(57)【要約】  本発明は、水相で陰イオン性薬物と陽イオン性化合物を静電気的結合を用いてナノ粒子を形成させる段階；および前記ナノ粒子を両親媒性高分子および任意にポリ乳酸塩からなる高分子ミセル内に含ませる段階を含むことによって、静電気的結合と疎水性結合を増加させて剤形の陰イオン薬物封入率を高めることによって陰イオン性薬物伝達用組成物の製造収得率を増加させる製造方法に関するものである。
2019501900.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）陰イオン性薬物と陽イオン性化合物をそれぞれ水性溶媒に溶解させて混合する段階：および、
（ｂ）両親媒性ブロック共重合体を水性溶媒または有機溶媒に溶解させて段階（ａ）で得られた混合物と混合する段階；
を含む、陰イオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
【請求項２】
段階（ｂ）で追加的にポリ乳酸塩を水性溶媒または有機溶媒に溶解させて段階（ａ）で得られた混合物と混合する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
（ｃ）段階（ｂ）で得られた混合物を０〜５０℃
の温度で５〜６０分間安定化する段階；
を追加的に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
（ａ’）陰イオン性薬物と陽イオン性化合物をそれぞれ水性溶媒に溶解させて混合した後、凍結乾燥する段階；
（ｂ−１）段階（ａ’）で得られた凍結建造物を有機溶媒に溶解する段階；
（ｂ−２）段階（ｂ−１）で得られた溶液を水性溶媒と混合する段階；および、
（ｂ−３）段階（ｂ−２）で得られた混合物から有機溶媒を除去する段階：
を含み、
両親媒性ブロック共重合体を段階（ｂ−１）の有機溶媒または段階（ｂ−２）の水性溶媒に溶解させる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記段階（ａ）または段階（ａ’）で陰イオン性薬物が溶解された水溶液に対する陽イオン性化合物が溶解された水溶液の体積比（陽イオン性化合物水溶液／陰イオン性薬物水溶液）が１〜２０である、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記陰イオン性薬物は、ペプチド、蛋白質または核酸であることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記核酸は、一つ以上の末端がコレステロール、トコフェロール、および炭素数１０〜２４個の脂肪酸から構成された群より選択される一つ以上で修飾されたことを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記陽イオン性化合物は陽イオン性脂質および陽イオン性高分子から構成された群より選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記陽イオン性脂質は、下記化学式１の陽イオン性脂質である、請求項８に記載の製造方法：
【化１】
2019501900.tif 000029
上記式において、
ｎとｍおよびｌはそれぞれ０〜１２であって、１≦ｎ＋ｍ＋ｌ≦１２であり、ａとｂおよびｃはそれぞれ１〜６であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して水素または炭素数１１〜２５個の飽和および不飽和炭化水素であって、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも一つは炭素数１１〜２５個の飽和および不飽和炭化水素である。
【請求項１０】
前記段階（ｂ）または段階（ｂ−１）の有機溶媒は、アセトン、エタノール、メタノール、メチレンクロリド、クロロホルム、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、エチルアセテートおよび酢酸からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記両親媒性ブロック共重合体は親水性ブロック（Ａ）および疎水性ブロック（Ｂ）を含むＡ−Ｂ型ブロック共重合体であり、前記親水性Ａブロックはポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリールアミドおよびその誘導体からなる群より選択される１種以上であり、前記疎水性Ｂブロックはポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステルおよびポリホスファジンからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ポリ乳酸塩は、下記化学式２〜７の化合物からなる群より選択される一つ以上である、請求項２に記載の製造方法：
【化２】
2019501900.tif 000030
上記式２において、Ａは−ＣＯＯ−ＣＨＺ−であり；Ｂは−ＣＯＯ−ＣＨＹ−、−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２であり；Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル、またはエチル基であり；ＺとＹはそれぞれ水素原子、またはメチルまたはフェニル基であり；ＭはＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；ｎは１〜３０の整数であり；ｍは０〜２０の整数である。
【化３】
2019501900.tif 000031
上記式３において、Ｘはメチル基であり；Ｙ’は水素原子またはフェニル基であり；ｐは０〜２５の整数であり、ｑは０〜２５の整数であって、但しｐ＋ｑは５〜２５の整数であり；Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチルまたはエチル基であり；ＭはＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；Ｚは水素原子、メチルまたはフェニル基である。
【化４】
2019501900.tif 000032
上記式４において、Ｗ−Ｍ’は
【化５】
2019501900.tif 000033
であり；ＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体およびＤ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体から構成された群より選択されるものであり；Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチルまたはエチル基であり；Ｍは独立してＮａ、Ｋ、またはＬｉである。
【化６】
2019501900.tif 000034
上記式５において、Ｓは
【化７】
2019501900.tif 000035
であり；Ｌは−ＮＲ１−または−０−であり、ここでＲ１は水素原子またはＣ１−１０アルキルであり；ＱはＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、またはＣＨ２Ｃ６Ｈ５であり；ａは０〜４の整数であり；ｂは１〜１０の整数であり；ＭはＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；ＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、およびＤ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体からなる群より選択される一つ以上である。
【化８】
2019501900.tif 000036
上記式６において、Ｒ’は−ＰＡＤ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＭであり、ここでＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体から構成された群より選択されるものであり、ＭはＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；ａは１〜４の整数である。
【化９】
2019501900.tif 000037
上記式７において、ＸおよびＸ’は独立して水素、炭素数１〜１０のアルキルまたは炭素数６〜２０のアリールであり；ＹおよびＺは独立してＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；ｍおよびｎは独立して０〜９５の整数であって、５＜ｍ＋ｎ＜１００であり；ａおよびｂは独立して１〜６の整数であり；Ｒは−（ＣＨ２）ｋ−、炭素数２〜１０の二価アルケニル（ｄｉｖａｌｅｎｔ ａｌｋｅｎｙｌ）、炭素数６〜２０の二価アリール（ｄｉｖａｌｅｎｔ ａｒｙｌ）またはこれらの組み合わせであり、ここでｋは０〜１０の整数である。
【請求項１３】
前記疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシ基は、コレステロール、トコフェロール、および炭素数１０〜２４個の脂肪酸から構成された群より選択される一つ以上で修飾されたものである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１４】
