(57)【要約】本発明は、多数の疾患、障害、および状態の治療、予防、または寛解のための遺伝子治療組成物用の改善された組成物を提供する。細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２】
細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項３】
前記細胞集団は、幹細胞を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記前記細胞集団は、造血細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞集団は、免疫エフェクター細胞を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
細胞集団は、Ｔ細胞を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞集団は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項１２】
ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項１３】
前記ゲノム編集エンハンサーは、ＤＮＡインターカレーターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ゲノム編集エンハンサーは、単官能性ＤＮＡインターカレーター、二官能性ＤＮＡインターカレーター、または多官能性ＤＮＡインターカレーターからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ゲノム編集エンハンサーは、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、およびフェナントリジンからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ゲノム編集エンハンサーは、１，８−ナフタルイミド、４’６−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン（ａｃｔｉｎｏｄａｐｈｎｉｄｉｎｅ）、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ボルジン、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ブブロカプニン（ｂｕｂｌｏｃａｐｎｉｎｅ）、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、ＤＡＰＩ、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、ＧｅｌＳｔａｒ、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、ＪＯＪＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、キネチンリボシド、コクサイニン（ｋｏｋｕｓａｉｎｉｎｅ）、ロベリン、ＬＯＬＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、パルマチン、フェナントリジン、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ピラルビシン、ポリピリジル、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２５、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６３、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５、ＳＹＴＯＸ  ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  ｏｒａｎｇｅ、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ウサンバレンシン、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、およびハルミンからなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ゲノム編集エンハンサーは、アミナクリン（９−アミノアクリジン）である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
細胞、アクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２２】
細胞、アクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２３】
細胞、９−アミノアクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２４】
細胞、９−アミノアクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２５】
アクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２６】
アクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２７】
９−アミノアクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２８】
９−アミノアクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、組成物。
【請求項２９】
前記人工ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から遺伝子操作される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項２９または請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから遺伝子操作される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記メガＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項３３または請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから遺伝子操作される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項３８または請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＺＦＮは、ＴＡＬＥ結合ドメインを含む、請求項４２または請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記人工ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４９】
前記Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、請求項４８または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡと、前記細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｃｒＲＮＡと、をさらに含む、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物は、前記細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｓｇＲＮＡをさらに含む、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記人工ヌクレアーゼは、末端プロセシング酵素活性を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記末端プロセシング酵素活性は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性である、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記末端プロセシング酵素活性は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片の３−５’エキソヌクレアーゼ活性である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記組成物は、末端プロセシング酵素、または前記末端プロセシング酵素をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記末端プロセシング酵素は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記末端プロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項５６または請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
βグロビン、δグロビン、γグロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）、ＨＰＲＴ、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＬＲＲＫ２、Ｈｔｔ、ＳＯＤ１、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＲＨＯ、ＣＦＴＲ、ＳＦＴＰＢ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＬＭＰ７、ＴＡＰ  １、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＣＩＩＴＡ、ＤＭＤ、ＧＲ、ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ−１、ＲＦＸ５、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、ＺＰ１５、ＫＡＳＩＩ、ＭＤＨ、ＥＰＳＰＳ、またはそれらの断片をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子；ホルモン；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体）、または人工抗原受容体をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
人工Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
細胞集団におけるゲノム編集を増大させる方法であって、
（ａ）細胞集団に人工ヌクレアーゼを導入することと、
（ｂ）前記細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含み、
前記ゲノム編集エンハンサーの存在下における前記人工ヌクレアーゼの発現が、前記細胞集団におけるゲノム編集の頻度を増加させる、方法。
【請求項６３】
細胞集団における相同組み換え修復（ＨＤＲ）を増大させる方法であって、
（ａ）前記細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、
（ｂ）標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するように人工ヌクレアーゼを導入することと、
（ｂ）前記細胞集団にドナー修復鋳型を導入することと、を含み、
前記ゲノム編集エンハンサーおよび前記ドナー修復鋳型の存在下における前記人工ヌクレアーゼの発現が、相同組み換え修復（ＨＤＲ）による前記標的部位における前記ドナー修復鋳型の組み込みの頻度を増加させる、方法。
【請求項６４】
細胞集団における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を増加させる方法であって、
（ａ）前記細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、
（ｂ）標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するように人工ヌクレアーゼを導入することと、
（ａ）細胞集団に人工ヌクレアーゼを導入することと、を含み、
前記ゲノム編集エンハンサーの存在下における前記人工ヌクレアーゼの発現が、前記標的部位におけるＮＨＥＪの頻度を増加させる、方法。
【請求項６５】
前記細胞は造血細胞である、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞は免疫エフェクター細胞である、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはそれらの組み合わせである、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞はＴ細胞である、請求項６２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項６２〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞はＣＤ３４＋細胞である、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞はＣＤ１３３＋細胞である、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ゲノム編集エンハンサーはＤＮＡインターカレーターである、請求項６２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ゲノム編集エンハンサーは、単官能性ＤＮＡインターカレーター、二官能性ＤＮＡインターカレーター、または多官能性ＤＮＡインターカレーターからなる群から選択される、請求項６２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ゲノム編集エンハンサーは、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、およびフェナントリジンからなる群から選択される、請求項６２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ゲノム編集エンハンサーは、１，８−ナフタルイミド、４’６−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン（ａｃｔｉｎｏｄａｐｈｎｉｄｉｎｅ）、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ボルジン、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ブブロカプニン（ｂｕｂｌｏｃａｐｎｉｎｅ）、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、ＤＡＰＩ、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、ＧｅｌＳｔａｒ、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、ＪＯＪＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、キネチンリボシド、コクサイニン（ｋｏｋｕｓａｉｎｉｎｅ）、ロベリン、ＬＯＬＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、パルマチン、フェナントリジン、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ピラルビシン、ポリピリジル、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２５、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６３、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５、ＳＹＴＯＸ  ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  ｏｒａｎｇｅ、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ウサンバレンシン、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項６２〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される、請求項６２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、およびハルミンからなる群から選択される、請求項６２〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである、請求項６２〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ゲノム編集エンハンサーは、アミナクリン（９−アミノアクリジン）である、請求項６２〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記人工ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項６２〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から遺伝子操作される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項８３または請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから遺伝子操作される、請求項８４〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記メガＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項８７または請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから遺伝子操作される、請求項８７〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項９２〜９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される、請求項９２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９７】
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＺＦＮは、ＴＡＬＥ結合ドメインを含む、請求項９６または請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される、請求項９６〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記人工ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０３】
前記Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、請求項１０２または請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡと、前記細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｃｒＲＮＡと、をさらに含む、請求項１０２〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組成物は、前記細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｓｇＲＮＡをさらに含む、請求項１０２〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記人工ヌクレアーゼは、末端プロセシング酵素活性を含む、請求項６２〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記末端プロセシング酵素活性は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記末端プロセシング酵素活性は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片の３−５’エキソヌクレアーゼ活性である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組成物は、末端プロセシング酵素、または前記末端プロセシング酵素をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項６２〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記末端プロセシング酵素は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記末端プロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１１０または請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
βグロビン、δグロビン、γグロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）、ＨＰＲＴ、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＬＲＲＫ２、Ｈｔｔ、ＳＯＤ１、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＲＨＯ、ＣＦＴＲ、ＳＦＴＰＢ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＬＭＰ７、ＴＡＰ  １、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＣＩＩＴＡ、ＤＭＤ、ＧＲ、ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ−１、ＲＦＸ５、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、ＺＰ１５、ＫＡＳＩＩ、ＭＤＨ、ＥＰＳＰＳ、またはそれらの断片をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項６２〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子；ホルモン；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体）、または人工抗原受容体をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項６２〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
人工Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体をコードするドナー修復鋳型を含む、請求項６２〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
請求項６２〜１１５のいずれか一項に記載の方法によって生成される、細胞。
【請求項１１７】
請求項１１６による細胞を含む、組成物。
【請求項１１８】
薬学的に許容される担体および請求項１１６による細胞を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３７７，３５７号の利益を米国特許法第１１９条の下で主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連付けられる配列リストは、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列リストが含まれるテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０７４＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは、４ＫＢであり、２０１７年８月１８日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出される。
【０００３】
技術分野
背景
本発明は概して、改善された遺伝子治療組成物およびそれを作成する方法に一部関する。より具体的には、本発明は、改善されたゲノム編集組成物および遺伝子治療薬ならびにそれを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の記載
３０００個のヒト遺伝子における突然変異が既に疾患表現型（ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ｇｅｎｅＭａｐ）と関連付けられており、より多くの疾患に関連する遺伝的変異が驚くほど急速に明らかにされている。しかしながら、医薬品開発における妥当な治療的仮説および多大な努力にもかかわらず、強い遺伝的寄与を示す疾患を治療するための小分子の使用における成功はごくわずかである。一遺伝子性の、浸透性の高い疾患の治療のためのメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼＣａｓ９等のプログラム可能なヌクレアーゼに基づく、新たに出現するゲノム編集ストラテジーの巨大な可能性は、未だに実現されていない。ヌクレアーゼに基づくゲノム編集ストラテジーを実行するための具体的な障害として、限定されないが、ゲノム編集効率の低さ、ヌクレアーゼ特異性、および送達の困難性が挙げられる。ほとんどのゲノム編集ストラテジーに関する当該技術分野の現状は、これらの基準のいくつかまたは全てを達成できていない。
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な要旨
本発明は概して、より安全かつより有効な遺伝子治療薬を開発するために、改善されたゲノム編集組成物およびそれを使用する方法に一部関する。
【０００６】
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【０００７】
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【０００８】
特定の実施形態において、細胞集団は、幹細胞を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、細胞集団は、造血細胞を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞を含む。
【００１１】
特定の実施形態において、細胞集団は、免疫エフェクター細胞を含む。
【００１２】
追加の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１３】
