【手続補正書】
【提出日】平成18年12月6日(2006.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
神経修復を高めるために現在遂行されている可能性を有する新しい研究アプローチは、コンドロイチナーゼＡＢＣを使用した瘢痕組織の消化、嗅神経有髄細胞(Olfactory ensheathing cell)および幹細胞を使用した架橋技術ならびに神経成長を促進するためのタンパク質生長因子を含む。Ｒｈｏ、膜結合グアノシントリスホスファターゼ(ＧＴＰａｓｅ)のような細胞内シグナル伝達物質による神経突起伸長阻害剤の遮断作用が、軸索生長の阻害において重要な手懸かり（link）のように見える。環状アデノシンモノホスフェート(ｃＡＭＰ)はインビトロでミエリンが関与する阻害に勝つことができ、インビボで再生を誘導する。ＮｇＲレセプターのペプチドインヒビター(ＮＥＰ１−４０)を使用して、ラットにおける脊髄傷害後の神経再生および機能回復を誘導する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
全てのヒトに自然に見られるタンパク質に対して産生したモノクローナル抗体は、非−ヒト系、例えばマウスにおいて発現し得る。この直接の結果として、ハイブリドーマとして産生した異種抗体は、ヒトに投与したとき、望ましくない免疫応答を誘発し、これは主に異種免疫グロブリンの定常部分により仲介される。これは、このような抗体の使用を、それらが長期間にわたり投与できないため、明らかに限定する。したがって、ヒトに投与したときに実質的にアロジェニック応答を誘発しそうにない一本鎖、単一ドメイン、キメラまたはヒト化抗体を使用することが特に好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
さらに、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０と解離定数＜１０００nMで結合でき、かつ
・順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む第一抗原結合部位(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域ＣＤＲ１−１１Ｃ７(配列番号８)、ＣＤＲ２−１１Ｃ７(配列番号９)およびＣＤＲ３−１１Ｃ７(配列番号１０)と少なくとも５０％、好ましくは８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である)；および
・順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む第二抗原結合部位(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域ＣＤＲ１'−１１Ｃ７(配列番号１１)、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７(配列番号１２)およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７(配列番号１３)と少なくとも５０％、好ましくは８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である)
結合分子。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本明細書で使用するポリペプチドの機能的誘導体は、本発明のポリペプチドと共通した質的生物学的活性を有する、すなわちヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０と結合する能力を有する分子を含む。機能的誘導体は、本発明のポリペプチドのフラグメントおよびペプチドアナログを含む。フラグメントは、例えば特記した配列の本発明のポリペプチドの配列内の領域を含む。“誘導体”なる用語は、アミノ酸配列変異体、および、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドの、共有結合的修飾を定義するために使用する。例えば軽鎖および重鎖の超可変領域の、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドの機能的誘導体は、好ましくは、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の全体的配列相同性を有し、かつ、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０に結合する能力を実質的に保持する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
