(57)【要約】同じ周波数、表面形態を有するおよび／または同じ表面接着分子が修飾されているＡＴカット水晶とＢＴカット水晶を培養皿または検出セルに入れるステップと、試験対象細胞を培養皿または検出セルに加え、接着または様々な内部・外部環境刺激下での任意時間ｔにおける細胞牽引力ΔＳｔを式ΔＳｔ＝（ＫＡＴ−ＫＢＴ）−１［ｔｑＡＴΔｆｔＡＴ／ｆｒＡＴ−ｔｑＢＴΔｆｔＢＴ／ｆｒＢＴ］（式中、ＫＡＴ＝２．７５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１、ＫＢＴ＝−２．６５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１はそれぞれＡＴカット水晶とＢＴカット水晶の応力係数、ｆｒＡＴはＡＴカット水晶の共振周波数、ｆｒＢＴはＢＴカット水晶の共振周波数、ｔｑＡＴはＡＴカット水晶の厚さ、ｔｑＢＴはＢＴカット水晶の厚さであり、すべては定数である）によって測定するステップとを含む細胞牽引力のリアルタイム定量的測定方法。ΔｆｔＡＴ、ΔｆｔＢＴはそれぞれ、ＡＴカット水晶、ＢＴカット水晶のそれらの基準点に対する任意の時間ｔにおける周波数シフトである。該方法は、細胞接着過程、および薬物の影響などの様々な内部・外部環境刺激下での細胞力の動的変化を研究するために使用することができ、薬物は細胞接着前または接着後に加えることができる。該方法は、初代細胞および継代細胞を含むすべての接着細胞に適用可能である。【選択図】図２
2019530442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞牽引力のリアルタイム定量的測定方法であって、
同じ周波数、表面形態を有するおよび／または同じ表面接着分子が修飾されているＡＴカット水晶とＢＴカット水晶を培養皿または検出セルに入れるステップ（１）と、
試験対象細胞を培養皿または検出セルに加え、細胞の接着時間ｔにおける細胞牽引力ΔＳｔを次式により測定するステップ（２）とを備え、
ΔＳｔ＝（ＫＡＴ−ＫＢＴ）−１［ｔｑＡＴΔｆｔＡＴ／ｆｒＡＴ−ｔｑＢＴΔｆｔＢＴ／ｆｒＢＴ］      （１）
式（１）中、ＫＡＴ＝２．７５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１、ＫＢＴ＝−２．６５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１はそれぞれ、ＡＴカット水晶とＢＴカット水晶の応力係数、ｆｒＡＴはＡＴカット水晶の共振周波数、ｆｒＢＴはＢＴカット水晶の共振周波数、ｔｑＡＴはＡＴカット水晶の厚さ、ｔｑＢＴはＢＴカット水晶の厚さであり、すべての数は定数であり、ΔｆｔＡＴ、ΔｆｔＢＴはそれぞれ、ＡＴカット水晶、ＢＴカット水晶のそれらの基準点に対する任意の時間ｔでの周波数シフトであり、
ΔＳｔが負の数の場合、細胞自体が圧縮応力を受けて、細胞が収縮状態にあり、それに対応して細胞外マトリックスが等しい大きさで反対方向の引張応力を受けていることを示し、ΔＳｔが正の数の場合、細胞自体が引張応力を受けて、細胞が拡張状態にあり、それに対応して細胞外マトリックスが等しい大きさで反対方向の圧縮応力を受けている、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞接着分子が、膜貫通タンパク質および力感受性分子インテグリンと相互作用することができる細胞外マトリックス分子、膜貫通タンパク質および力感受性分子インテグリンと相互作用することができる細胞外マトリックス生体模倣分子、細胞表面受容体と相互作用することができる分子、細胞表面に作用して細胞接着を促進できる分子を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膜貫通タンパク質および力感受性分子インテグリンと相互作用することができる前記細胞外マトリックス分子は、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンまたはコラーゲンであり、膜貫通タンパク質および力感受性分子インテグリンと相互作用することができる前記細胞外マトリックス生体模倣分子は、ＲＧＤ接着配列を含むポリペプチドであり、細胞表面受容体と相互作用することができる前記分子は細胞表面のカドヘリンと相互作用することができる分子、細胞表面に作用して細胞接着を促進できる前記分子はポリ−１−リジンである、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（２）の前記式において、ｔｑＡＴ＝０．１６６１／ｆｒＡＴ；ｔｑＢＴ＝０．２５３６／ｆｒＢＴである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞牽引力のリアルタイム定量的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
より多くの研究から、生化学的シグナルに加えて、細胞同士、そして細胞とそれらの微小環境との間で力シグナルを介して交流があることは示されている。細胞の微小環境の幾何学的および力学的性質は細胞の形態および機能に大きな影響を与える。細胞接着、細胞骨格極性、細胞増殖、細胞分化、胚形成および発達、癌転移、創傷治癒などを含む多くの生理学的プロセスは、細胞とそれらの微小環境との間の物理的な力伝達および感受性に著しく影響される。細胞の力学的性質は細胞骨格の組成と構造に直接関係しており、細胞骨格は細胞外マトリックスと隣接する細胞にそれぞれフォーカルアドヒージョン複合体（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）とカドヘリンによって結合されている。細胞力伝達に関与する主な細胞構造には、細胞膜および細胞膜と密接する細胞皮質（ｃｏｒｔｅｘ）剛性薄膜（アクチン、ミオシン、および関連タンパク質からなる）が含まれ、ｃｏｒｔｅｘはインテグリンにより細胞外マトリックスに接続されて、細胞が徐々に広がるにつれて細胞外マトリックスとフォーカルアドヒージョン（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）を形成する。細胞質のアクトミオシン（ａｃｔｏｍｙｏｓｉｎ）ネットワークは、細胞核に接続することによって細胞外マトリックスを収縮させる、または牽引力を印加する（図１）。細胞接着、細胞牽引力の大きさおよびフォーカルアドヒージョンの構造は、細胞内アクチン、分子モーター（たとえばミオシンなど）およびアクトミオシンネットワーク構造であるストレスファイバーに関連している。
【０００３】
したがって、細胞のアクトミオシンの収縮力またはその環境に印加される細胞牽引力は、細胞生物学などの分野における極めて重要な生物物理学的パラメータであり、異なる疾患の治療のための新たな主目的となっている。過去数十年にわたって、細胞牽引力を評価するためのいくつかの重要な技術が開発されてきたが、その技術の大部分は単一の個々の細胞牽引力の計算に限定されている。これらの技術の共通の特徴は、軟質弾性基板を用いて、細胞と弾性基板との相互作用によって引き起こされる基板の変形を用いて細胞牽引力を測定または計算することである。弾性基板は連続基板と非連続基板の両方を有し、前者は、しわのある薄いシリコンフィルムと蛍光マイクロビーズが埋め込まれたポリアクリルアミドゲルを含み、後者は、微細加工されたカンチレバーアレイとマイクロカラムアレイを有する。マイクロカラムアレイを例にとると、細胞は主に基板に対して垂直なマイクロカラムの上表面に付着し、細胞との接触点での牽引力の大きさおよび方向は、マイクロカラムの曲げ変形の程度および方向に従って直接測定できる。微細加工構造を有する基板は、製造プロセスが比較的複雑であり、細胞と基板の間が不完全接触することにより、微細構造の形態が接着細胞の形態および機能に著しく影響を及ぼし得るので、このような技術はこれらの不連続且つ所定接触点での細胞牽引力しか測定できない。
【０００４】
