(57)【要約】本発明は、ＤＮＡ１本鎖分子の組換え生成のための方法に関し、上記方法は、（１）偽遺伝子核酸を提供する工程；（２）上記偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を上記ベクターで形質転換し、前駆ｓｓＤＮＡを上記ベクターから細菌培養条件下で生成する工程；（３）上記前駆ｓｓＤＮＡを上記細菌培養物から単離する工程；（４）上記前駆ｓｓＤＮＡを、自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件下で消化する工程；および（５）上記標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離して得る工程を包含する。本発明の方法は、ＤＮＡ１本鎖分子の大量生産に適している。本発明はさらに、標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレチドの、特に、ＤＮＡナノテクノロジーにおける、または研究ツールとしての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ１本鎖分子の組換え生成のための方法であって、該方法は、
（１）偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで該偽遺伝子核酸は、少なくとも１種の標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する２種の自己切断ＤＮＡ配列を含む核酸である、
工程、
（２）該偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を該ベクターで形質転換し、そして前駆ｓｓＤＮＡを該ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで該前駆ｓｓＤＮＡは、該偽遺伝子核酸を含む、
工程；
（３）該前駆ｓｓＤＮＡを該細菌培養物から単離する工程；
（４）該前駆ｓｓＤＮＡを、該自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件下で消化する工程；ならびに
（５）該標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得るために、該標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記自己切断ＤＮＡ配列は、自己切断デスオキシリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅ、
例えば、Ｚｎ２＋依存性ＤＮＡｚｙｍｅ、例えば、Ｉ−Ｒ３
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記偽遺伝子核酸は、２種、３種、４種または約５０種より多くの標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、約２０ヌクレオチドから約数千ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ、特に、Ｋ１２由来Ｅ．ｃｏｌｉ安全株、例えば、ＤＨ５ａｌｐｈａ、ＸＬ−１ｂｌｕｅまたはＪＭ１０９から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（２）におけるベクターは、少なくとも１種のファージミドであり、必要に応じて、さらなる構成要素：
例えば、
−パッケージング配列、
−細胞分裂の間に該ファージミドの伝播を保証する構成要素、
−選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子、
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
さらにヘルパープラスミドまたはヘルパーファージが使用され、該ヘルパープラスミドまたはヘルパーファージは、さらなる構成要素、例えば、
−バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子、
−細胞分裂の間に該ヘルパープラスミドの伝播を保証する構成要素、
−選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（２）におけるベクターは、少なくとも１種のファージミドであり、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を介して前記細菌細胞内部で増幅され、ファージミドｓｓＤＮＡを生じる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ファージミドｓｓＤＮＡは、好ましくは前記細胞から分泌されるファージ様粒子へとパッケージされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（３）は、前記ファージ様粒子を前記細胞培養物から抽出すること、そして前記ファージミドｓｓＤＮＡを該ファージ様粒子から抽出することを包含する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（４）の消化は、Ｚｎ２＋イオンの添加によって誘発される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（５）における標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程は、
前記自己切断ＤＮＡ配列、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅから、例えば、クロマトグラフィーを介して分離すること、
を包含する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（６）前記標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに加工処理する工程、
例えば、ＤＮＡ折り紙構造、タイルに基づくＤＮＡナノ構造、もしくは結晶性ＤＮＡナノ物質へと自己アセンブルおよび／または折りたたむ工程、
あるいは他の分子を結合、検出、または加工処理するためのアプタマーもしくはＤＮＡｚｙｍｅとしての使用、
をさらに包含する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌培養は、バイオリアクター、例えば、撹拌タンクバイオリアクターで行われる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの
−ＤＮＡナノテクノロジーにおける、
−研究ツールとしての、
−診断用のプローブとしての、
−遺伝子合成における、
−遺伝子治療における、
−分子検知における、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ１本鎖分子の組換え生成のための方法に関し、上記方法は、（１）偽遺伝子核酸を提供する工程；（２）上記偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を上記ベクターで形質転換し、そして前駆ｓｓＤＮＡを上記ベクターから細菌培養条件下で生成する工程；（３）上記前駆ｓｓＤＮＡを上記細菌培養物から単離する工程；（４）上記前駆ｓｓＤＮＡを、自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件下で消化する工程；および（５）上記標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離して得る工程を包含する。本発明の方法は、ＤＮＡ１本鎖分子の大量生産に適している。本発明はさらに、上記標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、特に、ＤＮＡナノテクノロジーにおける、または研究ツールとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、種々の適用のために生命科学および医療において必要とされる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）または定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を、それぞれに行うためのプライマーとして要求される。さらに、オリゴヌクレオチドは、新たな遺伝子の合成のための出発物質として必要とされる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドに関する増大しつつある需要は、最小量で任意の所望の配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを迅速に生成することを主に専門にする産業をもたらした。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、代表的には、固相上での周期的化学合成プロセスにおいて一塩基ずつ生成される。このプロセスは、微視的なビーズ上で、またはチップ表面上でのインクジェット方法で行われ得る。塩基付加反応は、１００％効率では進まないので、任意の長さでＤＮＡ１本鎖を生成することは可能ではない。その収率は、指数関数的様式において、標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの所望の長さとともに低下する。代表的には、１００塩基までの長さの分子は、筋の通った努力をして生成され得る。企業によっては、２００塩基までの長さに対しては、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの（コスト集約的）合成を提供する。さらに、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、代表的には、ミリグラムスケールに制限される。これは、従来までの適用の大部分に関しては十分である。
【０００３】
今のところは、多量に（＞グラムスケール）および／またはより大きな長さ（＞２００塩基長）のユーザー定義の配列を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを要求する新たな技術が開発されている。この需要は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための既存のプロセスによって満たすことはできない。特に、ＤＮＡナノテクノロジーでは、ユーザー定義の配列を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、「構築材料」として多量に必要とされる。ＤＮＡナノテクノロジーは、潜在的な医療的またはさらには化学的／物理的な直接的関連性を有する新たな薬物送達ビヒクルおよびさらなるナノ粒子の生成の特定の潜在性の見込みがある（Ｊｏｎｅｓら，  ２０１５）。しかし、必要とされる出発物質（すなわち、ＤＮＡオリゴヌクレオチド）は、今のところは、拡大可能な様式で利用可能ではない。さらに、触媒として活性なＤＮＡ配列（ＤＮＡｚｙｍｅ）およびＤＮＡアプタマーは、診断剤としての、治療および検知における適用に関して、ますます関心を集めている。（Ｋｒｕｇら，  ２０１５；  Ｋｅｅｆｅら，  ２０１０；  Ｎｇら，  ２００６；  Ｔｏｒａｂｉら，  ２０１５）。このような適用のために、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの大量生産は、非常に重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Jones  MR,  Seeman  NC,  Mirkin  CA.  Nanomaterials.  Programmable  materials  and  the  nature  of  the  DNA  bond.  Science  2015;347(6224):1260901.  doi:  10.1126/science.1260901.
