(57)【要約】  本明細書に提供されるのは、ＭｅＣＰ２遺伝子が破壊された多能性細胞の効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ維持、拡大、培養、および／または種々のエリスロイド系列、ミエロイド系列、リンフォイド系列、もしくは内胚葉系列、とくに成熟赤血球への分化の方法である。多能性細胞は、規定条件下で維持および分化を行いうる。そのため、ある特定の実施形態では、マウスフィーダー細胞または血清の使用は前駆細胞の分化に必要とされない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来する造血前駆細胞（ＨＰＣ）をエリスロイド細胞、リンフォイド細胞、またはミエロイド細胞に分化させる方法であって、破壊されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を呈するＨＰＣを得ること、およびエリスロイド分化、ミエロイド分化またはリンフォイド分化を促進する条件下で前記ＨＰＣを培養することにより、エリスロイド細胞、ミエロイド細胞またはリンフォイド細胞を産生することを含む方法。
【請求項２】
前記ＨＰＣが、メチル化ＤＮＡに本質的に結合しない非機能性ＭｅＣＰ２を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＰＣが、ＭｅＣＰ２のＤＮＡ結合活性を発揮するのに十分なレベルでＭｅＣＰ２を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭｅＣＰ２が、ＭｅＣＰ２遺伝子のトランケーション、エクソンスキッピング、または突然変異により非機能性である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ることが、前記ＨＰＣと、ＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは低分子阻害剤とを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが野生型ＭｅＣＰ２および変異体ＭｅＣＰ２の両方を破壊する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ることが、ＰＳＣと、ＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、タンパク質阻害剤、または低分子阻害剤とを接触させること、および前記ＰＳＣを分化させてＨＰＣを産生することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ることが、ＭｅＣＰ２の発現、活性、および／または機能を破壊するようにＰＳＣを工学操作すること、および前記ＰＳＣを分化させてＨＰＣを産生することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工学操作することがＭｅＣＰ２遺伝子の遺伝子破壊を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子破壊が、ＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメインの前への停止コドンの挿入を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記停止コドンの挿入がＤＮＡ結合ドメインの導入を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ結合ドメインがジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ結合ドメインである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＳＣが誘導多能性幹細胞（ｉＰＳｃｓ）である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉＰＳＣがエピソーム的にリプログラムされたｉＰＳＣである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｉＰＳＣがウイルス的にリプログラムされたｉＰＳＣである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｉＰＳＣが９０２５、ＳＯＮＬ、ＴｉＰＳ１Ｅ、Ａ系、Ｈ系、またはＧ系ｉＰＳＣである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＳＣが哺乳動物多能性細胞である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＳＣを分化させてＨＰＣを産生することが、
（ａ）少なくとも１つの成長因子を含む第１の規定培地で前記ＰＳＣを培養すること、
（ｂ）複数の細胞の分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４およびＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む第２の規定培地で前記細胞を培養すること、および
（ｃ）複数の細胞の分化を促進するのに十分な量のＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＩＬ−６を含む第３の規定培地で前記細胞を培養することによりＨＰＣを産生すること、
の逐次工程を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）の前に、前記ＰＳＣが５〜１０継代にわたり低酸素に適合化される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＰＣが、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４１、ＣＤ２３５、ＤＬＬ４、およびＣＤ４５からなる群から少なくとも２つのマーカーを発現する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ３４とＣＤ４３とを発現するＨＰＣがリンフォイド分化を促進するように低酸素条件下で培養される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、２０％未満の酸素の大気圧で前記細胞を培養することを含む、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、５％未満の酸素の大気圧で前記細胞を培養することを含む、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２４】
複数の前記多能性細胞が胚様体（ＥＢ）を形成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記ミエロイド細胞が、マクロファージ、肥満細胞、赤血球、巨核球、血小板、樹状細胞、単球、好塩基球、好酸球、好中球、多形核顆粒球、マイクログリア、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ミエロイド細胞がマイクログリアである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記エリスロイド細胞が赤血球または赤芽球である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記赤血球が除核されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記赤血球がβグロビンを発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記赤血球が、εグロビンおよび／またはγグロビンの発現と比較してβグロビンをより多く発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記リンフォイド細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＴ／ＮＫ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
エリスロイド分化を促進するように前記細胞を培養することが、
（ｉ）赤芽球を生成させるようにｅｘｃｙｔｅとホロトランスフェリンとを含む規定培地で前記ＨＰＣを培養すること、および
（ｉｉ）エリスロイド細胞富化集団を産生するように拡大条件下で前記赤芽球を培養すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記規定培地が１種以上のサイトカインをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記１種以上のサイトカインが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記拡大条件が、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＴＰＯが本質的にフリーの規定培地で培養することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｉ）および／または工程（ｉｉ）が、１〜２週間培養することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記エリスロイド細胞富化集団が７０％超のエリスロイド細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記エリスロイド細胞富化集団が８０％超のエリスロイド細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記エリスロイド細胞がＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ、および／またはＣＤ３６を発現する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ミエロイド分化を促進するように前記細胞を培養することが、
（ａ）マイクログリアを生成させるのに十分な時間にわたりＭＣＳＦとＴＧＦβとＩＬ−３４とを含む規定マイクログリア培地で前記ＨＰＣを培養すること、および
（ｂ）ＣＤ２００とＣＸＣＬ１とをさらに含む規定マイクログリア培地で前記マイクログリアを成熟させることによりマイクログリア集団を産生すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記マイクログリア集団が、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ、および／またはＴＲＥＭ−２が陽性の細胞を少なくともを２５％含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記マイクログリア集団が、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ、および／またはＴＲＥＭ−２が陽性の細胞を少なくともを５０％含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
リンフォイド分化を促進するように前記細胞を培養することが、
（ｉ）Ｎｏｔｃｈリガンドを含むマトリックス被覆プレート上の規定培地でＣＤ３４および／またはＣＤ４３を発現するＨＰＣを培養すること、および
（ｉｉ）１種以上のサイトカインの存在下で前記培養を維持することによりリンフォイド細胞を産生すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が５％未満の酸素の大気圧で培養される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記規定培地がアスコルビン酸および／またはニコチンアミドを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記アスコルビン酸が５０μＭ〜１ｍＭの濃度で存在する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アスコルビン酸が１００μＭ〜２００μＭの濃度で存在する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ニコチンアミドが０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で存在する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記マトリックスがレトロネクチン、コラーゲン、ラミニン、またはフィブロネクチンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＮｏｔｃｈリガンドがＤＬＬ４である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＤＬＬ４がＤＬＬ４：Ｆｃキメラタンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記リンフォイド細胞がＣＤ４を本質的に発現しない、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記リンフォイド細胞が、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＴＣＲαβ、およびＣＤ３からなる群から選択されるマーカーを１つ以上発現する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記リンフォイド細胞の５％超が前記マーカーの少なくとも２つに関して陽性である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記リンフォイド細胞の１０％超が前記マーカーの少なくとも２つに関して陽性である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
ＰＳＣに由来する胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を内胚葉細胞に分化させる方法であって、破壊されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を呈するＤＥ細胞を得ること、および内胚葉分化を促進する条件下でＤＥを培養することにより内胚葉細胞を産生することを含む方法。
【請求項５７】
内胚葉分化を促進する条件下で前記ＤＥ細胞を培養することが、前記ＤＥ細胞を内胚葉前駆細胞（ＥＰＣ）に分化させることを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＥ細胞および／またはＥＰＣが、メチル化ＤＮＡに本質的に結合しない非機能性ＭｅＣＰ２を発現する、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＤＥ細胞および／またはＥＰＣが、ＭｅＣＰ２のＤＮＡ結合活性を発揮するのに十分なレベルでＭｅＣＰ２を発現しない、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＭｅＣＰ２が、ＭｅＣＰ２遺伝子のトランケーション、エクソンスキッピング、または突然変異により非機能性である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＤＥ細胞またはＥＰＣを得ることが、ＨＰＣと、ＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または低分子阻害剤とを接触させることを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが野生型ＭｅＣＰ２および変異体ＭｅＣＰ２の両方を破壊する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＤＥ細胞またはＥＰＣを得ることが、ＰＳＣと、ＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、タンパク質阻害剤、または低分子阻害剤とを接触させること、および前記ＰＳＣを分化させてＤＥ細胞またはＥＰＣを産生することを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項６４】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＤＥ細胞またはＥＰＣを得ることが、ＭｅＣＰ２の発現、活性、および／または機能を破壊するようにＰＳＣを工学操作すること、および前記ＰＳＣを分化させてＤＥ細胞またはＥＰＣを産生することを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項６５】
工学操作することがＭｅＣＰ２遺伝子の遺伝子破壊を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
遺伝子破壊がＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメインの前への停止コドンの挿入を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記停止コドンの挿入がＤＮＡ結合ドメインの導入を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＤＮＡ結合ドメインがジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ結合ドメインである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＰＳＣが誘導多能性幹細胞（ｉＰＳｃｓ）である、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＰＳＣが哺乳動物多能性細胞である、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記内胚葉細胞がβ細胞、α細胞、δ細胞、または肝細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＰＳＣを分化させてＤＥ細胞を産生することが、
（ａ）ＭＴＧとアクチビンＡとを含む培地で前記ＰＳＣを培養すること、
（ｂ）アスコルビン酸とＢＭＰ４とｂＦＧＦとＶＥＧＦとをさらに含む培地で前記細胞を培養すること、および
（ｃ）ＤＥ細胞を産生するのに十分な時間にわたりＢＭＰ４とｂＦＧＦとアクチビンＡとＶＥＧＦとを含む培地で前記細胞をさらに培養すること、
の逐次工程を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＤＥ細胞をＥＰＣに分化させることをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＥＰＣがＣＸＣＲ４／ＣＤ１１７および／またはＣＤ３４を発現する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
内胚葉分化を促進する条件下で前記ＤＥ細胞を培養することが、β細胞集団を産生するのに十分な時間にわたりアクチビンＡとＢＭＰ４とＴＧＦβとＥＧＦとＶＥＧＦとＨＧＦとを含む培地で前記ＤＥ細胞を培養することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７６】
前記β細胞集団が少なくとも２５％のＰＤＸ１陽性細胞を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記β細胞集団が少なくとも２０％のＮｅｕｒｏＤ１陽性細胞を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記β細胞集団が少なくとも５％のＮＫＸ６．１陽性細胞を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
内胚葉分化を促進する条件下で前記ＤＥ細胞を培養することが、
（ａ）低酸素条件下でＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、Ｄｅｘ、ＤＭＳＯ、および／またはＦＧＦ−１０を含む培地で前記ＤＥ細胞を培養すること、
（ｂ）ＤＡＰＴとビタミンＫとを含む培地で前記細胞をさらに培養すること、および
（ｃ）肝細胞集団を産生するのに十分な時間にわたりＤＡＰＴおよびビタミンＫが本質的にフリーの培地で前記細胞を分化させること、
を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項８０】
前記肝細胞集団が少なくとも２０％のアルブミン陽性細胞を含む、請求項７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１０月５日出願の米国仮特許出願第６２／４０４，４３０号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的には、分子生物学の分野に関する。より特定的には、ＭｅＣＰ２が破壊された前駆細胞から中胚葉、たとえば、エリスロイド細胞、ミエロイド細胞、リンフォイド細胞、および内胚葉系列を産生するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
造血前駆細胞（ＨＰＣ）の医学的可能性がかなりあるため、ＨＰＣからエリスロイド系列、ミエロイド系列、およびリンフォイド系列への分化方法の改善を試みた実質的研究が行われてきた。とくに、ヒト赤血球新生のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、正常状態および病的状態におけるエリスロイド分化の機序を研究するのに有用である。赤血球新生は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から成熟赤血球（ＲＢＣ）への分化および増殖のプロセスを規定する。成人では、エリスロイド分化により約２×１０11赤血球／日が産生される。エリスロイド系列の発生は、増殖促進因子と分化誘導因子との相反作用の微妙なバランスを必要とする。赤血球新生の通常利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのほとんどは、ネズミＭＥＬ細胞系やヒトＫ５６２、ＨＥＬ、ＵＴ７細胞系などの細胞系に基づく。しかしながら、不死化をもたらすトランスフォーメーションプロセス時に多くのレギュラトリー経路が改変されてしまうので、細胞系は赤血球新生の全プロセスを通常再現しない。そのほか、これらのモデルは、中程度の増殖を示すにすぎないかまたは最終分化の不在および除核を示す（Ｓｃｉｃｃｈｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０００４】
成熟ＲＢＣの現在の産生方法は、エリスロイドプロジェニターとヒト胎児肝間質細胞（ｈＦＬＳＣ）などの間質細胞との共培養を必要とする（Ｘｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。しかしながら、フィーダー細胞系と共にＨＰＣを培養すると、共培養時の種間暴露に以前から関連付けられてきた予想外のトランスフォーメーションのリスクを生じる。ヒトＨＰＣ培養の目的の１つは、最終的に人体に移植可能な組織を形成することであるので、ＨＰＣは、他の種の細胞にも他の種の細胞培養に使用された媒体にも暴露されないことがきわめて望ましい。したがって、ヒトＨＰＣ分化技術の開発を継続する中で、いかなる種類の共培養工程も伴うことなくヒトＨＰＣ細胞からエリスロイド系列、ミエロイド系列またはリンフォイド系列の細胞への分化を可能にする方法に大きな関心が寄せられている。そのため、フィーダー細胞を用いることなくＨＰＣをエリスロイド細胞、ミエロイド細胞、リンフォイド細胞、および内胚葉細胞、たとえば、成熟赤血球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、およびマイクログリアに効率的に分化させる方法についての明確な必要性が現在存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態では、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の発現が破壊された誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などのＰＳＣの産生方法が提供される。いくつかの態様では、ＰＳＣは、ＭｅＣＰ２の発現、活性、および／または機能を破壊するように工学操作される。いくつかの態様では、工学操作は、ＭｅＣＰ２遺伝子の遺伝子破壊を含む。特定の態様では、遺伝子破壊は、ＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメインの前への停止コドンの挿入を含む。ある特定の態様では、停止コドンの挿入は、ＤＮＡ結合ドメインの導入を含む。たとえば、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの態様では、ｉＰＳＣなどのＰＳＣは、哺乳動物たとえばヒトｉＰＳＣである。いくつかの態様では、ＭｅＣＰ２破壊は、ｉＰＳＣのメチル化状態の改変をもたらし、たとえば、成熟系列への分化能が向上したｉＰＳＣを産生する。さらなる態様では、ＭｅＣＰ２ノックアウト（ＭｅＣＰ２ＫＯ）などのＭｅＣＰ２破壊が行われたｉＰＳＣは、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞、または内胚葉前駆細胞（ＥＰＣ）などの前駆細胞に分化される。これらの前駆細胞は、成熟系列細胞、たとえば、赤血球、巨核球、マクロファージ、マイクログリア、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｂ細胞、β細胞、樹状細胞たとえば形質細胞様樹状細胞、および肝細胞にさらに分化しうる。
【０００６】
別の実施形態では、本開示は、ＨＰＣから成熟系列の細胞、たとえば、エリスロイド系列、ミエロイド系列、およびリンフォイド系列の細胞を生成させる方法を提供する。さらなる実施形態では、破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ること、エリスロイド分化、ミエロイド分化、またはリンフォイド分化を促進する条件下でＨＰＣを培養することによりエリスロイド細胞、ミエロイド細胞、またはリンフォイド細胞を産生することを含む、ＰＳＣ由来のＨＰＣからエリスロイド細胞、リンフォイド細胞またはミエロイド細胞への分化方法が提供される。
【０００７】
いくつかの態様では、ＨＰＣは、メチル化ＤＮＡに本質的に結合しない非機能性ＭｅＣＰ２を発現する。ある特定の態様では、ＨＰＣは、ＭｅＣＰ２のＤＮＡ結合活性を発揮するのに十分なレベルでＭｅＣＰ２を発現しない。特定の態様では、ＭｅＣＰ２は、ＭｅＣＰ２遺伝子のトランケーションまたは突然変異により非機能性である。
【０００８】
いくつかの態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ることは、ＨＰＣとＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または低分子阻害剤とを接触させることを含む。いくつかの態様では、タンパク質阻害剤は、ＭｅＣＰ２を破壊するために使用される。ある特定の態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、野生型ＭｅＣＰ２および突然変異体ＭｅＣＰ２の両方を破壊する。他の態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ることは、ＰＳＣとＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または低分子阻害剤とを接触させること、およびＰＳＣを分化させてＨＰＣを産生することを含む。
【０００９】
ある特定の態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ることは、ＭｅＣＰ２の発現、活性、および／または機能を破壊するようにｉＰＳＣなどのＰＳＣを工学操作すること、およびＰＳＣを分化させてＨＰＣを産生することを含む。いくつかの態様では、工学操作は、ＭｅＣＰ２遺伝子の遺伝子破壊を含む。特定の態様では、遺伝子破壊は、ＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメインの前への停止コドンの挿入を含む。ある特定の態様では、停止コドンの挿入は、ＤＮＡ結合ドメインの導入を含む。たとえば、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの態様では、ＰＳＣは、ヒトＰＳＣなどの哺乳動物多能性細胞である。特定の態様では、ＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣ、たとえば、ウイルス的リプログラムｉＰＳＣまたはエピソーム的リプログラムｉＰＳＣである。たとえば、ｉＰＳＣは、９０２５、ＳＯＮＬ、ＴｉＰＳ１Ｅ、Ａ系、Ｈ系、またはＧ系ｉＰＳＣでありうる。
【００１０】
ある特定の態様では、ＰＳＣを分化させてＨＰＣを産生することは、（ａ）少なくとも１つの成長因子を含む第１の規定培地でＰＳＣを培養すること、（ｂ）複数の細胞の分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを含む第２の規定培地で細胞を培養すること、および（ｃ）複数の細胞の分化を促進するのに十分な量のＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＩＬ−６を含む第３の規定培地で細胞を培養することにより複数のＰＳＣをＨＰＣに分化させること、の逐次工程を含む。いくつかの態様では、ＨＰＣは、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４１、ＣＤ２３５、およびＣＤ４５からなる群から少なくとも２つのマーカーを発現し、たとえば、ＣＤ４３およびＣＤ３４の両方が陽性である。いくつかの態様では、工程（ａ）の前に、ＰＳＣは、たとえば５〜１０継代にわたり低酸素に適合化される。
【００１１】
いくつかの態様では、ＣＤ３４およびＣＤ４３を発現するＨＰＣは、リンフォイド分化を促進する条件下で培養される。いくつかの態様では、リンフォイド細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ／ＮＫ細胞である。
【００１２】
ある特定の態様では、本方法は、２０％未満の酸素の大気圧で細胞を培養することを含む。特定の態様では、本方法は、５％未満の酸素の大気圧で細胞を培養することを含む。いくつかの態様では、複数の多能性細胞は胚様体（ＥＢ）を形成する。
【００１３】
ある特定の態様では、ミエロイド系列細胞は、マクロファージ、肥満細胞、赤血球、巨核球、血小板、樹状細胞、単球、好塩基球、好酸球、好中球、または多形核顆粒球である。特定の態様では、エリスロイド系列細胞は赤血球または赤芽球である。いくつかの態様では、赤血球は除核される。ある特定の態様では、赤血球はβグロビンを発現する。いくつかの態様では、赤血球は、εグロビンおよび／またはγグロビンの発現と比較してβグロビンをより多く発現する。特定の態様では、ＭｅＣＰ２破壊は、野生型ＭｅＣＰ２を有するｉＰＳＣに由来する赤血球（たとえばβグロビン発現がより少ないもの）よりも成熟した赤血球の産生をもたらす。
【００１４】
いくつかの態様では、エリスロイド分化を促進するように細胞を培養することは、（ｉ）赤芽球を生成させるようにｅｘｃｙｔｅとホロトランスフェリンとを含む規定培地でＨＰＣを培養すること、および（ｉｉ）エリスロイド細胞富化集団を産生するように拡大条件下で赤芽球を培養することを含む。ある特定の態様では、規定培地は１種以上のサイトカインをさらに含む。いくつかの態様では、１種以上のサイトカインは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）からなる群から選択される。ある特定の態様では、拡大条件は、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＴＰＯが本質的にフリーの規定培地で培養することを含む。いくつかの態様では、工程（ｉ）および／または工程（ｉｉ）は、１〜２週間培養することを含む。ある特定の態様では、エリスロイド細胞富化集団は、７０％超のエリスロイド細胞、たとえば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％のエリスロイド細胞を含む。いくつかの態様では、エリスロイド細胞富化集団は、８０％超のエリスロイド細胞、たとえば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のエリスロイド細胞を含む。いくつかの態様では、エリスロイド細胞は、ＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ、および／またはＣＤ３６を発現する。
【００１５】
いくつかの態様では、ミエロイド分化を促進するように細胞を培養することは、（ａ）マイクログリアを生成させるのに十分な時間にわたりＭＣＳＦとＴＧＦβとＩＬ−３４とを含む規定マイクログリア培地でＨＰＣを培養すること、および（ｂ）ＣＤ２００とＣＸＣＬ１とをさらに含む規定マイクログリア培地でマイクログリアを成熟させることによりマイクログリア集団を産生することを含む。いくつかの態様では、マイクログリア集団は、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ、および／またはＴＲＥＭ−２が陽性の細胞を少なくとも２５％、たとえば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％含む。
【００１６】
いくつかの態様では、リンフォイド分化を促進するように細胞を培養することは、（ｉ）Ｎｏｔｃｈリガンドを含むマトリックス被覆プレート上の規定培地でＣＤ３４および／またはＣＤ４３を発現するＨＰＣを培養すること、および（ｉｉ）１種以上のサイトカインの存在下で培養を維持することによりリンフォイド細胞を産生することを含む。いくつかの態様では、細胞は５％未満の酸素の大気圧で培養される。いくつかの態様では、規定培地はアスコルビン酸および／またはニコチンアミドを含む。アスコルビン酸の濃度は、約５０μＭ〜１ｍＭ、たとえば、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、または２００μＭでありうる。ニコチンアミドは、約０．１ｍＭ〜５ｍＭ、たとえば、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、または４．５ｍＭの濃度で存在しうる。ある特定の態様では、マトリックスは、レトロネクチン、コラーゲン、ラミニン、またはフィブロネクチンである。特定の態様では、ＮｏｔｃｈリガンドはＤＬＬ４である。たとえば、ＤＬＬ４はＤＬＬ４：Ｆｃキメラタンパク質である。いくつかの態様では、リンフォイド細胞はＣＤ４を本質的に発現しない。ある特定の態様では、リンフォイド細胞は、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ４５、ＣＤ５、およびＣＤ３からなる群から選択されるマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの態様では、リンフォイド細胞の５％超は、マーカーの少なくとも２つが陽性である。ある特定の態様では、リンフォイド細胞の１０％超、たとえば、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上は、マーカーの少なくとも２つが陽性である。
【００１７】
さらなる実施形態は、破壊されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を呈するＤＥ細胞を得ること、および内胚葉分化を促進する条件下でＤＥを培養することにより内胚葉細胞を産生することを含む、ＰＳＣに由来する胚体内胚葉（ＤＥ）細胞から内胚葉細胞への分化方法を提供する。いくつかの態様では、内胚葉分化を促進する条件下でＤＥ細胞を培養することは、ＤＥ細胞をＥＰＣに分化させることを含む。特定の態様では、内胚葉細胞は、β細胞、α細胞、δ細胞、または肝細胞である。
【００１８】
ある特定の態様では、ＤＥ細胞および／またはＥＰＣは、メチル化ＤＮＡに本質的に結合しない非機能性ＭｅＣＰ２を発現する。いくつかの態様では、ＤＥ細胞および／またはＥＰＣは、ＭｅＣＰ２のＤＮＡ結合活性を発揮するのに十分なレベルでＭｅＣＰ２を発現しない。いくつかの態様では、ＭｅＣＰ２は、ＭｅＣＰ２遺伝子のトランケーション、エクソンスキッピング、または突然変異により非機能性である。いくつかの態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＤＥ細胞またはＥＰＣを得ることは、ＨＰＣと、ＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または低分子阻害剤とを接触させることを含む。ある特定の態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、野生型ＭｅＣＰ２および変異体ＭｅＣＰ２の両方を破壊する。
【００１９】
