(57)【要約】  本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンジオポエチン（ＡＮＧ）に対する活性を有する二重特異性抗体、ならびにかかる二重特異性抗体を作製および使用する方法に関する。【選択図】図１
2019528694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖相補性決定領域１〜３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）および軽鎖相補性決定領域１〜３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む第１の結合ドメインと、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ここで前記第１の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号１７〜２２を含み、ここで前記第２の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号２３〜２８を含む、二重特異性抗体。
【請求項２】
前記第１の結合ドメインが、配列番号３および９を各々含む重鎖および軽鎖を含み、かつ前記第２の結合ドメインが、配列番号５および１１を各々含む重鎖および軽鎖を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号１を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸配列が配列番号７を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
部分ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＶＬ−ＣＬ、および１つ以上のｓｃＦｖ、Ｌ１、または任意選択的にはＬ２を有する式（式中、前記各部分は、ＶＨ＝重鎖可変ドメイン；ＣＨ１＝重鎖定常領域ドメイン１；Ｈ＝ヒンジ領域；ＣＨ２＝重鎖定常領域ドメイン２；ＣＨ３＝重鎖定常領域ドメイン３；ＶＬ＝可変軽鎖ドメイン；ＣＬ＝軽鎖定常ドメイン；Ｌ１＝リンカー；およびＬ２＝Ｌ１と独立したリンカーである）であって、
ａ．ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３およびｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ；
ｂ．ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬ；
ｃ．ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖおよびＶＬ−ＣＬ；
ｄ．ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２およびＶＬ−ＣＬ（式中、Ｌ１およびＬ２はＣＨ３に共有結合される）；
ｅ．ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬ（前記重鎖は、ヒンジ領域を有し得る、またはヒンジレスであり得る）
であり得る、式を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
前記式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖおよびＶＬ−ＣＬを含む、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
請求項１に記載の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列。
【請求項８】
請求項７に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載の二重特異性抗体を作製する方法であって、請求項９に記載のベクターを含む細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項１１】
血管新生を低減する方法であって、請求項１に記載の二重特異性抗体を対象に提供するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンジオポエチン（ＡＮＧ）に対する活性を有する二重特異性抗体、ならびにかかる抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の脈管構造からの新たな血管の形成であり、実質的にすべての臓器の形成および生理学的機能に必要とされる複雑な生物学的プロセスである。それは、胚形成、正常な生理学的増殖、修復、および腫瘍拡大などの病理学的プロセスに必須の要素である。通常、血管新生は、内皮細胞による血管出芽、分岐、および細管形成を含む多段階プロセス（内皮細胞（ＥＣ）の活性化、血管の脱安定化、分解酵素の合成および放出、ＥＣ遊走、ＥＣ増殖、ＥＣ組織化および分化、ならびに血管成熟などのプロセスを含む）において、血管新生因子と血管新生抑制因子の局所的平衡により密に調節される。
【０００３】
成体では、生理学的血管新生は、創傷治癒ならびに雌の生殖機能および胚発生の幾つかの要素に主に限定される。任意の異常な、望ましくないまたは病理学的な血管新生を含む疾患関連性の血管新生では、血管新生因子と血管新生抑制因子との間の局所的平衡が調節不全になり、不適切な、および／または構造的に異常な血管形成をもたらす。病理学的血管新生は、糖尿病性網膜症、乾癬、がん、関節リウマチ、アテローマ、カポジ肉腫、および血管腫を含む病態と関連づけられている（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１６：５７−６６；Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：２７−３１）。がんでは、原発性および続発性腫瘍の１〜２ｍｍ３を上回る増殖には血管新生が必要とされる（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９５；３３，１７５７−１７６３）。
【０００４】
ＶＥＧＦは、強力な広範に分布する血管増殖因子である。内皮細胞のための分泌マイトジェンとしてのＶＥＧＦの役割の同定に先立ち、それは血管透過性因子として同定された、増殖、遊走、特殊化、および生存を含む、内皮細胞挙動の多くの異なる側面を制御するＶＥＧＦの能力が強調された（Ｒｕｈｒｂｅｒｇ，２００３  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２５：１０５２−１０６０）。ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、および内分泌腺由来ＶＥＧＦ（ＥＧ−ＶＥＧＦ）を含む。ＶＥＧＦの活性型は、ホモ二量体または他のＶＥＧＦファミリーメンバーとのヘテロ二量体のいずれかとして合成される。ＶＥＧＦ−Ａは、選択的スプライシングにより産生される６つのアイソフォーム：ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６で存在する。これらのアイソフォームは、主にそのバイオアベイラビリティにおいて異なり、ＶＥＧＦ１６５が主要なアイソフォームである（Ｐｏｄａｒ，ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｂｌｏｏｄ  １０５（４）：１３８３−１３９５）。様々なアイソフォームの段階および組織に特異的な比をもたらす胚形成の間でのスプライシングの調節により、ＶＥＧＦに応答しての内皮細胞の異なる状況依存的な挙動に向けての豊かな潜在性が創出される。
【０００５】
ＶＥＧＦは、正常と疾患関連性双方の血管新生（Ｊａｋｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ：１３３，８４８−８５９；Ｋｏｌｃｈ，ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：３６，１３９−１５５）および血管透過性（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ：２６４，２００１７−２００２４）の重要な刺激因子であると考えられる。抗体を用いたＶＥＧＦの隔離によるＶＥＧＦ作用の拮抗は、腫瘍増殖における低下をもたらし得る（Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｎａｔｕｒｅ：３６２，８４１−８４４）。ＶＥＧＦ遺伝子のヘテロ接合性破壊は、脈管形成における致命的欠損をもたらした（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｎａｔｕｒｅ３８０：４３５−４３９；Ｆｅｒｒａｒａ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２）。
【０００６】
ＶＥＧＦファミリーに加えて、アンジオポエチンは、血管発生および生後血管新生に関与すると考えられる。アンジオポエチンは、天然に存在するアゴニスト、アンジオポエチン−１（ＡＮＧ−１）とともに、天然に存在するアンタゴニスト、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）を含む。ＡＮＧ−１の役割は、成体において保存されると考えられ、そこでそれは、広範かつ構成的に発現される（Ｈａｎａｈａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０（１９９７）；Ｚａｇｚａｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００（１９９９））。それに対し、ＡＮＧ−２の発現は、主に血管再構築の部位に限定され、そこでそれは、ＡＮＧ−１の構成的安定化または成熟化機能を遮断し、血管が発芽シグナルに対してより応答性であり得る塑性状態に戻り、その状態を維持することを可能にすると考えられる（Ｈａｎａｈａｎ，１９９７；Ｈｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：５３５６−６２（１９９９）；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，１９９７）。疾患関連血管新生におけるＡＮＧ−２発現に関する試験により、多数の腫瘍タイプが血管ＡＮＧ−２発現を示すことが見出されている（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５−６０（１９９７））。機能的試験によると、ＡＮＧ−２が腫瘍血管新生に関与することが示唆され、ＡＮＧ−２の過剰発現がマウス異種移植片モデルにおける腫瘍増殖の増加と関連づけられる（Ａｈｍａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：１２５５−１２５９（２００１））。他の試験では、ＡＮＧ−２の過剰発現が腫瘍血管過多と関連づけられている（Ｅｔｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：２１４５−５３（２００１）；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：７１２４−２９（２００２））。
【０００７】
相同性に基づくクローニング手法を用いて、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９９  Ｍａｒ  ２；９６（５）：１９０４−９）は、２つの新規なアンジオポエチン：マウスにおけるアンジオポエチン−３（ＡＮＧ−３）およびヒトにおけるアンジオポエチン−４（ＡＮＧ−４）を同定した。ＡＮＧ−３およびＡＮＧ−４は、ＡＮＧ−１およびＡＮＧ−２のマウスおよびヒトバージョンよりも互いに構造的に異なるが、それらは、マウスおよびヒトの同じ遺伝子座の対応物を表すように思われる。アンジオポエチンファミリーのこれらメンバーの生物学についてはほとんど知られていない。例えば、ＡＮＧ−４は、肺に限って高レベルで発現される（Ｔｓｉｇｋｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  １２（６）：９３３−９４１（２００３）；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１９０４−１９０９（１９９９））。ＡＮＧ−４の発現レベルは、低酸素状態に応答して増加することが知られており、内皮細胞増殖因子は、神経膠芽腫細胞系および内皮細胞においてＡＮＧ−４発現のレベル上昇をもたらす。しかし、発現調節の機構、および生理学的な疾患関連血管新生に対して得られる効果については未知である（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１８：１２００−１２０８（２００４））。
【０００８】