天然ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する“相同性”は、本明細書では、
最大相同性パーセントを達成するように、必要であれば、配列を整列し、ギャップを挿入した後の、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。Ｎ−またはＣ−末端伸長も挿入も、同一性または相同性を減少させるものと解釈すべきではない。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは既知である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
したがって、本発明はまた上記のＤＮＡ構築物の少なくとも１つを含む、原核または真核細胞系において複製可能な発現ベクターを提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
解剖学的結果の評価：２つの評価法を使用する：半定量的方法と定量的方法である。発芽および再生の強度の半定量的評価：番号付けした無作為に混ぜた動物の完全な矢状切断シリーズを、以下の定義を使用して損傷の吻側の発芽の再生の存在および密度を評価する：再生する発芽は、離断ＣＳＴから出てくる繊維である；それらは長く、そのコースは異常であり、正常灰白質側枝よりも分枝が少なく、損傷の周りを腹側または横に向かって生長する。再生する発芽はしばしば小さく球根状であり得るか、大きく分枝し得る、成長円錐で終わる。発芽の密度は各動物あたり０−３のスケールで評価する。−長距離の再生：損傷部から尾部脊髄までを貫通できる繊維を、長距離を再生した繊維と見なす。それらの損傷部からの最大距離を測定できるが、小腹側索ＣＳＴからのいくつかの非損傷繊維がしばしば存在するため、最小の距離であることがしばしばである；それらの分枝は再生している軸索のものと混ざり、区別が困難である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
脊髄損傷２週間後、両方の主ＣＳＴを含む約４０％の脊髄Ｔ８部分を、主に背面側半分を破壊する：コントロール動物におけるＣＳＴ追跡は、この路中の中程度の反応性発芽を示す。この現象は、文献で既知の損傷に応答した自発的発芽である。本発明の結合分子で、または本発明の結合分子をポンプ輸送することにより処置した損傷ラットは、損傷部の増進された発芽および傷害された神経突起の傷害された神経突起伸長の再生を示し得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本発明の結合分子は単独で、または他の薬剤と組み合わせてまたは連続的に組み合わせて提供できる。例えば、本発明の結合分子を卒中または脊髄損傷の後に、さらなる神経損傷の遮断と軸索再生の阻害の手段としてコルチコステロイドのようなしかしこれに限定されない抗炎症剤、ＮＧＦ、ＢＤＮＦのような神経栄養因子または他の神経変性疾患様薬剤、例えばExelonTMまたはLevodopaと組み合わせて投与できる。本明細書で使用するとき、２つの薬剤は、２つの薬剤を同時に投与するか、個々に、これらの薬剤が同時に作用するような形式で投与するとき、組み合わせて投与すると言う。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
以下の略語を使用する：
ＥＬＩＳＡ      酵素結合免疫吸着検定法
ＦＡＣＳ        蛍光標示式細胞分取器
ＦＩＴＣ        フルオレッセインイソチオシアネート
ＦＢＳ          ウシ胎児血清
ＨＣＭＶ        ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
ＩｇＧ          免疫グロブリンイソタイプＧ
ＭＡｂ          モノクローナル抗体
ＰＢＳ          リン酸緩衝化食塩水
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
