(57)【要約】本発明は、単一トポロジーのポリユビキチンよりも混合トポロジーのポリユビキチンに対して大きな結合力を有する抗体、及び多重特異性抗ポリユビキチン抗体、ならびにそれらを使用する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一トポロジーのポリユビキチンよりも混合トポロジーのポリユビキチンに対して大きな結合力を有する抗体であって、前記混合トポロジーのポリユビキチンが、第１の連結及び第２の連結を含み、前記第１の連結及び前記第２の連結が、互いに異なる、前記抗体。
【請求項２】
第１の連結及び第２の連結を含む混合トポロジーのポリユビキチンに結合する多重特異性抗体であって、前記抗体が、前記第１の連結に特異的な第１の抗原認識部位及び前記第２の連結に特異的な第２の抗原認識部位を含み、前記第１の連結及び前記第２の連結が、互いに異なる、前記抗体。
【請求項３】
前記第１の連結に特異的な第１のＶＨ／ＶＬ単位及び前記第２の連結に特異的な第２のＶＨ／ＶＬ単位を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４】
ノブ・イン・ホール二重特異性抗体、ロイシンジッパーを含む二重特異性抗体、架橋した抗体対、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、一本鎖Ｆｖ二量体、三重特異性抗体、オクトパス抗体、または二重作用ＦＡｂである、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記第１の連結または前記第２の連結が、Ｋ１１連結である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記第１の連結または前記第２の連結が、Ｋ４８連結である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記第１の連結または前記第２の連結が、Ｋ６３連結である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
前記第１の連結または前記第２の連結が、Ｃ末端とＮ末端との連結である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記第１の連結及び前記第２の連結が、
ａ）Ｋ１１連結及びＫ４８連結、
ｂ）Ｋ１１連結及びＫ６３連結、
ｃ）Ｋ１１連結及びＣ末端とＮ末端との連結、
ｄ）Ｋ４８連結及びＫ６３連結、
ｅ）Ｋ４８連結及びＣ末端とＮ末端との連結、または
ｆ）Ｋ６３連結及びＣ末端とＮ末端との連結である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｃ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
ｄ）（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む第１の半抗体を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｃ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
ｄ）（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
を含む第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体の前記ＨＶＲが、前記第１の半抗体の前記ＨＶＲと同一ではない、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
第１及び第２の半抗体を含み、
ａ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、
ｂ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、
ｃ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、
（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、
ｄ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、
ｅ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、
（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、または、
ｆ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、
（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、
ｂ）配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、
ｃ）配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、または
ｄ）配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、
ｂ）配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、
ｃ）配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、または
ｄ）配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、
前記第２の半抗体の前記ＶＬ及びＶＨ配列が、前記第１の半抗体の前記ＶＬ及びＶＨ配列と同一ではない、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
第１及び第２の半抗体を含み、
ａ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、
ｂ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、
ｃ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、
ｄ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、
ｅ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、または
ｆ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列、
ｂ）配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列、
ｃ）配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列、または
ｄ）配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列、
ｂ）配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列、
ｃ）配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列、または
ｄ）配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含み、
前記第２の半抗体の前記ＶＬ及びＶＨ配列が、前記第１の半抗体の前記ＶＬ及びＶＨ配列と同一ではない、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
第１及び第２の半抗体を含み、
ａ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含むか、
ｂ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含むか、
ｃ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含むか、
ｄ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含むか、
ｅ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含むか、または
