(57)【要約】  本発明は、改良された特徴を有するＣＤ２０抗体に関する。いくつかの実施形態は、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」と結合し得る可変ドメインを含んでなる抗体であって、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＰＣＤ機能性を有する抗体を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域と、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ：
【化１】
2019530661.tif 000035
と結合し得る可変ドメインとを含んでなる抗体であって、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＰＣＤ機能性を有する、抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＳＮＳＹＧＳＴＹＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体。
【請求項３】
前記重鎖可変領域が、配列ＳＹＮＬＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＳＮＳＹＧＳＴＹＷＹＦＤＶをそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記重鎖可変領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１：
【化２】
2019530661.tif 000036
の配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記軽鎖可変領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号２：
【化３】
2019530661.tif 000037
の配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域と、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ：
【化４】
2019530661.tif 000038
と結合し得る可変ドメインとを含んでなる抗体であって、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＣＤＣおよび／または高いＡＤＣＣ機能性を有し、好ましくは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＳＡＹＹＧＳＮＶＷＦＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、抗体。
【請求項７】
マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
重鎖と軽鎖とを含んでなり、前記重鎖が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１の配列および配列番号３、４または５の配列を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記軽鎖が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号２の配列および配列番号６の配列を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
個体における疾患の治療において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
過剰なＢ細胞、過活動Ｂ細胞および／または機能不全Ｂ細胞が関与する疾患の治療において使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、および黒色腫などのＣＤ２０陽性腫瘍の治療において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
過剰なＢ細胞、過活動Ｂ細胞、および／または機能不全Ｂ細胞が関与する疾患を有する個体の治療のための方法であって、それを必要とする個体に請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含んでなる、方法。
【請求項１５】
ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、または黒色腫などのＣＤ２０陽性腫瘍を有する個体の治療のための方法であって、それを必要とする個体に請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、抗体の分野に関する。特に、本発明は、ＣＤ２０と結合する抗体に関する。本発明はさらに、医学的方法および検出方法におけるＣＤ２０抗体の使用に関する。本発明はさらに、抗体の生産のための細胞、核酸分子および方法に関する。
【０００２】
３種類のＣＤ２０  ｍＡｂが、種々のサブタイプの非ホジキンリンパ腫および白血病（ＮＨＬ）の治療のために承認されている。上市されている第１のｍＡｂであるリツキシマブ（ＲＴＸ）は、化学療法計画と組み合わせて与えた場合に、患者の生存を著しく改善した（１〜５）。オファツムマブ（ＯＦＡ）は、古典的補体経路を活性化するその能力に基づいて選択され、膜の崩壊および補体依存性細胞傷害性(complement-dependent cytotoxicity)（ＣＤＣ）をもたらす。臨床試験では、例えば、慢性リンパ球性白血病(chronic lymphocytic leukemia)（ＣＬＬ）患者の組合せ療法および維持における、その新たに出現した可能性が強調された（６、７）。増強されたＦｃγＲＩＩＩ結合および直接プログラム細胞死(programmed cell death)（ＰＣＤ）誘導能を有するＣＤ２０  ｍＡｂであるオビヌツズマブ（ＯＢＺ；ＧＡ１０１）は、ＣＬＬ（８）およびＲＴＸ不応性濾胞性ＮＨＬ（９）の第一選択治療として承認されている。
【０００３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＤ２０ｍＡｂは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害／貪食作用（ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ）、ＣＤＣまたはＰＣＤを誘導することができる。それらの作用機序(mechanism-of-actions) （ＭｏＡ）に応じて、ＣＤ２０  ｍＡｂはＩ型およびＩＩ型に分類される。Ｉ型およびＩＩ型の両ｍＡｂは、ＲＴＸおよびＯＦＡを含むＡＤＣＣ  Ｉ型ｍＡｂを惹起し、ＣＤ２０を脂質ラフトに再配置し、補体系を効率的に活性化する（１０）。ＩＩ型ｍＡｂは、カスパーゼ非依存的経路を介してＰＣＤを誘導する（１１）。記載されているＩＩ型ｍＡｂは、ＯＢＺ（１２）、Ｂ１（１３）および１１Ｂ８（１４）のみである。興味深いことに、ＲＴＸは、リンパ腫細胞株および初代ＣＬＬ細胞において同じ経路を介して、しかしながらＩＩ型ｍＡｂよりも低い程度にＰＣＤを誘導することが示された（１５）。最近では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＩ型およびＩＩ型の特徴を示すＣＤ２０  ｍＡｂが記載されている（１６）。
【０００４】
文献では、（ａ）エピトープ、（ｂ）結合動態、および（ｃ）ＶＨ鎖フレームワークの肘−ヒンジ角決定領域内の残基、の３つの特徴がＩ／ＩＩ型の分類を支配することが示唆された。
【０００５】
ヒトＣＤ２０は、小（残基７２〜８０）および大（残基１４０〜１８６）細胞外ループを含んでなる。ＲＴＸのエピトープは、コア結合領域を表す１７０ＡＮＰＳ１７３を有するより大きなループに位置する（１７）。突然変異誘発実験によって、Ｎ１７１はＲＴＸにとって重要な残基であることが確認された（１８）。ＲＴＸならびにＩ型マウスＣＤ２０  ｍＡｂの別のパネルでは、Ａ１７０およびＰ１７２が重要であると決定された（１９、２０）。ＩＩ型ｍＡｂ  ＯＢＺおよびＢ１はＲＴＸと重複するエピトープ（１７０ＡＮＰＳＥＫＮＳＰ１７８）を有するが、残基１７６〜１７８が結合に最も寄与する（１８）。これに対して、Ｉ型ｍＡｂ  ＯＦＡおよびＩＩ型ｍＡｂ  １１Ｂ８のエピトープは、小ループおよび大ループ上の残基に含まれる（２０）。ＯＦＡはこのユニークなエピトープを認識して補体を効率的に活性化するので、膜近位結合は利用可能なＦｃフラグメントの有益な配向をもたらしてより良い補体沈着を可能とすることが示唆された。加えて、強力な補体誘導因子ＯＦＡは中等度のＣＤＣ能を有するＲＴＸよりもＣＤ２０から有意にゆっくり解離するので、Ａｂ動態はＣＤ２０  ｍＡｂのＣＤＣ活性と相関すると提案された（１４）。より緩慢な解離速度がより良いＣＤＣ誘導に寄与することを裏づけるさらなる証拠は、ＣＤ２０  ｍＡｂベルツズマブを用いた研究から得られている（２１）。
【０００６】
抗原結合特性に次いで、Ａｂの構造的な特徴が示唆された。ＢＬｙ−１（Ｉ型）からＯＢＺ（ＩＩ型）へのヒト化の際には、ＶＨ鎖フレームワークにＬ１１Ｖ突然変異が導入された。ＯＢＺにおける復帰突然変異は、ＰＣＤ誘導の低下をもたらした（１２）。ＲＴＸおよびＯＢＺのモデル化は、Ｌ１１Ｖ突然変異がＲＴＸ（１４０°）に比べてＯＢＺでより大きいＡｂ肘−ヒンジ角（１６７°）をもたらすことを示した（１８）。
【０００７】
種々のＣＤ２０抗体が知られているが、ＣＤ２０  ｍＡｂの作用機序を決定する特性についてはまだほとんど知られていない。
【０００８】
本発明は、新規なＣＤ２０抗体を開示する。総ての抗体がＩ型の特徴を示すが、これらのうちいくつかはまたＩＩ型の特徴も示す。エピトープも解離速度もそれら自体ではＣＤ２０抗体がＩ型を示すか、ＩＩ型を示すか、またはＩ／ＩＩ型活性を示すかを予測するには十分でないことが判明した。
【０００９】
本発明はさらに、ヒトＩｇＡ定常領域を有するＣＤ２０抗体を提供する。ＩｇＡは、粘膜に優勢なＡｂであり、血中でＩｇＧに次いで２番目に優勢な抗体である。単量体型のＩｇＡは大部分血清中に見られるが、重合体型のＩｇＡは粘膜部位で産生される。２つのＡｂサブクラスＩｇＡ１とＩｇＡ２はヒンジ領域が構造的に異なり、ＩｇＡ２に比べてＩｇＡ１ではアミノ酸１３個分長い。これにより、離れた抗原に対する到達の改善が可能となるが、同時にプロテアーゼによる分解をより受けやすくなる（３６）。さらに、ＩｇＡ１  Ａｂのヒンジ領域は、ＩｇＡ２  Ａｂには無い、いくつかのＯ結合グリコシル化部位を有する。ＩｇＡ２は、ＩｇＡ１に比べて２つの付加的Ｎ結合グリコシル化部位を有するＩｇＡ２（ｍ１）、および３つの付加的Ｎ結合グリコシル化部位を有するＩｇＡ２（ｍ２）とＩｇＡ２（ｎ）、の３つのアロタイプとして存在する。ＩｇＧとは対照的に、ＩｇＡは、Ｃ１ｑと結合することができないので、古典的補体経路の弱い活性化因子である（３７）。しかしながら、マンナン結合レクチン(mannan-binding lectin)（ＭＢＬ）の糖鎖認識ドメイン(carbohydrate recognition domain)（ＣＲＤ）はＩｇＡと結合し得るので、ＩｇＡ  ｍＡｂはレクチン経路を介して補体系を活性化することが示されている（３８）。
【００１０】
ＩｇＡは、骨髄系譜の細胞：好中球、単球、種々のマクロファージ集団および好酸球上で発現されるＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）と結合することによって免疫エフェクター細胞と会合する（３９）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じた樹状細胞上での発現が示されたが（４０、４１）、議論が残る。好中球は高レベルのＦｃαＲＩを発現するが、マクロファージでの発現はより低い（４２）。固形腫瘍標的を標的とするＩｇＡ  ｍＡｂを用いたＡＤＣＣアッセイでは、好中球は腫瘍細胞を効率的に根絶することが示された（４３〜４６）。これに対して、ＩｇＧ１  ｍＡｂは、このエフェクター細胞集団と会合することがほとんどできなかった。単球／マクロファージにより媒介される腫瘍細胞の死滅は、ＩｇＡ  ｍＡｂとＩｇＧ  ｍＡｂの間で同等であることが示された（４３）。活性化ＦｃγＲＩＩＩａとは別に、マクロファージはまた阻害性ＦｃγＲＩＩｂも発現する。ＦｃγＲＩＩｂの存在はｍＡｂ活性を低下させることが示された（４７）。ＩｇＡについては、阻害性受容体はまだ記載されていない。
【００１１】
腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＡ  ｍＡｂに関する知識は、ここ数年、著しく増えてきた。数年前に直面していたいくつかのボトルネックは今では克服され、現在、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験に十分な量の単量体ＩｇＡ  ｍＡｂを生産および精製することができる。マウスはＩｇＡに対する受容体を欠いているので、今では、ヒトＦｃαＲＩトランスジェニックを作出することでｉｎ  ｖｉｖｏ試験が可能となる（４８）。Ｂｏｒｏｓｓおよび共同研究者らは、ついに、免疫応答性腫瘍モデルにおいて、治療状況下でのＩｇＡ  ｍＡｂの大きな可能性を示した（４４）。これまでに研究された大多数のＩｇＡ  ｍＡｂは、固形腫瘍上で発現される抗原であるＨＥＲ２またはＥＧＦＲを標的としている。単量体ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの可能性に注目した研究は一つだけである（４９）。補体により媒介される腫瘍細胞の死滅は、古典経路の弱い間接的活性化と第二経路のより著しい直接的活性化に頼ることが示された。ＦｃαＲＩトランスジェニックマウスにおける受動免疫戦略を用い、単量体ＩｇＡ２−ＣＤ２０  ｍＡｂによって腫瘍発達に対する良好な保護が達成された。しかしながら、ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂに関する治療的ｉｎ  ｖｉｖｏ試験はまだ行われていない。さらに、ＩｇＡ１  ｍＡｂおよびＩｇＡ２  ｍＡｂの、特に、それらの補体活性化特性に関する直接的比較が欠けている。本発明は、ユニークなＩｇＡ１−ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＩｇＡ２−ＣＤ２０  ｍＡｂを記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】最新のＣＤ２０  ｍＡｂはユニークな重鎖および軽鎖配列を有する。（Ａ）重鎖および（Ｂ）軽鎖の可変領域をコードする配列をアラインし、同一性（％）(% identity)（ＰＩＤ）を用いて平均距離を計算することによって市販のＣＤ２０  ｍＡｂと比較した。右のパネルは左のツリーの断片である。
【図２】マウス抗体として、総ての新規ＣＤ２０マウスＩｇＧ  ｍＡｂは、Ｉ型の特徴を示す。（Ａ）ＰＣＤ：架橋Ａｂの不在または存在下で１μｇ／ｍＬのＣＤ２０  ｍＡｂとともに２４時間インキュベートしたＥＬ４−ＣＤ２０細胞。７−ＡＡＤ＋／アネキシンＶ−ＰＥ＋染色により決定されたＰＣＤ（平均＋ＳＥＭ）。（Ｂ）ＡＤＣＣ：エフェクター細胞としてＰＢＭＣを用いる（Ｅ：Ｔ＝１００：１）クロム放出アッセイにおける、１μｇ／ｍＬのＣＤ２０  ｍＡｂでのＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解（平均＋ＳＥＭ）。（Ｃ）新規ＣＤ２０  ｍＡｂによるＣＤＣを、１５．５％ヒト血清中、１０および１μｇ／ｍＬのｍＡｂで測定し、７−ＡＡＤ染色により検出した（（値ｓａｍｐｌｅ−平均ｍｅｄｉｕｍ）＋ＳＥＭ）。灰色のｍＩｇＧ２ａ−ＣＤ２０  ｍＡｂであるＢ１、ｍＲＴＸ、およびｍ７Ｄ８は対照として一緒に行った。桃色のｍＩｇＧ２ｃ  ｍＡｂおよび青色のｍＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ。
【図３】新規ｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂは様々なＣＤＣ特性を示す。（Ａ）Ｄａｕｄｉ細胞に対する総ての新規ｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂによる、ならびに（Ｂ）ＲａｍｏｓおよびＲａｊｉ細胞に対するｍ１、ｍ２およびｍ７Ｄ８による補体依存性細胞傷害性の誘導。ｍＩｇＧ２ａ−ＣＤ２０  ｍＡｂｓ  Ｂ１およびｍ７Ｄ８を対照として一緒に行った。細胞を示されたｍＡｂ濃度および１５．５％のヒト血清とともにインキュベートした。細胞傷害性は、７−ＡＡＤ染色により測定した（（値ｓａｍｐｌｅ−平均ｍｅｄｉｕｍ）＋ＳＥＭ）。
【図４】ＣＤ２０上の結合部位は新規ＣＤ２０  ｍＡｂ間で異なる。（Ａ）環状ペプチドＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳを用いたエピトープマッピングの結果、ｍ１のエピトープが同定されたが（左）、ｍ２は境界のみ同定された（右）。ペプチドおよび各アミノ酸が他の総ての利用可能なアミノ酸（位置スキャン；システインを除く）で置換された突然変異体に対する１μｇ／ｍＬのｍＡｂの結合をＥＬＩＳＡによって測定した。グレーの線と影付きの領域は、ＷＴ結合±ＳＥＭを表す。結果をテューキーの箱ひげ図（Tukey-whiskers）で示す。（Ｂ）ＣＤ２０  ＷＴまたはＣＤ２０突然変異体（ＫＤＤ＝Ｔ１５９Ｋ／Ｎ１６３Ｄ／Ｎ１６６Ｄ、ＡｘＰ＝Ａ１７０Ｓ／Ｐ１７２Ｓ）を用いたラフエピトープマッピング。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をプラスミドでトランスフェクトし、ｍＡｂ（５μｇ／ｍＬ）のＣＤ２０への結合をＦＡＣＳによって測定した。結合をＩ型ＣＤ２０  ｍＡｂ（ｍ７Ｄ８およびｍＲＴＸ）およびＩＩ型ｍＡｂ（Ｂ１およびｍ１１Ｂ８）と比較した。（Ｃ）ＣＤ２０  ｍＡｂ結合に重要な残基の決定。データは最良の結合剤に対する％として表す。最良の結合剤と比較した結合に従う彩色（濃いグレー：０〜２０％＝結合の欠如；グレー：２１〜７０％＝中等度の結合；薄いグレー：７１〜１００％完全な結合）。
【図５】明瞭に異なる動態を有する新規ＣＤ２０  ｍＡｂ  リガンドトレーサーグリーンを用いたＳＫＢＲ３−ＣＤ２０細胞に対するリアルタイム結合および解離曲線。（Ａ）ＲＰＭＩ培養培地（非競合的）または（Ｂ）１００ｎＭ非標識ＣＤ２０  ｍＡｂ（競合的）の存在下で３時間解離を追跡する前に、１０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＤ２０  ｍＡｂの会合を１時間モニタリングした。（Ｃ）１：１フィッティングモデルにより決定された非競合条件および競合条件下での解離速度定数の比較。
【図６】キメラ化はＰＣＤ活性を変更し得る。  架橋Ａｂ（ＩｇＧ１に関しては、ａ−ヒトＩｇＧ：２０μｇ／ｍＬ；Ｂ１に関しては、ａ−マウスＩｇＧ：５０μｇ／ｍＬ）の不在下（薄いグレーのバー）または存在下（濃いグレーのバー）での、Ｌ１１Ｖ突然変異を有するまたは有さないＩｇＧ１−ＣＤ２０−１およびＩｇＧ１−ＣＤ２０−２  ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）による同型凝集の誘導（写真）およびＰＣＤ。それぞれ陽性対照および陰性対照としてのＢ１およびＯＦＡ。細胞死の誘導は、７−ＡＡＤおよびアネキシンＶ−ＰＥ染色により測定した（平均＋ＳＥＭ）。
【図７】ｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性における違い。  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（マウス４〜６個体／群）に、ｍＡｂまたはＰＢＳ処置の１６時間前に、５×１０５のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ標識ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を腹腔内注射した。抗腫瘍応答を２４時間後に、ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブを用いた腹腔洗浄において残存する腫瘍細胞の量を測定することによって評価した。（Ａ）ｍ１、ｍ２およびｍ７Ｄ８のｍＡｂの力価測定（中央値±四分位範囲）。（Ｂ）ＰＢＳに対する％（中央値±四分位範囲）として表される１μｇのｍＩｇＧ２ｃ  ｍＡｂによる抗腫瘍応答。陽性対照としての１μｇのｍ７Ｄ８（ｍＩｇＧ２ａ）。点線により示されるように２回の独立した実験。
【図８】新規キメラＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂはＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞に結合する。  結合は、Ｄａｕｄｉ細胞をｍＡｂの希釈系とともにインキュベートした後にＦＡＣＳにより測定した。ＲＴＸおよびＯＦＡを陽性対照として、トラスツズマブをアイソタイプ対照として含めた。
【図９】新規キメラＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性の分析。  （Ａ）ＡＤＣＣ：より広いｍＡｂ濃度範囲でのエフェクター細胞としてＰＢＭＣを用いる（Ｅ：Ｔ＝５０：１）クロム放出アッセイにおけるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解（平均±ＳＥＭ）。（Ｂ）１５．５％ヒト血清中で測定され、７−ＡＡＤ染色により検出された新規ＣＤ２０  ｍＡｂのＣＤＣ（（値ｓａｍｐｌｅ−平均ｍｅｄｉｕｍ）＋ＳＥＭ）。（Ｃ）ＰＣＤ：２０μｇ／ｍＬの架橋Ａｂの不在下または存在下で１μｇ／ｍＬのＣＤ２０  ｍＡｂとともに２４時間インキュベートしたＥＬ４−ＣＤ２０細胞。ＰＣＤは、７−ＡＡＤ／アネキシンＶ−ＰＥ染色により測定した（平均＋ＳＥＭ）。Ｂ１（ｍＩｇＧ２ａ−ＣＤ２０  ｍＡｂ）はＰＣＤに対する陽性対照である（（値ｓａｍｐｌｅ−平均ｍｅｄｉｕｍ）＋ＳＥＭ）。総てのアッセイで、ＲＴＸおよびＯＦＡを陽性対照として、ＴＲＡをアイソタイプ対照として含めた。Ｌ１１Ｖ突然変異を有さないまたは有するＩｇＧ１−ＣＤ２０−１（１０μｇ／ｍｌ）による（Ｄ、Ｅ）Ｒａｍｏｓ細胞および（Ｆ、Ｇ）Ｄａｕｄｉ細胞に対するＰＣＤ誘導。細胞死の誘導は、（Ｄ、Ｆ）７−ＡＡＤ／アネキシンＶＰＥ  染色および（Ｅ、Ｇ）ＤｉＯＣ６／ＴＯ−ＰＲＯ−３染色により測定した（平均＋ＳＥＭ）。１１Ｂ８およびＯＦＡをそれぞれ陽性対照および陰性対照として一緒に行った。結果は３回の独立したアッセイの代表例である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のボンフェローニ事後解析による。
【図１０】自己設定(autologous setting)でのＣＤ１９＋生Ｂ細胞の消失。  ＣＤ２０  ｍＡｂによるＢ細胞枯渇は、健常なドナーからの未処理血液とともに３７℃で１時間ｍＡｂをインキュベートすることによって測定した。（Ａ）ＰＢＳ対照に比べてｍＡｂ（ここでは、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１）とのインキュベーション時の生Ｂ細胞の消失を示すＦＡＣＳプロット。（Ｂ）より広い濃度範囲で測定されたＣＤ２０  ｍＡｂにより媒介されるＢ細胞枯渇（平均±ＳＥＭ）。ＲＴＸおよびＯＦＡを陽性対照として、ＴＲＡをアイソタイプ対照として含めた。
【図１１】ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（マウス６個体／群）に、ｍＡｂ（１０μｇ）またはＰＢＳ処置の１６時間前に５×１０５のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ標識ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を腹腔内注射した。抗腫瘍応答を２４時間後に、ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブを用いた腹腔洗浄において残存する腫瘍細胞の量を測定することによって評価した（中央値±四分位範囲）。
【図１２】ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの生産。  （Ａ）ＨＣ、ＬＣおよびｐＡｄｖａｎｔａｇｅコードプラスミド間の最適比を決定するためのＨＥＫ２９３Ｆ細胞の試験トランスフェクション。生産されたＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの濃度をＩｇＡ特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。大規模生産されたＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂは、（Ａ）抗ヒトκアフィニティークロマトグラフィーとその後の（Ｂ）ルーズな軽鎖および凝集物から完全なサイズの抗体を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。代表的なグラフを示す。
