(57)【要約】  生体粒子の電気特性を測定するためのシステムが説明されている。システムは、限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータと、複数のウェル（１１０）を含む基板を保持するために、前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダとを含む。システムは、さらに、電気化学データを連続的に又は定期的に測定するように構成されている。システムはまた、連続的に又は定期的に測定された電気化学データを基準データと比較しかつ前記比較に基づいて活性化合物を添加する瞬間を決定するための処理手段を含む。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体粒子の電気特性を測定するためのシステムであって、前記システムは、
限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータと、
複数のウェルを含む基板を保持するために、前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダと、を含み、
前記システムは、電気化学データを連続的に又は定期的に測定するように構成され、
前記システムは、前記連続的に又は定期的に測定された電気化学データを基準データと比較しかつ前記比較に基づいて活性化合物を添加する瞬間を決定するための処理手段を含む、システム。
【請求項２】
前記システムは、さらに、前記決められた添加の瞬間に前記ウェル内へ活性化合物を自動的に送達するための送達手段を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記システムは、少なくとも２ディケードの周波数スパンにわたってインピーダンスデータを測定するように適応されており、１ディケード当たり少なくとも２つの測定点が記録される、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
前記処理手段は、前記ウェル内の前記生体粒子で実施された広域スペクトルインピーダンス測定から得られたパラメータ値に基づいて、活性化合物を添加するための前記瞬間を決定するように適用されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
前記広域スペクトルインピーダンス測定は、少なくとも１００Ｈｚ〜５０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１０Ｈｚ〜８０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの周波数範囲にわたるインピーダンス測定と対応する、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記システムは、前記インピーダンスの大きさ並びに位相の双方を含むインピーダンスデータを測定するように適応されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記システムは、溶液中の生体粒子で電気化学データを測定するように適応されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
前記処理手段は、特定の現象に関する情報を得るように適応されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
前記処理手段は、以下の現象：細胞用の化合物の毒性、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）や受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）やイオンチャンネル（ＩＣ）や核内受容体（ＮＲ）などの受容体の活性化及び阻害、信号伝達カスケードの解離、微生物バイオフィルムの形成／阻害／破壊、又はウイルスの侵入モード及び総ウイルス負荷量のうちの１つに関する情報を得るように適応された切り替え可能なモジュールである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記処理手段は、前記ウェルに前記活性化合物を送達するための前記決定された添加の瞬間を考慮して、前記現象に関する前記情報を決定するように適応されている、請求項８又は９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記システムは、さらに、前記インキュベータ内の環境パラメータを感知するための環境パラメータセンサーを含み、前記環境パラメータは、温度、湿度、ＣＯ２レベル、Ｏ２レベル、ｐＨ、塩分濃度、栄養素濃度、及び照度のうちの１つ以上である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記処理手段は、前記環境パラメータを考慮して、前記現象に関する前記情報を決定するように適応されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記システムは、
異なる回路によって異なるウェル又はウェル群を別々に駆動及び／又は読出すための複数の駆動及び／又は読出回路と、
前記複数の駆動及び／又は読出回路を、前記基板の個別のウェル又は異なるウェル群の異なる電極と、前記基板の裏側にあるそれらの異なる電気接続点へ接続することによって、接続するための電気接続手段と、をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記駆動及び／又は読出回路は、前記基板の下側の、前記異なるウェルの下側又は前記異なるウェル群の下側に実質的に位置決めされ、前記基板が前記基板ホルダ内に位置決めされると、電気回路が短くなり、かつ前記異なるウェル又は異なるウェル群と実質的に同じとなり得る、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記駆動及び／又は読出回路は、異なるウェル又は異なるウェル群を時間的に並行して、すなわち同時に読出すように構成されている、請求項１３又は１４に記載のシステム。
【請求項１６】
各駆動及び／又は読出回路は、アナログ・デジタル変換器及びデータ取得部品を含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記システムは、ウェルの電気化学測定データを取得し、かつ前記基板内の別のウェルの較正データを考慮せずに、前記データを処理するように適応されている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
生体粒子の電気特性を測定する方法であって、前記方法は、
限定された環境において、前記生体粒子上で電気化学データを連続的に又は定期的に測定することと、
前記連続的に又は定期的に測定された電気化学データを基準データと比較することと、
前記比較に基づいて活性化合物を添加する瞬間を決定することと、
前記決定された瞬間に前記活性化合物を添加することと、を含む方法。
【請求項１９】
電気化学データを連続的に又は定期的に測定することは、少なくとも２ディケードの周波数スパンにわたってインピーダンスデータを測定し、１ディケード当たり少なくとも２つの測定点が記録されることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
活性化合物を添加する前記瞬間を決定することは、前記ウェル内の前記生体粒子で実施された広域スペクトルインピーダンス測定から得られたパラメータ値に基づく、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記広域スペクトルインピーダンス測定は、少なくとも１００Ｈｚ〜５０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１０Ｈｚ〜８０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの周波数範囲にわたるインピーダンス測定に対応する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
電気化学データを測定することは、前記インピーダンスの大きさ並びに位相の双方を含むインピーダンスデータを測定することを含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法は、特定の現象に関する情報を得ることを含む、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法は、以下の現象：細胞用の化合物の毒性、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）や受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）やイオンチャンネル（ＩＣ）や核内受容体（ＮＲ）などの受容体の活性化及び阻害、信号伝達カスケードの解離、微生物バイオフィルムの形成／阻害／破壊、又はウイルスの侵入モード及び総ウイルス負荷量のうちの１つに関する情報を得ることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法は、前記ウェルに前記活性化合物を送達するための前記決定された添加の瞬間を考慮して、前記現象に関する前記情報を決定することを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法は、前記インキュベータ内の環境パラメータを感知することを含み、前記環境パラメータは、温度、湿度、ＣＯ２レベル、Ｏ２レベル、ｐＨ、塩分濃度、栄養素濃度、及び照度のうちの１つ以上である、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は、前記環境パラメータを考慮して、前記現象に関する前記情報を決定することを含む、請求項２３又は２４に従属する限りは請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法は、異なるウェル又は異なるウェル群を時間的に並行して、すなわち同時に読出すことを含む、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ウェルの電気化学測定データを取得し、かつ前記基板内の別のウェルの較正データを考慮せずに、前記データを処理するための、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
