(57)【要約】  本開示は、増進したムチン結合および／または細胞付着特性を有する遺伝子改変された微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。例えば、本開示は、Ｃａｃｏ−２細胞への増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合性、およびムチンへの増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合性を呈する細菌を提供する。そのような微生物（例えば、細菌）を使用して、例えば、哺乳動物対象の胃腸管に生物活性ポリペプチドを送達することができる。記載された様式での微生物の改変は、微生物（例えば、細菌）についての胃腸内保持および通過時間のモジュレーションを可能とする。例示的な微生物（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの乳酸菌）は、ＣｍｂＡなどの細胞付着ポリペプチド、およびトレフォイル因子（ＴＦＦ）（例えば、ヒトＴＦＦ３）などのムチン結合ポリペプチドを含有する融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有する。本開示は、記載された微生物（例えば、細菌）の製造および使用方法をさらに提供する。
2019530446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）Ｎ末端のムチン結合ポリペプチドおよび（Ｂ）細胞壁アンカー性ドメインを含むＣ末端の細胞付着ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む乳酸菌（ＬＡＢ）。
【請求項２】
前記細胞付着ポリペプチドが、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）、ラクトコッカス（Lactococcus）ムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の菌。
【請求項３】
前記細胞付着ポリペプチドが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡなどのＣｍｂＡである、請求項２に記載の菌。
【請求項４】
前記ＣｍｂＡポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の菌。
【請求項５】
前記ムチン結合ポリペプチドが、トレフォイル因子（ＴＦＦ）１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３から選択されるＴＦＦである、請求項１に記載の菌。
【請求項６】
前記ＴＦＦポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の菌。
【請求項７】
前記融合タンパク質がＣｍｂＡおよびＴＦＦを含む、請求項１に記載の菌。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、ＳＳｕｓｐ４５などの分泌シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の菌。
【請求項９】
融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、ｈｌｌａプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、およびｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）からなる群から選択されるプロモーターによって転写調節される、請求項１に記載の菌。
【請求項１０】
ａ．サイトカイン、
ｂ．インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８などの、ＩＬ、
ｃ．抗ＴＮＦα抗体、ＩＬ−４に対する抗体、ＩＬ−５に対する抗体、ＩＬ−１３に対する抗体、ＩＬ−１５に対する抗体、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する抗体などの、抗体またはその断片、
ｄ．プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）、樹木花粉アレルゲン（カバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンなど）、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン（ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲンなどの、抗原、
ｅ．グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、グルカゴン、エキセンジン−４、上皮成長因子および成長ホルモンなどの、ホルモン、
ｆ．ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３などの、ＴＦＦ、
ｇ．フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノ酸デカルボキシラーゼなどの、酵素、ならびに
ｈ．任意のこれらの組合せ
から選択される少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１に記載の菌。
【請求項１１】
少なくとも１つの治療用ポリペプチドがＰＡＬである、請求項１０に記載の菌。
【請求項１２】
少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする前記外因性核酸がｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）によって転写調節される、請求項１０に記載の菌。
【請求項１３】
ラクトバチルス（Lactobacillus）種細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）種細菌、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種細菌、およびラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などのラクトコッカス（Lactococcus）種細菌からなる群から選択される、請求項１に記載のＬＡＢ。
【請求項１４】
融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む前記菌が、前記融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を含まない対応する菌と比べた時に、
ａ．少なくとも１０％増加した胃腸（ＧＩ）通過時間、および／または
ｂ．少なくとも１０％増加した腸粘膜への付着、および／または
ｃ．少なくとも２０％増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力、および／または
ｄ．少なくとも１０％増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２細胞結合能力
を有する、請求項１に記載の菌。
【請求項１５】
ａ．大腸菌（Escherichia coli）ｏｔｓＢの挿入、
ｂ．ｕｓｐ４５プロモーター、ｕｓｐ４５、およびトレハロース−６−リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸、および任意選択で、前記ｕｓｐ４５とトレハロース−６−リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域を含むポリシストロン性発現カセットの挿入、
ｃ．ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の３’に位置する、トレハローストランスポーターｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４を含むポリシストロン性発現カセットの挿入、
ｄ．ｔｒｅＰＰの不活性化、
ｅ．ｐｔｃＣの不活性化、ならびに
ｆ．（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組合せ
から選択される、トレハロース蓄積を増加させる少なくとも１つの変異または挿入をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の菌。
【請求項１６】
先行請求項１のいずれか１項に記載の菌、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、および胃腸疾患からなる群から選択される疾患の治療または予防における、請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患、および栄養欠陥からなる群から選択される疾患の治療または予防のための医薬の調製のための、請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の組成物を投与することを含み、前記疾患が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、セリアック病、炎症性腸疾患、およびフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）から選択される、方法。
【請求項２０】
ａ．細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、Ｍｕｂ、ＭａｐＡ、ＭｂｐＬ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される細胞付着ポリペプチドをコードする配列、ならびに
ｂ．ＴＦＦポリペプチド、ＭｕｂＢＰ、およびこれらの組合せから選択されるムチン結合ポリペプチドをコードする配列
を含む、融合タンパク質をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月１３日に出願された米国仮出願第６２／３９４，０２４号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、この配列表は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年９月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０５３５０＿００３１＿００＿ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１２２，６４３バイトの大きさである。
【背景技術】
【０００３】
粘膜組織に治療用分子を送達するために、遺伝子改変された微生物（例えば、細菌）が使用されてきた。例えば、Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789; Robert S. and Steidler L., Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11; Braat et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2006, 4(6):754-759; およびSteidler et al., Science 2000, 289(5483):1352-1355を参照。
【０００４】
改善された薬物動態および薬力学特性を有する微生物（例えば、細菌）株の必要性、およびそのような遺伝子改変された細菌を用いて治療できる様々な疾患を治療するための有効な、標的化された、かつ制御された方法の必要性が当該技術分野において存在する。本開示はこれらの必要性に応えるものである。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、増進した細胞付着および／またはムチン結合特性を有する微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。例えば、本開示は、Ｃａｃｏ−２細胞への増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合性、およびムチンへの増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合性を呈する細菌を提供する。そのような微生物（例えば、細菌）を使用して、例えば、哺乳動物対象の胃腸管に生物活性ポリペプチドを送達することができ、記載された遺伝子改変は、微生物（例えば、細菌）の胃腸内保持および通過時間のモジュレーションを可能とする。記載された技術は、微生物（例えば、細菌）によって発現される生物活性ポリペプチドの薬物動態および薬力学特性のモジュレーションを可能とする。例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの乳酸菌（ＬＡＢ）の細胞壁におけるトレフォイル因子（ＴＦＦ）および細胞付着ポリペプチド（ＣｍｂＡなど）（例えば、Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681を参照）を含有する融合タンパク質（例えば、ＴＦＦ３−ＣｍｂＡ）の発現、分泌およびアンカーは、腸上皮細胞への細菌の付着を可能とし、かつムチンへの細菌の結合をさらに可能とする。
【０００６】
組成物
一部の態様では、本開示は、細胞付着ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。一部の例では、本開示は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌または酵母）であって、融合タンパク質をコードする外因性核酸が細胞付着ポリペプチドをコードする配列を含有する、微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、細胞および粘液結合プロテインＡ（cell and mucus-binding protein A）（ＣｍｂＡ）（例えば、Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681を参照）、粘液結合タンパク質（mucus binding protein）またはｍｕｂドメインタンパク質（Ｍｕｂ）（例えば、Boekhorst et al., Microbiology 2006, 152(1):273-280を参照）、粘液付着促進タンパク質（mucus adhesion promoting protein）（ＭａｐＡ）（例えば、Miyoshi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70(7):1622-8を参照）、ラクトコッカス（Lactococcus）ムチン結合タンパク質（lactococcal mucin binding protein）（ＭｂｐＬ）（例えば、Lukic et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000を参照）からなる群から選択される。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡアンカー断片（ＳｐａＸ）などの細胞壁アンカー性ペプチドを加えてもよい（例えば、Steidler et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(1):342-5を参照）。一部の例では、本開示は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌または酵母）であって、融合タンパク質がＣｍｂＡポリペプチドを含む、微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。一部の例では、ＣｍｂＡポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡである。例えば、上掲のJensen et al.に開示される例えばＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７４を参照。上記実施形態のいずれかによる一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣｍｂＡポリペプチドである。上記実施形態のいずれかによる他の例では、細胞付着ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の外因性核酸配列によってコードされるＣｍｂＡポリペプチドである。
【０００７】
上記実施形態のいずれかによる他の例では、融合タンパク質は、トレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチド（例えば、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、またはＴＦＦ３）またはＭｕｃＢＰポリペプチドなどのムチン結合ポリペプチドを含む（例えば、Lukic et al, Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000を参照）。したがって、一部の例では、本開示は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌または酵母）であって、融合タンパク質が細胞付着ポリペプチド（例えば、ＣｍｂＡポリペプチド）およびムチン結合ポリペプチド（例えば、ＴＦＦポリペプチド）を含有する、微生物（例えば、細菌または酵母）を提供する。一部の例では、ＴＦＦポリペプチドは、ヒトＴＦＦポリペプチド（例えば、ｈＴＦＦ１、ｈＴＦＦ２、またはｈＴＦＦ３）である。上記実施形態のいずれかによる一部の例では、ムチン結合ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ３ポリペプチドである。上記実施形態のいずれかによる他の例では、ムチン結合ポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の外因性核酸配列によってコードされるヒトＴＦＦ３ポリペプチドである。一部の例では、ＴＦＦポリペプチドは、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、またはウマのＴＦＦなどの、哺乳動物のＴＦＦポリペプチドである。さらなる例では、ＴＦＦは両生動物のＴＦＦである。例示的なＴＦＦポリペプチドは、例えば、Conlon et al., Peptides 2015, 72:44-49およびその参照文献（これらの開示のそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。他の例では、ＴＦＦポリペプチドはトレフォイル様ドメインである。この実施形態による例示的なポリペプチドはFujita et al., Mol. Reprod. Dev. 2006, 75(7):1217-1228（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０００８】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、本開示は、（１）ＴＦＦポリペプチド（例えば、ヒトＴＦＦ１、ヒトＴＦＦ２、またはヒトＴＦＦ３）およびＭｕｃＢＰポリペプチドから選択されるムチン結合ポリペプチド、および（２）ＣｍｂＡポリペプチド、Ｍｕｂポリペプチド、ＭａｐＡポリペプチド、ＭｂｐＬポリペプチド、およびＳｐａＸポリペプチドから選択される細胞付着ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む細菌（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの乳酸菌）を提供する。この実施形態による一部の例では、融合タンパク質は、ＣｍｂＡポリペプチド（例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡ）およびＴＦＦポリペプチド（例えば、ヒトＴＦＦ１、ヒトＴＦＦ２、またはヒトＴＦＦ３）を含有する。
【０００９】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、微生物の染色体、例えば細菌の染色体に組み込まれている。一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、微生物（例えば、細菌）中で構成的に発現される。他の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、プラスミド上に位置する。
【００１０】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質は、微生物（例えば、細菌）によって発現される。他の例では、融合タンパク質は、微生物（例えば、細菌）の細胞壁にアンカーされる。例えば、融合タンパク質は、微生物（例えば、細菌）の表面（すなわち、外膜）に提示される。
【００１１】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、分泌シグナルペプチドをコードする分泌リーダー配列をさらに含む。一部の例では、分泌リーダー配列は、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（Ｕｓｐ４５）の分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列を含有する。そのような分泌リーダー配列またはペプチドは、本明細書ではＳＳｕｓｐ４５と称される。一部の例では、ＳＳｕｓｐ４５は、配列番号５に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。他の例では、ＳＳｕｓｐ４５は、配列番号６または配列番号７に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列によってコードされる。グラム陽性菌に由来する任意の分泌リーダー配列、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）に由来する任意の分泌リーダー配列は、上記実施形態の文脈で有用である。上記実施形態のいずれかによるさらなる例では、分泌シグナルペプチド（例えば、ＳＳｕｓｐ４５）は、ＴＦＦポリペプチドなどのムチン結合ポリペプチドに結合している。この実施形態による一部の例では、ＳＳｕｓｐ４５は、ヒトＴＦＦポリペプチドに結合している。例えば、融合タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み得る。他の例では、融合タンパク質は、配列番号９に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含有する外因性核酸配列によってコードされ得る。
【００１２】
他の例では、微生物（例えば、細菌）は、ＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂＡポリペプチドを含有する融合タンパク質をコードする外因性核酸を含み、分泌シグナルペプチドがＴＦＦポリペプチド（例えば、ＳＳｕｓｐ４５）に結合している。例えば、融合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含み得る（またはそれからなり得る）。他の例では、融合タンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含有する（またはそれからなる）外因性核酸配列によってコードされ得る。
【００１３】
一部の例では、分泌シグナルペプチドは、リンカーペプチドを含む。一部の例では、分泌シグナルペプチドは、例えば、融合タンパク質が微生物（例えば、細菌）の細胞壁にアンカーされている時に、該融合タンパク質から切断される。
【００１４】
一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、微生物（例えば、細菌）に内因性のプロモーターによって転写調節される（例えば、その制御下に置かれる）。他の例では、融合タンパク質の発現は、外因性プロモーターによって制御される。一部の例では、プロモーターは、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、ｈｌｌａプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、およびｇａｐＢプロモーターから選択される。一部の例では、融合タンパク質をコードする核酸は、ＰｔｈｙＡプロモーターによって転写調節される。他の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ＰｈｌｌＡプロモーターによって転写調節される。他のプロモーターとしては、遺伝子ｈｏｌＡ、ｓｏｄａ、ｅｎｏＡ、ｔｕｆａ、ｆｂａＡ、ａｃｐＡ、ｐｓ４３１、ｍａｌＧ、ｐｔｓＨ、ｄｐｓＡ、ｐｇｋ、ａｈｐＣ、ｐｄｈＤ、ｐｔｓ＿ＩＩ、ｐｆｋ、ｔｒｅＰＰ、ｐｔｎＤ、ｐｇｉＡ、ｕｓｐ４５に先行するものが挙げられる。他の好適なプロモーターは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１０５８６３号明細書（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００１５】
本開示は、（例えば、微生物、例えば細菌の細胞壁にアンカーされた）融合タンパク質を含む微生物（例えば、細菌）であって、融合タンパク質がＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂＡポリペプチドを含む、微生物（例えば、細菌）をさらに提供する。一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、分泌リーダー配列、ＴＦＦポリペプチドをコードする配列、およびＣｍｂＡポリペプチドをコードする配列を含む外因性核酸を含む。一部の例では、分泌リーダー配列は、分泌シグナルペプチドをコードし、分泌シグナルペプチドは、例えば、融合タンパク質が微生物（例えば、細菌）の細胞膜を通過する（例えば、細胞壁にアンカーされる）時に、該融合タンパク質から切断される。
【００１６】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物は細菌である。上記実施形態のいずれかによる他の例では、そのような細菌は、グラム陽性菌、例えば非病原性グラム陽性菌である。上記実施形態のいずれかによる他の例では、細菌は乳酸菌（ＬＡＢ）である。例示的な乳酸菌は本明細書に開示されており、これらのそれぞれは、これらの実施形態の文脈において使用することができる。一部の実施形態では、ＬＡＢは、ラクトコッカス（Lactococcus）種細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）種細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）種細菌、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種細菌からなる群から選択される。一部の例では、ＬＡＢはラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。他の例では、ＬＡＢは、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、およびラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）から選択される。一部の例では、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＭＧ１３６３などのラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）である。
【００１７】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、ＴＦＦポリペプチドおよび細胞付着ポリペプチド（例えば、ＣｍｂＡ）を含む融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む。この実施形態による一部の例では、ＴＦＦポリペプチドは、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３から選択される。この実施形態による他の例では、ＴＦＦポリペプチドは、ヒトＴＦＦ、マウスＴＦＦ、ブタＴＦＦ、イヌＴＦＦ、ネコＴＦＦ、ウシＴＦＦ、およびヒツジＴＦＦから選択される。一部の例では、ＴＦＦポリペプチドはヒトＴＦＦである。他の例では、ＴＦＦポリペプチドは、ヒトＴＦＦ１、ヒトＴＦＦ２、およびヒトＴＦＦ３から選択される。さらに他の例では、ＴＦＦポリペプチドはヒトＴＦＦ３である。一部の例では、ＴＦＦポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。他の例では、ＴＦＦポリペプチドは、ＴＦＦバリアントポリペプチド、例えば、対応する野生型ＴＦＦポリペプチドと比べた時に増進したムチン結合能力を有するＴＦＦバリアントポリペプチドである。他の例では、ＴＦＦポリペプチドは、両生動物または魚のＴＦＦポリペプチドである。
【００１８】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含有する。一部の例では、治療用ポリペプチドは、インターロイキン（ＩＬ）などのサイトカインである。サイトカインの選択は、どの宿主応答を活性化または抑制しようとするかに基づいて為される。一部の例では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、またはＩＬ−２２である。他の例では、治療用ポリペプチドは抗原である。他の例では、治療用ポリペプチドは、抗原およびインターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、またはＩＬ−２２など）である。これらの実施形態のいずれかによる一部の例では、抗原は、自家抗原、例えばＴ１Ｄ特異的抗原である。例示的なＴ１Ｄ特異的抗原としては、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）、およびこれらの組合せが挙げられる。上記Ｔ１Ｄ特異的抗原の例示的なアミノ酸配列および核酸配列は、例えば、国際特許出願公開第２０１７／１２２１８０号パンフレット（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。他の例では、抗原は、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、またはこれらの組合せなどのアレルゲンである。一部の例では、アレルゲンは、雑草花粉アレルゲン、例えばブタクサ花粉アレルゲンである。他の例では、アレルゲンは、カバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンなどの樹木花粉アレルゲンである。さらに他の例では、アレルゲンは、ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、またはこれらの組合せなどの食物アレルゲンである。
【００１９】
さらなる例では、治療用ポリペプチドは、抗体またはその断片である。例えば、抗体は、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科動物またはサメ抗体）またはナノボディである。例示的な抗体としては、ＩＬ−４に対する抗体、ＩＬ−５に対する抗体、ＩＬ−７に対する抗体、ＩＬ−１３に対する抗体、ＩＬ−１５に対する抗体の他に、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する抗ＴＮＦα抗体、および任意のこれらの断片などのサイトカイン中和抗体が挙げられる。一部の例では、治療用ポリペプチドは融合タンパク質である。例えば、治療用ポリペプチドは、ＴＮＦ受容体（例えば、可溶性ＴＮＦ受容体２）などの可溶性受容体、および抗体または抗体断片（抗体のＦｃ領域など）を含む。これらの実施形態による一部の例では、治療用ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ）を含有する。一部の例では、治療用ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合した可溶性ＴＮＦ受容体２を含む。一部の例では、治療用ポリペプチドはエタネルセプトである。
【００２０】
さらに他の例では、治療用ポリペプチドは、酵素またはその断片（例えば、機能的断片）、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せである。一例では、治療用ポリペプチドは、ＰＡＬ、またはその機能的断片である。
【００２１】
さらなる例では、治療用ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、グルカゴン、エキセンジン−４、または任意のこれらの組合せである。他の例では、治療用ポリペプチドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（例えば、ヒトＥＧＦまたはブタＥＧＦ）などの成長因子である。さらに他の例では、治療用ポリペプチドは、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＴＦＦ３、またはこれらの組合せなどのＴＦＦである。
【００２２】
治療用ポリペプチドは、上記の治療用ポリペプチドのいずれかの組合せであってもよい。
【００２３】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸は、ｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、およびｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）から選択されるプロモーターによって転写調節される。一部の例では、少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸は、ｇａｐＢプロモーターによって転写調節される（例えば、その制御下にある）。他のプロモーターとしては、遺伝子ｈｏｌＡ、ｓｏｄａ、ｅｎｏＡ、ｔｕｆａ、ｆｂａＡ、ａｃｐＡ、ｐｓ４３１、ｍａｌＧ、ｐｔｓＨ、ｄｐｓＡ、ｐｇｋ、ａｈｐＣ、ｐｄｈＤ、ｐｔｓ＿ＩＩ、ｐｆｋ、ｔｒｅＰＰ、ｐｔｎＤ、ｐｇｉＡ、ｕｓｐ４５に先行するものが挙げられる。他の好適なプロモーターは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１０５８６３号明細書（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００２４】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、トレハロースの蓄積を促進し、胆汁塩および乾燥に対するＬＡＢの生存能力を増進させる、変異および挿入の組合せをさらに含む。例えば、これらは、
（ｉ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞トランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（ｉｉ）トレハロース−６−リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、
（ｉｉｉ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、ならびに
（ｉｖ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３０）
であり得る。
【００２５】
例えば、トレハロース−６−リン酸ホスファターゼ、例えば、大腸菌（Escherichia coli）ｏｔｓＢなどのｏｔｓＢをコードする外因性核酸。これらの実施形態による一部の例では、トレハロース−６−リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸は、染色体に組み込まれている。一部の例では、トレハロース−６−リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸は、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５）の３’において染色体に組み込まれている。この実施形態による一部の例では、ＬＡＢは、ｕｓｐ４５プロモーター、ｕｓｐ４５遺伝子（例えば、プロモーターの３’）、およびトレハロース−６−リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸（例えば、ｕｓｐ４５遺伝子の３’）を含む第２のポリシストロン性発現カセットを含む。一部の例では、第２のポリシストロン性発現カセットは、ｕｓｐ４５遺伝子とトレハロース−６−リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸との間の遺伝子間領域をさらに含む。一部の例では、第２のポリシストロン性発現カセットは、Ｐｕｓｐ４５＞＞ｕｓｐ４５＞＞遺伝子間領域＞＞ｏｔｓＢによって表される。これらの実施形態による一部の例では、遺伝子間領域は、本明細書に上記されるｒｐｍＤ（例えば、配列番号８または配列番号９を有する）である。したがって、第２のポリシストロン性発現カセットは、Ｐｕｓｐ４５＞＞ｕｓｐ４５＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｏｔｓＢによって表され得る。
【００２６】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ）は、微生物（例えば、ＬＡＢ）において破壊または不活性化されている。例えば、ｔｒｅＰＰは、ｔｒｅＰＰ遺伝子もしくはその断片を除去することによって不活性化されているか、または、ｔｒｅＰＰは、終止コドンを挿入することによって破壊されている。したがって、これらの実施形態による一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、ｔｒｅＰＰ活性を欠いている。