【図１３】ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂのＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞への結合。  結合は、Ｒａｍｏｓ細胞をｍＡｂの希釈系とともにインキュベートした後にＦＡＣＳにより測定した。
【図１４】ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂによる様々な程度のプログラム細胞死の誘導。  ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を、架橋Ａｂの不在下および存在下（Ｂ１：５０μｇ／ｍＬ；ＩｇＧ１およびＩｇＡ  ｍＡｂ：２０μｇ／ｍＬ）で１μｇ／ｍＬ  ｍＡｂとともに２４時間インキュベートした。細胞死の程度をアネキシンＶ＋およびアネキシンＶ＋／７ＡＡＤ＋細胞の合計として決定した（値ｓａｍｐｌｅ−平均ｍｅｄｉｕｍ＋ＳＥＭ）。Ｂ１（ｍＩｇＧ２ａ−ＣＤ２０  ｍＡｂ）およびＲＴＸを陽性対照として、ＯＦＡを陰性対照として一緒に行った。
【図１５】ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂにより誘導された補体依存性細胞傷害性。  標的細胞を示された時間、１５．５％のプールヒト血清とともにインキュベートし、ＣＤＣの程度を％７ＡＡＤ＋細胞として決定した。（Ａ、Ｂ）ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂによる補体誘導の時間依存性。１０μｇ／ｍＬのｍＡｂの存在下で１５、６０、２４０、および３６０分間インキュベートした（Ａ）Ｄａｕｄｉおよび（Ｂ）Ｒａｍｏｓ細胞の、補体により媒介される溶解。（Ｃ）１０μｇ／ｍＬのｍＡｂとともに１５分インキュベートした後の、補体により媒介されるＲａｍｏｓ細胞の溶解の程度は、示された阻害剤（熱失活血清；過剰なエクリズマブ；ＥＤＴＡ＋ＭｇＣｌ２）で補体源を前処理することによって阻害された。結果を（値ｓａｍｐｌｅ−平均ｍｅｄｉｕｍ）＋ＳＥＭとして示す。
【図１６】自己設定におけるＢ細胞枯渇アッセイ。  全血白血球を３７℃で３時間、ＣＤ２０  ｍＡｂとともにインキュベートした。ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ５６およびＣＤ１１ｂ陽性細胞が排除されるＦＳＣ／ＳＳＣリンパ球ゲートで分析を行った。ＣＤ１９をＢ細胞マーカーとして使用した。（Ａ）ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）上でのＣＤ１９発現の分析。（Ｂ）リンパ球ゲートで見られたＣＤ１９＋イベントの数。（Ｃ）バックグラウンド（抗体無し）の減算後のリンパ球ゲートで見られたＣＤ１９−細胞の数。
【図１７】抗ＣＤ２０  ＩｇＡはＣＤ２０標的の効率的な腫瘍細胞溶解を媒介する。  エフェクター細胞として（Ａ）ＰＢＭＣ、Ｅ：Ｔ＝１００：１、または（Ｂ）ＰＭＮ、Ｅ：Ｔ＝４０：１、および示された抗体濃度を用いて、ＥＬ４−ＣＤ２０−Ｌｕｃ２細胞からの５１Ｃｒの放出により測定したＡＤＣＣ。抗ＣＤ２０  ＩｇＡは、リツキシマブと同じ可変領域を含有する。
【図１８】様々なＶＨ鎖およびＶＬ鎖のアミノ酸配列。  ＣＤＲ配列は、左から右へ配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として下線が施されている。  ＶＨにおけるＣＤＲの位置は、以下の規準を用いて決定した。ＣＤＲ−Ｈ１  開始部−およそ残基２６（常にＣＹＳの４つ後）［Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ定義］。Ｋａｂａｔ定義は５残基後で始まる。常にＣＹＳ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸの前の残基。常にＴＲＰの後の残基。一般に、ＴＲＰ−ＶＡＬであるが、ＴＲＰ−ＩＬＥ、ＴＲＰ−ＡＬＡでもある。１０〜１２残基長（ＡｂＭ定義）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義では、最後の４残基が除かれる。ＣＤＲ−Ｈ２  開始部−ＣＤＲ−Ｈ１のＫａｂａｔ／ＡｂＭ定義の終了部の常に１５残基後。一般にＬＥＵ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＩＬＥ−ＧＬＹの前の残基であるが、いくつかのバリエーションがある。ＬＹＳ／ＡＲＧ−ＬＥＵ／ＩＬＥ／ＶＡＬ／ＰＨＥ／ＴＨＲ／ＡＬＡ−ＴＨＲ／ＳＥＲ／ＩＬＥ／ＡＬＡの後の残基。Ｋａｂａｔ定義で１６〜１９残基。ＣＤＲ−Ｈ３  開始部−ＣＤＲ−Ｈ２の終了部の常に３３残基後（常にＣＹＳの２つ後）。常にＣＹＳ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（一般にＣＹＳ−ＡＬＡ−ＡＲＧ）の前の残基。常にＴＲＰ−ＧＬＹ−ＸＸＸ−ＧＬＹの後の残基。３〜２５（！）残基長。  ＶＬにおけるＣＤＲの位置は、以下の規準を用いて決定した。ＣＤＲ−Ｌ１  開始部−およそ残基２４。前の残基は常にＣｙｓである。後の残基は常にＴｒｐである。一般に、ＴＲＰ−ＴＹＲ−ＧＬＮであるが、ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＧＬＮ、ＴＲＰ−ＰＨＥ−ＧＬＮ、ＴＲＰ−ＴＹＲ−ＬＥＵでもある。１０〜１７残基長。ＣＤＲ−Ｌ２  開始部−Ｌ１の終了部の常に１６残基後。一般にＩＬＥ−ＴＹＲ、またＶＡＬ−ＴＹＲ、ＩＬＥ−ＬＹＳ、ＩＬＥ−ＰＨＥの前の残基。常に７残基長。ＣＤＲ−Ｌ３  開始部−Ｌ２の終了部の常に３３残基後。前の残基は常にＣｙｓである。後の残基は常にＰＨＥ−ＧＬＹ−ＸＸＸ−ＧＬＹである。７〜１１残基長。
【図１９】ｍＩｇＧ−ＣＤ２０  ｍＡｂのＤａｕｄｉ細胞への結合。
【図２０】新規ＣＤ２０  ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）によるＥＬ４−ＣＤ２０細胞のＨＡの誘導はない（倍率２０×）。架橋Ａｂ（５０μｇ／ｍＬ）を陽性対照条件として加えた。陽性対照としてＢ１（ＩＩ型）。
【図２１】直鎖ペプチドＮＳＰＳＴＱＹＧＰＡＮＰＳＥＫを用いたエピトープマッピングの結果、（Ａ）ｍ１の結合に寄与するが（Ｂ）ｍ２の結合には寄与しないａａが同定された。ペプチドおよび各ａａが総ての他の利用可能なａａで置換された（ポジショナルスキャン；システインを除く）対応する突然変異体に対する１μｇ／ｍＬ  ｍＡｂの結合をＥＬＩＳＡによって決定した。グレーの線と影付きの領域はＷＴ結合±ＳＥＭであり、結果をテューキーの箱ひげ図で示す。
【図２２】（Ａ、Ｂ）ＦＡＣＳに基づく解離分析。Ｄａｕｄｉ細胞を１０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ６４７標識ＣＤ２０  ｍＡｂで染色した。細胞を（Ａ）ＲＰＭＩ培養培地（非競合）中に残すか、または（Ｂ）１０倍過剰の非標識ｍＡｂ（１００μｇ／ｍＬ；競合）の存在下に置いた。示された時点で細胞に結合したｍＡｂのレベルを決定した。（Ｃ、Ｄ）リガンドトレーサー技術を用いたＳＫＢＲ３−ＣＤ２０細胞に対するリアルタイム結合および解離曲線。１０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＤ２０  ｍＡｂの会合を、（Ｃ）ＲＰＭＩ培養培地（非競合）または（Ｄ）１００ｎＭの、同じクローンの非標識ＣＤ２０  ｍＡｂ（競合）の存在下で８時間解離を追跡する前に４時間モニタリングした。
【図２３】既存のＣＤ２０  ｍＡｂおよび新規なＣＤ２０  ｍＡｂの分子決定因子の概観のまとめ。３つの異なる分子決定因子がＣＤ２０  ｍＡｂのＭｏＡを決定することを表した：１）エピトープ（いくつかのＣＤ２０抗体の位置が示される）；２）動態（ＣＤ２０抗体のｋｏｆｆを高（１０−５）から低（１０−６）までランク付けした）、および３）肘角（市販のＣＤ２０  ｍＡｂ（ＯＦＡ、ＲＴＸおよびＯＢＺ）を文献に従って広角および狭角に分類した。Ｋａｂａｔ位置１１のアミノ酸は、この角度に影響を及ぼすことが記載され、これに基づき、本発明者らの新規なキメラｍＡｂがこの残基に従って配向された）。
【図２４】好適なＩｇＧ１、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２重鎖および軽鎖定常領域のアミノ酸配列。配列番号３  重鎖ＩｇＧ１定常領域ＣＨ１−３およびヒンジ、配列番号４  重鎖ＩｇＡ１定常領域ＣＨ１−３およびヒンジ、配列番号５  重鎖ＩｇＡ２定常領域ＣＨ１−３およびヒンジ、配列番号６  軽鎖定常領域。
【図２５】１μｇの抗体におけるＢ細胞からのＣＤ２０の内部移行。図面のＵＭＡＢ．．．参照中の数字は抗体ｍ．．．の可変ドメインを指し、ここで、個々の数字および定常領域は示されている通りである。
【図２６】Ｂ細胞のＣＤ２０内部移行における抗体の力価測定範囲。
【図２７】新規なキメラＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性の分析。（Ａ）ＩｇＡ１−ＣＤ２０抗体のＡＤＣＣ：エフェクター細胞としてＰＭＮを用いる（Ｅ：Ｔ＝４０：１）クロム放出アッセイにおけるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解。（Ｂ）ＩｇＡ２−ＣＤ２０抗体のＡＤＣＣ：エフェクター細胞としてＰＭＮを用いる（Ｅ：Ｔ＝４０：１）クロム放出アッセイにおけるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解。
【図２８】ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（マウス６個体／群）に、ｍＡｂ（１０μｇ）またはＰＢＳ処置の１６時間前に、５×１０ｅ５のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ標識ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を腹腔内注射した。抗腫瘍応答を２４時間後に、ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブを用いた腹腔洗浄において残存する腫瘍細胞の量を測定することによって評価した（中央値±四分位範囲）。
【図２９】ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ２０発現の低下はＩｇＧ処置後に見られるが、ＩｇＡ処置後には見られない。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（マウス６個体／群）に、ｍＡｂ（１０μｇ）またはＰＢＳ処置の１６時間前に、５×１０ｅ５のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ標識ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を腹腔内注射した。その後、ＣＤ２０発現をこれらの細胞でフローサイトメトリー分析によって測定した。
【図３０】示された抗体の可変ドメインおよび示された定常領域ＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２を有する抗体を用いた場合のＣＤ１９／ＣＤ２４＋イベント。
【００１３】
発明の概要
本発明は、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」（ＮおよびＳが太字）と結合し得る可変ドメインを含んでなる抗体であって、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＰＣＤ機能性を有する抗体を提供する。
【００１４】
本発明はまた、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＳＮＳＹＧＳＴＹＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体も提供する。
【００１５】
本発明はさらに、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」（Ｎが太字）と結合し得る可変ドメインを含んでなる抗体であって、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＡＤＣＣ機能性を有する抗体も提供する。
【００１６】
また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＹＹＹＧＳＳＹＧＡＭＤＹを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体も提供される。
【００１７】
さらに、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮｐｓＥＫ」（Ｎが太字）と結合し得る可変ドメインを含んでなる抗体であって、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＣＤＣ機能性を有する抗体も提供される。
【００１８】
また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＴＹＹＹＧＳＳＰＹＷＳＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体も提供される。
【００１９】
また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＳＲＬＦＤＳＳＹＧＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体も提供される。
【００２０】
さらに、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」（ＮおよびＳが太字）と結合し得る可変ドメインを含んでなる抗体であって、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＣＤＣおよび／または高いＡＤＣＣ機能性を有する抗体も提供される。
【００２１】
また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＳＡＹＹＧＳＮＶＷＦＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体も提供される。
【００２２】
さらに、個体における疾患の治療において使用するための、本明細書に記載されるような抗体も提供される。
【００２３】
また、過剰なＢ細胞、過活動Ｂ細胞、および／または機能不全Ｂ細胞が関与する疾患の治療において使用するための、本明細書に記載されるような抗体も提供される。
【００２４】
また、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫；有毛細胞白血病；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、または黒色腫などのＣＤ２０陽性腫瘍の治療において使用するための、本明細書に記載されるような抗体も提供される。
【００２５】
また、過剰なＢ細胞、過活動Ｂ細胞、および／または機能不全Ｂ細胞が関与する疾患を有する個体の治療のための方法であって、それを必要とする個体に本明細書に記載されるような抗体を投与することを含んでなる方法も提供される。
【００２６】
また、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫；有毛細胞白血病；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、または黒色腫などのＣＤ２０陽性腫瘍を有する個体の治療のための方法であって、それを必要とする個体に本明細書に記載されるような抗体を投与することを含んでなる方法も提供される。
【００２７】
また、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する小児および幹細胞移植後にＢ細胞疾患を有する小児白血病患者の治療のための方法も提供される。小児患者では、Ｂ細胞の永久枯渇およびナイーブＢ細胞の記憶Ｂ細胞へのスイッチ不能による生涯の免疫グロブリン枯渇というリツキシマブの長期の悪影響が注目される。体内でのＩｇＧの長い持続時間がおそらく原因である。本明細書に記載のＩｇＡ抗体は、同じ可変ドメインを含んでなるＩｇＧ抗体と比較した場合により強いＡＤＣＣ機能を有する。このことは、細胞をＣＤ２０抗体とともにインキュベートした際にトロゴサイトーシスを受けないＢ細胞特異的マーカーが分析される場合に明らかである。本明細書に記載のＩｇＡ抗体は、同じ可変ドメインを含んでなるＩｇＧ抗体比較した場合に短い半減期を有する。本明細書に記載されるようなＩｇＡ抗体は、同じ可変ドメインを有するＩｇＧ抗体と比較した場合に生じる副作用が少ない。簡単に述べれば、本発明のＩｇＡ抗体は、効果的なヒットを助長するだけでなく、Ｂ細胞レパートリーの良好な再生を可能とするに十分早く除去もされる。このことは特に、本発明の抗体で処置した、幹細胞移植後にＢ細胞疾患を有する上記の白血病患者および本発明の抗体によるＢ細胞枯渇の後の小児患者において、治療から回復した後のＢ細胞レパートリーの温存に特に有用である。
【００２８】
本発明はさらに、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１および２の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる可変ドメインを提供する。
【００２９】
本発明はさらに、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号７および８の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる可変ドメインを提供する。
【００３０】
本発明はさらに、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号９および１０の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる可変ドメインを提供する。
【００３１】
本発明はさらに、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１１および１２の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる可変ドメインを提供する。
【００３２】
本発明はさらに、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１３および１４の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる可変ドメインを提供する。さらに、本明細書で明示されるような可変ドメインを含んでなる抗体も提供される。
【００３３】
さらに、以下も提供される：
本明細書に記載されるような抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸分子；
本明細書に記載されるような抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ３をコードする核酸分子；
本明細書に記載されるような抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をコードする核酸分子；ならびに
本明細書に記載されるような抗体の重鎖または軽鎖の可変領域をコードする核酸分子。
【００３４】
さらに、本明細書に記載されるような抗体をコードする核酸を含んでなる細胞も提供される。
【００３５】
さらに、本明細書に記載されるような抗体の生産のための手段および方法も提供される。
【００３６】
詳細な説明
本発明は、ＣＤ２０と結合する抗体に関する。ＣＤ２０タンパク質はまた、膜貫通４−ドメインＡ１；ＭＳ４Ａ１；膜貫通４−ドメインサブファミリーＡメンバー１；白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６；ＣＤ２０抗原；Ｂｐ３５；Ｂリンパ球細胞表面抗原Ｂ１；Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１；ＣＤ２０受容体；ＬＥＵ−１６；ＣＶＩＤ５；ＭＳ４Ａ２；Ｂ１；およびＳ７などの種々の他の名称でも知られる。ＭＳ４Ａ１の外部Ｉｄは、ＨＧＮＣ：７３１５；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：９３１；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１５６７３８；ＯＭＩＭ：１１２２１０およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１１８３６である。
【００３７】
これらの名称にはＣＤ２０以外のタンパク質を指すために用いられてきたものまたは用いられてこなかったものもある。名称および配列の識別名は、単に参照のために示されるものである。本発明の抗体はＲａｍｏｓ細胞上で発現されるＣＤ２０に結合するだけでなく、抗体が結合するエピトープが利用可能である限り、他のＣＤ２０分子にも結合する。よって、スプライシング変異体または突然変異型ＣＤ２０分子（存在する場合）も、そのエピトープが利用可能である限り、本発明の抗体によって結合される。抗体がＣＤ２０に結合するということは、抗体がＣＤ２０に結合し得るということを意味し、抗体が実際にＣＤ２０と結合していることを意味するものではない。それはまた、その抗体が他のタンパク質と結合しないことも意味するものではない。このような交差反応性は本発明の抗体に関してはこれまでのところ知られていないが、このような交差反応性が存在する可能性があることは明白に排除されない。
【００３８】
免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる抗体（Ａｂ）は、大きく、一般に、Ｙ型のタンパク質である。抗体は免疫系の様々な成分と相互作用する。それらの相互作用のいくつかはそのＦｃ領域（「Ｙ」の基部に位置する）により媒介され、その領域はこれらの相互作用に関与する位置を含んでいる。
【００３９】
抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質である。それらは一般に２つの重鎖と２つの軽鎖を有する。抗原結合フラグメントに結合し得る５つの異なるタイプの結晶性フラグメント（Ｆｃ）を定義するいくつかの異なるタイプの抗体重鎖が存在する。５つの異なるタイプのＦｃ領域は、抗体を５つのアイソタイプに分類することを可能とする。特定の抗体アイソタイプのＦｃ領域は、その特定のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合することができるので、抗原−抗体複合体は、それが結合するＦｃＲによって異なる役割を媒介することが可能となる。ＩｇＧ抗体の、その対応するＦｃＲに結合する能力は、そのＦｃ領域内の部位に存在する相互作用部位の有／無およびグリカン（存在する場合）の構造によって調節される。抗体のＦｃＲに結合する能力は、それらが遭遇するそれぞれ異なるタイプの外来対象に適当な免疫応答を指示する助けとなる。
【００４０】
総ての抗体の一般構造は類似しているが、そのタンパク質の先端の領域は極めて多様であり、わずかに異なる先端構造、または抗原結合部位を有する何百万という抗体の存在を可能とする。この領域は超可変領域として知られる。抗体による抗原結合の膨大な多様性は、主として超可変領域および超可変領域を含有する可変ドメインによって定義される。
【００４１】
本発明の抗体は一般に全長抗体である。用語「全長抗体」は、本質的に完全な免疫グロブリン分子を含んでなるとして定義されるが、無傷の免疫グロブリンの必ずしも総ての機能を有するものではない。疑念を避けるため、全長抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖を有する。各鎖は定常（Ｃ）領域と可変（Ｖ）領域を含む。全長抗体の重鎖は一般に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ領域およびヒンジ領域を含んでなる。全長抗体の軽鎖は一般に、ＣＬ領域とＶＬ領域を含んでなる。
【００４２】
抗体は、Ｆａｂ部分に含まれる可変領域ドメインを介して抗原に結合する。抗体可変ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含んでなる。本発明による全長抗体は重鎖と軽鎖を包含し、ここで、所望の特徴を提供する突然変異が存在してもよい。全長抗体は、それらの領域のいずれの実質的部分の欠失も有してはならない。しかしながら、１または複数のアミノ酸残基が、結果として得られる抗体の抗原結合特徴を本質的に変更せずに置換、挿入、欠失またはそれらの組合せを受けたＩｇＧ分子も「全長」抗体という用語の範囲内に包含される。例えば、「全長」抗体は、好ましくは非ＣＤＲ領域の、１〜１０（含む）のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失またはそれらの組合せを有することができ、ここで、欠失されるアミノ酸はその抗体の結合特異性に必須ではない。
