(57)【要約】流体マルチウェルバイオリアクタが、少なくとも数週間および数ヶ月の長い期間にわたる多器官クロストークの生体外調査のためのマイクロ生理学的プラットフォームとして提供される。開示されるプラットフォームは、空気圧で駆動される流体流のためのオンボード圧送、供給源からシンクまでの自己レベリングのための再設計された流出路、非接触内蔵流体レベル感知デバイス、流体流プロファイルおよびパーティション化に対する精密な制御、そしてデイジーチェーン接続および多層積層等の簡易再構成を含む既存のバイオリアクタに優る１つまたはそれを上回る改良で特徴付けられる。プラットフォームは、全身毒性研究ならびに生理学ベースの薬物動態学的かつ薬力学的予測を含む広い範囲の生物医学用途のための好適なマイクロ生理学的相互作用システムにおける複数の器官の培養を支援する。開示されるバイオリアクタを製作するためのプロセスもまた提供される。
2019505214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オンボード圧送システムを伴う流体マルチウェルデバイスであって、
ａ）  第１の板であって、
２つまたはそれを上回るウェルであって、
底面および円周壁によって画定される、各ウェル内の３次元空間と、
各ウェル内の入口および出口と、
を備える、２つまたはそれを上回るウェルと、
前記少なくとも２つのウェル間に位置付けられ、第１のウェルの底面の上方から第２のウェルへの非指向性流体接続性を可能にする画定された幾何学形状を有する、流出路導管と、
前記２つのウェルのそれぞれの入口および出口を通して前記ウェルのうちの少なくとも２つの間に流体接続性を提供する、流路の回路網と、
を備える、第１の板と、
ｂ）取り外し可能な第２の板であって、
それぞれ、前記第２の板の対向する側上に入口開口部および出口開口部を伴う、複数の内部チャネルと、
前記内部チャネルのそれぞれと関連する、前記第２の板の表面上の１つまたはそれを上回る孔と、
を備える、取り外し可能な第２の板と、
ｃ）前記第１の板の流路と前記第２の板の表面上の１つまたはそれを上回る孔との間に位置付けられ、随意に、前記第１の板に接合される、障壁膜であって、
少なくとも部分的に可撓性であり、圧力を前記第２の板の内部チャネルに印加することは、前記膜を移動させ、それによって、前記第１の板の流路の一部を遮断または一掃する、障壁膜と、
を備える、デバイス。
【請求項２】
空気圧式マニホールドをさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記膜は、前記空気圧式マニホールドに接続される、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
マルチウェル細胞培養システムにおける自己レベリング流出路であって、流体の非指向性自己レベルのために前記流出路を横断して毛細管流を引き起こす幾何学形状を備える、流出路。
【請求項５】
段入口幾何学形状を備える、請求項４に記載の流出路。
【請求項６】
流体フィルム途絶を最小限にするためのＶカットを備える、請求項４に記載の流出路。
【請求項７】
供給源ウェルの周囲に半径方向メスニカスピニング溝を備える、請求項４に記載の流出路。
【請求項８】
自発的毛細管流を引き起こすために効果的な、導管に沿って底部に小幅および／または高縦横比の溝を備える、請求項４に記載の流出路。
【請求項９】
前記導管は、流体フィルムを液滴に破断するために、拡大された湾曲面積を備える、請求項８に記載の流出路。
【請求項１０】
前記導管は、前記壁に沿って、かつ行き先ウェルの底部に向かって垂直溝を備え、随意に、逆流およびサイフォニングを防止するために前記導管の出口から十分に位置付けられた前記行き先ウェルの壁の中へのアンダーカットを備える、請求項９に記載の流出路。
【請求項１１】
流体の接着を防止するリングを備える、請求項９に記載の流出路。
【請求項１２】
湿度を維持するために内部湿度センサおよび／または流体モートを備える、細胞を培養するための流体マルチウェルデバイス。
【請求項１３】
流体圧送チャネルと、中央モジュール式ポンプおよびマニホールドとを備える、流体マルチウェルデバイス。
【請求項１４】
脈動流のためのポンプを備える、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
平行な流体チャネルとの組み合わせにおける平滑流のためのポンプを備える、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１６】
１日あたりゼロ〜数百ミリリットルの流速を伴い、随意に、０．１〜１０マイクロリットル／ストロークの制御された体積流束および約０．１Ｈｚ〜２０Ｈｚの周波数を伴う圧送手段を備える、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１７】
酸素もしくは流体レベルセンサまたは流体レベルを判定するための光学的手段を備える、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１８】
流体凝集蓋をさらに備える、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１９】
監視装置として使用するための対称である前面および背面電極コンデンサを備える、請求項１２または１３に記載のデバイス。
【請求項２０】
流体マルチウェルデバイスのための灌流可能取り外し可能足場。
【請求項２１】
単独で、または組み合わせにおいて、請求項１−２０のうちのいずれか１項に記載のデバイス、流出路、または足場のいずれかを備える流体マルチウェルデバイスを備える、システム。
【請求項２２】
前記マルチウェルデバイス内に器官または組織特異的細胞をさらに備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記細胞は、前記マルチウェルデバイスのそれぞれにおいて異なる起源のものである、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
同一のデバイス内に異なる起源の細胞を伴うマルチウェルデバイスを備える、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記細胞は、肝細胞、腸細胞、膵臓細胞、筋細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、多能性細胞、および造血細胞から成る群から選択される、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
請求項１−２５のうちのいずれか１項に記載のデバイスに細胞を播種するステップを含む、細胞を培養する方法。
【請求項２７】
前記細胞に対するその影響を判定するために、前記細胞を作用剤に暴露するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記作用剤を異なる投与量において、異なる投与レジメンにおいて、または１つもしくはそれを上回る他の作用剤との組み合わせにおいて投与し、前記細胞に対するその影響を判定するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記作用剤は、異なる細胞タイプまたは１つもしくはそれを上回る疾患もしくは障害と関連付けられる細胞タイプに投与される、請求項２６−２８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年２月４日に出願された米国仮出願番号第６２／２９１，１０２号、および２０１６年７月７日に出願された米国仮出願番号第６２／３５９，５６７号に基づく優先権および利益を主張しており、これら仮出願は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
連邦政府によって支援された研究または開発に関する陳述
本発明は、国防高等研究計画局Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｇｒａｍおよび国立衛生研究所によってそれぞれ授与された契約Ｗ９１１ＮＦ−１２−２−００３９およびＵＨ３ＴＲ０００４９６の下、政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトの薬物応答の臨床前予測の有効性を改良することが、臨床治験における高コストな失敗を低減させることに対して重要である。複雑な疾患は、多くの場合、局所的および全身性摂動の統合からもたらされる、複数の器官を横断することを含む、全身性調節性回路網の調節不全から生じる。組織間コミュニケーションの不完全な理解は、病状の正確な診断および処置を妨げ得る。ヒトの病態生理学の研究は、ネズミ科モデル等の遺伝的に扱いやすい動物モデルに依拠しているが、これらの動物モデルは、多様な臨床表現型を伴う多遺伝子性かつ多因子性のヒト疾患を再現するために不適正であり得る。
【０００４】
細胞生物学、微細加工、およびマイクロフルイディクスにおける最近の進歩は、より高い予測能力を伴う臨床前アッセイのための根拠を提供し得る、生体機能チップ（ＯＣＣ）として公知である、ヒト器官の機能単位のマイクロエンジニアリングモデルの開発を可能にした。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，１９７，５７５号は、複雑な階層組織または器官構造の播種、付着、および培養のために好適なマイクロマトリクスおよび灌流アセンブリを説明している。Ｉｎｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第８，３１８，４７９号は、マルチウェル板フォーマットにおける培養およびアッセイのために好適な毛細管床の長さスケールにおける灌流を促進するシステムを説明している。
【０００５】
マイクロ生理学的システム（ＭＰＳ）と称されるこれらのプラットフォームは、栄養素輸送および／または機械的刺激の３Ｄ多細胞相互作用ならびに動的調整を再現するために、組織エンジニアリング原理を微細加工またはマイクロ機械加工技法と統合することによって、生理学的機能を模倣するように設計されている（Ｈｕｈ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１２（１２）：２１５６−２１６４（２０１２年）、Ｓｕｎｇ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１３（７）：１２０１−１２１２（２０１３年）、Ｗｉｋｓｗｏ  ＪＰ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  （Ｍａｙｗｏｏｄ）」２３９（９）：１０６１−１０７２（２０１４年）、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  ＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ」１４：２０７−２１０（２０１６年）、Ｙｕ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ」１９（１０）：１５８７−１５９４（２０１４年）、Ｚｈｕ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１６（２０）：３８９８−３９０８（２０１６年））。有意な進歩が、個々のＭＰＳ（例えば、心臓、肺、肝臓、脳）において成されているが（Ｒｏｔｈ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｒｅｖ」６９−７０：１７９−１８９（２０１４年）、Ｈｕｅｂｓｃｈ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ」６：２４７２６（２０１６年）、Ｄｏｍａｎｓｋｙ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１０（１）：５１−５８（２０１０年））、ＭＰＳの相互接続に向けた努力は、依然としてその初期段階にあり、殆どの研究は、主として、基本的生存能力および毒性実証に焦点を当てている（Ｏｌｅａｇａ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｓｃｉ  Ｒｅｐ」６：２００３０（２０１６年）、Ｅｓｃｈ  ＭＢ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１４（１６）：３０８１−３０９２（２０１４年）、Ｍａｓｃｈｍｅｙｅｒ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１５（１２）：２６８８−２６９９（２０１５年）、Ｍａｔｅｒｎｅ  ＥＭ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」２０５：３６−４６（２０１５年）、Ｌｏｓｋｉｌｌ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ」１０（１０）：ｅ０１３９５８７（２０１５年））。しかしながら、毒性ではなく、臨床的有効性の欠如が、第ＩＩ相およびＩＩＩ相の臨床治験（最も高コストな段階）において薬物減少の主な原因として識別された（Ｋｕｂｉｎｙｉ  Ｈによる「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ」２（８）：６６５−６６８（２００３年）、Ｃｏｏｋ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ」１３（６）：４１９−４３１（２０１４年）、Ｄｅｎａｙｅｒ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２（１）：５−１１（２０１４年））。主要な要因は、疾患機構の不完全な理解、予測バイオマーカの欠如、および種間差を含む。標的識別／検証およびバイオマーカ発見のためのヒト向けモデルシステムの必要性に起因して、薬物開発において急を要する満たされていない必要性がある。
【０００６】
より予測可能な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）システムの増加する必要性は、単一のＭＰＳ技術に限定されない。ヒト生理の複雑性は、治療剤および毒素に対する多器官クロストークならびに生理学的応答が、サロゲート信号（例えば、ケモカイン、サイトカイン、成長因子）および循環細胞（例えば、免疫細胞）を介して起こる、マルチＭＰＳプラットフォームにおいて全身レベルでより良好に再現されることができる。Ｓｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、マルチコンパートメントバイオリアクタシステムの薬理学的用途を実証した（Ｓｗｅｅｎｅｙ  ＬＭ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｖｉｔｒ」９、３０７−３１６（１９９５年））。Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、細胞が別個のチャンバ内の３Ｄヒドロゲル中に埋設され、相互作用するＭＰＳシステムのために使用され得る、微小細胞培養アナログ（μＣＣＡ）を示した（Ｓｕｎｇ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」９、１３８５（２００９年））。いくつかのプロトタイプは、ＭＰＳ間コミュニケーションのために重力流を使用する（Ｓｕｎｇ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１０、４４６−４５５（２０１０年））。３ＭＰＳシステムのいくつかのプロトタイプは、気泡トラップを用いたオフプラットフォーム圧送を使用する（Ｓｕｎｇ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」９、１３８５（２００９年）、Ｅｓｃｈ  ＭＢ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１４、３０８（２０１４年））。
【０００７】
毒物学および薬力学的研究は、一般的用途であるが、薬物動態学的研究は、マルチＭＰＳプラットフォームに限定されている。さらに、現在のマルチＭＰＳシステムは、概して、非常に少ない流体体積を用いて動作するための伝統的マイクロ流体チップと関連付けられるクローズドフォーマットを採用する（Ａｎｎａ  ＳＬによる「Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｆｌｕｉｄ  Ｍｅｃｈ．」４８、２８５−３０９（２０１６年））。これらのシステムに関する現在の加工プロセスは、主に、望ましい光学性質のためにＰＤＭＳのようなキャスタブルな弾性ポリマーの使用を要求するが、流体表面相互作用に起因して、薬物および成長因子吸着等が、一般的に存在する（Ｈａｌｌｄｏｒｓｓｏｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｂｉｏｓｅｎｓ．  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．」６３、２１８−２３１（２０１５年））。
【０００８】
本ハードウェアの設計および加工における他の実践的制限もまた、既存のマルチＭＰＳデバイスにおけるロバスト性、長期信頼性、およびカスタマイズの適合性を有意に低減させる。不良なハードウェア設計および構築物は、多くの場合、ウェル間の流体の指向性（ウェル間指向性）およびウェル内再循環に対する制御の不良または欠如をもたらし、流体流の破断、サイフォニング効果、および／または蒸発に起因して、いくつかのウェルを乾燥した状態にする。生理学的に近いスケールにおける培地枯渇および廃棄物除去は、多くの場合、単一通過培地流を要求し、徐放性薬物、薬物代謝物の影響、およびＭＰＳ間コミュニケーションを研究することを困難または不可能にする。マルチＭＰＳデバイスのウェルの中に嵌合するための取り外し可能な挿入物が、いくつかの組織を培養する際に望ましくあり得るが、培養物の灌流を支援するための流体流入とのその適合性が、達成することが困難である。
【０００９】
したがって、複数のモジュール式器官モデルの長期組織培養および簡易アッセイのための統合された流体制御手段を伴う改良された装置を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
流体圧送、レベリング、および感知をバイオリアクタと統合する方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１１】
灌流を支援し、損傷および汚染を引き起こすことなく、細胞および生体材料のオフプラットフォーム播種、単純な操作、ならびにバイオリアクタからの容易な除去を可能にする、開放流体バイオリアクタと適合する挿入デバイスを提供することが、本発明のまた別の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，１９７，５７５号明細書
【特許文献２】米国特許第８，３１８，４７９号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈｕｈ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１２（１２）：２１５６−２１６４（２０１２年）
【非特許文献２】Ｓｕｎｇ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１３（７）：１２０１−１２１２（２０１３年）、
【非特許文献３】Ｗｉｋｓｗｏ  ＪＰ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  （Ｍａｙｗｏｏｄ）」２３９（９）：１０６１−１０７２（２０１４年）、
【非特許文献４】Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  ＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ」１４：２０７−２１０（２０１６年）
【非特許文献５】Ｙｕ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ」１９（１０）：１５８７−１５９４（２０１４年）
【非特許文献６】Ｚｈｕ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１６（２０）：３８９８−３９０８（２０１６年）
【非特許文献７】Ｒｏｔｈ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｒｅｖ」６９−７０：１７９−１８９（２０１４年）
【非特許文献８】Ｈｕｅｂｓｃｈ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ」６：２４７２６（２０１６年）
【非特許文献９】Ｄｏｍａｎｓｋｙ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１０（１）：５１−５８（２０１０年））
【非特許文献１０】Ｏｌｅａｇａ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｃｉ  Ｒｅｐ」６：２００３０（２０１６年）
【非特許文献１１】Ｅｓｃｈ  ＭＢ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１４（１６）：３０８１−３０９２（２０１４年）
【非特許文献１２】Ｍａｓｃｈｍｅｙｅｒ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１５（１２）：２６８８−２６９９（２０１５年）
【非特許文献１３】Ｍａｔｅｒｎｅ  ＥＭ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」２０５：３６−４６（２０１５年）
【非特許文献１４】Ｌｏｓｋｉｌｌ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ」１０（１０）：ｅ０１３９５８７（２０１５年）
【非特許文献１５】）Ｋｕｂｉｎｙｉ  Ｈ，「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ」２（８）：６６５−６６８（２００３年）
【非特許文献１６】Ｃｏｏｋ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ」１３（６）：４１９−４３１（２０１４年）
【非特許文献１７】Ｄｅｎａｙｅｒ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２（１）：５−１１（２０１４年））
【非特許文献１８】Ｓｗｅｅｎｅｙ  ＬＭ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｖｉｔｒ」９、３０７−３１６（１９９５年））
【非特許文献１７】Ｓｕｎｇ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」９、１３８５（２００９年）
【非特許文献１９】Ｓｕｎｇ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１０、４４６−４５５（２０１０年）
【非特許文献２０】Ｓｕｎｇ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」９、１３８５（２００９年）
【非特許文献２０】Ｅｓｃｈ  ＭＢ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１４、３０８（２０１４年）
【非特許文献２１】Ａｎｎａ  ＳＬ．，「Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｆｌｕｉｄ  Ｍｅｃｈ．」４８、２８５−３０９（２０１６年）
【非特許文献２２】Ｈａｌｌｄｏｒｓｓｏｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｏｓｅｎｓ．  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．」６３、２１８−２３１（２０１５年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
マルチウェル細胞培養システム（または生体機能チップデバイス、マイクロフィジオームバイオリアクタ）が、統合された圧送、自発的液体レベリング、およびプログラム可能な薬物／培地投与を提供される。マルチウェル培養システム、すなわち、チップまたはバイオリアクタは、少なくとも３層の構造を含有し、これらは、上部から底部にかけて、（１）下方にウェルに接続される内蔵流体チャネル（例えば、流路）を伴うマルチウェル細胞培養板構築物と、（２）ポンプアクチュエータとしての障壁膜と、（３）圧力および減圧を提示するための空気圧式板とである。異なる実施形態では、膜層は、流体もしくは空気圧側のいずれかの上に接合されるか、または別個の構成要素である。膜層を空気または流体側に接合することは、信頼性を強化し、製造時間およびコストを低減させる。好ましい実施形態では、膜は、空気圧側に接合され、流体層は、片面開放され、洗浄および滅菌をより容易にする。いくつかの実施形態では、流体側上のいかなる接合も、層剥離を排除しない。
【００１５】
減圧または圧力の空気圧制御は、膜を作動させ、これは、流体チャネル上の通過または閉塞、したがって、本システムの流体側上の流体流を制御するための弁のように作用する。細胞培地等の流体は、ウェルのうちの少なくとも１つを充填するように流入され、上側空間内の２つのまたはそれを上回るウェルを接続する受動的自己レベリング流出路が、１つのウェルから別のものへの過剰な流体の移送を可能にする。ウェル内または２つのウェル間の再循環が、付加的ポンプを通して能動的に可能にされる。
【００１６】
本システムは、チップ上にモデル化された生体機能チップの動作性および性能を改良するために、以下の特徴のうちの１つまたはそれを上回るものを組み合わせる。一方向性流および抗サイフォン能力を助長するように画定される幾何学的配列を有する、流出路。流出路の入口、導管、および／または出口における１つもしくはそれを上回る特徴は、ＭＰＳチャンバ内の流体量の一方向性自己レベリングのための流出路を横断する自発的毛細管流を確実にするように提供される。いくつかの実施形態は、流体フィルム途絶を最小限にするために、段またはＶカットを排除する入口幾何学形状を提供し、供給源ウェルの周囲に半径方向メニスカスピニング溝を含み、溝は、流体メニスカスを「ピニング」することが可能であり、規定された流体高をエネルギー的に好ましくする。
【００１７】
いくつかの実施形態は、導管に沿って底部に小幅（例えば、３ｍｍを下回る）の高縦横比の溝を有し、自発的毛細管流、したがって、供給源ウェルから行き先ウェルへの過剰な流体のレベリングを可能にする、流出路導管を提供する。いくつかの実施形態は、流出路導管の端部における溝が拡大された湾曲面積に遭遇し、流体フィルムを薄くし、それによって、これを重力に起因して合体および落下する液滴に破断する出口幾何学形状を提供する。別の実施形態では、流出路の出口において、壁に沿って、かつ行き先ウェルの底部に向かって垂直溝が存在する。いくつかの実施形態は、加えて、行き先ウェルの壁の中へのアンダーカットを提供し、このカットは、導管の出口の下方のある程度の距離にあり、サイフォニング効果に起因する逆流を防止する。これらの特徴は、一方向性流における自己レベリング流出路を可能にし、供給源ウェルまたは導管内の流動の破断および過剰蓄積を防止する。
【００１８】
随意に、内部湿度リザーバまたは蒸発対抗モートと結合され、多器官ＭＰＳプラットフォームは、長期の、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６週間、または少なくとも１、２、３ヶ月にわたる機能性器官様組織の培養を可能にする。
【００１９】
オンボード圧送システム（例えば、内蔵流体圧送チャネル）は、管類の必要性を排除するが、モジュール式圧送は、外部流を駆動するように構成されることができる。フェルール接続が、内蔵ポンプを外部管類とインターフェースさせるために使用され、圧送マニホールドがコンパクトな包装内で同時に多数の流動を駆動することを可能にし得る。
【００２０】