他の態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＤＥ細胞またはＥＰＣを得ることは、ＰＳＣと、ＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、タンパク質阻害剤、または低分子阻害剤と、を接触させること、およびＰＳＣを分化させてＤＥ細胞またはＥＰＣを産生することを含む。いくつかの態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＤＥ細胞またはＥＰＣを得ることは、ＭｅＣＰ２の発現、活性、および／または機能を破壊するようにＰＳＣを工学操作すること、およびＰＳＣを分化させてＤＥ細胞またはＥＰＣを産生することを含む。特定の態様では、工学操作は、ＭｅＣＰ２遺伝子の遺伝子破壊を含む。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、ＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメインの前への停止コドンの挿入を含む。特定の態様では、停止コドンの挿入は、ＤＮＡ結合ドメインの導入を含む。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ結合ドメインである。
【００２０】
特定の態様では、ＰＳＣはｉＰＳｃｓである。特定の態様では、ＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣ、たとえば、ウイルス的にリプログラムされたｉＰＳＣまたはエピソーム的にリプログラムされたｉＰＳＣである。たとえば、ｉＰＳＣは、９０２５、ＳＯＮＬ、ＴｉＰＳ１Ｅ、Ａ系、Ｈ系、またはＧ系ｉＰＳＣでありうる。
【００２１】
いくつかの態様では、ＰＳＣを分化させてＤＥ細胞を産生することは、（ａ）ＭＴＧとアクチビンＡとを含む培地でＰＳＣを培養すること、（ｂ）アスコルビン酸とＢＭＰ４とｂＦＧＦとＶＥＧＦとをさらに含む培地で細胞を培養すること、（ｃ）ＤＥ細胞を産生するのに十分な時間にわたりＢＭＰ４とｂＦＧＦとアクチビンＡとＶＥＧＦとを含む培地で細胞をさらに培養すること、の逐次工程を含む。追加の態様では、本方法は、ＤＥ細胞をＥＰＣに、たとえば、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１１７および／またはＣＤ３４を発現するＥＰＣに分化させることをさらに含む。
【００２２】
ある特定の態様では、内胚葉分化を促進する条件下でＤＥ細胞を培養することは、β細胞集団を産生するのに十分な時間にわたりアクチビンＡとＢＭＰ４とＴＧＦβとＥＧＦとＶＥＧＦとＨＧＦとを含む培地でＤＥ細胞を培養することを含む。いくつかの態様では、β細胞集団は、少なくとも２５％、たとえば、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、またはそれ以上のＰＤＸ１陽性細胞を含む。ある特定の態様では、β細胞集団は、少なくとも２０％、たとえば、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、またはそれ以上のＮｅｕｒｏＤ１陽性細胞を含む。いくつかの態様では、β細胞集団は、少なくとも５％、たとえば、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、またはそれ以上のＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。
【００２３】
いくつかの態様では、内胚葉分化を促進する条件下でＤＥ細胞を培養することは、（ａ）低酸素条件下でＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、Ｄｅｘ、ＤＭＳＯ、および／またはＦＧＦ−１０を含む培地でＤＥ細胞を培養すること、（ｂ）ＤＡＰＴとビタミンＫとを含む培地で細胞をさらに培養すること、（ｃ）肝細胞集団を産生するのに十分な時間にわたりＤＡＰＴおよびビタミンＫが本質的にフリーの培地で細胞を分化させることを含む。特定の態様では、肝細胞集団は、少なくとも２０％、たとえば、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、またはそれ以上のアルブミン陽性細胞を含む。
【００２４】
本明細書には、ＭｅＣＰ２が破壊されたｉＰＳＣ、ＭｅＣＰ２ＫＯ  ｉＰＳＣに由来する前駆細胞、たとえば、ＨＰＣ、ＤＥ細胞、およびＥＰＣを含む組成物がさらに提供される。また、本明細書には、ＭｅＣＰ２ＫＯ  ｉＰＳＣに由来する成熟系列の細胞、たとえば、赤血球、巨核球、マクロファージ、マイクログリア、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｂ細胞、β細胞、樹状細胞たとえば形質細胞様樹状細胞、および肝細胞を含む組成物も提供される。また、本明細書には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび治療たとえばｉｎ  ｖｉｖｏ安定移植、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ化合物スクリーニング、ならびに疾患および傷害の機序の解明のための、ＭｅＣＰ２ＫＯ  ｉＰＳＣ、ＨＰＣ、ＤＥ細胞、ＥＰＣ、赤血球、巨核球、マクロファージ、マイクログリア、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｂ細胞、β細胞、樹状細胞たとえば形質細胞様樹状細胞、および肝細胞の使用方法も提供される。
【００２５】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲に含まれる各種の変更形態および修正形態は、本詳細な説明から当業者には明らかになるはずであり、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが単に例示を目的として与えられているにすぎないことを理解すべきである。
【００２６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照すればよりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ−１Ｂ】（１Ａ）Ｅ８培地および低酸素条件の存在下におけるＭａｔｒｉｇｅｌまたはビトロネクチン上でのフィーダーフリー成長に適合化されたｉＰＳＣを用いた３Ｄ  ＨＰＣ分化プロセスの模式図。ＨＰＣ分化の第１段階は、４日間にわたりＢＭＰ４とＶＥＧＦとＦＧＦとにより駆動され、分化の第２段階は、ヘパリンとＳＣＦとＴＰＯとＦｌｔ−３リガンドとＩＬ−３とＩＬ−６とを含有する培地に細胞を配置することにより駆動される。（１Ｂ）雄性ｉＰＳＣ細胞系０１２７９のＭｅＣＰ２ＫＯを生成させて９００６（０１２７９．１０７．３９０２）を形成する工学操作ストラテジー。
【図１Ｃ】（１Ｃ）ＭｅＣＰ２  ＴＡＬＥＮＳおよびドナープラスミドｐ１５５３でトランスフェクトされた０１２７９ｉＰＳＣに由来するＭｅＣＰ２変異体００１、００２、００５、および００８のアミノ酸アライメントの描画図。変異体（００１、００２、００５、および００８）はすべて、メチルＣｐＧ結合ドメインをコードしない。
【００２８】
【図２Ａ】（２Ａ）ＨＰＣ分化の１２日目における多くのｉＰＳＣ細胞系にわたる分化の概要。ＨＰＣ（ＣＤ４３+／ＣＤ３４+）二重陽性細胞のパーセントは、フローサイトメトリーにより定量される。
【図２Ｂ】（２Ｂ）ＨＰＣ生成効率は、生成ＨＰＣ絶対数をグラフに示される投入ｉＰＳＣ数で除算することにより計算される。
【００２９】
【図３】ｉＰＳＣ由来ＨＰＣからのエリスロイド系列分化の模式的概観。１２日目のＨＰＣは、ＳＣＦ、ＩＬ３、ＴＰＯ、およびＥＰＯの存在下で８日間、続いて、ＥＰＯおよびＳＣＦのみの存在下で１２０日間まで分化させて赤血球の純粋培養物を生成させたものである。
【００３０】
【図４Ａ】（４Ａ）臍帯血細胞由来ＨＰＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏエリスロイド分化時のグロビン出現の経時変化。β−グロビン発現の出現ならびに妊娠第１期の胚性グロビンから胎児グロビンへのおよび出生時近傍の胎児グロビンから成人グロビンへの生成スイッチの模式図（Ｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２に示される）。
【図４Ｂ】（４Ｂ）エリスロイド分化の２〜８週間における臍帯血（ＣＢ）由来ＨＰＣ、ｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯクローンのＣＤ２３５の表面染色のＦＡＣＳプロファイル。
【図４Ｃ】（４Ｃ）エリスロイド分化の２〜７週間におけるＣＢ由来ＨＰＣ、ｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯクローンのＣＤ７１の表面染色のＦＡＣＳプロファイル。
【図４Ｄ】（４Ｄ）エリスロイド分化の２〜８週間におけるＣＢ由来ＨＰＣ、ｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯクローンのＣＤ３６の表面染色のＦＡＣＳプロファイル。
【００３１】
【図５Ａ】（５Ａ）ＣＢ、ｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＷＴ、およびｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＫＯクローンに由来する赤血球培養物における細胞内成人βグロビン発現の比較分析。
【図５Ｂ】（５Ｂ）ＣＢ、ｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＷＴ、およびｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＫＯクローンに由来する赤血球培養物における細胞内胚性εグロビン発現の比較分析。
【図５Ｃ】（５Ｃ）ＣＢ、ｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＷＴ、およびｉＰＳＣ  ＭｅＣＰ２ＫＯクローン（５Ｃ）に由来する赤血球培養物における細胞内胎児γグロビン発現の比較分析。
【００３２】
【図６】ＣＢ、ｉＰＳＣ０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）、およびｉＰＳＣ０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）に由来する赤血球分化の２〜７週時の細胞内グロビン（β、ε、およびγ）の定量および比較分析。
【００３３】
【図７】ＣＢ）ｉＰＳＣ０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）およびｉＰＳＣ０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）に由来する赤血球分化の７週における組合せＣＤ２３５表面染色および細胞内グロビン共染色のＦＡＣＳプロファイル。
【００３４】
【図８】ＣＢ由来ＨＰＣおよびｉＰＳＣ０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）に由来する最終段階の赤血球から作製されたサイトスピンは、ライト染色で染色された。除核赤血球の存在は、サイトスピンに視覚的に捉えられた。
【００３５】
【図９】リンフォイド分化の模式図。５〜１１日目に採取されたＨＰＣは、２〜４週間にわたりＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−７、およびＦｌｔ−３リガンドの存在下で２５Ｋ／ｃｍ2の密度で非組織培養処理プレート上にプレーティングされた。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫ／Ｔ細胞の出現は、フローサイトメトリーにより定量された。
【００３６】
【図１０Ａ−１０Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成させたリンフォイド細胞を同定するためのゲーティングストラテジー。（１０Ａ）成人末梢血由来のリンパ球の一般的散乱プロファイル。（１０Ｂ）分化１８日目のリンフォイド細胞の散乱プロファイル。ＦＳＣ−ＳＳＣゲートおよびリンフォイドゲートが例示される。（１０Ｃ）ヨウ化プロピジウムを用いたＦＳＣ−ＳＳＣ散乱内およびリンフォイド散乱内の生細胞のゲーティング。
【００３７】
【図１１Ａ】（１１Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成させたリンフォイド細胞を同定するためのゲーティングストラテジー。分化１８日目のリンフォイド細胞の散乱プロファイルが示される。ＦＳＣ−ＳＳＣゲートおよびリンフォイドゲートが例示される。生細胞は、フローサイトメトリーによりヨウ化プロピジウムを用いてＦＳＣ−ＳＳＣ散乱内およびリンフォイド散乱内でゲートされてからＣＤ７およびＣＤ５が陽性の細胞に関して染色された。
【図１１Ｂ】（１１Ｂ）生細胞は、フローサイトメトリーによりヨウ化プロピジウムを用いてＦＳＣ−ＳＳＣ散乱内およびリンフォイド散乱内でゲートされてからＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ５６が陽性の細胞に関して染色された。
【００３８】
【図１２Ａ−１２Ｂ】低酸素条件下または正常酸素条件下に維持されて２５ｋ／ｃｍ2の密度でリンフォイド分化を開始するようにＲｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に配置された７〜１１日目のＨＰＣから分化された二重陽性ＣＤ７+／ＣＤ５+のプレＴ（１２Ａ）細胞およびプレＴリンフォイド（１２Ｂ）細胞のパーセント。
【００３９】
【図１３Ａ−１３Ｃ】ＨＰＣ分化７〜１１日目に採取されたかつ２５ｋ／ｃｍ2の密度でリンフォイド分化を開始するようにＲｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に配置されたプレＴ細胞およびプレＮＫ細胞の定量。低酸素条件下（１３Ａ）または正常酸素条件下（１３Ｂ）に維持された０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞さらには低酸素条件下（１３Ｃ）の０１２７９.１０７．３９０２細胞（ＭｅＣＰ２Ｋ０）の中のＣＤ８+ＣＤ３+（Ｔ細胞）、ＣＤ５６+／ＣＤ８+／ＣＤ３+（ＮＫ細胞）、およびＣＤ５６+／ＣＤ３+（ＮＫ／Ｔ細胞）のパーセントを決定した。
【００４０】
【図１４Ａ−１４Ｂ】ＨＰＣ分化７〜１１日目に２５ｋ／ｃｍ2の密度でリンフォイド分化を開始するようにＲｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に配置されたＴ（ＣＤ３+／ＣＤ８+）細胞の定量。ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯの状態を含むｉＰＳＣクローンで、すべて生存するＦＳＣ−ＳＳＣゲート下（１４Ａ）およびリンフォイドゲート下（１４Ｂ）の二重陽性ＣＤ８+／ＣＤ３+のパーセントを決定した。
【００４１】
【図１５Ａ−１５Ｂ】ＨＰＣ分化７〜１１日目に２５ｋ／ｃｍ2の密度でリンフォイド分化を開始するようにＲｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に配置されたＮＫ（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）細胞の定量。ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯの状態を含むｉＰＳＣクローンで、すべて生存するＦＳＣ−ＳＳＣゲート下（１４Ａ）およびリンフォイドゲート下（１５Ｂ）のＣＤ５６+／ＣＤ３-のパーセントを決定した。
【００４２】
【図１６Ａ−１６Ｂ】ＨＰＣ分化７〜１１日目に２５ｋ／ｃｍ2の密度でリンフォイド分化を開始するようにＲｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に配置されたＮＫ／Ｔ（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）細胞の定量。ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯの状態を含むｉＰＳＣクローンで、すべて生存するＦＳＣ−ＳＳＣゲート下（１６Ａ）およびリンフォイドゲート下（１６Ｂ）の二重陽性ＣＤ５６+／ＣＤ３+のパーセントを決定した。
【００４３】
【図１７Ａ−１７Ｂ】分化プロセスの効率の測定。ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯを含むｉＰＳＣをＨＰＣ分化７〜１１日目に採取し、２５ｋ／ｃｍ2の密度でリンフォイド分化を開始するようにＲｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に配置した。ＣＤ８およびＣＤ３の表面発現を有する細胞を染色した。ＦＳＣ−ＳＳＣゲート下およびリンフォイド散乱ゲート下でフローサイトメトリーにより細胞のパーセントを定量した。投入細胞数および１６日間の分化の終了時の全生存細胞数は分かったので、Ｔ（ＣＤ３+／ＣＤ8）の絶対数を決定した。プロセスの効率は、細胞型絶対数／全投入細胞数の比（１７Ａ）または細胞型絶対数／投入（ＣＤ４３+／ＣＤ３４+）ＨＰＣ数（１７Ｂ）の比により計算される。
【００４４】
【図１８Ａ−１８Ｂ】分化プロセスの効率の測定。ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯを含むｉＰＳＣをＨＰＣ分化７〜１１日目に採取し、２５ｋ／ｃｍ2の密度でリンフォイド分化を開始するようにＲｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に配置した。ＣＤ５６、ＣＤ８、およびＣＤ３の表面発現を有する細胞を染色した。ＦＳＣ−ＳＳＣゲート下およびリンフォイド散乱ゲート下でフローサイトメトリーにより細胞のパーセントを定量した。投入細胞数および１６日間の分化の終了時の全生存細胞数は分かったので、ＮＫ／Ｔ（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）およびＮＫ（ＣＤ５６+／ＣＤ３-）の絶対数を決定した。プロセスの効率は、細胞型（ＮＫ／ＴまたはＮＫ）絶対数／全投入細胞数の比（１８Ａ）または細胞型絶対数／投入（ＣＤ４３+／ＣＤ３４+）ＨＰＣ数の比（１８Ｂ）により計算される。
【００４５】
【図１９Ａ−１９Ｄ】リンフォイドプロジェニターの表現型シグネチャーの決定。ＨＰＣは、ＭｅＣＰ２ＫＯおよびＭｅＣＰ２ＷＴ  ｉＰＳＣから生成させた。次のマーカー：ＣＤ４３ＦＩＴＣ／ＣＤ４５ＰＥ／ＣＤ３４ＡＰＣ、ＣＤ２３５ＦＩＴＣ／ＣＤ７ＰＥ／ＣＤ３４ＡＰＣ、ＣＤ３１ＦＩＴＣ／ＤＬＬ４ＰＥ／ＣＤ１４４ＡＰＣ、ＣＤ３４ＦＩＴＣ／ＤＬＬ４ＰＥ／ＡＰＮＬＲ  ＡＰＣ、ＦＬＫ−１ＦＩＴＣ／ＣＤ３４ＰＥ／ＡＰＮＬＲ  ＡＰＣ、ＣＤ５６ＦＩＴＣ／ＣＤ３４ＰＥ／ＣＤ４４ＡＰＣを有するＨＰＣを分化のさまざまな段階で染色した。ｉＰＳＣ０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）におけるこれらの各種マーカーの発現プロファイルのパーセントは、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄに概要が示される。
【００４６】
【図２０】ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのクローンのリンフォイド分化時の集団倍加の定量。リンフォイド分化は、Ｒｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に２５Ｋ／ｃｍ2で細胞をプレーティングすることにより開始させた。細胞は、２、４、および６週間の終了時に採取され、集団倍加は、ｅ＝３．３２×ｌｏｇ（採取時細胞数／播種細胞数）であった。
【００４７】
【図２１】内胚葉分化のさまざまな段階の一般的概観。日数および分化プロセスを駆動するために培地で使用した因子と共にｉＰＳＣから内胚葉プロジェニター段階への変換が描かれている。
【００４８】
【図２２Ａ−２２Ｂ】０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）ｉＰＳＣおよび０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）ｉＰＳＣにおけるＥＰＣ純度の定量。グラフは、ＣＸＣＲ−４およびＣＤ１１７ならびに成熟マーカーＣＤ３４の表面発現を表す。（２２Ａ）０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞に由来するＥＰＣは１０〜１４継代で染色し、（２２Ｂ）０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）細胞に由来するＥＰＣは２〜１３継代で染色した。
【００４９】
【図２３Ａ−２３Ｃ】フィーダーフリーサイクル時の０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）（２３Ａ）ＥＰＣおよび０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）（２３Ｂ）ＥＰＣの増殖および細胞数拡大倍率。２Ｄで増殖させたＥＰＣからβ細胞を生成させるための模式図（２３Ｃ）。
【００５０】
【図２４Ａ−２４Ｃ】０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）ＥＰＣおよび０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）ＥＰＣに由来する２８日目の最終段階のβ細胞のフローサイトメトリー分析。細胞を採取し、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、０．１％サポニンを用いて透過化し、そしてフローサイトメトリーによりＰＤＸ１（２４Ａ）、ＮｅｕｒｏＤ１（２４Ｂ）、およびＮｋｘ６．１（２４Ｃ）が存在するものを染色した。
【００５１】
【図２５Ａ−２５Ｂ】０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）ＥＰＣおよび０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）ＥＰＣに由来する２８日目の最終段階のβ細胞のフローサイトメトリー分析。細胞を採取し、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、０．１％サポニンを用いて透過化し、そしてフローサイトメトリーによりグルカゴン（２５Ａ）およびＣペプチド（２５Ｂ）が存在するものを染色した。
【００５２】
【図２６】凝集体解離後の膵分化プロセス２２日目におけるＣペプチド、グルカゴン、およびソマトスタチンの発現の細胞内染色のＦＡＣＳプロファイル。散布プロットは、グルカゴン、ソマトスタチン、およびＣペプチドの発現の細胞内染色を表す。左側のプロットは、細胞の前方散乱および側方散乱を示し、続いて採取後の染色が示される。プロットは、ｉＰＳＣ−０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞および０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）細胞におけるＣペプチド対グルカゴン染色、Ｃペプチド対ソマトスタチン染色、およびＣペプチド対グルカゴン染色の二重染色プロファイルを示す。
【００５３】
【図２７】ｉＰＳＣ−０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞および０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ＫＯ）細胞から生成させた最終段階のβ細胞のグルコース反応性。データは、各種濃度のグルコースに対する非規格化Ｃペプチド放出の放出を表す。データは、細胞数アッセイに規格化されていない。
【００５４】
【図２８】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系に由来するＨＰＣ分化９日目のＣＤ４３発現。
【００５５】
【図２９】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系に由来するＨＰＣ分化９日目のＣＤ３４発現。
【００５６】
【図３０】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系に由来するＨＰＣ分化９日目のＣＤ３４およびＣＤ４３陽性細胞のパーセント。
【００５７】
【図３１】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系に由来するＨＰＣ分化９日目のＣＤ４５陽性細胞のパーセント。
【００５８】
【図３２Ａ】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系に由来するＨＰＣ分化９日目のＣＤ２３５陽性細胞のパーセント。
【図３２Ｂ】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系に由来するＨＰＣ分化９日目のＣＤ２３５陽性細胞のパーセント。
【００５９】
【図３３】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系に由来するＨＰＣ分化９日目のＤＬＬ４陽性細胞のパーセント。
【００６０】
【図３４】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系からのＨＰＣ生成効率。
【００６１】
【図３５】さまざまなｉＰＳＣクローンからマイクログリアを分化させてマーカーＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ、およびＴＲＥＭ−２によりそれらの純度を評価することにより、ＭｅＣＰ２ＷＴ対ＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ細胞由来マイクログリアを比較した。
【００６２】
【図３６】最終段階のマイクログリアの純度のＦＡＣＳ分析。
【００６３】
【図３７】指定されたＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系に由来する１つのＨＰＣからのマイクログリア生成効率。
【００６４】
【図３８Ａ】ＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣからプレＴ細胞を分化させた。（３８Ａ）ＣＤ５およびＣＤ７により測定されるプレＴ細胞のＦＡＣＳプロファイルのスナップショット。
【図３８Ｂ】（３８Ｂ）２週間の終了時に細胞を採取し、ＣＤ７／ＣＤ４５（３８Ｃ）またはＣＤ７／ＣＤ５によりプレＴプロジェニター細胞のパーセントを定量した。
【図３８Ｃ】（３８Ｂ）２週間の終了時に細胞を採取し、ＣＤ７／ＣＤ４５（３８Ｃ）またはＣＤ７／ＣＤ５によりプレＴプロジェニター細胞のパーセントを定量した。
【００６５】
【図３９Ａ】図３８のプレＴ細胞をさらに２週間分化させた。（３９Ａ）ＣＤ３およびＣＤ８により測定されるＴ細胞のＦＡＣＳプロファイルのスナップショット。２週間の終了時に細胞を採取し、全ＣＤ３陽性細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）、およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+ＣＤ５６+）を定量した。細胞は、（３９Ｂ）ＳＯＮＬ  ｉＰＳＣ、（３９Ｃ）９０２５ｉＰＳＣ、（３９Ｄ）ｉＰＳＣ系Ａ、（３９Ｅ）ｉＰＳＣ系Ｆ、または（３９Ｆ）ｉＰＳＣ系Ｈから分化させた。
【図３９Ｂ】図３８のプレＴ細胞をさらに２週間分化させた。（３９Ａ）ＣＤ３およびＣＤ８により測定されるＴ細胞のＦＡＣＳプロファイルのスナップショット。２週間の終了時に細胞を採取し、全ＣＤ３陽性細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）、およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+ＣＤ５６+）を定量した。細胞は、（３９Ｂ）ＳＯＮＬ  ｉＰＳＣ、（３９Ｃ）９０２５ｉＰＳＣ、（３９Ｄ）ｉＰＳＣ系Ａ、（３９Ｅ）ｉＰＳＣ系Ｆ、または（３９Ｆ）ｉＰＳＣ系Ｈから分化させた。
【図３９Ｃ】図３８のプレＴ細胞をさらに２週間分化させた。（３９Ａ）ＣＤ３およびＣＤ８により測定されるＴ細胞のＦＡＣＳプロファイルのスナップショット。２週間の終了時に細胞を採取し、全ＣＤ３陽性細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）、およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+ＣＤ５６+）を定量した。細胞は、（３９Ｂ）ＳＯＮＬ  ｉＰＳＣ、（３９Ｃ）９０２５ｉＰＳＣ、（３９Ｄ）ｉＰＳＣ系Ａ、（３９Ｅ）ｉＰＳＣ系Ｆ、または（３９Ｆ）ｉＰＳＣ系Ｈから分化させた。
【図３９Ｄ】図３８のプレＴ細胞をさらに２週間分化させた。（３９Ａ）ＣＤ３およびＣＤ８により測定されるＴ細胞のＦＡＣＳプロファイルのスナップショット。２週間の終了時に細胞を採取し、全ＣＤ３陽性細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）、およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+ＣＤ５６+）を定量した。細胞は、（３９Ｂ）ＳＯＮＬ  ｉＰＳＣ、（３９Ｃ）９０２５ｉＰＳＣ、（３９Ｄ）ｉＰＳＣ系Ａ、（３９Ｅ）ｉＰＳＣ系Ｆ、または（３９Ｆ）ｉＰＳＣ系Ｈから分化させた。
【図３９Ｅ】図３８のプレＴ細胞をさらに２週間分化させた。（３９Ａ）ＣＤ３およびＣＤ８により測定されるＴ細胞のＦＡＣＳプロファイルのスナップショット。２週間の終了時に細胞を採取し、全ＣＤ３陽性細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）、およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+ＣＤ５６+）を定量した。細胞は、（３９Ｂ）ＳＯＮＬ  ｉＰＳＣ、（３９Ｃ）９０２５ｉＰＳＣ、（３９Ｄ）ｉＰＳＣ系Ａ、（３９Ｅ）ｉＰＳＣ系Ｆ、または（３９Ｆ）ｉＰＳＣ系Ｈから分化させた。
【図３９Ｆ】図３８のプレＴ細胞をさらに２週間分化させた。（３９Ａ）ＣＤ３およびＣＤ８により測定されるＴ細胞のＦＡＣＳプロファイルのスナップショット。２週間の終了時に細胞を採取し、全ＣＤ３陽性細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）、およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+ＣＤ５６+）を定量した。細胞は、（３９Ｂ）ＳＯＮＬ  ｉＰＳＣ、（３９Ｃ）９０２５ｉＰＳＣ、（３９Ｄ）ｉＰＳＣ系Ａ、（３９Ｅ）ｉＰＳＣ系Ｆ、または（３９Ｆ）ｉＰＳＣ系Ｈから分化させた。
【００６６】
【図４０】ＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系から肝細胞を誘導する２Ｄプロトコルを示す模式図。
【００６７】
【図４１】ＭｅＣＰ２ＫＯを有する指定されたｉＰＳＣ系からの肝細胞分化。アルブミンまたはＡＡＴが陽性の細胞のパーセントが示される。
【００６８】
【図４２】赤血球分化に及ぼすＭｅＣＰ２ＫＯの影響。グラフは、指定された各細胞系に対してエリスロイド分化時のＣＤ２３５陽性細胞のパーセントを示す。
【００６９】
【図４３Ａ】（４３Ａ）７週間までＳＯＮＬ  ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＫＯ赤血球におけるグロビン発現。
【図４３Ｂ】（４３Ｂ）７週間にわたりＳＯＮＬ  ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＷＴ赤血球におけるグロビン発現。
【００７０】
【図４４Ａ】（４４Ａ）７週間までのＴｉＰＳ  ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＫＯ赤血球におけるグロビン発現。
【図４４Ｂ】（４４Ｂ）７週間にわたりＴｉＰＳ  ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＷＴ赤血球におけるグロビン発現。
【００７１】
【図４５Ａ】（４５Ａ）７週間まで９０２５ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＫＯ赤血球におけるグロビン発現。
【図４５Ｂ】（４５Ｂ）７週間にわたり９０２５ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＷＴ赤血球におけるグロビン発現。
【００７２】
【図４６Ａ】（４６Ａ）７週間までＡ系ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＫＯ赤血球におけるグロビン発現。
【図４６Ｂ】（４６Ｂ）７週間にわたりＡ系ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＷＴ赤血球におけるグロビン発現。
【００７３】
【図４７Ａ】（４７Ａ）７週間までＨ系ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＫＯ赤血球におけるグロビン発現。
【図４７Ｂ】（４７Ｂ）７週間にわたりＨ系ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＷＴ赤血球におけるグロビン発現。
【００７４】
【図４８Ａ】（４８Ａ）７週間までＧ系ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＫＯ赤血球におけるグロビン発現。
【図４８Ｂ】（４８Ｂ）７週間にわたりＧ系ｉＰＳＣから分化させたＭｅＣＰ２ＷＴ赤血球におけるグロビン発現。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
ＭｅＣＰ２遺伝子は、メチル化ＤＮＡに結合して標的遺伝子の転写をレギュレートすることが可能なタンパク質をコードする。ＭｅＣＰ２遺伝子は、メチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）、転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、核移行シグナル（ＮＬＳ）、およびＣ末端セグメントを有する（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。本開示の研究は、成熟系列の高純度の細胞を効率的に生成させるようにｉＰＳＣの分化を方向付けるＭｅＣＰ２の新しい役割を提供する。ＭｅＣＰ２はまた、ユビキタスで概日的にレギュレートされることも判明した。そのほか、本研究は、ｉＰＳＣ由来系列で成熟状態を出現させる脱メチル化の役割を支持する。
【００７６】
したがって、本開示は、ＴＡＬＥＮＳを用いたノックアウトなどによりＭｅＣＰ２発現を破壊して中胚葉、外胚葉、および内胚葉の細胞をはじめとする特定の細胞系列への分化能が向上した強化ｉＰＳＣを産生するようにｉＰＳＣを工学操作する方法を提供する。ＭｅＣＰ２が破壊されたｉＰＳＣは、赤血球、巨核球、マクロファージ、マイクログリア、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｂ細胞、β細胞、樹状細胞たとえば形質細胞様樹状細胞、および肝細胞に効率的に分化させうる。
【００７７】
とくに、ＭｅＣＰ２ノックアウト（ＭｅＣＰ２ＫＯ）を有するｉＰＳＣクローンは、造血前駆細胞（ＨＰＣ）さらには胚体内胚葉（ＤＥ）細胞および内胚葉前駆細胞（ＥＰＣ）をより効率的に産生することが判明した。ＨＰＣは、エリスロイド、リンフォイド、またはミエロイドの系列に高効率かつ高純度でさらに分化させうる。たとえば、ＨＰＣは、成熟した赤血球またはマイクログリアさらにはリンフォイド系列の細胞、たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＴ／ＮＫ細胞を生成させるために使用しうる。ＤＥ細胞またはＥＰＣは、β細胞や肝細胞などの内胚葉系列の細胞にさらに分化させうる。
【００７８】
より多くのγグロビンまたはεグロビンを発現する野生型（ＭｅＣＰ２ＷＴ）発現のｉＰＳＣとは対照的に、ｉＰＳＣのＭｅＣＰ２を破壊するとγグロビンまたはεグロビンと比べてβグロビンの発現が増加することから分かるようにより高い成熟度の赤血球が得られることが、本研究により示された。
【００７９】
そのほか、ＭｅＣＰ２破壊は、エリスロイド系列、ミエロイド系列（たとえばマイクログリア）、およびリンフォイド系列の細胞、たとえば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞をより効率的に産生するｉＰＳＣをもたらした。ＭｅＣＰ２が破壊されたｉＰＳＣの性質の向上は、ウイルス的およびエピソーム的リプログラムｉＰＳＣをはじめとするいくつかのｉＰＳＣ系にわたり観測された。そのため、本開示は、リンフォイド系列細胞およびエリスロイド、ミエロイド系列細胞を含む中胚葉細胞さらには肝細胞やβ細胞などの内胚葉細胞をＭｅＣＰ２が破壊されたＰＳＣから産生するための方法および組成物を提供する。
【００８０】
一方法では、ＭｅＣＰ２が破壊されたｉＰＳＣは、ＴＡＬＥＮを用いてＭｅＣＰ２のメチル結合ドメインの前に停止コドンを挿入するようにｉＰＳＣを工学操作することにより生成される。次いで、ＭｅＣＰ２ノックアウトｉＰＳＣは、規定のフィーダーフリー血清フリー条件下でＨＰＣ、ＤＥ細胞、またはＥＰＣに分化させうる。次いで、ＨＰＣは、本明細書に開示される方法によりエリスロイド系列、ミエロイド系列、またはリンフォイド系列の他の造血細胞を作製するようにさらに分化可能であり、一方、ＤＥ細胞またはＥＰＣは、適宜、内胚葉系列の細胞に分化させうる。たとえば、ＭｅＣＰ２ＫＯ  ＨＰＣは、エリスロイド拡大培地にＨＰＣを配置することにより成熟赤血球に分化させてＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ３６が陽性のエリスロイド細胞富化集団を生成させることが可能である。重要なこととして、本明細書に提供される成熟赤血球は、最終的成人β−グロビンを発現するとともに除核を呈する。