アンジオポエチンは、血管内皮内で選択的に発現されるＴｉｅ受容体チロシンキナーゼファミリーに対するリガンドとして最初に発見された（Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４２−４８（２０００））。ＡＮＧ−１、ＡＮＧ−２、ＡＮＧ−３およびＡＮＧ−４は、主にＴｉｅ−２受容体に結合することから、Ｔｉｅ−２リガンドとしても公知である。ＡＮＧ−１のＴｉｅ−２への結合は、該受容体の自己リン酸化を介したチロシンリン酸化とその後のシグナル伝達を介したそのシグナル伝達経路の活性化を誘導する（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｓｃｉｅｎｃｅ：２７７，５５−６０）。ＡＮＧ−２は、Ｔｉｅ−２受容体のＡＮＧ−１誘発性キナーゼ活性化の競合阻害を通じて作用する、ＡＮＧ−１に対する天然に存在するアンタゴニストである（Ｈａｎａｈａｎ，１９９７；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８７：１１６１−６９（１９９６）；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５−６０（１９９７））。
【０００９】
Ｔｉｅ−２およびＡＮＧ−１のノックアウトマウス試験は、類似の表現型を示し、ＡＮＧ−１刺激性のＴｉｅ−２リン酸化が、発生中の血管の再構築および安定化、血管新生の間での血管成熟の促進、ならびに内皮細胞−支持細胞接着の維持を媒介することを示唆する（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１８９７−１９０９（１９９４）；Ｓａｔｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０−７４（１９９５）；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：６，４６０−４６３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年、ＡＮＧ−１、ＡＮＧ−２および／またはＴｉｅ−２は、有望な抗がん治療標的として提起されている（例えば、米国特許第６，１６６，１８５号明細書、米国特許第５，６５０，４９０号明細書および米国特許第５，８１４，４６４号明細書（各々、抗Ｔｉｅ−２リガンドおよび受容体抗体を開示する）を参照）。可溶性Ｔｉｅ−２を用いる試験では、齧歯類における腫瘍の数およびサイズが低減されることが報告されている。また、幾つかのグループが、ＡＮＧ−２に結合する抗体（例えば、米国特許第６，１６６，１８５号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１２４１２９号明細書を参照）およびＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体（例えば、米国特許第８，２１６，５７１号明細書を参照）の使用について報告している。加えて、ＶＥＧＦ−ＡおよびＡＮＧ−２を標的化する例が存在する（例えば、国際公開第２００１９７８５０号パンフレット、国際公開第２００７０８９４４５号パンフレット、および米国特許第８，２６８，３１４号明細書を参照）。しかし、より許容可能または有効なＶＥＧＦ−ＡおよびＡＮＧ−２を標的化する二重特異性抗体における医術については満たされない需要がある。より詳細には、それが少なくともＶＥＧＦ−Ａの標的化に関連する毒性（例えば、血栓塞栓症、腎毒性など）に関することから、安全性の改善に関して満たされない需要がある。このため、本明細書で開示されるＶＥＧＦ−ＡおよびＡＮＧ−２を標的化する二重特異性抗体は、例えば血栓塞栓症および／または腎毒性に関連した毒性における低下とともに、血管調節不全および腫瘍増殖を低下させるのに有効である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＶＥＧＦおよびＡＮＧに結合する二重特異性抗体に関する。本発明はまた、ＶＥＧＦおよびＡＮＧに結合し、かつＶＥＧＦおよびＡＮＧの少なくとも１つの生物学的活性といった活性を低減する二重特異性抗体に関する。本発明はさらに、ＶＥＧＦおよびＡＮＧに結合し、かつ腫瘍増殖を低下および／または腫瘍体積を減少させる二重特異性抗体を、それを必要とする対象に提供することに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５つの異なる二重特異性抗体（ＢｉＳ）骨格ＢｉＳ１、ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、ＢｉＳ４、およびＢｉＳ５の一般的構造フォーマットの模式図を表す。ｓｃＦｖは暗灰色で表され、ＩｇＧ  Ｆｖは淡灰色で表される。
【図２】二重特異性抗体ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の概略図を表す。
【図３】二重特異性抗体ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の軽鎖におけるＤＮＡおよびタンパク質配列を表す。
【図４】二重特異性抗体ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の重鎖のＤＮＡ配列を表す。
【図５】二重特異性抗体ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の重鎖のタンパク質配列を表す。
【図６】二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２における溶出特性についての代表的データである。
【図７】二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２における精製特性についての代表的データである。
【図８】二重特異性抗体ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２における代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。ＢｓＡｂ−インタクトＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２；Ａｂ−抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ；ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＨ−ＢｓＡｂ−重鎖；抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂのＨ−Ａｂ−重鎖；ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２および抗ＶＥＧＦのＬ−軽鎖。
【図９】二重特異性抗体ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２に対するフォーカシング後の代表的データである。
【図１０】二重特異性抗体ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２における転移温度についての代表的データである。
【図１１】二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＶＥＧＦ−１６５およびＡＮＧ−２への同時結合についての代表的データである。
【図１２】図１２Ａ：ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いての二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＶＥＧＦ−１６５およびＡＮＧ−２への同時結合についての代表的データである。図１２Ｂ：ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いての二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＶＥＧＦ−１６５およびＡＮＧ−２への同時結合についての代表的データである。
【図１３】二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２によるＶＥＧＦ１２１への結合の欠如を示す代表的データである。
【図１４】二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２によるＶＥＧＦ１８９への結合の欠如を示す代表的データである。
【図１５】７８６−０腎細胞がんモデルにおける二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の存在下での腫瘍体積の減少を示す代表的データである。
【図１６】ＢｘＰＣ３膵がんモデルにおける二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の存在下での腫瘍体積の減少を示す代表的データである。
【図１７】図１７Ａ：二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の不在下での脈管形成を示す代表的データである。図１７Ｂ：二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の存在下での脈管形成を示す代表的データである。
【図１８】二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の存在下での網膜の末梢（破線）の方への血管遊走（矢印）の低下を示す代表的データである（４倍の拡大率）。
【図１９】ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の存在下での血管分岐の低下を示す代表的データである（２０倍の拡大率）。
【図２０Ａ−Ｂ】図２０Ａ：抗ＶＥＧＦ抗体および二重特異性抗体ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の不在下での腎臓病理を示す代表的データである。図２０Ｂ：抗ＶＥＧＦ抗体の存在下での腎臓病理データを示す代表的データである。
【図２０Ｃ】二重特異性ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の存在下での腎臓病理における低減を示す代表的データである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
定義
本発明を詳述する前に、本発明が特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それ故に変更可能であるがことは理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲にて用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明示されない限り、複数の参照対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに用語「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書中で交換可能に用いることができる。さらに、態様が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに本明細書に記載される場合は常に、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」の観点で記載される他の類似する態様もまた提供されることが理解される。
【００１４】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体であってその抗原に結合するものに関与する。ＣＤＲは、（Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））；Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３））；および他の方法を含む）当該技術分野における幾つかの方法により決定される。具体的なＣＤＲ配列が本明細書中に記載され、請求されるが、本発明はまた、当該技術分野で公知の任意の方法によって定義されるＣＤＲ配列を包含する。
【００１５】
本明細書中で用いられるように、用語「対象」は、脊索動物亜門の任意のメンバーを指す。例えば限定はされないが、ヒトおよび他の霊長類、例えば非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種；家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家畜哺乳類、例えば、イヌおよびネコ；実験動物、例えば齧歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモット；鳥類、例えば、飼育、野生および狩猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽、アヒル、ガチョウなどもまた非限定例である。
【００１６】
二重特異性抗体