【００２７】
上記実施形態のいずれかによる他の例では、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント遺伝子（ｐｔｃＣ）は、微生物（例えば、ＬＡＢ）において破壊または不活性化されている。例えば、ｐｔｃＣは、終止コドンを挿入することによって破壊されているか、または、ｐｔｃＣは、ｐｔｃＣもしくはその断片を除去することによって不活性化されている。したがって、これらの実施形態による一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、ｐｔｃＣ活性を欠いている。
【００２８】
上記実施形態のいずれかによる他の例では、ＬＡＢは、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子をさらに含む。一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、ＬＡＢに内因性である。一部の例では、ＬＡＢは、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子を過剰発現する。これらの実施形態による一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、外因性プロモーター、例えばｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の３’に位置する。例えば、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、ＰｈｌｌＡによって転写調節される。これらの実施形態による一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、ｌｌｍｇ＿０４５３、ｌｌｍｇ＿０４５４、および任意のこれらの組合せから選択される。一部の例では、ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４は、ＰｈｌｌＡによって転写調節される。
【００２９】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、１つまたは複数のトレハローストランスポーターをコードする１つまたは複数の遺伝子は、２つまたはそれより多くのトレハローストランスポーターをコードする２つの遺伝子を含み、遺伝子間領域が該２つの遺伝子の間に配置されている。一部の例では、遺伝子間領域は、例えば配列番号８または配列番号９を有する、ｒｐｍＤである。一部の例では、微生物（例えば、ＬＡＢ）は、２つの異なるトレハローストランスポーターをコードする２つの核酸配列（例えば、遺伝子）（トランスポーター１およびトランスポーター２の配列）および該２つの異なるトレハローストランスポーターをコードする２つの核酸の間の遺伝子間領域を含むポリシストロン性発現カセットを含む。そのような発現カセットは、ＰｈｌｌＡ＞＞トランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２によって表され得る。これらの実施形態による一部の例では、遺伝子間領域は、本明細書に上記されるｒｐｍＤ（例えば、配列番号８または配列番号９を有する）である。したがって、ポリシストロン性発現カセットは、ＰｈｌｌＡ＞＞トランスポーター１＞＞ｒｐｍＤ＞＞トランスポーター２によって表され得る。
【００３０】
したがって、一部の実施形態では、ＬＡＢは、単一株において、いくつもの有用な特色を含む。一実施形態では、ＬＡＢは、
（Ａ）染色体に組み込まれたプロモーター＞＞分泌シグナル＞＞ムチンおよび細胞付着融合タンパク質、
（Ｂ）１つまたは複数の染色体に組み込まれたプロモーター＞＞分泌シグナル＞＞治療用タンパク質、
（Ｃ）トレハロースの蓄積を促進し、胆汁塩および乾燥に対するＬＡＢの生存能力を増進させる、変異および挿入の組合せ
を含む、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。該変異は、
（ｉ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞トランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（ｉｉ）トレハロース−６−リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、
（ｉｉｉ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、および
（ｉｖ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３０）
から選択される。
ＬＡＢはまた、ｔｈｙＡなどの、生物学的封じ込めのための栄養要求性変異を含有してもよい。これらの機能（すなわち、ムチンおよび細胞付着、治療用タンパク質、トレハロース蓄積）の１つまたは複数は、ポリシストロン性オペロン中にあってよく、ポリシストロン性オペロンでは各遺伝子は遺伝子間領域によって隔てられていてもよい。
【００３１】
一実施形態では、ＬＡＢは、
（Ａ）生物学的封じ込めのための、ｔｈｙＡの変異、
（Ｂ）粘液および細胞結合融合タンパク質を細胞壁に輸送し、連結させるための、染色体に組み込まれたＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ｃｍｂＡ、
（Ｃ）ＬＡＢから成熟ＰＡＬを分泌させるための、染色体に組み込まれたＰｇａｐＢ＞＞ｇａｐＢ＞＞遺伝子間領域（ｒｐｍＤなど）＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｐａｌ、
（Ｄ）トレハロースの取込みのための、ｌｌｍｇ＿０４５３および／またはｌｌｍｇ＿０４５４などの、染色体に組み込まれたトレハローストランスポーター（ＰｈｌｌＡ＞＞トランスポーター１＞＞遺伝子間領域＞＞トランスポーター２など）、
（Ｅ）（例えば、遺伝子の欠失を通じて）不活性化されたトレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）、
（Ｆ）トレハロース−６−リン酸のトレハロースへの変換を促進する、ｕｓｐ４５（遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流に位置する、染色体に組み込まれたトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）、および
（Ｇ）不活性化されたセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）ｐｔｃＣ（例えば、４４６のうちコドン位置３０のｔｇａ；ｔｇａ３０）
を含む、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。
【００３２】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、記載された遺伝子改変を含まない、すなわち、融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べた時に増加した胃腸（ＧＩ）通過時間を有する。一部の例では、ＧＩ通過時間は、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約１００％（約２倍）増加している。他の例では、ＧＩ通過時間は、少なくとも約１０％から約５００％、少なくとも約２０％から約４００％、少なくとも約２０％から約３００％、少なくとも約２０％から約３００％、または少なくとも約３０％から約３００％増加している。
【００３３】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、本明細書に記載されるように遺伝子改変されていない、すなわち、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含まないまたは融合タンパク質を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べた時に増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力を呈する。一部の例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％（約２倍）増加している。他の例では、ムチン結合能力は、少なくとも約１０％から約５００％、少なくとも約１０％から約４００％、少なくとも約１０％から約３００％、少なくとも約１０％から約２００％、少なくとも約２０％から約２００％、少なくとも約２０％から約３００％、または少なくとも約２０％から約５００％増加している。
【００３４】
ムチン結合能力は、任意の当該技術分野で認識される方法、例えば本明細書に記載される方法にしたがって、測定することができる。一部の例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力は、固定化されたムチン（例えば、ブタ胃からのムチン）に微生物（例えば、細菌）を接触および結合させ、例えば、適切な波長、例えば４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０５）を検出するか、または結合した微生物細胞（例えば、結合した細菌細胞）を色素（例えば、クリスタルバイオレット）で染色した後に、用いた色素にとって適切な波長で吸光度を検出することによって、ムチンに結合した微生物細胞（例えば、細菌細胞）の数を測定することによって測定される。例えば、ムチンに結合した細菌細胞を染色するためにクリスタルバイオレットが使用される場合、５９５ｎｍで吸光度を測定することができる（ＯＤ５９５）。
【００３５】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、記載された遺伝子改変を有しない、すなわち、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含まないまたは融合タンパク質を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べた時に増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２細胞結合能力を呈する。一部の例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２結合能力は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約１００％（約２倍）、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、または少なくとも約４００％（約５倍）増加している。他の例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２結合能力は、少なくとも約１０％から約２００％、少なくとも約１０％から約３００％、少なくとも約１０％から約４００％、または少なくとも約１０％から約５００％増加している。Ｃａｃｏ−２細胞結合能力は、本明細書に開示される方法などの任意の当該技術分野で認識される方法にしたがって測定することができる。例えば、Ｃａｃｏ−２結合能力は、（ｉ）微生物（例えば、細菌）、例えば、微生物（例えば、細菌）の培養物をＣａｃｏ−２細胞と接触させること、（ｉｉ）Ｃａｃｏ−２細胞を洗浄して未結合の微生物（例えば、細菌細胞）を除去すること、（ｉｉｉ）Ｃａｃｏ−２細胞に結合した微生物細胞（例えば、細菌細胞）を脱着すること、および（ｉｖ）例えば本明細書に記載されるように、脱着した細菌細胞の数を決定すること（すなわち、脱着した細胞を滴定すること）によって測定される。
【００３６】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、記載された遺伝子改変を有しない、すなわち、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含まないまたは融合タンパク質を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べた時に増加した腸粘膜への付着を呈する。一部の例では、腸粘膜への微生物（例えば、細菌）の付着は、少なくとも約１０％から約１００％（約２倍）、少なくとも約１０％から約２００％、少なくとも約１０％から約４００％、または少なくとも約１０％から約５００％増加している。
【００３７】
本開示は、本開示の微生物（例えば、細菌）、例えば、上記実施形態のいずれかに記載された微生物（例えば、細菌）を含む組成物をさらに提供する。例えば、本開示は、（例えば、微生物、例えば細菌の細胞壁にアンカーされた）融合タンパク質を含む微生物（例えば、細菌）を含む組成物であって、融合タンパク質がＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂＡポリペプチドを含む組成物を提供する。一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、分泌リーダー配列（例えば、ＳＳｕｓｐ４５）、ＴＦＦポリペプチドをコードする配列、およびＣｍｂＡポリペプチドをコードする配列を含む外因性核酸を含む。一部の例では、分泌リーダー配列は、分泌シグナルペプチドをコードし、該分泌シグナルペプチドは、例えば、融合タンパク質が細菌の細胞膜を通過している時に、融合タンパク質から切断される。
【００３８】
本開示は、本開示の微生物（例えば、細菌）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。例えば、医薬組成物は、上記実施形態のいずれかに記載された微生物（例えば、細菌）を含有する。
【００３９】
本開示は、疾患の治療において使用するための本開示の微生物（例えば、細菌）、または本開示の組成物（例えば、医薬組成物）をさらに提供する。本開示は、疾患の予防または治療のための医薬の調製において使用するための微生物（例えば、細菌）または組成物（例えば、医薬組成物）をさらに提供する。これらの実施形態のいずれかによる一部の例では、疾患は、自己免疫疾患、アレルギー、栄養性または代謝性疾患、胃腸疾患、および遺伝的障害から選択される。本開示の微生物（例えば、細菌）および組成物を使用して治療できるさらなる疾患が本明細書に記載される。
【００４０】
本開示は、融合タンパク質をコードする単離された核酸であって、（ｉ）ＴＦＦポリペプチド（例えば、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、またはＴＦＦ３）またはＭｕｃＢＰポリペプチドなどのムチン結合ポリペプチドをコードする配列、および（ｉｉ）ＣｍｂＡポリペプチド、Ｍｕｂポリペプチド、ＭａｐＡポリペプチド、またはＭｂｐＬポリペプチドなどの細胞付着ポリペプチドをコードする配列を含む、核酸をさらに提供する。これらの実施形態による一部の例では、細胞付着ポリペプチドはＣｍｂＡポリペプチドである。したがって、本開示は、融合タンパク質をコードする単離された核酸であって、（ｉ）ＴＦＦ１（例えば、ヒトＴＦＦ１）、ＴＦＦ２（例えば、ヒトＴＦＦ２）、またはＴＦＦ３（例えば、ヒトＴＦＦ３）などのＴＦＦポリペプチドをコードする配列、および（ｉｉ）ＣｍｂＡポリペプチドをコードする配列を含有する、核酸を提供する。
【００４１】
本開示は、本開示の単離された核酸、例えば上記実施形態のいずれかによる単離された核酸を含むプラスミドをさらに提供する。
【００４２】
本開示は、本開示の単離された核酸または本開示のプラスミドを含む微生物（例えば、細菌）宿主細胞をさらに提供する。
【００４３】
本開示は、（１）本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物、医薬組成物、または単位剤形、および（２）微生物（例えば、細菌）、組成物、医薬組成物、または単位剤形を、動物またはヒトの対象または患者などの哺乳動物に投与するための説明書を含むキットをさらに提供する。
【００４４】
方法
本開示は、それを必要とする対象において疾患を治療する方法をさらに提供する。例示的な方法は、対象に治療有効量の本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物、または医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態による一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、本明細書に記載される治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。本開示のそのような微生物（例えば、細菌）および組成物を使用して治療できる例示的な疾患が本明細書に記載される。一部の例では、疾患は、自己免疫疾患、アレルギー、栄養性もしくは代謝性疾患、胃腸疾患、遺伝的障害、または任意のこれらの組合せである。上記実施形態のいずれかによる一部の例では、疾患は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）などの自己免疫疾患である。他の例では、疾患は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）などの代謝性疾患である。他の例では、疾患は、セリアック病、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸疾患、例えば、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎である。さらなる例では、疾患は成長遅延である。
【００４５】
一部の実施形態では、疾患はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。この実施形態による一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、ポリペプチド（例えば、例えば微生物を投与されている対象によってＰｈｅが吸収される前に、例えばＧＩ管において、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）を分解できる酵素）をコードする外因性核酸を含む。これらの実施形態による一部の例では、微生物（例えば、細菌）は、Ｐｈｅをケイ皮酸に変換する酵素であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする外因性核酸を含む。したがって、本開示は、それを必要とする対象においてＰＫＵを治療する方法を提供する。例示的な方法は、対象に治療有効量の本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物、または医薬組成物を投与することを含み、微生物（例えば、細菌）は、ＰＡＬをコードする外因性核酸を含む。Ｐｈｅ吸収の阻害およびＰＫＵの治療は、例えば、（ｅｎｕ２／２）マウスを利用するマウスＰＫＵモデルを使用して（例えば、Sarkissian, C. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 2339-2344を参照）、またはラットモデルを使用して（例えば、Chang et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1995, 23(1):1-21を参照）解析することができる。
【００４６】
本開示は、遺伝子改変された微生物（例えば、細菌）を調製する方法をさらに提供する。例示的な方法は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を微生物（例えば、細菌）と接触させることを含み、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ＣｍｂＡポリペプチド、Ｍｕｂポリペプチド、ＭａｐＡポリペプチド、またはＭｂｐＬポリペプチドなどの細胞付着ポリペプチドをコードする配列を含む。一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、ＣｍｂＡ、例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡである。一部の例では、上記方法を実行すること（すなわち、微生物を外因性核酸と接触させること）は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有する微生物（例えば、細菌）を結果としてもたらす。他の例では、微生物（例えば、細菌）を外因性核酸と接触させることは、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有し、それによって外因性核酸によってコードされる融合タンパク質を発現する微生物（例えば、細菌）を結果としてもたらす。一部の例では、方法は、微生物（例えば、細菌）を培養することおよび微生物（例えば、細菌）中で融合タンパク質を発現させることをさらに含む。一部の例では、接触させることは、前記細菌が外因性核酸を内在化させるために充分な条件下で行われる。これらの実施形態のいずれかによる一部の例では、外因性核酸は、プラスミド上に位置する。これらの実施形態による一部の例では、外因性核酸は、細菌の染色体に組み込まれる。
【００４７】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、トレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチドまたはＭｕｃＢＰポリペプチドなどのムチン結合ポリペプチドをコードする配列をさらに含む。一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ＣｍｂＡをコードする配列およびＴＦＦポリペプチドをコードする配列を含む。したがって、本開示は、遺伝子改変された微生物（例えば、細菌）を調製する方法であって、融合タンパク質をコードする外因性核酸を微生物（例えば、細菌）と接触させることを含み、融合タンパク質をコードする外因性核酸が、（ｉ）ＴＦＦポリペプチド（例えば、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、またはＴＦＦ３）をコードする配列および（ｉｉ）ＣｍｂＡをコードする配列を含む、方法を提供する。これらの実施形態のいずれかによる一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、例えば相同組換えを使用することによって、染色体に組み込まれる（例えば、細菌の染色体に組み込まれる）。この実施形態によれば、方法は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含むプラスミド（すなわち、組込みプラスミド）を形成することをさらに含み得る。
【００４８】
上記実施形態のいずれかによる一例では、方法は、例えば、微生物（例えば、細菌）を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と接触させる前にまたはその後に、微生物（例えば、細菌）を、治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることをさらに含む。
【００４９】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、上記方法によって調製された遺伝子改変された微生物（例えば、細菌）は、本方法にしたがって改変されていない、すなわち、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含まない対応する微生物（例えば、細菌）と比べた時に本明細書に記載される増加した粘膜および／または細胞付着特性を呈する。
【００５０】
関連する実施形態では、粘液および／または細胞への付着は、粘液および／または細胞の種類に特異的である。特定の細胞または粘液に見られる特定の受容体への優先的な結合の結果として、細菌は、特定の部位に局在化され得る。そのようにして、特定の分子の送達が最も効果的な部位への細菌の局在性を確実にすることができる。一部の実施形態では、その場所は、粘膜（腸、口腔、目、耳、泌尿生殖器）であり得る。一部の実施形態では、その場所は小腸であり得、一部の実施形態では、その場所は小腸上部であり得る。
【００５１】
一部の例では、方法は、遺伝子改変された細菌の培養物を少なくとも１つの凍結保存剤と合わせて細菌混合物を形成することをさらに含む。方法は、細菌混合物を乾燥（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）させて乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を形成することをさらに含み得る。方法は、遺伝子改変された細菌、または乾燥組成物（例えば、凍結乾燥組成物）を薬学的に許容される担体と合わせて医薬組成物を形成することをさらに含んでもよい。方法は、遺伝子改変された細菌、乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物、または医薬組成物を、錠剤、カプセル剤、または顆粒剤などの医薬単位剤形に配合することをさらに含んでもよい。
【００５２】
本開示は、本開示の少なくとも１つの微生物（例えば、細菌）、組成物、または医薬組成物を含む単位剤形をさらに提供する。一部の例では、そのような単位剤形は経口剤形である。これらの実施形態による他の例では、単位剤形は、カプセル剤（例えば、粉末を含有するか、またはマイクロペレットもしくはマイクロ顆粒を含有するカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、サシェ剤、または包装された液剤、例えば懸濁剤である。他の実施形態では、単位剤形は、定量のエアロゾル用量、または坐剤である。
【００５３】
一部の実施形態では、剤形中に含有される微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）は、その乾燥粉末形態または圧縮形態である。
【００５４】
本開示は、約１×１０４〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の本開示の微生物、例えば非病原性微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む単位剤形をさらに提供する。一部の実施形態では、単位剤形は、約１×１０６〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０９〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。
【００５５】
上記方法のいずれかにおける一部の実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、対象に経口投与される。例えば、微生物（例えば、細菌）は、微生物（例えば、細菌）および薬学的に許容される担体を含む経口投与用の医薬組成物の形態（例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、懸濁剤、または液剤）で対象に投与される。他の例では、微生物（例えば、細菌）は、食品の形態で対象に投与され、または食品（例えば、飲料）に加えられる。他の例では、微生物（例えば、細菌）は、栄養補助食品の形態で対象に投与される。さらに他の例では、微生物（例えば、細菌）は、坐剤製品の形態で対象に投与される。一部の例では、本開示の組成物は、微生物（例えば、細菌）によって発現されるポリペプチドの粘膜送達のために適当である。例えば、組成物は、対象の腸管中での治療用ポリペプチドの効率的な放出のために配合され得る。
【００５６】
本開示は、上記実施形態のいずれかによる方法によって調製された遺伝子改変された細菌、組成物、医薬組成物、または単位剤形をさらに提供する。
【００５７】
本開示は、哺乳動物において成長を増進させる方法をさらに提供する。例示的な方法は、哺乳動物に有効量の本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物、医薬組成物、または単位剤形を投与することを含む。一部の例では、哺乳動物は、ヒト、農用動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、またはヒツジ）、イヌ、ネコ、または他の家畜動物である。一部の例では、微生物（例えば、細菌）、組成物、医薬組成物、または単位剤形は、哺乳動物への投与のために配合され、例えば、経口投与のために配合される。一部の例では、この方法において用いられる微生物（例えば、細菌）は、成長因子または成長ホルモンをコードする外因性核酸を含有する。この実施形態による一部の例では、成長因子または成長ホルモンは、微生物（例えば、細菌）中で構成的に発現される。一部の例では、成長因子はＥＧＦである。他の例では、哺乳動物はブタであり、かつＥＧＦはブタＥＧＦである。
【００５８】
本開示は、（例えば、ムチン調製物へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合による測定で）腸粘膜への微生物（例えば、細菌）の結合を増加させる方法をさらに提供する。例示的な方法は、微生物（例えば、細菌）を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と接触させることであって、融合タンパク質をコードする外因性核酸が、ＣｍｂＡポリペプチドをコードする配列を含む、接触させること、および融合タンパク質をコードする外因性核酸を微生物（例えば、細菌）中で発現させることを含む。一部の例では、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ＴＦＦポリペプチドなどのムチン結合ポリペプチドをコードする配列をさらに含む。一部の例では、微生物（例えば、細菌）による融合タンパク質をコードする外因性核酸の発現は、ＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂＡポリペプチドを含む融合タンパク質を産生する。
【００５９】
上記の組成物および方法のいずれかによる一部の例では、微生物は、非病原性微生物、例えば、哺乳動物対象による摂取のために安全な任意の微生物である。一部の実施形態では、上記組成物および方法における微生物は酵母である。酵母は、サッカロミセス（Saccharomyces）種、ハンセヌラ（Hansenula）種、クルイベロミセス（Kluyveromyces）種、シゾサッカロミセス（Schizzosaccharomyces）種、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）種、ピキア（Pichia）種、モナスカス（Monascus）種、ゲオトリクム（Geothchum）種、およびヤロウィア（Yarrowia）種から選択され得る。一部の例では、酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００６０】
上記組成物および方法における他の実施形態では、非病原性微生物は非病原性細菌である。この実施形態による一部の例では、非病原性細菌はグラム陽性菌である。他の例では、グラム陽性菌は乳酸発酵細菌（ＬＡＢ）であり、例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）種（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、およびビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種から選択される。他の例では、非病原性細菌は、ストレプトコッカス（Streptococcus）種またはエンテロコッカス（Enterococcus）種である。追加の細菌種が本明細書に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ＣｍｂＡ発現／ｔｈｙＡ組込みベクターｐＡＧＸ２００５のプラスミドマップである。略語：ｔｈｙＡ５’、ＭＧ１３６３のチミジン合成酵素Ａ（ｔｈｙＡ）遺伝子の５’隣接領域；ＰｔｈｙＡ、ＭＧ１３６３のｔｈｙＡプロモーター；ＳＳｕｐｓ４５、ＭＧ１３６３タンパク質ｕｓｐ４５の分泌シグナルをコードする遺伝子；ｈＴＦＦ３、Ｌ．ラクチス（L. lactis）のために最適化されたコドン用法を有するヒトトレフォイル因子３をコードする遺伝子；ＣｍｂＡ、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７４の細胞および粘液結合プロテインＡをコードする遺伝子；ｔｈｙＡ３’、ＭＧ１３６３のｔｈｙＡ遺伝子の３’隣接領域；ＯＲＩ、プラスミドｐＯＲＩ１９の複製起点；Ｅｍ、エリスロマイシン耐性マーカー。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、ムチンへの細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した結合を実証するグラフであり、ムチン結合性はＯＤ４０５（図２Ａ）またはクリスタルバイオレット染色（図２Ｂ）を使用して測定される。ｐＡＧＸ１４１７：エンプティプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ１８９４：細菌表面でのｈＴＦＦ１−ＳｐａＸの発現のためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面でのｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡの発現のためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８。ムチンＩＩ型＝ブタ胃からのムチン、シアル酸に結合、約１％；ムチンＩＩＩ型＝ブタ胃からのムチン、シアル酸に結合（０．５〜１．５％）。
【図３】Ｃａｃｏ−２細胞への細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した付着を実証する図である。ｐＡＧＸ１４１７：エンプティプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ１８９３：細菌表面にＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ１８９４：細菌表面にｈＴＦＦ１−ｓｐａＸを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８。
【図４】例示的なＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３構築物を説明する図である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号８および配列番号９）。
【図５Ａ】あわせて、例示的なＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ構築物の説明である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号１０および配列番号１１）。
【図５Ｂ】あわせて、例示的なＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ構築物の説明である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号１０および配列番号１１）。
【図５Ｃ】あわせて、例示的なＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ構築物の説明である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号１０および配列番号１１）。
【図５Ｄ】あわせて、例示的なＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ構築物の説明である（アミノ酸および核酸配列：それぞれ配列番号１０および配列番号１１）。
【図６】Ｃａｃｏ−２細胞への細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した付着を説明するグラフであり、該細胞は、例示的な細胞付着ポリペプチド（ＣｍｂＡ）または例示的な融合タンパク質（ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ）をエピソームによりまたは構成的に発現する。回収％＝コロニー形成単位数による決定で、適用された全Ｌ．ラクチス（L. lactis）細胞と比べた洗浄後にムチンをコーティングしたウェルから回収されたＬ．ラクチス（L. lactis）細胞の％。ｐＡＧＸ１８９３：細菌表面にＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｓＡＧＸ０６１８：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面にＣｍｂＡ（ｔｈｙＡ−；ＰｔｈｙＡ＞＞ｃｍｂＡ）を構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３；ｓＡＧＸ６４４：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座の内因性ｔｈｙＡプロモーターによって転写調節される（ｔｈｙＡ−；ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ｍｂＡ）；ｓＡＧＸ６６０：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座のｈｌｌＡプロモーターによって転写調節される（ｔｈｙＡ−；ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ｃｍｂＡ）。
