(57)【要約】  本願の開示は、透過性凍結保護剤、糖類、および巨大分子を含む凍結保存組成物を提供する。本凍結保存組成物は、細胞および組織に対する毒性が低く、凍結保存中の生体材の生存および生存能の保持を促進する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）約２％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、
（２）約０．１Ｍから約１Ｍの糖類、および
（３）約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の巨大分子
を含み、
％（ｗ／ｖ）の単位およびＭの単位が、凍結保存組成物の総体積に基づく、
凍結保存組成物。
【請求項２】
前記透過性凍結保護剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項３】
前記糖類が、スクロース、ソルビトール、グルコース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、マンノース、マルトース、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項４】
前記糖類が、スクロース、トレハロース、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項５】
前記巨大分子が、約６５ｋＤａから約２００ｋＤａに及ぶ分子量を有する、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項６】
前記巨大分子が、アルブミン、ゼラチン、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項７】
実質的にＤＭＳＯを含まない、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項８】
アミノ酸、サイトカイン、脂質、成長因子、抗生物剤、抗真菌剤、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項９】
１つまたは複数の細胞をさらに含む、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項１０】
凍結保存状態にある、請求項９に記載の凍結保存組成物。
【請求項１１】
前記細胞が、約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまでに及ぶ濃度で存在する、請求項９に記載の凍結保存組成物。
【請求項１２】
（１）約２％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、
（２）約０．１Ｍから約０．５Ｍの糖類、および
（３）約１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の巨大分子
を含む、請求項１に記載の凍結保存組成物。
【請求項１３】
１つまたは複数の細胞をさらに含む、請求項１２に記載の凍結保存組成物。
【請求項１４】
凍結保存状態にある、請求項１３に記載の凍結保存組成物。
【請求項１５】
前記細胞が、約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまでに及ぶ濃度で存在する、請求項１２に記載の凍結保存組成物。
【請求項１６】
（ａ）１つまたは複数の細胞を凍結保存組成物と混合して、混合物を形成するステップ、および
（ｂ）前記混合物を凍結するステップ
を含み、
前記凍結保存組成物が、
（１）２から４０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、
（２）０．１から１Ｍの糖類、および
（３）１から１０％（ｗ／ｖ）の巨大分子
を含む、１つまたは複数の細胞を凍結保存するための方法。
【請求項１７】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、ヒト、ブタ、イヌ、ウマ、またはウシの細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が腫瘍細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が線維芽細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が幹細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記混合物が、約-７０℃から約-２００℃に及ぶ温度で凍結される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、前記混合物中に約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまでに及ぶ濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記凍結保存組成物が、実質的にＤＭＳＯを含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記凍結混合物を解凍するステップ（ｃ）をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、少なくとも７０％の解凍後生存能を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、少なくとも８０％の解凍後生存能を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜１５のいずれかに記載の凍結保存組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
この出願は、本明細書に参照によりその全体を組み込まれる、米国仮特許出願第６２／４０５，４４７号（２０１６年１０月７日出願）および第６２／４０４，１７０号（２０１６年１０月４日出願）の優先権を主張するものである。この出願はまた、本明細書に参照によりその全体を組み込まれる、２０１７年１０月４日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ」と題された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／に関連する。
【０００２】
本願の開示は、概ね凍結保存の分野に関する。具体的には、本願の開示は、細胞や組織などの生体材の凍結保存のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
０℃以下の温度での凍結保存手法は、動物（ヒトの細胞および組織を含める）や植物の細胞や組織などの生体材の長期保存に日常的に用いられている。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈａｗｉｎｇ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１４，ｅＬＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ：Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ．ＤＯＩ：１０．１００２／９７８０４７００１５９０２．ａ０００２５６１．ｐｕｂ２。哺乳類細胞を有効に長期貯蔵することは、そのような細胞を臨床ツールおよび研究ツールとして首尾よく適用するために決定的に重要である。例えば、幹細胞は、細胞移植、組織工学、および再生医療に用いられることがある。凍結保存された卵母細胞、精子、および胚は、生殖補助技術で用いられることがある。移植医療では、生体組織、例えば皮膚、角膜、膵島や、心臓弁などが凍結保存される必要がある。
【０００４】
細胞内の氷の形成と浸透圧の不均衡によって、凍結過程の間に細胞が損傷される可能性があることが示されてきた。Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ，ＩＬＡＲ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０００，４１（４）：１８７-１９６。これを避けるために、凍結中の細胞と組織の生存能を保持するように、凍結保護剤（ＣＰＡ）が用いられる。凍結保護剤は、３種の主な化学的クラス、すなわちポリオール類（例えばジオール、グリセロール）、アミド類、およびスルホキシドに分けて特徴付けられる。一般に用いられる凍結保護剤としては、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。さらに、いくらかの添加剤、例えば巨大分子や糖などが、凍結保存中の細胞および組織への損傷をさらに減少させるために添加されることがある。
【０００５】
これらの凍結保護剤の中でも、ＤＭＳＯは、細胞浸透性が高く、最も効果があり頻繁に採用されている。しかし、ＤＭＳＯは、生理的な毒性を有し、細胞をレシピエントに注入した際に高血圧、悪心、および嘔吐を引き起こすことが知られている。さらに、解凍した細胞を培養するかまたはレシピエントの体内に注入した後、このＤＭＳＯの毒性によって、細胞の生存率および／または機能が減弱する傾向がある。
【０００６】
緩やかな凍結と透化は、生体材の凍結保存のための昔ながらの２通りのアプローチである。緩やかな凍結の間、細胞は平衡凝固点を僅かに下回る温度に冷却され、氷が細胞外の培地中に播かれる。細胞外の溶液中に氷が形成するにつれて、外部の溶質濃度が増加してゆく。その結果、細胞の脱水、細胞質の融点の低下、および細胞内の氷の形成が回避される。透化は、試料の粘度によって規定されるが、この粘度は、固体のような挙動をとりつつも結晶化を生じないような十分な高さの値に及ぶものである。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３６８：Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｚｅ-Ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．。このガラス状の状態は、冷却が速やかに起こる場合に、殆どの液体で誘発され得る。凍結保護剤の添加によって、この必要な高い冷却速度を低下させることができる。
【０００７】
従来の哺乳類細胞の凍結保存のための手法は、概して、その細胞を臨床状況または研究状況で使用し得る可能性を損ねる欠点を伴う。そのため、生体材を凍結保存するための凍結保存培地と方法の改善が求められている。
【発明の概要】
【０００８】
本願の開示は、（１）約２％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約１Ｍの糖類、および（３）約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の巨大分子を含み、％（ｗ／ｖ）の単位およびＭの単位が、保存組成物（例えば凍結保存組成物）の総体積に基づく、保存組成物（例えば凍結保存組成物）を提供する。
【０００９】
本願の開示はまた、（１）約２％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約１Ｍの糖類、（３）約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の巨大分子、および（４）溶媒［例えば水、緩衝液、生理食塩水溶液、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの培養培地、または他の溶媒］を含む（またはそれらから本質的になるかもしくはなる）、保存組成物（例えば凍結保存組成物）を提供する。
【００１０】
また、本願の開示によって包含されるのは、（１）約２％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約０．５Ｍの糖類、および（３）約１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の巨大分子を含む、保存組成物（例えば凍結保存組成物）である。
【００１１】
本願の開示は、（１）約２％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約０．５Ｍの糖類、（３）約１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の巨大分子、および（４）溶媒［例えば水、緩衝液、生理食塩水溶液、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの培養培地、または他の溶媒］を含む（またはそれらから本質的になるかもしくはなる）、保存組成物（例えば凍結保存組成物）を提供する。
【００１２】
ある特定の実施形態では、本保存組成物（例えば本凍結保存組成物）は、実質的にＤＭＳＯを含まない。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本保存組成物（例えば本凍結保存組成物）は、アミノ酸、サイトカイン、脂質、成長因子、抗生物剤、抗真菌剤、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、またはそれらの組合せをさらに含む
【００１４】
ある特定の実施形態では、本保存組成物（例えば本凍結保存組成物）は、生体材（例えば、１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）をさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞は、本保存組成物（例えば本凍結保存組成物）中に約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまでに及ぶ濃度で存在する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、本保存組成物（例えば本凍結保存組成物）は凍結保存状態にある。
【００１６】
本願の開示は、生体材（例えば，１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）を凍結保存するための方法を提供し、この方法は、（ａ）生体材（例えば，１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）を凍結保存組成物と（例えば、混合物を形成するかまたは組合せを形成するように）接触させる／混合する／組み合わせるステップ、ならびに（ｂ）本凍結保存組成物と生体材（例えば、１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）との混合物または組合せを凍結するステップを含む。
