(57)【要約】  本発明は、オールトランスレチノイン酸注射剤及び腫瘍治療薬の調製におけるオールトランスレチノイン酸注射剤の使用を提供する。前記オールトランスレチノイン酸注射剤は、オールトランスレチノイン酸及び溶解補助分子を含み、オールトランスレチノイン酸の見かけ溶解度を０．０１ｍｇ／ｍｌから０．１ｍｇ／ｍｌ以上まで上昇させる。当該製剤は、腫瘍患者の血中及び腫瘍組織における浸潤免疫抑制細胞群の活性を低下させて、腫瘍に対する免疫・殺滅メカニズムの効果を向上させることが可能である。また、単独で使用しても、その他の薬物と併用しても、腫瘍の成長及び腫瘍の再発を抑制可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オールトランスレチノイン酸及び溶解補助分子を含むオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項２】
前記溶解補助分子は、脂質、ポリオキシエチレンヒマシ油、ＰＶＰ、ＨＰＭＣ、プルロニックブロック共重合体、シクロデキストリン又はＰＥＧのうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択することを特徴とする請求項１に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項３】
前記溶解補助分子とオールトランスレチノイン酸との質量比は、（１０〜８０）：１の範囲であることを特徴とする請求項１に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項４】
前記脂質は、リン脂質、コレステロール又はポリエチレングリコール化リン脂質のうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択することを特徴とする請求項２に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項５】
前記脂質とオールトランスレチノイン酸との質量比は、（２０〜８０）：１の範囲であることを特徴とする請求項２に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項６】
前記リン脂質は、ＥＰＣ、ＨＳＰＣ又はＤＰＰＣのうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択することを特徴とする請求項２に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項７】
前記オールトランスレチノイン酸注射剤は、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳剤性注射剤、又は注射用滅菌粉末であることを特徴とする請求項１に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項８】
前記オールトランスレチノイン酸の濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項９】
前記注射剤の投与経路は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射から選択することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤。
【請求項１０】
腫瘍治療薬の調製における請求項１〜７のいずれか一項に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤の使用。
【請求項１１】
前記オールトランスレチノイン酸注射剤は、腫瘍患者における異常な骨髄由来免疫抑制細胞の活性低下、骨髄由来免疫抑制細胞の分化誘導、腫瘍の増殖及び再発の抑制を可能とすることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記骨髄由来免疫抑制細胞は、乳腺癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、基底細胞癌、メラノーマ、濾胞性リンパ腫又は小リンパ球性リンパ腫の患者体内における骨髄由来免疫抑制細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
薬物調製における請求項１〜７のいずれか一項に記載のオールトランスレチノイン酸注射剤の使用であって、前記薬物は、
（１）腫瘍浸潤細胞における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させる作用、
（２）腫瘍浸潤ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−細胞の分化を誘導する作用、
（３）腫瘍患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ３３＋細胞の表現型の変化を促進する作用、
（４）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−細胞のＴ細胞に対する抑制作用を低下させる作用、
（５）腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する作用、
（６）腫瘍組織における浸潤リンパ球比率を増加させる作用、
（７）腫瘍細胞の転移を抑制する作用、
（８）腫瘍の成長を遅延させる作用、のうちのいずれか１つ又は複数を発揮する使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオファーミングの技術分野に属し、具体的には、オールトランスレチノイン酸注射剤及び応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トレチノインは体内におけるビタミンＡの代謝生成物である。オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、薬物としてざ瘡の治療に用いられる。また、急性前骨髄球性白血病（ａｃｕｔｅ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＰＬ）の臨床治療においても重要な薬物となっており、現在の臨床応用では経口製剤として投与されている。
【０００３】
オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は細胞内の特定受容体（ＲＡＲｓ，ＲＸＲｓ及びＲＯＲｓ）と結合して遺伝子発現に影響を及ぼすものであり、急性前骨髄球性白血病の治療においては、ＡＰＬ細胞の分化やＰＭＬ／ＲＡＲα遺伝子の分解を促進することで治療効果を発揮する（非特許文献１）。また、文献によれば、ＡＴＲＡは腫瘍患者の体内の骨髄由来免疫抑制細胞の分化を促進し、腫瘍組織内の各種骨髄由来免疫抑制細胞の数を減少させることが可能である（非特許文献２）。骨髄由来免疫抑制細胞が最初に発見されたのは１９８０年代である。骨髄由来免疫抑制細胞は、主として異なる分化度にある相対的に未熟な細胞から構成される。担癌マウスの骨髄、血液、リンパ器官及び腫瘍浸潤部位には、ＣＤ１１ｂ及びＧｒ−１で標識される大量の骨髄性細胞が発現する。これらの細胞は人体ではＣＤ３４＋ＣＤ３３＋ＣＤ１３＋となり、且つ、骨髄性前駆細胞と同様に寒天上でクローンを形成可能である。腫瘍の微小環境において、骨髄由来免疫抑制細胞は、アルギナーゼ、ＲＯＳ及びＩＬ−６を分泌してエフェクターＴ細胞の殺傷活性を低下させ、ＤＣ細胞の成熟を抑制する。また、ＡＴＲＡには腫瘍幹細胞の分化促進作用があるとの報告もされている（非特許文献３）。
