(57)【要約】  子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルに基づいて、それを必要とする対象における子宮内膜症の診断、評価、及び特徴付けに有用な組成物及び方法が本明細書に開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症の疑いのある対象の診断方法であって、
ａ．対象からの唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルを提供し、ここで前記唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルは、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡを含み；
ｂ．子宮内膜症に関するｍｉＲＮＡのレベルを検出し；
ｃ．唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルにおける子宮内膜症に関するｍｉＲＮＡの相対レベルを決定するために、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの検出レベルと基準値とを比較し；そして
ｄ．唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルにおける子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの相対レベルに基いて子宮内膜症を有する対象を診断することを含み、ここで子宮内膜症を有する対象の診断が９０％より高い特異性又は感度を有する、方法。
【請求項２】
ｍｉＲＮＡの検出方法であって、
ａ．対象からの唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルを提供し、ここで前記サンプルは核酸を含み、そして前記対象は子宮内膜症の疑いがあり；
ｂ．前記サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出するために、前記核酸に対する増幅又は配列決定反応を実施し、ここで少なくとも１つのｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５５３、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ− ４６６８、及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択され；そして
ｃ．ｍｉＲＮＡの存在を基準値に比較することを含む方法。
【請求項３】
前記サンプルが体液である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが血液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが唾液である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが無細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基準値が、子宮内膜症を有さない対象からのサンプルにおける少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−４５１、及びｍｉＲ−３６１３から成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１２５ｂである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−４５１aである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−３６１３−５ｐである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ａ．対象からのサンプルを提供し、ここで前記サンプルは核酸を含み、そして前記対象は子宮内膜症の疑いがあり；
ｂ．前記サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出するために、前記核酸に対する配列決定反応を実施し、ここで少なくとも１つのｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５５３、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ− ４６６８、及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択され；そして
ｃ．ｍｉＲＮＡの存在を基準値に比較することを含む方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、高スループット又は超並列配列決定により検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
子宮内膜症の症状を示すか又は子宮内膜症を有することが疑われる対象の診断方法であって、
ａ．ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３５、 ｍｉＲ−４４９ａ、 ｍｉＲ−３４ｃ、 ｍｉＲ−２００ａ、 ｍｉＲ−２００ｂ、 ｍｉＲ−１４１、 ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、 ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐではない少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出し；そして
ｂ．検出されたｍｉＲＮＡレベルが閾値レベルを超える場合、子宮内膜症を有する対象を診断することを含み、ここで前記子宮内膜症を有する対象の診断は９０％を越える特異性又は感度を有する、方法。
【請求項１６】
前記ｍｉＲＮＡが無細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、初期子宮内膜症を有する対象を診断することである、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、中程度〜重度の疾患を有する対象を診断することである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、ステージIII又はステージIV子宮内膜症を有する対象を診断することである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、治療に続いてｍＲＮＡ発現レベルの変化について対象をモニターリングすることをさらに含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、８５％よりも高い特異性又は感度を有する、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、９５％よりも高い特異性又は感度を有する、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
子宮内膜症について対象を治療することをさらに含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
治療が痛みを和らげるための薬である、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
治療がホルモン療法である、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
治療がホルモン避妊薬である、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
治療がゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストである、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
治療がゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニストである、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出が、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的なプローブとを接触し、ここで前記プローブは生成されたｃＤＮＡとの結合に基いてシグナルを放出し；そして（ｉｉｉ）プローブにより放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることを含む、請求項１５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ｍｉＲＮＡの検出方法であって、
ａ．対象からのサンプルを提供し、ここで前記サンプルは核酸を含み、そして前記対象は子宮内膜症の疑いがあり；
ｂ．前記核酸に対する増幅、マイクロアレイ又は配列決定反応を実施し；
ｃ．サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出し、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択され；そして
ｄ．基準値にｍｉＲＮＡの存在を比較することを含む方法。
【請求項３１】
前記サンプルが体液である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルが、血液、血漿、唾液又は血清である、請求項３０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記基準値が、子宮内膜症を有さない対象からのサンプルにおける少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によってである、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出が定量的ＰＣＲによってである、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出が、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡ由来のｃＤＮＡに対してユニークプライマーをハイブリダイズされることを含む、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出が、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的な少なくとも１つのプライマー又はプローブを用いて、又は少なくとも１つのユニバーサルプライマーを用いて、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して逆転写を実施することをさらに含む、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出が、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、シグナルを放出するインターカレート色素とを接触し；そして（ｉｉｉ）時間とともに放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることを含む、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出が、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的なプローブとを接触し、ここで前記プローブは生成されたｃＤＮＡとの結合に基いてシグナルを放出し；そして（ｉｉｉ）プローブにより放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることを含む、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記プローブが、蛍光団又は消光剤に結合される、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記検出が配列決定によってである、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
子宮内膜症は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡが基準値よりも少なくとも２倍高い場合に診断される、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
子宮内膜症は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡが基準値よりも少なくとも２倍低い場合に診断される、請求項３０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
子宮内膜症は、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１５０−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−３４２−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４５−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４３−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐがアップレギュレートされ、又はｍｉＲ−１８ａ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
子宮内膜症は、少なくとも３種のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされる場合、診断され、ここで前記少なくとも３種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ及びｍｉＲ−１８ａ−５ｐからなる群から選択される、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
子宮内膜症は、ｍｉＲ−６７５５−３ｐがダウンレギュレートされるか、又はｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される、請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−４５１aがアップレギュレートされ、そしてｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される、請求項３０〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される、請求項３０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象は、ＫＲＡＳ変異型対立遺伝子の存在について陰性である、請求項３０〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出されたｍｉＲＮＡレベルが、疾患の重症度を決定するために使用される、請求項３０〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象がヒト対象である、請求項３０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
子宮内膜症を有する対象の治療方法であって、比較対照に比較して、対象の生物学的サンプルにおけるｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−５５３、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−４６６８及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択された、異なるレベルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを有するとして同定された対象に子宮内膜症治療を施すことを含んで成る方法。
【請求項５３】
前記対象が比較対照に比較して、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−５５３、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−４６６８及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択された、異なるレベルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを有するとして同定される場合、子宮内膜症を有する対象を診断することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
子宮内膜症を有する対象の診断が、対象からの生物学的サンプルを提供し、そして比較対照に比較して、生物学的サンプルにおけるｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−５５３、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−４６６８及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択された、異なるレベルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記生物学的サンプルが体液である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記体液が、血液、血漿又は血清である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記体液が唾液である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記体液が尿である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
子宮内膜症を有する疑いがある対象の診断及び治療方法であって、
ａ．対象からの唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルを提供し、ここで前記サンプルは、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡを含み；
ｂ．子宮内膜症に関するｍｉＲＮＡのレベルを検出し；
ｃ．体液サンプルにおける子宮内膜症に関するｍｉＲＮＡの相対レベルを決定するために、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの検出レベルと基準値とを比較し； 
ｄ．唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルにおける子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの相対レベルに基いて子宮内膜症を有する対象を診断することを含み、ここで子宮内膜症を有する対象の診断が９０％より高い特異性又は感度を有し；そして
ｅ．子宮内膜症と診断された対象に治療を施すことを含む方法。
【請求項６０】
子宮内膜症を有する疑いある対象の診断及び治療方法であって、
ａ．ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８ａ、又はｍｉＲ−１４１ではない少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出し；そして
ｂ．検出されたｍｉＲＮＡレベルが閾値レベルを超える場合、子宮内膜症を有する対象を診断し；そして
ｃ．子宮内膜症を有すると診断された対象に治療を促すことを含む方法。
【請求項６１】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１２６ｂ−５ｐである、請求項６０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡがｍｉＲ−３６１３−５ｐである、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが無細胞ｍｉＲＮＡである、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、比較対照に比較して、少なくとも２倍の変化で存在する、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、初期子宮内膜症を有する対象を診断することである、請求項６０〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、中程度〜重度の疾患を有する対象を診断することである、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、ステージIII又はステージIV子宮内膜症を有する対象を診断することである、請求項６０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、治療に続いてｍＲＮＡ発現レベルの変化について対象をモニターリングすることをさらに含む、請求項６０〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記子宮内膜症を有する対象の診断が、９５％よりも高い特異性又は感度を有する、請求項６０〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
子宮内膜症について対象を治療することをさらに含む、請求項６０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
治療が痛みを和らげるための薬である、請求項６０〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
治療がホルモン療法、ホルモン避妊薬、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、及びゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニストから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７４】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７５】
定量的ＰＣＲを実施することにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７６】
（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、シグナルを放出するインターカレート色素とを接触し；そして（ｉｉｉ）時間とともに放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７７】
（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的なプローブとを接触し、ここで前記プローブは生成されたｃＤＮＡとの結合に基いてシグナルを放出し；そして（ｉｉｉ）プローブにより放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７８】
配列決定により少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７９】
高スループット又は超並列配列決定により少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８０】
少なくとも１つのｍｉＲＮＡが基準値よりも少なくとも２倍、高いレベルで存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項８１】
前記対象が、ＫＲＡＳ変異型対立遺伝子の存在について陰性である、請求項１に記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが、疾患の重症度を決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項８３】
前記対象がヒト対象である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項８４】
子宮内膜症は、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１５０−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−３４２−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４５−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４３−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐがアップレギュレートされ、又はｍｉＲ−１８ａ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される、請求項２に記載の方法。
【請求項８５】
子宮内膜症は、少なくとも３種のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされる場合、診断され、ここで前記少なくとも３種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−１８ａ−５ｐからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８６】
子宮内膜症は、ｍｉＲ−６７５５−３ｐがダウンレギュレートされるか、又はｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される、請求項２に記載の方法。
【請求項８７】
子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−４５１aがアップレギュレートされ、そしてｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される、請求項２に記載の方法。
【請求項８８】
子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される、請求項２に記載の方法。
【請求項８９】
サンプル中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の検出方法であって、
ａ．対象からの唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルを提供し、ここで前記サンプルは核酸を含み、そして前記対象は子宮内膜症の疑いがあり；
ｂ．前記核酸に対する増幅、又は配列決定反応を実施し；
ｃ．サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出し、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５５３、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ− ４６６８、及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択され；そして
ｄ．基準値にｍｉＲＮＡの存在を比較することを含む方法。
【請求項９０】
対象における子宮内膜症の診断方法であって、
ａ．対象の生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定し、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択され；そして
ｂ．前記生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルと、比較対照中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルとを比較し、ここで前記生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルと異なる場合、対象は子宮内膜症と診断される、方法。
【請求項９１】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−４５１ 及び ｍｉＲ−３６１３の組合せである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象がヒトである、請求項９０〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
子宮内膜症に関して対象を治療する工程をさらに含む、請求項９０〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記比較対照が、陽性対照、陰性対照、正常対照、野生型対照、歴史的対照、及び歴史的規範から成る群から選択された少なくとも１つの比較対照である、請求項９０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４及びｍｉＲ−１２６の少なくとも１つのレベルが、比較対照におけるレベルに比較して、生物学的サンプルにおいて高められることを検出することを含む、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及び ｍｉＲ−４６６８の少なくとも１つのレベルが、比較対照におけるレベルに比較して、生物学的サンプルにおいて低められることを検出することを含む、請求項９０〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの決定が、逆転写、ＰＣＲ及びマイクロアレイから成る群から選択された少なくとも１つの技術を利用する、請求項９０〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記生物学的サンプルが、血液、血清、血漿及びそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
対象における子宮内膜症の診断又は予後方法であって、子宮内膜症の疑いがあるか、又は有する対象の生物学的サンプルにおける、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡの変更された発現を検出する工程を含む方法。
【請求項１００】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−４５１及びｍｉＲ−３６１３の組合せである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記生物学的サンプルが、血液、血清、血漿及びそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される、請求項９９〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して選択的に結合する試薬を含むキットであって、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡである、キット。
