(57)【要約】  複製老化時の細胞周期進行の阻害を抑止するために、並びに、後生動物細胞バイオマスの応用および工業生産を拡張性のあるものとするためのクローン細胞株を得るために、標的化された遺伝子改変を用いる、後生動物の体細胞の複製能を拡張するための製品および方法。各タンパク質をコードする転写物の第１エクソンを標的とするガイドＲＮＡを用いての挿入変異または欠失変異は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される。標的化された改変により、ｐ１５タンパク質およびｐ１６タンパク質が不活性化されることで、未改変親集団と比べて前記改変細胞集団の増殖能が増加する。これらの改変を、ＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクトから得られる補助的なテロメラーゼ活性と組み合わせることで、前記改変細胞集団の複製能は無制限に増加する。応用として、１つは家禽種のニワトリ（Gallus gallus）由来の細胞を用いた食用骨格筋の製造であり、もう１つは家畜種のウシ（Bos taurus）由来の細胞を用いた食用骨格筋の製造である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
後生動物の体細胞集団の複製能を拡張するための方法であって、
遺伝子改変によりサイクリン依存性キナーゼ阻害因子（「ＣＫＩ」）を介した網膜芽細胞腫タンパク質の安定化を抑止することによって、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化中の細胞分裂周期の進行阻害を非干渉化すること；
機能的なテロメア逆転写酵素（「ＴＥＲＴ」）タンパク質の異所性発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号１１）を後生動物体細胞集団に形質導入することで、テロメラーゼ活性を維持すること；
前記遺伝子改変および前記ＴＥＲＴタンパク質の異所性発現を有するマスターセルバンクとなるセルバンクを維持すること；
生体外環境で前記マスターセルバンクから細胞を培養し、培養された細胞バイオマスとすること；並びに、
食用に前記培養された細胞バイオマスを回収すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記遺伝子改変が、前記後生動物体細胞集団におけるＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３９５０７６）を遺伝子改変することにより、ｐ１５タンパク質を不活性化することで、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化時の細胞周期の阻害を無効にすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子改変が前記ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子のエクソン１内の保存ヌクレオチド配列の変異である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子のエクソン１を標的とするガイドＲＮＡ（配列番号１、２、３、４および５）からなる群から選択されるガイドＲＮＡを用いてなされる挿入変異であり、且つ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ−Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ−Ｃａｓ９）を用いて作製される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子のエクソン１を標的とするガイドＲＮＡ（配列番号１、２、３、４および５）からなる群から選択されるガイドＲＮＡを用いてなされる欠失変異であり、且つ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること；
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること；
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること；並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記後生動物体細胞集団の種名がニワトリ（Gallus gallus）であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子改変が、前記後生動物体細胞集団におけるＣＤＫＮ２Ａ遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６１６３６９）を遺伝子改変することにより、ｐ１６タンパク質を不活性化することで、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化時の細胞周期の阻害を無効にすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子改変が前記ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のエクソン２内の保存ヌクレオチド配列の変異である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のエクソン２を標的とするガイドＲＮＡを用いてなされる挿入変異であり、且つ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のエクソン２を標的とするガイドＲＮＡ（配列番号８、９、および１０）からなる群から選択されるガイドＲＮＡを用いてなされる欠失変異であり、且つ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること；
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること；
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること；並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記後生動物体細胞集団の種名がウシ（Bos taurus）であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子改変が、ＣＤＫ４遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１０６１８）からのサイクリン依存性キナーゼ４（「ＣＤＫ４」）タンパク質のホモログの異所性発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号１２）で、前記細胞集団を改変することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること；
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること；
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること；並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記後生動物体細胞集団の種名がニワトリ（Gallus gallus）であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記後生動物細胞集団の改変が、ウシ（Bos taurus）ＣＤＫ４遺伝子からのＣＤＫ４タンパク質のホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号１２）によるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
以下を含む工程：
遺伝子改変によりＣＫＩを介した網膜芽細胞腫タンパク質の安定化を抑止することによって、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化中の細胞分裂周期の進行阻害を非干渉化すること；
機能的ＴＥＲＴタンパク質の異所性発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号１１）を後生動物体細胞集団に形質導入することで、テロメラーゼ活性を維持すること；
前記遺伝子改変および前記ＴＥＲＴタンパク質の異所性発現を有するマスターセルバンクとなるセルバンクを維持すること；
生体外環境で前記マスターセルバンクから細胞を培養し、培養された細胞バイオマスとすること；並びに、
食用に前記培養された細胞バイオマスを回収すること、
により得られ、
工業生産における適用を拡張性のあるものとするための無限の複製能を有する、
後生動物体細胞集団のクローン細胞株。
【請求項１９】
前記遺伝子改変が、前記後生動物体細胞集団におけるＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３９５０７６）を遺伝子改変することにより、ｐ１５タンパク質を不活性化することで、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化時の細胞周期の阻害を無効にすることを含む、請求項１８に記載のクローン細胞株。
【請求項２０】
前記遺伝子改変が前記ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子のエクソン１内の保存ヌクレオチド配列の変異である、請求項１９に記載のクローン細胞株。
【請求項２１】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子のエクソン１を標的とする（配列番号１、２、３、４および５）からなる群から選択されるガイドＲＮＡを用いてなされる挿入変異であり、且つ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される、請求項２０に記載のクローン細胞株。
【請求項２２】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子のエクソン１を標的とする（配列番号１、２、３、４および５）からなる群から選択されるガイドＲＮＡを用いてなされる欠失変異であり、且つ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される、請求項２０に記載のクローン細胞株。
【請求項２３】
前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること；
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること；