ｆ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２０】
マウス、ウサギ、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２４】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、ノブ変異を含む第１の重鎖定常領域を含み、前記第２の半抗体が、ホール変異を含む第２の重鎖定常領域を含むか、または前記第１の半抗体が、ホール変異を含む第１の重鎖定常領域を含み、前記第２の半抗体が、ノブ変異を含む第２の重鎖定常領域を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、前記ノブ変異が、Ｔ３６６Ｗ変異を含む、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、前記ホール変異が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの変異を含む、請求項２４または請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、ＩｇＧ４抗体であり、前記ノブ変異が、Ｔ３６６Ｗ変異を含む、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体が、ＩｇＧ４抗体であり、前記ホール変異が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの変異を含む、請求項２４または請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、
ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、
ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、または
ｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３０】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３１】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３３】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３４】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、
ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、
ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、または
ｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列と同一ではない、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３５】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜２９または３２〜３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３６】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜２９または３２〜３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３７】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜３１または３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３８】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜３１または３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３９】
第１及び第２の半抗体を含み、
ａ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｂ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｃ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｄ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｅ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｆ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
ｇ）前記第１及び第２の半抗体がのうちの一方が、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｈ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｉ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｊ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｋ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、または
ｌ）前記第１及び第２の半抗体のうちの一方が、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
前記第１及び第２の半抗体のうちの他方が、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４０】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号２の軽鎖配列、
ｂ）配列番号１６の軽鎖配列、
ｃ）配列番号３０の軽鎖配列、または
ｄ）配列番号４４の軽鎖配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４１】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号４の重鎖配列、
ｂ）配列番号１８の重鎖配列、
ｃ）配列番号３２の重鎖配列、または
ｄ）配列番号４６の重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜３１、３４、または３７〜４０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４２】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列、
ｂ）配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列、
ｃ）配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜３１、３４、または３７〜４０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４３】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号６の重鎖配列、
ｂ）配列番号２０の重鎖配列、
ｃ）配列番号３４の重鎖配列、または
ｄ）配列番号４８の重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜２９、３２〜３６、または３９〜４０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４４】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、
ａ）配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列、
ｂ）配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列、
ｃ）配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜２９、３２〜３６、または３９〜４０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４５】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号２の軽鎖配列、
