(57)【要約】  本発明は、哺乳動物における免疫不全ウイルスの細胞内リザーバの検出のための、分化マーカーＣＤ８９の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物免疫不全ウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバの検出のための方法であって、前記方法が、インビトロまたはエクスビボで、前記哺乳動物免疫不全ウイルスに感染し、および特に前記哺乳動物免疫不全ウイルスに対する特定の抗レトロウイルス療法で治療した哺乳動物の細胞を、表面上にＣＤ８９分化マーカーを発現するリンパ球細胞の検出を可能にする薬剤と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
表面上に分化マーカーＣＤ８９を発現するリンパ球細胞の検出を可能にする前記薬剤が、抗ＣＤ８９抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物免疫不全ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
表面上に前記分化マーカーＣＤ８９を発現する前記リンパ球細胞が、ＴＣＤ４リンパ球細胞、特に静止状態のＴＣＤ４細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
表面上にＣＤ８９分化マーカーを発現するリンパ球細胞であって、前記細胞が、その核デオキシリボ核酸中に、少なくとも１つの哺乳動物免疫不全ウイルスのゲノムを含み、前記少なくとも１つの哺乳動物免疫不全ウイルスのゲノムが、遺伝子組み換えされていて、天然に存在せず、特に前記少なくとも１つの遺伝子組み換えされた哺乳動物免疫不全ウイルスのゲノムが蛍光マーカータンパク質の発現を可能にする、リンパ球細胞。
【請求項６】
哺乳動物免疫不全ウイルスの細胞内リザーバを検出するためのキットであって、前記細胞の表面上のＣＤ８９分化マーカーを検出する少なくとも１種の薬剤と、前記細胞のゲノム中の前記哺乳動物免疫不全ウイルスのＤＮＡの存在を判定することを可能にする少なくとも１つの組成物とを含む、キット。
【請求項７】
前記細胞のゲノム中の前記哺乳動物免疫不全ウイルスのＤＮＡの存在を判定することを可能にする前記組成物が、特にポリメラーゼ連鎖反応の実行のための、前記ウイルスのゲノムの配列の特定のオリゴヌクレオチドを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
哺乳動物免疫不全に対する抗ウイルス療法剤を使用した治療の中止に続く哺乳動物免疫不全の再発に関するインビトロでの予後を診断するための方法であって、前記方法が、ＣＤ８９マーカーを表面上に発現し、かつ前記哺乳動物免疫不全の原因であるウイルスのＤＮＡをゲノム中に有するリンパ球細胞を定量化するステップを含む、方法。
【請求項９】
哺乳動物免疫不全に対する抗ウイルス療法剤を使用した治療の中止に続く哺乳動物免疫不全の完全寛解に関する診断をインビトロで行うための方法であって、前記方法が、哺乳動物免疫不全ウイルスのＤＮＡをゲノム中に有し、かつ表面上に少なくともＣＤ８９マーカーを発現するリンパ球細胞の不在を検出するステップを含む、方法。
【請求項１０】
哺乳動物免疫不全ウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバの検出のための方法であって、前記方法が、インビトロまたはエクスビボで、前記哺乳動物免疫不全ウイルスに感染し、ならびに特に前記哺乳動物免疫不全ウイルスに対する特定の抗レトロウイルス療法および／または前記細胞内リザーバを根絶することを目的とした療法で治療した哺乳動物の細胞を、表面上にＣＤ８９分化マーカーを発現するリンパ球細胞の検出を可能にする薬剤と接触させるステップを含む、方法。
【請求項１１】
哺乳動物免疫不全ウイルスに感染した哺乳動物細胞の細胞内リザーバの根絶を目的とした治療の有効性の評価のための方法であって、前記方法が、インビトロまたはエクスビボで、表面上にＣＤ８９分化マーカーを発現するリンパ球細胞の存在、量、または不在の検出を可能にする薬剤を使用して、前記細胞内リザーバを検出するステップを含む、方法。
【請求項１２】
検出された細胞内リザーバの存在、不在、または量に従い、前記感染した哺乳動物を分類するステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ８９マーカーの少なくとも１つのエピトープ、およびリンパ球細胞、特に前記リンパ球細胞、特にＴリンパ球細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーの両方を認識する、多重特異性抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、ＣＤ８９抗原およびＣＤ３抗原を特異的に認識する二重特異性抗体である、請求項１３に記載の多重特異性抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、モノクローナル抗体、特にヒトまたはヒト化抗体である、請求項１３または１４に記載の抗体。
【請求項１６】
哺乳動物免疫不全ウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバを根絶することにおける使用のための、ＣＤ８９マーカーを発現するリンパ球細胞を認識する少なくとも１種の薬剤を含む組成物。
【請求項１７】
前記薬剤が、ＣＤ８９マーカーを認識する少なくとも１つの抗体、特にＣＤ８９マーカーの単一特異性抗体、またはＣＤ８９マーカーおよびリンパ球細胞、特にＴリンパ球細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つのエピトープを認識する多重特異性抗体である、請求項１６に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
−請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の抗体と、
−抗レトロウイルス剤の組み合わせと、
−潜在的に、請求項１６または１７に記載の組成物と、を含む組成物。
【請求項１９】
レンチウイルスによる感染症、特にＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶに関連した感染症の治療における使用のための、レンチウイルスのリンパ球細胞内リザーバ上に発現されたＣＤ８９マーカーを特異的に認識する抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、潜在的に細胞毒性剤に結合された、抗ＣＤ８９抗体、または少なくとも二重特異性であり、ＣＤ８９マーカーおよび少なくとも１つの他の特異的マーカーに加えて、リンパ球細胞、特にＣＤ３マーカーを認識する抗体である、上に定義される使用のための抗体。
【請求項２１】
レンチウイルスによる感染症、特にＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶに関連した感染症の治療における使用のための、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記特異的抗体と抗レトロウイルス剤の組み合わせとが、同時に、別々に、または経時的に互い違いになるように使用される、請求項２１に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜マーカー、およびウイルスリザーバを形成する感染細胞、特にレトロウイルスに感染した細胞を特定することの一部としてのその使用に関する。
【０００２】
抗レトロウイルス治療は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者の予後を著しく改善し、特にウイルスを増殖させる能力を改変する。
【０００３】
これらの治療は、それらが停止され得るように十分に有効でないが、それらはウイルスの細胞内リザーバ (cellular reservoirs) を排除せず、中断された治療が、事実上全身的に血中のウイルス再出現をもたらすため、感染が持続していることを証明する。
【０００４】
したがって、これらの潜伏性ウイルスリザーバの持続は、ＨＩＶ感染を治癒するという概念に対する主要な障害であり、臨床および科学的分野における主要な問題となっている。
【０００５】
最近の研究は、一旦患者が感染すると、静止状態 (quiescent) のＴＣＤ４リンパ球が、長年の治療にわたって持続可能である主要なウイルスリザーバを構成することを示した［Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，１３１９３−１３１９７、Ｆｉｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１２９５−１３００；Ｃｈｏｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５，８９３−９００．］。
【０００６】
しかしながら、ＨＩＶ細胞内リザーバを非感染細胞と区別するのを可能にするマーカーは、これまで同定されていない。
【０００７】
これらのウイルスリザーバを同定するのを可能にするマーカーの不在下で、それらがホストするウイルスを「パージする (“purging”) 」ことによってその持続性を標的とすることを目的とする異なる戦略が試験されてきたが、これらの戦略は、研究室で観察されたその有効性が患者において再生されるのを可能にしなかった。これらの戦略が試験されたインビトロ条件は、「患者の状況」からかけ離れすぎている可能性がある。
【０００８】
加えて、ウイルス感染を完全に根絶するために、これらの細胞を同定する必要性がある。
【０００９】
本発明は、先行技術におけるこれらの短所を克服する方法を提案する。
【００１０】
本発明の目的のうちの１つは、細胞内リザーバを同定するのを可能にする新たなマーカーの使用を提案することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、ウイルスの細胞内リザーバを同定し、根絶するための方法を提供することである。
【００１２】
