【手続補正書】
【提出日】平成19年4月13日(2007.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】アムロジピンとアトルバスタチンの相乗効果
【特許請求の範囲】
【請求項１】  薬剤組成物であって、
(a)治療効果量のアムロジピンと、
(b)治療効果量のヒドロキシル化アトルバスタチン代謝物（ＡＴＭ）と、
(c)薬剤利用可能な賦形剤と、
を含んで成ることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項２】  アムロジピンは治療効果的なアムロジピン誘導体を含んでいることを特徴とする請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項３】  治療効果的なアムロジピン誘導体はアムロジピンベシレートを含んでいることを特徴とする請求項２記載の薬剤組成物。
【請求項４】  (a)ＬＤＬと脂質膜の脂質過酸化を共働的に抑制し、
(b)脂質酸化を実質的に抑制し、血圧と体脂質濃度を下げ、
(c)共働的に脂質酸化を抑制する、
ために使用することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項５】  脂質過酸化または脂質酸化の抑制は動脈疾患及び関連心臓疾患のリスクを低減させることを特徴とする請求項４記載の薬剤組成物。
【請求項６】  血圧の降下に使用されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項７】  動脈疾患及び関連心臓疾患の軽減されたリスクと整合するレベルにまで血圧を降下させることを特徴とする請求項６記載の薬剤組成物。
【請求項８】  統計的に正常なレベルにまで血圧を降下させることを特徴とする請求項６記載の薬剤組成物。
【請求項９】  体脂質濃度の降下に使用されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１０】  動脈疾患及び関連心臓疾患の軽減されたリスクと整合するレベルにまで体脂質濃度を降下させることを特徴とする請求項９記載の薬剤組成物。
【請求項１１】  統計的に正常なレベルにまで体脂質濃度を降下させることを特徴とする請求項９記載の薬剤組成物。
【請求項１２】  血圧及び体脂質濃度の降下に使用されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１３】  動脈疾患及び関連心臓疾患の軽減されたリスクと整合するレベルにまで血圧及び体脂質濃度を降下させることを特徴とする請求項１２記載の薬剤組成物。
【請求項１４】  統計的に正常なレベルにまで血圧及び体脂質濃度を降下させることを特徴とする請求項１２記載の薬剤組成物。
【請求項１５】  血圧及び体脂質濃度を同時的に降下させることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１６】  動脈疾患及び関連心臓疾患の軽減されたリスクと整合するレベルにまで血圧及び体脂質濃度を同時的に降下させることを特徴とする請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項１７】  統計的に正常なレベルにまで血圧及び体脂質濃度を同時的に降下させることを特徴とする請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項１８】  アムロジピンとアトルバスタチン代謝物は同一の治療または別々の治療において同時的あるいは別々の時間に投薬されることを特徴とする請求項１から１７のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１９】  治療薬の調剤に使用するアムロジピンとヒドロキシル化アトルバスタチン代謝物の組み合わせの利用法であって、
(a)ＬＤＬと脂質膜の脂質過酸化を共働的に抑制し、
(b)脂質酸化を実質的に抑制し、血圧と体脂質濃度を下げ、
(c)共働的に脂質酸化を抑制する、
ことを特徴とする治療薬利用法。
【請求項２０】  アムロジピンは治療効果的なアムロジピン誘導体を含んでいることを特徴とする請求項１９記載の薬剤利用法。
【請求項２１】  治療効果的なアムロジピン誘導体はアムロジピンベシレートを含んでいることを特徴とする請求項２０記載の薬剤利用法。
【請求項２２】
薬剤は動脈疾患及び関連心臓疾患の軽減されたリスクと整合するレベルにまで血圧及び体脂質濃度を降下させることを特徴とする請求項１９から２１のいずれかに記載の薬剤利用法。
【請求項２３】  薬剤は統計的に正常なレベルにまで血圧及び体脂質濃度を降下させることを特徴とする請求項１９から２１のいずれかに記載の薬剤利用法。
【請求項２４】  薬剤は動脈疾患及び関連心臓疾患の軽減されたリスクと整合する程度にまで脂質酸化を抑制することを特徴とする請求項１９から２１のいずれかに記載の薬剤利用法。
【請求項２５】  動脈疾患及び関連心臓疾患は、高血圧症、過類脂質血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈症、心筋梗塞症、鬱血性心臓機能不全、卒中及び狭心症で成る群から選択されることを特徴とする請求項２２または２４記載の薬剤利用法。
【請求項２６】
アムロジピンとアトルバスタチン代謝物は同一の治療または別々の治療において同時的あるいは別々の時間に投薬されることを特徴とする請求項１９から２５のいずれかに記載の薬剤利用法。
【請求項２７】
動脈疾患及び関連心臓疾患は、高血圧症、過類脂質血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈症、心筋梗塞症、鬱血性心臓機能不全、卒中及び狭心症で成る群から選択されることを特徴とする請求項５記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願の記載】
本出願は以下の４つの米国仮特許出願から得られる優先権を主張するものである。すなわち、１９９９年４月２３日出願の米国特許出願第６０／１３０，６６５号、１９９９年７月２３日出願の米国特許出願第６０／１４５，３０５号、１９９９年８月２７日出願の米国特許出願第６０／１５１，１２１号および１９９９年１１月１９日出願の米国特許出願第６０／１６６，５９２号である。
【０００２】
【発明の技術分野】
本発明は動脈および関連心疾患および関連慢性疾患を治療するための製薬組成および併用に関する。
【０００３】
【従来の技術】
冠状動脈疾患（ＣＡＤ）は先進諸国ではもっとも多い死因となっており、実質的な罹患率ともまた関係している。典型的には、ＣＡＤに罹患した患者は、高血圧、糖尿病、および異脂肪血症を含めた不良なアウトカムおよび複雑な治療に対する全体的なリスクを増大させるいくつかの随伴性病状を有する。
【０００４】
抗高血圧治療薬剤のなかでも、親油性ジヒドロピリジン型カルシウムチャンネルブロッカー（ＣＣＢ）ベシル酸アムロジピン（ＡＭＬ）は、高血圧およびアンギナの治療に関しては、安全性と効果についての確固とした記録を備えた、非常に良好な耐容性を有する薬剤である。ＣＡＤに罹患した患者の治療におけるＡＭＬの潜在的な治療の役割は、最近、Ｎｏｒｖａｓｃ   （ＡＭＬ）臨床試験（ＰＲＥＶＥＮＴ）の血管性効果の前向き無作為化評価において示されている。報告されたＣＡＤに罹患した患者のなかで、冠状動脈および頸動脈におけるアテローム硬化型の発症と進行については、この３年間の臨床試験においてＡＭＬの効果がプラシーボと比較して評価された（Ｂｙｉｎｇｔｏｎ  ＲＰ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＥ，  Ｈｅｒｉｎｇｔｏｎ  Ｄら、「Ｎｏｒｖａｓｃ臨床試験（ＰＲＥＶＥＮＴ）の血管性効果の前向き無作為化評価に関する合理的な設計およびベースライン特性（Ｒａｔｉｏｎａｌｅ，  ｄｅｓｉｇｎ，  ａｎｄ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｖａｓｃ  Ｔｒｉａｌ  （ＰＲＥＶＥＮＴ））」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９７；  ８０：１０８７−１０９０）。ＰＲＥＶＥＮＴの結果により、主な報告出来事あるいは手順において全体的に３０％減少を含めて、ＡＭＬ治療に関する強い印象を与える臨床上の利点が示されている（Ｂｙｉｎｇｔｏｎ  ＲＰ，  Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｆｕｒｂｅｒｇ  ＣＤ，  Ｐｉｔｔ，  Ｂ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ  ｏｎ
ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９９；  ３３：３１４Ａ）。ＡＭＬ治療はまた、Ｂモード超音波評価により測定されたところでは、頸動脈アテローム硬化症の進行において有意な遅延にも関連性があった（Ｂｙｉｎｇｙｔｏｎ  Ｒ，  Ｒｉｌｅｙ  Ｗ，  Ｂｏｏｔｈ  Ｄら、「報告された心疾患に罹患している患者の頸動脈アテローム硬化症の進行に対するアムロジピンの効果（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ  ｏｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．）」，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  １９９９；  １２；４２Ａ−４３Ａ）。ＣＡＤでＡＭＬにみられる臨床上の利点は、この問題を調べるのに使用されてきたジヒドロピリジン型薬剤を含めて、他のＣＣＢに関しては以前には報告されていなかった（Ｗａｔｅｒｓ  Ｄ，  Ｌｅｓｐｅｒａｎｃｅ  Ｊ，  Ｆｒａｎｃｅｔｉｃｈ  Ｍら、「冠動脈アテローム硬化症の進行に関するカルシウムブロッカーの効果を評価するための管理下臨床試験（Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９０；  ８２：  １９４０−１９５３；  Ｌｉｃｈｔｌｅｎ  ＰＲ，  Ｈｕｎｇｅｎｈｏｌｔｚ  ＰＧ，  Ｒａｆｆｌｅｎｂｅｕｌ  Ｗら、「カルシウムチャンネルブロッカーニフェジピンによるヒトにおける冠状動脈疾患の遅延：ＩＮＴＡＣＴ臨床試験の結果（抗アテローム硬化症治療に関する国際的なニフェルジピン臨床試験）（Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ：  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＮＴＡＣＴ  ｓｔｕｄｙ  （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ  Ｔｒｉａｌ  ｏｎ  Ａｎｔｉａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ））、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｄｒｕｇｓ  Ｔｈｅｒ．  １９９０；  ４：Ｓ１０４７−Ｓ１０６８；  Ｂｏｒｈａｎｉ  ＮＯ，  Ｍｅｒｃｕｒｉ  Ｍ，  Ｂｏｒｈａｎｉ  ＰＡら、「多施設イスラジピン利尿剤アテローム臨床試験（ＭＩＤＡＳ）の最終的なアウトカム結果（Ｆｉｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｉｓｒａｄｉｐｉｎ  Ｄｉｕｒｅｔｉｃ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｓｔｕｄｙ  （ＭＩＤＡＳ））」、無作為化管理下臨床試験（Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ  １９９６；  ２７６：７８５−７９１）」。この観察結果は、カルシウムチャンネル変調とは無関係である抗酸化薬の効果を含む、ＡＭＬの潜在的な抗アテローム原性特性に興味を持つことにつながった（Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｌｅｅｄｓ  ＰＲ，  Ｊａｃｏｂ  ＲＦら、「小脳下流細胞におけるカルシウムア��タタゴニストアムロジピンおよび抗酸化剤による神経細胞の過剰アポトーシスの阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌｓ．）」、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  １０００；  ７２：  １４４８−１４５６；  Ｔｕｌｅｎｋｏ  ＴＮ，  Ｌａｕｒｙ−Ｋｌｅｉｎｔｏｐ  Ｌ，  Ｗａｌｔｅｒ  ＭＦ，  Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  「コレステロール、カルシウム、アテローム硬化症：アテローム保護におけるカルシウムチャネルブロッカーの役割はあるのか？（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  Ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ？）、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９７；  ６２  （２  Ｓｕｐｐｌｅ）：  ５５Ｓ−６６Ｓ；  Ｋｒａｍｓｃｈ  ＤＭ，  Ｓｈａｒｍａ  ＲＣ，  「脂質低下治療の限界：抗アテローム硬化症薬としてのアムロジピンの利点（Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｔｈｅ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ  ａｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ．）」、Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  １９９５；  ９  （Ｓｕｐｐｌ  １）：  Ｓ３ Ｓ９」。
【０００５】
高脂血症治療ではまた、ＣＡＤと関連している罹患率と死亡率を減らすのに非常に有用であることが示された。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬剤のなかで、アトルバスタチンカルシウム（ＡＴ）は、高脂血症治療薬剤として、非常に効果的であることが示されている（Ｎａｗｒｏｃｋｉ  ＪＷ，  Ｗｅｉｓｓ  ＳＲ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＭＨら、「アトルバスタチンによる原発性高コレステロール血症に罹患した患者で、２５％〜６０％ＬＤＬコレステロールが軽減」（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  １９９５；  １５：６７８−６８２；  Ｂａｋｋｅｒ−Ａｒｋｅｍａ  ＲＧ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＭＨ，  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＲＪら、「高トリグリセリド血症に罹患している新しいＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるアトルバスタチンの効力と安全性」、ＪＡＭＡ  １９９６；  ２７５：１２８−１３３）。安定しているＣＡＤと進行したＣＡＤに罹患している患者を含む最近の臨床試験では、アトルバスタチンによる積極的な脂質低下治療が、最初の虚血性出来事までの期間を有意に遅らせ、また、通常のメディカルケアによる血管形成に比べると、心血管出来事の全体的な発生率で３６％減少させた（Ｐｉｔｔ  Ｂ，  Ｗａｔｅｒｓ  Ｄ，Ｂｒｏｗｎ  ＷＶら、「安定している冠状動脈疾患における血管形成と併用した積極的な脂質低下治療」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９９；  ３４１：７０−７６）。さらに、ＡＴのヒドロキシル化代謝物が、脂質タンパク質作成物における抗酸化剤効果を示すことが明らかにされた（Ａｖｉｒａｍ  Ｍ，  Ｒｏｓｅｎｂｌａｔ  Ｍ，  Ｂｉｓｇａｉｅｒ  ＣＬ，  Ｎｅｗｔｏｎ  ＲＳ．「その親薬剤ではなくて、アトルバスタチンおよびゲムフィブロジル代謝物は脂質タンパク質酸化に対する強力な抗酸化剤である。（Ａｔｒｏｖａｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  ｐａｒｅｎｔ  ｄｒｕｇｓ，  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．）」、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １９９８；  １３８：２７１−２８０）。
【０００６】
しかし、高血圧と高脂血症の両方を治療する製薬組成は今日存在していない。こうした製薬組成はいくつかの利点を有していると考えられる。例えば、個々人の患者においては多くの場合存在する動脈と関連心疾患複数のリスクファクターを同時に標的化することができる。さらに、１回の併用投与を受ける容易さにより治療処方箋に関する患者のコンプライアンスを有意に向上させることができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本出願の１つの目的は、動脈および関連心疾患に関与する複数の病理学的プロセスを治療する併用療法を提供することである。これらの疾患には、高血圧と高脂血症に限定されるわけではないが、それらが含まれる。本出願の１つの目的はまた、こうした併用療法に有用で都合の良い投与レベルと形態を開発することである。好適には、この製薬組成は、この組成成分の個々の効果が併用により向上されるといったように、動脈および関連心疾患のそうした特徴に対して相乗効果を有するものであろう。
【０００８】
このように、本発明は、アテローム硬化症に寄与している複数の潜在している疾患プロセスを同時に標的にすることができる薬剤の開発を含む、ＣＡＤの治療に対する治療目標を包含しており、それによってその疾患の経過を変化させるものである。したがって、本発明を使用することにより、ＣＡＤ治療は、抗高血圧薬剤とＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬とが単一のデリバリーシステムのなかで併用されるのであれば、増加した活性のアウトカムを有することが可能である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
意外にも、ＡＭＬとＡＴを併用してみると、ヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）と脂質膜における脂質の過酸化を防ぐに当たって、ＡＭとＡＴは相乗効果を有していた。すなわち、この効果は、異脂肪血症と高血圧の両方に関する、良好に確立されているそうした治療上の効果に加えて、生じたものである。併用による活性は、その２つの薬剤の何らかの相加的な効果を有意に超える、測定された効果として、相乗効果的なものであると考えられる。したがって、これらの薬剤は以前に未確認の相乗的な抗酸化効果、ＬＤＬの耐性およびアテローム発生時の酸化修飾に対して血管細胞膜を増加させることを可能にする特性を有していた。実際に、脂質の酸化修飾は、その内皮とその下に横たわっている平滑筋に対する損傷の十分に確定された原因となっている（Ｒｏｓｓ  Ｒ．  「アテローム硬化症−１つの炎症性疾患（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．）」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９９；  ３４０：１１５−１２６；  Ｄｉａｚ  ＭＮ，  Ｆｒｅｉ  Ｂ，  Ｖｉｔａ  ＪＡ，  Ｋｅａｎｅｙ  ＪＦ．  「抗酸化薬とアテローム硬化性心疾患（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．）」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９７；  ３３７：４０８−４１６）。脂質過酸化に対して保護する親油性薬剤が、臨床研究においてのみならず、アテローム硬化症のさまざまなモデルにおける病変発症を軽減することが示されている（Ｄｉａｚ  ＭＮ，  Ｆｒｅｉ  Ｂ，  Ｖｉｔａ  ＪＡ，  Ｋｅａｎｅｙ  ＪＦ．  「抗酸化薬とアテローム硬化性心疾患（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．）」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９７；  ３３７：４０８−４１６）。さらに、抗高脂血症治療に関する利点は、血漿の超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ＬＤＬ、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）値に対する効果、およびその結果として、アテローム発生酸化リポタンパク質の潜在的な形成の減少につながるその効果の両方に帰せられる。