【非特許文献２】Krug  N,  Hohlfeld  JM,  Kirsten  AM,  Kornmann  O,  Beeh  KM,  Kappeler  D,  Korn  S,  Ignatenko  S,  Timmer  W,  Rogon  C,  Zeitvogel  J,  Zhang  N,  Bille  J,  Homburg  U,  Turowska  A,  Bachert  C,  Werfel  T,  Buhl  R,  Renz  J,  Garn  H,  Renz  H.  Allergen-induced  asthmatic  responses  modified  by  a  GATA3-specific  DNAzyme.  N  Engl  J  Med.  2015;372(21):1987-95.  doi:  10.1056/NEJMoa1411776.
【非特許文献３】Keefe  AD,  Pai  S,  Ellington  A.  Aptamers  as  therapeutics.  Nat  Rev  Drug  Discov.  2010  Jul;9(7):537-50.  doi:  10.1038/nrd3141.
【非特許文献４】Ng  EW,  Shima  DT,  Calias  P,  Cunningham  ET  Jr,  Guyer  DR,  Adamis  AP.  Pegaptanib,  a  targeted  anti-VEGF  aptamer  for  ocular  vascular  disease.  Nat  Rev  Drug  Discov.  2006;5(2):123-32.
【非特許文献５】Torabi  SF,  Wu  P,  McGhee  CE,  Chen  L,  Hwang  K,  Zheng  N,  Cheng  J,  Lu  Y.  In  vitro  selection  of  a  sodium-specific  DNAzyme  and  its  application  in  intracellular  sensing.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2015;112(19):5903-8.  doi:  10.1073/pnas.1420361112.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明によれば、この目的は、ＤＮＡ１本鎖分子の組換え生成のための方法であって、該方法は、
（１）偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで該偽遺伝子核酸は、少なくとも１種の標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する２種の自己切断ＤＮＡ配列を含む核酸である、
工程、
（２）該偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を該ベクターで形質転換し、そして前駆ｓｓＤＮＡを該ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで該前駆ｓｓＤＮＡは、該偽遺伝子核酸を含む、
工程；
（３）該前駆ｓｓＤＮＡを該細菌培養物から単離する工程；
（４）該前駆ｓｓＤＮＡを、該自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件下で消化する工程；ならびに
（５）該標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得るために、該標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程、
を包含する方法によって解決される。
【０００６】
本発明によれば、この目的は、本発明の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを
−ＤＮＡナノテクノロジーにおいて、
−研究ツールとして、
−診断用のプローブとして、
−遺伝子合成において、
−遺伝子治療において、
−分子検知において／分子センサーとして、
使用することにより解決される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１：連結された前駆１本鎖ＤＮＡの生物工学的生成を示すフローチャート。
【図２】図２：ヘルパーファージミド１本鎖ＤＮＡのヘルパープラスミド補助による生成の模式図
【図３】図３：５種の標的配列（太線）および標的分子の抽出のために（５＋１）×２の隣接する触媒性ＤＮＡｚｙｍｅ配列（ヘアピン構造）を含むファージミドの模式図。
【図４】図４：生物工学的に生成された１本鎖出発物質を使用するＤＮＡ折り紙ナノロッドの生成。  Ａ，  ファージミド（左）およびＤＮＡナノロッドの内部鎖トポロジーの模式的表示。Ｂ，  化学的固相合成を介して生成されるステープルオリゴヌクレオチド（左）を使用する１０ヘリックスバンドルの自己アセンブルの生成物が、本発明の方法によって生成されるステープルオリゴヌクレオチド（右）の使用と比較されるアガロースゲルの写真。両方のサンプルが、匹敵するアセンブル品質を示唆する匹敵する移動特性を示す。  Ｃ，  ステープルオリゴヌクレオチドが本発明の方法によって生成されたナノロッドの走査型電子顕微鏡写真。
【図５】図５：含まれるＤＮＡｚｙｍｅ配列による所望の標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドへの連結された前駆ｓｓＤＮＡの自己触媒消化の図示。示されるのは、連結された前駆ｓｓＤＮＡの消化反応の生成物がインキュベーション時間の関数として電気泳動で分離されたアガロースゲルの写真である。
【図６Ａ】図６：ＤＮＡｚｙｍｅ配列の最適化。Ａ，  左：ＤＮＡｚｙｍｅ（タイプＩ−Ｒ３）の模式的表示。必須の塩基対（本発明者らの実験で同定されるとおり）が文字として示され、交換可能な塩基対は、線として示される。三角形は、切断位置を示す。右：１塩基対において異なるＤＮＡｚｙｍｅの２種の改変体の反応速度論のゲル電気泳動分析。ゆっくりと移動する方のバンドは、切断されていないオリゴヌクレオチドに相当し、速く移動する方のバンドは、反応生成物に相当する。τは、生成物のバンドの強度が切断されていないＤＮＡｚｙｍｅの強度を超える最初の時点として定義される。上のゲルは、Ｇｕら，  ２０１３によって記載されるとおりの元の配列の切断を示すのに対して、下のゲルは、Ｇ−Ｃ塩基対がＡ−Ｔ塩基対によって置き換えられている改変体の切断を示す。この交換は、ＤＮＡｚｙｍｅの有意に低い触媒活性をもたらすが、この塩基対は、Ｇｕらによる元の刊行物において交換可能と分類された。  Ｂ，  左：ＤＮＡｚｙｍｅによって分離されるナノロッドに関するステープルを含む２種のファージミドの模式的表示。右：その２種のファージミドの消化速度論のゲル電気泳動分析。下の改変体を、Ｇｕらによる元の刊行物からの必須の塩基の分類に基づいてデザインしたのに対して、上の改変体を、必須の塩基に関する本発明者ら独自の知見に基づいてデザインした。上の最適化した改変体は、迅速かつ完全な切断を示す（４０分後に、基本的には全てのＤＮＡが、所望の生成物に相当するバンド中にある）が、下の改変体は、２４時間のインキュベーション後すら、不完全な消化を示す。
【図６Ｂ】図６：ＤＮＡｚｙｍｅ配列の最適化。Ａ，  左：ＤＮＡｚｙｍｅ（タイプＩ−Ｒ３）の模式的表示。必須の塩基対（本発明者らの実験で同定されるとおり）が文字として示され、交換可能な塩基対は、線として示される。三角形は、切断位置を示す。右：１塩基対において異なるＤＮＡｚｙｍｅの２種の改変体の反応速度論のゲル電気泳動分析。ゆっくりと移動する方のバンドは、切断されていないオリゴヌクレオチドに相当し、速く移動する方のバンドは、反応生成物に相当する。τは、生成物のバンドの強度が切断されていないＤＮＡｚｙｍｅの強度を超える最初の時点として定義される。上のゲルは、Ｇｕら，  ２０１３によって記載されるとおりの元の配列の切断を示すのに対して、下のゲルは、Ｇ−Ｃ塩基対がＡ−Ｔ塩基対によって置き換えられている改変体の切断を示す。この交換は、ＤＮＡｚｙｍｅの有意に低い触媒活性をもたらすが、この塩基対は、Ｇｕらによる元の刊行物において交換可能と分類された。  Ｂ，  左：ＤＮＡｚｙｍｅによって分離されるナノロッドに関するステープルを含む２種のファージミドの模式的表示。右：その２種のファージミドの消化速度論のゲル電気泳動分析。下の改変体を、Ｇｕらによる元の刊行物からの必須の塩基の分類に基づいてデザインしたのに対して、上の改変体を、必須の塩基に関する本発明者ら独自の知見に基づいてデザインした。上の最適化した改変体は、迅速かつ完全な切断を示す（４０分後に、基本的には全てのＤＮＡが、所望の生成物に相当するバンド中にある）が、下の改変体は、２４時間のインキュベーション後すら、不完全な消化を示す。