今までに、細胞牽引力測定に最も広く使用されている技術は、連続弾性基板に基づく細胞牽引力顕微鏡（ＴＦＭ）である。基板と細胞との間の接触は細胞の真の生理学的環境により近い面接触であるので、細胞牽引力測定に使用されるＴＦＭは研究者により容易に受け入れられる。１９９５年以来、Ｌｅｅ、Ｊａｃｏｂｓｅｎ、およびＤｅｍｂｏら、並びにほかのグループは、軟基質上で細胞を移動または静止させることで生じる細胞牽引力を測定するためのいくつかの牽引力顕微鏡技術を開発してきた。ＴＦＭは、ポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲルなどの既知の弾性軟基板上で培養された細胞によって生じる基板の変形を利用して細胞牽引力を計算する。細胞をこのような弾性基板上で培養すると、細胞の広がり過程で基板に生じる牽引力が基板を変形させ、この変形が蛍光マイクロビーズの移動として反映され、蛍光マイクロビーズの運動情報が蛍光顕微鏡によって収集され、画像処理後、基板のひずみ情報が取得される。その後、特定の力学的モデルを介して細胞の牽引力を定量的に反転させ、細胞の収縮または移動過程における各時刻での力分布をコンピュータースクリーン上で視覚化することができる。このような方法が、牽引力顕微鏡（ＴＦＭ）（Ｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＦＭ）と呼ばれる。
【０００５】
定量的理論から、細胞牽引力の測定および計算は逆問題に属し、逆問題の重要な共通する特徴は、牽引力測定にとっては悪条件である。それによって、理論的分析及び数値的計算に、主に方程式の解が観測データ（入力データ）に継続的に依存しないように表される特定の難問が存在する。言い換えれば、観測データのわずかな偏差が解に大きな変化をもたらす可能性がある。実際の問題として、一般的な観測データの誤差（または雑音）は避けられないものであるので、多かれ少なかれ誤差（または雑音）を伴う観測データを逆算して得た方程式の解は真の解から大幅に逸脱する可能性が高い。
【０００６】
前記のとおり、細胞牽引力を測定するための従来の方法のほとんどは単一細胞分析に限定されている。軟質基板の微細加工プロセスが複雑であり、マイクロカラム間のギャップが大きく、細胞はカラムとしか接着構造を形成できない。これは体内の細胞環境とは異なるため、マイクロカラムの構造および形態は細胞の正常な生理および機能に影響を及ぼす可能性がある。ソフトゲル牽引力顕微鏡は牽引力を直接測定するのではなく、蛍光顕微鏡を用いてゲルに埋め込まれた蛍光標識マイクロビーズの変位を観察することによって計算されるものである。蛍光フィルムの製造における反転ステップにより大部分の蛍光粒子がフィルムの表面上に確実に堆積するが、２４時間または４８時間浸漬後、蛍光粒子は孔から培地中に逃げ出してフィルムに落ちることがある。その結果、蛍光フィルム表面の蛍光密度が低下してしまう。実際の撮影時に、表面から１μｍ離れたフィルム平面が選択するのが一般的であるが、普通の蛍光顕微鏡の比較的大きな被写界深度により、異なる平面での蛍光粒子を撮影する可能性があり、これはその後の変位計算に誤差をもたらす。長時間のレーザー照射がフルオレセインを消光するとともに、細胞の活性化にも影響を与える。さらに、ゲルフィルムの弾性率は、培地に長期間浸漬する過程で変化するため、正確な細胞牽引力を得るためには、培地で浸漬する対応時点でのゲル弾性率を測定する必要がある。したがって、従来の細胞牽引力測定方法は、細胞牽引力の長期連続測定には適しておらず、細胞機能の変化（たとえば細胞の成長や分化など）は数日から数週間かかり、さらに、従来の細胞牽引力測定技術は細胞機能の研究に寄与しないため、細胞の真の生理学的状態を反映することは困難である。
【０００７】
細胞牽引力顕微鏡を含める方法は単一細胞測定に制限されているが、細胞と細胞の間に不均一性が存在するので、異なる病理学または生理学的または異なる刺激下での細胞牽引力を比較して統計的に有意な変化を得るために、大量のサンプル分析を必要とし、時間がかかる。これらの技術は、細胞力によって引き起こされる可撓性基板またはセンサの変形に基づくものであり、写真撮影および長時間の画像処理、モデル構築および計算によって細胞牽引力の大きさを求めなければならない。したがって、細胞牽引力顕微鏡技術は現在、いくつかの専門の研究室（主に力生物学的分野）での使用に限定されている。
【０００８】
細胞牽引力顕微鏡で使用されるゲルまたは微細加工されたソフトマイクロカラムのいずれも、細胞は任意の形状を有して基板上を自由に動くことができるため、細胞力の自動測定は幾何学的制約の欠如により達成できず、大規模な実験には適さない。マイクロパターニング技術を使用すると、単一細胞を固定して細胞−細胞間の差異を減少させ、細胞により発生した力の位置を制御することにより力の計算を単純化し、それにより細胞牽引力測定のスループットを向上させることができる。しかしながら、マイクロパターニングは実験ステップが増えて困難さを高め、そして力の測定は依然として複雑な計算を通して蛍光マイクロビーズの変位データから得る必要がある。加えて、細胞の形状が制御されるが、細胞力は依然として離散的に分布しているので、細胞によって引き起こされる基板の変形は複雑であり、細胞によって異なる。
【０００９】
近年、細胞力顕微鏡は、いくつかの細胞および細胞単層の牽引力（単層牽引力顕微鏡、ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＭＴＭ））の測定にまで普及している。最近の進展として、９６チャネル細胞単層牽引力顕微鏡およびフーリエ変換９６チャネル細胞単層牽引力顕微鏡を薬物スクリーニング（後者は収縮力スクリーニングとして知られている）に使用する方法が確立されている。しかし、それは細胞単層および薬物添加から１時間または複数時間後の牽引力の相対変化に基づくため、固定終点の試験のみが達成され、細胞接着および薬物作用過程での連続的な動的牽引力変化は追跡されなかった。これらの方法は非常に有用であるが、通用の細胞培養皿の構成下で、異なる細胞数または異なる細胞−細胞間の相互作用下で、細胞の牽引力または収縮力をリアルタイムで連続的且つ定量的に測定できるほうがより望ましい。それのみによって、細胞牽引力は細胞の表現型を特徴付けるための重要な生物物理学的指標となり、さらに多くの重要な生物学的プロセスの細胞および分子のメカニズムをよりよく把握して、細胞生物学を含む生物学分野で受け入れられ広く使用することが可能になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の細胞牽引力の測定方法は主に、細胞により引き起こされる軟質基板の変形に依存しており、変形を測定または追跡するために光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を必要とする。本発明は、従来技術の欠点を克服し、細胞牽引力のリアルタイム定量的測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は下記の技術案を提供する。
【００１２】
前記細胞牽引力のリアルタイム定量的測定方法は、
同じ周波数、表面形態を有するおよび／または同じ表面接着分子が修飾されているＡＴカット水晶とＢＴカット水晶を培養皿または検出セルに入れるステップ（１）と、
試験対象細胞を培養皿または検出セルに加え、細胞の接着時間ｔにおける細胞牽引力ΔＳｔを次式により測定するステップ（２）とを備え、
ΔＳｔ＝（ＫＡＴ−ＫＢＴ）−１［ｔｑＡＴΔｆｔＡＴ／ｆｒＡＴ−ｔｑＢＴΔｆｔＢＴ／ｆｒＢＴ］      （１）
式（１）中、ＫＡＴ＝２．７５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１、ＫＢＴ＝−２．６５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１はそれぞれ、ＡＴカット水晶とＢＴカット水晶の応力係数、ｆｒＡＴはＡＴカット水晶の共振周波数、ｆｒＢＴはＢＴカット水晶の共振周波数、ｔｑＡＴはＡＴカット水晶の厚さ、ｔｑＢＴはＢＴカット水晶の厚さであり、２種類のカットの厚さと周波数の関係がそれぞれの周波数定数Ｎによって決まり、ＡＴカットとＢＴカット水晶の周波数定数はそれぞれＮＡＴ＝１．６６１ＭＨｚ・ｍｍ＝０．１６６１ＭＨｚ・ｃｍおよびＮＢＴ＝２．５３６ＭＨｚ・ｍｍ＝０．２５３６ＭＨｚ・ｃｍであるので、周波数が決定された水晶については、その厚さｔｑも決定されており、具体的には、ｔｑＡＴ＝０．１６６１／ｆｒＡＴ、ｔｑＢＴ＝０．２５３６／ｆｒＢＴである。ΔｆｔＡＴ、ΔｆｔＢＴはそれぞれＡＴカット、ＢＴカット水晶のそれらの基準点に対する任意の時間ｔにおける周波数シフトであり（培地中の安定値または接着後の安定値など）、
ΔＳｔが負の数の場合、細胞自体が圧縮応力を受けて、細胞が収縮状態にあり、それに対応して細胞外マトリックスが等しい大きさで反対方向の引張応力を受けていることを示し、ΔＳｔが正の数の場合、細胞自体が引張応力を受けて、細胞が拡張状態にあり、それに対応して細胞外マトリックスが等しい大きさで反対方向の圧縮応力、すなわち、いわゆる細胞収縮牽引力を受けているが、動物細胞微小管は主に細胞に圧縮応力を印加し、ストレスファイバーを含むアクチンフィラメントは細胞に引張応力を印加することが知られている。