本発明は、少なくとも１つのレンチウイルス、特にレンチウイルスの細胞内リザーバの検出のための、リンパ系細胞、および潜在的に骨髄系細胞の表面上に発現された細胞マーカーの使用に関し、当該細胞内リザーバは、当該レンチウイルスに感染した細胞であり、当該レンチウイルスに対する特定の治療剤に不応答性である。本発明は、少なくとも１つのレンチウイルス、特にレンチウイルスの細胞内リザーバの検出のための、リンパ系細胞、および潜在的に骨髄系細胞の表面上に発現された細胞マーカーの使用に更に関し、当該細胞内リザーバは、当該レンチウイルスに感染した細胞であり、当該レンチウイルスに対する特定の治療剤に不応答性である。
【００１３】
本発明は、細胞マーカー、特に表面抗原分類（ＣＤ）のある特定のマーカーが、特異的に発現されるか、またはレンチウイルスによる非感染細胞中の当該マーカーの発現レベルに対して、少なくとも１つのレンチウイルスの細胞内リザーバによって、ある特定のレベルで発現されるという、発明者らによって行われた驚くべき観察に基づいている。
【００１４】
下記の実施例に記載されるアプローチを使用して、発明者らは、ある特定の特異的ＣＤマーカーが、レンチウイルス細胞内リザーバを検出するために特に興味深いことを示した。
【００１５】
本発明において、細胞内リザーバは、複製可能なウイルス形態が蓄積し、活発に複製しているウイルス形態よりも遅い置換動態で持続する細胞を意味することが理解される。
【００１６】
特に興味深いマーカーは、以下のとおりである。ＣＤ１２３マーカー（遺伝子番号３５６３）、ＣＤ８７マーカー（遺伝子番号５３２９）、ＣＤ８９マーカー（遺伝子番号２２０４）、ＣＤ１７２ａマーカー（遺伝子番号１４０８８５）、ＣＤ１１２マーカー（遺伝子番号５８１９）、ＣＤ２１３ａ１マーカー（遺伝子番号３５９７）、ＣＤ１２０ｂマーカー（遺伝子番号７１３３）、ＣＤ１２１ａマーカー（遺伝子番号３５５４）、ＣＤ５４マーカー（遺伝子番号３３８３）、ＣＤ１１ｃマーカー（遺伝子番号３６８７）、ＦＰＲＬ１マーカー（遺伝子番号２３５８）、およびＣＤ３２マーカー（ＣＤ３２ａ遺伝子番号２２１２、ＣＤ３２ｂ遺伝子番号２２１３）。
【００１７】
ＣＤ１２３マーカーまたは抗原はまた、ヒトインターロイキン−３受容体のαサブユニットとして知られている。それは、Ｉ型膜貫通糖タンパク質およびサイトカイン受容体のスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ１２３は、インターロイキン−３受容体を形成するために、ＣＤ１３１抗原（インターロイキン−３受容体のβサブユニット）を有するヘテロ二量体を形成する。受容体内で、それはサイトカインへの特異性を付与するＣＤ１２３抗原である。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号２７の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号１の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号１４の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００１８】
ＣＤ８７マーカーまたは抗原はまた、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体またはｕＰＡＲとしても知られている。ＣＤ８７は、血管新生内皮の移行に関与する主要な参与因子である。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号２８の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号２の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号１５の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００１９】
ＣＤ８９マーカーは、クラスＡ免疫グロブリン（ＩｇＡ）の定常Ｆｃ領域の受容体である。膜貫通糖タンパク質受容体は、骨髄系統細胞、例えば好中球細胞、単球、マクロファージ、および好酸球の表面上で発現され、その中で病原体への免疫応答の媒介に参与する。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号２９の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号３の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号１６の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２０】
ＣＤ１７２ａまたはＳＩＲＰ  α抗原（シグナル調節タンパク質α抗原）は、骨髄系細胞、幹細胞、およびニューロンによって優先的に発現される膜糖タンパク質である。この抗原は、細胞の食作用を調節する目的で、ＣＤ４７抗原と相互作用する阻害剤受容体として作用する。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３０の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号４の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号１７の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２１】
ＣＤ１１２抗原は、ネクチン−２としても知られる膜糖タンパク質である。それはまた、ポリオまたはヘルペスウイルスの侵入におけるその関与に起因して、ＰＶＲＬ２（ポリオウイルス受容体関連２）またはＨＶＥＢ（ヘルペスウイルス侵入媒介物質Ｂ）としても知られている。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３１の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号５の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号１８の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２２】
ＣＤ２１３ａ１抗原はまた、インターロイキン−１３受容体のα−１鎖（ＩＬ１３ＲＡ１）であるとして知られている。受容体のこのサブユニットは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達に関与する。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３２の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号６の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号１９の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２３】
ＣＤ１２０抗原は、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）に対応する。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３３の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号７の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号２０の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２４】
ＣＤ１２１ａ抗原は、インターロイキン１受容体１型（ＩＬ１Ｒ１）に対応し、ＩＬ１に関わる免疫および炎症応答に関与する。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３４の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号８の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号２１の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２５】
ＣＤ５４抗原はまた、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）としても知られている。ＩＣＡＭ−１は、内皮細胞およびインテグリンと相互作用する免疫系細胞中で発現される細胞表面糖タンパク質である。ＩＣＡＭ−１はまた、標的細胞に侵入するためにライノウイルスによって使用される。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３５の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号９の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号２２の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２６】
ＣＤ１１ｃ抗原は、樹状細胞中で高度に発現されるが、単球、マクロファージ、好中球、およびいくつかのリンパ球Ｂ細胞によっても発現される、Ｉ型膜貫通タンパク質である。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３６の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号１０の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号２３の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２７】
ＦＰＲＬ１抗原はまた、Ｎ−ホルミルペプチド受容体２としても知られている。これは、好中球の化学誘引物質であり、後にその活性化を誘導する、Ｎ−ホルミル−メチオニルペプチドに対して低い親和性を有する受容体である。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３７の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号１１の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体が配列番号２４の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２８】