【請求項１０３】
少なくとも３種の試薬を含み、ここで第１試薬はｍｉＲ−１２５に対して選択的に結合し、そして第２試薬はｍｉＲ−４５１に対して選択的に結合し、そして第３試薬はｍｉＲ−３６１３に対して選択的に結合する、請求項１０２に記載のキット。
【請求項１０４】
子宮内膜症を有する対象の治療方法であって、比較対照に比較して、対象の生物学的サンプルにおけるｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮAの異なるレベルを有するとして同定された対象に子宮内膜症治療を施すことを含む方法。
【請求項１０５】
子宮内膜症に関して治療されている対象における子宮内膜症に対する応答のモニターリング方法であって、
ａ．対象の生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定し、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択され；そして
ｂ．前記生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルと、比較対照中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルとを比較する、方法。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡがｌｅｔ−７、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ又はｌｅｔ−７ｇを含む、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３８１，１３０号の優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組込まれる。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、１９〜２４個のヌクレオチドの高度に保存された小内在性非コードの機能的ＲＮＡ分子であり；それらは、相補的部位への塩基対合により標的ＲＮＡの翻訳及び安定性を制御し、そしてメッセンジャ−ＲＮＡ転写体の制御又は分解を誘発する（Bartel et al., 2009, Cell, 136:215-233）。それらは、多様な生物学的工程の発生及び細胞恒常性の調節において極めて重要な役割を果たす（Hassan et al., 2015, Bone, 81:746-756）。それらは、細胞内及び血清中に存在し（Corcoran et al., 2011, Clin Chem, 57(1):18-32）、そしてそれらを種々の疾患の診断のための有望なバイオマーカー候補体にする特異的特徴を有する（(Sayed et al., 2014, Heart Lung Cir, 23:503-510, Coskun et al., 2012, World J Gastroenterol, 18:4629-4634, Dorval et al., 2013, Front Mol Neurosci, 6:24, Jin et al., 2013, Cell Mol Neurobiol, 5:601-613, Liu et al., 2014, World J Gastroenterol, 20:12007-12017, Ulivi  et al., 2014, Molecules, 19:8220-8237, Zhu et al., 2014, Front Genet, 5:149, Bandiera et al., 2015, J Hepatol, 62:448-457）。無細胞ｍｉＲＮＡは、血清及び血漿、尿、及び唾液を含むいくつかの体液に安定して存在する（Chen et al., 2008, Cell Res, 18:997-1006）。血清ｍｉＲＮＡ発現は、安定しており、再現可能であり、そして個人間で一貫性がある。特異的発現パターンは、癌を含む多くの疾患のためのバイオマーカーとして同定されて来た（Schwarzenbach et al., 2014, Nat Rev Clin Oncol, 11:145-156）。ｍｉＲＮＡは、それらが細胞から膜小胞中の細胞外空間に放出されるか（Gallo et al., 2012, PLoS One, 7: e30679）、又はタンパク質複合体に結合される（Turchinovich et al., 2011, Nucleic Acids Res, 39:7223-7233, Arroyo et al., 2011, Proc Natl Acad Sci U S A, 108:5003-5008）場合、安定したままである。血中のｍｉＲＮＡレベルの変化は、通常の生物学的工程の変化に影響を及ぼし（Lai et al., 2014, Aging Cell, 13:679-689, Redni et al., 2011, Front Genet, 2:49）、そして婦人科疾患を含むいくつかの病理学的状態に関連している（Zhao et al., 2012, Clin Chem, 58:896-905, Murri et al., 2013, J Clin Endocrinol Metab, 98:E1835-1844）。
【０００３】
子宮内膜症は、一般的に婦人科疾患にあり、生殖年齢の女性の１０％が罹患している（Taylor et al., 2011, Reprod Sci, 18(9):814-823）。それは、子宮腔外の子宮内膜細胞の沈着及び増殖により特徴づけられる（Giudice et al., 2010, N Engl J Med, 362:2389-2398, Bulun et al., 2009, N Engl J Med, 360:268-279）。子宮内膜症の主な症状は、５０％の疾患における骨盤痛（Eskenazi et al., 1997, Obstet Gynecol Clin North Am, 24:235-258）及び４０〜５０％の患者における不妊症（Ozkan et al., 2008, Ann N Y Acad Sci, 1127:92-100, Moradi et al., 2014, BMC Womens Health, 14:123）である。不運なことには、現在、この疾患について入手可能な正確な血清バイオマーカーは存在しない。イメージング技術、例えば超音波は、子宮内膜症の診断及び病期分類において信頼性が低い（Dunselman et al., 2014, Hum Reprod, 29:400-412）。子宮内膜症の確定診断は、腹腔鏡検査による病巣の直接的可視化及び病理学の確認により疾患の後期段階でのみ行われることが多い。子宮内膜症の治療の成功に対する主な障害は、早期段階での診断の失敗である。子宮内膜症−特異的バイオマーカーについての単純な血液検査は、疾患のよりタイムリーで正確な診断を提供するだろうし、そして早い治療介入を導くことができる。そのようなバイオマーカーを同定するために相当の努力がなされて来たが（Wang et al., 2012, Clin Chem Lab Med, 50:1423-1428, Jia et al., 2013, Hum Reprod, 28:322-330, Suryawanshi et al., 2013, Clin Cancer Res, 19:1213-1224）、そのような非侵襲的診断ツールについての明確な選択は同定されていない。血清ＣＡ−１２５は子宮内膜症の一部の女性において高められるが、それは特異的ではなく、そして感度及び特異性が乏しい。上記のように、ｍｉＲＮＡはいくつかの疾患についてのバイオマーカーとして慎重に評価されており；それらは子宮内膜症の診断バイオマーカーとして期待されている。
【０００４】
子宮内膜症は、全ての生殖年齢の女性の１０％に、及び不妊女性の２０〜５０％に存在するという事実にかかわらず、まだ利用可能な子宮内膜症の明確な診断バイオマーカーは存在しない。イメージング技術、例えば超音波及び磁気共鳴イメージングは、この疾患の診断又は病期分類において信頼性が低いことが示されている。病変の直接的可視化及び外科的処置による組織学的確認は現在、全身麻酔、発達した外科技術、処置費用、及び潜在的な合併症の危険性を要する、子宮内膜症の確定診断のために不可欠である。従って、子宮内膜症に対する新しい非侵襲性診断マーカーの開発が、早期診断、及び疾患の適切な治療及び管理のために重要である。従って、子宮内膜症の非侵襲性バイオマーカーについての改良された組成物及び方法に対して当核分野において必要性がある。本開示は、この満たされていない必要性を満たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、子宮内膜症を有することが疑われる女性対象における子宮内膜症を検出し、診断し、そして／又は予後する新規方法、並びに子宮内膜症の新規治療方法を提供する。本明細書において提供される方法の多くは、一般的に、サンプル、例えば血液、血清又は唾液中のｍｉＲＮＡバイオマーカーを検出することに関する。そのように、前記方法は、子宮内膜症を検出するために非侵襲的又は最小侵襲的アッセイにおいて使用され得、そして多くの女性患者が、より侵襲的な処置、例えば子宮内膜組織の生検を回避するのを助けることができる。この方法はまた、早期診断を促進し、そして患者がより重症な又は重篤な症状を発症する前、早期段階で子宮内膜症の治療を促進できる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの側面によれば、本開示は、（ａ）対象からの唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルを提供し、ここで前記唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルは、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡを含み；（ｂ）子宮内膜症に関するｍｉＲＮＡのレベルを検出し；（c）唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルにおける子宮内膜症に関するｍｉＲＮＡの相対レベルを決定するために、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの検出レベルと基準値とを比較し；そして（ｄ）唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルにおける子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの相対レベルに基いて子宮内膜症を有する対象を診断することを含み、ここで子宮内膜症を有する対象の診断が９０％より高い特異性又は感度を有する、子宮内膜症の疑いのある対象の診断方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、前記サンプルは体液である。他の実施形態によれば、前記サンプルは血液である。他の実施形態によれば、前記サンプルは唾液である。他の実施形態によれば、前記サンプルは無細胞である。
【０００８】
他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−４５１、及びｍｉＲ−３６１３から成る群から選択される。他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１２５ｂである。他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐである。他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−４５１aである。他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−３６１３−５ｐである。いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡはｌｅｔ−７、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ又はｌｅｔ−７ｇ。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下のうちの少なくとも２つである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及び ｍｉＲ−３６１３。いくつかの実施形態によれば、基準値は、子宮内膜症を有さない対象からのサンプルにおける少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在である。
【０００９】
別の側面によれば、本開示は、(ａ)対象からの唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルを提供し、ここで前記サンプルは核酸を含み、そして前記対象は子宮内膜症の疑いがあり；（ｂ）前記サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出するために、前記核酸に対する増幅又は配列決定反応を実施し、ここで少なくとも１つのｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５５３、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ− ４６６８、及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択され；そして（ｃ）ｍｉＲＮＡの存在を基準値に比較することを含む、ｍｉＲＮＡの検出方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、前記サンプルは体液である。他の実施形態によれば、前記サンプルは血液である。他の実施形態によれば、前記サンプルは唾液である。他の実施形態によれば、前記サンプルは無細胞である。
【００１１】
他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−４５１、及びｍｉＲ−３６１３から成る群から選択される。他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１２５ｂである。他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐである。他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−４５１aである。他の実施形態によれば、前記ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−３６１３−５ｐである。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下のうちの少なくとも２つである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及び ｍｉＲ−３６１３。いくつかの実施形態によれば、基準値は、子宮内膜症を有さない対象からのサンプルにおける少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在である。
【００１２】
さらに別の側面によれば、本開示は、（ａ）対象からのサンプルを提供し、ここで前記サンプルは核酸を含み、そして前記対象は子宮内膜症の疑いがあり；（ｂ）前記サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出するために、前記核酸に対する配列決定反応を実施し、ここで少なくとも１つのｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５５３、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ− ４６６８、及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択され；そして（ｃ）ｍｉＲＮＡの存在を基準値に比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、高スループット又は超並列配列決定により検出される。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５b−５p、ｍｉＲ−４５１a及び ｍｉＲ−３６１３−５ｐ。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも２つである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０, ｍｉＲ−３４２及び ｍｉＲ−３６１３。
【００１３】
さらに別の側面によれば、本開示は、（ａ）ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、ｍｉＲ−３６１３−５ｐではない少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出し；そして（ｂ）検出されたｍｉＲＮＡレベルが閾値レベルを超える場合、子宮内膜症を有する対象を診断することを含み、ここで前記子宮内膜症を有する対象の診断は９０％を越える特異性又は感度を有する、子宮内膜症の症状を示すか又は子宮内膜症を有することが疑われる対象の診断方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、（ａ）ｌｅｔ−７、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ又はｍｉＲ−３６１３−５ｐではない少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出することを含む方法を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは無細胞である。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは無細胞サンプル、例えば無細胞血漿、血清、唾液及び／又は尿に存在する。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、初期子宮内膜症を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、中程度〜重度の疾患を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、ステージIII又はステージIV子宮内膜症を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、治療に続いてｍＲＮＡ発現レベルの変化について対象をモニターリングすることをさらに含む。
【００１６】
他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、７５％よりも高い、８０％よりも高い、８５％よりも高い、９０％よりも高い、９５％よりも高い又は９９％よりも高い特異性又は感度を有する。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、９５％よりも高い特異性又は感度を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、子宮内膜症について対象を治療することを含む。他の実施形態によれば、治療は痛みを和らげるための薬である。他の実施形態によれば、治療はホルモン療法である。他の実施形態によれば、治療はホルモン避妊薬である。他の実施形態によれば、治療はゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストである。他の実施形態によれば、治療はゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニストである。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、前記検出は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的なプローブとを接触し、ここで前記プローブは生成されたｃＤＮＡとの結合に基いてシグナルを放出し；そして（ｉｉｉ）プローブにより放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることを含む。
【００１９】
さらなる側面によれば、本開示は、（ａ）対象からのサンプルを提供し、ここで前記サンプルは核酸を含み、そして前記対象は子宮内膜症の疑いがあり；（ｂ）前記核酸に対する増幅、マイクロアレイ又は配列決定反応を実施し；（ｃ）サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出し、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択され；そして（ｄ）基準値にｍｉＲＮＡの存在を比較することを含む、ｍｉＲＮＡの検出方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記サンプルは体液である。他の実施形態によれば、前記サンプルは、血液、血漿、唾液又は血清である。他の実施形態によれば、前記基準値は、子宮内膜症を有さない対象からのサンプルにおける少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在である。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、前記検出はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によってである。他の実施形態によれば、前記検出は定量的ＰＣＲによってである。いくつかの実施形態によれば、検出はリアルタイムＰＣＲによってである。他の実施形態によれば、前記検出は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡ由来のｃＤＮＡに対してユニークプライマーをハイブリダイズされることを含む。他の実施形態によれば、前記検出は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的な少なくとも１つのプライマー又はプローブを用いて、又は少なくとも１つのユニバーサルプライマーを用いて、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して逆転写を実施することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記検出は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、シグナルを放出するインターカレート色素とを接触し；そして（ｉｉｉ）時間とともに放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることを含む。他の実施形態によれば、前記検出は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的なプローブとを接触し、ここで前記プローブは生成されたｃＤＮＡとの結合に基いてシグナルを放出し；そして（ｉｉｉ）プローブにより放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることを含む。他の実施形態によれば、前記プローブは、蛍光団又は消光剤に結合される。他の実施形態によれば、前記検出は配列決定によってである。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡが基準値よりも少なくとも２倍高い場合に診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡが基準値よりも少なくとも２倍低い場合に診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１５０−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−３４２−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４５−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４３−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐがアップレギュレートされ、又はｍｉＲ−１８ａ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、少なくとも３種のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされる場合、診断され、ここで前記少なくとも３種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−１８ａ−５ｐからなる群から選択される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−６７５５−３ｐがダウンレギュレートされるか、又はｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−４５１aがアップレギュレートされ、そしてｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される。いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される。いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症は、ｌｅｔ−７ｂがアップレギュレートされる場合、診断される。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、前記対象は、ＫＲＡＳ変異型対立遺伝子の存在について陰性である。他の実施形態によれば、前記検出されたｍｉＲＮＡレベルが、疾患の重症度を決定するために使用される。他の実施形態によれば、前記対象がヒト対象である。
【００２３】
さらなる側面によれば、本開示は、比較対照に比較して、対象の生物学的サンプルにおけるｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５５３、ｍｉＲ− ３６１３、ｍｉＲ−４６６８、及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択された、異なるレベルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを有するとして同定された対象に子宮内膜症治療を施すことを含んで成る、子宮内膜症を有する対象の治療方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記対象が比較対照に比較して、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５５３、ｍｉＲ− ３６１３、ｍｉＲ−４６６８、及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択された、異なるレベルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを有するとして同定される場合、子宮内膜症を有する対象を診断することをさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症を有する対象の診断は、対象からの生物学的サンプルを提供し、そして比較対照に比較して、生物学的サンプルにおけるｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５５３、ｍｉＲ− ３６１３、ｍｉＲ−４６６８、及びｍｉＲ−６７５５から成る群から選択された、異なるレベルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することを含む。いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下の全てである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐ。いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも２つである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、前記生物学的サンプルは体液である。いくつかの実施形態によれば、前記体液は、血液、血漿又は血清である。いくつかの実施形態によれば、前記体液は唾液である。いくつかの実施形態によれば、前記体液は尿である。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、初期子宮内膜症を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、中程度〜重度の疾患を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、ステージIII又はステージIV子宮内膜症を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、治療に続いてｍＲＮＡ発現レベルの変化について対象をモニターリングすることをさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、９５％よりも高い特異性又は感度を有する。他の実施形態によれば、治療は痛みを和らげるための薬である。他の実施形態によれば、治療はホルモン療法である。他の実施形態によれば、治療は、ホルモン避妊薬、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、及びゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニストから成る群から選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、定量的ＰＣＲを実施することにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、シグナルを放出するインターカレート色素とを接触し；そして（ｉｉｉ）時間とともに放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的なプローブとを接触し、ここで前記プローブは生成されたｃＤＮＡとの結合に基いてシグナルを放出し；そして（ｉｉｉ）プローブにより放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、配列決定により少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、高スループット又は超並列配列決定により少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、基準値よりも少なくとも２倍高いレベルで存在する。いくつかの実施形態によれば、対象は、ＫＲＡＳ変異型対立遺伝子の存在について陰性である。いくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態によれば、前記少なくともｍｉＲＮＡのレベルは、疾患の重症度を決定するために使用される。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１５０−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−３４２−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４５−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４３−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐがアップレギュレートされ、又はｍｉＲ−１８ａ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、少なくとも３種のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされる場合、診断され、ここで前記少なくとも３種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−１８ａ−５ｐからなる群から選択される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−６７５５−３ｐがダウンレギュレートされるか、又はｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−４５１aがアップレギュレートされ、そしてｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される。
