【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年8月20日(2007.8.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】        明細書
【発明の名称】    予防及び治療方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】  対象において粘膜抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）耐性を誘導する方法であって、該粘膜抗原を選択する工程、又はＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープの機能を発揮できないように粘膜抗原を改変する工程、及び次いで該粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を阻止若しくは低減させるのに十分な時間及び条件の下で該選択され若しくは改変された抗原を投与する工程を含む方法。
【請求項２】  該粘膜抗原が粘膜自己抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項３】  該粘膜抗原がペプチド又はポリペプチドとして投与されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】  該粘膜抗原が該粘膜抗原をコードするＤＮＡとして投与されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】  該粘膜抗原又は該粘膜抗原をコードするＤＮＡが粘膜表面に投与されるものである、請求項２又は請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】  投与が口、鼻、咽頭及び／又は気管支管の経路の一つ以上を経るものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】  投与がエーロゾル投与を経るものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】  対象における自己免疫疾患の状態を防止し、低減し、または緩和する方法であって、細胞により媒介される自己免疫の病状から護る免疫調節機構を誘導若しくは刺激するのに十分な時間及び条件の下で該自己免疫疾患と関連する抗原の有効量を該対象にエーロゾル投与する工程を含み、該抗原がＭＨＣクラスＩの相互作用領域を実質的に欠失しているものである方法。
【請求項９】  該対象がヒトである、請求項１又は請求項８記載の方法。
【請求項１０】  該ＭＨＣクラスＩエピトープがＭＨＣクラスＩ（Ｋd ) に限定されるエピトープである、請求項１又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  該抗原がインスリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）、徐々に進行するＩＤＤＭ（ＳＰＩＤＤＭ）及び／又は妊娠中の糖尿病に関連するものである、請求項１又は請求項８又は請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】  ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止または遅延させる工程と組合わせた、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】  対象におけるＩＤＤＭ、ＳＰＩＤＤＭ又は妊娠中の糖尿病を防止、低減、または緩和する方法であって、調節性Ｔ細胞を誘導するのに及び／又はＩＤＤＭと関連する細胞媒介性の自己免疫病状を抑制するのに十分な他の適切な機構を誘導するのに十分な時間及び条件の下で、ＩＤＤＭと関連する自己抗原の有効量を該対象にエーロゾルとして若しくは他の機能的に同等な手段により投与する工程を含み、該自己抗原が機能性のＭＨＣクラスＩの相互作用エピトープを実質的に欠失しているものである方法。
【請求項１４】  該対象がヒトである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】  該ＭＨＣクラスＩエピトープがＭＨＣクラスＩ（Ｋd ）に限定されるエピトープである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】  該調節性Ｔ細胞がＣＤ８Ｔ細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】  該ＣＤ８Ｔ細胞がＣＤ８γδＴ細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】  該調節性Ｔ細胞がＣＤ４Ｔ細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】  該ＣＤ４Ｔ細胞がＣＤ４αβＴ細胞である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】  該エーロゾル投与がスプレー、液の滴下、又は蒸気を経るものである、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】  該抗原がプレプロインスリン又はプロインスリン又はそれらの断片である、請求項１３〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】  該抗原がインスリン又はその断片である、請求項１３〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】  該抗原がプロインスリンペプチド２４〜３６である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】  ＣＴＬの誘導及び／若しくは成熟を阻止または遅延させる工程と組合わせた、請求項１３〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】  対象におけるＩＤＤＭを誘導し、抑制し、または緩和し若しくは防止する方法であって、ＣＴＬ耐性を防止、低減、または誘導するのに十分な時間及び条件の下で、ＭＨＣクラスＩに限定された任意のエピトープの機能を発揮できないようにそのＣ末端で抗原の先端を切断されたプロインスリンぺプチドを投与する工程を含む方法。
【請求項２６】  該対象がヒトである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】  該プロインスリンペプチドがヒト、ネズミ又はブタ起源のものである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】  該プロインスリンペプチドがヒト起源のものである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】  該プロインスリンがエーロゾルを経て投与されるものである、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】  該エーロゾル投与がスプレー、液の滴下、又は蒸気を経るものである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】  該プロインスリンが約１〜約２０リットル／分の速度で投与されるものである、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】  該プロインスリンがアジュバント内で投与されるものである、請求項２９又は請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
該アジュバントがコレラ毒素１３、大腸菌の熱不安定毒素、サポニカ若しくはその誘導体、クィルＡ抽出物、ＤＥＡＥ−デキストラン、硫酸デキストラン及びアルミニウム塩から選択されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】  アジュバントがサイトカイン、ムラミル−ジぺプチド又は細胞壁成分である、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】  ＣＴＬの誘導及び／若しくは成熟を阻止または遅延させる工程と組合わせた、請求項２５〜請求項３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】  粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を防止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を投与する工程を含み、それと同時若しくはその後にＣＴＬの誘導及び／又は成熟のアンタゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項３７】  該アンタゴニストがＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌの相互作用のアンタゴニストである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】  該アンタゴニストが抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】  該対象がヒトである、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】  該プロインスリンペプチドがヒト、ネズミ又はブタ起源のものである、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】  該プロインスリンペプチドがヒト起源のものである、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】  該プロインスリンがエーロゾルを経て投与されるものである、請求項３６記載の方法。
【請求項４３】  該エーロゾル投与がスプレー、液の滴下、又は蒸気を経るものである、請求項３６記載の方法。
【請求項４４】  粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止または遅延させるのに十分な時間及び条件の下で、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用のアンタゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項４５】  該アンタゴニストが抗ＣＤ４０抗体である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】  ＩＤＤＭ又はＳＰＩＤＤＭの治療又は予防のための物質であって、機能性のＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープを欠失するよう改変されているプロインスリン又はインスリンを含む物質。
【請求項４７】  ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻害する物質を更に含む、請求項４６記載の物質。
【請求項４８】  ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用を阻害する、請求項４７記載の物質。
【請求項４９】  抗ＣＤ４０Ｌ抗体である、請求項４７記載の物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に自己免疫疾患状態の予防及び治療方法並びにそのために有用な物質に関する。関連する一つの実施態様において、本発明は、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により媒介される自己免疫疾患の起こり易さ若しくはその危険を防止し又は少なくとも低減させるために、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止または遅延させることができる粘膜抗原及び／又は物質の使用を意図する。より具体的には、本発明は自己免疫病理と関連する症状から護るため又は該症状を緩和させるための粘膜により媒介される耐性を意図する。さらに一層具体的には本発明は、ＩＤＤＭ関連の自己抗原を粘膜表面にエーロゾル投与により又はＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止する物質により、臨床的インスリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）を防止する方法又は臨床的ＩＤＤＭの効果を防止若しくは低減若しくは緩和する方法を提供する。
【０００２】
発明の背景
本明細書におけるいかなる先行技術への言及も、この先行技術がオーストラリア国又は他の国で一般常識の一部となっているとの認識又は如何なる意味での示唆でもなく、そしてそう解釈すべきでもない。
【０００３】
本明細書で数値により言及した刊行物の書誌的詳細は明細書の末尾に収録してある。
【０００４】
免疫系一般そしてとりわけ細胞の免疫機構についての知識の増加により、治療薬の設計及びその投与の代替的経路が大きく促進されつつある。研究の一つの重要な領域は、自己免疫疾患状態における特定抗原により誘導される細胞免疫低応答性を支配する機構である。
【０００５】
自己抗原は、その投与が自己免疫疾患の通常の履歴を改変するときは病原性であると考えることができる。免疫耐性誘導のための自己抗原に特異的な戦術がゲッ歯類における実験的自己免疫疾患の通常の履歴を有利に改変することが示された（１〜６）。古典的な経口投与による可溶性タンパク質抗原の粘膜表面への提示は抗原特異的なＴ細胞により媒介される遅延型の過剰感作（ＤＴＨ）及びＩｇＥ応答の選択的抑制を結果として生ずる（１，７，８）。「経口耐性」はＴ細胞（Ｔｈ１）応答から抗体（Ｔｈ２）応答までの免疫の分化と、調節Ｔ細胞の誘導と、そして高抗原用量でＴ細胞アネルギー及びＴ細胞欠失の両方と関連させられてきた（１，９）。
