(57)【要約】  老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメント。
【請求項２】
前記ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントが、筋肉量を維持又は増大する、請求項１に記載の使用のためのＮＲＧ１又はそれらのフラグメント。
【請求項３】
サルコペニア又はフレイルの処置に使用するための、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメント。
【請求項４】
前記ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントが、対象に対して同時に、組み合わせて、連続的に、又は別個に投与される、ビタミンＢ１２との組み合わせ製剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのＮＲＧ１又はそれらのフラグメント。
【請求項５】
前記ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントが、ＮＲＧ１のＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、又はＶＩ型のアイソフォームであり、好ましくはＮＲＧ１のＩ型アイソフォームである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのＮＲＧ１又はそれらのフラグメント。
【請求項６】
前記ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントが、ＮＲＧ１  ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β、又はＨＲＧ−γアイソフォームであり、好ましくはＮＲＧ１  ＨＲＧ−βアイソフォームである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのＮＲＧ１又はそれらのフラグメント。
【請求項７】
前記ＮＲＧ１フラグメントが、ＮＲＧ１  ＥＧＦドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのＮＲＧ１又はそれらのフラグメント。
【請求項８】
前記ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントが、
（ａ）配列番号１又は５と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２、３、４、又は６と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号７又は８、好ましくは配列番号７と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのＮＲＧ１又はそれらのフラグメント。
【請求項９】
ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメントを、これらを必要としている対象に投与することを含む、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持又は改善・増大させる方法。
【請求項１０】
ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメントを、これらを必要としている対象に投与することを含む、サルコペニア又はフレイルの処置方法。
【請求項１１】
ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメントと、ビタミンＢ１２との組み合わせ製剤であって、前記ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントと、ビタミンＢ１２とが、対象に対して同時に、組み合わせて、連続的に、又は別個に投与するためのものである、組み合わせ製剤。
【請求項１２】
対象におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）レベルを増大可能な作用物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞集団を候補となる作用物質と接触させるステップ、
（ｂ）前記細胞集団におけるＮＲＧ１レベルを測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定した前記ＮＲＧ１レベルを、前記候補となる作用物質と接触させていない細胞の対照集団におけるＮＲＧ１レベルと比較するステップ、を含む、スクリーニング方法。
【請求項１３】
対象におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）レベルを増大させるための作用物質であって、好ましくは前記作用物質が、請求項１２に記載の方法により特定されている、及び／又は好ましくは前記作用物質が栄養補給剤である、作用物質。
【請求項１４】
（ａ）老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
（ｂ）老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、並びに／又は
（ｃ）サルコペニア又はフレイルの処置、において使用するための、請求項１３に記載の作用物質。
【請求項１５】
（ａ）対象から分離した生体試料を準備するステップ、
（ｂ）前記生体試料におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）のレベルを測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定した前記ＮＲＧ１レベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＮＲＧ１レベル又は参照レベルと比較するステップ、を含む、サルコペニア又はフレイルを診断する方法。
【請求項１６】
老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ビタミンＢ１２。
【請求項１７】
前記ビタミンＢ１２が、筋肉量を維持又は増大する、請求項１６に記載の使用のためのビタミンＢ１２。
【請求項１８】
サルコペニア又はフレイルの処置に使用するためのビタミンＢ１２。
【請求項１９】
前記ビタミンＢ１２が、アデノシルコバラミン及び／又はメチルコバラミンである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の使用のためのビタミンＢ１２。
【請求項２０】
前記ビタミンＢ１２が、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大に使用するためのアデノシルコバラミンである、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の使用のためのビタミンＢ１２。
【請求項２１】
前記ビタミンＢ１２が、老化している対象における筋繊維の大きさを増大させるのに使用するためのアデノシルコバラミンである、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の使用のためのビタミンＢ１２。
【請求項２２】
前記ビタミンＢ１２が、老化している対象における筋萎縮症を実質的に予防又は軽減するのに使用するためのメチルコバラミンである、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の使用のためのビタミンＢ１２。
【請求項２３】
前記対象が、ビタミンＢ１２欠乏症であるとの診断を予め受けている、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の使用のためのビタミンＢ１２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持又は改善・増大させるためのニューレグリン−１（ＮＲＧ１）及び／又はビタミンＢ１２の使用に関する。特に、本発明は、サルコペニア又は身体的なフレイルの処置のためのＮＲＧ１及び／又はビタミンＢ１２の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢による筋機能の低下及び筋肉量の減少は、全ての個体において必ず生じるものの、その進行は、広範な遺伝的要因並びに例えば身体活動及び栄養摂取などの環境的要因によって異なる。
【０００３】
一部の対象では、老化が筋肉に影響して、サルコペニア及びフレイルを含む特有の状態である病的状態へと進行する場合もある。サルコペニアは、加齢により筋機能の低下及び筋肉量の減少が生じ、衰弱をきたしクオリティ・オブ・ライフに影響を及ぼすようになった時点で生じているものとして定義されている（Ｓａｙｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｇｅ  Ａｇｅｉｎｇ  ４２：１４５−１５０）。対照的に、フレイルは、加齢に伴う筋機能不全についての分類であり、筋肉量ではなく、筋力及び筋機能に基づいている（Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ｄｉｒ．Ａｓｓｏｃ．１４：３９２−３９７）。
【０００４】
サルコペニア及びフレイルは、神経筋伝達障害、興奮収縮連関の変化、幹細胞枯渇に関連した再生能の低下、筋線維におけるミトコンドリア代謝及びエネルギー代謝の不全並びに骨格筋の大理石様脂肪化及び線維化などの病態生理学的変化に関連する多因性の症候群である（Ａｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ６０：２９４−３０５）。したがって、これらの症候群の病因論は複雑であり、また十分に解明されていないが、身体活動の低下、タンパク質同化ホルモン（例えば、アンドロゲン及びＩＧＦ−１）のホルモン減少、並びに栄養不良及び／又は栄養失調が重要な役割を果たしている（Ｍｉｔｈａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．２４：１５５５−１５６６）。
【０００５】
サルコペニアは、年齢に伴う身体活動の減少と、長寿命化とが特に顕著となっている、先進国において主要な健康問題になりつつある。重症の症例では、サルコペニアは、自立して生活する能力を低下させる場合もある。更に、サルコペニアは、集団ベースの研究において広範な身体障害の予測因子であり、平衡障害、歩行速度、転倒及び骨折の発生率の増大、と関連付けられている。
【０００６】
身体活動の減少は、サルコペニアの可能性を増大させるものと考えられることから、運動量を増やすことがかかる状態に抵抗するのに有効であろう。実際に、レジスタンス運動は、骨格筋におけるタンパク質合成の増加と関係がある。しかしながら、処置としての運動は、多くの場合、患者のコンプライアンスがよくない。
【０００７】
現在、サルコペニアの処置用に認可されている薬理作用物質はない。これに関連して数多くの成長ホルモンが試験されているものの、それらのホルモンが示した効果は微々たるものであった。その上、タンパク同化ステロイドは筋肉量及び筋力を増大可能であるものの、前立腺がんのリスク増大などの数多くの副作用を伴う。更に、既存の薬理学的及び栄養学的アプローチは、主に筋肉の同化をターゲットとしており、かかる状態に関連する神経筋異常に適切に対処するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、老化している対象における筋機能及び筋量を維持又は改善・増大させる方法が尚も強く求められている。特に、サルコペニア及びフレイルの処置方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
神経及び筋肉の両方の発達及び維持におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の役割がかねてより研究されている。例えば、ＮＲＧ１は、筋肉により産生され、筋分化に必須であることが知られている。ＮＲＧ１は収縮及び糖代謝に関するシグナルカスケードに関与することも示されている。しかしながら、これまでＮＲＧ１レベルと個体の年齢とは関連付けられていない。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに年齢に伴いＮＲＧ１の発現が減少することを見出した。年齢とＮＲＧ１との関連性が証明されたことを受け、本発明者らは、老化している動物モデルにおけるＮＲＧ１レベルを増大させると年齢に伴う筋肉萎縮効果が逆転したことの実証を進めた。
【００１１】
要約すると、本発明者らは、予想外にも、老化している対象におけるＮＲＧ１レベルを増大させることが、加齢による筋機能及び筋肉量の低下の処置に臨床的に適用され得るものであることを見出したことから、サルコペニア及びフレイルなどの加齢に関連する状態の処置への筋道を提供する。
【００１２】
その上、本発明者らは、予想外にも、老化している対象におけるビタミンＢ１２レベルを増大させることが、加齢による筋機能及び筋肉量の低下の処置に臨床的に許容され得るものであることを見出したことから、サルコペニア及びフレイルなどの加齢に関連する状態の処置への筋道を提供する。
【００１３】
特に、本発明者らは、驚くべきことに、異なるビタミンＢ１２アイソフォームが、異なる系及び経路に対し特定の効果を有することを見出した。したがって、特定のビタミンＢ１２アイソフォーム、又はビタミンＢ１２アイソフォームの組み合わせが、対象において特定の有益な効果を提供するよう選択され得る。
【００１４】
したがって、一態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメントを提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ビタミンＢ１２を提供する。
【００１６】