【図７Ａ】図７：本発明のＤＮＡｚｙｍｅベースの方法を使用して生成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドからアセンブルされるナノ構造。Ａ，  左上：３２００塩基長の足場および３１のステープルオリゴヌクレオチド（これらは全て１種のファージミドの中に含まれる）からアセンブルされる４８ヘリックスチューブの模式的表示。左下：消化されていないファージミド（左）、消化されたファージミド（中央）および折りたたまれた４８ヘリックスチューブ（右）が電気泳動されたアガロースゲルの画像。右：４８ヘリックスチューブの陰性染色の透過型電子顕微鏡写真（下）およびクラス平均（上）。  Ｂ，  左上：７２４９塩基長のＭ１３−足場および１６１のステープルオリゴヌクレオチドからアセンブルされたポインター物体の模式的表示。左下：その足場（左）および化学合成ステープル（中央）または生物工学的に生成したステープル（右）を使用してアセンブルした構造が電気泳動されたアガロースゲルの画像。右：ポインター物体の陰性染色の透過型電子顕微鏡写真およびクラス平均（挿入図）。
【図７Ｂ】図７：本発明のＤＮＡｚｙｍｅベースの方法を使用して生成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドからアセンブルされるナノ構造。Ａ，  左上：３２００塩基長の足場および３１のステープルオリゴヌクレオチド（これらは全て１種のファージミドの中に含まれる）からアセンブルされる４８ヘリックスチューブの模式的表示。左下：消化されていないファージミド（左）、消化されたファージミド（中央）および折りたたまれた４８ヘリックスチューブ（右）が電気泳動されたアガロースゲルの画像。右：４８ヘリックスチューブの陰性染色の透過型電子顕微鏡写真（下）およびクラス平均（上）。  Ｂ，  左上：７２４９塩基長のＭ１３−足場および１６１のステープルオリゴヌクレオチドからアセンブルされたポインター物体の模式的表示。左下：その足場（左）および化学合成ステープル（中央）または生物工学的に生成したステープル（右）を使用してアセンブルした構造が電気泳動されたアガロースゲルの画像。右：ポインター物体の陰性染色の透過型電子顕微鏡写真およびクラス平均（挿入図）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の好ましい実施形態の説明
本発明を以下により詳細に記載する前に、本発明は、本明細書で記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことは、これらが変動し得ることから、理解されるべきである。本明細書で使用される用語法が、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、本発明の範囲を限定するとは意図されないことはまた、理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書で引用される全ての参考文献は、これらの全体において参考として援用される。
【０００９】
濃度、量、および他の数値データは、範囲形式において本明細書で表現または提示され得る。このような範囲形式は便宜上および簡潔さのために使用されるに過ぎないので、各数値および部分範囲が明示的に記載されているかのように、その範囲の限界として明示的に記載される数値を包含するのみならず、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲の全てをも包含すると柔軟に解釈されるべきであることは、理解されるべきである。例証として、「５０〜３，０００ヌクレオチド」という数値範囲は、５０〜３，０００の明示的に記載される値を包含するのみならず、その示される範囲内の個々の値および部分範囲をも包含すると解釈されるべきである。従って、５０、５１、５２…  ２，９９８、２，９９９、３，０００のような個々の値および５０〜１５０、１００〜２５０、２００〜５００、５００〜２，５００などのような部分範囲がこの数値範囲の中に含まれる。この同じ原則が、ただ１つの数値、例えば、「少なくとも１」を記載する範囲に当てはまる。さらに、このような解釈は、記載されている範囲または特徴の外延に関わらず当てはまるはずである。
【００１０】
ｓｓＤＮＡを生成するための方法
本発明は、ＤＮＡ１本鎖分子、特に、１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの組換え生成のための方法を提供する。
【００１１】
上記方法は、
（１）偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで上記偽遺伝子核酸は、少なくとも１種の標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する２種の自己切断ＤＮＡ配列を含む核酸である
工程；
（２）上記偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を上記ベクターで形質転換し、前駆ｓｓＤＮＡを上記ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで上記前駆ｓｓＤＮＡは、上記偽遺伝子核酸を含む
工程；
（３）上記前駆ｓｓＤＮＡを上記細菌培養物から単離する工程；
（４）上記前駆ｓｓＤＮＡを、自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件下で消化する工程；ならびに
（５）上記標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離して得る工程、
を包含する。
【００１２】
（１）偽遺伝子核酸のデザインおよび提供
「偽遺伝子核酸（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、少なくとも１種の標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する２種の自己切断ＤＮＡ配列を含む核酸である。
【００１３】
好ましくは、偽遺伝子核酸は、１種または多くの標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列（例えば、２種、３種、４種または約５０種より多くの標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列）を含む。
【００１４】
標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、それらの配列およびそれらの長さにおいて同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００１５】
好ましくは、標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、化学合成されるオリゴヌクレオチドが利用可能である範囲を網羅しかつ超えて広がる、約２０ヌクレオチドから約数千ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００１６】
好ましくは、偽遺伝子核酸の中の標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の各々に隣接する自己切断ＤＮＡ配列は、自己切断デオキシリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅ、
例えば、
−Ｚｎ２＋依存性ＤＮＡｚｙｍｅ、
例えば、Ｉ−Ｒ３、およびＧｕら，  ２０１３に記載される他の改変体、ならびにＧｕら，  ２０１３に記載されるものから得られる改変体、
である。
【００１７】