【００３１】
さらなる側面によれば、本開示は、（ａ）対象からの唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルを提供し、ここで前記サンプルは、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡを含み；（ｂ）子宮内膜症に関するｍｉＲＮＡのレベルを検出し；（ｃ）体液サンプルにおける子宮内膜症に関するｍｉＲＮＡの相対レベルを決定するために、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの検出レベルと基準値とを比較し； （ｄ）唾液、痰、尿、リンパ液、滑液、脳脊髄液、便、又は粘液サンプルにおける子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの相対レベルに基いて子宮内膜症を有する対象を診断することを含み、ここで子宮内膜症を有する対象の診断が９０％より高い特異性又は感度を有し；そして（ｅ）子宮内膜症と診断された対象に治療を施すことを含む、子宮内膜症を有する疑いがある対象の診断及び治療方法を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、前記対象からのサンプルは、唾液サンプルである。いくつかの場合、対象からのサンプルは、尿サンプルである。いくつかの場合、対象からのサンプルは、粘膜サンプルである。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、初期子宮内膜症を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、中程度〜重度の疾患を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、ステージIII又はステージIV子宮内膜症を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、治療に続いてｍＲＮＡ発現レベルの変化について対象をモニターリングすることをさらに含む。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、９５％よりも高い特異性又は感度を有する。他の実施形態によれば、治療は痛みを和らげるための薬である。他の実施形態によれば、治療はホルモン療法である。他の実施形態によれば、治療は、ホルモン避妊薬、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、及びゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニストから成る群から選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、定量的ＰＣＲを実施することにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、シグナルを放出するインターカレート色素とを接触し；そして（ｉｉｉ）時間とともに放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的なプローブとを接触し、ここで前記プローブは生成されたｃＤＮＡとの結合に基いてシグナルを放出し；そして（ｉｉｉ）プローブにより放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、配列決定により少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、高スループット又は超並列配列決定により少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、基準値よりも少なくとも２倍高いレベルで存在する。いくつかの実施形態によれば、対象は、ＫＲＡＳ変異型対立遺伝子の存在について陰性である。いくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態によれば、前記少なくともｍｉＲＮＡのレベルは、疾患の重症度を決定するために使用される。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１５０−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−３４２−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４５−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４３−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐがアップレギュレートされ、又はｍｉＲ−１８ａ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、少なくとも３種のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされる場合、診断され、ここで前記少なくとも３種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−１８ａ−５ｐからなる群から選択される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−６７５５−３ｐがダウンレギュレートされるか、又はｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−４５１aがアップレギュレートされ、そしてｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される。
【００３８】
さらなる側面によれば、本開示は、（ａ）ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１８ａ、又はｍｉＲ−１４１ではない少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を検出し；そして（ｂ）検出されたｍｉＲＮＡレベルが閾値レベルを超える場合、子宮内膜症を有する対象を診断し；そして（ｃ）子宮内膜症を有すると診断された対象に治療を促すことを含む、子宮内膜症を有する疑いある対象の診断及び治療方法を提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐを含む。他の実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１２６ｂ−５ｐである。他の実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡはｍｉＲ−３６１３−５ｐである。他の実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは無細胞ｍｉＲＮＡである。他の実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、比較対照に比較して、少なくとも２倍の変化で存在する。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、初期子宮内膜症を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、中程度〜重度の疾患を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、ステージIII又はステージIV子宮内膜症を有する対象を診断することである。他の実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、治療に続いてｍＲＮＡ発現レベルの変化について対象をモニターリングすることをさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、前記子宮内膜症を有する対象の診断は、９５％よりも高い特異性又は感度を有する。他の実施形態によれば、治療は痛みを和らげるための薬である。他の実施形態によれば、治療はホルモン療法である。他の実施形態によれば、治療は、ホルモン避妊薬、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、及びゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニストから成る群から選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、定量的ＰＣＲを実施することにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、シグナルを放出するインターカレート色素とを接触し；そして（ｉｉｉ）時間とともに放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡを特異的に結合するプライマーを用いて、又はユニバーサルプライマーを用いて、逆転写アッセイを実施することによりサンプル内のｍｉＲＮＡを増幅し、それによりｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）生成されたｃＤＮＡと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して特異的なプローブとを接触し、ここで前記プローブは生成されたｃＤＮＡとの結合に基いてシグナルを放出し；そして（ｉｉｉ）プローブにより放出されたシグナルを検出するために検出器を用いることにより少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、配列決定により少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。他の実施形態によれば、前記方法は、高スループット又は超並列配列決定により少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出することをさらに含む。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、基準値よりも少なくとも２倍高いレベルで存在する。いくつかの実施形態によれば、対象は、ＫＲＡＳ変異型対立遺伝子の存在について陰性である。いくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態によれば、前記少なくともｍｉＲＮＡのレベルは、疾患の重症度を決定するために使用される。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１５０−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−３４２−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４５−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４３−３ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐがアップレギュレートされ、又はｍｉＲ−１８ａ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、少なくとも３種のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされる場合、診断され、ここで前記少なくとも３種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−１８ａ−５ｐからなる群から選択される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−６７５５−３ｐがダウンレギュレートされるか、又はｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされ、ｍｉＲ−４５１aがアップレギュレートされ、そしてｍｉＲ−３６１３−５ｐがダウンレギュレートされる場合、診断される。他の実施形態によれば、子宮内膜症は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがアップレギュレートされる場合、診断される。
【００４５】
別の側面によれば、本開示は、対象における子宮内膜症の診断方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、対象の生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定し、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択され；そして前記生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルと、比較対照中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルとを比較し、ここで前記生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルと異なる場合、対象は子宮内膜症と診断される、対象における子宮内膜症の診断方法を含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、さらに、子宮内膜症について対象を治療する工程を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−４５１ 及び ｍｉＲ−３６１３の組合せである。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、対象はヒトである。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、前記比較対照は、陽性対照、陰性対照、正常対照、野生型対照、歴史的対照、及び歴史的規範から成る群から選択された少なくとも１つの比較対照である。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、対象における子宮内膜症の診断方法を提供し、ここで前記方法は、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４及びｍｉＲ−１２６の少なくとも１つのレベルが、比較対照におけるレベルに比較して、生物学的サンプルにおいて高められることを検出することを含む。別の実施形態によれば、本開示は、対象における子宮内膜食の診断方法を提供し、ここで前記方法は、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及び ｍｉＲ−４６６８の少なくとも１つのレベルが、比較対照におけるレベルに比較して、生物学的サンプルにおいて低められることを検出することを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの決定が、逆転写、ＰＣＲ及びマイクロアレイから成る群から選択された少なくとも１つの技術を利用する。
【００５１】
いくつかの実施形態によれば、前記生物学的サンプルは、血液、血清、血漿及びそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される。
【００５２】
別の側面によれば、本開示はまた、子宮内膜症の疑いがあるか、又は有する対象の生物学的サンプルにおける、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡの変更された発現を検出する工程を含む、対象における子宮内膜症の診断又は予後方法を提供する。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−４５１及びｍｉＲ−３６１３の組合せである。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、前記生物学的サンプルは、血液、血清、血漿及びそれらのいずれかの組合せから成る群から選択される。
【００５５】
本開示はまた、少なくとも１つのｍｉＲＮＡに対して選択的に結合する試薬を含むキットも提供し、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡである。  いくつかの実施形態によれば、前記キットは、少なくとも３種の試薬を含み、ここで第１試薬はｍｉＲ−１２５に対して選択的に結合し、そして第２試薬はｍｉＲ−４５１に対して選択的に結合し、そして第３試薬はｍｉＲ−３６１３に対して選択的に結合する。
【００５６】
別の側面によれば、本開示、比較対照に比較して、対象の生物学的サンプルにおけるｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択された少なくとも１つのｍｉＲＮAの異なるレベルを有するとして同定された対象に子宮内膜症治療を施すことを含む、子宮内膜症を有する対象の治療方法を提供する。
【００５７】
別の側面によれば、本開示は、対象の生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定し、ここで前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８から成る群から選択され；そして前記生物学的サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルと、比較対照中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルとを比較する、子宮内膜症に関して治療されている対象における子宮内膜症に対する応答のモニターリング方法を提供する。
【００５８】
本開示の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付図面と組合して読まれる場合、より理解されるであろう。本開示を説明するために、現在、好ましい実施形態が図面に示されている。しかしながら、本開示は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、マイクロアレイ分析において示差的に発現されたｍｉＲＮＡの結果を示す画像である。
【００６０】
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂを含む図２は、リアルタイム定量的ＰＣＲにより決定される場合、子宮内膜症及び対照群において示差的に発現されたｍｉＲＮＡの結果を示す一連の画像である。
【００６１】
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂを含む図２は、リアルタイム定量的ＰＣＲにより決定される場合、子宮内膜症及び対照群において示差的に発現されたｍｉＲＮＡの結果を示す一連の画像である。
【００６２】
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄを含む図３は、示差的に発現されたｍｉＲＮＡのＡＵＣ値の結果を示す一連の画像である。図３Ａは、血清ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ及びｍｉＲ−３４２−３ｐの受信者操作特性（ＰＯＣ）曲線分析を示す画像である。図３Ｂは、血清ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ及びｍｉＲ−１４３−３ｐのＲＯＣ曲線分析を示す画像である。図３Ｃは、血清ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐのＲＯＣ曲線分析を示す画像である。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ（図３Ａ）は、０．９７４の最高のＡＵＣを示した。図３Ｄは、血清ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐの組合せが１．０００の最高のＡＵＣ値を示したことを示す画像である。
【００６３】
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄを含む図３は、示差的に発現されたｍｉＲＮＡのＡＵＣ値の結果を示す一連の画像である。図３Ａは、血清ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ及びｍｉＲ−３４２−３ｐの受信者操作特性（ＰＯＣ）曲線分析を示す画像である。図３Ｂは、血清ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ及びｍｉＲ−１４３−３ｐのＲＯＣ曲線分析を示す画像である。図３Ｃは、血清ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐのＲＯＣ曲線分析を示す画像である。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ（図３Ａ）は、０．９７４の最高のＡＵＣを示した。図３Ｄは、血清ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐの組合せが１．０００の最高のＡＵＣ値を示したことを示す画像である。
【００６４】
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄを含む図３は、示差的に発現されたｍｉＲＮＡのＡＵＣ値の結果を示す一連の画像である。図３Ａは、血清ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ及びｍｉＲ−３４２−３ｐの受信者操作特性（ＰＯＣ）曲線分析を示す画像である。図３Ｂは、血清ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ及びｍｉＲ−１４３−３ｐのＲＯＣ曲線分析を示す画像である。図３Ｃは、血清ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐのＲＯＣ曲線分析を示す画像である。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ（図３Ａ）は、０．９７４の最高のＡＵＣを示した。図３Ｄは、血清ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐの組合せが１．０００の最高のＡＵＣ値を示したことを示す画像である。
【００６５】
【図３Ｄ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄを含む図３は、示差的に発現されたｍｉＲＮＡのＡＵＣ値の結果を示す一連の画像である。図３Ａは、血清ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ及びｍｉＲ−３４２−３ｐの受信者操作特性（ＰＯＣ）曲線分析を示す画像である。図３Ｂは、血清ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ及びｍｉＲ−１４３−３ｐのＲＯＣ曲線分析を示す画像である。図３Ｃは、血清ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐのＲＯＣ曲線分析を示す画像である。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ（図３Ａ）は、０．９７４の最高のＡＵＣを示した。図３Ｄは、血清ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐの組合せが１．０００の最高のＡＵＣ値を示したことを示す画像である。
【００６６】
【図４】図４は、リアルタイム定量的ＰＣＲにより決定される場合、ヒヒにおける子宮内膜症、及び子宮内膜症治療を有するグループにおけるｍｉＲＮＡの相対的発現を示す画像である。ｐ値はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いての分析に基かれた。
【００６７】
【図５】図５は、子宮内膜症及び対照グループにおける唾液中のｍｉＲＮＡの相対的発現の結果を示す画像である。
【００６８】
【図６】図６は、子宮内膜症及び対照グループにおける唾液中のｍｉＲＮＡの相対的発現の結果を示す画像である。
【００６９】
【図７】図７は、腹腔鏡検査又は開腹術を受けた女性の血清中のｍＲＮＡの発現レベルを示す画像であり、子宮内膜症の存在を確認するか（疾患群）又は他の良性病理を明らかにした（対照群）。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本開示は、特定マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルが、子宮内膜症、例えば増殖期間中の子宮内膜症に関連するという発見に関する。従って、本明細書に記載される種々の実施形態によれば、本開示の方法は、子宮内膜症を有するものとしての対象の診断方法、子宮内膜症を有するか又は発症する対象の危険性の評価方法、対象の子宮内膜症の重症度の評価方法、臨床試験における割り当てのために子宮内膜症を有する対象の層別化方法、及び対象における子宮内膜症のモニターリング方法に関する。従って、本開示は、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルに基いて、それを必要とする対象における子宮内膜症の診断、評価及び特徴づけのためのｍｉＲＮＡの検出及び定量化のために有用な組成物及び方法に関する。本開示のマーカーは、スクリーニング、診断、発症のモニターリング、進行のモニターリング、及び子宮内膜症の治療の評価に使用され得る。本開示のマーカーは、治療計画を確立し、そして評価するために使用され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡは、子宮内膜症のマーカー又はバイオマーカーである。種々の実施形態によれば、本開示のバイオマーマーカーは、ｍｉＲ−１２５、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ−３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８のうち１つ又は２つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−４５１及びｍｉＲ−３６１３の組合せを含む。いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、以下の少なくとも２つを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐ。いくつかの実施形態によれば、バイオマーカーは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。いくつかの場合、バイオマーカーはさらに、ｍｉＲ-−４５１を含むことができる。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡは、子宮内膜症のマーカー又はバイオマーカーである。種々の実施形態によれば、本開示のバイオマーマーカーは、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、ｍｉＲ−５５３及び ｍｉＲ−４６６８−３ｐのうち１つ又は２つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐの組合せを含む。いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、以下の少なくとも２つを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐ。いくつかの実施形態によれば、バイオマーカーは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。いくつかの場合、バイオマーカーはさらに、ｍｉＲ-−４５１を含むことができる。
【００７３】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、子宮内膜症を発症する個人の危険性を予測するマーカーを提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示のマーカーは、疾患の出現が予防されるように予防的療法を施すことができる時点で危険性を予測することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態によれば、本開示のマーカーは、外科的処置なしで疾患の早期検出を可能にする子宮内膜症のための非侵襲性バイオマーカーである。例えば、子宮内膜症を有する対象の生物学的サンプルにおける特定ｍｉＲＮＡの変更された発現は、他の臨床的パラメーター、例えば骨盤痛、不妊症、疾患の再発と相関することができる。従って、本開示のマーカーは、疾患のバイオマーカーとしてのみならず、また予後及び再発に関するマーカーとしてても使用され得る。これは、子宮内膜症及び関連する合併症を診断するために当核分野で使用される反復の外科的処置が回避され得るので、有利である。
【００７５】