老化している対象は、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００歳より高齢のヒト対象であり得る。
【００１７】
好ましくは、筋肉は骨格筋である。
【００１８】
一実施形態では、ＮＲＧ１若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２は、筋肉量を維持又は増大する。
【００１９】
別の実施形態では、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、筋肉量の減少を実質的に予防又は軽減する。筋肉量の減少の予防（prevention or reduction in muscle mass）は、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントの非存在下で見込まれる筋肉量の減少と比較したものであり得る。
【００２０】
別の実施形態では、ビタミンＢ１２は、筋肉量の減少を実質的に予防又は軽減する。筋肉量の減少の予防（prevention or reduction in muscle mass）は、本発明のビタミンＢ１２の非存在下で見込まれる筋肉量の減少と比較したものであり得る。
【００２１】
別の態様では、本発明は、サルコペニア又はフレイルの処置に使用するためのニューレグリン−１（ＮＲＧ１）若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２を提供する。
【００２２】
本発明による使用のためのＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、対象に対して同時に、組み合わせて、連続的に、又は別個に投与されるビタミンＢ１２との組み合わせ製剤（a combined preparation）であり得る。
【００２３】
一実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、又はＶＩ型アイソフォームである。
【００２４】
好ましくは、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１のＩ型アイソフォームである。
【００２５】
別の実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１  ＨＲＧ−αアイソフォーム、ＨＲＧ−βアイソフォーム、又はＨＲＧ−γアイソフォームである。
【００２６】
好ましくは、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１  ＨＲＧ−βアイソフォームである。
【００２７】
一実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１  ＨＲＧ−β１アイソフォームである。別の実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１  ＨＲＧ−β２アイソフォームである。別の実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１  ＨＲＧ−β３アイソフォームである。
【００２８】
一実施形態では、本発明のＮＲＧ１フラグメントは、ＮＲＧ１  ＥＧＦドメインを含む。
【００２９】
一実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、
（ａ）配列番号１又は５と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２、３、４、又は６と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号７又は８、好ましくは配列番号７と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
好ましくは、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、を提供する。好ましくは、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、配列番号７により表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、配列番号１又は５に対し少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、を提供する。好ましくは、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、配列番号７により表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、配列番号２、３、４又は６に対し少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、を提供する。好ましくは、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、配列番号７により表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、配列番号７又は８、好ましくは配列番号７に対し少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、を提供する。好ましくは、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、配列番号７により表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００３４】
好ましくは、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、
（ａ）老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
（ｂ）老化している対象における筋消耗の予防若しくは軽減、並びに／又は
（ｃ）サルコペニア又はフレイルの処置、
に関して、配列番号７のタンパク質と比較して同様の効果又は向上した効果を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ＮＲＧ１  ＥＧＦドメインを含むポリペプチドを提供する。
【００３６】
一実施形態では、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、筋肉量を維持又は増大する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、サルコペニア又はフレイルの処置に使用するためのＮＲＧ１  ＥＧＦドメインを含むポリペプチドを提供する。
【００３８】
使用は本明細書に記載のとおりのものであり得る。
【００３９】
一実施形態では、ビタミンＢ１２は、アデノシルコバラミン及び／又はメチルコバラミンであり得る。
【００４０】
別の実施形態では、ビタミンＢ１２は、メチルコバラミン及び／又はアデノシルコバラミンへと変換され得る、ヒドロキソコバラミン及び／又はシアノコバラミンであり得る。
【００４１】
一態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大に使用するための、アデノシルコバラミンを提供する。特定の実施形態では、本発明は、老化している対象において筋繊維の大きさを増大するのに使用するための、アデノシルコバラミンを提供する。
【００４２】
一態様では、本発明は、老化している対象における筋消耗を実質的に予防又は軽減するのに使用するための、メチルコバラミンを提供する。特定の実施形態では、本発明は、老化している対象における筋萎縮症を実質的に予防又は軽減するのに使用するための、メチルコバラミンを提供する。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持又は改善・増大するのに、並びに筋萎縮症を軽減するのに使用するための、アデノシルコバラミン及びメチルコバラミンの併用を提供する。特定の実施形態では、本発明は、老化している対象における筋繊維の大きさを増大させるのに、及び筋萎縮症を実質的に予防又は軽減するのに使用するための、アデノシルコバラミン及びメチルコバラミンの併用を提供する。
【００４４】
ビタミンＢ１２は、経口、非経口（parental）、舌下、皮下、経皮、又は鼻腔内投与により投与され得る。
【００４５】
ビタミンＢ１２は、経口ビタミンＢ１２栄養補給剤又はビタミンＢ１２産生菌を含むプロバイオティク栄養補給剤として投与されてもよい。ビタミンＢ１２は、例えば、栄養組成物若しくは栄養補給剤、又はダイエット製品（diet product）の形態であってよい。
【００４６】
一実施形態では、対象はビタミンＢ１２欠乏症であるとの診断を予め受けていてもよい。
【００４７】
別の態様では、本発明は、本発明のニューレグリン−１（ＮＲＧ１）若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２を、これらを必要としている対象に投与することを含む、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持又は改善・増大させる方法を提供する。
【００４８】
一実施形態では、ＮＲＧ１若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２は、筋肉量を維持又は増大する。
【００４９】
別の実施形態では、ＮＲＧ１若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２は、筋肉量の低下を実質的に予防又は軽減する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、本発明のニューレグリン−１（ＮＲＧ１）若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２を、これらを必要としている対象に投与することを含む、老化している対象における筋消耗を実質的に予防又は軽減する方法を提供する。
【００５１】
ビタミンＢ１２は、本明細書に記載のとおりの方法で、筋機能及び／若しくは筋肉量を維持又は増大することができ、並びに／又は筋消耗を実質的に予防若しくは軽減することができる。
【００５２】
別の態様では、本発明は、本発明のニューレグリン−１（ＮＲＧ１）若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２を、これらを必要としている対象に投与することを含む、サルコペニア又はフレイルの処置方法を提供する。
【００５３】
好ましくは、筋肉は骨格筋である。
【００５４】
別の態様では、本発明は、
（ａ）老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
（ｂ）老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、並びに／又は
（ｃ）サルコペニア又はフレイルの処置、のための薬物を製造するための、本発明のニューレグリン−１（ＮＲＧ１）若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２の使用を提供する。
【００５５】
一実施形態では、薬物は、筋肉量を維持又は増大する。
【００５６】
別の実施形態では、薬物は、筋肉量の減少を実質的に予防又は軽減する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、本発明のニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメントと、ビタミンＢ１２との組み合わせ製剤を提供し、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントと、ビタミンＢ１２とは、対象に対して同時に、組み合わせて、連続的に、又は別個に投与するためのものである。
【００５８】
組み合わせ製剤のビタミンＢ１２は、例えば、栄養組成物若しくは栄養補給剤、又はダイエット製品の形態であってよい。ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、例えば、非経口投与（例えば、皮下、静脈内、又は筋肉内注射）に好適な形態であり得る。
【００５９】
別の態様では、本発明は、
（ａ）細胞集団を候補となる作用物質と接触させるステップ、
（ｂ）細胞集団におけるＮＲＧ１レベルを測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定したＮＲＧ１レベルを、候補となる作用物質と接触させていない細胞の対照集団におけるＮＲＧ１レベルと比較するステップ、を含む、対象におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）レベルを増大可能な作用物質をスクリーニングする方法、を提供する。
【００６０】
候補となる作用物質は、例えば、医薬品又は栄養補給剤であり得る。好ましくは、候補となる作用物質は栄養補給剤である。
【００６１】
一実施形態では、候補となる作用物質は、候補となる作用物質のライブラリ中に含まれる。
【００６２】
別の態様では、本発明は、対象におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）レベルを増大させるための作用物質を提供し、好ましくは、かかる作用物質は、本発明のスクリーニング方法により特定されたものである。
【００６３】
好ましくは、作用物質は栄養補給剤である。
【００６４】
作用物質は、ビタミンＢ１２との組み合わせ製剤であってよく、作用物質とビタミンＢ１２とは、対象に対して同時に、組み合わせて、連続的に、又は別個に投与される。
【００６５】
別の態様では、本発明は、
（ａ）老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
（ｂ）老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、並びに／又は
