(57)【要約】  本発明は、10B3と称する新規なPSMA結合抗体、並びに抗体10B3の薬学的及び診断的な使用を提供する。PSMA抗体10B3は、技術水準であるPMSA結合抗体J591と交差競合せず、J591と比較して抗原シフトの誘導が減少され、種々の起源の扁平細胞癌（SCC）細胞との特有の反応性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト前立腺特異的膜抗原（PSMA）に結合することができる抗体分子又はその抗原結合性フラグメントであって、
（i）配列番号03に述べるCDRH1領域（GFTFSDFYMY）と、配列番号04に述べるCDRH2領域（TISDGGGYTSYPDSVKG）と、配列番号05に述べるCDRH3領域（GLWLRDALDY）とを含む、又は配列番号03、配列番号04若しくは配列番号05と少なくとも75%の配列同一性若しくは少なくとも80%の配列同一性を有するCDRH1、CDRH2若しくはCDRH3の配列を含む重鎖可変ドメインと、
（ii）配列番号06に述べるCDRL1領域（SASSSISSNYLH）と、配列番号07に述べるCDRL2領域（RTSNLAS）と、配列番号8に述べるCDRL3領域（QQGSYIPFT）とを含む、又は配列番号06、配列番号07若しくは配列番号08と少なくとも75%の配列同一性若しくは少なくとも80%の配列同一性を有するCDRL1、CDRL2若しくはCDRL3の配列を含む軽鎖可変ドメインと、
を含む、抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
前記重鎖可変領域が、配列番号01若しくは配列番号09に述べるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、
前記軽鎖可変領域が、配列番号02若しくは配列番号10に述べるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
請求項1に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントのヒトPSMAへの結合と競合することができる、ヒトPSMAに結合可能な抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
前記抗体分子若しくはその抗原結合性フラグメントがヒトPSMAへのJ591の結合と競合しない、又は、
前記抗体分子若しくはその抗原結合性フラグメントがPSMAに結合する場合にJ591よりも抗原シフトの誘導が減少される、又は、
前記抗体分子若しくはその抗原結合性フラグメントが扁平細胞癌（SCC）の細胞に更に結合する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
（i）請求項1〜4のいずれか一項に定義される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む可変領域であって、ヒト前立腺特異的膜抗原（PSMA）に結合することができる第1の結合部位を含む、可変領域と、
（ii）第2の結合部位を含む、抗体分子の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、
を含む、二重特異性抗体分子。
【請求項６】
前記第1の結合部位又は第2の結合部位が、T細胞又はナチュラルキラー（NK）細胞特異的な受容体分子に結合し、前記T細胞又はNK細胞特異的な受容分子が好ましくはCD3である、請求項5に記載の抗体分子。
【請求項７】
第2の結合部位を含む、抗体分子の前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、OKT3又はUCHT1の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である、請求項6に記載の抗体分子。
【請求項８】
（i）前記第1の結合部位がFabフラグメントに含まれ、前記第2の結合部位がscFvフラグメントに含まれ、又は、
（ii）前記第1の結合部位が単鎖Fvフラグメントに含まれ、第2の結合部位がFabフラグメントに含まれ、
前記Fabフラグメント及び単鎖Fvフラグメントが、CH2ドメイン及び／又はCH3ドメインを介して連結される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項９】
Fc受容体への結合を媒介することができる前記CH2ドメインの少なくとも1個のアミノ酸残基が欠損又は変異導入されている、請求項8に記載の抗体分子。
【請求項１０】
Fabフラグメントと、CH2ドメインと、scFvフラグメントとを含み、
前記Fabフラグメントがヒンジ領域を含み、
前記Fabフラグメントがヒト化10B3抗体のFabフラグメントであり、及び／又は、
前記scFvフラグメントがOKT3抗体に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記抗体分子の重鎖が配列番号12に述べる配列を有し、及び／又は、
前記抗体分子の軽鎖が配列番号13に述べる配列を有する、
請求項8又は9に記載の抗体分子。
【請求項１１】
Fabフラグメントと、CH2ドメインと、CH3ドメインと、scFvフラグメントとを含み、
前記Fabフラグメントがヒンジ領域を含み、
前記Fabフラグメントがヒト化10B3抗体のFabフラグメントであり、及び／又は、
前記scFvフラグメントがヒト化UCHT1抗体に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記抗体分子の重鎖が配列番号11に述べる配列を有する、及び／又は、
前記抗体分子の軽鎖が配列番号13に述べる配列を有する、
請求項8又は9に記載の抗体分子。
【請求項１２】
前記抗体分子が四量体抗体分子、又はホモ二量体四価の抗体分子である、請求項11に記載の抗体分子。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に定義される抗体分子又はその抗体結合性フラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
疾患の診断又は治療における使用に対する、請求項1〜13のいずれか一項に定義される抗体分子又はその抗原結合性フラグメントであって、前記疾患が癌であり、前記癌が、前立腺癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、乳癌、膵臓癌、又は扁平細胞癌である、請求項1〜13のいずれか一項に定義される抗体分子又は抗原結合性フラグメント。
【請求項１５】
疾患を診断するin vitro方法であって、
被験体から得られた試料と、請求項1〜13のいずれか一項に定義される抗体分子又はその抗原結合性フラグメントとを接触させることを含み、前記疾患が癌であり、前記癌が前立腺癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、又は扁平細胞癌である、方法。
【請求項１６】
各単量体に、
（i）重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む可変領域を含み、前記可変領域が抗原に結合することができる第1の結合部位を含む、N末端Fabフラグメントと、
（ii）ヒト化UCHT1の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むC末端scFVフラグメントと、
を含み、
（i）と（ii）がCH2及びCH3のドメインによって接続される、
四価ホモ二量体二重特異性抗体分子。
【請求項１７】
Fc受容体への結合を媒介することができるCH2ドメインの少なくとも1個のアミノ酸残基が欠損又は変異導入されている、請求項16に記載の四価二重特異性抗体分子。
【請求項１８】
前記Fabフラグメントが、非ヒト化、キメラ化、又はヒト化された10B3又はJ591の抗体のFabフラグメントではなく、前記第1の結合部位がPSMAに結合することができない、請求項16又は17に記載の四価二重特異性抗体分子。
【請求項１９】
請求項1〜15のいずれか一項に定義される抗体分子ではなく、また請求項1〜15のいずれか一項に定義される抗原結合性フラグメントではない、請求項16〜18のいずれか一項に記載の四価二重特異性抗体分子。
【請求項２０】
ヒト化UCHT1の前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、アミノ酸配列DIQMT...で開始し、...VTVSSで終了する、配列番号11に示されるUCHT1の配列を含む、請求項16〜19のいずれか一項に記載の四価ホモ二量体二重特異性抗体分子。
【請求項２１】
前記Fabフラグメントが、腫瘍関連抗原に結合する、請求項16〜20のいずれか一項に記載の四価二重特異性抗体分子。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なPSMA結合抗体を提供する。本発明のPSMA抗体は、技術水準のPMSA結合抗体J591と交差競合せず、J591と比較して抗原シフトの誘導が減少され、種々の起源の扁平細胞癌（SCC：squamous cell carcinoma）細胞との特有の反応性を有する。さらに、本発明は二重特異性PSMA×CD3抗体分子に関する。また、本発明は、核酸、ベクター、及び宿主細胞と並んで、本発明の抗体分子を製造する方法に関する。本発明は、本発明のPMSA抗体分子を使用して疾患を治療する又は診断する方法に更に関する。
【背景技術】
【０００２】
1980年代に始まる科学研究は、腫瘍関連抗原（TAA：tumor associated antigen）及びT細胞受容体（TCR）/CD3複合体に対する二重特異性抗体がT細胞を活性化することができ、活性化T細胞によってTAA発現腫瘍細胞の溶解をもたらすことを確立した（非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3）。Fc部分を介してFc受容体（FcR）に結合されたCD3抗体は、望ましくない副作用であるT細胞活性化及びサイトカイン放出の誘導において過度に効果的であることから、FcR結合を防止し、FcR媒介ではなく標的細胞に限定された（target cell restricted）T細胞活性化を可能とするため、Fc枯渇（Fc-depleted）又はFc減衰（Fc-attenuated）二重特異性TAA×CD3抗体を構築することが最も重要である（非特許文献4、非特許文献5）。
【０００３】
工業的な品質及び量においてこの極めて重要な前提条件を満たす二重特異性抗体の産生は、依然として手ごわい課題である。最近、ブリナツモマブ（Blinatumomab）と称されるCD19×CD3特異性を有する組み換え二重特異性単鎖（bssc）抗体は、ALLを有する患者の治療において著しい効率を実証し（非特許文献6）、FDAによるブレイクスルー指定（break through designation）のもと承認を得た。特に、上記薬物は、その低い血清半減期及び幾らか高い毒性のため、数週間に亘って24時間の持続点滴として適用され、安全に適用可能な用量は、確立されている単一特異性抗腫瘍抗体による治療に使用されるものよりも10000倍低い、1日当たり患者一人当たりおよそ30 μgである（非特許文献7）。その結果得られる薬物の血清濃度は、1 ng/ml未満である（非特許文献8）。また、異なる二重特異性抗体による初期の臨床試験で観察されたこの厳格な用量制限（非特許文献9、非特許文献10）は、オフターゲットT細胞活性化に起因し、全身性サイトカイン放出をもたらす。言うまでもなく、この現象は、TCR/CD3複合体を賦活する二重特異性抗体の最適な治療活性を妨げる。
【０００４】
原理的には、用量を制限するオフターゲットT細胞活性化及び結果的に生じる毒性の問題は、以下により詳細に検討される課題P1及び課題P2によって引き起こされ得て、また低血清半減期は課題P3として検討される。
【０００５】
（P1）二重特異性抗体によって標的化されるTAAは完全に腫瘍特異的ではなく、正常なTAA発現細胞に結合することにより、抗体媒介T細胞活性化をもたらす。厳密な意味では、「間違っているもの」、すなわち悪性細胞ではなく、正常であるが抗原を発現する標的細胞によって誘導されることから、これはオフターゲット活性化ではない。ブリナツモマブの標的抗原CD19は正常なBリンパ球上で発現されることから、上に言及される二重特異性CD19×CD3抗体であるブリナツモマブは確実にこの課題に直面する。言うまでもなく、悪性組織に対する標的化抗原の特異性は、この種のオフターゲットT細胞活性化を防止するのに極めて重要である。広範囲の免疫組織的評価は、正常組織上でのこの抗原の発現が、前立腺上皮、乳腺、及び腎臓の近位尿細管に限定されることを明らかにしたため、PSMAはこの点で特に好適な抗原である［human protein atlas, http://www.proteinatlas.org］。悪性組織では、前立腺癌細胞、また結腸癌、乳癌、及び膵臓癌、並びに膠芽腫等の他の様々な固形腫瘍に上記抗原が豊富に発現される（非特許文献11、非特許文献12）。しかしながら、これらの後者の腫瘍では、PSMA発現は厳密に血管系に限定され、腫瘍細胞自体を温存する（spares）。興味深いことに、今のところ腫瘍細胞上での発現を伴う唯一の腫瘍である前立腺癌において、血管系はほとんどの場合PSMA発現を欠く（非特許文献11）ことから、最適な状況、すなわち、腫瘍細胞自体と並んで血管系での発現はめったにない（P1.1）。
【０００６】
その特異性とは別に、標的抗体の別の特性は、その治療活性にとって極めて重要な場合があり、抗体は、標的細胞への抗原の「放出（shedding）」又は取り込みのいずれかにより、抗原シフトを引き起こし得る。抗体と、その活性を発揮するために通常細胞への取り込みを必要とする毒素とを含むコンストラクトである免疫毒素の場合には、抗原取り込みは望ましい。しかしながら、抗体が免疫エフェクター細胞を動員するために使用される場合、あらゆる機構による抗原シフトが抗体の活性を妨げ得る。実際、治療用CD20抗体が様々な程度に種々のリンパ腫細胞において抗原シフトを誘導すること、またこの現象は、少なくとも一部には、これらの抗体の様々な程度の治療効果を担うことが実証されている（非特許文献13）。どのような場合も、二重特異性抗体を活性化するT細胞に関連して、標的化のために最小の抗原シフトを誘導する抗体を選択することは望ましいようである（P1.2）。
【０００７】
（P2）T細胞活性化は、それが本来あるべきようには標的細胞に限定されず、すなわち、二重特異性抗体コンストラクト内の一価のCD3エフェクター結合部位であっても、抗体が自身のターゲッティング部分によって結合する標的細胞の不在下で、或る程度のT細胞活性化を誘導することがある。これは、標的抗原を持つ細胞が上記現象を誘導するために必要とされないことから、厳密な意味ではオフターゲット活性化を表す。本発明者らは、この現象が、異なるフォーマットの異なるCD3抗体が使用される場合、またT細胞活性化に対して同時刺激を提供するリンパ腫細胞（SKW6.4）又は内皮細胞（HUVEC）等の或る特定の刺激バイスタンダー細胞（SBC：stimulating bystander cells）が添加される場合、かなり変化することに気づいた。したがって、二重特異性抗体の構築に対して最小の「オフターゲット」T細胞活性化を誘導するCD3部分を選択するべきである（P2.1）。
【０００８】
純粋に単量体CD3賦活によって誘導されるT細胞活性化に加えて、最近の論文は、二重特異性抗体のターゲッティング部に関与するオフターゲット活性化に対する代替機構を示唆し、この部分がT細胞表面上の二重特異性抗体のエフェクター部分のクラスター化を誘導する単鎖フラグメントからなる場合、持続性シグナル伝達（tonic signaling）が誘導され得て、従来の短期間のin vitroアッセイではかろうじて検出可能であるが、in vivoでの効率に著しく影響を及ぼすT細胞の疲弊をもたらす可能性がある（非特許文献14）。これらの観察は、キメラ抗原受容体（CAR T細胞）でトランスフェクトされたT細胞を使用して行われた。キメラT細胞受容体は、ターゲッティング部分として単鎖抗体を含む。これらの試薬は、一旦T細胞に結合すると、対応するCARでトランスフェクトされたT細胞と機能的に等価であることから、非特許文献14の結果は、かかる標的部を有する二重特異性抗体に同様に当てはまる可能性が非常に高い。大半の単鎖抗体には多量体及び凝集塊を形成する傾向があることはこの分野でよく知られている（非特許文献15）ことから、非特許文献14によって試験されたCARのうちの1つを除く全てが、程度は様々であるもののクラスター化の現象及び持続性CD3シグナル伝達を示したことは、意外なことではない（非特許文献14）。ここ（P.2.2）で概説される課題は、ターゲッティング部の多量体化及びターゲッティング部によるクラスター化を防止する二重特異性フォーマットを必要とする。
【０００９】
（P3）大半の二重特異性フォーマットは、分子量の減少及びCH3ドメインの欠如のため非常に低い血清半減期（1時間〜3時間）に悩まされる。したがって、プロトタイプのブリナツモマブ抗体は数週間にわたる24時間の持続性静脈内点滴によって適用される。二価C末端CD3結合部分によって誘導されるオフターゲット活性化が増加する可能性があるため、図1Bに示されるIgGsc等の血清半減期が増加されたIgG系フォーマット全体の使用は不適当であるとされてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Staerz et al. Nature 1985, 314:628-631
【非特許文献２】Perez et al. Nature 1985, 316:354-356
【非特許文献３】Jung et al. Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83:4479-4483
【非特許文献４】Jung et al. Immunol Today 1988; 9:257-260
【非特許文献５】Jung et al. Eur J Immunol 1991; 21:2431-2435
【非特許文献６】Bargou et al. Science 2008, 321:974-977
【非特許文献７】Adams and Weiner. Nat Biotechnol 2005, 23:1147-57
【非特許文献８】Topp et al. J Clin Oncol 2011; 29:2493-2498
【非特許文献９】Kroesen et al. Br J Cancer 1994; 70:652-661
【非特許文献１０】Tibben et al. Int J Cancer 1996; 66:477-483
【非特許文献１１】Chang et al. Cancer Res 1999, 59:3192
【非特許文献１２】Ross et al. Cancer Met Rev 2005, 24:521
【非特許文献１３】Glennie et al. Mol Immunol. 2007; 44:3823
【非特許文献１４】Long et al. Nat Med 2015; 6:581
【非特許文献１５】Worn et al. J Mol Biol 2001, 305:989-1010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記に基づいて、当該技術分野において、上に概説される課題の少なくとも1つに対処する、改善された抗体分子が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヒト前立腺特異的膜抗原（PSMA）に結合することができる抗体分子又はその抗原結合性フラグメントであって、
（i）配列番号03に述べるCDRH1領域（GFTFSDFYMY）と、配列番号04に述べるCDRH2領域（TISDGGGYTSYPDSVKG）と、配列番号05に述べるCDRH3領域（GLWLRDALDY）とを含む、又は配列番号03、配列番号04若しくは配列番号05と少なくとも75%の配列同一性若しくは少なくとも80%の配列同一性を有するCDRH1、CDRH2若しくはCDRH3の配列を含む重鎖可変ドメインと、
（ii）配列番号06に述べるCDRL1領域（SASSSISSNYLH）と、配列番号07に述べるCDRL2領域（RTSNLAS）と、配列番号08に述べるCDRL3領域（QQGSYIPFT）とを含む、又は配列番号06、配列番号07若しくは配列番号08と少なくとも75%の配列同一性若しくは少なくとも80%の配列同一性を有するCDRL1、CDRL2若しくはCDRL3の配列を含む軽鎖可変ドメインと、
を含む、抗体分子又はその抗原結合性フラグメントに関する。
【００１３】
本発明は、また、本発明の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントのヒトPSMAへの結合と競合することができる、ヒトPSMAに結合可能な抗体分子又はその抗原結合性フラグメントに関する。
【００１４】
本発明は、
（i）本発明のPMSA結合抗体分子の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む可変領域であって、ヒト前立腺特異的膜抗原（PSMA）に結合することができる第1の結合部位を含む、可変領域と、
（ii）第2の結合部位を含む、抗体分子の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、
を含む、二重特異性抗体分子に更に関する。
【００１５】
本発明は、本発明の抗体分子又はその抗体結合性フラグメントを含む、医薬組成物に更に関する。
【００１６】
本発明は、疾患の診断又は治療における使用に対する、本発明の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントに更に関する。
【００１７】
本発明は、疾患を診断するin vitro方法であって、被験体から得られた試料と、本発明の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントとを接触させることを含む、方法に更に関する。
【００１８】
本発明は、さらに、本発明の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、及び該核酸分子又は該ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１９】
本発明は、核酸の発現を可能とする条件下で抗体分子をコードする核酸を発現することを含む、本発明の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントを製造する方法に更に関する。
【００２０】
非限定的な実施例及び添付の図面と併せて考慮される場合、本発明は、詳細な記載を参照することによって、より一層理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明で使用された様々なフォーマットの二重特異性抗体分子を示す図である。Fabscフォーマット（図1A）及びIgGscフォーマット（図1B）の二重特異性PSMA×CD3抗体が示される。両方のフォーマットにおいて、Fc受容体へのCH2ドメインの結合は、規定のアミノ酸修飾によって妨げられる。また、bssc（二重特異性単鎖Fv）フォーマットが示される（図1C）。
【図２】種々のPSMA×CD3抗体によるオフターゲットT細胞活性化を示す図である。PBMCを、SKW6.4リンパ腫細胞の不在下及び存在下で指定の抗体とインキュベートした。3日後、T細胞のCD69発現をフローサイトメトリーによって分析した。
【図３−１】3Hチミジン取り込みによって評価されるT細胞活性化を示す図である。図3Aでは標的細胞の不在下でのオフターゲットT細胞活性化が示されるのに対し、比較してみると図3BはFabscフォーマットのPSMA×CD3抗体によるオンターゲット（on-target）T細胞活性化を示し、それぞれCD3抗体であるUCHT1（NPCU）及びOKT3（NPCO）を含む。図3Cでは、Xelligence細胞傷害性アッセイによって、活性化T細胞によるPSMA発現標的細胞の溶解が実証される。
【図３−２】同上
【図４】種々の二重特異性抗体フォーマットの多量体化及び凝集を示す図である。図4A及び図4Bでは、FLT3×CD3特異性を有する抗体（Fabscフォーマット対bsscフォーマット）が比較されるのに対し、図4C〜図4Fでは、PSMA×CD3特異性を有する抗体（Fabscフォーマット対IgGscフォーマット）が比較される。ゲル濾過をSuperdex S200カラム上で行った。
【図５−１】従来技術PSMA抗体J591、及び本発明の抗体10B3のPSMA発現細胞への結合を示す図である。結合（図5A）、結合競合の欠如（図5B）、及び抗体結合によるPSMA抗原のシフト（図5C）を、PSMAトランスフェクトSp2/0細胞を使用するフローサイトメトリーによって評価した。図5Bでは、ヤギ抗ヒト二次抗体によって特異的に検出されるキメラ（ch）J591は、ネズミ科10B3ではなくネズミ科（mu）J591によって打ち負かされた（out-competed）ことが実証される。
【図５−２】同上