【図７Ａ】ムチンへの細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した結合を示すグラフであり、該細胞は、例示的な細胞付着ポリペプチド（ＣｍｂＡ）または例示的な融合タンパク質（ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ）をエピソームによりまたは構成的に発現し、かつムチン結合性は、例えば実施例６において本明細書に記載されるようにＯＤ４０５（図７Ａ）またはクリスタルバイオレット染色（図７Ｂ）を使用して測定される。ｐＡＧＸ１８９３：細菌表面にＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｓＡＧＸ０６１８：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面にＣｍｂＡ（ｔｈｙＡ−；ＰｔｈｙＡ＞＞ｃｍｂＡ）を構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３；ｓＡＧＸ６４４：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座の内因性ｔｈｙＡプロモーター（ｔｈｙＡ−；ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ｃｍｂＡ）によって転写調節される；ｓＡＧＸ６６０：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈｔｆｆ３−ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座のｈｌｌＡプロモーター（ｔｈｙＡ−；ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ｃｍｂＡ）によって転写調節される。
【図７Ｂ】ムチンへの細菌（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））細胞の増進した結合を示すグラフであり、該細胞は、例示的な細胞付着ポリペプチド（ＣｍｂＡ）または例示的な融合タンパク質（ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ）をエピソームによりまたは構成的に発現し、かつムチン結合性は、例えば実施例６において本明細書に記載されるようにＯＤ４０５（図７Ａ）またはクリスタルバイオレット染色（図７Ｂ）を使用して測定される。ｐＡＧＸ１８９３：細菌表面にＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｐＡＧＸ２００５：細菌表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを発現するためのプラスミドを宿すＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８；ｓＡＧＸ０６１８：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面にＣｍｂＡ（ｔｈｙＡ−；ＰｔｈｙＡ＞＞ｃｍｂＡ）を構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３；ｓＡＧＸ６４４：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座の内因性ｔｈｙＡプロモーター（ｔｈｙＡ−；ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ｃｍｂＡ）によって転写調節される；ｓＡＧＸ６６０：例示的な治療用ポリペプチドＰＡＬ（ＰｇａｐＢ＞＞ｐａｌ）を構成的に発現し、かつ細菌表面に融合タンパク質ｈｔｆｆ３−ＣｍｂＡを構成的に発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３であり、融合タンパク質をコードする外因性核酸は、ｔｈｙＡ遺伝子座のｈｌｌＡプロモーター（ｔｈｙＡ−；ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ｃｍｂＡ）によって転写調節される。
【図８】粘膜付着ポリペプチドを発現しない（ｓＡＧＸ０５９９）、細菌表面に例示的な細胞付着ポリペプチドＣｍｂＡ（ｓＡＧＸ０６１８）、または細菌表面に例示的な融合タンパク質ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ（ｓＡＧＸ０６４４（ｔｈｙＡ−；ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ｃｍｂＡ）およびｓＡＧＸ０６６０（ｔｈｙＡ−；ＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３−ｃｍｂＡ））を発現する細菌細胞による例示的な治療用ポリペプチド（ＰＡＬ）の産生を説明するグラフである。１０９細胞あたりのＰＡＬ産生のμｇはＰＡＬ産生株にわたって類似していた。
【図９Ａ】ＰＡＬを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）の経口投与がフェニルアラニンの血中濃度を低下させることを示す図である。陰性ＣＴＲ＝ラクチス（lactis）なし、ボーラスのみ；陽性ＣＴＲ＝Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＮＺ９０００［ｐＡＧＸ１８８６］、ナイシン誘導ＰＡＬ（ＡＧＸ番号３１５１）；Ｌ．ラクチス（L. lactis）−ＰＡＬ＝ｓＡＧＸ０５９９（ＡＧＸ番号２９４７）、ＰＡＬを分泌する；Ｌ．ラクチス（L. lactis）−ＰＡＬ＋ＴＦＦ３−ＣｍｂＡ＝ｓＡＧＸ０６４５粘膜付着株（ＡＧＸ番号３２９０）、ＰＡＬを分泌し、表面のＴＦＦ３−ＣｍｂＡを有し、これは細胞および粘膜付着性である。図９Ａ〜Ｂは、放射線標識したＰｈｅのボーラスの投与後に経時的に測定したＰｈｅおよびＴｙｒの血中レベルを示し、図９Ｃ〜Ｄは対応するＡＵＣを示す。新たな構築物は、より低いレベルの血中Ｐｈｅに関連付けられる。Ｐｈｅの最終レベルは、ＰＡＬおよびＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するＬ．ラクチス（L. lactis）を投与されたマウスにおいて最も低かった。
【図９Ｂ】ＰＡＬを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）の経口投与がフェニルアラニンの血中濃度を低下させることを示す図である。陰性ＣＴＲ＝ラクチス（lactis）なし、ボーラスのみ；陽性ＣＴＲ＝Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＮＺ９０００［ｐＡＧＸ１８８６］、ナイシン誘導ＰＡＬ（ＡＧＸ番号３１５１）；Ｌ．ラクチス（L. lactis）−ＰＡＬ＝ｓＡＧＸ０５９９（ＡＧＸ番号２９４７）、ＰＡＬを分泌する；Ｌ．ラクチス（L. lactis）−ＰＡＬ＋ＴＦＦ３−ＣｍｂＡ＝ｓＡＧＸ０６４５粘膜付着株（ＡＧＸ番号３２９０）、ＰＡＬを分泌し、表面のＴＦＦ３−ＣｍｂＡを有し、これは細胞および粘膜付着性である。図９Ａ〜Ｂは、放射線標識したＰｈｅのボーラスの投与後に経時的に測定したＰｈｅおよびＴｙｒの血中レベルを示し、図９Ｃ〜Ｄは対応するＡＵＣを示す。新たな構築物は、より低いレベルの血中Ｐｈｅに関連付けられる。Ｐｈｅの最終レベルは、ＰＡＬおよびＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するＬ．ラクチス（L. lactis）を投与されたマウスにおいて最も低かった。
【図９Ｃ】ＰＡＬを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）の経口投与がフェニルアラニンの血中濃度を低下させることを示す図である。陰性ＣＴＲ＝ラクチス（lactis）なし、ボーラスのみ；陽性ＣＴＲ＝Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＮＺ９０００［ｐＡＧＸ１８８６］、ナイシン誘導ＰＡＬ（ＡＧＸ番号３１５１）；Ｌ．ラクチス（L. lactis）−ＰＡＬ＝ｓＡＧＸ０５９９（ＡＧＸ番号２９４７）、ＰＡＬを分泌する；Ｌ．ラクチス（L. lactis）−ＰＡＬ＋ＴＦＦ３−ＣｍｂＡ＝ｓＡＧＸ０６４５粘膜付着株（ＡＧＸ番号３２９０）、ＰＡＬを分泌し、表面のＴＦＦ３−ＣｍｂＡを有し、これは細胞および粘膜付着性である。図９Ａ〜Ｂは、放射線標識したＰｈｅのボーラスの投与後に経時的に測定したＰｈｅおよびＴｙｒの血中レベルを示し、図９Ｃ〜Ｄは対応するＡＵＣを示す。新たな構築物は、より低いレベルの血中Ｐｈｅに関連付けられる。Ｐｈｅの最終レベルは、ＰＡＬおよびＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するＬ．ラクチス（L. lactis）を投与されたマウスにおいて最も低かった。
【図９Ｄ】ＰＡＬを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）の経口投与がフェニルアラニンの血中濃度を低下させることを示す図である。陰性ＣＴＲ＝ラクチス（lactis）なし、ボーラスのみ；陽性ＣＴＲ＝Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＮＺ９０００［ｐＡＧＸ１８８６］、ナイシン誘導ＰＡＬ（ＡＧＸ番号３１５１）；Ｌ．ラクチス（L. lactis）−ＰＡＬ＝ｓＡＧＸ０５９９（ＡＧＸ番号２９４７）、ＰＡＬを分泌する；Ｌ．ラクチス（L. lactis）−ＰＡＬ＋ＴＦＦ３−ＣｍｂＡ＝ｓＡＧＸ０６４５粘膜付着株（ＡＧＸ番号３２９０）、ＰＡＬを分泌し、表面のＴＦＦ３−ＣｍｂＡを有し、これは細胞および粘膜付着性である。図９Ａ〜Ｂは、放射線標識したＰｈｅのボーラスの投与後に経時的に測定したＰｈｅおよびＴｙｒの血中レベルを示し、図９Ｃ〜Ｄは対応するＡＵＣを示す。新たな構築物は、より低いレベルの血中Ｐｈｅに関連付けられる。Ｐｈｅの最終レベルは、ＰＡＬおよびＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するＬ．ラクチス（L. lactis）を投与されたマウスにおいて最も低かった。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本開示は、ムチンへの増進したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合性および細胞への増進したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合性（例えば、Ｃａｃｏ−２細胞への付着）を呈する微生物（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの乳酸菌）を提供する。一部の実施形態では、そのような微生物は、増加したＧＩ通過時間を有する。例えば、そのような微生物は、治療用ポリペプチドを追加的に発現し得る。一部の例では、哺乳動物対象にそのような細菌を経口投与すると、ＧＩ管の異なる部分における細菌の滞留時間が増加し、対象はより長い期間にわたってＧＩ管中の治療用ポリペプチドに曝露される。例えば、細菌が放出されると、例えば、十二指腸において保護コーティングされたカプセルから放出されると、空腸および回腸における細菌の滞留時間は、腸粘膜に結合するまたはそれと相互作用する粘膜および細胞付着性タンパク質の表面提示／発現によって延長される。結果として、細菌用量を低減することができ、より低い発現プロファイルを有する微生物が治療有効用量を投与するために許容されるものとなり、より小さい単位剤形を開発することができ、かつより低頻度の投与を伴うレジメンを用いることができる（例えば、患者のコンプライアンスを増加させる）。
【００６３】
例えば、本開示は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の表面にラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）とのヒトトレフォイル因子３（ｈＴＦＦ３）の融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有する微生物を提供する。例示的な融合タンパク質は、ｈＴＦＦ３（例えば、Tomasetto et al., Gastroenterology 2000, 118(1):70-80を参照）およびラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡ（例えば、その分泌シグナルを有しない）に融合した、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のタンパク質ｕｓｐ４５の分泌シグナル（例えば、Van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet. 1993, 240:428-434を参照）から構成される。ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合タンパク質は、ｕｓｐ４５分泌シグナルによって分泌され、分泌シグナルペプチドは、ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合タンパク質がラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の細胞膜を通過した時に切断される。ＣｍｂＡの外側部分は腸上皮細胞に結合することができる。ｈＴＦＦ３をＣｍｂＡタンパク質に融合させることによって、追加の粘液結合ユニットが追加される。ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡの発現および表面提示は、腸粘膜への増加した付着を可能とし、改変されたラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）細胞のより遅いＧＩ通過時間を結果としてもたらした。
【００６４】
定義
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数への言及を包含する。例えば、「細胞」（a cell）という用語は、その混合物などの、複数の細胞を包含する。同様に、本明細書に記載される治療または医薬の調製のための「化合物」（a compound）の使用は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、そのような治療または調製のために１つまたは複数の本発明の化合物を使用することを想定する。
【００６５】
参照数値に関する「約」という用語、およびその文法的同等物は、本明細書で使用される場合、参照数値それ自体およびその参照数値からプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を包含できる。例えば、「約１０」という用語は、１０、および９〜１１を含めて９〜１１からの任意の値を包含する。一部の場合には、参照数値に関する「約」という用語は、その参照数値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の値の範囲も包含し得る。一部の実施形態では、特定の方法によって測定された数または範囲と関連する「約」は、所与の数値がその方法のばらつきによって決定される値を包含することを指し示す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「〜を含む」（comprising）という用語は、組成物および方法が記載された要素を含むが、他のものを除外しない意味であることを意図する。組成物および方法を定義するために使用される場合、「〜から本質的になる」は、組合せに対して何らかの本質的な意義を持つ他の要素を除外することを意味する。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の汚染物、および、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を除外しない。「〜からなる」は、他の成分の微量元素、および本発明の組成物を投与する実体的な方法ステップを超えるものを除外することを意味する。これらの移行句（transition terms）のそれぞれによって定義される実施形態は本発明の範囲内にある。
【００６７】
ポリペプチド配列の同一性パーセンテージは、参照配列をクエリ配列と比較する市販のアルゴリズムを使用して算出することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、（例えば、ＢＬＡＳＴＰもしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他のアライメントソフトウェアによる測定で）デフォルトのパラメーターを使用して、参照ポリペプチド、またはその断片に対して７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９２％、少なくとも９２％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、または少なくとも９９％または１００％同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸を参照して記載することもでき、例えば、核酸は、（例えば、デフォルトのパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮもしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他のアライメントソフトウェアによる測定で）参照核酸またはその断片に対して５０％、少なくとも５０％、６０％、少なくとも６０％、７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、少なくとも９９％、または１００％同一であり得る。ある分子がより大きい分子とある特定のパーセンテージの配列同一性を有すると言われる場合、それは、２つの分子が最適にアライメントされた時に、２つの分子が最適にアライメントされた順序にしたがってより小さい分子中の該パーセンテージの残基がより大きい分子中の残基とマッチし、「％」（パーセント）同一性がより小さい分子の長さにしたがって算出されることを意味する。
【００６８】
細菌中の外来タンパク質の発現は典型的に改変を必要とすることが理解されるべきである。これらとしては、イントロンおよび細菌によって認識されない他の真核性核酸モチーフを除去する核酸の改変、および宿主にコドン用法を最適化する核酸の改変が挙げられる。
【００６９】
同様に、タンパク質は、天然宿主において適切なプロセシングのために必要であるが、細菌宿主によって認識されないモチーフ（真核生物からまたは細菌の他の種からの分泌シグナルなど）を除去するように改変される。したがって、細菌中で発現される外来タンパク質について言及する場合、それは成熟形態について言及していることを当業者は理解するであろう。例えば、ヒトＩＬ−１０は、ヒト細胞中で分泌リーダー配列を有して翻訳され、分泌リーダー配列は細胞から分泌される成熟ＩＬ−１０には存在しない。真核性分泌リーダー配列は細菌中で機能しない。したがって、Ｌ．ラクチス（L. lactis）は「ＩＬ−１０」を発現する核酸をさらに含み、それは成熟ＩＬ−１０タンパク質を含有する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、遺伝子またはポリペプチドを「発現する」、またはポリペプチド（例えば、ＰＡＬ、ＩＬ−２ポリペプチドまたはＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチド）を「産生する」という用語は、それぞれ、「発現できる」および「産生できる」ことを包含する意味である。例えば、外因性核酸を含有する微生物は、充分な条件下（例えば、充分な含水および／または栄養分の存在下）で、外因性核酸によってコードされたポリペプチドを産生することができる。しかしながら、微生物は、コードされたポリペプチドを必ずしも活動的に産生しなくてもよい。微生物（例えば、細菌）は、乾燥（例えば、凍結乾燥）されていてもよく、その状態では休眠している（すなわち、ポリペプチドを活動的に産生していない）と考えることができる。しかしながら、微生物が充分な条件に供されると、例えば、対象に投与されて（例えば、対象の胃腸管中で）放出されると、微生物はポリペプチドの産生を開始することがある。したがって、本開示の遺伝子またはポリペプチドを「発現し」、またはポリペプチドを「産生する」微生物は、その「休眠」状態の微生物を包含する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、プロモーターの文脈での（または遺伝子発現もしくはポリペプチドの分泌に関するものに拡張された）「構成的」という用語は、それが関連する遺伝子の絶え間ない転写を可能とするプロモーターを指す。
【００７２】
「染色体に組み込まれた」もしくは「染色体中に組み込まれた」という用語またはその任意の変形は、核酸配列（例えば、遺伝子；オープンリーディングフレーム；ポリペプチドをコードする外因性核酸；プロモーター；発現カセットなど）が、微生物（例えば、細菌）の染色体上に位置すること（該染色体中に組み込まれていること）、すなわち、プラスミドなどのエピソームベクター上には位置しないことを意味する。核酸配列が染色体に組み込まれる一部の実施形態では、そのような染色体に組み込まれた核酸によってコードされたポリペプチドは、構成的に発現される。
【００７３】
「分泌リーダー配列」、「分泌リーダー」および「分泌シグナル配列」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。該用語は、それらの当該技術分野で認識される意味にしたがって使用され、一般に、「シグナルペプチド」または「分泌シグナルペプチド」をコードする核酸配列であって、微生物によって発現され、シグナルペプチドを含むポリペプチドが微生物によって分泌されることを引き起こす、すなわち、該ポリペプチドが細胞内空間を離れ、例えば、周囲媒体中に分泌される、または細胞壁にアンカーされ、該ポリペプチドの少なくとも一部分が周囲媒体、例えば微生物の表面に露出されることを引き起こす核酸配列を指す。
【００７４】
治療用ポリペプチド
「治療用ポリペプチド」という用語は、（例えば、哺乳動物対象において）治療的、予防的、または他の生物学的活性を有し、または生物学的活性を誘発する潜在能力を有する任意のポリペプチドを包含する。例としては、公知の生物学的製剤（認可されたものおよび治験されているもの）、および、ホルモンおよびサイトカインなどの任意のシグナルポリペプチド、ならびにそれらの受容体、アゴニストおよびアンタゴニストが挙げられる。「治療用ポリペプチド」は、対応する野生型ポリペプチドから改変されていてもよい。一部の例では、治療用ポリペプチドはサイトカインであり、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１またはＩＬ−２２などのＩＬである。
【００７５】
他の例では、治療用ポリペプチドは抗原である。この実施形態による一部の例では、抗原は「自家抗原」または自己抗原である。「自己抗原」または「自家抗原」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、自己抗原または自家抗原の当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書において使用され、一般に、対象自身の身体に起因する（対象自身の身体によって産生された）ポリペプチド／タンパク質を指し、該抗原は、対象自身の免疫系によって認識され、そのような抗原に対する抗体を典型的に産生する。自己免疫疾患は、一般に、ある特定の疾患特異的な自己抗原に関連する。例えば、Ｔ１Ｄにおいて、対象の免疫系は、ベータ細胞破壊プロセスに関連する少なくとも１つの抗原に対する抗体を産生することがある。一部の例では、自家抗原はＴ１Ｄ特異的抗原である。例示的なＴ１Ｄ特異的抗原としては、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、および任意のこれらの組合せが挙げられる。臨床的なＴ１Ｄは、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、およびシトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）、ならびに任意のこれらの組合せなどの、ベータ細胞によって発現される追加の候補標的分子にさらに関連し得る。上記Ｔ１Ｄ特異的抗原の例示的なアミノ酸配列および核酸配列は、例えば、仮特許出願第６２／３５０，４７２号明細書（出願日：２０１６年６月１５日）（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。一部の例では、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、野生型ヒトＰＩＮＳなどのＰＩＮＳである。例えば、受託番号ＮＭ＿０００２０７．２に含有されるＣＤＳ、または、そのような野生型ヒトＰＩＮＳと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性である配列を参照。追加の例示的なＰＩＮＳヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＡＹ８９９３０４（完全なＣＤＳ、選択的にスプライスされる）；ＮＭ＿０００２０７（転写物バリアント１）；ＮＭ＿００１１８５０９７（転写物バリアント２）；ＮＭ＿００１１８５０９８（転写物バリアント３）；ＮＭ＿００１２９１８９７（転写物バリアント４）のコーディング配列、およびこれらの部分配列によって表される。例示的なＰＩＮＳアミノ酸配列としては、上記ＰＩＮＳ核酸配列のいずれか１つによってコードされる配列が挙げられる。
【００７６】
他の例では、抗原は、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、またはこれらの組合せなどのアレルゲンである。一部の例では、アレルゲンは、雑草花粉アレルゲン、例えばブタクサ花粉アレルゲンである。他の例では、アレルゲンは、カバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンなどの樹木花粉アレルゲンである。さらに他の例では、アレルゲンは、ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、またはこれらの組合せなどの食物アレルゲンである。他の例では、治療用ポリペプチドは、抗原、および、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、またはＩＬ−２２などのインターロイキンである。
【００７７】
さらなる例では、治療用ポリペプチドは、抗体またはその断片である。例えば、抗体は、単一ドメイン抗体またはナノボディである。例示的な抗体としては、ＩＬ−４に対する抗体、ＩＬ−５に対する抗体、ＩＬ−７に対する抗体、ＩＬ−１３に対する抗体、ＩＬ−１５に対する抗体の他に、抗ＴＮＦα抗体、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する抗体、抗Ｐ４０、および任意のこれらの断片などのサイトカイン中和抗体が挙げられる。
【００７８】
さらに他の例では、治療用ポリペプチドは、酵素またはその断片（例えば、機能的断片）、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せである。一例では、治療用ポリペプチドは、ＰＡＬ、またはその機能的断片である。この実施形態のために有用な例示的なＰＡＬ配列は、例えば、国際特許出願公開第２０１４／０６６９４５号パンフレット（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＰＡＬはフェニルアラニンを代謝し、それによって、腸から血中に吸収されるＰｈｅのレベルを低減させることができ、したがって、フェニルケトン尿症を治療するために使用することができる。フェニルアラニンデカルボキシラーゼなどの芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼなどの他の酵素もまたＰｈｅを分解するために使用することができる。一部の実施形態では、対象は、ＰＡＬおよび第２のフェニルアラニン分解酵素を発現しかつ分泌する細菌を投与される。別の実施形態では、対象は、ＰＡＬを発現しかつ分泌する細菌、および第２のフェニルアラニン分解酵素を発現しかつ分泌する別の細菌を投与される。
【００７９】
さらなる例では、細菌は、Ｐｈｅ摂取および細胞内での利用を増進させるように操作される。そのような細菌の投与は、患者によって吸収されるＰｈｅの量をさらに低減させることができる。
【００８０】
さらなる例では、治療用ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、グルカゴン、エキセンジン−４、または任意のこれらの組合せである。他の例では、治療用ポリペプチドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（例えば、ヒトＥＧＦまたはブタＥＧＦ）などの成長因子である。さらに他の例では、治療用ポリペプチドは、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＴＦＦ３、またはこれらの組合せなどのＴＦＦである。
【００８１】
一部の例では、治療用ポリペプチドは免疫調節化合物である。「免疫調節化合物」または免疫モジュレーター」という用語は、それらの当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用される。免疫調節化合物は、当業者に公知の任意の免疫調節化合物であり得る。一部の実施形態では、免疫調節化合物は、寛容誘導化合物である。寛容誘導は、例えば、制御性Ｔ細胞を誘導することによって、または非直接的な方法、例えば、寛容樹状細胞への未熟樹状細胞の活性化および／または成熟樹状細胞上の「共刺激」因子の発現を誘導するＴｈ２免疫反応の阻害によって、得ることができる。免疫調節化合物および免疫抑制化合物は当業者に公知であり、スペルグアリンなどの細菌代謝物、タクロリムスまたはシクロスポリンなどの真菌およびストレプトミセス（Streptomyces）属細菌代謝物、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＴＧＦβ（制御性Ｔ細胞の選択的なアジュバントとして）Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＳＬＰおよびＲａｎｋ−Ｌ（選択的な寛容原性ＤＣの誘導剤として）などの免疫抑制性サイトカイン、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ３などの抗体および／またはアンタゴニスト（例えば、抗体）、ＣＴＬ−４１  ｇまたはＣＴＬＡ−４アゴニスト融合タンパク質などのタンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、免疫調節化合物は、免疫抑制化合物である。他の実施形態では、免疫抑制化合物は、免疫抑制性サイトカインまたは抗体である。他の実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、寛容増強性サイトカインまたは抗体である。「免疫調節化合物」という用語はまた、これらの機能的なホモログも含むことが当業者によって理解されるであろう。機能的なホモログは、意図する目的のために本質的に同じまたは類似の機能を有する分子であるが、構造的に異なることがある。一部の例では、免疫調節化合物は、抗ＣＤ３抗体、またはその機能的なホモログである。
【００８２】
本開示の微生物は、１つより多くの、または少なくとも１つの治療用ポリペプチドを発現し得る。治療用ポリペプチドは、上記の治療用ポリペプチドのいずれかの組合せであり得る。
【００８３】
疾患
本開示の微生物（例えば、細菌）、組成物および方法を使用して任意の疾患、例えば、粘膜、例えば胃腸粘膜の部位で活性な生物活性ポリペプチドによって治療できる疾患を治療または予防することができる。本開示の方法を使用して治療または予防できる例示的な疾患としては、自己免疫疾患、アレルギー、栄養性もしくは代謝性疾患、胃腸疾患、および遺伝性障害、または任意のこれらの組合せが挙げられる。
【００８４】
「栄養性疾患」という用語は、食品または栄養分の処理が不十分であることに関連し、例えば、栄養不良、低体重、または他の二次的状態（膨満感など）を結果としてもたらし得る任意の疾患を包含する。「栄養性疾患」は、脂質および炭水化物などの食品または食品成分を処理するある特定の酵素（リパーゼ、プロテアーゼ、または糖分解酵素など）の不十分な産生に関連することがある。「栄養性疾患」という用語は、確定的な状態または疾患が存在しない場合でさえも増進されることがある生物中の任意の代謝プロセス（「代謝増進」）を包含し、例えば、ブタ、ウシ、トリ、またはヒツジなどのある特定の農用動物は、より速く成長しまたはより大きい体重を蓄積するように治療されることがある。一部の例では、「栄養性疾患」は、乳糖不耐症などの、ある特定の食品または食品成分の不十分または異常な代謝に基づくそのような食品または食品成分への不耐症である。「栄養性疾患」という用語は、本明細書において交換可能に使用される「代謝性疾患」または「代謝障害」に関係する。「代謝性疾患」という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用され、一般に、身体中の異常な化学反応が正常な代謝プロセスを変化させる任意の状態を指す。一部の例では、代謝性疾患は遺伝的欠陥によって引き起こされ、遺伝性であり得る。代謝障害の例としては、酸と塩基の不均衡、代謝性脳疾患、カルシウム代謝障害、ＤＮＡ修復不全障害、グルコース代謝障害、高乳酸塩血症、鉄代謝障害、および脂質代謝障害が挙げられる。
【００８５】
栄養性または代謝性疾患の他の例としては、グルコースおよび／またはガラクトース吸収不良、レッシュ・ナイハン症候群、メンケス症候群、肥満症、膵臓がん、プラダー・ウィリ症候群、ポルフィリン症、レフサム病、タンジール病、ウィルソン病、ハーラー症候群（例えば、異常な骨構造および成長遅延によって特徴付けられる）、ニーマン・ピック病（例えば、乳児が肝肥大、栄養摂取困難、および神経損傷を発症する）、テイ・サックス病（例えば、幼児における進行性虚弱によって特徴付けられ、重篤な神経損傷に進行する）、ゴーシェ病（例えば、骨疼痛、肝肥大、および低血小板数によって特徴付けられる）；ファブリー病（例えば、小児期においては手足の痛み、成人期においては腎臓および心臓の疾患および発作によって特徴付けられる）、クラッベ病（例えば、幼児における進行性の神経損傷、成長遅延によって特徴付けられる）；ガラクトース血症（例えば、糖ガラクトース分解の障害によって特徴付けられ、新生児による授乳または栄養処方後に黄疸、嘔吐、および肝肥大に繋がることがある）；メープルシロップ尿症（例えば、酵素ＢＣＫＤの欠損によって特徴付けられ、身体中のアミノ酸の蓄積を引き起こす）；フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン貯蔵病（例えば、低血糖レベル、筋肉疼痛、および虚弱によって特徴付けられる）；ミトコンドリア障害、フリードライヒ運動失調症（例えば、タンパク質フラタキシンに関係する問題によって特徴付けられ、神経損傷、心臓の問題、歩行困難を引き起こすことがある）、およびペルオキシソーム障害（例えば、ペルオキシソーム内の不良な酵素機能によって特徴付けられ、毒性代謝物の蓄積に繋がることがある）が挙げられる。例示的なペルオキシソーム障害としては、例えば、ツェルウェーガー症候群（例えば、乳児における異常な顏の特徴、肝肥大、および神経損傷によって特徴付けられる）、および副腎白質ジストロフィー（例えば、小児期または成人早期における神経損傷の症状によって特徴付けられる）が挙げられる。他の栄養または代謝障害としては、金属代謝障害（例えば、タンパク質機能不良および身体中の金属の毒性の蓄積によって特徴付けられる）が挙げられる。例としては、例えば、ウィルソン病（例えば、肝臓、脳、および他の器官における毒性の銅レベルの蓄積によって特徴付けられる）、およびヘモクロマトーシス（例えば、遺伝性ヘモクロマトーシス）が挙げられ、ヘモクロマトーシスでは例えば、腸が過剰な鉄を吸収し、それが肝臓、膵臓、関節、および心臓に蓄積して損傷を引き起こす。栄養または代謝障害のさらなる例としては、有機酸血症（メチルマロン酸血症およびプロピオン酸血症（propionic academia）など）、尿素サイクル障害（オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症およびシトルリン血症など）が挙げられる。一部の例では、栄養性または代謝性疾患はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。他の例では、栄養性または代謝性疾患は、エネルギー調節異常に関係する代謝障害（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎）である。
【００８６】
