【手続補正書】
【提出日】平成19年10月4日(2007.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2007513874.tif 000001
を有するかまたはその塩、水和物または溶媒和物であり、かつ少なくとも１個の放射標識を含む化合物。
【請求項２】
該化合物が少なくとも１個、２個または３個のトリチウム置換をメタ位に含む、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式II：
【化２】
2007513874.tif 000002
の化合物またはその塩。
【請求項４】
化合物の活性をＩＫｒチャネルブロッカーとして特徴付けるためのアッセイ法であって、下記工程：
ａ)ＩＫｒチャネルを含む細胞膜の、式IIの化合物の存在下、かつ試験化合物の存在下または非存在下でのインキュベーション；
ｂ)試験化合物の存在下または非存在下、特異的に結合した標識化合物の測定；
ｃ)試験化合物による標識化合物の結合の阻害の計算
を含む、アッセイ法。
【請求項５】
ａ)１個またはそれ以上の濃度の試験化合物の溶液を調製し；
ｂ)式IIの化合物とＩＫｒチャネルを含む細胞膜を混合し；
ｃ)試験化合物の溶液と、式IIの化合物およびＩＫｒチャネルを含む細胞膜の混合物をインキュベートし；
ｄ)溶液から膜を単離し、そして膜の放射活性を測定し；
ｅ)試験化合物存在下のサンプルの放射活性を、試験化合物非存在下のコントロールと比較して計算する
工程を含む、請求項４記載のアッセイ法。
【請求項６】
ＩＫｒチャネルがヒトＥＲＧである、請求項４または５記載のアッセイ法。
【請求項７】
細胞膜がヒトＥＲＧ遺伝子でトランスフェクトした細胞系由来である、請求項６記載のアッセイ法。
【請求項８】
細胞系がＨＥＫである、請求項７記載のアッセイ法。
【請求項９】
１個またはそれ以上の候補化合物のＩＫｒチャネルブロッカー活性の特徴付けのためのアッセイにおける、式IIの化合物の使用。
【請求項１０】
アッセイが競合的結合アッセイである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
(１,５−シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニル−ホスフィン)イリジウム(Ｉ)ヘキサフルオロホスフェートの存在下、３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンをトリチウム標識することを含む、請求項３記載の式IIの化合物の製造法。
【請求項１２】
３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンおよび(１,５−シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニル−ホスフィン)イリジウム(Ｉ)ヘキサフルオロホスフェートがジクロロメタンに溶解されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
トリチウム標識をトリチウム標識マニフォールドを使用して行う、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
実質的にここに記載の式IIの化合物の製造法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
多くの化合物が、ｈＥＲＧによりコードされる心筋ＩＫｒチャネルの阻害のために市販し得る薬剤になれない。ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル(ｈＥＲＧ)遺伝子が変異しているＬＱＴ２症候群の患者もまたトルサード・ド・ポアンツを示す。ｈＥＲＧチャネルは、例えば、第III群抗不整脈薬メタンスルホンアニリド(ドフェチリド、Ｅ−４０３１およびＭＫ−４４９)および臨床でＱＴ延長の原因となるこのような部位を共有する多くの薬剤のための結合部位を有する。結果として、それらは警告表示(例えばピモジド)を有するかまたは市場から無くなる(例えばテルフェナジン)。ｈＥＲＧチャネルにおける活性と所望の標的の間の適切な治療域の欠如が、可能性のある薬剤のさらなる進歩を妨害するであろう。故に、新規化合物クラスでこの活性の減少を可能にするために、できるだけ早くｈＥＲＧ活性を評価する必要性がある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
結合アッセイにおける放射リガンド化合物の好結果の使用は、目的のチャネルに対する放射リガンドの親和性ならびにひとたびそれが結合したときの解離速度を含む多数のパラメーターに依存する。理想的には、適切な放射リガンドは、同じ部位に結合できる候補化合物と競合する親和性を有し、かつ、放射リガンドがその結合が検出可能になるのに十分な時間接触したままである解離速度を有する。化合物におけるこれらの特性は予測できない。従って、本発明は、１個、２個または３個トリチウム置換された式Ｉの化合物または式IIの化合物を合成でき、競合的結合アッセイにおける使用に適切であるとの発見に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の第二の局面において、本発明の化合物を使用することを含む、化合物をＩＫｒチャネルブロッカーとして特徴付けする方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
式IIの化合物：
【化３】
2007513874.tif 000003
｛３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン(式II)｝
を得るための放射標識を下記の通り行う：
３,７−ビス[２−(４−ニトロフェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン(１.６２mg、３.８２μmol)および(１,５−シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニル−ホスフィン)イリジウム(Ｉ)ヘキサフルオロホスフェート(８.６mg、１０.３μmol)をジクロロメタン(１ml)に溶解し、２ml重ガラス壁丸底フラスコに移す。フラスコをRC Tritecトリチウム標識マニフォールドに接続し、凍結、＜０.０１mbarへの排気および融解のサイクルに付し、サンプルを脱気する。ジクロロメタン溶液を最後に液体窒素で凍結し、マニフォールド上の一次ウラン床から発生したトリチウムガス(約１３０GBq、６１μmol)を溶液上の間隙に挿入する。反応物を室温に温め、２０時間、磁気撹拌棒の手段により撹拌する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
溶液を液体窒素で再凍結し、残存トリチウムガスをマニフォールドの二次ウラン貯蔵床に再吸収させる。フラスコをマニフォールドから離し、溶液をエタノール(２×５ml)を使用した２サイクルの凍結乾燥に付し、不安定なトリチウムを除去する。得られた残渣をエタノール(１０ml)に溶解し、３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナン(１９.３３GBq、放射化学純度３４％)の貯蔵溶液を得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
全結合
競合リガンド非存在下の全結合を媒体対照の存在下で定義する。この場合、１％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ(アッセイ緩衝液中の１０％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯの貯蔵溶液から２０μL／ウェル)であった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
表３. ３,７−ビス[２−(４−ニトロ[３,５−３Ｈ]フェニル)エチル]−３,７−ジアザビシクロ[３.３.１]ノナンを使用した競合結合アッセイおよび電気生理学由来の既知のｈＥＲＧチャネルブロッカーのｐＩＣ５０値の比較。
【表３】
2007513874.tif 000004
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
結論
単純な、確固とした放射リガンド−結合アッセイが開発され、それは構造クラスの様々な範囲におけるｈＥＲＧ結合活性を同定する。