本発明の好適な二重特異性抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはアロタイプ（例えばＧｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａまたはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、またはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２または３））であり得る、またはそれに由来する。かかる抗体は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づくλ鎖またはκ鎖のいずれかとして分類される軽鎖を含み得る。図１は、５つの異なる二重特異性骨格（ＢｉＳ）の配向性の模式図を示す（例えば、ＰＣＴ特許出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３５０２６号明細書および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２５２３２号明細書を参照）。ｓｃＦｖ内部の特定リンカーおよびｓｃＦｖを本発明の二重特異性抗体の特定部分に連結するリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）が記載される。しかし、ｓｃＦｖ内部の、またはｓｃＦｖを本発明の二重特異性抗体の任意の特定部分に連結する任意の好適なリンカーが用いられてもよい（例えば、ＰＣＴ特許出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３５０２６号明細書および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２５２３２号明細書を参照）。
【００１７】
結合分子の産生
本明細書に記載の二重特異性抗体について作製し、スクリーニングするための組換えＤＮＡ法は当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。本発明の二重特異性抗体を得るため、二重特異性抗体をコードするＤＮＡ、例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはそれらの組み合わせをコードするＤＮＡが、好適な発現ベクターに挿入され得、次に通常は抗体を産生することがない、好適な宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされ得る。
【００１８】
好適な発現ベクターは、当該技術分野で公知である。発現ベクターは、プロモーターに連結された二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含み得る。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく（例えば、米国特許第５，９８１，２１６号明細書；米国特許第５，５９１，６３９号明細書；米国特許第５，６５８，７５９号明細書および米国特許第５，１２２，４６４号明細書を参照）、該抗体の可変ドメインは、全重鎖（ｓｃＦｖ部分を含む）、全軽鎖、または全重鎖および全軽鎖の双方の発現を意図したようなベクターにクローン化されてもよい。二重特異性抗体を産生するため、発現ベクターは、通常の技術により宿主細胞に導入され得、トランスフェクト細胞は、通常の技術により培養され得る。
【００１９】
組換え抗体の発現用宿主として好適な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で公知であり、限定はされないが、ＣＨＯ細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞のがん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および幾つかの他の細胞株を含む、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手可能な多数の不死化細胞株を含む。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴および特定の機構を有する。二重特異性抗体の正確な修飾およびプロセシングを保証するため、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。このため、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が用いられてもよい。かかる哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（機能的免疫グロブリン鎖を全く内因性に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含む。モノクローナル抗体を組換え的に産生するため、ヒトリンパ球を不死化することにより発生されるヒト細胞株を用いることができる。モノクローナル抗体を組換え的に産生するため、ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いることができる。組換え抗体の発現用宿主として用いられてもよいさらなる細胞株は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）Ｂｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４）、または酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、米国特許第７３２６６８１号明細書など）、植物細胞（米国特許出願公開第２００８００６６２００号明細書）、またはニワトリ細胞（国際公開第２００８１４２１２４号パンフレット）を含む。
【００２０】
二重特異性抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いて細胞株で安定発現され得る。組換えタンパク質の長期にわたる高収率産生のため、安定発現を用いることができる。安定発現のため、宿主細胞は、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択可能マーカー遺伝子を含む適切に設計されたベクターを用いて形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、細胞は、濃縮培地中で１〜２日間、増殖が許容され、次に選択培地に交換される。組換えプラスミドにおける選択可能マーカーは、選択に対して耐性を付与し、プラスミドを自らの染色体に安定に組み込んでいる細胞が増殖し、フォーカスを形成することを可能にし、次にそのフォーカスは細胞株にクローン化および拡大され得る。安定細胞株を高収率で作製するための方法は当該技術分野で公知であり、試薬は一般に市販されている。一過性発現もまた、当該技術分野で公知の方法を用いることにより実施することができる。一過性遺伝子導入は、細胞に導入される核酸がその細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれることがなく、細胞における染色体外因子として（例えばエピソームとして）維持される場合のプロセスである。
【００２１】
二重特異性抗体を発現する細胞株は、安定にまたは一過性のいずれかでトランスフェクトされるものであり、二重特異性抗体の発現および産生をもたらす、当該技術分野で公知の細胞培地および条件で維持され得る。細胞培地は、例えばＤＭＥＭまたはハムＦ１２を含む市販の培地製剤に基づき得る。さらに、細胞培地は、細胞増殖および生物学的タンパク質発現の双方における増強を支持するため、修飾され得る。本明細書で用いられるとき、用語「細胞培地」、「培地」および「培地製剤」は、多細胞生物または組織以外の人工的インビトロ環境下での細胞の維持、成長、増殖、または拡大のための栄養液を指す。細胞培地は、細胞増殖を促進するために配合される細胞培養増殖培地または組換えタンパク質産生を促進するために配合される細胞培養産生培地を含む、特定の細胞培養用途のため、最適化されてもよい。栄養素、原料、および成分という用語は、細胞培地を構成する成分を指すように本明細書で交換可能に用いられる。細胞株は、流加培養法を用いて維持され得る。本明細書で用いられるとき、「流加培養法」は、細胞培養物が最初に基礎培地とともにインキュベートされてから追加的な栄養分の供給を受けるための方法を指す。例えば、流加培養法は、所与の期間内の決められた供給スケジュールに従って補充培地を添加することを含んでもよい。したがって、「流加細胞培養」は、培養終結前の周期的な細胞および／または生成物の収集の有無にかかわらず、細胞（典型的には哺乳類）、および培地が培養中の血管に最初に供給され、追加的な培養栄養分が培養中の培養物に継続的にまたは不連続増分で供給されるような細胞培養を指す。
【００２２】
細胞培地およびそれに含有される栄養分は、当該技術分野で公知である。細胞培地は、基礎培地と、修飾基礎培地をもたらす、少なくとも１つの加水分解物、例えば、大豆に基づく加水分解物、酵母に基づく加水分解物、または２種の加水分解物の組み合わせとを含んでもよい。追加的な栄養分は、専ら基礎培地、例えば濃縮基礎培地を含んでもよい、または専ら加水分解物、もしくは濃縮加水分解物を含んでもよい。好適な基礎培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最少必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、ＰＦ  ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯタンパク質不含培地（Ｓｉｇｍａ）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ＣＨＯ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）参照、およびイスコフ改変ダルベッコ培地を含む。用いてもよい基礎培地の他の例として、ＢＭＥ基礎培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅａｇｌｅ，Ｈ（１９６５）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８９，３６も参照）；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００）；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８：３９６；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９６０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：１８５．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ６：２，９３も参照）；ＣＭＲＬ  １０６６培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃１１５３０）；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９５７）Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５：３０３も参照）が挙げられる。
【００２３】
基礎培地は無血清であってもよく、これは、培地が血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、または当業者に公知の任意の他の動物由来血清）を含有しないこと、または動物タンパク質不含培地または合成培地であることを意味する。
【００２４】
基礎培地は、標準の基礎培地中に見出される特定の非栄養成分、例えば様々な無機および有機緩衝液、界面活性剤、および塩化ナトリウムを除去するため、修飾されてもよい。かかる成分を基本細胞培地から除去することは、残存する栄養成分の濃度増加を可能にし、全体的な細胞増殖およびタンパク質発現を改善することがある。さらに、除去された成分は、細胞培養条件の要求に従って修飾された基本細胞培地を含有する細胞培地に再び添加されてもよい。細胞培地は、修飾された基本細胞培地と、以下の栄養分、鉄供給源、組換え増殖因子；緩衝液；界面活性剤；容積モル浸透圧濃度調節剤；エネルギー源；および非動物加水分解物の少なくとも１つとを含有してもよい。さらに、修飾された基本細胞培地は、任意選択的には、アミノ酸、ビタミン、またはアミノ酸とビタミン双方の組み合わせを含有してもよい。修飾された基礎培地は、グルタミン、例えばＬ−グルタミン、および／またはメトトレキサートをさらに含有してもよい。
【００２５】
精製および単離
一旦二重特異性抗体が作製されていると、それは、免疫グロブリン分子を精製するための当該技術分野で公知の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性（特に特異抗原プロテインＡまたはプロテインＧに対する親和性によるもの）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解度により、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的技術により精製されてもよい。さらに、本発明の二重特異性抗体は、精製を容易にするため、異種ポリペプチド配列（本明細書中で「タグ」と称される）と融合されてもよい。
【００２６】
使用