（ｃ）サルコペニア又はフレイルの処置、に使用するための、本発明の作用物質を提供する。
【００６６】
好ましくは、筋肉は骨格筋である。
【００６７】
別の態様では、本発明は、
（ａ）対象から分離した生体試料を準備するステップ、
（ｂ）生体試料におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）のレベルを測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定したＮＲＧ１レベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＮＲＧ１レベル又は参照レベルと比較するステップ、を含む、サルコペニア又はフレイルの診断方法を提供する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ダイエット製品を提供する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、サルコペニア又はフレイルの処置に使用するためのダイエット製品を提供する。
【００７０】
好ましくは、本発明のダイエット製品は、サルコペニア若しくはフレイルを有する、又はサルコペニア若しくはフレイルを発症するリスクがあると本発明の方法により予め診断された対象に使用するためのものである。
【００７１】
一実施形態では、本発明のダイエット製品は、ビタミンＢ１２欠乏の対象に使用するためのものである。
【００７２】
別の態様では、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメント、ビタミンＢ１２、作用物質、又は本発明のダイエット製品は、筋機能及び／若しくは筋肉量を維持又は増大させる運動療法と組み合わせて使用され得る。
【００７３】
別の態様では、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）若しくはそれらのフラグメント、ビタミンＢ１２、作用物質、又は本発明のダイエット製品は、選択的アンドロゲン受容体モジュレーター（ＳＡＲＭ）、例えば、オスタリン又はミオスタチン阻害剤（例えば、ミオスタチン抗体、アクチビン受容体抗体、及びアクチビン受容体−Ｆｃ）、例えば、ＬＹ２４９５６５５又はビマグルマブ、又はβ２受容体アゴニスト、例えば、ホルモテロール、又はグレリン受容体アゴニスト、例えば、アナモレリン、又は同化異化変換剤（ＡＣＴＡ）、例えば、ＭＴ−１０２などといった、その他の医薬組成物と組み合わせて使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の血中濃度は、ラットにおいて年齢とともに低下する。相対蛍光単位（ＲＦＵ）の中央正規化（median−normalisation）後に、スローオフレートＤＮＡアプタマー検出（slow off−rate DNA aptamer detection）を用い、８ヶ月齢、１８ヶ月齢、又は２４ヶ月齢のラット由来の血清中ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）レベルを測定し、定量を行なった。１群当たり１０匹のラットを分析した。＊＊＝ｐ値＜０．０１。
【図２】ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて神経筋接合部をダメージから保護する。神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（２．５μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾールを使用した。Ａｂにより誘導されるダメージに対するニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の効果は、神経筋接合部（ＮＭＪ）の大きさを測定することにより評価した。全ての値は、１群当たり６ウェルに由来するものであり、対照条件（ＣＴＬ）に対する％として示す。＊＊＝ｐ値＜０．０１、＊＊＊＝ｐ値＜０．００１。
【図３】ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）は、年齢により誘導される萎縮症から骨格筋を保護する。１６ヶ月齢のプレサルコペニアラットを、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又は生理食塩水のいずれかで５ヶ月間処理した。ＮＲＧ１を１μｇ／ｋｇ（体重）で１週間当たり３回皮下注射した。次に、後肢の骨格筋量を評価し、生理食塩水の対照を注射した成体健常ラット群（実験開始時に８ヶ月齢）と比較した。＊＝ｐ値＜０．０５、＊＊＝ｐ値＜０．０１。
【図４Ａ】ビタミンＢ１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて神経筋接合部をダメージから保護する。神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（２．５μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾールを使用した。Ａｂに誘導されるダメージに対しメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）及びアデノシルコバラミン（ＡｄｅｎｏＣｂｌ）が示す効果を、神経筋接合部（ＮＭＪ）の大きさ（図４Ａ）、神経筋接合部数（図４Ｂ）、及び神経突起ネットワーク長（図４Ｃ）を測定することにより評価した。全ての値は、１群当たり６ウェルに由来するものであり、対照条件（ＣＴＬ）に対する％として示す。＊＊＝ｐ値＜０．０１、＊＊＊＝ｐ値＜０．００１。
【図４Ｂ】ビタミンＢ１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて神経筋接合部をダメージから保護する。神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（２．５μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾールを使用した。Ａｂに誘導されるダメージに対しメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）及びアデノシルコバラミン（ＡｄｅｎｏＣｂｌ）が示す効果を、神経筋接合部（ＮＭＪ）の大きさ（図４Ａ）、神経筋接合部数（図４Ｂ）、及び神経突起ネットワーク長（図４Ｃ）を測定することにより評価した。全ての値は、１群当たり６ウェルに由来するものであり、対照条件（ＣＴＬ）に対する％として示す。＊＊＝ｐ値＜０．０１、＊＊＊＝ｐ値＜０．００１。
【図４Ｃ】ビタミンＢ１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて神経筋接合部をダメージから保護する。神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（２．５μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾールを使用した。Ａｂに誘導されるダメージに対しメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）及びアデノシルコバラミン（ＡｄｅｎｏＣｂｌ）が示す効果を、神経筋接合部（ＮＭＪ）の大きさ（図４Ａ）、神経筋接合部数（図４Ｂ）、及び神経突起ネットワーク長（図４Ｃ）を測定することにより評価した。全ての値は、１群当たり６ウェルに由来するものであり、対照条件（ＣＴＬ）に対する％として示す。＊＊＝ｐ値＜０．０１、＊＊＊＝ｐ値＜０．００１。
【図５Ａ】ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）及びビタミンＢ１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経筋接合部の保護に対し、相加効果を有する。神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（１０μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾールを使用した。Ａｂにより誘導されるダメージに対するニューレグリン−１（ＮＲＧ１）及び／又はアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）の効果を、神経筋接合部（ＮＭＪ）の数（図５Ａ）及び神経筋接合部（ＮＭＪ）の大きさ（図５Ｂ）を測定することにより評価した。全ての値は、１群当たり６ウェルに由来するものであり、対照条件（ＣＴＬ）に対する％として示す。＊＊＝ｐ値＜０．０１、＊＊＊＝ｐ値＜０．００１。
【図５Ｂ】ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）及びビタミンＢ１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経筋接合部の保護に対し、相加効果を有する。神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（１０μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾールを使用した。Ａｂにより誘導されるダメージに対するニューレグリン−１（ＮＲＧ１）及び／又はアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）の効果を、神経筋接合部（ＮＭＪ）の数（図５Ａ）及び神経筋接合部（ＮＭＪ）の大きさ（図５Ｂ）を測定することにより評価した。全ての値は、１群当たり６ウェルに由来するものであり、対照条件（ＣＴＬ）に対する％として示す。＊＊＝ｐ値＜０．０１、＊＊＊＝ｐ値＜０．００１。
【図６Ａ】アデノシルコバラミンは、高齢ラットにおいて筋繊維の大きさを増大させる。老齢サルコペニアラットを、メチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）（図６Ａ）及びアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ（図６Ｂ）により１８ヶ月齢〜２３ヶ月齢の５ヶ月間にわたって処理して、月齢の等しいサルコペニア対照（老齢ＣＴＬ）又は若齢健常対照（成体）と比較した。前脛骨筋を切り出し、切片化し、筋繊維を免疫染色した。代表的なタイプ２Ａについて、筋繊維の大きさ分布を示す。全ての値は、１群当たり９匹のラットに由来するものである。
【図６Ｂ】アデノシルコバラミンは、高齢ラットにおいて筋繊維の大きさを増大させる。老齢サルコペニアラットを、メチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）（図６Ａ）及びアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ（図６Ｂ）により１８ヶ月齢〜２３ヶ月齢の５ヶ月間にわたって処理して、月齢の等しいサルコペニア対照（老齢ＣＴＬ）又は若齢健常対照（成体）と比較した。前脛骨筋を切り出し、切片化し、筋繊維を免疫染色した。代表的なタイプ２Ａについて、筋繊維の大きさ分布を示す。全ての値は、１群当たり９匹のラットに由来するものである。
【図７】メチルコバラミンは、筋萎縮症から保護する。２Ｄ＋マイクロパターン誘導（micro−pattern inducing）筋管アラインメントにおいて、ヒトの筋芽細胞を、萎縮因子ＴＮＦａ及び異なる形態のビタミンＢ１２の存在下で、筋管へと分化誘導した。ＴＮＦａにより誘導される筋萎縮の予防についての陽性対照としてＩＧＦを使用する。核の総数に対する筋管内部の核のパーセンテージ（すなわち、核を２個以上含有する）として、融合指数を計算した。値は、１群当たり３ウェルに由来するものであり、対照条件（ＣＴＬ）に対する％として示す。＊＊＝ＣＴＬ条件と比較してｐ値＜０．０１である。及び＊＊＊＝ＣＴＬ条件と比較してｐ値＜０．００１である。＃＃＝ＴＮＦａ条件と比較してｐ値＜０．０１である。
【図８Ａ】骨格筋において、アデノシルコバラミンは、サルコペニアに関連する遺伝子発現特性（gene expression signatures）を特異的に逆転するのに対し、メチルコバラミンは、異なる遺伝子発現特性に作用する。老齢サルコペニアラットを、アデノシル−コバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）又はメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）により、１８〜２３ヶ月齢の５ヶ月間にわたって処理して、月齢の等しいサルコペニア対照（老齢ＣＴＬ）又は若齢健常対照（成体）と比較した。ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイ解析のため、前脛骨筋を切り出した。図８Ａは老齢対照と成体とを比較して、図８Ｂはアデノシルコバラミンで処理した老齢ラットと老齢対照とを比較して、図８Ｃはメチルコバラミンで処理した老齢ラットと老齢対照とを比較して、調節された上位の経路についてのＧＳＥＡ遺伝子エンリッチメントを示す図である。
【図８Ｂ】骨格筋において、アデノシルコバラミンは、サルコペニアに関連する遺伝子発現特性（gene expression signatures）を特異的に逆転するのに対し、メチルコバラミンは、異なる遺伝子発現特性に作用する。老齢サルコペニアラットを、アデノシル−コバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）又はメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）により、１８〜２３ヶ月齢の５ヶ月間にわたって処理して、月齢の等しいサルコペニア対照（老齢ＣＴＬ）又は若齢健常対照（成体）と比較した。ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイ解析のため、前脛骨筋を切り出した。図８Ａは老齢対照と成体とを比較して、図８Ｂはアデノシルコバラミンで処理した老齢ラットと老齢対照とを比較して、図８Ｃはメチルコバラミンで処理した老齢ラットと老齢対照とを比較して、調節された上位の経路についてのＧＳＥＡ遺伝子エンリッチメントを示す図である。