【図６】従来技術の抗体J591及び本発明の10B3抗体を結合するPSMAによって染色されたクライオスタット切片を示す図である。図6A及び図6Bでは前立腺癌試料を平行して両抗体と、ドイツ国ベルリンのZytomed製のポリマーシステム（POLHRP-100）で染色したのに対し、図6C及び図6Dでは扁平細胞癌試料をZytomed製のポリマーシステムを使用して、平行して2つの抗体で再度染色した。矢印は、腫瘍間質（Tu）及び血管（Ve）を示す。10個の前立腺癌試料のうち9個、及び10個の扁平細胞癌試料のうちの7個からの代表的な結果を示す。様々な異なる健常ヒト組織（ドイツ国ハイデルベルクBioCatから入手した、T6234701-2）に対して、2つの抗体の染色パターンは、皮膚の上皮細胞との10B3の弱い反応性を除いて同一であった。
【図７】ヒト化及びマウスの10B3抗体分子の結合を示す図である。ヒト化CDR移植（h10B3）可変ドメイン、又はマウス（m10B3）抗体可変ドメインのいずれかを含むPSMA×CD3（10B3×OKT3）特異性を有する二重特異性Fabsc抗体分子を、PSMA発現22RV1細胞と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。
【図８】種々のPSMA×CD3抗体のCD3のターゲッティング部の結合を示す図である。CD3陽性Jurkat細胞を指定の抗体と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。
【図９】種々のPSMA抗体の細胞溶解活性を示す図である。PSMA発現22RV1前立腺癌細胞を、PBMC:標的の比率5:1でPBMC及び指定の二重特異性PSMA×CD3抗体と共にインキュベートした。接着性標的細胞の生存率を、Xelligenceシステムを使用して評価した。異なる健康なボランティアのPBMCを用いる4つの異なる実験のうちの1つの代表的な結果を示す。
【図１０】ネズミ科及びヒト化の10B3抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す図である。図10Aは、ネズミ科10B3抗体（配列番号01）の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR配列を下線で示す。図10Bは、ネズミ科10B3抗体（配列番号02）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR配列を下線で示す。図10Cは、ネズミ科抗体10B3の重鎖のCDRループ（CDRH1、CDRH2及びCHDR3）が重鎖生殖細胞系列配列IGHV3-11*06（配列番号09）の可変ドメインに移植されているヒト化10B3抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR配列を下線で示す。さらに、重鎖生殖細胞系列配列IGHV3-11*06の49位に存在するセリン残基を、配列番号9の可変ドメインにおいてネズミ科抗体10B3に存在するアラニンへと復帰突然変異する。図10C）中、49位のこのアラニン残基を太字及びイタリック体で強調する。図10Dは、抗体10B3の軽鎖のCDRループ（CDRL1、CDRL2、CDRL3）がヒトκ軽鎖（light chain）配列IGKV3-20*02（配列番号10）の可変ドメインに移植されている、ヒト化10B3抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR配列を下線で示す。さらに、IGKV3-20*02のヒト軽鎖配列の可変ドメインの配列位置72に存在するフェニルアラニンを、配列番号10の可変ドメインにおいて、ネズミ科抗体10B3のこの配列位置に存在するチロシン残基に復帰突然変異する。図10D中、72位のこのチロシン残基を太字及びイタリック体で強調する。
【図１１】PSMA（ヒト化h10B3）×CD3（ヒト化hUCHT1）二重特異性IgGscフォーマット抗体分子の重鎖のアミノ酸配列（配列番号11）を示す図である。重鎖は、10B3のヒト化重鎖（HC）可変領域と、IgG1 CH1ドメインと、IgG1ヒンジ領域と、改変IgG1 CH2ドメインと、IgG1 CH3ドメインと、ヒト化CD3（UCHT1）単鎖Fvフラグメントとを含む。
【図１２】PSMA（ヒト化h10B3）×CD3（ネズミ科OKT3）二重特異性Fabscフォーマット抗体分子の重鎖のアミノ酸配列（配列番号12）を示す図である。重鎖は、10B3のヒト化HC可変領域と、IgG1 CH1ドメインと、IgG1ヒンジ領域と、改変IgG1 CH2ドメインと、IgG1 CH3ドメインの開始と、ネズミ科CD3（OKT3）単鎖Fvフラグメントとを含む。
【図１３】PSMA（ヒト化h10B3）抗体のカッパー軽鎖のアミノ酸配列（配列番号13）を示す図である。この軽鎖は、配列番号11及び配列番号12の重鎖コンストラクトを完成して、それぞれh10B3×UCHT1 IgGsc分子及びh10B3×OKT3 Fabsc分子を形成する（図1を参照されたい）。
【図１４】抗体J519の可変ドメインのアミノ酸配列を示す図であり、図14Aは抗体J519の重鎖の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号15）を示し、図14Bは抗体J519の軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号16）を示す。
【図１５−１】in vitroでの本発明の二重特異性抗体の治療効果を示す図である。本発明のPSMA（ヒト化h10B3）×CD3（ヒト化hUCHT1）二重特異性IgGscフォーマット抗体分子及び対照二重特異性抗体（NG2×CD3）を、腫瘍細胞と共に又は腫瘍細胞なしでPBMCの存在下でインキュベートした。
【図１５−２】同上
【図１６−１】マウスモデルにおける、本発明のPSMA（ヒト化h10B3）×CD3（ヒト化hUCHT1）二重特異性IgGscフォーマット抗体分子のin vivoでの抗腫瘍活性を示す図である。
【図１６−２】同上
【図１６−３】同上
【図１７】抗CD3特異性としてUCHT1を有する非PSMAターゲッティング二重特異性IgGsc抗体のT細胞活性化及び腫瘍細胞増殖阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ヒト前立腺特異的膜抗原（PSMA：human prostate specific membrane antigen）に結合することができる抗体、抗体分子又はその抗原結合性フラグメントに関する。上記抗体、抗体分子又はその抗原結合性フラグメントは、（i）配列番号3に述べるCDRH1領域（アミノ酸配列GFTFSDFYMYを有する）と、配列番号4に述べるCDRH2領域（アミノ酸配列TISDGGGYTSYPDSVKGを有する）と、配列番号5に述べるCDRH3領域（アミノ酸配列GLWLRDALDYを有する）とを含む、又は配列番号3、配列番号4、若しくは配列番号5と少なくとも75%の配列同一性若しくは少なくとも80%の配列同一性を有するCDRH1、CDRH2、若しくはCDRH3の配列を含む、重鎖可変ドメインを含む。上記抗体、抗体分子又はその抗原結合性フラグメントは、（iii）配列番号6に述べるCDRL1領域（アミノ酸配列SASSSISSNYLHを有する）と、配列番号7に述べるCDRL2領域（アミノ酸配列RTSNLASを有する）と、配列番号8に述べるCDRL3領域（アミノ酸配列QQGSYIPFTを有する）とを含む、又は配列番号6、配列番号7、若しくは配列番号8と75%の配列同一性若しくは80%の配列同一性を有するCDRL1、CDRL2、若しくはCDRL3の配列を含む軽鎖可変ドメインを更に含む。配列番号3に述べるCDRH1領域と、配列番号4に述べるCDRH2領域と、配列番号5に述べるCDRH3領域と、配列番号6に述べるCDRL1領域と、配列番号7に述べるVLCDL2領域と、配列番号8に述べるVLCDL3領域とを含む抗体分子が本発明によって想定される。これに関連して、本発明の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントは、ヒトPSMAへの抗体J591の結合と競合しないことが好ましいことに留意されたい（最も高度に発達した臨床用の抗体、Liu et al., Cancer Res 1997; 57: 3629-34, Akhtar et al "Prostate-Specific Membrane Antigen-Based Therapeutics", Advances in Urology Volume 2012 (2012), Article ID 973820の総説を参照されたい）。さらに、本発明の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントは、J591と比較してPSMAに対して結合する場合、抗原シフトの誘導が減少され得る。また、種々の起源の扁平上皮癌細胞との特有の反応性を発揮し得る。
【００２３】
本発明は、配列番号01又は配列番号09に述べるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む（comprising）、抗体、抗体分子、又はその抗原結合性フラグメントに更に関する。また、軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号02又は配列番号10に述べるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体、抗体分子、又はその抗原結合性フラグメントが本発明によって包含される。特に、それぞれ配列番号01及び配列番号02に述べるネズミ科抗PSMA抗体10B3（m10B3）の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、抗体、抗体分子、又はその抗原結合性フラグメントが好ましい。また、それぞれ配列番号09及び配列番号10に述べるヒト化抗PSMA抗体10B3（h10B3）の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、抗体、抗体分子、又はその抗原結合性フラグメントが好ましい。
【００２４】
PSMAは抗体を媒介とするターゲッティングに特に魅力的な抗原であり、このタンパク質の細胞外の部分に対する幾つかの抗体が開発されている。最も高度な試薬であるJ591（Liu et al., Cancer Res 1997; 57: 3629-34）は、放射性同位体による標識、又はチューブリン阻害化合物であり、マイタシン（maytasine）の誘導体である毒素DM1への結合のいずれかにより、現在臨床試験で評価されている（Ross JS, et al. Cancer Met Rev 2005; 24:521、上記Akhtar et al, 2012）。本発明のPSMA抗体は、健常なヒト組織と同一の反応パターンを有する。しかしながら、本発明のPSMA抗体は異なる起源の扁平上皮癌細胞とのその反応において抗体J591とは異なる。驚いたことに、前立腺の癌と同様に、これらの腫瘍において、腫瘍細胞自体と、その腫瘍の内部及びその周囲の血管の両方が、配列番号3〜配列番号8（図6を参照されたい）に示される重鎖及び軽鎖の可変ドメインのCDR配列を含む、抗体10B3等のPMSA抗体によって染色されることが、本発明で見出された。扁平上皮癌は、20%〜30%の肺腫瘍と並んで、耳鼻咽喉のコンパートメント、食道及び子宮頸部に生じる大半の癌を構成し、かかる腫瘍でのPSMA発現は以前に記載されていない。したがって、これらの癌との本発明の抗体の好都合な反応性は、拡大され、改善された診断及び治療の選択肢を提供する。
【００２５】
PSMA抗体J591及び本発明の抗体は、別の重要な点で異なる。一般に、例えば生物活性を発揮するのに細胞への取り込みを必要とする免疫毒素の構築のため、標的細胞への結合によって、多くの抗体が望ましい特性である著しい抗原シフトを誘導する。ベンチマークPSMA抗体J591は、例えば、かかる目的に使用される（上記非特許文献12）。しかしながら、免疫学的エフェクター細胞の動員が望ましい場合、細胞中への抗原の急速な取り込みよりも、抗原の安定した発現の方が好ましい。図5は、PSMAトランスフェクトSp2/0細胞への本発明の抗体の結合が、J591の結合に匹敵し（図5A）、2つの抗体は互いに交差競合しないことを実証し、それらがPSMA分子の異なるエピトープに結合することを示す（図5B）。最も重要なことには、本発明の抗体は、J591と比較した場合、減少した抗原シフトを誘導する（図5C）。しかしながら、これに関連して、抗体10B3が結合するPMSA上のエピトープはまだ知られないことに留意されたい。また、これに関して、抗体10B3が扁平上皮癌細胞上で結合するエピトープは、特にPMSA発現が扁平上皮癌細胞上でまだ報告されていないことから、必ずしもPMSA上のエピトープと同じでなくてもよいという点に留意されたい。したがって、本発明の抗体分子が扁平上皮癌細胞上で結合するエピトープ（複数の場合もある）は、それらのアミノ酸配列又はそれらの配置に関してPMSA上のエピトープと関連づけられ得るに過ぎない。しかしながら、本発明の抗体分子が本明細書に記載されるPMSAを発現する細胞又は扁平上皮癌細胞に結合する限り、PMSA又は扁平上皮癌細胞上のそれぞれのエピトープの性質は本発明では関連が無い。またここで、細胞への本発明の抗体分子の結合が、必ずしも生理学的反応を惹起しなくてもよいことに留意されたい。むしろ、本発明の抗体が所与の細胞（上に提示されるエピトープ）に結合するだけで十分である。例えば、毒素又は放射性リガンド等の（such as）細胞傷害性物質に複合化される場合、抗体は、治療目的のため、細胞傷害性物質がその細胞傷害性（細胞殺傷）活性をはたらかせるべき細胞に細胞傷害性物質を運ぶ送達部分又はターゲッティング部分としてはたらく。同様に、診断目的で使用される場合、本発明の抗体は、抗体が結合した細胞の検出に使用され得る検出可能なシグナルを提供する画像化部分に複合化され得る。
【００２６】
また、本発明は、CDR移植（CDR grafting）によってヒト化された、10B3のヒト化変種を提供し、これはネズミ科抗体10B3のCDR領域がヒト抗体の重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域に挿入されることを意味する。原理では、任意の可変ヒト軽鎖及び／又は可変重鎖はCDR移植に対する足場としてはたらくことができる。本発明のヒト化抗体の或る一つの実例では、抗体10B3の軽鎖のCDR領域（配列番号6〜配列番号8のCDRループを意味する）を、アクセッション番号L37729のもとIMGT/LIGMデータベースに寄託されるヒトκ軽鎖配列IGKV3-20*02（の可変ドメイン）に挿入してもよく、また、Ichiyoshi Y., Zhou M., Casali P. A human anti-insulin IgG autoantibody apparently arises through clonal selection from an insulin-specific 'germ-line' natural antibody template. Analysis by V gene segment reassortment and site-directed mutagenesis' J. Immunol. 154（1）:226-238 （1995）を参照されたい。本発明のヒト化抗体の別の実例では、抗体10B3の重鎖のCDR領域（配列番号3〜配列番号5のCDRループを意味する）は、アクセッション番号AF064919のもとIMGT/LIGMデータベースに寄託される重鎖配列IGHV3-11*06（の可変ドメイン）に含まれ得る（また、Watson C.T., et al. Complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy-chain variable, diversity, and joining genes and characterization of allelic and copy-number variation.Am. J. Hum. Genet. 92（4）:530-546 （2013）を参照されたい）。本明細書に記載されるヒト化抗体の更に例示される実施形態では、抗体10B3の重鎖のCDRループは、重鎖生殖細胞系列配列IGHV3-11*06の可変ドメインに移植され、抗体10B3の軽鎖のCDRループは、ヒトκ軽鎖配列IGKV3-20*02の可変ドメインに移植される。親ネズミ科抗体10B3の結合特性を維持するため、ヒトフレームワークの残基を、ネズミ科抗体10B3の特定の配列位置に存在するアミノ酸残基に復帰突然変異することができる場合がある。かかるヒト化抗体の実例において、IGHV3-11*06のヒト生殖細胞系列配列の重鎖の可変ドメインでは、49位のセリンがネズミ科抗体10B3中に存在するアラニンへと復帰突然変異されたのに対し（49位のアラニン残基が太字及びイタリック体で強調される図10Cも参照されたい）、IGKV3-20*02の軽鎖配列の可変ドメインでは、ヒト生殖細胞系列配列の配列位置72のフェニルアラニンがネズミ科抗体10B3中のこの配列位置に存在するチロシン残基へと復帰突然変異された（72位のチロシン残基が太字及びイタリック体で強調される図10Dも参照されたい）。二重特異性Fabsc抗体に組み込まれたかかるヒト化抗体は、マウスの親抗体（図7を参照されたい）とPSMA発現細胞株に対して同じ結合活性で結合する。
【００２７】
「抗体」の用語は、一般的には、免疫グロブリンに基づくタンパク質性結合分子を指す。かかる抗体の典型例は、結合特異性を保持する免疫グロブリンの誘導体又は機能性フラグメントである。抗体及び抗体フラグメントの産生に関する技術は当該技術分野でよく知られている。また、「抗体」の用語は、免疫グロブリンの（Igの）種々のクラス（すなわちIgA、IgG、IgM、IgD、及びIgE）及びサブクラス（IgG1、lgG2等）を含む。また上に言及されるように、抗体誘導体又は抗体分子の実例として、Fabフラグメント、F（ab’）2、Fvフラグメント、単鎖Fvフラグメント（scFv）、ダイアボディ（diabodies）、又はドメイン抗体が挙げられる（Holt LJ et al., Trends Biotechnol. 21（11）, 2003, 484-490）。また、したがって「抗体」の用語の定義は、キメラ抗体、単鎖抗体、及びヒト化抗体等の実施形態を含む。
【００２８】
本明細書で使用される「抗体分子」は、免疫グロブリンM、免疫グロブリンG、免疫グロブリンA、免疫グロブリンD、又は免疫グロブリンEの対応する天然起源のドメインと少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を有する、1以上のドメインを持ち得る。この点に関して、本明細書で使用される「約」又は「およそ」の用語は、所与の値又は範囲の20%以内の偏差、例えば10%以内、又は5%以内の偏差を意味する。
【００２９】
本発明で使用される「パーセント（%）配列同一性」は、同一の残基対のパーセンテージ、すなわち、これらの2つの配列のより長い残基数に関して、以下の本発明のポリペプチドの配列と目的の配列との相同性アラインメントを意味する。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のアラインメントは、例えばBLAST、ALIGN、又はMegalign（DNASTAR）のソフトウェア等の公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して当該技術に含まれる様々な方法で達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長に亘って最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するのに適切なパラメーターを決定することができる。本明細書に開示されるヌクレオチド配列についても同じである。これに関連して、本明細書に記載される少なくとも75%又は少なくとも80%の配列同一性が本発明の抗体のCDR配列に関して例証される。まずCDRH 1を参照すれば、本発明の抗体は、CDRH1配列GFTFSDFYMY（配列番号3）又はこの配列と80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。このCDRH1配列は、10個のアミノ酸長を有することから、これらの10個の残基のうちの2個は、配列番号3に対して80%の配列同一性を有するように置き換えられ得る。例えば、CDR H1の3位のスレオニン残基をセリンによって置き換える（保存的置換を作製する）ことができ、CDRH1の5位でのセリン残基をスレオニン残基によって置き換える（保存的置換によるものも意味する）ことができる。したがって、配列番号3に関してこれら2個の保存的アミノ酸の交換を持つCDRH1の得られる配列GFSFTDFYMY（配列番号14）は、配列番号3の配列に対して80%の配列同一性を有するのに対し、これらの2個の保存的置換の1つのみが作製されるCDR H1配列は、配列番号3の配列と90%の配列同一性を有する。同様に、配列番号04に述べるCDRH2の配列（TISDGGGYTSYPDSVKG）は17個のアミノ酸残基を含み、80%の配列同一性は、（20%が3.4個の異なるアミノ酸に理論上相当することから）配列番号04の配列に関して3個までの突然変異を可能とする。例えば、配列番号4の第1のスレオニン残基はセリンにより置き換えられ得る。同様に、配列番号05に述べるCDRH3領域（GLWLRDALDY）は、10個のアミノ酸残基長を有する。したがって、配列番号05（GLWLRDALDY）に対して80%又は90%の配列同一性を有するCDRH3配列は、配列番号5と比較して、2個のアミノ酸の置き換え、例えば保存的置換を含み得る。配列番号06に述べるCDRL1領域（SASSSISSNYLH）は12個のアミノ酸残基を含む。したがって、配列番号06のアミノ酸配列と比較して、1個又は2個のアミノ酸置換を持つCDRL1配列は、配列番号06の配列に対して80%超の配列同一性を有する。配列番号07に述べるCDRL2領域（RTSNLAS）は、7個のアミノ酸残基長を有する。したがって、配列番号7のCDRL2配列と比較して、1個のアミノ酸置換を含むCDRL2配列は、配列番号07に対して84%の配列同一性を有する。最後に、配列番号08に述べるCDRL3領域（QQGSYIPFT）は、9個のアミノ酸残基長を有する。したがって、配列番号08の配列と比較して1個の置換されたアミノ酸を含むCDRL3配列は、配列番号08に対して89%の配列同一性を有し、配列番号08と比較して2個のアミノ酸置換を含むCDL3配列は、配列番号08の配列に対して78%の配列同一性を有する。上の説明及び本明細書に記載されるCDR領域の配列��ら、当業者は、本明細書に記載されるCDRH1、CDRH2、CDHL3、CDRL1、CDRL2、及びCDRL3（配列番号03〜配列番号08）のいずれかの配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、それはPMSA、また好ましくは本明細書に記載される扁平上皮癌細胞を結合するために結合することができる任意の配列が本発明に包含されることを理解する。配列番号03〜配列番号08のいずれかのそれぞれのCDR配列に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、又は少なくとも90%の配列同一性を有するCDR配列が1以上の保存的突然変異を含むことが好ましいが、抗体がPMSA、好ましくは扁平上皮癌細胞にも結合する能力を保持する限り、本発明の抗体の6つの「親」CDR領域（配列番号3〜配列番号8）のいずれかの配列に対する偏差、したがって、75%以上の配列同一性はCDR領域中の非保存的突然変異の存在に起因するものである可能性もある。
【００３０】
本明細書で使用される場合「免疫グロブリン」は、典型的には、各々およそ25 kDaの2本の軽（L）鎖と、各々およそ50 kDaの2本の重（H）鎖とで構成される四量体のグリコシル化タンパク質である。ラムダ及びカッパーと称される2種類の軽鎖は、免疫グロブリンにおいて見られ得る。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを5つの主なクラス、すなわちA、D、E、G、及びMに割り当てることができ、これらの幾つかは例えばIgG1、lgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2のサブクラス（アイソタイプ）に更に分割され得る。IgM免疫グロブリンは、J鎖と称される追加のポリペプチドと共に5個の基本的なヘテロ四量体単位からなり、10個の抗原結合部位を含むのに対し、IgA免疫グロブリンは、重合してJ鎖と共同して多価集合体を形成することができる、2個〜5個の基本的な4本鎖単位を含む。IgGの場合、4本鎖単位は一般に約150000ダルトンである。
【００３１】