生体粒子の電気特性を測定するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピューティング手段での実行時に、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の方法を実行するように適応されている、コンピュータプログラム製品。
【請求項３１】
付着細胞培養の増殖を監視するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項３２】
浮遊細胞培養の増殖を監視するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞のバイオセンシングの分野に関する。より具体的には、ウェル内にある生細胞で電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）を行うための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
非侵襲的に細胞培養を調査するために、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）が使用される。この目的のために、細胞培養は、底面に２つの電極を有するウェルに入れられて増殖されることが多い。この手法は、概して、細胞増殖の初期段階後に、これらのウェル内の細胞培養に活性化合物を添加することからなる。その瞬間から、応答の時間発展（evolution）が続き、ウェルにある細胞への活性化合物の影響について何かを学ぶ。これは、同様に、活性化合物の作用メカニズムについての情報を提供する。
【０００３】
ウェルで増殖する細胞培養は特有の増殖経路を示し、底部全体に細胞の層が密に詰め込まれている瞬間に最大となる。この増殖経路は、ウェルの幾何学的形状に依存するだけでなく、測定のために細胞を準備し、計数し、かつ与える手順全体に、並びに外部条件、例えば温度、雰囲気組成などにも依存する。そのようなものとして、増殖プロセスの動力学は、各実験で異なり得る。
【０００４】
信頼できる結果を獲得するために、測定の質及び再現性が不可欠である。
【０００５】
細胞培養で測定するための電気化学インピーダンス分光法の信頼性に影響を及ぼす要因の１つは、（潜在的な）活性化合物が細胞培養に添加される正確な瞬間である。活性化合物が添加されるのが早すぎると、増殖動力学（growth kinetics）、及び活性化合物との相互作用が干渉しすぎて、測定の妨害を生じる。他方で、活性化合物の添加が遅すぎると、細胞増殖競合（cell growth competition）に起因して、もはや瀕死の細胞を生じる。
【０００６】
電気化学測定は、一般に、複数のウェルプレートにおいて実施される。異なるウェルでの測定は、ウェル内の電極に基づき、これら電極は、ウェルプレートの１つ又は複数のエッジへのリード線でありかつさらに駆動及び／又は読出回路へのリード線である。ウェルにある電極は、一般に、ウェルの上側にわたって同一であるが、ウェル内の電極をウェルプレートのエッジにある電気接点に接続するリード線は、特にウェルプレート上でのウェルの異なる位置に起因して、幾何学的形状、サイズ及び／又は長さに大きな違いを示す。それゆえ、電極が異なるリード線によってアナライザに接続されている、複数のウェルに頼る試験セットアップは、本質的に、同じプレート上にある異なるウェル間で読取りの可変性を生じてしまう。従って、ウェルプレートの位置に依存するこの可変性は、器械を使用して得られた読取りをさらに不正確にする。これは、装置の読取りの質及び信頼性（reliability）に、それゆえ、個別のウェルで起こるプロセスが特定されかつ定量化され得る、信頼度（confidence）に悪影響を及ぼす。
【０００７】
実際には、インピーダンス測定におけるこの可変性は、現在のところ、ウェルプレート内のいくつものウェルを基準ウェルとして使用することによって、阻止される。これらは、細胞又は活性化合物ではなく、培地のみが充填される。これらのウェルから収集されたデータは、一般に、それに続くデータ分析での較正のために使用され、及びセットアップに存在する細胞又は化合物の挙動の理解を深めるためには、直接的に寄与しない。
【０００８】
細胞培養のインピーダンスは、ウェルのうちの１つにおいてインピーダンスを、１〜１００ｋＨｚの周波数範囲で、交互に測定することによって、決定される。しかしながら、多くの有益な情報が、より低い周波数範囲に含まれている。しかしながら、より低い周波数範囲での測定は、個別のウェルの測定時間が増加することを意味する。そのようなものとして、測定がより低い周波数範囲でも実施される場合には、個別のウェルの培養が続く時間分解能が、劇的に低下される。しかしながら、時間分解能は、添加された化合物との相互作用に関連する生細胞培養において起こる関連の効果を捉えるのに重要であり、それゆえ、定性的データの獲得と時間分解能の最適化との困難な妥協点を導入することになる。結果を明白に解釈するには、高品質な測定を必要とする。測定の質は、部分的には、実験ハードウェアだけでなく、外的影響によっても決定される。データ収集の際、例えば、測定ウェルプレートは、温度、雰囲気などが調整された条件にあるインキュベータ内に置かれている。しかしながら、実際には、インキュベータ内の条件は、実験（温度変動、衝撃など）の過程で変化し得る。これらの影響は、細胞の挙動に影響を及ぼすため、獲得されたデータに変換される。その瞬間から、添加された化合物に対する細胞の応答が、外部条件における変動又は変化に対する細胞の応答に巻き込まれてしまう。これは、データ解釈及び結果の質に悪い方向で著しく影響を及ぼし得るため、回避する必要がある。
【０００９】
上述の問題の１つ以上を解決する電気化学特性評価を実施するためのシステム及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、ロバストであるが高感度のデータ取得に基づいて、例えば細胞、細胞小器官、エキソソーム（exosome）又はウイルスなどの生体粒子の電気化学特性評価を実施するための方法及びシステムを提供することである。
【００１１】
上記の目的は、本発明による方法及び装置によって成し遂げられる。
【００１２】
本発明は、生体粒子の電気特性を測定するためのシステムに関し、このシステムは、限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータと、複数のウェルを含む基板を保持するために、前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダとを含み、システムは、電気化学データを連続的に又は定期的に測定するように構成され、システムは、連続的に又は定期的に測定された電気化学データを基準データと比較しかつ前記比較に基づいて活性化合物を添加する瞬間を決定するための処理手段を含む。
【００１３】
システムは、さらに、決められた添加の瞬間にウェル内へ活性化合物を自動的に送達するための送達手段を含み得る。
【００１４】
システムは、少なくとも２ディケードの周波数スパンにわたってインピーダンスデータを測定するように適応され、１ディケード当たり少なくとも２つの測定点が記録され得る。周波数スパンは、少なくとも５ディケードとし得る。１ディケード当たりに記録される測定点の数は、少なくとも３又は少なくとも４とし得る）。
【００１５】
処理手段は、ウェル内の生体粒子で実施された広域スペクトルインピーダンス測定から得られたパラメータ値に基づいて、活性化合物を添加する瞬間を決定するように適応され得る。
【００１６】
広域スペクトルインピーダンス測定は、少なくとも１００Ｈｚ〜５０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１０Ｈｚ〜８０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの周波数範囲にわたるインピーダンス測定に対応し得る。
【００１７】
システムは、位相角θでの、インピーダンスの大きさ｜Ｚ｜並びに位相Ｑの双方を含むインピーダンスデータを測定するように適応され得る。
【００１８】
システムは、溶液中の生体粒子で電気化学データを測定するように適応され得る。本発明の実施形態の利点は、溶液中の生体粒子が特徴付けられ得ることである。
【００１９】
処理手段は、特定の現象に関する情報を得るように適応され得る。
【００２０】