【図８Ｃ】骨格筋において、アデノシルコバラミンは、サルコペニアに関連する遺伝子発現特性（gene expression signatures）を特異的に逆転するのに対し、メチルコバラミンは、異なる遺伝子発現特性に作用する。老齢サルコペニアラットを、アデノシル−コバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）又はメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）により、１８〜２３ヶ月齢の５ヶ月間にわたって処理して、月齢の等しいサルコペニア対照（老齢ＣＴＬ）又は若齢健常対照（成体）と比較した。ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイ解析のため、前脛骨筋を切り出した。図８Ａは老齢対照と成体とを比較して、図８Ｂはアデノシルコバラミンで処理した老齢ラットと老齢対照とを比較して、図８Ｃはメチルコバラミンで処理した老齢ラットと老齢対照とを比較して、調節された上位の経路についてのＧＳＥＡ遺伝子エンリッチメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によって記述する。
【００７６】
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。このような技術は文献に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３  ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．及びＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００７７】
ニューレグリン
一態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメントを提供する。ニューレグリンは、可溶性でありかつＥＧＦ様ドメインを特徴とする膜貫通型増殖因子であるファミリーに属する。ニューレグリンは、内皮、ニューロン、及び間葉由来の細胞で主に発現され、増殖、生存、又は遊走などの多様な生物学的機能に関与する。
【００７８】
ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）遺伝子は、選択的スプライシングにより、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩ型アイソフォームと呼称される６種類の既知のＮＲＧ１アイソフォームを産生する。各アイソフォームは、受容体の活性化に必須であるＥＧＦ様のドメインを含有する。異なるアイソフォームの発現は空間的にかつ時間的に制御されることから、各アイソフォームは固有の機能を有し得ることが示唆される。全てのアイソフォームは、アイソフォームに応じて、固有の組み合わせのＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体、及びＥｒｂＢ４受容体に対して作用することにより、細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する（Ｙａｒｄｅｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：１２７−１３７）。
【００７９】
一実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ヒトＮＲＧ１又はそのフラグメントである。
【００８０】
一実施形態では、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、又はＶＩ型アイソフォームである。
【００８１】
好ましくは、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、ＮＲＧ１のＩ型アイソフォームである。あるいは、ＮＲＧ１のＩ型アイソフォームは、へレグリン（ＨＲＧ）、ＮＥＵ分化因子（ＮＤＦ）、及びアセチルコリン受容体誘導活性物質（acetylcholine receptor inducing activity）（ＡＲＩＡ）としても既知の場合がある。
【００８２】
ＮＲＧ１  ＨＲＧ−αアイソフォームのアミノ酸配列の例は、次のものである。
ＭＳＥＲＫＥＧＲＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡＧＳＱＳＰＡＬＰＰＲＬＫＥＭＫＳＱＥＳＡＡＧＳＫＬＶＬＲＣＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＣＫＶＩＳＫＬＧＮＤＳＡＳＡＮＩＴＩＶＥＳＮＥＩＩＴＧＭＰＡＳＴＥＧＡＹＶＳＳＥＳＰＩＲＩＳＶＳＴＥＧＡＮＴＳＳ
（配列番号１）
【００８３】
ＮＲＧ１  ＨＲＧ−β１アイソフォームのアミノ酸配列の例は、次のものである。
ＭＳＥＲＫＥＧＲＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡＧＳＱＳＰＡＬＰＰＲＬＫＥＭＫＳＱＥＳＡＡＧＳＫＬＶＬＲＣＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＣＫＶＩＳＫＬＧＮＤＳＡＳＡＮＩＴＩＶＥＳＮＥＩＩＴＧＭＰＡＳＴＥＧＡＹＶＳＳＥＳＰＩＲＩＳＶＳＴＥＧＡＮＴＳＳＳＴＳＴＳＴＴＧＴＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＰＮＥＦＴＧＤＲＣＱＮＹＶＭＡＳＦＹＫＨＬＧＩＥＦＭＥＡＥＥＬＹＱＫＲＶＬＴＩＴＧＩＣＩＡＬＬＶＶＧＩＭＣＶＶＡＹＣＫＴＫＫＱＲＫＫＬＨＤＲＬＲＱＳＬＲＳＥＲＮＮＴＭＮＩＡＮＧＰＨＨＰＮＰＰＰＥＮＶＱＬＶＮＱＹＶＳＫＮＶＩＳＳＥＨＩＶＥＲＥＡＥＴＳＦＳＴＳＨＹＴＳＴＡＨＨＳＴＴＶＴＱＴＰＳＨＳＷＳＮＧＨＴＥＳＩＬＳＥＳＨＳＶＩＶＭＳＳＶＥＮＳＲＨＳＳＰＴＧＧＰＲＧＲＬＮＧＴＧＧＰＲＥＣＮＳＦＬＲＨＡＲＥＴＰＤＳＹＲＤＳＰＨＳＥＲＹＶＳＡＭＴＴＰＡＲＭＳＰＶＤＦＨＴＰＳＳＰＫＳＰＰＳＥＭＳＰＰＶＳＳＭＴＶＳＭＰＳＭＡＶＳＰＦＭＥＥＥＲＰＬＬＬＶＴＰＰＲＬＲＥＫＫＦＤＨＨＰＱＱＦＳＳＦＨＨＮＰＡＨＤＳＮＳＬＰＡＳＰＬＲＩＶＥＤＥＥＹＥＴＴＱＥＹＥＰＡＱＥＰＶＫＫＬＡＮＳＲＲＡＫＲＴＫＰＮＧＨＩＡＮＲＬＥＶＤＳＮＴＳＳＱＳＳＮＳＥＳＥＴＥＤＥＲＶＧＥＤＴＰＦＬＧＩＱＮＰＬＡＡＳＬＥＡＴＰＡＦＲＬＡＤＳＲＴＮＰＡＧＲＦＳＴＱＥＥＩＱＡＲＬＳＳＶＩＡＮＱＤＰＩＡＶ
（配列番号２）
【００８４】
ＮＲＧ１  ＨＲＧ−β２アイソフォームのアミノ酸配列の例は、次のものである。
ＭＳＥＲＫＥＧＲＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡＧＳＱＳＰＡＬＰＰＲＬＫＥＭＫＳＱＥＳＡＡＧＳＫＬＶＬＲＣＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＣＫＶＩＳＫＬＧＮＤＳＡＳＡＮＩＴＩＶＥＳＮＥＩＩＴＧＭＰＡＳＴＥＧＡＹＶＳＳＥＳＰＩＲＩＳＶＳＴＥＧＡＮＴＳＳＳＴＳＴＳＴＴＧＴＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＰＮＥＦＴＧＤＲＣＱＮＹＶＭＡＳＦＹＫＡＥＥＬＹＱＫＲＶＬＴＩＴＧＩＣＩＡＬＬＶＶＧＩＭＣＶＶＡＹＣＫＴＫＫＱＲＫＫＬＨＤＲＬＲＱＳＬＲＳＥＲＮＮＴＭＮＩＡＮＧＰＨＨＰＮＰＰＰＥＮＶＱＬＶＮＱＹＶＳＫＮＶＩＳＳＥＨＩＶＥＲＥＡＥＴＳＦＳＴＳＨＹＴＳＴＡＨＨＳＴＴＶＴＱＴＰＳＨＳＷＳＮＧＨＴＥＳＩＬＳＥＳＨＳＶＩＶＭＳＳＶＥＮＳＲＨＳＳＰＴＧＧＰＲＧＲＬＮＧＴＧＧＰＲＥＣＮＳＦＬＲＨＡＲＥＴＰＤＳＹＲＤＳＰＨＳＥＲＹＶＳＡＭＴＴＰＡＲＭＳＰＶＤＦＨＴＰＳＳＰＫＳＰＰＳＥＭＳＰＰＶＳＳＭＴＶＳＭＰＳＭＡＶＳＰＦＭＥＥＥＲＰＬＬＬＶＴＰＰＲＬＲＥＫＫＦＤＨＨＰＱＱＦＳＳＦＨＨＮＰＡＨＤＳＮＳＬＰＡＳＰＬＲＩＶＥＤＥＥＹＥＴＴＱＥＹＥＰＡＱＥＰＶＫＫＬＡＮＳＲＲＡＫＲＴＫＰＮＧＨＩＡＮＲＬＥＶＤＳＮＴＳＳＱＳＳＮＳＥＳＥＴＥＤＥＲＶＧＥＤＴＰＦＬＧＩＱＮＰＬＡＡＳＬＥＡＴＰＡＦＲＬＡＤＳＲＴＮＰＡＧＲＦＳＴＱＥＥＩＱＡＲＬＳＳＶＩＡＮＱＤＰＩＡＶ
（配列番号３）
【００８５】
ＮＲＧ１  ＨＲＧ−β３アイソフォームのアミノ酸配列の例は、次のものである。
ＭＳＥＲＫＥＧＲＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡＧＳＱＳＰＡＬＰＰＲＬＫＥＭＫＳＱＥＳＡＡＧＳＫＬＶＬＲＣＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＣＫＶＩＳＫＬＧＮＤＳＡＳＡＮＩＴＩＶＥＳＮＥＩＩＴＧＭＰＡＳＴＥＧＡＹＶＳＳＥＳＰＩＲＩＳＶＳＴＥＧＡＮＴＳＳＳＴＳＴＳＴＴＧＴＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＰＮＥＦＴＧＤＲＣＱＮＹＶＭＡＳＦＹＳＴＳＴＰＦＬＳＬＰＥ
（配列番号４）
【００８６】
ＮＲＧ１  ＨＲＧ−γアイソフォームのアミノ酸配列の例は、次のものである。
ＭＳＥＲＫＥＧＲＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡＧＳＱＳＰＡＬＰＰＲＬＫＥＭＫＳＱＥＳＡＡＧＳＫＬＶＬＲＣＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＣＫＶＩＳＫＬＧＮＤＳＡＳＡＮＩＴＩＶＥＳＮＥＩＩＴＧＭＰＡＳＴＥＧＡＹＶＳＳＥＳＰＩＲＩＳＶＳＴＥＧＡＮＴＳＳＳＴＳＴＳＴＴＧＴＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫ
（配列番号５）
【００８７】
ＮＲＧ１  ＨＲＧ−βアイソフォームのアミノ酸配列の更なる例は、次のものである。
ＭＳＥＲＫＥＧＲＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡＧＳＱＳＰＡＬＰＰＲＬＫＥＭＫＳＱＥＳＡＡＧＳＫＬＶＬＲＣＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＣＫＶＩＳＫＬＧＮＤＳＡＳＡＮＩＴＩＶＥＳＮＥＩＩＴＧＭＰＡＳＴＥＧＡＹＶＳＳＥＳＰＩＲＩＳＶＳＴＥＧＡＮＴＳＳＳＴＳＴＳＴＴＧＴＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＰＮＥＦＴＧＤＲＣＱＮＹＶＭＡＳＦＹＫＨＬＧＩＥＦＭＥＱＫＲＶＬＴＩＴＧＩＣＩＡＬＬＶＶＧＩＭＣＶＶＡＹＣＫＴＫＫＱＲＫＫＬＨＤＲＬＲＱＳＬＲＳＥＲＮＮＭＭＮＩＡＮＧＰＨＨＰＮ
（配列番号６）
【００８８】
ＮＲＧ１のＥＧＦドメインのアミノ酸配列の例は、次のものである。
ＳＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＰＮＥＦＴＧＤＲＣＱＮＹＶＭＡＳＦＹＫＨＬＧＩＥＦ
（配列番号７、ＮＲＧ１β）
【００８９】
ＥＧＦドメインのアミノ酸配列の更なる例は、次のものである。
ＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＱＰＧＦＴＧＡＲＣ
（配列番号８、ＮＲＧ１α）
【００９０】
本発明のＮＲＧ１フラグメントは、所望の機能を維持する、完全長のポリペプチドの一部分であり、好ましくは老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減を提供する。例えば、かかるフラグメントは、配列番号７により表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持し得る。フラグメントは、完全長のＮＲＧ１の天然の機能を実質的に保持し得る。
【００９１】
好ましくは、本発明のＮＲＧ１フラグメントは、
（ａ）老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、
（ｂ）老化している対象における筋消耗の予防若しくは軽減、並びに／又は
（ｃ）サルコペニア又はフレイルの処置、
に関して、配列番号７のタンパク質と比較して同様の効果又は向上した効果を提供する。
【００９２】
本発明のＮＲＧ１フラグメントは、ＮＲＧ１  ＥＧＦドメインを含む、例えば、配列番号７又は８、好ましくは配列番号７に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドであってよく、好ましくは、ＮＲＧ１フラグメントは、配列番号７により表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００９３】
末梢神経系において、ＮＲＧ１は、発育中及び外傷後のいずれでも、ミエリン形成プロセスにおいて重要な役割を果たす。軸索周囲の脂質に富むミエリン鞘は、適切な電気的シグナルの伝導及び速度を可能にするものであり、軸索に対し並置されているシュワン細胞により産生される。出生後早期の発育中に、ＮＲＧ１などの外部からの合図によりシュワン細胞はミエリン形成を誘導される。ミエリン形成の際のＮＲＧ１の重要性は、ＮＲＧ１欠損変異マウスでは低ミエリン化（hypo−myelinated）された表現型が示されることを以て示されている（Ｇａｍｂａｒｏｔｔａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０８：２２３−２５６）。同様にして、神経再生及び再ミエリン化は、ニューレグリン−１の非存在下では不完全であるものの、ニューレグリン−１の過剰発現又は注入により増強される（Ｇａｍｂａｒｏｔｔａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０８：２２３−２５６；Ｓｔａｓｓａｒｔ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：４８−５４；Ｆｒｉｃｋｅｒ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３１：３２２５−３２３３）。