【００１７】
ある特定の実施形態では、本凍結保存組成物と生体材（例えば、１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）との混合物または組合せは、約-７０℃から約-２００℃までに及ぶ温度で凍結される。
【００１８】
ある特定の実施形態では、細胞は、混合物中に約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまでに及ぶ濃度で存在する。
【００１９】
ある特定の実施形態では、本方法は、（ｃ）本凍結保存組成物と生体材（例えば、１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）との凍結混合物または組合せを解凍するステップをさらに含む
【００２０】
ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の解凍後生存能を有する。
【００２１】
ある特定の実施形態では、本透過性凍結保護剤は、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはそれらの組合せを含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、糖類は、スクロース、ソルビトール、グルコース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、マンノース、マルトース、またはそれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、糖類は、スクロース、トレハロース、またはそれらの組合せを含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、巨大分子は、約６５キロダルトン（ｋＤａ）から約２００ｋＤａに及ぶ分子量を有する。ある特定の実施形態では、巨大分子は、アルブミン、ゼラチン、またはそれらの組合せを含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、細胞とは、哺乳類細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト、ブタ、イヌ、ウマ、またはウシの細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、線維芽細胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、幹細胞を含む。
【００２５】
本願の開示は、本願の保存組成物（例えば本凍結保存組成物）を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】異なる凍結保存組成物ＣＰＡ-１からＣＰＡ-９（実施例１を参照）を用いた後の解凍後細胞の生存能を示す図である。ＤＭＥＭを対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本願の開示は、透過性凍結保護剤、糖類（例えば糖）、および巨大分子を含む保存組成物（例えば、凍結溶液などの凍結保存組成物）を提供する。この凍結保存組成物は、生体材（例えば細胞、組織、または器官）に対する毒性が低く、凍結保存の過程の間のならびに凍結保存状態にある生体材の生存および生存能の保持を促進する。
【００２８】
この生体材は、次いで、種々の研究状況および臨床状況で、例えば、細胞療法に用いるために、生殖補助技術において、または化学療法もしくは放射線療法を行っている患者に用いるために、使用することができる。一実施形態では、本願の凍結保存組成物の毒性が低いことから、解凍後、細胞を含む本組成物を対象に投与してもよい。
【００２９】
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物は、実質的にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まないか（ｆｒｅｅ  ｏｆ）、ＤＭＳＯを含まないか（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、またはＤＭＳＯ不含である。ある特定の実施形態では、本願の組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用に比べて優れた凍結保護効果を示す。ある特定の実施形態では、本願の組成物は、ＤＭＳＯの使用に比べて同等かさらに良好な凍結保護効果を示す。
【００３０】
本願の組成物および方法を、凍結および凍結乾燥を含めて、低温保存用にまたは凍結保存用に使用してもよい。
【００３１】
本願の開示は、（１）約２％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）の１つまたは複数の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約１Ｍの１つまたは複数の糖類、および（３）約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の巨大分子［その際に、％（ｗ／ｖ）の単位およびＭの単位は、保存組成物の総体積に基づく］を含む、保存組成物（例えば凍結保存組成物）を提供する。
【００３２】
ある特定の実施形態では、本願の開示は、（１）約２％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）の１つまたは複数の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約１Ｍの１つまたは複数の糖類、（３）約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の巨大分子、および（４）溶媒を含む（またはそれらからなるかもしくは本質的になる）、保存組成物（例えば凍結保存組成物）を提供する。ある特定の実施形態では、溶媒は、水、緩衝液、生理食塩水溶液、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの培養培地、または他の溶媒である。
【００３３】
ある特定の実施形態では、本願の開示は、（１）約２％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）の１つまたは複数の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約０．５Ｍの１つまたは複数の糖類、および（３）約１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の巨大分子を含む保存組成物（例えば凍結保存組成物）を提供する。
【００３４】
ある特定の実施形態では、本願の開示は、（１）約２％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）の１つまたは複数の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約０．５Ｍの１つまたは複数の糖類、（３）約１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の巨大分子、および（４）溶媒を含む（またはそれらからなるかもしくは本質的になる）、保存組成物（例えば凍結保存組成物）を提供する。ある特定の実施形態では、溶媒は、水、緩衝液、生理食塩水溶液、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの培養培地、または他の溶媒である。
【００３５】
ある特定の実施形態では、透過性凍結保護剤は、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはそれらの組合せを含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、糖類は、スクロース、ソルビトール、グルコース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、マンノース、マルトース、またはそれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、糖類は、スクロース、トレハロース、またはそれらの組合せを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、巨大分子は、約３０キロダルトン（ｋＤａ）から約５００ｋＤａまで、約４０ｋＤａから約４００ｋＤａまで、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａまで、約６０ｋＤａから約３００ｋＤａまで、約６５ｋＤａから約２００ｋＤａまで、約６５ｋＤａから約１５０ｋＤａまで、約６５ｋＤａから約１００ｋＤａまで、または約３０ｋＤａから約１００ｋＤａまでに及ぶ分子量（または平均分子量）を有する。
【００３８】
ある特定の実施形態では、巨大分子は、アルブミン、ゼラチン、またはそれらの組合せを含む。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物は、１種、２種、３種、４種、５種、６種、またはそれを超える透過性凍結保護剤を、（本保存組成物の総体積の）約０．５％（ｗ／ｖ）から約８０％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約７０％（ｗ／ｖ）まで、約２％（ｗ／ｖ）から約６０％（ｗ／ｖ）まで、約２％（ｗ／ｖ）から約５０％（ｗ／ｖ）まで、約２％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）まで、約２％（ｗ／ｖ）から約３０％（ｗ／ｖ）まで、約２％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）まで、約５％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）まで、約１０％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）まで、約２０％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）まで、約１０％（ｗ／ｖ）から約３０％（ｗ／ｖ）まで、約１０％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）まで、約２０％（ｗ／ｖ）から約３０％（ｗ／ｖ）まで、または約５％（ｗ／ｖ）から約５０％（ｗ／ｖ）までに及ぶ濃度で含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物は、１種、２種、３種、４種、５種、６種、またはそれを超える糖類または糖を、約０．０５Ｍから約２Ｍまで、約０．０８Ｍから約１．５Ｍまで、約０．１Ｍから約１．２Ｍまで、約０．１Ｍから約１．１Ｍまで、約０．１Ｍから約１Ｍまで、約０．１Ｍから約０．９Ｍまで、約０．１Ｍから約０．８Ｍまで、約０．１Ｍから約０．７Ｍまで、約０．１Ｍから約０．６Ｍまで、約０．１Ｍから約０．５Ｍまで、約０．１Ｍから約０．４Ｍまで、約０．１Ｍから約０．３Ｍまで、約０．２Ｍから約１Ｍまで、約０．３Ｍから約１Ｍまで、約０．４Ｍから約１Ｍまで、約０．５Ｍから約１Ｍまで、約０．６Ｍから約１Ｍまで、約０．１Ｍから約０．８Ｍまで、約０．１Ｍから約０．６Ｍまで、約０．１Ｍから約０．５Ｍまで、約０．１Ｍから約０．４Ｍまで、または約０．１Ｍから約０．３Ｍまでに及ぶ濃度で含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物は、１種、２種、３種、４種、５種、６種、またはそれを超える巨大分子を、（本保存組成物の総体積の）約０．５％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）まで、約０．６％（ｗ／ｖ）から約１８％（ｗ／ｖ）まで、約０．８％（ｗ／ｖ）から約１６％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約１５％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約１２％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約９％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約８％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約７％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約６％（ｗ／ｖ）まで、約１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）まで、約１．２％（ｗ／ｖ）から約８％（ｗ／ｖ）まで、約１．５％（ｗ／ｖ）から約６％（ｗ／ｖ）まで、約２％（ｗ／ｖ）から約８％（ｗ／ｖ）まで、約２％（ｗ／ｖ）から約６％（ｗ／ｖ）まで、約２％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）まで、または約５％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）までに及ぶ濃度で含む。
【００４２】
本明細書に使用される際に、パーセンテージ「％（ｗ／ｖ）」とは、重量と体積とのパーセント（グラムでのｗとミリリットルでのｖ）であり、パーセンテージ「％（ｖ／ｖ）」とは、体積と体積とのパーセントであり、パーセンテージ「％（ｗ／ｗ）」または「ｗｔ％」とは、重量と重量とのパーセントである。
【００４３】
ある特定の実施形態では、本組成物は、約３００ｍｇ／Ｌから約８，０００ｍｇ／Ｌまで、約５００ｍｇ／Ｌから約７，０００ｍｇ／Ｌまで、約１０００ｍｇ／Ｌから約６０００ｍｇ／Ｌまで、約１０００ｍｇ／Ｌから約４５００ｍｇ／Ｌまで、約５００ｍｇ／Ｌから約２３００ｍｇ／Ｌまで、約１，０００ｍｇ／Ｌ、約４，５００ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、または約２，３００ｍｇ／Ｌのグルコースを含む。
【００４４】
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物（例えば凍結保存組成物）は、アミノ酸、サイトカイン、脂質、成長因子、抗生物剤、抗真菌剤、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、またはそれらの組合せをさらに含む。