IgGクラスの免疫グロブリンにおいて、重鎖には幾つかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書では、「免疫グロブリン（Ig）ドメイン」により、明確に異なる三次元構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。IgG抗体に関連して、IgGアイソタイプは各々3つのCH領域を有し、Kabat et al.のEUインデックスに従って「CH1」は118位〜220位を指し、「CH2」は237位〜340位を指し、「CH3」は341位〜447位を指す。本明細書では、「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」又は「免疫グロブリンヒンジ領域」又は「H」は、抗体の第1の定常ドメインと第2の定常ドメインとの間のアミノ酸を含む柔軟なポリペプチドを意味する。構造上、IgG CH1ドメインはEU位の220で終了し、IgG CH2ドメインは残基EU位の237で開始する。したがって、IgGについては、ヒンジは本明細書において221位（IgG1中のD221）〜236位（IgG1中のG236）を含むと定義され、ここで、ナンバリングはKabat et al.のEUインデックスに従う。本明細書で定義される定常重鎖は、CH1ドメインのN末端からCH3ドメインのC末端までを指すため118位〜447位を含み、ここで、ナンバリングはEUインデックスに従う。
【００３２】
「可変」の用語は、それらの配列において可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する免疫グロブリン領域の部分（すなわち、「可変ドメイン（複数の場合もある）」）を指す。可変性は、抗体の可変ドメインを通して均一に分散されるものではなく、重鎖及び軽鎖の可変領域の各々のサブドメインに集中される。これらのサブドメインは、「超可変領域」、「HVR」、又は「HV」、又は「相補性決定領域」（CDR）と称される。可変ドメインのより保存された部分（すなわち、非超可変部分）は、「フレームワーク」領域（FR）と呼ばれる。天然起源の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、βシート構造を接続する、また幾つかの場合にはその一部を形成するループを形成する3つの超可変領域によって接続される、大部分がβシート配置をとる4つのFR領域を含む。各鎖中の超可変領域はFRと隣接して共に保持され、他の鎖に由来する超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al.を参照されたい、また下記を参照されたい）。一般に、天然起源の免疫グロブリンは、VH（H1、H2、H3）に3つとVL（L1、L2、L3）に3つの6つのCDRを含む（以下を参照されたい）。天然起源の免疫グロブリンでは、H3及びL3は6つのCDRの中で最も広範囲な多様性を示し、特にH3は免疫グロブリンに対して微細特異性を与える際に特有の役割を果たすと考えられる。定常ドメインは直接抗原結合に関与しないが、例えば抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害、及び補体活性化等の様々なエフェクター機能を示す。
【００３３】
「VH」（VHとも称される）及び「VL」（VLとも称される）の用語は、免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをそれぞれ指すため本明細書で使用される。免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の可変領域は、3つの超可変領域が間に入る「フレームワーク」領域からなる。したがって、「超可変領域」の用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」に由来するアミノ酸残基を含む。免疫グロブリンの可変部分には3本の重鎖及び3本の軽鎖CDR（又はCDR領域）が存在する。したがって、本明細書で使用される「CDR」は、適切な場合には、3本全ての重鎖CDR（CDRH1、CDRH2及びCDRH3）若しくは3本全ての軽鎖CDR（CDRL1、CDRL2及びCDRL3）、又は全ての重鎖と全ての軽鎖のCDRの両方を指す。3つのCDRが軽鎖可変領域の結合特性を構成し、別の3つが重鎖可変領域の結合特性を構成する。CDRは、免疫グロブリン分子の抗原特異性を決定し、足場領域又はフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分離される。正確な定義的なCDRの境界及び長さは、異なる分類及びナンバリング方式によって左右される。抗体の構造及びタンパク質フォールディングは他の残基が抗原結合領域の一部と考えられ、当業者によってそのように理解され得ることを意味し得る。CDRは、抗原又はエピトープへの免疫グロブリンの結合に対して多数の接触残基（contact residues）を提供する。
【００３４】
CDR3は、典型的には、抗体結合部位内の分子の最も大きな多様性の源である。H3は、例えば、2個のアミノ酸残基まで短くなり得るか、又は26個のアミノ酸よりも大きくなり得る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当該技術分野において良く知られている。抗体構造の総説については、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988を参照されたい。当業者は、各サブユニット構造、例えばCH、VH、CL、VL、CDR、FRの構造が、活性フラグメント、例えばVH及びVLの部分を含むこと、又はCDRサブユニットが抗原、すなわち抗原結合性フラグメント、若しくは例えばFc受容体及び／又は補体に結合する及び／又はそれらを活性化するCHサブユニットの部分に結合することを認識する。CDRは、典型的には、Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services （1991）, eds. Kabat et al.に記載されるKabat CDRを指す。抗原結合部位の特性評価に対する別の基準は、Chothiaによって記載される超可変ループを指す。例えば、Chothia, et al. （1992; J. MoI. Biol. 227:799-817、及びTomlinson et al. （1995）EMBO J. 14:4628-4638を参照されたい。更に別の基準は、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されるAbMの定義である。一般的には、例えば、Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In: Antibody Engineering Lab Manual （Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg）を参照されたい。代替的には、Kabat CDRに関して記載される実施形態を、Chothia超可変のループ又はAbMで定義されるループに関して同様に記載される関係を使用して実施することができる。
【００３５】
対応する免疫グロブリンミュー重鎖、ガンマ重鎖、アルファ重鎖、デルタ重鎖、イプシロン重鎖、ラムダ軽鎖、又はカッパー軽鎖は、齧歯動物種を含む哺乳動物種、両生動物、例えば、カエル、ヒキガエル、サンショウウオ、若しくはイモリを含む、例えば平滑両生亜綱（subclass Lissamphibia）の、又は無脊髄動物種等の任意の種であってもよい。哺乳動物の例として、限定されないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハリネズミ、カモノハシ、アメリカナキウサギ、アルマジロ、イヌ、キツネザル、ヤギ、ブタ、雌ウシ、オポッサム、ウマ、コウモリ、ウッドチャック、オランウータン、アカゲザル、ウーリーモンキー、マカク、チンパンジー、タマリン（ワタボウシタマリン（saguinus oedipus））、マーモセット、又はヒトが挙げられる。
【００３６】
本明細書で言及されるように、免疫グロブリンは、典型的には、ジスルフィド結合によって連結される少なくとも2本の重（H）鎖及び2本の軽（L）鎖、又はそれらの抗原結合部分を含む、糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではVHと略記する）及び重鎖定常領域を有する。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域は3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略記する）及び軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は1個のドメインCLを含む。VH領域及びVL領域を、フレームワーク領域（FR）と称される、より保存される領域に散在する、相補性決定領域（CDR）と称される超可変領域に更に分けることができる。CDRは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う大半の残基を含む。VH及びVLはそれぞれ、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順にアミノ末端からカルボキシ末端に並んだ3個のCDR及び4個のFRを有する。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原のエピトープと相互作用する結合ドメインを含む。
【００３７】
「フレームワーク領域」又は「FR」の残基は、超可変領域以外のそれらの可変ドメイン残基である。異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種において比較的保存される。したがって、「ヒトフレームワーク領域」は、天然起源ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に対して、実質上同一（約85%以上、通常90%〜95%以上）のフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成成分である軽鎖と重鎖が組み合わされたフレームワーク領域は、CDRを配置し整列させる役目を果たす。CDRは主として抗原のエピトープへの結合を担う。
【００３８】
「Fab」、「Fab領域」、「Fab部分」、又は「Fabフラグメント」の用語は、VH、CH1、VL、及びCLの免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを定義すると理解される。Fabは、分離してこの領域を指してもよく、又は全長免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメントと並んで、抗体分子に関連してこの領域を指してもよい。典型的には、Fab領域は、抗体の軽鎖全体を含む。Fab領域は、免疫グロブリン分子の「アーム」を定義すると理解され得る。Fab領域は、そのIgのエピトープ結合部分を含む。天然起原の免疫グロブリンのFab領域を、パパイン分解によるタンパク質分解フラグメントとして得ることができる。「F（ab’）2部分」は、ペプシン消化免疫グロブリンのタンパク質分解フラグメントである。「Fab’部分」は、F（ab’）2部分のジスルフィド結合を還元して得られた生成物である。本明細書で使用される「Fab」、「Fab領域」、「Fab部分」、又は「Fabフラグメント」の用語は、抗体アームのC末端を定義するヒンジ領域を更に含み得る。このヒンジ領域は、抗体分子のアームがYと定義されると理解され得る、全長免疫グロブリン内のCH1ドメインのC末端に見られるヒンジ領域に対応する。ヒンジ領域の用語は、免疫グロブリンがこの領域において或る程度の柔軟性を有することから、当該技術分野で使用される。本明細書で使用される「Fab重鎖」は、VH及びCH1を含むFabフラグメントのその部分又はポリペプチドとして理解されるのに対し、本明細書で使用される「Fab軽鎖」は、VL及びCLを含むFabフラグメントのその部分又はポリペプチドとして理解される。
【００３９】
「Fc領域」又は「Fcフラグメント」の用語は、天然配列のFc領域及び変異体Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために本明細書で使用される。Fc部分は、抗体のエフェクター機能、例えば補体系及びNK細胞等のFc受容体を持つ免疫エフェクター細胞の活性化を媒介する。ヒトIgG分子では、Fc領域は、Cys226に対してパパインで切断されたN末端によって生成される。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化する可能性があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226位のアミノ酸残基から又はPro230からそのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Fc領域のC末端リジン（EUナンバリングシステムによる残基447）は、例えば抗体分子の産生若しくは精製の間、又は抗体分子の重鎖をコードする核酸を組み替え操作することにより除去され得る。天然配列のFc領域として、哺乳動物、例えばヒト又はネズミ科のIgG1、IgG2（IgG2A、IgG2B）、IgG3、及びIgG4が挙げられる。Fc領域は抗体のクラスに応じて、2個又は3個の定常ドメインを含む。免疫グロブリンがIgGである実施形態では、Fc領域にはCH2ドメインとCH3ドメインがある。
【００４０】
「単鎖可変フラグメント」（scFv）の用語は、免疫グロブリンの重鎖（VH）及び軽鎖（VL）の可変領域が共に融合され、10個〜約25個のアミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される抗体フラグメントを定義するため、本明細書で使用される。リンカーは、溶解度に対するセリン又はスレオニンと同様に、柔軟性のため通常グリシンに富み、VHのN末端をVLのC末端に接続し得るか、又はVLのN末端をVHのC末端に接続し得るかのいずれかである。scFvフラグメントは、特異性抗原結合部位を保持するが、免疫グロブリンの定常ドメインを欠く。
【００４１】
「抗原決定基」としても知られる「エピトープ」の用語は、抗体又はT細胞受容体が特異的に結合することにより複合体を形成する、抗原の部分を指す。したがって、「エピトープ」の用語は、免疫グロブリン又はT細胞受容体への特異的結合が可能な任意の分子又はタンパク質の決定基を含む。本明細書に記載される抗体分子の結合部位（複数の場合もある）（パラトープ）は、標的構造に特有の立体構造エピトープ又は連続エピトープ（conformational or continuous epitopes）と特異的に結合／相互作用し得る。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面の分類（groupings）からなり、通常、特定の電荷の性質と並んで、特定の三次元構造の性質を有する。幾つかの実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニル等の分子の化学的に活性な表面の分類を含み、或る特定の実施形態では、特定の三次元構造の性質及び／又は特定の電荷の性質を有し得る。ポリペプチド抗原に関して、配座エピトープ又は不連続エピトープは、一次配列で分離される2個以上の個別のアミノ酸残基の存在を特徴とするが、ポリペプチドが天然タンパク質／抗原へと折り畳まれる際には、分子表面で一貫した構造を構築する（SeIa, M., Science （1969）166, 1365-1374、Laver, W.G., et al. Cell （1990）61, 553-556）。エピトープに寄与する2個以上の個別のアミノ酸残基は、1以上のポリペプチド鎖の別々の区分に存在し得る。これらの残基は、ポリペプチド鎖（複数の場合もある）がエピトープを構成する三次元構造へと折り畳まれる際に分子の表面で一体となる。対照的に、連続的な又は直鎖のエピトープは、2個以上の個別のアミノ酸残基からなり、それはポリペプチド鎖の単一の直鎖セグメント中に存在する。
【００４２】
またこの文脈において、「に対する（directed to）」としても使用される、「特異的」又は「特異的に結合」の用語は、本発明と関連して、抗体又は免疫受容体フラグメントが、特定の抗原若しくはリガンド、又は特定の抗原若しくはリガンドのセットと特異的に相互作用する及び／又はそれらと結合することができるが、他の抗原又はリガンドと本質的に結合しないことを意味する。かかる結合は、「鍵と錠の原理」の特異性によって例証され得る。抗体が交差競合する場合、抗体は「同じエピトープに結合する」と言われることから、1つの抗体だけが所与の時間点でエピトープに結合することができる、すなわち、1つの抗体が他の抗体の結合又は調節効果を妨げる。
【００４３】
典型的には、結合親和性が10-6 M超又は10-7 M超である場合、結合は特異的であるとされる。特に、結合親和性が約10-8 M（KD）〜10-11 M（KD）、又は約10-9 M〜10-11 M以上である場合、結合は特異的であるとされる。必要に応じて、結合部位の非特異的結合は、結合条件を変化させることによって特異的結合に実質的に影響を与えることなく減少され得る。
【００４４】
本明細書で使用される「単離された抗体分子」の用語は、その天然環境の構成要素から同定され分離された、及び／又は回収された抗体分子を指す。その天然環境の汚染物質成分は、抗体に対する診断的又は治療的な使用を干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含み得る。幾つかの実施形態では、抗体分子は、ローリー法（Lowry method）によって特定される抗体の95重量%超まで、例えば99重量%超まで精製される。幾つかの実施形態では、抗体は、クマシーブルー、又は好ましくは銀染色を使用して、還元条件又は非還元条件下でSDS-PAGEによって判断される均一性まで精製される。単離された抗体分子は、幾つかの実施形態では、抗体の天然環境に存在しない1以上の構成要素と共に、組み換え細胞内に存在し得る。典型的には、単離された抗体は、少なくとも1回の精製工程によって調製される。
【００４５】
PMSAに結合する本発明の（組み換え）抗体分子、及び／又は本明細書に記載される扁平癌細胞は、例えば、Fvフラグメント、scFv、ヒンジ領域を欠く一価抗体、ミニボディ（minibody）、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F（ab’）2フラグメントとして、任意の好適な組み換えの抗体フォーマットで使用され得る。また、本発明の組み換え抗体分子は、ヒトIgG定常領域、CH1ドメイン（Fabフラグメントが含むような）及び／又は全Fc領域等（such as）の定常ドメイン（領域）を含み得る。また代替的には、本発明の抗体分子は抗体全長（全体）であってもよい。
【００４６】
必要とされる増殖経路の遮断による抗増殖性、アポトーシスをもたらす細胞内シグナル伝達、受容体の下方制御及び／又はターンオーバーの増強、補体依存性細胞傷害（CDC：complement-dependent cytotoxicity）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC：antibody-dependent cell- mediated cytotoxicity）、抗体依存性細胞介在性食作用（ADCP：antibody-dependent cell-mediated phagocytosis）、及び適応的免疫応答の促進を含む、抗体が細胞効果を媒介する多くの可能な機構が存在する（Cragg et al , 1999, Curr Opin Immunol 11 541-547、Glennie et al, 2000, Immunol Today 21 403-410）。抗体の有効性はこれらの機構の組み合わせに起因し得て、腫瘍学に関する臨床治療におけるそれらの相対的な重要性は癌に依存するようである。
【００４７】
ヒトにおける臨床的有効性と、親和性の高い（V158）又は低い（F158）多型形態のFcγRIIIaのアロタイプとの間で観察された相関関係（Cartron et al , 2002, Blood 99 754-758, Weng & Levy, 2003, Journal of Clinical Oncology, 21 3940-3947）から、幾つかの抗体の活性に対するFcγR媒介エフェクター機能の重要性がマウスにおいて実証されている（Clynes et al , 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95 652-656、Clynes et al , 2000, Nat Med 6 443-446,）。これらのデータは共に、或る特定のFcγRへの結合に対して最適化される抗体は、より良好にエフェクター機能を媒介して、それにより患者においてより効果的に標的細胞を破壊し得ることを示唆する。したがって、抗体の抗腫瘍力を増強するための有望な手段は、ADCC、ADCP及びCDC等の細胞傷害性エフェクター機能を媒介するそれらの能力の増強による。さらに、抗体は、抗体が腫瘍細胞上のその標的に結合する場合に生じ得る、増殖阻害又はアポトーシスシグナル伝達によって抗腫瘍機構を媒介することができる。抗体がFcγRによって免疫細胞に結合された腫瘍細胞に提示される場合、かかるシグナル伝達が強化され得る。したがって、FcγRに対する抗体の親和性の増加は、増強された抗増殖性効果をもたらし得る。
【００４８】
幾つかの成功は、増強されたエフェクター機能を提供するように、FcγRへの選択的に増強された結合によって抗体を修飾することで達成された。最適化されたエフェクター機能に対する抗体工学は、アミノ酸修飾を使用して達成された（例えば、米国特許出願第2004-0132101号又は同第2006-0024298号を参照されたい）。
【００４９】
したがって、本発明は、本発明の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントを、親抗体と比較して、FcγRIIIa受容体に対する親和性が増強されるように、又はADCCエフェクター機能が増強されるように改変することも検討する。ADCCの増強を達成する1つの方法は、抗体分子、例えばネズミ科又はヒト化10B3抗体のFc部分のCH2ドメインの239D及び332Eにアミノ酸置換を導入することによる。その後、これらの抗体の細胞殺傷活性は著しく増加され得るか、又は更には初めて検出され発生され得る。一実施形態では、アミノ酸置換はS239D及びI332Eである。
【００５０】
本発明の抗体分子はヒトPSMAに結合することができる。「前立腺特異的膜抗原」又は「PSMA」の用語は、本発明では同じ意味で使用され、ヒトPSMAの変異体、アイソフォーム、及び種ホモログを含む。また、PSMAは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII、NAALADase I＝N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸ペプチダーゼ（glutamate peptidase）I、葉酸加水分解酵素（Folathydrolase）I（FOLH1）と表される。ヒトPSMAはUniProtアクセッション番号Q04609（2015年12月9日の175版）を有する。したがって、本発明の抗体は、或る特定の場合には、ヒト以外の種に由来するPSMA、又はヒトPSMAと構造上関連する他のタンパク質（例えばヒトPSMAホモログ）と交差反応する。先に言及されるように、本発明の好ましい実施形態は、抗体10B3又はそのヒト化変種である。しかしながら、10B3と同じエピトープに結合する他の抗体分子も本発明の範囲に含まれる。
【００５１】
エピトープを決定するために、当該技術分野で知られている標準的なエピトープマッピング法が使用され得る。例えば、抗体を結合するPMSA（例えば合成ペプチド）のフラグメント（ペプチド）を使用して、候補抗体又はその抗原結合性フラグメントが同じエピトープを結合するかどうかを判定することができる。直鎖エピトープについて、規定の長さ（例えば8個以上のアミノ酸）の重複ペプチドが合成される。PSMAタンパク質配列の各8個のアミノ酸フラグメントを含む一連のペプチドが作製されるように、ペプチドは1個のアミノ酸によって相殺され得る。より少ないペプチドは、より大きなオフセット、例えば2個又は3個のアミノ酸の使用により作製され得る。さらに、より長いペプチド（例えば、9-mer、10-mer、又は11-mer）を合成することができる。抗体又はその抗原結合性フラグメントへのペプチドの結合は、表面プラズモン共鳴（BIACORE）及びELISAアッセイを含む標準的な方法論を用いて決定され得る。立体構造エピトープの調査のため、より大きなPSMAフラグメントが使用され得る。立体構造エピトープを定義するため質量分析を使用する他の方法が記載され、（例えば、Baerga-Ortiz et al., Protein Science 11:1300-1308, 2002及びそこに引用される文献を参照されたい）であってもよい。エピトープ決定に対する更なる他の方法は、Current Protocols in Immunology, Coligan et al., eds., John Wiley& SonsのUnit 6.8（"Phage Display Selection and Analysis of B-cell Epitopes"）及びUnit9.8（"Identification of Antigenic Determinants Using Synthetic Peptide Combinatorial Libraries"）等の標準的な実験室の参考図書において提供される。エピトープは、既知のエピトープに点突然変異又は欠失を導入した後、1以上の抗体又はその抗原結合性フラグメントとの結合を試験して、どの突然変異が抗体又は抗原結合性フラグメントの結合を減少させるかを判断することにより確認され得る。
