(57)【要約】  本発明は、ポリマーがヒアルロン酸であり、薬物が抗癌化合物である、ポリマー−薬物コンジュゲートに関する。抗癌化合物はヒアルロン酸にｐＨ依存性を示すボロン酸含有結合により共役結合している。このコンジュゲートは癌の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に使用するための、ポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物であって、
前記ポリマーは修飾ヒアルロン酸誘導体であり、前記薬物は抗癌化合物であり、前記抗癌化合物は前記修飾ヒアルロン酸誘導体にｐＨ依存性を示すホウ素含有結合により共役結合している、ポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項２】
請求項１に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物であって、前記修飾ヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸モノマー単位の一部が、抗癌剤と反応してｐＨ依存性を示すホウ素含有結合を形成する１種以上のペンダントボロネート酸（ｂｏｒｏｎａｔｅ  ａｃｉｄ）含有部分を含むように化学修飾されている、ヒアルロン酸ポリマーである、ポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項３】
前記ＨＡポリマーの骨格中に存在する前記モノマー単位の１〜３０％はペンダントボロン酸含有部分を含む、請求項２に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項４】
前記ＨＡポリマーの骨格中に存在する前記モノマー単位の５〜２０％はペンダントボロン酸含有部分を含む、請求項２又は３に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項５】
前記修飾ヒアルロン酸誘導体は、分子量が１００ｋＤａ〜１ＭＤａの範囲内にある可溶性ＨＡポリマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項６】
前記修飾ヒアルロン酸誘導体は、分子量が３００ｋＤａ〜８００ｋＤａの範囲内にある可溶性ＨＡポリマーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項７】
前記ペンダントボロン酸含有部分はＨＡモノマーのカルボキシ基にアミド結合を介して結合している、請求項２〜６のいずれか一項に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項８】
前記ペンダントボロネート含有部分は、次に示す一般構造式ＩＩ：
【化１】
2019530643.tif 000025
（式中、
Ｌは連結基であり；
Ｒは存在しないか、又は：Ａ）ＯＨ基；若しくはＢ）前記修飾ＨＡポリマー若しくは前記薬物分子のいずれかに存在する式−ＱｒＸｒＨで表される置換基がホウ素原子と会合することにより形成される−Ｘｒ−Ｑｒ−基（式中、Ｘｒは、−Ｏ−、−ＮＲｚ−（ＲｚはＨ又は（１〜４Ｃ）アルキル）又は−Ｓ−から選択されるヘテロ原子リンカーであり、Ｑｒは、前記修飾ＨＡポリマー又は前記薬物分子のいずれかに存在する前記置換基の残部である）から選択され；
Ｘ１は、前記連結基Ｌを、前記ヒアルロン酸モノマー単位中に存在するカルボン酸の−Ｃ（＝Ｏ）−に連結する官能基（例えば、−ＮＨ−又は−Ｏ−）であり；
Ｘ２は、Ｏ又はＮＨである）で表される、請求項２〜７のいずれか一項に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項９】
前記ペンダントボロネート含有部分は、次に示す一般構造式ＩＩａ：
【化２】
2019530643.tif 000026
（式中、
Ｌは任意選択的に置換されたフェニル基であり；
Ｒは請求項８と同義であり；
Ｘ１は−ＮＨ−であり；
Ｘ２はＯ又はＮＨである）で表される、請求項８に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項１０】
前記ペンダントボロネート含有部分は次に示す一般構造式ＩＩｃ：
【化３】
2019530643.tif 000027
（式中、
Ｘは−ＮＨ−であり；
Ｒは請求項８と同義であり；
Ｒ１はアミノであり；
ｎは０又は１であり；
Ｘ２はＯ又はＮＨである）で表される、請求項９に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項１１】
前記抗癌剤は、前記修飾ＨＡポリマーのペンダントボロン酸基に結合してｐＨ依存性を示す環状ボロン酸エステル結合を形成するカテコール部分を含むか又はカテコール部分を含むリンカー基に連結している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項１２】
前記抗癌剤は、クエルセチン、タンニン酸、ピセアタンノール、タキシフォリン、カテキン、クルクミン、又はチラパザミンから選択される、請求項１１に記載の癌の治療に使用するためのポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物と、１種以上の医薬的に許容される賦形剤とを含む、癌の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項１４】
固形腫瘍の治療に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリマー−薬物コンジュゲート又は請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＣＤ４４が過剰発現している腫瘍の治療に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリマー−薬物コンジュゲート又は請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
癌の治療を必要とする患者にこのような治療を行う方法であって、前記患者に治療有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリマー−薬物コンジュゲート又は請求項１３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
固形腫瘍の治療を必要とする患者にこのような治療を行う方法であって、前記患者に治療有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリマー−薬物コンジュゲート又は請求項１３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本発明はプロドラッグ化合物に関する。より具体的には、本発明は、プロドラッグとして作用する特定のヒアルロン酸ポリマー−抗癌剤コンジュゲートに関する。このコンジュゲートは癌の治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
癌は細胞増殖の抑制不全及び調節不全が原因となって起こる。細胞が抑制不全及び調節不全な形で悪性化及び増殖する明確な要因を追求するべくここ数十年に亘り活発な研究が行われてきた。
【０００３】
今日の癌治療に依然として残されている重要な課題の一つが、腫瘍部位で効果を発揮する効力の高い抗癌剤化合物を選択的に標的に指向させるための有効な戦略を見極め、それによって体の健康な組織が、このような効力の高い、しばしば有害となる薬物に曝露される機会を最小限に抑えることにある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
長年に亘り多くの異なる製剤及びプロドラッグ戦略が発展し、治験が行われてきたが、効力の高い抗癌剤を用いて腫瘍を選択的且つ効果的に標的とするための新規なアプローチが依然として求められている。
【０００５】
本発明は上記に鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本発明は、ポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物を提供し、このポリマーは、修飾ヒアルロン酸誘導体であり、薬物は、抗癌化合物であり、抗癌化合物は、修飾ヒアルロン酸誘導体に、ｐＨ依存性（ｐＨ−ｌａｂｉｌｅ）を示すホウ素含有結合により共役結合している。
【０００７】
他の態様において、本発明は、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物と、１種以上の医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【０００８】
他の態様において、本発明は、癌の治療に使用するための本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート若しくはその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物、又は本明細書に定義する医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、癌はヒト癌である。
【０００９】
他の態様において、本発明は、固形腫瘍の治療に使用するための、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート若しくはその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物、又は本明細書に定義する医薬組成物を提供する。
【００１０】
他の態様において、本発明は、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物の、癌の治療に使用するための医薬の製造における使用を提供する。好適には、この医薬はヒト癌の治療に使用される。
【００１１】
他の態様において、本発明は、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物の、固形腫瘍の治療に使用するための医薬の製造における使用を提供する。
【００１２】
他の態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞増殖を抑制する方法、細胞生存率を低下させる方法、他の抗増殖剤若しくは抗癌剤に対する細胞の感受性を向上させる方法、又はこれらの任意の組合せを提供する。上記方法は、有効量の本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物を細胞に接触させることを含む。
【００１３】
他の態様において、本発明は、癌の治療を必要とする患者にこのような治療を施す方法であって、治療有効量の本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート若しくはその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物、又は本明細書に定義する医薬組成物を、上記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００１４】
他の態様において、本発明は、固形腫瘍の治療を必要とする患者にこのような治療を施す方法であって、治療有効量の本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート若しくはその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物、又は本明細書に定義する医薬組成物を、上記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００１５】
さらに本発明は、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物の合成方法を提供する。
【００１６】
他の態様において、本発明は、本明細書に定義する合成方法により得ることができる、又は得られた、又は直接得られた、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物を提供する。
【００１７】
本発明の特定の一態様のいずれか１つの好ましい特徴、好適な特徴、及び最適な特徴は、他のいずれかの態様の、好ましい特徴、好適な特徴、及び最適な特徴でもある。
【００１８】
発明の詳細な説明
定義
特段の指定がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用する以下に示す用語は以下に説明する意味を有する。
【００１９】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」に言及する場合、これは予防に加えて、確立された病状の症状の軽減も包含すると理解されたい。したがって、ある状態（ｓｔａｔｅ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、又は病状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を「治療する」、又はこれらの「治療」とは：（１）ある状態、障害、又は病状に罹患しているか又はその素因を持つ可能性があるが、未だその状態、障害、又は病状の臨床症状又は潜在症状を経験又は呈示していないヒトにおいて進展しているその状態、障害、又は病状の臨床症状の出現を予防又は遅延すること；（２）その状態、障害、又は病状の阻害、すなわち、疾患若しくはその再発（維持療法の場合）、又はその臨床症状若しくは潜在症状の少なくとも１つの発生を抑止、軽減、又は遅延すること；又は（３）疾患の緩和又は減弱化、すなわち、その状態、障害、若しくは病状又はその臨床症状若しくは潜在症状の少なくとも１つを後退させること、を包含する。
【００２０】
「治療有効量」とは、疾患を治療する哺乳動物に投与する場合、このような疾患の治療が効果を発揮するのに十分な化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患、及びその重症度、並びに治療すべき哺乳動物の年齢や体重等に応じて変化するであろう。
【００２１】
「抗癌剤」という語は、癌治療に有用な薬理活性を示す薬物分子を意味する。
【００２２】
「ｐＨ依存性」という語は、本明細書においては、通常の生理学的ｐＨ値（例えば、ｐＨ７〜８、典型的にはｐＨ７．４前後）においては安定であるが、例えば、エンドサイトーシス後のエンドソーム内、ファゴサイトーシス後のファゴソーム内及び／又は腫瘍の間質空間内において存在し得る弱酸性条件下に曝されると開裂する環状ボロン酸エステル結合又は関連するホウ素含有リンカーを指すために用いられる。本発明者によれば、「弱酸性条件」とは、典型的にはｐＨ５〜６．５の範囲、より典型的にはｐＨ５〜６の範囲にあるｐＨ値を意味する。
【００２３】
「ホウ素含有結合」とは、本発明者らによれば、中心の３価又は４価のホウ素原子をベースとする構造を有し、簡潔には次に示すように表すことができる任意の化学基を意味し：