ある特定の実施形態において、細胞集団は、Ｔ細胞を含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、細胞集団は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
【００１６】
種々の実施形態において、本発明は、一部、ゲノム編集エンハンサー、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００１７】
種々の実施形態において、本発明は、一部、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００１８】
追加の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、ＤＮＡインターカレーターである。
【００１９】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、単官能性ＤＮＡインターカレーター、二官能性ＤＮＡインターカレーター、または多官能性ＤＮＡインターカレーターからなる群から選択される。
【００２０】
追加の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、およびフェナントリジンからなる群から選択される。
【００２１】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、１，８−ナフタルイミド、４’６−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン（ａｃｔｉｎｏｄａｐｈｎｉｄｉｎｅ）、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ボルジン、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ブブロカプニン（ｂｕｂｌｏｃａｐｎｉｎｅ）、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、ＤＡＰＩ、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、ＧｅｌＳｔａｒ、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、ＪＯＪＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、キネチンリボシド、コクサイニン（ｋｏｋｕｓａｉｎｉｎｅ）、ロベリン、ＬＯＬＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、パルマチン、フェナントリジン、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ピラルビシン、ポリピリジル、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２５、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６３、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５、ＳＹＴＯＸ  ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  ｏｒａｎｇｅ、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ウサンバレンシン、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。
【００２２】
ある特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される。
【００２３】
さらなる実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、およびハルミンからなる群から選択される。
【００２４】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アミナクリン（９−アミノアクリジン）である。
【００２６】
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞、アクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００２７】
特定の実施形態において、本発明は、一部、細胞、アクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００２８】
追加の実施形態において、本発明は、一部、細胞、９−アミノアクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００２９】
ある特定の実施形態において、本発明は、一部、細胞、９−アミノアクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明は、一部、アクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、一部、アクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００３２】
特定の実施形態において、本発明は、一部、９−アミノアクリジン、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００３３】
種々の実施形態において、本発明は、一部、９−アミノアクリジン、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼ、ならびに／または任意選択的に、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物を企図する。
【００３４】
特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される。
【００３５】
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から遺伝子操作される。
【００３６】
追加の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
【００３７】
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから遺伝子操作される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、メガＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含む。
【００３９】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
【００４１】
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
【００４２】
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから遺伝子操作される。
【００４３】
さらなる実施形態において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
【００４４】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００４５】
追加の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
【００４６】
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される。
【００４７】
さらなる実施形態において、ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む。
【００４９】
追加の実施形態において、ＺＦＮは、ＴＡＬＥ結合ドメインを含む。
【００５０】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
【００５２】
ある特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される。
【００５３】
さらなる実施形態において、人工ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。
【００５４】
特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。
【００５５】
追加の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡと、細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｃｒＲＮＡと、をさらに含む。
【００５７】
特定の実施形態において、組成物は、細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｓｇＲＮＡをさらに含む。
【００５８】
追加の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、末端プロセシング酵素活性を含む。
【００５９】
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素活性は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性である。
【００６０】
さらなる実施形態において、末端プロセシング酵素活性は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片の３−５’エキソヌクレアーゼ活性である。
【００６１】
ある特定の実施形態において、組成物は、末端プロセシング酵素、または末端プロセシング酵素をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
【００６２】
追加の実施形態において、末端プロセシング酵素は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す。
【００６３】
いくつかの実施形態において、末端プロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００６４】
特定の実施形態において、組成物は、βグロビン、δグロビン、γグロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）、ＨＰＲＴ、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＬＲＲＫ２、Ｈｔｔ、ＳＯＤ１、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＲＨＯ、ＣＦＴＲ、ＳＦＴＰＢ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＬＭＰ７、ＴＡＰ  １、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＣＩＩＴＡ、ＤＭＤ、ＧＲ、ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ−１、ＲＦＸ５、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、ＺＰ１５、ＫＡＳＩＩ、ＭＤＨ、ＥＰＳＰＳ、またはそれらの断片をコードするドナー修復鋳型を含む。
【００６５】
ある特定の実施形態において、組成物は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子；ホルモン；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体）、または人工抗原受容体をコードするドナー修復鋳型を含む。
【００６６】
追加の実施形態において、組成物は、人工Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体をコードするドナー修復鋳型を含む。
【００６７】
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団におけるゲノム編集を増大させる方法であって、細胞集団に人工ヌクレアーゼを導入することと、細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含み、ゲノム編集エンハンサーの存在下における人工ヌクレアーゼの発現が、細胞集団におけるゲノム編集の頻度を増加させる方法を企図する。
【００６８】
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団における相同組み換え修復（ＨＤＲ）を増大させる方法であって、細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するように人工ヌクレアーゼを導入することと、細胞集団にドナー修復鋳型を導入することと、を含み、ゲノム編集エンハンサーおよびドナー修復鋳型の存在下における人工ヌクレアーゼの発現が、相同組み換え修復（ＨＤＲ）による標的部位におけるドナー修復鋳型の組み込みの頻度を増加させる方法を企図する。
【００６９】
種々の実施形態において、本発明は、一部、細胞集団における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を増加させる方法であって、細胞集団をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するように人工ヌクレアーゼを導入することと、細胞集団に人工ヌクレアーゼを導入することと、を含み、ゲノム編集エンハンサーの存在下における人工ヌクレアーゼの発現が、標的部位におけるＮＨＥＪの頻度を増加させる方法を企図する。
【００７０】
さらなる実施形態において、細胞は造血細胞である。
【００７１】
追加の実施形態において、細胞は免疫エフェクター細胞である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはそれらの組み合わせである。
【００７３】
特定の実施形態において、細胞はＴ細胞である。
【００７４】
追加の実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
【００７５】
さらなる実施形態において、細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
【００７６】
ある特定の実施形態において、細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。
【００７７】
さらなる実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。
【００７８】
特定の実施形態において、細胞はＣＤ１３３＋細胞である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。
【００８０】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーはＤＮＡインターカレーターである。
【００８１】
追加の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、単官能性ＤＮＡインターカレーター、二官能性ＤＮＡインターカレーター、または多官能性ＤＮＡインターカレーターからなる群から選択される。
【００８２】
ある特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、およびフェナントリジンからなる群から選択される。
【００８３】
さらなる実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、１，８−ナフタルイミド、４’６−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン（ａｃｔｉｎｏｄａｐｈｎｉｄｉｎｅ）、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ボルジン、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ブブロカプニン（ｂｕｂｌｏｃａｐｎｉｎｅ）、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、ＤＡＰＩ、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、ＧｅｌＳｔａｒ、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、ＪＯＪＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、キネチンリボシド、コクサイニン（ｋｏｋｕｓａｉｎｉｎｅ）、ロベリン、ＬＯＬＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、パルマチン、フェナントリジン、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ピラルビシン、ポリピリジル、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２５、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６３、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５、ＳＹＴＯＸ  ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  ｏｒａｎｇｅ、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ウサンバレンシン、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。
【００８４】
ある特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される。
【００８５】
追加の実施形態において、編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、およびハルミンからなる群から選択される。
【００８６】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである。
【００８７】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーはアミナクリン（９−アミノアクリジン）である。
【００８８】
さらなる実施形態において、人工ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される。
【００８９】
追加の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から遺伝子操作される。
【００９０】
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから遺伝子操作される。
【００９２】
さらなる実施形態において、メガＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含む。
【００９３】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００９４】
追加の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
【００９５】
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
【００９６】
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから遺伝子操作される。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
【００９８】
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００９９】
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
【０１００】
さらなる実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、ＺＦＮは、ＴＡＬＥ結合ドメインを含む。
【０１０４】
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【０１０５】
さらなる実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
【０１０６】
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される。
【０１０７】
追加の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。
【０１１０】
特定の実施形態において、組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡと、細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｃｒＲＮＡと、をさらに含む。
【０１１１】
追加の実施形態において、組成物は、細胞のゲノムのプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｓｇＲＮＡをさらに含む。
【０１１２】
さらなる実施形態において、人工ヌクレアーゼは、末端プロセシング酵素活性を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、末端プロセシング酵素活性は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性である。
【０１１４】
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素活性は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片の３−５’エキソヌクレアーゼ活性である。
【０１１５】
特定の実施形態において、組成物は、末端プロセシング酵素、または末端プロセシング酵素をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
【０１１６】
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す。
【０１１７】
追加の実施形態において、末端プロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、方法は、βグロビン、δグロビン、γグロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）、ＨＰＲＴ、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＬＲＲＫ２、Ｈｔｔ、ＳＯＤ１、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＲＨＯ、ＣＦＴＲ、ＳＦＴＰＢ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＬＭＰ７、ＴＡＰ  １、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＣＩＩＴＡ、ＤＭＤ、ＧＲ、ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ−１、ＲＦＸ５、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、ＺＰ１５、ＫＡＳＩＩ、ＭＤＨ、ＥＰＳＰＳ、またはそれらの断片をコードするドナー修復鋳型を含む。
【０１１９】
さらなる実施形態において、方法は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子；ホルモン；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体）、または人工抗原受容体をコードするドナー修復鋳型を含む。
【０１２０】
特定の実施形態において、方法は、人工Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体をコードするドナー修復鋳型を含む。
【０１２１】
種々の実施形態において、本発明は、一部、本明細書で企図される方法によって生成される細胞を企図する。
【０１２２】
種々の実施形態において、本発明は、一部、本明細書で企図される細胞を含む組成物を企図する。
【０１２３】
種々の実施形態において、本発明は、一部、薬学的に許容される担体および本明細書で企図される細胞を含む薬学的組成物を企図する。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】フローサイトメトリーデータの分析ワークフローを示す。
【図２Ａ】細胞収量に与える影響に応じたランク順に化合物のプロットを示す。
【図２Ｂ】ＣＤ３陰性細胞の頻度に応じたランク順に化合物のプロットを示す。
【図２Ｃ】細胞収量の関数としてＣＤ３陰性細胞の頻度に応じた化合物のプロットを示す。
【図３Ａ】３７℃での初代Ｔ細胞における非相同末端結合編集効率を測定するためのアッセイにおける化合物の用量依存曲線を示す。
【図３Ｂ】３０℃での初代Ｔ細胞における非相同末端結合編集効率を測定するためのアッセイにおける化合物の用量依存曲線を示す。
【図３Ｃ】３７℃での初代Ｔ細胞の収量を測定するためのアッセイにおける化合物の用量依存曲線を示す。
【図３Ｄ】３０℃での初代Ｔ細胞の収量を測定するためのアッセイにおける化合物の用量依存曲線を示す。
【図４】メガＴＡＬに続いてアミナクリンを用いて培養した複数のドナーからのＴ細胞におけるＨＤＲ事象の頻度（ＧＦＰ＋細胞の％）に濃度依存性の増加を示す。
【図５】非標的ＣＣＲ５遺伝子座には見られないが、標的ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座に見られる、ＣＤ３４＋細胞におけるＨＤＲ頻度にアミナクリン誘発性の濃度依存性の増加を示す。
【図６】メガＴＡＬ単独で、メガＴＡＬおよびｒＡＡＶで、アミナクリンを用いてまたは用いずに処理したメチルセルロース培養ＣＤ３４＋細胞の細胞系譜解析の結果を示す。
【図７】メガＴＡＬ単独で、メガＴＡＬおよびｒＡＡＶで、アミナクリンを用いてまたは用いずに処理した初代ＣＤ３４＋細胞に由来するメチルセルロースコロニーにおいて上昇したＨＤＲ率を示す。
【図８】アミナクリンが、アミナクリンで処理しなかった細胞と比較して、メガＴＡＬを標的とするＢＣＬ１１Ａを用いて電気穿孔し、ＡＡＶドナー修復鋳型で形質導入したバルクヒトＣＤ３４＋細胞におけるＨＤＲを増大させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１〜１１は、種々のリンカーのアミノ酸配列を示す。
【０１２６】
配列番号１２〜１４は、プロテアーゼ切断部位および自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