【００５２】
また、例えばPSMAへの10B3の結合を競合的に阻害するため、PSMAへの結合に関して10B3等の本発明の抗体分子と競合する抗体分子も本発明の範囲に含まれる。競合的阻害を判定するため、当業者に知られている様々なアッセイを使用することができる。例えば、抗体又はその抗原結合性フラグメントが、別の抗体又はその抗原結合性フラグメントによって競合的にPSMAへの結合を阻害するかどうかを判定するため、交差競合アッセイを使用することができる。これらは、フローサイトメトリー又は固相結合分析を用いる細胞ベースの方法を含む。細胞の表面に発現されていないPSMA分子に対して交差競合する抗体又はその抗原結合性フラグメントの能力を評価する他のアッセイを固相又は溶相で使用することもできる。交差競合が試験され得るアッセイは、例えば、実施例10で示される。
【００５３】
本明細書で言及されるように、本発明は、PSMAに結合する場合、J591と比較して、抗原シフトが減少された抗体を包含する。かかる抗原シフトの減少は、例えば、実施例10に本質的に記載される方法を使用して評価され得る。好ましい実施形態では、かかる抗原シフトの減少は、PMSAトランスフェクトSp2/0細胞で検出される。
【００５４】
本発明による抗体分子は、幾つかの実施形態では軽鎖となり得る、より短い鎖と、幾つかの実施形態では重鎖とも称され得る、主鎖との2本鎖を有し得る。抗体分子は通常これらの2本鎖の二量体である。
【００５５】
本発明の抗体分子は、好ましくは二重特異性抗体分子であり得る。二重特異性抗体分子は、（i）先行する請求項のいずれか1つに定義される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む可変領域であって、ヒト前立腺特異的膜抗原（PSMA）に結合することができる第1の結合部位を含む、可変領域と、（ii）第2の結合部位を含む、抗体分子の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域とを含むことができる。PSMAに対する結合部位は、本明細書に記載される本発明のPSMA結合抗体の結合部位であることが好ましいと理解される。
【００５６】
「二重特異性」又は「二官能性」の抗体分子は、2つの異なるエピトープ／抗原結合部位を有し、したがって、2つの異なる標的エピトープに対する結合特異性を有する抗体分子である。これらの2つのエピトープは、同じ抗原のエピトープであってもよく、又は異なる抗原のエピトープであってもよい。それとは対照的に、「二価抗体」は、同一の抗原特異性の結合部位を有し得る。
【００５７】
「二重特異性抗体」は、重鎖と軽鎖、又は主鎖とより短い／より小さい鎖の第1の対によって定義される、2以上の結合アームのうちの1つにより1つの抗原又はエピトープを結合し、重鎖と軽鎖、又は主鎖とより小さい鎖の第2の対によって定義される、第2のアーム上で異なる抗原又はエピトープを結合する抗体分子であってもよい。二重特異性抗体のかかる実施形態は、特異性とCDR配列の両方において、2つの個別の抗原結合アームを有する。典型的には、二重特異性抗体は結合する各抗原に対して一価であり、すなわち、二重特異性抗体は、それぞれの抗原又はエピトープ1つのアームのみで結合する。しかしながら、二重特異性抗体もまた、二量体化又は多量体化され得る。例えば、本明細書に記載される二量体IgGscフォーマットでは、抗体は各抗原に対して2つの結合部位を有し得る。二重特異性抗体は、第1の軽鎖可変領域及び第1の重鎖可変領域によって定義される第1の結合領域と、第2の軽鎖可変領域及び第2の重鎖可変領域によって定義される第2の結合領域とを有し得る、ハイブリッド抗体分子であってもよい。これらの結合領域のうちの1つが重鎖／軽鎖対によって定義され得ることは、本発明によって想定される。本発明に関連して、二重特異性抗体分子は、主鎖及びより小さい鎖の可変領域によって定義される第1の結合部位と、抗体分子の主鎖に含まれるscFvフラグメントの可変領域によって定義される第2の異なる結合部位とを有し得る。
【００５８】
二重特異性抗体分子を作製する方法は、例えば2つの異なるモノクローナル抗体の化学的な複合化、又は例えば2つの抗体フラグメント、例えば2つのFabフラグメントの化学的な複合化も当該技術分野で知られている。代替的には、二重特異性抗体分子は、クアドローマ技術、すなわち親抗体を産生するハイブリドーマの融合によって作製される。H鎖及びL鎖の無作為な組み合せのため、10個の異なる抗体構造の可能性のある混合物が産生され、その1つのみが所望の結合特異性を有する。
【００５９】
本発明の二重特異性抗体分子は、各標的に関してモノクローナル抗体（MAb）として作用し得る。幾つかの実施形態では、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体である。二重特異性抗体分子は、例えば、二重特異性タンデム単鎖Fv、二重特異性Fab2、又は二重特異性ダイアボディであってもよい。
【００６０】
本発明の抗体分子に含まれるドメインに基づいて、本発明の二重特異性抗体分子は、一般的にはヒンジ領域と、CH2ドメインと、単鎖Fvフラグメントとを含み得る、Fabフラグメントを含み得る。かかる二重特異性抗体分子は、「Fabsc」抗体分子と称され、国際特許出願の国際公開第2003/092001号において初めて記載された。より具体的には、本明細書で使用される「Fabsc」フォーマットの抗体分子は、典型的には、Fabフラグメントを有する本発明の二重特異性抗体分子を指し、一般的には、CH2ドメインのN末端に連結されたFabフラグメントのC末端にあるヒンジ領域を含み、次いでそのC末端はscFvフラグメントのN末端に連結されている。かかる「Fabsc」は、CH3ドメインを含まない又は本質的に含まない。これに関連して、「含まない」又は「本質的に含まない」は、抗体分子が全長CH3ドメインを含まないことを意味する。「含まない」又は「本質的に含まない」は、抗体分子が10個以下、好ましくは5個以下、更には好ましくは3個以下のアミノ酸のCH3ドメインを含むことを意味することが好ましい。Fabscフォーマット抗体分子に対する実例を図1Aに示し、Fabscフォーマット抗体分子に対する別の実例を図12に示す。実例となる実施形態（これに関して図1Aも参照されたい）では、本発明のFabsc抗体分子は、Kabatナンバリング［EUインデックス］によるヒンジ領域の配列位置226のシステイン残基及び／又はヒンジドメインの1つの配列位置229のシステイン残基によって形成されるジスルフィド結合によって二量体化する能力を欠くCH2ドメインを含み得る。したがって、これらの実施形態では、配列位置226及び／又は配列位置229のシステイン残基は、除去されるか、又は例えばセリン残基によって置き換えられるかのいずれかである。追加的に又は代替的には、本発明の「Fabsc」抗体分子はまた、「Fc減衰した」CH2ドメイン（ヒンジ領域を含む）を有し得る。この「Fc減衰」は、Fc受容体への結合を媒介し得る、CH2ドメイン中の選択されたアミノ酸残基の少なくとも1つを欠失及び／又は置換する（変異導入する）ことにより達成される。実例となる実施形態では、Fc受容体への結合を媒介することができ、欠損している又は変異導入されているヒンジ領域又はCH2ドメインの少なくとも1つのアミノ酸残基は、配列位置228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327、及び330（EUインデックスによる配列位置のナンバリング）からなる群から選択される。実例では、かかるFc減衰抗体分子は、アミノ酸228の欠失、アミノ酸229の欠失、アミノ酸230の欠失、アミノ酸231の欠失、アミノ酸232の欠失、アミノ酸233の欠失、置換Glu233→Pro、置換Leu234→Val、アミノ酸234の欠失、置換Leu235→Ala、アミノ酸235の欠失、アミノ酸236の欠失、アミノ酸237の欠失、アミノ酸238の欠失、置換Asp265→Gly、置換Asn297→Gln、置換Ala327→Gln、及び置換Ala330→Ser（EUインデックスによる配列位置のナンバリング、また、例えば国際特許出願の国際公開第2013/092001号の図1O及び図1Pも関連して参照されたい）からなる群から選択される少なくとも1個の突然変異を含み得る。T細胞を活性化する、例えば腫瘍細胞に対する二重特異性抗体の場合、Fc減衰は、T細胞の望ましくないオフターゲット活性化をもたらし得る、Fc受容体を持つ細胞への抗体の結合を妨げるのに望まれ得る。
【００６１】
また、Coloma及びMorrisonの論文（Nat Biotechnol 15:159-63, 1997）によれば、本発明の二重特異性抗体分子は、一般的にはCH2ドメインのC末端に配置されるCH3ドメインを有し得る。また、かかる分子は、本明細書では「IgGsc」フォーマット抗体分子と称され、一般的にはヒンジ領域を含み、該ヒンジ領域は典型的にはCH2ドメインのN末端に連結されるFabフラグメントのC末端にあり、次いでCH2ドメインのC末端は典型的にはCH3ドメインのN末端に連結され、次いでCH3ドメインのC末端は典型的にはscFvフラグメントのN末端に連結される、Fabフラグメントを有する本発明の二重特異性抗体分子を意味する。IgGscフォーマット抗体分子の実例は図1Bに示され、かかる分子の重鎖及び軽鎖の配列はそれぞれ図11及び図13に示される分子である。
【００６２】
抗体フォーマットであるFabsc及びIgGscは、いずれもN末端ターゲッティング部がそれぞれ「生理学的な」Fab領域又はFab2領域からなることにより、分子のこの部分での単鎖部分の使用を回避する点で共通する。これらのフォーマットが標的細胞の限定的なT細胞活性化に使用されることになる場合、Fc受容体（FcR）結合の減衰は、（求められる場合又は必要に応じて）FcR媒介活性化を妨げるために用いられ得る。これは、例えば、上に記載され、また国際特許出願の国際公開第2013/092001号、及びArmour et al. Eur J Immunol 1999; 29:2613に記載される分子のCH2ドメイン中の確定された、良く知られている突然変異の導入によって達成され得る。また、したがって、本発明のIgGsc抗体分子は、ヒンジ領域、又はFc受容体への結合を媒介し得るCH2ドメインの少なくとも1個のアミノ酸残基が欠損又は変異導入されているCH2ドメイン（ヒンジ領域を含む）を有し得る。上に説明されるように、CH2及びヒンジ領域中のこの残基は、それぞれ、配列位置228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327、及び330（EUインデックスによる配列位置のナンバリング）からなる群から選択され得る。しかしながら、IgGsc分子中のCH3ドメインの存在により、2個の個別の分子は、（自発的に）CH3ドメインを介してホモ二量体化して4価の分子を形成する（この点に関して図1Bを再び参照されたい）。したがって、ヒンジ領域の配列位置226及び／又は配列位置229のシステイン残基を欠失又は変異導入する必要はない。したがって、本発明のかかる四量体IgGsc抗体分子は、Kabatナンバリング[EUインデックス]と一致して、それぞれのヒンジドメインのうち1つの配列位置226及び／又は配列位置229にシステイン残基を有し得る。
【００６３】
PMSA結合及び／又は扁平上皮癌細胞への結合を媒介する、1セットのCDR領域（例えば、配列番号3〜配列番号8のCDR配列、又は80%の配列同一性を有する配列）を含む二重特異性抗体分子の上記の開示と一致して、本発明の抗体分子は、T細胞又はNK細胞等の免疫細胞上の受容体に特異的に結合する第2の結合部位を含み得る。免疫細胞上に存在するこの受容体は、免疫細胞を活性化することができる、又は免疫細胞の免疫応答を賦活することができる受容体であってもよい。誘発された免疫応答は、好ましくは細胞傷害性免疫応答であってもよい。かかる好適な受容体は、例えば、CD3、抗原特異的T細胞受容体（TCR）、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）、及びCD95であってもよい。特に、第2の結合部位が、CD3、TCR又はCD16に結合する抗体分子が好ましい。第2の結合部位がCD3に特異的に結合する抗体分子が最も好ましい。好ましい抗体分子は、抗CD3抗体であるOKT3の抗原結合部位に対応する第2の結合部位を含む。OKT3抗体のVH及びVLの配列を図12に示す。また、抗体OKT3の重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、例えば、Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 （1996）及び国際特許出願の国際公開第2015/158868号（国際公開第2015/158868号の配列表中、配列番号17及び配列番号18を参照されたい）に記載される。別の好ましい抗体分子は、抗CD3抗体UCHT1の抗原結合部位に対応する第2の結合部位を含む。ヒト化UCHT1抗体のVH及びVLの配列は図11に示され、また、例えば国際特許出願の国際公開第2013/092001号に記載される。本発明において使用され得るCD3結合抗体分子の他の例として、欧州特許第2 155 783号又は欧州特許第2 155 788号に記載される、ヒト及びマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus oedipus）、又はリスザル（Saimiri sciureus）のCD3ε鎖のエピトープに結合することができる抗体分子が挙げられる。
【００６４】
したがって、本発明の二重特異性抗体分子は、本明細書に記載されるFabフラグメント及びscFvフラグメントを含むFabsc分子及びIgGsc分子等の二重特異性抗体分子であってもよい。この分子において、第1の結合部位はPSMAに結合し得て、本明細書に記載されるFabフラグメント中に含まれ得て、第2の結合部位（免疫受容体に結合し得る）はscFvフラグメントに含まれ得る。代替的には、PMSAに結合する第1の結合部位は、単鎖Fvフラグメントに含まれ、第2の結合部位（免疫受容体に結合し得る）はFabフラグメントに含まれる。
【００６５】
幾つかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体分子は、CD3への結合等の結合により、それ自体では免疫細胞、例えばT細胞を活性化しない。代わりに、両方の結合部位、例えばPMSA特異的結合部位（site）及びCD3特異的結合部位がT細胞上の受容体、及び標的細胞上のPMSAに結合される場合のみ、前者が、活性化している受容体を架橋し、エフェクター細胞を惹起して特定の標的細胞を殺傷し得る。本発明の二重特異性抗体分子の存在下及び不在下でリンパ球による標的細胞殺傷能力を評価するための標準的な機能アッセイを設定して、結合する受容体を活性化する抗体分子の能力について評価及び／又はスクリーニングすることができる。
【００６６】
理論に拘束されるものではないが、一価のCD3の刺激は有効なT細胞活性化を開始するのに十分ではないことから、本発明の二重特異性CD3結合抗体は、一般的には標的細胞の不在下でT細胞を活性化しないと考えられる。しかしながら、幾つかの場合には、この想定される挙動から幾分偏りがある可能性がある。UCHT1が二重特異性Fabscコンストラクト内のCD3抗体として本発明で使用される場合、PSMA発現標的細胞の不在下で一部のT細胞活性化が認められた。これらの知見は、SKW6.4リンパ腫細胞等の刺激バイスタンダー細胞の存在下で実験が行われた場合にかなり明白であった。これと対照的に、本発明者らは、驚いたことに、本明細書において、OKT3を含む抗体、また意外にもUCHT1を含むIgGsc抗体がオフターゲットT細胞活性化の著しい減衰を誘導することも見出した。UCHT1を含むIgGsc抗体による予想外に低いオフターゲット活性化は、少なくとも一部はCD3発現Jurkat細胞を使用する結合活性測定によって説明される。これらの実験は、（Fabscではなく）IgGscフォーマットで発現される場合、UCHT1が結合活性を喪失し、OKT3が結合活性を獲得することを実証する（図8を参照されたい）。PSMA発現22RV1細胞に対する長期細胞傷害性アッセイ（Xelligence）で試験した場合、本発明の発明者らは、驚いたことに、細胞傷害性活性に関する次のランキング、すなわちIgGsc（UCHT1）≒Fabsc（UCHT1）＞Fabsc（OKT3）＞IgGsc（OKT3）を見出した。したがって、IgGscフォーマット内では、UCHT1は好ましいCD3抗体（好都合なオフターゲット活性化及び細胞溶解性活性）の可能性があるのに対し、Fabscフォーマット内では、UCHT1含有Fabscによる不必要に高いオフターゲット活性化のため、OKT3が好ましい場合がある（図9を参照されたい）。
【００６７】
また、使用される特定のCD3抗体にかかわらず、ターゲッティング単鎖フラグメント間の相互作用によって誘導されるT細胞表面上の二重特異性抗体のクラスター化は、標的細胞の不在下でのオフターゲットT細胞活性化をもたらし得る。この現象を防ぐため、二重特異性コンストラクト内のターゲッティング部としての単鎖抗体ではなく、Fabscフォーマット又はIgGscフォーマットにそれぞれ含まれるようなFab部分又はFab2部分を使用することが望ましい場合がある。かかるフォーマットで発現される二重特異性抗体の多量体化及び凝集は、二重特異性単鎖抗体で観察されるものと比較して、著しく減少される。図4A及び図4Bは、サイズ排除クロマトグラフィーによって特定されるFLT3×CD3特異性を有する二重特異性単鎖フォーマットの凝集が、二重特異性単鎖（bssc）又はBiTEフォーマットの同一の抗体のそれと異なり、明白ではなかったことを示す。同様に図4C〜図4Fも、IgGscフォーマットと同様、Fabscフォーマットの4つのPSMA×CD3抗体の多量体又は凝集体を形成する傾向が強力に減少されることを示す。特に、本発明の発明者らは、驚いたことに、OKT3抗体を含むコンストラクトと比較して、多量体の形成が、UCHT1抗体を含む2つのコンストラクトにおいてより一層明白ではないことを見出した。いずれの場合にも、凝集は、それが生じる場合、単鎖として発現されるCD3エフェクター部に起因すると考えられる。N末端ターゲッティング部の生理学的Fab部分及びFab2部分は凝集しないと考えられ、また本発明において見出されたため、in vivoでのT細胞疲弊をもたらす可能性があるN末端ターゲッティング部の単鎖クラスター化は、本発明のそれぞれの抗体分子において生じ得ないと考えられる。
【００６８】
さらに、本発明者らは、本明細書にて、CH3ドメインとFcRn受容体との相互作用によって抗体分子の血清半減期の大半が決定されると予測する。ほとんどの二重特異性抗体がこのドメインを欠くことから、それらの血清半減期はむしろ短い場合がある（せいぜい数時間）。対照的に、全IgG分子は、通常、数日の血清半減期を有する。IgG系の二重特異性フォーマットは数年間利用可能であったが、それらは、二価のCD3の刺激がオフターゲットT細胞活性化をもたらす可能性があると考えられたため、CD3刺激性抗体の構築にはほとんど使用されなかった。しかしながら、本発明の発明者らは、驚いたことに、UCHT1抗体を含む2つの異なるフォーマットについてはそうでないこと、すなわち、FabscフォーマットによるオフターゲットT細胞活性化が、IgGscフォーマットの抗体によるものよりも著しく高いことを見出した。理論に拘束されるものではないが、これは後者のフォーマットにおいてCD3部分の結合活性が損なわれるからと考えられる（再び図8を参照されたい）。これは、UCHT1の可変領域を含む抗体分子の場合、驚いたことに、IgGscフォーマットが、著しく改善された血清半減期のみならず、オフターゲットT細胞活性化の減少も提供することを意味する。したがって血清半減期の延長が、例えば、長期的な持続注入を回避するために望ましい場合、Fab部分が10B3に由来する抗体の抗原結合部位を含み、scFv部分がUCHT1由来の抗体の抗原結合部位を含む、IgGscフォーマットの10B3×UCHT1二重特異性抗体が好ましい場合がある。血清半減期の延長が望ましくない場合、Fab部分が10B3に由来する抗体の抗原結合部位を含み、scFv部分がOKT3由来の抗体の抗原結合部位を含む、Fabscフォーマットの10B3×OKT3二重特異性抗体が好ましい場合がある。
【００６９】
したがって言いかえれば、代替の態様では、本発明は、（i）重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む可変領域を含み、該可変領域が抗原に結合することができる第1の結合部位を含む、N末端Fabフラグメントと、（ii）ヒト化UCHT1の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、C末端scFvフラグメントとを各単量体に含み、（i）及び（ii）がCH2ドメイン及びCH3ドメインによって接続される、四価ホモ二量体二重特異性抗体分子（本明細書に記載されるIgGscフォーマットの二重特異性抗体）に更に関する。
【００７０】
幾つかの実施形態では、Fc受容体への結合を媒介することができるCH2ドメインの少なくとも1個のアミノ酸残基が欠損又は変異導入されている、本発明の四価二重特異性抗体分子が好ましい（本明細書の他の箇所も参照されたい）。
【００７１】
幾つかの実施形態では、Fabフラグメントは非ヒト化、キメラ化、又はヒト化された10B3又はJ591の抗体のFabフラグメントではなく、好ましくは第1の結合部位がPSMAに結合することができない、本発明の四価二重特異性抗体分子が好ましい。したがって、幾つかの好ましい実施形態では、N末端Fabフラグメントによって提供される第1の結合部位は、PSMAに特異的ではないが、非PSMA抗原、好ましくはPSMA以外の腫瘍関連抗原に特異的である。「腫瘍関連抗原」の用語は、正常な条件下、すなわち健康な被験体において、限られた数の臓器及び／又は組織、又は特定の発生段階において特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば、腫瘍関連抗原は、正常な条件下で、胃組織、好ましくは胃粘膜において、生殖器、例えば精巣において、絨毛組織、例えば胎盤において、又は生殖細胞系列の細胞において特異的に発現され、また1以上の腫瘍又は癌組織において発現される又は異常発現される。これに関連して、「限られた数」は、3以下、より好ましくは2以下、又は1以下を意味することが好ましい。本発明と関連して、腫瘍関連抗原は、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常な条件下で或る特定の分化段階において或る特定の細胞型で特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常な条件下で精巣、時には胎盤に特異的に発現されるタンパク質、及び生殖細胞系列特異性抗原を含む。本発明と関連して、腫瘍関連抗原は、正常細胞において発現されない若しくはごくまれに（rarely）発現されるか、又は腫瘍細胞において変異導入されていることが好ましい。腫瘍関連抗原又は腫瘍関連抗原の異常発現（aberrant expression）は、癌細胞を識別することが好ましい。本発明と関連して、被験体、例えば、癌疾患を患う患者において癌細胞によって発現される腫瘍関連抗原は、該被験体の自己タンパク質であることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明と関連して、腫瘍関連抗原は、必須ではない組織又は臓器、すなわち、免疫系によって傷害された場合に被験体の死と結びつかない組織若しくは臓器、又は免疫系がアクセスできない若しくはほとんどアクセスできない身体の臓器若しくは構造において正常な条件下で特異的に発現される。腫瘍関連抗原は、発現される癌細胞によってMHC分子と関連して提示されることが好ましい。
【００７２】
本発明において有用となり得て、本発明の態様の好ましい実施形態によるPSMAではないTAAに関する例は、p53、ART-4、BAGE、ベータ−カテニン/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、CLAUDlN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap 100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT（又はhTRT）、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A、好ましくはMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11又はMAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、ミオシン/m、MUCl"、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NFl、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl90 minor BCR-abL、Pml/RARa、PRAME、プロテイナーゼ3、PSA、RAGE、RU1又はRU2、SAGE、SART-1又はSART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPl/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE、及びWTである。
