゼーションプローブに存在する配列が選択されるサブセットにオーバーラップしないサブセット）の１つの全部又は一部（例えば８〜１０ヌクレオチド）からなる（又はから本質的になる）配列を含み得る。当業者には明らかであろうが、試薬は、第１、第２、第３、及び第４のハイブリダイゼーションプローブに類似した性質を有し得る第５、第６等のハイブリダイゼーションプローブを含み得る。
【０１１１】
[00155]  幾つかの実施形態では、複数のハイブリダイゼーションプローブの第３は、配列番号４１〜８０の第３のサブセットから選択される配列と、第１及び第２の検出可能標識のそれぞれからスペクトル識別可能な第３の検出可能標識と、を含み得ると共に、配列番号４１〜８０の第１、第２、及び第３のサブセットは、非オーバーラップサブセットである。
【０１１２】
[00156]  更に他の実施形態では、試薬は、複数のハイブリダイゼーションプローブの第４（ただし、第４のハイブリダイゼーションプローブは配列番号４１〜８０の第４のサブセットから選択される配列を含み得る）と、第１、第２、及び第３の検出可能標識のそれぞれからスペクトル識別可能な第４の検出可能標識と、を更に含み得ると共に、配列番号４１〜８０の第１、第２、第３、及び第４のサブセットは、非オーバーラップサブセットである。
【０１１３】
[00157]  ハイブリダイゼーション試薬の種々の実施形態では、配列番号４１〜８０の各サブセットは、少なくとも１０の配列を含み得る。ハイブリダイゼーション試薬の種々の実施形態では、第１のサブセットは配列番号４１〜５０を含有し、第２のサブセットは配列番号５１〜６０を含有し、第３のサブセットは配列番号６１〜７０を含有し、且つ第４のサブセットは配列番号７１〜８０を含有する。
【０１１４】
[00158]  キット。捕捉物体のバーコードのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供される。ただし、キットは、本明細書に記載の複数の試薬を含み、各試薬の複数のハイブリダイゼーションプローブは、複数の他の全ての試薬のハイブリダイゼーションプローブのセットにオーバーラップしないセットを形成する。幾つかの実施形態では、キットは、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の試薬を含み得る。
【０１１５】
[00159]  捕捉物体のインサイチュ同定法。マイクロ流体デバイス内の１つ以上の捕捉物体のインサイチュ同定法もまた提供される。ただし、本方法は、以下のことを含む。
[00160]  １つ以上の捕捉物体の単一捕捉物体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に位置する１つ以上の隔離ペンのそれぞれの中に配置すること。ただし、各捕捉物体は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを有し、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、プライミング配列と捕捉配列とバーコード配列とを含み、バーコード配列は、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である。
[00161]  ハイブリダイゼーションプローブの第１のセットを含む第１の試薬溶液をマイクロ流体デバイスのエンクロージャ内のフロー領域に流入させること。ただし、フロー領域は、１つ以上の隔離ペンのそれぞれに流体接続され、第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブは、１つ以上の捕捉物体のいずれかの捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかのバーコード配列のいずれかに含まれるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列（ただし、第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブの相補的オリゴヌクレオチド配列は、第１のセットのハイブリダイゼーションプローブの他の全ての相補的オリゴヌクレオチド配列と非同一である）と、スペクトル識別可能検出可能標識のセットから選択される検出可能標識と、を有し、第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブの検出可能標識は、ハイブリダイゼーションプローブの第１のセットの他の全てのハイブリダイゼーションプローブの検出可能標識とは異なる。
[00162]  第１のセットのハイブリダイゼーションプローブを１つ以上の捕捉物体のいずれかの捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかのバーコード配列のいずれかの対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズさせること。
[00163]  ハイブリダイゼーションプローブの第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブに対して、１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連付けられる対応する検出可能シグナルを検出すること。
[00164]  １つ以上の隔離ペンの１つ内に配置された各捕捉物体に対して、（ｉ）マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内の隔離ペンの位置と、（ｉｉ）ハイブリダイゼーションプローブの第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブの対応する蛍光シグナルと捕捉物体との関連又は非関連と、を含む記録を作成すること。ただし、関連及び非関連の記録は、捕捉物体を隔離ペンに関連付けるバーコードを構成する。
【０１１６】
[00165]  本方法に使用される１つ以上の捕捉物体はそれぞれ、本明細書に記載の任意の捕捉物体であり得る。一般に、バーコード配列は全て、同数のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を有するであろう。また、特定の捕捉物体に含まれる複数の捕捉オリゴヌクレオチドの各捕捉オリゴヌクレオチドは、同一のバーコード配列を有するであろう。以上で考察されるように、各バーコード配列の３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、非同一カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットから選択される。カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットは、例えば、１２〜１００（又はそれ以上）の非同一オリゴヌクレオチド配列を含み得る。そのため、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットは、２つ以上（例えば２〜５）のスペクトル識別可能標識を含み得るスペクトル識別可能標識のセットのスペクトル識別可能標識の数よりも多い数のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１７】
[00166]  第１（又は後続）のセットのハイブリダイゼーションプローブの数は、各バーコード配列のカセット化可能オリゴヌクレオチドの数と同一であり得る。しかし、これら数は同一でなくてもよい。例えば、第１（又は任意の後続）のセットのハイブリダイゼーションプローブの数は、各バーコード配列のカセット化可能オリゴヌクレオチドの数よりも多くし得る。
【０１１８】
[00167]  各ハイブリダイゼーションプローブ（又は標識クラス）を検出することは、ハイブリダイゼーションプローブの第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブ（又は標識）の識別スペクトル特性を同定することを含む。更に、所与のハイブリダイゼーションプローブを検出することは、一般に、識別スペクトル特性を検出するために使用されるシステム（例えば光学縦列）に関連するバックグラウンド又は閾値レベルを超える識別スペクトル特性のレベルの検出を必要とする。かかる同定の後、検出された標識はいずれも、ハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチド配列に相補的なカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の存在に関連付けることが可能である。検出可能標識は、例えば、限定されるものではないが、フルオレセイン色素、シアニン色素、ローダミン色素、フェニルインドール色素、クマリン色素、アクリジン色素等の蛍光標識であり得る。限定されるものではないが幾つかの例としては、Alexa Fluor（登録商標）647、Alexa Fluor（登録商標）405、Alexa Fluor（登録商標）488等のAlexa Fluor色素、Cy（登録商標）5やCy（登録商標）7等のシアニン色素、又は当技術分野で公知の任意の好適な蛍光標識が挙げられる。各色素の蛍光シグナルが検出可能識別可能である限り、バーコードを検出するためにマイクロ流体環境に流入されるハイブリダイゼーションプローブ上に存在する識別可能フルオロフォアの任意のセットを選択し得る。代替的に、検出可能標識は、発光剤、例えば、ルシフェラーゼレポーター、ランタニドタグ又は無機フォスファー、チューナブルであり得る且つ半導体材料を含み得る量子ドットであり得る。フルオロフォア分子と共にクエンチャー分子を含み得るＦＲＥＴ標識等の他のタイプの検出可能標識を組み込み得る。ＦＲＥＴ標識としては、Black Hole Quencher（登録商標）（Biosearch）、Iowa Black（商標）、ダブシル等のダーククエンチャーが挙げられ得る。ＦＲＥＴ標識は、TaqMan（登録商標）プローブ、ヘアピンプローブ、Scorpion（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブ等のいずれかであり得る。
【０１１９】
[00168]  検出すること及び／又は記録を作成させることは、例えば、コントローラを利用して自動化可能である。
【０１２０】
[00169]  インサイチュ同定法は、次のことを更に含み得る。ハイブリダイゼーションプローブの第ｎのセットを含む第ｎの試薬溶液をマイクロ流体デバイスのフロー領域に流入させること。ただし、第ｎのセットの各ハイブリダイゼーションプローブは、１つ以上の捕捉物体のいずれかの捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかのバーコード配列のいずれかに含まれるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列（ただし、第ｎのセットの各ハイブリダイゼーションプローブの相補的オリゴヌクレオチド配列は、マイクロ流体デバイスのフロー領域に流入するハイブリダイゼーションプローブの第ｎのセット及び任意の他のセットのハイブリダイゼーションプローブの他の全ての相補的オリゴヌクレオチド配列と非同一である）と、スペクトル識別可能検出可能標識のセットから選択される検出可能標識（ただし、第ｎのセットの各ハイブリダイゼーションプローブの検出可能標識は、ハイブリダイゼーションプローブの第ｎのセットの他の全てのハイブリダイゼーションプローブの検出可能標識とは異なる）と、を含み得る。
[00170]  第ｎのセットのハイブリダイゼーションプローブを１つ以上の捕捉物体のいずれかの捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかのバーコード配列のいずれかの対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズさせること。
[00171]  ハイブリダイゼーションプローブの第ｎのセットの各ハイブリダイゼーションプローブに対して、１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連付けられる対応する検出可能シグナルを検出すること。
[00172]  １つ以上の隔離ペンの１つ内に配置された各捕捉物体に対して、ハイブリダイゼーションプローブの第ｎのセットの各ハイブリダイゼーションプローブの対応する検出可能シグナルと捕捉物体との関連又は非関連を記録に補足すること。ただし、ｎは、｛２、…、ｍ｝の値を有する正の整数のセットであり、ｍは、２以上の値を有する正の整数である。正の整数｛２、…、ｍ｝のセット内のｎの各値に対して、第ｎの試薬を流入させる上記のステップと、第ｎのセットのハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズさせることと、対応する検出可能シグナルを検出することと、記録に補足することと、を繰り返すこと。
【０１２１】
[00173]  種々の実施形態では、ｍは、３以上且つ２０以下（例えば５以上且つ１５以下）の値を有し得る。幾つかの実施形態では、ｍは、８以上且つ１２以下（例えば１０）の値を有し得る。
【０１２２】
[00174]  種々の実施形態では、第１の試薬溶液及び／又は第ｎの試薬溶液をフロー領域に流入させることは、１つ以上の隔離ペンへの拡散により第１の試薬溶液及び／又は第ｎの試薬溶液の平衡化を可能にすることを更に含み得る。
【０１２３】
[00175]  １つ以上の捕捉物体のいずれかに関連付けられる対応する蛍光シグナルを検出することは、ハイブリダイゼーションプローブを有していない濯ぎ溶液をマイクロ流体デバイスのフロー領域に通して流動させることと、濯ぎ溶液を１つ以上の隔離ペン内に拡散させて平衡化させることにより、第１のセット又は第ｎのセットのいずれかの非ハイブリダイズハイブリダイゼーションプローブを１つ以上の隔離ペンから拡散除去することと、を更に含み得る。幾つかの実施形態では、濯ぎ溶液を流動させることは、蛍光シグナルを検出する前に実施し得る。
【０１２４】
[00176]  インサイチュ検出法の幾つかの実施形態では、各捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの各バーコード配列は、３つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み得る。幾つかの実施形態では、第１のセットのハイブリダイゼーションプローブ及び第ｎのセットのハイブリダイゼーションプローブのそれぞれは、３つのハイブリダイゼーションプローブを含み得る。
【０１２５】
[00177]  インサイチュ検出法の種々の実施形態では、各捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの各バーコード配列は、４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み得る。幾つかの実施形態では、第１のセットのハイブリダイゼーションプローブ及び第ｎのセットのハイブリダイゼーションプローブのそれぞれは、４つのハイブリダイゼーションプローブを含む。
【０１２６】
[00178]  １つ以上の捕捉物体のそれぞれを配置することは、１つ以上の捕捉物体のそれぞれをマイクロ流体デバイス内の１つ以上の隔離ペンの分離領域内に配置することを含み得る。
【０１２７】
[00179]  幾つかの実施形態では、本方法は、１つ以上の生体細胞をマイクロ流体デバイスの１つ以上の隔離ペン内に配置することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、１つ以上の生体細胞のそれぞれは、１つ以上の隔離ペンの異なる１つ内に配置し得る。１つ以上の生体細胞は、マイクロ流体デバイスの１つ以上の隔離ペンの分離領域内に配置し得る。本方法の幾つかの実施形態では、１つ以上の生体細胞の少なくとも１つは、１つ以上の捕捉物体の１つが配置された隔離ペン内に配置し得る。幾つかの実施形態では、１つ以上の生体細胞は、クローン集団からの複数の生体細胞であり得る。本方法の種々の実施形態では、１つ以上の生体細胞を配置することは、１つ以上の捕捉物体を配置する前に実施し得る。
【０１２８】
[00180]  インサイチュ検出法の種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み得ると共に、１つ以上の捕捉物体を１つ以上の隔離ペン内に配置することは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて実施し得る。インサイチュ検出法の種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み得ると共に、１つ以上の生体細胞を１つ以上の隔離ペン内に配置することは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて実施し得る。マイクロ流体デバイスは、本明細書に開示される任意のマイクロ流体デバイスであり得る。例えば、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの被覆表面（例えば共有結合表面）を含み得る。少なくとも１つ被覆表面は、親水性又は負荷電の被覆表面を含み得る。
【０１２９】
[00181]  インサイチュ同定法の種々の実施形態では、各捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、捕捉配列により捕捉された標的核酸を更に含み得る。
【０１３０】
[00182]  次に、マイクロ流体デバイス内における捕捉物体のインサイチュ同定法をより良く理解できるように図７Ａに目を向けると、本明細書に記載の検出可能標識を含むハイブリダイゼーションプローブ４４０ａのフローに暴露される本明細書に記載のバーコードを含む捕捉オリゴヌクレオチドを有する捕捉物体４３０の模式図が示される。プローブ４４０ａとその標的である捕捉オリゴヌクレオチドのカセット化可能オリゴヌクレオチドとが関連付けられると、ハイブリダイズされたプローブ：カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が捕捉オリゴヌクレオチドの長さ部分に形成される７５５。これにより、捕捉物体７３０の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に沿って複数のハイブリダイズされたプローブ：カセット化可能オリゴヌクレオチド対を有する捕捉物体がもたらされる。図７Ｂは、チャネルに通じる隔離ペンを有するマイクロ流体デバイス内のマイクロ流体チャネルの写真を示しており、捕捉物体（この写真には見られない）は隔離ペン内に配置される。そのほか、視認可能なチャネル長さ部分の３つ全てに開口するペン内に捕捉物体が存在する間、最底側のチャネル長さ部分の隔離ペン内に配置された捕捉物体のみが、プローブ４４０ａの標的のカセット化可能オリゴヌクレオチドを含むバーコードを有していた。最上側チャネル又は中間チャネルに開口する隔離ペン内の捕捉物体は、プローブ４４０ａのハイブリダイゼーション標的であるカセット化可能オリゴヌクレオチドをそれらのそれぞれの捕捉オリゴヌクレオチド上に有していなかった。写真は、ハイブリダイゼーションプローブ４４０ａを含む試薬フローがフローチャネルを貫流して隔離ペン内に拡散している時点を示す。プローブの検出可能標識の蛍光は、フローチャネル全体にわたり隔離ペン内で視認可能であった。約２０分間にわたり試薬を流動させた後、ハイブリダイゼーションプローブ４４０ａを有していない濯ぎフローを本明細書に記載されるように実施した。図７Ｂは、濯ぎフローの終了後におけるプローブ４４０ａの検出可能標識を励起させるのに適した蛍光励起下の同一視野を示す。見えたものは、ハイブリダイズされたハイブリダイゼーションプローブ４４０ａからの検出可能シグナルを提供する、最底側チャネルに通じる隔離ペン内の捕捉物体７３０であった。そのほか見えたものは、蛍光照明下で視認可能でなかった、最上側及び中間のチャネル長さ部分に通じる隔離ペン内の他のクラスの捕捉物体であった。このことから、ハイブリダイゼーションプローブを用いて同定を実施することにより、マイクロ流体デバイス内の標的のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のみの特異的且つ選択的な同定が例示された。
【０１３１】
[00183]  図８Ａ〜８Ｃは、マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の各捕捉物体の各バーコードを同定するためにこの例では４つの異なるハイブリダイゼーションプローブを有する試薬の多重化された複数のフローをどのように使用し得るかを示す。図８Ａは、ペン番号８４、ペン番号１２、ペン番号１２６、及びペン番号２６０の例示された４つの隔離ペンのそれぞれに対してバーコードの検出の模式図を示す。各ペンは、その内部に存在する捕捉物体を有する。各捕捉物体は、４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むユニークバーコードを有する。ペン番号８４の捕捉物体は、配列：ＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴ（配列番号８９）を有するバーコードを有する。ペン番号１２の捕捉物体は、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号９０）の配列を有するバーコードを有する。ペン番号１２６の捕捉物体は、ＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴ（配列番号９１）の配列を有するバーコードを有する。ペン番号２６０の捕捉物体は、ＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号９２）の配列を有するバーコードを有する。
【０１３２】
[00184]  第１の試薬フロー８２０は、次のような配列及び検出可能標識を有する４つのハイブリダイゼーションプローブ、すなわち、４つの識別可能標識のセットから選択される第１の検出可能標識（パターン１を有する円として表される）を有するＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号８５）の配列（この例示では、配列の選択は解説用にすぎず、ポリＴの捕捉配列と組み合わせて使用されるプローブ配列は示されていない）の第１のプローブ４４０ａ−１、識別可能標識のセットから選択された第２の検出可能標識（パターン２を有する円として表される）を有する配列ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号８６）の第２プローブ４４０ｂ−１、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号８７）の配列と識別可能標識のセットから選択される第３の検出可能標識（パターン３を有する円として表される）とを有する第３のプローブ４４０ｃ−１、及びＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号８８）の配列と識別可能標識のセットから選択される第４の検出可能標識（パターン４を有する円として表される）とを有する第４のプローブ４４０ｄ−１を含む。
【０１３３】
[00185]  隔離ペン内への第１のフロー８１０の拡散が可能になってバーコードのいずれかに存在するいずれかの標的のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列にプローブがハイブリダイズした後、ハイブリダイズされたプローブを所定の位置に維持しながら非ハイブリダイズプローブを除去するために、プローブフリー培地を用いてフラッシングが実施される。これは、実験の部で以下に記載されるように、ハイブリダイズされたプローブ対をその標的から分離させない培地を使用することにより、例えば、ＤＰＢＳ又はＤｕｐｌｅｘ緩衝液を使用することにより達成される。過剰の非ハイブリダイズプローブ含有培地をフラッシュした後、適切な励起波長で励起することにより、依然としてその標的にハイブリダイズされたプローブ上の検出可能標識の検出が可能になる。この例では、ペン番号８４のシグナルは第２の識別可能検出波長で観測され、他の波長では観測されない。これは、パターン２がフロー１（８１０）で観測されたことを示唆するペン番号８４の隣のパターン化された円で表記される。ペン番号１２では、４つ全ての識別可能検出波長でシグナルが観測され、対応するパターン１〜４で表される。ペン番号１２６では、観測された検出可能シグナルはなく、図に沿った円はそのように表される。最後に、ペン番号２６０では、プローブ４４０ｂ−１、４４０ｃ−１、及び４４０ｄ−１の３つが結合し、観測された検出可能シグナルの表記は、パターン２、３、及び４を示すように行われる。
【０１３４】
[00186]  全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が検出されるとは限らないので、図８Ｂに示されるように第２のフロー８１５が実施されることが分かる。第２のフローは、４つの非同一プローブ、すなわち、識別可能標識のセットの検出可能標識１（パターン１として表される）を有するＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧ（配列番号９３）の配列のプローブ４４０ａ−２、セットの検出可能標識２（パターン２として表される）を有するＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号９４）の配列の第２プローブ４４０ｂ−２、セットの第３の検出可能標識（パターン３として表される）を有するＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号９５）の配列の第３のプローブ４４０ｃ−２、及びセットの第４の検出可能標識（パターン４として表される）を有するＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡ（配列番号９６）の配列の第４のプローブ４４０ｄ−２を含有する。
【０１３５】
[00187]  試薬フロー２（８１５）を流入させることと、拡散させて結合させることと、非ハイブリダイズプローブをフラッシュすることと、次いで４つの識別可能波長のそれぞれで検出することと、からなる同一のプロセスを実施する。図８Ｂに示されるように、ペン番号１２は、第２のフローのプローブがカセット化可能配列のいずれにもハイブリダイズするように構成されていないので検出可能シグナルを有していない。更に、ペン番号１２の捕捉物体のバーコードのカセット化可能配列は全て、すでに検出された。そのほか、これらの方法では、カセット化可能配列は各検出可能シグナルの１つのみを有するように選択され、且つリピートを有してないであろうから、検出可能標識波長チャネルの１つのシグナルが検出されているときは留意されたい。バーコードのそのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に結合するプローブはすでに検出されているので、より後のフローのそのチャネルの検出可能シグナルは無視し得る。幾つかの場合には、より後のフローでシグナルが見られることもあり得るが、それはバーコード配列にハイブリダイズされたまま依然として残留するより前のフローからのプローブの結果であり、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列に結合する新たなフロー試薬のものではない。
【０１３６】
[00188]  第２のフロー８１５の検出に基づく分析に戻ると、ペン番号８４の捕捉物体は、第１、第３、及び第４の検出可能シグナル波長チャネルのシグナルを有することが確認され、第１、第３、及び第４のパターンで表される。ペン番号１２６の捕捉物体は、４つ全てのプローブの結合を有するので、第１、第２、第３、及び第４のパターンで表される。ペン番号２６０の捕捉物体は、第１の検出可能標識シグナル波長チャネルのシグナルを有するものとして表され、第１のパターンで表される。これらの結果は、カセット化可能配列の全参照セットが対応するハイブリダイゼーションプローブで試験されるまで、第１のフロー８１０、第２のフロー８１５、第３のフロー８２０等、第ｘのフロー８９５まで、図８Ｃのようにまとめることが可能である。
【０１３７】
[00189]  ハイブリダイゼーションプローブの配列は既知であるので、特定の隔離ペン内の捕捉物体上の各バーコードの配列は、示されるように検出シグナルパターンと各カセット化可能オリゴヌクレオチドの相補的配列とをマッチさせて導出可能である。次いで、捕捉物体の配列は、示されるように帰属可能である。すなわち、インサイチュ検出法により、ペン番号１２の捕捉物体のバーコードは配列番号９０の配列を有し、ペン番号８４の捕捉物体のバーコードは配列番号８９の配列を有し、ペン番号１２６の捕捉物体のバーコードは配列番号９１の配列を有し、且つペン番号２６０の捕捉物体のバーコードは配列番号９２の配列を有すると決定される。
【０１３８】
[00190]  図８Ｄ〜Ｆは、バーコード配列に沿って同時に複数のプローブにハイブリダイズさせて検出する能力を示す他の実験を例示する。この実験では、使用したハイブリダイゼーションプローブ上で利用した色素は、Alexa Fluor（登録商標）647（Cy(登録商標)5チャネルで検出可能（例えば、Cy（登録商標）5色素を検出するがAlexa Fluor（登録商標）647色素も検出可能な検出フィルタ）及びAlexa Fluor（登録商標）594（テキサスレッドチャネルで検出可能（Alexa Fluor（登録商標）594も検出可能な検出フィルタ））であった。この実験では、全てバーコード配列内で互いに隣接して位置する同一の２つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を有する複数の捕捉物体をマイクロ流体デバイス８００内のマイクロ流体チャネル１２０に流入させ、それらを隔離ペン内に配置する試みは行わなかった。次いで、捕捉物体のバーコードの第１のカセット化可能オリゴヌクレオチドに結合する配列とAlexa Fluor（登録商標）594色素とを有する第１のハイブリダイゼーションプローブを含むフローを形成した。フローはまた、捕捉物体のバーコードの第２のカセット化可能オリゴヌクレオチドに結合する配列とAlexa Fluor647（登録商標）色素とを有する第２のハイブリダイゼーションプローブも含有していた。拡散させた後、ハイブリダイゼーション及び非ハイブリダイズプローブを除去するためのフラッシングを行う。
【０１３９】
[00191]  図８Ｄ、８Ｅ、及び８Ｆはそれぞれ、異なる波長領域の検出チャネル（フィルタ）を示した。図８Ｄは、２００ｍｓ露光のテキサスレッド検出チャネルと、励起されて検出された捕捉物体８３０と、を示す。これにより、第１のハイブリダイゼーションプローブのAlexa Fluor（登録商標）594標識の存在が確認された（例えば、バーコードのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に結合されたもの）。図８Ｅは、マイクロ流体デバイスチャネル１２０内の同一図を示しており、捕捉物体に結合されたAlexa Fluor647標識を検出した８００ｍｓ露光のCy（登録商標）5検出チャネルである。捕捉物体８３０は、このチャネルでも検出可能であったことから、第２のハイブリダイゼーションプローブは第１のハイブリダイゼーションプローブと同時に捕捉物体８３０に結合されたこと及び両方のシグナルが検出可能であることが確認される。図８Ｆは、２０００ｍｓ露光のＦＩＴＣ検出（フィルタ）チャネルの同一図であり、チャネル内の捕捉物体からのシグナルは見られなかった。この実験は、検出特異性を損なうことなく並行して蛍光プローブにハイブリダイズする能力を実証した。
【０１４０】
[00192]  種々の実施形態では、使用した検出可能標識は、マイクロ流体デバイス内で励起、観測、及びイベントの記録に使用される光学システムのCy（登録商標）5蛍光チャネルで検出されるAlexa Fluor（登録商標）647、光学システムのＤａｐｉ蛍光チャネルで検出可能なAlexa Fluor（登録商標）405、光学システムのＦＩＴＣ蛍光チャネルで検出可能なAlexa Fluor（登録商標）488、及び光学システムのテキサスレッド蛍光チャネルで検出可能なAlexa Fluor（登録商標）594を含み得る。フルオロフォアは、合成に好適なハイブリダイゼーションプローブに付着し得ると共に、プローブの５’末端又は３’末端に存在し得る。１つが５’末端に標識され且つ１つが３’末端に標識された２つのプローブのハイブリダイゼーションは、隣接標識の存在に影響されないことが分かった（データは示されていない）。
【０１４１】
[00193]  ゲノムデータとマイクロ流体デバイス内の細胞とを相関付ける方法。以下のことを含む、ゲノムデータとマイクロ流体デバイス内の生体細胞とを相関付ける方法が提供される。
[00194]  捕捉物体（単一捕捉物体であり得る）をマイクロ流体デバイスの隔離ペン内に配置すること。ただし、各捕捉物体は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、プライミング配列と捕捉配列とバーコード配列とを含み、バーコード配列は、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一であり、且つ複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、同一のバーコード配列を含む。
[00195]  複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定して、同定されたバーコード配列と隔離ペンとの間の関連を記録すること（すなわち、マイクロ流体デバイス内の捕捉物体の位置を同定すること）。
[00196]  生体細胞を隔離ペン内に配置すること。
[00197]  生体細胞を溶解させて溶解させた生体細胞から放出された核酸を捕捉物体に含まれる複数の捕捉オリゴヌクレオチドにより捕捉できるようにすること。
[00198]  捕捉された核酸を転写（例えば逆転写）して複数のバーコード付きｃＤＮＡ（ライブラリであり得る）を作製すること。ただし、各バーコード付きｃＤＮＡは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つに共有結合された相補的捕捉核酸配列を含む。
[00199]  転写された核酸及びバーコード配列をシーケンスして、バーコード配列のリード配列に関連付けられた複数の転写された核酸のリード配列を得ること。
[00200]  リード配列に基づいてバーコード配列を同定すること。
[00201]  リード配列で同定されたバーコード配列とインサイチュで同定されたバーコード配列とを用いて複数の転写された核酸のリード配列と隔離ペンとを関連付けすることにより、複数の転写された核酸のリード配列と隔離ペン内に配置された生体細胞とを相関付けること。
【０１４２】
[00202]  幾つかの実施形態では、単一生体細胞を隔離ペン内に配置して以上の方法に付し得る。代替的に、２つ以上の生体細胞（例えば、同一のクローン細胞集団からの２つ以上の生体細胞のグループ）を隔離ペン内に配置して以上の方法に付し得る。
【０１４３】
[00203]  捕捉物体を配置すること、捕捉物体のバーコードを同定すること、生体細胞を配置すること、溶解／転写／シーケンシングを行うこと、及び上記の方法のリード配列に基づいてバーコード配列を同定することは、これらの行為の順序の再構成が論理的順序に反すること（例えば、溶解前に転写を行うこと等）がないという限定条件で、記載の順序又は他の順序で実施可能である。例として、バーコード配列のインサイチュ同定は、生体細胞を隔離ペン内に導入した後、生体細胞を溶解させた後、又は捕捉された核酸の転写後に実施可能である。同様に、捕捉物体を隔離ペン内に導入するステップは、少なくとも１つ生体細胞を隔離ペン内に導入した後に実施可能である。
【０１４４】
[00204]  種々の実施形態では、ゲノムデータと生体細胞とを相関付ける方法は、生体細胞の表現型を観測することと、複数の転写された核酸のリード配列と生体細胞の表現型とを相関付けることと、を更に含み得る。本方法は、追加的に、生体細胞がクローン集団の代表であるとして生体細胞の表現型を観測することと、複数の転写された核酸のリード配列と生体細胞及びクローン集団の表現型とを相関付けることと、を含み得る。幾つかの実施形態では、生体細胞の表現型を観測することは、少なくとも１つの生体細胞の少なくとも１つの物理的特性を観測することを含み得る。他の実施形態では、生体細胞の表現型を観測することは、生体細胞でアッセイを実施してアッセイ時に発生した検出可能シグナルを観測することを含み得る。幾つかの実施形態では、アッセイはタンパク質発現アッセイであり得る。
【０１４５】
[00205]  例えば、生体細胞の表現型を観測することは、生体細胞とアッセイ試薬との相互作用時に発生した検出可能シグナルを観測することを含み得る。検出可能シグナルは蛍光シグナルであり得る。代替的に、アッセイは検出可能シグナルの欠如に基づき得る。生体細胞の表現型に関する検出可能シグナルの同定観察を提供する実施し得るアッセイの更なる例は、国際公開第２０１５／０６１４９７号（Ｈｏｂｂｓら）、米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（Ｃｈａｐｍａｎら）、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７７９５号（Ｌｉｏｎｂｅｒｇｅら）（それらの開示のそれぞれはその全体が本出願をもって参照により組み込まれる）の開示内に見いだし得る。
【０１４６】
[00206]  種々の実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定すること及び同定されたバーコード配列と隔離ペンとの間の関連を記録することは、生体細胞を隔離ペン内に配置する前に実施し得る。幾つかの他の実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定すること及び同定されたバーコード配列と隔離ペンとの間の関連を記録することは、生体細胞を隔離ペン内に導入した後に実施し得る。
【０１４７】
[00207]  更に他の実施形態では、捕捉物体を配置すること及び任意選択的に複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定すること及び同定されたバーコード配列と隔離ペンとの間の関連を記録することは、生体細胞の表現型を観測した後に実施し得る。幾つかの実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定すること及び同定されたバーコード配列と隔離ペンとの間の関連を記録することは、生体細胞を溶解させて溶解させた生体細胞から放出させた核酸を捕捉物体に含まれる複数の捕捉オリゴヌクレオチドにより捕捉できるようにした後に実施し得る。種々の実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定することは、本明細書に記載の方法の任意の変法を実施することを含み得る。ゲノムデータとマイクロ流体デバイス内の生体細胞とを相関付ける方法の種々の実施形態では、捕捉物体は本明細書に記載の任意の捕捉物体であり得る。
【０１４８】
[00208]  本方法の種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を含み得ると共に、捕捉物体を隔離ペン内に配置することは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて捕捉物体を移動させることを含み得る。本方法の幾つかの他の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み得ると共に、生体細胞を隔離ペン内に配置することは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて生体細胞を移動させることを含み得る。
【０１４９】
[00209]  ゲノムデータとマイクロ流体デバイス内の生体細胞とを相関付ける方法の種々の実施形態では、本方法は、複数の捕捉物体をマイクロ流体デバイスの対応する複数の隔離ペン内に配置することと（例えば、これは隔離ペン１つ当たり１つの捕捉物体を配置することを含み得る｝、複数の生体細胞を対応する複数の隔離ペン内に配置することと、本方法の追加のステップに従って複数の捕捉物体及び複数の生物学的細胞のそれぞれを処理することと、を更に含み得る。
【０１５０】
[00210]  核酸ライブラリを作製するためのキット。エンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、エンクロージャがフロー領域とフロー領域に通じる複数の隔離ペンとを含む、マイクロ流体デバイスと、複数の捕捉物体であって、複数の捕捉物体のそれぞれが複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが、捕捉配列と、少なくとも３つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列と、を含み、バーコード配列の各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一であり、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが同一のバーコード配列を含む、複数の捕捉物体と、を含む、核酸ライブラリを作製するためのキットも提供される。
【０１５１】
[00211]  複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、少なくとも２つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列（例えば、３、４、５、又はそれ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列）を含み得る。カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所に記載される通りであり得る。例えば、カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、非同一カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットから選択可能である。セットは、１２以上（例えば１２〜１００）の非同一カセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み得る。
【０１５２】
[00212]  マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載の任意のマイクロ流体デバイスであり得る。種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み得る。
【０１５３】
[00213]  核酸ライブラリを作製するためのキットの種々の実施形態では、複数の捕捉物体は、本明細書に記載の任意の複数の捕捉物体であり得る。幾つかの実施形態では、複数の捕捉物体のそれぞれは、複数の対応する隔離ペン内に１つずつ配置し得る。
【０１５４】
[00214]  核酸ライブラリを作製するためのキットの種々の実施形態では、キットは同定表を更に含み得ると共に、この同定表は、複数の捕捉物体のそれぞれの複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列と、対応する複数の隔離ペンと、を相関付ける。
【０１５５】