有機溶媒が融合性脂質（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）を含むものである、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記融合性脂質は、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジラウロイルホスファチジン酸（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジリノレオイルホスファチジン酸（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジン酸（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジン酸（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、コレステロール、およびトコフェロ���ルからなる群より選択された１種以上である、請求項１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陰イオン性薬物を含有し、これを伝達するための薬剤学的組成物およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾病は、様々な要因によって疾病遺伝子の発現が増加するか突然変異によって非正常的な活性が現れることによって発生する。ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、転写後工程で配列特異的に特定遺伝子の発現を抑制するので、遺伝子治療剤として多くの関心が集中している。特に、ｓｉＲＮＡの高い活性と精密な遺伝子選択性によって、既存のアンチセンスヌクレオチドやリボザイムなどの問題点を解決することができる核酸治療剤として期待されている。ｓｉＲＮＡは短い二重螺旋のＲＮＡ鎖であって、これらと塩基配列が相補的な遺伝子のｍＲＮＡを切断することによって該当遺伝子の発現を抑制させる（ＭｃＭａｎｕｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３：７３７（２００２）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８（２００１）。しかし、このような長所にもかかわらず、ｓｉＲＮＡは血中で核酸分解酵素によって速く分解され、腎臓を通じて速く体外に排せつされるだけでなく、強い負電荷を帯び細胞膜を容易に通過しないと知られている。
【０００３】
このようなｓｉＲＮＡを含む核酸物質、陰イオン性薬物を用いた治療において、安全で効率的な薬物伝達技術は長い間研究されてきたし、多様な伝達体および伝達技術が開発されてきた。伝達体は大きくアデノウイルスやレトロウイルスなどを用いたウイルス性伝達体と陽イオン性脂質および陽イオン性高分子などを用いた非ウイルス性伝達体に分けられる。
【０００４】
ウイルス性伝達体の場合は非特異的免疫反応などの危険性に露出されており、生産工程が複雑であって、商用化するのに多くの問題点があると知られている。したがって、最近の研究方向は非ウイルス性伝達体を用いてその短所を改善する方向に進められている。非ウイルス性伝達体は、ウイルス性伝達体に比べて効率性が劣るが、生体内安全性側面で副作用が少なく、経済性側面で生産価格が低廉であるという長所を有している。
【０００５】
非ウイルス性伝達体のうちの最も代表的なものは、陽イオン性脂質を用いた陽イオン性脂質と核酸の複合体（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）およびポリ陽イオン性（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）高分子と核酸の複合体（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）である。このような陽イオン性脂質あるいはポリ陽イオン性高分子は、陰イオン性薬物と静電気的相互作用を通じて複合体を形成することによって陰イオン性薬物を安定化させ、細胞内伝達を増加させるという点から多様な研究が行われてきた。しかし、十分な効果を得るために必要な量を使用する場合に、ウイルス性伝達体よりは少ないが、深刻な毒性を誘発して医薬品としての使用が不適当であるという結果を示した。したがって、毒性を誘発することのある陽イオン性高分子または陽イオン性脂質の使用量を最少化して毒性を減少させながら、血中および体液内で安定であり、細胞内伝達が可能で十分な効果を得ることができる陰イオン性薬物伝達技術の開発が必要である。
【０００６】
一方、両親媒性ブロック共重合体を用いて高分子ミセルの形態に難溶性薬物を可溶化し水溶液相で安定化させることによって薬物伝達体として用いようとする努力が多様に行われた（韓国登録特許第０１８０３３４号）。しかし、このような両親媒性ブロック共重合体は内部に疎水性を帯びる高分子ミセルを形成することによって疎水性を帯びる難溶性薬物を可溶化することはできるが、陰イオンを帯びる核酸などの親水性薬物は高分子ミセル内部に封入することができないので、これら核酸を含む陰イオン性薬物の伝達には適当でない。よって、本発明者らは核酸と陽イオン性化合物の静電気的相互作用による複合体を形成し、前記複合体が両親媒性ブロック共重合体のミセル構造内部に封入されるようにする陰イオン性薬物伝達組成物および多様な製造方法を開示したことがある。しかし、依然としてこのような陰イオン性薬物伝達組成物の製造収得率および核酸の安定性強化のための剤形製造方法の改善が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような背景下で、本発明者らは陰イオン性薬物伝達用組成物の製造収得率および前記陰イオン性薬物の安定性強化のための製造方法の開発に鋭意努力した結果、ｓｉＲＮＡのような陰イオン性薬物と陽イオン性化合物をそれぞれ水性溶媒に溶解させ、これを混合して単一相システム下で（ｍｏｎｏｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）複合体を形成させてこれを高分子ミセル内に封入する場合、卓越に陰イオン性薬物の収得率を向上させ陰イオン性薬物の安定性を強化させることができるのを確認して本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、陰イオン性薬物含有組成物製造収得率および核酸の安定性が強化された陰イオン性薬物伝達用組成物の製造方法およびそれから製造される陰イオン性薬物伝達用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、水相で陰イオン性薬物と陽イオン性化合物を静電気的結合を用いてナノ粒子を形成させる段階；および前記ナノ粒子を両親媒性高分子および任意にポリ乳酸塩からなる高分子ミセル内に含ませる段階を含むことによって、静電気的結合と疎水性結合を増加させて剤形の陰イオン薬物封入率を高めることによって陰イオン性薬物伝達用組成物の製造収得率を増加させる製造方法に関するものである。
【００１０】
具体的に、本発明による製造方法で製造しようとする組成物は、ミセル構造体を含む陰イオン性薬物伝達用組成物であって、両親媒性ブロック共重合体と任意にポリ乳酸塩のミセル構造体に薬物および陽イオン性化合物の複合体が含まれている構造を有し、有効成分として
陰イオン性薬物；
陽イオン性化合物；
両親媒性ブロック共重合体；および
任意に、ポリ乳酸塩
を含み、前記陰イオン性薬物は前記陽イオン性化合物と静電気的相互作用によって複合体を形成し、このように形成された複合体が両親媒性ブロック共重合体および任意にポリ乳酸塩によって形成されたミセル構造体の内部に封入されることを特徴とする。
【００１１】
前記製造方法は、具体的に以下のような段階を含む：
（ａ）陰イオン性薬物と陽イオン性化合物をそれぞれ水性溶媒に溶解させて混合する段階；および
（ｂ）両親媒性ブロック共重合体と任意にポリ乳酸塩を水性溶媒または有機溶媒に溶解させて段階（ａ）で得られた混合物と混合する段階。
【００１２】
以下、本発明をより詳しく説明する。
本発明による製造方法で、前記段階（ａ）では陰イオン性薬物と陽イオン性化合物の複合体を製造するために、これらをそれぞれ水相、即ち、水性溶媒に溶解させて混合する。
【００１３】
前記（ａ）段階で、水性溶媒に溶解された陰イオン性薬物と陽イオン性化合物は、静電気的相互作用によってナノ粒子形態の陰イオン性薬物と陽イオン性化合物との複合体をなす。前記段階で使用される水性溶媒は、蒸留水、注射用水、または緩衝液であってもよい。前記陰イオン性薬物と陽イオン性化合物がそれぞれ溶解された水溶液間の混合比率は特別な限定はなく、例えば体積基準に陰イオン性薬物水溶液に対する陽イオン性化合物水溶液の比率（陽イオン性化合物水溶液／陰イオン性薬物水溶液）が１〜２０、より具体的に１〜４であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００１４】
前記水溶液は、当業界に知られた適切な混合手段を通じて混合され、このような方法の例として、超音波粉砕機などが挙げられる。
【００１５】
前記段階（ａ）で使用される陰イオン性薬物は、最終的に製造される組成物の有効成分であって、水溶液中で分子内に負電荷を帯びる薬理学的活性を有する全ての物質を含む概念である。具体的な一様態として、前記陰イオン性は、カルボキシ基、ホスフェート基およびサルフェート基から構成された群より選択される一つ以上の官能基から与えられてもよい。また、本発明の一様態として、陰イオン性薬物は、ペプチド、蛋白質またはヘパリンなどの多重陰イオン性薬物または核酸であってもよい。
【００１６】
また、前記核酸物質は、デオキシリボ核酸、リボ核酸またはバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）、糖または塩基が化学的に変形されるか末端が修飾されたポリヌクレオチド誘導体などの核酸薬物であってもよく、より具体的には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アンチセンスＯＤＮ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）およびＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）などから構成された群より選択される一つ以上の核酸であってもよい。さらに、前記核酸は、血中安定性を増加させるか免疫反応を弱化させるなどの目的のためにバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）、糖または塩基が化学的に変形されるか末端が修飾されてもよい。具体的に、核酸のホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合の一部をホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合で代替するか、一部リボース塩基の２’−ＯＨ位置にメチル基、メトキシエチル基、フッ素などの多様な官能基が導入された修飾されたヌクレオチドを１種以上含んでもよい。