【００７３】
本発明の本態様によれば、ヒト化UCHT1は、アミノ酸配列DIQMT...で開始し、...VTVSSで終了する配列番号11に示される軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列（図11に示される）を含むscFvフラグメントであることが好ましい。scFvフラグメント中の軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列は、図11に示されるリンカー（「リンカー領域」）を介して接続されることが好ましい。
【００７４】
これに関連して、抗体分子が1以上の変異導入されたアミノ酸残基を含み得ることは、本発明の範囲に含まれることに留意されたい。核酸又はポリペプチドに関して「変異導入された」、「突然変異体」、及び「突然変異」の用語は、「天然」起源の核酸又はポリペプチド、すなわち、野生型を規定するために採用され得る参照配列と比較して、それぞれ1個以上のヌクレオチド又はアミノ酸の交換、欠失、又は挿入を指す。例えば、免疫化によって得られ、また本明細書に記載される抗体分子10B3の可変ドメインは、野生型配列として採用され得る。
【００７５】
この点に関して、本発明に従って使用される場合、「位置」の用語は、本明細書に示されるアミノ酸配列内のアミノ酸の位置を意味することが理解される。この位置は、類似する天然配列、例えば天然起源のIgGのドメイン又は鎖の配列に関して示されてもよい。また、本明細書で使用される「対応する」の用語は、或る位置が、先行するヌクレオチド／アミノ酸の数によって必ずしも決定されない、又はそれのみによって決定されないことを含む。したがって、置換され得る本発明による所与のアミノ酸の位置は、抗体鎖の他の場所でのアミノ酸の欠失又は付加により変化し得る。
【００７６】
したがって、本発明による「対応する位置」のもと、アミノ酸は、指定される数において異なり得るが、まだ同様の近隣のアミノ酸を有し得ると理解される。交換、欠失又は付加され得る上記アミノ酸もまた、「対応する位置」の用語によって包含される。天然起源の免疫グロブリンのドメイン又は鎖のアミノ酸配列中の或る特定の位置に対して所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基が対応するかどうかを判断するため、当業者は、当該技術分野でよく知られている手段及び方法、例えば手作業で、又はBasic Local Alignment Search Toolを表すBLAST2.0、若しくはClustalW、若しくは配列アラインメントを作成するのに適した任意の他の好適なプログラム等のコンピュータープログラムの使用のいずれかによるアラインメントを使用することができる。
【００７７】
幾つかの実施形態では、置換（又は置き換え）は保存的置換である。保存的置換は、一般的には、突然変異されるアミノ酸に従って列挙される以下の置換であり、それぞれ、保存的とされ得る1以上の置き換えがその後に続く：Ala→Gly、Ser、Val；Arg→Lys；Asn→Gln、His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg、Asn、Gln;Ile→Leu、Val；Leu→Ile、Val；Lys→Arg、Gln、Glu；Met→Leu、Tyr、Ile；Phe→Met、Leu、Tyr;Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp, Phe；Val→Ile、Leu。また、他の置換も許容可能であり、経験的に又は他の既知の保存的若しくは非保存的な置換に従って決定され得る。更なる配向として、以下の8つの群は、典型的には互いに保存的置換を定義するとされ得るアミノ酸をそれぞれ含む：
アラニン（Ala）、グリシン（Gly）；
アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）；
アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）；
アルギニン（Arg）、リジン（Lys）；
イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、メチオニン（Met）、バリン（Val）；
フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）；
セリン（Ser）、スレオニン（Thr）；及び、
システイン（Cys）、メチオニン（Met）。
【００７８】
かかる置換が生物学的活性の変化をもたらし、次に以下のような又はアミノ酸のクラスを参照して下記に更に記載されるより本質的な変化が導入され得て、生成物が所望の性質についてスクリーニングされる。かかるより実質的な変化の例は、Ala→Leu、Ile；Arg→Gln；Asn→Asp、Lys、Arg、His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met、Ala、Phe；Leu→Ala、Met、ノルロイシン；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val、Ile、Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr、Ser；Val→Met、Phe、Alaである。
【００７９】
幾つかの実施形態では、本発明による抗体分子は、システイン残基による二量体化を防止する、又はFc機能を調整する（上記を参照されたい）ように変異導入される、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、又は18個のアミノ酸残基を含む、1個以上のアミノ酸残基を含む。これらの実施形態の幾つかでは、Fc受容体への結合を媒介し得るCH2ドメイン及び／又はヒンジ領域の1個以上のアミノ酸残基（複数の場合もある）に変異導入される。もしあれば、Fc受容体への結合を媒介し得る1個以上のアミノ酸残基（複数の場合もある）は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）又は補体介在性細胞傷害（CDC：complement-mediated cytotoxicity）を活性化し得るアミノ酸残基であってもよい。幾つかの実施形態では、Fc受容体への結合を媒介し得る各アミノ酸残基は、一般的には、IgG等の免疫グロブリン中の対応する天然起源のドメインの配列に対して上記配列を比較する場合、別のアミノ酸によって置換される。幾つかの実施形態では、Fc受容体への結合を媒介し得る、かかるアミノ酸残基は、一般的にはIgG等の免疫グロブリン中の対応する天然起源のドメインの配列に関して、欠失される。
【００８０】
幾つかの実施形態では、変異導入される、例えば、置換される又は欠失される1個以上のアミノ酸残基は、226位、228位、229位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、265位、297位、327位、及び330位の1つに位置するアミノ酸である。ここでも、使用されるアミノ酸のナンバリングは、Kabatナンバリング［EUインデックス］に従う配列位置に対応する。アミノ酸の対応する欠失、例えば、アミノ酸228、一般的にはIgG中のプロリンの欠失、アミノ酸229、一般的にはIgG中のシステインの欠失、アミノ酸230、一般にはIgG中のプロリンの欠失、アミノ酸231、一般にはIgG中のアラニンの欠失、アミノ酸232、一般にはIgG中のプロリンの欠失、アミノ酸233、一般にはIgG中のグルタミン酸の欠失、アミノ酸234、一般にはIgG中のロイシンの欠失、アミノ酸235、一般にはIgG中のロイシンの欠失、アミノ酸236、一般にはIgG中のグリシンの欠失、アミノ酸237、一般にはIgG中のグリシンの欠失、アミノ酸238、一般にはIgG中のプロリンの欠失、及びアミノ酸265、一般にはIgG中のアスパラギン酸の欠失であってもよい。アミノ酸の対応する置換、例えば、アミノ酸226、一般的にはIgG中のシステインの置換、アミノ酸228、一般にはIgG中のプロリンの置換、アミノ酸229、一般にはIgG中のシステインの置換、アミノ酸230、一般にはIgG中のプロリンの置換、アミノ酸231、一般にはIgG中のアラニンの置換、アミノ酸232、一般にはIgG中のプロリンの置換、アミノ酸233、一般にはIgG中のグルタミン酸の置換、アミノ酸234、一般にはIgG中のロイシンの置換、アミノ酸235、一般にはIgG中のロイシンの置換、アミノ酸265、一般にはIgG中のアスパラギン酸の置換、アミノ酸297、一般にはIgG中のアスパラギンの置換、アミノ酸327、一般にはIgG中のアラニンの置換、及びアミノ酸330、一般的にはIgG中のアラニンの置換であってもよい。それぞれの置換は、置換Cys226→Ser、置換Cys229→Ser、置換Glu233→Pro、置換Leu234→Val、置換Leu235→Ala、置換Asp265→Gly、置換Asn297→Gln、置換Ala327→Gln、置換Ala327→Gly、及び置換Ala330→Serのうちの1つであってもよい。上記からわかるように、幾つかの実施形態では、ヒンジ領域の226位及び229位の1個又は2個のシステイン残基は別のアミノ酸で置換されており、例えば、セリン残基に置換されている。それにより、別の主鎖とのジスルフィド結合の形成が妨げられ得る。さらに、以下にも説明されるように、Fc受容体への結合を媒介し得るCH2ドメイン中の選択されたアミノ酸残基の欠失及び／又は置換（変異導入）は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害及び補体の固定に関して、本発明の抗体分子がより少ない活性を有するか又は活性を有しないようにすることができる。
【００８１】
別の種類の抗体のアミノ酸変異体は、（もしあれば）抗体分子の本来のグリコシル化パターンを変更する。変更は、抗体で見出される1以上の糖鎖（carbohydrate moieties）を欠失すること、及び／又は抗体中に存在しない1以上の糖鎖付加部位を追加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはN結合型又はO結合型のいずれかである。N結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖の付着を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−X−セリン及びアスパラギン−X−スレオニン（ここで、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的な付着に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、可能性のある糖鎖付加部位を作り出す。O結合型グリコシル化は、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンも使用され得るが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへのN-アセチルガラクトサミン（acetylgalactosamine）、ガラクトース又はキシロースの糖の1つの付着を指す。抗体への糖鎖付加部位の追加は、（N結合型糖鎖付加部位に対して）1以上の上記トリペプチド配列を含むように、アミノ酸配列を変更することによって簡便に遂行される。また、本来の抗体（O結合型糖鎖付加部位）の配列への、1個以上のセリン残基又はスレオニン残基の付加、又はそれらによる置換によって変更が行われ得る。
【００８２】
本発明に関連して、幾つかの実施形態では、免疫グロブリンのFc領域を表す本発明の抗体分子の主鎖の部分は、典型的には、Fc受容体への結合に関して不活性であるか、又は少なくとも本質的には影響が少ない。述べた通り、これは、Fc受容体への結合を媒介し得るCH2ドメイン中の選択されたアミノ酸残基の少なくとも1個を欠失及び／又は置換すること（変異導入すること）により達成される。また、かかる分子は、本明細書では「Fc減衰」抗体分子又は「Fcko」抗体分子と称される。Fcフラグメントの一部、すなわちCH2ドメイン、及び存在する場合はCH3ドメインを表すため採用され得る本発明による抗体鎖の部分は、したがって、例えばエフェクター機能等の特定の生物学的機能を提供しない「足場」を定義する場合がある。しかしながら、この足場は、既知の抗体分子と比較して、本発明の抗体分子の精製、産生効率、及び／又は安定性の点で著しい利点を提供し得ることが、本発明において見出された。
【００８３】
幾つかの実施形態では、所与のFc受容体へのこのFc対応部分の認識、したがって結合は、天然起源の免疫グロブリンのFc領域よりも約2倍以下、約5倍以下、約8倍以下、約10倍以下、約12倍以下、約15倍以下、約20倍以下である。幾つかの実施形態では、このFc対応部分は、Fc受容体へのその結合能を完全に欠く。解離定数を決定することを含むFc受容体への抗体の結合は、例えば、Biacore（商標）測定を使用する表面プラズモン共鳴等の標準的な技術を使用して当業者によって容易に特定され得る。例えば分光学的、光化学的、測光的、又は放射線学的な手段に依拠し得る、バイオ分子結合を測定する任意の他の方法も同様に使用され得る。対応する検出方法の例は、それぞれ、蛍光相関分光法、光化学架橋、及び光活性標識又は放射性標識の使用である。これらの方法のうちの幾つかは、電気泳動又はHPLC等の追加の分離技術を含み得る。
【００８４】
必要に応じて、上に説明されるように、アミノ酸残基の置換又は欠失がこの効果に対して行われ得る。好適な突然変異は、例えば、Armour et al.（Eur. J. Immunol. [1999] 29, 2613-2624）から採用され得る。さらに、抗体鎖の配列に対する突然変異に適した位置は、FcγRIIIとヒトIgG1 Fcフラグメントとの間の複合体に関して公開された結晶構造データ（Sondermann et al., Nature [2000] 406, 267-273）から採用することができる。上に記載される結合親和性の測定に加えて、「Fc減衰」のレベル又は結合親和性の喪失を評価するため、Fc受容体への結合を媒介する能力（の欠如）を機能的に評価することも可能である。1つの標的としてCD3を結合する抗体分子の場合、例えば、細胞上でのかかるCD3結合抗体分子のマイトジェン活性（mitogenicity）により結合を評価することができる。マイトジェン活性は、単球等の補助細胞上のFc受容体にへのCD3抗体の結合によって媒介される。CD3に対して1つの結合部位を有する本発明の抗体分子は細胞分裂促進効果を示さないが、機能的なFc部を有する親モノクローナル抗CD3抗体がT細胞において強い有糸分裂を誘導する場合、本発明の抗体分子が有糸分裂の欠如によりFc結合能を欠き、したがって「Fcノックアウト」分子と見なされ得ることは明らかである。抗CD3媒介マイトジェン活性を評価する方法の実例は、Davis, Vida & Lipsky（J.Immunol （1986）137, 3758）、及びCeuppens, JL, & van Vaeck, F, （see J.Immunol. （1987）139, 4067, or Cell. Immunol. （1989）118, 136）によって記載されている。抗体のマイトジェン活性を評価するアッセイの更なる実例となる好適な例は、Rosenthal-Allieri et al.（Rosenthal-Allieri MA, Ticcioni M, Deckert M, Breittmeyer JP, Rochet N, Rouleaux M, and Senik A, Bernerd A, Cell Immunol. 1995 163（1）:88-95）及びGrosse-Hovest et al. （Grosse-Hovest L, Hartlapp I, Marwan W, Brem G, Rammensee H-G, and Jung G, Eur J Immunol. [2003] May;33（5）:1334-1340）によって記載されている。さらに、Fc結合の欠如は、本発明の抗体分子がFc部の1以上の既知のエフェクター機能を媒介する能力によって評価され得る。
【００８５】
上に言及されるように、可能性のある又は既存のジスルフィド結合を導入する又は除去することを含む、1以上のジスルフィド結合を導入する又は除去するため、システイン残基の置換又は欠失が行われ得る。それにより、本発明による抗体分子の主鎖と、より低重量の／より長さの短い鎖との間の連結が制御（確立、強化、又は消失を含む）され得る。1個以上のシステイン残基の導入又は除去によって、ジスルフィド架橋が導入され得る、又は除去され得る。実例として、本発明による四量体抗体分子は、一般的には、2つの二量体の抗体分子を連結する1以上のジスルフィド結合を有する。かかる1つのジスルフィド結合は、典型的には第1の二量体の抗体分子の主鎖中のシステインと、第2の二量体の抗体分子のヒンジ領域中のシステインとによって規定される。この点で、幾つかの実施形態では、本発明による抗体は、Kabatナンバリング［EUインデックス］によるヒトIgG免疫グロブリンの配列に関して、226位及び／又は229位の天然システイン残基の別のアミノ酸残基によるアミノ酸置換を含み得る。
【００８６】
また、アルギニン残基、アスパラギン残基、セリン残基、スレオニン残基、又はチロシン残基等のアミノ酸残基の置換又は欠失は、抗体のグリコシル化パターンを修飾するために行われ得る。実例として、CH2ドメインのIgG分子はAsn297における単一のN結合型二分岐炭水化物を有する。血清に由来する、又はハイブリドーマ若しくは操作された細胞においてex vivoで産生されたIgGについて、IgGはAsn297結合型炭水化物に関して不均一である。ヒトIgGについて、コアオリゴ糖は、典型的には、異なる数の外部の残基を含む、GlcNAc2Man3GlcNAcからなる。
【００８７】
示されるように、抗原／エピトープの結合以外に、免疫グロブリンは、免疫グロブリンのFc領域（天然配列のFc領域、又はアミノ酸配列変異体のFc領域）に起因する生物活性である「エフェクター機能」を更に有し、免疫グロブリンのアイソタイプと共に変化することが知られている。抗体エフェクター機能の例として、Clq結合、及び補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、食作用、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）の下方制御、及びB細胞活性化が挙げられる。抗体のエフェクター機能を発揮させることは、一般的には、エフェクター細胞の動員を含む。幾つかの免疫グロブリンエフェクター機能は、抗体のFc領域を結合する、Fc受容体（FcR）によって媒介される。FcRは免疫グロブリンのアイソタイプに対するそれらの特異性によって定義され、IgG抗体に対するFc受容体はFcγR、IgEに対してはFcεR、IgAに対してFcαR等と称される。CDC又はADCC等（such as）のこれらのエフェクター機能のいずれか（又はかかるエフェクター機能の喪失）は、本発明の抗体分子がFc結合能を欠いているかどうかを評価するために使用され得る。
【００８８】
これに関連して、「Fc受容体」又は「FcR」の用語は、受容体、一般的には、抗体のFc領域に結合することができるタンパク質を定義する。Fc受容体は、生体の免疫系の或る特定の細胞、例えばナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、及び肥満細胞の表面に見られる。in vivoでは、Fc受容体は、感染細胞に固定化されるか、又は侵入する病原体上に存在する免疫グロブリンに結合する。Fc受容体の活性は、抗体媒介食作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害によって微生物、又は感染細胞を破壊するように食細胞若しくは細胞傷害性細胞を刺激する。フラビウイルス等の幾つかのウイルスは、感染の抗体依存性増強として知られる機構によってウイルスが細胞に感染するのを支援するため、Fc受容体を使用する。FcRは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 （1991）、Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 （1994）、及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 （1995）において総説される。
【００８９】
「補体依存性細胞傷害」又は「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典補体経路の活性化は、それらの同族の抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体への補体系（Clq）の第1の成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 （1997） に記載される、CDCアッセイを行ってもよい。
【００９０】
「補体系」の用語は、当該技術分野において補体因子と称される、血液中に見られ、一般的に不活性前駆物質（プロタンパク質（pro-proteins））として循環する、多くの小さなタンパク質を指すために使用される。上記用語は、この「補体」に対して不変で適合不可能なシステムの能力、すなわち生体から抗原−抗体複合体と並んで細菌等の病原体を取り除く抗体及び食細胞の能力を指す。補体因子の一例は、C1qと、2つのセリンプロテアーゼ（proteases）であるC1r及びC1sとを含む、複合体C1である。複合体C1はCDC経路の構成成分である。C1qは、およそ460000の分子量を有する六価の分子であり、6つのコラーゲン「茎（stalks）」が6つの球状の頭部領域に接続されたチューリップの花束に例えられる構造である。補体カスケードを活性化するため、C1qはIgG1、IgG2、又はIgG3の少なくとも2つの分子に結合しなければならない。
【００９１】
「抗体依存性細胞性細胞傷害（Antibody-dependent cellular cytotoxicity）」、すなわちADCCは、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、及びマクロファージ等の或る特定の細胞傷害性細胞上に存在するFc受容体（FcR）に結合された免疫グロブリン分子が、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を持つ標的細胞に特異的に結合され、後に細胞毒素により標的細胞を殺傷することを可能とする、細胞傷害性の形態を指す。抗体は細胞傷害性細胞に「武装（arm）」させて、この機構によって標的細胞を殺傷するのに必要とされる。ADCCを媒介する主な細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRlI及びFcγRIIIを発現する。造血細胞でのFcR発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 （1991）の464頁の表3に要約される。目的の分子のADCC活性を評価するため、米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載されるようなin vitro ADCCアッセイが行われ得る。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞として、限定されないが、末梢血単核細胞（PBMC）、及びナチュラルキラー（NK）細胞が挙げられる。幾つかの実施形態では、目的の分子のADCC活性は、in vivo、例えばClynes et al., PNAS USA 95: 652-656 （1998）に開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。
【００９２】
本発明の抗体分子は、任意の既知の確立されている発現系及び組み換え細胞培養技術を使用して、例えば細菌宿主（原核生物系）又は酵母、菌類、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞等の真核生物系での発現によって産生され得る。例えば、本発明の抗体分子は、「IgGsc」フォーマットで使用される場合、抗体分子は（当然ながら）Coloma and Morrison （Nat Biotechnol 15:159-63, 1997） によって記載されるように又は本出願の実施例の欄に記載されるように、産生され得る。同様に、「Fabsc」フォーマットで用いられる本発明の抗体分子は、国際特許出願の国際公開第2013/092001号に記載されるように、又は本明細書の実施例の欄に記載されるように産生され得る。また、本発明の抗体分子は、ヤギ、植物、又はヒト免疫グロブリン座の大きなフラグメントを有し、マウス抗体産生が欠乏している、改変されたマウス株であるXENOMOUSEトランスジェニックマウス等の遺伝子組み換え生物において産生され得る。また、抗体は化学合成によっても産生され得る。