【００４３】
本発明の抗体により認識されるエピトープおよび／またはその中の寄与の少ないアミノ酸は、とりわけ、エピトープを含むペプチド内でアミノ酸が他の総ての天然アミノ酸で置換されたポジショナルアミノ酸スキャンによって、また、細胞上で発現されるＣＤ２０タンパク質の突然変異体スクリーンによって決定した。抗体のエピトープへの結合に対するアミノ酸の寄与は、好ましくは、エピトープそれ自体を含んでなるペプチドへの結合と分析されるアミノ酸の位置にアラニンを有する以外は同じペプチドへの結合を比較することによって決定される。そのタンパク質においてアラニンによる置換が、非修飾タンパク質と比べてその抗体の結合に０〜７０％の低下をもたらす場合に、アミノ酸は、そのタンパク質に対する抗体の結合に関与する。これはまた結合の低下とも呼ばれる。非修飾タンパク質に比べて結合が０〜２０％まで低下すれば結合の欠損と見なされ、非修飾タンパク質に比べて２１〜７０％まで低下すれば中等度の結合と見なされる。このようにして同定されたアミノ酸は、抗体のタンパク質への結合に対する主要寄与因子または中等度の寄与因子であると見なされる。７１〜１００％の結合は、完全な結合と見なされる。検討中のアミノ酸は、その抗体のタンパク質への結合に有意に寄与すると見なされない。
【００４４】
本発明によって提供される抗体の一つは、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」（ＮおよびＳが太字）と結合し得る可変ドメインを含んでなり、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＰＣＤ機能性を有する抗体（Ａ）である。この抗体は好ましくは、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に匹敵するかまたは高いＣＤＣ機能性をさらに含んでなる。好ましくは、抗体のＡＤＣＣ機能性は、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に匹敵するかまたは低下している。抗体により結合されるＣＤ２０上のエピトープは「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」（ＮおよびＳが太字）である。大文字、小文字および太字は、抗体のペプチドへの結合に対するアミノ酸の関連を示す。太字の文字は、そのアミノ酸が抗体の結合に対する主要寄与因子であることを示し、小文字は、そのアミノ酸が結合に対して中等度の寄与を有することを示し、プレーンテキストの大文字は、そのアミノ酸が抗体のペプチドへの結合への寄与が小さいかまたは検出不能であることを示す。抗体は、「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」のアミノ酸ＮまたはＳのうち１以上がアラニンにより置換されたＣＤ２０タンパク質に対して２０％未満の結合を示し、この場合、この結合は、非修飾ＣＤ２０タンパク質への抗体の結合と比較される。また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有し、前記重鎖可変領域が配列ＳＮＳＹＧＳＴＹＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする可変ドメインを含んでなる、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体（Ａ１）も提供される。抗体（Ａ１）は、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＰＣＤ機能性を有する。この抗体は好ましくは、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に匹敵するかまたは高いＣＤＣ機能性をさらに含んでなる。好ましくは、この抗体のＡＤＣＣ機能性は、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に匹敵するかまたは低減されている。重鎖可変領域は、好ましくは、それぞれ配列ＳＹＮＬＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＳＮＳＹＧＳＴＹＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる。好ましくは、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１の配列を含んでなり、ここで、配列番号１は、下記配列を有する。
【化１】
2019530661.tif 000002
【００４５】
抗体（Ａ１）の軽鎖可変領域は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号２の配列を含んでなり、ここで、配列番号２は下記配列を有する。
【化２】
2019530661.tif 000003
【００４６】
抗体Ａ１は、好ましくは、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでなる。好ましい実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＡ１またはヒトＩｇＡ２重鎖定常領域、好ましくは、ヒトＩｇＡ２；より好ましくは、ヒトＩｇＡ２ｍ、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１またはＩｇＡ２ｍ２、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１重鎖定常領域である。別の好ましい実施形態では、この抗体は、マウスＩｇＧ２領域、好ましくは、ＩｇＧ２ｃ定常領域を含んでなる。
【００４７】
好ましい実施形態では、抗体ＡはＡ１抗体である。
【００４８】
抗体ＡまたはＡ１は、好ましくは、重鎖および軽鎖を含んでなり、ここで、重鎖は、配列番号１の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４または５の配列を含んでなる。
【００４９】
抗体ＡまたはＡ１は好ましくは、配列番号２の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００５０】
本発明はまた、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮＰｓＥＫ」（Ｎが太字）と結合し得る可変ドメインを含んでなり、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＡＤＣＣ機能性を有する抗体（Ｂ）も提供する。この抗体により結合されるＣＤ２０内のエピトープは、「ＥＰＡＮＰｓＥＫ」（Ｎが太字）である。大文字、小文字および太字は、抗体のペプチドへの結合に対するアミノ酸の関連を示す。太字の文字は、そのアミノ酸が抗体の結合に対する主要寄与因子であることを示し、小文字は、そのアミノ酸が結合に対して中等度の寄与を有することを示し、プレーンテキストの大文字は、そのアミノ酸が抗体のペプチドへの結合への寄与が小さいかまたは検出不能であることを示す。この抗体は、「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」内のアミノ酸Ｎがアラニンで置換されたＣＤ２０タンパク質に対して２０％未満の結合を示し、それにより、この結合は、非修飾ＣＤ２０タンパク質への抗体の結合と比較される。
【００５１】
また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有し、前記重鎖可変領域が配列ＹＹＹＧＳＳＹＧＡＭＤＹを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする可変ドメインを含んでなり、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体（Ｂ１）も提供される。抗体Ｂ１は、同じアイソタイプ定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＡＤＣＣ機能性を有する。重鎖可変領域は、好ましくは、それぞれ配列ＳＹＮＭＨ、ＧＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＹＹＹＧＳＳＹＧＡＭＤＹを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００５２】
好ましくは、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号７の配列を含んでなり、ここで、配列番号７は下記配列を有する。
【化３】
2019530661.tif 000004
【００５３】
抗体Ｂ１の軽鎖可変領域は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号８の配列を含んでなり、ここで、配列番号８は下記配列を有する。
【化４】
2019530661.tif 000005
【００５４】
抗体Ｂ１は、好ましくは、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでなる。好ましい実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＡ１またはヒトＩｇＡ２重鎖定常領域、好ましくは、ヒトＩｇＡ２；より好ましくは、ヒトＩｇＡ２ｍ、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１またはＩｇＡ２ｍ２、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１重鎖定常領域である。別の好ましい実施形態では、この抗体は、マウスＩｇＧ２領域、好ましくは、ＩｇＧ２ｃ定常領域を含んでなる。
【００５５】
好ましい実施形態では、抗体Ｂは、Ｂ１抗体である。
【００５６】
抗体ＢまたはＢ１は、好ましくは、重鎖と軽鎖を含んでなり、重鎖は、配列番号７の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４または５の配列を含んでなる。
【００５７】
抗体ＢまたはＢ１は、好ましくは、配列番号８の配列、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００５８】
本発明はまた、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮｐｓＥＫ」（Ｎが太字）と結合し得る可変ドメインを含んでなり、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＣＤＣ機能性を有する抗体（Ｃ）も提供する。好ましくは、それは、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと類似のＡＤＣＣ機能性を含んでなる。抗体により結合されるＣＤ２０内のエピトープは、「ＥＰＡＮｐｓＥＫ」（Ｎが太字）である。大文字、小文字および太字は、抗体のペプチドへの結合に対するアミノ酸の関連を示す。太字の文字は、そのアミノ酸が抗体の結合に対する主要寄与因子であることを示し、小文字は、そのアミノ酸が結合に対して中等度の寄与を有することを示し、プレーンテキストの大文字は、そのアミノ酸が抗体のペプチドへの結合への寄与が小さいかまたは検出不能であることを示す。この抗体は、「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」内のアミノ酸Ｎがアラニンで置換されたＣＤ２０タンパク質に対して２０％未満の結合を示し、それにより、この結合は、非修飾ＣＤ２０タンパク質への抗体の結合と比較される。
【００５９】
また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＴＹＹＹＧＳＳＰＹＷＳＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体（Ｃ１）も提供される。この抗体は、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＣＤＣ機能性を有する。好ましくは、それは、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと類似のＡＤＣＣ機能性を含んでなる。重鎖可変領域は、好ましくは、それぞれ配列ＳＹＮＭＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＴＹＹＹＧＳＳＰＹＷＳＦＤＶを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００６０】
好ましくは、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号９の配列を含んでなり、ここで、配列番号９は下記配列を有する。
【化５】
2019530661.tif 000006
【００６１】
抗体Ｃ１の軽鎖可変領域は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１０の配列を含んでなり、ここで、配列番号１０は、下記配列を有する。
【化６】
2019530661.tif 000007
【００６２】
抗体Ｃ１は、好ましくは、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでなる。好ましい実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＡ１またはヒトＩｇＡ２重鎖定常領域、好ましくは、ヒトＩｇＡ２；より好ましくは、ヒトＩｇＡ２ｍ、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１またはＩｇＡ２ｍ２、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１重鎖定常領域である。別の好ましい実施形態では、この抗体は、マウスＩｇＧ２領域、好ましくは、ＩｇＧ２ｂ定常領域を含んでなる。
【００６３】
好ましい実施形態では、抗体Ｃは、Ｃ１抗体である。
【００６４】
抗体ＣまたはＣ１は、好ましくは、重鎖と軽鎖を含んでなり、前記重鎖は、配列番号９の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４、または５の配列を含んでなる。
【００６５】
抗体ＣまたはＣ１は、好ましくは、配列番号１０の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００６６】
また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＳＲＬＦＤＳＳＹＧＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体Ｄ１も提供される。この抗体は、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＣＤＣおよび／または高いＡＤＣＣ機能性を有する。好ましくは、それは、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと同様に高いＡＤＣＣ機能性を含んでなる。重鎖可変領域は、好ましくは、それぞれ配列ＳＹＮＭＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＳＲＬＦＤＳＳＹＧＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００６７】
好ましくは、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１１の配列を含んでなり、ここで、配列番号１１は、下記配列を有する。
【化７】
2019530661.tif 000008
【００６８】
抗体Ｄ１の軽鎖可変領域は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１２の配列を含んでなり、ここで、配列番号１２は、下記配列を有する。
【化８】
2019530661.tif 000009
【００６９】
抗体Ｄ１は、好ましくは、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでなる。好ましい実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＡ１またはヒトＩｇＡ２重鎖定常領域、好ましくは、ヒトＩｇＡ２；より好ましくは、ヒトＩｇＡ２ｍ、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１またはＩｇＡ２ｍ２、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１重鎖定常領域である。別の好ましい実施形態では、この抗体は、マウスＩｇＧ２領域、好ましくは、ＩｇＧ２ｃ定常領域を含んでなる。
【００７０】
好ましい実施形態では、抗体Ｄは、Ｄ１抗体である。
【００７１】
抗体ＤまたはＤ１は、好ましくは重鎖と軽鎖を含んでなり、重鎖は、配列番号１１の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４、または５の配列を含んでなる。
【００７２】
抗体ＤまたはＤ１は、好ましくは、配列番号１２の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を有する軽鎖を含んでなる。
【００７３】
本発明はまた、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２定常領域、およびＲａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０上のエピトープ「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」（ＮとＳが太字）と結合し得る可変ドメインを含んでなり、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＣＤＣおよび／または高いＡＤＣＣ機能性を有する抗体（Ｅ）も提供する。抗体により結合されるＣＤ２０内のエピトープは、「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」（ＮとＳが太字）である。大文字、小文字および太字は、抗体のペプチドへの結合に対するアミノ酸の関連を示す。太字の文字は、そのアミノ酸が抗体の結合に対する主要寄与因子であることを示し、小文字は、そのアミノ酸が結合に対して中等度の寄与を有することを示し、プレーンテキストの大文字は、そのアミノ酸が抗体のペプチドへの結合への寄与が小さいかまたは検出不能であることを示す。この抗体は、「ＥＰＡＮｐＳＥＫ」内のアミノ酸ＮまたはＳの１以上がアラニンで置換されたＣＤ２０タンパク質に対して２０％未満の結合を示し、この場合、この結合は、非修飾ＣＤ２０タンパク質への抗体の結合と比較される。
【００７４】
また、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する可変ドメインを含んでなり、前記重鎖可変領域が配列ＳＡＹＹＧＳＮＶＷＦＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなることを特徴とする、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるヒトＣＤ２０の細胞外部分と結合し得る抗体（Ｅ１）も提供される。この抗体は、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較した場合に高いＣＤＣおよび／または高いＡＤＣＣ機能性を有する。重鎖可変領域は、好ましくは、それぞれ配列ＳＹＮＬＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＳＡＹＹＧＳＮＶＷＦＦＤＶを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる。
【００７５】
好ましくは、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１３の配列を含んでなり、ここで、配列番号１３は、下記配列を有する。
【化９】
2019530661.tif 000010
【００７６】
抗体Ｅ１の軽鎖可変領域は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１４の配列を含んでなり、ここで、配列番号１４は、下記配列を有する。
【化１０】
2019530661.tif 000011
【００７７】
抗体Ｅ１は、好ましくは、マウスＩｇＧ２；ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２重鎖定常領域またはそれらの組合せを含んでなる。好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでなる。好ましい実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＡ１またはヒトＩｇＡ２重鎖定常領域、好ましくは、ヒトＩｇＡ２；より好ましくは、ヒトＩｇＡ２ｍ、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１またはＩｇＡ２ｍ２、好ましくは、ＩｇＡ２ｍ１重鎖定常領域である。別の好ましい実施形態では、この抗体は、マウスＩｇＧ２領域、好ましくは、ＩｇＧ２ｃ定常領域を含んでなる。
【００７８】
好ましい実施形態では、抗体Ｅは、Ｅ１抗体である。
【００７９】
抗体ＥまたはＥ１は、好ましくは、重鎖と軽鎖を含んでなり、重鎖は、配列番号１３の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４、または５の配列を含んでなる。
【００８０】
抗体ＥまたはＥ１は、好ましくは、配列番号１４の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を有する軽鎖を含んでなる。
【００８１】
抗体の機能性は、同じアイソタイプの定常領域を有するリツキシマブと比較することができる。これは好ましくは同じ定常領域である。定常領域にはいくつかのアミノ酸差異が存在してよいが、このようなアミノ酸差異は、例えば、体細胞超突然変異によって導入することができる。０〜５のアミノ酸の差異が一般に許容され、より多い差異も可能であるが、機能性の比較のためには、抗体およびリツキシマブの定常領域は同じであることが好ましい。
【００８２】
本発明の抗体は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する重鎖可変領域を有することができ、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、これらのＣＤＲの配列は、各配列番号で示される通りである。重鎖可変領域は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜４のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することが好ましく、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。重鎖可変領域は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜３、より好ましくは、０〜２、より好ましくは、０〜１のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することが好ましく、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい実施形態では、本発明の抗体内の重鎖可変領域は、示された配列番号の配列に関してアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有さない。
【００８３】
本発明の抗体は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する軽鎖可変領域を有することができ、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、各配列番号で示される通りである。軽鎖可変領域は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜４のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することが好ましく、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。軽鎖可変領域は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜３、より好ましくは、０〜２、より好ましくは、０〜１のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することが好ましく、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい実施形態では、本発明の抗体内の軽鎖可変領域は、示された配列番号の配列に関してアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有さない。