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること；並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項１８に記載のクローン細胞株。
【請求項２４】
前記後生動物体細胞集団の種名がニワトリ（Gallus gallus）であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項１９に記載のクローン細胞株。
【請求項２５】
前記遺伝子改変が、前記後生動物体細胞集団におけるＣＤＫＮ２Ａ遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６１６３６９）を遺伝子改変することにより、ｐ１６タンパク質を不活性化することで、網膜芽細胞腫タンパク質による複製老化時の細胞周期の阻害を無効にすることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子改変が前記ＣＤＫＮ２Ａのエクソン２内の保存ヌクレオチド配列の変異である、請求項２５に記載のクローン細胞株。
【請求項２７】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤＫＮ２Ａのエクソン２を標的とする（配列番号８〜１０）からなる群から選択されるガイドＲＮＡを用いてなされる挿入変異であり、且つ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される、請求項２６に記載のクローン細胞株。
【請求項２８】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤＫＮ２Ａのエクソン２を標的とする（配列番号８〜１０）からなる群から選択されるガイドＲＮＡを用いてなされる欠失変異であり、且つ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される、請求項２６に記載のクローン細胞株。
【請求項２９】
前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること；
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること；
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること；並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項２５に記載のクローン細胞株。
【請求項３０】
前記後生動物体細胞集団の種名がウシ（Bos taurus）であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項２５に記載のクローン細胞株。
【請求項３１】
前記遺伝子改変が、ＣＤＫ４遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１０６１８）からのＣＤＫ４タンパク質のホモログの異所性発現を指示する遺伝子コンストラクトで、前記細胞集団を改変することをさらに含む、請求項１８に記載のクローン細胞株。
【請求項３２】
前記マスターセルバンクからの細胞の培養が、
マスターセルバンクから選択された細胞集団を増殖させること；
増殖した細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存し貯蔵すること；
前記マスターセルバンクストックインベントリからの細胞を生体外環境で播種および培養すること；並びに、
食用に培養された細胞バイオマスを回収すること、
をさらに含む、請求項３１に記載のクローン細胞株。
【請求項３３】
前記後生動物体細胞集団の種名がニワトリ（Gallus gallus）であり、前記後生動物体細胞集団の系譜が骨格筋である、請求項３１に記載のクローン細胞株。
【請求項３４】
前記後生動物細胞集団の改変が、ウシ（Bos taurus）ＣＤＫ４遺伝子からのＣＤＫ４タンパク質のホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号１２）によるものである、請求項３１に記載のクローン細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業的なバイオプロセス応用においてバイオマス製造を拡張性のあるものとするための、後生動物細胞の複製能を拡張する製品および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋原性（すなわち、「筋形成」）細胞株は、その誘導が５０年ほど前に初めて報告されてから、骨格筋のバイオロジーを理解するための基礎モデルとして使用されてきた。基礎研究の他に、筋（すなわち、筋芽）細胞株は、生物学的ロボット工学；バイオ人工筋構造体による薬理作用のある化合物のスクリーニング；遺伝性筋疾患の治療的矯正；および食事消費用の可食バイオマスの生体外生産での産業的応用が見込まれている。商業規模の動物バイオマス生産で利用するために、細胞供給源としてのドナー組織から初代筋細胞を獲得するには、技術的資源および物質的資源が必要となり、これが現在、特定用途向けのバッチ培養の妨げとなっている。さらに、初代細胞の元々の複製能も、遺伝子改変のために継代が可能な、またはセルバンキングおよび工業生産のために使用可能な、規模を制限している。これらの問題に取り組むため、本発明は、骨格筋系に特異的な細胞の再生能を拡張する遺伝子改変によって、以降「筋原細胞株」と称するものを作製することを含む。
【０００３】
筋原性またはそれ以外の、完全に機能的な細胞株は、系譜特異的な存在論的表現型、広範な核型によるゲノム安定性、恒久的な再生能、および、生体内の組織学的対応物に存在する高分化型細胞の機能的特徴を示す能力、によって特定される。骨格筋細胞株では、これらの特徴のうちのいくつかとして、細胞融合、横紋筋原線維の発生、およびアセチルコリン等の化学的刺激に対する生理応答が挙げられる。
【０００４】
正常組織からの単離物、および変異組織からの単離物、すなわち腫瘍からの単離物の連続継代を通じて、ある特定の骨格筋細胞株の誘導が成功している。今日まで、既存の筋原細胞株は特徴付けが不十分なままであり、多くの場合、ゲノム不安定性、異数性、分化能障害、並びにシグナル伝達および転写の分子的ネットワークにおける多面的変化などの望ましくない形質を有している。
【０００５】
利用可能な不死化細胞株の選択肢は、えり抜きの前駆細胞種になお限定されている。これらの細胞株のうち、全てではないにしろ大部分が、えり抜きの前駆細胞種の種特異的または高忠実度な提示を必要とする適用への機能的適合性を減じ得る、好ましくない特徴を有している。例えば、未だに、ウシ、ブタ、ニワトリおよびサケ等の農業的に重要な動物種からの不死化筋原細胞株の誘導は達成されていない。既存の筋原細胞株の選択は、生物医学研究で一般的に使用されているモデル種、すなわち、マウス種および霊長類種にほとんど限定されているが、これらの細胞株は、食用の可食バイオマスを生産するための前駆細胞供給源として、一般的に受け入れられるものではない。
【０００６】
このことは、網膜芽細胞腫ファミリータンパク質（すなわち、ｐ１０７、ｐＲＢ、ｐ１３０）を介した細胞周期移行阻害、および、連続的な細胞分裂周期の間の染色体末端におけるテロメアＤＮＡ配列リピート（ＴＴＡＧＧＧ）ｎの短縮により誘発されるＤＮＡ損傷応答など、複製老化に関与する個々の経路を直接標的とすることによる筋原細胞株を樹立するために使用される他のアプローチにも当てはまる。例えば、ｐＲＢ機能の消失は、筋原細胞が高分化状態に到達しその状態を維持する能力を損なわせるが、単独では、筋原細胞の増殖能を維持するのに不十分である。同様に、機能的なテロメア逆転写酵素（「ＴＥＲＴ」）の過剰発現によるテロメラーゼ活性の長期間維持によっても、テロメア浸食の相殺により初代筋芽細胞の再生能が拡張されるが、単独では、これらの細胞の老化を防ぐのに不十分である。
【０００７】
ｐ１０７は、正常な骨格筋で発現される主な網膜芽細胞腫ファミリータンパク質であり、未分化の増殖中の筋芽細胞ではＥ２Ｆ転写因子と複合体を形成する。最終分化において、筋芽細胞は、細胞分裂周期を脱出し、融合して多核性の筋管となり、さらに成熟して収縮性のある筋線維となる。筋芽細胞分化時の細胞周期脱出を惹起し、筋管の分裂終了状態を維持するための、Ｅ２Ｆを対象とした転写レベルでの遺伝子発現活性化の抑制における、網膜芽細胞腫ファミリータンパク質であるｐＲＢおよびｐ１３０の役割は、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子（「ＣＫＩ」）によって方向付けられる。しかし、現在までにモデル化および特徴付けされた哺乳類の骨格筋において、単独でのＣＫＩの機能は、最終分化時に細胞周期を停止させるのに十分とは言えない。そうではなく、ＣＫＩは、ｐ２１、ｐ１８、ｐ２７およびｐ５７を含む組み合わせの中で、筋芽細胞が分化する際の細胞周期からの脱出を指示および安定化する役割を共有している。ＣＫＩのどの組み合わせが、この役割を効果的に果たすのに十分であるか、また必要であるかについては、未だ意見の一致が得られていない。このような結論ではあるが、ＣＫＩタンパク質であるｐ１５およびｐ１６には、この役割との関連付けが未だされていない。
【０００８】
ＣＫＩタンパク質であるｐ１６（別名ＩＮＫ４Ａ）は、哺乳類で見られるＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の発現産物であるが、連続したＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子およびＣＤＫＮ２Ａ遺伝子によって共有されるＩＮＫ４Ｂ−ＡＲＦ−ＩＮＫ４Ａ遺伝子座の一部分を構成している。このＣＤＫＮ２Ａ遺伝子は、ＡＲＦとｐ１６という、選択的スプライスバリアントから翻訳される２種類のタンパク質の転写物をコードしている。それぞれのＣＤＫＮ２Ａ転写物の発現は別々のプロモーターによって制御されている。ＡＲＦタンパク質とｐ１６タンパク質はＣＤＫＮ２Ａ遺伝子内の共通のエクソンにコードされているが、ＡＲＦの転写物はｐ１６転写物とは異なる読み取り枠で転写されることから、ＡＲＦを構成するアミノ酸配列とｐ１６を構成するアミノ酸配列は完全に異なっている。ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子は、ｐ１５タンパク質（別名ＩＮＫ４Ｂ）という、構造と機能の両方においてｐ１６と類似したＣＫＩをコードしている。
【０００９】
Ｐ１５およびｐ１６は、哺乳類に存在するパラログであり、ここでＣＤＫＮ２Ａ遺伝子は、後生動物の系統樹内の哺乳類の分岐と同期したＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子の重複から生じたと考えられている。ｐ１５と異なり、ｐ１６は複製老化時に哺乳類において主要なＣＫＩとして働く。
【００１０】