【０００４】
ところが、オールトランスレチノイン酸薬物には、臨床応用において次のような限界がある。
１．オールトランスレチノイン酸は水溶性が極めて低い（４．７７ｅ−０３ｇ／ｌ）。
２．オールトランスレチノイン酸は血漿半減期が短いが、薬効を発揮させようとすると、一定の血中薬物濃度及び標的器官内での薬効濃度を比較的長時間にわたって維持せねばならない。
また、現在のところ、ほとんど全ての研究で経口製剤が用いられており、バイオアベイラビリティは３０％以下にとどまっている。研究によれば、ＡＴＲＡは一定の血中薬物濃度以上を維持しない限り、分化誘導能力を発揮することができない。そのため、オールトランスレチノイン酸の見かけ濃度の高い液状製剤を発見することがとりわけ重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｌｏｗ−Ｄｏｓｅ Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ（２５ｍｇ／ｍ２）ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ ８２，１２，１９９３．Ｐ．３５６０
【非特許文献２】Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；６６：（１８）．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５，２００６
【非特許文献３】Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ ｕｓｉｎｇ ｍＴＯＲ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ａｌｌ−ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ．ＯＮＣＯＬＯＧＹ ＲＥＰＯＲＴＳ ３０：１６４５−１６５０，２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術の課題を解消するために、本発明は、オールトランスレチノイン酸注射剤及び応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的及び関連するその他の目的を達成するために、本発明は以下の技術方案を用いる。
【０００８】
本発明は第一の局面において、オールトランスレチノイン酸及び溶解補助分子を含むオールトランスレチノイン酸注射剤を提供する。
【０００９】
好ましくは、前記溶解補助分子は、脂質、ポリオキシエチレンヒマシ油、ＰＶＰ、ＨＰＭＣ、プルロニックブロック共重合体、シクロデキストリン又はＰＥＧのうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択する。
【００１０】
好ましくは、前記溶解補助分子とオールトランスレチノイン酸との質量比は、（１０〜８０）：１の範囲である。
【００１１】
好ましくは、前記脂質は、リン脂質、コレステロール又はポリエチレングリコール化リン脂質のうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択する。
【００１２】
好ましくは、前記脂質とオールトランスレチノイン酸との質量比は、（２０〜８０）：１の範囲である。
【００１３】
好ましくは、前記リン脂質はＰＣリン脂質から選択する。より好ましくは、前記リン脂質は、ＥＰＣ、ＨＳＰＣ又はＤＰＰＣのうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択する。
【００１４】
好ましくは、前記ポリエチレングリコール化リン脂質の分子量は、５０〜１００００の範囲とする。
【００１５】
好ましくは、前記オールトランスレチノイン酸注射剤は、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳剤性注射剤、又は注射用滅菌粉末である。
【００１６】
より好ましくは、前記オールトランスレチノイン酸注射剤が溶液性注射剤、懸濁性注射剤又は乳剤性注射剤の場合、前記オールトランスレチノイン酸注射剤には溶媒が含まれ、且つ、前記溶媒には等浸透圧調整剤が含まれる。
【００１７】
好ましくは、前記等浸透圧調整剤は塩化ナトリウムである。前記塩化ナトリウムの溶媒における質量／体積パーセント濃度は０．５〜０．９％である。
【００１８】
好ましくは、前記溶媒は更に保護剤を含む。前記保護剤はショ糖である。前記ショ糖の溶媒における質量／体積パーセント濃度は２〜５％である。
【００１９】
質量／体積パーセント濃度とは、溶媒１００ｍｌあたりに含まれる溶質の質量（ｇ）である。
【００２０】
好ましくは、前記オールトランスレチノイン酸注射剤における前記オールトランスレチノイン酸の濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ以上である。より好ましくは、前記オールトランスレチノイン酸注射剤における前記オールトランスレチノイン酸の濃度は１．０ｍｇ／ｍｌ以上である。更に好ましくは、前記オールトランスレチノイン酸注射剤における前記オールトランスレチノイン酸の濃度は１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２１】
より好ましくは、前記注射用製剤の投与経路は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射から選択する。
【００２２】
本発明は第二の局面において、腫瘍治療薬の調製における前記オールトランスレチノイン酸注射剤の使用を提供する。
【００２３】
好ましくは、前記腫瘍治療薬は、腫瘍患者における異常な骨髄由来免疫抑制細胞、骨髄由来免疫抑制細胞の分化誘導、腫瘍の増殖及び再発の抑制を対象とした薬物である。
【００２４】
より好ましくは、前記骨髄由来免疫抑制細胞とは、乳腺癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、基底細胞癌、メラノーマ、濾胞性リンパ腫又は小リンパ球性リンパ腫の骨髄由来免疫抑制細胞である。
【００２５】
本発明は第三の局面において、薬物調製における前記オールトランスレチノイン酸注射剤の使用を提供する。前記薬物は、（１）腫瘍浸潤細胞における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させる作用、（２）腫瘍浸潤ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−細胞の分化を誘導する作用、（３）腫瘍患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ３３＋細胞の表現型の変化を促進する作用、（４）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−細胞のＴ細胞に対する抑制作用を低下させる作用、（５）腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する作用、（６）腫瘍組織における浸潤リンパ球比率を増加させる作用、（７）腫瘍細胞の転移を抑制する作用、（８）腫瘍の成長を遅延させる作用、のうちのいずれか１つ又は複数を発揮する。