【０００６】
特に衰弱している自己免疫状態は、自己免疫炎症性「インスリン炎」病巣内の、膵臓の島におけるインスリン生産性β細胞の選択的破壊から生ずるインスリン依存性の真正糖尿病（ＩＤＤＭ）である（１０，１１）。β細胞破壊を媒介する際の自己反応性Ｔ細胞の第一の役割は二つのＩＤＤＭの自然発生動物モデル、即ちバイオ−ブリーディング（ＢＢ）ラット（１２）と非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス（２）で直接示された。β細胞への免疫反応の引金となり又はそれを駆動する標的自己抗原は診断的適用を有するだけでなく特異的免疫治療のための薬物候補でもある（３〜６）。病原性を持つと思われる幾つかの島／β細胞自己抗原が、ゲッ歯類で還流する抗体又はＴ細胞との反応性により、そしてヒトで準臨床的若しくは臨床的ＩＤＤＭ、とりわけインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）及びＩＡ−２クラスのチロシンホスファターゼとの反応性により同定されてきた（１３）。しかしながら、インスリン及びその前駆体であるプリ−プロインスリンはβ細胞特異的な唯一のＩＤＤＭ自己抗原である。
【０００７】
ヒトでは、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）は臨床的ＩＤＤＭの発症の危険マーカーであり（１４）、そして糖尿病の母親の子孫における他の島抗原に対する自己抗体の前に検出された（１５）。準臨床ＩＤＤＭ対象及び最近診断されたＩＤＤＭ対象の半数までに、ヒトインスリンへの末梢血Ｔ細胞の増殖の増加が証明できる（１６）が、応答は比較的低い。これはおそらく優勢なヒトＴ細胞エピトープがプロインスリン中にあるからである。インスリンのＢ鎖とプロインスリン中の連結（Ｃ）ぺプチドの間の天然の開裂部位にまたがるぺプチドがＩＤＤＭの危険性のある親類の大部分でＴ細胞の増殖を誘導すると報告された（１７）。ＮＯＤマウスでは、ＩＡＡは糖尿病の発症の危険マーカーであると報告されており（１８）、そしてインスリン炎病巣から生じたＴ細胞クローンの大部分はインスリンＢ鎖、アミノ酸９〜２３と反応した（１９）。
【０００８】
幾つかの研究がＮＯＤマウスモデルにおいて粘膜により媒介されるインスリンへの耐性を評価した。例えば、ザングら（２０）はブタインスリンの経口投与（１ｍｇ週２回）が糖尿病の発症を遅延させそしてその発症率を低下させること、そして糖尿病マウス由来の脾臓細胞により若い非糖尿病マウスへの糖尿病の移転を部分的に阻止する脾臓Ｔ細胞と関連があることを見出した。続いてベルゲロットら（２１）は経口インスリンによる誘導された調節細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞であったことを報告した。しかしながら、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のルイスラットモデルにおけるモルモットのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する経口耐性の初期の研究（１）では、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを分泌し且つＣＤ４及びＣＤ８の両方を調節するＴ細胞が記述された。
【０００９】
細胞により媒介される自己免疫状態の抑制を誘導するための抗原の送達のための有効な投与戦術を開発する必要がある。この投与戦術は免疫学的に効果的でなければならないだけでなく、便利で直接的で且つ安全でなければならない。本発明に至る研究において、本発明者らは自然発生ＩＤＤＭの動物モデルである非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスで、インスリン及びその前駆体（プロインスリン）のエーロゾル吸入及び鼻孔内投与を研究し、これが膵臓島病状及び糖尿病の発症率を低減させるのに有効であることを明らかにした。さらに、エーロゾルインスリンは糖尿病の防止に寄与する調節的ＣＤ８γδＴ細胞を誘導した。代わりの戦術として、又は前述の方法と組み合わせて使用できる戦術として、本発明は、例えば、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の間の相互作用を阻止することによりＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止または遅延させる方法をさらに提供する。
【００１０】
発明の概要
本明細書を通じ、文脈が他の意を要求しない限り、「含む（comprise) 」という用語、又は「含む（comprises)」又は「含む(comprising)」などのその変形は、述べられた要素若しくは整数又は要素群若しくは整数群を含むことを意味するが、如何なる他の要素若しくは整数又は要素群若しくは整数群を排除するものではないことを意味すると理解すべきである。
【００１１】
本発明の一つの側面は、粘膜抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）耐性を含む免疫耐性を誘導する方法を意図する。この方法は該粘膜抗原を選択する工程、又はＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープの機能を発揮できないように粘膜抗原を改変する工程、及び次いで該粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を阻止又は低減させるのに十分な時間及び条件の下で該選択され又は改変された抗原を投与する工程を含む。
【００１２】
本発明の別の一側面は、実質的に粘膜自己抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を回避しながら細胞により媒介される自己免疫疾患を抑制する方法を意図する。この方法は該自己抗原を選択する工程、又はＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープの機能を発揮できないように粘膜自己抗原を改変する工程、及び次いで該自己抗原に対する耐性を誘導するが該抗原に対するＣＴＬ免疫を阻止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で該選択され又は改変された自己抗原を投与する工程を含む。
【００１３】
本発明のさらなる一側面は、対象における細胞により媒介される自己免疫疾患を抑制する方法であって、自己免疫の病状を防止し、低減し、または緩和するのに十分な時間及び条件の下で該自己免疫疾患と関連する抗原の有効量をエーロゾルとして投与する工程を含み、該抗原が機能性のＭＨＣクラスＩの相互作用領域を実質的に欠失しているものである方法を意図する。      【００１４】
本発明のさらに別の一側面は、対象における自己免疫疾患状態を防止し、低減し、または緩和する方法であって、細胞により媒介される自己免疫の病状から護る免疫調節機構を誘導若しくは刺激するのに十分な時間及び条件の下で該自己免疫疾患と関連する抗原の有効量を該対象にエーロゾルとして投与する工程を含み、該抗原がＭＨＣクラスＩの相互作用領域を実質的に欠失しているものである方法を提供する。      
【００１５】
本発明のなお一層別の一側面は、対象におけるＩＤＤＭ、徐々に進行する（ＳＰ）ＩＤＤＭ若しくは妊娠中のタイプＩ糖尿病を防止、低減、または緩和する方法であって、調節的Ｔ細胞を誘導するのに及び／又はＩＤＤＭと関連する細胞媒介性の自己免疫病状を抑制するために十分な他の適切な機構を誘導するのに十分な時間及び条件の下で、ＩＤＤＭと関連する自己抗原の有効量を該対象にエーロゾルとして若しくは他の機能的に同等な手段により投与する工程を含み、該自己抗原が機能性のＭＨＣクラスＩの相互作用エピトープを実質的に欠失しているものである方法を意図する。      
【００１６】
本発明のさらに別の一側面は、対象におけるＩＤＤＭを誘導し、抑制し、または緩和し若しくは防止する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止若しくは低減するのに、あるいはＣＴＬ耐性を含む免疫耐性を誘導するのに十分な時間及び条件の下で、ＭＨＣクラスＩに限定された任意のエピトープの機能を発揮できないようにそのＣ末端で先端を切断されたプロインスリンぺプチド抗原を投与する工程を含む方法を意図する。
【００１７】
本発明のさらに別の一側面は、一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤を含むエーロゾル製剤中に自己免疫疾患と関連する抗原を含む組成物を提供する。
【００１８】
本発明の別の一側面は、粘膜抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を実質的に回避しながらＣＴＬ耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫の誘導を阻止若しくは低減するのに十分な時間及び条件の下で、機能性のＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープを実質的に欠失している該粘膜抗原をコードする核酸分子若しくはその類縁物質を対象に投与する工程を含む方法を意図する。
【００１９】
本発明のさらなる側面はＣＴＬ免疫を実質的に回避しながらＩＤＤＭを防止又は抑制する方法であって、ＩＤＤＭの効果を防止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で機能性のＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープを実質的に欠失するＩＤＤＭ関連粘膜抗原をコードする核酸分子又はその類縁物質を対象に投与する工程を含む方法を意図する。
【００２０】
本発明の別の一側面は、従って、該抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら粘膜抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を投与し、その前、同時若しくは後にＣＴＬの誘導及び／又は成熟のアンタゴニストを投与する工程を含む方法を意図する。
【００２１】
より具体的には、本発明は、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を投与し、その前、同時若しくは後にＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４相互作用のアンタゴニストを投与する工程を含む方法を意図する。
【００２２】
本発明のさらに別の一側面は、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ誘導及び／又は成熟を阻止または遅延させるのに十分な時間及び条件の下である物質を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２３】
より具体的には、本発明は粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ誘導及び／又は成熟を阻止し、または遅延させるのに十分な時間及び条件の下である物質を投与する工程を含み、該物質がＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻止または破壊するものである方法を提供する。
【００２４】
本発明の別の一側面は、対象における疾患状態の治療又は予防のための医薬の製造における、不活性なＭＨＣクラスＩエピトープを持つ粘膜抗原の使用を意図する。
【００２５】
本発明のさらに別の一側面は、疾患状態の治療又は予防のための医薬の製造における、ＣＴＬ誘導及び／又は成熟を阻止できる物質の使用を意図する。
【００２６】
本発明は、上に意図した方法のいずれかの組合せにおける使用をさらに提供する。
【００２７】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明はインスリン又はその前駆体が免疫耐性を誘導するために使用されうるという驚くべき発見に基づいている。
【００２８】
従って、本発明の一つの側面は、対象における粘膜抗原に対する応答としてのＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら免疫耐性を誘導する方法であって、該粘膜抗原を選択する工程又はＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープの機能を発揮できないように粘膜抗原を改変する工程、及び次いで該粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を阻止若しくは低減するのに十分な時間及び条件の下で該選択され又は改変された抗原を投与する工程を含む方法を意図する。      
【００２９】
一般に、粘膜抗原はＣＴＬにより媒介される糖尿病そして取り分けＩＤＤＭなどの、これらに限定されるわけではないが、自己免疫疾患を防止するために用いられる。      
【００３０】
従って、本発明の別の一側面は、粘膜自己抗原への応答として生ずるＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら細胞により媒介される自己免疫疾患を抑制する方法であって、自己抗原を選択する工程又はＭＨＣクラスＩに限定されるエピトープの機能を発揮できないように該粘膜自己抗原を改変する工程、及び次に該選択され又は改変された自己抗原を、該自己抗原に対する耐性を誘導するが該自己抗原に対するＣＴＬ免疫を阻止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、投与する工程を含む方法を意図する。      
