(57)【要約】  本発明は，Cypateを含むヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体，疎水化複合体，その調製法，及びインビボイメージング及び新生物の治療のための医薬用途における使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体：
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（式中，Ｒ＋はＨ＋，又はＮａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋又はＣａ２＋を含む群から選択される生理学的に許容される塩であり，
Ｒ１は−Ｈ又は式IIのCypate残基であり，ここで〜は，式IIのCypate残基の共有結合の位置であり，
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少なくとも１つの繰り返し単位において１つのＲ１は式IIのCypate残基であり，ただし該単位に式IIのCypate残基であるＲ１が存在する場合は，該単位における他のＲ１はＨであり，そして
ｎは２〜６２５の範囲の整数である）。
【請求項２】
一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体のグルコサミン部分の６位が式IIのCypate残基で置換されている請求項１記載の蛍光複合体。
【請求項３】
一般式Iのヒアルロン酸又はその塩の複合体における式IIのCypate残基の置換度が，０．１〜２％，好ましくは１．０％である請求項１又は２記載の蛍光複合体。
【請求項４】
５７０nm〜７９０nmまでの領域の光を吸収し，６８０nm〜８５０nmまでの領域，好ましくは８５０nmの光を発する請求項１〜３いずれか１項記載の蛍光複合体。
【請求項５】
Ｒ＋，Ｒ１及びｎは請求項１で定義したとおりであり，同時に，少なくとも１つの繰り返し単位において，少なくとも１つのＲ１がＣ（＝Ｏ）Ｒ２であり，ここでＲ２はＣｘＨｙ置換基であり，ｘは５〜１７の範囲中の整数であり，ｙは１１〜３５の範囲中の整数であり，それは直鎖又は分岐した飽和又は不飽和のＣ６−Ｃ１８脂肪鎖である請求項１〜３いずれか１項記載のヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体。
【請求項６】
一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の複合体において置換基−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２の置換度が３〜７０％，好ましくは５〜１２％である請求項５記載の蛍光複合体。
【請求項７】
５７０nm〜７９０nmまでの領域の光を吸収し，６８０nm〜８５０nmまでの領域，好ましくは８５０nmの光を発する請求項５又は６記載の蛍光複合体。
【請求項８】
次式III
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のCypate Iを，ジメチルスルホキシド，ジメチルホルムアミド，ホルムアミド又はアセトニトリルを含む群から選択され，好ましくはジメチルスルホキシドである非プロトン性極性溶媒中で，Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを用いて活性化し，次式IV
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の反応性中間体モノ-イミダゾリドを生じさせ，それをイミダゾールの形態でその場で生成される有機塩基，又は反応混合物に添加される，例えば１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン，Ｎ−メチルモルホリン，イミダゾール，トリエチルアミン又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンを含む群から選択される添加される有機塩基，好ましくはその場で生成されるイミダゾール，及び上記のような極性の非プロトン性溶媒の存在下で，ヒアルロン酸又はその塩と反応させることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の複合体の調製方法。
【請求項９】
前記Cypateの活性化が２０〜６０℃の範囲，好ましくは２２℃から２５℃の範囲の温度で，１０分から２０時間，好ましくは０．５〜２時間行われることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
複合体形成の反応が４０℃〜８０℃，好ましくは４０℃〜６０℃，より好ましくは６０℃の温度で，１２〜４８時間，好ましくは２４時間行われることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
CypateＩ：ヒアルロン酸又はその塩：Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール：有機塩基のモル比が，反応混合物中で０．５：１：０．５：０．５〜３．５，好ましくは重量比で０．５：１：０．５：１であることを特徴とする請求項８〜１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
一般式V：  Ｒ２ＣＯＯＨ    (V)
（式中，Ｒ２はＣｘＨｙであり，ここでｘは５〜１７の範囲の整数であり，ｙは１１〜３５の範囲の整数であり，ＣｘＨｙは直鎖又は分岐した飽和又は不飽和鎖である）の脂肪酸の活性化を，一般式VI
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（式中，Ｒ３はＨ, −ＮＯ２，−ＣＯＯＨ，ハロゲン化物，Ｃ１−Ｃ６アルキルアルコキシを含んでいる群から選択され，好ましくはＨである１つ以上の置換基である）の置換又は未置換の塩化ベンゾイルを用いて，１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン，Ｎ−メチルモルホリン，トリエチルアミン又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンを含む群から選択され，好ましくはトリエチルアミンである有機塩基；及びイソプロピルアルコール，テトラヒドロフランを含む群から選択され，好ましくはイソプロピルアルコールである極性溶媒の存在下で行い，一般式VII
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（Ｒ２及びＲ３は上記で定義したとおりである）の反応性無水物を生成させること，
請求項１〜３いずれか１項記載の一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体を，有機塩基，好ましくは１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン，Ｎ−メチルモルホリン，イミダゾール，トリエチルアミン又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンを含む群から選択され，より好ましくはトリエチルアミンであるアミン；水と，イソプロピルアルコール，ジメチルスルホキシド又はテトラヒドロフランを含む群から選択され，好ましくはイソプロピルアルコールである水混和性極性溶媒との混合物の存在下でエステル化することを特徴とする請求項５〜７いずれか１項記載の蛍光複合体の調製方法。
【請求項１３】
一般式Vの脂肪酸の活性化を，０℃〜６０℃の範囲の温度で０．５〜２４時間，好ましくは０℃〜２５℃の温度で０．５時間行い，前記ヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体のエステル化を，２２〜２５℃の範囲の温度で０．５〜２時間，好ましくは２時間行うことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記有機塩基の量が，前記ヒアルロン酸又はその塩の二量体当たり２〜６モル当量，好ましくは４モル当量に相当し，
前記置換された又は未置換の塩化ベンゾイルの量が，前記ヒアルロン酸又はその塩の二量体当たり０．２〜２．０モル当量，好ましくは０．６モル当量に相当し，
前記脂肪酸の量が，前記ヒアルロン酸又はその塩の０．２〜２．０モル当量，好ましくは０．６モル当量に相当することを特徴とする請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
前記水と水混和性極性溶媒との混合物中の水の含有量が５０〜８０％v/vの範囲，好ましくは５０％v/vである請求項１２〜１４いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
好ましくは器官又は新生物のインビボイメージングのための，複合体の分布のインビボイメージングのための医薬の用途における使用のための請求項１〜７のいずれか一項の蛍光複合体。
【請求項１７】
静脈内，腹腔内又は皮下適用における使用のための請求項１６記載の蛍光複合体。
【請求項１８】
触診不可能な及び／又は触診可能な腫瘍のインビボイメージングのための用途における使用のための請求項１６記載の蛍光複合体。
【請求項１９】
静脈内，腹腔内投与における使用のための請求項１８の蛍光複合体。
【請求項２０】
蛍光複合体の凝集物及び少なくとも一つ以上の非極性薬剤，好ましくは医薬及び／又はナノ粒子を含む凝集した請求項５〜７いずれか１項記載の蛍光複合体をベースとする組成物。
【請求項２１】
前記医薬が，細胞増殖抑止剤，好ましくはドキソルビシン又はパクリタキセルであることを特徴とする請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記蛍光複合体がＲ１−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１７Ｈ３３である請求項５〜７いずれか１項記載の複合体であり，かつナノ粒子が超常磁性ナノ粒子であることを特徴とする請求項２０記載の組成物。
【請求項２３】
ヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体の重量に対して非極性化合物２〜１５重量％，好ましくは２〜６重量％を含有することを特徴とする請求項２０〜２２いずれか１項記載の組成物。
【請求項２４】
新生物のインビボイメージングのための医薬用途における使用のための請求項２０〜２３いずれか１項記載の組成物。
【請求項２５】
新生物の治療における使用のための請求項２０〜２３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体，疎水化複合体，それらの調製方法及び使用
技術分野
本発明は，インビボ診断可能な式IIIのヘプタメチンインドシアニン染料(Cypate)，又は１−［３−（２−カルボキシエチル）−１，１−ジメチル−５，９ｂ−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イウム−２−イル（クロリド）］−オクタ−１，３，５，７−テトラエニル］−１，１−ジメチル−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］プロパン酸を含むヒアルロン酸又はその塩の蛍光エステル複合体に関する。さらに，疎水化複合体，その調製法，及びインビボイメージング利用及び新生物の治療のための使用が記載されている。
【０００２】
発明の背景
ヒアルロン酸
ヒアルロン酸又はその塩（ＨＡ）は，重要なグリコサミノグリカンの群に属する線状多糖類である。その構造に関しては，それは互いにβ−（１，３）−グリコシド結合によって結合されたＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成る二糖単位の繰り返し（β−（１→４）グリコシド結合）から形成された生体高分子である（式１を参照）。
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式１  ヒアルロン酸
【０００３】
ヒアルロン酸は，非常に親水性で高度に水和された生体高分子として，ナトリウム塩の形態で生理的環境に存在する(Schante C. E; et al., Carbohydr. Polym. 2011, 85 (3), 469-489)。ＨＡは，細胞外マトリックスの構造及び構成に重要な役割を果たし，また，細胞，それらの増殖，分化及び可動性に適切な環境を形成する(D’Este M.; et al., Carbohydr.  Polym. 2014, 108, 239-246; Schante, C. E.; et al., F. Carbohydr. Polym. 2011, 85 (3), 469-489)。ＨＡは，さらに脊椎動物において全ての身体の器官及び柔軟な結合組織の細胞外マトリックスに含まれている(Eenschooten, C.; et al., Carbohydr.  Polym. 2010, 79 (3), 597-605)。