【００４５】
ある特定の実施形態では、本凍結保存組成物は、生体材（１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）をさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞は、本凍結保存組成物中に約１０４細胞個／ｍＬから約１０８細胞個／ｍＬまで、約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまで、約１０５細胞個／ｍＬから約１０８細胞個／ｍＬまで、約１０４細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまで、約１０５細胞個／ｍＬ、約１０６細胞個／ｍＬ、または約１０７細胞個／ｍＬに及ぶ濃度で存在する。本保存組成物中の細胞の濃度は、１０８細胞個／ｍＬよりも高くてもよいし１０４細胞個／ｍＬよりも低くてもよい。ある特定の実施形態では、本保存組成物中の細胞の濃度は、細胞のタイプに応じて変わることがある。例えば、卵母細胞では、細胞の濃度は低く、例えば＜１細胞／ｍＬも低いことがある。濃度は、具体的な細胞のタイプの専門の当業者によって決定することができる。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本願の組成物は、生体材（例えば細胞、組織、または器官）を含まない。
【００４７】
本願の開示は、生体材（例えば１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）を凍結保存するための方法を提供する。この方法は、（ａ）生体材（例えば１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）を凍結保存組成物と（例えば、混合物を形成するかまたは組合せを形成するように）接触させる／混合する／組み合わせるステップ、ならびに（ｂ）本凍結保存組成物と生体材（例えば１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）との混合物または組合せを凍結するステップを含むことがある。ある特定の実施形態では、本凍結保存組成物と生体材（例えば１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）との混合物または組合せを、約-７０ｏＣから-２００ｏＣに及ぶ温度で凍結する。
【００４８】
本願の方法は、（ｃ）本凍結保存組成物と生体材（例えば１つまたは複数の細胞、組織、器官、および／またはウイルス粒子）との凍結混合物または組合せを解凍するステップを、さらに含むことがある。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の解凍後生存能を有する。
【００４９】
ある特定の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、線維芽細胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、幹細胞を含む。
【００５０】
ある特定の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞を含み、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ヒト、ブタ、イヌ、ウマ、またはウシの細胞が挙げられる。
【００５１】
本願の方法は、解凍された生体材を対象（例えば患者）に投与するステップをさらに含むことがある。米国特許出願公開第２００９０１３０７５６号。
【００５２】
本願の開示は、生体材を保存する（例えば凍結保存する）ための方法を提供する。この方法は、以下のステップ：（ａ）本願の保存組成物を生体材と組み合わせること／混合すること／接触させること、（ｂ）混合物を冷却および／または凍結すること、ならびに（ｃ）生体材を貯蔵すること（例えば、適切な貯蔵条件で）を含むことがある。
【００５３】
生体材を本保存組成物に添加してもよい。あるいは、本保存組成物を生体材に添加することができる。ある特定の実施形態では、本方法のステップ（ａ）で、生体材（例えば細胞）を本保存組成物に懸濁する。
【００５４】
生体材の凍結または貯蔵に適した温度は変わり得る。例えば、細胞を、約-７０ｏＣから約-２００ｏＣまでに及ぶ温度で凍結または貯蔵してもよい。一実施形態では、細胞を、液体窒素の沸騰温度以上で、すなわち約-１９６℃以上で、凍結または貯蔵してもよい。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本保存組成物は、低温保存組成物（例えば低温保存溶液）である。ある特定の実施形態では、本保存組成物は、凍結保存組成物（例えば凍結保存溶液）である。そのような場合、溶液は、例えば凍結溶液（生体材が凍結される場合）であっても凍結乾燥溶液（生体材が凍結乾燥される場合）であってもよい。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本願の凍結保存組成物（生体材を含むか含まない）は、凍結保存状態（または凍結状態）にあるか、または凍結保存状態から解凍されている。ある特定の実施形態では、本願の凍結保存組成物（生体材を含むか含まない）は、低温状態にあるか、または凍結乾燥状態にある。
【００５７】
凍結保存状態にある本凍結保存組成物（生体材も含む）を、緩やかな凍結または透化によって得てもよい。米国特許第９，４５８，４２４号。
【００５８】
本願の保存組成物は、液体でも固体でもよい。ある特定の実施形態では、本願の保存組成物は、濃縮組成物、例えば乾燥形態（例えば粉末、錠剤、顆粒状、または他の適した物理的形態）や液体形態などであり、例えば２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×などのストック溶液である。このストック溶液は、例えば培養培地、生理的溶液、緩衝液、水などによって、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×などに希釈することができる。本保存組成物の乾燥形態を、例えば培養培地、生理的溶液、緩衝液、水などを添加することによって、液体形態に変換（例えば培養培地、生理的溶液、緩衝液、水などに例えば溶解）してもよい。
【００５９】
ある特定の実施形態では、本明細書に議論される構成成分の濃度とは、本願の保存組成物のストック溶液中の構成成分の濃度である。ある特定の実施形態では、本明細書に議論される構成成分の濃度とは、本願の保存組成物の作業用溶液中の構成成分の濃度である。
【００６０】
本願の保存組成物は、溶液としてもよい。ある特定の実施形態では、本組成物は、本明細書に議論される構成成分（例えば、１つまたは複数の透過性凍結保護剤、１つまたは複数の糖類、および１つまたは複数の巨大分子）の水溶液である。
【００６１】
ある特定の実施形態では、本願の組成物を調製する際に、本明細書に議論される構成成分（例えば、１つまたは複数の透過性凍結保護剤、１つまたは複数の糖類、および１つまたは複数の巨大分子）を、平衡電解質溶液（例えば生理食塩水溶液、細胞培養培地などの培養培地）に溶解する。ある特定の実施形態では、本保存溶液は、正常な浸透圧を維持するように、適切な濃度の電解質（例えばナトリウムイオン、カリウムイオン、および／または塩化物イオンなど）を含む。凍結保存での使用に適した生理食塩水溶液は、当技術分野に周知である。一実施形態では、生理食塩水溶液は、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）である。一実施形態では、生理食塩水溶液は、以下：塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化カルシウム、および重炭酸ナトリウムのうち１つまたは複数を含む
【００６２】
本願の保存組成物は、緩衝液系（例えば生理的な緩衝液）を含むことがある。本願の保存組成物は、平衡塩溶液または任意の生理的溶液を含むことがある。
【００６３】
緩衝液系の非限定的な例としては、リン酸緩衝液［例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］、ＢＥＳ、ＴＥＳ、アセトアミドグリシン、グリシンアミド類、グリシルグリシン、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＴＡＬＰ、トリスエタノールアミン、ベロナール、およびＨＥＰＥＳが挙げられる。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本願の組成物中の緩衝液の濃度は、約１ｍＭから約１０００ｍＭまで、約１ｍＭから約２００ｍＭまで、約５ｍＭから約２００ｍＭまで、または約５ｍＭから約５０ｍＭまでに及ぶ。
【００６５】
培養培地の非限定的な例としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ノックアウトＤＭＥＭ（ＫＯ-ＤＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ-ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、アドバンストＤＭＥＭ／ハムＦ１２、イスコフ改変ダルベッコ培地、および最小必須培地（ＭＥＭ）、ハムＦ-１０、ハムＦ-１２、培地１９９、ＲＰＭＩ１６４０培地、ならびにそれらの組合せおよび／またはそれらの改変物が挙げられる。
【００６６】
ある特定の実施形態では、本願の組成物は、約６．０から約８．５まで、約６．５から約８まで、約６．９から約７．５まで、または約７．２から約７．４までに及ぶｐＨを、室温または大気温（例えば２５℃）で有する。
【００６７】
ある特定の実施形態では、本保存組成物は、単位形態でパッケージングされる。一実施形態では、本凍結保存組成物は、１０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、５００ｍＬ、または１Ｌの体積でパッケージングされる。ある特定の実施形態では、本保存組成物は、１×、５×、１０×、または２０×の溶液としてパッケージングされる。
【００６８】
本願の組成物は、本明細書に議論される構成成分を混合することによって固体形態で、またはこの構成成分を水、緩衝液、溶液、培養培地などに溶解することによって水溶液として、得ることができる。
【００６９】
定義
用語「保存」とは、その生物活動が大幅に低減するものの、一方で生存可能性を保ち、かつその保存状態から取り出された際に本質的に正常な生物活動を再開し得るような条件下で、生体材を維持する過程を指す。保存の具体的な例は、凍結保存および低温保存である。
【００７０】
用語「保存組成物」は、生体材がその生存能を保持するように生体材の保存を可能にする組成物（または希釈もしくは溶解された際の組成物）に関する。保存組成物の具体的な実施形態は、生体材を低温で保存するためのものである。ある特定の実施形態では、本保存組成物は、保存溶液である。低温保存組成物および凍結保存組成物は、保存組成物の例である。
【００７１】
用語「凍結保存」とは、生体材（または生体材と保存組成物との混合物）の凍結温度を上回る温度からその凍結温度を下回る温度に生体材の温度を下げるステップを少なくとも１つ含む過程を指す。凍結保存は、凍結、透化、および凍結乾燥を包含する。用語「細胞の凍結保存」とは、継代培養することなく所望の期間にわたって細胞を維持する目的で、細胞を凍結し保存することを意味する。
【００７２】
用語「凍結保存組成物」、「凍結保存培地」または「凍結組成物」とは、凍結保存もしくは凍結前に生体材を浸漬する組成物もしくは培地（もしくは希釈もしくは溶解する際の組成物）、または凍結前に細胞もしくは組織を処理するのに使用することのできる組成物もしくは培地を指す。凍結保存組成物は、１つまたは複数の凍結保護剤を含有する。ある特定の実施形態では、凍結保存溶液は、凍結溶液、透化溶液、凍結乾燥溶液、および／またはそのような溶液の混合物であることがある。ある特定の実施形態では、凍結保存組成物とは、凍結保存溶液である。ある特定の実施形態では、凍結保存組成物とは、約８℃以下、約４℃以下、約０℃以下、約-２０℃以下、約-７０℃以下、約-１３５℃以下、約-１９６℃以下、または液体窒素中の温度で、生体材を貯蔵または凍結するための組成物または培地を指す。
【００７３】
用語「適切な凍結条件」または「適切な凍結保存条件」とは、生存可能な状態で生体材を維持するような凍結条件を意味する。
【００７４】
用語「低温保存」とは、生理的温度を下回るが凍結を上回る温度での保存を意味し、その場合、生物学的な過程は減速され、それゆえに生体材の貯蔵を延長することが可能になる（例えば８℃未満かつ０℃超で、または４℃と８℃との間で））。
【００７５】
用語「低温保存組成物」とは、生体材が８℃を下回る温度に耐えること、および必要代謝物がそのような温度で生存能を持続させることを可能にするような構成成分を含む、保存組成物を意味する。
【００７６】
用語「透化」とは、材料を結晶性構造の全くないガラス状の非晶質の固体に変換する過程を指す。ガラス質固化は、ガラス転移温度で起こる。
【００７７】
用語「非線形冷却」とは、温度対時間が一直線にも傾きの異なる２つの線区からなるプロファイルにもならないことを意図された凍結保存の過程を指す。一実施形態では、非線形冷却の凍結保存方法は、その方法の少なくとも一部の間に冷却速度を非定常とすることによって達成される。別の実施形態では、非線形の凍結保存方法は、２ステップの冷却過程によって達成され、その場合、細胞および組織を、一定または非定常の速度で第１の温度に、次いで引き続き一定または非定常の速度で第２の温度（例えば貯蔵温度）に、冷却する。
【００７８】
「貯蔵温度」とは、生体材を貯蔵する温度である。ある特定の実施形態では、貯蔵温度は、約８℃以下、約４℃以下、約０℃以下、約-２０℃以下、約-６０℃以下、約-７０℃以下、約-１３５℃以下、約-１９６℃以下、または液体窒素中である。
【００７９】