本開示は、子宮内膜症の診断及び予後のためのバイオマーカーを提供する。一般的に、本開示の方法は、患者からの血液、血漿又は血清において示差的に発現される（アップ又はダウンレギュレートされる）、バイオマーカーの発現レベルを検出することにより子宮内膜症の診断又は予後の提供に用途を見出す。同様に、それらのマーカーは、子宮内膜症を有する患者における受胎能の低下を診断するか、又は子宮内膜症を患っている患者における受胎能試験の予後を提供するために使用され得る。本開示はまた、子宮内膜症を治療又は予防するための化合物を同定する方法も提供する。本開示は、子宮内膜症の診断又は予後のためのキットを提供する。
【００７６】
定義：
特にことわらない限り、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似するか又は同等の任意の方法及び材料が本開示の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料が記載されている。
【００７７】
本明細書において使用される場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションにおいて、それに関連する意味を有する。
【００７８】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を言及するために、本明細書において使用される。例として、「１つの要素」とは、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
【００７９】
測定可能な値、例えば量、持続時間、及び同様のものを言及する場合、本明細書において使用されるような「約（about）」は、そのような変動は本開示の方法を実施するのに適切であるので、特定の値からの±２０％、±１０％、±５％又は±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００８０】
生物、組織、細胞又はそれらの構成要素に関して使用される場合、用語「異常（abnormal）」とは、少なくとも１つの観察可能又は検出可能な特徴（例えば、年齢、治療、経過時間、等）において、「正常（normal）」（予想される）なそれぞれの特徴を示すそれらの生物、組織、細胞又はそれらの構成要素とは異なる、それらの生物、組織、細胞又はそれらの構成要素を言及する。１つの細胞又は組織型について正常であるか、又は予想される特徴は、異なる細胞又は組織型について異常であり得る。
【００８１】
用語「アンチセンス（antisense）」とは、本明細書において使用される場合、標的配列に対して相補的である、例えばそれらだけには限定されないが、成熟標的ｍｉＲＮＡ配列、又はその副配列を含む標的ｍｉＲＮＡ配列に対して相補的である核酸配列を言及する。典型的には、アンチセンス配列は、アンチセンス核酸配列の全長にわたって標的配列に対して完全に相補的である。
【００８２】
用語、「体液（body, fluid 又はbodily fluid）」とは、血漿、血清、血液、リンパ液、脳脊髄液、滑液、尿、唾液、粘液、痰、及び痰を含むが、但しそれらだけには限定されない。体液サンプルは、任意の適切な方法により収集され得る。体液サンプルはすぐに使用されても、又は後での使用のために保存されても良い。当業界において知られている任意の適切な保存方法を用いて、体液サンプルを保存することができ；例えば、サンプルは約−２０℃〜約−７０℃で凍結され得る。適切な体液は、無細胞液である。「無細胞」液は、細胞が存在しないか、又は細胞部分におけるよりもむしろ、サンプルの液体部分に、決定されたｍｉＲＮＡがそのレベルを反映するような少量で存在する体液サンプルを含む。そのような無細胞液は一般的に、細胞を除去するために、例えば遠心分離又は濾過により細胞含有体液を処理することにより製造される。典型的には、無細胞体液は、損なわれていない細胞を含まないが、しかしながら、いくつかは細胞断片又は細胞死骸を含むことができる。無細胞液の例は、血漿又は血清、又は細胞が除去されている体液を包含する。
【００８３】
本明細書において使用される場合、用語「無細胞（cell-free）」とは、サンプルが身体から得られる直前、それが体内に出現する場合の核酸の状態を言及する。例えば、核酸は、それらが細胞と関連していない点で、無細胞状態で血液又は唾液などの体液に存在することができる。しかしながら、無細胞核酸は、血液又は他の体液に入る前、細胞、例えば子宮内膜症と本来、関係していた可能性がある。対照的に体内の細胞と単独で関連している核酸は一般的に「無細胞」であるとは考えられない。例えば、細胞サンプルから抽出された核酸は、この用語が本明細書において使用される場合、「無細胞」とは見なされない。
【００８４】
用語「臨床因子（clinical factors）」とは、本発明書において使用される場合、開業医が疾患の診断又は予後を決定する際に考慮し得る任意のデータを言及する。そのような因子は、患者の病歴、患者の健康診断、全血球計算、酵素活性の分析、細胞の検査、細胞遺伝学、及び血球の免疫表現型検査を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００８５】
「相補的（complementary）」とは、本明細書において使用される場合、２つの核酸間のサブユニット配列の相補性の広い概念を言及する。両分子中のヌクレオチド位置が通常、互いに塩基対合することができるヌクレオチドにより占められている場合、核酸はこの位置で互いに相補的であると考えられる。従って、各分子における対応する位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％及びより好ましくは、少なくとも約８０％が、通常互いに塩基対合するヌクレオチド（例えば、Ａ:Ｔ及びＧ:Ｃヌクレオチド対）により占められる場合、２つの核酸は実質的に、お互い相補的である。
【００８６】
本明細書において使用される場合、用語「診断（diagnosis）」とは、疾患又は障害の検出、又は疾患又は障害の段階又は程度の決定を意味する。通常、疾患又は障害の診断は、疾患の指標である、１又は２以上の要因及び／又は症状の評価に基かれる。すなわち、診断は、疾患又は状態の存在又は不在の指標である要因の存在、不在又は量に基いて行われ得る。特定疾患の診断のための指標であると思われる各要因又は症状は、特定の疾患に独占的に関連する必要はなく；すなわち、診断因子又は症状から推測され得る鑑別診断があり得る。同様に、特定の疾患の指標である要因又は症状が、特定の疾患を有さない個人に存在する場合もあり得る。診断方法は、独立して、又は特定の疾患又は障害に関して医学的分野で知られている他の診断及び／又は病期分類方法と組合して使用され得る。
【００８７】
本明細書において使用される場合、用語「レベルの差（difference of the level）」とは、対照又は参照レベルに比較して、サンプルにおける特定マーカー、例えば核酸又はタンパク質の量の差を言及する。例えば、特定のバイオマーカーの量は、参照レベルと比較して、疾患を有する患者のサンプル中に高められた量又は低められた量で存在し得る。いくつかの実施形態によれば、「レベルの差」は、対照に比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約 ５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％ 又それ以上の、サンプルに存在する特定バイオマーカーの量の間の差でありえる。いくつかの実施形態によれば、「レベルの差」は、対象に比較して、サンプルに存在するバイオマーカーの量の間の統計学的に有意な差であり得る。例えば、測定されたバイオマーカーのレベルが、任意の対照又は参照群の平均の約１．０標準偏差、約１．５標準偏差、約２．０標準偏差、又は約２．５標準偏差の外側にある場合、差異は統計学的に有意であり得る。
【００８８】
「疾患（diseace）」とは、動物が恒常性を維持できず、そして疾患が改善されない場合、動物の健康は悪化し続ける、動物の健康の状態である。
【００８９】
対照的に、動物における「障害（disorder）」とは、動物は恒常性を維持することができるが、しかし動物健康状態は、障害のない場合よりも好ましくない健康状態である。未治療のままにしておくと、障害は動物の健康状態をさらに必ずしも、低めるわけではない。
【００９０】
疾患又は障害は、その疾患又は障害の徴候又は症状の重症度、そのような徴候又は症状が患者により経験される頻度、又はその両者が低められる場合、「軽減される」。
【００９１】
用語「比較対照（comparator）」とは、本開示の１つの又は２以上のマーカー（又はバイオマーカー）の複数のマーカー（又はバイオマーカー）発現生成物を含まないか、又は正常、低又は高レベルで含む材料を表し、結果的に、その比較対照は、サンプルが比較され得る対照又は参照標準として役立つことができる。
【００９２】
用語「調節不全の（dysregulated）」及び「調節不全（dysregulation）」とは、本明細書において使用される場合、比較対照サンプル、例えば１又は２以上の正常な、危険性のない対象から、又は異なった時点での同じ対象から得られた比較対照におけるそのｍｉＲＮＡの発現のレベルに比較して、対象から得られたサンプルに存在し、そして検出されるｍｉＲＮＡの発現の低められた（ダウンレギュレートされた）又は高められた（アップレギュレートされた）レベルを表す。いくつかの場合、ｍｉＲＮＡ発現のレベルは、１人以上のリスクのない個人から得られた平均と比較される。他の場合、ｍｉＲＮＡ発現のレベルは、１人の正常なリスクのない個人から得られたサンプルにおいて評価されたｍｉＲＮＡレベルと比較される。
【００９３】
「マーカー（又はバイオマーカー）のレベルを決定する（determinig the level of marker (or biomarker)）」という語句は、十分な部分の任意のマーカー発現生成物を検出するために当業者に入手できる技法を用いて、核酸又はタンパク質レベルでサンプルにおけるマーカーの発現の程度を評価することを意味する。
【００９４】
用語「決定する（determining）」、「測定する（measuring）」、「評価する（assessing）」及び「アッセイする（assaying）」は、交換可能的に使用され、そして定量的及び定性的測定の両方を含み、そして特徴、形質又は特性が存在するか否かを決定することを含む。評価は、相対的でも絶対的でもあり得る。「存在の評価（assessing the presence of ）」とは、存在するか否かを決定することを含む。「存在の評価（assessing the presence of）」とは、存在する何かの量を決定すること、及びそれが存在するか否かを決定することを含む。
【００９５】
「示差的に高められた発現（differentially increased expression）」又は「アップレギュレーション（up regulation）」とは、比較対照よりも、少なくとも１０％又はそれ以上、例えば２０％、３０％、４０％、又は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高いか又はそれ以上、及び／又は１．１倍、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２．０倍、高いか又はそれ以上、及びその間の全部又は一部の増分である発現レベルを言及する。
【００９６】
「示差的に低められた発現（differentially decreased expression）」又は「ダウンレギュレーション（down regulation）」とは、比較対照よりも、少なくとも１０％又はそれ以上、例えば２０％、３０％、４０％、又は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％低いか又はそれ以下、及び／又は２．０倍、１．８倍、１．６倍、１．４％、１．２倍、１．１倍又はそれ以下、及びその間の全部又は一部の増分である発現レベルを言及する。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「内因性（endogenous）とは、生物、細胞、組織又は系から又はそれらの内部で成長された任意の物質を言及する。
【００９８】
用語「発現（expression）」とは、本明細書において使用される場合、特定ヌクレオチドの転写及び／又は翻訳として定義される。
【００９９】
「相同（homologous）」とは、本明細書において使用される場合、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子、例えば２つのＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子間、又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を言及する。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットにより占められる場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンにより占められる場合、それはその位置で相同である。２つの配列間の相同性は、一致位置又は相同位置の数の直接的な関数である。例えば、２つの化合物配列における位置の半分（例えば、ポリマー中の長さ１０のサブユニットにおける５つの位置）が相同である場合、それらの２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％、例えば１０のうち９が一致するか又は相同である場合、それらの２つの配列は９０％相同性を共有する。例えば、ＤＮＡ配列５'−ＡＴＴＧＣＣ−３' 及び５'−ＴＡＴＧＧＣ−３‘は、５０％相同性を有する。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「相同性（homelogy）」は、「同一性（identity）」と同義で使用される。
【０１０１】
マーカーの「障害剤（inhibitors）、「活性化剤（activators）」及び「調節剤（modulators）」は、子宮内膜症バイオマーカーのインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定された活性化分子、阻害分子又は調節分子を言及するために使用される。阻害剤は、活性を部分的に又は全体的に阻止するために結合し、活性化を低め、妨げ、遅延し、不活性化し、脱感作するか、又は子宮内膜症バイオマーカーの活性又は発現をダウンレギュレートする化合物である。「活性化剤（activators）」は、子宮内膜症バイオマーカーの活性を高め、開放し、促進し、増強し、感作し、アゴナイズし、又はアップレギュレートする化合物、例えばアゴニストである。阻害剤、活性化剤又は調節剤はまた、子宮内膜症バイオマーカーの遺伝子改変型、例えば変更された活性を有する型、並びに天然に存在する及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、ペプチド、環状ペプチド、核酸、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡi、マイクロＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ分子、有機小分子及び同様のものも含む。阻害剤及び活性化剤についてのそのようなアッセイは、例えば、本明細書の他の部分に記載されているように、インビトロで、細胞又は細胞抽出物において子宮内膜症バイオマーカーを発現し、推定調節剤化合物を適用し、そして次に、活性に対する機能的効果を決定することを含む。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「説明資料（instructional material）」は、出版物、記録、図表、又は本明細書に記載される種々の疾患又は障害の緩和をもたらすためのキットにおける本開示の化合物、組成物、ベクター、方法又は送達システムの有用性を伝達するために使用され得る他の任意の表現媒体を含む。任意には、又は他方では、説明資料は、哺乳類の細胞又は組織における疾患又は障害を軽減する１又は２以上の方法を説明することができる。本開示のキットの説明資料は、例えば、本開示の同定された化合物、組成物、ベクター又は送達システムを含む容器に添付され得るか、又は同定された化合物、組成物、ベクター又は送達システムを含む容器と一緒に出荷され得る。他方では、説明資料は、その説明資料及び化合物が受容者により協調的に使用されることを意図して、容器とは別に出荷され得る。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「単離された（isolated）」とは、ヒトの直接的又は関節的行動を通して天然の状態から変更されるか又は排除されることを意味する。例えば、生存動物において天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離されていない」が、しかしその天然状態の共存物質から部分的に又は完全に分離されているその同じ核酸又はペプチドは、「単離されている」。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形で存在され得るか、又は非天然の環境、例えば宿主細胞に存在することができる。
【０１０４】
「測定する（measuring）」又は「測定（measurement）」又は他方では「検出する（detecting）」とは、所定の物質の定性的又は定量的濃度レベルの由来を含む、臨床又は対象由来のサンプル内のそのような物質の存在、不在、数量又は量（有効量であり得る）を評価すること、又は他方では、対象の臨床パラメーターの値、又は分類を評価することを意味する。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、「マイクロＲＮＡ（microＲＮＡ）」又は「ｍｉＲＮＡ」は非コードの小ＲＮＡ分子、一般的に約１５〜約５０個の長さのヌクレオチド、好ましくは１７〜２３個のヌクレオチドを記載し、これはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる工程を通して遺伝子発現の調節において役割を果たすことができる。ＲＮＡｉは、標的遺伝子メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）中の配列に対して相補的又はアンチセンスである。ＲＮＡ配列の存在が標的遺伝子の発現の阻害をもたらす現象を説明する。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｓｅIII 酵素による連続的切断を介して一次転写体（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）から誘導される約７０又はそれ以上のヌクレオチドのヘアピン前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）からプロセッシングされる。ｍｉＲＢａｓｅは、ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにある包括的なマイクロＲＮＡデータベースであり、それはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」とは、参照配列（好ましくは、天然に存在する正常又は「野生型」の配列である）と比較しての核酸又はポリペプチド配列の変化を言及し、そして転座、欠失及び置換／点突然変異を包括する。本明細書において使用される場合、「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」とは、変異を含む核酸又はタンパク質のいずれかを言及する。
【０１０７】
「天然に存在する（naturally occurring）」は、本明細書において使用される場合、人工的に産生されるものとは異なるものとして天然において見出され得る組成物を説明する。例えば、天然源から単離され得、そしてヒトにより意図的に改変されていない、生物中に存在するヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【０１０８】
「核酸（nucleic acid）」とは、デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドから構成されるかどうか、及びホスホジエステル結合または修飾結合、例えばホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合、及びそのような架橋の組合せから構成されるかどうかにかかわらず、任意の核酸を意味する。用語、核酸はまた、５つの生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基から構成される核酸も特に含む。
【０１０９】
従来の標記法が、ポリヌクレオチド配列を説明するために本明細書において使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５′末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と呼ばれる。
【０１１０】
新生ＲＮＡ転写体へのヌクレオチドの５′→３′付加の方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖（coding strand）」と呼ばれる。ＤＮＡ上の基準点に対して５′側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列（upstream sequences）」と呼ばれる。ＤＮＡ上の基準点に対して３′側に位置するＤＮＡ上の配列は、「下流配列（downstream sequences）」と呼ばれる。
【０１１１】
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形及び混合されたポリマー、センス及びアンチセンス鎖を含み、そして非天然又は誘導体化された、合成、又は半合成ヌクレオチド塩基を含むよう化学的に又は生化学的に修飾され得る。また、それらだけには限定されないが、１又は２以上のヌクレオチドの欠失、挿入、置換、又は他のポリペプチド配列への融合を含む、野生型又は合成遺伝子の変異がまた、本開示の範囲内に含まれる。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、増幅のための「プライマー（primer）」は、標的又はマーカーヌクレオチド配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドである。プライマーの３′ヌクレオチドは、ポリメラーゼによる最適プライマー伸長のために、対応するヌクレオチド位置で標的又はマーカー配列と同一であるべきである。本明細書において使用される場合、「フォワードプライマー（forward primer）」は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のアンチセンス鎖にアニーリングするプライマーである。「リバースプライマー（reverse primer）」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖にアリーニングする。
【０１１３】
用語、「組換えＤＮＡ（recominant ＤＮＡ）」は、本明細書において使用される場合、異なる源からのＤＮＡ片を結合することにより生成されるＤＮＡとして定義される。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、用語「予後を提供する（providing a prognosis）」とは、重症度、期間、回復の可能性、などの予測を含む、子宮内膜症の推定経過及び結果の予測を提供することを意味する。状態がまだ初期段階にあるかどうか、又は状態が、積極的な治療が無効である段階に進歩したかどうかを示すことにより、適切な治療計画を考案するための方法もまた使用され得る。
【０１１５】
バイオマーカーの「基準レベル（reference level）」とは、特定の病状、表現型、又はその欠如、並びに病状、表現型又はその欠如の組合せを示すバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「陽性」基準レベルとは、特定の病状又は表現型を示すレベルを意味する。バイオマーカーの「陰性」基準レベルとは、特定の病状又は表現型の欠如を示すレベルを意味する。
【０１１６】
「サンプル（sample）」又は「生物学的サンプル（biological sample）」とは、本明細書において使用される場合、個体から単離された生物学的材料を意味する。生物学的サンプルは、所望のバイオマーカーを検出するために適切な任意の生物学的材料を含み、そして個体から得られる細胞性及び／又は非細胞性材料を含むことができる。
【０１１７】
「標準対照値（standard control value）」とは、本明細書において使用される場合、生物学的サンプルにおいて検出できる非所定量の特定タンパク質又は核酸を言及する。標準対照値は、生物学的サンプルに存在する目的のタンパク質又は核酸の量を比較するために、本開示の方法の使用のために適切である。標準対照として役立つ確立されたサンプルは、例えば性別、年齢、民族性及び症歴などの適度に一致した背景の平均的な健康な個人にとって典型的である生物学的サンプルにおける、平均量の目的のタンパク質又は核酸を提供する。標準対照値は、目的のタンパク質又は核酸、及びサンプル（例えば、血清）の性質に依存して変化することができる。
【０１１８】
用語「対象（subject）」、「患者（patient）」、「個体（individual）」及び同様のものは、本明細書においては互換的に使用され、そしてインビトロ又はインサイチュを問わず、本明細書に記載される方法に従って、任意の動物又はその細胞を言及する。特定の非制限的な実施形態によれば、患者、対象又は個体は、ヒトである。
【０１１９】
用語「低発現する（underexpress）」、「低発現（underexpresion）」、「低発現された（underexpressed）」又は「ダウンレギュレートされた（down-regulated）」とは、子宮内膜症を有さない女性からの生物学的サンプルに比較して、子宮内膜症を有する女性からの生物学的サンプにおいて検出可能的に低いレベルで転写されるか又は翻訳されるタンパク質又は核酸を互換的に言及する。前記用語は、対照と比較して、転写、後転写プロセッシング、翻訳、後翻訳プロセッシング、細胞局在化（例えば、細胞小器官、細胞質、核、細胞表面）、及びＲＮＡ及びタンパク質安定性のために低発現を含む。低発現は、ｍＲＮＡ(すなわち、Ｑ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション)又はタンパク質（すなわち、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的技法）を検出するための従来の技法を用いて検出され得る。低発現は、対照に比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以下であり得る。特定の場合、低発現は、対照に比較して、１−、 ２−、 ３−、 ４−、 ５−、 ６−、７−、８−、９−、１０−倍又はそれ以上、低いレベルの転写又は翻訳である。
【０１２０】
用語「過剰発現する（overexpress）」、「過剰発現（overexpression）」、「過剰発現された（overexpressed）」又は「アップレギュレートされた（up-regulated）」とは、子宮内膜症を有さない女性からの生物学的サンプルに比較して、通常子宮内膜症を有する女性からの生物学的サンプルにおいて、検出可能的に高いレベルで転写されるか又は翻訳されるタンパク質又は核酸（ＲＮＡ）を互換的に言及する。前記用語は、子宮内膜症を有さない女性からの細胞に比較して、転写、後転写プロセッシング、翻訳、後翻訳プロセッシング、細胞局在化（例えば、細胞小器官、細胞質、核、細胞表面）、及びＲＮＡ及びタンパク質安定性のために過剰発現を含む。過剰発現は、ｍＲＮＡ(すなわち、Ｑ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション)又はタンパク質（すなわち、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的技法）を検出するための従来の技法を用いて検出され得る。過剰発現は、子宮内膜症を有さない女性からの細胞に比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上であり得る。特定の場合、過剰発現は、子宮内膜症を有さない女性からの細胞に比較して、１−、 ２−、 ３−、 ４−、 ５−、 ６−、７−、８−、９−、１０−倍又はそれ以上、高いレベルの転写又は翻訳である。
【０１２１】
本明細書において使用される場合、「変異体（variant）」とは、それぞれ、参照核酸配列又はペプチド配列と配列が異なるが、しかし参照分子の本質的な性質を保持している、核酸配列又はペプチド配列である。核酸変異体の配列の変化は、参照核酸によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を変更することができず、又はアミ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらすことができる。ペプチド変異体の配列の変化は、典型的には制限されているか又は保存的であり、結果的に、参照ペプチド及び変異体の配列は、全体的に非常に類似しており、そして多くの領域で同一である。変異体及び参照ペプチドは、任意の組合せにおける１又は２以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なり得る。核酸又はペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように天然に存在することが知られていない変異体でもあり得る。核酸及びペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技法又は直接的合成により製造され得る。
【０１２２】
本明細書において使用される場合、用語「治療する（treat）」、「改善する（ameliorate）」、「治療（treatment）及び「治療する（treating）」とは、互換的に使用される。それらの用語は、それらに限定されないが、治療的利益及び／又は予防的利益を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを言及する。治療的利益とは、治療されている根本的な障害の根絶又は改善を意味する。また、治療的利益は、患者がまた、根本的障害に悩まされている可能性があるにもかかわらず、改善が患者において観察されるように、根本的障害に関連する生理学的症状の１又は２以上の症状の根絶又は改善により達成される。予防的利益に関しては、たとえこの患者の診断がなされていなくても、特定の疾患を発症する危険性のある患者に、又は疾患の１又は２以上の生理学的症状を報告する患者に治療が起こされ得る。
【０１２３】
本明細書において及び本開示を通して使用されるような用語「又は（ｏｒ）」は、特にことわらない限り、一般的に「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）を意味する。
【０１２４】
本明細書において使用される場合、用語「循環ｍｉＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲＮＡ）」とは、体液は従来、循環系の一部であると考えられているにもかかわらず、体液中の任意のＲＮＡを言及する。例えば「循環ｍｉＲＮＡ」は、対象の血液に存在するｍｉＲＮＡを包含し、そしてまた、対象の唾液、尿又は他の体液に存在するｍｉＲＮＡを包含する。