【００８１】
さらに、別の例示的な方法では、ＭｅＣＰ２破壊を含むｉＰＳＣに由来するＨＰＣは、フィーダーフリーマトリックスとしてＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎおよびＤＬＬ−４を用いてＴ細胞に分化可能である。Ｔ細胞分化は、効率および成熟を増加させるアスコルビン酸を用いることによりさらには低酸素条件下で培養することによりさらに増強しうる。興味深いことに、本発明者らは、エリスロイド、ミエロイド、およびリンフォイドの潜在能力に関してＨＰＣ分化時に最適時間枠（たとえば７〜１１日目）を決定した。
【００８２】
そのほか、ＭｅＣＰ２破壊を含むｉＰＳＣに由来するＨＰＣは、最終段階のマイクログリア（ｍｉｇｒｏｇｌｉａ）およびマクロファージを生成させるようにミエロイド分化経路に効率的に分化可能である。
【００８３】
そのため、本開示の方法は、安定なｉｎ  ｖｉｖｏ移植、化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング、血液疾患および傷害の機序の解明などの広範にわたる用途で、無制限の数の造血系列細胞、たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、および成熟赤血球、さらには内胚葉系列細胞、たとえば、肝細胞およびβ細胞を提供可能である。とくに、産生されるエリスロイド細胞の数が多くかつ純度が高いので、本開示の方法は、エリスロイドの生成および輸液用ＲＢＣの産生の基礎研究に有用である。
【００８４】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる場合、特定の成分に関して「本質的にフリー」とは、特定の成分がいずれも組成物に意図的に配合されたものではないことおよび／または汚染物質としてのみもしくは痕跡量でのみ存在するにすぎないことを意味するものとして本明細書で用いられる。したがって、組成物の意図されないなんらかの汚染から生じる特定の成分の全量は、０．０５％を十分に下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、特定の成分の量が標準的分析方法でまったく検出できない組成物である。
【００８５】
本明細書の中で用いられる場合、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味しうる。本特許請求の範囲の中で用いられる場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」という語と組み合わせて用いられるとき、「ａ」または「ａｎ」という語は１つまたは２つ以上を意味しうる。
【００８６】
本特許請求の範囲における「ｏｒ（または）」という用語の使用は、選択肢のみを意味するものとして明示的な指定がない限りまたは選択肢が互いに排他的でない限り「ａｎｄ／ｏｒ（および／または）」を意味するものとして用いられるが、本開示は、選択肢のみおよび「ａｎｄ／ｏｒ（および／または）」を意味する定義を支持する。本明細書で用いられる場合、「他の一つ」とは、少なくとも第２のものまたはそれよりも多くのものを意味しうる。
【００８７】
本出願全体を通じて、「ａｂｏｕｔ（約）」という用語は、その値がデバイスやその値の決定に利用される方法に固有の誤差の変動または研究対象に存在する変動を含むことを意味するものとして用いられる。
【００８８】
「外因性」という用語は、細胞もしくは生物のタンパク質、遺伝子、核酸、もしくはポリヌクレオチドとの関連で用いられるとき、人工もしくは天然の手段により細胞もしくは生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、もしくはポリヌクレオチドを意味し、または細胞との関連では、この用語は、単離後に人工もしくは天然の手段により他の細胞もしくは生物に導入された細胞を意味する。外因性核酸は、異なる生物もしくは細胞に由来しうるか、または生物内もしくは細胞内に天然に存在する核酸の１つ以上の追加のコピーでありうる。外因性細胞は、異なる生物に由来しうるかまたは同一の生物に由来しうる。限定されるものではないが、例として、外因性核酸は、天然の細胞のときとは異なる染色体上の位置にあるものであるか、さもなければ天然に見いだされるものとは異なる核酸配列がフランキングするものである。
【００８９】
「発現構築物」または「発現カセット」とは、転写の指令が可能な核酸分子を意味する。発現構築物は、１つ以上の所望の細胞型、組織、または器官で遺伝子発現を指令する少なくとも１つ以上の転写制御エレメント（たとえば、プロモーター、エンハンサー、または機能的にそれらと等価な構造）を含む。転写終止シグナルなどの追加のエレメントもまた含まれうる。
【００９０】
「ベクター」または「構築物」（遺伝子送達系または遺伝子移入「媒体」ということもある）とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含むマクロ分子または分子複合体を意味する。
【００９１】
ベクターの通常のタイプである「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して染色体ＤＮＡに依存せずに複製可能な染色体外ＤＮＡ分子である。ある特定の場合には、それは環状の二本鎖である。
【００９２】
「複製の起点」（「ｏｒｉ」）または「複製起点」とは、細胞のプラスミド中に存在するとき、結合された配列をプラスミド中におよび／またはＤＮＡ合成が開始される部位もしくはその近傍に維持可能なＤＮＡ配列たとえばリンパ球向性ヘルペスウイルスのＤＮＡ配列のことである。例として、ＥＢＶ（エプスタイン・バー（Ｅｂｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス）のｏｒｉは、ＦＲ配列（３０ｂｐリピートの不完全な２０コピー）および好ましくはＤＳ配列を含むが、ＥＢＶの他の部位はＥＢＮＡ−１に結合し、たとえば、Ｒｅｐ*配列は、複製の起点としてＤＳの代わりとなりうる（Ｋｉｒｓｈｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９９８）。そのため、ＥＢＶの複製起点は、ＦＲ配列、ＤＳもしくはＲｅｐ＊配列、または核酸修飾された機能的に等価な任意の配列、またはそれらに由来する合成的組合せを含む。たとえば、本開示の方法はまた、Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に具体的に記載されるように、個々のエレメントの挿入や突然変異などによりＥＢＶの複製起点を遺伝子工学操作したものも使用しうる。
【００９３】
特定のタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「トランスジーン」とは、適切なレギュラトリー配列の制御下に配置されたときに転写されるとともに任意選択的に遺伝子産物たとえばポリペプチドにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳される核酸分子のことである。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡの形態のいずれかで存在しうる。ＤＮＡの形態で存在するとき、核酸分子は一本鎖（すなわちセンス鎖）または二本鎖でありうる。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより決定される。限定されるものではないが、遺伝子は、原核または真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核または真核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含みうる。転写終止配列は、通常は遺伝子配列の３’側に位置するであろう。
【００９４】
「制御エレメント」という用語は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流レギュラトリードメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、スプライス接合部などを総称して意味し、全体としてレシピエント細胞において複製、転写、転写後プロセシング、コード配列の翻訳を提供する。これらの制御エレメントは、選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳されうるのであれば、すべてが存在する必要はない。
【００９５】
「プロモーター」という用語は、本明細書では、ＤＮＡレギュラトリー配列を含むヌクレオチド領域を意味するものとしてその通常の意味で用いられ、この場合、レギュラトリー配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合可能かつ下流（３’方向）のコード配列の転写を開始可能な遺伝子に由来する。それは、核酸配列の特異的転写を開始するようにＲＮＡポリメラーゼや他の転写因子などのレギュラトリータンパク質および調節分子が結合しうる遺伝的エレメントを含有しうる。「作動的に配置」、「作動的に結合」、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが核酸配列との関連で適正な機能位置および／または配向状態にありその配列の転写開始および／または発現を制御することを意味する。
【００９６】
「エンハンサー」とは、プロモーターに近接して配置したときにエンハンサードメインの不在下でプロモーターからもたらされる転写活性と比較して増加した転写活性を付与する核酸配列を意味する。
【００９７】
核酸分子に関して「作動可能に結合」または「共発現」とは、２つ以上の核酸分子（たとえば、転写される核酸分子、プロモーター、およびエンハンサーエレメント）が、核酸分子の転写を可能にするよう接続されることを意味する。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子に関して「作動可能に結合」または「共発現」とは、２つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖、すなわち、融合体の各ペプチドおよび／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの性質を有する融合ポリペプチドを生じるように接続されることを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくはキメラである。すなわち、異種分子で構成される。
【００９８】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の同一性パーセントを意味する。一方の配列と他方の配列との対応関係は、当技術分野で公知の技術により決定可能である。たとえば、相同性は、配列情報をアライメントして２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによりおよび容易に入手可能なコンピュータープログラムを用いることにより決定可能である。代替的に、相同性は、相同領域間の安定な二本鎖の形成を促進する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後で一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化して消化断片のサイズを決定することにより決定可能である。２つのＤＮＡまたは２つポリペプチドの配列は、以上の方法を用いて決定した場合、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％が分子の規定の長さにわたりマッチしたとき、互いに「実質的に相同」である。
【００９９】
「細胞」という用語は、本明細書では、当技術分野でのその最広義で用いられ、多細胞生物の組織の構造ユニットである、外部からそれを隔離する膜構造体に取り囲まれる、自己複製能を有する、かつ遺伝情報およびそれを発現する機序を有する、生存体を意味する。本明細書で用いられる細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（たとえば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）でありうる。
【０１００】
「幹細胞」という用語は、本明細書では、好適な条件下では多岐にわたる特殊化された細胞型に分化可能であるが、他の好適な条件下では自己再生および本質的に未分化の多能性状態の維持が可能である細胞を意味する。「幹細胞」という用語はまた、多能性細胞、複能性細胞、前駆細胞、およびプロジェニター細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血幹細胞もしくは間葉幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、または胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖細胞から取得可能である。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連するある特定の転写因子を発現して多能性状態にリプログラムすることにより体細胞からも産生可能である。これらの細胞は、「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣもしくはｉＰＳ細胞」と呼ばれる。
【０１０１】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」とは、初期段階の胚たとえば胚盤胞段階の内部細胞塊から得られる、または人為的手段（たとえば核移行）により産生され、生殖細胞（たとえば精子および卵子）を含めて胚もしくは成人の任意の分化細胞型をもたらしうる、未分化多能性細胞のことである。
【０１０２】
「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」とは、因子（本明細書ではリプログラミング因子という）の組合せを発現してまたは発現を誘導して体細胞をリプログラムすることにより生成される細胞のことである。ｉＰＳ細胞は、胎児、出生直後の産児、新生児、若年者、または成人の体細胞を用いて生成可能である。ある特定の実施形態では、体細胞から多能性幹細胞へのリプログラミングに使用可能な因子としては、たとえば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４ということもある）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態では、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞にリプログラムするために少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、少なくとも４つのリプログラミング因子、少なくとも５つのリプログラミング因子、少なくとも６つのリプログラミング因子、または少なくとも７つのリプログラミング因子を発現することによりリプログラムされる。
【０１０３】
「造血プロジェニター細胞」または「造血前駆細胞（ＨＰＣ）」とは、造血系列にコミットするがただしさらなる造血分化が可能である細胞を意味し、たとえば、造血幹細胞、複能性造血幹細胞、共通ミエロイドプロジェニター、巨核球プロジェニター、赤血球プロジェニター、およびリンフォイドプロジェニターである。造血幹細胞（ＨＳＣ）とは、ミエロイド系列（たとえば、単球およびマクロファージ、顆粒球（たとえば、好中球、好塩基球、好酸球、および肥満細胞）、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）ならびにリンフォイド系列（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）をはじめとするすべての血液細胞型をもたらす複能性幹細胞のことである（たとえば、Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｎｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５を参照されたい）。「マルチリンフォイドプロジェニター」（ＭＬＰ）とは、すべてのリンフォイド系列（たとえば、Ｂ、Ｔ、およびＮＫ細胞）をもたらすが他の（ミエロイド）潜在能力を有していても有してしなくてもよいかつＣＤ４５ＲＡ+，／ＣＤ１０+／ＣＤ７-である、任意のプロジェニターを記述するものとして定義される（Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。Ｂ、Ｔ、およびＮＫプロジェニターは、ＭＬＰともいいうる。「共通ミエロイドプロジェニター」（ＣＭＰ）とは、顆粒球、単球、巨核球、および赤血球をもたらしうるＣＤ４５ＲＡ-／ＣＤ１３５+／ＣＤ１０-／ＣＤ7細胞を意味する。
【０１０４】
「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）とは、１つ以上の組織もしくは器官または好ましくは３つの胚葉：内胚葉（たとえば、胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（たとえば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、もしくは外胚葉（たとえば、表皮組織および神経系）のいずれかを構成するすべての細胞に分化する潜在能力を有する幹細胞を意味する。
【０１０５】
本明細書で用いられる場合、「体細胞」という用語は、卵子や精子などの生殖細胞以外の任意の細胞でありそのＤＮＡを次世代に直接伝達しないものを意味する。典型的には、体細胞は、限られた多能性を有するかまたは多能性をまったく有していない。本明細書で用いられる体細胞は、天然に存在しうるかまたは遺伝子改変しうる。
【０１０６】
「プログラミング」とは、細胞により生成可能な後代の型を改変するプロセスのことである。たとえば、プログラミングを用いずに同一の条件下で生成可能な型と比較して少なくとも１つの新しい細胞型の後代を培養下またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで生成可能になるように改変されたとき、細胞はプログラムされている。このことは、かかる後代をプログラミング前に本質的にまったく生成できないならば、十分な増殖後、新しい細胞型の表現型特性を有する後代が測定可能な割合で観測されることを意味し、代替的には、新しい細胞型の特性を有する割合は、プログラミング前よりも多く測定されうる。このプロセスは、分化、脱分化、および分化転換を含む。
【０１０７】
「リプログラミング」とは、リプログラミングを用いずに同一の条件下で有しうるよりも少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成する測定可能に向上した能力を培養下またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞に付与するプロセスのことである。より具体的には、リプログラミングとは、多能性の潜在能力を体細胞に付与するプロセスのことである。このことは、かかる後代をリプログラミング前に本質的にまったく生成できないならば、十分な増殖後、新しい細胞型の表現型特性を有する後代が測定可能な割合になることを意味し、さもなければ、新しい細胞型の特性を有する割合は、リプログラミング前よりも多く測定されうる。
【０１０８】
「分化」とは、あまり特殊化されていない細胞がより特殊化された細胞型になるプロセスのことである。「脱分化」とは、部分的または最終的に分化された細胞がより初期の発生段階、たとえば、多能性または複能性の段階に戻る細胞プロセスのことである。「分化転換」とは、ある分化された細胞型を他の分化された細胞型に変換するプロセスのことである。典型的には、プログラミングによる分化転換は、細胞が中間的多能性段階を経由することなく行われる。すなわち、細胞は、ある分化された細胞型から他の分化された細胞型に直接プログラムされる。ある特定の条件下では、新しい細胞型の特性を有する後代の割合は、優先度が高い順に少なくとも約１％、５％、２５％、またはそれ以上でありうる。
【０１０９】
「フォワードプログラミング」という用語は、１つ以上の特定の系列決定遺伝子または遺伝子産物を複能性細胞または多能性細胞に提供することにより多能性をまったく有していない分化された体細胞とは対照的な複能性細胞または多能性細胞をプログラムすることを意味する。たとえば、フォワードプログラミングとは、造血前駆細胞もしくは他の前駆細胞または造血細胞もしくは他の分化された体細胞になるようにＥＳＣまたはｉＰＳＣをプログラムするプロセスを意味しうる。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合、「被験体」または「必要とする被験体」という用語は、哺乳動物、好ましくは、細胞または組織の移植を必要とする任意の年齢の男性または女性のヒトを意味する。典型的には、被験体（本明細書ではレシピエントともいう）は、細胞または組織の移植による治療に適合しうる障害または病理学的もしくは望ましくない病態、状態、もしくは症候群または物理的、形態学的、もしくは生理学的な異常が原因で細胞または組織の移植を必要とする。
【０１１１】
本明細書で用いられる場合、遺伝子の「破壊」とは、破壊の不在下における遺伝子産物の発現レベルと比較して、細胞において被験体の遺伝子によりコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現が排除または低減されることを意味する。例示的な遺伝子産物としては、遺伝子によりコードされるｍＲＮＡおよびタンパク質産物が挙げられる。破壊は、いくつかの場合には一過的また可逆的であり、他の場合には永久的である。破壊は、いくつかの場合には、機能性または全長のタンパク質またはｍＲＮＡの破壊であり、トランケート型または非機能性の産物が産生されうるという事実は関係しない。本明細書のいくつかの実施形態では、遺伝子の活性または機能は、発現とは対照的に破壊される。遺伝子破壊は、人工的方法により、すなわち、化合物、分子、複合体、もしくは組成物の添加もしくは導入により、および／またはＤＮＡレベルなどで遺伝子の核酸の破壊もしくは遺伝子との会合により、一般に誘導される。遺伝子破壊の例示的な方法としては、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト、および／または遺伝子破壊技術たとえば遺伝子編集が挙げられる。例としては、アンチセンス技術、たとえば、一般に発現の一過的低減をもたらすＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはリボザイム、さらには標的遺伝子の不活性化または破壊をもたらす遺伝子編集技術、たとえば、破壊および／または相同組換えの誘導によるものが挙げられる。例としては、挿入、突然変異、および欠失が挙げられる。破壊は、典型的には、遺伝子によりコードされる正常産物または「（野生型」産物の発現の抑制および／または完全欠如をもたらす。かかる遺伝子破壊の例としては、全遺伝子の欠失を含めて、遺伝子または遺伝子の一部の挿入、フレームシフト突然変異およびミスセンス突然変異、欠失、ノックイン、ならびにノックアウトが挙げられる。かかる破壊は、コード領域たとえば１つ以上のエクソンで行うことが可能であり、その結果、停止コドンの挿入などにより全長産物、機能性産物、またはいずれかの産物を産生できなくなる。かかる破壊はまた、遺伝子の転写を防止するようにプロモーターまたはエンハンサーまたは転写の活性化に影響を及ぼす他の領域を破壊することにより行いうる。遺伝子破壊としては、相同組換えによる標的遺伝子の不活性化をはじめとする遺伝子ターゲッティングが挙げられる。
【０１１２】
「Ｎｏｔｃｈリガンド」とは、造血幹細胞などのいくつかの異なる哺乳動物細胞の細胞膜に存在するＮｏｔｃｈレセプターポリペプチドに結合可能なタンパク質のことである。ヒト細胞で同定されたＮｏｔｃｈレセプターとしては、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、およびＮｏｔｃｈ−４が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的には、アミノ末端に２０〜２２アミノ酸を含む特徴的ＤＳＬドメイン（Ｄ−Ｄｅｌｔａ、Ｓ−Ｓｅｒｒａｔｅ、およびＬ−Ｌａｇ２）および細胞外表面に３〜８ＥＧＦ様リピートを有する（Ｆｕｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｕｒｉｅ，１９８８、Ｋｎｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【０１１３】
ＩＩ．多能性幹細胞
本開示のある特定の実施形態では、ＰＳＣから複系列ＨＰＣ、ＤＥ細胞、またはＥＰＣを提供するための方法および組成物が開示される。ＰＳＣは、限定されるものではないがｉＰＳＣおよび胚性幹細胞（ＥＳＣ）をはじめとする幹細胞でありうる。
【０１１４】
ＨＰＣまたはＥＰＣを産生する方法に使用されるＰＳＣは、有糸細胞分裂により自己を複製する能力および多岐にわたる特殊化された細胞型に分化する能力により特徴付けられる。大別される哺乳動物幹細胞の２つのタイプは、胚盤胞に見いだされる胚性幹細胞および成体組織に見いだされる成体幹細胞である。発生中の胚では、幹細胞は、特殊化された胚組織のすべてに分化可能である。成体生物では、幹細胞およびプロジェニター細胞は、特殊化された細胞を補充する生体修復系として作用するとともに、血液、皮膚、腸組織などの再生器官の正常代謝回転を維持する。
【０１１５】
特定の態様では、本明細書で用いられるＰＳＣは、本開示のＨＰＣ、ＤＥ細胞、またはＥＰＣをはじめとする生体のすべての細胞型に分化する潜在能力を維持しつつｉｎ  ｖｉｔｒｏで長期増殖可能なヒトＥＳＣまたはｉＰＳＣである。そのため、これらの細胞は、薬剤開発および治療的使用の両方のために患者特異的機能細胞の無制限供給を潜在的に提供しうる。ある特定の態様は、プログラミング遺伝子の組合せ発現を介してＥＳＣやｉＰＳＣなどのヒトＰＳＣからフォワードプログラミングにより複系列ＨＰＣ、ＤＥ細胞、またはＥＰＣを提供する。
【０１１６】
Ａ．胚性幹細胞
ある特定の態様では、ＰＳＣは胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化能を有する。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側栄養外胚葉を除去してから成長細胞のフィーダー層上で内部塊細胞を培養することにより単離可能である。再プレーティングされた細胞は、増殖を継続してＥＳ細胞の新しいコロニーを産生可能であり、このコロニーは、取出し、解離、再プレーティング、および成長が可能である。未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するこのプロセスは、何回か繰り返して未分化ＥＳ細胞を含有する細胞系を産生可能である（米国特許第５，８４３，７８０号明細書、同第６，２００，８０６号明細書、同第７，０２９，９１３号明細書）。ＥＳ細胞は、その多能性を維持しつつ増殖する潜在能力を有する。たとえば、ＥＳ細胞は、細胞および細胞分化を制御する遺伝子に関する研究に有用である。ＥＳ細胞の多能性は、遺伝子操作および選択と組み合わせてトランスジェニックマウス、キメラマウス、およびノックアウトマウスの生成を介してｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子解析研究に使用可能である。
【０１１７】
マウスＥＳ細胞の産生方法は周知である。一方法では、１２９系マウス由来の着床前の胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉（ｔｒｏｐｈｏｅｃｔｏｄｅｒｍ）を除去し、化学的に不活性化されたマウス胚性線維芽のフィーダー細胞層上のウシ胎仔血清を含有する培地で内部細胞塊を培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーをウシ胎仔血清の存在下でマウス胚性線維芽フィーダー層上で継代培養してＥＳ細胞の集団を産生する。いくつかの方法では、血清含有培養培地にサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加することによりフィーダー層の不在下でマウスＥＳ細胞を成長させることが可能である（Ｓｍｉｔｈ，２０００）。他の方法では、骨形態形成タンパク質およびＬＩＦの存在下で無血清培地でマウスＥＳ細胞を成長させることが可能である（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１１８】
ヒトＥＳ細胞は、以上に記載の方法により、精子および卵細胞の融合、核移行、単為発生（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）、またはクロマチンのリプログラミングおよび形質膜へのリプログラムクロマチンの組込みによる胚細胞の産生により産生される接合体または胚盤胞の段階の哺乳動物胚から産生または誘導することが可能である（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。一方法では、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に暴露し、栄養外胚葉細胞を溶解させて内部細胞塊から除去し、この内部細胞塊をマウス胚性線維芽のフィーダー層上で培養する。さらに、内部細胞塊に由来する細胞集塊を化学的または機械的に解離し、再プレーティングし、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットにより選択し、解離し、そして再プレーティングする。いくつかの方法では、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下で線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することにより、血清を用いることなくヒトＥＳ細胞を成長させることが可能である（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。他の方法では、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「馴化」培地の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）やラミニンなどのタンパク質マトリックス上で細胞を培養することにより、フィーダー細胞層を用いることなくヒトＥＳ細胞を成長させることが可能である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１１９】
また、以上に記載の方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｄｏｒｉｃｏ，２０００、米国特許第５，８４３，７８０号明細書）によりアカゲザルおよびマーモセットをはじめとする他の生物から、さらには樹立されたマウスおよびヒト細胞系から、ＥＳ細胞を誘導することも可能である。たとえば、樹立されたヒトＥＳ細胞系としては、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４、およびＡＣＴ３０が挙げられる。さらなる例として、樹立されたマウスＥＳ細胞系としては、１２９系マウス胚の内部細胞塊から樹立されたＣＧＲ８細胞系が挙げられる。また、ＣＧＲ８細胞の培養物は、フィーダー層を用いることなくＬＩＦの存在下で成長させることが可能である。
【０１２０】
ＥＳ幹細胞は、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−１、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、腫瘍拒絶抗原１−８１（ＴＲＡ−１−８１）、ＳＯＸ２、またはＲＥＸ１をはじめとするタンパク質マーカーにより検出可能である。
【０１２１】
Ｂ．誘導多能性幹細胞
他の態様では、本明細書で用いられるＰＳＣは誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり、通常、ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略記される。多能性の誘導は、多能性に関連する転写因子の導入を介して体細胞をリプログラムすることにより、最初にマウス細胞を用いて２００６年に（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、そしてヒト細胞を用いて２００７年に（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）達成された。ｉＰＳＣの使用は、ＥＳ細胞の大規模な臨床使用に伴う倫理上および実施上の問題のほとんどを回避し、ｉＰＳＣ由来自己移植片を有する患者は、移植拒絶を予防するための生涯にわたる免疫抑制治療を必要としないこともある。
【０１２２】
生殖細胞を除いて、いずれの細胞もｉＰＳＣの出発点として使用可能である。たとえば、細胞型は、角化細胞、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、または胃細胞でありうる。Ｔ細胞もまた、リプログラミング用の体細胞源として使用しうる（米国特許第８，７４１，６４８号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０１９１６９７号明細書）。細胞分化の程度にも細胞が採取される動物の年齢にも制限はなく、未分化プロジェニター細胞（体性幹細胞を含む）および最終分化成熟細胞でさえも、本明細書に開示される方法で体細胞源として使用可能である。ｉＰＳ細胞は、ヒトＥＳ細胞を特定の細胞型に分化させてＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１〜６０、およびＴＲＡ−１〜８１をはじめとするヒトＥＳ細胞マーカーを発現することが知られる条件下で成長させることが可能である。
【０１２３】
体細胞は、当業者に公知の方法を用いてｉＰＳ細胞を産生するようにリプログラムすることが可能である。当業者であればｉＰＳ細胞を容易に産生することが可能である。たとえば、米国特許出願公開第２００９／０２４６８７５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２７６６３６号明細書、米国特許第８，０５８，０６５号明細書、米国特許第８，１２９，１８７号明細書、ＰＣＴ国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレット、米国特許第８，２６８，６２０号明細書、米国特許第８，５４６，１４０号明細書、米国特許第９，１７５，２６８号明細書、米国特許第８，７４１，６４８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１０４１２５号明細書、および米国特許第８，６９１，５７４号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般的には、核リプログラミング因子は、体細胞から多能性幹細胞を産生するために使用される。いくつかの実施形態では、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の少なくとも３つまたは少なくとも４つが利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４が利用されるか、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８が利用される。
【０１２４】
これらの核リプログラミング物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列は、国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレットおよび米国特許第８，１８３，０３８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に挙げられたＮＣＢＩ受託番号に基づいて入手可能である。１つ以上のリプログラミング物質またはこれらのリプログラミング物質をコードする核酸の導入方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、米国特許第８，２６８，６２０号明細書、同第８，６９１，５７４号明細書、同第８，７４１，６４８号明細書、同第８，５４６，１４０号明細書、米国特許第８，９００，８７１号明細書、および米国特許第８，０７１，３６９号明細書（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１２５】
