【手続補正書】
【提出日】平成19年3月12日(2007.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
図面の簡単な説明
図１はＢ４ＥＣｖ３蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 386を示す（非開裂EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す）。
図２はＢ４ＥＣｖ３ＮＴ蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 387を示す（非開裂EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す）。
図３はＢ２ＥＣ蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 388を示す（非開裂エフリンB2リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す）。
図４はＢ４ＥＣｖ３-ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 389を示す（非開裂EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す）。
図５は、Ｂ２ＥＣ-ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 390を示す（非開裂エフリンB2リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す）。
図６はＢ４ＥＣ-ＦＣ結合アッセイ（プロテインＡ-アガロースベース）を示す。
図７はＢ４ＥＣ-ＦＣ阻害アッセイ（溶液中阻害）を示す。
図８はＢ２ＥＣ-ＦＣ結合アッセイ（プロテインＡ-アガロースベースアッセイ）を示す。
図９はＢ４Ｅｃｖ３に応答するＨＵＡＥＣ走化性を示す（縦軸は０．８ミクロン径の孔通過移動した細胞数。横軸は添加したＢ４Ｅｃｖ３量、ｎｇ／ml）。
図１０はＢ２ＥＣ-ＦＣに応答するＨＨＥＣの走化性を示す（縦軸は孔通過移動した細胞数。横軸は添加したＢ２ＥＣ-ＦＣ量、ｎｇ／ml）。
図１１はＢ２ＥＣに応答するＨＨＡＥＣの走化性を示す（縦軸は孔通過移動した細胞数。横軸は添加したＢ２ＥＣ量、ｎｇ／ml）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
図６１はヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
図６２はヒトEphB4のｃＤＮＡヌクレオチド配列SEQ ID NO: 392を示す。
図６３はヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
図６４はヒトエフリンB2のｃＤＮＡヌクレオチド配列SEQ ID NO: 394を示す。
図６５はヒトEphB4のアミノ酸配列SEQ ID NO: 395を示す。
図６６はヒトエフリンB2のアミノ酸配列SEQ ID NO: 396を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
材料及び方法
１）エフリンB2及びEphB4の組み換え型可溶性誘導体生産用のほ乳類発現ベクター；
エフリンB2及びEphB4の組み換え型可溶性誘導体を発現するためのプラスミドベクターは、pEF6／V5-His-TOPOベクター（インビトロジェン社製）、pIG（Novagen社製）又はｐＲＫ５をベースとした。pEF6／V5-His-TOPOは、ヒト延長因子１ａエンハンサー／プロモーター及びブラストサイジン耐性マーカーを含有する。pIGベクターは、ＣＭＶプロモーター調節下でヒトIgG１のＦｃ部位との高レベル発現の蛋白質融合をするように設計され、ｐＲＫ５は一般的目的ＣＭＶプロモーター含有ほ乳類発現ベクターである。プラスミド構築物pEF6-Ｂ４ＥＣ-ＮＴを生成するために、ヒトEphB4のｃＤＮＡフラグメントを、オリゴプライマー５’-ＧＧＡＴＣＣＧＣＣ  ＡＴＧＧＡＧＣＴＣ  ＣＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴ-３’（SEQ ID NO: 1）及び５’-ＴＧＧＡＴＣＣＣＴ  ＧＣＴＣＣＣＧＣ  ＣＡＧＣＣＣＴＣＧ  ＣＴＣＴＣＡＴＣＣＡ-３’ （SEQ ID NO: 2）を使用してＰＣＲ法で増幅し、pEF6／V5-His-TOPOベクターへＴＯＰＯ-クローン化した。pEF6-ｈＢ４ＥＣｖ３は、pEF6-Ｂ４ＥＣＮＴに由来し、プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶ及びＢｓｔＢＩで消化して、Klenow酵素及びリライゲートベクターで末端を補完した。pEF6-Ｂ４ＥＣ-ＮＴによりエンコードされた組み換え型EphB4誘導体は、エピトープ-又は精製標識を含有しない一方、pEF6-ｈＢ４ＥＣｖ３によりエンコードされた類似のＢ４ＥＣｖ３蛋白質は、そのＣ-末端にＶ５エピトープ標識及び６ｘＨｉｓ標識を含有し、条件付けした培地からの精製を促進する。