本発明の二重特異性抗体は、幾つかの方法で用いることができる。例えば、本発明の二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ、ＡＮＧ、またはこれらのタンパク質の任意の組み合わせに結合させ、それによりＶＥＧＦ、ＡＮＧの少なくとも１つの生物学的活性、またはこれらの活性の任意の組み合わせを低減するため、用いることができる。より詳細には、本発明の二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ−１６５、ＡＮＧ−２、またはこれらのタンパク質の任意の組み合わせに結合させ、それにより、それら各々の受容体の活性化もしくはリン酸化における低下および／または細胞調節不全に関連した血管新生における低下を含んでもよい、ＶＥＧＦ−１６５、ＡＮＧ−２の少なくとも１つの生物学的活性、またはこれらの活性の任意の組み合わせを低減するため、用いることができる。
【００２７】
例示的実施形態
本発明の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体の重鎖相補性決定領域１〜３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）および軽鎖相補性決定領域１〜３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００２８】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体はＶＥＧＦ１６５に結合する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００２９】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性で結合する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３０】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３１】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３２】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、ヒトＶＥＧＦＲ２リン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２リン酸化、またはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２リン酸化を低減する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３３】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、ヒトＴｉｅ２受容体リン酸化を低減する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３４】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、血管新生を低下させる。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３５】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、腫瘍を有する対象に提供されている結果として、腫瘍増殖を低下させる、腫瘍体積を減少させる、または腫瘍増殖を低下させかつ腫瘍体積を減少させる。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３６】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、ＡＮＧ−２に、第２の結合ドメインを作製するために用いられる親ＡＮＧ−２抗体よりも高い親和性で結合する。より特定の実施形態では、第２の結合ドメインのＡＮＧ−２に対する結合親和性は、約１倍〜約２０倍増加する。さらにより特定の実施形態では、第２の結合ドメインのＡＮＧ−２に対する結合親和性は、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、または約２０倍増加する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３７】
別の実施形態は、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、本明細書に記載の二重特異性抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体に関し、ここで第１の結合ドメインはＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ第２の結合ドメインはＡＮＧ−２に結合し、またここで二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ１６５に結合すること、ＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性でＶＥＧＦ１６５に結合すること、ＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性でＶＥＧＦ１６５に結合すること、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性でＶＥＧＦ１６５に結合すること、ヒトＶＥＧＦＲ２リン酸化を低減すること、マウスＶＥＧＦＲ２リン酸化を低減すること、ヒトおよびマウスＶＥＧＦＲ２リン酸化を低減すること、ヒトＴｉｅ２受容体リン酸化を低減すること、血管新生を低下させること、腫瘍増殖を低下させること、腫瘍体積を減少させること、腫瘍増殖を低下させかつ腫瘍体積を減少させること、および第２の結合ドメインを通じてＡＮＧ−２に対する親和性を、第２の結合ドメインを作製するために用いられる親ＡＮＧ−２抗体と比べて増加させることを含む、本明細書に記載の特徴の１つ以上または任意の組み合わせを有する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３８】
別の実施形態は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ＶＨは重鎖可変ドメイン、ＣＨ１は重鎖定常領域ドメイン１、Ｈはヒンジ領域、ＣＨ２は重鎖定常領域ドメイン２、かつＣＨ３は重鎖定常領域ドメイン３である）を有する抗体重鎖を含む二重特異性抗体に関する。別のさらなる実施形態では、二重特異性抗体は、式ＶＬ−ＣＬ（式中、ＶＬは可変軽鎖ドメインであり、かつＣＬは軽鎖定常ドメインである）を有する抗体軽鎖を含む。別のさらなる実施形態では、二重特異性抗体は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬを有する。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００３９】
別の実施形態は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬを含む二重特異性抗体に関し、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子は、抗体重鎖または抗体軽鎖の１つ以上のＮ末端部分に共有結合される。別のさらなる実施形態では、１つ以上のｓｃＦｖ分子は、二重特異性抗体の１つ以上のＶＬのＮ末端ドメインに共有結合される。より特定の実施形態では、二重特異性抗体は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３およびｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬを含み、ここでＬ１はリンカーであり、他の様々な部分は前述の通りである。別のより特定の実施形態では、二重特異性抗体は、式ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬを含む。
【００４０】
別の実施形態は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬを含む二重特異性抗体に関し、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子は、抗体重鎖の１つ以上のＣ末端部分に共有結合される。より特定の実施形態では、二重特異性抗体は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖおよびＶＬ−ＣＬを含む。別のより特定の実施形態では、二重特異性抗体は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２およびＶＬ−ＣＬを含み、ここでＬ２は、リンカーであり、Ｌ１とは独立し、またここでＬ１およびＬ２は、ＣＨ３に共有結合され、他の様々な部分は前述の通りである。別のさらにより特定の実施形態では、二重特異性抗体は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬを含み、ここでＬ１およびＬ２は独立したリンカーであり、またここで重鎖は、ヒンジ領域を有し得る、またはヒンジレスであり得る。さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２である。
【００４１】
具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ここで第１の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号１７〜２２を含み、ここで第２の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号２３〜２８を含む、二重特異性抗体が存在する。
【００４２】
別の具体的な実施形態では、第１の結合ドメインが、配列番号３および９を各々を含む重鎖および軽鎖を含み、かつ第２の結合ドメインが、配列番号５および１１を各々含む重鎖および軽鎖を含む、二重特異性抗体が存在する。
【００４３】
別の具体的な実施形態では、配列番号１を含む重鎖アミノ酸配列および配列番号７を含む軽鎖アミノ酸配列を含む二重特異性抗体が存在する。
【００４４】
別の具体的な実施形態では、部分ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＶＬ−ＣＬ、および１つ以上のｓｃＦｖ、Ｌ１、または任意選択的にはＬ２を有する式であって、
ａ．ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３およびｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ；
ｂ．ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬ；
ｃ．ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖおよびＶＬ−ＣＬ；
ｄ．ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２およびＶＬ−ＣＬ（式中、Ｌ１およびＬ２はＣＨ３に共有結合される）；
ｅ．ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬ（重鎖は、ヒンジ領域を有し得る、またはヒンジレスであり得る）
であり得る、式を含む二重特異性抗体が存在する。
【００４５】
別の具体的な実施形態では、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖおよびＶＬ−ＣＬを有する二重特異性抗体が存在する。
【００４６】
別の具体的な実施形態では、配列番号１３のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む二重特異性抗体が存在する。
【００４７】
別の具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ここで第１の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号１７〜２２を含み、ここで第２の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号２３〜２８を含む、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列が存在する。
【００４８】
別の具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ここで第１の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号１７〜２２を含み、ここで第２の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号２３〜２８を含む、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが存在する。
【００４９】