【０１２５】
範囲：この開示を通して、本開示の種々の側面が範囲の形式で提供され得る。範囲形式での記載は、単に便宜上及び簡単のためであり、そして本開示に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を特異的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６のような部分範囲、及び例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６の範囲内の個々の数を特異的に開示していると考えられるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０１２６】
説明
１つの側面によれば、本開示は、子宮内膜症と循環ｍｉＲＮＡの変化との間の関連の発見に関する。いくつかの実施形態によれば、循環ｍｉＲＮＡのレベルは、単独で及び従来の子宮内膜症血清マーカーと組合して、子宮内膜症検出を改善するために使用される。例示的な実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−１８、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−６７５５、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８及びその任意の組合せから成る群から選択される。例示的な実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４−３ｐ、 ｍｉＲ−１２６−３ｐ、 ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐ及びその任意の組合せから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも２つである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２及び ｍｉＲ−３６１３。 いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ及び ｍｉＲ−３６１３−５ｐ。 いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。いくつかの場合、本開示のｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ｂを含む。
【０１２７】
１つの側面によれば、本方法は一般的に、患者サンプル中の循環ｍｉＲＮＡのパターンの検出、測定及び比較を提供する。他の側面によれば、本方法は一般的に、体液（例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿）のサンプルに存在するｍｉＲＮＡのパターンの検出、測定及び比較を提供する。子宮内膜症においては、罹患細胞に接近することはしばしば困難である。従って、比較的非侵襲性の方法、例えば採血又は唾液の収集を用いて子宮内膜症を検出する方法は、非常に有益であろう。種々の実施形態によれば、本方法は、肝疾患を有する患者の血漿中のｍｉＲＮＡのレベルを決定することにより癌診断の問題を克服する。対照サンプル中の対応するｍｉＲＮＡ遺伝子生成物のレベルに対する、対象から得られたサンプル中のｍｉＲＮＡ遺伝子生成物のレベルの変化（すなわち、上昇又は低下）は、対象における子宮内膜症の存在を示す。 いくつかの実施形態によれば、試験サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ遺伝子生成物のレベルは、対照サンプル中のその対応するｍｉＲＮＡ遺伝子生成物のレベルよりも高い。別の実施形態によれば、試験サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ遺伝子生成物のレベルは、対照サンプル中のその対応するｍｉＲＮＡ遺伝子生成物のレベルよりも低い。
【０１２８】
追加の診断マーカーが、疾患の有無又は病期を予測するためのモデルを構築するために、循環ｍｉＲＮＡレベルと組合わされ得る。例えば、子宮内膜症の診断に関連する臨床因子は、患者の病歴、身体診察、及び他のバイオマーカーを包含するが、但しそれらだけに限定されない。子宮内膜症の診断はまた、症状のタイプ、症状の程度を包含する患者の症状により知られ得る。
【０１２９】
一般的に、本開示の方法は、患者からの血液又は血清において示差的に発現される（アップ又はダウンレギュレートされる）バイオマーカーの発現レベルを検出することによって、子宮内膜症の診断又は予後診断を提供するために使用される。それらのマーカーは、子宮内膜症の段階又は重症度を区別するために使用され得る。それらのマーカーは、子宮内膜症を有する患者の治療過程のための予後を提供するためにも使用され得る。同様に、それらのマーカーは、子宮内膜症を有する患者における不妊症を診断するために、又は子宮内膜症に罹患している患者における不妊試験の予後を提供するために使用され得る。本開示のバイオマーカー、子宮内膜症の診断又は予後のために単独で、又は組合して使用され得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、本開示の方法は、子宮内膜症に罹患する患者に治療を割り当てる際に使用される。本明細書に見出されるバイオマーカーの発現レベルを検出することにより、適切な治療が、子宮内膜症に罹患する患者に割り当てられ得る。それらの治療は、ホルモン療法、化学療法、免疫療法及び外科的療法を含むが、但しそれらだけには制限されない。同様に、本開示の方法は、子宮内膜症のために受胎能力が低下した患者に治療を割り当てるために使用され得る。このようにして、本明細書中に見出されるバイオマーカーの検出を通して、患者の受胎能力が低下した程度を決定することにより、適切な治療が割り当てられ得る。関連治療は、ホルモン療法、化学療法、免疫療法／及び外科的療法を包含するが、但しそれらだけには制限されない。
【０１３１】
使用のための１又は２以上のマーカーを含む診断及び予後キットが本明細書に提供される。同定された遺伝子サブセットのいずれか１つに見出されるマーカーの発現レベル又は活性を調節することによって、子宮内膜症又は子宮内膜症により引起された生殖能力低下を予防し又は治療することができる化合物を同定するための方法がまた、本開示により提供される。子宮内膜症又は子宮内膜症により引起される生殖能力低下が本開示のマーカーを標的とする剤を用いて治療される治療方法が提供される。
【０１３２】
種々の実施形態によれば、本開示の方法は、子宮内膜症を有するか又は発症する対象の危険性を評価する方法、患者の子宮内膜職を評価する方法、子宮内膜症の診断方法、子宮内膜症を特徴付ける方法、及び臨床試験における子宮内膜症を有する対象を層別化する方法に関する。
【０１３３】
本明細書に記載される本開示の組成物及び方法の種々の実施形態によれば、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡは、以下のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである：ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−１８、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−６７５５、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８。ｍｉＲＮＡファミリーメンバーの配列は、ｍｉＲＢａｓｅ（www. Mirbase.org）から公的に入手可能である。 いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡは、以下のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、又は以下のｍｉＲＮＡの１つをさらに含む：ｌｅｔ−７、ｌｅｔ−７ａ、 ｌｅｔ−７ｂ、 ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｃ、 ｌｅｔ−７ｄ、 ｌｅｔ−７ｅ、 ｌｅｔ−７ｆ又はｌｅｔ−７ｇ。 いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも２つである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、 ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。 いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ, ｍｉＲ−４５１ａ及び ｍｉＲ−３６１３−５ｐ。 いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。
【０１３４】
本明細書に記載される本開示の組成物及び方法の種々の実施形態によれば、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡは、以下のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４−３ｐ、 ｍｉＲ−１２６−３ｐ、 ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐ。ｍｉＲＮＡファミリーメンバーの配列は、ｍｉＲＮＡ(www.mirbase.org）から公的に入手可能である。
【０１３５】
いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、以下の１又は２以上を含む：ｍｉＲ−１２５、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−１８ａ、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−６７５５、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−５５３及び ｍｉＲ−４６６８。 いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症の診断のために有用な本開示のバイオマーカーは、以下の１又は２以上を含む：ｍｉＲ−１２５ｂ、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−１８、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−６７５５、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８。 いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症を診断するために有用な本開示のバイオマーカーは、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−４５１及びｍｉＲ−３６１３の組合せを含む。さらなる実施形態によれば、子宮内膜症を診断するために有用なバイオマーカーは、さらに、以下の１又は２以上を含む：ｌｅｔ−７、 ｌｅｔ−７ａ、 lｅｔ−７ｂ、 ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｃ、  ｌｅｔ−７ｄ、 ｌｅｔ−７ｅ、 ｌｅｔ−７ｆ又は ｌｅｔ−７ｇ。いくつかの特定の場合、バイオマーカーはさらに、ｌｅｔ−７ｂを含む。いくつかの特定の場合、 、バイオマーカーはさらに、lｅｔ−７ｂを含む。いくつかの実施形態によれば、バイオマーカーは以下の少なくとも２つを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。 いくつかの実施形態によれば、バイオマーカーは、以下の少なくとも１つの以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐ。 いくつかの実施形態によれば、バイオマーカーは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２及び ｍｉＲ−３６１３。いくつかの場合、バイオマーカーはさらにｍｉＲ−４５１を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、以下の１又は２以上を含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４−３ｐ、 ｍｉＲ−１２６−３ｐ、 mｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐ。 いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症を診断するために有用な本開示のバイオマーカーは、以下の１又は２以上を含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４−３ｐ、 ｍｉＲ−１２６−３ｐ、 ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、 ｍｉＲ−５５３及び ｍｉＲ−４６６８−３ｐ。好ましい実施形態によれば、子宮内膜症を診断するために有用な本開示のバイオマーカーは、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ 及び ｍｉＲ−３６１３−５ｐの組合せを含む。 いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症の診断のために有用なバイオマーカーは、以下の少なくとも１つを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。 いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症の診断のために有用なバイオマーカーは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐ。 いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症の診断のために有用なバイオマーカーは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてを含む：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。いくつかの場合、それらはさらに、ｍｉＲ−４５１を含む。いくつかの場合、それらはさらに、ｌｅｔ−７ｂを含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、通常レベルよりも低いレベルでダウンレギュレートされるか、又は発現される子宮内膜症に関連する１又は２以上のｍｉＲＮＡである。例えば、ｍｉＲ−６７５５、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８が、子宮内膜症を有する対象において、通常レベルよりも低いレベルでダウンレギュレートされるか、又は発現されることが、本明細書に記載される。従って、特定の実施形態によれば、本開示は、ｍｉＲ−６７５５、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８の少なくとも１つの低められたレベルの検出に基いて、それを必要とする対象における子宮内膜症の診断、評価及び特徴付けのために有用な組成物及び方法に関する。
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、通常レベルよりも低いレベルでダウンレギュレートされるか、又は発現される、子宮内膜症に関連する１又は２以上のｍｉＲＮＡである。例えば、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐが子宮内膜症を有する対象において通常レベルよりも低いレベルで、ダウンレギュレートされるか、又は発現されることが本明細書に記載される。従って、特定の実施形態によれば、本開示は、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ, ｍｉＲ３６１３−５ｐ, ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐの少なくとも１つの低められたレベルの検出に基いて、それを必要とする対象における子宮内膜症の診断、評価及び特徴付けのために有用な組成物及び方法に関する。
【０１３９】
いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、通常レベルよりも高いレベルでアップレギュレートされるか、又は発現される、子宮内膜症に関連する１又は２以上のｍｉＲＮＡである。例えば、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２１４及びｍｉＲ−１２６が子宮内膜症を有する対象において通常レベルよりも高いレベルで、アップレギュレートされるか、又は発現されることが本明細書に記載される。従って、特定の実施形態によれば、本開示はｍｉＲ−１２５、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−１８、 ｍｉＲ−２１４及びｍｉＲ−１２６の少なくとも１つの高められたレベルの検出に基いて、それを必要とする対象における子宮内膜症の診断、評価及び特徴付けのために有用な組成物及び方法に関する。いくつかの場合、以下のｍｉＲＮＡの１又は２以上が、子宮内膜症を有する対象において、正常レベルよりも高いレベルでアップレギュレートされるか、又は発現される：ｌｅｔ−７、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ又はｌｅｔ−７ｇ。
【０１４０】
いくつかの実施形態によれば、本開示のバイオマーカーは、通常レベルよりも高いレベルでアップレギュレートされるか、又は発現される、子宮内膜症に関連する１又は２以上のｍｉＲＮＡである。例えば、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ及び ｍｉＲ−１２６−３ｐが子宮内膜症を有する対象において通常レベルよりも高いレベルで、アップレギュレートされるか、又は発現されることが本明細書に記載される。従って、特定の実施形態によれば、本開示はｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ及びｍｉＲ−１２６−３ｐの少なくとも１つの高められたレベルの検出に基いて、それを必要とする対象における子宮内膜症の診断、評価及び特徴付けのために有用な組成物及び方法に関する。
【０１４１】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、子宮内膜症のマーカーの検出方法を提供する。 いくつかの実施形態によれば、本開示は、治療に応答してｍｉＲＮＡのレベルをモニターリングするための方法を提供する。 いくつかの実施形態によれば、本開示は、治療の後、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４−３ｐ、 ｍｉＲ−１２６−３ｐ、 ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐの少なくとも１つをモニターするための方法を提供する。 いくつかの実施形態によれば、本開示は、子宮内膜症の治療の後、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐ又はその任意の組合せのレベルをモニターするための方法を提供する。 いくつかの実施形態によれば、本開示は、しばしば、本明細書に提供される別のｍｉＲＮＡに加えて、ｌｅｔ−７、 ｌｅｔ−７ａ、 ｌｅｔ−７ｂ、 ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｃ、 ｌｅｔ−７ｄ、 ｌｅｔ−７ｅ、 ｌｅｔ−７ｆ又はｌｅｔ−７ｇのレベルをモニターするための方法を提供する。 いくつかの実施形態によれば、モニターされたｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも２つである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２及び ｍｉＲ−３６１３。 いくつかの実施形態によれば、モニターされたｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下の全てである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐ。 いくつかの実施形態によれば、モニターされたｍｉＲＮＡは、以下の少なくとも１つ、以下の少なくとも２つ、又は以下のすべてである：ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、 ｌｅｔ−７ｂ、 ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２及びｍｉＲ−３６１３。
【０１４２】
いくつかの場合、本方法は、以下のｍｉＲＮＡの少なくとも１つのレベルを測定することによる子宮内膜症の診断を含むことができる：ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、 ｌｅｔ−７ｃ、 ｌｅｔ−７ｃ、 ｌｅｔ−７ｄ、 ｌｅｔ−７ｅ、 ｌｅｔ−７ｆ及びｌｅｔ−７ｇ。いくつかの場合、本方法は、以下のｍｉＲＮＡの少なくとも２つのレベルを測定することによる子宮内膜症の診断を含むことができる：ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、 ｌｅｔ−７ｃ、 ｌｅｔ−７ｃ、 ｌｅｔ−７ｄ、 ｌｅｔ−７ｅ、 ｌｅｔ−７ｆ及びｌｅｔ−７ｇ。いくつかの場合、本方法は、以下のｍｉＲＮＡの少なくとも３つのレベルを測定することによる子宮内膜症の診断を含む：ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、 ｌｅｔ−７ｃ、 ｌｅｔ−７ｃ、 ｌｅｔ−７ｄ、 ｌｅｔ−７ｅ、 ｌｅｔ−７ｆ及びｌｅｔ−７ｇ。
【０１４３】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、表１に列挙されるｍｉＲＮＡの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも１０を検出するための方法を提供する。 いくつかの実施形態によれば、本開示は、表１に列挙される配列の少なくとも１つに対して、少なくとも ５０％、少なくとも ５５％、 少なくとも ６０％、 少なくとも ６５％、 少なくとも ７０％、 少なくとも ７５％、 少なくとも ８０％、 少なくとも ８５％、 少なくとも ９０％又は少なくとも １００％の相同性を有する核酸を検出するための方法を提供する。
【０１４４】
【表１】
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【０１４５】
従って、本開示は、しばしば、比較的高い感度を有する、子宮内膜症のマーカーを検出するための新規で且つ便利なプラットフォームを提供することができる。いくつかの実施形態によれば、本開示のシステムは、少なくとも８０％の感度、好ましくは少なくとも ９０％、好ましくは少なくとも ９１％、好ましくは少なくとも ９２％、好ましくは少なくとも ９３％、好ましくは少なくとも ９４％、好ましくは少なくとも ９５％、好ましくは少なくとも ９６％、好ましくは少なくとも ９７％、好ましくは少なくとも ９８％、好ましくは少なくとも ９９％、好ましくは少なくとも １００％の感度で、子宮内膜症のマーカーを検出するためのプラットフォームを提供する。
【０１４６】
いくつかの実施形態によれば、本開示のシステムは、子宮内膜症のマーカーを検出するためのプラットフォームを提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示のシステムは、少なくとも８０％の特異性、好ましくは少なくとも ９０％、好ましくは少なくとも ９１％、好ましくは少なくとも ９２％、好ましくは少なくとも ９３％、好ましくは少なくとも ９４％、好ましくは少なくとも ９５％、好ましくは少なくとも ９６％、好ましくは少なくとも ９７％、好ましくは少なくとも ９８％、好ましくは少なくとも ９９％、好ましくは少なくとも １００％の特異性で、子宮内膜症のマーカーを検出するためのプラットフォームを提供する。
【０１４７】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、少なくとも９０％、９１％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％、 １００％の感度；少なくとも９０％、９１％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％、 １００％の特異性；又は少なくとも９０％、９１％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％、 １００％の感度及び特異性で、子宮内膜症のマーカーを検出するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、少なくとも９０％、９１％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％、 １００％の精度で、子宮内膜症のマーカーを検出するためのシステムを提供する。
【０１４８】
従って、本開示は、しばしば、比較的高い感度で、子宮内膜症の１又は２以上のマーカーを検出するための新規で且つ便利な方法を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、本方法は、少なくとも８０％の感度、好ましくは少なくとも ９０％、好ましくは少なくとも ９１％、好ましくは少なくとも ９２％、好ましくは少なくとも ９３％、好ましくは少なくとも ９４％、好ましくは少なくとも ９５％、好ましくは少なくとも ９６％、好ましくは少なくとも ９７％、好ましくは少なくとも ９８％、好ましくは少なくとも ９９％、好ましくは少なくとも １００％の感度で、子宮内膜症を検出するか又は診断する。
【０１４９】
いくつかの実施形態によれば、本開示の方法は、少なくとも８０％の特異性、好ましくは少なくとも ９０％、好ましくは少なくとも ９１％、好ましくは少なくとも ９２％、好ましくは少なくとも ９３％、好ましくは少なくとも ９４％、好ましくは少なくとも ９５％、好ましくは少なくとも ９６％、好ましくは少なくとも ９７％、好ましくは少なくとも ９８％、好ましくは少なくとも ９９％、好ましくは少なくとも１００％の特異性で、子宮内膜症を検出する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、少なくとも９０％、９１％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％、 １００％の感度；少なくとも９０％、９１％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％、 １００％の特異性；又は少なくとも９０％、９１％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％、 １００％の感度及び特異性で、子宮内膜症を検出するか又は診断するための方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、少なくとも９０％、９１％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％、 １００％の精度で、子宮内膜症を診断する方法を提供する。
【０１５０】
サンプルの調製
無細胞体液の試験サンプル又は細胞含有サンプルは、個体又は患者から得られる。試験サンプルを得る方法は、当業者に周知であり、そして吸引、又は血液又は他の流体の吸引を含むが、但しそれらだけには限定されない。サンプルは、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、心膜液、胸水、尿、及び眼球液を含むが、但しそれだけには限定されない。試験サンプルが細胞を含むいくつかの実施形態によれば、細胞は、無細胞体液を生成するために、当業者において公知の方法（例えば、遠心分離）によりサンプルの液体部分から除去され得る。適切な実施形態によれば、血清又は血漿が、無細胞体液サンプルとして使用される。血漿及び血清は、当業者において公知の適切な方法を用いて、全血から調製され得る。それらの実施形態によれば、データは、無細胞体液の体積により標準化され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態によれば、唾液の試験サンプルは、対象から得られる、唾液サンプルの採取方法は、対象の口からの強制排出（例えば、吐き出し）、吸引、綿棒又は他の収集ツールによる除去、又は当業界において公知の任意の他の方法を含むが、但しそれらだけには限定されない。本明細書において使用される場合、用語「唾液」とは、痰は粘液又は痰サンプルに関連するので、痰を含まない。いくつかの実施形態によれば、唾液は当業者において知られている方法（例えば、遠心分離）により細胞及び非細胞画分に分離され得る。いくつかの実施形態によれば、核酸は、細胞又は非細胞画分から抽出され得る。
【０１５２】
細胞含有サンプルのサンプル調製における変動性は、例えばタンパク質含有量又は細胞数によりデータを標準化することにより補正され得る。特定の実施形態によれば、サンプルは、サンプル中の総タンパク質含有量に対して標準化され得る。サンプル中の総タンパク質含有量は、標準方法、限定されないが、Bradfordアッセイ及びLowry法を用いて決定され得る。他の実施形態によれば、サンプルは、細胞数に対して標準化され得る。
【０１５３】
アッセイ
本開示は、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルが子宮内膜症の存在、発症、進行及び重症度と関連しているという発見に関する。種々の実施形態によれば、本開示は、対象における子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現のレベルを決定するために対象の遺伝子スクリーニングアッセイに関する。本開示は、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを評価する方法、並びに子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現のレベルに基いて子宮内膜症を有するとして、又は発症する危険性があるとして対象を診断する方法に関する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される診断アッセイは、インビトロアッセイである。
【０１５４】