【００２６】
本発明は第四の局面において、患者に対し上述のオールトランスレチノイン酸注射剤を適用するステップを含む腫瘍の治療方法を提供する。具体的な投与量は、当業者が熟知する範囲とする。
【発明の効果】
【００２７】
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する。
（１）長期実験を通じて、本発明で調製されるオールトランスレチノイン酸注射剤は、オールトランスレチノイン酸の溶解度を従来技術における０．０１ｍｇ／ｍｌから０．１ｍｇ／ｍｌ以上にまで上昇させることができ、少なくとも１０倍上昇可能なことが発見及び証明された。
（２）当該製剤を用いれば、腫瘍進行の微小環境を効果的に調節可能となり、且つ、腫瘍部位における関連マクロファージの分化を効果的に誘導可能となる。静脈注射又は静脈点滴により投与する場合、本発明の血漿終末相半減期は８〜１２ｈにも達し得る。本発明で治療すると、腫瘍における４０〜７０％の骨髄由来免疫抑制細胞の分化又はアポトーシスを促進可能であり、且つ、成熟樹状細胞（ＤＣｓ）の形成を誘導可能となる。本発明で治療すると、骨髄由来免疫抑制細胞から分泌されるインターロイキン−６（ＩＬ−６）レベルが著しく低下する。また、単独で使用しても併用しても免疫療法効果を得ることができ、腫瘍細胞の増殖及び腫瘍再発の抑制に適用可能である。よって、医療面での実用性に極めて優れる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、マウスにおけるＥＰＣリポソームの血中薬物濃度曲線である。
【図２】図２は、オールトランスレチノイン酸注射剤によるマウスの腫瘍部位細胞のＭＤＳＣ抑制実験を示す。
【図３】図３は、オールトランスレチノイン酸注射剤による頭頚部粘膜扁平上皮癌患者の血中ＭＤＳＣの分化促進を示す。
【図４】図４は、オールトランスレチノイン酸注射剤による腫瘍患者のＭＤＳＣにおけるｉＮＯＳ発現の明らかな減少を示す。
【図５】図５は、オールトランスレチノイン酸注射剤を腫瘍患者の体内腫瘍組織に作用させた場合に、膀胱癌の腫瘍浸潤骨髄性細胞におけるＭＤＳＣ表現型細胞の数が明らかに減少し得ることを示す。
【図６】図６は、腫瘍患者のＭＤＳＣによるＴ細胞抑制作用がオールトランスレチノイン酸注射剤により低下したことを示す。
【図７】図７は、オールトランスレチノイン酸注射剤によりヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７のアポトーシスが促進されたことを示す。
【図８】図８は、オールトランスレチノイン酸注射剤によりヒト末梢血白血病Ｔ細胞Ｊｕｋａｔのアポトーシスが促進されたことを示す。
【図９】図９は、オールトランスレチノイン酸注射剤により４Ｔ１担癌マウスの腫瘍組織体積が減少したことを示す。
【図１０】図１０は、オールトランスレチノイン酸注射剤により腫瘍浸潤リンパ球（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞）の数が増加したことを示す。
【図１１】図１１は、オールトランスレチノイン酸注射剤により４Ｔ１担癌マウスの腫瘍細胞における肝臓組織の湿潤・転移が減少したことを示す（白矢印が腫瘍細胞の浸潤部位を示す）。
【図１２】図１２は、オールトランスレチノイン酸注射剤により４Ｔ１担癌マウスの腫瘍細胞における腎臓組織の湿潤・転移が減少したことを示す（白矢印が腫瘍細胞の浸潤部位を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
オールトランスレチノイン酸注射剤
【００３０】
本発明のオールトランスレチノイン酸注射剤は、オールトランスレチノイン酸及び溶解補助分子を含む。
【００３１】
前記溶解補助分子は、脂質、ポリオキシエチレンヒマシ油、ＰＶＰ、ＨＰＭＣ、プルロニックブロック共重合体、シクロデキストリン又はＰＥＧのうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択する。
【００３２】
前記溶解補助分子とオールトランスレチノイン酸との質量比は、（１０〜８０）：１の範囲である。
【００３３】
前記脂質は、リン脂質、コレステロール又はポリエチレングリコール化リン脂質のうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択する。
【００３４】
前記脂質とオールトランスレチノイン酸との質量比は、（２０〜８０）：１の範囲である。また、前記脂質とオールトランスレチノイン酸との質量比は、（２０〜５０）：１の範囲としてもよい。
【００３５】
前記リン脂質はＰＣリン脂質から選択してもよい。更に、前記リン脂質は、ＥＰＣ、ＨＳＰＣ又はＤＰＰＣのうちのいずれか１つ又は複数の組み合わせから選択する。
【００３６】
前記ポリエチレングリコール化リン脂質の分子量は、５０〜１００００の範囲とする。
【００３７】
本発明の一実施例では、前記ポリエチレングリコール化リン脂質が２０００の場合を示す。
【００３８】
また、本発明の一実施例では、前記ポリオキシエチレンヒマシ油としてクレモフォールＲＨ４０を使用する。
【００３９】
前記オールトランスレチノイン酸注射剤は、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳剤性注射剤、又は注射用滅菌粉末である。
【００４０】
更に、前記オールトランスレチノイン酸注射剤が溶液性注射剤、懸濁性注射剤又は乳剤性注射剤の場合、前記オールトランスレチノイン酸注射剤には溶媒が含まれ、且つ、前記溶媒には等浸透圧調整剤が含まれる。
【００４１】
前記等浸透圧調整剤としては塩化ナトリウムを選択可能である。前記塩化ナトリウムの溶媒における質量／体積パーセント濃度は０．５〜０．９％とする。
【００４２】
前記溶媒は、更に保護剤を含んでもよい。前記保護剤はショ糖である。前記ショ糖の溶媒における質量／体積パーセント濃度は２〜５％とする。
【００４３】
質量／体積パーセント濃度とは、溶媒１００ｍｌあたりに含まれる溶質の質量（ｇ）である。
【００４４】
前記オールトランスレチノイン酸注射剤における前記オールトランスレチノイン酸の濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ以上とする。更に、前記オールトランスレチノイン酸注射剤における前記オールトランスレチノイン酸の濃度は１．０ｍｇ／ｍｌ以上とする。また、更に、前記オールトランスレチノイン酸注射剤における前記オールトランスレチノイン酸の濃度は１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲とする。
【００４５】
更に、前記注射用製剤の投与経路は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射から選択する。
オールトランスレチノイン酸注射剤の用途
【００４６】
本発明において、オールトランスレチノイン酸注射剤は腫瘍治療薬の調製用途に適用可能である。
【００４７】
前記腫瘍治療薬は、腫瘍患者における異常な骨髄由来免疫抑制細胞、骨髄由来免疫抑制細胞の分化誘導、腫瘍の増殖及び再発の抑制を対象とした薬物である。
【００４８】