【００１７】
また、前記核酸の一つ以上の末端は、コレステロール、トコフェロールおよび炭素数１０〜２４個の脂肪酸から構成された群より選択される一つ以上で修飾されてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、センスおよび／またはアンチセンス鎖の５’末端、または３’末端、または両末端に修飾されてもよく、好ましくセンス鎖の末端に修飾されてもよい。
【００１８】
前記コレステロール、トコフェロールおよび炭素数１０〜２４個の脂肪酸には、コレステロール、トコフェロールおよび脂肪酸の各類似体、誘導体、および代謝体が含まれる。
【００１９】
前記ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と同一の細胞に存在する場合にｓｉＲＮＡの配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することによって、標的遺伝子の発現を減少させるか抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、または一本鎖ＲＮＡの内部で二本鎖の形態を帯びる一本鎖ＲＮＡを言う。二本鎖の間の結合は、ヌクレオチド間の水素結合を通じて行われ、二本鎖内部の全てのヌクレオチドが相補的に互いに結合しなければならないのではなく、前記両鎖は分離されているか（ｓｅｐａｒａｔｅ）分離されていなくてもよい。一様態として、前記ｓｉＲＮＡの長さは約１５〜６０個の（二本鎖ＲＮＡの一側ヌクレオチドの個数、即ち、塩基対の個数を意味し、一本鎖ＲＮＡの場合には一本鎖ＲＮＡ内部の二本鎖の長さを意味する）ヌクレオチドであり、具体的には、約１５〜３０個のヌクレオチドであり、より具体的には約１９〜２５個のヌクレオチドのｓｉＲＮＡを含む。
【００２０】
一様態として、二本鎖ｓｉＲＮＡは、３’または５’末端に１−５ヌクレオチドの突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を一側末端に、または両側末端に有してもよい。また他の例では、両末端が突出部を有しないブラント（ｂｌｕｎｔ）形態であってもよい。具体的には米国特許公開第２００２−００８６３５６号、米国特許第７，０５６，７０４に開示されたｓｉＲＮＡであってもよい（前記文献は本明細書に参照として含まれる）。
【００２１】
また、前記ｓｉＲＮＡは二本鎖の長さが同一な対称的な構造を有するか、一つの鎖が他の鎖より短い非対称的な二本鎖構造であってもよい。具体的に、１９〜２１ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｎｔ）のアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）；および前記アンチセンスに相補的な配列を有する１５〜１９ｎｔのセンス（ｓｅｎｓｅ）から構成される二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ）のｓｉＲＮＡ分子（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であって、前記ｓｉＲＮＡはアンチセンスの５’方向の末端が平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）であり、アンチセンスの３’末端に１−５ヌクレオチド突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有する非対称ｓｉＲＮＡであってもよい。具体的に国際特許公開第０９／０７８６８５号に開示されたｓｉＲＮＡであってもよい。
【００２２】
本発明において、陰イオン性薬物は、最終製造される全体組成物の重量を基準に、０．００１〜１０重量％、具体的には０．０１〜５重量％で含まれることがよい。前記陰イオン性薬物の含量が０．００１重量％未満であれば、薬物に比べて使用される伝達体の量が過度に多くて伝達体による副作用があることがあり、１０重量％を超過すれば、ミセルの大きさが過度に大きくなってミセルの安定性が低下し、フィルター滅菌時に損失率が大きくなる恐れがある。
【００２３】
具体的な一様態で、前記陽イオン性化合物と陰イオン性薬物は水相で静電気的相互作用によって結合されて複合体を形成し、前記複合体は凍結乾燥を通じて水を除去し固い陰イオン性薬物と陽イオン性化合物から構成された複合体を形成する。したがって、前記陽イオン性化合物は、陰イオン性薬物と静電気的相互作用によって複合体を形成することができ、水相に溶解可能な形態の脂質種類であってもよい。
【００２４】
前記陽イオン性化合物は、陰イオン性薬物と静電気的相互作用によって複合体を形成することができる全ての形態の化合物を含み、例えば、脂質と高分子種類であってもよい。陽イオン性脂質は、例えば、これに制限されるものではないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３ベータ−［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、コレステリルオキシプロパン−１−アミン（ＣＯＰＡ）、Ｎ−（Ｎ’−アミノエタン）カルバモイルプロパノイックトコフェロール（ＡＣ−トコフェロール）およびＮ−（Ｎ’−メチルアミノエタン）カルバモイルプロパノイックトコフェロール（ＭＣ−トコフェロール）から構成された群より選択された一つまたは二つ以上の組み合わせであってもよい。このような陽イオン性脂質を使用する場合、陽イオン性脂質から誘発される毒性を減少させるために分子内の陽イオン密度が高いポリ陽イオン性脂質を少なく使用することが好ましく、より具体的には分子当り水溶液相で陽イオンを示すことができる官能基が一つであってもよい。これにより、より好ましい一様態で、前記陽イオン性脂質は３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、およびＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＴＭＡ）からなる群より選択された１種以上のものであってもよい。
【００２５】
また、前記陽イオン性脂質は、分子当り水溶液相で陽イオンを示すことができる官能基が多数個である脂質種類であってもよい。具体的に、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）から構成された群より選択された一つ以上のものであってもよい。
また、前記陽イオン性脂質は、１〜１２個のオリゴアルキレンアミン（ｏｌｉｇｏａｌｋｙｌｅｎｅａｍｉｎｅ）のアミン官能基に炭素数１１〜２５個の飽和または不飽和炭化水素を結合させた陽イオン性脂質であってもよく、前記陽イオン性脂質は下記の化学式１で表現できる。
【００２６】
【化１】
2019501900.tif 000003
【００２７】
上記式において、
ｎとｍおよびｌはそれぞれ０〜１２であって、１≦ｎ＋ｍ＋ｌ≦１２であり、ａとｂおよびｃはそれぞれ１〜６であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して水素または炭素数１１〜２５個の飽和および不飽和炭化水素であって、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも一つは炭素数１１〜２５個の飽和および不飽和炭化水素である。
【００２８】
好ましくは、ｎとｍおよびｌは独立して０〜７であり、１≦ｎ＋ｍ＋ｌ≦７であってもよい。
【００２９】
好ましくは、ａとｂおよびｃは２〜４であってもよい。
【００３０】
好ましくは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、ラウリル（ｌａｕｒｙｌ）、ミリスチル（ｍｙｒｉｓｔｙｌ）、パルミチル（ｐａｌｍｉｔｙｌ）、ステアリル（ｓｔｅａｒｙｌ）、アラキジル（ａｒａｃｈｉｄｙｌ）、べへニル（ｂｅｈｅｎｙｌ）、リグノセリル（ｌｉｇｎｏｃｅｒｙｌ）、セロチル（ｃｅｒｏｔｙｌ）、ミリストレイル（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｙｌ）、パルミトレイル（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｙｌ）、サピエニル（ｓａｐｉｅｎｙｌ）、オレイル（ｏｌｅｙｌ）、リノレイル（ｌｉｎｏｌｅｙｌ）、アラキドニル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｙｌ）、エイコサペンタエニル（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｙｌ）、エルシル（ｅｒｕｃｙｌ）、ドコサヘキサエニル（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｙｌ）、およびセロチル（ｃｅｒｏｔｙｌ）からなる群より選択されたものであってもよい。
【００３１】
前記陽イオン性脂質の具体的な例は、モノオレオイルトリエチレンテトラミド、ジオレオイルトリエチレンテトラミド、トリオレオイルトリエチレンテトラミド、テトラオレオイルトリエチレンテトラミド、モノリノレオイルテトラエチレンペンタミド、ジリノレオイルテトラエチレンペンタミド、トリリノレオイルテトラエチレンペンタミド、テトラリノレオイルテトラエチレンペンタミド、ペンタリノレオイルテトラエチレンペンタミド、モノミリストレオイルジエチレントリアミド、ジミリストレオイルジエチレントリアミド、モノオレオイルペンタエチレンヘキサミド、ジオレオイルペンタエチレンヘキサミド、トリオレオイルペンタエチレンヘキサミド、テトラオレオイルペンタエチレンヘキサミド、ペンタオレオイルペンタエチレンヘキサミドおよびヘキサオレオイルペンタエチレンヘキサミドから構成された群より選択される一つ以上であってもよい。