【００１０】
心血管疾患の治療に関する単一デリバリーシステムにおけるＡＭＬ（Ｎｏｒｖａｓｃ   ）とＡＴ（Ｌｉｐｉｔｏｒ ）の併用を支持する科学的な分析が本発明では説明されている。特に、その活性過酸化代謝物（ＡＴＭ）を含む、カルシウムチャネルブロッカーであるＡＭＬと、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬であるＡＴの相乗的な抗酸化活性は、ヒトＬＤＬと、アテローム硬化症の活性酸素損傷の鍵となる、標的である多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）で富化された脂質膜において評価された。これらの薬剤の相乗効果は、コレステロールの存在下で作成された膜において示された。ＡＴＭとＡＭＬの併用は、１０．０ｎＭといった低い濃度での脂質活性酸素損傷の劇的かつ持続性のある減少に効果的であった。治療レベルでのこうした薬剤の併用に関する投与依存性抗酸化活性は高度に相乗的なものであったが、それは内因性薬剤であるビタミンＥによっては効果的に再現することはできなかった。脂質過酸化の相乗的な阻害もまた、ＡＭＬとＡＴの併用では観察された。しかし、ＡＭＬが、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）とメバスタチン（ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）を含む、その他のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬と一緒に併用される場合には、抗酸化活性は観察されなかった。Ｘ線回析および化学的分析により測定されているように、この薬剤併用に関して説明されている明確化されている活性は、カルシウム輸送およびコレステロール代謝におけるこうした薬剤のうまく特徴付けられた効果とは関係なく、膜二重層との強い物理−化学的相互作用に帰することができる。この相乗抗酸化の利点によって、これらの化合物に関する作用の新しい薬理学的メカニズムと、血漿におけるＬＤＬ値の減少による、またＬＤＬの保護と酸化に対する細胞膜の保護を改善することによる心血管疾患の治療におけるＮｏｒｖａｓｃ とＬｉｐｉｔｏｒ の活性成分の併用使用についての説得力のある理論的根拠が構築されている。この新しい特性は、高血圧および異脂肪血症についてこうした薬剤で確立されているその効果を補うものである。
【００１１】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、添付の図面とともに説明されている好適な実施態様の以下の詳細な説明から明らかになることであろう。
【００１２】
【発明の実施の形態】
脂質膜におけるアトルバスタチン／アトルバスタチン代謝物とのアムロジピンの相乗抗酸化効果：ＡＭＬ、ＡＴ、ＡＴＭの個別および併用の投与依存性抗酸化活性は、０．５：１モル比で、コレステロールとＰＵＦＡ、ジリノーレオイルホスファチジルコリンにより富化されたリン脂質から再構築された膜小胞で試験された。膜小胞は以下の理由でこうした実験で使用された。すなわち、１）この系はうまく定義されていて、また高度に再現可能である。２）リノール酸は、酸化損傷の第１次標的を代表しており、また血管細胞膜およびリポタンパク質粒子には通常ある。３）この膜系にはカルシウムチャンネルあるいはＨＭＧＣｏＡ還元酵素が含まれていない。４）高値の鉄やアスコルビン酸などの外因性化学的イニシエーターが無い場合、この系における脂質過酸化を３７℃にて自発的に開始することができる、といった理由である。こうした実験では、酸化は、漸次７２時間という期間にわたって分光光度的に測定された時間依存的なやり方で起こった。
【００１３】
図１では、ＡＭＬとＡＴＭの相乗抗酸化活性が、生理学的なものに準じた条件を再現するレベルでコレステロールとリン脂質から構成される膜小胞において示された（Ｔｕｌｅｎｋｏ  ＴＮ，  Ｃｈｅｎ  Ｍ，  Ｍａｓｏｎ  ＰＥ，  Ｍａｓｏｎ  ＲＰ．  「動脈平滑筋膜に対するコレステロールの物理的な効果：アテローム発生時の二重層の幅における不混和性コレステロールドメインおよび改変（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｎ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｗｉｄｔｈ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．）」、Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ．  Ｒｅｓ．  １９９８；  ３９：９４７−９５６）。１００．０ｎＭでは、ＡＴＭのみが個別にコレステロールにより富化される、この膜作成における脂質過酸化の何らかの有意な阻害（対照の９％）を産生した。しかし、これら薬剤が併用された場合は、阻害の程度は３３％に増加し、それらの薬剤を個別に測定したものよりもその効果は有意に高かった（ｐ＜０．０１）。併用の抗酸化活性は非常に明瞭であった。すなわち、それらの薬剤は、１００．０ｎＭ  （脂質過酸化形成の対照値は１．６ｍＭであった）といった濃度で脂質過酸化形成を阻害した（＞５(１０2(Ｍ）。この薬剤併用は広い濃度範囲にわたって高度に投与依存性であった効果を生み出した（図２）。有意な阻害（ｐ＜０．０５）が、５００．０ｎＭというＩＣ50を伴って、１０．０ｎＭという低濃度で観察された（ｐ＜０．０５）。９０％阻害よりも大きなもの（＞１ｍＭ脂質過酸化形成）が併用では１０．０(Ｍという濃度で観察された（図２）。サブマイクロモル値で阻害が観察されたという事実は、ＡＭＬとＡＴＭの併用で観察された利点は治療的関連性があるということを示している。
【００１４】
その併用の抗酸化効果は、濃度を上昇させても（１０．０(Ｍ）ビタミンＥによっては再現することができなかったやり方で、時間的経過にわたって持続した（図３）。この観察は、脂質過酸化プロセス時にビタミンＥあるいは(−トコフェノールが漸次消費されるという考え方に合致している。対照的に、ＡＭＬ／ＡＴＭ併用の活性は、総脂質過酸化レベルが７２時間経過時点で２．２ｍＭに増加したインキュベーション期間の長さによって影響を受けた。
【００１５】
ＡＴＭとＡＭＬの併用は、ＡＭＬとＡＴの併用よりも脂質過酸化形成を阻害するに当たって有意にさらに効果的であった。１００．０ｍＭと１．０(Ｍのレベルでは、ＡＴＭとＡＭＬの併用の効果は、ＡＭＬとＡＴの併用に関して観察されたものよりも、それぞれ、４５％と８６％大きかった。その付加ヒドロキシ基により媒介されるＡＴＭの増加極性は、形式的に荷電されたＡＭＬによってさらに強い相互作用を促進する場合があり、ｘ線回析分析により証拠立てられているように、リン脂質分子とのはっきりとした相互作用へとつながっていく。ＡＴＭと関連性のある付加ヒドロキシ基はまた、フリーラジカル分子に付与することができる付加的に引抜き可能な陽子を供与することができる（図４）。その陽子を失った後、残りの不対遊離電子は、図４に図示されているように、その代謝物の共鳴構造において効果的に安定化することができる。ＡＴＭとのＡＭＬの併用という場合のはっきりと区別の付く抗酸化活性は、図５に図示されているように、ＡＭＬが２つの他のスタチン類（メバスタチンとロバスタチン）のそれぞれと併用された場合には、同様の効果を再現することができなかったという観察により示される。
【００１６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究調査の結果では、心血管罹患率と死亡率、特にＣＡＤを減らすのに当たって、親油性抗酸化薬にとって重要な役割が示されている。酸化損傷に対してより大きな抵抗力を有するＬＤＬ粒子は、細胞毒性が軽減されることを示し、内皮由来硝酸産生には少ししか干渉せず、また、泡沫細胞形成には寄与していない（Ｄｉａｚ  ＭＮ，  Ｆｒｅｉ  Ｂ，  Ｖｉｔａ  ＪＡ，  Ｋｅａｎｅｙ  ＪＦ．  「抗酸化薬剤とアテローム硬化症心疾患（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．）」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９７；  ３３７：  ４０８−４１６）。抗酸化薬剤の補充は、酸化修飾に対するＬＤＬ抵抗力を増加させ、また、内皮細胞の細胞毒性を軽減することが示されている（Ｂｅｌｃｈｅｒ  ＪＤ，  Ｂａｌｌａ  Ｊ，  Ｂａｌｌａ  Ｇら、「ビタミンＥ、ＬＤＬ、そして内皮。短期経口ビタミン補充によりｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酸化ＬＤＬ媒介血管損傷を防ぐ（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ，  ＬＤＬ，  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｂｒｉｅｆ  ｏｒａｌ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．）」、Ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  １９９３；  １３：１７７９−１７８９）。プロブコールは、親油性抗酸化薬剤であるが、コレステロールを加えた霊長類でアテロームプラークの形成を減衰させ、酸化損傷に対するＬＤＬの増加抵抗力に相関している効果を有している（Ｓａｓａｈａｒａ  Ｍ，  Ｒａｉｎｅｓ  ＥＷ，  Ｃｈａｉｔ  Ａら、「プロブコールＩ．による非霊長類における高コレステロール血症誘発アテローム硬化症。アテローム硬化症の程度は酸化に対するＬＤＬの抵抗力に関係しているのか（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｔｈｅｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｂｙ  ｐｒｏｂｕｃｏｌ．  Ｉ．  Ｉｓ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ＬＤＬ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ？  ）」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９４；  ９４：１５５−１６４）。これは、コレステロール低下効果とは無関係に、アテローム硬化症のうまく特徴付けられた動物モデルであるワタナベ遺伝的高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギにおける病変部の形成を、この抗酸化薬剤は阻害した（Ｃａｒｅｗ  ＴＥ，  Ｓｃｈｗｅｎｋｅ  ＤＣ，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄ．  「その低コレステロール血症効果とは無関係なプロブコールの抗アテローム発生効果：ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗酸化がマクロファージに富む脂肪線条における低密度リポタンパク質分解を選択的に阻害することができ、またワタナベ遺伝性高脂血症ウサギにおけるアテローム硬化症の進行を遅くする証拠（Ａｎｔｉａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｂｕｃｏｌ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃａｎ  ｓ���ｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｒｉｃｈ  ｆａｔｔｙ  ｓｔｒｅａｋｓ  ａｎｄ  ｓｌｏｗ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗａｔａａｂｅ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ  ｒａｂｂｉｔ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８７；  ８４：  ７７２５−７７２９）。こうした動物研究を超えて、プラシーボ対照臨床研究では、プロブコールは、おそらくその抗酸化効果による冠状動脈バルーン血管形成後ＣＡＤ患者で４７％再狭窄を減らした（Ｔａｒｄｉｆ  ＪＣ，  Ｃｏｔｅ  Ｇ，  Ｌｅｓｐｅｒａｎｃｅ  Ｊら、「冠状動脈血管形成後再狭窄の予防におけるプロブコールと総合ビタミン。総合ビタミンとプロブコール研究グループ（Ｐｒｏｂｕｃｏｌ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｖｉｔａｍｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｏｎｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ．  Ｍｕｌｔｉｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｕｃｏｌ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９７；  ３３７：  ３６５−３７２）」）。１つの別の研究では、抗酸化ビタミンとは異なり、プロブコールは、血管内超音波技術によって測定される、血管形成を受けた患者の血管リモデリングに対する利点のある効果を有していたことが示されている（Ｃｏｔｅ  Ｇ，  Ｔａｒｄｉｆ  Ｊ−Ｃ，  Ｌｅｓｐｅｒａｎｃｅ  Ｊら、「冠状動脈血管形成後血管リモデリングに対するプロブコールの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｂｕｃｏｌ  ｏｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９９；  ９９：  ３０−３５）」）。
【００１７】
このように、入手可能なデータを概説することにより、ＣＡＤに関係している炎症性プロセスに干渉するために親油性抗酸化薬剤の使用に関する機構的な理論的根拠が提供される。酸化損傷に対するＬＤＬおよび血管細胞膜の抵抗力を増加することにより、抗酸化活性を有する薬剤は、アテローム発生時に血管壁における病理学的改変を効果的に干渉することが可能である。これらのプロセスには、気泡細胞形成、内皮機能不全および毒性、白血球および血小板粘着、および動脈血管攣縮、二次的な正常一酸化窒素の喪失が含まれるが、しかしそれらには限定されない。これらの細胞の観察が、ある種の抗酸化薬剤の血清レベルと冠状動脈疾患に関係した有害アウトカムの間にある逆の関連性を示す疫学的な分析を支持している（Ｓｔａｍｐｆｅｒ  ＭＪ，  Ｈｅｎｎｅｋｅｎｓ  ＣＨ，  Ｍａｎｓｏｎ  ＪＥ，  Ｃｏｌｄｉｔｚ  ＧＡ，  Ｒｏｓｎｅｒ  Ｂ，  Ｗｉｌｌｅｔｔ
ＷＣ．  「女性におけるビタミンＥ消費と冠状動脈疾患のリスク（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ．）」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９３；  ３２８：１４５０−１４５６；  Ｒｉｍｍ  ＥＢ，  Ｓｔａｍｐｆｅｒ  ＭＪ，  Ａｓｃｈｅｒｉｏ  Ａ，  Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ  Ｅ，  Ｃｏｌｄｉｔｚ  ＧＡ，  Ｗｉｌｌｅｔｔ  ＷＣ．  「男性におけるビタミンＥ消費と冠状動脈疾患のリスク（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｍｅｎ．）」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９３；  ３２８：  １４５０−１４５６；  Ｅｎｓｔｒｏｍ  ＪＥ，  Ｋａｎｉｍ  ＬＥ，  Ｋｌｅｉｎ  ＭＡ．  「米国人口のサンプルにおけるビタミンＣ摂取と死亡率（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｍｏｎｇ  ａ  ｓａｍｐｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．）」、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  １９９２；  ３：１９４−２０２；  Ｒｉｅｍｅｒｓｍａ  ＲＡ，  Ｗｏｏｄ  ＤＡ，  Ｍａｃｉｎｔｙｒｅ  ＣＣ，  Ｅｌｔｏｎ  Ｒ，  Ｇｅｙ  ＫＦ，  Ｏｌｉｖｅｒ  ＭＦ．  「低血漿ビタミンＥとＣ。スコットランド人男性におけるアンギナ増加リスク（Ｌｏｗ  ｐｌａｓｍａ  ｖｉｔａｍｉｎｓ  Ｅ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｎｇｉｎａ  ｉｎ  Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  ｍｅｎ．）」、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９８９；  ５７０：２９１−２９５；  Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｊ，  Ｆｌｏｗｅｒｓ  ＮＣ．  「ヒトにおける白血球アスコルビン酸および冠状動脈疾患との関係（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｍａｎ．）」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  １９８０；  ３３）２０７９−２０８７；  Ｈｅｎｎｅｋｅｎｓ  ＣＨ，  Ｂｕｒｉｎｇ  ＪＥ，  Ｍａｎｓｏ  ＪＥら、「悪性新生物と心血管疾患の発生率に対する(カロチンの長期補充効果の欠乏（Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｅｔａ  ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．）」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９９６；  ３３４：１１４５−１１４９；  Ｌｏｓｏｎｃｚｙ  ＫＧ，  Ｈａｒｒｉｓ  ＴＢ，  Ｈａｖｌｉｋ  ＲＪ．  「高年齢者におけるビタミンＥとビタミンＣ補助使用法と全原因のリスクと冠状動脈心疾患死亡率：高年齢者の疫学的研究に関して確定している人口集団（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｌｌ−ｃａｕｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ｐｅｒｓｏｎｓ：  Ｔｈｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｄ���ｒｌｙ．）」、Ａｍ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９９６；６４：１９０−１９６））。これらの疫学的研究のいくつかは、ビタミンＥ、酸化修飾に干渉する限定された能力を備えた抗酸化薬剤に関する利点を示している。この研究の結果では、ＡＭＬとＡＴＭの併用が、ＣＡＤに関連している血管損傷を減らすのに当たって、ビタミンＥよりも有意にさらに効果的であることが予測される。