前記骨髄由来免疫抑制細胞とは、乳腺癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、基底細胞癌、メラノーマ、濾胞性リンパ腫又は小リンパ球性リンパ腫の骨髄由来免疫抑制細胞である。
【００４９】
また、上記の用途は、以下の作用のうちのいずれか１つ又は複数を発揮する薬物の調製用途としてもよい。
（１）腫瘍浸潤細胞における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させる。
（２）腫瘍浸潤ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−細胞の分化を誘導する。
（３）腫瘍患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ３３＋細胞の表現型の変化を促進する。
（４）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−細胞のＴ細胞に対する抑制作用を低下させる。
（５）腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。
（６）腫瘍組織における浸潤リンパ球比率を増加させる。
（７）腫瘍細胞の転移を抑制する。
（８）腫瘍の成長を遅延させる。
腫瘍の治療方法
【００５０】
本発明における腫瘍の治療方法は、患者に対し上述のオールトランスレチノイン酸注射剤を適用するステップを含む。具体的な投与量は、当業者が熟知する範囲とする。
【００５１】
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、本発明による保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らないと解釈すべきである。また、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明による保護の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。また、以下の実施例で具体的条件を明記していない試験方法については、一般的に、汎用条件又はメーカーごとの推奨条件に基づき実施する。
【００５２】
実施例で数値範囲を提示している場合には、本発明において別途説明がない限り、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも適用可能であると解釈すべきである。また、別途定義しない限り、本発明で使用するあらゆる技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に解釈する意味と等しい。実施例で使用される具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者が把握する従来技術及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例における上記の方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
【００５３】
また、別途説明がない限り、本発明で開示する実験方法、測定方法、調製方法には、当業者にとって一般的な分子生物学、生物化学、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野の一般技術を適用可能である。これらの技術については従来文献で詳細に説明されており、具体的には以下の文献等を参照すればよい。
Ｓａｍｂｒｏｏｋほか，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１
Ａｕｓｕｂｅｌほか，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ
ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８
ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ （Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９
ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９
【実施例１】
【００５４】
本実施例では、異なる溶解補助分子によりＡＴＲＡを可溶化した場合の飽和溶解度について次の３種類の方法で考察した。
（１）乳化法：適量の溶解補助分子を１ｍｌの超純水に溶解し、水相とした。次に、１ｍｇの薬物を１ｍｌの有機溶媒に溶解して有機相とした。そして、攪拌条件下で有機相を水相に加えて一晩攪拌し、有機溶媒を揮発させるか、回転蒸発法（ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）で有機溶媒を除去することで薬物含有溶液を取得した。
（２）透析法：薬物を溶解補助分子とともに有機溶媒に溶解した後、１ｍｌの超純水を混合した。次に、取得した溶液を純水中で透析することで、薬物含有溶液を取得した。
（３）冷凍乾燥法：適量の溶解補助分子を１ｍｌの純水に溶解し、適量の凍結乾燥保護剤を加えて水相とした。次に、薬物を有機溶媒（ｔｅｒｔ−ブチルアルコール，ＴＢＡ）に溶解して有機相とし、有機相と水相を一定の比率で均一に混合してから凍結乾燥機に投入して凍結乾燥させた。これを２４時間後に取り出し、１ｍｌの超純水を加えて再溶解することで薬物含有溶液を取得した。
【００５５】
スクリーニングの結果、下記溶解補助分子を含有する次の注射剤を取得した。
即ち、２０％のクレモフォールＲＨ４０と５％のマンニトールを１ｍｌの純水に溶解して水相とした。次に、薬物として３ｍｇのＡＴＲＡを１．５ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルアルコールに溶解して有機相とし、有機相と水相を均一に混合してから５ｍｌのペニシリン瓶に充填した。これを凍結乾燥機に投入して凍結乾燥させ、２４時間後に取り出して封をした。また、投与前に１ｍｌの注射用水を加えて再溶解することで、薬物含有懸濁液を取得した。測定したところ、オールトランスレチノイン酸の飽和溶解度は０．１ｍｇ／ｍｌであった。また、動的光散乱法で測定したところ、懸濁液中の粒子の平均粒径は２７４ｎｍ±４２ｎｍであった。且つ、室温下で１０時間放置しても粒径は変わらず、特に良好な安定性と分散性を有していた。
【実施例２】
【００５６】
ＥＰＣ、ＨＳＰＣ、ＤＰＰＣをそれぞれ主な脂質材料として選択した。ＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００＝２：１：０．１２５のモル比で混合し、ＡＴＲＡを加えた（脂質／ＡＴＲＡの質量比はそれぞれ２０：１、４０：１、５０：１とした）。また、水和時に５〜７粒の小さなガラスビーズを加え、回転により３０ｍｉｎ水和させた。次に、孔径４００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍのポリカーボネート膜から順に１５回ずつ押し出した。これにより、オールトランスレチノイン酸リポソームの平均粒径を１００ｎｍ±３０ｎｍの範囲とした。ＰＤＩは約０．１であった。デキストランゲルＧ−５０マイクロカラムによって遊離オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を除去し、オールトランスレチノイン酸の基準曲線の線形範囲内において、リポソーム内に封入されたＡＴＲＡを除去した際の紫外線吸収値のピーク面積とＡＴＲＡ除去前の紫外線吸収値のピーク面積との比から、ＡＴＲＡリポソームの封入率を取得した。封入率は、それぞれ、ＥＰＣリポソーム：９４％、ＨＳＰＣリポソーム：９１％、ＤＰＰＣリポソーム：７６％であった。また、３種類のリポソーム製剤におけるＡＴＲＡ濃度はいずれも０．３ｍｇ／ｍｌ以上であった。