【０００４】
これは，水溶性多糖類の中で，比較的容易に化学修飾を受け，蛍光剤を含む他の化合物との結合に非常に適する生体分子と考えられる。ＨＡの利点はさらに，誘導体を特異的に例えば腫瘍組織に向けるために使用できるいくつかの細胞レセプターの存在である(Garg H. G.; et al., Chemistry and biology of hyaluronan, 1st ed.; Elsevier: Netherlands, 2004)。
【０００５】
インビボ診断
近年，核イメージング，Ｘ線ラジオグラフィー及びコンピュータートモグラフィーと並ぶ非侵襲性の診断に適する方法の一つは，螢光による光学イメージングである。螢光は，特にその比較的高い感度，特異性及びリアルタイムのイメージ獲得(image gaining)のおかげで生体内診断のための有望な方法と考えられる(Ye, Y.; et al.,Bioconjugate Chem. 2008,19(1), 225-234)。蛍光イメージングの利点には，さらに比較的低いコスト，実行可能性，非侵襲性及びイオン化放射線と比較しての安全性がある。この技術は腫瘍治療における検出，診断及び予防のために，さらにまた陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ），ＳＰＥＣＴ(単一光子放射断層撮影)又はＭＲＩ (磁気共鳴画像)を使用するイメージングの臨床適用における複雑な情報を獲得する補完方法としても，非常に大局的である(Ye, Y.; et al., Theranostics 2011, 1, 102-106)。
【０００６】
非侵襲性の診断法の利用において，放射線の組織への透過は吸収特性及び屈折率に大きく依存する(Frangioni, J. V. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003, 7 (5), 626-634)。近赤外線領域（ＮＩＲ）の放射線である６５０〜９００nmの範囲での吸収及び放出波長が最適であると考えらる。可視スペクトルのより短い波長と比較して，これらの波長の放射線はより深く浸透し，また，同時に，内因性の発蛍光団や望ましくない自己蛍光の上昇による吸収が生じない(Kobayashi, H.; et al., Chem.  Rev. 2010, 110, 2620-2640, Luo, S. et al.; Biomaterials 2011, 32 (29), 7127-7138)。
【０００７】
ＮＩＲ蛍光剤
近年，重要な外因性コントラス(contras)剤（造影剤）には，シアニン蛍光染料，スクアリン（squarine）の誘導体，フタロシアニン（phtalocyanines），ポルフィリン及びさらにホウ素−ジピロメテン (BODIPY) (Luo, S.; et al., Biomaterials 2011, 32 (29), 7127-7138)に由来するいくつかの薬剤がある。
【０００８】
イメージングの光学的方法に非常によく使用される薬剤に，シアニン染料がある。構造上，それらは殆ど二つの複素環式構造に関し，これらの複素環のうちの一つが正に荷電した窒素原子を有し，そしてそれらがさらにシアニン蛍光剤の一般式：
X−(CH = CH)n−CH = Y
（式中，Ｘ及びＹは複素環式窒素構造であり，n = １〜３であり，ｎ＝１であれば染料はトリシアニン(tricyanine)に，ｎ＝２であればペンタシアニン(pentacyanine)に，ｎ＝３であればヘプタシアニン(heptacyanine)化合物に含まれる）に示されるように，ポリメチン橋により結合されている。
【０００９】
一般に，ポリメチン橋の長さは，その誘導体の蛍光性の特性を決定する。また，ｎの増加毎に，化合物の吸収と放射の波長が約１００nm高くなる。トリメチン染料に典型的な波長は約５００nm，ペンタメチンについては約６００nm，そしてヘプタメチン誘導体については近赤外線領域の最終的にはリッチな(rich)波長である。波長の深色及び浅色移動は，やはり蛍光染料の吸収及び放射を決定する複素環式構造のタイプによってさらに部分的に影響を受ける(Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2. ed.; Elsevier: United States of America, 2008)。
【００１０】
様々な分子を有するＮＩＲ蛍光剤の複合体
従来は，非特異的イメージング，例えば血液回路及びその精製のためにのみＮＩＲ蛍光剤を単独で使用することが可能であった(Frangioni, J. V.Curr. Opin. Chem. Biol.2003,7(5), 626-634)。ポリメチンシアニン染料は水性環境中で凝集する傾向があり，その結果,それらの蛍光が失われ，従ってインビボ診断においては不利である(US6641798 B2)。前述の蛍光剤はさらに，まさにその回路系(circuit system)における分解の短い半減期(１５０〜１８０秒)により特徴付けられ，これは試験されるターゲット，例えば，腫瘍組織における染料の蓄積を制限し，またこれによりインビボコントラストをも減少させる(Hill T. K. et. al.,  Bioconjug Chem. 2015,; 26(2): 294-303)。ターゲットとなる場所及び組織での造影剤の蓄積をいかに増加させるか，又は水性環境でより良好な溶解度をいかに確保するかの単純で一般的なアプローチは，それらとペプチド，タンパク質，糖類などの群からの適切なリガンドとの結合である(Frangioni, J. V. Curr. Opin.  Chem. Biol. 2003, 7 (5), 626-634)。キャリアポリマー又はナノ粒子への造影剤の複合化は，殆どの場合リンカーによって行なわれる。リンカーは，蛍光を確実にするため(クエンチングを防ぐため)及び／又はシステムの分解可能な状態を確保するために使用すべきである(Frangioni, J. V. Curr. Opin.  Chem. Biol. 2003, 7 (5), 626-634)。この解決法の欠点は，反応がより多くの工程を有しており，それが非常に困難であり，また，入れる薬剤(entering agent)の誘導体化がしばしば使用され，それが生成物の精製の点で不利であるか及び／又は反応中間体の単離が必要であり，それは更に不利であることである。ナノ粒子システムの場合には，リンカーの長さを，造影剤の蛍光クエンチングが生じないように，かつ，造影剤が生体内で検知できるように選ばなければならない(即ち，リンカーはあまり短くあってはならない)(US20110104070)。
【００１１】
特許文献US6641798は，腫瘍の検出及び治療を増強するために調製された生物活性分子(例えばペプチド，タンパク質，抗体，糖類) とシアニン蛍光剤との低分子複合体の一般的な構造を請求している(posts the demands)。インビボ用途で使用される誘導体の重大な欠点はイメージングにおける螢光の短い安定性(約４５分間)である。
【００１２】
文献においては，インビボ診断のための造影剤の観点からＮＩＲ蛍光剤Cypateといくつかの異なるリガンド(アミノ糖類，ペプチド，多糖類)との複合体も記載された。ＮＩＲ蛍光剤Cypate自体の調製は文献WO2002032285に記載されており，さらに改善された合成が刊行物Ye, Y.; et al., Bioconjugate Chem. 2005, 16, 51-61に公表された。インビボ研究のために，Yunpeng Ye.; et al. (Ye, Y.; et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7740-7741)は一つ以上のＤ−（＋）−グルコサミン単糖ユニットが，カルボキシル基上にアミド結合によって結合された多価のプローブを調製した。示されたＮＩＲ蛍光剤は，樹状ポリマーの（dendrimeric）形成の核を形成し，同時に，それはナノ粒子用の発色団として寄与し，その生物分散が非侵襲性の光学的手法を使用して生体内で，そしてその後，生体外で調べられた。この解決法の1つの欠点は，ポリマーが複合化に使用されなかった場合の有機溶媒不存在下での水溶液中の該システムの不溶性である。
【００１３】
腫瘍イメージング用の別のタイプの既知のナノ粒子は，アミド結合を使用して共有結合Cypate，そしてさらにメチオニン及び葉酸を有するスクシニルキトサンをベースとするデュアルターゲットポリマーミセル(a dually targeted polymer micelle)である(Chen, H.; et al., Polym. Chem. 2014, 5, 4734-4746)。この解決法の欠点は，キャリヤー多糖類としてキトサンを使用することであり，キトサンは異物 (body-foreign agent)であることである。別の欠点は，生理学的条件中の天然のキトサンの非常に限定された溶解度であり，従って，天然のキトサンは常に修飾される必要があり，そうでなければ静脈内の適用においてキトサンを使用することが可能ではないであろう。さらに，修飾されたキトサンは，生理学的条件において通常は限定的にしか可溶性でない。その修飾，所望の用途に応じてキトサンの生分解性及び生体適合性の変化をもたらし得る(Balan, V.; et al., European Polymer Journal 2014, 53, 171-188; Dumitriu, S. Polymeric Biomaterials, 2nd ed.; Marcel Dekker, Inc.: United States of America, 2002)。Pluronic F68と，また，シアニン染料(Cy5.5)と結合したキトサンが，腫瘍マウスモデルにおいて蓄積を追跡するために使用された(W. II Choi.; et al.,Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 2015,11, 359-368)。ハーセプチン（herceptin）によるキャリヤーシステムのターゲッッティングなしに，インビボでの腫瘍トラッキングイメージングが可能であったが，１２時間後，ＮＩＲ蛍光強度は増加し続けず，従って，このシステムでは，さらにキャリヤーを追加する必要なしにインビボでインビボ腫瘍疾患を長期的にトラッキングすることが可能にはならないことが想定され得る。短いイメージング時間(適用後最長１〜２日)の同様の欠点は，さらにＮＩＲ染料と他のポリマー及び非ポリマーとの複合体においても知られている(D. Kokuryo; et al., Journal of Controlled Release 2013, 178, 125, Tan X.; et al., Biomaterials 2012, 33, 2230-2239)。
【００１４】
文献では，光学的−放射線イメージングシステム(optical-nuclear imaging system)を形成する目的で，前述の蛍光剤のカルボキシル基の一つに陽イオン金属のキレート化成分をアミド結合で結合させる場合に，Cypateを多機能のイメージングプローブの一部として記載している。Cypateは，特定細胞をターゲットにする目的で環式のＲＧＤペプチドにさらに結合させた (Ye, Y.; et al., Bioconjugate Chem. 2008, 19, 225-234)。このシステムの欠点は，金属陽イオンの存在下で蛍光の状態が変化し，そしてある場合には（Ｆｅ３＋かＣｕ２＋の存在）蛍光の完全なクエンチングに至ることがあり得るということである(Ye, Y.; et al., Bioconjugate Chem.2008, 19, 225-234)。
【００１５】
ヒアルロン酸とＮＩＲ蛍光剤の複合体