剤を「実質的に含まない」という用語は、その剤を含まないことを意味するか、または、本保存組成物中に存在するいかなる量の剤も、保存過程か、保存過程の結果か、またはその保存条件から取り出した後の生体材の質（例えば、そのような材に含まれている場合は生きた物体、例えば細胞などの生存能）に、何ら影響を持たないほどに低いものであると理解されるべきである。ある特定の実施形態では、剤を「実質的に含まない」という用語は、その剤が、約５％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約４％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約３％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約２％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約１％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約０．５％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約０．２％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約０．１％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約０．０５％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、約０．０２％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満、または約０．０１％ｗ／ｗ（もしくは％ｗ／ｖもしくは％ｖ／ｖ）未満であることを意味する。
【００８０】
数値に関する「約」という用語は、表示された数値の±１０％を指す。言い換えれば、数値は、表示された値の９０％から表示された値の１１０％の領域になり得る。
【００８１】
凍結保護剤
本明細書の「凍結保護剤」または「凍結保護用剤」という用語は、氷核形成、氷晶成長、氷形成、または任意のそれらの組合せを遅延または防止するのに用いられる化合物を指す。凍結保護剤は、凍結保存下で生体材の生存能を維持し、生体材に凍結保存中に損傷が引き起こされるのを防ぐために役立つ。
【００８２】
凍結保護剤としては、透過性凍結保護剤および非透過性凍結保護剤が挙げられる。
【００８３】
透過性凍結保護剤とは、細胞膜を貫通し細胞内に存在することのできる凍結保護剤である。透過性凍結保護剤の非限定的な例としては、グリセロール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール（１，２-プロパンジオール、プロパン-１，２-ジオール）、およびＤＭＳＯが挙げられる。
【００８４】
非透過性凍結保護剤とは、細胞膜を貫通せず細胞外溶液中に留まる凍結保護剤である。非透過性凍結保護剤の非限定的な例としては、高分子量分子、例えば糖類（例えばスクロース、トレハロース、マルトース）、糖、デンプン（例えばヒドロキシエチルデンプン）、タンパク質（例えば、血清アルブミンなどのアルブミン）、パーコール、フィコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、血清、血漿や、他の巨大分子などが挙げられる。ある特定の実施形態では、本願の組成物は、約３４２ダルトン（スクロースの分子量である）以上の分子量を持つ非浸透性凍結保護剤を含む。
【００８５】
凍結保護剤の非限定的な例としては、メトキシル化化合物類、エタノール、２-メトキシエタノール、１，２-ジメトキシエタン、１-メトキシ］-２-プロパノール、およびグリセロール誘導体類、例えば３-メトキシ-１，２-プロパンジオールや１，３-ジメトキシ-２-プロパノールなども挙げられる。ある特定の実施形態では、本願の組成物は、１つまたは複数のメトキシル化化合物を凍結保護剤として含むかまたは含まない。ある特定の実施形態では、本願の組成物は、１つまたは複数のジオールを凍結保護剤として含むかまたは実質的に含まない。
【００８６】
本願の組成物は、１つもしくは複数の透過性凍結保護剤、１つもしくは複数の非透過性凍結保護剤、または１つもしくは複数の透過性凍結保護剤と１つもしくは複数の非透過性凍結保護剤との組合せを含むことがある。
【００８７】
糖類
糖類としては、単糖類や二糖類などのオリゴ糖類、多糖類などが挙げられる。糖類は糖を含む。
【００８８】
糖類の非限定的な例としては、スクロース、ソルビトール、グルコース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、マンノース、ラフィノース、スタキオース、デキストラン、キシロース、アラビノース、マンニトール、キシリトール、ミオイノシトール、ラクトース、マルトース、セロビオース、ラクチトール、マルチトール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、イヌリン、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、キサンタンガム、グルコサミン、ガラクトサミン、およびそれらの組合せが挙げられる。米国特許第６，６７３，６０７号および第７，０９４，６０１号。
【００８９】
アルブミン
アルブミンの非限定的な例としては、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンまたはＨＡＳ）、血漿アルブミン（例えばヒト血漿アルブミン）、ウシ血清アルブミン、および／または合成血清アルブミン）、オバルブミン、植物アルブミン、またはそれらの組合せが挙げられる。アルブミンの非限定的な例としては、ウシ胎児血清も挙げられる。
【００９０】
アルブミンは、天然由来である（例えば天然の供給源から精製された）かまたは組換え由来である（組換えアルブミン）かのどちらかであることがある。一実施形態では、アルブミンは、ヒト由来の生体材からの精製によって生産される。それは、血液から得られる血漿を分画するための従来の手法［Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８（１９４６）４５９ｐｐ］によって、またはＪ．Ｌｉａｕｔａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．［１３ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩＡＢＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ；Ａ：“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ”，Ｋａｒｇｅｒ（ｅｄ．），Ｂａｌｅ，２７（１９７３）１０７ｐｐ］により記載された手法に従ってヒト胎盤から抽出することによって、得られることがある。一実施形態では、組換えアルブミンは、真核宿主にて生産される。
【００９１】
一実施形態では、用語「アルブミン」は、このタンパク質の多型の結果として生じる、ヒトアルブミンの任意の天然のバリアントを含む。
【００９２】
ゼラチン
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物中のゼラチンは、約１５キロダルトン（ｋＤ）から約４０ｋＤまで、約２５ｋＤから約４０ｋＤまで、約２５ｋＤから約５０ｋＤまで、約２５ｋＤから約４５ｋＤまで、約４０ｋＤから約５０ｋＤまで、約１０ｋＤから約１００ｋＤまで、約４０ｋＤから約１００ｋＤまで、約５０ｋＤダルトンから約１００ｋＤまで、約１００ｋＤから約２００ｋＤまで、約１００ｋＤから約２５０ｋＤまで、約８０ｋＤから約２００ｋＤまで、約１５０ｋＤから約２００ｋＤまで、約１００ｋＤから約１５０ｋＤまで、または約５０ｋＤから約２００ｋＤまでに及ぶ分子量（または重量平均分子量または平均分子量）を有する。
【００９３】
ある特定の実施形態では、ゼラチンは、約４．５から約９まで、約５から約９まで、約５から約７まで、約６から約７まで、約５から約６まで、約７から約９まで、または約４．７から約５．２までに及ぶ等電点（ｐＩ）を有する。
【００９４】
ある特定の実施形態では、ゼラチンは、哺乳動物組織を由来とする。ある特定の実施形態では、ゼラチンは、動物コラーゲンから得られる。ある特定の実施形態では、ゼラチンは、ウシ、トリ、ブタや、魚などの動物の皮膚、骨、結合組織、腱、靱帯などを含めた原料を由来とするが、これらに限定されない。一実施形態では、ゼラチンは、ウシ源、ブタ源、またはそれらの組合せのものである。ある特定の実施形態では、ゼラチンは、ウシの骨、ブタの皮膚、ウシの皮膚、豚肉、牛皮革、および／または魚の皮膚を供給源とする。一実施形態では、ゼラチンは、皮膚由来のゼラチン、および／または骨由来のゼラチンである。
【００９５】
ある特定の実施形態では、ゼラチンは、コラーゲンの部分加水分解によって生産されるペプチドとタンパク質との混合物である。ある特定の実施形態では、ゼラチンは、コラーゲンの加水分解形態である。ある特定の実施形態では、ゼラチンは、変性コラーゲンの形態である
【００９６】
ある特定の実施形態では、ゼラチンは、タイプＡゼラチンまたはタイプＢゼラチンであることがある。本明細書に使用される際に、タイプＡゼラチンとは、酸処理原料から得られるゼラチンであり、タイプＢゼラチンとは、アルカリ処理原料から得られるゼラチンである。
【００９７】
ある特定の実施形態では、ゼラチンを生産するために、コラーゲンの加水分解を、化学加水分解および／または熱加水分解によって実施する。一実施形態では、コラーゲンを煮沸する（例えば水中で）かまたは加熱して（大規模に）、ゼラチンを生産する。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ゼラチンを生産するために、コラーゲンの加水分解を、酸加水分解、アルカリ加水分解、および／または酵素加水分解によって実施する。
【００９９】
ある特定の実施形態では、ゼラチンの製造過程は、３つの主な段階：前処理、主要な抽出ステップ、ならびに精製処理および回収処理を含む。前処理は、原料を主要な抽出ステップのために準備し、最終的なゼラチン産物の生理化学的性質に負の作用を及ぼし得る不純物を除去する。主要な抽出ステップは、熱水または酸希釈溶液を用いて多段階抽出として行って、コラーゲンをゼラチンに加水分解してもよい。精製処理および回収処理は、水をゼラチン溶液から除去し、抽出されたゼラチンを配合し、ならびに／または乾燥、配合および摩砕された最終産物を得るために、濾過、清澄化、蒸発、滅菌、乾燥、ラッチング、摩砕、および／または篩い分けを含む。
【０１００】
他の構成成分
ある特定の実施形態では、本願の組成物は、アミノ酸、サイトカイン、脂質、成長因子、抗生物剤（例えばペニシリン、ストレプトマイシンなど）、抗真菌剤、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、血清、タンパク質、塩、ホルムアミド、メトキシル化化合物、および／またはポリマー（例えばポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコール）をさらに含むことがある。
【０１０１】
アミノ酸
本願の保存組成物は、１つまたは複数のアミノ酸を含んでいても含んでいなくてもよい。
【０１０２】
アミノ酸は、光学異性体、すなわちＤ-異性体とＬ-異性体との両方を含む。アミノ酸は、アルファ-アミノ酸、ならびにベータ-アミノ酸、ガンマ-アミノ酸、デルタ-アミノ酸、および非天然アミノ酸を含む。アミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびそれらの組合せが挙げられる。Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１（４）：２５７-２７９（２０００）。
【０１０３】
アミノ酸誘導体もまた、本願の組成物および方法に用いられることがある。アミノ酸誘導体の非限定的な例としては、アミノ酸塩およびアミノ酸溶媒和物が挙げられる。アミノ酸塩の非限定的な例としては、アルカリ金属塩、またはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩や、カルシウム塩など；ハロゲン酸塩、例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩や、ヨウ化水素酸塩など；無機酸塩、例えば硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩や、リン酸塩など；ならびに有機酸塩、例えばフマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、乳酸塩や、アスコルビン酸塩などが挙げられる。アミノ酸溶媒和物の非限定的な例としては、水和物、アルコラート（例えばメタノラート、エタノラート）、およびエーテラート（例えばジエチルエーテラート）が挙げられる。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、本願の組成物中のアミノ酸濃度は、０．０１〜１０．０重量％または０．１〜１．０重量％である。
【０１０５】
ＤＭＳＯ
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を実質的に含まないか、ＤＭＳＯを含まないか、またはＤＭＳＯ不含である。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物は、ＤＭＳＯを含む。様々な実施形態で、ＤＭＳＯの濃度は、約４％（ｖ／ｖ）以下、約３％（ｖ／ｖ）以下、約２％（ｖ／ｖ）以下、約１％（ｖ／ｖ）以下、約０．５％（ｖ／ｖ）以下、約０．１％（ｖ／ｖ）以下、約０．０５％（ｖ／ｖ）以下、約０．０２％（ｖ／ｖ）以下、または約０．０１％（ｖ／ｖ）以下である。
【０１０７】
ビタミン
他の一実施形態では、本保存組成物は、１つまたは複数のビタミンをさらに含む。ビタミンの非限定的な例としては、Ｄ-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、チアミンＨＣｌ、およびリボフラビンが挙げられる。
【０１０８】
塩
ある特定の実施形態では、本願の組成物は、無機塩および／または有機塩を含めて、１つまたは複数の塩をさらに含む。無機塩の非限定的な例としては、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびリン酸１水素ナトリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、重炭酸カリウム、１リン酸カリウム、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本組成物は、血清を含まない。ある特定の実施形態では、本組成物は、直接的なヒトもしくは動物由来のいかなる原料も、またはヒトもしくは動物由来の材料を用いて生産されているいかなる材料も含まない。
【０１１０】