【００８４】
本発明の抗体の重鎖は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することができ、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、各配列番号で示される通りである。重鎖は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜１０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することが好ましく、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。重鎖は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することができ、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。重鎖は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜３、より好ましくは、０〜２、より好ましくは、０〜１のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することが好ましく、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい実施形態では、本発明の抗体内の重鎖は、示される配列番号の配列に関してアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有さない。
【００８５】
本発明の抗体の軽鎖は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することができ、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。従って、ＣＤＲの配列は、各配列番号で示される通りである。軽鎖は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜１０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することが好ましく、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。軽鎖は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することができ、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。軽鎖は、各配列番号により示される配列に関して１以上の位置に０〜３、より好ましくは、０〜２、より好ましくは、０〜１のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有することが好ましく、ここで、これらの１以上の位置は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内の位置ではない。好ましい実施形態では、本発明の抗体内の軽鎖は、示された配列番号の配列に関してアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有さない。
【００８６】
本明細書に記載されるような抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１は、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるようなＣＤ２０の細胞外部分上の示されたエピトープ以外で、抗原と結合する１つの可変ドメインを含んでなる二重特異性抗体であり得る。他の抗原は、好ましくは、ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＣＤ３およびＣＤ４７である。好ましい実施形態では、抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１は、Ｒａｍｏｓ細胞上で発現されるようなＣＤ２０の細胞外部分上の同じエピトープとそれぞれ結合する２つの可変ドメインを含んでなり、ここで、エピトープは、抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１の可変ドメインに関して示される通りである。抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１は、好ましくは、２つの同一の可変ドメインを含んでなる。抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１は、好ましくは、それぞれ同じエピトープと結合する２つの可変ドメインを含んでなり、かつ、同じＶＨ配列および同じＶＬ配列を含んでなる。
【００８７】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１の可変ドメインを含んでなるＣＡＲ−Ｔ受容体を提供する。可変ドメインは、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する、各抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変鎖領域を含んでなる。各重鎖および軽鎖可変領域の配列を図１８に示す。
【００８８】
例えば、ＣＡＲ−Ｔ受容体は、好ましくは、抗体Ａ１の可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、可変ドメインは、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する、配列番号１および２の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる。
【００８９】
ＣＡＲ−Ｔ受容体は、好ましくは、抗体Ｂ１の可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、可変ドメインは、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する、配列番号７および８の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる。
【００９０】
ＣＡＲ−Ｔ受容体は、好ましくは、抗体Ｃ１の可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、可変ドメインは、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する、配列番号９および１０の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる。
【００９１】
ＣＡＲ−Ｔ受容体は、好ましくは、抗体Ｄ１の可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、可変ドメインは、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する、配列番号１１および１２の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる。
【００９２】
ＣＡＲ−Ｔ受容体は、好ましくは、抗体Ｅ１の可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、可変ドメインは、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する、配列番号１３および１４の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる。
【００９３】
また、養子細胞移入において使用するための本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞受容体を含んでなるＴ細胞も提供される。この使用は好ましくは、必要とする個体に本明細書に記載されるような抗体を投与することを含んでなる、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫；有毛細胞白血病；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、または黒色腫などのＣＤ２０陽性腫瘍を有する個体の治療を目的とする。それはまた、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する小児および幹細胞移植後にＢ細胞疾患を有する小児白血病患者の治療にも有用である。
【００９４】
特定の位置のアミノ酸を変化させる理由は免疫原性であり得る。他の理由としては、他の理由としては、限定されるものではないが、抗体の生産および均質性の改善が含まれる。本発明の抗体は、マウスバックグラウンドに由来する重鎖可変鎖領域および軽鎖可変鎖領域を有する。このような可変ドメインを有する抗体は、ヒトにおいて使用可能である。これまでのところ、このような可変ドメインを脱免疫化することが好ましい。脱免疫化は一般に、マウス配列を可能な限り多くのヒト配列に改変することを含む。一般に、このような改変は、可変ドメインから１以上のＴ細胞エピトープまたは２以上のＢ細胞エピトープを除去することに向けられる。好ましい実施形態では、本発明は、エピトープの少なくとも１つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することにより１以上の（ヒト）Ｔ細胞エピトープが除去された抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１を提供する。多くの場合、それはいわゆる「アンカー」アミノ酸を置換するために十分である。  好適な置換アミノ酸は、特定のＶＨまたはＶＬの体細胞超突然変異体から得ることができる。ヒト抗体においてその位置に本来存在しているアミノ酸による置換が好ましい。好ましい実施形態では、本発明は、エピトープの少なくとも１つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することにより１以上の（ヒト）Ｂ細胞エピトープが除去された抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１を提供する。多くの場合、それは、エピトープのアミノ酸を１個だけ置換するために十分である。好適な置換アミノ酸は、特定のＶＨまたはＶＬの体細胞超突然変異体から得ることができる。ヒト抗体においてその位置に本来存在しているアミノ酸による置換が好ましい。好ましくは、本発明の可変ドメインは、１以上の外部残基に関して修飾されている。このような残基は免疫系が容易に遭遇でき、好ましくは、ヒト残基で選択的に置換されて弱い免疫原性かまたは実質的に非免疫原性の表面を含んでなるハイブリッド分子を提供する。好適な置換アミノ酸は、特定のＶＨまたはＶＬの体細胞超突然変異体から得ることができる。ヒト抗体においてその位置に本来存在しているアミノ酸による置換が好ましい。従って、本発明はさらに、ヒト化重鎖可変領域、ヒト化軽鎖可変領域またはそれらの組合せを含んでなる抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１も提供する。
【００９５】
本発明はさらに、個体における疾患の治療において使用するための抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１も提供する。また、過剰なＢ細胞、過活動Ｂ細胞、および／または機能不全Ｂ細胞を含む疾患の治療において使用するための抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１も提供される。さらに、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫；有毛細胞白血病；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、および黒色腫などのＣＤ２０陽性腫瘍の治療において使用するための抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１も提供される。
【００９６】
また、過剰なＢ細胞、過活動Ｂ細胞、および／または機能不全Ｂ細胞を含む疾患の治療のための薬剤の製造のための抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１の使用も提供される。また、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫；有毛細胞白血病；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、および黒色腫などのＣＤ２０陽性腫瘍の治療のための薬剤の製造のための抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１の使用も提供される。
【００９７】
また、必要とする個体に抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１を投与することを含んでなる、過剰なＢ細胞、過活動Ｂ細胞、および／または機能不全Ｂ細胞を含む疾患を有する個体の治療のための方法も提供される。
【００９８】
さらに、必要とする個体に抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、またはＥ１を投与することを含んでなるＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫；有毛細胞白血病；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、または黒色腫などのＣＤ２０陽性腫瘍を有する個体の治療のための方法も提供される。
【００９９】
本発明はまた、重鎖、軽鎖および／またはそれらの可変領域をコードする核酸分子も提供する。このような核酸分子は、他を排するものではないが一般に、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）などの別の核酸も当業者に利用可能である。本発明により提供される核酸分子の例は以下の通りである：
本明細書に記載されるような抗体重鎖または軽鎖をコードする核酸分子；
本明細書に記載されるような抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ３をコードする核酸分子；
本明細書に記載されるような抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をコードする核酸分子；および
本明細書に記載されるような抗体の重鎖または軽鎖の可変領域をコードする核酸分子。
【０１００】
配列ＳＮＳＹＧＳＴＹＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１０１】
それぞれ配列ＳＹＮＬＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＳＮＳＹＧＳＴＹＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１０２】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１の配列を有する重鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号１は下記の配列を有する。
【化１１】
2019530661.tif 000012
【０１０３】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号２の配列を有する軽鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号２は下記の配列を有する。
【化１２】
2019530661.tif 000013
【０１０４】
配列番号１の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４または５の配列を含んでなる重鎖をコードする核酸分子。
【０１０５】
配列番号２の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を含んでなる軽鎖をコードする核酸分子。
【０１０６】
配列ＹＹＹＧＳＳＹＧＡＭＤＹを有するＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１０７】
それぞれ配列ＳＹＮＭＨ、ＧＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＹＹＹＧＳＳＹＧＡＭＤＹを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１０８】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号７の配列を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号７は下記の配列を有する。
【化１３】
2019530661.tif 000014
【０１０９】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号８の配列を含んでなる軽鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号８は下記の配列を有する。
【化１４】
2019530661.tif 000015
【０１１０】
配列番号７の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４または５の配列を含んでなる重鎖をコードする核酸分子。
【０１１１】
配列番号８の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を含んでなる軽鎖をコードする核酸分子。
【０１１２】
配列ＴＹＹＹＧＳＳＰＹＷＳＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１１３】
それぞれ配列ＳＹＮＭＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＴＹＹＹＧＳＳＰＹＷＳＦＤＶを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１１４】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号９の配列を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号９は下記の配列を有する。
【化１５】
2019530661.tif 000016
【０１１５】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１０の配列を含んでなる軽鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号１０は下記の配列を有する。
【化１６】
2019530661.tif 000017
【０１１６】
配列番号９の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４、または５の配列を含んでなる重鎖をコードする核酸分子。
【０１１７】
配列番号１０の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を含んでなる軽鎖をコードする核酸分子。
【０１１８】
配列ＳＲＬＦＤＳＳＹＧＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１１９】
それぞれ配列ＳＹＮＭＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＳＲＬＦＤＳＳＹＧＷＹＦＤＶを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１２０】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１１の配列を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号１１は下記の配列を有する。
【化１７】
2019530661.tif 000018
【０１２１】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１２の配列を含んでなる軽鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号１２は下記の配列を有する。
【化１８】
2019530661.tif 000019
【０１２２】
配列番号１１の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４、または５の配列を含んでなる重鎖をコードする核酸分子。
【０１２３】
配列番号１２の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を有する軽鎖をコードする核酸分子。
【０１２４】
配列ＳＡＹＹＧＳＮＶＷＦＦＤＶを有するＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１２５】
それぞれ配列ＳＹＮＬＨ、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧおよびＳＡＹＹＧＳＮＶＷＦＦＤＶを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【０１２６】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１３の配列を含んでなる重鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号１３は下記の配列を有する。
【化１９】
2019530661.tif 000020
【０１２７】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号１４の配列を含んでなる軽鎖可変領域をコードする核酸分子、ここで、配列番号１４は下記の配列を有する。
【化２０】
2019530661.tif 000021
【０１２８】
配列番号１３の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号３、４、または５の配列を含んでなる重鎖をコードする核酸分子。
【０１２９】
配列番号１４の配列ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を構成するアミノ酸の位置以外の１以上の位置に０〜１５のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加またはそれらの組合せを有する配列番号６の配列を有する軽鎖をコードする核酸分子。
【０１３０】
本明細書に記載されるような核酸分子は好ましくは、前記核酸分子を含んでなる細胞による、本明細書に記載されるような抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１またはＥ１の生産のために使用される。２以上の示された配列を含んでなる核酸分子は、前記核酸分子を含んでなる細胞による本明細書に記載されるような抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１またはＥ１の生産のために好適な順序および連結でこのような配列を含んでなる。核酸分子は好ましくは、記載されるような抗体の発現のための１以上の配列をさらに含んでなる。このような配列の限定されない例は、プロモーター、終止配列、エンハンサー、イントロンなどである。このような配列は、例えば、細胞の染色体内の核酸分子の組み込み部位、または前記核酸分子を含んでなるベクターによってシスで提供され得るので、このような配列は核酸分子上に必ずしも存在する必要はない。細胞染色体内の好適な組み込み部位は、例えば、相同組換えの手段によって容易に決定および標的化することができる。
【０１３１】
さらに、本明細書に記載されるような１以上の核酸分子を含んでなる細胞も提供される。
【０１３２】
