(57)【要約】  エフェクター免疫細胞の望ましくない活性化を防止または減弱させることができる阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ｉＣＡＲは、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）により哺乳類腫瘍細胞には存在しないが、少なくとも関連する哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する細胞外ドメインと、エフェクター免疫細胞を阻害する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインとを含む、核酸分子が提供される。核酸分子を含むベクターおよび形質導入されたエフェクター免疫細胞、ならびに形質導入されたエフェクター免疫細胞を投与することを含む癌の治療のための方法がさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクター免疫細胞の望ましくない活性化を防止または減弱させることができる阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ｉＣＡＲが、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）により哺乳類腫瘍細胞には存在しないが、少なくとも関連哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する細胞外ドメインと、エフェクター免疫細胞を阻害する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインとを含む、核酸分子。
【請求項２】
前記多形細胞表面エピトープが、ＨＬＡ  Ｉ型、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネルまたは受容体チロシンキナーゼなどのハウスキーピング遺伝子産物、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃのものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記細胞外ドメインが、（ｉ）ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の機能的フラグメント、ナノボディなどの単一ドメイン抗体、組換え抗体、および一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）などの抗体、その誘導体またはフラグメント、（ｉｉ）アフィボディ分子などの抗体模倣物、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、およびモノボディ、または（ｉｉｉ）アプタマーを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記哺乳類組織がヒト組織であり、前記関連哺乳類正常組織が腫瘍の発生した正常組織である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記エフェクター免疫細胞がＴ細胞、ナチュラルキラー細胞またはサイトカイン誘導性キラー細胞である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
エフェクター免疫細胞を阻害することができる前記少なくとも１つのシグナル伝達要素が、免疫チェックポイントタンパク質のシグナル伝達要素と相同である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＰＤ１；ＣＴＬＡ４；ＢＴＬＡ；２Ｂ４；ＣＤ１６０；ＣＥＡＣＡＭ１などのＣＥＡＣＡＭ；ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３などのＫＩＲ、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、ＬＩＲ８、およびＣＤ９４−ＮＫＧ２ＡなどのＫＩＲ；ＬＡＧ３；ＴＩＭ３；Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）；インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）；免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）含有タンパク質、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）、ならびにアデノシン受容体（例えば、Ａ２ａＲ）からなる群より選択される、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記細胞外ドメインが、可撓性のあるヒンジおよび膜貫通正準モチーフを介して前記細胞内ドメインへ融合している、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子と、前記核酸分子へ作動可能に連結された、プロモーターなどの少なくとも１つの制御要素と、を含むベクター。
【請求項１０】
抗原の非多形細胞表面エピトープまたは多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する細胞外ドメインを含む、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子をさらに含み、前記エピトープが、腫瘍関連抗原であるかまたは少なくとも関連腫瘍の細胞および正常組織によって共有されており、細胞内ドメインが、エフェクター免疫細胞を活性化させおよび／または共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが、抗原の非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合し、前記ｉＣＡＲの前記細胞外ドメインが、前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが結合する抗原とは異なる抗原の多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが、ＣＤ１９などの表１に列挙された抗原から選択される非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合する、請求項１０または１１に記載のベクター。
【請求項１３】
エフェクター免疫細胞を活性化させまたは共刺激する前記少なくとも１つのシグナル伝達要素が、例えばＣＤ３ζ鎖もしくはＦｃＲγ鎖の免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳなどの活性化キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、またはＤＡＰ１２などのアダプター分子、または例えばＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）もしくはＣＤ１３４（ＯＸ４０）の共刺激シグナル伝達要素と相同である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列が、前記ａＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列と前記ｉＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列との間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ａＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ｉＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列の下流にある、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド配列が、前記ａＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列と前記ｉＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列との間にウイルス自己切断性２Ａペプチドを含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１７】
前記ウイルス自己切断性２Ａペプチドが、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）由来のＴ２Ａ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来のＦ２Ａ、ウマ鼻炎Ａ型ウイルス（ＥＲＡＶ）由来のＥ２Ａおよびブタテッショウウイルス１型（ＰＴＶ１）由来のＰ２Ａからなる群より選択される、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
可撓性のあるリンカーを介して前記ｉＣＡＲへ連結された前記構成的ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１〜８に定義する、エフェクター免疫細胞の望ましくない活性化を防止または減弱させることができる阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）を調製する方法であって、
（ｉ）既知の変異体の少なくとも１つのデータベースからタンパク質をコードする遺伝子のヒトゲノム変異体のリストを検索することと、
（ｉｉ）（ｉ）で検索した変異体の前記リストを
（ａ）対応する参照対立遺伝子と比較して、前記それぞれの遺伝子によってコードされる前記タンパク質においてアミノ酸配列変異を結果的に生じる変異体を選択すること、
（ｂ）前記アミノ酸配列変異が前記コードされたタンパク質の細胞外ドメインにある遺伝子の変異体を選択すること、
（ｃ）少なくとも１つの腫瘍においてヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を受けている遺伝子の変異体を選択すること、および
（ｄ）（ｃ）によりＬＯＨを受けている前記少なくとも１つの腫瘍の起源の組織において少なくとも発現する前記遺伝子の変異体を選択すること、によってフィルター処理し、
それにより、ＬＯＨにより前記少なくとも１つの腫瘍において喪失し、前記少なくとも１つの腫瘍の起源の組織において少なくとも発現する、前記それぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質中の細胞外ドメインにおいてアミノ酸配列変異を有する変異体のリストを得ることと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において得られた前記リストから少なくとも１つの単一の変異体を含む配列領域を定義し、前記少なくとも１つの単一の変異体を含む前記配列領域および前記対応する参照対立遺伝子を含む配列領域をサブクローニングして発現させ、それにより、前記それぞれのエピトープペプチドを得ることと、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）において得られた、前記クローニングされた配列領域によってコードされるエピトープペプチドへ、または前記対応する参照対立遺伝子によってコードされるエピトープペプチドへのいずれかへ特異的に結合するｉＣＡＲ結合ドメインを選択することと、
（ｖｉｉ）（ｉｖ）において定義されたｉＣＡＲ結合ドメインをそれぞれ含む、請求項１〜８のいずれか１項に定義されたｉＣＡＲを調製することと、を含む、方法。
【請求項２０】
各変異体についてのマイナー対立遺伝子頻度が１、２、３、４または５％以上である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
安全なエフェクター免疫細胞を調製するための方法であって、（ｉ）腫瘍関連抗原に指向されるＴＣＲ操作されたエフェクター免疫細胞に、請求項１〜８のいずれか１項に記載のｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をトランスフェクトすること、もしくは前記細胞に請求項９に記載のベクターを形質導入すること、または（ｉｉ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子および請求項１０〜１３のいずれか１項に定義されるａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、未処置のエフェクター免疫細胞にトランスフェクトすること、または請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のベクターをエフェクター免疫細胞に形質導入すること、を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法によって得られる安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項２３】
抗原の非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含むａＣＡと、前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが結合する異なる抗原の多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する細胞外ドメインを含むｉＣＡＲと、をその表面上に発現する、請求項２２に記載の安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項２４】
前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが、ＣＤ１９などの、表１に列挙された抗原から選択される非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合する、請求項２２または２３に記載の安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項２５】
前記ａＣＡＲおよび前記ｉＣＡＲが別個のタンパク質として前記細胞表面上に存在する、請求項２２に記載の安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項２６】
前記ｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の発現レベルが、前記ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の発現レベル以上である、請求項２２に記載の安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項２７】
ＬＯＨを特徴とする腫瘍に罹患している対象の個別化されたバイオマーカーを選択する方法であって、
（ｉ）前記対象から腫瘍生検を得ることと、
（ｉｉ）前記対象から正常組織の試料、例えばＰＢＭＣを得ることと、
（ｉｉｉ）ＬＯＨのため前記腫瘍の細胞によって発現されないが前記正常組織の細胞によって発現される多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定することと、を含み、
それにより、前記対象について個別化されたバイオマーカーを同定する、方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載のエフェクター免疫細胞を患者へ投与することを含む、ＬＯＨを特徴とする腫瘍に罹患している前記患者における癌を治療するための方法であって、前記ｉＣＡＲが、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のため、前記腫瘍の細胞には存在しないが、少なくとも前記患者の関連哺乳類組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープをコードする単一の対立遺伝子変異体に指向される、方法。
【請求項２９】
前記ｉＣＡＲが、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のため、前記腫瘍の細胞には存在しないが、少なくとも前記患者の関連哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープをコードする単一の対立遺伝子変異体に指向される、ＬＯＨを特徴とする腫瘍に罹患している患者を治療することにおける使用のための、請求項２２に記載の安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項３０】
前記治療が、前記癌患者へ（ｉｉｉ）のａＣＡＲを発現するが（ｉｉｉ）のｉＣＡＲが欠失している免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの集団を投与することを含む治療と比較して、標的上の腫瘍外の反応性の低減を結果的に生じる、請求項２９に記載の使用のための安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項３１】
腫瘍関連抗原または抗原の非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含むａＣＡＲと、前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが結合する抗原とは異なる抗原である、前記腫瘍の起源の組織において少なくとも発現する抗原の、またはＨＬＡ−Ａなどのハウスキーピングタンパク質の、単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する細胞外ドメインを含むｉＣＡＲとをその表面上に発現する、請求項２９に記載の使用のための安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項３２】
自家またはユニバーサル（同種異系の）エフェクター細胞である、請求項２８に記載の使用のための安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項３３】
Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞またはサイトカイン誘導性キラー細胞より選択される、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の使用のための安全なエフェクター免疫細胞。
【請求項３４】
２つ以上の核酸分子の組み合わせであって、それぞれが、制御されたエフェクター免疫細胞活性化システムの異なるメンバーをコードするヌクレオチド配列を含み、前記核酸分子が、単一の連続核酸分子を形成するか、または２つ以上の別々の核酸分子を含み、前記制御されたエフェクター免疫活性化システムが、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）により１つ以上の染色体またはその画分を喪失した腫瘍細胞を殺滅するようにエフェクター免疫細胞に指示し、関連正常組織の細胞を温存する、組み合わせであって、
（ａ）第１のメンバーが、抗原の非多形細胞表面エピトープへまたは異なる多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する第１の細胞外ドメインを含む活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）ポリペプチドを含み、前記非多形性または多形性の細胞表面エピトープが、腫瘍関連抗原であるか、または関連する異常なおよび正常な哺乳類組織の細胞によって共有されており、
（ｂ）第２のメンバーが、ＬＯＨにより、異常な哺乳類組織によって発現しないが関連する哺乳類正常組織の全ての細胞の上に存在する多形細胞表面エピトープの単一対立遺伝子変異体へ特異的に結合する第２の細胞外ドメインを含む調節ポリペプチドを含む、組み合わせ。
【請求項３５】
前記第１のメンバーが、
（ａ）エフェクター免疫細胞を活性化させおよび／または共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインをさらに含む構成ａＣＡＲ、および
（ｂ）ヘテロ二量体化小分子のための結合部位の第１のメンバーを含む細胞内ドメインと、場合により少なくとも１つの共刺激シグナル伝達要素とをさらに含むが、活性化シグナル伝達要素を欠く条件付きａＣＡＲより選択され、前記第２のメンバーが、
（ｃ）エフェクター免疫細胞を抑制する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインをさらに含む抑制性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）、または
（ｄ）シェダーゼのための基質を含む細胞外調節領域と、膜内切断プロテアーゼのための基質を含む膜貫通正準モチーフと、細胞内ドメインと、をさらに含む保護的キメラ抗原受容体（ｐＣＡＲ）であって、前記細胞内ドメインが、エフェクター免疫細胞およびヘテロ二量体化小分子のための結合部位の第２のメンバーを活性化させおよび／または共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む、ｐＣＡＲより選択される、請求項３４に記載の組み合わせ。
【請求項３６】
（ｉ）前記ｉＣＡＲまたはｐＣＡＲの前記細胞外ドメインが、前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが結合する抗原とは異なる抗原である、前記抗原の多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する、（ｉｉ）前記ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲの前記細胞外ドメインが、前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが結合するのと同じ抗原の異なる多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する、あるいは
（ｉｉｉ）前記ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲの前記細胞外ドメインが、前記ａＣＡＲの前記細胞外ドメインが結合するのと同じ多形細胞表面エピトープの異なる単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する、請求項３４または３５に記載の組み合わせ。
【請求項３７】
前記シェダーゼのための基質が、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）またはベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）のための基質である、請求項３４に記載の組み合わせ。
【請求項３８】
前記基質が前記細胞外ドメインの一部を形成し、Ｌｉｎ１２／Ｎｏｔｃｈ反復とＡＤＡＭプロテアーゼ切断部位とを含む、請求項３７に記載の組み合わせ。
【請求項３９】
前記膜内切断プロテアーゼの基質が、ＳＰ２、γセクレターゼ、シグナルペプチドペプチダーゼ（ｓｐｐ）、ｓｐｐ様プロテアーゼまたはロンボイドプロテアーゼのための基質である、請求項３４に記載の組み合わせ。
【請求項４０】
前記基質が、前記膜貫通正準モチーフの一部を形成し、ノッチ、ＥｒｂＢ４、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、エフリン−Ｂ２、アミロイド前駆体タンパク質またはＣＤ４４の膜貫通ドメインと相同である／に由来する、請求項３９に記載の組み合わせ。
【請求項４１】
前記条件付きａＣＡＲの細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを別々のタンパク質としてコードするヌクレオチド配列を含み、各ドメインが独立して膜貫通正準モチーフに融合し、ヘテロ二量体化小分子に対する結合部位の異なるメンバーを含む、請求項３４に記載の組み合わせ。
【請求項４２】
ヘテロ二量体化小分子のための前記結合部位の前記第１および第２のメンバーのそれぞれが、
（ｉ）タクロリムス（ＦＫ５０６）結合タンパク質（ＦＫＢＰ）およびＦＫＢＰ、
（ｉｉ）ＦＫＢＰおよびカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）、
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、
（ｉｖ）ＦＫＢＰおよびＦＫＢＰ−ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＢ）、
（ｖ）ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）およびＧｙｒＢ、
（ｖｉ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびＤＨＦＲ、
（ｖｉｉ）ＤｍｒＢホモ二量体化ドメイン（ＤｍｒＢ）およびＤｍｒＢ、
（ｖｉｉｉ）ＰＹＬタンパク質（別名アブシジン酸受容体およびＲＣＡＲとして）およびＡＢＩ、
（ｉｘ）ＧＡＩシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）タンパク質（別名ジベレリン酸非感受性およびＤＥＬＬＡタンパク質ＧＡＩ（  ＧＡＩ））およびＧＩＤ１シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）タンパク質（ジベレリン受容体ＧＩＤ１としても既知）（ＧＩＤ１）より選択されるタンパク質に由来する、請求項３４に記載の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞の表面上に発現する抗原を認識する活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）、阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）および正常細胞によって発現するが、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）により腫瘍によって発現することがない同じまたは他の細胞表面抗原の対立遺伝子変異体に向かう保護的ＣＡＲ（ｐＣＡＲ）を採用する、養子細胞移植による癌免疫療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞によって独占的に発現するが健常な組織によっては発現しない標的化可能抗原の同定は、今日、癌免疫療法における間違いなく主要な課題である。Ｔ細胞が腫瘍細胞を根絶することができるという臨床的証拠は、Ｔ細胞を利用して癌を治療するための非常に多様なアプローチを評価している多数の研究から来ている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ，２０１５）。これらは、ドナーリンパ球注入による骨髄移植、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移植、ＣＡＲ（Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｅｓｈｈａｒ，２０１６ａ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した予め選択された抗原に遺伝的に向け直されたＴ細胞による治療、免疫チェックポイント阻害剤の使用または能動的ワクチン接種を採用する。これらのうち、遺伝子操作されたＴ細胞の使用および能動免疫のための異なる戦略は、耐久性のある臨床反応を示すが有害作用は最小限であると思われる候補抗原に関する既存の情報を必要とする。しかし、Ｓ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇによる最近の総説の表題に記載のとおり、「適切な標的を見つけることは癌遺伝子療法に対する大きな障壁である」（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２０１４）。
【０００３】
ＭＨＣ非依存的様式で選択した抗原に対してＴ細胞（またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびサイトカイン誘導性キラー細胞などの免疫系の他のキラー細胞）を遺伝的に向け直すためのキメラ抗原受容体（またはＣＡＲ）を使用する概念が、１９８０年代後半にＧｒｏｓｓおよびＥｓｈｈａｒによって初めて導入された（Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。それらは、Ｔ細胞活性化が可能なＣＤ３−ζまたはＦｃＲγ鎖の免疫受容体チロシン系活性化モチーフを含むシグナル伝達成分へ、可撓性のあるヒンジおよび膜貫通正準モチーフを介して融合した細胞外一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードするキメラ遺伝子から合成で産生される。現在、ＣＡＲは数十の臨床試験で検討されており、Ｂ細胞悪性腫瘍において非常に高い効能を示している（Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  Ｊｕｎｅ，２０１５、Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｅｓｈｈａｒ，２０１６ａ）。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の安全性は、全体として、腫瘍と健常組織とを区別するその能力によって決定される。臨床試験および前臨床試験で報告されている主なリスクおよび有害な自己免疫作用についての直接の原因は、標的抗原の腫瘍外発現に起因する腫瘍外の標的に当たる毒性である（本発明者らの近年の総説（Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｅｓｈｈａｒ，２０１６ｂ）および（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）において詳細に取り扱い）。このリスクに関して、現在臨床的にまたは前臨床的にＣＡＲ療法について試験されている、共有された変異していない細胞表面抗原は、一般に、それらの組織分布および発現様式により、いくつかのカテゴリーに分けることができる。
−厳密に腫瘍特異的な抗原。おそらくすでに臨床的に検討されているこの群の唯一のメンバーは、神経膠芽腫で頻繁に過剰発現し、また非小細胞肺癌ならびに正常組織にはない前立腺癌、乳癌、頭頸部癌および卵巣癌でも認められる表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の変異体ＩＩＩである。
−腫瘍上および非生命維持健常組織上に発現した表面抗原。この群の潜在的なＣＡＲ抗原は、Ｂ細胞系譜に主として制限されている分化関連分子である。これら（および多数の臨床試験における標的抗原）のうちで著名なものは、ＣＤ１９であり、Ｂ細胞分化のごく初期に獲得され、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）によるシグナル伝達に関与する膵Ｂ細胞マーカーである。膜前立腺抗原は、このカテゴリーの別のクラスの抗原を構成する。
−非悪性腫瘍促進細胞によって通常発現する抗原。１つのこのような抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）であり、多様な原発癌および転移癌において腫瘍関連線維芽細胞によってほぼ常に発現する細胞表面セリンプロテアーゼである。別の抗原は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）であり、これは腫瘍血管形成の間に多量に発現し、多くの生命維持器官における血管細胞およびリンパ内皮細胞上に通常発現する。
−生命維持健常組織と共有される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）。
【０００４】
前臨床試験および臨床試験で現在評価されている他のほとんどのＴＡＡは腫瘍によって過剰発現するが、通常より低いレベルで、必須の正常組織にも存在している。