【００１８】
ヒトＬＤＬにおけるヒドロキシアトルバスタチン代謝物とのアムロジピンの相乗抗酸化効果：ＡＭＬとＡＴＭの個別と併用抗酸化効果もまた、ヒトＬＤＬ製剤において評価された。ＬＤＬ過酸化を阻害するためのこれら薬剤の能力は、脂質過酸化のマーカーであるチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）の値を測定することにより、銅の添加（１０．０(Ｍ）後にｉｎ  ｖｉｔｒｏにて評価された。図６は、ＬＤＬ酸化の速度が、鋭い伸長と最終的なプラトー相により引き継がれる、開始ラグ相に始まるＳ字形の曲線運動により特徴付けられていることを示している（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ  Ｈ，  Ｇｅｂｉｃｋｉ  Ｊ，Ｐｕｈｌ  Ｈ，  Ｊｕｒｇｅｎｓ  Ｇ．  「ＬＤＬの酸化修飾における脂質過酸化と抗酸化薬剤の役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ
ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＤＬ．）」、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９９２；  １３：３４１−３９０）。４時間のインキュベーション期間後に、これらの化合物の示差的な効果を、３．０(Ｍという濃度で明確に観察することができた。対照脂質過酸化（１００％ＴＢＡＲＳ形成）に比較すると、ＡＭＬとＡＴＭについてのＴＢＡＲＳ形成はそれぞれ９３．３(６％および６５．６(７％であった。しかし、併用すると、ＴＢＡＲＳ形成は２９．３(６％であり、いずれかの薬剤単独について観察されたものよりも有意に低い値（ｐ＜０．０１）であった。併用の相乗的抗酸化効果は６時間の時点では持続していた。その薬剤の併用が、実質的にその予想されていた付加効果を超えていた阻害の値を生み出したように、これらの発見により、膜小胞において観察されたものと合致する相乗活性のさらなる証拠がもたらされる。ビタミンＥの抗酸化活性は、これら実験におけるＡＴＭ単独について観察されたものと同様であった。
【００１９】
アムロジピンとアトルバスタチン代謝物の相乗活性に関する化学的メカニズム：ＬＤＬにおけるこの薬剤の併用に関して観察される相乗的な抗酸化活性と再構成された脂質膜により、脂質ラジカルを除去するため、これらの化合物は互いに直接的に相互作用することを示唆している。
【００２０】
熱力学的考察に基づいて（図７）、式２に説明されているように、ＡＭＬよりも、ＡＴＭは脂質ラジカル（式１）とさらに急速に反応することが提案されている。これらは、その系に一緒に加えられたときに、その薬剤に有用なたった２つの経路しかない場合、その場合には、その併用効果は単に付け加えられたものである。しかし、両方の化合物の併用は、ＬＤＬと脂質膜の両方における過酸化実験の結果により支持されている代替案である第３の経路についての可能性（式３）をもたらす。経路１と３の併用は、それが経路２よりもさらに急速に発生するので、相乗効果を産み出すことであろう。実際に、半分は経験的な計算においては、反応３は好適なものであり、発熱性のプロセスであることが示唆されている（(Ｈf＝−４０．７ｋＪ／ｍｏｌ）。このように、速効性の阻害薬剤（ＡＴＭ）の存在により、それ自体の上でその脂質ラジカルと反応する場合よりも遅効性の阻害薬剤がさらに速効にフリーラジカルを除去することができるようにする。こうした相互作用を説明しているその３つの経路は以下のようなものであり、そこでは、ＬＯＯ・は脂質ラジカルを表わす。すなわち、
（１）ＬＯＯ・＋ＡＴＭ→ＬＯＯＨ＋ＡＴＭ・      速効性
（２）ＬＯＯ・＋ＡＴＭ→ＬＯＯＨ＋ＡＴＭ・      遅効性
（３）ＡＴＭ・＋ＡＭＬ→ＡＴＭ＋ＡＭＬ・        速効性
ＡＭＬとＡＴＭの間のこの相乗の結果として、リサイクルされた代謝物がここでは脂質ラジカルの付加的な除去用に有効である。総体的に、ＡＭＬとＡＴＭの間の阻害速度における差は、部分的に、これらの化合物とそれらの各々のラジカルに関して計算されたエンタルピーに基づいている（図７）。(Ｈf値が小さければ小さいほど（すなわち、より負であればあるほど）、それだけラジカル形成に関連している水素引抜きが好ましいものになる。一旦形成されると、ラジカル種に関連性のある不対ラジカルを共鳴構造のなかで安定化させることができる。
【００２１】
アムロジピンとアトルバスタチン／アトルバスタチン代謝物の分子膜相互作用：小角Ｘ線回析アプローチが、ＡＭＬとＡＴＭ併用の分子膜相互作用を調べるために使用された。この高度に定量的な技術は、薬剤が存在しない場合、および存在する場合で、膜脂質二重層の構造についての直接的な情報を提供する。ＡＭＬは、その他のＣＣＢに比較した場合に、アテローム硬化状態で膜脂質（Ｋｐ＞１０3）に対する高度な親和性を有していることが以前に報告されている（Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｍｏｉｓｅｙ  ＤＭ，  Ｓｈａｊｅｎｋｏ  Ｌ．  「コレステロールは、膜脂質二重層に対するＣａ2+  チャンネルブロッカーの結合を変化させる（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｌｔｅｒｓ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａ2+  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ．）」、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １９９２；  ４１：  ３１５−３２１）。ＡＭＬの明確な親油性は、私の実験室により以前に詳細に説明されているように、生物物理学的および生物化学的メカニズムの両方によりその後にフリーラジカルの増殖に干渉することができる膜の利得的な位置にその分子を導入するその両親媒性化学的構造に帰せられる（Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｌｅｄｄｓ  ＰＲ，  Ｊａｃｏｂ  ＲＦら「小脳下流細胞におけるカルシウムアンタタゴニストアムロジピンおよび抗酸化薬剤による神経細胞の過剰アポトーシスの阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌｓ．）」、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  １９９９；  ７２：  １４４８−１４５６；Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｍｏｉｓｅｙ  ＤＭ，  Ｓｈａｊｅｎｋｏ  Ｌ．  「コレステロールは、膜脂質二重層に対するＣａ2+  チャンネルブロッカーの結合を変化させる（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｌｔｅｒｓ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａ2+ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ．  ）」、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １９９２；  ４１：  ３１５−３２１；  Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＳＦ，  Ｗａｎｇ  ＳＤ，  Ｈｅｒｂｅｔｔｅ  ＬＧ．  「心膜におけるこのクラスの非荷電薬剤と、正に荷電した１，４−ジヒドロピリジンカルシウムチャンネルアンタゴニストアムロジピンの位置と結合の比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  １，４−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｕｎｃｈａｒｇｅｄ  ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｃｌａｓｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．）」、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８９；  ３６：６３４−６４０；  Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｗａｌｔｅｒ  ＭＦ，  Ｔｒｕｍｂｏｒｅ  ＭＷ，  Ｏｌｍｓｔｅａｄ  Ｊｒ．  ＥＧ，  Ｍａｓｏｎ  ＰＥ．  「荷電ジヒドロピリジンカルシウムアンタゴニストアムロピジンの膜抗���化効果（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ．）」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９９；  ３１：  ２７５−２８１）。コレステロールで富化されていない膜において、その他のＣＣＢあるいはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬剤であるカプトプリルにより再現することができなかったやり方でアムロジピンは脂質過酸化を阻害した（Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｗａｌｔｅｒ  ＭＦ，  Ｔｒｕｍｂｏｒｅ  ＭＷ，  Ｏｌｍｓｔｅａｄ  Ｊｒ．  ＥＧ，  Ｍａｓｏｎ  ＰＥ．  「荷電ジヒドロピリジンカルシウムアンタゴニストアムロピジンの膜抗酸化効果（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｍｐｌｏｄｉｐｉｎｅ．）」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９９；  ３１：  ２７５−２８１）。同じやり方で、私の実験室により最近報告されているように、アトルバスタチン代謝物の化学的構造はその薬剤が膜脂質二重層と相互作用を強力に行うことを可能にした両親媒性特性を有する（Ｍａｓｏｎ  ＲＰ．  「アトルバスタチンとその活性代謝物による低密度リポタンパク質と分離膜に対する酸化損傷の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｂｙ  ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ．）」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２０００；  ３５：３１７Ａ）。