デオキシリボザイム（ＤＮＡｚｙｍｅともいわれる）は、化学反応を触媒し得る構造を形成するＤＮＡ分子である（Ｂｒｅａｋｅｒ，  １９９７）。自己プロセシング反応を触媒するＤＮＡが存在する（Ｃａｒｍｉら，  １９９６）。このようなデオキシリボザイムは、特定の反応条件に曝される場合にそれらの本質的触媒活性に基づいて改変されるＤＮＡ構築物を作製する役に立ち得る。例えば、種々の方向付けられた進化戦略を使用することによって作製されている酸化（Ｃａｒｍｉら，  １９９６）、脱プリン反応（Ｓｈｅｐｐａｒｄら，  ２０００）、または加水分解（例えば、Ｃｈａｎｄｒａら，  ２００９を参照のこと）の機構を使用する操作された自己切断デオキシリボザイムが存在する。
【００１８】
近年、高速かつ配列特異性をもってＤＮＡを加水分解する２つのクラスの操作された自己切断デオキシリボザイムが記載された（Ｇｕら，  ２０１３）。１つのこのようなデオキシリボザイムは、Ｉ−Ｒ３（図３を参照のこと）と称され、１種または２種いずれかの２本鎖基礎構造が隣接する１７ヌクレオチドから構成される小さな触媒コアを有する。このデオキシリボザイムクラスの代表は、中性付近のｐＨにおいてかつミリモル濃度のＺｎ２＋の存在下でインキュベートした場合に、約１分−１（約４０秒の半減期）というＤＮＡ加水分解の観察された速度定数（ｋｏｂｓ）を示す。このデオキシリボザイムは、３′酸素とＡｐＡ結合のリン中心との間のホスホエステル結合を切断して、５′ホスフェート基を有する３′切断フラグメントを生じる。
【化１】
2019528743.tif 000002
ここでＴＡＧＴＴＧＡＧＣＴＧＴは、配列番号１であり、ＡＣＧＴＴＧＡＡＧは、配列番号２であり；
そしてここでＰ３は、自由裁量の配列のスペーサーであり、ここでＰ１およびＰ１’は、ＤＮＡ二重らせんを形成する２種の相補的配列である。同じことが、Ｐ２およびＰ２’についても当てはまる。
【化２】
2019528743.tif 000003
【００１９】
本発明において使用される自己切断ＤＮＡ配列（すなわち、自己切断デスオキシリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅ）は、規定された反応条件下でのみ活性になる（および自己切断を触媒する）。
【００２０】
例えば、Ｚｎ２＋依存性ＤＮＡｚｙｍｅ（例えば、Ｉ−Ｒ３）は、Ｚｎイオンの添加を要求する。
【００２１】
偽遺伝子核酸は、従来の／確立された遺伝子合成方法によって合成され得る。
【００２２】
例えば、それは発注され得、業者によって合成され得る。
【００２３】
（２）細菌培養物中での前駆ｓｓＤＮＡの生成
工程（２）では、偽遺伝子核酸は、ベクターに組み込まれる。上記ベクターは、形質転換を介して細菌細胞へと導入され、前駆ｓｓＤＮＡは、上記ベクターから細菌培養条件下で生成される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ベクターは、少なくとも１種のベクター（例えば、２種、３種、４種またはこれより多くのベクター）である。
【００２５】
「前駆ｓｓ１本鎖ＤＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）または「前駆ｓｓＤＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｓｓＤＮＡ）とは、１本鎖形態にある偽遺伝子核酸およびベクター骨格を含む。
【００２６】
好ましくは、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ、特に、Ｋ１２由来Ｅ．ｃｏｌｉ安全株（例えば、ＤＨ５ａｌｐｈａ、ＸＬ−１ｂｌｕｅまたはＪＭ１０９）から選択される。
【００２７】
好ましい実施形態において、工程（２）におけるベクターは、ファージミドである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、そのファージミドは、少なくとも１種のファージミド（例えば、２種、３種、４種またはこれより多くのファージミド）である。
【００２９】
上記（少なくとも１種の）ファージミドは、プラスミド骨格を含み、必要に応じて、さらなる構成要素、
例えば、
−パッケージング配列、
−細胞分裂の間にファージミドの伝播を保証する構成要素、
−選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子
を含み得る。
【００３０】
上記の実施形態において、さらに、さらなる構成要素、例えば、
−バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子、
−細胞分裂の間にヘルパープラスミドの伝播を保証する構成要素、
−選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子
を含むヘルパープラスミドまたはヘルパーファージが、使用される。
【００３１】
この実施形態において、（少なくとも１種の）ファージミドおよびヘルパープラスミドまたはヘルパーファージの両方が、細菌細胞に、好ましくは同時形質転換を介して導入される。
【００３２】
ベクターがファージミドであり（そしてそのベクターがヘルパープラスミドをも使用する）この実施形態において、ファージミドは、細菌細胞の内部でローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を介して増幅される。その同じことが、１種より多くのファージミドを利用する実施形態に当てはまる。
【００３３】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、ファージミドの１本鎖形態、ファージミドｓｓＤＮＡを生じる。上記ファージミドｓｓＤＮＡは、この実施形態において「前駆ｓｓＤＮＡ」である。
【００３４】
上記ファージミドｓｓＤＮＡは、細胞からまわりの培地へと好ましくは分泌される、細胞表面上のファージ様粒子へと好ましくはパッケージされる。
【００３５】
ファージ様粒子は、通常のファージゲノムの代わりに、ファージミドｓｓＤＮＡを含む。
【００３６】
例えば、ヘルパープラスミドがＭ１３バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子を含む実施形態において、Ｍ１３バクテリオファージ様粒子が形成され、これは、細胞溶解なしに宿主細胞から分泌される。
【００３７】
（３）前駆ｓｓＤＮＡを細菌培養物から得る工程
前駆ｓｓＤＮＡは、細菌培養物から単離される。
【００３８】
上記単離または精製は、当該分野で公知の従来法／確立された方法（例えば、遠心分離、沈殿、溶媒ベースの抽出、クロマトグラフィー法、またはこれらの組み合わせ）を使用することによって行われ得る。
【００３９】
（少なくとも１種の）ファージミドおよびヘルパープラスミドが利用される一実施形態において、単離または精製は、
−ファージ様粒子を細胞培養物から、好ましくは培養上清から
例えば、細胞をペレット化し、例えば、沈殿によって（例えば、ＰＥＧを使用して）、ファージ様粒子を上清から取り出し／抽出することを介して、
抽出する工程、
−ファージミドｓｓＤＮＡをファージ様粒子から、
例えば、タンパク質コートの化学的溶解およびｓｓＤＮＡのエタノール沈殿を介して
抽出する工程、
を包含する。
【００４０】
例えば、ｓｓＤＮＡの下流の加工処理は、以下の工程を包含し得る：宿主細胞および細胞外に生成されたファージ様粒子の分離、ＰＥＧ媒介性ファージ沈殿、化学的なファージ溶解、ならびにエタノールでのｓｓＤＮＡ沈殿。
例えば、Ｋｉｃｋら，  ２０１５を参照のこと。
【００４１】
（４）前駆ｓｓＤＮＡの自己触媒性消化
次いで、単離された前駆ｓｓＤＮＡは、自己触媒性様式で消化される、すなわち、自己切断ＤＮＡ配列は、前駆ｓｓＤＮＡを切断する。
【００４２】
上記消化は、自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件下で行われる。
【００４３】
Ｚｎ２＋依存性ＤＮＡｚｙｍｅ、例えば、Ｉ−Ｒ３が利用される一実施形態において、上記工程（４）における消化は、Ｚｎ２＋イオンの添加によって誘発される、すなわち、自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件がＺｎ２＋イオンの存在を要求する。
【００４４】
（５）標的１本鎖ＤＮＡ分子を得る工程