【００９４】
骨格筋レベルのＮＲＧ１は、高度に分化された構造である神経筋接合部の形成及び維持に関連付けられており、かかる神経筋接合部により、収縮のための神経から筋肉への電気インパルスの伝達が可能になる。脊椎動物の神経筋接合部は、運動ニューロンにより提供されるシナプス前神経末端と、アセチルコリン受容体の集合体から形成されるシナプス後筋肉部（postsynaptic muscular part）と、末端シュワン細胞と、から構成される。発育中、アセチルコリン受容体の発現は、ＮＲＧ１により、及びニューロンのアグリンによるそれらの集合体により誘導される。ＮＲＧ１は、成人期中の神経筋接合部の維持にも重要であるとも考えられている。ある研究では、マウス骨格筋においては、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ４の欠失が神経筋接合部の形成に影響を及ぼさないことが示され、このことにより、ＮＲＧ１がシュワン細胞を介し間接的に神経筋接合部に作用し得ることが示唆された。
【００９５】
本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、タンパク質の形態で対象に投与され得る。好適な投与経路としては、皮下、静脈内、及び筋肉内注射が挙げられる。
【００９６】
本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントは、遺伝子治療により対象に投与され得る。例えば、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントをコードしているポリヌクレオチドは、対象の標的細胞に導入され得る。本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを送達するのに好適な、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスベクターといったウイルスベクターなどの、数多くのベクターが利用可能である。
【００９７】
ビタミンＢ１２
一態様では、本発明は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大、並びに／又は老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、に使用するための、ビタミンＢ１２を提供する。
【００９８】
ビタミンＢ１２（コバラミンとしても既知）は人体で合成することができず、したがって食品から又は腸内微生物叢による合成から得る必要のあるコバルト含有水溶性ビタミン群である。
【００９９】
ビタミンＢ１２群は、コバルトイオンの上部軸配位子（upper axialligand）に応じて、いくつかの化学的形態のビタミンＢ１２を指し得る。これらは、
シアノコバラミン（Ｒ＝−ＣＮ）
ヒドロキソコバラミン（Ｒ＝−ＯＨ）
メチルコバラミン（Ｒ＝−ＣＨ３）及び
アデノシルコバラミン（Ｒ＝−５’−デオキシアデノシル）である。
【化１】
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【０１００】
ヒト体内におけるビタミンＢ１２のプールは、いくつかの形態から構成され、不活性であり、活性を得るには変換を要するシアノコバラミン、並びにビタミンＢ１２の代謝活性型であるメチルコバラミン及びアデノシルコバラミンである。
【０１０１】
２種類の酵素、メチオニン合成酵素及びメチルマロニルＣｏＡムターゼがビタミンＢ１２を補因子として利用することが知られている。メチオニン合成酵素は、ホモシステインをメチオニンに変換するのにメチルコバラミンを利用する細胞内酵素である。かかる酵素は、そのことにより、メチル化ドナーとしてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を提供し、ホモシステインの毒性の蓄積を予防するよう、重要な役割を果たす。重度のビタミンＢ１２欠乏により観察される低ＳＡＭレベル及び高ホモシステインレベルでは、末梢神経及び脊髄のミエリン形成が損なわれる。メチオニン合成酵素は、５−メチル−テトラヒドロ葉酸の、生物活性のあるテトラヒドロ葉酸への活性化も触媒し、この触媒効果は１−炭素代謝及びＤＮＡ合成に必要とされ、ひいては赤血球の増加に効果がある。メチルマロニルＣｏＡムターゼは、メチル−マロニルＣｏＡをスクシニルＣｏＡに変換するに当たりアデノシルコバラミンを利用するミトコンドリア酵素であり、スクシニルＣｏＡは続いてＴＣＡ回路に取り込まれる。これは分岐鎖アミノ酸及び奇数鎖長脂肪酸の分解によって示され、胚期中の神経発達の制御に必須であるものの、成人期では必須なものではない。
【０１０２】
本発明のビタミンＢ１２は、例えば、ビタミンＢ１２そのもの、半合成誘導体のシアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、及び／又はアデノシルコバラミンの形態であってよい。
【０１０３】
一実施形態では、本発明による使用のためのビタミンＢ１２は、本明細書に記載のとおりＮＲＧ１又はそれらのフラグメントと組み合わせて投与されない。
【０１０４】
本発明のビタミンＢ１２は、例えば、アデノシルコバラミン、メチルコバラミン、シアノコバラミン、及び／又はヒドロキソコバラミンの形態であり得る。
【０１０５】
一実施形態では、ビタミンＢ１２は、アデノシルコバラミン及び／又はメチルコバラミンであり得る。好ましい実施形態では、ビタミンＢ１２はアデノシルコバラミンであり得る。
【０１０６】
一実施形態では、アデノシルコバラミンは、筋肉量を維持又は増大し、例えば、一実施形態では、アデノシルコバラミンは筋繊維の大きさを増大する。
【０１０７】
一態様では、本発明は、老化している対象における筋肉量の維持又は増大するための、アデノシルコバラミンの使用を提供する。
【０１０８】
その他の態様では、本発明は、老化している対象における筋肉量を維持又は増大させる方法を提供し、かかる方法は、アデノシルコバラミンを、アデノシルコバラミンを必要としており老化している対象に投与するステップを含む。
【０１０９】
一態様では、本発明は、老化している対象における筋肉量の維持又は増大のための薬物の製造におけるアデノシルコバラミンの使用を提供する。
【０１１０】
本明細書において記載されるいくつかの実施形態では、アデノシルコバラミンは、筋繊維の大きさを維持又は増大させることにより、筋肉の大きさを維持又は増大する。
【０１１１】
一実施形態では、メチルコバラミンは、筋消耗を実質的に予防又は軽減する。本明細書で使用するとき、「筋消耗」は、「筋萎縮症」と同義であり得るものであり、筋肉量の減少を指すのに使用される。一実施形態では、したがって筋萎縮症の軽減は、筋肉量を維持することと同義であり得る。
【０１１２】
一態様では、本発明は、老化している対象における筋萎縮症を実質的に予防又は軽減するための、メチルコバラミンの使用を提供する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、老化している対象における筋萎縮症を実質的に予防又は軽減するための方法であって、メチルコバラミンを投与する必要のある老化している対象に、メチルコバラミンを投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１１４】
一態様では、本発明は、老化している対象における筋萎縮症を実質的に予防又は軽減するための、薬物の製造におけるメチルコバラミンの使用を提供する。
【０１１５】
一実施形態では、本発明は、老化している対象における、筋肉量を維持又は増大する、並びに筋消耗を実質的に予防又は軽減するのに使用するための、アデノシルコバラミン及びメチルコバラミンの併用を提供する。
【０１１６】
本発明のビタミンＢ１２は、任意の好適な経路により、例えば、経口、経鼻、静脈内、非経口（parentally）、舌下、皮下、経皮、又は筋肉内により対象に投与され得る。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、ビタミンＢ１２を必要としている対象に、ビタミンＢ１２を投与することを含む、サルコペニア又はフレイルの処置方法を提供する。
【０１１８】
更なる態様では、本発明は、
（ａ）老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は増大、
（ｂ）老化している対象における筋消耗の実質的な予防若しくは軽減、並びに／又は
（ｃ）サルコペニア又はフレイルの処置、のための薬剤の製造のための、本明細書において記載されるとおりのビタミンＢ１２の使用、を提供する。
【０１１９】
ビタミンＢ１２欠乏
一実施形態では、対象はビタミンＢ１２欠乏症であり得る。
【０１２０】
米国成人の栄養所要量（ＲＤＡ）は、食物からの平均吸収が約５０％であることに基づき、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより１日当たり２．４μｇに設定された（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０００）；Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｉｎｔａｋｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｉａｍｉｎ，Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ，Ｎｉａｃｉｎ，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ６，Ｆｏｌａｔｅ，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２，Ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ  Ａｃｉｄ，Ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，ｐｐ３０６−５６）。１日所要量は体格に応じて変動することが示された。
【０１２１】
ヒトにおけるビタミンＢ１２欠乏症の見込みは、ビタミンＢ１２の血清中濃度に従って次のように定義することができる。１４８ピコモル／Ｌ未満（２００ピコグラム／ｍＬ未満）は欠乏症のおそれあり、１４８〜２５８ピコモル／Ｌ（２０１〜３５０ピコグラム／ｍＬ）は欠乏症の可能性あり、２５８ピコモル／Ｌより上（３５０ピコグラム／ｍＬより上）は欠乏症の見込みなしであることを示す（ＢＭＪ，Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｈｔｔｐ：／／ｂｅｓｔｐｒａｃｔｉｃｅ．ｂｍｊ．ｃｏｍ／ｂｅｓｔ−ｐｒａｃｔｉｃｅ／ｍｏｎｏｇｒａｐｈ／８２２／ｂａｓｉｃｓ．ｈｔｍｌ）。しかしながら、ビタミンＢ１２レベル並びに活性及び不活性なビタミンＢ１２についての関連合併症を判定する判断基準がないことから、血清ビタミンＢ１２のアッセイは、ビタミンＢ１２欠乏症を診断するために、更なる生化学的アッセイ又は主症状に基づいた臨床的評価と組み合わせることが多い。
【０１２２】
ビタミンＢ１２欠乏症の更なる指標を与えるために実施することができる追加のアッセイは、対象から分離した試料中のホロトランスコバラミン、メチルマロン酸及び／又はホモシステインのレベルを、測定することを含む。
【０１２３】
ホロトランスコバラミンは、ビタミンＢ１２がその生物活性血清輸送トランスコバラミンＩＩに結合したものを指す。ホロトランスコバラミンレベルは、市販のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）を用いて測定することができる。ホロトランスコバラミンレベルが低いことは、潜在性ビタミンＢ１２欠乏症に関連する。
【０１２４】
メチルマロン酸（ＭＭＡ）は、ビタミンＢ１２依存酵素メチルマロニルＣｏＡムターゼの活性低下により蓄積する。したがって、ＭＭＡレベルが高いことは、ビタミンＢ１２欠乏症に関連する。
【０１２５】
ホモシステインは、ビタミンＢ１２依存酵素であるメチオニン合成酵素の活性低下により蓄積する。ホモシステインレベルが低い／高いこと（Low High levels of homocysteine）は、ビタミンＢ１２欠乏症に関連する。しかしながら、ホモシステインレベルのアッセイは、葉酸欠乏症により混乱が生じる可能性がある。
【０１２６】
ビタミンＢ１２は、例えば、錠剤、液体（例えば、経口摂取用、又は点鼻薬若しくは注射における使用）、又は経皮パッチの形態で提供され得る。例えば、ビタミンＢ１２は、そのまま、又はその他の栄養補給剤と組み合わせてのいずれかで、栄養補給剤として利用可能である。
【０１２７】
経口栄養補給は、典型的に、１日当たり２５０μｇ〜１ｍｇのビタミンＢ１２を与えることを伴う。
【０１２８】
本発明は、ビタミンＢ１２産生細菌を含むプロバイオティクス栄養補給剤を、対象に投与することを含み得る。
【０１２９】
プロバイオティクス栄養補給剤は、宿主対象の腸内細菌バランスを改善してビタミンＢ１２摂取を高めることによって、宿主対象に有益な影響を与える任意のプロバイオティクス微生物（複数可）を含むことができる。プロバイオティクス微生物は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はこれらの混合物を含む群から選択され得る。
【０１３０】
腸内細菌叢の天然成分である特定のプロバイオティクス微生物、例えば、デルブリュッキ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などの乳酸産生細菌がビタミンＢ１２を産生することが知られている（Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏ．；１１１（６）；（２０１１））。有利には、プロバイオティクス栄養補給剤は、ｉｎ  ｓｉｔｕでビタミンＢ１２を産生する、腸内にもともと存在する微生物を強化することができる。