【化１】
2019530643.tif 000002
ここで、
ＰＯＬは、修飾ＨＡポリマーを表し、結合部は炭素−炭素結合であり；
Ｘ１及びＸ２は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択されるヘテロ原子であり；Ｘ１及びＸ２は両方共、ホウ素原子を抗癌剤分子に連結させており；
Ｒは、存在しないか、又は：Ａ）ＯＨ基；若しくはＢ）修飾ＨＡポリマー若しくは薬物分子のいずれかに存在する式−Ｑｒ−Ｘｒ−Ｈで表される置換基がホウ素原子と会合することによって形成される−Ｘｒ−Ｑｒ−基（ここでＸｒは、−Ｏ−、−ＮＲｚ−（ＲｚはＨ又は（１〜４Ｃ）アルキルである）、又は−Ｓ−から選択されるヘテロ原子リンカーであり、Ｑｒは、修飾ＨＡポリマー又は薬物分子のいずれかに存在する置換基の残部である）から選択される。
【００２４】
Ｘ１及びＸ２が抗癌剤分子への２つの結合部を供与しているため、ホウ素含有結合は環状基を形成し、したがって、環状ホウ素結合と称することができる。Ｘ１及びＸ２が両方共Ｏである化合物は環状ボロン酸エステルとして知られており、Ｘ１及びＸ２が両方共Ｎである化合物は環状ボロン酸アミドとして知られる。
【００２５】
一実施形態において、Ｒは存在しない。他の実施形態において、Ｒは−ＯＨ基であり、これは中性又は塩基性ｐＨにおいてホウ素原子を４級化する。他の実施形態において、Ｒは、修飾ＨＡポリマー又は薬物分子のいずれかに連結している、ヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、Ｓ）を末端に有する基であるＸｒのヘテロ原子を介して連結している基とすることができ；この内部結合（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）を利用することによって、ホウ素含有結合の加水分解に対する安定性を向上させることが可能となる。
【００２６】
本明細書における「アルキル」という語は、直鎖及び分岐鎖の両方のアルキル基を包含する。「プロピル」等の個々のアルキル基について言及する場合は直鎖形態のみを特定しており、「イソプロピル」等の個々の分岐鎖アルキル基について言及する場合は分岐鎖形態のみを特定している。例えば、「（１〜６Ｃ）アルキル」は、（１〜４Ｃ）アルキル、（１〜３Ｃ）アルキル、プロピル、イソプロピル、及びｔ−ブチルを包含する。他の基についても同様の規定が適用され、例えば「フェニル（１〜６Ｃ）アルキル」は、フェニル（１〜４Ｃ）アルキル、ベンジル、１−フェニルエチル及び２−フェニルエチルを包含する。
【００２７】
「アリール」という語は、５〜１２個の炭素原子を有する環式及び多環式芳香族環を意味する。アリールという語は、１価の化学種及び２価の化学種の両方を包含する。アリール基の例としては、これらに限定されるものではないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル等が挙げられる。特定の実施形態において、アリールはフェニル又はナフチル、特にフェニルである。
【００２８】
「アルキレン」という語は、２つ以上の部分を１つに連結するアルキルリンカーを指す。
【００２９】
「アリーレン」という語は、２つ以上の部分を１つに連結するアリールリンカー（例えば、フェニレン（−Ｃ６Ｈ４−））を指す。
【００３０】
「任意選択的に置換された」という語は、置換されている、及び置換されていない、基、構造又は分子のいずれかを指す。任意選択的な置換基が「１種以上の」基から選択される場合、この定義には、特定した基のうちの１種から選択されるあらゆる基又は特定した基の２種以上から選択される置換基が包含されると理解されたい。任意選択的な置換基の例としては、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、（１〜６Ｃ）アルキル、（２〜６Ｃ）アルケニル、（２〜６Ｃ）アルキニル、（１〜６Ｃ）アルコキシ、（２〜６Ｃ）アルケニルオキシ、（１〜６Ｃ）アルキルチオ、（１〜６Ｃ）アルキルスルフィニル、（１〜６Ｃ）アルキルスルホニル、（１〜６Ｃ）アルキルアミノ、ジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］アミノ、（１〜６Ｃ）アルコキシカルボニル、Ｎ−（１〜６Ｃ）アルキルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］カルバモイル、（２〜６Ｃ）アルカノイル、（２〜６Ｃ）アルカノイルオキシ、（２〜６Ｃ）アルカノイルアミノ、Ｎ−（１〜６Ｃ）アルキル−（２〜６Ｃ）アルカノイルアミノ、Ｎ−（１〜６Ｃ）アルキルスルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］スルファモイル、及び上述の基のいずれかの任意選択のアルキル部分が、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、（１〜６Ｃ）アルコキシ、（１〜６Ｃ）アルキルチオ、（１〜６Ｃ）アルキルスルフィニル、（１〜６Ｃ）アルキルスルホニル、（１〜６Ｃ）アルキルアミノ、又はジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］アミノの１種以上で任意選択的に置換されたものが挙げられる。
【００３１】
ポリマー−薬物コンジュゲート（プロドラッグ）
一態様において、本発明は、ポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物を提供し、ポリマーはヒアルロン酸であり、薬物は抗癌化合物であり、抗癌化合物はヒアルロン酸にｐＨ依存性を示すホウ素含有結合を介して共有結合している。
【００３２】
本発明のポリマー−薬物コンジュゲートは数多くの重要且つ有利な特性を有している。
【００３３】
まず第１に、ポリマー−薬物コンジュゲートの高分子構造は、抗癌剤分子にある程度の化学的安定性を付与することができる。具体的には、抗癌剤化合物と一緒にボロン酸エステル結合が形成されることによって、抗癌化合物上に存在する、もし保護されていなければ化学的及び／又は酵素的分解が起こりやすくなる可能性がある、典型的には酸化性を有する特定の官能基（例えば、薬物分子上に存在する１，２−ジヒドロキシベンゼン基又は１，２−ジアミノベンゼン基等）を保護することができる。加えて、場合によっては、ポリマー−薬物コンジュゲートは、抗癌化合物に対する抗原性及び／又は毒性をマスキングすることができる。
【００３４】
本発明のポリマー−薬物コンジュゲートの高分子構造は、抗癌剤の腎臓でのクリアランスを低下させることもできる。これは分子サイズ（ｓｉｚｅ）が影響しやすい現象であり、分子サイズの閾値は、一般に、血清アルブミンのサイズ、すなわち２〜４ｎｍの範囲を下回ることが認められている。加えて、ヒアルロン酸ポリマーには抗原性がないため、ポリマー−薬物コンジュゲートが異物として認識され、循環から排除される可能性を最小限に抑えることができる。
【００３５】
本発明の巨大分子ポリマー−薬物コンジュゲートはまた、例えば、固形腫瘍組織等の毛細管漏出が増加していることを特徴とする部位に優先的に集積するであろう。固形腫瘍のリンパ排出が低下していることも、最終的には、コロイドの循環時間が長くなり、腫瘍内に優先的に局在することを可能にする血管透過性・滞留性亢進効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）（ＥＰＲ効果）に寄与している。
【００３６】
本発明のポリマー−薬物コンジュゲートのヒアルロン酸部分はまた、腫瘍標的指向性をさらに高めることが可能な、レセプターが媒介するエンドサイトーシスの機序を利用することができる。ヒアルロン酸は多くのレセプターに結合することができる。主要なＨＡレセプターの１つがＣＤ４４であり、これはエンドサイトーシス機能を有する。本発明のポリマー−薬物コンジュゲートは認識されてＣＤ４４の発現と実質的に比例する形で細胞に取り込まれるであろうと考えられている。ＣＤ４４等のヒアルロン酸のレセプターは腫瘍で過剰発現していることが多い。さらに、ＣＤ４４は癌幹細胞マーカーともみなされている。特に、一部のＣＤ４４バリアント、例えばバリアント６は腫瘍でしか発現しない。ＨＡがＣＤ４４に結合する能力を有することにより、本発明のポリマー−薬物コンジュゲートを腫瘍部位に高度に局在化させると共に、薬物が腫瘍細胞内への取り込みを促進する手段となる。
【００３７】
本発明のコンジュゲートに存在するホウ素含有結合は、水性環境において良好な化学的安定性を示す。抗癌剤分子に存在するカテコール部分と一緒に環状ボロン酸エステル結合が形成される好ましい実施形態、又は抗癌剤分子に結合しているリンカーに結合する基に存在するカテコール部分と一緒に環状ボロン酸エステル結合が形成される好ましい実施形態において、環状ボロン酸エステル結合は良好な化学結合強度を有することを特徴とし、生理学的ｐＨにおけるＫｄが２〜３百μＭ程度又はそれを下回る。ヒアルロン酸上に存在するボロン酸基の数を、利用可能な各カテコール部分に対しボロン酸基が過剰になるように増加させることによって結合強度をさらに強化することができ、それによってヒアルロン酸誘導体の薬物に対する結合強度が増大する。ボロン酸エステル結合はまた、ｐＨが低下し、例えば、ｐＨが６未満になると容易に解離する。それにより、酸性ｐＨを特徴とする環境下、例えば、エンドソーム／ファゴソーム内（レセプターが媒介するエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれた後）の環境、低酸素状態の腫瘍細胞内の酸性環境、又は、可能性として、腫瘍の細胞間隙（ｉｎｔｅｎｓｔｉｓｉａｌ  ｓｐａｃｅ）においても（腫瘍に集積した後、細胞外に放出）、結合している抗癌剤分子を放出させることが可能になる。
【００３８】
修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）
「ＨＡ」とも称されるヒアルロン酸は、天然起源の、細胞外マトリクスの主成分である水溶性多糖類であり、動物組織に幅広く分布している。天然起源のＨＡは、一般に、分子量が約６×１０４〜約８×１０６Ｄａｌｔｏｎの範囲にある。生体適合性に極めて優れ、対象に注射しても異物と認識されたりアレルギー反応を起こしたりしない。ＨＡはまた、生体材料として、特に美容整形及び眼科用の注入剤として、変形性関節症の関節内補充療法（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）用として、加えて、幾つかの再生医療のシナリオにおいて、幅広く使用されている。
【００３９】
本発明の薬物コンジュゲートにおいて、修飾ヒアルロン酸は分子量が１００ｋＤａ〜１ＭＤａの範囲にある可溶性ＨＡポリマーである。好適には、修飾ヒアルロン酸ポリマーは好適には１００ｋＤａ〜８００ｋＤａの範囲の分子量を有する。より好適には、修飾ヒアルロン酸ポリマーは、好適には３００ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲の分子量を有する。
【００４０】
「修飾ヒアルロン酸ポリマー」又は「修飾ＨＡ」という語は、本明細書において、二糖モノマー単位の一部が、ペンダントボロン酸含有部分を組み込むために化学修飾されたヒアルロン酸ポリマーを指す。
【００４１】
ヒアルロン酸の単一のモノマー単位は次に示す通りである。
【化２】
2019530643.tif 000003
【００４２】
上に示したＨＡモノマー単位に存在するカルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）基は、ペンダントしているボロン酸含有部分をＨＡポリマー骨格にカップリングさせるための好都合な手段となる。当業者は、このようなカルボン酸基において多くの異なる化学的カップリングが可能であることを理解するであろう。例えば、ボロン酸含有部分に存在するアミン基をＨＡモノマーに存在するカルボン酸基と反応させることにより、ペンダントボロン酸含有部分をＨＡモノマーに共有結合させるアミド結合が形成されるであろう。或いは、ＨＡモノマー単位のカルボン酸基をボロン酸含有部分に存在する好適な反応性を有する脱離基（例えば、塩素等のハロゲン原子）と反応させることによってエステル結合を形成することもできる。
【００４３】
一実施形態において、ボロン酸含有部分は、ＨＡモノマーのカルボキシ基にエステル結合又はアミド結合により結合している。他の実施形態において、ボロン酸含有部分は、ＨＡモノマーのカルボキシ基にアミド結合により結合している。
【００４４】
本発明のポリマー−薬物コンジュゲートには、任意の好適なペンダントボロン酸含有部分を用いることができる。
【００４５】
一実施形態において、ペンダントボロン酸含有部分は次に示す一般構造式Ｉ：
−Ｘ１−Ｌ−Ｂ（ＯＨ）２      Ｉ
（式中、Ｌは連結基であり、Ｘ１は、連結基Ｌをヒアルロン酸モノマー単位中に存在するカルボン酸基の−Ｃ（＝Ｏ）−に連結する官能基（例えば、−ＮＨ−又はＯ−）である）を有する。
【００４６】
Ｌは、任意の好適な連結基、例えば、任意選択的に置換された（１〜１０Ｃ）アルキレン又は任意選択的に置換されたアリーレンリンカーとすることができる。一実施形態において、Ｌは、任意選択的に置換されたアリーレンリンカー、例えば、任意選択的に置換されたフェニレンリンカーである。
【００４７】
Ｘ１は、Ｌをヒアルロン酸モノマー単位のカルボン酸基の−Ｃ（＝Ｏ）−に連結させることができる任意の好適な官能基とすることができる。一実施形態において、Ｘ１は−Ｏ−又は−ＮＲ−であり、ここでＲはＨ又は（１〜６Ｃ）アルキルである。他の実施形態において、Ｘ１は−Ｏ−又は−ＮＨ−である。
【００４８】
一実施形態において、ペンダントボロン酸含有部分は上に示した構造式Ｉを有し、式中、Ｌはフェニレンリンカーである、すなわち、ペンダントボロン酸含有部分は次に示す構造式Ｉａ：
【化３】
2019530643.tif 000004
（式中、
【化４】
2019530643.tif 000005
は、ヒアルロン酸モノマー単位の−Ｃ（＝Ｏ）−基への結合部を表し；
Ｘ１は、ＨＡモノマー単位中に存在するカルボン酸基のＣ（Ｏ）原子に連結する官能基（例えば、−ＮＨ−又は−Ｏ−）であり；
Ｒ１は、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、（１〜６Ｃ）アルキル、（２〜６Ｃ）アルケニル、（２〜６Ｃ）アルキニル、（１〜６Ｃ）アルコキシ、（２〜６Ｃ）アルケニルオキシ、（１〜６Ｃ）アルキルチオ、（１〜６Ｃ）アルキルスルフィニル、（１〜６Ｃ）アルキルスルホニル、（１〜６Ｃ）アルキルアミノ、ジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］アミノ、（１〜６Ｃ）アルコキシカルボニル、Ｎ−（１〜６Ｃ）アルキルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］カルバモイル、（２〜６Ｃ）アルカノイル、（２〜６Ｃ）アルカノイルオキシ、（２〜６Ｃ）アルカノイルアミノ、Ｎ−（１〜６Ｃ）アルキル−（２〜６Ｃ）アルカノイルアミノ、Ｎ−（１〜６Ｃ）アルキルスルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］スルファモイル、及び上述の基のいずれかの任意選択のアルキル部分が、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、（１〜６Ｃ）アルコキシ、（１〜６Ｃ）アルキルチオ、（１〜６Ｃ）アルキルスルフィニル、（１〜６Ｃ）アルキルスルホニル、（１〜６Ｃ）アルキルアミノ、又はジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］アミノの１種以上で任意選択的に置換されているものから選択される置換基であり；