注目すべきことに、長命の抗腫瘍性げっ歯類であるハダカデバネズミが、ｐ１５の第１エクソンとｐ１６の第２および第３エクソンとを架橋した転写性スプライスバリアント（transcriptional splice variant）から、ｐ１５／ｐ１６ハイブリッドタンパク質を発現していることが知られている。魚類および鳥類では、ＩＮＫ４Ｂ−ＡＲＦ−ＩＮＫ４Ａ遺伝子座の成分は部分的にしか保存されていない。ニワトリゲノムでは、ＣＤＫ２ＮＡ遺伝子はｐ１６タンパク質をコードしておらず、ｐ１５タンパク質とＡＲＦタンパク質のみがコードされている。シーケンスおよびアノテーションされた魚類ゲノムはＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子を特徴とするが、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子はこれらのゲノム内に存在していない。ニワトリのｐ１５タンパク質は機能的にヒトのｐ１６タンパク質に対応しており、ヒト線維芽細胞で過剰発現された場合、共にＣＤＫ４／６と結合して細胞周期進行を制限する。さらに、ニワトリ線維芽細胞では、ｐ１５は複製老化を促す場合がある。
【００１１】
加えて、不死筋原性マウスＣ２Ｃ１２細胞株での、特にＩＮＫ４Ｂ−ＡＲＦ−ＩＮＫ４Ａ遺伝子座内の欠失変異によって、ｐ１６およびＡＲＦの発現が抑制される。現在までに、ＩＮＫ４Ｂ−ＡＲＦ−ＩＮＫ４Ａ遺伝子座の標的化された非確率的な遺伝子改変によって、筋原細胞株が作製されたという報告はない。むしろ、ＣＤＫ４（すなわちサイクリン依存性キナーゼ４）タンパク質を異所的に過剰発現させることにより、ヒト筋原細胞におけるｐ１６タンパク質の抑制的ＣＫＩ機能が部分的に克服され、その結果、老化が克服されて細胞株が得られた。
【００１２】
ｐ１６およびｐ１５の機能の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）サイレンシングなどの、他の方法による、長期の継代を可能とする筋原細胞株の誘導支援は未だ示されていない。魚類種、家禽類種および家畜種から骨格筋細胞株を作製するための非確率的な方法は、未だ報告が無い。現在までに、動物バイオマスが、食事による消費を目的として生体外培養によって商業的に製造されたことはない。動物バイオマスから製造された試作食品は種々報告されてはいるが、これらの試作品の製造に使用された細胞ストックは、その細胞ストックの遺伝的プログラムが許容する増殖規模に限定され、使用された正常体細胞では複製老化が伴って生じる。
【００１３】
複製老化を回避するための１つのアプローチは、無限の再生能を有する以前に樹立された多能性または非筋原細胞株の存在論的系譜決定を、筋原系へと配向することを利用する。米国特許出願番号１５／１３４，２５２を参照されたい（参照により本明細書に援用）。対照的に、本明細書に記載される代わりのアプローチは、系譜決定された筋細胞の複製能を無制限に拡張することで、食事による消費および産業的なバイオプロセス応用のための、拡張性のあるバイオマス製造のための、筋原細胞株を作製する、相互的（reciprocal）な方法である。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、正常な未改変体細胞の複製老化特徴が軽減または消失し、後生動物細胞バイオマスの工業生産における拡張性のある適用のためのクローン細胞株が得られるように、テロメラーゼ活性を維持しながら、分化時ではなく増殖時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞周期阻害を抑止することによる、後生動物体細胞の複製能を拡張するための遺伝子改変を使用する、製品および方法である。
【００１５】
前記適用が食用に製造されたバイオマスである本発明の１つの実施例では、前記細胞の種名はニワトリ（Gallus gallus）であり、細胞系譜は骨格筋である。１つの実施形態において、本発明の遺伝子改変は、ＣＤＫ４の阻害因子「ＩＮＫ４」（サイクリン依存性キナーゼ４「ＣＤＫ４」の阻害因子（故に、その名称はＩＮｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＣＤＫ４））であるＣＫＩホモログｐ１５およびｐ１６を表すタンパク質の直接的な不活性化を成す。ｐ１５およびｐ１６の不活性化を、ＩＮＫ４Ｂ−ＡＲＦ−ＩＮＫ４Ａ遺伝子座にコードされるＩＮＫ４タンパク質をコードする保存ヌクレオチド配列を変異させることで達成し、これにより標的細胞集団の増殖能を拡張させる。
【００１６】
具体的には、ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子の第１エクソンを標的として、ニワトリ（Gallus gallus）骨格筋から単離された初代細胞集団内のｐ１５タンパク質を破壊する。第１エクソンを標的とするガイドＲＮＡを用いる挿入または欠失変異（インデル）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（clustered regularly-interspaced short palindromic repeats-Cas9）を用いて作製する。これにより、未改変親集団との比較で改変細胞集団の増殖能を増加させるには、ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子座の単独の破壊で十分であることが示される。
【００１７】
しかし、これらの改変を、テロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクトから得られる（例えば、異所性ＴＥＲＴ遺伝子から得られる）補助的なテロメラーゼ活性と組み合わせると、改変された細胞集団の複製能は無制限に増加する。増殖および老化の指標を未改変の初代細胞集団に対してスコア化することで、前記アプローチを検証する。
【００１８】
いくつかの理由から、雌ニワトリ（Gallus gallus）種核型の細胞をこの方法のモデル化に選んだ。１つは、ニワトリ（Gallus gallus）の雌核型が、異型配偶子性の性別を構成することである。ＣＤＫＮ２Ｂ対立遺伝子はニワトリ（Gallus gallus）の性染色体上に位置しているため、雌動物では一方のみの対立遺伝子の標的化によっても、このゲノムはヌル接合体となる。２つ目は、このニワトリ（Gallus gallus）ゲノムが、ｐ１６タンパク質をコードする哺乳類ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のオルソログを欠くことである。すなわち、このモデルで全ｐ１５／ｐ１６活性を消失させるには、一方のＩＮＫ４をコードする遺伝子のみを不活性化すればよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、先行する活性調節領域（例示：デスミンプロモーター）の制御下にある遺伝子（例示：血清アルブミン）を含む、トランスジェニックＤＮＡ配列の挿入を示している。
【図２】図２は、ゲノム内因性の標的遺伝子（例示：血清アルブミン）からの発現の制御のための活性調節領域（例示：デスミンプロモーター）を含む、トランスジェニックＤＮＡ配列の挿入を示している。
【図３】図３は、調節領域（例示：血清アルブミン遺伝子）の活性化のための、インデル（INDEL）または点変異による内因性調節領域（例示：血清アルブミンプロモーター）ＤＮＡ配列の遺伝子改変を示している。
【図４】図４は、組織特異的活性を有する内在性５’側調節領域（例示：ミオスタチンプロモーター）の制御下で発現されること、および、それと同時に、挿入されたＤＮＡ配列の３’側の内在性遺伝子（例示：ミオスタチン遺伝子）の前記調節領域による活性化を途絶すること、を目的とした標的遺伝子（例示：血清アルブミン遺伝子）、を表すトランスジェニックなＤＮＡ配列（transgenic DNA sequence）の挿入を示している。
【図５】図５は、標的遺伝子のプロモーター領域からの遺伝子発現（例示：血清アルブミンプロモーターおよび血清アルブミン遺伝子）の標的化された活性化のみを目的とした、または、遺伝子配列を標的とした活性化の繋留（activation tether）による前記調節領域の外側のエンハンサーによる遺伝子発現の活性化も併せて目的とした、エピジェネティックな、または転写プログラムを介した、誘導性改変を示している。例示として、ＣＲＩＳＰＲａ（すなわちＣＲＩＳＰＲ活性化（CRISPR activation））を表す様式が示されている。
【図６】図６は、ＤＮＡ配列を標的とした抑制の繋留（repression tether）による、標的遺伝子の調節領域からの遺伝子発現、または標的遺伝子のコード配列からの直接的な遺伝子発現、の標的化された抑制のための、エピジェネティックな、または転写プログラムを介した、抑制性改変を示している（例示：血清アルブミンプロモーターおよび血清アルブミン遺伝子）。例示として、ＣＲＩＳＰＲｉ（すなわちＣＲＩＳＰＲ干渉（CRISPR interference））を表す様式が示されている。
【図７】図７は、内在性標的遺伝子（例示：ミオスタチン遺伝子）の発現をサイレンシングまたは途絶させるインデル変異または点変異による、内在性調節領域（例示：ミオスタチンプロモーター）の、または開始コドン等の標的遺伝子コード配列の、遺伝子改変を示している。
【図８】図８は、活性調節領域（例示：デスミンプロモーター）の後に続き、且つそれの制御下にある、ｓｈＲＮＡコード領域（例示：ミオスタチンｓｈＲＮＡ）を含むトランスジェニックＤＮＡ配列の挿入を示している。
【図９ａ】図９はｐ１６およびｐ１５のアミノ酸配列比較を示している：ａ．  代表的な哺乳類である、マウス（ハツカネズミ（Mus musculus）；配列番号１７）、ウシ（ウシ（Bos taurus）；配列番号１８）、およびブタ（イノシシ（Sus scrofa）；配列番号１９）のｐ１６オルソログ（パネルＡ）内での予測アミノ酸配列相同性の間での保存。
【図９ｂ】図９はｐ１６およびｐ１５のアミノ酸配列比較を示している：ｂ．  代表的な後生動物であるキジ目（ニワトリ（Gallus gallus）；配列番号２０）、マウス（ハツカネズミ（Mus musculus）；配列番号２１）、ウシ（ウシ（Bos taurus）；配列番号２３）、ブタ（イノシシ（Sus scrofa）；配列番号２２）、サケ科（ニジマス（Oncorhynchus mykiss）；配列番号２４）およびカワスズメ科（ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）；配列番号２５）のｐ１５のオルソログ（パネルＢ）内での予測アミノ酸配列相同性の間での保存。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の遺伝子改変は、複製老化時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞分裂周期進行阻害を非干渉化する。これは、例示的な実施形態に示されるように、ＣＫＩを介した網膜芽細胞腫タンパク質の安定化を抑制することによって達成される。３つの例示的な実施形態が開示される：（Ｉ）コード配列の標的変異を通じたＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子の破壊によるｐ１５タンパク質の不活性化；（ＩＩ）コード配列の標的変異を通じたＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の破壊によるｐ１６タンパク質の不活性化；および、（ＩＩＩ）網膜芽細胞腫タンパク質による細胞分裂周期進行阻害の、内在性ＣＫＩを介した安定化の、サイクリン依存性キナーゼホモログの過剰発現による抑制。これらの改変は、単独で、または異所性遺伝子コンストラクトによって指示される補助的なテロメラーゼ過剰発現との組み合わせにおいて、改変を受けた後生動物細胞の複製能を拡張する。