出版物Choi K.  (Choi, K. Y.; et al., J. Mater. Chem. 2009, 19 (24), 4102-4107 及び Choi, K. Y.; et al., Biomaterials 2010, 31 (1), 106-114)には，５βーコール酸を用いたヒアルロン酸の疎水化誘導体が記載された。しかしながら，５β−コール酸の作用は，それらの初期段階において大腸癌の発癌を助けることになることがわかった(Baijal, K. P.; et al.,Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 1998, 76(12), 1095-1102)。さらに，ＮＩＲ蛍光剤Cy5.5が，エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド／ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＥＤＣ／ＨＯＢｔ）及びリンカーアジピン酸ジヒドラジドを使用して，ヒアルロン酸のカルボキシル基上に結合された。欠点は多工程合成だけでなく，使用される活性化剤が，ヒアルロナンの望ましくない分子内網状構造(netting)を引き起こすことがあり，そしてそれに対応して最終生成物の溶解度が減少することである(Huerta-Angeles, G.; et al., Carbohydr. Polym. 2014, 111 (13), 883-891)。アミド結合によってCy5.5と複合化させたヒアルロン酸の誘導体が，さらにヒアルロニダーゼ活性のインビボＭＲＩ／光学的検出の組み合わせのためののマルチモーダルプローブを形成する目的で，超常磁性ナノ粒子酸化鉄（ＳＰＩＯＮ）の表面処理に使用された(Lee, D.; et al.,  Macromol. Res. 2011, 19 (8), 861-867)。光学的手法によるインビボ診断に関して，ペンタメチン誘導体の群からの蛍光剤Cy5.5は理想的な選択ではない。ヘプタメチン誘導体とは対照的に，インビボ非侵襲性の診断に推奨されるような高い吸収及び放射波長，即ちペンタメチン誘導体を使用すると典型的な波長に達することはなく，内因性発蛍光団の望ましくない自家蛍光を生成し得る。
【００１６】
シアニンのヘプタメチン誘導体の場合には，市販のＮＩＲの蛍光性IR-783とヒアルロン酸の複合体と，結果としてIR-783-S-Ph-COOHが得られる改変された４ステップ合成が知られており，ここでこの誘導体はアミド結合によってヒアルロン酸に結合されている。この誘導体は，ＨＡのインビボでの薬物動態学，その分解，及び生理的及び病理学的条件における役割のより深い理解の研究のために調製された(Wang, W.; Cameron, A.  G.; Shi, K. Molecules 2012, 17, 1520-1534)。不運にも，この非常に複雑な合成は，経済の観点から，又は非常に低い収量の観点からさらに工業規模へ変換することができない(Wang, W.; Cameron, A. G.; Shi, K. Molecules 2012, 17, 1520-1534)。
【００１７】
この種の蛍光剤の他の代表例に，インドシアニングリーン(ICG)がある。インドシアニングリーン及びポリエチレングリコール(PEG)と結合させたＨＡは水性環境において凝集粒子を作り，光学的手法及び光音響検出を用いた腫瘍のインビボデュアルイメージング(dual imaging)の可能性を有する (Miki, K.; et al.,  Biomacromolecules 2015, 16, 219-227)。インビボでインドシアニングリーンを使用することの大きな不利益は肝胆道(hepatobiliary)毒性及び肝臓によるこの染料の速い除去である(G. R. Cherrick, et al. J. Clinical Investigation, 1960, 39, 592-600)。ＨＡのＮＩＲ蛍光剤による誘導体の欠点は，それらがヒアルロン酸のカルボキシル基に結合する場合に起こるものであり，その結果，生体高分子の本来の負電荷の中和をもたらし，さらに生理的環境中でのＨＡの溶解度に影響を及ぼし得ること，そして結局は細胞受容体によるＨＡの認識を乱すことである(Mero, A.; et al., Carbohydr. Polym. 2010, 79 (3), 597-605)。
【００１８】
発明の要約
前述の先行技術の欠点は，一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体によって克服される。
2019501262.tif 000004
（式中，Ｒ＋はＨ＋，又はＮａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋又はＣａ２＋を含む群から選択される生理学的に許容される塩であり，
Ｒ１は−Ｈ又は式IIのCypate残基であり，ここで〜は，式IIのCypate残基の共有結合の位置であり，
2019501262.tif 000005
少なくとも１つの繰り返し単位において１つのＲ１は式IIのCypate残基であり，ただし該単位に式IIのCypate残基であるＲ１が存在する場合は，該単位における他のＲ１はＨであり，そして
ｎは２〜６２５の範囲の整数である。）
【００１９】
本発明の好ましい実施例によれば，一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体のグルコサミン部分の６位が式IIのCypate残基で置換されている。
【００２０】
CypateＩは活性化後にヒアルロン酸の水酸基に結合され（下記のスキーム１及び２参照），それは，特にヒアルロン酸の生物学的特性を維持する点で，またその生理学的環境における溶解度の点で有利である。本発明の複合体の溶解度は生理学的溶液１００μL当たり１〜３mgである。本発明の蛍光複合体は５７０nm〜７９０nmの範囲で励起され，光を吸収し，６８０nm〜８５０nmの範囲，好ましくは８５０nmの光を発する。
【００２１】
一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の複合体に結合した式IIのCypate残基の置換度は，０．１〜２％，好ましくは１．０％である。ＨＡの構造を著しく変えることなくインビボでの複合体の画像分布(image distribution）を可能にできるので，本発明の複合体におけるCypate残基の置換度は低いのが好ましい。
【００２２】
該複合体の調製自体は，蛍光剤:Cypateの合成，さらに該蛍光剤のカルボキシル基の活性化，そして続いてのヒアルロン酸のエステル化にある。
【００２３】
式IIIのCypate Iのカルボキシル基の活性化は，好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），ホルムアミド又はアセトニトリルを含む群から選択され，より好ましくはＤＭＳＯである非プロトン性極性溶媒中で，Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを用いて行われる（下記のスキーム１を参照）。この活性化は穏やかな反応条件下でも非常に有効であり，そこでは該カルボキシル基とＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）との反応により反応中間体モノ−イミダゾリド(式IVのCypate II)が生じ，該反応は二酸化炭素及びイミダゾールの放出により進む(下記のスキーム１を参照)。該活性化反応は，１０分〜２４時間，好ましくは０．５〜２時間進行する。その反応温度は２０〜６０℃の範囲，好ましくは２２℃〜２５℃の範囲であり得る。
2019501262.tif 000006
スキーム１：ＣＤＩを使用するCypateのカルボキシル基の活性化
【００２４】
ヒアルロン酸自体のエステル化において，スキーム２(Ｒ＋は上記の定義のとおりである)で示されるように，スキーム１のCypateIIからイミダゾールが消失され，そしてヒアルロン酸の少なくとも１つの水酸基と式IVのCypateの間のエステル結合が形成される。
2019501262.tif 000007
スキーム２:活性化されたCypateのヒアルロン酸との反応
【００２５】
該複合体の調製については，好ましくはヒアルロン酸の酸型又は有機溶媒(DMSO)中でのヒアルロン酸の可溶化に使用される他の有機塩，例えばテトラブチルアンモニウム)（ＴＢＡ）(スキーム２)が使用される。所定の反応についてのヒアルロン酸の酸型又は他の有機塩に適する分子量は，５，０００〜２５０，０００g/molの範囲，好ましくは(１０，０００〜３２，０００g/mol)である。ＨＡ又はＨＡ塩の異なる分子量は反応の障害にはならない。さらに，ＣＤＩ（Ｎ，Ｎ’カルボニルジイミダゾール）により活性化されたカルボキシル基を有する蛍光剤の添加によって，非プロトン性極性溶媒中のＨＡの水酸基のエステル化が行われる。この反応は，イミダゾールの形態でその場で生成される有機塩基，又は例えばＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン），Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン，Ｎ−メチルモルホリン，イミダゾール，トリエチルアミン（ＴＥＡ）又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含む群から選択される添加される有機塩基，好ましくはその場で生成されるイミダゾール，及び上記に定義したような極性非プロトン性溶媒の存在下で行われる。この複合体形成の反応は４０℃〜８０℃，好ましくは４０℃〜６０℃，より好ましくは６０℃の温度で，１２〜４８時間，好ましくは２４時間行われる。より綿密な研究は，該蛍光剤によるＨＡの置換度がCypateIの当量に依存し，そしてさらにそれは，１当量の有機塩基の存在によって確実に影響を受け，好ましい組み合わせはCypateI０．５モル当量：ＨＡ１モル当量：Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール０．５モル当量：有機塩基０．５〜３．５モル当量，より好ましくは有機塩基１モル当量であることを明らかにした。従って，Cypate I：ヒアルロン酸又はその塩：Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール：有機塩基の分子比は，反応混合物中で０．５：１：０．５：０．５〜３．５，好ましくはモル比は０．５：１：０．５：１である。有機塩基がその場で生成する場合には，Cypate：ヒアルロン酸又はその塩：Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールのモル比は，０．１：１：０．１５〜０．７：１：０．８，好ましくは０．５：１：０．５であることが適用される。
【００２６】
好ましくは一般式Ｉのヒアルロナンとヘプタメチンインドシアニン蛍光剤（即ちCypate）の複合体をさらに変化させ，疎水化させた本発明の一般式Ｉの蛍光複合体を形成する。ここで，Ｒ＋，Ｒ１及びｎは上記で定義したとおりであり，同時に，少なくとも１つの繰り返し単位において，少なくとも１つのＲ１はＣ（＝Ｏ）Ｒ２であり，ここでＲ２はＣｘＨｙ置換基であり，ｘは５〜１７の範囲中の整数で，ｙは１１〜３５の範囲中の整数であり，それは直鎖又は分岐した，飽和又は不飽和のＣ６−Ｃ１８脂肪鎖である。
【００２７】
一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の複合体において置換基−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２  の置換度は１〜７０％，好ましくは５〜１２％である。本発明の疎水化された蛍光複合体は５７０nm〜７９０nmの範囲の波長で励起され，光を吸収し，６８０〜８５０nmの範囲，好ましくは８５０nmの光を発する。
【００２８】
Ｃ６−Ｃ１８アシル鎖は，ＨＡの少なくとも一つの水酸基にエステル結合により結合された脂肪酸鎖である。それは，好ましくはエステル化に一般に適している第一水酸基に結合する（スキーム３を参照）。脂肪酸は短い（ＳＣＦＡ），中間（ＭＣＦＡ），又は長い（ＬＣＦＡ）脂肪鎖を有することができる。また，それは必須又は非必須である。
一般式V  Ｒ２ＣＯＯＨ    (V)
（Ｒ２は上記で定義したとおり）の脂肪酸の活性化は，例えば一般式VI
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（式中，Ｒ３はＨ, −ＮＯ２，−ＣＯＯＨ，ハロゲン化物，Ｃ１−Ｃ６アルキルアルコキシを含む群から選択され，好ましくはＨである１つ以上の置換基である）の置換又は未置換塩化ベンゾイルによって，例えばＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン，Ｎ−メチルモルホリン，トリエチルアミン（ＴＥＡ），Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含む群から選択される有機塩基，好ましくはＴＥＡの存在下で行なわれる。活性化の例はスキーム３Ａに示される。反応環境はイソプロピルアルコール（ＩＰＡ），テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）からなる群から選択される極性溶媒，好ましくはイソプロピルアルコールにより作られ，一般式VII
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（Ｒ２及びＲ３は上記で定義したとおりである）
の反応性無水物が形成され，これにより本発明の一般式Ｉのヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体がエステル化される（例えばスキーム３Ｂに示される）。