【００２２】
これらの研究に関しては、ＡＭＬとＡＴＭの併用は、０．５：１モル比で、コレステロールとリン脂質から再構築された膜小胞に加えられた（図８）。膜サンプルのｘ線回析分析では、典型的な対照と薬剤含有サンプルに関しては、強力でまた再現可能な回析パターンが作り出された。薬剤が無い場合、表面水和物を含む全体的な膜二重層幅が、４４Åという二重層間頭部分離によって、５５．５Åとなった。個別に添加されたに比較すると、１：１５という薬剤対リン脂質の比でその２つの薬剤を一緒に添加することにより、そのリン脂質二重層の構造と組織に明確な変化を生み出している（図８）。薬剤併用を行っている場合は、表面水和物を含む全体的な膜二重層の幅は４１Åという二重層間頭部分離により５３．５Åに減少した。個別に、ＡＭＬとＡＴＭを単独で含有していた膜の膜二重層の幅は、それぞれ５４．８Åと５８．０Åであった（図９）。これらの構造上の発見により、それらの個別の効果と比較すると、これらの薬剤の併用は、脂質分子の構造を差次的に調節するという直接的な証拠が提供されている。
【００２３】
膜電子密度プロフィールの直接減算（Å対電子数／Å3）では、それら薬剤の存在に帰することができた脂質構造における大きな差異が提示された（図８）。特に、薬剤の併用の添加によって、その二重層の中央から上部炭化水素コア／膜二重層の水和頭部領域、(１１〜２１Åに関連している電子密度では広範な増加が生み出された。１０Åにわたって分布している電子密度におけるこの大幅な増加は、膜における薬剤の平衡位置に帰することができる。この変化に付随して、膜の中央炭化水素コア領域、(０〜１１Åに関係して無秩序なものにしている効果が観察された。この電子密度における減少は、膜炭化水素コア／水インターフェイス近傍の高分子密度領域の中への薬剤分子の挿入から結果的に生じる分子容の増加によるものである。したがって、膜二重層の中へ薬剤併用を挿入することにより、コレステロール含量を減少させる、あるいはサンプル温度を増加させるかのいずれかにより観察されるものと同様のやり方でリン脂質分子の分子間充填制約を改変する（Ｔｕｌｅｎｋｏ  ＴＮ，  Ｃｈｅｎ  Ｍ，  Ｍａｓｏｎ  ＰＥ，  Ｍａｓｏｎ  ＲＰ．  「動脈平滑筋膜に対するコレステロールの物理的な効果：アテローム発生時の二重層の幅における不混和性コレステロールドメインおよび改変（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｎ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｗｉｄｔｈ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．）」、Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ．  Ｒｅｓ．  １９９８；  ３９：９４７−９５６；  Ｃｈａｎ  ＨＭ，  Ｒｅｉｔｓｔｅｔｔｅｒ  Ｒ，  Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｇｒｕｅｎｅｒ  Ｒ．  「コレステロールによるチャンネル運動と導率の減衰：構造応力を統一する一つの概念として用いた１つの解釈（Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：  Ａｎ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｓ  ａ  ｕｎｉｆｙｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔ．）」、Ｊ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．  １９９５；  １４３：５１−６３））。生物物理学的特性におけるこうした変化により、脂質二重層マトリックスを通してフリーラジカルの増殖に干渉することが示されている（ＭｃＬｅａｎ  ＬＲ，
Ｈａｇａｍａｎ  ＫＡ．  「リポソームの過酸化速度に対する脂質の物理的状態（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．）」、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９９２；  １２：  １１３−１１９））。
【００２４】
個別に、構成要素であるリン脂質分子との特異的相互作用により、その薬剤の併用と比較すると、膜構造における明確な変化をＡＭＬとＡＴＭはもたらす（図８と９）。全体的な膜幅における２Åあるいは４％減少（ｐ＜０．０１）をもたらす一方で、ＡＴＭは個別に、幅（２．５Å）における５％の増加を生み、一方、ＡＭＬ単独では、二重層間頭部分離を含めた膜寸法を有意に変えることはなかった。ＡＭＬ単独と比較すると、ＡＴＭは炭化水素コア電子密度におけるより大きな減少を生んだ。膜構造に対するこの効果は、ＡＭＬに比較すると、そのより大きな抗酸化能力に帰することができる。ＡＭＬとＡＴＭの併用は、膜におけるそれら個別の位置に加えて、膜脂質二重層との相互作用の新たな部位をもたらす（図８）。
【００２５】
したがって、本発明は、アムロジピンとアトルバスタチン化合物から成る製薬組成物に関する。これらの個々の製薬薬剤は、最大治療反応を生み出すように、併用して、あるいは個別に、塩類として、さまざまな形態および投与方法において製剤化することができる。この併用治療法は、高血圧、高脂血症、アテローム硬化症、動脈硬化、冠状動脈疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中および狭心症に限定されるわけではないが、それらを含む動脈および関連心疾患に関するさまざまな病理生理学的症状を治療するために設計されている。特に、この併用治療法は、動脈弱体化およびプラーク沈着に限定されるわけではないが、それらを含むその調節が欠如している関連病理生理学的結果とともに、血圧および全身性脂質濃度を低下させるために設計される。動脈と関連心疾患に関するこれらのさまざまなプロセスと出来事に対するこれら個々の薬剤の効果は、併用で使用される場合には、付加的および／または相乗的なものになり得る。
【００２６】
前記開示の文面ならびに精神と一致しており、また本発明の本明細書と添付の請求項の範囲内にあるその他の実施態様、改良、詳細および使用法は作成することができる。
【００２７】
【実験方法】
ジリノレオイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ），１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）とエステル化されていないコレステロールは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社（アラバマ州アラバスター市）から入手されたもので、−８０℃にて保存された。ヒト血漿からのＬＤＬ（Ｌ−２１３９）のアリコートは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州セントルイス市）から入手されたものである。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｍ  （ＰＤ−１０）カラムはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ市）から購入されたものである。ベシル酸アムロピジンはＰｆｉｚｅｒ中央研究所（コネチカット州Ｇｒｏｔｏｎ市）から入手され、一方、アトルバスタチンカルシウムとそのヒドロキシ代謝物はＰａｒｋ  Ｄａｖｉｓ  （ミシガン州Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ市）により提供されたものである。ビタミンＥはトロロックス（ビタミンＥ類似体）、ロバスタチンおよびメバスタチンはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州セントルイス市）から購入されたものである。
【００２８】
膜脂質過酸化分析：これら薬剤の個別および併用による投与依存性抗酸化活性が、０．５コレステロール対リン脂質モル比で作成されたＰＵＦＡにより富化された膜において調べられた（Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｗａｌｔｅｒ  ＭＦ，  Ｔｒｕｍｂｏｒｅ  ＭＷ，  Ｏｌｍｓｔｅａｄ  Ｊｒ．  ＥＧ，  Ｍａｓｏｎ  ＰＥ．  「荷電ジヒドロピリジンカルシウムアンタゴニストアムロピジンの膜抗酸化効果（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ．）」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９９；  ３１：  ２７５−２８１）。これらのサンプルに使用される脂質（ジリノレオイルホスファチジルコリンとコレステロール）は、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィ）−グレードのクロロホルム（２５．０  ｍｇ／ｍｌ）で溶解された。脂質のアリコート（１．０ｍｇ）が個々の１３(１００ｍｍガラス製試験管に加えられ、またクロロホルムが、Ｎ2ガスの定常流下での多管円筒形乾燥法により除去された。その脂質はエタノールに溶解された薬剤（複数）が存在する場合あるいはその存在下で乾燥された。そのサンプルが光から遮光されている間に残留溶媒は真空下で除去された。膜小胞は、１．０ｍｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（０．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳと１５４．０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ７．２）を加えた後、室温にて乾燥させた脂質を急速に混合させることにより産生された。最終的なリン脂質濃度は１．０ｍｇ／ｍｌ緩衝液であって、また、薬剤の最終濃度は１０．０ｎＭ乃至１０．０(Ｍの範囲であった。