【００３１】
この自己抗原の投与はＤＮＡ又はポリペプチド／ぺプチドの送達によるものでも、任意の適当な手段によるものでもよいが、好ましい投与経路は経口、経鼻、経咽頭又は経気管支管を含む粘膜表面を経るものであり、そして鼻孔内エーロゾルを含むエーロゾル経由である。      
【００３２】
本発明のさらに別の一側面は対象の細胞により媒介される自己免疫疾患を抑制する方法であって、自己免疫病状を阻止し、低減し、または緩和するのに十分な時間及び条件の下で該自己免疫疾患と関連する抗原の有効量をエーロゾルとして投与する工程を含み、該抗原が機能性ＭＨＣクラスＩ相互作用領域を実質的に欠失しているものである方法を意図する。
【００３３】
より具体的には、本発明は対象の自己免疫疾患状態を阻止し、低減し、または緩和する方法であって、細胞により媒介される自己免疫病状から護る免疫調節機構を誘導し又は刺激するのに十分な時間及び条件の下で該自己免疫疾患と関連する抗原の有効量を該対象にエーロゾルとして投与する工程を含み、該抗原がＭＨＣクラスＩ相互作用領域を実質的に欠失しているものである方法を提供する。
【００３４】
本明細書で「免疫調節機構」というときは、細胞により媒介される免疫応答を調節する全ての機構に対する言及であると理解されるべきであり、例えば、Ｔ細胞の機能的活性の調節、一つ以上のサプレッサーＣＤ４Ｔ細胞、Ｔｈ１、Ｔｈ２又はγδＴ細胞（本明細書で「調節性Ｔ細胞」と呼ぶ）を含むＣＤ８Ｔ細胞による調節、又はリンパ球、骨髄細胞又はストローマ細胞によるサイトカイン生産の調節を経由するものなどであるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明は、本発明者らによる一部の粘膜自己抗原がＭＨＣクラスＩに限定されたＣＴＬに対するエピトープを含むという認識に一部基礎を置く。結果として、これらの抗原の投与はＣＴＬ免疫及びＣＴＬ耐性を結果とし生じうる。従って、本発明は、機能性のＭＨＣクラスＩで相互作用するエピトープを欠失している抗原の選択又はこのエピトープを除去するように抗原を改変することを必要とする。      
【００３６】
特に好ましい実施態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープはＭＨＣクラスＩ（Ｋd ）に限定されるエピトープである。      
【００３７】
本発明は以降にＩＤＤＭ、成人における潜在性自己免疫糖尿病〔ＬＡＤＡ〕とも呼ばれる徐々に進行するＩＤＤＭ（ＳＰＩＤＤＭ）及びＩＤＤＭが根底にあることによる妊娠中の糖尿病の防止、低減、または緩和に関して記述する。これは、しかしながら、本発明が細胞により媒介されるある範囲の自己免疫状態に及ぶという理解の下でなされる。      
【００３８】
従って、本発明の別の一側面は、対象のＩＤＤＭ、ＳＰＩＤＤＭ若しくは妊娠糖尿病を防止し、低減し、または緩和する方法であって、調節Ｔ細胞の誘導、及び／又はＩＤＤＭと関連する細胞媒介性の自己免疫病状を抑制するのに十分な他の適切な機構の誘導に十分な時間及び条件の下で、ＩＤＤＭと関連する自己抗原の有効量をエーロゾルとして若しくは他の機能的に同等な手段により該対象に投与する工程を含み、該自己抗原が機能性ＭＨＣクラスＩ相互作用エピトープを実質的に欠失しているものである方法を意図する。      【００３９】
本明細書で以降における「ＩＤＤＭ」への言及には、ＩＤＤＭ、ＳＰＩＤＤＭ及び妊娠ＩＤＤＭが含まれる。      
【００４０】
誘導される調節Ｔ細胞は抗原の形及びその投与経路に依存する。例えば、分解されていない、立体構造的に完全なポリペプチド若しくはタンパク質分子全体（例えばインスリン）を投与するときは、ＣＤ８Ｔ細胞がそしてより具体的にはＣＤ８γδＴ細胞が誘導される。プロインスリンぺプチド（例えば、プロインスリンぺプチド２４〜３６）などのより小さなぺプチドは一般的にＣＤ４Ｔ細胞、そしてより具体的にはＣＤ４αβＴ細胞を誘導する。特に経口ルートで投与するときＣＤ４調節Ｔ細胞を優勢に形成するように、タンパク質全体を複数のぺプチドに分解してもよい。      
【００４１】
機能性のＭＨＣクラスＩ相互作用エピトープの不存在には、このエピトープ領域の全部若しくは一部を含む１個若しくは複数のアミノ酸の欠失が含まれる。また、このエピトープは抗体又は他の分子と相互作用によるなどの他の手段により阻止されうる。      
【００４２】
特に好ましい投与剤形はエーロゾルスプレー、液の滴下、又は蒸気を経る鼻孔内投与である。      
【００４３】
鼻孔内投与又は他の投与経路のために用いられるＩＤＤＭと関連する好ましい抗原は、インスリン及びプレプロインスリン若しくはプロインスリン、及びそれらの免疫応答刺激性誘導体、例えばプロインスリン、プレプロインスリン若しくはインスリンのぺプチド断片であるが、これらに限定されない。ただし、これらの抗原はＣＴＬ免疫の誘導に関与する機能性のＭＨＣクラスＩ関連領域を欠失しているか又は実質的に欠失していることが条件である。免疫応答刺激には、調節性Ｔ細胞刺激が含まれることが好ましい。しかしながら、種々のイソ型（例えば、ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７）におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）若しくはその誘導体及びチロシンホスファターゼＩＡ−２若しくはその誘導体など、これらに限定されないが、のいずれの島抗原も使用することができる。これらの抗原はヒト由来のものであってもマウスなどの任意の非−ヒト種由来のものであってもよい。最も好ましい抗原は、アミノ酸２４〜３３により定義されたＭＨＣクラスＩ相互作用領域を不活性化するように改変されたプロインスリンぺプチドである。この相互作用領域を改変して、重要なＭＨＣクラスＩアンカー残基の一つ以上を欠失しているぺプチド又はＭＨＣクラスＩの結合が低減するように改変された残基を含むぺプチドを形成させてもよい。このプロインスリンぺプチドはＭＨＣクラスＩエピトープを不活性化するためにＣ末端の先端切断を受けさせることが好ましい。その結果として、ＣＴＬ免疫の誘導はＣＴＬ耐性を含む耐性の誘導から切り離される。      【００４４】
従って、本明細書の別の一側面は、対象におけるＩＤＤＭを誘導し、抑制し、または緩和し若しくは防止する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止若しくは低減させるのに、あるいはＣＴＬ耐性を含む免疫耐性を誘導するのに十分な時間及び条件の下で、ＭＨＣクラスＩに限定されたいかなるエピトープの機能をも発揮できないようにするためそのＣ末端抗原で先端切断したプロインスリンぺプチドを投与する工程を含む方法を意図する。
【００４５】
さらに以下に論ずるように、本発明の方法は、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止するための戦術と組み合わせて用いてもよい。一つのアプローチでは、例えば、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の相互作用が阻止される。        
【００４６】
用語「誘導体」には、抗原の断片、一部、部分、化学的等価物、突然変異体、同族体及び類縁物質が含まれる。類縁物質は天然起源のものでも、合成又は組換え起源のものでもよく、融合タンパク質も含まれる。抗原の化学的等価物は抗原の機能的類縁物質として作用できる。化学的等価物は必ずしも抗原から誘導される必要はなく、ある種の立体構造的類似性を共有すればよい。また、化学的等価物は抗原のある種の物理化学的特性を模倣するように特異的に設計されてもよい。化学的等価物は化学的に合成してもよく、例えば天然生産物のスクリーニングの後に検出してもよい。        
【００４７】
本発明で意図される抗原の同族体は、ヒト由来の抗原又はマウスなどの任意の非ヒト種由来の抗原を含むが、必ずしもこれらに限定される必要はない。
【００４８】
誘導体には、一つ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換が含まれる。アミノ酸の挿入誘導体は、１個又は複数のアミノ酸の配列内挿入並びにアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合を含む。挿入アミノ酸配列変異型は一つ以上のアミノ酸残基が該ぺプチド中の予め定められた部位に導入されるものである、もっとも、得られる生産物の適切なスクリーニングを伴う無差別挿入も可能である。欠失変異型は該配列から一つ以上のアミノ酸の除去が特徴である。置換アミノ酸変異型は該配列中の少なくとも一つの残基が除去され異なる残基がその位置に挿入されたものである。アミノ酸配列への付加には、他のぺプチド又はポリペプチドとの融合が含まれる。例えば、好ましい対象のぺプチドを他のぺプチド又は機能性同族体若しくは類縁物質により置換することも可能である。ハイブリッドぺプチドはぺプチドの組合せを含みうる。
【００４９】
用語「エーロゾル」はその最も一般的な意味て用いられ、鼻、咽喉、気管支又は経口の経路を経て投与できるいかなる製剤をも含む。エーロゾルは一般に気体又は蒸気中に懸濁された液体又は固体の粒子を含む。このエーロゾルは分散媒体が気体である霧のようなコロイド系であるのが便利である。エーロゾル製剤を投与する方法はいかなる手段でもよく、手動ポンプ、電動ポンプ、加圧ディスペンサー、点鼻薬、若しくは他の便利な手段を用いて達成してもよい。さらに、液滴の大きさは肺の浸透を決定しうる、そして液滴の大きさは投与の効率を最大にするように操作する必要がある。本発明の方法は鼻孔内表面に該製剤の直接適用にまで及ぶことが理解されるべきである。      
【００５０】
特に好ましい実施態様では、エーロゾルは約１から約２０リットル／分の速度、好ましくは約２から約１５リットル／分の速度で、そして液滴の大きさが約０．１から約１０μｍ、より好ましくは約０．１から約６μｍで送達される。抗原の貯蔵溶液は約０．５から約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、又はより好ましくは約１．０から約１０ｍｇ／ｍｌの担体溶液で調製されるのが便利である。市販されているインスリンは約４ｍｇ／ｍｌであるのが特に有用である。有用な用量は貯蔵溶液から約５０μｌから１０００μｌであり、好ましくは１００μｌから５００μｌである。
【００５１】
抗原はアジュバントの中で又はアジュバントと共に単独で又は製剤により投与されうる。このアジュバントは、コレラ毒素Ｂ、大腸菌の熱不安定毒素、サポニン、クィルＡ抽出物及び他のサポニン誘導体、ＤＥＡＥ−デキストラン、硫酸デキストラン、アルミニウム塩、及び非イオン性ブロック・コポリマーを含む免疫調節応答を増強するある範囲のアジュバントから選択される。アジュバントはサイトカイン（例えば、ＩＬ−４又はＩＬ−１３）、ムラミル−ジぺプチド及び誘導体、及び細胞壁成分、例えば大腸菌などのグラム陰性細菌由来の細胞壁リポタンパク質、ミコバクテリウム若しくはコリネバクテリウムの種由来の細胞壁成分などの他の免疫調節因子を含んでもよい。アジュバント製剤はリストしたアジュバントの二つ以上の組合せを含んでもよい。これらのリストは網羅的と解すべきではない。アジュバントの選択は、標的とされる種に部分的に依存し、求められる免疫応答のレベル及び期間及び反応原性（即ち、組織適合性）の欠如に基づく。活性成分及びアジュバントのレベルは必要なレベル及び免疫応答の期間を達成するように選択される。
【００５２】
抗原は治療的に有効な量で投与される。治療的に有効な量とは所望の効果を達成するため、又は治療されるべき特定の状態の開始を遅延させるため、進行を阻止するため、又は両者合わせて開始又は進行を遅延又は阻止するために少なくとも部分的に必要な量を意味する。このような量は、勿論治療されるべき特定の状態、その状態の重篤度、及び年齢、肉体状態、大きさ、体重及び同時に行なわれる治療を含む個々の患者のパラメータに基づくものである。これらの因子は当業者には良く知られており、単なる機械的実験で取り組むことができる。最高用量が使用されるのが一般に好ましい、即ち健全な医学的判断に従った最高の安全な用量である。しかしながら、より低い用量又は耐用可能な用量が医学的な理由、生理学的理由又は事実上の他の任意の理由のため投与されうることは当業者には理解されることである。
【００５３】
一般に、抗原の毎日の経口用量は約０．０１ｍｇ／用量／対象／日から１０００ｍｇ／用量／対象／日である。初めに小用量（０．０１〜１ｍｇ）が投与され、その後用量を約１０００ｍｇ／Ｋｇ／日まで増加させてもよい。このような投与で対象の応答が不十分である場合は、より高い用量（又は異なる経路、より局部的送達経路による効果的なより高い用量）さえも、患者の耐性が許す程度まで用いてもよい。１個の用量が投与されてもよく、複数の用量が毎時、毎日、毎週若しくは毎月の基準で投与されてもよい。抗原の効果的な量は個体により変わるが、対象当たりの用量当たりで、約０．１μｇから約１００ｍｇまでの範囲であり、好ましくは約１μｇから約１０ｍｇまで、より好ましくは約５μｇから２０ｍｇの範囲である。特により低い用量はエーロゾル投与又は鼻孔内投与用に意図されており、例えばｎｇ〜μｇ用量が最適である。
【００５４】
本発明の関連する側面では、治療を受ける対象は治療又は予防の処置が必要ないかなるヒト又は動物であってもよい。
【００５５】