単一のマルチチャンバユニット圧送システムに加えて、二重圧送システムが、脈動流だけではなく、また、平滑流量プロファイルを可能にする。三重圧送システムまたはより並列のチャネルがさらに、流動の平滑度を増加させ得る。
【００２１】
プラットフォーム上のウェルの中に嵌合するための取り外し可能であるが潅流を可能にする足場が、提供される。統合可能な特徴がバイオリアクタにおける灌流プロセスに関与することを可能にしない従来の取り外し可能挿入物とは異なり、足場は、細胞培養物がオンプラットフォームで灌流され、オフプラットフォームで処理されることを可能にする。足場は、随意に、非接触酸素（Ｏ２）感知のための流体凝集蓋を含有し得る。
【００２２】
非接触流体レベリング感知のための１つまたはそれを上回る手段が、提供される。対称である前面および背面電極設計を伴うコンデンサが、ウェルの壁内からのウェル内の流体レベルの正確な測定を提供し、直接接触、電気化学的反応、および潜在的な汚染を回避する。
【００２３】
２つまたはそれを上回る多器官バイオリアクタが、バイオリアクタの空気圧式板の本体を通過する内部チャネル（例えば、空気作動ライン）の貫通設計に起因して、デイジーチェーン接続され得る。２つまたはそれを上回るバイオリアクタはまた、空間を節約するために積層され得る。積層構成に関する空気圧式ラインおよび流体接続レイアウトが、提供される。
【００２４】
プラットフォームは、好ましくは、吸着に起因する生化学的因子の損失を最小限にする材料から加工される。いくつかの実施形態では、上部流体板は、ポリスルホンから加工される。いくつかの実施形態では、上部流体板は、ポリスチレンから加工される。いくつかの実施形態では、空気圧式板は、アクリル材料から加工される。いくつかの実施形態では、作動膜は、ポリウレタンから加工され、代替として、エラストマが、ポリウレタン膜に取って代わるために、区分においてマルチチャンバ圧送ユニット上に配置される。
【００２５】
生体機能チップは、肝臓組織等の機能性組織の延長された３Ｄ培養を達成するために、オンボード空気圧式マイクロ流体圧送を有する。オンボード圧送技術は、過剰な管類と関連付けられる空間、補助機器、および死容積を最小限にする。本多器官プラットフォームは、約０．０１Ｈｚ〜２０Ｈｚの周波数において、ストロークあたり０．１〜１０マイクロリットル等、制御された体積流束を伴う１日あたり０〜数百ミリリットルの広い範囲の流速に対する精密な流速制御のための決定的圧送を特徴とし、各ＭＰＳ内での培地の制御された再循環ならびに制御された「全身性」循環を提供する。
【００２６】
プラットフォームは、異なるタイプのマイクロ組織を格納するように設計されるチャンバを伴う典型的なマルチウェル板と類似する占有面積を有する。個々の組織コンパートメントは、栄養素再循環を提供するために、その独自のＭＰＳ内ポンプを具備し、レベル制御のために受動的流出路を介してミキサに流体的に接続される。１つの器官の培養は、本プラットフォームを用いて（例えば、他のウェルに由来する灌流および薬物添加の利益によって）実行可能であるが、本ハードウェアは、２方向、３方向、４方向、およびＮ方向相互作用（Ｎ＞＝２）を含む複数の用途を、混合チャンバから異なる組織までの流速および流動パーティション化のユーザ定義された制御と適応させるように再構成され、生理学的に関連する循環を再現することができる。
【００２７】
多方向ＭＰＳインタラクトームの検証もまた、提供される。「Ｍ−Ｗ  ＭＰＳ」は、それによって、各個々のマイクロ生理学的システムが、その独自の内部循環を有し、本プラットフォーム上の他のＭＰＳユニットから独立して酸素供給および混合ならびに機械的刺激を制御する構成を指す。各ＭＰＳは、中央循環流回路を介した、または直接接続を介した制御された様式で、他のＭＰＳユニットに流体的に接続される。例えば、腸モジュールは、トランスウェル膜の真下に流体を混合するための内部循環を有し、中央循環流からの流動を受容し、次いで、その流出物は、直接肝臓に向かう。肝臓モジュールは、その独自の内部循環流を有し、腸、膵臓、および中央循環流からの流動を受容する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、オンボード圧送システムを伴うマルチウェルデバイス内の構成要素の例示的図である。流体板１００は、トランスウェル１１０１等の挿入物を用いて嵌合され得る２つまたはそれを上回るウェルと、ウェルのうちの少なくとも２つの間に流体接続性を提供する流路１０１と、第２の板２００との取付のためのピン孔またはスロット１０２とを含有する。第２の板２００（例えば、空気圧式板）は、それぞれ、第２の板２００の対向する側上に開口部２１０（入口開口部および出口開口部）を伴う、いくつかの内部チャネル（すなわち、空気作動ライン）を含有する。第２の板の表面上には、流体板１００の流路１０１の形状、曲がり、および長さに対応する、１つまたはそれを上回る突出特徴２０１がある。これらの突出特徴は、内部チャネルのそれぞれに関連する孔を有し、したがって、圧縮された空気または減圧が、内部チャネルを通して空気圧式板の表面上の孔に分配される。空気圧式板はまた、流体板との取付のためのスロット２０２を有する。ステンレス鋼ねじが、層をともに、伝統的なＮウェル板のように取り扱われ得る単一のユニットに締結する。
【００２９】
【図２】図２は、空気圧式板２００の内部チャネル（すなわち、空気作動ライン）の開口部２１０におけるデイジーチェーン接続された２つのデバイスを示す概略図である。流体板１００（板蓋１２００を伴う）は、空気圧式板２００と組み立てられる。
【００３０】
【図３Ａ】図３Ａは、細胞培養物および／または混合培地のためのウェル１０３を有し、トランスウェル挿入物１１０１がウェルの中に嵌合される、組み立てられた７方向デバイスの概略図を示す。流体板の流路と流体接続する２つのポート１０５が、流体のインポートおよび／またはエクスポートのための外部流体容器と接続するために使用され得る。
【００３１】
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに対応する７方向プラットフォーム上に配置されるべき器官およびその上の器官間の流動指向性を示すマップである。
【００３２】
【図４】図４は、７方向デバイスの空気圧式板の上面図の概略である。板は、整合のための整合ピン２０３と、流体板との取付のためのスロット２０２とを有する。板は、複数の場所において、３チャンバユニット２２０ａ、２２０ｂ、および２２０ｃのセットを表す、３つの孔のセットを有する表面上に突出特徴２０１を有する。これらの３チャンバユニットの３つのセットは、空気圧式板の対向する側上に入口および出口開口部２１０ａおよび２１０ｂを伴う３つの内部チャネル（すなわち、空気作動ライン）と空気／圧力接続する。これらの３チャンバユニットの３つのセットのそれぞれの中間孔／チャンバは、同一の内部チャネル（すなわち、空気作動ライン）を共有するように位置付けられる。これらの３チャンバユニットの３つのセットのそれぞれの中間孔／チャンバの同一側（すなわち、左または右側）上の孔／チャンバは、別の同一の内部チャネル（すなわち、空気作動ライン）を共有するように位置付けられ、本デバイスの空気圧で作動される流動制御の複雑性を低減させる。流体板のウェルおよび流出路導管１２１の対応する位置もまた、ここで、空気圧式板上に示される。
【００３３】
【図５】図５は、腸−肝臓−肺−子宮内膜４方向プラットフォームの断面側面図を示す概略である。矢印は、流体流の方向を表し、流体は、ウェル内の入口１１１ａを介して腸ウェル１０３ｄの中に圧送され、ある高さを上回る過剰な流体は、流出路導管１２１を通して、酸素供給尾部１０３ｃを含有する肝臓ウェル１０３ｂに流出される。腸ウェルはまた、入口１１１ａを用いた流体の潜在的同一ウェル再循環のために、ウェル内に出口１１１ｂを有する。ミキサ／混合ウェル１０３ａからの流体は、流路を通して、子宮内膜ウェル１０３ｅおよび肺ウェル１０３ｆを含む細胞培養ウェルに流動する。板はまた、蒸発に対抗するためのモート１０４を有する。
【００３４】
【図６】図６は、２方向構成において動作する４方向プラットフォーム上の各ウェルの流動指向性および細胞培養タイプを示す図である。
【００３５】
【図７】図７は、１器官構成において動作する４方向プラットフォーム上の各ウェルの流動指向性および機能を示す図である。
【００３６】
【図８】図８は、２方向構成における各ウェルの流動指向性、流動パーティション化、および細胞培養タイプを示す図である。
【００３７】
【図９】図９は、別の４方向プラットフォーム上の各ウェルの流動指向性、流動パーティション化、および細胞培養タイプを示す図である。
【００３８】
【図１０】図１０は、７方向プラットフォーム上の各ウェルの流動指向性、流動パーティション化、および細胞培養タイプを示す図である。
【００３９】
【図１１】図１１は、２方向インタラクトームへの薬物添加のためのウェル配向の異なる構成の図である。
【００４０】
【図１２】図１２は、供給源ウェル１０３ｉからシンクウェル（または行き先ウェル）１０３ｊへの一方向性流体接続性を提供する、流出路（流出路導管１２１を含有する）の上面図を示す概略である。供給源ウェル１０３ｉの入口１１１ａおよび出口１１１ｂもまた、示される。
【００４１】
【図１３】図１３は、（例えば、能動的圧送誘発再循環のための出口孔１１１ｂを含有する）供給源ウェル１０３ｉからの流出路に関する入口幾何学形状の側面図である。半径方向メニスカスピニング溝１２２が、流出路の湾曲した入口幾何学形状１２４と整合し、湾曲した入口幾何学形状は、流出路導管の導管溝１２５の底部と整合する。トランスウェル高さは、その上にトランスウェルの外側周縁が静止する、段シェルフ１２３の垂直場所によって設定される。
【００４２】
【図１４】図１４は、行き先ウェル１０３ｊの中への流出路１２１に関する出口幾何学形状の側面図である。流出路の出口幾何学形状は、流出路導管の縁の下方の行き先ウェルの壁内のアンダーカット１３０と、行き先ウェルの壁に沿って誘導するための垂直溝１３１とを含む。
【００４３】
【図１５】図１５は、足場内の頂点容積１１０２およびウェル内の基底容積１１０３を示す、デバイスの灌流されるウェル内の灌流可能な足場の断面側面図である。
【００４４】
【図１６】図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、流出路を横断する初期連続的流体フィルム（図１６Ａ）から、流体フィルムの破断（図１６Ｂ）、最後に、シンクウェル内の乾燥および供給源内の過剰蓄積（図１６Ｃ）までの、（断面側面図の）流出路Ｖ形入口幾何学形状の連続的な経時的な潜在的進展を図示する。
【００４５】
【図１７】図１７は、流出路を横断する連続的流体フィルムに関する、図１６ＡにおけるＶ形状を伴わない別の流出路入口幾何学形状の断面側面図の概略である。
【００４６】
【図１８】図１８は、図１７、すなわち、底部に溝を伴うＵ形導管に対応する流出路入口幾何学形状の拡大断面側面図の概略である。
【００４７】
【図１９】図１９は、流出路幾何学形状の別の実施形態の断面側面図の概略である。本流出路は、タワー導管１２８ａの入口および上向き導管出口１２９ａを用いて開放流体流（導管１２６の上方の空間）を可能にする導管１２７を有する。
【００４８】
【図２０】図２０は、図１９に示される流出路の上面図の概略である。タワー導管は、供給源ウェルの壁内の段の表面上に開口部、すなわち、孔１２８ｂを有し、これは、開放流体構成１２６における流出路導管１２７に接続する。
【００４９】
【図２１】図２１は、ねじ１４０がタワー導管１２８にプラグ接続し、供給源ウェルからの流出流を防止する、図１９に示される流出路の断面側面図の概略である。
【００５０】
【図２２】図２２Ａ、図２２Ｂ、および図２２Ｃは、導管の中への初期流体フロント（図２２Ａ）から、導管に沿った流体フロントの移動（図２２Ｂ）、および導管内の流体蓄積（図２２Ｃ）までの、（断面側面図の）Ｖ形入口幾何学形状を伴う流出路の連続的な経時的進展を図示する。
【００５１】
【図２３】図２３は、自発的毛細管流（ＳＣＦ）を判定するための計算に関する導管幾何学形状の寸法の概略図である。ＷＦは、液体−空気界面の寸法を表す。
【００５２】
【図２４】図２４は、ＳＣＦを判定するための計算に関する長方形導管の寸法の概略図である。導管は、ｂの深さおよびａの幅を有し、合計でＰｗの断面導管外周になる一方、液体−空気界面は、ＰＦの外周を有する。
【００５３】
【図２５】図２５は、ＳＣＦを支援するためのＶ形入口幾何学形状を伴わない流出路の断面側面の概略図である。
【００５４】
【図２６】図２６Ａ−２６Ｄは、入口（図２６Ａ）、対角図（図２６Ｂ）、断面図（図２６Ｃ）、および出口（図２６Ｄ）における、丸形底部流出路導管の異なる図を示す。
【００５５】
【図２７】図２７Ａ−２７Ｄは、入口（図２７Ａ）、対角図（図２７Ｂ）、断面図（図２７Ｃ）、および出口（図２７Ｄ）における、ナイフエッジ幾何学形状を伴う流出路導管の異なる図を示す。
【００５６】
【図２８】図２８Ａ−２８Ｄは、入口（図２８Ａ）、対角図（図２８Ｂ）、断面図（図２８Ｃ）、および出口（図２８Ｄ）における、Ｖカット幾何学形状を伴う流出路導管の異なる図を示す。
【００５７】
【図２９】図２９は、高い深さ対幅比（例えば、３を上回る）の底部に位置する長方形溝を伴う流出路導管幾何学形状、すなわち、Ｕ形の断面側面図の概略である。
【００５８】
【図３０】図３０Ａ、図３０Ｂ、および図３０Ｃは、流出路を横断する初期連続的流体フィルム（図３０Ａ）から、導管内の流体蓄積（図３０Ｂ）、およびサイフォン効果（図３０Ｃ）までの、Ｖ形入口幾何学形状（断面側面図）を伴う流出路の別の連続的な経時的進展を図示する。
【００５９】
【図３１】図３１は、流出路導管１２７がスロープ１３２で終了し、導管の下方のｄの距離に、行き先ウェルの壁内のアンダーカット１３０が存在する、流出路出口幾何学形状の断面側面図の概略である。スロープ１３２の下方の、アンダーカット１３０によって中断される垂直溝１３１が、行き先ウェルの壁に沿って存在する。
【００６０】
【図３２】図３２は、小幅溝１２７から流動する流体が、退出のために拡大された湾曲面積１３２に遭遇する、流出路出口幾何学形状の上面図の概略である。
【００６１】
【図３３】図３３は、ウェルの底面上に誘導溝１５１を伴う酸素供給尾部１５０ａの上面図の概略である。
【００６２】
【図３４】図３４は、ジグザグ酸素供給尾部１５０ｂに接続するウェル１０３の上面図の概略である。
【００６３】
【図３５】図３５は、位相誘導目的のために、図３４に示されるジグザグ酸素供給尾部の幾何学形状特徴を示す図である。尾部は、Ｗ１の最大幅およびＷ２の最小幅を有し、それぞれ、Ｌ１およびＬ２の長さにわたって交互する順序で現れる。角度αは、酸素供給尾部における流体流方向に対する増加する幅の方向を表す。
【００６４】
【図３６】図３６は、プラットフォーム上の壁の中に挿入される取り外し可能な灌流される足場１６０の断面側面図の概略であり、これは、足場を固着させる（例えば、ねじ山によって回転する）ためのランプ領域１５９、半径方向シール１６１ａおよび１６１ｂ（例えば、Ｏリング）、足場内の細胞培養領域１６２、ならびに非接触酸素感知のために有用な流体凝集蓋１６３を示す。
【００６５】
【図３７Ａ】図３７Ａは、空気圧式板の表面上の３チャンバユニットの上面図を示す概略である。
【００６６】
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、図３７Ａに対応する３チャンバユニットの側面図を示す概略である。障壁膜３００が、流体板（流路１０１を含有する）および空気圧式板を分離する。空気圧式板は、その上に孔が空気圧式板（本図に図示せず）の内部チャネル（空気作動ライン）に接続されるチャンバ空間を生成する、突出特徴２０１を有する。ここでは、チャンバ２２１は、弁としての役割を果たし、チャンバ２２２は、ポンプとしての役割を果たし、チャンバ２２３は、別の弁としての役割を果たす。
【００６７】
【図３８】図３８は、４つの空気作動ラインによって制御される、二重３チャンバユニットの上部上の分割される流体流の上面図の概略である。
【００６８】
【図３９】図３９は、基板１２０２（例えば、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）基板）の対向する側上にある前面電極１２０１および背面電極１２０３を含む、壁内流体レベル感知コンデンサ１２００の断面側面図概略である。
【００６９】
【図４０】図４０は、図３９に示される壁内流体レベル容量センサの電極の上面図概略であり、一方の側上で共面である前面基準電極１２０１ａおよび他方の側上で同一面にある別の前面基準電極１２０１ｃを伴う前面感知電極１２０１ｂならびに一方の側上で同一面にある背面基準電極１２０３ａおよび他方の側上で同一面にある別の背面基準電極１２０３ｃを伴う背面感知電極１２０３ｂを示す。
【００７０】
【図４１】図４１は、積層プラットフォームに関する空気圧式ラインの３つの層の概略図である。
【００７１】
【図４２】図４２は、２つの板間の焼結を支援する幾何学形状を伴う、上部板１５０および底部板２５０の断面側面図概略である。底部板２５０は、それぞれ、狭化された頂点２５２ａおよび２５２ｂを伴う突出柱２５１ａおよび２５１ｂと、ｄ２の高さだけ突出柱よりも低い平坦面突出部２５３とを有する。
【００７２】
【図４３】図４３は、図４２の上部板１５０および底部板２５０から焼結された、融合された一体構築物３５０の断面側面図概略である。焼結（熱下の上部板と底部板との間の強制圧縮）後の図４２の突出柱の頂点は、焼結された表面２５２ｃおよび２５２ｄに変形し、上部板に取り付けられている。焼結前の底部板の突出部間の空間は、流体のための空間（例えば、チャネル）３５１になっている。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
Ｉ．  定義
同義的に使用される用語「生体機能チップ（ＯＯＣ）」、「バイオリアクタ」、および「マイクロ生理学的システム（ＭＰＳ）」は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）プラットフォーム上で単一または複数の器官もしくは他の組織タイプ間の相互作用を提供し、これらの組織の成長の維持を提供するプラットフォームを指す。
【００７４】
用語「空気圧式」は、動作のために空気または減圧圧力を使用するシステムを指す。
【００７５】
用語「マニホールド」は、空気圧式または流体接続のための相互接続デバイスを指す。
【００７６】
用語「流出路」は、供給源ウェル内の流体レベルを自動的に維持するための、供給源ウェルと行き先ウェルとの間の流体接続のシステムを指す。
【００７７】
用語「レベリング」は、流体レベルを維持することを指す。
【００７８】
用語「自己レベリング」は、受動的手段を使用して、すなわち、能動的手段を伴わずにレベルを維持することを指す。
【００７９】
用語「アンダーカット」は、張出特徴と関連付けられる機械的細部を指す。
【００８０】
用語「湿潤」は、本システムのギブスエネルギーの最小値によって判定される、気体環境中の液体による固体表面の湿潤を指す。気体環境中の液体による固体表面の湿潤は、固体／液体（ＳＬ）および液体／気体（ＬＧ）界面間の液相を横断する平衡接触角θを、それらが接触線から発生する際にもたらす。概して、用語「湿潤」および「非湿潤」表面は、それぞれ、θ＜９０°およびθ＞９０°の場合を指す。接触角と関与する界面エネルギーとの間の関係は、ヤングの方程式γＳＶ＝γＳＬ−γｃｏｓθによって表され、式中、γＳＶ、γＳＬ、およびγは、それぞれ、固体と気体との間、固体と液体との間、および液体と蒸気との間のギブス界面エネルギーであり、最終量は、表面張力として扱われる。熱力学的平衡要件を満たすために、気相は、蒸気を用いて飽和される。
【００８１】
用語「メニスカス」は、流体の固体材料および蒸気相との交点における流体境界を指す。
【００８２】
本明細書における用語「メニスカスピニング」は、垂直ウェル内の湿潤液体のレベルが上縁まで上昇する状況において、液体の蓄積がウェルの縁からの流出をもたらし、したがって、接触線を解放する（「ピニング解除する」）まで、液体レベルのさらなる増加中にウェル側壁の上縁において接触角θが＜９０°から＞９０°に上昇する間に、接触角θを伴う湿潤線の終点がウェルの上縁に留まる（または「ピニングされる」）ことを指す。非湿潤液体に関して、メニスカスピニングは、垂直ウェルの側面の底縁および上縁において起こり、上縁において、接触線における液体配向に関する角度は、値θ〜θ＋９０°に変化する。本用語の詳細が、Ｗｉｊｓ  ｅｔ  ａｌ．による「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」６２（１２）：４４５３−４４６５（２０１６年）に説明されている。
【００８３】
用語「毛細管長」は、重力加速および界面における表面張力に起因する表面力の両方を受ける、２つの流体間の界面に関する特徴的長さスケールを指す。
【００８４】
用語「挿入物」は、ＭＰＳのウェル内に機械的に組み立てられ得る要素を指す。
【００８５】
関連する節における用語「足場」は、組織構造のための支持を提供するウェルの挿入物または構成要素である。
【００８６】
用語「ホイップルツリー」は、リンケージを通して力または圧力を均一に分配するための機構を指す。本明細書で使用されるように、これは、中心またはそれに近接して１つの方向から印加される力または圧力を指し、先端（概して、２つの先端）に分配され、それぞれ、さらなる先端への分配のための中心としての役割を果たす。
【００８７】
用語「プログラム」または「ソフトウェア」は、上記に議論されるような実施形態の種々の側面を実装するようにコンピュータまたは他のプロセッサをプログラムするために採用され得る、任意のタイプのコンピュータコードまたはコンピュータ実行可能命令のセットを指す。加えて、実行されると、本発明の方法を実施する１つまたはそれを上回るコンピュータプログラムは、単一コンピュータまたはプロセッサ上に常駐する必要はなく、いくつかの異なるコンピュータまたはプロセッサ間にモジュール方式で分散され、本発明の種々の側面を実装し得ることを理解されたい。
【００８８】
ＩＩ．  装置および装置の動作
各マルチウェルデバイスは、概して、オンボード圧送システムを伴う３構成要素構造である。流体板１００は、いくつかがＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）１１０１（Ｃｏｒｎｉｎｇ、また、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによっても供給される）等の挿入物を用いて嵌合される複数のウェルと、培養培地の分配のための内蔵マイクロ機械加工流路１０１とを含有する（図１）。空気圧式板２００が、圧縮空気および減圧を小孔を通して空気圧式板の表面に分配する。障壁膜３００（略半透明）が、流体板１００と空気圧式板２００との間に置かれ、これは、圧力下で、拡張または収縮するように撓曲し、それによって、流体板の流路の対応する部分を遮断または一掃し得る。本障壁膜はまた、滅菌障壁を提供し、ポンプおよび弁の作動層として作用する。
【００８９】
複数のデバイスが、同時の同相動作／作動のために連鎖されることができる（図２）。各デバイスは、バイオリアクタであり、これは、プラットフォームとして、異なる器官、その相互接続、および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）としての相互作用を模倣する複数のＭＰＳの培養を支援する。開放ウェルおよびチャネルは、直接流体接触を要求する測定を実施するために、ユーザによる細胞および培養培地への容易なアクセスを可能にする。最大７つのこれらのＭＰＳが、実施例において実証されるようにともに結合されているが、本システムは、合計で７つに限定されない、１つを上回る同一タイプのＭＰＳの混合ならびに種々の異なるタイプの混合および統合を可能にすることを理解されたい。
【００９０】
本システムは、複数の器官培養を支援するように効果的に構成される、高自由度（ＤＯＥ）オンボード圧送システムを一意に組み込む。既存のデバイスは、ループを通した流動を駆動するために単一のポンプによって直線状にリンクされるコンパートメント（Ｍａｔｅｒｎｅ  ＥＭ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｊ．  Ｖｉｓ．  Ｅｘｐ．」１−１１（２０１５年）．ｄｏｉ：１０．３７９１／５２５２６）または事前定義された受動的流速を付与するチャネル直径と並列にリンクされるコンパートメント（Ｏｌｅａｇａ  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．」６，２００３０（２０１６年））を有するが、高ＤＯＦ制御は、新しいＭＰＳの追加またはあるコンパートメントの除外のために本プラットフォームを再構成することを容易にする。
【００９１】
４方向ＭＰＳバイオリアクタのいくつかの実施形態では、本プラットフォームは、１８自由度（「ＤＯＦ」）または１８個の個々の管類のチャネルを用いて動作し得る。例えば、肝臓−腸−肺−子宮内膜４方向ＭＰＳでは、個別に行き先指定可能なポンプが、３ＤＯＦを要求する一方、複数のポンプは、複数のポンプを横断する空気圧式マニホールド上の入口を共有することによって、同一速度において起動されることができる。４方向ＭＰＳプラットフォームが、９つのポンプを駆動するために使用される、６つの独立してプログラム可能な流速を有し得る。ミキサ−ＭＰＳ流動を提供する全ての４つのポンプは、個別に行き先指定可能であり得る。再循環ポンプ速度は、共有され、ミキサ／肝臓再循環は、リンクされ、腸／肺／子宮内膜再循環のようである。ポンプ速度をリンクすることは、これがプラットフォームのために要求される空気圧式弁および管類接続の数を低減させるため、経済的に有利である。
【００９２】
７方向ＭＰＳバイオリアクタのいくつかの実施形態では、本プラットフォームは、プラットフォームあたり１７個のシリンジポンプの機能的同等物を動作させる３６ＤＯＦを有し、ＭＰＳ内およびＭＰＳ間混合を動的に制御することができる。本事例では、それぞれ、３つの空気圧式ラインを要求するため、１２個の流速のみが、独立して規定されることができる。
【００９３】
Ａ．  マルチウェルバイオリアクタ
（１）  流体流の方向の概観
図３Ａは、７器官双方向性バイオリアクタの概略図を示し、それに関して、図３Ｂは、各ウェル内で培養されるべき組織および流体流の方向の例示的マップを示す。肺、子宮内膜、腸、肝臓、心臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、および膵臓を含有する例示的７方向バイオリアクタでは、流体の略能動流が、内蔵流体チャネルを介して、ミキサウェル（ミキサ）から肺に（図３Ｂの矢印１）、ミキサから子宮内膜に（Ｅｎｄｏ；図３Ｂの矢印３）、ミキサから腸に（図３Ｂの矢印４）、ミキサから肝臓に（図３Ｂの矢印７）、ミキサから膵臓に（図３Ｂの矢印９）、ミキサからＣＮＳに（図３Ｂの矢印１０）、ミキサから心臓に（図３Ｂの矢印１１）導通され、ウェル内圧送を介して、肺、子宮内膜、腸、心臓、ＣＮＳ、肝臓、膵臓、およびミキサのそれぞれの中を再循環するように（図３Ｂの矢印２、６、および１２）導通される。外部供給源が、ミキサにインポートされ得（図３Ｂの矢印８）、これは、流体流を通して、各器官ウェルに分配される。ミキサからの廃棄物が、外部コレクタにエクスポートされ得る（図３Ｂの矢印５）。いくつかの実施形態では、ミキサから器官への各流出は、個別に制御された流速ならびにミキサへの外部供給源インポートおよびミキサから外部コレクタへの廃棄物のエクスポートのために指定されたポンプを有する。いくつかの実施形態では、複雑性を低減させるために、肺、子宮内膜、および腸のそれぞれの中での再循環は、同じ再循環流速のために１つのポンプ制御を共有し得、心臓、ＣＮＳ、および膵臓のそれぞれの中での再循環は、同じ再循環流速のために別のポンプ制御を共有し得、ミキサ内および肝臓内の再循環は、同じ再循環流速のためにまた別のポンプ制御を共有し得る。
【００９４】
流出路が、概して、ウェルの少なくとも１つの対間に設計され、７器官プラットフォームの一実施形態では、肺とミキサとの間、子宮内膜とミキサとの間、腸と肝臓との間、肝臓とミキサとの間、心臓とミキサとの間、ＣＮＳとミキサとの間、および膵臓と肝臓との間に設計され、前者のウェルから後者に過剰な流体を自動的に移送する。
【００９５】