ＣＤ３２抗原は、リンパ球Ｂ細胞の大半によって発現される免疫グロブリンＧ膜受容体である。ＣＤ３２は、過剰産生中の免疫グロブリンの産生の調節に関与する。ヒトにおいて、例えば、この抗原は、配列番号３８または配列番号３９の配列に含まれる遺伝子によってコードされる。抗原は、特に、配列番号１２（ＣＤ３２ａ）または配列番号１３（ＣＤ３２ｂ）の配列によって表されるアミノ酸の配列によって形成され、それ自体がそれぞれ、配列番号２５または配列番号２６の配列によって表される核酸分子（ｃＤＮＡ）によってコードされる。
【００２９】
本発明において、ＣＤ（表面抗原分類）分子が言及されるとき、これらの分子は、交換可能に「マーカー」、「抗原」、または「分子」と称される。
【００３０】
加えて、本発明はまた、有利に、以下の抗原、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、およびＣＤ３２ａマーカーもしくはＣＤ３２ｂマーカー、または両方のうちの少なくとも１つ、あるいはレンチウイルスの細胞内リザーバであって、上に定義されるとおりである細胞内リザーバの検出のための当該上述のマーカーを検出するための手段の使用に関する。
【００３１】
本発明において、研究される細胞内リザーバに感染するレンチウイルスは、有利に、哺乳動物免疫不全、とりわけ類人猿、とりわけヒト科動物、特にヒト、およびネコ科動物、とりわけネコに関与するレンチウイルスである（すなわち、それぞれＨＩＶ１および２ウイルス、ＳＩＶ、ならびにＦＩＶ）。
【００３２】
加えて、本発明はまた有利に、哺乳動物免疫不全ウイルス、特にレンチウイルスの細胞内リザーバであって、当該哺乳動物免疫不全ウイルスに感染し、哺乳動物免疫不全抗ウイルス療法剤に不応答性の細胞である細胞内リザーバの検出のための、以下の抗原、ＣＤ３２マーカー、特にＣＤ３２ａもしくはＣＤ３２ｂ、または両方、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、およびＣＤ１２３マーカーから選択される少なくとも１つの抗原の使用に関する。
【００３３】
本発明において、上述のマーカーのうちの１つ、または上述のマーカーの組み合わせを使用することが可能である。
【００３４】
上述の選別のために、ＣＤ８９マーカーを単独で、または上述のマーカーのうちの少なくとも１つと組み合わせて使用することが特に有利である。
【００３５】
加えて、本発明はまた有利に、哺乳動物免疫不全ウイルス、特にレンチウイルスの細胞内リザーバであって、当該哺乳動物免疫不全ウイルスに感染し、不応答性の細胞である、細胞内リザーバの検出のための、少なくともＣＤ８９分化マーカーの使用、特に単一ＣＤ８９マーカーの使用に関し、当該細胞は、治療法、特にヒトにおける３剤併用療法または多剤併用療法を停止した後のウイルスリバウンドに関与する。
【００３６】
本発明において（上記および下記）、ＣＤ３２についての言及は、ＣＤ３２ａマーカーもしくはＣＤ３２ｂマーカー、またはＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂの２つのマーカーに関する。
【００３７】
有利な実施形態において、本発明は、上述の使用に関し、上記ＣＤ８９マーカーが、配列番号３の配列のタンパク質からなる。
【００３８】
下記の実施例に示すように、発明者らは、特に哺乳動物免疫不全に関与するレンチウイルスに関連した細胞である、細胞内リザーバの表面上で特異的に発現されるものとして、ＣＤ８９マーカーを同定した。
【００３９】
本発明において、「治療剤に不応答性」とは、特に免疫不全ウイルスに感染した細胞について、薬物治療の効果に対する著しい応答がないことを意味することが理解される。治療剤への不応答性は、ウイルス潜伏性または治療剤へのアクセス不能に起因する、応答の完全な不在を特徴とし得、これは１つ以上の薬物の効果が、いかなる治療剤（薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤、水、またはプラセボでさえ）も含有しない組成物の効果と本質的に同じであることを意味する。不応答性はまた、いかなる治療剤も含有しない組成物で得られるものと著しく異ならない応答を特徴とし得る。
【００４０】
本発明の細胞内リザーバは、ウイルスを根絶するために使用される現在の治療法では、これらの細胞が殺滅されないか、破壊されないか、またはアポトーシスもしくは壊死プロセスに誘導されないため、あるいは免疫系によって非自己の一部として認識されるため、抗ウイルス治療剤に対して不応答性であると呼ばれる。ＨＩＶ（ＨＩＶ１もしくはＨＩＶ２）、ＳＩＶ、またはＦＩＶなどの免疫不全ウイルスの特定の場合において、細胞内リザーバは、現在使用されている抗レトロウイルス剤（侵入阻害剤、逆転写酵素阻害剤、抗プロテアーゼ、修飾ヌクレオチド等）によって排除されない。
【００４１】
加えて、本発明は更に、少なくとも１つの哺乳動物免疫不全ウイルス、特にレンチウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバの検出のための方法に関し、当該方法は、特にインビトロまたはエクスビボで、当該哺乳動物免疫不全ウイルスに感染した、特に当該哺乳動物免疫不全ウイルスに対する特定の抗レトロウイルス療法で治療された哺乳動物の細胞を、以下の抗原、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、およびＣＤ３２マーカーのうちの少なくとも１つを表面上に発現するリンパ球細胞の検出を可能にする薬剤と接触させるステップを含む。
【００４２】
本発明において、「少なくとも１つのウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバ」は、当該少なくとも１つのウイルスに感染した細胞下位集団を意味し、当該集団は、感染した細胞の集団の一部であることが理解される。これらの細胞内リザーバは、上に定義されるとおりである。「少なくとも１つのウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバ」はまた、少なくとも１つのウイルスの細胞内リザーバを意味する。
【００４３】
上述の方法は、（ヒトまたは動物）対象のリンパ球細胞を、上述のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞を特異的に明示可能な薬剤 (an agent capable of specificially evidencing cell) と接触させるレンチウイルス細胞内リザーバを検出することを提案する。これを行うために、当業者に周知である、フローサイトメトリーなどのリンパ球細胞を単離するための従来の免疫学的方法を使用することができる。
【００４４】
上記マーカーを検出するのを可能にする薬剤は、有利に、１つ以上の抗体である。この抗体またはこれらの抗体は、複数のマーカーを同時に検出することが目的である場合、または同じマーカーの複数の抗体が使用される場合、抗体とそれらの標的との間の免疫複合体を検出するのを可能にする薬剤のうちの１つに結合され得る。例えば、抗体は、発光もしくは蛍光分子、またはその産生物が分析者の目に見える反応を触媒する酵素に結合され得る。免疫複合体を検出するためのこれらの技法は、先行技術において非常に広く知られている。
【００４５】
有利に、本発明は、少なくとも１つの免疫不全ウイルス、特に哺乳動物ウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバの検出のための方法であって、当該方法は、特にインビトロまたはエクスビボで、当該哺乳動物免疫不全ウイルスに感染し、当該哺乳動物免疫不全ウイルスに対する特定の抗レトロウイルス療法で治療した哺乳動物の細胞を、表面上に少なくともＣＤ８９分化マーカーを発現するリンパ球細胞の検出を可能にする薬剤と接触させるステップを含む。
【００４６】
有利な実施形態において、本発明は、上述の方法に関し、上記ＣＤ８９マーカーが、配列番号３の配列のタンパク質からなる。
【００４７】
有利に、本発明は、上に定義される方法に関し、表面上に分化マーカーＣＤ８９を発現するリンパ球または骨髄系細胞を検出するのを可能にする上記薬剤が、抗ＣＤ８９抗体である。
【００４８】
有利な実施形態において、本発明は、上に定義される方法に関し、上記哺乳動物免疫不全ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、特にＨＩＶ１もしくはＨＩＶ２ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）である。
【００４９】
有利な実施形態において、本発明は、上に定義される方法に関し、表面上に分化マーカーＣＤ８９を発現するリンパ球細胞が、ＴＣＤ４リンパ球細胞、特に静止状態のＴＣＤ４細胞である。静止状態のリンパ球は、それらが分割せず、長い寿命（数週間〜数年）、低い転写速度、およびそれらに固有の代謝活性を有することを特徴とする。
【００５０】
本発明は、その表面上の以下のマーカー、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、およびＣＤ３２マーカーのうちの少なくとも１つを発現するリンパ球細胞に更に関し、当該細胞は、その核デオキシリボ核酸中に、少なくとも１つの哺乳動物免疫不全ウイルスのゲノムを含み、当該少なくとも１つの哺乳動物免疫不全ウイルスのゲノムは、遺伝子組み換えされていて、自然界に天然に存在しない。
【００５１】
細胞は新しく、天然の状態で存在しない。これらの細胞は、修飾レンチウイルスがゲノムに挿入された細胞である。これらの細胞は、ヒト、サル、またはネコ細胞である。これらの細胞はまた、単離される。
【００５２】
有利に、本発明は、表面上に少なくともＣＤ８９分化マーカーを発現するリンパ球細胞に更に関し、当該細胞は、その核デオキシリボ核酸中に、少なくとも１つの哺乳動物免疫不全ウイルスのゲノムを含み、当該少なくとも１つの哺乳動物免疫不全ウイルスのゲノムは、遺伝子組み換えされ、ヒト介入なしに哺乳動物において天然の状態で存在しない。
【００５３】
有利な実施形態において、本発明は、上述の細胞に関し、上記ＣＤ８９マーカーが、配列番号３の配列のタンパク質からなる。
【００５４】
有利に、本発明は、上述の細胞に関し、上記少なくとも１つの遺伝子組み換えされた哺乳動物免疫不全ウイルスのゲノムが、蛍光マーカータンパク質を発現するのを可能にする。
【００５５】
特に、上述の細胞は、それらが、それらの表面上にＣＤ８９抗原を発現し、免疫不全に関与するレンチウイルスをそれらのゲノムに統合したリンパ球細胞内リザーバであることを特徴とし、レンチウイルスは、ウイルスの生活環に関与する遺伝子とは別に、ＧＦＰまたはその誘導体などの、マーカータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子が挿入されるように遺伝子組み換えされている。