プラスミド構築物pEF6-ｈＢ２ＥＣを、オリゴプライマー５’-ＴＧＧＡＴＣＣＡＣ  ＣＡＴＧＧＣＴＧＴ  ＧＡＧＡＡＧＧＧＡＣ-３’（SEQ ID NO: 3）及び５’-ＡＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＴＧＡＣＴＡＣ  ＣＣＡＣＴＴＣＧＧ  ＡＡＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＣ-３’（SEQ ID NO: 4）を使用した、エフリンB2ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅をし、pEF6／V5-His-TOPOベクター中へのＴＯＰＯ-クローニングにより製造した。プラスミド構築物pIG-ｈＢ２ＥＣ-ＦＣを、オリゴプライマー５’-ＴＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧ  ＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＣ-３’（SEQ ID NO: 5）及び５’-ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＴＣＧＧＡ  ＡＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴ  ＣＣＣ-３’（SEQ ID NO: 6）を使用した、エフリンB2 ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅をし、それに続くＴＯＰＯ-クローニングにより製造し、次に得られたＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIにより切断したpIGｈIgG１Fc融合発現ベクター内でサブクローニングして塩基配列決定した。同様に、pIG-ｈＢ２ＥＣ及びpIG-ｈＢ４ＥＣｖ３をオリゴプライマー５’-ＡＴＡＡＧＣＴＴＣＣ  ＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣ  ＴＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧ-３’（SEQ ID NO: 7）及び５’-ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧ  ＣＣＡＧＣＣＣＴＣＧＣ  ＴＣＴＣＡＴＣ-３’（SEQ ID NO: 8）を使用して、EphB4  ＥＣＤ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅部位を製造し、次にＢａｍＨ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIにより切断したpIGｈIgG１Fc融合発現ベクター内へ続いてサブクローニングした。上記ベクターによりエンコードされた蛋白質の推定配列を図１〜５に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
Ｈ．材料及び方法；
１）発現構築物；
可溶性用発現ベクターを生産するために、６ｘＨｉｓ標識化EphB4-ＥＣＤ変異体、クローン化された完全長ヒトEphB4ｃＤＮＡを下記オリゴプライマーを使用してＰＣＲ法で増幅した：ＴＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴ（SEQ ID NO: 9）（通常のEphB4Ｎ-末端プライマー）及びＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＡＧＧＡ  ＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＡ（SEQ ID NO: 10）（Ｂ４-ＧＣ）、ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＡＡＴＧＧＧＡ（SEQ ID NO: 11）（Ｂ４-ＧＣＦ１）又はＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＴＣＡＴ（SEQ ID NO: 12）（Ｂ４-ＧＣＦ２）。得られたＰＣＲフラグメントを、ＥＦ-１αプロモーター調節下でほ乳類発現ベクターpEF6／V5-His-TOPO（インビトロジェン社製）中でＴＡ-クローン化した。発現した組み換え型蛋白質は、ヒトEphB4の成熟細胞外部の下記フラグメントをエンコードする：アミノ酸位置１〜５２２（ＧＣＦ２）、１〜４１２（ＧＣＦ１）及び１〜３１２（ＧＣ）。pEF6クローニング用のＢ４-ＣＦ２欠失（δアミノ酸１３-１８３）ＰＣＲフラグメントを生成するために、EphB4ｃＤＮＡを下記オリゴプライマーを使用して２ステップオーバーラップＰＣＲ法により増幅した：ＴＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴ（SEQ ID NO: 13）、ＣＡＧＣＴＧＡＧＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＣ（SEQ ID NO: 14）、ＧＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣ（SEQ ID NO: 15）及びＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＧＣＴ（SEQ ID NO: 16）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