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スキーム３（Ａ）  脂肪酸のカルボキシル基の活性化。（Ｂ）  ヒアルロナンと飽和又は不飽和脂肪酸の蛍光複合体の疎水化。ｎ及びＲ２の定義は上記のとおりである。
【００２９】
エステル化は，水と水混和性の極性有機溶媒，例えばイソプロピルアルコール（ＩＰＡ），ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），又はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ），好ましくはイソプロピルアルコールとの混合物中で，脂肪酸の活性化されたカルボキシル基を用いて行われる。このエステル化は，水含有量が５０〜８０％v/vの範囲，好ましくは５０％v/vの水と水混和性の極性溶媒との混合物中で行われる。
【００３０】
該反応はまた，有機塩基，好ましくは例えばＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン，Ｎ−メチルモルホリン，イミダゾール，トリエチルアミン（ＴＥＡ），又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含む群から選択されるアミン，より好ましくは，トリエチルアミンの存在下で行われる。本発明の疎水化複合体の調製法において，一般式Ｖの脂肪酸の活性化は，０℃〜６０℃の範囲の温度で０．５〜２４時間，好ましくは０℃〜２５℃の温度で０．５時間行われ，そしてヒアルロン酸又はその塩の蛍光複合体のエステル化は，室温で，即ち２２〜２５℃の範囲の温度で，０．５〜２時間，好ましくは２時間行なわれる。
【００３１】
本発明の疎水化複合体の調製法の好ましい実施態様によれば，有機塩基の量はヒアルロン酸又はその塩の二量体当たり２〜６モル当量，好ましくは４モル当量に相当する。置換された又は未置換の塩化ベンゾイルの量は，ヒアルロン酸又は塩の二量体当たり０．２〜２．０モル当量，好ましくは０．６モル当量に相当する。脂肪酸の量は，ヒアルロン酸又はその塩の二量体当たり０．２〜２．０モル当量，好ましくは０．６モル当量に相当する。より綿密な研究により，本発明のヒアルロン酸又はその塩の疎水化複合体の脂肪酸による置換度は，活性化された脂肪酸の当量に依存し，そしてさらに有機塩基の存在によって確実に影響を受ける。
【００３２】
好ましくは，本発明の一般式Ｉのヒアルロナンとヘプタメチンインドシアニン蛍光剤（Cypate）との疎水化複合体は，非極性薬剤(nonpolar agent)，好ましくは医薬品又は疎水性表面を有するナノ粒子のカプセル封入（非共有結合）に使用することができる。該疎水化複合体は，凝集して，それらの挙動を有するポリマーミセルと類似したシステムを形成することができる。従って，本発明の凝集した疎水化蛍光複合体をベースとして，疎水化蛍光複合体の凝集物と，少なくとも一つ以上の非極性薬剤，好ましくは医薬品，より好ましくは細胞増殖抑止剤，最も好ましくはドキソルビシン又はパクリタキセル，及び／又はナノ粒子，好ましくは超常磁性ナノ粒子（即ちＳＰＩＯＮ）を含む組成物が形成される。ＳＰＩＯＮは好ましくは組成中の鉄の量が０．３〜３重量％好ましくは１〜１．５重量％である酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３，Ｆｅ３Ｏ４）をベースとする。超常磁性ナノ粒子の大きさは４〜６nm，好ましくは５nmである。好ましい実施態様では，該組成物は，Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１７Ｈ３３である本発明の凝集した疎水化蛍光複合体と，ナノ粒子，好ましくは酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３，Ｆｅ３Ｏ４）をベースとする超常磁性のナノ粒子を含む。そのような組成物は好ましくはさらに細胞増殖抑止剤，好ましくはドキソルビシン又はパクリタキセルを含むことができる。
【００３３】
本発明の別の実施態様によれば，該組成物は，本発明のヒアルロン酸又はその塩の疎水化蛍光複合体の質量に対して非極性薬剤を２〜１５重量％，好ましくは２〜６重量％を含有する。
【００３４】
本発明の組成物は，腫瘍のインビボイメージングのための，又は腫瘍の治療のための医薬の用途に使用することができる。
【００３５】
これまでに記載されたヒアルロン酸とシアニン蛍光剤の複合体の調製方法と比較して，本発明に記載された複合体の調製法はいくつかの利点をもたらす。刊行物に記載された技術とは対照的に，それはリンカーもヒアルロン酸又は蛍光剤の予めの修飾も使用しない直接合成に関する。活性化中には，毒性がなく容易に反応混合物から取り除くことができるイミダゾール及びＣＯ２の放出が生じる。イミダゾールの放出は，さらに複合体の調製において，その場で生成される有機塩基として使用することができ，従って反応の進行に必要な他の有機塩基として添加する必要がない。ヒアルロン酸のエステル化は有機溶媒，例えばＤＭＳＯ中で進行する。Cypateの活性化剤はＣＤＩである。ＣＤＩは中間体の単離の必要なしにCypateのＨＡへの複合化に使用することができる。この場合の利点は，ＨＡの第２の水酸基が保護されていない場合にさえＨＡの第一水酸基の選択的な修飾が起こり，また，ＤＭＳＯ中でのＨＡの酸化のような望ましくない反応（Pfitzner-Moffatt反応）が生じないことである。
【００３６】
Cypateの構造は２つの官能性カルボキシル基を含んでいるが，驚くべきことに，最終生産物の溶解度の減少をもたらすＨＡの蛍光複合体の網状構造は生じない（図３〜図５を参照）。
【００３７】
同様のＨＡのエステル誘導体は，他の方法，又は塩化ベンゾイル（ＢＣ）及び２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド（ＴＢＣ）のような活性化剤を用いて得るのは容易ではない(WO2014082609)。また，発色団（Cypate）の分解及び蛍光特性の損失を導くので，カルボキシル基を活性化することができるエチルクロロホルミエート（ethyl chloroformiate）(WO2012034544)も使用することができない。有機溶媒中のヒアルロナンのカルボキシル基の別の活性化剤として，ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）がしばしば使用されているが，その大きな欠点はこれが強いアレルゲンとして指摘されており(Derm Beruf. Umwelt. 1986; 34(4):110-1.)，毒性が高いことである(Macrom. Rapid Commun. 2004, 25, 916-920)。
【００３８】
本発明の一般式Ｉのヒアルロン酸とCypateの複合体，及びその疎水化複合体は，好ましくは５７０nm〜７９０nmの範囲で励起することができ，６８０〜８５０nmで発光し，従って，本発明の複合体の分布のインビボイメージングのため，好ましくは例えば肝臓，皮膚を含む群から選択される器官のインビボイメージングのため；又は静脈内，腹腔内又は皮下適用後の腫瘍のイメージングのための医薬の用途に使用するのに適している。
【００３９】
これらの複合体は，静脈内又は腹腔内投与の後に腫瘍組織（つまり新生物）の中に，好ましくは触診可能な腫瘍，及び／又は非常に小さな（触診不可能な）腫瘍の中に浸透することができ，従って，疾病，特に腫瘍疾患の診断に対するイメージングに適している。ペンタメチン化合物と比較して，ヒアルロナンのヘプタメチンシアニン複合体は蛍光性の特性，特に放射浸透（radiation penetration）がより深く，また望ましくない自己蛍光のさらなる制限に関して有利である。腫瘍疾患の診断は，好ましくは低分子のヒアルロナンを選択的に取り込む腫瘍組織（例えばより高いＣＤ４４の発現を有する組織）に適用可能である。本発明の疎水化複合体の溶解度は，生理食塩水１００μl当たり１〜３mgである。
【００４０】
本発明の疎水化複合体は，蛍光特性の点で非常に安定であり，静脈内投与後少なくとも１５日間複合体の再投与の必要なしに好ましくイメージングできる。本発明の複合体は，小さな（触診による検出不可能な）腫瘍にさえ非常に容易に集まる。本発明の疎水化複合体の別の利点は，抗癌剤（細胞増殖抑止剤）との非共有結合の可能性，そしてそれによるセラノスティクス，即ち診断・治療の機能を同時に備えたキャリヤーの構築のための使用である。セラノスティクスとしての本発明の疎水化複合体の主な利点は，腫瘍組織（特に乳房腫瘍中）に蓄積する能力の使用，長期イメージング，及び腫瘍の治療自体への利用である。
【００４１】
用語の定義：
Cypateは，一般式IIIの構造（CypateＩ），又は１−［３−（２−カルボキシエチル）−１，１−ジメチル−５，９ｂ−ジヒドロベンゾ［ｅ］インドール−３−イウム−２−イル（クロリド）］−オクタ−１，３，５，７−テトラエニル］−１，１−ジメチル−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］プロパン酸，ヘプタメチンインドシアニン染料を含む。
ＳＳ＝置換度＝ヒアルロナン二糖単位１００個あたりのヒアルロナンの修飾された二糖単位のパーセンテージ（１００％は，ヒアルロナンの二糖単位１００個あたり１００個の修飾単位が検出されたことを示す）。
用語「室温」は，２２〜２５℃の範囲の部屋の温度を意味する。
当量（eqv.）は，ヒアルロン酸の二量体に関し，特記しない限りモル当量を意味する。
結合能力は，特記しない限り，重量百分率で表した結合された薬剤の量である。
用語「非極性薬剤」は，荷電が対称分布した化合物を意味する。それは，有機溶媒，特にアルコールに可溶で水に不溶性の薬剤を指す。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）複合体ＨＡ-Cypate。
【図２】ＤＯＳＹ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ）複合体ＨＡ-Cypate。
【図３】SEC-MALLS(ＨＡ-Cypate 14,000g/mol)複合体ＨＡ-Cypate（実施例３）のクロマトグラム記録。
【図４】SEC-MALLS(ＨＡ-Cypate 14,000g/mol)複合体ＨＡ-Cypate（実施例７）のクロマトグラム記録。
【図５】SEC-MALLS(ＨＡ-Cypate 58,000g/mol)複合体ＨＡ-Cypate（実施例８）のクロマトグラム記録。
【図６】SEC-MALLS(ＨＡ-Cypate 72,000g/mol)複合体ＨＡ-Cypate（実施例９）のクロマトグラム記録。
【図７】６５０，６６０，６６５及び６７０nmでの励起における水溶液中の複合体ＨＡ-Cypateの螢光の発光スペクトル。
【図８】フィルタートランスミッティングなしでのλ＝６３２．８nmのレーザーでの励起による（左パネル），λ＝６３５nmを超えるフィルタートランスミッティング波長と組み合わせた（右パネル）水溶液中の複合体の蛍光発光。
【図９】インビボ蛍光イメージング：ＨＡ-Cypate皮下適用。適用の場所は文字Ｓで示されている。図は，異なる励起及び放射フィルターを使用した発光の検出を示す。
【図１０】ＨＡ-Cypateの腹腔内適用後のインタイム(in time)インビボ蛍光イメージング。
【図１１】ＨＡ-Cypate-C18:1の静脈内投与後のインタイム(in time)インビボ蛍光イメージング。
【図１２】ＨＡ-Cypate-C18:1の静脈内適用後のインタイム(in time)インビボ蛍光イメージング(腫瘍を有するマウス，化学発光ルシフェラーゼで示された腫瘍細胞)。
【図１３】(i)ＨＡ-Cypate-C18:1(=ＨＡ cyp)，(ii)ＨＡ-Cypate-C18:1+ドキソルビシン(=ＨＡ cyp dox)，(iii)ＨＡ-Cypate-C18:1+ドキソルビシン+spion(=ＨＡ cyp dox+spions)の投与の後の腫瘍のインビボルミネセンスの評価。
【図１４】(i)ＨＡ-Cypate-C18:1(=ＨＡ cyp)投与後，(ii)ＨＡ-Cypate-C18:1+ドキソルビシン(=ＨＡ cyp dox)投与後，(iii)ＨＡ-Cypate-C18:1+ドキソルビシン+spion(=ＨＡ cyp dox+spions) 投与後の脾臓及び肝臓の重量の比較。
【図１５】ＨＡ-Cypate-C18:1(発光ルシフェラーゼで示された腫瘍と腫瘍細胞を備えたマウス)の腹腔内適用後のインタイムインビボ蛍光イメージング。
【図１６】ヒアルロナンリアーゼによる複合体ＨＡ-Cypateの酵素分解により得られた二量体ＨＡ-Cypateの質量スペクトル。
【００４３】
本発明の実施態様の実施例
器具の説明