別の具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ここで第１の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号１７〜２２を含み、ここで第２の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号２３〜２８を含む、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞が存在する。
【００５０】
別の具体的な実施形態では、二重特異性抗体を作製する方法であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ここで第１の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号１７〜２２を含み、ここで第２の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号２３〜２８を含む、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞を培養することを含む、方法が存在する。
【００５１】
別の具体的な実施形態では、二重特異性抗体を対象に提供することを含む、血管新生を低減する方法であって、ここで二重特異性抗体が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメインと、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインとを含み、ここで第１の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号１７〜２２を含み、ここで第２の結合ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号２３〜２８を含む、方法が存在する。
【００５２】
2019528694.tif 000003
【００５３】
2019528694.tif 000004
【００５４】
2019528694.tif 000005
【００５５】
2019528694.tif 000006
【００５６】
2019528694.tif 000007
【実施例】
【００５７】
本明細書に記載の実験においては、必要に応じての単一特異性または二重特異性抗体として、ＭＥＤＩ３６１７（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２０１２  Ｍａｙ；４０（５）：１３２１−３０）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，３３３：３２８−３３５，２００５）、Ｇ６−３１（Ｌｉａｎｇ，ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：９５１−９６１，２００６）、Ｂ２０−４．１（Ｌｉａｎｇ，ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：９５１−９６１，２００６）、およびＲ３４７と名付けたアイソタイプ対照を含む様々な抗体を用いた。一部の結合および機能試験において、マウスと交差反応性がないすべてのＶＥＧＦアイソフォームに結合する能力がある抗ＶＥＧＦ  ＩｇＧ１抗体を陽性対照として用いることができる。マウスＶＥＧＦに対する交差反応が必要である場合、抗体Ｇ６−３１およびＢ２０−４．１を陽性対照として用いることができる。
【００５８】
実施例１−ＢＳ３ＡＢ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ２のフォーマットおよび配列
ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、ＶＥＧＦ−ＡおよびＡＮＧ−２の１つ以上の生物学的活性を、それら各々の受容体ＶＥＧＦＲおよびＴｉｅ２への結合を低下させることによって同時に低減するように設計した。図２は、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の模式図である。二重特異性二価抗体は、Ｄｉｍａｓｉｅｔ．ａｌ．（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９）により先に記載された通り、各重鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖを有する完全長ＩｇＧ分子からなる。Ｆａｂ領域の結合特異性は抗ＶＥＧＦ−Ａ（第１の結合ドメイン）であり、ｓｃＦｖは抗ＡＮＧ−２（第２の結合ドメイン）である。第１の結合ドメインの軽鎖をコードする全ヌクレオチド配列を図３に示す。翻訳されたアミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列もまた図３に示す。抗ＶＥＧＦ軽鎖は、１０７位でトレオニンをリジンに変異させることにより訂正された生殖系列であった。生殖系列が訂正された抗ＶＥＧＦ配列をＨ１ＲＫと称する。重鎖の完全ヌクレオチド配列を図４に示し、対応するアミノ酸配列を図５に示す。重鎖配列のアミノ酸配列は、第１の結合ドメインの重鎖可変領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域、接続するグリシンセリンリンカー、第２の結合ドメインの可変軽鎖、ｓｃＦｖグリシンセリンリンカー、ならびに第２の結合ドメインの可変重鎖領域にさらに分割され得る。
【００５９】
実施例２−一過性トランスフェクション
ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２および親抗体の一過性トランスフェクションを、１２０ｒｐｍ、３７℃および８％ＣＯ２でのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養したＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞において実施した。トランスフェクションに１日前、細胞を０．７×１０６に分割した。２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３００μＬおよび２００μｇのＤＮＡを５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に別々に希釈し、室温で５分間インキュベートした。ＤＮＡおよび２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）混合物を結合させ、さらに３０分間インキュベートし、次に３００ｍＬの１×１０６のＨＥＫ２９３Ｆ細胞／ｍＬに添加した。トランスフェクトした培養物の体積を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）無血清培地を用いて３日ごとに２倍にした。培養物を１１日目に１５００×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、０．２ｍＭで濾過した（エッペンドルフ）。
【００６０】
ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２および親抗体の発現を、プロテインＡ結合法を用いて監視した。培地の一定分量を０．２μｍで濾過し（エッペンドルフ）、ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＬＣ）を用いてプロテインＡカラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ａの２０μｍカラム、４．６×５０ｍｍ、０．８ｍＬ）上に負荷した。カラムを１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、抗体を０．１％リン酸（ｐＨ１．８）で溶出させた。Ａ２８０ｎｍのＵＶシグナルを取り込むことによって決定される溶出ピーク下面積を測定し、発現レベルを既知のＩｇＧ標準と比較することによって計算するために用いた。表１は、親抗体およびＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の発現レベルを示す。
【００６１】
【表１】
2019528694.tif 000008
【００６２】
実施例３−タンパク質の精製および濃度測定
抗体を標準のプロテインＡ親和性クロマトグラフィー法により精製した。条件培地１リットルを１５００×ｇで１０分間遠心分離し、０．２μＭ真空濾過した（Ｎａｌｇｅｎｅ）。濾過した上清を、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ）を用いるｍＡｂｓｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム（ＧＥ）上に負荷した。プロテインＡカラムを２０カラム体積の１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化し、５ｍＬ／分の流速を用いて濾過した培地を負荷した。結合していない材料を、２０カラム体積の１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いることにより除去した。１０カラム体積の０．１Ｍグリシン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ３．２）を用いて抗体溶出を実施した。２８０ｎｍの吸光度を用いて溶出を監視した。プロテインＡ溶出抗体は、１／１０の体積／画分の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を用いることにより、直ぐに中和した。次に、０．２２μＭのシリンジフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を用いて抗体を濾過した。精製抗体の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２８０ｎｍでの吸光度を読み取ることおよび１．４Ｍ−１ｃｍ−１の消衰係数により判定した。
【００６３】
ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の発現中に生成される凝集体は、Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（ＧＥ）精製により効率的に除去することができる。ＣＨＴカラムを５カラム体積の１Ｍ水酸化ナトリウムで予め条件化し、５ｍＬ／分での１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．２）でｐＨ７．２に中和した。カラムを使用前に平衡化するため、２０カラム体積の緩衝液Ａ（２０％の１倍ＰＢＳ、ｐＨ７．２、滅菌水中）を用いた。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２プロテインＡ溶出液をＣＨＴカラム上に直接的に負荷し、２０カラム体積の緩衝液Ａで洗浄した。単量体画分を、１５％緩衝液Ａおよび８５％緩衝液Ｂ（５倍ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１５カラム体積にわたり溶出させた。１００％緩衝液Ｂを用いて凝集体を溶出させた。代表的な溶出特性を図６に示す。単量体画分を１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で一晩透析した。
【００６４】
凝集体レベルを判定するため、また磨くステップが必要である場合、プロテインＡ精製後、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の単量体含量を測定した。ＴＳＫ  ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を実施した。２５０μｇの二重特異性抗体をその分析用に用いた。用いた移動相は、０．１Ｍ硫酸ナトリウム、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８であり、２８０ｎｍの吸収性を用いて抗体を監視した。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）をその分析用に用い、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて図面を準備した。タンパク質精製後およびセラミックハイドロキシアパタイト精製後の代表的な単量体含量を図７に示す。ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２における凝集体の少なくとも１２％は、セラミックハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより効率的に除去され得る。
【００６５】