一実施形態では、本願の組成物は、複数のナノ粒子、微粒子、ナノチューブ、またはそれらの組合せを含む。例示的なナノ粒子、微粒子、またはナノチューブとしては、カーボンまたは貴金属（例えば金、銀、チタン、パラジウム、白金、および銅）のナノ粒子、微粒子、またはナノチューブが挙げられる。Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒ７９：２２５２-２２５４，２００１；Ｅａｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒ７８：７１８-７２０，２００１。
【０１１１】
本願の保存組成物は、任意選択の他の構成成分を含むことがあり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ペプチド、他のタンパク質、糖アルコール、アミノ糖類、糖タンパク質、およびアルコール、ｐＨ制御剤、保湿剤、保存剤、粘度制御剤、またはそれらの組合せが挙げられる。米国特許第９，０５５，７３９号。
【０１１２】
凍結保存
本願の開示は、凍結保存組成物、および生体材を凍結保存するための方法を提供する。
【０１１３】
本願の方法は、生体材（例えば細胞、組織、器官、ウイルス粒子）を凍結保存組成物と接触させること／組み合わせることを含む。ある特定の実施形態では、この接触させる／組み合わせる／混合するステップは、本凍結保存組成物を細胞に添加すること、および細胞を本凍結保存組成物と混合することを含む。本願の方法のこのステップ［例えばステップ（ａ）］の結果、培地中懸濁液にて細胞の混合物（例えば液体混合物）を得ることがある。
【０１１４】
本願の開示は、本凍結保存組成物中に細胞を配するステップ、および本凍結保存組成物中の細胞を凍結保存するステップを含む、細胞を凍結保存する方法を提供する。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、細胞を凍結保存用に処理する際に、細胞を液体状態の本凍結保存組成物に懸濁した後、結果として得られる懸濁液を、凍結保存のための条件下に維持することによって凍結する。細胞を必要とする際に、細胞と本凍結保存組成物との凍結混合物を解凍プロセスに供した後、細胞を回復させることができる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、（例えば細胞懸濁液を形成するために）接着または半接着の細胞を基材から剥がすため、細胞をプロテイナーゼ（例えばトリプシン）などの酵素で処理する。ある特定の実施形態では、基材から緩んだ細胞を機械的にこすり落とすことによって、細胞を培養基材（例えば細胞培養のディッシュ、フラスコなど）から剥がす。ある特定の実施形態では、（例えば細胞懸濁液を形成するために）接着または半接着の細胞を基材から剥がすため、細胞を化学物質（例えば界面活性剤）で処理する。ある特定の実施形態では、化学処理または酵素処理の場合には、次いで、酵素または界面活性剤を除去するために、細胞を遠心分離および洗浄する。
【０１１７】
細胞および本凍結保存組成物は、複数の方法に従って、物理的に組み合わせることができる。ある特定の実施形態では、細胞は、本凍結保存組成物と組み合わせる前に細胞懸濁液中に存在する。一実施形態では、細胞を本凍結保存組成物と組み合わせるステップは、凍結保存用の細胞を細胞懸濁液中に用意すること、および本凍結保存組成物を細胞懸濁液に添加すること（混合するかまたはせずに）を含む。一実施形態では、細胞を本凍結保存組成物と組み合わせるステップは、凍結保存用の細胞を細胞懸濁液中に用意すること、および細胞懸濁液を本凍結保存組成物に添加すること（混合するかまたはせずに）を含む。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本凍結保存培地を、段階的な増分で濃度を増加させて、生体材（例えば細胞、組織、器官、ウイルス粒子）に添加してもよい。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、凍結保存前に、凍結保存に必要な全ての構成成分を含むように細胞培養培地を改変し、次いで、細胞を培養基材（例えば細胞培養用のディッシュ、フラスコなど）から除去する。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、生体材と混合する／組み合わせる際または前に、凍結保存組成物の温度は、約４℃から約４５℃まで、約１０℃から約４０℃まで、約１５℃から約４０℃まで、約２０℃から約４０℃まで、約３０℃から約４０℃まで、約３３℃から約３８℃まで、または約３７℃に及ぶ。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、細胞と本凍結保存培地との混合物を、混合物の凍結前に平衡化する。例えば、この混合物を、約１０秒間から約１時間まで、約２０秒間から約５０分まで、約２０秒間から約４０分間まで、約３０秒間から約３０分間まで、約３０秒間から約２０分間まで、約３０秒間から約１０分間まで、約３０秒間から約５分間まで、約３０秒間まで約２分間まで、約３０秒間から約１分間まで、約１分間から約４０分間まで、約５分間から約３０分間まで、または約５分間から約１０分間までに及ぶ時間にわたって平衡化する。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、混合物を凍結する前に、細胞と本凍結保存培地との混合物を、約４℃から約４５℃まで、約１０℃から約４０℃まで、約１５℃から約４０℃まで、約２０℃から約４０℃まで、約３０℃から約４０℃まで、約３３℃から約３８℃まで、または約３７℃に及ぶ温度で平衡化する。
【０１２３】
さらに別のステップでは、本願の方法は、生体材と本凍結保存組成物との混合物を凍結することを妥協する。一実施形態では、生体材を含む混合物を凍結容器に移し、次いで、この容器を零下の温度に移す。適した容器としては、以下に限定されないが、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（登録商標）凍結容器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。冷凍庫に置く際に、そのような容器は、一定の冷却速度をもたらす助けとなることがある。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本願の方法は、生体材（例えば細胞、組織、器官、ウイルス粒子）を本願の保存組成物と組み合わせるステップ、および組み合わされた生体材と本願の保存組成物とを凍結保存条件に供するステップを含む。本明細書に使用される際に、「凍結保存条件」とは、細胞を凍結保存するために本技術分野で有用であるものとして典型的に認識される、任意の一連の条件を指す。一実施形態では、凍結保存条件とは、凍結保存温度、または細胞内の生物活性を遅延もしくは停止するのに充分に０℃を下回る温度をもたらす環境を指すことがあり、上記活性としては、以下に限定されないが、細胞死に繋がるものとなる細胞内の生化学反応が挙げられる。具体的な実施形態では、凍結保存温度は、約０℃以下、約-２０℃以下、約-５０℃以下、約-６０℃以下、約-７０℃以下、約-８０℃以下、約-９０℃以下、約-１００℃以下、約-１１０℃以下、約-１２０℃以下、約-１３５℃以下、約-１９６℃以下、または液体窒素の温度を含む。
【０１２５】
本明細書に使用される際に、用語「凍結保存状態」とは、凍結保存温度にある状態を意味する。
【０１２６】
本願の開示に従う凍結乾燥および凍結保存を、生体材に適したいずれの方法で実施してもよい。本願の開示の上記の方法の凍結は、当技術分野に公知のいずれの方法または装置でも行うことができる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本願の方法は、生体材を緩やかに凍結することを含む。一実施形態では、緩やかに凍結するために、生体材を、最初に制御速度で-５０℃未満、-７０℃未満の温度、または-７０℃と-１００℃との間の温度に冷却し、その後、任意選択的に、例えば生体材を液体窒素（Ｎ２）に移すことによって、生体材をさらに冷却する。ある特定の実施形態では、制御速度とは、約-０．１℃／分と約-１０℃／分との間、約-０．２℃／分と約-５℃／分との間、または約１℃／分の冷却速度である。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、生体材を含む本凍結保存組成物を含有する凍結容器を、-７０℃と-１００℃との間、または-８０℃の温度で、ある期間（例えば一晩）置く。その後、容器を約-１９６ｏＣの液体窒素（Ｎ２）に移してもよい。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、生体材を含む本凍結保存組成物を含有する凍結容器を、-７０℃と-１００℃との間、または-８０℃の温度で、ある期間（例えば一晩）置く。その後、容器を約-１９６ｏＣの液体窒素（Ｎ２）に移してもよい。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本願の方法は、生体材の透化を含む。ある特定の実施形態では、本凍結保存組成物中の生体材を、次いで、約３０，０００〜約１００，０００，０００℃／分、約５０，０００℃／分以上、約１００，０００℃／分以上、約２００，０００℃／分以上、約３５０，０００℃／分以上、または約１，０００，０００℃／分以上の速度で冷却する。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本凍結保存組成物中の生体材を、-８０℃（例えばドライアイス）以下、-１００℃以下、-１９６℃（例えば液体窒素）、または-２０５℃（例えば、液体と固体の窒素の混合物であるスラッシュ窒素）の温度に曝露する。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、凍結保存または蘇生の過程の間、継続的な温度制御が与えてもよい。米国特許第９，４８５，９８４号。
【０１３３】
一実施形態では、本願の方法は、細胞を凍結保存する段階的な方法を含み、この方法は、細胞を第１の温度に冷却すること、その第１の温度で第１の期間保つこと、次いで、細胞を貯蔵するために細胞を第２の温度に冷却することを含む。
【０１３４】
一実施形態では、生体材（例えば細胞、ウイルス粒子など）を、本凍結保存組成物に懸濁し、そのように調製した懸濁液を、凍結用チューブ（例えば凍結チューブ、凍結バイアルなど）中に分配し、結果として得られるチューブを、直接的に超低温冷凍庫（例えば-８０℃）に置いて生体材を冷却する。一実施形態では、本凍結保存組成物中の生体材を、直接的に冷凍庫中-８０℃で凍結する。
【０１３５】
実施形態によっては、温度のランプアップおよび／またはランプダウンの速度が生体材の完全性を破綻させないように、ならびに解凍後に生体材の生存能または機能に不利な影響を及ぼさないように、凍結ステップおよび／または解凍ステップのパラメーターを最適化する。
【０１３６】
実施形態によっては、本凍結保存組成物中の生体材を、選択された温度低下の速度を有する温度ランプダウン相で冷却する。実施形態によっては、温度ランプダウン相での温度低下の速度は、分当たり約１０℃、分当たり約１℃、分当たり約２℃、分当たり約５℃、分当たり約７℃、分当たり約１２℃、分当たり約１５℃、分当たり約１７℃、分当たり約２０℃、または上記の値内の速度である。実施形態によっては、温度ランプダウン相は、およそ１０秒当たり１０℃、２０秒当たり１０℃、３０秒当たり１０℃、４０秒当たり１０℃、５０秒当たり１０℃、６０秒当たり１０℃、７０秒当たり１０℃、８０秒当たり１０℃、９０秒当たり１０℃、１００秒当たり１０℃、１１０秒当たり１０℃、１２０秒当たり１０℃、１３０秒当たり１０℃、１４０秒当たり１０℃、１５０秒当たり１０℃、１６０秒当たり１０℃、１７０秒当たり１０℃、１８０秒当たり１０℃、１９０秒当たり１℃、または２００秒当たり１０℃の速度で生体材を冷却することを含むことがある。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、温度ランプダウン相は、急速冷凍（例えば最大温度低下）のステップを含むことがある。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、本願の方法の凍結ステップは、非線形冷却を含む。非線形冷却の凍結保存のプロトコールは、バルク凍結ユニット、または低温電子顕微鏡装置、または所定の冷却プロファイルに従って細胞を冷却するようにプログラムできるプログラム可能なサーマルサイクラーを備えたものを含めた他の適した装置を用いて、実行することができる。
【０１３９】
一実施形態では、本願の方法の凍結ステップは、生体材を第１の温度に第１の期間冷却すること、次いで、その細胞を貯蔵するためにその細胞を第２の温度に冷却することを含む。一実施形態では、細胞を、約-３℃と-３０℃との間の温度に冷却し、その温度で１分から３０分間保ち、次いで、-６０℃を下回る温度に冷却して細胞を貯蔵する。米国特許第９，０７８，４２９号。
【０１４０】
一実施形態では、本方法は、細胞を凍結保存組成物中に配することと、本組成物に開始温度４℃を達成させることとを含む。細胞を含む本組成物がその開始温度を達成すると、その温度で約１５分間保たれる。次いで、本細胞組成物が約-３℃の温度を達成するまで、細胞を約-１℃／分の速度で冷却する。
【０１４１】
一実施形態では、本方法は、細胞を凍結保存組成物中に配することと、本組成物に開始温度４℃を達成させることとを含む。次いで、細胞を１℃／分の速度で４℃と-４５℃との間に冷却する。次いで、本組成物が約-４５℃の温度になれば、本細胞組成物が約-１２０℃の貯蔵温度を達成するまで、本組成物をさらに冷却する。
【０１４２】
一実施形態では、凍結保存での細胞懸濁液を、凍結チューブまたは凍結バイアルなどの中に分注し、次いで、それらを凍結容器中に置く。凍結容器を、４℃に約１時間移し、次いで、チャンバ内に約-８０℃で少なくとも１２時間または少なくとも２４時間置く。次いで、凍結チューブを液体窒素中に貯蔵する。
【０１４３】
実施形態によっては、生体材を任意選択的に、中間の貯蔵温度に所望の期間供する。中間の貯蔵温度は、約０℃から約-１００℃まで、約-５０℃から約-６０℃まで、約-６０℃から約-７０℃まで、約-７０℃から約-８０℃まで、約-８０℃から約-９０℃まで、約-９０℃から約-１００℃まで、およびそれらの重複する範囲に及ぶことがある。
【０１４４】
実施形態によっては、生体材を、ある期間にわたって中間の貯蔵温度で貯蔵した後、さらに長期の貯蔵に移してもよい。例えば、細胞を中間の貯蔵温度で一晩、または任意の他の適した期間維持した後、長期貯蔵のために液体窒素に移してもよい。他の温度を他の実施形態で使用してもよい（例えば、-２０℃、-３０℃、-４０℃、-５０℃、-６０℃などでの貯蔵）。いくつかの実施形態では、複数の（２種、３種、４種、５種またはそれを超える）中間貯蔵温度を用いる多段階「ステップダウン」手順を使用する。
