(57)【要約】  いくつかの神経学的、筋肉、および不妊の疾患および症状の治療のための安定化無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）が提供される。特に、安定化ＡＣＣは軸索欠損および筋ジストロフィ−の治療で使用され得る。さらに、補助的生殖技術において使用される改善された方法が提供される。このような方法の例は、インビトロ受精および精子の質の改善である。改善されたＩＶＦ法は、例えば、受精および胚発達の段階が生じる細胞培養培地への安定化ＡＣＣの添加を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、筋ジストロフィ−および軸索欠損から選択される疾患または症状を治療するのに使用するため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む、上記医薬組成物。  
【請求項２】
前記筋ジストロフィ−が、デュシェンヌ型、ベッカ−型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋強直性、眼咽頭、遠位型、およびエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィ−から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記筋ジストロフィ−が、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−（ＤＭＤ）である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記軸索欠損が軸索損傷である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
軸索損傷を治療することが、損傷した神経の再生を高めることを含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記欠損または損傷が、中枢神経系の神経または末梢神経系の神経に対するものである、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１種類の安定化剤が、ポリリン酸、リン酸化アミノ酸、有機酸、リン酸化、ホスホン酸化、硫酸化、またはスルホン酸化有機化合物、ヒドロキシカルボン酸のリン酸または硫酸エステル、ビスホスホネ−ト、サッカライドおよびそれらの誘導体、タンパク質、ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化ペプチド、天然および合成バイオポリマ−およびそれらの誘導体、ならびにそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。  
【請求項８】
前記安定化剤が、ホスホセリン、三リン酸、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、フィチン酸、クエン酸、エチドロン酸、ピロリン酸、エタノ−ル、ヘキサメタリン酸、キチン、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記組成物が、全身投与を介して投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、経口によって投与される、請求項９に記載の医薬組成物。  
【請求項１１】
前記医薬組成物が、錠剤、カプセル、ピル、粉末、または顆粒から選択される固体投与剤形、あるいはエリキシル、チンキ、懸濁液、シロップ、エマルション、コロイド、またはゲルから選択される液体または半液体投与剤形に製剤化される、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記疾患または症状が軸索欠損であり、前記医薬組成物が局所投与される、請求項１、および４〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＡＣＣが、欠損または傷害がある神経に近接して投与される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記投与が注射、注入による、またはポンプを介したものである、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記医薬組成物が、懸濁液、エマルション、コロイド、またはゲルから選択される液体または半液体投与剤形として製剤化される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記安定化ＡＣＣ一次粒子の平均直径が、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
インビトロ受精のための方法であって、（ａ）哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させ、（ｂ）胚をインビトロ培養することを含み、ここでステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、または両ステップ（ａ）および（ｂ）は少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地で実施される、上記方法。
【請求項１８】
前記胚を少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地においてインビトロ培養することを含み、これによって胚発達を高める、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）の前に、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地における卵母細胞のインビトロ成熟のステップをさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
精子の質を改善するための方法であって、精子を少なくとも１種類の安定剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）に暴露することを含む、上記方法。
【請求項２１】
前記精子の質を改善することが、精子運動率を高める、精子前進運動率を高める、精子数を増加する、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
精子数を増加することが、運動率または前進運動率処理を実施するときに当該精子数を増加することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＸおよびＹ染色体を有する精子を分離するための方法であって、（ａ）精子サンプルを少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣと接触させ、（ｂ）スイムアップ法を実施し、（ｃ）運動性精子を含む分画を得、（ｄ）ステップ（ｃ）で得られる分画の上相と下相を分離することを含み、ここで上相はＹ染色体を有する精子が豊富であり、下相はＸ染色体を有する精子が豊富である、上記方法。
【請求項２４】
前記精子、卵母細胞、または胚が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の精子、卵母細胞、または胚である、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記非ヒト哺乳動物が、家畜動物、家庭用愛玩動物、げっ歯類、および霊長類からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記精子がヒト精子、卵母細胞、または胚である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１種類の安定化剤が、ポリリン酸、リン酸化アミノ酸、有機酸、リン酸化、ホスホン酸化、硫酸化、またはスルホン酸化有機化合物、ヒドロキシカルボン酸のリン酸または硫酸エステル、ビスホスホネ−ト、サッカライドおよびそれらの誘導体、タンパク質、ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化ペプチド、天然および合成バイオポリマ−およびそれらの誘導体、ならびにそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
男性不妊を治療するのに使用するための医薬組成物であって、少なくとも１種類の安定剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む、上記医薬組成物。
【請求項２９】
前記男性不妊が、低い精子数、低い精子運動率、および低い精子前進運動率によって生じる男性不妊から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
当該方法を必要とする被験体における筋ジストロフィ−および軸索欠損から選択される疾患または症状を治療するための方法であって、当該被験体に少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬品として許容可能な組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項３１】
前記筋ジストロフィ−が、デュシェンヌ型、ベッカ−型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋強直性、眼咽頭、遠位型、およびエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィ−からなる群から選択され、あるいはここで前記軸索欠損が軸索損傷である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
当該方法を必要とする被験体における男性不妊を治療するための方法であって、当該被験体に少なくとも１種類の安定剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の効果的な量を含む医薬組成物を投与することを含む、上記方法。  
【請求項３３】
前記男性不妊が、低い精子数と関連する男性不妊、低い精子運動率と関連する男性不妊、および低い精子前進運動率と関連する男性不妊からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記安定化剤が、ポリリン酸、リン酸化アミノ酸、有機酸、リン酸化、ホスホン酸化、硫酸化、またはスルホン酸化有機化合物、ヒドロキシルカルボン酸のリン酸または硫酸エステル、ビスホスホネ−ト、サッカライドおよびそれらの誘導体、タンパク質、リン酸化タンパク質、天然および合成バイオポリマ−およびそれらの誘導体、ならびにそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０または３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞成長を高めるための方法であって、細胞を少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣに暴露することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特定の筋肉、神経学的、および不妊の疾患または症状の治療のための安定化無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を提供する。さらに、安定化ＡＣＣは種々の補助的生殖技術、例えば、哺乳動物胚の成長を高めるまたは精子の質の改善において使用され得る。  
発明の背景
【０００２】
ＡＣＣの投与がカルシウム生物学的利用能の向上（Ｍｅｉｒｏｎら，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１，２６（２）：３６４−７２，Ｓｈａｌｔｉｅｌら，Ｈｅａｌｔｈ  ５，２０１３，１８−２９、およびＶａｉｓｍａｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，２９  （１０），ｐｐ  ２２０３−２２０９）、つまりカルシウム吸収不全と関連する症状および疾患を緩和する上で特に重要となる効果をもたらしたことが、前臨床的および臨床的な生物学的利用能モデルで示されている。ＡＣＣの経口投与は骨パラメ−タに好ましい効果をもたらし、骨粗しょう症予防モデルにおける再吸収抑制作用、同化効果、および骨機械的強度の維持によって実証された（Ｓｈａｌｔｉｅｌら）。ＷＯ２０１３／０８８４４０は、カルシウム吸収不全および吸収不全関連障害、疾患、および症状の治療における使用のため、ならびにカルシウム吸収不全および骨代謝関連障害における骨塩密度を増加するため、無定形炭酸カルシウム組成物を開示する。
【０００３】
ＷＯ２００５／１１５４１４は、安定なＡＣＣを含む経口投与可能な組成物、ならびに骨粗しょう症、骨軟化症、および関連疾患を治療するための方法を記載している。ＷＯ２００８／０４１２３６は、増殖性疾患、神経学的疾患、および筋骨格疾患を含む様々な病理学的症状を治療するのに有効である無定形または微細結晶炭酸カルシウムを含む製剤を記載している。ＷＯ２００９／０５３９６７は、無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）、および少なくとも１種類のリン酸化アミノ酸またはリン酸化ペプチドを含む組成物を記載している。当該組成物は、本明細書において示される様々な疾患の治療のために使用され得る。
【０００４】
神経傷害は臨床診療において一般的である。事故などによって生じた末梢神経の損傷が完全には回復されない多くの例がある。また、末梢神経が一般的に外科手術の結果として切除されなければならない臨床例も多い。中枢神経系（ＣＮＳ）は神経線維の長期的で弱い自己修復を有し、末梢神経系（ＰＮＳ）は迅速な神経線維再生による神経修復能力を有する。傷害後のＰＮＳ機能性の回復に関する研究が、軸索再生を促進して導くための適切な方法を探求することに専念され、急速に発展している分野になっている。
【０００５】
様々な方法が、損傷した末梢神経を再生する試みで開発されている。このような１つの技術は、切断された神経の近位端と遠位端の実際の縫合を含む。切断された再生軸索の誘導のために、近位および遠位の神経断端間で縫合される様々な導管の使用が積極的に追求されている。
【０００６】
現在十分な治療を欠如しているさらなる疾患は、筋ジストロフィ−と関連する。筋ジストロフィ−は筋骨格系を弱めて運動を妨げる筋疾患群である。筋ジストロフィ−は、進行性骨格筋の脱力、筋タンパク質の欠如、および筋細胞および組織の死によって特徴付けられる。このような疾患の一つは、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−（ＤＭＤ）であり、致死的な筋消耗性疾患に少年の約３５００名に一人が罹患している。デュシェンヌ型の少年は、約２０年の限られた平均余命を有する。障害はジストロフィン遺伝子における変異によって生じ、多くの異なる変異がタンパク質ジストロフィンの機能障害をもたらすものとして特定されている。これは進行性骨格筋消耗および変性によって特徴付けられ（Ｓｈｉｎら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１３，４５（１０）：２２６６−７９）、異常なカルシウム恒常性も含む。筋ジストロフィ−の医療管理は、コルチコステロイドの使用を含んでいるが、これらのかなり有効な効果にも関わらず、コルチコステロイドによる長期化した治療は骨粗しょう症をもたらし得る。コルチコステロイドがなくとも、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−は運動性の低下をもたらし、それ自体が骨折の機会増加および骨塩密度の低下と関連する（Ｎａｎｅｔｔｅら，Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ．２０１２，２３（４）：７７３−９９）。
【０００７】
現在、ＤＭＤまたは神経傷害のための満足のいく治療は今までなく、徴候の重篤度を低下させ、これらの症状を有する患者の生活の質を改善することが成果として考えられ得る。  
【０００８】
補助的生殖技術（ＡＲＴ）の領域は、雄および雌不妊の両方の問題を解決することが目的とされる。主な技術の一つは、インビトロ受精（ＩＶＦ）である。細胞培養培地の内容物は、受精および胚発達、そのため結果的に処置の成果に大きく影響し得る。ＩＶＦの成功率は、移植される胚の数、ならびに胚の品のような因子と主に関連している。培養培地を変更することは、インビトロ胚発達に大きく影響し得る。胚の質および胚の数を高めることが達成されるとき、進行した発達段階が受胎の成功する機会を増加させ得、インビトロ胚発達のための最適条件を見つけ出すことによってＩＶＦ全過程の効率を増加することができる。
【０００９】
「男性要因」不妊は、１および４週離して収集された２回の精子分析の少なくとも１サンプルでの精子濃度および／または運動率および／または形態学における変化として認められる。ヒトでは、これは不妊の４０〜５０％を占め、全男性の約７％に影響する。男性不妊は一般的に、低い精子数、運動率、および精子の異常な形態学に反映される精液または精液の質における欠如に起因する（Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ，２０１５，Ｊ．  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．，８（４）：１９１−１９６）。  
【００１０】
子宮内受精または従来のＩＶＦのようなＡＲＴのほとんどの技術は、精子の少なくとも正常な運動率を必要とする。精子選択のいくつかの方法が現在存在し、例えば、従来の洗浄スイムアップ法が使用され、本来の精子運動率に基づいてほとんどの運動性精子を選択する。選択された精子は結果的にＩＶＦ処理に使用され得る。インビトロ精子改善に関する多くの技術が示唆されている。インビトロ実験の結果は、ビタミンＥが酸化的損傷および運動率低下から精子を保護し得、ならびにハムスタ−卵貫通アッセイにおいて精子能力を高め得ることを示唆する（Ａｇａｒｗａｌ＆Ｓｅｋｈｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１０，１３（４）：２１７−２２５）。Ｂｈｏｕｍｉｋら（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２０１４，７０：１１７７−１１８３）は、カルシウム無含有培地へのＣａ２＋イオンの添加が精子前進運動率を２０％まで増加することを実証した。  
【００１１】
男性不妊の現象は世界中で増加しており（ＫｕｍａｒおよびＳｉｇｈ）、ますます多くの夫婦を補助的生殖技術に向かわせる。このため、インビトロで精子運動率を改善するための新規の方法が必要とされる。
【発明の概要】
【００１２】
無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）は細胞の再生、発達、成熟、および分化をプラスに高めることができることが、驚くべきことに発見されている。部分的に本発明は、ＡＣＣが神経線維再生を加速する、筋管形成を促進する、精子の質を改善する、および限定されないが発達の進行した段階に達する胚の数を増加することを含めて胚の発達を高めるという、予期せぬ結果に基づいている。  
【００１３】
一つの態様では、本発明は神経筋欠損と関連する疾患または症状を治療するのに使用するため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態により、疾患または症状は筋ジストロフィ−および軸索欠損から選択される。いくつかの実施形態により、医薬組成物は軸索欠損、例えば軸索損傷を治療するのに使用するためのものである。別の実施形態により、医薬組成物はデュシェンヌ型筋ジストロフィ−のような筋ジストロフィ−を治療するのに使用するためのものである。さらなる態様により、本発明はこの方法を必要とする被験体における筋ジストロフィ−および軸索欠損から選択される疾患または症状を治療するための方法を提供し、当該被験体に少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬品として許容可能な組成物を投与することを含む。
【００１４】
別の実施形態により、本発明はインビトロ受精のための方法を提供し、（ａ）哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させ、（ｂ）胚をインビトロ培養することを含み、ここでステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、または両ステップ（ａ）および（ｂ）は少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地において実施される。本方法は、いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の前に、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地における卵母細胞のインビトロ成熟のステップをさらに含み得る。いくつかの実施形態により、動物はヒトおよび非ヒト哺乳動物から選択される。  