【００３２】
一方、陽イオン性高分子はキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、グリコールキトサン（ｇｌｙｃｏｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ）、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、ポリアルギニン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、高分子ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミンおよびポリビニルアミン（ＰＶＡｍ）から構成された群より選択されることを特徴とし、好ましくは高分子ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミンおよびポリビニルアミン（ＰＶＡ）からなる群より選択される１種以上のものであってもよい。
【００３３】
本発明で使用される陽イオン性化合物は、最終的に製造される全体組成物の重量を基準に、０．０１〜５０重量％、具体的には０．１〜１０重量％使用されてもよい。前記陽イオン性化合物の含量が０．０１重量％未満であれば陰イオン性薬物と複合体を形成することができる十分な量にならなく、５０重量％を超過すれば、ミセルの大きさが過度に大きくなってミセルの安定性が低下しフィルター滅菌時に損失率が大きくなる恐れがある。
【００３４】
前記陽イオン性化合物と陰イオン性薬物は、水相で静電気的相互作用を通じて結合して、複合体を形成する。
【００３５】
具体的な一様態として、前記陽イオン性化合物（Ｎ）と陰イオン性薬物（Ｐ）の電荷量の比率（Ｎ／Ｐ；陰イオン性薬物の陰イオン電荷に対する陽イオン性化合物の陽イオン電荷比率）は、０．１〜１２８であり、具体的には０．５〜６４、さらに具体的には１〜３２であり、より一層具体的には１〜２４、最も具体的には６〜２４であることがよい。前記比率（Ｎ／Ｐ）が０．１未満である場合には陽イオン性化合物が陰イオン性薬物と十分に結合しないため、前記比率が０．１以上であってこそ陽イオン性化合物と陰イオン性薬物が静電気的結合によって十分な量の陰イオン性薬物を含む複合体を形成することができて有利である。反面、比率（Ｎ／Ｐ）が１２８超過時には毒性を誘発する恐れがあるので、１２８以下にすることがよい。
【００３６】
前記段階（ｂ）は両親媒性ブロック共重合体と任意にポリ乳酸塩を水性溶媒または有機溶媒に溶解させて段階（ａ）で得られた混合物と混合する段階である。
【００３７】
両親媒性ブロック共重合体と任意にポリ乳酸塩を水性溶媒に溶解させて混合する場合、ナノ粒子形態の陰イオン性薬物−陽イオン性化合物との複合体を両親媒性ブロック共重合体と任意にポリ乳酸塩が形成するミセル構造体内部に封入する陰イオン性薬物伝達用組成物の製造が水相で行われる。
【００３８】
この時、前記水性溶媒は段階（ａ）で使用された水性溶媒と同一である。
また、前記両親媒性ブロック共重合体は、親水性Ａブロックおよび疎水性Ｂブロックを含むＡ−Ｂ型ブロック共重合体であってもよい。前記Ａ−Ｂ型ブロック共重合体は、水相で、疎水性Ｂブロックがコア（内壁）を形成し、親水性Ａブロックがシェル（外壁）を形成するコア−シェルタイプの高分子ミセルを形成する。
【００３９】
これに関連して、前記親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリールアミドおよびその誘導体から構成された群より選択される一つ以上であってもよい。より具体的に、親水性Ａブロックはモノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体およびポリビニルピロリドンから構成された群より選択される一つ以上であってもよい。前記親水性Ａブロックは数平均分子量が２００〜５０，０００ダルトン、より具体的には１，０００〜２０，０００ダルトン、より一層具体的には１，０００〜５，０００ダルトンであるものであってもよい。
【００４０】
また、必要によって親水性Ａブロックの末端に特定組織や細胞に到達できる官能基、リガンド、または細胞内伝達を促進することができる官能基を化学的に結合させて、両親媒性ブロック共重合体と任意にポリ乳酸塩で形成された高分子ミセル伝達体の体内分布を調節するか前記ミセル伝達体が細胞内に伝達される効率を高めることができる。前記官能基やリガンドは単糖類、多糖類、ビタミン、ペプチド、蛋白質および細胞表面受容体に対する抗体からなる群より選択された１種以上であってもよい。より具体的に、前記官能基やリガンドはアニスアミド（ａｎｉｓａｍｉｄｅ）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ガラクトース、ラクトース、マンノース、ヒアルロン酸、ＲＧＤペプチド、ＮＧＲペプチド、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に対する抗体などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００４１】
前記疎水性Ｂブロックは、生体適合性生分解性高分子であって、一実施形態で、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステルおよびポリホスファジンから構成された群より選択される一つ以上であってもよい。より具体的に、前記疎水性Ｂブロックはポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン−２−オン、ポリラクチドとグリコリドの共重合体、ポリラクチドとポリジオキサン−２−オンの共重合体、ポリラクチドとポリカプロラクトンの共重合体およびポリグリコリドとポリカプロラクトンの共重合体から構成された群より選択される一つ以上であってもよい。また他の一実施形態で、前記疎水性Ｂブロックは、数平均分子量が５０〜５０，０００ダルトン、より具体的には２００〜２０，０００ダルトン、より一層具体的には１，０００〜５，０００ダルトンであるものであってもよい。また、疎水性ブロックの疎水性を増加させてミセルの安定性を向上させるために、トコフェロール、コレステロール、または炭素数１０〜２４個の脂肪酸を疎水性ブロック末端のヒドロキシ基に化学的に結合させることができる。
【００４２】
前記親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体の含量は、組成物全体乾燥重量を基準に、４０〜９９．９８重量％であり、具体的には８５〜９９．８重量％、さらに具体的には９０〜９９．８重量％であることがよい。前記両親媒性ブロック共重合体の含量が４０重量％未満であればミセルの大きさが過度に大きくなりミセルの安定性が低下しフィルター滅菌時に損失率が大きくなる恐れがあり、含量が９９．９８重量％を超過すれば含入できる陰イオン性薬物の含量が過度に少なくなる。
【００４３】
さらに、前記両親媒性ブロック共重合体において、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）の組成比は、共重合体重量を基準に、親水性ブロック（Ａ）が４０〜７０重量％、具体的には５０〜６０重量％範囲であってもよい。親水性ブロック（Ａ）の比率が４０重量％未満であれば高分子の水に対する溶解度が低くてミセルを形成しにくいため、共重合体がミセルを形成するに十分な水に対する溶解度を有するために親水性ブロック（Ａ）の比率が４０重量％以上であることがよい一方、７０重量％を超過すれば親水性が過度に高くて高分子ミセルの安定性が低くなり陰イオン性薬物／陽イオン性化合物複合体の可溶化組成物として使用しにくいので、ミセル安定性を考慮して親水性ブロック（Ａ）の比率が７０重量％以下であることがよい。
【００４４】
前記疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシ基は、コレステロール、トコフェロール、および炭素数１０〜２４個の脂肪酸から構成された群より選択される一つ以上で修飾されたものであってもよい。
【００４５】
また、ポリ乳酸塩（例えば、ＰＬＡＮａ）は前記両親媒性ブロック共重合体と別途の成分としてミセル内壁に含まれ得るものであって、ミセルのコア（内壁）に分布してコアの疎水性を強化させミセルを安定させると同時に体内で細網内皮系（ＲＥＳ）を効果的に回避する役割を果たす。即ち、ポリ乳酸塩のカルボン酸陰イオンがポリ乳酸より効果的に陽イオン性複合体と結合して高分子ミセルの表面電位を減少させポリ乳酸塩を含まない高分子ミセルに比べて表面電位の正電荷が減少し細網内皮系によって少なく捕獲され、これによって目的する部位（例えば、癌細胞、炎症細胞など）への伝達効率に優れているという長所がある。
【００４６】
このようなポリ乳酸塩は数平均分子量が５００〜５０，０００ダルトン、具体的に１，０００〜１０，０００ダルトンであることがよい。分子量が５００ダルトン未満であれば疎水性が過度に低くてミセルのコア（内壁）に存在しにくく、分子量が５０，０００ダルトンを超過すれば高分子ミセルの粒子が大きくなる問題がある。
【００４７】
前記ポリ乳酸塩は、両親媒性ブロック高分子１００重量部に対して１〜２００重量部、具体的に１０〜１００重量部、さらに具体的に３０〜６０重量部で使用されてもよい。ポリ乳酸塩の含量が両親媒性ブロック高分子１００重量部に対して２００重量部を超過すればミセルの大きさが増加して、滅菌膜を用いたろ過が難しくなり、１重量部未満であれば疎水性を強化してミセルを安定させ細網内皮系を効果的に回避しようとする目的する効果を十分に得られない。
【００４８】
