(57)【要約】サブビジブル（下位的可視）粒子サンプルの純度を定量化する方法である。分析すべきサンプルを電子顕微鏡に配置してサンプルの電子顕微鏡法による生物学的粒子の画像100を取得する。サンプルは対象物114を含む。主眼粒子120のサイズ範囲とは異なるサイズ、及び主眼粒子120のサイズ範囲内にあるサイズを有する対象物114を鮮鋭化させる。対象物114は、主眼粒子120又はデブリ106として検出される。検出した主眼粒子120は対象物114から除外し、これにより対象物114は、デブリ106を含むが、主眼粒子120を含まないようになる。検出されたデブリ106の第１総面積Ｔ１を測定する。検出された主眼粒子120の第２総面積Ｔ２を測定する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブビジブル粒子サンプルの純度を定量化する方法であって、
対象物（１１４）を含む分析すべきサンプルを電子顕微鏡に配置し、前記サンプルの電子顕微鏡法による画像（１００）を取得するステップと、
主眼粒子（１２０）のサイズ範囲とは異なるサイズ、及び主眼粒子（１２０）のサイズ範囲内にあるサイズを有する前記画像における前記対象物（１１４）を鮮鋭化するステップと、
前記画像における前記対象物（１１４）を主眼粒子（１２０）又はデブリ（１０６）として検出するステップと、
前記検出した主眼粒子（１２０）を前記対象物（１１４）から除外して、前記対象物（１１４）がデブリ（１０６）を含むが主眼粒子（１２０）含まないようにするステップと、
前記検出したデブリ（１０６）の第１総面積（Ｔ１）を測定するステップと、
前記検出した主眼粒子（１２０）の第２総面積（Ｔ２）を測定するステップと、
前記第１総面積（Ｔ１）対前記第２総面積（Ｔ２）の比を計算して、前記サンプルの純度の定量的測定を決定するステップと、
を備える、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、さらに、前記画像における主眼粒子（１２０）のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物（１１６）のエッジを鮮鋭化するステップと、及び前記対象物（１１６）の丸みを解析して主眼粒子（１２０）を同定するステップとを備える、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、さらに、前記画像における主眼粒子（１２０）のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物（１１６）のエッジを鮮鋭化するステップと、及び前記対象物（１１６）の半径方向における密度プロファイルを解析して主眼粒子（１２０）を同定するステップと、を備える、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、さらに、前記画像における主眼粒子（１２０）のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物（１１６）のエッジを鮮鋭化するステップと、及び前記対象物（１１６）の直ぐ外側における平均濃淡度に対する前記対象物の内側における平均濃淡度を測定することによって前記対象物（１１６）の境界における信号対ノイズ比を解析して主眼粒子（１２０）を同定するステップと、を備える、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、さらに、前記画像における主眼粒子（１２０）のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物（１１６）のエッジを鮮鋭化するステップと、及び前記対象物のエッジの鮮明度を解析することによって前記対象物（１１６）の局所的コントラストを解析するステップと、を備える、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、さらに、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を含むサンプルを前記電子顕微鏡に配置するステップを備える、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、さらに、２つの平滑化フィルタで前記画像をフィルタ処理して、第１フィルタ処理済み画像及び第２フィルタ処理済み画像を生成するステップと、及び前記第２フィルタ処理済み画像から前記第１フィルタ処理済み画像を差し引くステップと、を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子顕微鏡法を使用することによりサンプルがどの程度の純度であるかを検定評価しまた定量的に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物医薬品の開発及び生産は、一般的には、細胞デブリ（残屑）、破損粒子、他の汚染物及びクラスター等を除去して、最終製品が望ましい主眼粒子のみを含むことになるようにすべき数段階の精製ステップを伴う。