図４は、図３Ｂにマッピングされるような多器官培養のための図３Ａに示される例示的７方向装置に対応する空気圧式底部板の概略図を示す。空気圧式板は、上部板の底部上の対応する特徴（例えば、ピン孔またはスロット）と噛合／整合するために、空気圧式板の側上に整合ピン２０３を有し、いくつかの実施形態では、中心周りの対称位置において２つのピンを有し得る。空気圧式板はまた、整合するべき上部流体板の底部上の対応する突出ピン特徴のために、（空気導通作動ラインを遮断しない）複数の場所上に板の深さ全体を通していくつかの孔２０２を有し得る。図４に示される空気圧式板上には、空気圧式板の内側を横断して水平に及ぶ空気導通作動ラインとして、１８個の内部チャネルが存在する。例えば、空気入口および空気出口２１０ａおよび２１０ｂ（板の配向に対する入口および出口）を伴う３つの空気導通作動ラインのセットは、空気圧式板の作動側（すなわち、作動膜を通して流体板の底部と組み立てられる側）の表面上に位置する複数の３チャンバユニット２２０ａ、２２０ｂ、および２２０ｃを制御する。各３チャンバユニット（例えば、２２０ａ、２２０ｂ、および２２０ｃとして括られる）は、３つのチャンバを有し、それぞれ、下方の水平空気導通ラインと接続する、表面への空気導通孔を有し、３つのチャンバは全体として、いったん組み立てられると、膜の正および負の偏向を引き起こす空気圧式作動を介して、上部板の流体チャネル内のストロークまたは蠕動流体流を制御する。空気圧式板はまた、１つまたはそれを上回る３チャンバユニットを接続する、突出曲線隆起特徴２０１を有し得る。これらの隆起特徴は、種々の流体ＭＰＳモジュールを相互接続する画定された流体回路内で流体を導通させる、流体板の底面内の対応する流体チャネルのための合致するシール面を提供する。これらの隆起特徴２０１は、いったん空気圧式板が流体板と組み立てられると、流体板内の流路の位置の輪郭を描くように見られることができる。要素１２１は、いったん空気圧式板が流体板と組み立てられると、流体板内のＭＰＳモジュール間で流体を運搬する流出路の位置を示す。
【００９６】
図５は、ミキサから腸への流体流のための内蔵チャネルおよび腸から肝臓への大まかな流出路位置を示す、例示的４方向プラットフォームの断面を示す。多器官ＭＰＳプラットフォーム上の細胞培養のための開示されるウェルは、概して、動作のこの「流入／流出」原理に従う。
【００９７】
流体の能動流および受動的流出の方向の動作は、概して、生体内システムにおける循環経路を模倣し、例示的７器官バイオリアクタに示されるような原理は、２方向、３方向、４方向、または他の数のＭＰＳシステムのプラットフォームに適用可能である。マルチウェルプラットフォームにおける使用からの１つまたはそれを上回るウェルの除外は、動作のためのソフトウェアコードにおける改変を介して実行可能であり、いかなるハードウェア変更も、要求されない。各ウェルはまた、複数の使用のために再構成可能である。例えば、混合チャンバ（ミキサウェル）はまた、免疫コンピテント腸ＭＰＳウェルとして使用される、またはＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）と併用され得る。肝臓ＭＰＳウェルが、培地リザーバまたは薬物リザーバとして使用され得る。マルチウェルプラットフォームの例示的な再構成された使用が、図６−１０に示される。流動パーティション化が、概して、圧送の周波数を変動することによって達成される。マルチウェルプラットフォームの別の例示的構成が、図１１に示され、３つのウェル内に格納される３つの薬物が、肝臓ウェルおよび腸ウェルに送達される一方、ウェルは、ミキサウェルおよび肝臓と腸との間の流出路を介して、灌流され、相互作用する。
【００９８】
（２）  流動方向およびレベルを制御するための手段  
自己レベリング流出路
本装置は、ミキサに戻るように過剰な流体を送達するために、板の上部側に切り込まれる流出路チャネルのシステムによって、ＭＰＳウェルの受動的な自己レベリングおよび、概して、ミキサへの流体戻りを達成する。概して、流出路は、底部ウェルのある程度上方にチャネル（例えば、開放流体）を含み、これは、入口ウェルを出口ウェルに接続する（図１２）。流出路は、流入と流出との間の均衡を強化するための戻りポンプおよびレベルセンサの必要性を排除する一方、また、戻り流が入口ＭＰＳ給送流を横切ることを可能にする。好ましい実施形態では、流出路は、レベリングが必要とされるとき、流出路内の流体流の破断を回避し、ウェルの乾燥を防止するためにサイフォン効果を回避する。
【００９９】
本装置は、自発的毛細管流（自己湿潤）および位相誘導原理を使用し、流路内の流動および湿潤を誘導し、開放流体生体機能チップシステムのよりロバストな動作を可能にする。供給源ウェルから行き先ウェルへの一方向性流が、以下に詳述されるメニスカス制御特徴ならびに、流出路導管の付加的溝幾何学形状、制御された表面粗度、表面張力、および流出路の入口および出口における付加的特徴を含む、他の特性を用いて達成される。生体機能チップ装置のための流体容器内のこれらの１つまたはそれを上回る幾何学的特徴は、半径方向方式における流体のピニングが、表面張力によって生成されるメニスカス効果を限定することを可能にする。本構成は、より良好な受動的流体レベリングを可能にし得、これは、次いで、これらのシステム内のより決定的な性能および測定につながり得る。
【０１００】
流出路は、以下の方式で受動的レベリングを実装する。入口ウェルの中への流体流が、入口ウェル内の流体の正味蓄積を引き起こす場合、入口ウェル内のレベルは、上昇し始める。レベルが上昇し始めるにつれて、流体は、流出路において上昇し、それによって、流出路を通した出口ウェルの中への増加された流動を引き起こす。入口ウェル内のレベルが減少する場合、入口ウェルの流出路における流体レベルは、低下し、それによって、流出路を通した流動を減少させる。このように、入口ウェル内のレベルは、所望のレベルにほぼ等しくなるように受動的に制御される。そのようなレベリングは、レベルを感知し、本レベルの感知に応答してある程度圧送速度を変更する能動的プロセスが存在しない点において受動的である。むしろ、重力および表面張力の効果が、組み合わせられ、明示的な感知および制御を要求しない受動的様式で流動を調整する。
【０１０１】
適切な流出機能を達成するために、流出路は、供給源内の流体の設計された高さを上回る、供給源からシンクへの方向における低抵抗流路を採用する。いくつかの実施形態では、経路は、シンクから供給源および本システムに流入するために、不浸透性であり、したがって、全体として、流出路は、傾斜に起因する流体高の過渡変化に耐性があり得る。
【０１０２】
入口幾何学形状
種々の入口特徴が、供給源ウェルメニスカスを安定させるために有用であり、流出路チャネルへの入口または供給源ウェル内の培地の体積をシールする方法を提供する。
【０１０３】
図１６Ａ−１６Ｃは、供給源ウェル（入口ウェル）においてＶカットを伴う流出路が流体フィルムの遮断を被り（例えば、流体フィルムが破断し）、したがって、流出路導管が乾燥し、流体を供給源ウェルおよびシンクウェル内に蓄積させ、空になるまで乾燥させる様子の経時的概略図を示す。本タイプの流出路は、流体輸送を可能にする接続された流体プロファイルを伴う準安定形態において動作を開始する。流体フィルムが（具体的には、入口段およびＶカット幾何学形状において）破断すると、流体は、供給源ウェル内に蓄積することがよりエネルギー的に好ましいと見出し、したがって、流出路入口において前進し、導管およびシンクウェル（出口ウェル）の中に流出するのではなく、高さにおいて増加する。高さがある値を超えて増加すると、これは、最終的に流出するが、膵臓および肝臓等の広い表面積を有する器官に関して、本高さの増加は、大量の体積を要求し、これは、これらの幾何学形状を使用する７方向プラットフォームの試験において、ミキサが培養器内で１２時間後に乾燥する主な理由であると見出された。
【０１０４】
以下は、有効性を改良するために判定された。
【０１０５】
平坦メニスカスのための浅く緩やかな入口
流出路へのより浅く、より緩やかな入口幾何学形状が、導管溝の中に流体を流出させるためのエネルギーを最小限にする。供給源ウェル内の半径方向溝が、メニスカスを指向させ、高さ増加を利用し、流出事象を生成する。流体フィルムが存在し、流出路が流体を導通させているとき、段およびＶカット特徴は、体積変位を過渡傾斜またはサイフォニングから防止しない場合がある。したがって、いくつかの実施形態に関して、入口段およびＶカットは、本レベルにおける流体フィルム途絶を最小限にするために排除される。段障壁が、図１８に示されるＶカットを伴わない例示的入口の断面図を伴う図１７に示されるように、さらなる流体蓄積を防止するために使用され得る。
【０１０６】
より大きい相互接続する流出路を伴う大きいウェルのように、重力が優勢であり、表面張力効果が無視できるとき、Ｖカットは、自己レベリングの厳密な高さを判定し、接続を破断する際に効果的である。より小さい幾何学形状に関して、流出路への直接入口を有し（および一実施形態では、メニスカスピニング溝を有し）、流出路出口特徴の使用によって流体接触を注意して破断することが、より効果的である。
【０１０７】
流体ピニング溝
いくつかの実施形態では、流出路への入口は、加えて、「流体ピニング」溝を含み、これは、流体ウェル内の２０、３０、４０、４５、５０、または６０度の円周溝１２２であり、好ましくは、４５度であり得る。本溝は、流体メニスカスを捕捉し、これは、画定された流体高を維持することを促進し、レベリングおよび流出路動作の動力学を改良する。本半径方向メニスカスピニング溝の底部は、図１３に詳述されるように、流出路流体流チャネルの底部と整合する。ピニングされたメニスカスは、不安定であり、したがって、流出し、したがって、流体は、半径方向メニスカスピニング溝の高さを越えて上昇しない。
【０１０８】
決定的流体レベルのためのテフロン（登録商標）リングの挿入
流出路に対する異なる高さにおいてテフロン（登録商標）リングを配置することは、流出前の最大流体高を判定する。挿入されたテフロン（登録商標）リングは、メニスカスを捕捉し、したがって、これを越えないように液体レベルを固着させる。リングはまた、蒸発を防止することに役立つ。
【０１０９】
実施形態
図１３は、半径方向メニスカスピニング溝を介した流体の浅く緩やかな入口がウェルの周囲にあり、メニスカスピニング溝の底部が溝付き流体流チャネルの底部と整合する、流出路に関する改良された入口幾何学形状の一実施形態を示す。
【０１１０】
図１９および２０は、それぞれ、断面側面図および上面図における、開放導管流出路に関する改良された入口幾何学形状の別の実施形態を示す。傾斜導管タワー１２８ａが、供給源ウェルを開放導管１２７に接続し、これは、底部において自発的毛細管流（ＳＣＦ）溝を有し得る。入口幾何学形状は、壁内孔設計を利用し、孔１２８ｂが、段表面上に作成され、傾斜導管タワー１２８ａに接続する。ねじシール１４０が、導管１２８ａの開口孔をプラグ接続し、ＭＰＳ相互作用を隔離するために配置され得る（図２１）。ねじシールは、概して、ねじ山に隣り合ってＯリングを有し、いったん孔の中にプラグ接続されると、良好なシールを生成する。
【０１１１】
自発的毛細管流（ＳＣＦ）を可能にする導管
図２２Ａ−２２Ｃは、Ｖ形入口幾何学形状を伴う流出路からの流出路導管を横断する流体の経時的進展を図示する。導管がプライミングされていないとき、または流出路導管が蒸発もしくは流体フィルム途絶に起因して乾燥しているとき、供給源ウェルに由来する移動する流体のフロントは、導管の壁内にメニスカスを形成し、これは、緩慢に前進し、導管の溝の上方に流体を蓄積する。本流出路導管問題は、最初に、７方向アルファ流出路に対する染料試験において観察され、流出路は、流体フロントによって湿潤されたが、導管に沿った流体移動は、緩慢であり、流出路全体を湿潤させるために相当な体積を要求した。
【０１１２】
以下は、導管幾何学形状を改変することによって流動を改良するための手段を表す。
【０１１３】
自発的毛細管流がチャネルにおけるロバストな湿潤を確実にすることを可能にするための幾何学形状および寸法
チャネルに沿った流体移動効率が、匹敵する小寸法の丸形底部、Ｖ形、および長方形底部開放チャネル間で比較された。２μＬの流体液滴が、チャネルのプライミングを伴わない湿潤距離を測定するために、開放チャネルの一方の端部に追加された。Ｖ形チャネルは、１０３ｍｍの湿潤距離を呈することが示され、長方形チャネルは、４４ｍｍの湿潤距離を有し、丸形底部チャネルは、７ｍｍの湿潤距離を有していた。Ｖ形チャネルおよび長方形底部チャネルの両方が、Ｃｏｎｃｕｓ−Ｆｉｎｎ流を支援する（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．による「ＡＩＭＳ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ」１（１）：３１−４８（２０１４年））。より長い湿潤距離は、概して、開放チャネル流出路内の連続的流体流を維持する、さらなる湿潤性性能を示す。
【０１１４】
導管を形成するために使用される材料の影響
自発的毛細管流（ＳＣＦ）を伴う導管は、流体フィルムを維持し、したがって、最小体積要件を伴い、任意の特定のプライミングまたは圧送速度を伴わない流体連通を維持する。ＳＣＦを達成するために、導管の断面は、以下の関係を満たすべきである。
【化１】
2019505214.tif 000003
式中、
ＰＦ＝遊離（空気と接触する）外周
ＰＷ＝湿潤した（壁と接触する）外周
θ＝一般化されたＣａｓｓｉｅ角（材料の平均接触角）である。
【０１１５】
ＳＣＦは、湿潤壁からのエネルギー低減が、遊離表面を延在させることからのエネルギー増加を上回るときにもたらされる。ギブス熱力学的方程式を使用して、複合壁および空気システムにおける自発的毛細管流に関する一般的基準は、＜９０°であるはずの一般化されたＣａｓｓｉｅ角θである。一般化されたＣａｓｓｉｅ角は、材料の平均接触角である。流体板がポリスルホンを用いて作製される好ましい実施形態では、培地−ポリスルホン−空気に関する接触角は、水または培地を伴うポリスルホンに関して３０°＜θｃ＜１１３°であると測定された。本広い範囲の接触角は、表面マイクロパターン化の影響に基づき、より少ない程度で、ポリスルホン疎水性におけるわずかな差異および培養環境の熱効果に基づく。ＳＣＦ関係を満たすために、本明細書に説明される実施形態においてＳＣＦを可能にする外周比の範囲は、０＜ＰＦ／Ｐｗ＜０．８６６に及ぶ（
【化２】
2019505214.tif 000004
；負の外周比は、可能ではなく、したがって、考慮されない）。これは、例示的推定であり、他の実装が、代替比率を利用し得ることを理解されたい。実践的に、チャネル内の任意の場所の接触角は、合理的に≦８０°であると仮定され、メニスカス効果および／または不良に湿潤可能な表面（これは、より高い湿潤性を促すために、平滑な仕上げを生成するように機械加工され得る）を考慮する。したがって、接触角が約８０°であるように、顕著なメニスカス効果を伴う、または不良に湿潤可能な表面を伴うシナリオでは、ＳＣＦ関係を満たすために、外周比は、０＜ＰＦ／Ｐｗ＜０．１８
【化３】
2019505214.tif 000005
になる。
【０１１６】
図２３および図２４は、任意形状のチャネルの断面分析を提供する。ここでは、空気に暴露される液体の外周ＷＦは、上記の関係では、遊離外周ＰＦであり、３つの壁と接触する液体外周の合計Ｗ１＋Ｗ２＋Ｗ３は、上記の関係の湿潤した外周ＰＷであろう。図２４は、ａの幅およびｂの高さを伴う例示的長方形チャネルを図示する。ＳＣＦ関係を満たすために、外周比は、以下に従うべきである。
【化４】
2019505214.tif 000006
【０１１７】
縦横比を定義するとき、λ＝ｂ／ａであり、したがって、ｂ＝λａであり、関係は、以下になる。
【化５】
2019505214.tif 000007
これは、不良に湿潤可能な表面および／または顕著なメニスカス効果を伴うチャネル表面によって、ＳＣＦを可能にするために、以下の縦横比に関する基準を導出するように計算されることができる。
【化６】
2019505214.tif 000008
【０１１８】
したがって、３を上回る縦横比を伴う小長方形チャネルが、概して、ＳＣＦを達成することができる。
【０１１９】
製造能力を考慮するいくつかの実施形態では、縦横比範囲は、ＳＣＦ設計原理を支援するために、２．５＜λ＜５である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、自発的毛細管流は、約２の縦横比を伴う三角形水平チャネルにおいて達成され、壁平滑度は、接触角が約６０°であるようにされる。三角形チャネルに関するＰＦ／Ｐｗの計算は、長方形チャネルと比較して異なるであろうが、同一の原理が、保持される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、流出路導管内の好ましい流路は、３を上回る縦横比を伴う長方形またはＶ形チャネルであり、これは、毛細管流が起こることを可能にするためのマイクロ流体寸法以内である（流出路を横断する連続的流体フィルムを示す図２５）。導管チャネルとの初期流体接触に応じて、ＳＣＦを支援する幾何学形状を伴うチャネル内の流体の最小体積が、幾何学形状全体を迅速に湿潤させ、供給源からシンクに流体を効率的に輸送することが可能な流体フィルムを生成する。
【０１２２】
重力依存流出を確実にするための毛細管長および流出路幅
Ｂｒａｋｋｅ  ｅｔ  ａｌ．による「Ｅｘｐ  Ｍａｔｈ」１（２）：１４１−１６５（１９９２年）によると、（ポリスルホンと類似する疎水性を有する）アクリルと接触する水に関して、毛細管長［γ／（ρ＊ｇ）］１／２（式中、γは、表面張力であり、ρは、液体の密度であり、ｇは、重力加速度である）は、２．７ｍｍである。チャネルの２つの壁の間の距離（すなわち、流出路チャネルの幅）が、毛細管長を下回る場合、重力は、無視できる影響を及ぼす。したがって、２．１ｍｍの流出路幅は、本システムを重力が毛細管作用よりも支配的ではない形態にする。
【０１２３】
流出が（例えば、導管タワー１２８ａ内で）重力によって駆動されることが所望されるいくつかの実施形態では、流出路幅は、３ｍｍを上回る。
【０１２４】
実施形態
図２９は、自発的毛細管流を可能にするための３：１縦横比の長方形溝を伴う例示的流出路導管幾何学形状を示す。流出路の上方のＵ形チャネルは、ドリルビットコレットのための空間を可能にするためのリリーフカットである。
【０１２５】
好ましい実施形態では、いったん供給源ウェル内の液体がレベリングされると、表面張力は、自発的に伝搬し、導管を通した標的ウェルへの流体の移動を駆動する。
【０１２６】
アンダーカット設計を伴う出口幾何学形状
図３０Ａ−３０Ｃは、Ｖ形入口幾何学形状を伴い、いかなる付加的出口幾何学形状も伴わない、流出路からの流出路出口を図示する。流出路出口が、垂直壁において流体フィルムを有していないとき、流体は、導管内で蓄積を開始し、出口幾何学形状における流出バーストまたはさらには安定したメニスカスにつながる。本蓄積は、導管における流体のメニスカスが、シンクにおけるメニスカスと接触すると停止し、流体フィルムが、再確立される。流体フィルムが常時存在するとき、不良な出口設計は、供給源流体レベルがシンクレベルを下回った後であっても、サイフォン効果に遭遇し得る。
本問題は、以下の選択肢のうちの１つまたはそれを上回るものを使用して回避されるか、もしくは最小限にされることができる。
【０１２７】
逆流を防止するための高縦横比の垂直溝に沿った鋭的アンダーカット
図３１は、シンク／行き先ウェルの壁に沿った垂直溝１３１と接続するためのわずかにテーパ状の浅いスロープ（縁）１３２を介した、流出路導管１２７出口を図示する。例えば、ミリング機械を用いて作製される鋭的アンダーカット１３０が、垂直溝１３１を２つの部分に分断する。アンダーカットは、テーパ状の浅いスロープ１３２の下方のシンクウェルの壁の中へのカットであり、約３０°を上回る垂直線からの角度（例えば、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、またはそれを上回るもの、および例示的数字間の任意の連続的角度）を有する。いくつかの実施形態では、アンダーカット１３０と流出路導管出口との間の距離ｄは、サイフォン効果を防止するために、流出路導管の幅の約５〜約１０倍である。垂直溝１３１は、自発的毛細管流（ＳＣＦ）を呈し、流体フィルムを維持するように設計される。垂直溝は、アンダーカットが存在する場所を除いて、上部から底部に連続的に延設される。本幾何学形状は、順方向の流体指向性が存在する限り、導管およびシンクを接続する安定した流体フィルムを維持することに役立つ。逆流（例えば、サイフォン効果）の場合では、アンダーカットは、流体フィルムを切断し、順流が再確立されるときにのみ流体フィルムを再接続する流体メニスカスを生成する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、流出路出口垂直溝は、導管内のＳＣＦ溝における説明された同一の設計パラメータ、例えば、３を上回る高縦横比を使用して、自発的毛細管流（ＳＣＰ）を呈するように構成される。アンダーカットおよび高縦横比の垂直溝は、３×３アルファ流出路および機械加工されたポリスルホンブロックにおける一連の実験において試験され、制御された流体フィルム破断および抗サイフォニング効果につながった。改良された出口幾何学形状上の安定した垂直流体フィルムは、容易に蒸発せず、流出路出口における順流が再開されることに応じて、流体フィルム復元および流動を可能にする。
【０１２９】
フィルムを液滴に破断するための丸められたスロープ出口および小幅溝
別の改良された特徴は、流出路導管の端部に丸められたスロープ出口／縁を導入することである。流出路導管の小幅ＳＣＦ溝が、拡大された丸形湾曲面積（図３２）に「衝合」すると、（表面張力に起因する）小幅ＳＣＦ溝内の安定した液体フィルムは、拡大された丸い湾曲出口面積において不安定になり、これは、効果的に液滴に破断され、シンクウェルの中に落下する（「流れる」）であろう。このように、供給源ウェルは、シンクウェルから独立した状態になり、流体流の一方向性が、達成される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、供給源ウェルから導管への入口幾何学形状は、いかなるスロープも有しておらず、すなわち、これは、鋭的縁から落下する一方、導管からの出口幾何学形状は、液体がシンクウェルの中に落下する前に、拡大された湾曲面積に遭遇する。
【０１３１】
導管からの代替上向き出口
ＳＣＦチャネルがシンクウェル内の所望の液体レベルの下方にあるいくつかの実施形態では、図１９の要素１２９ａによって示されるように、出口孔を伴う上向き出口導管が、利用される。
【０１３２】
実施形態
図３１は、出口の真下のアンダーカットおよび抗サイフォン効果のための垂直溝を伴う流出路出口を図示する。
【０１３３】
平面壁の縁上にピニングされる壁境界液滴は、概して、壁縁境界液滴と称される。壁縁境界液滴は、典型的には、自然において、相当な体積に到達し、液滴が落下するまで、植物の葉から懸下する雫として見出される。液滴が鋭い壁縁上にピニングされるとき、それらは、壁縁頂点境界液滴と称される。壁縁頂点境界液滴シミュレーションは、（流出路出口を形成する）非常に湿潤する固体壁と接触する液体界面が、角度が増加するにつれて滴下する傾向にあることを示す。これは、壁を湿潤させることからのエネルギー減少が、液体−空気界面のエネルギーを上回り、したがって、接触面積が、薄い流体フィラメントが形成されるより小さい角度を伴う角において無制限に拡張しようとするためである。薄い流体フィラメントの生成は、これらのフィラメントの準安定性が、流体輸送を可能にする、または停止させるための手段を提供し得るため、流体レベリングおよび流動の正確な制御が開放チャネル流体システムのために必要とされる状況において関連し、望ましい。
【０１３４】
（３）  再循環
受動的自己レベリングが、上記に詳細に説明されるように、流動の戻りに寄与し得る。
【０１３５】
典型的には、再循環は、ウェル内で、濃度が良好に分布され、均一であることを確実にするために使用される。したがって、再循環流速は、典型的には、器官間流速よりも高い。
【０１３６】
ウェル内圧送によって駆動される能動的再循環は、培地の酸素供給を増加させ得る。例えば、再循環は、７方向ＭＰＳプラットフォームにおける肺、子宮内膜、腸、心臓、ＣＮＳ、肝臓、膵臓、およびミキサのそれぞれの中で起こり得る。いくつかの実施形態では、複雑性を低減させるために、肺、子宮内膜、および腸のそれぞれの中での再循環は、同じ再循環流速のために１つのポンプ制御を共有し得、心臓、ＣＮＳ、および膵臓のそれぞれの中での再循環は、同じ再循環流速のために別のポンプ制御を共有し得、ミキサ内および肝臓内の再循環は、同じ再循環流速のためにまた別のポンプ制御を共有し得る。
【０１３７】
（４）  酸素供給を促すための特徴
一般的に、数十万〜数百万個の細胞を含有する「メソスケール」組織への適正な灌流速度は、困難であり、細胞生存能力に対して重要である。循環流体として細胞培養培地を使用する、高い酸素要件を有する肝臓の酸素消費速度に基づいて、約６〜１０μＬ／秒の流速が、数百万個の細胞あたりに必要とされる（Ｐｏｗｅｒｓ  Ｍ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ」７８、２５７−６９（２００２年）、Ｄｏｍａｎｓｋｙ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ」１０、５１−５８（２０１０年）、Ｅｂｒａｈｉｍｋｈａｎｉ  ＭＲ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ａｐｒ」１３２−５７（２０１４年））。気体交換が、開示される装置における開放流体システム内の空気−液体界面において起こり得るため、プラットフォーム材料自体は、随意であるが、酸素透過性である必要はない。
【０１３８】
酸素供給尾部
細胞培養のための主要ウェルに加えて、尾部が、好ましくは、生存のためにより高いレベルの酸素供給を要求する肝臓等の器官のために設計される。酸素供給尾部は、浅い壁、より速い再循環、ならびに独立した流入および流出ライン等、培地の中への酸素のより良好な拡散および混合を支援する特徴を有する。
【０１３９】
酸素供給尾部の例示的レイアウトは、誘導溝尾部（図３３）、垂直に丸められた形である（例えば、深くする）尾部、ピニングカラムを伴う平坦尾部、およびメニスカスピニング溝尾部を伴う平坦尾部を含む。
【０１４０】
尾部は、好ましくは、十分な通気／酸素供給のために、液体の深さが５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、または１ｍｍと同程度に薄くあり得るような傾斜面を含む。好ましい実施形態では、本装置は、最大１ヶ月、２ヶ月、またそれよりも長くにわたって細胞培養物生存を支援する。
【０１４１】
尾部表面上の表面粗度およびパターンの幾何学形状に加えて、尾部の曲がりならびに尾部の幅が、酸素供給を強化するために修正され得る。例えば、ジグザグ形の蛇行した尾部は、肝臓モジュールのための低減された液体体積を要求する酸素供給を強化するための手段を提供する。各折り返しループまたは折り返し点は、メニスカスがピニングし得る場所である。図３４は、肝臓モジュールのためのジグザグ尾部レイアウトを図示する。約２２５ｍｍの合計尾部長が、強化された受動的酸素供給のために、約８０μＬの合計尾部体積を支持し、すなわち、空気に暴露される液体の表面積を増加させ得る。図３５は、酸素供給尾部に沿って繰り返し存在する位相誘導幾何学形状を図示する。本尾部は、ジグザグ尾部全体を通して繰り返される様式で、それぞれ、交互する最大幅および最小幅Ｗ１およびＷ２（Ｗ１＞Ｗ２）を有する。概して、２つのＵ形ループ間の尾部の各区画内に、交互する最大および最小幅の２回、３回、４回、またはそれを上回る繰り返しが存在する。交互される幅は、それぞれ、その独自の長さを有し、例えば、全ての最大幅Ｗ１は、Ｌ１の長さを有し、全ての最小幅Ｗ２は、Ｌ２の長さを有する。概して、より多くの体積を収容するために、Ｌ１は、Ｌ２よりも長い。位相誘導特徴は、幅の角度増加に起因する。図３５に示されるように、角度αは、尾部内の流体流の順方向に対する尾部幅の増加を表す。尾部幅の角度増加、すなわち、順方向流体流の方向における尾部幅の狭化は、流体指向性のためのより良好な誘導を提供する。Ｗ１は、０．１ｍｍ〜１０ｍｍ、例えば、約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲内であり得る。Ｗ２は、０．０５ｍｍ〜５ｍｍ、例えば、約０．３ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲内であり得る。Ｌ１は、０．５ｍｍ〜１０ｍｍの範囲内であり得る。Ｌ２は、０．１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲内であり得る。角度αは、９０°〜１８０°の範囲内であり得る。一実施形態では、Ｗ１は、０．８ｍｍであり、Ｗ２は、０．４５ｍｍであり、Ｌ１は、１ｍｍであり、Ｌ２は、０．５ｍｍであり、αは、１５０°である。ジグザグ酸素供給尾部の深さは、約０．０５ｍｍ〜５ｃｍ、例えば、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲内の固定された深さまたは徐々に変動する深さであり得る。一実施形態では、尾部の深さは、０．５ｍｍに固定される。