【０１３１】
経口ビタミンＢ１２栄養補給は、食品製品又は飲料製品の形態であってよい。食品製品又は飲料製品は、ビタミンＢ１２産生細菌、又はｉｎ  ｓｉｔｕでビタミンＢ１２を産生する、腸内にもともと存在する微生物を強化することができる、他のプロバイオティクスを含む、プロバイオティクス栄養補給剤を含み得る。
【０１３２】
典型的には、医師が個々の対象に最も適切であろう実際の用量を決定し、この用量は特定の患者の年齢、体重及び反応に応じて変動する。用量は、活性ビタミンＢ１２の所要量をもたらすのに十分なものである。
【０１３３】
一態様では、本発明は、本発明のニューレグリン−１（ＮＲＧ１）又はそれらのフラグメントと、ビタミンＢ１２との組み合わせ製剤を提供し、ＮＲＧ１又はそれらのフラグメントと、ビタミンＢ１２とは、対象に対して同時に、組み合わせて、連続的に、又は別個に投与するためのものである。
【０１３４】
「同時に」は、２つの作用物質が並行的に投与されることと理解されるのに対し、用語「併用して（combined）」は、同時ではなく、したがって両方の作用物質を同じ時間枠内で治療的に作用させるよう利用可能なある時間枠内で「連続的」に、２つの作用物質が投与されることを意味するものとして使用される。したがって、「連続」投与では、ある作用物質が投与されてから５分以内、１０分以内、又は対象とする時間内に他の作用物質が投与されてもよく、但し、最初に投与される作用物質の血中半減期は、両方の作用物質が治療的に有効な量で並行的に存在するものである。構成成分の投与間の時間の遅れは、構成成分の実際の性質、かかる成分間の相互作用、並びにそれら各々の半減期によって異なる。
【０１３５】
「併用」又は「連続的」とは異なり、「別個に」とは、ある作用物質と、他の作用物質との投与間の間隔が有意なものであり、すなわち、最初に投与された作用物質は、第２の作用物質が投与される時には治療的に有効な量では血流中にもはや存在しないことを意味するものとして理解される。
【０１３６】
筋機能及び筋肉量
本発明の化合物、組成物、使用及び方法は、老化している対象における筋機能及び／若しくは筋肉量の維持又は改善・増大を提供し得る。
【０１３７】
用語「筋機能」は、対象の生活に悪影響は及ぼさないような様式で筋肉を機能させる能力を指し、筋力、筋収縮、筋持久力、及び／又は筋弾性のパラメーターを包含する。
【０１３８】
筋機能を評価する好適な試験としては、握力計を用いた握力測定、レッグプレス、チェストプレス、又は脚部伸展における１回最大反復測定（one repeat maximum）、歩行速度、６分間歩行検査、ＴＵＧテスト（timeup and go）、簡易身体能力バッテリー、Ｆｒｉｅｄによるフレイル基準、並びに段差を上る時間の測定（stairclimbing time assessments）が挙げられる。
【０１３９】
筋肉量（筋肉の体積、筋肉の厚み、又は筋繊維の大きさと同等であり得る）は、二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＸＡ）試験又は生体インピーダンス試験で測定され得る。同様にして、筋肉の体積の評価にはＭＲＩを使用でき、筋肉の厚み及び羽状角の評価には超音波を使用できる。
【０１４０】
好ましくは、本発明の化合物、組成物、使用、及び方法は、老化している対象における筋肉量の維持又は増大を提供する。
【０１４１】
用語「維持」は、筋機能及び／又は筋肉量などの特定のパラメーターがある程度の期間にわたり（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０年以上）実質的に変化なく保たれることを指す。
【０１４２】
一実施形態では、筋肉量は少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、又は２０％増大する。
【０１４３】
別の実施形態では、筋肉量は１〜２．５％、１〜５％、１〜１０％、又は１〜２０％増大する。
【０１４４】
好ましくは、筋肉は骨格筋である。
【０１４５】
処置方法
本明細書において「処置」についてなされる全ての言及は、治癒的、緩和的、及び予防的処置を含むものの、本発明の文脈においてなされる「予防」についての言及は、より一般的に予防的処置に関連することは認識されるであろう。処置に、疾患の重症度の進行を停止することもまた更に含んでもよい。
【０１４６】
対象
哺乳類、特にヒトの処置が好ましい。しかし、ヒト及び動物の処置の両方が、本発明の範囲内である。
【０１４７】
処置を受ける、老化している対象は、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００歳より高齢のヒトであり得る。獣医学的用途に関しては、動物の齢は、ヒトの場合の状況をもとに、平均寿命を補正に利用して増減される。
【０１４８】
本発明の実施形態では、ＮＲＧ１若しくはそれらのフラグメント又はビタミンＢ１２は、筋機能を維持又は増大させること、並びに／又は筋消耗を実質的に予防若しくは軽減させること、並びに／又はサルコペニア若しくはフレイルを処置することのため、老化している対象に対し薬物として投与され、ここで、かかる対象の筋肉量及び／又は筋機能は低下しており、衰弱及び／又は対象のクオリティ・オブ・ライフへの悪影響が生じている。
【０１４９】
サルコペニア及びフレイル
本発明は、年齢に伴って生じる筋機能及び筋肉量の低下に対処するための手段を提供する。加齢による筋機能の低下及び筋肉量の減少は、全ての個体において必ず生じるものの、その進行は、広範な遺伝的要因並びに例えば身体活動及び栄養摂取などの環境的要因によって異なる。
【０１５０】
サルコペニアに特異的な状態は、加齢による筋肉量及び筋機能の低下により、衰弱及びクオリティ・オブ・ライフへの影響が生じた時点で生じているものと定義される（Ｓａｙｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｇｅ  Ａｇｅｉｎｇ  ４２：１４５−１５０）。対照的に、フレイルは、加齢に伴う筋機能不全についての分類であり、筋肉量ではなく、筋力及び筋機能に基づいている（Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ｄｉｒ．Ａｓｓｏｃ．１４：３９２−３９７）。
【０１５１】
サルコペニア及びフレイルは、神経筋伝達障害、興奮収縮連関の変化、幹細胞枯渇に関連した再生能の低下、筋線維におけるミトコンドリア代謝及びエネルギー代謝の不全、並びに骨格筋の大理石様脂肪化及び線維化などの病態生理学的変化に関連する多因性の症候群である（Ａｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ６０：２９４−３０５）。したがって、これらの症候群の病因論は、複雑であり、また十分に解明されていないが、身体活動の低下、タンパク同化ホルモン（例えば、アンドロゲン及びＩＧＦ−１）のホルモン減少、並びに栄養不良及び／又は栄養失調が重要な役割を果たしている（Ｍｉｔｈａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．２４：１５５５−１５６６）。
【０１５２】
スクリーニング方法
一態様では、本発明は、対象におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）レベルを増大させることのできる作用物質を、スクリーニングするための方法を提供する。かかる方法は、
（ａ）細胞集団を候補となる作用物質と接触させるステップ、
（ｂ）細胞集団におけるＮＲＧ１レベルを測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定したＮＲＧ１レベルを、候補となる作用物質と接触させていない細胞の対照集団におけるＮＲＧ１レベルと比較するステップ、を含む。
【０１５３】
好ましくは、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法である。
【０１５４】
候補となる作用物質は、例えば、医薬品又は栄養補給剤であり得る。好ましくは、候補となる作用物質は栄養補給剤である。
【０１５５】
一実施形態では、候補となる作用物質は、候補となる作用物質のライブラリ中に含まれる。
【０１５６】
一実施形態では、細胞集団は、神経細胞集団（例えば、神経シュワン細胞、特にラットの初代細胞）又は筋肉細胞集団（例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞株及び／又はヒト初代筋芽細胞）である。別の実施形態では、細胞集団は、神経細胞集団及び筋肉細胞集団を合わせたものである。
【０１５７】
用語「ＮＲＧ１レベル」は、試料中に見られるＮＲＧ１タンパク質の量を指す。ＮＲＧ１タンパク質の量は、直接的に又は間接的に測定され得る。ＮＲＧ１を測定する直接法としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法、クロマトグラフ法（例えば、ＨＰＬＣ又はＦＰＬＣ）、マススペクトルベースの方法（例えば、ＬＣ／ＭＳ）及びＮＭＲが挙げられる。ＮＲＧ１を測定する間接法としては、ＮＲＧ１をコードしている核酸、特に、ｍＲＮＡの検出をベースにした、ｑＰＣＲなどの方法が挙げられる。
【０１５８】
ＮＲＧ１レベルに対する、候補となる作用物質の影響は、特定の時間枠にわたって測定を繰り返し実施することにより、時間の関数として評価することもできる。
【０１５９】
候補となる作用物質を、シュワン細胞／運動ニューロンの共培養系において、ミエリン形成に対する効果について（例えば、スクリーニング方法の後続ステップにおける検証として）分析することもできる。
【０１６０】
スクリーニング方法の例としては、次のものが挙げられる。
（ａ）筋肉細胞ベースのスクリーニング（例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞株及び／又はヒト初代筋芽細胞）：細胞を９０％コンフルエントまで増殖させて、最大で１４日間分化誘導する。候補となる作用物質を１〜２日間培地に加えて、ＮＲＧ１発現をｑＰＣＲにより評価する。
（ｂ）神経シュワン細胞ベースのスクリーニング（ラット初代細胞）。細胞を増殖条件下で増殖させ、候補となる作用物質を１〜２日間培地に加える。ＮＲＧ１発現をｑＰＣＲにより評価する。
（ｃ）候補となる作用物質を共培養系（シュワン細胞／運動ニューロン）で試験して、ミエリン形成について評価する。
【０１６１】
候補となる作用物質の例としては、リポ酸、ビタミンＢ１２誘導体、ＨＤＡＣ阻害剤、及び／又は伝統的な漢方薬構成成分が挙げられる。
【０１６２】
診断方法
一態様では、本発明は、
（ａ）対象から分離した生体試料を準備するステップ、
（ｂ）生体試料におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）のレベルを測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定したＮＲＧ１レベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＮＲＧ１レベル又は参照レベルと比較するステップ、を含む、サルコペニア又はフレイルの診断方法を提供する。
【０１６３】
１つ以上の対照試料を、サルコペニア若しくはフレイルを有する、又は有しない対象から分離することができる。したがって、かかる対照試料との比較により、サルコペニア若しくはフレイルを有する、又はサルコペニア若しくはフレイルの状態まで悪化している対象についての指標が提供され得る。
【０１６４】
あるいは又は更に、所定の参照レベルに満たないＮＲＧ１レベルは、対象がサルコペニア又はフレイルを有することを示し得るのに対し、それとは異なる所定の参照レベルより高いＮＲＧ１レベルは、対象がサルコペニア又はフレイルを有しないことを示し得る。
【０１６５】
用語「ＮＲＧ１レベル」は、試料中に見られるＮＲＧ１タンパク質の量を指す。ＮＲＧ１タンパク質の量は、直接的に又は間接的に測定され得る。ＮＲＧ１を測定する直接法としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法、クロマトグラフ法（例えば、ＨＰＬＣ又はＦＰＬＣ）、マススペクトルベースの方法（例えば、ＬＣ／ＭＳ）及びＮＭＲが挙げられる。ＮＲＧ１を測定する間接法としては、ＮＲＧ１をコードしている核酸、特に、ｍＲＮＡの検出をベースにした、ｑＰＣＲなどの方法が挙げられる。
【０１６６】
生体試料は、対象の身体から分離するのに好適な、血液試料（例えば、血漿若しくは血清）又は組織生検（特に、筋肉生検）などの任意の試料であってよい。
【０１６７】
一実施形態では、方法は、本発明のＮＲＧ１又はそれらのフラグメントを、対象に投与する更なるステップを含んでよく、かかる対象は、サルコペニアを有するとして、若しくはサルコペニアを発症するリスクがあるとして、又はフレイルであるとして若しくはフレイルになるリスクがあるとして予め診断されている。
【０１６８】
別の実施形態では、方法は、筋機能及び／若しくは筋肉量を維持又は増大させるための食事療法を適用する更なるステップを含んでよく、かかる対象は、サルコペニアを有するとして若しくはサルコペニアを発症するリスクがあるとして、又はフレイルであるとして若しくはフレイルになるリスクがあるとして予め診断されている。好ましくは、食事療法は、筋肉量を維持又は増大させるためのものである。食事療法の例としては、高タンパク質食及び／又は高炭水化物食が挙げられる。
【０１６９】
別の態様では、本発明は、
（ａ）対象から分離した生体試料を準備するステップ、
（ｂ）生体試料におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）のレベルを測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定したＮＲＧ１レベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＮＲＧ１レベル又は参照レベルと比較するステップ、を含む、年齢に伴う筋機能及び／又は筋肉量の低下を診断する方法を提供する。
