【手続補正書】
【提出日】平成19年6月7日(2007.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、免疫賦活核酸であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
ここで前記オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する、前記免疫賦活核酸。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約５０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項３】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約２６ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド配列が、3'末端ステムループ二次構造を形成する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項５】
オリゴヌクレオチド配列が、3'末端に回文配列または相補配列を有する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項６】
配列番号２、３、４、９、１２、１３、１４、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、６０、６１、６２６３および６５からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項７】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、低減された免疫賦活活性を有する免疫賦活核酸であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
ここで前記オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の5'末端に二次構造を有する、前記免疫賦活核酸。
【請求項８】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約５０ヌクレオチド長である、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド配列が、約１２〜約２６ヌクレオチド長である、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチド配列が、5'末端ステムループ二次構造を形成する、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド配列が、5'末端に回文配列または相補配列を有する、請求項１に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１２】
配列番号５、６、７、１０、１５、１６および１７からなる群から選択される、請求項７に記載の免疫賦活核酸。
【請求項１３】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を低減または消失する方法であって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、そして
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、
前記オリゴヌクレオチド配列の5'末端に、二次構造を含む核酸配列を導入することを含む、前記方法。
【請求項１４】
二次構造が、ステムループ構造である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
二次構造が、回文配列または相補配列との水素結合である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の免疫賦活核酸および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項７に記載の免疫賦活核酸および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活核酸であって、該免疫賦活核酸は二次構造を有し、そして該免疫賦活核酸は一般構造：
ＤｏｍａｉｎＡ−ＤｏｍａｉｎＢ−ＤｏｍａｉｎＣ          （Ｉ）
を含み、
式中、ＤｏｍａｉｎＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよく、
ＤｏｍａｉｎＢは、ＤｏｍａｉｎＡおよびＣを結びつけるリンカーで、3'-5'連鎖、2'-5'連鎖、3'-3'連鎖、ホスフェート基、ヌクレオシドまたは、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコールまたは複素環部分であってもよい非ヌクレオシドリンカーであり、
ＤｏｍａｉｎＣは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Ｃは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Ｇは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
Ｃ＊は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-Ｏ-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
Ｇ＊は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-Ｏ-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ Poly I-Poly Cであってもよい、前記免疫賦活核酸。
【請求項１９】
ＤｏｍａｉｎＡが配列番号３７、３８、３および６４からなる群から選択され、ＤｏｍａｉｎＢが少なくとも１つのリンカーであり、ＤｏｍａｉｎＣが配列番号５５、６７、６８、７１および７３からなる群から選択されから、ＤｏｍａｉｎＡの３’末端とＤｏｍａｉｎＣの３’末端とが前記リンカーに結合している、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【請求項２０】
ＤｏｍａｉｎＡが配列番号３９、４０、４１、４４および６４からなる群から選択され、ＤｏｍａｉｎＢが少なくとも１つのＣ３リンカーであり、ＤｏｍａｉｎＣが配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５９および７２からなる群から選択されから、ＤｏｍａｉｎＡの３’末端とＤｏｍａｉｎＣの３’末端とが前記リンカーに結合している、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【請求項２１】
ＤｏｍａｉｎＡが配列番号３９の配列を含み、ＤｏｍａｉｎＢがテトラエチレングリコールリンカーであり、ＤｏｍａｉｎＣが配列番号４７および５０からなる群から選択されから、ＤｏｍａｉｎＡの３’末端とＤｏｍａｉｎＣの３’末端とが前記リンカーに結合している、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【請求項２２】
ＤｏｍａｉｎＡが配列番号３９の配列を含み、ＤｏｍａｉｎＢがヘキサエチレングリコールリンカーであり、ＤｏｍａｉｎＣが配列番号４７および５０からなる群から選択されから、ＤｏｍａｉｎＡの３’末端とＤｏｍａｉｎＣの３’末端とが前記リンカーに結合している、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【請求項２３】
ＤｏｍａｉｎＡが配列番号６６の配列を含み、ＤｏｍａｉｎＢがグリセロールであり、ＤｏｍａｉｎＣが配列番号４７、７２、７４、７５および７６からなる群から選択されから、ＤｏｍａｉｎＡの３’末端とＤｏｍａｉｎＣの３’末端とが前記グリセロール部分に結合している、請求項１８に記載の免疫賦活核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
【表２】