【００２１】
図１〜５には、遺伝子の標的化された転写活性化のための５つの例示的な誘導性改変モデルが図示されている。図４、図６〜図８には、遺伝子産物の標的抑制のための４つの例示的な抑制性改変モデルが図示されている。図１〜８において、ＧはネイティブなゲノムＤＮＡ配列を表し、Ｔは外来のトランスジェニックＤＮＡ配列を表す。なお、図４は、導入された導入遺伝子に対する誘導性改変、および、ネイティブなプロモーターから分離された内在性遺伝子に対する抑制性改変を表し得る。この例のための、野生型宿主細胞の組織系譜は、ミオスタチン＋／デスミン＋骨格筋である。例示的に、矢印は、インデルまたは点変異による、プロモーターおよび／または遺伝子のＤＮＡ配列内の、例示的な遺伝子改変領域を示している。ＲＯＳＡ２６は、例示的な、転写活性を有する改変遺伝子座を示している。改変には、例えば、内在性または未改変の、遺伝的プログラム、後成的プログラムまたは転写プログラムに対する、改変が含まれ得る。
【００２２】
家畜に分類されるものとして一般的に認められた種の間で、ｐ１６タンパク質の予想アミノ酸配列は大部分が保存されており、ウシ（Bos taurus）（配列番号１８）およびイノシシ（Sus scrofa）（配列番号１９）の間では８２％の対が同一である。同様に、家畜および海産物に分類される種の間では、ｐ１５タンパク質のアミノ酸配列は以下の通りに保存されている：ウシ（Bos taurus）（配列番号２３）とイノシシ（Sus scrofa）（配列番号２２）との間では９２％の対が同一であり、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）（配列番号２４）とナイルティラピア（Oreochromis niloticus）（配列番号２５）との間では６０％の対が同一である。さらに、ｐ１５遺伝子座で家畜、家禽および海産物の全てを比較すると（図９のパネルＢに示される）、ゲノムのアラインメントにより、５８％の対同一性があることが分かる（ニワトリ（Gallus gallus）、配列番号２０；ハツカネズミ（Mus musculus）、配列番号２１；ウシ（Bos taurus）、配列番号２３；イノシシ（Sus scrofa）、配列番号２２；ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、配列番号２４；およびナイルティラピア（Oreochromis niloticus）、配列番号２５）。
【００２３】
図９はｐ１６およびｐ１５のアミノ酸のアラインメントを示している：ａ．  代表的な哺乳類であるマウス（ハツカネズミ（Mus musculus）；配列番号１７）、ウシ（ウシ（Bos taurus）；配列番号１８）、およびブタ（イノシシ（Sus scrofa）；配列番号１９）のｐ１６オルソログ内のアミノ酸配列ホモロジー間での保存（パネルＡ）；ｂ．  代表的な後生動物であるキジ目（ニワトリ（Gallus gallus）；配列番号２０）、マウス（ハツカネズミ（Mus musculus）；配列番号２１）、ウシ（ウシ（Bos taurus）；配列番号２３）、ブタ（イノシシ（Sus scrofa）；配列番号２２）、サケ科（ニジマス（Oncorhynchus mykiss）；配列番号２４）およびカワスズメ科（ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）；配列番号２５）のｐ１５オルソログ内のアミノ酸配列ホモロジー間での保存（パネルＢ）。暗い領域は保存の程度（すなわち、同一性および類似性）を示しており：Ｂｌｏｓｕｍ６２スコア行列に基づいて、黒色の網掛けは１００％の類似度を示しており、灰色は６０〜８０％の類似度を示しており、白色は６０％未満の類似度を示している（画像およびスコアリングはＧｅｎｅｉｏｕｓ  Ｒ１０（http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012）で作成）。
【００２４】
まとめると、これらのオルソログは、家畜、家禽および海産物に分類される種の間の、本発明の実施形態で標的とされるｐ１５オルソログおよびｐ１６オルソログの、保存されたアミノ酸配列ホモロジーを示している。なお、アノテーションされた魚類および鳥類のゲノムはｐ１６オルソログを欠いている。従って、本発明における標的化された適用のためのプラットフォームとして、ｐ１５を介した機能の完全性が鳥類種、哺乳類種および魚類種の全体に亘って保存されていること、並びに、ｐ１６を介した機能の完全性が哺乳類種の全体に亘って保存されていること、が予測される。
【００２５】
＜第一の例示的な実施形態：ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子座の遺伝子改変およびＴＥＲＴの異所性発現による複製老化の遅延＞
（Ａ）ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子座の遺伝子改変による複製老化の遅延
要約すると、この第一の例示的な実施形態は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号１〜５）を用いてＣＤＫＮ２Ｂのエクソン＃１（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿２０４４３３．１）に標的化されたインデルを作製するためのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９を用いて、ニワトリ（Gallus gallus）骨格筋から単離された初代筋芽細胞集団内のｐ１５タンパク質をコードするＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子座を破壊する。ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子座の破壊は単独でも利益をもたらすが、ＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号６）（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００１０３１００７．１；ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４２０９７２）から得られる補助的なテロメラーゼ活性と組み合わされた場合、改変細胞集団の複製能を無制限に増大させる。標的化されたＣＤＫＮ２Ｂ不活性化は新規なあプローチである。
【００２６】
大まかに言えば、第一の実施形態は、以下の５段階の工程で、生体外培養により後生動物体細胞の元々の複製能を拡張する：（１）分化時ではなく、増殖時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞周期阻害が無効にされるように、ｐ１５タンパク質を不活性化することによって、複製老化時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞分裂周期進行阻害を非干渉化する工程；（２）機能的ＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現（「ＴＥＲＴの異所性発現」）を指示する遺伝子コンストラクトを後生動物体細胞に形質導入することによりテロメラーゼ活性を維持することで、正常な未改変の後生動物体細胞に典型的な複製老化を低減する工程；（３）ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子変異およびＴＥＲＴの異所性発現を有するセルバンク（すなわち、「マスターセルバンク」）を維持する工程；（４）生体外環境で前記マスターセルバンクから細胞を培養する工程；並びに、（５）食用に前記培養された細胞バイオマスを回収する工程。
【００２７】
より具体的には、一実施形態では、ｐ１５タンパク質をコードするＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子の第１エクソン（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿２０４４３３．１）を、ｇＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｇＲＮＡ配列番号１〜５）を用いて遺伝子改変の標的とすることで、ニワトリ（Gallus gallus）細胞集団のゲノム内のＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子の第１エクソン内に変異を挿入する。これらの例に使用された方法のより詳細な説明については、以下の材料と方法のセクションＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、およびＦを参照されたい。
【００２８】
例示的な実施形態Ｉは、内在性ｐ１５タンパク質の機能を破壊するために、図７に図示されたモデルを利用する。特に、図７に示されるモデルは、転写活性化を可能にする開始コドン配列または調節領域配列の変異によって内在性遺伝子の発現を破壊する本発明での使用に適当であり得る。あるいは、内在性遺伝子の機能は、開始コドンの後にフレームシフト変異を導入することによって破壊されてもよい。例えば、本発明に適用される場合、図７に示されるモデルは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって標的化されるヌクレアーゼ活性を用いてＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子のコード配列の５’側に導入されるインデル変異によるｐ１５機能の抑制を表すものであってもよい。
【００２９】
（Ｂ）異所性ＴＥＲＴ遺伝子の発現
実施形態Ｉ−Ａに記載されるように改変された細胞は、ＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ００１０３１００７．１；ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４２０９７２）で改変されてもよい。この後、ＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号６）を導入されたこの集団からの、テロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する前記遺伝子コンストラクトによる遺伝子改変を特徴とする細胞についての、細胞のセレクションが続く。