【０１７０】
筋機能及び／又は筋肉量の低下は、サルコペニア又はフレイルと関連し得る。
【０１７１】
別の態様では、本発明は、
（ａ）対象から分離した生体試料を準備するステップ、
（ｂ）生体試料におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）のレベルを測定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定したＮＲＧ１レベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＮＲＧ１レベル又は参照レベルと比較するステップ、並びに
（ｄ）筋機能及び／若しくは筋肉量を維持又は増大させるための食事療法を適用する更なるステップ、を含む、食事療法の選択方法を提供し、かかる対象は、サルコペニアを有するとして若しくはサルコペニアを発症するリスクがあるとして、又はフレイルであるとして若しくはフレイルになるリスクがあるとして予め診断されている。
【０１７２】
好ましくは、食事療法は、筋肉量を維持又は増大させるためのものである。食事療法の例としては、高タンパク質食及び／又は高炭水化物食、並びにビタミンＢ１２栄養補給剤及び／又はビタミンＤ栄養補給剤が挙げられる。
【０１７３】
対照試料は、同じ対象に由来する、より早い時点で採取されたものであってよい。同様にして、参照レベルは、同じ対象に対してそれまでに実施された分析に基づき決定され得る。したがって、別の態様では、本発明は、
（ａ）対象から分離した生体試料を準備するステップ、
（ｂ）生体試料におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）のレベルを測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定したＮＲＧ１レベルを、より早い時点で同じ対象から採取された試料から測定されたＮＲＧ１レベルと比較するステップ、を含む、対象におけるサルコペニア又はフレイルの進行を判定する方法を提供する。
【０１７４】
食事療法及び食事製品
用語「食事療法」は、対象に与えられ、対象の食生活に変化をもたらす、外部因子を指す。一実施形態では、食事療法は、高カロリー食である。別の実施形態では、食事療法は、高タンパク質食及び／又は高炭水化物食である。別の実施形態では、食事療法は、ビタミン及びミネラル、特にビタミンＢ１２及び／又はビタミンＤが栄養補給された、規定食である。
【０１７５】
好ましい実施形態では、食事療法は、ビタミンＢ１２、特にアデノシルコバラミン及び／又はメチルコバラミンが栄養補給された、規定食である。
【０１７６】
別の好ましい実施形態では、食事療法は、ビタミンＢ１２、特にメチルコバラミン及び／又はアデノシルコバラミンへと変換され得るヒドロキソコバラミン及び／又はシアノコバラミンが栄養補給された、規定食である。
【０１７７】
規定食は、対象の初期体重に合わせて調整したものであってよい。
【０１７８】
食事療法には、少なくとも１つのダイエット製品の投与が含まれていてもよい。ダイエット製品は、食事代替製品又は栄養補給製品（例えば被検者の食欲を増強可能）であってもよい。ダイエット製品は、食品製品、飲料、ペットフード製品、食品栄養補給剤、機能性食品、食品添加物、又は栄養配合物を含み得る。経口栄養補給剤の例としては、Ｎｅｓｔｌｅ製品のブースト及びＭｅｒｉｔｅｎｅが挙げられる。
【０１７９】
多様体、誘導体、類似物、相同体、及びフラグメント
本明細書において言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加え、本発明は、それらの多様体、誘導体、類似物、相同体、及びそれらのフラグメントの使用を包含する。
【０１８０】
本発明の文脈において、いずれかの所与の配列の多様体は、対象とするポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能が実質的に保持されるような方法で、特定の配列残基（アミノ酸残基又は核酸残基のいずれか）が改変されている配列である。多様体配列は、天然に生じるタンパク質中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、改変、置き換え、及び／又は多様体化により得ることができる。
【０１８１】
本明細書で使用するとき、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関し、用語「誘導体」は、得られるタンパク質又はポリペプチドが、その内在的な機能のうちの少なくとも１つを実質的に保有することを条件として、配列からの、又はかかる配列に対しての、１つ（以上の）アミノ酸残基の任意の置換、多様体化、改変、置き換え、欠失、及び／又は付加を含む。
【０１８２】
本明細書で使用するとき、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関し、用語「類似物」は、任意の模倣物を含み、すなわち、模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内在的な機能のうちの少なくとも１つを保有する化学的な化合物を含む。
【０１８３】
典型的には、改変された配列が求められる活性又は性能を実質的に保有するという条件で、アミノ酸置換、例えば、１、２、又は３〜１０個又は２０個の置換がなされ得る。アミノ酸置換は、非天然に生じる類似物の使用を含み得る。
【０１８４】
本発明で使用されるタンパク質は、サイレントな変化をもたらし、結果として機能的に等価なタンパク質が得られる、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も含み得る。内在的な機能が保有されるという条件で、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性をもとに、計画的なアミノ酸置換がなされ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に帯電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられ、並びに帯電しておらず同様の親水性値をもつ極性頭部を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、及びチロシンが挙げられる。
【０１８５】
保存的置換は、例えば、下表によりなされ得る。第２欄の同じブロックにおけるアミノ酸、及び好ましくは第３欄の同じ行内にあるアミノ酸は、互いに置換され得る。
【表１】
2019501169.tif 000003
【０１８６】
本明細書で使用するとき、用語「相同体」は、野生型アミノ酸配列及び野生型核酸配列に対しある程度の相同性を有する対象物を意味する。用語「相同性」は、「同一性」と同一視し得る。
【０１８７】
相同配列は、対象とする配列に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５％、又は９７％、又は９９％同一であり得る、アミノ酸配列を含む。典型的には、相同体は、対象とするアミノ酸配列と同じ活性部位等を含み得る。相同性は、類似性の点で考慮することもできるものの（すなわち、同様の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈において、相同性は、配列同一性の観点で表現されることが好ましい。
【０１８８】
相同配列は、対象とする配列に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５％、又は９７％、又は９９％同一であり得る、核酸配列を含む。相同性は、類似性の点で考慮することもできるものの、本発明の文脈において、相同性は、配列同一性の観点で表現されることが好ましい。
【０１８９】
好ましくは、本明細書に記載の配列番号のうちのいずれか１つに対しある程度の同一性（％）を有する配列についての言及は、参照する配列番号の全長に対し記載の同一性（％）を有する配列を指すものである。
【０１９０】
相同性比較は、目で行うこともでき、又はより一般的には、容易に利用できる配列比較プログラムを使用して実施できる。これらの市販のコンピュータプログラムにより、２つ以上の配列間の相同性又は同一性のパーセンテージを計算することができる。
【０１９１】
相同性パーセンテージは、連続的な配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインメントし、一方の配列中のそれぞれのアミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれている。典型的には、こうしたギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
【０１９２】
これは、極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、ヌクレオチド配列中の１つの挿入又は欠失により、それ以外の点では同一の配列ペアにおいて、後続するコドンがアラインメントから外れる場合があることを考慮していないため、グローバルアラインメントを実施する場合には、相同性パーセントが大幅に低下する可能性がある。そのため、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティを適用することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れた最適アラインメントを生成するように設計されている。これは、局所相同性を最大にするように、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１９３】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸に対して、２つの比較配列間の関係性がより高いことを反映している可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有する配列アラインメントよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てている。典型的に、ギャップの存在には比較的高いコストを課し、ギャップ中の後続するそれぞれの残基には小さなペナルティを課す、「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。当然のことながら、高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適化アラインメントを生成する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップについては−１２であり、各伸長については−４である。
【０１９４】
したがって、最大相同性パーセンテージの算出には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの生成が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートの比較ツールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとは２つともオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書７−５８〜７−６０頁参照）。しかしながら、いくつかの用途については、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称する別のツールもまた、タンパク質とヌクレオチド配列との比較に使用できる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７：１８７−８参照）。
【０１９５】
最終的な相同性（％）を同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセスそのものは、典型的には、イエスかノーかのペア比較に基づいていない。むしろ、化学的類似性又は進化距離に基づいて、各々のペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケール化類似性スコア行列が通常使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、パブリックデフォルト値か、又は提供される場合はカスタムシンボル比較表かのいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアル参照）。いくつかの用途については、ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値を用いるか、他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用するのが好ましい。
【０１９６】
ソフトウェアにより最適アラインメントが生成されたら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することができる。典型的に、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを行い、数値による結果を生成する。
【０１９７】
ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の「フラグメント」も多様体であり、かかる用語は、典型的には、機能的に又は例えばアッセイにおいてのいずれかで対象とされる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドについて選択された領域を指す。したがって「フラグメント」は、完全長のポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸配列又は核酸配列を指す。
【０１９８】