一般的に免疫状態そして特異的には調節Ｔ細胞及びサイトカインプロファイルのレベルは当業者に知られた通常の方法を用いて任意の治療計画を通じて容易に決定することができる。例えば、調節Ｔ細胞レベルはＴ細胞サブセットに特異的な市販の抗体で標識化した後サイトメトリー分析によりモニターすることができる。対象の状態を決定する適切な方法の他の例としては、密度遠心分離により末梢血の単核細胞の精製の後ＧＡＤ、ＩＡ−２ファミリー構成員、プレプロインスリン、プロインスリン又はインスリン又はこれらの抗原由来のぺプチド配列などの周知の抗原とインキュベートすることによる刺激が挙げられる。その結果得られる増殖を 3Ｈチミジンの取込みを検定することにより定量できる。サイトカインプロファイルは抗原で刺激した後約２４〜７２時間で測定できる。該サイトカインは、例えば、サイトカイン特異的抗体を用いて検出できる。抗原で刺激した後約２４時間以内に、刺激した細胞を、例えば活性化マーカー発現のフローサイトメトリー分析により表現型として特徴付けることができる（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５）。活性化細胞の細胞表面標識化の後、該細胞をさらに固定しサイトカインに特異的な蛍光色素標識化抗体と共にインキュベートして細胞内のサイトカインレベルを測定する。特に、例えば、二重標識化検定により細胞をさらに評価してもよい。この二重標識化細胞はフローサイトメトリー分析又は蛍光顕微鏡法を用いて分析してもよい。
【００５６】
本発明の別の一側面は、一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤を含むエーロゾル製剤に自己免疫疾患と関連する抗原を含む組成物を提供する。
【００５７】
自己免疫疾患はＩＤＤＭであることが好ましい。
【００５８】
この抗原はインスリン、又はプレプロインスリン、プロインスリンなどのその前駆体の改変型又はそれらの誘導体（例えば、プロインスリンぺプチド２４〜３６）又はＧＡＤ又はチロシンホスファターゼＩＡ−２若しくはその誘導体の改変型などの島抗原であることが好ましく、該抗原はＭＨＣクラスＩエピトープの機能を妨げるように改変されているものである。
【００５９】
該抗原及び投与経路は、インスリンＣＤ８Ｔ細胞などの分子全体に関しては調節Ｔ細胞そして最も好ましくはＣＤ８γδＴ細胞、又はプロインスリンぺプチド２４〜３６などのより小さな分子に関してはＣＤ４Ｔ細胞そして最も好ましくはＣＤ４αβＴ細胞を誘導するものであることが好ましい。
【００６０】
代替的実施態様では、ＩＤＤＭ関連自己抗原をコードする核酸分子が投与される。一般に、この実施態様によれば、プロインスリン又はその改変型をコードするＤＮＡなどの核酸分子の鼻孔内若しくは他の適切な投与が糖尿病の発症を抑制するＣＤ４Ｔ細胞の集団を誘導する。
【００６１】
該核酸分子は機能性ＭＨＣクラスＩ相互作用分子を欠失しているぺプチドをコードすることが好ましい。
【００６２】
該核酸分子は好ましくはｃＤＮＡなどのＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであり、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドである。該核酸分子はプラスミド又はベクターの形であることがとりわけ好ましい。該核酸分子は安定性を増強するためにヌクレオチド塩基の付加又は置換類似体を含んでもよい。
【００６３】
従って、本発明の別の一側面は、粘膜抗原への応答としてのＣＴＬ免疫を実質的に回避しながらＣＴＬ耐性を含む免疫耐性を誘導する方法であって、機能性ＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープを実質的に欠失している粘膜抗原をコードする核酸分子又はその類縁物質を、ＣＴＬ免疫の誘導を阻止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、対象に投与する工程を含む方法を意図する。
【００６４】
より具体的には、本発明はＣＴＬ免疫を実質的に回避しながらＩＤＤＭを防止又は抑制する方法であって、機能性ＭＨＣクラスＩに限定されたエピトープを実質的に欠いているＩＤＤＭ関連自己抗原をコードする核酸分子又はその類縁物質を、ＩＤＤＭの効果を防止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、対象に投与する工程を含む方法を意図する。
【００６５】
本発明のさらに別の一側面はＣＴＬ耐性からＣＴＬ免疫を切り離すための他の方法を意図する。特に、ＣＴＬのエフェクターである「キラー」細胞への成熟は樹状細胞などの抗原提示細胞によるプライミングを要求する。この樹状細胞は該抗原ぺプチド（即ち、エピトープ）をＭＨＣクラスＩ分子との複合体としてＣＤ８ＣＴＬのＴ細胞受容体に提示する。樹状細胞それ自体は、Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と樹状細胞上のＣＤ４０の間の相互作用を通じて「ヘルパー」ＣＤ４Ｔ細胞との先立つ相互作用によりこの機能を発揮するようにプライムされる（図１１参照）。ＣＤ８Ｔ細胞自体もＣＤ４０Ｌを発現することが示された。従って、別の実施態様では、粘膜抗原の投与と連結してＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用のアンタゴニストを投与することが提唱される。このようなアンタゴニストの１例はモノクローナル抗体などのＣＤ４０Ｌ抗体である。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用のアンタゴニストは粘膜抗原の投与の前、同時又はその後に投与されうる。逐次投与には、数秒以内、数分以内、数時間以内、数日以内又は数週間以内が含まれる。同時には実質的な同時が含まれる。この余分の処理は粘膜抗原又は粘膜抗原をコードする核酸分子の投与と一緒でもよい。
【００６６】
本発明の別の一側面は、従って、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟のアンタゴニストの投与の前、同時若しくは後に、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を投与する工程を含む方法を意図する。
【００６７】
より具体的には、本発明は、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬ免疫を阻止又は低減するのに十分な時間及び条件の下で、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用のアンタゴニストの投与の前、同時若しくは後に、該粘膜抗原又はそれをコードする核酸を投与する工程を含む方法を意図する。
【００６８】
本発明のさらに別の一側面は、粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止または遅延させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質を投与する工程を含む方法を提供する。
【００６９】
より具体的には、本発明は粘膜抗原に対するＣＴＬ免疫を実質的に回避しながら該抗原に対する耐性を誘導する方法であって、ＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止または遅延させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質を投与する工程を含み、該物質がＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻止または妨害するものである方法を提供する。
【００７０】
本発明の一層別の一側面は、ある疾患状態の治療又は予防のための医薬の製造におけるＣＴＬの誘導及び／又は成熟を阻止できる物質の使用を意図する。
【００７１】
本発明は下記の非限定的な実施例によりさらに説明する。
【００７２】
実施例１
エーロゾル治療と糖尿病評価
８匹の雌ＮＯＤマウスを入れた準密封箱のそれぞれを、標準的な患者用電動ポンプ（メイメッド・エーロゾルＭＫＶ，アネステティック・サプライズ，シドニー，オーストラリア）及びアエロフロ・ネブライザー（ウエイト・アンド・コウ．，シドニー）に連結することによりエーロゾル化した。４ｍｇ／ｍｌの組換えヒトインスリン（ヒュームリンＲ，イーライ・リリー）又は対照オボアルブミンタンパク質を、２４〜３２マウスの群に、流速１２リットル／分、定格液滴サイズ＜５．８μｍで１０分間以上送達した。すべての処置は０９００及び１１００時間の間に行なわれた。治療計画とマウスの世話は、インスティチューショナル・アニマル・エチック・コミティーにより承認され監督された。１００日齢から少なくとも２８日毎に後眼窩の静脈血を採取し、マウスは反復テストにより確認されたその血中グルコースが１１ｍＭより多いときは糖尿病であると判断された。グルコースは、麻酔をかけていないマウスの後眼窩の静脈叢からガラス毛細管を介して吸引した血液滴について、ＢＭ−Ｔｅｓｔ  Ｇｌｙｃｅｍｉｅ（登録商標）ストリップ及びＲｅｆｌｏｌｕｘ（登録商標）IIメーター（ベーリンガー−マンハイム）を用いて測定した。
【００７３】
実施例２
組織学
マウスをＣＯ2 吸入により殺し、膵臓及び唾液腺を直ちにブインの定着液中に摘出し、パラフィン中に包埋した。島浸潤の重篤度の尺度であるインスリン炎評点は、ヘマトキシリンとエオシンで染色した一連の６μｍの膵臓切片中の最小でも１５の別々の島の等級付けとその平均をとることにより二人の独立の研究者によりブラインドで決定された。等級付けのスケールは、０，浸潤なし，島は無傷、１，島周辺に１０未満のリンパ細胞，島は無傷、２．島周辺及び島内に１０〜２０個のリンパ細胞，島は無傷、３，島周辺及び島内に２０より多くのリンパ細胞，島の５０％未満が置換又は破壊、４，大量のリンパ細胞浸潤，５０％以上の島が置換又は破壊、である。唾液腺の浸潤はクラスターにおけるリンパ細胞の数により等級付けされた。０，細胞なし、１，細胞が１０未満、２，細胞が１０〜５０、３，細胞が５０より大。
【００７４】
実施例３
免疫応答
個々の正常血糖マウス由来の脾臓細胞を赤血球溶解緩衝液で処理し、示された濃度の抗原を含む丸底ウェル中の４連の５０μモルの２−メルカプトエタノールを含む２×１０5 ／２００μｌの無血清ＨＬ−１培地（ハイコール，アーヴィン，ＣＡ）に再懸濁し、インキュベートした。５％ｖ／ｖＣＯ2 ／空気中、３７℃で３日間の後、それぞれのレプリカ上清から１００μｌの部分標本をとり、サイトカイン検定のため−７０℃で貯蔵した。次いで、細胞に３Ｈ−チミジンを加え、１６時間後に収穫し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（商標）ミクロ−シンチレーション・カウンター（パッカード，メリデン，ＣＴ）で計数した。インスリンは、エーロゾル治療に用いたと同様の組換え体ヒト（ヒュームリンＲ，イーライ・リリー）であった。マウスインスリンIIのアミノ酸９〜２３に対応するインスリンＢ鎖ぺプチド（ぺプチド・エクスプレス，フォート・コリンズ，ＣＯ）はＨＰＬＣ分析により９０％を越える純度であった。ＧＡＤ６５はバキュロウイルス系でＣ末端ヘキサヒスチジンを持って発現された組換え体ヒトであり、Ｎｉ2 + キレーションアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥで１本のバンドとして分離され、定量的リムルス・ライゼート検定（バイオ・ホイタッカー，ウォーカースヴィル，ＭＤ）により、内毒素フリーであった。
【００７５】
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γはモノクローナル抗体の対（ファーミンゲン）を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。検出の最低限界はそれぞれ、６２、１６、１６及び５５ｐｇ／ｍｌであった。ＴＧＦ−β１はＥＬＩＳＡキット（プロメガ）を用いて最低検出限界１６ｐｇ／ｍｌで測定した。
【００７６】
インスリン抗体を検出するため、 125Ｉ標識化ヒトインスリン（約１００，０００ｃｐｍ，比活性１２０μＣｉ／μｇ）を、プロテアーゼ阻害剤と逐次対数希釈したマウス血清の混合物を含むリン酸塩緩衝化食塩水中で、過剰の無標識インスリン（１０μｇ／ｍｌ）を含め又は含めずに、４℃で５日間インキュベートした。次いで、複合体をウサギ抗マウスグロブリン抗血清を用いて沈殿させ、洗浄し、ガンマカウンターで計数した。ポジティブの対照の血清（モルモットの抗ブタインスリン血清、ヒトのＩＤＤＭ血清）は、総放射活性のうちの３７〜５４％が最大沈殿した。過剰の非標識化インスリンの存在下での非特異的結合は３％以下であった。
【００７７】
実施例４
糖尿病の養子免疫細胞移入
６〜９週齢の雄ＮＯＤマウス（１６／群）にコバルト線源から照射し（８００Ｒ）、次いで３〜６時間後に最近糖尿病を発症した１４〜１９週齢の雌ＮＯＤマウス由来の脾臓細胞プールの２×１０7 及びエーロゾルのインスリンかオブアルブミンで処理されたマウス由来の脾臓細胞の２×１０7 （又はこの数から分画された細胞）を２００μｌ中に一緒に懸濁させ、尾の静脈経由で与えた。次いで、移入後２週間に血中グルコースの測定を開始することにより、糖尿病の発症を追跡監視した。
【００７８】
実施例５
脾臓細胞集団の分画
脾臓細胞は赤血球溶解緩衝液で処理し、マウス等張リン酸塩緩衝化食塩水中に再懸濁した。全てのＴ細胞をナイロンウールへの非吸着により精製した。ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞は製造者の説明書に従ってＭＡＣＳ・ミクロビーズ（ミルテニ・ビオテク，ＧｍｂＨ，ドイツ）に直接結合したモノクローナル抗体で磁気的にポジティブに選択／除去し、生存細胞（トリパン・ブルー染色が負）として計数した。フローサイトメトリーにより、ＣＤ４細胞又はＣＤ８細胞の９５％除去が明らかになり、それぞれの回収率は約８０％及び約５０％であった。
【００７９】