【００１５】
特定の態様により、本発明は精子の質を改善または向上するための方法を提供し、精子を少なくとも１種類の安定剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）に暴露することを含む。いくつかの実施形態により、本方法は精子を少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣに暴露する、または接触させることを含む。一つの実施形態により、精子はヒト精子である。別の実施形態により、精子の質を改善することは、精子運動率を高める、精子前進運動率を高める、精子数を増加することを含み、従って、本発明の方法は、精子運動率を高める、精子前進運動率を高める、精子数を増加することを含む。
【００１６】
別の実施形態により、本発明はＸおよびＹ染色体を有する精子細胞を分離するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）精子サンプルを少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣと接触させ、（ｂ）スイムアップ法を実施し、（ｃ）運動性精子を含む分画を得、（ｄ）ステップ（ｃ）から得られる分画の上相と下相を分離することを含み、ここで上相はＹ染色体を有する精子が豊富であり、下相はＸ染色体を有する精子が豊富である。
【００１７】
さらに別の態様により、本発明は男性不妊を治療するのに使用するため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬組成物を提供する。  
【００１８】
いくつかの態様により、本発明はこの方法を必要とする被験体における男性不妊を治療するための方法を提供し、当該被験体に少なくとも１種類の安定剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の効果的な量を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００１９】
前記態様のいずれか一つにより、ＡＣＣは少なくとも１種類の安定化剤によって安定化される。一つの実施形態により、安定化剤は、ポリリン酸、リン酸化アミノ酸、有機酸、リン酸化、ホスホン酸化、硫酸化、またはスルホン酸化有機化合物、ヒドロキシル−カルボン酸のリン酸または硫酸エステル、ビスホスホネ−ト、サッカライドおよびそれらの誘導体、タンパク質、リン酸化タンパク質、天然および合成バイオポリマ−、およびそれらの誘導体、ならびにそれらのいずれかの組み合わせから選択される。  
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】培養した脊髄−後根神経節（ＳＣ−ＤＲＧ）スライスから得た神経発芽における異なるカルシウム源の効果を示す図である。下記のカルシウム化合物（２ｍＭのＣａ２＋濃度）に暴露されたＳＣ−ＤＲＧスライスから成長した神経線維の免疫蛍光染色（抗神経細糸抗体）。（Ａ）ＡＣＣ−エチドロン酸、（Ｂ）ＡＣＣ−ホスホセリン、（Ｃ）胃石、（Ｄ）結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）、および（Ｅ）ＣａＣｌ２溶液（対照）。原倍率×１００。
【図２】キトサンマイクロキャリア（ＭＣ）で培養された脳細胞から得られる神経発芽における、（Ａ）エチドロン酸によって安定化されたＡＣＣ、および（Ｂ）ＣａＣｌ２溶液（対照）の効果を示す図である。ＡＣＣ−エチドロン酸またはＣａＣｌ２のどちらかの２ｍＭの存在下での培養３０日後に、脳細胞−キトサンＭＣ凝集物から成長した神経線維の免疫蛍光染色（抗神経細糸抗体）を示す。
【図３】健全な骨格筋培養における筋管の形成に対するＡＣＣの効果を示す図である。原倍率×４０。骨格筋培養は、下記のカルシウム化合物に暴露させた（２ｍＭの最終Ｃａ２＋濃度）。ＡＣＣ−エチドロン酸、ＡＣＣ−ＡＤＰ、胃石、結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）、およびＣａＣｌ２溶液（対照）。培養を４日および７日後に固定してギムザで染色した。骨格筋培養による筋管形成の向上がＡＣＣ処理細胞で認められた。
【図４】ｍｄｘ細胞株培養における筋管の初期形成に対する培養培地中のＡＣＣの効果を示す図である。ＣａＣｌ２、ＡＣＣ−ＥＴ、およびＡＣＣ−ホスホセリン（ＡＣＣ−ＰＳ）を含む培地に暴露された培養のギムザ染色を示す。原倍率×１００。
【図５】２種のＡＣＣ調製物（ＡＣＣ−ＥＴおよびＡＣＣ−ＰＳ）対ＣａＣｌ２に暴露されたｍｄｘ筋細胞株で測定されたクレアチニンキナ−ゼ（ＣＫ）量を示す図である。
【図６】ｍｄｘマウス一次培養における筋管の形成に対するＡＣＣ（ＡＣＣ−ＰＳ、ＡＣＣ−ＰＰ対対照（ＣａＣｌ２））の効果（ギムザ染色、原倍率×５０）を示す図である。
【図７】ｍｄｘマウス一次培養における筋管の形成に対するＡＣＣの効果を、ミオシンの免疫染色によって実証して示す図である。対照（ＣａＣｌ２）、ＡＣＣ−ＰＳ、ＡＣＣ−ポリリン酸（ＡＣＣ−ＰＰ）。原倍率×１００。
【図８】異なるタイプのカルシウムサプリメントが経口投与されたマウス（野生型およびｍｄｘマウス）のクレアチニンキナ−ゼ値を示す図である。
【図９】ｍｄｘマウスの四肢ハンギング試験におけるこれらの能力に対する安定化ＡＣＣの投与の効果を示す図である。
【図１０】ＡＣＣの種々の濃度を添加したワンステップ培地におけるインビトロでのマウス胚発達に対する安定化ＡＣＣの効果を示す図である。
【図１１】ワンステップ培地におけるインビトロでのマウス胚発達に対する安定化ＡＣＣの効果を示す図である。
【図１２】分割培地におけるインビトロでのマウス胚発達に対する安定化ＡＣＣの効果を示す図である。
【図１３】様々な培地処理の機能として培養１０日後の骨芽細胞のアリザリンレッド染色を示す図である。培地はＡ−ＡＣＣ、Ｂ−ＣａＣｌ２の１ｍＭの追加Ｃａ２＋が補充され、Ｃ−対照はＣａ２＋未補充だった。
【図１４】様々な培地処理の機能として培養１０日後の骨芽細胞のアルカリホスファタ−ゼ染色を示す図である。培地はＡ−ＡＣＣ、Ｂ−ＣａＣｌ２の１ｍＭの追加Ｃａ２＋が補充され、Ｃ−対照はＣａ２＋未補充だった。
【図１５】添加された１ｍＭの追加Ｃａ２＋の異なる供給源による培地で成長させたｍｄｘ細胞株のアリザリンレッド染色（Ａ〜Ｃ）およびアルカリホスファタ−ゼ（Ｄ〜Ｆ）を示す図である。ＡおよびＤ−ＡＣＣ、ＢおよびＥ−ＣａＣｌ２、またはＣおよびＦ−対照（カルシウムの追加補充なし）。
【図１６】卵母細胞を囲む顆粒膜細胞が完全であるインビトロ培養された卵巣（Ａ）の安定化ＡＣＣの効果を、不完全な顆粒膜細胞および卵母細胞が胚胞段階で観察される対照（Ｂ）（培地にＡＣＣ無添加）に対して示す図である。本発明の詳細な説明
【００２１】
本発明は、細胞成長および成熟におけるＡＣＣの予期せぬ利点を開示する。これらの寄与は、後述で例示される細胞成長の様々な系で観察された。
【００２２】
いくつかの特定の態様により、本発明は神経筋疾患または症状から選択される疾患または症状を治療するのに使用するため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、疾患は筋ジストロフィ−および軸索欠損から選択され得る。本発明のいくつかの他の特定の態様により、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣは補助的生殖技術（ＡＲＴ）において使用され得る。一つの実施形態により、ＡＲＴはインビトロ受精である。別の実施形態により、ＡＲＴは精子の質を改善することを含む。  
【００２３】
本発明の各態様のため、個別的および集合的に、次の用語が使用され、特定のパラメ−タが後述のように定められる。
【００２４】
用語「医薬組成物」および「医薬品として許容可能な組成物」は本明細書において交換可能で使用され、１種類以上の医薬品として許容可能な担体とともに製剤化される、本明細書において後述で開示されるような、１種類以上の安定剤によって安定化されたＡＣＣを含む組成物を意味する。  
【００２５】
本明細書で使用される用語「医薬品として許容可能な担体」または「医薬品として許容可能な賦形剤」は、医薬品投与に適合性である、いずれかおよびすべての溶媒、分散メディア、保存剤、抗酸化剤、コ−ティング、等張剤、吸収緩徐剤、界面活性剤、緩衝剤などを意味する。医薬品として有効な成分のためのこのようなメディアおよび薬剤の使用は、従来技術で良く知られている。本組成物は、補助、追加、または増強された治療機能をもたらす他の有効薬剤を含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態により、疾患または症状は軸索欠損であり、そのため本発明は軸索欠損を治療するのに使用するため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
本明細書で使用される用語「治療する」は、臨床的な結果を含む、有益または所望の結果を得る段階を実施することを意味する。有益または所望の臨床結果は、限定されないが、症状と関連する１つ以上の徴候の軽減または改善を含む。  
安定化ＡＣＣ：
【００２８】
前記実施形態のいずれか一つにより、ＡＣＣは少なくとも１種類の安定化剤によって安定化される。用語「無定形炭酸カルシウム」および「ＡＣＣ」は本明細書において交換可能で使用され、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された炭酸カルシウムの非結晶無定形型を意味する。用語「安定化剤」および「安定剤」は本明細書では交換可能で使用され、炭酸カルシウムをＡＣＣ生産、製剤化、保存、および／または使用の際に無定形状態に維持するのに寄与するいずれかの物質を意味する。特定の実施形態では、安定化剤は単剤である。他の実施形態では、いくつかの安定化剤の使用が包含される。用語「安定化ＡＣＣ」および「少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣ」は、いくつかの実施形態では交換可能で使用され得る。
【００２９】
ＡＣＣは天然源または化学的な合成から得ることが可能である。用語はまた、胃石から得られるＡＣＣのような自然に安定化されたＡＣＣを含む。
【００３０】
本明細書で使用される用語「天然ＡＣＣ」は、天然源から分離または派生されるいずれかのＡＣＣを意味する。ＡＣＣの天然源の非限定的な例には、淡水甲殻類の胃石が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される用語「合成ＡＣＣ」は、ヒトによって生体外で産生および／または派生されるいずれかのＡＣＣを意味する。
【００３２】
安定剤は１つ以上の官能基を有する分子を含み得、限定されないが、ヒドロキシル、カルボキシル、エステル、アミン、ホスフィノ、ホスホノ、ホスフェ−ト、スルホニル、サルフェ−ト、またはスルフィン基から選択される。水酸化物と結合されるヒドロキシ含有化合物は、任意にカルボキシルなどの他の官能基も有するが、エステル化されないヒドロキシルを伴う。
【００３３】
いくつかの実施形態により、安定剤は哺乳動物細胞または生物、特にヒトに対して毒性が低いまたは毒性を有さない。他の実施形態により、安定剤は食品、栄養補助食品、または医薬品グレ−ドである。  
【００３４】
特定の実施形態では、ＡＣＣ安定化剤は各存在において独立して、有機酸；リン酸化、ホスホン酸化、硫酸化、またはスルホン酸化有機化合物；ヒドロキシルカルボン酸のリン酸または硫酸エステル；有機アミン化合物；ヒドロキシルを含む有機化合物；有機亜リン酸化合物またはその塩；リン酸化アミノ酸およびその誘導体、ビスホスホネ−ト；有機リン酸化合物；有機ホスホン酸化合物；有機ポリリン酸、無機ポリリン酸、無機亜リン酸、前記で定められる複数官能基を有する有機化合物；無機リン酸およびポリリン酸化合物；ポリリン酸鎖を有する有機化合物；有機界面活性剤；生体必須無機イオン；サッカライドおよびその誘導体、タンパク質、リン酸化タンパク質、天然および合成バイオポリマ−およびそれらの誘導体、あるいはそれらのいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態により、安定剤はまた医薬品活性を有し得、例えばビスホスホネ−トまたはＡＴＰである。  
【００３５】
このため、一つの実施形態では、安定化剤は、無機ポリリン酸のようなポリリン酸、有機酸、リン酸化、ホスホン酸化、硫酸化、またはスルホン酸化有機化合物、ヒドロキシカルボン酸のリン酸または硫酸エステル、リン酸化アミノ酸、ビスホスホネ−ト、有機ポリリン酸、サッカライドおよびそれらの誘導体、タンパク質、ペプチド、リン酸化タンパク質、リン酸化ペプチド、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態により、安定化剤は、ホスホセリン、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、フィチン酸、クエン酸、エチドロン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、三リン酸、エタノ−ル、ヘキサメタリン酸、キチン、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。  
【００３６】
いくつかの実施形態により、安定剤は有機酸である。特定の実施形態により、有機酸はアスコルビン酸、クエン酸、乳酸、酢酸、シュウ酸、マロン酸、グルタコン酸、コハク酸、マレイン酸、乳酸、グルタミン酸、アコニット酸、および任意に少なくとも２つのカルボン酸を有して任意に２５０ｇ／ｍｏｌを超えない分子量を有する化合物、例えばクエン酸、酒石酸、リンゴ酸などから選択される。一つの特定の実施形態により、安定剤はクエン酸である。
【００３７】
別の実施形態では、安定剤はホスホエノ−ルピルビン酸のようなヒドロキシルカルボン酸のリン酸エステルである。別の実施形態では、ヒドロキシルカルボン酸のリン酸または硫酸エステルはアミノ酸を含む。このようなエステルの例はホスホセリン、ホスホトレオニン、スルホセリン、スルホトレオニン、およびホスホクレアチンである。  
【００３８】
別の実施形態では、安定剤はサッカライドである。一つの実施形態により、サッカライドは、モノ−、ジ−、トリ−、オリゴ−、およびポリサッカライドであり、スクロ−ス、マンノ−ス、グルコ−ス、キトサン、およびキチンなどである。安定剤は、いくつかの実施形態ではグリセロ−ルなどのポリオ−ルである。別の実施形態により、安定剤はアミノ酸であり、セリンまたはトレオニンなどである。それぞれの実現性は本発明の別々の実施形態を示す。  
【００３９】
天然および合成バイオポリマ−および誘導体の非限定例はポリヌクレオチドおよび糖タンパク質である。
【００４０】
食品消費で承認されているようなＡＣＣ安定剤におけるいくつかの具体的な非限定例は、自然食品またはヒトで認められており、フィチン酸、クエン酸、ピロリン酸ナトリウム二塩基性、アデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）ナトリウム塩、アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）ナトリウム塩、およびアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）二ナトリウム塩水和物、ホスホセリン、リン酸化アミノ酸、食品グレ−ド界面活性剤、ステアロイルラクチラ−トナトリウム、およびそれらの組み合わせを含む。  
【００４１】
いくつかの実施形態により、安定剤は、ホスホエノ−ルピルビン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、スルホセリン、またはスルホトレオニンのようなヒドロキシルカルボン酸のリン酸または硫酸エステル、ならびに例えば、スクロ−ス、マンノ−ス、グルコ−スなどのモノ−、ジ−、トリ−、オリゴ−、およびポリサッカライドから選択されるサッカライドから選択される、少なくとも１種類の成分を含む。ヒドロキシ含有化合物はさらに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのような、少なくとも１種類の水酸化アルカリを含み得る。リン酸化された酸は、オリゴペプチドおよびポリペプチドに存在し得る。本発明の別の実施形態では、安定剤はモノカルボン酸または多カルボン酸、例えば、ジカルボン酸またはトリカルボン酸から選択される有機酸である。それぞれの実現性は本発明の別々の実施形態を示す。有機酸は前記で定める通りであり得る。  
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態では、ＡＣＣ安定剤はリン酸化アミノ酸、ポリオ−ル、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、安定なＡＣＣは安定剤としてリン酸化化合物を含み、ここでリン酸化は有機化合物のヒドロキシル基で実施される。いくつかの実施形態では、安定なＡＣＣはクエン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ホスフェ−ト、ホスファイト、ホスホネ−ト基、およびこれらの塩またはエステルを含む安定剤の非限定的な例は、フィチン酸、リン酸ジメチル、リン酸トリメチル、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸テトラエチル、リブロ−スビスホスフェ−ト、エチドロン酸、および他の医療用ビスホスホネ−ト、３−ホスホグリセリン酸塩、グリセルアルデヒド３−リン酸、１−デオキシ−Ｄ−キシルロ−ス−５−リン酸ナトリウム塩、ジエチレントリアミンペンタキス（メチルホスホン酸）、ニトリロトリ（メチルホスホン酸）、５−ホスホ−Ｄ−リボ−ス１−二リン酸五ナトリウム塩、アデノシン５’−二リン酸ナトリウム塩、アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩水和物、α−Ｄ−ガラクトサミン１−リン酸、２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩、α−Ｄ−ガラクト−ス１−リン酸二カリウム塩五水和物、α−Ｄ−ガラクトサミン１−リン酸、Ｏ−ホスホリルエタノ−ルアミン，二ナトリウム塩水和物、２，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸五ナトリウム塩、ホスホ（エノ−ル）ピルビン酸一ナトリウム塩水和物、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸、ｓｎ−グリセロ−ル３−リン酸リチウム塩、Ｄ−（−）−３−ホスホグリセリン酸二ナトリウム塩、Ｄ−グルコ−ス６−リン酸ナトリウム塩、ホスファチジン酸、イバンドロン酸ナトリウム塩、ホスホノ酢酸、ＤＬ−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸、またはそれらの組み合わせを含む。生体必須無機イオンは、とりわけ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、酸化物の相におけるＰまたはＳ、あるいはアンモニアまたはニトロ基としてのＮを含み得る。
【００４３】
安定剤はさらにホスホン酸化合物を含み得、限定されないが、ビスホスホネ−ト、ポリリン酸など、限定されないがピロリン酸またはポリリン酸または有機ポリリン酸など、限定されないがアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）などが挙げられる。
【００４４】
任意にＡＣＣはホスホセリンおよびクエン酸の併用によって安定化される。別の実施形態では、ＡＣＣは三リン酸およびクエン酸によって安定化される。  
【００４５】
