(57)【要約】  本発明は、極地方に生息する新規菌株のＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）由来の菌体外多糖及びこれを含有する細胞の凍結保護用組成物に関し、本発明の菌体外多糖は、凍結保存時に優れた細胞凍結保護能を有し、細胞毒性を示さず、既存の高濃度で細胞毒性を示した凍結保護剤に代替することができる。
2019530471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）によって生産され、グルコースとガラクトースで構成されている、菌体外多糖。
【請求項２】
前記グルコースと前記ガラクトースとのモル比が、約３．４：１である、請求項１に記載の菌体外多糖。
【請求項３】
請求項１の菌体外多糖を加水分解して得られる、１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａの分子量を持つ、菌体外多糖。
【請求項４】
請求項１または３に記載の菌体外多糖を含有する、細胞の凍結保護のための組成物。
【請求項５】
グリセロールまたはＤＭＳＯをさらに含有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の菌体外多糖を製造する方法であって、
（ａ）Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）を培養して菌体外多糖を生成させる工程；および
（ｂ）生成された菌体外多糖を回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の菌体外多糖を加水分解する工程を含んでなる、請求項３に記載の１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａの分子量を持つ菌体外多糖を製造する方法。
【請求項８】
請求項１または３の菌体外多糖を利用する、細胞を凍結保存する方法。
【請求項９】
粘液性菌体外多糖を生産する能力を有する、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極地方に生息する新規菌株であるＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株由来の菌体外多糖に関し、さらに詳しくは、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株由来の菌体外多糖及びこれを含有する細胞の凍結保護用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
海洋環境に生息する細菌の多くの種類は、菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅｓ、ＥＰＳ）という粘性の細胞外炭化水素ポリマーを分泌する。海洋細菌が生産する殆どのＥＰＳは、６炭糖、５炭糖、アミノ糖またはｕｒｏｎｉｃ酸などの３または４種類の単糖が１０個以上のグループで構成された繰り返し単位からなるヘテロ多糖（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅｓ）である。ＥＰＳは、微生物を寒い環境で保護する役割をし、極地方の寒い環境の細菌が分泌するＥＰＳは、新たな構造と凍結防止能を有することが多い。
【０００３】
北極海のバクテリアであるＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＭ２０３１０と南極のバクテリアであるＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｃｔｉｃａ  ＫＯＰＲＩ  ２１６５３から分泌されるＥＰＳは、非極地方のバクテリアである大腸菌の凍結融解周期（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｅ）に対する生存力を向上させることが確認され、これらの細菌のＥＰＳを凍結保護剤（ＣＰＡｓ）として使用可能なことが提示されている（Ｌｉｕ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７９：２２４、２０１３；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．＆Ｙｉｍ，Ｊ．Ｈ．、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４５：５１０、２００７）。
【０００４】
氷の形成と成長は、細胞水準で物理的な損傷をもたらすだけでなく、溶液内の水体積を減少させて、細胞外溶液の濃度増加による浸透圧ショックをもたらし、これは、氷点以下の気温で生物学的物質を保管する際に問題となる。
【０００５】
再生医学科における臓器移植が急速に増えながら、供与細胞、組織、臓器及び赤血球（ＲＢＣ）の凍結保存の必要性が増加している。一般的にパッキングされた血液は、凍結保存せずＡＤＳＯＬのような複合等張溶液で４℃の条件で４２日間保管され、溶血現象が高い割合で起こる。これは、グリセロールを凍結保護剤として使用して解決可能であるが、４０％ｗ／ｖ以上の高濃度のグリセロールを添加し、１℃／分の冷却速度で非常にゆっくり冷却させて−８０℃で保管すればこそ、高い赤血球回復能を保つことができる。
【０００６】
しかし、グリセロールは、解凍後の洗浄を通じて１％以下に希釈されなければ細胞に毒性がなくならず、このようなグリセロールの短所を克服するために、トレハロース、スクロース、グルコース、ラフィノース、マルトースなどの低分子糖を含む他の凍結保護剤を使用する試みが続けられているが、このような方法は、浸透圧や酸化などの問題により、赤血球の最終凍結効果に影響を及ぼす可能性がある。解凍後の複雑な洗浄過程を単純化するために、グリセロールに代わり、ＨＥＳ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｓｔａｒｃｈ）、ポリビニルピロリドン及びデキストランのような非浸透性添加剤を使用する方法が試みられている（Ｓｃｏｔｔ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．、１９：１２７、２００５；Ｓｔｏｌｚｉｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｃｉ．、４６：１３７、２０１２；Ｅ．Ｐ．Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．、８５：７３９、１９９７）。このようなポリマーは、細胞膜を透過できず、細胞膜の外部のみに存在するため、赤血球の凍結後の解凍時における複雑な洗浄過程が不要である。しかし、赤血球の凍結保存のためには、２０％ｗ／ｖ以上の高濃度のＨＥＳ溶液が要求され、このような高濃度は、高い粘性をもたらし、凍結過程をハンドリングするのに困難を来たす。
【０００７】