【００５７】
上記により調製したオールトランスレチノイン酸リポソームを静脈注射により投与したところ、マウス体内におけるＡＴＲＡの半減期は４〜１２時間の間であった。このうち、マウスにおけるＥＰＣリポソームの血中薬物濃度曲線は図１の赤線で示したようになり、算出したところ半減期は２４７ｍｉｎであった。
【実施例３】
【００５８】
０．０９７ｇの水素添加大豆リン脂質（ＨＳＰＣ）、０．０３１ｇのポリエチレングリコール化リン脂質である１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）、及び０．０３１ｇのコレステロールを量り、１．６ｍｌのエタノールで溶解してから、７０℃のウォーターバスで水浴により溶解及び混合した。次に、エタノール混合物を６．４ｍｌの酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ９．０）に加え、７０℃で３０分間水浴した。そして、取得したリポソーム小胞を孔径４００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍのポリカーボネート膜から順に８回ずつ押し出して、最終的に平均粒径が約９０ｎｍのリポソームを取得した。
【００５９】
上記手順で取得したリポソームを１００００孔径の透析膜により透析した。水相を質量分率１０％且つｐＨ６〜７のショ糖溶液に置換し、これに４ｍｇ／ｍｌのオールトランスレチノイン酸懸濁液を加えて、６０℃で４５分間インキュベートした。インキュベートの終了後、再び１００００孔径の透析膜で透析し、リポソームに封入されなかった遊離オールトランスレチノイン酸を除去することで、最終的にオールトランスレチノイン酸リポソーム注射液を取得した。なお、ＡＴＲＡの濃度は２．０ｍｇ／ｍｌであった。
【００６０】
静脈注射又は静脈点滴により投与したところ、マウスにおけるＡＴＲＡの血漿終末相半減期は８〜１２ｈであった。
【実施例４】
【００６１】
オールトランスレチノイン酸注射剤による腫瘍の骨髄由来免疫抑制細胞の体外分化誘導
１．Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍モデルの構築
（１）ＣＴ−２６細胞を対数増殖期まで培養してから、パンクレアチンで消化した。次に、消化した細胞を収集し、遠心分離機において回転数３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。そして、上清液を除き、滅菌ＰＢＳで細胞を再懸濁させてから細胞をカウントし、細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌとなるよう調整した。
【００６２】
（２）６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを購入し、皮下接種する側をしっかりと剃毛してから、４％の抱水クロラール２００μｌを腹腔注射して麻酔した。麻酔後に、右腋窩部に対し消化したＣＴ−２６懸濁液を皮下注射した。細胞接種量は５×１０５〜１×１０６／匹とし、接種後も飼育を継続した。
【００６３】
（３）約２〜３週間飼育した後、ノギスで腫瘍の長径及び短径を測定し、腫瘍体積の計算式 Ｖ＝１／２×長径×短径２で腫瘍サイズを算出した。そして、腫瘍体積が約１００ｍｍ３まで成長した段階で実験可能とした。
２．腫瘍関連リンパ球のＭＤＳＣキャラクタリゼーション及びソーティング
【００６４】
（１）マウスを断頭処置し、ピンセットとハサミで皮下から腫瘍を取り出してから、４０μｍのセルストレーナー上で破砕した。腫瘍組織の破砕時には、剪断力によって腫瘍細胞が傷付かないよう注意した。また、組織の破砕過程では５％ＰＢＳで組織を終始水洗いした。
【００６５】
（２）組織の破砕後、全ての組織と洗浄用ＰＢＳ溶液を合わせて遠心分離にかけ、上清を除去した後に、全ての組織を共に１ｍｌの腫瘍組織消化液を含む１５ｍｌの遠沈管に移し、３７℃、２００ｒｐｍ／ｍｉｎの振とう器条件で１ｈ消化した。
【００６６】
（３）消化した細胞を再び４０μｍのセルストレーナーに通し、ＰＢＳで細胞を洗浄することで、残った腫瘍組織消化液と細胞断片及び死細胞を除去し（洗浄後の遠心分離条件は、回転数：１０００ｒｐｍ、遠心分離時間：５ｍｉｎとした）、２〜３回洗浄した。最後にＰＢＳで再懸濁し、腫瘍単一細胞の懸濁液を取得した。
【００６７】
（４）１０７細胞あたり９０μｌの体積比率でソーティングバッファを加えるとともに、１０７細胞あたり１０μｌの体積比率でＣＤ１１ｂ磁気ビーズを加えた。
【００６８】
（５）磁気ビーズと細胞を十分均一に混合し、４℃の遮光条件下で３０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、１０７細胞あたり１ｍｌの体積比率で９０μｌのバッファを加え、１０００ｒｐｍ条件で５ｍｉｎ遠心分離した。また、遠心分離の終了後、バッファを用いて続けて２回洗浄した。
【００６９】
（６）最後に、５００μｌのバッファを加えて再懸濁し、磁気ビーズをインキュベートした腫瘍単一細胞の懸濁液を生成した。
【００７０】
（７）ＭＳカラムをキットのマグネットに配置し、予めバッファでリンスすることでＭＳカラムを十分に飽和させた。
【００７１】
（８）リンス終了後、磁気ビーズをインキュベートした腫瘍単一細胞の懸濁液をＭＳカラムの上方から投入した。そして、１ｍｌのバッファでＭＳカラムを洗浄することで、磁気ビーズと未結合の細胞をカラムから洗い流した。
【００７２】
（９）３〜５回繰り返し洗浄してからＭＳカラムを取り外し、１５ｍｌの遠沈管に投入した。続いて、１ｍｌのバッファを加え、ＭＳカラムキットの機器で急速に押し下げることで、ＭＳカラムに残留したＣＤ１１ｂ陽性細胞を収集した。
【００７３】
（１０）上記手順で取得したＣＤ１１ｂ陽性細胞懸濁液について細胞をカウントし、細胞濃度を１０７／ｍｌに調整することでフローサイトメトリー用サンプルを調製した。
【００７４】
（１１）フローサイトメトリー用サンプルを、ネガティブ群、Ｇｒ−１シングルポジティブ群、ＣＤ１１ｂシングルポジティブ群、検出対象サンプル群に分類した。また、群ごとに２〜３本の平行チューブを設けた。ネガティブ群については、ネガティブ条件として何らの蛍光抗体も加えなかった。一方、２つのシングルポジティブ群については、後の蛍光補正のために単一の蛍光抗体をそれぞれ加えた。また、検出対象サンプル群については検出対象の蛍光抗体を加えた。
【００７５】
（１２）全てのフローチューブに対し、フロー染色バッファ（Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）で再懸濁した体積１００μｌの細胞（約１０６個）をそれぞれ投入した。ネガティブ対照群には何らの蛍光抗体も加えなかったが、Ｇｒ−１シングルポジティブ群にはＧｒ−１抗体を、ＣＤ１１ｂシングルポジティブ群にはＣＤ１１ｂ抗体を加えた。また、検出対象サンプル群にはＧｒ−１及びＣＤ１１ｂ抗体ともに加えた。