誘導されたら、多能性を維持するのに十分な培地でｉＰＳＣを培養することが可能である。米国特許第７，４４２，５４８号明細書および米国特許出願公開第２００３／０２１１６０３号明細書に記載されるように、ｉＰＳＣは、多能性幹細胞、より特定的には胚性幹細胞を培養するために開発された各種培地および技術で使用しうる。マウス細胞の場合には、培養は、分化抑制因子として白血病抑制因子（ＬＩＦ）を通常の培地に添加して行われる。ヒト細胞の場合には、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加することが望ましい。当業者には公知であろうが、ｉＰＳＣを培養および維持するための他の方法を本明細書に開示される方法と併用しうる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、規定されていない条件を使用しうる。たとえば、幹細胞を未分化状態に維持するために、線維芽フィーダー細胞上または線維芽フィーダー細胞に暴露された培地上で多能性細胞を培養しうる。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞分裂を終了させるために放射線または抗生物質で処理されたマウス胚性線維芽細胞をフィーダー細胞として共存させて培養される。代替的に、ＴＥＳＲ（商標）培地（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ、Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）やＥ８（商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）などの規定のフィーダー非依存培養系を用いて、本質的に未分化状態で多能性細胞を培養および維持しうる。
【０１２７】
プラスミドは、たとえば、レギュレートされた高コピー数の達成、および細菌におけるプラスミド不安定性の潜在的原因の回避、およびヒト細胞をはじめとする哺乳動物細胞での使用に適合可能なプラスミド選択手段の提供など、いくつかの目標を踏まえて設計されてきた。ヒト細胞で使用するためにプラスミドに課された２つの要件には、とくに注意を払われてきた。第１に、多量のＤＮＡの産生および精製が可能になるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での維持および発酵に好適である。第２に、ヒト患者および動物で使用するうえで安全かつ好適である。第１の要件では、細菌発酵時に比較的容易に選択および安定維持を可能にする高コピー数のプラスミドが要求される。第２の要件では、選択可能マーカーや他のコード配列などのエレメントへの考慮が要求される。いくつかの実施形態では、マーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数の複製起点、（２）選択可能マーカー、たとえば、限定されるものではないがカナマイシンによる抗生物質選択用のｎｅｏ遺伝子、（３）チロシナーゼエンハンサーをはじめとする転写終止配列、および（４）各種核酸カセット組込み用のマルチクローニング部位、および（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に結合されたマーカーをコードする核酸配列で構成される。特定の態様では、プラスミドは、チロシナーゼエンハンサーもプロモーターも含まない。タンパク質をコードする核酸を誘導するための当技術分野で公知のプラスミドベクターは多数存在する。これらとしては、限定されるものではないが、米国特許第６，１０３，４７０号明細書、米国特許第７，５９８，３６４号明細書、米国特許第７，９８９，４２５号明細書、および米国特許第６，４１６，９９８号明細書、ならびに米国特許出願第１２／４７８，１５４号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるベクターが挙げられる。
【０１２８】
エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター（米国特許第８，５４６，１４０号明細書）、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクター、またはレンチウイルスベクターでありうる。ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡベースまたはＤＮＡベースのウイルスベクターでありうる（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６２９１１号パンフレット、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６９５８８号パンフレット）。
【０１２９】
Ｃ．体細胞核移入により誘導された胚性幹細胞
ＨＰＣ、ＤＥ細胞、またはＥＰＣを産生するためのＰＳＣはまた、体細胞核移入（ドナー核が紡錘体フリー卵母細胞に移入される）を利用して調製しうる。核移行により産生される幹細胞は、ドナー核と遺伝的に同一である。一方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核は、電気融合により紡錘体フリー成熟中期ＩＩアカゲザル卵母細胞の細胞質に導入される（Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。融合卵母細胞は、イオノマイシンへの暴露により活性化され、次いで、胚盤胞段階までインキュベートされる。選択された胚盤胞の内部細胞塊は、次いで、胚性幹細胞系を産生するように培養される。胚性幹細胞系は、正常ＥＳ細胞形態を示し、各種ＥＳ細胞マーカーを発現し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で複数の細胞型に分化する。
【０１３０】
ＩＩＩ．メチルＣｐＧ結合タンパク質２の遺伝子破壊
ある特定の態様では、ＭｅＣＰ２遺伝子の発現、活性、または機能は、ＰＳＣ（たとえばＥＳＣやｉＰＳＣ）などの細胞において破壊される。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、遺伝子の破壊、たとえば、ノックアウト、挿入、ミスセンス突然変異もしくはフレームシフト突然変異たとえば両対立遺伝子フレームシフト突然変異、遺伝子の全部もしくは一部たとえば１つ以上のエクソンもしくはその一部の欠失、および／またはノックインを行うことにより実施される。たとえば、破壊は、ＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼを含めて配列特異的ヌクレアーゼまたは標的化ヌクレアーゼにより、たとえば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＲＮＡガイドヌクレアーゼ、たとえば、具体的にはＭｅＣＰ２遺伝子の配列またはその一部を標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）により、行うことが可能である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、遺伝子の発現、活性、および／または機能の破壊は、遺伝子破壊により行われる。いくつかの態様では、遺伝子は、遺伝子破壊の不在下または破壊を行うために導入された成分の不在下での発現と比較して、少なくとも２０、３０、もしくは４０％またはそれらの近傍の％、一般的には少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、もしくは９５％またはそれらの近傍の％だけ発現が低減されるように破壊される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、破壊は、より後の時点で遺伝子の発現が回復されるように一過的または可逆的である。他の実施形態では、破壊は、可逆的でも一過的でもなくたとえば永久的である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、遺伝子中の１つ以上の二本鎖切断および／または１つ以上の一本鎖切断の誘導により、典型的には、標的化法により行われる。いくつかの実施形態では、二本鎖切断または一本鎖切断は、ヌクレアーゼにより、たとえば、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼにより行われる。いくつかの態様では、破壊は、遺伝子のコード領域たとえばエクソンで誘導される。たとえば、いくつかの実施形態では、誘導は、コード領域のＮ末端部近傍、たとえば、第１のエクソン、第２のエクソン、または後続のエクソンで行われる。
【０１３４】
いくつかの態様では、二本鎖切断または一本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）や相同指向修復（ＨＤＲ）などの細胞修復プロセスを介して修復を受ける。いくつかの態様では、修復プロセスは、エラープローンであり、フレームシフト突然変異たとえば両対立遺伝子フレームシフト突然変異などの遺伝子破壊をもたらし、遺伝子の完全ノックアウトを引き起こす可能性がある。たとえば、いくつかの態様では、破壊は、欠失、突然変異、および／または挿入を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、破壊は、早期停止コドンの存在をもたらす。いくつかの態様では、挿入、欠失、転座、フレームシフト突然変異、および／または未成熟停止コドンの存在は、遺伝子の発現、活性、および／または機能の破壊をもたらす。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、アンチセンス技術を用いて達成され、たとえば、遺伝子の発現を選択的に抑制または阻止するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、および／またはリボザイムが使用される。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相同な配列と、ヌクレオチド配列に相補的な配列と、を有する二本鎖ＲＮＡ分子を利用するＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの一領域に相同／相補的であるか、または異なる領域に相同／相補的な複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡでありうる。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡはポリシストロニック構築物に含まれる。特定の態様では、ｓｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡからの野生型および変異体ＭｅＣＰ２翻訳の両方を抑制する。
【０１３６】
いくつかの態様では、遺伝子破壊は、ＭｅＣＰ２に対する薬理学的薬剤または低分子阻害剤を投与することにより行われる。ＤＮＡメチル化とクロマチン脱アセチル化との間には関連性がある。ＭｅＣＰ２による転写抑制にはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）依存モードおよびＨＤＡＣ非依存モードの両方がある。そのため、ＭｅＣＰ２を破壊するためにトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）やバルプロ酸などのＨＤＡＣ阻害剤を使用可能である。そのほか、タンパク質阻害剤、転写を阻害するＤＮＡ結合タンパク質、およびＭｅＣＰ２タンパク質に結合して機能を阻害するタンパク質を使用しうる。さらに、分化された雌マウス胚性幹細胞では、ＰＤＰＫ１阻害剤は、媒体と比較してＸｉｓｔレベルを減少させ、かつＭｅＣＰ２  ｍＲＮＡレベルを増加させた（Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１３７】
Ａ．エンドヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、破壊は、ＤＮＡ標的化分子、たとえば、ＤＮＡ結合タンパク質もしくはＤＮＡ結合核酸、またはそれらを含有して遺伝子に特異的に結合もしくはハイブリダイズする複合体、化合物、もしくは組成物を用いて達成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、たとえば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン、転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）もしくはＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＤＮＡ結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ由来ＤＮＡ結合ドメインを含む。ジンクフィンガー系、ＴＡＬＥ系、およびＣＲＩＳＰＲ系の結合ドメインは、たとえば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の工学操作（１つ以上のアミノ酸の改変）により、あらかじめ決められたヌクレオチド配列に結合するように工学操作することが可能である。工学操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。設計の合理的基準には、置換規則の適用、さらには既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計ならびに結合データに関する情報を記憶するデータベースの情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムの適用が含まれる。たとえば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書、同第６，４５３，２４２号明細書、および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。また、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット、国際公開第９８／５３０５９号パンフレット、国際公開第９８／５３０６０号パンフレット、国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット、および国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書も参照されたい。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子、複合体、または組合せは、ＤＮＡ結合分子と、遺伝子の抑制または破壊を促進するエフェクタードメインなどの１つ以上の追加のドメインと、を含有する。たとえば、いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、ＤＮＡ結合タンパク質と異種レギュラトリードメインまたはその機能性断片とを含む融合タンパク質により行われる。いくつかの態様では、ドメインは、たとえば、転写因子ドメイン、たとえば、アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、サイレンサー、癌遺伝子、ＤＮＡ修復酵素ならびにその関連因子およびモディファイヤー、ＤＮＡ再構成酵素ならびにその関連因子およびモディファイヤー、クロマチン関連タンパク質およびそのモディファイヤー、たとえば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ、およびＤＮＡ修飾酵素、たとえば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、およびそれらの関連因子およびモディファイヤーを含む。ＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼ切断ドメインとの融合に関する詳細については、たとえば、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書、同第２００６／０１８８９８７号明細書、および同第２００７／０２１８５２８号明細書（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの態様では、追加のドメインはヌクレアーゼドメインである。そのため、いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、工学操作されたタンパク質たとえばヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼなどの非特異的ＤＮＡ切断分子に融合または複合体化された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインで構成されるヌクレアーゼ含有複合体または融合タンパク質を用いて、遺伝子編集またはゲノム編集により促進される。
【０１３９】
いくつかの態様では、これらの標的化キメラヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ含有複合体は、標的化された二本鎖切断または一本鎖切断を誘導して、エラープローンな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同指向修復（ＨＤＲ）をはじめとする細胞ＤＮＡ修復機序を刺激することにより、正確な遺伝子改変を行う。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、たとえば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、たとえば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはメガヌクレアーゼである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ドナー核酸、たとえば、遺伝子工学操作された抗原レセプターをコードするドナープラスミドまたは核酸が提供され、ＤＳＢの導入に続いてＨＤＲにより遺伝子編集の部位に挿入される。そのため、いくつかの実施形態では、遺伝子の破壊および抗原レセプターたとえばＣＡＲの導入は同時に行われ、それにより、遺伝子は、部分的にはＣＡＲコード核酸のノックインまたは挿入により破壊される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ドナー核酸はまったく提供されない。いくつかの態様では、ＤＳＢの導入に続くＮＨＥＪ媒介修復は、たとえば、ミスセンス突然変異またはフレームシフト突然変異を生成することにより、遺伝子破壊を引き起こしうる挿入または欠失の突然変異をもたらす。
【０１４２】
１．ＺＦＰおよびＺＦＮ
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合されたＤＮＡ結合タンパク質、たとえば、１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）または転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）を含む。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、およびＴＡＬＥＮが挙げられる。Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照されたい。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、配列特異的にＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、亜鉛イオンの配位を介して構造が安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記されることが多い。ＺＦＰの中には、典型的には９〜１８ヌクレオチド長の特定のＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインが含まれる。このドメインは、個別のフィンガーのアセンブリーにより生成される。
【０１４４】
ＺＦＰとしては、単一のフィンガードメインが約３０アミノ酸長であり、単一のβターンの２つのシステインと共に亜鉛を介して配位された２つの不変ヒスチジン残基を含有するαヘリックスを含有し、かつ２、３、４、５、または６つのフィンガーを有するものが挙げられる。一般的には、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（−１、２、３、および６）でアミノ酸置換を行うことにより改変しうる。そのため、いくつかの実施形態では、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は、天然には存在せず、たとえば、選択された標的部位に結合するように工学操作される。たとえば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、米国特許第６，４５３，２４２号明細書、同第６，５３４，２６１号明細書、同第６，５９９，６９２号明細書、同第６，５０３，７１７号明細書、同第６，６８９，５５８号明細書、同第７，０３０，２１５号明細書、同第６，７９４，１３６号明細書、同第７，０６７，３１７号明細書、同第７，２６２，０５４号明細書、同第７，０７０，９３４号明細書、同第７，３６１，６３５号明細書、同第７，２５３，２７３号明細書、および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書、同第２００７／０２１８５２８号明細書、同第２００５／０２６７０６１号明細書（すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１４５】
いくつかの態様では、ＭｅＣＰ２破壊は、遺伝子の第１の標的部位と第１のＺＦＰとを接触させて遺伝子を破壊することにより行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子の標的部位と、６つのフィンガーおよびレギュラトリードメインを含む融合ＺＦＰと、を接触させることにより遺伝子の発現を阻害する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、接触させる工程は、遺伝子の第２の標的部位と第２のＺＦＰとを接触させることをさらに含む。いくつかの態様では、第１および第２の標的部位は隣接している。いくつかの実施形態では、第１および第２のＺＦＰは共有結合されている。いくつかの態様では、第１のＺＦＰは、１つのレギュラトリードメインまたは少なくとも２つのレギュラトリードメインを含む融合タンパク質である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＺＦＰは、それぞれ１つのレギュラトリードメインを含むまたはそれぞれ少なくとも２つのレギュラトリードメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、レギュラトリードメインは、転写リプレッサー、転写アクチベーター、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、またはヒストンデアセチラーゼである。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に結合されたＺＦＰ核酸によりコードされる。いくつかの態様では、本方法は、最初に核酸を脂質：核酸複合体としてまたはネイキッド核酸として細胞に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、プロモーターに作動可能に結合されたＺＦＰ核酸を含む発現ベクターによりコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、誘導プロモーターに作動可能に結合された核酸によりコードされる。いくつかの態様では、ＺＦＰは、弱いプロモーターに作動可能に結合された核酸によりコードされる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、標的部位は遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの態様では、標的部位は遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの態様では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接している。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するようにＤＮＡ切断ドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのｌｉＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と、工学操作されていてもいなくてもよい１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、切断ドメインは、ｌｉＳ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩに由来する。ＦｏｋＩは、一般に、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドの位置および他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの位置でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。たとえば、米国特許第５，３５６，８０２号明細書、同第５，４３６，１５０号明細書、および同第５，４８７，９９４号明細書、さらにはＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ａ、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ｂ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。］
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＺＦＮは、工学操作された細胞に存在する遺伝子を標的とする。いくつかの態様では、ＺＦＮは、たとえば遺伝子のコード領域のあらかじめ決められた部位で効率的に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。標的とされる典型的な領域は、エクソン、Ｎ末端領域をコードする領域、第１のエクソン、第２のエクソン、およびプロモーターまたはエンハンサーの領域を含む。いくつかの実施形態では、ＺＦＮの一過的発現は、工学操作された細胞の標的遺伝子の高効率な永久破壊を促進する。とくに、いくつかの実施形態では、ＺＦＮの送達は、５０％を超える効率で遺伝子の永久破壊をもたらす。
【０１５２】
工学操作された多くの遺伝子特異的ジンクフィンガーは市販されている。たとえば、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と協同でジンクフィンガー構築用のプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、研究者によるジンクフィンガーの構築および検証を完全に回避できるようにして、何千ものジンクフィンガーを特異的に標的とするタンパク質を提供している（Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７−４０５）。いくつかの実施形態では、市販のジンクフィンガーが使用されるかまたはカスタム設計される。（たとえば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＣＳＴＺＦＮＤ、ＣＳＴＺＦＮ、ＣＴｉｌ−ｌＫＴ、およびＰＺＤ００２０を参照されたい）。
【０１５３】
２．ＴＡＬ、ＴＡＬＥ、およびＴＡＬＥＮ
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、たとえば、転写アクチベーター様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質中に、天然に存在するまたかは工学操作された（天然に存在しない）転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。たとえば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１５４】
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＡＬＥは、１つ以上のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、そのコグネイト標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」ともいう）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質中の他のＴＡＬＥリピート配列に対して少なくともいくらかの配列相同性を呈する。各ＴＡＬＥリピート単位は、典型的にはリピートの位置１２および／または１３にリピート可変二塩基（ＲＶＤ）を構成する１または２ＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識用の天然（カノニカル）コードは、位置１２および１３のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、かつＮＯがＴに結合するように決定されており、非カノニカル（非定型）ＲＶＤもまた知られている。米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に対する特異性をもたせてＴＡＬアレイを設計することにより、任意の遺伝子を標的としうる。標的配列は一般にチミジンから始まる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、分子は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼである。いくつかの態様では、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥに由来するＤＮＡ結合ドメインと、核酸標的配列を切断するヌクレアーゼ触媒ドメインと、を含む融合タンパク質である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、遺伝子の標的配列を認識して切断する。いくつかの態様では、ＤＮＡの切断は、二本鎖切断をもたらす。いくつかの態様では、破壊は、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を向上させる。一般に、ＮＨＥＪは、多くの場合、切断部位のＤＮＡ配列に変化をもたらす不完全修復プロセスである。いくつかの態様では、修復機序は、直接再ライゲーションを介してまたはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合を介して２つのＤＮＡ末端の残りの部分を再結合することを含む（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９８）。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪを介する修復は、小さな挿入または欠失をもたらし、遺伝子の破壊しして抑制するために使用可能である。いくつかの実施形態では、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加でありうる。いくつかの態様では、切断誘導突然変異誘発イベント、すなわち、ＮＨＥＪイベントに続いて突然変異誘発イベントが起こった細胞は、当技術分野で周知の方法により同定および／または選択が可能である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥリピートは、遺伝子を特異的に標的とするようにアセンブルされる。（Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。１８，７４０ヒトタンパク質コード遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリーが構築されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。カスタム設計ＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を介して市販されている。具体的には、ＣＤ３８を標的とするＴＡＬＥＮが市販されている（Ｇｅｎｃｏｐｏｅｉａカタログ番号ＨＴＮ２２２８７０−ｌ、ＨＴＮ２２２８７０−２、およびＨＴＮ２２２８７０−３）。例示的な分子は、たとえば、米国特許出願公開第２０１４／０１２０６２２号明細書および同第２０１３／０３１５８８４号明細書に記載されている。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、１つ以上のプラスミドベクターによりコードされるトランス遺伝子として導入される。いくつかの態様では、プラスミドベクターは、前記ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含有しうる。
【０１５９】
３．ＲＧＥＮ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）
いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて破壊が行われる。たとえば、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介して破壊が行われる。たとえば、破壊は、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行うことが可能である。一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」とは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含めてＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の転写物およびその活性の発現に関与するまたはそれを指令する他のエレメント、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（たとえば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系との関連で「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡプロセシング部分ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系との関連で「スペーサー」ともいう）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する他の配列および転写物を総称して意味する。
【０１６０】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡと、ヌクレアーゼ機能（たとえば２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（たとえばＣａｓ９）と、を含みうる。ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物たとえばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ系に由来しうる。
【０１６１】
いくつかの態様では、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと固定ｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体を含む）は、細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端の標的部位は、相補的塩基対合を用いてＣａｓヌクレアーゼを標的部位たとえば遺伝子に標的化する。標的部位は、典型的にはＮＧＧやＮＡＧなどのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ５’側のその位置に基づいて選択しうる。これに関連して、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１、または１０ヌクレオチドを改変することにより所望の配列を標的とする。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントにより特徴付けられる。典型的には、「標的配列」とは、一般に、相補性を有するようにガイド配列を設計して標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するようにするための配列を意味する。ハイブリダイゼーションを引き起こしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性がある限り、必ずしも完全な相補性は必要とされない。
【０１６２】
ＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書で考察されるように、標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導してから破壊を引き起こすことが可能である。他の実施形態では、標的部位で一本鎖にニックを入れるために、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９変異体が使用される。たとえば、特異性を向上させるために、ニックの導入と同時に５’オーバーハングが導入されるように一対の異なるｇＲＮＡ標的化配列によりそれぞれ指令される対をなすニッカーゼを使用可能である。他の実施形態では、遺伝子発現に影響を及ぼすように転写リプレッサーや転写アクチベーターなどの異種エフェクタードメインに触媒不活性Ｃａｓ９が融合される。