分泌されたヒトエフリンB2-アルカリホスファターゼ（Ｂ２-ＡＰ）試薬の生産用ベクターは、下記プライマーを使用してヒトエフリンB2 ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により構成された：ＴＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＣ（SEQ ID NO: 17）及びＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＡＡＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＣＣＣ（SEQ ID NO: 18）：得られたフラグメントをクローニングし、Ｈｉｎｄ III及びＢａｍＨ Ｉで消化して、Ｈｉｎｄ III-Ｂｇ１ II消化されたｐＡＰＴａｇ２ベクター（GenHunter、Inc.社製）とする。それぞれの場合、発現ベクター中の挿入部分は、完全塩基配列決定により確認した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
２）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及びEphB4siRNA
EphB4特異的アンチセンスホスホロチオアート-改質オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）及びセンスＯＤＮは、Qiagen社（アラメダ、CA）により合成され精製された。配列は下記の通り:センス、5’-TCC-TGC-AAG-GAG-ACC-TTC-AC-3’ （SEQ ID NO: 19）；AS1：5’-GTG-CAG-GGA-TAG-CAG-GGC-CAT-3’（SEQ ID NO: 20）；AS10：5’-ATG-GAG-GCC-TCG-CTC-AGA-AA-3’（SEQ ID NO: 21）。siRNAは、USC/Norris Comprehensive Cancer Center Microchemical Core laboratory社により合成された。EphB4 siRNAの配列は、siRNA472の5’-GGU-GAA-UGU-CAA-GAC-GCU-GUU-3’（SEQ ID NO: 22）及びsiRNA2303の5’-cuc-uuc-cga-ucc-cac-cua-cuu-3’（SEQ ID NO: 23）である。スクランブルされたGAPDHに対する陰性コントロールsiRNAは、Ambion社（オースチン、TX）から購入した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
５）ワンステップＲＴ-ＰＣＲ及び量的ＲＴ-ＰＣＲ；
合計ＲＮＡをRNA STAT-60（商標、Tel-Test、Inc.社製、フレンズウッド、ＴＸ）を使用して前立腺癌標本及び隣接した正常標本から抽出した。量的ＲＴ-ＰＣＲ用にファーストストランドｃＤＮＡを５μｇの合計ＲＮＡからSuperScriptIII（商標、インビトロジェン社製、カールスバッド、ＣＡ）を使用して合成した。量的ＲＴ-ＰＣＲをStratageneＭＸ３０００Ｐシステム（商標、Stratagene社製、ラホーヤ、ＣＡ）でSYBR Green I Brilliant Mastermix（商標、Stragene社製）を使用して製造者の取り扱い説明書に従い行った。EphB4及びβ-アクチン（正常化遺伝子として使用）用の最適化反応は、１５０ｎＭのフォワードプライマー（β-アクチン、５’-ＧＧＡ-ＣＣＴ-ＧＡＣ-ＴＧＡ-ＣＴＡ-ＣＣＴ-Ａ-３’（SEQ ID NO: 24）；EphB4、５’-ＡＡＧ-ＧＡＧ-ＡＣＣ-ＴＴＣ-ＡＣＣ-ＧＴＣ-ＴＴ-３’（SEQ ID NO: 25））及びリバースプライマー（β-アクチン５'-ＴＴＧ-ＡＡＧ-ＧＴＡ-ＧＴＴ-ＴＣＧ-ＴＧＧ-ＡＴ-３’（SEQ ID NO: 26）；EphB4、５’-ＴＣＧ-ＡＧＴ-ＣＡＧ-ＧＴＴ-ＣＡＣ-ＡＧＴ-ＣＡ-３’（SEQ ID NO: 27））それぞれを使用して９５℃で１０分間、次に９５℃で３０秒、６０℃で１分間、７２℃で１分間のサイクル４０回によるポリメラーゼのＤＮＡ変性／活性化であった。遺伝子-特異的増幅の特異性を、単一解離ピークの存在により確認した。全反応を三個の複製物の試験においてＲＴでテンプレートなしの陰性コントロールを使用して行った。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
２）ＲＴ-ＰＣＲ；
合計ＲＮＡをランダム六量体（インビトロジェン社製）を使用して逆転写した。EphB4及びエフリンB2用プライマーをプライマー３ソフトウェアで設計した。全プライマー用配列は下記の通りである：EphB4フォワードプライマー及びEphB4リバースプライマー（例えば、実施例２参照）；エフリンB2フォワードプライマー及びエフリンB2リバースプライマー（例えば、実施例６参照）；Ｇ３ＰＤＨフォワードプライマー、５’-ＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴ-３’（SEQ ID NO: 28）；Ｇ３ＰＤＨリバースプライマー、５’-ＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧ-３’（SEQ ID NO: 29）；Clonetics（商標）キットをＰＣＲ用に使用した。ＰＣＲをＡＢＩＰＣＲシステム２７００（商標、Applied Bioシステム社製）を使用して行った。ＰＣＲ条件は９５℃５分間、次に９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間のサイクル３５回であった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