【０１２７】
詳細な説明
Ａ．概要
遺伝子治療薬は、十分な治療遺伝子の発現を得るため、かつ／または、遺伝子治療の有効性に悪影響を及ぼすかもしくはその有効性を低減する遺伝子の発現を排除するために、ゲノム編集に一部依存し得る。ゲノム編集ストラテジーを実行する際の主な制約の１つは、ゲノム編集の効率が低いことである。改善された遺伝子治療薬を生成するために本明細書で企図されるゲノム編集ストラテジー、ならびにそれを作製および使用する方法は、当該技術分野が抱えるこれらおよび他の問題を解決する。
【０１２８】
本明細書で企図される種々の実施形態は、概して、改善されたゲノム編集組成物に一部関する。ゲノム編集組成物は、一遺伝子性の障害、疾患、および状態、例えば、異常ヘモグロビン症、癌、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全を治療するための遺伝子治療薬の生成における飛躍的改善を意味する。本明細書で企図されるゲノム編集組成物および方法を用いて製造される遺伝子治療薬は、治療薬を生成するための商品原価の低下、歴史的に低いゲノム編集効率を有する細胞に対する幅広い範囲の遺伝子治療薬、および遺伝子治療組成物の力価の増加を含むがこれらに限定されない、既存の遺伝子治療薬と比較して数多くの利点を提供する。
【０１２９】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、遺伝子治療薬を製造するために使用されるヌクレアーゼに基づく遺伝子編集ストラテジーにおいて相同組み換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を高めるゲノム編集エンハンサーを含む。
【０１３０】
種々の実施形態は、ゲノム編集エンハンサーおよび人工ヌクレアーゼを含むゲノム編集組成物を企図する。特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、好ましくは核酸インターカレーターであり、より好ましくは、ゲノム編集エンハンサーはＤＮＡインターカレーターであり、さらにより好ましくは、ゲノム編集エンハンサーはアクリジンであり、さらにより好ましくは、ゲノム編集エンハンサーは９−アミノアクリジンである。
【０１３１】
種々の他の実施形態が、核酸インターカレーターが導入されていない細胞と比較して、細胞におけるゲノム編集の頻度を増加させるのに十分な量および時間、細胞集団に人工ヌクレアーゼおよび核酸インターカレーターを導入することを含む、ゲノム編集効率を高めるための方法を企図する。
【０１３２】
特定の実施形態の実施は、そうではないという明確な指示のない限り、当該技術分野の技術の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用い、それらの多くは例示のために後述される。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；およびＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の学術雑誌の研究書を参照されたい。
【０１３３】
Ｂ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、特定の実施形態の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態を以下に記載する。本開示の目的のために、以下の用語を次に定義する。
【０１３４】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の対象となる１つのまたは１つより多くの（すなわち、少なくとも１つまたは１つ以上）ものを指すために本明細書で使用される。例として「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【０１３５】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、その選択肢のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。
【０１３６】
用語「および／または」は、その選択肢のいずれか一方または両方を意味すると理解されるべきである。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけことなる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、用語「約」または「およそ」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、ｏｒ±１％の範囲の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
【０１３８】
一実施形態において、範囲、例えば、１〜５、約１〜５、または約１〜約５は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、非限定的かつ例示的であるに過ぎない一実施形態において、範囲「１〜５」は、１、２、３、４、５；または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０；または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上高い数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じ効果、例えば、生理学的効果をもたらす数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
【０１４０】
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載されるステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を暗示するが、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の除外を暗示するものではないことを理解されたい。「からなる」は、「からなる」という句に続くあらゆるものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、列挙される要素が必要または必須であり、他の要素は存在しなくてもよいことを示す。「から本質的になる」は、この句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙される要素に関して本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という句は、列挙される要素は必要または必須であるが、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素は存在しないことを示す。
【０１４１】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所に出現する上記の句は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性が、１つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされてもよい。また、一実施形態におけるある特徴についての肯定の記述は、特定の実施形態においてその特徴を排除する根拠となることも理解されたい。
【０１４２】
用語「エクスビボ」は、生物の外部で起こる活動、例えば、好ましくは、自然の状態からの変化を最小限に抑えながら、生物の外部の人工環境で生体細胞の中または上で行われる実験または測定を一般的に指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から生体細胞または組織を取り出し、通常、無菌条件下で、典型的には数時間または最長２４時間だが、状況に応じて４８時間もしくは７２時間、実験装置において培養または調節することを含む。ある特定の実施形態において、そのような組織または細胞を、採取して凍結させ、後にエクスビボ処理のために解凍することができる。生体細胞または組織を用いた数日よりも長く継続する培養実験または手順は、典型的には「インビトロ」であると考えられるが、ある特定の実施形態において、この用語は、エクスビボと互換的に使用され得る。
【０１４３】
用語「インビボ」は、細胞の自己再生および細胞の増殖または増加等の、生物の内部で起こる活動を一般的に指す。一実施形態において、用語「インビボでの増加」は、細胞集団がインビボで数を増加させる能力を指す。一実施形態において、細胞はインビボで遺伝子操作または修飾される。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、用語「量」は、所望の結果、例えば、細胞集団においてゲノム編集の所望の速度を達成するのに十分な化合物、組成物、または処置の「効果的な量」または「有効量」を指す。
【０１４５】
「増強する」または「促進する」または「増加させる」または「増大させる」は、本明細書で企図される組成物が、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きな応答（すなわち、生理学的応答）を産生する、誘発する、または引き起こす能力を一般に指す。測定可能な応答は、ＨＲまたはＨＤＲ効率の増加を含み得る。「増加された」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって産生される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（中間のおよび１を超えるあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である増加を含むことができる。
【０１４６】
「減少させる」または「減らす」または「低減させる」または「低下させる」または「弱める」または「除去する」または「抑制する」または「減弱する」は、本明細書で企図される組成物が、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より少ない生応答（すなわち、生理学的応答）を産生する、誘発する、または引き起こす能力を一般に指す。測定可能な応答は、内因性遺伝子の発現または機能の低下、免疫エフェクター細胞の消耗に関連するバイオマーカーの発現低下等を含み得る。「減少された」または「低下された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によって産生される応答（参照応答）、または特定の細胞系統における応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（中間のおよび１を超えるあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である減少を含むことができる。
【０１４７】
「維持する」または「保存する」または「維持」または「変化なし」または「実質的な変化なし」または「実質的な減少なし」は、本明細書で企図される組成物が、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系統における応答と比較して、細胞において実質的に同様または同程度の生理学的応答（すなわち、下流効果）を産生する、誘発する、または引き起こす能力を一般に指す。同程度の応答は、参照応答と有意に異ならないまたは測定可能なほど異ならない応答である。
【０１４８】
「小分子」、「有機小分子」、または「小分子化合物」は、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．５ｋＤ未満の分子量を有する低分子量の化合物を指す。特定の実施形態において、小分子は、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、他の小さな有機化合物または薬物等を含むことができる。真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物等の化学的混合物および／または生物学的混合物のライブラリーは当該技術分野で既知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、（Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ｂ；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に見出すことができる。
【０１４９】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉および相同組換えを含むが、これらに限定されない。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機構を介して細胞における二本鎖切断の修復中に起こるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）を修復するための鋳型として「ドナー分子」または「ドナー修復鋳型」を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすことから、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として広く知られている。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング、および／または関連プロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。
【０１５０】
「ＮＨＥＪ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復鋳型または相同配列の非存在下における二本鎖切断の回復を指す。ＮＨＥＪは、切断部位における挿入および欠失をもたらし得る。ＮＨＥＪは、いくつかの副経路によって媒介され、それらの各々は、異なる変異結果を有する。古典的ＮＨＥＪ経路（ｃＮＨＥＪ）は、ＫＵ／ＤＮＡ−ＰＫｃｓ／Ｌｉｇ４／ＸＲＣＣ４複合体を必要とし、最小限のプロセシングにより末端を連結し直し、切断の正確な修復をもたらす。代替的ＮＨＥＪ経路（ａｌｔＮＨＥＪ）もまた、ｄｓＤＮＡ切断の回復において活性であるが、これらの経路は変異原性が著しくより高く、挿入および欠失を特徴とする切断の不正確な修復をもたらす場合が多い。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、末端プロセシング酵素、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えば、Ｔｒｅｘ２によるｄｓＤＮＡ切断の修飾は、修復をａｌｔＮＨＥＪ経路に偏らせ得ることが企図される。
【０１５１】
「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断（ｂｒｅａｋａｇｅ）を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断およぶ二本鎖切断のどちらも可能である。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断に用いられる。
【０１５２】
「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合するおよび／または切断する核酸の一部を定義する染色体または染色体外の核酸配列であるが、但し、結合および／または切断に十分な条件が存在するものとする。
【０１５３】
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞に導入され得る分子である。例示的な外因性分子として、限定されないが、有機小分子、例えば、ＤＮＡインターカレーター、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体、または上記分子の１つ以上を含む任意の複合体が挙げられる。外因性分子を細胞に導入するための例示的な方法は、当業者に既知であり、脂質媒介形質移入（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、およびウイルスベクター媒介形質移入を含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。
【０１５５】
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、および遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかにかかわらず）を含む。遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、用語「ゲノム編集」は、遺伝子の発現を回復させ、修正し、かつ／もしくは修飾する、ならびに／または１つ以上の免疫力エンハンサー、免役抑制シグナルダンパー、および人工抗原受容体を発現する、細胞のゲノムの標的部位における遺伝子材料の置換、欠失、および／または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、任意選択的にドナー修復鋳型の存在下で、細胞のゲノムの標的部位にＤＮＡ損傷を生成するために、ゲノム編集エンハンサーおよび１つ以上の人工ヌクレアーゼ（またはそれをコードするｍＲＮＡ）を細胞に導入することを含む。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子操作された」または「遺伝子組み換えされた」は、細胞内の全遺伝子材料にＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝子材料を染色体または染色体外で付加することを指す。遺伝子組み換えは、細胞のゲノムの特定の部位を標的化してもまたは標的化しなくてもよい。一実施形態において、遺伝子組み換えは部位特異的である。一実施形態において、遺伝子組み換えは部位特異的ではない。
【０１５９】
Ｃ．ゲノム編集エンハンサー
ゲノム編集ストラテジーを用いる際の制約の１つは、効率の低さである。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ゲノム編集エンハンサーを用いることにより非効率的な編集の問題を解決する。本明細書で使用される場合、用語「ゲノム編集エンハンサー」は、相同組み換え修復（ＨＤＲ）および／または誤りの多い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を増加させる小分子または化合物を指す。特定の実施形態において企図される組成物および方法における使用に適したゲノム編集エンハンサーとして、限定されないが、核酸挿入剤が挙げられる。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、用語「挿入剤」または「インターカレーター」は、核酸二重鎖の塩基対間の非共有結合挿入が可能な化合物として当該技術分野で既知であり、この点に関して、「ヘアピンループ」等に形成された塩基対を有する一本鎖核酸の部分を含む核酸構造の二本鎖（ｄｓ）部分のみに特異的である。核酸構造は、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。用語「挿入剤」または「インターカレーター」は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、またはある場合にはｄｓＲＮＡの隣接する塩基対間の平面芳香族化合物または複素芳香族化合物の挿入を説明するためにも使用される。特定の実施形態において、ゲノム編集の有効性は、好ましくは、ゲノム編集エンハンサーを使用して、より好ましくは核酸インターカレーター、より好ましくはＤＮＡインターカレーター、さらにより好ましくはアクリジン、さらにより好ましくは９−アミノアクリジンを使用して増加される。
【０１６１】
本明細書で企図される特定の組成物および方法における使用に適したゲノム編集エンハンサーの例示的な例として、限定されないが、単官能性挿入剤、二官能性挿入剤、および多官能性挿入剤が挙げられる。
【０１６２】
本明細書で企図される特定の組成物および方法における使用に適したゲノム編集エンハンサーの追加の例示的な例として、限定されないが、アクリジン、アントラサイクリン、アルカロイド、クマリン、フェナントリジン、およびナフタルイミドが挙げられる。
【０１６３】
特定の例示的実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、１，８−ナフタルイミド、４’６−ジアミジノ−α−フェニルインドール、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、アクロナイシン、アクチノダフニジン（ａｃｔｉｎｏｄａｐｈｎｉｄｉｎｅ）、アミナクリン、アムサクリン、アントラサイクリン、アントラマイシン、アントラピラゾール、ベンゾフェナントリジンアルカロイド、ベルバミン、ベルベリン、ベルベルビン、ブレオマイシン、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ボルジン、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ブブロカプニン（ｂｕｂｌｏｃａｐｎｉｎｅ）、カンプトテシン、カシチン、シャルトルーシン、クロロキン、クロモマイシン、シンコニジン、シンコニン、コプチシン、コラリン、クマリン、クリプトレピン、ダクチノマイシン、ＤＡＰＩ、ダウノルビシン、ジセントリン、ジクタミン、ジスタマイシン、ドキソルビシン、エリプチシン、エメチン、エタクリジン、エチジウム、エボリトリン、ファガリン、ファガロニン、蛍光クマリン、ＧｅｌＳｔａｒ、ゲンタマイシン、グラウシン、ハルマリン、ハルミン、ハルミン、ヘダマイシン、ヘキシジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ホミジウム、ヒカントン、イミダゾアクリジノン、インダゾール類似体、ヨウ化物、イソコリジン、イソキノリンアルカロイド、ジャトロリジン、ＪＯＪＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、キネチンリボシド、コクサイニン（ｋｏｋｕｓａｉｎｉｎｅ）、ロベリン、ＬＯＬＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ルカントン、マスキュリン、マタジン、メパクリン、メタロ−インターカレーター、ミトラマイシン、ミトキサントロン、ネオクリプトレピン、ネトロプシン、ニチジン、ニトラクリン、ノガラマイシン、ノルハルマン、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、パルマチン、フェナントリジン、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ピラルビシン、ポリピリジル、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、プロフラビン、プロピジウム、ソラレン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノキサリン、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ロジウム系インターカレーター、ルテニウム系インターカレーター、サンギナリン、セルペンチン、スキムミアニン、ストレプトマイシン、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２５、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６３、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５、ＳＹＴＯＸ  ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  ｏｒａｎｇｅ、タクリン、サリドマイド、チアゾールオレンジ、チロロン、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ウサンバレンシン、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群から選択される。
【０１６４】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、ハルミン、ヒカントン、ダウノルビシン、硫酸サンギナリン、キネチンリボシド、乳酸エタクリジン、およびシクロヘキサミドからなる群から選択される。
【０１６５】
特定の実施形態において、編集エンハンサーは、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）、およびハルミンからなる群から選択される。
【０１６６】
好ましい実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、アクリジンまたはジアクリジンである。
【０１６７】
別の好ましい実施形態において、ゲノム編集エンハンサーはアミナクリン（９−アミノアクリジン）である。
【０１６８】
Ｄ．ヌクレアーゼ
細胞の１つ以上の標的部位を標的とする人工ヌクレアーゼは、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および方法に使用される。「人工ヌクレアーゼ」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、該ヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断標的配列に隣接するＤＮＡ結合標的配列に結合するように設計および／または修飾されている。人工ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼからまたは以前に遺伝子操作されたヌクレアーゼから設計および／または修飾されてもよい。特定の実施形態において企図される人工ヌクレアーゼは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。
【０１６９】
特定の実施形態において企図される人工ヌクレアーゼは、標的配列に一本鎖ＤＮＡニックまたは二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生成する。さらに、ＤＳＢは、一本鎖ニックを生成する２つのヌクレアーゼ（ニッカーゼ）の使用によって標的ＤＮＡにおいて達成され得る。それぞれのニッカーゼがＤＮＡの１つの鎖を切断し、２つ以上のニッカーゼの使用により、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（例えば、ねじれ型の二本鎖切断）を形成することができる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼはドナー修復鋳型と組み合わせて使用され、ＤＳＢにおける相同組換えを介してＤＮＡ切断部位の標的配列に導入される。
【０１７０】