一部の例では、疾患は自己免疫疾患である。例示的な自己免疫疾患としては、心筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、抗糸球体基底膜腎炎、間質性膀胱炎、ループス腎炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎、抗合成酵素症候群、円形脱毛症、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円板状エリテマトーデス、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、斑状強皮症、尋常性天疱瘡、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ムッハ・ハーベルマン病、乾癬、全身性強皮症、白斑、アジソン病、多腺性自己免疫症候群（ＡＰＳ）１型、多腺性自己免疫症候群（ＡＰＳ）２型、多腺性自己免疫症候群（ＡＰＳ）３型、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、オルド甲状腺炎、グレーヴス病、自己免疫性卵巣炎、子宮内膜症、自己免疫性睾丸炎、シェーグレン症候群、自己免疫性腸疾患、セリアック病、クローン病、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性大腸炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ、ＡＰＬＳ）、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、寒冷凝集素病、本態性混合寒冷グロブリン血症、エバンス症候群、夜間発作、ヘモグロビン尿症、悪性貧血、赤芽球癆、血小板減少症、有痛性脂肪症、成人発症スチル病、強直性脊椎炎、ＣＲＥＳＴ症候群、薬物誘発性ループス、骨付着部炎関連関節炎、好酸性筋膜炎、フェルティ症候群、ＩｇＧ４関連疾患、若年性関節炎、ライム病（慢性）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、回帰性リウマチ、パリー・ロンベルク症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、乾癬性関節炎、反応性関節炎、再発性多発軟骨炎、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、皮膚筋炎、線維筋痛症、封入体筋炎、筋炎、重症筋無力症、神経性筋強直症、腫瘍随伴性小脳変性症、多発性筋炎、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性運動性軸索型ニューロパチー、抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（抗ＮＭＤＡ）受容体脳炎、バロー同心円性硬化症、ビッカースタッフ脳炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、突発性炎症性脱髄疾患、ランバート・イートン筋無力症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、パターンＩＩ、オシュトラン症候群（Oshtoran syndrome）、レンサ球菌感染性小児自己免疫神経精神障害（ＰＡＮＤＡＳ）、進行性炎症性ニューロパチー、レストレスレッグ症候群、スティッフパーソン症候群、シデナム舞踏病、横断性脊髄炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性ぶどう膜炎、コーガン症候群、グレーヴス眼病、中間部ぶどう膜炎、木質性結膜炎、モーレン潰瘍、視神経脊髄炎、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、強膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、トロサ・ハント症候群、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、メニエール病、ベーチェット病、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、巨細���動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、ＩｇＡ血管炎（ＩｇＡＶ）、川崎病、白血球破砕性血管炎、ループス血管炎、リウマチ性血管炎、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発筋痛症、蕁麻疹様血管炎、血管炎、および原発性免疫不全が挙げられる。一部の例では、自己免疫疾患は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）である。
【００８７】
他の例では、疾患は、短腸症候群、セリアック病、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）などの胃腸疾患である。
【００８８】
一部の例では、疾患は炎症性疾患（例えば、Ｔｈ２および／またはＩｇＥ誘発性炎症）である。例示的な炎症性疾患としては、尋常性ざ瘡、喘息、自己炎症性疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶、移植片対宿主病、血管炎、化膿性汗腺炎（hydradenitis suppurativa）、憩室炎、間質性膀胱炎が挙げられる。自己炎症性疾患の例としては、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、周期性発熱を伴う高免疫グロブリンＤ血症（ＨＩＤＳ）、メバロン酸尿症、メバロン酸キナーゼ欠損症、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、マックル・ウェルズ症候群（蕁麻疹・難聴・アミロイドーシス（urticaria deafness amyloidosis））、家族性寒冷蕁麻疹、新生児期発症多臓器系炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、周期性発熱、アフタ性口内炎、咽頭炎および腺炎（ＰＦＡＰＡ症候群）、ブロー症候群、化膿性無菌性関節炎、壊疽性膿皮症、ざ瘡（ＰＡＰＡ）、インターロイキン１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）が挙げられる。
【００８９】
さらなる例では、疾患は成長遅延である。他の例では、疾患は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、肥満症、または疼痛（例えば、神経障害性疼痛）である。
【００９０】
他の例では、疾患は、アレルギー、例えば、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、またはこれらの組合せから選択されるアレルゲンに対するアレルギーである。一部の例では、疾患は、雑草花粉アレルゲン、例えばブタクサ花粉アレルゲンに対するアレルギーである。他の例では、疾患は、カバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンなどの樹木花粉アレルゲンに対するアレルギーである。さらに他の例では、疾患は、ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、またはこれらの組合せなどの食物アレルゲンに対するアレルギーである。
【００９１】
フェニルケトン尿症
一部の例では、本開示は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療する方法を提供する。「フェニルケトン尿症」という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用される。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、アミノ酸代謝の最も流行する障害の１つである。遺伝的欠損（酵素ＰＡＨの欠損）が高レベルの血中フェニルアラニン（Ｐｈｅ）を結果としてもたらし、これが、人生の早期に認識されて治療されなければ、重篤な精神遅滞に繋がることがある。食事の順守の下であっても、ＰＫＵ患者は青年期以降の認知障害のリスクがある。
【００９２】
プロモーター
「プロモーター」は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始させる、核酸分子上、例えばＤＮＡ分子上の領域を意味する。プロモーターは、例えば、プロモーターが転写を制御する配列の上流、すなわち５’に位置する。プロモーターは、追加の天然調節配列または領域、例えばオペレーターに関連してもよいことを当業者は理解するであろう。発現のために必要とされる調節領域の精密な性質は生物ごとに異なることがあるが、一般に、原核生物において、（ＲＮＡ転写の開始を導く）プロモーターの他に、ＲＮＡに転写された時に、タンパク質合成の開始のシグナルを送るＤＮＡ配列の両方を含有するプロモーター領域を含む。そのような領域は、通常、プリブノーボックス（ＴＡＴＡボックスを参照）、シャイン・ダルガノ配列などの、転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディング配列を含む。
【００９３】
「作動可能に連結された」という用語は、記載された複数のコンポーネントが、意図した様式で機能することを可能とする関係性で並置されていることを指す。コーディング配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合性の条件下でコーディング配列の発現が達成されるようにライゲートされている。例えば、プロモーターは、連結または接続が遺伝子の転写を可能としまたはもたらす場合に、前記遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列に作動可能に連結されていると言われる。さらなる例では、５’および３’の遺伝子、シストロン、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列は、連結または接続が少なくとも３’の遺伝子の翻訳を可能としまたはもたらす場合に、ポリシストロン性発現ユニット中で作動可能に連結されていると言われる。例えば、例えばプロモーターおよびオープンリーディングフレームなどのＤＮＡ配列は、配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を結果としてもたらさない、（２）オープンリーディングフレームの転写を導くプロモーターの能力に干渉しない、または２５（３）オープンリーディングフレームがプロモーター領域配列によって転写される能力に干渉しない場合に、作動可能に連結されていると言われる。
【００９４】
発現カセット
「発現カセット」または「発現ユニット」という用語は、当該技術分野において一般に認められる意味にしたがって使用され、１つまたは複数の遺伝子および該１つまたは複数の遺伝子の発現を制御する配列を含有する核酸を指す。例示的な発現カセットは、少なくとも１つのプロモーター配列および少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する。
【００９５】
ポリシストロン性発現カセット
「ポリシストロン性発現カセット」、「ポリシストロン性発現ユニット」または「ポリシストロン性発現システム」という用語は、当該技術分野において一般に認められる意味にしたがって本明細書において交換可能に使用される。それらは、２つまたはそれより多くの遺伝子の発現が、プロモーター、オペレーターなどの共通の調節機構によって調節される核酸配列を指す。本明細書で使用されるポリシストロン性発現ユニットという用語は、マルチシストロン性発現ユニットと同義である。ポリシストロン性発現ユニットの例は、２シストロン性、３シストロン性、４シストロン性の発現ユニットであるが、これらに限定されない。タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドなどの個々の発現産物をコードする、２つまたはそれより多く（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれより多く）のオープンリーディングフレームまたはコーディング領域を含む任意のｍＲＮＡは、ポリシストロン性という用語に包含される。ポリシストロン性発現カセットは、少なくとも１つのプロモーター、および該プロモーターによって制御された少なくとも２つのオープンリーディングフレームを含み、該２つのオープンリーディングフレームの間に遺伝子間領域が配置されてもよい。
【００９６】
一部の例では、「ポリシストロン性発現カセット」は、微生物（例えば、ＬＡＢ）に内因性のプロモーターによって転写制御される１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるポリシストロン性発現ユニットまたはシステムは、微生物（例えば、ＬＡＢ）に外因性のプロモーターによって転写制御される。さらなる実施形態では、本明細書に記載される翻訳上または転写上連結された１つまたは複数の内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子は、前記１つまたは複数の内因性遺伝子（の１つ）の天然プロモーターによって転写制御される。別の実施形態では、ポリシストロン性発現ユニットは、前記ポリシストロン性発現ユニットに含まれる前記１つまたは複数の内因性遺伝子（の１つ）の天然プロモーターによって転写制御される。別の実施形態では、ポリシストロン性発現ユニットは、グラム陽性内因性プロモーターに作動可能に連結されている。例示的な実施形態では、プロモーターは、それが作動可能に連結されるオープンリーディングフレームの上流、すなわち、５’に位置し得る。さらなる実施形態では、プロモーターは、ポリシストロン性発現ユニット中の内因性遺伝子の最も５’、すなわち最も上流の天然プロモーターである。したがって、一部の例では、ポリシストロン性発現ユニットは、前記１つまたは複数の内因性遺伝子の３’末端に転写上連結された内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子を含有し、例えば、前記１つまたは複数の外因性遺伝子は、ポリシストロン性発現ユニットの最も３’の遺伝子である。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「翻訳上連結された」（translationally coupled）という用語は、「翻訳上連結された」（translationally linked）または「翻訳上接続された」と同義である。これらの用語は、本質的に、ポリシストロン性発現カセットまたはユニットに関する。２つまたはそれより多くの遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列は、共通の調節エレメント（特に、共通のプロモーター中にあるものなど）が、前記２つまたはそれより多くの遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列をコードする１つのｍＲＮＡとして前記２つまたはそれより多くの遺伝子の転写をもたらし、それをその後に２つまたはそれより多くの個々のポリペプチド配列に翻訳できる時に、翻訳上連結されていると言われる。細菌オペロンは、２つまたはそれより多くの遺伝子が翻訳上または転写上連結された天然に存在するポリシストロン性発現システムまたはユニットであることを当業者は理解するであろう。
【００９８】
遺伝子間領域
本明細書で使用される場合、「遺伝子間領域」という用語は、「遺伝子間リンカー」または「遺伝子間スペーサー」と同義である。遺伝子間領域は、隣接する（すなわち、同じポリ核酸配列上に位置する）遺伝子、オープンリーディングフレーム、シストロンまたはコーディング配列の間のポリ核酸配列として定義される。拡張により、遺伝子間領域は、前記遺伝子間領域によって連結された５’の遺伝子の終止コドンおよび／または３’の遺伝子の開始コドンを含み得る。本明細書で定義される通り、遺伝子間領域という用語は、ポリシストロン性発現ユニット中の隣接する遺伝子間の遺伝子間領域に特に関する。例えば、本明細書で定義される遺伝子間領域は、オペロン中の隣接する遺伝子間に見出すことができる。したがって、一実施形態では、本明細書で定義される遺伝子間領域は、オペロンの遺伝子間領域である。
【００９９】
一部の例では、遺伝子間領域、リンカーまたはスペーサーは、グラム陽性菌のｒｐｌＷ、ｒｐｌ  Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥまたはｒｐｌＮに先行する、すなわち５’の、より具体的にはすぐ５’の、遺伝子間領域から選択される。一部の実施形態では、グラム陽性菌は、乳酸菌、例えばラクトコッカス（Lactococcus）種、例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、および任意のその亜種または株である。一実施形態では、前記遺伝子間領域は、ｒｐｌＷ、ｒｐｌ  Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥもしくはｒｐｌＮの開始コドンおよび／または先行する、すなわち５’の、遺伝子の終止コドンを包含する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるグラム陽性菌または組換え核酸に関し、内因性遺伝子および１つまたは複数の外因性遺伝子は、グラム陽性菌中で活性の遺伝子間領域（単数または複数）によって転写上連結されており、例えば、遺伝子間領域（単数または複数）は前記グラム陽性菌に対して内因性であり、例えば、内因性遺伝子間領域は、ｒｐｌＷ、ｒｐｌ  Ｐ、ｒｐｍＤ、ｒｐｌＢ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＥ、またはｒｐｌＮ、ｒｐｌＭ、ｒｐｌＥ、およびｒｐｌＦに先行する遺伝子間領域から選択される。
【０１００】
遺伝子間領域が５’の終止コドンおよび／または３’の開始コドンを包含する場合、正しい翻訳の開始および／または終結に影響することがある二重の開始および／または終止コドンを回避するために、これらの各々のコドンは、一部の場合には、前記遺伝子間領域によって連結された遺伝子中に存在しないことを当業者は理解するであろう。遺伝子間領域を同定する方法は当該技術分野において公知である。さらなるガイダンスによって、遺伝子間領域は、例えば、ソフトウェアが当該技術分野において公知かつ利用可能な、オペロン、および関連するプロモーターおよびオープンリーディングフレームの予測に基づいて同定することができる。例示的な遺伝子間領域は、国際特許出願公開第２０１２／１６４０８３号パンフレット（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１０１】
対象
「対象」は、例えば本開示の方法にしたがって、本開示の組成物を投与されることから利益を得る可能性がある生物である。対象は、哺乳動物（「哺乳動物対象」）であり得る。例示的な哺乳動物対象としては、ヒト、農用動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど）、愛玩動物（イヌ、ネコ、およびウサギなど）、および、マウス、ラット、および霊長目動物などの他の動物が挙げられる。一部の例では、哺乳動物対象は、ヒト患者である。
【０１０２】
粘膜
「粘膜」（mucosa）または「粘膜」（mucous membrane）という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用される。「粘膜」は、口腔粘膜、直腸粘膜、胃粘膜、腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、頬粘膜、気管支または肺粘膜、および鼻または嗅覚粘膜などの、身体中に見られる任意の粘膜であり得る。粘膜は、体表粘膜、例えば、魚および両生動物に見られる体表粘膜を指すこともある。
【０１０３】
本明細書で使用される「粘膜送達」という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって使用され、すなわち、例えば、粘膜との本開示の組成物の接触を介した、粘膜への送達である。口腔粘膜送達としては、頬側、舌下および歯肉経路の送達が挙げられる。したがって、一部の実施形態では、「粘膜送達」としては、経胃送達、経腸送達、経直腸送達、経頬送達、経肺送達、経眼送達、経鼻送達、経膣送達および経口送達が挙げられる。経口送達は胃腸管の遠位部分への送達に影響し得ることを当業者は理解するであろう。
【０１０４】
「粘膜寛容」という用語は、哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）が粘膜経路を介して抗原に曝露された後の、該対象における抗原への特異的免疫反応性の阻害を指す。一部の場合には、粘膜寛容は、全身寛容である。低用量経口寛容は、低用量の抗原によって誘導される経口寛容であり、ナイーブ宿主に寛容を与えることができるシクロホスファミド感受性制御性Ｔ細胞によって媒介される活性の免疫抑制によって特徴付けられる。高用量経口寛容は、高用量の抗原によって誘導される経口寛容であり、シクロホスファミド治療に対して非感受性であり、かつ抗原特異的Ｔ細胞のアネルギーおよび／または欠失を介してＴ細胞低応答性の誘導に進む。シクロホスファミドへの感受性の違いを使用して、低用量寛容と高用量寛容とを区別することができる（Strobel et al., 1983）。一部の場合には、経口寛容は、Mayer and Shao (2004)によって記載される低用量経口寛容である。
【０１０５】
ムチン
「ムチン」という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用される。ムチンは、ヒトおよび動物において上皮組織によって製造される高分子量のグリコシル化されたタンパク質（複合糖質）のファミリーである。ムチンは、ゲルを形成する能力を有し、ゲル状分泌物の鍵となる成分である。一部のムチンは、疎水性膜貫通ドメインの存在により膜に結合している。ほとんどのムチンは、粘膜によって粘液の主要成分として分泌され、または、分泌されて唾液の成分となる。ムチン遺伝子としては、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、およびＭＵＣ２１が挙げられる。ＭＵＣ２はほとんどが腸において分泌されるが、気道においても分泌される。成熟ムチンは２つの別個の領域から構成され、アミノ末端領域およびカルボキシ末端領域は若干グリコシル化されているが、システインに富む。システイン残基は、ムチン単量体内およびムチン単量体間のジスルフィド結合の確立に参加する。大きい中心領域が、１０〜８０残基の配列の複数の縦列反復配列から形成され、そのアミノ酸の半分までがセリンまたはスレオニンである。この区画は、ほぼＯ結合型オリゴサッカリドで飽和する。ムチンタンパク質（例えば、ＭＵＣ１）の過剰発現は多くの種類のがんに関連する。本開示の文脈において、「ムチン」はまた、「ムチン調製物」または「ムチンを含有する粘液または他の調製物」も意味し得る。
【０１０６】
治療
本明細書で使用される「治療」、「治療する」などの用語は、疾患または状態、例えばＰＫＵまたはＴ１Ｄの特徴的な症状または外徴を改善しまたは軽減することを意味する。例えば、Ｔ１Ｄの治療は、対象において抗原特異的免疫寛容の回復または誘導を結果としてもたらし得る。他の例では、治療は、自己免疫糖尿病を阻止すること、または自己免疫糖尿病を後退させることを意味する。本明細書で使用される場合、これらの用語はまた、疾患もしくは状態または疾患もしくは状態に関連する症状の発症を予防しまたは遅延させることを包含し、これには、疾患もしくは状態の重篤度または前記疾患もしくは状態に罹患する前にそれに関連する症状を低減させることが含まれる。罹患前のそのような予防または低減は、投与の時点で疾患または状態に罹患していない患者に本開示の微生物（例えば、細菌）または組成物を投与することを指す。「予防する」はまた、例えば、改善期間後の、疾患もしくは状態またはそれに関連する症状の再発を予防することまたはぶり返しの防止を包含する。
【０１０７】
「それを必要とする」対象の治療は、対象が疾患または状態を有し、本発明の治療方法が特定の疾患または状態を治療する意図的な目的で行われることを表す。
【０１０８】
治療有効量
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、望ましい治療レジメンにしたがって投与された時に所望の治療効果または反応を誘発する本開示の非病原微生物または組成物の量を指す。一部の例では、化合物または組成物は、１日あたり１回または複数回投与された時に治療有効量と同等の活性成分の量を含有する単位剤形、例えば錠剤またはカプセル剤として提供される。
【０１０９】
所望の治療効果（例えば、Ｔ１Ｄの効果的な治療のため）を達成するために必要とされる組換え微生物の治療有効量は、例えば、微生物によって発現されるポリペプチドの性質、投与経路、ならびにレシピエントの年齢、体重、および他の特徴に応じて変化することを当業者は理解するであろう。
【０１１０】
分泌されるポリペプチドの量は、Ｑ−ＰＣＲなどの先端的な方法によって、またはＥＬＩＳＡを使用することによって、ｃｆｕに基づいて決定することができる。例えば、特定の微生物は、１０９ｃｆｕあたり少なくとも約１ｎｇ〜約１μｇの活性ポリペプチドを分泌し得る。それに基づいて、当業者は、他のｃｆｕ用量で分泌される抗原ポリペプチドの範囲を算出することができる。
【０１１１】
治療有効量は、本明細書に記載される任意の投薬レジメンとの関連で投与することができる。活性ポリペプチドの１日の用量は、１日全体を通じて１、２、３、４、５、または６の部分で投与されてもよい。さらに、１日の用量は、投与期間の間の任意の回数の休息期間と共に、任意の日数にわたって投与されてもよい。例えば、約０．０１〜約３．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の活性剤（例えば、インターロイキン）の用量を計６週にわたって１日毎に投与することができる。他の例では、ＰＡＬは、１日あたり０．１〜１０００ｍｇに及ぶ用量、例えば各食事時に１〜１００ｍｇの用量で、投与される。
【０１１２】
Ｔ１Ｄ特異的抗原
一部の実施形態では、上記組成物および方法のいずれかにおいて、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、Ｔ１Ｄで実行される公知の自家抗原から選択され、プロインスリン（ＰＩＮＳ）；インスリン（ＩＮＳ）；グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（例えば、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、またはＧＡＤ２）；インスリノーマ関連タンパク質２（膵島抗原−２；ＩＡ−２）（タンパク質チロシンホスファターゼ受容体型Ｎ（ＰＴＰＲＮ）、チロシンホスファターゼ様タンパク質、またはＩＣＡ５１２とも称される）、（例えば、Long et al., Diabetes 2013, 62 (6), 2067-2071を参照）；膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（例えば、ＧＲＰ７８）（例えば、Rondas et al., Diabetes 2015; 64(2):573-586、およびYe et al., Diabetes 2010, 59(1):6-16を参照）、およびこれらの抗原の２つまたはそれより多くの組合せが挙げられる。他の実施形態では、上記組成物および方法において、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、ＰＩＮＳ、ＧＡＤ６５、またはＩＡ−２である。他の実施形態では、上記組成物および方法において、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、ＰＩＮＳである。様々な実施形態では、Ｔ１Ｄ特異的抗原は、全長（例えば、野生型）遺伝子より短いバリアント核酸配列によってコードされ、そのため、「切除」型は、多くの場合に、使用される微生物（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によってより効率的に発現および／または分泌される。分泌はより効率的であるが、多くの「切除」型は、それらの生物学的活性の全て（または実質的部分）を保持し、例えば、充分なＴｒｅｇ刺激および／または寛容誘導能力を保持する。
【０１１３】
微生物
本明細書に提示する実施形態のいずれかによる一部の例では、微生物は非病原性微生物、例えば、非病原性および非浸潤性細菌である。他の実施形態では、微生物は、非病原性かつ非浸潤性の酵母である。
【０１１４】
一部の実施形態では、微生物は、サッカロミセス（Saccharomyces）種、ハンセヌラ（Hansenula）種、クルイベロミセス（Kluyveromyces）種、シゾサッカロミセス（Schizzosaccharomyces）種、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）種、ピキア（Pichia）種、モナスカス（Monascus）種、ゲオトリクム（Geothchum）種およびヤロウィア（Yarrowia）種からなる群から選択される酵母株である。一部の実施形態では、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。他の実施形態では、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）は、亜種ブラウディ（boulardii）である。本発明の一実施形態では、組換え酵母宿主ベクター系は、生物学的に封じ込められた系である。生物学的封じ込めは当業者に公知であり、例えば、ｔｈｙＡ変異などの自殺性の栄養要求性変異、またはその同等物といった、栄養要求性変異の導入により実現することができる。あるいは、例えば、数世代後に失われる不安定なエピソーム構築物を使用することなどによって、ポリペプチドをコードする遺伝子を持つプラスミドのレベルで生物学的封じ込めを実現することができる。所望の場合、プラスミドの不安定性および栄養要求性などのいくつものレベルの封じ込めを組み合わせて、高レベルの封じ込めを確実にすることができる。
【０１１５】
本発明の他の実施形態では、微生物は、非病原性細菌（例えば、食品グレードの細菌株）などの細菌である。一部の例では、非病原性細菌は、グラム陽性菌、例えば、グラム陽性の食品グレードの細菌株である。一部の実施形態では、グラム陽性の食品グレードの細菌株は、乳酸発酵性の細菌株（すなわち、乳酸菌（ＬＡＢ））またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）である。
【０１１６】
一部の実施形態では、乳酸発酵性の細菌株は、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）の種である。本明細書で使用される場合、ラクトコッカス（Lactococcus）またはラクトバチルス（Lactobacillus）は、特定の種または亜種に限定されないが、ラクトコッカス（Lactococcus）またはラクトバチルス（Lactobacillus）の種または亜種のいずれかを含むことを意図する。例示的なラクトコッカス（Lactococcus）種としては、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ピスシウム（Lactococcus piscium）、ラクトコッカス・プランタルム（Lactococcus plantarum）、およびラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）が挙げられる。一部の例では、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）は、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、またはラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）である。
【０１１７】
例示的なラクトバチルス（Lactobacillus）種としては、ラクトバチルス・アセトトレランス（Lactobacillus acetotolerans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチルス・アルジダス（Lactobacillus algidus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・アミロリチカス（Lactobacillus amylolyticus）、ラクトバチルス・アミロフィラス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバチルス・アビアリウス（Lactobacillus aviarius）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種ラフィノサス（Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス（Lactobacillus aviarius subsp. aviarius）、ラクトバチルス・ババリカス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カルニス（Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種アラクトサス（Lactobacillus casei subsp. alactosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種シュードプランタラム（Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum）、ラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種トレランス（Lactobacillus casei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・カテナフォルミス（Lactobacillus catenaformis）、ラクトバチルス・セロビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・コンフサス（Lactobacillus confusus）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜種クルバタス（Lactobacillus curvatus subsp. curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜種メリビオサス（Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus）、ラクトバチルス・デルブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種デルブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・ジベルゲンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・フォルニカリス（Lactobacillus fornicalis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・フルクトサス（Lactobacillus fructosus）、ラクトバチルス・ガリナラム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・グラミニス（Lactobacillus graminis）、ラクトバチルス・ハロトレランス（Lactobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamsteri）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ヘテロヒオキー（Lactobacillus heterohiochii）、ラクトバチルス・ヒルガルジー（Lactobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホモヒオキー（Lactobacillus homohiochii）、ラクトバチルス・イネルス（Lactobacillus iners）、ラクトバチルス・インテスチナリス（Lactobacillus intestinalis）、ラクトバチルス・ジェンセニー（Lactobacillus jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）、ラクトバチルス・ケフィルグラナム（Lactobacillus kefirgranum）、ラクトバチルス・クンキー（Lactobacillus kunkeei）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ライヒマンニー（Lactobacillus leichmannii）、ラクトバチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）、ラクトバチルス・マレフェルメンタンス（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス・マルタロミカス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・マニホチボランス（Lactobacillus manihotivorans）、ラクトバチルス・ミノル（Lactobacillus minor）、ラクトバチルス・ミヌタス（Lactobacillus minutus）、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・ムリナス（Lactobacillus murinus）、ラクトバチルス・ナゲリー（Lactobacillus nagelii）、ラクトバチルス・オリス（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラクトバチルス・パラブクネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種トレランス（Lactobacillus paracasei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Lactobacillus parakefiri）、ラクトバチルス・パラリメンタリウス（Lactobacillus paralimentarius）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ペロレンス（Lactobacillus perolens）、ラクトバチルス・ピスシコラ（Lactobacillus piscicola）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ポンチス（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・リマエ（Lactobacillus rimae）、ラクトバチルス・ロゴサエ（Lactobacillus rogosae）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・サケイ亜種カモサス（Lactobacillus sakei subsp. camosus）、ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリシニウス（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチルス・シャルペエ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobacillus suebicus）、ラクトバチルス・トリコデス（Lactobacillus trichodes）、ラクトバチルス・ウリ（Lactobacillus uli）、ラクトバチルス・バクシノステルカス（Lactobacillus vaccinostercus）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、ラクトバチルス・ビリデスセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバチルス・ビツリナス（Lactobacillus vitulinus）、ラクトバチルス・キシロサス（Lactobacillus xylosus）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種マリ（Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis subsp. yamanashiensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、およびビフィドバクテリウム・インファンチス（Bifidobacterium infantis）が挙げられる。一部の例では、ＬＡＢは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ）である。