いくつかの実施形態によれば、本開示の方法は、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが対象から採取された生物学的サンプルにおいて低められるかどうかを決定することにより、それを必要とする対象における子宮内膜症の存在、発生、進行及び重症度を評価するための診断アッセイである。種々の実施形態によれば、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが対象から採取された生物学的サンプルにおいて低められるかどうかを決定するために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが、少なくとも１つの比較対照のレベル、例えば陽性対照、陰性対照、正常対照、野生型コントロール、歴史的対照、歴史的規範、又は生物学的サンプルにおける別の参照分子のレベルと比較される。いくつかの実施形態によれば、本開示の診断アッセイは、インビトロアッセイである。他の実施形態によれば、本開示の診断アッセイは、インビボアッセイである。アッセイにより同定されたｍｉＲＮＡは、子宮内膜症に関連する任意のｍｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−１８、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−６７５５、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８の少なくとも１つである。アッセイにより同定されたｍｉＲＮＡは、子宮内膜症に関連する任意のｍｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４−３ｐ、 ｍｉＲ−１２６−３ｐ、 ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、 MIR−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐの少なくとも１つである。本開示の種々の実施形態によれば、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ、少なくとも３つのｍｉＲＮＡ、少なくとも４つのｍｉＲＮＡ、少なくとも５つのｍｉＲＮＡ、少なくとも６つのｍｉＲＮＡ、少なくとも７つのｍｉＲＮＡ、少なくとも８つのｍｉＲＮＡである。診断アッセイの結果は、単独で、又は対象からの他の情報、又は対象から採取された生物学的サンプルからの他の情報と組合して、使用され得る。
【０１５５】
本開示のアッセイの種々の実施形態によれば、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが、比較対対照に比較される場合、少なくとも １０％、少なくとも ２０％、 少なくとも ３０％、 少なくとも ４０％、 少なくとも ５０％、 少なくとも ６０％、 少なくとも ７０％、 少なくとも ８０％、 少なくとも ９０％、 少なくとも １００％、 少なくとも １２５％、 少なくとも １５０％、 少なくとも １７５％、 少なくとも ２００％、 少なくとも ２５０％、 少なくとも ３００％、 少なくとも ４００％、 少なくとも ５００％、 少なくとも ６００％、 少なくとも ７００％、 少なくとも ８００％、 少なくとも ９００％、 少なくとも １０００％、 少なくとも １５００％、 少なくとも ２０００％又は少なくとも ５０００％、低められる場合、ダウンレギュレートされることが決定される。
【０１５６】
本開示のアッセイの種々の実施形態によれば、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが、比較対対照に比較される場合、少なくとも １０％、少なくとも ２０％、 少なくとも ３０％、 少なくとも ４０％、 少なくとも ５０％、 少なくとも ６０％、 少なくとも ７０％、 少なくとも ８０％、 少なくとも ９０％、 少なくとも １００％、 少なくとも １２５％、 少なくとも １５０％、 少なくとも １７５％、 少なくとも ２００％、 少なくとも ２５０％、 少なくとも ３００％、 少なくとも ４００％、 少なくとも ５００％、 少なくとも ６００％、 少なくとも ７００％、 少なくとも ８００％、 少なくとも ９００％、 少なくとも １０００％、 少なくとも １５００％、 少なくとも ２０００％又は少なくとも ５０００％、高められる場合、アップレギュレートされることが決定される。
【０１５７】
本開示のアッセイの種々の実施形態によれば、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが、比較対照に比較して、少なくとも １．５−倍、少なくとも ２−倍、 少なくとも ３−倍、 少なくとも ５−倍、 少なくとも １０−倍、 少なくとも ２５−倍、 少なくとも ５０−倍、 少なくとも １００−倍、 少なくとも １５０−倍、 少なくとも ２００−倍又は少なくとも ５００−倍、低められる場合、ダウンレギュレートされていると決定される。  本開示のアッセイの種々の実施形態によれば、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが、比較対照に比較して、少なくとも １．５−倍、少なくとも ２−倍、 少なくとも ３−倍、 少なくとも ５−倍、 少なくとも １０−倍、 少なくとも ２５−倍、 少なくとも ５０−倍、 少なくとも １００−倍、 少なくとも １５０−倍、 少なくとも ２００−倍又は少なくとも ５００−倍、高められる場合、アップレギュレートされていると決定される。
【０１５８】
本開示のアッセイ方法によれば、対象からの試験生物学的サンプルは、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルについてアッセイされる。試験生物学的サンプルは、インビトロサンプル又はインビボサンプルであり得る。種々の実施形態によれば、対象はヒト対象であり、そして任意の人種、性別及び年齢のものであり得る。代表的な対象は、子宮内膜症の疑いのある人、子宮内膜症と診断されている人、子宮内膜症を有する人、子宮内膜症を患ったことのある人、子宮内膜症の再発の危険性のある人、及び子宮内膜症の発症の危険性のある人を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症関連のｍｉＲＮＡ結合分子は、子宮内膜症の診断のためにインビボで使用される。いくつかの実施形態によれば、子宮内膜症関連のｍｉＲＮＡ結合分子は、本開示の子宮内膜症関連のｍｉＲＮＡとハイブリダイズする核酸である。
【０１６０】
いくつかの実施形態によれば、試験サンプルは、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡを含む核酸のフラグメントを少なくとも含むサンプルである。用語「フラグメント（fragment）」とは、本明細書において使用される場合、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡを含むとしてそれを同定するのに十分である核酸の部分（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を示す。
【０１６１】
いくつかの実施形態によれば、試験サンプルには、対象から採取された生物学的サンプルから調製される。生物学的サンプルは、子宮内膜症関連のｍｉＲＮＡを含む核酸を含む任意の源、例えば体液（例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、等）、又は組織、又はエキソソーム、又は細胞、又はそれらの組合せであり得る。生物学的サンプルは、例として、生検又は体液採取などの適切名方法により得ることができる。生物学的サンプルは、試験サンプルとして使用され得；他方では、生物学的サンプルは、ポリペプチド、核酸、又は核酸のコピー（例えば、子宮内膜症に関連するｍｉＲＭＡを含む核酸のコピー）へのアクセスを増強するために処理され得、そして処理された生物学的サンプルは、試験サンプルとして使用され得る。例えば、種々の実施形態によれば、核酸は、本方法に使用するために、生物学的サンプルから調製される。他方では、又はさらに、所望により、増幅方法が、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの発現レベルの評価に試験サンプルとして使用するために、生物学的サンプル中の核酸のすべて又はフラグメントを含む核酸を増幅するために使用され得る。
【０１６２】
試験サンプルが、対象の核酸に存在する子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現のレベルを決定するために評価される。一般的に、ｍｉＲＮＡの検出は、試験サンプルにおける目的のｍｉＲＮＡを含む核酸の存在又は非存在を決定することにより実施され得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態によれば、ハイブリダイゼーション法、例えばノーザン分析、又はインサイチューハイブリダイゼーションが使用され得る（Current Protocols in Molecular Biology, 2012, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons（すべてのサプリメントを含む）を参照のこと）。例えば、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡの存在は、核酸プローブへのハイブリダイゼーションにより示され得る。「核酸プローブ（ｎucleic acid probe）」とは、本明細書において使用される場合、核酸プローブ、例えばＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブであり得る。核酸プローブの使用の代表的例については、例えば米国特許第５，２８８，６１１号及び第４，８５１，３３０号を参照のこと。
【０１６４】
目的の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出するために、ハイブリダイゼーションサンプルが、試験サンプルと、少なくとも１つの核酸プローブとを接触させることにより形成される。ｍｉＲＮＡを検出するための好ましいプローブは、ｍｉＲＮＡにハイブリダイズできる標識された核酸プローブである。例えば、核酸プローブは、全長核酸分子、又はその一部、例えば適切なｍｉＲＮＡに緊縮条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分で、且つ少なくとも１０、１５、又は２５の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり得る。ハイブリダイゼーションサンプルは、目的のｍｉＲＮＡ標的への核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分である条件下で維持される。特異的ハイブリダイゼーションは、適切な場合、高い緊縮条件又は中程度の緊縮条件下で実施され得る。好ましい実施形態によれば、特異的ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は、高い緊縮性である。存在するなら、特異的ハイブリダイゼーションは、標準方法を用いて検出される。特異的ハイブリダイゼーションが試験サンプルにおける核酸プローブとｍｉＲＮＡとの間で生じる場合、核酸プローブに存在する配列もまた、対象のｍｉＲＮＡに存在する。２つ以上の核酸プローブがまた、この方法に同時に使用され得る。核酸プローブのうちいずれか１つの特異的ハイブリダイゼーションが、本明細書に記載されるように、目的のｍｉＲＮＡの存在を示す。
【０１６５】
他方では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブが、本明細書に記載されるハイブリダイゼーション法において、核酸プローブの代わりに使用され得る。ＰＮＡは、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に結合される有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ）を有する、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位などのペプチド様無機骨格を有するＤＮＡ模倣体である（例えば、1994, Nielsen et al., Bioconjugate Chemistry 5:1を参照のこと）。ＰＮＡプローブは、目的の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む核酸配列に特異的にハイブリダイズするよう企画され得る。核酸配列へのＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、目的のｍｉＲＮＡの存在を示す。
【０１６６】
直接的な配列分析がまた、目的のｍｉＲＮＡを検出するために使用され得る。核酸を含むサンプルが使用され得、そして必要に応じて、ＰＣＲ又は他の適切な方法が、核酸の全部又はフラグメント及び／又はそのフランキング配列を増幅するために使用され得る。
【０１６７】
別の実施形態によれば、対象からの標的核酸配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイが、子宮内膜症に関連するｍｉＲＮＡを検出し、同定し、そして定量化するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドアレイが使用され得る。オリゴヌクレオチドアレイは典型的には、異なる既知の位置での支持体の表面にカップリングされる複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。「Genechips」としても知られているそれらのオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、及びＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９０／１５０７０号及び９２／１００９２号に、一般的に記載されている。それらのアレイは一般的に、フォトリソグラフィー法及び固相オリゴヌクレオチド合成法の組合せを組込む機械的合成法又は光指向性合成法を用いて製造される。Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991), Pirrung et al., 米国特許第５，１４３，８５４号 (またＰＣＴ 出願番号 ＷＯ ９０/１５０７０も参照のこと) 及び Fodor et al., ＰＣＴ 出願番号ＷＯ ９２/１００９２及び米国特許第５，４２４，１８６号を参照のこと。機械的合成法を用いてのそれらのアレイの合成技法は、例えば米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。
【０１６８】
オリゴヌクレオチドアレイが調製された後、ｍｉＲＮＡを含むサンプルが、そのアレイによりハイブリダイズされ、そしてｍｉＲＮＡについてスキャンされる。ハイブリダイゼーション及びスキャニングは一般的に、本明細書に記載される方法により、及びまた、例えば国際公開出願番号ＷＯ ９２/１００９２及び ＷＯ ９５/１１９９５、及び米国特許第５，４２４，１８６号（その全教示は参照により本明細書に組込まれる）にも記載される方法により実施される。
【０１６９】
要するに、標的ｍｉＲＮＡ配列は、周知の増幅技法、例えばＲＴ、ＰＣＲにより増幅される。典型的には、これは、標的ｍｉＲＮＡに対して相補的であるプライマー配列の使用を包含する。一般的に標識を組み込んでいる増幅された標的は、次に、適切な条件下でアレイによりハイブリダイズされる。アレイのハイブリダイゼーション及び洗浄の完結の後、アレイは、標的配列がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定するためにスキャンされる。そのスキャンから入手されるハイブリダイゼーションのデータは、典型的には、アレイ上の位置の関数とし蛍光強度の形で存在する。
【０１７０】
他の核酸分析法が、目的のｍｉＲＮＡを検出するために使用され得る。代表的な方法は、以下を包含する：直接手動的配列決定（1988, Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995; 1977, Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467; Beavis et al. 米国特許第５，２８８，６４４号）；自動蛍光配列決定；一本鎖高次構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ）；クランプ変性グル電気泳動（ＣＤＧＥ）；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＣＥ）（(Sheffield et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232-236）；移動度シフト分析（Orita et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770; Rosenbaum and Reissner, 1987, Biophys. Chem. 265:1275; 1991, Keen et al., Trends Genet. 7:5）；ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Myers, et al., 1985, Science 230:1242）；Luminex xMAP（登録商標 ）技法; 高スループット配列決定(ＨＴＳ) (Gundry and Vijg, 2011, Mutat Res, doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.001); 次世代配列決定(ＮＧＳ) (Voelkerding et al., 2009, Clinical Chemistry 55:641-658; Su et al., 2011, Expert Rev Mol Diagn. 11:333-343; Ji and Myllykangas, 2011, Biotechnol Genet Eng Rev 27:135-158); 及び/又はイオン半導体配列決定 (Rusk, 2011, Nature Methods doi:10.1038/nmeth.f.330; Rothberg et al., 2011, Nature 475:348-352)。それらの及び他の方法は、単独で又は組合して、対照から採取された生物学的サンプルにおける目的の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを検出し、そして定量化するために使用され得る。本開示のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるように、目的のｍｉＲＮＡを検出及び定量化するための生物学的サンプルの評価方法は、それを必要とする対象における子宮内膜症の診断、評価及び特徴付けに使用される。
【０１７１】
いくつかの実施形態によれば、配列決定は、次世代配列決定アッセイを用いて実施され得る。本明細書において使用される場合、用語「次世代（next generation）」とは、当業界において良く理解されており、そして一般的に、任意の高スループット配列決定アプローチを言及し、それは以下の１つ又は２つ以上を包含するが、但しそれらだけには限定されない：大規模並列シグネチャー配列決定、パイロシーケンシング（例えば、Ｒｏｃｈｅ４５４配列決定装置を用いる）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、合成による配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、イオントレント配列決定、連結による配列決定（例えば、ＳＯＬＩＤ配列決定）、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ポロニル配列決定、ＤＮＡナルボール配列決定、ヘリスコープ単一分子配列決定（Ｈｅｌｉｃｏｓ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びナノポア配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎoｐｏｒｅ）。いくつかの場合、配列決定アッセイは、ナノポア配列決定を使用する。いくつかの場合、配列決定アッセイは、ナノポア配列決定を使用する。いくつかの場合、配列アッセイは、何らかの形のＳａｎｇｅｒ配列決定を含む。いくつかの場合、配列決定は、ショットガン配列決定を含み；いくつかの場合、配列決定は、ブリッジＰＣＲを含む。いくつかの場合、配列決定は広域スペクトルである。いくつかの場合、配列決定は標的とされる。
【０１７２】
本開示のプローブ及びプライマーは、検出可能な及び／又は定量可能なシグナルを得るために、当業者に周知の方法により、放射性又は非放射性化合物により、直接的又は間接的に標識され得；本開示のプライマー又はプローブの標識は放射性元素又は放射性分子により実施される。使用される放射性同位体の中で、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ又は３Ｈを挙げることができる。非放射性物質は、リガンド、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はジゴキシゲニン、パプテン、染料、及び発光剤、例えば放射線発光剤、化学発光剤、生物発光剤、蛍光剤又はリン光剤が選択される。
【０１７３】
核酸は、既知技法を用いて、生物学的サンプルから得られる。本明細書においては、核酸は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、等を含むＲＮＡを包含する。核酸は、二本鎖又は一本鎖（すなわち、センス又はアンチセンス一本鎖）であり得、そしてポリペプチドをコードする核酸に対して相補的でもあり得る。核酸含有量はまた、新鮮な又は固定された生物学的サンプルに対して行われる抽出から得られても良い。
【０１７４】
特定の核酸配列を検出するための当業界において公知の多くの方法があり、そして新規方法が継続的に報告されている。既知の特定の核酸検出方法の大多数は、特定のハイブリダイゼーション反応において核酸プローブを利用する。
【０１７５】
ノーザンブロックにおいては、核酸プローブは、好ましくはタグにより標識される。そのタグは、放射性同位体、蛍光染料又は他の周知の材料であり得る。当業界において公知の身体サンプル中の外因性生物の核酸の特異的検出のための別の種類の方法は、米国特許第６，１５９，６９３号及び第６，２７０，９７４号、及び関連特許により例示されるようなハイブリダイゼーション方法である。それらの方法のうち１つを簡単に要約すると、目的の標的核酸の所望する領域に対して相補的な配列を有する、少なくとも１０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２５個のヌクレオチドの核酸プローブが、サンプルにおいてハイブリダイズされ、解重合条件にゆだねられ、そしてサンプルが、核酸配列が存在するなら、ルミネセンスであろう、ＡＴＰ／ルシフェラーゼシステムにより処理される。定量的なノーザンブロットにおいては、多型核酸のレベルが核酸の野生型レベルと比較され得る。
【０１７６】
ハイブリダイズされた核酸の検出のためのさらなる方法は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲ方法は、当業者において周知である（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号）。ＰＣＲを簡単に要約すると、核酸増幅標的核酸配列の反対鎖に対して相補的な核酸プライマーが、変性サンプルにアニーリングされる。ＤＮＡポリメラーゼ（典型的には、熱安定性）が、ハイブリダイズしたプライマーからＤＮＡ二本鎖を伸長する。この工程が反復され、核酸標的が増幅される。核酸プライマーがサンプルにハイブリダイズしない場合、対応する増幅されたＰＣＲ生成物は存在しない。
【０１７７】
ＰＣＲにおいては、核酸プローブは、前述のようにタグにより標識され得る。最も好ましくは、二本鎖の検出は、標的核酸に向けられた少なくとも１つのプライマーを用いて行われる。ＰＣＲのさらに別の実施形態によれば、ハイブリダイズされた二本鎖の検出は、電気泳動ゲルに分離、続く染料に基く可視化を含む。
【０１７８】
ＰＣＲによる核酸増幅手順は、周知であり、そして米国特許４，６８３，２０２号に記載されている。簡単には、プライマーは、互いに異なる部位で及び反対方向に標的核酸にアニーリングする。標的配列にアニーリングされたプライマーは、熱安定性ポリメラーゼの酵素作用により伸長される。次に、伸長生成物が加熱により、標的配列から変性され、そしてこの工程が反復される。両鎖についてのこの手順の連続的循環が、プライマーが隣接する領域の指数関数的増幅をもたらす。
【０１７９】
次に、増幅が、ＰＣＲ型技術、すなわちＰＣＲ技法又は他の関連する任意の技法を用いて行われる。次に、標的核酸配列に対して相補的な２つのプライマーが、ポリメラーゼと共に核酸内容物に添加され、そしてポリメラーゼが、プライマー間のＤＮＡ領域を増幅する。
【０１８０】
増幅は、核酸配列のコピー数を増加させるための任意の方法を意味する。例えば、増幅は、例えば１又は２以上のポリメラーゼ鎖反応において、ポリメラーゼにより行われ得る。増幅は、当業界において周知の方法を用いて実施され得る。それらの方法は、核酸又はその相補体の複数のコピーの生成物触媒形成にしばしば依存する。そのような方法の１つは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）であり、以下を含む：ＡＦＬＰ (増幅フラグメント長多型) ＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、Ａｌｕ ＰＣＲ、アセンブリー, 非対称ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、 ヘリカーゼ依存性ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、インサイチュＰＣＲ、配列間特異的ＰＣＲ又はＩＳ ＳＲ ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、指数関数的後線形−ＰＣＲ、又は後期ＰＣＲ、ロングＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、二重ＰＣＲ、 マルチプレックスＰＣＲ、 定量的ＰＣＲ、又は シングルセルＰＣＲ。以下の他の増幅方法にまた使用され得る：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、 線形増幅、等温線形増幅、Ｑ−ベータレプリカーゼ法、 ３ＳＲ、鎖置換増幅 （ＳＤＡ）又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）。
【０１８１】
ステム−ループＲＴ−ＰＣＲは、目的のｍｉＲＮＡを増幅し、そして定量化するための本開示の方法において有用であるＰＣＲ方法である（Caifu et al., 2005, Nucleic Acids Research 33:e179; Mestdagh et al., 2008, Nucleic Acids Research 36:e143; Varkonyi-Gasic et al., 2011, Methods Mol Biol.744:145-57を参照のこと）。簡単に説明すると、その方法は、以下の２つの段階を含む：ＲＴＡ及びリアルタイムＰＣＲ。まず、ステム−ループＲＴプライマーがｍｉＲＮＡ分子にハイブリダイズされ、そして次に、逆転写酵素により逆転写される。次に、ＲＴ生成物が、従来のリアルタイムＰＣＲを用いて定量化される。
【０１８２】
緊縮条件下で特異的ハイブリダイズするという表現は、本開示の方法におけるハイブリダイズする工程を示し、ここでプローブ又はプライマーとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、増幅の間に生じ得る非特異的結合の量を最少にするために、適切な長さで、且つ十分に明確なものである。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、化学合成方法のような任意適切な方法により調製され得る。
【０１８３】
ハイブリダイゼーションは典型的には、非特異的結合を妨げるが、しかしプローブ又はプライマーと有意なレベルの相同性を有するこの鋳型核酸の結合を可能にする緊縮条件下で鋳型核酸にオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーをアニーリングすることにより達成される。
【０１８４】
緊縮条件には、約５０℃〜約９５℃の範囲である、プライマー組を用いての増幅工程の融解温度（Ｔｍ）がある。典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄緊縮条件は、鋳型核酸又はオリゴヌクレオチドプローブのサイズ（すなわち、長さでのオリゴヌクレオチド数）、塩基組成、及び単価及び二価のカチオン濃度に一部、依存する（Ausubel et al., 1994, eds Current Protocols in Molecular Biology）。
【０１８５】
好ましい実施形態によれば、本開示の定量的及び定性的プロファイルを決定するための工程は、増幅が、緊縮条件下で、核酸配列又は多型核酸配列のセグメントと特異的にハイブリダイズすることができる標識プローブ、好ましくは標識加水分解プローブを用いて行われるリアルタイム増幅であることにおいて特徴付けられる。標識プローブは、各増幅サイクルが起こるたびに検出可能なシグナルを放すことができる。
【０１８６】
リアルタイム増幅、例えばリアルタイムＰＣＲは、当業界において周知であり、そして種々の既知技法が、本方法の実施のために最良の手段で使用されるであろう。それらの技法は、加水分解プローブ、ハイブリダイゼーション隣接プローブ、又は分子ビーコンなどの種々のカテゴリーのプローブを用いて実施される。加水分解プローブ又は分子ビーコンを用いる技法は、蛍光消光剤／レポーターシステムの使用に基いており、そしてハイブリダイゼーション隣接プローブは、蛍光受容体／ドナー分子の使用に基かれている。
【０１８７】
蛍光消光剤／レポーターシステムを有する加水分解プローブは、市場で入手可能であり、そして例えば、Applied Biosystemsグループ（ＵＳＡ）により商品化されている。多くの蛍光染料、例えばＦＡＭ染料（６−カルボキシ−フルオレセイン）、又は任意の他の染料ホスホルアミダイト試薬が使用され得る。
【０１８８】
本開示の任意の１つの加水分解プローブに適用される緊縮条件には、約５０℃〜９５℃の範囲のＴｍがある。好ましくは、本開示の任意の１つの加水分解プローブのＴｍは、約５５℃〜約８０℃の範囲である。最も好ましくは、本開示の任意の１つの加水分解プローブに適用されるＴｍは、約７５℃である。
【０１８９】
別の好ましい実施形態によれば、本開示による定量的及び定性的プロファイルを決定するための方法は、増幅生成物が伸長され、ここで伸長生成物はそれらの長さに対して分離されることを特徴とする。伸長生成物について得られるシグナルが測定され、そして伸長生成物の長さに対する標識強度の定量的及び定性的プロファイルが確立される。