【０１４２】
能動的酸素供給圧送システム
酸素供給を強化するための別の手段は、肝臓ウェルと尾部との間の両方向において能動的酸素供給圧送システムを利用することである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、肝臓培養ウェルは、それ自体の中に、再循環圧送システムを有し、したがって、これは、酸素供給された培地の底部−上部流動を有する。概して、浅い深さの液体を含有する酸素供給尾部は、それ自体の中で再循環され、したがって、要求される酸素濃度に、定常状態において到達する。能動的圧送は、足場を伴うウェルからの培地（概して、代謝消費に起因して、酸素が少ない）が、酸素の豊富な尾部部分に圧送されることを可能にする。尾部からの酸素供給された培地は、次いで、ウェルに戻るように圧送される。
【０１４４】
（５）  取り外し可能な挿入物
灌流のために統合可能な取り外し可能な足場
取り外し可能な足場が、選択肢、例えば、肝臓および膵臓のＭＰＳのために使用され、灌流された組織のオフプラットフォーム播種、操作、およびアッセイを可能にし得る。他者による以前の足場は、損傷または汚染を引き起こさずにプラットフォームから除去することが困難である。いくつかの実施形態では、取り外し可能な足場は、標準サイズである、例えば、開示されるプラットフォームおよび／または商業的に利用可能なＬＩＶＥＲＣＨＩＰ（登録商標）と適合するフィルタならびに保定リングを保持する。
【０１４５】
足場は、傾斜した誘導ランプに沿った回転および摺動を介して、緩やかな挿入および除去を可能にするように構成される。これらの足場と併用するために設計されるいくつかのＭＰＳコンパートメントは、足場の挿入および／または除去を誘導するために、傾斜したランプを含む。本プラットフォームとの半径方向シールが、低結合Ｏリング（例えば、ＶＩＴＯＮ（登録商標）Ｏリング）を用いて確立され、取り外し可能なデバイス全体の灌流を可能にする。
【０１４６】
図３６は、灌流された細胞構築物が周辺プラットフォームから緩やかに除去されることを可能にする、例示的モジュール式取り外し可能な灌流足場を図示する。本デバイスは、半径方向Ｏリングシール１６１ａ／１６１ｂを伴うカップ様シェルと、その基部における流動拡散支持構造とを含む。生体材料を伴う、または伴わない細胞は、本支持体１６２の上部上で成長することができる。足場の上側本体または延長アームにおける本デバイスの側上では、２つの孔が、滅菌ピンセットを用いた操作を可能にし、小さいフランジが、ランプねじ山に沿ってこれを誘導することに役立つ。ランプ１５９は、垂直力ではなく、回転を介して緩やかな挿入および除去を可能にする。足場を定位置にトルク付与することは、挿入および除去中に細胞が被る流体圧力を最小限にする。
【０１４７】
携帯性が、マルチウェルバイオリアクタの使用性を改良するいくつかの機能を可能にする。例えば、構築物が、一意の細胞培地中で単離して培養され、次いで、それらがヒト生体機能チップ実験のためにともに継合される前に、健常性および生存能力に関して選択されることができる。取り外し可能な足場がまた、マルチウェルバイオリアクタからの１つの細胞集団の完全な単離を可能にし、細胞健常性および代謝の外部アッセイが、共有される培地を潜在的に有害な試薬によって汚染することなく実施されることを可能にする。
【０１４８】
足場は、本プラットフォーム上で、下方、すなわち、ウェルの底面からの流体流入および他のウェルへの流出路流出を支援する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、流体凝集デバイス１６３が、随意に、取り外し可能な灌流足場上に追加され、狭いオリフィスの中への流動を収集する。流体は、混合され、凝集された流体が、固定された場所を過ぎて収集される。流出場所において、酸素分圧または他の流体性質が、本デバイスの上部の内側に静止する小さいプローブによって照会されることができる。このように、平均Ｏ２測定のためのセンサは、培地または培養物の一部の中への浸漬を要求しない。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、膜上に置かれる、約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、好ましくは、約０．１ｍｍ〜約１ｍｍ、または約０．２５ｍｍの薄い底部／壁厚さを伴う薄い足場が、強化された酸素供給のために肝臓関連細胞を播種するために利用され、足場は、チャネルのアレイ（例えば、約０．３ｍｍ直径）を用いて穿孔され、再循環流マルチウェル板バイオリアクタ内に維持される。足場の中に播種される肝臓細胞は、３Ｄ組織様構造を形成し、これは、過剰な剪断を伴わずに足場を横断して生理学的酸素分圧降下を生成するために十分な流速において灌流され（Ｙａｔｅｓ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」９７、２２５−２４６（２００７年））、無血清培養培地中で数週間にわたって機能状態において維持されることができる。
【０１５１】
ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）
本装置は、商業的に利用可能なＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）挿入物または細胞もしくはオルガノイドを支持するためのカスタム生体材料足場等、細胞培養のための複数の挿入物伝達手段を保持するために適合するウェルを含有することができる。
【０１５２】
（６）  蒸発を低減させるためのモート
加えて、または代替として、本装置のいくつかの実施形態は、細胞培養培地から局所的湿度を増加させ、蒸発を低減させるために、湿度モート（図５の要素１０４）を含む。モートは、外部流体供給源または流体板内の内蔵流体チャネルを介して圧送される流体に接続され得る。モートの中への流体の監視および圧送が、概して、器官培養ウェル内の流動変動に依存する、蒸発に起因する液体の損失を補償するために必要とされ得る。プラットフォーム内モートまたはマイクロ蒸発チャンバは、流体板の任意の領域内に配置され、モート面積を増加させ、ウェルからの蒸発を最小限にし、マイクロ生理学的ウェル区域の周囲に湿度微小環境の生成を可能にすることができる。モート内の局所的加熱もまた、使用され得、したがって、本プラットフォームの上方に高い相対的湿度を維持するための蒸発の大部分は、モートに由来する。
【０１５３】
（７）  作用剤／試料の添加または抜去のための手段
本装置は、１つまたはそれを上回る自動サンプリングデバイスに接続される、またはそれと併用され得る。例えば、自動サンプリングデバイスは、低湿潤サンプル収集管に流体的に接続され得る。
【０１５４】
（８）  空気圧式作動
オンボード圧送は、商業的シリンジまたは蠕動ポンプと比較して空間およびコストを劇的に節約し、より拡張可能であり、非常に少ない死容積を伴う閉ループ動作を可能にする。流速および指向性の動的制御が、濃度プロファイルの精密な調整を可能にし、実験動作が臨床／生理学的分布に合致するようにスケーリングされることを可能にする。流動パーティション化が、個々のマイクロ生理学的システムにおいて具体的圧送周波数を付与することによって制御され、具体的流速、したがって、流動の「パーティション化」につながる。
【０１５５】
空気圧式マニホールド／板
流体板内の空気圧で制御される流体流は、概して、３チャンバユニット、例えば、図４の２２０ａ、２２０ｂ、または２２０ｃを介して達成される。図３７Ａおよび３７Ｂは、それぞれの側上で、中心のポンプおよび２つの弁を含有する、例示的３チャンバユニットの詳細を図示する。連続的に作動されると、本弁配列は、逆流を防止しながら、順方向流体変位を可能にすることによって、流動における指向性を提供することができる。良好に特徴付けられる信頼性のある弁−ポンプ−弁ユニットは、流体の固定されたストロークを提供し、これは、決定的な流体流を生成する。これは、約１μＬ／日〜約１０ｍＬ／分の広い動的圧送範囲を支援する。いくつかの実施形態では、圧送チャネルのうちの１つまたはそれを上回るものもしくは全ては、可逆性流を有し、プライミング、サンプリング、および／または培地／薬物送達構成を支援する。
【０１５６】
概して、空気圧式層は、貫通設計を使用し、空気入口および空気出口２１０ａおよび２１０ｂ（板の配向に対する入口および出口）を伴う空気導通作動ラインが、好ましくは、直線経路において、空気圧式板を水平に通過する。空気導通作動ラインの直線経路は、より少ない合計プラットフォーム占有面積を占有し、それらは、より速い空気圧応答（例えば、低体積に起因する速い圧力変化）を支援する。対称である空気入口および空気出口は、プラットフォームが同時に起動するためにデイジーチェーン接続されることを可能にし、１つの板の出口を、短い長さの管類を用いて次のものに直接接続する。
【０１５７】
空気圧式マニホールドは、概して、内部空気圧式チャネルの作成を可能にする材料の単一結合層を採用する。空気圧式アクチュエータ膜は、概して、空気圧式板と流体板との間に押圧されるか、または板のうちの１つに取り付けられ得る、単一層ポリマー材料、例えば、ポリウレタンである。本場合における流体側は、流体の指向および排出を可能にするミクロン範囲の分解能幾何学形状を伴う流体チャネルを含有する。流体チャネルのより高い分解能は、概して、流体移動のより緩慢な速度につながるが、これは、より小さい死容積を可能にし得る。
【０１５８】
４レーン二重チャネルポンプ
弁−ポンプ−弁（Ｖ−Ｐ−Ｖ）空気圧式作動構成に加えて、ポンプ−ポンプ−ポンプ（Ｐ−Ｐ−Ｐ）構成が、流体の蠕動移動を可能にするために追加されることができる。
【０１５９】
３チャンバユニットの２つまたは３つのセットは、図３８に示されるように、１つまたは２つの空気導通作動ラインを共有し得る。（流体板の）流体チャネルが、１つの作動ラインをオフにして配置され、１８０°位相がずれる、Ｖ−Ｐ−ＶポンプのセットおよびＰ−Ｐ−Ｐポンプのセットの両方によって空気圧で調整される２つのチャネルに分割されると、これらの２つの脈動するストロークから組み合わせられる全体的流体は、平滑な体積プロファイルを有する。これらのポンプの２つのセットのための４つの作動ラインは、４自由度を占め、これは、Ｖ−Ｐ−Ｖ構成よりも１つだけ多くの空気圧式ラインを要求する。
【０１６０】
１つまたはそれを上回るｘチャンバユニット（ｘ＞＝３）が、図３８に示されるものと類似する原理において、１つまたはそれを上回る空気導通作動ラインをオフにして配置され、カスタマイズされた流体体積の平滑度を有し得る。
【０１６１】
モジュール式圧送
独立した圧送が、共有されるポンプによって提供されるものと異なる、例えば、それよりも高い流速を可能にする。板への流体ウェルの組み込みは、管類の必要性を低減または排除することができるが、ポンプ設計は、外部流を駆動することにも同様に適し得る。フェルール接続等の接続が、内蔵ポンプを外部管類とインターフェースさせるために使用され、圧送マニホールドが同時にコンパクトな包装内で多数の流動を駆動することを可能にすることができる。
【０１６２】
単一通過または再循環灌流のためのポンプブロック
上部または流体層は、ＭＰＳコンパートメントと、それらを相互接続するポンプおよびチャネルとを含有する。流体層の下方で、ポリウレタン膜等の薄い膜が、チャネルのためのシール面を提供し、ポンプのための作動層として機能する。底部層は、圧縮空気を各ポンプチャンバの基部に配索することによって、ポンプの空気圧式作動を提供するマニホールド（例えば、アクリルマニホールド）である。減圧が印加されると、膜は、空気圧式層に向かって下方に引動され、流体を用いてポンプを充填する。逆に、圧力が印加されると、膜は、流体板へ上方に押進され、ポンプから流体を駆動する。３つのチャンバを連続して作動することによって、固定された変位蠕動ポンプが、形成され、逆流を伴わずに流体が直線状にヘッド圧に対して移動されることを可能にする（Ｄｏｍａｎｓｋｙ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１０（１）：５１−５８（２０１０年）、Ｗａｌｋｅｒ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」１７（５）：８９１（２００７年））。
【０１６３】
膜応力を低減させるための幾何学形状
図３７Ｂに示されるもの以外のポンプの異なる幾何学形状が、使用され得る。代替形態は、ポンプを弁に接続する水平チャネルが除去され、２つの隣接するチャンバを直接リンクするＶ形接続のみを残す設計を含む。これらのＶ幾何学形状の背後にある論拠は、これらの特徴が、膜が偏向すると、１つのチャンバを他のものから空気圧で隔離し、したがって、１つの弁が作動されると、その隣接する弁は、応答しないことである。ポンプ幾何学形状の代替構成は、膜応力を低減させ、作動システムの寿命およびその一貫性を増加させ得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ポンプ空洞幾何学形状のさらなる修正が、膜と異なるＶ形ブリッジとの間に１つの凹状接点および１つの凸状接点をもたらすように作成され、したがって、膜変形および破壊を防止する。
【０１６５】
圧送の検証
意図される流速と実際の流速との間の等価性は、プラットフォーム上のＭＰＳ間の良好な混合および意図される分子生体内分布を可能にする。本ハードウェアの検証は、毛細管流測定ツールを使用するポンプ速度の直接測定を含み得る。いくつかの実施形態では、ツールは、各ＭＰＳコンパートメント内の出口とインターフェースされ、したがって、流動が、固定された長さの管類を充填するために要求される時間の関数として測定され得る。１つの流体板から別のものへの流速の逸脱は、ポンプチャンバの深さにおけるわずかな機械加工差異に起因し得る。それにもかかわらず、測定から計算されるソフトウェア較正係数が、圧送速度を標的流速の約±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％以内に補正するために入力され、個々のポンプを調節し得る。概して、誤差のわずかなマージンは、依然として、信頼性のある決定的な動作および正確なデータ解釈を可能にする。
【０１６６】
（９）  非接触流体レベル感知のための手段
３電極設計を用いた容量感知
ＭＰＳウェル内の流体レベルは、静電容量感知を使用する非接触様式で測定され得る。電荷は、プラスチックを通過し、したがって、プローブが、ウェルに隣り合うが、ウェルの培地／培養物と接触せずに配置され、可能性として考えられる汚染を回避することができる。静電容量感知プローブが、（例えば、プラスチックから作製される）ウェルの壁材料内に埋設され得る。回路は、流体接触を伴わずに、壁を通して静電容量を感知する。静電容量感知電極が、流体から隔離されるプラスチックの層の後方に位置する。図３９に示されるように、前面電極１２０１が、流体に近接する静電容量を測定する一方、背面電極１２０３が、（基準として）プラスチックの静電容量のみを測定する。前面電極および背面電極は、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）基板１２０２またはフレックスバッキングの２つの側上に構築され、したがって、それによって裏打ちされ得る。前面電極は、中間に感知電極を有し、２つの基準電極を各側に１つずつ有し、これらは、中央感知電極と同一面にある（図４０）。基準電極および感知電極の本編成は、良好な合致を可能にする。鏡面対向電極が、自己防護を提供する。
【０１６７】
以前の設計は、非接触様式においてウェル壁内から液体レベルを測定する試みにおいて、１つの負の（基準電極）導電性板を１つの正の（感知電極）導電性板に横並びかつ同一面に配置する。これは、基準コンデンサＣｒｅｆを誤った場所に配置させ、流体レベルの不正確な測定をもたらす。
【０１６８】
本装置は、３つの対称である電極、すなわち、ＰＣＢ基板の裏側上の電極のミラーセットと結合される、中央感知電極と同一面にあり、それを中心として対称である２つの基準電極を含有する改良された設計を利用する。これは、自己防護およびより良好な合致のために、正しい場所におけるＣｒｅｆをもたらす。
【０１６９】
光学測定
流体面の光照射が、ウェル内の液体の深さを示し得る。
【０１７０】
圧力感知
いくつかの実装では、ウェル内の流体の高さを判定するために、圧力センサを使用することが、有利であり得る。これは、Ｐ＝ｒｈｏ×ｇ×ｈによって与えられる圧力と高さとの間の周知の関係が与えられて可能であり、式中、Ｐは、圧力であり、ｒｈｏは、流体密度であり、ｇは、重力加速度であり、ｈは、流体高である。当分野で公知のタイプの圧力センサが、ウェルへの流体接続内に組み込まれ得、したがって、圧力センサは、既知の基準高さにおいてウェル内の圧力を測定する。
【０１７１】
体積および流速に関するポンプのフィードバック制御
ウェル内の流体レベルの測定値は、１つまたはそれを上回るＭＰＳウェルの中に圧送される液体の流速を調整する制御ユニットに伝送されることができる。ウェル内の流体高の容量感知測定によって、そのウェル内の液体の体積が、ウェルの既知の表面積を用いて計算されることができる。したがって、流体レベルのリアルタイム測定が、体積流速（すなわち、その期間にわたる流体高における差異）の情報を提供する。フィードバックは、ＭＰＳウェルへの設定点体積および圧送流速の制御を促進する。
【０１７２】
（１０）  温度および圧力感知ならびに制御のための手段
温度が、全体的温度を３７±０．５度以内に維持する培養器内にこれらのプラットフォームを配置することによって制御される。圧力感知が、当分野で公知の静的圧力感知センサタイプのいずれかを用いて行われ、ウェル内の流体高のインジケーションを与えることができる。フィードバックループにおいて、静電容量流体レベルセンサまたは圧力センサを使用してウェル流体高を測定するためにセンサを組み込むことは、ウェル流体体積を能動的に制御する際に役立つことができる。
【０１７３】
（１１）  統合された構成要素の組立
空気圧側の流体側との固着  
いくつかの実施形態では、整合ピンを通したボルト締めが、バイオリアクタの空気圧側を流体側と組み立てるための手段として使用され得る。不十分なシールは、流体漏出をもたらし得る。
【０１７４】
クランプ締めが、バイオリアクタの空気圧側を流体側と固着させるための代替手段として使用され得る。機械的ならびに磁気的クランプが、流体板、作動膜、および空気圧式板をともに咬持するために使用され得る。
【０１７５】
ホイップルツリー圧力分配機構が、異なる空気作動ラインを横断して、またはプラットフォームを横断して圧力を分配する際に利用され得る。
【０１７６】
複数のバイオリアクタのデイジーチェーン
いくつかの実施形態では、２つまたはそれを上回る多器官ＭＰＳプラットフォームは、空気入口および出口において次々とチェーン接続される。空気圧式板を横断する空気導通作動ラインの貫通直線経路設計によって、２つまたはそれを上回るプラットフォームは、空気圧および同一のコントローラのセットを共有する。いかなる付加的ハードウェアも、群におけるプラットフォームの数を増やすために必要とされない。各バイオリアクタ上の対称である空気入口および出口によって、デイジーチェーン接続は、設定および分解することが容易である。本特徴は、いくつかのバイオリアクタ／ＭＰＳプラットフォームを同時に動作させるための時間、コスト、および空間を節約する。
【０１７７】
多層生体機能チップ流体および空気圧式板
図４１は、プラットフォームの多層積層構成に関する圧送システムの十字交差設計を図示する。
【０１７８】
多層生体機能チップ板は、独立した層の接合または３Ｄ印刷のいずれかによって作製される、内部チャネルを介して組み立てられ得る。ポンプ間の接続は、本より高密度の流体板のために、重複することができる。これはまた、異なる圧送および弁構成（例えば、空気圧式作動において説明されるもの等）と適合する。多層板を有する能力は、弁内のＶカットを交換し得る内部チャネルを可能にし、これは、弁動作に起因する圧力スパイクを低減させ、より決定的な圧送プロファイルに関する性能を改良する。
【０１７９】
多層板は、単一層咬持板に優るいくつかの利益を有し得る。より高い密度のポンプおよびチャネルは、概して、より良好なシール、全体的デバイス占有面積の削減、使い捨てマニホールドに対して必要とされない洗浄、および交差チャネルを用いて制御を多重化する増加された能力を可能にする。また、撮像が所望されるか、またはセンサが測定のために挿入される必要がある面積の周囲でチャネルを迂回させることは、単一層チェーン構成よりも多層板構成において容易である。これは、培養ウェルのレイアウトおよび新しいポンプ構成を組み込む能力においてさらなる自由を提供する。
【０１８０】
外部接続
多層バイオリアクタ装置は、外側から圧送源を提供するために、マイクロコントローラおよび外部空気圧式ソレノイドマニホールドに接続され得る。バイオリアクタ装置の培養に関して、培養器の後部を通して中継コネクタに延設される、３６個またはカスタマイズされた数の管類のチャネルを制御する空気圧式ソレノイドマニホールドが、接続される。培養器の内側では、管類が、弁付き分離式結合具を通してプラットフォーム／バイオリアクタに取り付けられ、培地交換およびサンプリングのための培養器からの容易な除去を可能にする。コネクタおよびソフトウェアアーキテクチャは、ソフトウェア構成を殆ど修正せずに、設定が、２方向、３方向、４方向、５方向、６方向、７方向、またはカスタマイズ可能な数の多器官プラットフォーム、ならびに多くの将来のプラットフォーム変形例と適合することを可能にする。ポンプ流速および較正係数は、ラップトップ上のグラフィカルユーザインターフェースを通して設定され、ＵＳＢまたはＷｉＦｉを経由してカスタマイズされたマイクロコントローラ（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｍｙＲＩＯ−１９００）に送信されることができる。ポンプ速度の手動および事前プログラムされた制御の両方が、実験必要性に応じて利用可能であり、マイクロコントローラは、ラップトップから独立して起動することができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、多器官ＭＰＳプラットフォームは、コントローラとポンプとの間の局所リザーバに接続される。他の実施形態では、これは、外部供給源のインポートおよび廃棄物のエクスポートのために、外部マイクロ流体デバイスに接続される。
【０１８２】
コンピュータ化動作
制御ソフトウェアが、マイクロコントローラ（例えば、ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ  ＭＹＲＩＯマイクロコントローラ）等の適切なデバイス上に、またはそれを用いてインスタンス作成／インストールされ、専用ラップトップまたはデスクトップコンピュータの必要性なくフィジオミメティックプラットフォームの連続的動作を可能にするように構成されるが、いくつかの実施形態は、そのような専用コンピュータを利用し得ることを理解されたい。ソフトウェアは、（栄養素および酸素を細胞に提供する）流体補充および混合、内部もしくは外部源からの新鮮な培地の導入（給送）、内部もしくは外部収集容器への培地の除去（サンプリングおよび廃棄物収集）、ならびに／または試験化合物、成長因子、薬物、もしくは他の着目実験の化学物質／タンパク質の投与（投与）を目的として、本プラットフォーム内に含有される空気圧式ポンプを動作させる。
【０１８３】
混合、給送、サンプリング、および投与の制御のためのグラフィカルユーザインターフェースを提供することによって、本ソフトウェアは、コンパートメント化された器官の生理学的相互作用を複製することを意味する複合的な実験の実行を促進する。
【０１８４】
コンポーネントおよび／またはソフトウェアはまた、マイクロコントローラ、空気圧式ソレノイド、圧力センサ、および／または電力分配電子機器を含有し得る、ハードウェアに統合された圧力および減圧センサからリアルタイムフィードバックを提供する。いくつかの実施形態では、許容可能範囲外の圧力および減圧のドリフトに関するアラームを追加する能力もまた存在し、これらの値の長期データロギングが、実装されることができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、個々のおよび全体的補正係数が、ソフトウェアに組み込まれ、本プラットフォーム上のポンプにおける製造変動に関する補正を可能にする。例えば、同一の周波数（例えば、２Ｈｚ）において動作する２つのポンプは、一方が他方よりもわずかに深く機械加工されている場合、必ずしも、全く同一の速度において圧送するわけではない。補正係数を（反復的および／または実験的に）判定することによって、ポンプの速度は、非常に厳密になるように調整されることができ、ポンプは、２Ｈｚにおいて１μＬ／秒を標的とするように測定、較正、および再測定された。ソフトウェア補正係数は、ポンプの性能を改良し、プラットフォームを横断する製造変動を最小限にする。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、マイクロコントローラは、ＷｉＦｉと適合性がある。ソフトウェアは、ポンプを制御するためのウェブＵＩおよびバックエンド（例えば、ＬａｂＶｉｅｗバックエンド）を用いて構成されることができる。これは、ユーザが、マイクロコントローラに物理的に接続する必要なく、ウェブブラウザにおいてソフトウェアの制御パネルにアクセスすることを可能にし、部屋を横断する、または世界中からの実験の遠隔制御および監視を可能にする。
【０１８７】
ユーザから出力への例示的情報フローは、以下を含む。ユーザは、ローカルネットワークを経由して、またはＶＰＮを介して遠隔にウェブＵＩにアクセスする。制御変更が、ウェブＵＩからバックエンドに渡され、これは、所望の流速を満たすために、ソレノイド作動のタイミングを調節する（個々のおよび全体的ポンプ較正係数を考慮する）。マイクロコントローラは、次いで、３Ｖデジタルオン／オフ信号を制御盤に出力し、これは、その信号を所望のソレノイドの１２Ｖアナログ作動に増幅する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、誤動作するソレノイドを見出すか、または本プラットフォームの個々のポンプおよび弁の手動開放／閉鎖を目的として、あらゆるソレノイドの手動動作を可能にするデバッグモードが存在する。
【０１８９】
異なるプラットフォームハードウェア設計に応じて、ソフトウェアは、４方向プラットフォームソフトウェア（圧送および較正係数を制御し、４器官プラットフォームに関する圧力／減圧データを表示する）、７方向プラットフォームソフトウェア（圧送および較正係数を制御し、７器官プラットフォームに関する圧力／減圧データを表示し、経時的な自動化流速変更を定義するためのプログラムモードを含み、本プラットフォーム上の外部ポートからの自動化給送およびサンプリングを制御する）、３ｘＧＬプラットフォームソフトウェア（圧送および較正係数を制御し、３器官プラットフォームに関する圧力／減圧データを表示し、経時的な自動化流速変更を定義するためのプログラムモードを含み、器官への自動化給送および薬物投与（制御された体積）を制御する）を含む、いくつかの異なる方法において実装される。
【０１９０】
また、コンピュータが、本明細書に開示されるような１つまたはそれを上回るディスプレイを含む、１つまたはそれを上回る入力および出力デバイスを有し得る。これらのデバイスは、とりわけ、ユーザインターフェースを提示するために使用されることができる。ユーザインターフェースを提供するために使用され得る出力デバイスの実施例は、出力の視覚表現のためのプリンタまたは表示スクリーンおよび出力の可聴表現のためのスピーカまたは他の音声生成デバイスを含む。ユーザインターフェースのために使用され得る入力デバイスの例は、キーボードならびにマウス、タッチパッド、およびデジタイザタブレット等のポインティングデバイスを含む。別の実施例として、コンピュータは、音声認識を通して、または他の可聴フォーマットにおいて入力情報を受信し得る。