標的配列に結合および切断するように遺伝子操作され得るヌクレアーゼの例示的な例として、限定されないが、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、メガＴＡＬ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼ、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼ系が挙げられる。
【０１７１】
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、細胞の１つ以上の標的部位において一本鎖ニックまたは二本鎖切断（ＤＳＢ）に結合して導入するように遺伝子操作される。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」と「メガヌクレアーゼ」は互換的に使用され、１２〜４５の塩基対切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼまたは人工メガヌクレアーゼを指し、配列および構造モチーフに基づいて一般的にＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ  ｂｏｘ、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫの５つのファミリーにグループ化される。
【０１７２】
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、天然に見られる野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、基礎活性を高めるように修飾された野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
【０１７３】
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」、「再プログラム化ホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼ変異体」、「人工メガヌクレアーゼ」、「再プログラム化メガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼ変異体」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、該ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列に結合および切断するように親または天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼから設計および／または修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼ変異体は、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼからまたは別のホーミングエンドヌクレアーゼ変異体から設計および／または修飾されてもよい。特定の実施形態において企図されるホーミングエンドヌクレアーゼ変異体は、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。
【０１７４】
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）変異体は、天然には存在せず、組換えＤＮＡ技術によってまたはランダム変異誘発によって得ることができる。ＨＥ変異体は、天然に存在するＨＥまたはＨＥ変異体において１つ以上のアミノ酸改変を行うことによって、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異させる、置換する、付加する、または欠失させることによって得られてもよい。特定の実施形態において、ＨＥ変異体は、ＤＮＡ認識界面に対する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
【０１７５】
特定の実施形態において企図されるＨＥ変異体は、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、ＨＥ変異体は、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素によりＴ細胞に導入される。ＨＥ変異体および３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡに別個に導入されてもよいか、あるいは、例えば、融合タンパク質として、またはウイルスの自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物に一緒に導入されてもよい。
【０１７６】
再プログラム化ＬＨＥまたはＬＨＥ変異体が設計され得るＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）の例示的な例として、限定されないが、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩが挙げられる。
【０１７７】
再プログラム化ＬＨＥまたはＬＨＥ変異体が設計され得るＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）の別の例示的な例として、限定されないが、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉが挙げられる。
【０１７８】
一実施形態において、再プログラム化ＬＨＥまたはＬＨＥ変異体は、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択される。
【０１７９】
一実施形態において、再プログラム化ＬＨＥまたはＬＨＥ変異体はＩ−ＯｎｕＩである。
【０１８０】
一実施形態において、再プログラム化ＬＨＥまたはＬＨＥ変異体は、天然のＩ−ＯｎｕＩから産生される。好ましい実施形態において、再プログラム化ＬＨＥまたはＬＨＥ変異体は、以前に遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩから産生される。
【０１８１】
特定の実施形態において、再プログラム化ＬＨＥまたはＬＨＥ変異体は、ＤＮＡ認識界面に１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩのＤＮＡ認識界面（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）または遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩの変異体と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０１８２】
一実施形態において、再プログラム化ＬＨＥまたはＬＨＥ変異体は、Ｉ−ＯｎｕＩのＤＮＡ認識界面（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）または遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩの変異体に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０１８３】
種々の例示的実施形態は、１つ以上の標的部位の標的領域に結合して切断するメガＴＡＬヌクレアーゼを企図する。「メガＴＡＬ」は、人工ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび人工メガヌクレアーゼを含み、任意選択的に、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。特定の実施形態において、メガＴＡＬは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素によりＴ細胞に導入され得る。メガＴＡＬおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡに別個に導入されてもよいか、あるいは、例えば、融合タンパク質として、またはウイルスの自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物に一緒に導入されてもよい。
【０１８４】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬエフェクター）のＤＮＡ結合部分であり、植物の転写活性化因子を模倣して植物のトランスクリプトームを操作する（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、新規に、または天然に存在するＴＡＬＥから、例えば、ＡｖｒＢｓ３は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅから、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍから遺伝子操作される。ＤＮＡ結合ドメインを誘導および設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号に開示されており、その中に列挙される参考文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
特定の実施形態において、メガＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、反復の１２位および／または１３位で反復可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１個または２個のＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然の（正準の）コードは、１２位および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）に結合し、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように決定されている。ある特定の実施形態において、非正準（非定型）ＲＶＤが企図される。
【０１８６】
特定の実施形態において企図される特定のメガＴＡＬにおける使用に適した非正準ＲＶＤの例示的な例として、限定されないが、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮ；およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊が挙げられ、（＊）は、１３位のアミノ酸が存在しないことを意味する。特定の実施形態において企図される特定のメガＴＡＬにおける使用に適したＲＶＤの追加の例示的な例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものをさらに含む。
【０１８７】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるメガＴＡＬは、３〜３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、メガＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるメガＴＡＬは、５〜１３個の反復単位、より好ましくは７〜１２個の反復単位、より好ましくは９〜１１個の反復単位、およびより好ましくは９、１０、または１１個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０１８８】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるメガＴＡＬは、３〜３０個の反復単位と、一連のＴＡＬＥ反復単位のＣ末端に位置する２０アミノ酸を含む追加の単一の切断型ＴＡＬＥ反復単位、すなわち、追加のＣ末端ハーフＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位（以下の本明細書の他の箇所に開示されるＣキャップのアミノ酸−２０〜−１）とを含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。したがって、特定の実施形態において、本明細書で企図されるメガＴＡＬは、３．５〜３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、メガＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるメガＴＡＬは、５．５〜１３．５個の反復単位、より好ましくは７．５〜１２．５個の反復単位、より好ましくは９．５〜１１．５個の反復単位、およびより好ましくは９．５、１０．５、または１１．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０１８９】
特定の実施形態において、メガＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチド、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチド、人工メガヌクレアーゼ、およびドメインを連結する１つ以上のリンカーペプチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドは、天然に存在するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。本明細書で使用される場合、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドは、天然に存在するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。
【０１９０】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるメガＴＡＬは、約１２２アミノ酸〜１３７アミノ酸のＮＴＤ、約９．５、約１０．５、または約１１．５個の結合反復単位、約２０アミノ酸〜約８５アミノ酸のＣＴＤ、ならびにＩ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択される人工Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥ、好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩを含む。
【０１９１】
特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮである。「ＴＡＬＥＮ」は、人工ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン（またはそのエンドヌクレアーゼハーフドメイン）を含み、任意選択的に、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素によりＴ細胞に導入され得る。ＴＡＬＥＮおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡに別個に導入されてもよいか、あるいは、例えば、融合タンパク質として、またはウイルスの自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物に一緒に導入されてもよい。
【０１９２】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮは、ＮＴＤ、約３．５〜３０．５個の反復単位、例えば、約３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＴＤ、およびエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインを含む。
【０１９３】
一実施形態において、本明細書で企図されるＴＡＬＥＮは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。一実施形態において、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼはＦｏｋ  Ｉである。
【０１９４】
ＴＡＬＥＮおよびそれを作製する方法の例示的な例は、米国特許第８，５８６，５２６号、同第８，９１２，１３８号、および同第９，３１５，７８８号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。「ＺＦＮ」は、１つ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン（またはそのエンドヌクレアーゼハーフドメイン）を含み、任意選択的に、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。特定の実施形態において、ＺＦＮは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す末端プロセシング酵素によりＴ細胞に導入され得る。ＺＦＮおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡに別個に導入されてもよいか、あるいは、例えば、融合タンパク質として、またはウイルスの自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物に一緒に導入されてもよい。
【０１９６】
特定の実施形態において、ＺＦＮは、１，２，３，４，５，６，７、もしくは８個またはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを有するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼハーフドメイン）とを含む。典型的には、単一のジンクフィンガーモチーフは、約３０アミノ酸長である。ジンクフィンガーモチーフは、正準Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーおよび非正準ジンクフィンガーの両方、例えば、Ｃ３ＨジンクフィンガーおよびＣ４ジンクフィンガーを含む。
【０１９７】
ジンクフィンガー結合ドメインは、任意のＤＮＡ配列に結合するように遺伝子操作することができる。個々のジンクフィンガーモチーフは、３個または４個のヌクレオチド配列に結合する。所与の３ｂｐのＤＮＡ標的配列に対するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン候補が同定されており、対応する複合ＤＮＡ標的配列を標的とするマルチフィンガーペプチド中に複数のドメインを連結するためのモジュールアセンブリストラテジーが考案されている。当該技術分野で既知の他の適切な方法、例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピューター／合理的設計、親和性選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的構築等も、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸を設計および構築するために使用することができる（例えば、米国特許第．５，７８６，５３８号；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２：３４４−３４８（１９９５）；Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９−５６９５（１９９４）；Ｒｅｂａｒ＆Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３（１９９４）；Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ  ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）；Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ  ９１：１１１６８−１１１７２（１９９４）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ８９：７３４５−７３４９（１９９２）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３−９６（１９９５）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２：９７５２−９７５６（１９９５）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：５５２５−５５３０（１９９７）；Ｇｒｉｅｓｍａｎ＆Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７−６６１（１９９７）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９１：１１−９９−１１１０３（１９９４）を参照されたい）。
【０１９８】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＺＮＦは、２，３，４，５，６，７、もしくは８個またはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。一実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインは、Ｆｏｋ  Ｉ  ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼに由来する。
【０１９９】
ＺＮＦおよびそれを作製する方法の例示的な例は、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２００】
種々の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系は、１つ以上の標的部位において一本鎖ニックまたは二本鎖切断（ＤＳＢ）に結合して導入するように遺伝子操作される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、哺乳類のゲノム工学に使用することができる、細菌系に基づいて最近遺伝子操作されたヌクレアーゼ系である。例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６；Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５２：１１７３−１１８３；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４７１；Ｄａｖｉｄ  Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００５６３；Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８（１１）：２２８１−２３０８；Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７７１を参照されたく、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０１】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、Ｃａｓヌクレアーゼ、ならびにＣａｓヌクレアーゼを標的部位に動員する１つ以上のＲＮＡ、例えば、トランス活性化ｃＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、本明細書において「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される１つのポリヌクレオチド配列に遺伝子操作することができる。
【０２０２】
一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼまたは触媒活性を伴わないＣａｓとして遺伝子操作することができ、標的部位内に位置するプロトスペーサー標的配列の部位特異的ＤＮＡ認識および部位特異的切断のためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡと標的複合体を形成する。プロトスペーサーモチーフは、Ｃａｓ／ＲＮＡ複合体の動員において役割を果たす短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に接している。Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドに特異的なＰＡＭモチーフを認識する。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、特定のＣａｓポリペプチドに特異的な特定の３’ＰＡＭ配列が隣接する二本鎖ポリヌクレオチド配列のいずれかまたは両方の鎖を標的とするおよび切断することができる。ＰＡＭは、バイオインフォマティクスを使用して、または実験的手法を使用して同定することができる。Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０（１１）：１１１６−１１２１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２０３】
種々の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。
【０２０４】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に適したＣａｓ９ポリペプチドの例示的な例として、限定されないが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｏｗｎｅｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｕｂｆｌａｖａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａを含む細菌種から得ることができる。
【０２０５】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に適したＣｐｆ１ポリペプチドの例示的な例は、限定されないが、特に、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ菌種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ菌種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ菌種を含む細菌種から得ることができる。
【０２０６】