さらに、本発明の核酸分子または本発明の核酸分子を含んでなる細胞を用いる、本明細書に記載されるような抗体の生産のための手段および方法も提供される。
【０１３３】
本発明による核酸は、例えば、細胞に含まれる。前記核酸が前記細胞で発現されると、その核酸分子の翻訳産物が本発明の抗体に組み込まれ得る。従って、本発明はまた、本発明による核酸分子を含んでなる細胞も提供する。本発明はさらに、本発明の核酸分子を含んでなり、かつ、本発明の抗体を生産することができる細胞を提供する。さらに、本発明の抗体をコードする１以上の核酸分子を発現させることを含んでなる細胞を培養すること、および培養培地、細胞またはそれらの組合せから前記抗体を採取することを含んでなる、本発明の抗体を生産するための方法も提供される。前記細胞は好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞である。細胞は好ましくは、ヒトにおいて使用するための抗体の生産のために通常使用される細胞である。このような細胞の限定されない例は、ＣＨＯ、ＮＳＯおよびＰＥＲ．Ｃ６細胞である。細胞は、特定の目的に適合するように特に設計されてよく、例えば、抗体の生産のために使用されるほとんどの細胞株は、懸濁液中、高密度および他の特性において増殖するように適合されている。本発明において、好適な  細胞は、本発明による抗体を含んでなり得る、好ましくは生産することができる任意の細胞である。
【０１３４】
特許請求されるようなＰＣＤ機能は好ましくは、フローサイトメトリーにおけるアネキシンＶ陽性に基づく方法で測定される（例えば、例３に記載の通り）。
【０１３５】
特許請求されるような抗体のＡＤＣＣ機能は好ましくは、健常ボランティアから採取した血液においてフローサイトメトリーで測定され、ＣＤ２４陽性細胞の減少、骨髄マーカー陰性、または古典的クロム放出アッセイにより測定されるＢ細胞枯渇に基づく方法で測定される（例えば、例１に記載の通り）。
【０１３６】
特許請求されるような抗体のＣＤＣは好ましくは、フローサイトメトリーにおける７ＡＡＤ陽性に基づく方法で測定される（例えば、例１参照）。
【実施例】
【０１３７】
例１  新規なＣＤ２０抗体およびこれらの抗体の機能特性を支配する分子決定因子
材料および方法
抗体
ＣＤ２０  ｍＡｂは、細胞免疫誘導および標準的な脾細胞の融合によるハイブリドーマの取得によって作製した。アイソタイプは、ＦＡＣＳ（ラット−抗ｍＩｇＧ２ａ−ビオチン（ｍＩｇＧ２ｃと交差反応する；ＢＤ）、ヤギ−抗ｍＩｇＧ２ｂ−Ｆｃγ−ＲＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、ヤギ−抗ｍＩｇＧ３−ＰｅｒＣＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ））により決定した。ｍＡｂは、無血清培地で増殖させた後に、ＨｉＴＲａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。結合したタンパク質を０．１Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ２．５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶出させ、そのまま１Ｍのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８で中和した。キメラＩｇＧ１（ＩｇＧ１）ｍＡｂは、可変領域（Ｓｈｉｎｅｇｅｎｅにより合成）をＬｏｎｚａ発現ベクター（ｐＥＥ１４．４−κＬＣ、ｐＥＥ１４．４−ＩｇＧ１）にクローニングすることによって作製した。Ｌ１１Ｖ突然変異を部位特異的突然変異誘発によって導入した。ＩｇＧ１  ｍＡｂは総て、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞２２の一過性トランスフェクションによって生産し、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。総てのｍＡｂをＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対して透析し、濃度を下式：２８０ｎｍでのＯＤ値／補正係数（ｍＩｇＧ  １．３６；ｃｈＩｇＧ  １．３５）を用いて求めた。
【０１３８】
ＲＴＸ（ｃｈＩｇＧ１；Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）、ＯＦＡ（ヒト（ｈ）ＩｇＧ１；Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）、マウス（ｍ）ＩｇＧ２ａ−ＣＤ２０−７Ｄ８（ｍ７Ｄ８）およびｍＩｇＧ２ａ−ＣＤ２０−１１Ｂ８（ｍ１１Ｂ８）（厚意によりＧｅｎｍａｂ  ＢＶ、ユトレヒト、オランダにより提供）、Ｂ１（ｍＩｇＧ２ａ、厚意によりＭａｒｋ  Ｃｒａｇｇ、サウサンプトン、ＵＫにより提供）およびｍＩｇＧ２ａ−ＲＴＸ（ｍＲＴＸ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、必要であれば、ＰＢＳに対して透析した。Ａｂは製造者の説明書に従い、ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＡｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。
【０１３９】
細胞株
ＳＫＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ）に、レトロウイルスによりヒトＣＤ２０を形質導入してＳＫＢＲ３−ＣＤ２０細胞を作出した。ＣＤ２０を安定発現するサブクローンを限界希釈によって樹立した。ＥＬ４−ＣＤ２０細胞は、従前に記載されているように２３作出した。Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）、および上述の細胞は、３７℃／５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０＋ＨＥＰＥＳ＋グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有培養培地で培養した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、オービタルシェーカー上、３７℃／８％  ＣＯ２にて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。
【０１４０】
可変領域のコンセンサスアミノ酸配列の決定
凍結乾燥細胞ペレットから、ＲＮＡを単離し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）とともに、精製されたＲＮＡ（２μｇ）をｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用した。次に、軽鎖可変（ＶＬ）および重鎖可変（ＶＨ）領域をＰＣＲ反応で増幅した（補足の材料および方法を参照）。ゲル精製したＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ平滑ＴＯＰＯベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングし、ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、いくつかのクローンからプラスミドＤＮＡを単離した。その後、各ｍＩｇＧ−ＣＤ２０  ｍＡｂからのＶＬおよびＶＨ領域のコンセンサスＤＮＡ配列を、挿入配列を含有するいくつかのプラスミドクローンのＤＮＡシークエンシング（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）によって決定した。各ｍＡｂのいくつかのクローンの配列情報に基づき、コンセンサスＶ領域配列を決定し、その後の、アミノ酸配列を推定した。
【０１４１】
同型凝集および細胞生存率アッセイ
０．４×１０５のＥＬ４−ＣＤ２０細胞を、培養培地中１μｇ／ｍＬのＡｂとともに９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。架橋条件において、以下のＡｂを３０分後に加えた：２０μｇ／ｍＬのウサギ−Ｆ（ａｂ’）２−抗ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）または５０μｇ／ｍＬのウサギ−Ｆ（ａｂ’）２−抗ｍＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）。同型凝集は、ＥＶＯＳ顕微鏡（２０倍）を用いて半定量的に評価した。細胞生存率は、製造者の説明書に従い、アネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）染色により決定した。
【０１４２】
ヒトＰＢＭＣ  ＡＤＣＣ
５１Ｃｒ標識標的細胞を用いるＡＤＣＣアッセイを従前に記載されているように行った２２，２４。簡単に述べれば、フィコール分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により健常個体（ＭｉｎｉＤｏｎｏｒＤｉｅｎｓｔ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）から単離したＰＢＭＣを５１Ｃｒ標識Ｄａｕｄｉ細胞（エフェクター：標的比＝１００：１）および希釈したＣＤ２０  ｍＡｂと合わせた。３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、上清を採取し、液体シンチレーションカウンター（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にて計数した。溶解率を下式：溶解率％＝（（サンプルの計数値−最小放出）／（最大放出−最小放出））×１００を用いて計算した。それぞれ最小放出および最大放出を決定するために、培養培地または２．５％トリトンＸ−１００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加した培地中でＤａｕｄｉ細胞をＰＢＭＣとともに使用した。
【０１４３】
ＣＤＣアッセイ
１０５の細胞（Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ）を９６ウェルプレートに播種し、室温で３０分間、培養培地で希釈したＡｂとともにプレインキュベートした。補体源としてのヒト血清（８名の健常ドナーからプール）（終濃度１５．５％）を加え、この調製物を３７℃／５％ＣＯ２で１５分間維持した。補体により媒介される溶解の程度を、７−ＡＡＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇ）染色により評価した。細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）にて測定した。
【０１４４】
ＣＤ２０ペプチドライブラリー設計およびスクリーン
ＣＤ２０ペプチドライブラリーの設計は他所に記載されている２０。簡単に述べれば、２つの細胞外ループにわたるサイズの異なるループを有する、線状および環状の両方のペプチドを、直接ポリプロピレンプレート上に合成した２５，２６。線状および不連続エピトープを再構築し、各ペプチドに関して全アミノ酸スキャンを含めた（補足の材料および方法を参照）。
【０１４５】
ＣＤ２０  ｍＡｂによるペプチドの認識は、従前に記載されているように２０ＰｅｐＳｃａｎに基づくＥＬＩＳＡで評価した。簡単に述べれば、ペプチドを共有結合させたプレートに１μｇ／ｍＬのｍＡｂを加え、４℃で一晩インキュベートした。十分な洗浄の後、結合したｍＡｂをＨＲＰ結合ウサギ抗ｍＩｇＧ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で２５℃にて１時間検出した。結合していない検出Ａｂを洗い流した。ＡＢＴＳ基質を用いプレートを現像し、ＣＣＤカメラおよび画像処理システムを用いて発色を定量した。
【０１４６】
突然変異体スクリーン
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、製造者の説明書に従って２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、野生型または変異型ＣＤ２０をコードするベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション１日後に、細胞を採取し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、氷上にて３０分間、５μｇ／ｍＬのＣＤ２０  ｍＡｂで染色した。ｍＡｂ結合をヤギ抗ｈＩｇＧ−ＡＰＣまたはヤギ抗ｍＩｇＧ−ＡＰＣ  Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）で検出した。細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）にて測定した。
【０１４７】
リガンドトレーサー
ｍＡｂとＣＤ２０の間の相互作用の動態分析は、ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ  ｇｒｅｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＢ）を用いて行った。１０６のＳＫＢＲ３−ＣＤ２０細胞を標的細胞領域として、１０ｃｍの培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の片側に播種し、１０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＤ２０  ｍＡｂの会合を測定した。非競合解離または競合解離として、標識ｍＡｂ溶液をそれぞれＲＰＭＩ培養培地または同じクローンの非標識ｍＡｂ  １００ｎＭで置き換えた。分析は、ＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒ（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＢ）にてＯｎｅＴｏＯｎｅフィッティングモデルを用いて行った。
【０１４８】
ＥＬ４−ＣＤ２０リンパ腫モデル
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｊａｎｖｉｅｒ（フランス）から購入するか、または本発明者らの施設で育てた。マウス４〜６個体／群に５×１０５のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（１０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）標識ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。１６時間後、マウスをｍＡｂまたはＰＢＳ（１００μＬ）のｉ．ｐ．注射で処置した。５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳでの腹腔洗浄を２４時間後に行い、残存する腫瘍細胞の量を、ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブ（ＢＤ）を用いて測定した。実験は総てＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔの動物倫理委員会によって承認されたものであった。
【０１４９】
補足の材料および方法
ＶＨおよびＶＬ領域の増幅
ＰＣＲ反応は、製造者の説明書に従い、２５ｎｇのｃＤＮＡ、１×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、それぞれシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡに、および抗体の定常領域にアニールする２５ｐｍｏｌの５’および３’プライマー（Ｂｉｏｌｅｇｉｏ）、ならびにＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んだ。増幅は、９５℃で２分間の初期変性、次いで、３４回の９５℃で３０秒の変性、５５または６０℃で３０秒のアニーリング、および６８℃で２．５分の伸長、最後に３４サイクルの後に６８℃で７分の伸長を行った。ＰＣＲチューブは、さらに処理を行うまで４℃で維持した。
【０１５０】
結合アッセイ
１０５のＤａｕｄｉ細胞を９６ウェルプレートに播種し、４５分間氷上でｍＩｇＧ  ＣＤ２０  ｍＡｂ（ＰＢＳ中）とともにインキュベートした。洗浄後、結合したＣＤ２０  ｍＡｂをヤギ−Ｆ（ａｂ’）２−抗ｍＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＡＰＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出し、その後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）にて測定した。
【０１５１】
エピトープマッピング実験に使用したペプチドライブラリーの詳細な説明
２つの細胞外ＣＤ２０ループにわたるシングルドメインペプチドおよびダブルドメインペプチドを、線状エピトープおよび不連続エピトープを再構築するために使用した。各ペプチドに関して、フルポジショナルａａスキャン（すなわち、各位置が他の総てのａａで置換される）を含めた。ライブラリーの第２の部分は、Ｐｅｐｓｃａｎ技術(www.pepscan.nl)を用いてシステインに基づくループを導入することにより、環状ペプチドからなった。以下のペプチドが含まれた：（ａ）各３４マーペプチドのフルアラニンスキャンを含め、大ループにわたる総てのオーバーラッピング線状３４マー；（ｂ）２つの異なる部分に散在する不連続エピトープをマッピングするために、大ループに由来する３４のオーバーラッピングペプチドと小ループに由来する１ペプチドを互いに３５×３５のマトリックスで組み合わせた；（ｃ）完全なＣＤ２０にわたる全オーバーラッピング線状１５マー；（ｄ）ＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳのフルポジショナルａａスキャン（システインを除く）；（ｅ）ペプチドにわたる１つのダブルループを有する小ループ；（ｆ）特定のループサイズに依存する立体配座エピトープを捕捉するための、大ループにわたる種々のサイズのシングルループペプチド、および（ｇ）ＣＤ２０分子の完全な細胞外配列にわたる全オーバーラッピングシングルループ１５マー。
【０１５２】
ＦＡＣＳに基づく解離
１０５のＤａｕｄｉ細胞を３７℃で１時間、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７標識ｍＡｂとともにインキュベートした後、ペレットとし、１００μｇ／ｍＬの非標識ｍＡｂまたは完全ＲＰＭＩ培養培地のいずれかに再懸濁させた。細胞を３７℃／５％ＣＯ２に置き、細胞に結合したｍＡｂのレベルを経時的に決定するために、示された時点でＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩにて測定した。各時点で残存する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、最初のＭＦＩに対するパーセンテージとして表した。
【０１５３】
結果
新規ＣＤ２０  ｍＡｂはＩ型の特徴を示す
本発明者らは、新規ＣＤ２０  ｍＡｂのパネルを作製し、詳細な特性決定を行った。６個体の免疫マウスの脾臓Ｂ細胞の融合の後、本発明者らはｍＩｇＧ２ｃ−、ｍＩｇＧ２ｂ−およびｍＩｇＧ３−ＣＤ２０  ｍＡｂを産生する１７の安定なハイブリドーマクローンを得た（表１）。１７のＣＤ２０  ｍＡｂのうち１４について、本発明者らは類似度の異なるユニークなＶＨおよびＶＬ鎖配列対を賦活化した（図１）。新規ｍＩｇＧ−ＣＤ２０  ｍＡｂと利用可能なＩ／ＩＩ型ＣＤ２０  ｍＡｂの比較によって、ＶＨ鎖のＣＤＲ３は保存性が最も低いことが明らかとなった（新規ｍＩｇＧ−ＣＤ２０  ｍＡｂではＲＴＸの２７〜６３％と同定）。さらなる研究のため、本発明者らは、１１のＣＤ２０  ｍＡｂを精製した。それらの結合は、Ｉ型ＣＤ２０  ｍＡｂ  ｍ７Ｄ８（同等の特性を有する１４が、ｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂとして発現されるＯＦＡと同じパネルに由来する）およびｍＲＴＸに匹敵した（図１９）。
【０１５４】
次に、本発明者らはそれらのＭｏＡを決定した。ＩＩ型ｍＡｂによって強く惹起されるＰＣＤ（図２Ａ）も同型凝集（図２０）のいずれも、架橋Ａｂの不在下では新規ＣＤ２０  ｍＡｂによって誘導されなかった。
【０１５５】
Ｉ／ＩＩ型ｍＡｂの共通の特徴として、本発明者らは、Ｄａｕｄｉ細胞を標的として、ＰＭＢＣをエフェクターとして用いるＡＤＣＣアッセイで特異的細胞溶解を判定した（図２Ｂ）。総てのｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂで同等の程度の溶解が得られた。対照的に、ｍＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂはあまり効果的ではなかった。注目すべきは、Ｉ型ｍＡｂによってのみ惹起されるＭｏＡであるＣＤＣ活性は、ＣＤ２０  ｍＡｂ間で著しく異なっていたことである（図２Ｃ）。
【０１５６】
新規ｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂのＣＤＣ能の変動
さらなる比較のため、本発明者らは、ｍＩｇＧ２ｃ  ｍＡｂがより高レベルのエフェクター機能を示したことから、それらに着目した。本発明者らは、高ＣＤ２０および低補体調節タンパク質（ＣＲＰ）発現のために補体媒介性の溶解に感受性のある細胞株であるＤａｕｄｉ細胞で、より広い濃度範囲でＣＤＣを分析した（図３Ａ）。ｍ１およびｍ９は、特に、０．１〜３μｇ／ｍＬ  ｍＡｂで最高のＣＤＣ活性を示した。ｍ１０は中等度のＣＤＣ効力を示し、ｍ２は最小の効力であった。Ｒａｍｏｓ細胞およびＲａｊｉ細胞を用いたアッセイでもｍ２に比べてｍ１によってより良好なＣＤＣ誘導が検出され、ＣＤ２０発現は低下し、ＣＲＰ発現は増強されていた（図３Ｂ）。
【０１５７】
オーバーラップするが明瞭に異なるエピトープを有する新規ＣＤ２０  ｍＡｂ
機能特性とエピトープの間の可能性のある相関を検討するために、本発明者らは、ｍ１およびｍ２（両方ともｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂであるが、ＣＤＣにおいて最高／最低）に、ＰｅｐＳｃａｎ技術を適用する詳細なエピトープマッピング分析を行った。本発明者らは、より大きな細胞外ループにわたるポジショナルアミノ酸スキャンとともに線状ペプチド（図２１Ａ）および環状ペプチド（図４Ａ、左）を使用することによって、ｍ１の重要な残基が１６８ＥＰＡＮＰＳＥＫ１７５であることを同定した。対照的に、ｍ２の線状ペプチド（図２１Ｂ）および環状ペプチド（図４Ａ、右）への結合のシグナルはむしろ低かった。しかしながら、野生型（ＷＴ）結合シグナルを下回るシグナルの低下は、１６８ＥＰＡＮＰＳＥＫ１７５配列モチーフ内にのみ見られた。このことは、両ｍＡｂのエピトープとも同じ領域内の大きい方のループに位置するが、それらの結合特性は異なることを示唆する。このデータは、ｍ１は線状エピトープに結合し、一方、ｍ２は立体配座エピトープに結合し得ることを示唆する。
【０１５８】
ペプチドスキャニングに基づき２つの新規ＣＤ２０  ｍＡｂのエピトープを同定した後、本発明者らは次に、完全なｍＡｂパネルに関して適切に折り畳まれたＣＤ２０上の認識部位を定義することに関心を持った。よって、本発明者らはまず、ＣＤ２０の小ループ（Ｔ１５９Ｋ／Ｎ１６３Ｄ／Ｎ１６６Ｄ）または大ループ（Ａ１７０Ｓ／Ｐ１７２Ｓ）のいずれかにおいてアミノ酸を変異させた２つのＣＤ２０突然変異体を用いてラフエピトープマッピング実験を行った（図４Ｂ）。新規ＣＤ２０  ｍＡｂに、ｍ７Ｄ８の結合領域における突然変異（Ｔ１５９Ｋ／Ｎ１６３Ｄ／Ｎ１６６Ｄ）時に結合障害を示したものはなかった。  ＲＴＸエピトープ領域内の突然変異（Ａ１７０Ｓ／Ｐ１７２Ｓ）の結果、総ての新規ＣＤ２０  ｍＡｂの結合が様々な程度に低減された（ＷＴ結合の０〜２０％：ＲＴＸ、ｍ１、ｍ６、ｍ７、ｍ１７；ＷＴ結合の２０〜３０％：ｍ３、ｍ４、ｍ５、ｍ１０；ＷＴ結合の５０〜８０％：ｍ２、ｍ９、ｍ１１）。
【０１５９】