ＡＣＣは１種類を超える安定剤、例えば２種類の安定剤によって安定化され得る。いくつかの実施形態では、第一安定剤および第二安定剤は同一である。他の実施形態では、第一安定剤および第二安定剤は異なる安定剤を含む。第一および第二安定剤はそれぞれ独立して上記で定める通りであり得る。安定なＡＣＣは、２種類を超える安定剤を含むことができ、ここで安定剤は同一または異なり得る。安定なＡＣＣは２種類を超える安定剤を含むことができ、ここで１種類以上の安定剤はＡＣＣの形成および沈殿の際にＡＣＣに加えられ、そのため「内部」安定剤を構成し、別の１種類以上の安定剤はＡＣＣ粒子表面にこれらの形成後に加えられ、そのため「外部」安定化剤を構成する。安定なＡＣＣおよびこの調製のためのさらなる例は、国際特許出願番号ＷＯ２００９／０５３９６７、ＷＯ２０１４／０２４１９１、およびＷＯ２０１６／１９３９８２に認められ得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、安定化剤はタンパク質またはペプチドである。一つの実施形態では、タンパク質またはペプチドは、天然に産生されて精製されたタンパク質またはペプチドである。別の実施形態では、タンパク質は合成によって産生されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質はＧＡＰ６５、ＧＡＰ２２、ＧＡＰ２１、およびＧＡＰ１２タンパク質から選択される。別の実施形態では、タンパク質は、ＣｑＣＤＡ１、キチナ−ゼ２、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼ、ＧＡＭＰ様タンパク質、キチン結合タンパク質、ＣｑＣＢＰ、ＣＡＰ１０、ＧＡＰ１８．２、ＧＡＰ０２５２６、ＣｑＨｃ１、ＣｑＨｃ２、ＣｑＨｃ３、ＣｑＨｃ４、ＣｑＨｃ５、ＣｑＨｃ６、ＣｑＨｃ７、クリプトシアニン１、シクロフィリン、シスタチン１、シスタチン２、ＬＰＳ−ＢＰ、ＬＥＡタンパク質、およびクリスタシアニンから選択され、任意に当該タンパク質はレッドクロウ由来である。特定の実施形態により、タンパク質はリン酸化タンパク質である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、安定化剤は、ポリリン酸、リン酸化アミノ酸、有機酸、リン酸化、ホスホン酸化、硫酸化、またはスルホン酸化有機化合物、ヒドロキシカルボン酸のリン酸または硫酸エステル、ビスホスホネ−ト、サッカライド、それらの誘導体、タンパク質、リン酸化タンパク質、天然および合成バイオポリマ−、およびそれらの誘導体、ならびにそれらのいずれかの組み合わせから選択される。他の実施形態では、安定化剤は、ホスホセリン、三リン酸、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、フィチン酸、クエン酸、エチドロン酸、ピロリン酸、エタノ−ル、ヘキサメタリン酸、キチン、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される。  
【００４８】
いくつかの実施形態では、安定化剤は、有機酸、リン酸化有機酸、ヒドロキシカルボン酸のリン酸または硫酸エステル、リン酸化アミノ酸、ビスホスホネ−ト、有機ポリリン酸、サッカライド、それらの誘導体、タンパク質、ならびにそれらのいずれかの組み合わせから選択される。  
【００４９】
いくつかの実施形態により、少なくとも１種類の安定剤は、ポリリン酸、ビスホスホネ−ト、リン酸化アミノ酸、クエン酸、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１種類を超える安定剤、例えば、２、３、または４種類の安定剤が加えられる。
【００５０】
いくつかの実施形態により、安定剤は、ポリリン酸または医薬品として許容可能なその塩である。いくつかの実施形態により、ポリリン酸は、ナトリウム、カリウム、およびポリリン酸の他の欠かせないカチオンからなる群から選択される、生理学的に適合性である水溶性ポリリン酸塩である。一つの実施形態では、ポリリン酸は有機または無機ポリリン酸である。本明細書で使用される用語「ポリリン酸」は、ＰＯ４の高分子量エステルを意味する。いくつかの実施形態により、ポリリン酸は、ポリリン酸ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択される、生理学的に適合性である水溶性ポリリン酸塩である。いくつかの実施形態では、ポリリン酸は無機ポリリン酸またはその医薬品として許容可能な塩である。このような塩の非限定的な例は、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｍｎ、およびＺｎである。いくつかの実施形態により、無機リン酸は２〜１０個のリン酸基を含み、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリン酸基である。いくつかの実施形態により、ポリリン酸はピロリン酸、三リン酸、およびヘキサメタリン酸から選択される。一つの実施形態により、安定剤はピロリン酸またはその医薬品として許容可能な塩であり、ピロリン酸ナトリウムなどが挙げられる。別の実施形態により、安定剤は三リン酸またはその医薬品として許容可能な塩であり、三リン酸ナトリウムなどが挙げられる。用語「三リン酸」および「トリポリリン酸」は本明細書において交換可能で使用される。さらなる実施形態により、安定剤はヘキサメタリン酸またはその医薬品として許容可能な塩であり、ヘキサメタリン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５１】
いくつかの実施形態により、安定剤はビスホスホネ−ト、またはその医薬品として許容可能なその塩である。塩の非限定的な例は、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｍｎ、およびＺｎである。
【００５２】
本明細書で使用される用語「ビスホスホネ−ト」は、２つのリン酸（ＰＯ（ＯＨ）２）基を有する有機化合物を意味する。用語はさらにＰＯ３−有機−ＰＯ３の骨格を有する化合物を意味する。最も一般的なものは、骨粗鬆症を治療する医薬品として使用される一連のビスホスホネ−トである。いくつかの実施形態により、ビスホスホネ−トは、エチドロン酸、ゾレドロン酸、メドロン酸、アレンドロン酸、およびそれらの医薬品として許容可能な塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態により、安定剤はエチドロン酸またはその医薬品として許容可能な塩である。別の実施形態により、安定剤はゾレドロン酸またはその医薬品として許容可能なその塩である。さらなる実施形態により、安定剤はメドロン酸またはその医薬品として許容可能なその塩である。いくつかの実施形態により、安定剤はアレンドロン酸またはその医薬品として許容可能な塩である。
【００５３】
特定の実施形態により、安定剤はリン酸化アミノ酸である。一つの実施形態により、リン酸化アミノ酸はホスホセリンである。別の実施形態により、リン酸化アミノ酸はホスホトレオニンである。
【００５４】
いくつかの実施形態により、ＡＣＣ組成物は前記で開示される安定剤の組み合わせを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態により、安定剤は前述で定められるポリリン酸またはビスホスホネ−トであり、安定剤のＰ原子とＡＣＣのＣａ原子の間のモル比（Ｐ：Ｃａモル比）は、約１：９０〜１：１である。一つの実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：４０〜約１：１である。さらなる実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：３５〜約１：２である。特定の実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：３０〜約１：３である。特定の実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：２８〜約１：３である。他の実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：２５〜約１：４である。さらなる実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：２０〜約１：５である。別の実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：２０〜約１：６である。特定の実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：１５〜約１：５である。別の実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：２５〜約１：５である。いくつかの実施形態により、このようなポリリン酸は、ピロリン酸、三リン酸、ヘキサメタリン酸、またはそれらの医薬品として許容可能な塩である。別の実施形態により、ビスホスホネ−トは、アレンドロン酸、エチドロン酸、ゾレドロン酸、またはメドロン酸であり、Ｐ：Ｃａモル比は前述で定められた通りである。
【００５６】
いくつかの実施形態により、ポリリン酸またはビスホスホネ−トを含む安定化ＡＣＣのカルシウム含量（Ｃａ含量）は、約１ｗｔ％〜約３９ｗｔ％、約５ｗｔ％〜約３９ｗｔ％、約１０ｗｔ％〜約３９ｗｔ％、約１５ｗｔ％〜約３９％、約２０ｗｔ％〜約３８ｗｔ％、約２５ｗｔ％〜約３８ｗｔ％、または約３０ｗｔ％〜約３８ｗｔ％である。用語「Ｃａ含量」および「カルシウム含量」は、本明細書において交換可能で使用され、ＡＣＣの最終組成物におけるカルシウムの含量を意味する。
【００５７】
特定の実施形態では、Ｐ：Ｃａモル比は約１：４０〜約１：１であり、Ｃａ含量は約２０ｗｔ％〜約３９ｗｔ％である。いくつかの実施形態では、モル比は約１：２８〜約１：３であり、Ｃａ含量は約３０ｗｔ％〜約３８ｗｔ％である。別の実施形態では、モル比は約１：２５〜約１：５であり、Ｃａ含量は約３０ｗｔ％〜約３６ｗｔ％である。
【００５８】
いくつかの実施形態により、安定剤は、ポリリン酸、リン酸化アミノ酸、ビスホスホネ−ト、クエン酸、酒石酸、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。一つの実施形態により、ポリリン酸は、三リン酸、ピロリン酸、およびヘキサメタリン酸からなる群から選択され、リン酸化アミノ酸はホスホセリンまたはホスホトレオニンであり、ビスホスホネ−トはアレンドロン酸、エチドロン酸、ゾレドロン酸、およびメドロン酸からなる群から選択される。
【００５９】
いくつかの実施形態により、安定化ＡＣＣは安定化剤を２０ｗｔ％未満、１５ｗｔ％未満、１０ｗｔ％未満、または５ｗｔ％未満含む。いくつかの実施形態では、安定化ＡＣＣは安定化剤を５ｗｔ％まで含む。  
【００６０】
一つの実施形態により、安定化ＡＣＣ一次粒子の平均直径は約１０ｎｍ〜約５μｍである。別の実施形態により、ＡＣＣ一次粒子の平均直径は約３０〜約４００ｎｍである。さらに別の実施形態により、ＡＣＣ一次粒子の平均直径は約３０ｎｍ〜３５０ｎｍである。特定の実施形態により、ＡＣＣ一次粒子の平均直径は、約３５ｎｍ〜３００ｎｍ、４０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約４５ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約１００ｎｍである。さらに別の実施形態により、ＡＣＣ一次粒子の平均直径は約３０〜００ｎｍである。なお別の実施形態により、ＡＣＣの一次粒子は凝集され、凝集体の平均直径は０．５μｍ〜３００μｍである。一つのさらなる実施形態により、ＡＣＣ一次粒子の凝集体の直径は、約１〜約１００μｍ、約１０〜約５０μｍ、または約２０〜約４０μｍである。別の実施形態により、ＡＣＣ一次粒子の凝集体の平均直径は１μｍ〜１０μｍである。
医薬組成物および投与の経路
【００６１】
前記実施形態のいずれか一つにより、本発明の医薬組成物は投与の任意の既知経路によって投与され得る。用語として、被験体に物質、化合物、薬剤、または医薬組成物「を投与すること」または「の投与」は、従来技術の当業者によって知られている様々な方法の一つを用いて実施することができる。例えば、化合物、薬剤、または組成物は、経腸的または非経口的に投与することができる。経腸的は経口、舌下、または直腸を含む消化管を介した投与を意味する。非経口投与は、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼、舌下、鼻腔内、吸入、脊髄内、脳内、および経皮（例えば皮膚管を通した、吸収による）による投与を含む。化合物または薬剤はまた、充電可能なまたは生物分解性ポリマ−のデバイスまたは他のデバイス、例えば、パッチおよびポンプによって、あるいは、化合物または薬剤の延長、緩徐、または制御された放出をもたらす製剤によって適切に導入することができる。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１回以上の延長期間にわたって実施することができる。いくつかの実施形態では、投与は、自己投与を含む直接的投与、および薬剤または医療食品を処方する行為を含む間接的投与の両方を含む。例えば、本明細書で使用されるとき、薬剤または医療食品を自己投与すること、または別の者によって投与される薬剤または医療食品を有することを患者に指図する、および／または患者に薬剤または医療食品のための処方を提供する医師は、患者に薬剤または医療食品を投与している。いくつかの実施形態により、医薬組成物は医薬食品または補助食品である。
【００６２】
一つの実施形態では、安定化ＡＣＣを含む医薬組成物は、全身投与によって投与される。例えば、安定化ＡＣＣは経口、舌下、または直腸によって投与され得る。あるいは、安定化ＡＣＣは、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼、舌下、鼻腔内、吸入、脊髄内、脳内、および経皮によって投与され得る。一つの具体的な実施形態では、安定化ＡＣＣは経口によって投与される。
【００６３】
本発明による医薬組成物は、任意の既知の方法で調製され得る。特に、医薬組成物は、投与後に有効成分の迅速、持続、または遅延放出をもたらすような従来技術で知られた方法を用いて製剤化され得る。一つの特定の実施形態では、医薬組成物は錠剤、カプセル、粉末、または顆粒から選択される固体投与剤形として製剤化される。別の実施形態では、医薬組成物はエリキシル、チンキ、懸濁液、シロップ、エマルション、またはゲルから選択される液体または半液体投与剤形として製剤化される。医薬組成物はガムのような半固体剤形として製剤化され得る。
【００６４】
経口使用のために意図された医薬組成物は、医薬組成物の製造のために従来技術で知られている任意の方法によって調製され得、さらに医薬品として洗練されて味の良い調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤から選択される１種類以上の薬剤を含み得る。錠剤は有効成分を、錠剤の製造に適している非毒性の医薬品として許容可能な賦形剤と混合して含む。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクト−ス、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムのような不活性増量剤、コ−ンスタ−チまたはアルギン酸などの顆粒化および崩壊剤、結合剤、ならびに滑剤であり得る。錠剤は既知技術を用いて任意にコ−ティングして、消化管における崩壊および吸収を遅延させ、これによって長期間にわたる薬剤の延長放出をもたらす。
神経筋疾患または症状
【００６５】
一つの実施形態により、本発明は軸索欠損を治療するのに使用するため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
用語「軸索欠損」は、末梢または中枢神経系の神経細胞の軸索部分に対するいずれかの欠損、損傷、または傷害を意味する。神経は外傷または疾患のどちらかによって損傷され得る。手根管症候群のような外傷性神経傷害は、神経の圧迫によって生じる。落下および交通事故のような他の外傷は、神経の断絶をもたらし得る。神経を害する疾患には、多発性硬化症、糖尿病、脊椎破裂、およびポリオが含まれる。例えば、多発性硬化症は、軸索を囲む遮断性ミオシンの分解を生じる。本発明のいくつかの実施形態により、欠損または損傷は、脳、脊髄、脊髄から末梢神経まで現れる求心性および遠心性神経に生じ得る。
【００６７】
いくつかの実施形態により、軸索欠損を治療することは、傷害のような軸索損傷を治療することを含む。いくつかのさらなる実施形態により、軸索損傷を治療することは、損傷した神経の再生および／または回復を高めることを含む。別の実施形態により、軸索損傷を治療することは、神経再生を高めることを含む。いくつかの実施形態により、軸索損傷を治療することは、多発性硬化症のような疾患から生じる欠損を治療することを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態により、軸索欠損は軸索損傷であり、そのため、本発明の医薬組成物は、軸索損傷、例えば軸索傷害などを治療するのに使用するためのものである。  
【００６９】
一つの実施形態では、軸索損傷を治療することは、損傷した神経の再生および／または回復を高めることを含む。  
【００７０】
本明細書で使用される用語「ニュ−ロン再生」および「神経再生」は交換可能で使用され得、損傷した神経の機能の回復を意味する。具体的には、これは末梢または中枢神経系の損傷部位を修復すること、つまり軸索および樹状神経線維再成長による、神経を介したシグナル化の回復を含む。いくつかの実施形態では、神経再生は損傷した神経線維から発芽することを意味する。  
【００７１】
いくつかの実施形態により、局所投与される医薬組成物は、前述で定められる液体または半液体剤形に製剤化される。一つの実施形態では、液体または半液体製剤は、懸濁液、エマルション、コロイド、またはゲルから選択される。一つの特定の実施形態では、安定化ＡＣＣは懸濁液として投与される。  
【００７２】
損傷した神経の欠損は、末梢神経系（ＰＮＳ）または中枢神経系（ＣＮＳ）の神経であり得る。このため一つの実施形態では、本発明の医薬組成物は中枢神経系の神経に対する損傷を治療するためのものである。別の実施形態により、本発明の医薬組成物は末梢神経系の神経に対する損傷を治療するためのものである。本発明のいくつかの実施形態により、本発明の医薬組成物は、脳、脊髄、脊髄から末梢神経まで現れる求心性および遠心性神経、または末梢神経に生じた損傷を治療するためのものである。
【００７３】
一つの実施形態により、医薬組成物は局所に投与される。一つのより具体的な実施形態では、医薬組成物は損傷した神経に近接して投与される。いくつかの実施形態により、医薬組成物は注射、注入、またはポンプ経由によって投与される。  
【００７４】
一つの実施形態により、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む医薬組成物は、軸索損傷のような軸索欠損を治療するのに使用するため、ホスホセリン、三リン酸、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、フィチン酸、クエン酸、エチドロン酸、ピロリン酸、エタノ−ル、ヘキサメタリン酸、キチン、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される。
【００７５】
いくつかの実施形態により、疾患または障害は筋ジストロフィ−である。そのため一つの実施形態では、本発明は筋ジストロフィ−を治療するのに使用するため、安定化ＡＣＣを含む医薬品として許容可能な組成物を提供する。
【００７６】
本明細書で使用される用語「筋ジストロフィ−」は、進行性骨格筋脱力および脆弱によって特徴付けられるいくつかの変性障害、疾患、または症状のいずれか一つを意味する。これらの疾患の多くは、ジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）のタンパク質をコ−ドする遺伝子における変異から生じる。一つの実施形態では、筋ジストロフィ−は、デュシェンヌ型、ベッカ−型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋強直性、眼咽頭、遠位型、またはエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィ−として特定される疾患を意味する。一つの特定の実施形態では、筋ジストロフィ−はデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（ＤＭＤ）である。このため一つの実施形態では、本発明の医薬品として許容可能な組成物はＤＭＤを治療するのに使用するためものである。
【００７７】
一つの実施形態では、用語「治療する」は、筋ジストロフィ−と関連する１つ以上の徴候の軽減または改善、その障害の遅延化または緩徐化を意味する。いくつかの実施形態により、筋ジストロフィ−を治療することは筋管形成を促進することを含む。本明細書で使用される用語「筋管形成」は、筋芽細胞が多核化線維である筋管に融合する過程を意味する。いくつかの実施形態により、用語「筋ジストロフィ−を治療する」はさらにまた、当該筋管の自発的収縮活動の発症までの時間を低下することを含む。自発的収縮活動の発生までの時間は、筋芽細胞が融合して自発的に収縮するまでに必要とされる時間として定められる。
【００７８】
本発明の教示により、ＡＣＣは前述で説明される少なくとも１種類の安定化剤によって安定化される。一つの実施形態により、安定化ＡＣＣは、胃石などの天然源から得られる天然ＡＣＣであり、あるいは化学的に合成される。  
【００７９】
一つの実施形態により、本発明はＤＭＤを治療するのに使用するため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む医薬組成物を提供し、ここで安定化剤はホスホセリン、三リン酸、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、フィチン酸、クエン酸、エチドロン酸、ピロリン酸、エタノ−ル、ヘキサメタリン酸、キチン、およびそれらのいずれかの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態により、安定化剤はクエン酸とともに、ホスホセリン、三リン酸、ビスホスホネ−ト、およびそれらの組み合わせから選択される。一つの実施形態により、医薬組成物は全身に、例えば経口によって投与される。