【０１１８】
さらなる例では、細菌は、エンテロコッカス・アルセジニス（Enterococcus alcedinis）、エンテロコッカス・アクイマリナス（Enterococcus aquimarinus）、エンテロコッカス・アシニ（Enterococcus asini）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium）、エンテロコッカス・カッカエ（Enterococcus caccae）、エンテロコッカス・カメリエ（Enterococcus camelliae）、エンテロコッカス・カニンテスチニ（Enterococcus canintestini）、エンテロコッカス・カニス（Enterococcus canis）、エンテロコッカス・カセリフラバス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコラム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・コランバエ（Enterococcus columbae）、エンテロコッカス・デブリエセイ（Enterococcus devriesei）、エンテロコッカス・ジエストラムメナエ（Enterococcus diestrammenae）、エンテロコッカス・ジスパル（Enterococcus dispar）、エンテロコッカス・デュランス（Enterococcus durans）、エンテロコッカス・エウレケンシス（Enterococcus eurekensis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ギルバス（Enterococcus gilvus）、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス（Enterococcus haemoperoxidus）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Enterococcus hermanniensis）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・イタリカス（Enterococcus italicus）、エンテロコッカス・ラクチス（Enterococcus lactis）、エンテロコッカス・レマニー（Enterococcus lemanii）、エンテロコッカス・マロドラタス（Enterococcus malodoratus）、エンテロコッカス・モラビエンシス（Enterococcus moraviensis）、エンテロコッカス・ムンドチー（Enterococcus mundtii）、エンテロコッカス・オリバエ（Enterococcus olivae）、エンテロコッカス・パレンス（Enterococcus pallens）、エンテロコッカス・フォエニクリコラ（Enterococcus phoeniculicola）、エンテロコッカス・プランタルム（Enterococcus plantarum）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Enterococcus pseudoavium）、エンテロコッカス・クエベセンシス（Enterococcus quebecensis）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Enterococcus raffinosus）、エンテロコッカス・ラッティ（Enterococcus ratti）、エンテロコッカス・リボラム（Enterococcus rivorum）、エンテロコッカス・ロタイ（Enterococcus rotai）、エンテロコッカス・サッカロリチカス（Enterococcus saccharolyticus）、エンテロコッカス・シレシアカス（Enterococcus silesiacus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococcus solitarius）、エンテロコッカス・スルフレウス（Enterococcus sulfureus）、エンテロコッカス・テルミチス（Enterococcus termitis）、エンテロコッカス・タイランジカス（Enterococcus thailandicus）、エンテロコッカス・ウレアシチカス（Enterococcus ureasiticus）、エンテロコッカス・ウレイリチカス（Enterococcus ureilyticus）、エンテロコッカス・ビーキエンシス（Enterococcus viikkiensis）、エンテロコッカス・ビロラム（Enterococcus villorum）、およびエンテロコッカス・シャンファンゲンシス（Enterococcus xiangfangensis）からなる群から選択される。
【０１１９】
さらなる例では、細菌は、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）、ストレプトコッカス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・ジスガラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・エクイナス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス・イニエ（Streptococcus iniae）、ストレプトコッカス・インテルメジウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ミレリ（Streptococcus milleri）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・ペロリス（Streptococcus peroris）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・シュードニューモニエ（Streptococcus pseudopneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッティ（Streptococcus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・チグリナス（Streptococcus tigurinus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Streptococcus vestibularis）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）からなる群から選択される。
【０１２０】
本発明の特定の態様では、グラム陽性の食品グレードの細菌株は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、または、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、およびラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）などのその亜種のいずれかである。本発明の別の態様では、組換えグラム陽性菌株は、乳中での正常な増殖および酸産生の能力を喪失した、プラスミドなしのラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＭＧ１３６３などの、生物学的に封じ込められた系（Gasson, M.J. (1983) J. Bacteriol. 154:1-9）；またはスレオニンおよびピリミジン栄養要求株誘導Ｌ．ラクチス（L. lactis）株（Sorensen et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258、Glenting et al. (2002) 68:5051-5056）である。
【０１２１】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、細菌は大腸菌（E. coli）ではない。
【０１２２】
本発明の一実施形態では、組換え細菌宿主ベクター系は、生物学的に封じ込められた系である。生物学的封じ込めは当業者に公知であり、栄養要求性変異、例えばｔｈｙＡ変異などの自殺性の栄養要求性変異、またはその同等物の導入によって実現することができる。あるいは、生物学的封じ込めは、例えば、数世代後に失われる不安定なエピソーム構築物を使用することなどによって、ポリペプチドをコードする遺伝子を持つプラスミドのレベルで実現することができる。所望の場合、プラスミドの不安定性および栄養要求性などのいくつものレベルの封じ込めを組み合わせて、高レベルの封じ込めを確実にすることができる。
【０１２３】
結合および付着分子
「結合」および「付着」という用語は、本明細書において概ね同義である。結合／付着は、哺乳動物細胞および／または生物学的表面（粘液、フィブロネクチン、コラーゲンなど）もしくは他の非生物表面を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを通じて、および、例えば、定着、残存の測定を通じて、または生物学的効果によって暗示されるようにｉｎ  ｖｉｖｏで、評価することができる。
【０１２４】
そのような結合／付着は、典型的に、標的とする分子、細胞、または部位に特異的である。生物は、他の細胞、非生物の物体、および粘液などの細胞産物への結合および付着を促進する多様な分子（多くの場合、ポリペプチド、糖タンパク質および炭水化物）を産生し得る。結合および付着を促進するそのような分子は、標的分子（典型的には、別のタンパク質、糖タンパク質または炭水化物）への様々な程度の特異性を有する。異なる結合分子の発現は、異なる生物学的表面への優先的な結合に繋がる。例えば、ＧＩ管の異なる細胞は異なる表面分子を発現し、特定の表面分子の頻度はＧＩ管に沿って異なることがある。したがって、細菌細胞は、特定の宿主細胞、またはＧＩ管の特定の領域に優先的に結合することができる。結合は、増加した定着、標的部位での標的タンパク質の送達、増加したＧＩ通過時間などに関連し得る。反対に、ＧＩ管の１つの部位への結合は、ＧＩの別の部位への低減した結合に関連し得る。
【０１２５】
細菌結合タンパク質の天然のバリエーションは、変異によって、および、他の生物由来のものなどの他の結合分子からのモチーフを発現させる組換えによって、補足することができる。そのような組換え結合タンパク質は、単独で、または単一分子において複数の結合特異性を提供する融合タンパク質として、発現させることができる。
【０１２６】
タンパク質が細菌を生物学的表面に結合させるために、結合ポリペプチドは典型的に細胞質から輸送され、細菌の表面にアンカーされる。ラクトコッカス（Lactococcus）などのグラム陽性菌では、付着分子は典型的に、（ａ）細胞膜を通じた分泌を導くＮ末端分泌シグナル、および（ｂ）ポリペプチドを細胞壁にアンカーさせるＣ末端アンカー性ドメイン（すなわち、「細胞壁アンカー性ドメイン」）を有して発現される。アンカー性ドメインが無い場合、ポリペプチドは細胞外環境に放出される。
【０１２７】
例えば、トレフォイル因子（ＴＦＦ）は、動物細胞によって分泌され、粘液に結合し、粘液膜の治癒などのいくつかの生物学的効果を有する。細菌性分泌シグナルをＴＦＦに組換えによって加えることによって、ＴＦＦを細胞外環境に分泌させて粘液膜の治癒を促進するように細菌を操作することができる。細菌はまた、分泌シグナルおよびアンカーシグナルの両方をＴＦＦに加えることによって、粘液結合特性を有するように操作することもできる。
【０１２８】
細胞付着ポリペプチド
本開示の一部の実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、細胞付着ポリペプチドを含有する融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有する。細胞付着特性、例えば、腸細胞またはその細胞株（例えば、Ｃａｃｏ−２、ＩＥＣ−１８、またはＨＴ２９−ＭＴＸ細胞）への結合性を呈する任意のポリペプチドが本開示の文脈において有用である。細胞付着能力は、本明細書に開示されるものなどの当該技術分野で認識される方法を使用して測定することができる。一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）（例えば、Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681を参照）、粘液結合タンパク質またはｍｕｂドメインタンパク質（Ｍｕｂ）（例えば、Boekhorst et al., Microbiology 2006, 152(1):273-280を参照）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）（例えば、Miyoshi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70(7):1622-8を参照）、ラクトコッカス（Lactococcus）ムチン結合タンパク質（ＭｐｂＬ）（例えば、Lukic et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000を参照）から選択される。一部の例では、融合タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡアンカー断片（ＳｐａＸ）（例えば、Steidler et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(1):342-5を参照）などの細胞壁アンカーペプチドを含み得る。上記開示の全ては、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡなどのＣｍｂＡポリペプチドである。例えば、上掲のJensen et al.に開示されるＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７４を参照。
【０１２９】
上記実施形態のいずれかによる一部の例では、細胞付着ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣｍｂＡポリペプチドである。上記実施形態のいずれかによる他の例では、細胞付着ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の外因性核酸配列によってコードされるＣｍｂＡポリペプチドである。
【０１３０】
ムチン結合ポリペプチド
本開示の一部の実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、ムチン結合ポリペプチドを含有する融合タンパク質をコードする外因性核酸を含有する。ムチン結合特性、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのムチン調製物への結合性を呈する任意のポリペプチドが本開示の文脈において有用である。ムチン結合能力は、本明細書に開示されるものなどの当該技術分野で認識される方法を使用して測定することができる。例示的なムチン結合ポリペプチドとしては、トレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチド（例えば、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、またはＴＦＦ３）（例えば、Caluwaerts, S. et al., Oral. Oncol. 2010, 46:564-570を参照）およびＭｕｃＢＰポリペプチド（例えば、Lukic et al, Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000を参照）が挙げられる。一部の例では、本開示は、融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む微生物（例えば、細菌）であって、融合タンパク質が細胞付着ポリペプチド（例えば、ＣｍｂＡポリペプチド）およびムチン結合ポリペプチド（例えば、ＴＦＦポリペプチド）を含有する、微生物（例えば、細菌）を提供する。一部の例では、ＴＦＦポリペプチドはヒトＴＦＦポリペプチド（例えば、ｈＴＦＦ１、ｈＴＦＦ２、またはｈＴＦＦ３）である。上記実施形態のいずれかによる他の例では、ムチン結合ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するヒトＴＦＦ３ポリペプチドである。上記実施形態のいずれかによる他の例では、ムチン結合ポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の外因性核酸配列によってコードされるヒトＴＦＦ３ポリペプチドである。一部の例では、ムチン結合ポリペプチドは、魚のＴＦＦポリペプチド、または両生動物のＴＦＦポリペプチドである。さらに他の例では、ムチン結合ポリペプチドは、Fujita et al., Mol. Reprod. Dev. 2006, 75(7):1217-1228に開示されるものなどの、トレフォイル様ドメインを含む（またはそれからなる）。
【０１３１】
構築物
一部の実施形態では、微生物（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの細菌）は、融合タンパク質および任意選択で治療用ポリペプチドを発現できる発現ベクターを含む。例えば、融合タンパク質は、粘膜、例えば胃腸管中の粘膜に存在する条件下で細胞表面に露出される。微生物（例えば、細菌）は、所望のＧＩ保持を提供するために充分な程度で融合タンパク質が細胞表面に露出されるように融合タンパク質を発現できる発現ベクターを含み得る。当業者は、対象に提供される微生物（例えば、細菌）の量を調整して、所望の量の治療用ポリペプチドを送達することができる。
【０１３２】
通常、発現システムは、例えば、宿主微生物中での配列の発現を導くことができるプロモーターに作動可能に連結された、少なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む。好適には、発現される融合タンパク質は、宿主の好ましいコドン用法に適した核酸配列によってコードされ得る。構築物は、当業者に公知なように、選択された宿主中で作動可能な、エンハンサー、転写開始配列、シグナル配列、レポーター遺伝子、転写終結配列などの（全ての）他の好適なエレメントをさらに含有してもよい。
【０１３３】
一部の例では、構築物は、ベクター、プラスミドまたはミニ染色体などの、宿主の形質転換のために好適な形態、および／または、宿主中で安定的に維持され得る形態である。微生物（例えば、細菌）中に導入するための核酸を含む好適なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター断片、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含む、適切な調節配列を含有するものを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス（例えば、ファージまたはファージミド）であり得る。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press（その関連する開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照。
【０１３４】
例えば、核酸構築物の調製、変異生成、シークエンシング、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、およびタンパク質の解析における、核酸のマニピュレーションのための多くの公知の技術およびプロトコールはShort Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992（その関連する開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。一実施形態では、融合タンパク質のためのコーディング配列はオペロン、すなわち、ポリシストロン性発現用の核酸構築物中に含有される。オペロンにおいて、プロモーターからの転写は、１つより多くのコーディング配列を含むｍＲＮＡを結果としてもたらし、各コーディング配列は上流にそれ自体の好適に位置したリボソーム結合部位を有する。したがって、１つより多くのポリペプチドを単一のｍＲＮＡから翻訳することができる。オペロンの使用は、融合タンパク質および治療用ポリペプチドの発現が調和することを可能とする。細菌宿主細胞におけるポリシストロン性発現システムは、例えば、Vanden-Broucke et al.の米国特許出願第２０１４／０１０５８６３号明細書（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３５】
一実施形態では、本発明は、安定的にトランスフェクトされた微生物（例えば、細菌）に関する。一部の例では、本開示は、融合タンパク質をコードする外因性核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれた微生物（例えば、細菌）を提供する。安定的にトランスフェクトされた微生物を確立するための技術は当該技術分野において公知である。例えば、融合タンパク質をコードする核酸を相同組換えを介して宿主の染色体中にクローニングすることができる。一部の例では、宿主の必須遺伝子は、遺伝子の欠失などの相同組換え事象、必須遺伝子によってコードされたタンパク質の不活性型を生じるか、または必須遺伝子によってコードされたタンパク質の切断型を結果としてもたらすフレームシフト変異を生じる１つまたは複数のアミノ酸置換によって破壊される。一実施形態では、必須遺伝子は、ｔｈｙＡ遺伝子である。例示的な技術は、例えば、国際公開第０２／０９０５５１号パンフレット（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。形質転換用プラスミドは、破壊される必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子を補完できないものである限り、任意のプラスミドであってよい。プラスミドは自己複製性であってよく、１つまたは複数の目的の遺伝子を持ってよく、かつ１つまたは複数の耐性マーカーを持ってよい。一部の例では、プラスミドは組込み型プラスミド（すなわち、組込みプラスミド）である。そのような組込みプラスミドを使用して、必須遺伝子の遺伝子座、例えばｔｈｙＡ部位での組込みを引き起こし、それによって必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子の機能を破壊することによって、必須遺伝子を破壊することができる。一部の例では、ｔｈｙＡ遺伝子などの必須遺伝子は、ｔｈｙＡ標的部位などの必須遺伝子への挿入を標的化する標的化配列が隣接した、目的の遺伝子（単数または複数）を含むカセットによる二重相同組換えによって置換される。これらの標的化配列は、標的部位中への目的の遺伝子の組込みを可能とするために充分に長くかつ充分に相同的であることが理解されるであろう。
【０１３６】
融合タンパク質をコードする遺伝子構築物は、宿主細胞中の染色体外に存在して、例えば、自身の複製起点を使用して自律的に複製してもよく、または、微生物のゲノムＤＮＡ、例えば、細菌または酵母の染色体、例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）の染色体に組み込まれていてもよい。後者の場合、核酸の単一コピーまたは複数コピーを組み込むことができ、組込みは、染色体のランダムな部位において、または、上記の通り、その予め定められた部位、ラクトコッカス（Lactococcus）（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））のｔｈｙＡ遺伝子座中などで起こり得る。
【０１３７】
それ故、一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする遺伝子構築物は、宿主細胞の染色体への遺伝子構築物の挿入をもたらすように構成された配列をさらに含み得る。一部の例では、微生物ゲノム、例えば宿主細胞の染色体内の特定の部位への遺伝子構築物の挿入は、相同組換えによって促進され得る。例えば、本開示の遺伝子構築物は、宿主細胞の染色体内の組込みの部位に相同な１つまたは複数の領域を含み得る。染色体の部位の配列は、天然のもの、すなわち、天然に存在するものであってもよいし、または、先行する遺伝子操作によって導入された外因性配列であってもよい。
【０１３８】
一部の例では、相同性の領域は、少なくとも５０塩基対（ｂｐ）、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ  ７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、またはそれより大きいものであり得る。
【０１３９】
一例では、遺伝子構築物中に存在する関連する発現ユニットのそれぞれの端部に隣接した、相同な２つの領域を含めることができる。そのような構成は、有利なことに、関連配列を宿主細胞に挿入し得る。特に細菌宿主中における相同組換え、および組換え体を選択する方法は、当該技術分野において一般に公知である。
【０１４０】
例えばプロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションなどの、微生物の形質転換法は当業者に公知である。
【０１４１】
高度な発現は、相同的発現および／または微生物、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）中に存在する発現ベクター上の分泌シグナルを使用することによって達成することができる。発現シグナルは当業者に明らかであろう。発現ベクターは、それが組み込まれる微生物に応じて発現について最適化することができる。例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、カゼイ（casei）およびプランタルム（plantarum）において充分なレベルの発現を与えた特定の発現ベクターが公知である。さらに、非病原性、非定着性、非浸潤性の食品グレードの細菌ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）における異種抗原の発現用に開発されたシステムが公知である（英国特許第２２７８３５８号明細書（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照）。一部の例では、本開示の構築物は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が組み込まれた、ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５（国際公開第９６／３２４８７号パンフレット）に記載された複数コピーの発現ベクターを含む。そのような構築物は、高レベルの発現での乳酸菌、特にラクトバチルス（Lactobacillus）における所望のポリペプチドの発現のために特に好適であり、そしてまた、発現産物を細菌細胞の表面に導くためにも使用することができる。（例えば、ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５の）構築物は、融合タンパク質をコードする核酸配列に先行して、リボソーム認識およびＲＮＡ安定化のために必要とされる最小配列を少なくとも含む５’非翻訳核酸配列が存在することを特徴とし得る。これに翻訳開始コドンが後続することができ、該翻訳開始コドンに（直ちに）、乳酸菌の遺伝子の翻訳される核酸配列の５’末端部分の少なくとも５つのコドンの断片または該断片の構造的もしくは機能的同等物が後続してもよい。断片はまた、プロモーターによって制御されてもよい。ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５（それに開示された様々な実施形態を含む）および本明細書で言及された全ての他の文献の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の一態様は、宿主における異種遺伝子の高レベルの調節された発現および発現の分泌への連結を可能とする方法を提供する。別の実施形態では、国際公開第９３／１７１１７号パンフレット（参照することにより本明細書に組み込まれる）にしたがって強力な発現システムを開発するためにＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼおよびその同族プロモーターが使用される。一実施形態では、発現プラスミドは、ｐＴ１  ＮＸに由来する。
【０１４２】
一部の実施形態では、本開示にしたがって用いられるプロモーターは、細菌中で構成的に発現される。構成的プロモーターの使用は、発現を起こすために誘導剤または他の調節シグナルを供給する必要性を回避する。例えば、プロモーターは、たとえ増殖が維持されなくても、細菌宿主細胞が生存可能なままである、すなわち、一部の代謝活性を保持するレベルでの発現を導く。有利なことに、そのような発現は低いレベルであってもよい。例えば、発現産物が細胞内に蓄積する場合、発現のレベルは、細胞内タンパク質の約１０％未満、または約５％もしくは約５％未満、例えば約１〜３％での発現産物の蓄積に繋がり得る。プロモーターは、用いられる細菌に同属的、すなわち、天然でその細菌中に見られるものであり得る。例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）のプロモーターをラクトコッカス（Lactococcus）において使用することができる。ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（または他のラクトコッカス（Lactococcus）属細菌）において使用するための例示的なプロモーターは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の染色体に由来する「Ｐ１」である（Waterfield, N R, Lepage, R W F, Wilson, P W, et al. (1995). “The isolation of lactococcal promoters and their use in investigating bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis” Gene 165(1):9-15）。プロモーターの別の例は、ｕｓｐ４５プロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｓｔｅｉｄｌｅｒらの米国特許第８，７５９，０８８号明細書、およびＶａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅらの米国特許出願第２０１４／０１０５８６３号明細書（これらの開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１４３】
核酸構築物（単数または複数）は、分泌シグナル配列を含み得る。したがって、一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、例えば、シグナル配列をコードする核酸配列をポリペプチドをコードする核酸配列に適切に連結することによって、ポリペプチドの分泌を提供し得る。抗原を分泌するための核酸を宿す細菌の能力は、該生物の生存能力を維持する培養条件においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。例示的な分泌シグナル配列としては、バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridium）およびラクトバチルス（Lactobacillus）などのグラム陽性生物中で活性を有する任意の分泌シグナル配列が挙げられる。そのような配列は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のα−アミラーゼ分泌リーダー、またはスタフィロコッカス（Staphylococcus）の一部の株によって分泌され、グラム陽性およびグラム陰性の両方の宿主において機能することが公知のスタフィロキナーゼ酵素の分泌リーダー（“Gene Expression Using Bacillus,” Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnology 1:21-27を参照）、あるいは多数の他のバチルス（Bacillus）酵素またはＳ層タンパク質からのリーダー配列（pp 341-344 of Harwood and Cutting, “Molecular Biological Methods for Bacillus,” John Wiley & Co. 1990を参照）を含み得る。一実施形態では、前記分泌シグナルは、ｕｓｐ４５に由来する（Van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet. 1993, 240:428-434）。一部の実施形態では、融合タンパク質は、構成的に分泌される。
【０１４４】
配合物およびレジメン
本開示の方法では、複数の治療用ポリペプチドが同じまたは異なる微生物によって発現され得る。例えば、（ａ）ＰＡＬおよびアミノ酸デカルボキシラーゼ；（ｂ）ＰＩＮＳなどのＴ１Ｄ特異的抗原およびＩＬ−２またはＩＬ−１０などのＴｒｅｇ活性化サイトカイン、（ｃ）グルテン抗原およびＩＬ−２またはＩＬ−１０、などである。別の生物中で発現される場合、一方または好ましくは両方の細菌は、ムチンおよび／または細胞結合因子を発現する。２つのポリペプチドが異なる微生物によって発現される場合、それらは同じ（例えば、合わせた）配合物中で対象に投与されてもよいし、または、別の（例えば、異なる）配合物中で対象に投与されもよい。別の配合物は同時にまたは異なる時点に投与することができる。例えば、各々の配合物中での第１および第２の治療用ポリペプチド産生微生物の使用は、同時に対象に施されてもよいし、または、逐次的に、例えば、両者の間の休息期間と共に、施されてもよい。
【０１４５】
一部の実施形態では、第１および第２の治療用ポリペプチド産生微生物は同時に投与される。これらの実施形態による一部の例では、第１の治療用ポリペプチドの微生物、および第２の治療用ポリペプチドの微生物は、同じ医薬配合物中に含まれ、または同時に用いられる１つより多くの医薬配合物中に含まれる。一部の実施形態では、２つの生物活性ポリペプチドは、ＩＬ−２およびＴ１Ｄ特異的抗原の両方を産生する微生物を使用して対象に送達される。
【０１４６】
一部の実施形態では、微生物は、例えば経口配合物を使用して、１日１回、２回、３回、４回、５回、または６回投与される。一部の実施形態では、微生物は、毎日、２日毎、週に１回、週に２回、週に３回、または週に４回投与される。他の実施形態では、治療は、２週毎に１回行われる。他の実施形態では、治療は、３週毎に１回行われる。他の実施形態では、治療は、月に１回行われる。
【０１４７】
方法の治療サイクルの継続時間は、例えば、疾患の治療もしくは後退、または再発の予防のための必要に応じて、７日から対象の生涯までである。一部の実施形態では、治療サイクルは、約３０日から約２年にわたって続く。他の実施形態では、対象は、３０日から１．５年続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から１年続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から１１カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から１０カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から９カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から８カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から７カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から６カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から５カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から４カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から３カ月続く治療サイクルを有する。他の実施形態では、対象は、３０日から２カ月続く治療サイクルを有する。