ｂ）配列番号１６の軽鎖配列、
ｃ）配列番号３０の軽鎖配列、または
ｄ）配列番号４４の軽鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４６】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号４の重鎖配列、
ｂ）配列番号１８の重鎖配列、
ｃ）配列番号３２の重鎖配列、または
ｄ）配列番号４６の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜３１、３４、３７〜４０、または４３〜４５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４７】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列、
ｂ）配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列、
ｃ）配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜３１、３４、３７〜４０、または４３〜４５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４８】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号６の重鎖配列、
ｂ）配列番号２０の重鎖配列、
ｃ）配列番号３４の重鎖配列、または
ｄ）配列番号４８の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜３１、３４、３７〜４２、または４５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４９】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第２の半抗体が、
ａ）配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列、
ｂ）配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列、
ｃ）配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列が、前記第１の半抗体の前記軽鎖及び重鎖配列と同一ではない、請求項１〜３１、３４、３７〜４２、または４５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５０】
第１及び第２の半抗体を含み、
ａ）前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含むか、
ｂ）前記１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含むか、
ｃ）前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含むか、
ｄ）前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含むか、
ｅ）前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含むか、
ｆ）前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含むか、
ｇ）前記第１の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含むか、
ｈ）前記第１の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含むか、
ｉ）前記第１の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含むか、
ｊ）前記第１の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含むか、
ｋ）前記第１の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含むか、または
ｌ）前記第１の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、
前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５１】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５２】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項５３】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項５４】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項５５】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項５６】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項５７】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項５８】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項５９】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項６０】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項６１】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項６２】
第１及び第２の半抗体を含み、前記第１の半抗体が、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、前記第２の半抗体が、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンが、１つ以上の重鎖から欠損している、請求項１〜５０の１項に記載の抗体。
【請求項６３】
混合トポロジーのポリユビキチンへの結合について、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体と競合する、抗体。
【請求項６４】
先行請求項のいずれか１項に記載の抗体と同じ混合トポロジーのポリユビキチンのエピトープに結合する、抗体。
【請求項６５】
二重特異性抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６６】
ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディである、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６７】
標識にコンジュゲートされる、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６８】
前記標識が、蛍光、酵素、または発色標識である、請求項６７に記載の抗体。
【請求項６９】
前記標識が、放射性同位体であり、任意でポジトロン放出体であり、任意で８９Ｚｒである、請求項６７に記載の抗体。
【請求項７０】
請求項１〜６９のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物であって、単一特異性抗体、未組み立て半抗体、または単一特異性抗体及び未組み立て半抗体の両方を実質的に含まない、前記組成物。
【請求項７１】
請求項１〜６９のいずれか１項に記載の抗体と、細胞毒性剤と、を含む、免疫コンジュゲート。
【請求項７２】
薬学的に許容される担体と、
ａ）請求項１〜６９のいずれか１項に記載の抗体、または
ｂ）請求項７１に記載の免疫コンジュゲート
のうちの少なくとも１つと、を含み、任意で、前記組成物が、単一特異性抗体、未組み立て半抗体、または単一特異性抗体及び未組み立て半抗体の両方を実質的に含まない、薬学的製剤。
【請求項７３】
ａ）請求項１〜６６のいずれか１項に記載の抗体、