【００５６】
本発明はまた有利に、哺乳動物免疫不全ウイルスの細胞内リザーバを検出するためのキットまたはパックに関し、少なくとも１つの検出剤を含むか、または細胞の表面上の、以下のマーカー、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、およびＣＤ３２マーカーのうちの少なくとも１つ、ならびに当該細胞のゲノム中の当該哺乳動物免疫不全ウイルスのＤＮＡの存在を判定するのを可能にする少なくとも１つの組成物の検出を可能にする。
【００５７】
したがって、上述の検出キットは、上述のマーカーのうちの少なくとも１つの膜発現を検出するための手段、および免疫不全に関与するレンチウイルスのＤＮＡ細胞のゲノムへの挿入を検出するための手段を含む。マーカーを検出するための手段は、上述されるもの、特に当該マーカーの特異的抗体である。
【００５８】
有利に、本発明はまた、哺乳動物免疫不全ウイルスの細胞内リザーバを検出するためのキットまたはパックに関し、細胞の表面上のＣＤ８９分化マーカーを検出する少なくとも１種の薬剤と、当該細胞のゲノム中の当該哺乳動物免疫不全ウイルスのＤＮＡの存在を判定するのを可能にする少なくとも１つの組成物と、を含む。
【００５９】
有利な実施形態において、本発明は、上述のキットに関し、上記ＣＤ８９マーカーが、配列番号３の配列のタンパク質からなる。
【００６０】
有利に、本発明は、上に定義されるキットに関し、上記細胞のゲノム中の上記哺乳動物免疫不全ウイルスのＤＮＡの存在を判定するのを可能にする上記組成物が、特にポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲの実行のために、当該ウイルスのゲノムの配列の特定のオリゴヌクレオチドを含む。
【００６１】
ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶウイルスの発見以降に構築された知識に照らして、当業者は、当該ウイルスの存在が細胞のゲノム中で同定されるのを可能にするオリゴヌクレオチドを同定することが可能である。ＰＣＲ反応が実行されるのを可能にするオリゴヌクレオチド対の使用は、特に有利であるが、当業者は、所望される場合、サザンブロットなどの他の分子生物学技法を利用する。
【００６２】
別の態様では、本発明は、哺乳動物免疫不全に関与する抗ウイルス療法剤での治療の中止に続く哺乳動物免疫不全の再発に関して、特にインビトロで予後を診断するための方法に関し、当該方法は、表面上の以下の抗原、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、およびＣＤ３２マーカーのうちの少なくとも１つを発現し、当該哺乳動物免疫不全に関与するウイルスのＤＮＡをゲノム中に有するリンパ球細胞を定量化するステップを含む。
【００６３】
本発明の予後診断方法 (prognosis method) は、レンチウイルス細胞内リザーバの検出または検出の不在に基づいている。
【００６４】
ＨＩＶに対する抗ウイルス治療の中止に続いて、ウイルスは再興し、病理（免疫不全）が再出現する。患者が抗ウイルス治療および細胞内リザーバを根絶することを目的とする治療の両方により治療された場合、抗ウイルス治療の中止に続いて、ウイルスの再活性化に起因する、患者における疾患再興の可能性を決定する必要がある。加えて、本発明の状況において、細胞内リザーバを検出するための記載された手段を使用して、上述の治療（抗ウイルス治療および抗細胞内リザーバ治療）に続いて残留細胞内リザーバの量を測定することが可能である。患者が非常に低い量の細胞内リザーバを有するか、またはそれらがもはや細胞内リザーバを有していない場合、予後はこの症例において非常に好ましく、疾患が短期間で再興する可能性は低い。対照的に、多くの細胞内リザーバが依然として存在する場合、診断は好ましくなく、患者の再発は急速である。
【００６５】
有利に、本発明はまた、哺乳動物免疫不全に関与する抗ウイルス療法剤による治療の中止に続く哺乳動物免疫不全の再発に関する、特にインビトロでの予後を診断するための方法であって、当該方法が、少なくともＣＤ８９マーカーを表面上に発現し、当該哺乳動物免疫不全に関与するウイルスのＤＮＡをゲノム中に有するリンパ球細胞を定量化するステップを含む。
【００６６】
有利な実施形態において、本発明は、上述の方法に関し、上記ＣＤ８９マーカーが、配列番号３の配列のタンパク質からなる。
【００６７】
加えて、本発明は、哺乳動物免疫不全に関与する抗ウイルス療法剤での治療の中止に続く哺乳動物免疫不全の完全寛解に関して、特にインビトロで診断を行うための方法に関し、当該方法は、表面上の以下のマーカー、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、およびＣＤ３２マーカーのうちの少なくとも１つを発現し、哺乳動物免疫不全ウイルスのＤＮＡをゲノム中に有するリンパ球細胞の不在を検出するステップを含む。
【００６８】
この診断方法において、患者がもはや体内にいかなるＨＩＶ細胞内リザーバも有しない場合、ウイルス感染の、したがって関連した免疫不全の完全寛解の診断を提供することが可能である。細胞内リザーバの不在の検出は、当然のことながら、本発明による検出手段によって実行される。
【００６９】
有利に、本発明はまた、哺乳動物免疫不全に関与する抗ウイルス療法剤による治療の中止に続く哺乳動物免疫不全の完全寛解に関する診断を、特にインビトロで行うための方法に関し、当該方法は、哺乳動物免疫不全ウイルスのＤＮＡをゲノム中に有し、表面上に少なくともＣＤ８９マーカーを発現するリンパ球細胞の不在を検出するステップを含む。
【００７０】
有利な実施形態において、本発明は、上述の方法に関し、上記ＣＤ８９マーカーが、配列番号３の配列のタンパク質からなる。
【００７１】
本発明はまた、哺乳動物免疫不全ウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバの検出のための方法に関し、当該方法は、インビトロまたはエクスビボで、当該哺乳動物免疫不全ウイルスに感染し、ならびに、特に当該哺乳動物免疫不全ウイルスに対する特定の抗レトロウイルス療法および／または当該細胞内リザーバを根絶することを目的とした療法で治療した哺乳動物の細胞を、表面上に上述の分化マーカー、特にＣＤ８９マーカーを発現するリンパ球細胞の検出を可能にする薬剤と接触させるステップを含む。
【００７２】
本発明はまた、上記哺乳動物免疫不全ウイルスに感染した哺乳動物細胞の細胞内リザーバの根絶を目的とした治療の有効性の評価のための方法に関し、当該方法が、インビトロまたはエクスビボで、表面上にＣＤ８９分化マーカーを発現するリンパ球細胞の存在、量、または不在の検出を可能にする薬剤を使用して、当該細胞内リザーバを検出するステップを含む。
【００７３】
有利に、本発明は、上述の方法に関し、検出された細胞内リザーバの存在、不在、または量に従い、上記感染した哺乳動物を分類するステップを更に含む。
【００７４】
この方法において、細胞内リザーバは、それらを破壊することを目的とする治療に続いて捜される。細胞内リザーバが、依然としてそれらを根絶することを目的とする上記治療前の数と実質的に同一の数で存在する場合、したがって治療は機能しなかった。しかしながら、細胞内リザーバの数が著しく減少した場合、特に細胞内リザーバを同定することがもはや可能でなくなった場合、治療は機能した。
【００７５】
加えて、本発明は、本発明において同定されるレンチウイルスのリンパ球細胞内リザーバ、特にＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＳＩＶ、およびＦＩＶウイルスなどの哺乳動物免疫不全に関与するウイルスの細胞内リザーバを特異的に標的とする治療剤に関する。
【００７６】
有利に、治療剤は、抗体または本発明において同定される細胞内リザーバを認識することが可能な化学剤である。
【００７７】
上述の治療剤は、より有利に、以下のマーカーのうちの１つ、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、ＣＤ３２マーカー、およびＣＤ３抗原（Ｔリンパ球の特異的Ｔ細胞受容体もしくはＴＣＲに関連したタンパク質）、またはＴ細胞の１つ以上の他の特異的マーカーの両方を認識することが可能な二官能性抗体である。
【００７８】
本発明は、有利に、ＣＤ８９マーカーの少なくとも１つのエピトープおよびリンパ球細胞、特にリンパ球細胞、特にＴリンパ球細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーの両方を認識する多重特異性抗体に関する。
【００７９】
より有利に、本発明は、上述の多重特異性抗体に関し、当該抗体は、ＣＤ８９抗原およびＣＤ３抗原を特異的に認識する二重特異性抗体である。
【００８０】
有利に、本発明の状況において、上述の抗体は、モノクローナル抗体、特にヒトもしくはヒト化抗体、サルもしくはサル化抗体、またはネコもしくはネコ化抗体である。
【００８１】
本発明において、多重特異性抗体は、その第１のＣＤＲによって第１の抗原を認識し、その第２のＣＤＲによって第２の抗原を認識することが可能な抗体を意味することが理解される。
【００８２】
有利に、上に定義される抗体は、ＣＤ８９抗原およびＣＤ３抗原を認識する二官能性または二重特異性抗体である。
【００８３】
本発明において、二官能性または二重特異性抗体は、特定のエピトープを認識する超可変領域、および第１のものとは異なる第２のエピトープを認識する第２の超可変領域を有する組み換え抗体を意味することが理解される。したがって、二官能性または二重特異性抗体は、２つの異なるタンパク質を同時に認識することができる。これらの抗体はまた、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性ｂｉ−ｓｃＦｖ、二重特異性ミニボディ、または二重特異性ダイアボディなどのそれらの断片の形態であってもよい。
【００８４】
これらの二重特異性抗体またはそれらの断片は、有利に、ヒト療法における使用のためにヒト化されている。先行技術において周知のヒト化は、抗体の全体構造を、一般にマウスのモノクローナル抗体に由来する関心対象の超可変領域がグラフトされる、ヒト配列分子と置き換えることを必要とする。
【００８５】