【０１４８】
連日の維持投与を対象において臨床的に望ましい期間にわたって与えてもよく、該期間は、例えば、１日から数年まで（例えば、対象の残りの生涯全体にわたって）、例えば約（２、３もしくは５日、１もしくは２週、または１カ月）以上かつ／または例えば約（５年、１年、６カ月、１カ月、１週、または３もしくは５日）までである。約３日〜約５日または約１週〜約１年にわたる連日の維持用量の投与が典型的である。治療効果が観察されるまで、単位用量を例えば１日２回から２週毎に１回まで投与することができる。
【０１４９】
第１および第２の治療用ポリペプチドを産生する微生物は、疾患の治療のために単剤療法または併用療法で送達され得る。一部の実施形態では、本開示の組成物は、追加の治療活性剤を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物、および対象の治療は、他の活性成分を伴わず、例えば、抗体（例えば、Ｔ１Ｄの治療用の抗ＣＤ３）などの追加の免疫調節物質を伴わない。したがって、一部の例では、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載される微生物（治療的なＩＬ−２および抗原ポリペプチドを発現する）、および薬学的に許容される担体から本質的になる。
【０１５０】
医薬組成物および担体
微生物（例えば、本明細書に記載される細菌または酵母）は、純粋形態、他の活性成分との組合せ、および／または薬学的に許容される（すなわち、非毒性の）添加剤または担体との組合せで投与することができる。「薬学的に許容される」という用語は、その当該技術分野で認識される意味にしたがって本明細書で使用され、医薬組成物の他の成分と適合し、かつそのレシピエントにとって有害でない担体を指す。
【０１５１】
本発明の組成物は、粘膜への微生物（例えば、細菌）の全身性送達の提供における使用のために好適な任意の公知またはその他の効果的な投与量または製品形態に調製することができ、該製品形態には医薬組成物および剤形の他に栄養製品形態が含まれる。
【０１５２】
一部の実施形態では、配合物は、経口配合物または医薬組成物である。この実施形態による一部の例では、配合物または医薬組成物は、任意選択で他の乾燥担体と組み合わせて、乾燥粉末形態（例えば、凍結乾燥形態）またはその圧縮形態で非病原微生物を含む。経口配合物は、通常、不活性希釈担体または食用担体を含む。
【０１５３】
一部の例では、経口配合物は、コーティングを含むか、またはカプセル化戦略を利用し、これは腸管中への配合物の送達を促進し、かつ／または微生物が腸管（例えば、回腸、小腸、または結腸）中で放出および含水されることを可能とする。微生物が配合物から放出され、充分に含水すると、微生物は、生物活性ポリペプチドの発現を開始し、それはその後に周囲環境中に放出されるか、または微生物の表面上に発現される。そのようなコーティングおよびカプセル化戦略（すなわち、遅延放出戦略）は当業者に公知である。例えば、米国特許第５，９７２，６８５号明細書、国際公開第２０００／１８３７７号パンフレット、および国際公開第２０００／２２９０９号パンフレット（これらの開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
【０１５４】
一部の実施形態では、本開示は、デキストラン、グルタミン酸ナトリウム、およびポリオールなどの他の成分との組合せであってもよい、凍結乾燥（lyophilized）または凍結乾燥（freeze dried）形態の微生物（例えば、非病原性細菌）を含む医薬組成物を提供する。例示的な凍結乾燥組成物は、例えば、Ｃｏｒｖｅｌｅｙｎらの米国特許出願第２０１２／００３９８５３号明細書（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。例示的な配合物は、凍結乾燥された細菌（例えば、治療有効量の細菌）および薬学的に許容される担体を含む。凍結乾燥された細菌は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤および散剤の形態に調製することができ、これらのそれぞれは経口的に投与され得る。あるいは、凍結乾燥された細菌は、好適な媒体中の水性または油性懸濁液として調製されてもよいし、または凍結乾燥された細菌は、使用の直前に飲料などの好適な媒体中に懸濁されてもよい。
【０１５５】
経口投与の場合、配合物は、胃耐性経口剤形であり得る。例えば、経口剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、ペレット、マイクロペレット、顆粒剤など）は、胃での溶解または破壊に耐性であるが腸内では耐性でないことによって、胃を通過して腸（例えば、小腸または結腸）での分解、溶解および吸収に有利に働くことを可能とする添加剤（通常、ポリマー、セルロース誘導体および／または親油性材料）の薄層でコーティングすることができる。一部の例では、経口配合物は、微生物の制御放出、持続放出、または長期放出を提供することによって、微生物中でコードされた所望のタンパク質の制御放出を提供する化合物を含み得る。これらの剤形（例えば、錠剤またはカプセル剤）は、典型的に、親油性、ポリマー性、セルロース系、不溶性、膨潤性の添加剤などの、従来周知の添加剤を含有する。制御放出性配合物はまた、腸、結腸などの任意の他の送達部位、生体接着または舌下送達（すなわち、歯科粘膜送達）および気管支送達のために使用することもできる。本発明の組成物が直腸内または経膣的に投与される場合、医薬配合物は、坐剤およびクリームを含み得る。この場合、宿主細胞は、脂質も含む一般的な添加剤の混合物中に懸濁される。上述の配合物のそれぞれは当該技術分野において周知であり、例えば以下の参照文献に記載されている：Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, (Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug delivery, J. Wiley & Sons); Gazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for colonic specific delivery, Int. J. Pharm. 108:77-83)。
【０１５６】
一部の実施形態では、経口配合物は、微生物によって発現される生物活性ポリペプチドの粘膜送達および／または粘膜吸収を増進できる化合物を含む。他の例では、配合物は、配合物内、かつ／または放出されてからの微生物の生存能力を増進させる化合物を含む。
【０１５７】
本発明の細菌は、治療すべき疾患を有するヒトまたは動物に投与するための医薬配合物中に懸濁することができる。そのような医薬配合物は、生きたグラム陽性菌および投与のために好適な媒体を含むがこれらに限定されない。細菌は、ラクトース、他の糖、ステアリン酸、炭酸および／または硫酸のアルカリおよび／またはアルカリ土類塩（例えば、ステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウム）、カオリン、シリカ、香料および芳香剤などの一般的な添加剤の存在下で凍結乾燥することができる。そのように凍結乾燥された細菌は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤および散剤（例えば、マウスウォッシュ粉末）の形態に調製することができ、これらのそれぞれを経口経路で投与することができる。あるいは、一部のグラム陽性菌は、好適な媒体中の水性懸濁液として調製されてもよいし、または凍結乾燥された細菌は、本明細書で言及される添加剤およびグルコース、グリシンおよびサッカリン酸ナトリウムなどの他の添加剤を含む媒体などの、好適な媒体中に使用の直前に懸濁されてもよい。
【０１５８】
一部の例では、微生物は、任意の好適な方法を使用して対象の胃腸管に局所的に送達される。例えば、ミクロスフェア送達システムを用いて腸への送達を増進させることができる。ミクロスフェア送達システムは、対象の胃腸管での局所放出を提供するコーティングを有するマイクロ粒子を含む（例えば、腸溶性コーティング配合物および結腸用配合物などの制御放出性配合物）。
【０１５９】
経口投与の場合、胃耐性経口剤形を配合することができ、該剤形はまた、グラム陽性菌の制御放出を提供することによって該細菌中でコードされた所望のタンパク質（例えば、ＩＬ−２）の制御放出を提供する化合物も含むことができる。例えば、経口剤形（カプセル剤、錠剤、ペレット、顆粒剤、散剤など）は、胃での溶解または破壊に耐性であるが腸内では耐性でないことによって、胃を通過して腸での分解、溶解および吸収に有利に働くことを可能とする添加剤（例えば、ポリマー、セルロース誘導体および／または親油性材料）の薄層でコーティングすることができる。
【０１６０】
経口剤形は、グラム陽性菌および産生される外因性タンパク質の徐放を可能とするように、例えば、制御放出、持続放出、長期放出、持効性の錠剤またはカプセル剤として設計することができる。これらの剤形は、通常、親油性、ポリマー性、セルロース系、不溶性、膨潤性の添加剤などの、従来周知の添加剤を含有する。そのような配合物は当該技術分野において周知であり、例えば以下の参照文献に記載されている：Hansel et al., Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins, 1990; Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker; Prescott et al., Novel drug delivery, J.Wiley & Sons, 1989; and Gazzaniga et al., Int. J. Pharm. 108: 77-83 (1994)。
【０１６１】
医薬剤形（例えば、カプセル剤）は、胃液耐性を得るためならびに回腸終末部および結腸での意図する送達（そこでポリマーはｐＨ  ６．５で溶解する）のために、ｐＨ依存性のオイドラギットポリマーでコーティングされる。他のオイドラギットポリマーまたはポリマー間の異なる比を使用することによって、遅延放出プロファイルを調整し、例えば十二指腸または空腸で細菌を放出することができる。
【０１６２】
医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含有する。好適な添加剤、希釈剤、および担体の非限定的な例としては、防腐剤、無機塩、酸、塩基、緩衝剤、栄養分、ビタミン、デンプン、糖、マンニトール、およびケイ酸誘導体などの充填剤および増量剤；カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチン、およびポリビニルピロリドン（polyvinyl pyrolidone）などの結合剤；グリセロールなどの保湿剤／炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの溶解遅延剤；第４級アンモニウム化合物などの再吸収促進剤；アセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールなどの表面活性剤；カオリンおよびベントナイトなどの吸着性担体；プロピレングリコールおよびエチルアルコールなどの担体、ならびにタルク、カルシウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および固体ポリエチルグリコールが挙げられる。
【０１６３】
薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの添加剤、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチなどの分散剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジの香味物質などの香味剤。投薬単位形態がカプセル剤である場合、投薬単位形態は、上記種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有することができる。加えて、投薬単位形態は、投薬単位の物理形態を修飾する様々な他の材料、例えば、糖衣、シェラック、または腸溶剤を含有することができる。さらに、シロップ剤は、活性化合物に加えて、甘味剤としてスクロースおよびある特定の防腐剤、色素、着色剤、および香味物質を含有してもよい。薬学的に許容される担体の形態および特徴は、それと組み合わせる活性成分の量、投与経路および他の周知の変数によって定められることが理解されるであろう。担体は、配合物の他の成分と適合し、かつそのレシピエントにとって有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。
【０１６４】
投与用の代替的な調製物としては、滅菌された水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、ジメチルスルホキシド、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、アルコールと水との混合物、緩衝化媒体、および食塩水が挙げられる。静脈内賦形剤としては、リンゲルのデキストロースに基づくものなどの、液体および栄養補充液、電解質補充液が挙げられる。例えば、抗菌物質、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在することができる。食塩水、アルコール、ＤＭＳＯ、および水性溶液などの様々な液体配合物がこれらの送達方法のために可能である。
【０１６５】
経口水性配合物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム（sodium saccharine）、セルロース、および／または炭酸マグネシウムなどの添加剤を含む。これらの組成物は、マウスウォッシュおよびマウスリンスなどの溶液の形態をとり、例えば、水、アルコール／水溶液、食塩水溶液、塩化ナトリウム、リンゲルのデキストロースなどの非経口賦形剤などの水性担体をさらに含む。
【０１６６】
水性マウスウォッシュ配合物は当業者に周知である。マウスウォッシュおよび経口リンスに関する配合物は、例えば、米国特許第６，３８７，３５２号明細書、米国特許第６，３４８，１８７号明細書、米国特許第６，１７１，６１１号明細書、米国特許第６，１６５，４９４号明細書、米国特許第６，１１７，４１７号明細書、米国特許第５，９９３，７８５号明細書、米国特許第５，６９５，７４６号明細書、米国特許第５，４７０，５６１号明細書、米国特許第４，９１９，９１８号明細書、米国特許出願第２００４／００７６５９０号明細書、米国特許出願第２００３／０１５２５３０号明細書、および米国特許出願第２００２／００４４９１０号明細書（これらのそれぞれは、参照することにより本明細書のこのセクションおよび本明細書の全ての他のセクションに具体的に組み込まれる）に詳細に論じられている。
【０１６７】
香味物質、甘味剤もしくは着色剤、または防腐剤などの他の添加物が本開示の配合物中に存在してもよい。ペパーミントまたはミドリハッカなどのミント、シナモン、ユーカリ、柑橘類、カシア、アニスおよびメントールは好適な香味剤の例である。香味剤は、０〜３％の範囲、例えば、最大２％、最大０．５％など、例えば液体組成物の場合に約０．２％といった量で、経口組成物中に存在することができる。
【０１６８】
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、スクロース、グルコース、サッカリン、デキストロース、レブロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、フルクトース、マルトース、キシリトール、ソーマチン、アスパルテーム、Ｄ−トリプトファン、ジヒドロカルコン、アセスルファム、および任意のこれらの組合せなどの人工または天然甘味剤が挙げられ、これらは、経口組成物の約０〜２％の範囲、例えば、最大１％ｗ／ｗ、０．０５〜０．３％ｗ／ｗなどの量で存在することができる。
【０１６９】
着色剤は、二酸化チタンもしくはＣＩ  ４２０９０、またはこれらの混合物などの、好適な天然または合成色素である。着色剤は、好ましくは、０〜３％の範囲、例えば最大０．１％、最大０．０５％など、例えば液体組成物の場合に約０．００５〜０．０００５％の量で組成物中に存在することができる。一部の例では、安息香酸ナトリウムが、例えば、組成物のｐＨを変化させるために実質的に不十分な濃度で、防腐剤として加えられ、そうでなければ所望のｐＨに到達するために緩衝剤の量の調整が必要なことがある。
【０１７０】
他の任意選択の成分としては、保湿剤、界面活性剤（非イオン性、陽イオン性または両性）、増粘剤、ゴムおよび結合剤が挙げられる。保湿剤は配合物に形を与え、歯磨き剤組成物中の水分を保持する。加えて、保湿剤は、配合物の貯蔵の間の微生物の劣化の防止を助ける。保湿剤はまた、相安定性の維持を補助し、かつ透明または半透明の歯磨き剤を配合する方法を提供する。
【０１７１】
好適な保湿剤としては、グリセリン、キシリトール、グリセロール、およびプロピレングリコールなどのグリコールが挙げられ、これらは、それぞれ最大５０％ｗ／ｗの量で存在することができるが、例えば、保湿剤全体は組成物の約６０〜８０％ｗ／ｗより多くない。例えば、液体組成物は、最大約３０％のグリセリンおよび最大約５％、または約２％ｗ／ｗのキシリトールを含み得る。一部の例では界面活性剤は、陰イオン性でなく、組成物の最大約６％、または約１．５〜３％ｗ／ｗの量でポリソルベート２０またはココアミドベタインなどを含み得る。
【０１７２】
一部の例では、本発明の経口組成物が液体形態である場合、それは、経口組成物の最大約３％ｗ／ｗ、例えば、０〜０．１％、または約０．００１〜０．０１％などの範囲内、経口組成物の約０．００５％ｗ／ｗなどであり得る膜形成剤。好適な膜形成剤としては、（ヒアルロン酸ナトリウムに加えて）Ｇａｎｔｒｅｚという商標名の下で販売されているものが挙げられる。
【０１７３】
経口または経腸投与用の液体栄養配合物は、脂質、炭水化物、タンパク質、ビタミン、および鉱物などの１つまたは複数の栄養分を含み得る。多くの異なる供給源および種類の炭水化物、脂質、タンパク質、鉱物およびビタミンが公知であり、そのような栄養分が選択された配合物中に加えられる成分と適合性であり、安全かつ意図する使用に効果的であり、かつ製品の性能を過度に損なわない限り、本発明の栄養液の実施形態において使用することができる。
【０１７４】
これらの栄養液は、充分な粘性、流動性、または他の物理的もしくは化学的特徴を有するように配合されて、栄養液の飲用または投与の間の粘膜のより効果的かつ鎮静的なコーティングを提供することができる。これらの栄養分の実施形態はまた、個体の単独の、主要な、または補助的な栄養分の必要性を満たすために好適な均衡の取れた栄養供給源となり得る。
【０１７５】
好適な栄養液の非限定的な例は、米国特許第５，７００，７８２号明細書（Ｈｗａｎｇら）、米国特許第５，８６９，１１８号明細書（Ｍｏｒｒｉｓら）、および米国特許第５，２２３，２８５号明細書（ＤｅＭｉｃｈｅｌｅら）（これらの記載は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１７６】
本明細書での使用のために好適な栄養タンパク質は、加水分解されていてもよいし、部分的に加水分解されていてもよいし、または加水分解されていなくてもよく、乳汁（例えば、カゼイン、乳清）、動物（例えば、肉、魚）、穀物（例えば、米、麦）、野菜（例えば、大豆）、またはこれらの組合せなどの任意の公知またはその他の好適な供給源に由来し得る。
【０１７７】
栄養液において使用するために好適な脂肪または脂質としては、ココナッツ油、大豆油、コーン油、オリーブ油、サフラワー油、高オレイン酸サフラワー油、ＭＣＴ油（中鎖トリグリセリド）、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、構造化トリグリセリド、パーム油およびパーム核油、パームオレイン、キャノーラ油、海洋油、綿実油、およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。栄養液において使用するために好適な炭水化物は、単純または複合、ラクトース含有またはラクトース非含有、またはこれらの組合せであってよい。好適な炭水化物の非限定的な例としては、加水分解されたコーンスターチ、マルトデキストリン、グルコースポリマー、スクロース、コーンシロップ、コーンシロップ固形物、米由来炭水化物、グルコース、フルクトース、ラクトース、高フルクトースコーンシロップ、およびフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）などの難消化性オリゴサッカリド、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
【０１７８】
栄養液は、様々なビタミンのいずれかをさらに含んでよく、その非限定的な例としては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビタミンＢ１２、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＣ、コリン、イノシトール、その塩および誘導体、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
【０１７９】
栄養液は、Ｔ１ＤのリスクがあるまたはＴ１Ｄを患った患者における使用（us）のための公知またはそれ以外に好適な様々な鉱物のいずれかをさらに含んでよく、その非限定的な例としては、カルシウム、リン、マグネシウム  鉄、セレニウム、マンガン、銅、ヨウ素、ナトリウム、カリウム、塩化物、およびこれらの組合せが挙げられる。
【０１８０】
本発明の微生物、特に酵母および細菌はまた、簡便な経口または直腸投与用のエリキシルまたは溶液として、あるいは非経口投与、例えば、筋肉内、皮下または静脈内経路による非経口投与のために適切な溶液として配合されてもよい。さらに、ヌクレオシド誘導体はまた、活性成分のみを放出し、または、腸管の特定の部分において、例えば持続的または長期間にわたって、放出して効果をさらに増進させる剤形などの、持続または長期放出剤形としての配合物のために特によく適する。そのような剤形におけるコーティング、エンベロープ、および保護マトリックスは、例えば、製薬の技術分野において周知のポリマー物質またはワックスから作ることができる。
【０１８１】
本発明の組成物は、ロゼンジ剤、トローチ剤またはパステル剤などの医薬剤形を含む。これらは、通常、好適な香味の基剤中に活性成分を含有する円盤形状の固体である。基剤は、硬質の氷砂糖、グリセリンゼラチン、または形態を与える充分な粘質物との砂糖の組合せであってよい。トローチ剤は口の中に入れられるとゆっくりと分解し、粘膜との直接的な接触のために活性成分を解放する。
【０１８２】
本発明のトローチ剤の実施形態は、例えば、柔軟な塊が形成されるまで粉末状の活性物質、粉末状の砂糖、およびゴムの混合物に水をゆっくり加えることによって調製することができる。７％のアカシア粉末を使用して塊に充分な粘着性を提供することができる。塊を転がし、トローチ片を扁平状の塊から切り出し、または塊を転がして円柱状にし、分割することができる。切り出されまたは分割された各片を成形し、乾燥させることによってトローチ剤形を形成する。
【０１８３】
活性成分が熱に不安定な場合、圧縮によってロゼンジ剤調製物にしてもよい。例えば、調製中の造粒ステップは、任意の圧縮錠剤のために使用される方法と類似の方法で行われる。ロゼンジ剤は、剤形が口中でゆっくり溶けまたは崩壊するのに望ましくなるように通常よりも硬い錠剤を与えるために、強い圧縮の設備を使用して作られる。一部の例では、成分は、遅延溶解性の特徴を促進するように選択される。
【０１８４】
本発明の特定の配合物では、微生物は、アルファデンプンおよび架橋ポリ（アクリル酸）を含有する生体接着性担体中に組み込まれて、頬側塗布のために好適（すなわち、長期の生体接着および持続的な薬物送達を有する）な生体接着性の錠剤および生体接着性のゲルを形成する。例えば、本発明による非病原性かつ非浸潤性の細菌の粉末混合物、生体接着性ポリマー（噴霧乾燥を介して一緒に加工されたアルファデンプンおよび架橋ポリ（アクリル酸））、フマル酸ステアリルナトリウム（滑沢剤）、および二酸化ケイ素（滑剤）を加工して錠剤（重量：１００ｍｇ；直径：７ｍｍ）にする。これらの錠剤の製造方法は当業者に周知であり、様々な薬物（ミコナゾール、テストステロン、フッ化物、シプロフロキサシン）を含有する生体接着性の錠剤の開発の成功について以前に記載されている（Bruschi M. L. and de Freitas O., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2005 31:293-310）。全ての添加剤材料は医薬品グレードで市販されている。
【０１８５】
配合物を最適化するために、錠剤中の薬物含有量およびデンプンとポリ（アクリル酸）との比は様々である。先行する研究に基づいて、一緒に加工された生体接着性担体中の最大の薬物含有量は約６０％（ｗ／ｗ）であり、デンプン／ポリ（アクリル酸）の比は７５／２５から９５／５（ｗ／ｗ）の間で変化させることができる。最適化の研究において、錠剤の生体接着特性および錠剤からの薬物放出が主要な評価パラメーターであり、標準的な錠剤特性（硬度、破砕性）が二次的な評価基準である。
【０１８６】
細菌は、アルファデンプンおよび架橋されたポリ（アクリル酸）の水性分散液中に組み込まれる。このポリマー分散液は、高せん断ミキサーを使用して標準的な手順を介して調製される。
【０１８７】
錠剤と同様に、食道粘膜への最適な接着を有するゲルを得るために、ゲルの薬物含有量およびデンプン／ポリ（アクリル酸）の比を最適化する必要がある。ゲルの場合、分散液中のポリマーの濃度は、ゲルの粘度、したがってその粘膜付着特性を決定するので、追加の変数である。
【０１８８】
食道の粘膜へのポリマー分散液の生体接着特性をスクリーニングするモデルは、Batchelor et al. (Int. J. Pharm., 238:123- 132, 2002)によって詳細に記載されている。
【０１８９】
投与の他の経路および形態としては、生きた微生物を含有する食品調製物が挙げられる。一部の例では、生物活性ポリペプチド発現微生物は、乳製品中に含めることができる。
【０１９０】
本発明の医薬組成物は、選択された剤形を配合または製造するための任意の公知またはその他の効果的な方法によって調製することができる。例えば、微生物を、添加剤および希釈剤などの、一般的な、例えば、薬学的に許容される担体と共に配合し、経口の錠剤、カプセル剤、噴霧剤、ロゼンジ剤、処理された基材（例えば、経口または外用スワブ、パッド、または本発明の組成物で処理された使い捨ての非消化性の基材）；経口液（例えば、懸濁液、溶液、エマルション）、粉末、坐剤、または任意の他の好適な剤形を形成することができる。一部の実施形態では、本開示は、医薬組成物を製造する方法を提供する。例示的な方法は、微生物（例えば、非病原性細菌）を薬学的に許容される担体と接触させ、それによって医薬組成物を形成することを含む。一部の例では、方法は、培地中で微生物を増殖させることをさらに含む。方法は、微生物を含有する液体を乾燥（例えば、凍結乾燥）することをさらに含んでもよく、該液体は、薬学的に許容される担体を含む。
【０１９１】
単位剤形
本開示は、食品グレードのまたは薬学的に許容される担体との組合せであってもよいある特定の量の本開示の微生物（例えば、細菌）を含む単位剤形をさらに提供する。例示的な単位剤形は、約１×１０３〜約１×１０１４コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含有する。他の例示的な単位剤形は、約１×１０４〜約１×１０１３コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）、または約１×１０４〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含有する。他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０５〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０６〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０８〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。さらに他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０９〜約１×１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。さらに他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０７〜約１×１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０８〜約１×１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。
【０１９２】
さらに他の実施形態では、単位剤形は、約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９〜約１００×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）の非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）を含む。
【０１９３】
単位剤形は、任意の物理形態または形状を有し得る。一部の実施形態では、単位剤形は、経口投与のために適当である。これらの実施形態による一部の例では、単位剤形は、カプセル剤、錠剤、または顆粒剤の形態である。例示的なカプセル剤としては、マイクロ顆粒を充填したカプセル剤が挙げられる。一部の実施形態では、剤形中に含有される非病原微生物（例えば、非病原性グラム陽性菌）は、乾燥粉末形態である。例えば、微生物は、凍結乾燥粉末形態であり、これは圧縮およびコーティングされていてもよい。
【０１９４】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるが、これらは、後述の特許請求の範囲により完全に記載される本発明の例示に過ぎないことを当業者は容易に理解するであろう。さらに、本出願の全体を通じて、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、参照することにより、本発明が関連する技術分野の現状をより充分に説明するためにその全体が本出願に組み込まれる。
【実施例】
【０１９５】
[実施例１]
細菌表面にＣｍｂＡを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株の生成
（ａ）ＣｍｂＡのエピソーム発現
ＣｍｂＡをコードする遺伝子（配列番号２および配列番号１１におけるＣｍｂＡのコーディング領域を参照、図５Ａ〜Ｄ）のコドン用法をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化した。結果として得られたＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５（ｕｓｐ４５分泌シグナル）およびｃｍｂＡを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｃｍｂＡ発現ユニットをＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した。結果として得られたＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｃｍｂＡ＞＞３’ｔｈｙＡをプラスミドｐＯＲＩ１９（例えば、Law et al., J. Bacteriol. 1995, 177(24):7011-7018を参照）にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ１８９３を生成させた。プラスミドｐＡＧＸ１８９３でラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＬＬ１０８を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９３］を結果として得た。
【０１９６】
（ｂ）染色体への組込み（ＣｍｂＡの構成的発現）
治療用ポリペプチドＰＡＬをコードする異種核酸配列（ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｐａｌ）を含有する２シストロン性発現カセット（配列番号２４および２５）を含有する２つの異なるＬ．ラクチス（L. lactis）株に組込みベクターｐＡＧＸ１８９３をエレクトロポレートした。これらの２つの株はｓＡＧＸ０５９９およびｓＡＧＸ０５８５（トレハロース蓄積株）であった。ｔｈｙＡ遺伝子座における相同組換え（ダブルクロスオーバー）によるＳＳｕｓｐ４５−ｃｍｂＡの挿入をＰＣＲおよびサンガーＤＮＡシークエンシングによって確認した。結果として得られた株をそれぞれｓＡＧＸ０６１８およびｓＡＧＸ０６１９と称した。
【０１９７】
[実施例２]
細菌表面にＭｂｐＬを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株の生成
（ａ）ＭｂｐＬのエピソーム発現（天然のシグナルペプチドを使用）
［ＰｔｈｙＡ＞＞ｍｂｐＬ］ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターｐＡＧＸ１９０３の構築：ＭｂｐＬをコードする遺伝子（シグナルペプチドあり；ＳＳｍｂｐＬ）のコドン用法をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化した。結果として得られたＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡおよびｍｂｐＬを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｍｂｐＬ＞＞ｍｂｐＬ発現ユニット（配列番号１７）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した。結果として得られたＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｍｂｐＬ＞＞ｍｂｐＬ＞＞３’ｔｈｙＡをプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ１９０３を生成させ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１９０３］を結果として得た。
【０１９８】
（ｂ）ＭｂｐＬのエピソーム発現（ＳＳｕｓｐ４５を使用）
ｍｂｐＬを組み込んだ別の構築物は、ＭｂｐＬ自体のシグナルペプチドの代わりに分泌リーダー配列ＳＳｕｓｐ４５を含み得る。［ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｍｂｐＬ］ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターは実施例１に概説した手順にしたがって調製することができ、ｃｍｂＡをコードする核酸配列は、それ自体のシグナルペプチドを含まないＭｂｐＬポリペプチドをコードする核酸配列と置換することができる。ＭｂｐＬをコードする遺伝子（シグナルペプチドを含まない）をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化することができる。結果として得られるＤＮＡ配列を合成により作製することができる。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５およびｍｂｐＬを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させることができる。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｍｂｐＬ発現ユニット（配列番号１５）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置することができる。結果として得られるＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｍｂｐＬ＞＞３’ｔｈｙＡを例えばプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングして別のプラスミドを生成させることができ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）、例えば株ＬＬ１０８を形質転換することができる。
【０１９９】
[実施例３]
細菌表面にＭａｐＡを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株の生成
（ａ）ＭａｐＡのエピソーム発現（天然のシグナルペプチドを使用）
［ＰｔｈｙＡ＞＞ｍａｐＡ］ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターｐＡＧＸ１９４６の構築：ｍａｐＡをコードする遺伝子（シグナルペプチドを含む）をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化した。結果として得られたＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡおよびｍａｐＡを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｍａｐＡ＞＞ｍａｐＡ発現ユニット（配列番号２１）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した。結果として得られたＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｍａｐＡ＞＞ｍａｐＡ＞＞３’ｔｈｙＡをプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ１９４６を生成させ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１９４６］を結果として得た。