ｎは、０、１、又は２である）を有する。
【００４９】
一実施形態において、Ｒ１は、ホウ素原子に配位することができ、それにより、環状ボロン酸エステル（又は関連するホウ素含有リンカー）の安定性を高める置換基である。一実施形態において、Ｒ１は、アミノで置換された（１〜６Ｃ）アルキル、（１〜６Ｃ）アルキルアミノ、又はジ−［（１〜６Ｃ）アルキル］アミノである。他の実施形態において、Ｒ１はアミノで置換された（１〜４Ｃ）アルキルである。
【００５０】
一実施形態において、ペンダントボロン酸含有部分は次に示す構造式Ｉｂ：
【化５】
2019530643.tif 000006
（式中、
【化６】
2019530643.tif 000007
は、ヒアルロン酸モノマー単位の−Ｃ（＝Ｏ）−基への結合部を表し；
Ｘ１は、ＨＡモノマー単位に存在するカルボン酸基のＣ（Ｏ）原子に連結する官能基（例えば、−ＮＨ−又は−Ｏ−）であり；
Ｒ基は、それぞれ水素又は（１〜４Ｃ）アルキルから選択される）を有する。
【００５１】
さらなる実施形態において、ペンダントボロン酸含有部分は次に示す構造式Ｉｃ：
【化７】
2019530643.tif 000008
（式中、
【化８】
2019530643.tif 000009
は、ヒアルロン酸モノマー単位の−Ｃ（＝Ｏ）−基への結合部を表し；
Ｘ１は、−ＮＨ−又は−Ｏ−であり；
Ｒ３は、（１〜４Ｃ）アルキルである）を有する。
【００５２】
特定の実施形態において、ペンダントボロン酸含有部分は次に示す構造式Ｉｄ：
【化９】
2019530643.tif 000010
（式中、
【化１０】
2019530643.tif 000011
は、ヒアルロン酸モノマー単位の−Ｃ（＝Ｏ）−基への結合部を表す）を有する。
【００５３】
好適には、ＨＡポリマー骨格中に存在するモノマー単位の１〜３０％がペンダントボロン酸含有部分を含む。一実施形態において、ＨＡポリマー骨格中に存在するモノマー単位の５〜２０％がペンダントボロン酸含有部分を含む。さらなる実施形態において、ＨＡポリマー骨格中に存在するモノマー単位の８〜１５％がペンダントボロン酸含有部分を有する。さらなる実施形態において、ＨＡポリマー骨格に存在するモノマー単位の１０〜１５％がペンダントボロン酸含有部分を含む。
【００５４】
好適には、ＨＡポリマー骨格上に存在するモノマー単位の約１０％がペンダントボロン酸含有部分を含む。
【００５５】
抗癌剤
抗癌剤としては：
（ｉ）修飾ＨＡポリマーのボロン酸基に直接カップリングして本明細書に定義するホウ素含有結合を形成する抗癌剤、又は
（ｉｉ）修飾ＨＡポリマーのボロン酸基にカップリングすることができる好適なリンカー基を介してカップリングし、それによって本明細書に定義するホウ素含有結合を形成する抗癌剤、
のいずれかとすることができる、当該技術分野において知られている任意の好適な抗癌剤を用いることができる。
【００５６】
ボロン酸は、１，２−ジオールと反応することにより環状ボロン酸エステルを形成するか、又は１，２−ジアミンボロン酸アミドと反応するか、又はビシナルアミノアルコールと反応することにより構造的に関連のある環状ボロン酸アミドを形成することが知られている。これらはまた、類似の機構で１，３−ジケトンと反応することもできる。
【００５７】
例示的なボロン酸エステル及びボロン酸アミドの構造を次に示す。
【化１１】
2019530643.tif 000012
【００５８】
カテコール部分（１，２−ジヒドロキシベンゼン部分）を含む薬物又はこの種の部分を含むリンカー基に連結している薬物は、本発明の修飾ＨＡポリマーにカップリングさせるのに特に適している。
【００５９】
この種の部分を含む薬物分子の例としては、クエルセチン、タンニン酸、ピセアタンノール、タキシフォリン、カテキン、及び他の多くのフラボノイド類を含む天然化合物を挙げることができる。クルクミン及びその誘導体の多くは、中心にある１，３−ジケトンを介して結合することができる。
【００６０】
例えば、ジオール（例えば、カテコール）部分やジアミン部分等の好適なボロン酸結合性基（ｂｏｒｏｎｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を含まない薬物分子であっても、依然として、好適なボロン酸結合性部分を含むリンカー基を介してＨＡポリマーにカップリングさせることが可能であることが理解されるであろう。
【００６１】
リンカー基は、薬物分子に結合することができる官能基と、本発明のホウ素含有修飾ＨＡポリマーに結合することができる１，２−ジオール（例えば、カテコール）、１，２−ジアミン、又はビシナルアミノアルコール部分とを含む。好適なリンカー基の例としては、ドーパミン及びグルコース、マンノース、及びアスコルビン酸等の糖ジオールが挙げられる。
【００６２】
好適なボロン酸結合性基を含まない抗癌剤分子の例がチラパザミンであり、これは、好適なリンカー基、例えばドーパミンを介してＨＡポリマーに連結させることができる。
【００６３】
また、本発明の修飾ＨＡポリマーは、修飾ＨＡポリマーにカップリングするのに適した部分を含む、他の結合している分子を、酸性ｐＨを特徴とする環境に放出するのにも有用な可能性がある。この種の好適な分子としては、ピロカテコール、ピロガロール、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、及び２−ヒドロキシエストラジオール等の芳香族ジオール、又はグルコース、マンノース、及びアスコルビン酸等の糖ジオールを挙げることができる。
【００６４】
ポリマー−薬物コンジュゲート
本発明のポリマー−薬物コンジュゲートにおいて、抗癌剤は、ｐＨ依存性ボロン酸エステル結合又はボロン酸アミド結合によりヒアルロン酸に連結している。
【００６５】
好適には、この種の連結は、ボロン酸基を１，２−ジオール又は１，２−ジアミンと反応させることにより、本明細書において上述したボロン酸エステル結合又はボロン酸アミド結合を形成することによって形成される。
【００６６】
一実施形態において、薬物−ポリマーコンジュゲートは次に示す式ＩＩ：
【化１２】
2019530643.tif 000013
（式中、
Ｘ１及びＬは、それぞれ上に記載した定義のいずれか１つを有し；
Ｘ２は、Ｏ又はＮＨであり；
Ｒは上記と同義であり；
ｐは、ホウ素含有結合（例えば、ボロン酸エステル結合又はボロン酸アミド結合）を介して抗癌剤にカップリングしているＨＡモノマー単位の比率を表し；
ｑは、カップリングしていないペンダントボロン酸含有部分を有するＨＡモノマー単位の比率を表し；
ｕは、ペンダントボロン酸含有部分を含まないＨＡモノマー単位の比率を表す）を有する。
【００６７】
一実施形態において、Ｘ１は−Ｏ−又はＮＨ−である。他の実施形態において、Ｘ１は−ＮＨ−である。
【００６８】
一実施形態において、Ｌは、式：
【化１３】
2019530643.tif 000014
（式中、
実線の結合はＸへの結合部を表し、破線の結合はホウ素原子への結合部を表し；
Ｒ１及びｎは、本明細書において上に定義した通りである）で表される基である。
【００６９】
一実施形態において、Ｌは、
【化１４】
2019530643.tif 000015
（式中、
実線の結合はＸへの結合部を表し、破線の結合はホウ素原子への結合部を表し；
Ｒ１は、本明細書において上に定義した通りである）である。
【００７０】
一実施形態において、Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｒ３又は−ＣＨ２−ＮＨ２から選択される。
【００７１】
一実施形態において、Ｌは、
【化１５】
2019530643.tif 000016
（式中、
実線の結合はＸへの結合部を表し、破線の結合はホウ素原子への結合部を表す）である。
【００７２】
一実施形態において、Ｌは、
【化１６】
2019530643.tif 000017
（式中、
実線の結合はＸへの結合部を表し、破線の結合はホウ素原子への結合部を表す）である。
【００７３】
一実施形態において、ｐは０．５〜２０である。他の実施形態において、ｐは１〜１０である。他の実施形態において、ｐは３〜７である。他の実施形態において、ｐは４〜６である。他の実施形態において、ｐは５である。
【００７４】
一実施形態において、ｑは０．５〜２０である。他の実施形態において、ｑは１〜１０である。他の実施形態において、ｑは３〜７である。他の実施形態において、ｑは４〜６である。他の実施形態において、ｑは５である。
【００７５】
一実施形態において、ｕは６０〜９９である。他の実施形態において、ｕは７０〜９９である。他の実施形態において、ｕは８０〜９９である。他の実施形態において、ｕは８５〜９５である。他の実施形態において、ｕは９０である。
【００７６】
一実施形態において、ｐ＋ｑは１〜４０である。他の実施形態において、ｐ＋ｑは１〜３０である。他の実施形態において、ｐ＋ｑは１〜２０である。他の実施形態において、ｐ＋ｑは５〜１５である。
【００７７】
一実施形態において、薬物−ポリマーコンジュゲートは上に示した式ＩＩで表され、ｐ、ｑ及びｕの比は５：５：９０である。
【００７８】
好適には、Ｘ１は−ＮＨ−であり、Ｘ２は−Ｏ−であり、Ｌはフェニル等の連結基である。
【００７９】
一実施形態において、抗癌剤は、反応することによりボロン酸エステル結合を形成するカテコール部分を含む薬物（例えば、クエルセチン及びピセアタンノール）であるか、又はカテコール部分を含むリンカー基に連結している薬物分子である。
【００８０】
上に述べたように、環状ボロン酸エステル結合及び環状ボロン酸アミド結合は、標準的な生理学的ｐＨにおいては薬物が安定であるが、エンドソーム内及び／又は固形腫瘍の腫瘍細胞間の細胞間隙内、並びに低酸素腫瘍環境において生じている弱酸性条件下で容易に開裂することができるように、ｐＨ依存性を示す。
【００８１】
一実施形態において、抗癌剤は、低酸素条件下において抗癌作用が向上する薬物（例えば、チラパザミン）である。
【００８２】
本発明のポリマー−薬物コンジュゲートに好適な医薬的に許容される塩は、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム又はカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム又はマグネシウム塩）、アンモニウム塩、又は生理学的に許容される陽イオンを生成する有機塩基との塩、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリン、又はトリス（２−ヒドロキシエチル）アミンとの塩である。
【００８３】
本発明の特定のポリマー−薬物コンジュゲートは、例えば、水和形態等の溶媒和形態のみならず非溶媒和形態でも存在することができることも理解されたい。本発明はこの種のあらゆる溶媒和形態を包含することを理解されたい。
【００８４】
合成
本明細書に記載する合成方法の記載において提示する、溶媒の選択、反応雰囲気、反応温度、実験時間、及びワークアップ手順等のあらゆる反応条件は当業者により選択することができる。
【００８５】
分子の様々な部分に存在する官能性は、利用される試薬及び反応条件と適合性を有するものでなければならないことは有機合成の当業者に理解される。
【００８６】
必要な出発物質は有機化学の標準的な手順により得ることができる。この種の出発物質の調製を次に示す代表的な種々のプロセス及び添付の実施例と一緒に説明する。或いは、必要な出発物質は、例示した手順に類似の、有機化学者の通常の技術範囲内の手順により得ることができる。
【００８７】
本明細書に定義するプロセスにおいて本発明のポリマー−薬物コンジュゲートを合成する最中に、又は特定の出発物質を合成する最中に、特定の置換基を、それらが望ましくない反応を起こさないように保護することが望ましい場合がある。化学の当業者は、この種の保護が必要とされる場合、この種の保護基をどのように定位置に配置し、後に除去することができるかを理解しているであろう。
【００８８】
保護基の例については、この主題に関する多くの一般的な教科書の１つ、例えば、Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｇｒｅｅｎ著，‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’（出版社：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）を参照されたい。保護基は、対象とする保護基の除去に適した、文献に記載されているか又は化学の当業者に知られている任意の好都合な方法により除去することができ、この種の方法は、分子内に存在する他の基に及ぼされる影響を最小限に抑えながら保護基の除去が実施されるように選択される。
【００８９】
したがって、反応体が、例えば、アミノ、カルボキシ、又はヒドロキシ等の基を含む場合、本明細書に述べる反応の幾つかにおいて、この基を保護することが望ましいであろう。
【００９０】
本発明の合成プロセスは、抗癌剤分子に存在するボロン酸結合性部分又はそこに結合しているリンカーと、本明細書に定義する修飾ＨＡポリマー上に存在するペンダントボロン酸含有部分とを反応させることにより、ボロン酸エステル結合又はボロン酸アミド結合を形成することを含む。
【００９１】
この種の結合を形成する好適な技法は当該技術分野において知られており、添付の実施例においてさらに説明する。
【００９２】
さらに本発明は、本明細書に定義する合成手順により得られた、得ることができる、又は直接得られた、本明細書に定義するポリマー薬物−コンジュゲートも提供する。
【００９３】
医薬組成物
本発明のさらなる態様によれば、本明細書において上に定義したポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物を、医薬的に許容される希釈剤又は担体と一緒に含む、医薬組成物が提供される。
【００９４】
本発明の組成物は、非経口投与形態（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は筋肉内投与に適した滅菌水性又は油性エマルジョンとして）とすることができる。
【００９５】
本発明の組成物は当該技術分野において知られている従来の医薬用賦形剤を使用して従来の手順により得ることができる。したがって、経口用とすることが意図されている組成物は、例えば、１種以上の希釈剤、緩衝剤、及び／又は防腐剤を含むことができる。
【００９６】