処理手段は、以下の現象：細胞用の化合物の毒性、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）や受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）やイオンチャンネル（ＩＣ）や核内受容体（ＮＲ）などの受容体の活性化及び阻害、信号伝達カスケードの解離、微生物バイオフィルムの形成／阻害／破壊、又はウイルスの侵入モード及び総ウイルス負荷量のうちの１つに関する情報を得るように適応された切り替え可能なモジュールとし得る。受容体の活性化及び阻害は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、イオンチャンネル（ＩＣ）の、又は核内受容体（ＮＲ）の活性化及び阻害を含み得る。本発明の少なくともいくつかの実施形態の利点は、収集されるデータの質、及び獲得される情報量の双方が、従来のシステムと比較して改良されることである。本発明の少なくともいくつかの実施形態の利点は、コスト並びに測定持続時間が、従来のＥＩＳ測定と比較して削減され得ることである。
【００２１】
本発明の少なくともいくつかの実施形態の利点は、結果の自動解釈が実施され得ることであり、これは、解釈を実施する個人の能力に依存しない。本発明の実施形態の利点は、行われるプロセスに関する結論が、統計学ベースの有意水準を有し得ることである。
【００２２】
本発明の少なくともいくつかの実施形態の利点は、例えば温度変動、衝撃、雰囲気などの環境パラメータが、監視され得、及び獲得された測定結果の解釈に考慮され得ることである。そのようなパラメータは、基板上で又はインキュベータ内で測定され得る。
【００２３】
処理手段は、ウェルに活性化合物を送達するための前記決定された添加の瞬間を考慮して、前記現象に関する前記情報を決定するように適応され得る。
【００２４】
システムは、さらに、インキュベータ内の環境パラメータを感知するための環境パラメータセンサーを含み得、環境パラメータは、温度、湿度、ＣＯ２レベル、Ｏ２レベル、ｐＨ、塩分濃度、栄養素濃度、及び照度のうちの１つ以上である。
【００２５】
処理手段は、前記環境パラメータを考慮して、前記現象に関する前記情報を決定するように適応され得る。
【００２６】
システムは、さらに、異なる回路によって異なるウェル又はウェル群を別々に駆動及び／又は読出すための複数の駆動及び／又は読出回路、前記複数の駆動及び／又は読出回路を、基板の個別のウェル又は異なるウェル群の異なる電極と、基板の裏側にあるそれらの異なる電気接続点に接続することによって、接続するための電気接続手段を含み得る。
【００２７】
駆動及び／又は読出回路は、実質的に、基板の下側の、異なるウェルの下側又は異なるウェル群の下側に位置決めされ得、基板が基板ホルダ内に位置決めされると、電気回路は短くし得、及び異なるウェル又は異なるウェル群と実質的に同じとし得る。
【００２８】
駆動及び／又は読出回路は、異なるウェル又は異なるウェル群を時間的に並行して、すなわち同時に読出すように構成され得る。
【００２９】
各駆動及び／又は読出回路は、アナログ・デジタル変換器及びデータ取得部品を含み得る。
【００３０】
システムは、ウェルの電気化学測定データを取得し、かつ基板内の別のウェルの較正データを考慮せずに、そのデータを処理するように適応され得る。
【００３１】
本発明はまた、生体粒子の電気特性を測定する方法に関し、この方法は、限定された環境において、生体粒子上で電気化学データを連続的に又は定期的に測定すること、連続的に又は定期的に測定された電気化学データを基準データと比較すること、前記比較に基づいて活性化合物を添加する瞬間を決定すること、及び決定された瞬間に活性化合物を添加することを含む。
【００３２】
電気化学データを連続的に又は定期的に測定することは、少なくとも２ディケードの周波数スパンにわたってインピーダンスデータを測定し、１ディケード当たり少なくとも２つの測定点が記録されることを含み得る。周波数スパンは、少なくとも５ディケードとし得る。記録される１ディケード当たりの測定点は、少なくとも３又は少なくとも４とし得る。
【００３３】
活性化合物の添加の瞬間を決定することは、ウェル内の生体粒子で実施された広域スペクトルインピーダンス測定から得られたパラメータ値に基づき得る。
【００３４】
広域スペクトルインピーダンス測定は、少なくとも１００Ｈｚ〜５０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１０Ｈｚ〜８０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの周波数範囲にわたるインピーダンス測定に対応し得る。
【００３５】
電気化学データを測定することは、インピーダンスの大きさ並びに位相の双方を含むインピーダンスデータを測定することを含み得る。
【００３６】
方法は、特定の現象に関する情報を得ることを含み得る。
【００３７】
方法は、以下の現象：細胞用の化合物の毒性、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）や受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）やイオンチャンネル（ＩＣ）や核内受容体（ＮＲ）などの受容体の活性化及び阻害、信号伝達カスケードの解離、微生物バイオフィルムの形成／阻害／破壊、又はウイルスの侵入モード及び総ウイルス負荷量のうちの１つに関する情報を得ることを含み得る。
【００３８】
方法は、ウェルに活性化合物を送達するための前記決定された添加の瞬間を考慮して、前記現象に関する前記情報を決定することを含み得る。
【００３９】
方法は、インキュベータ内の環境パラメータを感知することを含み得、環境パラメータは、温度、湿度、ＣＯ２レベル、Ｏ２レベル、ｐＨ、塩分濃度、栄養素濃度、及び照度のうちの１つ以上である。
【００４０】
方法は、前記環境パラメータを考慮して、前記現象に関する前記情報を決定することを含み得る。
【００４１】
方法は、異なるウェル又は異なるウェル群を、時間的に並行して、すなわち同時に読出すことを含み得る。
【００４２】
方法は、ウェルの電気化学測定データを取得し、かつ基板内の別のウェルの較正データを考慮せずに、そのデータを処理することを含み得る。
【００４３】
本発明はまた、生体粒子の電気特性を測定するためのコンピュータプログラム製品に関し、コンピュータプログラム製品は、コンピューティング手段での実行時に、上述のような方法を実行するように適応されている。
【００４４】
本発明はまた、付着細胞培養の増殖を監視するための、上述のようなシステムの使用に関する。
【００４５】
本発明はまた、浮遊細胞培養の増殖を監視するための、上述のようなシステムの使用に関する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、個別のウェル内の生体粒子の電気特性を測定するための基板に関し、基板は、複数の個別のウェル、少なくとも２つの個別のウェル又は少なくとも２つのウェル群に対し、ウェル内の生体粒子の電気パラメータを電気的に特徴付けるために、ウェル当たり少なくとも２つの電極、各ウェルの電極と基板の裏にある電気接続点との間に、基板を通して導電通路を提供するための導線、及び少なくとも２つの個別のウェル又は少なくとも２つのウェル群を別々に駆動及び／又は読出回路に接続するための電気接続点を含む。
【００４７】
生体粒子は、例えば細胞、細胞小器官、エキソソーム、ウイルスなどとし得る。
【００４８】
本発明の実施形態の利点は、個別のウェルの電極を駆動及び／又は読出回路と接続する電気回路が、例えば長さが、互いにあまり異ならないように作製され得、電気通路の影響の差が小さくされ得かつより正確な測定が獲得され得ることである。
【００４９】
本発明の実施形態の利点は、使用される電気通路の長さが、基板を貫通する導線を提供することによって、及び基板の裏側にある駆動及び／又は読出回路への電気的接続を提供することによって、短くされ得ることである。異なる導線は、基板の長さにわたって延びる必要がないため、異なる導線の長さの違いは、減少され得る。それにより、長さが短いことは、外部雑音を拾う可能性を減少させ、データの品質、従って測定結果を改善することを意味する。
【００５０】
個別のウェルのそれぞれに対して、実質的に個別のウェルの下方に、駆動及び／又は読出回路に別々に接続するための電気接続点が設けられ得る。本発明の実施形態の利点は、異なるウェルが、駆動及び／又は読出回路に実質的に同じ方法で接続され、データの品質を改善し得ることである。
【００５１】
本発明の実施形態の利点は、異なるウェルは、実質的に並行して駆動及び／又は読出され、測定に対する時間分解能のゲインを生じ得ることである。
【００５２】
本発明の実施形態の利点は、駆動及び／又は読出回路に関する回路の違いを補償するためにウェルを較正するために、ウェルがほとんど必要されないか又は全く必要されないことである。後者は、実際の測定により多くのウェルを使用する可能性を生じる。
【００５３】
前記少なくとも２つのウェル群は、隣接するウェルからなる群とし得、１つの群内の隣接するウェル間の距離は、異なるウェル群のウェル間の距離以下である。
【００５４】
本発明の実施形態の利点は、駆動及び／又は読出回路のための回路の長さは、全てのウェルに対して比較的短いことである。
【００５５】
基板は、さらに、環境パラメータを感知するための環境パラメータセンサーを含み得、環境パラメータは、温度、湿度、ＣＯ２レベル、Ｏ２レベル、塩分濃度、栄養素濃度、照明及びｐＨのうちの１つ以上である。
【００５６】
本発明の実施形態の利点は、環境パラメータが、プロセスが実施される条件を制御するために考慮され得ることである。
【００５７】
本発明はまた、例えば電気化学インピーダンススペクトルなどの生体粒子の電気特性を測定するためのシステムに関し、システムは、
−  限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータ、