ｇ)３Ｔ３繊維芽細胞およびＣＨＯ延展アッセイ：本３Ｔ３延展アッセイは先に記載(Spillmann AA, Bandtlow CE, Lottspeich F, Keller F, Schwab ME(1998)Identificationおよびcharacterization of a bovine neurite growth inhibitor(bNI-220). J.Biol.Chem. 273:19283-19293)のように行う。ＣＨＯ延展アッセイは本質的に３Ｔ３繊維芽細胞に関するのと同じ方法で行う。簡単に言えば、ＣＨＯ細胞を１：２に分ける。２４時間後、それらをＰＢＳ−ＥＤＴＡ中で３０秒トリプシン処理し、〜８,０００ＣＨＯ細胞を、５、１、０.５および０.２μg／ウェルＮｉＧまたはＮｏｇｏ−６６で予めコートした培養皿に撒く。３０−４５分後、細胞を４％(ｗ／ｖ)ＰＦＡ、５％(ｗ／ｖ)スクロースで固定し、次いでSpillmann et al, (前掲)に記載のように分析する。〜１００細胞を、光学顕微鏡でウェルあたり計数する；延展細胞の基準：(ａ)皿への付着および(ｂ)膜状仮足の指標となる伸長した形態；光学顕微鏡下で延展していない、丸い細胞より暗く、大きく見える細胞である；非延展細胞は、(ａ)皿に付着していないかまたは(ｂ)皿に付着しているが、小さく、丸く、皿につきだした検出可能な膜状仮足がない細胞と考える。延展および非延展細胞の比率を、基層の非許容性の程度と定義する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
ｉ)網膜神経節細胞ストライプアッセイ：本網膜神経節細胞ストライプアッセイを、Vielmetter(Vielmetter J, Stolze B, Bonhoeffer F, Stuermer CA(1990) In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Exp. Brain Res. 81:283-287参照)にしたがい、改変して(Schmalfeldt M, Bandtlow CE, Dours-Zimmermann MT, Winterhalter KH, Zimmermann DR(2000)Brain derived versican V2 is a potent inhibitor of axonal growth. J. Cell Sci. 113:807-816参照)行う。外植片を、４％(ｗ／ｖ)ＰＦＡ、０.１％(ｖ／ｖ)グルタールアルデヒドのＰＢＳ溶液で１０分、ＲＴで固定後に評価する。免疫染色のために、固定した外植片を、１時間、ＲＴでＲＮＯ−遮断溶液(０.５％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ、０.３％(ｗ／ｖ)ＴｏｐＢｌｏｃｋ(Juro Supply)、０.１％(ｗ／ｖ)ＮａＮ３のＰＢＳ溶液)で遮断し、１０分、０.０５％(ｖ／ｖ)Ｔｘ−１００のＲＮＯ−遮断溶液で透過性にし、１分、−２０℃で凍結し、一次抗体(ＮｉＲについてはAS Bianca、Ｎｏｇｏ−Ａ、ＮｉＲ−Ｇ、ＮｉＧ、ＮｉＧ−Ｄ３およびＮｉＧ−Ｄ２０についてはAS Laura、Ｎｏｇｏ−Ｃおよびベータ−Ｇａｌコントロールタンパク質についてはNovagen mAb抗−Ｔ７)とインキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣ−およびＴＲＩＴＣ(ＦＩＴＣ：フルオレッセインイソチオシアネート：ＴＲＩＴＣ：テトラメチルローダミンイソチオシアネート)−結合抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)を外植片に添加する(１：１５０)。サンプルを５０％(ｖ／ｖ)グリセロール、２５mM  ＮａＨＣＯ３、４０mM  ＮａＣｌ、１％(ｗ／ｖ)ｐ−フェニレンジアミン(Sigma)中カバーガラスに載せる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
結果：
ａ)Ｎｏｇｏ−ＡのＮ−末端における２つの領域は、３Ｔ３繊維芽細胞の延展に関して阻害性である：３Ｔ３繊維芽細胞延展の阻害を担うＮｏｇｏ−Ａの領域を同定するために、５０個のＮｏｇｏ欠失構築物ライブラリーを作成し、組み換えタンパク質を細菌中で発現させる(方法１ａ参照)。３Ｔ３繊維芽細胞延展阻害に対する見かけのＥＣ５０は、４００−５００ng／０.１ml  Ｎｏｇｏ−Ａ一晩被覆／培養皿cm２(〜４pmol／cm２)であった。Ｎｏｇｏ−Ａまたはそのフラグメントの８Ｍ  尿素での処置は、阻害活性の著しい減少をもたらし、この構造が重要であることを示唆する。繊維芽細胞延展アッセイでのＮｏｇｏフラグメントの分析は、少なくとも２つのＮｏｇｏ−Ａタンパク質の範囲が新たに培養した繊維芽細胞の延展を阻害し、この２つはＮｉＲ−Ｄ２(ａａ  ５９−１７２)およびＮｉＧ−Ｄ２０(ａａ  ５４４−７２５)であることを明らかにする。ＮｉＧ−領域由来の全てのフラグメントが阻害活性(例えばＮｉＧ−Ｄ４およびＮｉＧ−Ｄ８)を示し、一部ＮｉＧ−Ｄ２０と重複する。高タンパク質濃度でのわずかな阻害活性が、ＮｉＧ−Ｄ６領域中のＮｉＧ−Ｄ１９で観察される。Ｎｏｇｏ−Ｃ、Ｎｏｇｏ−６６およびラットペプチド４(GrandPre et al., 2000により、Ｎｏｇｏ−６６の阻害性領域であるはずであると示されている)は繊維芽細胞延展に阻害性ではない。これらのデータは、３Ｔ３繊維芽細胞におけるＮｏｇｏ−Ａの抗−延展活性が、Ｎ−末端(ＮｉＲ−Ｄ２)に位置する２つの定義された範囲およびタンパク質のＮｏｇｏ−Ａ−特異的部分(ＮｉＧ−Ｄ２０)に帰することを示す。非特異的物理化学的特性(フラグメントの酸性度、プロリンおよびセリン残基による構造的効果)はこの効果の原因ではない。Ｃ−末端ＲＴＮドメインは、繊維芽細胞延展の阻害に関与しない。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