【０００５】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法における自己免疫に取り組むために考案された広範な戦略は、損傷が明白になった時点で導入されたＴ細胞を除去または抑制しようとするもの（反応性手段）と、そもそも潜在的な損傷を予防することを目的とするもの（予防的手段）とに分けることができる（Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｅｓｈｈａｒ，２０１６ａ）。反応性アプローチはしばしば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）および、短縮型ヒトカスパーゼ９と変異型ＦＫ５０６結合タンパク質とを含む融合ポリペプチドであるｉＣ９などの自殺遺伝子を使用する。他のアプローチは、破壊される操作された細胞を選択的に除去するための抗体、または近年実証されたように、細胞内シグナル伝達ドメインへのＣＡＲ認識部分のカップリングを支配するヘテロ二量体化小分子薬を利用する（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。いくつかの予防的手段は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の生体内での持続性または機能を制限するように設計されている（例えば、遺伝子送達のためのｍＲＮＡ電気穿孔法の使用）が、その他は、非腫瘍組織への損傷を回避するよう、治療用ＣＡＲの抗原選択性を高める臨床的な課題に直接対処する。これらのうちの２つは、ＣＡＲ  Ｔ細胞が安全に標的とされることができる腫瘍抗原の範囲を潜在的に広げることができるので、特に関心が寄せられる。
−コンビナトリアル（または「スプリット」）抗原認識。真の腫瘍特異的表面抗原はまれであるが、所与の腫瘍によって共発現する腫瘍関連抗原として必ずしも分類されない２つの異なる抗原の組み合わせは、新たな腫瘍特異的シグネチャーを定義することができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性をこのような抗原対に制限することは、重要な安全基準を提供し、結果として、腫瘍特異的標的の範囲を拡大し、実質的な治療的価値となり得る。第２世代および第３世代のＣＡＲは、ＣＡＲエンドドメインで２つ以上のシグナル伝達部分をつなぎ合わせることによって単一の抗原と係合すると、治療用Ｔ細胞に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを提供するように設計されてきた。しかしながら、活性化および共刺激が、それぞれ異なる抗原に特異的な２つのＣＡＲの間で同じＴ細胞において分けられる場合、完全な生じる応答は、２つの抗原の存在下でのみ達成され得る２つの相補的シグナルの協力を必要とするであろう。この原理はいくつかの前臨床試験で実証されている（Ｋｌｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｌａｎｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、ＷＯ２０１６／１２６６０８）。
【０００６】
疑いなく興味をそそるものの、このアプローチは依然として、有効な標的に当たり、腫瘍に当たるＴ細胞反応性を可能にしかしないであろう最適なバランスに達するために、活性化シグナルおよび共刺激シグナルの両方の大きさの細かい滴定における必要性に直面する。このようなバランスが臨床現場で日常的に達成できるかどうかは依然として疑問である。
【０００７】
２つの抗原の独特な組み合わせを発現する標的細胞のみにＴ細胞応答を制限するための全く新たなアプローチが最近公開された（Ｒｏｙｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６ａ）。その中枢要素は、Ｎｏｔｃｈを含むいくつかの細胞表面受容体の作用様式を利用する「遺伝子スイッチ」として機能する。このような受容体のそのリガンドへの結合に続いて、それは二重切断を受け、それが細胞内ドメインを結果的に遊離させ、それが細胞核に輸送され、そこでそれは転写因子として機能する。この原理の実行は、エフェクターＴ細胞への２つの遺伝子の共導入を伴う。第１のものは構成的に発現し、第１の抗原に向けられた認識部分を備えたこのようなキメラ切断可能な受容体をコードする。標的細胞の表面上のこの抗原との係合は、第２の抗原に向けられた従来のＣＡＲをコードする第２の遺伝子の発現をオンにするであろう。標的細胞は、それがこの第２の抗原を同様に共発現する場合にのみ殺滅されるであろう。
【０００８】
阻害性ＣＡＲ腫瘍外反応性は、ＣＡＲに再度向けられたキラー細胞の標的抗原が正常組織と共有されているときに生じる。この正常組織が腫瘍に存在しない別の表面抗原を発現する場合、阻害シグナル伝達部分を有するこの非共有抗原を標的とする追加のＣＡＲを、遺伝子改変細胞中で共発現することは、正常細胞によるＴ細胞活性化を防止することができる。
【０００９】
活性化ドメイン（ＦｃＲγまたはＣＤ３−ζなど）の代わりに、ｉＣＡＲは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＮＫ阻害受容体など、Ｔ細胞活性化に拮抗することができる阻害受容体に由来するシグナル伝達ドメインを有する。候補のａＣＡＲ抗原を腫瘍と共有する正常組織が、腫瘍と共有されない別の表面抗原を発現する場合、この非共有抗原を標的とする同じＴ細胞によって発現するｉＣＡＲが正常組織を保護することができる（図１）。
【００１０】
体細胞的に再配置された遺伝子セグメントによってコードされる独特の二本鎖ＴＣＲをそれぞれ発現するＴ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は抗原特異的受容体を発現しない。その代わりに、ＮＫ細胞は、感染細胞および健常細胞の細胞表面で多数の活性化リガンドおよび阻害リガンドをそれぞれ認識する、生殖細胞系列がコードした一連の活性化受容体および阻害受容体を発現する。ＫＩＲ３ＤＬ１などのＮＫ阻害受容体に基づくｉＣＡＲの保護能力が説明されている（米国特許第９，７４５，３６８号）。ＫＩＲ３ＤＬ１および他のＮＫ阻害受容体は、免疫学的シナプスを迅速かつ包括的な様式で解体することによって機能する。単一のＮＫ細胞が阻害リガンドおよび活性化リガンドの両方を発現する耐性細胞を免れさせながら、同時にそれが関与する感受性細胞を殺すことができ、そのことが活性化リガンドのみを発現するという有力な証拠がある（Ａｂｅｙｗｅｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｖｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この絶妙な能力は、結果として細胞溶解性顆粒のエキソサイトーシスに影響するそれぞれの免疫シナプスの各々において形成されるシグナル伝達分子の異なる空間的組織化によって支配される（総説については（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を参照されたい）。より近年では、Ｆｅｄｏｒｏｖら（Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ａ、ＷＯ２０１５／１４２３１４）は、この目的のためにＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の細胞内ドメインをうまく採用した。ＮＫ阻害受容体とは異なり、これらのｉＣＡＲの調節作用は細胞全体に影響した。それでも、これらの効果は一時的なものであり、ａＣＡＲ抗原のみを発現する標的細胞とのその後の遭遇時に完全なＴ細胞活性化を可能にした。
【００１１】
ｉＣＡＲおよびａＣＡＲが標的とする抗原の組織分布は、臨床的効能を犠牲にすることなく最大限の安全性を付与するのに必要とされるｉＣＡＲの最適な作用様式を決定する。例えば、腫瘍および保護されるべき正常組織（複数可）の解剖学的部位が交差しない場合、一過性阻害（ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１様）でおそらく十分であろう。しかし、これらの部位が重複している場合、シナプス限定阻害（すなわち、ＮＫ作用様式）のみが治療用細胞の一定の麻痺を防ぎ、それらの有効な殺腫瘍活性を可能にするであろう。標的上の腫瘍外反応性を低減させるためにｉＣＡＲを使用するアプローチは、腫瘍細胞の中で下方調節されるが正常組織の上に存在する抗原の悲惨な欠失を被る。
【００１２】
次世代配列決定（ＮＧＳ）により、所与の腫瘍生検における全タンパク質コード遺伝子（全ゲノムの約１％）のＤＮＡ配列の決定、および同じ患者の癌の「エクソーム」と健常組織のそれ（通常白血球由来）との比較を可能にする。エクソーム配列決定は、生検後の除去後数日以内に比較的低コストで完了することができる。並行して、トランスクリプトーム解析（ＲＮＡ−ｓｅｑ）は、同じ細胞試料によって実際に発現する遺伝子に関する補足情報を提供することができる。
【００１３】
各個々の腫瘍の変異の様相が独特であることがますます明らかになりつつある（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。非同義変異の結果として、腫瘍細胞は、患者のＨＬＡ産物のうちの１つ以上において患者の免疫系へ新生ペプチドの個人用セットを潜在的に提示する可能性がある。実際、近年、患者自身のＣＤ８またはＣＤ４Ｔ細胞レパートリーによって認識され、免疫療法の標的として役立つことができる腫瘍特異的新生エピトープの同定にここ数年多大な努力が注がれている（総説については（Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｖａｎ  Ｂｕｕｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｏｖｅｒｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０１５）を参照されたい）。しかしながら、累積的な知見は、新生抗原系Ｔ細胞免疫療法が、黒色腫および肺癌などのより高い変異量を示す癌には有効である可能性がより高いが、より少数の変異を有するたいていの癌においては利点をしばしば示し損ね得ることを示唆している（Ｓａｖａｇｅ，２０１４、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０１５）。さらに、かなりの腫瘍内不均一性（Ｂｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）は、変異喪失変異体の出現を回避するためにいくつかの抗原を同時に共標的化することを必要とし、これは有用な免疫原性新生ペプチドの不足の点でますます需要が高まりつつある課題である。
【００１４】
結局のところ、遺伝的に再び向けられたキラー細胞の養子伝達を介した癌免疫療法のための適切な標的を同定する喫緊の必要性は依然として広く満たされていない。
【発明の概要】
【００１５】
一態様において、本発明は、エフェクター免疫細胞の望ましくない活性化を防止または減弱させることができる阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、ここで、ｉＣＡＲは、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のために哺乳動物腫瘍細胞には存在しないが少なくとも関連する哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する、多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する細胞外ドメインと、エフェクター免疫細胞を阻害する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインとを含む。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義の本発明の核酸分子と、核酸分子へ操作可能に連結された、プロモーターなどの、少なくとも１つの制御要素とを含むベクターを提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、本明細書に定義の本発明により、エフェクター免疫細胞の望ましくない活性化を防止または減弱させることができる阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）を調製する方法であって、（ｉ）既知の変異体の少なくとも１つのデータベースからタンパク質コード遺伝子のヒトゲノム変異体のリストを検索することと、（ｉｉ）（ａ）対応する参照対立遺伝子と比較して、個々の遺伝子によってコードされるタンパク質においてアミノ酸配列変異を結果的に生じる変異体を選択することと、（ｂ）アミノ酸配列の変化が、コードされるタンパク質の細胞外ドメインである、遺伝子の変異体を選択することと、（ｃ）少なくとも１つの腫瘍においてヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を受ける遺伝子の変異体を選択することと、（ｄ）（ｃ）によってＬＯＨを受けている少なくとも１つの腫瘍の少なくとも起源の組織において発現する遺伝子の変異体を選択し、それによりＬＯＨにより少なくとも１つの腫瘍において喪失した個々の遺伝子によってコードされ、少なくとも１つの腫瘍の少なくとも起源の組織において発現するタンパク質における細胞外ドメインにおけるアミノ酸配列変化を有する変異体のリストを得ることとによって、（ｉ）において検索された変異体のリストをフィルター処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られたリストから少なくとも１つの単一の変異体を含む配列領域を定義し、少なくとも１つの単一の変異体を含む配列領域および、対応する参照対立遺伝子を含む配列領域をサブクローニングして発現させ、それにより個々のエピトープペプチドを得ること、（ｉｖ）（ｉｉｉ）で得られた、クローニングされた配列領域によってコードされるエピトープペプチドまたは対応する参照対立遺伝子によってコードされるエピトープペプチドのいずれかへ特異的に結合するｉＣＡＲ結合ドメインを選択することと、（ｖｉｉ）（ｉｖ）に定義のｉＣＡＲ結合ドメインを各々含む、本明細書に定義のｉＣＡＲを調製することと、を含む方法を提供する。
【００１８】
なおも別の態様において、本発明は、（ｉ）腫瘍関連抗原に対して向けられたＴＣＲ操作エフェクター免疫細胞に、本明細書に定義のｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をトランスフェクトすること、もしくはこの細胞に本明細書に定義のベクターを形質導入すること、または（ｉｉ）未処置のエフェクター免疫細胞に、本明細書に定義のｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および本明細書に定義のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をトランスフェクトすること、もしくはエフェクター免疫細胞に本明細書に定義のベクターを形質導入すること、を含む、安全なエフェクター免疫細胞を調製するための方法を提供する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に説明の本発明の方法によって得られる安全なエフェクター免疫細胞を提供する。安全なエフェクター免疫細胞は、外来性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびｉＣＡＲを発現する再び向けられたＴ細胞であり得、ここで、外来性ＴＣＲは、抗原の非多形細胞表面エピトープまたは多形細胞の単一の対立遺伝子変異体に向けられ、ここで、当該エピトープは腫瘍関連抗原であるか、もしくは少なくとも関連腫瘍および正常組織の細胞によって共有され、ｉＣＡＲは本明細書に定義の通りであり、または安全なエフェクター免疫細胞は、本明細書に定義のｉＣＡＲおよびａＣＡＲを発現するナチュラルキラー細胞もしくはＴ細胞などの再び向けられたエフェクター免疫細胞である。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する対象のための個別化バイオマーカーを選択する方法であって、（ｉ）対象から腫瘍生検を得ることと、（ｉｉ）対象から正常組織、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の試料を得ることと、（ｉｉｉ）ＬＯＨのため腫瘍の細胞によって発現することはないが、正常組織の細胞によって発現する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定し、それにより、対象の個別化バイオマーカーを同定することと、を含む方法を提供する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者へ、本明細書に定義のエフェクター免疫細胞を投与することを含む、当該患者において癌を治療するための方法を提供し、ｉＣＡＲは、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のために腫瘍の細胞には存在しないが、少なくとも患者の関連哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープをコードする単一の対立遺伝子変異体へ向けられる。
【００２２】
なおもさらなる態様において、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者を治療するのに使用するための本明細書に定義の安全なエフェクター免疫細胞に向けられ、ここでｉＣＡＲは、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のため腫瘍の細胞には存在しないが、少なくとも患者の関連哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープをコードする単一の対立遺伝子変異体に向けられる。
【００２３】
なおさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＬＯＨのため腫瘍細胞によって発現することはないが、正常組織の細胞によって発現する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定するかまたはその情報を受容することと、（ｉｉ）抗原の非多形細胞表面エピトープまたは多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定するかまたはその情報を受容することであって、ここで、当該エピトープは腫瘍関連抗原であるか、または当該癌患者における少なくとも関連腫瘍および正常組織の細胞によって共有される、同定するかまたは受容することと、（ｉｉｉ）本明細書に定義のｉＣＡＲを定義する少なくとも１つの核酸分子、および本明細書に定義のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、または本明細書に定義の少なくとも１つのベクターを選択するかまたは受容することであって、ｉＣＡＲは（ｉ）の細胞表面エピトープに特異的に結合する細胞外ドメインを含み、ａＣＡＲは（ｉｉ）の細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含むことと、（ｉｖ）（ｉｉｉ）の核酸分子をエフェクター免疫細胞にトランスフェクトすること、または（ｉｉｉ）のベクターをエフェクター免疫細胞に形質導入することによって、安全な再び向けられたエフェクター免疫細胞の少なくとも１つの集団を調製するかまたは受容することと、（ｖ）当該癌患者へ、（ｉｖ）の安全な再び向けられた免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの集団を投与することと、を含む、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者における癌を治療するための方法に向けられる。
【００２４】
同様の態様において、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者において癌を治療するための安全な再び向けられた免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの集団を提供し、ここで、安全な再び向けられた免疫細胞は、（ｉ）ＬＯＨのため腫瘍細胞によって発現することはないが、正常組織の細胞によって発現する、多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定するかまたはその情報を受容すること、（ｉｉ）抗原の非多形細胞表面エピトープまたは多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定するかまたはその情報を受容することであって、当該エピトープは腫瘍関連抗原であるか、または当該癌患者の少なくとも関連腫瘍および正常組織の細胞によって共有されている、同定するかまたは受容すること、（ｉｉｉ）本明細書に定義のｉＣＡＲを定義する少なくとも１つの核酸分子、および本明細書に定義のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、または本明細書に定義の少なくとも１つのベクターを選択するかまたは受容することであって、ｉＣＡＲは（ｉ）の細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含み、ａＣＡＲは（ｉｉ）の細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含む、選択するかまたは受容すること、（ｉｖ）エフェクター免疫細胞に（ｉｉｉ）の核酸分子をトランスフェクトすること、またはエフェクター免疫細胞に（ｉｉｉ）のベクターを形質導入することによって、安全な再び向けられたエフェクター免疫細胞の少なくとも１つの集団を調製するかまたは受容すること、によって得られる。
【００２５】
別の態様において、本発明は、各々１つが制御エフェクター免疫細胞活性化システムの異なるメンバーをコードするヌクレオチド配列であって、単一の一部であるかまたは単一を形成する当該核酸分子は、核酸分子を続行すること、または２つ以上の別個の核酸分子を含む、２つ以上の核酸分子の組み合わせに向けられており、ここで、制御エフェクター免疫活性化システムは、エフェクター細胞に、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のため、１つ以上の染色体またはその一部を喪失した腫瘍細胞を殺滅させ、関連する正常組織の細胞を免れさせ、（ａ）第１のメンバーは、抗原の非多形細胞表面エピトープへまたは異なる多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する第１の細胞外ドメインを含む活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）ポリペプチドを含み、当該非多形または多形細胞表面エピトープは、腫瘍関連抗原であるかまたは関連する異常および正常哺乳類組織の細胞によって共有され、（ｂ）第２のメンバーは、ＬＯＨのために異常な哺乳類組織によって発現することはないが関連する哺乳類正常組織の全ての細胞上に存在する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する第２の細胞外ドメインを含む調節ポリペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ｉＣＡＲの概念を示す（（Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ａ）より引用）。
【図２】ａＣＡＲ／ｐＣＡＲ分子設計および作用様式を示す。ｐＣＡＲが正常細胞上のその抗原へ結合することは、これらがａＣＡＲ抗原を発現するか否かにかかわらず、迅速なＲＩＰおよびポリペプチドの３つの別個のフラグメントへの分解を結果的に生じると期待される。
【図３Ａ】ＨＬＡクラスＩ遺伝子座をコードする染色体領域におけるＬＯＨを受けている腫瘍試料の百分率を示す。ＴＣＧＡデータベースからの腫瘍型におけるＡ．ＨＬＡ−Ｇ、Ｂ．ＨＬＡ−Ａ、Ｃ．ＺＮＲＤ１。嫌色素性腎（ＫＩＣＨ）、副腎皮質癌（ＡＣＣ）、膵腺癌（ＰＡＡＤ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、腎臓腎乳頭細胞癌（ＫＩＲＰ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）、胸腺腫（ＴＨＹＭ）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸内膜腺癌（ＣＥＳＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、乳房浸潤癌（ＢＲＣＡ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、リンパ性新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）、中皮腫（ＭＥＳＯ）、胆管癌（ＣＨＯＬ）、子宮癌肉腫（ＵＣＳ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、子宮体部子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）、脳低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、前立腺癌（ＰＲＡＤ）、肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ＰＣＰＧ）、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）、ぶどう膜黒色腫（ＵＶＭ）
【図３Ｂ】ＨＬＡクラスＩ遺伝子座をコードする染色体領域におけるＬＯＨを受けている腫瘍試料の百分率を示す。ＴＣＧＡデータベースからの腫瘍型におけるＡ．ＨＬＡ−Ｇ、Ｂ．ＨＬＡ−Ａ、Ｃ．ＺＮＲＤ１。嫌色素性腎（ＫＩＣＨ）、副腎皮質癌（ＡＣＣ）、膵腺癌（ＰＡＡＤ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、腎臓腎乳頭細胞癌（ＫＩＲＰ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）、胸腺腫（ＴＨＹＭ）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸内膜腺癌（ＣＥＳＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、乳房浸潤癌（ＢＲＣＡ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、リンパ性新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）、中皮腫（ＭＥＳＯ）、胆管癌（ＣＨＯＬ）、子宮癌肉腫（ＵＣＳ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、子宮体部子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）、脳低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、前立腺癌（ＰＲＡＤ）、肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ＰＣＰＧ）、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）、ぶどう膜黒色腫（ＵＶＭ）
【図３Ｃ】ＨＬＡクラスＩ遺伝子座をコードする染色体領域におけるＬＯＨを受けている腫瘍試料の百分率を示す。ＴＣＧＡデータベースからの腫瘍型におけるＡ．ＨＬＡ−Ｇ、Ｂ．ＨＬＡ−Ａ、Ｃ．ＺＮＲＤ１。嫌色素性腎（ＫＩＣＨ）、副腎皮質癌（ＡＣＣ）、膵腺癌（ＰＡＡＤ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、腎臓腎乳頭細胞癌（ＫＩＲＰ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）、胸腺腫（ＴＨＹＭ）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸内膜腺癌（ＣＥＳＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、乳房浸潤癌（ＢＲＣＡ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、リンパ性新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）、中皮腫（ＭＥＳＯ）、胆管癌（ＣＨＯＬ）、子宮癌肉腫（ＵＣＳ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、子宮体部子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）、脳低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、前立腺癌（ＰＲＡＤ）、肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ＰＣＰＧ）、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）、ぶどう膜黒色腫（ＵＶＭ）
【図４Ａ】ＨＬＡクラスＩ遺伝子座をコードする染色体領域におけるＬＯＨを受けている腫瘍試料の百分率を示す。図１と同じ腫瘍型におけるＡ．ＨＬＡ−Ｂ、Ｂ．ＨＬＡ−Ｃ。
【図４Ｂ】ＨＬＡクラスＩ遺伝子座をコードする染色体領域におけるＬＯＨを受けている腫瘍試料の百分率を示す。図１と同じ腫瘍型におけるＡ．ＨＬＡ−Ｂ、Ｂ．ＨＬＡ−Ｃ。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
１９７１年にＡ．Ｇ．Ｋｎｕｄｓｏｎ（Ｋｎｕｄｓｏｎ  Ｊｒ．，１９７１）によって提唱された腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）の革命的な概念を参照して、Ｄｅｖｉｌｅｅ、Ｃｌｅｔｏｎ−ＪａｎｓｅｎおよびＣｏｒｎｅｌｉｓｓｅは、「Ｅｖｅｒ  ｓｉｎｃｅ  Ｋｎｕｄｓｏｎ」（Ｄｅｖｉｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）という表題のエッセイの冒頭の段落において「多くの公開物が、広範な種々の腫瘍における多くの異なる染色体についてＬＯＨを記録しており、複数のＴＳＧの存在を含意しているＫｎｕｄｓｏｎの２ヒット仮説は、これらのＬＯＨ事象がＴＳＧのいずれの対立遺伝子の不活性化においても第２のステップであると予測している」と述べた。Ｌｅｎｇａｕｅｒ、Ｋｉｎｚｌｅｒ、およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎは、ヒトの癌における遺伝的不安定性に関する影響力の強い総説（Ｌｅｎｇａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）において、「核型研究は、癌の大部分が染色体を喪失または獲得することを示しており、分子レベルの研究は、核型データが実際には、このような変化の真の範囲を過小評価していることを示している。ヘテロ接合性の喪失、すなわち腫瘍における母方または父方の対立遺伝子の喪失は広範囲であり、しばしば反対側の対立遺伝子の獲得を伴っている。腫瘍は、例えば、父方の第８染色体を複製しながら、母方の第８染色体を喪失し、細胞に正常な第８染色体の核型であるが異常な第８染色体の「対立遺伝子型」を残したままにし得る。結腸、乳房、膵臓、または前立腺の「平均的な」癌は、その対立遺伝子の２５％を喪失し得、腫瘍がその対立遺伝子の半分超を喪失したことは珍しいことではない」と記した。これらの見解はそれ以来、数多くの報告で補強されており、実質的にすべての癌腫を含むヒトのほぼすべての癌へ広がってきた（総説については（ＭｃＧｒａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を参照されたい）。現在では、ほぼすべての個々の腫瘍が、全染色体、全染色体アーム、または様々なサイズの染色体の下位領域の多数の喪失を示すことが明白に確立されている。エクソーム配列データに基づいた何らかの所与の細胞試料におけるＬＯＨ特性の決定の新たなアルゴリズムが急速に開発されている（例えば、Ｓａｔｈｉｒａｐｏｎｇｓａｓｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。統計的偏りは現在のところいくつかの解釈の妥当性に疑問を呈し得る（Ｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が、このようなアルゴリズムはＮＧＳ以前の時代にこの目的のために採用されてきたＬＯＨ特性を確立するための他のほとんどの方法論を改良し置き換えているようである。