関心対象である主眼粒子の最終製品における純度及び分散は製品の品質及び有効性にとって重要である。したがって、定量的に純度を評価することは、最終製品にとって重要であるが、上流の開発及び生産プロセス中にも各精製ステップの有効性及び効果を評価するのが重要である。電子顕微鏡法は、サンプルにおける関心対象粒子（主眼粒子）、並びに望ましくないデブリ、汚染物及びクラスターを同定するのに十分な解像度でサブビジブル（下位的可視）粒子を画像化できる方法である。ウイルス粒子、ウイルス様粒子、無機ビーズ及び他のナノ粒子のようなサブビジブル粒子のサンプル、並びに液状サンプルからのマイクロ粒子がどの位の純度であるかの客観的で定量的な測定は多くのプロセスで重要である。例えば、改造ウイルスベクターは、遺伝子治療用途で一般的に使用されており、また改造ウイルス粒子はワクチンとして使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、純度を定量的に検定評価する現行の利用可能方法は極めて正確であるとは言えず、また最終結果を歪めるおそれがある手作業のステップを伴うことがよくある。したがって、サブビジブル主眼粒子及び汚染物／デブリを含む液体サンプルの純度を検定評価及び測定するためのより効果的で信頼性の高い方法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の方法は、上述の問題に対する解決法を提供する。とくに、本発明方法は、サブビジブル粒子サンプルの純度を定量化する方法である。分析すべきサンプルの電子顕微鏡法による画像を取得するようサンプルを電子顕微鏡に配置する。サンプルは主眼粒子並びにデブリの対象物を含む。デブリは、主眼粒子の破損断片又はパーツ（亜粒子）、及び／又は汚染物、及び／又は主眼粒子若しくはデブリのクラスター若しくは凝集体、及び／又は生成段階からの使い残し材料であり得る。画像における対象物は、鮮鋭化され、また主眼粒子のサイズ範囲とは異なるサイズ、及び主眼粒子のサイズ範囲内にあるサイズを有する。画像における対象物は主眼粒子又はデブリとして検出する。検出された主眼粒子は対象物から除外して、対象物がデブリを含むが主眼粒子含まないようにする。検出したデブリの第１総面積（Ｔ１）を測定する。検出した主眼粒子の第２総面積（Ｔ２）を測定する。第１総面積（Ｔ１）対前記第２総面積（Ｔ２）の比を計算して、サンプルの純度の定量的測定を決定する。
【０００５】
他の実施形態において、画像における主眼粒子のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物のエッジを鮮鋭化する。この対象物の丸みを解析して主眼粒子を同定する。
【０００６】
他の実施形態において、画像における主眼粒子の形状にほぼ類似する形状を有する対象物を主眼粒子として同定する。
【０００７】
他の実施形態において、画像における主眼粒子のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物のエッジを鮮鋭化し、また該対象物の半径方向における密度プロファイルを解析して主眼粒子を同定する。
【０００８】
さらに他の実施形態において、画像における主眼粒子のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物のエッジを鮮鋭化し、また該対象物の直ぐ外側における平均濃淡度に対する該対象物の内側における平均濃淡度を測定することによって該対象物の境界における信号対ノイズ比を解析して主眼粒子を同定する。
【０００９】
他の実施形態において、画像における主眼粒子のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物のエッジを鮮鋭化し、また該対象物の外側エッジの鮮明度を解析することによって該対象物の局所的コントラストを測定する。
【００１０】
他の実施形態において、画像における主眼粒子のサイズ範囲にほぼ類似するサイズを有する対象物のエッジを鮮鋭化し、また該対象物の構造をテクスチャ解析によって測定して主眼粒子を同定する。
【００１１】
他の実施形態において、画像における対象物の構造をテクスチャ解析によって測定して主眼粒子を同定する。
【００１２】
他の実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を含むサンプルを電子顕微鏡に配置する。
【００１３】