[00215]  核酸ライブラリを作製するためのキットの種々の実施形態では、キットは、複数のハイブリダイゼーションプローブを更に含み得る。ただし、各ハイブリダイゼーションプローブは、複数の捕捉物体のいずれか１つの複数の捕捉オリゴヌクレオチドのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列と、標識と、を含み、複数の各ハイブリダイゼーションプローブの相補的配列は、異なるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的であり、複数の各ハイブリダイゼーションプローブの標識は、スペクトル識別可能標識のセットから選択される。種々の実施形態では、複数のハイブリダイゼーションプローブの各相補的配列は、配列番号４１〜８０のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含み得る。種々の実施形態では、標識は蛍光標識であり得る。
【０１５６】
[00216]  捕捉物体の作製方法。複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれを捕捉物体に化学結合させることを含む、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを有する捕捉物体の作製方法も提供される。ただし、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、プライマーに結合するプライミング配列と、捕捉配列（例えば、標的核酸にハイブリダイズするように構成される）と、バーコード配列と、を含み、バーコード配列は、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一であり、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、同一のバーコード配列を含む。
【０１５７】
[00217]  種々の実施形態では、捕捉物体はビーズであり得る。例えば、捕捉物体は、常磁性材料、高分子材料、及び／又はガラスを含むコアを有するビーズ（又は類似の物体）であり得る。高分子材料は、捕捉オリゴヌクレオチドに結合するように機能し得るポリスチレン又は任意の他のプラスチック材料であり得る。捕捉物体のコア材料は、官能化ポリマーを含み得る捕捉オリゴヌクレオチドにリンカーを付着するのに好適な材料を提供するように被覆し得るが、他の構成も可能である。
【０１５８】
[00218]  種々の実施形態では、関連付けることは、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれを捕捉物体に共有結合させることを含み得る。代替的に、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれをビーズに非共有結合させ得る。これはストレプトアビジン／ビオチン結合により行い得る。バーコード付きビーズは、当技術分野で公知の任意の好適な方法で合成し得る。プライミング配列／ユニーク分子識別子タグ／細胞バーコード／プライマー配列は、全オリゴヌクレオチド合成、スプリット・プール合成、任意の長さのオリゴヌクレオチドセグメントのライゲーション、又はそれらの任意の組合せにより合成し得る。
【０１５９】
[00219]  複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、最も５’側のヌクレオチドと最も３’側のヌクレオチドとを含み得る。この場合、プライミング配列は、最も５’側のヌクレオチドに隣接し得るか又はそれを含み得る。捕捉配列は、最も３’側のヌクレオチドに隣接し得るか又はそれを含み得る。そしてバーコード配列は、プライミング配列の３’側且つ捕捉配列の５’側に位置し得る。
【０１６０】
[00220]  種々の実施形態では、各バーコード配列の３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、介在オリゴヌクレオチド配列を何ら含むことなくタンデムに結合し得る。幾つかの他の実施形態では、カセット化可能オリゴヌクレオチドの１つ以上は、ライゲーション化学による結合を可能にするために介在する１つ又は２つのヌクレオチドを介して他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に結合し得る。
【０１６１】
[00221]  種々の実施形態では、本方法は、スプリット・プール合成により３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれを複数の捕捉オリゴヌクレオチドに導入することを更に含み得る。
【０１６２】
[00222]  捕捉物体の作製方法の種々の実施形態では、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、約６〜１５ヌクレオチドを含んでいてもよいし約１０ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０１６３】
[00223]  種々の実施形態では、本方法は、各バーコード配列の３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれを１２〜１００の非同一カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のセットから選択することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、本方法は、各バーコード配列の３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列のそれぞれを配列番号１〜４０から選択することを含み得る。
【０１６４】
[00224]  幾つかの実施形態では、細胞関連バーコード配列は、４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み得る。種々の実施形態では、本方法は、第１のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を配列番号１〜１０のいずれか１つから選択することと、第２のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を配列番号１１〜２０のいずれか１つから選択することと、第３のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を配列番号２１〜３０のいずれか１つから選択することと、第４のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を配列番号３１〜４０のいずれか１つから選択することと、を含み得る。
【０１６５】
[00225]  捕捉物体の作製方法の種々の実施形態では、前記捕捉オリゴヌクレオチドから分離されたときにＤＮＡポリメラーゼをプライミングする。幾つかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素である。幾つかの実施形態では、プライミング配列はＰ７又はＰ５プライマーの配列を含む。
【０１６６】
[00226]  幾つかの実施形態では、本方法は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが異なるＵＭＩを含むようにユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれに導入することを更に含み得る。ＵＭＩは、５〜２０ヌクレオチド（例えば８〜１５ヌクレオチド）を含むオリゴヌクレオチド配列であり得る。
【０１６７】
[00227]  捕捉物体の作製方法の種々の実施形態では、捕捉配列は、ポリｄＴ配列、ランダムヘキサマー、又はモザイク末端配列を含み得る。
【０１６８】
[00228]  捕捉物体の作製方法の種々の実施形態では、本方法は、プライマー配列を複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれに捕捉オリゴヌクレオチドの５’末端近傍で導入することと、捕捉配列を複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれに捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端近傍で導入することと、を更に含み得る。幾つかの実施形態では、本方法は、プライミング配列の導入後且つ捕捉配列の導入前に複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれにバーコード配列を導入することを更に含み得る。
【０１６９】
[00229]  幾つかの実施形態では、本方法は、プライミング配列の導入後且つ捕捉配列の導入前に複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれにＵＭＩを導入することを更に含み得る。更に他の実施形態では、本方法は、Ｎｏｔ１制限部位を含む配列を複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれに導入することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、本方法は、バーコード配列の導入後且つ捕捉配列の導入前にＮｏｔ１制限部位を含む配列を導入することを更に含み得る。
【０１７０】
[00230]  捕捉物体の作製方法の種々の実施形態では、本方法は、１つ以上のアダプター配列を複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれに導入することを更に含み得る。
【０１７１】
[00231]  シーケンシングライブラリの作製方法。本明細書に記載のワークフローに基づいて、ゲノムデータと、原細胞の位置更にはその細胞で観測された表現型情報と、の相関付けを可能にする様々なシーケンシングライブラリを作製し得る。ここに示される方法は、合成化学によるIllumina（登録商標）シーケンシングを用いた最終的使用に適合化されるが、それに限定されるものではない。いずれの種類のシーケンシング化学も、これらの方法で使用するのに好適であり得る。また、その例としては、エマルジョンＰＣＲ、合成シーケンシング、パイロシーケンシング、及び半導体検出が挙げられ得る。当業者であれば、これらの方法をPacBioロングリードシステム（SMRT,Pacific Biosystems）、Ion Torrent（ThermoFisher Scientific）、Roche454、Oxford Nanopore等の他の大規模並列シーケンシングプラットフォーム及び化学で使用するために、本方法並びに捕捉オリゴヌクレオチド及び関連するアダプター、プライマー等の構築を適合化させることが可能である。
【０１７２】
[00232]  ＲＮＡ捕捉及びライブラリ作製。また、以下のことを含む、生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを提供する方法が提供される。マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に位置する隔離ペン内に生体細胞を配置すること。隔離ペン内に捕捉物体を配置すること。ただし、捕捉物体は複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、プライミング配列と捕捉配列とバーコード配列とを含み、バーコード配列は、３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列は、バーコード配列の他の全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である。生体細胞を溶解させて溶解させた生体細胞から放出された核酸を捕捉物体に含まれる複数の捕捉オリゴヌクレオチドにより捕捉できるようにすること。
[00233]  捕捉された核酸を転写させて捕捉物体をデコレートする複数のバーコード付きｃＤＮＡを生成すること。ただし、各バーコード付きｃＤＮＡは、（ｉｉ）複数の捕捉オリゴヌクレオチドの１つに共有結合された、（ｉ）捕捉された核酸の対応する１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む。捕捉物体は単一捕捉物体であり得る。溶解生体細胞から放出された核酸は、捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれの捕捉配列により捕捉し得る。幾つかの実施形態では、転写は逆転写を含み得る。捕捉物体及び／又は生体細胞は、例えば、隔離ペンの分離領域内に配置可能である。
【０１７３】
[00234]  幾つかの実施形態では、生体細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等の免疫細胞であり得る。幾つかの実施形態では、生体細胞は、黒色腫癌細胞、乳癌細胞、神経癌細胞等の癌細胞であり得る。他の実施形態では、生体細胞は、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、誘導多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）又はプロジェニター細胞であり得る。更に他の実施形態では、生体細胞は、胚（例えば、接合体、２〜２００細胞胚、胞胚等）であり得る。種々の実施形態では、生体細胞は単一生体細胞であり得る。代替的に、生体細胞はクローン集団等の複数の生体細胞であり得る。
【０１７４】
[00235]  種々の実施形態では、生体細胞を配置することは、生体細胞をマーキングすること更に含み得る（例えば、Dapi染色やHoechst染色等の核酸マーカーを用いて。
【０１７５】
[00236]  捕捉物体は、本明細書に記載の任意の捕捉物体であり得る。
【０１７６】
[00237]  幾つかの実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上（個別であり得る）の捕捉配列は、オリゴｄＴプライマー配列を含み得る。他の実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上（例えば個別）の捕捉配列は、遺伝子特異的プライマー配列を含み得る。幾つかの実施形態では、遺伝子特異的プライマー配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするｍＲＮＡ配列（例えば、ＴＣＲα鎖又はＴＣＲβ鎖、特に可変領域をコードするｍＲＮＡの領域又は可変領域の３’側に位置するがそれに近接するｍＲＮＡの領域）を標的とし得る（又はそれに結合し得る）。他の実施形態では、遺伝子特異的プライマー配列は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードするｍＲＮＡ配列（例えば、ＢＣＲ軽鎖又はＢＣＲ重鎖、特に可変領域をコードするｍＲＮＡの領域又は可変領域の３’側に位置するがそれに近接するｍＲＮＡの領域）を標的とし得る（又はそれに結合し得る）。
【０１７７】
[00238]  種々の実施形態では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上（例えば、全て又は実質的に全て）の捕捉配列は、放出核酸の１つに結合し得ると共に放出核酸をプライミングして、捕捉された核酸をポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）により転写できるようにする。
【０１７８】
[00239]  種々の実施形態では、捕捉物体は、磁気成分（例えば磁気ビーズ）を含み得る。代替的に、捕捉物体は非磁性であり得る。
【０１７９】
[00240]  幾つかの実施形態では、生体細胞を隔離ペン内に配置することは、捕捉物体を隔離ペン内に配置する前に実施し得る。幾つかの実施形態では、捕捉物体を隔離ペン内に配置することは、生体細胞を隔離ペン内に配置する前に実施し得る。
【０１８０】
[00241]  種々の実施形態では、本方法は、捕捉物体が隔離ペン内に位置する間に捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定することを更に含み得る。バーコードを同定することは、本明細書に記載のバーコードを同定する任意の方法を用いて実施し得る。種々の実施形態では、バーコード配列を同定することは、生体細胞を溶解させる前に実施し得る。
【０１８１】
[00242]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、少なくとも１つ被覆表面を含み得る。被覆表面は、トリス及び／又はポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＰＧブロックコポリマーで被覆可能である。更に他の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、少なくとも１つの調整された表面を含み得る。
【０１８２】
[00243]  少なくとも１つの調整された表面は、共有結合された親水性部分又は負荷電部分を含み得る。共有結合された親水性部分又は負荷電部分は、親水性ポリマー又は負荷電ポリマーであり得る。
【０１８３】
[00244]  種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み得る。生体細胞を配置すること及び／又は捕捉物体を配置することは、生体細胞及び／又は捕捉物体に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を印加することにより実施し得る。
【０１８４】
[00245]  マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを更に含み得る。種々の実施形態では、本方法は、複数の生体細胞を複数の隔離ペン内に配置することを更に含み得る。種々の実施形態では、複数の生体細胞はクローン集団であり得る。種々の実施形態では、複数の生体細胞を複数の隔離ペン内に配置することは、複数の生体細胞の実質的に１つのみを対応する複数の隔離ペン内に配置することを含み得る。そのため、配置された生体細胞を有する複数の隔離ペンのそれぞれは、一般に、単一生体細胞を含有するであろう。例えば、占有された隔離ペンの１０％、７％、５％、３％、又は１％未満は、２つ以上の生体細胞を含有し得る。
【０１８５】
[00246]  種々の実施形態では、本方法は、複数の捕捉物体を複数の隔離ペン内に配置することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、複数の捕捉物体を複数の隔離ペン内に配置することは、実質的に１つの捕捉物体のみ複数の隔離ペンの対応する隔離ペン内に配置することを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の捕捉物体を複数の隔離ペン内に配置することは、１つの生体細胞又は複数の生体細胞の溶解前に実施し得る。複数の捕捉物体は、本明細書に記載の任意の複数の捕捉物体であり得る。
【０１８６】
[00247]  種々の実施形態では、本方法は、１つの捕捉物体又は複数の捕捉物体をマイクロ流体デバイスから搬出することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、１つ以上の捕捉物体はｃＤＮＡデコレート捕捉物体である。幾つかの実施形態では、複数の捕捉物体を搬出することは、複数の捕捉物体のそれぞれを個別に（すなわち１つずつ）搬出することを含み得る。種々の実施形態では、本方法は、複数の捕捉物体のそれぞれをマイクロ流体デバイス外の個別の目的容器に送達することを更に含み得る。
【０１８７】
[00248]  種々の実施形態では、１つの生体細胞又は複数の生体細胞を配置すること、１つの捕捉物体又は複数の捕捉物体を配置すること、１つの生体細胞又は複数の生体細胞を溶解させて溶解させた１つの生体細胞又は複数の生体細胞から放出させた核酸を捕捉できるようにすること、転写させること、及び１つの捕捉物体又は複数の捕捉物体のそれぞれのバーコード配列をインサイチュで（実施する場合）同定すること、の１つ以上は、自動で実施し得る。
【０１８８】
[00249]  本明細書に記載の任意の方法により得られた１つの捕捉物体のｃＤＮＡライブラリ又は複数の捕捉物体のそれぞれのｃＤＮＡライブラリを増幅することと、増幅された１つのＤＮＡライブラリ又は複数のｃＤＮＡライブラリをタグメント化して１つ以上のバーコード付きシーケンシングライブラリを作製することと、を含む、バーコード付きシーケンシングライブラリを提供する方法が提供される。種々の実施形態では、１つのｃＤＮＡライブラリ又は複数のｃＤＮＡライブラリを増幅することは、プールインデックス配列を導入することを含み得る。プールインデックス配列は４〜１０ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本方法は、複数のバーコード付きシーケンシングライブラリを組み合わせることを更に含み得る。ただし、複数のバーコード付きシーケンシングライブラリのそれぞれは、異なるバーコード配列及び／又は異なるプールインデックス配列を含む。
【０１８９】
[00250]  ＲＮＡ等の放出させた核酸からｃＤＮＡを得る方法は、プロセスの模式図である図９に目を向ければ、より十分に理解し得る。細胞分離及び細胞溶解のボックス９０２では、生体細胞４１０は、マイクロ流体デバイス内の隔離ペン内に配置し得る。本明細書に記載の任意の捕捉物体として構成し得る捕捉物体９３０は、同一の隔離ペン内に配置し得る。これは隔離ペン内への細胞４１０の配置前又は配置後に実施し得る。細胞４１０は、以下の例に記載されるように細胞４１０の外側細胞膜を溶解させる（ただし核膜を溶解させない）溶解試薬を用いて溶解し得る。溶解させた細胞４１０’は、このプロセスから生じてＲＮＡ等の核酸９０５を放出する。捕捉物体９３０の捕捉オリゴヌクレオチドは、５’−  ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号１０４）の配列を有するプライミング配列５２０と、本明細書に記載の任意のバーコードのように構成し得るバーコード配列５２５と、を含む。捕捉物体９３０の捕捉オリゴヌクレオチドは、任意選択的にＵＭＩ５３０を含み得る。捕捉物体９３０の捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉配列を含み、この場合には、３’末端にポリＡ配列を有する放出させた核酸９０５を捕捉可能なポリＴ配列を含む。捕捉配列５３５は、放出させた核酸９０５を捕捉する。細胞及び分子バーコーディングボックス９０４並びに逆転写ボックス９０６では、捕捉オリゴヌクレオチドは、／５Ｍｅ−ｉｓｏｄＣ／／ｉｓｏｄＧ／／ｉＭｅ−ｉｓｏｄＣ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣｒＧｒＧｒＧ（配列番号１０３）の配列を有するテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド９１５の存在下で、放出させた核酸９０５から逆転写される。バーコードの同定９１２は、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、バーコード付きビーズへのＲＮＡ捕捉前、ビーズに捕捉されたＲＮＡの逆転写前、又はビーズ上のＲＮＡの逆転写後のいずれかで実施し得る。幾つかの実施形態では、細胞特異的バーコードの同定は、ビーズに捕捉されたＲＮＡの逆転写後に実施し得る。逆転写及び捕捉物体のバーコードのインサイチュ同定の両方を達成した後、ｃＤＮＡデコレート捕捉物体はマイクロ流体デバイスから搬出される。複数のｃＤＮＡ捕捉物体は同時に搬出し得る。また、プーリング及びｃＤＮＡ増幅のボックス９１２（ＤＮＡアンプリコン９２の生成）は、５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴ  ＡＣＡＣＧＡＣＧＣ３’（配列番号１０５）の配列を有する増幅プライマーを用いて実施される。次いで、適合化、サイジング、及びインデクシングのボックス９１６は、増幅されたＤＮＡ９２０で実施される。これは、ＤＮＡをＤＮＡ９２５のサイズに断片化してタグメンテーションアダプター９４２を挿入する片側タグメンテーションボックス９１４を含む。本明細書にはタグメンテーションが示されるが、このプロセスは、フラグメンターゼ（ＮＥＢ，Ｋａｐａ）等の酵素的断片化及び続いて末端修復により実施することも可能である。
【０１９０】
また、ボックス０９１６には、タグメント化ＤＮＡ９４０にプライマー９３５ａ及び９３５ｂが作用するプールインデクシングボックス９１８も含まれる。タグメンテーションアダプター９４２に対する第１のプライマー９３５ａは、５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３（配列番号１０７）の配列を有するＰ７シーケンシングアダプター９３２を導入すると共に、更に任意選択的プールインデックス９３４を導入する。（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ−３（配列番号１０６）の配列を有する第２のプライマー９３５ｂは、プライミング配列５２０に対する部分を有し、Ｐ５シーケンシングアダプター配列９３６を導入する。サイジング、インデクシング、及び適合化が行われたシーケンシングライブラリ９５０は、シーケンシングボックス９２２でシーケンスし得る。この場合、第１のシーケンシングリード９５５（配列リード開始点はバーコード５２５及び任意選択的ＵＭＩ５３９を読み取る。第２のシーケンシングリード９６０はプールインデックス９３４を読み取る。第３のシーケンシングリード９６５は、ＤＮＡライブラリ自体に含まれる所望のｂｐ数を読み取ってゲノムリードを発生させる。
【０１９１】
[00252]  図１０Ａ〜１０Ｄは、本開示の一実施形態に従って外側細胞膜の溶解後にＲＮＡ捕捉を行うプロセスの一実施形態の写真図である。図１０Ａは、マイクロ流体デバイス１０００内の隔離ペン内にそれぞれ配置された溶解前の捕捉物体４３０及び細胞４３０を示す明視野画像を示す。図１０Ｂは、溶解前の同じ時点のインタクト細胞４１０のＤＡＰＩ染色核からの蛍光を示す。図１０Ｃは、溶解終了後の捕捉物体９３０及び残留非溶解核４１０’の明視野画像を示す。図１０Ｄは、溶解後の図１０Ｃと同じ時点の蛍光画像を示し、非破壊核４１０’からのＤＡＰＩ蛍光を示すと共に、核がインタクトであることを示す。
【０１９２】
[00253]  図１１Ａは、図９に示されるようにＲＮＡの捕捉から生じるｃＤＮＡの処理の模式図であり、この処理は、幾つかの品質分析と共にｃＤＮＡ増幅ボックス９１２、片側タグメンテーションボックス９１４、プールインデクシングボックス９１８、及びシーケンシングボックス９２２を含めて、マイクロ流体環境外で実施される。ｃＤＮＡ増幅ボックス９１２後のＱＣは、増幅されたＤＮＡ９２０に対して図１１Ｂに示されており、７００から１０００ｂｐをはるかに超えるサイズの多量の産物を有するサイズ分布を示す。タグメンテーションステップの終了後、バーコード付きライブラリで得られた断片のサイズ分布は図１１Ｃに示されており、合成プロトコルによるシーケンシングに最適な３００〜８００ｂｐの範囲内にある。Ｑｕｂｉｔにより測定された定量値から、約１．１６０ｎｇ／マイクロリットルのバーコード付きＤＮＡサンプルが単一細胞から得られたことが示される。シーケンシングランでは、約１００の単一細胞から個別にバーコード付き材料をプールしてシーケンシングランを実施することにより、約１００の単一細胞のそれぞれに対してシーケンシングデータを提供した。
【０１９３】
[00254]  また、このワークフローは、以上で得られたバーコード付きｃＤＮＡを処理することによりPacBioライブラリ作製（SMRT system,Pacific Biosystems）に適合化し得ると共に、SMRTbellアダプターは、全長バーコード付き転写物に直接ライゲートし得る。
【０１９４】
[00255]  ＤＮＡ捕捉及びシーケンシングライブラリの作製。また、ゲノムＤＮＡを含む生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に位置する隔離ペン内に配置することと、生物学的微小物体と生物学的微小物体の核膜を破壊可能な溶解試薬とを接触させて生物学的微小物体のゲノムＤＮＡを放出させることと、放出させたゲノムＤＮＡをタグメント化して、第１のタグメンテーションインサート配列により規定される第１の末端と、第２のタグメンテーションインサート配列により規定される第２の末端と、を有する複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片を生成することと、隔離ペン内に捕捉物体を配置することであって、捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが、第１のプライミング配列と第１のタグメンテーションインサート捕捉配列とバーコード配列とを含み、バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、バーコード配列の他の全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である、配置することと、複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のそれぞれと、（ｉ）捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれの第１のタグメンテーションインサート捕捉配列、（ｉｉ）第２のタグメンテーションインサート捕捉配列、ランダム化プライマー配列、又は遺伝子特異的プライマー配列に結合された第２のプライミング配列を含む増幅オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）鎖置換酵素とポリメラーゼとを含む酵素混合物と、を接触させることと、接触させた複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片をある時間にわたりインキュベートして、複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のそれぞれの増幅と、複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のそれぞれの末端への捕捉オリゴヌクレオチド及び増幅オリゴヌクレオチドの付加と、を同時に行うことによりバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを生成することと、マイクロ流体デバイスからバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを搬出することと、を含む、生物学的微小物体からバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法が提供される。
【０１９５】
[00256]  幾つかの実施形態では、ゲノムＤＮＡはミトコンドリアＤＮＡを含み得る。
【０１９６】
[00257]  種々の実施形態では、捕捉物体は、タグメント化するステップの前又は後に隔離ペンに配置可能である。種々の実施形態では、インキュベーションは、等温条件下（例えば、約３０℃〜約４５℃、典型的には約３７℃）で実施可能である。
【０１９７】
[00258]  搬出することは、増幅されたゲノムＤＮＡを隔離ペンから隔離ペンに接続されたフロー領域（例えばチャネル）内に拡散させることと、次いで、フロー領域を介してマイクロ流体デバイスから適切な容器（例えば、ウェルプレートのウェル、マイクロ遠心分離管等の管等）内に媒体（例えば、増幅緩衝液、搬出緩衝液等）を流動させることと、を含み得る。
【０１９８】
[00259]  幾つかの実施形態では、生物学的微小物体を隔離ペン内に配置することは、捕捉物体を隔離ペン内に配置する前に実施し得る。
【０１９９】
[00260]  幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は生体細胞であり得る。他の実施形態では、生物学的微小物体は生体細胞（例えば真核細胞）の核であり得る。
【０２００】
[00261]  幾つかの実施形態では、生体細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等）である。幾つかの実施形態では、生体細胞は、癌細胞（例えば、黒色腫癌細胞、乳癌細胞、神経癌細胞等）であり得る。
【０２０１】
[00262]  幾つかの実施形態では、溶解試薬は少なくとも１つのリボヌクレアーゼ阻害剤を含み得る。
【０２０２】
[00263]  種々の実施形態では、タグメント化することは、放出させたゲノムＤＮＡと、（ｉ）第１のタグメンテーションインサート配列を含む第１の二本鎖ＤＮＡ断片及び（ｉｉ）第２のタグメンテーションインサート配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片が装填されたトランスポザーゼと、を接触させることを含み得る。幾つかの実施形態では、第１の二本鎖ＤＮＡ断片は、第３のプライミング配列に結合された第１のモザイク末端配列を含み得ると共に、第２の二本鎖ＤＮＡ断片は、第４のプライミング配列に結合された第２のモザイク末端配列を含み得る。
【０２０３】
[00264]  幾つかの実施形態では、捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの第１のタグメンテーションインサート捕捉配列は、第１のタグメンテーションインサート配列に少なくとも部分的に（又はある実施形態では完全にであり得る）相補的な配列を含み得る。幾つかの実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドの第２のタグメンテーションインサート捕捉配列は、第２のタグメンテーションインサート配列に少なくとも部分的に（又は幾つかの実施形態では完全にであり得る）相補的な配列を含む。例えば、各捕捉オリゴヌクレオチドの第１のタグメンテーションインサート捕捉配列は、第１のタグメンテーションインサート配列の第１のモザイク末端配列及び／又は第３のプライミング配列に少なくとも部分的に（例えば完全に）相補的であり得る。他の例では、増幅オリゴヌクレオチドの第２のタグメンテーションインサート捕捉配列は、第２のタグメンテーションインサート配列の第２のモザイク末端配列及び／又は第４のプライミング配列に少なくとも部分的に（例えば完全に）相補的であり得る。
【０２０４】
[00265]  種々の実施形態では、捕捉物体は、本明細書に記載の任意の捕捉物体であり得る。幾つかの実施形態では、捕捉物体は、磁気成分（例えば磁気ビーズ）を含み得る。代替的に、捕捉物体は非磁性であり得る。
【０２０５】
[00266]  バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法の種々の実施形態では、本方法は、捕捉物体が隔離ペン内に位置する間に捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列をインサイチュで同定することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、バーコード配列を同定することは、本明細書に記載の任意の方法を用いて実施し得る。幾つかの他の実施形態では、バーコード配列を同定することは、生体細胞を溶解させる前に実施される。代替的に、バーコード配列を同定することは、放出させたゲノムＤＮＡをタグメント化する前又はバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを搬出した後に実施可能である。
【０２０６】
[00267]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、少なくとも１つの被覆表面を含み得る。被覆表面は、トリス及び／又はポリマー、例えば、ＰＥＧ−ＰＰＧブロックコポリマーで被覆可能である。幾つかの他の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、少なくとも１つの調整された表面を含む。少なくとも１つの調整された表面が共有結合された親水性部分又は負荷電部分を含む、請求項１４１に記載の方法。幾つかの実施形態では、共有結合された親水性部分又は負荷電部分は、親水性ポリマー又は負荷電ポリマーであり得る。
【０２０７】
[00268]  種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み得ると共に、生物学的微小物体を配置すること及び／又は捕捉物体を配置することは、生体細胞及び／又は捕捉物体に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を適用することにより実施し得る。
【０２０８】
[00269]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを更に含み得る。種々の実施形態では、本方法は、複数の生物学的微小物体を複数の隔離ペン内に配置することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、複数の生物学的微小物体を複数の隔離ペン内に配置することは、複数の生物学的微小物体の実質的に１つのみを対応する複数の隔離ペン内に配置することを含み得る。
【０２０９】
[00270]  そのため、配置された生物学的微小物体を有する複数の隔離ペンのそれぞれは、一般に、単一の生物学的微小物体を含有するであろう。例えば、占有された隔離ペンの１０％、７％、５％、３％、又は１％未満は、２つ以上の生物学的微小物体を含有し得る。幾つかの実施形態では、複数の生物学的微小物体は生体細胞のクローン集団であり得る。
【０２１０】
[00271]  種々の実施形態では、本方法は、複数の捕捉物体を複数の隔離ペン内に配置することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、複数の捕捉物体を複数の隔離ペン内に配置することは、実質的に１つの捕捉物体のみ複数の隔離ペンの対応する隔離ペン内に配置することを含み得る。他の実施形態では、複数の捕捉物体を複数の隔離ペン内に配置することは、１つの生物学的微小物体又は複数の生物学的微小物体の溶解前に実施し得る。
【０２１１】
[00272]  幾つかの実施形態では、複数の捕捉物体は、本明細書に記載の任意の複数の捕捉物体であり得る。
【０２１２】
[00273]  種々の実施形態では、タグメント化するステップ、接触させるステップ、及びインキュベートするステップは、複数の生物学的微小物体の１つを含有する隔離ペンのそれぞれに対して実質的に同時に実施し得る。
【０２１３】
[00274]  幾つかの実施形態では、１つの生物学的微小物体又は複数の生物学的微小物体を配置すること、１つの捕捉物体又は複数の捕捉物体を配置すること、１つの生物学的微小物体又は複数の生物学的微小物体を溶解させて溶解させた１つの生体細胞又は複数の生体細胞から放出させた核酸を捕捉できるようにすること、放出させたゲノムＤＮＡをタグメント化すること、複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のそれぞれを接触させること、接触させた複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片をインキュベートすること、１つのバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリ又は複数のＤＮＡライブラリを搬出すること、及び１つの捕捉物体又は複数の捕捉物体のそれぞれのバーコード配列をインサイチュで同定すること、の１つ以上は、自動で実施し得る。
【０２１４】
[00275]  幾つかの実施形態では、本方法は、１つの捕捉物体又は複数の捕捉物体をマイクロ流体デバイスから搬出することを更に含み得る。複数の捕捉物体を搬出することは、複数の捕捉物体のそれぞれを個別に搬出することを含み得る。幾つかの実施形態では、本方法は、複数の捕捉物体のそれぞれをマイクロ流体デバイス外の個別の目的容器に送達することを更に含み得る。
【０２１５】
[00276]  本方法は、図１２Ａ〜Ｇ及び以下の実施例３及び４に目を向ければ、よりよく理解し得る。図１２Ａ〜１２Ｆは、本明細書に記載のインサイチュ検出可能バーコードを有するシーケンシングライブラリを得るためのワークフローを例示する。生体細胞４１０は、マイクロ流体デバイス内のマイクロ流体チャネル（図示せず）に開口する隔離ペン４０５内に配置される（図１２Ａ）。細胞は、図１２Ｂのように、細胞膜更には核膜の両方を破壊するために溶解されてゲノムＤＮＡ１２２０を放出する。図１２Ｃは、その次のプロセス、すなわち、適正サイズの断片を形成するために、且つタグを挿入して捕捉及び増幅を可能にするタグメント化ＤＮＡ１２２５を提供するために、利用されるタグメンテーションを例示する。図１２Ｄでは、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを有する捕捉物体１２３０は、タグメント化ＤＮＡ１２２５を含有するペン４０５に導入される。複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、インサイチュ検出可能バーコードとプライミング配列と捕捉配列とを含む。図１２Ｅでは、タグメント化ＤＮＡ１２２５は、リコンビナーゼ／ポリメラーゼ増幅を用いて等温増幅に付される。この場合、捕捉オリゴヌクレオチドの捕捉配列は、リコンビナーゼ／ポリメラーゼ機構の存在下で（捕捉物体１２３０’）タグメント化ＤＮＡをシェパード及びダイレクトして、シーケンシングアダプターとバーコードとＵＭＩやプールインデックス等の任意選択的インデックスとを含む増幅されたＤＮＡ１２３５を提供する。増幅及びその後全体を通じて、増幅された適合化バーコード付きＤＮＡ１２３５は、隔離ペン４０５から拡散して隔離ペンに開口するマイクロ流体チャネル１２２内に入り、流体媒体フロー２４２を用いてマイクロ流体デバイスから搬出される（図１２Ｆ）。搬出後、増幅された適合化バーコード付きＤＮＡ１２３５は、シーケンシングライブラリとして使用するために定量され、シーケンシングラン用の他のライブラリと共にプールし得る。ＤＮＡ１２３５の搬出終了後、捕捉物体１２３０の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコードのインサイチュ決定は、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて実施される（図１２Ｆ）。
【０２１６】
[00277]  図１２Ｇは、細胞のＤＮＡからシーケンシングライブラリを作製する方法における捕捉オリゴヌクレオチド及びＤＮＡの処理の模式図を示す。捕捉物体１２３０の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、リンカー１２１５を介して共有結合又は非共有結合されており、捕捉オリゴヌクレオチドの５’末端から、プライミング配列／アダプター１２４０と、バーコード１２４５と、任意選択的ＵＭＩ１２５０と、タグメンテーションインサート捕捉配列を有すると共にモザイク末端インサート配列を捕捉（例えばシェパード及びダイレクト）し得る捕捉配列１２５５と、を含む。バーコード配列１２４５は、本明細書に記載されるように少なくとも３つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含有する任意のバーコード配列であり得る。タグメント化ＤＮＡ１２２５は、モザイク末端配列インサートであり得るタグメンテーションインサート配列１２５５とＤＮＡ断片１２６０とを有する。それは等温リコンビナーゼポリメラーゼ駆動増幅時に、Ｐ５アダプター／プライミング配列１２７０と、任意選択的プールインデックス１２６５と、タグメンテーションインサート捕捉配列１２５５と、を有するいずれかのジェネリックプライマー１２７５によりプライミングされる。代替的に、遺伝子特異的プライマー１２７５’を使用し得る。この場合、プライマー１２６１の一部分は、遺伝子特異的配列等のＤＮＡのサブセットを選択するようにダイレクトされる。