【００３０】
例示的な実施形態Ｉでは、異所性ＴＥＲＴ遺伝子の発現に、図１に示されるモデルが利用される。特に、図１に示されるモデルは、異所性遺伝子が外来性プロモーターの制御下で発現される本発明での使用に適当であり得る。例えば、本発明に適用される場合、図１に示されるモデルは、導入されたＣＡＧプロモーターからの異所性ＴＥＲＴ遺伝子の発現を表すものであってもよい。
【００３１】
図２に示されるモデルは、内在性遺伝子が外来性プロモーターの制御下で発現される本発明での使用に適当であり得る。例えば、本発明に適用される場合、図２に示されるモデルは、導入されたＣＡＧプロモーターからの内在性ＴＥＲＴ遺伝子の発現を表すものであってもよい。
【００３２】
図３に示されるモデルは、遺伝子発現がその調節配列の標的変異によって変化される本発明での使用に適当であり得る。例えば、本発明に適用される場合、図３に示されるモデルは、内在性ＴＥＲＴプロモーター内のリプレッサー結合部位が変異によって破壊されている、該内在性ＴＥＲＴプロモーターからの内在性ＴＥＲＴ遺伝子の発現を表すものであってもよい。
【００３３】
図４に示されるモデルは、外来遺伝子の発現が該遺伝子の３’末端に挿入された内在性プロモーターの制御下で発現される本発明での使用に適当であり得る。例えば、本発明に適用される場合、図４に示されるモデルは、内在性β−アクチンプロモーターからの外来性ＴＥＲＴ遺伝子の発現を表すものであってもよい。
【００３４】
図５に示されるモデルは、内在性遺伝子の発現が、遺伝子配列を標的とした活性化の繋留により、プロモーターから転写レベルで活性化される、本発明での使用に適合し得る。例えば、本発明に適用される場合、図５に示されるモデルは、ＴＥＲＴプロモーターに標的化されたＣＲＩＳＰＲａによる内在性ＴＥＲＴ遺伝子の誘導を表すものであってもよい。例示的なＣＲＩＳＰＲａ様式として、限定はされないが、単一のｇＲＮＡにより標的遺伝子の調節領域へと標的化されたヌクレアーゼ活性欠失型Ｃａｓ９タンパク質によってもたらされる活性化が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲａの範囲外では、この誘導性改変機構の様式には、遺伝子配列を標的とした活性化の繋留が包含され、例えば、限定はされないが、ヌクレアーゼ活性欠失型ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびヌクレアーゼ活性欠失型転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が包含される。
【００３５】
図６に示されるモデルは、内在性遺伝子の発現が、遺伝子配列を標的とした抑制の繋留により、プロモーターから転写レベルで抑制される、本発明での使用に適当であり得る。例えば、本発明に適用される場合、図６に示されるモデルは、ＣＤＫＮ２Ｂプロモーターに標的化されたＣＲＩＳＰＲｉによる内在性ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子の抑制を表すものであってもよい。例示的なＣＲＩＳＰＲｉ抑制様式として、限定はされないが、単一のｇＲＮＡにより調節領域または調節遺伝子へと標的化されたヌクレアーゼ活性欠失型Ｃａｓ９タンパク質によってもたらされる抑制が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲｉの範囲外では、この抑制性改変機構の様式は、ＤＮＡ配列を標的とした抑制の繋留を包含し、例えば、限定はされないが、ヌクレアーゼ活性欠失型ＺＦＮおよびヌクレアーゼ活性欠失型ＴＡＬＥＮが包含される。
【００３６】
これらの例で使用された方法のさらなる詳細については、下記の材料と方法、パラグラフＣ、Ｇ、ＨおよびＩを参照されたい。なお、前記製造工程は、上記セクションＩ−Ｂに記載の同一の製造工程を用いて、この例示的な実施形態で達成できる。
【００３７】
（Ｃ）食用のバイオマスの製造
一実施形態では、食用バイオマスの製造は４つの工程を含む：（１）ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子座への遺伝子改変および／またはＴＥＲＴの異所性発現を有する、選択を受けた細胞集団を増殖させる工程；（２）増殖させた細胞集団をマスターセルバンクストックインベントリ内で凍結保存および貯蔵する工程；（３）生体外環境でマスターセルバンクストックインベントリから細胞を播種および培養する工程；並びに、（４）培養された食用の細胞バイオマスを回収する工程。
【００３８】
工程１は、ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子座への遺伝子改変を有する、選択を受けた細胞集団の増殖である。前記遺伝子改変を有する選択を受けた細胞集団を、ゼラチン被覆の組織培養処理プラスチック（tissue-culture treated plastic）からなる基板上に、標準的な１０％動物血清含有増殖培地（例えば、限定はされないが、ウシ血清＋基本培地）中に、７．５×１０３細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、５％二酸化炭素、５％酸素雰囲気の条件で培養する。培養物が８０％コンフルエントに到達した場合、細胞を酵素的に解離させ、細胞の増殖分を７．５×１０３細胞／ｃｍ２で播種する。解離後に回収される細胞総数が１．０×１０８細胞を超えるまでこの工程を繰り返す。
【００３９】
工程２は、増殖した細胞集団のマスターセルバンクストックインベントリ内での凍結保存および貯蔵である。細胞を１．０×１０８以上の量で回収する。増殖後、選択した細胞を３００×ｇ、５分間の遠心分離でペレット化する。この細胞ペレットを、標準的な凍結保存培地中に２．５×１０６細胞／ｍＬで懸濁し、クライオバイアル１本当たり１．０ｍＬで分注する。長期保存用に、クライオバイアルを制御冷却容器で１℃／分で−８０℃に冷却し、液体窒素を含むデュワー瓶に移す。細胞ストックがこのバンクから枯渇した場合、残りの細胞バイアルを実施形態Ｉ−Ｂ−１に記載の通りに増殖させ、実施形態Ｉ−Ｂ−２に記載の通りに凍結保存して、マスターセルバンクインベントリを補充および増殖する。
【００４０】
工程３は、生体外環境でのマスターセルバンクからの細胞の播種および培養である。所望の培養規模に基づいて、マスターセルバンクからの一つまたは複数のバイアルを室温まで急速解凍させる。凍結保存培地を５分間の３００×ｇ遠心分離工程によって細胞から取り除く。細胞を標準的な増殖培地中に懸濁し、ゼラチン被覆培養用基板上の標準的な増殖培地中に播種し、回収前の最終継代で、細胞を細胞培養基板上で１００％コンフルエント以上に増殖させること以外は実施形態Ｉ−Ｂ−１の要約の通りに培養する。バイオマス回収のための培養規模を表１に要約する。ここで、推定平均細胞質量は２．０×１０−９グラムであり、推定平均細胞倍加時間は２４時間である。
【００４１】
【表１】
2019501657.tif 000002
【００４２】
表１はバイオマス生産規模での推定培養物収量（Biomass Production Scale Cultivation Yield Estimate）を示している。質量はグラム単位で示される。１バイアルは−２．５×１０６個の細胞に相当する。
【００４３】
工程４は培養された食用細胞バイオマスの回収である。細胞をコンフルエントまで増殖させた後、培地を除去し、接着細胞培養物をリン酸緩衝食塩水でリンスする。次に、コンフルエントな接着細胞バイオマスをスクラッピング用デバイスによって基板から機械的に解離させる。解離したバイオマスを遠心管内に集め、４００×ｇで５分間ペレット化させて余液を除去し、食品配合用に加工する。
【００４４】
＜第二の例示的な実施形態：ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座の遺伝子改変およびＴＥＲＴの異所性発現による複製老化の遅延＞
要約すると、この第二の例示的な実施形態は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号８〜１０）を用いてＣＤＫＮ２Ａの第１エクソンに標的化されたインデル変異を作製するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、ウシ（Bos taurus）骨格筋から単離された初代筋芽細胞集団である後生動物体細胞集団内のｐ１６タンパク質をコードするＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座を破壊する。ウシ（Bos taurus）のＣＤＫＮ２Ａ遺伝子は、ｐ１６をコードする最初のエクソンがＣＤＫＮ２Ａの第２エクソンである、２つの予想スプライスバリアント（ＮＣＢＩ受入番号：ＸＭ＿０１０８０７７５９．２、ＸＭ＿０１０８０７７５８．１）を有している。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座の破壊は単独でも複製的恩恵をもたらすが、同一細胞集団でＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する合成遺伝子コンストラクト（配列番号１１）（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００１０４６２４２．１；ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ５１８８８４）から得られる補助的なテロメラーゼ活性と組み合せて使用された場合、両改変の相乗作用により、いずれか単独の改変よりもさらに改変細胞集団の複製能は増加し得る。ウシ（Bos taurus）種のゲノムは、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がｐ１６をコードする予想転写物（ＮＣＢＩ受入番号：ＸＭ＿０１０８０７７５９．２）を有することを特徴とする。言い換えれば、前記遺伝子改変は、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のエクソン２（すなわち、ｐ１６をコードする遺伝子配列のエクソン１）内の保存ヌクレオチド配列の変異、および、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のエクソン２（すなわち、ｐ１６をコードする遺伝子配列のエクソン１）を標的とするガイドＲＮＡであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製される。予想ｐ１６コード配列内のＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座の破壊は、本願における新規の方法である。これらの例に使用された方法のより詳細な説明については、材料と方法のセクションＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩを参照されたい。