増殖性疾患の治療に使用するための本発明のポリマー−薬物コンジュゲートの有効量は、癌の治療又はその進行の遅延に十分な量である。
【００９７】
単回投与剤形を製造するために１種以上の賦形剤と一緒に用いられる有効成分の量は、必然的に、治療される宿主及び具体的な投与経路に応じて変化することになる。例えば、ヒトに非経口投与することが意図された製剤は、例えば、活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）を０．５ｍｇ〜５ｇ含むことができる。
【００９８】
治療又は予防を目的とする本発明のポリマー−薬物コンジュゲートの投与量（ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｓｅ）は、必然的に、よく知られている医学の原則（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）に従い、治療すべき病状の性質及び重症度、動物又は患者の年齢及び性別、並びに投与経路に応じて変化することになる。
【００９９】
本発明の化合物を治療又は予防目的で使用する場合は、一般に、一日量が、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲となるように投与されることになり、必要に応じて、任意選択的に、分割投与される。一般に、非経口経路が採用される場合はより低い用量で投与されるであろう。したがって、例えば、静脈内又は腹腔内投与の場合、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量が一般に用いられるであろう。
【０１００】
治療的使用及び用途
本発明のポリマー−薬物コンジュゲートは癌の治療に使用することができる。これらは固形腫瘍の治療に特に適していると期待されている。加えてこれらは、予後が最も不良であり、転移傾向を有し、化学療法に対する耐性がより高いことが多いＣＤ４４が過剰発現している腫瘍（例えば、卵巣腫瘍（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，５（２０１５）３０５１）；腎細胞癌（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５  （２０１５）１３１５７）、乳癌（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ８  （２０１５）１１２８７）；非小細胞肺癌（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ７  （２０１４）３６３２））の治療に特に適していると期待されている。
【０１０１】
治療可能な癌の種類は、修飾ＨＡポリマーに結合している抗癌剤の性質、効力、及び作用機序に依存するであろう。
【０１０２】
したがって本発明は、癌の治療に使用するための、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート若しくはその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物、又は本明細書に定義する医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、癌はヒト癌である。
【０１０３】
他の態様において、本発明は、固形腫瘍の治療に使用するための、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート若しくはその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物、又は本明細書に定義する医薬組成物を提供する。
【０１０４】
他の態様において、本発明は、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物の、癌の治療に使用するための医薬の製造における使用を提供する。好適には、医薬はヒト癌の治療に使用するためのものである。
【０１０５】
他の態様において、本発明は、本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物の、固形腫瘍の治療に使用するための医薬の製造における使用を提供する。
【０１０６】
他の態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで細胞増殖を阻害する方法であって、細胞に有効量の本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物を接触させることを含む、方法を提供する。
【０１０７】
他の態様において、本発明は、癌の治療を必要とする患者にこのような治療を行う方法であって、上記患者に治療有効量の本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート若しくはその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物、又は本明細書に定義する医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０１０８】
他の態様において、本発明は、固形腫瘍の治療を必要とする患者にこのような治療を行う方法であって、上記患者に治療有効量の本明細書に定義するポリマー−薬物コンジュゲート若しくはその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物、又は本明細書に定義する医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０１０９】
投与経路
本発明の化合物、又は活性化合物を含む医薬組成物は、対象に全身投与／末梢投与又は局所投与（すなわち作用させたい部位に投与）のいずれであってもよい任意の従来の経路により投与することができる。
【０１１０】
併用療法
本明細書において上に定義した抗癌治療は、単独治療として行ってもよいし、或いは本発明のポリマー−薬物コンジュゲートに加えて、従来の外科手術、放射線治療、又は他の化学療法剤若しくは分子標的剤を用いる治療を併用してもよい。この種のさらなる治療は、次に示す抗腫瘍剤の分類の１種以上を含むことができる：
（ｉ）腫瘍内科にて使用される他の抗増殖／抗悪性腫瘍剤及びこれらの組合せ、例えば、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、及びニトロソウレア）；代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン、並びに葉酸代謝拮抗剤、例えば、フルオロピリミジン（５−フルオロウラシル及びテガフール等）、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、及びヒドロキシウレア）；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アドリアマイシン等のアントラサイクリン類、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、及びミトラマイシン）；有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビノレルビン等のビンカアルカロイド類、並びにタキソール及びタキソテール等のタキソイド類、並びにＰｏｌｏキナーゼ阻害剤）；並びにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド等のエピポドフィロトキシン、並びにテニポシド、アムサクリン、トポテカン、及びカンプトテシン）；
（ｉｉ）細胞分裂阻害剤、例えば、アンチオエストロゲンズ（ａｎｔｉｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）（例えば、タキモシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、及びヨードキシフェン（ｉｏｄｏｘｙｆｅｎｅ））、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、及び酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨ拮抗薬又はＬＨＲＨ作動薬（例えば、ゴセレリン、リュープロレリン、及びブセレリン）、プロゲストーゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール（ｖｏｒａｚｏｌｅ）、及びエキセメスタン）、及び５α−還元酵素阻害剤（フィナステリド等）；
（ｉｉｉ）抗浸潤阻害剤［例えば、４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際公開第０１／９４３４１号パンフレット）、Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ、ＢＭＳ−３５４８２５；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４７，６６５８−６６６１）、及びボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）等のｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤、並びにマリマスタット等のメタロプロテイナーゼ阻害剤、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤、又はヘパラナーゼの抗体］；
（ｉｖ）増殖因子機能の阻害剤：例えば、この種の阻害剤として、増殖因子抗体及び増殖因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体であるトラスツズマブ［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）］、抗ＥＧＦＲ抗体であるパニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体であるセツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２２５］、及びＳｔｅｒｎらによりＣｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ．５４，ｐｐ．１１−２９に開示されたいずれかの増殖因子又は増殖因子受容体抗体）が挙げられ；この種の阻害剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮細胞成長因子ファミリーの阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ７７４）、及び６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ  １０３３）等のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブ等のｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤）；肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤；インスリン増殖因子ファミリーの阻害剤；イマチニブ及び／又はニロチニブ（ＡＭＮ１０７）等の血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤；セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤等のＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤、例えば、ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６）、ティピファルニブ（Ｒ１１５７７７）、及びロナファーニブ（ＳＣＨ６６３３６））、ＭＥＫ及び／又はＡＫＴキナーゼを介した細胞シグナル伝達の阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｐｌｔ３キナーゼ阻害剤、ＣＳＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体（インスリン様成長因子）キナーゼ阻害剤；オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８、及びＡＸ３９４５９）、並びにＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４阻害剤等のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤も挙げられる；
（ｖ）血管内皮細胞増殖因子の作用を阻害するもの等の抗血管新生剤［例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体であるベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））及び、例えば、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、バンデタニブ（ＺＤ６４７４）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、スニチニブ（ＳＵ１１２４８）、アキシチニブ（ＡＧ−０１３７３６）、パゾパニブ（ＧＷ７８６０３４）、及び４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１；国際公開第００／４７２１２号パンフレットの実施例２４０）、例えば、国際公開第９７／２２５９６号パンフレット、国際公開第９７／３００３５号パンフレット、国際公開第９７／３２８５６号パンフレット、及び国際公開第９８／１３３５４号パンフレット等に開示されている化合物）、並びに他の機序で作用する化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、及びアンジオスタチン）］；
（ｖｉ）コンブレタスタチンＡ４等の血管破壊剤（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄａｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、並びに国際公開第９９／０２１６６号パンフレット、国際公開第００／４０５２９号パンフレット、国際公開第００／４１６６９号パンフレット、国際公開第０１／９２２２４号パンフレット、国際公開第０２／０４４３４号パンフレット、及び国際公開第０２／０８２１３号パンフレットに開示されている化合物；
（ｖｉｉ）エンドセリン受容体拮抗剤、例えば、ジボテンタン（ＺＤ４０５４）又はアトラセンタン；
（ｖｉｉｉ）ＨＳＰ９０阻害剤（例えば、ゲルダナマイシン、ラディシコール、又は１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ））；