【００８０】
別の態様により、本発明は軸索欠損および筋ジストロフィ−から選択される疾患または症状の治療のための医薬品の調製のため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣの使用を提供する。
補助的生殖技術：
【００８１】
本発明のいくつかの態様により、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣは補助的生殖技術（ＡＲＴ）において使用され得る。  
【００８２】
別の実施形態により、本発明はインビトロ受精のための方法を提供し、（ａ）哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させ、（ｂ）胚をインビトロ培養することを含み、ここでステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、または両ステップ（ａ）および（ｂ）は少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地において実施される。一つの実施形態により、本発明はインビトロ受精のための方法を提供し、（ａ）哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させ、（ｂ）少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地で胚をインビトロ培養することを含む。別の実施形態では、本発明はインビトロ受精のための方法を提供し、（ａ）哺乳動物卵母細胞を少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地でインビトロ受精させ、（ｂ）胚をインビトロ培養することを含む。他の実施形態では、両ステップ、すなわち、（ａ）哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させ、（ｂ）胚をインビトロ培養するステップは、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地で実施される。
【００８３】
いくつかの実施形態により、ステップ（ａ）および（ｂ）の細胞培養培地は、一つの実施形態において、異なる培地であり得る。別の実施形態では、当該培地は同一培地であり得る。
【００８４】
本明細書で使用される用語「胚」は、受精した哺乳動物卵母細胞、すなわち接合子、および発達のその初期段階で当該接合子から発達する多細胞生物を意味する。  
【００８５】
本発明の教示により、ＡＣＣを含む細胞培養培地において胚を培養することは、胚発達を高める。用語「胚形成」および「胚発達」は本明細書において交換可能で使用され、従来技術で知られているように、胚が生じて接合子段階から発達して胚になる過程を意味し、分割、緊密化、胚盤胞形成、または胚盤胞孵化の期に達する段階を含む。本明細書で使用される用語「分割」、「緊密化」、「胚盤胞」、および「孵化」は、発生学で日常的に使用される用語を意味する。用語「分割」は、早期胚における細胞の分裂である。元の接合子と同様なサイズの細胞クラスタ−を生じる。分割から得られる異なる細胞は卵割球と呼ばれる。本明細書で使用される用語「緊密化」は、接合子から生じた分裂細胞が極性化および接着によってこれらの互いの接触を最大にして、堅い結合によって互いを保持する密着球を形成する段階を意味する。本明細書で使用される用語「胚盤胞」は、緊密化段階後に発達され、引き続き胚を形成する内細胞塊、ならびに内細胞塊および胞胚腔と呼ばれる流体が充満した孔を囲む胚盤胞の外層を含む構造を意味する。本明細書で使用される用語「孵化」は、胚がその外殻（透明帯）を通って出現する段階を意味する。
【００８６】
本明細書で使用される用語「胚発達を高める」は、発達過程の速度および／または効率を促進、向上、または改善すること、ならびに順調に成長および発達した胚の割合を意味する。向上は、同一処理を実施するが、細胞培養培地にＡＣＣが添加されていない対照サンプルと比較して測定される。このため一つの実施形態では、本方法は少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地において胚をインビトロ培養することを含み、これによって胚発達を高める、および／または胚の質を改善する。  
【００８７】
本明細書で使用される用語「胚の質」は、いずれかの知られている容認可能な方法による胚発達の評価を意味する。胚等級付けは、胚段階の選択および胚の質の評価基準に関して異なり得る。移植前の胚の質の評価に関していくつかの段階がある。これらの方法のいくつかはＮａｓｉｒｉおよびＥｆｔｅｋｈａｒｉ−Ｙａｚｄｉ（Ｃｅｌｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１５，１６（４），３９２−４０５）で報告されている。一つの実施形態では、胚の質を改善することは、緊密化、胚盤胞形成、または透明帯孵化の段階に到達する胚の比率を増加することを含む。  
【００８８】
用語「細胞培養培地」、「成長培地」、および「培養培地」は本明細書において交換可能で使用され、細胞、組織、または器官の成長のために使用される、または成長を支持することができる細胞培養培地を意味する。細胞培養培地は液体、固体、または半固体であり得る。異なる細胞培養培地は異なる特性を有し得、異なる塩および栄養素を含むが、すべての培地は等張性培地であり、細胞成長に適した浸透圧を有する。このため、細胞培養培地は等張性細胞培養培地である。一つの特定の実施形態では、「成長培地」はヒト胚の成長に適している。胚細胞培養培地は従来技術で良く知られており、その内容物は、例えば胚の段階に応じて変化し得、従来技術の当業者はその必要に応じて細胞培養培地を適応させることを理解している。前記実施形態のいずれか一つにより、少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣは、卵母細胞および／または胚の成長または発達に適したいずれかの既知の培地に加えられ得る。非限定例は、ＳＡＧＥ１−Ｓｔｅｐ（商標）のような単一培養培地、および／またはＱｕｉｎｎｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）逐次培地（ＯＲＩＧＩＯ）のような逐次培地である。
【００８９】
いくつかの実施形態により、本方法はステップ（ａ）の前に、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地における卵母細胞のインビトロ成熟のステップをさらに含む。そのため一つの実施形態では、本発明はインビトロ受精のための方法を提供し、（ａ）卵母細胞のインビトロ成熟、（ｂ）哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させ、（ｃ）胚をインビトロ培養することを含み、ここでステップ（ａ）およびステップ（ｂ）、ステップ（ａ）および（ｃ）、またはステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地で実施される。
【００９０】
本発明の教示により、少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地において卵母細胞を培養することは卵母細胞成熟を高め、従って本方法は卵母細胞成熟を高めることを含む。用語「卵母細胞成熟」は、過程およびその段階のそれぞれを意味し、それによって卵母細胞は受精することができない未成熟状態から、受精可能で生きた胚を産生することができる減数分裂で成熟している卵母細胞に進行する。卵母細胞成熟を高めることは、過程の迅速化、ならびに卵母細胞が成熟期に達する確率を増加させることを意味する。従って一つの実施形態では、本方法は卵母細胞成熟を高めることを含む。他の実施形態では、本方法は少なくとも１種類の安定剤によって安定化された細胞培養培地における卵母細胞および胚の成熟を含み、従って、卵母細胞成熟および胚発達を高める。
【００９１】
本明細書で使用される用語「高める」は、成長パラメ−タを促進、改善、増大、一般的には増加することを意味し、ＡＣＣが添加されない以外は同一培地で成長させる対照サンプルと比較して測定される。  
【００９２】
前記実施形態のいずれか一つにより、細胞培養培地における安定化ＡＣＣの最終濃度は、約０．１〜約２０ｍＭ、約０．５〜約１５ｍＭ、約１〜約１０ｍＭ、約２〜約８ｍＭ、約３ｍＭ〜約６ｍＭ、または約４ｍＭ〜約５ｍＭである。一つの実施形態により、ＡＣＣは約０．８ｍＭ〜約５ｍＭ、または約１．３ｍＭ〜約３．５ｍＭの最終濃度、あるいは約１．７ｍＭ〜約２．６ｍＭの最終濃度で加えられる。より特定的な実施形態では、安定化ＡＣＣは、０．５〜約４ｍＭ、約１〜約３ｍＭ、約１．５〜約２．５、あるいは約１、１．５、２、または２．５ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態により、細胞培養培地における安定化ＡＣＣの濃度は、約０．０００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、約０．０００５％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖ、約０．００１％ｗ／ｖ〜約０．１％ｗ／ｖ、約０．００５％ｗ／ｖ〜約０．０５％ｗ／ｖ、約０．０１％ｗ／ｖ〜約０．０３％ｗ／ｖである。  
【００９３】
一つの実施形態により、安定化ＡＣＣを卵母細胞および／または胚と接触させることは、胚発達および／または卵母細胞成熟を約１０％〜約３００％、約２０％〜約２５０％、約３０％〜約２００％、約４０％〜約１５０％、約６０％〜約１００％、または約７０％〜約９０％高める。１００％の向上は２倍に増加したパラメ−タ、例えば増殖を意味し、２００％の向上は３倍に増加したパラメ−タ、例えば胚発達を意味する、などである。いくつかの実施形態により、安定化ＡＣＣを卵母細胞および／または胚と接触させることは、胚発達および／または卵母細胞成熟を約５０％〜約３００％、約１００％〜約２５０％、約１５０％〜約２５０％高める。
【００９４】
いくつかの実施形態により、卵母細胞成熟の向上および／または胚発達の向上は、ＩＶＦの結果を高める。従って一つの実施形態により、本発明はＩＶＦ処理を高めるための方法を提供し、当該方法は安定化ＡＣＣに卵母細胞を暴露する、胚を暴露する、または卵母細胞および胚の両方を暴露することを含む。別の実施形態により、本方法はさらに少なくとも１つの卵母細胞を哺乳動物の雌から回収する、および／または胚を哺乳動物の雌に移植することを含む。
【００９５】
前記実施形態のいずれか一つでは、胚および／または卵母細胞は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の胚および／または卵母細胞である。一つの特定の実施形態では、胚および／または卵母細胞は、ヒトの胚および／または卵母細胞である。他の実施形態では、胚および／または卵母細胞は、非ヒト哺乳動物の胚および／または卵母細胞である。非ヒト哺乳動物胚および／または卵母細胞の非限定例は、家畜動物、家庭用愛玩動物、げっ歯類、ウサギ目、および霊長類の胚および／または卵母細胞である。一つの実施形態では、非ヒト胚は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、ロバ、スイギュウ、またはラクダのような家畜動物の胚である。一つの特定の実施形態では、胚および／または卵母細胞は、ウシの胚および／または卵母細胞である。いくつかの他の実施形態では、家庭用愛玩動物の胚および／または卵母細胞はネコまたはイヌの胚および／または卵母細胞であり、げっ歯類の胚および／または卵母細胞はマウス、ラット、モルモット、またはハムスタ−の胚および／または卵母細胞であり、ウサギ目の胚および／または卵母細胞はウサギの胚および／または卵母細胞であり、霊長類の胚および／または卵母細胞はマカクのようなサルまたはチンパンジ−のような類人猿である。
【００９６】
前記実施形態のいずれか一つにより、少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣは、卵母細胞および／または胚の発達または成熟に適したいずれかの既知の培地に加えられ得る。このような培地の例は、ＳＡＧＥ１−Ｓｔｅｐ（商標）のような単一培養培地、またはＱｕｉｎｎｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）逐次培地（ＯＲＩＧＩＯ）のような逐次培地である。
【００９７】
一つの実施形態により、本発明はインビトロ受精のための方法を提供し、（ａ）哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させ、（ｂ）胚をインビトロ培養することを含み、ここでステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、または両ステップ（ａ）および（ｂ）は、ホスホセリン、三リン酸、エチドロン酸、ピロリン酸、エタノ−ル、キチン、ヘキサメタリン酸、クエン酸、およびホスホセリン、三リン酸、エチドロン酸、またはヘキサメタリン酸のクエン酸との併用から選択される少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣが補充された細胞培養培地で実施される。別の実施形態により、本方法はステップ（ａ）の前に、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地における卵母細胞のインビトロ成熟のステップを含む。そのため一つの実施形態では、本発明はインビトロ受精を高めるための方法を提供し、（ａ）卵母細胞のインビトロ成熟、（ｂ）哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させ、（ｃ）胚をインビトロ培養することを含み、ここでステップ（ａ）および（ｂ）、ステップ（ａ）および（ｃ）、またはステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む細胞培養培地で実施される。一つの実施形態により、胚成長に適した培地は、ＳＡＧＥ１−Ｓｔｅｐ（商標）のような単一培養培地、またはＱｕｉｎｎｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）逐次培地（ＯＲＩＧＩＯ）のような逐次培地である。一つの実施形態により、ＡＣＣは約０．８ｍＭ〜約５ｍＭ、または約１．３ｍＭ〜約３．５ｍＭの最終濃度、あるいは約１．７ｍＭ〜約２．６ｍＭの最終濃度で加えられる。一つの実施形態により、本方法は卵母細胞成熟を高める、および／または胚発達を高めることを含む。別の実施形態により、本方法は胚の質を改善する、従ってＩＶＦ成功率を増加することを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態により、本発明はインビトロ胚産生のための方法を提供し、（ａ）卵母細胞をインビトロで受精させ、（ｂ）少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを含む胚培養培地で胚をインビトロで成長させることを含む。いくつかの実施形態により、本方法はステップ（ａ）の前に哺乳動物の雌から少なくとも１つの卵母細胞を回収することを含む。
【００９９】
一つの態様により、本発明は精子の質を改善するための方法を提供し、当該方法は精子を少なくとも１種類の安定剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の効果的な量に暴露することを含む。
【０１００】
本明細書において交換可能で使用される用語「精子（ｓｐｅｒｍ）」および「精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）」は、雄の生殖細胞を意味する。用語「精子サンプル」は、精子を含む１つ以上のサンプルを意味する。精子サンプルは、被験体から得られる精液、または処理した精液、液化精液、沈殿化および任意に再懸濁化精液などであり得る。
【０１０１】
一つの実施形態により、精子の質を改善することは、精子運動率を高める、精子前進運動率を高める、精子数を増加する、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。  
【０１０２】
本明細書で使用される用語「精子運動率」は、所定の標本サンプルにおけるすべての精子細胞の中で動く精子の割合を意味する。本明細書で使用される用語「前進運動率」は、おおよそ一定方向に移動する精子の割合を意味する。本明細書で使用される用語「精子運動率を高める」および「精子前進運動率を高める」は、それぞれ運動性精子および前進運動性を有する精子の割合を増加することを意味する。従って、一つの実施形態では、本発明は精子運動率を高めるための方法を提供する。別の実施形態により、本発明は精子前進運動率を高めるための方法を提供する。精子運動率、前進運動率、および精子成熟期は、従来技術で知られている方法によって評価され得る。例えば、運動率はコンピュ−タ支援精子分析（ＣＡＳＡ）法（Ａｍａｎｎ＆Ｗａｂｅｒｓｋｉ，２０１４，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，８１：５−１７）によって評価され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態により、精子数を増加することは、運動率または前進運動率処理における精子数を増加することを含む。一つの実施形態により、運動率または前進運動率処理はスイムアップ法である。
【０１０４】
用語「高める」は本明細書で定められるように使用される。いくつかの実施形態により、精子運動率を高める、精子前進運動率を高める、精子数を増加することは、約１０％〜約６００％、約２０％〜約５００％、約３０％〜約４００％、約４０％〜約３００％、約５０％〜約２００％、約６０％〜約１５０％、または約７０％〜約１００％、精子運動率を高める、精子前進運動率を高める、精子数を増加することを含む。１００％高めることは、２倍増加したパラメ−タ、例えば運動率を意味する。いくつかの実施形態により、運動率または精子数は約１００％〜約５００％、約１２０％〜約４００％、約１５０％〜約３００％高められる。
【０１０５】
前記実施形態のいずれか１つにより、精子はヒトまたは非ヒト哺乳動物の精子である。いくつかの実施形態により、非ヒト哺乳動物は、家畜動物、家庭用愛玩動物、げっ歯類、野生動物、および霊長類からなる群から選択される。
【０１０６】
一つの実施形態では、家畜動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、ロバ、スイギュウ、およびラクダから選択される。いくつかの他の実施形態では、家庭用愛玩動物はネコまたはイヌであり、げっ歯類はラット、マウス、モルモット、またはハムスタ−であり、ウサギ目はウサギであり、霊長類はマカクのようなサルまたはチンパンジ−のような類人猿である。
【０１０７】
別の実施形態により、精子は非哺乳動物の精子である。いくつかの実施形態により、非哺乳動物は魚類、昆虫、および鳥類からなる群から選択される。  
【０１０８】
一つの実施形態により、精子はヒト精子である。
【０１０９】
前記実施形態のいずれか一つにより、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣに細胞を暴露することは、当該ＡＣＣを細胞培養培地に加えることを含む。用語「に暴露する」および「と接触させる」は、本明細書において交換可能で使用され、安定化ＡＣＣのような成分を含む環境の培地に細胞を配置するまたは移す、あるいは安定化ＡＣＣなどの成分を細胞が成長または培養される培地に加える、あるいは安定化ＡＣＣを精子が配置される環境に加えることを意味する。いくつかの実施形態により、安定化ＡＣＣに暴露することは、細胞を被験体の体内でＡＣＣと接触させることを含む。
【０１１０】
前記実施形態のいずれか一つにより、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣは、精子ハンドリングまたは成熟に適しているいずれかの既知の培地に加えられ得る。いくつかの実施形態により、培地はＩＳｏｌａｔｅ（登録商標）、ＰｕｒｅＣｅｐｔｉｏｎ（商標）、Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＭＨＭ（登録商標））のような精子分離培地、Ｑｕｉｎｎｓ（商標）Ｓｐｅｒｍ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＭＨＭ（登録商標））、およびゲンタマイシン−ＨＥＰＥＳ添加改変ＨＴＦ培地のような精子洗浄用培地、ならびにビガ−ズ−ウィッテン−ウィッティンガム（ＢＷＷ）培地、ハム−Ｆ１０、および改変タイロ−ド培地（ＨＳＭ）のような受精能獲得用培地から選択される。
【０１１１】