さらに他の実施形態において、２つの平滑化フィルタで画像をフィルタ処理して、第１フィルタ処理済み画像及び第２フィルタ処理済み画像を生成し、また前記第２フィルタ処理済み画像から前記第１フィルタ処理済み画像を差し引く。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】溶液中のネガティブ染色した生物学的粒子サンプルの透過電子画像である。
【図２】ガウシアン差分の使用で微妙エッジを鮮鋭化した後の結果を示す画像である。
【図３】図２に示す画像で特異的検出法を用いることによって検出した主眼対象物の画像である。
【図４】元画像に対してガウシアン差分を用いて典型的デブリサイズである対象物を鮮鋭化した後の結果を示す画像である。
【図５】対象物を鮮鋭化した画像の閾値化後の結果を示す画像である。
【図６】主眼粒子に対応する対象物を除外した後の結果を示す画像である。
【図７】主眼粒子及びデブリの双方を含む最終結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、溶液内におけるサブビジブル粒子又はナノ粒子（例えば、約１００ｎｍのサイズ）を含むサンプルの純度を定量的に測定する独特の方法であって、サンプルの電子顕微鏡法による画像における自動的かつ客観的な画像解析に基づく。サンプルは、例えば、液体、溶解固体、又は粉体のサンプルであり得る。
【００１６】
ネガティブ染色透過電子顕微鏡法による画像を使用することができる。概して、本発明の純度測定は、好適には、主眼粒子対非主眼粒子（小デブリ並びに大デブリのクラスターを含む）の面積比である。本発明方法の要素ステップは以下の通り、すなわち、
1.  分析すべきサンプルを電子顕微鏡に配置し、該サンプルの電子顕微鏡法による画像を取得するステップ、
2.  該画像における主眼粒子として典型的なサイズを有する主眼粒子のエッジ（例えば、微妙エッジ）を鮮鋭化するステップ、
3.  特定主眼粒子を同定し得る方法を用いて該画像におけるすべての主眼粒子を特異的に検出するステップ、
4.  該画像におけるデブリクラスター及び汚染物として典型的なサイズの対象物を鮮鋭化するステップ、
5.  ステップ４で鮮鋭化した対象物のすべてを、例えば閾値化方法を用いて検出するステップ、
6.  検出した鮮鋭化済み対象物から同定済み主眼粒子を除外する（差し引く）ステップ、
7.  ステップ６からの検出済みで残存するデブリクラスター及び汚染物の総面積を測定するステップ、
8.  ステップ３で検出された検出済み主眼粒子の総面積を測定するステップ、及び
9.  ステップ７から結果として得られる面積対ステップ８から結果として得られる面積の比を計算するステップ
である。
【００１７】
代表的な実施例の画像１００を図１に示し、またステップ２〜６を図２〜６に示す。図７は、最終結果１０２、すなわち、主眼粒子１２０及びデブリ対象物１０６を示す。主眼粒子１２０及びデブリ対象物１０６の測定面積は、それぞれステップ７〜９で使用し、純度の度合いを導き出す。
【００１８】
より具体的には、図１は、溶液におけるネガティブ染色した生物学的粒子サンプルの透過電子顕微鏡法による画像１００である。生物学的粒子は、ウイルス粒子又は他の有機粒子とすることができる。無機粒子を含むサンプルも本発明による方法で分析することができる。ガウシアン差分又は任意な他の適当な方法のような適切な方法を用いて、例えば、分析すべき主眼粒子（ステップ２）にとって典型的なサイズを有する画像における対象物１１６の微妙エッジ（又はコントラスト／希薄領域）を鮮鋭化する（ステップ２）ことができる。図２は、ガウシアン差分を使用して同定した対象物１１６の微妙エッジを鮮鋭化した後における結果１０５を示す。同定した対象物１１６は、大部分は主眼粒子であるが、幾分かの望ましくないデブリ及び汚染物１０６を含み得る（以下により詳細に説明する）。或るタイプのウイルス粒子は１００ｎｍサイズであることが予想されることがあり、したがって、それとは大幅に異なるサイズを有する粒子は、ほとんど主眼粒子ではなく、望ましくないデブリ粒子１０６となり得る。ステップ２における解析は粒子全体のサイズには限定されないことに留意されたい。所望主眼粒子に固有な主眼粒子構造部分、例えば、粒子の模様（パターン）又は外側エッジの濃さに注目することもできる。この場合、粒子の模様又は外側エッジの濃さのような粒子の固有部分を鮮鋭化することができる。
【００１９】