Ｃａｓ９オルソログの保存領域は、中心のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよび分割されたＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ  Ｈドメインを含む。Ｃｐｆ１オルソログは、ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ  Ｈドメインは有するが、識別可能なＨＮＨドメインは有しない。ＨＮＨおよびＲｕｖＣ様ドメインは、各々、二本鎖ＤＮＡ標的配列の１つの鎖の切断に寄与する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼポリペプチドのＨＮＨドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｖＣ様ドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに非相補的なＤＮＡ鎖を切断する。Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１の各ＲｕｖＣ様ドメインが標的部位の相補的または非相補的な鎖のいずれかを切断する二量体として作用することが予測される。特定の実施形態において、ＨＮＨまたはＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインに、変異体ドメインのヌクレアーゼ活性を低減するまたは排除する１つ以上のアミノ酸付加、欠失、突然変異、または置換を含むＣａｓ９ヌクレアーゼ変異体（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）が企図される。
【０２０７】
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を低減するまたは排除するＣａｓ９  ＨＮＨ突然変異の例示的な例として、限定されないが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄ１０Ａ）；Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｄ９Ａ）；Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｄ１３Ａ）；およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｄ１６Ａ）が挙げられる。
【０２０８】
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を低減するまたは排除するＣａｓ９  ＲｕｖＣ様ドメイン突然変異の例示的な例として、限定されないが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、またはＮ８６３Ａ）；Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、またはＮ６２２Ａ）；Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｄ８７８Ａ、Ｈ８７９Ａ、またはＮ９０２Ａ）；およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、またはＮ６１１Ａ）が挙げられる。
【０２０９】
Ｅ．標的部位
特定の実施形態において企図される人工ヌクレアーゼは、任意の適切な標的配列に結合するように設計することができ、天然に存在するヌクレアーゼと比較して新規結合特異性を有することができる。特定の実施形態において、標的部位は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーエレメント等を含む遺伝子の抑制領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライシング部位である。ある特定の実施形態において、人工ヌクレアーゼは、遺伝子の発現を下方制御するまたは低減するように設計される。人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型は、所望の標的配列を欠失するように設計することができる。いくつかの実施形態において、人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型は、遺伝子のコード配列もしくは制御領域の突然変異を修正するように、かつ／または遺伝子もしくはその制御領域によってコードされるポリペプチドに正常な機能を回復するように設計される。
【０２１０】
適切な標的配列の例示的な例として、以下の遺伝子が挙げられる：βグロビン、δグロビン、γグロビン、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１（ＢＣＬ１１Ａ）、クルッペル様因子１（ＫＬＦ１）、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ハンチンチン（Ｈｔｔ）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ロドプシン（ＲＨＯ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、肺サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体α（ＴＲＡＣ）、Ｔ細胞受容体β（ＴＲＢＣ）、プログラム細胞死１（ＰＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＬＭＰ７、抗原ペプチド輸送体（ＴＡＰ）１、ＴＡＰ２、タパシン（ＴＡＰＢＰ）、主要組織適合抗原ＩＩ型トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ジストロフィン（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ−１、ＲＦＸ５、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、ＺＰ１５、ＫＡＳＩＩ、ＭＤＨ、およびＥＰＳＰＳ。
【０２１１】
治療用導入遺伝子をコードするドナー鋳型の挿入に適した標的部位の追加の例示的な例として、限定されないが、「セーフハーバー遺伝子座」、例えば、ＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、アルブミン、およびＣＣＲ５遺伝子が挙げられる。
【０２１２】
Ｆ．ドナー修復鋳型
特定の実施形態において企図される細胞に基づく組成物は、人工ヌクレアーゼ、ゲノム編集エンハンサーを用いたゲノム編集、および１つ以上のドナー修復鋳型の導入によって生成される。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞における１つ以上の人工ヌクレアーゼの発現は、標的部位で一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を生成し、ゲノム編集エンハンサーおよびドナー修復鋳型の存在下におけるヌクレアーゼ発現および切断の生成は、相同組換えにより標的部位での鋳型の挿入または組み込みをもたらし、それによって切断を修復することが企図される。
【０２１３】
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、１つ以上の相同性アームを含む。
【０２１４】
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＤＳＢ部位に隣接する１つ以上の相同性アームを含む。
【０２１５】
本明細書で使用される場合、用語「相同性アーム」は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されたＤＮＡ切断に隣接するＤＮＡ配列と同一またはほぼ同一のドナー修復鋳型の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＤＮＡ切断部位のＤＮＡ配列５´と同一またはほぼ同一のドナー修復鋳型の核酸配列を含む５´相同性アームを含む。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＤＮＡ切断部位のＤＮＡ配列３´と同一またはほぼ同一の核酸配列を含む３´相同性アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復鋳型は、５´相同性アームおよび３´相同性アームを含む。ドナー修復鋳型は、ＤＳＢ部位に直接隣接するゲノム配列に対する相同性、またはＤＳＢ部位由来の任意の数の塩基対内のゲノム配列に対する相同性を含み得る。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐまたはそれ以上のゲノム配列に対して相同である核酸配列を含む（その間の全ての長さの相同配列を含む）。
【０２１６】
特定の実施形態において企図される相同性アームの適切な長さの例示的な例は、独立して選択され得、限定されないが、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、または約３０００ｂｐ、またはそれよりも長い相同性アームが挙げられる（その間の全ての長さの相同性アームを含む）。
【０２１７】
適切な相同性アーム長さの追加の例示的な例として、限定されないが、約１００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ〜約１５００ｂｐが挙げられる（その間の全ての長さの相同性アームを含む）。
【０２１８】
特定の実施形態において、５´および３´相同性アームの長さは、約５００ｂｐ〜約１５００ｂｐから独立して選択される。一実施形態において、５´相同性アームは約１５００ｂｐであり、３´相同性アームは約１０００ｂｐである。一実施形態において、５´相同性アームは約６００ｂｐであり、３´相同性アームは約６００ｂｐである。
【０２１９】
ドナー修復鋳型は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、本明細書の他の箇所で企図されるプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終止シグナル、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグをさらに含み得る。
【０２２０】
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、５´相同性アーム、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、治療遺伝子またはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、導入遺伝子または選択可能なマーカー、および３´相同性アームを含む。
【０２２１】
種々の実施形態において、標的部位は、５´相同性アーム、治療遺伝子またはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、導入遺伝子または選択可能なマーカー、および３´相同性アームを含むドナー修復鋳型で修飾される。
【０２２２】
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、治療遺伝子もしくはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、導入遺伝子、または選択可能なマーカーを含む。
【０２２３】
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、限定されないが、βグロビン、δグロビン、γグロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）、ＨＰＲＴ、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＬＲＲＫ２、Ｈｔｔ、ＳＯＤ１、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＲＨＯ、ＣＦＴＲ、ＳＦＴＰＢ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＬＭＰ７、ＴＡＰ  １、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＣＩＩＴＡ、ＤＭＤ、ＧＲ、ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ−１、ＲＦＸ５、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、ＺＰ１５、ＫＡＳＩＩ、ＭＤＨ、およびＥＰＳＰＳを含む、治療遺伝子もしくはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、導入遺伝子、または選択可能なマーカーを含む。
【０２２４】
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、サイトカイン、リンホカイン、モノカイン、ケモカイン、ホルモン、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β、血小板成長因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、β、およびγ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β、ならびにＬＩＦおよび（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子からなる群から選択される治療遺伝子またはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０２２５】
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体）、ならびに人工抗原受容体（例えば、人工Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体）からなる群から選択される遺伝子または導入遺伝子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０２２６】
本明細書で使用される場合、用語「人工ＴＣＲ」は、Ｔ細胞受容体を指し、例えば、標的抗原に対して高い結合活性および反応性を有するαβＴＣＲを指す。人工ＴＣＲは、選択され、クローニングされ、続いて養子免疫療法に使用されるＴ細胞の集団に導入することができる。人工ＴＣＲは、通常は特定のＴＣＲを発現しないＴ細胞に導入されるため、外因性ＴＣＲである。人工ＴＣＲの本質的側面は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）または同様の免疫学的成分によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合活性を有するということである。人工ＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣ非依存的様式で標的抗原に結合するように遺伝子操作される。
【０２２７】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体を指す。ＣＡＲの例示的な例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６４７５９号、同第ＷＯ２０１５／１８８１１９号、および同第ＷＯ２０１６／０１４７８９号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
本明細書で使用される場合、用語「Ｄａｒｉｃ受容体」は、多鎖人工抗原受容体を指す。Ｄａｒｉｃ構造およびその成分の例示的な例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０１７２１４号および米国特許公開第２０１５０２６６９７３号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２９】
本明細書で使用される場合、用語「キメラサイトカイン受容体」または「ゼータカイン」は、細胞外ドメインを細胞表面、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達ドメインに繋ぎ止めることができる支持領域に連結された可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインを含むキメラ膜貫通免疫受容体を指す。ゼータカインの例示的な例は、米国特許第７，５１４，５３７号、同第８，３２４，３５３号、同第８，４９７，１１８号、および同第９，２１７，０２５号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
Ｇ．ゲノム編集細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるゲノム編集細胞は、改善された遺伝子治療組成物を提供する。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、ゲノム編集エンハンサーを用いて達成される高いゲノム編集効率に起因して、より強力なゲノム編集細胞組成物を提供すると考えられる。
【０２３１】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集細胞は、自家／自律（「自己」）または非自家（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であり得る。「自家」は、本明細書で使用される場合、同じ対象由来の細胞を指す。「同種」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは遺伝学的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞と遺伝学的に同一である異なる対象の細胞を指す。「異種」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞はヒト対象から得られる。
【０２３２】
「単離された細胞」は、非天然起源の細胞、例えば、インビボ組織または器官から得られた、細胞外基質を実質的に含まない、天然には存在しない細胞、修飾された細胞、遺伝子操作された細胞等を指す。
【０２３３】
本明細書で企図される組成物および方法を使用してゲノムを編集することができる細胞型の例示的な例として、限定されないが、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。
【０２３４】
用語「幹細胞」は、（１）長期自己再生が可能な非分化細胞である細胞、または元の細胞の少なくとも１つの同一コピーで産生する能力、（２）複数の、また場合によっては唯一の、特殊な細胞型への単一細胞レベルでの分化、および（３）組織のインビボ機能再生を指す。幹細胞は、それらの発生能に応じて全能性、多能性、多分化能性および少能性／単能性に細分類される。「自己再生」は、不変の娘細胞を生成し、特殊な細胞型を産生する特異な能力（潜在力）を有する細胞を指す。自己再生は、２つの方式で達成され得る。非対称細胞分裂は、親細胞と同一の娘細胞を１つと、親細胞とは異なる、前駆細胞または分化細胞である娘細胞を１つ生成する。対称細胞分裂は、同一の娘細胞を２つ生成する。細胞の「増殖」または「増加」は、対称に分裂する細胞を指す。
【０２３５】
本明細書で使用される場合、用語「前駆体」または「前駆細胞」は、自己再生して、より成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は、単一の系統に沿って分化するが、非常に広範な増殖能を有し得る。
【０２３６】
一実施形態において、ゲノム編集細胞は胚性幹細胞である。
【０２３７】
一実施形態において、ゲノム編集細胞は、成人の幹細胞または前駆細胞である。
【０２３８】
特定の実施形態において、ゲノム編集細胞は、中胚葉幹細胞または前駆細胞、内胚葉幹細胞または前駆細胞、および外胚葉幹細胞または前駆細胞からなる群から選択される幹細胞または前駆細胞である。
【０２３９】
関連する実施形態において、ゲノム編集細胞は中胚葉幹細胞または前駆細胞である。中胚葉幹細胞または前駆細胞の例示的な例として、限定されないが、骨髄幹細胞または前駆細胞、臍帯幹細胞または前駆細胞、脂肪組織由来幹細胞または前駆細胞、造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）、間葉系幹細胞または前駆細胞、筋肉幹細胞または前駆細胞、腎臓幹細胞または前駆細胞、造骨幹細胞または前駆細胞、軟骨幹細胞または前駆細胞等が挙げられる。
【０２４０】
他の関連する実施形態において、ゲノム編集細胞は外胚葉幹細胞または前駆細胞である。外胚葉幹細胞または前駆細胞の例示的な例として、限定されないが、神経幹細胞または前駆細胞、網膜幹細胞または前駆細胞、皮膚幹細胞または前駆細胞等が挙げられる。
【０２４１】
他の関連する実施形態において、ゲノム編集細胞は内胚葉幹細胞または前駆細胞である。内胚葉幹細胞または前駆細胞の例示的な例として、限定されないが、肝臓幹細胞または前駆細胞、膵臓幹細胞または前駆細胞、上皮幹細胞または前駆細胞等が挙げられる。
【０２４２】
一実施形態において、ゲノム編集細胞は、骨細胞（ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、造骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、筋芽細胞、筋細胞、平滑筋細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、グリア細胞、星状膠細胞、ニューロン、色素細胞、上皮細胞、皮膚細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、乳房細胞、結腸細胞、食道細胞、消化管細胞、胃細胞、結腸細胞、頭部細胞、頸部細胞、歯肉細胞、舌細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、上咽頭細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、子宮頸部細胞、膣細胞、子宮細胞、膵臓細胞、膵臓実質細胞、膵臓導管細胞、膵臓島細胞、前立腺細胞、陰茎細胞、生殖腺細胞、精巣細胞、造血細胞、リンパ球系細胞または骨髄系細胞である。
【０２４３】
好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物および方法は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、免疫エフェクター細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞等を編集するために使用される。
【０２４４】
造血細胞を得るための例示的な源として、限定されないが、臍帯血、骨髄または動員末梢血が挙げられる。
【０２４５】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物の生存期間にわたって成熟血液細胞の全レパートリーを産生することができる重要な造血前駆細胞（ＨＰＣ）をもたらす。用語「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄系統（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系統（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、ならびに当該技術分野において既知である他の系統（Ｆｅｉ，Ｒ．らの米国特許第５，６３５，３８７号；ＭｃＧｌａｖｅらの米国特許第５，４６０，９６４号；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．らの米国特許第５，６７７，１３６号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらの米国特許第５，７５０，３９７号；Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第５，７５９，７９３号；ＤｉＧｕｉｓｔｏらの米国特許第５，６８１，５９９号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらの米国特許第５，７１６，８２７号を参照されたい）を含む、生物の全ての血液細胞型をもたらす多分化能性幹細胞を指す。致死的に照射された動物またはヒトに移植されると、造血幹細胞は、赤芽球プール、好中球−マクロファージプール、巨核球プールおよびリンパ造血細胞プールを再配置させることができる。
【０２４６】
本明細書で企図される方法および組成物を用いた使用に適した造血幹細胞または前駆細胞の追加の例示的な例として、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−である造血細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８Ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）である造血細胞、ならびにＣＤ１３３＋である造血細胞が挙げられる。
【０２４７】
一実施形態において、造血細胞はＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞である。
【０２４８】
造血の階層性を特徴付けるために種々の方法が存在する。特徴付けの方法の１つはＳＬＡＭコードである。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、第１染色体（マウス）上の単一の遺伝子座に大部分の遺伝子がタンデムに位置し、全てが免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、最初はＴ細胞刺激に関与すると考えられていた１０分子未満の群である。このファミリーは、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４等を含み、ＣＤ１５０が創始メンバーであるため、ｓｌａｍＦ１、すなわちＳＬＡＭファミリーメンバー１とも称される。造血の階層性に関する特徴的なＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）−ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−；多分化能性前駆細胞（ＭＰＰ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＣＤ２４４＋；系統制限前駆細胞（ＬＲＰ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋ＣＤ２４４＋；一般的な骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｍｉｄ；顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｈｉ；および巨核球・赤芽球前駆細胞（ＭＥＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４−ＣＤ１６／３２ｌｏｗである。
【０２４９】
一実施形態において、造血細胞はＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−細胞である。
【０２５０】
一実施形態において、造血細胞はＣＤ３４＋造血細胞である。
【０２５１】
種々の実施形態において、造血細胞は免疫エフェクター細胞である。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
【０２５２】