【００１３】
前記細胞接着分子は主に以下の種類を含む。１）フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ラミニン（ｌａｍｎｉｎ）、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）など、膜貫通タンパク質および力感受性インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）と相互作用することができる細胞外マトリックス分子；２）ＲＧＤ接着配列を含むポリペプチドなどの上記細胞外マトリックス生体模倣分子；３）細胞表面上の他の受容体（カドヘリンなど）と相互作用することができる分子；４）ポリ−１−リジン（ポリリジン）のような、他の機構によって細胞表面に作用して細胞接着を促進する分子。一般に細胞培地に特定組成のウシ胎児血清が添加されており、そしてウシ胎児血清自体には細胞の付着、拡張および増殖を促進するトレース量のタンパク質を含むため、センサ表面に細胞接着分子（裸金電極など）が修飾されていないとしても、細胞への接着は培地中におけるこれらの成分を吸着させることによっても達成することができ、さらに、細胞自体も細胞外マトリックスを分泌してそのセンサ表面への接着を促進する機能を有する。
【００１４】
一般的に、細胞牽引力とは細胞とマトリックスとの間のフォーカルアドヒージョンの形成によってマトリックスに印加される力を指すが、細胞がマトリックスに接着できる限り、フォーカルアドヒージョンが形成されるかに関わらず、さらに接着が化学的または力学的作用によるかに関わらず、接着したマトリックスに表面応力を印加できる。フォーカルアドヒージョン形成がない場合、細胞とマトリックスとの相互作用は細胞接着力と呼ばれる。加えて、細胞増殖、移動、分化などのプロセスもマトリックスに様々な程度の力を発生させる。一般に、細胞がマトリックスに発生可能な力の順序は、分裂中に発生する力＞牽引力＞接着力である。これらの力のいずれについても、本発明の技術を使用して、リアルタイムで定量的且つ連続的に測定して研究することができる。さらに、本発明を使用して、様々な細胞接着分子および様々な力学的形態によるこれらの力応答への動的影響を研究して比較することができる。さらに、本発明は、薬物の影響など、異なる内部・外部環境刺激下での細胞力の動的変化を研究することに利用し得る。
【００１５】
本発明は、初代細胞および継代細胞を含む全ての付着細胞に適用可能である。懸濁細胞にまで普及でき、懸濁細胞とマトリックスとの間の弱い相互作用の直接研究、およびマトリックスに懸濁細胞の表面と相互作用する分子または材料を修飾して行う研究が含まれる。本発明はさらに原核細胞および真核細胞を含む全ての細胞に適用できる。すなわち、動物細胞以外、全ての細菌、真菌、および植物細胞にも適用できる。
【００１６】
以下、本発明をさらに説明する。
【００１７】
本発明のコア技術は、具体的には、ＡＴカット水晶とＢＴカット水晶を用いた圧電二重共振技術であり、ＡＴカットとＢＴカット配向の結晶の応力係数がほぼ同じであるが、符号が逆である。応力の変化は、二重共振器による同一界面過程の周波数シフトに基づいていわゆる「二重共振器技術」によって推定することができる。すなわち、ＡＴカットおよびＢＴカット表面堆積過程において外部堆積物によって発生する質量と応力が同じである条件が満たされる限り、表面堆積過程に伴う質量と応力は、ＡＴおよびＢＴカット結晶の厚さ（または周波数）および２種類のカット結晶の周波数変化に基づいて定量的に求められる。この技術は、水晶への金属膜イオンスパッタ、金属パラジウムへの水素吸着およびｐＨ変化により引き起こされるカルボン酸自己組織化チオール膜の相転移に伴う動的表面応力の測定に使用されてきたが、生細胞研究には利用されていない。それ以前、Ｔａｎらは、細胞接着によって引き起こされる表面応力が細胞接着圧電水晶微量天秤（ＱＣＭ）応答の主要なメカニズムの１つであることを初めて提案しており、質量による影響が無視できると仮定して、細胞をニュートン流体として扱い、次に走査型電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）によってＡＴカット水晶の力−周波数定数を得た後、細胞接着過程の動的応力変化を計算した。この研究は非常に重要であり、ＱＣＭ技術の細胞収縮または牽引力の測定の将来的な利用可能性を示している反面、それには制限がある。ニュートン液滴は生細胞の力学モデルとして使用されているが、懸濁細胞に主に使用され、ここでは過度に簡略化されており、その仮定は細胞とセンサの間に弱い相互作用がある場合にのみ成立し、質量効果への影響も同様である。実際には、上記研究者が使用している細胞数は６０,０００個であり、この場合、細胞−細胞間の作用が強い細胞単層を形成するため、細胞とセンサの相互作用は弱い。さらに、単一ＡＴカットの場合は、細胞の表面応力の方向も決定できない。ＢＴカット水晶はまだ生細胞の研究に適用されておらず、本発明では、ＡＴカットとＢＴカットの２種の異なる配向を有する結晶を用いて、細胞接着過程および後続の薬物などの作用下で細胞が水晶に印加した表面応力（収縮または牽引力）の大きさと方向（圧縮または引張応力）をリアルタイムで定量的に測定することを初めて提案した。他の要因の影響がない場合、これら２種の配向を有する結晶では、応力の変化は大きさが同じで符号が逆である周波数シフトを引き起こす。特に、同じ周波数および表面粗さを有し、同じ表面分子が同じ方式によって表面に修飾されるＡＴカットとＢＴカット結晶は、質量および粘弾性に対して同じ感受性を有するはずである。したがって、細胞接着過程におけるいずれの時点においても、結晶が受ける表面応力または細胞牽引力は、常に下式によって正確に測定できる。
【００１８】
ΔＳｔ＝（ＫＡＴ−ＫＢＴ）−１［ｔｑＡＴΔｆｔＡＴ／ｆｒＡＴ−ｔｑＢＴΔｆｔＢＴ／ｆｒＢＴ］      （１）
式中、ＫＡＴ＝２．７５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１、ＫＢＴ＝−２．６５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１はそれぞれ、ＡＴカット水晶とＢＴカット水晶の応力係数、ｆｒＡＴはＡＴカット水晶の共振周波数、ｆｒＢＴはＢＴカット水晶の共振周波数、ｔｑＡＴはＡＴカット水晶の厚さ、ｔｑＢＴはＢＴカット水晶の厚さであり、すべて定数である。したがって、接着過程または薬物の作用下で細胞が結晶に印加した表面応力または牽引力は、ＡＴカット、ＢＴカット結晶のそれらの基準点（培地中の安定値または薬物添加前の安定性など）に対する任意の時間ｔにおける周波数シフトΔｆｔＡＴおよびΔｆｔＢＴ（Ｈｚ）に基づいて、式（１）によって定量的に測定され得る。水晶周波数はデジタル信号であり、周波数計数装置またはＱＣＭ特殊機器によって容易かつ連続的に採集して測定することができる。
【００１９】
９ＭＨｚ  ＡＴカットおよびＢＴカット結晶の場合、ｆｒＡＴ＝ｆｒＢＴ＝９ＭＨｚ＝９×１０６Ｈｚ、ｔｑＡＴ＝０．０１８５ｃｍ、ｔｑＢＴ＝０．０２８３ｃｍ。
このように、（１）式は以下のように簡素化される。
ΔＳｔ＝２．０５８×１０４（０．０１８５ΔｆｔＡＴ−０．０２８２ΔｆｔＢＴ）      （２）
【００２０】
求められた表面応力ΔＳｔの単位は、ｄｙｎ／ｃｍである。ΔＳｔが負の数の場合、細胞自体が圧縮応力を受けて、細胞が収縮状態にあり、それに対応して細胞外マトリックスが等しい大きさで反対方向の引張応力を受けていることを示す。ΔＳｔが正の数の場合、細胞自体が引張応力を受けて、細胞が広がり状態にあり、それに対応して細胞外マトリックスが等しい大きさで反対方向の圧縮応力、すなわち、いわゆる細胞収縮力を受けている。
【００２１】