ＮＭＲスペクトルは５００．１３MHz（１Ｈ）の周波数でBRUKER AVANCE 500に記録した。実験データの処理については，Bruker TOPSPIN 1.2によるソフトウェア又はソフトウェアSpinWorks 3.1を使用した。ＮＭＲ分析からのスペクトルの解釈については，略語：ｓ（シングレット），ｄ（ダブレット），ｔ（トリプレット），ｍ（マルチプレット）を用いた。波長領域１９０〜８００nmのＵＶ／Ｖｉｓスペクトル測定については，ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計Varian Cary 100を使用した。蛍光スペクトルは装置PTI Quantamaster 400に記録した。CypateのＥＳＩ−ＭＳ分析は，エレクトロスプレーのイオン化源及び四重極型質量分析計を備えた，イオントラップを有する質量分光光度計amazon X(BrukerDaltonics)で行った。測定は正及び負のモードで行った。ＨＡ-Cypate複合体の構造は，ヒアルロナンリアーゼによる酵素開裂の後の該複合体のＬＣ−ＭＳ分析を用いて確認された。オリゴ糖類の混合物は，カラムKinetex 1.7 um F5 100A(Phenomenex)でＨ２Ｏ及びアセトニトリル中の勾配０．１%ＨＣＯＯＨを用いて分離した。検出は，エレクトロスプレーによるイオン化を用いる負の分解モードでのSynapt G2-Si上で行なわれた。最初のヒアルロナンのサンプル及び質量分析は，UV/VIS 2489及び屈折率測定検出器RID2414及び光散乱検出器miniDAWN TREOSによりSEC-MALLS法(HPLC Alliance)を使用して測定した。データはソフトウェアAstraバージョン5.3.4.20(Wyatt Technology Europe GmbH)を使用して処理された。インビボイメージング分析は全て，装置IVIS Luminia XRシリーズIIIにより，Balb/c系実験室マウスについて行った。
【００４４】
実施例１：３−（２−カルボキシエチル）−１，２，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−ブロミドの合成
２．０g(９．６ミリモル)の１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンズインドール及び２．２g(１４．３ミリモル)の３−ブロモプロパン酸を１０mlの１，２−ジクロロベンゼンに溶解し，常時撹拌しながら１１５℃で１６時間加温した。，粗反応混合物を，室温に冷却し，結果として生じた沈殿を，１，２−ジクロロメタン（１０×５０ml）で洗浄した。最終生産物を濾過により分離し，ロータリーエバポレータ(RE)で真空下で乾燥させ，それは淡い灰色の結晶粉末の形態で得られた(収量２．２g(６４%))。
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.38 (d, J = 8.35, 1Harom), 8,29 (d, J = 9.00, 1Harom), 8.23 (d, J = 8.35, 1Harom), 8.18 (d, J = 9.00, 1Harom), 7.80- 7.71 (m, 2Harom), 4.79 (t, J = 6.95, 2H, -CH2-), 3.05 (t, J = 6.95, 2H, -CH2-), 2.98 (s, 3H,    -CH3), 1.76 (s, 6H,-CH3) ppm 
ESI-MS: +MS [M]+= 282
【００４５】
実施例２：Cypateの調製
０．８ｇ（２．８ミリモル)のグルタコン酸ジアルデヒドジアニリン（dianiline）塩酸塩を８mlの１，２−ジクロロメタンに溶解し０〜５℃に調節した。少量の２−ジクロロメタン(dichlormethan)(0.5ml)中の無水酢酸５２１μl（５．５ミリモル）及び４８１μl（２．８ミリモル）及びＤＩＰＥＡを該溶液へ滴加し，該反応混合物を冷却及び撹拌しながら放置し，３時間反応させた。一方，１５mlの量の溶剤アセトニトリル／常水９５／５の混合物中の実施例１で調製された３−（２−カルボキシエチル）−１，２，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムブロミド２g（５．５ミリモル），酢酸ナトリウム０．９g（１１．０ミリモル)を還流させ，最初の反応混合物を滴下した。その反応は暗所で還流下で１８時間進行させた。粗反応混合物を，酢酸エチル４００ml及び１ＭのＨＣｌ４００mlで洗浄し，室温に冷却し，生成物を濾過し，減圧下で乾燥させた。結果として生じる生成物は，１．６２ｇ（８８％）の収量の濃緑色の結晶粉末の形態で得られた。
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.25 (d, J = 8.75, 2H), 8.07-7.97 (m, 6H), 7.82 (t, J = 12.65, 1H), 7.73 (d, J = 8.75, 2H), 7.69 -7.62 (m, 2H), 7.54 -7.48 (m, 2H), 6.60 (t, J = 12.65, 2H), 6.47 (d, J = 13.75, 2H), 4.43 (bt, 4H -CH2-), 2.77 (t, J = 6.9, 4H -CH2-), 1.92 (s, 12H -CH3) ppm
ESI-MS: +MS [M]+= 625; -MS [M-2H]-= 623 m/z
UV/Vis: λabs.max= 782 nm (MeOH)
【００４６】
実施例３：複合体ＨＡ-Cypateの調製
実施例２からのCypate８７mg（０．１３ミリモル，０．５当量）を２mlのＤＭＳＯに溶解し，２２mg（０．１３ミリモル，０．５当量）のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを添加し，常時撹拌しながら室温で二時間活性化させた。一方，１００mg（０．２７ミリモル，１当量）の酸形態のヒアルロン酸Mv１４，０００g/molをＤＭＳＯに６０℃で溶解させた。その後，１５μl(０．１３ミリモル，０．５当量)のＮ−メチルモルホリン及び前もって単離していない最初の反応混合物を該溶液に添加した。その反応は６０℃で暗所で常時撹拌下で２４時間進行した。所望の生成物の析出が生じた時，反応混合物の初期量の１０倍の体積の１００％イソプロピルアルコール(ＡＩＰＡ)及びＮａＣｌの飽和溶液の添加により反応を停止させた。その粗生成物を５×１００ml ＡＩＰＡで精製し，５０mlの脱イオン水に溶かし，透析管へ移した。ＨＡのプロトン型を，第一日目にＮａＣｌの０．５％溶液及び０．５％ＮａＨＣＯ３中で中和し，さらに第二日目及び第三日目に脱イオン水中で透析を行った。管の内容物を冷凍し凍結乾燥した。生じたヒアルロナン型生成物は，重量８９mg（８７％）の緑色の凍結乾燥体として得られた。
1H NMR (D2O) (Fig. 1): cypate: δ 8.80 (s, 2H), 8.50-8.47 (m, 2H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.29 -8.19 (m, 2H), 8.16-8.10 (m, 2H), 8.08 -7.89 (m, 2H), 7.88-7.81 (m, 2H), 7.79-7.73 (m, 2H), 7.58 (s, 2H), 7.51-7.46 (m, 2H), 5.16, - 5.14 (m, 4H), 3.14-3.09 (m, 4H), 2.02 (12H, CH3, ＨＡのシグナルとの重なり), HA: δ 4.62-4.39 (m, 2H アノマー), 4.01-3.28 (m, 10H 骨格の(skeletal)), 2.02 (s, 3H, -CH3) ppm
DOSY (D2O): (図２)
SS = 1.5 % (1H NMRから測定)
SEC-MALLS-LS-UV/Vis-RI: (図３)
蛍光光度計: λem.max= 695 nm (at λexc.. = 665 nm; H2O); (図７)
波長λ= 632.8 nmのレーザー光で励起された複合体の蛍光（図８）
ESI-MS: [M-H]-= 984 m/z （図１６，複合体のリアーゼによる酵素分解の後に検出された二量体）
【００４７】
実施例４：複合体ＨＡ-Cypateの調製
実施例２からのCypate ８７mg（０．１３ミリモル，０．５当量）を２mlのＤＭＳＯに溶解し，２２mg（０．１３ミリモル，０．５当量）のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを添加し，常時撹拌しながら室温で３０分間活性化させた。ＤＭＳＯ中の６０℃の酸形態のヒアルロン酸（Mv１４，０００g/mol）１００mg（０．２７ミリモル，１当量）を添加した。その反応は６０℃で暗所で常時撹拌下で２４時間進行した。反応混合物の初期量の１０倍の体積の１００％イソプロピルアルコール(ＡＩＰＡ)及びＮａＣｌの飽和溶液の添加により該反応を停止させると，所望の生成物の析出が生じた。その粗生成物を５×１００ml のＡＩＰＡで精製し，５０mlの脱イオン水に溶かし，透析管へ移した。ＨＡのプロトン型を，第一日目にＮａＣｌの０．５％溶液及び０．５％ＮａＨＣＯ３中で中和し，さらに第二日目及び第三日目に脱イオン水中で透析を行った。管の内容物を冷凍し凍結乾燥した。生じたヒアルロナン型生成物は，重量８９mg（８７％）の緑色の凍結乾燥体として得られた。
1H NMR (D2O) (Fig. 1): cypate: δ 8.80 (s, 2H), 8.50-8.47 (m, 2H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.29 -8.19 (m, 2H), 8.16-8.10 (m, 2H), 8.08-7.89 (m, 2H), 7.88-7.81 (m, 2H), 7.79-7.73 (m, 2H), 7.58 (s, 2H), 7.51-7.46 (m, 2H), 5.16, - 5.14 (m, 4H), 3.14-3.09 (m, 4H), 2.02 (12H, CH3, ＨＡのシグナルとの重なり), HA: δ 4.62-4.39 (m, 2H アノマー), 4.01-3.28 (m, 10H 骨格の), 2.02 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 1 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max= 695 nm (at λexc.. = 665 nm; H2O)
【００４８】
実施例５：複合体ＨＡ-Cypateの調製
実施例２からのCypate １７mg（０．０３ミリモル，０．１当量）を１mlのＤＭＳＯに溶解し，６mg（０．０４ミリモル，０．１５当量）のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを添加し，常時撹拌しながら室温で３０分間活性化させた。ＤＭＳＯ中の１００mg（０．２７ミリモル，１当量）の酸形態のヒアルロン酸Mv１４，０００g/molを６０℃で溶解させた。その反応は６０℃で暗所で常時撹拌下で２４時間進行した。反応混合物の初期量の１０倍の体積の１００％イソプロピルアルコール(ＡＩＰＡ)及びＮａＣｌの飽和溶液の添加により反応を停止させると，所望の生成物の析出が生じた。その粗生成物を５×１００mlのＡＩＰＡで精製し，５０mlの脱イオン水に溶かし，透析管へ移した。ＨＡのプロトン型を，第一日目にＮａＣｌの０．５％溶液及び０．５％ＮａＨＣＯ３中で中和し，さらに第二日目及び第三日目に脱イオン水中で透析を行った。管の内容物を冷凍し凍結乾燥した。生じたヒアルロナン型生成物は，重量９２mg（９０％）の緑色の凍結乾燥体として得られた。
1H NMR (D2O): cypate: δ 8.80 (s, 2H), 8.50-8.47 (m, 2H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.29-8.19 (m, 2H), 8.16-8.10 (m, 2H), 8.08-7.89 (m, 2H), 7.88-7.81 (m, 2H), 7.79-7.73 (m, 2H), 7.58 (s, 2H), 7.51-7.46 (m, 2H), 5.16, - 5.14 (m, 4H), 3.14-3.09 (m, 4H), 2.02 (12H, CH3, ＨＡのシグナルとの重なり), HA: δ 4.62-4.39 (m, 2H アノマー), 4.01-3.28 (m, 10H 骨格の), 2.02 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 0.7 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 695 nm (at λexc.. = 665 nm; H2O)
【００４９】
実施例６：複合体ＨＡ-Cypateの調製