【０１６３】
標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドやＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含みうる。標的配列は、細胞の核または細胞質に、たとえば、細胞のオルガネラ内に位置しうる。一般に、標的配列を含む標的遺伝子座に組換えを導入するために使用しうる配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」という。いくつかの態様では、外因性テンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートということもある。いくつかの態様では、組換えは相同組換えである。
【０１６４】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系との関連では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズされるかつ１つ以上のＣａｓタンパク質に複合体化されるガイド配列を含む）の形成は、標的配列位置またはその近傍（たとえば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対内、またはそれ以上の塩基対内）で一方または両方の鎖の切断をもたらす。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（たとえば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５ヌクレオチド、またはそれ以上）を含みうるまたはそれからなりうるｔｒａｃｒ配列はまた、たとえば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に作動可能に結合されたｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部にハイブリダイズすることにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成しうる。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するのに十分な程度のｔｒａｃｒメイト配列に対する相補性、たとえば、最適にアライメントしたときにｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を有する。
【０１６５】
ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指令するように細胞に導入可能である。成分はまた、タンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達可能である。たとえば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ、個別のベクター上の個別のレギュラトリーエレメントに作動可能に結合しうる。代替的に、同一または異なるレギュラトリーエレメントから発現される２つ以上のエレメントは、単一のベクターで組み合わせうるとともに、１つ以上の追加のベクターは、第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲ系の任意の成分を提供する。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」ともいう）などの１つ以上の挿入部位を含みうる。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入部位は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一の発現構築物を用いて細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するようにしうる。
【０１６６】
ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合されたレギュラトリーエレメントを含みうる。限定されるものではないがＣａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログまたはそれらの改変体が挙げられる。これらの酵素は既知であり、たとえば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見いだしうる。
【０１６７】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（たとえば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．ニューモニア（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来）でありうる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、たとえば、標的配列内および／または標的配列の相補体内において、標的配列の位置で一方または両方の鎖の切断を指令可能である。ベクターは、突然変異されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠如するように、対応する野生型酵素に対して突然変異されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードすることが可能である。たとえば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９のＲｕｖＣＩ触媒ドメインでアスパラギン酸→アラニン置換（Ｄ１０Ａ）を行うと、Ｃａｓ９は、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、たとえば、ＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用しうる。この組合せを用いれば、両方の鎖にニックを入れてＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘導できるようになる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に対してコドン最適化が行われる。真核細胞は、特定の生物、たとえば、限定されるものではないがヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長動物をはじめとする哺乳動物のものまたはそれに由来するものでありうる。一般に、コドン最適化とは、天然アミノ酸配列を維持しつつ天然配列の少なくとも１つのコドンをその宿主細胞の遺伝子でより高頻度または最も高頻度に用いられるコドンに置き換えることにより対象宿主細胞における発現を向上させるように核酸配列を改変するプロセスを意味する。さまざまな種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、多くの場合、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率に相関し、ひいては、翻訳されるコドンの性質および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用能にとくに依存すると考えられている。細胞で選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの現れである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物において最適な遺伝子発現になるように調整可能である。
【０１６９】
一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列に対して十分な相補性を有するとともに標的配列にハイブリダイズして標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指令する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補度、好適なアライメントアルゴリズムを用いて最適にアライメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれらを超える％である。
【０１７０】
最適アライメントは、配列をアライメントするための任意の好適なアルゴリズムを用いて決定しうる。例としては、限定されるものではないが、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（たとえば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。
【０１７１】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部でありうる。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列および任意選択的に任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含みうる。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合しうるタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および次の活性、すなわち、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。限定されるものではないがエピトープタグの例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、自己蛍光タンパク質たとえば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するまたは他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片、たとえば、限定されるものではないがマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体をコードする遺伝子配列に融合しうる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成しうる追加のドメインは、米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１７２】
Ｂ．核酸の送達
いくつかの態様では、ＤＮＡ標的化分子、複合体、または組合せをコードする核酸は、細胞に投与または導入される。核酸は、典型的には、ウイルス発現ベクターなどの発現ベクターの形態で投与される。いくつかの態様では、発現ベクターは、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ＤＮＡプラスミド発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである。いくつかの態様では、破壊分子または複合体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドたとえばＤＮＡ標的化分子は、細胞に送達される。いくつかの態様では、送達は、１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、および／またはそれらから転写された１つ以上のタンパク質の送達により細胞に送達される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入した結果として細胞においてｉｎ  ｓｉｔｕで合成される。いくつかの態様では、ポリペプチドは、細胞外で産生された後、それに導入しうる。ポリヌクレオチド構築物を動物細胞に導入する方法は公知であり、例としては、限定されるものではないが、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれる安定トランスフォーメーション法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれない一過的トランスフォーメーション法、およびウイルス媒介法が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、たとえば、組換えウイルスベクター（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどにより細胞に導入しうる。たとえば、いくつかの態様では、一過的トランスフォーメーション法としては、マイクロインジェクション、電気穿孔、または粒子照射が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞で発現されることを考慮して、ベクター、より特定的にはプラスミドまたはウイルスに含まれうる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子移入法は、哺乳動物細胞または標的組織の核酸に導入するために使用可能である。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲ系、ＺＦＰ系、ＺＦＮ系、ＴＡＬＥ系、および／またはＴＡＬＥＮ系の成分をコードする核酸を培養下または宿主生物中の細胞に投与するために使用可能である。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（たとえば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達媒体に複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２、Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｉｇｎｅｒ，１９９３、Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，１９９３、Ｄｉｌｌｏｎ，１９９３、Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，１９８８、Ｖｉｇｎｅ，１９９５、Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９５、Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照されたい。
【０１７５】
核酸の非ウイルス送達法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用剤強化取込みが挙げられる。リポフェクションは（たとえば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書、および同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（たとえば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的レセプター認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性の脂質としては、Ｆｅｉｇｎｅｒの国際公開第９１１１７４２４号パンフレット、国際公開第９１１１６０２４号パンフレットに記載のものが挙げられる。送達は、細胞（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織（たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）に行いうる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、送達は、核酸の送達ではＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系を用いて行われる。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、患者に直接投与しうるか（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで細胞を処理した後で患者に投与するように使用可能である。いくつかの実施形態では、ウイルスベース系としては、遺伝子移入ではレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられる。
【０１７７】
いくつかの態様では、限定されるものではないが、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質たとえば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をはじめとするレポーター遺伝子は、遺伝子産物の発現の変化または改変を測定するためのマーカーとして機能する遺伝子産物をコードするように細胞に導入しうる。さらなる実施形態では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子は、ベクターを介して細胞に導入しうる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物はルシフェラーゼである。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、トランスジーンカセットは、トランスポザーゼ系を用いて組み込まれる。転位因子（ＴＥまたはトランスポゾン）とは、ゲノム内でその位置を変化させることが可能であり、ときには突然変異の生成または逆転および細胞のゲノムサイズの改変をもたらすＤＮＡ配列のことである。トランスポゾンは、挿入突然変異に関する遺伝子研究および組換え遺伝子工学操作に使用可能である。挿入突然変異は、トランスポゾンがベクターとして機能するとき、遺伝子配列の除去および組込みを支援しうる。設計が比較的単純でありＤＮＡ配列を移動させる固有の能力を備えていることから、トランスポゾンは、遺伝物質のトランスダクションに対する適合性が高く、理想的な遺伝学的ツールとなる。一般に、トランスポザーゼ系としては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ｍｉｎｉＴｏｌ２、およびＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられる。
【０１７９】
ｍｉｎｉＴｏｌ２プラスミド系（Ｂａｌｃｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）は、トランスジーンの組込みに使用しうる。２プラスミド系では、一方のプラスミドは、レポーター遺伝子を駆動するプロモーターにフランキングする末端Ｔｏｌ２配列を含有し、他方のプラスミド（ｐＴｒａｎｓ）は、他のプロモーターの制御下にトランスポザーゼ配列を含有する。ｍｉｎｉＴｏｌ２プラスミド系に使用されるプロモーターは、ｐＣＡＧＧＳプロモーターのＣＭＶ  ＩＥプロモーターでありうる。この系では、ｍｉｎｉＴｏｌレポーター遺伝子配列は標的ゲノムＤＮＡに取り込まれるが、ｐＴｒａｎｓ配列は取り込まれないであろう。
【０１８０】
「切り貼り」機序を介してベクターと染色体との間を効率的に転位する可動遺伝エレメントのＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを使用可能である。転位時、ＳｕｐｅｒＰＢトランスポザーゼは、トランスポゾンベクターの両末端に位置するトランスポゾン特異的逆位末端リピート配列（ＩＴＲ）を認識し、元の部位から内容物を移動し、それをＴＴＡＡ染色体部位に効率的に組み込む。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系の強力な活性により、ＰＢベクターの２つのＩＴＲ間の対象遺伝子は標的ゲノムに容易に移動可能になる。
【０１８１】
ＩＶ．成熟系列細胞の産生
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭｅＣＰ２が破壊されたｉＰＳＣ細胞、たとえば、ＨＰＣ、ＤＥ細胞、またはＥＰＣを介して成熟系列に分化しうるＭｅＣＰ２ＫＯを提供する。ＨＰＣは、エリスロイド、リンフォイド、またはミエロイドの系列に高効率かつ高純度でさらに分化させうる。たとえば、ＨＰＣは、成熟した赤血球またはマイクログリアさらにはリンフォイド系列の細胞、たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＴ／ＮＫ細胞を生成させるために使用しうる。ＤＥ細胞またはＥＰＣは、β細胞や肝細胞などの内胚葉系列の細胞にさらに分化させうる。
【０１８２】
本研究はまた、ｉＰＳＣ由来系列で成熟状態を出現させる脱メチル化の役割を支持する。哺乳動物ゲノムでは、ＣｐＧの約６０％〜９０％はメチル化される。残りの非メチル化ＣｐＧは、ゲノムの約１％を占めるＣｐＧアイランドと呼ばれるものにクラスター化される。メチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）ファミリーのタンパク質は、クロマチンリモデラー、ヒストンデアセチラーゼ、およびメチラーゼをリクルートしてメチル化ＤＮＡに作用することによりエピジェネティックリモデリングおよび転写抑制をもたらす。それらは、本質的に生物時計として機能してクロマチンを組織化し、ニッチ依存シグナルに反応してコヒーレント転写を調整する（Ｂｉｒｄ，１９８６、Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔａｋａｉ，２００１）。本研究では、ｉＰＳＣにおいてＭｅＣＰ２をノックアウトすると細胞内の生物時計を操作するメチル化状態が改変されてｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟系列が生成することを示した。そのため、分化時にｉｎ  ｖｉｔｒｏでｉＰＳＣから成熟系列を生成する一過的な段階特異的脱メチル化（低分子、ＲＮＡｉ、または化合物を介する）工程を含むウィンドウを提供する。この知見はｉＰＳＣに特有なものでありうる。なぜなら、プライミングされた発生段階およびユニークなｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化環境に起因するからである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、成熟系列の細胞に効率的に分化可能なｉＰＳＣを提供するために、ＭｅＣＰ２を破壊することによりｉＰＳＣのメチル化状態を改変する方法を提供する。
【０１８３】
Ａ．ＨＰＣの産生
ＭｅＣＰ２が破壊されるように工学操作されたＰＳＣ（たとえば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）は、米国特許第８，３７２，６４２号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される当技術分野で公知の方法によりＨＰＣに分化させることが可能である。たとえば、ＢＭＰ４とＶＥＧＦとＦｌｔ３リガンドとＩＬ−３とＧＭＣＳＦとの組合せを用いて、造血分化を促進しうる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ４とＶＥＧＦと（任意選択的にＦＧＦ−２と）を含む第１の培地に細胞培養物を暴露してから逐次的にＦｌｔ３リガンドとＳＣＦとＴＰＯとＩＬ−３とＩＬ−６とを含む第２の培地で培養することにより、多能性細胞を造血前駆細胞および造血細胞に分化させることが可能である。さらに、ＢＭＰ４とＶＥＧＦとを含有する培地にＦＧＦ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）を組み込むことにより、多能性細胞から造血前駆細胞を生成させる効率を向上させることが可能である。
【０１８４】
多能性細胞からＨＰＣへの分化は、規定条件または未規定条件を用いて行いうる。一般的には、得られた細胞をヒト被験体に投与することが意図される実施形態では、規定条件が一般に好ましいことは分かるであろう。ＨＰＣは、規定条件下でＰＳＣから培養しうるとともに（たとえば、ＴｅＳＲ培地およびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などのマトリックス成分を用いて）、造血細胞は、多能性細胞に由来する胚様体から生成させうる。他の実施形態では、多能性細胞は、ＯＰ９細胞上またはマウス胚性線維芽細胞上で共培養してから分化させうる。
【０１８５】
多能性細胞は、分化プロセスの一部として胚様体または凝集体を形成するようにしうる。分化を誘導するための「胚様体」（ＥＢ）または成長細胞クラスターの形成は、一般に、ヒト多能性幹細胞からＥＢへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝集を含み、ヒト多能性幹細胞から内胚葉起源、外胚葉起源、および中胚葉起源を呈する複数の組織型への自発的ランダム分化を可能にする。そのため、三次元ＥＢを用いて造血細胞および内皮細胞のいくつかの画分を産生することが可能である。
【０１８６】
次のプロトコルを用いてＥＢを形成しうる。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）被覆プレート上またはビトロネクチン被覆プレート上でのフィーダーフリー成長に適合化された未分化のｈＥＳＣまたはｉＰＳＣは、室温で約８〜１０分間の０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ処理を用いて集密状態で採取しうる。ＥＤＴＡは、インキュベーション後に吸引され、ＥＢは、ｒｏｃｋ阻害剤またはブレビスタチンを含有するＥＢ基本培地に細胞を採取することにより形成しうる。翌日、培地は、さまざまなサイトカイン配合物を含有するＥＢ分化培地に変更しうる。細胞は、凝集体形成を促進するために２５万〜５０万細胞／ｍｌの密度で配置される。
【０１８７】
ＥＢ形成を促進するために、すでに記載されているように、細胞を低付着プレートに移して、７５％ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）と、０．５％Ｎ２および１％Ｂ−２７（ＲＡサプリメントなし）、２００ｍＭ  ｌ−グルタミン、０．０５ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩（Ａｓｃ  ２−Ｐ）（ＷＡＫＯ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ならびに４．５×１０-4  ＭＴＧが補充された２５％ハム改変Ｆ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ）と、からなる血清フリー分化（ＳＦＤ）培地で一晩インキュベーションに付しうる（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｎｏｖ；２４（１１）：１４０２−１１）翌日、各ウェルから細胞を採取して遠心分離しうる。次いで、分化の最初の４日間で、約５０ｎｇ／ｍｌ骨形態形成因子（ＢＭＰ−４）、約５０ｎｇ／ｍｌ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および５０ｎｇ／ｍｌ  ｚｂ  ＦＧＦが補充されたＳＦＤ基本培地からなる「ＥＢ分化培地」に細胞を再懸濁させうる。細胞は、４８時間ごとに半分ずつ供給する。分化５日目、培地は、５０ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍＬ、および５０ｎｇ／ｍｌトロンボポイエチン（ＴＰＯ）が補充されたＳＦＤ培地で構成された第２の培地と交換する。細胞は、４８時間ごとに新鮮な分化培地と共に半分ずつ供給する。培地変更は、分化培養物を３００ｇで５分間遠心沈降させること、分化培養物から体積の半分を吸引すること、およびそれを同一の体積の新鮮培地で補充することにより実施される。ある特定の実施形態では、ＥＢ分化培地は、ＢＭＰ４（たとえば約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（たとえば約５０ｎｇ／ｍｌ）、および任意選択的にＦＧＦ−２（たとえば約２５〜７５ｎｇ／ｍｌまたは約５０ｎｇ／ｍｌ）を含みうる。上清は、吸引して新鮮な分化培地と交換しうる。代替的に、細胞は、２日ごとに新鮮培地と共に半分ずつ供給しうる。細胞は、分化プロセス時の異なる時間点で採取しうる。
【０１８８】
ＨＰＣは、規定培地を用いてＰＳＣから培養しうる。規定培地を用いて多能性細胞を造血ＣＤ３４+幹細胞に分化させる方法は、米国特許出願第１２／７１５，１３６号明細書（権利放棄することなくその全体が参照により組み込まれる）に記載されている。この方法は、本開示で使用しうると予想される。
【０１８９】
たとえば、規定培地を用いて造血ＣＤ３４＋分化を誘導しうる。規定培地は、成長因子ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、および／またはＧＭＣＳＦを含有しうる。多能性細胞は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、および任意選択的にＦＧＦ−２を含む第１の規定培地で培養してから（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦ）または（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＴＰＯ）のいずれかを含む第２の培地で培養しうる。第１および第２の培地はまた、ＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ−２、および／またはＴＰＯの１つ以上を含みうる。実質的に低酸素の条件（たとえば、２０％未満のＯ2）は、造血分化または内皮分化をさらに促進しうる。
【０１９０】
細胞は、機械的または酵素的な手段により実質的に個別化しうる（たとえば、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いて）。また、ＲＯＣＫ阻害剤（たとえば、Ｈ１１５２またはＹ−２７６３２）も培地に含まれうる。これらの方法は、ロボット自動化などを用いて自動化しうると予想される。ｉＰＳＣは、低酸素条件下で培養することによりコンディショニングしうる。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、実質的に低酸素の条件を用いて、多能性細胞から造血プロジェニター細胞への分化を促進する。当業者であれば分かるであろうが、約２０．８％未満の大気酸素含有量は、低酸素であるとみなされよう。培養下のヒト細胞は、周囲空気と比較して低減された酸素含有率を有する大気条件で成長させることが可能である。この相対的な低酸素は、培養下の細胞に暴露される大気酸素を減少させることにより達成しうる。胚細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、典型的には低酸素条件下で、一般的には周囲レベルの二酸化炭素を伴って約１％〜約６％の大気酸素で発生する。理論により拘束されることを望むものではないが、低酸素条件は、ある特定の胚発生条件の態様をミミックしうると予想される。以下の例に示されるように、ある特定の実施形態では、低酸素条件は、ｉＰＳＣやｈＥＳＣなどの多能性細胞から造血前駆細胞などのより分化された細胞型へのさらなる分化を促進するために使用可能である。
【０１９２】
多能性細胞から造血プロジェニター細胞への分化を促進するために、次の低酸素条件を使用しうる。ある特定の実施形態では、造血前駆細胞への分化を促進するために、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％の大気酸素含有量を使用しうる。ある特定の実施形態では、低酸素大気は約５％の酸素ガスを含む。
【０１９３】
特定の培地がいずれの所与の造血プロジェニター細胞の拡大に使用されるかにかかわらず、使用される培地は、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬ、より一般的には１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度の少なくとも１つのサイトカインが追加される。好適なサイトカインとしては、限定されるものではないが、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（ｓｔｅｅｌ因子（ＳｔＩ）、肥満細胞成長因子（ＭＧＦ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）とも呼ばれる）、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１１、ＭＩＰ−１α、ＬＩＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド／ＴＰＯ、およびｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド（Ｆｌｔ２ＬまたはＦｌｔ３Ｌ）が挙げられる（Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９、Ｇｏｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０、Ｌｕｓｉｓ，１９８１、Ａｂｂｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、Ｏｋａｂｅ，１９８２、Ｆａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。とくに、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＴＰＯの少なくとも１つを含むであろう。より特定的には、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＴＰＯを含むであろう。
【０１９４】
一実施形態では、サイトカインは、培地に含まれかつ培地灌流により補充される。代替的に、バイオリアクター系を使用する場合、サイトカインは、培地灌流を行うことなく個別の入口ポートを介して濃厚溶液として個別に添加しうる。灌流を用いることなくサイトカインを添加する場合、典型的には、約２〜４日ごとに新鮮なサイトカインを添加しながらバイオリアクターの容積の１／１０〜１／１００に等しい量の１０×〜１００×溶液として添加されるであろう。さらに、灌流培地のサイトカインに加えて、新鮮な濃厚サイトカインを個別に添加することも可能である。
【０１９５】
Ａ．エリスロイド分化
ＨＰＣは、エリスロイド分化培地などを用いてエリスロイド細胞に分化させうる。エリスロイド分化培地は、血清フリー培地または規定培地でありうる。また、培地は、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、インスリン、デキサメタゾンまたはヒドロコルチゾン、およびトランスフェリンを含有しうる（Ｓｌｕｋｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。エリスロイドプロジェニターは、ヒドロコルチゾン、ホロトランスフェリン、およびＥＸＣＹＴＥ（登録商標）を含有する培地にＭｅＣＰ２が破壊された造血前駆細胞を配置することにより生成させうる。
【０１９６】
代表的な一方法では、ＨＰＣは、低付着プレート中でＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヘパリン（たとえば１〜１０Ｕ／ｍＬ、たとえば５Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＴＰＯ（たとえば５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒト組換えＳＣＦ（たとえば５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＬＴ３Ｌ（たとえば５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（たとえば１〜２０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−６（たとえば１〜２０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地に移される。約４〜６日後、エリスロイド細胞は、０．１％〜０．５％Ｅｘｃｙｔｅ、たとえば０．３％Ｅｘｃｙｔｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ホロトランスフェリン（たとえば０．５〜５ｍｇ／ｍＬ、たとえ１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（たとえば０．５〜５ｍＭ、たとえば１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、インスリン（たとえば５〜５０ｎｇ／ｍＬ、たとえば２０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＳＣＦ（たとえば１０〜１００ｎｇ／ｍＬ、たとえば５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＥＰＯ（たとえば１〜５Ｕ／ｍＬ、たとえば２Ｕ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−３（たとえば１〜１０ｎｇ／ｍＬ、たとえば５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（たとえば１〜２５ｎｇ／ｍＬ、たとえば１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＴＰＯ（たとえば１０〜１００ｎｇ／ｍＬ、たとえば５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＳＦＥＭ培地でさらに２〜３週間拡大させる。続いて、培地からＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＴＰＯを除去し、ＳＣＦおよびＥＰＯの存在下で細胞を培養する。細胞内懸濁物中の赤芽球の存在は、フローサイトメトリーを用いて表面染色ＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）、ＣＤ３６、およびＣＤ７１により定量される。