【０１４５】
本凍結保存組成物中の生体材の凍結を、プログラム可能な冷凍庫を用いて行ってもよい。本凍結保存組成物中の生体材の凍結を、プログラム可能な冷凍庫を用いずに行ってもよい。
【０１４６】
凍結は、指向性凍結、定常性凍結などであることがある。
【０１４７】
凍結方法の非限定的な例としては、指向性凍結デバイスの使用、機械式冷凍庫の使用、ステップワイズ凍結装置の使用、スラッシュ凍結、極低温液中での凍結、速度制御冷凍庫中での凍結、液体浴冷凍庫の使用、空冷冷凍庫の使用、などが挙げられる。米国特許第５，８２７，７４１号および第６，７２３，４９７号。
【０１４８】
凍結保存状態を維持するように零下の温度を長期にわたって与えることのできる、いずれの凍結装置を使用してもよい。凍結および貯蔵は、同じ装置で実施してもよいし、第１の凍結装置を使用してから凍結試料を長期貯蔵装置に移してもよい。一実施形態では、液体窒素貯蔵ベッセルを使用する。ある特定の実施形態では、プログラム可能な速度制御式Ｐｌａｎｅｒ冷凍庫（Ｐｌａｎｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）などのさらに高度な冷却デバイスを含む、消極的な凍結方法を使用する。米国特許第８，５１２，９４１号。
【０１４９】
本凍結保存組成物中の生体材は、それらが必要とされるまで、任意の長さの期間にわたって凍結保存状態で貯蔵されてもよい。細胞が貯蔵温度にある場合、それらは、所望の期間、例えば約１〜５時間、約５〜１２時間、約１２〜２４時間、約２４〜４８時間、約４８時間、約１週間、約２週間、約３週間、約１か月、約２か月、約３か月、約６か月、約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、またはそれよりも長期などにわたって、貯蔵されることがある。米国特許出願公開第２０１７０２０２２１２号。
【０１５０】
解凍
生体材を保持するために適切な貯蔵条件は、生体材を生存可能に維持するような任意の条件を含む。そのような条件としては、約０℃以下、約-２０℃以下、約-５０℃以下、約-６０℃以下、約-７０℃以下、約-８０℃以下、約-９０℃以下、約-１００℃以下、約-１１０℃以下、約-１２０℃以下、約-１３５℃以下、約-１９６℃以下、または液体窒素中の凍結保存温度を挙げることができる。低温保存用には、温度を、８℃と０℃との間とすることができる。凍結乾燥試料の場合、湿気から材料を離しておく限り、温度は、０℃を超えるか（例えば室温、大気温など）または０℃を下回る任意の温度としてよい。
【０１５１】
生体材が必要とされるまで、何日か、何週間か、何か月か、または何年かの間、生体材を保存状態（例えば凍結保存状態）のままとすることができる。必要とされた際に、この凍結保存された生体材を取り出して解凍する。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、本願の方法は、凍結組成物を解凍するステップを、さらに具体的には細胞の生存能を維持する条件下で行うことをさらに含む。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、本凍結保存組成物中の生体材を、約４２℃以下、約１０℃から約４０℃まで、約２０℃から約３７℃まで、室温、または約３７℃の温度で、水浴中で解凍する（例えば、凍結チューブまたは凍結バイアルを水浴中に置くことによって）。
【０１５４】
一実施形態では、本凍結保存組成物中の生体材を、水浴中約３７℃で解凍する。任意選択的に、次いで、４℃や氷上などのさらに低い温度に移動させるものとする。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ステップアップ加熱速度（または温度ランプアップ加熱速度）を有した「ステップアップ」解凍プロセスを用いる。例えば、凍結バイアルを、温度増加を伴う順序立った貯蔵環境に置いた後、体温に近い温度、例えば３７℃前後の温度または他の任意の適した温度の水浴に移してもよい。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本凍結保存組成物中の凍結保存された生体材を、約５℃／分から約８０℃／分まで、約１０℃／分から約７０℃／分まで、約１０℃／分から約６０℃／分まで、約１０℃／分から約５０℃／分まで、約１０℃／分から約４０℃／分まで、約１０℃／分から約３０℃／分まで、約１０℃／分から約２０℃／分まで、約２０℃／分から約４０℃／分まで、約２０℃／分超、約２５℃／分超、約３０℃／分超、約３５℃／分超、約４０℃／分超、または約３０℃／分に及ぶ加温速度で解凍する。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、解凍後、生体材を洗浄し、適切な培地に懸濁し、研究適用または臨床適用での使用に必要となった際に処理する。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、解凍後、細胞を再培養のために培養ディッシュに移す。研究適用または臨床適用の前に、細胞を、適切な条件下で約３０分間、約１時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約８６時間、約１１０時間、約１週間、約２週間、または３週間超という期間にわたって培養してもよい。米国特許出願公開第２０１７０１９６２２１号。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、蘇生した接着細胞または半接着細胞を、解凍時に速やかに再懸濁する。そのようにして、蘇生した細胞は、負った損傷、例えば凍結保存前の培養から取り出される間の負傷を克服するための回復時間を与えられる。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、解凍後、培養ステップを間におかずに、生体材をｉｎ  ｖｉｖｏで使用する。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、解凍後、意図される使用に適した流体または他の培地に細胞を再懸濁してもよい。例えば、細胞を、任意の浸透圧支持溶液に再懸濁することができる。ある特定の実施形態では、細胞を、生理的に適合性のある緩衝液、例えば本明細書に記載される緩衝液溶液などに再懸濁することができる。好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの送達に便利な組成物をもたらすいずれの生理的に適合性のある材料も、細胞を再懸濁するのに用いることができる。
【０１６２】
凍結保存細胞の生存能
本願の組成物および方法によって、細胞の保存（例えば凍結保存）が可能になることがあり、その場合、細胞は、回復後に良好な生存能を維持する。保存は、保存の方法および生体材の性質に合わせるために選び得る数多くの異なるプロセスを用いて中止してもよく、そのようなものとしては、生体材の温度の上昇、凍結乾燥された生体材の加水、および／または溶質の除去が挙げられる。
【０１６３】
本明細書に使用される際に、用語「生存能」とは、生存可能な生体材（細胞、例えばＤＮＡおよび／または無傷の細胞膜系の存在に基づくものや、生存可能なウイルスなど）のパーセンテージを指す。ある特定の実施形態では、生存可能な生体材とは、いくらかの生存可能な細胞を含むか、または保存状態からの解除後に代謝的に活性であるかもしくは代謝的に活性となる細胞の画分を含む、生体材を指す。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、生体材（例えば細胞またはウイルス）の解凍後生存能は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、本願の組成物および方法によって、解凍後に細胞が限定量または最小の壊死およびアポトーシスを確実に示すようになる。ある特定の実施形態では、壊死および／またはアポトーシスは、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満の細胞に観察される。
【０１６６】
生存能は、当技術分野に公知の任意の方法によって測定することができる。ある特定の実施形態では、トリパンブルー内在化試験を用いて、またはヨウ化プロピジウムの取込みを測定することによって、生存能を測定する。ある特定の実施形態では、細胞が効率良く付着する能力をアッセイすることによって（例えば付着アッセイ）、生存能を測定する。ある特定の実施形態では、増殖アッセイを使用して、凍結保存後に付着細胞が予想通りに増殖できるか否かを決定することができる。付着および増殖の効率を、凍結保存を経ていない対照細胞と比較することができる。
【０１６７】
細胞の生存能および機能を決定するための、当技術分野に公知の様々な試験がある。ある特定の実施形態では、これらの試験は、細胞のタイプおよび細胞の所望の使用に依存する。
【０１６８】
幹細胞または前駆細胞については、本明細書に記載される方法によって、細胞がその多能性を確実に維持するようになることがある。これは、系列特異的なマーカーの発現を決定することによって確かめることができる。例えば、間葉系幹細胞の機能特性解析は、商業的に利用可能な分化キットを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脂肪、骨形成、および軟骨形成への分化の誘導と、脂肪、骨形成、および軟骨形成への分化能を標示するｍＲＮＡの系列特異的な発現を検出するためのＲＴ-ＰＣＲとを含むことがある。同様に、未分化幹細胞の質を、ｍＲＮＡの単離および細胞特異的マーカーの試験によって試験することができる。具体的な実施形態では、指定された系列の細胞に分化する能力が維持される、すなわち未処理細胞と大きな違いがない。胚性幹（ＥＳ）細胞の多能性は、技術分野に公知の方法を用いて試験することができ、そのようなものとしては、例えばＯｃｔ４-ＧＦＰの発現、アルカリホスファターゼの発現の上昇、およびＳＳＥＡ-１表面糖タンパク質の発現が挙げられる。いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を適用して、実験処理後の幹細胞の回復を評価することができる。これらの評価としては、以下に限定されないが、膜の完全性、代謝および他の機能アッセイおよび／または培養でのコロニー成長、ならびにＳＹＴＯ／ＥＢなどの蛍光アッセイが挙げられ得る。ある特定の実施形態では、分化試験、免疫表現型特性解析、および／または形態の精査を使用して、幹細胞および／または前駆細胞をアッセイしてもよい。
【０１６９】
接合子の凍結保存については、卵割速度を凍結保存後に決定し、対照群と比較して、凍結保存プロセス中の細胞損傷があるか否かを決定することができる。卵母細胞の生存能は、凍結保存後の細胞の形態学的特性を調べることによって決定することができる。形態学的に生存可能な卵母細胞は、無傷の透明帯および形質膜と屈折性の細胞質とを示すのに対し、生存可能ではない卵母細胞は、光学顕微鏡下で可視化した際に変性を呈する。卵母細胞の生存能および機能の究極の基準は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで健康な精子により受精し、続いて卵割、胚盤胞、および／または孵化もしくは胎仔の発達を生じる能力である。米国特許第９，５３８，７４５号。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、本願の保存組成物および方法、ならびに本願の保存組成物および方法を用いた保存から回復した生体材を、研究適用および／または臨床適用（例えば細胞療法、移植、再生医療、診断試験および遺伝子試験、サーベイランス用の細胞／組織バンキング、毒性試験、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精）に用いることができる。
【０１７１】
生体材
用語「生体材」とは、細胞、細胞凝集体、組織、器官、生体液、ウイルス粒子、および任意の他の膜性の実体、例えばリポソーム（天然または合成の）などを指す。
【０１７２】
いずれのタイプの細胞または組織も、本願の組成物および方法を用いて保存してよい。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、細胞とは、哺乳類細胞であり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ヒト細胞、マウス細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、ウマ細胞、およびウシ細胞が挙げられる。細胞は、絶滅危惧種（ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ  ｏｒ  ｔｈｒｅａｔｅｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の哺乳動物を由来とすることがある。細胞は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばオナガザル上科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａ  ｆａｍｉｌｙ）、ヒト上科（Ｈｏｍｉｎｏｉｄｅａ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）、キヌゲネズミ属（Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ  ｓｐｐ．）、ウマ属（Ｅｑｕｕｓ  ｓｐｐ．）［例えばウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）、ロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｓｉｎｕｓ）］、ウマ科（Ｅｑｕｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、コブウシ（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ）、ウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、スイギュウ（Ｂｕｂａｌｕｓ  ｂｕｂａｌｉｓ）、家畜ヤギ（Ｃａｐｒａ  ａｅｇａｇｒｕｓ  ｈｉｒｃｕｓ）、シカ科（Ｃｅｒｖｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、  シカ科（Ｃｅｒｖｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、ビッグホーン（Ｏｖｉｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、家畜ヤギ（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）、ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ゴールデンハムスター属（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ｓｐｐ．