用語「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、当該技術分野で認識されており、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含む。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、または任意の他のＴ細胞のサブセットであり得る。一実施形態において、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。特定の実施形態における使用に適したＴ細胞の他の例示的な集団は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を含む。
【０２５３】
「強力なＴ細胞」および「若いＴ細胞」は、特定の実施形態において互換的に使用されており、分化においてＴ細胞が増殖および付随して減少することができるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態において、若いＴ細胞は「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、若いＴ細胞は、以下の生物学的マーカーの１つ以上または全てを含む：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８。一実施形態において、若いＴ細胞は、以下の生物学的マーカーの１つ以上または全てを含む：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８。一実施形態において、若いＴ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３の発現が欠如している。
【０２５４】
Ｔ細胞は、限定されないが、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多数の源から得ることができる。
【０２５５】
Ｈ．ポリペプチド
限定されないが、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工抗原受容体、治療ポリペプチド、融合ポリペプチド、およびポリペプチドを発現するベクターを含む種々のポリペプチドが本明細書で企図される。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、そうではないという規定のない限り、互換的に、かつ従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他の変異体を含む。ポリペプチドは、さまざまな周知の組換えおよび／または合成技術のいずれかを用いて調製することができる。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含むことができ、天然起源および非天然起源の両方の、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾も含むことができる。
【０２５６】
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」等は、本明細書で使用される場合、細胞環境からの、および細胞の他の成分との関連からのペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロでの単離および／または精製を指す：すなわち、これはインビボ物質と有意に関連していない。
【０２５７】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例として、限定されないが、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工ＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃｓ、治療ポリペプチドおよび融合ポリペプチド、ならびにそれらの変異体が挙げられる。
【０２５８】
ポリペプチドは「ポリペプチド変異体」を含む。「ポリペプチド変異体」は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加および／または挿入において天然に存在するポリペプチドとは異なり得る。そのような変異体は天然に存在してもよいか、または例えば、上記ポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成的に生成されてもよい。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチドに１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入を導入することによって人工ヌクレアーゼ、人工ＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ等の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書で企図される参照配列のいずれかに少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、変異体は、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【０２５９】
ポリペプチド変異体は、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性な断片」または「最小限に生物学的に活性な断片」は、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％を維持するポリペプチド断片を指す。ポリペプチド断片は、天然に存在するまたは組換えによって生成されるポリペプチドの１つ以上のアミノ酸のアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失もしくは置換を有する単量体または多量体であり得るポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含むことができる。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００またはそれ以上のアミノ酸長であることを理解されたい。
【０２６０】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。
【０２６１】
特定の実施形態において企図される融合タンパク質の例示的な例として、限定されないが、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工抗原受容体、および他のポリペプチドを含むポリペプチドが挙げられる。
【０２６２】
融合ポリペプチドは、任意選択的に、１つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを結合するために使用することができるリンカーを含んでもよい。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮できるように、各ポリペプチドがその適切な二次構造および三次構造に折り畳むことを確実にするのに十分な距離だけ、任意の２つ以上のポリペプチド成分を分離するように用いられ得る。
【０２６３】
例示的なリンカーとして、限定されないが、以下のアミノ酸配列が挙げられる：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー；ＧＧＧ（配列番号１）；ＤＧＧＧＳ（配列番号２）；ＴＧＥＫＰ（配列番号３）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号４）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上記参照）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４または５）（配列番号５）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号６）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号７）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号８）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号９）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１０）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号１１）。代替として、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）、またはファージディスプレイ方法によって、可撓性リンカーを合理的に設計することができる。
【０２６４】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間、または内因性オープンリーディングフレームとドナー修復鋳型によってコードされるポリペプチドとの間に、ポリペプチド切断シグナルをさらに含んでよい。さらに、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルは、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、および自己切断ウイルスオリゴペプチド等のポリペプチド切断認識部位を含む（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
【０２６５】
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位として、限定されないが、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ−２にコードされるプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。切断ストリンジェンシーが高いことに起因して、ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１２）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１３）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１４）（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）が、一実施形態において好ましい（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間またはＱとＳの間で起こる）。
【０２６６】
ある特定の実施形態において、自己切断ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列、またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０２６７】
Ｉ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のメガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、人工ＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃｓ、治療ポリペプチド、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【０２６８】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、組換え、合成、または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドは、限定されないが、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、合成ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、＋鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態の、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、もしくは少なくとも１５０００またはそれよりも長いヌクレオチド長、およびその中間の全ての長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、引用される値の間の任意の長さ、例えば、６、７、８、９等、１０１、１０２、１０３等；１５１、１５２、１５３等；２０１、２０２、２０３等を意味することは容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは変異体は、参照配列に対して少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【０２６９】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはコドン最適化されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」は、ポリペプチドの発現、安定性および／または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいてコドンを置換することを指す。
【０２７０】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」等は、ストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと実質的に配列相同性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾により参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」は、１つ以上のヌクレオチドが付加された、または欠失された、または修飾された、または異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。これに関連して、突然変異、付加、欠失および置換を含むある特定の改変が参照ポリヌクレオチドに対して行われてもよく、それによって、改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは、当該技術分野において十分に理解されている。
【０２７１】
「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態でこれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ断片に通常近接する配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然には存在しない、人の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
【０２７２】
本明細書で使用される用語「核酸カセット」または「発現カセット」は、ＲＮＡおよびその後にポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝的配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的の遺伝子（複数可）、例えば、目的のポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および目的の遺伝子（複数可）、例えば、目的のポリヌクレオチド（複数可）を含有する。特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、１つ以上の核酸カセットを含む。
【０２７３】
本明細書で使用される場合、用語「目的のポリヌクレオチド（複数可）」は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、発現ベクターに挿入されたポリペプチド（すなわち、目的のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。
【０２７４】
ある特定の実施形態において、目的のポリヌクレオチドは、限定されないが、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたは別の阻害性ＲＮＡを含む阻害性ポリヌクレオチドを含む。
【０２７５】
ポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡ配列、例えば、本明細書の他の箇所で企図されるかまたは当該技術分野で既知である、プロモーターおよび／もしくはエンハンサー、未翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終止シグナル、転写後応答エレメント、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグと組み合わされてもよく、そのため、それらの全体的な長さが著しく異なり得る。したがって、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片が用いられ得ることが企図され、全長は、好ましくは、意図する組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用し易さによって限定される。
【０２７６】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知および利用可能なさまざまな十分に確立された技術のいずれかを用いて調製する、操作する、発現させる、および／または送達することができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。
【０２７７】
特定の実施形態において、ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれる。
【０２７８】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクターまたは染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、用語「エピソーム」は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれることなく、また、分裂する宿主細胞から漸進的に喪失することなく複製することができるベクターを指し、該ベクターが染色体外にまたはエピソームに複製することも意味する。
【０２７９】
ベクターの例示的な例として、限定されないが、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられる。
【０２８０】
追加の例示的なベクターの例として、限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）、ラムダファージまたはＭ１３ファージ等のバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。
【０２８１】
発現ベクター内に存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」、または「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳領域−複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域−である。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性において異なり得る。用いられるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む任意の数の適切な転写および翻訳エレメントが使用され得る。
【０２８２】
用語「作動可能に連結した」は、記載される成分が、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサー等）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの間の機能的な連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を導く。
【０２８３】
用語「ベクター」は、別の核酸分子を導入または輸送することが可能な核酸分子を指すために本明細書において使用される。導入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結され、例えば、挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を導く配列を含んでもよいか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のポリヌクレオチドを細胞に送達するために非ウイルスベクターが使用される。
【０２８４】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを送達する例示的な方法として、限定されないが、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられる。
【０２８５】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に適したポリヌクレオチド送達系の例示的な例として、限定されないが、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、  ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって提供されるものが挙げられる。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。効率的なポリヌクレオチドの受容体認識リポフェクションに適したカチオン脂質および中性脂質は文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７およびＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。抗体を標的とする、最近由来の、非生体ナノ細胞ベースの送達もまた、特定の実施形態において企図される。
【０２８６】
１つ以上の治療ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ウイルス法によって標的細胞に導入され得る。
【０２８７】
Ｊ．ウイルスベクター
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはレトロウイルスベクター、またさらにより好ましくはレンチウイルスベクターを用いて標的細胞に導入される。
【０２８８】
当業者には明らかであるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には、核酸分子の導入もしくは細胞のゲノム内への組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）、または、核酸導入を媒介するウイルスもしくはウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用されている。ウイルス粒子は、典型的には、核酸（複数可）に加えて、種々のウイルス成分、および時には宿主細胞成分も含む。
【０２８９】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、典型的には、後述するように全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内への点滴）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達され得る。代替として、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検等）、または普遍的ドナー造血幹細胞等の細胞に、ベクターをエクスビボで送達して、その後、細胞を患者に再移植することができる。
【０２９０】
一実施形態において、人工ヌクレアーゼおよび／またはドナー修復鋳型を含むウイルスベクターは、インビボで細胞を形質導入するために生物に直接投与される。代替として、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、限定されないが、注射、点滴、局所適用および電気穿孔を含む、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるように導入するために通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸を投与するのに適した方法は、当業者に利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために１つより多くの経路が使用されてもよいが、多くの場合、特定の経路が別の経路より迅速かつより効果的な反応を提供することができる。
【０２９１】
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に適したウイルスベクター系の例示的な例として、限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、遺伝子導入のためのワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
【０２９２】
種々の実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で細胞を形質導入することによって、人工ヌクレアーゼおよび／またはドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが細胞に導入される。ＡＡＶは、小さい（約２６ｎｍ）、複製欠損性の、主にエピソームの非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最小限の導入遺伝子およびその調製配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）からなる。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離されたカプシド配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラｒＡＡＶが使用され、ＩＴＲ配列が１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列が異なるＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列およびＡＡＶ６由来のカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のいずれか１つに由来のカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列およびＡＡＶ６由来のカプシド配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子操作および選択方法は、ＡＡＶカプシドが目的の細胞を形質導入し易くするようにそれらに適用することができる。ｒＡＡＶベクターの構築、その生成および精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号、および同第８，７８４，７９９号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９３】