ｂ）請求項４０〜６６のいずれか１項に記載の抗体の第１の半抗体、または
ｃ）請求項４６〜６６のいずれか１項に記載の抗体の第２の半抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項７４】
請求項７３に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項７５】
抗体または半抗体を産生する方法であって、前記抗体または半抗体が産生されるように、請求項７３に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項７６】
請求項１〜６６のいずれか１項に記載の抗体を作製する方法であって、第１の半抗体及び第２の半抗体から前記抗体を形成することを含む、前記方法。
【請求項７７】
生体試料中の混合トポロジーのポリユビキチンを検出する方法であって、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の抗体の前記混合トポロジーのポリユビキチンへの結合を許容する条件下で、前記生体試料を前記抗体と接触させることと、前記抗体と前記生体試料中の混合トポロジーのポリユビキチンとの間に複合体が形成されたかを検出することと、を含む、前記方法。
【請求項７８】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、非ユビキチンポリペプチドに共有結合している、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、分岐状である、請求項７７または請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、非分岐状である、請求項７７または請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、第１の連結及び前記第１の連結とは異なる第２の連結を含み、前記第１及び第２の連結が各々独立して、Ｋ１１連結、Ｋ４８連結、Ｋ６３連結、またはＣ末端とＮ末端との連結である、請求項７７〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、Ｋ１１連結及び前記Ｋ１１連結とは異なる第２の連結を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、Ｋ４８連結及び前記Ｋ４８連結とは異なる第２の連結を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、Ｋ６３連結及び前記Ｋ６３連結とは異なる第２の連結を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、Ｃ末端とＮ末端との連結及び前記Ｃ末端とＮ末端との連結とは異なる第２の連結を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記混合トポロジーのポリユビキチンが、
ａ）Ｋ１１連結及びＫ４８連結、
ｂ）Ｋ１１連結及びＫ６３連結、
ｃ）Ｋ１１連結及びＣ末端とＮ末端との連結、
ｄ）Ｋ４８連結及びＫ６３連結、
ｅ）Ｋ４８連結及びＣ末端とＮ末端との連結、または
ｆ）Ｋ６３連結及びＣ末端とＮ末端との連結を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
生体試料中のポリユビキチン化タンパク質を検出する方法であって、前記ポリユビキチン化タンパク質が、２つ以上の位置において少なくとも第１及び第２のポリユビキチンでポリユビキチン化され、前記第１及び第２のポリユビキチンが、異なる連結を有し、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の抗体の前記ポリユビキチン化タンパク質への結合を許容する条件下で、前記生体試料を前記抗体と接触させることと、前記抗体と前記生体試料中のポリユビキチン化タンパク質との間に複合体が形成されたかを検出することと、を含む、前記方法。
【請求項８８】
前記第１及び第２のポリユビキチンがそれぞれ、
ａ）Ｋ１１連結及び前記Ｋ１１連結とは異なる第２の連結、
ｂ）Ｋ４８連結及び前記Ｋ４８連結とは異なる第２の連結、
ｃ）Ｋ６３連結及び前記Ｋ６３連結とは異なる第２の連結、
ｄ）Ｃ末端とＮ末端との連結及び前記Ｃ末端とＮ末端との連結とは異なる第２の連結、
ｅ）Ｋ１１連結及びＫ４８連結、
ｆ）Ｋ１１連結及びＫ６３連結、
ｇ）Ｋ１１連結及びＣ末端とＮ末端との連結、
ｈ）Ｋ４８連結及びＫ６３連結、
ｉ）Ｋ４８連結及びＣ末端とＮ末端との連結、または
ｊ）Ｋ６３連結及びＣ末端とＮ末端との連結を含む、請求項８７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／３５４，３０５号の優先権の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗ポリユビキチン多重特異性抗体及びそれらを作製及び使用する方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
ユビキチンは、幅広い細胞経路において重要な制御役割を有する小タンパク質である。これらの中でも最も良く知られているのは、タンパク質分解におけるユビキチンの役割であり、ユビキチンの標的タンパク質への共有結合により、２６Ｓプロテアソームによる標的タンパク質の認識及び破壊が可能となる（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１１（３）：１４１−１４８（２０００）を参照されたい）。７６個のアミノ酸のタンパク質であるユビキチンの標的タンパク質への共有結合は、三段階の酵素プロセスである（Ｐｉｃｋａｒｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：５０３−５３３（２００１））。第１に、ユビキチン活性化酵素Ｅ１が、ＡＴＰ依存性反応においてユビキチン−Ｅ１チオエステルを形成する。第２のステップにおいて、ユビキチンが、ユビキチン−Ｅ１チオエステルからユビキチン−コンジュゲート酵素（Ｅ２）ファミリーのメンバーへと転移される。第３のステップにおいて、ユビキチン−タンパク質リガーゼ（Ｅ３）の補助によって、ユビキチンのカルボキシル末端と標的タンパク質上のリジン残基のε−アミノ基との間にイソペプチド結合が形成される。デユビキチナーゼと称される酵素が、標的タンパク質からユビキチン部分を除去する（Ｇｕｔｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｐｅｐ．Ｓｃｉ．５：２０１−２１０（２００４））。
【０００４】
ユビキチンは、７つのリジン残基（Ｌｙｓ６、Ｌｙｓ１１、Ｌｙｓ２７、Ｌｙｓ３３、Ｌｙｓ２９、Ｌｙｓ４８、及びＬｙｓ６３）を含有し、故にユビキチン自体がユビキチン化のための標的タンパク質としての役割を果たし得る（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：９２１−９２６（２００３）、Ｐｉｃｋａｒｔ  ａｎｄ  Ｆｕｓｈｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：６１０−６１６（２００４））。ユビキチンタンパク質のユビキチン化で産生された分子は、ポリユビキチン分子と称され、２つ以上のユビキチン部分を含み得る。ユビキチン内に異なるリジン残基へのイソペプチド結合を有する異なる種のポリユビキチンが存在するように、ユビキチンのユビキチン化は、理論上、７つのリジン残基のうちのいずれでも生じ得る（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：９２１−９２６（２００３））。７つ全てのリジン残基に、内部イソペプチド連結内のポリユビキチン鎖が報告されている。Ｉｗａｉ  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｎａｇａ，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：７０６−７１３（２００９）。
【０００５】