そこで、本発明者らは、非浸透性でかつ細胞毒性が低く、優れた凍結保護効果を有する凍結保護剤を探すために鋭意努力した結果、南極の海洋に生息する新規菌株のＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）が生産する菌体外多糖（ＥＰＳ）を赤血球の凍結保存時に添加する場合、他の凍結保護剤（ＣＰＡｓ：Ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ）に比べて相対的に低い濃度で優れた凍結保護効果を表し、細胞毒性が表れないことを確認して、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、細胞に対する凍結保護能を有するＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）由来の菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１）及びその製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、Ｓｔｒａｉｎ  ＣＹ０１由来の菌体外多糖を加水分解して得られる１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａの分子量を持つ菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）及びその製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、前記菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１またはｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）を含有する細胞の凍結保護用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、前記菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１またはｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）を利用することを特徴とする細胞の凍結保存方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、極地方で生息し、菌体外多糖を生成するＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  ＣＹ０１（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）によって生産され、グルコースとガラクトースで構成されている菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１）を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１）を加水分解して得られる１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａの分子量を持つ菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、前記菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１またはｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）を含有する細胞の凍結保護用組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、（ａ）Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）を培養して菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１）を生成させる段階と、（ｂ）前記生成された菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１）を回収する工程とを含むＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  ＣＹ０１（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）によって生産され、グルコースとガラクトースで構成されている菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１）の製造方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  ＣＹ０１（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）によって生産され、グルコースとガラクトースで構成されている菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１）を加水分解する段階を含む１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａの分子量を持つ菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）の製造方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、前記菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）を利用することを特徴とする細胞の凍結保存方法を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、粘液性菌体外多糖を生産する能力を持つＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】分離された１０個菌株のＥＰＳ生産能と凍結保護効果を示すもので、白い棒は生産されたＥＰＳを示し、黒い棒はＥＰＳの大腸菌に対する凍結保護効果（％）を示す。標準偏差（±ＳＤ）は、３回の繰り返し実験を通じて示す。
【図２】ＣＹ０１菌株の１６ｓＲＮＡ配列を利用した系統分析を行った結果を示す。
【図３】ＣＹ０１由来ＥＰＳのクロマトグラフィーピークを示すもので、Ａは、アニオンクロマトグラフィー結果を示し、Ｂは、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図４】ゲル濾過カラムクロマトグラフィーで得られたＣＹ０１由来のＥＰＳ分画の純粋性をＨＰＬＣで確認した結果を示す。
【図５】Ａは、ＥＰＳの構成糖成分をＧＳ／ＭＳで確認した結果を示し、Ｂは、ＥＰＳの構成糖の結合様式をＧＣ／ＭＳで確認した結果を示す。
【図６】Ａ、Ｂは、ｐ−ＣＹ０１を低分子化して得られたｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの１Ｈ  ａｎｄ  １３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを確認した結果を示す。
【図７】Ａ、Ｂは、低分子化して得られたｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの２Ｄ−ＨＳＱＣスペクトルでｐｒｏｔｏｎ−ｃａｒｂｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを確認した結果であり、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆは、２Ｄ−ＴＯＣＳＹ、２Ｄ−ＣＯＳＹ、２Ｄ−ＨＭＢＣ、２Ｄ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）のスペクトルを示す。
【図８】前記ＧＣ／ＭＳとＮＭＲ分析結果に基づいてｐ−ＣＹ０１の主要構造を分析した結果を示す。
【図９】Ａは、ｐ−ＣＹ０１と酸分解処理して低分子化されたｐ−ＣＹ０１＿ＬＭとの大きさ排除のクロマトグラフィー結果を示し、Ｂは、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液の流動学的性質の変化を確認した結果を示す。＃はｐ−ＣＹ０１を、＊はｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを示す。
