【手続補正書】
【提出日】平成19年3月28日(2007.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  対象において側副枝血管形成を増進させるための組成物であって、心臓又は肢組織における虚血の部位に直接投与された場合に前記組織において側副枝血管形成を誘発するための有効量の自己骨髄吸引物を含む、前記組成物。
【請求項２】  前記自己骨髄吸引物が注入のために調製される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】  前記自己骨髄吸引物が、心筋内注入のために調製される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】  前記自己骨髄吸引物が、心外膜経由または心内膜経由注入のために調製される、請求項２記載の組成物。
【請求項５】  前記組成物が、カテーテルを介して、心内膜経由注入のために調製される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】  前記自己骨髄吸引物が、イクス  ビボ(ex vivo)でならし培地において成長している間に刺激され、前記ならし培地が、顆粒球-単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、内皮のPASドメインタンパク質１(EPAS1)、及び低酸素誘発性因子-1(HIF-1)から選択される少なくとも１つの剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項７】  前記自己骨髄吸引物が、イクス  ビボ(ex vivo)でならし培地において成長している間に、それから分泌される１以上の脈菅形成刺激サイトカインとの接触によって刺激され、前記ならし培地が、顆粒球-単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、内皮のPASドメインタンパク質１(EPAS1)、及び低酸素誘発性因子-1(HIF-1)から選択される少なくとも１つの剤を含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】  前記組成物が、単球化学誘引タンパク質-1（MCP-1）又は脈管内皮増殖因子(VEGF)をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】  前記自己骨髄吸引物が、低酸素に一時的にさらすことによって、培養においてイクス  ビボ(ex vivo)で刺激されたものである、請求項６記載の組成物。
【請求項１０】  前記自己骨髄吸引物が、医薬若しくはタンパク質、又はその両方をさらに含み、それらは内皮細胞の増殖、移動または血管形成を促進する脈管形成増殖因子の骨髄製造を増進する、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】  前記自己骨髄吸引物及び１以上の剤が、投与の前にイクス  ビボ(ex vivo)で合わせられている、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】  前記自己骨髄吸引物が、イクス  ビボ(ex vivo)でならし培地において刺激され、前記ならし培地が、顆粒球-単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、内皮のPASドメインタンパク質１(EPAS1)、及び低酸素誘発性因子-1(HIF-1)から選択される少なくとも１つの剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】  虚血の心臓組織内に注入するために、前記自己骨髄吸引物を培養し、骨髄細胞及び内生的に分泌された脈菅形成サイトカインを含むならし培地を形成することによって調製される、請求項１に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、側副枝血管形成を増進させるための組成物に関する。より詳細には、本発明は、側副枝血管形成および組織灌流を増すための自己骨髄の心筋内注入に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、側副枝血管形成を増進させるための組成物を提供することである。
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の議論においてさらに明らかになろう。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
組織病理学
注入カテーテルを用いることによるBM吸引物の注入が機械的な細胞傷害に関係するかどうかを評価するために、新たにろ過したABM吸引物を、イン  ビボ研究のときと同様の注入圧を用いて、針を通して押し出す前後で、標準のBM塗抹標本を調製した。研究のプロトコールを知らされていない、独立した実験技術者により、形態学的な評価を行った。
サンプリングした心臓組織について、組織病理学的評価を行った。試験的研究において、7mm厚の短軸切片をUV光下で調べて、蛍光の付いた領域を同定した。各同定領域を3つの全厚の隣接片（中心、右および左）に切断し、これを、10％緩衝ホルムアルデヒド中で浸漬-固定した。次に、そのような各片を3つのレベルに切断し、そのうちの２つは、ヘマトキシリン(Hematoxylin)およびエオジン(Eosin)(H&E)で染色し、１つはPASで染色した。さらに、各動物の虚血領域から１つの新しい蛍光標識組織片を得、OCTコンパウンド（サクラ  ファインテク(Sakura Fineteck)USA社、トランス(Trance)、カリフォルニア州）中に包埋し、液体窒素中で凍結させた。これらの急速凍結した心筋組織の凍結切片を風乾し、アセトンで固定した。自動化されたダコ  イムノ  ステイナー(Dako immuno Stainer)（ダコ(Dako)、カーペンテリア(Carpenteria)、カリフォルニア州）を用いて、イムノペルオキシダーゼ染色を行った。固有のペルオキシダーゼおよび非特異的取り込みは、0.3％水素ペルオキシダーゼおよび10％オボアルブミン(ovo-albumin)で封鎖した。CD-34に対するモノクローナルマウス抗体（ベクトン  ディッキンソン(Becton Dickinson)、サン  ジョゼ(San Jose)、カリフォルニア州）を、一次抗体として使用した。連結抗体は、ビオチン化したヤギ抗マウスIgG抗体であり、３次抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼを用いて、ストレプトアビジンコンジュゲート(conjugate)した。ジアミノベンジジン(DAB)を色原体として使用し、切片を1％メチルグリーンで対比染色した。脱水および洗浄後、スライドを乗せ、ニコン  ラブフォト(Nikon Labphot)顕微鏡で調べた。
効力試験においては、虚血領域および非虚血領域からの、全厚の1.5平方センチメートルの切片を、パラフィン切片のために加工処理した。試料のそれぞれをH&Eマッソン(Masson)のトリクロームおよび因子VIII関連抗原で染色した。イムノペルオキシダーゼ染色したスライドを、内皮細胞群の密度および脈管化について調べた。後者は、管腔の存在によって前者と区別された。虚血および非虚血の心筋層の内半分から得た、因子VIII染色したスライドの５つの顕微鏡写真試料を用いて、脈管質を評価した。内皮細胞の密度は、同じ顕微鏡写真のデジタル化した像を用いて評価した。内皮群の密度は、シグマ  スキャン  プロ  モルフォメトリー  ソフトウェア(Sigma-Scan Pro morphometry software)によって、強度閾値法を用いて決定した。各試料ならびに各標本についての全内皮領域を、相対パーセント内皮領域［（内皮領域）／（調べた心筋層の領域）］と共に得た。全内皮領域はまた、調べた心筋層の梗塞不形成（生存可能）領域の相対パーセントとして計算した。トリクローム染色した切片をデジタル化し、青色染色コラーゲンによって占められた領域ならびに、心外膜によって占められた領域（正常にコラーゲンを含んでいた）を除く全切片領域を、シグマ  スキャン  プロ(Sigma-Scan Pro)を用いて測定した。次に、梗塞形成領域を、青色染色によって占められた領域として計算した。