【０２１７】
[00278]  シーケンシングライブラリを形成する等温増幅産物は、増幅且つ適合化されたＤＮＡ１２８０又は１２８０’である。増幅且つ適合化されたＤＮＡ１２８０は、ジェネリックプライマー１２７５の産物であり、ＤＮＡ断片１２６０のジェネリックライブラリを含み、一方、増幅されたＤＮＡ１２８０’は、遺伝子特異的増幅産物を含むＤＮＡ断片領域１２６２（遺伝子特異的プライミング配列によりプライミングされた遺伝子特異的ＤＮＡの残りの部分）＋１２６１（遺伝子特異的プライミング配列）を有する。
【０２１８】
[00279]  同一細胞からのバーコード付きｃＤＮＡライブラリ及びバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリの作製。また、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に位置する隔離ペン内に生体細胞を配置することと、隔離ペン内に第１の捕捉物体を配置することであって第１の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが、第１のプライミング配列と第１の捕捉配列（例えば、放出させた核酸を捕捉するように構成される）と第１のバーコード配列とを含み、第１のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、第１のバーコード配列の他の全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である、配置することと、本明細書に記載されるようにｃＤＮＡライブラリを得る任意の方法を実施することによりバーコード付きｃＤＮＡライブラリを得ることであって、生体細胞を溶解させることが、生体細胞の形質膜を分解するように実施される、得ることと、生体細胞の核膜をインタクトな状態で残したまま生体細胞から細胞質ＲＮＡを放出させて、生体細胞のＲＮＡからバーコード付きｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を提供することと、マイクロ流体デバイスからｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を搬出することと、隔離ペン内に第２の捕捉物体を配置することであって、第２の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、そのそれぞれが、第２のプライミング配列と第１のタグメンテーションインサート捕捉配列と第２のバーコード配列とを含み、第２のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、第２のバーコード配列の他の全てのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と非同一である、配置することと、本明細書に記載されるようにバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを得る任意の方法を実施することによりバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを得ることであって、生体細胞からの複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片が、第２の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれの第１のタグメンテーションインサート捕捉配列に接触されて、生体細胞のゲノムＤＮＡからバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する、得ることと、マイクロ流体デバイスからバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを搬出することと、を含む、単一生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリ及びバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法が提供される。
【０２１９】
[00280]  幾つかの実施形態では、本方法は、第１の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、第１の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することは、隔離ペンに生体細胞を配置する前、生体細胞のＲＮＡからバーコード付きｃＤＮＡライブラリを得る前、又はマイクロ流体デバイスからバーコード付きｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を搬出する前に実施し得る。幾つかの実施形態では、本方法は、第２の捕捉物体の複数のオリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することを更に含み得る。
【０２２０】
[00281]  種々の実施形態では、第２の捕捉の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することは、バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを得る前又はマイクロ流体デバイスからバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを搬出した後に実施し得る。
【０２２１】
[00282]  種々の実施形態では、第１又は第２の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することは、本明細書に記載されるようにインサイチュでバーコードを同定する任意の方法を用いて実施し得る。
【０２２２】
[00283]  種々の実施形態では、第１の捕捉物体及び第２の捕捉物体はそれぞれ、本明細書に記載の任意の捕捉物体であり得る。
【０２２３】
[00284]  幾つかの実施形態では、第１の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドの第１のプライミング配列は、第２の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドの第２のプライミング配列とは異なり得る。他の実施形態では、第１の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドの第１の捕捉配列は、第２の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドの第１のタグメンテーションインサート捕捉配列とは異なり得る。
【０２２４】
[00285]  種々の実施形態では、第１の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列は、第２の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列と同一であり得る。他の実施形態では、第１の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列は、第２の捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列とは異なり得る。
【０２２５】
[00286]  Ｂ細胞受容体シーケンシングライブラリの作製。
[00287]  Ｂリンパ球からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを作製することであって、作製することが、本明細書に記載されるようにバーコード付きｃＤＮＡライブラリを作製する任意の方法に従って実施され、バーコード付きｃＤＮＡライブラリが、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉物体をデコレートし、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが、Ｎｏｔ１制限部位配列を含む、作製することと、バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅することと、バーコード付きｃＤＮＡライブラリからバーコード付きＢＣＲ配列を選択してバーコード付きＢＣＲ配列が富化されたライブラリを作製することと、バーコード付きＢＣＲ配列が富化されたライブラリからの配列を環化して環化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを作製することと、環化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを再線状化して再構成バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを提供することであって、そのそれぞれがそれぞれの可変（Ｖ）サブ領域及び／又はそれぞれの多様性（Ｄ）サブ領域の３’側にＢＣＲ配列の定常（Ｃ）領域を提示する、提供することと、シーケンシングアダプターの付加並びにＶサブ領域及び／又はＤサブ領域のサブ選択を行ってバーコード付きＢＣＲシーケンシングライブラリを作製することと、を含む、バーコード付きＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シーケンシングライブラリを提供する方法が提供される。
【０２２６】
[00288]  種々の実施形態では、本方法は、ＢＣＲシーケンシングライブラリを増幅してバーコード付きＢＣＲサブ領域配列の増幅されたライブラリを提供することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅することは、ユニバーサルプライマーを用いして実施し得る。
【０２２７】
[00289]  幾つかの実施形態では、ＢＣＲ配列領域を選択することは、ＢＣＲ配列に対して選択性のあるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施してバーコード付きＢＣＲ領域選択的増幅ＤＮＡライブラリを作製することを含み得る。幾つかの実施形態では、バーコード付きＢＣＲ配列を選択することは、少なくとも１つのシーケンシングプライマー配列及び／又は少なくとも１つのインデックス配列を付加することを更に含み得る。種々の実施形態では、バーコード付きＢＣＲ配列が富化されたライブラリからの配列を環化することは、各バーコード付きＢＣＲ配列の５’末端をそのそれぞれの３’末端にライゲートすることを含み得る。種々の実施形態では、環化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを再線状化することは、環化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリのそれぞれをＮｏｔ１制限部位で消化することを含み得る。
【０２２８】
[00290]  他の実施形態では、シーケンシングアダプターを付加すること並びにＶ及び／又はＤサブ領域をサブ選択することは、ＰＣＲを実施してシーケンシングアダプターの付加並びにＶ及び／又はＤサブ領域のサブ選択を行うことを含み得る。
【０２２９】
[00291]  幾つかの他の実施形態では、捕捉物体は本明細書に記載の任意の捕捉物体である。
【０２３０】
[00292]  種々の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるようにバーコードをインサイチュで同定する任意の方法を用いて捕捉物体の複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、同定することは、バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅する前に実施し得る。他の実施形態では、同定することは、バーコード付きｃＤＮＡライブラリを作製する間に実施し得る。
【０２３１】
[00293]  種々の実施形態では、バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅すること、バーコード付きＢＣＲ配列に対して選択性のあるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施すること、配列を環化させること、環化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリをＮｏｔ１制限部位で再線状化すること、及びシーケンシングアダプターの付加並びにＶ及び／又はＤサブ領域のサブ選択を行うこと、のいずれかは、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に位置する隔離ペン内で実施し得る。
【０２３２】
[00294]  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シーケンシングライブラリの作製方法は、図１３Ａ〜Ｂに目を向ければ、よりよく理解し得る。図１３Ａ〜Ｂは、本明細書及び実施例７に記載のＢＣＲシーケンシングライブラリの作製プロセスの模式図である。捕捉物体１３３０は、明確さを期して複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうち１つの捕捉オリゴヌクレオチドのみが示されてビーズ１３１０を含む。捕捉物体１３３０の捕捉オリゴヌクレオチドは、リンカー１３１５を介してビーズ１３１０に結合される。この結合は共有結合であっても非共有結合であってもよい。リンカー１３１５は、プライミング配列１（１３２０）が捕捉オリゴヌクレオチドの長さに沿って位置する捕捉オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。捕捉オリゴヌクレオチドはまた、本明細書に記載の任意のインサイチュ検出可能バーコードであり得るバーコード１３２５と、任意選択的ＵＭＩ１３３５と、シーケンシングアダプター配列１３４０と、Ｎｏｔ１制限部位配列と、この例ではＲＮＡに対するジェネリック捕捉配列ポリＴ（３’末端に２つの追加のヌクレオチドＶＮを有し得る）である捕捉配列１３５０と、を含む。Ｎｏｔ１配列１３４５は、捕捉配列１３５０の５’側且つバーコード１３２５、プライミング配列１３２０、シーケンシングアダプター１３４０、及び任意のＵＭＩ１３３５の３’側にある。捕捉オリゴヌクレオチドは、原細胞の細胞膜の溶解時に放出される対象ＲＮＡ配列１３０１（ポリＡ配列１３５０’以外）を有するＲＮＡ５０５を捕捉するように構成される。ＲＮＡは、そのポリＡ配列１３５０’を捕捉物体のポリＴ捕捉配列１３５０にハイブリダイズして改変捕捉物体１３３０’を形成することにより、捕捉物体に捕捉される。逆転写ボックス１３６５は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド１３０６の存在下でｃＤＮＡデコレート捕捉物体を提供する。この時点で捕捉オリゴヌクレオチドは、逆転写された核酸１３５５の領域を含有する。プライミング配列１（１３２０）及びｃＤＮＡに取り込まれたテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの部分１３０７に対するジェネリックプライマー１３１１、１３１２（表６、配列番号１１３参照）を用いたＰＣＲを介するｃＤＮＡの増幅は、増幅されたＤＮＡライブラリ１３７０を提供する。プライマー１３０２（ＤＮＡ１３７０のプライミング配列１（１３２０）に対する配列１３２０と、任意選択的プールインデックス１３０５と、シーケンシングプライミング配列２（１３０４）と、を有する）と、ＢＣＲ配列のみを選択する種依存のＢＣＲ選択的プライマー１３０３と、を用いた選択ＰＣＲ１３７５。ＢＣＲ選択的プライマー１３０３は、重鎖又は軽鎖の領域を標的とすることが可能なプライマー（１３５６）の混合物であり得る。表６参照（配列番号１１４〜１５０）。産物選択ＤＮＡ１３８０は、増幅産物１３７０に対して以上に列挙したプライミング配列とＵＭＩとバーコード配列とを有するが、この時点ではＤＮＡ断片はＢＣＲ領域１３５７のみを含有し、ＢＣＲ領域１３５７の最も５’側の領域はＢＣＲの全長定常（Ｃ）サブ領域１３５１であり、連結（Ｊ）領域１３５２（研究下の種に存在する場合）、多様性（Ｄ）サブ領域１３５３、及び最後に３’末端可変（Ｖ）領域１３５４を伴う。
【０２３３】
[00295]  よりシーケンシング解析に適合したより興味深いＢＣＲサブ領域（Ｖ、Ｄ、Ｊ）を作製するために、再構成を実施する。選択されたＤＮＡ１３８０をライゲーションにより環化して図１３Ｂの環化ＤＮＡライブラリ１３８５を生成する。次いで、環化ＤＮＡライブラリ１３８５をＮｏｔ１制限部位１３４５（黒矢印）で消化して再線状化ＤＮＡライブラリ１３９０を生成する。環化及び再線状化の効果は、シーケンシングプライミング部位に対してより興味深いＢＣＲサブ領域（Ｖ、Ｄ、Ｊ）の近接度をより良くしてより高品質のリードを達成できるようにすることである。再線状化ＤＮＡライブラリ１３９０では、ＢＣＲサブ領域配列の５’→３’順序が逆転し、この時点では可変（Ｖ）領域１３５４は全てのＢＣＲサブ領域の５’末端方向に配置され、そして３’方向に多様性（Ｄ）サブ領域１３５３、連結（Ｊ）領域１３５２（研究下の種に存在する場合）、最後にＢＣＲ領域配列１３５７の最も３’側部分にＢＣＲの全長定常（Ｃ）サブ領域１３５１が続く。
【０２３４】
[00296]  次いで、サブ選択ＰＣＲ１３９４が実施される。この場合、プライマー配列１３６０と選択領域１３５１’’とを含むプライマー１３０８は、定常（Ｃ）サブ領域の配列１３５１’に向けてダイレクトされる。配列１３５’は、Ｃサブ領域の５’末端の近くにくるように選択されてＣサブ領域の多くを切除する。これによりプライミング配列１３６０も追加されてサブ選択ＤＮＡライブラリ１３９５を生じる。この時点で、より良くシーケンシングプライミング部位に近接して配置することにより、且つ１）ポリＴ配列１３５０を完全に除去することにより、且つ２）ＢＣＲのＣサブ領域の実質的な領域を除去することにより、サブ選択ＢＣＲ領域は、Ｖ、Ｄ、及びＪ領域に入り込んでより高品質のリード及びリード長を可能にする。シーケンシング１３９６は、サブ選択ＤＮＡライブラリ１３９５で実施され、バーコード１３２５及び任意選択的ＵＭＩ１３３５の第１のリードを生成する。シーケンシング１３９２は、任意選択的プールインデックスを読み取る。シーケンシング１３９３及び１３９７は、サブ選択ＢＣＲ１３５７’を読み取る。
【０２３５】
[00297]  シーケンシングライブラリの作製方法はいずれも、２つ以上の捕捉物体を隔離ペンに導入することにより実施し得る。２つ以上の捕捉物体のそれぞれは、以上に記載の１つ以上のカセット化可能サブユニットを含む細胞関連バーコードと、更にはプライミング配列と、を有する２つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを有し得る。幾つかの実施形態では、２つ以上の捕捉物体のそれぞれは同一のバーコードを有し得る。幾つかの他の実施形態では、２つ以上の捕捉物体が同一のペンに導入される場合、各捕捉物体は異なる細胞関連バーコードを有し得る。他の実施形態では、２つ以上の捕捉物体のそれぞれは同一の細胞関連バーコードを有し得る。２つ以上の捕捉物体の使用は、より大きな核酸捕捉能を可能にし得る。本明細書に記載のインサイチュ同定法は、１つの隔離ペン内で２つ以上の捕捉物体を同定するように容易に拡張し得る。
【０２３６】
[00298]  マイクロ流体デバイス並びにかかるデバイスの操作及び観測のためのシステム。図１Ａは、生物学的微小物体の保持、分離、アッセイ、又は培養に使用可能なマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を例示する。カバー１１０を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス１００内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス１００の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６を通って流体培地１８０が流れることができ、任意選択的に１つ以上の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内及び／又はマイクロ流体回路１２０を通して搬送する。１つのマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２又は３個）のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス１００はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１Ａに例示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み得ると共に、各隔離ペンは、流路１０６に流体連通した状態で１つ以上の開口を有し得る。図１Ａのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路１０６に流体連通した状態で単一の開口部のみを有し得る。更に以下で考察するように、マイクロ流体隔離ペンは、培地１８０が流路１０６を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の概説を提供する。
【０２３７】
[00299]  図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
【０２３８】
[00300]  図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ以上のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
【０２３９】
[00301]  支持構造体１０４は、１つ以上の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ以上の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）を更に含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。
【０２４０】
[00302]  マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、（１つ以上のフローチャネルを含んでもよい、又は1つ以上のフローチャネルである）フロー領域、チャンバ、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１Ａに示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。
【０２４１】
[00303]  マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料  −  したがって、マイクロ流体回路材料１１６  −  は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。
【０２４２】
[00304]  カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
【０２４３】
[00305]  幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ以上の部分（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ以上の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ以上の電極を更に含むことができる。１つ以上の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム−錫−酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ以上の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
【０２４４】
[00306]  図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の一部）を含む。
【０２４５】
[00307]  電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ以上の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス（撮像モジュール１６４の一部、以下に記載）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイスは、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器を更に含む。撮像デバイスは、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイスは顕微鏡（又は光学縦列）を更に含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【０２４６】
[00308]  システム１５０は、１つ以上の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成された傾斜デバイス１９０（撮像モジュール１６４の一部、以下に記載）を更に含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
【０２４７】
[00309]  幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ以上の隔離ペンの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ以上の隔離ペンよりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ以上の隔離ペンよりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
【０２４８】
[00310]  幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離ペンの真上又は真下に配置されずに、１つ以上の隔離ペンの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
【０２４９】
[00311]  システム１５０は培地源１７８を更に含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
【０２５０】
[00312]  図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２を更に含むことができる。
【０２５１】
[00313]  マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されたデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されたマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ以上により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
【０２５２】
[00314]  培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ以上の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
【０２５３】
[00315]  原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
【０２５４】
[00316]  撮像モジュール１６４は撮像デバイスを制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイスから画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイスからの画像データは、撮像デバイスにより捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の検出可能な標識の蓄積の有無等）。撮像デバイスにより捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度を更に計算することができる。
【０２５５】
[00317]  傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ以上の隔離ペンへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
【０２５６】
[00318]  図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル１２２への開口部を含むが、ペンがペン内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他のペン内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離ペンの壁は、ベースの内面１０９からカバー１１０の内面に延在してエンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル１２２へのペンの開口は、フロー１０６がペン内にダイレクトされないように流体培地１８０のフロー１０６に対して角度をなして配置される。フローは、ペンの開口平面に接し得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ以上の微小物体をマイクロ流体回路１２０内部に物理的に入れるように構成される。本開示による隔離ペンは、以下に詳細に考察され示されるように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー及び／又は重力との併用に最適化される様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
【０２５７】
[00319]  マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離ペンを含み得る。５つの隔離ペンが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少ない又はより多くの隔離ペンを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０は、それぞれ、生物学的微小物体の保持、分離、アッセイ、又は培養に役立つ１つ以上の利益を提供し得る様々な特徴及び形状を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離ペンを含む。
【０２５８】
[00320]  図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成された複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７を更に含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
【０２５９】
[00321]  幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離ペンは、標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
【０２６０】
[00322]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ以上の微小物体トラップ１３２を更に含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０の１つ以上の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
【０２６１】
[00323]  トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成された開口部を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成された他の特徴を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離ペンの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離ペンの開口部に関してマイクロ流体チャネル１２２の逆側に配置され、それにより、チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それにより、トラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
【０２６２】
[00324]  幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ以上の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離ペンにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ以上の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本開示の実施形態により前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
【０２６３】
[00325]  他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ以上の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ以上の位置（例えば、流路及び／又は隔離ペンの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ以上の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本開示の実施形態により前に収集された液滴を隔離ペンから選択的に取り出す。
【０２６４】
[00326]  幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離ペンの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴をペン内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。更に他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
【０２６５】
[00327]  図１Ｂ、１Ｃ、及び２Ａ〜２Ｈは、本開示の実施形態の実施に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成された実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスの更に別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
【０２６６】
[00328]  生物学的微小物体を配置可能、培養可能、及び／又は監視可能なペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（２０１３年１０月２２日出願の米国出願第１４／０６０，１１７号）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（２０１４年１０月２２日出願の米国出願第１４／５２０，５６８号）、及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（２０１４年１０月２２日出願の米国出願第１４／５２１，４４７号）（それぞれその全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。また、米国特許出願第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号には、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法が記載されている。上記の各出願には更に、光電子ピンセット（ＯＥＴ）等のように誘電泳動（ＤＥＰ）力を生じるように構成された又はオプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されたマイクロ流体デバイスが記載されている。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に例示される光電子ピンセットデバイスは、個別の生物学的微小物体又は一群の生物学的微小物体を選択して移動させるために本開示の実施形態で利用し得るデバイスの例である。
【０２６７】
[00329]  マイクロ流体デバイス原動構成。上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより、個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより、個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
【０２６８】
[00330]  ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離ペン、フロー領域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。更に、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることを更に理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ以上を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
【０２６９】
[00331]  図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成された電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
【０２７０】
[00332]  特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
【０２７１】
[00333]  電源２１２が活性化されている場合、上記ＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
【０２７２】
[00334]  図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。マイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより、活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
【０２７３】
[00335]  幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０６の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０２７４】
[00336]  他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
【０２７５】
[00337]  フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）に記載されており（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、この内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０２７６】
[00338]  ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。更に、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。
【０２７７】
[00339]  ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ以上のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ以上のＤＥＰ電極を活性化することにより、インサイチュで生成された捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。
【０２７８】
[00340]  他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ以上の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０２７９】
[00341]  更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。下記のように、誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
【０２８０】
[00342]  誘電層（図示せず）は、１つ以上の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ〜約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム〜約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
【０２８１】
[00343]  幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５〜３．０ｎｍ）を有する。
【０２８２】
[00344]  幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。更に、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
【０２８３】
[00345]  幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ−Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
【０２８４】
[00346]  したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
【０２８５】
[00347]  他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０２８６】
[00348]  マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
【０２８７】
[00349]  隔離ペン。一般的な隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ〜２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