（ｉｘ）アンチセンス治療、例えば、上に列挙した標的を指向する、ＩＳＩＳ  ２５０３（抗ｒａｓアンチセンス）等；
（ｘ）遺伝子治療アプローチ、例えば、変異ｐ５３又は変異ＢＲＣＡ１若しくはＢＲＣＡ２等の異常遺伝子を置換するアプローチ、ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ、例えば、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、又は細菌由来のニトロ還元酵素を用いるもの等、並びに患者の化学療法又は放射線療法に対する耐容性を高めるためのアプローチ（多剤耐性遺伝子療法等）；並びに
（ｘｉ）免疫療法的アプローチ、例えば、患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるｅｘ  ｖｉｖｏ  及び  ｉｎ  ｖｉｖｏアプローチ（インターロイキン２、インターロイキン４、又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子等のサイトカインの導入等）、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインを導入した樹状細胞等の遺伝子導入免疫細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ）を用いるアプローチ、サイトカインを導入した腫瘍細胞株を用いるアプローチ、並びに抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチ等。
【０１１１】
この種の併用治療（ｃｏｎｊｏｉｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、治療の個々の成分を同時に、順次、又は別々に投与することにより達成することができる。このようなコンビネーション製品（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ）は、本明細書において上に述べた範囲の用量の本発明のポリマー−薬物コンジュゲートと、承認されている範囲の用量の他の医薬活性を有する薬剤とを使用するものである。
【０１１２】
本発明のこの態様によれば、本明細書において上に定義した本発明のポリマー−薬物コンジュゲート又はその医薬的に許容される塩若しくは溶媒和物と、他の抗腫瘍剤とを含む、癌（例えば、固形腫瘍を伴う癌）の治療に使用するのに好適な組合せが提供される。
【０１１３】
本明細書において、「併用（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」、「組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」、「コンビネーション（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」という語が使用される場合、これは、同時に、別々に、又は順次投与することを指すと理解されたい。本発明の一態様においては、「併用」、「組合せ」、「コンビネーション」は同時に投与することを指す。本発明の他の態様において、「併用」、「組合せ」、「コンビネーション」は別々に投与することを指す。本発明のさらなる態様において、「併用」、「組合せ」、「コンビネーション」は順次投与することを指す。投与が順次又は別々に行われる場合、第２成分の投与の遅延により、併用の有利な効果を失うことなどがないようにすべきである。
【０１１４】
次に示す図面については後述する実施例項において言及する。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図面左：未修飾のヒアルロン酸（下）及びＨＡＢ（上）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである；差し込み図は後者のスペクトルの芳香族領域の拡大図であり、灰色のバーは水のシグナルに重ねている。図面右：ＨＡＢの構造を示しており、数字はＮＭＲスペクトルで観測されたプロトンの位置に対応する。典型的な例では、修飾単位及び未修飾単位の個数の比であるｎ／ｍ＝０．３１６（２４：７６）である。
【図２】ＦＡ−ＨＡＢ／ローダミン−ドーパミン（ＦＲＥＴ受容体）複合体のＦＲＥＴ効果のｐＨ依存性を示すものである。蛍光シグナルはλｅｘ＝４８０ｎｍ及びλｅｍ＝５６０ｎｍで観測した。
【図３】３７℃で異なる濃度のＡ：平均分子量が２００ｋＤａである未修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）；Ｂ：ボロン酸基（ｂｏｒｏｎｉｃ  ｇｒｏｕｐ）で誘導体化したＨＡ（ＨＡカルボン酸残基の２４％、ＨＡＢ）；Ｃ：最終巨大分子プロドラッグを得るためにさらにクエルセチンで誘導体化したＨＡＢ（材料１グラム当たりクエルセチン０．３９６ｍｍｏｌ、ＨＡＢＱ）；Ｄ：クエルセチンに曝露してから２４、４８、及び７２時間後のＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の生存率（黒色の印）を、ＨＡＢＱ（白抜きの印）と比較して示したものである。最後のグラフの横軸は遊離形態又は結合形態にある薬物のモル濃度を示しており；ＨＡＢＱ骨格と共役した結果として、ＩＣ５０は少なくとも１桁上昇することに注目されたい。
【図４】Ａ：ＦＡ−ＨＡＢＱのＬＮＣａＰ細胞株への取り込み量の経時変化を示すものである。１００％のラインはＦＡ−ＨＡＢＱの０．３ｍｇ／ｍＬ溶液の蛍光発光に相当する。８時間後には定常状態に到達し、少なくとも２４時間後まで維持されるが、これはＣＤ４４により媒介されるＨＡ誘導体の細胞内移行に典型的なものである。Ｂ〜Ｅ：０．３ｍｇ／ｍＬのＦＡ−ＨＡＢＱに０．５（Ａ）、２（Ｂ）、４（Ｃ）、及び２４（Ｄ）時間接触させた後のＬＮＣａＰ細胞株の共焦点画像を示すものである。緑色の途切れた蛍光は取り込まれた粒子に相当し、インキュベーションを行う間に周辺部から移行して中心部（核周囲）に局在していることが明らかである。
【図５】抗ヒトＣＤ４４ｖ６抗体を前投与せずに（Ａ）、又は前投与してから（Ｂ）ＦＡ−ＨＡＢＱと２時間接触させた後のＬＮＣａＰ細胞株の共焦点画像である。Ｂに緑色の蛍光が認められないことが、ＨＡＢＱの細胞内移行がＣＤ４４に媒介されるという性質を実証している。
【図６Ａ】Ａ、Ｃ、及びＥ：前立腺癌マウスに蛍光標識した（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）プロドラッグ（Ａ：ＦＡ−ＨＡＢＱ；Ｂ：ＦＡ−ＨＡＢＰ）又はヒアルロン酸担体構造体（Ｃ：ＦＡ−ＨＡＢ）を２４時間全身投与した後の、様々な臓器における注射量に対する重量％を示すものである。投与量の約３０％は依然として循環しているはずであることに留意されたい。Ｂ、Ｄ、及びＦ：臓器内のＦＡ−ＨＡＢＱ（Ｂ）、ＦＡ−ＨＡＢＰ（Ｄ）、及びＦＡ−ＨＡＢ（Ｆ）の対応する濃度。例えば、腫瘍内のＨＡＢＱ濃度は、クエルセチン濃度としておおよそ２０〜４０ｎＭ相当になることに留意されたい。
【図６Ｂ】図６Ａ参照。
【図６Ｃ】図６Ａ参照。
【図７】Ａ：ヒト前立腺癌を移植したマウスのクエルセチン投与時間及び量に対する腫瘍体積を示すものである。矢印は、プロドラッグアプローチの有効性を視覚的に比較するために、クエルセチンの総濃度が同じである処方を比較できるようにしたものである。Ｂ：遊離クエルセチンを使用した場合に記録された腫瘍体積を、クエルセチン総濃度が同一であるＨＡＢＱを使用して得られた腫瘍体積で除した数値である。結果として得られた腫瘍体積の差はプロドラッグアプローチの有効性を定量的に示唆しており、数値が高いほど有効性が高いことを示唆している。
【図８】ヒト癌細胞株を、シトクロムＰ４５０還元酵素の産生という観点でスクリーニング（ウエスタンブロット）したものである；様々な癌細胞株をコンジュゲートに３時間曝露した後のＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡの毒性を、ＴＰＺ基のモル濃度に関し（対応するＩＣ５０値として表して）示したものである。
【図９】常酸素（空気）条件及び低酸素（０．１％酸素）条件の両方でＴＰＺ−ＤＯＰＡに３時間曝露した後の８種の癌細胞株の７２時間後の生存率を、対照と比較した細胞生存率で表したものである。
【図１０】常酸素（空気）条件及び低酸素（０．１％酸素）条件の両方でＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡに３時間曝露した後の８種の癌細胞株の７２時間後の生存率を、対照と比較した細胞生存率で表したものである。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
実施例
以下に示す実施例において、ａ）カテコール基を含み、ｂ）公知の化学療法活性を有し、ｃ）不溶性に加えて腎毒性を有することに起因して治療能力が乏しく；今日に至るまで、これらの問題が一部しか解決されていない（例えば、リポソーム製剤１を用いることによる）、クエルセチンをモデル薬物として採用した。実施例５においてはピセアタンノール（固形腫瘍における集積）も、及び実施例８においてはクルクミンも使用した。ＨＡＢに共役させることができる低酸素活性化型抗癌剤の例としてチラパザミンを使用した（実施例７）。
【０１１７】
実施例１−クエルセチンの巨大分子プロドラッグの調製
概要
次に示す手順は、平均分子量が２００ｋＤａであるヒアルロン酸をベースとする巨大分子プロドラッグの調製を例示するものであり、クエルセチンの担持量は０．３９６ｍｏｌ／ｇ材料である。他の分子量、クエルセチン担持量、又はクエルセチン／ボロネート（ｂｏｌｏｎａｔｅ）の比は、調製条件を分かりやすい形で変化させることにより容易に調製することができる。
【０１１８】
方法
蛍光標識されていないボロン酸化ＨＡ（ＨＡＢ）
ヒアルロン酸（粘度計による平均分子量：２００ｋＤａ）４０ｍｇ（カルボン酸基１００μｍｏｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶解した。この溶液に４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド２８ｍｇ（ＤＭＴＭＭ、１００μｍｏｌ）を加えた。１０分後、この混合物に８．６ｍｇ／ｍＬの３−アミノフェニルボロン酸（３−ＡＰＢＡ、４９．６μｍｏｌ）の水溶液１ｍＬを加え、室温で一夜撹拌した。生成物を冷エタノール中で析出させ、次いで、過剰のＤＭＴＭＭ、副生成物、及び未反応の３−ＡＰＢＡを除去するために、再生セルロース（ＲＣ）製Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜チューブ（ＭＷＣＯ＝１０，０００ｇ／ｍｏｌ）を用いて蒸留水で透析した。透析液の電気伝導度の降下を認めたら透析は完了であり、最後にこの材料を凍結乾燥させた。平均収率（回収した材料の重量／回収可能な材料の重量）＝７５〜８５％であった。ＮＭＲスペクトルから３−ＡＰＢＡのピーク及びＨＡのアセチルピークの下側の面積を積分し、基準ピークとしてＨＡのアセチル基及び試料ピークとしてＡＰＢＡの芳香族シグナルを用いて、これらの積分値を次式に従い比較することにより誘導体化率を得た：
【数１】
2019530643.tif 000018
【０１１９】
カルボン酸基の２４％がボロン酸で修飾された（１Ｈ−ＮＭＲ分析）。これは材料１グラム当たりボロネートが０．５６ｍｍｏｌであることに相当する。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝７．７６−７．８１（Ｈ２＊），７．４９−７．６（Ｈ４＊及び６＊），７．３６−７．４２（Ｈ５＊），４．３−４．５（Ｈ１及び７），３．１−３．８（Ｈ２から６まで及び８から１１まで），１．８−１．９ｐｐｍ（Ｈ１２）．
【０１２０】
蛍光標識されたボロン酸化ＨＡ（ＦＡ−ＨＡＢ）
ＨＡＢＱを５０ｍｇを蒸留水４０ｍＬに溶解し、ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）で希釈した。フルオレセインアミン２５ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）、アセトアルデヒド２５μＬ（０．９μｍｏｌ）、及びシクロヘキシルイソシアニド２５μＬ（０．２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１００μＬ）に溶解した溶液をＨＡＢＱ溶液に加えた。一夜撹拌した後、ポリマーを冷エタノール中で３回析出させ（フルオレセインの蛍光が消失する）、凍結乾燥させた。収率：８０〜８５％（重量）。標識化度は４８５±２０ｎｍ（励起）及び５２８±２０ｎｍ（蛍光）のフィルタを使用してフルオリメトリカリー（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）に測定し、較正は遊離フルオレセインアミンで行った。カルボン酸基全体の０．２９％がペンダント蛍光物質で修飾されていた。
【０１２１】
クエルセチン巨大分子プロドラッグ（ＨＡＢＱ）
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）にＨＡＢが４ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液５ｍＬ（全体でボロネート１１μｍｏｌ）と、ＤＭＳＯ（１０％ｖ／ｖ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ８）にクエルセチンが２．１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液５ｍＬとを混合した（クエルセチン３４μｍｏｌ、クエルセチン／ボロネートのモル比３：１に相当）。この溶液を３０分間撹拌した後、未反応のクエルセチンを冷エタノール中で析出させることにより除去した。エタノールを蒸発させた後、ＨＡＢＱを蒸留水５ｍＬに溶解し、凍結乾燥させた。ポリマーに担持された薬物の量は、まずクエルセチンをポリマー構造から放出させ（ポリマー１ｍｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４）１ｍＬに溶解）、次いで遊離したクエルセチンの量を、ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×２５０ｍｍ）及び３７０ｎｍを検出するＵＶ検出器を取付けたＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズ、文献２に記載）にて、較正曲線を利用して求めることにより決定した。クエルセチン担持量：材料１グラム当たりクエルセチン０．３９６ｍｍｏｌ（ボロン酸残基の７０％が修飾）。
【０１２２】
同様に、ＨＡＢをＦＡ−ＨＡＢに替えて、蛍光標識した巨大分子プロドラッグ（ＦＡ−ＨＡＢＱ）を調製した。
【０１２３】
ピセアタンノール巨大分子プロドラッグ（ＨＡＢＰ）