３）ジゴキシゲニン標識化ＲＮＡプローブ調製；
エフリン-Ｂ２及びEphB4ＰＣＲ生成物を、製造者の取り扱い説明書に従いｐＧＥＭ-Ｔ  Easyシステム（商標、Promega社製、マジソン、ＷＩ）を使用してクローン化した。プライマー及びＰＣＲ生成物は、５’-ｔｃｃｇｔｇｔｇｇａａｇｔａｃｔｇｃｔｇ-３’（SEQ ID NO: 30）（フォワード）、５’-ｔｃｔｇｇｔｔｔｇｇｃａｃａｇｔｔｇａｇ-３’（SEQ ID NO: 31）（リバース）ではエフリン-Ｂ２用に、２９６-ｂｐ生成物を生成し、５’-ｃｔｔｔｇｇａａｇａｇａｃｃｃｔｇｃｔｇ-３’（SEQ ID NO: 32）（フォワード）、５’-ａｇａｃｇｇｔｇａａｇｇｔｃｔｃｃｔｔｇ-３’（SEQ ID NO: 33）ではEphB4用に２９７-ｂｐ生成物を生成した。ＤＮＡ塩基配列決定により確実性及びインサート方向を再確認した。
ヒトエフリンB2又はEphB4遺伝子のＰＣＲ生成物を含有するｐＧＥＭ-Ｔ ＥａｓｙプラスミドをＳｐｅ  Ｉ又はＮｃｏ  Ｉで直鎖化した。アンチセンス又はセンスジゴキシゲニン（DIG）標識化ＲＮＡプローブを、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターから、ＤＩＧ ＲＮＡラベリングキット（商標、Roche社製、インディアナポリス、ＩＮ）を使用してランオフ転写により転写した。ＲＮＡプローブを、ＤＩＧＲＮＡラベリングキット取り扱い説明書に従いスポットアッセイにより定量化した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
【表１】
2006521111.tif 000001
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
【表３】
2006521111.tif 000002
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
【表４】
2006521111.tif 000003
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
【表５】
2006521111.tif 000004
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
【表６−１】
2006521111.tif 000005
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
【表６−２】
2006521111.tif 000006
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５４】
【表６−３】
2006521111.tif 000007
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５５】
【表６−４】
2006521111.tif 000008
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５６】
【表７−１】
2006521111.tif 000009
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
【表７−２】
2006521111.tif 000010
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
【表７−３】
2006521111.tif 000011
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
実施例９（エフリンB2アンチセンスプローブ及びＲＮＡｉプローブによるエフリンB2の遺伝子発現阻害）
ＫＳ  ＳＬＫ；内因性高レベルのエフリンB2を発現する細胞系。細胞生存能力を、一定の投薬量のそれぞれのオリゴヌクレオチド（５ＵＭ）を使用して試験した。遺伝子発現ダウンレギュレーションを、完全長エフリンB2を安定して発現するように設計された細胞系２９３を使用して行った。エフリンB2を発現するＫＳ  ＳＬＫも又一定の投薬量５０ｎＭで試験されたＲＮＡｉプローブへの応答である生存能力を試験するために使用した。蛋白質発現レベルを完全長エフリンB2を安定して発現する２９３細胞を使用して、一定の（fixed）５０ｎＭのＲＮＡｉプローブで２４時間処理後の細胞溶解産物中で測定した。
エフリンB2アンチセンスプローブについての結果は、下記表８にまとめた。エフリンB2ＲＮＡｉプローブについての結果は、下記表９にまとめた。
表８は、エフリンB2アンチセンスＯＤＮを示す。