【図１０】Ａは、凍結保存液内のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの濃度が増加することによる赤血球溶血率（％）を示し、Ｂは、２．５％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で凍結保存後に解凍された赤血球の完全率を顕微鏡で確認したものであり、Ｃは、ＰＢＳ溶液で凍結保存後に解凍された赤血球の完全率を確認したものであり、Ｄは、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で長期間凍結保存後に解凍した赤血球の溶血率を示すものである。黒い棒は、２．５％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で凍結保存後に解凍された赤血球の溶血率（％）を示し、白い棒は、ＰＢＳ溶液で凍結保存後に解凍された赤血球の溶血率（％）を示す。
【図１１】ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で凍結保存された赤血球を溶血させて、ＡＴＰと２，３−ＤＰＧ活性を測定した結果を示す。
【図１２】Ａは、凍結保存液に添加されるそれぞれの成分に対する赤血球保存能を確認したもので、ＡＤＳＯＬはＡＤＳＯＬ溶液を示し、「Ｇ＋Ｄ」は１％（ｗ／ｖ）グリセロールとＤＭＳＯ、「ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ」は２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液を示し、「Ｇ＋Ｄ＋ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ」は１％（ｗ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ及び２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを含有する溶液を示す。＊は、各成分をＡＤＳＯＬに溶解させたものを示す。Ｂは、凍結保存液に添加される各成分の赤血球の冷凍保存に対する主効果の分析をＰｌａｃｋｅｔｔ−Ｂｕｒｍａｎ統計分析法を利用して結果として示したものである。＊は、ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ値が０．０５以下であることを示す。
【図１３】ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液のＤＳＣ分析結果を示したもので、Ａは、陰性対照群として、グリセロール１％及びＤＭＳＯ１％溶液であり、Ｂは、１％グリセロール、１％ＤＭＳＯ及び０．５％ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液であり、Ｃは、１％グリセロール、１％ＤＭＳＯ及び２．５％ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液を示す。
【図１４】ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液の抗凍結能を氷結晶の形態分析で確認した結果を示す。Ａは、グリセロール１％及びＤＭＳＯ１％溶液であり、Ｂは、１％グリセロール、１％ＤＭＳＯ及び２．５％ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを含むＡＤＳＯＬ溶液（ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液）である。そしてＣは、１％グリセロール、ＤＭＳＯ及び２．５％ＨＥＳを含むＡＤＳＯＬ溶液で氷結晶の形態分析結果である。各実験群の１〜２は、氷結晶種が冷却されながら氷結晶の形態が大きくなることを意味する。スケールは１０μｍを示す。
【図１５】ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの抗凍結能について冷凍解凍過程を顕微鏡上で観察しながら赤血球の残存形態と氷結晶形態の変化分析を通じて確認した結果を示したもので、（Ａ）はＰＢＳにおける赤血球、（Ｂ）はｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液における赤血球、（Ｃ）は１％グリセロール、ＤＭＳＯ及び２．５％ＨＥＳを含むＡＤＳＯＬ溶液における赤血球の形態を示す。赤血球の溶血イメージは、各段階で５分後に得たもので、スケールは２０μｍを示す。
【図１６】ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの氷再結晶化の抑制活性（ＩＲＩ：ｉｃｅ  ｒｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を確認した結果を示したもので、（Ａ）はＰＢＳ、（Ｂ）はｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液、（Ｃ）は１％グリセロール、ＤＭＳＯ及び２．５％ＨＥＳを含むＡＤＳＯＬ溶液を示す。スケールは１００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明では、南極の海水サンプルから菌体外多糖（Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を生産する新規のＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  ＣＹ０１を分離した。ＣＹ０１菌株が生産する菌体外多糖が初期の選別過程で大腸菌について高い凍結保護効果を有することを確認し、このような結果が、ＣＹ０１菌株が生産する菌体外多糖が細胞の凍結保存時に凍結保護剤として使用可能であるかを確認した。凍結保存時に適合した物性を有するために、ＣＹ０１由来の菌体外多糖を部分的に酸分解して低分子化した後、前記低分子菌体外多糖を赤血球の凍結保存時に添加した結果、高い抗凍結能を示し、細胞毒性を持たないことを確認した。
【００２２】
従って、本発明は、一観点において、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）によって生産され、グルコースとガラクトースで構成されている菌体外多糖に関する。
【００２３】
本発明では、南極海水サンプルから分離した２，９８０の菌株のうち粘液性菌体外多糖を生産する７３個の菌株を分離し、菌体外多糖生産能に優れた１０菌株を選別した。各菌株から得た０．２％（ｗ／ｗ）助菌体外多糖溶液から大腸菌を凍結−解凍サイクルを行った後、大腸菌の生存率を確認して測定し、これらの１０菌株のうちＣＹ０１菌株が生産する助菌体外多糖が最も高い凍結保護能を示した。
【００２４】
本発明の一様態において、０．２％のＣＹ０１菌株由来の助菌体外多糖を含有する溶液で大腸菌の生存率は８８．１６±２．９２％であり、他の菌株由来の助菌体外多糖含有溶液（０．２％）における大腸菌の生存率は４２．０１±１．９３％〜６７．２８±４．３２％であった。
【００２５】
本発明において、ＣＹ０１由来の菌体外多糖の前記グルコースと前記ガラクトースとのモル比は、約３．４：１であることを特徴とすることができる。
【００２６】
本発明において、ＣＹ０１由来の菌体外多糖のｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｌｉｎｋａｇｅ分析とＮＭＲ分析の結果、４−リンクグルコピラノースと６−リンクガラクトピラノースが主な構成として繰り返し構造を有し、この成分は、主鎖をなす構成成分であることを特徴とすることができる。