γδＴ細胞は、エーロゾル処理マウス由来のＴ細胞を、まずビオチン化ＧＬ３−１Ａ抗体（ファルマシア，サンジエゴ，ＣＡ）と、次いでストレプトアビジン−ＭＡＣＳミクロビーズとインキュベートし、その後磁気分離することにより、ポジティブに選択／除去した。フローサイトメトリーにより、γδ細胞は１〜２％のＮＯＤ脾臓細胞を含み、ＧＬ３−１Ａ抗体でその全てを除去した。ＣＤ８γδＴ細胞を精製するために、ＣＤ８Ｔ細胞をまず抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ抱合体及び抗ＦＩＴＣミクロビーズを持つ全てのＴ細胞から磁気的に選択した。このミクロビーズを次にミルテニル・バイオテク・プロトコルに従って放出し、ついでＣＤ８細胞をγδ陽性画分とγδ欠如画分とに磁気的に分離した。二重染色及びＦＡＣＳ分析により、γδ細胞の完全な欠如とＣＤ８集団を表す高及び低ＧＬ３−１Ａとしてのその回収が示された。
【００８０】
実施例６
糖尿病とインスリン
エーロゾル・ヒトインスリン又はエーロゾル・オブアルブミンを２８日齢の雌ＮＯＤマウスに異なる計画で投与し、インスリン炎がマウス集団で検出可能となる最も早い時、及び糖尿病の発症率及びインスリン炎の重篤度を続いて測定する。
【００８１】
糖尿病の発症率は２８日齢での１回のエーロゾルインスリン処理では僅かしか影響されず、エーロゾル・オブアルブミン投与後の８８％に比べ２４０日齢までで７５％である。しかしながら、３又は１０連続日の間の処理及びその後毎週１回の処理により、糖尿病の発症は有意に遅延しそしてその発症率は有意に低下した。５回の別々の実験で、１５６日齢における糖尿病の発症率は、オブアルブミン処理マウスにおける４７％の中央値からインスリン処理マウスにおける２３％まで低下し、糖尿病の累積発症率が最高に達する２４０日齢で、その値はそれぞれ７９％及び４９％であった（ｐ＝０．００５、カプラン−マイアー生存統計）。最初の処理が３又は１０日間であったときは相違はなかった。処理が１０連続日次いで毎週１回なされたがインスリン炎が十分に確立された４９日齢まで処理が開始されなかった別の実験では、エーロゾルインスリンは１５６日での糖尿病発症率を、５８％から２５％までなお有意に低下させた（ｐ＝０．００１）。インスリン処理は、「インスリン炎評点」により判断すると、島病巣の重篤度の有意の低下と関連した。これは糖尿病発症率の減少と平行した（表１）。ＮＯＤマウスでも起こった唾液腺のリンパ細胞による浸潤（シアリティス，sialitis）はエーロゾルインスリンにより影響を受けなかった。
【００８２】
吸収促進物質の不存在下で、ヒトの鼻咽喉粘膜からのインスリンの全身取込みは微々たるものであった（２２）。ＮＯＤマウスでは、血中グルコースはエーロゾルインスリンにより短期間では変わらなかった。１０％エバンス・ブルー色素で標識したインスリン溶液は鼻咽喉、気管、及び主要気管支部分並びに食道に沈着することが観察された。可溶性タンパク質のエーロゾル送達又は鼻孔内送達の後に一部の胃腸管への接触を避けることは、不可能ではないにしても、困難であるが、鼻咽喉のみへの送達で耐性を誘導するのに十分である（７、２３、２４）。
【００８３】
【表１】
2003512435.tif 000001
【００８４】
マウス（３２／群）に２８日齢から１０連続日の間エーロゾル・インスリンか又はエーロゾル・オブアルブミンを投与し、ついで毎週１回投与した。１０５日齢の時に、各群からの５匹の非糖尿病マウスを殺して膵臓の組織検討を行なった。インスリン炎評点は平均値±ＳＤとして表す。1   インスリン処理マウスのインスリン炎評点は有意に低下した（ｐ＜０．０１、マン−ホイットニーＵテスト）。2   インスリン処理マウスの糖尿病発症率は有意に低下した（ｐ＝０．０４、フィッシャーのエグザクトテスト）。
【００８５】
実施例７
免疫応答
【００８６】
本発明者らは、エーロゾル・インスリン処理がインスリンに対する免疫応答を変えるか否かを研究した。プライムしていないＴ細胞の、インスリンを含む島抗原に対する増殖性の応答がＮＯＤマウスで報告された（２５）が、必ずしも再現性がなかった（２６）。インスリンか又はオブアルブミンで処理された５６〜１０５日齢のマウス由来の脾臓細胞（０．５〜２．５×１０6 ／ｍｌ）のヒトインスリン又はヒトオブアルブミン（０．２、２．０、２０及び４０μｇ／ｍｌ）に対する異なる血清補充培地若しくは無血清培地における増殖性応答は、基礎レベルの２倍未満まで変化し、通常はインスリンの最高濃度での基礎レベル未満に抑制された。高濃度のインスリンはＴ細胞の応答を阻害すると報告された（２７）。対照的に、オブアルブミン処理の対照マウスでは、インスリンＢ鎖ぺプチドａ９〜２３、即ちＮＯＤマウス島由来のＴ鎖クローン（１９）に対する優勢エピトープに対する応答は有意であった（表２）が、インスリン処理マウスではそうでなかった。さらに、オブアルブミンマウスはＮＯＤマウスで脾臓Ｔ鎖を刺激すると先に報告された（２５）ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）に対しインスリンマウスよりも有意に高い応答を示した。両処理群からのマウスで、コンカナバリンＡ又はＴ細胞受容体ＣＤ３モノクローナル抗体である１４５−２Ｃ１１による非抗原特異的刺激への増殖性応答は同様であり（表２）、そして無処理マウスとの相違もなかった。このことはエーロゾル処理が一般的免疫抑制を惹起したのではなかったことを示す。インスリンＢ鎖９〜２３への応答としてのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＧＦ−β１の分泌はインスリン処理マウスとオブアルブミン処理マウスの間で有意差はなかった。しかしながら、ＩＬ−４そしてとりわけＩＬ−１０のレベルはインスリン処理マウスの細胞の場合、より高かった（表３）。
【００８７】
【表２】
2003512435.tif 000002
【００８８】
群当たり３匹のマウスからの脾臓細胞を４連でＨＬ−１無血清培地中で検定した。統計学的比較（マン−ホイットニーＵテスト）は各群について１２回の結果の間で行なった。
【００８９】
【表３】
2003512435.tif 000003
【００９０】
複製培養ウェルから得た上清（表２）を３日培養した後に試料とし、サイトカインについて検定した。
【００９１】
インスリン抗体は、インスリン処理及びオブアルブミン処理の７０〜１０５日齢のマウス（ｎ＝１２／群）から得た血清について標準的免疫沈降検定法により測定した。インスリン処理マウスから得た血清中の抗体による 125Ｉ−インスリン放射活性の沈降（１２．７±３．６％、沈降したｃｐｍの平均値±ＳＤ）はオブアルブミン処理マウス（６．９±２．５％）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０１、マン−ホイットニーＵテスト）。エーロゾルインスリン後のＴ細胞増殖の抑制及びインスリンＢ鎖ぺプチドへのＩＬ−４及びＩＬ−１０の応答の増加と共にインスリン抗体の「レベル」の増加は、ルイスラットにおける経口ＭＢＰ（１）及びＮＯＤマウスにおける鼻孔内ＧＡＤぺプチド（２８）の後に記述されたような、免疫偏向の現象と一致する。ＩＤＤＭのＤＴＨ病巣内でのβ細胞の崩壊はＴｈ１により媒介されるプロセスの１例であり（１０，１１）、エーロゾルインスリンによるその阻害は、重要な島抗原に対する応答としてＴｈ１／Ｔｈ２のバランスをＴｈ２へとシフトさせると予想されるかも知れない。欠陥のあるサプレッサーＴ細胞の機能はＩＤＤＭにおいてこのバランスをＴｈ１へシフトすることだと仮定された（１１）。Ｔ細胞のＧＡＤに対する増殖性応答の減少はインスリンエーロゾルにより誘導された調節性細胞によるＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１０（１）の分泌の結果の「傍観者」抑制を反映するものであろうとは思われない。何故なら、ＧＡＤを含む培養物中にインスリンを添加しなかったことを除いては、コンＡ及び抗ＣＤ−３への応答は損なわれなかったからである。直接的説明は、ＧＡＤへの応答の減少はインスリン炎及びβ細胞破壊に及ぼすエーロゾルインスリンの保護効果を反映するというものである。このことは少なくとも一部のＧＡＤ免疫が二次的であり、（プロ）インスリンに対する免疫がβ細胞破壊においてより近接した役割を持ちうることを意味する。ヒトＧＡＤ６５に対するＮＯＤマウスのＴ細胞の応答はより強力であり、天然のヒトインスリンに対する応答よりもより早いように見えると報告されてきた（２５）が、ＮＯＤマウスの抗原提示細胞におけるマウスプロインスリンIIのトランスジェニック発現はインスリン炎及び糖尿病を完全に阻止することが見出された（２９）。
【００９２】
実施例８
調節性ＣＤ８γδＴ細胞
本発明者らは、エーロゾルインスリンが病原性のエフェクターＴ細胞による糖尿病の養子免疫細胞移入を阻害できるであろう調節性細胞を誘導したか否かを研究した。古典的な養子免疫細胞移入モデル（３０）（図６参照）においては、若齢の放射線照射された非糖尿病の同系の雄又は雌のレシピエントへ静脈注射された糖尿病のＮＯＤ雌マウス由来の脾臓細胞は、４週間以内に大部分に臨床的糖尿病を惹起する。老齢の糖尿病マウス由来の２×１０7 個の脾臓細胞をエーロゾルオブアルブミンマウス由来の同数の脾臓細胞と共に共注射すると、若齢のレシピエントの大部分が４〜５週間以内に糖尿病を発症した、対照的に、エーロゾルインスリンマウス由来の脾臓細胞との共注射後には、少数しか糖尿病を発症しなかった（図４Ａ）。糖尿病の発症率は、エーロゾルインスリンマウス由来の脾臓細胞か又はナイロンウール非吸着性脾臓細胞（Ｔ細胞が濃縮）のいずれかを用いた六つの独立実験において７５％以上抑制された。
【００９３】
次に、脾臓細胞を、分画し、糖尿病移入の抑制の原因となる該調節性細胞を同定した。ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞の涸渇選択並びにポジティブ選択は、ＣＤ８細胞が専ら移入の抑制の原因であることを明白に示した（図４Ｂ）。ＣＤ４細胞の涸渇は、エーロゾルインスリンマウス由来の残りの脾臓細胞の移入抑制能力を変えなかった（図４Ｂ）、そしてポジティブ選択されたＣＤ４細胞は移入を抑制しなかった（図４Ｃ）。他方で、エーロゾルインスリンマウス由来のＣＤ８の涸渇した脾臓細胞による抑制は存在しなかった（図４Ｄ）のに対して、ポジティブ選択されたＣＤ８細胞は移入を抑制した（図４Ｅ）。ポジティブ選択されたＣＤ８細胞による部分抑制は、これらの涸渇後の糖尿病の急速な進行と対比して、多分ＣＤ８細胞の非効率的な回収によるものである。この実験では、７ｘ１０5 個の精製されたＣＤ８細胞が糖尿病マウス由来の２ｘ１０7 個の脾臓細胞とともに各レシピエント内に共注射されたのである。
【００９４】
γδ受容体をもつＴ細胞は免疫調節の役割を果たすことが示されてきた（３１〜３６）。興味深いことに、全末梢血のγδ細胞は準臨床的ＩＤＤＭのヒトにおけるβ細胞機能の喪失と同時に減少することが報告されている（３７）。観察された糖尿病移入の抑制がγδＴ細胞によるものであったか否かを決定するために、本発明者らは抗γδＴ細胞モノクローナル抗体であるＧＬ３−１Ａを用いて脾臓細胞を分画した（３８）。ＣＤ８細胞の涸渇と同様に、γδＴ細胞の涸渇により、インスリンエーロゾル処理されたマウスに由来するナイロンウール非吸着性脾臓細胞は糖尿病の養子免疫細胞移入を抑制する能力を完全に失った（図５Ａ）。逆に、インスリンエーロゾル処理されたマウスに由来する比較的少数のγδＴ細胞は移入を抑制できた。移入後の糖尿病の発症率は、１．４ｘ１０5 γδＴ細胞が糖尿病マウス由来の２ｘ１０7 個の脾臓細胞と共に注射されると、少なくとも７０日間で５０％まで低下した（図５Ａ）。糖尿病移入を抑制した脾臓のＣＤ８及びγδＴ細胞は、同一物であり、二つの相互依存集団ではなかった。従って、それらがまずγδＴ細胞を涸渇させた場合、インスリンエーロゾル処理されたマウスに由来するＣＤ８細胞の移入を抑制する能力は喪失したが、一方、該ＣＤ８細胞から精製された少数のγδ細胞は移入を防止した（図５Ｂ）。１１の異なる共移入実験から得られた結果の概要は図６に提示する。
【００９５】
ＦＡＣＳ分析は、ＧＬ３抗体と反応するγδ細胞が１２〜１６週齢の雌ＮＯＤマウスの脾臓における全細胞の１．６〜２．４％及びＣＤ８+ 細胞の約１％を構成することを明らかにした。これらの値はインスリン又はオブアルブミンのエーロゾルで処理されたマウス群間で差異は無かった。しかしながら、それらの低い産出量のため、抗原に特異的なＣＤ８γδＴ細胞の異なる亜集団はこの方法で識別するのは難しいであろう。分画された細胞、例えば逐次精製されたＣＤ８γδ細胞を用いたより高い保護（図６）は、定量的であり未分画細胞のそれと比較してより高い絶対数を反映している。
【００９６】
実施例９
インスリンのエーロゾル化
粘膜へのインスリン送達の様式としてのエーロゾル吸入は、ＮＯＤマウスの糖尿病の発症率を減少させる際に経口インスリン（２２、２３）と同じく効果的であった。これがインスリン炎の発症後の治療であったという事実は、循環する島の抗原に反応する抗体及びＴ細胞の存在が潜在的なインスリン炎を反映すると解釈される、準臨床的疾患の危険性のあるヒトのＩＤＤＭの予防に特に重要である。実際、最近診断されたＩＤＤＭのヒトと比較して、ＮＯＤマウスはより重いインスリン炎を患い、雌の大部分が糖尿病に進行する（１０、１１、２４）。エーロゾルインスリンは明白な代謝効果を有しなかったが、調節性ＣＤ８γδＴ細胞の集団を誘導し、その少数は、病原性のエフェクターＴ細胞の糖尿病を養子免疫細胞移入する能力を抑制した。細胞に媒介された自己免疫病状から防御するこれらの抗原に誘導された「サプレッサー」Ｔ細胞はこれまでに記載されたことはなかった。
【００９７】
経口耐性は、細胞性の抗原特異的免疫の低減並びに時折体液性の抗原特異的免疫の増大と関連させられ、ＴＧＦ−β又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β１をそれぞれ分泌するＣＤ８Ｔ細胞又はＣＤ４Ｔ細胞のいずれかと関連させられてきた（８）。しかしながら、これらの調節性細胞はγδ受容体を担うものとして同定されてこなかった。ＮＯＤマウスでは、インスリンに対する経口耐性は調節性ＣＤ４Ｔ細胞に帰せられた（２１）。本発明によれば、ＣＤ８γδＴ細胞がエーロゾルインスリンにより誘導される該調節性細胞である。