ＨＡＢ（全体でボロネート１１μｍｏｌ）を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）に４ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液５ｍＬと、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８．６）にピセアタンノールを１．６ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液５ｍＬとを混合した（ピセアタンノール３３μｍｏｌ、ピセアタンノール／ボロネートのモル比３：１に相当）。この溶液を３０分間撹拌した後、未反応のピセアタンノールを冷エタノール中で析出させることにより除去した。エタノールを蒸発させた後、ＨＡＢＰを蒸留水５ｍＬに溶解し、凍結乾燥させた。ポリマーに担持された薬物の量を、まずポリマー構造からピセアタンノールを放出させ（ポリマー１ｍｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４）１ｍＬに溶解）、次いで遊離したピセアタンノールの量をＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×２５０ｍｍ）及び３２５ｎｍを検出するＵＶ検出器を取付けたＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズ、文献２に記載）にて、較正曲線を利用して求めることにより決定した。ピセアタンノール担持量：材料１グラム当たりピセアタンノール０．４３８ｍｍｏｌ（ボロン酸残基の７７％が修飾）。
【０１２４】
同様に、ＨＡＢをＦＡ−ＨＡＢに替えて、蛍光標識した巨大分子プロドラッグ（ＦＡ−ＨＡＢＰ）を調製した。
【０１２５】
実施例２−新規化学物質がカテコールをベースとする化合物を酸性ｐＨで放出することが可能であるという基本原理の実証
概要
次に示す実施例は、酸性ｐＨにより、カテコールとボロネート含有ヒアルロン酸（ＨＡＢ）との複合体からカテコールを遊離形態で放出させるように誘導することができることを示すものである。
【０１２６】
本発明者らは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）供与体（フルオレセイン）をボロン酸含有巨大分子に導入し、ＦＲＥＴ受容体（ローダミン）をカテコールに導入し、巨大分子モデル化合物におけるカテコール／ボロネート複合体の形成に参加する２つの基の空間的近接の指標としてＦＲＥＴ効率を用いた。ＦＲＥＴが起こると、フルオレセインの励起に伴いローダミンの発光が５６０ｎｍで観測されることになる。
【０１２７】
方法
ＦＲＥＴ受容体としてのカテコールを有する蛍光物質の調製
文献手順３に従い、ドーパミン塩酸塩を蛍光物質であるローダミンイソチオシアナートに非酸化性条件下で共役結合させた。得られた構築物をドーパミン−ローダミンコンジュゲートと称する。まずメタノール及び他の必要な溶液を、ドーパミンを酸化から保護するために脱気した。ドーパミン塩酸塩（３７．９ｍｇ／２０μｍｏｌ）を脱気したメタノール１０ｍＬに溶解し、過剰のトリエチルアミン（６０μＬ／４０μｍｏｌ）を添加することにより遊離塩基形態に変換し、溶液をアルゴン中で３０分間撹拌した。次いでローダミンイソチオシアナート（１０６ｍｇ／２０μｍｏｌ）を溶液に加え、混合物を室温で４時間撹拌したまま放置した。
【０１２８】
巨大分子モデル化合物の調製
ＦＡ−ＨＡＢを２０ｍｇ（ボロネート基０．０２４ｍｍｏｌに相当）を脱気した１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）２５ｍＬに溶解した。０．７ｍｇ／ｍＬのＦＲＥＴ受容体溶液１０ｍＬ（カテコール０．０４０ｍｍｏｌに相当）を３０分間かけて滴下した。次いで反応混合物を７日間に亘り（透析液中にローダミンの蛍光が認められなくなる）、アルゴンを通気しながら蒸留水で透析することにより精製した（分画分子量５ｋＤ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。最後に溶液を凍結乾燥させることにより生成物１５ｍｇを得た。
【０１２９】
ＦＲＥＴ実験
手順
巨大分子モデル化合物を、濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．７及び５）、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６、７、及び７．５）、トリス緩衝液（ｐＨ８及び８．５）に溶解した。９６ウェル黒色プレート上で、励起に４８０ｎｍ±１０（フルオレセインの励起波長ピーク）を使用し、５６０ｎｍ±１０（ローダミンの発光波長ピーク）の発光強度を測定することによりＦＲＥＴ測定を行った。測定はＩ  ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアを搭載したＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００プレートリーダーを用いて２５℃で行った。
【０１３０】
考察（図２参照）
ＦＲＥＴ効果はｐＨの低下に伴い大幅に低下し、カテコール含有分子の放出が酸性ｐＨにより誘導されることを示している。
【０１３１】
実施例３−新規化学物質が安全であるという基本原理の実証
概要
次に示す実施例は、担体構造（ＨＡＢ）の細胞毒性が非常に低いことと、クエルセチンが結合形態に維持されているのであれば、すなわち構築物が中性のｐＨに維持されているのであれば、クエルセチン含有高分子プロドラッグ（ＨＡＢＱ）の毒性も低いこととを示すものである。
【０１３２】
この実験に使用する巨大分子プロドラッグは、粘度計による平均分子量が２００ｋＤａであるヒアルロン酸をベースとし、材料１グラム当たりボロン酸単位を０．５６５ｍｍｏｌ有し、材料１グラム当たりクエルセチン０．３９６ｍｍｏｌを担持したものである（ボロン酸／クエルセチンのモル比１：０．７）。
【０１３３】
方法
ＨＡＢＱの細胞毒性を前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ細胞株）で評価した。製造業者（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の指示に従い、改変ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルジアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］法にてそのミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を評価した。９６ウェルプレートに、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、及び２ｍＭＬグルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を入れ、前立腺癌細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下に３７℃で播種した。改変ＭＴＴアッセイを用いて、２４、４８、及び７２時間後の細胞毒性を、巨大分子プロドラッグ濃度に応じて評価した。インキュベーション時間が終了したら、細胞をｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄し、ＭＴＴ溶液１００μＬ（細胞培養培地中０．５ｍｇ／ｍＬ）と一緒に３７℃で４時間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００プレートリーダーにてＩ−ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアを使用し、波長４５０ｎｍの吸光度を読み取った。相対的な細胞生存率（％）を、式［Ａ］試験品／［Ａ］対照品×１００（「［Ａ］試験品」は試料の吸光度であり、「［Ａ］対照品」は培養培地のみでインキュベートした対照細胞の吸光度である）を用いて算出した。細胞毒性を評価した後、総タンパク質含量を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。簡潔に説明すると、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、細胞溶解バッファー（０．５％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳ）１５０μＬ中で１５分間インキュベートし、ここにＭｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット試薬１５０μＬ（製造業者の指示に従い調製）を添加した。最後にプレートリーダーで５６２ｎｍの吸光度を測定した。次いで、細胞毒性の測定値を各ウェルの総タンパク質含有量で規格化した。
【０１３４】
考察（図３参照）
Ａ）癌細胞を、７．５ｍｇ／ｍＬまでの濃度のＨＡＢＱと一緒に、又はその非存在下に、２４、４８、及び７２時間インキュベートした後、細胞培養液のｐＨを測定したところ、その存在の有無に関わらず、２４及び４８時間後のｐＨ値は７．８であり、７．５ｍｇ／ｍＬの濃度のプロドラッグと７２時間接触させた後は７．５となった。したがって、このＨＡＢＱを用いた実験において、クエルセチンは基本的に巨大分子プロドラッグとしてのみ存在し（酸性ｐＨではないため、遊離した薬物としては存在しない）と推測され得る。
【０１３５】
Ｂ）ＨＡ担体構造（ＨＡＢ）は高濃度まで毒性が無視できる（７２時間インキュベートした後でさえもＩＣ５０＞＞８ｍｇ／ｍＬである）ことが示されており、これは、担体構造自体が生物学的に良性と見なすことができることを意味している。
【０１３６】
Ｃ）巨大分子プロドラッグＨＡＢＱは低毒性である（インキュベーション時間が４８時間までであればＩＣ５０≒５〜７．５ｍｇ／ｍＬ）ことが示されたが、一方、７２時間後には生存率がかなり低下した（ＩＣ５０＝１〜１．５ｍｇ／ｍＬ）。このＩＣ５０値は、総クエルセチン濃度が０．５ｍＭ（７２ｈ）及び＞２ｍＭ（２４ｈ）の間にあることに相当する。
【０１３７】
他方、遊離クエルセチンは毒性がはるかに高く、ＩＣ５０値は、通常、ＨＡＢＱで測定された値よりも１〜３桁低く：ＮＣＩ−Ｈ２０９肺癌細胞においては５μＭ（２４ｈ）４、ＭＣＦ７乳癌細胞においては１０μＭ（７２ｈ）５、１６−Ｆ１０メラノーマ細胞においては２０μＭ（７２ｈ）６、ＨＫ１、及びＣ６６−１扁平上皮癌細胞においては１５０〜２００μＭ（７２ｈ）７である。したがって、ＨＡＢＱは、巨大分子プロドラッグ形態が良性の性質を有することに由来して毒性が低くなると結論付けられる。
【０１３８】
実施例４−新規化学物質が腫瘍細胞株のＣＤ４４を標的にするという基本原理の実証
概要
次に示す手順は、クエルセチンを含有する巨大分子プロドラッグ（ＨＡＢＱ）が腫瘍細胞に取り込まれ、ヒアルロン酸と同一のレセプター（ＣＤ４４）が媒介する細胞内移行機序を利用することを示すものである。
【０１３９】
この検討にはＢ項（ｐｏｉｎｔ  Ｂ）で説明したものと同一のＦＡ−ＨＡＢＱ誘導体を使用した。
【０１４０】
取り込みの定量化
方法
ＬＮＣａＰ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、Ｌ−グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下に３７℃で培養した。取り込み実験を行うために、２４ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで播種し、２４時間増殖させた。次いで培地を、ＦＡ−ＨＡＢＱを培養培地に０．３ｍｇ／ｍＬで含む溶液０．１ｍＬに交換し、０．５〜２４時間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、規定の時間が経過した後、上清を除去することにより実験を停止し、細胞を１０ｍＭＰＢＳで３回洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加した０．２ＮのＮａＯＨを０．１ｍＬで細胞を溶解した。細胞溶解液の蛍光を分析（λｅｘｃ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５３５ｎｍ）し、細胞溶解液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／０．２Ｎ  ＮａＯＨ溶液１ｍＬに１０６個の未処理細胞を溶解したもの）に０．００１〜０．６ｍｇ／ｍＬのＦＡ−ＨＡＢＱを分散させた分散液で較正を行うことにより、膜に結合し細胞内移行したＦＡ−ＨＡＢＱを定量化した。
【０１４１】
考察
ＦＡ−ＨＡＢＱの取り込みが約８時間後に定常状態に到達した（図４Ａ）。この飽和現象はＨＡ含有物質に共通している。これは、ＨＡレセプター、特にＣＤ４４が再利用されないことに起因しており、そのため、２４〜３６時間以内に細胞表面から消失する。したがって、このデータは、癌細胞においてレセプターが媒介する細胞内移行が起こっていることを示唆している。
【０１４２】
画像化及び競合的阻害
方法
ＬＮＣａＰ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、Ｌ−グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下に３７℃で培養した。その後、２４ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで播種し、２４時間増殖させた。次いで培地を、１／２００に希釈した抗ヒトＣＤ４４ｖ６抗体ＩｇＧ１（ｃｌｏｎｅ  ＶＦＦ７、Ａｂｃａｍ、原液濃度１ｍｇ／ｍＬ）に交換し、１時間経過させた。次いでウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最後に培地を、ＦＡ−ＨＡＢＱを０．３ｍｇ／ｍＬで含む培養培地に交換し、２時間インキュベートした。
【０１４３】
次いで、細胞をＰＢＳで３回十分に洗浄し、２．５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで２０分間固定化した。コンカナバリンＡ−テトラメチルローダミンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにして膜染色を行った。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０分間ブロックし、ＰＢＳで３回洗浄した。データ取得用のＥＺ−Ｃ１ソフトウェアを搭載し、６０×油浸対物レンズを取付けた共焦点顕微鏡（Ｃ１  Ｎｉｋｏｎ）を使用し、巨大分子プロドラッグの励起／発光波長を４９２／５１８ｎｍとし、細胞膜の励起／発光波長を５５５／５８０ｎｍとして画像化した。
【０１４４】
考察
ＦＡ−ＨＡＢＱの蛍光（図４Ｂ〜Ｅの緑色）は早い段階で細胞内区画の周囲に結合していることが視認され（０．５〜４ｈ、図４Ｂ〜Ｄ）、一方、２４時間後（図４Ｅ）には、より中心に近く、おそらくリソソームに局在していることが認められた。最後に（図５Ａ及びＢ）、ＣＤ４４ｖ６抗体とプレインキュベーションすることによってプロドラッグの取り込みが完全に遮断されており、したがって、最終的に、ＨＡＢＱはＣＤ４４に依存する形で取り込まれることが実証された。