【００２７】
他の観点において、本発明は、菌体外多糖を加水分解して得られる１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａの分子量を持つ菌体外多糖に関する。
【００２８】
本発明では、菌体外多糖を凍結保護剤として使用する時、取扱い時と洗浄時に困難を来す菌体外多糖の高い粘度を下げ、可溶性を高めるために酸分解を行った。
【００２９】
本発明の一様態では、ＣＹ０１由来の菌体外多糖（ｐ−ＣＹ０１）を０．１Ｍ  ＴＦＡ処理し、１２１℃で１時間加熱して酸分解されたｐ−ＣＹ０１（ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）を得て、その結果、ｐ−ＣＹ０１の平均分子量が約１．１×１０７Ｄａであることに対し、酸によって部分分解されたｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの分子量は１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａの範囲であり、低分子量化されたｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液の流動学的性質の変化によって粘度が減少し、可溶性が増加したことを確認した。
【００３０】
また他の観点において、本発明は、前記菌体外多糖を含有する細胞の凍結保護用組成物に関する。
【００３１】
本発明の一様態においては、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭと凍結保護剤を含有する赤血球試料の凍結時に、冷却速度を調節せず（−８０℃に直ぐ冷却）、−８０℃で保管した。赤血球試料は、４０℃の水槽で急激解凍し、解凍後にｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの凍結保護剤としての性能は、赤血球の溶血測定及び光学顕微鏡の分析を通じて確認し、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの濃度が増加するにつれて溶血率（％）が減少し、２．５％〜４．０％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭで９．０８±０．３７％〜５．６４±０．９６％の溶血率を示し、３．５％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを使用した時、最も低い溶血率（５．４０％）を示した。つまり、２．５〜４．０％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭで解凍後に９０％のＲＢＣが完全な状態を示すことを確認した（図７Ａ）。
【００３２】
本発明で凍結保存される物質は、細菌、真菌、動物細胞、植物細胞、赤血球、血小板、精母細胞、卵母細胞、組織、臓器などかある。
【００３３】
本発明の組成物は、組織及び臓器を構成する細胞の場合も凍結から保護することができる。
【００３４】
本発明の凍結保護用組成物は、グリセロールまたはＤＭＳＯをさらに含有するか、グリセロール及びＤＭＳＯをさらに含有することを特徴とすることができる。
【００３５】
本発明の他の様態では、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭが長期（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ）凍結保存で輸血可能な凍結保護剤としてグリセロールに代替できるかを確認し、２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ、１％（ｖ／ｖ）グリセロール及び１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含有したＡＤＳＯＬ（以下、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液という）で赤血球を−８０℃に急速冷却した後、１時間保存後の赤血球溶血率は６．０９±０．６４％であり、５ヶ月保管後の溶血率は７．２４±２．１５％と、５ヵ月の保管期間において溶血率には変化が殆どなかった（図７  Ｄ）。
【００３６】
また他の観点において、本発明は、（ａ）Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）を培養して菌体外多糖を生成させる段階と、（ｂ）前記生成された菌体外多糖を回収する工程とを含むＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  ＣＹ０１（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）によって生産され、グルコースとガラクトースで構成されている菌体外多糖の製造方法に関する。
【００３７】
また他の観点において、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  ＣＹ０１（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）によって生産され、グルコースとガラクトースで構成されている菌体外多糖を加水分解する段階を含む１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａの分子量を持つ菌体外多糖の製造方法に関する。
【００３８】
本発明において、前記加水分解は、弱酸による酸分解であることを特徴とすることができる。
【００３９】
本発明において、前記加水分解する段階は、熱処理する段階をさらに行うことを含むことを特徴とすることができる。
【００４０】
また他の観点において、本発明は、前記菌体外多糖を利用することを特徴とする細胞の凍結保存方法に関する。
【００４１】
本発明において、前記凍結は、１０℃／分〜１９６℃／分の広い凍結速度の範囲を有する急速凍結であることを特徴とすることができる。
【００４２】
また他の観点において、本発明は、粘液性菌体外多糖を生成するＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）に関する。前記Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＹ０１株（ＫＣＴＣ  １２８６７ＢＰ）は、南極に生息することを特徴とすることができる。
【００４３】
本発明のＣＹ０１菌株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を通じた系統学的分析を通じて、南極に多く存在するＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属菌株に分類された（図２）。ＣＹ０１菌株は、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐａｒａｇｏｒｇｉｃｏｌａ  ＫＭＭ  ３５４８Ｔ（９９．５２％）、Ｐ．ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ  ＮＣＩＩＭＢ  ８６１４Ｔ（９９．５１％）及びＰ．ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ  ＫＭＭ  ２５５Ｔ（９９．３８％）と高い相同性を示した。
【００４４】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を持った者において自明であろう。
【００４５】
実施例１：凍結保護能を有する菌体外多糖を生産する菌株のスクリーニング及び同定