【００９８】
実施例１０
鼻腔内のインスリン（図１）、プロインスリン（図２）
又はプロインスリンペプチド２４〜３６（図３）
インスリン担体溶液又はマウス等張リン酸塩緩衝化食塩水のいずれかに溶解した４ｍｇ／ｍｌの市販のインスリン、又は同液に溶解した１〜４ｍｇ／ｍｌのプロインスリン若しくはプロインスリンペプチド２４〜３６を、２８日齢又は５６日齢のいずれかの麻酔をかけずに拘束したＮＯＤ雌マウスの鼻孔に１０〜２０μｌの容量で適用した。５６日齢までに全マウスは潜在的な島の炎症（インスリン炎）を呈することに留意せよ。
【００９９】
２８日齢又は５６日齢のいずれかでのインスリン、プロインスリン又はプロインスリンペプチド２４〜３６の１回投与はそれぞれ、対照タンパク質のオブアルブミン又は鶏卵リゾチームと比較して、ＮＯＤ雌マウスにおける糖尿病の発症を有意に遅延させた。比較用量のベースで、プロインスリン及びプロインスリンペプチド２４〜３６はインスリンより効果があった。これらの効果は該タンパク質又はペプチドの反復用量を用いるとより大きくなる。プロインスリン２４〜３６の１回鼻孔内投与（４０μｇ）で前処理された雌のマウスにおいて、全脾臓細胞、及びＣＤ８Ｔ細胞を涸渇させたがＣＤ４Ｔ細胞は涸渇していない全脾臓細胞は、糖尿病マウス由来の脾臓細胞による糖尿病の養子免疫細胞移入を有意に抑制した（図７）。雌のマウスを２８日齢で処理した後、屠殺し、それらの脾臓細胞を５６日齢で養子免疫細胞共移入のために採取した。
【０１００】
実施例１１
危険性のある個体における鼻孔内インスリンの臨床試行
この鼻孔内インスリン試行（ＩＮＩＴ）は、島の自己抗原と反応する循環する抗体及びＴ細胞を含むＩＤＤＭの免疫マーカーと共に、危険性があるが他方で健康な一親等の親類への鼻孔内インスリンの投与を含む。本発明者らの対象は、インスリン、ＧＡＤ又はチロシンホスファターゼＩＡ−２に対する少なくとも二つの抗体を有し、末梢血のＴ細胞はインスリン、プロインスリンペプチド２４〜３６に応答し、時々ＧＡＤ及びＩＡ−２ペプチドに応答する。この実験の理由は、インスリンに対する粘膜媒介性免疫耐性を誘導することであり、ＮＯＤマウスの本アプローチの成功に基づいて、安全性を証明することである。市販のヒトの組換えインスリンを使用する。これは通常ＩＤＤＭの人達への皮下注射又は静脈注射により日常的に投与される。この試行に参加した４〜３０歳（平均１１．４歳）の３８人の危険性の高い対象において、有意な副作用は観察されなかった。粘膜刺激の可能性は存在するが、これはごく稀であり、その上大したことでなく一過性であった。エーロゾル又は鼻孔内のインスリンで処理されたＮＯＤマウスは臨床的合併症又は生検でも異常を示さなかった。
【０１０１】
このＩＮＩＴ試行はＩＤＤＭの代用免疫マーカーへの鼻孔内インスリンの影響を調べる。この計画は、無作為化された、二重盲検及びプラシーボ対照であり、６カ月で交差させた。プラシーボはインスリン用に通常使用される担体溶液である。本目的はインスリン及び他のベータ細胞の抗原に対する抗体及びＴ細胞のレベルに及ぼす有意な効果を証明することである。更に、グルコースの静脈注射への応答としての第一段階のインスリン放出（ＦＰＩＲ）、即ちベータ細胞の機能の測定は、開始時、６ヶ月及び１２ヶ月に監視される。該交差の設計は、治療の機会を全対象に与え（危険性のある親類にとって重要な問題）、何らかの治療効果があれば測定は維持され、群内及び群間の分析を可能にする。治療は最初に１０日連続で毎日、次いで一週間に二日連続で投与される。６ヶ月後、治療は交差される（インスリンからプラシーボへ、又は逆に）。
【０１０２】
鼻孔を通じたインスリンの投与用量は市販の４ｍｇ／ｍｌ溶液を約２００μＬ（８００μｇ）である。該プラシーボはインスリンが通常溶かされる担体溶液である。
【０１０３】
結果
鼻孔内インスリンは、インスリン抗体全長の有意な増加（ｐ＝０．０１）、並びに変性したヒトのインスリンに対する末梢血の単核（Ｔ細胞）増殖の相伴う減少と関連しており、インスリン抗体のレベル及び変性したインスリンに対するＴ細胞の増殖性応答は第一期（ｐ＝０．０５）及び第二期（ｐ＝０．０１）で反比例の関係にあった。これらの結果はＮＯＤマウスで見られたものと一致している。ＦＰＩＲが初期に第一のパーセンタイルより上で測定可能であったどの対象にもＦＰＩＲに変化は無かった。免疫パラメータの変化はＦＰＩＲの変化と関連しておらず、例えば、インスリンについてのインスリン抗体の増加は、第一のパーセンタイルよりＦＰＩＲが大きな対象でのベータ細胞機能の低下と関連していなかった。鼻孔内インスリンの副作用は明白でなかった。この結果は、長期ＦＰＩＲ及び糖尿病の発症率に対する鼻孔内インスリンの効果を決定するために更なる試行を勇気づける。
【０１０４】
実施例１２
機能性ＭＨＣクラスＩに相互作用するエピトープを除去するための
プロインスリンペプチド２４〜３６の改変
プロインスリンペプチド２４〜３６の投与後、糖尿病の養子免疫細胞移入をほとんど完全に阻止したＣＤ４調節性Ｔ細胞が誘導されたが（単離され、エフェクター「糖尿病誘発性」Ｔ細胞を用いて若齢の放射線照射されたＮＯＤマウス中にトランスフェクトされた場合）、自然発生糖尿病の発症は遅延されたが防止されることはなかった。本発明者らは、該プロインスリンペプチドがＭＨＣクラスＩ（Ｈ２−Ｋd ）に限定されたＣＴＬ、即ちアミノ酸２６〜３４及びアミノ酸２５〜３４の推定エピトープを有することを観察した。従って、プロインスリンペプチド２４〜３６の投与により、ＣＴＬ免疫及びＣＴＬ耐性の同時誘導が結果として生ずるであろう。まず、この投与は、２６〜３４及び特に２５〜３４がＫd に結合でき（図８）そしてＮＯＤマウスにＣＴＬを誘発できることを示した（図９にアミノ酸２６〜３４を示す）。次に、これらは、該プロインスリンアミノ酸２４〜３６ペプチドの一連のＣ末端の先端切断の効果を証明した（図１０）。位置９のアンカー残基（アミノ酸３４）の欠失によるＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの不活性化は、中核のＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｇ７）結合配列が鼻腔内投与後に糖尿病を防止する能力を有意に増強した。位置（ｐ）９のＣ末端アミノ酸は、ＭＨＣクラスＩ分子への結合に必要とされる重要な「アンカー」残基である。
【０１０５】
実施例１３
ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０シグナル発信を標的化することによる
経口耐性からの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫の切り離し材料及び方法
マウス
マウスはザ・ウォルター・アンド・イライザ・ホール・インスティチュート・オブ・メディカル・リサーチで飼育し維持した。経口耐性及びＣＴＬ活性は、６から８週齢の雌のＣ５７Ｂ１／６マウスで決定した。ＭＨＣクラスＩに限定されたＯＶＡ257-264 ペプチドに対するトランスジェニックＣＤ８Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を保持するトランスジェニックＯＴ−１／ラッグ（Ｒａｇ）- / - マウス及びＭＨＣクラスIIに限定されたＯＶＡ323-339 ペプチドに対するトランスジェニックＣＤ４ＴＣＲを保持するＯＴ−IIマウスは、Ｌｙ５．１／ＣＤ４５．２同系Ｃ５７Ｂ１／６マウス（ＯＴ−Ｉ細胞）内及びＲＩＰ−ＯＶＡトランスジェニックマウス（ＯＴ−Ｉ細胞及びＯＴII細胞）中への養子免疫細胞移入用にＯＶＡに反応するＴ細胞のドナーとして６から１２週間の間使用した。
【０１０６】
耐性の誘導
経口耐性は、報告された高用量及び低用量のＯＶＡに対応する二つのプロトコルを用いて誘導された。
【０１０７】
ＯＶＡ（Ｖ等級、シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）は、弱いメトキシフルラン（Penthrane （商標））麻酔の下で胃内挿管を介して２０ｍｇを１日おきに３日間（高用量）又は０．５ｍｇを１日おきに５日間（低用量）のいずれかで雌のＣ５７Ｂ１／６マウスに投与した。リムルス・ライゼート検定（バイオ・ホイタッカー、ウォーカースヴィル、メリーランド州）で測定されたＯＶＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）の内毒素濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ以下であった。ＣＤ４０Ｌのシグナル発信はハムスターＩｇＧ１抗マウスＣＤ４０ＬｍＡｂＭＲ−１（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）の投与により阻止され、その対照はヒトＢｃｌ−２に特異的なハムスターｍＡｂ６Ｃ８であった。両ｍＡｂを、Ｇタンパク質−セファロース（ファルマシア社、ウップサラ、スウェーデン）上でアフィニティークロマトグラフィーによりハイブリドーマ細胞培養液から精製し、記載したように２５０μｇの用量で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。
【０１０８】
細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）検定
ＣＴＬは下記のように検定した。
【０１０９】
マウスは、２０ｘ１０6 個のＯＶＡ被覆Ｈ−２Ｋbm-1脾臓細胞（ＣＤ４Ｔ細胞の援助に依存している）を用いて静脈注射でプライムされ、又は２００μｇのＯＶＡペプチド２５７〜２６４のＣＦＡ１００μｌ（ＣＤ４Ｔ細胞の援助に依存しない）を用いて尾の基部に皮下注射（ｓ．ｃ．）でプライムされた。実験に応じて、マウスはｍＡｂ及び経口ＯＶＡを受容した２週間後又は３週間後にプライムされた。マウスはプライミングの７日後に屠殺され、その脾臓細胞は51Ｃｒ放出検定でエフェクターとして使用する前に更に６日間インビトロで刺激された。溶血ユニットは、各脾臓から生成したエフェクターの総数を３０％のＯＶＡに特異的な溶解に必要なエフェクターの総数で割ることにより算出した。
【０１１０】
ＣＴＬ前駆体の経口ＯＶＡ±抗ＣＤ４０Ｌ処理の効果
経口ＯＶＡに対するＯＶＡに特異的なＣＴＬ前駆体の応答並びにＣＤ４０Ｌ阻害の効果を決定するために、３×１０6 個のＯＴ−Ｉ細胞をＬｙ５．１同系雌マウス内に移入した後、該マウスに０日目及び３日目にＭＲ−１又は対照の６Ｃ８ｍＡｂのいずれかを与えた。経口ＯＶＡ２０ｍｇは１〜３日目に毎日与えた。マウスは１４日目に屠殺され、脾臓ＯＴ−Ｉ細胞の数並びにそれらのＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン活性マーカー）の発現を Lysys２（商標）ソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いてＦＡＣＳｃａｎにより分析した。細胞は、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４４及び抗Ｌ−セレクチンｍＡｂ（ファーミンゲン社、サンノゼ、カリフォルニア州）とともにビオチン化抗Ｌｙ５．２ｍＡｂ（ファーミンゲン社）及びＰＥ結合抗ＣＤ８ｍＡｂ（シグマ社）とインキュベートした後、ストレプトアビジン結合ＰｅｒＣｐ（ファーミンゲン社）と第二段階のインキュベーションを行いＬｙ５．２を検出した。
【０１１１】
ＲＩＰ−ＯＶＡloマウスの糖尿病誘導に及ぼす経口ＯＶＡ±抗ＣＤ４０Ｌ処理の効果
ＣＴＬの経口ＯＶＡのインビボ活性化へのＣＤ４０Ｌ阻害の効果が経口ＯＶＡであることを調べるために、膵臓のβ細胞上でＯＶＡを発現するＲＩＰ−ＯＶＡマウスに、０．３ｘ１０６個のＯＴ−１細胞及び０．２ｘ１０6 個のＯＴ−１細胞を養子免疫細胞移入し、移入日（０日目）にＭＲ−１及び対照の６Ｃ８ｍＡｂを与えた。次に、マウスに一日目から始めて０．５ｍｇを１日おきに５日間の経口ＯＶＡで処理した。血中グルコースは、１４日目及び２１日目に後眼窩の静脈血滴についてグルコメーターを用いて測定し、１４ｍｍｏｌ／ｌを上回る値は糖尿病の徴候とみなした。
【０１１２】
経口耐性の評価
全身プライミングに対するＣＴＬ耐性を評価するため、経口ＯＶＡの最終投与の１４日後又は２１日後に、マウスに２０ｘ１０6 個のＯＶＡ被覆Ｈ−２Ｋbm-1脾臓細胞を用いて静脈注射し又はＣＦＡ中０．１ｍｇのＯＶＡタンパク質を用いて皮下注射した。続いて、これらの脾臓ＣＴＬ活性を上記のように測定した。粘膜耐性の通常のインデックスを評価するため、経口ＯＶＡの最終投与の７日後に、マウスにＣＦＡ中のＯＶＡ（０．１ｍｇ）を尾の基部に皮下注射により免疫化した。１０日後、マウスに麻酔をかけ、後眼窩の静脈叢からガラスの毛細管を用いて給餌し、ＣＯ2 窒息により屠殺し、これらの脾臓及び鼠蹊リンパ節を摘出した。血清を回収しＯＶＡ抗体の検定用に−２０℃で保存した。細胞懸濁液を、ステンレス鋼網を用いて機械的破壊により脾臓及び節から調製し、洗浄し、計数し、そしてＯＶＡに対する増殖応答及びサイトカイン応答の検定用に２ｍＭのグルタミン、５ｘ１０-5の２−メルカプトエタノール及び５％v/vの胎児牛血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁した。
【０１１３】
ＯＶＡに対するＩｇＧサブクラス抗体は、前述したようにペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３抗体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエイツ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１１４】