表９は、エフリンB2ＲＮＡｉプローブを示す。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６０】
【表８−１】
2006521111.tif 000012
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
【表８−２】
2006521111.tif 000013
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６２】
【表８−３】
2006521111.tif 000014
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
【表９−１】
2006521111.tif 000015
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
【表９−２】
2006521111.tif 000016
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
実施例１０（EphB4抗体は腫瘍増殖を阻害する。）
図５７は、Ｇ２５０及びプルダウンアッセイによるEphB4モノクローナル抗体の比較結果を示す。
図５８は、EphB4抗体はマトリゲル及び増殖因子の存在下でＳＣＣ１５細胞のin vivo腫瘍増殖を阻害することを示す。
ＢａＩｂＣヌードマウスへ２．５×１０6の生存腫瘍細胞ＳＣＣ１５を皮下注射した。ＳＣＣ１５は、頭部及び頚部扁平上皮細胞癌系である。腫瘍は、nu/nuマウス中に、マトリゲル及び増殖因子並びにＡｂ’と予備混合した２．５〜５×１０6細胞を皮下注射して開始され、腫瘍異種移植が開始された。マウスを注射１４日後に解剖した。ＳＣＣ１５は頭部及び頚部扁平上皮細胞癌系であり、Ｂ１６は黒色腫細胞系であり、ＭＣＦ-７は乳癌系である。これらの処理に対する腫瘍の応答を、ＰＢＳ注射を受けたコントロール処理マウスと比較した。動物の腫瘍増殖を毎日観察し、皮下腫瘍をカリパスを使用して毎２日に測定した。抗体番号１及び２３は、コントロールと比較して、特に追加的増殖因子添加なしのコントロールではＳＣＣ１５腫瘍サイズの顕著な退縮を示した。
図５９は、EphB4抗体は、ＳＣＣ１５頭部癌及び頚部癌腫瘍種の、アポトーシス、壊死及び血管形成減少を引き起こすことを示す。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６６】
血管形成をＣＤ-３１免疫組織化学法により評価した。処理及び未処理のマウスからの腫瘍組織断片をＣＤ３１用に染色した。アポトーシスを免疫組織化学TUNNEL法により評価し、BrdUアッセイにより増殖した。外科的除去に続き、腫瘍を標準手順に従い直ちに２ｍｍ連続断片へスライスし、パラフィン中に包埋した。パラフィン包埋した組織を５μｍへ断片化し、ワックスを除去し、組織を再水和した。再水和した組織に、抗原賦活（retreival）液中でマイクロ波を照射した。スライドをＰＢＳで洗浄し、TUNNEL法反応混合物（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びフルオレセイン標識化ヌクレオチド溶液）及びBrdUを完全に光を遮断した湿性チャンバー中に加えた。次にTUNNEL及びBrdU反応混合物を除去し、スライドを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合している抗フルオレセイン抗体を添加した。インキュベーション及び洗浄後、３，３’ジアミノベンジジンを添加した。マッソン社製トリクローム（商標）及びヘマトキシリン及びエオシンも又スライドを染色して形態を画像化するために使用した。マッソン社製トリクローム（商標）は、壊死及び線維症の画像化を可能とした。腫瘍は腫瘍／皮膚、筋肉境界から血液サポートを得た。腫瘍が成長するに従い、内側領域は栄養が欠乏した。これは壊死（細胞死）を、好ましくは腫瘍中央で導く。細胞死後、（腫瘍）組織は、繊維芽細胞組織で置換される。スライドを、得られたデジタル画像を２０倍拡大して画像化した。ＳＣＣ腫瘍の、投与された抗体それぞれで異なる形態が得られた。Ａｂ番号１は、アポトーシスではなく壊死及び線維症の増加部分を示した。Ａｂ番号２３は、アポトーシス、壊死及び線維症の増加及び脈管湿潤物の減少を示した。Ａｂ番号３５は、壊死及び線維症の増加、並びにアポトーシスのわずかな増加並びに脈管湿潤物の減少を示した。Ａｂ番号７９はアポトーシス、ネクローシス及び線維症の大きな増加を示した。Ａｂ番号９１は、アポトーシスに変化は無く、増殖の増加を示した。Ａｂ番号１３８は、アポトーシス、壊死、線維症の増加並びに増殖及び脈管湿潤物の減少を示した。コントロールＰＢＳで処理した腫瘍は、高い腫瘍密度及び活発な血管形成応答を示した。EphB4抗体で処理した腫瘍は、生存腫瘍細胞の領域中の腫瘍細胞密度の減少及び腫瘍血管形成の顕著な阻害、並びに腫瘍壊死及びアポトーシスを示した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
図６０は、異種移植における抗体の全身的投与は、異種移植でのＳＣＣ１５腫瘍の腫瘍退縮を導くことを示す。