画像における選択した粒子又は主眼粒子の微妙エッジの鮮鋭化（例えば、ガウシアン差分の使用による）は予想外に驚くほど良好な結果をもたらした。例えば、染色生物学的サンプル（例えば、ウイルス粒子）は、サンプルの異なる部分における、並びに異なるサイズの対象物／粒子の周囲における染色の異なる濃さに起因して、画像における対象物／粒子周りの異なる染色量を生ずる結果となる。染色量（濃さ）及びひいてはグリッドのどの部分で純度度合いを計算するかは、純度度合いに直接影響し、また測定の適正さを低下させることがあり得る。上述したように、画像における選択したサイズ範囲にあるエッジ又は対象物は、例えばガウシアン差分手法の使用で鮮鋭化する。当然のことながら、他のエッジ又は対象物鮮鋭化手法を使用することもできる。ガウシアン差分方法において、画像を２つのガウシアン平滑化フィルタ（異なる平滑化係数シグマを有する）でフィルタ処理する。次に１つのフィルタ処理済み画像を、例えば或るサイズの鮮鋭化エッジ又は鮮鋭化対象物を有する画像が得られる結果となる他の画像から差し引く処理をする。その結果は部分的に使用する平滑化係数の組合せに依存する。次に主眼粒子、デブリ及び汚染物が検出されるのは、これら修正画像においてである。上述したように、エッジ／対象物鮮鋭化ステップは、染色の異なる量及び不均一分布の影響を減少する。この重要かつ革新的なステップは、ウイルス粒子及び他の粒子の生物学的サンプルを分析するときのように不均一染色が問題となる用途／ケースで必要である。無機材料／粒子のみを含むサンプルにおいて、エッジ鮮鋭化ステップは排除することができる。さらに、ステップ４による鮮鋭化後にすべての対象物を検出する前に、例えば、エッジ濃さ又はパターンのような或る選択されたサイズ又は特性を有する対象物（すなわち、ステップ２／３における主眼粒子）を鮮鋭化することは、画像における不均一な背景カラーリング及びライティングの問題を軽減し、そうでない場合には対象物境界の間違った位置決めをもたらすことになり易く、また対象物を誤って若しくは不適正に喪失又は検出する結果とさえなり易い。換言すれば、ステップ２での鮮鋭化は、顕微鏡からの変動する背景色及びライティングを考慮して主眼粒子を同定し易くする。例えば、鮮鋭化は、画像の若干のセグメントにおけるより明るい色の影響及び明度勾配の影響を排除又は軽減する。
【００２０】
しかし、望ましくないデブリ及び汚染物粒子の幾分かは、分析すべき主眼粒子のサイズに類似するサイズを有することがあり得る。換言すれば、ステップ２における鮮鋭化は、主眼粒子に類似するサイズを有する又は主眼粒子に類似の他の特性を有するが、主眼粒子ではない粒子を鮮鋭化することがあり得る。このとき、ステップ２における鮮鋭化した対象物をさらに解析する必要があり、この解析は、例えば、主眼粒子のサイズ範囲内にあるサイズを有することがあり得るデブリから主眼粒子１２０を同定及び区別するため、オブジェクト１１６の形状又は丸みを解析することにより行う。このことはステップ３で行い（この結果１０７を図３に示す）、ステップ２で同定した図２に示すような粒子／対象物の半径方向の対称性を解析するというような検出方法を用いて検出された主眼粒子１２０を同定する。
【００２１】
本発明方法及び定量的純度度合いを客観性（すなわち、ユーザー偏見が入らない）及び確実性のあるものにするため、本発明方法のステップは、主眼粒子のおおよそのサイズ、並びに非主眼粒子／対象物（デブリ及びクラスター）の上限及び下限を選択することのみを与えるユーザー入力で自動的に実施するのが好ましい。本発明の重要な態様は、非主眼粒子／対象物から主眼粒子を自動的に区別する能力である。ステップ３につき説明したように、円形の主眼粒子（ウイルスベクター）は、例えば、円形対称特性、又は主眼粒子１２０を特異的に検出する他の方法に基づいて検出することができる。例えば、半径方向対称性のウイルス粒子構造はグレイ階調レベルプロファイルに変換することができる。そのプロファイルは、ウイルス粒子構造の周縁又はシェルに向かって中心から離れる各距離での平均グレイ階調レベルを計算することによって構造を記述するのに使用することができる。さらに、グレイ階調スケールに頼る代わりに、ウイルス粒子構造又は形状を記述する数学アルゴリズムを開発することもできる。
【００２２】
本発明方法の重要な特徴は、グレイ階調スケールプロファイルに基づいてウイルス粒子を客観的に記述するテンプレートを作成できる点である。これらテンプレートは数学的方法を使用しても作成することができる。このようにして、サイズ範囲内における検出した対象物のすべてを、典型的な主眼粒子を表すプロファイル又はテンプレートと比較し、検出した対象物がプロファイル／テンプレートに十分類似する場合に真の主眼粒子１２０として分類すべきと決定するのにプロファイル／テンプレートを使用する。さらに、ステップ３において、例えば、楕円状、ロッド状又は結晶状の形状を検出する方法のような他の方法を使用して、主眼粒子１２０を同定することもできる。
【００２３】
ウイルス粒子についての言及は単に実施例であり、本発明はウイルス粒子に限定されるものではないと理解されたい。さらに、粒子の円形度／丸みについての言及は単に実施例であり、固有パターン、固有形状及び対象物表面のような他の特性も使用することができる。