，）、ミンク（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｖｉｓｏｎ）、モルモット（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、シナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）、チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ  ｌａｎｉｇｅｒ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、クマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ  ｓｐｐ．）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、ウォーターバック属（Ｋｏｂｕｓ  ｓｐｐ．）、ヤケイ属（Ｇａｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、シチメンチョウ（Ｍｅｌｅａｇｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖｏ）、カモ科（Ａｎａｔｉｄａｅ  ｓｐｐ．）、フェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ）、イエバト（Ｃｏｌｕｍｂａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、カワラバト（Ｃｏｌｕｍｂａ  ｌｉｖｉａ）、ホロホロチョウ（Ｎｕｍｉｄａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｓ）、カモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ）、インドクジャク（Ｐａｖｏ  ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）、バイソン属（Ｂｉｓｏｎ  ｓｐｐ．）、ダチョウ属（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ  ｓｐｐ．）、リャマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、レア（Ｒｈｅａ  ｓｐｐ．）、Ｄｒｏｍｉｃｅｉｕｓ  ｓｐｐ．（エミュー属）、Ｌａｍａ  ｐａｃｏｓ（アルパカ）、トナカイ（Ｒａｎｇｉｆｅｒ  ｔａｒａｎｄｕｓ）、ヤク（Ｂｏｓ  ｇｒｕｎｎｉｅｎｓ）、フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）］、および任意の絶滅危惧種を由来とすることがある。
【０１７４】
本願の組成物および方法を、微生物、細菌、非哺乳動物細胞（例えば昆虫細胞、トリ細胞、魚細胞など）、または植物細胞を保存するのに使用してもよい。
【０１７５】
細胞の非限定的な例としては、幹細胞、前駆細胞、胚、精子、卵母細胞、生殖母細胞、および接合子が挙げられる。
【０１７６】
細胞は、腫瘍細胞でも非腫瘍細胞でもよい。一実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。
【０１７７】
生体材は、限定はないが、以下：線維芽細胞、幹細胞、前駆細胞、全血またはその画分、赤血球、白血球、臍帯血またはその画分、臍帯血細胞、骨髄、卵母細胞、精子、卵子、胚、軟骨、卵巣、心臓、皮膚、腎臓、肝臓、肺のうちいずれを含んでいてもよい。さらに、そのような生体材は、細胞生物を含んでいてもよく、それらは、真核生物であっても原核生物であってもよく、細菌、および酵母などを含む。さらに、生体材は、凍結保存を生き延びることのできる線虫などの全多細胞生物も含んでいてもよい。血液の画分は、血球（白および／または赤）、血漿および／または溶質および／または細胞内構成成分（例えば血小板などの細胞の画分、変性細胞の構成成分など）、タンパク質、脂質、抗体などを含む、いずれの血液の画分を含んでいてもよい。
【０１７８】
本願の組成物および方法を、いずれのタイプの細胞を保存するためにも使用してよく、そのようなものとしては、以下に限定されないが、組織および器官を由来とする細胞材が挙げられ、そのようなものとしては、以下に限定されないが、膵島細胞、軟骨細胞、神経由来の細胞、肝由来の細胞、眼由来の細胞、整形科由来の細胞、結合組織由来の細胞、生殖器由来の細胞、ならびに心臓および心血管由来の細胞が挙げられる。
【０１７９】
幹細胞としては、成人幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉系幹細胞、組織および器官または胎仔性および／もしくは胚性の供給源を含めた他の供給源を由来とする幹細胞、ならびに他の細胞とのおよび異なる供給源由来の幹細胞の混合物が挙げられる。成人幹細胞としては、骨髄幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、眼幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞などが挙げられる。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、内胚葉由来の幹細胞とは、肺上皮幹細胞、胃腸管幹細胞、膵臓幹細胞、または肝オーバル細胞、および／またはそれらの前駆細胞である。具体的な実施形態では、泌尿生殖器由来の細胞とは、乳腺および前立腺の幹細胞または卵巣および精巣の幹細胞のどちらかに分類される、および／またはそれらの前駆細胞である。具体的な実施形態では、中胚葉由来の細胞とは、骨髄細胞、造血幹細胞、間質幹細胞、または心筋幹細胞、および／またはそれらの前駆細胞である。具体的な実施形態では、外胚葉由来の細胞とは、神経幹細胞、皮膚幹細胞、または眼幹細胞、および／またはそれらの前駆細胞である。
【０１８１】
本願の開示の組成物および方法を用いて凍結保存され得る細胞のタイプとしては、例えば、分化細胞、例えば線維芽細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂ-細胞、Ｔ-細胞、赤血球、マクロファージ、単球、または筋細胞など；および未分化細胞、例えば胚性幹細胞、間葉系幹細胞、または成人幹細胞などが挙げられる。細胞は、１倍体、２倍体、または３倍体とすることができる。他の細胞としては、膀胱、脳、食道、卵管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、臍帯、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、または子宮から得られる細胞が挙げられる。
【０１８２】
さらに別の具体的な実施形態では、細胞は、成人の脳、骨髄、血管、骨格筋、皮膚、歯、心臓、腸、肝臓、または他の成人組織から得られる。具体的な実施形態では、細胞は、内胚葉、泌尿生殖器、中胚葉、または外胚葉の由来からなる群から選択される。
【０１８３】
組織としては、ヒト、動物、魚、甲殻類、および植物から得られる角膜、軟骨、骨、皮膚、心臓弁、ランゲルハンス島、胚、ならびにヒトおよび動物から得られる卵巣組織が挙げられる。本願の組成物および方法はまた、工学的に作られた組織および組織構築物を保存することがある。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、本願の組成物および方法は、生殖補助技術において卵母細胞または精子を凍結保存するために、または化学療法もしくは放射線療法を受ける患者のために、使用することができる。また、本方法は、幹細胞の凍結保存に使用することもでき、次いで、その幹細胞を、幹細胞療法、細胞移植、組織工学、および再生医療の基盤として使用することができる。また、本方法を使用して、稀少であるかやがて絶滅する危機にある動物から得られる卵母細胞または精子を、その種の保存のための生殖補助技術において将来的に使用するために、凍結保存することができる。本方法は、動物の畜産の目的に（例えば、動物の繁殖および飼育）に、例えば、ウシ、ブタや、ヒツジなどの動物から得られる胚性幹細胞、生殖母細胞、卵母細胞、または精子の凍結保存のために、さらに使用することができる。
【０１８５】
凍結保存された細胞は、種々の疾患の治療に有用である。例えば、いくつかの実施形態では、眼細胞を使用して眼疾患を治療するが、そのような疾患としては、以下に限定されないが、加齢性黄斑変性症（滲出型または萎縮型）、糖尿病性黄斑浮腫、特発性脈絡膜血管新生、または強度近視性黄斑変性症が挙げられる。いくつかの眼の実施形態では、ＲＰＥ細胞を使用する。いくつかの実施形態では、心筋幹細胞を使用して心血管障害を治療するが、そのような障害としては、例えば心筋梗塞、虚血性心組織損傷、うっ血性心不全、動脈瘤、アテローム性動脈硬化誘導性症状、脳血管発作（脳卒中）や、冠動脈疾患などがある。いくつかの実施形態では、肝幹細胞を使用して肝疾患を治療するが、そのような疾患としては、例えば肝炎、硬変、がんなどがある。他の組織、例えば腎臓、肺、膵臓、腸、骨および／または軟骨、ならびに神経組織における疾患は、とりわけ、本明細書に開示される方法およびデバイスを用いて治療されることがある。実施形態によっては、採取した骨髄幹細胞を使用して、白血病、がん、または血球数を低減する治療に起因して低減した造血細胞を再配置することがある。
【０１８６】
本願の開示はまた、様々な治療方法で有用である。細胞性療法または細胞療法は、一般に、損傷した組織および／または細胞を置き換えまたは修復するためのヒトまたは動物の細胞の移植を包含し得る。細胞療法は、関節の軟骨の損傷を再構築し、脊髄の傷害を修復し、弱まった免疫系を強化し、自己免疫疾患を治療し、アルツハイマー病、パーキンソン病や、てんかんなどの神経障害に罹った患者の助けとするために、使用されている。さらに別の使用としては、幅広い慢性状態、例えば動脈硬化、先天性欠損や、性機能不全などの治療が挙げられる。
【０１８７】
細胞療法は、典型的には、全細胞か細胞抽出物のどちらかを注射することを含み、この全細胞および細胞抽出物は、異種間、同種異系間（他のヒトのドナー由来）、または自己（細胞が同じ患者から取り出されて同じ患者内に移植により戻される）のものである。
【０１８８】
本願の組成物および方法は、後の細胞療法で使用するために細胞をある期間貯蔵するのに有用である場合の適用に、使用することができる。このようなものとしては、後の移植に用いる患者自身の細胞の貯蔵、ならびに一般的な細胞株（例えば、研究または治療で使用するための胚性幹細胞株）の貯蔵を挙げることができる。
【０１８９】
ウイルスまたはウイルス粒子は、任意のウイルスとすることができる。ある特定の実施形態では、ウイルスまたはウイルス粒子は、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスなどを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスまたはウイルス粒子は、遺伝子治療に使用されることがあるものである。
【０１９０】
キット
本願の開示はまた、本願の保存組成物を（本明細書に記載されるような固体または液体の形態で）含むキットを提供する。そのようなキットは、本願の保存組成物を含む１つまたは複数の容器を含むことがある。一実施形態では、本キットは、生体材を含む本願の保存組成物を含む。一実施形態では、本キットは、保存（例えば凍結保存）用の生体材を含む。
【０１９１】
実施形態によっては、本キットは、本明細書に記載される任意の方法での使用のための説明を含むことができる。一実施形態では、本キットは、本保存組成物および方法を用いる生体材の保存のための説明を含む。本キットは、対象がその治療を必要とするか否かを特定することに基づいて治療に適した対象を選択する記載を、さらに含むことがある。実施形態によっては、上記説明は、凍結保存後に解凍した生体材を、その治療を必要とする対象に投与する記載を含む。ある特定の実施形態では、本キットに供給される説明は、ラベルまたは添付文書にある説明書である。このラベルまたは添付文書はまた、生体材の臨床適用および／または研究適用を示すことがある。
【０１９２】
キットのパーツは、同時に使用してもよいし、時間の経過に沿ってずらして、すなわち異なる時点で、キットの任意の構成成分について均等または異なる時間間隔で使用してもよい。この時間間隔は、所望の効果を得るように選択することができる。
【０１９３】
本明細書に記載されるキットは、適したパッケージングとされる。適したパッケージングとしては、以下に限定されないが、バイアル（例えば凍結バイアル）、ボトル、アンプル、チューブ（例えば凍結チューブ）、バッグ、フラスコ、ジャー、フレキシブルパッケージなどが挙げられる。また想定されるのは、特定のデバイス、例えば凍結容器、凍結バイアル、および／または凍結チューブと組み合わせて使用するためのパッケージである。
【０１９４】
キットは、任意選択的に、緩衝液や説明的な情報などの追加の構成部分を提供することがある。通常、キットは、容器と、ラベルかまたは容器上もしくは容器に付属した添付文書とを含む。実施形態によっては、本開示は、上記に記載されたキットの内容を含む製品を提供する。
【０１９５】
以下は、本願発明の例であり、限定していると解釈されるものではない。
【０１９６】
実施例１
凍結溶液の調製
９つの凍結溶液のストック試料を調製した（表１）。アルブミンは、Ｋｅｄｒｉｏｎから購入したＨＳＡとした。ゼラチンは、Ｇｅｌｉｔａ（ゼラチンをウシの皮革から調製；バッチ番号Ｌ６００２１７）またはＮｉｐｐｉ（ゼラチンをウシ、ブタおよび／または魚などから調製；ロット番号Ｓ１５０８０６）から購入した。トレハロースは、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａから購入した。スクロースは、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。グリセロールは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍから購入した。ＰＥＧは、ＳＩＧＭＡから購入した。実施例の表中の様々な構成成分のパーセンテージは、％（ｗ／ｖ）である。