【００７６】
（１３）４℃の遮光条件下で３０ｍｉｎインキュベートした。インキュベート終了後、１ｍｌの染色バッファを加えて遠心分離し、細胞に未結合の抗体を洗い流してから、染色バッファで細胞を２回洗浄した。最後に、体積５００μｌの染色バッファで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで検出した。
３．オールトランスレチノイン酸注射剤による末梢血リンパ球及び腫瘍部位リンパ球の分化誘導作用
【００７７】
（１）実施例１，２，３の方法でオールトランスレチノイン酸注射剤を調製した。
【００７８】
（２）腫瘍組織のＭＤＳＣ細胞をソーティングし、カウントした後、細胞濃度が１０７／ｍｌとなるよう調整した。次に、ソーティングして収集した細胞を２４ウェルプレートに接種し、各ウェルの最終細胞濃度を１０６／ウェルとした。
【００７９】
（３）細胞を敷き詰めたウェルプレートに２０μｌのＰＢＳ、２０μｌのオールトランスレチノイン酸注射剤、５０μｌのオールトランスレチノイン酸注射剤を順に加え、３７℃で２４ｈインキュベートした。
【００８０】
（４）１日インキュベートした後、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ−II抗体を用いて細胞をインキュベートした。そして、フローサイトメーターで細胞中のＭＤＳＣ及びＤＣの変化を観察した。なお、フローサンプル処理の過程では、アイソタイプコントロールの投入及び蛍光補正に注意した。
【００８１】
実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤については、図２に示すように、薬物の投与量を変えることでＧｒ−１ｈｉの細胞数に明らかな減少が認められた。高用量投与群（＋５０μｌオールトランスレチノイン酸注射剤）では、Ｇｒ−１ｈｉの細胞比率が対照群の１７．５％から９．１０％まで低下した。また、Ｇｒ−１ｉｎｔの細胞については明らかな比率の変化は見られなかったが、これは高発現のＧｒ−１がオールトランスレチノイン酸の誘導作用によって中低度の発現に変化したためと考えられる。また、Ｇｒ−１ｌｏｗの細胞比率は薬物投与量の増加に伴って上昇しており、オールトランスレチノイン酸がＭＤＳＣの分化を誘導した結果、Ｇｒ−１の発現量が低下したことを更に意味している。腫瘍部位の大部分に浸潤するＭＤＳＣはＧｒ−１ｈｉ又はＧｒ−１ｉｎｔを特性として有することから、オールトランスレチノイン酸注射剤は腫瘍部位におけるＭＤＳＣの分化を誘導可能であり、結果としてＭＤＳＣの数が減少したと推定される。
【００８２】
実施例１及び実施例２におけるその他のオールトランスレチノイン酸注射剤についても同様の実験結果が得られた。即ち、腫瘍部位におけるＭＤＳＣの分化を誘導可能であり、結果としてＭＤＳＣの数が減少した。
【実施例５】
【００８３】
オールトランスレチノイン酸注射剤による頭頸部粘膜扁平上皮癌患者の体内におけるＰＢＭＣのＣＤ３３＋細胞表現型の変化促進
頭頸部粘膜扁平上皮癌患者の末梢血を２ｍｌ取り、２ｍｌのＰＢＳを加えて１倍希釈した。次に、４ｍｌの希釈血液を試験管の内壁に沿ってゆっくりと３ｍｌのヒトリンパ球分離溶液に添加して、希釈血液標本をヒトリンパ球分離溶液に重ねた。これを室温下において毎分３００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離した（加速２、減速１）。次に、ストローで単核細胞層を全て吸い出し、ＰＢＳ液で１０ｍｌまで希釈してから３００ｇで２回遠心洗浄した。そして、上清を捨ててから少量のＰＢＳを加え、大量のＰＢＭＣを取得して４℃で保管した。続いて、磁気ビーズ分離装置の操作マニュアルを参照し、ＣＤ３３抗体で標識した磁気ビーズを用いて分離することでＰＢＭＣ細胞中の骨髄性細胞を取得した。各ウェル５×１０５細胞とし、ＲＰＭＩ１６４０完全培地（１０％ＦＢＳを添加）を用いて１２ウェル細胞用プレートに細胞を培養した。これに実施例１又は実施例２又は実施例３で調製して取得したオールトランスレチノイン酸注射剤を加え、２４時間培養してから、フローサイトメーターを用いてＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋表現型ＤＣ細胞群が骨髄性細胞に占めるパーセンテージを検出した。
【００８４】
図３に示すように、実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤について、フローサイトメーターによりＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋表現型ＤＣ細胞群が骨髄性細胞に占めるパーセンテージを検出したところ、顕著な数の増加が見られた。また、図４に示すように、これらの細胞ではｉＮＯＳの発現に著しい減少が見られた。このほか、Ａｒｇ−１、ＩＬ−６等の発現レベルにも著しい減少が見られた。
【００８５】
また、実施例１及び２におけるその他の各オールトランスレチノイン酸注射剤についても同様の実験結果が得られた。即ち、オールトランスレチノイン酸注射剤を用いることで、ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋表現型ＤＣ細胞群が骨髄性細胞に占めるパーセンテージを著しく増加させることができた。また、これら細胞におけるＡｒｇ−１、ｉＮＯＳ、ＩＬ−６等の発現レベルに著しい減少が認められた。
【実施例６】
【００８６】
オールトランスレチノイン酸注射剤による膀胱癌の腫瘍浸潤骨髄性細胞におけるＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＭＤＳＣ数の明らかな減少
膀胱癌患者の腫瘍サンプルを取って無菌塩水で洗浄してから、１０％ウシ胎児血清を含む４℃のＲＰＭＩ１６４０（ペニシリン１００μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍを含む）細胞培養液に加え、実験室に運んで処理した。腫瘍を２ｍｌの培地に配置して氷上で組織を破砕してから、２ｍｌの酵素消化液（コラゲナーゼＩ及びＩＶ消化液０．６〜１ｍｇ／ｍｌ）を含む１５ｍｌの遠沈管に移し、軽く旋回させて均一に混合した。そして、３７℃の恒温振とう器を用い、２００ｒｐｍで２ｈ振とうした。続いて、滅菌ＰＢＳでゆっくりと洗浄し、４０μｍ膜を通して５０ｍｌ遠沈管に投入した。これを３００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した後、ＰＢＳで細胞を再懸濁し、カウントした。そして、磁気ビーズ分離装置の操作マニュアルを参照し、ＣＤ３３抗体で標識した磁気ビーズを用いて分離することで腫瘍組織の浸潤細胞における骨髄性細胞を取得した。次に、各ウェル５×１０５細胞とし、ＲＰＭＩ１６４０完全培地（１０％ＦＢＳを添加）を用いて１２ウェル細胞用プレートに細胞を培養した。これに実施例１又は実施例２又は実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤薬物を加え、２４時間培養してから、フローサイトメーターを用いてＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＭＤＳＣ細胞群が骨髄性細胞に占めるパーセンテージを検出した。
【００８７】