【０１９０】
ラン−オフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）反応とも呼ばれる伸長工程は、増幅生成物の長さの決定を可能にする。長さは、従来の技術を用いて、例えば分離のためのポリアクリルアミドゲルなどのゲル、ＤＮＡ配列決定機及び適合ソフトウェアを用いて決定され得る。いくつかの突然変異は長さの不均一性を示すので、いくつかの突然変異は、伸長生成物の長さの変化により決定され得る。
【０１９１】
１つの側面によれば、本開示は、目的のｍｉＲＮＡの核酸配列に対して相補的であるプライマーを含み、そしてより特定には、前記プライマーは、目的のｍｉＲＮＡの配列に対して実質的に相補的な１２又はそれ以上の連続ヌクレオチドを含む。好ましくは、本開示において特徴付けられるプライマーは、約１２〜２５個のヌクレオチドの核酸配列に対してハイブリダイズするのに十分に相補的なヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、プライマーは、標的ヌクレオチド配列とは、１、２又は３個以上のヌクレオチドで異なる。別の側面によれば、プライマーの長さは、長さ、好ましくは約１５〜２８個のヌクレオチド長（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド長）で変化し得る。
【０１９２】
治療又は予後の有効性の決定
１つの側面によれば、患者の生物学的サンプル中の１又は２以上の循環ｍｉＲＮＡのレベルは、疾患の治療又は予後の有効性をモニターするために使用される。いくつかの実施形態によれば、治療された患者から採取された試験サンプル中の１又は２以上の循環ｍｉＲＮＡのレベルが、治療の開始の前、患者から採取された基準サンプルからのレベルに比較され得る。治療の臨床モニターリングは、典型的には、各患者が彼ら自身のベースライン管理として役立つことを伴う。いくつかの実施形態によれば、試験サンプルは、治療を施した後、複数の時点で得られる。それらの実施形態によれば、試験サンプル中の１又は２以上の循環ｍｉＲＮＡのレベルの測定は、治療のインビボ効果の程度及び期間の指標を提供する。
【０１９３】
バイオマーカーレベルの測定は、疾患の治療過程のモニターリングを可能にする。疾患に対する治療計画の有効性は、対象から経時的に採取されたサンプルからの有効量の１又は２以上のバイオマーカーを検出し、そして検出されたバイオマーカーの量を比較することによりモニターリングされ得る。例えば、第１のサンプルは、対象が治療を受ける前に採取され得、そして１又は２以上の続くサンプルは、対象の治療の後又は治療中に採取される。サンプルを通してのバイオマーカーレベルの変化は、治療の有効性に関する指標を提供し得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、治療に応答してのｍｉＲＮＡのレベルをモニターリングする方法を提供する。例えば、特定の実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載される１又は２以上のｍｉＲＮＡのレベルを測定することにより、対象における治療の有効性を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上のｍｉＲＮＡのレベルは、経時的に測定され得、ここで治療の開始後のある時点でのレベルが、治療の開始後の別の時点でのレベルと比較される。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上のｍｉＲＮＡのレベルが、経時的に測定され得、ここで治療の開始後のある時点でのレベルが、治療開始後のレベルと比較される。いくつかの実施形態によれば、本開示は、治療の後、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−１８、 ｍｉＲ−２１４、 ｍｉＲ−１２６、 ｍｉＲ−６７５５、 ｍｉＲ−３６１３、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８の少なくとも１つをモニターリングする方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、子宮内膜症治療の後、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３６１３又はそれらの任意の組合せのレベルをモニターリングするための方法を提供する。
【０１９５】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、治療の後、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ、 ｍｉＲ−１４５−５ｐ、 ｍｉＲ−１４３−３ｐ、 ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、 ｍｉＲ−４５１ａ、 ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、 ｍｉＲ−２１４−３ｐ、 ｍｉＲ−１２６−３ｐ、 ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ−３６１３−５ｐ、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐの少なくとも１つをモニターリングする方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、子宮内膜症治療の後、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３６１３又はそれらの任意の組合せのレベルをモニターリングするための方法を提供する。
【０１９６】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、子宮内膜症治療の有効性を評価するための方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態によれば、本方法は、ｍｉＲ−１２５のレベルが、治療を受けていない対照罹患対象又は集団と比較して、治療された対象のサンプルにおいて、低められる場合、その治療は有効であることを示唆する。いくつかの実施形態によれば、本方法は、ｍｉＲ−１５０のレベルが、治療を受けていない対照罹患対象又は集団と比較して、治療された対象のサンプルにおいて、高められる場合、その治療は有効であることを示唆する。いくつかの実施形態によれば、本方法は、ｍｉＲ−３６１３のレベルが、治療を受けていない対照罹患対象又は集団と比較して、治療された対象のサンプルにおいて、高められる場合、その治療は有効であることを示唆する。
【０１９７】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、子宮内膜症治療の有効性を評価するための方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態によれば、本方法は、ｍｉＲ−１２５−５ｂのレベルが、治療を受けていない対照罹患対象又は集団と比較して、治療された対象のサンプルにおいて、低められる場合、その治療は有効であることを示唆する。いくつかの実施形態によれば、本方法は、ｍｉＲ−１５０−５ｂのレベルが、治療を受けていない対照罹患対象又は集団と比較して、治療された対象のサンプルにおいて、高められる場合、その治療は有効であることを示唆する。いくつかの実施形態によれば、本方法は、ｍｉＲ−３６１３−５ｂのレベルが、治療を受けていない対照罹患対象又は集団と比較して、治療された対象のサンプルにおいて、高められる場合、その治療は有効であることを示唆する。
【０１９８】
特定の対象のために適切である治療薬又は薬物を同定するために、対象から試験サンプルがまた、治療剤又は薬物に暴露され得、そして１又は２以上のバイオマーカーのレベルが決定され得る。バイオマーカーレベルが、治療、又は治療剤又は薬物への暴露の前後で対象に由来するサンプルと比較され得、又はそのような治療又は暴露の結果として疾患と比較して改善を示した１又は２以上の対象由来のサンプルと比較され得る。従って、１つの側面によれば、本開示は、対象からの第１サンプル中のバイオマーカーパネルの第１の測定を行い；対象に関する治療を実施し；対象から第２サンプル中のバイオマーカーパネルの第２測定を行い；そして治療の有効性を評価するために第１及び第２の測定値を比較することを含む、対象に関する治療の有効性を評価する方法を提供する。
【０１９９】
さらに、特定の対象への投与のために適切な治療剤は、対象から採取されたサンプルからの有効量の１又は２以上のバイオマーカーを検出し、そして対象由来のサンプル中のバイオマーカーの量を決定する試験化合物に、対象由来のサンプルを暴露することにより同定され得る。従って、子宮内膜症を有する対象への使用のための治療又は治療計画は、対象から採取されたサンプル中のバイオマーカーの量に基いて選択され得、そして基準値と比較され得る。２つ以上の治療又は治療計画が、治療又は治療計画が疾患の発症を遅らせるか、又は進行を遅らせるために対象への使用のために最も有効であるかを決定するために並行して評価され得る。種々の実施形態によれば、疾患の治療を開始するか、又は継続するかについての推薦が行われる。
【０２００】
予後は、患者が生存すると予測され得る時間量として表現され得る。他方では、予後は、疾患が寛解に入る可能性、又は疾患が寛解にとどまると予想され得る時間量を言及することができる。予後は種々の手段で表現され得る；例えば、予後は、１年後、５年後、１０年後などに患者が生存するであろう可能性の百分率として表され得る。他方では、予後は、平均して、状態又は疾患の結果として患者が生存することが期待できる年数として表され得る。患者の予後は、相対主義の表現と考えられ、多くの要因が最終的な結果に影響を及ぼす。例えば、特定の状態を有する患者については、予後は、状態が治療可能又は治療可能であり得る可能性、又は疾患が寛解する可能性として適切に表現され得るが、より重度の状態を有する患者に関しては、予後は、特定期間の生存性の可能性として、より適切に表現され得る。ベースラインレベルからの臨床因子の変化は、患者の予後に影響を及ぼし得、そして臨床因子のレベルの変化の程度は、有害事象の重症度に関連され得る。統計学的有意性は、２つの集団を比較し、そして信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより、しばしば決定される。
【０２０１】
循環ｍｉＲＮＡの複数の決定が行われ得、そして活性の一時的変化が、予後を決定するために使用され得る。例えば、比較測定が、複数の時点で患者における無細胞体液中の循環ｍｉＲＮＡに対して行われ、そして２以上の時点での循環ｍｉＲＮＡ値の比較が特定の予後の指標となり得る。
【０２０２】
特定の実施形態によれば、１又は２以上の循環ｍｉＲＮＡの活性レベルは、好ましくない予後の指標として使用される。この方法によれば、予後の決定は、測定された循環ｍｉＲＮＡレベルを、健康な個体からの匹敵するサンプルにおいて決定されたレベル、又は好ましいか又は好ましくない結果と一致することが知られているレベルと比較することにより行われ得る。得られる循環ｍｉＲＮＡレベルは、多く要因、例えば、但しそれらだけには限定されないが、アッセイを実施する実験室、使用されるアッセイ方法、使用される体液サンプルの型、及び患者が罹患している疾患の種類に依存する。この方法によれば、特定の障害を有する一連の患者から値が収集され、その障害に対する循環ｍｉＲＮＡの適切な基準範囲が決定される。当業者は、決定されたレベルと、観察された患者の結果とを比較し、そして特定の障害を有する患者の予後を指定するために使用され得るレベルの範囲を確立する遡及的研究を実施することができる。例えば、最低範囲のレベルがより好ましい予後を示し、ところが最高範囲での循環ｍｉＲＮＡレベルは好ましくない予後を示す。従って、この側面によれば、用語「上昇したレベル（elevated levels）」とは、基準値の範囲を超えるレベルを言及する。いくつかの実施形態によれば、「高い」又は「上昇した」レベルを有する患者は、その疾患を有する患者集団におけるメジアン活性よりも高いレベルを有する。特定の実施形態によれば、特定疾患を有する患者についての「高い」又は「上昇した」レベルとは、その障害を有する患者についてのメジアン値を越えるか、又は障害を有する患者の上位４０％にあるレベル、又は障害を有する患者の上位２０％にあるレベル、又は障害を有する患者の上位１０％にあるレベル、又は障害を有する患者の上位５％にあるレベルを言及する。
【０２０３】
患者からの試験サンプル中の循環ｍｉＲＮＡのレベルは連続的に患者の予後に関連しているので、予後の決定は、決定された循環ｍｉＲＭＡを患者の予後に関連づけるために統計学的分析を用いて実施され得る。当業者は、適切な統計学的方法を企画することができる。例えば、本方法は、予後の決定に、カイ二乗検定、Kaplan-Meier法、ログランク検定、多変量ロジスティック回帰分析、Coxの比例ハザードモデル、及び同様のものを使用することができる。コンピューター及びコンピューターソフトウェアプログラムは、データの組織化及び統計学的分析の実施に使用され得る。Giles et. al., British Journal of Hemotology, 121:578-585によるアプローチは典型的である。Giles et al. におけるように、分類変数（例えば、ｍｉＲＮＡレベル及び臨床的特徴）間の関連性は、クロス集計及びFisherの直接確率検定により評価され得る。未調整の生存確率は、Kaplan and Meierの方法を用いて推定され得る。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルはまた、Grambsch-Therneau検定、Schoenfeld残差プロット、martingale残差プロット及び尤度比統計により評価される「適合度（goodness of fit）」を用いて、生存性を予測する患者の特性（例えば、ｍｉＲＮＡレベル）の能力を評価するために使用され得る（Grambsch et al, 1995を参照のこと）。いくつかの実施形態によれば、コンアプローチは、パーソナルコンピューター又は携帯情報端末（ＰＤＡ）と共に使用され得る単純なコンピュータープログラムとして適合され得る。循環ｍｉＲＮＡレベルに基く患者の生存期間の予測は、マイクロソフトエクセル内で開発されたアプリケーション用のビジュアルベーシック（ＶＢＡ）（visual basic for applications）コンピュータープログラムの使用により実施され得る。コアの構築及び分析は、Ｃｏｘ比例ハザードモデルに基かれる。ＶＢＡアプリケーションは、基本ハザード率パラメーター推定値を得ることにより開発され得る。それらの統計学的分析は、統計学的プログラム、例えばＳＡＳ比例ハザード回帰、ＰＨＲＥＧ、手順を用いて実施され得る。次に、患者の共変量を考慮して、推定値を用いて、１〜２４ヶ月の生存確率を得ることができる。プログラムは、所定の患者の予測生存曲線のグラフ表示を作るために、推定確率を利用することができる。特定の実施形態によれば、プログラムはまた、６ヶ月、１年及び１８ヶ月の生存確率を提供する。グラフィカルインターフェースが、患者に優しい態様で患者の特徴を入力するために、使用され得る。本開示のいくつかの実施形態によれば、患者の予後を決定する場合、循環ｍｉＲＮＡレベルを含む複数の予後因子が考慮される。例えば、子宮内膜症の対象の予後は、体液中のｍｉＲＮＡの存在、及び細胞遺伝学、パフォーマンス状態、年齢、性別及び以前の診断から成る群から選択される１又は２以上の予後因子に基いて決定され得る。別の例によれば、癌患者の予後は、循環ｍｉＲＮＡ及び細胞遺伝学、パフォーマンス状態、年齢、性別及び以前の診断から成る群から選択される１又は２以上の予後因子に基いて決定され得る。特定の実施形態によれば、より正確に予後を決定するためには、他の予後因子が、アルゴリズム内の循環ｍｉＲＮＡレベル又は他のバイオマーカーと組合わされ得る。
【０２０４】
治療
本開示は、子宮内膜症の治療又は予防のための治療分子を提供する。いくつかの実施形態によれば、治療分子は、本開示のマーカーの阻害剤、活性化剤及び調節剤を包含するが、但しそれらだけには限定されない。例えば、遺伝子が子宮内膜症においてダウンレギュレートされる場合、治療の形態として活性化剤を用いて、ダウンレギュレートされた遺伝子の発現を正常レベルまで高めることが所望される。活性化剤は、子宮内膜症バイオマーカーの活性を高め、開放し、活性化し、促進し、増強し、感作し、アゴナイズするか、又はアップレギュレートする化合物である。他方では、遺伝子が子宮内膜症においてアップレギュレートされる場合、治療の形態として、阻害剤を用いて、アップレギュレートされた遺伝子の発現を正常レベルに低めることが所望される。阻害剤は、例えば、活性に結合し、部分的又は全体的にブロックし、活性を低め、予防し、遅延され、子宮内膜症バイオマーカーの活性を不活性化し、脱感作し、又はその発現をダウンレギュレートする化合物である。
【０２０５】
本開示のマーカーの発現レベルを高めるか又は低めるための方法及び材料は周知であり、そして当業者の範囲内である。既知方法及び材料の非制限的なリストには、以下を含む：ダイエット、ビタミン、栄養補助食品、遺伝子治療法、アンチセンスオリゴヌクレオチド、薬品及びホルモン剤。
【０２０６】
本開示は、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡを標的とすることにより子宮内膜症を治療する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載される１又は２以上のｍｉＲＮＡの発現又はレベルを高める剤を投与することを含む、対象における子宮内膜症の治療方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態によれば、本方法は、１又は２以上のｍｉＲ−６７５５、ｍｉＲ３６１３、ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８の発現又はレベルを高める剤を投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載される１又は２以上のｍｉＲＮＡの発現又はレベルを高める剤を投与することを含む、対象における子宮内膜症の治療方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態によれば、本方法は、１又は２以上のｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−１５０、 ｍｉＲ−３４２、 ｍｉＲ−１４５、 ｍｉＲ−１４３、 ｍｉＲ−５００、 ｍｉＲ−４５１、 ｍｉＲ−１８、 ｍｉＲ−２１４、 及びｍｉＲ−１２６の発現又はレベルを低める剤を投与することを含む。
【０２０７】
本開示は、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡを標的とすることにより子宮内膜症を治療する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載される１又は２以上のｍｉＲＮＡの発現又はレベルを高める剤を投与することを含む、対象における子宮内膜症の治療方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態によれば、本方法は、１又は２以上のｍｉＲ−６７５５−３ｐ、 ｍｉＲ３６１３−５ｐ、 ｍｉＲ−５５３及びｍｉＲ−４６６８−３ｐの発現又はレベルを高める剤を投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載される１又は２以上のｍｉＲＮＡの発現又はレベルを高める剤を投与することを含む、対象における子宮内膜症の治療方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態によれば、本方法は、１又は２以上のｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ, ｍｉＲ−１５０−５ｐ, ｍｉＲ−３４２−３ｐ, ｍｉＲ−１４５−５ｐ, ｍｉＲ−１４３−３ｐ, ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ, ｍｉＲ−４５１ａ, ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ, ｍｉＲ−２１４−３ｐ及び ｍｉＲ−１２６−３ｐの発現又はレベルを低める剤を投与することを含む。
【０２０８】
患者が子宮内膜症を有すると診断されるか、又は危険性があると診断されるとすぐに、患者は、当業界において知られている方法を用いて治療され得る。子宮内膜症に対する周知の治療は、鎮痛剤、ホルモン療法、化学療法及び外科的療法を包含するが、但しそれらだけには制限されない。子宮内膜症の治療のために使用される鎮痛剤は、単純鎮痛剤、例えばパラセタモール、ＣＯＸ−２阻害剤、アスピリン、及び当業界において周知の他の非ステロイド系抗炎症薬、並び麻薬性鎮痛剤、例えばモルヒネ、コジン、オキシコドン、及び当業界において周知の他のものを包含する。ホルモン治療は、以下を包含するが、但しそれらだけには制限されない：経口避妊薬、プロゲスチン、例えばジドロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、デポ酢酸メドロキシプロゲステロン、ノルエチステロン、レボノルゲストレル、および当技術分野で周知の他のもの、プロゲステロンおよびプロゲステロン様物質、ＧｎＲＨアゴニスト、例えばロイプロレリン、ブセレリン、ゴセレリン、ヒストレリン、デスレリン、ナファレリン、及びトリプトレリン、ダナゾールのようなアンドロゲン及び合成アンドロゲン、及びアロマターゼ阻害剤。外科的療法は、腹腔鏡手術、子宮摘出術及び卵巣摘出術を包含するが、但しそれらだけには制限されない。本開示への使用に特に適した他の治療法は、当業界において周知である。いくつかの実施形態によれば、患者は、スタチン、例えばアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチン（但し、それらだけには制限されない）を用いて、治療され得る。
【０２０９】
キット
本開示はまた、本開示の方法において有用なキットにも関する。そのようなキットは、本明細書に記載されるいずれかの方法において有用な成分、例えばハイブリダイゼーションプローブ又はプライマー（例えば、標識プローブ又はプライマー）、標識分子、オリゴヌクレオチドアレイ、制限酵素、抗体、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを検出するための試薬、対象の核酸を増幅するための手段、対象のＲＮＡを逆転写するための手段、対象の核酸配列を分析するための手段及び説明資料を含む。例えば、いくつかの実施形態によれば、キットは、子宮内膜症に関連する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの検出及び定量化のために有用な成分を生む。本開示の好ましい実施形態によれば、キットは、本明細書の他の箇所に記載されるように、子宮内膜症に関連する１又は２以上のｍｉＲＮＡを検出するための成分を含む。
【０２１０】
本開示はまた、子宮内膜症において示差的に発現されることが知られている１又は２以上の核酸バイオマーカーについてのプローブを含む、子宮内膜症又は子宮内膜症により引起される低められた不妊症の診断のためのキットも提供する。１つの特定の実施形態によれば、キットは、選択されたバイオマーカーの定量的増幅のための試薬を含む。他方では、キットはマイクロアレイを含む。いくつかの実施形態によれば、キットは２又はそれ以上のプローブを含む。他の実施形態によれば、キットは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又はそれ以上のプローブを含むことができる。
【０２１１】
本開示はまた、本開示の方法において有用なキットにも関連する。そのようなキットは、本開示のバイオマーカーを定量的に分析するための材料（例えば、ポリペプチド及び／又は核酸）、本開示のバイオマーカーの活性を評価するための材料（例えば、ポリペプチド及び／又は核酸）、及び説明資料を含む、本明細書の他の箇所に記載される方法のいずれかにおいて有用な成分の種々の組合せを含む。例えば、いくつかの実施形態によれば、キットは、生物学的サンプル中の所望する核酸の定量化のために有用な成分を含む。
【０２１２】
さらなる実施形態によれば、キットは、対象から採取された生物学的サンプル中の本開示のバイオマーカーのレベルが、治療を施す間又はその後、調節されるかどうかを決定するための説明資料及び成分を含む、その必要な対象に施される治療の有効性をモニターリングするためのアッセイ中の成分を含む。種々の実施形態によれば、本開示のバイオマーカーのレベルが対象から採取された生物学的サンプルにおいて調節されるかどうかを決定するために、バイオマーカーのレベルが、キットに含まれる少なくとも１つの比較対照、例えば陽性対照、陰性対照、  歴史的対照、歴史的規範、又は他の参照分子のレベル、又は生物学的サンプル中の別の基準分子のレベルと比較される。特定の実施形態によれば、バイオマーカー及び基準分子の比は、治療のモニターリングを助けることが決定される。
【実施例】
【０２１３】
以下の実験例を参照して本開示をさらに詳細に説明する。 これらの実施例は説明の目的のためだけに提供され、そして他に特定されない限り限定することを意図しない。 従って、本開示は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【０２１４】
これ以上の説明がなくても、当業者であれば、前述の説明及び以下の例示的な実施例を用いて本開示を作成及び利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。 従って、以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を具体的に指摘しており、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２１５】
実施例１：子宮内膜症の診断マーカーとしての血清マイクロＲＮＡ；包括的なアレイベースの分析
子宮内膜症の有無にかかわらず女性の同所性及び異所性子宮内膜組織からのマイクロアレイ研究は、いくつかのｍｉＲＮＡの示差的発現を示す（Ohlsson et al., 2009, Mol Endocrinol, 23:265-275, Petracco et al., 2011, J Clin Endocrinol Metab, 96:E1925-1933）。それらは、遺伝子発言を調節することにより子宮内膜症の病因及び関連する不妊症において重要な役割を果たす（Teague et al., 2010, Hum Reprod Update, 16:142-165）。組織のｍｉＲＮＡは、病理組織から循環系に放出され、そして強い相関が、循環レベルと組織レベルとの間に示されている（Resnick et al., 2009, Gynecol Oncol, 112:55-59）。いくつかの示差的に発現されたｍｉＲＮＡが、子宮内膜症患者の血清に同定されている（Jia et al., 2013, Hum Reprod, 28:322-330, Wang et al., 2013, J Clin Endocrinol Metab, 98:281-289）。以前に、let-7b及びｍｉＲ−１３５ａが子宮内膜症患者からの血清において示差的に発現され、そしてその疾患の有用なバイオマーカーであることが実証されている（Cho et al., 2015, Fertil Steril, 103(5):1252-1260）。この研究においては、他のｍｉＲＮＡがこの疾患のマーカーであることが実証されている。この研究は、子宮内膜症を有する女性の血清におけるグローバルｍｉＲＮＡプロファイルの包括的評価であり、そして疾患の非侵襲的バイオマーカーとして使用されるいくつかのｍｉＲＮＡを特定する。
【０２１６】
それらの実験に使用される材料及び方法を現在、記載する。
【０２１７】
研究集団
子宮内膜症の有無にかかわらず、４８人の女性から血清サンプルを採取した。この研究集団は、２０１０年６月〜２０１３年３月の間、骨盤内腫瘤、骨盤痛、不妊、及び子宮内膜症を含む複数の良性徴候について腹腔鏡検査を患者から選択された。患者は、研究に参加することについてインフィームドコンセントを与えられた。選択基準は、２０〜５０歳で、手術前、少なくとも３ヶ月間ホルモン療法を受けておらず、他の炎症性疾患もなかった。除外基準は、閉経後の状態、手術後3ヶ月以内での以前のホルモン、又はゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストの使用、腺筋症、子宮内膜がん、過形成、又は子宮内膜ポリープ、感染症、慢性又は急性炎症性疾患、悪性腫瘍、自己免疫疾患、及び心血管疾患を含んだ。すべての患者における治療前血清ＣＡ−１２５レベルを、Roche/Hitachi Modular Analytics E170 システム(Roche Diagnostics)を備えたＣＡ−１２５II電気科学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）を用いて測定した。手術の間、考えられる全ての子宮内膜症病変を切除し、そして最終診断のために検査した。切除した組織の病理学的確認の後、患者を子宮内膜症グループに割り当てた子宮内膜症の程度を、米国生殖医学学会（ＡＳＲＭ）の改定分類（Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis. Fertil Steril 1996, 67:817-821）を用いて決定した。２４人の患者は、組織学的に確認された腹膜及び／又は卵巣子宮内膜症を有し、中程度から重度の疾患（ステージIII及びＩＶ）を有した。２４人の患者が、対象として参加し、これは、類皮嚢胞の１０例（ｎ ＝ １０）、漿液性嚢胞腺腫（ｎ ＝ ５）、粘液嚢胞腺腫（ｎ ＝ ３）、単純卵巣嚢胞（ｎ ＝ ５）、及び口蓋嚢胞（ｎ ＝ １）を含んだ。
【０２１８】
サンプル採取及びＲＮＡ抽出
血液サンプル（１０ｍｌ）を、手術前、８時間の絶食後に採取した。添加物を含まない減菌管を使用した。サンプルをすぐに遠心分離し、そして血清を、さらなる分析のために−８０℃凍結した。各個体からのサンプルの半分を、マイクロアレイ分析のためにプールし、そしてサンプルの残りの半分を、マイクロＲＮＡの個々の分析のために使用した。製造業者の指標に従って、miRVana RNA Isolation Kit (Applied Biosystems)を用いて、４００μｌの血清から全ＲＮＡを抽出し、そして５０ｍｌのヌクレアーゼフリーの水により溶出した。ＲＮＡの収量を、Nano Drop ND-2000-分光光度計 (Nano drop Technologies, USA)を用いて決定した。
【０２１９】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイ発現プロファイリング