加えて、ユビキチンのＣ末端グリシンが、別のユビキチン分子のＮ末端メチオニンのα−アミノ基にコンジュゲートされる、直鎖状ポリユビキチン連結が形成される。Ｉｗａｉ  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｎａｇａ，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：７０６−７１３（２００９）。直鎖状ポリユビキチンは、２つのｒｉｎｇフィンガータンパク質、ＨＯＩＬ−１Ｌ及びＨＯＩＰで構成される、直鎖状ユビキチン鎖組み立て複合体（ＬＵＢＡＣ）を介して形成される。Ｔｏｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１２３−１３２（２００９）。遺伝的にコードされた非アンカー直鎖状ポリユビキチンは、そのＣ末端がイソペプチダーゼＴによる切断を受け易いため、細胞内には存在しないと考えられる。Ｉｗａｉ  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｎａｇａ，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：７０６−７１３（２００９）。この観察は、直鎖状ポリユビキチンが翻訳後に基質タンパク質上に組み立てられること、及びコンジュゲートされた直鎖状ポリユビキチン分子がタンパク質活性及び機能の潜在的な調節因子であることを示唆する。同上。例えば、ＮＦ−κＢ必須調節因子（ＮＥＭＯ）の直鎖状ポリユビキチン化は、ＮＦ−κＢ活性化において役割を果たすことが示されている。同上。
【０００６】
２つ以上のＵｂ対Ｕｂ連結（３つ以上のユビキチンモノマー）を含むポリユビキチン鎖は、同種トポロジーまたは混合トポロジーを有し得る。鎖は、均一に直鎖状の（もしくはＭｅｔ１−）、Ｌｙｓ１１−、Ｌｙｓ４８−、またはＬｙｓ６３−連結鎖の場合にように、連続的な伸長ステップ中に同じ残基が修飾される場合に同種である一方で、鎖は、鎖内の異なる位置に異なる連結が存在する場合に、混合トポロジーを有する。Ｋｏｍａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｐｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：２０３−２９（２０１２）。混合鎖は、分岐状であり得（るが、必ずしもそうではなく）、同じモノマーは、少なくとも３つの異なる連結（３つの他のユビキチンモノマーへの連結、または基質ポリペプチドへの連結及び２つの他のユビキチンモノマーへの連結など）を有する。同上。混合トポロジー鎖は、ＮＦ−κＢシグナル伝達及びタンパク質輸送の文脈において報告されている。同上、その中の参考文献７〜１０もまた参照されたい。加えて、同じタンパク質は、２つ以上の位置において少なくとも第１及び第２のポリユビキチンでポリユビキチン化され得、第１及び第２のポリユビキチンは、異なる連結を有する。
【０００７】
トリプシン消化の連結を決定するための従来の方法及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、分岐鎖では実行可能であるとは考えられていない。ユビキチンの一次配列内の、Ｋ１１とＫ４８との間の追加のリジン及びアルギニン残基の後での、トリプシンによる切断は、単一ペプチド内での修飾Ｋ１１及びＫ４８の特定を妨げる。
【０００８】
分岐状ポリユビキチン鎖を検出するための間接的アプローチが、説明されている。分岐鎖の存在を実証するために、後期促進複合体／サイクロソームによって合成された連結の特異性を再プログラム化するためのキメラＥ２酵素とともに、Ｋ１１Ｒ及びＫ４８Ｒユビキチン変異体と、挿入されたＴＥＶ切断部位を含有する操作されたユビキチンとの組み合わせが使用された。Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｊ．＆Ｒａｐｅ，Ｍ．Ｃｅｌｌ  １５７，９１０−９２１（２０１４）を参照されたい。
【０００９】
混合トポロジーのポリユビキチンに結合する、かつ／または異なるポリユビキチン連結に対する特異性を有する多重特異性抗体は、混合トポロジーのポリユビキチン鎖または異なる連結を有するポリユビキチンでポリユビキチン化されたタンパク質の検出の簡略化、タンパク質分解及び制御におけるそのような鎖の更なる役割の検査の促進、混合トポロジーのポリユビキチンに関与する経路におけるその標的化及び調節、または少なくとも有用な選択肢などの利益を提供し得る。
【００１０】
多重特異性抗ポリユビキチン抗体及び免疫コンジュゲート、ならびにそれらを使用する方法が本明細書に提供される。本抗体は、免疫組織化学、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡなどの検出手順、及び機能アッセイに有用であり得る。
【００１１】
単一トポロジーのポリユビキチンよりも混合トポロジーのポリユビキチンに対して大きな結合力を有する抗体であって、混合トポロジーのポリユビキチンが、第１の連結及び第２の連結を含み、第１の連結及び第２の連結が、互いに異なる、抗体が本明細書に提供される。第１の連結及び第２の連結を含む混合トポロジーのポリユビキチンに結合する多重特異性抗体であって、抗体が、第１の連結に特異的な第１の抗原認識部位及び第２の連結に特異的な第２の抗原認識部位を含み、第１の連結及び第２の連結が、互いに異なる、抗体もまた本明細書に提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗体は、第１の連結に特異的な第１のＶＨ／ＶＬ単位及び第２の連結に特異的な第２のＶＨ／ＶＬ単位を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ノブ・イン・ホール二重特異性抗体、ロイシンジッパーを含む二重特異性抗体、架橋した抗体対、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、一本鎖Ｆｖ二量体、三重特異性抗体、オクトパス抗体、または二重作用ＦＡｂである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、第１の連結または第２の連結は、Ｋ１１連結である。
【００１４】
第１の連結または第２の連結は、Ｋ４８連結である。
【００１５】
第１の連結または第２の連結は、Ｋ６３連結である。
【００１６】
第１の連結または第２の連結は、Ｃ末端とＮ末端との連結である。
【００１７】
第１の連結または第２の連結は、Ｋ１１連結及びＫ４８連結、Ｋ１１連結及びＫ６３連結、Ｋ１１連結及びＣ末端とＮ末端との連結、Ｋ４８連結及びＫ６３連結、Ｋ４８連結及びＣ末端とＮ末端との連結、またはＫ６３連結及びＣ末端とＮ末端との連結である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本抗体は、ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｃ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、またはｄ）（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む第１の半抗体を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本抗体は、ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｃ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、またはｄ）（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む第２の半抗体を含み、第２の半抗体のＨＶＲは、第１の半抗体のＨＶＲと同一ではない。