【００９３】
本発明の組み換え抗体分子の産生のため、典型的には、抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、更なるクローニング（増幅）又は発現のためプラスミド等の複製可能なベクターに挿入する。好適な発現系の実例は、例えばCHO又はNS0である宿主細胞によるグルタミン酸合成酵素系（Lonza Biologicsによって販売されるもの等）である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して、容易に単離され、配列決定される。使用され得るベクターは、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体であってもよく、それらのうちプラスミドが典型的な実施形態である。一般的には、かかるベクターは、発現を促進するように、シグナル配列、複製起点、1以上のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、軽鎖及び／又は重鎖ポリヌクレオチドに制御可能に連結されたプロモータ配列及び転写終結配列を更に含む。軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクターに挿入され得て、同じ宿主細胞にトランスフェクトされ得るか、又は望ましい場合は、宿主細胞へのトランスフェクションのため重鎖及び軽鎖はどちらも同じベクターに挿入され得る。両方の鎖は、例えば、Skerra, A. （1994）Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli, Gene 151, 131-135、又はSkerra, A. （1994）A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments, Gene 141, 79-8に記載されるように、ジシストロニックオペロンの制御下で配列され、発現されて機能的に正確に折り畳まれた抗体分子をもたらす。したがって、本発明の或る一つの態様によれば、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメントの軽鎖及び／又は重鎖をコードするベクターを構築する方法が提供され、該方法は、ベクターに、本発明の抗体分子の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかをコードするポリヌクレオチドを挿入することを含む。
【００９４】
組み換え技術を使用する場合、抗体分子は、細胞膜周辺腔において細胞内に産生され得るか、又は培地に直接分泌され得る（上のSkerra 1994も参照されたい）。第1の工程として抗体が細胞内で産生される場合、宿主細胞又は溶解されたフラグメントのいずれかである微粒子の残骸は、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 （1992）は、E.コリ（E.coli）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載する。また、抗体は、任意の酸化環境において産生され得る。かかる酸化環境はグラム陽性細菌の細胞外環境（milieu）で又は真核細胞（昆虫細胞又は哺乳動物細胞等の動物細胞を含む）の小胞体の内腔で、E.コリ等のグラム陰性細菌のペリプラズムによって提供され得て、通常、構造ジスルフィド結合の形成を支援する。しかしながら、E.コリ等の宿主細胞の細胞質ゾル中に本発明の抗体分子を産生することもできる。この場合、ポリペプチドは、可溶性で折り畳まれた状態で直接得られるか、又は封入体の形態で回収された後in vitroで再生されるかのいずれかであり得る。更なる選択肢は、酸化している細胞内環境を有する特定の宿主株の使用であり、それにより、細胞質ゾル中のジスルフィド結合の形成が可能となり得る（Venturi M, Seifert C, Hunte C. （2002） "High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm." J. Mol. Biol. 315, 1-8）。
【００９５】
細胞によって産生される抗体分子は、任意の従来の精製技術、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得て、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術の一つである。抗体分子は、CH1ドメイン又はCLドメイン等の定常ドメインを特異的かつ可逆的に結合する、タンパク質／リガンドによる親和性精製によって精製され得る。かかるタンパク質の例は、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、又はプロテインL等の免疫グロブリン結合細菌タンパク質であり、ここで、プロテインL結合は、カッパー軽鎖を含む抗体分子に限定される。κ軽鎖による抗体の精製に対する代替法は、ビーズに連結された抗カッパー抗体（KappaSelect）の使用である。親和性リガンドとしてのプロテインAの適応性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンFcドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインAは抗体を精製するために使用され得る（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 （1983））。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトガンマ3に対して推薦される（Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 （1986））。本発明の特定の抗体分子に使用される精製方法の選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００９６】
また、本発明の抗体分子の鎖のうちの1つに1以上の親和性タグを持たせることが可能である。Strepタグ（商標）又はStrepタグ（商標）II（Schmidt, T.G.M. et al. （1996）J. Mol. Biol. 255, 753-766）、mycタグ、FLAG（商標）タグ、His6タグ又はHAタグ等の親和性タグは検出を容易にし、また組み換え抗体分子の単純精製を可能とする。
【００９７】
ここで、本発明の核酸を見ると、本発明による抗体の1以上の鎖をコードする核酸分子は、1本鎖、2本鎖、又はそれらの組み合わせ等の任意の可能な配置の任意の核酸であってもよい。核酸として、例えば、DNA分子、RNA分子、ヌクレオチドアナログを使用して又は核酸化学を使用して生成されたDNA又はRNAのアナログ、ロックド核酸分子（LNA）、及びタンパク質核酸分子（PNA）が挙げられる。DNA又はRNAはゲノム起源又は合成起源であってもよく、1本鎖であっても2本鎖であってもよい。かかる核酸は、例えばmRNA、cRNA、合成RNA、ゲノムDNA、cDNA合成DNA、DNAとRNAの共重合体、オリゴヌクレオチド等であってもよい。さらに、それぞれの核酸は、非天然ヌクレオチドアナログを含んでもよく、及び／又は親和性タグ若しくは標識に連結されてもよい。
【００９８】
幾つかの実施形態では、本発明による抗体の主鎖及び／又はより小さい鎖等の鎖をコードする核酸配列は、プラスミド等のベクターに含まれる。抗体の天然起源のドメイン又は領域と比較した場合、置換又は欠失が抗体鎖に含まれる場合、例えば、免疫グロブリンの配列に含まれる、それぞれの天然のドメイン／領域のコーディング配列を突然変異誘発に対する開始点として使用することができる。選択されたアミノ酸位置の突然変異誘発のため、当業者は、部位特異的変異誘発に対する様々な確立された標準法を自由に用いることができる。一般的に使用される技術は、所望の配列位置に変性した塩基組成物を持つ、合成オリゴヌクレオチドの混合物を使用する、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いた突然変異の導入である。例えばコドンNNK又はNNSの使用（ここで、N＝アデニン、グアニン又はシトシン又はチミン；K＝グアニン又はチミン；S＝アデニン又はシトシン）は、突然変異誘発の間、20個のアミノ酸全てとアンバー停止コドンの組み込みを可能にするが、コドンVVSは、それがアミノ酸Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Valをポリペプチド配列の選択された配列位置への取り込みから除外するため、取り込みが可能なアミノ酸の数を12に制限し、コドンNMS（ここで、M＝アデニン又はシトシン）の使用は、それがアミノ酸Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Valを選択された位置への取り込みから除外するため、例えば、選択された配列位置での可能なアミノ酸の数を11に制限する。この点に関して、セレノシステイン又はピロリジン等の他のアミノ酸に対するコドン（通常の20個の天然起源アミノ酸以外）を抗体分子の核酸に組み込むこともできることに留意されたい。また、Wang, L., et al. （2001）Science 292, 498-500、又はWang, L., and Schultz, P.G. （2002）Chem. Comm. 1, 1-11に記載されるように、他の異常アミノ酸、例えばo-メチル-L-チロシン又はp-アミノフェニルアラニンを挿入するため、通常、停止コドンとして認識されるUAG等の「人工」コドンを使用することもできる。
【００９９】
例えば、イノシン、8-オキソ-2'デオキシグアノシン、又は6（2-デオキシ-β-D-リボフラノシル）-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド（pyrimido）-1,2-オキサジン-7-オン（Zaccolo et al. （1996）J. Mol. Biol. 255, 589-603）としての塩基対特異性が減少されたヌクレオチド基本単位の使用は、選択された配列セグメントへの突然変異の導入に対する別の選択肢である。更なる可能性は、いわゆるトリプレット突然変異誘発である。この方法は、コード配列中への組み込みのため、その各々が1個のアミノ酸をコードする種々のヌクレオチドトリプレットの混合物を使用する（Virnekas B, et al., 1994 Nucleic Acids Res 22, 5600-5607）。
【０１００】
本発明による抗体の主鎖及び／又はより小さい鎖等の鎖をコードする核酸分子は、任意の好適な発現系を使用して、例えば、好適な宿主細胞又は無細胞系において発現され得る。得られる抗体分子は、選択及び／又は単離の手段によって濃縮され得る。
【０１０１】
また、本発明は、本発明の抗体分子と、任意に薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【０１０２】
本発明による抗体分子は、タンパク質薬物に対して治療的に有効な任意の非経口的又は非経口ではない（経腸）経路によって投与され得る。非経口的な適用方法として、例えばエアロゾル混合物、スプレー、又は粉末の形態でのエアロゾル装置及び吸入と並んで、例えば、注射溶液、輸液又はチンキ剤の形態での、例えば皮内、皮下、筋肉内、気管内、鼻腔内、硝子体内、又は静脈内の注射及び注入技術が挙げられる。肺への薬物送達、すなわち、エアゾール剤の吸入（鼻腔内投与にも使用され得る）、又は気管内（intratracheal）装置のいずれかによる薬物送達に関する概要は、例えばJ.S. Patton et al. The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery. Proc. Amer. Thoracic Soc. 2004 Vol. 1 pages 338-344によって与えられる）。非経口送達ではない様式は、例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤、溶液、若しくは懸濁物の形態で経口的、又は例えば坐剤の形態で経直腸的である。本発明の抗体分子は、所望に応じて、従来の無毒な薬学的に許容可能な賦形剤、又は担体、添加剤、及びビヒクルを含む製剤で全身投与又は局所投与され得る。
【０１０３】
本発明の或る一つの実施形態では、医薬品は、哺乳動物、特にヒトに非経口的に投与される。対応する投与方法として、限定されないが、例えばエアロゾル混合物、スプレー、又は粉末の形態でのエアロゾル装置及び吸入と並んで、例えば、注射溶液、輸液、又はチンキ剤の形態での、例えば、皮内、皮下、筋肉内、気管内、又は静脈内の注射及び注入技術が挙げられる。静脈内及び皮下注入及び／又は注射の組み合わせは、比較的短い血清半減期を有する化合物の場合に最も都合がよいといえる。医薬組成物は、水性溶液、水中油型エマルジョン、又は油中水型エマルジョンであってもよい。
【０１０４】
この点に関して、経皮的送達技術、例えばMeidan VM and Michniak BB 2004 Am. J. Ther. 11（4）: 312-316に記載されるイオン導入、ソノフォレーシス（sonophoresis）、又はマイクロニードル促進送達（microneedle-enhanced delivery）も、本明細書に記載される抗体分子の経皮的送達に使用され得る。非経口ではない送達様式は、例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤、溶液、若しくは懸濁物の形態の経口投与、又は例えば坐剤の形態の直腸投与である。本発明の抗体分子は、様々な従来の無毒の薬学的に許容可能な賦形剤又は担体、添加剤、及びビヒクルを含む製剤で全身投与又は局所投与され得る。
【０１０５】
適用される抗体分子の投薬量は、所望の予防効果又は治療反応を達成するために幅広い範囲で変化し得る。投薬量は、例えば、in vivoでの抗体分子とリガンドとの間の複合体の半減期と並んで、選択される標的に対する抗体分子の親和性に基づく。さらに、最適な投薬量は、患者の医学的状態と並んで、抗体分子又はそのコンジュゲートの体内分布、投与の様式、治療されている疾患／障害の重症度に依存する。例えば、局所塗布用の軟膏で使用される場合、高濃度の抗体分子が使用され得る。しかしながら、要求に応じて、抗体分子は、持続放出製剤、例えばPolyActive（商標）又はOctoDEX（商標）のようなリポソーム分散剤又はハイドロゲル系ポリマーマイクロスフェアでも与えられ得る（Bos et al., Business Briefing: Pharmatech 2003: 1-6を参照されたい）。入手可能な他の持続放出製剤は、例えば、PLGA系ポリマー（PR pharmaceuticals）、PLA-PEG系ヒドロゲル（Medincell）、及びPEA系ポリマー（Medivas）である。
【０１０６】
したがって、本発明の抗体分子は、確立された調剤方法と共に、薬学的に許容可能な原料を使用して組成物へと製剤化され得る（Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. （2000）Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）。医薬組成物を調製するため、薬学的に不活性な無機又は有機の賦形剤が使用され得る。例えば、丸剤、粉末、ゼラチンカプセル剤、又は坐剤を調製するため、例えばラクトース、タルク、ステアリン酸及びその塩、脂質、ワックス、固体又は液体のポリオール、天然油及び硬化油が使用され得る。溶液、懸濁物、エマルジョン、エアロゾル混合物、又は使用前の溶液若しくはエアロゾルの混合物への再構成用の粉末の製造に適した賦形剤として、植物油と並んで、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、及びそれらの好適な混合物が挙げられる。
【０１０７】
また、医薬組成物は、添加剤、例えば充填剤、結合剤、湿潤剤、滑剤、安定剤、防腐剤、乳化剤、また更には溶媒若しくは可溶化剤、又は貯蔵効果を達成するための薬剤を含み得る。後者の場合、融合タンパク質を、リポソーム及びマイクロカプセル等の徐放若しくは持続放出、又は標的化送達システムに組み込んでもよい。
【０１０８】
製剤は、細菌保持フィルターを通す濾過を含む多数の手段によって、又は使用の直前に滅菌水若しくは他の無菌の媒質に溶解若しくは分散され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。
【０１０９】
抗体分子は、疾患の治療又は予防に適しており、それに使用することができる。したがって、幾つかの実施形態では、本発明による抗体分子は、障害又は疾患等の医学的状態を治療及び／又は予防する方法において使用され得る。同様に、本発明の抗体分子は、疾患の治療に使用され得る。治療又は予防される疾患は、増殖性疾患であってもよい。かかる増殖性疾患は、腫瘍又は癌であり得ることが好ましい。PMSAを結合する本発明の抗体分子の能力により、この抗体分子は、原発性及び転移性の前立腺癌細胞（従来の（明細胞）腎臓癌、膀胱の移行上皮癌、精巣胎芽性癌、結腸腺癌、神経内分泌癌、多形膠芽腫、悪性黒色腫、膵管癌腫、非小細胞性肺癌、軟部組織肉腫及び乳癌等の広範囲の悪性新生物の血管新生を参照されたい）等のPSMAを発現する細胞からなる癌を治療するために使用され得る（これに関連して、Chang SS et al. Five different anti prostate specific membrane antigen （PSMA）antibodies confirm PSMA expression in tumor associated neovasculature. Cancer Res 1999; 59:3192を参照されたい）。したがって、本発明の抗体分子は、或る一つの態様では、前立腺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、又は膠芽腫等の固形癌の治療において使用され得る。しかしながら、本発明の抗体が扁平細胞にも結合するという驚くべき知見により、本発明の抗体分子は、別の態様では、皮膚、頭頚部、食道、肺、及び子宮頚の癌腫（を含むがそれらに限定されない）といった種々の起源の扁平細胞癌の治療にも使用され得ることが好ましい。
【０１１０】
融合タンパク質で治療される被験体は、ヒトであってもよく、又は非ヒト動物であってもよい。かかる動物は、哺乳動物、例えばヒト、ブタ、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、又はウマであることが好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０１１１】
また、本発明の抗体分子は、本明細書に記載される疾患等の疾患の診断に使用され得る。抗体分子は、この目的のため、好適な検出可能なシグナリング標識で標識化され得る。かかる標識化抗体分子は、PSMAのレベル、又は前立腺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、又は膠芽腫、扁平細胞癌等の癌、及び試料若しくは被験体における上に列挙される種々の起源の扁平細胞癌の検出又は定量を可能とし得る。in vivoでの使用が指定される場合、上記検出可能なシグナリング標識は、in vivoで検出可能であることが好ましい。
【０１１２】
標識化抗体分子は、免疫画像化技術において使用され得る。その後、検出可能なシグナリング標識は、例えば、診断に用いられる免疫画像化技術に基づいて選択され得て、例えば、それぞれ、ガンマカメラ画像化技術/SPECTの場合のガンマ線放射性核種（又はガンマ放出体）、MRI又はPETの画像化技術の場合の金属又は陽電子放出体である。この点に関して、本開示の1以上の検出可能なシグナリング標識は、ガンマカメラ画像形成剤（imageable agents）、PET画像形成剤、及びMRI画像形成剤、例えば放射性核種、蛍光剤、蛍光助剤（fluorogens）、発色団、色素原、燐光発光物質（phosphorescers）、化学発光物質、及び生物発光物質を含む。
【０１１３】
好適な検出可能なシグナリング標識は放射性核種であってもよい。上記放射性核種は、3H、14C、35S、99Tc、1231、1251、131I、mIn、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、及び201T1からなる群から選択され得る。
【０１１４】
また、好適な検出可能なシグナルリング標識は、フルオロフォア又は蛍光助剤であってもよい。上記フルオロフォア又は蛍光助剤は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド（phthalaldehyde）、フルオレサミン、フルオレセイン誘導体、Oregon Green、Rhodamine Green、Rhodol Green、又はTexas Redからなる群から選択され得る。
【０１１５】
標識化抗体分子は、検出可能なシグナリング標識に直接又は間接のいずれかで連結され得る。例えば、抗体分子は、検出可能なシグナルリング標識に直接（例えば抗体分子のチロシン残基を介して）又は間接（例えば金属キレート剤としてリンカーを介して）のいずれかで連結され得る。幾つかの他の実施形態では、抗体分子は、使用時及び使用の場所において、検出可能なシグナリング標識に（in vitro又はin vivoのいずれかで）連結され得る分子に連結されてもよい。
【０１１６】
検出可能なシグナリング標識は、抗体分子に連結される1以上のジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）残基により、抗体分子に結合され得る。
【０１１７】
また、本明細書に定義される疾患を検出する又は診断するin vitro方法も本発明によって意図される。かかる方法は、被験体から得られた試料と、好ましくは標識化された本発明の抗体分子とを接触させることを含み得る。試料は、血液、尿又は脳脊髄液試料であってもよいが、好ましくは組織試料又は生検試料であってもよい。検出される又は診断される疾患は、前立腺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、又は扁平細胞癌であることが好ましく、扁平細胞癌が最も好ましい。
【０１１８】
本発明は、更に以下の項を特徴とする。
【０１１９】
項1．ヒト前立腺特異的膜抗原（PSMA）に結合することができる抗体分子又はその抗原結合性フラグメントであって、
（i）配列番号03に述べるCDRH1領域（GFTFSDFYMY）と、配列番号04に述べるCDRH2領域（TISDGGGYTSYPDSVKG）と、配列番号05に述べるCDRH3領域（GLWLRDALDY）とを含む、又は配列番号03、配列番号04若しくは配列番号05と少なくとも75%の配列同一性若しくは少なくとも80%の配列同一性を有するCDRH1、CDRH2若しくはCDRH3の配列を含む重鎖可変ドメインと、
（ii）配列番号06に述べるCDRL1領域（SASSSISSNYLH）と、配列番号07に述べるCDRL2領域（RTSNLAS）と、配列番号08に述べるCDRL3領域（QQGSYIPFT）とを含む、又は配列番号06、配列番号07若しくは配列番号08と少なくとも75%の配列同一性若しくは少なくとも80%の配列同一性を有するCDRL1、CDRL2若しくはCDRL3の配列を含む軽鎖可変ドメインと、
を含む、抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２０】
項2．前記重鎖可変領域が、配列番号01又は配列番号09に述べるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２１】
項3．前記軽鎖可変領域が、配列番号02又は配列番号10に述べるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1又は2に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２２】
項4．上記抗体が、scFv、ヒンジ領域を欠く一価抗体、ミニボディ、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F（ab’）2フラグメント、及び全抗体からなる群から選択される、項1〜3のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２３】
項5．ヒトIgG定常ドメインを含む、項1〜4のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２４】
項6．CH1ドメインを含む、項1〜5のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２５】
項7．Fc領域を含む、項1〜6のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２６】