【０２００】
（ｂ）ＭａｐＡのエピソーム発現（ＳＳｕｓｐ４５を使用）
ｍａｐＡを組み込んだ別の構築物は、ＭａｐＡ自体のシグナルペプチドの代わりに分泌リーダー配列ＳＳｕｓｐ４５を含み得る。［ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｍａｐＡ］ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターは例えば実施例１の手順にしたがって調製することができ、ｃｍｂＡをコードする核酸配列は、そのシグナルペプチドを含まないＭａｐＡポリペプチドをコードする核酸配列と置換することができる。ｍａｐＡをコードする遺伝子をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化することができる。結果として得られるＤＮＡ配列を合成により作製することができる。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５およびｍａｐＡ（シグナルペプチドを含まない）を融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させることができる。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｍａｐＡ発現ユニット（配列番号１９）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置することができる。結果として得られるＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｍａｐＡ＞＞３’ｔｈｙＡを例えばプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングして別のプラスミドを生成させることができ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株、例えばＬＬ１０８を形質転換することができる。
【０２０１】
[実施例４]
細菌表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株
（ａ）ｈＴＦＦ３の発現
図４は、Ｃ末端付着ポリペプチドと共に、融合タンパク質のＮ末端部分として使用できる例示的なＳＳｕｓｐ４５−ｈｔｆｆ３構築物（アミノ酸および核酸配列）を説明する。Ｃ末端付着ポリペプチドは、ＰＣＲ融合またはより伝統的なライゲーションを通じて付加することができる。
【０２０２】
（ｂ）ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡのエピソーム発現
［ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ｃｍｂＡ］ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターを構築した。ｈＴＦＦ３およびＣｍｂＡ（シグナルペプチドを含まない）をコードする遺伝子のコドン用法をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化した。結果として得られたｈｔｆｆ３およびｃｍｂＡのＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５、ｈＴＦＦ３およびｃｍｂＡを融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ発現ユニット（配列番号１１および図５Ａ〜Ｄを参照）をＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した。結果として得られたＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ｃｍｂＡ＞＞３’ｔｈｙＡをプラスミドｐＯＲＩ１９（Law et al., 1995、上掲）にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ２００５（図１を参照）を生成させ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ２００５］を結果として得た。
【０２０３】
（ｂ）染色体への組込み（ｈＴＦＦ３−ｃｍｂＡの構成的発現；ｔｈｙＡプロモーター）
治療用ポリペプチドＰＡＬをコードする２シストロン性発現カセット（ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｐａｌ）を含有する２つの異なるｔｈｙＡ−野生型ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ｓＡＧＸ０５９９およびｓＡＧＸ０５８５（トレハロース蓄積株）に組込みベクターｐＡＧＸ２００５（上記および図１を参照）をエレクトロポレートした。ｔｈｙＡ遺伝子座における相同組換え（ダブルクロスオーバー）によるＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ（例えば、配列番号１１および図５Ａ〜Ｄを参照）の挿入をＰＣＲおよびサンガーＤＮＡシークエンシングによって確認した。結果として得られた株をｓＡＧＸ０６４４およびｓＡＧＸ０６４５と称した。
【０２０４】
（ｃ）染色体への組込み（ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡの構成的発現；ＰｈｌｌＡプロモーター）
治療用ポリペプチドＰＡＬ（ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｐａｌ）およびＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ３−ｃｍｂＡをコードする２シストロン性発現カセットを含有するＬ．ラクチス（L. lactis）株ｓＡＧＸ０６４４（上記を参照）にプロモーター置換ベクターｐＡＧＸ２０４１（ＰｔｈｙＡ−＞ＰｈｌｌＡ）をエレクトロポレートした。相同組換え（ダブルクロスオーバー）によるＰｔｈｙＡのＰｈｌｌＡによる置換をＰＣＲおよびサンガーＤＮＡシークエンシングによって確認した。結果として得られた株をｓＡＧＸ０６６０と称した。
【０２０５】
[実施例５]
細菌表面にｈＴＦＦ１−ＳｐａＸを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株
（ａ）ｈＴＦＦ１−ｓｐａＸのエピソーム発現
［ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ１−ｓｐａＸ］（配列番号２２および２３）ｔｈｙＡ組込み／発現ベクターｐＡＧＸ１８９４の構築：ｈＴＦＦ１をコードする遺伝子のコドン用法をＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に最適化した。結果として得られたＤＮＡ配列を合成により作製した。オーバーレイＰＣＲアセンブリーを使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５、ｈＴＦＦ１、および、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡの細胞壁アンカーをコードする遺伝子（ＳｐａＸ、Steidler et al., 1998）を融合させ、１つのＰＣＲ断片を形成させた。ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ１−ｓｐａＸ発現ユニットをＰＣＲによってＬ．ラクチス（L. lactis）株ＭＧ１３６３の５’ｔｈｙＡ領域と３’ｔｈｙＡ領域との間に配置した。結果として得られたＰＣＲ断片：５’ｔｈｙＡ＞＞ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５−ｈＴＦＦ１−ｓｐａＸ＞＞３’ｔｈｙＡをプラスミドｐＯＲＩ１９にサブクローニングしてプラスミドｐＡＧＸ１８９４を生成させ、これでＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８を形質転換して株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９４］を結果として得た。
【０２０６】
[実施例６]
ムチン結合および細胞結合ポリペプチドをエピソームにより発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株
以下のプラスミドおよびラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株を本明細書に記載される通りに調製し、ムチンおよび細胞結合（Ｃａｃｏ−２、ＩＥＣ−１８、およびＨＴ２９−ＭＴＸ細胞）能力について試験した。下記の表１に列挙したプラスミドをＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８にエレクトロポレートした。
【０２０７】
【表１】
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【０２０８】
（ａ）ムチンへのラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ２００５］の結合
実験手順：ムチン（Ｓｉｇｍａ  ＩＩ型、製品番号Ｍ２３７８−１００Ｇ、ブタ胃から（form）のムチン、およびＳｉｇｍａ  ＩＩＩ型、製品番号Ｍ１７７８−１０Ｇ、ブタ胃からのムチン、シアル酸（０．５〜１．５％）に結合、部分精製）をＮｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートに５０ｍＭ炭酸緩衝液中５００μｇ／ｍｌでコーティングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングし、ＰＢＳで３回洗浄した。終夜飽和させたＬ．ラクチス（L. lactis）培養物をＰＢＳでＯＤ６００＝１に希釈した。培養物をＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、１ボリュームのＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０に再懸濁した。１００μｌの細菌懸濁液を各ウェルに適用した。プレートを４℃で１６時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。プレートを５５℃で１時間乾燥させた。（Ａ）ＯＤを４０５ｎｍで測定した。（Ｂ）ウェルあたり１００μｌのクリスタルバイオレット（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で４５分間インキュベートした。その後にＯＤを５９５ｎｍで測定した。
【０２０９】
結果：
図２は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡアンカー断片ＳｐａＸ（Steidler et al., 1998、上掲）の使用によってその表面にヒトトレフォイル因子１（ｈＴＦＦ１）を発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９４］、およびその表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ２００５］が、２つの異なる計測方法を使用して測定した時に同等の強度でムチン（Ｓｉｇｍａ  ＩＩ型およびＩＩＩ型）に結合することを示す。対照的に、エンプティ対照ベクターを含有する対照株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１４１７］は、２つの計測方法についてムチンへのいかなる結合も示さなかった。
【０２１０】
（ｂ）Ｃａｃｏ−２細胞へのラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ２００５］の付着
実験手順：Ｃａｃｏ−２細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２で１２ウェルプレートに播種した。細胞を１７日間生育して分化させた。終夜飽和させたＬ．ラクチス（L. lactis）培養物をＤＭＥＭで１／１０００に希釈し、ＤＭＥＭで３回洗浄した。そしてＬ．ラクチス（L. lactis）細胞をＤＭＥＭに再懸濁した。１ｍｌの細菌懸濁液を１２ウェルプレート中の細胞に適用し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭで３回洗浄した。細胞をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００での溶解により回収した（ＰＢＳ中の１ｍｌの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を細胞に適用し、細胞が完全に脱着するまで５〜１０分間インキュベートした）。回収した細胞懸濁液を適宜希釈し、ＧＭ１７Ｅプレートにプレートした。３０℃での２４時間のインキュベーション後にプレート上の細菌数を測定した。回収した細胞懸濁液のプレーティングから回収されたＬ．ラクチス（L. lactis）細胞をＣａｃｏ−２細胞に最初に適用された細胞数で割ることによって回収パーセントを決定した。
【０２１１】
図３は、その表面にＣｍｂＡを発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９３］およびその表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ２００５］がＣａｃｏ−２細胞への同等の付着を呈することを示す。対照的に、対照株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１４１７］（対照）およびその表面にｈＴＦＦ１−ＳｐａＸを発現する株ＬＬ１０８［ｐＡＧＸ１８９４］はＣａｃｏ−２細胞への増進した付着を呈しなかった。
【０２１２】
結論：
それらの表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合ポリペプチドを発現するＬ．ラクチス（L. lactis）株は、ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合ポリペプチドを発現しない対応する株と比べた時にムチンへの増進したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合性およびＣａｃｏ−２細胞への増進した付着を呈する。
【０２１３】
[実施例７]
２シストロン性発現ユニットを含有する組込みプラスミドの構築
遺伝子間領域（例えば、ｒｐｌＮに先行する遺伝子間領域）を組み込んだ構築物を使用して本明細書に記載される通りに下記の表２に列挙される組込みプラスミドを調製し、それらのムチンおよび細胞結合能力を本明細書に記載される通りに試験することができる。表２に列挙されるプラスミドをＬ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８などの宿主細胞にエレクトロポレートして、これらの構築物によってコードされるポリペプチドを発現する（例えば、構成的に発現する）細菌を生成することができる。
【０２１４】
【表２】
2019530446.tif 000004
【０２１５】
[実施例８]
染色体に組み込まれた発現ユニットを含有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株
以下のプラスミドおよびラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株を本明細書に記載される通りに調製し、実施例６に記載される通りにそれらのムチンおよび細胞結合能力について試験した。結果を図６および図７に説明する。染色体に組み込まれたＰＡＬ発現ユニット（ＰｇａｐＢ＞＞ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｐａｌ）を含有するＬ．ラクチス（L. lactis）宿主株に下記の表３に列挙されるプラスミドを組み込んだ。宿主株の一部は、細胞内のトレハロース蓄積（＊）に繋がる遺伝子改変をさらに含んだ。例示的なトレハロース蓄積株は、（ｉ）機能的なトレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ（ΔｔｒｅＰＰ）を欠いており、かつ機能的なセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ΔｐｔｃＣ）遺伝子を欠いており；（ｉｉ）大腸菌（E. coli）トレハロース−６−リン酸ホスファターゼ（E. coli otsB）を発現し、かつ（ｉｉｉ）トレハローストランスポーター遺伝子（ＰＴＳ遺伝子）を発現する。例えば、米国特許第９，２００，２４９号明細書および米国特許出願公開第２０１４／０２３４３７１号明細書（これらの開示は、全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
【０２１６】
選択された株はＰＡＬ発現についても試験した。結果（図８に要約される）は、細胞付着および粘膜付着ポリペプチドの発現は細胞あたりの発現されるＰＡＬの量（μｇ／１０９細胞）に有意な影響を有しなかったことを指し示す。
【０２１７】
【表３】
2019530446.tif 000005
【０２１８】
[実施例９]
染色体に組み込まれた発現ユニットを含有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株の構築
適切な構築物を使用して本明細書に記載される通りに下記の表４に列挙されるラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株を調製することができ、本明細書に記載される通りにそれらのムチンおよび細胞結合能力について試験することができる。
【０２１９】
それらの表面にムチン結合および細胞付着ポリペプチドを発現するこれらの細菌株のそれぞれ（例えば、それらの表面にｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合タンパク質を発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株）を胃腸（ＧＩ）通過時間について評価することができ、またムチン結合および細胞付着ポリペプチドを発現しない対応する株（例えば、ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ融合ポリペプチドを発現しない対応する株）と比較することができる。
【０２２０】
例えば、ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを発現するか、または融合タンパク質を発現しない、細菌株の同数の細菌細胞（例えば、ｃｆｕに基づく）を個体（ヒトまたは動物）に投与することができる。非エピソーム株＋／−ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡは抗生物質選択マーカー（例えば、エリスロマイシン耐性を与えるｐＴ１ＮＸ）を備え得る。Ｅｍ耐性に基づいてエピソーム株をさらに選択することができる。以下の方法の１つによってＧＩ通過時間を測定することができる：
【０２２１】
【表４】
2019530446.tif 000006
【０２２２】
（１）一定（例えば、１ｈ）の間隔で、全糞便を回収し、例えば、Ｑ−ＰＣＲまたはエリスロマイシンを含有する固形寒天への希釈プレーティングにより、各株について回収されたｃｆｕ数を決定することができる。これはあらゆる株についての回収の動態をもたらし、回収されるｃｆｕ数が最大となる収集時点を示し得る。この最大を超える時点において、より多くのｃｆｕがｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ＋株について回収されることが観察される。
【０２２３】
（２）一定（例えば、１ｈ）の間隔で、試験動物（例えば、マウス）を屠殺し、それらの動物から回収された細菌のｃｆｕ数を、エリスロマイシンを含有する固形寒天への希釈プレーティングによって決定することができる。これは、時間の進行と共により多くのｃｆｕがｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡ＋株について回収されることを示す。
【０２２４】
[実施例１０]
ＰＫＵの治療−本開示の遺伝子改変された細菌によって発現されたＰＡＬを使用するフェニルアラニンの胃腸での分解
Ｐｈｅをケイ皮酸に変換しかつ共因子を必要としない酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するために使用されてきた。例えば、Sarkissian, C. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105: 20894-20899を参照。ＰＡＬは胃腸（ＧＩ）管で迅速に分解されるので、経口送達の達成は困難である。概念実証研究は、ＰＫＵ（ｅｎｕ２／２）マウス中で遺伝子操作された大腸菌（E. coli）によって発現されたＰＡＬの経口投与は血漿Ｐｈｅレベルの有意な低減を結果としてもたらすことを示した。例えば、Sarkissian, C. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:2339-2344を参照。しかしながら、大腸菌（E. coli）の投与に関連する安全上の懸念がヒトでのこの戦略の使用を妨げる。ＰＡＬを発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株が生成され、ＰＫＵマウスモデルにおいて評価されている。組換え細菌の経口投与は、重水素化Ｐｈｅの吸収の低減を結果としてもたらした。例えば、国際特許出願公開第２０１４０６６９４５号パンフレットを参照。
【０２２５】
ヒトＰＫＵ患者へのＰＡＬを発現する遺伝子改変された細菌の投与を可能とするために、本発明者らは、ＰＡＬ酵素を構成的に発現し、かつ増加したＧＩ通過時間、ＧＩ条件下でのより大きな安定性、および自己封じ込め（自制）を呈するようにさらに改変された「臨床グレード」株を調製した。エピソーム発現は安全性の懸念に関連するので、生物活性ポリペプチドの染色体への組込みは重要である。例えば、エピソームは胃腸システム中で他の細菌に容易に伝染し得る。さらに、エピソームの維持は製造にとっての障害を提供することがある。さらに、公知のＰＡＬ産生株は、近位ＧＩ管で迅速に破壊される。さらに、公知のＰＡＬ産生細菌は身体外で生存し、増殖する懸念がある。
【０２２６】
例えば実施例８において本明細書に上記される通りに、以下の改善された特徴の１つまたは複数を有する複数のＬ．ラクチス（L. lactis）株を生成した：１）安全性を改善しかつ製造を容易にするために細菌染色体に組み込まれ、構成的プロモーターによって駆動されるＰＡＬ発現カセット；２）ＧＩ管でのＬ．ラクチス（L. lactis）の生存を改善するトレハロース蓄積を促進する改変（例えば、Termont, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72: 7694-7700を参照）；３）ヒト身体外での生存を防止するためにチミジンに対する栄養要求依存性の組込み（例えば、Steidler, L. et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21: 785-789を参照）；および４）近位ＧＩ管での保持を向上させ、Ｐｈｅ分解を長期化させるために粘膜付着表面タンパク質を発現させるための遺伝子改変（例えば、Caluwaerts, S. et al., Oral. Oncol. 2010, 46:564-570を参照）。実施例６および実施例８に記載される通りに、ＰＡＬ発現および各々の細胞付着および粘膜付着特性について株を評価した。付着タンパク質の表面発現は、Ｃａｃｏ−２単層上の細菌保持を約８倍向上させた。ＩＩ型およびＩＩＩ型の両方のムチンへの付着が同様に増進した。重要なことに、ＧＩ管での生存の改善のためのトレハロース修飾および付着分子の発現は、細菌によって発現されるＰＡＬレベルを変化させなかった。
【０２２７】
選択された細菌株、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株（例えば、ＰＡＬを構成的に発現する株；例えば、ｓＡＧＸ０５９９、ｓＡＧＸ０６４４、ａＡＧＸ０５８５、およびｓＡＧＸ０６４５）をｅｎｕ２／２  「ＰＫＵ」マウスモデルにおける有効性について試験してヒトでの臨床試験のために好適な株を同定することができる。
【０２２８】
第１の研究では、胃管栄養を介して１０９ｃｆｕのＬ．ラクチス（L. lactis）と同時に重水素化Ｐｈｅの投与を与えたＰＫＵマウスにおいてｓＡＧＸ０５９９、およびｓＡＧＸ０６４５を試験した。血液を１５分間隔で１時間にわたって採取し、重水素化Ｐｈｅについてアッセイを行った。陽性対照動物には、例えば国際特許出願公開第２０１４０６６９４５号パンフレットに記載される、公知のエピソーム組換え株を与えた。陰性対照動物には細菌を与えなかった。図９に示すように、マウスによって吸収された全Ｐｈｅは、ｓＡＧＸ０５９９（ＰＡＬを分泌する）およびｓＡＧＸ０６４５（ＰＡＬおよびＴＦＦ３−ＣｍｂＡ）を与えたマウスにおいて最低であり、陽性対照よりも優れていた。興味深いことに、Ｐｈｅの最終レベルは、ｓＡＧＸ０６４５（ＰＡＬおよびＴＦＦ３−ＣｍｂＡ）を与えたマウスで最低であったが、ＰｈｅのＣｍａｘはより高かった。これは、付着融合タンパク質を有しないＬ．ラクチス（L. lactis）と比べてｓＡＧＸ０６４５がＰｈｅ摂取の特定の部位まで小腸をゆっくり降りていくことを反映している可能性がある。より低いＣｍａｘおよびＡＵＣは、給餌前のＰｈｅ分解細菌の投与によって得られ得る。より低いＣｍａｘおよびＡＵＣはまた、食餌と共に細菌を定期的に投与して、ある食餌からＰｈｅを低減させるための遠位のＰｈｅ分解細菌が、先行する食餌から既に存在するようにすることによっても得られ得る。
【０２２９】
Ｐｈｅの供給はＰＫＵの人工的モデルであることに留意すべきである。単一のアミノ酸は非常に効率的に吸収される。典型的な状況では、タンパク質は腸を通過する間に分解され、吸収のために利用可能な遊離アミノ酸は小腸上部よりもより遠位の部分において主に生じる。したがって、腸のより遠位の部分に位置するＰＡＬ分泌細菌はまた、直接的にＰｈｅを投与する実験によって示唆されるよりも食品からのＰｈｅ摂取をより良好に阻害できる可能性がある。
【０２３０】
さらに、Ｌ．ラクチス（L. lactis）を異なる細胞および粘液付着分子で改変して、腸の最適な区分へのＰＡＬの送達を局在化させることができる。
【０２３１】
第２の研究では、選択された細菌株、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株の薬力学を評価し得る。重水素化Ｐｈｅの最大６時間前に細菌を投与することができる。血液を上記の通りにアッセイすることができる。結果として得られるデータは、その後の研究のスケジュール設定のための情報を与え、かつ臨床応用に関連する情報を提供することができる。例えば、ヒトは、各食事と共に細菌を含有する１つの単位剤形（例えば、カプセル剤）を服用することができる。
【０２３２】
第３の研究は、Ｐｈｅ血中レベルの低下における細菌の長期的有効性を評価し得る。選択された細菌株（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株）、例えば第１の研究からの最適な株を胃管栄養法により動物に与えることができ、次いで標準飼料の食餌を与えることができる。例えば、２回目からの転帰によって決定される各食餌についての継続時間での、それぞれの日の２回のＬ．ラクチス（L. lactis）関連の食餌などである。血中Ｐｈｅレベルは定期的に、例えば、３週にわたって週に２回、評価することができる。対照は、第１の研究において用いられたものであってよく、また、低Ｐｈｅの食餌コホートを含むこともできる。注記：この研究は重水素化Ｐｈｅを使用しなくてもよい。転帰良好は、Ｐｈｅ血中レベルの統計的に有意な改善、例えば、臨床的有効性を結果としてもたらす可能性が充分な改善であり得る。他の研究は、食餌への介入と細菌療法（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis）療法）を組み合わせ得る。
【０２３３】
各研究は、統計解析のために充分となるように５匹のマウスのコホートを利用することができ、マウスは洗い出し後に再使用することができる。Ｐｈｅはタンデム質量分析によってアッセイすることができ、これは高感度かつ特異的で、最小量の血液を必要とする。
【０２３４】
[実施例１１]
口腔粘膜炎の治療
口腔粘膜炎は口腔粘膜の破壊であり、がん治療、特に頭頸部がんの治療によく見られる合併症である。ＴＦＦ１はＧＩ管上部で分泌され、粘膜表面の保護および治癒に関連する。ＴＦＦ１は、口腔粘膜炎の治療の見込みを示す。口腔粘膜のＴＦＦ１の送達を増加させるために、両方の染色体上で、「遊離」ｈＴＦＦ１と共にｈＴＦＦ１−ＣｍｂＡ融合物の両方を発現するようにＬ．ラクチス（L. lactis）を操作する。これを段階的に行った場合、１つのｈｔｆｆ１遺伝子が染色体上の別のｈｔｆｆ１遺伝子と組換えを起こすリスクがある。このリスクを最小化するために、ｈＴＦＦ１−ｃｍｂＡおよびｈｔｆｆ１をポリシストロン性に構築することができ、したがって、１ステップで形質転換および染色体への組込みを行うことができる。さらに、各コドンの第３の塩基を１つのｔｆｆ１配列において変化させて、そのヌクレオチド配列が他のｔｆｆ１配列と異なるが、翻訳されたｈＴＦＦ１が同じであるようにすることができる。例えば、６つのアラニンコドンが以下の頻度で存在する：ＵＣＵ（１８．６）、ＵＣＣ（４．０）、ＵＣＡ（２０．６）、ＵＣＧ（３．９）、ＡＧＵ（１６．７）、およびＡＧＣ（７．３）。したがって、ＵＣＣおよびＵＣＧは交換可能であり得る。ＵＣＵ、ＵＣＡ、およびより低い程度でＡＧＵは交換可能であり得る。
【０２３５】
コドン頻度の改変後に、ＰＣＲを通じてＰｈ１１Ａ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｈＴＦＦ１＞＞ｒｐｍＤ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｈＴＦＦ１−ＣｍｂＡを構築し、ｐＯＲＩ１９に由来する条件複製型キャリアープラスミドの５’ｔｈｙＡと３’ｔｈｙＡとの間にクローニングする。本明細書の別の箇所に記載される通りのＬ．ラクチス（L. lactis）の形質転換および選択は、染色体のｔｈｙＡ遺伝子座への組込みに繋がる。
【０２３６】
結果として得られる株は、ＴＦＦ１を分泌し、かつＴＦＦ１を単独で発現する株と比べて口腔粘液への増加した結合を媒介するＴＦＦ−ＣｍｂＡ融合物を発現することが示される。株を粘膜炎のモデルにおいて試験し、ＴＦＦ−ＣｍｂＡの存在は口腔での持続を増加させ、治療的なＴＦＦ１の送達を増加させ、それにより投薬の頻度を減少させることができる。
【０２３７】
[実施例１２]
糖尿病の治療
上記されるｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを分泌するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株をヒトプロインスリンＰＩＮＳおよびヒトＩＬ１０を発現するように改変する。例えば、ｈＰＩＮＳ発現用の構築物は、強いｇａｐＢプロモーターの制御下、およびｇａｐＢ遺伝子およびｒｐｍＤスペーサーの後にＳＳＵｓｐ４５分泌リーダーを有するｈＰＩＮＳであり得る（すなわち、ＰｇａｐＢ＞＞ｇａｐＢ＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｕｓｐ４５＞＞ＰＩＮＳ）。ｈＩＬ−１０について、構築物はＰｈｌｌＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５＞＞ｈｉｌ−１０であり得る。
【０２３８】
ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡがｔｈｙＡ遺伝子座に既に挿入されているので、ＰＩＮＳおよびＩＬ−１０はｐｔｃＣまたはｔｒｅＰＰなどの別の遺伝子部位に挿入することができる。ＰｔｃＣおよびｔｒｅＰＰの変異はトレハロース蓄積に関連する。結果として得られる株をｈＩＬ−１０、ＰＩＮＳおよびｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡの発現について試験する。次いで、該株を、ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを欠いた株に対して、１型糖尿病の動物モデルであるＮＯＤマウスにおいて試験する。ｈＴＦＦ３−ＣｍｂＡを欠いた株は、ＰＩＮＳに対するＴｒｅｇ応答を生成し、膵臓のベータ細胞に対する自己免疫反応を後退させ、それによって糖尿病を治療することが以前に示されている。該治療は発症直後の疾患に特に有効である。ｈＴＦＦ−ＣｍｂＡの存在は、腸での定着および持続を増加させ、より強いＴｒｅｇ応答を結果としてもたらし得る。
【０２３９】
一部の実施形態を本明細書に示して記載したが、そのような実施形態は単に例として与えるものである。本発明から離れることなく、多数の変形、変更、および置換が当業者にここで想起されるであろう。本明細書に記載される発明の実施形態に対して様々な代替手段が本発明の実施において用いられることが理解されるべきである。
【０２４０】
例示的な実施形態
１．融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む細菌であって、前記融合タンパク質が細胞付着ポリペプチドを含む、細菌。
２．前記細胞付着ポリペプチドが、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）、ラクトコッカス（Lactococcus）ムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１の細菌。
３．前記細胞付着ポリペプチドがＣｍｂＡである、実施形態２の細菌。
４．前記ＣｍｂＡがラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡである、実施形態３の細菌。
５．前記融合タンパク質がムチン結合ポリペプチドをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの細菌。
６．前記ムチン結合ポリペプチドがトレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチドである、実施形態５の細菌。
７．前記融合タンパク質がＣｍｂＡおよびＴＦＦを含む、実施形態６に記載の細菌。
８．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、実施形態１〜７のいずれか１つの細菌。
９．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸がプラスミド上に位置する、実施形態１〜７のいずれか１つの細菌。
１０．前記融合タンパク質が前記細菌によって発現される、先行する実施形態のいずれか１つの細菌。
１１．前記融合タンパク質が前記細菌の細胞壁にアンカーされている、実施形態１０の細菌。
１２．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、分泌シグナルペプチドをコードする分泌リーダー配列をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの細菌。
１３．前記分泌リーダー配列がＳＳｕｓｐ４５である、実施形態１２の細菌。
１４．前記分泌リーダー配列が、配列番号５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する分泌シグナルペプチドをコードする、実施形態１３の細菌。
１５．前記分泌シグナルペプチドが前記ムチン結合ポリペプチドに結合している、実施形態１２〜１４のいずれか１つの細菌。
１６．前記分泌シグナルペプチドがリンカーに結合している、実施形態１２〜１５のいずれか１つの細菌。
１７．前記分泌シグナルペプチドが前記融合タンパク質から切断されている、実施形態１２〜１６のいずれか１つの細菌。
１８．前記分泌シグナルペプチドが、前記融合タンパク質が前記細菌の細胞壁にアンカーされている時に前記融合タンパク質から切断される、実施形態１７の細菌。
１９．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、ｈｌｌａプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、およびｇａｐＢプロモーターからなる群から選択されるプロモーターによって転写調節される、実施形態１〜１８のいずれか１つの細菌。
２０．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸がＰｔｈｙＡによって転写調節される、実施形態１９の細菌。
２１．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸がＰｈｌｌＡによって転写調節される、実施形態１９の細菌。
２２．前記細菌の細胞壁にアンカーされた融合タンパク質を含む細菌であって、前記融合タンパク質がＴＦＦポリペプチドおよびＣｍｂＡポリペプチドを含む、細菌。
２３．グラム陽性菌である、実施形態１〜２２のいずれか１つの細菌。
２４．前記グラム陽性菌が非病原性である、実施形態２３の細菌。
２５．乳酸菌（ＬＡＢ）である、実施形態１〜２４のいずれか１つの細菌。
２６．前記ＬＡＢが、ラクトコッカス（Lactococcus）種細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）種細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）種細菌、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種細菌からなる群から選択される、実施形態２５の細菌。