２００μＬの培地中での脾臓細胞（１ｘ１０6 ）又は鼠蹊リンパ節細胞（５ｘ１０5 ）のＯＶＡに対する増殖応答は、５％ＣＯ2 ／大気中３７℃で９６時間０．１ｍｇ／ｍｌのＯＶＡの存在下又は非存在下でインキュベーションした後、９６穴リンブロプレート（フローラブズ社、マックリーン、バージニア州）の丸底ウェルで８回反復して測定した。 3Ｈ−チミジン（１μＣｉ）を細胞回収前１０〜１６時間に各ウェルに添加し、該細胞を回収し、洗浄し、トップカウントシンチレーションカウンターで計数した。ＯＶＡに対する脾臓細胞又は鼠蹊リンパ節細胞のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の応答はＥＬＩＳＰＯＴ検定により測定した。細胞（５ｘ１０5 ／２００μｌ）は、５μｇ／ｍｌＰＢＳのモノクローナルラット抗マウスＩＦＮγ（クローンＲ４−６Ａ２）又はＩＬ−４（クローン１１Ｂ１１）抗体で一晩予め被覆したマルチスクリーン・インモビロン−Ｐ膜９６穴プレート（ＭＡＩＰＳ４５１０；ミリポア社、ノースライド、オーストラリア）の穴に添加した。細胞は、５％ＣＯ２／大気中３７℃で２４時間０．１ｍｇのＯＶＡの存在下又は非存在下でインキュベーションした後、洗浄して得た。膜に結合したサイトカインは、４μｇ／ｍｌのビオチン複合モノクローナルラット抗マウスＩＦＮ−γ（クローンＸＭＧ１．２）又はＩＬ−４（クローンＢＶＤ６−２４Ｇ２）と４℃で一晩反応させた。洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ、次いで３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ；ダコ社、カルピンテリア、カリフォルニア州）を用いて発色させた。全てのモノクローナル抗体はファーミンゲン社、サンディエゴ、カリフォルニア州から購入した。
【０１１５】
統計  治療群間の差異はフィッシャーの正確検定又はマン−ホイットニー試験により分析した。
【０１１６】
結果ＣＤ４０Ｌの阻害は経口ＯＶＡによるＣＴＬ誘導を損なう
ＣＤ４Ｔ細胞の援助に依存する経路（図１２Ａ）によるＣＴＬプライミングを阻害するＭＲ−１ｍＡｂの用量（２５０μｇ、腹腔内注射）を決定した後、同様の用量の対照のｍＡｂ６Ｃ８又はＭＲ−１ｍＡｂのいずれかをＣ５７Ｂ１／６マウスに与えた後、１日おきに３日間該マウスに２０ｍｇのＯＶＡを給餌した。経口ＯＶＡは、６Ｃ８で処理したマウスでは７５％（９／１２）にＣＴＬ応答を誘導したが、ＭＲ−１で処理したマウスでは２５％（３／１２）しか誘導しなかった（図１２Ｂ）。
【０１１７】
経口ＯＶＡによるＣＴＬの活性化及び増加はＣＤ４０Ｌを必要とする
経口ＯＶＡによるＣＴＬ誘導がＣＴＬ前駆体の活性化及び増加と関連したことを証明するため、養子免疫細胞移入されたＯＶＡに特異的なトランスジェニックＣＴＬ（ＯＴ−Ｉ細胞）を実験未使用のＬｙ５．１同系レシピエント内に移入し、ＯＶＡを給餌した。経口ＯＶＡに対するＯＴ−Ｉ細胞の応答におけるＣＤ４０Ｌの役割は、対照のｍＡｂ６Ｃ８又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂＭＲ１のいずれかでレシピエントマウスを前処理することにより調べた。最終結果を分析する前に活性化、増殖、再循環そしておそらくは細胞死を生じさせるために、本発明者らは経口ＯＶＡの最終投与の１４日後に該脾臓から得たＯＴ−Ｉ細胞を調べた。この部位及び時間は、例えばＯＶＡに誘導されたＣＴＬを測定するために用いた他のプロトコルに相当するものであった。経口ＯＶＡ及び６Ｃ８に応答して、脾臓のＯＴ−Ｉ細胞が非常に増加し（図１３Ｂ）ＣＤ４４の発現を増大させ（図１３Ａ、１３Ｃ）並びにＣＤ６２Ｌの発現を減少させた（図１３Ａ、１３Ｄ）。このことは多数が活性化／記憶表現型を獲得したことを示している。しかしながら、ＭＲ１の存在下で、ＯＴ−Ｉ細胞の増加（図１３Ｂ）及び活性化（図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｄ）を誘導する経口ＯＶＡの能力は著しく損なわれた。
【０１１８】
抗ＣＤ４０Ｌ処理はＲＩＰ−ＯＶＡloマウスにおける経口ＯＶＡによる糖尿病の誘導を防止する
予備実験で、本発明者らは、０．３ｘ１０6 個のＯＴ−ＩＩ細胞及び０．２ｘ１０6 個のＯＴ−Ｉ細胞の最少量の移入がＯＶＡ被覆脾臓細胞でレシピエントのＲＩＰ−ＯＶＡloマウスを全身プライミングした後の糖尿病の発症に必要であることを見出した。従って、これらの数のＯＴ−ＩＩ細胞及びＯＴ−Ｉ細胞をＲＩＰ−ＯＶＡloマウスに移入し、その翌日に該マウスに対照のｍＡｂ６Ｃ８又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂＭＲ１を与え、次いで１日おきに５日間０．５ｍｇのＯＶＡを給餌した。経口ＯＶＡの後、６Ｃ８を与えられたマウスの６０％（９／１５）が糖尿病を発症したのに対し、ＭＲ１を与えられたマウスではわずか１４％（２／１４）しか発症しなかった（ｐ＝０．０２）（図１４）。
【０１１９】
抗ＣＤ４０Ｌ処理は経口耐性の誘導を防止しない
ＣＤ４０Ｌ遺伝子を標的とするマウスの実験は、ＣＤ４０Ｌシグナル発信が経口耐性の誘導に必要であることを示した（３９）。しかしながら、この突然変異はパイアー斑（３９）の発症及び胚中心（４０）の発達に影響する。従って、抗ＣＤ４０ＬｍＡｂで短期処理され且つ遺伝子操作されていないマウスにおいて経口耐性が誘導できるか否かを決定することが重要であった。以前、ＣＴＬ免疫を誘導しながら、経口ＯＶＡが全身ＯＶＡによる強力なＣＴＬ免疫の更なるプライミングを逆に抑制することが示された（４１）。抗ＣＤ４０Ｌ処理がＣＴＬへの経口ＯＶＡのこの耐性原効果に影響するか否かを決定するために、Ｃ５７Ｂ１／６マウスに２５０μｇの対照ｍＡｂ６Ｃ８又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂＭＲ１を腹腔内投与し、次いでＰＢＳ又はＰＢＳ中のＯＶＡを給餌した。１４日後又は２１日後、これらを、ＣＤ４Ｔ細胞に依存する様式で、ＯＶＡ被覆脾臓細胞を静脈注射で（図１５Ａ）又は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中１００μｇのＯＶＡを皮下注射で（図１５Ｂ）プライムした。後者の方法はＣＤ４Ｔ細胞の援助と関わりなく直接的にＣＴＬをプライムする。これらの実験は、ＭＲ１による抗ＣＤ４０Ｌ処理がいずれかの方法によるＣＴＬの全身プライミングへの経口ＯＶＡの該耐性原効果を改変しないことを証明した。これは、マウスが高用量（２０ｍｇを１日おきに３日間）又は低用量（０．５ｍｇを１日おきに５日間）の経口ＯＶＡの１４日後又は２１日後にチャレンジされたかどうかを問わず、全実験で一致した（図１５Ｃ、１５Ｄ）。
【０１２０】
次に、抗ＣＤ４０Ｌ処理が経口耐性の通常パラメータに影響するか否かを決定するための実験を行った。経口ＯＶＡ（２０ｍｇを１日おきに３日間）の最初の投与前におけるＭＲ１の１回注射は、全身ＯＶＡでプライムしたＴ細胞増殖又はＩＦＮ−γ生産（図１６Ａ及び図１６Ｂに脾臓細胞をそれぞれ示す）又は血清抗ＯＶＡ抗体（図１６Ｃ）の抑制を限定しなかった。増殖の平均刺激インデックスは、６Ｃ８投与後３．５０（経口ＰＢＳ）から１．９６（経口ＯＶＡ）に低減し（ｐ＜０．０５）、ＭＲ１投与後３．２１から２．０４に低減した（ｐ＜０．０５）（図１６Ａ）。経口ＯＶＡ後のプライムされたＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答の抑制は、より劇的で抗ＣＤ４０Ｌ処理により影響されなかった（図１６Ｂ）。いずれの条件下でもＩＬ−４ＥＬＩＳＰＯＴＳ（４／穴以下）はほとんど検出されなかった。
【０１２１】
抗原の粘膜投与は、自己抗原の場合、該抗原に対する次の免疫応答に耐性となることができ、自己免疫抗原の場合には、自己免疫疾患の発症を抑制できる。しかしながら、該モデルタンパク質抗原のオブアルブミン（ＯＶＡ）の粘膜投与も細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）免疫を誘導し、これは疾患を惹起しうる。本発明者らは、経口ＯＶＡに誘導された耐性とＣＴＬ免疫が、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の間の相互作用を標的化することにより切り離すことができることを示す。ＣＤ４０Ｌのモノクローナル抗体阻害はＣＴＬの同時誘導を妨げることにより耐性を強化した。これは、経口ＯＶＡへの応答としての養子免疫細胞移入されたＯＶＡに特異的なＣＴＬ（ＯＴ−１−ＣＤ８細胞）の活性化及び増大の阻害により反映された。更に、膵臓β細胞上でＯＶＡをトランスジェニック発現するマウスにおいて、ＣＤ４０Ｌの阻害は、ＯＶＡの経口投与に続くＣＴＬ（ＯＴ−１細胞）媒介性自己免疫糖尿病の発症を有意に阻害した。これらの結果は、ＣＴＬに対する粘膜耐性がＣＴＬプライミングのためのＣＤ４０Ｌシグナル発信の要件とは無関係に誘導されることを示している。従って、ＣＤ４０Ｌシグナル発信の阻害はＣＴＬ媒介性自己免疫疾患を予防するための粘膜抗原の有効性（及び安全性）を改良できるであろう。これを証明するために、８週齢の雌ＮＯＤマウスに、１日目、３日目、１０日目、２４日目及び３８日目にエーロゾルインスリン（４ｍｇ／ｍｌ、１０分間）又は希釈対照の投与直前に抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体であるＭＲ−１又は対照抗体の６Ｃ８を用いて処理された（３００μｇ、腹腔内注射）。エーロゾルインスリンによる抗ＣＤ４０Ｌ抗体の処理は、希釈剤又は対照抗体並びにエーロゾルインスリン又は希釈剤のいずれかによる抗ＣＤ４０Ｌ抗体処理と比較して糖尿病の発症率を著しく低減した（図１７）。
【０１２２】
実施例１４
鼻腔内プロインスリンＤＮＡは糖尿病を予防するＣＤ４Ｔ細胞を誘導する材料及び方法ＤＮＡ
マウスのプロインスリンIIｃＤＮＡ又はオブアルブミンゲノムＤＮＡを、ＣＭＶ初期プロモーターの制御下で哺乳動物発現ベクターのｐＣＩに由来するプラスミドベクター内にサブクローニングした。該ベクターを改変し、ＣＩＧＨと名付ける。プラスミドを、大腸菌から調製し、ＰＥＧ沈降及びトリトンＸ１１４相分配により精製し、１ｍｌのＰＢＳに２ｍｇのＤＮＡを希釈し、−２０℃で凍結した。
【０１２３】
マウス及び処理
マウスはザ・ウォルター・アンド・イライザ・ホール・インスティチュート・オブ・メディカル・リサーチで飼育し維持した。３週齢及び５週齢で、５０μｇのＤＮＡを含む２５μｌのＰＢＳを麻酔をかけていない雌マウスに５μｌずつ繰り返し鼻腔内投与した。他の実験においては、マウスを開始時３週齢で４週間連続して２５μｇのＤＮＡを鼻腔内投与した。
【０１２４】
糖尿病の決定
血中グルコースは、後眼窩の静脈叢から微細なガラスの毛細管を介して得られた血液滴についてアドバンテージモニター（ベーリンガーマンハイム社）を用いて測定した。これらの血中グルコースが連続した日で１１ｍＭを上回る場合、マウスは糖尿病とみなされた。養子免疫細胞移入研究で用いた糖尿病のドナーマウスは１週間未満で高い血中グルコースを示した。
【０１２５】
結果
初期の実験では、１０週齢の鼻腔内ＤＮＡ処理されたマウスから得られた脾臓細胞を、ナイロンウールを経る経路によりＴ細胞（以下の本明細書で脾臓Ｔ細胞と呼ぶ）について濃縮し、次いで、糖尿病になったばかりのＮＯＤマウスからの脾臓細胞と共に放射線照射した６週齢の雄ＮＯＤマウスに静脈注射で共移入するか又はシクロホスファミド処理したＮＯＤ雌内に静脈注射で移入した。シクロホスファミド処理はＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症を早めた。両実験モデルにおいて、プロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞を受容したレシピエントマウスに糖尿病発症率の有意な低下が観察された。５ｘ１０6 個の脾臓Ｔ細胞が２ｘ１０7 個の「糖尿病」脾臓細胞とともに共移入された３つの実験において、移入４週間後のレシピエントにおける糖尿病の合計発症率は、オブアルブミンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞のレシピエントの６４％と比較してプロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞のレシピエントでは１４％であった（ｐ＝０．００３）（表４）。平行して、５ｘ１０6 個の脾臓Ｔ細胞を、３００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射で受容した２日後の８〜１０週齢の雌ＮＯＤマウス内に移入した。シクロホスファミドの１７日後に観察された糖尿病の最大発症率は、プロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞のレシピエントの１２．５％と比較してオブアルブミンＤＮＡ処理されたドナーからの細胞のレシピエントでは５６％であった（ｐ＝０．０２）（表５）。プロインスリンＤＮＡの筋内注射を二回受けたマウスから得た５ｘ１０6 個の脾臓Ｔ細胞をシクロホスファミド処理されたレシピエント内に注射した場合、防御は観察されなかった（表５）。
【０１２６】
鼻腔内プロインスリンIIＤＮＡを投与されたＮＯＤマウスの脾臓ＣＤ４Ｔ細胞は糖尿病の養子免疫細胞移入を抑制する  
【０１２７】
【表４】
2003512435.tif 000004
【０１２８】
＊ｐ＝０．００３、＊＊ｐ＝０．０２は、オブアルブミンＤＮＡ対照と比較してのもの、フィッシャーの正確検定      
【０１２９】
鼻腔内プロインスリンIIＤＮＡを投与されたＮＯＤマウスの脾臓ＣＤ４Ｔ細胞はシクロホスファミド誘導性糖尿病を抑制する      
【０１３０】
【表５】
2003512435.tif 000005
【０１３１】
＊ｐ＝０．００２、＊＊ｐ＝０．０４は、オブアルブミンＤＮＡ対照と比較してのもの、フィッシャーの正確検定    
【０１３２】