【００２８】
初期のＬＯＨ事象は、同じ組織の前悪性細胞では検出することができるが、周囲の正常細胞では検出することはできない（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＬＯＨは不可逆的であり、事象は蓄積することしかできないので、腫瘍の不均一性は腫瘍進行全体にわたる喪失の蓄積を反映する。より後期のＬＯＨ事象において異なる腫瘍サブクローンが発生する可能性があるが、所与の患者における前悪性細胞、推定上の腫瘍幹細胞およびすべての腫瘍サブクローンによって共有される最小のＬＯＨシグネチャーの存在が通例であると予想される。この「体幹」のＬＯＨパターンから生じる枝は、同じ患者におけるすべての腫瘍細胞をまとめて網羅する部分的に重複するシグネチャーの限られたセットを依然として創出するであろう。
【００２９】
全体的なＬＯＨ事象の避けられない結果は、欠失した染色体材料上に存在する他の全ての遺伝子の付随的な喪失であり、これらは当然、膜貫通タンパク質をコードする多くの遺伝子を含む。それらの同一性に関して、３，７０２の異なるヒト細胞表面タンパク質（「サーフェソーム」）のカタログが編集されてきた（Ｄａ  Ｃｕｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。約４２％のサーフェソーム遺伝子の発現は広範な組織分布を示すのに対し、約８５の遺伝子は検査したすべての組織によって発現し、これはハウスキーピング遺伝子の特徴である。これらの遺伝子は候補であり、それらの異なる多型変異体は、本発明のｉＣＡＲおよびａＣＡＲの標的として役立ち得る。
【００３０】
さらに近年、Ｂａｕｓｃｈ−Ｆｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｕｓｃｈ−Ｆｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）は、４１のヒト細胞型における１４９２の細胞表面糖タンパク質の組み合わせセットを同定するために彼らのケモプロテオミクス細胞表面捕捉技術を適用した。サーフェソームの大部分は何らかの所与の腫瘍によって発現すると予想され、各々は異なる特性を呈する。細胞表面タンパク質をコードする遺伝子は、それらのコード領域において一塩基多型（ＳＮＰ）が他の全ての遺伝子よりもわずかに濃縮されていることが発見された（Ｄａ  Ｃｕｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。より稀である多型インフレーム挿入および欠失はさらに、変異体の数に寄与しており、ペプチド配列変更（非同義）ＳＮＰよりもポリペプチド産物に及ぼす頑強な構造効果を発揮する可能性が高い。全体として、典型的なゲノムは、非同義変異体および１９０〜２１０のインフレーム挿入／欠失を有する１０，０００〜１２，０００の部位を含有する（Ａｂｅｃａｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ａｕｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらの変異体は、ＨＬＡ遺伝子座（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ｓｔａｔｓ．ｈｔｍｌ）またはある特定のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）などの高度に多型の遺伝子が異なる変異体の「ホットスポット」を創出するので、ゲノムのいたるところで均一に分布していない。ＬＯＨ関連のホットスポットの別の層は、ある特定の染色体、または異なる癌における染色体アームの頻繁な喪失に起因する（例えば、小細胞肺癌における３ｐおよび１７ｐ（Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、大腸癌における１７ｐおよび１８ｑ（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、乳癌における１７ｑおよび１９（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）黒色腫における９ｐ（Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｈａｙｗａｒｄ，２００７）、膠芽腫における１０ｑ（Ｏｈｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）など）。
【００３１】
表面タンパク質における対立遺伝子変異の有意な部分が個々の遺伝子産物の細胞外部分に影響し、原則として高度に特異的なｍＡｂによって認識され他の変異体と区別されることができる異なる対立遺伝子制限エピトープを潜在的に創出するであろう。単一のアミノ酸のみが異なる同じタンパク質の２つの変異体を区別するｍＡｂを単離することができることは十分に実証されている（例えば、Ｒａｓ癌遺伝子の点変異産物を絶妙な特異性で認識するｍＡｂの初期の例を参照されたい（Ｃａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６））。興味深いことに、タンパク質エピトープ中の単一アミノ酸交換に特異的な２つのｍＡｂは、それらの重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子プールとは構造的に異なる可変領域を使用できることが示された（Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｃａｔｏｎ，１９９１）。近年、Ｓｋｏｒａら（Ｓｋｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）は、変異したＫＲＡＳタンパク質およびＥＧＦＲタンパク質に由来するＨＬＡ−Ｉ結合新生ペプチドとそれらの野生型対応物とを区別することができるペプチド特異的ｓｃＦｖの単離を報告しており、いずれの場合も１アミノ酸だけ異なっていた。
【００３２】
すべてまとめると、個々の患者の全身における他の全ての細胞からの明確な識別を可能にする、腫瘍細胞の独特の抗原シグネチャーが出現する。そのことは、ＬＯＨのために腫瘍細胞表面には存在しないが、起源の癌組織の正常細胞またはこれらの遺伝子を発現する他の組織の正常細胞に存在する対立遺伝子変異体によってコードされる全ての膜貫通タンパク質を含む。当然、ＬＯＨによって影響される各遺伝子は、真のハウスキーピング遺伝子を除き、組織分布の異なるパターンを特徴とするであろう。これらの遺伝子の大部分は、腫瘍形成または形質転換した表現型の維持に直接関与しているとは予想されず、この意味で、それらの喪失は「パッセンジャー」性のものである。
【００３３】
先に示した理論的根拠は、ほとんどすべての腫瘍について、独特の分子描写が必然的にＬＯＨによって形作られていることを主張しており、このことは正常細胞上に存在する多数の多形表面構造の欠失を特徴とする。個々の腫瘍のこの仮定されたシグネチャーを、標的化可能な抗原性エピトープのセットに変換することは、特定の「欠如」の認識を、標的細胞殺滅を誘起することができる活性化の手がかりに翻訳するための実用的な免疫学的戦略を伴う。重要なことに、標的に当たるが腫瘍外の反応性が厳密に回避されることを確実にするための安全装置の組み込みは、この戦略の将来の臨床的実施において非常に好ましいであろう。
【００３４】
本発明は、単一対の遺伝子の各治療用キラー細胞における共発現を通してこの課題に取り組む。この対の一方のパートナーは活性化ＣＡＲ（ａＣＡＲ）をコードし、もう一方は保護ＣＡＲ（ｐＣＡＲ）または阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）をコードする。
【００３５】
本発明は、正常細胞を安全に保ちながら腫瘍細胞の特異的標的化を可能にする新たな手段を提供することを強調すべきである。本明細書に提示の概念は、ｉＣＡＲ（またはｐＣＡＲ）についての新たな標的の同定を準備しており、これらの標的は、正常組織上で発現したままであるが、存在する染色体領域のＬＯＨのため、腫瘍細胞から喪失された多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を含むと定義される。多型変異のために、この２つの対立遺伝子を区別し、腫瘍細胞において欠けている対立遺伝子のみを標的とすることは可能である。さらに、標的抗原は、それ自体が必ずしも腫瘍抑制遺伝子、または癌に関与すると予測される遺伝子ではないかもしれないが、その理由は、それがＬＯＨによって喪失された領域内にあるために選択され、それゆえこのような遺伝子に単純に連結され得るからである。このことは、腫瘍関連抗原または多形にかかわらず腫瘍において下方調節された抗原を標的とする癌療法において今日まで採用されているかまたは示唆されている方法とは概念上異なる。
【００３６】
ゲノム事象であるＬＯＨが、喪失した対立遺伝子を取り戻す可能性が非常に低い腫瘍からの特定の変異体の完全な喪失を結果として生じるので、この区別は極めて重要である。ＬＯＨ事象が腫瘍発生のごく早期に起こる場合、それは転移性腫瘍を含む初期の前悪性組織に由来する全ての腫瘍細胞において均一な標的シグネチャーを確実にする。さらに、ＬＯＨはほぼすべての型の癌で起こり、それゆえこの概念は、これらすべての癌の型と関連するマーカーを開発するための普遍的なツールとして信頼することができる。ＬＯＨ事象はある程度無作為であるので、本発明はさらに、各個々の癌患者に対して起こった特定のＬＯＨ事象に基づいて、当該患者に対する個別化腫瘍マーカーの選択を準備する。この概念を実行する際に信頼されるツールであるａＣＡＲおよびｉＣＡＲは、よく知られており、例えば、本明細書で完全に開示されているかのように参照によりいずれも組み込まれたＷＯ２０１５／１４２３１４号および米国特許第９，７４５，３６８号に教示されている分野でよく知られている方法を使用して容易に調製することができる。
【００３７】
１つの戦略によれば、所与の対ごとの２つのＣＡＲは、患者がヘテロ接合性である同じ標的遺伝子の異なる対立遺伝子変異体の産物を特異的に認識する。基本原理は次の通りである。ａＣＡＲは所与の腫瘍細胞によって発現し、ＬＯＨによって影響されない選択された細胞表面タンパク質の対立遺伝子変異体を標的とし、一方、ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲは、ＬＯＨによりこれらの腫瘍細胞から喪失された同じ遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされる産物を標的とする。当該遺伝子を発現するその個々の患者の他の正常組織では、いずれの対立遺伝子も存在し、等しく機能的であることが知られており、すなわち、発現はすべての組織において２対立遺伝子である（無作為な１対立遺伝子発現を呈し得る他の遺伝子とは対照的（Ｃｈｅｓｓ，２０１２、Ｓａｖｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。１つのシナリオでは、２つのＣＡＲは、タンパク質産物上の同じ位置に存在する２つの関連エピトープを標的とし、それらは１つ、またはごく数個のアミノ酸だけ異なる。別のシナリオでは、ａＣＡＲは同じタンパク質上の非多形エピトープを標的とするが、ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲは対立遺伝子特異的である。この場合、正常細胞上のａＣＡＲエピトープの密度は、概して、ｉＣＡＲまたはｐＣＡＲのそれよりも２倍高いであろう。
【００３８】
別の戦略は、ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲがハウスキーピング遺伝子のタンパク質産物を標的とするときに利用する。定義により、これらの遺伝子は体内のすべての細胞で発現するので、これらはｐＣＡＲまたはｉＣＡＲの安全な標的である。すなわち、所与の患者がヘテロ接合性であるハウスキーピング遺伝子の膜産物をｐＣＡＲまたはｉＣＡＲが標的とする場合、ＬＯＨのためにこの対立遺伝子を喪失した腫瘍細胞を除く、体内のすべての細胞が保護されるであろう。この戦略は、ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲからのａＣＡＲ標的遺伝子産物の脱共役を可能にする。実際、このため、ａＣＡＲ標的は、腫瘍によって発現する何らかの非多形エピトープであり得る。この戦略の変形は、所与の患者がヘテロ接合性であり、少なくとも腫瘍の起源の組織において、好ましくはａＣＡＲ標的抗原が発現する追加の生命維持正常組織において発現する遺伝子の膜産物に対するｉＣＡＲまたはｐＣＡＲと組み合わせて、非多形性腫瘍関連抗原を標的とする既知のａＣＡＲ、例えば臨床使用中または臨床試験中のａＣＡＲを利用することであろう。
【００３９】
ｉＣＡＲによって伝達される阻害性シグナルがａＣＡＲシグナルよりも厳密かつ恒久的に優勢であり、ｉＣＡＲとａＣＡＲの間の相互認識が起こらないことを確実にするように注意を払わなければならない。ｉＣＡＲの優位性は、両方の対立遺伝子を発現する正常細胞と遭遇した際のキラー細胞の活性化が防止されるであろうことを保証する。しかしながら、この既定のブレーキは腫瘍細胞との関わり合いでは作動しないであろうし、その標的抗原の非存在下では、ｉＣＡＲは阻害性シグナルを送達せず、したがって予想されるａＣＡＲ仲介性細胞活性化およびその後の腫瘍細胞溶解を自由にさせる。
【００４０】
ｉＣＡＲ技術は免疫チェックポイントに基づき得る。この点において、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の調節要素がｉＣＡＲシグナル伝達成分として組み込まれた場合に強力なＴ細胞阻害能力を有するという実証（Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ｂ、ＷＯ２０１５／１４２３１４）は有望であるが、これらの所見は近年疑問視された（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ  ａｎｄ  Ｂｏｎａｍｉｎｏ，２０１４，２０１５）。さらに、これらのチェックポイントタンパク質によって誘起される精確な分子経路は完全には理解されていないが、それらの関与は近位および遠位の両機序を通じてＴ細胞活性化を減弱させ、Ｔ細胞を、付随する活性化刺激に対して無応答にする（Ｎｉｒｓｃｈｌ  ａｎｄ  Ｄｒａｋｅ，２０１３）。このゆえに、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲによって保証される不活性化状態は実際、一時的かつ可逆的である（Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ｂ）が、そのことはｉＣＡＲおよびａＣＡＲの両標的を発現する組織におけるＴ細胞活性化を可能にしないであろう。対照的に、活性化受容体に対するＮＫ阻害受容体の優位性は、健常細胞が時間的機序よりもむしろ空間的機序を通じてＮＫ細胞攻撃から免れることを保証する。（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。単一のＮＫ細胞が阻害性リガンドと活性化リガンドの両方を発現する耐性細胞をなおも守ることができ、同時にそれが関与する、活性化リガンドのみを発現する感受性細胞を殺すことができるという説得力のある証拠がある。この絶妙な能力は、結果として細胞溶解性顆粒のエキソサイトーシスに影響するそれぞれの免疫シナプスの各々において形成されるシグナル伝達分子の異なる空間的な組織化によって支配される（例えば、Ａｂｅｙｗｅｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１年、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９年、Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｖｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、米国特許第９，７４５，３６８号）。
【００４１】
ｉＣＡＲによって現れた制御に基づく戦略は、先に説明したように、ａＣＡＲ活性に対するｉＣＡＲ活性の優位性に依存する。いったん態様では、本発明は、シナプス選択的様式でＣＡＲ  Ｔ細胞中で作動し、共発現したａＣＡＲを上回る完全な優位性を保証するように設計された、本明細書でｐＣＡＲ（保護ＣＡＲについては、図１を参照されたい）と称する全く新しいタイプのｉＣＡＲを導入する。それは２つの技術的快挙を統合します。
１．ａＣＡＲの活性化部分（ＦｃＲγ／ＣＤ３−ζ）を認識単位および共刺激要素（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ）から、それらを２つの異なるポリペプチド産物上に遺伝的に置くことにより脱連結させること。ａＣＡＲ機能に必須であるこれらの要素の再連結は、各ポリペプチドに別個に組み込まれたそれぞれの結合部位を架橋することができるヘテロ二量体化薬の添加によってのみ起こるであろう（図２Ｂ）。ヘテロ二量体化薬によって同様に分割された認識部分および活性化部分を架橋することによる完全に機能的なＣＡＲの再構築は、近年、Ｗｕらによって報告された（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。この目的のために、本著者らは、ラパマイシン類似体ＡＰ２１９６７の存在下でヘテロ二量体化するＦＫ５０６結合タンパク質ドメイン（ＦＫＢＰ、１０４アミノ酸）およびＦＫＢＰ−ラパマイシン結合ドメインのＴ２０８９Ｌ変異体（ＦＲＢ、８９アミノ酸）を使用した（スキームＩ）。この薬剤は、ラパマイシンと比較して１０００倍低い免疫抑制活性を有し（Ｂａｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｇｒａｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、  Ｌｉｂｅｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、市販されている（ＡＲＧＥＮＴ（商標）、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＡＲＩＡＤ）。
【化１】
2019530456.tif 000002
２．２つの膜内切断部位を含有するＲＩＰ制御受容体の膜貫通ドメインの２つの表面上に、それぞれｐＣＡＲ認識単位および欠損活性化ドメインを移植すること（図２Ａ）。ｐＣＡＲをその抗原へ結合することは、まず外部ドメインを除去する細胞外ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）ファミリーのメンバーによって、次いで細胞内γ−セクレターゼによって、コードされたポリペプチドの二重切断を誘起し、それによってｐＣＡＲの細胞内ドメインを遊離する。この事象は、欠損している活性化要素の機能的な膜固定構造へのアクセスを獲得するための切詰型ａＣＡＲの能力を破壊し、それにより作動様式を獲得すると予測される（図２Ｃ）。この原理は、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性を腫瘍細胞上の２つの異なる抗原の同時認識に制限して、ＲＩＰを介して機能する２つのよく研究されている受容体であるＮｏｔｃｈ受容体（Ｍｏｒｓｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｒｏｙｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６ｂ  ）または上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、Ｐｉｚｅｍ，Ｙ．，本発明者の監督下での科学修士論文）のいずれかを適用するように設計された新たな遺伝子スイッチの開発において近年利用された。これらの研究では、ＲＩＰ系のＣＡＲが１つの抗原に結合すると、遺伝子操作された細胞内ドメインが放出され、それが細胞核に輸送され、そこで第２のＣＡＲの発現がオンになる。これとは異なり、本発明は、防御抗原の存在下でいかなる潜在的なａＣＡＲ活性も解除するためにこの過程を利用する。
【００４２】
先に説明した提唱された作用様式は、隣接するａＣＡＲのみが影響され、それらの抗原を生産的に結合して免疫学的シナプスを形成することはもはやできないので、局所的効果を及ぼすと予測される。結果として、ａＣＡＲと多数の非腫瘍細胞との複数の相互作用が起こる可能性がある場合でさえ、細胞がさらなる相互作用が完全にできるので、これらの相互作用は一過性かつ非機能的であると予想されるに過ぎない。
【００４３】
ａＣＡＲの機能はｐＣＡＲの存在に完全に依存するので、ａＣＡＲ対応物に対するｐＣＡＲの優位性はこのシステムに固有である。所与のＴ細胞におけるｐＣＡＲの相対的な不足は、活性化ドメインの欠失のため、ａＣＡＲを非機能的にするであろう。
【００４４】
認識ドメインおよび活性化ドメインの両方が形質膜に局在することは極めて重要である（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。それゆえ、形質膜からの活性化ドメインを切り離す第２の切断は、このドメインを非機能的にし、望ましくない細胞活性化を防止する。
【００４５】
ａＣＡＲおよびｐＣＡＲは、相互に排他的な機序を介して機能するように設計されている。ｐＣＡＲが切断を受ける能力は、阻害性シグナル伝達の強度に依存しないので、シグナル伝達結果の完成は起こらないであろう。ｐＣＡＲが切断されている限り、ａＣＡＲは、別の極めて重要なレベルの安全性を確保するシナリオであるそれらのそれぞれの抗原との相互作用の相対的な結合力とは無関係に、機能することができない。
【００４６】
ａＣＡＲおよびｐＣＡＲまたはｉＣＡＲの標的に対するこれらの特異的結合を付与する認識部分を操作するために、何らかの関連技術を使用してもよい。例えば、このｉＣＡＲ−ａＣＡＲライブラリーを含む認識部分は、理想的にはコンビナトリアルディスプレイライブラリーより選択されたマスター認識部分プールに由来してもよく、それにより、
−まとめると、選択された認識部分は、全２２のヒト常染色体の２本の腕の各々に存在する一連の遺伝子の細胞表面産物を標的とする。隣接する遺伝子間の距離が短ければ短いほど、網羅性は広くなり、使用の普遍性は大きくなる。
−選択された遺伝子の各々について、一組の対立遺伝子特異的認識部分が単離され、各々は、ヒト集団において優勢である異なる対立遺伝子変異体間の厳密な識別を可能にする。標的変異体の数が多ければ多いほど、患者へ提供することができる治療用遺伝子対の数は多い。
【００４７】
所与の対立遺伝子産物は、各場合における特定のＬＯＨパターンに応じて、１人の患者において潜在的なｐＣＡＲ標的またはｉＣＡＲ標的となることができ、同じ対立遺伝子を有する別の患者において有用なａＣＡＲ標的となることができる。このゆえに、適切な認識部分遺伝子が同定されると、各々がｐＣＡＲまたはｉＣＡＲとａＣＡＲ遺伝子足場との両方へ移植されるであろう。それゆえ、同じ遺伝子の対立遺伝子変異体に向けられたすべての認識部分が、類似の範囲の結合親和性を有することが望ましい。このような所与の認識部分のセット内で、集団全体におけるその遺伝子の潜在的な対立遺伝子組成物の最も高い網羅性を確実にするために、ｐＣＡＲ−ａＣＡＲ対またはｉＣＡＲ−ａＣＡＲ対のすべての可能な組み合わせを予め組み立てることができる。
【００４８】
より一般的なシナリオでは、患者は、メジャー対立遺伝子およびマイナー対立遺伝子についてヘテロ接合性であり、それらの産物は、非同義ＳＮＰ、またはそれほど頻繁ではないが挿入欠失の結果としてコードされるポリペプチドに沿った単一の位置において異なる。それほど一般的ではないシナリオでは、患者は、２つの別個の位置においてメジャーな対立遺伝子とは異なる２つのマイナーな対立遺伝子についてヘテロ接合性である。個々の患者における当該遺伝子を包含する特定のＬＯＨ事象に応じて、所与の変異体エピトープは、ある患者においてはｉＣＡＲ標的として、別の患者においてはａＣＡＲ標的として役立つことができる。
【００４９】
変異体特異的ｍＡｂ（例えば、マイナー対立遺伝子「ａ」によってコードされるエピトープに特異的なｍＡｂ）の同定は、当該分野において周知であり、原則として、何らかの従来の抗原決定基に対するｍＡｂの同定に類似しており、例えば、ファージ（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、リボソーム（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）または酵母（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）のディスプレイ技術を利用する組換え抗体ｓｃＦｖライブラリーの高処理量スクリーニングを介して最もよく達成されることができる。ライブラリースクリーニングに採用される抗原は、２つの対立遺伝子間の変異の位置にまたがる合成ペプチド（典型的には長さ１５〜２０アミノ酸以上）、この分野で稼働している多くの企業のうちの１つによって市販されているかもしくは手動合成されているかのいずれかであることができる組換え全長ポリペプチド、またはさらにはこの対立遺伝を発現しない同じ細胞で行われるサブトラクションステップ後の遺伝子トランスフェクション（例えば、ｐＧＥＭ４Ｚ／Ａ６４ベクターにおける試験管内ｍＲＮＡ転写のためのテンプレートとしてクローン化された全長のｃＤＮＡをコードするｍＲＮＡの電気穿孔法（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００））による高レベルで当該対立遺伝子変異体を発現する全細胞のいずれかであり得る。これらの方法は周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第４版）Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｅｄｗａｒｄ  Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編，２０１２  ＣＳＨ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，１９９９  ＣＳＨ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓにおいて説明されている。
【００５０】
定義により、メジャー対立遺伝子（「Ａ」）によってコードされる対応するエピトープ（同じ位置にある）は、単一アミノ酸（ＳＮＰ）の同一性における「ａ」または長さ（挿入欠失）によって作られるものとは異なる独特な抗原決定基を創出する。この決定基は、原則として、同じまたは他の抗体ディスプレイスクリーニング技術によって同定された異なるセットのｍＡｂによって認識されることができる。２セットの同定されたｍＡｂの各々において異なるメンバーが２つのエピトープについて識別する能力、すなわち第１セット由来の抗体が対立遺伝子「ａ」の産物に結合するが「Ａ」の産物に結合せず、第２セット由来のＡｂは「Ａ」に相互に結合するが、「ａ」には結合しないことは、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーなどの従来の結合アッセイを用いて決定することができる（Ｓｋｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。あるいは、いったん「Ａ」に結合しない「ａ」結合性Ａｂが同定され、そのタンパク質配列が決定されると、「Ａ」に結合するが「ａ」には結合しない「相補的」抗体ｓｃＦｖの配列を予測するために計算方法を潜在的に使用することができる。このような計算方法については、例えば（Ｓｅｌａ−Ｃｕｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５ａ，ｂ）を参照されたい。
【００５１】
標的遺伝子としてＨＬＡクラスＩ遺伝子座遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを提示する私的な例では、利用可能な多数の対立遺伝子特異的モノクローナル抗体、例えば実施例３に列挙する抗体がある。
【００５２】
これらの抗体の可変領域をコードする配列は、関連するハイブリドーマから容易にクローン化されることができ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第４版）Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｅｄｗａｒｄ  Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編，２０１２  ＣＳＨ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，１９９９  ＣＳＨ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓに開示されているように広く利用可能なツールを用いてＣＡＲコンストラクトへの組込みに適した具体的なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子エピトープ変異体に対するｓｃＦｖをコードする遺伝子を構築するために使用できる。
【００５３】
本発明は、ＬＯＨのために腫瘍細胞において喪失され、細胞表面産物をコードする多型変異体のＤＮＡ配列を含むデータベースを提供し、ここで、ＤＮＡ配列における変化は、コードされたタンパク質の細胞外ドメインにおけるアミノ酸の変化を結果として生じる。この情報は、ＴＣＧＡなど、とりわけ、種々の腫瘍型における遺伝子の相対的なコピー数を推測するために使用することができるデータを提供する公共のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＴＣＧＡデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）、およびとりわけ、種々の集団におけるＳＮＰ変異体の対立遺伝子頻度を提供するｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇにおけるＴＣＧＡデータについてのｃｂｉｏポータル（Ｃｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、遺伝子についての組織発現データを含むＧｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥＸ）データベースｖ６ｐ（ｄｂＧａＰ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｐｈｓ０００４２４．ｖ６．ｐ１）（（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ，Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＧＴ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１５）、Ｎ−グリコシル化した細胞表面タンパク質の質量分析系データベースであるＣｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ（Ｂａｕｓｃｈ−Ｆｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、ならびにＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ）において利用可能な一般人に公開されているいくつかのデータベースから検索した。Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２０１５）  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｓ；  ａｎｄ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ｓｕｃｈ  ａｓ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ  （Ｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）；  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ  （Ｂａｕｓｃｈ−Ｆｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５），  ａ  ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＵｎｉＰｒｏｔ  ｄａｔａｂａｓｅ  （ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ）．