【０１９７】
これらの実験では、所望の作業用濃度の２倍の濃度で所望の剤をＤＭＥＭに溶解することによって、ストック凍結溶液を配合した。そのため、細胞懸濁液と１：１体積比で混合した後、所望の作業用濃度を得ることができる。同様に、３倍、４倍、または５倍の濃度の所望の作業用濃度を有したストック凍結溶液も、必要に応じて調製することができる。
【０１９８】
表１：２×ストック凍結溶液
【表１】
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【０１９９】
細胞の凍結
線維芽細胞を培養し、５日間拡大した。細胞が約８０〜９０％の集密度に到達した後、細胞をトリプシン処理してＤＭＥＭに懸濁した。５００μＬの細胞懸濁液（１０６細胞個／ｍＬ）を、凍結チューブ中で５００μＬの２×ストック凍結溶液と混合した。ＣＰＡ-１からＣＰＡ-９（異なる試料）において、凍結溶液の各構成成分の終濃度（作業用濃度）を表２に示す。対照試料はＤＭＥＭを含有する。
【０２００】
表２：凍結溶液の構成成分の作業用濃度
【表２】
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【０２０１】
凍結チューブを、次いで、イソプロパノールを含有する凍結容器［例えばＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ］に移し、-８０℃冷凍庫に１〜２日間貯蔵した。続いて、これらの凍結チューブを長期貯蔵のために、-８０℃冷凍庫から液体窒素貯蔵タンクに移した。
【０２０２】
細胞生存能試験
凍結チューブを３７℃の水浴中に２〜３分間配して、凍結保存細胞を解凍した。解凍した細胞懸濁液を穏やかに混合し、細胞の生存能をＡＤＡＭ-ＭＣ自動細胞カウンター（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ）によって分析した。
【０２０３】
結果
様々な細胞凍結溶液中の線維芽細胞の生存能を、表３および図１に示す。巨大分子、糖、および透過性凍結保護剤を含有する凍結保存組成物中で凍結保存された細胞は、ＤＭＥＭのみよりも高い生存能を維持した。
【０２０４】
表３  細胞の解凍後生存能
【表３】
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【０２０５】
実施例２
凍結保存溶液の様々な構成成分が細胞生存能に及ぼす効果を試験するために、表４に従って各種試料を調製した。
【０２０６】
表４
【表４】
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【０２０７】
２７種の凍結保存組成物を表７に従って調製し、その内訳は、９種のグループＩ凍結保存組成物、９種のグループＩＩ凍結保存組成物、および９種のグループＩＩＩ凍結保存組成物であった。
【０２０８】
凍結保存前の細胞の拡大
胎児皮膚線維芽細胞であるＦＥ００２-ＳＫ２細胞のチューブ２本（９継代；Ｐ９）を、以下の生存能を以て解凍した（表５）。
【０２０９】
表５
【表５】
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【０２１０】
チューブ２本からの細胞を組み合わせて、５本のＴ１５０細胞培養フラスコ（約４，６６６細胞個／ｃｍ２）に均等に分注した。２０ｍＬの細胞培養培地を細胞培養フラスコに添加して、細胞を培養した。
【０２１１】
細胞の回収
播種の約７日後、以下の生存能を以て細胞を回収した（表６）。
【０２１２】
表６
【表６】
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【０２１３】
５倍希釈する前に、元の細胞濃度を１．０８×１０６×５＝５．４×１０６細胞個／ｍＬとした。総細胞懸濁液を５．８ｍＬとした。２ｍＬの細胞培養培地を細胞に添加した。このようにして、細胞濃度を４×１０６細胞個／ｍＬに希釈した。総細胞懸濁液は７．８ｍＬであった。
【０２１４】
２００μＬの細胞懸濁液を、凍結チューブ中の２００μＬの各２×凍結保存組成物（表７）に添加した。細胞濃度は２×１０６細胞個／０．４ｍＬであった。
【０２１５】
凍結保存組成物と細胞混合物とを含む凍結チューブを、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（登録商標）凍結容器に置き、次いで、容器を-８０℃冷凍庫に一晩置いた。凍結チューブを長期貯蔵のために液体窒素タンクに移した。
【０２１６】
解凍後細胞の生存能
凍結チューブを３７℃の水浴中に置いて、細胞を解凍した。細胞の生存能をＡＤＡＭ-ＭＣ自動細胞カウンター（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ）によって分析した。簡単に述べれば、凍結チューブ１本を都度解凍し、混合物を５回ピペッティングして混合した。２０μＬの混合物を２０μＬの染色溶液と混合し、細胞カウンターを用いて計数した。
【０２１７】
表７  凍結保存組成物と解凍後細胞の生存能
【表７】
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【０２１８】
実施例では、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ-ＣＰＡ」、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ-１」、または「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ-２」は、透過性凍結保護剤（例えばグリセロール）、糖類（例えばトレハロース）、および巨大分子（例えばＨＳＡ）を含有する凍結保存組成物を指す。それらは本願の凍結保存組成物の実施形態である。「ＳＤ」は標準偏差を指す。「Ａｖｇ」は平均値を指す。
【０２１９】
実験の生データを表８に示す。
【０２２０】
表８
【表８】
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【０２２１】
ＣＰＡ-１からＣＰＡ-２７は異なる試料である。対照試料は、ＤＭＳＯ-１、ＤＭＳＯ-２、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ-１、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ-２である。
【０２２２】
考察
結果では、本願の凍結保存組成物の一実施形態（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ-ＣＰＡ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ-１、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ-２）を用いて凍結保存された細胞の解凍後生存能が８０％を上回り、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ-ＣＰＡ、ＤＭＳＯ-１、およびＤＭＳＯ-２）を含有する凍結保存組成物に匹敵するものであったことが示されている。
【０２２３】
結果ではさらに、３つの構成成分（巨大分子、糖、および透過性凍結保護剤）のうちいずれかを凍結保存組成物から除くかまたはその構成成分を最適でない濃度で使用すると、解凍後細胞の生存能が減少するようになることが示されている。
【０２２４】
例示的なシステムおよび方法は、以下の項目に規定される。
項目１：（１）約２％（ｗ／ｖ）から約４０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約１Ｍの糖類、および（３）約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）の巨大分子を含み、前記％（ｗ／ｖ）の単位およびＭの単位が、凍結保存組成物の総体積に基づく、凍結保存組成物。
項目２：前記透過性凍結保護剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはそれらの組合せを含む、項目１に記載の凍結保存組成物。
項目３：前記糖類が、スクロース、ソルビトール、グルコース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、マンノース、マルトース、またはそれらの組合せを含む、項目１、２のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目４：前記糖類が、スクロース、トレハロース、またはそれらの組合せを含む、項目１〜３のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目５：前記巨大分子が、約６５ｋＤａから約２００ｋＤａに及ぶ分子量を有する、項目１〜４のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目６：前記巨大分子が、アルブミン、ゼラチン、またはそれらの組合せを含む、項目１〜５のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目７：実質的にＤＭＳＯを含まない、項目１〜６のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目８：アミノ酸、サイトカイン、脂質、成長因子、抗生物剤、抗真菌剤、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、またはそれらの組合せをさらに含む、上記項目のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目９：１つまたは複数の細胞をさらに含む、項目１〜８のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目１０：凍結保存状態にある、項目１〜９のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目１１：前記細胞が、約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまでに及ぶ濃度で存在する、項目１〜１０のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目１２：（１）約２％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤、（２）約０．１Ｍから約０．５Ｍの糖類、および（３）約１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の巨大分子を含む、項目１〜１１のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目１３：１つまたは複数の細胞をさらに含む、項目１〜１２のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目１４：凍結保存状態である、項目１〜１３のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目１５：前記細胞が、約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまでに及ぶ濃度で存在する、項目１〜１４のいずれかに記載の凍結保存組成物。
項目１６：（ａ）１つまたは複数の細胞を凍結保存組成物と混合して、混合物を形成するステップと、（ｂ）前記混合物を凍結するステップとを含み、前記凍結保存組成物が、（１）２から４０％（ｗ／ｖ）の透過性凍結保護剤と、（２）０．１から１Ｍの糖類と、（３）１から１０％（ｗ／ｖ）の巨大分子とを含む、１つまたは複数の細胞を凍結保存するための方法。
項目１７：前記細胞が哺乳類細胞である、項目１６のいずれかに記載の方法。
項目１８：前記細胞が、ヒト、ブタ、イヌ、ウマ、またはウシの細胞である、項目１６、１７のいずれかに記載の方法。
項目１９：前記細胞が腫瘍細胞を含む、項目１６〜１８のいずれかに記載の方法。
項目２０：前記細胞が線維芽細胞を含む、項目１６〜１９のいずれかに記載の方法。
項目２１：前記細胞が幹細胞を含む、項目１６〜２０のいずれかに記載の方法。
項目２２：前記混合物が、約-７０℃から約-２００℃に及ぶ温度で凍結される、項目１６〜２１のいずれかに記載の方法。
項目２３：前記細胞が、前記混合物中に約１０５細胞個／ｍＬから約１０７細胞個／ｍＬまでに及ぶ濃度で存在する、項目１６〜２２のいずれかに記載の方法。
項目２４：前記凍結保存組成物が、実質的にＤＭＳＯを含まない、項目１６〜２３のいずれかに記載の方法。
項目２５：（ｃ）前記凍結混合物を解凍するステップをさらに含む、項目１６〜２４のいずれかに記載の方法。
項目２６：前記細胞が、少なくとも７０％の解凍後生存能を有する、項目１６〜２５のいずれかに記載の方法。
項目２７：前記細胞が、少なくとも８０％の解凍後生存能を有する、項目１６〜２６のいずれかに記載の方法。
項目２８．項目１〜１５のいずれかに記載の凍結保存組成物を含むキット。
【０２２５】
本願発明の範囲は、本明細書中の上記に具体的に示され記載されているものに限定されない。当業者は、描図にて例示された物質、構成、構造、および寸法の適切な代替があることを認識するものとなる。数々の参考文献が、特許および様々な刊行物を含めて、この発明の記載中に引用され議論されている。そのような参考文献の引用および議論は、本願発明の記載を明確にするために示されているに過ぎず、何らかの参考文献が本明細書に記載される発明の先行技術であることを自認するものではない。この明細書に引用され議論される全ての参考文献は、本明細書に参照によりその全体を組み込まれる。本明細書に記載されるものの変形、改変、および他の実施が、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく当業者に生じるものとなる。本願発明のある特定の実施形態が示され記載されている一方で、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく変化および改変が為されることが、当業者にいずれ明らかになる。上述の記載に規定される事柄は、説明として示されているに過ぎず、限定として示されるものではない。
【図１】
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【国際調査報告】
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