【０１９７】
ＨＰＣから赤血球、マクロファージ、および／または顆粒球への分化を誘導するために、メチルセルロースを使用しうる。メチルセルロースは、良好な光学的透明性を備えた安定なゲルを形成する比較的イナートなポリマーである。それは、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２−メルカプトエタノール、インスリン、トランスフェリン、および組換えサイトカインをはじめとする化合物またはコロニー刺激因子源として馴化培地が補充された培養培地で０．９〜１．２％の最終濃度で通常使用される。細胞のメチルセルロース分化を含む方法は、たとえば、Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されている。
【０１９８】
メチルセルロースベースの培地は、他のタイプの半固体マトリックスよりもエリスロイド系列細胞の良好な成長を可能にするので、同一の培養物内でエリスロイド、顆粒球、単球、および複能性ＣＦＣのアッセイを可能にする。巨核球プロジェニターは、補充コラーゲンベースの培地で好適に培養され、免疫細胞化学的染色を用いて特定的に同定される。
【０１９９】
記載の方法により生成させたエリスロイド細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ７１、およびＣＤ２３５ａからなる群から選択される１つ以上の造血／エリスロイドマーカーの発現により特徴付けられうる。加えて、エリスロイド細胞は、胚（ε）および胎児（γ）および成人（β）グロビンをはじめとするグロビンの発現の評価により特徴付けられうる。特定の態様では、成熟エリスロイド細胞は、γ−グロビンおよびε−グロビンの発現と比較してβ−グロビンのより高い発現を有するであろう。赤芽球の除核形態を確認するために、細胞のサイトスピンを用いてライト染色を実施可能である。エリスロイド細胞はまた、細胞表面マーカーＣＤ２３５を有する各種グロビンに対する共染色が可能である。
【０２００】
Ｂ．ミエロイド分化
１．巨核球分化
ＨＰＣは、巨核球にさらに分化しうる。体内では、巨核球は、血液骨髄（ｂｌｏｏｄ  ｍａｒｒｏｗ）に見いだされ、細胞を形成するプロセスから血小板または前血小板を産生する。ヒト体内の巨核球細胞は、骨髄細胞の小部分を占めるにすぎないが、ある特定の疾患に反応して１０倍まで数が増加する可能がある。体内では、巨核球は、典型的には、次のように造血細胞から分化する。すなわち、血球芽細胞が巨核芽球に分化し、次いで巨核芽球が前巨核球に分化し、次いで前巨核球が巨核球に分化する。
【０２０１】
多能性細胞または造血前駆細胞を巨核球に分化させるために、各種培地および方法を使用しうる。たとえば、米国特許出願公開第２００７／００７７６５４号明細書（権利放棄することなくその全体が参照により組み込まれる）に記載の多能性細胞から巨核球に分化させるための方法および培地は、本開示で使用しうる。
【０２０２】
巨核球分化培地には、好ましくは成長因子が含まれる。たとえば、巨核球分化培地は、ＦＬＴ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の１つ、２つ、３つ、４つ、または全部を含有しうる。ある特定の実施形態では、巨核球分化培地にはＳＣＦのみが含まれうる。他の実施形態では、ＩＬ−３および／またはＩＬ−６の一方または両方と組み合わせてＳＣＦを使用しうる。種々の実施形態では、ＦＬＴ−３リガンドおよび／またはＴＰＯは、本開示の巨核球分化培地から除外しうる。
【０２０３】
造血細胞は、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３、２０％  ＢＩＴ９５００を含有する培地に造血前駆細胞を配置することにより、巨核球に分化させうる。巨核球の生成を誘導するために、巨核球分化培地を使用しうる。巨核球を生成させるための各種製品および方法が記載されており、国際公開第２００６／０５０３３０号パンフレットに記載されるように本開示で使用しうる。加えて、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＭｅｇａｃｕｌｔ（商標）を入手可能であり、巨核球の産生／分化に使用しうる。種々の実施形態では、巨核球分化培地には、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、および／または幹細胞因子が含まれうる。細胞の巨核球分化のための方法は、たとえば、Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されている。
【０２０４】
２．肥満細胞の生成
ＨＰＣは、肥満細胞にさらに分化させうる。幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−９、および／またはＩＬ−１０に多能性幹細胞を暴露することにより、肥満細胞分化を促進しうる。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、次のプロトコルを用いて、肥満細胞への分化を促進しうる。造血細胞は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３、２０％  ＢＩＴ９５００をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ含有する培地「ＭＫ５」に造血前駆細胞を配置することにより、巨核球に分化させうる。肥満細胞は、ＭＫ５拡大培地で、続いて５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６を含有する培地で前駆体を拡大させることにより産生しうる。
【０２０６】
種々の実施形態では、巨核球分化を促進するために、臍帯血または末梢血を肥満細胞に分化させるための方法も使用しうる。たとえば、Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）には、種々の時点でＩＬ−６と組み合わせてまたはＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０と組み合わせてＳＣＦを用いることにより、臍帯血プロジェニターを肥満細胞に分化させる方法が記載されている。Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）には、種々の時間で添加されたＳＣＦおよび他のサイトカイン（たとえば、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−９、およびＩＬ−４）を用いて細胞を培養することにより、末梢血を肥満細胞に分化させる方法が提供される。これらの方法はいずれも、本開示でうまく使用しうると予想される。
【０２０７】
３．マクロファージおよび樹状細胞
造血前駆細胞は、樹状細胞にさらに分化させうる。たとえば、造血前駆細胞ＨＰＣは、低付着プレート中でＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヘパリン（たとえば１〜１０Ｕ／ｍＬ、たとえば５Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＴＰＯ（たとえば５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒト組換えＳＣＦ（たとえば５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＬＴ３Ｌ（たとえば５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（たとえば１〜２０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−６（たとえば１〜２０ｎｇ／ｍＬ、たとえば１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地に８日間移される。続いて、細胞は、共通ミエロイドプロジェニターを生成させるために１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦを含有する培地に８日間配置される。次いで、これらの細胞は、Ｍ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地に細胞を約２週間配置することによりマクロファージに、または２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４中に細胞を配置することにより樹状細胞に、さらに分化させうる。培養物中で出現しうるマクロファージの存在は、ＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＣＤ６８、およびＣＤ４５の細胞表面発現の存在の染色により定量可能である。
【０２０８】
４．マイクログリアの生成
凝集体、たとえば、分化９日目のＨＰＣまたはＨＰＣ分化１３日目のＣＤ３４+／ＣＤ４３+磁気選別純粋ＨＰＣは、Ａｂｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７に記載の方法に従って１０〜１５ｋ／ｃｍ2の細胞密度でＭａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上にプレーティングすることによりマイクログリア分化を開始させうる。常酸素条件下でマイクログリア分化を行いうる。
【０２０９】
代表的な一方法では、分化の最初の２２日間にわたり２５ｎｇ／ｍｌ  ＭＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ、および１００μｇ／ｍｌ  ＩＬ−３４を含有するマイクログリア分化培地が細胞に供給される。次いで、細胞は、２５ｎｇ／ｍｌ  ＭＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ、１００μｇ／ｍｌ  ＩＬ−３４、ＣＤ２００、およびＣＸ３ＣＬ１を含有するマイクログリア成熟培地に配置される。細胞は、２７日目に採取され、最終段階の培養物でマイクログリアの出現を確認するために、細胞内フローサイトメトリーによりＰ２ＲＹ、ＴＲＥＭ−２、ＩＢＡ、およびＣＸＣ３ＣＲ１が存在するものが染色される。
【０２１０】
Ｃ．リンフォイド分化
ＨＰＣはまた、リンフォイド系列にもさらに分化させうる。いくつかの態様では、分化プロセスの７〜１１日目、たとえば、７日目、８日目、９日目、１０日目、または１１日目に単離されたＨＰＣは、Ｔ細胞やＮＫ細胞などのリンフォイド細胞への分化が可能である。いくつかの態様では、リンフォイドプロジェニターの起源のタイミングは、ＨＰＣ分化時の血液内皮プロジェニターの低下およびエリスロイドプロジェニターの出現に一致する。特定の態様では、９日目のＨＰＣは、増加したＴ細胞生成効率を有しうる。リンフォイド分化可能なＨＰＣは、ある特定のマーカーの発現により単離および／または同定が可能である。たとえば、ＣＤ３４および／またはＣＤ４３の表面発現を有する細胞は、リンフォイド分化用として選択しうる。リンフォイドプロジェニターを検出するための追加のマーカーとしては、ＤＬＬ４、ＣＤ１４４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３lo、ＣＤ４５lo/-、ＣＤ２３５、ＣＤ７、Ｆｌｋ−１、ＡＰＮＬＲが挙げられる。特定の態様では、ＣＤ３４／ＣＤ７、ＣＤ２３５／ＣＤ７、ＤＬＬ４／ＣＤ３４、ＤＬＬ４／ＣＤ３１、ＤＬＬ４／ＣＤ１４４、またはＣＤ３４／ＣＤ４３loの二重陽性集団の存在は、リンフォイドプロジェニターを同定するために使用される。
【０２１１】
ＨＰＣは、リンフォイド分化のための規定フィーダーフリー条件で培養しうる。培養培地は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、フィブロネクチン、ＲＧＤペプチドなどの１つ以上のマトリックス成分を含有しうる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、マトリックス成分は、胚性幹細胞の成長のための固体担体を提供しうる。ある特定の実施形態では、マトリックス成分は、培養表面に適用して培地に細胞を播種する前に培養培地に接触させうる。たとえば、細胞は、細胞を集塊に機械的に分離してまたは細胞を個別化して造血前駆細胞への分化を誘導する前に、フィブロネクチンまたはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で被覆されたプレート上の規定培地（たとえばＴｅＳＲ培地）で培養しうる。
【０２１２】
多能性細胞を培養するために、コラーゲン（たとえばコラーゲンＩＶ）、ラミニン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ゼラチン、ポリリシン、トロンボスポンジン（たとえば、ＴＳＰ−１、−２、−３、および／または−４  −５）、および／またはＰｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｆ（商標）をはじめとする各種マトリックス成分を使用しうる。ある特定の実施形態では、細胞生存能に悪影響を及ぼす可能性があることから、事前にＴｅＳＲを用いて培養された細胞と共にＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲンＩＶ、またはラミニンのみを使用することは回避しうるが、それにもかかわらず、これらの組成物は、他のマトリックス成分と組み合わせて有利に使用しうる。これらのマトリックス成分の組合せは、細胞成長および細胞生存能を向上させる追加の利点を提供しうる。ある特定の実施形態では、細胞を培養するために、造血分化の前などに１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のマトリックス成分を使用しうる。
【０２１３】
リンフォイド分化のための例示的なフィーダーフリーマトリックスは、実施例４に開示される。特定の態様では、ＨＰＣのリンフォイド分化に使用するために、非組織培養処理プレートをＤＬＬ４：Ｆｃキメラタンパク質およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（フィブロネクチン断片ＣＨ−２９６、日本国の宝酒造株式会社）で被覆しうる。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、リンフォイド分化を向上させるためにアスコルビン酸を使用しうる。規定培地は、約１０μＭ〜約１ｍＭ、たとえば約５０μＭ〜約１００μＭ、とくに約９５μＭアスコルビン酸が補充されうる。
【０２１５】
１．Ｔ細胞分化
ある態様では、本開示は、被験体においてＮｏｔｃｈリガンドの産生を増加させる物質を投与し、Ｎｏｔｃｈリガンドの内因性活性を改変し、造血プロジェニター細胞の分化を調整することにより、被験体においてＴ細胞系列の細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ拡大を行うための方法を提供する。本方法はまた、培地で細胞を培養することを含む。この場合、培地は、有効量のｎｏｔｃｈリガンドと、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、およびＩＬ−３からなる群から選択される１種以上のサイトカインと、を含む。いくつかの特定の実施形態、培地は、ＩＬ−６をさらに含みうる。いくつかの実施形態では、ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ４：Ｆｃキメラなどのｄｅｌｔａ４  ｎｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ４）である。たとえば、培養細胞は、抗ＣＤ３抗体で細胞を染色することによりＴ細胞の生成に関してフローサイトメトリーによりモニターしうる。細胞は、細胞表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ９４、およびＣＤ５６を用いてＴ細胞およびＮＫ細胞の存在に関して分析しうる。たとえば、ＣＤ８+／ＣＤ３+の細胞は、分化されたＴ細胞の指標となるであろう。一方、ＮＫ細胞はＣＤ３-／ＣＤ５６+であり、ＮＫ／Ｔ細胞はＣＤ３+／ＣＤ５６+であろう。
【０２１６】
Ｔ細胞系列の細胞の分化および増殖を促進および維持するＮｏｔｃｈリガンドが選択される。Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒト起源でありうるか、または他の種、たとえば、齧歯動物、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、霊長動物などの哺乳動物種に由来しうる。Ｎｏｔｃｈリガンドの特定例としては、Ｄｅｌｔａファミリーが挙げられる。Ｄｅｌｔａファミリーとしては、Ｄｅｌｔａ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００３５２２、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０８４５７６、ラタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、Ｄｅｌｔａ様１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６１８およびＮＰ＿００５６０９（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ８０９０３、Ｉ４８３２４、Ｍ．ムスクルス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、Ｄｅｌｔａ様３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０５３６６６、Ｎ＿４４６１１８、ラタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、Ｄｅｌｔａ−４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２７３４５４、ＢＡＢ１８５８０、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２７９３０５、ＡＡＦ８１９１２、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、およびＤｅｌｔａ様４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ９ＮＲ６１、ＡＡＦ７６４２７、ＡＦ２５３４６８、ＮＭ＿０１９０７４、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１９４５４、ムス・ムスクルス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、市販されているか、または組換えＤＮＡ技術により産生してさまざまな度合いで精製可能である。
【０２１７】
２．ＮＫ細胞分化
本方法は、分化されたＮＫ細胞を産生するのに十分な継続時間にわたり以上に記載の培養物中にＨＰＣ  ＭｅＣＰ２−ＫＯ細胞を維持する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、分化されたＮＫ細胞は、Ｔ細胞と共に培養物中で出現するが、ＮＫ細胞は、６週間後に増殖を停止しうる。一般に、ＮＫ細胞の数の増加および／またはその分化状態の決定は、当業者に公知の従来の方法を用いて評価される。たとえば、培養細胞は、抗ＣＤ５６抗体および抗ＣＤ３抗体で細胞を染色することによりＮＫ細胞の生成に関してフローサイトメトリーによりモニターしうる。ＣＤ５６+／ＣＤ３-の細胞は、分化されたＮＫ細胞の指標となるであろう。
【０２１８】
Ｄ．ＤＥ細胞およびＥＰＣの産生
本開示のある特定の実施形態は、フィーダーフリー条件下に維持された誘導多能性幹細胞に由来するＤＥ細胞またはＥＰＣの産生方法を提供する。この方法により誘導されたＤＥ細胞およびＥＰＣは、モノホルモンβ細胞および肝細胞を生成可能である。例示的な一プロセスの模式図は図２１に提供される。膵分化プロセスの段階は図２３Ｃに提供される。特定の態様では、分化は低酸素条件下で実施される。
【０２１９】
胚体内胚葉（ＤＥ）は、急速に分化する過渡的状態であり、増殖可能ではなく、識別可能な形態を有しておらず、内胚葉運命に十分にコミットしない可能性がある。一方、ＥＰＣは、一過的でなく、識別可能な形態を有し、無制限に培養しうる（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。また、内胚葉プロジェニター細胞は、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＥＯＭＥＳ、ＣＤ３４はおよびＳＯＸ１７を発現するものとして特徴付けられる。内胚葉プロジェニター細胞は、肝臓、膵臓、腸などの内胚葉系列の細胞を生成可能であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれでも中胚葉も外胚葉も生成可能でない。同様に、ＥＰ細胞は、免疫欠損マウスにおいて奇形腫を形成しない。したがって、ＤＥおよびＥＰの細胞は、別個の発生中間段階を示しうるとともに、さまざまな発生潜在能力を有しうる。
【０２２０】
本方法は、分化されたグルコース反応性β細胞を産生するのに十分な継続時間にわたり以上に記載の培養物中にＭｅＣＰ２ＷＴ細胞およびＭｅＣＰ２ＫＯ細胞に由来するＤＥ細胞またはＥＰＣを維持する工程をさらに含む。懸濁培養で生成したＤＥ細胞またはＥＰＣは、膵細胞型の生成のための分化培地に配置される。ＥＰ細胞の膵分化では、Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）により記載され、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によりさらに修正されたプロトコルを利用しうる。全プロセスは、低酸素条件下で３Ｄ培養として継続しうる。
【０２２１】
例示的な方法では、ＥＰＣ培養物は１５日間拡大され、前腸／中腸内胚葉細胞を生成させるために、Ｗｎｔ３Ａ（３ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびドルソモルフィン（０．７５μＭ）を含有するＳＦＤ培地で３日間培養される。細胞は、膵内胚葉細胞を生成させるために、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、Ｂ２７（レチノイン酸（１％）を含まない）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）、ｔｒａｎｓレチノイン酸（２μＭ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地で３日間培養される。この工程の後、細胞は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、Ｂ２７（レチノイン酸（１％）を含まない）、アスコルビン酸（５０ｇ／ｍｌ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）、ＳＢ４３１５４２（６Ｍ）、およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地で３日間培養される。次いで、細胞は、セクレターゼ阻害剤（２μＭのＤＡＰＴ）が補充された先の高グルコースＤＭＥＭ培地で１〜２日間培養される。この段階から、細胞は、グルコース（４０ｍＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳＦＤ培地で１〜２日間培養される。最後に、その次の１０日間にわたり、細胞は、ＳＢ４３１５４２（５．４μＭ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（８００ｐＭ）、およびニコチンアミド（１０ｍＭ）を含有するＳＦＤ培地で培養され、その際、培地は、添加された追加のグルコース（４０ｍＭ）を含むおよび添加された追加のグルコースを含まないかかる培地で交互に毎日交換される。ニコチンアミドは、約０．１ｍＭ〜約１５ｍＭ、たとえば、約１０ｍＭの濃度で添加しうる。モノホルモンβ細胞の存在は、２Ｄ方式で分化の１０〜１５日目に検出される。
【０２２２】
β細胞培養物は、分化の２１〜２５日目に採取され、固定され、そして細胞内フローサイトメトリーによりＰＤＸ１／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンの定量のために染色される。最終段階の培養物は、モノホルモン細胞の存在を示す。最終段階の培養物は、ＰＤＸ１、ＮｅｕｒｏＤ１、およびいくつかのレベルのＮＫＸ６．１に関して陽性である。最終段階の凝集体は、グルコースに対する反応性を示す。
【０２２３】
別の態様では、胚体内胚葉細胞（ＤＥ）は、当技術分野で公知の方法により肝細胞に分化される。一方法では、図４０に示されるように、肝細胞は、ＤＥ細胞から分化させうる。たとえば、全分化プロセスは、分化プロセスの２５日目まで低酸素条件下で実施される。簡潔に述べると、ＤＥは、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（０．１μＭ）、ＤＭＳＯ（１％）、およびＦＧＦ−１０（６０ｎｇ／ｍＬ）が補充されたＳＦＤ培地で２Ｄで約６日間培養される。次いで、細胞は、コラーゲン上においてｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＯＳＭ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（０．２μＭ）、ＤＭＳＯ（１％）、ＤＡＰＴ（２μＭ）、およびビタミンＫ（６μｇ／ｍＬ）が補充されたＳＦＤ培地に約６日間再プレーティングされる。第３段階では、細胞は、肝細胞を産生するために、Ｂ２７（１×）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＯＳＭ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（０．１μＭ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）が補充されたウィリアムＥ培地に２Ｄでプレーティングされる。
【０２２４】
Ｅ．細胞培養
ある特定の実施形態では、ＰＳＣからＨＰＣへ、ＨＰＣからエリスロイド系列、ミエロイド系列、またはリンフォイド系列へ、またはＤＥ細胞もしくはＥＰＣから内胚葉系列への分化を促進するために、実質的に低酸素の条件を使用しうる。ある特定の実施形態では、分化を促進するために、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％の大気酸素含有量を使用しうる。ある特定の実施形態では、低酸素大気は約５％の酸素ガスを含む。
【０２２５】
本明細書に記載されるように、本細胞の分化を促進するために、１つ以上の規定培養培地を有利に使用しうる。とくに、血清やマウスフィーダー層などの動物産物を排除することにより、動物産物への細胞の暴露に関連付けられるリスクを低減可能であり、より安全にヒト被験体に投与できる細胞の生成を可能にしうる。伝統的な幹細胞培養の発生は、幹細胞をさまざまな細胞型に分化させるために、血清産物およびマウスフィーダー層に依拠するので、これらの伝統的な手順では、分化を実施可能なスケール、増大する生物学的多様性および潜在的な汚染、有用性の証明を妨げるおそれのあるトランスレーショナル療法における著しく阻まれるＥＳ細胞の使用が制限されてきた。
【０２２６】
一般に、本開示の細胞は、細胞成長を持続可能な栄養素リッチ緩衝溶液である培養培地で培養される。本明細書に記載の方法に従って本細胞の単離、拡大、および分化を行うのに好適な培養培地としては、限定されるものではないが、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１５、ＲＰＭＩ１６４０、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。既知組成培地は最少必須培地を含み、たとえば、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘＣｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ナトリウムピルベート、グルタミン、ならびにマイトジェンが補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）もまた好適である。本明細書で用いられる場合、マイトジェンとは、細胞分裂を刺激する作用剤を意味する。作用剤は、有糸分裂をトリガーする化学物質、通常は、細胞分裂を開始するように細胞に働きかけるなんらかの形態のタンパク質でありうる。一実施形態では、血清フリー培地、たとえば、米国特許出願第０８／４６４，５９９号明細書および国際公開第９６／３９４８７号パンフレットに記載のもの、ならびに米国特許第５，４８６，３５９号明細書に記載の「完全培地」は、本明細書に記載の方法での使用が企図される。いくつかの実施形態では、培養培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト自己血清、ヒトＡＢ血清、またはヘパリン（２Ｕ／ｍｌ）補充血小板リッチ血漿が補充される。
【０２２７】
ミエロイド細胞、エリスロイド細胞、およびリンフォイド細胞は、エリスロイド系列、ミエロイド系列、またはリンフォイド系列への細胞の分化を促進するのに十分な程度に細胞内因子レベルを増加させた条件下の培地で多能性幹細胞または造血前駆細胞を培養することにより生成可能である。培地はまた、さまざまな種類の成長因子のような１つ以上の造血細胞分化剤および成熟剤を含有しうる。これらの作用剤は、より成熟した表現型にコミットするか−または好ましくは成熟細胞の生存を促進するか−またはこれらの作用の両方を兼備するかのいずれかになるように細胞を誘導するのを支援しうる。分化剤および成熟剤は、造血細胞系列の細胞の成長を促進可能な可溶性成長因子（ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド−レセプター複合体、および他の化合物）を含みうる。限定されるものではないが、かかる作用剤の例としては、造血成長因子または内皮成長因子、たとえば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ＦＬＴ−３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、もしくは果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはそれらのアイソフォームもしく変異体が挙げられる。
【０２２８】
Ｖ．成熟系列細胞の使用
本開示の方法および組成物より提供される成熟系列細胞（たとえば、エリスロイド、ミエロイド、リンフォイド、および内胚葉）は、さまざまな用途に使用可能である。こうしたものとしては、わずかではあるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の移植または植込み、細胞傷害性化合物、発癌性物質、突然変異原成長／レギュラトリー因子、医薬化合物などのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング、血液疾患および傷害の機序の解明、薬剤および／または成長因子が奏功する機序の研究、患者における癌の診断およびモニター、遺伝子療法、ならびに生物学的活性産物の産生が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２２９】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
本明細書に提供されるエリスロイド系列、ミエロイド系列、リンフォイド系列、および内胚葉系列は、本明細書に提供されるエリスロイド細胞、ミエロイド細胞、およびリンフォイド細胞の特性に影響を及ぼす因子（たとえば、溶媒、低分子薬剤、ペプチド、およびポリヌクレオチド）または環境条件（たとえば、培養条件または操作）をスクリーニングするために使用可能である。
【０２３０】
本開示の特定のスクリーニング用途は、薬剤研究における医薬化合物の試験に関する。読者は、一般的には、標準的教科書Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７を参照されたい。ある特定の態様では、エリスロイド細胞、ミエロイド細胞、リンフォイド細胞、および内胚葉細胞は、これまで短期培養で造血細胞および前駆体に対して実施されてきた標準的な薬剤スクリーニングおよび毒性アッセイに供される試験細胞の役割を果たす。候補医薬化合物の活性の評価は、一般的には、本開示のある特定の態様に提供される造血細胞または前駆体を候補化合物と組み合わせること、化合物に帰属可能な細胞の形態、マーカー表現型、または代謝活性の変化を決定すること（未処置細胞または不活性化合物で処理された細胞と比較して）、次いで、化合物の作用を観測された変化と相関付けることを含む。スクリーニングは、化合物が造血細胞または前駆体に対して薬理学的作用を有するように設計されるので、または他の箇所で作用を有するように設計された化合物が造血細胞または前駆体に対して予期せぬ副作用を有することもありうるので、行われうる。可能性のある薬剤間相互作用を検出するために、２種以上の薬剤を組み合わせて（同時にまたは逐次的に細胞と組み合わせることにより）試験することが可能である。
【０２３１】
Ｂ．造血細胞療法
実施形態はまた、血液疾患もしくは障害または傷害が原因でかかる療法を必要とする被験体においてある程度の機能を回復するための、本明細書に提供されるエリスロイド細胞、ミエロイド細胞、リンフォイド細胞、および内胚葉細胞の使用を提供する。たとえば、本明細書に開示される方法により誘導されるエリスロイド細胞、ミエロイド細胞、リンフォイド細胞、および内胚葉細胞は、異常ヘモグロビン症、貧血などの血液疾患および障害を治療するために使用しうる。そのほか、エリスロイド系列およびミエロイド系列の細胞は、必要とする被験体（たとえば、輸血を必要とする被験体または血液障害を有する被験体）に血液または血液細胞（たとえば、赤血球、血小板、好中顆粒球など）を供給するのに有用でありうる。かかる細胞は、化学療法などの細胞抑制療法により引き起こされる造血細胞欠損の治療に有用でありうる。
【０２３２】
治療用途の本明細書に提供される細胞の好適性を決定するために、最初に好適な動物モデルで細胞を試験することが可能である。あるレベルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで生存するかつその表現型を維持する能力に関して細胞を評価する。本明細書に提供される細胞は、免疫不全動物（たとえば、ＮＯＤマウスまたは化学的にもしくは照射により免疫不全を起こした動物）のさらなる観察に適した部位、たとえば、腎被膜下、脾臓中、肝小葉中、または骨髄中に投与される。組織は、数日後〜数週間後またはそれよりも後に採取され、赤血球などの出発細胞型が依然として存在するかを評価する。これは、検出可能な標識（たとえば、緑色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ）を用いてまたは投与されたヒト細胞に特異的な構成マーカーを測定することにより、実施可能である。本明細書に提供される細胞を齧歯動物モデルで試験する場合、投与された細胞の存在および表現型は、ヒト特異的抗体を用いて免疫組織化学もしくはＥＬＩＳＡにより、またはヒトポリヌクレオチド配列に特異的な増幅を引き起こすプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を用いてＲＴ−ＰＣＲ分析により、評価可能である。ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで遺伝子発現を評価するのに好適なマーカーは、本開示の他の場所に提供される。
【０２３３】
本開示の方法により提供されるエリスロイド系列、ミエロイド系列、リンフォイド系列、および内胚葉系列は、血液障害および傷害を治療するそれらの能力に関して各種動物モデルで試験しうる。たとえば、鎌状赤血球貧血マウスモデルまたはＴ／Ｂ細胞欠損Ｒａｇ−２ノックアウトマウスは、本明細書に開示されるエリスロイド細胞、ミエロイド細胞、およびリンフォイドの細胞を試験するのにとくに有用な動物モデルでありうる
【０２３４】
動物モデルで望ましい機能特性または有効性を実証する本開示のある特定の態様に提供されるエリスロイド系列、ミエロイド系列、リンフォイド系列、および内胚葉系列は、また、それを必要とするヒト被験体への直接投与に好適でありうる。止血の目的では、細胞は、循環系を適正に利用できる任意の部位に投与可能である。造血細胞またはその前駆体はまた、傷害または疾患の部位に送達しうる。
【０２３５】