又、EphB4モノクローナル抗体又はコントロールとして同体積のＰＢＳでの隔日治療は、第４日、腫瘍が確立された後に開始して１４日間連続した。ＩＰ又はＳＣのいずれかの全身的投与を投与したが顕著な違いは無かった。全実験を実験者の先入観を除くためにダブル-ブラインド手順で実施した。マウスを２週間の治療期間終結時に犠牲にした。腫瘍を死後直ちに採取し、固定化し、免疫組織化学的に処理した。EphB4抗体４０ｍｇ／ｋｇ体重を投与した。EphB4抗体での処理は、コントロール処理マウスと比べてヒトＳＣＣ腫瘍の増殖を非常に阻害した（ｐ＜０．０５）。EphB4抗体での処理は、コントロール処理マウスと比べて腫瘍重量を非常に阻害した（ｐ＜０．０５）。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６８】
資料の組み込み
ここで挙げた全ての刊行物及び特許は、それぞれの個々の刊行物又は特許が資料として使用されるものとして特別に、別々に表されたように、その全体をここで資料として使用する。
本発明が所定の例示で示されていても、上記例示は説明のためであり本発明を限定するためではない。特許請求の範囲及び明細書の記載を基にして、本発明の多くの変形が当業者には理解できる。本発明の範囲は特許請求の範囲に従い定められ、それらの全ての均等物をも含むものである。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
【図１】Ｂ４ＥＣｖ３蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 386を示す。
【図２】Ｂ４ＥＣｖ３ＮＴ蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 387を示す。
【図３】Ｂ２ＥＣ蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 388を示す。
【図４】Ｂ４ＥＣｖ３-ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 389を示す。
【図５】Ｂ２ＥＣ-ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列SEQ ID NO: 390を示す。
【図６】Ｂ４ＥＣ-ＦＣ結合アッセイ（プロテインＡ-アガロースベース）を示す。
【図７】Ｂ４ＥＣ-ＦＣ阻害アッセイ（溶液中阻害）を示す。
【図８】Ｂ２ＥＣ-ＦＣ結合アッセイ（プロテインＡ-アガロースベースアッセイ）を示す。
【図９】Ｂ４Ｅｃｖ３に応答するＨＵＡＥＣ走化性を示す。
【図１０】Ｂ２ＥＣ-ＦＣに応答するＨＨＥＣの走化性を示す。
【図１１】Ｂ２ＥＣに応答するＨＨＡＥＣの走化性を示す。
【図１２】ＨＵＡＥＣ細管形成に対するＢ４Ｅｃｖ３の効果を示す。
【図１３】ＨＵＡＥＣ細管形成に対するＢ２ＥＣ-ＦＣの効果を示す。
【図１４】ヒトエフリンB2構成の概略図である。
【図１５】ヒトEphB4構成の概略図である。
【図１６】組み換え型可溶性EphB4ＥＣ蛋白質の領域構造を示す。
【図１７Ａ】EphB4ＥＣ蛋白質の精製（精製されたEphB4由来の組み換え型可溶性蛋白質のＳＤＳ-ＰＡＡＧゲル電気泳動）を示す。
【図１７Ｂ】EphB4ＥＣ蛋白質のリガンド結合性を示す。
【図１８】EphB4ｖ３が走化性を抑制することを示す。
【図１９Ａ】代表的試験でのＢ４ｖ３による細管形成の強い阻害を示す。
【図１９Ｂ】Ｂ４ｖ３濃度増加での管長さの減少及び結合数の減少を示す。
【図２０】可溶性EphB4は、ＭＴＳアッセイで評価した細胞毒性効果は検出されなかったことを示す。
【図２１】ネズミマトリゲル（商標）アッセイにおいてＢ４ｖ３は、内皮細胞による侵襲及び細管形成を抑制することを示す。
【図２２】EphB4由来の組み換え型可溶性蛋白質の存在下又はその非存在下で、エフリンB2-Fc融合での刺激に応答しての、ＰＣ３細胞中のEphB4レセプターのチロシンリン酸化を示す。
【図２３】生存能力（生存率）及び細胞周期に対する可溶性EphB4 ＥＣＤの効果を示す。
【図２４】Ｂ４ｖ３は、ネズミ角膜hydronマイクロポケットアッセイ中の新血管応答を阻害することを示す。
【図２５】ｓＢ４ｖ３とのＳＣＣ１５、Ｂ１６及びＭＣＦ-７の共注射は、マトリゲル及び増殖因子の存在下で、これらの細胞のin vivo腫瘍増殖を抑制することを示す。
【図２６】可溶性EphB4は３種の腫瘍種、Ｂ１６黒色腫、ＳＣＣ１５（頭部癌及び頚部癌）、及びＭＣＦ-７（乳癌）でアポトーシス、壊死及び血管形成減少を生じることを示す。
【図２７】前立腺細胞系でのEphB4の発現を示す。
【図２８】前立腺癌組織中のEphB4の発現を示す。
【図２９】腫瘍抑制剤による前立腺癌細胞中のEphB4のダウンレギュレーション及びＲＸＲ発現を示す。
【図３０】ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ-１による前立腺癌細胞中のEphB4のダウンレギュレーションを示す。
【図３１Ａ】発現及び前立腺細胞機能に対して特別なEphB4 ＡＳ-ＯＤＮ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）及びsiRNAの効果を示し、EphB4発現を阻害するsiRNA４７２の能力を評価するためにコントロールsiRNA（ＧＦＰsiRNA）又はEphB4 siRNA４７２でトランスフェクション後、EphB4モノクローナル抗体でプローブし、β-アクチンモノクローナル抗体で再プローブした細胞溶解産物のウェスタンブロット法を示す。
【図３１Ｂ】完全長EphB4を一時的に発現する２９３中での発現に対するEphB4 AS-１０の効果を示す。