本発明のコア内容は、ＡＴおよびＢＴカット二重共振水晶微量天秤技術を用いて、細胞牽引力を定量的に測定することを初めて提案し実施した。二重共振器技術の表面応力測定への使用は、Ｅｒｒｏｌ  Ｐ．ＥｅｒＮｉｓｓｅによって初めて提案され、本発明で使用される式もＥｅｒＮｉｓｓｅの成果に基づいているが、我々の研究対象は、ＥｅｒＮｉｓｓｅが対象とする質量および表面応力以外の粘弾性を有する細胞である。同じ周波数のＡＴカット水晶とＢＴカット水晶は溶液粘度と密度に対する応答ルールが同じであると考えられ、且つこの考えは異なる重量百分率濃度を有するスクロース水溶液を用いた実験によって確認されたため、同じ周波数の２種類のカットは（細胞）粘弾性に対する応答ルールが同じである。このため、本発明の式を用いて細胞牽引力を定量的に計算できる。式中のＫＡＴ、ＫＢＴはそれぞれ所定の結晶配向のＡＴ、ＢＴカット水晶の応力係数であり、定数である。２種類のカットの厚さと周波数との間の関係はそれぞれの周波数定数Ｎによって決まる。ＡＴカット水晶とＢＴカット水晶の周波数定数はそれぞれＮＡＴ＝１．６６１ＭＨｚ・ｍｍ＝０．１６６１ＭＨｚ・ｃｍおよびＮＢＴ＝２．５３６ＭＨｚ・ｍｍ＝０．２５３６ＭＨｚ・ｃｍである。したがって、共振周波数ｆｒが決定された水晶については、その厚さｔｑは決定しており、具体的には、ｔｑＡＴ＝０．１６６１／ｆｒＡＴ；ｔｑＢＴ＝０．２５３６／ｆｒＢＴである。したがって、この水晶の周波数が高いほど、ウエハが薄くなる。薄すぎると、結晶ウエハが脆くなり、加工性やハンドリング性が劣化するので、ＡＴおよびＢＴカット水晶の基本周波数の上限はそれぞれ４０ＭＨｚおよび６０ＭＨｚに制限される。しかし、次の２つの方法で水晶の動作周波数を大幅に向上させることができる。１）水晶ウエハの中央部でイオンスパッタリングなどの技術によりウエハを所望の周波数の厚さまでエッチングし、次いでエッチング部分のみに金属電極をめっきして、水晶の振動を薄いエネルギー制限領域に制限する。２）倍音モードでの動作、すなわち、水晶は基本周波数で動作できる以外、３、５、７、９、１１などの倍音回数でも動作できる。これら２つの方法を通して、従来の技術は、水晶の動作周波数を約４００ＭＨｚ程度に高めることができる。ＡＴおよびＢＴカット水晶の動作周波数の下限は、約０．５ＭＨｚ程度である。したがって、現在、細胞牽引力測定に利用可能なＡＴおよびＢＴカット水晶の動作周波数範囲は０．５〜４００ＭＨｚに達し、対応したＡＴおよびＢＴカット水晶の厚さ範囲はそれぞれ５．５μｍ〜３．３ｍｍおよび６．３μｍ〜５．１ｍｍである。
【００２２】
ΔＳによるＡＴカットおよびＢＴカット結晶の周波数の変化は以下のとおりである。
【００２３】
Δｆ，ｓＡＴ＝ｆｒ，ｓＡＴ−ｆｒＡＴ＝ｆｒＡＴＫＡＴΔＳ／ｔｑＡＴ＝ＫＡＴｆｒ２，ＡＴΔＳ／ＮＡＴ      （３）
【００２４】
Δｆ，ｓＢＴ＝ｆｒ，ｓＢＴ−ｆｒＢＴ＝ｆｒＢＴＫＢＴΔＳ／ｔｑＢＴ＝ＫＢＴｆｒ２，ＢＴΔＳ／ＮＢＴ      （４）
【００２５】
上記の２つの式中、ｆｒ，ｓは応力状態での水晶共振周波数、Ｋ、ＮおよびｆｒはそれぞれＡＴまたはＢＴカット水晶の応力係数、周波数定数、共振周波数である。したがって、応力によって引き起こされる周波数変化は結晶の動作共振周波数の２乗に比例する。上記の２つの式から、同じ細胞牽引力下で、３００ＭＨｚで引き起こされる周波数変化は、９ＭＨｚの場合の１１１１倍であると推定できる。９ＭＨｚ水晶は１，０００〜５，０００個と少ない細胞とそれら細胞の牽引力を検出することができるので、３００ＭＨｚ水晶は単一細胞とそれらの牽引力の変化を検出することが期待できる。さらに、このような超高周波の二重共振器センシング技術は、分子間相互作用（ポリマー重合や解重合など）のプロセスに伴う力の動的変化のモニタリングに使用することも期待される。水晶の動作周波数の下限は０．５ＭＨｚであるので、本発明の技術は組織（血管など）、器官（心臓、胚など）、さらには小動物や植物にまで普及させることができる。したがって、本技術は、分子から単細胞、細胞集団、組織および器官、さらには小生物まで、異なるレベルで発生する力の動的モニタリングに使用することが期待できる。
【発明の効果】
【００２６】
従来技術と比較して、本発明の有益な効果は以下の通りである。
【００２７】
１）該方法は、細胞接着過程および薬物などの作用下での細胞牽引力をリアルタイムで連続的かつ動的に測定することができ、光学顕微鏡を使用せずに、高周波ＡＴおよびＢＴカット水晶の周波数のモニタリングに基づいて、デジタル周波数信号を測定するため、サンプリング速度が速い（データセットごとに０．１秒まで）。該技術は非破壊的であるとともに、培養皿の構造に合わせてＣＯ２インキュベーターにセットして長期間のモニタリングを行うことができるため、細胞の移動、増殖および分化などの細胞機能に伴う細胞牽引力の連続的かつ長期間のモニタリングが実現できる。提案された方法の速い応答時間、サンプリング速度および連続的、動的および長期間のモニタリング能力は、既存の細胞牽引力方法では達成不可能である。
【００２８】
２）該方法は、異なる細胞数（たとえば、１００〜６００００個）または異なる細胞表面密度での細胞の総牽引力の大きさおよび方向の定量的測定に使用できる。結晶周波数の増加および／または細胞パターニングの使用によって、測定対象となる細胞の数をさらに減らし、さらに単細胞の測定が達成できる。すなわち、本発明は、単一細胞から細胞単層まで、牽引力の定量的測定を達成することが期待される。
【００２９】
３）動物接着細胞は、それらに隣接する細胞と相互に作用するだけでなく、細胞外マトリックスと互いに接触して作用する。本発明の技術の他の特徴は、センサ表面に異なる細胞外マトリックス成分および細胞接着分子を修飾してそれらの表面密度を変えることにより、細胞牽引力に対する影響を定量的に調べ、細胞機能および挙動と相関させることができることにある。さらに、光透過性センサ電極および蛍光標識フォーカルアドヒージョンタンパク質を使用することによって、センサによって測定された細胞牽引力を細胞形態（拡張程度）およびフォーカルアドヒージョン構造と相関させることができる。細胞牽引力は、主にフォーカルアドヒージョンを介して細胞外マトリックスに印加され、フォーカルアドヒージョンにおける豊富なシグナルタンパク質分子はまた、感知された細胞外微小環境における物理的および化学的情報を細胞内部に伝達して、一連の細胞内生化学反応を誘発させ、細胞の機能や挙動に重要な影響を与える（たとえば、細胞骨格構造の変化、遺伝子発現の変化、アポトーシスなど）。したがって、本発明は、細胞の力感受性をさらに定量的に研究したり、細胞の生物学分野に適用するために、効果的な新規手段を提供する。
【００３０】
４）本発明は、ハイスループット細胞牽引力の測定にさらに応用でき、たとえば、異なる周波数のＡＴおよびＢＴカット水晶ウエハの外周を軟質接着剤によって不活性ガラスまたはプラスチックの有孔基板に接着し、異なるスループットを有する音波抵抗性圧電式結合共振チップを製造する。このようなハイスループット音波抵抗性圧電式結合共振チップは、細胞アクトミオシンの収縮力などに影響を与える薬物のスクリーニングと評価に特に適している。
【００３１】
前記のとおり、本発明は、基板変形に基づく測定原理とは異なり、細胞力に対して高感受性を有するセンサ技術を直接用いるものであり、細胞牽引力の大きさおよび方向が、センサに加えられた表面応力によるセンサ出力信号の変化によって直接測定されるため、光学顕微鏡による写真撮影も蛍光標識マイクロビーズの使用も必要としない。本発明は、異なる細胞数または異なる細胞−細胞間相互作用下での細胞集団の総牽引力の大きさおよび方向の定量的測定に適用できる。本発明のセンシング技術は、非破壊的であり、異なる細胞外マトリックス下での細胞接着過程、その後の薬物などの外部刺激、および細胞移動、成長および分化などの過程における、細胞牽引力をリアルタイムで連続的かつ動的に測定できる。本発明で使用されるセンサは、細胞生物学および薬物スクリーニングなどの広範な分野に普及できるように、従来の細胞培養皿の底部に配置されて、共通の培養皿（異なるスループットを有するマルチウェルプレートを含む）の構造に合わせて使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】細胞構造−力学およびＱＣＭ音波検出の概略図である。
【図２】細胞牽引力試験に用いられる２種の構成を示す。
【図３】細胞牽引力、細胞形態、およびフォーカルアドヒージョンの情報を同時に測定するための２種の構成である。
【図４】実施例における２０，０００個のＨ９Ｃ２ラット心筋細胞（一番目の矢印にて添加）の、ＡＴカットとＢＴカットの両方の裸金電極への接着状態、および、陽性変力薬であるイソプレナリン１２５ｎＭと陰性変力薬であるベラパミル２５ｎＭの作用下（二番目の矢印にて最終濃度で添加）での動的ＱＣＭ接着および力応答の曲線を示す。（Ａ）は、接着およびイソプレナリン作用下での周波数シフトと動的抵抗変化の曲線（ＡＴカット）を示し；（Ｂ）は、接着およびイソプレナリン作用下での周波数シフトと動的抵抗変化の曲線（ＢＴカット）を示し；（Ｃ）は接着およびベラパミル作用下での周波数シフトと動的抵抗変化の曲線（ＡＴカット）を示し；（Ｄ）は、接着およびベラパミル作用下での周波数シフトと動的抵抗変化の曲線（ＢＴカット）を示し；（Ｅ）は、接着およびイソプレナリン作用下での動的細胞牽引力の変化曲線を示し；（Ｆ）は、接着およびベラパミル作用下での動的細胞牽引力の変化曲線を示す。