２７．前記ＬＡＢが、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ピスシウム（Lactococcus piscium）、ラクトコッカス・プランタルム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）、ラクトバチルス・アセトトレランス（Lactobacillus acetotolerans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチルス・アルジダス（Lactobacillus algidus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・アミロリチカス（Lactobacillus amylolyticus）、ラクトバチルス・アミロフィラス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバチルス・アビアリウス（Lactobacillus aviarius）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種ラフィノサス（Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス（Lactobacillus aviarius subsp. aviarius）、ラクトバチルス・ババリカス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カルニス（Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種アラクトサス（Lactobacillus casei subsp. alactosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種シュードプランタラム（Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum）、ラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種トレランス（Lactobacillus casei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・カテナフォルミス（Lactobacillus catenaformis）、ラクトバチルス・セロビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・コンフサス（Lactobacillus confusus）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜種クルバタス（Lactobacillus curvatus subsp. curvatus）、ラクトバチルス・クルバタス亜種メリビオサス（Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus）、ラクトバチルス・デルブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種デルブルエッキー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキー亜種ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・ジベルゲンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・フォルニカリス（Lactobacillus fornicalis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・フルクトサス（Lactobacillus fructosus）、ラクトバチルス・ガリナラム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・グラミニス（Lactobacillus graminis）、ラクトバチルス・ハロトレランス（Lactobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamsteri）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ヘテロヒオキー（Lactobacillus heterohiochii）、ラクトバチルス・ヒルガルジー（Lactobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホモヒオキー（Lactobacillus homohiochii）、ラクトバチルス・イネルス（Lactobacillus iners）、ラクトバチルス・インテスチナリス（Lactobacillus intestinalis）、ラクトバチルス・ジェンセニー（Lactobacillus jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）、ラクトバチルス・ケフィルグラナム（Lactobacillus kefirgranum）、ラクトバチルス・クンキー（Lactobacillus kunkeei）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ライヒマンニー（Lactobacillus leichmannii）、ラクトバチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）、ラクトバチルス・マレフェルメンタンス（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス・マルタロミカス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・マニホチボランス（Lactobacillus manihotivorans）、ラクトバチルス・ミノル（Lactobacillus minor）、ラクトバチルス・ミヌタス（Lactobacillus minutus）、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・ムリナス（Lactobacillus murinus）、ラクトバチルス・ナゲリー（Lactobacillus nagelii）、ラクトバチルス・オリス（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラクトバチルス・パラブクネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種トレランス（Lactobacillus paracasei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Lactobacillus parakefiri）、ラクトバチルス・パラリメンタリウス（Lactobacillus paralimentarius）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ペロレンス（Lactobacillus perolens）、ラクトバチルス・ピスシコラ（Lactobacillus piscicola）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ポンチス（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・リマエ（Lactobacillus rimae）、ラクトバチルス・ロゴサエ（Lactobacillus rogosae）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・サケイ亜種カモサス（Lactobacillus sakei subsp. camosus）、ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリシニウス（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）、ラクトバチルス・サンフランシスセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチルス・シャルペエ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobacillus suebicus）、ラクトバチルス・トリコデス（Lactobacillus trichodes）、ラクトバチルス・ウリ（Lactobacillus uli）、ラクトバチルス・バクシノステルカス（Lactobacillus vaccinostercus）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、ラクトバチルス・ビリデスセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバチルス・ビツリナス（Lactobacillus vitulinus）、ラクトバチルス・キシロサス（Lactobacillus xylosus）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種マリ（Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis subsp. yamanashiensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Bifidobacterium infantis）、エンテロコッカス・アルセジニス（Enterococcus alcedinis）、エンテロコッカス・アクイマリナス（Enterococcus aquimarinus）、エンテロコッカス・アシニ（Enterococcus asini）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium）、エンテロコッカス・カッカエ（Enterococcus caccae）、エンテロコッカス・カメリエ（Enterococcus camelliae）、エンテロコッカス・カニンテスチニ（Enterococcus canintestini）、エンテロコッカス・カニス（Enterococcus canis）、エンテロコッカス・カセリフラバス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコラム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・コランバエ（Enterococcus columbae）、エンテロコッカス・デブリエセイ（Enterococcus devriesei）、エンテロコッカス・ジエストラムメナエ（Enterococcus diestrammenae）、エンテロコッカス・ジスパル（Enterococcus dispar）、エンテロコッカス・デュランス（Enterococcus durans）、エンテロコッカス・エウレケンシス（Enterococcus eurekensis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ギルバス（Enterococcus gilvus）、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス（Enterococcus haemoperoxidus）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Enterococcus hermanniensis）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・イタリカス（Enterococcus italicus）、エンテロコッカス・ラクチス（Enterococcus lactis）、エンテロコッカス・レマニー（Enterococcus lemanii）、エンテロコッカス・マロドラタス（Enterococcus malodoratus）、エンテロコッカス・モラビエンシス（Enterococcus moraviensis）、エンテロコッカス・ムンドチー（Enterococcus mundtii）、エ��テロコッカス・オリバエ（Enterococcus olivae）、エンテロコッカス・パレンス（Enterococcus pallens）、エンテロコッカス・フォエニクリコラ（Enterococcus phoeniculicola）、エンテロコッカス・プランタルム（Enterococcus plantarum）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Enterococcus pseudoavium）、エンテロコッカス・クエベセンシス（Enterococcus quebecensis）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Enterococcus raffinosus）、エンテロコッカス・ラッティ（Enterococcus ratti）、エンテロコッカス・リボラム（Enterococcus rivorum）、エンテロコッカス・ロタイ（Enterococcus rotai）、エンテロコッカス・サッカロリチカス（Enterococcus saccharolyticus）、エンテロコッカス・シレシアカス（Enterococcus silesiacus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococcus solitarius）、エンテロ
コッカス・スルフレウス（Enterococcus sulfureus）、エンテロコッカス・テルミチス（Enterococcus termitis）、エンテロコッカス・タイランジカス（Enterococcus thailandicus）、エンテロコッカス・ウレアシチカス（Enterococcus ureasiticus）、エンテロコッカス・ウレイリチカス（Enterococcus ureilyticus）、エンテロコッカス・ビーキエンシス（Enterococcus viikkiensis）、エンテロコッカス・ビロラム（Enterococcus villorum）、エンテロコッカス・シャンファンゲンシス（Enterococcus xiangfangensis）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）、ストレプトコッカス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・ジスガラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・エクイナス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス・イニエ（Streptococcus iniae）、ストレプトコッカス・インテルメジウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ミレリ（Streptococcus milleri）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・ペロリス（Streptococcus peroris）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・シュードニューモニエ（Streptococcus pseudopneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッティ（Streptococcus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・チグリナス（Streptococcus tigurinus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Streptococcus vestibularis）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）からなる群から選択される、実施形態２５の細菌。
２８．ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、実施形態２７の細菌。
２９．前記ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）が、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、およびラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）からなる群から選択される、実施形態２８の細菌。
３０．前記ＴＦＦポリペプチドが、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３からなる群から選択される、実施形態６〜２９のいずれか１つの細菌。
３１．前記ＴＦＦポリペプチドが、ヒトＴＦＦ、マウスＴＦＦ、ブタＴＦＦ、イヌＴＦＦ、ネコＴＦＦ、ウシＴＦＦ、ヒツジＴＦＦ、魚ＴＦＦ、および両生動物ＴＦＦからなる群から選択される、実施形態６〜２９のいずれか１つの細菌。
３２．前記ＴＦＦポリペプチドがヒトＴＦＦである、実施形態３１の細菌。
３３．前記ヒトＴＦＦがヒトＴＦＦ３である、実施形態３２の細菌。
３４．前記ＴＦＦポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、実施形態６〜２９のいずれか１つの細菌。
３５．前記ＴＦＦポリペプチドがＴＦＦバリアントポリペプチドである、実施形態６〜２９のいずれか１つの細菌。
３６．前記ＴＦＦバリアントポリペプチドが、対応する野生型ＴＦＦポリペプチドと比べて増進したムチン結合能力を有する、実施形態３５の細菌。
３７．前記ＣｍｂＡポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、実施形態１〜３６のいずれか１つの細菌。
３８．少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、実施形態１〜３７のいずれか１つの細菌。
３９．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドがサイトカインである、実施形態３８の細菌。
４０．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドがインターロイキン（ＩＬ）である、実施形態３８または３９の細菌。
４１．前記インターロイキンが、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態４０の細菌。
４２．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが抗原である、実施形態３８の細菌。
４３．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが抗原およびインターロイキンである、実施形態４２の細菌。
４４．前記インターロイキンがＩＬ−２またはＩＬ−１０である、実施形態４３の細菌。
４５．前記抗原が自家抗原である、実施形態４２〜４４のいずれか１つの細菌。
４６．前記自家抗原が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に特異的な抗原である、実施形態４５の細菌。
４７．前記Ｔ１Ｄ特異的抗原が、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態４６の細菌。
４８．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが抗体またはその断片である、実施形態３８の細菌。
４９．前記抗体が単一ドメイン抗体またはナノボディである、実施形態４８の細菌。
５０．前記抗体が、抗ＴＮＦα抗体、ＩＬ−４に対する抗体、ＩＬ−５に対する抗体、ＩＬ−１３に対する抗体、ＩＬ−１５に対する抗体、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する抗体、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態４８または４９の細菌。
５１．前記抗体が、可溶性ＴＮＦ受容体および抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質である、実施形態４８または４９の細菌。
５２．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが酵素またはその断片である、実施形態３８の細菌。
５３．前記酵素またはその断片が機能的である、実施形態５２の細菌。
５４．前記酵素またはその断片が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態５２または５３の細菌。
５５．前記酵素またはその断片がＰＡＬである、実施形態５４の細菌。
５６．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、グルカゴン、エキセンジン−４、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態３８の細菌。
５７．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドが成長因子である、実施形態３８の細菌。
５８．前記成長因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）である、実施形態５７の細菌。
５９．前記ＥＧＦがヒトＥＧＦまたはブタＥＧＦである、実施形態５８の細菌。
６０．前記少なくとも１つの治療用ポリペプチドがＴＦＦである、実施形態３８の細菌。
６１．前記ＴＦＦが、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＴＦＦ３、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態６０の細菌。
６２．前記治療用ポリペプチドがヒトポリペプチドである、実施形態３８〜６１のいずれか１つの細菌。
６３．前記抗原がアレルゲンである、実施形態４２〜４４のいずれか１つの細菌。
６４．前記アレルゲンが、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態６３の細菌。
６５．前記アレルゲンが雑草花粉アレルゲンである、実施形態６４の細菌。
６６．前記雑草花粉アレルゲンがブタクサ花粉アレルゲンである、実施形態６５の細菌。
６７．前記アレルゲンが樹木花粉アレルゲンである、実施形態６４の細菌。
６８．前記樹木花粉アレルゲンがカバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンである、実施形態６７の細菌。
６９．前記アレルゲンが食物アレルゲンである、実施形態６４の細菌。
７０．前記食物アレルゲンが、ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態６９の細菌。
７１．少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする前記外因性核酸がｇａｐＢプロモーターによって転写調節される、実施形態３８〜７０のいずれか１つの細菌。
７２．前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する細菌と比べた時に増加した胃腸（ＧＩ）通過時間を有する、実施形態１〜７１のいずれか１つの細菌。
７３．前記ＧＩ通過時間が少なくとも約１０％増加している、実施形態７２の細菌。
７４．前記ＧＩ通過時間が少なくとも約３０％増加している、実施形態７３の細菌。
７５．前記ＧＩ通過時間が少なくとも約１０％から約５０％増加している、実施形態７２の細菌。
７６．前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する細菌と比べた時に増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力を有する、実施形態１〜７５のいずれか１つの細菌。
７７．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力が少なくとも約２０％増加している、実施形態７６の細菌。
７８．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力が少なくとも約５０％増加している、実施形態７７の細菌。
７９．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力が少なくとも約１００％（約２倍）増加している、実施形態７８の細菌。
８０．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力が少なくとも約２０％から約５００％増加している、実施形態７６の細菌。
８１．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力が、前記細菌をブタ胃からのムチンに結合させた後、
（ａ）４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ４０５）を検出すること、または
（ｂ）前記細菌をクリスタルバイオレットで染色し、その後に５９５ｎｍでの吸光度（ＯＤ５９５）を検出すること
によって測定されたものである、実施形態７６〜８０のいずれか１つの細菌。
８２．前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する細菌と比べた時に増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２細胞結合能力を有する、実施形態１〜８１のいずれか１つの細菌。
８３．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２結合能力が少なくとも約１０％増加している、実施形態８２の細菌。
８４．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２結合能力が少なくとも約１００％（約２倍）増加している、実施形態８３の細菌。
８５．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２結合能力が少なくとも約４００％（約５倍）増加している、実施形態８４の細菌。
８６．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２結合能力が少なくとも約１０％から約５００％増加している、実施形態８２の細菌。
８７．前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２結合能力が、
（ａ）前記細菌の培養物をＣａｃｏ−２細胞と接触させること、
（ｂ）前記Ｃａｃｏ−２細胞を洗浄して未結合の細菌細胞を除去すること、
（ｃ）前記Ｃａｃｏ−２細胞に結合した細菌細胞を脱着させ、それによって脱着した細菌細胞を形成すること、および
（ｄ）前記脱着した細菌細胞を滴定すること
によって測定されたものである、実施形態８２〜８６のいずれか１つの細菌。
８８．前記外因性核酸を含まないまたは前記融合タンパク質を含まない対応する細菌と比べた時に腸粘膜への増加した付着を呈する、実施形態１〜８７のいずれか１つの細菌。
８９．腸粘膜への前記付着が少なくとも約１０％から約５００％増加している、実施形態８８の細菌。
９０．実施形態１〜８９のいずれか１つの細菌を含む組成物。
９１．実施形態１〜８９のいずれか１つの細菌、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
９２．自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、および胃腸疾患からなる群から選択される疾患の治療または予防において使用するための、実施形態１〜８９のいずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、または実施形態９１の医薬組成物。
９３．疾患の治療または予防のための医薬の調製において使用するための、実施形態１〜８９のいずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、または実施形態９１の医薬組成物。
９４．前記疾患が、自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患、および栄養欠陥からなる群から選択される、実施形態９３の細菌、組成物、または医薬組成物。
９５．それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の実施形態１〜８９のいずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、または実施形態９１の医薬組成物を投与することを含む方法。
９６．前記疾患が、自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態９５の方法。
９７．前記疾患が自己免疫疾患である、実施形態９６の方法。
９８．前記自己免疫疾患が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）である、実施形態９７の方法。
９９．前記疾患が代謝性疾患である、実施形態９６の方法。
１００．前記代謝性疾患がフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、実施形態９９の方法。
１０１．前記疾患が胃腸疾患である、実施形態９６の方法。
１０２．前記胃腸疾患がセリアック病である、実施形態１０１の方法。
１０３．前記胃腸疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、実施形態１０１の方法。
１０４．前記ＩＢＤがクローン病または潰瘍性大腸炎である、実施形態１０３の方法。
１０５．細菌を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と接触させることを含む、遺伝子改変された細菌を調製する方法であって、融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が細胞付着ポリペプチドをコードする配列を含む、方法。
１０６．前記接触させることが、前記細菌が前記外因性核酸を内在化させるために充分な条件下で行われる、実施形態１０５の方法。
１０７．前記外因性核酸がプラスミド上に位置する、実施形態１０５または１０６の方法。
１０８．前記外因性核酸が前記細菌の染色体に組み込まれる、実施形態１０６または１０７の方法。
１０９．前記細菌を培養することおよび前記細菌中で前記融合タンパク質を発現させることをさらに含む、実施形態１０５〜１０８のいずれか１つの方法。
１１０．前記細胞付着ポリペプチドが、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、Ｍｕｂ、ＭａｐＡ、ＭｂｐＬ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１０５〜１０９のいずれか１つの方法。
１１１．前記細胞付着ポリペプチドがＣｍｂＡである、実施形態１１０の方法。
１１２．前記ＣｍｂＡがラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡである、実施形態１１１の方法。
１１３．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ムチン結合ポリペプチドをコードする配列をさらに含む、実施形態１０５〜１１２のいずれか１つの方法。
１１４．前記ムチン結合ポリペプチドがトレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチドである、実施形態１１３の方法。
１１５．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ＣｍｂＡをコードする配列およびＴＦＦポリペプチドをコードする配列を含む、実施形態１１４の方法。
１１６．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が前記細菌の染色体に組み込まれる、実施形態１０５〜１１５のいずれか１つの方法。
１１７．前記外因性核酸が、相同組換えを使用して前記細菌の染色体に組み込まれる、実施形態１１６の方法。
１１８．前記細菌を、治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることをさらに含む、実施形態１０５〜１１７のいずれか１つの方法。
１１９．前記細菌を、治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸と前記接触させることが、前記細菌を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と前記接触させることの前に行われる、実施形態１１８の方法。
１２０．前記細菌を、治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸と前記接触させることが、前記細菌を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と前記接触させることの後に行われる、実施形態１１８の方法。
１２１．前記遺伝子改変された細菌が、融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を含まない対応する細菌と比べた時に増加した粘膜および細胞付着特性を呈する、実施形態１０５〜１２０のいずれか１つの方法。
１２２．前記遺伝子改変された細菌の培養物を少なくとも１つの凍結保存剤と合わせて細菌混合物を形成することをさらに含む、実施形態１０５〜１２１のいずれか１つの方法。
１２３．前記細菌混合物を凍結乾燥して凍結乾燥組成物を形成することをさらに含む、実施形態１２２の方法。
１２４．前記遺伝子改変された細菌、または前記凍結乾燥組成物を薬学的に許容される担体と合わせて医薬組成物を形成することをさらに含む、実施形態１０５〜１２１または実施形態１２３のいずれか１つの方法。
１２５．前記凍結乾燥組成物または前記医薬組成物を医薬剤形に配合することをさらに含む、実施形態１２３または１２４の方法。
１２６．実施形態１０５〜１２５のいずれか１つの方法によって調製された、遺伝子改変された細菌。
１２７．実施形態１〜８９のいずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、または実施形態９１の医薬組成物を含む、単位剤形。
１２８．経口剤形である、実施形態１２７の単位剤形。
１２９．前記経口剤形が、錠剤、カプセル剤、サシェ剤、および包装された液体からなる群から選択される、実施形態１２８の単位剤形。
１３０．哺乳動物において成長を増進させる方法であって、有効量の実施形態１〜８９のいずれか１つの細菌、実施形態９０の組成物、実施形態９１の医薬組成物、または実施形態１２７〜１２９のいずれか１つの単位剤形を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
１３１．前記哺乳動物が、ヒト、ブタ、ウシ、およびヒツジからなる群から選択される、実施形態１３０の方法。
１３２．前記細菌、前記組成物、前記医薬組成物、または前記単位剤形が、前記哺乳動物への投与のために配合されている、実施形態１３０または１３１の方法。
１３３．前記細菌が、成長因子をコードする外因性核酸を含む、実施形態１３０〜１３２のいずれか１つの方法。
１３４．前記成長因子が前記細菌中で構成的に発現される、実施形態１３３の方法。
１３５．前記成長因子がＥＧＦである、実施形態１３３または１３４の方法。
１３６．前記哺乳動物がブタであり、かつ前記ＥＧＦがブタＥＧＦである、実施形態１３５の方法。
１３７．腸粘膜への細菌の結合を増加させる方法であって、
（ａ）前記微生物を、融合タンパク質をコードする外因性核酸と接触させることであって、融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ＣｍｂＡポリペプチドをコードする配列を含む、接触させること、および
（ｂ）前記細菌中で融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を発現させること
を含む方法。
１３８．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸がＴＦＦポリペプチドをコードする配列をさらに含む、実施形態１３７の方法。
１３９．融合タンパク質をコードする前記外因性核酸の発現が、前記ＴＦＦおよび前記ＣｍｂＡを含む融合タンパク質を産生する、実施形態１３８の方法。
１４０．（１）実施形態１〜８９のいずれか１つに記載の細菌、実施形態９０に記載の組成物、実施形態９１の医薬組成物、または実施形態１２７〜１２９のいずれか１つの単位剤形、および（２）前記細菌、前記組成物、前記医薬組成物、または前記単位剤形を哺乳動物に投与するための説明書を含むキット。
１４１．前記哺乳動物がヒトである、実施形態１４０のキット。
１４２．（ｉ）細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、Ｍｕｂ、ＭａｐＡ、ＭｂｐＬ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される細胞付着ポリペプチドをコードする配列、ならびに
（ｉｉ）ＴＦＦポリペプチド、ＭｕｂＢＰ、およびこれらの組合せから選択されるムチン結合ポリペプチドをコードする配列
を含む、融合タンパク質をコードする核酸。
１４３．前記ムチン結合ポリペプチドがＴＦＦポリペプチドである、実施形態１４２の核酸。
１４４．前記ＴＦＦポリペプチドがＴＦＦ３である、実施形態１４３の核酸。
１４５．前記細胞付着ポリペプチドがＣｍｂＡである、実施形態１４２〜１４４のいずれか１つの核酸。
１４６．実施形態１４２〜１４５のいずれか１つの核酸を含むプラスミド。
１４７．実施形態１４６のプラスミドを含む細菌宿主細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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