南極海水サンプルから分離された２，９８０個の菌株を直接製作したＳ−ＺｏＢｅｌｌ（ｐＨ７．０）アガープレートを使用して、１５℃で３日間培養し、粘液性菌体外多糖を生産する７３個の菌株を分離した。分離された菌株によって生成される菌体外多糖の生産量は、Ｓ−ＺｏＢｅｌｌ（ｐＨ７．０）液体培地を使用して、１５℃で３日間培養し、菌体外多糖を抽出して凍結乾燥後、乾燥重量を測定して確認した。凍結保護能は、各菌株から得た０．２％（ｗ／ｗ）助菌体外多糖溶液から大腸菌を凍結−解凍サイクルを行った後、大腸菌の生存率を確認して測定した。
【００４６】
分離された菌株のうち１０個の菌株が１ｇ／Ｌ以上の助菌体外多糖（ｃｒｕｄｅ  ＥＰＳ）を生成し、これらの菌株が生産する助菌体外多糖の範囲は、１．０４±０．１８ｇ／Ｌ〜２．０４±０．１３ｇ／Ｌであり、これらの１０菌株のうちＲｏｓＰｏ１３の菌株が２．０４ｇ／Ｌと、最も高い菌体外多糖生産能を示し、ＣＹ０１菌株が生産する助菌体外多糖が最も高い凍結保護能を示した（図１）。
【００４７】
０．２％のＣＹ０１菌株由来の助菌体外多糖を含有する溶液で大腸菌の生存率は８８．１６±２．９２％であり、他の菌株由来の助菌体外多糖含有溶液（２％）における大腸菌の生存率は、４２．０１±１．９３％〜６７．２８±４．３２％であった。
【００４８】
ＣＹ０１菌株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を通じた系統学的分析を通じて、南極に多く存在するＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属菌株に分類された（図２）。ＣＹ０１菌株は、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐａｒａｇｏｒｇｉｃｏｌａ  ＫＭＭ  ３５４８Ｔ（９９．５２％）、Ｐ．ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ  ＮＣＩＩＭＢ  ８６１４Ｔ（９９．５１％）及びＰ．ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ  ＫＭＭ  ２５５Ｔ（９９．３８％）と高い相同性を示した。
【００４９】
実施例２：ＣＹ０１菌株由来の菌体外多糖の精製及び精製された菌体外多糖の特性確認
菌体外多糖ＣＹ０１菌株培養物からエタノール沈殿を通じて分離し、プロテアーゼを処理してタンパク質を除去し、得た助菌体外多糖はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを利用したアニオンクロマトグラフィーを通じて菌体外多糖含有分画を得た（図３Ａ）。得られた菌体外多糖分画は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ−ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎクロマトグラフィーカラムで精製し（図３Ｂ）、単一分画を得た。分画に含まれた菌体外多糖濃度は、Ａｎｔｈｒｏｎｅ−ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ分析方法によりＯＤ６３０で測定した。
【００５０】
前記得られた分画でＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を行った。ＨＰＬＣは、菌体外多糖分画を蒸留水に溶かした溶液（０．１％ｗ／ｗ）５μｌを注入し、０．４ｍｌ／分の流速で行い、ＲＩ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）検出器を使用して検出した。
【００５１】
その結果、図４に示すように、単一のピークが検出され、ＲＩを利用して大きさ排除のクロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製された菌体外多糖の分子量を測定した結果、平均分子量が約１．１×１０７Ｄａであり、ＣＹ０１菌株由来の精製されたＥＰＳは、ｐ−ＣＹ０１と命名した。
【００５２】
ＧＣ／ＭＳを利用して菌体外多糖の糖構成の分析を行った。分析は、Ｃｌａｒｕｓ  ５００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を利用して、質量選択検出器とｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｉｍｐａｃｔ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅで行った。
【００５３】
その結果、図５Ａに示すように、ｐ−ＣＹ０１は、グルコースとガラクトースで構成され、グルコースが多い糖成分であり、グルコース：ガラクトースのモル比は約３．４：１であった。
【００５４】
図５Ｂと表１に示すように、ｐ−ＣＹ０１のｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｌｉｎｋａｇｅの分析結果、４−リンクグルコピラノースと６−リンクガラクトピラノースが主な構成として確認され、マイナーピークとして末端にリンクされたガラクトピラノースと末端にリンクされたグルコピラノース、３，４−リンクグルコピラノース及び４，６−リンクガラクトピラノースが確認された。
【００５５】
【表１】
2019530471.tif 000003
【００５６】
ｐ−ＣＹＯ１について、１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲ構造の結晶実験は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ（６００ＭＨｚ）ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを利用し、試料は２５℃の条件で、１Ｈ  ＮＭＲは６００ＭＨｚで、１３Ｃ  ＮＭＲは１５０ＭＨｚで測定した。
【００５７】
ＮＭＲ分析を通じて、ｐ−ＣＹ０１の１Ｈ  ａｎｄ  １３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（図６Ａ、Ｂ）から、典型的なポリグルコピラノースとポリガラクトピラノースのｐｅａｋ様式を確認することができた。特に、ｐ−ＣＹ０１は、→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→と→６）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→の繰り返し単位が主成分であり、他の岐結合（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）のｐｅａｋは相対的に小さ過ぎるか、主繰り返しユニットのｐｅａｋに重畳すると確認された。また、２Ｄ−ＨＳＱＣスペクトル（図７Ａ、Ｂ）からｐｒｏｔｏｎ−ｃａｒｂｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎをしたが、２Ｄ−ＴＯＣＳＹ、２Ｄ−ＣＯＳＹ、２Ｄ−ＨＭＢＣ、２Ｄ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）からは主成分であるグルコピラノースとガラクトピラノースのｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ以外に特別な情報を確認することはできなかった（図７Ｃ〜Ｆ）。上記のｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｌｉｎｋａｇｅ分析結果とＮＭＲスペクトルの分析結果を総合してｐ−ＣＹ０１の主要構造を確認した（図８）。ｐ−ＣＹ０１は分析した結果、４−リンクグルコピラノースと６−リンクガラクトピラノースが主な構成として繰り返し構造を有し、ＩＩＩの［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→］ｎの連結構造とＩＩの［→６）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］ｎの連結構造が繰り返して続けられ主鎖をなす構造であることを特徴とすることができる。また、主鎖の側岐構造としてＩ：Ｔ−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１、４→連結構造を少量有することを確認した。