【図５】実施例における２０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞の、異なるＫＲＧＤ濃度で修飾された９ＭＨｚ  ＡＴおよびＢＴカット水晶金電極への接着過程におけるＱＣＭ周波数シフト、動的抵抗変化および牽引力動的応答曲線を示す。（Ａ）は、接着過程におけるＲＧＤ修飾ＡＴカット結晶での周波数シフト応答を示し；（Ｂ）は、接着過程におけるＲＧＤ修飾ＢＴカット結晶での周波数シフト応答を示し；（Ｃ）は、接着過程におけるＲＧＤ修飾ＡＴカット結晶での動的抵抗変化を示し；（Ｄ）は、接着過程におけるＲＧＤ修飾ＢＴカット結晶での動的抵抗変化を示し；（Ｅ）は、接着過程におけるＲＧＤ修飾結晶での細胞牽引力の動的変化を示す。
【図６】実施例における２０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞の、異なるフィブロネクチン濃度で修飾された９ＭＨｚ  ＡＴカットおよびＢＴカット水晶金電極への接着過程におけるＱＣＭ周波数シフト、動的抵抗変化および牽引力の動的応答曲線を示す。（Ａ）は、接着過程におけるフィブロネクチン修飾ＡＴカット結晶での周波数シフト応答を示し；（Ｂ）は、接着過程におけるフィブロネクチン修飾ＡＴカット結晶での周波数シフト応答を示し；（Ｃ）は、接着過程におけるフィブロネクチン修飾ＡＴカット結晶での動的抵抗変化を示し；（Ｄ）は、接着過程におけるフィブロネクチン修飾ＢＴカット結晶での動的抵抗変化を示し；（Ｅ）は、接着過程におけるフィブロネクチン修飾結晶での細胞牽引力の動的変化を示す。
【図７】実施例における２０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞の、５０μｇ／ｍＬのＫＲＧＤの濃度で修飾された９ＭＨｚ  ＡＴカットおよびＢＴカット水晶金電極への接着過程における、および、１．２２μＭブレビスタチン薬物作用下でのＱＣＭ周波数シフト、動的抵抗変化および細胞牽引力の動的応答曲線を示す。（Ａ）は、ＡＴカット結晶での周波数シフトと動的抵抗応答を示し；（Ｂ）は、ＢＴカット結晶での周波数シフトと動的抵抗応答を示し；（Ｃ）は、細胞牽引力の動的変化を示す。
【図８】実施例における２０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞の、２０μｇ／ｍＬフィブロネクチン濃度で修飾された９ＭＨｚ  ＡＴカットおよびＢＴカット水晶金電極への接着過程における、および、０．５μＭノコダゾール作用下でのＱＣＭ周波数シフト、動的抵抗変化および細胞牽引力の動的応答曲線を示す。（Ａ）は、ＡＴカット結晶での周波数シフトと動的抵抗応答を示し；（Ｂ）は、ＢＴカット結晶での周波数シフトと動的抵抗応答を示し；（Ｃ）は、細胞牽引力の動的変化を示す。
【図９】実施例における２０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞（一番目の矢印にて添加）のＡＴカットおよびＢＴカット裸金電極の両方への接着、および、０．１単位／ｍＬの血管内皮バリア機能阻害薬であるトロンビンと０．５μＭ内皮バリア機能保護薬であるＹ−２７６３２の作用下（二番目の矢印にて最終濃度で添加）での動的ＱＣＭ接着および力反応曲線を示す。（Ａ）は、接着およびトロンビン作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＡＴカット）を示し；（Ｂ）は、接着およびトロンビン作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＢＴカット）を示し；（Ｃ）は、接着およびＹ−２７６３２の作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＡＴカット）を示し；（Ｄ）は、接着およびＹ−２７６３２の作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＢＴカット）を示し；（Ｅ）は、接着およびトロンビン作用下での動的細胞牽引力の変化曲線を示し；（Ｆ）は、接着およびＹ−２７６３２の作用下での動的細胞牽引力の変化曲線を示す。
【図１０】実施例における５０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞の、ＡＴカットおよびＢＴカットの２種の裸金電極への接着、および、異なる濃度のＥＧＴＡの作用下（二番目の矢印にて最終濃度で添加）での動的ＱＣＭ接着および力応答曲線を示す。（Ａ）は、接着および１ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＡＴカット）を示し；（Ｂ）は、接着および１ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＢＴカット）を示し；（Ｃ）は、接着および１０ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＡＴカット）を示し；（Ｄ）は、接着および１０ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＢＴカット）を示し；（Ｅ）は、接着および５０ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＡＴカット）を示し；（Ｆ）は、接着および５０ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での周波数シフトおよび動的抵抗変化曲線（ＢＴカット）を示し；（Ｇ）は、接着および１ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での動的細胞牽引力の変化曲線を示し；（Ｈ）は、接着および１０ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での動的細胞牽引力の変化曲線を示し；（Ｉ）は、接着および５０ｍＭ  ＥＧＴＡの作用下での動的細胞牽引力の変化曲線を示し；（Ｊ）は、異なるＥＧＴＡ濃度の作用下での動的細胞牽引力の変化曲線の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
図２は、ＡＴカットおよびＢＴカット二重共振技術を用いた細胞牽引力の定量的測定の２種の構成である。図２Ａ中、ＡＴカットとＢＴカット結晶は異なる２つの培養皿または検出セル内にあり、この場合、ＡＴカットとＢＴカット結晶は同じ周波数および表面形態を有し、および／または同じ表面接着分子が修飾されており、同じ数および同じ質量の同一バッチの細胞を２つのセルに添加した後、２つの結晶の周波数変化をリアルタイムで検出後、式（１）によって細胞の牽引力を定量的に測定することができる。図２Ｂ中、ＡＴカットとＢＴカット結晶は同一培養皿または検出セルにあり、同様に、２つの結晶の周波数と表面形態が一致し、および／または同じ表面接着分子が修飾されていることが要求され、一定数の細胞をセルに添加した後、２つの結晶の周波数変化をリアルタイムで検出後、式（１）によって細胞の牽引力を定量的に測定することができる。細胞牽引力の測定は顕微鏡を必要としないので、水晶の表面に被覆された金属電極および修飾分子と材料は透明である必要はなく、任意の材料としてもよく、これは該方法の別の利点である。具体的には、水晶表面は、細胞と生体適合性を有する金属金または非金属ＳｉＯ２などで被覆され得る。
【００３４】
好ましくは、細胞牽引力の変化に伴う細胞形態やフォーカルアドヒージョンなどの動的情報を得るために、ＱＣＭ結晶を光学顕微鏡または蛍光顕微鏡と組み合わせて使用することができる。このような場合、ＩＴＯ電極などの透光性ＱＣＭ電極を用いる必要があり、同様に、図３Ａおよび図３Ｂに示すように、２つの異なる構成を用いてもよい。
【００３５】
前記細胞牽引力のリアルタイム定量的測定方法は、
同じ周波数、表面形態を有する、および／または同じ表面接着分子が修飾されているＡＴカット水晶とＢＴカット水晶を培養皿または検出セルに入れるステップ（１）と、
試験対象細胞を培養皿または検出セルに加え、次式により細胞牽引力ΔＳを求めるステップ（２）とを備える。
ΔＳｔ＝（ＫＡＴ−ＫＢＴ）−１［ｔｑＡＴΔｆｔＡＴ／ｆｒＡＴ−ｔｑＢＴΔｆｔＢＴ／ｆｒＢＴ］  
