【手続補正書】
【提出日】平成19年2月21日(2007.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  細胞に取り込まれる分子であって、該分子がインターカレート部分と結合している腫瘍探索バイオ分子を含んでおり、金属と複合体化しており、該金属が好ましくは放射性金属である分子の、腫瘍および悪性腫瘍の処置用および診断用の治療的組成物を製造するための使用。
【請求項２】  該バイオ分子が、ソマトスタチン-、ニューロテンシン-、ボンベシン-レセプター結合分子、抗体、ペントラチン(登録商標)、およびGPIIb/IIIaレセプター類に結合する分子からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】  該インターカレート部分が二本鎖DNAに対してインターカレートできる結合親和性を有する芳香族分子である、請求項１および請求項２に記載の使用。
【請求項４】  該インターカレート部分が、アクリジン、ポルフィリン、エリプチシン、フェナントロリン、カルバゾール、ベンゾイミダゾール、またはテトラサイクリン(アントラサイクリン)のクラスの既知の細胞分裂停止活性(抗生物質)を有する化合物、例えばダウノルビシン、エピルビシン、またはミキソキサントロンなど、からなる群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】  放射性金属がγ放射核種である、請求項１ないし請求項４に記載の使用。
【請求項６】  放射性金属が、Tc-99m、Re-186、Re-188およびMnからなる群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】  該分子が図２に示す一般構造式を有する、請求項１ないし請求項６に記載の使用。
【請求項８】  該分子が図１に示す構造の何れか１つを有する、請求項１ないし請求項７に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
この目的は、本発明により、３種の機能を組合せた分子の提供によって成し遂げられる。この分子は、腫瘍探索分子を含むものであり、それはインターカレート部分を結合しており、金属と複合体化する能力があり、該金属は好ましくは放射性金属である。この分子は、この腫瘍探索分子によって腫瘍を特異的に標的とし、そしてそれらの細胞に取込ませることができる。それから、このインターカレート部分はDNA鎖中に挿入され、そして切断を誘起させることができる。さらに、放射性金属もまたDNA鎖の切断をもたらし得る。これらの新規な分子の利点は、それらの分子が悪性細胞を特異的に指向し、そしてそれらの細胞に取り込まれることである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
腫瘍探索分子は好ましくは、バイオ分子、例えば腫瘍細胞に対して活発に標的化されるペプチドまたはタンパク質、である。これらのバイオ分子の例は、ソマトスタチン-、ニューロテンシン-、ボンベシン-レセプター結合分子、モノクローナル抗体、ペントラチン(登録商標)、および糖タンパク質、およびGPIIb/IIIaレセプターに結合する分子である。しかしながら本発明はこれらの例に限定されるものではなく、他の腫瘍探索物質にも同様に一般に適用できる。さらに、このカテゴリーは、核または核膜中へ輸送されることが知られている化合物を包含する。これらの例は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、増殖因子(デオキシウリジンのような)、および小分子(スペルミジンのような)である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
インターカレート部分は、好ましくは、二本鎖DNAに対してインターカレートできる結合親和性を有する芳香族分子である。このような芳香族化合物の例は、すなわちアクリジン、ポルフィリン、エリプチシン、フェナントロリン、カルバゾール、ベンズイミダゾールを含有する化合物、またはテトラサイクリン(アントラサイクリン)のクラスの、既知の細胞分裂停止活性を有する化合物(抗生物質)、例えばダウノルビシン、エピルビシンまたはミキソキサントロン(mixoxantrone)など、を含む化合物であり、そして[M(CO)3]+部分と配位する能力のあるリガンドにより官能化されている化合物である。このようなリガンドの例には、EP-879 606に記載されているものや、さらにポリアミノ-ポリカルボキシレート、ホスフェートまたはホスホネート、脂肪族または芳香族、または混合トリアミン類およびチオン類がある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
インターカレート機能および腫瘍探索機能は、時には分子中で組合せて存在している。インターカレート部分とペプチドを組合せているインターカレート剤の例は、アクチノマイシンおよびトリオスチンである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
この形態の薬剤用の賦形剤および希釈剤は当業者によく知られている。しかし、当該分子は安定性のためにある種の条件を必要とする。むしろ、賦形剤または希釈剤は、親水性、好ましくは有機性のものがよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
1.  インターカレーターと配位機能性を有する二機能リガンドの合成
二機能リガンドを図３に記載のストラテジーに従って調製した。図７は、以下に記載する反応の特定の反応スキームを示す。
【化１】
2002537360.tif 000001
2 -メチルキノリン (1)
2-メチルキノリン(1)をFlukaから購入し、さらに精製することなく使用した。
キノリン-2-カルボアルデヒド (2)
ジオキサン 50 mlおよび水 2 ml中、セレニウムジオキシド(49.5 mmol) 5.5 gの混合物を、10分以上かけて少量ずつ、ジオキサン 20 ml中 2-メチルキノリン(1) 4.4 g(30.7 mmol)の沸騰した溶液に加えた。6時間沸騰させた後、暖かい反応混合物を濾過した。濾液を蒸発留去し、ジクロロメタンに溶かし、そしてAloxに通して濾過した。溶媒を蒸発留去して得られた黄褐色固体生成物をジクロロメタンから再結晶した。収量：3.76 g (78%)