【００５４】
本発明はさらに、ＬＯＨを受ける発現した細胞表面タンパク質をコードする遺伝子のゲノム全体での同定のための方法を提供する。同定された遺伝子は、次の基準を満たさなければならない。１）遺伝子は膜貫通タンパク質をコードし、それゆえ、細胞表面上に発現してｉＣＡＲ結合を可能にする部分を有し、２）遺伝子は少なくとも２つの発現した対立遺伝子を有し（少なくともチェックされた１つの民族集団において）、３）当該遺伝子について見出された対立遺伝子変異は、タンパク質の細胞外領域において参照配列と比較してアミノ酸変化を引き起こし、４）遺伝子は、癌においてＬＯＨを受ける染色体領域に位置し、５）遺伝子は、対応する領域がＬＯＨを受けることが見出された腫瘍型の起源組織において発現する。
【００５５】
原則として、ｉＣＡＲ結合のための標的をコードするのに適した先に説明したような遺伝子は、データベースマイニングだけでなく、当該技術分野において公知の何らかの方法によって同定されてもよい。例えば、ＬＯＨの概念は新しいものではなく、特定の腫瘍における特定の遺伝子、染色体、またはゲノム／染色体領域についてのＬＯＨ情報はすでに文献において公開されており、それゆえ、候補遺伝子は利用可能な公開物から得ることができる。あるいは、このような情報は、マイクロサテライトプローブなどの染色体マーカーとの全ゲノムハイブリッド形成（Ｍｅｄｉｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０００  Ａｕｇ；１０（８）：１２１１〜１２１８）によって、または何らかの他の適切な方法（Ｒａｍｏｓ  ａｎｄ  Ａｍｏｒｉｍ，２０１５，Ｊ．Ｂｒａｓ．Ｐａｔｏｌ．Ｍｅｄ．Ｌａｂ．５１（３）：１９８〜１９６）によって見出すことができる。
【００５６】
同様に、対立遺伝子変異体に関する情報は、様々なデータベースで公的に入手可能であり、疑わしい領域のゲノム配列決定によって個別化された症例についても容易に得ることができる。また、タンパク質構造および発現パターンに関する情報は、先に説明したとおり、公的に入手可能であり、容易にアクセス可能である。
【００５７】
したがって、多くの遺伝子およびＳＮＰについての様々な基準に関する情報は公的に入手可能であり、それを検索するための技術は概して知られているので、本出願の主たる新規性は、ｉＣＡＲ認識のための標的を選択するための基準としてＬＯＨを使用すること、および特定の患者において喪失された特定の対立遺伝子に基づいて治療を個別化する概念である。
【００５８】
非限定的な例として、本発明によれば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＣのＬＯＨは、様々な頻度で、多くの腫瘍型において比較的頻繁な事象であることが見出され（図４を参照されたい）、このことによって、これらの遺伝子は、本発明の目的のためにｉＣＡＲ認識のための標的として使用されるための優れた候補となるであろう。
【００５９】
ｐＣＡＲ標的またはｉＣＡＲ標的の非存在下での何らかの健常な必須組織における正常細胞上のａＣＡＲ標的の認識は有害であろうし、厳密に禁止されている。この点において、本明細書で提唱されているように、ｐＣＡＲ−ａＣＡＲ対またはｉＣＡＲ−ａＣＡＲ対の概念は、以下のように失敗−安全活性化スイッチを構成する。ｉ）ａＣＡＲ標的抗原が存在しないことにより、選択された遺伝子を発現しない細胞は（同じ遺伝子のａＣＡＲ標的およびｐＣＡＲ標的またはｉＣＡＲ標的の異なる産物の場合）標的とされないであろうし、ｉｉ）この同じ遺伝子を発現する正常細胞は両方の対立遺伝子を共発現するであろうし、ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲの優勢のために標的化されないであろうし、ｉｉｉ）ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲが多型ハウスキーピング遺伝子の産物を標的とする場合、体内の全ての細胞は保護されるであろうし、ｉｖ）ａＣＡＲ標的を発現するがｐＣＡＲ標的またはｉＣＡＲ標的を発現しない腫瘍細胞のみが攻撃されるであろう。
【００６０】
先に強調したように、活性化シグナルに対する阻害シグナルの恒久的な優位性は絶対的に必須である。それゆえ、所与のキラー細胞において、そのｉＣＡＲ保護機能がない場合は、いかなるときでもａＣＡＲ遺伝子が発現しないことを確保することは極めて重要である。このことは、これらのｉＣＡＲ−ａＣＡＲ遺伝子対を一本鎖産物として直列に組み立てることを通じて、または例えば内部リボソーム進入部位に基づくもしくはいくつかのウイルス自己切断性２Ａペプチドのうちの１つに基づく適切な二シストロン様式を介して実施され得る。二シストロン性発現に関して報告された膨大な量のデータによって示唆されるように、ｉＣＡＲ遺伝子は常に、好ましい化学量論量を保証するためにそのａＣＡＲパートナーの上流に位置するだろう。もちろん、これは、ｐＣＡＲ−ａＣＡＲ遺伝子対を使用するときには問題ではない。
【００６１】
ｉＣＡＲ優位性を確実にするための別の魅力的な選択肢は、ヘテロ二量体化小分子の存在下でいずれの実体も１つの機能的受容体へのみ組み立てられることができるように、ａＣＡＲ認識部分をその活性化／共刺激部分から切り離すことである。精確なタイミング、薬用量および位置によってこのような分裂受容体の作動状態を厳密に制御する能力が、抗腫瘍性ＣＡＲの脈絡において近年実証された（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００６２】
さらに、予想される優位性はまた、選択されたａＣＡＲプラットフォームのシグナル伝達強度と「競合する」べきである、選択されたｉＣＡＲ設計において細胞内部分へと組み込まれたｉＣＡＲシグナル伝達要素の特定の組成に固有である可能性が高い。この能力はまた、それらのそれぞれの標的エピトープに対する２つの認識部分の相対的親和性（このことは、上述で取り扱った）およびそれらの相互作用の全体的な結合力によって影響されるであろう。後者に関しては、提唱された戦略は、正常細胞上での好ましいｉＣＡＲ／ａＣＡＲ化学量論量およびそれらの個々の標的エピトープのバランスのとれた分布の両方を保証する。なお、このことは、ｐＣＡＲ−ａＣＡＲ遺伝子対を使用するときには問題ではない。
【００６３】
安全性をさらに確実にするために、自殺遺伝子の使用または一過性発現のためのｍＲＮＡ電気穿孔法の使用など、ＣＡＲおよびＴＣＲ免疫療法の分野において現に実施されている他の従来の手段を採用することができる。
【００６４】
ＬＯＨはしばしば所与の遺伝子のたった１つの対立遺伝子を有する細胞を残すが、それにはしばしば、残存する染色体または染色体部分の重複を伴い、結果的に「コピー数が中性の」ＬＯＨを生じる（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｓａｔｈｉｒａｐｏｎｇｓａｓｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらの状況下では、エピトープ喪失変異体の出現は２つの独立した事象を必要とし、したがってあまり起こりそうもない。遺伝子改変細胞の異なる部分においていくつかのｐＣＡＲ−ａＣＡＲ対またはｉＣＡＲ−ａＣＡＲ対を発現させることは、標的対立遺伝子の単一コピーのみが保持されている「コピー数喪失」ＬＯＨの場合でさえも変異を逃れた細胞の出現を防ぐであろう。それでも、単一コピー遺伝子が必須になるかもしれないので、それらの機能喪失ははるかに低い可能性があろう。
【００６５】
先の点において、一態様において、本発明は、エフェクター免疫細胞の望ましくない活性化を防止するかまたは減弱させることができる阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、ここでヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のために哺乳類腫瘍細胞には存在しないが少なくとも関連する哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する細胞外ドメインと、エフェクター免疫細胞を阻害する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインとを含む。
【００６６】
ある特定の実施形態において、多形細胞表面エピトープは、腫瘍抑制遺伝子、またはそのような遺伝子は腫瘍においてＬＯＨによって欠失している可能性が高いため、腫瘍抑制遺伝子に遺伝的に連結された遺伝子によってコードされる抗原の一部である。さらに、多形細胞表面エピトープは、癌細胞においてしばしばＬＯＨを受ける、染色体アーム３ｐ、６ｐ、９ｐ、１０ｑ、１７ｐ、１７ｑ、もしくは１８ｑ、または第１９染色体などの染色体または染色体アームに通常存在する遺伝子によってコードされる抗原の一部であり得る。これらのエピトープは、本明細書に説明の関連データベースにおいて容易に同定することができる。
【００６７】
ある特定の実施形態では、多形細胞表面エピトープは、未分類のＡＰ２Ｓ１、ＣＤ８１、ＧＰＡＡ１、ＬＧＡＬＳ９、ＭＧＡＴ２、ＭＧＡＴ４Ｂ、ＶＡＭＰ３などのハウスキーピング遺伝子産物、細胞接着タンパク質ＣＴＮＮＡ１  ＮＭ＿００１９０３、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＮＮＢＩＰ１  ＮＭ＿０２０２４８、ＣＴＮＮＢＬ１  ＮＭ＿０３０８７７、ＣＴＮＮＤ１  ＮＭ＿００１０８５４５８デルタカテニン、チャネルおよびトランスポーターＡＢＣＢ１０  ＮＭ＿０１２０８９、ＡＢＣＢ７  ＮＭ＿００４２９９、ＡＢＣＤ３  ＮＭ＿００２８５７、ＡＢＣＥ１  ＮＭ＿００２９３９、ＡＢＣＦ１  ＮＭ＿００１０９０、ＡＢＣＦ２  ＮＭ＿００５６９２、ＡＢＣＦ３  ＮＭ＿０１８３５８、ＣＡＬＭ１［１］［７］カルモジュリン捕捉カルシウム、ＭＳＦＤ１０別名ＴＥＴＲＡＮまたはテトラサイクリン輸送体様タンパク質と同様のＭＦＳＤ１１  ＮＭ＿０２４３１１［１］、ＭＦＳＤ１２  ＮＭ＿１７４９８３、ＭＦＳＤ３  ＮＭ＿１３８４３１、ＭＦＳＤ５  ＮＭ＿０３２８８９、ＳＬＣ１５Ａ４  ＮＭ＿１４５６４８、ＳＬＣ２０Ａ１  ＮＭ＿００５４１５、ＳＬＣ２５Ａ１１［１］ミトコンドリアオキソグルタル酸／リンゴ酸担体、ＳＬＣ２５Ａ２６  ＮＭ＿１７３４７１、ＳＬＣ２５Ａ２８  ＮＭ＿０３１２１２、ＳＬＣ２５Ａ３  ＮＭ＿００２６３５、ＳＬＣ２５Ａ３２  ＮＭ＿０３０７８０、ＳＬＣ２５Ａ３８  ＮＭ＿０１７８７５、ＳＬＣ２５Ａ３９  ＮＭ＿０１６０１６、ＳＬＣ２５Ａ４４  ＮＭ＿０１４６５５、  ＳＬＣ２５Ａ４６  ＮＭ＿１３８７７３、ＳＬＣ２５Ａ５  ＮＭ＿００１１５２、ＳＬＣ２７Ａ４  ＮＭ＿００５０９４、ＳＬＣ３０Ａ１  ＮＭ＿０２１１９４、ＳＬＣ３０Ａ５  ＮＭ＿０２２９０２、ＳＬＣ３０Ａ９  ＮＭ＿００６３４５、ＳＬＣ３５Ａ２  ＮＭ＿００５６６０、ＳＬＣ３５Ａ４  ＮＭ＿０８０６７０、ＳＬＣ３５Ｂ１  ＮＭ＿００５８２７、ＳＬＣ３５Ｂ２  ＮＭ＿１７８１４８、ＳＬＣ３５Ｃ２  ＮＭ＿０１５９４５、ＳＬＣ３５Ｅ１  ＮＭ＿０２４８８１、ＳＬＣ３５Ｅ３  ＮＭ＿０１８６５６、ＳＬＣ３５Ｆ５  ＮＭ＿０２５１８１、ＳＬＣ３８Ａ２  ＮＭ＿０１８９７６、ＳＬＣ３９Ａ１  ＮＭ＿０１４４３７、ＳＬＣ３９Ａ３  ＮＭ＿１４４５６４  、ＳＬＣ３９Ａ７  ＮＭ＿００６９７９、ＳＬＣ４１Ａ３  ＮＭ＿０１７８３６、ＳＬＣ４６Ａ３  ＮＭ＿１８１７８５、ＳＬＣ４８Ａ１  ＮＭ＿０１７８４２、ＡＣＶＲＬ１  ＴＧＦベータ受容体ファミリーのＲｅｎｄｕ−Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群と同様の受容体ＡＣＶＲ１  ＮＭ＿００１１０５、ＡＣＶＲ１Ｂ  ＮＭ＿００４３０２、ＣＤ２３［１］ＦＣＥＲ２低親和性ＩｇＥ受容体（レクチン）、ならびにＲＮＡスプライシングに関与するＨＬＡ／免疫グロブリン／細胞認識群ＢＡＴ１、別名ＤＤＸ３９Ｂ、ＢＳＧ  Ｂａｓｉｇｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎスーパーファミリー、細胞外メタロプロテイナーゼ、ＭＩＦマクロファージ遊走阻止因子、ＴＡＰＢＰのものである（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ）。
【００６８】
ある特定の実施形態において、ハウスキーピング遺伝子は、Ｉ型ＨＬＡ、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネルまたは受容体チロシンキナーゼ、好ましくはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃである。
【００６９】
ａＣＡＲおよびｐＣＡＲまたはｉＣＡＲの標的へのこれらの特異的結合を付与する認識部分を操作するために、何らかの関連技術を使用してもよい。ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、（ｉ）ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の機能的フラグメント、ナノボディなどの単一ドメイン抗体、組換え抗体、一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）などの、抗体、その誘導体もしくはフラグメント、（ｉｉ）アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、およびモノボディなどの、抗体模倣物、または（ｉｉｉ）アプタマーを含む。好ましくは、細胞外ドメインはＳｃＦｖを含む。
【００７０】
ある特定の実施形態では、哺乳類組織はヒト組織であり、他の実施形態では、関連哺乳類正常組織は、腫瘍が発症した正常組織である。
【００７１】
ある特定の実施形態では、エフェクター免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞である。
【００７２】
ある特定の実施形態では、エフェクター免疫細胞を阻害することができる少なくとも１つのシグナル伝達要素は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ１などのＣＥＡＣＡＭ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３などのＫＩＲ、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、ＬＩＲ８、およびＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）含有タンパク質、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）、ならびにアデノシン受容体（例えば、Ａ２ａＲ）からなる群より選択される免疫チェックポイントタンパク質などの免疫チェックポイントタンパク質のシグナル伝達要素と相同である。
【００７３】
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ナチュラルキラー細胞阻害受容体、例えばＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３などのＫＩＲ、またはＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、ＬＩＲ８などの白血球Ｉｇ様受容体、およびＣＤ９４とヘテロ二量体を形成し、２つのＩＴＩＭを含有するＣ型レクチン受容体であるＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａである。
【００７４】
ｉＣＡＲにおいてキラー細胞受容体を調製しおよび使用するための方法は、本明細書に完全に開示されているかのように参照により組み込まれる米国特許第９，７４５，３６８号に説明されている。
【００７５】
ある特定の実施形態では、先の実施形態のいずれか１つの細胞外ドメインは、可撓性のあるヒンジおよび膜貫通正準モチーフを介して当該細胞内ドメインへ融合している。
【００７６】
ある特定の実施形態では、ｉＣＡＲは、エフリン受容体（例えば、ＥＰＨＡ７）およびクローディンを含まない、抗原の単一の対立遺伝子変異体に対して向けられるかまたは当該変異体へ特異的に結合する。
【００７７】
ある特定の実施形態では、ｉＣＡＲは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子の単一の対立遺伝子変異体によってコードされるエピトープに対して向けられるかまたは当該エピトープへ特異的に結合する。
【００７８】
さらなる態様では、本発明は、先の実施形態のいずれか１つに定義の本発明の核酸分子と、核酸分子へ操作可能に連結されたプロモーターなどの少なくとも１つの制御要素とを含むベクターを提供する。
【００７９】
ある特定の実施形態では、ベクターは、抗原の非多形細胞表面エピトープまたは多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する細胞外ドメインであって、当該エピトープが腫瘍関連抗原であるかまたは少なくとも関連する腫瘍および正常組織の細胞によって共有される、細胞外ドメインと、エフェクター免疫細胞を活性化するおよび／または共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインとを含むａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、ベクターに含まれる核酸によってコードされるａＣＡＲの細胞外ドメインは、抗原の非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合し、ｉＣＡＲの細胞外ドメインは当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合するものとは異なる抗原の多形細胞表面の単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する。
【００８１】
ある特定の実施形態では、ベクターに含まれる核酸によってコードされるｉＣＡＲの細胞外ドメインは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子の単一の対立遺伝子変異体に対して向けられるかまたは当該変異体へ特異的に結合する。
【００８２】
ある特定の実施形態では、ベクターに含まれる核酸によってコードされるａＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＤ１９など、表１に列挙される抗原より選択される非多形細胞表面エピトープに対して向けられるかまたは当該エピトープへ特異的に結合する。
【００８３】
ある特定の実施形態では、ベクターに含まれる核酸によってコードされるｉＣＡＲの細胞外ドメインは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子の単一の対立遺伝子変異体に対して向けられるかまたは当該変異体へ特異的に結合する。ベクターに含まれる核酸によってコードされるａＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＤ１９など、表１に列挙される抗原より選択される非多形細胞表面エピトープに対して向けられるかまたは当該エピトープへ特異的に結合する。
【００８４】
ある特定の実施形態では、エフェクター免疫細胞を活性化しまたは共刺激するａＣＡＲの少なくとも１つのシグナル伝達要素は、例えば、ＣＤ３ζ鎖もしくはＦｃＲγ鎖の免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、正に帯電したアミノ酸残基もしくは正に帯電した側鎖を含む活性化キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の膜貫通ドメイン、または例えばＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳの活性化ＫＩＲ膜貫通ドメイン、またはＤＡＰ１２などのアダプター分子、または例えばＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）もしくはＣＤ１３４（ＯＸ４０）の共刺激シグナル伝達要素と相同である。
【００８５】
ある特定の実施形態では、ベクターのヌクレオチド配列は、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列との間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。概して、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列およびｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、何らかの順序にあり得るが、特定の実施形態では、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、ｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の下流にある。
【００８６】
ある特定の実施形態では、ベクターのヌクレオチド配列は、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列との間にウイルス自己切断性２Ａペプチドを含む。特に、ウイルス自己切断性２Ａペプチドは、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）由来のＴ２Ａ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来のＦ２Ａ、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来のＥ２Ａ、およびブタテッショウウイルス１（ＰＴＶ１）由来のＰ２Ａからなる群より選択され得る。
【００８７】
ある特定の実施形態では、ベクターは、可撓性のあるリンカーを介して当該ｉＣＡＲへ連結された構成的ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
免疫細胞は、例えば、ＲＮＡトランスフェクションによって、あるいは真核細胞における複製および／もしくは転写に適したプラスミドにおけるまたはウイルスベクターにおける組込みによって、本明細書に説明する適切な核酸分子をトランスフェクトされ得る。ある特定の実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターから選択される。
【００８９】
カプシドタンパク質がヒト細胞を感染させるのに機能的であろう場合、レトロウイルスベクターと適切なパッケージング株との組み合わせも使用することができる。ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１〜４３７）、ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｉ．６：２８９５〜２９０２）、およびＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ，ｅｔ  ａｉ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０〜６４６４）を含む、いくつかの両種指向性ウイルス産生細胞株が知られている。ＢｉｏＩ．５：４３１−４３７）；  ＰＡ３１７  （Ｍｉｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｉ．６：２８９５−２９０２）；  ａｎｄ  ＣＲＩＰ  （Ｄａｎｏｓ，  ｅｔ  ａｉ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４）．あるいは、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬ  Ｖエンベロープでシュードタイプ分類された粒子など、非両種指向性粒子を使用することができる。細胞は、産生細胞とも直接的な共培養によって、例えばＢｒｅｇｎｉ，ｅｔ  ａｉ．  （１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４１８〜１４２２の方法によって、またはウイルス上清単独もしくは濃縮したベクターストックとの培養で、例えば、Ｘｕ，ｅｔ  ａｉ．  （１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．  ２２：２２３〜２３０およびＨｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｉ．  （１９９２）Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８９：１８１７の方法によってさらに形質導入することができる。
【００９０】
別の態様では、本発明は、先に定義したような本発明により、エフェクター免疫細胞の望ましくない活性化を防止しまたは減弱させることができる阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）を調製する方法であって、（ｉ）既知の変異体の少なくとも１つのデータベースからタンパク質コード遺伝子のヒトゲノム変異体のリストを検索することと、（ｉｉ）（ａ）対応する参照対立遺伝子と比較して、個々の遺伝子によってコードされるタンパク質においてアミノ酸配列変異を結果的に生じる変異体を選択することと、（ｂ）アミノ酸配列の変化が、コードされるタンパク質の細胞外ドメインである、遺伝子の変異体を選択することと、（ｃ）少なくとも１つの腫瘍においてヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を受ける遺伝子の変異体を選択することと、（ｄ）（ｃ）によってＬＯＨを受けている少なくとも１つの腫瘍の少なくとも起源の組織において発現する遺伝子の変異体を選択し、それによりＬＯＨにより少なくとも１つの腫瘍において喪失した個々の遺伝子によってコードされ、少なくとも１つの腫瘍の少なくとも起源の組織において発現するタンパク質における細胞外ドメインにおけるアミノ酸配列変化を有する変異体のリストを得ることとによって、（ｉ）において検索された変異体のリストをフィルター処理することと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られたリストから少なくとも１つの単一の変異体を含む配列領域を定義し、少なくとも１つの単一の変異体を含む配列領域および、対応する参照対立遺伝子を含む配列領域をサブクローニングして発現させ、それにより個々のエピトープペプチドを得ること、（ｉｖ）（ｉｉｉ）で得られた、クローニングされた配列領域によってコードされるエピトープペプチドまたは対応する参照対立遺伝子によってコードされるエピトープペプチドのいずれかへ特異的に結合するｉＣＡＲ結合ドメインを選択することと、（ｖｉｉ）（ｉｖ）に定義のｉＣＡＲ結合ドメインを各々含む、本明細書に定義のｉＣＡＲを調製することと、を含む方法を提供する。
【００９１】
ある特定の実施形態では、選択される遺伝子の候補変異体は、ある特定の腫瘍型において少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％でＬＯＨを受ける。
【００９２】
ある特定の実施形態では、選択された各変異体についてのマイナー対立遺伝子頻度は、少なくとも１つの集団において１、２、３、４または５％以上である。
【００９３】
なおも別の態様において、本発明は、（ｉ）腫瘍関連抗原に対して向けられたＴＣＲ操作エフェクター免疫細胞に、本明細書に定義のｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をトランスフェクトすること、もしくはこの細胞に請求項９に記載のベクターを形質導入すること、または（ｉｉ）未処置のエフェクター免疫細胞に、本明細書に定義のｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および先に本明細書に定義のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をトランスフェクトすること、もしくはエフェクター免疫細胞に先に本明細書に定義のベクターを形質導入すること、を含む、安全なエフェクター免疫細胞を調製するための方法を提供する。
【００９４】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に説明の本発明の方法によって得られる安全なエフェクター免疫細胞を提供する。安全なエフェクター免疫細胞は、外来性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびｉＣＡＲを発現する再び向けられたＴ細胞であり得、ここで、外来性ＴＣＲは、抗原の非多形細胞表面エピトープまたは多形細胞の単一の対立遺伝子変異体に向けられ、ここで、当該エピトープは腫瘍関連抗原であるか、もしくは少なくとも関連腫瘍および正常組織の細胞によって共有され、ｉＣＡＲは本明細書に定義の通りであり、または安全なエフェクター免疫細胞は、先に定義のｉＣＡＲおよびａＣＡＲを発現するナチュラルキラー細胞もしくはＴ細胞などの再び向けられたエフェクター免疫細胞である。
【００９５】
ある特定の実施形態では、安全なエフェクター免疫細胞は、その表面に、抗原の非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含むａＣＡＲ、および当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合する異なる抗原の多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する細胞外ドメインを含むｉＣＡＲを発現する。ある特定の実施形態では、ｉＣＡＲの細胞外ドメインは、異なる多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合し、当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合するのと同じ抗原であり、または、ｉＣＡＲの細胞外ドメインは、当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合するのと同じ多形細胞表面エピトープ領域の異なる単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する。
【００９６】
ある特定の実施形態において、細胞表面上に発現するａＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＤ１９など、表１に列挙される抗原より選択される非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合する。
【００９７】
ある特定の実施形態において、細胞表面上に発現するｉＣＡＲの細胞外ドメインは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子の単一の対立遺伝子変異体に対して向けられるかまたは当該変異体へ特異的に結合する。
【００９８】
ある特定の実施形態において、細胞表面上に発現するｉＣＡＲの細胞外ドメインは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子の単一の対立遺伝子変異体に対して向けられるかまたは当該変異体へ特異的に結合し、細胞表面上に発現するａＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＤ１９など、表１に列挙される抗原より選択される非多形細胞表面エピトープに対して向けられるかまたは当該エピトープへ特異的に結合する。
【００９９】