大きい方の細胞外ループ内での結合に必要とされる重要なアミノ酸を決定するために、本発明者らは、１６８ＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰ１７８配列にわたる単一突然変異体ライブラリーを使用した（図４Ｃ）。ユニークな配列対を有する評価した１１のＣＤ２０  ｍＡｂは総て、明瞭に異なる結合パターンを示した。１１の新規ＣＤ２０  ｍＡｂに、それぞれＩＩ型ｍＡｂ  Ｂ１およびｍ１１Ｂ８の結合に影響を及ぼすことが判明した２つの残基Ｎ１７６またはＥ１７４の突然変異時に結合の低下を示したものはなかった。ｍ９の結合は、いずれの突然変異体によっても無傷のままであった。他の総ての新規ＣＤ２０  ｍＡｂは、ｍＲＴＸについて見られたように、Ｎ１７１の突然変異時にＣＤ２０分子への結合に障害を示した。これら２つの単一突然変異体Ａ１７０ＰおよびＰ１７２Ａは、Ａ１７０Ｓ／Ｐ１７２Ｓ二重突然変異体内の寄与アミノ酸の同定を可能とした。Ａ１７０Ｐ突然変異はｍＡｂ結合に影響を及ぼさなかった。対照的に、Ｐ１７２Ａ突然変異体は、ｍ２、ｍ９およびｍ１１を除く総ての新規ＣＤ２０  ｍＡｂの結合に影響を及ぼした。残基Ｓ１７３は、ｍＲＴＸ、ｍ１、ｍ４およびｍ１０の結合のために重要であると同定された。全体的に見れば、ほとんどの新規ＣＤ２０  ｍＡｂのエピトープは、１７０ＡＮＰＳＥ１７４まで狭くなり得たが、結合には違うアミノ酸が必要とされる。
【０１６０】
ＣＤ２０  ｍＡｂは結合安定性に変動を示す
緩慢なＡｂ解離速度は、古典的補体経路の第一成分であるＡｂ−Ｃ１ｑ複合体の形成に有利である可能性がある。ＦＡＣＳに基づく解離アッセイはｍ１およびｍ２のユニークな解離挙動を暗示し（図２２Ａ、Ｂ）、ｍ２に対してより速い解離／結合速度を示唆した。ｍＡｂの相互作用動態および親和性を特徴付けるために、本発明者らは、細胞受容体に対するＡｂのリアルタイム結合および解離を記録するためにリガンドトレーサー技術を使用した。本発明者らは、非競合条件（図５Ａ、左）および競合条件（図５Ａ、右）下で、４つ総てのｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂに関する動態分析を行い、それらの結合挙動の違いを検出した。総てのｍＡｂが、低ナノモル〜ナノモル下の範囲で同様の見掛けの親和性を有した（表３）。結合速度定数は総てのｍＡｂに関して同等であった。動態の主な違いは解離相で見られた。ＯＦＡ、ｍ９およびｍ１０は極めて緩慢に解離したが、ｍ１、ｍ２およびＲＴＸはより顕著な二相性の放出パターンを有し、ｍＡｂのある画分は急速に解離しているが、別の画分はより安定に結合していることを意味する（相互作用マップ分析により判定；データは示されていない）。また、ｍ９以外、競合条件下での解離は、非競合条件下よりも速く（図５Ｃ）、解離したｍＡｂが非競合条件下で細胞に再結合したことを示す。これは、例えば、他の受容体が近接している場合またはＡｂ−（ＣＤ２０）２またはＣＤ２０−Ａｂ−Ｃ１ｑ複合体など、Ａｂ結合が複数の結合によって安定化される場合に起こる。ｍ２は、放出の速いＡｂの最大の画分を有し、解離は競合によって最も強い影響を受ける。複数の相互作用によるより安定な複合体の形成は、競合はインキュベーション時間が延長された場合に標識ｍＡｂの放出により強い影響を有するという所見（図２２Ｃ、Ｄ）によって実証される。
【０１６１】
キメラ化は機能特性に影響を及ぼし得る
Ｂ−Ｌｙ１のＯＢＺへのヒト化の際に、ＶＨ鎖のＫａｂａｔ位置１１におけるロイシンからバリンへの突然変異が導入された。Ｖ１１Ｌ突然変異のＯＢＺ配列への挿入の結果、そのＰＣＤ能が低下し、その肘角が拡大した。この残基が一般にＣＤ２０  ｍＡｂのＭｏＡを変更するかどうかを評価するために、本発明者らは、それぞれキメラ化型のｍ１（ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１）およびｍ２（ＩｇＧ１−ＣＤ２０−２）に復帰突然変異（Ｌ１１Ｖ）を導入した。結合、ＡＤＣＣおよびＣＤＣは飽和濃度で同等であった（データは示されていない）。驚くことに、ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を用いたＰＣＤアッセイ（図６）で、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１は、Ｖ１１Ｌ突然変異の挿入時に消失した特性であるＰＣＤを誘導した。対照的に、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−２については、親型も変異型もＰＣＤを誘導しなかった。このことは、ＭｏＡはキメラ化の際に変化する可能性があること、および肘角決定領域はそれに重要な役割を果たすことを示す。
【０１６２】
新規ＣＤ２０  ｍＡｂはｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍応答に変動を示す
ｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂはｉｎ  ｖｉｔｒｏで最も効力があったことから、本発明者らは、本発明者らの研究室で従前に樹立した短期低腫瘍量モデル(short low tumor burden model)２７でそれらのｉｎ  ｖｉｖｏ効力を検討することにした。このモデルでは、ＣＤＣは、腫瘍細胞根絶のドミナントエフェクター機構であることが示された。ｍ１とｍ２がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて最も大きな違いを示したことから、本発明者らはまず、有効Ａｂ濃度を決定するためにこれら２つのｍＡｂを使用した（図７Ａ）。明らかな濃度依存的抗腫瘍応答が見られ、ｍ１では１μｇ  ｍＡｂで腫瘍細胞の完全なクリアランスが達成されたが、ｍ２では達成されなかった。残存するｍＩｇＧ２ｃ  ｍＡｂの有効性を１μｇで試験し、本発明者らは、ｍ９とｍ１０がｍ１と同等の機能であったことを示す（図７Ｂ）。
【０１６３】
考察
Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のために、ＣＤ２０を標的とするＲＴＸ（ｃｈＩｇＧ１）、ＯＦＡ（ｈＩｇＧ１）およびＯＢＺ（ＡＤＣＣの増強のために糖鎖が改変されたｈＩｇＧ１  Ｆｃ領域）がＦＤＡの承認を受けている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、それらはＡＤＣＣおよびＣＤＣ（Ｉ型；ＲＴＸおよびＯＦＡ）またはＡＤＣＣおよびＰＣＤ（ＩＩ型；ＯＢＺ）のいずれかによって媒介される腫瘍細胞の死滅を誘導する。例えば、あまり有益でないＦｃγＲ多形または違うタイプのＢ細胞悪性腫瘍を有する特定の患者群は、高補体活性ｍＡｂまたはアポトーシス誘導ｍＡｂによる治療から利益を受け得ると思われる。より有効なＣＤ２０治療用ｍＡｂを開発するためには、ＣＤ２０  ｍＡｂのＭｏＡを指示する、基礎にある特徴のさらなる理解が重要である。型特異的なＣＤ２０  ｍＡｂを作出することは、ＣＤ２０分子自体の低い自然免疫原性のためだけでなく、どのＡｂ特性が機能に関連があるかの理解の欠如のために依然として困難である。本発明者らは、所内で開発した効率的な免疫誘導法を用いて新規ＣＤ２０  ｍＡｂを作製し、さらなる特性評価のために１１のｍＡｂを精製した。機能特性の研究により、総ての新規ＣＤ２０  ｍＡｂが、ＣＤＣを誘導するがＰＣＤは誘導しないことから、Ｉ型特性を示すことが明らかになった。本発明者らのパネルにおいて、ｍＩｇＧ２ｂは最も頻度の高いアイソタイプであり、ｍＩｇＧ２ｃおよびｍＩｇＧ３がそれに次いだ。ｍＩｇＧ２ｃ  ＡｂおよびｍＩｇＧ２ｂ  ＡｂはＣ５７ＢＬ／６マウスの重鎖のクラススイッチ順序（５’ｃμ−ｃδ−ｃγ３−ｃγ１−ｃγ２ｂ−ｃγ２ｃ−ｃε−ｃα３’）でさらに発達することから２８、これはより成熟したＡｂの指標となる。この可変領域における多様性は、本発明者らが親和性成熟したＣＤ２０  ｍＡｂを作出したことを示した。
【０１６４】
本発明者らの新規ｍＡｂのＭｏＡの基礎にある特性を検討するために、本発明者らは、Ｋａｂａｔ位置１１における突然変異に基づき、エピトープ、結合動態および構造特性を決定した。エピトープに関して、ＣＤ２０の大ループのＣ末端部分がＢ１およびＯＢＺ結合に関連することが判明し、このエピトープがＡｂのＩＩ型特性に重要であることが示唆された１８，２９。しかしながら、ＯＢＺおよびＢ１のエピトープが類似の位置であることは、ＯＢＺの親ＡｂであるＢ−Ｌｙ１３０がヒト化前に完全なＩＩ型特性を示さない３１ということを完全に説明するものではない可能性が最も高い。加えて、ＩＩ型ｍＡｂ  １１Ｂ８のエピトープは、オーバーラッピングはないが、７Ｄ８およびＯＦＡと同様に小および大細胞外ループに位置するアミノ酸からなる。本発明者らのｍＡｂの１１のうち１０がＲＴＸと同じ領域で結合した。本発明者らのデータは、残基Ｓ１７３がエピトープの型を決定するにあたって重要であることを示唆する。ｍ１の結合（線状エピトープ）は、残基Ｓ１７３の突然変異時に排除される。対照的に、ｍ２結合（立体配座エピトープ）ははるかに影響が小さい。この異なる認識の結果、結合挙動が変化し、徹底的な分析で、それは二次的相互作用を生み出すｍＡｂの能力に影響を有することが示唆される。また、最近では、ｍＡｂ  ＩＩ型特性を元に戻すＧＡ１０１におけるＶ１１Ｌ突然変異が普遍的な説明とならないことが示唆された。配列比較により、本発明者独自のＩ型ＣＤ２０  ｍＡｂだけでなく、Ｂ１も１１Ｂ８も、総てこの位置にロイシンを有することが確認された。興味深いことに、ｍ１に由来するｍＡｂをキメラ化したものはＰＣＤ能を示した。その後にＫａｂａｔ位置１１にバリンを導入すると全ＰＣＤ活性が無効となった。このことは、肘−ヒンジ角の関与を指摘するが、ｍ１とｍ２のＶＨフレームワークのアミノ酸配列は同一であるので、本発明者らはどの残基が重要であるかを結論付けることはできない。Ｋａｂａｔ位置１１とＢ１は関与している可能性があり、肘−ヒンジ角に次いで、Ｎ１７１に対する結合の欠如が第２の要件として関連付けられた１２。
【０１６５】
結合動態に関して、ＣＤ２０  ｍＡｂの解離速度のＣＤＣに対する寄与についてのこれまでの所見は矛盾していた。非補体活性化試薬でＲＴＸの解離速度を弱めると、そのＣＤＣ活性が高まった１４。また、１残基以外はＲＴＸと同一のＣＤＲを有するヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂであるベルツズマブは、ＲＴＸよりも緩慢な解離速度と高いＣＤＣ能を示す３２。しかしながら、より緩慢な解離速度を有するＲＴＸ突然変異体によっては、ＣＤＣの増強は誘導されなかった３３。ＣＤＣ惹起能が様々な本発明者らのｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂパネルを用いた場合、リガンドトレーサー実験において判定されるように、良好なＣＤＣと緩慢な解離の間に相関は見られなかった。一般に、機能特性は、相互作用動態または親和性および／またはエピトープに見られる違いと明らかに相関させることができなかった。最近、ｈＩｇＧ１  ｍＡｂのより優れたＣＤＣ活性が抗原結合後のＦｃ−Ｆｃ相互作用によるものであり、最終的にＣ１ｑ結合を促進するヘキサマーの形成をもたらすことが示唆された３４。弱い補体活性化ＡｂにおいてＦｃ相互作用を強化する突然変異の導入は、ＣＤＣ活性の増強をもたらした３５。
【０１６６】
しかしながら、本発明者らの結合動態分析によって多様な解離パターンが明らかとなり、本発明者らのＣＤ２０  ｍＡｂは他の分子と結合してＡｂ結合の安定化をもたらす能力が異なることが示唆されるが、ほとんどのＯＦＡおよびｍ１０は急速に安定な相互作用を形成し、ｍ１、ｍ２、およびＲＴＸに関しては、よりヘテロなパターンが見られた。ｍ２の放出は自己競合によって明らかに影響を受けた。これらのデータは、パネル内で異なるｍＡｂのマルチサイト結合を指摘する。より急速に放出するｍＡｂの画分は、インキュベーション時間が長くなると減少する。これらの所見は、複合体形成の時間依存性とタイプおよびＩ型ｍＡｂによる脂質ラフト形成に及ぼすその影響、ならびに最終的にＣＤＣ誘導に及ぼす影響の問題を浮上させる。
【０１６７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、新規ｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂは、強い（ｍ１およびｍ９）、中等度（ｍ１０）および弱い（ｍ２）補体誘導因子に分類することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ｍ１、ｍ９およびｍ１０は同等の機能を示すが、ｍ２は効果が低い。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＤＣアッセイにおいて検出される違いが使用したモデルでは顕著でなかったことを示唆する。これはおそらくモデル依存的効果であり、他のｉｎ  ｖｉｖｏモデルを用いると異なる可能性がある。ＣＤ２０  ｍＡｂの機能特性を支配する特徴を図２３に示す。
【０１６８】
例２
材料および方法
抗体
リツキシマブ（ＲＴＸ、キメラ（ｃｈ）ＩｇＧ１）、オファツムマブ（ＯＦＡ、ヒト（ｈ）ＩｇＧ１）、およびトラスツズマブ（ＴＲＡ、ヒト化ＩｇＧ１）は、ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔの薬局から入手した。
【０１６９】
新規キメラＩｇＧ１  ｍＡｂ  ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１およびＩｇＧ１−ＣＤ２０−２の作製は第７章に記載した。ＩｇＧ１−ＣＤ２０−７、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−９、およびＩｇＧ１−ＣＤ２０−１０はＵ−Ｐｒｏｔｅｉｎ（ユトレヒト）により作製され、同社はこれらのｍＡｂをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で生産した。総てのｍＡｂを１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対して透析し、下式を用いて濃度を決定した。
【数１】
2019530661.tif 000022
【０１７０】
細胞株
Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ）を、３７℃／５％ＣＯ２にて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（１×Ｐ／Ｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０＋ＨＥＰＥＳ＋グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有ＲＰＭＩ培養培地で培養した。ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を従前に記載されているように（２３）作出し、ＲＰＭＩ培養培地で培養した。
【０１７１】
結合アッセイ
１０５のＤａｕｄｉ細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂ（ＰＢＳ中）とともに氷上で４５分間インキュベートした。洗浄後、結合したＣＤ２０  ｍＡｂをヤギ−Ｆ（ａｂ’）２−抗ｈＩｇＧ−ＲＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）にて測定した。
【０１７２】
ヒトＰＢＭＣ  ＡＤＣＣ
５１Ｃｒ標識標的細胞を用いたＡＤＣＣアッセイは従前に記載されているように（２２）行った。ＰＢＭＣは、健常個体（ＭｉｎｉＤｏｎｏｒＤｉｅｎｓｔ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）からフィコール分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により単離した。５１Ｃｒ標識Ｄａｕｄｉ細胞をＰＢＭＣ（エフェクター：標的比＝５０：１）および希釈ＣＤ２０  ｍＡｂと合わせた。３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、上清を採取し、液体シンチレーションカウンター（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で計数した。溶解率は下式を用いて計算した。
【数２】
2019530661.tif 000023
【０１７３】
ＲＰＭＩ培養培地または２．５％トリトンＸ−１００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加した培地中、Ｄａｕｄｉ細胞とエフェクター細胞を用いて、それぞれ最小放出(minimal release)および最大放出(maximal release)を決定した。
【０１７４】
ＣＤＣアッセイ
１０５細胞のＤａｕｄｉ細胞を９６ウェルプレートに播種し、室温で３０分間、ＲＰＭＩ培養培地で希釈したｍＡｂとともにプレインキュベートした。補体源としてヒト血清（８名の健常ドナーからプール）（終濃度１５．５％）を加え、この調製物を３７℃／５％ＣＯ２で１５分間維持した。補体により媒介される溶解の程度を、７−ＡＡＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇ）で死細胞を染色することによって評価した。細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）にて測定した。
【０１７５】
細胞生存率アッセイ
４×１０４のＥＬ４−ＣＤ２０細胞を、ＲＰＭＩ培養培地中１μｇ／ｍＬのＡｂとともに９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。架橋条件において、インキュベーション開始の３０分後に２０μｇ／ｍＬのウサギ−Ｆ（ａｂ’）２−抗ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加えた。細胞生存率は、製造者の説明書に従い、アネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）染色により決定した。
【０１７６】
Ｂ細胞枯渇アッセイ
健常ドナーからの血液をヒルディン血液管に採取し、使用まで氷上で保存した。ｍＡｂは、ＲＰＭＩ−１６４０＋ＨＥＰＥＳ＋グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、未処理の血液を加えた。３７℃／５％ＣＯ２で６０分間プレートをインキュベートした後に、サンプルを以降の総ての工程に関して氷上で維持した。白血球およびＣＤ１９＋細胞を、３０分間、マウス抗ｈＣＤ４５−ＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびマウス抗ｈＣＤ１９−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加えることによって染色した。続いて、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＣｙｔｏ／Ｃａｌ  Ｍｕｌｔｉｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ  Ｖｉｏｌｅｔフローサイトメーターアラインメントビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した１×ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ溶解バッファー（ＢＤ）で赤血球を溶解させた後に、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）にて測定した。
【０１７７】
ＥＬ４−ＣＤ２０リンパ腫モデル
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＪａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、フランス）から購入した。マウス６個体／群に５×１０５のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（１０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）標識ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。１６時間後、マウスを１０μｇのｍＡｂまたはＰＢＳ（１００μＬ）のｉ．ｐ．注射で処理した。５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳによる腹腔洗浄を２４時間後に行った。残存する腫瘍細胞の量を、ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブ（ＢＤ）を用いて測定した。実験は総てＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔの動物倫理委員会によって承認されたものであった。
【０１７８】
結果
従前に特性評価を行ったｍＩｇＧ  ＣＤ２０  ｍＡｂのパネルから、本発明者らはキメラ化のために５つの有望な候補を選択した。これらのうち４つはｍＩｇＧ２ｃ  ｍＡｂ（ｍ１、ｍ２、ｍ９、およびｍ１０；例１参照）であり、これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏで多様な機能パターンを示した。これらのｍＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂのうち、ｍ７は最高の補体依存性細胞傷害性を示した。可変領域をヒトＩｇＧ１定常領域およびヒトκ軽鎖（ＬＣ）発現ベクターにクローニングした後、本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞のいずれかでｍＡｂを再生した。その後、精製したｃｈＩｇＧ１  ｍＡｂに予備的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性評価を行った。
【０１７９】
まず、本発明者らは、総てのキメラ化ｍＡｂ  ＣＤ２０  ｍＡｂの抗原結合能を試験した。それらはＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞に特異的に結合した（図８）。それらの結合パターンは、市販のＣＤ２０  ｍＡｂであるＲＴＸ（ｃｈＩｇＧ１）およびＯＦＡ（ｈＩｇＧ１）に匹敵した。
【０１８０】
次に、本発明者らは、２つの異なるアッセイで腫瘍細胞を根絶するそれらの能力を評価した。まず、腫瘍細胞死滅は、５１Ｃｒ標識Ｄａｕｄｉ細胞をｍＡｂおよびＰＢＭＣ（エフェクター：標的比＝５０：１）とともにインキュベートすることによる古典的クロム放出ＡＤＣＣアッセイにて測定した（図９Ａ）。キメラＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂを用いた場合、それらのマウス型に比べてＡＤＣＣ能に明らかな違いを見て取ることができた（例１）。１μｇ／ｍＬ  ｍＡｂにおける最大溶解パーセンテージは、３８％（ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１）〜４９％（ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１０）の範囲であった。最大溶解は市販のｍＡｂであるＲＴＸおよびＯＦＡがやや高かったものの、低濃度では、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−２、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−９、およびＩｇＧ１−ＣＤ２０−１０の機能はＲＴＸよりも良好であった。
【０１８１】
補体系の活性化による腫瘍細胞死滅は、ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂによって一般に誘導される第２のエフェクター機構である。ｃｈＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂは、濃度依存的な腫瘍細胞溶解を示した（図９Ｂ）。総てのｍＡｂが、ＲＴＸに比べて高い程度のＣＤＣを誘導した。ＩｇＧ１−ＣＤ２０−２は、最小の効力に留まった。ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１およびＩｇＧ１−ＣＤ２０−１０は同等の機能であり、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−７は低濃度でＯＦＡよりもずっと良好であった。
【０１８２】
ＣＤ２０  ｍＡｂによって誘導されることが記載される最後の作用機序は、プログラム細胞死（ＰＣＤ）による腫瘍細胞死である。この特性は、オビヌツズマブ（ＯＢＺ）（１２）およびＢ１（ｍＩｇＧ２ａ  ＣＤ２０  ｍＡｂ）（１３）のようないわゆるＩＩ型ＣＤ２０  ｍＡｂによって強く誘導される。ＲＴＸは、程度は低いが、同じカスパーゼ非依存性経路によって腫瘍細胞を死滅させることが示されている（１５）。親マウスＣＤ２０  ｍＡｂには、細胞死誘導の徴候としての同型凝集も７−ＡＡＤおよびアネキシンＶ陽性の増加も誘導するものはなかった。例１に記載されるように、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１は、ＥＬ４−ＣＤ２０細胞のＰＣＤを誘導した。ここで、全ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂパネルを比較したが、他の４つのＣＤ２０  ｍＡｂについては、キメラ化がこれらの特徴を変化させることはなかった（図９Ｃ）。