【００２９】
膜脂質過酸化は、以前に詳細に説明されているように、外因性刺激因子を加えることなく振とう水槽の中で３７℃にて実施された（Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｗａｌｔｅｒ  ＭＦ，  Ｔｒｕｍｂｏｒｅ  ＭＷ，  Ｏｌｍｓｔｅａｄ  Ｊｒ．  ＥＧ，  Ｍａｓｏｎ  ＰＥ．  「荷電ジヒドロピリジンカルシウムアンタゴニストアムロピジンの膜抗酸化効果（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ．）」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９９９；  ３１：  ２７５−２８１）。さまざまな時間間隔（２４、４８、６５および７２時間）で、５．０  ｍＭの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の２５(ｌと、３５．０  ｍＭの濃度のブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）の２０(ｌが過酸化反応を停止させるためにそのサンプルに即座に加えられる前に、脂質サンプルのアリコート（１０〜１００(ｌ）が除去された。
【００３０】
膜脂質過酸化の程度は、以前に詳細に説明されているように、ＣＨＯＤ−Ｉヨウ化物により測定された（Ｅｌ−Ｓａａｄａｎｉ  Ｍ，  Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ  Ｈ，  ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  Ｍ，  Ｇｏｈｅｒ  Ｍ，  Ｎａｓｓａｒ  ＡＹ，  Ｊｕｒｇｅｎｓ  Ｇ．  「市販されていて入手可能な試薬を用いた血清リポタンパク質における脂質過酸化に関する分光光度測定（Ａ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｒｅａｇｅｎｔ．）」、Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ．  Ｒｅｓ．  １９８９；  ３０：  ６２７−６３０）。Ｌがリン脂質分子を表わす以下の反応からＩ3-が定量化された。すなわち、
ＬＯＯＨ  ＋  ２Ｈ+ ＋  ２Ｉ- →  ＬＯＨ  ＋  Ｈ2Ｏ  ＋  Ｉ2
Ｉ2 ＋Ｉ-→Ｉ3-
膜サンプルのアリコートは、さまざまな時点で除去され、またその後に、２０．０(ＭＢＨＴ，  ２４．０(Ｍ  ＥＤＴＡおよび０．２％  トリトン−Ｘを含む１．０  ｍｌ  のＣＨＯＤ呈色試薬（Ｅ．Ｍ．Ｓｃｉｎｅｃｅ社、ニュージャージー州Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ市）に加えられた。サンプルはその後、ホイールで覆われて、３６５ｎｍ（ ＝２．４  ｘ  １０4  Ｍ-1ｃｍ-1）でそのサンプルの吸光度を測定する前に、光が存在しない状態で２時間インキュベートすることが許容された。そのバックグラウンドサンプルは、３通りで試験サンプルに沿って走行させたが、また、０．６５２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ７６．７(ｌと５．０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２０(ｌおよびＤＤＩ水３．３(ｌがそれには含まれている。脂質過酸化の程度は、各薬剤濃度について３通りで測定され、また薬剤を含有していない対照サンプルと比較した。これらの実験の統計的な有意性は、非対ｔ−検定により評価された。有意性はｐ＜０．０５で認められた。
【００３１】
ＬＤＬ酸化測定：脂質膜に加えて、ＡＭＬとＡＴＭの抗酸化活性がヒトＬＤＬで評価された。ヒト血漿から得られたＬＤＬサンプルのＥＤＴＡ含量がＰＤ−１０  Ｘｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５−Ｍろ過カラムを用いたゲル濾過により除去された。ＰＢＳ（窒素除去されたもの）が溶出液として使用された。ＬＤＬサンプル（５０(ｇタンパク質／ｍｌ）がその後に、薬剤（３．０(Ｍ）とともに、あるいは薬剤無しで、３０分間３７℃にてプレインキュベートされた。ＬＤＬの酸化はその後に、１０．０(Ｍ  ＣｕＳＯ4を加えることにより誘導された。ＴＢＡＲＳ形成により測定されたＬＤＬ酸化の時間経過は、６時間３７℃にて継続された（Ｍａｋ  ＩＴ，  Ｋｒａｍｅｒ  ＪＨ，  Ｗｅｇｌｉｃｋｉ  ＷＢ．  「脂質両親媒性化合物による筋細胞膜に対するフリーラジカル誘導脂質過酸化損傷の増強（Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ．）」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８６；  ２６１：  １１５３−１１５７）。ＴＢＡＲＳ法により測定されたＬＤＬ酸化は、開始ラグ相ではＳ字形曲線運動となり、その後は鋭い伸長と最終的なプラトー相が続く（Ｅｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ  Ｈ，  Ｇｅｂｉｃｋ  Ｊ，  Ｐｕｈｌ  Ｈ，  Ｊｕｒｇｅｎｓ  Ｇ．  「ＬＤＬの酸化修飾における脂質過酸化と抗酸化薬剤の役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＤＬ．）」、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９９２；  １３：３４１−３９０）。ＬＤＬのタンパク質含量は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から得たクーマシータンパク質プラス測定キットを使用して測定された（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ．  「タンパク質色素結合の原理を利用してタンパク質のマイクログラム量の定量化に関する迅速で感受性の高い方法（Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．）」、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９７６；  ７２：２４８−２５４）。
【００３２】
小角Ｘ線回析分析：小角Ｘ線回析分析は、ＡＭＬ、ＡＴおよびＡＴＭの分子膜相互作用を直接調べるのに使用された。これらのサンプルに使用される脂質（１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンとコレステロール）がＨＰＬＣ−グレードのクロロホルム（１０．０ｍｇ／ｍｌ）の中で溶解された。膜小胞は、過酸化実験に関して説明されたのと同じ方法によりこれらの脂質から産生された。最終的なリン脂質濃度は５．０ｍｇ／ｍｌ緩衝液であって、また薬剤対リン脂質のモル比は１：１５であった。膜サンプルは、以前に説明されているように、遠心分離にそれらサンプルをかけることにより、回析分析のためにその分子が配向された（Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＤＷ，  ｈｅｒｂｅｔｔｅ  ＬＧ，  Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｊｏｓｌｙｎ  ＡＦ，  Ｔｒｉｇｇｌｅ  ＤＪ，  Ｋｏｐｐｅｌ  ＤＥ．  「心筋細胞膜脂質多二重層におけるジヒドロピリジンカルシウムチャンネルアンタゴニストの拡散（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｔａｇｏｓｉｓｔｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｍｕｌｔｉｂｉｌａｙｅｒｓ．）」、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  １９８７；  ５２：１０２１−１０３０）。手短に言うと、小胞はアルミニウムホイール基板を含んだ沈降細胞の中に置かれた。その小胞は３５，０００  ｘ  ｇ  で１．５時間５℃にてＳＷ−２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カリフォルニア州Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ市）で沈降させた。遠心分離後、その上清はペレットから除去され、またそのサンプルはその後、曲げられたガラス支持体上に戴置された。以前に詳細に説明されているように、回析実験時の相対的湿度と温度を制御するために、サンプルは密封されたキャニスターの中に戴置された（Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＤＷ，  Ｈｅｒｂｅｔｔｅ  ＬＧ，  Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｊｏｓｌｙｎ  ＡＦ，  Ｔｒｉｇｇｌｅ  ＤＪ，  Ｋｏｐｐｅｌ  ＤＥ．  「心筋細胞膜脂質多二重層におけるジヒドロピリジンカルシウムチャンネルアンタゴニストの拡散（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｔａｇｏｓｉｓｔｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｍｕｌｔｉｂｉｌａｙｅｒｓ．）」、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  １９８７；  ５２：１０２１−１０３０）。