実施例４−ＢＩＳＡＢ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の分析的特徴づけ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元および非還元により、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２を分析した。２μｇのタンパク質、抗ＶＥＧＦまたはＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、１×ＮｕＰＡＧＥ還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下および不在下で、１５μＬの１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中でＬＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液５μＬと混合した。Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μＬをタンパク質ラダーとして用いた。試料を、７０℃で１０分間加熱し、ベンチトップ遠心機を用いて１３，５００ｒｐｍで遠心沈殿させ、４〜１２％Ｎｕｐａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に負荷した。電気泳動は、ＭＯＰＳ緩衝液中、２００ボルトで１時間実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、水で一晩脱染色した。代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図８に示す。
【００６６】
ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の画像化キャピラリー等電点電気泳動を、ｉＣＥ２アナライザー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて実施した。ｐＨ３〜１０および８〜１０．５のファルマライトをＳｉｇｍａから入手した。陽極液（０．１％メチルセルロース中、８０ｍＭリン酸）、陰極液（０．１％％メチルセルロース中、１００ｍＭ水酸化ナトリウム）、０．５％メチルセルロース、ヘモグロビンおよび両性電解質およびｐＩマーカー（０．３５％メチルセルロース中）を含む、ｉＣＥ３アナライザーの性能評価のためのＦＣカートリッジＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｋｉｔは、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅから購入した。５．８５および９．４６ｐＩマーカーは、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅから入手した。用いるＦＣカートリッジ分離は、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅから購入した。ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、脱イオン水中、１ｍｇ／ｍＬで調製した。１ｍｇ／ｍｌのＢｓ３Ａｂ−ＶＥＧＦ−Ａｎｇ２溶液５０μｌ、５．８５ｐＩマーカー２μｌ、９．４６ｐＩマーカー２μｌ、０．５％メチルセルロース１４０μｌ、３〜１０のファルマライト２μｌおよび８〜１０．５のファルマライト６μｌを結合させ、４５秒間ボルテックスし、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。オートサンプラー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて、試料をキャピラリーに導入した。試料分離を、１０００ｋＶで１分／秒、その後の３０００ｋＶで７分／秒のプレフォーカスにより実施した。検出は、２８０ｎｍでのジュウテリウムランプ検出器を用いて実施した。データを分析し、ｉＣＥ２８０アナライザーソフトウェアを用いて図面を準備した。ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の代表的なフォーカシングを図９に示し、タンパク質のｐＩを示す。
【００６７】
ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２を、ＶＰ−ＤＳＣ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いる示差走査熱量測定分析に先立ち、２５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）で一晩３回透析した。最終透析緩衝液を参照スキャン用に用い、参照サブトラクションにおける安定なベースラインを得た。試薬を最低で２分間脱気し、タンパク質を参照緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、１６秒のフィルター期間を用いて２０℃から１１０℃にかけて１℃／分で走査した。ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２における代表的な転移温度を図１０に示す。
【００６８】
実施例５−ＢＩＳ３ＡＢ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＡＮＧ−２に対する結合親和性
ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＡＮＧ−２に対する結合親和性を判定した。平衡結合定数（ＫＤ）は、ＫｉｎＥｘＡ  ３０００および３２００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）でなされた測定から得られた。ヒトＡＮＧ−２（ｈｕＡｎｇ２）タンパク質を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９）中、５ｍｇ／ｍＬおよび３０ｍｇ／ｍＬの濃度でＵｌｔｒａＬｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔビーズ（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上にコーティングした。次に、コーティングされたビーズを未反応のｈｕＡｎｇ２タンパク質溶液から分離し（穏やかなパルススピン）、室温、ＢＳＡを１０ｍｇ／ｍＬで含有する）１Ｍトリス（ｐＨ８）で約１５分間ブロッキングした。この後、ブロッキング溶液を除去するため、ビーズスラリーを回転させ、次にブロッキングステップを、新しいブロッキング緩衝液を用いて約２時間反復し、使用まで４℃で貯蔵した。使用前にｈｕＡｎｇ２でコーティングされたビーズをビーズバイアルに移し、約２７ｍＬの機器緩衝液（ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（ｐＨ７．４）は、１０ｍＭヘペス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｐ２０＋０．０２％ＮａＮ３を含有する）に再懸濁し、ＫｉｎＥｘＡ機器にかけた。つまり、ＢｉＳ３Ａｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の溶液を、機器緩衝液（ＨＢＳ−Ｐ緩衝液）中、４ｐＭ、４０ｐＭおよび４００ｐＭで調製し、次に３つの別々の一連の１３チューブに分注した。二重特異性抗体のこれらの濃度は、受容体およびＫＤの双方が制御される条件下で測定できるように選択し、それにより試薬の活性および親和性各々のより厳密な推定が可能になった。次に、ｈｕＡｎｇ２タンパク質の２倍連続希釈物を、二重特異性抗体溶液を含有するチューブの９つを通じて、その後１０倍希釈物を、さらなる２つのチューブを通じて滴定し、１つのチューブを二重特異性のみの「ゼロ」対照として残した。そのように行うことで、これにより、ｈｕＡｎｇ２タンパク質の３９ｆＭ〜２ｎＭ（４ｐＭの二重特異性実験）、１５６ｐＭ〜８ｎＭ（４０ｐＭおよび４００ｐＭの二重特異性実験）を範囲とする一連の濃度が得られた。ソフトウェアベンダー（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）を通じて利用可能な理論曲線のシミュレーションに基づき、混合物を室温で１〜３日インキュベートし、結合を平衡に到達できた。この期間の終了時、各測定セットにおける適切な稼動条件を決定するため、シグナル試験の実験を行った。ＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬで含有する機器緩衝液中、０．７５ｍｇ／ｍＬまたは１．０ｍｇ／ｍＬで用いる種特異的な二次抗体試薬（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＤｙＬｉｇｈｔ６４９、パート番号１０９−４９５−０８８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、遊離抗体の検出が可能になった。次に、表２に報告のような平衡結合定数（ＫＤ）を得るため、すべての測定セットから得られるデータを、該ソフトウェアのｎ曲線分析の特徴を用いて１サイト結合モデルに同時にフィッティングした。
【００６９】
【表２】
2019528694.tif 000009
【００７０】
ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＶＥＧＦに対する結合親和性を判定した。抗ｈｕ−ＡＮＧ２の測定と同様、平衡結合定数（ＫＤ）の測定をＫｉｎＥｘＡ  ３０００および３２００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）で実施した。ヒトＶＥＧＦ（ｈｕＶＥＧＦ）タンパク質を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９）中、３ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬおよび５０ｍｇ／ｍＬの濃度でＵｌｔｒａＬｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔビーズ（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上にコーティングした。次に、コーティングされたビーズを、未反応のｈｕＶＥＧＦタンパク質溶液から分離し（穏やかなパルススピン）、室温、ＢＳＡを１０ｍｇ／ｍＬで含有する）１Ｍトリス（ｐＨ８）で約１５分間ブロッキングした。この後、ブロッキング溶液を除去するため、ビーズスラリーを回転させ、次にブロッキングステップを、新しいブロッキング緩衝液を用いて約２時間反復し、使用まで４℃で貯蔵した。使用前にｈｕＡｎｇ２でコーティングされたビーズをビーズバイアルに移し、約２７ｍＬの機器緩衝液（１０ｍＭヘペス＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２＋０．０５％Ｐ２０＋０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ８）に再懸濁し、ＫｉｎＥｘＡ機器にかけた。つまり、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の溶液を、機器緩衝液中、１０ｐＭ、１００ｐＭおよび２．５ｎＭで調製し、次に３つの別々の一連の１３チューブに分注した。二重特異性抗体のこれらの濃度は、受容体およびＫＤの双方が制御される条件下で測定できるように選択し、それにより試薬の活性および親和性各々のより厳密な推定が可能になった。次に、ｈｕＶＥＧＦタンパク質の２倍連続希釈物を、二重特異性抗体溶液を含有するチューブの９つを通じて、その後１０倍希釈物を、さらなる２つのチューブを通じて滴定し、１つのチューブを二重特異性のみの「ゼロ」対照として残した。そのように行うことで、これにより、ｈｕＶＥＧＦタンパク質の７８ｆＭ〜４ｎＭ（１０ｐＭの二重特異性実験）、４８８ｆＭ〜２５ｎＭ（１００ｐＭの二重特異性実験）、および３．９１ｐＭ〜２００ｎＭ（２．５ｎＭの二重特異性実験）を範囲とする一連の濃度が得られた。ソフトウェアベンダー（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）を通じて利用可能な理論曲線のシミュレーションに基づき、混合物を室温で１〜４日インキュベートし、結合を平衡に到達できた。この期間の終了時、各測定セットにおける適切な稼動条件を決定するため、シグナル試験の実験を行った。ＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬで含有する機器緩衝液中、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬで用いる種特異的な二次抗体試薬（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＤｙＬｉｇｈｔ６４９、パート番号１０９−４９５−０８８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、遊離抗体の検出が可能になった。次に、上の表２に報告のような平衡結合定数（ＫＤ）を得るため、すべての測定セットから得られるデータを、該ソフトウェアのｎ曲線分析の特徴を用いて１サイト結合モデルに同時にフィッティングした。
【００７１】
実施例６−ＢＩＳ３ＡＢ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２によるＡＮＧ−２およびＶＥＧＦ１６５への同時結合