式中、ΔＳｔは、接着時間ｔにおける細胞の牽引力であり、ＫＡＴ＝２．７５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１、ＫＢＴ＝−２．６５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１はそれぞれ所定の結晶配向を有するＡＴおよびＢＴカット水晶の応力係数、ｆｒＡＴおよびｆｒＢＴはＡＴカットおよびＢＴカット水晶の共振周波数、ｔｑＡＴおよびｔｑＢＴはそれぞれＡＴカットおよびＢＴカット水晶の厚さであり、すべて定数である。ΔｆｔＡＴ、ΔｆｔＢＴはそれぞれ、ＡＴカット、ＢＴカット水晶の基準点（培地中の安定値）に対する任意の時間ｔにおける周波数シフトである。
【００３６】
細胞牽引力の二重共振技術の実験
【００３７】
裸金電極ＡＴおよびＢＴカット水晶による細胞牽引力測定のステップは以下の通りである。
【００３８】
１）１滴のＰｉｒａｎｈａ溶液（８０℃１：３（ｖ：ｖ）３０％Ｈ２Ｏ２：Ｈ２ＳＯ４）を水晶金電極の中央に滴下して約３０秒間処理し、次いで蒸留水ですすぎ、窒素ガスで乾燥させ、この手順を３回繰り返した。
【００３９】
２）結晶をテフロンウェル型セルに組み立てた。
【００４０】
３）セルを蒸留水で２回洗浄した後、約３００μＬの滅菌水を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れた。
【００４１】
４）８チャネルＱＣＭ機器ＱＣＡ９２２に結晶共振周波数と動的抵抗の出力があることを確認してから、検出セルを順番に接続して、各検出セル（２つのＡＴカット、２つのＢＴカット結晶検出セルなど）がすべて作動することを確認して、ソフトウェアを起動してデータ収集を開始した。
【００４２】
５）各チャネルに対応したデータが安定した後、滅菌水を取り除いて、次いで滅菌水で２回洗浄した後、ＰＢＳで洗浄した。次いでウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地５２μＬを添加して、ＱＣＭ共振周波数（ｆ）および動的抵抗（Ｒ）のデータを２時間収集し、さらに、所定量（たとえば２０，０００個）のＨ９Ｃ２ラット心筋細胞またはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を含有する培地２５０μＬを添加した後、ｆおよびＲデータを約２０時間連続して収集した。異なる時間での各チャネルの細胞接着によって引き起こされるＱＣＭ相対周波数シフトΔｆおよび動的抵抗変化ΔＲは、該チャネルの時間（ｔ）におけるＱＣＭ応答値から培地中の対応した安定値を差し引くことによって求められた。
【００４３】
６）実験終了後、培地を収集して、ＰＢＳで軽く洗浄し、トリプシンを加えて消化処理し、収集した画分中の細胞をサイトメーターで測定した。
【００４４】
７）細胞接着過程における細胞牽引力の動的変化ΔＳは、ペアとなるＡＴおよびＢＴカット水晶の時間ｔにおける周波数シフトΔｆｔＡＴおよびΔｆｔＢＴから以下の式によって定量的に測定することができる。
ΔＳｔ＝（ＫＡＴ−ＫＢＴ）−１［ｔｑＡＴΔｆｔＡＴ／ｆｒＡＴ−ｔｑＢＴΔｆｔＢＴ／ｆｒＢＴ］      （１）
式中、ΔＳｔは、接着時間ｔにおける細胞の牽引力であり、ＫＡＴ＝２．７５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１、ＫＢＴ＝−２．６５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１はそれぞれ所定の結晶配向を有するＡＴカットとＢＴカット水晶の応力係数であり、定数である。ｆｒＡＴおよびｆｒＢＴはそれぞれＡＴカットおよびＢＴカット水晶の共振周波数、ｔｑＡＴおよびｔｑＢＴはそれぞれＡＴカットおよびＢＴカット水晶の厚さであり、すべて定数である。したがって、細胞が接着過程または薬物の作用下で結晶に印加した表面応力または牽引力は、ＡＴカット、ＢＴカット結晶のそれらの基準点（培地中の安定値または薬物添加前の安定値など）に対する周波数シフトΔｆｔＡＴおよびΔｆｔＢＴ（単位Ｈｚ）に基づいて式（１）によって定量的に測定できる。水晶周波数はデジタル信号であり、周波数計数装置またはＱＣＭ特殊機器によって容易かつ連続的に収集して測定することができる。本発明の実験で使用された結晶の周波数は９ＭＨｚであり、その場合、ｔｑＡＴ＝０．０１８５ｃｍ、ｔｑＢＴ＝０．０２８２ｃｍであった。したがって、式（１）は、以下のように簡素化される。
ΔＳｔ＝２．０５８×１０４（０．０１８５ΔｆｔＡＴ−０．０２８２ΔｆｔＢＴ）      （２）
【００４５】
特異的細胞接着分子ＲＧＤおよびフィブロネクチンが修飾されているＡＴおよびＢＴカット水晶による細胞牽引力測定のステップは以下の通りである。
【００４６】
１）無水エタノール、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅで洗浄して、窒素ガスを吹き付けてＡＴ、ＢＴカット９ＭＨｚ結晶を乾燥させた。
【００４７】
２）１滴のＰｉｒａｎｈａ溶液（８０℃１：３（ｖ：ｖ）３０％Ｈ２Ｏ２：Ｈ２ＳＯ４）を水晶金電極に滴下して３０秒間処理し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水、無水エタノールで洗浄し、窒素ガスを吹き付けて乾燥させ、これを３回繰り返した。無水エタノールを電極上に滴下して数分間放置し、滅菌水ですすぎ、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００４８】
３）表面処理されたＡＴおよびＢＴカット水晶をテフロンウェル型セルに取り付けた。
【００４９】
４）２０ｍＭ  ３−メルカプトプロピオン酸と１ｍＭトリエチレングリコールモノ−１１−メルカプトウンデシルエーテルの混合無水エタノール溶液を室温でセルに添加して、暗所で一晩放置した。
【００５０】
５）溶液を取り出して、滅菌水で洗浄した後、１５０ｍＭ  ＥＤＣと３０ｍＭ  ＮＨＳを溶解させたＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝５．５）を加えて約３０分間静置した。
【００５１】
６）溶液を取り出して、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝５．５）、滅菌水ですすぎ、異なる濃度のＫＲＧＤまたはフィブロネクチンのＰＢＳ溶液を加えて、１〜２時間（ＲＧＤＫ）または一晩（フィブロネクチン）静置して反応させた。
【００５２】
７）溶液を取り出して、滅菌ＰＢＳ、滅菌水ですすいで、ＫＲＧＤまたはフィブロネクチン修飾金電極を得た。２０，０００個のＨＵＶＥＣｓまたはＨ９Ｃ２細胞を加えて、ＱＣＭをオンにしてモニタリングした。
【００５３】
８）実験終了後、培地を回収して、ＰＢＳで軽く洗浄し、トリプシンを加えて処理し、収集した画分中の細胞をサイトメーターで測定した。
【００５４】
９）細胞接着過程における細胞牽引力の動的変化ΔＳは、同じ濃度のＲＧＤまたはフィブロネクチンが修飾されたＡＴおよびＢＴカット水晶の時間ｔにおける周波数シフトΔｆｔＡＴおよびΔｆｔＢＴから定量的に測定できる。
【００５５】
心血管アゴニストであるイソプレナリンｉｓｏｐｒｅｎａｌｉｎｅ（ＩＳＯ）と阻害薬であるベラパミルｖｅｒａｐａｍｉｌ（ＶＲＰ）によるＨ９Ｃ２ラット心筋細胞牽引力への影響
【００５６】
４つのテフロンウェル型セル、２つの同一の９ＭＨｚ  ＡＴカットおよび２つの同一の９ＭＨｚＢＴカット金電極被覆結晶を取り、前述の裸金電極ＡＴおよびＢＴカット水晶による細胞牽引力の測定ステップのように、４つのセルに２０，０００個のＨ９Ｃ２細胞を別々に加えて２０時間培養した後、４つのセルから５μＬの培養液を取り出し、５μＬの１０μＭＩＳＯ（最終濃度１２５ｎＭ）と５μＬの２μＭＶＲＰ（最終濃度２５ｎＭ）を２つのＡＴおよびＢＴ結晶検出セルにそれぞれ加えて、２０時間モニタリングし続け、データを収集した。
【００５７】
血管内皮バリア機能阻害薬であるトロンビンと保護薬であるＹ‐２７６３２によるヒト臍静脈内皮細胞の牽引力への影響の実験ステップ
【００５８】
４つのテフロンウェル型セル、２つの同一の９ＭＨｚ  ＡＴカットおよび２つの同一の９ＭＨｚＢＴカット金電極被覆結晶を取り、前述の裸金電極ＡＴおよびＢＴカット水晶による細胞牽引力の測定ステップのように、４つのステップにＤＭＥＭ培地３００μＬを別々に加えて、データを約２時間収集し、さらに２０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞を含む培地３００μＬをそれぞれ加えた後、データを２４時間収集したときに薬物トロンビンとＹ−２７６３２を最終濃度になるまで約２４時間かけて添加し、約２４時間データ収集を続けた。