前記実施形態のいずれか一つにより、細胞培養培地における安定化ＡＣＣの最終濃度は、約０．１〜約２０ｍＭ、約０．５〜約１５ｍＭ、約１〜約１０ｍＭ、約２〜約８ｍＭ、約３ｍＭ〜約６ｍＭ、または約４ｍＭ〜約５ｍＭである。一つの実施形態により、ＡＣＣは約０．８ｍＭ〜約５ｍＭ、または約１．３ｍＭ〜約３．５ｍＭの最終濃度、あるいは約１．７ｍＭ〜約２．６ｍＭの最終濃度で加えられる。より特定的な実施形態では、安定化ＡＣＣは、０．５〜約４ｍＭ、約１〜約３ｍＭ、約１．５〜約２．５、あるいは約１、１．５、２、または２．５ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態により、細胞培養培地における安定化ＡＣＣの濃度は、約０．０００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、約０．０００５％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖ、約０．００１％ｗ／ｖ〜約０．１％ｗ／ｖ、約０．００５％ｗ／ｖ〜約０．０５％ｗ／ｖ、約０．０１％ｗ／ｖ〜約０．０３％ｗ／ｖである。  
【０１１２】
前記実施形態のいずれか一つにより、本方法はさらにＩＶＦまたは子宮内受精における精子の使用を含む。
【０１１３】
さらなる実施形態により、本発明はＸおよびＹ染色体を有する精子の分離のための方法を提供し、（ａ）精子サンプルを少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣと接触させ、（ｂ）前進運動率処理を実施し、（ｃ）運動性精子を含む分画を得、（ｄ）ステップ（ｃ）で得られる分画の上相と下相を分離することを含み、ここで上相はＹ染色体を有する精子が豊富であり、下相はＸ染色体を有する精子が豊富である。本方法はＸ染色体を有する精子細胞とＹ染色体を有する精子細胞の間の分離を包含する。
【０１１４】
一つの実施形態により、前進運動率処理はスイムアップ法である。スイムアップ法は従来技術で良く知られている。一般的に、精子サンプルは試験管の底に配置されて、精子培地層で積層され、試験管を３７℃で１時間培養して、運動性精子をサンプルから精子培地に移動させる。そして精子培地を収集して、Ｙ染色体を有する精子が豊富である上相、およびＸ染色体を有する精子が豊富である下相に分離する。いくつかの実施形態により、短いインキュベ−ション時間、例えば１０〜３０分を使用することができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態により、本方法はさらに、ＩＶＦまたは子宮内受精における上相および／または下相の使用を含む。
【０１１６】
いくつかの態様により、本発明は補助的生殖技術（ＡＲＴ）における、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣの使用を提供する。いくつかの実施形態により、ＡＲＴはインビトロ受精（ＩＶＦ）、性選択、および精子改善から選択される。
【０１１７】
いくつかの態様により、本発明はＩＶＦにおける、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣの使用を提供する。一つの実施形態により、安定化ＡＣＣは、インビトロ卵母細胞成熟、哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させる、胚をインビトロ培養する、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される段階で細胞培養に加えられる。このため一つの実施形態では、安定化ＡＣＣは胚をインビトロ培養する段階で細胞培養培地に加えられる。別の実施形態では、安定化ＡＣＣは卵母細胞成熟の段階で細胞培養培地に加えられる。さらなる実施形態により、安定化ＡＣＣは卵母細胞成熟の間、および胚をインビトロ培養する間に加えられる。一つの実施形態により、安定化ＡＣＣは卵母細胞の成熟化および／または胚の発達を高める。  
【０１１８】
別の実施形態により、本発明は精子の質を改善するために、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣの使用を提供する。いくつかの実施形態により、精子の質を改善することは、精子運動率を高める、精子前進運動率を高める、精子数を増加する、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態により、本方法によって得られる精子は子宮内受精またはＩＶＦで使用され得る。
【０１１９】
別の実施形態により、本発明は性選択技術における、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣの使用を提供する。一つの実施形態により、性選択技術は精子サンプルを１つのタイプの性染色体を有する精子を豊富にするステップを含む。本ステップは、（ａ）精子サンプルを少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣと接触させ、（ｂ）スイムアップ法を実施し、（ｃ）運動性精子を含む分画を得、（ｄ）ステップ（ｃ）で得られる分画の上相と下相を分離することを含み、ここで上相はＹ染色体を有する精子が豊富であり、下相はＸ染色体を有する精子が豊富である。  
【０１２０】
別の実施形態により、本発明は補助的生殖技術（ＡＲＴ）における使用のために少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣを提供する。いくつかの実施形態により、ＡＲＴはインビトロ受精（ＩＶＦ）、性選択、精子改善から選択される。
【０１２１】
一つの実施形態により、安定化ＡＣＣは、ＩＶＦにおける使用ためのものである。一つの実施形態により、安定化ＡＣＣは、インビトロ卵母細胞成熟、哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させる、胚をインビトロ培養する、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される段階における使用のためのものである。いくつかの実施形態により、安定化ＡＣＣは、前述で定められるように、インビトロ卵母細胞成熟のための培地、哺乳動物卵母細胞をインビトロ受精させるための培地、および胚をインビトロ培養するための培地から選択される培地に加えられる。
【０１２２】
別の実施形態により、安定化ＡＣＣは精子の質を改善するのに使用するためのものである。いくつかの実施形態により、本方法は精子を安定化ＡＣＣに暴露することを含む。いくつかの実施形態により、精子の質を改善することは、精子運動率を高める、精子前進運動率を高める、精子数を増加する、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態により、本方法によって得られる精子は子宮内受精またはＩＶＦで使用され得る。
【０１２３】
さらなる実施形態により、安定化ＡＣＣは性選択技術における使用のためのものである。一つの実施形態により、安定化ＡＣＣはＸおよびＹ染色体を有する精子を分離するために使用され、（ａ）精子サンプルを少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣと接触させ、（ｂ）スイムアップ法を実施し、（ｃ）運動性精子を含む分画を得、（ｄ）ステップ（ｃ）で得られる分画の上相と下相を分離することを含み、ここで上相はＹ染色体を有する精子が豊富であり、下相はＸ染色体を有する精子が豊富である。
【０１２４】
前記実施形態のいずれか一つにより、卵母細胞または精子を安定化ＡＣＣと接触させることは、前述で定められる細胞培養培地に安定化ＡＣＣを加えることを含む。
【０１２５】
前記実施形態のいずれか一つにより、細胞培養培地における安定化ＡＣＣの最終濃度は、約０．１〜約２０ｍＭ、約０．５〜約１５ｍＭ、約１〜約１０ｍＭ、約２〜約８ｍＭ、約３ｍＭ〜約６ｍＭ、または約４ｍＭ〜約５ｍＭである。一つの実施形態により、ＡＣＣは約０．８ｍＭ〜約５ｍＭ、または約１．３ｍＭ〜約３．５ｍＭの最終濃度、あるいは約１．７ｍＭ〜約２．６ｍＭの最終濃度で加えられる。より特定的な実施形態では、安定化ＡＣＣは、０．５〜約４ｍＭ、約１〜約３ｍＭ、約１．５〜約２．５、あるいは約１、１．５、２、または２．５ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態により、細胞培養培地における安定化ＡＣＣの濃度は、約０．０００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、約０．０００５％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖ、約０．００１％ｗ／ｖ〜約０．１％ｗ／ｖ、約０．００５％ｗ／ｖ〜約０．０５％ｗ／ｖ、約０．０１％ｗ／ｖ〜約０．０３％ｗ／ｖである。  
【０１２６】
別の態様により、本発明は男性不妊を治療するのに使用するため、少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬組成物を提供する。
【０１２７】
いくつかの実施形態により、男性不妊は、低精子数によって生じる男性不妊および男性不妊低精子運動率から選択される。用語「低精子運動率」は、ＩＵＩのための運動性精子の数が５百万未満である状態を意味する。
【０１２８】
いくつかの実施形態により、医薬組成物は前述のいずれかの既知の方法によって投与され得る。一つの実施形態により、医薬組成物は経口によって投与される。  
【０１２９】
いくつかの態様により、この方法を必要とする被験体における男性不妊を治療するための方法を提供し、少なくとも１種類の安定剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬組成物を当該被験体に投与することを含む。  
【０１３０】
別の態様により、本発明はこの方法を必要とする被験体における筋ジストロフィ−および軸索欠損から選択される疾患または症状を治療するための方法を提供し、当該被験体に少なくとも１種類の安定化剤によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）を含む医薬品として許容可能な組成物を投与することを含む。  
【０１３１】
用語「医薬品として許容可能な組成物」、「ＡＣＣ」、「安定化剤」、「軸索欠損」、および「筋ジストロフィ−」は、前述で定められる通りである。
【０１３２】
一つの実施形態により、本発明はこの方法を必要とする被験体における軸索欠損を治療するための方法を提供し、当該被験体に少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣの治療上効果的な量を含む医薬品として許容可能な組成物を投与することを含む。一つの実施形態により、軸索欠損は軸索損傷、例えば軸索傷害である。特定の実施形態により、軸索欠損または損傷は、中枢神経系の神経または末梢神経系の神経に対するものである。いくつかの実施形態により、軸索損傷を治療することは、損傷した神経の回復および／または再生を高めることを含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態により、投与することは、医薬品として許容可能な組成物を、前述のように、全身投与または局所投与を介して投与することを含む。いくつかの実施形態により、全身投与は、腸内投与、すなわち、例えば経口、舌下、または直腸などの消化管を介した投与、および非経口投与、例えば静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼、舌下、鼻腔内、吸入、脊髄内、脳内、および経皮などを含む。一つの実施形態により、医薬組成物は経口によって投与される。他の実施形態により、投与は局所投与であり、特に、欠損、損傷、または傷害のある神経に近接している。一つの実施形態により、医薬品として許容可能な組成物は、注射、注入、またはポンプ経由によって投与される。
【０１３４】
別の実施形態により、本発明はこの方法を必要とする被験体における筋ジストロフィ−を治療するための方法を提供し、当該被験体に少なくとも１種類の安定化剤によって安定化されたＡＣＣの治療上効果的な量を含む医薬品として許容可能な組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態により、筋ジストロフィ−は、デュシェンヌ型、ベッカ−型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋強直性、眼咽頭、遠位型、およびエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィ−からなる群から選択される。一つの特定の実施形態では、筋ジストロフィ−はデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（ＤＮＤ）である。
細胞成長を高めるための方法：
【０１３５】
いくつかの態様により、本発明は細胞成長を高めるための方法を提供し、細胞を少なくとも１種類の安定剤によって安定化されたＡＣＣに暴露することを含む。
【０１３６】
本明細書で使用される用語「成長」は、増殖、成熟、繁殖、再生、分化、発達、およびこれらの任意の組み合わせのいずれかを包含し、細胞型に従って様々に使用され得る。  
【０１３７】
前述で定められるように、用語「高める」は、成長パラメ−タを促進、改善、増大、一般的には増加することを意味し、ＡＣＣが添加されない以外は同一培地で成長させる対照サンプルと比較して測定される。このため一つの実施形態では、本方法は、細胞の増殖を高める、成熟を高める、繁殖を高める、再生を高める、および／または分化を高めることを含む。一つの実施形態では、成長を高めることは細胞の質を改善する、例えば、胚の質を改善することを含む。別の実施形態により、成長を高めることは、前記パラメ−タの２つ以上を高める、例えば増殖および分化を高めることを含む。
【０１３８】
前記実施形態のいずれか１つにより、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態により、真核細胞は動物、植物、および昆虫細胞から選択される。  
【０１３９】
一つの実施形態により、細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態により、動物細胞はヒトまたは非ヒト哺乳動物の細胞である。特定の実施形態により、非ヒト哺乳動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、ロバ、スイギュウ、またはラクダのような家畜動物、ネコまたはイヌなどの家庭用愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、またはハムスタ−のようなげっ歯類、ウサギのようなウサギ目、およびサル（例えば、マカク）または類人猿（例えば、チンパンジ−）などの霊長類から選択される。
【０１４０】
さらなる実施形態により、細胞は神経、筋肉、上皮、骨、脂肪、幹細胞、生殖細胞、血液細胞、および胚から選択される。
【０１４１】
一つの実施形態により、本発明は筋細胞の成長を高めるための方法を提供する。別の実施形態により、筋細胞の成長を高めることは筋管形成を高めることを含む。  
【０１４２】
本明細書で使用される用語「筋管形成」は、筋芽細胞が多核化線維である筋管に融合する過程を意味する。  
【０１４３】
いくつかの実施形態により、本発明はまた、当該筋管の自発的収縮活動の発生までの時間を低下することを含む。自発的収縮活動の発生までの時間は、筋芽細胞が融合して自発的に収縮するまでに必要とされる時間として定められる。  
【０１４４】
一つの実施形態では、当該筋芽細胞から形成される筋細胞は骨格筋細胞または心筋細胞から選択される。より特定的な実施形態では、筋細胞は骨格筋細胞である。  
【０１４５】
いくつかの実施形態により、本方法は、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィ−症例などの骨格筋細胞における筋管形成および／または収縮の発生を高めることを含む。
【０１４６】
他の実施形態により、本方法は神経細胞の成長を高めることを含む。一つの実施形態では、神経細胞の成長を高めることは、神経細胞再生を高めるおよび促進することを含む。そのため一つの実施形態では、本方法は、末梢および中枢神経系の軸索および樹状神経線維の再成長を高める、および／または損傷した神経線維から発芽させることを含む。  
【０１４７】
いくつかの実施形態により、本方法は細胞の成熟を高める、例えば、卵母細胞のインビトロ成熟を高めることを含む。いくつかの実施形態により、卵母細胞はヒト卵母細胞または非ヒト哺乳動物卵母細胞から選択される。非ヒト哺乳動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、ロバ、スイギュウ、またはラクダのような家畜動物、ネコまたはイヌなどの家庭用愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、またはハムスタ−のようなげっ歯類、ウサギのようなウサギ目、およびサル（例えば、マカク）または類人猿（例えば、チンパンジ−）などの霊長類から選択される。
【０１４８】
他の実施形態により、本発明はインビトロで培養された胚の質を改善する、または胚発達を高めることを含む。用語「胚の質」は前述のように使用される。一つの実施形態では、胚の質を改善することは、緊密化、胚盤胞形成、および胚盤胞孵化期からなる群から選択される段階に到達する胚の比率を増加することを含む。別の実施形態では、胚の質を改善することは、緊密化、胚盤胞形成、および胚盤胞孵化期からなる群から選択される段階に到達するまでの時間によって測定される正常な胚形成を加速させることを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態により、胚はヒト胚または非ヒト哺乳動物胚から選択される。非ヒト哺乳動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、ロバ、スイギュウ、またはラクダのような家畜動物、ネコまたはイヌなどの家庭用愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、またはハムスタ−のようなげっ歯類、ウサギのようなウサギ目、およびサル（例えば、マカク）または類人猿（例えば、チンパンジ−）などの霊長類から選択される。
【０１５０】
細胞、組織、または器官の増殖、成熟、繁殖、再生、発達、および／または分化の向上は、前述で定められる対照との比較における向上の割合として測定され得る。従って、一つの実施形態により、安定化ＡＣＣが補充された細胞培養培地は、成長パラメ−タを約１０％〜約６００％、約２０％〜約５００％、約３０％〜約４００％、約４０％〜約３００％、約５０％〜約２００％、約６０％〜約１５０％、または約７０％〜約１００％高めることができる。１００％の向上は２倍に増加したパラメ−タ、例えば増殖を意味し、２００％の向上は３倍に増加したパラメ−タ、例えば胚発達を意味する、などである。いくつかの実施形態により、成長パラメ−タは約１００％〜約５００％、約１２０％〜約４００％、約１５０％〜約３００％高められる。
【０１５１】
いくつかの実施形態により、本方法は幹細胞分化を高めることを含む。一つの実施形態により、本方法は幹細胞増殖を高めることを含む。さらなる実施形態により、本方法は幹細胞分化および増殖を高めることを含む。用語「幹細胞」は、異なる細胞型に増殖および分化する能力を有する細胞を意味する。いくつかの実施形態により、幹細胞は胚性、絨毛性、羊水、造血性、間葉性、神経、グリア、成体、および誘導多能性幹細胞から選択される。一つの実施形態により、幹細胞は胚幹細胞である。別の実施形態により、幹細胞は造血幹細胞である。さらなる実施形態により、幹細胞は間葉幹細胞である。さらに別の実施形態により、幹細胞は多能性幹細胞である。いくつかの実施形態により、幹細胞はヒト幹細胞である。別の実施形態により、幹細胞は非ヒト哺乳動物幹細胞である。一つの実施形態により、本方法はＭＢＡ１３の骨芽細胞への分化のような幹細胞の分化を高めることを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態により、細胞培養培地は動物、植物、または昆虫細胞の成長に適している。一つの実施形態により、細胞培養培地は天然培地または人工培地であり得る。いくつかの実施形態により、天然培地は血漿、血清、リンパ、ヒト胎盤臍帯血、および羊水から選択される生物学的流体を含む。別の実施形態により、天然培地は、肝臓、脾臓、腫瘍、リンパ球、および骨髄の抽出物のような組織抽出物、ウシ胚およびニワトリ胚の抽出物を含む。さらなる実施形態により、天然培地は凝固剤または血餅を含む。いくつかの実施形態により、培地は補充された人工培地である。一つの実施形態により、人工培地は平衡化塩溶液である。平衡化塩溶液の例は、ＰＢＳ、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＥＢＳＳ、タイロ−ドＴ６、ＷＭ１、プ−ルＰ１、Ｑｕｉｎｎ’ｓ  ＨＴＦ、およびガ−ドナ−Ｇ１である。別の実施形態により、人工培地は基礎培地である。いくつかの実施形態により、培地はさらに従来技術で良く知られているように補充され得る。一つの実施形態により、培地は血清、例えば、ウシ胎児血清によって補充される。さらなる実施形態により、人工培地は複合培地である。  