種々の実施形態において、レトロウイルス、例えば、１つ以上のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで細胞を形質導入することによって、人工ヌクレアーゼおよび／またはドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが細胞に導入される。
【０２９４】
本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルス」は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状の二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合によって組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に適した例示的なレトロウイルスとして、限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））ならびにレンチウイルスが挙げられる。
【０２９５】
本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルス」は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとして、これらに限定されないが、：ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態において、ＨＩＶに基づくベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。
【０２９６】
種々の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、１つ以上のＬＴＲ、およびｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、輸送エレメント、ポリ（Ａ）配列のアクセサリーエレメントの１つ以上または全てを含み、任意選択的に、本明細書の他の箇所で論じされるような、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、インスレーターエレメント、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子を含んでもよい。
【０２９７】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、組み込み型または非組み込み型または組み込み欠損レンチウイルスであってもよい。本明細書で使用される場合、用語「組み込み欠損レンチウイルス」は、宿主細胞のゲノムにウイルスゲノムを組み込む能力を欠いたインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み不能ウイルスベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許出願第ＷＯ２００６／０１０８３４号に記載されている。
【０２９８】
インテグラーゼ活性を低減するのに適したＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子における例示的な突然変異として、限定されないが、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１  Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１  Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３ＡおよびＫ２６４Ｈが挙げられる。
【０２９９】
用語「長い末端反復（ＬＴＲ）」は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、それらの天然配列に関して、直接反復であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含有する。
【０３００】
本明細書で使用される場合、用語「ＦＬＡＰエレメント」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」は、その配列に、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中心ポリプリントラクトおよび中心終止配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕらの２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。
【０３０１】
本明細書で使用される場合、用語「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」とは、ウイルスＲＮＡのウイルスカプシドまたは粒子への挿入に必要である、レトロウイルスゲノム内に位置するＰｓｉ［Ψ］配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
【０３０２】
用語「輸送エレメント」は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節因子を指す。ＲＮＡ輸送因子の例として、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。
【０３０３】
特定の実施形態において、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および任意選択的に、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって、ウイルスベクターにおける異種配列の発現を増加させる。さまざまな転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）等が、タンパク質で異種核酸の発現を増加させることができる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）。
【０３０４】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲを修飾した結果として、いくつかの安全性強化部を含む。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、最初のラウンドのウイルス複製を超えるウイルス転写を防止するために、Ｕ３領域として知られる右側（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が修飾された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損ベクターを指す。追加の安全性強化部は、ウイルス粒子の生成中にウイルスゲノムの転写を駆動するために、異種プロモーターで５’ＬＴＲのＵ３領域を置換することによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例として、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。
【０３０５】
用語「シュードタイプ」または「シュードタイピング」は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特徴を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）は、通常、ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的化するため、ＨＩＶを水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングすることができ、そうすることによりＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することができる。
【０３０６】
ある特定の実施形態において、既知の方法に従ってレンチウイルスベクターが生成される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０；Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０３０７】
本明細書で企図されるある特定の特異的な実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全てがレンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルス配列の多くの異なる源が使用されてもよいかまたは組み合わされてもよく、レンチウイルス配列のいくつかにおける多数の置換および改変は、本明細書に記載される機能を実行する導入ベクターの能力を損なうことなく適応され得ることを理解されたい。さらに、さまざまなレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ，１９９６ｂ，ａｎｄ１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）；Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、これらの多くは、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは導入プラスミドを産生するように適合させることができる。
【０３０８】
種々の実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで細胞を形質導入することによって、人工ヌクレアーゼおよび／またはドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが細胞に導入される。
【０３０９】
アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を可能にし、また細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いると、高い力価および高レベルの発現が得られる。このベクターは、比較的単純な系で大量に生成することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換し、その後、複製欠損ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞で増殖するように遺伝子操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見られるもの等の非分裂性の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い運搬能を有する。
【０３１０】
複製欠損性である現在のアデノウイルスベクターの産生および増殖は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する、２９３と名付けられた特有のヘルパー細胞株を用いることができる（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムには不要であるため（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の補助により、Ｅ１領域、Ｄ３領域のいずれかまたは両方に外来ＤＮＡを担持する（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）に用いられてきた。異なる組織に組換えアデノウイルスを投与する研究は、気管滴下（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈注射（Ｈｅｒｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を含む。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍ワクチン接種のためのポリヌクレオチド治療を含んでいた（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
【０３１１】
種々の実施形態において、単純ヘルペスウイルス、例えば、１つ以上のポリヌクレオチドを含むＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２で細胞を形質導入することによって、人工ヌクレアーゼおよび／またはドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが細胞に導入される。
【０３１２】
成熟したＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する包被された正二十面体のカプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶに基づくウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須のＨＳＶ遺伝子が欠損している。一実施形態において、ＨＳＶに基づくベクターは複製欠損性である。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を妨げるために、１つ以上の最初期、初期または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含有する。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期のＤＮＡ発現をもたらし得る潜伏段階に入るその能力と、最大２５ｋｂの外来性ＤＮＡインサートを収容し得るその大型ウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶに基づくベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、および同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、同第ＷＯ９６／０４３９４号、同第ＷＯ９８／１５６３７号、および同第ＷＯ９９／０６５８３号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３１３】
Ｋ．組成物および製剤
特定の実施形態において企図される組成物は、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに本明細書において企図されるようなゲノム編集組成物およびゲノム編集細胞組成物を含み得る。
【０３１４】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞集団を編集するのに有用である。本明細書で使用される場合、用語「細胞集団」は、本明細書の他の箇所に記載されるような任意の数および／または組み合わせの同種または異種の細胞型で構成され得る複数の細胞を指す。例えば、細胞集団は、形質導入される標的細胞型の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％を含み得る。
【０３１５】
種々の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ゲノム編集エンハンサーおよび人工ヌクレアーゼを含む。人工ヌクレアーゼは、上に開示したポリヌクレオチド送達法、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子等によって細胞に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。本組成物は、ゲノム編集エンハンサーを欠く組成物と比較して、誤りの多いＮＨＥＪによってゲノム編集の割合が増加されたまたは高められた、増強されたゲノム編集細胞集団を生成するために用いられ得る。
【０３１６】
種々の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ゲノム編集エンハンサー、ドナー修復鋳型、および人工ヌクレアーゼを含む。人工ヌクレアーゼは、上に開示したポリヌクレオチド送達法、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子等によって細胞に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。本組成物は、ゲノム編集エンハンサーを欠く組成物と比較して、誤りの多いＨＤＲによってゲノム編集の割合が増加されたまたは高められた、増強されたゲノム編集細胞集団を生成するために用いられ得る。
【０３１７】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞集団、ゲノム編集エンハンサー、人工ヌクレアーゼ、および任意選択的に、ドナー修復鋳型を含む。人工ヌクレアーゼは、上に開示したポリヌクレオチド送達法によって細胞に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。
【０３１８】
特定の実施形態において、細胞集団は、限定されないが、造血幹細胞、造血前駆細胞、およびＴ細胞を含む造血細胞を含む。
【０３１９】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、好ましくは核酸インターカレーターであり、より好ましくはＤＮＡインターカレーターであり、さらにより好ましくはアクリジンであり、さらにより好ましくは９−アミノアクリジンである。
【０３２０】
組成物は、限定されないが、薬学的組成物を含む。「薬学的組成物」は、単独で、または１つ以上の他の治療法と組み合わせて細胞または動物に投与するために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に配合された組成物を指す。また、組成物は、必要に応じて他の薬剤、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤と組み合わせて投与され得ることも理解されたい。組成物中に同時に含まれ得る他の成分には実質的に制限はないが、但し、追加の薬剤は、意図する治療を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。
【０３２１】
「薬学的に許容される」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書において使用される。
【０３２２】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」は、限定されないが、米国食品医薬品局によってヒトまたは家畜動物における使用に許容されるという認可を受けている任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体として、限定されないが、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ワックス、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質不含水；等張性食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤に用いられる任意の他の適合する物質が挙げられる。
【０３２３】
特定の実施形態において、組成物は、ゲノム編集エンハンサーを含む、本明細書で企図される方法によって製造されるある量のゲノム編集細胞を含む。好ましい実施形態において、薬学的な細胞組成物は、ゲノム編集エンハンサーを使用して編集されていない細胞集団と比較して増加した割合のゲノム編集細胞を含む細胞集団を含む。
【０３２４】
ある特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーを使用して製造される薬学的細胞組成物は、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、もしくは約９６％、９７％、９８％、または９９％のゲノム編集細胞を含む細胞集団を含む。
【０３２５】
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるゲノム編集細胞を含む薬学的組成物は、約１０２〜約１０１０細胞／体重Ｋｇ、約１０５〜約１０９細胞／体重Ｋｇ、約１０５〜約１０８細胞／体重Ｋｇ、約１０５〜約１０７細胞／体重Ｋｇ、約１０７〜約１０９細胞／体重Ｋｇ、または約１０７〜約１０８細胞／体重Ｋｇ（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投与量で投与され得ると概括的に述べることができる。細胞の数は、組成物中のゲノム編集細胞のパーセンテージ、組成物が意図される最終用途、およびその中に含まれる細胞の種類に依存する。本明細書に提供される使用のために、細胞は概して、１リットルまたはそれより少ない体積であり、５００ｍＬ以下、さらには２５０ｍＬもしくは１００ｍＬまたはそれより少なくてもよい。したがって、所望の細胞密度は、約１０６細胞／ｍＬよりも大きく、通常約１０７細胞／ｍＬよりも大きく、通常約１０８細胞／ｍＬよりも大きく、またはそれよりも大きい。臨床的に関連する細胞数は、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２細胞と累積的に等しいかまたはそれを上回る複数の輸液に分配することができる。
【０３２６】
いくつかの実施形態において、特に、細胞集団に高い割合のゲノム編集細胞が存在するため、１０６／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１）の範囲のより少ない数の細胞が、これらの範囲内の投与量で複数回投与されてもよい。細胞は、治療を受ける患者にとって同種、同系、異種、または自家であり得る。
【０３２７】
特定の実施形態において、本明細書で企図される薬学的組成物は、ある量のゲノム編集Ｔ細胞を、１つ以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む。
【０３２８】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集細胞を含む薬学的組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態において企図される組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与のために製剤化される。
【０３２９】
液体の薬学的組成物は、それらが溶液、懸濁物、または他の同様の形態であるかにかかわらず、以下のうちの１つ以上を含んでもよい：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理的食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体として機能し得る合成モノグリセリドまたはジグリセリド等の不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸等の緩衝液、および、張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース等。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。注射用薬学的組成物は、好ましくは無菌である。
【０３３０】
一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地において製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に適している。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は無血清培地である。
【０３３１】
無血清培地は、単純化されたより良好に定義された組成、混入物の程度が低いこと、感染病原体の潜在的な源の排除、およびより低いコストを含む、血清含有培地に勝るいくつかの利点を有する。種々の実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択的にタンパク質を含まない場合がある。任意選択的に、培地は、生物薬剤学的に許容される組換えタンパク質を含有してもよい。「動物質を含まない」培地は、その成分が非動物性の源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地において天然タンパク質の代わりとなり、栄養分は、合成の植物性または微生物性の源から得られる。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、タンパク質を実質的に含まないものとして定義される。
【０３３２】
特定の組成物に使用される無血清培地の例示的な例として、限定されないが、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ  １０が挙げられる。
【０３３３】
好ましい一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含む溶液中に製剤化される。
【０３３４】
別の好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集細胞を含む組成物は、凍結保存培地を含む溶液中に製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地が、解凍後の高い細胞生存率の成績を維持するために使用されてもよい。特定の組成物に使用される凍結保存培地の例示的な例として、限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が挙げられる。
【０３３５】
より好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集細胞を含む組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  ＡおよびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０を含む溶液中に製剤化される。
【０３３６】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、有効量のゲノム編集細胞組成物を単独で、または１つ以上の治療剤と組み合わせて含む。したがって、組成物は、単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光ダイナミック療法等の他の既知の治療と組み合わせて投与され得る。また、組成物は、抗生物質と組み合わせて投与されてもよい。そのような治療剤は、特定の癌等の、本明細書に記載される特定の病状のための標準的治療として当該技術分野で許容され得る。特定の実施形態において企図される例示的な治療剤は、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体、または他の活性および補助的な薬剤を含む。