加えて、本発明は、有利に、以下のマーカー、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、ＣＤ３２マーカー、およびＣＤ３マーカーのうちの１つの両方を同時に認識することができる、モノクローナル抗体、特にヒト化抗体、またはその上述の断片のうちの１つに関する。
【００８６】
本発明において、使用される抗体は、毒素（例えば、リシンもしくはメイタインシンＤＭ１誘導体）などの活性剤、放射性アイソトープ（例えば、イットリウム−９０もしくは９０Ｙ（βマイナス放射の純粋な放射体）、およびヨード−１３１または１３１Ｉ（βマイナスおよびγ放射体））、生物学的薬剤、薬物、あるいは酵素に結合され得る。したがって、治療効果は、主に結合された薬剤に基づき、抗体は、標的に対して薬剤を誘導するベクターの役割を有する。
【００８７】
本発明はまた、レンチウイルスによる感染症、特にＨＩＶまたはＳＩＶに関連した感染症の治療における使用のための、以下のマーカー、ＣＤ１２３マーカー、ＣＤ８７マーカー、ＣＤ８９マーカー、ＣＤ１７２ａマーカー、ＣＤ１１２マーカー、ＣＤ２１３ａ１マーカー、ＣＤ１２０ｂマーカー、ＣＤ１２１ａマーカー、ＣＤ５４マーカー、ＣＤ１１ｃマーカー、ＦＰＲＬ１マーカー、およびＣＤ３２マーカーのうちの１つ、ならびに特異的Ｔ−細胞マーカー、特にＣＤ３マーカーの両方に対する二重特異性抗体に関する。
【００８８】
より有利に、本発明は、レンチウイルスによる感染症、特にＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶに関連した感染症の治療における使用のための、ＣＤ８９およびＣＤ３の両方に対する二重特異性抗体に関する。
【００８９】
本発明は、哺乳動物免疫不全ウイルスに感染した細胞の細胞内リザーバを根絶することにおける使用のための、ＣＤ８９マーカーを発現するリンパ球細胞を認識する少なくとも１種の薬剤を含む、組成物に更に関する (The invention further relates to a composition comprising at least one agent that recognizes the lymphocyte cells expressing the CD89 marker, for its use in eradicating cellular reservoirs of cells infected by a mammalian immunodeficiency virus)。
【００９０】
有利に、本発明は、上述の組成物に関し、上記薬剤は、その上述の使用のための、ＣＤ８９マーカーを認識する少なくとも１つの抗体、特にＣＤ８９マーカーの単一特異性抗体、またはＣＤ８９マーカーおよびリンパ球細胞、特にＴリンパ球細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つのエピトープを認識する多重特異性抗体 (a multi-specific antibody that recognizes at least one epitope of the CD89 marker and at least one marker characteristic of the lymphocyte cells, in particular the T lymphocyte cells) である。
【００９１】
上に示すように、毒性剤に結合された抗体は、細胞内リザーバを根絶するために有利であり得る。
【００９２】
本発明はまた、
−上に定義される二重特異性抗体と、
−レンチウイルスによる感染症、特にＨＩＶまたはＳＩＶに関連した感染症の治療における使用のための、抗レトロウイルス剤の組み合わせ、との両方、
−およびもしかすると（potentially）、細胞内リザーバを根絶する組成物を含む、組成物に関する。
【００９３】
有利に、本発明は、その上述の使用のための組成物に関し、特異的抗体および抗レトロウイルス剤が、同時に、別々に、または経時的に互い違いになるように使用される。
【００９４】
レンチウイルス、特に哺乳動物免疫不全を引き起こすレンチウイルスによる感染症を治療するための方法もまた記載され、有効用量の上述の組成物を、感染した哺乳動物、特にＨＩＶに感染したヒトに投与することを含む。
【００９５】
本発明はまた、レンチウイルスによる感染症、特にＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶに関連した感染症の治療における使用のための、レンチウイルスのリンパ球細胞内リザーバ上に発現されたＣＤ８９マーカーを特異的に認識する抗体に関する。
【００９６】
有利に、上述の抗体は、潜在的に細胞毒性剤に結合された (potentially coupled to a cytotoxic agent) 抗ＣＤ８９抗体、または少なくとも二重特異性であり、ＣＤ８９マーカーおよび少なくとも１つの他の特異的マーカーに加えて、リンパ球細胞、特にＣＤ３マーカーを認識する抗体 (an antibody that is at least bispecific and recognizes lymphocyte cells, in particular the CD3 marker, in addition to the CD89 marker and at least one other specific marker) である。
【００９７】
本発明はまた、レンチウイルスによる感染症、特にＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶに関連した感染症の治療における使用のための、上述の組成物に関する。
【００９８】
有利に、本発明は、その上述の使用のための組成物に関し、特異的抗体および抗レトロウイルス剤が、同時に、別々に、または経時的に互い違いになるように使用される。
【００９９】
本発明は、以下に記載される実験データおよびこれを例証する図面に照らしてより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】潜伏的に感染したＴＣＤ４リンパ球を得るために、発明者らによって使用された実験的アプローチを示す。Ａ．：健康な個体（ＨＩＶに感染していない）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ｔ０で採取する。いかなる更なる治療もせずに、それらは対照細胞４（感染していない、ＮＩ）を構成する。ＰＢＭＣの残りを、タンパク質Ｖｐｘ（ＶＬＰ−Ｖｐｘ、Ｂ．）で治療する。後に治療されない細胞は、Ｖｐｘ治療した非感染細胞の第２の対照３を構成する。  最後に、残りの細胞を、ＨＩＶウイルスに感染させ、ＧＦＰ（Ｃ．）の構成的発現を可能にする。故に、ＨＩＶに曝露された細胞分画は、２つのカテゴリーに分割される。ＧＦＰ（２．）を発現しない曝露された非感染細胞および感染し、ＧＦＰ（１．）を発現するウイルスに曝露された細胞。  異なる細胞を、それらのＲＮＡの抽出、当該抽出されたＲＮＡのシーケンシング、生物情報学的分析、およびフローサイトメトリーによる候補の検証のための調製において、フローサイトメーターによってソートする。
【図２】ユークリッド距離にわたって実行され、細胞１．〜３．の各サブアセンブリと非感染細胞（４．）との間で正則化対数変換遺伝子発現カウントを使用して計算される、階層クラスタリングを示すカラーチャートである（本明細書では黒色および白色）。このチャートは、異なる４ドナーに由来するＰＢＭＣについての結果を示す。  １−：個体２に由来する細胞１．、２−：個体４に由来する細胞１．、３−：個体１に由来する細胞１．、４−：個体３に由来する細胞１．、５−：個体４に由来する細胞４．、６−：個体１に由来する細胞３．、７−：個体１に由来する細胞２．、８−：個体１に由来する細胞４．、９−：個体２に由来する細胞３．、１０−：個体２に由来する細胞２．、１１−：個体３に由来する細胞４．、１２−：個体４に由来する細胞３．、１３−：個体４に由来する細胞２．、１４−：個体２に由来する細胞４．、１５−：個体３に由来する細胞３．、１６−：個体３に由来する細胞２．、１７−：個体３に由来する細胞２．、１８−：個体３に由来する細胞３．、１９−：個体２に由来する細胞４．、２０−：個体４に由来する細胞２．、２１−：個体４に由来する細胞３．、２２−：個体３に由来する細胞４．、２３−：個体２に由来する細胞２．、２４−：個体２に由来する細胞３．、２５−：個体１に由来する細胞４．、２６−：個体１に由来する細胞２．、２７−：個体１に由来する細胞３．、２８−：個体４に由来する細胞４．、２９−：個体３に由来する細胞１．、３０−：個体１に由来する細胞１．、３１−：個体４に由来する細胞１．、および３２−：個体２に由来する細胞１．。
【図３】健康な４ドナーからのサブグループ１．（黒色の点）、２．（濃灰色の点）、３．（薄灰色の点）、および４．（白色の点）についての正則化対数変換遺伝子発現の主成分分析を示すグラフである。このグラフは、２つの第１の主成分についての点を示す。ｘ軸は、ＰＣ２：１７％の分散を示し、ｙ軸は、ＰＣ１：５８％の分散を示す。
【図４】感染ＴＣＤ４細胞（１．）と曝露された非感染ＴＣＤ４細胞（２．）との間の、有意性（偽発見率（ＦＤＲ））および遺伝子発現改変を示すボルケーノプロットを示す。黒色の点は、細胞２．と比較して、分画１．におけるそれらの有意な過剰発現に起因して選別された遺伝子を示す（ＦＤＲ＜１０−８）。ｘ軸は、発現改変の底を２とする対数を示し、ｙ軸は、ＦＤＲの底を１０とする対数を示す。
【図５】４群間、特に２．対１．の示差的に発現された２５３遺伝子を示すベン図を示す。（ＦＤＲ＜１０−８）。濃灰色の交差部は、後の分析のために選別された遺伝子を示す。Ａ：４．対３．、Ｂ：４．対１．、Ｃ：２．対１．、およびＤ：４．対２．
【図６】ＴＣＤ４細胞１．および２．において評価されたマーカー（１１１潜在的候補における遺伝子１〜２２）の各々について、発現増加サイトメトリー（ｘ軸）の結果を示す棒グラフを示す。  マーカーは、以下のとおりである。９：ａｑｐ９、１５：ｍｕｃｌ１、３：ｃａ１２、１４：ｖｎｎ３、１１：ｅａａｔ１、１０：ｃ２２ｏｒｆ４２、１３：ｇｐｒ９１、１７：ＣＤ６６ｄ、１２：ｓｔｅｐ１ｂ、２：ｇｊｂ２、１：ｃｏｌｅｃ１２、１９：ＣＤ８０、１６：ｎｉａｃｒ１、８：ＣＤ３５４、２０：ＣＤ１１６、２１：ｓｃａｒｆ１、２２：ｌｌｒｋ２、４：ＣＤ３００ｃ、５：ｃｌｅｃ４ｄ、１８：ｔｌｒ２、７：ＣＤ３２、および６：ｆｐｒｌ１。