−  上述のような基板を保持するために前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダ、
−  異なる回路によって異なるウェル又はウェル群を別々に駆動及び／又は読出すための複数の駆動及び／又は読出回路、
−  前記複数の駆動及び／又は読出回路を、基板の個別のウェル又は異なるウェル群の異なる電極と、基板の裏側においてそれらの異なる電気接続点に接続することによって、接続するための電気接続手段
を含む。
【００５８】
さらなる特徴及び利点は、第１の態様に関して説明したような、任意選択的な特徴及び利点と対応し得る。
【００５９】
本発明はまた、個別のウェル内にある、例えば細胞、細胞小器官、エキソソーム又はウイルスなどの、生体粒子の電気特性を測定するための基板に関し、基板は、
複数の個別のウェル、
前記ウェルのそれぞれに対し、ウェル内の生体粒子の電気パラメータを電気的に特徴付けるための少なくとも２つの電極
を含み、
前記基板は、さらに、環境パラメータを感知するための環境パラメータセンサーを含み、環境パラメータは、温度、湿度、ＣＯ２レベル、Ｏ２レベル、ｐＨ、塩分濃度、栄養素濃度、及び照度のうちの１つ以上である。
【００６０】
本発明はまた、例えば細胞、細胞小器官、エキソソーム又はウイルスなどの生体粒子の電気特性を測定するためのシステムに関し、
システムは、
限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータ、
基板を保持するために、前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダ
を含み、
システムは、さらに、基板ホルダ内にある基板上に位置決めされた環境パラメータセンサーから、又はインキュベータ内に設けられた環境パラメータセンサーから、環境パラメータを収集するためのデータ収集手段を含み、環境パラメータは、温度、湿度、ＣＯ２レベル、Ｏ２レベル、ｐＨ、塩分濃度、栄養素濃度、及び照度のいずれかである。
【００６１】
さらなる特徴及び利点は、第１の態様に関して説明したような任意選択的な特徴及び利点と対応し得る。
【００６２】
本発明はまた、例えば細胞、細胞小器官、エキソソーム又はウイルスなどの生体粒子の電気特性を測定するためのシステムに関し、システムは、
限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータ、
基板を保持するために、前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダ
を含み、
システムは、電気化学測定データを受信しかつ特定の現象に関する情報を得るために適応された処理手段を含む。
【００６３】
さらなる特徴及び利点は、第１の態様に関して説明したような任意選択的な特徴及び利点と対応し得る。
【００６４】
本発明はまた、生体粒子の電気特性の測定に基づいて、及び
−  基板で測定された環境パラメータ、又は
−  活性化合物が生体粒子に添加されたときの、決定された瞬間に関する情報
に基づいて、現象の情報を得るためのコンピュータプログラム製品に関する。
【００６５】
現象は、以下の現象：細胞用の化合物の毒性、受容体の活性化及び阻害、信号伝達カスケードの解離、微生物バイオフィルムの形成／阻害／破壊、及びウイルスの侵入モード及び／又は総ウイルス負荷量のうちの１つ以上とし得る。受容体の活性化及び阻害は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、イオンチャンネル（ＩＣ）の、又は核内受容体（ＮＲ）の活性化及び阻害を含み得る。
【００６６】
一態様において、本発明はまた、生体粒子の電気特性を測定するためのシステムに関し、システムは、限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータと、複数のウェルを含む基板を保持するために、前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダとを含み、システムは、少なくとも２ディケードの周波数スパンにわたってインピーダンスデータを測定し、１ディケード当たり少なくとも２つの測定点が記録されるように構成される。周波数スパンは、少なくとも５ディケードとし得る。１ディケード当たり記録された測定点の数は、少なくとも３又は少なくとも４とし得る）。広域スペクトルインピーダンス測定は、少なくとも１００Ｈｚ〜５０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１０Ｈｚ〜８０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの周波数範囲にわたるインピーダンス測定に対応し得る。
【００６７】
システムは、位相角θでの、インピーダンスの大きさ｜Ｚ｜並びに位相Ｑの双方を含むインピーダンスデータを測定するように適応され得る。
【００６８】
システムは、溶液中の生体粒子で電気化学データを測定するように適応され得る。本発明の実施形態の利点は、浮遊状態にある生体粒子が特徴付けられ得ることである。
【００６９】
さらなる特徴及び利点は、第１の態様に関して説明したような任意選択的な特徴及び利点と対応し得る。
【００７０】
本発明はまた、生体粒子の電気特性を測定する方法に関し、方法は、少なくとも２ディケードの周波数スパンにわたって電気化学データを測定し、１ディケード当たり少なくとも２つの測定点が記録されることを含む。周波数スパンは、少なくとも５ディケードとし得る。１ディケード当たり記録される測定点の数は、少なくとも３又は少なくとも４とし得る。測定は、広域スペクトルにわたって実施され得る。広域スペクトルインピーダンス測定は、少なくとも１００Ｈｚ〜５０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１０Ｈｚ〜８０ｋＨｚの周波数範囲、例えば少なくとも１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの周波数範囲にわたるインピーダンス測定に対応し得る。
【００７１】
電気化学データを測定することは、位相角θでの、インピーダンスの大きさ｜Ｚ｜並びに位相Ｑの双方を含むインピーダンスデータを測定することを含み得る。
【００７２】
本発明の特定の及び好ましい態様は、添付の独立及び従属請求項において説明されている。従属請求項からの特徴は、適切なように、特許請求の範囲において明白に説明されるものだけではなく、独立請求項の特徴及び他の独立請求項の特徴と組み合わせられ得る。
【００７３】
本発明のこれらの及び他の態様は、以下説明する１つ又は複数の実施形態から明らかとなり、かつそれらを参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】搭載手段と、感知素子として電極アレイとを含むウェルの前面図又は上面図を示す。
【図２】複数のウェルを含む基板の側面図を示す。
【図３】本発明の実施形態による基板の前側を示す。
【図４】本発明の実施形態による基板の裏側を示す。
【図５】本発明の実施形態による基板の前側の斜視図を示す。
【図６】基板の裏側の斜視図を示す。
【図７】本発明のいくつかの実施形態によるプレートウェルの分解図を示す。
【図８】モジュール式基板及びモジュール式ＣＰＵ用のホルダを含むインキュベータの例示的な実施形態を示す。
【図９】モジュール式ＣＰＵの概略的な実施形態を示す。
【図１０】回路上にＡＤＣ／ＤＡＣを含む、本発明の実施形態によるウェルの側面図を示す。
【図１１】本発明の実施形態の特性を示す、２４時間増殖するように置かれた、２００００個の始原細胞のジャーカット細胞培養のインピーダンススペクトルを３０分毎に記録することによって得られた、１００Ｈｚ〜６０ｋＨｚの｜Ｚ｜の相対標準偏差を示す。
【図１２】本発明の実施形態の特性を示す、２００００個、１００００個及び５０００個の細胞の始原集団でのジャーカット細胞培養の細胞増殖の際の｜Ｚ｜の時間発展を示し、（ａ）は、５０ｋＨｚでの、及び（ｂ）は、２ｋＨｚでの時間発展を示す。
【図１３】本発明の実施形態の特性を示す、２４時間増殖するように置かれた、２００００個の始原細胞のジャーカット細胞培養のインピーダンススペクトルを３０分毎に記録することによって得られた、１００Ｈｚ〜６０ｋＨｚのθの相対標準偏差を示す。
【図１４】本発明の実施形態の特性を示す、５０ｋＨｚでの、２００００個、１００００個及び５０００個の細胞の始原集団でのジャーカット細胞培養の細胞増殖の際のθの時間発展を示す。
【図１５】本発明の実施形態の特性を示す、５０ｋＨｚでの、１０００００個、５００００個及び２５０００個の細胞の始原集団でのＰＢＭＣ培養の細胞増殖の際のθの時間発展を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
図面は、概略的なものにすぎず、及び非限定的である。図面では、要素のいくつかのサイズは、説明のために誇張されており、縮尺通りではないかもしれない。
【００７６】
特許請求の範囲のいずれの参照符号も、範囲を限定するものとはみなされない。
【００７７】
異なる図面において、同じ参照符号が同じ又は類似の要素を指す。
【００７８】
例示的な実施形態の詳細な説明
本発明は、特定の実施形態に関して、及びいくつかの図面を参照して説明されるが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。説明される図面は、概略的にすぎず、及び非限定的である。図面では、要素のいくつかのサイズは、説明のために誇張されており、縮尺通りではないかもしれない。寸法及び相対寸法は、本発明を実施するための実際の縮尺図に対応しない。