次に、標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、特に、工程（４）の副生成物である自己切断ＤＮＡ配列から分離される。
【００４５】
上記分離または精製は、当該分野で公知の従来法／確立された方法、
例えば、
例えば、エタノールおよび酢酸カリウムでの、またはポリエチレングリコールでの沈殿、
クロマトグラフィー、
またはこれらの組み合わせ、
によって行われ得る
【００４６】
最後に、標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが得られる。
【００４７】
（６）さらなる工程
一実施形態において、本発明の方法は、さらなる工程、
（６）標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに加工処理する工程、
を包含する。
【００４８】
例えば、標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ＤＮＡ折り紙構造、タイルに基づくＤＮＡナノ構造、または結晶性ＤＮＡナノ物質へと自己アセンブルおよび／または折りたたまれ得る。あるいは、それらは、他の分子を結合、検出またはプロセシングするために、アプタマーまたはＤＮＡｚｙｍｅとして使用され得る。
【００４９】
−ｓｓＤＮＡ分子の大量生産
【００５０】
一実施形態において、細菌培養は、バイオリアクター、例えば、撹拌タンクバイオリアクター中で行われる。
【００５１】
このような実施形態は、グラムスケールでの標的ｓｓＤＮＡ分子の生成を可能にする。
【００５２】
従って、１本鎖ＤＮＡ分子の大量生産が可能である。
【００５３】
得られたｓｓＤＮＡ分子の使用
本発明は、本発明の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、ＤＮＡナノテクノロジーにおける使用を提供する。
【００５４】
例えば、標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、ＤＮＡ折り紙構造へと自己アセンブルし得るように、すなわち、足場鎖およびいくつかのステープル鎖であるように、デザインされ得る。
ＤＮＡ折り紙構造は、以下であり得る：
ＤＮＡナノロッド、
例えば、本明細書の実施例１に記載されるもの；
ＤＮＡナノポア、
例えば、欧州特許出願第２  ６９５  ９４９号に記載されるもの；
ＤＮＡヘリックスチューブ、
例えば、本明細書の実施例３に記載されるもの；
ＤＮＡポインター物体、
例えば、本明細書の実施例３またはＢａｉら，  ２０１２に記載されるもの；
治療上活性なＤＮＡナノ構造または薬物送達ビヒクル、配置デバイス（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）、
ナノセンサー。
【００５５】
本発明は、本発明の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、研究ツールとしての使用を提供する。
【００５６】
本発明は、本発明の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、診断用のプローブとしての使用を提供する。
【００５７】
本発明は、本発明の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、遺伝子治療における使用を提供する。
【００５８】
本発明は、本発明の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、分子検知における／分子センサーとしての使用を提供する。
【００５９】
好ましい実施形態のさらなる説明
本発明者らは、細菌における１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの組換え生成のための生物工学的方法を提示する。上記方法を用いると、数千塩基までの長さを有する１本鎖ＤＮＡ分子は、任意の拡大可能な量で生成され得る。この方法に起因して、ＤＮＡベースのナノ構造の大量生産が、事実上可能になる。
【００６０】
その方法は、図１のフロー図において示されるように、７工程を包含する。
【００６１】
工程（１）では、特別の条件付き形態で生成されるべきＤＮＡヌクレオチド配列を含む偽遺伝子がデザインまたは構築される。この形態は、以下でより詳細に記載され、本発明の方法に必須である。
【００６２】
工程（２）では、その偽遺伝子は、遺伝子合成の現在の方法／確立された方法を介して生成される。
【００６３】
次に、その偽遺伝子は、ベクターまたはプラスミドへと組み込まれ、拡大可能な様式において液体細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物中で「連結された（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）前駆ｓｓＤＮＡ」として生成される（工程（３））。
【００６４】
次いで、その連結された前駆ｓｓＤＮＡは、精製および単離される（工程（４））。
【００６５】
工程（５）では、その連結された前駆ｓｓＤＮＡは、自己触媒性様式で消化され、ここで上記消化は、本発明の方法の重要な特徴である。
【００６６】
上記消化から生じる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、従来の方法を使用して単離される（工程（６））。
【００６７】
次いで、その標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドはさらに、例えば、より大きなスケールでのＤＮＡ折り紙構造の生成のために加工処理され得る（工程（７）：下流の適用）。
【００６８】
−連結された前駆ｓｓＤＮＡの生物工学的生成
２種のＤＮＡプラスミドが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の中に、同時形質転換を介して導入される（図２）。その「ヘルパープラスミド」は、Ｍ１３バクテリオファージのタンパク質およびＥ．ｃｏｌｉ細胞分裂の間に娘細胞へのヘルパープラスミドの伝播を保証するさらなる情報（プラスミド骨格）のための遺伝子を含む。その「ファージミド」（＝ファージ−プラスミド）は、特別の条件付き形態（「連結された前駆ｓｓＤＮＡ」）において生成されるべきＤＮＡオリゴヌクレオチド配列およびとりわけ、細胞分裂の間のそのファージミドの伝播を保証するさらなる情報を含む。
【００６９】
最初は、その２種のプラスミドの各々は、クローニングを介して生成される必要がある。連結された前駆ｓｓＤＮＡを有するファージミドを生成するために、従来の遺伝子合成は、事前に行われる必要がある。
【００７０】
細胞内部では、そのファージミドは、（ローリングサークル増幅を介して）増幅される。同時に、そのＭ１３ファージタンパク質が生成される。
【００７１】
その１本鎖ファージミドは、特別なパッケージング配列を含み、このパッケージング配列を通じて、ファージタンパク質によって認識されかつファージ粒子へとパッケージされる。その結果として、その細胞は、−通常のファージゲノムの代わりに−そのファージミドの１本鎖形態、従って、その生成されるべきＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含むファージ様粒子を分泌する。
【００７２】
そのファージ粒子は、細胞がペレット化された後に上清から単離され得る。そのファージ粒子の中に含まれるＤＮＡは、精製され得る。
【００７３】
上記で記載される生物工学的プロセスは、細菌培養物におけるタンパク質の組換え生成（Ｋｉｃｋら，  ２０１５）と同様に、拡大可能である。
【００７４】
−連結された前駆ｓｓＤＮＡのさらなる加工処理
図３は、上記特別の条件付き形態、すなわち、「連結された前駆ｓｓＤＮＡ」における偽遺伝子の構造を示す。
【００７５】
生成されるべきＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は、触媒として活性なＤＮＡ配列（「Ｉ−Ｒ３」）（Ｇｕら（２０１３）を参照のこと）によって両方の末端において隣接される。これらのＤＮＡｚｙｍｅは、自己切断効果を有する、すなわち、上記ＤＮＡｚｙｍｅは、二価の亜鉛カチオンの添加後かつ適切な反応条件下で、骨格加水分解を（黒の矢尻として、図３の挿入図に示される位置において）触媒する。
【００７６】