実施例２からのCypate １２２mg（０．１９ミリモル，０．７当量）を１mlのＤＭＳＯに溶解し，３４mg（０．２１ミリモル，０．８当量）のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを添加し，常時撹拌しながら室温で３０分間活性化させた。ＤＭＳＯ中の１００mg（０．２７ミリモル，１当量）の酸形態のヒアルロン酸Mv１４，０００g/molを６０℃で溶解させた。その反応は６０℃で暗所で常時撹拌下で２４時間進行した。反応混合物の初期量の１０倍の体積の１００％イソプロピルアルコール(ＡＩＰＡ)及びＮａＣｌの飽和溶液の添加により反応を停止させると，所望の生成物の析出が生じた。その粗生成物を５×１００ml ＡＩＰＡで精製し，５０mlの脱イオン水に溶かし，透析管へ移した。ＨＡのプロトン型を，第一日目にＮａＣｌの０．５％溶液及び０．５％ＮａＨＣＯ３中で中和し，さらに第二日目及び第三日目に脱イオン水中で透析を行った。管の内容物を冷凍し凍結乾燥した。生じたヒアルロナン型生成物は，重量８５mg（８８％）の緑色の凍結乾燥体として得られた。
1H NMR (D2O): cypate: δ 8.80 (s, 2H), 8.50-8.47 (m, 2H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.29-8.19 (m, 2H), 8.16-8.10 (m, 2H), 8.08-7.89 (m, 2H), 7.88-7.81 (m, 2H), 7.79-7.73 (m, 2H), 7.58 (s, 2H), 7.51-7.46 (m, 2H), 5.16, - 5.14 (m, 4H), 3.14-3.09 (m, 4H), 2.02 (12H, CH3, ＨＡのシグナルとの重なり), HA: δ 4.62-4.39 (m, 2H アノマー), 4.01-3.28 (m, 10H 骨格の), 2.02 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 1.3 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 695 nm (at λexc.. = 665 nm; H2O)
【００５０】
実施例７：複合体ＨＡ-Cypateの調製
実施例２からのCypate ８７mg（０．１３ミリモル，０．５当量）を２mlのＤＭＳＯに溶解し，２２mg（０．１３ミリモル，０．５当量）のＣＤＩを添加し，常時撹拌しながら室温で二時間活性化させた。一方，１００mg（０．２７ミリモル，１当量）の酸形態のヒアルロン酸Mv１４，０００g/molをＤＭＳＯに６０℃で溶解させた。その後，１３８μl(０．７９ミリモル(３当量)のＤＩＰＥＡ及び最初の反応混合物を該溶液に添加した。その反応は６０℃で暗所で常時撹拌下で２４時間進行した。
反応混合物の初期量の１０倍の体積の ＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加により反応を停止させると，所望の生成物の析出が生じた。その粗生成物を５×１００ml ＡＩＰＡで精製し，５０mlの脱イオン水に溶かし，透析管へ移した。ＨＡのプロトン型を，第一日目にＮａＣｌの０．５％溶液及び０．５％ＮａＨＣＯ３中で中和し，さらに第二日目及び第三日目に脱イオン水中で透析を行った。管の内容物を冷凍し凍結乾燥した。生じたヒアルロナン型生成物は，重量８６mg（８４％）の凍結乾燥体として得られた。
1H NMR (D2O): cypate: δ 8.81 (s, 2H), 8.50-8.47 (m, 2H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.29-8.19 (m, 2H), 8.16-8.10 (m, 2H), 8.08-7.89 (m, 2H), 7.88-7.81 (m, 2H), 7.79-7.73 (m, 2H), 7.58 (s, 2H), 7.51-7.46 (m, 2H), 5.16, - 5.14 (m, 4H), 3.14-3.09 (m, 4H), 2.03 (12H, CH3, ＨＡのシグナルとの重なり), HA: δ 4.62-4.38 (m, 2H アノマー), 4.01-3.26 (m, 10H 骨格の), 2.03 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 1.5 % (1H NMRから測定)
SEC-MALLS-LS-UV/Vis-RI: (図４)
蛍光光度計: λem.max = 695 nm (at λexc.max = 665 nm; H2O)
【００５１】
実施例８：複合体ＨＡ-Cypateの調製
実施例２からのCypate ８７mg（０．１３ミリモル，０．５当量）を２mlのＤＭＳＯに溶解し，２２mg（０．１３ミリモル，０．５当量）のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを添加し，常時撹拌しながら室温で２時間活性化させた。ＤＭＳＯ中の１００mg（０．２７ミリモル，１当量）の酸形態のヒアルロン酸Mv（５．８ｘ１０４g/mol）を６０℃で溶解させた。その後，１５μl（０．１３ミリモル，０．５当量）のＮ−メチルモルホリン及び前もって精製していない最初の反応混合物を該溶液に添加した。その反応は６０℃で暗所で常時撹拌下で２４時間進行した。反応混合物の初期量の１０倍の体積のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加により反応を停止させると，所望の生成物の析出が生じた。その粗生成物を５×１００ml ＡＩＰＡで精製し，５０mlの脱イオン水に溶かし，透析管へ移した。ＨＡのプロトン型を，第一日目にＮａＣｌの０．５％溶液及び０．５％ＮａＨＣＯ３中で中和し，さらに第二日目及び第三日目に脱イオン水中で透析を行った。管の内容物を冷凍し凍結乾燥した。生じたヒアルロナン型生成物は，重量９５mg（９３％）の緑色の凍結乾燥体として得られた。
1H NMR (D2O): cypate: δ 9.2 (m, 2H), 8.82-8.77 (m, 2H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.29-8.19 (m, 2H), 8.16-8.10 (m, 2H), 8.08-7.89 (m, 2H), 7.89-7.81 (m, 2H), 7.79-7.73 (m, 2H), 7.58 (s, 2H), 7.51-7.46 (m, 2H), 5.16, - 5.14 (m, 4H), 3.14-3.09 (m, 4H), 2.03 (12H, CH3, ＨＡのシグナルとの重なり), HA: δ 4.64-4.38 (m, 2H アノマー), 4.04-3.21 (m, 10H 骨格の), 2.03 (s, 3H, -CH3) ppm
[SS = 1.0 % (1H NMRから測定)
SEC-MALLS-LS-UV/Vis-RI: (図５)
蛍光光度計: λem.max = 695 nm (at λexc. = 665 nm; H2O))
【００５２】
実施例９：複合体ＨＡ-Cypateの調製
実施例２からのCypate ８７mg（０．１３ミリモル，０．５当量）を２mlのＤＭＳＯに溶解し，２２mg（０．１３ミリモル，０．５当量）のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを添加し，常時撹拌しながら室温で２時間活性化させた。１００mg（０．２７ミリモル，１当量）の酸形態のヒアルロン酸Mv（７．２ｘ１０４g/molをＤＭＳＯに６０℃で溶解させた。その後，１５μl（０．１３ミリモル，０．５当量）のＮ−メチルモルホリン及び最初の反応混合物を該溶液に添加した。その反応は６０℃で暗所で常時撹拌下で２４時間進行した。
反応混合物の初期量の１０倍の体積のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加により反応を停止させると，所望の生成物の析出が生じた。その粗生成物を５×１００ml の１００％ＡＩＰＡで精製し，５０mlの脱イオン水に溶かし，透析管へ移した。プロトン型(protonized form)のＨＡを，第一日目にＮａＣｌの０．５％溶液及び０．５％ＮａＨＣＯ３中で中和し，さらに第二日目及び第三日目に脱イオン水中で透析を行った。管の内容物を冷凍し凍結乾燥した。生じたヒアルロナン型生成物は，重量９６mg（９４％）の凍結乾燥体として得られた。
1H NMR (D2O): cypate: δ 9.2 (m, 2H), 8.83-8.5 (m, 2H), 8.45-8.43 (m, 2H), 8.30-8.18 (m, 2H), 8.16-7.99 (m, 2H), 7.99-7.89 (m, 2H), 7.89-7.81 (m, 2H), 7.79-7.73 (m, 2H), 7.58 (s, 2H), 7.51-7.46 (m, 2H), 5.16, - 5.14 (m, 4H), 3.14-3.09 (m, 4H), 2.03 (12H, CH3, ＨＡのシグナルとの重なり), HA: δ 4.64-4.38 (m, 2H アノマー), 4.04-3.21 (m, 10H 骨格の), 2.03 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 1.0 % (1H NMRから測定)
SEC-MALLS-LS-UV/Vis-RI: (Fig. 6)
蛍光光度計: λem.max = 695 nm (at λexc. = 665 nm; H2O))
【００５３】
実施例１０：複合体ＨＡ−Cypateの調製
実施例２からのCypate ８７mg（０．１３ミリモル，０．５当量）を２mlのＤＭＳＯに溶解し，２２mg（０．１３ミリモル，０．５当量）のＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを添加し，常時撹拌しながら室温で２時間活性化させた。１００mg（０．２７ミリモル，１当量）の酸形態のヒアルロン酸Mv（２．５ｘ１０５g/molをＤＭＳＯに４０℃で溶解させた。その後，１５μl（０．１３ミリモル，０．５当量）のＮ−メチルモルホリン及び最初の反応混合物を該溶液に添加した。その反応は４０℃で暗所で常時撹拌下で２４時間進行した。
反応混合物の初期量の１０倍の体積のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加により反応を停止させると，所望の生成物の析出が生じた。その粗生成物を５×１００ml ＡＩＰＡで精製し，５０mlの脱イオン水に溶かし，透析管へ移した。ＨＡのプロトン型を，第一日目にＮａＣｌの０．５％溶液及び０．５％ＮａＨＣＯ３中で中和し，さらに第二日目及び第三日目に脱イオン水中で透析を行った。管の内容物を冷凍し凍結乾燥した。生じたヒアルロナン型生成物は，重量９３mg（９２％）の凍結乾燥体として得られた。
1H NMR (D2O): cypate: δ 9.2 (m, 2H), 8.83-8.5 (m, 2H), 8.45-8.43 (m, 2H), 8.30- 8.17 (m, 2H), 8.16-7.99 (m, 2H), 7.99 -7.89 (m, 2H), 7.89-7.81 (m, 2H), 7.79-7.73 (m, 2H), 7.58 (s, 2H), 7.51-7.42 (m, 2H), 5.16, - 5.14 (m, 4H), 3.14-3.09 (m, 4H), 2.03 (12H, CH3, ＨＡのシグナルとの重なり), HA: δ 4.62-4.38 (m, 2H アノマー), 4.01-3.26 (m, 10H 骨格の), 2.03 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 0.5 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 695 nm (at λexc. = 665 nm; H2O)
【００５４】
実施例１１：ヘキサン酸によるＨＡ−Cypateのエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水及び１３mlのＡＩＰＡに溶解し，その後３８２μl（２．２０ミリモル，３当量）のＤＩＰＥＡ及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。１６５μl（１．３２ミリモル，１．８当量）のヘキサン酸を２mlのＡＩＰＡに溶解し，２５５μl（１．４６ミリモル，２当量）のＤＩＰＥＡ１５３μl（１．３２ミリモル，１．８当量）の塩化ベンゾイルを添加し，０℃で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は２３０mg （７３％）であった。