２５℃、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって提供される標準のアミンカップリングプロトコルを用い、１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）中でＣＭ５センサーチップ表面上に固定化した１０ｎＭのＶＥＧＦ１６５、１００ｎＭのＡｎｇ２および１０ｎＭのＢｓ３Ａｂ−ＶＥＧＦ−Ａｎｇ２を用いて、同時結合実験を実施した。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２溶液の固定化チップ、１００ｎＭのＶＥＧＦ、および１００ｎＭのＶＥＧＦと５００ｎＭのＡＮＧ−２との混合物をＨＢＳ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で調製した。ＶＥＧＦ溶液を３０ｍＬ／分の流速で５００秒間注射した。初回注射後のＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ／ＡＮＧ−２混合物の追加的な注射は、２５０秒間注射した。５００ｎＭのＡＮＧ−２の初回注射、その後のＶＥＧＦ／ＡＮＧ−２混合物のさらなるＡＮＧ−２注射により、同様の実験を実施した。同時結合をさらに確認するため、ＶＥＧＦおよびＡＮＧ−２でコーティングされたチップを用いた。ＶＥＧＦ１６５の表面においては、５０ｎＭのＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２が３０ｍＬ／分で６００秒間流れ、その後、５０ｎＭのＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２および５００ｎＭのＡＮＧ−２の２回目注射を行った。同様の実験のため、ＡＮＧ−２の表面を用いた。３０ｍＬ／分で５００秒間の初回注射用に、５０ｎＭのＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２を用いた。２回目注射は、５０ｎＭのＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２またはＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２と１００ｎＭのＶＥＧＦ１６５との混合物のいずれかを用いて行った。データはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析し、図面はＰｒｉｓｍ５（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を用いて準備したが、代表的結果を図１１に示す。
【００７２】
ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２抗体はまた、二重結合ＥＬＩＳＡにおいて、ＶＥＧＦおよびＡＮＧ−２への同時結合についてスクリーニングした。マキシソーププレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３９４５４）を、Ｃａ＋＋またはＭｇ＋＋の不在下、ＰＢＳで希釈した１．０μｇ／ｍＬのヒトまたはマウスＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）１００μｌでコーティングし、一晩冷蔵した。プレートをデカントし、次にプレートシェーカー上、２００μｌの３％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−３０５９）および１倍ＰＢＳ中０．１％ツイーン２０で１．５時間ブロッキングした。プレートを、０．１％ツイーン２０を含有する１倍ＰＢＳで３回洗浄した。ブロッキング緩衝液中、５０μｌの６０ｎＭおよび連続希釈物のＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２二重特異性抗体、ＡＮＧ−２抗体、またはｒ３４７アイソタイプ対照群を有する二重特異性抗体（ＢＳ３Ａｂ−ｒ３４７−ＡＮＧ２）を二通りに添加し、プレートシェーカー上で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次にブロッキング緩衝液中、５０μｌの１μｇ／ｍｌのヒトまたはマウスＡｎｇ２−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、プレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に５０μｌの１：１５，０００のストレプトアビジンＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、プレートシェーカー上、室温で１時間添加した。プレートを洗浄し、次に５０μｌのＴＭＢ溶液（ＫＰＬ）を各ウェルに添加することにより展開し、次に反応を５０μｌの１Ｍリン酸で停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを４５０ｎｍで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）における非線形回帰分析（ログ用量反応、４パラメータフィット曲線）を用いて、ＥＣ５０値を判定した。代表的結果を図１２Ａ（ヒト）および図１２Ｂ（マウス）に示す。ヒトおよびマウスのＶＥＧＦおよびＡＮＧ−２に対する強力な同時結合が、ＶＥＧＦおよびＡＮＧ−２に同時に結合できないことを意味する、このアッセイにおける弱い結合を示すＡｎｇ２抗体（ＭＥＤＩ３６１７）単独およびＢＳ３Ａｂ−ｒ３４７−ＡＮＧ２と比べて、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２により示された（ＥＣ５０は各々、１０．８ｐＭおよび１０３．８ｐＭ）。
【００７３】
実施例７−ＢＩＳＡＢ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＶＥＧＦ１２１への結合低下についてのスクリーニング
ＥＬＩＳＡフォーマットで、抗体のＶＥＧＦ１２１への結合についてスクリーニングした。９６ウェルハーフウェルのマキシソーププレートを、Ｃａ＋＋またはＭｇ＋＋の不在下、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）２５μｌでコーティングし、一晩冷蔵した。プレートをデカントし、次に１８０μｌの３％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−３０５９）および１倍ＰＢＳ中０．１％ツイーン２０で、３７℃で１．５時間ブロッキングした。プレートを、０．１％ツイーン２０を含有する１倍ＰＢＳで３回洗浄した。ブロッキング緩衝液中、５０μｌの連続希釈物の抗ＶＥＧＦ抗体、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（陽性対照；抗ＶＥＧＦ抗体）およびｒ３４７（陰性対照）を二通りに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次に５０μｌの１：５０００のヤギ抗ヒトＨＲＰ  ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを５０μｌのＴＭＢ溶液（ＫＰＬ）を各ウェルに添加することにより展開し、次に反応を５０μｌの１Ｍリン酸で停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを４５０ｎｍで読み取った。代表的結果を図１３に示す。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、陽性対照Ｂ２０−４．１と比べて、ＶＥＧＦ１２１への結合が欠けていた。
【００７４】
実施例８−ＢＩＳＡＢ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のＶＥＧＦ１８９への結合低下についてのスクリーニング
ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２を、ＥＬＩＳＡフォーマットでＶＥＧＦ１８９への結合についてスクリーニングした。９６ウェルハーフウェルのマキシソーププレートを、Ｃａ＋＋またはＭｇ＋＋の不在下、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ１８９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）２５μｌでコーティングし、一晩冷蔵した。プレートをデカントし、次に１８０μｌの３％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−３０５９）および１倍ＰＢＳ中０．１％ツイーン２０で、３７℃で１．５時間ブロッキングした。プレートを、０．１％ツイーン２０を含有する１倍ＰＢＳで３回洗浄した。ブロッキング緩衝液中、５０μｌの６．７ｎＭおよび連続希釈物のＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２、Ｇ６−３１（陽性対照）およびＢＳ３Ａｂ−ｒ３４７−ＡＮＧ２（陰性対照）を二通りに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次に５０μｌの１：５０００のヤギ抗ヒトＨＲＰ  ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを５０μｌのＴＭＢ溶液（ＫＰＬ）を各ウェルに添加することにより展開し、次に反応を５０μｌの１Ｍリン酸で停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを４５０ｎｍで読み取った。図１４は、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２における代表的結果を示す。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、陽性対照Ｇ６−３１と比べて、ＶＥＧＦ１８９への５倍低い結合を示した（ＥＣ５０は０．０５７ｎＭ対０．００９６ｎＭ）。
【００７５】
実施例９−ＶＥＧＦ−ＡＮＧ２二重特異性抗体の力価を判定するための機能的アッセイ
ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２を、ヒト、マウスおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）受容体の場合に細胞株中のｐＶＥＧＦＲ２およびｐＴｉｅ２を低下させる能力について判定するため、機能的バイオアッセイでスクリーニングした。Ａｄ２９３−ＨｕＶＥＧＦＲ２（Ｃｌ．Ｅ２）、Ｈｅｋ２９３−Ｔｉｅ２、Ａｄ２９３−ｍｕＶＥＧＦＲ２−ｍｕＡｎｇ２細胞（Ｃｌ．Ｄ１０）、Ａｄ２９３−ｃｙｎｏＶＥＧＦＲ２−ｃｙｎｏＡｎｇ２細胞（Ｃｌ．ＳＢ５）およびＡｄ２９３−ｃｙｎｏＴｉｅ２細胞（Ｃｌ．Ｄ１２）を安定なトランスフェクションから作製した。細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｋｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を有する９６ウェルのポリ−Ｄ−リジン組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）にサブコンフルエント状態で播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、培地を吸引し、５０μｌの飢餓培地（ＤＭＥＭ＋０．２％ＦＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）と交換し、細胞をインキュベーターに一晩戻した。２４時間後、培地を吸引し、２６６０ｎＭ（２倍濃度）の抗体、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２およびＢＳ３Ａｂ−ＨＰＶ−ｒ３４７陰性対照を血清不含ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡで連続希釈し、３７℃で３０分間、プレートに二通りに添加した。次に、５０μｌの１２μｇ／ｍｌのヒト、マウス（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはカニクイザルＡｎｇ２（自家調製）＋２０ｎＭのヒト、マウス（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、またはカニクイザル（自家調製）ＶＥＧＦ（４倍）（１：１に混合）をウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次にプレートを３７℃でさらに７分間インキュベートした。プレートをデカントし、ウェルをプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｋｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する氷冷ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）５５μｌで溶解した。ヒト、カニクイザルおよびマウスｐＶＥＧＦＲ２を、ｐＶＥＧＦＲ２全細胞ライセートキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて検出した。