【図３１Ｃ】方法段落記載のようにsiRNAで処理されたＰＣ３細胞の４８ｈ生存能力アッセイを示す。
【図３１Ｄ】方法段落記載のようにＯＤＮで処理したＰＣ３細胞の５日間生存能力アッセイを示す。
【図３１Ｅ】上記（Ａ）中でトランスフェクトされた５０ｎＭのsiRNAの存在下でのＰＣ３細胞の移動のスクレープアッセイを示す。
【図３２】細胞周期及びアポトーシスに関するEphB4 siRNA４７２の効果を示す。
【図３３】EphB4及びエフリンB2が中皮腫細胞系中で発現されたことをＲＴ-ＰＣＲ（Ａ）及びウェスタンブロット法（Ｂ）で確認されることを示す。
【図３４】中皮腫細胞中でのin situハイブリダイゼーションによるエフリンB2及びEphB4の発現を示す。
【図３５】中皮腫培養物中のEphB4及びエフリンB2の細胞性発現を示す。
【図３６】中皮腫腫瘍中のエフリンB2及びEphB4の発現を示す。
【図３７】Ｈ２８細胞の増殖に対するEphB4アンチセンスＯＤＮプローブの効果及びＨ２８細胞の増殖に対するEphB4 siRNAの効果を示す。
【図３８】細胞移動に対するEphB4アンチセンス（ＡＳ）プローブの効果及びＨ２８の移動に対するEphB4  siRNAの効果を示す。
【図３９Ａ】左側は、EphB4はＨＮＳＣＣ主要組織及び転移で発現したことを示し、上段が本発明のEphB4モノクローナル抗体で染色された部分が、腫瘍細胞に局在化した代表的保存用断片の免疫組織を示す。下段は、隣接する断片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。右側は、リンパ節転移の凍結断片であり、EphB4ポリクローナル抗体で染色され（上）コントロール（中央）はヤギ血清でのインキュベーションであり、Ｈ＆Ｅ（底部）は、染色されないストロマで囲まれた転移性病巣である。
【図３９Ｂ】ランオフ転写により生成された、DIG標識化EphB4（左）及びエフリンB2（右）のアンチセンス又はセンスプローブでプローブされたＨＮＳＣＣケースの連続凍結断片のin situハイブリダイゼーションを示す。左下は、腫瘍構造を示すＨ＆Ｅで染色された連続断片である。
【図３９Ｃ】正常組織（Ｎ）及びリンパ節バイオプシー（ＬＮ）から構成される患者サンプルの蛋白質抽出物のウェスタンブロット法を示す。
【図４０】EphB4はＨＮＳＣＣ細胞系中で発現し、ＥＧＦによりレギュレートされることを示す。
【図４１】ＥＧＦによるEphB4のレギュレーション機構を示す。
【図４２Ａ】特異的EphB4 siRNAは、EphB4発現、細胞生存能力を阻害し、細胞周期停止を引き起こすことを示し、安定して完全長EphB4を発現する２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（商標）を使用してＲＮＡｉでトランスフェクトした結果を示す。
【図４２Ｂ】siRNAで４８時間処理したＳＣＣ細胞系のＭＴＴ細胞生存能力アッセイを示す。
【図４２Ｃ】siRNAで上記のようにトランスフェクトされたＳＣＣ１５細胞を、トランスフェクション２４時間後、記載のようにフローサイトメトリーにより細胞周期段階を分析した結果を示す。
【図４３Ａ】ＳＣＣ細胞に対する特別なEphB4 ＡＳ-ＯＤＮのin vitro効果を示し、EphB4完全長発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした２９３細胞を、トランスフェクション６時間後上記アンチセンスＯＤＮで処理した結果を示す。
【図４３Ｂ】ＳＣＣ２５細胞を４８ウェルプレートへ均一密度で接種し、EphB4 ＡＳ-ＯＤＮで２及び４日処理した結果を示す。
【図４３Ｃ】未処理細胞（上部）と比較した３６時間ＡＳ-１０で処理したＳＣＣ１５細胞（底部）の細胞周期分析を示す。
【図４３Ｄ】プラスチックパスツールピペットでスクレープして単層中に３ｍｍ幅裂け目を作成したＳＣＣ１５細胞の融合培養物を示す。
【図４３Ｅ】２室アッセイ中の、ＥＧＦでのＳＣＣ１５細胞の移動を示す。
【図４３Ｆ】細胞数を５個の高性能視野中で計測した結果を示す。
【図４４】EphB4 ＡＳ-ＯＤＮはin vivo腫瘍増殖を抑制することを示す。
【図４５Ａ】EphB4ではなくエフリンB2がＫＳバイオプシー組織中で発現したことを示し、エフリンB2及びEphB4用アンチセンスプローブとのin situハイブリダイゼーション、及び腫瘍構造を示すためにＨ＆Ｅ染色された対応する断片を示す。
【図４５Ｂ】EphB4／Fc融合蛋白質でのエフリンB2の検出を示す。
【図４５Ｃ】エフリンB2及びＨＨＶ８潜伏蛋白質ＬＡＮＡ（潜伏感染関連核抗原）１の共発現を示す。
【図４６Ａ】ＨＨＶ-８は静脈性内皮細胞中での動脈性マーカー発現を誘起することを示し、動脈／静脈マーカー及びウィルス性蛋白質用のＨＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣ／ＢＣ-１の培養物の免疫蛍光を示す。
【図４６Ｂ】ＨＵＶＥＣ及び２個のＨＨＶ-８感染させた培養物の、エフリンB2及びEphB4に対するＲＴ-ＰＣＲを示す。
【図４７】ＨＨＶ-８はカポジ肉腫細胞中の動脈性マーカー発現を誘起することを示す。
【図４８】ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ-ＣがエフリンB2発現をレギュレートすることを示す。