【０１８３】
最後に、本発明者らは、自己全血アッセイにおいてＢ細胞枯渇の程度を評価した。本発明者らはいずれの濃度のｍＡｂとインキュベートした場合にも、７ＡＡＤ＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の増加を認めなかったことから、生ＣＤ１９＋Ｂ細胞の数にのみ着目した（図１０Ａ）。本発明者らは、ｍＡｂ濃度依存的な生ＣＤ１９＋Ｂ細胞の減少を検出した（図１０Ｂ）。最も弱いＣＤＣ誘導因子としてのＲＴＸの機能は最も悪かった。新規ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂ間に明らかな違いを見て取ることはできなかった。
【０１８４】
最終的に、従前に確立されたＥＬ４−ＣＤ２０低腫瘍量モデルを用い、本発明者らは、完全飽和濃度である１０μｇのｍＡｂで本発明者らのキメラＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂの有効性を決定した。大きな違いは検出できなかったが、総てのｍＡｂがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞死滅の強力な誘導を示した（図１１）。
【０１８５】
考察
マウス配列を用いて開始し、ヒト化を行う前の重要な工程は、キメラｍＡｂをそれらの治療能に関して試験することである。本発明者らは５つの新規キメラＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂを作出し、それらは総てｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞死滅を誘導した。しかしながら、それらのＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性における違いはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるより良好な抗腫瘍応答として表せなかった。
【０１８６】
強力なＡＤＣＣおよびＰＣＤ誘導因子であるＯＢＺは、ＮＨＬ異種移植モデルにおいてＲＴＸよりも効率的にＳＣＩＤマウスの製造を延長することが示された（１２）。しかしながら、有効性に対するＡＤＣＣまたはＰＣＤの個々の寄与はまだ評価されていない。
【０１８７】
ＣＤ２０  ｍＡｂの能力を全血Ｂ細胞枯渇アッセイで詳細に検討した。通常、４時間〜２４時間のインキュベーション時間を用いた（１２、５０、５１）。ＯＢＺは、健常ドナー血液だけでなく患者ドナー血液でも、自己設定において、ＲＴＸに比べてより良好かつ迅速なＢ細胞の死滅を示すことが示された。しかしながら、これらのアッセイにおいて、総てのエフェクター機構が寄与する可能性がある。本発明者らは、ｍＡｂを非処理血液とともに１時間インキュベートした。この設定は、エフェクター細胞により媒介されるものよりものむしろ補体により媒介される腫瘍細胞死滅の評価に有益である。ＣＤＣは即誘導されるが、ＮＫ細胞により媒介される腫瘍細胞根絶はより長いインキュベーション時間を要する。このことはおそらく、最も弱い補体活化因子であるＲＴＸを用いた場合に得られた不十分な結果を説明する。Ｂ細胞枯渇アッセイにおける新規ＣＤ２０  ｍＡｂの有効性は、得られたＣＤＣ結果と相関があった。ドナーのばらつきとは別に、本発明者らは、リンパ球ゲート内のＣＤ１９発現の低下を検出し、これはＣＤ１９に対するＣＤ２０  ｍＡｂ処置の影響を示す。ＲＴＸ処置は好中球および単球／マクロファージにより媒介される機構であるＣＤ１９のシェービングまたはトロゴサイトーシスを誘導することが従前に示されている（９〜１１）。これは極めて迅速な効果であると思われるので、本発明者らは、現在、自己設定におけるＣＤ２０  ｍＡｂのＢ細胞枯渇能を決定するための別の戦略を検討している。ここで、第２のＢ細胞マーカーとしてのＣＤ２４が探索されているところである。本発明者らの所見は、マウスＩｇＧ  ｍＡｂによって示される機能特性はキメラに関しては予測されないことを示す（表２）。抗体ＧＡ１０１（オビヌツズマブ）は有意な補体活性を持たない。Herter et al (2013) Mol Cancer Ther. 12(10):2031-42. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-12-1182参照。
【０１８８】
例３
リツキシマブ、オファツムマブおよびオビヌツズマブのようなＩｇＧ１−ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、種々の種類のＢ細胞悪性腫瘍を有すると診断された患者を治療するために臨床で使用されている。ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂについては、様々な作用機序が腫瘍細胞の根絶に寄与することが知られている（５６〜６１）：（ａ）主としてナチュラルキラー細胞および単球／マクロファージ上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の会合によって媒介される抗体依存性細胞傷害および貪食作用（ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ）；（ｂ）ＣＤＣによる腫瘍細胞溶解をもたらす、Ｃ１ｑとの結合による古典的補体経路の活性化；（ｃ）ＣＤ２０分子との直接的結合時のＰＣＤの誘導。加えて、このｍＡｂによる治療は適応細胞性免疫応答を誘導できることが示唆された。Ａｂｅｓおよび共同研究者らによる所見は、Ｆｃにより媒介される応答が腫瘍再負荷後の免疫応答性マウスの持続的保護をもたらすことを示した（６２）。細胞傷害性Ｔ細胞の誘導は樹状細胞により開始され得るが、この樹状細胞は、Ａｂによりオプソニン化された標的細胞の貪食作用の後に腫瘍由来ペプチドを交差提示する（６３、６４）。この持続的抗腫瘍免疫は患者においてはまだ示されていないが、一部の患者に関して、なぜＣＤ２０  ｍＡｂで永続的な腫瘍退縮が達成され得るかを説明するかもしれない。
【０１８９】
ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂによる抗腫瘍応答の誘導に必要とされるエフェクター細胞の会合は、ＦｃγＲとの相互作用に頼るものである。しかしながら、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａ内の一塩基多型（ＳＮＰ）は、より良好なまたは悪い治療転帰に関連付けられている（６５〜６８）。さらに、未知の理由のために、総ての患者にＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂ療法が奏効するわけではない。リツキシマブ治療後に再発するかまたは耐性を示す患者も報告されている（６９〜７３）。よって、これらの制限を克服するために別の治療選択肢が必要とされる。一つの可能性は、異なるＡｂアイソタイプ、すなわち、ＩｇＡの使用である。ＩｇＡは、血中でＩｇＧに次いで２番目に優勢な抗体であり、粘膜における主要なＡｂである。単量体型のＩｇＡは大部分血清中に見られるが、重合体型のＩｇＡは粘膜部位で産生される。２つのＡｂサブクラスＩｇＡ１とＩｇＡ２はヒンジ領域が構造的に異なり、ＩｇＡ２に比べてＩｇＡ１ではアミノ酸１３個分長い。これにより、離れた抗原に対する到達の改善が可能となるが、同時にプロテアーゼによる分解をより受けやすくなる（３６）。さらに、ＩｇＡ１  ｍＡｂのヒンジ領域は、ＩｇＡ２  ｍＡｂには無い、いくつかのＯ結合グリコシル化部位を有する。ＩｇＡ２は、ＩｇＡ１に比べて２つの付加的Ｎ結合グリコシル化部位を有するＩｇＡ２（ｍ１）、および３つの付加的Ｎ結合グリコシル化部位を有するＩｇＡ２（ｍ２）とＩｇＡ２（ｎ）、の３つのアロタイプとして存在する。ＩｇＧとは対照的に、ＩｇＡは、Ｃ１ｑと結合することができないので、古典的補体経路の弱い活性化因子である（３７）。しかしながら、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）はＩｇＡと結合し得るので、ＩｇＡ  ｍＡｂはレクチン経路を介して補体系を活性化することが示されている（３８）。
【０１９０】
ＩｇＡは、骨髄系譜の細胞：好中球、単球、種々のマクロファージ集団および好酸球上で発現されるＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）と結合することによって免疫エフェクター細胞と会合する（３９）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じた樹状細胞上での発現が示されたが（２３、２４）、議論が残る。好中球は高レベルのＦｃαＲＩを発現するが、マクロファージでの発現はより低い（４２）。固形腫瘍標的を標的とするＩｇＡ  ｍＡｂを用いたＡＤＣＣアッセイでは、好中球は腫瘍細胞を効率的に根絶することが示された（４３〜４６）。これに対して、ＩｇＧ１  ｍＡｂは、このエフェクター細胞集団と会合することがほとんどできなかった。単球／マクロファージにより媒介される腫瘍細胞の死滅は、ＩｇＡ  ｍＡｂとＩｇＧ  ｍＡｂの間で同等であることが示された（４４）。活性化ＦｃγＲＩＩＩａとは別に、マクロファージはまた阻害性ＦｃγＲＩＩｂも発現する。ＦｃγＲＩＩｂの存在はｍＡｂ活性を低下させることが示された（４７）。ＩｇＡについては、阻害性受容体はまだ記載されていない。
【０１９１】
腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＡ  ｍＡｂに関する知識は、ここ数年、著しく増えてきた。数年前に直面していたいくつかのボトルネックは今では克服され、現在、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験に十分な量の単量体ＩｇＡ  ｍＡｂを生産および精製することができる。マウスはＩｇＡに対する受容体を欠いているので、今では、ヒトＦｃαＲＩトランスジェニックを作出することでｉｎ  ｖｉｖｏ試験が可能となる（４８）。Ｂｏｒｏｓｓおよび共同研究者らは、ついに、免疫応答性腫瘍モデルにおいて、治療状況下でのＩｇＡ  ｍＡｂの大きな可能性を示した（４４）。これまでに研究された大多数のＩｇＡ  ｍＡｂは、固形腫瘍上で発現される抗原であるＨｅｒ２またはＥＧＦＲを標的としている。単量体ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの可能性に注目した研究は一つだけである（４９）。補体により媒介される腫瘍細胞の死滅は、古典経路の弱い間接的活性化と第二経路のより著しい直接的活性化に頼ることが示された。ＦｃαＲＩトランスジェニックマウスにおける受動免疫戦略を用い、単量体ＩｇＡ２−ＣＤ２０  ｍＡｂによって腫瘍発達に対する良好な保護が達成された。しかしながら、ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂに関する治療的ｉｎ  ｖｉｖｏ試験はまだ行われていない。さらに、ＩｇＡ１  ｍＡｂおよびＩｇＡ２  ｍＡｂの、特に、それらの補体活性化特性に関する直接的比較が欠けている。従って、ここでの研究の本発明者らの目的は、種々のサブクラスのいくつかのＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂを作出し、それらの特性評価を行うことであった。ここに、本発明者らは、ユニークなＩｇＡ１−ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＩｇＡ２−ＣＤ２０  ｍＡｂの予備的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性評価を記載する。これまでに作出したｍＩｇＧ２ｃ−ＣＤ２０  ｍＡｂ  ｍ１およびｍ２（例１）を、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２変異体として産生させるために選択した。それらの予備的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性評価によって有望な能力が明らかになった。
【０１９２】
材料および方法
抗体
以下の抗体を陽性対照または陰性対照として使用した：リツキシマブ（ＲＴＸ；Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）、抗ｈＣＤ２０−ｈＩｇＡ２（ＩｇＡ２−ＲＴＸ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、抗ｈＣＤ２０−ｈＩｇＡ１（ＩｇＡ１−ＲＴＸ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）；ＩｇＡ１−およびＩｇＡ２（ｍ１）−Ｈｅｒ２（独自生産）、オファツムマブ（ＯＦＡ、Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）、Ｂ１（ｍＩｇＧ２ａ−ＣＤ２０  ｍＡｂ、厚意によりＭａｒｋ  Ｃｒａｇｇ、サウサンプトン大学、ＵＫにより提供）、およびトラスツズマブ（ＴＲＡ、Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）。
【０１９３】
細胞株
バーキットリンパ腫細胞株ＲａｍｏｓおよびＲａｊｉ（ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＣＳおよび１×Ｐ／Ｓを添加したＲＰＭＩ−１６４０＋ＨＥＰＥＳ＋グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有ＲＰＭＩ培養培地で３７℃／５％ＣＯ２にて維持した。ＥＬ４−ＣＤ２０細胞は、従前に記載されているように（２３）に作出し、ＲＰＭＩ培養培地で培養した。
【０１９４】
ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの生産
重鎖可変および軽鎖（ＨＣおよびＬＣ）配列（ＳｈｉｎｅＧｅｎｅにより合成）にはＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位が隣接した。可変領域をＬｏｎｚａベクターｐＥＥ１４．４−κＬＣ、ｐＥＥ１４．４−ＩｇＡ１、およびｐＥＥ１４．４−ＩｇＡ２（ｍ１）にクローニングした。
【０１９５】
一過性抗体生産については、ＨＥＫ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）系を従前に記載されているように（２２）使用した。簡単に述べれば、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、２９３フェクチン（商標）トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈したＬＣ、ＨＣおよびｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ（商標）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＤＮＡでトランスフェクトした。４時間後に１×Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）を加えた。トランスフェクション４日後に上清を採取し、濾過し、精製まで４℃で保存した。
【０１９６】
総てのカラム精製工程は、ＡＫＴＡＰｒｉｍｅプラスシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。抗体含有上清を結合バッファー（１×ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１：１希釈し、ＩｇＡ  ｍＡｂを、５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  ΚＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。結合したタンパク質を０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５でカラムから溶出させた。画分を採取し、そのまま１Ｍトリス、ｐＨ８．８で中和し、Ｎａｎｏｄｒｏｐで測定したＡ２８０の吸収によって決定したタンパク質濃度に基づいてプールした。タンパク質含有画分に対して、ＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００高分解カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。単量体ＩｇＡ  ｍＡｂを含有する画分を採取し、プールし、ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮カラム（１００  ０００ＭＷＣＯ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて濃縮した。ＩｇＡ  ｍＡｂの最終濃度は、以下を用いてＮａｎｏｄｒｏｐにより決定した。
【数３】
2019530661.tif 000024
【０１９７】
ＩｇＧおよびＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ  ｍａｘｉｓｏｒｐ）を４℃にて一晩、１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で希釈したヤギ抗ｈｕΚ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でコーティングした。１％ＢＳＡ／０．０５％ツィーン−ＰＢＳでブロッキングし、０．０５％ツィーン−ＰＢＳで洗浄した後、サンプルを加え、室温で９０分間インキュベートした。サンプルおよび標品を１％ＢＳＡ／０．０５％ツィーン−ＰＢＳに希釈した。精製したｈｕＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂ）をＩｇＡ  ｍＡｂの標品として使用した。洗浄したプレートを０．０５％ツィーン−ＰＢＳに希釈した二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＡ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに室温で１時間インキュベートした。結合した抗体をＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）で検出した後、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＲＣ（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４０５ｎｍで測定した。
【０１９８】
ＣＤ２０結合アッセイ
１０５のＲａｍｏｓ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１×ＰＢＳに希釈したｍＡｂとともに氷上で４５分間インキュベートした。十分に洗浄した後に、結合したＡｂは、細胞を氷上で４５分間、ヤギ−Ｆ（ａｂ’）２−抗ヒトＩｇＡ−ＲＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートすることによって検出した。細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定した後、それらをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）で測定した。
【０１９９】
ＣＤＣアッセイ
１０５のＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ細胞を、ＲＰＭＩ培養培地で希釈したｍＡｂで、室温にて３０分間、オプソニン化した。次に、８名のドナーからプールした１５．５％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）を加え、この混合物を種々の時間（１５、６０、２４０、および３６０分）にわたって３７℃でインキュベートした。ブロッキング実験のための血清は、細胞の添加前に、熱失活（５６℃で３０分）、１０ｍＭのＥＧＴＡ＋２ｍＭのＭｇＣｌ２でのプレインキュベーション、または室温で１５分間のエクリズマブ（抗Ｃ５  ｍＡｂ）のｍＡｂ：Ｃ５モル比５：１での添加によって処理した。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、死細胞を７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で室温にて１５分間染色した。サンプルをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）で測定し、補体依存性腫瘍細胞溶解を７−ＡＡＤ陽性細胞のパーセンテージとして決定した。
【０２００】
細胞死誘導アッセイ
０．４×１０５のＥＬ４−ＣＤ２０細胞を、３７℃で２４時間、１μｇ／ｍＬのｍＡｂとともにインキュベートした。細胞をＣＤ２０  ｍＡｂとインキュベートした３０分後に、架橋Ａｂ（２０μｇ／ｍＬのウサギＦ（ａｂ’）２−抗ｈＩｇＧ；５０μｇ／ｍＬのウサギＦ（ａｂ’）２−抗ｍＩｇＧ、および２０μｇ／ｍＬのヤギ  Ｆ（ａｂ’）２−抗ヒト血清ＩｇＡ；Ｊａｃｋｓｏｎ）を加えた。サンプルを採取し、アネキシンＶ結合バッファーで洗浄し、アネキシンＶ−ＡＰＣと７−ＡＡＤ（両方ともＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の混合物とともに室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで測定し、プログラム細胞死の程度を％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋＋％アネキシンＶ＋細胞として求めた。
【０２０１】
Ｂ細胞枯渇アッセイ
ヘパリン管に採取した健常ドナー血液から、ヒストパーク−フィコール密度勾配とその後の赤血球(eryhtrocyte)溶解バッファー（１５５ｍＭの塩化アンモニウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭの重炭酸カリウム、ｐＨ７．４）を用いた残留赤血球の溶解により、全白血球を単離した。単離した白血球を９６ウェルプレート中で、０．２×１０６白血球／ウェルで抗体希釈液と合わせ、３７℃／５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。上清を遠心分離後に除去し、細胞を氷冷ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（ＦＡＣＳバッファー）で洗浄し、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、マウス抗ヒトＣＤ１１ｂ−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗ヒトＣＤ１４−Ｖ５００（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗ヒトＣＤ５６−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（クローンＢ１５９、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびマウス抗ヒトＣＤ３−ＰｅｒＣｐ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有する抗体混合物で、氷上で３０分間染色した。洗浄後、細胞を、Ｃｙｔｏ／Ｃａｌ  Ｍｕｌｔｉｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ  Ｖｉｏｌｅｔフローサイトメーターアラインメントビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（商標）ＩＩを用いてフローサイトメトリーを行った。
【０２０２】
ヒトＰＭＮ  ＡＤＣＣ
５１Ｃｒ標識標的細胞を用いたＡＤＣＣアッセイは、従前に記載されているように行った。簡単に述べれば、ＰＭＮは、健常個体（ＭｉｎｉＤｏｎｏｒＤｉｅｎｓｔ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）からフィコール／ヒストパーク分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により単離した。５１Ｃｒ標識Ｄａｕｄｉ細胞をＰＭＮ（エフェクター：標的比＝４０：１）および希釈ＣＤ２０  ｍＡｂと合わせた。３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、上清を採取し、液体シンチレーションカウンター（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で計数した。溶解は、下式を用いて計算した。
【数４】
2019530661.tif 000025