【図７】細胞１における最も信頼できる候補の発現を強調するために、各マーカーを発現する全ＴＣＤ４細胞２．のパーセンテージを示す棒グラフを示す。マーカーは、以下のとおりである。９：ａｑｐ９、１５：ｍｕｃｌ１、３：ｃａ１２、１４：ｖｎｎ３、１１：ｅａａｔ１、１０：ｃ２２ｏｒｆ４２、１３：ｇｐｒ９１、１７：ＣＤ６６ｄ、１２：ｓｔｅｐ１ｂ、２：ｇｊｂ２、１：ｃｏｌｅｃ１２、１９：ＣＤ８０、１６：ｎｉａｃｒ１、８：ＣＤ３５４、２０：ＣＤ１１６、２１：ｓｃａｒｆ１、２２：ｌｌｒｋ２、４：ＣＤ３００ｃ、５：ｃｌｅｃ４ｄ、１８：ｔｌｒ２、７：ＣＤ３２、および６：ｆｐｒｌ１。
【図８】＃７マーカー（ＣＤ３２）および＃６マーカー（ｆｐｒｌ１）を発現する全ＴＣＤ４細胞１．のパーセンテージを示す棒グラフを示す。
【図９Ａ−９Ｂ】発明者らによって開発されたウイルス潜伏モデルにおける＃７マーカー（ＣＤ３２）の発現プロファイルを示す。    図９Ａは、図１に示されるように生成された、潜伏的に感染したＴＣＤ４細胞についてのサイトメトリーの結果を示す。＃７マーカー（ＣＤ３２）の発現は、感染ＴＣＤ４細胞（１．、Ｂ．）および静止状態の非感染ＴＣＤ４細胞２．（Ａ．）（ｎ＝３）の表面上でフローサイトメトリーによって評価した。ＧＦＰ＋／マーカー＃７＋（ＣＤ３２＋）パーセンテージを各パネルに示す。ｘ軸は、ＧＦＰの蛍光強度を示し、ｙ軸は、ＣＤ３２マーカーの蛍光強度を示す。    図９Ｂは、細胞２．（ＧＦＰｎｅｇ、Ａ．）と４．（ＧＦＰｐｏｓ、Ｂ．）との間の、＃７＋（ＣＤ３２＋）マーカーを発現する細胞のパーセンテージを示す棒グラフを示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】感染ＴＣＤ４細胞（ｎ＝３）中のＧＦＰの発現の強度と相関させた、＃７（ＣＤ３２）マーカーの蛍光強度を示す。    図１０Ａは、以下３つの細胞下位群について、ＣＤ３２マーカーの蛍光強度の関数として、細胞数の表現を示す。Ａ．：ＧＦＰを発現しない細胞、Ｂ．：ＧＦＰを弱く発現する細胞、およびＣ．：ＧＦＰを強く発現する細胞。    図１０Ｂは、図１０Ａに記載される３つのカテゴリーＡ．、Ｂ．、およびＣ．について、ＴＣＤ４細胞中のＣＤ３２マーカーのパーセンテージのグラフを示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】非刺激ＴＣＤ４細胞（１１Ａ）またはＴＣＲ経路によって刺激されたＴＣＤ４細胞（ｎ＝２）（１１Ｂ）の集団の表面上の＃７（ＣＤ３２）マーカーの発現を示すグラフを示す。黒色の棒は、陽性ＧＦＰ細胞のパーセンテージを示し、灰色の棒は、陰性ＧＦＰ細胞のパーセンテージを示す。
【図１２】偽型ウイルス粒子ＶＳＶ−Ｇの使用が、ＴＣＤ８細胞（ｎ＝２）などの細胞上の＃７（ＣＤ３２）マーカーの発現の誘導を証明するのを可能にすることを示すグラフを示す。平均およびＩＱＲは、必要に応じて、細胞２．（ＧＦＰｎｅｇ）と４．（ＧＦＰ＋）との間の増加とともに、各棒グラフ上に提示される。
【図１３Ａ−１３Ｂ】感染していないか、またはＶＬＰ−Ｖｐｘのみで治療された細胞と比較して、静止状態の感染ＴＣＤ４細胞（ＧＦＰ＋）の表面上の＃７（ＣＤ３２）マーカーの誘導に関するサイトメトリー分析を示す。  健康なドナー（ｎ＝３）からのＰＢＭＣを、ＳＩＶｍａｃ２３９ウイルス（１３Ａ）およびＨＩＶ−２（１３Ｂ）に感染させた。ＦＡＣＳ分析の結果は、非感染集団（ＧＦＰ−、Ａ．）および感染集団（ＧＦＰ＋、Ｂ．）における＃７（ＣＤ３２）マーカーを発現する細胞の％で表される。棒グラフは、ＳＩＶｍａｃ２３９およびＨＩＶ−２を使用して実行された実験の平均および標準偏差を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】健康なドナー（Ａ）と比較して、ＨＩＶ−１に感染し、ウイルス抑制された（Ｂ）患者のＴＣＤ４細胞の表面上の＃７（ＣＤ３２）マーカーの発現のエクスビボレベルの比較を示す棒グラフを示す。    図１４Ａは、ＴＣＤ４細胞の総数におけるＣＤ３２＋細胞のパーセンテージを示す。    図１４Ａは、未成熟ＤＲ＋ＴＣＤ４細胞の総数におけるＣＤ３２＋細胞のパーセンテージを示す。
【図１５Ａ−１５Ｃ】第１の患者におけるＣＤ３２マーカーの発現の結果を示す。    図１５Ａは、アイソタイプによって、非ウイルス血症患者（ｎ＝２）におけるＴＣＤ４リンパ球（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋選別）上の＃７（ＣＤ３２）マーカーの発現の異なるエクスビボレベルを示すフローサイトメトリーの結果を示す。ｘ軸は、ＣＤ３の蛍光のレベルを示し、ｙ軸は、ＣＤ３２の蛍光のレベルを示す。    図１５Ｂは、抗ＣＤ３２抗体によって、非ウイルス血症患者（ｎ＝２）におけるＴＣＤ４リンパ球（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋選別）上の＃７（ＣＤ３２）マーカーの発現の異なるエクスビボレベルを示すフローサイトメトリーの結果を示す。Ａ：ＣＤ３２を強く発現する細胞、Ｂ：ＣＤ３２を弱く発現する細胞、およびＣ：ＣＤ３２を発現しない細胞。ｘ軸は、ＣＤ３マーカーの蛍光強度を示し、ｙ軸は、ＣＤ３２マーカーの蛍光強度を示す。    図１５Ｃは、以下の細胞上でｑＰＣＲによって定量化（β−グロビン遺伝子で標準化）された細胞別の全ＨＩＶ−１  ＤＮＡのコピー数を示す棒グラフを示す。Ａ：ＣＤ４＋細胞、Ｂ：ＣＤ４＋  ＣＤ３２−細胞、Ｃ：ＣＤ４＋  ＣＤ３２（強く発現された）。
【図１６】全ＴＣＤ４細胞（Ａ）の集団、ＴＣＤ４  ＣＤ３２−（Ｂ）集団、およびＴＣＤ４  ＣＤ３２＋（Ｃ）集団中の、非ウイルス血症の７患者においてｑＰＣＲによって定量化された細胞別のＨＩＶ−１  ＤＮＡのコピー数を示すグラフである。ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２−分画とＣＤ３２＋分画との間のウィルコクソン検定は、ＣＤ３２＋分画中のＨＩＶ−１  ＤＮＡの有意な富化を示す（ｐ＝０．０１５６）。
【図１７】ＨＩＶウイルスの再活性化後の４患者（２７、４３９、５６６、および７７１）に由来するＴＣＤ４  ＣＤ３２＋細胞の集団の１００万当たりの感染単位の対数を示す棒グラフである。
【図１８】異なる別々の患者から得た３つの試料からの全ＴＣＤ４細胞（黒色の点）またはＣＤ３２細胞中で枯渇したＴＣＤ４（灰色の点）の集団からの経時的な（数日で発現された、ｘ軸）ウイルス再活性化を示す３つの曲線を示す。ｙ軸は、ｐ２４の量をｐｇ．ｍＬ−１で示す。
【図１９Ａ−１９Ｃ】ＣＤ３２およびＣＤ８９表面マーカーのアイソタイプ対照（陰性対照）を示すフローサイトメトリー結果を示す。    図１９Ａは、患者からの、ＣＤ３およびＣＤ４マーカーで検出された細胞に関するフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ４＋ＣＤ３＋集団は、窓によってマークされる（集団の４０．５％）。    図１９Ｂは、図１９Ａの窓からの細胞、ならびにＣＤ３および対照アイソタイプマーカーを使用して検出されたＣＤ３２マーカーのアイソタイプ対照マーカーに関するフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ３およびアイソタイプでマークされた細胞は、ＣＤ３２抗原に対するそれらの陽性または陰性について検出される。    図１９Ｃは、図１９Ｂにおける下窓からの細胞（ＣＤ３２−）に関するフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ３およびアイソタイプでマークされた細胞は、ＣＤ８９抗原に対するそれらの陽性または陰性について検出される。
【図１９Ｄ−１９Ｆ】ＣＤ３２およびＣＤ８９表面マーカーを示すフローサイトメトリーの結果を示す。    図１９Ｄは、患者からの、ＣＤ３およびＣＤ４マーカーで検出された細胞に関するフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ４＋ＣＤ３＋集団は、窓によってマークされる（集団の４３．８％）。    図１９Ｅは、図１９Ａの窓からの、ＣＤ３およびＣＤ３２マーカーを使用して検出される細胞に関するフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ３２＋細胞（上窓）およびＣＤ３２−細胞（下窓、８８．８％）が示される。    図１９Ｆは、図１９Ｂにおける下窓からの細胞（ＣＤ３２−）に関するフローサイトメトリーの結果を示す。ＣＤ３およびＣＤ８９でマークされた細胞は、ＣＤ８９抗原に対するそれらの陽性または陰性について検出される。窓は、ＣＤ８９＋  ＣＤ３２−細胞（０．０７４％）を示す。
【図２０】別々の４患者から得たＴＣＤ４細胞の全集団（Ａ）、ＴＣＤ４＋ＣＤ３２−ＣＤ８９−細胞の下位集団（Ｂ）、およびＴＣＤ４＋ＣＤ３２−ＣＤ８９＋細胞の下位集団（Ｃ）からの１細胞当たりのＨＩＶ  ＤＮＡコピー数を示すグラフである。これらの分画の各々に存在するウイルス性ＤＮＡを、ｑＰＣＲ  ＤＮＡ  ＨＩＶ−１によって定量化した。試験した患者において、ＣＤ８９マーカーは、実際に、感染細胞のリザーバを同定する（ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２ａ−ＣＤ８９＋細胞当たり０．１ＨＩＶ−１  ＤＮＡコピーの近似中央値）。
【図２１】ＨＩＶ再活性化に供されたＧＦＰ＋患者の細胞中のＣＤ３２に関して、マーカーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ（ＣＤ８９）、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩの比を示す棒グラフである。ウイルスの再活性化は、ＲＮＡｓｅｑによって測定される。
【図２２】ＨＩＶ再活性化に供されたＧＦＰ＋患者の細胞中のＣＤ３２−細胞中のマーカーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ（ＣＤ８９）の比を示す棒グラフである。これらのマーカーは、ＣＤ３２と相互に排他的である。
【図２３】ＣＤ３２およびＣＤ８９抗体で（右下の画像）またはアイソタイプで（左側の画像）マークされた患者（患者８１２）から得たＴＣＤ４細胞、ならびに単一マークされた（ＣＤ３２またはＣＤ８９）細胞および二重マークされた（ＣＤ３２およびＣＤ８９）細胞の検出に関するフローサイトメトリーの結果を示す。２つの集団は排他的であり、二重マーキングは検出されなかったことが指摘される。
【実施例】
【０１０１】
実施例１−細胞内リザーバの特異的マーカーの同定