【図４９Ａ】特異的siRNAでのエフリンB2ノックダウンは、ＶＥＧＦの存在下であり、ＩＧＦ、ＥＧＦ又はｂＦＧＦの非存在下でのＫＳ細胞中の生存能力及びＨＵＶＥＣ増殖を抑制することを示し、ＫＳ-ＳＬＫ細胞を種々のsiRNA、エフリンB2及びコントロールでトランスフェクトしたところ、等価ロード及び移動が示された。
【図４９Ｂ】エフリンB2及びEphB4 siRNAの存在下でのＫＳ-ＳＬＫ培養物の３日細胞生存能力アッセイを示す。
【図４９Ｃ】ＨＵＶＥ細胞をＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ml）又はＥＧＦ、ＦＧＦ及びＩＧＦを含有する培地でインキュベーションした結果を示す。
【図５０】可溶性EphB4は、ＫＳ及びＥＣコード形成及びin vivo血管形成を抑制することを示す。
【図５１】膀胱癌細胞系中でのEphB4の発現（Ａ）及びＥＧＦＲシグナル経路によるEphB4発現のレギュレーション（Ｂ）を示す
【図５２】ｐ５３のトランスフェクションは５６３７細胞中のEphB4の発現を阻害することを示す。
【図５３】EphB4 siRNA４７２での処理による膀胱癌細胞系（５６３７）の増殖阻害を示す。縦軸は生存能力を示す。
【図５４】EphB4 siRNA４７２でトランスフェクトされた５６３７細胞のアポトーシス研究の結果を示す。下のグラフの縦軸は４０５ｎｍでの吸光度である。
【図５５】EphB4アンチセンスプローブの細胞移動に対する効果を示す。
【図５６】EphB4 siRNAの細胞侵襲に対する効果を示す。
【図５７】Ｇ２５０及びプルダウンアッセイによるEphB4モノクローナル抗体の比較を示す。
【図５８】EphB4抗体はＳＣＣ１５／ＭＧ異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。
【図５９】EphB4抗体はＳＣＣ１５、頭部癌及び頚部癌腫瘍種の、アポトーシス、壊死及び血管形成減少を引き起こすことを示す。
【図６０】EphB4抗体の全身的投与は腫瘍退縮に導くことを示す。
【図６１ａ】ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
【図６１ｂ】ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
【図６１ｃ】ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
【図６１ｄ】ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
【図６１ｅ】ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
【図６１ｆ】ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
【図６１ｇ】ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
【図６１ｈ】ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 391を示す。
【図６２ａ】ヒトEphB4のｃＤＮＡヌクレオチド配列SEQ ID NO: 392を示す。
【図６２ｂ】ヒトEphB4のｃＤＮＡヌクレオチド配列SEQ ID NO: 392を示す。
【図６３ａ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｂ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｃ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｄ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｅ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｆ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｇ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｈ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｉ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｊ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｋ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｌ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６３ｍ】ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列SEQ ID NO: 393を示す。
【図６４ａ】ヒトエフリンB2のｃＤＮＡヌクレオチド配列SEQ ID NO: 394を示す。
【図６４ｂ】ヒトエフリンB2のｃＤＮＡヌクレオチド配列SEQ ID NO: 394を示す。
【図６５】ヒトEphB4のアミノ酸配列SEQ ID NO: 395を示す。
【図６６】ヒトエフリンB2のアミノ酸配列SEQ ID NO: 396を示す。