【０２８８】
[00350]  図２Ａ〜２Ｃの隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、それぞれ、マイクロ流体チャネル１２２に直接開口する単一開口を有する。隔離ペンの開口は、マイクロ流体チャネル１２２の横方向に開口する。電極活性化基板２０６は、マイクロ流体チャネル１２２並びに隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の両方の下側に配置される。隔離ペンのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上表面（隔離ペンのフロアを形成する）は、マイクロ流体チャネル１２２（又はチャネルが存在しないときはフロー領域）内の電極活性化基板２０６の上表面（マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれフロー領域）のフロアを形成する）と同一レベル又は実質的に同一レベルに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴部を有していなくてもよいし、その最高位からその最低位まで約３ミクロン未満、２．５ミクロン、２ミクロン、１．５ミクロン、１ミクロン、０．９ミクロン、０．５ミクロン、０．４ミクロン、０．２ミクロン、０．１ミクロン、若しくはそれ以下で変動する不規則表面若しくはパターン化表面を有していてもよい。マイクロ流体チャネル１２２（又はフロー領域）及び隔離ペンの両方を横切る基板の上表面の高位の変動は、隔離ペンの壁又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．５％未満、０．３％未満、又は０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に記載されているが、このことは本明細書に記載のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００、７００、８００、１０００のいずれにも適用されている。
【０２８９】
[00351]  したがって、マイクロ流体チャネル１２２は掃引領域の例であり得、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は非掃引領域の例であり得る。述べたように、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８は、１つ以上の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ａ〜２Ｂに示される例では、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２３０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体培地１８０を含むと、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２２２から流出口として機能する別のポート２２２への培地のフロー２４２を生成することができる。
【０２９０】
[00352]  図２Ｃは、本開示による隔離ペン２２４の例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。
【０２９１】
[00353]  既知のように、隔離ペン２２４の基端開口部２３４を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、隔離ペン２２４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２４４を生じさせることができる。隔離ペン２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を２次フロー２４４から分離するために、隔離ペン２２４の接続領域２３６の長さＬｃｏｎ（すなわち、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで）は、接続領域２３６への２次フロー２４４の侵入深さＤｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２４４の侵入深さＤｐは、マイクロ流体チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにマイクロ流体チャネル１２２及びマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、マイクロ流体チャネル１２２及び基端開口部２３４の構成は固定され、一方、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度は可変である。したがって、隔離ペン２２４毎に、２次フロー２４４の侵入深さＤｐが接続領域２３６の長さＬｃｏｎを超えないことを保証するマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６への２次フロー２４４を制限することができ、分離領域２４０に入らないようにすることができる。したがって、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き込まない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。
【０２９２】
[00354]  更に、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２の流量がＶｍａｘを超えない限り、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をマイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬｃｏｎを２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐよりも大きくすることで、ある隔離ペン２２４の、マイクロ流体チャネル１２２又は別の隔離ペン（例えば、図２Ｄの隔離ペン２２６、２２８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
【０２９３】
[00355]  マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２により影響を及ぼすことができるため、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、マイクロ流体チャネル１２２から接続領域２３６を通り分離領域２４０内の第２の流体培地２４８への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体培地２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の培地２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通り、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２４８の成分の拡散によってのみ、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離ペンの分離領域とフロー領域との間の流体培地交換の程度は、流体交換の約９０％超、９１％、９２％、９３％、９４％  ９５％、９６％、９７％、９８％、又は約９９％超である。第１の培地１８０は、第２の培地２４８と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。更に、第１の培地１８０及び第２の培地２４８は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ以上の細胞により又はマイクロ流体チャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２４８を調整することを通して）。
【０２９４】
[00356]  マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２により生じる２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、マイクロ流体チャネル１２２の形状（例えば、マイクロ流体チャネルは、培地を接続領域２３６に向けることができ、接続領域２３６から培地を逸らすことができ、又はマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２３４でのマイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２４８の粘度等が挙げられる。
【０２９５】
[00357]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の寸法は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２のベクトルに対して以下のように向けることができる：マイクロ流体チャネル幅Ｗｃｈ（又はマイクロ流体チャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
【０２９６】
[00358]  図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内にあり得る。代替的に、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
【０２９７】
[00359]  図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での基端領域２５４の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の値であり得る。代替的に、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。更に、先端開口部２３８は基端開口部２３４よりも小さくてよく、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間で狭め得る。例えば、接続領域２３６は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。更に、接続領域２３６の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の部分）。
【０２９８】
[00360]  図２Ｄ〜２Ｆは、図１Ａの各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形であるマイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形である複数の隔離ペン２６６も有する。特に、図２Ｄ〜２Ｆに示されるデバイス４００の隔離ペン２６６をデバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００、７００、８００、１０００での上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００、７００、８００、１０００と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
【０２９９】
[00361]  図２Ｄ〜２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造体（図２Ｄ〜２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｄ〜２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２６２は枠２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは図１Ａに示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は複数のチャネル２６４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル２６４に複数の隔離ペン２６６が流体接続される。
【０３００】
[00362]  各隔離ペン２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。マイクロ流体チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２での先端開口部２７６まで、接続領域２６８はマイクロ流体チャネル２６４を分離領域２７０に流体接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体培地２５４のフロー２７８は、マイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の培地２５４の２次フロー２８２をもたらすことができる。
【０３０１】
[00363]  図２Ｅに示されるように、各隔離ペン２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４の基端開口部２７４と分離構造２７２の先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬｃｏｎは、２次フロー２８２の最大侵入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー２８２は、分離領域２７０に向かってリダイレクトされずに接続領域２６８内に延びる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大侵入深さＤｐよりも小さい長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー２８２は、接続領域２６８を通って延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２との和は最大侵入深さＤｐよりも大きく、したがって、２次フロー２８２は分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬｃｏｎが侵入深さＤｐよりも大きいか否か又は接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が侵入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８は、侵入深さＤｐを有する２次フローをもたらし、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の微小物体（示されていないが、図２Ｃに示される微小物体２４６と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８により分離領域２７０外に引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８は、様々な材料（図示せず）もチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内に引き込まない。したがって、マイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内の成分をマイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内の成分を分離領域２７０からマイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地２５４は第２の培地２５８と同じ培地であり得、又は第１の培地２５４は第２の培地２５８と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地２５４及び第２の培地２５８は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域２７０内の１つ以上の細胞により又はマイクロ流体チャネル２６４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
【０３０２】
[00364]  図４Ｂに示されるように、マイクロ流体チャネル２６４内のマイクロ流体チャネル２６４の幅Ｗｃｈ（すなわち、図２Ｄにおいて矢印２７８で示されるマイクロ流体チャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１に略直交することができ、したがって、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅ｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２は、互いと略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、角度：約３０°〜約９０°、約４５°〜約９０°、約６０°〜約９０°等を含む。
【０３０３】
[00365]  隔離ペンの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。
【０３０４】
[00366]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約５０〜１０００μｍ、５０〜５００μｍ、５０〜４００μｍ、５０〜３００μｍ、５０〜２５０μｍ、５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、７０〜５００μｍ、７０〜４００μｍ、７０〜３００μｍ、７０〜２５０μｍ、７０〜２００μｍ、７０〜１５０μｍ、９０〜４００μｍ、９０〜３００μｍ、９０〜２５０μｍ、９０〜２００μｍ、９０〜１５０μｍ、１００〜３００μｍ、１００〜２５０μｍ、１００〜２００μｍ、１００〜１５０μｍ、又は１００〜１２０μｍであり得る。幾つかの他の実施形態では、基端開口（例えば２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば１２２）の幅Ｗｃｈは、約２００〜８００ミクロン、２００〜７００ミクロン、又は２００〜６００ミクロンであり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、上記列挙される任意の終点内の幅であることもできる。更に、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域で、これらの任意の幅内であるように選択することができる。
【０３０５】
[00367]  幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約３０〜約２００ミクロン又は約５０〜約１５０ミクロンの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約１×１０４〜３×１０６平方ミクロン、２×１０４〜２×１０６平方ミクロン、４×１０４〜１×１０６平方ミクロン、２×１０４〜５×１０５平方ミクロン、２×１０４〜１×１０５平方ミクロン、又は約２×１０５〜２×１０６平方ミクロンの断面積を有する。
【０３０６】
[00368]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、以下の任意の高さ内の高さであり得る：２０〜１００μｍ、２０〜９０μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜７０μｍ、２０〜６０μｍ、２０〜５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜９０μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜７０μｍ、３０〜６０μｍ、３０〜５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜９０μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜７０μｍ、４０〜６０μｍ、又は４０〜５０μｍ。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、上記列挙される任意の終点内の高さであることもできる。マイクロ流体チャネル１２２の高さＨｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域で、これらの任意の高さ内であるように選択することができる。
【０３０７】
[00369]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、約５００〜５０，０００平方μｍ、５００〜４０，０００平方μｍ、５００〜３０，０００平方μｍ、５００〜２５，０００平方μｍ、５００〜２０，０００平方μｍ、５００〜１５，０００平方μｍ、５００〜１０，０００平方μｍ、５００〜７，５００平方μｍ、５００〜５，０００平方μｍ、１，０００〜２５，０００平方μｍ、１，０００〜２０，０００平方μｍ、１，０００〜１５，０００平方μｍ、１，０００〜１０，０００平方μｍ、１，０００〜７，５００平方μｍ、１，０００〜５，０００平方μｍ、２，０００〜２０，０００平方μｍ、２，０００〜１５，０００平方μｍ、２，０００〜１０，０００平方μｍ、２，０００〜７，５００平方μｍ、２，０００〜６，０００平方μｍ、３，０００〜２０，０００平方μｍ、３，０００〜１５，０００平方μｍ、３，０００〜１０，０００平方μｍ、３，０００〜７，５００平方μｍ、又は３，０００〜６，０００平方μｍであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、上記列挙される任意の終点内の任意の領域であることもできる。
【０３０８】
[00370]  隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、約１〜６００μｍ、５〜５５０μｍ、１０〜５００μｍ、１５〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜５００μｍ、４０〜４００μｍ、６０〜３００μｍ、８０〜２００μｍ、又は約１００〜１５０μｍであり得る。上記は単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、上記列挙される任意の終点内の任意の長さであることもできる。
【０３０９】
[00371]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）での接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、約２０〜５００μｍ、２０〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜２００μｍ、２０〜１５０μｍ、２０〜１００μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜６０μｍ、３０〜４００μｍ、３０〜３００μｍ、３０〜２００μｍ、３０〜１５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜６０μｍ、４０〜３００μｍ、４０〜２００μｍ、４０〜１５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜６０μｍ、５０〜２５０μｍ、５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、５０〜８０μｍ、６０〜２００μｍ、６０〜１５０μｍ、６０〜１００μｍ、６０〜８０μｍ、７０〜１５０μｍ、７０〜１００μｍ、又は８０〜１００μｍであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）の接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される任意の値）。
【０３１０】
[00372]  隔離ペンの種々の実施形態では、基端開口（例えば２３４）における接続領域（例えば２３６）の幅Ｗｃｏｎは、隔離ペンで意図される微小物体（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は卵細胞若しくは胚であり得る生体細胞）の最大寸法と少なくとも同程度であり得る。上記は単なる例にすぎず、基端開口（例えば２３４）における接続領域（例えば２３６）の幅Ｗｃｏｎは上記の例と異なり得る（例えば、以上に列挙した端点のいずれかの範囲内の幅）。
【０３１１】
隔離ペンの種々の実施形態では、接続領域の基端開口の幅Ｗｐｒは、隔離ペンで意図される微小物体（例えば、細胞等の生物学的微小物体）の最大寸法と少なくとも同程度であり得る。例えば、幅Ｗｐｒは、約５０μｍ、約６０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍであり得るか、又は約５０〜３００μｍ、約５０〜２００μｍ、約５０〜１００μｍ、約７５〜１５０μｍ、約７５〜１００μｍ、若しくは約２００〜３００μｍであり得る。
【０３１２】
隔離ペンの種々の実施形態では、接続領域（例えば２３６）の長さＬｃｏｎと基端開口２３４における接続領域（例えば２３６）の幅Ｗｃｏｎとの比は、次の比のいずれか以上、すなわち、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はそれ以上であり得る。上記は単なる例にすぎず、接続領域２３６の長さのＬｃｏｎと基端開口２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎとの比は、上記の例と異なり得る。
【０３１３】
[00375]  マイクロ流体デバイス１００、２００、２３、２５０、２８０、２９０、３００、７００、８００、１０００の種々の実施形態では、Ｖｍａｘは、０．２、０．５、０．７、１．０、１．３、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．７、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５マイクロリットル／ｓｅｃの近傍に設定可能である。
【０３１４】
[00376]  隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの種々の実施形態では、隔離ペンの分離領域（例えば２４０）の容積は、例えば、少なくとも５×１０５、８×１０５、１×１０６、２×１０６、４×１０６、６×１０６、８×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８又は８×１０８立方μｍ、又はそれ以上であり得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの種々の実施形態では、隔離ペンの容積は、約５×１０５、６×１０５、８×１０５、１×１０６、２×１０６、４×１０６、８×１０６、１×１０７、３×１０７、５×１０７、又は約８×１０７立方μｍ、又はそれ以上であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約１ナノリットル〜約５０ナノリットル、２ナノリットル〜〜約２５ナノリットル、２ナノリットル〜約２０ナノリットル、約２ナノリットル〜約１５ナノリットル、又は約２ナノリットル〜約１０ナノリットルであり得る。
【０３１５】
[00377]  種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、本明細書で考察される実施形態のいずれかで構成される隔離ペンを有する。この場合、マイクロ流体デバイスは、約５〜約１０の隔離ペン、約１０〜約５０の隔離ペン、約１００〜約５００の隔離ペン、約２００の〜約１０００の隔離ペン、約５００〜約１５００の隔離ペン、約１０００〜約２０００の隔離ペン、約１０００〜約３５００の隔離ペン、約３０００〜約７０００の隔離ペン、約５０００〜約１０，０００の隔離ペン、約９，０００〜約１５，０００の隔離ペン、又は約１２，０００〜約２０，０００の隔離ペンを有する。隔離ペンは全て同一のサイズである必要はなく、様々な構成（例えば、異なる幅、隔離ペン内の異なる特徴）を含み得る。
【０３１６】
[00378]  図２Ｇは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。マイクロ流体デバイス２８０は図２Ｇに示され、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離ペン１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２に通じる複数の隔離ペンを更に含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離ペンは、図２Ｃに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。
【０３１７】
[00379]  図３Ａ〜３Ｂは、本発明によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００、７００、８００、１０００）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４を更に含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３２０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
【０３１８】
[00380]  図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載され、ＰＣＢＡ３２２に電気的に集積することができる。例示的な担体は、同様にＰＣＢＡ３２２に搭載されるソケット３０２も含む。
【０３１９】
[00381]  通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）を更に含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。
【０３２０】
[00382]  特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８を更に含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロプロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
【０３２１】
[00383]  幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されるＤＣ−ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ〜−６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。
【０３２２】
[00384]  図３Ａに示されるように、支持構造体３００（例えば、ネスト）は、熱制御サブシステム３０６を更に含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、ネスト３００により保持されるマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造体３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造体３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
【０３２３】
[00385]  幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／−０．１％、温度係数＋／−０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／−０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
【０３２４】
[00386]  ネスト３００はシリアルポート３２４を含むことができ、シリアルポート３２４により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェース３１０（図示せず）を介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
【０３２５】
[00387]  上述したように、システム１５０は撮像デバイスを含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイスは光変調サブシステム３３０を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって、光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる（図３Ｂを参照）。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。
【０３２６】
[00388]  特定の実施形態では、撮像デバイスは顕微鏡３５０を更に含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。
【０３２７】
[00389]  特定の実施形態では、顕微鏡３５０は１つ以上の検出器３４８を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は撮像モジュール１６４により制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。更に、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ以上の検出器３４８に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
【０３２８】
[00390]  特定の実施形態では、撮像デバイスは、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２は構造化光の生成（例えば、光変調サブシステム３３０を介した）に使用することができ、第２の光源３３４は非構造化光の提供に使用することができる。第１の光源３３２は、光学的に作動される動電学的及び／又は蛍光励起のために構造化光を生成することができ、第２の光源３３４は、明視野照明の提供に使用することができる。これらの実施形態では、原動モジュール１６４を使用して第１の光源３３２を制御することができ、撮像モジュール１６４を使用して第２の光源３３４を制御することができる。顕微鏡３５０の光学縦列は、（１）デバイスがネスト３００により保持されているとき、構造化光を光変調サブシステム３３０から受け取り、構造化光を光学作動式動電学的デバイス等のマイクロ流体デバイス内の少なくとも第１の領域で結像し、（２）マイクロ流体デバイスから反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、そのような反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を検出器３４８上に結像するように構成され得る。光学縦列は、デバイスがネスト３００により保持されているとき、非構造化光を第２の光源から受け取り、非構造化光をマイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域で結像するように更に構成され得る。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域は重複領域であり得る。例えば、第１の領域は第２の領域のサブセットであり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、追加的又は代替的に、任意の好適な波長の光を有し得るレーザーを含み得る。図３Ｂに示される光学システムの図は模式図にすぎず、光学システムは、追加のフィルタ、ノッチフィルタ、レンズ等を含み得る。第２の光源３３４が明視野及び／又は蛍光励起更にはレーザー照明のための１つ以上の光源を含む場合、光源の物理的構成は、図３Ｂに示されるものと異なり得ると共に、レーザー照明は、光学システム内の任意の好適な物理的位置に導入し得る。光源３３４及び光源３３２／光変調サブシステム３３０の模式的位置は、同様に交換し得る。
【０３２９】
[00391]  図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０により提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３３６を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。
【０３３０】
[00392]  幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム３３０から来る構造化光は、試料面３４２で反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ３４６を透過して検出器３４８に到達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に到達する光の量と第２の光源３３４から検出器３４８に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
【０３３１】
[00393]  コーティング溶液及びコーティング剤。理論により限定することを意図するものではないが、マイクロ流体デバイスとその中に維持された生物学的微小物体との間に主要なインタフェースを提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を呈するようにマイクロ流体デバイスの少なくとも１つ以上の内面が調整又はコーティングされている場合、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成のマイクロ流体デバイス）内の生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は容易であり得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で向上した生存能、より大量の増殖、及び／又はより向上した可搬性を呈する）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体デバイスのカバーの内面、及び／又は回路材料の表面）の１つ以上は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するようにコーティング溶液及び／又はコーティング剤で処理又は改質し得る。
【０３３２】
[00394]  コーティングは、生物学的微小物体の導入前又は導入後に施してもよいし、生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、１つ以上のコーティング剤を含む流体培地に入れてマイクロ流体デバイスに搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、マイクロ流体デバイスへの生物学的微小物体の導入前にコーティング剤を含むコーティング溶液で処理又は「プライミング」される。
【０３３３】
[00395]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体の維持及び／又は増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する（例えば、以下に記載の調整された表面を提供する）コーティング材料を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面は実質的に全て、コーティング材料を含む。コーティングされた内面は、フロー領域（例えばチャネル）、チャンバ、若しくは隔離ペンの表面又はそれらの組合せを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、コーティング材料でコーティングされた少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、コーティング材料でコーティングされた少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、コーティング材料でコーティングされる。
【０３３４】
[00396]  コーティング剤／溶液。限定されるものではないが、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、界面活性剤、酵素、及びそれらの任意の組合せをはじめとする任意の便利なコーティング剤／コーティング溶液を使用可能である。
【０３３５】
[00397]  ポリマー系コーティング材料。少なくとも１つの内面は、ポリマーを含むコーティング材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、スターポリマー（スターコポリマー）、及びグラフトポリマー又はコームポリマー（グラフトコポリマー）に見られるような様々な構造モチーフを有し得ると共に、それらは全て、本明細書に開示される方法に好適であり得る。
【０３３６】
[00398]  ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量ＭＷで、約２０００Ｄａ〜約２０ＫＤａの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２〜１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。コーティングされた表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ＭＷ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、ＭＷ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭＷを有し得る。
【０３３７】
[00399]  他の実施形態では、コーティング材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。他の実施形態では、コーティング材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含有するポリマーを含み得る。更に他の実施形態では、コーティング材料は、スルホン酸部分を含有するポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル部分、アルケニル部分、又は芳香族部分を含有するサブユニットであり得る。限定されるものではないが一例は、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。更なる実施形態では、コーティング材料は、アミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレシンが挙げられる。
【０３３８】
[00400]  他の実施形態では、コーティング材料は、糖部分を含有するポリマーを含み得る。限定されるものではないが例として、キサンタンガムやデキストラン等の多糖は、マイクロ流体デバイスにおいて細胞固着を低減又は防止し得る材料を形成するのに好適であり得る。例えば、約３ｋＤａのサイズを有するデキストランポリマーは、マイクロ流体デバイス内の表面のコーティング材料を提供するために使用し得る。