このような多様体は、部位特異的変異導入などの標準的な組換ＤＮＡ法を用い調製され得る。挿入がなされる場合、挿入部位のいずれかの側の天然に生じる配列に相当する５’及び３’隣接領域と合わせて挿入部位をコードしている、合成ＤＮＡが作製され得る。隣接領域は、適切な酵素（複数可）により配列が切断されて、合成ＤＮＡが切断部分にライゲートされ得るよう、天然に生じる配列中の部位に相当する好便な制限部位を含有し得る。次に、このＤＮＡを本発明により発現させて、コードされているタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作について当該技術分野で既知の数多くの標準法について単に例示するものであり、その他の既知の手法も使用され得る。
【実施例】
【０１９９】
実施例１
材料及び方法
ラットにおける齢によるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の血中濃度の変動。
スローオフレートＤＮＡアプタマー検出（Ｇｏｌｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５：ｅ１５００４）を用い、８ヶ月齢、１８ヶ月齢、又は２４ヶ月齢のラット由来の血清中、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１、特に、ＮＲＧ１βＥＧＦドメイン）のレベルを、測定した。１群当たり１０匹のラットを分析した。
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経筋接合部に対するニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の効果
神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（２．５μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾール（５μＭ）を使用した。Ａｂにより誘導されるダメージに対するニューレグリン−１（ＮＲＧ１、図２に示す通り様々な濃度）の効果は、神経筋接合部（ＮＭＪ）の大きさを測定することにより評価した。１群につき６ウェルを解析し、対照条件と比較した。未損傷の対照条件は、Ａｂ処理を行わない場合の神経筋接合部の大きさとする。その他の全ての条件を、ダメージを受けた神経筋接合部の大きさについての参照値を表すＡｂ処理のみの場合と比較する。
【０２０１】
年齢により誘導される骨格筋萎縮症に対するニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の効果
１６ヶ月齢のプレサルコペニアラットを、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１、ＲｅｐｒｏｋｉｎｅのＮＲＧ１  βＥＧＦドメイン（カタログ番号ＲＫＱ０２２９７））又は生理食塩水のいずれかで５ヶ月間処理した。ＮＲＧ１を１μｇ／ｋｇ（体重）で１週間当たり３回皮下注射した。次に、後肢の骨格筋量を評価し、生理食塩水の対照を注射した成体健常ラット群（実験開始時に８ヶ月齢）と比較した。次に、後肢骨格筋量を評価し、成体健常ラット群と比較した。
【０２０２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経筋接合部に対するビタミンＢ１２の効果
神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（２．５μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾール（５μＭ）を使用した。Ａｂにより誘導される損傷に対するメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ、１又は１００ｎＭ）及びアデノシルコバラミン（ＡｄｅｎｏＣｂｌ、１又は１００ｎＭ）の効果を、神経筋接合部（ＮＭＪ）の数及び大きさ、並びに神経突起ネットワークを測定することにより評価した。１群につき６ウェルを解析し、対照条件（ＣＴＬ）と比較した。未損傷の対照条件は、Ａｂ処理を行わない場合の神経筋接合部の大きさとする。その他の全ての条件を、ダメージを受けた神経筋接合部の大きさについての参照値を表すＡｂ処理のみの場合と比較する。
【０２０３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける骨格筋に対するビタミンＢ１２の効果
１６ヶ月齢のプレサルコペニアラットを、アデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ，Ｃ０８８４，Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ）、メチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ，Ｍ９７５６，Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ）、又は生理食塩水のいずれかで５ヶ月間処理した。ＡｄｏＣｂｌ及びＭｅＣｂｌを１μｇ／ｋｇ（体重）で１週間当たり３回皮下注射した。次に、前脛骨筋（ＴＡ）を切り出し、更なる解析のため凍結した。組織学的検査のため、ＴＡを１０μｍで凍結切片化し、ラミニンで染色して（Ｌ９３９３，Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ）筋繊維を観察可能な状態にした。その後、１、２Ａ、及び２Ｂ型の特有の筋繊維型を適切な抗体（クローンＢＡＤ５、ＢＦＦ３、及びＳＣ７１、それぞれＤＳＨＢより）により免疫標識した。スライドスキャナ（ＶＳ−１２０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して画像を取得し、ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ｊｏｕｒｎａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＵＳＡ））を用い解析した。老齢ラット由来の画像を、生理食塩水の対照を注射した成体健常ラット群（実験開始時に８ヶ月齢）と比較した。遺伝子発現の解析のため、製造元の指示どおりにｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを抽出し、標準感度のＲＮＡ解析キットをＦｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で使用して、ＲＮＡの品質を確認した。次に、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｔ７法に基づく標準的なアフィメトリクスプロトコルにより、試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｒａｔ２３０ＰＭ９６−Ａｒｒａｙに結合させた。ＬＩＭＭＡを使用して、統計解析を実施し、ＧＳＥＡに利用して、老齢対照ラットと成体ラットとの比較、並びにＡｄｏＣｂｌ又はＭｅＣｂｌのいずれかで処理した老齢ラットと老齢対照ラットとの比較を行った。
【０２０４】
筋萎縮症からの保護に対するビタミンＢ１２の効果
ＨＳＭＭヒト筋芽細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させて、成熟筋管へと分化誘導した。４０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦａと共に４日間インキュベートし、筋管萎縮を誘導した。ＴＮＦａと共にＭｅＣｂｌ（１ｎＭ）及びＡｄｏＣｂｌ（１ｎＭ）をインキュベートして、誘導される筋萎縮症に対するそれらの効果を試験した。筋萎縮の予防についての陽性対照として１５ｎＭのＩＧＦ１を使用する。４日間の処理後、核とミオシン重鎖とについて細胞を染色し、筋管内部の核の割合（すなわち、融合指数）を定量した。
【０２０５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経筋接合部に対するニューレグリン−１（ＮＲＧ１）及びビタミンＢ１２の効果。
神経と筋肉との共培養物を、神経筋接合部が成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた。β−アミロイド（Ａｂ）を用いるインキュベーション（１０μＭ）によりダメージを誘導し、Ａｂにより誘導されるダメージからの神経筋接合部の保護についての陽性対照としてはリルゾール（５μＭ）を使用した。Ａｂにより誘導されるダメージに対するニューレグリン−１（ＮＲＧ１、３０ｎＭ）及び／又はアデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ、１ｎＭ）の効果は、神経筋接合部（ＮＭＪ）の大きさ又は数を測定することにより評価した。１群につき６ウェルを解析し、Ａｂにより誘導されるダメージなしの対照条件（ＣＴＬ）と比較した。
【０２０６】
結果
８ヶ月齢、１８ヶ月齢、又は２４ヶ月齢のラット由来の血清に対しアプタマーベースのスクリーニング（Somalogic）を用い、本発明者らは、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）血中濃度が年齢と共に低下することを発見した（図１）。この低下は、サルコペニアの進行に付随して生じる。
【０２０７】
ニューレグリン−１が、神経レベル及び神経筋接合部レベルのいずれにおいても主要な役割を果たすことを考慮し、本発明者らは、次に、ニューレグリン−１が老化中に生じるダメージから神経筋接合部を保護できるかを調査することにした。この目的のため、本発明者らは、神経筋接合部の形成及び維持を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏでの共培養モデルを用い、ｂ−アミロイドとのインキュベートによりダメージを誘導した。
【０２０８】
図２に示すとおり、ニューレグリン−１は、３０ｎＭの投与で神経筋系をダメージから保護することができた。これらの結果をまとめると、神経筋系の維持にはニューレグリン−１が効果的であり、かつ年齢に伴うこのタンパク質の減少は、サルコペニアの進行と関連付けられ得ることが示唆される。
【０２０９】
ニューレグリン−１による処理がサルコペニアの表現型から回復させ得るか試験するため、本発明者らは、プレサルコペニアラットをニューレグリン−１で５ヶ月間処理し、かかるラットの骨格筋量を、対照として生理食塩水で処理した成体ラット及びプレサルコペニアラットと比較して評価した。
【０２１０】
図３に示すとおり、本発明者らは、ニューレグリン−１で処理したラット由来の後肢の筋肉では、対照と比較して有意に筋肉量が増加していたことを観察した。この増加は、ニューレグリン−１が、年齢により誘導される骨格筋萎縮症を予防していることを示す。
【０２１１】
これに合わせて、本発明者らの結果により、ニューレグリン−１が、加齢による機能障害から神経筋系を保護し、したがってサルコペニアの予防に使用され得ることが示唆される。
【０２１２】
ニューロン及び神経系に対するビタミンＢ１２の作用についてのこれまでの報告を受け、本発明者らは、２とおりの活性型ビタミンＢ１２（メチルコバラミン及びアデノシルコバラミン）の効果についても試験した。メチルコバラミンでは不能であったが、アデノシルコバラミンは、試験したいずれの投与量でも系を保護することができた（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。
【０２１３】
興味深いことに、系をより強いダメージにさらした場合（より高濃度のβ−アミロイド下でより長時間インキュベート）、ニューレグリン−１又はアデノシルコバラミンのいずれもが、単独では系を回復できなかったものの、併用処理（co−treatment）により、弱い保護を提供したことから、これら２つの化合物は相乗効果を有し得ることが示唆された（図５Ａ、５Ｂ）。
【０２１４】
図６Ａ、６Ｂに示すとおり、メチルコバラミンでは不能であったが、アデノシルコバラミンは、高齢ラットにおける筋繊維の大きさの増大を誘導することもできた。
【０２１５】
対照的に、メチルコバラミンは、筋萎縮症を予防することができた（図７）。
【０２１６】
この効果の違いは、アデノシルコバラミン及びメチルコバラミンが骨格筋において回復する、加齢による遺伝子発現特性が異なっていることにより生じ得る（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）。
【０２１７】
上記明細書で言及した全ての出版物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明に記載の化合物、組成物、使用及び方法の様々な修正及び変更が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかとなるであろう。本発明を特定の好適な実施形態とともに記載したが、請求される本発明は、こうした特定の実施形態に過度に限定されるべきではないということは理解すべきである。事実、記載された本発明を実施するための様態の様々な修正は、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2019501169.tif 000004
【図２】
2019501169.tif 000005
【図３】
2019501169.tif 000006
【図４Ａ】
2019501169.tif 000007
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019501169.tif 000011
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2019501169.tif 000013
【図７】
2019501169.tif 000014
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
2019501169000001.app
【国際調査報告】
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