項8．上記抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）エフェクター機能を有する、項1〜7のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２７】
項9．親抗体と比較して、FcγRIIIa受容体に対する親和性が増強された、又はADCCエフェクター機能が増強された、項8に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２８】
項10．重鎖と軽鎖と親抗体と比較して定常領域の少なくとも1つのアミノ酸置換とを含み、上記少なくとも1つのアミノ酸置換がアミノ酸置換S239D及びI332Eを含み、上記位置のナンバリングがEUインデックスに従う、項1〜9のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１２９】
項11．項1に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントのヒトPSMAへの結合と競合することができる、ヒトPSMAに結合可能な抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１３０】
項12．上記抗体分子又はその抗原結合性フラグメントがヒトPSMAへのJ591の結合と競合しない、項1〜11のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１３１】
項13．上記抗体分子又はその抗原結合性フラグメントが、PSMAに結合する場合、J591よりも抗原シフトの誘導が減少される、項1〜12のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１３２】
項14．上記抗原シフトがPMSAトランスフェクトSp2/0細胞において誘導される、項13に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１３３】
項15．上記抗体分子又はその抗原結合性フラグメントが扁平細胞癌（SCC）細胞に更に結合する、項1〜14のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１３４】
項16．（i）項1〜15のいずれか一項に定義される重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む可変領域であって、ヒト前立腺特異的膜抗原（PSMA）に結合することができる第1の結合部位を含む、可変領域と、（ii）第2の結合部位を含む、抗体分子の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域とを含む、二重特異性抗体分子。
【０１３５】
項17．上記第1の結合部位及び上記第2の結合部位が異なる結合パートナーに結合する、項16に記載の抗体分子。
【０１３６】
項18．上記第1の結合部位又は上記第2の結合部位が、T細胞又はナチュラルキラー（NK）細胞特異的な受容体分子に結合する、項16又は17に記載の抗体分子。
【０１３７】
項19．T細胞又はNK細胞特異的な受容分子が、CD3、T細胞受容体（TCR）、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1 BB、CD2、CD5、PD-1、及びCD95の一つである、項16〜18のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１３８】
項20．上記TCRがTCR（アルファ／ベータ）又はTCR（ガンマ／デルタ）である、項19のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１３９】
項21．上記T細胞な又はNK細胞特異的な受容分子がCD3である、項19に記載の抗体分子。
【０１４０】
項22．第2の結合部位を含む、抗体分子の上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、OKT3又はUCHT1の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である、項21に記載の抗体分子。
【０１４１】
項23．（i）上記第1の結合部位がFabフラグメントに含まれ、上記第2の結合部位がscFvフラグメントに含まれ、又は（ii）上記第1の結合部位が単鎖Fvフラグメントに含まれ、第2の結合部位がFabフラグメントに含まれる、項15〜21のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１４２】
項24．上記Fabフラグメント及び単鎖FvフラグメントがCH2ドメイン及び／又はCH3ドメインを介して連結される、項23に記載の抗体分子。
【０１４３】
項25．Fc受容体への結合を媒介することができる上記CH2ドメインの少なくとも1個のアミノ酸残基が欠損又は変異導入されている、項24に記載の抗体分子。
【０１４４】
項26．配列位置226、228、及び229（EUインデックスに従う配列位置のナンバリング）の1以上のアミノ酸残基が欠損又は変異導入されている、項24又は25に記載の抗体分子。
【０１４５】
項27．上記Fabフラグメントが、Fabフラグメントの重鎖CH1及びVHドメインを介して、又はFabフラグメントのCL及びVL軽鎖ドメインを介してCH2ドメインに連結される、項24〜26のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１４６】
項28．上記Fabフラグメントの重鎖ドメイン又は上記Fabフラグメントの軽鎖ドメインが、抗体分子のポリペプチド鎖のN末端に配置される、項27に記載の抗体分子。
【０１４７】
項29．上記Fabフラグメントがヒンジ領域を含む、項1〜28のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１４８】
項30．Fc受容体への結合を媒介することができるCH2ドメインの少なくとも1個のアミノ酸残基が、欠損又は変異導入され、配列位置230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327、及び330（EUインデックスに従う配列位置のナンバリング）からなる群から選択される、項24〜29のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１４９】
項31．226位及び229位の1つ又は両方のシステインが異なるアミノ酸で置き換えられる、項24〜30のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１５０】
項32．Fabフラグメントと、CH2ドメインと、scFvフラグメントとを含み、該Fabフラグメントがヒンジ領域を含む、項24〜31のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１５１】
項33．上記Fabフラグメントがヒト化10B3抗体のFabフラグメントである、及び／又は、
scFvフラグメントがOKT3抗体に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、項32に記載の抗体分子。
【０１５２】
項34．上記抗体分子の重鎖が配列番号12に述べる配列を有する、及び／又は上記抗体分子の軽鎖が配列番号13に述べる配列を有する、項33に記載の抗体分子。
【０１５３】
項35．Fabフラグメントと、CH2ドメインと、CH3ドメインと、scFvフラグメントとを含み、該Fabフラグメントがヒンジ領域を含む、項24〜31のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１５４】
項36．上記Fabフラグメントがヒト化10B3抗体のFabフラグメントである、及び／又は、
scFvフラグメントがヒト化UCHT1抗体に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、項35に記載の抗体分子。
【０１５５】
項37．上記抗体分子の重鎖が配列番号11に述べる配列を有する、及び／又は上記抗体分子の軽鎖が配列番号13に述べる配列を有する、項36に記載の抗体分子。
【０１５６】
項38．上記抗体分子が四量体抗体分子である、項35〜37のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１５７】
項39．上記抗体分子が、二重特異性タンデム単鎖Fv、二重特異性Fab2、又は二重特異性ダイアボディである、項16(17)〜23のいずれか一項に記載の抗体分子。
【０１５８】
項40．項1〜39のいずれか一項に定義される抗体分子又はその抗体結合性フラグメントを含む、医薬組成物。
【０１５９】
項41．疾患の診断又は治療における使用に対する、項1〜39のいずれか一項に定義される抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１６０】
項42．上記疾患が増殖性疾患（proliferative disease）である、項41に記載の使用に対する抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１６１】
項43．上記増殖性疾患が癌である、項42に記載の使用に対する抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１６２】
項44．上記癌が、前立腺癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、乳癌、膵臓癌、又は膠芽腫である、項43に記載の使用に対する抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１６３】
項45．上記癌が扁平細胞癌である、項43に記載の使用に対する抗体分子又はその抗原結合性フラグメント。
【０１６４】
項46．被験体から得られた試料を、項1〜39のいずれか一項に定義される抗体分子又はその抗原結合性フラグメントと接触させることを含む、疾患を診断するin vitro方法。
【０１６５】
項47．上記試料が組織試料又は生検試料である、項46に記載のin vitro方法。
【０１６６】
項48．上記疾患は、癌であり、好ましくは前立腺癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、乳癌、膵臓癌、膠芽腫、又は扁平細胞癌である、項46又は47に記載のin vitro方法。
【０１６７】
項49．項1〜39のいずれか一項に定義される抗体分子又はその抗抗原結合性フラグメントをコードする核酸分子。
【０１６８】
項50．項49に記載の核酸分子を含むベクター。
【０１６９】
項51．項49に記載の核酸分子又は項50に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０１７０】
項52．核酸の発現を可能とする条件下で抗体分子をコードする核酸を発現することを含む、項1〜39のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合性フラグメントを製造する方法。
【０１７１】
項53．上記抗体分子又はその抗原結合性フラグメントが宿主細胞又は無細胞系で発現される、項52に記載の方法。
【０１７２】
配列表の簡単な説明
配列番号01：ネズミ科10B3抗体の重鎖可変ドメイン（アミノ酸配列）。
配列番号02：ネズミ科10B3抗体の軽鎖可変ドメイン（アミノ酸配列）。
配列番号03：ネズミ科10B3抗体のCDRH1（アミノ酸配列）。
配列番号04：ネズミ科10B3抗体のCDRH2（アミノ酸配列）。
配列番号05：ネズミ科10B3抗体のCDRH3（アミノ酸配列）。
配列番号06：ネズミ科10B3抗体のCDRL1（アミノ酸配列）。
配列番号07：ネズミ科10B3抗体のCDRL2（アミノ酸配列）。
配列番号08：ネズミ科10B3抗体のCDRL3（アミノ酸配列）。
配列番号09：ヒト化10B3抗体の重鎖可変ドメイン（アミノ酸配列）。
配列番号10：ヒト化10B3抗体の軽鎖可変ドメイン（アミノ酸配列）。
配列番号11：ヒト化h10B3×ヒト化hUCHT1二重特異性IgGscフォーマット抗体分子の重鎖。
配列番号12：ヒト化h10B3×ネズミ科OKT3二重特異性Fabscフォーマット抗体分子の重鎖。
配列番号13：ヒト化10B3抗体のカッパー軽鎖。
配列番号14：配列番号3に対して少なくとも75%の配列同一性を有するネズミ科10B3抗体の変異CDRH1の実例（アミノ酸配列）。
配列番号15：抗体J519の重鎖の可変ドメインのアミノ酸配列。
配列番号16：抗体J519の軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列。
【実施例】
【０１７３】
実験例
本発明を、更に以下の非限定的な実施例によって説明する。
【０１７４】
実施例1：10B3抗体の作製、同定、及び産生
放射線照射されたPSMAトランスフェクトSp2/0  Ag14細胞による雌性BALB/cマウスの免疫化の後、抗体10B3を作製した（ATCC（商標）CRL-1581（商標）の名称のもと商業的に入手可能なATCCからSp2/0-Ag14細胞を得た）。最後の免疫化から4日後、脾臓細胞をトランスフェクトしたSp2/0細胞と融合し、HAT選択培地で培養した。生育しているハイブリドーマ細胞の上清をPSMAトランスフェクトしたSp2/0細胞及びPSMAトランスフェクトしていないSp2/0細胞を使用するフローサイトメトリーによってPSMA抗体の産生についてスクリーニングした。限界希釈によってサブクローニングした後、安定なモノクローナルハイブリドーマ細胞株を得た。抗体産生のため、ハイブリドーマ細胞を1%FCS（ドイツ国ベルリンのBiochrom GmbH）で補足した血清低減（advanced）DMEM培地（米国02451マサチューセッツ州ウォルサムのGibco、Thermo Scientific）に適合させて精製中のウシIgGによる汚染を回避した。抗体をプロテインA親和性クロマトグラフィーによって細胞培養上清から単離し、精製した抗体のアイソタイプをIgG2b/カッパーであると同定した（Rapid Mouse-Monoclonal Isotyping Kit、21754メリーランド州イジャムズビルのBioAssay Works）。可変重鎖（配列番号1及び図10Aに示される）及び可変軽鎖（配列番号2及び図10Bに示される）の配列は、ドイツ国フライブルクのAlvedron GmbHによって決定された。
【０１７５】
実施例2：ヒト化10B3抗体の作製
10B3抗体は、ヒト可変κ軽配列IGKV3-20*02（この配列は、アクセッション番号L37729のもとIMGT/LIGMデータベースに寄託され、またIchiyoshi Y., Zhou M., Casali P. A human anti-insulin IgG autoantibody apparently arises through clonal selection from an insulin-specific 'germ-line' natural antibody template. Analysis by V gene segment reassortment and site-directed mutagenesis' J. Immunol. 154（1）:226-238 （1995）を参照されたい）及び可変重鎖配列IGHV3-11*06（この配列はアクセッション番号AF064919のもとIMGT/LIGMデータベースに寄託され、またWatson C.T., et al. Complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy-chain variable, diversity, and joining genes and characterization of allelic and copy-number variation. Am. J. Hum. Genet. 92（4）:530-546 （2013）を参照されたい）の生殖細胞系列配列にCDR領域を移植することによりヒト化された。IMGT/LIGM-DBは、ヒト及び他の脊椎動物種に由来する免疫グロブリン（IG）及びT細胞受容体（TR）のヌクレオチド配列のIMGT総合データベースであり、Nucleic Acids Res. 2006 （Jan 1）; 34（Database issue）:D781-4を参照されたい。
【０１７６】
親ネズミ科抗体の結合特性を維持するため、以下の2つの復帰突然変異を可変ヒトのフレームワーク領域に導入した。IGHV3-11*06のヒト生殖細胞系列の重鎖の可変ドメインでは、49位のセリンがネズミ科抗体10B3中に存在するアラニンに復帰突然変異された（49位のアラニン残基が太字及びイタリック体で強調される図10Cも参照されたい）。IGKV3-20*02の軽鎖配列の可変ドメインでは、ヒト生殖細胞系列配列の配列位置72のフェニルアラニンは、ネズミ科抗体10B3中のこの配列位置に存在するチロシン残基に復帰突然変異された（72位のチロシン残基が太字及びイタリック体で強調される図10Dも参照されたい）。
【０１７７】
実施例3：組み換え抗体分子の産生及び種々のPSMA×CD3抗体によるオフターゲットT細胞活性化
組み換え二重特異性抗体分子の構築のため、PSMA抗体J591及び10B3の可変ドメインを、次のの順にCD3抗体OKT3又はUCHT1のヒト定常領域及び可変領域へと融合した。Fabscフォーマット及びIgGscフォーマットの両方に対して、VL-CL。重鎖を次の通り構築した：Fabscフォーマットに対してVH-CH1-CH2mod-scFv（OKT3/UCHT1）、IgGscフォーマットに対してVH-CH1-CH2mod-CH3-scFv（OKT3/UCHT1）（図1A及び図1Bも参照されたい）。これらの抗体分子では、PMSA結合部位はFabフラグメントとして存在するが、CD3結合部位はscFvフラグメントとして存在する（図1A及び図1Bを再度参照されたい）。FcR結合、糖鎖付加部位、及びジスルフィド結合の形成を抑制するため、以下の修飾をFabscフォーマットのヒンジ領域及びCH2ドメインに導入した（EUインデックス）：C226S；C229S；E233P；L234V；L235A；ΔG236；D265G；N297Q；A327Q；A330S（これに関して国際特許出願の国際公開第2013/092001号も参照されたい）。IgGscフォーマットの修飾は、IgGscフォーマットを欠くヒンジ領域中の配列位置226及び229の2つのシステイン突然変異を除いて同一であった。コンストラクトをpcDNA3.1に由来する発現ベクター（InVitrogen、Thermo Fisher）にクローニングし、国際特許出願の国際公開第2013/092001号にも記載される電気穿孔によってSp2/0細胞にトランスフェクトした。kappaSelect（Fabsc）樹脂又はプロテインA（IGGsc）樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによってトランスフェクトした細胞の上清から抗体分子を精製した。両方の親和性樹脂をドイツ国フライブルクのGE Health Careから購入した。
【０１７８】
オフターゲットT細胞活性化の特性評価のため、PBMCを、SKW6.4バイスタンダーリンパ腫細胞の不在下及び存在下でJ519及び10B3の指定の抗体分子と共にインキュベートした。2日後に、CD4 T細胞のCD69発現をフローサイトメトリーによって分析した。この目的のため、PMBCをCD4（FITC標識化クローンHP2/6）、CD8（APC標識化クローンHIT8a）、及びCD69（PE標識化クローンFN50）に対する検出抗体と共にインキュベートし、活性化マーカーであるCD69を発現するT細胞を同定した。細胞をBD Biosciences製のFACS Canto IIを使用して分析した。
【０１７９】
結論：図2（抗体J519の可変ドメインを含む二重特異性抗体分子に関する結果を示す）に示されるように、CD3結合抗体UCHT1のscFvフラグメントを含むFabsc抗体分子は、PSMA発現細胞の不在下でT細胞活性化を誘導する（オフターゲットT細胞活性化）が、同じ標的、すなわち、PMSA結合部位及びエフェクター抗体結合部位を含むIgGsc抗体分子（すなわち、CD3結合抗体UCHT1のscFvフラグメント）はオフターゲットT細胞活性化を誘導しない。
【０１８０】
実施例4：FabscフォーマットのPSMA×CD3抗体によるオンターゲットT細胞活性化
図3において、T細胞活性化を3Hチミジン取り込みによって評価した。図3Aには、比較のためオフターゲットT細胞活性化を示す。図3Cでは、活性化T細胞によるPSMA発現標的細胞の溶解を、Xelligence細胞傷害性アッセイによって実証する。3Hチミジン取り込みアッセイのため、PBMC（205個／ウェル）を96ウェルプレートに3連（triplicates）で蒔き、放射線照射した（100 Gy）PSMA発現22RV1細胞（105個／ウェル）を含んで（図3B）又はそれを含まずに（図3A）、様々な濃度の二重特異性抗体分子と共にインキュベートした。72時間後、細胞は3Hチミジン（0.5 μCi／ウェル）で更に20時間パルスされ、フィルターマット上で採取された。取り込まれた放射能を、2450 Microplate counter（Perkin Elmer）において液体シンチレーションカウンティングによって特定した。
【０１８１】
Xelligenceアッセイのため、培養培地50 μlを96ウェルEプレート（Roche）に添加してバックグラウンド値を特定した。その後、標的細胞（22RV1）を1ウェル当たり40000個の細胞密度で蒔いた。次の20時間〜24時間に亘って、細胞をウェルに付着させた。その後、密度勾配遠心分離によって単離したPBMCを標的細胞に添加した。標的に対するエフェクター比（E:T）は5:1であり、二重特異性抗体濃度は1 μg/mlであった。接着性標的細胞の生存率に対する基準として、数日間に亘り15分ごとにインピーダンスをモニターした。
【０１８２】
結論：OKT3（NP-CO）を含む二重特異性PSMA×CD3抗体は、「オンターゲット」T細胞活性化の媒介、及びUCHT1（NP-CU）を含む試薬としての標的細胞殺傷にそれほど有効ではない。
【０１８３】
実施例5：種々の二重特異性抗体フォーマットの多量体化及び凝集
図4A及び図4Bでは、FLT3×CD3特異性を有する抗体分子を比較する（Fabscフォーマット対bsccフォーマット）のに対し、図4C〜図4Fでは、PSMA×CD3特異性を有するそれらの抗体分子を比較する（Fabscフォーマット対IgGscフォーマット）。多量体化の挙動を分析するため使用したゲル濾過をSuperdex S200カラム上で行った。
【０１８４】
結論：（i）図4Bに示されるように、bsscフォーマットの抗体（図4Bの実験で使用される二重特異性単鎖フォーマットについて図1Cを参照されたい）は、多量体及び凝集塊を形成する傾向が著しく高い。この傾向は、Fabscフォーマット及びIGscフォーマット（図4A、図4C〜図4F）の場合にははるかに低い。（ii）Fabsc/IgGscコンストラクトによって形成される多量体の適切な量は、UCHT1を含む抗体（図4D、図4F）と比較して、OKT3を含む抗体（図4C、図4E）に対してより多い。図4C〜図4Fに示される結果がPMSA結合部位（binding site）として抗体J591の可変ドメインを含むFabsc/IgGsc分子で得られる一方で、抗体10B3のそれぞれのFabsc分子について類似する挙動が観察された（データは示されない）。
【０１８５】
実施例6：PSMA発現細胞へのPSMA抗体J591及び10B3の結合
結合（図5A）、結合競合の欠如（図5B）、及び抗体結合によるPSMA抗原のシフト（図5C）を、PSMAトランスフェクトSp2/0細胞を使用するフローサイトメトリーによって評価した。この目的のため、種々のα-PSMA抗体をこれらの細胞と共に、4℃にて30分間〜45分間、96ウェルプレートでインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、PE複合化ヤギ-抗マウスF(ab)2フラグメント（図5A、図5C）（Jackson ImmunoResearch）、又はPE-ヤギ-抗ヒトFC-γ特異的フラグメント（Jackson ImmunoResearch）（B）と共にインキュベートした。細胞をFACSCalibur（BD Biosciences）で分析した。図5Bではヤギ抗ヒト二次抗体によって特異的に検出されるキメラ（ch）PMSA結合抗体J591は、ネズミ科（mu）抗体J591によって打ち負かされるが、ネズミ科抗体10B3、すなわち本発明の抗体によっては打ち負かされないことを実証する。抗原シフトの判定のため（図5C）、PSMA発現細胞を、実験の開始時に指定される抗体と共に、また24時間後及びFACS分析の前に再び、飽和量（10 μg/ml）の各抗体と共にインキュベートした。未処理の細胞によるPSMA発現は、参照（100%PSMA発現）としての役割を果たした。
【０１８６】
結論：抗体J591によって発揮されたものと比較した場合、（i）J591と10B3の両方の抗体の結合は類似し、（ii）上記抗体は互いに交差競合しない、すなわち、それらは異なるエピトープに結合し、（iii）10B3抗体によって誘導される抗原シフトは著しく減少される。