【０３３９】
[00401]  他の実施形態では、コーティング材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含んでもよく、高分子電解質表面を提供する。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７−デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。
【０３４０】
[00402]  更に他の実施形態では、コーティング材料は、アミノ酸部分を含有するポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含有するポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得ると共に、それらはいずれもペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。限定されるものではないが一例では、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び／又はコーティング剤としてアルブミン及び／又は１つ以上の他の類似のタンパク質を含む血清（又は複数の異なる血清の組み合わせ）であり得る。血清は、限定されるものではないがウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等をはじめとする任意の便利な供給源に由来し得る。特定の実施形態では、コーティング溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の位置を含めて、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。特定の実施形態では、コーティング溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の位置を含めて、約２０％（ｖ／ｖ）〜約５０％ｖ／ｖの濃度で存在し得る。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬでコーティング溶液中にコーティング剤として存在し得る。これに対して、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬでコーティング溶液中にコーティング剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、３０％でコーティング溶液中にコーティング剤として存在する。幾つかの実施形態では、細胞接着を最適化して細胞成長を促進するために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質をコーティング材料中に提供し得る。コーティング材料に含まれ得る細胞マトリックスタンパク質としては、限定されるものではないがコラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えばフィブロネクチン）、又はラミニンが挙げられ得る。更に他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスのコーティング材料中に提供し得る。
【０３４１】
[00403]  幾つかの実施形態では、コーティング材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、コーティング材料は、調整された表面に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
【０３４２】
[00404]  共有結合コーティング材料。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイス内における生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する共有結合分子を含み、かかる細胞に対して調整された表面を提供する。
【０３４３】
[00405]  以下に記載されるように、共有結合分子は結合基を含み、結合基はマイクロ流体デバイスの１つ以上の表面に共有結合される。結合基はまた、生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分に共有結合される。
【０３４４】
[00406]  幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された共有結合部分は、アルキル部分若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分、単糖若しくは多糖（限定されるものではないがデキストランを含み得る）、アルコール（限定されるものではないがプロパルギルアルコールを含む）、ポリアルコール、限定されるものではないがポリビニルアルコールを含む、アルキレンエーテル、限定されるものではないがポリエチレングリコールを含む、高分子電解質（限定されるものではないがポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含む）、アミノ基（その誘導体、例えば、限定されるものではないがアルキル化アミン、ヒドロキシアルキル化アミノ基、グアニジニウム、及び非芳香族窒素環原子含有ヘテロ環式基、例えば、限定されるものではないがモルホリニル若しくはピペラジニルを含む）、カルボン酸、限定されるものではないがプロピオル酸を含む（カルボキシレートアニオン性表面を供給し得る）、ホスホン酸、限定されるものではないがエチニルホスホン酸を含む（ホスホネートアニオン性表面を提供し得る）、スルホネートアニオン、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸、又はアミノ酸を含み得る。
【０３４５】
[00407]  種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスにおいて生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された共有結合部分は、非ポリマー部分、例えば、アルキル部分、置換アルキル部分、例えば、フルオロアルキル部分（限定されるものではないがペルフルオロアルキル部分を含む）、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又は糖部分を含み得る。代替的に、共有結合部分は、以上に記載の部分のいずれかであり得る高分子部分を含み得る。
【０３４６】
[00408]  幾つかの実施形態では、共有結合アルキル基部分は、直鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２個、若しくはそれ以上の炭素の直鎖）を形成する炭素原子を含み得、並びに非分岐鎖アルキル部分を含み得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は、置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかは、フッ素化又は過フッ素化し得る）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含んでもよく、ここで、第１及び第２のセグメントは、直接又は間接的（例えば、エーテル結合により）に結合され得る。アルキル基の第１のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第２のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。
【０３４７】
[00409]  他の実施形態では、共有結合部分は、２つ以上のタイプのアミノ酸を含み得る少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。したがって、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。
【０３４８】
[00410]  他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも１つのアルキレンオキシド部分を含み得ると共に、以上に記載の任意のアルキレンオキシドポリマーを含み得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの有用な一クラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは、約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭｗを有し得る。
【０３４９】
[00411]  共有結合部分は１つ以上のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、非分岐鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
【０３５０】
[00412]  共有結合部分は１つ以上のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス及び任意選択的に隔離ペン及び／又はフロー領域（例えば、チャネル）内の環境のｐＨ変調を可能にする構造を有し得る。
【０３５１】
[00413]  調整された表面を提供するコーティング材料は、１種類のみの共有結合部分を含み得るか又は２種類以上の異なる共有結合部分を含み得る。例えば、フルオロアルキルで調整された表面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同一の、例えば、同一の結合基及び表面への共有結合、同一の全長、並びにフルオロアルキル部分を含む同一の数のフルオロメチレンユニットを有する、複数の共有結合部分を有し得る。代替的に、コーティング材料は、表面に付着された２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、コーティング材料は、特定数のメチレンユニット又はフルオロメチレンユニットを有する共有結合されたアルキル部分又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得ると共に、より嵩高い部分をコーティング表面に呈する能力を提供し得るより多数のメチレンユニット又はフルオロメチレンユニットを有するアルキル鎖又はフルオロアルキル鎖に共有結合された荷電部分を有する分子の更なるセットを更に含み得る。この場合、異なるそれほど立体的に嵩高くない末端及びより少数の骨格原子を有する分子の第１のセットは、全基板表面の機能化を支援可能であり、それにより、基板自体を構成するシリコン／酸化ケイ素、酸化ハフニウム、又はアルミナへの望ましくない接着又は接触を防止する。他の例では、共有結合部分は、表面上にランダムに交互電荷を呈する双性イオン性表面を提供し得る。
【０３５２】
[00414]  調整された表面の性質。調整された表面の組成以外に、疎水性材料の物理的厚さ等の他の因子がＤＥＰ力に影響を及ぼし得る。調整された表面を基板に形成する方法（例えば、気相堆積、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、静電コーティング）等の各種因子は、調整された表面の物理的厚さを変化させ得る。幾つかの実施形態では、調整された表面は、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７ｎｍ、約１ｎｍ〜約５ｎｍ、又はそれらの間の任意の個別値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合された部分により形成された調整された表面は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有し得る。種々の実施形態では、本明細書に記載されるように作製された調整された表面は、１０ｎｍ未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整された表面の共有結合された部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成の基板表面）に共有結合された場合、単層を形成し得ると共に、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５〜３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。これらの値は、例えば、典型的には約３０ｎｍの厚さを有し得るスピンコーティングにより作製された表面のものとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整された表面は、ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイス内の操作で好適に機能するように完全に形成された単層を必要とするものではない。
【０３５３】
[00415]  種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整された表面を提供するコーティング材料は、望ましい電気的性質を提供し得る。理論により限定することを意図するものではないが、特定のコーティング材料でコーティングされた表面のロバスト性に影響を及ぼす因子の１つは、固有電荷トラッピングである。様々なコーティング材料が電子をトラップし得るので、コーティング材料が破壊されるおそれがある。コーティング材料の欠陥は、電荷トラッピングを増加させてコーティング材料の更なる破壊をもたらし得る。同様に、様々なコーティング材料が様々な絶縁耐力（すなわち、絶縁破壊をもたらす最小印加電界）を有するので、電荷トラッピングが影響を受けるおそれがある。特定の実施形態では、コーティング材料は、電荷トラッピングの量を低減又は制限する全体構造（例えば、密充填単層構造）を有し得る。
【０３５４】
[00416]  調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化（又はパーフルオロ化）炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。
【０３５５】
[00417]  単一部分又は複数部分で調整された表面。共有結合コーティング材料は、以下に記載されるように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分をすでに含有する分子の反応により形成し得る。代替的に、共有結合コーティング材料は、生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分と、それ自体が表面に共有結合された表面改質リガンドと、をカップリングさせることにより２部系列で形成し得る。
【０３５６】
[00418]  共有結合コーティング材料を調製する方法。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離ペン及び／又はフロー領域の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合されるコーティング材料は、式１又は式２の構造を有する。コーティング材料を一ステップで表面に導入する場合、それは式１の構造を有し、一方、コーティング材料を多ステッププロセスで導入する場合、それは式２の構造を有する。
【化１】
2019528762.tif 000005
【０３５７】
[00419]  コーティング材料は、ＤＥＰ構成又はＥＷ構成の基板の表面の酸化物に共有結合し得る。ＤＥＰ構成又はＥＷ構成の基板は、シリコン、酸化ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得る。酸化物は、基板の天然化学構造の一部として存在し得るか又は以下で考察されるように導入し得る。
【０３５８】
[00420]  コーティング材料は、シロキサン基又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されるシロキシ基又はホスホネートエステル基であり得る結合基（「ＬＧ」）を介して酸化物に付着し得る。マイクロ流体デバイスにおいて生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分は、本明細書に記載の部分のいずれかであり得る。結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイスにおいて生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分に直接的又は間接的に接続し得る。結合基ＬＧが部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカー（「Ｌ」）は存在せず、ｎは０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬが存在し、ｎは１である。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及び／又はリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。それにはエーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、及び／又はホスホネート基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環式基から選択し得る１つ以上の部分の任意の組合せが介在し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は１０〜２０原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は、約５原子〜約２００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。
【０３５９】
[00421]  幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分は、以上に示されたように、多ステッププロセスで基板の表面に付加し得ると共に式２の構造を有する。この部分は以上に記載の部分のいずれかであり得る。
【０３６０】
[00422]  幾つかの実施形態では、カップリング基ＣＧは、反応性部分Ｒｘと反応性対部分Ｒｐｘ（すなわち、反応性部分Ｒｘと反応するように構成された部分）との反応から得られる基を表す。例えば、典型的なカップリング基ＣＧの１つは、アミノ基と、カルボン酸の誘導体、例えば、活性化エステル、酸塩化物等と、の反応の結果であるカルボキサミジル基を含み得る。他のＣＧは、トリアゾリレン基、カルボキサミジル、チオアミジル、オキシム、メルカプチル、ジスルフィド、エーテル、若しくはアルケニル基、又は反応性部分とそのそれぞれの反応性対部分との反応により形成し得る任意の他の好適な基を含み得る。カップリング基ＣＧは、以上に記載の要素の任意の組合せを含み得るリンカーＬの第２の末端（すなわち、マイクロ流体デバイスにおいて生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分に近接する末端）に位置し得る。幾つかの他の実施形態では、カップリング基ＣＧは、リンカーＬの骨格に介在し得る。カップリング基ＣＧがトリアゾリレンである場合、それはクリックカップリング反応から生じる生成物であり得ると共に、更に置換されていてもよい（例えば、ジベンゾシクロオクテニル（dibenzocylcooctenyl）縮合トリアゾリレン基）。
【０３６１】
[00423]  幾つかの実施形態では、コーティング材料（又は表面改質リガンド）は、化学気相堆積を用いてマイクロ流体デバイスの内面上に堆積される。気相堆積プロセスは、任意選択的に、例えば、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８又はＥＷ構成基板の支持構造体１０４の誘電体層）のプレクリーニングにより、溶媒浴、超音波処理、又はそれらの組み合わせへの暴露により改善可能である。代替的又は追加的に、かかるプレクリーニングは、各種不純物を除去可能であると同時に酸化表面（例えば、本明細書に記載されるように共有結合修飾し得る表面の酸化物）を導入する酸素プラズマクリーナによるカバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板の処理を含み得る。代替的に、酸素プラズマクリーナの代わりに、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、約３：１〜約７：１の硫酸対過酸化水素比を有し得るピラニア溶液）を使用し得る。
【０３６２】
[00424]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス２００が組み立てられて、マイクロ流体回路１２０を画定するエンクロージャ１０２を形成した後、蒸着を使用してマイクロ流体デバイス２００の内面をコーティングする。理論により限定することを意図するものではないが、完全にアセンブルされたマイクロ流体回路１２０上にかかるコーティング材料を堆積させることは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６誘電体層及び／又はカバー１１０との間の結合の弱化により引き起こされるデラミネーションの防止に有益であり得る。２ステッププロセスを利用する実施形態では、以上に記載されるように気相堆積により表面改質リガンドを導入してから、生物学的微小物体の維持／増殖に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分を導入し得る。後続反応は、表面改質マイクロ流体デバイスを溶液中で好適なカップリング試薬に暴露することにより実施し得る。
【０３６３】
[00425]  図２Ｈは、調整された表面を提供する例示的な共有結合コーティング材料を有するマイクロ流体デバイス２９０の断面図を示す。例示されるように、コーティング材料２９８（模式的に示される）は、ＤＥＰ基板であり得るベース２８６の内面２９４及びマイクロ流体デバイス２９０のカバー２８８の内面２９２の両方に共有結合された密充填分子の単層を含み得る。コーティング材料２９８は、幾つかの実施形態では以上で考察したように、マイクロ流体デバイス２９０内の回路要素及び／又は構造体を規定するために使用されるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含めて、マイクロ流体デバイス２９０のエンクロージャ２８４に近接する内向きの実質的に全て内面２９４、２９２上で配置可能である。代替的な実施形態では、コーティング材料２９８は、マイクロ流体デバイス２９０の内面の１つのみ又は幾つかの上に配置可能である。
【０３６４】
[00426]  図２Ｈに示される実施形態では、コーティング材料２９８は、オルガノシロキサン分子の単層を含み得ると共に、各分子は、シロキシリンカー２９６を介してマイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４に共有結合される。以上で考察したコーティング材料２９８はいずれも使用可能であり（例えば、オルガノシロキシ部分に対するアルキル末端部分、フルオロアルキル末端部分、ＰＥＧ末端部分、デキストラン末端部分、又は正電荷若しくは負電荷を含有する末端部分）、末端部分は、そのエンクロージャ対向末端（すなわち、内面２９２、２９４に結合せずにエンクロージャ２８４に近接するコーティング材料２９８の単層部分）に配置される。
【０３６５】
[00427]  他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４をコーティングするために使用されるコーティング材料２９８は、アニオン性、カチオン性、若しくは双性イオン性の部分又はそれらの任意の組合せを含み得る。理論により限定することを意図するものではないが、マイクロ流体回路１２０のエンクロージャ２８４の内面にカチオン性部分、アニオン性部分、及び／又は双性イオン性部分を呈することにより、コーティング材料２９８は、得られる水和水が生物学的微小物体と非生物学的分子（例えば、基板のシリコン及び／又は酸化ケイ素）との相互作用を回避する層（又は「シールド」）として作用するように水分子との強い水素結合を形成可能である。そのほか、コーティング材料２９８がコーティング剤と併用される実施形態では、コーティング材料２９８のアニオン、カチオン、及び／又は双性イオンは、エンクロージャ２８４内の培地１８０（例えばコーティング溶液）に存在する非共有結合コーティング剤（例えば溶液中のタンパク質）の荷電部分とのイオン結合を形成可能である。
【０３６６】
[00428]  更に他の実施形態では、コーティング材料は、そのエンクロージャ対向末端に親水性コーティング剤を含み得るか又はそれを呈するように化学修飾し得る。幾つかの実施形態では、コーティング材料は、ＰＥＧ等のアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、コーティング材料は、デキストラン等の多糖を含み得る。以上で考察した荷電部分（例えば、アニオン性、カチオン性、及び双性イオン性の部分）のように、親水性コーティング剤は、得られる水和水が生物学的微小物体と非生物学的分子（例えば、基板のシリコン及び／又は酸化ケイ素）との相互作用を回避する層（又は「シールド」）として作用するように水分子との強い水素結合を形成可能である。
【０３６７】
[00429]  適切なコーティング処理及び改質の更なる詳細は、２０１６年４月２２日出願の米国特許出願第１５／１３５，７０７号（その全体が参照により組み込まれる）に見いだし得る。
【０３６８】
[00430]  マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の細胞の生存能を維持するための追加のシステムコンポーネント。細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加のコンポーネントにより機能細胞の維持の助けとなる環境条件を提供し得る。例えば、かかる追加のコンポーネントは、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調節、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供可能である。
【０３６９】
[00431]  マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の細胞の生存能を維持するための追加のシステムコンポーネント。細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加のコンポーネントにより機能細胞の維持の助けとなる環境条件を提供し得る。例えば、かかる追加のコンポーネントは、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調節、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供可能である。
【０３７０】
[00432]  装填方法。生物学的微小物体又は微小物体、例えば、限定されるものではないがビーズ等の装填は、本明細書に記載されるように、流体フロー、重力、誘電泳動（ＤＥＰ）力、エレクトロウェッティング、磁力、又はそれらの任意の組合せの使用を必要とし得る。ＤＥＰ力は、例えば、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成により光学的に、及び／又は時間／空間パターンで電極／電極領域の活性化により電気的に、発生可能である。同様に、エレクトロウェッティング力は、例えば、オプト−エレクトロウェッティング（ＯＥＷ）構成により光学的に、及び／又は時間空間パターンで電極／電極領域の活性化により電気的に提供し得る。
【０３７１】
実験
[00433]  システム及びマイクロ流体デバイス。システム及びマイクロ流体デバイス：Berkeley Lights, Inc.製。システムには、少なくともフローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整・ポンプコンポーネント、光作動ＤＥＰ構成用の光源、マイクロ流体デバイス用の取付けステージ、及びカメラが含まれていた。マイクロ流体デバイスは、OptoElectroPositioning（OEP（商標））技術を用いて構成されたOptoSelect（商標）デバイス（Berkeley Lights, Inc.）であった。マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネル及びそれに流体接続された複数のNanoPen（商標）チャンバを含み、チャンバは約７×１０５立方μｍの容積を有していた。
【０３７２】
[00434]  プライミングレジーム。２５０マイクロリットルの１００％二酸化炭素を１２マイクロリットル／ｓｅｃのレートで流入させた。これに続いて、次のように構成された２５０マイクロリットルのプライミング媒体を流入させた：１０００ｍｌイスコフ改変ダルベッコ培地（ATCC（登録商標）カタログ番号30-2005）、２００ｍｌウシ胎児血清（ATCC（登録商標）カタログ番号30-2020）、１０ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Life Technologies（登録商標）カタログ番号15140-122）、及び１０ｍＬ  Pluronic F-127（Life Techカタログ番号50-310-494）。プライミングの最終ステップは、１２マイクロリットル／ｓｅｃで流入させた２５０マイクロリットルのプライミング媒体を含んでいた。
続いて、培養媒体の導入を行う。
【０３７３】
[00435]  かん流レジーム。かん流方法は以下の２つの方法のいずれかであった。
[00436]  １．  ０．０１マイクロリットル／秒で２時間かん流させ、２マイクロリットル／秒で６４秒間かん流させ、そして繰り返す。
[00437]  ２．  ０．０２マイクロリットル／秒で１００秒間かん流させ、フローを５００秒間停止し、２マイクロリットル／秒で６４秒間かん流させ、そして繰り返す。
【０３７４】
[00438]  バーコード付き核酸捕捉ビーズ：ビーズは、ポリスチレン（１６μｍ）又は磁性体（２２μｍ）（Spherotech #SVP-150-4又は#SVM-200-4）のいずれかであった。ビーズは、本明細書に記載されるようにバーコードを有するオリゴヌクレオチドを含むように改変した。バーコード付きビーズは、当技術分野で公知の任意の好適な方法で合成し得る。
【０３７５】
【表３】
2019528762.tif 000006
【０３７６】
[00440]  ＲＮＡシーケンシング：ビーズは、オリゴ（ｄＴ）捕捉配列／ユニーク分子識別子配列／バーコード／プライミング配列を呈するように改変した。バーコードは、各ビーズに対してユニークになるように選択した。オリゴ（ｄＴ）プライマー／ユニーク分子識別子タグ／細胞バーコード／プライマー配列は、全オリゴヌクレオチド合成、スプリット・プール合成、任意の長さのオリゴヌクレオチドセグメントのライゲーション、又はそれらの任意の組合せにより合成し得る。オリゴ（ｄＴ）プライマー／ユニーク分子識別子タグ／細胞バーコード／プライマー配列は、直接的若しくは間接的にビーズに付着し得るか、又は例えばストレプトアビジン／ビオチンリンカー等を介して、非共有結合で付着し得る。この実験では、捕捉配列、ＵＭＩ、バーコード、及びプライミング配列を含む完全合成オリゴヌクレオチドは、非共有結合ビオチン／ストレプトアビジン結合を介してビーズに付着した。
【０３７７】
[00441]  実施例１．ＯＫＴ３細胞で実証されるＲＮＡ捕捉、シーケンシングライブラリ作製、及びシーケンシング結果。
[00442]  細胞：ＯＫＴ３細胞（ネズミ骨髄腫ハイブリドーマ細胞系）は、ATCC（ATCC（登録商標）カタログ番号CRL-8001（商標））から得た。細胞はサスペンジョン細胞系として提供した。ガス環境として空気中５％二酸化炭素を用いて約１×１０５〜約２×１０５生細胞／ｍＬで播種し、３７℃でインキュベートすることにより、培養物を維持した。２〜３日ごとに細胞を分割した。マイクロ流体デバイスに装填するために、ＯＫＴ３細胞数及び生存能を計測し、細胞密度を５×１０５／ｍｌに調整した。
【０３７８】
[00443]  培養培地：１０００ｍｌイスコフ改変ダルベッコ培地（ATCC（登録商標）カタログ番号30-2005）、２００ｍｌウシ胎児血清（ATCC（登録商標）カタログ番号30-2020）、及び１０ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Life Technologies（登録商標）カタログ番号15140-122）を組み合わせて培養培地を作製した。完全培地を０．２２μｍフィルタに通して濾過し、使用時まで明所を避けて４℃で貯蔵した。
【０３７９】
[00444]  インキュベーション時のかん流の間、OptoSelectデバイスへの導入前に空気中５％二酸化炭素で培養培地を連続的に調整した。
【０３８０】
[00445]  実験：２００マイクロリットル中２Ｅ６の密度でＯＫＴ３細胞のサンプルをOptoSelectデバイスに導入した。光学作動誘電泳動力により２５０細胞を移動させて各NanoPenチャンバにつき１個の細胞をロードした。マイクロ流体チャネルへの開口から最も離れたチャンバのセクション（例えば分離領域）内に各細胞を位置決めした。続いて、単一ユニークバーコード付きビーズを占有されたチャンバのそれぞれに装填した。単一生体細胞を有するNanoPenチャンバに装填されたビーズの全数は２２３であり、各ビーズもまた、貫流する流体フローに晒されない各チャンバの部分内に位置決めした。この実験では、合計４つのカセット化可能配列をそれぞれ有する２５６のユニークバーコード付きビーズを形成した。バーコード内において、第１の位置で４つの可能な配列のうち１つ、第２の位置で４つの可能な配列の第２の異なるセットの４つのうち１つ、第３の位置で４つの可能な配列の第３の異なるセットの４つのうち１つ、及び第４の位置で４つの可能な配列の第４の異なるセットの４つのうち１つを選択することにより多様性を形成した。
【０３８１】
[00446]  溶解試薬（単一細胞溶解キット、Ambionカタログ番号4458235）をマイクロ流体チャネルに流入させてNanoPenチャンバ内に拡散できるようにした。ペンに個別に隔離されたＯＫＴ３細胞を溶解緩衝液に１０分間暴露した。溶解停止緩衝液（単一細胞溶解キット、Ambionカタログ番号4458235）を流入させてマイクロ流体チャネルにフローがない状態で室温で２分間インキュベートすることにより溶解を停止させた。限定されるものではないが、溶解停止処理ステップを必要としないClontech溶解緩衝液（カタログ番号635013）をはじめとする他の溶解緩衝液を用いて、類似の結果を得ることが可能である。使用した条件下では、核膜は破壊されなかった。放出させたｍＲＮＡを同一のNanoPenチャンバ内に存在するバーコード付きビーズ上に捕捉した。
【０３８２】
[00447]  捕捉されたＲＮＡをＲＴ試薬混合物（Thermo Scientific（商標）Maxima（商標）H Minus RT（Thermofisher、カタログ番号EP0751）：４マイクロリットルのＲＴ緩衝液、２マイクロリットルの各１０ミリモルｄＮＴＰ（New England Biolabsカタログ番号NO447L）、２マイクロリットルの１０マイクロモルＥ５Ｖ６プライマー（５Ｍｅ−ｉｓｏｄＣ／／ｉｉｓｏｄＧ／／ｉＭｅ−ｉｓｏｄＣ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣｒＧｒＧｒＧ、配列番号１０３）、１マイクロリットルのH Minus RT酵素、１１マイクロリットルの水）に流入させることにより、ｃＤＮＡに逆転写させた。代替的に、酵素、緩衝液、及びＤＴＴを含むClontech SMARTscribeTM逆転写酵素キット（カタログ番号639536）を用いて、捕捉された核酸からｃＤＮＡを得ることが可能である。NanoPenチャンバ内への試薬混合物の拡散を１６℃で２０分間行い、続いて、４２℃で９０分間の反応時間を設けた。
【０３８３】
[00448]  逆転写後、陰性対照として３マイクロリットル／ｓｅｃで１２マイクロリットルのブランク搬出を実施した。次いで、この対照を個別に処理したが、以下に記載のビーズの搬出グループと同様に取り扱った。
【０３８４】
[00449]  次いで、以上に記載の蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブの多重化フローにより各ビーズのユニーク細胞バーコードを同定した。識別可能蛍光標識を有する４つのプローブからなる各グループを用いた蛍光標識プローブ（４プローブ／試薬フローのセットで提供され、各プローブはフロー中の他のプローブのいずれとも異なるフルオロフォア及び非同一のオリゴヌクレオチド配列を含有する）を１００ｍＭストックから１×ＤＰＢＳに１マイクロモルで希釈してマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内に流入させ、１６℃でNanoPenチャンバ内を２０分間拡散させ、次いで４２Ｃで９０分間ハイブリダイズさせた。（代替的に、異なる緩衝溶液（IDT Duplex緩衝液、カタログ番号11-05-01-12）を用いてもうまくいった。３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１００ｍＭ酢酸カリウムを含有するヌクレアーゼフリーのこのｐＨ７．５緩衝液の使用はまた、これらの条件下で優れた二本鎖形成を促進した。）ハイブリダイゼーション時間の終了後、新鮮培地（ＤＰＢＳ又はDuplex緩衝液）をマイクロ流体デバイスに通して２０分間貫流させ（０．２５マイクロリットル／ｓｅｃで３００マイクロリットル）、非関連ハイブリダイゼーションプローブをマイクロ流体デバイスのフロー領域からフラッシュした。フラッシュ時間は、ハイブリダイズされていないハイブリダイゼーションプローブが各NanoPenチャンバから拡散するのに十分な程度に長い時間になるように選択した。続いて、各識別可能蛍光波長（Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ、及びテキサスレッドのチャネル）の励起を行って、NanoPenチャンバのいずれかが蛍光シグナルを示した場合にはその同定を行った。NanoPenチャンバに局在化された各プローブの蛍光標識の位置及び色に注目し、第１の試薬フローのハイブリダイゼーションプローブの既知の配列及び蛍光標識に相関付け、ビーズ上のバーコードの対応するカセット化可能配列のアイデンティティをアサイメントした。蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブの更なるセットの逐次追加試薬フロー（それぞれ互いに非同一オリゴヌクレオチド配列を有し、第１及び先行する他のいずれの試薬フローの配列とも異なる）を以上のように流動させ、検出を継続させた。試薬フロー及び検出の各ラウンド間で、１００マイクロリットルの１×ＤＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ）の第１のフラッシュ及び続いて同一培地の第２の５０マイクロリットルのフラッシュを用いてフラッシングを実施した。両方とも０．５マイクロリットル／ｓｅｃで実施した。第２以降の試薬フロー中のカセット化可能配列の誤同定を最小限に抑えるために、各識別可能フルオロフォアの最初に同定された蛍光シグナルのみを用いてバーコードのカセット化可能配列同一性をアサイメントした。試薬フローの終了時、マイクロ流体デバイス内の全てのビーズのバーコードで使用されたカセット化可能配列を全て合わせて、NanoPenチャンバ内の全てのビーズのバーコードを各単一NanoPenチャンバごとにアサイメントした。本方法によりアサイメントされた特定のバーコード配列のアサイメントされた位置を用いて、どの特定の細胞からＲＮＡがビーズに捕捉されたか、例えば、マイクロ流体デバイスのNanoPenチャンバ内の原核酸の位置を同定した。図１４Ａは、１つのNanoPenチャンバ番号４７０のプロセス時の逐次点を示す。識別可能蛍光シグナル領域のそれぞれはＡ〜Ｄの表示で各カラムの頂部に示される。各フローは、１〜４の表示で垂直に示される。フロー１のプローブをハイブリダイズさせてからフラッシングを終了した後、NanoPenチャンバ４７０のビーズは、カラーチャネルＢにのみ蛍光シグナルを有していた。第２の試薬フローを導入し、ハイブリダイズさせ、そしてフラッシングを行った後、追加の標識は検出されなかった。NanoPenチャンバ番号４７０は第２のフロー時に「Ｂ」蛍光チャネルのシグナルを示すが、各バーコード及び各プローブは、各バーコードが識別可能蛍光標識のそれぞれを有するカセット化可能配列を１つのみ有するように設計されたことに留意されたい。この第２のシグナリングは、第１のフロープローブがビーズに結合されたままであったことを示したので、記録されない。試薬フロー２のプローブでも試薬フロー３でも、追加のカセット化可能配列は同定されなかった。しかし、他の３つの蛍光チャネルのそれぞれに対して第４のフローで蛍光シグナルが同定された。結果として、NanoPenチャンバ４７０のビーズのバーコードでは、バーコードはＡ４Ｂ１Ｃ４Ｄ４カセット化可能配列に相関付けられる配列を有するものとして同定された。検出後、更なる操作の前に、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（０．５マイクロリットル／ｓｅｃで２００マイクロリットル）を用いてマイクロ流体デバイスのフロー領域を２回フラッシュすることにより、残留ハイブリダイゼーションプローブを除去した。
【０３８５】
次いで、図１４Ｂに示されるように、光学作動誘電泳動力を用いて変位緩衝液（１０マイクロモルトリス）中でバーコード付きビーズをNanoPenチャンバからフロー領域（例えばフローチャネル）に搬出した。NanoPenチャンバから搬出されたビーズは、フローを用いてマイクロ流体デバイスから搬出しプールした。搬出グループに陽性対照ビーズが存在した。８０℃１０分間のインキュベーションによる逆転写酵素の不活性化及びＥｘｏ１緩衝液（１７マイクロリットルの搬出ビーズ、１マイクロリットルのエキソヌクレアーゼ溶液、及び２マイクロリットルのＥｘｏＩ緩衝液）中のエキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ、カタログ番号M0293L）処理を行った後、ビーズの搬出グループ（２０マイクロリットルの体積）を５マイクロリットルの１０×Advantage2 PCR緩衝液、ｄＮＴＰ、１０マイクロモルＳＮＧＶ６プライマー（５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ３’、配列番号１０５）、１マイクロリットルのAdvantage2ポリメラーゼミックス、及び２２マイクロリットルの水に添加した。この配列は、Ｅ５Ｖ６プライマー上に存在すると共にビーズ上のオリゴ内にも存在し、単一プライマーＰＣＲを介してｃＤＮＡを増幅してより短い断片で全長ｃＤＮＡを富化するために使用した。ｃＤＮＡは、１８サイクルのＤＮＡ増幅（Advantage（登録商標）2PCRキット、Clontech、カタログ番号639206）に付した。
【０３８６】