ある特定の実施形態では、ａＣＡＲおよびｉＣＡＲは別個のタンパク質として細胞表面に存在する。
【０１００】
ある特定の実施形態において、ｉＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の細胞表面上の発現レベルは、ａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の発現レベル以上である。
【０１０１】
さらに別の態様では、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する対象のための個別化バイオマーカーを選択する方法であって、（ｉ）対象から腫瘍生検を得ることと、（ｉｉ）対象から正常組織、例えばＰＢＭＣの試料を得ることと、（ｉｉｉ）ＬＯＨのため腫瘍の細胞によって発現することはないが、正常組織の細胞によって発現する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定し、それにより、対象の個別化バイオマーカーを同定することと、を含む方法を提供する。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、バイオマーカーは対象の治療を個別化するために使用されるので、方法は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者へ、先に定義のエフェクター免疫細胞を投与することを含む、患者において癌を治療するステップをさらに含み、ここで、ｉＣＡＲは、（ｉｉｉ）で同定された単一の対立遺伝子変異体に向けられる。
【０１０３】
さらなる態様において、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者へ、先に定義のエフェクター免疫細胞を患者へ投与することを含む、患者において癌を治療するための方法を提供し、ここで、ｉＣＡＲは、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のため腫瘍の細胞には存在しないが、少なくとも患者の関連哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープをコードする単一の対立遺伝子変異体に向けられる。
【０１０４】
同様の態様において、本発明は、患者へ、先に定義するようなエフェクター免疫細胞を投与することを含む、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する対象における腫瘍量を低減させる方法を提供し、ここで、ｉＣＡＲは、ヘテロ接合性（ＬＯＨ）の喪失のため腫瘍の細胞には存在しないが、少なくとも患者の関連哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープをコードする単一の対立遺伝子変異体に向けられる。
【０１０５】
別の同様の態様では、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する対象の生存率を増大させる方法を提供し、ここで、ｉＣＡＲは、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のため腫瘍の細胞には存在しないが、少なくとも患者の関連哺乳類正常組織の全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープをコードする単一の対立遺伝子変異体に向けられる。
【０１０６】
なおもさらなる態様では、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者を治療し、当該患者における腫瘍量を低減させ、または当該患者の生存率を増大させる上での使用のための、先に定義の安全なエフェクター免疫細胞に向けられており、ここで、ｉＣＡＲは、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のため腫瘍の細胞には存在しないが患者の関連哺乳類正常組織の少なくとも全ての細胞に存在する多形細胞表面エピトープをコードする単一の対立遺伝子変異体に向けられる。
【０１０７】
なおさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＬＯＨのため腫瘍細胞によって発現することはないが、正常組織の細胞によって発現する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定するかまたはその情報を受容することと、（ｉｉ）抗原の非多形細胞表面エピトープまたは多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定するかまたはその情報を受容することであって、ここで、当該エピトープは腫瘍関連抗原であるか、または当該癌患者における少なくとも関連腫瘍および正常組織の細胞によって共有される、同定するかまたは受容することと、（ｉｉｉ）本明細書に定義のｉＣＡＲを定義する少なくとも１つの核酸分子、および本明細書に定義のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、または本明細書に定義の少なくとも１つのベクターを選択するかまたは受容することであって、ｉＣＡＲは（ｉ）の細胞表面エピトープに特異的に結合する細胞外ドメインを含み、ａＣＡＲは（ｉｉ）の細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含むことと、（ｉｖ）（ｉｉｉ）の核酸分子をエフェクター免疫細胞にトランスフェクトすること、または（ｉｉｉ）のベクターをエフェクター免疫細胞に形質導入することによって、安全な再び向けられたエフェクター免疫細胞の少なくとも１つの集団を調製するかまたは受容することと、（ｖ）当該癌患者へ、（ｉｖ）の安全な再び向けられた免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの集団を投与することと、を含む、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者における癌を治療するための方法に向けられる。
【０１０８】
同様の態様において、本発明は、ＬＯＨを特徴とする腫瘍を有する患者において癌を治療するための安全な再び向けられた免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの集団を提供し、ここで、安全な再び向けられた免疫細胞は、（ｉ）ＬＯＨのため腫瘍細胞によって発現することはないが、正常組織の細胞によって発現する、多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定するかまたはその情報を受容すること、（ｉｉ）抗原の非多形細胞表面エピトープまたは多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体を同定するかまたはその情報を受容することであって、当該エピトープは腫瘍関連抗原であるか、または当該癌患者の少なくとも関連腫瘍および正常組織の細胞によって共有されている、同定するかまたは受容すること、（ｉｉｉ）本明細書に定義のｉＣＡＲを定義する少なくとも１つの核酸分子、および本明細書に定義のａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、または本明細書に定義の少なくとも１つのベクターを選択するかまたは受容することであって、ｉＣＡＲは（ｉ）の細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含み、ａＣＡＲは（ｉｉ）の細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含む、選択するかまたは受容すること、（ｉｖ）エフェクター免疫細胞に（ｉｉｉ）の核酸分子をトランスフェクトすること、またはエフェクター免疫細胞に（ｉｉｉ）のベクターを形質導入することによって、安全な再び向けられたエフェクター免疫細胞の少なくとも１つの集団を調製するかまたは受容すること、によって得られる。
【０１０９】
癌の治療または癌の治療に使用するための安全な免疫エフェクター細胞に向けられた先の実施形態のうちのいずれか１つを参照するある特定の実施形態では、（ｉ）ｉＣＡＲの細胞外ドメインは、ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原とは異なる抗原である抗原の多形表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合するか、（ｉｉ）当該ｉＣＡＲの細胞外ドメインは、当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合するのと同じ抗原の異なる多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合するか、または（ｉｉｉ）当該ｉＣＡＲの細胞外ドメインは、当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合するのと同じ多形細胞表面エピトープの異なる単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する。
【０１１０】
ある特定の実施形態において、治療することは、（ｉｉｉ）のａＣＡＲを発現するが（ｉｉｉ）のｉＣＡＲを欠失する免疫エフェクター細胞の少なくとも１つの集団を癌患者へ投与することを含む治療と比較して、標的に当たるが、腫瘍を外す反応性の低減を結果的に生じる。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、先に定義の癌を治療するために使用される安全なエフェクター免疫細胞は、それらの表面上に、腫瘍関連抗原または抗原の非多形細胞表面エピトープへ特異的に結合する細胞外ドメインを含むａＣＡＲと、少なくとも腫瘍の起源の組織においてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃなど、当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原とは異なる抗原であるハウスキーピングタンパク質の組織において発現する抗原の多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する細胞外ドメインを含むｉＣＡＲとを発現する。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞の１つを超える集団が投与され、異なる集団は、異なる遺伝子産物の細胞表面エピトープへの特異的結合を有する異なる対のａＣＡＲおよびｉＣＡＲを発現する。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、癌を治療する方法において使用される安全なエフェクター免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞またはサイトカイン誘導性キラー細胞より選択される。ある特定の実施形態では、安全なエフェクター免疫細胞は自家細胞または普遍的（同種異系）エフェクター細胞である。ある特定の実施形態において、先に定義の癌を治療する方法のうちのいずれか１つにおいて使用されるｉＣＡＲは、ａＣＡＲの標的抗原が存在する患者の全ての組織へ向けられ、ここで、ａＣＡＲの標的抗原は、抗原の非多形細胞表面エピトープであるか、または多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体が存在し、当該エピトープは腫瘍関連抗原であるか、または少なくとも関連腫瘍および正常組織の細胞によって共有される。
【０１１４】
ある特定の実施態様において、癌は、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ）、副腎皮質癌（ＡＣＣ）、膀胱尿路上皮癌（ＢＬＣＡ）、脳低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、乳房浸潤癌（ＢＲＣＡ）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸内膜腺癌（ＣＥＳＣ）、胆管癌（ＣＨＯＬ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、嫌色素性腎（ＫＩＣＨ）、腎臓腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、腎臓腎乳頭細胞癌（ＫＩＲＰ）、肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、リンパ性新生物びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、中皮腫（ＭＥＳＯ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）、膵腺癌（ＰＡＡＤ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ＰＣＰＧ）、前立腺癌（ＰＲＡＤ）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）、胸腺腫（ＴＨＹＭ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、子宮癌肉腫（ＵＣＳ）、子宮体部子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）、ぶどう膜黒色腫（ＵＶＭ）より選択される。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、先に列挙した癌型のうちのいずれか１つなどの癌を治療するために使用されるｉＣＡＲは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子の単一の対立遺伝子変異体に向けられるかまたは当該変異体へ特異的に結合する。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、先に列挙した癌型のうちのいずれか１つなどの癌を治療するために使用されるａＣＡＲは、ＣＤ１９など、表１に列挙される抗原より選択される非多形細胞表面エピトープに対して向けられるかまたは当該エピトープへ特異的に結合する。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、先に列挙した癌型のうちのいずれか１つなどの癌を治療するために使用されるｉＣＡＲは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子の単一の対立遺伝子変異体に対して向けられるかまたは当該変異体へ特異的に結合し、先に列挙した癌型のうちのいずれか１つなどの癌を治療するために使用されるａＣＡＲは、ＣＤ１９など、表１に列挙される抗原より選択される非多形細胞表面エピトープに対して向けられるかまたは当該エピトープへ特異的に結合する。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、各々１つが制御エフェクター免疫細胞活性化システムの異なるメンバーをコードするヌクレオチド配列であって、単一の一部であるかまたは単一を形成する当該核酸分子は、核酸分子を続行すること、または２つ以上の別個の核酸分子を含む、２つ以上の核酸分子の組み合わせに向けられており、ここで、制御エフェクター免疫活性化システムは、エフェクター細胞に、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のため、１つ以上の染色体またはその一部を喪失した腫瘍細胞を殺滅させ、関連する正常組織の細胞を免れさせ、（ａ）第１のメンバーは、抗原の非多形細胞表面エピトープへまたは異なる多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する第１の細胞外ドメインを含む活性化キメラ抗原受容体（ａＣＡＲ）ポリペプチドを含み、当該非多形または多形細胞表面エピトープは、腫瘍関連抗原であるかまたは関連する異常および正常哺乳類組織の細胞によって共有され、（ｂ）第２のメンバーは、ＬＯＨのために異常な哺乳類組織によって発現することはないが関連する哺乳類正常組織の全ての細胞上に存在する多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合する第２の細胞外ドメインを含む調節ポリペプチドを含む。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、第１のメンバーは、（ａ）エフェクター免疫細胞を活性化させおよび／または共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインをさらに含む構成的ａＣＡＲ、ならびに（ｂ）ヘテロ二量体化小分子のための結合部位の第１のメンバーを含む細胞内ドメインと、場合により少なくとも１つの共刺激シグナル伝達要素とをさらに含むが、活性化シグナル伝達要素を欠く条件付きａＣＡＲより選択され、第２のメンバーは、（ｃ）エフェクター免疫細胞を阻害する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む細胞内ドメインをさらに含む阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）、または（ｄ）シェダーゼのための基質を含む細胞外調節領域と、膜内切断プロテアーゼのための基質を含む膜貫通正準モチーフと、細胞内ドメインとをさらに含む保護的キメラ抗原受容体（ｐＣＡＲ）であって、当該細胞内ドメインは、エフェクター免疫細胞およびヘテロ二量体化小分子のための結合部位の第２のメンバーを活性化させおよび／または共刺激する少なくとも１つのシグナル伝達要素を含む、ｐＣＡＲである。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、（ｉ）ｉＣＡＲまたはｐＣＡＲの細胞外ドメインは、抗原の多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合し、これは、ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原とは異なる抗原であるか、（ｉｉ）ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲの細胞外ドメインは、当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合するのと同じ抗原の異なる多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合するか、または（ｉｉｉ）当該ｐＣＡＲまたはｉＣＡＲの細胞外ドメインは、当該ａＣＡＲの細胞外ドメインが結合するのと同じ多形細胞表面エピトープの異なる単一の対立遺伝子変異体に特異的に結合する。
【０１２１】
ある特定の実施形態において、シェダーゼのための基質は、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）またはベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）のための基質である。ある特定の実施形態において、基質は細胞外ドメインの一部を形成し、Ｌｉｎ  １２／Ｎｏｔｃｈ反復とＡＤＡＭプロテアーゼ切断部位とを含む。
【０１２２】
ＡＤＡＭ切断を予測する一貫した配列モチーフはないことが概して受け入れられているが、Ｃａｅｓｃｕら（Ｃａｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）は、表２に、本明細書に完全に開示されたかのように参照により本明細書により組み込まれた、本発明のｐＣＡＲにおけるＡＤＡＭのための基質として役立ち得る多数のＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７の基質配列を開示している。ある特定の実施形態において、ＡＤＡＭ基質配列は、アミロイド前駆体タンパク質、ＢＴＣ、ＣＤ２３、コラーゲン、ＤＩＩ−１、エボラ糖タンパク質、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦ、エピレグリン、Ｆａｓリガンド、成長ホルモン受容体、ＨＢ−ＥＧＦ、ＩＩ型インターロイキン１受容体、ＩＬ−６受容体、Ｌ−セレクチン、Ｎ−カドヘリン、Ｎｏｔｃｈ、ｐ５５ＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦ受容体、Ｐｍｅｌ１７、プリオンタンパク質、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼＺ、ＴＧＦ−α、ＴＮＦまたはＴＲのものである（Ｃａｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１２３】
ＡＤＡＭ１０は、例えばリンパ球上に比較的高レベルで構成的に存在するので、本発明のｐＣＡＲにおいてＡＤＡＭ１０切断配列を使用することは有利であり得る。ＡＤＡＭ１０とは対照的に、刺激されていない細胞では、比較的近いＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７が低レベルでしか検出されない。Ｔ細胞芽細胞上のＡＤＡＭ１７表面発現は刺激によって迅速に誘導される（Ｅｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１２４】
Ｈｅｍｍｉｎｇら（Ｈｅｍｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）は、基質対非基質において、ＢＡＣＥ１切断を予測する一貫した配列モチーフが同定されていなかったことを報告しているが、表１に、本明細書に完全に開示されているかのように参照により本明細書により組み込まれ、本発明のｐＣＡＲにおけるＢＡＣＥ１の基質として役立ち得る、ＢＡＣ１切断配列を有する多数のＢＡＣＥ１基質を開示している。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、膜内切断プロテアーゼの基質は、ＳＰ２、γ−セクレターゼ、シグナルペプチドペプチダーゼ（ｓｐｐ）、ｓｐｐ様プロテアーゼまたは菱形プロテアーゼの基質である。
【０１２６】
Ｒａｗｓｏｎら（Ｒａｗｓｏｎ，２０１３）は、ＳＰ２基質が少なくとも１つの２型膜貫通ヘリックスを有し、ＳＰ２基質中にＡｓｐ−Ｐｒｏモチーフなどのヘリックス不安定化モチーフを含むことを開示している。この論文は、表１に、本明細書に完全に開示されているかのように参照により本明細書により組み込まれ、本発明のｐＣＡＲにおいてＳＰ２の基質として役立ち得る、ＳＰ２−切断配列を有する多数のＳＰ２基質を開示している。
【０１２７】
ＨａａｐａｓａｌｏおよびＫｏｖａｃｓ（Ｈａａｐａｓａｌｏ  ａｎｄ  Ｋｏｖａｃｓ，２０１１）は、アミロイドβタンパク質前駆体（ＡβＰＰ）がプレセニリン（ＰＳ）依存性γセクレターゼ（ＰＳ／γセクレターゼ）の基質であり、少なくとも９０のさらなるタンパク質がこの酵素複合体によって同様のタンパク質分解を受けることがわかった。γセクレターゼ基質はいくつかの共通の特色を有する。ほとんどの基質タンパク質はＩ型膜貫通タンパク質であり、ＰＳ／γセクレターゼ仲介性γ様切断（ＡＩＣＤを放出する、ＡβＰＰにおけるε切断に対応）は、膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの境界またはその近くで起こる。ε様開裂部位は、リジン残基および／またはアルギニン残基が豊富な疎水性アミノ酸配列鎖に隣接する。ＰＳ／γセクレターゼ開裂は、開裂部位におけるまたはそれに隣接する特定のアミノ酸標的配列に依存せず、むしろ膜貫通ドメインの立体配座状態に依存すると思われる。ＨａａｐａｓａｌｏおよびＫｏｖａｃは、表１に、その切断配列が本明細書に完全に開示されているかのように参照により本明細書により組み込まれ、本発明のｐＣＡＲにおけるγ−セクレターゼの基質として役立ち得るγセクレターゼ基質のリストを開示している。
【０１２８】
Ｖｏｓｓら（Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）は、ＧｘＧＤアスパルチルプロテアーゼ（ｓｐｐｓ）について、基質内の一次配列要素に基づいたコンセンサス開裂部位がこれまで説明されていなかったことを教示している。膜タンパク質の膜貫通ドメインは、それらのペプチド結合がプロテアーゼにほとんど接近できないαヘリックス構造を優先的に採用する。それゆえ、膜貫通ドメインを膜内タンパク質分解に対して高感度にするために、膜貫通ドメインのαヘリックス含有量は、ヘリックス不安定化アミノ酸によって低減される必要があると仮定された。この仮説と一致して、様々なシグナルペプチドは、それらのｈ領域内に、ＳＰＰによるそれらのタンパク質分解プロセシングに決定的に影響するヘリックス不安定化アミノ酸を含有することが示されている。さらに、種々のＨＣＶ株のシグナルペプチド内の例えばセリン残基およびシステイン残基は、ＳＰＰ切断に極めて重要であるので、シグナルペプチドのｈ領域内にある極性残基は、ＳＰＰによる開裂に影響し得る。これらの極性残基が、シグナルペプチドのらせん含有量にも単純に影響するのか、それと特にヒドロキシル基もしくはスルフヒドリル基がＳＰＰによる切断を誘起するのに必要とされるかどうかはまだ完全には理解されていない。同様に、ＳＰＰＬ２ｂによるＢｒｉ２膜貫通ドメインの開裂は、Ｂｒｉ２膜貫通ドメインのαヘリックス含有量が減少すると有意に増大する。興味深いことに、推定ヘリックス不安定化力価を有する４つの残基のうちの１アミノ酸残基のみが、リン脂質系の環境におけるＢｒｉ２膜貫通ドメインのαヘリックス含有量を有意に低減させた。このことは、αへリックス膜貫通ドメインの不安定化が単にある特定のアミノ酸残基によって引き起こされるのではなく、むしろこれらのアミノ酸の脈絡および位置がそれらのらせん不安定化能力、したがってＳＰＰ／ＳＰＰＬによる膜内タンパク質分解への膜貫通ドメインの接近可能性を決定することを示唆している。Ｖｏｓｓらはさらに、表１に、本明細書に完全に開示されたかのように参照により本明細書により組み込まれ、本発明のｐＣＡＲにおけるｓｐｐの基質として役立ち得るｓｐｐ基質およびｓｐｐ様基質のリストを開示している。
【０１２９】
Ｂｅｒｇｂｏｌｄら（Ｂｅｒｇｂｏｌｄ  ａｎｄ  Ｌｅｍｂｅｒｇ，２０１３）は、菱形プロテアーゼについて、基質認識についての２つの異なるモデルが示唆されたことを教示している。第１のモデルでは、菱形活性部位の近傍での膜の浸漬と組み合わされた基質ペプチド骨格の立体配座の可撓性は、特異性を提供するのに十分である。十分に特徴付けられたショウジョウバエ基質Ｓｐｉｔｚについては、グリシン−アラニンモチーフは、膜貫通ドメインが菱形活性部位へと展開できるヘリックス破壊として役立つことが示されている。第２のモデルは、菱形プロテアーゼが主に、切断部位を取り囲む特定の配列を認識すること、および膜貫通ヘリックス不安定化残基がいくつかの基質にのみ必要とされる二次的特色であることを示唆している。この特定の配列はまだ同定されていない。Ｂｅｒｇｂｏｌｄらは、表２に、本明細書に完全に開示されたかのように参照により本明細書により組み込まれ、本発明のｐＣＡＲにおける菱形プロテアーゼの基質として役立ち得る菱形プロテアーゼ基質のリストを開示している。
【０１３０】
先の点において、ほとんどの場合、膜内切断プロテアーゼについてコンセンサスモチーフは未だ確立されておらず、膜内切断プロテアーゼ基質を同定するためのアッセイは、本明細書中に引用された文献において先に説明したように当該技術分野で周知であるので、ｐＣＡＲは、このように同定されたアミノ酸配列を含み得、膜貫通ヘリックス不安定化残基をさらに含み得る。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、基質は膜貫通正準モチーフの一部を形成し、Ｎｏｔｃｈ、ＥｒｂＢ４、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、エフリン−Ｂ２、アミロイド前駆体タンパク質またはＣＤ４４の膜貫通ドメインと相同であり／これに由来する。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、当該条件付きａＣＡＲの細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを別個のタンパク質としてコードするヌクレオチド配列を含み、各ドメインは、膜貫通正準モチーフへ独立して融合し、ヘテロ二量体化小分子のための結合部位の異なるメンバーを含む。
【０１３３】
ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体化小分子についての結合部位の第１および第２のメンバーの各１は、以下より選択されるタンパク質に由来する。（ｉ）タクロリムス（ＦＫ５０６）結合タンパク質（ＦＫＢＰ）およびＦＫＢＰ、（ｉｉ）ＦＫＢＰおよびカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）、（ｉｉｉ）ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、（ｉｖ）ＦＫＢＰおよびＦＫＢＰ−ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＢ）、（ｖ）ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）およびＧｙｒＢ、（ｖｉ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびＤＨＦＲ、（ｖｉｉ）ＤｍｒＢホモ二量体化ドメイン（ＤｍｒＢ）およびＤｍｒＢ、（ｖｉｉｉ）ＰＹＬタンパク質（別名アブシジン酸受容体およびＲＣＡＲとして）およびＡＢＩ、（ｉｘ）ＧＡＩシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）タンパク質（別名ジベレリン酸非感受性およびＤＥＬＬＡタンパク質ＧＡＩ（ＧＡＩ））およびＧＩＤ１シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）タンパク質（ジベレリン受容体ＧＩＤ１としても既知）（ＧＩＤ１）。
【０１３４】
定義：
本明細書で使用する「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。
【０１３５】
本明細書で使用する「ゲノム変異体」という用語は、同じゲノム位置での参照配列またはコンセンサス配列と比較される、配列決定した試料中のゲノムレベルでの少なくとも１つのヌクレオチドの変化を指す。
【０１３６】
変異体に関して本明細書で使用する「対応する参照対立遺伝子」という用語は、その変異体と同じゲノム位置にある参照配列もしくはコンセンサス配列または参照ヌクレオチドもしくはコンセンサスヌクレオチドを意味する。
【０１３７】
タンパク質に関して本明細書で使用する「細胞外ドメイン」という用語は、細胞膜の外側にあるタンパク質の領域を意味する。
【０１３８】
本明細書で使用する「ヘテロ接合性の喪失」または「ＬＯＨ」という用語は、体細胞中の２つの染色体のうちの１つのコピーにおける、完全な染色体またはその一部などの染色体材料の喪失を意味する。
【０１３９】
変異体または参照対立遺伝子に関して本明細書で使用する「配列領域」という用語は、抗体によって認識されることができる「エピトープペプチド」へ翻訳されることができる、変異体の位置から上流で始まり、下流で終わる配列を意味する。
【０１４０】
多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体へ特異的に結合するｓｃＦｖなどの細胞外ドメインの脈絡における本明細書で使用する「特異的結合」という用語は、１つの対立遺伝子変異体に対するｓｃＦｖの相対的な結合、および同じ多形細胞表面エピトープの対応する異なる対立遺伝子変異体へ結合することができないことを指す。このことは、結合活性（Ｔ細胞上のＣＡＲコピー数、標的細胞（または保護されるべき細胞）の表面上にある抗原分子数）、および使用される具体的なＣＡＲの親和性に依存するので、機能的定義は、具体的なｓｃＦｖが、特異的である多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体に対してＥＬＩＳＡにおける有意なシグナルを提供するであろうことか、またはｓｃＦｖを提示するＣＡＲをトランスフェクトした細胞がＦＡＣＳアッセイにおける多形細胞表面エピトープの単一の対立遺伝子変異体で明確に標識されるであろうが、同じ多形細胞表面エピトープの対応する異なる対立遺伝子変異体を用いる同じアッセイがいかなる検出可能なシグナルも付与しないであろうということであろう。