【０１８７】
実施例7：PSMA抗体J591及び10B3で染色されたクライオスタット切片
図6A、図6Bでは、前立腺癌細胞試料を両方の抗体で染色したのに対し、図6C及び図6Dでは、扁平細胞癌試料を両方の抗体で染色した。両方の実験において、平行して、ドイツ国ベルリンのZytomed製のポリマー系（POLHRP-100）を使用して染色を行った。矢印は腫瘍間質（Tu）及び血管（Ve）を示す。10個の前立腺癌試料のうちの9個及び10個の扁平細胞癌試料のうちの7個による代表的な結果を示す。
【０１８８】
様々な異なる健常なヒトの組織（ドイツ国ハイデルベルクのBioCatから得られた、T6234701-2）に対して、2つの抗体の染色パターンは、抗体10B3と皮膚の上皮細胞との弱い反応性を除いて同一であった。
【０１８９】
結論：（i）前立腺癌試料及び正常組織の染色は両方の抗体で類似し、（ii）扁平細胞癌試料では、J5191(J591)抗体は血管細胞のみを染色するのに対して、抗体10B3は血管細胞（J591より広範囲に）及び腫瘍細胞自体を染色する。
【０１９０】
実施例8：ヒト化及びマウスの10B3抗体の結合
ヒト化、CDR移植（h10B3）又はマウス（m10B3）抗体の可変ドメインのいずれかを含む、PSMA×CD3（10B3×OKT3）特異性を有する二重特異性Fabsc抗体を、PSMA発現22RV1細胞と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した（図7）。この目的のため、細胞を4℃にて30分間〜45分間に亘り96ウェルプレートにおいて、指定の抗体と共にインキュベートした。インキュベーションに際して、細胞を洗浄し、二次PE-ヤギ-抗ヒトFC-γ特異的フラグメント（Jackson ImmunoResearch）と共にインキュベートした。細胞をFACSCalibur（BD Biosciences）で分析した。
【０１９１】
結論：PSMA発現細胞へのマウスの及びヒト化された10B3の変種の結合（Fabsc抗体分子内の10B3の可変ドメインのFab部分として組み込まれる）は同一である。
【０１９２】
実施例9：CD3への種々のPSMAxCD3抗体の結合
Jurkat細胞を抗体分子（Fabsc（UCHT1）＝抗体UCHT1のCD3結合可変ドメイン及び抗体J591の可変ドメインを含むFabsc分子、IgGsc（UCHT1）＝抗体UCHT1のCD3結合可変ドメイン及び抗体J591の可変ドメインを含むIgGsc分子、Fabsc（OKT3）＝抗体OKT3のCD3結合可変ドメイン及び抗体J591の可変ドメインを含むFabsc分子、IgGsc（OKT3）＝抗体OKT3のCD3結合可変ドメイン及び抗体J591の可変ドメインを含むIgGsc分子）と共に、4℃にて30分間〜45分間、96ウェルプレートでインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ビオチン-ヤギ-抗ヒトIgG、F（ab’）2フラグメント特異的（Jackson ImmunoResearch）、及びストレプトアビジン-PE（Life Technologies）と共にインキュベートした。細胞をFACSCalibur（BD Biosciences）で分析した。
【０１９３】
結論：図8に示されるように、CD3に対する結合活性は、UCHT1を含むFabsc抗体に対して最も高く、OKT3を含むものに対しては最も低い。IgGscフォーマット内では、UCHT1コンストラクトは結合活性を失い、OKT3コンストラクトは結合活性を得る。CD3に対する二重特異性抗体分子の結合活性は、明らかにもっぱらCD3結合（部位）に依存することから、抗体10B3の結合部位を含む二重特異性抗体分子の結合活性のランキングは、代表的なPMSA結合部位（標的結合部位）として抗体J591の可変ドメインを使用して本明細書で特定されるのと同じになると考えられる。
【０１９４】
実施例10：種々のPSMA抗体の細胞溶解性活性
PSMA発現22RV1前立腺癌細胞をPBMC及び指定の二重特異性PSMA×CD3抗体分子（Fabsc（UCHT1）＝抗体UCHT1のCD3結合可変ドメイン及び抗体J591の可変ドメインを含むFabsc分子、IgGsc（UCHT1）＝抗体UCHT1のCD3結合可変ドメイン及び抗体J591の可変ドメインを含むIgGsc分子、Fabsc（OKT3）＝抗体OKT3のCD3結合可変ドメイン及び抗体J591の可変ドメインを含むFabsc分子、IgGsc（OKT3）＝抗体OKT3のCD3結合可変ドメイン及び抗体J591の可変ドメインを含むIgGsc分子）と共に、PBMC：標的の比（ratio）5:1でインキュベートした。接着性標的細胞の生存率を、実施例4に記載されるXelligenceシステムを使用して評価した。標的に対するエフェクターの比（E:T）は5:1であり、抗体の濃度を5 nMに設定した。
【０１９５】
異なる健康なボランティアのPBMCによる4つの異なる実験のうちの1つの実験の代表的な結果を図9に示す。
【０１９６】
結論：溶解活性のランキングは次のとおりである:Fabsc（UCHT1）≒IgGsc（UCHT1）＞Fabsc（OKT3）＞IgGsc（OKT3）。二重特異性抗体分子の溶解活性は、CD3結合（部位）に依存することから、抗体10B3の結合部位を含む二重特異性抗体の溶解活性のランキングは、代表的なPMSA結合部位（標的結合部位）として抗体J591の可変ドメインを使用して本明細書で特定されるのと同じになると考えられる。
【０１９７】
実施例11：in vitroでのPSMA×CD3 IgGsc（CC-1）の治療効果
本発明のPSMA×CD3（h10B3×UCHT1）-IgGsc（CC-1）二重特異性抗体及び対照二重特異性抗体（NG2×CD3）を、腫瘍細胞（22Rv1細胞、ヒト前立腺癌細胞；Sramkoski RM et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999 Jul-Aug;35（7）:403-9.を参照されたい）と共に又はその腫瘍細胞なしでインキュベートした。CD4及びCD8のT細胞活性化を、3日間のインキュベーションの後、細胞表面マーカーとしてCD69及びCD25を使用して、FACSによって分析した。両方のT細胞タイプは活性化され（図15A）、インターフェロンガンマレベル（図15B）及びT細胞増殖（図15C）は増加された。さらに、クロム放出アッセイ（20時間後のE:T比  10:1）及びFACS（72時間超、E：T比1:1）は、CC-1を使用する腫瘍細胞の強力な溶解を示した（図15D及び図15E）。また、本発明のCC-1による治療は、in vitroでの腫瘍増殖を阻害した。2:1のE:T比では、Xelligenceシステム（図15F左）及び顕微鏡を使用する目視検査（図15F右）によって分析されるように、CC-1の存在下で、腫瘍細胞増殖は著しく損なわれる。
【０１９８】
結論：CC-1は、T細胞の腫瘍細胞に限定される活性化及びサイトカインの産生を誘導し、T細胞増殖及び抗腫瘍活性をもたらす。
【０１９９】
実施例12：in vivoでのPSMA×CD3 IgGsc（CC-1）の治療効果
次に、CC-1（本発明のIgGsc二重特異性抗体）を、マウスモデルにおけるin vivoでの抗腫瘍活性について試験した。1.5×106個の22Rv1細胞をNSG（NOD scid gamma （NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ））マウスに静脈内注射した（n=4/群）。3日後、3×106個のヒトPBMCを注射し、3日目及び5日目に10 μgのCC-1又は陰性対照としてPBSを注射した。8日後、FACSを使用して肺における転移形成を分析した。形成された転移の数の著しい減少が、CC-1治療群で見られた（図16A）。その後、NSGマウス（n=3/群）にマウス1匹当たり2×107個のPBMCを注射し、4日間の間隔で2×20 μgで「最大投与量以上の（supratherapeutic）」CC-1用量、及び対照抗体（T細胞を非特異的に活性化する、陽性対照としてのUCHT1）又は陰性対照としてのPBSで治療した。自己免疫活性のマーカーとしてのIFNガンマ放出及び体重を分析した（図16B）。UCHT1と比較してCC-1はIFNガンマ産生を誘導せず、UCHT1治療群とは対照的に、CC-1治療マウスの体重の減少は観察されなかった。別の実験では、NOS/SCIDマウスに22Rv1細胞（PSMA陽性（positive）腫瘍細胞）又はDU145細胞（PSMA陰性ヒト前立腺腫瘍細胞）を注射し、そして35日後の腫瘍の定着（establishment）の後、マウスを放射性同位元素で標識したCC-1抗体（50 μCi）で治療し、24時間後に屠殺して、種々の臓器で放射能を測定した。22Rv1治療マウスの腫瘍においてのみ、放射能の著しい増加を観察することができた（図16C）。BiTE又は本発明のIgGscのフォーマットの二重特異性抗体の血清半減期の差を試験するため、CC-1（IgGscフォーマット）又はBiTEフォーマットのいずれかの二重特異性PSMA×CD3抗体50μgをBalb/Cマウスに注射した。血清濃度を経時的に測定した。BiTEフォーマットの二重特異性抗体は注射から2時間〜4時間後に検出できなかったのに対し、CC-1は注射から24時間後であっても検出可能であった（図16D）。したがって、本発明のIgGscフォーマットは、他の二重特異性抗体フォーマットと比較して、血清安定性の増加を提供する。
【０２００】
結論：CC-1は何らの非特異的免疫応答も誘導することなくin vivoで腫瘍成長を抑制する。CC-1は、特異的にPSMA発現腫瘍組織を標的とし、他の二重特異性フォーマットと比較して血清半減期が増加している。
【０２０１】
実施例13：UCHT1及びOKT3の比較
IgGsc二重特異性抗体フォーマット（上記を参照されたい）のCD3結合部位としてOKT3に対するUCHT1の本明細書に示される優越性（supremacy）を更に解明するため、両方の単一特異性抗体のFab型及びIgG型を比較して試験した。OKT3及びUCHT1をプロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製した。Fabフラグメントを、以前に記載される（Jung et al. Target cell induced T cell activation with bi- and trispecific antibody fragments. Eur J Immunol 1991; 21,2431-2435）通り、ペプシン消化に続くヒンジ領域ジスルフィド結合の還元及び修飾によって作製した。Fabフラグメントを、Superdex S200カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０２０２】
その後、CD3発現Jurkat細胞を濃度が増大する指定の抗体、ビオチン標識化検出抗体（抗ヒトFab）、続いてPE複合体化ストレプトアビジンと共にインキュベートした。その後、試料をフローサイトメトリーによって分析した（表1）。最大半量の結合が観察される濃度を示す（nM）。
【０２０３】
表1:Fab型及びIgG型の抗CD3抗体の結合活性
【表１】
2019505589.tif 000002
【０２０４】
結論：
二価の無傷のIgG分子ではなく一価のFabフラグメントとして使用される場合、OKT3は結合活性を失う（loses）。対照的に、UCHT1フラグメントの結合活性は変わらない。理論に拘束されるものではないが、これは無傷のUCHT1抗体の一価の結合を指し、その結合活性は二価で結合するOKT3抗体に匹敵する。UCHT1を支持する一価のFabフラグメントの結合の著しい差は、Fabscフォーマット内の2つの抗体の結合における対応する差を説明する（図8、実施例9）。このフォーマットでは、抗体は、標的抗体のC末端に付着した一価の単鎖分子として存在する（図1）。また、UCHT1の一価の結合は、FabscフォーマットではなくIgGscフォーマット内に存在する場合に、OKT3が結合活性を得るのに対して、なぜこの抗体が結合活性を失う（loses）のかを説明する（図1及び図8、実施例9）。
【０２０５】
IgGフォーマットでは、UCHT1を含む分子（IgGsc-UCHT1）の結合活性はIgGsc-OKT3に匹敵するか、又はそれよりもわずかに低いが、腫瘍細胞に対するIgGsc-UCHT1の活性は著しく予想外に高い（図9、実施例10）。
【０２０６】
要約すると、IgGsc-UCHT1は、低いオフターゲット活性化（図2、実施例3）と腫瘍細胞に対する最適な溶解作用（図9、実施例10）とを兼ね備える、最適化された特性を有するフォーマットである。
【０２０７】
実施例14：UCHT1は他の二重特異性IgGscフォーマット抗体において有効である。
IgGscに基づく抗体フォーマットの抗CD3抗体としてのUCHT1の好ましい使用を、他の非PSMA特異抗体について更に試験した。この抗原のO-アセチル化形態（oaGD2）と同様に、ガングリオシドGD2を発現する放射線照射したM21メラノーマ細胞を、健常なヒトドナーの末梢血から単離した末梢血単核細胞（PBMC）及び指定の特異性を有する二重特異性IgGsc抗体と共にインキュベートした。これらのコンストラクト内に使用される親単一特異性抗体は、それぞれhu14.18（抗GD2）、8B6（抗oaGD2）、J591（抗PSMA）、及びUCHT1（抗CD3）であった。3日後、3Hチミジン取込みアッセイを使用してT細胞活性化を評価した（assessed）。さらに、M21細胞をPBMC及び指定の二重特異性IgGsc抗体（50 nM）とインキュベートした。その後、Xelligenceシステムを使用して腫瘍細胞の増殖をモニターした。無関係な標的特異性（MOPC）を有する二重特異性IgGsc抗体を対照として使用した。
【０２０８】
結論：
GD2及びoaGD2を発現する腫瘍細胞、及びこれらの抗原を標的とする二重特異性抗体の存在下で、PBMC集団内のT細胞の有効な活性化が観察された。M21がPSMAを発現しないことから、対照抗体ターゲッティングPSMAは効果がなかった（図17A）。
【０２０９】
標的特異性としてGD2又はoaGD2、及びエフェクター特異性としてCD3に対する二重特異性IgGsc抗体は、これらの抗原を発現する腫瘍細胞を効果的に殺傷する（図17B）。使用した特異的なGD2抗体及びCD3抗体を図17Aに対する凡例に列挙する。
【０２１０】
本明細書に実例として記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素（単数又は複数）、限定（単数又は複数）のない状態で好適に実施されてもよい。したがって、例えば、「含む、含んでいる（comprising）」、「含む、含んでいる、挙げられる（including）」、「含有する、含有している（containing）」等の用語は、拡大的に、限定なく読まれるものとする。さらに、本明細書で採用される用語及び表現は、限定ではなく説明する用語として使用されており、かかる用語及び表現の使用において、示され記載される特徴又はそれらの一部の任意の等価物を除外する意図はなく、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲において様々な修飾が可能であることが認識される。したがって、本発明は例示的な実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される例示的な実施形態に具体化される本発明の任意の特徴、変更形態及び変形形態が当業者によって用いられてもよく、かかる変更形態及び変形形態は、本発明の範囲に含まれるものとすることが理解されるべきである。
【符号の説明】
【０２１１】
図面訳
図1
Cystein depleted  システイン枯渇
Fc-attenuated  Fc減衰
CH2 domain  CH2ドメイン
図2
CD69 expression [%]  CD69発現［%］
without antibody  抗体なし
CD3 antibody  CD3抗体
図3
without target cells  標的細胞なし
target cells  標的細胞
Cell death, 22RV1 cells+PBMC  細胞死、22RV1細胞+PBMC
normalized cell index  正規化した細胞指標
PBMC only  PBMCのみ
Time [h]  時間［時間］
図4
Elution volume [ml]  溶出容量［ml］
Retention time [min]  保持時間［分］
Molecular weight standard  分子量スタンダード
図5A
Binding  結合
図5B
Competition of binding  結合の競合
(median)  （中央値）
図5C
Antigen shift  抗原シフト
shift PSMA  シフトPSMA
図6
A: Prostate Ca, PSMA antibody J591  A：前立腺癌、PSMA抗体J591
B: Prostate Ca, PSMA antibody 10B3  B：前立腺癌、PSMA抗体10B3
C: Squamous cell Ca, PSMA antibody J591  C：扁平細胞癌、PSMA抗体J591
D: Squamous cell Ca, PSMA antibody 10B3  D：扁平細胞癌、PSMA抗体10B3
図8
Binding to Jurkat cells (CD3+)  Jurkat細胞（CD3+）への結合
Median fluorescence intensity  中央値蛍光強度
PSMA (J591) X CD3 concentration (nM)  PSMA（J591）×CD3濃度（nM）
図9
Cell Index  細胞指標
Time (Hour)  時間（時間）
図10A
PSMA (m10B3) murine HC variable region  PSMA（m10B3）ネズミ科HC可変領域
(SEQ ID NO:01)  （配列番号01）
図10B
PSMA (m10B3) murine LC variable region  PSMA（m10B3）ネズミ科LC可変領域
(SEQ ID NO:02)  （配列番号02）
図10C
PSMA (h10B3) humanized HC variable region  PSMA（h10B3）ヒト化HC可変領域
(SEQ ID NO:09)  （配列番号09）
図10D
PSMA (h10B3) humanized LC variable region  PSMA（h10B3）ヒト化LC可変領域
(SEQ ID NO:10)  （配列番号10）
図11
IgGsc_PSMA(h10B3)_CD3(hUCHT1) Heavy chain  IgGsc_PSMA （h10B3）_CD3 （hUCHT1）重鎖
Ig Leader peptide  Igリーダーペプチド
Humanized PSMA (10B3) HC variable region  ヒト化PSMA（10B3）HC可変領域
IgG1 CH1 domain  IgG1 CH1ドメイン
IgG1 hinge region  IgG1ヒンジ領域
Mutated IgG1 CH2 domain  変異IgG1 CH2ドメイン
IgG1 CH3 domain  IgG1 CH3ドメイン
Humanized CD3 single chain (UCHT1) LC variable region  ヒト化CD3単鎖（UCHT1）LC可変領域
Linker region  リンカー領域
Humanized CD3 single chain (UCHT1) HC variable region  ヒト化CD3単鎖（UCHT1）HC領域
(SEQ ID NO: 11)  （配列番号11）
図12
S6:Fabsc_PSMA (h10B3)_mCD3(OKT3) Heavy chain  S6:Fabsc_PSMA（h10B3）_mCD3（OKT3）重鎖
Ig Leader peptide  Igリーダーペプチド
Humanized PSMA (10B3) HC variable region  ヒト化PSMA（10B3）HC可変領域
IgG1 CH1 domain  IgG1 CH1ドメイン
IgG1 hinge region  IgG1ヒンジ領域
Mutated IgG1 CH2 domain  変異IgG1 CH2ドメイン
Beginning of IgG1 CH3 domain  IgG1 CH3ドメインの開始
CD3 single chain (OKT3) HC variable region  CD3単鎖（OKT3）HC可変領域
Linker region  リンカー領域
CD3 single chain OKT3 LC variable region  CD3単鎖OKT3 LC可変領域
(SEQ ID NO: 12)  （配列番号12）
図13
PSMA (h10B3)_Kappa_Light chain  PSMA（h10B3）_カッパー_軽鎖
Ig Leader peptide  Igリーダーペプチド
Humanized PSMA (10B3) LC variable region  ヒト化PSMA（10B3）LC可変領域
C-Kappa  C-カッパー
(SEQ ID NO: 13)  （配列番号13）
図14A
mPSMA (J591) HC variable region  mPSMA（J591）HC可変領域
(SEQ ID NO: 15)   （配列番号15）
図14B
mPSMA (J591) LC variable region  mPSMA（J591）LC可変領域
(SEQ ID NO: 16）  （配列番号16)
図15
CD69+ T Cells [%]  CD69+ T細胞［%］
CD25+ T Cells [%]  CD25+ T細胞［%］
Control  対照
PBMC alone  PBMC単独
Without Targe cells  標的(Target）細胞を含まない
with Target cells  標的細胞を含む
3H-Thymidine Incorporation [103 cpm]  3H-チミジン取り込み［103 cpm］
Specific lysis [%]  特異的溶解［%］
Antibody concentration [μg/ml]  抗体濃度［μg/ml］
Living tumor cells  生存腫瘍細胞
Tumor cell growth  腫瘍細胞増殖
Un-treated  未処理  Time [h]  時間［時間］
図16
Pulmonary foci/mouse  肺病巣／マウス
control  対照
Un-treated  未処理
Body weight [%]  体重［%］
Days after injection  注射後の日数
Blood  血液
Tumor 22Rv1 (PSMA+)  腫瘍22Rv1（PSMA+）
Tumor DU145 (PSMA-)  腫瘍DU145（PSMA-）
Heart  心臓
Lung  肺
Liver  肝臓
Right kidney  右腎臓
Left kidney  左腎臓
Spleen  脾臓
Right muscle  右の筋肉
Antibody concentration [μg/ml]  抗体濃度［μg/ml］
Time [h]  時間［時間］
図17
[3H]-incorporation (cpm)  [3H]取り込み（cpm）
Antibody concentration [nM]  抗体濃度［nM］
Cell index  細胞指標
Time (Hour)  時間（時間）
【図１】
2019505589.tif 000003
【図２】
2019505589.tif 000004
【図３−１】
2019505589.tif 000005
【図３−２】
2019505589.tif 000006
【図４】
2019505589.tif 000007
【図５−１】
2019505589.tif 000008
【図５−２】
2019505589.tif 000009
【図６】
2019505589.tif 000010
【図７】
2019505589.tif 000011
【図８】
2019505589.tif 000012
【図９】
2019505589.tif 000013
【図１０】
2019505589.tif 000014
【図１１】
2019505589.tif 000015
【図１２】
2019505589.tif 000016
【図１３】
2019505589.tif 000017
【図１４】
2019505589.tif 000018
【図１５−１】
2019505589.tif 000019
【図１５−２】
2019505589.tif 000020
【図１６−１】
2019505589.tif 000021
【図１６−２】
2019505589.tif 000022
【図１６−３】
2019505589.tif 000023
【図１７】
2019505589.tif 000024
【配列表】
2019505589000001.app
【国際調査報告】
2019505589.tif 000025
2019505589.tif 000026
2019505589.tif 000027
2019505589.tif 000028
2019505589.tif 000029