2007500018.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【表３】
2007500018.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【表４】
2007500018.tif 000003
＊:大文字-PS;小文字-PO;太字-2'-O-メチル-リボヌクレオチド（２６および２７中）;G-2'-デオキシ-7-デアザ-G（２８中）;G-araG（２９中）;X-C3-リンカー（３７および３８中）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
代替的に、本発明の核酸分子は、非ヌクレオチドリンカーによって結合した２つのイムノマーであり得る。これら分子の限定されない例を表２に示す。
【表５】
2007500018.tif 000004
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
【表６】
2007500018.tif 000005
【表７】
2007500018.tif 000006
＊大文字-PS;小文字-PO、X-C3-リンカー;Y-テトラエチレングリコールリンカー;Z-ヘキサエチレングリコールリンカー、太字-2'-O-メチルリボヌクレオチド（３９および４８ならびに３９および５４中）;G-2'-デオキシ-7-デアザ-G（４０および４７中）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
図１５Ｂに示したＢ細胞増殖のデータは、二次構造を形成するＣｐＧ ＤＮＡ１８および１９並びに形成しないＣｐＧ ＤＮＡ２２が強いＢ細胞増殖を誘導したことを示している。賦活化モチーフをもたない配列３０は、最小限の増殖を誘導し、ＣｐＧモチーフは活性化に要求されるが、二次構造は要求されないことが示唆された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
【表８】
2007500018.tif 000007
ａ：主要な賦活化ドメインおよび構造ドメインを示す新規なＣｐＧ ＤＮＡデザイン（ボックス）の概略図。賦活化ドメインは適切なＣｐＧモチーフを含むが、構造ドメインは含まない；
ｂ：全ての配列は８を除いてホスホロチオエート修飾した。７においてイタリックで示したヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチドを示し、８において下線のヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を示す；
c：ＮＤ−測定せず
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
表４  イムノマー構造およびヒトＢ細胞増殖アッセイにおける免疫賦活活性（７２時間）
【表９】
2007500018.tif 000008
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
表５Ａ  イムノマー構造およびヒト樹状細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１０】
2007500018.tif 000009
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
【表１１】
2007500018.tif 000010
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
【表１２】
2007500018.tif 000011
【表１３】
2007500018.tif 000012
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
表５Ｂ  イムノマー構造およびヒト樹状細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１４】
2007500018.tif 000013
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
【表１５】
2007500018.tif 000014
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-リボヌクレオシドを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン  G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
全ての場合に、細胞培養上清におけるＩＦＮ−２およびＩＬ−６のレベルは、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６のそれぞれ同じ実験条件下で作成した標準曲線から計算した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
表６Ａ  イムノマー構造およびヒトPBMCアッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１６】
2007500018.tif 000015
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMe-リボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
表６Ｂ  イムノマー構造およびヒトPBMCアッセイにいおける免疫賦活活性（２４時間）
【表１７】
2007500018.tif 000016
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
【表１８】
2007500018.tif 000017
【表１９】
2007500018.tif 000018
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン  G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
表７  イムノマー構造およびヒトＢ細胞アッセイにおける免疫賦活活性（２４時間）
【表２０】
2007500018.tif 000019
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
表８  イムノマー構造およびヒトPBMCからのBCの発現（２４時間）
【表２１】
2007500018.tif 000020
【表２２】
2007500018.tif 000021
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMeリボヌクレオチドを示す;XはC3-リンカーを示す
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
【表２３】
2007500018.tif 000022
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
【表２４】
2007500018.tif 000023
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン  G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
表９  イムノマー構造およびヒトPBMCからのDCの発現（２４時間）
【表２５】
2007500018.tif 000024
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
【表２６】
2007500018.tif 000025
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;下線は2'-OMe-ヌクレオシドを示す；XはＣ３−リンカーを示す。
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン
【表２７】
2007500018.tif 000026
普通字はホスホロチオエート連鎖を示す;イタリック字はホスホジエステル連鎖を示す。
下線＝2'-OMe-ヌクレオシド
R＝2'-デオキシ-7-デアザグアノシン  G1＝2'-デオキシ-7-デアザグアノイス
X＝グリセロールリンカー