【０１４１】
本明細書で使用する「治療すること」という用語は、所望の生理学的効果を得る手段を指す。その効果は、疾患および／またはその疾患に起因する症状を部分的にまたは完全に治癒させることに関して治療的であり得る。この用語は、疾患を阻害すること、すなわちその発症を捕捉すること、または疾患を改善すること、すなわち疾患の後退を引き起こすことを指す。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」は、診断、予後、または療法が望まれる何らかの対象、特に哺乳類対象、例えば、ヒトを指す。
【０１４３】
本発明に従った使用のための医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容され得る担体または賦形剤を使用する従来の様式で製剤され得る。担体（複数可）は、組成物の他の成分と相溶性があり、その受け手に有害ではないという意味で「許容され得」なければならない。
【０１４４】
担体、投与様式、剤形などの次の例示は、担体、投与様式、剤形などが本発明を用いた使用のために選択され得る既知の可能性として列挙される。しかしながら、当業者は、選択された何らかの所与の製剤および投与の様式が所望の結果を達成することを判断するためにまず検査されるべきであることを理解するであろう。
【０１４５】
投与の方法には、非経口経路、例えば静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、粘膜経路（例えば経口経路、鼻腔内経路、頬側経路、膣内経路、直腸内経路、眼内経路）、髄腔内経路、局所経路および皮内経路が含まれるが、これらに限定されない。投与は全身的または局所的であり得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は経口投与に適している。
【０１４６】
「担体」という用語は、活性のある薬剤が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。医薬組成物中の担体は、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビニルまたはポビドン）、トラガカントゴム、ゼラチン、デンプン、ラクトースまたはラクトース一水和物などの結合剤、アルギン酸、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤または界面活性剤、およびコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤を含み得る。
【０１４７】
経口投与については、医薬製剤は、液状、例えば液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤であり得るか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルによる再構成のための薬品製剤として呈され得る。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素添加食用脂肪）、乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、または分別植物油）、および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容され得る助剤を用いる従来の手段によって調製され得る。医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）、または湿潤剤（例、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容され得る賦形剤を用いる従来の手段によって調製された、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は当該技術分野で周知の方法でコーティングされ得る。
【０１４８】
経口投与用調製物は、活性のある化合物の徐放性を与えるように適切に製剤され得る。
【０１４９】
頬側投与の場合、組成物は従来の様式で製剤された錠剤またはロゼンジ剤の形態をとり得る。
【０１５０】
組成物は、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤され得る。注射用製剤は、防腐剤を加えた単位剤形、例えばアンプルまたは複数回用量容器に入れて呈され得る。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形態をとり得、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方用剤を含有し得る。あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌済み発熱物質非含有水を用いた構成のための粉末形態にあり得る。
【０１５１】
組成物はまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物中にも製剤され得る。
【０１５２】
吸入による投与のために、本発明による使用のための組成物は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体の使用で、加圧パックまたはネブライザーからのエアゾールスプレーの形態で簡便に送達される。加圧エアゾールの場合、薬用量単位は、定量された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。吸入器または吹送器における使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤され得る。
【０１５３】
本明細書で使用する「末梢血単核球（ＰＢＭＣ）」という用語は、リンパ球、単球またはマクロファージなど、円形核を有するあらゆる血球を指す。血液からＰＢＭＣを単離する方法は当業者には容易に明らかである。非限定的な例は、血液の層を分離する親水性多糖であるフィコールを用いた全血からのこれらの細胞の抽出であり、単球およびリンパ球は血漿の層の下にバフィーコートを形成し、または白血球分離によって、赤血球および白血球の少ない血漿をドナーに戻して、白血球濃縮物を調製する。
【０１５４】
明確にする目的で、および決して教示の範囲を制限しない方法で、別段に示さない限り、本明細書中に列挙する量、百分率または比率を表すすべての数、および他の数値は、「約」という用語によってすべての場合において先行されるものとして解釈されるべきである。したがって、本明細書に列挙される数値パラメータは、所望の結果に応じて変わり得る近似値である。例えば、各数値パラメータは、報告された有意な桁の数に鑑みて、および通常の丸め技術を適用することによって解釈され得る。
【０１５５】
本明細書で使用する「約」という用語は、示された値の上下１０％以内の値も含まれることを意味する。
【実施例】
【０１５６】
実施例１．発現した細胞表面タンパク質をコードし、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を受ける多型遺伝子のゲノム全体の同定
ｉＣＡＲ標的として役立つことができる遺伝子を同定するために、次の必要条件を採用した。
１．遺伝子は膜貫通タンパク質をコードし、それゆえ細胞表面上に発現してｉＣＡＲ結合を可能にする部分を有する。
２．遺伝子は少なくとも２つの発現する対立遺伝子を有する（チェックされた少なくとも１つの民族集団において）。
３．当該遺伝子について見出された対立遺伝子変異は、タンパク質の細胞外領域において参照配列と比較してアミノ酸変化を引き起こす。
４．遺伝子は癌においてＬＯＨを受ける染色体領域に位置する。
５．遺伝子は、対応する領域がＬＯＨを受けることが判明した腫瘍型の起源組織において発現する。
【０１５７】
対立遺伝子の同定：
Ｅｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍデータベース（ＥｘＡＣ、ｅｘａｃ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ）を解析への入力として使用した。ＥｘＡＣデータベースは、合計６０，７０６のエクソームを含む、さまざまな集団レベルの配列決定研究からのエクソームの編集物である（Ｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＥｘＡＣは、変異体対立遺伝子の計数の数と比較した参照対立遺伝子の計数の数（対立遺伝子頻度−染色体の総数からの変異体対立遺伝子の計数の数）を含む各変異体についての情報を含有する。対立遺伝子頻度情報は、表２に詳述されるようにデータベース内の下位集団にわたっており、閾値は少なくとも１つの集団において５％以上の対立遺伝子頻度であった。
【表１】
2019530456.tif 000003
【０１５８】
先に列挙する必要条件に従って、ＥｘＡＣデータベースから検索した変異体へ次のフィルターを適用した。
１）変異体は、コードされたタンパク質のアミノ酸組成に影響しなければならない。ｉｉ）変異体は、ＥｘＡＣデータベースに現れる少なくとも１つの集団において０．０５（５％）以上のマイナー対立遺伝子の頻度を有しなければならない。マイナー対立遺伝子が０．５（５０％）よりも大きな対立遺伝子部分を有するシナリオについて、分析を修正した。ある部位に３つを超える対立遺伝子が観察された場合、最も一般的な置換を用いた。
２）変異体（この場合、一塩基多型（ＳＮＰ））は、その変異が次の変異体クラスのいずれかに分類される場合、タンパク質の組成に与える影響を有するものと注釈された：「ミスセンス変異体」、「インフレーム欠失」、「終止喪失」、「終止獲得」、「インフレーム挿入」、「終止保有変異体」、「フレームシフト変異体」、「終止喪失」、「コード配列変異体」、「タンパク質変化変異体」。
【０１５９】
解析は、９，３６２，３１９のＳＮＰ変異体から始まり、そのうちの２９，９０４の変異体がこれら２つのフィルターを通過した。これらの変異体は、５％以上のマイナー対立遺伝子の頻度を有する対立遺伝子を有し、タンパク質アミノ酸配列に影響を与える１０，３２２の遺伝子に分類された。これら２つのフィルターと一致する全ての対立遺伝子を解析に含めた。
【０１６０】
発現遺伝子の同定
遺伝子型−組織発現（ＧＴＥＸ）データベースｖ６ｐ（ｄｂＧａＰ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｐｈｓ０００４２４．ｖ６．ｐ１）を、種々の組織型において発現する遺伝子の同定のために使用した（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ，Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＧＴ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１５）。ＧＴＥＸデータベースは、多様な健常組織型からの８，５５５のヒト試料のＲＮＡ配列決定からなる。
【０１６１】
解析物がＴＣＧＡデータベースに存在する各腫瘍型に対応する起源組織における各遺伝子の平均発現レベルも含めた。これらのデータを得るために、本発明者らは、対応する正常組織への腫瘍型のマッピングを作成した。例えば、ＴＣＧＡデータベース由来の膵癌データは、ＧＴＥＸ由来の膵臓組織で注釈を付けられるであろう。いくつかの場合、マッピングは、腫瘍型についての明確な起源組織の欠如のため、概算であった。例えば、膠芽腫の発現データは、ＧＴＥＸにおいて脳として注釈をつけられているすべての組織からマッピングした。
【０１６２】
特定の組織で過剰発現している遺伝子は、優れたａＣＡＲ標的である可能性がある。逆に、すべての組織にわたって均一に発現する遺伝子は、より優れたｉＣＡＲ標的である可能性がある。
【０１６３】
次の基準を満たす場合、遺伝子を「普遍的に発現する」と定義した。（ｉ）組織間での平均発現が１０ＲＰＫＭ（１００万のマッピングされた読み取りあたりの転写産物１キロ塩基あたりの読み取り）よりも大きかった。（ｉｉ）最も発現が少ない組織は、１よりも大きなＲＰＫＭを有した。（ｉｉｉ）平均ＲＰＫＭと比較した、組織にわたるＲＰＫＭ中央値の標準偏差の比は１未満であった。１つ前のステップで検索された１０，３２２個の遺伝子のうち、１，０９２個の遺伝子のみを普遍的に発現すると注釈づけた。
【０１６４】
細胞表面タンパク質の注釈づけ：
タンパク質がＣＡＲ−Ｔ媒介性治療薬のための優れた標的となるためには、その一部を細胞表面に発現させる必要がある。細胞表面タンパク質の同定に役立つように、本発明者らは、いくつかのデータベースを使用した。第１のデータベースは、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓであり、３２種類の組織を解析するために使用された２４，０２８の抗体に由来する解析である（Ｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。第２のデータベースは、Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓであり、Ｎ−グリコシル化した細胞表面タンパク質の質量分析に基づくデータベースである（Ｂａｕｓｃｈ−Ｆｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。第３のデータベースは、細胞表面発現を含むタンパク質の細胞内局在を同定するための、高処理量免疫蛍光法および自動画像解析を用いた近年公開された解析物である（Ｔｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。各ＳＮＰに、タンパク質が出現したデータベースの数を注釈づけた。３つのデータベース全てにおいて遺伝子によってコードされるタンパク質は、「高い信頼度」、２つのデータベースで「中等度の信頼度」、１つのデータベースで「低い信頼度」で細胞表面に発現すると言われた。表３に示すように、１０，３２２個の遺伝子のうちの３，３５９個が上述のように膜発現の何らかの証拠を有した。
【表２】
2019530456.tif 000004
【０１６５】
ＳＮＰに先のデータベースによって注釈づけたが、候補を後述のようにＵｎｉＰｒｏｔ注釈のみに基づいて選択した。
【０１６６】
タンパク質機能に及ぼす対立遺伝子の影響：
ｉＣＡＲが膜タンパク質のうちの１つの対立遺伝子を喪失した癌細胞だけを有効に認識するためには、タンパク質の構造はどの対立遺伝子がコードされているかに基づいて十分に異なっているべきである。ＳＩＦＴ（耐容性から非耐容性を選別すること）アルゴリズムは、タンパク質変異体がタンパク質構造に影響を及ぼし、それゆえ機能するであろうかどうかを予測しようと試みる（Ｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，２００３）。スコアは０（有害）から１（良性）の範囲であり得る。ＳＩＦＴスコア（第ｓｉｆｔ５．２．２版）は、スコアが利用可能であるあらゆるＳＮＰについて含めた。
【０１６７】
タンパク質の細胞外部分に収まっている対立遺伝子の分類：
ｉＣＡＲが対立遺伝子を認識するためには、対立遺伝子はタンパク質の細胞外部分に収まっていなければならない。各ＳＮＰについて、コンセンサス翻訳において影響されたアミノ酸の位置を抽出し、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓからダウンロードした、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから細胞外として注釈を付けたドメインと比較した。全てのタンパク質のドメインの特徴付けの欠如のため、多くの偽陰性が起こり得る。１１４６個の遺伝子における合計４５７７個のＳＮＰに細胞外として注釈づけた。
【０１６８】
ＬＯＨを受けている腫瘍の比率
優れたｉＣＡＲ標的は、腫瘍の大部分でヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を受けるＳＮＰであろう。セグメントコピー数ファイルを、ＴＣＧＡデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇのｃｂｉｏポータルからダウンロードした（Ｃｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。各遺伝子についてＬＯＨを受けているＴＣＧＡデータベース中の３２の腫瘍のうちの腫瘍の比率を、ＨＬＡ遺伝子についてより詳細に後述の通り決定した。
【０１６９】
実施例２．ＨＬＡクラスＩタンパク質のヘテロ接合性の喪失
ＨＬＡクラスＩ遺伝子は、それらの既知の特徴、すなわち、いずれの対立遺伝子からも発現する細胞表面タンパク質、幅広い組織分布、高レベルの多型、および腫瘍の回避機序としての腫瘍における記録されたＬＯＨにより、第１のセットの潜在的なｉＣＡＲ標的として選択した。このゆえに、本発明者らは、ＨＬＡクラスＩタンパク質が様々な腫瘍型において喪失された割合を決定することによって解析を開始した。本発明者らは、表４に列挙するＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣのゲノム遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失の存在についてこれらのコピー数特性を解析した。
【表３】
2019530456.tif 000005
【０１７０】
ＴＣＧＡから公的に利用可能な何千もの腫瘍試料についてのＳＮＰアレイデータは、コピー数計算のための情報源として役立つことができ、公的ＮＩＨ  ＴＣＧＡデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）上で利用可能な全ての腫瘍型にわたるＨＬＡ  ＬＯＨ頻度を予測するために使用した。
【０１７１】
ＬＯＨ呼び出しがゲノム位置の変化に対して頑強であるかどうかを決定するために、本発明者らはＨＬＡ−Ａの上流にある遺伝子（ＨＬＡ−Ｇ、図３Ａ）および下流にある遺伝子（ＺＮＲＤ１、図３Ａ）のＬＯＨパターンを検査し、すべての遺伝子がＨＬＡ−Ａと同じＬＯＨパターンを示すと結論付けた（図３Ｂ）
【０１７２】
全てのＨＬＡクラスＩ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）が第６染色体の短いアーム上の主要組織適合遺伝子座（ＭＨＣ）において互いに染色体上で近くに位置しているので、これらは腫瘍型にわたってＬＯＨの同じパターンおよび頻度をすべて呈することがわかった（ＨＬＡ−ＢおよびＣについてはそれぞれ図４ＡおよびＢ）。
【０１７３】
上述に基づき、および図４に示すように、本発明者らは、ＨＬＡクラスＩ領域ＬＯＨが多くの腫瘍における共通の事象であるが、ＬＯＨの百分率が腫瘍型の間で変化すると結論付けた。それゆえ、ＨＬＡ遺伝子はｉＣＡＲ標的の優れた候補である。
【０１７４】
実施例３．ＬＯＨの免疫細胞化学的検証および対立遺伝子特異的抗体の特異性。
異なる腫瘍において同定された数対の保存されおよび喪失した対立遺伝子変異体を選択するので、それらのポリペプチド産物は変異体特異的ｍＡｂの生成に役立つであろう。候補ｍＡｂの識別力は、次のように、二重染色およびフローサイトメトリー実験または免疫組織化学によってアッセイされる。
【表４】
2019530456.tif 000006
【０１７５】
凍結組織試料−
凍結組織をしばしばホルマリン系の溶液中で固定し、試料の凍結切片化を可能にするＯＣＴ（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ化合物）中で包埋する。ＯＣＴ中の組織を−８０℃で凍結保存する。凍結ブロックを、切片化の前に−８０℃から取り出し、クリオスタットチャンバー中で平衡化し、薄い切片（しばしば５〜１５μｍ厚）に切断する。切片を組織学的スライド上に載せる。スライドは−２０℃〜−８０℃で保存することができる。ＩＨＣ染色の前に、スライドを室温（ＲＴ）で１０〜２０分間解凍する。
【０１７６】
パラフィン包埋組織−
組織をホルムアルデヒド固定液中に包埋した。パラフィン蝋の添加前に、室温で特定の回数および持続時間で、漸増濃度のエタノール（７０％、９０％、１００％）およびキシレン中での徐々の浸漬によって組織を脱水する。次に、組織をパラフィン蝋中に包埋する。
パラフィン包埋組織をミクロトームで５〜１５μｍ厚の切片へと切断し、５６℃の水浴中で浮遊させ、組織学的スライド上に載せる。スライドは室温で保つことができる。
ＩＨＣ染色の前に、パラフィン包埋切片は再水和ステップを必要とする−
再水和−切片をキシレン中での浸漬（２×１０分）、続いて低下する濃度のエタノール中での１０分ずつの浸漬によって再水和させる。１００％×２
９５％エタノール−５分
７０％エタノール−５分
５０％エタノール−５分
ｄＨ２Ｏ中でのすすぎ
【０１７７】
免疫蛍光検出：
１．スライドを洗浄緩衝液（ＰＢＳＸ１）中で１０分間再水和させる。洗浄緩衝液を排水する
２．抗原検索を実行する−必要な場合（熱誘導抗原検索または酵素検索）
３．細胞内抗原については、透過処理を行う−スライドをＰＢＳ×１中の０．１％トリトンＸ−１００中で室温で１０分間インキュベートする。
４．ブロッキング−ブロッキング緩衝液中で組織を室温で３０分間ブロッキングする。ブロッキングバッファーは検出方法に依存し、通常はＰＢＳ×１中５％の動物血清、またはＰＢＳＸ１中１％のＢＳＡである
５．一次抗体−抗体の製造元の説明書により、一次抗体をインキュベーション緩衝液（すなわち、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、１％ロバ血清）中に希釈する（他のインキュベーション緩衝液も使用することができる）。希釈した一次抗体中で組織を４℃で一晩インキュベートする。一次抗体は、先に詳述したように、モノクローナル抗ＨＬＡ−Ａ、抗ＨＬＡ−Ｂまたは抗ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子特異的抗体であり得る。
結合型一次抗体を使用する場合は、遮光してステップ８へ進む
陰性対照として、一次抗体を含まないインキュベーション緩衝液のみで組織をインキュベートする
また、実験に使用したモノクローナル抗体のアイソタイプを一致させた対照を行う
６．洗浄−スライドを洗浄緩衝液中で洗浄する（３×５〜１５分）。
７．二次抗体−抗体の製造元の説明書により、インキュベーション緩衝液中に二次抗体を希釈する。室温で３０〜６０分間、希釈した二次抗体中で組織をインキュベートする。遮光する
８．洗浄−スライドを洗浄緩衝液中で洗浄する（３×５〜１５分）。
９．ＤＡＰＩ染色−ＤＡＰＩインキュベーション緩衝液を希釈する（約３００ｎＭ〜３μＭ）。各切片に３００μｌのＤＡＰＩ溶液を加える。室温で５〜１０分間インキュベートする。
１０．洗浄−スライドをＸ１ＰＢＳで１回洗浄する
１１．退色防止用マウントメディアでマウントする
１２．スライドを遮光したままにする
１３．蛍光顕微鏡を使用してスライドを可視化する
【０１７８】
色素生成検出：
１．スライドを洗浄緩衝液（ＰＢＳＸ１）中で１０分間再水和させる。洗浄緩衝液を排水する
２．抗原検索を行う−必要な場合−上述を参照されたい
３．ＨＲＰ試薬については、内在性ペルオキシダーゼ活性をメタノール中の３．０％過酸化水素で少なくとも１５分間遮断する
４．切片をｄＨ２Ｏ中で５分間浸漬することによって洗浄する
５．細胞内抗原については、透過処理を行う−スライドをＰＢＳＸ１中０．１％トリトンＸ−１００中で室温で１０分間インキュベートする。
６．ブロッキング−ブロッキング緩衝液中で組織を室温で３０分間ブロッキングする。ブロッキング緩衝液は検出方法に依存し、通常はＰＢＳＸ１中５％の動物血清、またはＰＢＳＸ１中１％のＢＳＡである。
７．一次抗体−抗体の製造元の説明書により、一次抗体をインキュベーション緩衝液（すなわち、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、１％ロバ血清）中で希釈する（他のインキュベーション緩衝液も使用することができる）。希釈した一次抗体中で組織を４℃で一晩インキュベートする
８．洗浄−スライドを洗浄緩衝液中で洗浄する−３×５〜１５分。
９．二次抗体−ＨＲＰ結合二次抗体中で組織を室温で３０〜６０分間インキュベートする。
１０．洗浄−スライドを洗浄緩衝液中で３×５〜１５分間洗浄する。
１１．製造元の指針により、ＡＢＣ−ＨＲＰ試薬を添加する。室温で６０分間インキュベートする。
１２．製造元の指針により、ＤＡＢ溶液（または他の色素原）を調製し、組織切片に適用する。色素生成反応は、エピトープ部位を褐色にする（通常、数秒〜１０分間）。シグナルの強度が撮像に適しているとき、次のステップへ進む
１３．洗浄−スライドを洗浄緩衝液中で洗浄する−３×５〜１５分間。
１４．スライドをｄＨ２Ｏ中で洗浄する−２×５〜１５分間。
１５．核染色−ヘマトキシリン溶液を添加する。室温で５分間インキュベートする。
１６．組織切片を脱水する−
９５％エタノール−２×２分間。
１００％エタノール−２×２分間。
キシレン−２×２分間。
１７．退色防止用マウントメディアでマウントする
１８．明視野照明を使用してスライドを可視化する
【０１７９】
実施例４．ＣＡＲ−Ｔの構築
本研究の目的は、ＣＡＲ−Ｔ療法の標的に当たるが「腫瘍オフ」効果を阻害するであろう合成受容体を創製することとする。その程度まで、活性化ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲから構成されるＣＡＲコンストラクトのライブラリーが確立されるであろう。
【０１８０】
コンストラクトの第１のセットは、ＨＬＡ−Ｉ型配列（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）に向けられた阻害性ＣＡＲ、および腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９）に向けられた活性化ＣＡＲを含むであろう。次のセットのコンストラクトは、本発明者らの生物情報学解析によって同定された標的抗原に向けられるＣＡＲ配列を含むであろう。標的候補は、示された基準（例えば、標的発現パターン、標的発現レベル、抗原性など）によって優先順位付けされるであろう。
【０１８１】
ｉＣＡＲコンストラクトについては、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２ｓｃＦＶの下流で、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをＰＤ−１の第１の注釈付き細胞外ドメイン（アミノ酸１４５〜２８８）またはＣＴＬＡ４（アミノ酸１６１〜２２３）まで融合させるであろう。ｉＣＡＲの検出および選別のために、レポーター遺伝子（すなわち、ＧＦＰ、ＤｓＲＥＤ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）は、ＩＲＥＳ配列または２Ａ配列を介してｉＣＡＲ配列の下流に組み込まれるであろう。
【０１８２】
ＨＬＡ−Ａ２ｓｃＦｖは、実施例２に上記した抗体のいずれか１つを発現するハイブリドーマからクローニングされ構築される。
【０１８３】
ａＣＡＲコンストラクトについては、ＣＤ１９ｓｃＦｖは、ａＣＡＲの検出のために、第２世代のＣＡＲ（ＣＤ８ヒンジまたはＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ２８の膜貫通、ＣＤ２８または４１ＢＢ共刺激１およびＣＤ３ζ）または第３世代のＣＡＲ（ＣＤ８ヒンジまたはＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ２８の膜貫通、ＣＤ２８および４１ＢＢおよびＣＤ３ζ）に融合し、レポーター遺伝子（すなわち、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）を選別することは、ＩＲＥＳ配列または２Ａ配列を介してａＣＡＲ配列に対して下流に組み込まれるであろう。
【０１８４】
ａＣＡＲ配列およびｉＣＡＲ配列の両方は、レトロウイルス輸送ベクターまたはレンチウイルス輸送ベクターへとクローン化グされ、次に、例えばＨＥＫ−２９３Ｔのような適切なパッケージング細胞を用いるウイルス粒子産生に使用されるであろう。
【０１８５】
Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、および健常ドナー由来の活性化Ｔ細胞には、異なる感染多重度（ＭＯＩ）でａＣＡＲ、ｉＣＡＲ、またはその両方を形質導入するであろう。レポーター遺伝子発現に基づくＦＡＣＳ選択は、異なるレベルのａＣＡＲ、ｉＣＡＲ、またはその両方を発現する細胞集団の選別および選択のために使用されるであろう。
【０１８６】
標的細胞の調製−
標的外細胞に対するａＣＡＲの活性を阻害する上でのｉＣＡＲコンストラクトの機能性を検査するための試験管内組換え系が確立されるであろう。この目的のために、ａＣＡＲエピトープ、ｉＣＡＲエピトープまたは両方を発現する標的細胞が作出されるであろう。ａＣＡＲエピトープを発現する組換え細胞は、標的上の「腫瘍オン」細胞を表すのに対し、ａＣＡＲエピトープおよびｉＣＡＲエピトープの両方を発現する細胞は、標的上の「腫瘍外」健常細胞を表すであろう。
【０１８７】
本発明者らの第１のｉＣＡＲ／ａＣＡＲセットはそれぞれ、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ１９であるので、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ１９、またはその両方を発現する組換え細胞は、これらの遺伝子をコードする発現ベクターを細胞株（すなわち、Ｈｅｌａ、Ｈｅｌａ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅまたはＲａｊｉ）にトランスフェクトすることによって作出されるであろう。組換えＣＤ１９およびＨＬＡ  Ａ−２発現の検出のために、両方の遺伝子をタンパク質タグ（すなわち、ＨＡまたはＦｌａｇまたはＭｙｃなど）へ融合させるであろう。
【０１８８】
アッセイ−
ｉＣＡＲの阻害効果は試験管内および生体内の両方で検査されるであろう。
【０１８９】
試験管内アッセイにおいて、本発明者らは、サイトカイン分泌および細胞毒性効果を測定することに焦点を当てるであろうが、生体内では、標的上腫瘍外異種移植片に対するｉＣＡＲの阻害および保護を評価するであろう。レポーター遺伝子を用いてｉＣＡＲ／ａＣＡＲ二重陽性であるようにＴ細胞を選別することによる結果を混入することから、ｉＣＡＲを欠失するＴ細胞を制限するであろう。ｉＣＡＲ遮断活性についての陰性対照として、ｓｃＦｖドメインを欠失する偽のトランスフェクトしたＣＡＲを使用してもよい。
【０１９０】
試験管内アッセイ−
ルシフェラーゼ細胞毒性アッセイ−ホタルルシフェラーゼを発現するように組換え標的細胞（Ｔ）を操作するであろう。試験管内ルシフェラーゼアッセイは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行われるであろう。形質導入されたエフェクター（Ｅ）Ｔ細胞（ｉＣＡＲおよびａＣＡＲまたは偽ＣＡＲの両方で形質導入）を、異なるエフェクター対標的比で、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ１９またはその両方を発現する組換え細胞と共に２４〜４８時間インキュベートする。細胞殺滅は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅシステムを用いて定量化するであろう。
【０１９１】
形質導入したＴ細胞集団をｉＣＡＲ／ａＣＡＲ発現レベルによって選別することによって、または組換え標的細胞の下位集団をそれらのＣＤ１９発現レベルもしくはＨＬＡ−Ａ２発現レベルによって選択することによって、「腫瘍外」細胞毒性を最適化してもよい。
【０１９２】
ｉＣＡＲを形質導入したＴ細胞が試験管内で「腫瘍オン」細胞と「腫瘍外」細胞とを識別することができるかどうかを検査するために、１：１の比での「腫瘍オン」と「腫瘍オフ」の細胞の混合物とともにインキュベートした、形質導入したＴ細胞の殺滅効果を検査するであろう。腫瘍オン組換え細胞は、ルシフェラーゼ発現によって「腫瘍外」組換え細胞と区別されるであろう（一度に１つの細胞集団のみがルシフェラーゼ遺伝子を発現するように操作されるであろう）。殺滅することは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、２４〜４８時間の共インキュベーションの後に定量されるであろう。
【０１９３】
活性化された切断カスパーゼ３に対する抗体によるＣＴＬ誘導性アポトーシスのカスパーゼ３検出。