【００５９】
ブレブビスタチンおよびノコダゾール薬物の検証試験ステップは以下の通りである。
【００６０】
前記ＲＧＤ修飾フィブロネクチンとＡＴおよびＢＴカット水晶による細胞牽引力の定量的測定のステップのように、５０μｇ／ｍＬ濃度のＫＲＧＤおよび２０μｇ／ｍＬ濃度のフィブロネクチンを用いて９ＭＨｚ  ＡＴおよびＢＴ結晶を修飾した後、２０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞を加えて、接着過程についてＱＣＭ検出を約１７時間行い、次に、最終濃度１．２２μＭのブレビスタチンまたは０．５μＭのノコダゾールをＡＴおよびＢＴカット結晶検出セルに添加して、モニタリングを約１０または５時間続け、データを収集し細胞接着過程およびブレビスタチンとノコダゾール薬物の作用下での細胞牽引力の変化を求めた。
【００６１】
異なる濃度のＥＧＴＡによるヒト臍静脈内皮細胞の牽引力への影響の実験ステップ
【００６２】
前述の裸金電極ＡＴおよびＢＴカット水晶を用いた細胞牽引力測定のステップのように、９ＭＨｚ  ＡＴおよびＢＴカット金電極被覆結晶を洗浄して、テフロンウェル型セルに組み立てた。無血清ＤＭＥＭ培地４００μＬを４つのセルそれぞれに加えて、データを約２時間収集し、次に５０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞を含む培地２００μＬを添加した後、データを約２〜１５時間収集したときにＰＢＳに溶解させたＥＧＴＡを、最終濃度が１ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭになるまで加えて、データ収集を約２〜１５時間続けた。
【００６３】
ラット心筋細胞の接着過程および心血管強心薬の作用下での細胞牽引力の動的変化
【００６４】
以下、９ＭＨｚ  ＡＴおよびＢＴカット水晶を用いて、ラット心筋Ｈ９Ｃ２細胞の、接着およびそれに続く陽性変力薬ＩＳＯおよび陰性変力薬ＶＲＰの作用下での動的ＱＣＭ応答を測定する場合を示し、結果を図４に示す。ここで、裸金電極は、ＤＭＥＭ中の１０％ウシ胎児血清に含まれる付着因子を吸着することによって、Ｈ９Ｃ２細胞への非特異的付着を実現する。図４ＡおよびＢに示されるように、ＩＳＯを添加すると、ＱＣＭ上の２つの裸金電極ＡＴカット、ＢＴカットでのｆ（周波数）がすべて低下して、Ｒ（動的抵抗）がすべて上昇する。陰性変力薬ＶＲＰの作用下での結果として、図４Ｃ、Ｄに示されるように、ＶＲＰを添加すると、ＱＣＭｆが上昇して、Ｒが低下する。この結果は、前記したＡＴカットに関する細胞接着実験および薬物実験の傾向と一致している。さらに、細胞が細胞接着過程および薬物の作用下で水晶に印加した表面応力または牽引力のΔＳの動的変化（図４Ｅ、Ｆ参照）を、二重共振ＡＴおよびＢＴカットの周波数シフトから、式（２）により定量的に測定する。式（２）の結果から、ΔＳが負の数の場合、細胞自体が圧縮応力を受け（細胞が収縮するか、または陽性変力が作用する場合）、正の数の場合、細胞自体が引張応力を受ける（細胞が広がるか、または陰性変力が作用する場合）ことを示している。細胞への裸金電極の接着能力が限られるため、図４の結果は、ΔＳが０付近で変動することを示し、該実験条件下で細胞が裸金電極上にうまく広がらずに、ある程度収縮状態を保持することを示している。陽性変力薬ＩＳＯの作用下では、細胞収縮はより強くなり、細胞牽引力は減少し、負の方向へ変化する。陰性変力薬ＶＲＰの作用下では、細胞は弛緩して広がり、細胞の牽引力は増加し、正の方向へ変化する。
【００６５】
ヒト臍静脈内皮細胞のＫＲＧＤ修飾金電極への接着に伴う細胞牽引力の変化
【００６６】
９ＭＨｚ  ＡＴおよびＢＴカット水晶金電極に、異なる表面密度を有する細胞特異的接着ポリペプチドＲＧＤを異なるＫＲＧＤ濃度（０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）で修飾した後、２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地において２０，０００個のＨＵＶＥＣｓ細胞の接着段階におけるＱＣＭ周波数シフトの応答およびその細胞牽引力の動的変化を図５に示す。ＡＴカットおよびＢＴカットの周波数シフト応答曲線のいずれも、中程度のＫＲＧＤ濃度（５０μｇ／ｍＬ）で修飾した水晶による細胞への接着効果が最も高く、周波数シフトが最大であり（図５Ａおよび図５Ｂ）、動的抵抗変化も最大（図５Ｃおよび図５Ｄ）であることを示している。図５Ｅの結果は、細胞牽引力ΔＳが正の数であり、経時的に急速に増大して、約８時間でΔＳが極値になり、それ以降僅かに低下することを示す。それ故、細胞は、ＲＧＤ分子が修飾された表面上によく広がり、細胞自身が引張応力を受けて、ΔＳは正である。ＱＣＭ周波数シフト応答の結果と一致するように、５０μｇ／ｍＬのＫＲＧＤ濃度で修飾されたＲＧＤ表面が最大の細胞牽引力を発生させるので、該ＲＧＤの表面密度では、細胞はＲＧＤとの良好な相互作用を有し、円滑に広がることが可能である。裸金電極（０μｇ／ｍＬＲＧＤ濃度）では、センサの応答は最小である。より高い濃度（７５μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ）のＲＧＤで修飾された表面上で細胞によって生成されたＱＣＭ応答は中間値であり、これは、高ＲＧＤ濃度では、細胞とセンサとの相互作用が、ＲＧＤの配向が立体障害に影響されることにより、細胞への接着が最も良好である５０μｇ／ｍＬＲＧＤよりも、減衰したためである。
【００６７】
ヒト臍静脈内皮細胞のフィブロネクチン修飾金電極への接着に伴う細胞牽引力の変化
【００６８】
図６は、９ＭＨｚ  ＡＴおよびＢＴカット水晶金電極に、異なるフィブロネクチン（ＦＮ）濃度（０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ）で、異なる表面密度を有する細胞外マトリックスタンパク質ＦＮを修飾した後、２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地において２０，０００個のＨＵＶＥＣｓ細胞接着過程におけるＱＣＭ周波数シフト、動的抵抗応答およびその細胞牽引力の動的変化を示すとともに、裸金電極の結果を対照として示す。ＦＮ修飾なしの裸金電極上に２０，０００個のＨＵＶＥＣｓを付着させることによって引き起こされるＱＣＭ周波数シフトおよび動的抵抗変化が最小であることを示す。それは、この場合に細胞への接着が最も弱く、細胞が主に収縮状態でうまく広がることができず、細胞牽引力ΔＳが負の数であることを示している。しかし、接着時間が長くなるにつれて、電極表面が細胞接着に寄与する接着因子や細胞自身が分泌する細胞外マトリックス因子を吸着して、ΔＳが正の方向へ変化し、細胞は徐々に広がり、最終的にＦＮ濃度（１０μｇ／ｍＬ）で修飾された金電極での細胞牽引力の値に近くなる可能性がある。ＦＮが金電極に修飾された後、細胞牽引力ΔＳは正になり、このことから、細胞がうまく広がり、結晶に圧縮応力すなわち収縮牽引力を印加することが示されている。これら５つのＦＮ濃度で修飾された金電極の応答ΔＳを比較すると（図６Ｅ）、ΔＧは、ＲＧＤの場合、つまり、ほぼ中間濃度（２０μｇ／ｍＬ）では、最大かつ安定的であり、このときのＱＣＭ周波数シフトと動的抵抗応答も最大であることが示される。試験用の最低ＦＮ濃度（１０μｇ／ｍＬ）および最高ＦＮ濃度（５０μｇ／ｍＬ）では、細胞牽引力は近似かつ最小であり、それに対応したＱＣＭ周波数シフトおよび動的抵抗変化応答もまた最小であった。より高いＦＮ濃度（３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ）におけるＱＣＭ周波数シフトおよび動的抵抗変化応答は中間値にあり、それに対応したΔＳ応答は初期に最も速く増加したが、経時的に変動してある程度の減衰を示すので、最終的な安定値は中濃度（２０μｇ／ｍＬ）でのΔＳ値よりも低くなる。
【００６９】
ブレビスタチンおよびノコダゾール薬物の作用下での細胞牽引力の動的応答
【００７０】