【０１５３】
本明細書で使用される用語「基礎培地」は、無機塩、糖、アミノ酸の栄養素混合物を意味し、任意にまたビタミン、有機酸、および／または緩衝剤を含む。サプリメントを伴う基礎培地は、細胞の生命、成長、および再生産を支持するのに必要な栄養素を提供する。使用される基礎培地の選択は、培養に適したものであるべきである。  
【０１５４】
一つの実施形態により、人工培地は無血清培地である。さらなる実施形態により、人工培地は血清含量が低下した細胞培養培地である。別の実施形態により、人工培地は無タンパク質培地である。  
【０１５５】
安定化ＡＣＣが本発明に従って加えられて使用され得る細胞培地の例は、ダルベッコ改変イ−グル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（ロズウェルパ−ク記念研究所で開発された）、およびイ−グル基礎培地（ＢＭＥ）である。本発明による培地のさらなる例は、ハム栄養混合物であり、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＤＭＥＭおよびハムＦ−１２）が挙げられる。他の例は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、およびグラスゴ−ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）である。昆虫細胞成長に適した培地の例は、ＩＰＬ−４１昆虫培地、シュナイダ−ショウジョウバエ培地、グレ−ス昆虫培地、無血清昆虫培地、Ｓｆ−９００、ＴＣ−１０、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓａｎｇ  Ｍ３昆虫培地、ＴＣ−１００昆虫培地、ＴＭＭ−ＦＨ昆虫培地、およびＩＰＬ−１０である。胚成長に適した培地の例は、ＳＡＧＥ１−Ｓｔｅｐ（商標）のような単一培養培地、またはＱｕｉｎｎｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）逐次培地（ＯＲＩＧＩＯ）のような逐次培地である。植物細胞成長に適した培地の例は、ムラシゲスク−グ（ＭＳ）、Ｂ５、Ｎ６、およびニッチ培地である。  
【０１５６】
培地の他の例は、改変培地、ＮＣＴＣ培地、ＭｅｇａＣｅｌｌ培地、クレイコム、クリック培地、Ｌ−１５培地、培地１９９、ＭＣＤＢ培地、エイムス培地、ＢＧＪｂ培地（フィットン−ジャクソン改変）、クリック培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、マッコイ５Ａ改変培地、ＮＣＴＣ培地、スイムＳ−７７培地、ウェイマウス培地、ウィリアム培地Ｅ、ならびに体外受精培地、例えば、ｇｌｏｂａｌ（登録商標）、ＧＭ５０１、ＳＳＭ（商標）、分割Ｋ−ＳＩＣＭ、胚盤胞Ｋ−ＳＩＢＭ、Ｑｕｉｎｎｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）分割、Ｑｕｉｎｎｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）胚盤胞、ＦＥＲＴＩＣＵＬＴ（商標）ＩＶＦ培地、ＦＥＲＴＩＣＵＬＴ（商標）Ｇ３培地、ＩＶＣ−ＴＷＯ（商標）、ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ（商標）、ＥＣＭ（登録商標）、ＭｕｌｔｉＢｌａｓｔ（登録商標）、ＥｍｂｒｙｏＡｓｓｉｓｔ（商標）、ＢｌａｓｔＡｓｓｉｓｔ（商標）、ＩＳＭ１、ＩＳＭ２、Ｇ−１（商標）ＰＬＵＳ、Ｇ−２（商標）ＰＬＵＳ、ＩＶＦ（商標）、およびＣＣＭ（商標）である。培地のさらなる例は、ＩＳｏｌａｔｅ（登録商標）、ＰｕｒｅＣｅｐｔｉｏｎ（商標）、Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＭＨＭ（登録商標））のような精子分離用培地、Ｑｕｉｎｎｓ（商標）Ｓｐｅｒｍ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＭＨＭ（登録商標））またはゲンタマイシン添加改変ＨＴＦ培地のような精子洗浄用培地、および未成熟卵母細胞を移植に適した完全に発達した胚に培養することができる成熟用培地である。  
【０１５７】
そのため一つの実施形態により、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＩＭＤＭＬ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭＣＤＢ培地、培地１９９、ｏｐｔｉ−ＭＥＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ−１２、シュナイダ−ショウジョウバエ培地、グレ−ス昆虫培地、ＩＰＬ−４１昆虫培地、Ｓｆ−９００、無血清昆虫培地、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓａｎｇ  Ｍ３昆虫培地、ＴＣ−１００昆虫培地、ＴＮＭ−ＦＨ昆虫培地、ハムＦ−１２、ハムＦ−１０、ＧＭＥＭ、エイムス培地、イ−グル基礎培地（ＢＭＥ）、クレイコム、クリック培地、グラスゴ−最小必須培地（ＧＭＥＭ）、ＭｅｇａＣｅｌｌ培地、マッコイ５Ａ改変培地、ＮＣＴＣ培地、ウィリアムズ培地Ｅ、ウェイマウス培地、ＴＣ−１０、およびＩＰＬ−１０培地から選択される。別の実施形態により、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ハムＦ−１２およびＤＭＥＭ／Ｆ−１２、シュナイダ−ショウジョウバエ培地、グリ−ス昆虫培地、Ｓｆ−９００、ＴＣ−１０、ＩＰＬ−１０培地、ならびに例えば、ＩＳｏｌａｔｅ（登録商標）、ＰｕｒｅＣｅｐｔｉｏｎ（商標）、Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＭＨＭ（登録商標））、Ｑｕｉｎｎｓ（商標）精子洗浄培地、Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＭＨＭ（登録商標））、およびゲンタマイシン添加改変ＨＴＦ培地などの精子分離、洗浄、または成熟用培地から選択される。  
【０１５８】
前記実施形態のいずれか一つにより、用語「含む」は「からなる」の意味を含み、これによって置換され得る。
【０１５９】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、量、一時的期間などのような測定可能な値を意味する場合、特定された値から±１０％、または±５％、±１％、またはさらに±０．１％の変動を包含することが意味される。
【０１６０】
本発明はここで全般的に説明されているが、同様なことは、図によって示され、本発明を制限することが意図されない、後述の例を参考にしてさらに容易に理解されるであろう。
例
例１．ＳＣ−ＤＲＧ共培養におけるＡＣＣの効果
【０１６１】
方法
【０１６２】
培養培地
【０１６３】
培養培地は、カルシウム枯渇した（カルシウムイオン無添加培地、特別調製）ダルベッコ改変イ−グル培地−栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）が９０％、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、６ｇ／ＬのＤ−グルコ−ス、２ｍＭグルタミン、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および０．０５ｎｇ／ｍｌインスリン用増殖因子１（ＩＧＦ−Ｉ）（すべてＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエルから購入）から構成された。
【０１６４】
神経培養用の基材としてのＮＶＲ−Ｇｅｌ
【０１６５】
Ｎｅｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｇｅｌ（神経および血管再構成ゲル）（ＮＶＲ−Ｇｅｌ、ＮＶＲ  Ｌａｂｓ所有権）は、２種の主成分である高分子ヒアルロン酸（ＨＡ、３×１０６Ｄａ、ＢＴＧ、イスラエル）およびラミニン（シグマ）からなる。神経細胞培養では、１％のＮＶＲ−Ｇｅｌを０．３〜０．５％の最終濃度まで培養培地で希釈した。ゲルは粘性液体の組成を有し、これは組み込まれた細胞または外植片をプラスチックまたはガラスの基底に容易に適切に付着させ、神経線維の３Ｄパタ−ンにおける神経線維成長を可能にした。
【０１６６】
神経組織培養の調製  
【０１６７】
すべての実験は、動物実験に関してイスラエル当局によって承認された地域倫理委員会によって実施され認可された。後根神経節（ＤＲＧ）および脊髄（ＳＣ）の静置組織培養、ならびに分離された脳細胞の培養を、ラット胎児（妊娠１５日、ルイス同系交配、ｈａｒｌａｎ、イスラエル）から調製した。切除後直ちに、分離した組織をＭａｃｗａｉｎ組織チョッパ−で小切片（厚さ４００μｍ）に切断した。これらの試験では、２種の組織培養法を使用した。第一の方法では、組織片を０．３〜０．５％ＮＶＲ−Ｇｅｌ含有の１ｍｌ培養培地を含む１２ウェル培養プレ−トに直接的に播種した。第二の方法では、組織片をさらにトリプシン−ＥＤＴＡによって３０分間解離させ、培養培地で洗浄した。続いて、解離した細胞をキトサン粉末または胃石粉末（マイクロ担体、ＭＣ）の懸濁液に加え、懸濁液中で３７℃、４日間インキュベ−ションした。そして形成された浮遊性細胞／ＭＣ凝集体を収集して、０．３〜０．５％ＮＶＲ−Ｇｅｌ含有の１ｍｌ培養培地を含む１２ウェル培養プレ−トに播種した。  
【０１６８】
Ｃａ２＋サプリメント源
【０１６９】
Ｃａ２＋源（下表に示す）を１または２ｍＭの最終濃度で、播種段階でゲルに一度加え、そして各引き続く補給時に栄養培地に加えた。カルシウム源は、ＡＣＣ−エチドロン酸、（ＡＣＣ−ＥＴ）（新鮮な懸濁液）、ＡＣＣ−ホスホセリン（ＡＣＣ−ＰＳ）（新鮮な懸濁液）、胃石（０．１ＭのＨＣｌで溶解し、１ＭのＮａＯＨで中和）、胃石粉末、ＣＣＣ−結晶炭酸カルシウムの水性懸濁液（市販ナノ粒子粉末）、およびＣａＣｌ２溶液−対照だった。
【０１７０】
培養は、培養を進行設定した２４時間後から開始した位相差顕微鏡観察によって毎日モニタリングした。  
【０１７１】
新鮮なＡＣＣ調製物の懸濁液は、安定な懸濁液を形成する粒子からなった。胃石はカニから分離された天然ＡＣＣであり、乾燥粉末としてのみ購入することができる。この剤形では、他の特徴的成分（カルシウムイオンおよびタンパク質など）は細胞に利用可能ではない。これらの生物利用能を高めるため、胃石粉末を０．１ＭのＨＣｌ（胃に存在する酸性を模倣する）に溶解してから１ＭのＮａＯＨによって中和した。  
【０１７２】
神経培養の免疫蛍光染色
【０１７３】
培養培地の除去後、後根神経節（ＤＲＧ）培養をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％ホルムアルデヒドで１５分間固定して、再度ＰＢＳで洗浄した。固定した細胞を０．１％トライトンＸ−１００含有ＰＢＳで透過処理してから１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳによって室温で１時間、免疫ブロッキング（非特異染色を回避するため）した。そして標本を抗神経細糸ウサギ抗体（ＮＦ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：５００）と共にインキュベ−ションして神経突起成長を可視化した。第一抗体を０．１％ＢＳＡおよび０．０５％ツイ−ン２０含有ＰＢＳ（希釈緩衝液）で希釈し、標本とともに４℃で一昼夜インキュベ−ションした。０．０５％ツイ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄緩衝液）ですすいだ後、ＤＲＧ標本を第二抗体であるＡｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ−５９４共役体化ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，米国、希釈緩衝液で１：８００）とともに室温で１時間インキュベ−ションした。最後に、サンプルを洗浄緩衝液で再度すすいで、封入剤（Ｉｍｍｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、米国）によって封入した。画像はすべてオリンパスＩＸ７０顕微鏡によって観察した。
【０１７４】
結果
【０１７５】
様々なカルシウム調製物の効果をＳＣ−ＤＲＧ共培養で試験した。一般的に、培養は４００ミクロンのＳＣ片を、接着または分離されたＤＲＧ片とともに含んだ。試験したＡＣＣ調製物のすべて（ＡＣＣ−ＥＴ、ＡＣＣ−ＰＳ、および胃石）が、神経線維再生をＣＣＣおよびＣａＣｌ２と比べて有意に高めた。表１は、様々なカルシウム調製物（２ｍＭのＣａ２＋濃度）の存在または安定化剤のみの存在における培養４日後に発芽する神経線維を表す外植片の一部（６例のうち）を示す（安定剤は各ウェルに（５％のストック溶液から）０．０５％の濃度で添加された）。最も強い発芽はＡＣＣ−ＥＴ（外植片の１００％）に暴露された培養で観察され、ＡＣＣ−ＰＳおよび胃石（外植片の６６．６％）が続いたことが認められた。ＣＣＣおよびＣａＣｌ２は外植片の５０％からのみの神経発芽を誘発し、安定化剤のみはさらに低い割合（０〜３３％）だった。培養の確立の間（培養の第一週の後）、神経ネットワ−クの形成まで、主に様々なＡＣＣ調製物に暴露された場合、再生した神経線維はより長く、より厚く、そして分枝されるようになった（図１）。
【表１】
2019501947.tif 000002
例２．脳培養におけるＡＣＣの効果
【０１７６】
ＡＣＣの効果を、懸濁液における４日後にゲルに播種された脳細胞−ＭＣ凝集体の培養で試験した（例１の方法部分を参照する）。結果を図２に示し、ＡＣＣが塩化カルシウムよりも有意に神経線維再生を高めたことを示す。このことは特に、２処置間で神経線維の数よび長さを比較したときに顕著である。
例３−健全な骨格筋細胞におけるＡＣＣ調製物の効果
【０１７７】
方法
【０１７８】
骨格筋培養の調製  
【０１７９】
静置骨格筋培養を健康な１日齢新生ラット（スプラグド−リ−、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）から調製した。筋組織を後脚から切除し、完全に刻んだ。消化をトリプシン−ＥＤＴＡによって、優しく粉砕しながら実施した。３０分後、切除した細胞を含む上清を収集し、新鮮なトリプシン−ＥＤＴＡを加えた。この手順を２回を超えて繰り返した。そして、すべての上清をプ−ルして遠心分離し、細胞ペレットを増殖培地に再懸濁させた。細胞をゼラチンコ−ティングした１２ウェル培養培地プレ−トに、細胞１×１０５個／ウェルを含む増殖培地１ｍｌで播種した。２日後、培地を融合培地に変更し、そして週に２回交換した。培養は、培養を設定して進行した２４時間後から位相差顕微鏡観察によって毎日モニタリングした。所定の日に、培養をメタノ−ルで２０分間固定し、そしてギムザによって染色して培養期間で形成された筋管の数を評価した。  
【０１８０】
ゼラチンコ−ティング培養プレ−ト
【０１８１】
水に１％ブタゼラチンを含有するストック溶液を、オ−トクレ−ブで滅菌した。冷却後、溶液５００μＬを１２ウェル培養プレ−トの各ウェルに加えた。室温で２０分間インキュベ−ション後、過剰な溶液を取り除き、細胞を播種した。  
【０１８２】
増殖培地
【０１８３】
増殖段階では、細胞はＤＭＥＭ／Ｆ１２（１ｍＭのＣａ２＋含有）＋１０％ＦＢＳ、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミン中で培養した。  
【０１８４】
融合培地  
【０１８５】
融合段階では、増殖培地を融合培地に変更し、融合培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１ｍＭのＣａ２＋含有）、２％ウマ血清（ＨＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および４単位／１００ｍｌインスリン（すべてＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエルから購入）によって調製した。  
【０１８６】
試験したカルシウム調製物のリスト  
【０１８７】
融合培地は表２にリスト化された様々なカルシウム調製物によって１ｍＭのＣａ２＋濃度で増加させた（培地は既に１ｍＭのカルシウムイオンを含んだため、Ｃａ２＋の最終濃度は２ｍＭだった）。対照培養はさらにカルシウムを加えることなく成長させる、または培養を遊離（可溶性）安定剤によって増加させた。実験は種々のカルシウム調製液に任意の番号のみを印すことによって盲検化した。
【０１８８】
成分は方法として、（ｉ）乾燥材料の水性懸濁液、（ｉｉ）新鮮な材料（乾燥前）の水性懸濁液、または（ｉｉｉ）ＨＣｌによる溶解（胃に存在する酸性度を模倣する。溶解が終了した後、生成された溶液を１ＭのＮａＯＨで中和した。）の方法の一つで添加した。溶解が終了した後、生成された溶液を１ＭのＮａＯＨで中和した。
【表２】
2019501947.tif 000003
【０１８９】
結果
【０１９０】
健全な骨格筋における乾燥ＡＣＣの効果
【０１９１】
第一段階では、乾燥ＡＣＣ粉末を使用した。粉末（これらの調製物で使用される安定化剤に従って表２に示す）を水に懸濁させ、ついで１ｍＭの濃度で培養培地に加えた。培地は既に１ｍＭのカルシウムイオンを含んだため、Ｃａ２＋の最終濃度は２ｍＭだった。結果は、そのいくつかを図３（左図）で示すが、ＡＣＣに暴露された培養は、培養の４日以内で既に多くの筋管の初期形成を現わし、異なるＡＣＣ調製物間で有意差はなかったことを示した。添加されたＣＣＣまたはＣａＣｌ２に暴露された対照培養では、筋管形成は遅れて観察された。７日後、ＡＣＣによって処理された培養は多数の長くて厚い筋線維を示したが、一方、ＣＣＣおよびＣａＣｌ２によって処理された培養では、これよりも少ない薄く短い筋線維が発達した（図３、右図）。  
【０１９２】
ＡＣＣ調製物に暴露された培養では、筋収縮が播種の７日後に既に観察されたが、一方、添加されたＣＣＣまたはＣａＣｌ２に暴露された培養では、筋収縮は１０日以降でのみ現れたことも留意する。
【０１９３】
前記インビトロ結果から、すべてのＡＣＣ調製物が健全な横紋筋培養の筋管形成および初期筋収縮を高めると結論付けられた。  
例４．デュシェンヌ型筋ジストロフィ−筋細胞株におけるＡＣＣの効果を評価する−インビトロ試験
【０１９４】
方法
【０１９５】
ｍｄｘ細胞調製
【０１９６】
異なるカルシウム調製物の影響を、イスラエルのワイツマン科学研究所からＤａｖｉｄ  Ｙａｆｆｅ教授（名誉）によって厚意により提供されたｍｄｘ細胞株（デュシェンヌ型筋ジストロフィ−モデル）について検討した。
【０１９７】
ｍｄｘ細胞株由来の株をゼラチンコ−ティングした１２ウェル培養プレ−トに、細胞３×１０４個／ウェルを含む増殖培地１ｍｌで播種した。２日後（約６６％の密集）、培地を融合培地に変更し、週に２回交換した。様々なカルシウム調製物を、表３に記載された処理に従って融合培地に別々に加えた。培養は様々なカルシウム調製物によって、１ｍＭのＣａ２＋濃度で増加させた。培地は既に１ｍＭのカルシウムイオンを含んだため、Ｃａ２＋の最終濃度は２ｍＭだった。
【表３】
2019501947.tif 000004
【０１９８】
細胞増殖、筋管を形成する融合、および筋収縮に対する試験した炭酸カルシウム調製物の効果を、位相差顕微鏡観察によって毎日モニタリングした。所定の日に、培養をメタノ−ルで２０分間固定し、そしてギムザによって染色して培養時間で形成された筋管の数を評価した。  
【０１９９】
筋組織培養におけるクレアチニンキナ−ゼ（ＣＫ）分析
【０２００】
筋細胞培養では、ＣＫは筋管形成における指標であり、ＣＫ量は筋培養における筋管形成の発達と正の相関で（組織培養プレ−ト中で）増加する。所定の日に、細胞を培養ウェルから収集し（ラバ−ポリスマンを使用）、分析するまで１ｍｌのＰＢＳ（Ｃａ２＋無添加）中で−７０℃に維持した。ＣＫ測定のため、細胞サンプルを小分けして、超音波処理装置を用いて物理的に溶解させて、筋管からＣＫを放出させた。ＣＫ濃度をクレアチニンキナ−ゼ活性アッセイキット（ＣＫ−ＮＡＣ  ＲＥＡＧＥＮＴ  ＳＥＴ，ＣＵＲＴＩＳＳ，ＣＨＥＭ−ＩＮＤＥＸ  ＩＮＣ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，米国）を用いて測定した。
【０２０１】
結果
【０２０２】
前記実験の結果を図４および５に示す。明確に示されるように、ＡＣＣの添加は、従来のカルシウム源（ＣａＣｌ２）の添加よりも筋管の細胞融合および形成を高めた。この驚くべき結果は、生化学的（ＣＫ活性）および形態学的（顕微鏡）分析の両方で実証された（図４および５）。さらに、ＡＣＣ調製物に暴露された培養では、筋収縮が播種の７日後に既に観察されたが、一方、対照では、これは１０日以降でのみ現れた。従って、ＡＣＣサプリメント添加はＤＭＤ患者を治療する可能性を有すると結論付けられる。
例５．一次ｍｄｘマウス細胞におけるカルシウム源の効果