ウェスタン・ブロット分析：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロット分析を先に記載のように行い(Huber AB, Weinmann O, Brosamle C, Oertle T, Schwab ME(2002)Patterns of Nogo mRNA and protein expression indeveloping and adult rat and after CNS lesions. J. Neurosci. 22:3553-3567)、遮断は３％(ｗ／ｖ)Top Block(Juro Supply, Lucerne, Switzerland)で行う。抗体を下記のように希釈する：精製モノクローナル１１Ｃ７またはハイブリドーマ上清１：１５０。二次抗体はＨＲＰ−コンジュゲート抗−マウス((Pierce；１：５０００,)１：５０,０００)である。１１Ｃ７抗体とのハイブリダイゼーションは４℃で一晩行う。検出のためにAmersham PharmaciaのＥＣＬ検出試薬を使用する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
Ｎｏｇｏ−ＡのＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０エピトープは培養オリゴデンドロサイトの細胞表面に存在する：マウス１１Ｃ７  ｍＡｂとインキュベートしたオリゴデンドロサイトの生存培養は、分化オリゴデンドロサイト細胞体およびそれらの放射状突起を染色する。コントロールマウスＩｇＧおよび細胞性タンパク質ＣＮＰａｓｅに対する抗体は生存細胞を染色しない。マウス１１Ｃ７と対応する免疫原性ペプチド(＝ラットＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０配列番号１)とのプレインキュベーションは、背景レベルまで染色を減少させた(競合アッセイ)。細胞表面染色は全ての大きいおよび小突起および細胞体上に存在する。故に、マウス１１Ｃ７  ｍＡｂにより認識される分子のＮｏｇｏ−Ａ特異的部分は、オリゴデンドロサイトの原形質膜上の細胞外空間に暴露される。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
実施例６：ＥＬＩＳＡを使用した、Ｎｏｇｏ−Ａドメインへの１１Ｃ７およびＦａｂの結合
Greiner  ９６ウェルＰＳプレート(#655161)を、０.４−２μg／ml  Ｎｏｇｏタンパク質フラグメントのＰＢＳ(１００μl／ウェル)で被覆し、カバーし、４時間、室温でインキュベーションする。プレートを軽く叩き、２００μl／ウェル遮断緩衝液(ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ)を再び入れ、カバーし、インキュベーションする。１時間、ＲＴまたは一晩、４℃、次いで４回水およびＰＢＳで洗浄する。マウス１１Ｃ７  ｍＡｂまたは１１Ｃ７  Ｆａｂの異なる濃度をＰＢＳ＋２％ＢＳＡ(１００μl／ウェル)で希釈し、２時間、ＲＴまたは一晩、４℃でインキュベートする。洗浄段階を繰り返し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)と結合したヤギ抗−マウスＩｇＧを、ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ／０.１％Nonidet 40(１００μl／ウェル)中の１：５０００(ICN #55550)の希釈で添加し、インキュベートする。２時間、ＲＴまたは一晩、４℃、そして洗浄段階を繰り返す。ＨＲＰ反応を、１００μl／ウェル  ＢＭブルーＰＯＤ(Roche #1484281)を添加により開始し、暗所でＲＴで１５分インキュベートする。Ｈ２ＳＯ４  ５０μl／ウェル  １Ｍを添加してＨＲＰ基質反応を停止し、光学密度を４５０nmに設定したマイクロプレートリーダー(Packard Spectra Count)を使用して測定する。