【０１９１】
そのようなコンピュータは、企業ネットワーク等のローカルエリアネットワークまたは広域ネットワークおよびインテリジェントネットワーク（ＩＮ）またはインターネットを含む、任意の好適な形態における１つまたはそれを上回るネットワークによって相互接続され得る。そのようなネットワークは、任意の好適な技術に基づき得、任意の好適なプロトコルに従って動作し得、無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバネットワークを含み得る。
【０１９２】
本明細書に概説される種々の方法またはプロセスは、種々のオペレーティングシステムまたはプラットフォームのうちのいずれか１つを採用する、１つまたはそれを上回るプロセッサ上で実行可能なソフトウェアとしてコード化され得る。加えて、そのようなソフトウェアは、いくつかの好適なプログラミング言語および／またはプログラミングもしくはスクリプトツールのいずれかを使用して書き込まれ得、また、フレームワークまたは仮想マシン上で実行される実行可能な機械言語コードもしくは中間コードとしてコンパイルされ得る。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、マルチＭＰＳプラットフォームを動作させるための開示されるソフトウェアは、１つまたはそれを上回るコンピュータもしくは他のプロセッサ上で実行されると、上記に議論される本発明の種々の実施形態を実装する方法を実施する１つまたはそれを上回るプログラムを用いてエンコードされる、コンピュータ可読記憶媒体（または複数のコンピュータ可読記憶媒体）（例えば、コンピュータメモリ、１つもしくはそれを上回るフロッピディスク、コンパクトディスク、光学ディスク、磁気テープ、フラッシュメモリ、フィールドプログラマブルゲートアレイもしくは他の半導体デバイス内の回路構成、または他の非一過性媒体もしくは有形コンピュータ記憶媒体）として具現化される。コンピュータ可読媒体または複数の媒体は、トランスポート可能であり得、したがって、その上に記憶されたプログラムまたは複数のプログラムは、１つまたはそれを上回る異なるコンピュータもしくは他のプロセッサ上にロードされ、上記に議論されるような種々の側面を実装することができる。
【０１９４】
コンピュータ実行可能命令は、１つまたはそれを上回るコンピュータもしくは他のデバイスによって実行される、プログラムモジュール等の多くの形態であり得る。概して、プログラムモジュールは、特定のタスクを実施する、または特定の抽象データタイプを実装する、ルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造等を含む。典型的には、プログラムモジュールの機能は、種々の実施形態において所望に応じて組み合わせられる、または分散され得る。
【０１９５】
また、データ構造は、任意の好適な形態におけるコンピュータ可読媒体内に記憶され得る。例証を簡易化するために、データ構造は、データ構造内の場所を通して関連するフィールドを有するように示され得る。そのような関係は、フィールドに関する記憶装置にフィールド間の関係を伝達するコンピュータ可読媒体内の場所を割り当てることによって同様に達成され得る。しかしながら、ポインタ、タグ、またはデータ要素間の関係を確立する他の機構の使用を通してを含む、任意の好適な機構が、データ構造のフィールド内の情報間の関係を確立するために使用され得る。
【０１９６】
本方法の一部として実施される行為は、任意の好適な方法で順序付けられ得る。故に、行為が例証されるものと異なる順序で実施される実施形態が、構築され得、これは、例証的実施形態では連続的行為として示されても、いくつかの行為を同時に実施するステップを含み得る。
【０１９７】
ＩＩＩ．  装置の製作
上記に説明される装置は、成形、機械加工、および滅菌プロセスを通して製作され得る。モノリシック表面マイクロ機械加工流体板が、好ましい。これは、信頼性のある性能を提供し、洗浄することが、容易である。表面に接触する全ての流体は、洗浄するためにアクセス可能である。全ての構成要素は、比較的に長い寿命を有し、いかなる層剥離も、オートクレーブ等の滅菌プロセスにおいて起こらない。空気圧は、凝縮を容易に一掃されることができる。概して、本装置は、ともに接合される２つの板構成要素のみを使用し、したがって、全ての空気圧式チャネルは、板内の同一平面を占有する。入口は、そのチャネルを交互配置し、削孔特徴を使用することによって積層され、異なる垂直位置における入口をチャネル層に接続し、したがって、マニホールドの側面上にそれらをより密集してまとめ得る。
【０１９８】
モジュール化されたコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）および機械加工に関するターンアラウンドサイクルは、比較的に迅速である。これは、容易であり、研究者の個々の必要性に従って迅速にカスタマイズ可能である。
【０１９９】
Ａ．  材料
生体機能チップシステムは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスルホン、および他の材料から加工され得る。ＰＤＭＳは、成形することが容易な（したがって、プロトタイプを製造するために非常に適した）多用途エラストマであり、良好な光学性質を有し、酸素透過性である。いくつかの実施形態では、ステロイドホルモンおよび多くの薬物を含む疎水性化合物は、ＰＤＭＳへの強いパーティション化を呈し、したがって、薬物暴露の定量的分析および制御を妨げる（Ｔｏｅｐｋｅ  ＭＷ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」６、１４８４−１４８６（２００６年））。
【０２００】
好ましい実施形態では、流体板は、ポリスルホン（ＰＳＦ）から加工される。ＰＳＦは、食品等級ＦＤＡ承認（２１ＣＦＲ１７７．１６５５）およびＵＳＰクラスＶＩ生体適合性を伴う、剛性、琥珀色の機械加工可能な熱可塑性物質である。これは、概して、広い範囲の化学溶媒に耐性があり、加圧滅菌されることができ、器具類および医療デバイスのために一般的に使用される。ＰＳＦはまた、疎水性および親油性化合物の劇的に低い表面吸着性を有し、そのバルク吸収性を殆ど有していない（Ｎｇ  ＳＦ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」２、２０９−２２３（２０１０年））。
【０２０１】
開示される装置の全ての流体面は、本プラットフォームにおける生体分子または薬物の結合をさらに低減させるために、血清アルブミンを使用して、各実験に先立って不動態化され得る。流体板はまた、必要に応じて、複数回洗浄および再使用されることができる。
【０２０２】
上部流体板は、選択された材料、例えば、ポリスルホン（ＰＳＦ）プラスチックのモノリシックブロックから機械加工され、各ＭＰＳおよび相互接続チャンバ（ミキサまたは混合チャンバと呼ばれる）を収容するためのコンパートメントを含め、戻り流を統合および混合し、全身性循環を表し得る。マイクロ流体チャネルおよびポンプは、流体板の下側に機械加工され、混合チャンバから各ＭＰＳに流体を運搬する。個別に行き先指定可能なマイクロポンプが、内蔵流体チャネルと一直線に加工され、３チャンバの蠕動ポンプ−ポンプ−ポンプ設計または弁−ポンプ−弁設計に基づき得る。各ウェルの下の付加的ポンプが、再循環流を提供し、各コンパートメント内の栄養素および酸素勾配を低減させる。
【０２０３】
Ｂ．  組立および接合のための技法
流体板、空気圧式板、および膜（滅菌バッグ内）は、概して、生物安全性キャビネット内で組み立てられる。組立前に、滅菌マイクロ板蓋が、概して、流体板上にテープ留めされ、細胞培養領域の滅菌性を保護する。層は、次いで、アクリル板を通した視覚整合を補助するために、逆さまに組み立てられることができる。いったん整合ピンが流体板と噛合すると、本プラットフォームは、フードから注意深く除去され、板間のシールを維持するように圧力を保つことができる。板が分離されていない限り、ねじが、非滅菌環境中で挿入および引締されることができる。２つの完全に組み立てられたプラットフォームが、対応するポートに真っ直ぐ横断して接続する短い長さの管類を用いてそれらを接続することによって、デイジーチェーン接続されることができる。デイジーチェーン接続されたプラットフォームは、大きい金属トレイを用いて最も容易に輸送される。
【０２０４】
プラットフォームは、着目細胞培養実験の開始に数日（例えば、４日）先立って組み立てられる。滅菌プラットフォームの表面不動態化（プライミング）が、各コンパートメントに適切な体積における１％ＢＳＡおよびＰＢＳ中のペニシリン−ストレプトマイシンを用いて実行されることができる。ポンプ機能および管類接続が、概して、ミキサから各乾燥したコンパートメントに圧送し、次いで、再循環ポンプを後方に起動し、チャネルから全ての空気を一掃することによって、視覚的に確認されることができる。流出路が、流出路動作を確実にするために、小体積を用いて手動で湿潤されることができる。プラットフォームは、通常、細胞の添加前に不動態化し、全動作を確認するために、培養器内で１晩起動される。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、流体板は、具体的な先鋭さのプラスチック板間の焼結方法を使用して、閉鎖された流路を作成するように接合される。
【０２０６】
図４２および４３は、複数の構成要素を接合するための焼結方法を図示し、底部板２５０は、上部板１５０との１つまたはそれを上回る小さい（例えば、鋭い）接触面積２５１ａ／２５１ｂと、小さい接触面積２５１ａ／２５１ｂの頂点よりもｄ２の差異だけ高さにおいて低い一部の平坦な表面積２５３とを有する。底部板とともに上部板を焼結するための力および処理に続いて、以前までの小さい表面積は、上部板の平坦底面とともに、接触された平坦面２５３の継合高さによって設定される高さまで変形および融合され、流体の通過のための内部空間／容積３５１を有する融合された構成要素３５０をもたらす。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、５０ミクロン厚さ等、約２０〜２００ミクロン厚さ、好ましくは、５０〜１００ミクロン厚さのポリウレタン（ＰＵ）膜が、一定の張力を維持するために、張力リング上に延伸され得る。ねじ孔が、上部板を空気圧式板と整合するために存在する場合、それらは、空気圧式板上のねじ孔の対応するパターンでレーザ切断されることができる。
【０２０８】
膜ダイヤフラム（随意に、空気圧式のポンプおよび弁に対応する領域においてエラストマを含有する）が、空気圧式板と流体培養のための板との間に延伸され、空気圧式板に接着するように押圧されることができる。いくつかの実施形態では、自動化が、膜を流体板に取り付けるために使用される。
【０２０９】
代替として、エラストマパッチが、膜層上に使用され、流体板内にシールおよび密封経路を生成し得る。エラストマ材料は、空気圧式ポンプおよび弁に対応する膜またはパッチの領域においてのみ使用され得る。エラストマパッチを含有する膜は、前もって調製され、チップの組立のために滅菌状態に保たれることができる。これは、エラストマが偏向され、板の非常に局所的な領域においてのみ圧送作用を生成する、生体機能チップ板の組立および動作を促進するであろう。広い範囲のエラストマタイプおよび厚さが、適用可能であり得る。
【０２１０】
Ｃ．  湿潤性を制御するための表面処理
表面パターン化が、生体機能チップ板内の開放流体通路の湿潤性を制御するために使用され得る。機械加工パターンは、ゼブラ（直線状）、シャーク、同心、および平滑表面を含む。
【０２１１】
異なる機械加工プロセスおよびマイクロテクスチャ加工の使用は、生体機能チップのための培養板の湿潤性に劇的に影響を及ぼすことができる。表面仕上げは、水または細胞培養培地との接触角において、ポリスルホン湿潤性を最大約４０°変化まで有意に修正し得る。培養器条件もまた、約２〜３°差異のわずかな範囲で湿潤性を増加させ得る。性能を改良するために、メソ流体デバイスが増加された湿潤性を有することが、好ましくあり得る。
【０２１２】
概して、暗ポリスルホンは、明ポリスルホンよりも疎水性である。異なる等級のポリスルホンの選択は、板の湿潤性を変動するための別の手段を提供する。
【０２１３】
Ｄ．  滅菌
１つまたはそれを上回る滅菌手順が、細胞培養流体板、作動膜、および随意に、空気圧式板に対して実施され得る。滅菌技法は、気体処理（例えば、エチレンオキシド）、電離放射線、超音波処理、表面処理（例えば、界面活性剤）、およびオートクレーブを含む。
【０２１４】
概して、使用前に、上部板（例えば、ポリスルホン上部板）は、洗浄および滅菌される。最初に、板は、約３０〜６０分にわたって約１０％漂白剤中に浸漬され、蒸留水中での短い濯ぎが続くことができる。残留物のない界面活性剤が、次いで、約１５分にわたって約１０％溶液（例えば、７倍溶液、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＃ＭＰ０９７６６８０ＨＰ）中に浸漬された、いずれの残りの汚染物質も超音波処理することによって除去するために使用された。新鮮な脱イオンされた真水中での２つの後続１５分超音波処理サイクルが、最終脱イオン水濯ぎの前に、全ての界面活性剤を除去するために続く。板は、次いで、風乾され、滅菌バッグ内にシールされ、加圧滅菌されることができる。
【０２１５】
概して、空気圧式板は、正式な滅菌を要求しないが、組立に先立って、これは、７０％エタノールを用いて噴霧されたキムワイプを用いて完全に拭き取られ、膜に接触するシール面積からいずれの粉塵または粒子も除去し得る。
【０２１６】
空気圧式アクチュエータ膜が、約１０％の７倍溶液中で、過剰な脱イオン水を用いて濯がれ得る。概して、エチレンオキシド気体滅菌ステップが、膜が風乾された後に続き、膜は、化学的換気フード内で２４時間脱気することを可能にされる。
【０２１７】
Ｅ．  細胞
幹細胞およびパネート細胞等の分化された細胞タイプおよび特殊化された細胞タイプ、ならびに腸ＭＰＳ等のいくつかの実施形態のためのマイクロバイオームが、本プラットフォームに添加され得る。
【０２１８】
本プラットフォームによって支持されるマイクロ生理学的システム（ＭＰＳ）は、初代細胞、細胞株、多能性幹細胞、前駆細胞、オルガノイド、または哺乳類もしくは非哺乳類細胞の任意の組み合わせを含み得る。例えば、ＨＴ２９細胞と混合されるＣａｃｏ２細胞またはＣａｃｏ−２細胞からトランスウェル挿入物上に形成される上皮単層が、腸の１つのモデルであり、（トランスウェルの真下の）基底コンパートメント内での循環は、上皮層の頂点側から上皮層の基底側への薬物および他の作用剤の混合、したがって、輸送を改良する役割を果たし、この混合は、基底コンパートメント内での薬物および他の化合物の急速な分配を促進し、したがって、本プラットフォーム上の異なるＭＰＳユニット間の全体的混合を改良する。本モデルは、免疫細胞供給源（例えば、ヒト末梢血単球または他の供給源からの樹状細胞もしくはマクロファージ）を膜の基底側に添加することによって、より洗練されることができる。これは、細胞外マトリクスゲル中にカプセル化される間質の上部上で上皮を培養することによって、さらに洗練されることができ、類似する配列が、初代腸細胞と併用されることができる。第２のタイプの流動モジュールが、肝臓チップライプ配列によって例示され、流動は、組織を通して流動を分配するように設計される足場上に複数のセルタイプを含む、３Ｄ組織を含有する足場を通して圧送される。別の構成では、中央ゲル領域の両側上に流動チャネルを伴う閉鎖されたマイクロ流体デバイスが、組織様３Ｄ島組織またはリンパ節を支持し得、島組織またはリンパ節を伴うゲルの中に播種された内皮細胞が、チャネルを通した島組織またはリンパ節の灌流を可能にする３Ｄ容器を形成する。島組織またはリンパ節はまた、トランスウェル挿入物内のゲル中に維持され得、トランスウェル挿入物の基底側は、内皮細胞を用いて被覆されることができる。最後に、細胞が、中央循環ユニットまたは個々のＭＰＳ循環ユニットのいずれかに添加され、細胞輸送を可能にし得る。例えば、腸の基底コンパートメントに添加されたＰＢＭＣは、炎症信号下で膜を横断して間質に輸送されることができる。
【０２１９】
肝臓における三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）（すなわち、エストロゲン、プロゲステロン、およびＨｅｒ２受容体の発現の欠如）微小転移が開示される装置においてモデル化される、いくつかの実施形態では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、初代ヒト肝細胞および非実質細胞とともに、培養され得る。
【０２２０】
腸および肝臓ＭＰＳが休眠微小転移の炎症関連刺激を評価するためにモデル化される、いくつかの実施形態では、吸収性腸細胞（例えば、ＣＣ２ＢＢ／ｅ１株）およびムチン分泌杯細胞（例えば、ＨＴ２９−ＭＴＸ株）が、概して、２０：１〜５：１、より好ましくは、１３：１〜７：１、または約９：１の数比において頂点面上に播種され得る一方、ヒトＰＢＭＣ由来単球の生体外分化から取得される樹状細胞は、本装置の１つのウェル内のＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）の膜の下側上に播種され得る。
【０２２１】
他の細胞株または細胞タイプも、使用に応じて添加され得る。
【０２２２】
ＩＶ．  適用
生体外−生体内変換（ＩＶＩＶＴ）は、ＭＰＳ結果を臨床的に関連する成果と比較し、検証する解釈ステップである。開示される装置は、薬物動態学および薬力学（ＰＫおよびＰＤ）の予測における内因性成長因子、炎症、およびホルモン信号等の付加的因子を評価する際にＩＶＩＶＴ方法を用いて適用され得る。ＰＫの予測において生体内−生体内相関（ＩＶＩＶＣ）および生体内−生体外外挿（ＩＶＩＶＥ）方法と比較すると、ＩＶＩＶＴは、これらの付加的因子の分析を含み、したがって、加えて、ＭＰＳ技術からの情報を使用して、ＰＤ、臨床毒物学、バイオマーカ、および患者層別化を予測するステップにさらに進む。ＩＶＩＶＴに関する生理学ベースのＰＫ（ＰＢＰＫ）モデルと組み合わせられると、開示される装置は、試験作用剤へのヒト応答に対する改良された定量的予測を提供し、欠落した器官、器官および培地サイズ不整合、および薬物暴露を考慮する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本システムはまた、疾患または障害を例示するために使用されることができる。例えば、本装置は、比較的に大きい（≧１００万個の細胞）肝細胞の塊の状況における微小転移を確立し、次いで、患者において（循環培地に対して）日常的に成され得る測定ならびに患者に対してもまた成され得ない測定（腫瘍細胞成長および死の動態）の両方を使用して、複雑な細胞間連通回路網徴候を分析するために使用され得る。
【０２２４】
Ａ．  臨床前薬物発見
ＭＰＳは、２、３、４、５週間、２ヶ月、３ヶ月、またはそれよりも長い時間等の長い期間にわたって、生体機能チップ上１つまたはそれを上回る器官の生存および機能的培養を支援する。長期の多器官培養は、低クリアランス薬物の薬理学を研究し、繰り返される薬物暴露を支援し、薬物間相互作用を分析し、慢性疾患をモデル化するために特に有利である。
【０２２５】
本プラットフォームは、標的識別および検証、標的ベースのスクリーニング、表現型スクリーニング、および他のバイオ技術用途のために使用されることができる。
【０２２６】
細胞および培地体積は、ＥＬＩＳＡおよび高含量多重化アッセイ等の商業的アッセイのために十分な信号を提供する。
【０２２７】
ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質への細胞内の情報フローのスケール、タンパク質活性状態、および代謝、ならびに類似するタイプの患者由来の免疫細胞機能の分析を横断する複数の何らかのオーミクス測定がある。
【０２２８】
標準的培養システムは、殆どの小分子薬物ＰＫアッセイのために合理的に効果的であるが、適正な療法が欠如する膨大な数の疾患は、炎症影響を有し、標準的培養システムにおいて良好に表されないか、またはモデル化されていない。本装置は、概して、免疫系に関わる薬物開発の後期段階のために特に好適であり得る。本装置は、標準的培養では再現され得ない現象である、抗ＩＬ６受容体抗体、トシリズマブ、およびシンバスタチンの代謝間の複雑な免疫学ベースの薬物間相互作用を再現するように示されている（Ｌｏｎｇ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ」４４、１９４０−１９４８（２０１６年））。
【０２２９】
広い範囲の薬剤（小分子、ペプチド、タンパク質、核酸等）が、医薬、美容、または科学的用途のために、開示される装置において試験され得る。概して、混合ウェルへの添加は、静脈内投与を模倣し、腸ウェルへの添加は、経口投与を模倣する。
【０２３０】
作用剤が、処置または防止されるべき疾患もしくは障害に基づいて選択される。
【０２３１】
Ｂ．  モデル化されるべき疾患および障害
多器官装置は、疾患モデル化および薬物開発のために、特に、病態を表すために、相互作用する器官系の適切な「最小セット」を識別および定義する際に有用なツールである。
【０２３２】
種々の疾患および／または障害のための薬物開発は、開示されるマルチ生体機能チップ装置を利用して、全身性研究のために関連する組織または細胞タイプを培養することによって改良され得る。疾患の局所的特徴、特に、炎症を捕捉する複合的な個々の生体機能チップは、好ましくは、複数の器官と関連付けられるか、または複数のタイプの細胞に関与する全身性疾患もしくは複数の疾患をモデル化するために適用可能である。開示されるバイオリアクタにおいてモデル化され得る疾患および／または障害は、限定ではないが、癌／腫瘍（例えば、乳房、骨、肝臓、肺、および脳における腫瘍）、慢性炎症性疾患（例えば、糖尿病、関節炎、子宮内膜症、アルツハイマー病）、子宮内膜の子宮の外側への非悪性成長（子宮内膜症）または子宮筋の中に変位する非悪性成長（子宮腺筋症）、非アルコール性脂肪肝疾患によって引き起こされるもの等の異常肝機能を含む。
【０２３３】
本システムは、細胞を作用剤に暴露し、異なる投与量において、異なる投与レジメンにおいて、または１つもしくはそれを上回る他の作用剤との組み合わせにおいて作用剤を投与する場合の細胞に対するその効果を判定し、ならびに作用剤が異なる細胞タイプまたは１つもしくはそれを上回る疾患もしくは障害と関連付けられる細胞タイプに投与される場合の細胞に対するその効果を判定するための手段を提供する。これは、少なくとも部分的に制御された条件下で、ヒトを模倣する条件下でヒト細胞を用いて生体外で作用剤を試験し、他の細胞タイプに対する効果、ならびにある効果に関して監視することを所望される細胞に対する効果を探求することを可能にする。これは、より迅速であり、より制御され、さらに、単一クラスの細胞または組織に制限されない。
【実施例】
【０２３４】
本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによってさらに理解される。
【０２３５】
（実施例１）  チップ上の灌流される単一器官マイクロ生理学的システム（ＭＰＳ）
（１）  肝臓：３週間灌流される肝細胞−クッパーの培養
材料および方法
代謝性かつ免疫学的にコンピテントな３Ｄ凍結保存ヒト肝細胞およびクッパー細胞が、共培養された。複数の肝細胞およびクッパー細胞ドナーが、ＭＰＳにおいて適格とされた。共培養物は、０．０１μｇ／ｍｌまでのリポ多糖類（ＬＰＳ）刺激に応答した。
【０２３６】
結果
表１は、灌流されたＭＰＳプラットフォームにおける７日にわたる、肝細胞のみならびに１０：１比における肝細胞およびクッパー細胞の共培養物の比較を示す。
【０２３７】
【表１】
2019505214.tif 000009
【０２３８】
共培養された肝臓ＭＰＳのインターロイキン６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の分泌が測定された。ＬＰＳ刺激へのＩＬ−６応答の再現性が、判定された。生理学的に関連する（比較的に低い）レベルのコルチゾールが、共通培地中で使用された。ヒドロコルチゾン（コルチゾール）は、分化された機能を強化したが、炎症応答を抑制した。
【０２３９】
灌流されたＭＰＳプラットフォーム上の凍結保存されたヒト肝細胞およびクッパー細胞共培養の持続時間は、３週間に延長された。
【０２４０】
８４個の肝臓遺伝子の発現は、７日目〜２１日目で安定したままであった。クッパー細胞は、ＬＰＳを用いて刺激されるまで、２１日にわたって不活性化されたままであった。細胞死マーカＬＤＨは、播種後に低下し、一定の低いレベルのままであった。アルブミンおよびＣＹＰ４５０を含む肝臓表現型活性は、測定可能なままであり、２１日にわたって２Ｄ培養物よりも優れていた。ＣＹＰ４５０活性は、培養物におけるヒドロコルチゾンレベルに感受性があった。
【０２４１】
（２）  肺：初代ヒト気管気管支上皮分化
材料および方法
気管気管支モジュールが、ＭＰＳプラットフォーム上のＴＲＡＮＳＷＥＬＬ内に開発された。初代基底上皮細胞（全てＣＫ５＋）が、空気−液体界面において、上皮細胞タイプの全サブセットに分化された。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）、粘液生産、分化細胞集団、および基底ＩＬ−８生産を含む、異なるメトリックが、評価された。
【０２４２】
結果
蛍光顕微鏡画像が、取得され、分化および機能マーカ、すなわち、チューブリン（繊毛）、Ｃｋ５（基底）、Ｍｕｃ５Ａｃ（杯）、およびファロイジン（アクチン）の発現を確認した。
【０２４３】
【表２】
2019505214.tif 000010
【０２４４】
表２は、生理学的推定値と良好に整合される程度において、細胞の肺ＭＰＳモデル支援分化を確認し、これは、初代ヒト気管気管支上皮モデルのその機能を示した。
【０２４５】
（３）  子宮内膜：上皮−間質の半初代共培養は、安定し、機能的に糖タンパク質を分泌する。
材料および方法
月経サイクルでは、ヒト子宮内膜は、エストロゲンの増加したレベルによって示される増殖期と、プロゲステロンの増加したレベルによって示される分泌期とを経る。分泌期では、子宮内膜は、グリコデリン、プロラクチン、およびインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦ−ＢＰ１）等の特徴的タンパク質を分泌する。
【０２４６】
ＭＰＳプラットフォーム上のＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）内の細胞培養システムの例示的子宮内膜モデルは、間質細胞をカプセル化するヒドロゲルを含み、ヒドロゲルの上面上の上皮細胞が、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）の頂点側上で培養された。上皮細胞源は、初代ヒト子宮内膜上皮細胞であり、これは、子宮内膜生検から容易に取得され、培養において限定された拡大および寿命を有し、増殖期および分泌期における収穫間で機能的差異を呈し、ロバストなグリコデリン分泌（分泌期細胞）を支援した。使用された細胞株は、イシカワヒト第１ステージ腺癌細胞株であり、これは、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体陽性であり、マトリゲル（Ｃｈｉｔｃｈｏｌｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．による「Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（２０１３年））または機能化ＰＥＧゲル中で分極され、グリコデリンの低／可変分泌を有していた。間質細胞源は、初代ヒト子宮内膜間質細胞であり、これは、ヒト生検から容易に取得され、明確に確立された生体外拡大プロトコルを有し、増殖期および分泌期における収穫間で機能的差異を示した。使用された細胞株は、ヒトｔｅｒｔ不死化細胞株（ｔＨＥＳＣ）であり、これは、非常に増殖性かつ安定性であり、強い脱落膜化のきっかけを伴わないプロラクチンまたはＩＧＦ−ＢＰ１の低／可変分泌を有し、ＰＥＧゲル中で静止され得た。
【０２４７】
結果