【００７９】
さらに、明細書及び特許請求の範囲において、用語第１、第２などは、必ずしも、時間的な、空間的な、ランキングでの、又は任意の他の方法のいずれかでの順序を説明するためではなく、同様の要素を区別するために使用される。そのように使用される用語は、適切な環境下では取り替え可能であり、及び本明細書で説明する本発明の実施形態は、本発明で説明又は図示された以外の他の順序で動作できることを理解されたい。
【００８０】
さらに、明細書及び特許請求の範囲において、用語最上部、下などは、必ずしも、相対位置を説明するためではなく、記述的に使用される。そのように使用される用語は、適切な環境下では取り替え可能であり、及び本明細書で説明する本発明の実施形態は、本発明で説明又は図示された以外の他の向きで動作できることを理解されたい。
【００８１】
特許請求の範囲で使用される用語「含む」は、その後にリストする手段に限定されると解釈されるベきではない；他の要素又はステップを除外しないことに気が付かれたい。それゆえ、述べた特徴、整数、ステップ又は構成要素の存在を、言及したように明記することであると解釈されるが、他の特徴、整数、ステップ又は構成要素、又はそれらの群のうちの１つ以上の存在又は追加を除外するものではない。それゆえ、表現「手段Ａ及びＢを含む装置」の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるべきではない。本発明に対して、装置の唯一の関連の構成要素がＡ及びＢであることを意味する。
【００８２】
本明細書を通して、「一実施形態」又は「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。それゆえ、本明細書を通した様々な個所での語句「一実施形態において」又は「実施形態において」の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指すものではないが、指してもよい。さらに、特定の特徴、構造又は特性は、１つ以上の実施形態において、本開示から当業者に明白であるように、任意の好適な方法で組み合わせられ得る。
【００８３】
同様に、本発明の例示的な実施形態の説明においては、本発明の様々な特徴は、本開示を合理化しかつ様々な発明の態様の１つ以上の理解に役立つようにするために、単一の実施形態、図面、又はその説明にまとめられることがあることを認識されるべきである。しかしながら、開示のこの方法は、特許請求する発明が、各特許請求項において明白に列挙されるよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映するとは解釈されない。むしろ、以下の特許請求の範囲が表すように、発明の態様は、単一の上述の開示の実施形態の特徴の全てにあるわけではない。それゆえ、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、この詳細な説明に明白に含まれ、各特許請求項は、それ自体が本発明の別個の実施形態にある。
【００８４】
さらに、本明細書で説明するいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれる特徴のいくつかを含むが、他の特徴は含まず、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあると意図され、及び当業者に理解されるように、異なる実施形態を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲では、特許請求する実施形態のいずれかを、任意の組み合わせにおいて使用し得る。
【００８５】
本明細書で提供される説明においては、多数の具体的な詳細が説明される。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細が無くても実施され得ることが理解される。他の場合には、周知の方法、構造及び技術は、この説明の理解を曖昧にしないために、詳細には示されていない。
【００８６】
本発明の実施形態において、「基板」に言及する場合、感知素子及びコンテンション手段（contention means）を含む１組の位置を指す。例えば、基板は、単一部片、又は接続可能な部片を含む積重ねプレートを含み得る。基板は、ウェルプレートとし得る。基板はまた、積重ねウェルを含む基板とし得る。
【００８７】
本発明の実施形態において、「感知素子」に言及する場合、試料と相互作用して応答を獲得しかつそれを測定する感知回路の一部又はセルを指す。例えば、本発明を参照して説明される感知素子は、限定されるものではないが、「電極アレイ」を含み、これは、１組の電極、例えば陽極及び陰極を形成する少なくとも２つの電極を含み得る。そのような感知素子は、試料の電気特性、例えば静電容量、インダクタンスなどの測定に好適である。
【００８８】
第１の態様において、本発明は、限定された環境内において、生体試料などの試料で測定、例えば電気化学測定を実施するシステムに関する。システムは、限定された環境内で電気化学測定を実施するためのインキュベータと、複数のウェルを含む基板を保持するための、前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダとを含み、システムは、電気化学データを連続的に又は定期的に測定するように構成されている。システムは、連続的に又は定期的に測定された電気化学データを基準データと比較しかつ前記比較に基づいて活性化合物を添加する瞬間を決定するための処理手段を含む。
【００８９】
それゆえ、システムは、電気化学データを連続的に又は定期的に（例えば動力学に関する見解を得るために、選択された又は予め決められた時間間隔で）測定するように構成されており、及び基準データは、メモリに含まれ得る。これは、例えば、反応を測定している際に活性化合物が添加されるべき時点を、合図するために使用され得る。一態様において、本発明はまた、生体粒子の電気特性を測定するためのシステムに関し、システムは、電気化学データを連続的に測定するように構成されており、システムは、さらに、連続的に測定された電気化学データを基準データと比較しかつ前記比較に基づいて活性化合物を添加する瞬間を決定するための処理手段を含む。後者は好都合である。なぜなら、可能な限り質が高い測定を獲得するために、信頼性を増大させるためにここぞという瞬間に活性化合物を添加することが重要であるためである。信頼性が高いほど、薬品開発プロセスがより最適化され得る。ここぞという瞬間（細胞培養を測定ウェルに添加した後、数時間及び数分で）は、生体粒子のタイプ、実験室の条件、インキュベータのパラメータなどで異なり得る。それゆえ、記録データの起こり得る散乱を低減させるために、本発明の実施形態は、添加の瞬間を決定するためのオンライン測定方法を利用し得る。本発明の実施形態のいくつかの例において、実験の開始からウェル内の生体粒子で実施された広域スペクトルインピーダンス測定から生じるパラメータ値が、添加の瞬間の決定に使用され得る。このパラメータの値は、連続的な、繰り返しの測定によって決定される。その時間における発展は、追跡調査され得、及びその時間発展を説明する曲線が、特定の予め決められた曲線と似ているとき、活性化合物を培養物に添加する理想的な瞬間に達している。換言すると、活性化合物を添加する瞬間は、連続的に又は繰り返し測定された電気特性を基準データと比較することによって、決定され得る。このプロセスは自動化され得る。例えば、システムは、いつ添加するかを自動的に決定するための手段を含み得る。システムはまた、例えばマルチチャンネルピペットなどの送達手段によって、活性化合物を自動的に添加する手段を含み得る。それゆえ、決定された瞬間に、活性化合物は、フィードバックループによって取得機器に接続されている装置によって自動的に添加され得る。あるいは、人間のオペレータに信号が提供されて、それにより、正しい量の化合物を測定ウェルに添加し得る。本発明の実施形態によれば、後続の生体粒子の挙動の分析において、この時点（活性化合物の添加）を、細胞培養に対する化合物の影響の調査のための基準点として利用し得る。そのような実施形態では、異なるウェルのための従来の電気通路を備える従来のウェルプレートが利用され得るが、特性を特徴付けているのは、プロセスが連続的に監視されており、かつそれが、いつ活性化合物が生体粒子に送達されたかを規定するために利用されているということである。決定プロセスにおいて、任意選択的に、環境パラメータを感知するセンサーのデータも考慮され得る。
【００９０】
実例として、本発明の実施形態はこれに限定されるものではないが、システムの標準的及び動作特徴を下記でさらに説明する。図８は、インキュベータ８００を含み得るシステムの例を示し、この内部に基板、例えばウェルプレート８０１が配置され得る。このインキュベータ８００は、コンテンションゾーン（例えばウェル）に含まれるいずれの試料、例えば細胞、細胞小器官、エキソソーム又はウイルスも、制御された条件、例えば温度、湿度及びＣＯ２及び／又はＯ２のレベル、ｐＨ、塩分濃度、栄養素濃度、及び照度下で確実に保たれるようにし得る。これらの要素は、細胞増殖に影響を及ぼすかもしれず、かつまた、細胞と、任意の化合物、例えばウェル内の細胞に添加される活性化合物との間の相互作用に対する影響を有し得る。さらに詳細に述べるように、インキュベータは、環境パラメータを測定する手段、及びこれらを変更及び制御する手段を含み得る。環境センサーは基板の一部とし得ると上述したが、その代わりに又はそれに加えて、そのような環境センサーはまた、システム８００に直接導入されてもよいし、又はその代わりに存在しなくてもよい。
【００９１】