その連結された前駆ｓｓＤＮＡは、従って、多くの異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含み得る。
【００７７】
前駆ｓｓＤＮＡの精製後、その触媒作用は、亜鉛を添加することによって開始され得る（「切断」）。
切断に起因して、その前駆ｓｓＤＮＡは、所望の１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび触媒性ＤＮＡｚｙｍｅ（これは、副生成物である）へと、分離または分かれる。そのＤＮＡｚｙｍｅは、標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドから、例えば、クロマトグラフィーを介して分離され得る。
【００７８】
−本発明の方法の利点
ヘルパープラスミド（Ｍａｒｃｈｉら，  ２０１４）または酵素（Ｓｃｈｍｉｄｔら，  ２０１５）を用いる１本鎖ファージミドＤＮＡの生物工学的生成のための方法は、当該分野で記載されている。さらに、長い環状ｓｓＤＮＡをユーザー定義の配列において制限エンドヌクレアーゼの助けを借りて消化する工程を包含する方法が、当該分野で記載されている（Ｄｕｃａｎｉら，  ２０１３）。
【００７９】
Ｄｕｃａｎｉら（２０１３）によって記載される方法では、タンパク質ベースの制限ヌクレアーゼが利用され、従って、さらなる試薬として要求される。これらの酵素は、購入されるかまたは別個の生物工学的プロセスにおいて生成されるかのいずれが必要である。さらに、Ｄｕｃａｎｉらによって記載される方法では、全てのステープルオリゴヌクレオチドは、分取用ゲル電気泳動を使用して精製されるが、この電気泳動は、単調でかつスケールに合わせて調整されない。本明細書で記載される上記方法では、さらなるコスト集約的または労働集約的試薬は、消化のために必要でない。なぜなら標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を生成するために要求される全ての構成要素は、ヘルパープラスミド、ファージミドと偽遺伝子との組み合わせシステムの中に既に含まれるからである。
【００８０】
本発明の必須の局面は、方向付けられた展開を介して生成される触媒として活性なＤＮＡ配列、すなわち、ＤＮＡｚｙｍｅ（Ｇｕら，  ２０１３）の使用である。上記触媒として活性なＤＮＡ配列は、連結された前駆ｓｓＤＮＡの中に含まれ、生物工学的プロセスにおいて、その標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列と一緒に増幅される。Ｇｕらによって提示される方法は、異なる長さのオリゴヌクレオチドを生成するが、自由裁量の配列のものは生成しない。それらの前駆ＤＮＡは、同じ冗長配列の数コピーを含む。本明細書で記載される方法は、ＤＮＡ折り紙の生成のために要求されるように、自由裁量の配列を有するオリゴヌクレオチドの生成を可能にする。さらに、Ｇｕらは、同じ末端配列、従って、同じＤＮＡｚｙｍｅを使用するが、本発明の方法は、異なる標的オリゴヌクレオチド配列を生成するために異なるＤＮＡｚｙｍｅ配列を使用する。
【００８１】
以下の例および図面は、本発明を例証するが、本発明をこれら例および図面に限定することはない。
【実施例】
【００８２】
実施例１    ＤＮＡベースのナノロッドの生成
プロトタイプとして、ＤＮＡベースのナノロッドを、本発明の方法によって専ら生成したＤＮＡ物質から生成した。そのＤＮＡベースのナノロッドを消化し、ＤＮＡ折り紙デザイン法（Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，  ２００６を参照のこと；米国特許出願２００７／１１７１０９  Ａ１号および同２０１２／  ２５１５８３  Ａ１号；米国特許第７，８４２，７９３  Ｂ２号および同第８，５０１，９２３  Ｂ２号もまた参照のこと）で発展させた。このナノロッドは、ハニカム格子の状態で平行に整列されかつ鎖接続（ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を介して架橋される１０種のＤＮＡ二重らせんからなる（図４Ａを参照のこと）。そのナノロッドに関しては、２５００塩基長の１本鎖ＤＮＡ骨格分子（「足場鎖」）は、２１のＤＮＡオリゴヌクレオチド（「ステープル鎖」）（各々は、約１００塩基の長さを有する）と同様に必要とされる。全ての要求される構築エレメントは、そのために特別に構築されたファージミドに由来する。
【００８３】
１．１  材料および方法
−配列：
ＤＮＡｚｙｍｅ：
【化３】
2019528743.tif 000004
ここで配列番号１＝ＴＡＧＴＴＧＡＧＣＴＧＴであり、配列番号２＝ＡＣＧＴＴＧＡＡＧである；
そしてここでＰ３は、自由裁量の配列のスペーサーであり、ここでＰ１およびＰ１’は、ＤＮＡ二重らせんを形成する２種の相補的配列である。その同じことがＰ２およびＰ２’にも当てはまる。
【００８４】
２１種のオリゴヌクレオチド（各々は、約１００塩基の長さを有する）：
【化４−１】
2019528743.tif 000005
【化４−２】
2019528743.tif 000006
【００８５】
【化５】
2019528743.tif 000007
【００８６】
【化６−１】
2019528743.tif 000008
【化６−２】
2019528743.tif 000009
【００８７】
２．Ｅ．ｃｏｌｉ培養条件
この実施例において、ファージミド１本鎖ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ液体培養物中で生成し、そこから精製した。この目的のために、ケミカルコンピテントＤＨ５ａｌｐｈａ細胞を、ファージミドおよびヘルパープラスミドで共形質転換した。そのようにして得られた株を、５０ｍｇ／ｌ  カナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌ  カルベニシリンを含む２×ＹＴ培地中で増殖させた。３７℃において一晩のインキュベーション後、その培養物を４０００ｒｃｆにおいて３０分間遠心分離した。固体ＰＥＧ  ８０００およびＮａＣｌを、各々最終濃度３％（ｍ／ｖ）になるようにその上清に添加した。次いで、ファージ様粒子を、４０００ｒｃｆにおいて３０分間遠心分離することによって沈殿させた。ｓｓＤＮＡを、Ｋｉｃｋら，  ２０１５に記載されるようにこれらの粒子から抽出した。
【００８８】
３．標的構造の消化およびアセンブル
次いで、そのファージミド１本鎖ＤＮＡを、反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＺｎＣｌ２）中で、３時間、３７℃においてインキュベートした。インキュベーション後、そのＤＮＡを所望のセグメントへと完全に消化する（図５を参照のこと）。その後、そのＤＮＡをエタノールおよび酢酸カリウムで沈殿させ、折り紙折りたたみ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に溶解する。そのＤＮＡ溶液を、１５分間にわたって６５℃へと加熱し、次いで、６０℃から４０℃へとゆっくりと冷却する（３時間／１℃）。ゲル電気泳動分析（図４Ｂを参照のこと）および透過型電子顕微鏡法（図４Ｃを参照のこと）から、標的構造の成功裡のアセンブルが確認される。
【００８９】
実施例２    ＤＮＡｚｙｍｅ配列の最適化
本発明者らのファージミドを構築するために、本発明者らは、制限酵素結合部位が挿入されるその同じ方法で、その標的オリゴヌクレオチド間に一定のＤＮＡｚｙｍｅ配列を単に置くことはしない。ＤＮＡｚｙｍｅの配列は、生成されるべきであるオリゴヌクレオチドの末端配列に依存する。Ｇｕら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０１３）は単に同じ末端配列、従って同じＤＮＡｚｙｍｅを使用するが、本発明者らの方法は、異なる標的オリゴヌクレオチド配列を生成するために異なるＤＮＡｚｙｍｅ配列を使用する
【００９０】
ＤＮＡｚｙｍｅ配列中の必須の塩基を同定するために、本発明者らは、オリゴヌクレオチドとして個々のＤＮＡｚｙｍｅの約４０種の異なる改変体（２つの例については図６Ａを参照のこと）および全長ファージミドの５つのバージョン（２つの例については図６Ｂを参照のこと）をスクリーニングした。本発明者らは、ＤＮＡｚｙｍｅの元の刊行物（Ｇｕら，  ＪＡＣＳ  ２０１３）において必須として分類されていないいくつかの塩基が、実際には必須であることを見出す。このことは、本発明者らが所望の生成物へと許容可能な時間で完全に切断されるファージミドを構築することを可能にした（図６Ｂを参照のこと）。