[00451]  供給業者の説明書に従って０．６×ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）ビーズ（Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881））を用いて搬出グループに対して粗増幅混合物の初期精製を実施した。電気泳動及び／又は蛍光（Qubit（商標）、ThermoFisher Scientific）により定量を実施し（Bioanalyzer2100、Agilent, Inc.）（図１４Ｃ）、増幅されたＤＮＡの許容可能な回収が示された。更なるライブラリ作製の前に、供給業者の説明書に従って片側タグメンテーション（Nextera XT DNAライブラリ作製キット、Illumina（登録商標）, Inc.）の実施に使用する。第２の０．６×ＳＰＲＩ精製の後、サイズ選択を実施した（プレキャストアガロースゲル電気泳動システム。ラダー：５０ｂｐラダー（ThermoFisher、カタログ番号10488-099）。E-gel（登録商標）：２％アガロース（Thermofisher、カタログ番号G501802）。ゲル抽出キット：QIAquickゲル抽出キット（Qiagen、#28704）。以上のように定量を実施し、シーケンシングに適した３００〜８００ｂｐサイズを有するライブラリを提供した。（図１４Ｄ）
【０３８７】
[00452]  Miseqシーケンサー（Illumina（登録商標）, Inc.）を用いてシーケンシングを実施した。ブランク対照搬出から得られたデータは、ＤＮＡ担持ビーズの搬出グループとは異なっているように見えると共に、シーケンシングリードは、陽性対照配列に関連付けられるように思われることが、シーケンシング結果の初期分析から示唆された。（データは示されていない）。ブランク対照搬出内のバーコードアイデンティティを分析したところ、最もよく代表されるバーコードは、陽性対照ビーズに由来することが分かった。（データは示されていない）。バーコードは特定のNanoPenチャンバに関連付け可能であるので、細胞バーコードの比較から、検出された且つ搬出されたビーズ（「ペン排出」）からの細胞バーコードは、検出されたがその特定のNanoPenチャンバ位置から搬出されなかった（「非ペン排出」）細胞バーコードよりもはるかによく代表されることが示された。図１５Ａに示されるように、ヒートマップ表現は、NanoPenチャンバから搬出されたことが分かっているビーズから検出されたバーコードの大きなグループを示した（「ペン排出」、「ＤＵ」で表される）。検出されたＤＵバーコードのほとんどは、より高頻度で同定された配列を表すヒートマップのより高いｙ軸位置に存在する。搬出されなかったビーズに関連付けられることが分かっている検出されたバーコードのより小さなセットは、「ＤＮ」で表されるカラムに示される（例えば、検出されたがペン排出でない）。更にまた、各ＤＮバーコードの垂直位置は、バーコード配列同定の相対頻度を示した。Miseqシーケンサー（Illumina（登録商標）,Inc.）を用いてシーケンシングを実施した。リード１を用いて５５サイクルのシーケンシングを実施して、４０ｂｐのバーコード及び１０ｂｐのＵＭＩをシーケンスした。特定の実験でバーコードのライゲーションに４ｂｐを使用したので、全長バーコードの最初の２「ワード」と後続の２ワードとの間で４回の追加のサイクルが必要とされた。最後のサイクルはベースコーリング目的に使用した。Nexteraライブラリ作製時に追加されたプールインデックスを表す更に８ｂｐをシーケンスし、同一のシーケンシングランで、幾つかのチップ／実験の多重化を可能にした。最後に、ｃＤＮＡ（転写物／遺伝子）の配列を提供するリード２（ペアエンドラン）を用いてシーケンシングの追加の４６サイクルを実施した。追加のサイクルは、使用したシーケンシングキット及び所望の情報に依存して実施可能である。図１５Ｂは、同一データのボックスプロット図を示した。理論により拘束されるものではないが、検出されたがペン排出でない位置のこうした細胞バーコードはプライマー及び／又はビーズ合成のアーチファクトとして生じたものであり得る。シーケンシングデータに見いだされるバーコードの表現の比較から、ビーズ搬出サンプルは、ブランク搬出から回収されたバーコードと有意差があることを示される。
【０３８８】
[00453]  図１６Ａ及びＢは、こうした方法を用いたシーケンシングデータ及びライブラリ作製の追加の品質評価を例示する。図１６Ａは、以上で実施された２つの異なる実験Ａ及びＢを列挙したものであり、逆転写ステップを実施した時間（６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ）が異なる。実験Ａは、１０８ビーズの搬出から得られたＤＮＡライブラリのデータを含んでいた（１０８細胞からＲＮＡを捕捉した）。実験Ｂは、１２０ビーズの搬出から得られたＤＮＡライブラリのデータを含んでいた（１２０細胞からＲＮＡを捕捉した）。図１６Ｂでは、全体のカラムには、各実験でシーケンシングデータから得られたリードの全数を示した。アサイメント数のカラムには、１）バーコードにマップされる且つ２）シーケンシング品質が所定の品質閾値を超えるリードの数を表した。アライメント数のカラムには、対象ゲノムにマッピングされるリードの数を示した。参照に存在しなかった偽遺伝子、ミスアノテート遺伝子、及び遺伝子間領域にマッピングされてアサイメントされたリードは、この全数を得る際に除外した。Mito Totalのカラムには、ミトコンドリア参照にマッピングされるリードの数が含まれる。これは、通常は増加した数のミトコンドリア遺伝子を発現する劣悪な生理学的条件の細胞に関係する。Mito ＵＭＩのカラムには、ミトコンドリア参照にマッピングされた識別可能ユニーク分子識別子を有するリードの数を示した。Refseq Totalのカラムには、mRNA Refseq参照にアライメントされたリードの数を示した。一方、Refseq UMIのカラムには、mRNA Refseq参照にアライメントされた識別可能ＵＭＩを有するリードの数を示し、また、細胞の溶解時に捕捉ビーズにより捕捉された元の分子数を示した。これらの数は全て、こうした方法により提供されたＤＮＡライブラリが細胞のレパートリーを代表する良好な品質のシーケンシングデータを生成することを示唆する。
【０３８９】
[00454]  幾つかの他の解析を用いてシーケンシングサンプルライブラリの品質を評価した。同一細胞のプールからの１ｎｇの全抽出ＲＮＡを用いてオフチップ実験を行った。全部で２５６通りのバーコードの組合せを含有するビーズミックスを用いてｃＤＮＡを作製した。以上に記載したように下流処理を実施して、バーコードの同定を必要としないバルク対照を提供した。これらの各投入から等量の投入ＤＮＡをシーケンスした。これらのサンプルから得られたシーケンシングデータの比較を図１６Ｃ及びＤに示す。シーケンシングデータ内で同定可能であったバーコードリードのパーセントは、全リード数の約７８％〜約８７％の範囲内であり、シーケンシングリードによりカバーされた配列は、参照トランスクリプトームにアライメントしたとき、約４９％〜約６１％の範囲内であった。（図１６Ｃ）。最後に、上位５つまでの発現遺伝子には、ＲＰｌ２８（リボソームタンパク質）、Ｅｍｂ（Ｂ細胞特異的）、Ｒｐｌ２４（Ｂ細胞特異的）、Ｄｃｕｎ１ｄ５（Ｂ細胞特異的）、Ｒｐ３５ａ（リボソームタンパク質）、及びＤｄｔ（Ｂ細胞特異的）が含まれており、それらは細胞型及び細胞起源が一致した。（図１６Ｄ）。図１７は、９０分間の逆転写反応時間を用いた実験１００、９８、１０５、１０６全体を通じて様々な各実験の間で検出されたバーコードのセットを示しており、NanoPenチャンバへのビーズ送達が良好にランダム化されていることが示唆される。オフチップ実験（２５６で表される）、ブランク（ＸＸＸ−ｂｌ）、及び４つの実験（実験１００、９８、１０５、１０６）のそれぞれで搬出されたビーズデータの比較が図１８に示される。図１８は、幾つかのNanoPenチャンバに対してシーケンスされたリードの回収を示したものである。各実験では、ＸＸＸ−Ｅ１はｃＤＮＡデコレートビーズの第１の搬出であり、ＸＸＸ−Ｅ２は同一ペンからの後続の第２の搬出であった。図１８のバイオリンプロットのｙ軸は、各サンプルからのバーコードリードの量であった。オフマイクロ流体デバイス対照２５６は、全て等価に表されたバーコードを有していた。搬出されたビーズデータ（ＸＸＸ−Ｅ１又はＸＸＸ−Ｅ２）は全てに満たないバーコードを示し、バーコードリードの量もまた、それほど等価に表されなかった。驚くべきことではないが、サンプルＸＸＸ−Ｅ２は、更に少ないリードを示したが、それらのリードの数はより変化に富んでいた。最後に、ブランクリードは、前に考察したように、非常に少ない数のバーコードリードを示したが、リードの１つ又は２つは、理にかなった出現頻度を有する。
【０３９０】
[00455]  実施例２．Ｔ細胞の表現型決定、培養、アッセイ、及びＲＮＡシーケンシング。表現型とゲノム情報との関連付け。
[00456]  マイクロ流体システム、材料、及び方法は、以下の点を除けば実験１のときと同じであった。
[00457]  細胞：対照細胞はヒト末梢血Ｔ細胞であった。サンプル細胞はヒト腫瘍サンプルに由来するヒトＴ細胞であった。
[00458]  培養培地：ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco, #12633-012）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、（Seradigm, #1500-500）２％ヒトＡＢ血清（Zen-bio, #HSER-ABP100ml）、ＩＬ−２（R&D Systems, 202-IL-010）２Ｕ／ｍｌ、ＩＬ−７（PeproTech, #200-07）１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１５｛PeproTech, #200-15）１０ｎｇ／ｍｌ、１×Pluronic F-127（Life Techカタログ番号50-310-494）。
【０３９１】
[00459]  ヒト腫瘍サンプルに由来するヒトＴ細胞をオフチップで抗原で染色し、次いで、５ｘＥ６細胞／ｍｌの密度でOptoSelectデバイスのマイクロ流体チャネルに導入した。抗原陽性Ｔ細胞（Ｐ−Ａｇ）及び抗原陰性細胞（Ｎ−Ａｇ）の両方を光学作動誘電泳動力により移動させて単一Ｔ細胞に分離した状態で個別NanoPenチャンバに導入し、複数の格納NanoPenチャンバを形成した。
【０３９２】
[00460]  ４日間の培養期間時にＣＤ３／２８ビーズ（Dynabeads（登録商標）ヒトＴアクチベーターＣＤ２／ＣＤ２８、ThermoFisher No.Gibco（商標）#11131D）の存在下でヒト末梢血Ｔ細胞を活性化させ（図１９）、活性化されたただし抗原特異的でない集団を形成した。標識抗原による処理は、標識対照活性化Ｔ細胞をもたらさなかった。これらの対照活性化Ｔ細胞集団を５ｘＥ６細胞／ｍｌの密度でマイクロ流体チャネルに導入し、選択された複数の対照活性化Ｔ細胞を光学作動誘電泳動力により移動させ、腫瘍サンプルに由来するＴ細胞のセットを含有するNanoPenチャンバのセットとは異なる複数のNanoPenチャンバのそれぞれに単一対照活性化Ｔ細胞を配置した。
【０３９３】
[00461]  占有された各チャンバに、ライゲーション（この特定の実験では）により合成された単一バーコード付きビーズを添加した。各ビーズは、プライミング配列、バーコード配列、ＵＭＩ配列、及び以上に記載の捕捉配列を含んでいた。続いて、以上に記載したように溶解及びＲＮＡの捕捉を行った。使用した条件下では、核膜は破壊されない。放出させたｍＲＮＡを同一NanoPenチャンバ内に存在するバーコード付きビーズ上に捕捉した。
【０３９４】
[00462]  図２０Ａ、２１Ａ、及び２２Ａでは、４つの写真画像のセットは、代表的な占有されたNanoPenチャンバを例示する。写真の各セットは、左から右に、１）光学作動誘電泳動力を用いてNanoPenチャンバ内に配置した後のＴ細胞の明視野照明、２）抗原特異的染色のための蛍光検出（テキサスレッドチャネル）プロービング、３）光学作動誘電泳動力を用いて１つのバーコード付き捕捉ビーズを搬入した後のNanoPenチャンバの明視野照明、及び４）溶解後の明視野照明を示した。以上のように、溶解条件は、細胞膜を破壊したが核膜を擾乱しなかった。
【０３９５】
[00463]  図２０Ａでは、１４４６の位置識別子を有するNanoPenチャンバは、１個の細胞により占有された状態で示された。この細胞は、図２０Ａのセットの第２の写真より示されるように、蛍光シグナル（NanoPenチャンバ内の白丸内に示される）を有する抗原陽性染色細胞（Ｐ−Ａｇ）であった。図２０Ａのセットの第３の写真は、単一ビーズがNanoPenチャンバ内に配置されたことを示し、図２０Ａのセットの第４の写真は、ビーズ及び残留する核が依然としてNanoPenチャンバ内に位置することを示す。図２１Ａでは、NanoPenチャンバ番号５４７内への細胞（第２のセットの第１の写真）及びビーズ（第２のセットの第３の写真）の類似の配置が示された。しかし、この細胞は抗原で染色されず、図２１Ａの写真のセットの第２の写真で蛍光シグナルは検出されなかった。したがって、この細胞は抗原陰性Ｔ細胞（Ｎ−Ａｇ）として同定された。図２２Ａでは、対照活性化Ｔ細胞を含有するNanoPenチャンバ３４３１の等価なセットの写真が示された。予想通り、セットの第２の写真に蛍光シグナルは存在しなかったことから、この細胞は抗原陽性でないことが確証される。
【０３９６】
[00464]  ＲＮＡ放出、捕捉、ライブラリ作製、及びシーケンシング。マイクロ流体環境内における逆転写及びバーコード読取りに関して実施例１で説明したプロトコルを実施し、各NanoPenチャンバに対してバーコードの同定が記録された。図２０Ｂ、２１Ｂ、及び２２Ｂでは、それぞれのNanoPenチャンバのバーコード検出プロセスの画像が示される。NanoPenチャンバ１４４６は、バーコードＡ１Ｂ１Ｃ１Ｄ４を含有するビーズを有すると決定された。NanoPenチャンバ５４７は、バーコードＡ１Ｂ３Ｃ３Ｄ４を有するビーズを有していた。また、NanoPenチャンバ３４３１は、バーコードＡ２Ｂ３Ｃ４Ｄ４を含有するビーズを有していた。ビーズ搬出、並びに搬出されたデコレートビーズからのｃＤＮＡのオフチップ増幅、タグメンテーション、精製、及びサイズ選択は、実施例１に記載されるように実施した。
【０３９７】
[00465]  Miseqシーケンサー（Illumina（登録商標）, Inc.）を用いてシーケンシングを実施した。第１のシーケンシングリードでは、リード１を用いて５５サイクルでシーケンシングを行って４０ｂｐのバーコード及び１０ｂｐのＵＭＩをシーケンスした。この特定の実験ではバーコードライゲーションのために追加の４ｂｐを使用したので、全長バーコードの最初の２つのカセット化可能配列及び最後の２つのカセット化可能配列の間で４つの追加のサイクルが必要とされた。最後のサイクルはベースコーリング目的に使用した。第２のシーケンシングリードでは、Nexteraライブラリ作製時に追加されたプールインデックスを表す８ｂｐをシーケンスして、同一のシーケンシングランで幾つかの実験の多重化を可能にした。最後に、ｃＤＮＡ（転写物／遺伝子）のシーケンシングを提供するリード２を用いて、追加の４６サイクルでシーケンスした（ペアエンドラン）。この実験では使用しなかったが、所望により、より長いリードを取得し得る。
【０３９８】
[00466]  図２３は、この実験のシーケンシング結果のヒートマップを示し、シーケンシングリードのカラムを有する。各カラム、NanoPenチャンバ内で１細胞から単一ビーズに捕捉されたＲＮＡを表し、それは１）腫瘍抗原に暴露されて抗原陽性のもの、２）腫瘍抗原に暴露されて抗原陰性のもの、又は３）陰性対照活性化Ｔ細胞、ただし、抗原に暴露されないものである。カラムは、シーケンシングリードの類似性に従って配置されており、遺伝子発現情報に関連付けられる。カラー（暗色バンド対明色バンド）は発現レベルを表した。カラム１〜１４は、カラム１５〜３６によりも互いにより近くに関連付けられた。各カラムで可読バーコードを同定可能であるので（１細胞からビーズごと）、ビーズが回収された位置を決定し、またＲＮＡが得られた細胞の表現型を決定した。例えば、以上に規定された３つのビーズ、すなわち、NanoPenチャンバ１４４６（グループＡ内のカラム番号６に見いだされる２ＥＢ１ｐ＿１４６６（Ｐ−Ａｇ）で表されるもの）、５４７（グループＡ内のカラム番号８に見いだされる２ＥＢ１ｎ＿５４７（Ｎ−Ａｇ））、及び３４３１（グループＢのカラム番号３３に見いだされるＥＡ１ＮＣ＿３４３１（ＮＣ）で表されるもの）は、それぞれ強調表示されたカラムに示された遺伝子発現プロファイルを提供した。カラム１５〜３６（ヒートマップのトップの関係ブラケットにグループＢとしてクラスタ化）と、カラム１〜１４（グループＡ）と、の遺伝子発現の差は、腫瘍抗原への暴露に実質的に依存するように見えた。抗原染色が陽性であるか陰性であるかにかかわらず、グループＡのカラム１〜１４の実質的に全ての原細胞は、腫瘍抗原に暴露された。これとは対照的に、カラム１５〜３６の原細胞は全て、陰性対照細胞であり、腫瘍抗原に暴露されなかった。各カラムは、１つの実験のシーケンシングリードを表し、カラーは、発現レベルを表す。ビーズ活性化抗原非特異的対照Ｔ細胞（ＮＣ）のそれぞれのシーケンシングリードは、抗原陽性腫瘍由来Ｔ細胞（Ｐ−Ａｇ）又は抗原陰性腫瘍由来（Ｎ−Ａｇ）Ｔ細胞のシーケンシングリードのいずれとも明確に区別可能であった。特定の区別可能な単一細胞ＲＮＡシーケンシングが実証された。更に、表現型情報を単一細胞の遺伝子発現プロファイルに関連付け可能であることが示された。
【０３９９】
[00467]  実施例３．ＯＫＴ３細胞で実証されるＤＮＡ捕捉、シーケンシングライブラリ作製、及びシーケンシング結果。この実施例で特に明記されていない限り、装置、プライミング及びかん流レジームは、細胞源、並びに作製は、以上の一般的方法のときと同様に使用／実施された。特に明記されていない限り、３培地及びOptoSelectデバイスは７℃に維持された。
【０４００】
【表４】
2019528762.tif 000007
【０４０１】
[00469]  この実験は、ビーズに付着された１つのビオチン化されたプライミング配列（バーコードを有する）と遊離の１つのプライマーとを溶液中で用いて等温ＰＣＲによりNexteraシーケンシングライブラリ（Illumina）を作製可能であることを実証した。ＯＫＴ３細胞（１５０）をOptoSelectデバイスに搬入し、光学作動誘電泳動力を用いてNanoPenチャンバ内に装填した。図２４は、NanoPenチャンバへの送達後の細胞を示した。光学作動誘電泳動力により、７つのNanoPenチャンバに、各NanoPenチャンバにつき１個の細胞を送達し、１つのNanoPenチャンバに細胞を送達し損ない、１つのNanoPenチャンバに２個の細胞を送達して、実質的に各NanoPenチャンバにつき１個の細胞のみを送達した。
【０４０２】
[00470]  溶解。順序を自動化して溶解手順を実施したが、各ステップの手動制御によって好適に実施し得る。溶解緩衝液をOptoSelectデバイス（Buffer TCL（Qiagen、カタログ番号1031576））に流入させ、次いで、フローを２分間で停止し、緩衝液をペン内に拡散させた。細胞膜及び核膜の両方の溶解を行った。次いで、各５０マイクロリットルのフラッシュ後に３０秒間の休止を含めて、OptoSelectデバイスを５０マイクロリットルの培養培地で３回フラッシュした。８００マイクログラム／ミリリットルの濃度でプロテイナーゼＫ（Ambionカタログ番号AM2546、２０ｍｇ／ｍｌ）をOptoSelectデバイスに導入し、かん流を用いることなく２０分間維持した。プロテイナーゼＫをNanoPenチャンバに拡散させ、望ましくないタンパク質をタンパク質分解し、そしてクロマチンを破壊してｇＤＮＡの抽出を可能にした。終了後、各フロー後の１０分間の保持時間を含めて、５０マイクロリットルのＰＢＳの３サイクルでOptoSelectデバイスをフラッシュした。
【０４０３】
[00471]  １×ＰＢＳ中１：１０００でＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ染色（ThermoFisher Scientific、カタログ番号S7585）で染色を実施して、図２５に示されるように、核の緻密化ＤＮＡ２５１０の存在を実証した。そのほか、NanoPenチャンバを介して光学作動誘電泳動力を用いて両方向（上下、クロスオーバー）に垂直にスキャンして掃引を実施した。図２５では、垂直「クロスオーバー」掃引を形成するために使用される２つの光パターン（「ＯＥＰバー」）が示される。この結果、放出させた核ＤＮＡ２５１５からの蛍光シグナルのぼけた拡大した領域を生じたことから、緻密化形態から核膜溶解を示唆するより大きなより分散した領域に緻密化ＤＮＡをドラッグする能力が実証される。図２６Ａは、溶解前の染色ＯＫＴ３細胞をそれぞれ含有する特定のNanoPenチャンバのセットの写真を示し、図２６Ｂは、ＯＥＰ掃引後の同一NanoPenチャンバの写真を示す。このことから、チャンバ内のより大きな領域に染色（例えばＤＮＡ）が分散されたことが実証する。
【０４０４】
[00472]  タグメンテーション。トランスポザーゼによるＤＮＡのタグメンテーション。３．３マイクロリットルのタグメントＤＮＡ緩衝液（ＴＤ）、１６マイクロリットルのタグメントＤＮＡ酵素ミックス（ＴＤＥ１緩衝液）、及び１４マイクロリットルのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ（Ambionカタログ番号AM9937）を含む１５マイクロリットルの体積のトランスポソーム試薬（Nextera DNA Library Prep Kit, Illumina，カタログ番号15028212）をOptoSelectデバイス内に導入することにより、タグメンテーションのプロトコルに従った。１５分間にわたりタグメンテーション試薬をNanoPenチャンバに拡散させた。次いで、１００マイクロリットルのＰＢＳで流入口ライン及び流出口ラインを清浄化したり、５０マイクロリットルのＰＢＳでデバイス自体をフラッシュしたりすることを含めて、OptoSelectデバイスを広範囲にフラッシュした。図２７は、このプロトコルにより得られたタグメント化産物のサイズの分布グラフを示しており（Bioanalyzer, Agilent）、３００ｂｐの真下に分布の最大値を有し、約６００ｂｐ超のサイズを有するタグメント化産物が少ないことから、大規模並列シーケンシング法に好適であることが実証される。
【０４０５】
[00473]  ビーズへのＤＮＡ捕捉。ビオチン化１６μｍポリスチレン捕捉ビーズ（Spherotech）をストレプトアビジン標識オリゴヌクレオチドにより改変した。オリゴヌクレオチドは、５’→３’の順に、プライミング配列、バーコード配列、及び捕捉配列（例えばモザイク配列）を含んでいた。バーコード配列は、少なくとも１つのサブバーコードモジュールを含有し、OptoSelectデバイスの特定のNanoPenチャンバ内のる原細胞の同定を可能にした。オリゴヌクレオチド内に組み込まれたプライミング配列は、この実験ではＰ７（Ｐ７アダプター配列）であった。（しかし、他のプライミング配列、例えば、Ｐ５又はＲＰＡプロセスのリコンビナーゼ及びポリメラーゼとの適合性が得られるように特に設計されたプライミング配列を利用し得る。約３００ｒｐｍまでのスピードで撹拌しながら（ＶＷＲアナログボルテックスミキサー）、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．００００２％ＴｒｉｔｏｎＸを含む結合緩衝液中で過剰のＳＡ−オリゴヌクレオチドに１５分間結合させた後、ビーズを新鮮な結合緩衝液の３つのアリコート及び続いて５０マイクロリットルのＰＢＳで洗浄した。Ｐ７プライミング配列（シーケンシングアダプター）／バーコード／捕捉配列のオリゴヌクレオチドを含有する新たに作製したビーズを溶解前の細胞を含有したNanoPenチャンバに送達した。このステップは、NanoPenチャンバへのＯＥＰ送達を含めて順序を自動化して実施したが、所望により手動で実施してもよい。この実験では、使用した特定の自動化プロセスは、終了までに１時間かかった。より迅速な送達が有利であり得る。そのほか、３７℃未満に低下させた温度は効果的なＤＮＡ捕捉に有利であり得る。
【０４０６】
[00474]  等温増幅。床上に捕捉されたＤＮＡの等温増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応（TwistAMP TABA S03, TwistDX）を用いて実施した。プロセス時に形成された置換ループ（Ｄループ）を安定化させる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）結合タンパク質も含まれる。反応混合物中にはまた、Ｐ５モザイク配列、Ｐ７及びＰ５プライマー（ＩＤＴ）も存在していた。次の混合物：ＴｗｉｓｔＤｘキットの乾燥酵素ペレット、２７．１マイクロリットルの再懸濁緩衝液、２．４マイクロリットルの１０マイクロモルＰ５プライマー、２．４マイクロリットルの１０マイクロモルＰ７プライマー、及び２．４マイクロリットルの１０マイクロモルＰ５末端インデックスプライマー（例えばＳ５２１）を２．５マイクロリットルの２８０ミリモルマグネシウムアセテート（ＭｇＯＡｃ）に添加し、遠心分離管内でボルテックスした。１５マイクロリットルのこの可溶化された且つスピンされた溶液を１マイクロリットル／秒のレートでOptoSelectデバイスのマイクロ流体チャネル内に搬入し、NanoPenチャンバ内に拡散させ、且つビーズ上に捕捉されたＤＮＡに４０〜６０分間触させた。
【０４０７】
[00475]  等温増幅時間の終了後、ＰＢＳを用いてOptoSelectデバイスから５０マイクロリットルの流体媒体を搬出した。NanoPenチャンバから拡散させた増幅されたＤＮＡを含有する搬出された溶液（「即時搬出」）を１×AMPure（登録商標）ビーズ（Agencourt Bioscience）を用いて清浄化し、１００ｂｐ未満のサイズのプライマー及び他の核酸材料を除去した。
【０４０８】
[00476]  チャネルに拡散しなかったビーズ及び増幅されたＤＮＡを依然として含有するOptoSelectデバイスを４℃に一晩維持し、５０マイクロリットルのＰＢＳを用いて第２の搬出を行い、その時点でマイクロ流体チャネルに存在していた増幅産物を捕捉した（「第２の搬出」）。定量及びサイズ分析のためにＰＣＲを介して２つのサンプルを個別に更に増幅した。それぞれ、KAPA HiFi Hotstart（KAPA Biosystems）、１マイクロリットルの１０マイクロモルＰ５プライマー、及び１マイクロリットルの１０マイクロモルＰ７プライマーを含む２５マイクロリットルの反応で５サイクルＰＣＴを使用した。１×AMPure（登録商標）ビーズによる処理を繰り返すことにより、即時搬出及び第２の搬出サンプルのそれぞれを清浄化してプライマーを除去した。即時搬出サンプルは、約３１２ｂｐの平均サイズを有してシーケンシングに好適な断片サイズを有する合計４０ｎｇを生成した（データは示されていない）。第２の搬出サンプルは、ＮＧＳ並列技術による更なるシーケンシングに好適でない約７６０ｂｐの平均サイズを有して合計８５ｎｇを生成した（データは示されていない）。
【０４０９】
[00477]  共有Miseq大規模並列シーケンシング実験（Illumina）内で即時搬出サンプルをシーケンスした。図２８に示されるように、カバレッジは低かったが（平均＝０．００２７３１）、リードはマウスゲノム全体にわたりマッピングされた。図２８では、各染色体はｘ軸に沿って表される。左側の明色バーは各染色体の予想長さを表し、一方、右側の暗色バーは、即時搬出サンプルからのデータに見られるマッピングされた全リードに対するパーセントを表す。幾つかの染色体はデータで多く見積もられた（ｃｈｒ２、ｃｈｒ１６）、他の染色体は少なく見積もられた（ｃｈｒ８、ｃｈｒ１２、ｃｈｒ１５）。雌マウスに由来する細胞であるため、予想通り、Ｙ染色体に対して得られたリードはなかったことに留意されたい。許容し得る程度に低レベルのアダプター汚染物質（０．００００１３％）が同定された。そのほか、特定の対象配列もまたデータに見いだされた（例えば、ＣＸＣＲ４配列、データは示されていない）。
【０４１０】
[00478]  実施例４．ＤＮＡ分離、ライブラリ作製、及びヒトＢリンパ球に由来するＯＫＴ３細胞及びヒトＬＣＬ１細胞の混合物のシーケンシング。ＬＣＬ１細胞の供給元：Coriell Institute。カタログ番号：GM128781C。培養に使用した培地は、ＲＰＭＩ−１６４０（Life Technologies、カタログ番号11875-127）、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１０００Ｕ／ｍｌ）、２ｍＭ  Glutamaxである。
【０４１１】
[00479]  実験では１５０のＯＫＴ３細胞：１５０のＨｕＬＣＬ１細胞又は７５のＯＫＴ３細胞：７５のＨｕＬＣＬ１細胞のいずれかを使用した。細胞は、各ＯＫＴ３及び各ＨｕＬＣＬ１細胞の位置が分かるようにＯＥＰ力を用いて個別NanoPenチャンバに１細胞を１チャンバに特定的に送達した。
【０４１２】
[00480]  溶解及びタグメンテーションのプロセスは、実験３のときと同様に実施したが、次の配列： 
Tn5ME-A（Illumina FC-121-1030）、５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号１６１）、
Tn5ME-B（Illumina FC-121-1031）、５’ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号１６２）
の１つを有するトランスポザーゼにより、断片化ＤＮＡに追加されたモザイク末端＋インサート配列を有していた。
【０４１３】
[00481]  ＯＫＴ３細胞含有NanoPenに対してのみ第１のユニークバーコードを有するバーコード付きビーズの第１のセットの特定の送達を行い、続いて、ＨｕＬＣＬ１細胞含有NanoPenに対してのみ第２のユニークバーコードを有するバーコード付きビーズの第２のセットの特定の送達を行った。これにより、ネズミＤＮＡリードが元の方向にネズミ細胞にマッピングされるように且つＨｕＬＣＬ１細胞ＤＮＡリードが元の方向にヒト細胞にマッピングされるように、ビーズの各セットから増幅されたＤＮＡに対して特定の識別子を提供した。タグメンテーションステップの後、ビーズをNanoPenチャンバに送達した。実験３のときと同様に等温増幅を実施し、５．６７ｎｇ（全３００細胞から）又は２．６２ｎｇ（全１５０細胞から）を生成した。以上に記載したように各ライブラリに対して２サイクルのＰＣＲランを実施し、ＮＧＳシーケンシング用のＰ５、Ｐ７の存在を保証し、清浄化を同様に実施した。図２９Ａ（１５０細胞から）及び２９Ｂ（３００細胞から）は、それぞれ、後続の２サイクルＰＣＲ増幅及び清浄化の後の２つの（ＯＫＴ３／ｈｕＬＣＬ１）ＤＮＡライブラリを示す。これらの結果は、標準的ウェルプレートフォーマットで個別に処理されたＯＫＴ３細胞更にはｈｕＬＣＬ１細胞から発生させた対照ライブラリのサイズ分布トレース（図２９Ｃ（ＯＫＴ３）及び図２９Ｄ（ｈｕＬＣＬ１）に示される）と比較可能である。マイクロ流体プロトコル内でより理想な断片分布を得るために更なる最適化が望ましいであろうことが、比較から示唆される。混合ＯＫＴ３／ｈｕＬＣＬ１  ＤＮＡライブラリに基づくシーケンシング結果から、２つのバーコードのそれぞれを有するリードが得られることが示された（データは示されていない）。
【０４１４】
[00482]  インサイチュバーコード検出。増幅されたＤＮＡ産物の搬出後、以上に記載の蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブの逐次フローによりバーコード位置を同定した。
【０４１５】
[00483]  実施例５．バーコード付きビーズの導入並びにＤＮＡ分離、ライブラリ調製及び増幅ワークフロー手順内におけるバーコード付きビーズのインサイチュ検出。理論によって拘束されることを望むものではないが、トランスポゾンの活性は一本鎖結合オリゴでなく、二本鎖核酸に向けられる。推論実験において、これらの条件に対する捕捉ビーズのロバスト性が示された。実験３について調製したとおりのビーズ、２０マイクロリットルを、その同じ実験の条件下でタグメンテーション反応試薬に曝露した。トランスポゾンに曝露されたビーズ及び曝露されていない対照ビーズの両方を１．４ｎｇのヒト標準ＤＮＡに接触させた。ＲＰＡ（S521）で２．４マイクロリットルのペアプライマー（S521、Illumina）を使用して、等温増幅において２．４マイクロリットルの各ビーズセットを使用し、実質的に同程度の量の増幅ＤＮＡが提供された。これらの結果は、ＤＮＡ捕捉での使用前にトランスポゾンに曝露した捕捉ビーズが妥当な同等量の増幅産物をもたらしたことを示しており、トランスポゾンによって捕捉ビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチドが分解されなかったことが指摘される。
【０４１６】
【表５】
2019528762.tif 000008
【０４１７】
[00485]  実施例６．ＲＮＡシーケンシングを実施した同じ細胞からの核ＤＮＡのシーケンシング。図３０Ａ〜図３０Ｆは、各々、ＯＫＴ３細胞及び捕捉ビーズが入ったOptoSelectデバイスの４つのNanoPenチャンバの列を示す。一連の写真は、実験１にあるとおりの、ＲＮＡ捕捉、タグメンテーション及び搬出が実施されたプロトコルの経過中に撮影した。搬入前に細胞にNucBlue（登録商標）LiveReady Probes（登録商標）試薬（Molecular Probes、R37605）染色剤を加えた（搬入直前に２００マイクロリットルの細胞溶液に２滴を加える）。プロトコル全体を通じて追加の染色剤は加えなかった。各細胞の核ｄｓＤＮＡを染色し、この染色はＲＮＡ捕捉、タグメンテーション、及び逆転写のステップ全体を通じて維持された。図３０Ａ〜図３０Ｃは明視野条件下で撮影し、図３０Ｄ〜図３０Ｆは紫外励起光下で撮影して（ＤＮＡへの結合時３６０ｎｍで励起、発光極大は４６０ｎｍ）、４００〜４１０ｎｍのＤＡＰＩフィルタによって可視化した。図３０Ａ及び図３０Ｄは、それぞれ明視野下及びＤＡＰＩフィルタ露光下の、溶解前の時点における細胞が入った同じNanoPenチャンバの対を成す画像である。３００２はバーコード付きビーズであり、３００４は同じNanoPenチャンバの中にある生体細胞である。図中の４つのNanoPenチャンバのうち他のチャンバにも他のビーズ及び他の細胞をまた見ることができ、ただし符号は付していない。図３０Ｂ及び図３０Ｅは、それぞれ明視野下及び４００ｎｍ光下における、図３０Ａ及び図３０Ｃに示されるものと同じNanoPenチャンバの対を成す画像である。これらの写真は、実験１に記載されるとおりの外膜溶解の完了後に撮影した。４００ｎｍ励起光下で核ＤＮＡ３００４をなおも見ることができるとともに（図３０Ｅ）、明視野下でビーズ３００２と共に核３００４の形状がなおも残っている。図３０Ｃ及び図３０Ｆは、図３０Ａ〜図３０Ｄと同じ一群の４つのNanoPenチャンバの中にある同じ細胞についての対を成す画像、それぞれ、明視野、及び４００ｎｍ励起光である。図３６０Ｃ及び図３０Ｆの写真は、逆転写を完了して、ｃＤＮＡでデコレートされたバーコード付きビーズ３００２’を各NanoPenチャンバから搬出した後に撮影した（写真上部のマイクロ流体チャネルの中にある３００２を参照）。明視野下でコンパクトな核３００６をなおも見ることができ、図３０Ｆは、それらの核３００６がなおも核ＤＮＡを含有したことを示している。追加の色素は加えなかったため、ビーズ上にｃＤＮＡの染色は生じなかった。
【０４１８】
[00486]  図３０Ａ〜図３０Ｆから、ＲＮＡ捕捉／ライブラリ調製、及びＤＮＡ捕捉／ライブラリ調製に関して本明細書に記載されるプロトコルを用いることにより、コンパクトな核がなおもＤＮＡライブラリ作製用の実現性のある核ｄｓＤＮＡ源であったことが指摘される。したがって、同じ単一細胞からＲＮＡ及びＤＮＡの両方のシーケンシング結果を入手することができ、シーケンシングしたＲＮＡ及びＤＮＡの特定の単一細胞源のOptoSelectデバイス中における位置と相互に関係付けることができる。このようにＲＮＡ／ＤＮＡシーケンシング結果の単一細胞源の位置を相互に関係付け可能であることにより、特異的抗原に対する抗体を産生する細胞など、同じ単一細胞の表現型の所見と更に相互に関係付けることができる。
【０４１９】
[00487]  バーコード付きプライミング配列を担持するビーズ（ｂｅｄ）を導入するステップは、タグメンテーションステップの前、又はタグメンテーションの後（実験３のように）のいずれでも好適に実施されることが示された。
【０４２０】
[00488]  加えて、NanoPenチャンバの中に置かれたバーコード付きビーズ上の１つ以上のバーコードを読み取るステップは、タグメンテーション前、等温増幅前、増幅したＤＮＡの搬出前、又は増幅したＤＮＡの搬出後（実施例４に示されるとおり）に実施されてもよい。或いは、ビーズは生体細胞の搬入前にNanoPenチャンバの中に置かれてもよい。この実施形態では、バーコードはまた、生体細胞がマイクロ流体環境に持ち込まれる前に検出されてもよい。
【０４２１】
[00489]  実施例７．ＯＫＴ３細胞及びＯＫＴ８細胞について実証されるとおりのＢ細胞受容体（ＢＣＲ）捕捉、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシング結果
[00490]  細胞：マウス骨髄腫ハイブリドーマ細胞株であるＯＫＴ３細胞はＡＴＣＣから入手した（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号CRL-8001（商標））。細胞は浮遊細胞株として提供された。培養物は、約１×１０５〜約２×１０５生細胞／ｍＬを播種し、気体環境として空気中５％二酸化炭素を用いて３７℃でインキュベートすることにより維持した。細胞は２〜３日毎に分割した。ＯＫＴ３細胞数及び生存率をカウントした。マイクロ流体デバイスへのローディングのため細胞密度は５×１０５／ｍｌに調整する。
【０４２２】
[00491]  マウス骨髄腫ハイブリドーマ細胞株であるＯＫＴ８細胞はＡＴＣＣから入手した（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号CRL-8014（商標））。細胞は浮遊細胞株として提供された。培養物は、約１×１０５〜約２×１０５生細胞／ｍＬを播種し、気体環境として空気中５％二酸化炭素を用いて３７℃でインキュベートすることにより維持した。細胞は２〜３日毎に分割した。ＯＫＴ８細胞数及び生存率をカウントした。マイクロ流体デバイスへのローディングのため細胞密度は５×１０５／ｍｌに調整する。
【０４２３】
[00492]  培養培地：イスコフ改変ダルベッコ培地（ＯＫＴ３については；ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号30-2005、ＯＫＴ８については；ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号30-2005）、１０％ウシ胎児血清（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号30-2020）及び１０ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Life Technologies（登録商標）カタログ番号15140-122）を合わせて培養培地を作製した。この完全培地は０．２２μｍフィルタでろ過し、使用時まで暗所下に４℃で保存した。
【０４２４】
[00493]  インキュベーション期間中におけるかん流時、培養培地はOptoSelectデバイスへの導入前に空気中５％二酸化炭素で継続的に調整した。
【０４２５】
【表６−１】
2019528762.tif 000009
【０４２６】
【表６−２】
2019528762.tif 000010
【０４２７】
[00495]  実験：OptoSelectデバイスにＯＫＴ３細胞のサンプルを２００マイクロリットル中２Ｅ６の密度で導入した。約１５０個の細胞を光学作動の誘電泳動力によって移動させることにより、各NanoPenチャンバにつき１個の細胞をロードした。各細胞は、チャンバの中でマイクロ流体チャネルへの開口部から最も離れた区画内（例えば、分離領域）に位置した。次にOptoSelectデバイスを５０マイクロリットルのプライミング培地で１回フラッシュした。閉じ込められたＯＫＴ３細胞の位置を同定するため、OptoSelectデバイスの明視野像を撮影した（図示せず）。OptoSelectデバイスにＯＫＴ８細胞のサンプルを２００マイクロリットル中２Ｅ６の密度で導入した。約１５０個の細胞を光学作動の誘電泳動力によって移動させることにより、ＯＫＴ３細胞が閉じ込められていない視野内に各NanoPenチャンバにつき１個の細胞をロードした。次にOptoSelectデバイスを５０マイクロリットルのプライミング培地で１回フラッシュした。閉じ込められたＯＫＴ８細胞の位置を同定するため、OptoSelectデバイスの明視野像を撮影した（図示せず）。OptoSelectデバイスに、本明細書に記載されるとおりの捕捉オリゴ（２つの例示的な、ただし限定はされない配列は、配列番号１０１及び１０２であり、表２を参照のこと）を有するバーコード付きビーズのサンプルを２００マイクロリットル中２Ｅ６の密度で導入した。続いて占有されているチャンバの各々に、単一の一意にバーコード付きされたビーズをロードした。単一の生体細胞を有するNanoPenチャンバにロードされたビーズの総数は１２６個で、５７個のビーズがＯＫＴ３細胞に割り当てられ、６９個のビーズがＯＫＴ８細胞に割り当てられ、各ビーズはまた、各チャンバの中で侵入してくる流体のフローを受けない部分の範囲内に位置した。次にOptoSelectデバイスを５０マイクロリットルの１×ＤＰＢＳで１回フラッシュした。
【０４２８】
[00496]  溶解試薬（単一細胞溶解キット、Ambionカタログ番号4458235）をマイクロ流体チャネルに流入させて、NanoPenチャンバ内に拡散させた。個々に閉じ込められたＯＫＴ３及びＯＫＴ８細胞を溶解緩衝液に１０分間曝露した。次にOptoSelectデバイスを３０マイクロリットルの１×ＤＰＢＳで１回フラッシュした。溶解停止緩衝液（単一細胞溶解キット、Ambionカタログ番号4458235）を流入させて、マイクロ流体チャネルにフローがない間に室温で２分間インキュベートすることにより、溶解を停止させた。或いは、１０×溶解緩衝液、カタログ番号635013、Clontech/Takaraなどの溶解緩衝液を使用して同様の結果をもたらすことができ、これには溶解停止緩衝液を使用する必要がないという利点がある。次にOptoSelectデバイスを３０マイクロリットルの１×ＤＰＢＳで１回フラッシュした。使用した条件下では、核膜は破壊されなかった。同じNanoPenチャンバ中に存在するバーコード付きビーズ上に遊離ｍＲＮＡが捕捉された。
【０４２９】
[00497]  ＲＴ試薬混合物（Thermo Scientific（商標）Maxima（商標）H Minus RT（Thermofisher、カタログ番号EP0751））及びテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（配列番号１１２）を流入させることにより、捕捉されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。酵素をNanoPenチャンバ内に１６℃で２０分の時間にわたり拡散させた後、続いて４２℃で９０分の反応時間とした。逆転写後、次にOptoSelectデバイスを３０マイクロリットルの１×ＤＰＢＳで１回フラッシュした。
【０４３０】