【００４５】
その他の全ての点で、第二の例示的な実施形態は前記第一の例示的な実施形態で要約された方法に従って、以下を含む生体外培養工程で食用バイオマスを製造する：（１）分化時ではなく、増殖時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞周期阻害が無効にされるように、ｐ１５タンパク質を不活性化することによって、複製老化時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞分裂周期進行阻害を非干渉化する工程；（２）機能的ＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現（「ＴＥＲＴの異所性発現」）を指示する遺伝子コンストラクトを後生動物体細胞に形質導入することによりテロメラーゼ活性を維持することで、正常な未改変の後生動物体細胞に典型的な複製老化を低減する工程；（３）ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座変異およびＴＥＲＴの異所性発現を有するセルバンク（「マスターセルバンク」）を維持する工程；（４）生体外環境で前記マスターセルバンクから細胞を培養する工程；並びに、（５）食用に前記培養された細胞バイオマスを回収する工程。
【００４６】
例示的な実施形態ＩＩは、内在性ｐ１６タンパク質の機能を破壊するために、図７に示されるモデルを使用する。例示的な実施形態ＩＩは、異所性ＴＥＲＴ遺伝子の発現のために、図１に示されるモデルを使用する。
【００４７】
＜第三の例示的な実施形態：異所性サイクリン依存性キナーゼおよび異所性ＴＥＲＴの発現による複製老化の遅延＞
大まかに言えば、第三の例示的な実施形態は、サイクリン依存性キナーゼホモログの異所性発現によって、具体的にはＣＤＫ４遺伝子からのＣＤＫ４タンパク質ホモログの異所性発現を指示する遺伝子コンストラクト（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１０６１８）を用いた細胞の改変によって、複製老化時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞分裂周期阻害の、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子による安定化を、抑制する。ＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの過剰発現を指示する遺伝子コンストラクト（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１８８８４）から得られる補助的なテロメラーゼ活性を追加することにより、さらなる恩恵を得ることができる。テロメラーゼタンパク質ホモログの過剰発現は、未改変親集団と比べて、改変細胞集団の複製能を増加させる。
【００４８】
より具体的に１つの実施形態では、ニワトリ（Gallus gallus）を、サイクリン依存性キナーゼ遺伝子からのサイクリン依存性キナーゼタンパク質ホモログの異所性発現を指示する遺伝子コンストラクトを用いて家禽類骨格筋細胞を改変するためのモデルに選び、サイクリン依存性キナーゼ遺伝子からのサイクリン依存性キナーゼタンパク質ホモログの異所性発現を指示する遺伝子コンストラクトを有する細胞のマスターセルバンクストックインベントリを維持した。前記後生動物細胞集団の形質導入は、ウシ（Bos taurus）ＣＤＫ４遺伝子からのＣＤＫ４タンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号１２）（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００１０３７５９４．２；ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１０６１８）を用いたものである。これらの例に使用された方法のより詳細な説明については、材料と方法のセクションＣ、Ｇ、Ｈ、およびＩを参照されたい。
【００４９】
ＴＥＲＴ遺伝子からのテロメラーゼタンパク質ホモログの発現を指示する遺伝子コンストラクト（配列番号１１）を用いての後生動物細胞集団からの食用バイオマスの製造および細胞の改変は、上記の第一の例示的な実施形態に記載の方法に従う。
【００５０】
例示的な実施形態ＩＩＩでは、異所性ＣＤＫ４遺伝子の発現に、図１に示されるモデルが利用される。例示的な実施形態ＩＩＩでは、異所性ＴＥＲＴ遺伝子の発現に、図１に示されるモデルが利用される。
【実施例】
【００５１】
＜材料と方法＞
（Ａ）標的遺伝子座の配列決定
それぞれの種について、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（オメガバイオテック社）を用いて初代細胞の単離物からゲノムＤＮＡを注出する。ニワトリ（Gallus gallus）由来の内在性ＣＤＫＮ２Ｂおよびウシ（Bos taurus）由来の内在性ＣＤＫＮ２Ａを増幅するように設計されたプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅する。
【００５２】
ニワトリ（Gallus gallus）では、配列番号２６〜３１のプライマーを用いて、推定プロモーター領域およびＣＤＫＮ２ＢをＰＣＲ増幅する。プライマー標的の詳細については以下の表２を参照されたい。ウシ（Bos taurus）では、配列番号３２〜４３のプライマーを用いて、推定プロモーター領域およびＣＤＫＮ２ＡをＰＣＲ増幅する。プライマー標的の詳細については以下の表２を参照されたい。
【００５３】
【表２−１】
2019501657.tif 000003
【００５４】
【表２−２】
2019501657.tif 000004
【００５５】
表２はｇＲＮＡ配列およびプライマー配列の詳細を示している。
【００５６】
ゲル電気泳動（１０Ｗ／ｃｍでの１％アガロース泳動）を用いて、ＰＣＲ産物をコンピュータ予想配列サイズと比較した。ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ｂのゲノム配列を決定するために、各々のＰＣＲ産物を、市販の磁気ビーズキットを用いて精製し、Ｓａｎｇｅｒ法で配列決定した。配列決定用プライマーは最初のＰＣＲ産物の増幅に使用されたものと同一である。ＰＣＲプライマーは全て、ニワトリ（Gallus gallus）ＣＤＫＮ２Ｂ（ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿２０４４３３．１）およびウシ（Bos taurus）ＣＤＫＮ２Ａ（ＮＣＢＩ受入番号：ＸＭ＿０１０８０７７５９．２）の参照配列を用いて、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｒ１０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ、Kearse et al., 2012）で利用可能な、Ｐｒｉｍｅｒ３  ２．３．７（Untergasser et al., 2012）の修正版を用いて設計される。各々の種の参照染色体アセンブリ（reference chromosome assembly）（ウシ（Bos taurus）はＮＣＢＩ受入番号：ＡＣ＿０００１６５、ニワトリ（Gallus gallus）はＮＣＢＩ受入番号：ＮＣ＿００６１２７）を用いて、各々の遺伝子の推定プロモーター領域を増幅するプライマーを設計する。
【００５７】
（Ｂ）ｇＲＮＡ設計
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、ウシ（Bos taurus）ゲノム内のＣＤＫＮ２Ａのｐ１６およびニワトリ（Gallus gallus）ゲノム内のＣＤＫＮ２Ｂのｐ１５を破壊する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に好適なｇＲＮＡは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｒ１０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ、Kearse et al., 2012）の「Ｆｉｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｓｉｔｅｓ」機能を用いて設計される。各々の種について、ＮＣＢＩ上の最新の参照ゲノムを用いて、非特異的な作用をふるいにかける：Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ−５．０（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ受入番号：ＧＣＦ＿０００００２３１５．４．）およびＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  ｖ３．１．１（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ受入番号：ＧＣＦ＿０００００３０５５．６）。オフターゲットスコアが９０％を超えるｇＲＮＡのみ合成を検討する。合成のために選択されるガイドＲＮＡ配列には、ニワトリ（Gallus gallus）については配列番号１〜５が、ウシ（Bos taurus）については配列番号８〜１０が含まれるが、これらに限定はされない。各々の選択されたｇＲＮＡ用に、別々のｐＧＳ−ｇＲＮＡベクターが、サードパーティベンダーにより構築、増幅および精製されている。各々のｇＲＮＡプラスミドと同時導入されるｐＳｐＣａｓ９  ＰＸ１６５ベクターも、サードパーティベンダーから供給される。
【００５８】
（Ｃ）合成コンストラクトの設計
ＣＡＧ（Cytomegalovirus, Chicken Beta-Actin, Rabbit Beta-Globulin）調節エレメント（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ、Ｃｏｕｃｈｍａｎ、およびＷｈｉｔｅｆｏｒｄ、２００８）を用いて、全ての導入された合成コンストラクトのロバストな発現が促進される。ニワトリ（Gallus gallus）ＴＥＲＴ参照配列（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００１０３１００７．１）はＮＣＢＩから検索された。各々の転写物バリアント（ＮＭ＿００１０３１００７．１およびＸＭ＿０１５２８２３３４．１）については、コードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）領域を注出して連結し、連結配列にする。次いで、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｒ１０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ、Kearse et al., 2012）で、前記ＣＡＧ調節エレメントを、各転写物バリアントの前記ＣＤＳの５’末端に連結する。完全合成コンストラクトの配列番号６および配列番号７は、商業ベンダーにより構築され哺乳類発現ベクターにクローニングされたものである。ここに記載された戦略は、合成ＴＥＲＴコンストラクトのウシバージョンを作製するのにも使用される。ウシ（Bos taurus）ＴＥＲＴコンストラクト（配列番号１１）は参照配列（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００１０４６２４２．１）を用いて設計する。