イシカワ上皮細胞では、頂点培地は、エストラジオールおよびプロゲステロンを含有していた。イシカワグリコデリン分泌は、検出限界を下回った。ｔＨＥＳＣのオフプラットフォーム培養は、検出限界および初代からのプロラクチン（ＰＲＬ）の量を検出可能な境界線ちょうどにおけるＩＧＦ−ＢＰ１を生産した（希釈効果に起因する可能性が高い）。これらの「半初代」細胞株のオンプラットフォーム共培養は、安定し、頂点サンプリングから検出可能な機能を有していた。
【０２４８】
（４）  腸／免疫：完全な障壁を形成する２週間にわたる共培養および免疫応答をトリガする薬物誘発漏出性
材料および方法
生理学的腸システムは、吸収および代謝、腸免疫系、マイクロバイオームおよび粘膜相互作用間の相互作用、細胞およびマイクロバイオーム間の免疫相互作用、ならびに薬物−免疫相互作用を特徴とする。ＭＰＳプラットフォーム上のＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）内に細胞培養物を伴う例示的な免疫学的にコンピテントな腸モデルが、腸細胞を含み、杯細胞が、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬの頂点側上で共培養され、免疫細胞が、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ膜の基底側上で共培養された。使用された細胞株は、Ｃａｃｏ２（腸細胞）、ＨＴ２９−ＭＴＸ（杯細胞）、および樹状細胞（免疫細胞）であり、腸細胞：杯細胞は、９：１比（小腸を模倣する）において、２週間にわたってオフプラットフォームで成熟するまで培養され、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ膜の基底側上に添加された免疫細胞を伴う灌流プラットフォームに移された。
【０２４９】
結果
オフプラットフォーム（静的培地）で培養されると、免疫蛍光顕微鏡法を介して確認されるように、１４日における免疫細胞は、側底流を伴うオンプラットフォームで培養されたものよりもはるかに少ない生存物を有していた。１４日におけるオンプラットフォーム培養は、腸障壁細胞の機能およびその分化を支援した。
【０２５０】
（実施例２）  チップ上の個々のまたは２方向ＭＰＳにおける薬物毒性の評価．
（１）  肝臓／免疫：ジクロフェナクおよびトルカポンの毒性
免疫学的にコンピテントな肝臓ＭＰＳモデルが、調製および研究された。ジクロフェナクは、肝機能を減損させた一方、細胞死は、最小限であった。トルカポンは、ミトコンドリア活性を減少させ、細胞死を引き起こした。
【０２５１】
（２）  腸／免疫：ジクロフェナクおよびトルカポンの毒性
免疫学的にコンピテントな腸ＭＰＳモデルが、調製および研究された。ジクロフェナクは、上皮障壁完全性を低減させ、細胞死を殆ど伴わずに腸に漏出性を引き起こした。トルカポンは、深刻な細胞死につながり、したがって、上皮機能の完全な喪失につながった。
【０２５２】
（３）  子宮内膜ＭＰＳ：ジクロフェナクおよびトルカポンの毒性
子宮内膜ＭＰＳモデルが、調製および研究された。ジクロフェナクは、細胞死と相関する機能の喪失を誘発した。トルカポンは、細胞死と相関する機能の喪失を誘発した。
【０２５３】
（４）  腸−肝臓２方向：トルカポンの腸への（「経口」）投与が、腸特異性毒性をもたらす。
材料および方法
免疫学的にコンピテントな腸−肝臓相互作用ＭＰＳモデルが、調製（詳細が実施例３に同様に示される）および研究された。トルカポンが、「経口」投与を模倣するために、腸ＭＰＳに添加された。メトリックは、以下のような３つの培地コンパートメントからの体積加重平均であった。信号全身性＝信号頂点、腸×体積頂点、腸＋信号基底、腸×体積基底、腸＋信号肝臓×体積肝臓
【０２５４】
結果
トルカポンの存在下では、腸および肝臓は、ＭＰＳ特異的機能喪失を被り、これは、「経口」で送達されてもトルカポンのＭＰＳ特異的毒性を示した。腸および肝臓はまた、ＭＰＳ特異的細胞死マーカを被った一方、遺伝子マーカは、トルカポンに感受性がなく、これは、トルカポンの毒性部位を示した。腸脂肪酸結合タンパク質（Ｉ−ＦＡＢＰ）が、種々の病態に関する腸細胞損傷の臨床的バイオマーカとして使用された。
【０２５５】
（実施例３）  腸−肝臓２方向ＭＰＳにおける炎症性サイトカイン／ケモカインクロストーク
腸（腸細胞、胚細胞、および樹状細胞）マイクロ生理学的システムと組み合わせられた免疫学的にコンピテントなヒト肝臓（肝細胞およびクッパー細胞）が、通常および炎症状況下の腸−肝臓相互作用を検証するために、本生体外プラットフォームにおいて研究される。
【０２５６】
肝臓は、腸から下流に置かれ、したがって、これは、代謝物、微生物抗原、および炎症性媒介物を含む、腸由来因子に常に暴露される。しかしながら、これらの多細胞組織がコミュニケーションし、全体的（病態）生理学にどのように寄与するかの定量的理解は、限定される。
【０２５７】
背景
腸−肝臓クロストークは、通常の生理機能の不可欠な部分であり、その調節不全は、多くの疾患条件における共通の性質である（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＪＣによる「Ｈｏｓｔ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｒａｕｍａ，  Ｓｈｏｃｋ  ａｎｄ  Ｓｅｐｓｉｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」ｅｄｓ  Ｆａｉｓｔ  Ｅ、Ｍｅａｋｉｎｓ  ＪＬ，  ＆  Ｓｃｈｉｌｄｂｅｒｇ  ＦＷ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、２４３−２５２（１９９３年））。さらに、腸および肝臓は、薬物吸収および代謝に関与する主要器官であり、その機能的相互作用の変化は、治療的介入へのその応答に影響を及ぼし得る（Ｍｏｒｇａｎ  ＥＴによる「Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ」２９（３）：２０７−２１２（２００１年）、Ｄｅｎｇ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」６１（３）：２６２−２８２（２００９年）、Ｌｏｎｇ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」４４（１２）：１９４０−１９４８（２０１６年））。腸および肝機能は、その解剖学的近接によって緊密にリンクされる。肝臓は、門脈循環を介して腸からその血液供給の７０％を受容し、したがって、これは、代謝物、微生物抗原、および炎症性媒介物を含む、腸由来因子に常に暴露される。腸−肝臓軸は、身体の全体的免疫状態にかなり寄与し、腸は、最大の免疫器官であり、肝臓は、身体における合計マクロファージ集団の７０％以上を抱える。種間差異は、多くの場合、動物モデルにおけるヒト応答の正確な予測を妨げ、不一致は、免疫系に関与するプロセスにおいて特に明白である（Ｍｅｓｔａｓ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」１７２（５）：２７３１−２７３８（２００４年）、Ｇｉｅｓｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．による「Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｒｅｖ」６９：１０３−１２２（２０１４年））。例えば、敗血症処置に関する臨床治験の多くは、薬物承認に至っていない（Ｓｅｏｋ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ」１１０（９）：３５０７−３５１２（２０１３年）、Ｆｉｎｋ  ＭＰ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ５（１）：１４３−１５３（２０１４年））。敗血症では、胃腸および肝臓傷害が、増加される疾患重症度と関連付けられる（Ｒｏｗｌａｎｄｓ  ＢＪ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ」５５（１）：１９６−２１１（１９９９年）、Ｎｅｓｓｅｌｅｒ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ」１６（５）：２３５（２０１２年））。敗血症の発病に続く最初の７２時間以内の急性肝不全は、敗血症患者における予後不良と非常に相関していた。しかしながら、特異的かつ予測的バイオマーカの欠如は、効果的な介入のための早期診断および患者層別化を妨げる（Ｐｉｅｒｒａｋｏｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．による「Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ」１４（１）：Ｒ１５（２０１０年））。腸−肝臓軸は、敗血症応答の深刻化に関与しているが、関与する機構および分子プレーヤは、十分に定義されていない。したがって、腸−肝臓クロストークの基本的理解が、薬物消長、有効性、および毒性の予測だけではなく、また、（病態）生理学的機構の解明に対して重要である。
【０２５８】
材料および方法
生体内で、肝臓は、肝動脈および門脈から二重血液供給を受容する（Ｌｉａｓｋｏｕ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ」２０１２：９４９１５７（２０１２年）、Ｂｒｏｗｎ  ＲＰ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ」１３（４）：４０７−４８４（１９９７年））。対応して、ミキサウェルからの流動は、以下の表３および表４に示されるように、生理学的心拍出量および肝臓血流量に比例してスケーリングされる、それぞれ、７５％および２５％になるように腸および肝臓コンパートメントにパーティション化された。腸モジュールからの出力は、肝臓の中に給送され、門脈循環を表した。１５ｍＬ／日の全身性再循環流速が、外因性および内因性因子の効率的分布を確実にするために使用された。
【０２５９】
【表３】
2019505214.tif 000011
【０２６０】
【表４】
2019505214.tif 000012
【０２６１】
本研究における肝臓および腸組織構造は、代謝、障壁、および免疫機能を含む、複数の重要機能を包含するように設計される、多細胞性および（本質的に）免疫学的にコンピテントであった。肝臓微小組織は、先に説明されるように（Ｌｏｎｇ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」４４（１２）：１９４０−１９４８（２０１６年）、Ｓａｒｋａｒ  Ｕ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」４３（７）：１０９１−１０９９（２０１５年））、炎症応答の保持を許容する培養培地中に維持される、生理学的１０：１比におけるヒト初代凍結保存肝細胞およびクッパー細胞の共培養物を含んでいた。腸組織は、小腸を模倣するように操作され、上皮単層は、９：１比の吸収性腸細胞（（Ｃａｃｏ２−ＢＢＥ）および粘液生産杯細胞（ＨＴ２９−ＭＴＸ）に由来し、そして免疫コンパートメントは、初代単球由来樹状細胞を含有していた。
【０２６２】
ヒト初代肝細胞およびクッパー細胞は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＨＭＣＰＭＳ，  ＨＵＫＣＣＳ）から購入された。足場が、７０％ＥｔＯＨ中で１５分間洗浄され、ＰＢＳ中で２回濯がれ、ＰＢＳ中の３０ｎｇ／ｍＬラット尾コラーゲン中の＠ＲＴで１時間にわたって培養され、室温において１晩乾燥され、プラットフォーム（保定リングの下の足場の下のフィルタ）の中にパンチされた。実験開始の３日前に、１０：１比の肝細胞およびクッパー細胞が、温かい凍結保存肝細胞回復培地（ＣＨＲＭ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中で解凍され、８分にわたって１００ｇで遠心分離し、低温の肝細胞播種培地（２５０ｍＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ＋９ｍＬ  Ｇｉｂｃｏ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ａ＋１２．５ｍＬ  ＦＢＳ）中に、それぞれ、６×１０５および６×１０４細胞／ウェルにおいて播種された。１日後、培地は、Ｄ（−２）培地（２５０ｍＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ＋１０ｍＬ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｂ）に交換された。さらに２日後、培地は、相互作用実験の持続時間のための共通培地に交換された。
【０２６３】
本研究において使用された共通培地は、５００ｍＬ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地＋２０ｍＬ  Ｇｉｂｃｏ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｂ＋１００ｎＭ  ヒドロコルチゾン＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）から成っていた。
【０２６４】
Ｃａｃｏ２（クローン：Ｃ２ＢＢｅ１、ＡＴＣＣ、継代４８−５８）およびＴ２９−ＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ、継代２０−３０）細胞株が、腸上皮培養のために使用された。両方の細胞株は、解凍後、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ播種のためのその使用前に、２回継代された。細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｓ１１１５０、３０分にわたって５７°において熱失活）、１倍ＧｌｕｔａＭａｘ（ＧｉｂｃｏＴＭ  ３５０５０−０６１）、１×非必須アミノ酸（（ＧｉｂｃｏＴＭ  １５１４０−１４８）、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＴＭ  １５１４０−１４８）で補完されたＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＴＭ  １１９６５−０９２）中に維持された。約７０〜８０％コンフルエンスにおけるＣａｃｏ２および約８０〜９０％コンフルエンスにおけるＨＴ２９−ＭＴＸが、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＴＭ  ２５２００−０５６）を使用して収穫され、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ播種のために単一の細胞へと機械的に壊された。細胞をＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）の中に播種する際、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ膜の頂点および基底側は、１晩で４℃において５０μｇ／ｍＬのコラーゲンタイプＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５４２３６）を用いてコーティングされた。本挿入物は、非結合タンパク質を除去するために、ＰＢＳ−／−を用いて洗浄された。９：１比のＣ２ＢＢｅ１およびＨＴ２９−ＭＴＸが、１０５細胞／ｃｍ２の密度において、１２ウェルの０．４μｍ細孔サイズＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）挿入物（Ｃｏｓｔａｒ  ３４６０）上に播種された。播種培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＴＭ  １２４９１−０１５）中に１０％熱失活ＦＢＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、１％Ｐ／Ｓを含有していた。頂点培地は、いずれの付着していない細胞も除去するために、播種の１日後に交換された。ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ板の上部および底部コンパートメントは、２〜３日毎に０．５ｍＬおよび１．５ｍＬの播種培地を給送された。７日後、培地は、ＦＢＳをインスリン（５μｇ／ｍｌ）−トランスフェリン（（５μｇ／ｍｌ）−亜セレン酸ナトリウム（５ｎｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ  １１０７４５４７００１）と交換することによって、無血清腸培地に切り替えられた。
【０２６５】
腸−肝臓相互作用における長期機能性生存能力を評価するために、プラットフォーム上の対応する単一組織対照群が、同じ培地体積、流速、および流動パーティション化を用いてアッセイされた。全ての条件は、腸および肝機能の維持を支援する定義された無血清共通培地において試験された。肝細胞（１０：１の肝臓細胞：クッパー細胞）は、組織形成および播種関連ストレス応答からの回復を可能にするために、相互作用実験の開始に３日先立ってプラットフォーム上に播種された。腸ＭＰＳは、相互作用実験の開始に先立って、オフプラットフォームで３週間にわたって分化された。長期動作中、本システム内の共通培地は、３日毎に交換された。
【０２６６】
肝臓の健常性を評価するために、全てのコンパートメントからのサンプルが、培地交換毎（７２時間毎）に取得され、ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｅ８０−１２９）を介してアルブミンに関してアッセイされた。
【０２６７】
種々のチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性が、開発されたＣＹＰカクテルアッセイを使用して測定された（Ｐｉｌｌａｉ  ＶＣ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ」７４：１２６−１３２（２０１３年））。簡潔には、ＣＹＰ基質のカクテルが、１時間の培養のために肝臓コンパートメントに添加され、上澄部が、下流プロセッシングのために収集された。基質特異的代謝物生産が、質量分析器を使用して分析された。
【０２６８】
単球由来樹状細胞が、腸ＭＰＳの免疫成分として使用された。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、Ｌｅｕｋｏｐａｋ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ７０５００）から処理され、液体窒素中に貯蔵された。実験毎に、ＰＢＭＣは、解凍され、単球が、ＥａｓｙＳｅｐヒト単球富化キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  １９０５８）を使用して単離された。単球は、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、１％Ｐ／Ｓ、５０ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ５７２９０３）、３５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ５７４００４）、および１０ｎＭ  レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｒ２６２５）で補完されたＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ培地（ＧｉｂｃｏＴＭ  １２６３３−０１２）中で樹状細胞に分化された。分化の７日後（腸上皮細胞成熟の１９〜２０日目）、未成熟の樹状細胞が、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＴＭ  Ａ１１１０５−０１）を使用して収穫され、２時間にわたって反転された腸ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）の基底側上に播種された。２時間後、細胞は、培養板に戻され、腸培地を給送された。
【０２６９】
樹状細胞播種の１日後、腸障壁機能が、評価された。少なくとも２５０オーム×ｃｍ２の経上皮電気抵抗値を伴う腸ＭＰＳが、実験のために許容可能であると見なされた。プラットフォーム上の全ての相互作用実験に関して、腸ＭＰＳは、共通培地中で維持された。
【０２７０】
ＴＥＥＲ測定が、ＥＶＯＭ２メータを伴うＥｎｄＯｈｍ−１２チャンバ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して実施された。サンプルおよびＥｎｄＯｈｍチャンバは、ホットプレート上で約３７℃において暖かく保たれた。温度は、変動を最小限にするために、ＴＥＥＲ測定の間に厳密に維持された。
【０２７１】
分泌されたムチンが、Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅアッセイを使用して、頂点腸コンパートメント内で測定された。ムチン定量化プロトコルが、（５）から適合された。簡潔には、頂点からの培地が、低結合管内に収集され、５分にわたって１０，０００ｇで遠心分離され、上澄部が、収集され、後続分析のために−８０℃において貯蔵された。ムチン分泌は、培養培地中に溶解したムチンの標準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ３８９５）に対して定量化された。サンプルおよび標準は、９６ウェルプレート内で２時間にわたって３：１のサンプル対Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ溶液（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の混合物中でインキュベートされた。インキュベーション後、プレートは、室温において３０分にわたって１，６４０ｇに遠心分離された。上澄部が、プレートを反転させることによって除去された。サンプルは、洗浄緩衝液（ｐＨ５．８の２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する４０％（ｖ／ｖ）のエタノールおよび６０％（ｖ／ｖ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液）を用いて２回濯がれ、各濯ぎ後に１０分の遠心分離ステップを伴った。第２の遠心分離後、上澄部が、除去され、サンプルを、蒸留水中で１０％ＳＤＳを用いて溶解した。プレートは、典型的には、サンプルを完全に再懸濁するために、振盪またはピペット操作を要求した。気泡が再懸濁中に形成される場合、プレートは、６２０ｎｍにおけるＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｍ３／ｍ２ｅ上での吸収測定に先立って、約５分にわたって再び遠心分離された。
【０２７２】
サイトカインレベルが、マルチプレックスサイトカインアッセイ、３７プレックスヒト炎症および４０プレックスパネルケモカインパネル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して測定された。簡潔には、培地サンプルが、低結合管内に収集され、細胞細片を除去するために５分にわたって１０，０００ｇで遠心分離され、上澄部が、−８０℃において貯蔵された。サンプルは、測定値がアッセイの線形動的範囲内にあることを確実にするために、複数の希釈において測定された。ビーズへの非特異的結合を最小限にするために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、全てのサンプルにおいて５ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するために添加された。タンパク質標準が、同一の媒体中で再構築され、タンパク質ストックが、連続的に希釈され、８点標準曲線を生成した。アッセイが、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ３Ｄ懸濁アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）上で実行された。データが、ＦＬＥＸＭＡＰ  ３Ｄソフトウェア、バージョン４．２に関するｘＰＯＮＥＮＴ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ，  ＵＳＡ）を使用して収集された。各分析物の濃度は、標準曲線から判定され、これは、各分析物の既知の濃度に対する平均蛍光の５パラメータロジスティック回帰をフィッティングすることによって生成された（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア）。
【０２７３】
プラットフォームあたりの合計生産量を求めるために、濃度値は、コンパートメント容積によって正規化され、各プラットフォーム内の全てのコンパートメント（ミキサ、腸、肝臓）を横断して合計された。
【０２７４】
ベースラインおよび炎症条件（３日目、ｎ＝４）の両方に関して、腸および肝組織が、プラットフォームから取り出され、ｍＲＮＡが、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡミニキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  １２１８３０１８Ａ）を使用して抽出された。合計ＲＮＡが、フラグメントアナライザ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して分析および定量化され、ｃＤＮＡが、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ  ｖ３キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して生成された。ｃＤＮＡフラグメント化（Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２）後、ｃＤＮＡは、ＳＰＲＩ−ｗｏｒｋｓ  フラグメントライブラリシステムＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して末端修復およびアダプタ結合された。アダプタ結合されたｃＤＮＡは、次いで、ＰＣＲ増幅中に指標付けられ、結果として生じるライブラリが、フラグメントアナライザおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００上で配列決定される前のｑＰＣＲを使用して定量化された。サンプルあたり１，５００万〜２千万または５百万リードの平均深さを伴う４０〜５０ｎｔシングルエンドリードが、それぞれ、ベースラインおよび炎症条件に関して配列決定された。
【０２７５】
ＦＡＳＴＱファイルが、配列決定実行から生成された。結果として生じるリードは、スプライスジャンクションを考慮する既知の転写物にマッピングされるリードを識別するために、Ｔｏｐｈａｔ（バージョン２．０．１２）（Ｋｉｍ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ」１４（４）：Ｒ３６（２０１３年））を使用して、ヒト基準ゲノム（ＧＲｃｈ３７／ｈｇ１９）にアラインされた。ＨＴＳｅｑが、既知のゲノム特徴と一意に重複するリードカウント数を判定するために使用された（Ａｎｄｅｒｓ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ」３１（２）：１６６−１６９（２０１５年））。
【０２７６】
単離  対  相互作用条件において有意に改変される遺伝子を識別するために、カウントデータの鑑別的遺伝子分析が、ＲにおけるＤＥＳｅｑ２（バージョン１．１２．３）を使用して実施された（Ｌｏｖｅ  ＭＩ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ」１５（１２）：５５０（２０１４年））。少なくとも４つの複製における１ｃｐｍ（カウントパーミリオン）を上回る遺伝子のみが、分析に含まれた。複数の試験補正が、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの手順を使用して実施された。０．０５のＦＤＲカットオフを下回る調節されたＰ値を伴う遺伝子が、有意であると見なされた。