[00498]  次に、各捕捉ビーズについて、本明細書に記載されるとおりの蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブの多重フローにより、一意のバーコードを同定した。各蛍光標識プローブセットの連続試薬フローは、１×ＤＰＢＳ（或いは、IDT Duplex緩衝液が用いられてもよい）に希釈した１マイクロモル濃度でマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させて、NanoPenチャンバ内に拡散させた。ハイブリダイゼーション後、OptoSelectデバイスを１５０マイクロリットルの１×ＤＰＢＳでフラッシュすることによりバックグラウンドシグナルを取り除いた。このように同定された各Cell Barcodeの位置（例えば、当該のCell Barcodeで標識されたビーズのNanoPen位置）を記録し、それを用いてどの特定のセルからＢＣＲ配列がビーズに捕捉されたかを同定した。図３１Ａ及び図３１Ｂに、２つの個別のNanoPenチャンバ、３４４１及び１４５１に関するバーコード検出の画像及び結果を示す。NanoPenチャンバ３４４１のバーコードはＣ３Ｄ１１Ｆ２２Ｔ３１と決定され、このバーコードは４つのカセット化可能配列GAATACGGGG（配列番号３）TTCCTCTCGT（配列番号１１）AACATCCCTC（配列番号２２）CCGCACTTCT（配列番号３１）で形成された。NanoPenチャンバ１４５１のバーコードはＣ１Ｄ１１Ｆ２４Ｔ３１と決定され、このバーコードは４つのカセット化可能配列CAGCCTTCTG（配列番号１）TTCCTCTCGT（配列番号１１）TTAGCGCGTC（配列番号２４）CCGCACTTCT（配列番号３１）で形成された。
【０４３１】
[00499]  検出後、チップを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（０．５マイクロリットル／秒で２００マイクロリットル）で２回洗浄し、その後、ｃＤＮＡでデコレートされた捕捉ビーズを搬出した。
【０４３２】
[00500]  選択のバーコード付きｃＤＮＡデコレートビーズは、移動緩衝液の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中で光学作動の誘電泳動力を用いてNanoPenチャンバから搬出した。１回の搬出につき、ＯＫＴ３割り当てウェルからは４７個のビーズ、ＯＫＴ８割り当てウェルからは６９個のビーズが含まれた。NanoPenチャンバから搬出し終えたビーズは、続いてフローを用いてマイクロ流体デバイスから搬出し、プールした。
【０４３３】
[00501]  エキソヌクレアーゼＩ（NEB、カタログ番号M0293L）で処理した後、搬出群のビーズを5’-ACACTCTTTCCCT ACACGACGC-3’（配列番号１１３）をプライマーとして使用した２２サイクルのＤＮＡ増幅（Advantage（登録商標）2 PCRキット、Clontech、カタログ番号639206）に供した。１×ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）ビーズ（Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881））を供給業者の指示に従い使用して、搬出群の粗増幅混合物の初期精製を実施した。
【０４３４】
[00502]  次に粗増幅混合物を２つに分割し、ここでこれらの２つのうち第１の部分は重鎖用のＢＣＲ特異的フォワードプライマー（配列番号１１４〜１３２、表６）の混合物による１８サイクルのＰＣＲに供し、第２の部分は軽鎖用のＢＣＲ特異的フォワードプライマー（配列番号１３３〜１５０、表６）の混合物による１８サイクルのＰＣＲに供した（Q5（登録商標）ハイ・フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、NEB、カタログ番号M0491S）。リバースプライマー（配列番号１５１及び１５２）が、搬出群のビーズ及び重鎖又は軽鎖に割り当てられたインデックスと共にプライミング配列を付加した。タッチダウンＰＣＲプロトコル（連続サイクルにおいてアニール温度を低下させる）を使用して増幅特異性を増加させた。１×ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）ビーズ（Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881））を供給業者の指示に従い使用してＢＣＲ配列含有アンプリコンの初期精製を実施し、続いて２％アガロースゲル上（E-gel（商標）EXアガロースゲル２％、カタログ番号G401002、ThermoFisher Scientific）でサイズにより選択した。供給業者の指示に従い（Zymoclean（商標）ゲルＤＮＡ回収キット、カタログ番号D4001、Zymo Research）、ゲル抽出を実施した。
【０４３５】
[00503]  精製及びサイズ選択したＢＣＲ配列含有アンプリコンをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、NEB、カタログ番号M0201）で処理し、次に１×ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）ビーズ（Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881））を供給業者の指示に従い使用して反応物を精製した。蛍光による定量化を実施した（Qubit（商標）、ThermoFisher Scientific）。
【０４３６】
[00504]  次に、１０ｎｇ以下のＢＣＲアンプリコンを使用した精製後のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ処理ＢＣＲ配列含有アンプリコンをセルフライゲートして環状化ＤＮＡ分子を作成した（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、カタログ番号EL0011、ThermoFisher Scientific）。検出限界、大まかに約０．５ｎｇを超える任意の量のＤＮＡが、環状化反応に十分であろう。別のアンプリコン分子とのクロスライゲーションよりむしろ自己環状化するようにドライブするには、約１０ｎｇ以下が有用である。
【０４３７】
[00505]  １×ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）ビーズ（Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881）を供給業者の指示に従い使用してライゲーション反応物を精製し、続いて２％アガロースゲル上（E-gel（商標）EXアガロースゲル２％、カタログ番号G401002、ThermoFisher Scientific）の位置によって環状化ＤＮＡ分子を選択した。供給業者の指示に従い（Zymoclean（商標）ゲルＤＮＡ回収キット、カタログ番号D4001、Zymo Research）、ゲル抽出を実施した。
【０４３８】
[00506]  次に、Ｎｏｔ１制限酵素消化（Not1-HF、NEB、カタログ番号R3189S）を製造者の指図に従い実施し、続いて反応を不活性化させることにより、精製した環状化ＤＮＡ分子を再び線状化した。１×ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）ビーズ（Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881）を供給業者の指示に従い使用して、再線状化ＤＮＡを精製した。
【０４３９】
[00507]  再線状化ＤＮＡをＰ７アダプター配列フォワードプライマー（配列番号１５３、表６）及びＰ５アダプター配列を含有するＢＣＲ定常領域プライマー（配列番号１５４、表６）による１６サイクルのＰＣＲに供した（KAPA HiFi HotStart ReadyMix、KK2601、KAPA Biosystems/Roche）。１×ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）ビーズ（Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881）を供給業者の指示に従い使用して、増幅したＤＮＡ分子を精製した。次に増幅したＤＮＡ産物をＰ７及びＰ５アダプター配列プライマー（配列番号１５３及び１５５、表６）によるＰＣＲに、重鎖について７サイクル及び軽鎖について６サイクル供した（KAPA HiFi HotStart ReadyMix、KK2601、KAPA Biosystems/Roche）。１×ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）ビーズ（Agencourt AMPure XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63881）を供給業者の指示に従い使用して、得られたシーケンシングライブラリを精製し、続いて２％アガロースゲル上（E-gel（商標）EXアガロースゲル２％、カタログ番号G401002、ThermoFisher Scientific）でサイズ（５５０〜７５０ｂｐ）により選択した。供給業者の指示に従い（Zymoclean（商標）ゲルＤＮＡ回収キット、カタログ番号D4001、Zymo Research）、ゲル抽出を行った。
【０４４０】
[00508]  精製したシーケンシングライブラリの定量化を蛍光的に実施した（Qubit（商標）、ThermoFisher Scientific）。シーケンシングはMiSeqシーケンサー（Illumina（登録商標），Inc.）を用いて実施した。
【０４４１】
[00509]  配列結果を逆多重化することにより、リード１及びリード２プライマーに含まれるインデックスでプール（重鎖又は軽鎖を含む）毎及びユニークなバーコード配列によって同定されるとおりの細胞毎に分けて配列データのＦＡＳＴＱファイルを作成した。ＯＫＴ３及びＯＫＴ８細胞株の可変領域の、抗原結合部位に対する、重要なサブ領域を含む既知のＣＤＲ３  ＢＣＲ配列を各細胞のリードデータとアラインメントし、それを用いてリードをＯＫＴ３細胞又はＯＫＴ８細胞のいずれかに由来すると同定した。図３２の中の右側の列は、細胞１〜８からのリードが、
TGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGG（配列番号１５６）
のＣＤＲ３配列を有する、ＯＫＴ３配列アイデンティティ（配列番号１５７、表６）にマッチしたことを示している。
【０４４２】
[00510]  細胞９〜１２からのリードは、ＯＫＴ８配列アイデンティティ（配列番号１５９、
TGTGGTAGAGGTTATGGTTACTACGTATTTGACCACTGG（配列番号１５８）
のＣＤＲ２配列を有する）にマッチした。
【０４４３】
[00511]  各細胞のバーコードはまた、シーケンシングによっても決定しており、細胞１〜１２の各々について示す。シーケンシングによって決定されたバーコードと上記に記載される試薬フロー方法によって決定されたバーコードとのマッチにより、細胞とゲノムとの間を明白に相互に関係付けることが可能であった。例えば、NanoPenチャンバ１４５１についてフロー試薬によって上記で決定されたバーコードは、ＯＫＴ３細胞の表現型にマッチするＣＤＲ３配列を有する細胞１にマッチした。NanoPen３４４１についての、上記に記載される他のバーコードは、ＯＫＴ８の表現型にマッチするＣＤＲ３配列を有する細胞９のバーコードにマッチした。これは原理証明実験であるため、特定のNanoPenチャンバの中にどのタイプの細胞が配置されているかは分かっており、シーケンシング結果は、バーコードフロー試薬検出が、シーケンシングによって決定された、予想ＣＤＲ３配列を含むバーコードに完全に結び付いたことを示した。これにより、ＢＣＲ配列データを供給源細胞の物理的位置と関連付けることが可能であると実証された。
【０４４４】
[00512]  上記に示した任意の改良例に加えて、当業者は、本記載の趣旨及び範囲から逸脱することなく数多くの他の変形例及び代替的構成を考案することができ、添付の特許請求の範囲は、かかる改良例及び構成を包含することが意図される。したがって、上記には、現在最も実際的で好ましい態様と見なされるものに関連する情報が特殊性をもって詳細に記載されているが、当業者には、限定はされないが、形態、機能、動作方法、及び使用を含め、数多くの改良が、本明細書に示される原理及び概念から逸脱することなく行われ得ることは明らかであろう。また、本明細書で使用されるとき、実施例及び実施形態は、あらゆる点で例示に過ぎないことも意図され、いかなる形であれ限定するものと解釈されてはならない。更に、本明細書において要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照される場合、かかる参照は、挙げられる要素それ自体のいずれか１つ、挙げられる要素の全部より少ない任意の組み合わせ、及び／又は挙げられる要素の全ての組み合わせを包含することが意図される。また、本明細書で使用されるとき、ある（ａ）、ある（ａｎ）、及び１つ（ｏｎｅ）という用語は、各々、少なくとも１つ及び１つ以上という用語と同義的であり得る。また、本明細書においてはステップという用語が使用されるが、この用語は単に、記載される方法の異なる部分に注意を向けさせるために用いられるのであってよく、方法の任意の部分の出発点又は停止点を表現すること、又は他の何らかの方法で限定されることを意味するものではないことにも留意しなければならない。
【０４４５】
例示的実施形態
[00513]
本明細書に開示される主題において提供される例示的実施形態としては、限定はされないが、特許請求の範囲及び以下の実施形態が挙げられる：
【０４４６】
[00514]  １．複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
プライミング配列と；
捕捉配列と；
３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列であって、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と
を含む、捕捉物体。
【０４４７】
[00515]  ２．前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含む、実施形態１の捕捉物体。
【０４４８】
[00516]  ３．前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが最も５’側のヌクレオチドと最も３’側のヌクレオチドとを含み、
前記プライミング配列が前記最も５’側のヌクレオチドに隣接するか、又はそれを含み、
前記捕捉配列が前記最も３’側のヌクレオチドに隣接するか、又はそれを含み、及び
前記バーコード配列が前記プライミング配列の３’側且つ前記捕捉配列の５’側に位置する、実施形態１又は２の捕捉物体。
【０４４９】
[00517]  ４．前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が６〜１５ヌクレオチドを含む、実施形態１〜３のいずれか１つの捕捉物体。
【０４５０】
[00518]  ５．前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が１０ヌクレオチドを含む、実施形態１〜４のいずれか１つの捕捉物体。
【０４５１】
[00519]  ６．前記バーコード配列の３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、いかなる介在オリゴヌクレオチド配列もなしにタンデムで連結されている、実施形態１〜５のいずれか１つの捕捉物体。
【０４５２】
[00520]  ７．前記バーコード配列の前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が、複数の１２〜１００個のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列から選択される、実施形態１〜６のいずれか１つの捕捉物体。
【０４５３】
[00521]  ８．前記バーコード配列の前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が、配列番号１〜４０のいずれか１つの配列を有する、実施形態１〜７のいずれか１つの捕捉物体。
【０４５４】
[00522]  ９．前記バーコード配列が４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含む、実施形態１〜８のいずれか１つの捕捉物体。
【０４５５】
[00523]  １０．第１のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が配列番号１〜１０のいずれか１つの配列を有し；第２のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が配列番号１１〜２０のいずれか１つの配列を有し；第３のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が配列番号２１〜３０のいずれか１つの配列を有し；及び第４のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が配列番号３１〜４０のいずれか１つの配列を有する、実施形態９の捕捉物体。
【０４５６】
[00524]  １１．前記プライミング配列が、前記捕捉オリゴヌクレオチドから分離されるとポリメラーゼをプライミングする、実施形態１〜１０のいずれか１つの捕捉物体。
【０４５７】
[00525]  １２．前記プライミング配列がＰ７又はＰ５プライマーの配列を含む、実施形態１１の捕捉物体。
【０４５８】
[00526]  １３．前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドがunique molecule identifier（ＵＭＩ）配列を更に含む、実施形態１〜１２のいずれか１つの捕捉物体。
【０４５９】
[00527]  １４．前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが異なるＵＭＩ配列を含む、実施形態１３の捕捉物体。
【０４６０】
[00528]  １５．前記ＵＭＩが前記プライミング配列の３’側且つ前記捕捉配列の５’側に位置する、実施形態１３又は１４の捕捉物体。
【０４６１】
[00529]  １６．前記ＵＭＩ配列が、５〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列である、実施形態１３〜１５のいずれか１つの捕捉物体。
【０４６２】
[00530]  １７．前記ＵＭＩの前記オリゴヌクレオチド配列が１０ヌクレオチドを含む、実施形態１３〜１５のいずれか１つの捕捉物体。
【０４６３】
[00531]  １８．各捕捉オリゴヌクレオチドがＮｏｔ１制限部位配列を更に含む、実施形態１〜１７のいずれか１つの捕捉物体。
【０４６４】
[00532]  １９．前記Ｎｏｔ１制限部位配列が前記捕捉配列の５’側に位置する、実施形態１８の捕捉物体。
【０４６５】
[00533]  ２０．前記Ｎｏｔ１制限部位配列が前記バーコード配列の３’側に位置する、実施形態１８又は１９の捕捉物体。
【０４６６】
[00534]  ２１．各捕捉オリゴヌクレオチドが１つ以上のアダプター配列を更に含む、実施形態１〜２０のいずれか１つの捕捉物体。
【０４６７】
[00535]  ２２．前記捕捉配列が、ポリ−ｄＴ配列、ランダムヘキサマー配列、又はモザイク末端配列を含む、実施形態１〜１９のいずれか１つの捕捉物体。
【０４６８】
[00536]  ２３．複数の捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉物体が、実施形態１〜２２のいずれか１つに係る捕捉物体であり、ここで、前記複数のうちの各捕捉物体について、前記捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含み、及び前記複数のうちの各捕捉物体の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列が前記複数のうちの他のいずれの捕捉物体の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列とも異なる、複数の捕捉物体。
【０４６９】
[00537]  ２４．前記複数が少なくとも２５６個の捕捉物体を含む、実施形態２３の複数の捕捉物体。
【０４７０】
[00538]  ２５．前記複数が少なくとも１０，０００個の捕捉物体を含む、実施形態２３の複数の捕捉物体。
【０４７１】
[00539]  ２６．配列番号１〜４０のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含むカセット化可能オリゴヌクレオチド配列。
【０４７２】
[00540]  ２７．３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列であって、前記バーコード配列の前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列の各々が配列番号１〜４０のいずれか１つの配列を有し、及び前記バーコード配列の各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列。
【０４７３】
[00541]  ２８．３つ又は４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含む実施形態２７のバーコード配列。
【０４７４】
[00542]  ２９．前記３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列が、いかなる介在オリゴヌクレオチド配列もなしにタンデムで連結されている、実施形態２７又は２８のバーコード配列。
【０４７５】
[00543]  ３０．少なくとも６４個の同一でないバーコード配列を含むバーコード配列セットであって、前記セットの各バーコード配列が実施形態２７〜２９のいずれか１つに係る構造を有する、バーコード配列セット。
【０４７６】
[00544]  ３１．セットが、６４、８１、１００、１２５、２１６、２５６、３４３、５１２、６２５、７２９、１０００、１２９６、２４０１、４０９６、６５６１、又は１０，０００個のバーコード配列から本質的になる、実施形態３０のバーコード配列セット。
【０４７７】
[00545]  ３２．配列番号４１〜８０のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチド配列と；蛍光標識とを含むハイブリダイゼーションプローブ。
【０４７８】
[00546]  ３３．複数のハイブリダイゼーションプローブを含む試薬であって、前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブが実施形態３２に係るハイブリダイゼーションプローブであり、及び前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブが、（ｉ）複数のうちの他のいずれのハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチド配列とも異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、及び（ｉｉ）複数のうちの他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識とも分光的に区別可能な蛍光標識を含む、試薬。
【０４７９】
[00547]  ３４．複数のハイブリダイゼーションプローブが２〜４個のハイブリダイゼーションプローブからなる、実施形態３３の試薬。
【０４８０】
[00548]  ３５．複数のうちの第１のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第１のサブセットから選択される配列と、第１の蛍光標識とを含み；
複数のうちの第２のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第２のサブセットから選択される配列と、前記第１の蛍光標識と分光的に区別可能な第２の蛍光標識とを含み、配列番号４１〜８０の第１及び第２のサブセットが重複のないサブセットである、実施形態３３又は３４の試薬。
【０４８１】
[00549]  ３６．複数のうちの第３のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第３のサブセットから選択される配列と、前記第１及び第２の蛍光標識の各々と分光的に区別可能な第３の蛍光標識とを含み、配列番号４１〜８０の第１、第２、及び第３のサブセットが重複のないサブセットである、実施形態３５の試薬。
【０４８２】
[00550]  ３７．複数のうちの第４のハイブリダイゼーションプローブが、配列番号４１〜８０の第４のサブセットから選択される配列と、前記第１、第２、及び第３の蛍光標識の各々と分光的に区別可能な第４の蛍光標識とを含み、配列番号４１〜８０の第１、第２、第３、及び第４のサブセットが重複のないサブセットである、実施形態３６の試薬。
【０４８３】
[00551]  ３８．配列番号４１〜８０の各サブセットが少なくとも１０個の配列を含む、実施形態３５〜３７のいずれか１つの試薬。
【０４８４】
[00552]  ３９．前記第１のサブセットが配列番号４１〜５０を含み、前記第２のサブセットが配列番号５１〜６０を含み、前記第３のサブセットが配列番号６１〜７０を含み、及び前記第４のサブセットが配列番号７１〜８０を含む、実施形態３５〜３７のいずれか１つの試薬。
【０４８５】
[00553]  ４０．実施形態３３〜３９のいずれか１つに係る複数の試薬を含むキットであって、各試薬の複数のハイブリダイゼーションプローブが、複数のうちの他のいずれの試薬のハイブリダイゼーションプローブセットとも重複のないセットを形成する、キット。
【０４８６】
[00554]  ４１．３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の前記試薬を含む、実施形態４０のキット。
【０４８７】
[00555]  ４２．マイクロ流体デバイス内での１つ以上の捕捉物体のインサイチュ同定方法であって、
前記マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する１つ以上の隔離ペンの各々に前記１つ以上の捕捉物体のうちの単一の捕捉物体を配置することであって、各捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、及び前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
プライミング配列と；
捕捉配列と；
バーコード配列であって、前記バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と
を含むこと；
第１のハイブリダイゼーションプローブセットを含む第１の試薬溶液を前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャ内のフロー領域に流入させることであって、前記フロー領域が前記１つ以上の隔離ペンの各々に流体接続し、及び前記第１のセットの各ハイブリダイゼーションプローブが、
前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかに含まれるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列であって、第１のセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的なオリゴヌクレオチド配列が前記第１のセット中の前記ハイブリダイゼーションプローブの他のいずれの相補的なオリゴヌクレオチド配列とも同一でない、相補的なオリゴヌクレオチド配列と；
分光的に区別可能な蛍光標識のセットから選択される蛍光標識であって、前記第１のセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識が前記第１のハイブリダイゼーションプローブセット中の他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識とも異なる、蛍光標識と
を含むこと；
前記第１のセットの前記ハイブリダイゼーションプローブを前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかにおける対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすること；
前記第１のハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブについて、前記１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連する対応する蛍光シグナルを検出すること；及び
前記１つ以上の隔離ペンのうちの１つの中に配置された各捕捉物体について、（ｉ）前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャ内での隔離ペンの位置と、（ｉｉ）前記第１のハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブの前記対応する蛍光シグナルと前記捕捉物体との関連性又は非関連性と、を含むレコードを生成することであって、前記関連性及び非関連性レコードが、前記捕捉物体を前記隔離ペンと関連付けるバーコードを構成すること
を含む方法。
【０４８８】
[00556]  ４３．第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットを含む第ｎの試薬溶液を前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に流入させることであって、前記第ｎのセットの各ハイブリダイゼーションプローブが、
前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかに含まれるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列であって、第ｎのセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的なオリゴヌクレオチド配列が、前記第ｎのセット中及び前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に流入させる任意の他のハイブリダイゼーションプローブセット中の前記ハイブリダイゼーションプローブの他のいずれの相補的なオリゴヌクレオチド配列とも同一でない、相補的なオリゴヌクレオチド配列と；
分光的に区別可能な蛍光標識のセットから選択される蛍光標識であって、前記第ｎのセット中の各ハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識が前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセット中の他のいずれのハイブリダイゼーションプローブの蛍光標識とも異なる、蛍光標識と
を含むこと；
前記第ｎのセットの前記ハイブリダイゼーションプローブを前記１つ以上の捕捉物体のいずれかの前記捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかの前記バーコード配列のいずれかにおける対応するカセット化可能オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすること；
前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブについて、前記１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連する対応する蛍光シグナルを検出すること；及び
前記１つ以上の隔離ペンのうちの１つの中に配置された各捕捉物体について、前記レコードに、前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各ハイブリダイゼーションプローブの前記対応する蛍光シグナルと前記捕捉物体との関連性又は非関連性を補足すること
を更に含む、実施形態４２の方法であって、
ｎが、｛２，．．．，ｍ｝の値を有する正の整数の集合であり、
ｍが、２以上の値を有する正の整数であり、及び前述の、前記第ｎの試薬を流入させるステップ、前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットをハイブリダイズするステップ、前記対応する蛍光シグナルを検出するステップ、及び前記レコードを補足するステップが、前記正の整数の集合中のｎの各値について繰り返される、方法。
【０４８９】
[00557]  ４４．ｍが３以上２０以下（例えば５以上１５以下）の値を有する、実施形態４３の方法。
【０４９０】
[00558]  ４５．ｍが８以上１２以下（例えば１０）の値を有する、実施形態４３の方法。
【０４９１】
[00559]  ４６．前記第１の試薬溶液及び／又は前記第ｎの試薬溶液を前記フロー領域に流入させることが、前記第１の試薬溶液及び／又は前記第ｎの試薬溶液を前記１つ以上の隔離ペン内への拡散によって平衡化させることを更に含む、実施形態４３〜４５のいずれか１つの方法。
【０４９２】
[00560]  ４７．前記１つ以上の捕捉物体のいずれかに関連する前記対応する蛍光シグナルを検出することが、
ハイブリダイゼーションプローブを有しないリンス溶液を前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に流すこと；
前記１つ以上の隔離ペン内に前記リンス溶液を拡散によって平衡化させることであって、それにより前記第１のセット又は前記第ｎのセットのいずれかのうちのハイブリダイズしなかったハイブリダイゼーションプローブを拡散させて前記１つ以上の隔離ペンから出すことを更に含み；及び更に、前記リンス溶液を前記流すことが、前記蛍光シグナルの検出前に実施される、実施形態４３〜４５のいずれか１つの方法。
【０４９３】
[00561]  ４８．各捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの各バーコード配列が３つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含む、実施形態４３〜４７のいずれか１つの方法。
【０４９４】
[00562]  ４９．前記第１のハイブリダイゼーションプローブセット及び前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各々が３つのハイブリダイゼーションプローブを含む、実施形態４８の方法。
【０４９５】
[00563]  ５０．各捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの各バーコード配列が４つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含む、実施形態４３〜４７のいずれか１つの方法。
【０４９６】
[00564]  ５１．前記第１のハイブリダイゼーションプローブセット及び前記第ｎのハイブリダイゼーションプローブセットの各々が４つのハイブリダイゼーションプローブを含む、実施形態５０の方法。
【０４９７】
[00565]  ５２．前記１つ以上の捕捉物体の各々を配置することが、前記マイクロ流体デバイスの中の前記１つ以上の隔離ペンの分離領域の中に前記１つ以上の捕捉物体の各々を配置することを含む、実施形態４２〜５１のいずれか１つの方法。
【０４９８】
[00566]  ５３．前記マイクロ流体デバイスの前記１つ以上の隔離ペンの中に１つ以上の生体細胞を配置することを更に含む、実施形態４２〜５２のいずれか１つの方法。
【０４９９】
[00567]  ５４．前記１つ以上の生体細胞の各１つずつが、前記１つ以上の隔離ペンのうちの異なる隔離ペンに配置される、実施形態５３の方法。
【０５００】
[00568]  ５５．前記１つ以上の生体細胞が前記マイクロ流体デバイスの前記１つ以上の隔離ペンの前記分離領域の中に配置される、実施形態５３又は５４の方法。
【０５０１】
[00569]  ５６．１つ以上の生体細胞のうちの少なくとも１つが、中に配置された前記１つ以上の捕捉物体のうちの１つを有する隔離ペンの中に配置される、実施形態５３〜５５のいずれか１つの方法。
【０５０２】
[00570]  ５７．１つ以上の生体細胞が、クローン集団からの複数の生体細胞である、実施形態５３〜５６のいずれか１つの方法。
【０５０３】
[00571]  ５８．前記１つ以上の生体細胞を配置することが、前記１つ以上の捕捉物体を配置する前に実施される、実施形態５３〜５７のいずれか１つの方法。
【０５０４】
[00572]  ５９．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、及び前記１つ以上の捕捉物体を１つ以上の隔離ペン内に配置することが誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて実施される、実施形態４２〜５８のいずれか１つの方法。
【０５０５】
[00573]  ６０．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、及び前記１つ以上の生体細胞を前記１つ以上の隔離ペン内に前記配置することが誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて実施される、実施形態５３〜５９のいずれか１つの方法。
【０５０６】
[00574]  ６１．前記１つ以上の捕捉物体が、実施形態１〜２５のいずれか１つに係る捕捉物体である、実施形態４２〜６０のいずれか１つの方法。
【０５０７】
[00575]  ６２．各捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、前記捕捉配列によってそこに捕捉された標的核酸を更に含む、実施形態４２〜６１のいずれか１つの方法。
【０５０８】
[00576]  ６３．ゲノムデータをマイクロ流体デバイス内の生体細胞と相互に関係付ける方法であって、
捕捉物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペン内に配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
プライミング配列と；
捕捉配列と；
バーコード配列であって、前記バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列と
を含み；及び
前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含むこと；
前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定すること及び前記同定されたバーコード配列と前記隔離ペンとの間の関連性を記録すること；
前記生体細胞を前記隔離ペン内に配置すること；
前記生体細胞を溶解させること及び前記溶解した生体細胞から放出される核酸を、前記捕捉物体に含まれる前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドによって捕捉させること；
前記捕捉された核酸を転写することであって、それにより、前記捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つに共有結合的に結合した相補的な捕捉核酸配列を各々が含む複数の転写核酸を作製すること；
前記転写核酸及び前記バーコード配列をシーケンシングすることであって、それにより前記バーコード配列のリード配列に関連する前記複数の転写核酸のリード配列を入手すること；
前記リード配列に基づき前記バーコード配列を同定すること；及び
前記リード配列によって同定されたバーコード配列及び前記インサイチュで同定されたバーコード配列を使用して前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記隔離ペンと関連付けること、及びそれにより前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記隔離ペン内に置かれた前記生体細胞と相互に関係付けること
を含む方法。
【０５０９】
[00577]  ６４．前記生体細胞の表現型を観察すること；及び前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記生体細胞の前記表現型と相互に関係付けることを更に含む、実施形態６３の方法。
【０５１０】
[00578]  ６５．前記生体細胞の表現型を観察することであって、前記生体細胞がクローン集団を代表するものであること；及び前記複数の転写核酸の前記リード配列を前記生体細胞及び前記クローン集団の前記表現型と相互に関係付けることを更に含む、実施形態６３の方法。
【０５１１】
[00579]  ６６．前記生体細胞の前記表現型を観察することが、前記少なくとも１つの生体細胞の少なくとも１つの物理的特性を観察することを含む、実施形態６４又は６５の方法。
【０５１２】
[00580]  ６７．前記生体細胞の前記表現型を観察することが、前記生体細胞に関してアッセイを実施すること、及び前記アッセイ中に生成される検出可能シグナルを観察することを含む、実施形態６４又は６５の方法。
【０５１３】
[00581]  ６８．前記アッセイがタンパク質発現アッセイである、実施形態６７の方法。
【０５１４】
[00582]  ６９．前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定すること及び前記同定されたバーコード配列と前記隔離ペンとの間の関連性を記録することが、前記生体細胞を前記隔離ペン内に配置する前に実施される、実施形態６３〜６８のいずれか１つの方法。
【０５１５】
[00583]  ７０．前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定すること及び前記同定されたバーコード配列と前記隔離ペンとの間の関連性を記録することが、前記生体細胞を前記隔離ペン内に導入した後に実施される、実施形態６３〜６８のいずれか１つの方法。
【０５１６】
[00584]  ７１．前記捕捉物体を配置すること、及び前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定すること及び前記同定されたバーコード配列と前記隔離ペンとの間の関連性を記録することが、前記生体細胞の表現型を観察した後に実施される、実施形態６４〜６８のいずれか１つの方法。
【０５１７】
[00585]  ７２．前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定すること及び前記同定されたバーコード配列と前記隔離ペンとの間の関連性を記録することが、前記生体細胞を溶解させること及び前記溶解した生体細胞から放出される前記核酸を前記捕捉物体に含まれる前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドによって捕捉させることの後に実施される、実施形態６３〜６８のいずれか１つの方法。
【０５１８】
[00586]  ７３．前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することが、実施形態４２〜６０のいずれか１つの方法を実施することを含む、実施形態６３〜７２のいずれか１つの方法。
【０５１９】
[00587]  ７４．前記捕捉物体が、実施形態１〜２３のいずれか１つの捕捉物体である、実施形態６３〜７３のいずれか１つの方法。
【０５２０】
[00588]  ７５．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を含み、及び前記捕捉物体を前記隔離ペン内に配置することが、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて前記捕捉物体を動かすことを含む、実施形態６３〜７４のいずれか１つの方法。