【０２０３】
ＲＰＭＩ培養培地または２．５％トリトンＸ−１００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加した培地中、Ｄａｕｄｉ細胞とエフェクター細胞を用いて、それぞれ最小放出および最大放出を決定した。
【０２０４】
結果
抗体の生産および精製
本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションによってＩｇＡ１  ｍＡｂおよびＩｇＡ２  ｍＡｂを生産した。まず、重鎖、軽鎖およびｐＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＤＮＡの間の最適比を小規模のテストトランスフェクションで決定した。総てのｍＡｂに関して、本発明者らは、最高の生産を得るためには１：２：１比であることを見出した（図１２Ａ）。次に、線形アップスケーリングアプローチによって新規ｍＡｂを生産した。フルサイズのｍＡｂを、１）抗κ精製（図１２Ｂ）および２）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図１２Ｃ）を含む二段階精製プロトコールによって単離した。κ精製ピークは両サブクラスで同じように見えるが、ＳＥＣの際には異なるパターンを見て取ることができた。ＩｇＡ１サンプルは、フルサイズのＡｂに次いで、より高いレベルのルーズなκ軽鎖を含んでいた（図１２Ｃ左）。対照的に、ＩｇＡ２サンプルは、より多いＡｂコンジュゲート（より短い保持時間；図１２Ｃ右）を含んでいた。ＳＥＣ後に得られたフルサイズのｍＡｂの収率は、両サンプル間で同等であった。精製されたＩｇＡ  ｍＡｂの純度および完全性はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した（データは示されていない）。
【０２０５】
機能特性
まず、本発明者らは、ＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞に結合する抗体の能力を評価した（図  １３）。結合能は、総てのＩｇＡ２−ＣＤ２０  ｍＡｂに関して同じ範囲にあった。しかしながら、ＩｇＡ１  ｍＡｂは、ＩｇＡ２  ｍＡｂに比べて良好な結合能を有した。
【０２０６】
次に、新規に合成された抗体の機能性を試験した。ＩＩ型ＣＤ２０  ｍＡｂとして知られるＩｇＧ−ＣＤ２０  ｍＡｂのサブクラスは、それらの標的との結合時にＰＣＤを誘導する。本発明者らは、本発明者らのＩｇＡ  ｍＡｂに対して細胞死誘導アッセイを行った。ＥＬ４−ＣＤ２０腫瘍細胞をこれらのｍＡｂと２４時間インキュベートしたところ、これらの新規ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂによってＰＣＤにわずかな増加がもたらされた（図１４）。これはＩｇＡ２  ｍＡｂよりもＩｇＡ１で若干顕著であった。
【０２０７】
次に、本発明者らは、ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂとＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂのＣＤＣ誘導能を比較した。補体により媒介されるＤａｕｄｉ細胞の溶解は、ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂでは１５分後にすでに見られたが、ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂでは見られなかった（図１５Ａ）。ＩｇＡ−ＣＤ２０−１  ｍＡｂによる低いＣＤＣ誘導は、補体活性血清とともに６０分インキュベートした後に見られ、これはインキュベーション時間が長いと上昇した。予想に反して、Ｄａｕｄｉ細胞よりもＣＤ２０の発現が低いがＣＤ４６およびＣＤ５９のレベルは高いＲａｍｏｓ細胞は、ＣＤＣに対してより感受性が高かった（図１５Ｂ）。さらに、ＩｇＡ１−ＣＤ２０補体媒介溶解は遅延したが、２４０分後にＩｇＡ２−ＣＤ２０  ｍＡｂと同等のレベルに達した。ＩｇＡ−ＣＤ２０−１により誘導される溶解は補体の活性化により媒介されたことを確認するために、本発明者らは、種々の補体阻害剤の存在下でＣＤＣアッセイを行った（図１５Ｃ）。ＩｇＡ−ＣＤ２０−１  ｍＡｂにより誘導される溶解は、熱失活血清およびエクリズマブ（抗Ｃ５  ｍＡｂ）で前処理した血清を使用した場合に無効になった。第二経路がＩｇＡ  ｍＡｂと関与しているかどうかを判定するために、本発明者らは、ＥＧＴＡ＋ＭｇＣｌ２を用いて古典経路およびレクチン経路を阻害した。ＩｇＧ１に関してだけでなく、ＩｇＡ−ＣＤ２０−１  ｍＡｂによっても溶解はバックグラウンドレベルにまで低下した。
【０２０８】
クロム放出アッセイで、新規ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの、ＰＭＮにより媒介される腫瘍細胞溶解を誘導する能力を判定した後、本発明者らは次に、ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの、ヒトＢ細胞を枯渇させる能力を分析した。健常ドナーからの白血球をこれらのｍＡｂとともにインキュベートしたところ、ＣＤ１９＋イベントの濃度依存的低下が生じた（図１６Ａ）。この効果は、ＲＴＸとＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの間で同等であった。ＣＤ１９＋イベントの数（図１６Ｂ）は、総てのＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂで一貫して低下し、０．０５〜０．５μｇ／ｍＬ  ｍＡｂの間でプラトーに達した。対照的に、ＲＴＸインキュベーション時のＣＤ１９＋イベントの数は０．０５μｇ／ｍＬで最小となったが、より高濃度では再び上昇した。両アイソタイプについて、ＣＤ１９−イベントの数は０．０５〜０．５μｇ／ｍＬの間で最適に達した（図１６Ｃ）。
【０２０９】
考察
現在のところ、上市されている総てのＣＤ２０標的ｍＡｂはＩｇＧ１アイソタイプである。治療に対して変動のある応答は、別の療法を開発する必要を強調する。近年において、研究者らはＨｅｒ２およびＥＧＦＲのような特に固形腫瘍標的を標的するＩｇＡ  ｍＡｂの抗癌能を検討してきた（４３〜４６、７４）。ここに、本発明者らは、従前に選択された２つのマウスｍＡｂのユニークな可変ドメイン配列を有するＩｇＡ１−ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＩｇＡ２（ｍ１）−ＣＤ２０  ｍＡｂの比較を記載する。親マウスｍＡｂ  ｍ１およびｍ２の機能特性は、これらの補体により媒介される腫瘍細胞溶解能、結合動態およびエピトープ認識に明瞭に異なる挙動を示した（例１）。
【０２１０】
本発明者らは、ＩｇＧ１  ｍＡｂに関して記載されたような腫瘍細胞の根絶をもたらすＦａｂおよびＦｃにより媒介される機構を研究した。いくつかのＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂ（例えば、オビヌツズマブおよびＢ１）は、ＣＤ２０と結合した際に腫瘍細胞死滅を誘導する（Ｆａｂにより媒介される効果）。本発明者らは、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−１を用いた場合にＰＣＤを認めたが、ＩｇＧ１−ＣＤ２０−２を用いた場合には認めなかった。対照的に、ＩｇＡ−ＣＤ２０−１およびＩｇＡ−ＣＤ２０−２は両方とも、低レベルにもかかわらずＰＣＤを誘導したが、このことはＩｇＡ  ｍＡｂに関するこの作用機序がエピトープに依存しないことを示す。この仮説を強めるためには、ＩｇＧ１とはＰＣＤ能が異なり、異なるエピトープを標的とする他の既知の抗体（例えば、ＲＴＸおよびオビヌツズマブ）をＩｇＡ変異体として比較する必要があろう。
【０２１１】
ＩｇＧ１により誘導されるＣＤＣは、腫瘍細胞を溶解するための効率的なＦｃ媒介機構である。ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂは、Ｃ１ｑと結合することにより古典的補体経路を活性化する。しかしながら、この経路の活性化は、ＩｇＡ  ｍＡｂに関しては、それらがＣ１ｑ認識部位を欠いている（３７）ためにあり得ない。文献には、ヒト血清から単離されたＩｇＡ  ＡｂはＭＢＬと結合すると記載されている（３８）。これによりＣ３の沈着が起こり、これはレクチン経路の関与を示す。なお、Ｐａｓｃａｌおよび共同研究者らは、ＩｇＡ２−ＣＤ２０  ｍＡｂは、直接的には第二経路を活性化すること、および間接的には古典的経路の関与によってＣＤ２０＋腫瘍細胞株のサブセットを溶解することを示した（３９）。本発明者らは、独自のデータをもって、ＩｇＡ  ｍＡｂによる腫瘍細胞死滅におけるＣＤＣの関与を確認している。しかしながら、本発明者らの結果は、第二経路の活性化を排除する。異なる補体経路の寄与をさらに詳細に分析するためには、特異的阻害剤を用いてさらなる実験を行わなければならない。例えば、Ｃ１ｑ枯渇血清は古典的経路を遮断するために使用することができ、因子Ｂ枯渇血清は第二経路の阻害のために、また、ＭＡＳＰ−１またはＭＡＳＰ−２特異的阻害剤はレクチン経路を遮断するために使用することができる（７５、７６）。本発明者らは、互いに隣り合う両サブクラスを初めて比較し、ＩｇＡ２  ｍＡｂはＩｇＡ１  ｍＡｂよりもＣＤＣの誘導が早いことを示した。この矛盾は、ＩｇＡ１（２つのＮ結合グリカン）およびＩｇＡ２（ｍ１）（４つのＮ結合グリカン）の重鎖の示差的なグリコシル化パターンの結果である可能性があり、ＩｇＡ２によりレクチン経路のより良好な活性化がもたらされる。
【０２１２】
標的抗原発現レベル、膜結合補体調節タンパク質の発現、エピトープ、および結合動態のような特性は、ＩｇＧ１により媒介されるＣＤＣに影響を及ぼすことに関連付けられている。これまで、本発明者らは、ＩｇＡ−ＣＤ２０−２  ｍＡｂよりも良好なＣＤＣ活性を有し、また、より良好に補体を活性化するｍＩｇＧに由来するＩｇＡ  ｍＡｂのエピトープに関して、ＩｇＡ−ＣＤ２０−１  ｍＡｂと同様に、役割を画定できたに過ぎなかった。他の特性も重要であるかどうかを解明する必要がある。
【０２１３】
ＦｃαＲＩ発現エフェクター細胞によるＡＤＣＣは、単球／マクロファージによるよりもＰＭＮによってより早く媒介されることが示されている。ＩｇＡ−ＣＤ２０により媒介されるＢ細胞枯渇におけるこれらの免疫エフェクター細胞の役割を決定するために、本発明者らは、補体源の不在下での自己設定においてＣＤ１９＋Ｂ細胞を枯渇させた。ｍＡｂにより媒介されるＣＤ１９＋細胞の枯渇は、一般に、ＲＴＸの場合よりもＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの場合に良好であり、ＩｇＡ１−ＣＤ２０  ｍＡｂの機能が最良であった。しかしながら、両アイソタイプともＣＤ１９発現の低下を誘導する。これは、ＲＴＸとともにインキュベートされた健常ドナーからのＢ細胞は細胞死を受けることなくそれらのＣＤ１９発現を低下させるという従前に公開されている所見（５２）と一致する。同じ抗原性変調がＣＤ２０でも記載されており、４５分以内に７５〜９０％の低下が見られた（５５）。脱落も内部移行もＣＤ１９の損失に関連がなかった。代わりに、特に好中球および単球により媒介されるＦｃ依存的様式でのシェービング／トロゴサイトーシスが作用機序として記載された。本発明者らは、ＩｇＧ１  ｍＡｂに比べてＩｇＡ  ｍＡｂによるＰＭＮのより強い関与が最終的にトロゴサイトーシスによる腫瘍細胞死をもたらすと推測する（５３、５４）。
【０２１４】
本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｂ細胞枯渇アッセイにおいて、濃度が高すぎるとＡｂの有効性が低下することが示されたことから、ＲＴＸの治療用量は注意深く決定しなければならない。対照的に、この効果は、ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂでは見られなかった。しかしながらやはり、ＣＤ２０  ｍＡｂはＢ細胞マーカーの発現を変調するので、Ｂ細胞トラッキングは、ｍＡｂにより媒介されるＢ細胞枯渇を適切に決定するためのより良いアプローチとなり得る。
【０２１５】
例４
ＩｇＡ  ＣＤ２０抗体の特性評価
ヒト身体は、主として粘膜バリア上で病原体から自らを守るためにＩｇＡを用いる。ＩｇＡは直接的機構を介してまたは好中球の活性化を介して病原体を死滅させる。極めて少量のＩｇＡがＦｃα受容体（ＦｃαＲ）を介して効果的に好中球を誘導することができる。重要なこととして、好中球はＮＫ細胞よりもはるかに有効なキラー細胞であり、優れた組織浸透能を有する。従って、ＩｇＡは、腫瘍免疫療法に魅力的な抗体クラスであると思われる。しかしながらやはり、臨床用のＩｇＡ抗体を開発することは困難である。最近まで、マウスはＦｃαＲの発現を欠くことから、ＩｇＡ免疫療法のための優れたｉｎ  ｖｉｖｏモデル系は無かった。本発明者らの研究グループは、好中球上でヒトＦｃαＲ（ＣＤ８９）を発現するトランスジェニックマウスを開発した。このマウスモデルを用い、本発明者らは、治療用ＩｇＡ抗体は、いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、種々の位置で長期的および短期的に、免疫応答性マウスにおいて、腫瘍成長からマウスを効果的に守ることができることを実証した（６）。当所で開発されたユニークな免疫誘導法を用い、本発明者らは新規なＣＤ２０抗体（全部ＩｇＧ）のブロードパネルを得た。これらの抗体のうち２つは臨床的可能性を持ち、現在利用可能な総てのＣＤ２０抗体よりも効果的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を死滅させる。両抗体とも、現在、ヒトＩｇＡ  Ｆｃフラグメントを有するキメラ抗体（＋／−７０％ｈｕＩｇＡ）に形質転換され、目下、それらの有効性に関して調査されている（図１７）。
【０２１６】
ＣＤ２０の内部移行
参照文献７７〜７９には、リンパ腫治療に治療的に使用される特定の抗体（例えば、リツキシマブおよびオファツムマブ）は、Ｂ細胞表面からＦｃγ受容体ＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）により媒介される内部移行を受けることが記載されており、抗体系治療薬にとって重要な意味を持つ。
【０２１７】
標的細胞それ自体の上でのＦｃγＲの発現は、このＡｂ−ＣＤ２０複合体の内部移行に重要である。免疫エフェクター細胞Ｆｃ−ＦｃγＲのトランスでの相互作用は、特に抗原が高レベルで発現される場合には、標的細胞を枯渇させる働きをする。異種移植モデルにおけるリツキシマブの有効性にとっての活性化ＦｃγＲの重要性は従前に実証されたが、今や、特定のタイプのＢ細胞悪性腫瘍上で発現される阻害性ＦｃＲであるＦｃγＲＩＩｂもまたＡｂ−ＣＤ２０複合体の内部移行に役割を果たすことが知られている。ＦｃγＲＩＩｂは、特定のホスファターゼを動員し、活性化ＦｃγＲによるシグナル伝達に対抗する働きをする免疫受容体チロシンに基づく阻害性モチーフを含む。ＦｃγＲＩＩｂにより媒介される、Ｂ細胞表面からのリツキシマブの内部移行は、エフェクター細胞の関与を制限することが示され、この効果は、高レベルのＦｃγＲＩＩｂを発現し、ＣＤ２０  ｍＡｂ療法に対する応答の低下を示す、慢性リンパ球性白血病およびマントル細胞リンパ腫などの悪性腫瘍において特に重要であり得る。
【０２１８】
この効果は、抗体ｍ１、ｍ２、ｍ７、ｍ９、ｍ１０のＩｇＡ抗体では見られなかった。これらはこの負の副作用を持たない。実際に、Ｂ細胞が健常ボランティアの血液から単離された場合、ＣＤ２０  ＩｇＧ抗体は４０〜６０パーセントのＣＤ２０標的分子の減少を示すが、ＩｇＡ抗体はＢ細胞の細胞表面に８０％レベルで残存し（図２５および２６参照）、ＩｇＡ抗体はＩｇＧ抗体に比べて療法において副作用が少ないことを示唆する。
【０２１９】
ＣＤ２０内部移行の方法
ＰＢＭＣを健常ドナーから、フィコール（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配により分離し、ＭＡＣＳヒトＢ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  ｂｉｏｔｅｃ）を用いるＢ細胞単離に使用した。５×１０ｅ４の単離されたＢ細胞をコニカル９６ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕまたは４８８（ＡＬ４８８）標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）Ａｂとともに３７℃／５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。結合していないＡｂを洗い流し、ＡＬ４８８シグナルを、２５μｇ／ｍｌのヤギ抗ＡＬ４８８（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてクエンチした。残存ＣＤ２０の％は、（（非クエンチＭＦＩ−クエンチＭＦＩ）／非クエンチＭＦＩ）×１００として計算した。
【０２２０】
例５
材料および方法
ＡＤＣＣアッセイ
５１Ｃｒ標識標的細胞を用いるＡＤＣＣアッセイは、従前に記載されているように（２２、２４）行った。簡単に述べれば、健常個体（ＭｉｎｉＤｏｎｏｒＤｉｅｎｓｔ  ＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）からフィコール／ヒストパーク分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単離したＰＢＭＣおよびＰＭＮを５１Ｃｒ標識Ｄａｕｄｉ細胞（エフェクター：標的比＝１００：１）および希釈ＣＤ２０  ｍＡｂと合わせた。３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、上清を採取し、液体シンチレーションカウンター（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて計数した。溶解率は下式を用いて計算した：溶解率％＝（（サンプルの計数値−最小放出）／（最大放出−最小放出））×１００。培養培地または５％トリトンＸ−１００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加した培地中、Ｄａｕｄｉ細胞とエフェクター細胞を用いて、それぞれ最小放出および最大放出を決定した。
【０２２１】
ＥＬ４−ＣＤ２０リンパ腫モデル
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＪａｎｖｉｅｒ（フランス）から購入するか、または本発明者らの施設で育てた。マウス４〜６個体／群に５×１０５のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（１０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）標識ＥＬ４−ＣＤ２０細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。１６時間後、マウスをｍＡｂまたはＰＢＳ（１００μＬ）のｉ．ｐ．注射で処置した。５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳでの腹腔洗浄を２４時間後に行い、残存する腫瘍細胞の量を、ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブ（ＢＤ）を用いて測定した。実験は総てＵＭＣ  Ｕｔｒｅｃｈｔの動物倫理委員会によって承認されたものであった。
【０２２２】
ＥＬ４−ＣＤ２０リンパ腫細胞上のＣＤ２０の飽和
従前に記載されたＥＬ−４リンパ腫モデルを実施した後、採取した腫瘍細胞をＰＢＳで２回洗浄し、二次ＩｇＡまたはＩｇＧ−ＰＥ標識抗体で染色した。ＣＤ２０の抗ＣＤ２０抗体での飽和は、抗体（１０μｇ／ｍｌ）をｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に加えた後、二次抗体で染色する前に、シグナルの増大が存在しないことにより示された。ＣＤ２０のシェービングは、ＰＢＳ処置マウスからのＥＬ４細胞上でのＣＤ２０発現を抗体処置マウスと比較することによって決定した。
【０２２３】
結果
機能特性評価：
ＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞と結合する抗体の能力およびＰＣＤに対する抗体の機能性を図１３および図１４に示す。ＩｇＧ１−ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂのＣＤＣ誘導能を図１５に示す（例３も参照）。クロム放出アッセイにおける、新規ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの、ＰＭＮにより媒介される腫瘍細胞溶解を誘導する能力を図２７に示す。ＩｇＡ１抗体は同等のＡＤＣＣ能を有するが、ＩｇＡ１−ＣＤ２０  ＵＭＡＢ００７が最も有効である（図２７Ａ）。ＩｇＡ２抗体については、総ての抗体が同等の有効性を示すが、ＩｇＡ２−ＣＤ２０  ＵＭＡＢ０１０が最高の死滅能を有する（図２７Ｂ）。次に、本発明者らは、ＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂのヒトＢ細胞枯渇能を分析した。健常ドナーからの白血球をｍＡｂとともにインキュベートすると、濃度依存的なＣＤ１９＋イベントの低下が起こった（図１６Ａ）。この効果はＲＴＸとＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂの間で同等であった。ＣＤ１９＋イベントの数（図１６Ｂ）は、総てのＩｇＡ−ＣＤ２０  ｍＡｂで一貫して低下し、０．０５〜０．５μｇ／ｍＬ  ｍＡｂの間でプラトーに達した。対照的に、ＲＴＸインキュベーション時のＣＤ１９＋イベントの数は０．０５μｇ／ｍＬで最小となったが、より高濃度では再び上昇した５。両アイソタイプについて、ＣＤ１９−イベントの数は０．０５〜０．５μｇ／ｍＬの間で最適に達した（図１６Ｃ）。これらの抗体の選択のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をＥＬ４−ＣＤ２０リンパ腫モデルで検討した（図２８）。ＩｇＡ２−ＣＤ２０  ＵＭＡＢ００２およびＩｇＡ１−ＣＤ２０  ＵＭＡＢ００７は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩｇＡ抗体の能力を示すリツキシマブと同じ効力であった。最後に、リツキシマブによる処置後にＣＤ２０発現の低下が見られたが（図２８−Ａ）、その発現はＩｇＡ抗体による処置後には低下しない（図２８−Ｂ−Ｃ）ことが示された。次に、ＥＬ４−ＣＤ２０細胞のＣＤ２０発現をこれらのサンプルで決定した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ２０発現はＩｇＧ処置後に低下したが、ＩｇＡ処置後には低下しなかったことが示される（図２９）。この特定のアッセイにおいて、Ｕｍａｂ  ００２および００７はｕｍａｂ  ００１よりも良好に機能すると思われる。ＩｇＡ２は、ｕｍａｂ  ００１およびｕｍａｂ  ００２に関してより良好なアイソタイプであると思われるが、ＩｇＡ１はｕｍａｂ  ００７と組み合わせた場合により良好である。ＩｇＡ１−ＣＤ２０  ＵＭＡＢ．．．（ここで、点は三桁を示す）は、明示された５つのマウス抗体のうちの１つの示された定常領域および可変ドメインを有する抗体である。ＵＭＡＢ参照の最後の桁は、同じ数字を有するｍ抗体の可変ドメインを示す。
【０２２４】
【表１】
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【０２２５】
【表２】
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【０２２６】
【表３】
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【０２２７】
参照文献
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【図１−１】
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【図１−２】
2019530661.tif 000040
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ−Ｅ】
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【図９Ｆ−Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｂ】
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【図２２Ｃ−Ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019530661.tif 000084
2019530661.tif 000085