【００５８】
実施例３：菌体外多糖の加水分解による分子量の変化及び流動学的（ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ）特徴の分析
菌体外多糖が有する高い粘性と低い溶解性は、生物産業に適用する障害になるため、ポリマーの分解を通じて、平均分子量の減少が粘性を下げて、可溶性を増加させることができる。最近、ＰＶＡを高濃度で使用して卵子と赤血球を凍結保全する場合、溶液の高い粘性のため取り扱いが容易でなく、洗浄を行わなければならないという短所があった（Ｄｅｌｌｅｒ、ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．、５：３２４４、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ４２４４、２０１４）。
【００５９】
本実施例では、ポリマーが有するこのような短所を克服するために，本発明のｐ−ＣＹ０１の分子量を弱酸分解を通じて調節した。ｐ−ＣＹ０１を０．１ＭのＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と共に１２１℃で１時間加熱して酸分解ｐ−ＣＹ０１を得て、ゲル透過クロマトグラフィー（ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＰＣ）を行った。その結果、ＴＦＡ処理をしていないｐ−ＣＹ０１は、１９〜２５分の間でＧＰＣカラムで溶出され、ＴＦＡと熱処理されたｐ−ＣＹ０１の場合は、主なピークが３３分と３７分に溶出され、５１分にも溶出された（図９Ａ）。３３分と３７分の高分子量ピークは、ｐ−ＣＹ０１が部分的に分解された分画であり、５１分に表われたピークは、単糖（ｍｏｎｏｓｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）に分解されたものである。ｐ−ＣＹ０１の平均分子量が約１．１×１０７Ｄａであることに対し、酸によって部分分解されたｐ−ＣＹ０１の分子量は１．０×１０５〜４．３×１０５Ｄａであった。
【００６０】
低分子量ｐ−ＣＹ０１（ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）溶液の流動学的性質の変化を確認した。
【００６１】
流動学的性質は、スピンドルＳ１８を利用してＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計で測定し、互いに異なるせん断速度に対するｐ−ＣＹ０１、ＰＢＳ及びｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液（０、２％、２、５％及び５．０％、ｗ／ｖ）のせん断ストレス（ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ）を確認した。
【００６２】
その結果、図９Ｂに示すように、０．２％ｐ−ＣＹ０１溶液の場合は、せん断速度が増加するにつれてせん断ストレスも増加したが、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの場合は、高いせん断速度でせん断ストレスが増加しなかった。これは、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの粘度が顕著に減少したことを表し、このような粘度の減少は、ｐ−ＣＹ０１の分子量変化によるものである。菌体外多糖が分解され、脱重合化（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）すると、粘度が減少し、可溶性が増加する。
【００６３】
実施例４：ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭによるヒト赤血球（ＲＢＣ）の凍結保存
赤血球は、ＡＤＳＯＬと共に４℃で３２日間保存することができ、赤血球はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  ＡＣＰ２１５で脱グリセロール作業を行い、ＡＤＳＯＬで保管すれば、４℃で３日間１％未満の溶血度を有しながら保管することができる。グリセロールは、細胞内の凍結保護剤であり、赤血球の溶血を防止するために、解凍後の洗浄を通じてグリセロールの最終濃度は１％に減少しなければならない。
【００６４】
ＤＭＳＯは、ヒト血小板と赤血球の凍結保存剤としてＦＤＡで承認して使用されている。従って、以下のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの凍結保存実験では、グリセロールとＤＭＳＯを共に使用し、ＰＢＳに代わりＡＤＳＯＬを凍結保存バッファ溶液として使用した。
【００６５】
臨床において、赤血球は４０％の高いグリセロール濃度を使用して低速度冷却（１℃／分）して、−８０℃で保管するか、液体窒素で保管することが高い赤血球回収率を表すことができる。さらに、菌体外多糖凍結保護剤（ＰＶＰ、ＨＥＳ）は、液体窒素における物理的な凍結及び保管過程が要求される。
【００６６】
本実施例では、赤血球試料を凍結する際に、冷却速度を調節せず（−８０℃で直ちに冷却）、−８０℃で保管した。赤血球試料は、４０℃の水槽で急激解凍し、解凍後に溶血をＤｒａｂｋｉｎ’ｓアッセイを通じて定量した。
【００６７】
ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの凍結保護剤としての性能は、赤血球の溶血アッセイ及び光学顕微鏡の分析を通じて確認した。
【００６８】
図１０Ａに示すように、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの濃度が増加するにつれて溶血率（％）が減少することが分かる。２．５％〜４．０％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭで９．０８±０．３７％〜５．６４±０．９６％の溶血率を表し、３．５％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを使用した時に最も低い溶血率（５．４０％）を表した。即ち、２．５％〜４．０％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭで解凍後に９０％のＲＢＣが完全な状態を表すことが確認された。米国血液銀行連合（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）の標準は、８０％の即時生存率（２０％未満の溶血率）と輸血細胞の７０％が２４時間生存することを条件として要求している。
【００６９】
２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭと１％（ｖ／ｖ）グリセロール及び１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含有したＡＤＳＯＬで、９．０８±０．３７％の溶血（９０．９２％の解凍後、赤血球完全率）を表し（図１０Ａ、Ｂ）、ＰＢＳにおける溶血率は、９２．４８±６．４９％（７．５２％の解凍後、赤血球完全率）を表した（図１０Ａ、Ｃ）。