【０３３７】
Ｌ．ゲノム編集方法
種々の実施形態において、細胞集団のゲノムを編集する方法が企図される。細胞のゲノムを編集するためのゲノム編集組成物およびその使用方法は、高いゲノム編集効率を提供する。いずれか特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図されるゲノム編集組成物におけるゲノム編集エンハンサーの使用は、集団におけるゲノム編集細胞の数を有意に増加させることが企図される。
【０３３８】
特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、ゲノム編集エンハンサーを使用せずに製造された集団におけるゲノム編集細胞の数と比較して、集団におけるゲノム編集細胞の割合を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約２００％、またはそれ以上増加させる。特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、ゲノム編集エンハンサーを使用せずに製造された集団におけるゲノム編集細胞の数と比較して、集団におけるゲノム編集細胞の割合を約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、もしくは約１０倍またはそれ以上増加させる。
【０３３９】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集方法は、標的部位でＤＳＢを形成するために、本明細書で企図される１つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーを細胞集団に導入することと、任意選択的に、誤りの多いＮＨＥＪによる切断の修復の速度または頻度を増加させるために、末端プロセシング酵素、例えば、３´−５´エキソヌクレアーゼまたはその生物学的に活性な断片、例えば、Ｔｒｅｘ２を細胞に導入することと、を含む。
【０３４０】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集方法は、標的部位でＤＳＢを形成するために、本明細書で企図される１つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーを細胞集団に導入することと、その後、相同組換えによってＤＳＢで細胞のゲノムに組み込まれる細胞集団に１つ以上のドナー修復鋳型を導入することと、を含む。
【０３４１】
一実施形態において、細胞集団におけるゲノム編集を増大させる方法は、細胞に人工ヌクレアーゼを導入することと、細胞集団におけるゲノム編集の頻度を増加させるために細胞をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含む。
【０３４２】
一実施形態において、細胞集団における相同組み換え修復（ＨＤＲ）を増大させる方法は、細胞に人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型することと、細胞集団におけるＨＤＲの頻度を増加させるために細胞をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含む。
【０３４３】
一実施形態において、細胞集団における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を増加させる方法は、人工ヌクレアーゼおよび任意選択的に末端プロセシング酵素、例えば、３´−５´エキソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２、Ｅｘｏ１、ＴｄＴｅｔｃ．）を細胞に導入することと、細胞集団におけるＮＨＥＪの頻度を増加させるために該細胞をゲノム編集エンハンサーと接触させることと、を含む。
【０３４４】
ゲノム編集の速度または効率が増加する限り、ゲノム編集エンハンサーは、特定の実施形態において任意の好適な濃度で使用することができる。特定の実施形態において、ゲノム編集エンハンサーは、約０．０１μＭ〜約２００μＭ、約０．０１μＭ〜約１００μＭ、約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０１μＭ〜約１．０μＭ、約０．１μＭ〜約２００μＭ、約０．１μＭ〜約１００μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．１μＭ〜約１．０μＭ、約１．０μＭ〜約２００μＭ、約１．０μＭ〜約１００μＭ、約１．０μＭ〜約１０μＭ、または約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約２．０μＭ、約３．０μＭ、約４．０μＭ、約５．０μＭ、約６．０μＭ、約７．０μＭ、約８．０μＭ、約９．０μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、もしくは約１００μＭまたはそれ以上の濃度、およびその間の任意の濃度でゲノム編集を増大させるために使用される。
【０３４５】
特定の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ベクターを用いて細胞に導入される。他の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、好ましくはｍＲＮＡとして細胞に導入される。ヌクレアーゼは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入等によって細胞に導入されてもよい。
【０３４６】
特定の実施形態において、１つ以上のドナー鋳型は、治療遺伝子もしくはその断片、導入遺伝子、または選択可能なマーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３４７】
種々の実施形態において、ドナー修復鋳型は、限定されないが、βグロビン、δグロビン、γグロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）、ＨＰＲＴ、アルブミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＬＲＲＫ２、Ｈｔｔ、ＳＯＤ１、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＲＨＯ、ＣＦＴＲ、ＳＦＴＰＢ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ  Ａ、ＨＬＡ  Ｂ、ＨＬＡ  Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＬＭＰ７、ＴＡＰ  １、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ、ＣＩＩＴＡ、ＤＭＤ、ＧＲ、ＩＬ２ＲＧ、Ｒａｇ−１、ＲＦＸ５、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、ＺＰ１５、ＫＡＳＩＩ、ＭＤＨ、およびＥＰＳＰＳ；二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子；ホルモン；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体）、および人工抗原受容体（例えば、人工Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体）を含む遺伝子またはその断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０３４８】
ドナー鋳型は、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入等によって細胞に導入されてもよい。
【０３４９】
好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によって細胞に導入され、１つ以上のドナー修復鋳型は、ウイルス形質導入によって細胞に導入される。
【０３５０】
別の好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によって細胞に導入され、１つ以上のドナー修復鋳型は、ＡＡＶ形質導入によって細胞に導入される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のいずれか１つに由来の血清型を含み得る。好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ、およびＡＡＶ２またはＡＡＶ６由来の血清型を含み得る。
【０３５１】
別の好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によって細胞に導入され、１つ以上のドナー修復鋳型は、レンチウイルス形質導入によって細胞に導入される。レンチウイルスベクター骨格は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来してもよい。
【０３５２】
細胞集団は、１つ以上の人工ヌクレアーゼおよびドナー修復鋳型が細胞に導入される前、間、または後に、ゲノム編集エンハンサーと接触させることができる。１つ以上のドナー修復鋳型は、１つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーが細胞に導入される前、それと同時に、またはその後に送達されてもよい。ある特定の実施形態において、１つ以上のドナー修復鋳型は、１つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーと同時に送達される。他の実施形態において、１つ以上のドナー修復鋳型は、例えば、限定されないが、１つ以上の人工ヌクレアーゼの約１分〜約３０分、約１分〜約６０分、約１分〜約９０分、約１時間〜約２４時間前、または１つ以上の人工ヌクレアーゼの２４時間よりも前を含む、１つ以上のドナー修復鋳型の数秒から数時間から数日前に、１つ以上の人工ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーの前に送達される。ある特定の実施形態において、１つ以上のドナー修復鋳型は、ヌクレアーゼおよびゲノム編集エンハンサーの後に、好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、もしくは８時間以内に、より好ましくは約１、２、３、もしくは４時間以内に、またはより好ましくは約４時間以内に送達される。
【０３５３】
１つ以上のドナー修復鋳型は、１つ以上の人工ヌクレアーゼと同じ送達系を用いて送達されてもよい。非限定的な例として、同時に送達される場合、ドナー修復鋳型および人工ヌクレアーゼは、同じベクター、例えば、ＩＤＬＶレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）によってコードされ得る。特定の好ましい実施形態において、人工ヌクレアーゼ（複数可）はｍＲＮＡ電気穿孔によって送達され、ドナー修復鋳型はＡＡＶベクターを用いた形質導入によって送達される。
【０３５４】
特定の実施形態において、細胞の標的部位を修飾するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が使用される場合、ＣａｓヌクレアーゼはｍＲＮＡ電気穿孔によって細胞に導入され、ゲノムおよびドナー修復鋳型において編集される部位付近に結合するｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをコードする発現カセットは、ＩＤＬＶレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクターを用いた形質導入によって送達される。
【０３５５】
特定の実施形態において、細胞の標的部位を修飾するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が使用される場合、Ｃａｓヌクレアーゼ、およびゲノムにおいて編集される部位付近に結合するｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｍＲＮＡ電気穿孔によって細胞に導入され、ドナー修復鋳型は、ＩＤＬＶレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクターを用いた形質導入によって送達される。
【０３５６】
一実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、化学的に保護された５および３’末端を有する化学的に合成されたＲＮＡである。
【０３５７】
別の実施形態において、Ｃａｓ９は、化学的に合成されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと複合体を形成したタンパク質として送達される。
【０３５８】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、および発行された特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５９】
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図および例によってある程度詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変更および修正を行うことができることが当業者には容易に明らかになろう。以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるに過ぎない。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得るさまざまな重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０３６０】
実施例１
小分子スクリーニングで遺伝子編集エンハンサーを同定する
小分子スクリーニング（図１）を行って、初代ヒトＴ細胞のＴＣＲ遺伝子座においてゲノム編集の効率を調整することができる可溶性因子候補を同定する。
【０３６１】
端的に述べると、精製したＣＤ３＋初代ヒトＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズで活性化し、ＩＬ−２添加完全ＲＰＭＩ培地で４８時間培養してからビーズを除去した。ビーズの除去後、Ｔ細胞を洗浄し、メガＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合ｍＲＮＡを標的とするＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）をコードするインビトロ転写ｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。次いで、細胞を３８４ウェルフォーマットに分配し、約２０００個の既知の薬物、天然産物、および他の生理活性成分のライブラリー（Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ’ｓ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と接触させた：各薬物の最終濃度は１０μＭとした。細胞を３７℃で２４時間化合物とともに培養し、次いで洗浄し、さらに３日間培養した。次いで、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８表面マーカーについて染色し、ハイスループット体積フローサイトメトリー分析に供した。メガＴＡＬによって媒介されるＴＣＲα遺伝子の破壊をＣＤ３染色の損失によって検出した。
【０３６２】
各化合物の存在下におけるメガＴＡＬの編集効率を、ＣＤ３染色が陰性であったＣＤ４／ＣＤ８＋細胞の割合として定量化した。ＦＳＣ／ＳＳＣプロファイルの「ライブ」ゲートにおけるフローサイトメトリー事象の数を細胞収量の尺度として用いた。フローサイトメトリー分析時の細胞収量に与える影響に応じたランク順に（図２Ａ）、ＣＤ３陰性細胞の頻度に応じたランク順に（図２Ｂ）化合物をプロットすることにより、またＣＤ３陰性細胞の頻度を２０００個の化合物全ての細胞収量の関数として（図２Ｃ）プロットすることにより、ゲノム編集に対する各化合物の影響を分析した。１０個の最も活性な化合物の収量およびメガＴＡＬ活性を表１に示す。
【表１】
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【０３６３】
実施例２
チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）およびハルミンは、メガＴＡＬによって媒介される初代Ｔ細胞における遺伝子破壊を増強する
実施例１に記載されるようにＴ細胞を精製し、活性化し、ＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合物を標的とするＴＣＲαをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、３０℃または３７℃のいずれかで、チロロン、アミナクリン、臭化ホミジウム（臭化エチジウム）およびハルミンを用いて２４時間培養した。次いで、細胞を洗浄して残りの化合物を除去し、さらに３日間培養した。３日間の培養後、細胞をＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ３で染色し、実施例１に記載されるようにフローサイトメトリーにより分析した。
【０３６４】
ＣＤ３陰性細胞の割合によって決定されるように、各化合物の濃度とＴＣＲα破壊の効率との間に正相関が観察された。図３Ａおよび図３Ｂ。遺伝子破壊における濃度依存性の増加に加えて、各化合物がＴ細胞の生存率および収率に対して濃度依存性の影響を示した。図３Ｃおよび図３Ｄ。アミナクリンは、細胞生存率に最小限の影響を与え、遺伝子破壊を大幅に増強した。
【０３６５】
実施例３
アミナクリンは蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子のＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）遺伝子座への相同組換えを増強する
プロモーターと、蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子と、ポリアデニル化シグナルとを含む導入遺伝子カセットを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドを設計および構築した。ＡＡＶ  ＩＴＲエレメントの完全性は、ＸｍａＩによる消化で確認した。導入遺伝子発現カセットをＴＣＲα遺伝子のエクソン１内の２つの相同性領域の間に配置し、メガＴＡＬを標的とするＴＣＲαを用いた相同組換え（ＡＡＶ標的ベクター）による標的化を可能にした。５´および３´相同性領域は、それぞれ、約１５００ｂｐおよび約１０００ｂｐの長さであり、いずれの相同性領域も相補性メガＴＡＬ標的部位を含有していなかった。導入遺伝子発現カセットは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーと、負の制御領域の欠失と、蛍光ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターとを含有していた。発現カセットは、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルも含有していた。
【０３６６】
組換えＡＡＶ−６（ｒＡＡＶ）は、必要な複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントを提供する１つ以上のプラスミドでＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を一過性にコトランスフェクトすることにより調製した。イオジキサノール勾配で超遠心分離を用いて、コトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞培養物からｒＡＡＶを精製した。
【０３６７】
メガＴＡＬ誘導性の相同組み換え修復（ＨＤＲ）を、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化し、ＩＬ−２を添加した完全培地で培養した初代ヒトＴ細胞において評価した。３日後、Ｔ細胞を洗浄し、メガＴＡＬを標的とするＴＣＲαをコードするインビトロ転写ｍＲＮＡを用いて電気穿孔し、その後、ＭＮＤ−ＧＦＰ導入遺伝子カセットをコードする精製された組換えＡＡＶで形質導入した。対照は、メガＴＡＬまたはｒＡＡＶ標的ベクターを単独で含有するＴ細胞を含んでいた。２つの異なる用量のアミナクリンの存在下または非存在下で、３０℃で一晩、細胞を培養した。電気穿孔の５日後、ＧＦＰ＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーにより測定した。メガＴＡＬによって媒介されるＴＣＲα遺伝子の破壊をＣＤ３染色の損失によって検出した。
【０３６８】
メガＴＡＬのトランスフェクションに続いてＴ細胞にアミナクリンを添加したときに（１８％対３６％ＧＦＰ＋および１０μＭアミナクリン）、ＨＤＲ事象の頻度（ＧＦＰ＋細胞の％）に濃度依存性の増加が観察されたのに対し、ＡＡＶ単独で処理した試料には最小限のＧＦＰ発現が観察されたのみであった。図４および表２。
【表２】
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【０３６９】
実施例４
アミナクリンは蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子のＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー領域への相同組換えを増強する
プロモーター、ＧＦＰまたはＢＦＰリポーター導入遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドを設計、構築、および検証した。導入遺伝子は１．３ｋｂおよび１．０ｋｂいずれかの相同性アームによってＤＨＳ５８のＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座に隣接していた（Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３４２（６１５５）：２５３−７（２０１３））。実施例３に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりｒＡＡＶを生成した。
【０３７０】
初代ヒト末梢血由来ＣＤ３４＋細胞をサイトカイン添加培地で７２時間培養した。細胞を洗浄し、ヒトＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー領域に特異的なメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡ、またはヒトＣＣＲ５遺伝子座を標的とするメガＴＡＬのいずれかを用いて電気穿孔した。次いで、０μＭ、０．３μＭ、１．０μＭ、および３．０μＭの濃度のアミナクリンを用いてまたは用いずに、細胞をＡＡＶベクターとともに２４時間インキュベートし、洗浄し、サイトカイン添加培地で培養した。フローサイトメトリーにより規則的な時点にＨＤＲを分析し、ＢＦＰの蛍光を測定した。
【０３７１】
アミナクリンは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座においてＣＤ３４＋細胞のＨＤＲ頻度（ＢＦＰ＋細胞の％）に濃度依存性の増加を誘導した。図５。ＣＤ３４＋細胞における非相同性によって促進されるＮＨＥＪ経路を介した鋳型の捕捉はアミナクリンによって増加されなかった。ＣＣＲ５特異的メガＴＡＬをＢＣＬ１１Ａ標的化ＡＡＶ鋳型と組み合わせた場合、アミナクリンの添加によってＢＦＰ＋細胞の割合は有意に増加しなかった。Ｉｄ．
【０３７２】
実施例５
アミナクリン処理は有害な影響を与えない
造血幹細胞または前駆細胞の生存率
遺伝子修復を増強するために小分子を使用することの潜在的な注意点は、造血幹細胞または前駆細胞の細胞生存率への影響である。メチルセルロースコロニー形成アッセイを用いて、アミナクリン処理がインビトロでの造血幹細胞または前駆細胞の生存率に与える影響を判定した。実施例４に記載されるように、ヒト末梢血ＣＤ３４＋細胞をサイトカイン添加培地で培養し、ＢＣＬ１１Ａ特異的メガＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔し、ＢＣＬ１１Ａ−ＨＤＲ  ＡＡＶベクターで形質導入した。
【０３７３】
電気穿孔後の最初の２４時間の間、アミナクリンの存在下または非存在下で細胞を培養した。この電気穿孔後の回収ステップに続いて、細胞を計数し、メチルセルロース培地に播種した。
【０３７４】
メチルセルロース培地で１４日後、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ）および造血コロニー形成単位（ＣＦＵ）を頻度および形態に基づいてスコア化した。メガＴＡＬ単独で、メガＴＡＬおよびｒＡＡＶで、アミナクリンを用いてまたは用いずに処理したＣＤ３４＋細胞は、同様の系統結果をもたらし、対照電気穿孔細胞と比較しても明白な系統の歪みを示さなかった。図６。
【０３７５】
アミナクリンによる処理が初代ヒト造血幹細胞および前駆細胞由来のメチルセルロースコロニーにおいてＨＤＲ率の増加をもたらすことができるかどうかを判定するために、コロニーを回収してフローサイトメトリーによって分析した。メガＴＡＬベクターおよびｒＡＡＶベクターの両方で処理した試料におけるフローサイトメトリーによって測定されるように、アミナクリン処理はＨＤＲを受ける細胞の割合を増加させた。図７。
【０３７６】
実施例６
アミナクリンはバルクＨＳＣ集団においてＨＤＲを増大させる
初代ヒト末梢血由来ＣＤ３４＋細胞をサイトカイン添加培地で４８時間培養した。細胞を洗浄し、ヒトＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー領域に特異的なメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。次いで、１．０μＭの濃度のアミナクリンを用いてまたは用いずに、細胞をＡＡＶベクターとともに２４時間インキュベートし、洗浄し、サイトカイン添加培地で培養した。フローサイトメトリーにより規則的な時点にＨＤＲを分析し、ＢＦＰの蛍光を測定した。
【０３７７】
アミナクリンは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座においてＣＤ３４＋細胞のＨＤＲ頻度（ＢＦＰ＋細胞の％）を増加させた。図８。
【０３７８】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲において開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲の権利が与えられる均等物の全範囲に加えて全ての可能な実施形態を包含するものとして解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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