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、ａ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、ｂ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、ｃ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、ｄ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２８を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、ｅ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２８を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むか、またはｆ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、ｂ）配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、ｃ）配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、またはｄ）配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、ｂ）配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、ｃ）配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、またはｄ）配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第２の半抗体のＶＬ及びＶＨ配列は、第１の半抗体のＶＬ及びＶＨ配列と同一ではない。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、ａ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、ｂ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、ｃ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、ｄ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、ｅ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含むか、またはｆ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号３５と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列、ｂ）配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列、ｃ）配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列、またはｄ）配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列、ｂ）配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列、ｃ）配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列、またはｄ）配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含み、第２の半抗体のＶＬ及びＶＨ配列は、第１の半抗体のＶＬ及びＶＨ配列と同一ではない。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、ａ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含むか、ｂ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含むか、ｃ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含むか、ｄ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含むか、ｅ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含むか、ｆ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本抗体は、マウス、ウサギ、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ノブ変異を含む第１の重鎖定常領域を含み、第２の半抗体は、ホール変異を含む第２の重鎖定常領域を含むか、または第１の半抗体は、ホール変異を含む第１の重鎖定常領域を含み、第２の半抗体は、ノブ変異を含む第２の重鎖定常領域を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１抗体であり、ノブ変異は、Ｔ３６６Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１抗体であり、ホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの変異を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ４抗体であり、ノブ変異は、Ｔ３６６Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ４抗体であり、ホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの変異を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、またはｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｂ）配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｃ）配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、またはｄ）配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、またはｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｂ）配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｃ）配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、またはｄ）配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、またはｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、またはｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列と同一ではない。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｂ）配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｃ）配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、またはｄ）配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、またはｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｂ）配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｃ）配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、またはｄ）配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｂ）配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、ｃ）配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列、またはｄ）配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、ａ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｂ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｃ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｄ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｅ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｆ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｇ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｈ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｉ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｊ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、ｋ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号１６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、またはｌ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号３０と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９５％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号２の軽鎖配列、ｂ）配列番号１６の軽鎖配列、ｃ）配列番号３０の軽鎖配列、またはｄ）配列番号４４の軽鎖配列を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号４の重鎖配列、ｂ）配列番号１８の重鎖配列、ｃ）配列番号３２の重鎖配列、またはｄ）配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列、ｂ）配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列、ｃ）配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列、またはｄ）配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号６の重鎖配列、ｂ）配列番号２０の重鎖配列、ｃ）配列番号３４の重鎖配列、またはｄ）配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ａ）配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列、ｂ）配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列、ｃ）配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列、またはｄ）配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号２の軽鎖配列、ｂ）配列番号１６の軽鎖配列、ｃ）配列番号３０の軽鎖配列、またはｄ）配列番号４４の軽鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号４の重鎖配列、ｂ）配列番号１８の重鎖配列、ｃ）配列番号３２の重鎖配列、またはｄ）配列番号４６の重鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列、ｂ）配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列、ｃ）配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列、またはｄ）配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号６の重鎖配列、ｂ）配列番号２０の重鎖配列、ｃ）配列番号３４の重鎖配列、またはｄ）配列番号４８の重鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列とは同一ではなく、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第２の半抗体は、ａ）配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列、ｂ）配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列、ｃ）配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列、またはｄ）配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、第２の半抗体の軽鎖及び重鎖配列は、第１の半抗体の軽鎖及び重鎖配列と同一ではない。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、ａ）第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含むか、ｂ）第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含むか、ｃ）第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含むか、ｄ）第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含むか、ｅ）第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含むか、ｆ）第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含むか、ｇ）第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含むか、ｈ）第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含むか、ｉ）第１の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含むか、ｊ）第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含むか、ｋ）第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含むか、またはｌ）第１の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【００６４】
混合トポロジーのポリユビキチンへの結合について、本明細書に開示される抗体と競合する、抗体もまた本明細書に提供される。本明細書に開示される抗体と同じ混合トポロジーのポリユビキチンのエピトープに結合する、抗体もまた本明細書に提供される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、本抗体は、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディである。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本抗体は、標識にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、標識は、蛍光、酵素、または発色標識である。いくつかの実施形態において、標識は、放射性同位体であり、任意でポジトロン放出体であり、任意でポジトロン放出体であり、任意で８９Ｚｒである。
【００６７】
本明細書に開示される抗体を含む組成物であって、単一特異性抗体、未組み立て半抗体、または単一特異性抗体及び未組み立て半抗体の両方を実質的に含まない、組成物もまた本明細書に提供される。
【００６８】
本明細書に開示される抗体と、細胞毒性剤とを含む、免疫コンジュゲートもまた本明細書に提供される。
【００６９】
薬学的に許容される担体と、本明細書に開示される抗体または免疫コンジュゲートのうちの少なくとも１つとを含む、薬学的製剤もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、本組成物は、単一特異性抗体、未組み立て半抗体、または単一特異性抗体及び未組み立て半抗体の両方を実質的に含まない。
【００７０】
本明細書に開示される抗体、本明細書に開示される抗体の第１の半抗体、または本明細書に開示される抗体の第２の半抗体をコードする、単離された核酸もまた本明細書に提供される。本明細書に開示される核酸を含む、宿主細胞もまた本明細書に提供される。抗体または半抗体が産生されるように、本明細書に開示される宿主細胞を培養することを含む、抗体または半抗体を産生する方法もまた本明細書に提供される。