ＣＴＬが標的細胞を殺滅する経路のうちの１つは、Ｆａｓリガンドを介してアポトーシスを誘導することによる。ＣＡＳＰ３タンパク質は、システイン−アスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）ファミリーの一員である。カスパーゼの連続的な活性化は、細胞アポトーシスの実行相において有意な役割を担っている。プロカスパーゼ３のカスパーゼ３への切断は、立体配座の変化および触媒活性の発現を結果的にもたらす。カスパーゼ３の切断された活性化型は、モノクローナル抗体によって特異的に認識されることができる。
【０１９４】
形質導入されたＴ細胞は、２〜４時間、予めＣＦＳＥで標識された「腫瘍オン」組換え細胞または「腫瘍外」組換え細胞のいずれかと共にインキュベートされるであろう。標的細胞のアポトーシスはフローサイトメトリーによって定量されるであろう。細胞を透過処理し、内側染色キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって固定し、活性化型カスパーゼ３に対する抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色するであろう。
【０１９５】
時間差マイクロＣＴＬ−
標的細胞はレポーター遺伝子（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）で標識されるであろう。形質導入されたＴ細胞は、最長５日間、「腫瘍」細胞または「腫瘍外」細胞のいずれかと共にインキュベートされるであろう。時間差顕微鏡は殺滅を可視化するために使用されるであろう。あるいは、終点時点で標的細胞数を決定するための生細胞数染色およびＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するフローサイトメトリー分析を実施するであろう。
【０１９６】
ａＣＡＲ／ｉＣＡＲを形質導入したＴ細胞が試験管内で標的を識別することができるかどうかを確認するために、本発明者らは、各組換え標的細胞（「腫瘍オン」または「腫瘍オフ」）に異なるレポータータンパク質（例えば、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ）を標識するであろう。形質導入されたＴ細胞（エフェクター細胞）は、１：１の比のＥ／Ｔで組換え細胞（標的細胞）と共インキュベートされるであろう。次に、本発明者らは、顕微鏡撮像によって細胞の運命を追跡するであろう。
【０１９７】
サイトカイン放出−
形質導入されたＴ細胞を組換え標的細胞と共にインキュベートし、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ  Ｓｅｔキットにより細胞培養上清中のサイトカイン分泌を測定することによって、またはサイトカインを産生するＴ細胞の百分率のフローサイトメトリー解析によってのいずれかで、サイトカイン産生（ＩＬ２またはＩＮＦγ）を定量するであろう。フローサイトメトリー解析については、サイトカインの分泌を防止するためにゴルジ体の停止を使用するであろう。形質導入されたＴ細胞を標的細胞と共に６および１８〜２４時間インキュベートした後、Ｔ細胞を内側染色キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって浸透および固定し、Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３およびＣＤ８）に対する抗体ならびにサイトカインＩＬ２およびＩＮＦγに対する抗体で染色するであろう。
【０１９８】
ＣＤ１０７ａについての染色
Ｔ細胞の脱顆粒は、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）であるＣＤ１０７ａの表面発現によって同定することができる。ＬＡＭＰ−１の表面発現はＣＤ８Ｔ細胞の細胞毒性と相関することが示されてきた。この分子はリソソームの内腔側に位置する。活性化の際、ＣＤ１０７ａは、活性化されたリンパ球の細胞膜表面へ輸送される。ＣＤ１０７ａは、一過性に細胞表面上に発現し、エンドサイトーシス経路を介して迅速に再内在化する。それゆえ、ＣＤ１０７ａの検出は、細胞刺激中の抗体染色によって、およびモネンシンの添加（酸性化およびそれに続くエンドサイトーシスを受けたＣＤ１０７ａ抗体複合体の分解を防ぐため）によって最大限となる。
【０１９９】
本発明者らは、モネンシンの存在下で、形質導入されたＴ細胞を標的細胞と共に６〜２４時間インキュベートするであろうし、Ｔ細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ８）に対する結合型抗体、およびＣＤ１０７ａに対する結合型抗体を用いるフローサイトメトリーによってＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ発現を追跡するであろう。
【０２００】
生体内
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−マウスに腫瘍細胞を静脈内接種するであろう。腫瘍細胞の１つの可能性は、ホタルルシフェラーゼを発現するように操作されるであろうＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ６（ＡＴＣＣ、ヒトＢ−ＡＬＬ細胞株）細胞であり得る。さらに、「標的オン」、「腫瘍オフ」細胞の確立のために、ＮＡＬＭ６もｉＣＡＲエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）を発現するように操作され、それによって健常細胞を提示するであろう。マウスを試験群に分け、一方の群にＮＡＬＭ６細胞を注射し、もう一方の群にｉＣＡＲエピトープを発現するＮＡＬＭ−６を注射するであろう。数日後、マウスに、ａＣＡＲ、ａＣＡＲ／ｉＣＡＲおよび形質導入していないＴ細胞のまたはＴ細胞を有さない対照群であろう。マウスを屠殺し、腫瘍量を総フラックスにより定量するであろう。
ｉＣＡＲコンストラクトを発現するＴ細胞が同じ生物内での生体内で標的細胞と標的オフ細胞を識別できるかどうかを検査するために、「腫瘍オン」／「腫瘍オフ」のＮＡＬＭ−６細胞の１：１混合物をマウスに注射し、続いてａＣＡＲ単独またはａＣＡＲおよびｉＣＡＲの両方のいずれかを発現する形質導入したＴ細胞の注射が行われるであろう。マウスの屠殺の際に、脾臓および骨髄における「腫瘍オン」および「腫瘍オフ」細胞の存在が、２つのマーカー、すなわちＣＤ１９およびｉＣＡＲエピトープについてのフローサイトメトリーによって解析されるであろう。
【０２０１】
付録．
【表５】
2019530456.tif 000007
2019530456.tif 000008
2019530456.tif 000009
【表６】
2019530456.tif 000010
略語：ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）、ＢＡＦＦ（ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟化抗原）、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）、ＢＭ（骨髄）、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素）、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）、ＣＮＳ（中枢神経系）、ＣＳＰＧ４（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４）、ＤＣ（樹状細胞）、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）、ＥＧＦＲ（表皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲの変異体ＩＩＩ）、ＥｐｈＡ２（エリスロポエチン産生肝細胞癌Ａ２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＲ−α（葉酸受容体α）、ＧＢＭ（多形性膠芽腫）、ＧＰＩ（糖ホスファチジルイノシトール）、Ｈ＆Ｎ（頭頸部）、ＨＬ（ホジキンリンパ腫）、Ｉｇ（免疫グロブリン）、Ｌ１−ＣＡＭ（Ｌ１細胞接着分子）、ＭＭ（多発性骨髄腫）、ＮＢ（神経芽細胞腫）、ＮＦ−κＢ（核因子κＢ）、ＮＨＬ（非ホジキンリンパ腫）、ＮＫ（ナチュラルキラー）、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ（ＮＫＧ２Ｄリガンド）、ＰＢＭＣ（末梢血単核球）、ＰＣ（形質細胞）、ＰＬＬ（前リンパ球性白血病）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＣＣ（腎細胞癌）、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）、ＴＣＬ（Ｔ細胞白血病／リンパ腫）、Ｔｈ２（Ｔヘルパー２）、ＴＮＢＣ（三重陰性乳癌）、ＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）、ＶＥＧＦＲ−２（血管内皮成長因子２）。
参考文献
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Ｂａｒｂａｓ，  Ｃａｒｌｏｓ  Ｆ．，  Ｄｅｎｎｉｓ  Ｒ．  Ｂｕｒｔｏｎ，  Ｊａｍｉｅ  Ｋ．  Ｓｃｏｔｔ，  Ｇ．Ｊ．Ｓ．  ２００４．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｂａｕｓｃｈ−Ｆｌｕｃｋ，  Ｄ．，  Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ａ．，  Ｂｏｃｋ，  Ｔ．，  Ｆｒｅｉ，  Ａ．Ｐ．，  Ｃｅｒｃｉｅｌｌｏ，  Ｆ．，  Ｊａｃｏｂｓ，  Ａ．，  Ｍｏｅｓｔ，  Ｈ．，  Ｏｍａｓｉｔｓ，  Ｕ．，  Ｇｕｎｄｒｙ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｙｏｏｎ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ａ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔｌａｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０．
Ｂａｙｌｅ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｇｒｉｍｌｅｙ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｓｔａｎｋｕｎａｓ，  Ｋ．，  Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｗａｎｄｌｅｓｓ，  Ｔ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｃｒａｂｔｒｅｅ，  Ｇ．Ｒ．（２００６）．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｅｒｍｉｔ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，  ９９−１０７．
Ｂｅｒｇｂｏｌｄ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｌｅｍｂｅｒｇ，  Ｍ．Ｋ．（２０１３）．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｒｈｏｍｂｏｉｄ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８２８，  ２８４０−２８４８．
Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｔ．，  Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ，  Ｍ．，  Ｕｃｋｅｒｔ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｈ．（２０１５）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，  １１２−１１９．
Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ，  Ｄ．，  Ｓ．  Ｋ．  Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｈ．  Ｎａｍ，  Ｈ．  Ｋ．  Ｌｙｅｒｌｙ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｇｉｌｂｏａ．２０００．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：  １０２８−３４．Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｃ．Ａ．，  Ｐｒｅｖｏ，  Ｂｕｒｒｅｌｌ，  Ｒ．Ａ．，  ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，  Ｎ．，  Ｂａｒｔｅｋ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｗａｎｔｏｎ，  Ｃ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｃａｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０１，  ３３８−３４５．
Ｖａｎ  Ｂｕｕｒｅｎ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｃａｌｉｓ，  Ｊ．Ｊ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，  Ｔ．Ｎ．Ｍ．（２０１４）．Ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｅｘｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３．
Ｃａｅｓｃｕ，  Ｃ．Ｉ．，  Ｊｅｓｃｈｋｅ，  Ｇ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｔｕｒｋ，  Ｂ．Ｅ．（２００９）．Ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ＴＡＣＥ  ａｎｄ  ＡＤＡＭ１０．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４２４，  ７９−８８．
Ｃａｒｎｅｙ，  Ｗ．Ｐ．，  Ｐｅｔｉｔ，  Ｄ．，  Ｈａｍｅｒ，  Ｐ．，  Ｄｅｒ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｆｉｎｋｅｌ，  Ｔ．，  Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，  Ｍ．，  Ｍｏｂｔａｋｅｒ，  Ｈ．，  Ｄｅｌｅｌｌｉｓ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，  Ａ．Ｓ．（１９８６）．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＲＡＳ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．  Ａ．８３，  ７４８５−７４８９．
Ｃｅｒａｍｉ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｂｉｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｐｏｒｔａｌ：  Ａｎ  ｏｐｅｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｄａｔａ．Ｃａｎｃｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１２；２：４０１−４０４．
Ｃｈａｏ，  Ｇ．，  Ｗ．  Ｌ．  Ｌａｕ，  Ｂ．Ｊ．Ｈａｃｋｅｌ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｓａｚｉｎｓｋｙ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｌｉｐｐｏｗ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｄ．  Ｗｉｔｔｒｕｐ．２００６．Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１．
Ｃｈｅｓｓ，  Ａ．（２０１２）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｏｎｏａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３，  ４２１−４２８．
Ｃｈｉｃａｙｂａｍ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｂｏｎａｍｉｎｏ，  Ｍ．Ｈ．（２０１４）．Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２７９７：  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＡＲ）  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７４，  ２７９７−２７９７．
Ｃｈｉｃａｙｂａｍ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｂｏｎａｍｉｎｏ，  Ｍ．Ｈ．（２０１５）．Ａｂｓｔｒａｃｔ  ３１５６：  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＡＲ）  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７５，  ３１５６−３１５６．
Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＧＴ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  （ｇｔｅｘ）  ｐｉｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｍｕｌｔｉｔｉｓｓｕｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４８：６４８−６６０．
Ｄａ  Ｃｕｎｈａ，  Ｊ．Ｐ．Ｃ．，  Ｇａｌａｎｔｅ，  Ｐ．Ａ．Ｆ．，  Ｄｅ  Ｓｏｕｚａ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｄｅ  Ｓｏｕｚａ，  Ｒ．Ｆ．，  Ｃａｒｖａｌｈｏ，  Ｐ．Ｍ．，  Ｏｈａｒａ，  Ｄ．Ｔ．，  Ｍｏｕｒａ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｏｂａ−Ｓｈｉｎｊａ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｍａｒｉｅ，  Ｓ．Ｋ．Ｎ．，  Ｓｉｌｖａ  Ｊｒ．，  Ｗ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅｏｍｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．  Ａ．１０６，  １６７５２−１６７５７．
Ｄｅｖｉｌｅｅ，  Ｐ．，  Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎ，  Ａ．−Ｍ．，  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅ，  Ｃ．Ｊ．（２００１）．Ｅｖｅｒ  ｓｉｎｃｅ  Ｋｎｕｄｓｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１７，  ５６９−５７３．
Ｄｏｔｔｉ，  Ｇ．，  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，  Ｓ．，  Ｓａｖｏｌｄｏ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｍ．Ｋ．（２０１４）．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７，  １０７−１２６．
Ｅｂｓｅｎ，  Ｈ．，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ａ．，  Ｋａｂｅｌｉｔｚ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｊａｎｓｓｅｎ，  Ｏ．（２０１３）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡＭ１０  ａｎｄ  ＡＤＡＭ１７  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，  ｅ７６８５３．
Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｌｅｉｔｚ，  Ｇ．，  Ｆａｌｌｍａｎ，  Ｅ．，  Ａｘｎｅｒ，  Ｏ．，  Ｒｙａｎ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｍ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｓｅｎｔｍａｎ，  Ｃ．Ｌ．（１９９９）．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｌｔｅｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｙｅｔ  ａｌｌｏｗ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １９０，  １００５−１０１２．
Ｆｅｄｏｒｏｖ，  Ｖ．Ｄ．，  Ｔｈｅｍｅｌｉ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ，  Ｍ．（２０１３ａ）．ＰＤ−１−  ａｎｄ  ＣＴＬＡ−４−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  （ｉＣＡＲｓ）  ｄｉｖｅｒｔ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．  ５，  ２１５ｒａ１７２．
Ｆｅｄｏｒｏｖ，  Ｖ．Ｄ．，  Ｔｈｅｍｅｌｉ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ，  Ｍ．（２０１３ｂ）．ＰＤ−１−  ａｎｄ  ＣＴＬＡ−４−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  （ｉＣＡＲｓ）  ｄｉｖｅｒｔ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  （Ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ：  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＭＳＫＣＣ），  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  １００６５，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ；  Ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ：  Ｔｒｉ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ＭＳＴＰ  Ｐｒｏｇｒａｍ  （ＭＳＫＣＣ，  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｗｅｉｌｌ−Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ），  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  １００６５，  Ｕｎ），．
Ｆｅｅｎｓｔｒａ，  Ｍ．，  Ｖｅｌｔｋａｍｐ，  Ｍ．，  ｖａｎ  Ｋｕｉｋ，  Ｊ．，  Ｗｉｅｒｔｓｅｍａ，  Ｓ．，  Ｓｌｏｏｔｗｅｇ，  Ｐ．，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｔｗｅｅｌ，  Ｊ．，  ｄｅ  Ｗｅｇｅｒ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｔｉｌａｎｕｓ，  Ｍ．（１９９９）．ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｔ  ６ｐ  ａｎｄ  １５ｑ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５４，  ２３５−２４５．
ＧａｏＪ．ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃＢｉｏ  Ｐｏｒｔａｌ．Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．２０１３  ２；６（２６９）
Ｇｉｌｌ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｊｕｎｅ，  Ｃ．Ｈ．（２０１５）．Ｇｏｉｎｇ  ｖｉｒａｌ：  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２６３，  ６８−８９．
Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｗ．Ｒ．，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，  Ｂ．，  Ｈｅ，  Ｌ．，  Ｍｉｌｅｓ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｊ．，  Ｔｉｙａｎｏｎｔ，  Ｋ．，  ＭｃＡｒｔｈｕｒ，  Ｄ．Ｇ．，  Ａｓｔｅｒ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，  Ｎ．，  Ｌｏｐａｒｏ，  Ｊ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｙ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｆｏｒｃｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ３３，  ７２９−７３６．
Ｇｒａｅｆ，  Ｉ．Ａ．，  Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｄｉｖｅｒ，  Ｓ．，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｓ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｃｒａｂｔｒｅｅ，  Ｇ．Ｒ．（１９９７）．Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｌｉｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＺＡＰ７０．ＥＭＢＯＪ．１６，  ５６１８−５６２８．
Ｇｒｏｓｓ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｅｓｈｈａｒ，  Ｚ．（２０１６ａ）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  Ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｏｆｆ−Ｔｕｍｏｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓａｆｅ  ＣＡＲ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１６．５６：５９−８３．
Ｇｒｏｓｓ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｅｓｈｈａｒ，  Ｚ．（２０１６ｂ）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  （ＣＡＲｓ）  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  Ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｏｆｆ−Ｔｕｍｏｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓａｆｅ  ＣＡＲ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６，  ５９−８３．
Ｇｒｏｓｓ，  Ｇ．，  Ｗａｋｓ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｅｓｈｈａｒ，  Ｚ．（１９８９）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８６，  １００２４−１００２８．
Ｈａａｐａｓａｌｏ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｋｏｖａｃｓ，  Ｄ．Ｍ．（２０１１）．Ｔｈｅ  ｍａｎｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ／γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２５，  ３−２８．
Ｈａｎｅｓ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ．１９９７．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．  Ａ．９４．
Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ，  Ｂ．，  Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，  Ｔ．Ｎ．Ｍ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎｏｍｅ．ＥＭＢＯＪ．３２，  １９４−２０３．
Ｈｅｍｍｉｎｇ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｅｌｉａｓ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｇｙｇｉ，  Ｓ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ，  Ｄ．Ｊ．（２００９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  （ＢＡＣＥ１）  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，  ｅ８４７７．
Ｈｕｓｅ，  Ｍ．，  Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｍｉｌａｎｏｓｋｉ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ａｂｅｙｗｅｅｒａ，  Ｔ．Ｐ．（２０１３）．Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｙ  ｄｉｓｍａｎｔｌｉｎｇ  ｓｙｎａｐｓｅｓ：  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５１，  １４３−１５３．