本発明によって取り組まれる問題は、インビトロモデルおよび有効な抗ウイルス（抗レトロウイルス）治療中のＨＩＶ−１に感染した患者の一次細胞のエクスビボ表現型調査によって、感染した細胞の特異的マーカーを同定し、検証することである。感染した細胞の表面上の、特にＣＤ３２マーカーの特異的発現のインビトロおよびエクスビボを用いて、ＨＩＶ−１に感染した患者におけるウイルスリザーバを標的とし、排除すること、したがって感染した患者においてウイルスを決定的に根絶するのを可能にする有効な治療法を提案することができる。
【０１０２】
材料および方法：
１．ウイルス産生およびＶＬＰ
Ｖｐｘおよびウイルス粒子を含有するＶＬＰは、２９３Ｔ細胞中のＤＮＡのリン酸カルシウム形質移入についての標準プロトコルに従って産生した。ＶＬＰ−Ｖｐｘは、８μｇのｐＳＩＶ３＋プラスミドおよび２μｇのｐＭＤ２−Ｇ  ＶＳＶ−Ｇプラスミドを同時形質移入することによって産生した。形質移入後１６時間で培養培地を置き換えた後、４８時間後にＶＬＰを抽出し、それらを遠心分離し、それらを０．４５ｍｍフィルター上で濾過し、それらを超遠心分離によって１００倍遠心分離した。ＨＩＶ−１−ＣＭＶ−ｅＧＦＰウイルス粒子は、５μｇのｐＨＲＥＴプラスミド、５μｇのｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド、および２μｇのｐＭＤ２−Ｇプラスミドを同時形質移入することによって産生した。濃縮後、ｐ２４力価ウイルスストックを、ＥＬＩＳＡによって測定し、感染力価（ＭＯＩ）を、２９３Ｔ細胞上の力価によって測定した。
【０１０３】
２．インビトロでの静止状態の感染したＴＣＤ４＋リンパ球の感染および「ソーティング」
健康なドナーからの末梢血単核細胞を、密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ）によって単離し、２４ウェルプレート上でＶＬＰ−Ｖｐｘの存在下、最終３００μＬの完全培地（ＲＰＭＩ  １０％ＳＶＦ）中２．１０６細胞／ウェルの濃度で１２時間培養した。次いで、ＨＩＶ−１−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ（１０倍のＭＯＩに相当する１μｇ  ｐ２４）を添加することによって、細胞を感染させた。対照として、ＶＬＰ−Ｖｐｘ、ＨＩＶ−１−ＣＭＶ−ｅｇＦＰの存在下で排他的に細胞を培養するか、または未治療のままにした。感染の３日後に、静止状態の感染した（ＸＨ＋）ＴＣＤ４＋細胞（ＣＤ６９−ＨＬＡ−ＤＲ−）、ＨＩＶ−１−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ（ＸＨ−）で排他的に治療された静止状態のＴＣＤ４＋細胞、および対照（ＸまたはＮＴ）を、ソーターによって単離した。ソートした細胞を、β−メルカプトエタノールを添加したＲＡ１中に再懸濁し、全ＲＮＡ抽出前に−８０℃で貯蔵した。
【０１０４】
３．全ＲＮＡシーケンシングおよび生物情報学的分析
ＸＨ＋、ＸＨ−、Ｘ、およびＮＴ分画に由来する全ＲＮＡを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡミニキットを使用して抽出した。ＲＮＡの品質を、Ａｇｉｌｅｎｔからの２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で、およびＲＮＡ  Ｎａｎｏｃｈｉｐによって分析した。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーを確立した。シーケンシング前に、試料を多重化した。異なる分画について、正則化対数変換遺伝子発現カウントの主成分分析を実行した。
【０１０５】
４．ＨＩＶ−１患者からの末梢血単核細胞の単離
有効に治療されたＨＩＶ−１患者からの末梢血単核細胞（ウイルス負荷＜２０コピーのＲＮＡ  ＨＩＶ−１／ｍＬ血液）を、密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ）によって単離した。
【０１０６】
５．ＴＣＤ４＋リンパ球の下位集団のフローサイトメトリーおよび「ソーティング」
健康なドナーおよびＨＩＶ−１患者からの末梢血のインビトロ感染に由来する細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ３２、抗ＨＬＡ−ＤＲ、および抗ＣＤ６９抗体を使用してマークし、ＦＡＣＳによって分析した。ＨＩＶ−１患者からの新鮮な細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ３２、および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用してマークし、ＣＤ３２マーカーの発現の関数としてＳＨ８００（Ｓｏｎｙ）を使用してソートするために、ＩｇＧ２アイソタイプ対照をマークした（全ＴＣＤ４＋、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２−、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２低、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２＋）。各下位集団について、ソートした細胞の一部を、全ＨＩＶ−１  ＤＮＡの定量化のために乾燥ペレット中−８０℃で保持し、第２の部分を、誘導性およびウイルス増幅試験のために培養した。
【０１０７】
６．全ＨＩＶ−１  ＤＮＡの定量化
ＨＩＶ−１患者の血液から単離した異なる分画のＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤＮＡ濃度を、β−グロビンｑＰＣＲによって決定した。１細胞当たりの全ＨＩＶ−１  ＤＮＡのコピー数を、超高感度ｑＰＣＲ（Ｂｉｃｅｎｔｒｉｃ）によって決定した。
【０１０８】
具体的な説明
マーカー候補を同定するために、発明者らは、健康なドナーに由来する静止状態のＴＣＤ４リンパ球が初めて感染するのを可能にするインビトロモデルを開発した。実際に、これらの細胞は、先行する活性化シグナル（ＴＣＲまたはＰＨＡ／ＩＬ２による活性化）なしに、ＨＩＶ−１による感染に対して許容状態ではない。これらの細胞中の制限に関与するＳＡＭＨＤ１タンパク質を同定する発明者らは、Ｖｐｘタンパク質（ＳＩＶｍａｃ２５１ウイルスによりコードされる）を含有するＶＬＰによる治療の開発を可能にし、制限を取り除くことを可能にし、活性化シグナルを必要とすることなく、感染の配向を可能にした。健康なドナーからのＰＢＭＣが、ＶＬＰ−Ｖｐｘで治療され、次いでＨＩＶ−１−ＣＭＶ−ＧＦＰに感染したこのモデル（図１）を使用して、メッセンジャーＲＮＡ上でＲＮＡ−ｓｅｑ実験を実行するために、感染細胞（ＧＦＰ＋）の全ＲＮＡを抽出した。ＶＬＰ−Ｖｐｘで治療されたが、感染しなかったＰＢＭＣ、ならびに非感染細胞は、対照として使用した。統計的および生物情報学的分析は、静止状態のＴＣＤ４リンパ球の転写プログラムに対するＨＩＶ−１感染の影響を決定するのを可能にした。
【０１０９】
実際に、主成分分析（ＰＣＡ）（図２）および階層的クラスタリングＨＣ（図３）を、ＲＮＡ−ｓｅｑ結果に基づいて実行した。４ドナーに対して実行された２つの分析ＰＣＡおよびＨＣは、ＶＬＰ−Ｖｐｘで治療し、感染した細胞（ＶＬＰ−Ｖｐｘ  ＧＦＰ＋）が、対照細胞（ＶＬＰ−Ｖｐｘ  ＧＦＰ−、ＶＬＰ−Ｖｐｘのみ、および非感染）の別個のクラスタを形成したことを証明した。これらの結果は、異なるドナーからのＶＬＰ−Ｖｐｘ  ＧＦＰ＋細胞が、それらを他の集団と区別するサインを共有することを示す。したがって、感染中に、ＨＩＶ−１は、静止状態のＴＣＤ４リンパ球の遺伝子発現を調整し、それらを非感染細胞と区別する表現型プロファイルに翻訳することができた。
【０１１０】
したがって、発明者らは、示差的に発現した遺伝子（ＤＥ遺伝子）および特に潜伏性感染中の上方調節された遺伝子に興味を持った（図４および５）。したがって、表面タンパク質に対応する２２マーカー候補は、インビトロでの検証のために選別された。健康なドナーからのＰＢＭＣ上でインビトロモデルを使用することによって、２２マーカーの発現を、静止状態の感染ＴＣＤ４リンパ球上でＦＡＣＳ分析（図６）により試験した。結果を、ＧＦＰ＋感染細胞および非感染細胞（ＧＦＰ−）上のマーカー（＃１〜＃２２）の発現率で提示する。この分析は、対照細胞と比較して、感染細胞上のＣＤ３２マーカー（マーカー＃７）の特異的発現を明らかにした（図７および８）。したがって、マーカー候補の同定は、ＣＤ３２マーカーに焦点を当てた。
【０１１１】
図２１は、他の９マーカーもまた、感染し、ウイルス性再発しやすい患者のＴＣＤ４細胞の表面上で発現されることを示す。
【０１１２】
新たなドナーに対する分析を継続することにより、ＧＦＰ高集団におけるこのマーカーの発現レベルの富化を伴い潜在的に、感染細胞中のＣＤ３２マーカーの特異的発現の誘導を確認することが可能になった（図９Ａおよび９Ｂ、ならびに１０Ａおよび１０Ｂ）。発明者らはまた、ＣＤ３２マーカーの誘導が、静止状態の集団に限定されることを示した。実際に、ＴＣＲ経路により刺激された細胞（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８）は、ＣＤ３２マーカーを発現しない（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＶＳＶウイルスのエンベロープを介した偽型ウイルスの使用は、ＣＤ８などの他の感染集団上のこのマーカーの誘導を実証するのを可能にした（図１２）。加えて、ＨＩＶ−２およびＳＩＶレンチウイルスが、ＨＩＶ−１と同じ方法でＣＤ３２の発現を誘導するかどうかを決定した。図１３Ａおよび１３Ｂは、ＳＩＶおよびＨＩＶ−２が、Ｖｐｘの存在下で静止状態の感染ＴＣＤ４細胞の表面上にＣＤ３２の発現を誘導可能であることを示す。
【０１１３】
ＣＤ３２マーカーをインビトロで検証した後に、発明者らは、エクスビボでその関連を確立しようとした。したがって、ＴＣＤ４細胞リンパ球上のこのマーカーの発現レベルの表現型ＦＡＣＳ分析を、健康なドナーと比較して、感染し、抗ウイルスで有効に治療した患者のＰＢＭＣ上で実行した。患者におけるＣＤ３２の著しく高い発現を証明することができた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０１１４】
最後に、発明者らは、２人のウイルス抑制された患者においてＣＤ３２マーカーを示差的に発現するＴＣＤ４リンパ球の異なる下位群（全ＴＣＤ４、ＴＣＤ４  ＣＤ３２−、ＴＣＤ４  ＣＤ３２低、およびＴＣＤ４  ＣＤ３２＋）におけるＨＩＶ−１  ＤＮＡによる富化のレベルを調査した。これらの異なる集団をソートした後に（図１５Ａ〜１５Ｃ）、ゲノムＤＮＡを抽出し、全ＨＩＶ−１  ＤＮＡを、異なる分画中でｑＰＣＲにより定量化した。２人の患者について得られた結果は、このマーカーを発現しないＴＣＤ４と比較して、ＣＤ３２マーカーを発現するＴＣＤ４分画中のＨＩＶ−１  ＤＮＡの強力な富化を示す（図１６）。