その結果、図５に示すように、本発明の実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤を腫瘍患者体内の腫瘍組織に作用させた場合、膀胱癌の腫瘍浸潤骨髄性細胞におけるＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＭＤＳＣ表現型細胞の数を明らかに減少させることができた。また、図６に示すように、本発明の実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤は、腫瘍患者のＭＤＳＣによるＴ細胞抑制作用を低減可能であった。
【００８８】
実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤についても同様の実験結果が得られた。即ち、腫瘍患者体内の腫瘍組織に作用させた場合、膀胱癌の腫瘍浸潤骨髄性細胞におけるＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＭＤＳＣ表現型細胞の数を明らかに減少させることができた。且つ、前記オールトランスレチノイン酸注射剤は、腫瘍患者のＭＤＳＣによるＴ細胞抑制作用を低減可能であった。
【実施例７】
【００８９】
オールトランスレチノイン酸注射剤によるヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７のアポトーシス促進
実験１日前に、５×１０５個のＭＣＦ−７細胞を６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で５％ＣＯ２細胞インキュベーターにより一晩培養した。２日目に細胞培養プレートから培養液を除去し、新鮮な培地と実施例１又は実施例２又は実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤薬物を添加した。そして、３７℃で５％ＣＯ２細胞インキュベーターにより２４ｈ培養した。次に、ＥＤＴＡを含有しないパンクレアチンで消化してから、４℃下において３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離することで細胞を収集した。その後、予め冷やしておいたＰＢＳで細胞を２回洗浄した。いずれの洗浄時にも４℃下において３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、１〜５×１０５個の細胞を収集した。そして、ＰＢＳを吸い出し、１００μＬの１×結合バッファ（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）を加えて細胞を再懸濁した。これに５μＬのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び１０μＬのヨウ化プロピジウム溶液（ＰＩ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加え、均一となるよう軽く混合した。続いて、遮光室温下で１０〜１５ｍｉｎ反応させた後、４００μＬの１×結合バッファを加えて均一に混合し、氷上に放置した。サンプルは１時間以内にフローサイトメーターで検出した。
【００９０】
その結果、図７に示すように、本発明の実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤はヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７のアポトーシスを著しく促進可能であった。
【００９１】
実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤についても同様の実験結果が得られた。即ち、実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤はヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７のアポトーシスを著しく促進可能であった。
【実施例８】
【００９２】
オールトランスレチノイン酸注射剤によるヒト末梢血白血病Ｔ細胞Ｊｕｋａｔのアポトーシス促進
実験１日前に、５×１０５個のＪｕｋａｔ細胞を６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で５％ＣＯ２細胞インキュベーターにより一晩培養した。２日目に細胞培養プレートから培養液を除去し、新鮮な培地と実施例１又は実施例２又は実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤薬物を添加した。そして、３７℃で５％ＣＯ２細胞インキュベーターにより２４ｈ培養した。次に、４℃下において３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離することで細胞を収集した。その後、予め冷やしておいたＰＢＳで細胞を２回洗浄した。いずれの洗浄時にも４℃下において３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、１〜５×１０５個の細胞を収集した。そして、ＰＢＳを吸い出し、１００μＬの１×結合バッファを加えて細胞を再懸濁した。これに５μＬのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び１０μＬのヨウ化プロピジウム溶液を加え、均一となるよう軽く混合した。続いて、遮光室温下で１０〜１５ｍｉｎ反応させた後、４００μＬの１×結合バッファを加えて均一に混合し、氷上に放置した。サンプルは１時間以内にフローサイトメーターで検出した。
【００９３】
その結果、図８に示すように、本発明の実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤はヒト末梢血白血病Ｔ細胞Ｊｕｋａｔのアポトーシスを著しく促進可能であった。
【００９４】
実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤についても同様の実験結果が得られた。即ち、実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤はヒト末梢血白血病Ｔ細胞Ｊｕｋａｔのアポトーシスを著しく促進可能であった。
【実施例９】
【００９５】
オールトランスレチノイン酸注射剤による担癌マウスの腫瘍成長抑制
４Ｔ１皮下移植腫瘍モデルを次の手法で構築した。即ち、体外で４Ｔ１腫瘍細胞株を培養してカウントし、腫瘍細胞懸濁液を調製してから、調製した腫瘍細胞懸濁液を均一となるようブローイング（ｂｌｏｗｉｎｇ）した。次に、Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス）を固定し、エタノール綿球で注射部位の皮膚を消毒した後、動物ごとに１×１０６個の細胞を皮下接種した。注射終了後は、注射部位を軽く押さえて逆流を防止した。接種後に腫瘍の成長状況を観察し、移植腫瘍の体積を測定した。また、ノギスで腫瘍の最長径（ａ）と最短径（ｂ）を測定し、Ｖ＝１／２×ａｂ×（ａ＋ｂ）で腫瘍体積（Ｖ）を算出した。そして、マウスの腫瘍が約１０ｍｍ３まで成長してから、尾に実施例１又は実施例２又は実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤（５ｍｇ／ｋｇ）を一日置きに静脈注射した。また、対照群のマウスの尾には、同量のオールトランスレチノイン酸を含まない注射剤を一日置きに静脈注射した。そして、マウスの体重を観察し、腫瘍の平均体積を測定及び統計して成長曲線を描いた。