本開示のある特定の態様に提供される細胞は、それを必要とするいずれの被験体の治療にも使用可能である。かかる治療に適切でありうるヒト病態としては、各種貧血および異常ヘモグロビン症さらには造血細胞の数の減少により特徴付けられる疾患（たとえば、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、好中球減少症、顆粒球減少症、グランツマン血小板無力症、血小板減少症、後天性免疫不全症候群など）が挙げられる。ヒト治療では、用量は、一般的には約１０9〜１０12細胞、典型的には約５×１０9〜５×１０10細胞であり、被験体の体重、罹患の性質および重症度、ならびに投与される細胞の複製能に合わせて調整される。治療モードおよび適切な用量を決定する最終的な責任は、担当臨床医にある。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本開示の成熟肝細胞は、肝組織を標的とするウイルスの研究でおよび治療剤として薬剤代謝および毒性試験に使用しうる。成熟肝細胞は、好ましくは、機能的肝酵素活性を呈する。一実施形態では、本方法は、（ａ）上記の１つ以上の成熟肝細胞を化合物に暴露すること、および（ｂ）毒性徴候に関して１つ以上の成熟肝細胞胞をモニターすることを含む。別の実施形態では、かかる方法は、（ａ）肝細胞により化合物が代謝される条件に１つ以上の成熟肝細胞を暴露すること、（ｂ）化合物の得られた代謝物と１つ以上の非肝細胞とを接触させること、および（ｃ）いずれかの代謝物誘導変化に関して非肝細胞をモニターすることを含む。化合物の代謝を研究する方法は、（ａ）１つ以上の成熟肝細胞を暴露すること、および（ｂ）化合物の肝内処理によりどのような代謝物が産生されるかを決定することを含みうる。肝臓障害を治療する方法は、肝臓障害を有する患者に１つ以上の成熟肝細胞を投与する工程を含みうる。限定されるものではないが、この方法を用いて治療しうる肝臓障害の例としては、急性肝損傷または代謝性肝疾患、たとえば、α１アンチトリプシン欠損症またはウィルソン病が挙げられる。
【０２３７】
本開示はまた、本明細書に開示される方法を用いて生成させた成熟β細胞を細胞治療法に、たとえば、β細胞数またはβ細胞機能の低下が起因または寄与する病態の治療に使用するための方法を提供する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される成熟マイクログリアたとえばＭ１分極またはＭ２分極のものは、アルツハイマー病などの神経疾患の治療のスクリーニングさらにはそれらの治療に使用しうる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本開示の成熟マクロファージたとえばＭ１分極またはＭ２分極のものは、スクリーニングおよび治療に使用しうる。Ｍ１およびＭ２は、ケモカインの識別可能な発現プロファイルを有する。「分極」という用語は、本明細書では、マクロファージの表現型特性および機能特性を表すために用いられる。表現型は、マクロファージにより発現される表面マーカーを介して規定可能である。Ｍ１マクロファージは、Ｔｈ１の誘引で知られるＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０ケモカインを発現し、一方、Ｍ２マクロファージは、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、およびＣＣＬ２４を発現する。ＣＣＬ２やＣＸＣＬ４などのケモカインはまた、マクロファージをＭ２様表現型に分極させることが可能である。
【０２４０】
加えて、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｂ細胞などの成熟リンフォイド細胞は、各種スクリーニングおよび治療用途に使用しうる。いくつかの態様では、リンフォイド系列は、治療用化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに使用しうる。リンフォイド系列はまた、癌の治療などで養子細胞療法としても使用しうる。
【０２４１】
Ｃ．商業、治療、および研究の目的での配布
製造、配布、および使用の目的では、本開示のエリスロイド細胞、ミエロイド細胞、リンフォイド細胞、および内胚葉細胞は、典型的には、輸送または貯蔵を容易にするために任意選択的に凍結されて等張賦形剤中または培養培地中の細胞培養物または懸濁物の形態で供給される。
【０２４２】
本開示はまた、製造時、配布時、または使用時の任意の時点で存在する細胞のセットまたは組合せを含めてさまざまな試薬系を含む。細胞セットは、本開示に記載の２つ以上の細胞集団の任意の組合せ、たとえば、限定されるものではないが、未分化幹細胞、体細胞誘導造血細胞、または他の分化細胞型と組み合わされたプログラミング誘導細胞（造血系列細胞、その前駆体およびサブタイプ）が挙げられる。セット中の細胞集団は、同一のゲノムまたはその遺伝子改変形態を共有することもある。セット中の各細胞型は、全部まとめてまたは個別の容器に入れて、同一の施設または異なる場所で、同一または異なる時間で、同一のエンティティーまたは取引関係を共有する異なるエンティティーの制御下でパッケージ化しうる。
【実施例】
【０２４３】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本発明者により発見された技術が、本発明の実施で十分に機能することを示しており、したがって、その好ましい実施形態を構成するとみなしうることを、当業者であれば認識すべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を加えうることかつそれにより本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同一もしくは類似の結果が得られることは分かるはずである。
【０２４４】
実施例１−ＭｅＣＰ２ノックアウト細胞系の生成
造血分化プロセスにおけるＭｅＣＰ２の役割を決定するために、ＭｅＣＰ２ノックアウトｉＰＳＣ細胞系を生成させた。ＭｅＣＰ２をノックアウトするように雄性野生型（ＷＴ）０１２７９ｉＰＳＣ系を工学操作することにより、ＭｙＣｅｌｌ（登録商標）０１２７９．１０７．３９０２細胞系を作製した。ＴＡＬヌクレアーゼを用いてＭｅＣＰ２  ＴＡＬＥＮおよび停止コドン挿入を含有するドナープラスミドのトランスフェクションによりＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメインの前に一連の停止コドンを挿入し（図１Ｂ）、続いて、ＬｏｘＰをフランキングさせてＰＧＫｐ−ピューロマイシン−ＳＶ４０ｐＡを逆向きに挿入した。０１２７９ｉＰＳＣは、ＭｅＣＰ２  ＴＡＬＥＮＳおよび野生型ＥＢＮＡ１を発現するドナープラスミドｐ１５５３でトランスフェクトした。ｉＰＳＣ９０２５、ＳＯＮＬ（すなわち、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８のリプログラミング因子を用いたエピソーム的リプログラムｉＰＳＣ）、ＴＩＰＳ１ｅ（すなわち、Ｔ細胞から分化されたｉＰＳＣ）、ＨＬＡ−Ｈ  Ａ系、およびＨＬＡ−Ｇを含む追加のｉＰＳＣ系も、ＭｅＣＰ２  ＴＡＬＥＮＳおよびドナープラスミドでトランスフェクトした。
【０２４５】
挿入が陽性の細胞をピューロマイシン選択により選択し、次いで、コロニーを採取し、組込みＰＣＲによりスクリーニングした。初期スクリーニングは、採取したすべてのコロニーで右腕、左腕、および骨格に対して実施した。すべてのコロニーを約３継代で再びスクリーニングにかけて、ＰＣＲによりＭｅＣＰＲ２ノックアウト状態を確認した。ＰＣＲ確認の後、クローンをＥ８培地および低酸素条件に移した。スクリーニングで選択されたコロニーのうち、約６〜５０％は適正に工学操作されたことが分かった。
【表１】
2019528773.tif 000002
【表２】
2019528773.tif 000003
2019528773.tif 000004
【０２４６】
０１２７９ｉＰＳＣ系でスクリーニングされたコロニーのうち、９６％は２つのＰＣＲスクリーニング反応で挿入が陽性であった。１４クローンを拡大し、３継代でスクリーニングしたところ、８クローンは骨格プラスミドの取込みに関して陰性であることが分かった。そのため、残りのクローンのうち３つをインサートを介してシーケンスしたところ、２つがポリクローナルであることが分かった。１つのモノクローナル系０１２７９．１０７．３９０２を選択し、さらなる研究で十分に特徴付けした。追加のクローンも取得し、適正に工学操作されたものとして特徴付けた。ＭｅＣＰ２変異体００１、００２、００５、および００８のアミノ酸アライメントは、図１Ｃに描かれている。変異体００８は、メチルＣｐＧ結合ドメインをコードしていない。
【０２４７】
実施例２−ＨＰＣ産生のための３Ｄプロトコル
ＨＰＣを産生するために、実施例の０１２７９．１０７．３９０２  ＭｅＣＰ２ノックアウト（ＭｅＣＰ２ＫＯ）細胞およびＷＴ０１２７９細胞を３Ｄ分化プロトコルに付した（図１Ａ）。最初に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆（商標）上またはビトロネクチン被覆上のフィーダーフリー条件下のＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（Ｅ８）培地でｉＰＳＣを５〜１０継代にわたり低酸素条件に順化させた。凝集体は、５μＭブレビスタチンが補充された血清フリー規定（ＳＦＤ）培地の存在下で２５万〜５０万細胞／ｍｌの密度の半集密ｉＰＳＣから作製した。プロセスは、超低付着（ＵＬＡ）プレートまたはスピンナーフラスコにおいて７５％ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１２２００−０６９）（グルタミンおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋Ｐ／Ｓを含む）、２５％ハムＦ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ１０−０８０−ＣＶ）、０．５％Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１７５０２−０４８）、１％Ｂ２７サプリメント（レチノイン酸を含まない）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１２５８７−０１０）、０．０５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および４．５×１０-4Ｍモノチオグリセロールを含有するＳＦＤ基本培地で実施された。
【０２４８】
胚様体（ＥＢ）が形成されたら、最初の４日間にわたりＳＦＤ基本培地に５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを補充することにより分化を開始した。５日目に、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、および５Ｕ／ｍｌのヘパリンの存在下にＥＢ培養物を配置した。ＥＢ培養物は、分化１２〜１６日目まで低酸素条件下で分化プロセス時に２日ごとにサイトカインを含有する新鮮な分化培地を体積の半分ずつ補充した。分化プロセス後に細胞を採取し、フローサイトメトリーにより表現型を評価し、ＣＦＵアッセイを用いて機能能力を評価した。
【０２４９】
フローサイトメトリー分析では、細胞を培地に採取し、１回洗浄した。３７℃のインキュベーター内でＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンを用いて細胞ペレットを５〜１０分間消化し、続いて、培地で洗浄し、７０μｍ細胞ストレーナーに通した。ＦＡＣＳ緩衝液を含有するＰＢＳ−ＦＢＳ中に細胞を再懸濁させ、カウントして細胞生存能を推定し、そして蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体：抗ヒトＣＤ４３（１Ｇ１０）、抗ヒトＣＤ３１（ＷＭ−５９）、抗ヒトＣＤ４１（ＨＩＰ８）、抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０）、抗ヒトＣＤ３４（５８１、８Ｇ１２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、および抗ヒトＣＤ２３５で染色した。７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＰＩを用いて生存不能細胞を除外した。生細胞分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）またはＡｃｃｕｒｉフローサイトメーターを用いて実施した。
【０２５０】
クローン原性造血プロジェニターアッセイ（ＣＦＵアッセイ）では、ＴｒｙｐＬＥまたは０．５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いてＥＢを単一細胞懸濁物として分散した。生存細胞を定量し、プレーティングし（５０，０００〜３００，０００細胞／ｍＬ）、そして幹細胞因子（ＳＣＦ）５０ｎｇ／ｍＬ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）３Ｕ／ｍＬ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）１０ｎｇ／ｍＬ、インターロイキン−３（ＩＬ−３）１０ｎｇ／ｍＬを含有するヒトメチルセルロース完全培地（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて加湿チャンバー内で造血ＣＦＣをアッセイした。１４日後、形態に従ってコロニーをスコア付けし、コロニー数／１０5細胞を定量した。血清含有または血清フリーのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてコロニーを生成させうる。
【０２５１】
実施例３−エリスロイド分化に及ぼすＭｅＣＰ２の影響
エリスロイド分化に及ぼすＭｅＣＰ２ノックアウトの影響を決定するために、ＭｅＣＰ２ノックアウト０１２７９．１０７．３９０２ＨＰＣ、ＷＴ０１２７９ＨＰＣ、ｉＣｅｌｌ（登録商標）ＨＰＣ（すなわち、フォワードプログラミングから産生された０１２７９細胞）、ＣＤ３４-誘導画分（すなわち、０１２７９細胞のＣＤ３４陰性画分）、２Ｄ誘導０１２７９ＨＰＣ、および臍帯血ＨＰＣ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１０９２０８号パンフレット）を含めて、ｉＰＳＣに由来するＨＰＣのパネルを成熟エリスロイド細胞を生成させるそれらの能力に関して評価した。
【０２５２】
造血分化を誘導するために、ＥＤＴＡを用いてｉＰＳＣ細胞を採取し、凝集体形成を容易にするために、低付着プレート中で血清フリーＥＢ基本培地に１２時間配置した。最初の４日間にわたり骨形態形成因子（ＢＭＰ−４）、血管内皮成長因子、およびゼブラフィッシュＦＧＦ−２（ＶＥＧＦ）でＳＦＤを補充し、続いて、次の８日間にわたりＦｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン、および幹細胞因子（ＳＣＦ）が補充された培地でインキュベートした。得られたＨＰＣを採取し、ＣＤ４３／ＣＤ３４細胞のパーセントをフローサイトメトリーにより定量した（図２Ａ）。プロセスの効率は、生成したＨＰＣの絶対数を投入ｉＰＳ細胞数で除算することにより計算した（図２Ｂ）。
【０２５３】
ｉＰＳＣに由来するＨＰＣからヒト赤芽球を生成させるために、原始エリスロイド拡大培地（ｐＥＥＭ）で０．５〜１×１０6細胞／ｍＬの密度で細胞を１〜２週間培養した（図３）。ｐＥＥＭ培地は、０．３％Ｅｘｃｙｔｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ホロトランスフェリン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）が補充されたＳＦＥＭ培地を含んでいた。２週間後、この段階で培養下の細胞は、ＣＤ７１、ＣＤ２３５、およびＣＤ３６の表面発現を有することが観測された。そのため、細胞は、エリスロイド系列の方向に分化していた。ＭｅＣＰ２ＫＯ細胞は、ＭｅＣＰ２ＷＴ細胞よりも高レベルのＣＤ２３５陽性細胞を呈した（表３）。
【０２５４】
【表３】
2019528773.tif 000005
【０２５５】
これとは対照的に、赤血球分化方向にＨＰＣを分化させるために、ＨＰＣをエリスロイド拡大培地（ＥＥＭ）で培養した。ＥＥＭ培地は、０．３％Ｅｘｃｙｔｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ホロトランスフェリン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充されたＳＦＥＭ培地を含んでいた。次の１〜２週間にわたり細胞をこの培地に残留させ、１日おきに新鮮培地を供給した。エリスロイド細胞富化集団の存在を２週間の終了時に観測したところ、８０〜９０％がＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ３６を発現することが分かった。
【０２５６】
各種ＨＰＣ細胞系が呈した赤血球分化の詳しい分析は、分化の２〜８週で細胞表面マーカーＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ３６、ＣＤ７１／２３５ａ、ＣＤ２３５ａ／３６、およびＣＤ７１／３６が陽性の細胞のパーセントを測定することにより実施した（図４Ａ〜４Ｃ）。０１２７９．１０７．３９０２ＨＰＣは、赤芽球の細胞表面マーカーが陽性の細胞のパーセントが有意により高いことが分かった。そのため、ｉＣｅｌｌ（登録商標）ＨＰＣ以外の細胞系はすべて、分化の４週間にわたり赤血球に分化することが示されたが、ＭｅＣＰ２ＫＯは、赤血球の産生を増強させた。
【０２５７】
次いで、赤血球分化プロセスの９週間にわたりＨＰＣ細胞系のそれぞれの細胞数を測定した。細胞系のほとんどは分化プロセスにわたり細胞数の低減が観測されたが、０１２７９．１０７．３９０２細胞は、０週から４週まで細胞数の増加を示した。そのほか、他の細胞系と比較して、０１２７９．１０７．３９０２細胞は、４週から６週まで赤血球マーカーグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現の増加を示した。
【０２５８】
次いで、ＣＤ２３５ａおよび各種グロビン、たとえば、βグロビン、γグロビン、およびεグロビンに関して細胞を共染色した。０１２７９．１０７．３９０２細胞系から分化させた７および８週齢の細胞は、βグロビンが陽性の細胞のパーセントが高く、かつεグロビンが陽性の細胞のパーセントが低いことが観測された（図５Ａ〜５Ｂ、６）。赤血球分化プロセスにわたり、０１２７９ＨＰＣと比較して、０１２７９．１０７．３９０２細胞は、βグロビン発現が高レベルであった。一方、０１２７９．１０７．３９０２細胞は、ε発現が低発現であった。そのほか、０１２７９．１０７．３９０２細胞系から分化させた赤血球のライト染色から除核が示された。したがって、０１２７９．１０７．３９０２細胞系は、ＷＴ０１２７９ＨＰＣ細胞系と対比してより高レベルのβグロビンを有することから示されるように、より成熟した赤血球に分化した。そのため、ＭｅＣＰ２ＫＯは、ｉＰＳＣに由来する赤血球の成熟を容易にする。
【０２５９】
実施例４−リンフォイド分化に及ぼすＭｅＣＰ２ノックアウトの影響
リンフォイド分化に及ぼすＭｅＣＰ２ノックアウトの影響を決定するために、細胞系をＴおよびＮＫ細胞分化の培養条件に付した。最初に、間質依存プロトコルでＴ細胞分化に関していくつかの変数を試験した。ＯＰ９骨髄間質細胞およびＭＳ５ネズミ骨髄間質細胞をはじめとする間質系で、異なる細胞系から産生された１２日目のＨＰＣをＴ細胞潜在能力に関して試験した。２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬ  Ｆｌｔ−３、および５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７を含むαＭＥＭ培地で細胞を培養した。培地の半分を週３回交換することにより細胞をリフレッシュさせた。Ｔ細胞の存在に関して細胞を分析したところ、細胞は、ミエロイド細胞を生成させる傾向を有しＣＤ３+細胞の存在が検出できないことが示された。そのほか、間質共培養は、低酸素条件下で不十分な性能であった。
【０２６０】
したがって、フィーダーフリーＴ細胞分化プロトコルを開発した。０．５μｇ／ｃｍ2のレトロネクチンおよびＮｏｔｃｈ  ＤＬＬ４で被覆された未処理組織培養プレート上に約５，０００〜約２５，０００の細胞／ｃｍ2の細胞密度でＨＰＣをプレーティングした。１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリンストレプトマイシン、９５μＭアスコルビン酸（ＷＡＫＯ  ｌａｂｓ）、さらには５０ｎｇ／ｍＬＩＬ−７、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、およびＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補充されたＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＥＭ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地でＨＰＣを培養した。４８時間ごとに培地を補充し、２週間で細胞を非酵素的にスプリットして新しいリガンド被覆プレートに移した。そのほか、２週間と３週間との間で、細胞表面マーカーＣＤ５およびＣＤ７によりプレＴ細胞の存在に関して細胞を分析した。４週間で、細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８によりＴ細胞の存在に関して細胞を分析した。６〜８週間で、細胞表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ９４、およびＣＤ５６を用いてＴ細胞およびＮＫ細胞の存在に関して細胞を分析した。
【０２６１】
Ｔ細胞分化に及ぼす影響に関して試験したパラメーターの１つは、培養プレート上のマトリックスコーティングの選択であった。プレーティングの３週間後、Ｎｏｔｃｈ  ＤＬＬ４と臍帯血細胞との各種マトリックスの組合せを用いて血清フリー条件下でプレＴ細胞の出現を分析することにより、比較を行った。その結果、レトロネクチンとＤＬＬ４との組合せは、ビトロネクチンまたはテネイシンを含む組合せよりも臍帯血細胞をプレＴ細胞に分化させるのにより有効であることが示された（表４）。
【０２６２】
【表４】
2019528773.tif 000006
【０２６３】
驚くべきことに、低酸素条件はフィーダーフリーＴ細胞分化を向上させることが分かった。具体的には、低酸素は、常酸素条件下で分化された細胞と比較して、ＣＤ８が陽性の細胞のパーセントの増加およびＣＤ４が陽性の細胞のパーセントの減少をもたらすことが観測された（表５）。
【０２６４】
【表５】
2019528773.tif 000007
【０２６５】
【表６】
2019528773.tif 000008
【０２６６】
実施例２に記載のＨＰＣ分化の５日目、７日目、９日目、および１１日目に０１２７９．１０７．３９０２、０１２７９．１０７．３９０５、０１２７９．１０７．３９０６、０１２７９．１０７．３９０７、および０１２７９．１０７．３９０８のクローンを採取し、リンフォイド系列への分化のＭｅＣＰ２ノックアウトクローンの効率を分析した。以上に記載の時点で凍結保存されていたＨＰＣ細胞を解凍し、レトロネクチン被覆プレート上およびＤＬＬ４被覆プレート上にプレーティングした。２日ごとに細胞に新鮮培地を供給し、ＨＰＣ細胞解凍後の２週間でプレＴ細胞マーカー（図１３Ａ、１３Ｂ）、４週間でＴ細胞マーカーおよびＮＫ細胞マーカーに関して分析した。プレＴ細胞マーカーの分析では、野生型０１２７９．１０７．３９０４細胞以外の細胞はすべて、ＣＤ５+ＣＤ７+、ＣＤ７+ＣＤ４５+、およびＣＤ５+ＣＤ４５+として同定されるプレＴ細胞の存在を有していた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成させたリンフォイド細胞を同定するためのゲーティングストラテジーは、分化１８日目について図７および８に描かれる。ヨウ化プロピジウムを用いてＦＳＣ−ＳＳＣ散乱内およびリンフォイド散乱内の生細胞のゲーティングを実施し、続いて、フローサイトメトリーによりＣＤ７およびＣＤ５陽性細胞を染色し、さらにはＣＤ３  ＡＰＣ、ＣＤ８  ＰＥ、およびＣＤ５６  ＦＩＴＣで染色し、集団中のＴ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）を同定した（図９）。ＣＤ４５、ＣＤ７、およびＣＤ５（図１０）、ならびにＣＤ５６、ＣＤ８、およびＣＤ３（図１１）の表面発現を有する細胞を染色し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫ／Ｔ細胞の存在を定量した。
【０２６７】
投入細胞数は分かったので、Ｔ（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）、およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）の絶対数を決定した。プロセスの効率は、細胞型（Ｔ、ＮＫ、またはＮＫ／Ｔ）絶対数／全投入細胞数の比（図１２Ａ）または細胞型絶対数／投入ＨＰＣ数の比（図１２Ｂ）により計算される。Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）のパーセント（図１３）およびＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）のパーセント（図１４）は、ＦＳＣ−ＳＳＣゲート下およびリンフォイド散乱ゲート下でフローサイトメトリーにより定量した。出現するＮＫ／Ｔ（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）（図１５）、（ＣＤ３+／ＣＤ８+）（図１６）、ＮＫ／Ｔ（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）、およびＮＫ（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）（図１７）の細胞の量も決定した。さらなる分析を行ったところ、ＣＤ２３５／ＣＤ７、ＣＤ１４４+／ＤＬＬ４+、およびＦｌｋ１+／ＣＤ３４+の発現は、分化１１日目に低下することが示された（図１８）。分化１１日目にリンフォイド細胞が不在であるので、このことから、これらのマーカーのある特定の発現閾値レベルは、ＤＬＬ４の存在下でリンフォイド分化に向かって細胞をプライミングするうえで本質的なものであることが示唆されうる。
【０２６８】
最近の研究（Ｏｂｅｒｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）により、全ヒト肝細胞の０．６％未満を構成するＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）発現集団の存在が実証された。この集団はＣＤ３４およびＣＤ４５を共発現し、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ造血アッセイおよび長期移植実験により評価したとき、ＣＤ１４４-ＣＤ３４+ＣＤ４５+カウンターパートよりも大きな自己再生能、増殖能、および分化能を呈した。
【０２６９】
ｉＰＳＣ由来ＨＰＣ生成時、ＣＤ１４４発現細胞はまたｎｏｔｃｈＤＬＬ４を発現した。最終的ＨＳＣは、成人レシピエントにおける長期複系列移植の能力により規定され、後に、大動脈・性腺・中腎（ＡＧＭ）として知られる領域の動脈血管、たとえば、背側大動脈で検出され、続いて、胎児肝臓に居を移し、骨髄への播種前にＨＳＣはさらなる成熟および有意な増殖拡大を行う（Ｋｉｅｕｓｓｅｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｎｏｔｃｈ経路は最終的ＨＳＣに不可欠である。Ｎｏｔｃｈ  ＤＬＬ４は、二分化造血プロジェニターのサブ集団の造血分化時に発現される（Ｏｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ａｙｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。高レベルのＤＬＬ４を発現する細胞は、内皮運命にコミットすることが示され、一方、低レベルのＤＬＬ４を発現する細胞は、造血運命へのバイアスを有するが、高いＤＬＬ４を発現する細胞の非常に近くに存在する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏリンフォイド分化はＮｏｔｃｈ  ＤＬＬ４の存在下で行われたので、リンフォイドプロジェニターは、低レベルのＤＬＬ４を発現するＶＥ−カドヘリン陽性細胞でありうる。加えて、ヒト臍帯血中のマイナーなリンフォイドプロジェニターは、ＣＤ３４hiＣＤ４５ＲＡhiＣＤ７+として同定された（Ｈａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ｉＰＳＣ由来ＨＰＣ分化時に表現型によりリンフォイドプロジェニターを同定するために、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）、汎白血球抗原ＣＤ４５、血液内皮マーカーＣＤ３４、およびマイナーなリンフォイドプロジェニターＣＤ７を用いて選別実験を行った。
【０２７０】
リンフォイド細胞の表現型シグネチャーを同定するために、リンフォイド能力の欠如に伴って低下するマーカーのリストを用いて、ＴｉＰＳＣｓ  １Ｅ細胞および３９０２細胞に由来する８日目のＨＰＣプロジェニターを用いて磁気選別ストラテジーを実施した。８日目のＨＰＣプロジェニターを採取し、個別化し、次いで表５に記載の磁気選別の４つの条件下に配置した。選別後に得られた陽性および陰性の画分を２５ｋ／ｃｍ2の密度でプレーティングし、Ｒｅｔ−ＤＬＬ４被覆マトリックス１２ウェルプレート上さらには２４ウェルプレート上でＴ細胞分化を誘導した。Ｔ細胞分化は、先に記載したように低酸素条件下で実施した。
【０２７１】
Ｔ細胞マーカーの分析（図１９）から、ＭｅＣＰ２ＷＴ細胞系ではなくＭｅＣＰ２ＫＯ細胞系がリンフォイド分化の潜在能力を有することが示された。ＭｅＣＰ２ＷＴ細胞由来の９日目のＨＰＣプロジェニターはＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞を本質的に有していなかったが、試験した他のＨＰＣプロジェニターは、ＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞集団に分化した。そのため、ＭｅＣＰ２のメチル結合ドメインのノックアウトは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を産生するＨＰＣプロジェニターの潜在能力を向上させた。
【０２７２】
実施例５−β細胞への分化
ＭｅＣＰ２ＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳ細胞はまた、モノホルモンβ細胞を生成可能なＤＥ細胞およびＥＰＣに分化した。プロセスの模式図は図２１に提供されている。膵分化プロセスの段階は図２３Ｃに提供される。全分化は低酸素条件下で実施される。
【０２７３】
懸濁培養で生成したＥＰＣは、膵細胞型の生成のための分化培地に配置される。内胚葉前駆細胞の膵分化では、Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１により記載され、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａによりさらに修正されたプロトコルを利用した。全プロセスは低酸素条件下で３Ｄ培養として継続させた。
【０２７４】
ＥＰＣ培養物を１５日間拡大し、前腸／中腸内胚葉細胞を生成させるために、Ｗｎｔ３Ａ（３ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびドルソモルフィン（０．７５μＭ）を含有するＳＦＤ培地で３日間培養した。膵内胚葉細胞を生成させるために、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、Ｂ２７（レチノイン酸（１％）を含まない）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）、ｔｒａｎｓレチノイン酸（２μＭ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地で細胞を３日間培養した。この工程の後、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、Ｂ２７（レチノイン酸（１％）を含まない）、アスコルビン酸（５０ｇ／ｍｌ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地で細胞を３日間培養した。次いで、セクレターゼ阻害剤（２μＭのＤＡＰＴ）が補充された先の高グルコースＤＭＥＭ培地で細胞を１〜２日間培養した。この段階から、グルコース（４０ｍＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳＦＤ培地で細胞を１〜２日間培養した。最後に、その次の１０日間にわたり、ＳＢ４３１５４２（５．４μＭ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（８００ｐＭ）、およびニコチンアミド（１０ｍＭ）を含有するＳＦＤ培地で細胞を培養し、その際、添加された追加のグルコース（４０ｍＭ）を含むおよび添加された追加のグルコースを含まないかかる培地で培地を交互に毎日交換した。モノホルモンβ細胞の存在は、２Ｄ方式で分化の１０〜１５日目に検出された。
【０２７５】
分化の２１〜２５日目にβ細胞培養物を採取し、固定し、そして細胞内フローサイトメトリーによりＰＤＸ１／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンの定量のために染色した（図２４、２５、２６）。最終段階培養物は、モノホルモン細胞の存在を示した。最終段階の培養物は、ＰＤＸ１、ＮｅｕｒｏＤ１、およびいくつかのレベルのＮＫＸ６．１に関して陽性であった。最終段階の凝集体は、グルコースに対する反応性を示した（図２７）。
【０２７６】
実施例６−ＨＰＣ分化に及ぼすＭｅＣＰ２ＫＯの影響
ＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯを含有するｉＰＳＣクローンをＥ８／Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で５〜１０継代にわたり低酸素に適合化させ、ＨＰＣを産生するための３Ｄ分化プロトコルに付した。５μＭブレビスタチンが補充されたＳＦＤ培地の存在下で２５万〜５０万細胞／ｍｌの密度の半集密ｉＰＳＣから凝集体を作製した。ＵＬＡプレートまたはスピンナーフラスコにおいて、７５％ＩＭＤＭ、２５％ハムＦ１２、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント（レチノイン酸を含まない）０．０５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および４．５×１０-4Ｍモノチオグリセロールを含有するＳＦＤ基本培地でプロセスを実施した。ＥＢが形成されたら、最初の４日間にわたりＳＦＤ基本培地に５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを補充することにより分化を開始した。ＥＢ分化の５日目に、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ヘパリン、およびＴＰＯの存在下に培養物を配置した。ＨＰＣ分化９日目に凝集体を採取し、造血細胞の出現を定量した。
【０２７７】
ＣＤ４３（図２８）、ＣＤ３４（図２９）、ＣＤ３４／ＣＤ４３（図３０）、ＣＤ４５（図３１）、ＣＤ２３５（図３２Ａ、図３２Ｂ）、およびＤＬＬ−４の発現をフローサイトメトリーにより定量した。１つのｉＰＳＣを１つのＨＰＣ（３４／４３）細胞に変換する効率も定量した（図３４）。全ＨＰＣ分化を低酸素条件下で実施した。一般に、ＭｅＣＰ２ＫＯは、ＨＰＣ分化９日目に、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ４３／ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ２３５、およびＤＬＬ４が陽性の細胞のパーセントがより高いことが観測された。そのほか、ＭｅＣＰ２のノックアウトは、ｉＰＳＣからＨＰＣへの分化効率を約２〜７倍に増加させた。
【０２７８】
実施例７−マイクログリア生成に及ぼすＭｅＣＰ２ＫＯの影響
ＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯを含有するｉＰＳＣクローンをＥ８／Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で５〜１０継代にわたり低酸素に適合化させ、ＨＰＣを産生するための３Ｄ分化プロトコルに付した。５μＭブレビスタチンが補充されたＳＦＤ培地の存在下で２５万〜５０万細胞／ｍｌの密度の半集密ｉＰＳＣから凝集体を作製した。ＵＬＡプレートまたはスピンナーフラスコにおいて、７５％ＩＭＤＭ、２５％ハムＦ１２、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント（レチノイン酸を含まない）０．０５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および４．５×１０-4Ｍモノチオグリセロールを含有するＳＦＤ基本培地でプロセスを実施した。
【０２７９】