一具体例で、陰イオン性薬物１重量部に対して両親媒性ブロック共重合体を１０〜１，０００重量部、ポリ乳酸塩を５〜５００重量部で使用することができる。好ましくは、両親媒性ブロック共重合体を５０〜８００重量部、より好ましくは１００〜５００重量部で使用することができる。好ましくは、ポリ乳酸塩を１０〜３００重量部、より好ましくは５０〜１００重量部で使用することができる。
【００４９】
好ましい一つの様態として、本発明のポリ乳酸塩は下記の化学式２〜７の化合物からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする。
【００５０】
【化２】
2019501900.tif 000004
【００５１】
上記式２において、Ａは−ＣＯＯ−ＣＨＺ−であり；Ｂは−ＣＯＯ−ＣＨＹ−、−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２であり；Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル、またはエチル基であり；ＺとＹはそれぞれ水素原子、またはメチルまたはフェニル基であり；ＭはＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；ｎは１〜３０の整数であり；ｍは０〜２０の整数である。
【００５２】
【化３】
2019501900.tif 000005
【００５３】
上記式３において、Ｘはメチル基であり；Ｙ’は水素原子またはフェニル基であり；ｐは０〜２５の整数であり、ｑは０〜２５の整数であって、但しｐ＋ｑは５〜２５の整数であり；Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチルまたはエチル基であり；ＭはＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；Ｚは水素原子、メチルまたはフェニル基である。
【００５４】
【化４】
2019501900.tif 000006
【００５５】
上記式４において、Ｗ−Ｍ’は
【化５】
2019501900.tif 000007
であり；ＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体およびＤ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体から構成された群より選択されるものであり；Ｒは水素原子、またはアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチルまたはエチル基であり；Ｍは独立してＮａ、Ｋ、またはＬｉである。
【００５６】
【化６】
2019501900.tif 000008
【００５７】
上記式５において、Ｓは
【化７】
2019501900.tif 000009
であり；Ｌは−ＮＲ１−または−０−であり、ここでＲ１は水素原子またはＣ１−１０アルキルであり；ＱはＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、またはＣＨ２Ｃ６Ｈ５であり；ａは０〜４の整数であり；ｂは１〜１０の整数であり；ＭはＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；ＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、およびＤ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体からなる群より選択される一つ以上である。
【００５８】
【化８】
2019501900.tif 000010
【００５９】
上記式６において、Ｒ’は−ＰＡＤ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＭであり、ここでＰＡＤはＤ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸と１，４−ジオキサン−２−オンの共重合体から構成された群より選択されるものであり、ＭはＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；ａは１〜４の整数である。
【００６０】
【化９】
2019501900.tif 000011
【００６１】
上記式７において、ＸおよびＸ’は独立して水素、炭素数１〜１０のアルキルまたは炭素数６〜２０のアリールであり；ＹおよびＺは独立してＮａ、Ｋ、またはＬｉであり；ｍおよびｎは独立して０〜９５の整数であって、５＜ｍ＋ｎ＜１００であり；ａおよびｂは独立して１〜６の整数であり；Ｒは−（ＣＨ２）ｋ−、炭素数２〜１０の二価アルケニル（ｄｉｖａｌｅｎｔ ａｌｋｅｎｙｌ）、炭素数６〜２０の二価アリール（ｄｉｖａｌｅｎｔ ａｒｙｌ）またはこれらの組み合わせであり、ここでｋは０〜１０の整数である。
【００６２】
前記ポリ乳酸塩は化学式２または化学式３の化合物であることが好ましい。
【００６３】
具体的な一様態で、前記両親媒性ブロック共重合体は任意にポリ乳酸塩と共にミセル壁を形成して水溶液相で陰イオン性薬物と陽イオン性化合物複合体をミセル構造内部に封入させ、この時、両親媒性ブロック共重合体の重量（ｂ）に対する陰イオン性薬物および陽イオン性化合物複合体の重量（ａ）比率［ａ／ｂ×１００；（陰イオン性薬物重量＋陽イオン性化合物重量）／両親媒性ブロック共重合体重量×１００］は、０．００１〜１００重量％、具体的には０．０１〜５０重量％、より具体的には０．１〜１０重量％であってもよい。前記重量比率が、０．００１重量％未満の場合には陰イオン性薬物および陽イオン性化合物複合体の含量が過度に低くなって陰イオン性薬物が効果的に作用できる有効含量を充足させにくく、反対に１００重量％超過時には両親媒性ブロック共重合体の分子量と陰イオン性薬物および陽イオン性化合物複合体の量を考慮する時、適切な大きさのミセル構造を形成しないためである。
【００６４】
本発明の一様態で、（ｃ）段階（ｂ）で得られた混合物を０〜５０℃
の温度で５〜６０分間安定化する段階；を追加的に含んでもよい。前記安定化は、混合物をじっとまたはスターリング（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）下に放置（ａｌｌｏｗ ｔｏ ｓｔａｎｄ）することによって遂行できる。前記安定化条件は０〜５０℃、より具体的には４〜３０℃で５分〜１時間、より具体的には１０分〜３０分であることがよいが、これに制限されるものではない。５分以下である場合は複合体が安定化されなく、１時間を超過すれば複合体の沈殿が発生する問題がある。
【００６５】
一方、また他の一つの追加的な様態として、本発明による陰イオン性薬物伝達用組成物の製造方法は以下の段階を含んでもよい。
（ａ’）陰イオン性薬物と陽イオン性化合物をそれぞれ水性溶媒に溶解させて混合した後、凍結乾燥する段階；
（ｂ−１）段階（ａ’）で得られた凍結建造物を有機溶媒に溶解させる段階；
（ｂ−２）段階（ｂ−１）で得られた溶液を水性溶媒と混合する段階；および、
（ｂ−３）段階（ｂ−２）で得られた混合物から有機溶媒を除去する段階。
【００６６】
この時、前記両親媒性ブロック共重合体と任意にポリ乳酸塩を段階（ｂ−１）の有機溶媒または段階（ｂ−２）の水性溶媒に溶解させることができる。
【００６７】
前記段階（ａ’）では、陰イオン性薬物と陽イオン性化合物をそれぞれ水性溶媒に溶解させ混合して得られた混合物を凍結乾燥する。段階（ａ’）で静電気的結合によって効果的に複合体を形成し、このように形成された複合体は凍結乾燥を通じて水を除去する過程で結合力が増加する。
【００６８】
さらに、前記段階（ｂ−１）では乾燥されたナノ粒子形態の複合体を有機溶媒上に溶かし、この時使用される有機溶媒はアセトン、エタノール、メタノール、メチレンクロリド、クロロホルム、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、エチルアセテートおよび酢酸からなる群より選択される一つ以上であってもよい。好ましくは、エタノール、ジメチルスルホキシド、エチルアセテートおよび酢酸からなる群より選択される一つ以上であってもよい。
【００６９】
前記有機溶媒は、融合性脂質（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）を含むものであってもよい。前記融合性脂質は、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジラウロイルホスファチジン酸（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジリノレオイルホスファチジン酸（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジン酸（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジン酸（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏ���ｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、コレステロール、およびトコフェロールからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００７０】
前記段階（ｂ−２）は段階（ｂ−１）で得られた溶液を水性溶媒中に混合させナノ粒子形態の陰イオン性薬物−陽イオン性化合物との複合体を両親媒性ブロック共重合体と任意にポリ乳酸塩が形成するミセル構造体内部に封入させる段階であって、この時使用される前記水性溶媒は蒸留水、注射用水、または緩衝液であってもよい。前記水性溶媒の使用量は特別な限定はなく、例えば段階（ｂ−１）の有機溶媒に対する体積基準に１〜１０、より具体的に１〜５であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００７１】
また、前記段階（ｂ−１）または（ｂ−２）で使用される前記両親媒性ブロック共重合体およびポリ乳酸塩は、前述で言及した両親媒性ブロック共重合体およびポリ乳酸塩と同一な種類および含量を使用することができる。