1H-NMR (DMSO):δ, 10.12s, 8.61d, 8.22d, 8.12d, 7.99d, 7.91t, 7.79t
化合物 3a
メタノール 15 ml中 キノリン-2-カルボアルデヒド(2) 500 mg(3.2 mmol)およびN-(2-アミノエチル)-アセトアミド 330mg(3.23 mmol)の混合物を室温で２時間撹拌した。得られた淡褐色固体生成物を次の反応にそのまま使用した。収量：〜770 mg(〜100％)
1H-NMR (CDC13):δ, 8.57s, 8.21d, 8.13d, 8.10d, 7.85d, 7,75t, 7. 59t
化合物 3b
エタノール 10 ml中 NaBH4 175 mg(4.62 mmol)の溶液を、エタノール 30 ml中 3a 500 mg(2.07mmol)の溶液に、0℃で２時間かけてゆっくり加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発留去した後に得られた固体物質を、3M Na2CO3溶液を用いて粉砕した。所望の淡褐色生成物(3b)をジクロロメタンで抽出した。収量：382 mg(76％)  1H-NMR (CDC13)：δ, 8.15d, 8.05d, 7.81d, 7.71t, 7.54t, 7.35d, 6.84br, 4.21s, 3.50q, 3.02t, 2.02s
化合物 3c
2N HCl 20 ml中 3b 200 mg(0.82 mmol)の溶液を、６時間還流した。溶媒を蒸発留去した後に得られた油状物をエタノールで洗浄し、所望の淡褐色固体塩酸塩 3cを得た。収量：203 mg(90%)
1H-NMR (D2O)：δ, 8.40d, 7.95t, 7.76t, 7.59t, 7.49d, 4.57s, 3.46t, 3.34t
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
実施例２
モデル系における、本発明の分子を用いる鎖切断
1. 序論
1.1 プラスミドの使用
99mTcを有するインターカレート複合体のDNA鎖切断を誘起する能力を検討する目的で、プラスミドをモデル系として使用した。電気泳動分析で二本鎖切断と一本鎖切断との間で差異を識別できるので、プラスミドは非常に適切である。さらに、細胞生物学的方法を使用して大量のプラスミドを非常に簡便に調製することができる。
プラスミドは環状の二本鎖DNA分子であり、二重らせん軸を高次らせんにドリルすることができる。高次らせんの形態をタイプＩとして記載する。このタイプは一本鎖切断によって高次らせん構造が緩まることができ、そして弛緩した環状DNA(タイプII)として存在する。しかしながら、直線型(タイプIII)のプラスミドの両方のタイプの二本鎖切断も起こり得る。図４に、これらの3種のDNAタイプの構造の例を示す。
これらの3種のDNAタイプは異なる構造を有するため、それらの大きさ、そして特にアガロースゲル上の電気泳動法での形態、によってよく分離することができる。検討する混合物(実験後のタイプI-III)を、アガロースゲル上に添加する。一定の電圧を適用すると、負に荷電したDNA-フラグメントがカソードの方へ移動するであろう。フラグメントの形態が大きい程、ゲルに沿っての移動は遅くなる。タイプIのDNA(最も小型)は、最も速く、タイプIIは最も遅い。ゲルを、ごく少量のエチジウムブロマイドを含む溶液中に入れる。DNAフラグメントを、インターカレーションによって、そして赤橙色蛍光(590 nm)を示す300 nmのUV光の照射によって、可視化することができる。この方法は非常に鋭敏であるため、バンド中5 ng未満のDNAを検出することができる。図５のゲルの写真記録で、移動方向は上から下である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
1.2 プラスミドの産生
2958塩基対の大きさを有するプラスミド Bluescript KSTM を、QIAGEN社の標準的な手順に従って調製した。通常、このプラスミドは高次らせん型(タイプ I)で存在する。制限酵素KpnIを用いて、プラスミドDNAの直線化型(タイプ III)を調製することができる。弛緩環状型のプラスミド(タイプ II)をもたらす一本鎖切断は、酵素DNAaseIで誘起することができる。図５中の右レーンは、これらの3種のタイプのDNAの混合物の、アガロースゲル上における電気泳動法を示す。電気泳動法のために、数種の大きさのDNA断片を有するマーカーを参照として使用した(左レーン)。
右レーンの3つのバンドで説明される様に、3種のタイプのDNAは明確に分離され、可視化の後、識別することができる。一本鎖または二本鎖切断が転換電子に起因するならば、この方法によって容易に検出することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
2. [99mTc(P1)(teta)(CO)3]の鎖切断を誘起する能力の検討
約0.3 mCi/mlの[99mTc(P1)(teta)(CO)3]溶液 5μ1およびタイプＩプラスミド(〜=3*10-5M/塩基対) 100 ngを18時間にわたって放置した。それからこの混合物と３つの参照の電気泳動を行なった(図６)。
測定溶液(レーン3)中のプラスミドは標準液よりゆっくり移動することが明らかに認識できる。この観測の理由は、プラスミドの構造の小さな変化は、おそらく、複合体の二本鎖へのインターカレーションによって誘起されることによる。プラスミドの三次構造の変化は、エチジウムブロマイドのインターカレーションをさらに良くし、このことは、サンプル溶液のバンドの強度の方が強いことを説明している。
さらに、ネガティブ参照液(レーン4)と比較すると、99mTc複合体で処理した溶液のレーンでは、１つまたは、多分２つの新たなバンドが現われた(矢印)ことが明らかである。これらの２つのバンドの強い方は、３つのタイプを含むレーン2中の標準液のバンド上のタイプIIの位置にほぼ相当する。これは、複合体が、プラスミド中で一本鎖切断を誘起したことを意味する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2002537360.tif 000002