【００９１】
ＤＮＡｚｙｍｅオリゴヌクレオチド（図６Ａに示されるとおり）：  
【化７】
2019528743.tif 000010
【００９２】
ファージミド（図６Ｂに示されるとおり）：
【化８−１】
2019528743.tif 000011
【化８−２】
2019528743.tif 000012
【化８−３】
2019528743.tif 000013
【００９３】
実施例３    本発明のＤＮＡｚｙｍｅベースの方法を使用して生成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドからアセンブルされるさらなるナノ構造
【００９４】
ナノロッドに加えて、本発明者らは、３２００塩基長足場および３１のステープルオリゴヌクレオチドからアセンブルされる４８ヘリックスチューブをデザインした（図７Ａを参照のこと）。ナノロッドと同様に、この４８ヘリックスチューブのための全てのステープルは、１種のファージミド上でコードされ、そのファージミドの骨格は、足場として働く。ナノロッドのように、この物体は、本質的に完全な１：１化学量論に起因して、足場に対して過剰なステープルを使用することなく、所望の形状へと効率的にアセンブルする。
【００９５】
既存の完全サイズのＤＮＡ折り紙物体のアセンブルへの本発明者らの方法の適用可能性を示すために、本発明者らは、低温電子顕微鏡研究（Ｂａｉら，  ２０１２）において以前に使用されたポインター物体（図７Ｂを参照のこと）のアセンブルに必要とされる全１６１のステープルオリゴヌクレオチドをコードするファージミドを生成した。ナノロッドおよび４８ヘリックスバンドルとは対照的に、そのポインターのステープルは、４種の個々のファージミドにわたって分配され、別個の足場（Ｍ１３ｍｐ１８、７２４９塩基長、Ｂａｉらによる折り紙研究において使用されたのと同じ配列）が使用される。相対的濃度における不確定要素を補償するために、本発明者らは、足場に対してわずかに過剰のステープルを使用した（１．２５  対  １）。比較において、化学合成されたステープルを使用するアセンブルは、２．５  対  １というより大過剰を要求した。
【００９６】
ファージミド配列
【化９−１】
2019528743.tif 000014
【化９−２】
2019528743.tif 000015
【化９−３】
2019528743.tif 000016
【化９−４】
2019528743.tif 000017
【化９−５】
2019528743.tif 000018
【化９−６】
2019528743.tif 000019
【００９７】
前述の説明、特許請求の範囲、および／または添付の図面において開示される特徴は、別個に、およびこれらの任意の組み合わせにおいて、両方で、その多様な形態で本発明を実現するための材料であり得る。
【００９８】
参考文献
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【図１】
2019528743.tif 000020
【図２】
2019528743.tif 000021
【図３】
2019528743.tif 000022
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2019528743.tif 000025
【図６Ｂ】
2019528743.tif 000026
【図７Ａ】
2019528743.tif 000027
【図７Ｂ】
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【配列表】
2019528743000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月25日(2019.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ１本鎖分子の組換え生成のための方法であって、該方法は、
（１）偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで該偽遺伝子核酸は、少なくとも１種の標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する２種の自己切断ＤＮＡ配列を含む核酸である、
工程、
（２）該偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を該ベクターで形質転換し、そして前駆ｓｓＤＮＡを該ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで該前駆ｓｓＤＮＡは、該偽遺伝子核酸を含む、
工程；
（３）該前駆ｓｓＤＮＡを該細菌培養物から単離する工程；
（４）該前駆ｓｓＤＮＡを、該自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件下で消化する工程；ならびに
（５）該標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得るために、該標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記自己切断ＤＮＡ配列は、自己切断デスオキシリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅ、
例えば、Ｚｎ２＋依存性ＤＮＡｚｙｍｅ、例えば、Ｉ−Ｒ３
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記偽遺伝子核酸は、２種、３種、４種または約５０種より多くの標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、約２０ヌクレオチドから約数千ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ、特に、Ｋ１２由来Ｅ．ｃｏｌｉ安全株、例えば、ＤＨ５ａｌｐｈａ、ＸＬ−１ｂｌｕｅまたはＪＭ１０９から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（２）におけるベクターは、少なくとも１種のファージミドであり、必要に応じて、さらなる構成要素：
例えば、
−パッケージング配列、
−細胞分裂の間に該ファージミドの伝播を保証する構成要素、
−選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子、
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
さらにヘルパープラスミドまたはヘルパーファージが使用され、該ヘルパープラスミドまたはヘルパーファージは、さらなる構成要素、例えば、
−バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子、
−細胞分裂の間に該ヘルパープラスミドの伝播を保証する構成要素、
−選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（２）におけるベクターは、少なくとも１種のファージミドであり、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を介して前記細菌細胞内部で増幅され、ファージミドｓｓＤＮＡを生じる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ファージミドｓｓＤＮＡは、好ましくは前記細胞から分泌されるファージ様粒子へとパッケージされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（３）は、前記ファージ様粒子を前記細胞培養物から抽出すること、そして前記ファージミドｓｓＤＮＡを該ファージ様粒子から抽出することを包含する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（４）の消化は、Ｚｎ２＋イオンの添加によって誘発される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（５）における標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程は、