【００７２】
さらに、前記段階（ｂ−３）では、前記段階（ｂ−２）で製造された混合物から有機溶媒を蒸発させることによって除去し高分子ミセル水溶液を収得する。
【００７３】
さらに、好ましい一つの様態として、本発明の製造方法は、前記段階（ｂ−３）以後に、（ｄ）凍結乾燥補助剤を加えて凍結乾燥する工程をさらに含んでもよい。
【００７４】
また他の一つの追加的な様態として、本発明の製造方法は、前記段階（ｄ）の凍結乾燥前に、段階（ｂ−３）から得られた高分子ミセル水溶液を滅菌フィルターで滅菌する工程を追加的に含んでもよい。
【００７５】
本発明で使用される凍結乾燥補助剤は、凍結乾燥された組成物がケーキ形態を維持できるようにするか、両親媒性ブロック共重合体組成物を凍結乾燥後、再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）する過程で早い時間内に均一に溶けることを助けるために添加するものであって、具体的に、ラクトース、マンニトール、ソルビトールおよびスクロースからなる群より選択される一つ以上であってもよい。前記凍結乾燥補助剤の含量は、凍結乾燥組成物全体乾燥重量を基準に、１〜９０重量％、さらに具体的には１０〜６０重量％である。
【００７６】
以上のような本発明の製造方法によれば、陰イオン性薬物と陽イオン性化合物を単一相の水相で複合体を形成させて静電気的結合によってナノ粒子形態の複合体が効果的に形成され、凍結乾燥を通じて水溶液を除去する過程で結合力が増加し、最終的に製造される高分子ミセルが収得率が非常に向上する。さらに、このような製造方法は、有機溶媒を相対的に少なく使用するので環境親和的であるだけでなく、陽イオン性脂質が複合体形成以後の段階で製造器具、容器などに付いて組成物比率が変更されることを防止して再現性が維持され、製造が非常に便利でたやすく、陰イオン性薬物を複合体形成を通じて疎水性薬物粒子に変え大量生産が容易であるという特徴を有する。
【００７７】
また、本発明によって製造された組成物では、前記陰イオン性薬物と陽イオン性化合物複合体は前記両親媒性ブロック共重合体および任意にポリ乳酸塩によって形成されるミセル構造体内に封入された状態を維持するため、血中または体液内での安定性が向上する。
【００７８】
一方、また他の一つの様態として、本発明は、前記製造方法によって製造された高分子ミセルを含む陰イオン性薬物伝達用組成物に関するものである。
【００７９】
本発明の製造方法によれば、前記陰イオン性薬物と陽イオン性化合物は静電気的相互作用を通じて結合して、陰イオン性薬物−陽イオン性化合物複合体を形成し、この複合体が両親媒性ブロック高分子と任意にポリ乳酸塩によって形成されたミセル構造内部に封入された高分子ミセル構造体が製造される。このように本発明の一態様によって製造された高分子ミセル伝達体の大略的な構造を図１に示した。
【００８０】
図１に示したように、両親媒性ブロック共重合体およびポリ乳酸塩によって形成されるミセル構造体は、水相環境で両親媒性ブロック共重合体の親水性部分がミセルの外壁を形成し、両親媒性ブロック共重合体の疎水性部分と前記両親媒性ブロック共重合体と別途の成分として含まれているポリ乳酸塩がミセルの内壁を形成し、その形成されたミセルの内部に陰イオン性薬物と陽イオン性化合物複合体が封入された構造である。
【００８１】
前記組成物の構成成分の陰イオン性薬物、陽イオン性化合物、両親媒性ブロック高分子およびポリ乳酸塩などに関する事項は前記本発明による製造方法で記載されたとおりである。
【００８２】
好ましい一様態で、前記組成物中のミセルの粒子大きさは、１０〜２００ｎｍであり、さらに具体的には１０〜１００ｎｍであることがよい。また、前記ミセル粒子の標準電荷は−２０〜２０ｍＶであり、さらに具体的に−１０〜１０ｍＶであることがよい。前記粒子大きさおよび標準電荷は、ミセル構造の安定性および構成成分らの含量と体内での陰イオン性薬物の吸収度および安定性面で最も好ましい。
【００８３】
本発明による両親媒性ブロック共重合体および任意にポリ乳酸塩ミセル構造体に封入された陰イオン薬物−陽イオン性化合物複合体含有組成物は、血管、筋肉、皮下、経口、骨、経皮または局所組織などの投与経路を通じて投与でき、このような投与経路に適するように、多様な経口または非経口投与製剤として剤形化できる。前記経口投与製剤としては錠剤、カプセル、粉体製剤、液剤など、非経口投与製剤としては点眼剤、注射剤など多様な製剤を例示することができ、好ましい一様態として、前記組成物は注射用製剤であってもよい。例えば、本発明による組成物を凍結乾燥する場合、これを注射用蒸留水、０．９％生理食塩水および５％デキストロース水溶液などで再構成して注射用製剤形態に製造することができる。
【発明の効果】
【００８４】
本発明による製造方法は、陰イオン性薬物と陽イオン性化合物を水相で複合体を形成させ静電気的結合によってナノ粒子形態の複合体が効果的に形成され、凍結乾燥を通じて水溶液を除去する過程で結合力が増加し、最終的に製造される高分子ミセルの収得率が非常に向上する。さらに、このような製造方法は、有機溶媒を相対的に少なく使用することによって環境親和的であるだけでなく、製造が非常に便利でたやすく、大量生産が容易であるという特徴を有する。また、本発明の製造方法によって製造された陰イオン性薬物伝達用組成物は体内に投与した場合、陰イオン性薬物の血中あるいは体液内安定性を高めることができ、特に細網内皮系を回避して陰イオン性薬物が細胞内に効率的に伝達され得るという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の製造方法によって製造された高分子ミセル伝達体の大略的な構造を図式化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
以下、本発明を下記の実施例に基づいてより詳しく説明するが、これらは本発明を説明するためのものに過ぎず、これらによって本発明の範囲が何らかの形でも制限されるのではない。
【実施例】
【００８７】
［比較例１］ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）含有組成物製造
１，６ｄｉｏＴＥＴＡ１２６μｇをクロロホルム６．３μｌに溶かし、ｓｉＲＮＡ５μｇを蒸留水４μｌに溶かした。ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）０．５ｍｇをクロロホルム１０μｌに溶かし、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）１ｍｇをクロロホルム２０μｌに溶かした。全体的に水層に対する有機層の体積比率が１０倍になるようにクロロホルム３．７μｌを追加した。前記ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール１ｍｇをクロロホルムに溶かした溶液の中のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール０．２ｍｇ（２０重量％）に該当する量の４μｌにクロロホルム４４μｌを添加して一ツ口丸底フラスコに入れ蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で減圧蒸留して溶媒を除去した。
【００８８】
前記ｄｉｏＴＥＴＡ溶液、ＰＬＡＮａ溶液、そしてｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール０．８ｍｇ溶液を混合し、ｓｉＲＮＡ水溶液を一滴ずつ加えながら超音波紛砕機を用いて乳状液を製造した。乳状液をｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール０．２ｍｇが塗布された一ツ口丸底フラスコに入れ蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で減圧蒸留して溶媒を除去した。フラスコに蒸留水１００μｌを加えて、軟らかく振って溶かすことによってｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ含有組成物を製造した（比較例１）。
【００８９】
［比較例２−３］ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＤＯＰＥ／（ＰＬＡＮａ）含有組成物製造
比較例２と３の場合、比較例１と同様な方法で組成比を異にして製造した。ｓｉＲＮＡ５μｇを蒸留水４μｌに溶かし、水層に対する有機層の比率が１０倍になるようにｓｉＲＮＡを除いた残りの組成物をクロロホルムに溶かした。比較例２の場合、クロロホルムに１，６ｄｉｏＴＥＴＡ９４．５μｇを５μｌに溶かし、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）１ｍｇを２０μｌに溶かし、ＤＯＰＥ１０４μｇを５．２μｌに溶かし、９．８μｌのクロロホルムを追加した。比較例３の場合、クロロホルムに１，６ｄｉｏＴＥＴＡ９４．５μｇを５μｌに溶かし、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）１ｍｇを２０μｌに溶かし、ＰＬＡＮａ０．３ｍｇを９。８μｌに溶かし、ＤＯＰＥ１０４μｇを５．２μｌに溶かした。前記ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール１ｍｇをクロロホルムに溶かした溶液の中のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール０．２ｍｇ（２０重量％）に該当する量の４μｌにクロロホルム４４μｌを添加して一ツ口丸底フラスコに入れ、蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で減圧蒸留して溶媒を除去した。
【００９０】