【００７０】
従って、２．５％ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを赤血球の凍結保存に最適な濃度として選択した。
【００７１】
ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭが長期（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ）凍結保存で輸血可能な凍結保護剤としてグリセロールに代替できるかを確認した。図１０Ｄに示すように、２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ、１％（ｖ／ｖ）グリセロール及び１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含有したＡＤＳＯＬ（以下、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液という）で、赤血球を−８０℃に急速冷却後、１時間保存した後の赤血球溶血率は６．０９±０．６４％であり，５カ月保管後の溶血率は７．２４±２．１５％と、５ヵ月の保管期間の溶血率には変化が殆どなかった。
【００７２】
さらに、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で室温で１時間保管された赤血球の溶血率は、２％未満（９８％以上の赤血球完全率）で維持され、凍結保管作業を行う過程で、これは、細胞毒性や溶血が起こらないことを示す。
【００７３】
実施例５：ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭで凍結された赤血球の生化学的性質の測定
赤血球のＡＴＰ水準で赤血球膜の窪んだ形態の維持有無と、赤血球膜の力学的変動の増加を確認することができる。ＡＴＰ水準とヘモグロビンの酸素親和度を調節する２，３−ＤＰＧ（２，３−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）の水準を測定して、細胞機能と赤血球の治療的有用性水準を確認した。
【００７４】
陽性対照群としては、新鮮赤血球の溶血液のＡＴＰと２，３−ＤＰＧ活性を測定し、試験群として、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で−８０℃、１時間凍結保管した赤血球の溶血液のＡＴＰと２，３−ＤＰＧ活性を測定した。
【００７５】
その結果、図１１に示すように、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で凍結保管された赤血球の場合、ＡＴＰ活性において陽性対照群と差異が殆どなかった。ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で凍結保管された赤血球のＡＴＰ活性は、２．５０±０．０６μｍｏｌ／ｇＨｂ〜２．２６±０．１９μｍｏｌ／ｇＨｂであり、陰性対照群であるＰＢＳで凍結保管された赤血球のＡＴＰ活性は、０．１８±０．０２μｍｏｌ／ｇＨｂと大きく減少した。２，３−ＤＰＧの濃度は、新鮮赤血球の場合、４．２６±０．２４μｍｏｌ／ｇＨｂであり、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で凍結保管された赤血球は３．９８±０．４７μｍｏｌ／ｇＨｂであり、ＰＢＳで凍結保管した場合は０．７８±０．９２μｍｏｌ／ｇＨｂであった。
【００７６】
新鮮赤血球とｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で凍結保管された赤血球との間には、ＡＴＰ及び２，３−ＤＰＧ濃度で大きな差異がなかった。
【００７７】
実施例６：主要凍結添加剤の確認及び赤血球凍結保存における主な効果の分析
赤血球の凍結保存において、それぞれの凍結保護剤の効果を分析するために、ＡＤＳＯＬ単独、１％（ｗ／ｖ）グリセロールと１％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ溶液（Ｇ＋Ｄ）、２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液、及び１％（ｗ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ及び２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを含有した溶液（Ｇ＋Ｄ＋ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ）の赤血球保存能を溶血率で確認した。
【００７８】
その結果、図１２Ａに示すように、１％（ｖ／ｖ）グリセロール及びＤＭＳＯを共に含有した溶液では、溶血水準が７６．２９±２．９５％と陰性対照群であるＰＢＳやＡＤＳＯＬを使用した時と比較して大きな差異がなかった。２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを単独で含有する溶液の場合は、赤血球溶血率が１８．７３±１．８６％と顕著に低い溶血率を表し、１％（ｗ／ｖ）グリセロール、１％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ及び２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを含有した溶液は、９．４３±２．１６％の低い溶血率を表し、最も優れた凍結保護効果を奏した。
【００７９】
Ｐａｃｋｅｔｔ−Ｂｕｒｍａｎ方法を利用して赤血球の凍結保護に対する各保護剤成分の赤血球の冷凍保護に対する主効果数値（ｍａｉｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）を求めた。
【００８０】
図１２Ｂと表２に示すように、１（％）グリセロール、１（％）ＤＭＳＯ、ＡＤＳＯＬ及び２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭは、赤血球の凍結保存で陽（＋）の主な効果を表した。それぞれの主効果数値は、グリセロールは２．３２であり、ＤＭＳＯは２．６２であり、ＡＤＳＯＬは５．８２であり、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭは５１．６９と、赤血球の凍結保存で使用されるｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの適用濃度は、グリセロールやＤＭＳＯより単に２．５倍であるが、赤血球の凍結保存に関与する主効果は１９倍以上であった。この時、ＡＤＳＯＬとｐ−ＣＹ０１＿ＬＭは、Ｐ値（Ｐ−ｖａｌｕｅ）が０．０５以下で、グリセロールやＤＭＳＯに比べて有意度の高い因子として確認された。
【００８１】
【表２】
2019530471.tif 000004
【００８２】
実施例７：ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭのＤＳＣ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）分析
ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液の冷却及び解凍におけるＤＳＣ分析を行った（図１３）。各試料は、＋５℃から−７８℃まで４０℃／分の速度で冷却し、２℃／分の速度で解凍した。