【０１４５】
実施例５−新規化学物質が固形腫瘍に集積する基本原理の実証
概要
次に示す実施例は、クエルセチン−又はピセアタンノール含有巨大分子プロドラッグ（ＨＡＢＱ）が、免疫不全のげっ歯類モデルに異所的に移植したヒトの腫瘍性組織に優先的に集積することを例示するものである。この集積量は、薬物を含まない担体構造（ＨＡＢ）よりも大幅に高い。
【０１４６】
注記：ピセアタンノールは抗白血病作用を持つことが実証されているカテコールを含む化合物であるが、代謝産物でもあり、おそらく、癌予防薬としてよく知られているレスベラトロールの活性も担っている８、９。
【０１４７】
方法
ＬＮＣａＰ細胞１×１０６個を生理食塩水１００μＬに懸濁させた懸濁液を、無胸腺ヌードマウス（７週齢、２０〜２５ｇ）の背側の皮下空間に注射することにより担腫瘍マウスを作製した。腫瘍を適度に増殖させてから１４日後、ＦＡ−ＨＡＢＱ（材料１グラム当たりクエルセチン０．３９６ｍｍｏｌ、ボロン酸／クエルセチンのモル比１：０．７）、ＦＡ−ＨＡＢＰ（材料１グラム当たりピセアタンノール０．４３８ｍｍｏｌ、ボロン酸／ピセアタンノールのモル比１：０．８）、及びＦＡ−ＨＡＢを担腫瘍マウス（ｎ＝１０匹／群）の尾静脈に１０ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した。これはクエルセチン３．９６μｍｏｌ又はピセアタンノール４．３８μｍｏｌ／ｋｇ体重に相当する。２４時間後に動物を屠殺し、腫瘍、脾臓、心臓、肝臓、肺、腎臓を摘出し、重量を測定し、５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液中で１時間溶解し、蛍光強度を解析するために処理した。数値は、組織１ｇ当たりの蛍光標識巨大分子プロドラッグのμｇ数として（図６、Ａ）、及び臓器毎の注入量に対する割合（％ＩＤ／臓器）（図６、Ｂ）として表したものであり、５ｍｇ／ｍＬ〜０．０５μｇ／ｍＬまでの濃度範囲のＦＡ−ＨＡＢＱの検量線を用いた規格化処理に基づき算出した。
【０１４８】
考察
高分子プロドラッグ及びボロン酸化ＨＡ担体は、両方共、心組織及び肺組織には有意に集積せず、腎臓及び脾臓において少量が確認され、その一方で、腫瘍性組織及び肝臓において最も高い集積量が記録された。
【０１４９】
まず第１に、高分子プロドラッグと遊離薬物の間に大きな薬物動態学的相違がある：クエルセチン１０、１１及びピセアタンノール８は高い腎及び肺集積性を示す１０、１１。第２に、高分子プロドラッグの分布は、他のどの臓器よりも肝臓に優先的に局在するＨＡの分布に依存するようであり１２−１４、固形腫瘍中においても同様の挙動をする１５、１６。しかしながら、ＨＡ担体は単独では肝臓により多量に集積する一方で、プロドラッグが最も多量に局在するのは腫瘍であることが示された。
【０１５０】
実施例６−新規化学物質が抗腫瘍効果及びその遊離薬物を超える利点を示す基本原理の実証
次に示す実施例は、クエルセチン含有巨大分子プロドラッグ（ＨＡＢＱ）が、免疫不全のげっ歯類モデルに異所的に移植した腫瘍の増殖を有意に低下させることを示すものである。この低下の度合いは遊離クエルセチンを用いた場合よりも大幅に高い。この効果と送達処方の毒性が大幅に低いこととが複合化している。
【０１５１】
方法
ＬＮＣａＰ細胞１×１０６個を生理食塩水（１００μＬ）に懸濁させた懸濁液を無胸腺ヌードマウス（７週齢、２０〜２５ｇ）の背側の皮下空間に注射することにより担腫瘍マウスを作製した。腫瘍を適度に増殖させてから１４日後、担ＬＮＣａＰマウスを８群に分けた（ｎ＝各群１０匹）。腫瘍体積が９０ｍｍ３に達したら処置を開始した。次いでマウスに、次に示す溶液２００μＬを静脈内投与した：ＨＡＢＱ（ＨＡ分子量：２００ｋＤａ；材料１グラム当たりクエルセチン０．３９６ｍｍｏｌ担持；ボロン酸／クエルセチンのモル比１：０．７）を、投与量が２５及び５０ｍｇ／ｋｇ（それぞれクエルセチン３及び６ｍｇ／ｋｇに相当）となるように含むＰＢＳ；１１％ｗｔ．ＤＭＳＯを含み、遊離クエルセチンを、投与量が３、６、２５ｍｇ／Ｋｇとなるように含むＰＢＳ；ＨＡＢを、投与量が５０ｍｇ／Ｋｇとなるように含むＰＢＳ；並びに１１％ｗｔ．ＤＭＳＯを含むＰＢＳ。静脈内注射による尾静脈投与を３日毎に計２１日間行うことによって処置し、次いで実施中の倫理に関する法令に則り、文献方法１に従って屠殺した。処置期間中、腫瘍サイズを長径及びそれと直交する径をノギスで測定することにより求めた。腫瘍体積を次式に従い算出した：Ｖ＝ａ×ｂ２×０．５２（ａは文献手順１７による表面の最大径であり、ｂは表面の最小径である）。
【０１５２】
考察
腫瘍の増殖速度の低下は、採用した両方のＨＡＢＱ投与量（クエルセチンの投与量が３及び６ｍｇ／ｋｇに相当）で特に顕著であり、一方、遊離クエルセチンは投与量２５ｍｇ／ｋｇでしかこれに匹敵する結果を得ることができなかった（図７Ａ）。プロドラッグの効力及び遊離薬物の効力を比較すると、クエルセチン投与量が等しければ、プロドラッグアプローチによって２倍（３ｍｇ／ｋｇ投与）又は４倍（６ｍｇ／ｋｇ）優れた結果が得られることが明らかとなった。
【０１５３】
実施例７−低酸素状態で活性化可能な基とコンジュゲートさせると巨大分子プロドラッグを形成した後もその応答活性を維持し続けるという基本原理の実証
概要
次に示す実施例は、低酸素状態において高い毒性を示す薬物であるチラパザミン（ＴＰＺ）を、カテコール含有リンカー基（ドーパミン、ＤＯＰＡ）を介して高分子プロドラッグに変換することができることと、ＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡコンジュゲートが低酸素状態で活性化される細胞毒性を有していることとを示すものである。
【０１５４】
方法
トリ−ＴＢＤＭＳ保護ドーパミンの合成（１００）
【化１７】
2019530643.tif 000019
アルゴン雰囲気中、ドーパミン塩酸塩（１２．６ｇ、６６．４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）及びトリエチルアミン（４６．３ｍＬ、３３５．０ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ．）を無水アセトニトリル（１３１．３ｍＬ）に溶解した。溶液を氷浴で０℃に冷却し、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（４０．１ｇ、２６６．１ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ．）の無水アセトニトリル（１３１．３ｍＬ）溶液を滴下した。反応混合物を室温で一夜撹拌した。次いで溶媒を真空中で蒸発させ、得られた粗生成物を水（１００ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で分液した。次いで有機層を分離し、水相をＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ｍＬ）で抽出した。最後に有機相を合一し、１Ｍクエン酸緩衝液（５０ｍＬ、ｐＨ５）で洗浄し、ＮａＳＯ４上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた粗生成物を真空乾燥機で一夜乾燥させることにより、トリ−ＴＢＤＭＳ保護ドーパミン１００３１．１１ｇを淡褐色ワックスとして得た（収率：９７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．０９（ｓ，６Ｈ），０．１９（ｓ，１２Ｈ），０．９２（ｓ，９Ｈ），０．９８（ｓ，１８Ｈ），１．７６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），２．６２（ｔ，２Ｈ），２．９０（ｔ，２Ｈ），６．６３（ｄｄ，１Ｈ），６．６６（ｄ，１Ｈ），６．７５（ｄ，１Ｈ）；ＩＲ（ｃｍ−１）（固体）：２９５４，２９２９，２８５２，１５７５，１５１０，１２９３，１２５２，９０７，８３４，７７７．
【０１５５】
ジ−ＴＢＤＭＳ保護ドーパミン（１０１）の合成
【化１８】
2019530643.tif 000020
アルゴン雰囲気中、１００（７．７ｇ、１５．９８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を、０．５Ｍのイソプロピルアルコール中ＨＣｌ（１５４ｍＬ）に０℃で溶解した。反応混合物を３６時間撹拌した後、生成した少量の固体析出物を濾去した。次いで、微粉砕したＮａ２ＣＯ３を８．１６ｇ（ＨＣｌに対し２．０ｅｑ．）を加え、この溶液を０℃で一夜撹拌した。固体を濾別し、溶媒をロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、この溶液に微粉砕したＣａＣｌ２（約１ｇ）を加え、一夜室温で撹拌したままにした。最後に固体を除去した後、溶液をロータリーエバポレーターで濃縮することにより、ジ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護ドーパミン１０１を５．４３ｇを淡褐色固体として得た（収率：８９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：０．１６−０．２０（ｍ，１２Ｈ），０．９６−１．００（ｍ，１８Ｈ），２．９５−３．０２（ｍ，２Ｈ），３．１９（ｍ，２Ｈ），６．６７（ｓ，１Ｈ），６．６８−６．７１（ｍ，１Ｈ），６．７４−６．７８（ｍ，１Ｈ），８．４３（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）；ＩＲ（ｃｍ−１）（固体）：２９５４，２９２９，２８５７，１５９９，１５０９，１２９０，１２５２，９０２，８３６，７７０．
【０１５６】
チラパザミン活性エステル（１０２）の合成
【化１９】
2019530643.tif 000021
微粉砕したチラパザミン（ＴＰＺ）（５００ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ．）を無水トルエン（１２．５ｍＬ）に懸濁させた懸濁液を、アルゴン雰囲気中で還流させた。無水トルエン（３７．５ｍＬ）に溶解したトリホスゲン（８６５ｍｇ、２．９１ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ．）を反応フラスコに等量ずつ３回に分けて３０分置きに加えた。最後の添加が終了したら反応混合物をさらに１０分間撹拌した後、室温に戻した。その後、ヘキサン（８０ｍＬ）を加え、黄色固体析出物を回収し、ヘキサンで十分に洗浄（３回）した後、真空乾燥させることにより、チラパザミン活性エステル１０２を４８６ｍｇを黄色固体として得た（収率：８５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δｐｐｍ：７．７５（ｄｄｄ，１Ｈ），８．０１（ｄｄ，１Ｈ），８．２１（ｄｄｄ，１Ｈ），８．４３（ｄｄ，１Ｈ）；ＩＲ（ｃｍ−１）（固体）：３０７９，１８１１，１６０９，１５３７，１４８３，１４３４，１３４２．
【０１５７】
ジ−ＴＢＤＭＳ保護ＴＰＺ−ＤＯＰＡ（１０３）の合成
【化２０】
2019530643.tif 000022
アルゴン雰囲気中、チラパザミン活性エステル１０２（４６５ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ．）及びジ−ＴＢＤＭＳ保護ドーパミン１０１（１０００ｍｇ、２．６２ｍｍｏｌ、１．１５ｅｑ．）を無水ＤＭＦ（３４ｍＬ）に溶解した。次いで反応混合物を０℃に冷却し、次いでトリエチルアミン（５４８μＬ、３．９１ｍｍｏｌ、１．７２ｅｑ）を滴下した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した後、室温に戻し、一夜撹拌した。その後、溶媒を減圧下に濃縮し、得られた粗生成物を１．５％のエタノール中酢酸（６０ｍＬ）に溶解し、溶媒を減圧下に濃縮した。得られた固体をシリカゲル（７０〜２３０メッシュ）に充填し、カラムクロマトグラフィー（グラジエント：酢酸エチル：ヘキサン：酢酸  ４９．７５：４９．７５：０．５から７４．７５：２４．７５：０．５）で精製した。最終生成物中の微量の酢酸をトルエンと一緒に共沸させて蒸発させることによって除去し、ジ−ＴＢＤＭＳ保護ドーパミン−ＴＰＺ１０３を１．０３ｇを橙色固体として得た（収率：７７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δｐｐｍ：０．１７（ｓ，１２Ｈ），０．９４（ｓ，１８Ｈ），２．６７（ｔ，２Ｈ），３．３０−３．３７（ｍ，２Ｈ），６．７０−６．８０（ｍ，３Ｈ），７．６３（ｔ，１Ｈ），７．７６（ｔ，１Ｈ），８．０４（ｔ，１Ｈ），８．２６（ｄ，２Ｈ），８．３０（ｄ，２Ｈ），９．９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）；ＩＲ（ｃｍ−１）（固体）：３３５８，３０７９，２９３０，２８５７，１７０５，１５３６，１５０８，１４８５，１４１３，１３３２，１２９０，１２５３，１１６１，１０９０，９０６，８３５，７７７．
【０１５８】
ＴＰＺ−ＤＯＰＡ（１０４）の合成
【化２１】
2019530643.tif 000023
アルゴン雰囲気中、ジ−ＴＢＤＭＳ保護ＴＰＺ−ＤＯＰＡ１０３（２００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）をイソプロピルアルコール（１６ｍＬ）に溶解した。次いで１Ｍの水性ＨＣｌ（４ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で４８時間撹拌したままにした。生成した析出物を遠心分離により単離し、イソプロピルアルコール、次いでヘキサンで十分に洗浄し、真空乾燥させることによりＴＰＺ−ＤＯＰＡ１０４を９７．８ｍｇを黄色固体として得た（収率：８０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δｐｐｍ：２．６０（ｔ，２Ｈ），３．３０−３．３５（ｍ，２Ｈ），６．４９（ｄｄ，１Ｈ），６．６１−６．６７（ｍ，２Ｈ），７．６１（ｔ，１Ｈ），７．７６（ｄｄｄ，１Ｈ），８．０３（ｄｄｄ，１Ｈ），８．２６（ｄ，１Ｈ），８．３０（ｄ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），９．９８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δｐｐｍ：３５．０，４１．８，１１６．２，１１６．６，１１８．５，１２０．２，１２１．７，１３０．４，１３０．７，１３２．７，１３６．９，１３８．６，１４４．１，１４５．６，１４６．５，１５１．６；ＩＲ（ｃｍ−１）（固体）：３４７５，３３３３，３０８２，２９３８，１６６４，１５９３，１５１９，１４８８，１４１５，１３３５，１２９３，１２６８，１１８８，１１１９，１０９４，９５７；ＭＳｍ／ｚ（ＥＳ＋）３５８．１［ＭＨ＋］，３８０．１［ＭＮａ＋］，ｍ／ｚ（ＥＳ−）３５６．１［ＭＨ−］；ＨＲ−ＭＳｍ／ｚ計算はＣ１６Ｈ１５Ｎ５Ｏ５Ｎａ［ＭＮａ＋］＝３８０．０９７；ｍ／ｚ（ＨＲ−ＥＳ＋）３８０．０９７［ＭＮａ＋］．