【００９６】
結果、図９に示すように、本発明の実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤を４Ｔ１担癌マウスに作用させたところ、マウスの腫瘍組織の体積サイズが減少した。
【００９７】
実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤についても同様の実験結果が得られた。即ち、実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤を４Ｔ１担癌マウスに作用させたところ、マウスの腫瘍組織の体積サイズが減少した。
【実施例１０】
【００９８】
オールトランスレチノイン酸注射剤による担癌マウスモデルの腫瘍浸潤リンパ球比率の著しい増加
実施例９の４Ｔ１担癌マウスから腫瘍組織を取り、４％ホルムアルデヒド溶液で３〜５日間固定した後、固定液から組織を取り出して適切な形状及び厚さに手直しした。次に、組織片を８０％、９０％、９５％、１００％のエタノールＩ、１００％のエタノールII、１００％のエタノールIIIに通して脱水処理し、キシレンＩで３０ｍｉｎ、キシレンIIで３０ｍｉｎ透徹処理した後、パラフィンＩで１ｈ、パラフィンIIで６ｈ浸漬した。原則として試料切断面を下向きとし、パラフィンで組織を包埋してから、パラフィンブロックが冷やし固められた後に−２０℃で冷蔵した。続いて、切片の厚さを４μｍとし、６５℃のサーモスタットに６〜１２ｈ投入した。その後、容器に入れて常温保存した。
【００９９】
パラフィンによる免疫組織化学のステップとしては、パラフィン切片を脱パラフィン・再水和し、室温下で３％Ｈ２Ｏ２により５〜１０分間インキュベートすることで、内在性ペルオキシダーゼ活性を除去した。そして、蒸留水による洗浄及びＰＢＳによる５分間の浸漬を２回繰り返した。次に、５〜１０％の正常ヤギ血清（ＰＢＳで希釈）でブロッキングし、室温で１０分間インキュベートした後、血清を除去したが洗浄はしなかった。これに一次抗体作用液を滴下し、３７℃で１〜２時間インキュベートするか、４℃で一晩インキュベートした。そして、１回あたり５分間のＰＢＳ洗浄を３回繰り返した。これに適量の二次抗体作用液を滴下し、３７℃で１０〜３０分間インキュベートした。そして、１回あたり５分間のＰＢＳ洗浄を３回繰り返した。続いて、ＤＡＢ発色剤で３〜１５分間発色させた後、水道水で十分に洗浄し、再染色、脱水、透徹、封入を行った。
【０１００】
その結果、図１０に示すように、本発明の実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤を４Ｔ１担癌マウスに作用させたところ、マウスの腫瘍組織における浸潤リンパ球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の数が増加した。
【０１０１】
実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤についても同様の実験結果が得られた。即ち、実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤を４Ｔ１担癌マウスに作用させたところ、マウスの腫瘍組織における浸潤リンパ球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の数が増加した。
【実施例１１】
【０１０２】
オールトランスレチノイン酸注射剤による担癌マウスモデルの腎臓及び肝臓腫瘍細胞の明らかな転移抑制
実施例９の４Ｔ１担癌マウスから肝臓組織及び腎臓組織を取り、４％ホルムアルデヒド溶液で３〜５日間固定した後、固定液から組織を取り出して適切な形状及び厚さに手直しした。次に、組織片を８０％、９０％、９５％、１００％のエタノールＩ、１００％のエタノールII、１００％のエタノールIIIに通して脱水処理し、キシレンＩで３０ｍｉｎ、キシレンIIで３０ｍｉｎ透徹処理した後、パラフィンＩで１ｈ、パラフィンIIで６ｈ浸漬した。原則として試料切断面を下向きとし、パラフィンで組織を包埋してから、パラフィンブロックが冷やし固められた後に−２０℃で冷蔵した。続いて、切片の厚さを４μｍとし、６５℃のサーモスタットに６〜１２ｈ投入した。その後、容器に入れて常温保存した。
【０１０３】
パラフィン組織のＨＥ染色ステップは次の通りであった。
脱パラフィン・再水和：キシレンＩで１５ｍｉｎ、キシレンIIで１５ｍｉｎ、無水エタノールＩで５ｍｉｎ、無水エタノールIIで５ｍｉｎ、９５％エタノールで５ｍｉｎ、８０％エタノールで５ｍｉｎ、水道水で１ｍｉｎ浸漬洗浄した。
【０１０４】
染色：切片をヘマトキシリン染色液に浸漬して常温で５ｍｉｎ染色した後、水道水で１ｍｉｎ洗浄した。次に、切片を１％塩酸アルコール溶液に数秒間浸漬してから、水道水で組織を色出しした。続いて、切片をエオジン染色液に浸漬して３〜５ｍｉｎ染色し、水道水でスライドガラス上の色浮きを洗い落とした。
【０１０５】
脱水・透徹・封入：８０％エタノールで０．５ｍｉｎ、９５％エタノールＩで０．５ｍｉｎ、９５％エタノールIIで０．５ｍｉｎ、無水エタノールＩで０．５ｍｉｎ、無水エタノールIIで０．５ｍｉｎ脱水し、キシレンＩで３ｍｉｎ透徹し、キシレンIIで３ｍｉｎ透徹した後、これを取り出して中性バルサム（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｂａｌｓａｍ）で封入し、染色結果を観察及び評価した。
【０１０６】
その結果、図１１及び図１２に示すように、本発明の実施例３で調製したオールトランスレチノイン酸注射剤を４Ｔ１担癌マウスに作用させたところ、マウスの肝臓腫瘍細胞の湿潤・転移は対照群のマウスの肝臓組織よりも少なかった（図１１）。また、腎臓腫瘍細胞の浸潤・転移は対照群のマウスの腎臓組織よりも少なかった（図１２）。
【０１０７】
実施例１及び２で調製した各オールトランスレチノイン酸注射剤についても同様の実験結果が得られた。即ち、オールトランスレチノイン酸注射剤を注射した４Ｔ１担癌マウスの肝臓腫瘍細胞の湿潤・転移は対照群のマウスの肝臓組織よりも少なく、腎臓腫瘍細胞の浸潤・転移は対照群のマウスの腎臓組織よりも少なかった。
【０１０８】
以上は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を形式的、実質的になんら制限するものではない。当業者であれば、本発明の方法から逸脱しないことを前提に、若干の改良及び補足が可能であり、これらの改良及び補足もまた本発明による保護の範囲とみなすべきである。本専門分野に精通した技術者が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、上記で開示した技術内容を利用して実施可能な些細な修正、追加及び変形による等価の変化は、いずれも本発明における等価の実施例である。また、本発明の実質的技術に基づいて上記の実施例に対し実施される等価の変化の修正、追加及び変形は、いずれも本発明の技術方案の範囲に属するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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