本発明の実施形態によるシステムは、基板を保持するための基板ホルダ８０２を含み得る。例えば、専用の接続部を備えるコネクタ８０４が、一般に、基板８０１と基板ホルダ８０２との間に設けられてもよいし、又は基板ホルダの一部としてもよい。それゆえ、コネクタは、基板への接続専用、及び第１の態様で説明するような基板８０１への駆動／読出信号の提供／獲得専用とし得る。
【００９２】
システムはまた、データを処理するための、中央処理装置（ＣＰＵ）などの処理手段８０３をホスト（host）し得る。処理手段８０３は、論理演算装置８０３としてもよく、及び接続部８０５を介してシステムに接続され得る。下記で詳細に説明するように、処理手段は、いくつかの現象の分析専用としてもよく、及び予め決められた現象の分析を扱うことができるようにするためにシステムを調整するために、ユーザによって交換可能としてもよい。論理演算装置８０３の例示的な実施形態を、図９に示す。第１の構成要素は、記録データを処理しかつ記憶装置９０２に記憶しかつそれを正しいタイムスタンプ及びウェルＩＤに取り付けるデータ処理装置９０１とし得る。記憶装置９０２に記録されたデータは、そのウェル群プレート内の複数のウェルのそれぞれから記録されたデータを含み得る。別の構成要素は、メモリ９０２から、一回の測定からの記録データを検索し、かつ予め規定されたモデルを使用してデータを処理して、測定されるウェルのそれぞれでどのプロセスが行われるかをある程度の信頼度で決定するデータ処理構成要素９０３である。データ処理は、異なる現象の選択及び分析に使用され得る、例えば、細胞用の化合物の毒性、ＧＰＣ受容体の活性化状態、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）や受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）やイオンチャンネル（ＩＣ）や核内受容体（ＮＲ）などの受容体の活性化及び阻害、信号伝達カスケードの解離、微生物バイオフィルムの形成、阻害又は破壊、ウイルスの侵入モード及び総ウイルス負荷量に関する情報を得るようにプログラムされ得るか又は切り替えられ得る。論理演算装置の第４の部分は、この手続きの結果を、画像、テキストデータ、電子信号又は代替手段によってユーザ又は追加的な装置へ出力するインターフェース装置９０４である。他のモジュール、例えばドライバーが、論理演算装置８０３のさらなる実施形態に含まれ得る。
【００９３】
システムは、より一般的には、モジュール式システムとし得、ここでは、異なる組のウェルプレート及び論理演算装置が、各実験の必要性に従って切り替えられて入れ替えられ得る。ホルダと異なる組のウェルプレートとの間の接続部は、互換性があるようにされてもよく、これは、商業的な優位性を示す。
【００９４】
図１０は、さらに、本発明の実施形態の特徴を示す。本発明によるウェルプレート８０１は、コンテンション手段１１０とも呼ばれる複数の個別のウェル、及びコネクタ８０４又はプレート内の個別のウェルからの電気信号をベースユニット８０２へ伝達する他の手段を含み得る。個別のウェルの底部には、１組の２つ以上の電極（金、金メッキ、又は任意の他の好適な材料）を含むアレイ１０５が存在する。信号（例えば電流又は電位）が、ウェルの底部に存在する電極アレイ１０５内の個々の電極の少なくとも２つの間に印加される。これは、例えばウェルプレートの下部に配置される個々のＤＡＣ１００１を使用して行われるが、他の実施形態は、ウェルプレートから離れているＤＡＣを提示してもよい。このＤＡＣは、ウェルプレートの底部に配置される電極アレイ１０５へ、個々の接続点１０１、１０２並びに導電リード１０３、１０４を使用して接続される。同時に、電極アレイの双方の間で生成される、結果として得られる電流（及び／又は電位信号）が、記録され、かつＡＤＣ１００２を使用してデジタル化される。このＡＤＣは、ＤＡＣ１００１と同じハウジング内に配置できるだけでなく、異なるハウジングにも配置できる。ＡＤＣ並びにＤＡＣの双方とも、個別のウェルの真下に配置され得るが、いずれかの又は双方の変換器が離れた箇所にあることも可能である。アナログ及び／又はデジタル信号は、コネクタ８０４を通してクレードルユニット８０２へ、さらにＣＰＵ又は任意の他の論理演算装置へ伝達され得る。印加される信号は、論理演算装置、ベースユニット８０２又はウェルプレート自体のいずれかにおいて生成され得る。
【００９５】
それゆえ、図１０に示すように、駆動及び／又は読出回路は、ウェルプレートがウェルプレートホルダ内に位置決めされているとき、ウェルプレートの下側の、異なるウェルの下側に又は異なるウェル群の下側に位置決めされ得る。電気回路は、短くし得、及び異なるウェル又は異なるウェル群に対して実質的に同じとし得る。
【００９６】
上述の通り、異なるウェル又は異なるウェル群の下側に個々の駆動及び／又は読出回路を設けることによって、異なるウェル又は異なるウェル群は、並行して対処され得る。後者により、測定時間全体を削減する。異なる測定ウェル間でのクロストークが発生しない。
【００９７】
これらの駆動及び／又は読出回路は、異なるウェル又は異なるウェル群を時間的に並行して、すなわち同時に読出すように構成され得る。
【００９８】
好ましい実施形態では、個別のウェル内の生体粒子応答の測定は、データ取得装置と同一の方法で測定ウェルのそれぞれを接続することによって、全く同じ方法で実施され得る。これは、プレート内の個別のウェルの下側にデータ取得エレクトロニクスを配置し、かつそれを全く同じ方法でウェル電極に接続することによって、行われる。
【００９９】
別の態様では、本発明は、基板、例えば、複数の積重ねウェルを含む基板又はウェルプレートなどに関する。基板は、ウェル、又はより一般的には、生体試料などの試料を導入するための、及び電気測定、例えば電気化学測定を実施するためのコンテンション手段を含む。
【０１００】
本発明の実施形態によれば、少なくとも２つの個別のウェル又は少なくとも２つのウェル群では、システムは、ウェル内の生体粒子の電気パラメータを電気的に特徴付けるために、ウェル当たり少なくとも２つの電極と、基板を通って各ウェルの電極間及び基板の裏の電気接続点間に導電通路を設けるための導線と、駆動及び／又は読出回路に別々に少なくとも２つの個別のウェル又は少なくとも２つのウェル群を接続するための電気接続点とを含む。
【０１０１】
基板に使用される特定の材料、又は特定の形状又は数のウェルは、本発明の実施形態に限定されないことが理解される。
【０１０２】
基板の裏に接続点を使用することによって、ウェルのそれぞれに、より均一な電気接続特性が得られ得る。
【０１０３】
実例として、例示的な個別のウェルを図１に概略的に示し、図１は、２つの個々の電極接続点１０１、１０２と、試料１０６の生体粒子、例えば細胞、エキソソーム、ウイルス、細胞小器官などのパラメータ（この場合電気パラメータ）、例えば予め決められた電気パラメータの値、例えばインピーダンス、静電容量、インダクタンス、抵抗などを特徴付けるために、接続点１０１、１０２と感知素子１０５、例えば電極アレイとの間に電気接点を提供する２つの導電リード１０３、１０４とを備えるウェルを含む基板１００の一部を示す。本発明の実施形態によれば、測定データを駆動及び／又は読出すために使用される電気接続点は、基板、例えばウェルプレートの裏側に位置決めされ（この具体的な位置は、図１の概略図には示していないが、別の図面に示されている）、及びこれらは、基板を貫通する導電リードを経由して電極と接続されている。図１に示す特定の例のアレイ１０５は、かみ合い状の電極のアレイであるが、任意の他の好適なアレイを使用してもよい。生体粒子１０６は、ウェル内に位置決めされる測定用電極アレイ１０５上に設けられる。ウェルはまた、一般に、アレイの外部への変位、又は交差汚染を回避するために、直立壁を有する。
【０１０４】
図２は、直立壁１１０を備える複数のウェル２０１を含む例示的な基板１００の断面を示す。各ウェル２０１の底部２０２は、図１の電極アレイを含み得る。他の実施形態は、接続可能なウェルのスタックを含み、それらを通して、導電リードも設けられ得る。
【０１０５】
本発明の実施形態では、導電リード１０３、１０４は、基板の裏にあるさらなる回路、例えば駆動回路、読出、アナログ・デジタル変換器（ＡＤＣ）、デジタル・アナログ変換器（ＤＡＣ）、これらの組み合わせなどと、基板の上部にある感知素子１０５との接続を可能にするために、基板の基板１００を通って基板の裏までの導電通路を提供する。
【０１０６】
図３は、基板３００を上面図で示す。プレート３００の表面は、感知素子１０５を含む複数のウェルで覆われている。例えば、本実施形態では、感知素子１０５は複数の電極アレイとし得る。複数の電極アレイは、例えば図３に示すように行列に、１２×８の行列などに均一に分布され得るが、ウェルは、任意の他の好適な分布（例えば六角形、線形など）及び数でも可能である。各電極アレイは、基板１００を通って図４に示す接続点１０１、１０２に向かう２つの導電リード１０３、１０４に接続される。
【０１０７】
それゆえ、図４は、ウェルプレートの背面図を示す。個々の接続点１０１、１０２は、プレート３００の裏面に示されている。電極アレイ１０５は、ウェルプレートの対向（上側）面に配置されている。導電リードは、基板１００を通した、接続点と電極アレイ１０５との間の電気接点を提供する。
【０１０８】
基板を通したこの接続は、図５において斜視的な上面図に示されている。この図面では、基板１００を透視図で示している。導電リード１０３、１０４は、例えばビアとして、基板の上部及び内部に設けられている。複数の導電リードは、それぞれ同じ長さを有し得る。各電極アレイをさらなる回路に接続するために、異なる長さのワイヤを使用する必要はなく、これにより、空間を削減し及びウェルの密度を高め、並びに導体によって伝えられる信号の差を減少させる。それゆえ、電極アレイが装置のどの位置にあろうと、リードを通る同じ信号の特性は、リードの長さに差が存在しないため、各電極アレイに対して同じである。それゆえ、いずれの駆動又は測定信号も、リードの異なる抵抗率による影響を受けない。並行測定が正確に実施され得、これにより時間を節約し、及び各電極アレイに対する較正の必要性を低減させ得るか又はさらには取り除き得る。