【０２７７】
ＧＯＳｅｑ  Ｒパッケージ（Ｙｏｕｎｇ  ＭＤ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ」１１（２）：Ｒ１４（２０１０年））が、差次的に発現された遺伝子（ＦＤＲ調節されたＰ値＜０．０５）の過剰表現生物学的製剤を判定するために使用された。
【０２７８】
ＧＳＥＡ（バージョン２．２．３）が、（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．による（２００５年）「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１０２（４３）：１５５４５−１５５５０）に説明されるように、単離  対  相互作用において差次的に調整される遺伝子セットを識別するために実施された。分散を安定化させるために、正規化されたカウントデータが、ＤＥＳｅｑ２における規則化対数変換を使用して処理された。信号対雑音メトリックが、ランク付けされた遺伝子のリストを生成するために使用された。分子署名データベース（ｃ２．ｃｐ．ｖ５．２）からの標準的経路遺伝子セットが、使用され、これは、複数のデータベース（例えば、Ｒｅａｃｔｏｍｅ、ＫＥＧＧ、ＢｉｏＣａｒｔａ、ＰＩＤ）からのキュレーションされた遺伝子セットの集合である。富化スコア毎の経験的Ｐ値が、１，０００個の遺伝子セット順列を介して算出された富化スコアのヌル分布に対して計算された。公称Ｐ値＜０．０１およびｑ値＜０．０５を伴う遺伝子セットが、有意であると見なされた。Ｃｙｔｏｓｃａｐｅプラグインである富化マップ（１１）が、有意な遺伝子セット間の重複を可視化し、異なる生物学的プロセス間の相互依存性の系統的解釈を促進するために使用された。
【０２７９】
結果
１．ベースライン肝臓機能および腸特異的機能は、腸−肝臓インタラクトームにおいて比較的に長期（＞２週間）にわたって維持された。
２週間のインキュベートにわたって評価された肝臓および腸機能は、アルブミン生産、腸障壁完全性、および腸粘液生産の測定によって評価されるように、コミュニケーションまたは単離して維持されるＭＰＳに匹敵した。２週間の実験の終了時における肝臓代謝機能を評価するために、（腸の不在下の）単離および相互作用条件からの肝臓組織に、具体的ＣＹＰ４５０酵素を標的とする薬物基質のカクテルが投与された。培地中の薬物特異的代謝物生産が、異なるアイソフォームのチトクロムＰ４５０活性を判定するために、質量分析器を使用して測定された。全体的に、肝臓代謝機能は、大いに維持され、選択されたチトクロムＰ４５０活性の調整が、腸−肝臓相互作用において観察された。特に、Ｃｙｐ２Ｃ９活性は、有意に強化された一方、Ｃｙｐ３Ａ４／５活性は、抑制された。障壁完全性および粘液生産を含む腸特異的機能は、相互作用および単離対照群間で殆ど改変されなかった。チトクロムＰ４５０活性（例えば、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９）のわずかであるが有意な調整が、２週間の相互作用後に観察された。
【０２８０】
２．胆汁酸合成経路が、双方向腸−肝臓クロストークにおいて調整された。
ＲＮＡ配列決定が、対応する単離対照群（すなわち、腸のみおよび肝臓のみ）を用いて、３日の相互作用後の腸および肝臓組織における全体的トランスクリプトーム変化をプロファイルするために実施された。１０５個の遺伝子が、単離対照群と比較して、相互作用中に肝臓において有意に（ＦＤＲ調節されたＰ＜０．０５）改変され、その７０個は、上方制御され、３５個は、下方制御された。腸に関して、６個の遺伝子が、有意に差次的に発現され、その２個は、上方制御され、４個は、下方制御された。これらの分子変化の機能的影響を理解するために、ジーンオントロジ（ＧＯ）分析が、相互作用下で改変された過剰表現生物学的プロセスを識別するために実施された。有意に改変された遺伝子（ＦＤＲ調節されたＰ＜０．０５）のみが、ＧＯ分析のために使用された。肝臓における上方制御された生物学的プロセスは、主として、細胞分割関連プロセスを伴った（表５）。
【表５】
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【０２８１】
肝臓における細胞サイクル遺伝子の誘導は、腸由来信号への適応応答を示し得るが、関与する可溶性因子は、未知である。一方、肝臓において下方制御される生物学的プロセスは、主に、胆汁酸生合成、脂質代謝、および生体異物代謝を含む代謝プロセスであった（表６）。
【表６】
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【０２８２】
具体的には、胆汁酸代謝の媒介物ＣＹＰ７Ａ１が、下方制御され、これは、腸−肝臓機能の生理学的結合、例えば、胆汁酸媒介腸肝クロストークを示した。ＣＹＰ７Ａ１は、胆汁酸合成の中心的な酵素であり、ＦＧＦ１９腸肝コミュニケーションを介したそのフィードバック阻害が、明確に確立される（Ｄｉｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｉｎ  Ｂ」５（２）：１３５−１４４（２０１５年））。ＣＹＰ７Ａ１に対する結果は、７時間にわたるマイクロ流体デバイス内の精密切断されたラット腸および肝組織の灌流が、胆汁酸媒介ＣＹＰ７Ａ１阻害をもたらした以前の所見と一貫した（ｖａｎ  Ｍｉｄｗｏｕｄ  ＰＭ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ」１０（２０）：２７７８−２７８６（２０１０年））。腸サンプル中の有意な遺伝子の数は、ＧＯ分析のために不十分であったが、差次的に発現した遺伝子のうちの１つであるＰＣＳＫ９は、コレステロールおよび脂質ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすことが見出された。実際に、コレステロールおよび種々のタイプの胆汁酸が、Ｃａｃｏ２腸培養においてＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ発現を抑制することが示されている（Ｌｅｂｌｏｎｄ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ」２９６（４）：Ｇ８０５−８１５（２００９年））。本研究は、コレステロールおよび胆汁酸代謝経路に対する収束が、ＭＰＳ間コミュニケーションに起因する転写性再配線を示すことを示した。
【０２８３】
３．協調されたトランスクリプトーム変化および組織特異的トランスクリプトーム変化が、炎症性腸−肝臓クロストークにおいて観察された。
多数の免疫細胞が、ホメオスタシス中に腸および肝臓に存在し、疾患におけるその活性化は、全身性病態生理学に寄与し得る。特有な薬物有害反応と関連付けられる肝機能障害が、不適切な免疫活性化に関連している（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ＢＤ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」２３７（３）：３１７−３３０（２００９年））。本研究は、疾患モデル化および薬物試験のためのより生理学的に関連する培養プラットフォームを提供するために、腸および肝臓の両方における免疫細胞を用いて実質組織モデルを補完した。相互的な免疫−上皮細胞コミュニケーションは、全身性炎症を引き起こす。
【０２８４】
内毒血症を模倣する炎症性状況では、本システムの動作および単離対照群が、上記のベースライン研究と類似する方法で試験されながら、２ｎｇ／ｍＬリポ多糖類（ＬＰＳ）が、０日目（プラットフォーム上の腸ＭＰＳ）から３日目（ＲＮＡｓｅｑが実施された）まで循環培地中に添加された。ＬＰＳ濃度は、炎症性疾患を伴う患者において報告された血漿エンドトキシンの臨床関連範囲（２〜１０ｎｇ／ｍＬ）に基づいて選定された（Ｇｕｏ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ，による「Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ」１８２（２）：３７５−３８７（２０１３年））。
【０２８５】
ＲＮＡ配列決定が、炎症性腸−肝臓クロストークと関連付けられる全体的分子変化を評価するために実施された。肝臓に関して、２，５４８個の遺伝子が、相互作用において有意に改変され、その１，１３７個の遺伝子は、上方制御され、１，４１１個の遺伝子は、下方制御された。差次的に発現した遺伝子のＧＯ分析は、サイトカイン応答ならびに抗原処理および提示経路の上方制御と、脂質および生体異物代謝経路の下方制御を示した（表７）。
【表７】
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【表８】
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【０２８６】
腸に関して、７８０個の遺伝子が、相互作用中に有意に改変され、その２９０個の遺伝子は、上方制御され、４９０個の遺伝子は、下方制御された。同様に、ＧＯ分析は、防御応答、抗原処理および提示経路、ならびにタンパク質変換の上方制御を示し、下方制御された経路は、アルコール生合成、ステロイドおよび脂質代謝を含んだ（表９）。
【表９】
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【０２８７】
【表１０】
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【０２８８】
任意の統計的カットオフによって判定される有意に改変された遺伝子にのみ焦点を当てる遺伝子ベースのＧＯ分析に加えて、遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）もまた、機能的に関連する遺伝子の群における協調された変化を明らかにするために実施された。ＧＳＥＡは、遺伝子ベースのアプローチにおける厳密なカットオフによってマスクされている場合があるより微妙な経路調整を示すことができる。概して、ＧＳＥＡ結果は、ＧＯ分析成果と大いに一貫するが、より高い解釈可能性および一般性を伴った。異なるデータベースからの遺伝子セットのコンセンサスクラスタが、取得され、これは、主要な生物学的プロセスを定義する、重複するが別個の遺伝子の群を含有していた。具体的には、ＩＦＮα／β／γ信号伝達を中心とする炎症関連経路が、上方制御される一方、コレステロールおよび脂質代謝を伴う代謝プロセスは、相互作用する腸および肝臓の両方において下方制御された（表１１）。炎症性プロセスおよび脂質代謝における顕著な改変は、敗血症応答の特徴であった。
【表１１】
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【０２８９】
【表１２】
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【０２９０】
共同調整された経路に加えて、組織特異的調整もまた、識別された。低酸素症およびＴＧＦβ／ＳＭＡＤ信号伝達に関与する経路が、相互作用する肝臓において排他的に上方制御され、繊維症を進行させる応答を示唆した。本研究は急性炎症に焦点を当てているが、慢性肝臓炎も、肝臓線維症に関連している。
【０２９１】
腸では、ＰＩ３Ｋ媒介ＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ４信号伝達が、上方制御され、これは、場合によっては保護機構としての役割を果たす、創傷治癒または抗アポトーシス性応答を示した。先に、ＥＲＢＢ２（Ｙａｍａｏｋａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ」１０５（３３）：１１７７２−１１７７７（２００８年）、Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ」９２（３）：４３７−４５０（２０１２））およびＥＲＢＢ４（Ｆｒｅｙ  ＭＲ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ」１３６（１）：２１７−２２６（２００９年））信号伝達が、生体外および生体内で、腸上皮細胞におけるＴＮＦ誘発アポトーシスに対して保護し、腸傷害に続く生存促進性および治癒促進性効果を提供するように示されている。
【０２９２】
組織特異的調整に関与する遺伝子セットの完全なリストが、以下に示される。
炎症性腸−肝臓クロストーク中に肝臓において一意に上方制御される遺伝子セットは、以下を含んだ。Ｂｉｏｃａｒｔａ＿ＴＮＦＲ２＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｓｔ＿ｔｕｍｏｒ＿ｎｅｃｒｏｓｉｓ＿ｆａｃｔｏｒ＿ｐａｔｈｗａｙ、ＰＩＤ＿ＴＮＦ＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ＿ｂｉｎｄ＿ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ、Ｋｅｇｇ＿ｃｙｔｏｋｉｎｅ＿ｃｙｔｏｋｉｎｅ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ＿ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、Ｋｅｇｇ＿ｒｉｇ＿ｉ＿ｌｉｋｅ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ＿ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｋｅｇｇ＿ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ＿ｄｎａ＿ｓｅｎｓｉｎｇ＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｎｅｇａｔｉｖｅ＿ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ＿ｏｆ＿ｒｉｇ＿ｉ＿ＭＤＡ５＿ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｎａｂａ＿ｓｅｃｒｅｔｅｄ＿ｆａｃｔｏｒｓ、ＰＩＤ＿ＣＤ４０＿ｐａｔｈｗａｙ、ＰＩＤ＿ｈｉｆ１＿ｔｆｐａｔｈｗａｙ、ＰＩＤ＿ｈｉｆ２ｐａｔｈｗａｙ、ＰＩＤ＿ｉｌ２３＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｋｅｇｇ＿ｐｒｉｍａｒｙ＿ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ａｎｔｉｖｉｒａｌ＿ｍｅｃｈａｎｉｓｍ＿ｂｙ＿ｉｆｎ＿ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ＿ｇｅｎｅｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿）Ｏ．ｏ＿ｌｉｎｋｅｄ＿ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｍｕｃｉｎｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｈｙｐｏｘｉａ＿ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ＿ｆａｃｔｏｒ＿ｈｉｆ＿ｂｙ＿ｏｘｙｇｅｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｒｉｇ＿ｉ＿ｍｄａ５＿ｍｅｄｉａｔｅｄ＿ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｉｆｎ＿ａｌｐｈａ＿ｂｅｔａ＿ｐａｔｈｗａｙｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＿ｂｙ＿ｔｇｆ＿ｂｅｔａ＿ｒｅｃｅｐｔｏｒ＿ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｓｍａｄ２＿ｓｍａｄ３＿ｓｍａｄ４＿ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒ＿ｒｅｇｕｌａｔｅｓ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｔｒａｆ６＿ｍｅｄｉａｔｅｄ＿ｉｒｆ７＿ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ＿ａｃｔｉｖｉｔｙ＿ｏｆ＿ｓｍａｄ２＿ｓｍａｄ３＿ｓｍａｄ４＿ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒ、および  Ｓｔ＿ｆａｓ＿ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＿ｐａｔｈｗａｙ。
炎症性腸−肝臓クロストーク中に腸において一意に上方制御される遺伝子セットは、以下を含んだ。ＰＩＤ＿ＩＬ１２＿２ｐａｔｈｗａｙ、Ｋｅｇｇ＿ａｂｃ＿ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ａｍｉｎｏ＿ａｃｉｄ＿ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ＿ａｎｄ＿ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ＿ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｉｏｎ、Ｋｅｇｇ＿ａｍｉｎｏａｃｙｌ＿ｔｒｎａ＿ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ＿ｔｒｎａ＿ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｔｒｎａ＿ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ、Ｋｅｇｇ＿ｃｅｌｌ＿ａｄｈｅｓｉｏｎ＿ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＿ｃａｍｓ、Ｋｅｇｇ＿ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｇｅｎｅｓ＿ｂｙ＿ａｔｆ４、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｐｅｒｋ＿ｒｅｇｕｌａｔｅｄ＿ｇｅｎｅ＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ＰＩ３Ｋ＿ｅｖｅｎｔｓ＿ｉｎ＿ｅｒｂｂ２＿ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、および  Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ＰＩ３Ｋ＿ｅｖｅｎｔｓ＿ｉｎ＿ｅｒｂｂ４＿ｓｉｇｎａｌｉｎｇ。
炎症性腸−肝臓クロストーク中に肝臓において一意に下方制御される遺伝子セットは、以下を含んだ。Ｂｉｏｃａｒｔａ＿ａｍｉ＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｂｉｏｃａｒｔａ＿ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｋｅｇｇ＿ａｌａｎｉｎｅ＿ａｓｐａｒｔａｔｅ＿ａｎｄ＿ｇｌｕｔａｍａｔｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ＿ａｃｉｄ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ａｒｇｉｎｉｎｅ＿ａｎｄ＿ｐｒｏｌｉｎｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｂｅｔａ＿ａｌａｎｉｎｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ＿ｏｆ＿ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ＿ｆａｔｔｙ＿ａｃｉｄｓ、Ｋｅｇｇ＿ｂｕｔａｎｏａｔｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｃｉｔｒａｔｅ＿ｃｙｃｌｅ＿ｔｃａ＿ｃｙｃｌｅ、Ｋｅｇｇ＿ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ＿ａｎｄ＿ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ＿ｃａｓｃａｄｅｓ、Ｋｅｇｇ＿ｄｒｕｇ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ＿ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ＿ｐ４５０、Ｋｅｇｇ＿ｄｒｕｇ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ＿ｏｔｈｅｒ＿ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｋｅｇｇ＿ｆａｔｔｙ＿ａｃｉｄ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｇｌｙｃｉｎｅ＿ｓｅｒｉｎｅ＿ａｎｄ＿ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ＿ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｋｅｇｇ＿ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ＿ａｎｄ＿ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｌｉｎｏｌｅｉｃ＿ａｃｉｄ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｌｙｓｉｎｅ＿ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、Ｋｅｇｇ＿ｏｘｉｄａｔｉｖｅ＿ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、Ｋｅｇｇ＿ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ＿ｄｉｓｅａｓｅ、Ｋｅｇｇ＿ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ、Ｋｅｇｇ＿ｐｒｏｘｉｍａｌ＿ｔｕｂｕｌｅ＿ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ＿ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｋｅｇｇ＿ｐｙｒｕｖａｔｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｒｅｔｉｎｏｌ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｔｙｒｏｓｉｎｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｋｅｇｇ＿ｖａｌｉｎｅ＿ｌｅｕｃｉｎｅ＿ａｎｄ＿ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ＿ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、ＰＩＤ＿ｈｎｆ３ｂ＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＿ｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｂｒａｎｃｈｅｄ＿ｃｈａｉｎ＿ａｍｉｎｏ＿ａｃｉｄ＿ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｃｉｔｒｉｃ＿ａｃｉｄ＿ｃｙｃｌｅ＿ｔｃａ＿ｃｙｃｌｅ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｆａｔｔｙ＿ａｃｉｄ＿ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ＿ａｎｄ＿ｋｅｔｏｎｅ＿ｂｏｄｙ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｆｏｒｍａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｆｉｂｒｉｎ＿ｃｌｏｔ＿ｃｌｏｔｔｉｎｇ＿ｃａｓｃａｄｅ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ＿ｏｆ＿ａｍｉｎｏ＿ａｃｉｄｓ＿ａｎｄ＿ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ＿ｌｉｐｉｄ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｐｈａｓｅ＿ｉｉ＿ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｐｙｒｕｖａｔｅ＿ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ＿ａｎｄ＿ｃｉｔｒｉｃ＿ａｃｉｄ＿ｔｃａ＿ｃｙｃｌｅ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ＿ｅｌｅｃｔｒｏｎ＿ｔｒａｎｓｐｏｒｔ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ＿ｅｌｅｃｔｒｏｎ＿ｔｒａｎｓｐｏｒｔ＿ａｔｐ＿ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ＿ｂｙ＿ｃｈｅｍｉｏｓｍｏｔｉｃ＿ｃｏｕｐｌｉｎｇ＿ａｎｄ＿ｈｅａｔ＿ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ＿ｂｙ＿ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ＿ｐｒｏｔｅｉｎｓ＿、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ＿ｏｆ＿ｂｉｌｅ＿ａｃｉｄｓ＿ａｎｄ＿ｂｉｌｅ＿ｓａｌｔｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ＿ｏｆ＿ｂｉｌｅ＿ａｃｉｄｓ＿ａｎｄ＿ｂｉｌｅ＿ｓａｌｔｓ＿ｖｉａ＿７ａｌｐｈａ＿ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、および  Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｔｃａ＿ｃｙｃｌｅ＿ａｎｄ＿ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ＿ｅｌｅｃｔｒｏｎ＿ｔｒａｎｓｐｏｒｔ。