【００５９】
ウシ細胞でＣＤＫ４の強い発現を駆動するために、上記の方法を用いて別の合成コンストラクト一式を作製した。ウシ（Bos taurus）ＣＤＫ４参照配列（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００１０３７５９４．２）はＮＣＢＩから検索された。野生型配列および変異型配列の両方について、ＣＤＳ領域を注出して連結し、連結配列にした。合成コンストラクトの配列番号１２は、サードパーティベンダーにより構築および哺乳類発現ベクターにクローニングされたものである。
【００６０】
（Ｄ）ニワトリ（Gallus gallus）ＣＤＫＮ２Ｂまたはウシ（Bos Taurus）ＣＤＫＮ２Ａのインデル変異誘発のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の細胞へのトランスフェクション
標的化されたインデル変異誘発を行うため、プラスミドがコードするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるｇＲＮＡ配列を、トランスフェクション用に合成、増幅、および精製する。プラスミドＤＮＡは、原核細胞系での増幅に必要な調節エレメントを含有する標準的なベクター骨格を有する。各々のプラスミドは、各々の標的細胞集団内で一過性にｇＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質を発現させて、５’調節領域、コード領域、またはそれら両方の内部でインデル変異形成を引き起こすために必要な、調節領域およびコード領域も含有する。
【００６１】
プラスミドＤＮＡコンストラクトの送達は、浮遊液中および接着中の初代細胞単離物に直接送達される、非リポソーム性のＤＮＡ複合体形成トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ、プロメガ社）によって媒介される。トランスフェクトされたプラスミドからの発現に対し、ｐ１５をコードするニワトリ（Gallus gallus）ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子の５’領域またはｐ１６をコードするウシ（Bos taurus）ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の５’領域を標的とするｇＲＮＡを設計する。トランスフェクションは、初代ヒト骨格筋筋芽細胞の標的化された改変のための、ＧｒｕｎｗａｌｄおよびＳｐｅｅｒ（２００７）のプロトコルの修正版を用いて行う（Biochemica 3/2007、２６〜２７頁）。作製したプラスミドＤＮＡは無菌脱イオン水中１μｇ／μＬの作用濃度に希釈する。各々のプラスミドＤＮＡストックを、全ＤＮＡ量が２μｇとなるように、Ｃａｓ９プラスミドＤＮＡ：ｇＲＮＡプラスミドが２：１比となるように分注し、粉砕（trituration）によりよく混合する。全ＤＮＡを無菌脱イオン水中１μｇ／５０μＬの濃度に希釈する。このＤＮＡ混合物にＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを６：２（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ試薬（単位μＬ）：全ＤＮＡ（単位μｇ））の比で添加し、十分に混合する。
【００６２】
この混合物を室温で１５分間保温して、ＤＮＡとの複合体形成を促進する。保温後のＤＮＡ混合物に等量の無菌脱イオン水を加えて希釈する。次に、この反応混合物全てを、浮遊液中の細胞に滴加する。細胞およびＤＮＡ反応混合物を、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気の条件下で１６時間インキュベートする。
【００６３】
標的細胞集団は組織培養用処理プラスチック（６ウェルプレート）上の増殖培地中で維持する。細胞は培地１ｍｌ当たり４×１０５個の細胞密度に維持する。トランスフェクションに先立ち、細胞培地を無菌的に除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄してから、１×解離用試薬（ＴｒｙｐＬＥ、ギブコ社）に３７℃で３分間曝す。等量の増殖培地を添加することで反応を止め、その後穏やかに粉砕する。その後、細胞を０．１％ゼラチン被覆ウェルに移す。この時点で、前記ＤＮＡトランスフェクション反応複合体を添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２の条件で４８時間インキュベートし、４８時間後にさらなる処理と評価を行う。
【００６４】
（Ｅ）ＣＤＫＮ２ＢまたはＣＤＫＮ２Ａを標的とするトランスフェクト細胞の限界希釈
まず、１回のトランスフェクションサイクルを受けた親細胞プールから個々のクローン細胞集団を単離することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡを用いて先にトランスフェクトされた細胞集団を選択する。細胞は限界希釈法を用いて選択する。トランスフェクト細胞を酵素的に解離させて単個細胞浮遊液にする。２×１０４細胞／ｍＬ増殖培地の希釈用ストック（working stock）を、全量５００μＬとなるように作製する。組織培養用処理９６ウェルプレートの各ウェルを０．１％ゼラチンでコートする。ウェルＡ１を除いて、各ウェルに１００μｌの増殖培地を加える。４×１０３個の細胞（２００ｕＬ）を、組織培養用処理９６ウェルプレートの０．１％ゼラチン被覆Ａ１ウェルに無菌的に入れる。ウェルＡ１の半分量（１００μＬ）を直ちにウェルＢ１に移し、十分に混合する。この希釈系列（１：２）をウェルＣ１からＨ１まで繰り返す。細胞が移された後、ウェルＨ１から１００μＬを取り出し廃棄する。１００μＬの無細胞増殖培地をＡ１からＨ１の各ウェルに添加し、十分に混合する。次いで、ウェルＡ１内の半分量をウェルＡ２に移し、十分に混合する。この工程をウェルＡ２からＡ１２まで繰り返す。再度、ウェルＢ１から始めてＢ１２まで続けて、この希釈系列を繰り返す。この工程全体を行Ｃから行Ｈまで繰り返し、プレート全体（９６ウェル全て）に希釈量の細胞を入れる。希釈系列を完了させるために、列１２の各ウェルから半分量（１００μＬ）を取り出し廃棄する。列２〜１２の各ウェルに１００μＬの無細胞増殖培地を各々加えて、プレート上の各ウェルの最終体積を２００μＬにする。個々の細胞コロニーが現われるまで（細胞倍加１０回以上、すなわち１，０２４細胞以上）、プレート全体を３７℃の低酸素下でインキュベートする。１個の単一単離細胞に由来する細胞を含んでいるように見えるウェルを、単一細胞に解離し、０．１％ゼラチン被覆２４ウェルプレートの１つのウェルに１：１継代し、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気の条件下でインキュベートする。９０％コンフルエントになったら、１２ウェルプレート、次に６ウェルプレートへと、細胞を増殖させる。
【００６５】
限界希釈により単離し、６ウェルプレート内で９０％コンフルエントまで増殖させた細胞を、次に、６ウェルプレートに１：４継代する。その後、９０％コンフルエントのウェルをさらなる評価用に処理する。１つのウェルを単一細胞にまで解離させ、洗浄し、３００×ｇで５分間ペレット化する。全細胞ゲノムＤＮＡを単離し定量化する。次に、全ゲノムＤＮＡをＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子座またはＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座のＰＣＲ増幅にかけ、１％アガロースゲル上で１０Ｗ／ｃｍで泳動して分離させる。次に、これらのＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、Ｓａｎｇｅｒ法による配列決定にかける。配列トレースを、前もって確認した野生型の未処理親細胞集団のＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子配列またはＣＤＫＮ２Ａ遺伝子配列と比較する。
【００６６】
（Ｆ）細胞増殖および老化アッセイ（ＥｄＵ法）
次に、ｐ１５機能を標的としたニワトリ（Gallus gallus）ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子の、または、ｐ１６機能を標的としたウシ（Bos taurus）ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の、５’領域にインデル変異形成を示す細胞集団を、標準的なＥｄＵアッセイにより、機能的特徴および表現型的特徴について評価する。正確にインデルにより破壊された遺伝子を有することが確認され、クローン的に純粋な細胞集団を、先のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化を受けておらず、且つ、前記インデル改変細胞と細胞集団倍加数が同じである野生型細胞と同時に、等密度に播種する。各々の細胞型を、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気の条件下で２４時間インキュベートする。この後、標準的なチミジン類似体試薬（ＥｄＵ）を培地に添加し（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  Ａｌｅｘａ  ４８８  ＥｄＵキット、サーモ・フィッシャー社）、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気の条件下で４時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を洗浄、固定、および透過処理し、抗ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  ４８８結合型アジドを用いてプロービングする。標準的なＤＡＰＩ核染色を用いて核の対比染色を行う。次に、細胞を標準的な４８８ｎｍ波長の光の下で励起して可視化する。野生型細胞集団およびＣＤＫＮ２Ｂ／Ａ遺伝子改変型細胞集団のＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８／ＤＡＰＩの比を数量化し比較することで、各細胞群内の増殖集団割合を評価する。集団処理毎の総細胞数および細胞継代数全体で測定された総細胞数の両方における、陽性のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８シグナルは、ＤＮＡ複製が生じていたことを示すものであり、細胞が活発に増殖していることの直接的な尺度となる。連続継代中の増殖能の相対的な維持を定量化および追跡するために、続く集団倍加の間、少なくとも１つの細胞集団が増殖をやめ老化となるまで、この手順を繰り返す。