前記ｄｉｏＴＥＴＡ溶液、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール０．８ｍｇ溶液、そして（または）ＰＬＡＮａ溶液またはＤＯＰＥ溶液を混合し、ｓｉＲＮＡ水溶液を一滴ずつ加えながら超音波紛砕機を用いて乳状液を製造した。乳状液をｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール０．２ｍｇが塗布された一ツ口丸底フラスコに入れ、蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で減圧蒸留して溶媒を除去した。フラスコに蒸留水１００μｌを加え、軟らかく振って溶かすことによってｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＤＯＰＥ含有組成物（比較例２）、ｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ含有組成物（比較例３）を製造した。
【００９１】
【表１】
2019501900.tif 000012
【００９２】
（組成比において、各成分の単位はｓｉＲＮＡ：μｇ、脂質：Ｎ／Ｐ比率、高分子：ｍｇ、融合脂質：脂質に対するモル比率である。高分子１はｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール：高分子２はＰＬＡＮａを意味する。以下、表で同様に適用される。）
【００９３】
［実施例１−２］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）含有組成物製造（水相で剤形製造）
１，６ｄｉｏＴＥＴＡは１２６μｇを２５２μｌの蒸留水に溶かした後、超音波洗浄機に１０分間置いて粒子を小さくした。ｓｉＲＮＡ５μｇを蒸留水４μｌに溶かし、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）１ｍｇとＰＬＡＮａ（１．７ｋ）５００μｇをそれぞれ蒸留水１０μｌ、２μｌに溶かした。ｓｉＲＮＡと１，６ｄｉｏＴＥＴＡを先に混合した後、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールとＰＬＡＮａを混合した。体積比率が１：１になるように蒸留水を添加した。ｓｉＲＮＡ、１，６ｄｉｏＴＥＴＡ混合物とｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール、ＰＬＡＮａ混合物を超音波粉砕状態で一滴ずつ混合した。剤形安定化のために１０分間４℃で保管後、０．４５μｍ親水性ＰＶＤＦフィルターでろ過させて粒子の大きい剤形は排除した（実施例１）。
【００９４】
実施例１でｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）５００μｇとＰＬＡＮａ（１．７ｋ）１００μｇを使用したものを実施例２にした。
【００９５】
【表２】
2019501900.tif 000013
【００９６】
［実施例３］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）含有組成物製造（水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後乳状液内で高分子ミセルに封入する製造法）
ｓｉＲＮＡ５μｇは蒸留水４μｌに溶かし、ｄｉｏＴＥＴＡ１２６μｇは１２６μｌの蒸留水に溶かした後、超音波粉砕状態で一滴ずつ混合した。この混合物を凍結乾燥させて粉末状態にした後、ＰＬＡＮａ３００μｇをエチルアセテート５０μｌに溶かした溶液で粉末を溶かした。ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）１ｍｇを蒸留水１００μｌに溶かした溶液にｓｉＲＮＡ、ｄｉｏＴＥＴＡ、ＰＬＡＮａが混合された混合物を一滴ずつ加えながら超音波紛砕機を用いて乳状液を製造した。製造した乳状液を一ツ口丸底フラスコに入れて蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で減圧蒸留することによってエチルアセテートを選択的に除去し、ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮＡ含有高分子ミセルを製造した。
【００９７】
［実施例４−６］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）含有組成物製造（水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、乳状液内で高分子ミセルに封入する製造法）
実施例３と類似の方法であるが、組成物を混合する順序を異にしてｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）含有組成物を製造した。組成物、溶媒の種類と量、製造順序は同一であり、組成物をどの溶媒に溶かすかによって次のような実施例に区分される。ｓｉＲＮＡとｄｉｏＴＥＴＡ粉末をｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）が含有されているエチルアセテートに溶かした後、ＰＬＡＮａを溶かした蒸留水で複合乳状液を製造するか（実施例４）、粉末をエチルアセテートに溶かした後、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）とＰＬＡＮａが溶かされた蒸留水で複合乳状液を製造した（実施例５）。また、粉末をｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）とＰＬＡＮａが含有されているエチルアセテートに溶かした後、蒸留水で複合乳状液を製造した（実施例６）。
【００９８】
【表３】
2019501900.tif 000014
【００９９】
［実施例７−１２］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）含有組成物製造（水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、乳状液内で高分子ミセルに封入する製造法）
実施例３と同様な方法で組成を異にしてｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）含有組成物を製造した。
実施例７〜１２で得られた組成物は下記の表４に整理した：
【０１００】
【表４】
2019501900.tif 000015
【０１０１】
［実施例１３−１４］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＤＯＰＥ含有組成物製造（水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、乳状液内で高分子ナノ粒子に封入する製造法）
実施例６と同様な方法で組成を異にしてｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＤＯＰＥ含有組成物を製造した。
実施例１３〜１４で得られた組成物は下記の表５に整理した：
【０１０２】
【表５】
2019501900.tif 000016
【０１０３】
［実施例１５−１６］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）／ＤＯＰＥ含有組成物製造（水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、乳状液内で高分子ナノ粒子に封入する製造法）
実施例６と同様な方法で組成を異にしてｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）／ＤＯＰＥ含有組成物を製造した。
実施例１５〜１６で得られた組成物は下記の表６に整理した：
【０１０４】
【表６】
2019501900.tif 000017
【０１０５】
［実験例１］製法による高分子ミセルのｓｉＲＮＡ含量比較
各製造法および組成によってナノ粒子の収得率がどのように変化するか確認するためにｓｉＲＮＡ含量を定量した。
変形されたＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ抽出法を用いて製造された高分子ミセルでｓｉＲＮＡ量を定量した。高分子ミセルを５０ｍＭソジウムホスフェート（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、７５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）溶液に溶かし、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ単一相を作った後、１００ｍＭソジウムホスフェート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）およびクロロホルムで抽出して水溶液層のｓｉＲＮＡをリボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量した。
水相で剤形製造および水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、高分子ミセルに封入する製造法によるｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）／ＰＬＡＮａ（１．７ｋ）高分子ミセルのｓｉＲＮＡ含量を下記の表７に示した。
【０１０６】
【表７】
2019501900.tif 000018
【０１０７】
水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、乳状液内で高分子ミセルに封入する製造法で組成を異にした実施例７−１２のｓｉＲＮＡ含量を下記の表８に示した。
【０１０８】
【表８】
2019501900.tif 000019
【０１０９】
水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、乳状液内で高分子ナノ粒子に封入する製造法で組成を異にした実施例１３−１６のｓｉＲＮＡ含量を下記の表９に示した。