実施例３と比較した1H NMRの更なるシグナル (D2O, 500 MHz): δ 2.4 (m, 2H, αCH2), 1.6 (m, 2H, βCH2), 1.31 (m, 4H, γCH2), 0.8 (m, 3H, -CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 70 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 700 nm (at λexc. = 665 nm; H2O)
【００５５】
実施例１２：ＨＡ−Cypateのパルミチン酸によるエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水に溶解し，その後３０６μl（２．２０ミリモル，３当量）のＴＥＡ及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。一方，３mlのＴＨＦに溶解した９４mg（０．３７ミリモル，０．５当量）のヘキサデカン酸，１５３μl（１．１０ミリモル，１．５当量）のＴＥＡ，４３μl（０．３７ミリモル，０．５当量）の塩化ベンゾイルを添加し，室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３及び０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は１８９mg（６１％）であった。
実施例３に対する1H NMRの更なるシグナル (D2O, 500 MHz): δ 2.76-2.66 (m, 2H, αCH2), 1.64-1.48 (m, 2H, βCH2), 1.31-1.08 (m, 24H, CH2), 0.98-0.78 (m, 3H, -CH2-CH3) ppm 
SS アシル化 = 7 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００５６】
実施例１３：ＨＡ−Cypateのパルミチン酸によるエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体２００mg (０．４９ミリモル，１当量)を１０mlのｄｅｍｉ水に溶解し，その後１３６μl（０．９８ミリモル，２当量）のＴＥＡ及び３mg（０．０２ミリモル，０．０４当量）のＤＭＡＰを添加した。３mlのＴＨＦに溶解した３８mg（０．１６ミリモル，０．３当量）のパルミチン酸，６８μl（０．４８ミリモル，１当量）のＴＥＡ，１７μl（０．１６ミリモル，０．３当量）の塩化ベンゾイルを添加し，室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は７６mg（３７％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル:  δ 2.76-2.66 (m, 2H, αCH2), 1.64-1.48 (m, 2H, βCH2), 1.31-1.08 (m, 24H, CH2), 0.98-0.78 (m, 3H, -CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 5 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００５７】
実施例１４：ＨＡ−Cypateのパルミチン酸によるエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体２００mg (０．４９ミリモル，１当量)を１０mlのｄｅｍｉ水に溶解し，その後２５５μl（１．４７ミリモル，３当量）のＤＩＰＥＡ及び３mg（０．０２ミリモル，０．０４当量）のＤＭＡＰを添加した。３８mg（０．１５ミリモル，０．３当量）のパルミチン酸を３mlのＴＨＦに溶解し，８５μl（０．４〜９ミリモル，１当量）のＤＩＰＥＡ，１７μl（０．１５ミリモル，０．３当量）の塩化ベンゾイルを添加し，室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は９３mg（４５％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル:  δ 2.76-2.66 (m, 2H, αCH2), 1.64-1.48 (m, 2H, βCH2), 1.31-1.08 (m, 24H, CH2), 0.98-0.78 (m, 3H, -CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 5 % (determined from 1H NMR)
蛍光光度計: λem.max = 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００５８】
実施例１５：ＨＡ−Cypateのオレイン酸によるエステル化
実施例３からのＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水及び１３mlのＡＩＰＡに溶解し，その後３０６μl（２．２０ミリモル，３当量）のＴＥＡ及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。２mlのＡＩＰＡに溶解した１８６μl（０．５９ミリモル，０．８当量）のシス−９−オクタデセン酸，３０６μl（２．２０リモル，３当量）のＴＥＡ，６８μl（０．５９ミリモル，０．８当量）の塩化ベンゾイルを添加し，全てを室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は２１０mg（６６％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル:  δ 5.41-5.34 (m, 2H, CH=CH), 2.48-2.40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1.68-1.54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1.40-1.23 (m, 24 H, (-CH2)12), 0.91-0.68 (m, 3H,-CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 10 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 710 nm (atλexc. = 685 nm; H2O)
【００５９】
実施例１６：  ＨＡ-Cypateのオレイン酸によるエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水及び１３mlのＡＩＰＡに溶解し，その後３０６μl（２．２０ミリモル，３当量）のＴＥＡ及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。２mlのＡＩＰＡに溶解した１１６μl（０．３６ミリモル，０．５当量）のシス−９−オクタデセン酸，１５３μl（１．０８ミリモル，１．５当量）のＴＥＡ，４３μl（０．３６ミリモル，０．５当量）の塩化ベンゾイルを添加し，室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は２０５mg（７３％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル:  5.41-5.34 (m, 2H, CH=CH), 2.48-2.40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1.68-1.54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1.40-1.23 (m, 24 H, (-CH2)12), 0.91-0.68 (m, 3H,-CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 8 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００６０】
実施例１７：  ＨＡ-Cypateのオレイン酸によるエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水及び１３mlのＡＩＰＡに溶解し，その後３８２μl（２．２０ミリモル，３当量）のＤＩＰＥＡ及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。２mlのＡＩＰＡに溶解した１３９μl（０．４５ミリモル，０．６当量）のシス−９−オクタデセン酸，２２９μl（１．３２ミリモル，１．８当量）のＤＩＰＥＡ，５１μl（０．４４ミリモル，０．６当量）の塩化ベンゾイルを添加し，０℃で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は２０４mg（６５％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル:  δ 5.41-5.34 (m, 2H, CH=CH), 2.48-2.40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1.68-1.54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1.40-1.23 (m, 24 H, (-CH2)12), 0.91-0.68 (m, 3H,-CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 12 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max.= 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００６１】
実施例１８：  ＨＡ-Cypateのオレイン酸によるエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水及び１１mlのＡＩＰＡに溶解し，その後３０６μl（２．２０ミリモル，３当量）のＴＥＡ及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。２mlのＡＩＰＡに溶解した２３１μl（０．７３ミリモル，１当量）のシス−９−オクタデセン酸，２０４μl（１．４６ミリモル，２当量）のＴＥＡ，８５μl（０．７３ミリモル，１当量）の塩化ベンゾイルを添加し，室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は２２６mg（７０％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル: δ 5.41-5.34 (m, 2H, CH=CH), 2.48-2.40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1.68-1.54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1.40-1.23 (m, 24 H, (-CH2)12), 0.91-0.68 (m, 3H,-CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 12 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max.= 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００６２】
実施例例１９：オレイン酸によるＨＡ-Cypateのエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水及び１１mlのＡＩＰＡに溶解し，その後３７５μl（１．７６ミリモル，２．４当量）のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。２mlのＡＩＰＡに溶解した１３９μl（０．４４ミリモル，０．６当量）のシス−９−オクタデセン酸，３７５μl（１．７６ミリモル，２．４当量）のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン，５１μl（０．４４ミリモル，０．６当量）の塩化ベンゾイルを添加し，室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は２１７mg（７０％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル: δ 5.41-5.34 (m, 2H, CH=CH), 2.48-2.40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1.68-1.54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1.40-1.23 (m, 24 H, (-CH2)12), 0.91-0.68 (m, 3H,-CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 6 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max.= 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００６３】