【０１０９】
接続点１０３、１０４のそれぞれは、ウェルのそれぞれに対して、例えば２つの個別のウェル又は２つのウェル群に対して、個別とし得、及びそれらは、実質的に個別のウェルの下側に設けられ得、そこには、別個の駆動回路又は読出回路が設けられ得る。それゆえ、接続点が全ての個別のウェルに設けられるいくつかの実施形態では、ウェルの１つ１つが同じ電気特性（同じ自己インダクタンス、同じ損失、同じ抵抗）を有し、これにより、さらなる回路との非常に均質な接続性を提供し、電子信号及びデータの品質を改善する。
【０１１０】
このようにして、異なるウェルに関する駆動及び／又は読出回路用の回路の差は減少されるか又はさらには回避されるため、較正の必要性を低減させる。従来技術の装置では、正確な測定を実施する場合には、１つ以上のウェルが較正専用である必要があるが、本発明では、それよりも多い、又は全てのウェルが、実際の測定に使用され得る。
【０１１１】
個別のウェル間、又は同じ群内の個別のウェル間の距離は、均一とし得る。感知領域（例えばウェル）と任意のさらなる（駆動及び／又は読出）回路への接続部との間の距離は、全てのウェルに対して同じとしてもよく、及び短くてもよく、例えばプレートの基板１００の幅と同じとしてもよい。図６は、プレートの斜視的な背面透視図を示し、基板１００を通してビアを形成する、導電リードによって感知素子１０５に接続された接続点１０１、１０２を示す。
【０１１２】
いくつかの実施形態では（図示せず）、導電リードは、基板の上部には全く延びていなくてもよい。そのような場合には、リードは、電極アレイ又は感知素子を、基板を通ってプレートの裏側に直接接続し得る。
【０１１３】
プレートは、図２に示すものなどの、窪み、凸状部、又はさらには止まり穴２０１などのコンテンションゾーンを含み得、及び感知素子（例えば電極アレイ）は、これらのゾーンの底部に取り付けられても、取り外し可能に取り付けられても、堆積されても、又は概して配置されてもよい。導電リードは、そのような窪みの底部にある任意の感知素子を１つ以上の接続点に直接接続し得る。
【０１１４】
プレートはまた、実質的に平坦とし得る。プレートは積層プレートとし得る。プレート材料は、ポリマー、ガラス、複合材、テフロン（登録商標）（Teflon）又は半導体材料ベースの基板としてもよいし、又は任意の他の好適な材料で作製されてもよい。
【０１１５】
図７は、本発明の特定の実施形態の分解図を示し、この分解図は、感知層７０１が、電極アレイなどの感知素子１０５を含み、かつさらに導電リード及び接続点を含む、ウェルプレートの底部分を示し、及びウェルの壁を示す。基板の一部は、コンテンションゾーンの機能を果たす複数の構造体、例えばポリマー、ガラス、複合材、テフロン（登録商標）などとし得る複数の中空シリンダーを含む。本発明は、密度及びパッケージングを高めるために任意の他の好適な形状、例えばプリズムを使用し得、及び分布及び形成材料は、各測定ゾーン間の熱的接触を増減させるために選択され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態によれば、基板はまた、温度（例えば熱電対、サーモパイル、赤外線センサーなどによって）、湿度、ＣＯ２含有量、ｐＨ、酸素含有量、栄養素濃度、塩分濃度、照明などを測定するための環境パラメータセンサーを含み得る。それゆえ、１つ又は複数の追加的なセンサーが、基板内の環境パラメータを直接測定し得る。後者は、生物学的粒子が評価される位置の近くのパラメータを決定できるようにするため、好都合とし得る。
【０１１７】
上述の通り、本発明の利点は、基板１００を通して、全てが実質的に同じ長さである導電リードを使用して、全てのセンサーがさらなる読出／駆動回路に接続していることである。いくつものウェルに対する接続点がグループ分けされる場合でも、これらは、本発明の実施形態によれば、電気通路の長さのばらつきが従来のウェルプレートよりも著しく少なくなるように選択される。電気的接続部の長さのばらつきがより少ないため、より正確な測定が得られ得る。異なるウェルに異なる接続点を設けることによって、並行して測定が実施され得る。さらに、電気的接続部の長さが、異なるウェルに対して同様又は同じとし得るため、非常に正確な較正の必要性が低減され得る又は取り除かれ得る。
【０１１８】
第３の態様では、本発明は、限定された環境において、生体試料などの試料で測定、例えば電気化学測定を実施するシステムを含む。システムは、限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータ、及び上述のような基板ホルダを含む。システムはまた、異なる回路によって異なるウェル又はウェル群を別々に駆動及び／又は読出すための複数の駆動及び／又は読出回路を含む。システムはまた、前記複数の駆動及び／又は読出回路を、基板の個別のウェル又は異なるウェル群の異なる電極と、基板の裏側にあるそれらの異なる電気接続点に接続することによって、接続するための電気接続手段を含む。
【０１１９】
本発明の実施形態のさらなる特徴及び利点は、第１の態様の実施形態の特徴及び利点と対応し得る。
【０１２０】
第１の態様、第２の態様及び第３の態様の実施形態では、基板及びシステムは、任意選択的に環境パラメータが感知されかつ考慮されると説明されるが、本発明はまた、一態様において、異なるウェル又はウェル群の電気通路長が従来のウェルプレートから公知であるようなものであるが、基板又はシステムは、環境パラメータを感知するための環境パラメータセンサーで特徴付けられる、基板及びシステムに関する。そのような環境パラメータは、温度、湿度、ＣＯ２レベル、Ｏ２レベル、ｐＨ、塩分濃度、栄養素濃度、及び照度のうちの１つ以上とし得る。システムは、得られた測定値をさらに処理するために、そのような測定された環境パラメータを考慮するように適応され得る。上述の通り、環境パラメータセンサーは、温度センサー、ガス含有量又は組成センサー、湿度センサー、照射センサー、ｐＨセンサー、塩分濃度センサー、栄養素濃度を決定するためのセンサーなどとし得る。１つの特定の例は、熱電対Ｐｔ１００とし得るが、他の感知素子も使用され得る。条件の測定は、好都合なことに、経時変化するインキュベータ内の変化する条件、又は体積部内の基板の位置を取り扱うことができるようにする。システムは、データを収集する期間の前及びその最中の、培養の温度の連続的な又は繰り返しの測定を可能にし得る。好都合には、システムは、インピーダンスデータを記録できるだけでなく、同時に、ウェルプレート内に又はその近くに、又はインキュベータ内に埋め込まれたセンサーを使用して、環境パラメータを測定及び記憶することもできる。その後、この温度データを、記録データの解釈の第２のフェーズにおいて使用する。これは、アルゴリズムへの入力を表し、かつ装置の出力に対する不確実性を低下させる。
【０１２１】
さらに別の態様では、本発明は、生体粒子の電気特性を測定するためのシステムに関し、それにより、システムは、限定された環境において電気化学測定を実施するためのインキュベータと、複数のウェルを含む基板を保持するために、前記インキュベータ内に位置決めされた基板ホルダとを含み、及びシステムは、電気化学測定データを受信しかつ特定の現象についての情報を得るように適応された、切り替え可能又は交換可能な処理手段を含む。それゆえ、システムは、専用の処理手段を使用するように適応されてもよく、ここでは、専用の処理手段は、特定の現象に関する情報を得るように適応されている。このようにして、システムは、専用の処理手段を切り替えることによって、特定の現象を検出するように、簡単に調節されることができる。専用のプロセッサーが設けられ得る異なる現象の例は、細胞用の化合物の毒性、受容体の活性化及び阻害、信号伝達カスケードの解離、微生物バイオフィルムの形成／阻害／破壊、及びウイルスの侵入モード及び／又は総ウイルス負荷量である。本発明の実施形態の利点は、専用の処理手段を使用することによって、生成されたデータ及び分析の精度及び信頼性を高くし得ることである。さらに、いくつかの実施形態によれば、インピーダンスに関する値の時系列を含む時間グラフをもはや提供しないが、生じている現象の決定及びこの決定の重要性を直接提供する装置によって、追加的なロバストネスが得られ得る。これは、機器において得られたＥＩＳ信号の解釈を含むことによって、達成される。
【０１２２】
それにより、ウェルプレートを位置付け、固定しかつそれに接触するために使用される基板ホルダが、全てのタイプの調査に使用され得ることが有利である。しかしながら、この基板ホルダのために、調査される現象のタイプに特有の、特定のＣＰＵユニットが接続される必要がある。そのため、分析される現象を切り替えるためには、単に、別の処理手段が基板ホルダに接続され得る。これにより、研究所に、時間をかけて発展させる柔軟性を与えるだけでなく、例えば薬品開発プロセスに必要とされる熟練したスタッフの量を削減することによる、コスト削減も可能にする。