【０１１０】
【表９】
2019501900.tif 000020
【０１１１】
表７、８および９に示したように、本発明の製造方法によって製造された実施例１−１６の組成物中のｓｉＲＮＡ含量は比較例に比べて顕著に優れていることが分かる。このような結果は水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡのナノ粒子を形成する製造方法がｓｉＲＮＡと陽イオン性脂質間の効率的な結合を増加させることによって効率的にｓｉＲＮＡをミセル内に封入させることが分かる。
【０１１２】
［比較例４］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）含有組成物製造（複合乳状液製造法）
ｄｉｏＴＥＴＡ１２６μｇをクロロホルムに溶かし、ｓｉＲＮＡ５μｇを蒸留水に溶かした。ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）１ｍｇをクロロホルムに溶かした。ｄｉｏＴＥＴＡとｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールを混合し、ｓｉＲＮＡを一滴ずつ加えながら超音波紛砕機を用いて乳状液を製造した。乳状液を蒸留水に加えながら超音波紛砕機を用いて複合乳状液を製造した。複合乳状液を一ツ口丸底フラスコに入れ、蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で減圧蒸留することによってクロロホルムを除去してｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）含有組成物を製造した。
【０１１３】
【表１０】
2019501900.tif 000021
【０１１４】
［実施例１７］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）含有組成物製造（水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、乳状液内で高分子ミセルに封入する製造法）
ｓｉＲＮＡ５μｇは蒸留水４μｌに溶かし、ｄｉｏＴＥＴＡ１２６μｇは１２６μｌの蒸留水に溶かした後、超音波粉砕状態で一滴ずつ混合した。この混合物を凍結乾燥させて粉末状態にした後、エチルアセテート５０μｌで粉末を溶かした。ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）１ｍｇを蒸留水１００μｌに溶かした溶液にｓｉＲＮＡ、ｄｉｏＴＥＴＡ、ＰＬＡＮａが混合された混合物を一滴ずつ加えながら超音波粉砕機を用いて乳状液を製造した。製造した乳状液を一ツ口丸底フラスコに入れ蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で減圧蒸留することによってエチルアセテートを選択的に除去してｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）含有高分子ミセルを製造した。
【０１１５】
【表１１】
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【０１１６】
［実験例２］ｓｉＲＮＡ／１，６−ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）高分子ミセルの製法によるｓｉＲＮＡ含量比較
各製造法によってナノ粒子の収得率がどのように変化するか確認するためにｓｉＲＮＡ含量を定量した。
変形されたＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ抽出法を用いて製造されたｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（２ｋ−１．７ｋ）含有高分子ミセルでｓｉＲＮＡ量を定量した。高分子ミセルを５０ｍＭソジウムホスフェート（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、７５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）溶液に溶かし、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ単一相を作った後、１００ｍＭソジウムホスフェート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）およびクロロホルムで抽出して水溶液層のｓｉＲＮＡをリボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量した。
比較例４と実験例１７のミセル内に封入されたｓｉＲＮＡ含量比較結果は下記表１２に示した。
【０１１７】
【表１２】
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【０１１８】
表１２に示したように、本発明の製造方法によって製造された実施例１７のｓｉＲＮＡ含量は比較例に比べて顕著に優れていることが分かる。
【０１１９】
［実験例３］高分子ミセルの安定性比較（ヘパリン競争分析法）
各製造法および組成によるｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を確認するためにヘパリン競争分析法を実施した。剤形１０μｌ（ｓｉＲＮＡ３００ｎｇ）にヘパリン４０μｇを処理して１０分間常温に反応させた後、電気泳動を通じて瓦解したｓｉＲＮＡを測量した。ｓｉＲＮＡ瓦解度が低いほど安定性に優れた剤形であり、組成比による安定性比較は下記の表１３に示した。
【０１２０】
【表１３】
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【０１２１】
また、水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子形成後、乳状液内で高分子ナノ粒子に封入する製造法で組成を異にした実施例１３−１６の安定性比較は下記の表１４に示した。
【０１２２】
【表１４】
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【０１２３】
表１３と１４は、高分子ミセル伝達体のヘパリン競争を通じた安定性比較結果を示したものである。水相製造または水相でｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡナノ粒子を形成した後、乳状液内で高分子ミセルに封入する本発明による製造法を通じて製造された伝達体の場合、ヘパリンによる瓦解度が低いのが分かる。このような結果はｓｉＲＮＡが高分子ミセル内に安定的に封入され血中または体内でも安定性が維持されるのを示す。
【０１２４】
［実験例４］製法による高分子ミセル製造再現性比較
特定組成比と製法を選定してｓｉＲＮＡ基準２００μｇスケールで剤形を製造した。同一な実験を３回反復することによって剤形の製造再現性をｓｉＲＮＡ含量（収得率）を基準に比較した。
製法による製造再現性は比較例１と実施例３、７を比較し、結果は下記の表１５に示した。
【０１２５】
【表１５】
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【０１２６】
［実験例５］製法による高分子ミセル製造量増加によるｓｉＲＮＡ含量（収得率）比較
特定組成比と製法を選定してｓｉＲＮＡ基準２００μｇ、５００μｇ、１０００μｇスケールで剤形を製造した。同一な実験を２回反復することによって製造量増加による収得率を比較してみた。
製造量増加による収得率は比較例１と実施例７を比較し、結果は下記の表１６に示した。
【０１２７】
【表１６】
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【０１２８】
［実験例６］高分子ミセルの血中濃度分析
製造された剤形を動物に投与し、投与０．５時間、６時間後に採血をしてＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）とｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法を用いて以下のような方法でミセルの血中濃度を分析する。
【０１２９】
剤形を１ｍｇ／ｋｇでＢａｌｂ／ｃマウスに静脈注射し、０．５時間、６時間後にそれぞれ採血する。血液を１３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離機を作動させて上層部分のみ新しいチューブに集め、スタンダード用剤形の濃度は４μＭから０．００２５６μＭまで総１１個の濃度にＰＢＳに希釈して準備する。ＰＣＲ用９６ウェルプレートにスタンダード用に希釈した剤形を１μｌ入れ、９μｌのＢａｌｂ／ｃマウス血清と９０μｌの０．２５％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れる。実験群血液サンプル１０μｌに９０μｌの０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れた後、伝達体を溶かす前処理段階を経る。剤形が溶かされることによって露出されたｓｉＲＮＡを逆転写（ＲＴ）段階を経てｃＤＮＡとして合成し、合成されたｃＤＮＡを用いてｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を行った。分析はＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒプログラムを用いて分析した。
【０１３０】
【表１７】
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【図１】
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【国際調査報告】
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