【００６７】
（Ｇ）異所的プラスミドＤＮＡトランスフェクション法
異所的に発現させるために、研究対象の後生動物に種特異的なＴＥＲＴまたはＣＤＫ４の調節配列およびコード配列（すなわち、「目的遺伝子」）を含むプラスミドＤＮＡコンストラクトを、商業的プラスミド作製サービス、および特有の真核生物抗生物質耐性遺伝子（すなわち、他の常在性の薬剤選択マーカーに特有）を用いて、作製する。本明細書に記載される用途のために、プラスミドＤＮＡは、原核細胞系での増幅に必要な調節エレメントを含有する標準的なベクター骨格を有する。
【００６８】
プラスミドはそれぞれ、各々の標的細胞集団に恒常的に含まれる、ＴＥＲＴタンパク質またはＣＤＫ４タンパク質のいずれかを発現するのに必要な調節領域およびコード領域を含む。プラスミドＤＮＡコンストラクトの送達は、浮遊液中および接着中の初代細胞単離物に直接送達される、非リポソーム性のＤＮＡ複合体形成トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ、プロメガ社）によって媒介される。前記プラスミドは、目的遺伝子および真核生物抗生物質耐性をコードする遺伝子の両方の発現を促進するために必要な調節配列を含む。トランスフェクションは、初代ヒト骨格筋筋芽細胞の標的化された改変のための、ＧｒｕｎｗａｌｄおよびＳｐｅｅｒ（２００７）のプロトコルの修正版を用いて行う（参考文献Biochemica 3/2007、２６〜２７頁）。作製したプラスミドＤＮＡを、ユニークな制限酵素認識部位を利用して、５’調節成分の上流で制限酵素消化する。切断されたプラスミドを未切断または誤切断のプラスミドから単離するため、１０Ｗ／ｃｍでの０．８％アガロースゲル泳動にかけて分離させる。サンプリングされた全てのプラスミドＤＮＡが適切に直線化されたならば、切断されたプラスミドを無菌脱イオン水中１μｇ／μＬの作用濃度に希釈する。２μｇの全ＤＮＡを無菌脱イオン水中１μｇ／５０μＬの濃度に希釈する。このＤＮＡ混合物にＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを６：２（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ試薬（単位μＬ）：全ＤＮＡ（単位μｇ））の比で添加し、十分に混合する。この混合物を室温で１５分間保温して、ＤＮＡとの複合体形成を促進する。保温後のＤＮＡ混合物に等量の無菌脱イオン水を加えて希釈する。次に、この反応混合物全てを、浮遊液中の細胞に滴加する（下記参照）。細胞およびＤＮＡ反応混合物を、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気の条件下で４８時間インキュベートする。
【００６９】
（Ｈ）異所性ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のクローン選択
細胞集団を抗生物質による選択および生存により選択する。Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ：直線化されたＴＥＲＴまたはＣＤＫ４プラスミドＤＮＡ配列中でインキュベートされた細胞から培地を除去し、１×ＰＢＳで洗浄し、新鮮な増殖培地を加える。その後、致死量の抗生物質を培地に加えて細胞クローン選択を開始する。細胞を致死的な抗生物質への暴露の下、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件で、１４日間、インキュベートする。細胞培地を監視し、一定間隔で交換することで、薬剤誘導死による細胞性のデトリタスおよびデブリスを除去する。トランスフェクトされたプラスミドに含まれていた抗生物質耐性遺伝子を有する単一細胞から生じた病的でない（non-morbid）増殖性細胞コロニーを、無菌ｐ２００ピペットチップを用いてピックし、９６ウェルプレートの０．１％ゼラチン被覆ウェルに移す。次に、致死的な抗生物質濃度を有する２００μＬの増殖培地を以前の通りに再添加し、一定の選択圧を維持する。細胞を、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２雰囲気の条件下でコロニーが現われるまでインキュベートする。株化された増殖性のコロニーを次に、単一細胞に解離させ、より大きな表面積のゼラチン被覆ウェル内に、６ウェルプレートの６個のウェル内でコンフルエントとなるまで増殖させる。次に、目的遺伝子含有プラスミドによって標的とされた、生存中の増殖後細胞集団それぞれの、各６ウェルプレートの１つのコンフルエントなウェルを、全ゲノムＤＮＡ単離にかける。全細胞ゲノムＤＮＡを単離し定量化する。次に、全ゲノムＤＮＡを目的遺伝子のコード配列のＰＣＲ増幅にかけ、０．８％アガロースゲル上で１０Ｗ／ｃｍで泳動して分離させる。次に、これらのＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、Ｓａｎｇｅｒ法による配列決定にかける。配列トレースを、野生型の未処理親細胞集団、および種特異的な目的遺伝子配列のコンピュータシミュレーションによる設計と比較する。次に、コンピュータシミュレーションによる予測と一致する目的遺伝子のゲノム配列を示す細胞集団を、機能的特徴および表現型的特徴について評価する。
【００７０】
（Ｉ）ＴＲＡＰを用いるテロメラーゼ機能確認アッセイ
標準的なＴＲＡＰアッセイを用いて、ＴＥＲＴ発現産物の機能評価を行う。ＴＲＡＰ（Telomerase Repeated Amplification Protocol）は以下の方法で行う。ＴＥＲＴコンストラクトを含むことが確認された単離クローン細胞集団を、ＴＥＲＴコンストラクトを含まない細胞（未処理細胞対照）と同時に、等濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気の条件下で８０％コンフルエントまでインキュベートする。次に、細胞を洗浄、収集、ペレット化、および溶解して、細胞内タンパク質画分およびゲノムＤＮＡを集める。このゲノムＤＮＡに対し、必要な試薬および緩衝液を含む市販のＴＲＡＰアッセイキット（ＴＲＡＰｅｚｅ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＥＭＤミリポア社）を用いてＰＣＲ増幅を行う。増幅産物を非変性アクリルアミドゲル上で泳動して、活性テロメラーゼの存在を示すバンドパターン（すなわち、活性テロメラーゼの増加またはその不在と正に相関するラダー状のバンドパターン）を分離する。
【００７１】
＜結論＞
本発明は、複製老化時の網膜芽細胞腫タンパク質による細胞分裂周期進行の抑制を非干渉化するために使用された特定の手法に限定されない。本明細書で名を挙げられたこれらの特定の手法に加えて、他の手法によってもこの抑制は達成可能である。そのような手法の例として以下が挙げられるが、これらに限定はされない：（１）低分子ヘアピン型ＲＮＡによるＲＮＡ翻訳のサイレンシング（図８）；（２）ガイドＲＮＡによって標的化されたヌクレアーゼ活性欠失型Ｃａｓ９による内在性遺伝子発現の改変（図５および図６）；（３）レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、トランスフェクトＤＮＡまたは相同組換えによる遺伝子操作；（４）ＲＢ１遺伝子座からの遺伝子発現を途絶させる図４、図６、図７、および図８にモデル化された方法によるＲＢタンパク質の機能または遺伝子発現の直接標的阻害；（５）ＣＤＫ６およびＣＤＫ２等の野生型サイクリン依存性キナーゼホモログ、並びにＣＫＩ阻害に対して抵抗性であるＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ等の変異型ＣＤＫホモログ（Wolfel et. al., 1995; Science Vol. 269 pp 1281 - 1284）の異所性過剰発現；（６）ｐ１５およびｐ１６の両転写物を種の特徴とする細胞におけるｐ１５およびｐ１６の両機能の同時破壊；並びに、（７）ロイシン−Ｘ−システイン−Ｘ−グルタミン酸を含むペンタペプチドモチーフに相同なモチーフを含む、網膜芽細胞腫ファミリータンパク質を標的とするウイルスタンパク質を用いる、網膜芽細胞腫ファミリータンパク質の機能破壊。
【００７２】
本方法の１つの実施形態により食用の動物バイオマスの培養がなされたが、他の適用としては、革などの織物原料を生産するためのバイオプロセス；並びに、治療用組織（therapeutic tissue）およびワクチンなどの医療用途が挙げられる。さらに、世界的に食肉需要が急増していることから、食肉用の、クローナルな、完全に筋性の不死化された家畜細胞株の資源要求および生態学的影響は、家畜の骨格筋発達機構の理解、家畜の体重増加の向上、獣医学および他の動物応用において、貴重な供給源を提供し得る。また、本発明の範囲内である記述された用途は、以下を包含し、これらを排除せず、且つこれらに限定されないことを理解されたい：（１）農業で普及している動物種に由来しない遺伝的独自性を有する細胞株への応用；および、（２）骨格筋以外の組織の存在論的細胞系譜からの動物バイオマスの生産。
【００７３】
分類群的に、本発明および本方法の範囲には以下が包含される：ニワトリ（Gallus gallus）、シチメンチョウ（Meleagris gallopavo）およびマガモ（Anas platyrhynchos）を含むがこれらに限定はされない、家禽として認められている種、ウシ（Bos taurus）、イノシシ（Sus scrofa）およびヒツジ（Ovis aries）を含むがこれらに限定はされない、家畜として認められている種、並びに、タイセイヨウサケ（Salmo salar）、タイセイヨウクロマグロ（Thunnus thynnus）、タイセイヨウマダラ（Gadus morhua）、アメリカウミザリガニ（Homarus americanus）およびシロエビ（Litopenaeus setiferus）を含むがこれらに限定はされない、海産物として認められている種。
【図１】
2019501657.tif 000005
【図２】
2019501657.tif 000006
【図３】
2019501657.tif 000007
【図４】
2019501657.tif 000008
【図５】
2019501657.tif 000009
【図６】
2019501657.tif 000010
【図７】
2019501657.tif 000011
【図８】
2019501657.tif 000012
【図９ａ】
2019501657.tif 000013
【図９ｂ】
2019501657.tif 000014
【国際調査報告】
2019501657.tif 000015