実施例２０：オレイン酸によるＨＡ-Cypateのエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水及び１１mlのＡＩＰＡに溶解し，その後２４１μl（２．２０ミリモル，３当量）のＮ−メチルモルホリン及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。２mlのＡＩＰＡに溶解した１３９μl（０．４４ミリモル，０．６当量）のシス−９−オクタデセン酸，１９３μl（１．７６ミリモル，２．４当量）のＮ−メチルモルホリン，５１μl（０．４４ミリモル，０．６当量）の塩化ベンゾイルを添加し，室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３，０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は２６４mg（８２％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル: δ 5.41-5.34 (m, 2H, CH=CH), 2.48-2.40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1.68-1.54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1.40-1.23 (m, 24 H, (-CH2)12), 0.91-0.68 (m, 3H,-CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 12 % (1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００６４】
実施例２１：オレイン酸によるＨＡ-Cypateのエステル化
実施例３により調製されたＨＡ-Cypate複合体３００mg (０．７３ミリモル，１当量)を１５mlのｄｅｍｉ水及び１１mlのＡＩＰＡに溶解し，その後２４６mg（２．２０ミリモル，３当量）のＤＡＢＣＯ及び４．５mg（０．０４ミリモル，０．０５当量）のＤＭＡＰを添加した。２mlのＡＩＰＡに溶解した１３９μl（０．４４ミリモル，０．６当量）のシス−９−オクタデセン酸，１４８mg（１．３２ミリモル，１．８当量）のＤＡＢＣＯ，５１μl（０．４４ミリモル，０．６当量）の塩化ベンゾイルを添加し，室温で常時撹拌しながら３０分間反応させた。時間の経過後，全てを最初の反応混合物に定量的に移し，その後室温で２時間エステル化を進行させた。
その反応を高過剰のＡＩＰＡ及びＮａＣｌの飽和溶液の添加によって停止させると，生成物の沈殿が生じた。粗生成物を４×２００mlのＡＩＰＡで洗浄し，さらに脱イオン水に溶解させ，透析管に移した。透析は０．５％のＮａＨＣＯ３及び０．５％のＮａＣｌに対して２４時間，そしてさらに脱イオン水中で４８時間行われた。該生成物は緑色の凍結乾燥体の形態で得られ，収量は１８３mg（６０％）であった。
実施例３に対する1H NMR (D2O, 500 MHz)の更なるシグナル: δ 5.41-5.34 (m, 2H, CH=CH), 2.48-2.40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1.68-1.54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1.40-1.23 (m, 24 H, (-CH2)12), 0.91-0.68 (m, 3H,-CH2-CH3) ppm
SS (アシル化) = 3 % 1H NMRから測定)
蛍光光度計: λem.max = 710 nm (at λexc. = 685 nm; H2O)
【００６５】
実施例２２：  疎水化ＨＡ-Cypateへの非極性化合物の担持
実施例１６によって調製されたＨＡ-Cypateのアシル化複合体１５０mgを，マグネチックスターラーで常時撹拌しながらｄｅｍｉ水１５mlに２時間溶解した。その後，２mlのクロロホルム中の１０mgのパクリタキセルを徐々に添加し，得られた混合物を蒸発乾固させ（RE)，ｄｅｍｉ水（１５ml）で水和した。未結合のパクリタキセルを１．０μmのガラスフィルターで濾過することにより除去し，得られた生成物を凍結乾燥した。
未結合のパクリタキセルの量(HPLC測定)の量:４．２％(重量)
【００６６】
実施例２３： 疎水化ＨＡ-Cypateへの非極性化合物の担持
実施例１８によって調製されたＨＡ-Cypateのアシル化された複合体１５０mgを，マグネチックスターラーで常時撹拌しながらdemi水１５mlに２時間溶解した。その後，２mlのクロロホルム中の１５mgのドキソルビシンを徐々に添加し，得られた混合物をまず均一な混合物に達するまで超音波で処理し(パルス音波処理cca １５分，２００W，振幅６５％，サイクル０．５秒)，その後蒸発乾固させ（RE)，そしてdemi水（１５ml）で水和した。未結合のドキソルビシンを１．０μmのガラスフィルターで濾過することにより除去し，得られた生成物を凍結乾燥した。
未結合のパクリタキセルの量(HPLC測定)の量:７．５％(重量)
【００６７】
実施例２４：疎水化ＨＡ-Cypateへの非極性化合物の担持
実施例１８によって調製されたＨＡ-Cypateのアシル化された複合体１５０mgを，マグネチックスターラーで常時撹拌しながら脱イオン水１５mlに２時間溶解した。その後，５mlのクロロホルム中の鉄（Ｆｅ２Ｏ３，Ｆｅ３Ｏ４）（５mm）及び２０mgのドキソルビシンを徐々に添加し，得られた混合物をまず均一な混合物に達するまで超音波で処理し(パルス音波処理cca １５分，２００W，振幅６５％，サイクル０．５秒)，その後蒸発乾固させ（RE)，そしてｄｅｍｉ水（１５ml）で水和した。未結合のドキソルビシンを１．０μmのガラスフィルターで濾過することにより除去し，得られた生成物を凍結乾燥した。
未結合のパクリタキセルの量(HPLC測定)の量:６．５％(重量)，未結合のＳｐｉｏｎ：２％(重量)
【００６８】
実施例２５：インビボ実験−複合体ＨＡ-Cypateの螢光
インビボ実験のために，実施例３により調製されたＨＡ-Cypateを生理食塩水に溶解し(ｃ＝１００μl溶液中３．８mgの誘導体)，その後濾過(０．２２μm)によって滅菌した。５０μl（図９）及び／又は腹腔内に１５０μl（図１０）の所定の誘導体の無菌液を，皮下麻酔中のBalb/cタイプのマウスに適用した。螢光は異なる励起波長及び発光フィルターの組み合わせを使用して検知した。
図９及び図１０は，インビボイメージングのための皮下・腹腔内適用の後の誘導体の十分な螢光強度を示す。イメージングは様々な励起波長(５３０〜７４５nm)及び発光のためのフィルタ(ICG，Cy5.5)を使用して行なうことができる。フィルターDsRedは使用することができない。図１０から，この誘導体の発蛍光団としての安定性は，腹腔内投与の後でもさらに明らかである。
【００６９】
実施例２６：インビボ実験−複合体ＨＡ-Cypate-C18:1の蛍光
実施例１５によって調製されたＨＡ-Cypate-C18:1（ＳＳ＝１０％）を，燐酸緩衝液に溶解し(ｃ＝１００μl溶液中３．６mgの複合体)，その後濾過(０．２２μm)によって滅菌した。そのように調製した溶液１００μlを２匹のモデルマウスBalb/c(麻酔中の)に静脈内適用し，蛍光をインビボで７日間観察した（図１１）。
図１１は，ＨＡ-Cypate-C18:1が，健常なマウスに静脈投与した後に特に肝臓に分布することを示す。複合体の螢光はインビボイメージングに十分であり，複合体の螢光はさらに非常に安定であり，一回投与後２週間イメージングを行うことができる。
【００７０】
実施例２７：  インビボ実験−複合体ＨＡ-Cypate-C18:1の蛍光
実施例１５によって調製されたＨＡ-Cypate-C18:1 (SS =10%)を，生理食塩水に溶解し(ｃ＝１００μl溶液中１．８mgの複合体)，その後濾過(０．２２μm)によって滅菌した。そのように調製した溶液１００μlを，触診不可能な乳房腫瘍(同所性投与(orthotopic administration)4T1 luc細胞，ルシフェリンの腹腔内注射後にルシフェラーゼ活性の検出を化学ルミネセンス検出によって表示することができる)を有する３匹のモデルマウスBalb/c(麻酔中)に静脈内投与し，蛍光をインビボで７２時間観察した（図１２）。
図１２は，ＨＡ-Cypate-C18:1が，静脈内投与後に肝臓に分布し，さらに２４時間後に非常に小さな(触診不可能な)腫瘍に分布することを示す。腫瘍では，経時的に増加するＨＡ-Cypate-C18:1の蓄積があり，そして腫瘍中の複合体の存在は複合体投与後１５日でも非常に顕著である。インビボでの該複合体の螢光はこのように非常に安定しており，該複合体は，非常に小さな腫瘍のイメージング，及び経時的な腫瘍観察に使用することができる。図の左パネルには，発光イメージング(ルシフェラーゼ活性の検出)による腫瘍のコントロール画像がある。
【００７１】
実施例２８：  インビボ実験−複合体ＨＡ-Cypate-C18:1の蛍光
4T1 luc細胞（ルシフェリンの腹腔内適用後にルシフェラーゼ活性の検出を化学ルミネセンス検出によって表示することができる)を９匹のモデルマウスBalb/c(麻酔中)に同所性投与し，乳房腫瘍を１４日間増大させた。１４日目に，マウスを３つの群（１群＝３動物）に分けた。全ての群に，１４日目，２１日目及び２８日目に，１００μl燐酸緩衝液中の選択された複合体１mgを静脈内適用し，その後:第１群には，実施例１５で調製されたＨＡ-Cypate-C18:1を，第２群には実施例２３で調製されたドキソルビシンが担持されたＨＡ-Cypate-C18:1を，第３群には実施例２４で調製されたドキソルビシンとspionが担持されたＨＡ-Cypate-C18:1を適用した。放射は，３５日間インビボで評価された(図１３)。次に，マウスを屠殺し，個々の群の中の腫瘍と脾臓の重量を比較した(図１４)。
図１３は，ＨＡ-Cypateのみを投与された群で腫瘍の増大が最も遅いことを示す。ＨＡ-Cypate-C18:1+ドキソルビシンが投与された群と比較して，ＨＡ-Cypate-C18:1+ドキソルビシン+spionが投与された群ではより遅い増大が見られた。
図１４は，第１(未処理)群が最も高い脾臓及び腫瘍重量を有することを示す。与えられたモデルでは，増大した脾臓は，疾病の進行を示す(duPre et al., Experimental and Molecular Pathology 2007, 82, 12-24)。第２（処理された）群及び第３（処理された）群では第１群に比べて脾臓は著しく小さくなり，腫瘍も小さくなった。最も小さな腫瘍サイズは第３群で見られた。従って，このキャリヤーシステムはイメージングできるだけではなく，腫瘍を治療することもでき，またセラノスティクスの機能を満たす。
【００７２】
実施例２９：  インビボ実験−複合体ＨＡ-Cypate-C18:1の蛍光
実施例１５によって調製されたＨＡ-Cypate-C18:1（ＳＳ＝１０%）を，生理食塩水に溶解し(ｃ＝１００μl溶液中０；０．６２５；１．２５；２．５mgの複合体)，その後濾過(０．２２μm)によって滅菌した。そのように調製した溶液１００μlを乳房腫瘍(4T1 luc細胞の同所性投与後３５日目，ルシフェリンの腹腔内注射後にルシフェラーゼ活性の検出を化学ルミネセンスによって表示することができる）を４匹のモデルマウスBalb/c(麻酔中)に腹腔内適用し，7日間その螢光をインビボで観察した(図１５)。
図１５は，ＨＡ-Cypate-C18:1が腹腔投与後に腫瘍と肝臓に分布することを示す。該腫瘍は，使用された全ての濃度において複合体の投与後最低でも７日間，何の問題もなくインビボで表示することができる。図の左パネルには，発光イメージング（ルシフェラーゼの検出）による腫瘍のコントロール画像がある。図の右パネルには誘導体の溶液を投与された４匹のマウスを示す−左から右に向かって濃度が高くなる(１００μl溶液中，投与された複合体が０；０．６２５；１．２５；２．５mg）。
【図１】
2019501262.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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