【０１５９】
ＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡの調製
クエルセチン／ピセアタンノールをＴＰＺ−ＤＯＰＡ１０４に替えて、実施例１に記載したＨＡＢＱ及びＨＡＢＰの調製に用いた手順と類似の手順を用いることにより、ＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡ巨大分子プロドラッグを調製した。
【０１６０】
腫瘍細胞生存率アッセイ
複数のヒト腫瘍細胞株をシトクロムＰ４５０還元酵素産生に関しスクリーニングした（ウエスタンブロット）。ＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡの毒性をコンジュゲートに３時間曝露した後の細胞生存率でスクリーニングすることによりＴＰＺ基のモル濃度に応じて評価し、対応するＩＣ５０値で表した。結果を図８に示す。コンジュゲートであるＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡは低酸素で活性化可能な挙動を示すことが明らかであり、低酸素状態のＩＣ５０値がより低いことから分かるように、コンジュゲートの細胞毒性は通常（空気中）条件下と比較して低酸素条件下で増大した。また、コンジュゲートの細胞毒性はＰ４５０還元酵素発現量の増加に伴い増大した。
【０１６１】
細胞毒性比較実験において、ヒト癌細胞株パネルをＴＰＺ、ＴＰＺ−ＤＯＰＡ又はＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡに３時間曝露し、常酸素（空気中）条件下又は低酸素（０．１％Ｏ２）条件下の両方における７２時間後の細胞生存率を評価した。ｎ＝３回の実験から求めたＩＣ５０値（μＭ）を表１に示す。
【０１６２】
【表１】
2019530643.tif 000024
【０１６３】
表１から、低酸素状態における癌細胞生存率は常に常酸素条件下よりも大幅に低かったことが分かる。ＴＰＺは低酸素状態及び常酸素状態の細胞毒性の差がより大きいが、ＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡはＴＰＺと比較すると全体的に毒性が高くなっていることが分かる。
【０１６４】
ＴＰＺ−ＤＯＰＡ及びＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡにそれぞれ３時間曝露した後の８種の癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＢｒ３、Ｃａｌ−２７、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及びＦａＤｕ）の７２時間後の生存率のデータも図９及び図１０に示す。図９から、低酸素条件下の生存率は常酸素条件下の生存率よりも低いことが分かる。図１０において、ＨＡＢ−ＴＰＺ−ＤＯＰＡコンジュゲートに関しては、低酸素条件下の生存率は常に常酸素条件下よりも大幅に低く、ほとんどの場合、図９のＴＰＺ−ＤＯＰＡよりも低酸素／常酸素条件の差が大きかった。
【０１６５】
実施例８−クルクミン及びクルクミン−ＨＡＢコンジュゲートの乳癌細胞に対する毒性の測定
方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、Ｌ−グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）（培地）で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下に３７℃で培養した。クルクミン及びクルクミン−ＨＡＢコンジュゲートの毒性を測定するために細胞を９６ウェルプレートに播種し、培地中の密度を１，０００細胞／ウェルとし、接着させるために２４時間静置した。次いで培地を除去し、様々な濃度のクルクミン又はクルクミン−ＨＡコンジュゲートを含む培地に交換した。次いで細胞を５％ＣＯ２を含む空気中３７℃で３時間インキュベートした。その後、薬物含有培地を除去し、新鮮な培地と交換し、細胞をさらに９６時間インキュベートした。その後、改変ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルジアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］法を用いて製造業者（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の指示に従い細胞生存率を求めた。簡潔に説明すると、ＭＴＴ溶液（細胞培養培地中０．５ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを各ウェルに加えた。さらに３７℃で４時間インキュベートした後、各ウェルから培地を除去し、フォルマザンの結晶を溶解するためにＤＭＳＯ（２００μＬ）に交換した。次いで各ウェルの吸光度を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００プレートリーダーにてＩ−ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアを使用して４５０ｎｍの波長を読み取った。相対的な細胞生存率（％）を式［Ａ］試験品／［Ａ］対照品×１００（「［Ａ］試験品」は試料の吸光度であり、「［Ａ］対照品」は培養培地のみでインキュベートした対照細胞の吸光度である）を用いて算出した。
【０１６６】
結果
これらの実験から、クルクミンにより達成することができた最大細胞死滅率は４０％であった。これは、クルクミンを４０μＭの濃度で使用した場合に達成された。これとは対照的に、この水準の細胞死滅率を達成するのに必要なクルクミン−ＨＡＢコンジュゲートに含まれるクルクミンの濃度は５μＭであった。このように８分の１に低下したことは、ＨＡＢとコンジュゲートさせることによりクルクミンの送達性が向上することに一致する。
【０１６７】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１  Ｙｕａｎ，Ｚ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，３１９３−３１９９（２００６）．
２  Ｆａｎｇ，Ｆ．，Ｌｉ，Ｊ．−Ｍ．，Ｐａｎ，Ｑ．−Ｈ．＆Ｈｕａｎｇ，Ｗ．−Ｄ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｗｉｎｅ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｂｙＨｐｌｃ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０１，４２８−４３３（２００７）．
３  Ｓｉｘｏｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ−ｔｒａｎｓｆｅｒ（ｆｒｅｔ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，６６２−６６８（１９９４）．
４  Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｓ  ｖｉａ  ｇ（２）／ｍ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３４，２９６−３０４（２００６）．
５  Ｉｎｄａｐ，Ｍ．Ａ．，Ｒａｄｈｉｋａ，Ｓ．，Ｍｏｔｉｗａｌｅ，Ｌ．＆  Ｒａｏ，Ｋ．Ｖ．Ｋ．Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ：Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇａｉｎｓ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６８，４６５−４６９（２００６）．
６  Ｋｕｂｏ，Ｉ．，Ｎｉｔｏｄａ，Ｔ．＆  Ｎｉｈｅｉ，Ｋ．−ｉ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｏｎ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｂ１６−ｆ１０  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １２，１０４５−１０５６（２００７）．
７  Ｄａｋｅｒ，Ｍ．，Ａｈｍａｄ，Ｍ．＆  Ｋｈｏｏ，Ａ．Ｓ．Ｂ．Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ａ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １２（２０１２）．
８  Ｐｏｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｉｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ  ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｐ４５０  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｙｐｉｂｉ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８６，７７４−７７８（２００２）．
９  Ｗｉｅｄｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ，ａＨｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｂｊａｂ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ，ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １５，１７３５−１７４２（２００１）．
１０  Ｂｉｅｇｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｆｔｅｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３８，１４１７−１４２０（２００８）．
１１  ｄｅ  Ｂｏｅｒ，Ｖ．Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｐｉｇｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３５，１７１８−１７２５（２００５）．
１２  Ｆｒａｓｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｅ．，Ａｐｐｅｌｇｒｅｎ，Ｌ．Ｅ．＆  Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＨｙａｌｕｒｏｎｉｃ−ａｃｉｄ−ａ  ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ  ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｕｄｙ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３３，２８５−２９３（１９８３）．
１３  Ｆｒａｓｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｅ．，Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．，Ｐｅｒｔｏｆｔ，Ｈ．＆  Ｂａｘｔｅｒ，Ｅ．Ｐｌａｓｍａ−ｃｌｅａｒａｎｃｅ，ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆＨｙａｌｕｒｏｎｉｃ−ａｃｉｄ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００，４１５−４２４（１９８１）．
１４  Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ，Ｓ．，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｔ．＆  Ｗｅｓｔｌｉｎ，Ｊ．Ｅ．Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆＨｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔＨｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｗｉｔｈ  ｉ−１２５  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ−ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１，６０８−６１３（１９９４）．
１５  Ｅｌ−Ｄａｋｄｏｕｋｉ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｌｏａｄｅｄＨｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｃｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ６，６９７−７０５（２０１４）．
１６  Ｇａｎｅｓｈ，Ｓ．，Ｉｙｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｇａｔｔａｃｃｅｃａ，Ｆ．，Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．Ｖ．＆  Ａｍｉｊｉ，Ｍ．Ｍ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｒｎａ  ａｎｄ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｃｄ４４−ｔａｒｇｅｔｅｄＨｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １７２，６９９−７０６（２０１３）．
１７  Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ  ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，９６１１−９６１６（２００５）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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