【００７６】
ヒトおよびカニクイザルｐＴｉｅ２については、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いて開発されたプロトコルを用いて判定した。ＭＳＤ  ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄプレートを、２μｇ／ｍｌのＴｉｅ２抗体クローン１６（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で一晩コーティングした。翌日、プレートをトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）のみで洗浄し、ＴＢＳ中、３％ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ＋０．０５％ツイーン２０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で回転振盪下、室温で１時間ブロッキングした。プレートをＴＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で洗浄し、ライセートをプレートに添加し、次に回転振盪下、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＴｉｅ２抗体（ＡＦ２７２０，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を回転振盪下、室温で１時間添加した。プレートを洗浄し、次に１μｇ／ｍｌのスルホタグヤギ抗ウサギ二次抗体（ＭＳＤ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をプレートに回転振盪下、室温で１時間添加した。プレートを洗浄し、Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（ＭＳＤ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を添加し、次にプレートを、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭＳＤ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて直ぐに読み取った。
【００７７】
マウスｐＴｉｅ２については、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いて開発されたプロトコルを用いて判定した。ＭＳＤストレプトアビジンプレートを、ＴＢＳ中、３％ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ＋０．０５％ツイーン２０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で回転振盪下、室温で１時間ブロッキングした。プレートをＴＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で洗浄し、次にブロッキング緩衝液中、２５μｌ／ウェル、２μｇ／ｍｌのビオチン抗マウスＴｉｅ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃１２４００６）を回転振盪下、室温で１時間インキュベートした。プレートをデカントし、３回洗浄した。次に、２５μｌ／ウェルのライセートをウェル毎に二通りに添加し、プレートシェーカー上、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次にスルホタグＰＹ２０（ＭＳＤ）２５μｌをウェル毎に添加し、プレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に１５０μｌの２×ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを添加し、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭＳＤ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてプレートを直ぐに読み取った。
【００７８】
ｐＴｉｅ２およびｐＶＥＧＦＲ２に対するパーセントリン酸化を、式：［平均ＲＬＵ（試験試料）／平均ＲＬＵ（抗体なし）］＊１００により算出した。代表的結果を表３に示す。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、ヒト、マウスおよびカニクイザルのｐＶＥＧＦＲ２およびｐＴｉｅ２を強力に減少させ、これは両群が二重特異性形式で機能的であることを示す。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の抗ＡＮＧ−２活性は、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のｓｃＦＶ抗ＡＮＧ−２を作製するために用いられるＡＮＧ−２抗体（ＭＥＤＩ３６１７）と比べると、顕著により大きい活性を示した。
【００７９】
【表３】
2019528694.tif 000010
【００８０】
実施例１０−ＢＩＳＡＢ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２のインビボ活性
ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２を、７８６−０腎細胞がんおよびＢｘＰＣ３膵がんモデル（腫瘍区画内部の抗血管新生を図示するためのＢｘＰＣ３腫瘍のキャスティングを含む）における有効性について、インビボで試験した。追加的に、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の活性をさらに実証するため、網膜脈管形成モデルを実施した。さらに、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２で、ＶＥＧＦのすべてのアイソフォームに結合する抗ＶＥＧＦ陽性対照抗体（Ｇ６−３１）と比べて毒性低下が生じるか否かを判定するため、マウスにおける血小板減少症のモデルを実施した。最後に、腎臓病理を評価した。
【００８１】
７８６−０腎細胞がんモデルにおいては、ヒト腎がん細胞株７８６−０からの腫瘍断片を、ヌードマウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達した後、投与を開始した。マウスを週に２回、全部で６回用量にわたり治療した（軸上の三角形）。用量を分子量に基づいて正規化した。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、腫瘍増殖を低下させるのに、ＡＮＧ−２抗体（ＭＥＤＩ３６１７）またはＶＥＧＦ抗体（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））単独のいずれかと比べてより有効であった。一元配置分散分析Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）による判定として、Ｐ値＝０．０３である。代表的データを図１５に示す。
【００８２】
ＢｘＰＣ３膵がんモデルにおいては、ＢｘＰＣ３腫瘍断片を、雌の重症複合免疫不全マウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達した後、投与を開始した。マウスに週に２回、全部で６回用量にわたり投与した（軸上の三角形）。用量を分子量に基づいて正規化した。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、腫瘍増殖を低下させるのに、ＡＮＧ−２抗体（ＭＥＤＩ３６１７）またはＶＥＧＦ抗体（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））単独のいずれかと比べてより有効であった。一元配置分散分析Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）による判定として、Ｐ値＝０．０２である。代表的データを図１６に示す。
【００８３】
腫瘍体積に加えて、腫瘍脈管構造を、ＢｘＰＣ３膵がんモデル研究から得た腫瘍を用いて評価した。マウスに対し、血液凝固を防止するため、安楽死の１５分前にヘパリンを投与した。０．１ｍＭナトリウムニトロプルシドの溶液を、約６ｍＬ／分の速度で灌流した。Ｍｉｃｒｏｆｉｌ  ＭＶ−１２２を、ラテックス８ｍＬ、希釈剤１０ｍＬおよび治療剤９００ｕＬを混合することにより調製した。混合物が定着後（約１分）、１７ｍＬの総体積が投与されるまで、それを２ｍＬ／分の速度で灌流した。６０〜９０分後、腫瘍を切断し、１０％ＮＢＦ中に２４時間浸漬した。次に、試料を、２４時間、エタノール勾配（２５％ＥＴＯＨ／ＰＢＳ、５０％ＥＴＯＨ／ＰＢＳ、７５％ＥＴＯＨ／ＰＢＳ、９５％ＥＴＯＨ、そして次に１００％ＥＴＯＨ）を通して各勾配レベルに移行させた。最終のインキュベーション後、光学顕微鏡によるイメージング前に脱水した腫瘍試料を清澄化するため、試料をサリチル酸メチルに浸漬した。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２を有するマウスにおいて、腫瘍脈管構造が縮小した。代表的データを図１７に示す。
【００８４】
上記のモデルに加えて、網膜血管新生モデルにおいてＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２を評価した。このモデルを用いて、ＣＤ１マウスに対し、出生時、１、３、および５日目に腹腔内に投与した。８日目、マウスに対し、麻酔し、フルオレセイン標識デキストランを注入した。眼を取り除き、フラットマウントの調製前に１０％ホルマリンで固定した。フラットマウントを蛍光顕微鏡により試験した。
【００８５】
新生児網膜血管新生は、２つのプロセス、すなわち視神経から網膜の縁への血管遊走（図１８のドット矢印）および分岐からなる。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、血管遊走が、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の不在下での遊走の程度と比べて減少することを示した。代表的結果を図１８に示す。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、血管分岐が、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の不在下での分岐の程度と比べて減少することを示した。代表的データを図１９に示す。
【００８６】
血小板減少症モデルにおいては、Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７：１７１−８１，２００９）からの方法を採用した。つまり、８〜１６週齢のＦＣγ受容体２Ａトランスジェニックマウスに対し、予備混合したＶＥＧＦ１６５、０．６単位のヘパリン、および抗体を側方尾静脈に注射した。次に、マウスを窮迫の行動徴候について観察し、（−）コーナー間を常に停止および移動、正常な呼吸、（＋）嗜眠の徴候、より長い持続時間での停止および移動、浅い呼吸、（＋＋）非常に嗜眠的、移動の停止、ボックスの概ね片側に滞在、深い呼吸、（＋＋＋）重度の血栓事象−攣縮およびトワリング（ｔｗｉｒｌｉｎｇ）、（＋＋＋＋）死亡、としてスコア化した。ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２は、抗ＶＥＧＦ対照（Ｇ６−３１）と比べて血小板減少症を低減していた。代表的データを表４に示す。
【００８７】
【表４】
2019528694.tif 000011
【００８８】
１群あたり動物４匹からの腎臓を、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）を介した染色により試験した。ＰＡＳ染色を用いて、治療薬の１４回投与後、腎臓病理について試験した。抗ＶＥＧＦ（Ｇ６−３１）で治療した動物において、ＢｉＳＡｂ−ＶＥＧＦ  Ｈ１ＲＫ−ＡＮＧ−２の場合と比べて、メサンギウムマトリックスの増加およびキャピラリーループの肥厚化（矢印）が認められた。代表的データを表５および図２０Ａ〜Ｃに示す。
【００８９】
【表５】
2019528694.tif 000012
【００９０】
参照による援用
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書中に引用されるすべての参考文献、およびそれらに引用される参考文献は、あらゆる目的でそれらの全体が参照により本明細書中に援用されることがまだなされていないが、ここでなされる。
【００９１】
均等物
前述の明細書文書は、当業者が実施形態を実行することを可能にするのに十分であると考えられている。しかし、上文がテキストでいかに詳細に述べられていても、実施形態が多くの方法で実行されてもよく、特許請求の範囲がその任意の均等物を含むことは理解されるべきである。
【図１】
2019528694.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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