確立された圧電細胞力検知法を検証するために、５０μｇ／ｍｌＲＧＤ濃度で修飾された水晶を用いて、ミオシンＩＩ阻害剤であるブレビスタチンの作用下でのＱＣＭ応答を調べた。図７は、ブレビスタチンの作用下で、細胞牽引力ΔＳが減少することを示す。ブレビスタチンは非筋肉ミオシンＩＩ型ＡＴＰアーゼ阻害剤であり、ここでの結果は文献におけるほかの方法において報告されたブレビスタチンが細胞牽引力を減少させるという結論と一致する。さらに、細胞の力学的性質に対する微小管阻害剤ノコダゾールの阻害効果も調べた結果、０．５μＭ  ノコダゾールの作用下で、細胞牽引力が初期は増加するが、次いで減少し始めたことを示している（図８）。細胞骨格内の剛性構造としての微小管は細胞に圧縮応力を印加するものであり、細胞に引張応力を印加する細胞骨格アクチンフィラメントとともに細胞の力のバランスを左右する。微小管阻害剤であるノコダゾールは、微小管を解重合することによって、細胞牽引力が初期に増加する。ノコダゾールの作用時間が増加するにつれて、細胞内の剛性微小管がさらに失われると、細胞収縮およびフォーカルアドヒージョンが減少し、その結果、細胞牽引力が減少する。これは、文献で細胞牽引力顕微鏡によって報告されている結果と一致する。
【００７１】
血管内皮バリア機能調節薬であるトロンビンとＹ‐２７６３２による細胞内牽引力への影響
【００７２】
図９は、血管内皮バリア阻害薬であるトロンビンおよび保護薬であるＹ−２７６３２がヒト臍帯静脈内皮細胞に作用することにより引き起こされる９ＭＨｚ  ＡＴおよびＢＴカット結晶の周波数、動的抵抗および細胞牽引力の変化曲線である。トロンビンの作用下で、結晶の周波数シフトが減少し、動的抵抗がわずかに増加することから、細胞接着が増強され、細胞牽引力が向上することを示していることが分かる。Ｙ−２７６３２の作用下では、結晶の周波数シフトが減少し、動的抵抗が減少することから、細胞接着が弱まり細胞牽引力が減少することを示していることが分かる。血管内皮バリア阻害試薬であるトロンビンは、細胞の牽引力を高めて細胞の透過性を高める細胞骨格収縮アゴニストである。血管内皮バリア保護試薬であるＹ−２７６３２は、逆の役割を果たすものであり、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤とともに細胞骨格弛緩剤として機能し、皮質ミオシンの活性に影響を及ぼし、細胞牽引力を減らし、透過性を維持する能力を持っている。二重共振ＱＣＭ技術によって測定された２つの試薬の結果は、それらの機能や文献に報告されている細胞牽引力の測定結果と一致している。
【００７３】
異なる濃度のＥＧＴＡによるヒト臍静脈内皮細胞牽引力への影響
【００７４】
図１０は、裸金９ＭＨｚ  ＡＴおよびＢＴカット水晶を用いた５０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞の接着、およびその後の異なる濃度のＥＧＴＡの作用下での動的ＱＣＭ応答を示している。５０，０００個のＨＵＶＥＣｓを添加した後、ＱＣＭ周波数が低下し、抵抗が上昇することがわかった。２４時間後、ＱＣＭ周波数は３００〜４００Ｈｚ低下したが、すべての実験において、初期段階を除き、同じ時点では、ＢＴカット結晶の周波数シフトの低下は常にそれとペアとなるＡＴカット結晶の周波数シフトよりも大きいので、接着過程において細胞が電極に印加された表面応力ΔＳは正であり、且つ細胞の広がりにつれてΔＳは急激に増加した後、安定的になる。２４時間後、ΔＳは１１５，０００〜１７５，０００ｄｙｎｅ／ｃｍに達した（図８Ｇ−Ｉ）。異なる濃度のＥＧＴＡを添加した後、全体的に細胞牽引力は減少傾向を示し、細胞はこの時点で脱着していることを示し、細胞形態学のシミュレーション実験から、ＥＧＴＡ濃度で５分間作用した後、細胞広がり面積が小さくなり、細胞が楕円形に引き込まれたことが観察された。１ｍＭの低ＥＧＴＡ濃度を除いて、ＥＧＴＡ時間の増加につれて細胞力はいずれも減少し、５０ｍＭ  ＥＧＴＡ下での細胞力の減少速度は１０ｍＭ  ＥＧＴＡ濃度での減少速度よりも有意に速かった。これは、ＥＧＴＡ濃度の増加につれて細胞接着面積の減少速度が速くなるという細胞形態学シミュレーションの結果と一致している。１ｍＭの低ＥＧＴＡ濃度の作用下では、初期段階の細胞牽引力は減少しなかったばかりか、わずかに増加し、それ以降、残りの濃度と一致する減少の傾向が現れた。細胞−マトリックスの相互作用を左右するインテグリンファミリーｉｎｔｅｇｒｉｎｓ、および細胞−細胞間の相互作用を左右するカドヘリンファミリーＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎｓはいずれもＣａ２＋濃度と密接に関連している。したがって、Ｃａ２＋とキレート化できるＥＧＴＡは、細胞−マトリックスと細胞−細胞間の動的接着および力のバランスに影響を与えることが予想できる。５００００個の内皮細胞の場合、細胞間の距離は小さく、そして強い細胞間作用力が示される。したがって、１ｍＭの低ＥＧＴＡ濃度では、ＥＧＴＡは主に細胞−細胞間に作用して細胞−細胞間の相互作用を減少させ、細胞−センサマトリックス間の細胞牽引力を増加させ、次に、細胞−マトリックスに作用して細胞牽引力を減少させると推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月5日(2017.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞牽引力のリアルタイム定量的測定方法であって、
同じ周波数、表面形態を有するおよび／または同じ表面接着分子が修飾されているＡＴカット水晶とＢＴカット水晶を培養皿または検出セルに入れるステップ（１）と、
試験対象細胞を培養皿または検出セルに加え、細胞の接着時間ｔにおける細胞牽引力ΔＳｔを次式により測定するステップ（２）とを備え、
ΔＳｔ＝（ＫＡＴ−ＫＢＴ）−１［ｔｑＡＴΔｆｔＡＴ／ｆｒＡＴ−ｔｑＢＴΔｆｔＢＴ／ｆｒＢＴ］      （１）
式（１）中、ＫＡＴ＝２．７５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１、ＫＢＴ＝−２．６５×１０−１２ｃｍ２ｄｙｎ−１はそれぞれ、ＡＴカット水晶とＢＴカット水晶の応力係数、ｆｒＡＴはＡＴカット水晶の共振周波数、ｆｒＢＴはＢＴカット水晶の共振周波数、ｔｑＡＴはＡＴカット水晶の厚さ、ｔｑＢＴはＢＴカット水晶の厚さであり、すべての数は定数であり、ΔｆｔＡＴ、ΔｆｔＢＴはそれぞれ、ＡＴカット水晶、ＢＴカット水晶のそれらの基準点に対する任意の時間ｔでの周波数シフトであり、
ΔＳｔが負の数の場合、細胞自体が圧縮応力を受けて、細胞が収縮状態にあり、それに対応して細胞外マトリックスが等しい大きさで反対方向の引張応力を受けていることを示し、ΔＳｔが正の数の場合、細胞自体が引張応力を受けて、細胞が拡張状態にあり、それに対応して細胞外マトリックスが等しい大きさで反対方向の圧縮応力を受けている、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞接着分子が、膜貫通タンパク質および力感受性分子インテグリンと相互作用することができる細胞外マトリックス分子、膜貫通タンパク質および力感受性分子インテグリンと相互作用することができる細胞外マトリックス生体模倣分子、細胞表面受容体と相互作用することができる分子、細胞表面に作用して細胞接着を促進できる分子を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膜貫通タンパク質および力感受性分子インテグリンと相互作用することができる前記細胞外マトリックス分子は、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンまたはコラーゲンであり、膜貫通タンパク質および力感受性分子インテグリンと相互作用することができる前記細胞外マトリックス生体模倣分子は、ＲＧＤ接着配列を含むポリペプチドであり、細胞表面受容体と相互作用することができる前記分子は細胞表面のカドヘリンと相互作用することができる分子、細胞表面に作用して細胞接着を促進できる前記分子はポリ−１−リジンである、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（２）の前記式において、細胞牽引力による結晶周波数変化と結晶作動周波数の二乗が比例し、すなわち、Δｆ，ｓＡＴ＝ＫＡＴｆｒ２ΔＳ／ＮＡＴ、Δｆ，ｓＢＴ＝ＫＢＴｆｒ２ΔＳ／ＮＢＴであり、ＮＡＴ＝１．６６１×１０５Ｈｚ・ｃｍ、ＮＢＴ＝２．５３６×１０５Ｈｚ・ｃｍはそれぞれ、ＡＴおよびＢＴカット結晶の周波数係数であり、水晶の作動周波数を変えることにより、単一細胞から細胞単層、さらに組織、器官の牽引力の定量的測定が可能になる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
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