ＥＢが形成されたら、最初の４日間にわたりＳＦＤ基本培地に５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを補充することにより分化を開始した。ＥＢ分化の５日目に、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ヘパリン、およびＴＰＯの存在下に培養物を配置した。ＨＰＣ分化９日目に凝集体を採取し、１０〜１５ｋ／ｃｍ2の細胞密度でＭａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上にプレーティングし、Ａｂｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７に記載の方法に従ってマイクログリア分化を開始させた。ＨＰＣ分化は低酸素条件下で実施したが、マイクログリア分化は低常酸素条件下で実施した。
【０２８０】
分化の最初の２２日間にわたり２５ｎｇ／ｍｌ  ＭＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ、および１００μｇ／ｍｌ  ＩＬ−３４を含有するマイクログリア分化培地を細胞に供給した。２５ｎｇ／ｍｌ  ＭＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ、１００μｇ／ｍｌ  ＩＬ−３４、ＣＤ２００、およびＣＸＣＬ１を含有するマイクログリア成熟培地に細胞を配置した。２７日目に細胞を採取し、最終段階の培養物でマイクログリアの出現を確認するために、細胞内フローサイトメトリーによりＰ２ＲＹ、ＴＲＥＭ−２、ＩＢＡ、およびＣＸＣ３ＣＲ１が存在するものを染色した。分化プロセスの終了時の最終段階のマイクログリアの純度をフローサイトメトリーにより定量するとともに（図３６）、ＨＰＣからマイクログリアを生成させる効率を定量した（図３７）。ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ、およびＴＲＥＭ−２が陽性の細胞のパーセントにより決定されるように、ＭｅＣＰ２のノックアウトは、マイクログリア細胞集団の純度の増加をもたらすことが観測された。
【０２８１】
実施例８−リンフォイド細胞生成に及ぼすＭｅＣＰ２ＫＯの影響
ＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯを含有するｉＰＳＣクローンをＥ８／Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で５〜１０継代にわたり低酸素に適合化させ、ＨＰＣを産生するための３Ｄ分化プロトコルに付した。５μＭブレビスタチンが補充されたＳＦＤ培地の存在下で２５万〜５０万細胞／ｍｌの密度の半集密ｉＰＳＣから凝集体を作製した。ＵＬＡプレートまたはスピンナーフラスコにおいて、７５％ＩＭＤＭ、２５％ハムＦ１２、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント（レチノイン酸を含まない）０．０５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および４．５×１０-4Ｍモノチオグリセロールを含有するＳＦＤ基本培地でプロセスを実施した。
【０２８２】
ＥＢが形成されたら、最初の４日間にわたりＳＦＤ基本培地に５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを補充することにより分化を開始した。ＥＢ分化の５日目に、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ヘパリン、およびＴＰＯの存在下に培養物を配置した。ＨＰＣ分化９日目に、凝集体を採取し、ｒｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に２５ｋ／ｃｍ2の細胞密度でプレーティングした。分化の最初の１４日間にわたり、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−７、およびＦｌｔ−３リガンドを含有するＴ細胞分化培地を低酸素条件下で細胞に供給した。２週間の終了時に細胞を採取し、プレＴプロジェニター（ＣＤ４５／ＣＤ７）（図３８Ｂ）および（ＣＤ７／ＣＤ５）（図３８Ｃ）の細胞のパーセントをフローサイトメトリーにより定量した。プレＴ細胞（ＣＤ５／ＣＤ７）のＦＡＣＳプロファイルのスナップショットは、（図３８Ａ）に描かれている。
【０２８３】
出現するプレＴ細胞を新鮮なＲｅｔ−ＤＬＬ４被覆プレート上に配置し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−７、Ｆｌｔ−３リガンド、および１０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有する培地で分化をさらに２週間継続した。Ｔ細胞（ＣＤ３／ＣＤ８）のＦＡＣＳプロファイルのスナップショットは、（図３９Ａ）に描かれている。種々のＷＴおよびＭｅＣＰ２ＫＯクローン、ＳＯＮＬ（図３９Ｂ）、ｉＰＳＣ９０２５（図３９Ｃ）、ｉＰＳＣ  Ａ系（図３９Ｄ）、Ｆ系（図３９Ｅ）、Ｈ系（図３９Ｆ）で、全ＣＤ３、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−／ＣＤ５６）、およびＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）の定量を行った。このように、ＭｅＣＰ２ＫＯ  ｉＰＳＣを用いてｉＰＳＣからＴ細胞およびＮＫ／Ｔ細胞を効率的に生成させることが可能である。
【０２８４】
実施例９−肝細胞成熟に及ぼすＭｅＣＰ２ＫＯの影響
図２１に記載されるように、ＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯのｉＰＳＣ系を胚体内胚葉細胞に分化させた。次いで、図４０に示されるプロトコルに従って胚体内胚葉細胞を肝細胞にさらに分化させた。全分化プロセスは、分化プロセスの２５日目まで低酸素条件下で実施した。簡潔に述べると、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（０．１μＭ）、ＤＭＳＯ（１％）、およびＦＧＦ−１０（６０ｎｇ／ｍＬ）が補充されたＳＦＤ培地で２ＤでＤＥ細胞を約６日間培養した。次いで、コラーゲン上においてｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＯＳＭ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（０．２μＭ）、ＤＭＳＯ（１％）、ＤＡＰＴ（２μＭ）、およびビタミンＫ（６μｇ／ｍＬ）が補充されたＳＦＤ培地に細胞を約６日間再プレーティングした。第３段階では、細胞は、Ｂ２７（１×）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＯＳＭ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ（０．１μＭ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）が補充されたウィリアムＥ培地に２Ｄでプレーティングした。
【０２８５】
Ａｃｃｕｍａｘを用いて最終段階の肝細胞を採取し、細胞内フローサイトメトリーを実施することによりα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）の存在およびアルブミンの発現を有するものを染色した。ＡＡＴおよびアルブミンは、成体肝細胞のマーカーとして知られ、ＭｅＣＰ２ＫＯ  ｉＰＳＣから分化させた肝細胞は、ＭｅＣＰ２ＷＴ  ｉＰＳＣから分化させた肝細胞と比較してアルブミンのより高い発現を有することが観測された。そのため、ＭｅＣＰ２ＫＯ  ｉＰＳＣを用いて、より成熟した肝細胞を効率的に生成させることが可能である。
【０２８６】
実施例１０−ＭｅＣＰ２ＫＯ  ｉＰＳＣからの赤芽球産生の特徴付け
ＭｅＣＰ２ＷＴまたはＭｅＣＰ２ＫＯを含有するｉＰＳＣクローンをＥ８／Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で５〜１０継代にわたり低酸素に適合化させ、ＨＰＣを産生するための３Ｄ分化プロトコルに付した。５μＭブレビスタチンが補充されたＳＦＤ培地の存在下で２５万〜５０万細胞／ｍｌの密度の半集密ｉＰＳＣから凝集体を作製した。プロセスは、ＵＬＡプレートまたはスピンナーフラスコにおいて７５％ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１２２００−０６９）（グルタミンおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋Ｐ／Ｓを含む）、２５％ハムＦ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ１０−０８０−ＣＶ）、０．５％Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１７５０２−０４８）、１％Ｂ２７サプリメント（レチノイン酸を含まない）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１２５８７−０１０）、０．０５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および４．５×１０-4Ｍモノチオグリセロールを含有するＳＦＤ基本培地で実施された。
【０２８７】
ＥＢが形成されたら、最初の４日間にわたりＳＦＤ基本培地に５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを補充することにより分化を開始した。ＥＢ分化の５日目に、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ヘパリン、およびＴＰＯの存在下に培養物を配置した。ＨＰＣ分化９日目に凝集体を採取し、造血細胞の出現を定量した。
【０２８８】
ｉＰＳＣに由来するＨＰＣからヒト赤芽球を生成させるために、原始エリスロイド拡大培地（ｐＥＥＭ）で０．５〜１×１０6細胞／ｍＬの密度で細胞を１〜２週間培養した。ｐＥＥＭ培地は、０．３％Ｅｘｃｙｔｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ホロトランスフェリン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）が補充されたＳＦＥＭ培地を含んでいた。分化の２〜７週でグリコホリン（ＣＤ２３５）が存在する細胞を染色した。赤血球分化を行う各クローンのＣＤ２３５発現の動態は、図４２に描かれている。一般に、ＭｅＣＰ２ＫＯを含むｉＰＳＣから分化させた赤血球は、エリスロイド分化時にＣＤ２３５発現がより初期に出現し、ＣＤ２３５が陽性の細胞のパーセントがより高いことが観測された。
【０２８９】
赤血球分化の２〜７週で、ＣＤ２３５ａおよび各種グロビン、たとえば、βグロビン、γグロビン、およびεグロビンに関して細胞を共染色した。ｉＰＳＣ  ＳＯＮＬ  ＭｅＣＰ２ＫＯ（図４３Ａ）、ＳＯＮＬ  ＭｅＣＰ２ＷＴ（図４３Ｂ）、ｉＰＳＣ  ＴＩＰＳ  ＭｅＣＰ２ＫＯ（図４４Ａ）、ＴＩＰＳ  ＭｅＣＰ２ＷＴ（図４４Ｂ）、ｉＰＳＣ９０２５  ＭｅＣＰ２ＫＯ（図４５Ａ）、９０２５ＭｅＣＰ２ＷＴ（図４５Ｂ）、ｉＰＳＣ  Ａ系ＭｅＣＰ２ＫＯ（図４６Ａ）、Ａ系ＭｅＣＰ２ＷＴ（図４６Ｂ）、ｉＰＳＣ  Ｈ系ＭｅＣＰ２ＫＯ（図４７Ａ）、Ｈ系ＭｅＣＰ２ＷＴ（図４７Ｂ）、ｉＰＳＣ  Ｇ系ＭｅＣＰ２ＫＯ（図４８Ａ）、およびＧ系ＭｅＣＰ２ＷＴ（図４８Ｂ）。ＭｅＣＰ２ＫＯ細胞系から分化させた赤血球ではすべて、βグロビンの発現は、胚性εグロビンのレベルの低下を伴うことから、胚性グロビンから成人グロビンへのスイッチが示唆する。これには胎児γグロビンのレベルの減少を伴う。そのため、ＭｅＣＰ２ＫＯ  ｉＰＳＣ由来の赤血球は、ＭｅＣＰ２ＷＴ  ｉＰＳＣから分化させた赤血球よりも成熟している。
【０２９０】
本明細書に開示および特許請求される方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく実行可能である。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく本方法および本明細書に記載の方法の工程または工程の順序に変更を加えうることは、当業者にことは明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある特定の作用剤は、本明細書に記載の作用剤の代わりになりうるとともに、同一または類似の結果を達成するであろうことは明らかであろう。当業者に明らかなかかる類似の代替物および改変物はすべて、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨、範囲、および概念に包含されるとみなされる。
【０２９１】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書の記載内容を補足する例示的な手順または他の詳細事項を提供する範囲内で参照により本明細書に組み込まれる。
Ａｂｂｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，５８：１１４８−１１５４，１９８１．
Ａｂｄｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２０１７．
Ａｋｋｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２５８１−２５８５，１９９６．
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５０９２−５０９６，１９８８．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３，１９９２．
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９６．
Ａｙｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２９（８）：１７４１−１７５３，２０１５．
Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１，２００２．
Ｂｈａｔｎａｇａｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１４．
Ｂｉｒｄ  Ａ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８６；３２１：２０９−１３，１９８６．
Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３６：５７５−５８３，２００８．
Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５９０：５８２−５８３，１９９０．
Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９：２２２８−２２３３，１９９１．
Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（９）：６６４１−６６４９，１９９７．
Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７．
Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １０（４）：３７１−３８４，２０１２．
Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６，２０００．
Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２３（１０）：３９４−８，１９９８．
Ｄｉｌｌｏｎ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５，１９９３．
Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．１０：１２０−３６，２０１２．
Ｅｒｃｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１５３３５−１５３４１，１９８８．
Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ−Ｒａｖｅｎ，ＮＹ，１０５４−１０８７，１９９７．
Ｆａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１：７３−８０，１９８１
Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３−８４６７，１９８７．
Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９．
Ｆｒｉｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐａｒｔ  ＩＩＩ，１２５−１２７，２００１
Ｆｕｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｕｒｉｅ，Ｃｅｌｌ  ５３：５０５−５１８，１９８８．
Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１（７），３９７−４０５，２０１３．
Ｇｏｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５９３−５９６，１９８０．
Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９７３．
Ｈａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０４（１３）：３９１８−３９２６，２００４．
Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９５．
国際公開第９４／０９６９９号パンフレット
国際公開第９５／０６１２８号パンフレット
国際公開第９６／３９４８７号パンフレット
Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０，２００１．
Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４，１９８８．
Ｊｏｎｅｓ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｔａｋａｉ  Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９３：１０６８−７０，２００１．
Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５  ４１８，１９９０．
Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，３６：３７１−３７９，１９８９．
Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１  ３３６４，１９９１．
Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：１９，２００１．
Ｋｉｅｕｓｓｅｉａｎ，Ａ．，Ｐ．Ｂｒｕｎｅｔ  ｄｅ  ｌａ  Ｇｒａｎｇｅ，Ｏ．Ｂｕｒｌｅｎ−Ｄｅｆｒａｎｏｕｘ，Ｉ．Ｇｏｄｉｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｃｕｍａｎｏ（２０１２）．“Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３９（１９）：３５２１−３５３０．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２，１９９４ｂ．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７，１９９４ａ．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：３８７９−３８８２，１９９２．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，２５１−２５８，２０１３．
Ｋｎｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．７６１−７６６，１９８７．
Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４，１９９５．
Ｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：３３８−３４３，２００６．
Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（７）：６１８１−６１８５，１９９８．
Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ａｌｌｅｒｇｙ，３７：１４０４−１４１４，２００７．
Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）：１２６１６−１２６２１，１９９７．
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９，１９９２．
Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（２２１）：１−７，２０１３．
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，（２）：１８５−１８７，２００６ａ．
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３（８）：６３７−６４６，２００６ｂ．
Ｌｕｓｉｓ，Ｂｌｏｏｄ，５７：１３−２１，１９８１．
Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１．
Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８．
Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３．
Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９６：１５９１−１５９３，２０００．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０，１９９２．
Ｍｉｎｓｋａｉａ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２０１３
Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６，１９９３．
Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｉｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７，１９９３．
Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９．
Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３−２６７，１９９６．Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５（９）：８７１−８７５，Ｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１７：６０１−６１５，１９８９．
Ｎｉｃｏｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，５４：６１４−６２７，１９７９．
Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４−５１３，１９８８．
Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２．
Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６，１９８７．
Ｎｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８：８６１−８７１，２０１１．
Ｎｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１８−２２１，２０１１．
Ｏｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６（２２）：４４４４−４４５５，２０１０．
Ｏｋａｂｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．，１１０：４３−４９，１９８２．
Ｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２０（１５）：２９４５−２９５３，２０１２．
Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０，２００１．
Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：２４２−２４８，１９７５．
Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＰ１５０７８６５
ＰＣＴ国際公開第２００６／０５０３３０号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット
Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４（６１８０）：３２０−３２５，１９８８．
Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９（２）：１６９−１７７，１９８５．
Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４．
Ｑｕｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：９５３９−９５４５，１９８９．
Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３７：２６３−２７２，１９８４．
Ｒｉｐｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９８：３７８４−３７９２，２００１．
Ｓｃｉｃｃｈｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．３１：７６０−９，２００３．
Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７，２００１．
Ｓｌｕｋｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  Ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，＃３３，ＡＳＣＩ／ＡＡＰ  Ｊｏｉｎｔ  Ｍｅｅｔ．Ｐｏｓｔｅｒｓ，２００７．
Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８９１−１８９７，１９８７．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１（５）：８６１−８７２，２００７．
Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（Ｅｄ．），ＮＹ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１４９−１８８，１９８６．
Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，１９８６．
米国特許出願第０８／４６４，５９９号明細書
米国特許出願第１２／４７８，１５４号明細書
米国特許出願第１２／７１５，１３６号明細書
米国特許出願公開第２００７／００７７６５４号明細書
米国特許出願公開第２００９／０２４６８７５号明細書
米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号明細書
米国特許出願公開第２０１１／００５９５０２号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０１０４１２５号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書
米国特許出願公開第２０１２／０２７６６３６号明細書
米国特許出願公開第２０１３／０３１５８８４号明細書
米国特許出願公開第２０１４／０１２０６２２号明細書
米国特許出願公開第２０１５／０１９１６９７号明細書
米国特許出願第６１／０８８，０５４号明細書
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
米国特許第４，８９７，３５５号明細書
米国特許第４，９４６，７８７号明細書
米国特許第５，０３０，０１５号明細書
米国特許第５，０４９，３８６号明細書
米国特許第５，３０２，５２３号明細書
米国特許第５，３２２，７８３号明細書
米国特許第５，３８４，２５３号明細書
米国特許第５，４６４，７６５号明細書
米国特許第５，４８６，３５９号明細書
米国特許第５，５３８，８７７号明細書
米国特許第５，５３８，８８０号明細書
米国特許第５，５５０，３１８号明細書
米国特許第５，５５６，９５４号明細書
米国特許第５，５６３，０５５号明細書
米国特許第５，５８０，８５９号明細書
米国特許第５，５８９，４６６号明細書
米国特許第５，５９１，６１６号明細書
米国特許第５，６１０，０４２号明細書
米国特許第５，６５６，６１０号明細書
米国特許第５，７０２，９３２号明細書
米国特許第５，７３６，５２４号明細書
米国特許第５，７８０，４４８号明細書
米国特許第５，７８９，２１５号明細書
米国特許第５，８４３，７８０号明細書
米国特許第５，９２８，９０６号明細書
米国特許第５，９４５，１００号明細書
米国特許第５，９８１，２７４号明細書
米国特許第５，９９４，１３６号明細書
米国特許第５，９９４，６２４号明細書
米国特許第６，０１３，５１６号明細書
米国特許第６，１０３，４７０号明細書
米国特許第６，２００，８０６号明細書
米国特許第６，４１６，９９８号明細書
米国特許第７，０２９，９１３号明細書
米国特許第７，４４２，５４８号明細書
米国特許第７，５９８，３６４号明細書
米国特許第７，９８９，４２５号明細書
米国特許第８，０５８，０６５号明細書
米国特許第８，０７１，３６９号明細書
米国特許第８，１２９，１８７号明細書
米国特許第８，１８３，０３８号明細書
米国特許第８，２６８，６２０号明細書
米国特許第８，３７２，６４２号明細書
米国特許第８，５４６，１４０号明細書
米国特許第８，６９１，５７４号明細書
米国特許第８，７４１，６４８号明細書
米国特許第８，９００，８７１号明細書
米国特許第９，１７５，２６８号明細書
米国特許出願公開第２００２００５５１４４号明細書
米国特許出願公開第２００９０１４８４２５号明細書
Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４，１９８８．
Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６，１９９５．
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９：９１−１０５，２００９．
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９．
Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７９４，１９８０．Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９．
Ｗｙｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：１０６９−１０７０，２００５．
Ｘｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ，２０１３．Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１（５）：８６１−７２，２００７．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６，１９９４．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８（５８５８）：１９１７−１９２０，２００７．
【図１Ａ−１Ｂ】
2019528773.tif 000009
【図１Ｃ】
2019528773.tif 000010
【図２Ａ】
2019528773.tif 000011
【図２Ｂ】
2019528773.tif 000012
【図３】
2019528773.tif 000013
【図４Ａ】
2019528773.tif 000014
【図４Ｂ】
2019528773.tif 000015
【図４Ｃ】
2019528773.tif 000016
【図４Ｄ】
2019528773.tif 000017
【図５Ａ】
2019528773.tif 000018
【図５Ｂ】
2019528773.tif 000019
【図５Ｃ】
2019528773.tif 000020
【図６】
2019528773.tif 000021
【図７】
2019528773.tif 000022
【図８】
2019528773.tif 000023
【図９】
2019528773.tif 000024
【図１０Ａ−１０Ｃ】
2019528773.tif 000025
【図１１Ａ】
2019528773.tif 000026
【図１１Ｂ】
2019528773.tif 000027
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2019528773.tif 000028
【図１３Ａ−１３Ｃ】
2019528773.tif 000029
【図１４Ａ−１４Ｂ】
2019528773.tif 000030
【図１５Ａ−１５Ｂ】
2019528773.tif 000031
【図１６Ａ−１６Ｂ】
2019528773.tif 000032
【図１７Ａ−１７Ｂ】
2019528773.tif 000033
【図１８Ａ−１８Ｂ】
2019528773.tif 000034
【図１９Ａ−１９Ｄ】
2019528773.tif 000035
【図２０】
2019528773.tif 000036
【図２１】
2019528773.tif 000037
【図２２Ａ−２２Ｂ】
2019528773.tif 000038
【図２３Ａ−２３Ｃ】
2019528773.tif 000039
【図２４Ａ−２４Ｃ】
2019528773.tif 000040
【図２５Ａ−２５Ｂ】
2019528773.tif 000041
【図２６】
2019528773.tif 000042
【図２７】
2019528773.tif 000043
【図２８】
2019528773.tif 000044
【図２９】
2019528773.tif 000045
【図３０】
2019528773.tif 000046
【図３１】
2019528773.tif 000047
【図３２Ａ】
2019528773.tif 000048
【図３２Ｂ】
2019528773.tif 000049
【図３３】
2019528773.tif 000050
【図３４】
2019528773.tif 000051
【図３５】
2019528773.tif 000052
【図３６】
2019528773.tif 000053
【図３７】
2019528773.tif 000054
【図３８Ａ】
2019528773.tif 000055
【図３８Ｂ】
2019528773.tif 000056
【図３８Ｃ】
2019528773.tif 000057
【図３９Ａ】
2019528773.tif 000058
【図３９Ｂ】
2019528773.tif 000059
【図３９Ｃ】
2019528773.tif 000060
【図３９Ｄ】
2019528773.tif 000061
【図３９Ｅ】
2019528773.tif 000062
【図３９Ｆ】
2019528773.tif 000063
【図４０】
2019528773.tif 000064
【図４１】
2019528773.tif 000065
【図４２】
2019528773.tif 000066
【図４３Ａ】
2019528773.tif 000067
【図４３Ｂ】
2019528773.tif 000068
【図４４Ａ】
2019528773.tif 000069
【図４４Ｂ】
2019528773.tif 000070
【図４５Ａ】
2019528773.tif 000071
【図４５Ｂ】
2019528773.tif 000072
【図４６Ａ】
2019528773.tif 000073
【図４６Ｂ】
2019528773.tif 000074
【図４７Ａ】
2019528773.tif 000075
【図４７Ｂ】
2019528773.tif 000076
【図４８Ａ】
2019528773.tif 000077
【図４８Ｂ】
2019528773.tif 000078
【配列表】
2019528773000001.app
【国際調査報告】
2019528773.tif 000079
2019528773.tif 000080
2019528773.tif 000081