【０１１５】
故にこのインビトロおよびエクスビボ結果の組は、ＨＩＶ−１に感染した細胞の特異的マーカーとしてＣＤ３２を検証するのを可能にした。ＣＤ３２の同定は、ＨＩＶ−１に感染した細胞を直接標的とすることを目的とする新たな戦略を確立するのを可能にし、ウイルスリザーバがパージされるのを可能にし、ＡＩＤＳの治癒を可能にする。
【０１１６】
実施例２
ＨＩＶ−１患者の血液から単離された細胞下位集団を、ＩＬ２（５０ＩＵ／ｍＬ）の存在下、ＰＨＡまたは抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、および抗ＣＤ２ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）などの賦活剤の不在下または存在下で培養した。ＴＣＤ４＋およびＴＣＤ４＋  ＣＤ３２−分画を、２４ウェルプレート上で１ｍＬの完全培地当たり１０６細胞の濃度で培養し、ｐ２４  ＥＬＩＳＡ試験のために、上清を２日毎に回収した。
【０１１７】
以下の表および図１７に結果を記載する。
【表１】
2019530872.tif 000002
【０１１８】
この第１の実験は、ＣＤ３２＋分画を含有する全ＴＣＤ４＋リンパ球からの新たなウイルス粒子の産生が、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２＋細胞の場合よりも低いことを証明しようとし、これはウイルスリザーバが、ＣＤ３２ａ＋細胞であることを示す。得られた結果は、全ＴＣＤ４＋リンパ球に対して、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２ａ＋細胞中のＩＵＰＭ数の３０００倍の富化を示す。
【０１１９】
第２の実験では、３患者の血液から単離されたＴＣＤ４＋リンパ球を、ウイルス産生対照としてインビトロでポリクローン的に活性化した（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８＋ＩＬ２）。同時に同じ患者について、ＣＤ３２ａマーカーを発現する細胞中で枯渇したＴＣＤ４＋リンパ球もまた、単離され、次いで同じ条件下インビトロで活性化した。
【０１２０】
ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２低およびＣＤ３２＋分画を、丸底９６ウェルプレート上で培養した後、ＳＩＭＯＡによるウイルス増幅試験、超高感度ｐ２４  ＥＬＩＳＡアッセイのために、培養物上清を３日毎に除去して、２０００  ＭＴ４Ｃ５細胞に添加する。この第２の実験は、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２＋およびＴＣＤ４＋  ＣＤ３２低の活性化によって産生が誘導されたウイルスが、共培養において産生性感染を確立可能であることを実証することを目的とする。
【０１２１】
この実験は、ＣＤ３２＋細胞中で枯渇したＴＣＤ４＋細胞とは逆に、ＣＤ３２＋分画を含有する全ＴＣＤ４＋リンパ球からの新たなウイルス粒子の産生を誘導することが可能であることを証明しようとした。
【０１２２】
結果を図１８に記載する。
【０１２３】
全ＴＣＤ４＋細胞（黒色の点）とＴＣＤ４＋  ＣＤ３２ａ−細胞（灰色の点）との間のウイルス複製動態の比較の結果は、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２ａ＋の枯渇が、ウイルス複製の大幅な遅延につながることである。これらの結果は、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２ａ＋細胞が、感染し、ウイルス複製可能な細胞の全リザーバに著しく寄与することを確認する。
【０１２４】
実施例３
この実施例では、発明者らは、患者に由来し、ＣＤ３２中で枯渇したＴＣＤ４細胞の集団がどのように、活性化後にＨＩＶウイルスを常に再活性化し得るかを理解しようとした。
【０１２５】
他の上記マーカーを試験し、ＣＤ３２を発現するもの以外のリザーバを特定した。
【０１２６】
特に、発明者らは、ＴＣＤ４  ＣＤ８９＋細胞が、ウイルスリザーバを形成したことを特定した。実施例１と同じプロトコルを使用した。
【０１２７】
４患者において、特異的抗体によるマーキングは、ＴＣＤ４＋リンパ球の表面上のＣＤ８９の発現を証明するのを可能にした。これらの細胞の表面上のＣＤ８９マーカーの発現が、その感染につながったことを実証するために、全ＴＣＤ４＋リンパ球のみならず、ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２ａ−  ＣＤ８９−細胞およびＴＣＤ４＋  ＣＤ３２ａ−  ＣＤ８９＋細胞もまた、上記のように（代表的な患者に対する開窓戦略）これらの同じ患者から単離した。結果を図１９Ａ〜１９Ｆに記載する。
【０１２８】
実施例１と同じプロトコルに従い、これらの分画の各々に存在するウイルスＤＮＡを、ｑＰＣＲ  ＤＮＡ  ＨＩＶ−１によって定量化した（図２０）。試験した患者において、ＣＤ８９マーカーは、実際に、感染細胞のリザーバを同定する（ＴＣＤ４＋  ＣＤ３２ａ−ＣＤ８９＋細胞当たり０．１ＨＩＶ−１  ＤＮＡコピーの近似中央値）。
【０１２９】
実施例４
研究を継続するために、発明者らは、異なるマーカー候補が、ウイルスリザーバであるとして同定された細胞中で同時発現したかどうかを最後に試験した。
【０１３０】
図２２は、ＴＣＤ４細胞（ＣＤ３２を発現しない）の表面上にＣＤ８９マーカーが発現される、６つのマーカーを示し、これらのマーカーは、ＨＩＶに感染した細胞の１７〜３０％を表し、したがって当該ＨＩＶを再活性化する可能性が高い。
【０１３１】
ＣＤ８９マーカーが、ＣＤ３２について同定されたもの以外のリザーバを形成するかどうかを特定するために、発明者らは、患者からの細胞集団上のＣＤ３２およびＣＤ８９の共発現を試験した。
【０１３２】
結果を図２３に記載する。
【０１３３】
これらの結果は、２つのマーカー、ＣＤ３２およびＣＤ８９が互いに排他的であり、各々が別々のリザーバを同定することを示す。
【０１３４】
実施例５
ＣＤ３２に対して配向される本発明の抗体は、当業者に既知の様々な技法、特に下記のものによって産生され得る。
【０１３５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、総ヒトＣＤ３２タンパク質で、またはヒト免疫グロブリンのＦｃドメインに融合された細胞外断片で免疫付与される。マウスに、皮下投与によって、１０μｇのタンパク質または断片を、０日目、１４日目、および２８日目に、フロイント完全アジュバント（第１の注入）、または不完全アジュバント（第２および第３の注入）の存在下で注入する。マウスの脾細胞を、上記プロトコル（Ｓａｌｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００４）に従い、マウス骨髄腫細胞（ＰＸ６３．Ａｇ８．６５３；ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に融合させる。ハイブリドーマの選別を可能にするＨＡＴ培地中の培養プレート上で（１ウェル当たり１０５細胞）、細胞を培養する。１２日後に、上清を回収し、ＣＤ３２へのそれらの結合について、ＥＬＩＳＡによって試験する。したがって、細胞を限界希釈によってサブクローニングステップに供し、次いで陽性クローンを、単離するために限界希釈によって第２のサブクローニングサイクルに供し、ＥＬＩＳＡに従い、精製されたクローンは、最高の親和性を有する。次いで、これらのクローンを更に大きな規模で培養して、抗体をインビトロで産生する。次いで、タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーカラム中で上清を精製する。
【０１３６】
ＷＯ２００７／０７４４９６に記載されるように改変ベクターを使用するファージディスプレイ、またはファージディスプレイ選別に続くバイオパニング選別（Ｋｒｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）、ＷＯ２００６／１１７６９９）の技法はまた、ＣＤ３２に対して配向された高親和性抗体を得るための別の代替例である。
【０１３７】
次いで、選別されたハイブリドーマのシーケンシングまたは選別されたファージ既に知られている得られたシーケンシングは、可変領域、またはより具体的にはプラスミド中のエピトープへの特異的結合に関与するＣＤＲのクローン化を可能にし、形質移入後、ＣＨＯ細胞などの細胞を産生する際に、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体の産生および入手を可能にする。
【０１３８】
抗ＣＤ３抗体は、同じステップを実行することによって得られる。次いで、単一特異性抗ＣＤ３２または二重特異性抗ＣＤ３２／ＣＤ３ヒト化またはヒト抗体の作成は、以前に得られた配列を使用することを必要とする（対応する抗原（それぞれＣＤ３２およびＣＤ３）またはバクテリオファージに対して最良親和性を有するハイブリドーマ）。抗体がハイブリドーマに由来する場合、ＣＤＲは、抗原を認識するために重要なアミノ酸、およびＣＤＲの良好な折り畳みを可能にする構造アミノ酸を最適化するように、突然変異誘発によって改変される。ヒト化のステップは、マウスハイブリドーマに由来する配列を、ヒト抗体配列のデータベース、Ｋａｂａｔデータベースと比較することを必要とする。次いで、それらのマウス性質に起因して潜在的に免疫原性であるアミノ酸が改変される。ヒト化後に、抗体がハイブリドーマによって得られた場合、または配列から開始して、ファージディスプレイ技法の場合に得られた場合、２つの抗原（ＣＤ３２およびＣＤ３）に対して配向されたヒト化／ヒト重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）可変領域についてコードする配列を、真核発現ベクターへの融合によってクローン化して、ＣＨＯ細胞中の産生を可能にする。
【０１３９】
本発明は、本明細書に記載される実施形態に限定されず、他の実施形態が当業者に明らかとなるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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