前記自己切断ＤＮＡ配列、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅから、例えば、クロマトグラフィーを介して分離すること、
を包含する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（６）前記標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに加工処理する工程、
例えば、ＤＮＡ折り紙構造、タイルに基づくＤＮＡナノ構造、もしくは結晶性ＤＮＡナノ物質へと自己アセンブルおよび／または折りたたむ工程、
あるいは他の分子を結合、検出、または加工処理するためのアプタマーもしくはＤＮＡｚｙｍｅとしての使用、
をさらに包含する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌培養は、バイオリアクター、例えば、撹拌タンクバイオリアクターで行われる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの
−ＤＮＡナノテクノロジーにおける、
−研究ツールとしての、
−遺伝子合成における、または
−分子検知における、
使用。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物であって、
−ＤＮＡナノテクノロジーにおける、
−研究ツールとしての、
−診断用のプローブとしての、
−遺伝子合成における、
−遺伝子治療における、または
−分子検知における、
使用のための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明によれば、この目的は、本発明の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを
−ＤＮＡナノテクノロジーにおいて、
−研究ツールとして、
−診断用のプローブとして、
−遺伝子合成において、
−遺伝子治療において、
−分子検知において／分子センサーとして、
使用することにより解決される。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＤＮＡ１本鎖分子の組換え生成のための方法であって、該方法は、
（１）偽遺伝子核酸を提供する工程であって、
ここで該偽遺伝子核酸は、少なくとも１種の標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列および各標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列に隣接する２種の自己切断ＤＮＡ配列を含む核酸である、
工程、
（２）該偽遺伝子核酸をベクターに組み込み、細菌細胞を該ベクターで形質転換し、そして前駆ｓｓＤＮＡを該ベクターから細菌培養条件下で生成する工程であって、
ここで該前駆ｓｓＤＮＡは、該偽遺伝子核酸を含む、
工程；
（３）該前駆ｓｓＤＮＡを該細菌培養物から単離する工程；
（４）該前駆ｓｓＤＮＡを、該自己切断ＤＮＡ配列が活性になる反応条件下で消化する工程；ならびに
（５）該標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得るために、該標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程、
を包含する方法。
（項目２）
前記自己切断ＤＮＡ配列は、自己切断デスオキシリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅ、
例えば、Ｚｎ２＋依存性ＤＮＡｚｙｍｅ、例えば、Ｉ−Ｒ３
である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記偽遺伝子核酸は、２種、３種、４種または約５０種より多くの標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、約２０ヌクレオチドから約数千ヌクレオチドの範囲の長さを有する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ、特に、Ｋ１２由来Ｅ．ｃｏｌｉ安全株、例えば、ＤＨ５ａｌｐｈａ、ＸＬ−１ｂｌｕｅまたはＪＭ１０９から選択される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記工程（２）におけるベクターは、少なくとも１種のファージミドであり、必要に応じて、さらなる構成要素：
例えば、
−パッケージング配列、
−細胞分裂の間に該ファージミドの伝播を保証する構成要素、
−選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子、
を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
さらにヘルパープラスミドまたはヘルパーファージが使用され、該ヘルパープラスミドまたはヘルパーファージは、さらなる構成要素、例えば、
−バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３バクテリオファージのタンパク質をコードする遺伝子、
−細胞分裂の間に該ヘルパープラスミドの伝播を保証する構成要素、
−選択マーカー、
代表的には抗生物質耐性遺伝子、
を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記工程（２）におけるベクターは、少なくとも１種のファージミドであり、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を介して前記細菌細胞内部で増幅され、ファージミドｓｓＤＮＡを生じる、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記ファージミドｓｓＤＮＡは、好ましくは前記細胞から分泌されるファージ様粒子へとパッケージされる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
工程（３）は、前記ファージ様粒子を前記細胞培養物から抽出すること、そして前記ファージミドｓｓＤＮＡを該ファージ様粒子から抽出することを包含する、項目６〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記工程（４）の消化は、Ｚｎ２＋イオンの添加によって誘発される、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記工程（５）における標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを分離する工程は、
前記自己切断ＤＮＡ配列、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅから、例えば、クロマトグラフィーを介して分離すること、
を包含する、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
（６）前記標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに加工処理する工程、
例えば、ＤＮＡ折り紙構造、タイルに基づくＤＮＡナノ構造、もしくは結晶性ＤＮＡナノ物質へと自己アセンブルおよび／または折りたたむ工程、
あるいは他の分子を結合、検出、または加工処理するためのアプタマーもしくはＤＮＡｚｙｍｅとしての使用、
をさらに包含する、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記細菌培養は、バイオリアクター、例えば、撹拌タンクバイオリアクターで行われる、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
先行する項目のいずれか１項に記載の方法において得られる標的１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの
−ＤＮＡナノテクノロジーにおける、
−研究ツールとしての、
−診断用のプローブとしての、
−遺伝子合成における、
−遺伝子治療における、
−分子検知における、
使用。
【国際調査報告】
2019528743.tif 000029
2019528743.tif 000030