【０５２１】
[00589]  ７６．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、及び前記生体細胞を前記隔離ペンの中に配置することが、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いて前記生体細胞を動かすことを含む、実施形態６３〜７５のいずれか１つの方法。
【０５２２】
[00590]  ７７．複数の捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスの対応する複数の隔離ペン内に配置すること；
複数の生体細胞を前記対応する複数の隔離ペン内に配置すること、及び、
前記複数の捕捉物体及び複数の生体細胞の各々を前記方法の前記追加的なステップに従い処理すること
を更に含む、実施形態６３〜７６のいずれか１つの方法。
【０５２３】
[00591]  ７８．エンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、前記エンクロージャがフロー領域と前記フロー領域に通じる複数の隔離ペンとを含む、マイクロ流体デバイスと；
複数の捕捉物体であって、前記複数のうちの各捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
捕捉配列；及び
少なくとも３つのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列であって、前記バーコード配列の各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列と同一でない、バーコード配列を含み、及び前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含む、複数の捕捉物体とを含む、核酸ライブラリを作製するためのキット。
【０５２４】
[00592]  ７９．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含む、実施形態７８のキット。
【０５２５】
[00593]  ８０．前記複数の捕捉物体が、実施形態２３〜２５のいずれか１つに係る複数の捕捉物体である、実施形態７８又は７９のキット。
【０５２６】
[00594]  ８１．前記複数の捕捉物体の各々が、複数のうちの対応する隔離ペン内に１つずつ配置される、実施形態７８〜８０のいずれか１つのキット。
【０５２７】
[00595]  ８２．同定テーブルを更に含む、実施形態８１のキットであって、前記同定テーブルが前記複数の捕捉物体の各々の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列を前記複数のうちの前記対応する隔離ペンと相互に関係付ける、キット。
【０５２８】
[00596]  ８３．複数のハイブリダイゼーションプローブであって、各ハイブリダイゼーションプローブが、
前記複数の捕捉物体のいずれか１つの前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記カセット化可能オリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列
を含む、複数のハイブリダイゼーションプローブと；
標識であって、前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブの前記相補的な配列が異なるカセット化可能オリゴヌクレオチド配列に相補的である、標識と
を更に含む、実施形態７８〜８２のいずれか１つのキットであって；及び
前記複数のうちの各ハイブリダイゼーションプローブの前記標識が分光的に区別可能な標識のセットから選択される、キット。
【０５２９】
[00597]  ８４．前記複数のうちのハイブリダイゼーションプローブの各相補的な配列が、配列番号４１〜８０のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチド配列を含む、実施形態８３のキット。
【０５３０】
[00598]  ８５．前記標識が蛍光標識である、実施形態８３又は８４のキット。
【０５３１】
[00599]  ８６．生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に前記生体細胞を配置すること；
前記隔離ペンの中に捕捉物体を配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
プライマーに結合するプライミング配列と；
捕捉配列と；
バーコード配列であって、前記バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、バーコード配列と
を含むこと；
前記生体細胞を溶解させること及び前記溶解した生体細胞から放出される核酸を、前記捕捉物体に含まれる前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドによって捕捉させること；及び
前記捕捉された核酸を転写することであって、それにより前記捕捉物体をデコレートする複数のバーコード付きｃＤＮＡを作製し、各バーコード付きｃＤＮＡが、（ｉ）前記捕捉された核酸のうちの対応する１つに相補的なオリゴヌクレオチド配列、それが共有結合的に結合した（ｉｉ）前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つを含むこと
を含む方法。
【０５３２】
[00600]  ８７．前記生体細胞が免疫細胞である、実施形態８６の方法。
【０５３３】
[00601]  ８８．前記生体細胞が癌細胞である、実施形態８６の方法。
【０５３４】
[00602]  ８９．前記生体細胞が幹細胞又は前駆細胞である、実施形態８６の方法。
【０５３５】
[00603]  ９０．前記生体細胞が胚である、実施形態８６の方法。
【０５３６】
[00604]  ９１．前記生体細胞が単一の生体細胞である、実施形態８６〜９０のいずれか１つの方法。
【０５３７】
[00605]  ９２．前記生体細胞を前記配置することが、前記生体細胞をマーキングすることを更に含む、実施形態８６〜９１のいずれか１つの方法。
【０５３８】
[00606]  ９３．前記捕捉物体が、実施形態１〜２２のいずれか１つに係る捕捉物体である、実施形態８６〜９２のいずれか１つの方法。
【０５３９】
[00607]  ９４．前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の前記捕捉配列がオリゴｄＴプライマー配列を含む、実施形態８６〜９３のいずれか１つの方法。
【０５４０】
[00608]  ９５．前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の前記捕捉配列が遺伝子特異的プライマー配列を含む、実施形態８６〜９３のいずれか１つの方法。
【０５４１】
[00609]  ９６．前記遺伝子特異的プライマー配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするｍＲＮＡ配列を標的にする、実施形態９５の方法。
【０５４２】
[00610]  ９７．前記遺伝子特異的プライマー配列が、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードするｍＲＮＡ配列を標的にする、実施形態９５の方法。
【０５４３】
[00611]  ９８．前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の前記捕捉配列が前記放出された核酸のうちの１つに結合して前記放出された核酸をプライミングし、それにより前記捕捉された核酸をポリメラーゼによって転写させる、実施形態８６〜９７のいずれか１つの方法。
【０５４４】
[00612]  ９９．前記捕捉物体が磁性成分を含む、実施形態８６〜９８のいずれか１つの方法。
【０５４５】
[00613]  １００．前記隔離ペンの中に前記生体細胞を配置することが、前記隔離ペンの中に前記捕捉物体を配置する前に実施される、実施形態８６〜９９のいずれか１つの方法。
【０５４６】
[00614]  １０１．前記隔離ペンの中に前記捕捉物体を配置することが、前記隔離ペンの中に前記生体細胞を配置する前に実施される、実施形態８６〜９９のいずれか１つの方法。
【０５４７】
[00615]  １０２．前記捕捉物体が前記隔離ペンの中に位置する間に、前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することを更に含む、実施形態８６〜１０１のいずれか１つの方法。
【０５４８】
[00616]  １０３．前記バーコードを前記同定することが、実施形態４２〜６２のいずれか１つの方法を用いて実施される、実施形態１０２の方法。
【０５４９】
[00617]  １０４．前記バーコード配列を同定することが、前記生体細胞を溶解させる前に実施される、実施形態１０２又は１０３の方法。
【０５５０】
[00618]  １０５．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが少なくとも１つのコーティングされた表面を含む、実施形態８６〜１０４のいずれか１つの方法。
【０５５１】
[00619]  １０６．前記少なくとも１つのコーティングされた表面が、共有結合的に結合した表面を含む、実施形態１０５の方法。
【０５５２】
[00620]  １０７．前記少なくとも１つのコーティングされた表面が親水性又は負電荷のコーティングされた表面を含む、実施形態１０５又は１０６の方法。
【０５５３】
[00621]  １０８．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含む、実施形態８６〜１０７のいずれか１つの方法であって、及び前記生体細胞を配置すること及び／又は前記捕捉物体を配置することが、前記生体細胞及び／又は前記捕捉物体上に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を印加することによって実施される、方法。
【０５５４】
[00622]  １０９．前記マイクロ流体デバイスが複数の隔離ペンを更に含む、実施形態８６〜１０８のいずれか１つの方法。
【０５５５】
[00623]  １１０．前記複数の隔離ペンの中に複数の前記生体細胞を配置することを更に含む、実施形態１０９の方法。
【０５５６】
[00624]  １１１．前記複数の前記生体細胞がクローン集団である、実施形態１１０の方法。
【０５５７】
[00625]  １１２．前記複数の隔離ペンの中に前記複数の前記生体細胞を配置することが、前記複数のうちの対応する隔離ペンに前記複数のうちの実質的に１つのみの生体細胞を配置することを含む、実施形態１１０又は１１１の方法。
【０５５８】
[00626]  １１３．前記複数の隔離ペンの中に複数の前記捕捉物体を配置することを更に含む、実施形態１０９〜１１２のいずれか１つの方法。
【０５５９】
[00627]  １１４．前記複数の隔離ペンの中に前記複数の前記捕捉物体を配置することが、前記複数の隔離ペンのうちの対応する１つの中に実質的に１つのみの捕捉物体を配置することを含む、実施形態１１３の方法。
【０５６０】
[00628]  １１５．前記複数の隔離ペンの中に前記複数の捕捉物体を配置することが、前記生体細胞又は前記複数の前記生体細胞を前記溶解することの前に実施される、実施形態１１３又は１１４の方法。
【０５６１】
[00629]  １１６．前記複数の前記捕捉物体が、実施形態２３に係る複数の捕捉物体である、実施形態１１３〜１１５のいずれか１つの方法。
【０５６２】
[00630]  １１７．前記捕捉物体又は前記複数の前記捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出することを更に含む、実施形態８６〜１１６のいずれか１つの方法。
【０５６３】
[00631]  １１８．前記複数の前記捕捉物体を搬出することが、前記複数の前記捕捉物体の各々を個別に搬出することを含む、実施形態１１７の方法。
【０５６４】
[00632]  １１９．前記複数のうちの各前記捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスの外部にある別個の収容先に送ることを更に含む、実施形態１１８の方法。
【０５６５】
[00633]  １２０．前記生体細胞又は複数の前記生体細胞を前記配置すること；前記捕捉物体又は前記複数の前記捕捉物体を前記配置すること；前記生体細胞又は前記複数の前記生体細胞を前記溶解すること及び前記溶解した生体細胞又は前記複数の前記生体細胞から放出される核酸を前記捕捉させること；前記転写すること；及び前記捕捉物体又は前記複数のうちの各前記捕捉物体の前記バーコード配列をインサイチュで前記同定することのうちの１つ以上が自動化された方式で実施される、実施形態８６〜１１９のいずれか１つの方法。
【０５６６】
[00634]  １２１．バーコード付きシーケンシングライブラリを提供する方法であって、
実施形態８６〜１２０のいずれか１つの方法によって得られた捕捉物体のｃＤＮＡライブラリ又は複数の前記捕捉物体の各々のｃＤＮＡライブラリを増幅すること；及び
前記増幅したＤＮＡライブラリ又は前記複数のｃＤＮＡライブラリをタグメンテーションすることであって、それにより１つ以上のバーコード付きシーケンシングライブラリを作製すること
を含む方法。
【０５６７】
[00635]  １２２．前記ｃＤＮＡライブラリ又は前記複数のｃＤＮＡライブラリを増幅することが、プールインデックス配列を導入することを含み、前記プールインデックス配列が４〜１０ヌクレオチドを含む、実施形態１２１の方法。
【０５６８】
[00636]  １２３．複数の前記バーコード付きシーケンシングライブラリを組み合わせることを更に含む、実施形態１２２の方法であって、前記複数のうちの各バーコード付きシーケンシングライブラリが異なるバーコード配列及び／又は異なるプールインデックス配列を含む、方法。
【０５６９】
[00637]  １２４．生物学的微小物体からバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
ゲノムＤＮＡを含む生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に配置すること；
前記生物学的微小物体の核膜を破壊する能力を有する溶解試薬を前記生物学的微小物体に接触させることであって、それにより前記生物学的微小物体のゲノムＤＮＡを放出させること；
前記放出されたゲノムＤＮＡをタグメンテーションすることであって、それにより第１のタグメンテーション挿入配列によって定義される第１の末端と第２のタグメンテーション挿入配列によって定義される第２の末端とを有する複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片を作製すること；
前記隔離ペンの中に捕捉物体を配置することであって、前記捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
第１のプライミング配列と；
第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と；
バーコード配列であって、前記バーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記バーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、バーコード配列と
を含むこと；
前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの１つを、（ｉ）前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列、（ｉｉ）第２のタグメンテーション挿入捕捉配列、ランダム化プライマー配列、又は遺伝子特異的プライマー配列に結合した第２のプライミング配列を含む増幅オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）鎖置換酵素とポリメラーゼとを含む酵素混合物と接触させること；
前記接触させた複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片をある期間インキュベートすることであって、それにより同時に前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの前記１つを増幅するとともに前記捕捉オリゴヌクレオチド及び前記増幅オリゴヌクレオチドを前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの前記１つの末端に付加して前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを作製すること；及び
前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを前記マイクロ流体デバイスから搬出すること
を含む方法。
【０５７０】
[00638]  １２５．前記隔離ペンの中に前記生物学的微小物体を配置することが、前記隔離ペンの中に前記捕捉物体を配置する前に実施される、実施形態１２４の方法。
【０５７１】
[00639]  １２６．前記生物学的微小物体が生体細胞である、実施形態１２４又は１２５の方法。
【０５７２】
[00640]  １２７．前記生物学的微小物体が生体細胞（例えば真核細胞）の核である、実施形態１２４又は１２５の方法。
【０５７３】
[00641]  １２８．前記生体細胞が免疫細胞である、実施形態１２６又は１２７の方法。
【０５７４】
[00642]  １２９．前記生体細胞が癌細胞である、実施形態１２６又は１２７の方法。
【０５７５】
[00643]  １３０．前記溶解試薬が少なくとも１つのリボヌクレアーゼ阻害薬を含む、実施形態１２４〜１２９のいずれか１つの方法。
【０５７６】
[00644]  １３１．前記タグメンテーションすることが、前記放出されたゲノムＤＮＡを、（ｉ）前記第１のタグメンテーション挿入配列を含む第１の二本鎖ＤＮＡ断片、及び（ｉｉ）前記第２のタグメンテーション挿入配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片を負荷したトランスポザーゼと接触させることを含む、実施形態１２４〜１３０のいずれか１つの方法。
【０５７７】
[00645]  １３２．前記第１の二本鎖ＤＮＡ断片が、第３のプライミング配列に結合した第１のモザイク末端配列を含み、及び前記第２の二本鎖ＤＮＡ断片が、第４のプライミング配列に結合した第２のモザイク末端配列を含む、実施形態１３１の方法。
【０５７８】
[00646]  １３３．前記捕捉物体の各捕捉オリゴヌクレオチドの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列が、前記第１のタグメンテーション挿入配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、実施形態１３１又は１３２の方法。
【０５７９】
[00647]  １３４．前記増幅オリゴヌクレオチドの前記第２のタグメンテーション挿入捕捉配列が、前記第２のタグメンテーション挿入配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、実施形態１３１〜１３３のいずれか１つの方法。
【０５８０】
[00648]  １３５．前記捕捉物体が、実施形態１〜２０のいずれか１つに係る捕捉物体である、実施形態１２４〜１３４のいずれか１つの方法。
【０５８１】
[00649]  １３６．前記捕捉物体が磁性成分を含む、実施形態１２４〜１３５のいずれか１つの方法。
【０５８２】
[00650]  １３７．前記捕捉物体が前記隔離ペンの中に位置する間に、前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列をインサイチュで同定することを更に含む、実施形態１２４〜１３６のいずれか１つの方法。
【０５８３】
[00651]  １３８．前記バーコード配列を前記同定することが、実施形態４２〜６２のいずれか１つの方法を用いて実施される、実施形態１３７の方法。
【０５８４】
[00652]  １３９．前記バーコード配列を同定することが、前記生体細胞を溶解させる前に実施される、実施形態１３７又は１３８の方法。
【０５８５】
[00653]  １４０．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが少なくとも１つのコーティングされた表面を含む、実施形態１２４〜１３９のいずれか１つの方法。
【０５８６】
[00654]  １４１．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが少なくとも１つの調整された表面を含む、実施形態１２４〜１４０のいずれか１つの方法。
【０５８７】
[00655]  １４２．前記少なくとも１つの調整された表面が、共有結合的に結合した親水性部分又は負電荷部分を含む、実施形態１４１の方法。
【０５８８】
[00656]  １４３．前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャが誘電泳動（ＤＥＰ）構成を更に含み、及び前記生物学的微小物体を配置すること及び／又は前記捕捉物体を配置することが、前記生体細胞及び／又は前記捕捉物体上に又はそれに近接して誘電泳動（ＤＥＰ）力を印加することによって実施される、実施形態１２４〜１４２のいずれか１つの方法。
【０５８９】
[00657]  １４４．前記マイクロ流体デバイスが複数の隔離ペンを更に含む、実施形態１２４〜１４３のいずれか１つの方法。
【０５９０】
[00658]  １４５．前記複数の隔離ペンの中に複数の前記生物学的微小物体を配置することを更に含む、実施形態１４４の方法。
【０５９１】
[00659]  １４６．前記複数の前記生物学的微小物体が生体細胞のクローン集団である、実施形態１４５の方法。
【０５９２】
[00660]  １４７．前記複数の隔離ペンの中に前記複数の前記生物学的微小物体を配置することが、前記複数のうちの対応する隔離ペンに前記複数のうちの実質的に１つのみの生物学的微小物体を配置することを含む、実施形態１４５又は１４６の方法。
【０５９３】
[00661]  １４８．前記複数の隔離ペンの中に複数の前記捕捉物体を配置することを更に含む、実施形態１４４〜１４７のいずれか１つの方法。
【０５９４】
[00662]  １４９．前記複数の隔離ペンの中に前記複数の前記捕捉物体を配置することが、前記複数の隔離ペンのうちの対応する１つの中に実質的に１つのみの捕捉物体を配置することを含む、実施形態１４８の方法。
【０５９５】
[00663]  １５０．前記複数の隔離ペンの中に前記複数の捕捉物体を配置することが、前記生物学的微小物体又は前記複数の前記生物学的微小物体を前記溶解することの前に実施される、実施形態１４８又は１４９の方法。
【０５９６】
[00664]  １５１．前記複数の前記捕捉物体が、実施形態２３に係る複数の捕捉物体である、実施形態１４８〜１５０のいずれか１つの方法。
【０５９７】
[00665]  １５２．前記捕捉物体又は前記複数の前記捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出することを更に含む、実施形態１２４〜１５１のいずれか１つの方法。
【０５９８】
[00666]  １５３．前記複数の前記捕捉物体を搬出することが、前記複数の前記捕捉物体の各々を個別に搬出することを含む、実施形態１５２の方法。
【０５９９】
[00667]  １５４．前記複数のうちの各前記捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスの外部にある別個の収容先に送ることを更に含む、実施形態１５３の方法。
【０６００】
[00668]  １５５．前記タグメンテーションするステップ、接触させるステップ、及びインキュベートするステップが、前記複数の生物学的微小物体のうちの１つが入った前記隔離ペンの各々について実質的に同時に実施される、実施形態１４５〜１５４のいずれか１つの方法。
【０６０１】
[00669]  １５６．前記生物学的微小物体又は前記複数の前記生物学的微小物体を前記配置すること；前記捕捉物体又は前記複数の前記捕捉物体を前記配置すること；前記生物学的微小物体又は前記複数の前記生物学的微小物体を前記溶解させること及び前記溶解した生体細胞又は前記複数の前記生体細胞から放出される核酸を前記捕捉させること；前記放出されたゲノムＤＮＡを前記タグメンテーションすること；前記複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片のうちの１つを前記接触させること；前記接触させた複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片を前記インキュベートすること；前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリ又は前記複数のＤＮＡライブラリを前記搬出すること；及び前記捕捉物体又は前記複数のうちの各前記捕捉物体の前記バーコード配列をインサイチュで前記同定することのうちの１つ以上が自動化された方式で実施される、実施形態１２４〜１５５のいずれか１つの方法。
【０６０２】
[00670]  １５７．単一の生体細胞からバーコード付きｃＤＮＡライブラリ及びバーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを提供する方法であって、
マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中に前記生体細胞を配置すること；
前記隔離ペンの中に第１の捕捉物体を配置することであって、前記第１の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドが、
第１のプライミング配列と；
第１の捕捉配列と；
第１のバーコード配列であって、前記第１のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記第１のバーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、第１のバーコード配列と
を含むこと；
実施形態８６〜１２３のいずれか１つの方法を実施することにより前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを入手することであって、前記生体細胞を溶解させることが、前記生体細胞の細胞膜が分解されて前記生体細胞から細胞質ＲＮＡが放出される一方で、前記生体細胞の核膜はインタクトなまま残るように実施され、それにより前記生体細胞の前記ＲＮＡからの前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリでデコレートされた前記第１の捕捉物体が提供されること；
前記ｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出すること；
前記隔離ペンの中に第２の捕捉物体を配置することであって、前記第２の捕捉物体が複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、各々が
第２のプライミング配列と；
第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と；
第２のバーコード配列であって、前記第２のバーコード配列が３つ以上のカセット化可能オリゴヌクレオチド配列を含み、各カセット化可能オリゴヌクレオチド配列が前記第２のバーコード配列の他のいずれのカセット化可能オリゴヌクレオチド配列とも同一でない、第２のバーコード配列と
を含むこと；
実施形態１２４〜１５６のいずれか１つの方法を実施することにより前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを入手することであって、前記生体細胞からの複数のタグメント化ゲノムＤＮＡ断片が前記第２の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と接触し、それにより前記生体細胞の前記ゲノムＤＮＡからの前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリが提供されること；及び
前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを前記マイクロ流体デバイスから搬出すること
を含む方法。
【０６０３】
[00671]  １５８．前記第１の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列を同定することを更に含む、実施形態１５７の方法。
【０６０４】
[00672]  １５９．前記第１の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列を同定することが、前記隔離ペンに前記生体細胞を配置する前；前記生体細胞の前記ＲＮＡから前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを入手する前；又は前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリでデコレートされた第１の捕捉物体をマイクロ流体デバイスから搬出する前に実施される、実施形態１５８の方法。
【０６０５】
[00673]  １６０．前記第２の捕捉物体の前記複数のオリゴヌクレオチドの前記バーコード配列を同定することを更に含む、実施形態１５７〜１５９のいずれか１つの方法。
【０６０６】
[00674]  １６１．前記第２の捕捉の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列を同定することが、前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを入手する前又は前記バーコード付きゲノムＤＮＡライブラリを前記マイクロ流体デバイスから搬出した後に実施される、実施形態１６０の方法。
【０６０７】
[00675]  １６２．前記第１又は前記第２の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列を同定することが、実施形態４２〜６０のいずれか１つの方法を用いて実施される、実施形態１５７〜１６１のいずれか１つの方法。
【０６０８】
[00676]  １６３．前記第１の捕捉物体及び前記第２の捕捉物体が、各々、実施形態１〜２２のいずれか１つの捕捉物体である、実施形態１５７〜１６２のいずれか１つの方法。
【０６０９】
[00677]  １６４．前記第１の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記第１のプライミング配列が前記第２の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記第２のプライミング配列と異なる、実施形態１５７〜１６３のいずれか１つの方法。
【０６１０】
[00678]  １６５．前記第１の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記第１の捕捉配列が前記第２の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記第１のタグメンテーション挿入捕捉配列と異なる、実施形態１５７〜１６４のいずれか１つの方法。
【０６１１】
[00679]  １６６．前記第１の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が前記第２の捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドの前記バーコード配列と同じである、実施形態１５７〜１６５のいずれか１つの方法。
【０６１２】
[00680]  １６７．バーコード付きＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シーケンシングライブラリを提供する方法であって、
Ｂリンパ球からバーコード付きｃＤＮＡライブラリを作成することであって、前記作成することが実施形態８６〜１０９のいずれか１つの方法により実施され、前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリが、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉物体をデコレートし、前記複数のうちの各捕捉オリゴヌクレオチドがＮｏｔ１制限部位配列を含むこと；
前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅すること；
前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリからバーコード付きＢＣＲ配列を選択することであって、それによりバーコード付きＢＣＲ配列が富化されたライブラリを作製すること；
バーコード付きＢＣＲ配列が富化された前記ライブラリからの配列を環状化することであって、それにより環状化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを作製すること；
前記環状化バーコード付きＢＣＲ配列ライブラリを再び線状化して、各々がそれぞれの可変（Ｖ）サブ領域及び／又はそれぞれの多様性（Ｄ）サブ領域の３’側に前記ＢＣＲ配列の定常（Ｃ）領域を呈する再配列されたバーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを提供すること；及び、
シーケンシングアダプターを付加して前記Ｖサブ領域及び／又は前記Ｄサブ領域をサブ選択することであって、それによりバーコード付きＢＣＲシーケンシングライブラリを作製すること
を含む方法。
【０６１３】
[00681]  １６８．前記ＢＣＲシーケンシングライブラリを増幅して、バーコード付きＢＣＲサブ領域配列の増幅ライブラリを提供することを更に含む、実施形態１６７の方法。
【０６１４】
[00682]  １６９．前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅することが、ユニバーサルプライマーを使用して実施される、実施形態１６７又は１６８の方法。
【０６１５】
[00683]  １７０．前記ＢＣＲ配列領域を選択することが、ＢＣＲ配列に選択的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、それにより前記バーコード付きＢＣＲ領域選択的増幅ＤＮＡのライブラリを作製することを含む、実施形態１６７〜１６９のいずれか１つの方法。
【０６１６】
[00684]  １７１．前記バーコード付きＢＣＲ配列を選択することが、少なくとも１つのシーケンシングプライマー配列及び／又は少なくとも１つのインデックス配列を付加することを更に含む、実施形態１６７〜１７０のいずれか１つの方法。
【０６１７】
[00685]  １７２．バーコード付きＢＣＲ配列が富化された前記ライブラリからの配列を環状化することが、各バーコード付きＢＣＲ配列の５’末端をそのそれぞれの３’末端にライゲートすることを含む、実施形態１６７〜１７１のいずれか１つの方法。
【０６１８】
[00686]  １７３．前記環状化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを再び線状化することが、前記環状化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリの各々を前記Ｎｏｔ１制限部位で消化することを含む、実施形態１６７〜１７２のいずれか１つの方法。
【０６１９】
[00687]  １７４．前記シーケンシングアダプターを付加してＶサブ領域及び／又はＤサブ領域をサブ選択することが、ＰＣＲを実施することであって、それによってシーケンシングアダプターを付加して前記Ｖサブ領域及び／又はＤサブ領域をサブ選択することを含む、実施形態１６７〜１７３のいずれか１つの方法。
【０６２０】
[00688]  １７５．前記捕捉物体が、実施形態１〜２２のいずれか１つに係る捕捉物体である、実施形態１６７〜１７４のいずれか１つの方法。
【０６２１】
[00689]  １７６．実施形態４２〜６０のいずれか１つの方法を用いて前記捕捉物体の前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのバーコード配列を同定することを更に含む、実施形態１６７〜１７５のいずれか１つの方法。
【０６２２】
[00690]  １７７．前記同定することが、前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅する前に実施される、実施形態１７６の方法。
【０６２３】
[00691]  １７８．前記同定することが、前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを作成する間に実施される、実施形態１７７の方法。
【０６２４】
[00692]  １７９．前記の前記バーコード付きｃＤＮＡライブラリを増幅すること；バーコード付きＢＣＲ配列に選択的な前記ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施すること；配列を環状化すること；前記環状化バーコード付きＢＣＲ配列のライブラリを前記Ｎｏｔ１制限部位で再び線状化すること；及び前記シーケンシングアダプターを付加してＶサブ領域及び／又はＤサブ領域をサブ選択することのいずれかが、マイクロ流体デバイスのエンクロージャの中に位置する隔離ペンの中で実施される、実施形態１６７〜１７８のいずれか１つの方法。
【０６２５】
【表７−１】
2019528762.tif 000011
【０６２６】
【表７−２】
2019528762.tif 000012
【０６２７】
【表７−３】
2019528762.tif 000013
【０６２８】
【表７−４】
2019528762.tif 000014
【０６２９】
【表７−５】
2019528762.tif 000015
【図１Ａ】
2019528762.tif 000016
【図１Ｂ】
2019528762.tif 000017
【図１Ｃ】
2019528762.tif 000018
【図２Ａ】
2019528762.tif 000019
【図２Ｂ】
2019528762.tif 000020
【図２Ｃ】
2019528762.tif 000021
【図２Ｄ】
2019528762.tif 000022
【図２Ｅ】
2019528762.tif 000023
【図２Ｆ】
2019528762.tif 000024
【図２Ｇ】
2019528762.tif 000025
【図２Ｈ】
2019528762.tif 000026
【図３Ａ】
2019528762.tif 000027
【図３Ｂ】
2019528762.tif 000028
【図４Ａ】
2019528762.tif 000029
【図４Ｂ】
2019528762.tif 000030
【図５】
2019528762.tif 000031
【図６】
2019528762.tif 000032
【図７Ａ】
2019528762.tif 000033
【図７Ｂ】
2019528762.tif 000034
【図７Ｃ】
2019528762.tif 000035
【図８Ａ】
2019528762.tif 000036
【図８Ｂ】
2019528762.tif 000037
【図８Ｃ】
2019528762.tif 000038
【図８Ｄ】
2019528762.tif 000039
【図８Ｅ】
2019528762.tif 000040
【図８Ｆ】
2019528762.tif 000041
【図９】
2019528762.tif 000042
【図１０Ａ】
2019528762.tif 000043
【図１０Ｂ】
2019528762.tif 000044
【図１０Ｃ】
2019528762.tif 000045
【図１０Ｄ】
2019528762.tif 000046
【図１１Ａ】
2019528762.tif 000047
【図１１Ｂ】
2019528762.tif 000048
【図１１Ｃ】
2019528762.tif 000049
【図１２Ａ】
2019528762.tif 000050
【図１２Ｂ】
2019528762.tif 000051
【図１２Ｃ】
2019528762.tif 000052
【図１２Ｄ】
2019528762.tif 000053
【図１２Ｅ】
2019528762.tif 000054
【図１２Ｆ】
2019528762.tif 000055
【図１２Ｇ】
2019528762.tif 000056
【図１３Ａ】
2019528762.tif 000057
【図１３Ｂ】
2019528762.tif 000058
【図１４Ａ】
2019528762.tif 000059
【図１４Ｂ】
2019528762.tif 000060
【図１４Ｃ】
2019528762.tif 000061
【図１４Ｄ】
2019528762.tif 000062
【図１５Ａ】
2019528762.tif 000063
【図１５Ｂ】
2019528762.tif 000064
【図１６Ａ】
2019528762.tif 000065
【図１６Ｂ】
2019528762.tif 000066
【図１６Ｃ】
2019528762.tif 000067
【図１６Ｄ】
2019528762.tif 000068
【図１７】
2019528762.tif 000069
【図１８】
2019528762.tif 000070
【図１９】
2019528762.tif 000071
【図２０Ａ】
2019528762.tif 000072
【図２０Ｂ】
2019528762.tif 000073
【図２１Ａ】
2019528762.tif 000074
【図２１Ｂ】
2019528762.tif 000075
【図２２Ａ】
2019528762.tif 000076
【図２２Ｂ】
2019528762.tif 000077
【図２３】
2019528762.tif 000078
【図２４】
2019528762.tif 000079
【図２５】
2019528762.tif 000080
【図２６Ａ】
2019528762.tif 000081
【図２６Ｂ】
2019528762.tif 000082
【図２７】
2019528762.tif 000083
【図２８】
2019528762.tif 000084
【図２９Ａ】
2019528762.tif 000085
【図２９Ｂ】
2019528762.tif 000086
【図２９Ｃ】
2019528762.tif 000087
【図２９Ｄ】
2019528762.tif 000088
【図３０Ａ】
2019528762.tif 000089
【図３０Ｂ】
2019528762.tif 000090
【図３０Ｃ】
2019528762.tif 000091
【図３０Ｄ】
2019528762.tif 000092
【図３０Ｅ】
2019528762.tif 000093
【図３０Ｆ】
2019528762.tif 000094
【図３１Ａ】
2019528762.tif 000095
【図３１Ｂ】
2019528762.tif 000096
【図３２】
2019528762.tif 000097
【配列表】
2019528762000001.app
【国際調査報告】
2019528762.tif 000098
2019528762.tif 000099
2019528762.tif 000100
2019528762.tif 000101