【００２４】
主眼粒子１２０の特異的検出に関連する（また主眼粒子に類似するサイズを有する非主眼粒子を排除するための）ステップ３に関して、対象物１１６の境界における信号対ノイズ比又は局所的コントラストを使用する追加のステップを備えることができる。このことは、主眼粒子１２０の検出及びどれが主眼粒子であるか否かに関する自動判定を改善するために行われる。信号対ノイズ比は、好適には、粒子の直ぐ外側における平均濃淡度に比較して粒子内部における平均濃淡度として測定される。局所的コントラスト手法は、主眼粒子か否かを決定できる上で粒子の外側又は内側のエッジの鮮明さがどの程度良好であるかを解析するのに使用することができる。またステップ３に関し、非球形の粒子に対しては、主眼粒子１２０の固有形状又は他の特性、例えばテクスチャ（粒子表面におけるパターン）の検出用に設計された他の方法を使用することができる。
【００２５】
次のステップは、サンプル内における望ましくないデブリ及び汚染物を検出することである。図４は対象物を元画像で鮮鋭化した後の結果１０８を示す。１つの問題は、ステップ４での解析及び鮮鋭化は、ステップ３で同定された主眼粒子１２０の幾つか又はすべてを同定しなければならない、また含んでいる点である。ステップ４において、画像におけるすべての対象物１１４は、例えば、ガウシアン法の差分を使用して鮮鋭化する。デブリ及びクラスターは、例えば、大津閾値化方法のような（自動）濃淡度閾値化法によって検出することができる。手動で濃淡度閾値を選択することはうまく機能しもするが、望ましくないユーザー偏見が入り込み易い。
【００２６】
好適には、デブリ／汚染物は任意な形状及び色を有する場合があり得るので、対象物１１４は、デブリクラスター及び汚染物に典型的な所定サイズ範囲に注目することで同定できる。先ず、デブリ及び汚染物に典型的であるが主眼粒子よりも小さいサイズの対象物に注目し、次に主眼粒子よりも大きいサイズの対象物に注目することができる。好適には、対象物１１４の濃淡度を解析してデブリ及び汚染物を含む領域又は面積を同定する。
【００２７】
このようにして、画像におけるすべての鮮鋭化した対象物１１４をステップ５で検出し、またその結果１１０を図５に示す。換言すれば、ステップ４で使用される同定方法は、主眼粒子１２０を除外する上で十分に特異的ではなく、デブリ粒子及び主眼粒子の幾つか又はすべての双方とも対象物１１４として同定され、このことは結果１１０で示される。
【００２８】
ステップ６において、ステップ３で同定され、また対象物１１４に含まれている同定済み主眼粒子１２０を、図５に示される対象物１１４から除外する又は差し引く処理をし、これにより検出されたデブリ及び汚染物１０６を図６の結果１１２に示す。これは、ステップ５で使用した鮮鋭化方法の結果として対象物１１４に含まれていたことになっていたいかなる主眼粒子も除外されることを意味し、これにより結果１１２はデブリ及び汚染物粒子１０６のみを示す。
【００２９】
ステップ７において、ステップ６の後、すなわち、主眼粒子を除外した後の残存対象物又はデブリ１０６の総面積Ｔ１を測定する。ステップ８において、図３に示すような検出された主眼粒子１２０の総面積Ｔ２を測定する。ステップ９において、ステップ７及びステップ８それぞれの後に結果として得られた面積の比Ｒを計算する。
【００３０】
主眼粒子対他の粒子の面積比として純度を定量化する上述の手法は堅牢性がある。少数の誤検出された又は喪失された主眼粒子は無視できる程度しか結果に影響せず、これはすなわち、測定が、サンプルをはっきりと示す、好適には、自動化画像取得（ユーザー偏見のない）又は手動取得した画像から得られる多数の画像に基づくものであるからである。
【００３１】
本発明は、好適な構成及び実施形態に基づいて説明したが、本発明の精神及び特許請求の範囲から逸脱することなく若干の置換及び変更を加えることができると理解されたい。
【符号の説明】
【００３２】
１００    画像
１０２    最終結果
１０５    （ステップ２の）結果
１０６    デブリ対象物
１０７    （ステップ３の）結果
１０８    （ステップ４の）結果
１１０    （ステップ５の）結果
１１２    （ステップ６の）結果
１１４    対象物１１４
１１６    対象物
１２０    主眼粒子１２０
【図１】
2019532253.tif 000003
【図２】
2019532253.tif 000004
【図３】
2019532253.tif 000005
【図４】
2019532253.tif 000006
【図５】
2019532253.tif 000007
【図６】
2019532253.tif 000008
【図７】
2019532253.tif 000009
【国際調査報告】
2019532253.tif 000010