【０１２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、データ、例えば時系列データの分析は、自動的に実施され得る。これは、様々な広範な調査に関してインピーダンス測定装置がもはや使用できないが、特定のプロセスを特定することに集中する新しい手法によって、可能である。それゆえ、いくつかの実施形態では、システムは、もはや、インピーダンスに関する値の時系列を含む時間グラフを提供せず、単に、生じている現象の性質はなんであるかの決定及びこの決定の重要性を提供する。これは、いくつかの実施形態では、機器において獲得されるＥＩＳ信号（その時間発展）の解釈を含むことによって、達成される。この解釈が外的影響によって曖昧にされることを回避するために、解釈アルゴリズムは、環境パラメータを考慮し得る。そのようなものとして、いくつかの実施形態によれば、システムは、インピーダンスデータを、環境パラメータ及び解釈アルゴリズムにおける両源のデータフィードなどの他のデータと同時に収集して、信頼できる決定を生じるようにする。
【０１２４】
さらに別の態様では、本発明はまた、現象に関する情報を得るためのコンピュータプログラム製品に関する。本発明の実施形態によれば、コンピュータプログラム製品は、生体粒子の電気特性の測定に関する情報、及び以下：基板において測定された環境パラメータ、又は活性化合物がいつ生体粒子に添加されたかを決定した瞬間のうちの少なくとも１つに関する情報を受信するように適応される。コンピュータプログラム製品は、さらに、前記現象に関する情報を得るために前記受信情報を処理するように適応されている。電気特性の測定の際に及び／又は活性化合物の添加の瞬間に存在した環境パラメータを考慮することによって、現象に関するより正確な情報が研究の対象となっている。
【０１２５】
例として、本発明の実施形態はこれに限定されるわけではないが、研究中の現象は、細胞用の化合物の毒性、受容体の活性化及び阻害、信号伝達カスケードの解離、微生物バイオフィルムの形成／阻害／破壊、及びウイルスの侵入モード及び／又は総ウイルス負荷量のうちの１つ以上とし得る。受容体の活性化及び阻害は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、イオンチャンネル（ＩＣ）の、又は核内受容体（ＮＲ）の活性化及び阻害を含み得る。
【０１２６】
コンピュータプログラム製品は、プロセッサーに記憶され得る。そのようなプロセッサーの一構成は、例えば、少なくとも１つの形態のメモリ、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭなどを含むメモリサブシステムに結合された少なくとも１つのプログラマブル・コンピューティング・コンポーネントを含み得る。１つ又は複数のコンピューティング・コンポーネントは、汎用の、又は特殊用途のコンピューティング・コンポーネントとしてもよく、及び装置、例えば、他の機能を実行する他のコンポーネントを有するチップに含まれるようにしてもよいことに留意されたい。それゆえ、本発明の１つ以上の態様は、デジタル電子回路、又はコンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、又はそれらの組み合わせに実装され得る。例えば、上述したような装置又はシステムの機能のそれぞれは、コンピュータ実装ステップとし得る。それゆえ、そのようなプロセッサーは従来技術であるが、上述のような装置又はシステムの機能の態様を実装するための命令を含むシステムは、従来技術ではない。それゆえ、本発明はまた、コンピューティング装置で実行されるときに、本発明による装置又はシステムのいずれかの機能を提供するコンピュータプログラム製品を含む。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、例えば上述のようなシステム又は装置を使用して、生体粒子の電気測定を実施するためにコンピュータプログラム製品を担持するためのデータキャリアに関する。そのようなデータキャリアは、そこに明白に組み入れられたコンピュータプログラム製品を含み得、及びプログラマブル・プロセッサーによって実行される機械可読コードを担持し得る。それゆえ、本発明は、コンピューティング手段での実行時に、上述したような装置及びシステムに関して説明したような機能のいずれかを実行するための命令を提供するコンピュータプログラム製品を担持するキャリア媒体に関する。用語「キャリア媒体」は、プロセッサーに実行用の命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。そのような媒体は、限定されるものではないが、不揮発性媒体、及び伝送媒体を含む、多くの形態を取り得る。不揮発性媒体は、例えば、光又は磁気ディスク、例えば大容量記憶装置の一部である記憶装置を含む。一般的な形態のコンピュータ可読媒体は、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フレキシブル・ディスク又はフロッピーディスク、テープ、メモリチップ又はカートリッジ又はコンピュータが読むことができる任意の他の媒体を含む。様々な形態のコンピュータ可読媒体は、１つ以上の一連の１つ以上の命令を実行用のプロセッサーに搬送することに関与され得る。コンピュータプログラム製品はまた、ネットワーク内の搬送波、例えばＬＡＮ、ＷＡＮ又はインターネットを経由して送信され得る。伝送媒体は、電波及び赤外線データ通信の際に生成されるものなどの音波又は光波の形態を取り得る。伝送媒体は、コンピュータ内にバスを構成するワイヤを含めた、同軸ケーブル、銅線及び光ファイバを含む。
【０１２８】
別の態様では、本発明はまた、生体粒子の電気特性を測定する方法に関する。方法は、限定された環境において、生体粒子上で電気化学データを連続的に又は定期的に測定すること、連続的に又は定期的に測定された電気化学データを基準データと比較すること、前記比較に基づいて活性化合物を添加する瞬間を決定すること、及び決定された瞬間に活性化合物を添加することを含む。
【０１２９】
さらに別の態様では、本発明は、上述のような生体粒子の電気特性を測定する方法を実施するためのコンピュータプログラム製品に関する。
【０１３０】
実例として、本発明の実施形態はこれに限定されるものではないが、例示的な結果を示して、浮遊状態にある細胞の特徴付けの可能性を説明する。
【０１３１】
広域スペクトル電気化学インピーダンス分光法を使用することによって、浮遊哺乳類細胞である本例において、浮遊状態にある細胞の増殖の監視が実施され得ることが分かったことは驚きであった。付着細胞培養のために電気化学インピーダンス分光法を使用して細胞の増殖を監視することは知られているが、これは浮遊細胞構造には当てはまらない。本発明の実施形態によれば、良好な特徴付けは、広帯域スペクトルが記録される場合に決定され得る適切な周波数を使用して、及びインピーダンスの大きさ（｜Ｚ｜）を使用するだけでなく、インピーダンスの位相角（θ）も考慮することによって、実施され得る。これらの値は、下記の式によって定義されるが、位相角は度外視している。
Ｚ＝｜Ｚ｜ｅｉθ
【０１３２】
一般的に、ＥＩＳを使用する付着細胞の増殖の監視は、１０〜５０ｋＨｚの周波数で｜Ｚ｜を使用して行われる。しかしながら、これは、浮遊細胞培養を使用するときには、満足のいく結果を与えない。この理由は、図１１に示すように、１０〜５０ｋＨｚよりも広いインピーダンススペクトルにわたって、増殖の際の｜Ｚ｜の変化を見ることによって、見出され得る。図１１は、２４時間増殖するように置かれた、２００００個の始原細胞のジャーカット細胞培養のインピーダンススペクトルを３０分毎に記録することによって獲得された、１００Ｈｚ〜６０ｋＨｚの間の｜Ｚ｜の相対標準偏差を示す。このグラフから、｜Ｚ｜に対する細胞増殖の最大の影響は、１０〜５０ｋＨｚではなく、２ｋＨｚを下回る周波数に位置付けられることであることが明らかになっている。その結果、伝統的な周波数帯域を使用する測定システムは、最適な周波数範囲を使用して得られるものよりも５分の１まで弱い信号強度を有する。結果として得られる感度の差は、図１２に示されている。ここで、５０ｋＨｚでの｜Ｚ｜の監視は、異なる細胞集団を区別するための十分な分解能を与えないことがはっきりと分かる。２ｋＨｚでは、この区別は、はっきりと目に見える。適切な周波数での｜Ｚ｜の監視は、異なる細胞集団を区別する可能性を与えるが、｜Ｚ｜の挙動は、実際は減少するため、細胞集団の増大に直観的に関連付けられるものではない。
【０１３３】
これは、完全なインピーダンスＺのθ成分を使用することによって、解決され得る。インピーダンススペクトルにわたる増殖の際のθの変化は、図１３に提示されている。図１３は、２４時間増殖するように置かれた、２００００個の始原細胞のジャーカット細胞培養のインピーダンススペクトルを３０分毎に記録することによって得られた、１００Ｈｚ〜６０ｋＨｚの間のθの相対標準偏差を示す。θの場合には、５０ｋＨｚを上回る周波数は、細胞増殖を最も受けやすいものであると特定され得る。これは、図１４に示すように、時間にわたるθの時間発展を生じる。図１４は、５０ｋＨｚでの２００００個、１００００個及び５０００個の細胞の始原集団での、ジャーカット細胞培養の細胞増殖の際のθの時間発展を示す。これは、異なる細胞集団の明白な区別をもたらすだけでなく、増殖する細胞集団と監視したパラメータとの間の直観的な関係を維持もする。同様の結果は、Ｔｏｌｅｄｏ、Ｚ１３８、ＢＶ１７３、ＭＶ−４−１１、ＫＧ１ａ、Ｒａｍｏｓ及びＭｏｌｍ１３細胞株、並びに末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ’ｓ）を使用して得られている。この例として、ＰＢＭＣ’ｓに関する異なる細胞集団に関するθの時間発展は、図１５に示されている。図１５は、５０ｋＨｚでの１０００００個、５００００個及び２５０００個の細胞の始原集団でのＰＢＭＣ培養の細胞増殖の際のθの時間発展を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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