Ｊｉｍｅｎｅｚ，  Ｐ．，  Ｃａｎｔｏｎ，  Ｊ．，  Ｃｏｌｌａｄｏ，  Ａ．，  Ｃａｂｒｅｒａ，  Ｔ．，  Ｓｅｒｒａｎｏ，  Ａ．，  Ｒｅａｌ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｇａｒｃｉａ，  Ａ．，  Ｒｕｉｚ−Ｃａｂｅｌｌｏ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｒｉｄｏ，  Ｆ．（１９９９）．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｌｏｓｓ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ  ｔｏ  ＨＬＡ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８３，  ９１−９７．
Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，  Ｃ．Ａ．，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ，  Ｎ．Ｐ．（２０１６）．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｏｌｉｄ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ２２，  ２６−３６．
Ｋｌｏｓｓ，  Ｃ．Ｃ．，  Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ，  Ｍ．，  Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ，  Ｍ．，  Ｂａｃｈｍａｎｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ，  Ｍ．（２０１３）．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１，  ７１−７５．
Ｋｎｕｄｓｏｎ  Ｊｒ．，  Ａ．Ｇ．（１９７１）．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．  Ａ．６８，  ８２０−８２３．
Ｌａｎｉｔｉｓ，  Ｅ．，  Ｐｏｕｓｓｉｎ，  Ｍ．，  Ｋｌａｔｔｅｎｈｏｆｆ，  Ａ．Ｗ．，  Ｓｏｎｇ，  Ｄ．，  Ｓａｎｄａｌｔｚｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｒ．，  Ｊｕｎｅ，  Ｃ．Ｈ．，  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｌｌ  Ｊｒ，  Ｄ．Ｊ．（２０１３）．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１，  １０．１１５８／２３２６−６０６６．ＣＩＲ  −  １３−０００８．
Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｓｔｏｊａｎｏｖ，  Ｐ．，  Ｐｏｌａｋ，  Ｐ．，  Ｋｒｙｕｋｏｖ，  Ｇ．  Ｖ，  Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，  Ｋ．，  Ｓｉｖａｃｈｅｎｋｏ，  Ａ．，  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｃ．，  Ｍｅｒｍｅｌ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｓ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，  ２１４−２１８．
Ｌｅｅ，  Ａ．，  Ｒａｎａ，  Ｂ．Ｋ．，  Ｓｃｈｉｆｆｅｒ，  Ｈ．Ｈ．，  Ｓｃｈｏｒｋ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｂｒａｎｎ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｉｎｓｅｌ，  Ｐ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｄ．Ｍ．（２００３）．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８１，  ２４５−２４８．
Ｌｅｋ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ６０，７０６  ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６；５３６：２８５−２９１．
Ｌｅｎｇａｕｅｒ，  Ｃ．，  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｋ．Ｗ．，  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ．（１９９８）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９６，  ６４３−６４９．
Ｌｉ，  Ｈ．，  Ｙａｎｇ，  Ｂ．，  Ｘｉｎｇ，  Ｋ．，  Ｙｕａｎ，  Ｎ．，  Ｗａｎｇ，  Ｂ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｚ．，  Ｈｅ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｚｈｏｕ，Ｊ．（２０１４）．Ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．  ４．
Ｌｉｂｅｒｌｅｓ，  Ｓ．Ｄ．，  Ｄｉｖｅｒ，  Ｓ．Ｔ．，  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｄ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｓ．Ｌ．（１９９７）．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｈｒｅｅ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｃｒｅｅｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４，  ７８２５−７８３０．
Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈ，  Ｋ．，  Ｔａｎｅｎｂａｕｍ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｄａｌｙ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｅ．，  Ｌｕｉ，  Ｗ．−Ｏ．，  Ｖｉｌｌａｐａｋｋａｍ，  Ａ．，  Ｓｔａｎｔｏｎ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｃ．，  Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｔ．Ｊ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｂ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｒｒａｙｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  １００１−１００５．
Ｌｏ，  Ｋ．Ｃ．，  Ｂａｉｌｅｙ，  Ｄ．，  Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，  Ｔ．，  Ｇａｒｄｉｎａ，  Ｐ．，  Ｔｕｒｐａｚ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｃｏｗｅｌｌ，  Ｊ．Ｋ．（２００８）．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  １００Ｋ  ＳＮＰ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ＢＡＣ  ａｒｒａｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７，  ２２１−２３７．
Ｌｏｎｇ，  Ｅ．Ｏ．，  Ｓｉｋ  Ｋｉｍ，  Ｈ．，  Ｌｉｕ，  Ｄ．，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｍ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，  Ｓ．（２０１３）．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１，  ２２７−２５８．
Ｍａｌｅｎｏ，  Ｉ．，  Ｌｏｐｅｚ−Ｎｅｖｏｔ，  Ｍ．Ａ．，  Ｃａｂｒｅｒａ，  Ｔ．，  Ｓａｌｉｎｅｒｏ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｒｉｄｏ，  Ｆ．（２００２）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｌｏｓｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ６ｐ２１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５１，  ３８９−３９６．
Ｍａｌｅｎｏ，  Ｉ．，  Ｃａｂｒｅｒａ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｃａｂｒｅｒａ，  Ｔ．，  Ｐａｃｏ，  Ｌ．，  Ｌｏｐｅｚ−Ｎｅｖｏｔ，  Ｍ．Ａ．，  Ｃｏｌｌａｄｏ，  Ａ．，  Ｆｅｒｒｏｎ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｒｉｄｏ，  Ｆ．（２００４）．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｌｏｓｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ６ｐ２１．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５６，  ２４４−２５３．
Ｍａｌｅｎｏ，  Ｉ．，  Ｒｏｍｅｒｏ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｃａｂｒｅｒａ，  Ｔ．，  Ｐａｃｏ，  Ｌ．，  Ａｐｔｓｉａｕｒｉ，  Ｎ．，  Ｃｏｚａｒ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｔａｌｌａｄａ，  Ｍ．，  Ｌｏｐｅｚ−Ｎｅｖｏｔ，  Ｍ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｒｉｄｏ，  Ｆ．（２００６）．ＬＯＨ  ａｔ  ６ｐ２１．３  ｒｅｇｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５８，  ５０３−５１０．
Ｍａｌｅｎｏ，  Ｉ．，  Ａｐｔｓｉａｕｒｉ，  Ｎ．，  Ｃａｂｒｅｒａ，  Ｔ．，  Ｇａｌｌｅｇｏ，  Ａ．，  Ｐａｓｃｈｅｎ，  Ａ．，  Ｌｏｐｅｚ−Ｎｅｖｏｔ，  Ｍ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｒｉｄｏ，  Ｆ．（２０１１）．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １５  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６３，  ６５−７１．
ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，  Ｎ．，  Ｂｕｒｒｅｌｌ，  Ｒ．Ａ．，  Ｅｎｄｅｓｆｅｌｄｅｒ，  Ｄ．，  Ｎｏｖｅｌｌｉ，  Ｍ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｗａｎｔｏｎ，  Ｃ．（２０１２）．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  １３，  ５２８−５３８．
Ｍｏｒｓｕｔ，  Ｌ．，  Ｒｏｙｂａｌ，  Ｋ．Ｔ．，  Ｘｉｏｎｇ，  Ｘ．，  Ｇｏｒｄｌｅｙ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｃｏｙｌｅ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｌｉｍ，  Ｗ．Ａ．（２０１６）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎｏｔｃｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １６４，  ７８０−７９１．
Ｎｇ  ＰＣ，  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ．  Ｓｉｆｔ：  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｔｈａｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００３；３１：３８１２−３８１４．
Ｎｉｒｓｃｈｌ，  Ｃ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｒａｋｅ，  Ｃ．Ｇ．（２０１３）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ：  Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，  ４９１７−４９２４．
Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，  Ｃ．，  ＭｃＤｅｖｉｔｔ，  Ｍ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ，  Ｊ．Ｐ．  （２０１０）．Ｃｏｐｙ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１５，  ２７３１−２７３９．
Ｏｈｇａｋｉ，  Ｈ．，  Ｄｅｓｓｅｎ，  Ｐ．，  Ｊｏｕｒｄｅ，  Ｂ．，  Ｈｏｒｓｔｍａｎｎ，  Ｓ．，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｔ．，  Ｄｉ  Ｐａｔｒｅ，  Ｐ．−Ｌ．，  Ｂｕｒｋｈａｒｄ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｕｌｅｒ，  Ｄ．，  Ｐｒｏｂｓｔ−Ｈｅｎｓｃｈ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｍａｉｏｒｋａ，  Ｐ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ：  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，  ６８９２−６８９９．
Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，  Ｗ．Ｗ．，  Ｗａｎｇ，  Ｅ．，  Ｍａｒｉｎｃｏｌａ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，  Ｈ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ，  Ｎ．Ｐ．（２０１３）．Ｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｏｍｅ：  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  １，  １１．
Ｒａｎａ，  Ｂ．Ｋ．，  Ｓｈｉｉｎａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｌ，  Ｐ．Ａ．（２００１）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１，  ５９３−６２４．
Ｒａｗｓｏｎ，  Ｒ．Ｂ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｓｉｔｅ−２  ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８２８，  ２８０１−２８０７．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．Ａ．  （２０１４）．Ｆｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｏｂｓｔａｃｌｅ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２１，  ４５−４７．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ，  Ｎ．Ｐ．（２０１５）．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，  ６２−６８．
Ｒｏｙｂａｌ，  Ｋ．Ｔ．，  Ｒｕｐｐ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｍｏｒｓｕｔ，  Ｌ．，  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｗ．Ｊ．，  ＭｃＮａｌｌｙ，  Ｋ．Ａ．，  Ｐａｒｋ，  Ｊ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌｉｍ，  Ｗ．Ａ．（２０１６ａ）．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｃｅｌｌ．
Ｒｏｙｂａｌ，  Ｋ．Ｔ．，  Ｒｕｐｐ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｍｏｒｓｕｔ，  Ｌ．，  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｗ．Ｊ．，  ＭｃＮａｌｌｙ，  Ｋ．Ａ．，  Ｐａｒｋ，  Ｊ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌｉｍ，  Ｗ．Ａ．（２０１６ｂ）．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｃｅｌｌ  １６４，  ７７０−７７９．
Ｓａｔｈｉｒａｐｏｎｇｓａｓｕｔｉ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｌｅｅ，  Ｈ．，  Ｈｏｒｓｔ，  Ｂ．Ａ．Ｊ．，  Ｂｒｕｎｎｅｒ，  Ｇ．，  Ｃｏｃｈｒａｎ，  Ａ．Ｊ．，  Ｂｉｎｄｅｒ，  Ｓ．，  Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｓ．Ｆ．（２０１１）．Ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：  ＥｘｏｍｅＣＮＶ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，  ２６４８−２６５４．
Ｓａｖａｇｅ，  Ｐ．Ａ．（２０１４）．Ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｒｅｖｅａｌｅｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，  ４７−４８．
Ｓａｖｏｖａ，  Ｖ．，  Ｃｈｕｎ，  Ｓ．，  Ｓｏｈａｉｌ，  Ｍ．，  ＭｃＣｏｌｅ，  Ｒ．Ｂ．，  Ｗｉｔｗｉｃｋｉ，  Ｒ．，  Ｇａｉ，  Ｌ．，  Ｌｅｎｚ，  Ｔ．Ｌ．，  Ｗｕ，  Ｃ．−Ｔ．，  Ｓｕｎｙａｅｖ，  Ｓ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｇｉｍｅｌｂｒａｎｔ，  Ａ．Ａ．（２０１６）．Ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅｌｙ  ｔｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４８，  ２３１−２３７．
Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，  Ｔ．Ｎ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｒ．Ｄ．（２０１５）．Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  （８０−．）．３４８，  ６９−７４．
Ｓｅｌａ−Ｃｕｌａｎｇ，  Ｉ．，  Ｙ．  Ｏｆｒａｎ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｐｅｔｅｒｓ．２０１５ａ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  −  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．  １１．
Ｓｅｌａ−Ｃｕｌａｎｇ，  Ｉ．，  Ｓ．  Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，  Ｂ．  Ｐｅｔｅｒｓ，  ａｎｄ  Ｙ．  Ｏｆｒａｎ．２０１５ｂ．ＰＥＡＳＥ：  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３１．
Ｓｋｏｒａ，  Ａ．Ｄ．，  Ｄｏｕｇｌａｓｓ，  Ｊ．，  Ｈｗａｎｇ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｔａｍ，  Ａ．Ｊ．，  Ｂｌｏｓｓｅｒ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｇａｂｅｌｌｉ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｃａｏ，  Ｊ．，  Ｄｉａｚ，  Ｌ．Ａ．，  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｎ．，  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｋ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡＮＡｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｓｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．  Ａ．１１２，  ９９６７−９９７２．
Ｓｔａｒｋ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈａｙｗａｒｄ，  Ｎ．（２００７）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｒｒａｙｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７，  ２６３２−２６４２．
Ｓｔａｒｋ，  Ｓ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｃａｔｏｎ，  Ａ．Ｊ．（１９９１）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｕｓｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １７４，  ６１３−６２４．
Ｔｅｏ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｐａｗｉｔａｎ，  Ｙ．，  Ｋｕ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｃｈｉａ，  Ｋ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｓａｌｉｍ，  Ａ．（２０１２）．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８，  ２７１１−２７１８．
Ｔｈｕｌ  ＰＪ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７；３５６．
Ｔｒｅａｎｏｒ，  Ｂ．，  Ｌａｎｉｇａｎ，  Ｐ．Ｍ．Ｐ．，  Ｋｕｍａｒ，  Ｓ．，  Ｄｕｎｓｂｙ，  Ｃ．，  Ｍｕｎｒｏ，  Ｉ．，  Ａｕｋｓｏｒｉｕｓ，  Ｅ．，  Ｃｕｌｌｅｙ，  Ｆ．Ｊ．，  Ｐｕｒｂｈｏｏ，  Ｍ．Ａ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｄ．，  Ｎｅｉｌ，  Ｍ．Ａ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｍｉｃｒｏｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｋｉｌｌｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｎａｐｓｅｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７４，  １５３−１６１．
Ｕｈｌｅｎ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４７：１２６０４１９．
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ．，  Ｆｅａｒｏｎ，  Ｅ．Ｒ．，  Ｋｅｒｎ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｐｒｅｉｓｉｎｇｅｒ，  Ａ．Ｃ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｒ．（１９８９）．Ａｌｌｅｌｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  （８０−．）．２４４，  ２０７−２１１．
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ．，  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｎ．，  Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，  Ｖ．Ｅ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｓ．，  Ｄｉａｚ  Ｊｒ．，  Ｌ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｋ．Ｗ．（２０１３）．Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  （８０−．）．３４０，  １５４６−１５５８．
Ｖｏｓｓ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｆｌｕｈｒｅｒ，  Ｒ．（２０１３）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  （ＳＰＰ）  ａｎｄ  ＳＰＰ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８２８，  ２８２８−２８３９．
Ｖｙａｓ，  Ｙ．Ｍ．，  Ｍｅｈｔａ，  Ｋ．Ｍ．，  Ｍｏｒｇａｎ，  Ｍ．，  Ｍａｎｉａｒ，  Ｈ．，  Ｂｕｔｒｏｓ，  Ｌ．，  Ｊｕｎｇ，  Ｓ．，  Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，  Ｊ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｂ．（２００１）．Ｓｐａｔｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｎｏｎｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，  ４３５８−４３６７．
Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｃ．，  Ｌｉｎ，  Ｍ．，  Ｗｅｉ，  Ｌ．−Ｊ．，  Ｌｉ，  Ｃ．，  Ｍｉｒｏｎ，  Ａ．，  Ｌｏｄｅｉｒｏ，  Ｇ．，  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｌ．，  Ｒａｍａｓｗａｍｙ，  Ｓ．，  Ｔａｎｅｎｂａｕｍ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，  ６４−７１．
Ｗｉｌｋｉｅ，  Ｓ．，  Ｖａｎ  Ｓｃｈａｌｋｗｙｋ，  Ｍ．Ｃ．Ｉ．，  Ｈｏｂｂｓ，  Ｓ．，  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｖａｎ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｐｅｒｅｉｒａ，  Ａ．Ｃ．Ｐ．，  Ｂｕｒｂｒｉｄｇｅ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｂｏｘ，  Ｃ．，  Ｅｃｃｌｅｓ，  Ｓ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｍａｈｅｒ，Ｊ．（２０１２）．Ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＥｒｂＢ２  ａｎｄ  ＭＵＣ１  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，  １０５９−１０７０．
Ｗｕ，  Ｃ．−Ｙ．，  Ｒｏｙｂａｌ，  Ｋ．Ｔ．，  Ｐｕｃｈｎｅｒ，  Ｅ．Ｍ．，  Ｏｎｕｆｆｅｒ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｉｍ，  Ｗ．Ａ．（２０１５）．Ｒｅｍｏｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  （８０−．）．３５０，  ａａｂ４０７７．
Ｙｅｕｎｇ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｏｈｎｉｓｈｉ，  Ｋ．，  Ｉｋｅｕｒａ，  Ｍ．，  Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖａ，  Ｍ．Ｎ．，  Ｆｅｒｒｏｎｅ，  Ｓ．，  Ｊａｋａｃｋｉ，  Ｒ．Ｉ．，  Ｐｏｌｌａｃｋ，  Ｉ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  Ｈ．（２０１３）．ＬＯＨ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｔ  ６ｐ２１  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｈｏｒｔｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，  １８１６−１８２６．
【図１】
2019530456.tif 000011
【図２】
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【図３Ａ】
2019530456.tif 000013
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2019530456.tif 000015
【図４Ａ】
2019530456.tif 000016
【図４Ｂ】
2019530456.tif 000017
【国際調査報告】
2019530456.tif 000018
2019530456.tif 000019