【００８３】
１％グリセロールと１％ＤＭＳＯ溶液（図１３Ａ）と１％グリセロール、１％ＤＭＳＯ及び（０．５〜２．５％）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液（図１３Ｂ、Ｃ）について、ＤＳＣ分析を実施した。陰性対照群である１％未満の低濃度のグリセロールとＤＭＳＯのみを使用した場合、エンタルピー変化量は２１２．０±３．８（Ｊ／ｇ）と、従来の高濃度グリセロールとＤＭＳＯ（１０〜４０％）を使用した時に有する凍結保護メカニズムのように、エンタルピー変化量ΔＨ（Ｊ／ｇ）が顕著に減少して、凍結時の氷形成量を減少させる作用ができないことを確認した（表３）。グリセロール１％及びＤＭＳＯ１％溶液の超冷却点（ｓｕｐｅｒ  ｃｏｏｌｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）は−１４．２℃であり、１％グリセロール、１％ＤＭＳＯ及び０．５％ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液の超冷却点は−１３．９℃であり、１％グリセロール、１％ＤＭＳＯ及び２．５％ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液の超冷却点は−３２．１℃であった。表３には、前記各実験群の冷却と解凍温度と凍結によるエンタルピー変化を示した。その中で、１％グリセロール、１％ＤＭＳＯ及び２．５％ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液で冷却及び解凍温度が顕著に下降し、エンタルピー変化量ΔＨ（Ｊ／ｇ）が５２．８１±８．７（Ｊ／ｇ）と顕著に減少することを確認することができた（表３）。このような現象は、凍結−解凍サイクルの間に、水から氷に形成される総量が減少することを意味し、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭが有する抗凍結機作である。
【００８４】
【表３】
2019530471.tif 000005
【００８５】
実施例８：ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液の氷形成阻害
凍結過程の氷結晶の成長阻害（Ｉｃｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）分析を通じて、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの抗凍結能を確認した。
【００８６】
図１４に示すように、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液（１％グリセロール、ＤＭＳＯ、２．５％ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを含有するＡＤＳＯＬ）内の氷結晶の種（図１４Ｂ１）は、温度が冷却されるにつれて氷結晶の成長が阻害されて、６角星（図１４Ｂ２）の形態で氷結晶が成長した。このような現象は、抗凍結タンパク質（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）でよく現れる現象で、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭが有する抗凍結機作である。一方、対照群（１％グリセロール及びＤＭＳＯを含むＡＤＳＯＬ）とＨＥＳ溶液（１％グリセロール、ＤＭＳＯ、２．５％ＨＥＳを含有するＡＤＳＯＬ）では、氷結晶の成長が阻害されず、丸いか、平らな氷結晶に成長して（図１４Ａ１−Ａ２及びＣ１−Ｃ２）、氷結晶の成長阻害による抗凍結効果が観察されなかった。また、陰性対照群である水の超冷却点が−１５．９℃であることに対し、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ溶液の超冷却点は、表３に示すように、−３０．５℃である。このような結果は、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの抗凍結効果であるといえる。
【００８７】
実施例９：冷凍と解凍時の赤血球に対するリアルタイム凍結顕微鏡の観察
ＩＲＩ（ｉｃｅ  ｒｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）アッセイを通じて、解凍時の氷結晶の大きさを分析した。氷再結晶化の阻害剤が存在する場合、解凍時に再結晶化する氷結晶の大きさが大きくは育たないはずである。従って、本実施例は、凍結顕微鏡を使用して、赤血球を凍結し解凍する過程の中で赤血球細胞と氷結晶をイメージングした。赤血球を２．５％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭを含むＡＤＳＯＬ溶液と２．５％（ｖ／ｖ）のＨＥＳを含むＡＤＳＯＬ溶液で２５℃／分の速度で−４０℃に冷却した。前記サンプルを２５℃／分の速度で−６℃に温度を上昇した後、５分間置いて写真を撮影した。
【００８８】
図１５は、２．５％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭの有無によって赤血球と氷結晶の再結晶化形態のイメージを示したものである。ＰＢＳ（図１５Ａ）や２．５％ＨＥＳが添加された溶液（図１５Ｃ）より２．５％のｐ−ＣＹ０１＿ＬＭが存在する場合（図１５Ｂ）、再結晶化された氷の大きさが顕著に小さく、特に完全に解凍された時、赤血球の形態が完全に維持されていることを確認した（図１５Ａ４、Ｂ４、Ｃ４）。
【００８９】
このような結果は、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭのＩＲＩ活性を測定して再確認した。直径１０μｍ未満の多核性氷ウェーハを−６℃で３０分間成長させた後、氷結晶の大きさを対照群（ＰＢＳ）と比較して確認した。
【００９０】
図１６に示すように、ＰＢＳ（図１６Ａ）、２．５％（ｗ／ｖ）ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ（図１６Ｂ）及び２．５％（ｖ／ｖ）ＨＥＳ（図１６Ｃ）について測定した結果、ｐ−ＣＹ０１＿ＬＭ含有溶液が同一濃度で明らかなＩＲＩ活性を示して氷の再結晶化を抑制し、ＨＥＳは相対的に特別な抑制効果を示さなかった。
【００９１】
［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１２８６７ＢＰ
受託日付：２０１５０７１５
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の菌体外多糖は、凍結保存時に優れた細胞凍結保護能を有し、細胞毒性を示さず、赤血球の凍結保存について、既存の高濃度で細胞毒性を示し複雑な解凍過程を要求する凍結保護剤に代替することができ、血液の冷凍長期保存に効果がある。
【００９３】
以上により、本発明内容の特定部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を持った者において、このような具体的技術は単に好ましい実施態様であるだけで、これにより本発明の範囲が制限されるものではないことが明らかであろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2019530471.tif 000013
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【国際調査報告】
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2019530471.tif 000031