炎症性腸−肝臓クロストーク中に腸において一意に下方制御される遺伝子セットは、以下を含んだ。  Ｂｉｏｃａｒｔａ＿ＴＮＦＲ２＿ｐａｔｈｗａｙ、Ｋｅｇｇ＿ＤＮＡ＿ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｋｅｇｇ＿ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ＿ａｎｄ＿ｃｏａ＿ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｋｅｇｇ＿ｐｅｎｔｏｓｅ＿ａｎｄ＿ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ＿ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ、Ｋｅｇｇ＿ｓｔｅｒｏｉｄ＿ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｋｅｇｇ＿ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ＿ｂａｃｋｂｏｎｅ＿ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＰＩＤ＿ａｕｒｏｒａ＿ｂ＿ｐａｔｈｗａｙ、ＰＩＤ＿ｈｉｆ１＿ｔｆｐａｔｈｗａｙ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ａｔｒ＿ｉｎ＿ｒｅｓｐｏｎｓｅ＿ｔｏ＿ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ＿ｓｔｒｅｓｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｔｈｅ＿ｐｒｅ＿ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ＿ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＿ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｎｅｗ＿ｃｅｎｐａ＿ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ＿ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ＿ａｔ＿ｔｈｅ＿ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ＤＮＡ＿ｓｔｒａｎｄ＿ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｅ２ｆ＿ｍｅｄｉａｔｅｄ＿ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｄｎａ＿ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｆａｔｔｙ＿ａｃｙｌ＿ｃｏａ＿ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｆｏｒｍａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿ｔｕｂｕｌｉｎ＿ｆｏｌｄｉｎｇ＿ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ＿ｂｙ＿ｃｃｔ＿ｔｒｉｃ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｇ１＿ｓ＿ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｇ２＿ｍ＿ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ＿ｔｒａｎｓｐｏｒｔ＿ｏｆ＿ｖｉｔａｍｉｎｓ＿ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＿ａｎｄ＿ｒｅｌａｔｅｄ＿ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、およびＲｅａｃｔｏｍｅ＿ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ＿ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ。
【０２９３】
４．全身性炎症が、肝臓解毒機能を抑制した。
内因性および生体異物化合物の肝臓クリアランスが、２つの機構、すなわち、代謝および胆汁排除によって媒介される。その結果、炎症性クロストークが、これらの経路の両方に悪影響を及ぼし、毒性副産物の蓄積につながり得ることを示した。集合的に、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ならびにＣＹＰ３Ａ４および３Ａ５は、既知の薬物の９０％以上の代謝に関与する（Ｊａｃｏｂ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ」２（３）：２０３−２１１（２００９年）、Ｅｂｒａｈｉｍｋｈａｎｉ  ＭＲ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ」６９−７０：１３２−１５７（２０１４年））。これらは全て、ＩＬ６、ＴＮＦα、および／またはタイプＩインターフェロン等の炎症性媒介の蓄積におそらく起因して、統合システム内の肝臓において抑制された（Ｌｏｎｇ  ＴＪ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」４４（１２）：１９４０−１９４８（２０１６年）、Ｈｕａｎｇ  ＳＭ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ」８７（４）：４９７−５０３（２０１０年））。
【０２９４】
要するに、脂質代謝および炎症は、腸−肝臓相互作用中に改変される支配的経路であった。ＬＰＳへのリポタンパク質結合は、ＬＰＳ取り込みをクッパー細胞から肝細胞に再指向し、それによって、免疫活性化を減衰させ、ＬＰＳの胆汁クリアランスを促進することができる（Ｋｈｏｖｉｄｈｕｎｋｉｔ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ」４５（７）：１１６９−１１９６（２００４年））。脂質代謝の主要制御因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）が、抗炎症効果を付与することが示されている（Ｖａｒｇａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ」１８１２（８）：１００７−１０２２（２０１１年））。まとめると、炎症性腸−肝臓クロストーク中に観察されるアポリポタンパク質合成およびＰＰＡＲ信号伝達の抑制は、保護機構の潜在的喪失を示し、それによって、免疫および上皮細胞における炎症を増大させる。摂動への全身性応答の複雑性は、多細胞および多器官実験モデルの必要性を促す。
【０２９５】
敗血症患者は、肝臓代謝機能の炎症誘発抑制、具体的には、シトクロムＰ４５０酵素系の活性に起因して薬物有害反応を受けやすい（Ｋｉｍ  ＴＨ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｆｅｂｓ  Ｊ」２７８（１３）：２３０７−２３１７（２０１１年））。その結果、炎症性腸−肝臓クロストークにおける第Ｉ相および第ＩＩ相代謝酵素の改変されたｍＲＮＡ発現を実証した。したがって、薬物の薬物動態学および薬力学の正確な予測は、多器官相互作用ならびに生理学的状況（すなわち、健常性対疾患）の考慮を必要とする。これは、シトクロムＰ４５０活性のわずかな変化であっても毒性を促進し得るため、狭い治療濃度域を伴う薬物に対して特に関連する。
【０２９６】
５．腸−肝臓統合システムにおけるサイトカインレベルが、個々の単離されたシステムの線形和から逸脱する。
分泌されたサイトカインおよびケモカインのレベルが、炎症性応答の時間的発展を検証するために、刺激後６、２４、および７２時間において培地中で測定された。対での階層クラスタ化が、分析物と条件との間のサイトカイン応答の相関を探求するために、７２時間サイトカイン測定に対して実施された。無監督の主成分分析（ＰＣＡ）が、サイトカインデータセットにおける共分散の９６％以上が第１の２つの主成分によって捕捉され得ることを示した。ＰＣ１は、データにおける変動の７６．５％を占め、相互作用対単離制御群を単離し、ＰＣ２は、合計分散の１９．８％を占め、腸および肝臓のみの条件を区別した。ローディングプロットは、第１および第２の主成分に対する各分析物の相対的寄与を描写した。全ての分析物は、ＰＣ１に対して積極的にロードされ、統合システムにおけるサイトカインレベルに寄与した一方、ＰＣ２に対するローディングは、統合システムにおいて循環するサイトカイン／ケモカインの起源の一次組織を推測することに役立つことができる。可溶性因子のいずれも腸または肝臓に一意ではなかったが、多変量サイトカインパターンは、組織特異的徴候を示すことができる。
【０２９７】
統合された炎症性応答に対するＭＰＳ間クロストークの寄与を正確に評価するために、相互作用するシステムにおける測定されたサイトカインレベルは、単離された条件の理論的線形和と比較された。単離して観察されたサイトカインレベルは、直接的ＴＬＲ４活性化およびＭＰＳ内パラクリン信号伝達に起因するサイトカイン出力を説明した。統合システムにおける実際の（測定された）サイトカインレベルは、単離されたシステムの線形和から有意に逸脱し、ＭＰＳ間コミュニケーションの結果としてのサイトカイン生産の非線形調整を示した。分析物の約５８％は、線形に加法的であり、２３％は、加法を下回り、１９％は、加法を上回り、一部は、非常に顕著であった。興味深いこととして、いくつかのサイトカインは、ＣＸＣＬ６と類似する時間的動態を呈し、これは、２４時間まで線形に加法であり、次いで、線形和から分散し、加法を上回る状態になった。これは、閾値依存性調整を示唆し得、サイトカイン生産は、器官クロストーク中の上流誘発因子分子の蓄積に依存する。
【０２９８】
６．炎症関連ＣＸＣＲ３リガンドが、腸−肝臓相互作用において大幅に増幅された。
表は、ＣＸＣＲ３リガンドの顕著な加法を上回る増幅を示し、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）およびＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）は、最も有意に加法を上回り、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）は、境界線で有意であることを示した。個々の腸および個々の肝臓におけるレベルの線形和と比較される、腸−肝臓ＭＰＳ内のレベルの観点から加法、劣加法性、および加法を上回る合計分析物の割合は、それぞれ、５８％、２３％、および１９％であった。ＣＸＣＲ３信号伝達は、自己免疫、移植拒絶、感染、および癌に関与している（Ｇｒｏｏｍ  ＪＲ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」８９（２）：２０７−２１５（２０１１年）、Ｓｉｎｇｈ  ＵＰ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｅｎｄｏｃｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ」７（２）：１１１−１２３（２００７年））。
【０２９９】
【表１３】
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【０３００】
これらの結果は、腸−肝臓クロストークの考慮が、全身性炎症性プロセスおよび疾患進展に対するその潜在的影響を評価するために重要であり得ることを示した。
【０３０１】
ＲＮＡ配列決定データは、器官クロストーク中の腸および肝臓の両方におけるＩＦＮα／β／γ信号伝達経路の活性化を示した。ＴＮＦαは、ＣＸＣＲ３リガンドのＩＦＮ依存性生産を拡大することができる。ＰＣＡローディングは、ＴＮＦαが主に腸由来であり、ＩＦＮγが腸および肝臓の両方によって匹敵するレベルで生産されることを示した。腸（樹状細胞）由来ＴＮＦαが組織特異的ＩＦＮγ信号伝達と相互作用し、腸および肝臓の両方においてＣＸＣＲ３リガンド生産を引き起こすことが、妥当であった。しかしながら、統合された応答に対する上皮および免疫コンパートメントの相対的寄与は、確認することが困難であった。免疫細胞は、表に示されるように、ＴＬＲ４のより高い発現に起因してエンドトキシンに対する主要な応答者であるが、上皮細胞もまた、ＴＮＦαおよびＩＬ−１等の免疫細胞由来サイトカインによる活性化を介して間接的に炎症に寄与する（Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＶ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ」４３（５）：７７４−７８５（２０１５年）、Ｙｅｒｕｖａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ」２３（３）：３０５−３１７（２００８年）、Ｄｗｉｎｅｌｌ  ＭＢ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ」１２０（１）：４９−５９（２００１年））。
【０３０２】
【表１４】
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【０３０３】
生体外におけるＴＮＦαおよびＩＦＮγへのラット肝細胞の暴露は、ＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を助長した（Ｈａｓｓａｎｓｈａｈｉ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｉｒａｎ  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」６（３）：１１５−１２１（２００７年））。ＩＬ−１α／β、ＴＮＦα、およびＩＦＮγの組み合わせは、腸細胞株およびヒト腸移植片においてＣＸＣＲ３リガンド遺伝子発現およびタンパク質分泌を誘発することが示されている。サイトカイン応答に対する上皮の寄与を評価するために、５ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦα、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ、またはその両方が、２４時間の存在のために添加され、腸上皮（Ｃａｃｏ２−ＢＢＥ／ＨＴ２９−ＭＴＸ）を基礎的に刺激した。免疫細胞の不在下での腸上皮に対するＴＮＦαおよびＩＦＮγの同時処置は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、およびＣＸ３ＣＬ１を含む、統合システムにおいて識別される８つのケモカインのうち４つの際立った増幅をもたらした（表１１）。
【０３０４】
これらの結果は、ＲＮＡｓｅｑ所見を用いて確証され、ＩＦＮγおよびＴＮＦα信号伝達クロストークが統合システムにおけるケモカイン生産の中心であることを実証した。これらの結果は、上皮細胞が炎症性腸−肝臓クロストーク中に受動的なバイスタンダではないが、免疫細胞とのパラクリン相互作用を介して全体的免疫環境にかなり寄与することを示した。
【０３０５】
炎症性腸−肝臓相互作用下では、ケモカイン生産の加法を上回る増幅が、開示される統合腸−肝臓ＭＰＳから検出された。本増幅は、部分的にＴＮＦαおよびＩＦＮγ信号伝達によって媒介された。免疫細胞は、通常、エンドトキシンの一次センサと見なされるが、ここでの結果は、上皮細胞が免疫細胞由来信号に応答し、ＣＸＣＬ９／１０／１１およびＣＸ３ＣＬ１ケモカイン生産に影響を及ぼすことを示した。ＴＮＦαおよびＩＦＮγへの暴露は、腸上皮細胞におけるＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ６、およびＣＣＬ２の増幅をもたらさず、これは、おそらく異なる細胞タイプにおける付加的機構の関与を示した。
【０３０６】
統合システムにおいて観察されるケモカイン生産は、先天性免疫系および適応免疫系の細胞を標的とすることができる（表）。潜在的な免疫細胞動員が、ケモカインおよび対応する受容体プロファイルに基づいて推測されることができる。適応免疫は、本システムには表されないが、先天性免疫系および適応免疫をリンクする経路の調整が、器官クロストーク中に明白であった。例えば、ＣＤ４０共刺激プロセスの富化が、識別された。ＣＤ４０は、免疫細胞ならびに非免疫細胞上に普遍的に発現される表面受容体である。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって主に発現され、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ関与は、異種細胞連通を媒介する（Ｄａｎｅｓｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｇｕｔ」５３（７）：１０３５−１０４３（２００４年））。まとめると、ＣＸＣＲ３ケモカイン生産およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ調整は、Ｔｈ１信号伝達に向けたバイアスを含意する。
【０３０７】
（実施例４）  薬物動態学的／薬力学的（ＰＫ−ＰＤ）予測のためのチップ上の４方向ＭＰＳ
（１）  少なくとも２週間にわたる４方向ＭＰＳ生存および機能
材料および方法
検証：１３個の４ＭＰＳプラットフォーム（プラットフォームあたりｎ＝９ポンプ）における流速が、較正を伴わずに０．８２〜１．１２μＬ／秒に平均化され、０．０７μＬ／秒の平均標準偏差を有していた。ソフトウェア較正係数が、流速測定から計算され、標的流速の±５％以内にポンプ速度を補正するように入力された。
【０３０８】
Ｑｍｉｘ＝５ｍＬ／日の全身性相互作用流速が、実験の持続時間にわたって使用された。流動は、ヒトの各組織タイプに対する心拍出量の相対的パーセンテージに基づいて、ミキサから各ＭＰＳにパーティション化され、これらの数字は、異なるスケーリング戦略およびＭＰＳモジュールに関してプラットフォーム上で容易に修正されることができる。加えて、０．２５μＬ／秒（腸、肺、および子宮内膜ＭＰＳ）および１μＬ／秒（肝臓ＭＰＳおよびミキサ）のＭＰＳ内基底再循環速度が、各コンパートメント内に良好に混合された基底培地を提供し、肝臓組織に酸素供給するために使用された。完全な培地交換が、４８時間毎に実行された。培地交換中、サンプルが、２週間の相互作用研究全体を通して、ＭＰＳ機能を評価するために各コンパートメントから取り出された。健常細胞機能のバイオマーカメトリックが、流動のパーティション化を用いて、４方向ＭＰＳ、すなわち、肝臓、腸、肺、および子宮内膜の２週間共培養中に測定された。２日毎に、分泌されたアルブミンおよびＩＧＦＢＰ−１が、調整された培地から測定された。腸および肺ＭＰＳの障壁完全性が、商業的ＥｎｄＯｈｍシステムを使用してオフプラットフォームで測定される、経上皮電気抵抗を用いて定量化された。同時に、単離した各ＭＰＳの（ＴＥＥＲ）機能が、監視された。
【０３０９】
結果
１．  ４方向ＭＰＳは、少なくとも２週間にわたって細胞生存能力および機能を支援する。
４ＭＰＳプラットフォーム研究からの連続的機能性メトリックが、２週間培養中の多器官ＭＰＳ生存能力を示した。過渡アルブミン分泌動態が、アルブミン分泌の初期増加から観察され、実験の終了による漸進的低下が続いた。腸および肺ＭＰＳの障壁完全性が、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を用いて定量化された。腸ＭＰＳからのＴＥＥＲ値は、残りの実験にわたって１５０〜２５０Ωｃｍ２範囲に収まる前に、相互作用研究の初期に変動した。肺ＭＰＳ  ＴＥＥＲ値は、最初の数日間に類似する高ＴＥＥＲの傾向を辿るが、最終的に、６００〜８００Ωｃｍ２範囲内の安定した値を確立した。インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）の分泌によって評価される子宮内膜ＭＰＳ機能性は、研究全体を通して２０〜３０ｐｇ／日範囲内に留まった。単離研究における表現型メトリック毎の類似する傾向が、観察されたが、単離された子宮内膜ＭＰＳ（オフプラットフォーム）におけるＩＧＦＢＰ−１分泌速度は、相互作用研究のものよりも低かった。
【０３１０】
２．  １つの器官から内因的に生産されたアルブミンが、制御された全身性流速を用いて各コンパートメントに均一に分配された。
４ＭＰＳプラットフォームでは、アルブミン（肝臓ＭＰＳによって内因的に生産される）分泌および分配動態に対する全身性流速（Ｑｍｉｘ）の影響は、各コンパートメントからサンプルを収取することを介して特性評価され、次いで、結果は、分配の正確度を評価するために、コンピュータ的にモデル化された。各コンパートメントおよび混合チャンバ内のアルブミン濃度は、２日目（Ｑｍｉｘ＝５ｍｌ／日）、４日目（Ｑｍｉｘ＝１５ｍｌ／日）、および６日目（Ｑｍｉｘ＝３０ｍｌ／日）であった。
【０３１１】
増加する全身性流速では、アルブミンは、実験測定によって実証されるようにより均一に分配され、ＭＰＳ間の偏差は、より高い流速でかなりより低かった。同様に、計算されたアルブミン分泌速度は、より小さい標準偏差を示す。しかしながら、１つのプラットフォームは、２〜４日目にわたる全てのコンパートメント内でかなりより少ないアルブミンを示した。さらに、コンピュータ的に生成されたアルブミン分布プロファイルが、実験的に測定されたアルブミン濃度と比較された。両方の値の比率は、より高い流速が、４方向ＭＰＳプラットフォームにおいてより決定的な分子体内分布をもたらすことを示した。
【０３１２】
（２）腸−肝臓／肺／子宮内膜４方向プラットフォーム：独立した流速制御は、複雑な生理機能に対するＰＫ−ＤＫ予測を改良する。
背景
ヒトに関する現代の医学の研究では、ヒト処置の見通しのための動物研究からの結果の解釈は、概して、非比例的スケーリングを採用し、生体内有効性の見通しのための生体外結果の解釈は、一般的に、ＩＶＩＶ相関および外挿と称される。肝臓ＭＰＳ薬物動態学（ＰＫ）の生体外研究は、培地中の結合、薬物取り込み、および排除を考慮することによって特徴付けられる。生体内研究は、匹敵するパラメータを計算するために、既知の臨床データおよび生理学ベースのＰＫ（ＰＢＰＫ）／吸収／結合モデルを使用する。
【０３１３】
Ｍａｎｖｅｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２年）、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００年）、Ｙｉｌｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１年）、Ｗｉｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９年）からの７つの薬物の臨床ＰＫデータが、ＬＩＶＥＲＣＨＩＰＴＭからの生体外結果の予測正確度を評価するために、ＬＩＶＥＲＣＨＩＰＴＭから収集された生体外肝臓データと比較された。細胞あたりの遊離ジクロフェナク排除に関する生体内ＰＢＰＫは、１．７６×１０−１０（細胞×分）−１の速度定数を有するが、ＬＩＶＥＲＣＨＩＰＴＭからのスケーリングされた肝臓ＭＰＳは、５．６６×１０−９（細胞×分）−１のジクロフェナク排除速度定数を示すことが研究された。したがって、ＬＩＶＥＲＣＨＩＰＴＭからの生体外薬物ＰＫデータは、生体内薬物排除速度を過大推定した。
【０３１４】
材料および方法
図および流動パーティション化（合計Ｑｍｉｘｉｎｇ＝１μＬ／秒、肝臓／ミキサ再循環＝１μＬ／秒、腸／肺／子宮内膜再循環速度＝０．５μＬ／秒）（９つの圧送流：５つの自己循環、４つの混合；６つの独立した流速：２つの独立した空気圧デューティサイクルに圧潰される５つの自己循環流；６つのポンプセット＝１８ＤＯＦ）に従って、４方向ＭＰＳインタラクトームが、研究され、混合チャンバへの作用剤の添加は、静脈内投与を考慮する一方、腸チャンバへの添加は、経口投与を考慮した。薬物が、実験のために腸チャンバの頂点側に添加された。
【０３１５】
結果
下流（子宮内膜）ＭＰＳが混合チャンバ内で９０％の濃度に到達すると、均一な薬物分布が、計算された。
【０３１６】
薬物暴露が、下流（子宮内膜）ＭＰＳにおける０〜４８時間の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）として計算された。薬物暴露および分布は、有用な動作範囲、すなわち、１０−６ｃｍ／秒を上回る薬物浸透性に関するＱｍｉｘｉｎｇ＞１５ｍＬ／日および２×１０４ｎｇ／Ｌ×時間を上回るＡＵＣ０〜４８時間に関するＱｍｉｘｉｎｇ＞４０ｍＬ／日の選択を大いに促すことが可能であった。
【０３１７】
（実施例５）  チップ上の７方向ＭＰＳの動作
材料および方法
検証：１０個の７方向プラットフォーム（プラットフォームあたりｎ＝１７ポンプ）における流速は、１．１２±０．１０μＬ／秒に平均化された。ソフトウェア較正係数が、流速測定から計算され、標的流速（０．９９±０．０５６μＬ／秒）の±５％以内にポンプ速度を補正するように入力された。
【０３１８】
７方向ＭＰＳプラットフォームが、利用され、実施例４に説明される４ＭＰＳプラットフォームと類似する様式で動作された。７方向プラットフォームは、腸（免疫コンピテント）、肝臓（免疫コンピテント）、肺、子宮内膜、心臓、脳、および膵臓ＭＰＳを含み、３週間の期間にわたって生存性および機能に関して評価された。各ＭＰＳは、相互作用研究に先立って、単離して分化または成熟させた。プラットフォームは、流動パーティション化を用いて、Ｑｍｉｘ＝１０ｍＬ／日の全身性流速において作動させた。培地交換中、基底共通培地が、腸、肺、肝臓、および子宮内膜ＭＰＳのために使用された一方、新しいＭＰＳは、その好ましい維持培地を供給された。各基底培地は、次いで、一連の相互作用全体を通して混合することを可能にされ、４８時間間隔において培地交換を伴った。各ＭＰＳの機能性が、非相互作用ＭＰＳ機能をベンチマーキングするために、単離されたＭＰＳと比較して最大３週間まで２〜４日毎に評価された。単離された膵臓ＭＰＳの機能性の劇的な低減に起因して、島組織が、相互作用および単離研究の両方に関して、１２日目に新鮮な島組織と交換された。
【０３１９】
結果
１．  ７方向ＭＰＳは、少なくとも３週間にわたって細胞生存能力および機能を支援する。
過渡アルブミン分泌動態、持続される腸および肺ＴＥＥＲ値、ならびにＩＧＦＢＰ−１分泌プロファイルが、確立された。ビート周波数によって監視された心臓ＭＰＳの機能性は、研究中に良好に維持された。Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）およびｃ−ペプチド放出プロファイルが、脳ＭＰＳおよび膵臓の両方もまた最大３週間まで機能的であることを示した。相互作用結果の単離結果との比較は、相互作用のＭＰＳ機能性に対するいかなる悪影響もないことを示した。増加されたＮＡＡ分泌およびより持続されるｃペプチド分泌が、相互作用中に観察された。長期ＭＰＳ生存能力および機能性は、少なくとも３週間の長い培養期間にわたって７ＭＰＳプラットフォームにおいて維持され得る。
【０３２０】
２．  「経口」投与された薬物およびその代謝物が、モデル薬物動態学予測と一貫する濃度においてＭＰＳを横断して分配された。
臨床的に間連する濃度を用いた外因性薬物研究は、生体外結果を臨床成果に変換するために重要である。非ステロイド性抗炎症薬物であるジクロフェナク（ＤＣＦ）の薬物動態学が、７ＭＰＳプラットフォームにおいて分析された。生体内経口ジクロフェナクの最大の測定される血漿濃度Ｃｍａｘは、２〜６μＭで変動する（Ｄａｖｉｅｓ  ＮＭ，  ｅｔ  ａｌ．による「Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．」３３、１８４−２１３（１９９７年））。４´−ヒドロキシ−ＤＣＦ（４−ＯＨ−ＤＣＦ）が、ＤＣＦの一般的代謝物である。
【０３２１】
本プラットフォームにおいて経口送達からの臨床的に観察されるＣｍａｘを再現するために、ジクロフェナクは、腸ＭＰＳの頂点側に添加された。異なるＭＰＳコンパートメントを横断するＤＣＦおよび４´−ヒドロキシ−ＤＣＦ培地の測定された濃度は、個別の薬物動態学モデル予測と適合した。ＤＣＦ投与量は、腸上皮障壁を横断して吸収され、肝臓ＭＰＳに分配され、続けて、混合チャンバおよび全ての他のＭＰＳコンパートメントに分配された。代謝物４−ＯＨ−ＤＣＦが、肝臓ＭＰＳ内で生産され、７方向ＭＰＳプラットフォームを横断して循環され、全ての他のＭＰＳコンパートメント内で検出された。ＤＣＦおよび４−ＯＨ−ＤＣＦ濃度の両方に対する生理学ベースの薬物動態学（ＰＢＰＫ）モデル予測が、測定されたデータと良好に整合し、これは、本プラットフォームが生物学的予測と一貫する決定的な様式で機能することを示した。非結合内因性クリアランス（ＣＬ＿ｉｎｔ（ｕ）：すなわち、流動の不在下で薬物を除去する肝臓の能力）は、１３．９０μＬ／分であると推定され、本クリアランスの約１９％は、４−ＯＨ−ＤＣＦ代謝物の形成に向けたものであると推定された。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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