【０２０３】
方法
【０２０４】
一次細胞の抽出  
【０２０５】
大腿筋を新生（１日齢）ｍｄｘマウスの後脚から無菌条件下で取り出し、ＰＢＳで洗浄して過剰な血液細胞を取り除いた。筋肉を小さい断片に切り刻んだ。酵素的解離のため、筋断片をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５ｍＭ）を含むビ−カ−に加えた。細胞分離を確実にするため、混合物をスタ−ラ−に設置し、室温で２０分間静かに撹拌した。混合物を収集して３００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットをＤＭＥＭ含有ＰＢＳで再懸濁させた。トリプリン処理段階を３回を超える回数で繰り返した。すべての上清を１本の試験管に集めた。細胞分離を目視（位相差顕微鏡を使用）によって測定した。細胞密度を、血球計算機を用いて測定した。
【０２０６】
細胞を１２ウェルプレ−トに２×１０５個／ウェルの濃度で加えた。使用した培地は、１５％ＦＢＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミン、ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２  Ｗ／Ｏ  Ｃａ２＋だった。カルシウムを表４に記載された処理に従って培地に別々に加えた。２日目（約６６％密集）に、培地を融合培地（Ｃａ２＋無添加、１０％ＨＳ、インスリン（４単位／１００ｍｌ）、およびゲンタマイシン（２５μ／ｍｌ）の添加）に変更した。培地は３日毎に交換した。
【表４】
2019501947.tif 000005
【０２０７】
細胞増殖および融合は質的に毎日モニタリングした。培養を２、３、４、５、および７日目に固定して、ギムザまたはミオシン抗体を用いて染色した。  
【０２０８】
結果
【０２０９】
結果を図６および７に示す。ＡＣＣ製剤の有効な効果が対照と比べて、特に早い時点である３および４日目の筋管形成によって実証された。形成された筋管における差は、５および７日目で区別できなくなった。ギムザ染色とミオシンに対する染色の間に高い相関があった。
例６．マウスにおける筋ジストロフィ−に対するＡＣＣの効果を評価する−インビボ試験
【０２１０】
実験マウスに対照または試験品を経口投与した（給餌または飲水によって）。対照または試験品を試験終了まで（１２週後）毎日繰り返し投与した。
【表５】
2019501947.tif 000006
【０２１１】
試験システム  
【０２１２】
種：マウス
【０２１３】
ｍｄｘ系統：Ｃ５７／ＢＩ  １０ＳｃＳｎ／ＤＭＤ  ｍｄｘ／Ｊ  
【０２１４】
野生型系統：Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯＩａＨｓｄ．
【０２１５】
性別および齢：雄、試験開始時に３週齢
【０２１６】
体重：試験開始時の動物の体重変差は、性別の平均体重の±５％を超えない。
【０２１７】
飼育：試験開始前に動物を４２．５×２６．５×１８．５ｃｍの寸法のポリスチレンゲ−ジで飼育し、ペレット化食餌およびプラスチック容器中の飲用水を容易にするステンレス製天面網を備え、寝藁材としてカンナ屑（（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ａｓｐｅｎ／  Ｓａｎｉ−ｃｈｉｐｓ  ｂｅｄｄｉｎｇ）で満たした。寝藁材は少なくとも１週間に１回、ケ−ジとともに交換した。
【０２１８】
識別：耳タグおよびケ−ジカ−ド
【０２１９】
終了：試験の最後に、動物をＣＯ２窒息によって安楽死させた。
【０２２０】
正当性：ＭＤＸマウスはデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（ＤＭＤ）を評価するための一般的な動物モデルである。
【０２２１】
試験開始の定義
【０２２２】
最初の対照または試験品投与を「１日目」として定めた。  
【０２２３】
試験終了の定義
【０２２４】
試験は開始から１２週で終了した。  
【０２２５】
愛護的最後  
【０２２６】
瀕死状態が認められた動物、および重度の痛みを示していた、または重度な苦痛の徴候に耐えていた動物は、愛護上安楽死させた。最初の体重から２０％を超える体重の低下を示す動物は報告された。
【０２２７】
試験品投与
【０２２８】
動物に食餌または飲料によってＡＣＣを投与した。動物に給餌によってＣＣＣを投与した。対照は給餌によって投与した。対照または試験品を試験終了まで（１２週後）毎日繰り返し投与した。
【０２２９】
試験および評価
【０２３０】
疾病率および死亡率観察  
【０２３１】
疾病率および死亡率の徴候に関する観察を、毎日および試験終了時に実施した。
【０２３２】
体重測定
【０２３３】
体重測定を週に１回および試験終了時に、１２週間記録した。
【０２３４】
クレアチニンキナ−ゼ（ＣＫ）量のための血液収集および血清調製  
【０２３５】
試験終了時、血液サンプルをすべての動物から、ケタミン／キシラジンによる軽い麻酔下で、後眼窩静脈叢から直接的に採取した。
【０２３６】
血液２００μＬを、凝固活性剤ゲルを加えた黄色カップチュ−ブに収集した。チュ−ブを凝固化のために室温で少なくとも３０分間維持し、室温で４０００ＲＰＭによって１０分間、遠心分離した。血清サンプルを、Ａ．ＭＬ検査所でのＣＫ分析のために送るまで、２〜４℃で保存する。
【０２３７】
クレアチニンキナ−ゼ−結果
【０２３８】
クレアチニンキナ−ゼ試験の結果を図８に示し、明確な傾向を実証する。すべてのｍｄｘマウスは野生型に比べて高いＣＫ値を示し、筋破壊を表した。しかし、この増加は食餌によってＡＣＣが与えられた群（４Ｍ群）では、正常な食餌のみが与えられた群と比べて有意に穏やかだった（２Ｍ群：スチュ−デントｔ検定、Ｐ値＝０．０３４）。ＣＣＣが与えられた３Ｍ群におけるマウスも、２Ｍ群（無処理）のマウスよりも穏やかな上昇を示したが、差は統計学的に有意ではなかった（スチュ−デントｔ検定、Ｐ値＝０．４５）。  
【０２３９】
飲水によってＡＣＣが与えられた５Ｍ群は、食餌によってＣＣＣが与えられた３Ｍ群と同様な結果を示した（それぞれ２１，１６４±８，３９１および２１，６７６±１４，５０８ＩＵ／ｍｌ）。いかなる理論または作用メカニズムによっても拘束されることは望まないが、４Ｍ群（食餌中のＡＣＣ）および５Ｍ群（飲水によるＡＣＣ）間の結果における差の理由は、ＡＣＣ懸濁液の異種性、従ってＡＣＣの不均一な投与に起因し得る。しかし、ＡＣＣの投与がｍｄｘマウスにおけるＤＭＤの徴候を有意に緩和したことは明らかである。
例７．ＭＤＸマウスにおける筋ジストロフィ−に対するＡＣＣ消費の効果を評価する
【０２４０】
本例において、異なる安定剤によって安定化されたＡＣＣのｍｄｘマウス（デュシェンヌ型筋ジストロフィ−のげっ歯類モデル）に対する効果を試験した。  
【０２４１】
試験品
【０２４２】
マウスに安定化ＡＣＣを毎日経口によって（給餌）、または１週間に連続して６回、腹腔内注射によって投与した。対照または試験品は同様に投与した。  
【０２４３】
試験システム
【０２４４】
種：マウス
【０２４５】
ｍｄｘ系：Ｃ５７／ＢＩ  １０ＳｃＳｎ／ＤＭＤ  ｍｄｘ／Ｊ  
【０２４６】
野生型系統：Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯＩａＨｓｄ
【０２４７】
性別および齢：雄、試験開始時に３〜５週齢
【０２４８】
体重：試験開始時の動物の体重変差は、性別の平均体重の±１５％を超えない。
【０２４９】
群サイズ：表１、試験設計を参照する。
【０２５０】
群数：６（表６を参照）
【表６】
2019501947.tif 000007
【０２５１】
実験手順：
【０２５２】
ＭＤＸマウスはデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（ＤＭＤ）を評価するための動物モデルである。
【０２５３】
試験終了の定義：試験は１〜４群について開始から２４週、および５〜６群について開始から１２週で終了する。
【０２５４】
試験品投与
【０２５５】
すべての動物（対照を除く）は、食餌（毎日）または腹腔内注射（１週間に６回連続）のどちらかによって安定化ＡＣＣが投与された。  
【０２５６】
試験および評価
【０２５７】
臨床徴候観察
【０２５８】
動物は臨床徴候について試験終了まで週に１回観察した。  
【０２５９】
観察は皮膚、毛、眼、粘膜、呼吸、分泌物の発生、および排泄（例えば、下痢）におけるいずれかの変化について実施した。異様な行動の存在として、足取り、姿勢、およびハンドリングに対する反応の変化、震戦、痙攣、睡眠、および昏睡も含めた。
【０２６０】
すべての観察された異常、毒性徴候、瀕死状態、および末期前を記録した。  
【０２６１】
試験の間に愛護的に屠殺された動物は、試験の間に死亡した動物として試験結果の解釈のために考慮される。
【０２６２】
体重測定
【０２６３】
体重測定を週に１回、四肢ハンギング試験直前に記録した。試験開始時および終了時にも体重を測定した。  
【０２６４】
機能試験−四肢ハンギング試験（グリップ試験）  
【０２６５】
四肢ハンギング試験を使用して、筋強度をモニタリングし、神経筋障害および運動協調性について示した。試験を使用してＡＣＣの有効性を判断した。  
【０２６６】
四肢ハンギング試験では、ワイヤグリッドシステムを使用して、重力に対して維持された四肢張力を示すマウスの能力を測定する。ハンギング時間は秒ならびに最小保持インパルス（保持インパルス＝体重×ハンギング時間，［Ｎ秒］，換算係数−９．８０６×１０３ニュ−トン／ｇ）で測定される。
【０２６７】
グリップ試験（四肢ハンギング試験）をＴＲＥＡＴ−ＮＭＤ  ＳＯＰ番号ＤＭＤ  Ｍ．２．１．００５プロトコルに従って実施した。簡単に説明する。
【０２６８】
マウス（最小齢−４週）をグリッド（グリッド平方サイズ約１×１ｃｍ２）の天面に配置し、この環境に３〜５秒順応させた。  
【０２６９】
グリッドをマウスが逆さまになるようにひっくり返した。グリッドの高さをケ−ジ床の少なくとも３５ｃｍ上に配置した。十分な量の柔軟な寝藁（５〜７ｃｍ）をグリッドの下に配置して、安全な着地を確実にした。４〜２４週齢のマウスは、自然にグリッドに留まり、床への落下を避けるようにする。この高さは動物が傷を負うことがない十分な低さであり、落下を確実に避けるのに十分な高さである。  
【０２７０】
各ハンギング期間は、４本のマウスの足すべてがグリッドを握ることによって開始しなければならない。ハンギング時間をストップウォッチで測定して記録した。  
【０２７１】
試験を最大６００秒まで、または少なくとも２分の休息間隔で３回繰り返して実施した。
【０２７２】
最長のハンギング時間を使用して保持インパルスを評価した。
【０２７３】
四肢ハンギング試験を全実験の間、各週で実施した。
【０２７４】
クレアチニンキナ−ゼ（ＣＫ）量のための血液収集および血清調製：  
【０２７５】
試験終了時、血液サンプルをすべての動物から軽い麻酔下（ケタミン／キシラジンによる）で、後眼窩静脈叢から直接採取する。
【０２７６】
血液２００μＬを、凝固活性剤ゲルを加えた黄色カップチュ−ブに収集する。チュ−ブを凝固化のために室温で少なくとも３０分間維持し、室温で４０００ＲＰＭによって１０分間、遠心分離する。血清サンプルを、Ａ．ＭＬ検査所でのＣＫ分析のために送るまで、２〜４℃で保存する。
【０２７７】
試験終了および剖検
【０２７８】
最終採血後、動物を二酸化炭素窒息によって殺し、肉眼所見を実施して、主要組織および器官系を検査する。  
【０２７９】
骨格筋収集
【０２８０】
剖検の際、すべての動物から選択した筋（横隔膜筋、心筋、および腓腹筋）を収集する。すべての動物から得る筋を、将来の組織病理学検査のために、１０％中性緩衝化ホルマリン（約４％ホルムアルデヒド溶液）中で少なくとも２４時間保存する。  
【０２８１】
結果
【０２８２】
マウスは全群で体重が増加した。いずれの群の平均体重にも有意差は認められなかった。  
【０２８３】
機能試験−四肢ハンギング試験−中間結果
【０２８４】
有意差が、標準食（カルシウムを含む）が投与された対照群に対して、ＡＣＣ製剤が経口投与された両ｍｄｘ群（安定剤１−ホスホセリン、安定剤２−三リン酸）の保持インパルス（ＨＩ）で認められた、図９を参照。差は試験の第２週で既に観察され、ＡＣＣ処理マウスのＨＩは対照群のＨＩより２倍高かった。この差は試験が進むと増加し、約６〜８週後にプラト−に達した。ＡＣＣ処理マウスのＨＩは対照群よりも約２〜３．８倍高かったことが図９から認められる。  
例８．ＡＣＣ補充培地における胚発達の向上
【０２８５】
材料および方法
【０２８６】
ＣＢＡ雄マウスをＢＬ  Ｃ５７雌マウスと交配させた。マウスを無制限の水および食餌供給によって、１２時間の明暗サイクルで維持した。子を得た６〜８週後、各雌マウスに妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）の５ＩＵを腹腔内注射した。  
【０２８７】
４８時間後、各雌マウスに５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内注射した。繁殖力が証明されている雄マウスを、過排卵雌と一緒にした。次の朝、雌マウスを膣栓の存在について検査した。膣栓を有した雌を２４時間後（性交後約３６時間）に安楽死させ、卵管をＱｕｉｎｎ’ｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ分割培地（ＳＡＧＥ，Ｏｒｉｇｉｏ，デンマ−ク）中で切開し、胚をミネラルオイルで積層したＱｕｉｎｎ’ｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ分割培地（ＳＡＧＥ，Ｏｒｉｇｉｏ，デンマ−ク）による２０μＬ液滴に移し、５％ＣＯ２および大気酸素下、３７℃で培養することによって、２細胞期の胚を卵管から回収した。収集した胚は胚盤胞／孵化期まで成長、すなわちインビトロ培養（ＩＶＣ）を続けた。無定形炭酸カルシウムの効果を試験するため、Ｑｕｉｎｎ’ｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ分割培地（以後、「分割培地」）を異なる添加剤、すなわち、ポリリン酸によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ−ＰＰ）、結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）、ポリリン酸（ＰＰ）、ホスホセリン（ＰＳ）、または炭酸ナトリウム（ＮａＣＯ３）で補充した。すべてのサプリメントは新たに調製した懸濁液として加え、ＡＣＣサプリメントの調製は無菌条件下で実施した。未処理分割培地（いずれの添加物の添加もない）を対照（Ｃｏｎｔ  Ｑとして表示）として使用した。胚を、２細胞、緊密化期、胚盤胞形成、および孵化期の段階の検出のために顕微鏡観察によって毎日評価した。各期に到達した胚の割合（パ−セント）を計算した（２細胞胚の数を１００％に設定した）。
【０２８８】
結果
【０２８９】
ＰＰで安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ−ＰＰ）の１．７ｍＭが補充された分割培地における胚発達を、対照（Ｃｏｎｔ  Ｑ−未処理培地における発達）と比較した。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（後者は括弧で示す）を表７に示す。
【表７】
2019501947.tif 000008
例９．  
【０２９０】
ＡＣＣ−ＰＰまたは塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）のどちらかが１．７ｍＭ補充された分割培地における胚発達を２つの別々の検査で試験した（ＡおよびＢ）。試験Ａでは胚を胚盤胞期まで、試験Ｂでは孵化期まで成長させた。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（括弧内）を表８（試験Ａ）および表９（試験Ｂ）に示す。
【表８】
2019501947.tif 000009
【表９】
2019501947.tif 000010
例１０．  
【０２９１】
１．７ｍＭのＣａＣｌ２、１．７ｍＭのＡＣＣ−ＰＰ、または０．８５ｍＭのＡＣＣ−ＰＰ（ＡＣＣ−ＰＰの最初の濃度の半分、ＡＣＣ−ＰＰ０．８５として識別）が補充された分割培地における胚発達。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（括弧内）を表１０に示す。
【表１０】
2019501947.tif 000011
例１１．
【０２９２】
１．７ｍＭのＣａＣｌ２、１．７ｍＭまたは０．８５ｍＭのＡＣＣ−ＰＰ（ＡＣＣ−ＰＰ０．８５）が補充された分割培地における胚発達を試験し、未処理培地における発達と比較した。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（括弧内）を表１１に示す。
【表１１】
2019501947.tif 000012
例１２．  
【０２９３】
この実験では、４匹の５月齢雌マウスを安楽死させた。各マウスから得る胚を材料および方法で記載されたように収集したが、胚は一緒にプ−ルせず、各マウスの各卵管からの胚を１．７ｍＭのＣａＣｌ２または１．７ｍＭのＡＣＣ−ＰＰが補充された分割培地のどちらかで成長させて、培養で別々に成長させた。この方法では、各雌から得る胚が同胞だったため、マウス間の差を評価することもできた。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（括弧内）を表１２に示す。
【表１２】
2019501947.tif 000013
例１３．
【０２９４】
この実験では、７匹の６月齢雌マウスを安楽死させた。各マウスから、胚を材料および方法で記載されたように収集したが、マウスＮｏ．１および２からは、胚は一緒にプ−ルせず、例５のように別々に成長させた。マウスＮｏ．１から得る胚は、未処理分割培地または２．６ｍＭのＡＣＣ−ＰＰを補充した培地（ＡＣＣ−ＰＰ２．６）のどちらかで成長させた。マウスＮｏ．２から得る胚は、ＡＣＣ−ＰＰの１．３ｍＭまたは０．６ｍＭが補充された分割培地（それぞれ、ＡＣＣ−ＰＰ１．３およびＡＣＣ−ＰＰ０．６で表す）で成長させた。マウスＮｏ．３〜７から得る胚はすべて一緒にプ−ルし、ポリリン酸の１．６ｍＭ添加で成長させた（ＰＰ）。さらに、胚盤胞の直径および容積を計算した。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（括弧内）を表１３に示す。
【表１３】
2019501947.tif 000014
【０２９５】
ＡＣＣ−ＰＰの２．６ｍＭ添加で成長させて孵化した胚盤胞は、対照よりも２８％大きい直径および２倍大きい容積を有した。  
例１４．
【０２９６】
この実験では、７匹の６月齢雌マウスを安楽死させた。各マウスから得る胚を材料および方法（例６）に記載されたよう収集した。胚を一緒にプ−ルし、５群に分けて、未処理分割培地（Ｃｏｎｔ  Ｑ）、または２．６ｍＭ、１．３ｍＭ、０．６ｍＭのＡＣＣ−ＰＰ（それぞれ、ＡＣＣ−ＰＰ２．６、ＡＣＣ−ＰＰ１．３、およびＡＣＣ−ＰＰ０．６として表す）、または１．６ｍＭのポリリン酸（ＰＰ）が補充された培地で成長させた。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（括弧内）を表１４に示す。
【表１４】
2019501947.tif 000015
例１５．
【０２９７】
この実験では、６匹の６月齢雌マウスを安楽死させた。各マウスから得る胚を材料および方法に記載されたよう収集した。胚を一緒にプ−ルして３つの群に分け、１つの群は対照（Ｃｏｎｔ  Ｑ）として使用し、他の２つの群では胚はＡＣＣ−ＰＰの３．３ｍＭ（ＡＣＣ−ＰＰ３．３）または３．３ｍＭの市販ナノメ−タ−結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）が補充された分割培地で成長させた。すべての培地は無菌条件下で調製した。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（括弧内）を表１５に示す。
【表１５】
2019501947.tif 000016
例１６．
【０２９８】
この実験では、６匹の７月齢雌マウスを安楽死させた。各マウスから、胚を材料および方法（例６）に記載されたよう収集した。胚は一緒にプ−ルし、１．７ｍＭのＣａＣｌ２、１．７ｍＭのＡＣＣ−ＰＰ、０．８ｍＭのＡＣＣ−ＰＰ（ＡＣＣ−ＰＰ０．８）、または１．７ｍＭのホスホセリン（ＰＳ）が補充された分割培地において成長させた。各発達期の胚数および最初の胚数に対するこれらの割合（括弧内）を表１６に示す。
【表１６】
2019501947.tif 000017
【０２９９】
この特定の実験では、塩化カルシウムを加えることは、胚発達に負の影響を及ぼし、胚盤胞および孵化胚盤胞の低い割合をもたらした。  
例１７．
【０３００】