本発明者らは、次に、分画した脾臓Ｔ細胞集団を移入することにより防御の原因となるＴ細胞の表現型を同定することに努めた。脾臓Ｔ細胞を、磁気ＭＡＣＳマイクロビーズと結合させた抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体又は抗マウスＣＤ８モノクローナル抗体のいずれかとインキュベートし、ポジティブ選択カラム（ミルテニー社）上で精製した。ＦＡＣＳ分析によるＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の純度はそれぞれ＞９５％及び＞８５％であった。次に、４ｘ１０6 個のＣＤ４Ｔ細胞又は１ｘ１０6 個のＣＤ８Ｔ細胞のいずれかを２ｘ１０7 個の糖尿病脾臓細胞と共に６週齢の放射線照射された雄内に共移入された。移入４週間後の糖尿病の発症率は、オブアルブミンＤＮＡ処理された対照からのＣＤ４Ｔ細胞のレシピエントの７１％と比較してプロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからのＣＤ４Ｔ細胞のレシピエントでは３６％であった（ｐ＝０．０２）（表４）。対照的に、プロインスリンＤＮＡ又はオブアルブミンＤＮＡのいずれかで処理されたマウスからのＣＤ８細胞を共移入されたレシピエントでは糖尿病の発症率（９４％対８３％）に差異はなかった（表４）。４ｘ１０6 個のＣＤ４Ｔ細胞又は２．５ｘ１０6 個のＣＤ４涸渇（ＣＤ８Ｔ細胞が濃縮された）脾臓Ｔ細胞を、シクロホスファミド処理された１０週齢の雌マウス内に注射した場合に同様の結果が得られた。従って、プロインスリンＤＮＡ処理されたドナーからのＣＤ４Ｔ細胞を受容したマウスの糖尿病発症率（１７％）は、オブアルブミンＤＮＡ処理されたドナーからＣＤ４Ｔ細胞を受容したマウス（５６％）と比較して有意に低下し（ｐ＝０．０４）、一方、プロインスリンＤＮＡ又はオブアルブミンＤＮＡで処理されたドナーからのＣＤ４涸渇脾臓Ｔ細胞を受容したマウスでは糖尿病発症率の差異はなかった（表５及び表６）。
【０１３３】
【表６】
2003512435.tif 000006
【０１３４】
＊ｐ＝０．００７、＊＊ｐ＝０．４は、オブアルブミンＤＮＡ対照と比較してのもの、フィッシャーの正確検定      
【０１３５】
ヒト及びＮＯＤマウスの両方で、高血糖症の発症は「インスリン炎」の後に起き、「インスリン炎」は、該島の血管の極又は境界でのリンパ球の島周囲の蓄積からβ細胞破壊に関連した該島内への重度の浸潤まで及ぶ。次に、本発明者らは、ＮＯＤマウスの島を調べ、インスリン炎の程度が７０日齢及び１００日齢の両方でオブアルブミンＤＮＡ処理されたマウスと比べてプロインスリンＤＮＡ処理されたマウスで有意に低いことを見出した（０．８９±０．０８対１．６±０．１２、ｐ＜０．０１、マンーホイットニー試験）。
【０１３６】
当業者は本明細書に記載された本発明が具体的に記載されたもの以外の変形及び修飾を受け入れる余地があることを理解するであろう。本発明はこのようなあらゆる変形及び修飾を包含することが理解されるべきである。本発明は、この明細書中で言及し又は示した段階、特徴、組成物及び化合物の全てを個別に又は集合的に包含し、並びに任意の二つ以上の該段階若しくは特徴の任意の組合わせ又は全ての組合わせも包含する。
【０１３７】
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【０１４５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、日齢５６日におけるヒトインスリン（８０μｇ）の経鼻投与が雌ＮＯＤマウスにおける糖尿病発症開始を遅延させることを示すグラフ表示である。
【図２】  図２は、日齢５６日におけるヒトプロインスリン（４０μｇ）の経鼻投与が糖尿病開始を遅延させることを示すグラフ表示である。
【図３】  図３は、ヒトプロインスリンアミノ酸２４〜３６の経鼻投与（日齢５６日に４０μｇ）が糖尿病開始を遅延させることを示すグラフ表示である。
【図４】  図４は、エーロゾルインスリンが糖尿病の移入を抑制するＣＤ８Ｔ細胞を誘導することを示すグラフ表示である。週齢６〜９週のＮＯＤ雄マウス（ｎ＝１６／群）に、エーロゾルインスリン処理又はオバルブミン処理したＮＯＤ雌マウス由来の分画していない（Ａ）又は分画した（Ｂ〜Ｅ）脾臓細胞と共に、最近糖尿病にかかった１４〜１９週齢の雌マウス由来のプールした脾臓細胞を注射し、それらの糖尿病発症率をその後追跡監視した。示した実験では、エーロゾル供与マウスは１０連続日の間次いで４９日齢からは毎週１回処理されたが、１５６日齢で犠牲にしたときは正常血糖値であった。
【図５】  図５は、エーロゾルインスリンが糖尿病移入を抑制するＣＤ８γδＴ細胞を誘導することを示すグラフ表示である。若い雄ＮＯＤマウスに「糖尿病」脾臓細胞（２×１０7 ）と図４の説明のようにエーロゾル処理されたマウス由来の総又は分画した脾臓Ｔ細胞とを同時注射した。注射した分画細胞の数は、Ａ）で、エーロゾルインスリンマウス由来であり、約１０7 総Ｔ細胞であり、約１０7 のγδ欠失Ｔ細胞又は１．４×１０5 γδＴ細胞であり、Ｂ）では、エーロゾルインスリンマウス由来であり、約１０7 総Ｔ細胞、２×１０6 ＣＤ８Ｔ細胞、２×１０6 γδ欠失ＣＤ８Ｔ細胞又は１．５×１０5 ＣＤ８γδ陽性Ｔ細胞であった。
【図６】  図６は、糖尿病の養子免疫細胞移入はエーロゾルインスリンにより誘導されたＣＤ８γδＴ細胞により抑制されることを示す図式的表示である。１１の実験の要約である。
【図７】  図７は、ヒトプロインスリンアミノ酸２４〜３６（日齢５６日に４０μｇ）の経鼻投与がＮＯＤマウスにおいて糖尿病の養子免疫細胞移入を抑制するＣＤ４Ｔ細胞を誘導することを示すグラフ表示である。
【図８】  図８は、マウスのプロインスリンアミノ酸２６〜３４及びある程度までマウスプロインスリンアミノ酸２５〜３４がＭＨＣクラスＩ分子Ｋd に結合することを示すグラフ表示である。この検定では、ＲＭＡ−Ｓ細胞の表面でのＫd の発現がフローサイトメーター中での蛍光により検出されるモノクローナル抗Ｋd 抗体の結合によって監視される。該細胞へのＫd 結合ぺプチドの付加はＫd を安定化し、シグナル応答における右側シフトにより示されるように細胞表面でのその発現を増加させる。イソ型対照＝対照のモノクローナル抗体、ぺプチドなし＝構成的Ｋd 発現、ＨＡＰ及びＬＬＯ＝Ｋd に結合することが知られており、陽性対照として用いられたフル・ヘマグルチニン及びリステリア由来のぺプチド。
【図９】  図９は、マウスプロインスリンアミノ酸２５〜３４がＮＯＤマウスにおいてＫd に限定された細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することを示すグラフ表示である。６週齢の雌マウスを、完全フロイントアジュバント中のぺプチド５０μｇで皮下に免疫化した。１４日後にその脾臓を摘出し、脾臓細胞をイン・ビトロで１０μｇ／ｍｌのぺプチドで６日間、再刺激した。脾臓細胞を次に51Ｃｒ及びぺプチド負荷ＲＭＡ−Ｓ標的細胞に対するＣＴＬ活性についてテストした。
【図１０】  図１０Ａ及び図１０Ｂは、Ｃ−末端切断が経鼻投与のプロインスリンＢ−Ｃぺプチドの糖尿病抑制効果を増強することを示す図式的表示である。
【図１１】  図１１は、ＣＤ８Ｔ細胞を活性化してＣＴＬとするＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用の役割を含む、Ｉ型糖尿病におけるβ細胞破壊の仮定された機構を示す図式的表示である。
【図１２】  図１２は、ＣＴＬの全身プライミング（Ａ）及び経口プライミング（Ｂ）がＣＤ４０Ｌのシグナル発信を要求することを示すグラフ表示である。（Ａ）対照ｍＡｂである６Ｃ８（白抜き四角）又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ１（白丸）の２５０μｇを、ＣＴＬをプライムするためにＯＶＡ被覆Ｈ−２Ｋbm-1脾臓細胞の２０×１０6 個を静脈注射でチャレンジする１日前にＣ５７Ｂ１／６マウスに１回腹腔内注射した。１４日後にマウスを殺し、その脾臓細胞をＣＴＬ活性についてテストし、代表的個々のマウスについてＯＶＡ特異的溶解として表した。（Ｂ）６Ｃ８又はＭＲ１の同じ用量をマウスに給餌し、次いで１日おきに３日間２０ｍｇのＯＶＡを給餌した。１４日後にさらにプライミングすることなく、マウスを殺し、その脾臓細胞をＣＴＬ活性についてテストし、今度は個々のマウスの脾臓当たりの溶解ユニットとして表した（ｎ＝１２／群）。
【図１３】  図１３は、経口ＯＶＡによるＯＶＡ特異的ＣＴＬの活性化及び拡大がＣＤ４０Ｌを要求することを示すグラフ表示である。Ｌｙ５．１に対して類遺伝子的なレシピエントマウスＣ５７Ｂ１／６を、３×１０6 トランスジェニックＯＴ−Ｉ細胞（Ｌｙ５．２）で養子免疫細胞移入し、次いで対照ｍＡｂである６Ｃ８又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ１の２５０μｇを腹腔内投与した。各処理群からのマウスを次に二つの群に分け、ＰＢＳか又はＰＢＳ中の２０ｍｇＯＶＡのいずれかを１日おきに３日間に給餌した。ｍＡｂ処理は第３回目の給餌の前に繰り返した。給餌開始から１４日目にマウスを殺し、それらの脾臓中のＯＴ−Ｉ細胞の数及び表現型をフローサイトメトリーにより分析した。（Ａ）個々のマウスのドット−プロットは、ＯＴ−Ｉ細胞上でのＣＤ４４発現（左）及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）発現（右）を示す。高レベルのＣＤ４４又は低レベルのＣＤ６２Ｌを発現する細胞の百分率は対応する四半分に示してある。６Ｃ８又はＭＲ１で処理され次いでＰＢＳ又はＯＶＡを給餌された個々のレシピエントマウスにおける脾臓当たりのＯＴ−Ｉ細胞の数（Ｂ）、ＣＤ４４の発現（Ｃ）及びＣＤ６２Ｌlo（Ｄ）ＯＴ−Ｉ細胞の％は１回の実験について示されるが、類似の結果が３回の実験で得られた。
【図１４】  図１４は、抗ＣＤ４０Ｌ処理がＲＩＰ−ＯＶＡloマウスの経口ＯＶＡによる糖尿病の誘導を防止することを示すグラフ表示である。ＯＴ−Ｉ細胞及びＯＴ−II細胞を保持するＲＩＰ−ＯＶＡloマウスに、対照ｍＡｂである６Ｃ８又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ１を２５０μｇ腹腔内注射した。低用量経口耐性計画を模倣するため、次に１日おきに５日間０．５ｍｇのＯＶＡをマウスに給餌した。給餌の開始後１２日目に血中グルコースを測定し、１３ミリモル／ｌを越える価を糖尿病の診断と考えた。データは２回の実験からプールする。
【図１５】  図１は、抗ＣＤ４０Ｌ処理がＣＴＬの全身プライミングに対する経口耐性を制限しないことを示すグラフ表示である。ＯＶＡ被覆脾臓細胞での静脈内プライミング（Ａ）又はＣＦＡにおけるＯＶＡでの皮下プライミング（Ｂ）への応答としてのＣＴＬ活性は、対照ｍＡｂである６Ｃ８及び抗ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ１で処理されたマウスにおける経口ＯＶＡによって同じ様に減弱されない。マウスを６Ｃ８又はＭＲ１の２５０μｇで腹腔内注射し、次いで１日おきに３日間ＰＢＳ（黒四角）又はＰＢＳ中の２０ｍｇＯＶＡ（白丸）のいずれかを給餌した。１４日又は２１日（示していない）の後に、マウスを全身的にプライムし、７日後に殺し、それらの脾臓細胞を、ＣＴＬ活性の標準的なイン・ビトロ51Ｃｒ放出検定のために回収した。エフェクター（Ｅ）としてプライムした脾臓細胞を、標的（Ｔ）としての51Ｃｒ負荷細胞に対してテストした。それぞれのプロットは個々のマウスを表す。個々のマウスに対するＣＴＬ活性プロットを、（Ａ）におけるようにプライミング後の４回の実験（Ｃ）からそして（Ｂ）におけるようなプライミング後の２回の実験（Ｄ）からの溶解性ユニットに変換した。これらの実験では、マウスはＰＢＳか又は２０ｍｇの経口ＯＶＡのいずれかを１日おきに３日（Ｃ）又はＰＢＳか０．５ｍｇの経口ＯＶＡのいずれかを１日おきに５日間（Ｄ）投与された。
【図１６】  図１６は、抗ＣＤ４０Ｌ処理が、Ｔ細胞増殖応答（Ａ）及びＩＦＮ−γ応答（Ｂ）、又は抗体生産（Ｃ）の全身プライミングに対する経口耐性を制限しないことを示すグラフ表示である。マウス（ｎ＝３／群）に、対照ｍＡｂである６Ｃ８又は抗ＣＤ４０ＬｍＡｂであるＭＲ１の２５０μｇを腹腔内注射した。次いでそれらにＰＢＳか又はＰＢＳ中の２０ｍｇＯＶＡのいずれかを１日おきに３日間給餌した。７日後に、尾の基部にＣＦＡ中のＯＶＡ（０．１ｍｇ）を皮下注射してマウスを免疫化した。１０日後に脾臓及び鼠蹊部のリンパ節及び血清を採取して、０．１ｍｇ／ｍｌのＯＶＡ（平均値及び標準偏差は脾臓に対するもの）及び抗ＯＶＡ抗体の非存在下（黒線）又は存在下（縞模様）におけるＴ細胞増殖及びサイトカイン生産の測定を、方法の部で記載したように行なった。
【図１７】  図１７は、エーロゾルインスリンを投与されたＮＯＤマウスにおける糖尿病発症率に及ぼす抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体（ＭＲ−１）による処理の効果を示すグラフ表示である。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2003512435.tif 000007
【図２】
2003512435.tif 000008
【図３】
2003512435.tif 000009
【図４Ａ】
2003512435.tif 000010
【図４Ｂ】
2003512435.tif 000011
【図４Ｃ】
2003512435.tif 000012
【図４Ｄ】
2003512435.tif 000013
【図４Ｅ】
2003512435.tif 000014
【図５Ａ】
2003512435.tif 000015
【図５Ｂ】
2003512435.tif 000016
【図６】
2003512435.tif 000017
【図７】
2003512435.tif 000018
【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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