子宮内膜症を有する女性及び対照のプールされたサンプルからの全ＲＮＡを、マイクロＲＮＡマイクロアレイプロファイリングのために使用した。全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を、マイクロＲＮＡ、完全標識及びHybキット(Affymetrix, USA)により標識し、そして１２０５のヒト及び１４４のヒトウィルスマイクロＲＮＡのための６００００のプローブを含むヒトマイクロRNAマイクロアレイキット(Release 16.0, Affymetrix)上でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションシグナルを、Affymetrixマイクロアレイスキャナー(Affymetrix)により検出し、そしてスキャンされた画像を、Affymetrix特徴抽出ソフトウェア (Affymetrix)を用いて分析した。
【０２２０】
ｍｉＲＮＡのための定量的リアルタイムポリメラーゼ鎖反応
Invitrogen NCode ｍｉＲＮＡ第１鎖ｃＤＮＡ合成ＭＩＲＣ−５０キットを、製造元の支持に従って使用した。各サンプルからの全ＲＮＡ（２５ｎｇ）を、逆転写し、そしてｍｉＲＮＡを、以下のような、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ（配列番号３７)、ｍｉＲ−１５０−５ｐ（配列番号３８)、 ｍｉＲ−３４２−３ｐ（配列番号３９）、ｍｉＲ−１４５−５ｐ（配列番号４０)、ｍｉＲ−１４３−３ｐ（配列番号４１)、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ（配列番号４２)、ｍｉＲ−４５１ａ（配列番号４３)、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ（配列番号４４)、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ（配列番号４５)、ｍｉＲ−３６１３−５ｐ（配列番号４６)、ｍｉＲ−５５３（配列番号４７)、ｍｉＲ−４６６８−３ｐ（配列番号４８）のための特異的フォワードプライマー、及びアンカープライマーに対して相補的なユニバーサルリバースプライマーと共に、iQ SYBRグリーンスーパーミックスキット (Bio-Rad Laboratories)を用いて定量化した：
miR-125b-5p    フォワード            UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA; (配列番号37) 
miR-150-5p     フォワード            UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG; (配列番号38)
miR-342-3p     フォワード            UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU; (配列番号39)
miR-145-5p     フォワード            GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU; (配列番号40)
miR-143-3p     フォワード            UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC; (S配列番号41)
miR-500a-3p    フォワード            AUGCACCUGGGCAAGGAUUCUG; (配列番号42)
miR-451a       フォワード            AAACCGUUACCAUUACUGAGUU; (配列番号43)
miR-18a-5p     フォワード            UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG; (配列番号44)
miR-6755-3p    フォワード            UGUUGUCAUGUUUUUUCCCUAG; (配列番号45)
miR-3613-5p    フォワード            UGUUGUACUUUUUUUUUUGUUC; (配列番号46)
miR-553        フォワード            AAAACGGUGAGAUUUUGUUUU; (配列番号47)
miR-4668-3p    フォワード            GAAAAUCCUUUUUGUUUUUCCAG; (配列番号48)
miR-214-3p     フォワード            ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU; (配列番号49)
miR-126-3p     フォワード            UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG; (配列番号50)
【０２２１】
反応混合物は、４μｌのｃＤＮＡ、５μｌのiQSYBR グリーンスーパーミックス、０．５μｌのフォワードプライマー、０．５μｌのユニバーサル定量的ポリメラーゼ鎖反応プライマーを含み、最終反応体積は１０μｌであった。熱サイクル条件は、５０℃で２分間のウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ活性化、及び９５℃で１５分間の初期変性、続いて９５℃で１５秒間の５０サイクル、及び５９℃で５０秒間のアニーリングにより開始された。閾値サイクル及び融解曲線は、Bio-Rad iCycleri Qsystem (Bio-Rad Laboratories)の定量化及び融解曲線プログラムを用いることにより得た。アンカー逆転写プライマーを、負の対照のための鋳型として使用し、そしてＵ６（Ｕ６フォワード、ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ)（配列番号５１）小核ＲＮＡを、対照として使用し、相対的ｍｉＲＮＡ発現を検出した（Kuwabara et al., 2011, Circ Cardiovasc Genet, 4:446-454）。相対的ｍＲＮＡレベルを、比較サイクル閾値（Ｃｔ）方法（２ΔΔＣＴ方法としても知られている）を用いて決定した。
【０２２２】
統計学的分析
子宮内膜症と対象グループとの間の臨床学的特徴の差異の統計学的有無を決定するために、スチューデントｔ検定及びフィッシャーの正確検定を用いた。グループ間の血清ｍｉＲＮＡ発現レベルを、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて比較した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線及びＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）を確立し、子宮内膜症と対象とを区別するために血漿マイクロＲＮＡの診断値を評価した。ＲＯＣ分析に基いて、血漿ｍｉＲＮＡの最良な統計学的カットオフ値を計算し、そして選択されたカットオフ点に対する感度及び特異性を評価した。すべての統計学的分析を、ＳＰＳＳ １６．０ (SPSS Inc, Chicago, IL)を用いて実施した。Ｐ＜０．０５は統計学的に有意と見なされた。
【０２２３】
実験結果が今、説明される。
【０２２４】
臨床的特徴
子宮内膜症の女性の平均（±ＳＤ）年齢は、３３．０８±６．６３歳であり、そして対照は、３２．１６±９．４６際であった（ｐ＞０．０５）。重力、出産歴、アルコール使用量及び他の併存症を含む他の臨床パラメーター間に統計学的に有意な差は存在しなかった。ＶＡＳ（視覚的アナログ尺度）により決定された子宮内膜症グループの骨盤痛強度は、対照グループより高かった（それぞれ、５．４±３．４、２．１±２．４、ｐ＜０．００１）。ＣＡ−１２５値は、対照グループよりも子宮内膜症グループにおいて有意に高かったが、非常に多様であった（それぞれ、１０３．３±１２１．７、１７．５±６．３ 、ｐ＜０．００３）。子宮内膜症を有する全ての女性は、卵巣子宮内膜症を有し、それらのうち１６人は腹膜疾患を有し、そしてそれらのうち８人は深部浸潤性子宮内膜症を有した。
【０２２５】
研究集団の血清中の循環ｍｉＲＮＡの発現
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｍｉＲＮＡ  ４．０アレイを用いて、プールされたサンプルのｍｉＲＮＡプロファイルを検出し、そしてそれらのアレイ研究から合計２６，３５４のｍｉＲＮＡを分析した。それらのｍｉＲＮＡのうち、１１，６５３がダウンレギュレートされ、そして１０，０００がアップレギュレートされた。子宮内膜症と対照グループとの間での発現において１０倍以上の変化した、示差的に発現されたｍｉＲＮＡを選択した（図１）。図１に示されるように、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐはアップレギュレートされ、ところがｍｉＲ−３６１３−５ｐ及びｍｉＲ−６７５５−３ｐはダウンレギュレートされた。
【０２２６】
子宮内膜症の有無にかかわらず、女性の血清におけるｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５５−３ｐ、ｍｉＲ−３６１３−５ｐの相対的発現を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ鎖反応を用いて評価した。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐレベルの発現のレベルは、図２A及び２Bに示されるように、子宮内膜症を有する女性においてはダウンレギュレートされた（ｐ＜０．０５）。月経周期を通してのそれらのｍｉＲＮＡの変動をまた決定した。子宮内膜症グループにおいては、それぞれ８及び１６の増殖性サンプルが存在した。対照グループにおいては、１３の増殖性及び１１の分泌性サンプルがあった。子宮内膜症患者間では、それらのｍｉＲＮＡの示差的月経周期段階特異的発現は存在しなかった（ｐ＞０．０５）。
【０２２７】
子宮内膜症における循環ｍｉＲＮＡの診断値の評価
２つのグループ間で示差的に発現された血清ｍｉＲＮＡのＲＯＣ曲線分析を実施した。示差的に発現されたｍｉＲＮＡのＡＵＣ値は、表２及び図３に示されている。示差的に発現されたｍｉＲＮＡの中で、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ発現レベルは、０．０６８８のカットオフ値について、それぞれ１００％及び９６％の感度及び特異性を伴って、最も高いＡＵＣ（０．９７４、９５％信頼区間[ＣＩ]、０．００−１．００、ｐ ＜０．００１）を有した。子宮内膜症の診断におけるｍｉＲＮＡ発現は、疾患サンプル対対照サンプルを用いたデータにロジスティク回帰モデルを適用することにより改善された。すべてのバイオマーカーの分布は正常に偏っていなかったので、変数は対数変換された（図３Ａ−３Ｃ）。高いＡＵＣが、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐのみについて観察された。１．０００へのＡＵＣのさらなる上昇が、予測子１２５ｂ−５ｐ、４５１ａ及び３６１３−５ｐを組合す場合、達成された（図３Ｄ）。それらの３つのマイクロＲＮＡが組合されると、感度及び特異性は１００％に達した。従って、マイクロＲＮＡの組合せは、任意の個々のマイクロＲＮＡよりも改善された診断能力を示した。以下のロジスティックモデルを選択した：ｍｉＲＮＡの組合せ＝１１８．４０６ ＋ １０８．７５１ ｘ ｌｏｇ１０（１２５ｂ−５ｐ） ＋ ４１．０１５ ｘ ｌｏｇ１０（４５１ａ） - ５７．９３５ ｘ ｌｏｇ１０（３６１３−５ｐ）。表３に示されるマイクロアレイデータは、トップｍｉＲＮＡヒット、及び子宮内膜症（Ｅ１）アップレギュレーション対対照（Ｃ１）、Ｅ１ダウンレギュレーション対Ｃ１の比較を示す。
【０２２８】
子宮内膜症のためのバイオマーカーとしてのマイクロＲＮＡの使用
この研究においては、子宮内膜症のためのバイオマーカーとしての示差的に発現された循環ｍｉＲＮＡを実証した。結果は、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ発現がマイクロアレイデータにおいて同定されたｍｉＲＮＡ間で最高のＡＵＣレベルを有したことを実証した。子宮内膜症は、平均６．７年の診断遅延と関連しており、疾患の進行及び生活の質の低下をもたらす（Nnoaham et al., 2011, Fertil Steril, 96:366-373）。子宮内膜症の早期診断は、迅速な治療、生活の質の改善、及び受胎能の潜在的保存を可能にするであろう。いくつかの増殖因子及びサイトカインが、この疾患の潜在的バイオマーカーとして血清、血漿、及び水において研究されて来た（Cho et al., 2012, Hum Reprod, 27:515-522, Reis et al., 2012, Hum Reprod, 27:1445-1450）；しかしながら、それらのどれもが子宮内膜症の臨床診断ツールに翻訳されるのに十分に敏感でも又は特異的でもない（May et al., 2010, Hum Reprod, 16:651-674）。
【０２２９】
ｍｉＲＮＡが血漿に運ばれるメカニズム及び遠方の器官に対するそれらの生物学的影響についてはほとんど知られていない。正常な子宮内膜症並びに対を成す同所性及び異所性子宮内膜症サンプルは、異なるｍｉＲＮＡ発現パターンを有する（Jia et al., 2013, Hum Reprod, 28:322-330）。さらに、血清／血漿のｍｉＲＮＡプロファイルと組織との間の強い関連性が、いくつかの癌を調べる研究において実証されている（Resnick et al., 2009, Gynecol Oncol, 112:55-59, Wang et al., 2013, J Clin Endocrinol Metab, 98:281-289）。バイオマーカーとしてのそれらの役割に加えて、循環ｍｉＲＮＡは、遠方の組織に対して調節効果を有する。ここで同定された循環ｍｉＲＮＡは、子宮内膜症と子宮内膜との間の連絡手段である。さらに、それらは、全身的な効果を有し、遠方の器官系を変える。動物モデルにおいて、腹腔から遠く離れた子宮遺伝子発現に影響を及ぼすことが実証されている（Naqvi et al., 2016, Reprod Sci, 23:186-191）。循環ｍｉＲＮＡは、子宮内膜症が子宮に影響を及ぼすシグナル伝達メカニズムである。
【０２３０】
ｍｉＲＮＡは、異常細胞分化、浸潤及び炎症を調節することにより子宮内膜症の病因に寄与することが実証されている（Petracco et al., 2011, J Clin Endocrinol Metab, 96:E1925-E1933, Teague et al., 2010, Hum Reprod Update, 16:142-165, Naqvi et al., 2016, Reprod Sci, 23:186-191）。多くの個々の循環ｍｉＲＮＡが子宮内膜症において同定されていることもまた実証されている（ia et al., 2013, Hum Reprod, 28:322-330, Wang et al., 2013, J Clin Endocrinol Metab, 98:281-289, Cho et al., 2015, Fertil Steril, 103(5):1252-1260）。Ｊｉａなどは、以下のことを報告している：血漿ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−２２は、子宮内膜症を有する女性においてダウンレギュレートされたが（Jia et al., 2013, Hum Reprod, 28:322-330）、しかしながら、それらのｍｉＲＮＡはカットオフ閾値に達せず、そしてこの研究においては、さらに試験されていない。同定されたｍｉＲＮＡにおける差異は、年齢、人種的疾患の重症度、又は医学療法の使用の差異によるものである。
【０２３１】
子宮内膜症を有する女性の循環における全ｍｉＲＮＡの最初の包括的分析においては、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐが子宮内膜症の最良の単一候補体バイオメーカーであることが同定された。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐは、子宮内膜症を有する女性の血清において有意にアップレギュレートされ、そしてそれは、任意の単一のｍｉＲＮＡの最高のＡＵＣ並びに感度及び特異性（ＡＵＣ ＝ ０．９７４、９５％信頼区間[ＣＩ]、０．００−１．００、ｐ ＜０．００１）（それぞれ１００％及び９６％）を有した。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐは、癌の浸潤及び病因における役割を実証し、そして肺癌において癌遺伝子として作用する（Wang et al., 2015, Mol Med Rep, 11(5):3880-3887）。それは、乳癌患者の血清においてアップレギュレートされ、そして化学療法耐性の、より高い発現レベルを有する無反応性患者に関連しているが（Wang et al., 2012, PLoS One, 7:e34210, Matamala et al., 2015, Clin Chem, 61(8):1098-1106）、一方、有意に高いレベルが、ＨＢＶ陽性幹細胞癌患者の血清に見出された（Giray et al., 2014, Mol Biol Rep, 41(7):4513-4519）。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐがＱｓｘ発現の調節を介してｈＢＭＳＣの骨形成分化を調節することもまた実証されてる（Chen et al., 2014, Mol Med Rep, 9(5):1820-1826）。この研究においては、大多数の症例が、浸潤を伴う重度の子宮内膜症、及びその表現型に寄与するｍｉＲＮＡ１２５を有した。この研究で見出された他のｍｉＲＮＡはまた、この疾患の病因に寄与している。ｍｉＲ−４５１ａは、神経芽細胞腫及び骨肉腫において腫瘍抑制機能を有し（Liu et al., 2016, Mol Med Rep, doi: 10.3892/mmr. 4770, Xu et al., 2014, Cell Biochem Biophys, 69(1):163-168）、そして高められたレベルが、子宮内膜症性病変細胞の生存を制限するよう機能する子宮内膜症組織に見出された（Graham et al., 2015, Hum Reprod, 30(3):642-652）。
【０２３２】
結論として、この研究は、子宮内膜症における循環ｍｉＲＮＡ、特にｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐの示差的発現を示した。この発見はまた、この疾患の診断における血漿ｍｉＲＮＡプロファイリングの臨床的有用性も支持する。疾患のバイオマーカーの欠如、及び診断の遅れを考えると、ｍｉＲＮＡは早期検出及び介入に有用である。さらに、循環ｍｉＲＮＡの役割は、子宮内膜症の全身的影響のより良好な理解を提供し、そしてより新規の治療を可能にする。
【０２３３】
【表２】
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【０２３４】
【表３】
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【０２３５】
実施例２：ヒヒの子宮内膜症病変におけるｍｉＲＮＡの相対的発現
ヒヒの子宮内膜症病変におけるｍｉＲＮＡの相対的発現が、図４に示されるように、リアルタイム定量的ＰＣＲにより決定された。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ及びｍｉＲ−３６１３−５ｐの相対的発現レベルと、スタチン治療の後のそれぞれのｍｉＲＮＡの相対的発現レベルとの比較を実施した。病変がスタチン治療された動物において縮小したことが観察された。末処置動物のサンプル中のｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ発現レベルは、治療された動物から採取されたサンプルよりも高い相対的発現レベルを有したことが示された。
【０２３６】
さらに、ｍｉＲ−３６１３−５ｐの相対的レベルは、治療された動物からのサンプルにおけるｍｉＲ−３６１３−５ｐのレベルに比較して、対照の未処置動物からのサンプルにおいて低かったことが観察された。最後に、ｍｉＲ−１５０−５ｐの相対的レベルは、処置動物からのサンプル中のｍｉＲ−１５０−５ｐのレベルに比較して、対照の末処置動物からのサンプルにおいて低かったことが観察された。
【０２３７】
実施例３：子宮内膜症の診断マーカーとしての唾液マイクロＲＮＡ
段階１：唾液からのＲＮＡ抽出
唾液サンプル（２００μｌ）を採取し、そして１．５ｍｌの管に移した。サンプルの総体積を２００μｌにするために、ＲＮａｓｅフリー水を、２００μｌ以下の体積のサンプルに添加した。１ｍｌのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を、サンプルに添加した。管を短時間ボルテックスし、そしてサンプルを、室温で５分間、インキュベートした。次に、２００μｌのクロロホルムを溶解物に添加し、そして約１５秒間、ボルテックスした。次に、サンプル混合物を、室温で２分間インキュベートし、そして室温（約４℃）で１５分間、１２，０００ｘｇで遠心分離した。約５６０μｌの水性相を、新しい１．５ｍｌの管に移した。８４０μｌの１００％エタノールを、５００μｌの水性相に添加し、合計体積１４００μｌを得た。次に７００μｌの混合物を、２ｍｌの収集管で備えたRNeasy MiniElute回転カラムに移した。収集管を備えた回転カラムを、１５秒間、９，０００ｘｇで遠心分離した。フロースルーを捨て、そして残る７００μｌの混合物を、収集管で備えた回転カラムに移し、そして再び、１５秒間、９，０００ｘｇで遠心分離した。フロースルーを捨て、そして７００μｌの緩衝液ＲＷＴを、各回転カラム添加し、そして１５秒間、９，０００ｘｇで遠心分離した。フロースルーを捨て、そして５００μｌの緩衝液ＲＰＥを、各回転カラムに添加し、そして次に１５秒間、９，０００ｘｇで遠心分離した。フロースルーを捨て、そして別の５００μｌの緩衝液ＲＰＥを、回転カラムに添加し、そして次に、９，０００ｘｇで１５秒間、遠心分離した。次に、５００μｌの８０％エタノールを回転カラムに添加し、そして９，０００ｘｇで２分間、遠心分離した。フロースルー及び収集管を連続して捨て、そして回転カラムを、新しい２ｍｌの収集管に移した。回転カラムの蓋を開けたままにし、そして次に、１２，０００ｘｇで５分間、遠心分離し、膜を乾燥した。次に、回転カラムを、１．５ｍｌの管に置いた。１４μｌのＲＮａｓｅフリーの水を、回転カラムに添加し、そしてそれを１２，０００ｘｇで１分間、遠心分離し、全ＲＮＡを溶離した。回転カラムを捨て、そしてＲＮＡを−８０℃で貯蔵した。
【０２３８】
段階２：ｃＤＮＡの調製
ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成キットを用いて、以下の４つの連続工程でｃＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ａ２８００７）を調製した：Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ。
【０２３９】
工程Ａを、各反応において以下の内容で実施した：０．５μＬの １０Ｘ Ｐｏｌｙ Ａ 緩衝液; ０．５μＬ の１０  ｍＭ ＡＴＰ; ０．３μＬの Ｐｏｌｙ Ａ酵素、 ５ Ｕ/μＬ; １．７μＬの ＲＮａｓｅフリー水; ２．０μＬ のサンプル。プレート又は管を密封し、そして短時間、ボルテックスした。プレート又は管を遠心分離し、内容物を回転沈降し、そしていずれかの気泡も取り除いた。プレート又は管を熱サイクラー中に配置し、そして以下の設定でインキュベートした：
１．３７℃で４５分間のポリアデニル化。
２．６５℃で１０分間、反応の停止。
３．４℃での維持。
【０２４０】
工程Ｂを、各反応において以下の内容で実施した：３．０μＬの ５Ｘ ＤＮＡリガーゼ緩衝液; ４．５μＬ の５０％ ＰＥＧ ８０００; ０．６μＬ の２５Ｘ 連結アダプター; １．５μＬ のＲＮＡ リガーゼ; ０．４μＬ のＲＮａｓｅフリー水。連続反応混合物をボルテックスし、内容物を十分に混合し、そして次に、短時間、遠心分離し、内容物を回転沈降し、そして気泡を除去した。１０μｌの連結反応混合物を、ポリ（Ａ）テーリング反応生成物を含む、反応プレートの各ウェル又は各反応管に移した。反応プレート又は管を密封し、次に短時間、ボルテックスするか又は振盪し（エッペンドルフ（登録商標）MixMate（登録商標）、内容物を十分に混合した。反応プレート又は管を短時間、遠心分離し、内容物を回転沈降した。プレート又は管を、熱サイクラー中に配置した。
【０２４１】
工程Ｃを、各反応において以下の内容で実施した:６μＬの ５Ｘ ＲＴ緩衝液; １．２μＬ のｄＮＴＰ 混合物 (それぞれ２５  ｍＭ); 1.５μＬの ２０Ｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＴ プライマー; ３μＬの １０Ｘ ＲＴ 酵素混合物; ３．３μＬの ＲＮａｓｅフリー水。ＲＴ反応混合物をボルテックスし、内容物を十分に混合し、次に短時間、遠心分離し、内容物を回転沈降し、そして気泡を除去した。１５μｌのＲＴ反応混合物を、アダプター連結反応生成物を含む、反応プレートの各ウェル又は反応管に移した。反応プレート又は管を密封し、そして短時間ボルテックスし、内容物を十分に混合した。次に、反応プレート又は管を、短時間、遠心分離し、内容物を回転沈降した。プレート又は管を、熱サイクラーに配置し、そして以下の設定でインキュベートした：
１．４２℃で１５分間の逆転写。
２．８５℃で５分間の反応の停止。
３．４℃での維持
【０２４２】
工程Ｄを、各反応において以下の内容で実施した：２５μＬの ２Ｘ ｍｉＲ−Ａｍｐ マスター混合物; ２．５μＬ の２０Ｘ ｍｉＲ−Ａｍｐ プライマー混合物; １７．５μＬの ＲＮａｓｅフリ水。ｍｉＲ−Ａｍｐ反応混合物をボルテックスし、内容物を十分に混合し、次に短時間、遠心分離し、内容物を回転沈降し、そして気泡を除去した。４５μｌのｍｉＲ−Ａｍｐ反応混合物を、新反応プレートの各プレート又は反応管に移した。５μｌのＲＴ反応性生物を、各反応ウェル又は反応管に添加した。各ウェル又は管中の合計体積は５０μｌであった。反応プレート又は管を密封し、そして次に、短時間、ボルテックスし、内容物を十分に混合した。次に、反応プレート又は管を短時間、遠心分離し、内容物を回転沈降し、混合した。反応プレート又は管を、熱サイクラー中に配置し、そして次に、以下の設定、ＭＡＸランプ濃度及び標準サイクリングを用いてインキュベートした：
１．９５℃で５分間の酵素活性化、１サイクル
２．９５℃で３秒間の変性、１４サイクル
３．６０℃で３０秒間のアニーリング／伸長、１４サイクル
４．９９℃で１０分間、反応の停止、１サイクル
５．４℃での維持。
【０２４３】
段階３：マイクロＲＮＡの増幅
ＲＴ―ＰＣＲプロトコル：
１．９５℃で３分
２．７５℃で１５秒
３．５９℃で５秒
４．７２℃で５５秒
５．３９サイクルの間、２〜４工程の反復
６．５５℃で１０秒間の融解曲線
７．９５℃で５秒
８．４℃での維持
【０２４４】
対照グループと子宮内膜症グループとの間で示差的に発現された唾液ｍｉＲＮＡの相対的発現を、図５及び６に示す。データは、各グループの１５のサンプルを表す。ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、Ｌｅｔ７ｂ及びｍｉＲ−１５０−５ｐの倍数変化は、それぞれ、２５、７及び１．８倍である。それらの倍数変化は、上記ｍｉＲについてのｐ値は０．０５以下（ｐ＜０．０５）であるので、子宮内膜症グループと対照のループとを比較する場合、統計学的に有意である。ｐ値は、以下の通りである：ｍｉＲ １２５ｂ−５ｐ (ｐ ＜ ０．００１)、Ｌｅｔ７ｂ （ｐ ＜ ０．０２５） 及びｍｉＲ １５０−５ｐ (ｐ ＜ ０．０４７)。ｍｉＲ−３６１３−５ｐの統計学的に有意なダウンレギュレーションが、観察された。
【０２４５】
実施例４：外科的診断の前、子宮内膜症を診断するのに使用される血清マイクロＲＮＡ
良性婦人科適応症のために腹腔鏡検査又は開腹術を受けている生殖年齢の女性は、前向きの症例対照研究に登録された。手術により子宮内膜症の存在が確認される場合、患者は疾患グループに分類され、そして手術が他の良性病理を明らかにした場合、対照とした。２３人の対照患者及び１７人の子宮内膜症患者が登録され、そして研究における選択基準を満たした。対照には、対照には、類皮嚢胞の４人の患者、嚢胞腺腫の３人、子宮筋腫の６人、慢性骨盤感染症の証拠のある２人、及び異常な病状のない８人が含まれた。マイクロＲＮＡ  １２５ｂ及び１５０の発現レベルは、対照と比較して、子宮内膜症を有する患者において有意に高かった（それぞれ、マイクロＲＮＡ １２５: Ｘ対Ｙ； ｐ ＝ ０．０２８、マイクロＲＮＡ １５０：Ｚ対Ｗ； ｍ ／ ｚ、ｐ ＝ ０．０１４）。骨盤痛、及び疑われる子宮内膜症を有する４人の患者は、外科的評価で子宮内膜症を有することが見出されなかった。それらの患者における１２５ｂ及び１５０の発現は、対照のそれと一致し、そして外科的に確認された子宮内膜症を有する患者のそれとは異なった。
【０２４６】
製造業者のプロトコルに従って、全マイクロＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて血清から抽出した。ｃＤＮＡの調製を、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成キット (ThermoFisher)を用いて実施した。定量的リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ｑＲＴ−ＰｃＲ）を実施し、マイクロＲＮＡ  １２５ｂ−５ｐ及び１５０−５ｐの発現レベルを決定した。対照グループと子宮内膜症グループとの間の血清マイクロＲＮＡの発現レベルを、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検査を用いて比較した。研究の結果（図７）は、マイクロＲＮＡ  １２５ｂ−５ｐ及び１５０−５ｐが、対照に比較して、子宮内膜症を有する患者において有意に高められたことを示した。
【０２４７】
実施例５：子宮内膜症の診断及び治療
この予言的な例においては、血液又は唾液サンプルを、子宮内膜症の症状を有する女性患者から採取した。次に、サンプル中のマイクロＲＮＡ  １２５ｂ−５ｐの量を決定し、そしてその量が閾値を上回る場合、患者は子宮内膜症と診断される。患者は、治療上有効量の化合物により治療される。化合物は、経口投与、静脈内投与、又は筋肉内投与により患者に投与される。化合物は、子宮内膜症の症状の軽減を引起す。患者は、毎月１回、治療される。１ヶ月の治療、６ヶ月の治療及び１年の治療の後、患者は、子宮内膜症の症状の軽減について評価される。
【０２４８】
本明細書においては、本発明の好ましい実施形態を示し説明して来たが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。 当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を思い付くであろう。 本明細書に記載されている開示の実施形態に対する様々な代替物が本発明を実施する際に使用され得ることを理解される。 以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、そしてこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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