この実験では、６匹の６月齢雌マウスを安楽死させた。各マウスから得る胚を材料および方法（例６）に記載されたように収集したが、マウスＮｏ．１および２から得る胚は一緒にプ−ルせず、同胞実験としてむしろ別々に成長させた（例１０を参照）。雌Ｎｏ．１から得る胚を未処理分割培地または１．７ｍＭのナノメ−タ−結晶炭酸カルシウム（ＣＣＣ）が補充された培地で成長させた。マウスＮｏ．２から得る胚を１．７ｍＭのＡＣＣ−ＰＰまたは１．７ｍＭの炭酸ナトリウム（ＮａＣＯ３）が補充された培地で成長させた。マウスＮｏ．３〜６から得る胚はすべて一緒にプ−ルし、未処理培地、あるいは１．７ｍＭのＮａＣＯ３または１．７ｍＭのＡＣＣ−ＰＰが補充された培地で成長させた。さらに、胚盤胞の直径および容積を計算した（表１７を参照）。
【表１７】
2019501947.tif 000018
【０３０１】
炭酸ナトリウムを添加することは、対照またはＡＣＣ−ＰＰの添加と比べて非常に乏しい胚発達をもたらしたことが認められる。ＡＣＣ−ＰＰの２．６ｍＭ補充した分割培地で成長させて孵化した胚盤胞は、対照よりも２８％大きい直径および２倍大きい容積を有したことも認められた。  
例１８．細胞培養培地サプリメントとして製剤化された１０％ＴＰ−１％クエン酸ＡＣＣ（１０％三リン酸および１％クエン酸によって安定化されたＡＣＣ）の調製
【０３０２】
３％塩化カルシウム溶液３６ｍｌを０．２７％クエン酸溶液４ｍｌおよび０．５４０６％三リン酸溶液１０ｍｌと混合した。１．９４８５％炭酸ナトリウム溶液４０ｍｌを加えてＡＣＣを沈殿させた。０．５４０６％三リン酸を含む安定化溶液１０ｍｌをＡＣＣ懸濁液に加えて安定化ＡＣＣ懸濁液を得た。得られた懸濁液をＱｕｉｎｎ’ｓ（商標）分割培地またはＱｕｉｎｎ’ｓ（商標）１−Ｓｔｅｐ培地にサプリメントとして使用した。懸濁液を１．７または３．４ｍＭのＡＣＣ最終濃度まで加えた。あるいは、懸濁液をブフナ−漏斗を用いてろ過し、固体物を水で洗浄し、固体物をさらにオ−ブンなどで乾燥させる。粉末を１．７または３．４ｍＭの最終濃度まで分割培地に加える。
例１９．  
【０３０３】
この実験では、４匹の６〜８週齢雌マウスを安楽死させた。各マウスから得る胚を材料および方法に記載されたように収集した。安定化ＡＣＣ（１０％三リン酸および１％クエン酸によって安定化されたＡＣＣ）を例１６で説明したように調製した。各雌から得る胚を分離し、第一部分を未処理ＳＡＧＥ１−Ｓｔｅｐ（商標）培地で、第二部分を１．７ｍＭのＡＣＣ−ＰＰまたは３．４ｍＭのＡＣＣ−ＰＰが補充されたＳＡＧＥ１−Ｓｔｅｐ（商標）培地で成長させた。図１０から認められるように、安定化ＡＣＣの添加は胚発達に正の効果を有し、特に３．４ｍＭのＡＣＣによって胚盤胞および孵化胚盤胞の高い割合がもたらされた。予期せぬことに、孵化した胚盤胞の割合を増加するために、いずれの他の培地にも移すことが必要とされなかった。
例２０．  
【０３０４】
２つの異なる実験では、３匹の６〜８週齢雌マウスを安楽死させた（各実験において）。各マウスから得る胚を材料および方法に記載されたよう収集した。安定化ＡＣＣ（１０％三リン酸および１％クエン酸によって安定化されたＡＣＣ）を例１７で説明したように調製した。一つの実験では（実験Ａ）、各雌から得る胚を分離し、第一部分を未処理ＳＡＧＥ１−Ｓｔｅｐ（商標）培地で、第二部分を３．４ｍＭのＡＣＣ−ＰＰが補充されたＳＡＧＥ１−Ｓｔｅｐ（商標）培地で成長させた。第二の実験では（実験Ｂ）、各雌から得る胚を分離し、第一部分を未処理分割培地（ＳＡＧＥ）、および第二部分を３．４ｍＭのＡＣＣ−ＰＰが補充された分割培地で成長させた。これらの実験の結果を図１１（実験Ａ）および図１２（実験Ｂ）に示す。
【０３０５】
実験から認められるように、安定化ＡＣＣの添加は胚発達に正の効果を有し、特に胚盤胞および孵化胚盤胞の高い割合がもたらされた。予期せぬことに、両培地では、孵化した胚盤胞の割合を増加するために、いずれの他の培地にも移すことが必要とされなかった。
例２１．細胞培養培地サプリメントとして製剤化されたＡＣＣの調製
【０３０６】
異なる安定化剤（三リン酸（ＴＰ）、ヘキサメタリン酸（ＨＭＰ）、ピロリン酸（Ｐｙｒ）、ホスホセリン（ＰＳ）、エチドロン酸（ＥＴ）、ゾレドロン酸（ＺＡ）、またはメドロン酸（ＭＡ）を調製した）によって安定化されたＡＣＣの組成物を調製した。典型的な手順では、カルシウム溶液（水３００ｍｌ、塩化カルシウム２４ｇ、および安定剤）および炭酸溶液（水２００ｍｌおよび炭酸ナトリウム１７．３ｇ）を一緒に混合してＡＣＣを沈殿させた。安定剤溶液（水１００ｍｌおよび安定剤、表１８にカルシウムおよび安定剤溶液における安定剤の含量を示す）をＡＣＣ懸濁液に加えて安定化ＡＣＣ懸濁液を得た。懸濁液はサプリメントとして使用され得る。ついでＡＣＣをブフナ−漏斗によってろ過し、固体物を水で洗浄した。懸濁液を乾燥させて粉末を得た。粉末は細胞培養培地サプリメントとして加える、または水性培地に再懸濁させて懸濁液として加え得る。
【表１８】
2019501947.tif 000019
【０３０７】
他の例では、組成物は前述のように、最終組成物で１％クエン酸を得るように、カルシウム溶液へのクエン酸の添加によって調製した。懸濁液それ自体が培養培地サプリメントとして使用される。あるいは、懸濁液はさらに水で洗浄して乾燥させて粉末を得た。粉末は任意の細胞培養培地に加え得る、または水性培地で再懸濁させ得る。  
【０３０８】
例２２．ＭＢＡ１３幹細胞（骨髄間質細胞）の骨芽細胞への成長材料および方法
【０３０９】
解凍の２日後、ＭＢＡ−１３細胞（ワイツマン科学研究所、Ｄｏｖ  Ｚｉｐｏｒｉ教授から入手）を組換えトリプシン溶液に再懸濁し、ＭＳＣ  Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）ＸＦ基礎培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ｃａｔ  Ｎｏ．０５−２００−１Ａ）に間葉幹細胞（ＭＳＣ）補充混合培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｃａｔ  Ｎｏ．０５−２０１−０６）を５０ｍｌ：３００μＬの割合で補充して用いて、９６ウェルプレ−トに細胞１×１０４個／ウェルの濃度で播種した（０日目）。９６ウェルプレ−トの１〜４列のＡ〜Ｈ行を、細胞播種のためにＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋イオン無添加）で１：１００の比に希釈したＭＣＳ接着溶液によってプレコ−ティングした。９６ウェルプレ−トの５〜８列のＡ〜Ｈ列を、０．１％ゼラチンによって室温、３０分間プレコ−ティングした。  
【０３１０】
２日目に、８０％を超える細胞密集が達成されたとき（約４８時間）、培地を骨芽細胞分化を促進する因子を含むＭＳＣｇｏ  ｒａｐｉｄ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ（迅速骨形成培地）（ｃａｔ  Ｎｏ．０５−４４２−１Ｂ）に交換した。培地交換後、Ａ〜Ｃ行に１０％三リン酸＋１％クエン酸によって安定化された無定形炭酸カルシウム（ＡＣＣ）由来の１ｍＭ追加カルシウム（全２．４８８ｍＭカルシウム）を補充し、Ｄ〜Ｆ行に塩化カルシウム由来の１ｍＭ追加カルシウム（全２．４８８ｍＭカルシウム）を補充し、プレ−トのＧ行はＭＳＣｇｏ培地（全１．４８８ｍＭカルシウム）で処理した。プレ−トのＨ行はＭＳＣ  ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）  ＸＦ栄養基礎培地＋サプリメント混合物（全１．４８８ｍＭカルシウム）で処理した。  
【０３１１】
４日目に、培地をＡＣＣの新鮮な調製物に交換した。  
【０３１２】
並行して、対照プレ−トもＭＤＸマウスの損傷した筋肉由来のＭＤＸ細胞株で播種した。これらの細胞の染色を使用して、細胞本来のカルシウムのバックグランド染色を設定し、またＡＣＣ処理のカルシウム沈着が染色される可能性を排除した。播種前に、ウェルをゼラチンでコ−ティングし、これはＭＤＸ細胞接着用の標準的基材として使用される。ＭＤＸ細胞を２４ウェルプレ−トに３×１０４個／ウェルの濃度で加えた。播種日を「０日」として定める。  
【０３１３】
２日目に、ウェルの培地を次のように交換した。
【０３１４】
１および２列は施設内で調製する脊髄（ＳＣ）培地（０．６ｗｔ％Ｄ−グルコ−ス、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、Ｂ２７、Ｎ２、０．１  ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、Ｈｅｐｅｓ、１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、および５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉを含む培地）＋ＡＣＣ由来の１ｍＭカルシウム（２ｍＭの全カルシウム濃度）で処理した。３および４列はＳＣ培地＋ＣａＣｌ２由来の１ｍＭで処理した。５および６列はＳＣ培地で処理した。細胞の両タイプ（ＭＢＡ１３およびＭＤＸ）を１０日目まで培養した。
【０３１５】
各タイプについて数ウェルの固定（４％ホルムアルデヒドで２０分間）を、培地交換後の５、７、および１０日目、すなわち試験の７、９、および１２日目に実施した。  
【０３１６】
細胞を固定してから、２種の染色試薬を使用して細胞外カルシウムまたは骨沈着を染色して骨芽細胞機能性を評価した。（ｉ）アリザリンレッド（シグマ、Ａ５５３３３）および（ｉｉ）アルカリホスファタ−ゼ（ＤＡＫＯ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質システムＫ０５９８）は次の通りだった。
【０３１７】
アリザリンレッド染色手順−ｐＨを４．２に調整した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、冷却エタノ−ルで５分間固定し、ついでＰＢＳで再度洗浄した。アリザリン溶液を２％の濃度で１５〜２０分間使用した。染色インキュベ−ション後、サンプルを水で２〜３回洗浄して非特異的染色を取り除いた。
【０３１８】
アルカリホスファタ−ゼ染色−細胞をＰＢＳで１または２回洗浄し、ついで４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。そしてＰＢＳで３回洗浄し、残存ＰＢＳを除去後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴキット溶液の３滴を使用して細胞を覆い、対照としていずれの細胞も含まない空ウェルを測定の質を高めるために含めた。アルカリホスファタ−ゼキットのインキュベ−ションを１時間実施し、ついで蒸留水ですすいだ。
【０３１９】
結果
【０３２０】
１０日間培養し、アリザリンおよびアルカリホスファタ−ゼによって染色された細胞の結果を示す。１０日前に実施された観察は、両染色法においていずれのカルシウム沈着もほとんど検出されなかった。
【０３２１】
細胞状態を２日および４日の２時点で光学顕微鏡（固定なし）によって観察した。両観察において、ＭＳＣ接着溶液によってプレコ−ティングしたウェルに播種された細胞は、良好な状態でなく、細胞は丸みを帯びた。これに対し、ゼラチンでプレコ−ティングしたウェルに播種された細胞は良好な状態だった。だが、両タイプのプレコ−ティングで継続することにした。次の結果および染色手順は、接着基材として使用されたゼラチンにおける細胞成長に関するものである。  
【０３２２】
アリザリンレッド染色では、カルシウム沈着はオレンジレッド色によって検出される。  
【０３２３】
アリザリンレッド染色は、ＡＣＣが補充された骨芽細胞における非常に強いシグナルを、弱いシグナルのみを示したＣａＣｌ２が補充されたものと比較して実証した（図１３）。シグナルに加え、大きいカルシウム沈着が染色され、これは対照処理のいずれでも観察されないことが図で認められる。  
【０３２４】
ＭＳＣｇｏ迅速培地で成長させた細胞のアリザリンレッド染色もまたカルシウム沈着のいくつかの染色を示したが、沈着のサイズおよびその量は有意に低く、ＣａＣｌ２が補充された細胞で認められた形態学および量と類似する。カルシウム沈着はＭＳＣ  ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標）ＸＦサプリメント（ＭＳＣｓｕｐ、テ−タは示さず）で成長させた細胞では認められなかった。ＭＳＣ  ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標）ＸＦサプリメント培地は通常、細胞分化よりもむしろ細胞増殖を誘発するために使用される。実際、観察される細胞の数は多いが、カルシウム沈着は観察されない。  
【０３２５】
観察は、ＡＣＣ処理が骨芽細胞へのＭＢＡ１３細胞分化を高め、細胞カルシウム沈着を増加させる、すなわちこれらの機能性を高めることを示唆する。
【０３２６】
骨芽細胞分化に関する別の独立したマ−カ−はアルカリホスファタ−ゼである。この酵素は、細胞のマトリックス成熟期が生じるとき、最大限に発現される。アルカリホスファタ−ゼ染色は、骨芽細胞分化および機能性を検出する補足的方法として使用し、アリザリン染色によって得られた結果を検証した。  
【０３２７】
アルカリホスファタ−ゼ染色は黒色として示され、結果を図１４に示す。ＡＣＣによって処理されたＭＢＡ１３細胞は、他の処理と比べて強いシグナルを示した。実際、アルカリホスファタ−ゼ染色は、骨芽細胞分化がＡＣＣによって処置された培養で優れていることを裏付ける。
【０３２８】
ＡＣＣ添加培地によって播種後１０日間処理されたＭＤＸ細胞のアリザリン染色は、処理間で染色に大きな差のないことを示した（図１５Ａ〜Ｃを参照）。これらの結果は、骨芽細胞のアリザリンレッド染色が、骨芽細胞によるカルシウム沈着に起因しており、処理それ自体によって生じたＡＣＣ沈着によるものではないことを裏付ける（すなわち、実験上の人為的結果ではない）。
【０３２９】
ＭＤＸ細胞株のアルカリホスファタ−ゼ染色（図１５Ｄ〜Ｆ）は、骨形成が生じなかったことを示した。興味深いことに、アルカリホスファタ−ゼ染色では、高められた筋管形成が、ＣａＣｌ２補充された培地または対照で成長された細胞と比べてＡＣＣ処理細胞で観察された。
【０３３０】
結論
【０３３１】
異なる培地における播種の１０日後のアリザリンレッドおよびアルカリホスファタ−ゼ染色である独立した両染色は、使用された対照と比べてＡＣＣが補充された培地で成長した骨芽細胞沈着のかなり強い染色を示した。  
【０３３２】
細胞をＡＣＣの存在中で成長させたとき、大きいカルシウム沈着プラ−クが観察されたが、このような沈着はＣａＣｌ２が補充された培地で成長させた細胞では観察されなかった。染色がより多くのプラ−ク沈着を示したため、強いシグナルが高い機能性を示している可能性がある。ＭＤＸ細胞染色によって得られる結果は、プラ−クがＡＣＣ添加によるものではなく、骨芽細胞の機能による直接的な結果であることを示唆する。  
例２３．精子運動率向上のためのＡＣＣ  
【０３３３】
材料および方法
【０３３４】
ＡＣＣサプリメント調製  
【０３３５】
３％塩化カルシウム溶液３６ｍｌを０．３％クエン酸溶液４ｍｌおよび０．５％三リン酸溶液１０ｍｌと混合した。２％炭酸ナトリウム溶液４０ｍｌを加えてＡＣＣを沈殿させた。０．５％三リン酸を含む安定化溶液１０ｍｌをＡＣＣ懸濁液に加えて安定化ＡＣＣ懸濁液を得た。得られる懸濁液のカルシウム元素濃度は７５ｍＭだった。
【０３３６】
精子収集
【０３３７】
精子を同一ヒツジから３回（実験１）または３頭のヒツジから２回（実験２および３）採取し、室温で濃度および運動率を評価した。精子を、ミリＱ水に１０７．７０ｍＭのＮａＣｌ、７．１６ｍＭのＫＣｌ、１．１９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．７１ｍＭのＣａＣｌ２、０．４９ｍＭのＭｇＣｌ２、２５．０７ｍＭのＮａＨＣＯ３、３．３０ｍＭの乳酸ナトリウム、および１．５０ｍＭグルコ−ス（１０）を含む合成卵管液（ＳＯＦ）で５千万個／ｍｌの濃度に希釈した。モル浸透圧濃度は２７０ｍＯｓｍｏｌおよびｐＨ７．５５となる。
【０３３８】
そして精子についてＣＡＳＡ（Ｔｈｅ  ｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ８１，Ｉｓｓｕｅ１，Ｐａｇｅｓ５−１７）を用いで運動率を評価し、４℃まで１℃／分で冷却した。
【０３３９】
スイムアップ法  
【０３４０】
スイムアップ法は３８℃で実施し、原精子（１０μＬ）をエッペンドルフ１ｍｌバイアルに加え、０．２５ｍｌストロ−（ＣＢＳ、フランス）に挿入されたＳＯＦ培地中で約１時間インキュベ−ションした。４０〜６０分後、ストロ−に入った精子をスライドに加え、ＣＡＳＡによって評価した。
【０３４１】
結果
【０３４２】
新たに収集された精子の運動率を材料および方法セクションで説明されたように、無定形炭酸カルシウムの添加または無添加で試験した。結果を表１９に示す。
【表１９】
2019501947.tif 000020
【０３４３】
ＡＣＣが補充された精子は未処理精子と比べて非常に高い前進運動率を有したことが認められる。
例２４．スイムアップ実験における精子運動率に対するＡＣＣの効果
【０３４４】
精子運動率におけるＡＣＣの効果を評価するため、標準的なスイムアップ実験をＡＣＣ懸濁液の１７μＬ／ｍｌおよび３４μＬ／ｍｌ（それぞれ１．３および２．６ｍＭのＣａ元素）の存在中で実施した。生存可能な精子を１時間後に計数し、結果を表２０にまとめて示す。
【表２０】
2019501947.tif 000021
【０３４５】
ＡＣＣの添加はすべての実験において生存可能な精子の数を有意に増加したことが明確に認められる。ＡＣＣが補充されたサンプルでは、生存可能な精子の数は未処理サンプルよりも２〜７倍高かった。
例２５．スイムアップ実験における精子運動率に対するＡＣＣ濃度の効果  
精子の運動率におけるＡＣＣ濃度の効果を、各ＡＣＣについて３種の異なるサンプルを用いてスイムアップ実験によって試験した。結果を表２１にまとめて示す。
【表２１】
2019501947.tif 000022
【０３４６】
卵管液（ＳＯＦ）溶液への１７μＬ／ｍｌのＡＣＣ懸濁液の添加および３８℃で１時間のインキュベ−ションは、運動性精子の濃度を少なくとも３倍増加した。興味深いことに、ＡＣＣの濃度が高くなるとスイムアップ後の移動性精子の濃度を低下させなかった。ＡＣＣはスイムアップ法後の精子濃度を高め、イオン性カルシウムにおけるいずれの二相性効果も有さなかった。最小の効果的用量を超えるいずれのＡＣＣ濃度も運動率を増加させる。
例２６ＡＣＣはインビトロで卵巣を維持する。
【０３４７】
材料および方法
【０３４８】
卵巣をマウス（６週齢）から収集して０．４ｍｍ×０．４ｍｍ片に切断した。卵巣を１２ウェルプレ−トで培養した。培養培地は、培養培地は、カルシウム枯渇した（カルシウムイオン無添加培地、特別調製）ダルベッコ改変イ−グル培地−栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）が９０％、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および０．３〜０．５％ＮＶＲ−Ｇｅｌから、３．４ｍＭ安定化ＡＣＣ−ＰＰの添加または無添加で構成された。培養の４８時間後、妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）の５ＩＵを培養皿に加えた。
【０３４９】
結果
【０３５０】
二次卵胞が安定化ＡＣＣの存在下でインビトロ培養の２週後に発達し、卵母細胞を囲む顆粒膜細胞は完全なものだったことが、図１６で認められる。これに反し、対照群における二次卵胞は、不完全な顆粒膜細胞および胚胞卵母細胞を示す。かなり多くの卵胞がＡＣＣ群で観察され、培養培地におけるＡＣＣの添加が卵胞の迅速で優れた成長を可能にすることを意味した。  
【０３５１】
本発明はその好ましい実施形態の手段によって本明細書で前述されているが、添付の請求で定められる本発明の精神および性質から逸脱することなく変更され得る。  
【図１】
2019501947.tif 000023
【図２Ａ】
2019501947.tif 000024
【図２Ｂ】
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【図３】
2019501947.tif 000026
【図４】
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【図５】
2019501947.tif 000028
【図６】
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【図７】
2019501947.tif 000030
【図８】
2019501947.tif 000031
【図９】
2019501947.tif 000032
【図１０】
2019501947.tif 000033
【図１１】
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【図１２】
2019501947.tif 000035
【図１３】
2019501947.tif 000036
【図１４】
2019501947.tif 000037
【図１５】
2019501947.tif 000038
【図１６】
2019501947.tif 000039
【国際調査報告】
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