【００３３】
Ｘ線回析実験は、高輝度回転陽極微焦点発生器（Ｒｉｇａｋｕ  Ｒｏｔａｆｌｅｘ  ＲＵ−２００、マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ市）により産生された平行化、ニッケルフィルター単色Ｘ線源（ＣｕＫ(＝１．５４Å）に対してかすめるような入射角にサンプルを整列させることにより行われた。Ｋ(1とＫ(2が成分に分解されていない線源を定義するために、単一、ニッケル被膜Ｆｒａｎｋｓ鏡から成る固定幾何学的配置ビーム線が使用された。回析データは、サンプルから１５０ｍｍの距離に置かれた１次元位置感受性電子検出器上で収集された（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、マサチューセッツ州Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ市）。各メリジオナル回析ピークは以前に説明されているように、Ｌｏｒｅｎｔｚ修正およびバックグラウンド修正された（Ｍａｓｏｎ  ＲＰ，  Ｇｏｎｙｅ  ＧＥ，  Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＤＷ，  Ｈｅｒｂｅｔｔｅ  ＬＧ．「モデルと生物学的膜におけるＢａｙ  Ｋ  ８６４４、１，４−ジヒドロピリジンカルシウムチャンネルアゴニストの区分化と位置決め（Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４，  １，４−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｇｏｎｉｓｔ，  ｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．）」、Ｂｉｏｌｐｈｙｓ．  Ｊ．  １９８９；  ５５：  ７６９−７７８）。４次数データに関する相はスエリング分析より測定された。（Ｍｏｏｄｙ  ＭＦ．  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅ  ｍｙｅｌｉｎ：  Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６３；  １４２：  １１７３−１１７）。データのフーリエ変換が、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、マサチューセッツ州Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ市）により回析データから生成された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、生理学的レベルのコレステロールを含有する膜で、脂質過酸化に対する薬剤（１００．０ｎＭ）の低治療濃度のＡＭＬとＡＴＭの相乗効果を示す。ｘは脂質過酸化のパーセント阻害であり、またｙはアムロジピン（ＡＭＬ）、アトルバスタチン代謝物（ＡＴＭ）と、１００  ｎＭのレベルでの両方（ＡＭＬ＋ＡＴＭ）の併用による治療である。値は、ｎ＝６に対する平均(標準偏差であり、＊＊＊はｐ＜０．００１対対照およびその他の治療であることを示している。
【図２】図２は、広範な濃度範囲（０．０１乃至１０．０(Ｍ）にわたるＡＭＬとＡＴＭの併用投与依存性抗酸化効果を示す。ｘは脂質過酸化のパーセント阻害であり、またｙは示されている(Ｍ濃度におけるＡＭＬとＡＴＭの併用による治療である。値は、ｎ＝６に対する平均(標準偏差であり、＊＊＊はｐ＜０．００１対対照およびその他の治療であることを示している。
【図３】図３は、同じ濃度（１０．０(Ｍ）における時間経過の関数としてビタミンＥを超えるＡＭＬ／ＡＴＭ併用の優位な抗酸化活性を示す。ｘは脂質過酸化のパーセント阻害であり、またｙは、両方とも１０(Ｍにおけるアムロジピンとアトルバスタチン代謝物、黒塗り棒グラフ、（ＡＭＬ＋ＡＴＭ）の併用による治療、あるいはビタミンＥ（Ｅ）、斜め格子模様の棒グラフ、による治療である。値はｎ＝６〜１２に対する平均(標準偏差であり、＊＊＊はｐ＜０．００１対対照およびその他の治療であることを示している。
【図４】図４は、共鳴安定化計算（棒グラフ４Ｂ乃至４Ｄ）とともに、４Ａにおける抗酸化活性に寄与するＡＴＭに関する陽子引抜き（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３）の部位を示す。
【図５】図５は、同じ濃度における異なるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬との併用時に、ＡＭＬ抗酸化活性の比較による効果を示す。ｘは脂質過酸化のパーセント阻害であり、またｙは、アムロジピンとアトルバスタチン代謝物（ＡＭＬ＋ＡＴＭ）、黒塗り棒グラフの併用による治療、アムロジピンとメバスタチン（ＡＭＬ＋ＡＴ）、黒塗り棒グラフの併用による治療、アムロジピンとメバスタチン（ＡＭＬ＋Ｍ）と斜め格子線模様の棒グラフ、あるいはアムロジピンとロバスタチン（ＡＭＬ＋Ｌ）と脂質過酸化阻害は無し、による治療であり、すべて１．０(Ｍ濃度である。値はｎ＝６〜１２に対する平均(標準偏差であり、＊＊＊は対照およびその他の治療に対してｐ＜０．００１であることを示している。
【図６】図６は、Ｔｒｏｌｏｘ  Ｃ（トロロックスＣ；可溶性ビタミンＥ）と比較した、ヒトＬＤＬサンプルにおけるＡＭＬとＡＴＭの相乗的抗酸化効果を示す。図６Ａでは、ｘは５３２  ｎｍの吸光度において測定されたチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）形成であり、またｙは時間を単位とする時間経過である。対照は実線と黒丸で示され、トロロックスＣ（可溶性ビタミンＥ）は、短い破線と逆三角黒塗りで示されており、ＡＭＬ単独は長い破線と白ダイヤモンド型矩形で示されており、またＡＴＭ単独は長いダッシュと短いダッシュが交互に並ぶ鎖線と白丸で示されており、ＡＭＬとＡＴＭは点線と黒塗り正方形で示されている。図６Ｂでは、ｘは５３２  ｎｍの吸光度において測定されたチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）形成であり、またｙはアムロジピン（ＡＭＬ）、黒塗り棒グラフ、アトルバスタチン代謝物（ＡＴＭ）、斜め格子模様棒グラフによる治療、あるいはアムロジピンとアトルバスタチン代謝物（ＡＭＬ＋ＡＴＭ）、黒塗り棒グラフの併用による治療であり、濃度は３．０(Ｍである。値は平均(標準偏差であり、＊＊＊はｐ＜０．００１対対照およびその他の治療であることを示している。
【図７】図７は、ＡＴＭ、ＡＭＬとそれらの各々のラジカル種について計算されたエンタルピーを示す。
【図８】図８は、個別対ＡＭＬとＡＴＭの併用脂質膜相互作用のＸ線回析測定を示す。ｘは相対的電子密度であり、またｙは脂質二重層の真中からのオングストローム単位の距離である。３つの図すべてにおいて、対照は実線である。図８Ａでは、ＡＭＬは点線であり、図８Ｂでは、ＡＴＭは点線であり、図８Ｃでは、ＡＭＬとＡＴＭの併用が点線となっている。各図８Ａ〜Ｃの黒塗り領域では、対照と治療電子密度プロフィールの間の電子密度が異なっている。
【図９】図９は、ｘ線回析分析により測定された膜二重層の寸法に対する個別対ＡＭＬとＡＴＭの併用効果を示す。ｘはオングストローム単位での膜の幅における変化であり、またｙはＡＭＬ、黒塗り棒グラフ、ＡＴＭ、斜め格子模様の棒グラフ、ＡＴ、黒塗り棒グラフおよびＡＭＴとＡＴＭの併用、斜め線の棒グラフ、による治療群である。値は平均(標準偏差であり、＊＊＊はｐ＜０．００１対対照およびその他の治療であることを示している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  図面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】                  （４Ａ）
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【図４】                  （４Ｂ）
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【図４】                （４Ｃ）
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【図４】                （４Ｄ）
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【図５】
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【図６】                （６Ａ）
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【図６】                  （６Ｂ）
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【図７】
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【図８】        （８Ａ）
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【図８】        （８Ｂ）
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【図８】          （８Ｃ）
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【図９】
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