【００７１】
本明細書に開示される抗体を作製する方法であって、第１の半抗体及び第２の半抗体から抗体を形成することを含む、方法もまた本明細書に提供される。
【００７２】
生体試料中の混合トポロジーのポリユビキチンを検出する方法であって、抗体の混合トポロジーのポリユビキチンへの結合を許容する条件下で、生体試料を本明細書に開示される抗体と接触させることと、抗体と生体試料中の混合トポロジーのポリユビキチンとの間に複合体が形成されたかを検出することとを含む、方法もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、非ユビキチンポリペプチドに共有結合している。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、分岐状である。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、非分岐状である。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、第１の連結及び第１の連結とは異なる第２の連結を含み、第１及び第２の連結は各々独立して、Ｋ１１連結、Ｋ４８連結、Ｋ６３連結、またはＣ末端とＮ末端との連結である。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、Ｋ１１連結及びＫ１１連結とは異なる第２の連結を含む。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、Ｋ４８連結及びＫ４８連結とは異なる第２の連結を含む。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、Ｋ６３連結及びＫ６３連結とは異なる第２の連結を含む。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、Ｃ末端とＮ末端との連結及びＣ末端とＮ末端との連結とは異なる第２の連結を含む。いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンは、Ｋ１１連結及びＫ４８連結、Ｋ１１連結及びＫ６３連結、Ｋ１１連結及びＣ末端とＮ末端との連結、Ｋ４８連結及びＫ６３連結、Ｋ４８連結及びＣ末端とＮ末端との連結、またはＫ６３連結及びＣ末端とＮ末端との連結を含む。
【００７３】
生体試料中のポリユビキチン化タンパク質を検出する方法であって、ポリユビキチン化タンパク質が、２つ以上の位置において少なくとも第１及び第２のポリユビキチンでポリユビキチン化され、第１及び第２のポリユビキチンが、異なる連結を有し、抗体のポリユビキチン化タンパク質への結合を許容する条件下で、生体試料を請求項１〜６９のいずれか１項に記載の抗体と接触させることと、抗体と生体試料中のポリユビキチン化タンパク質との間に複合体が形成されたかを検出することとを含む、方法もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリユビキチンはそれぞれ、Ｋ１１連結及びＫ１１連結とは異なる第２の連結、Ｋ４８連結及びＫ４８連結とは異なる第２の連結、Ｋ６３連結及びＫ６３連結とは異なる第２の連結、Ｃ末端とＮ末端との連結及びＣ末端とＮ末端との連結とは異なる第２の連結、Ｋ１１連結及びＫ４８連結、Ｋ１１連結及びＫ６３連結、Ｋ１１連結及びＣ末端とＮ末端との連結、Ｋ４８連結及びＫ６３連結、Ｋ４８連結及びＣ末端とＮ末端との連結、またはＫ６３連結及びＣ末端とＮ末端との連結を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１ａ−ｂ】図１ａ〜ｄは、二重特異性抗Ｋ１１／Ｋ４８ポリユビキチン連結特異性抗体の操作、精製、及び特徴付け。ａ、ノブ半抗体及びホール半抗体をＣＨＯ細胞内で別個に組み換え発現させ、個々に親和性精製し、その後、インビトロで組み立てた。ｂ、精製後のノブ半抗体及びホール半抗体、ならび組み立てた二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＤＴＴの不在（−）または存在（＋）下で試料を泳動させた。ＨＬ標識は、半抗体種を表し、Ｈ２Ｌ２標識は、完全抗体を表す。還元した試料中、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を示す。ｃ、抗Ｋ１１ノブ半抗体及び抗Ｋ４８ホール半抗体、ならびに組み立てた抗Ｋ１１／Ｋ４８二重特異性抗体の分析的サイズ排除分析。ｄ、精製した抗Ｋ１１／Ｋ４８二重特異性抗体の質量分析。上部パネルは、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）の不在下のものであり、下部パネルは、ＣＰＢでの消化後のものである。
【図１ｃ−ｄ】図１ａ〜ｄは、二重特異性抗Ｋ１１／Ｋ４８ポリユビキチン連結特異性抗体の操作、精製、及び特徴付け。ａ、ノブ半抗体及びホール半抗体をＣＨＯ細胞内で別個に組み換え発現させ、個々に親和性精製し、その後、インビトロで組み立てた。ｂ、精製後のノブ半抗体及びホール半抗体、ならび組み立てた二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＤＴＴの不在（−）または存在（＋）下で試料を泳動させた。ＨＬ標識は、半抗体種を表し、Ｈ２Ｌ２標識は、完全抗体を表す。還元した試料中、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を示す。ｃ、抗Ｋ１１ノブ半抗体及び抗Ｋ４８ホール半抗体、ならびに組み立てた抗Ｋ１１／Ｋ４８二重特異性抗体の分析的サイズ排除分析。ｄ、精製した抗Ｋ１１／Ｋ４８二重特異性抗体の質量分析。上部パネルは、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）の不在下のものであり、下部パネルは、ＣＰＢでの消化後のものである。
【図２ａ】図２ａ〜ｃは、半抗体及び対照二重特異性抗体の特徴付け。ａ、抗Ｋ１１ホール半抗体及び抗ｇＤノブ半抗体、ならびに組み立てた抗Ｋ１１／ｇＤ及び抗Ｋ４８／ｇＤ二重特異性対照抗体の分析的サイズ排除分析。ｂ、親和性精製した抗Ｋ１１ノブ半抗体、抗Ｋ１１ホール半抗体、抗Ｋ４８ホール半抗体、及び抗ｇＤノブ半抗体の質量分析。各半抗体の上部パネルは、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）の不在下のものであり、下部パネルは、ＣＰＢでの消化後のものである。上部パネル内の矢印は、ＣＰＢ処理時に消失する、抗Ｋ１１ノブ半抗体、抗Ｋ１１ホール半抗体、及び抗ｇＤノブ半抗体に対する＋１２８Ｄａの付加を示し、これは、それが抗体の一部分に依然結合したままである重鎖カルボキシ末端リジンによるものであることを示す。ｃ、精製した抗Ｋ１１／ｇＤ及び抗Ｋ４８／ｇＤ対照二重特異性抗体の質量分析。各二重特異性抗体の上部パネルは、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）の不在下のものであり、下部パネルは、ＣＰＢでの消化後のものである。
【図２ｂ】図２ａ〜ｃは、半抗体及び対照二重特異性抗体の特徴付け。ａ、抗Ｋ１１ホール半抗体及び抗ｇＤノブ半抗体、ならびに組み立てた抗Ｋ１１／ｇＤ及び抗Ｋ４８／ｇＤ二重特異性対照抗体の分析的サイズ排除分析。ｂ、親和性精製した抗Ｋ１１ノブ半抗体、抗Ｋ１１ホール半抗体、抗Ｋ４８ホール半抗体、及び抗ｇＤノブ半抗体の質量分析。各半抗体の上部パネルは、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）の不在下のものであり、下部パネルは、ＣＰＢでの消化後のものである。上部パネル内の矢印は、ＣＰＢ処理時に消失する、抗Ｋ１１ノブ半抗体、抗Ｋ１１ホール半抗体、及び抗ｇＤノブ半抗体に対する＋１２８Ｄａの付加を示し、これは、それが抗体の一部分に依然結合したままである重鎖カルボキシ末端リジンによるものであることを示す。ｃ、精製した抗Ｋ１１／ｇＤ及び抗Ｋ４８／ｇＤ対照二重特異性抗体の質量分析。各二重特異性抗体の上部パネルは、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）の不在下のものであり、下部パネルは、ＣＰＢでの消化後のものである。
【図２ｃ】図２ａ〜ｃは、半抗体及び対照二重特異性抗体の特徴付け。ａ、抗Ｋ１１ホール半抗体及び抗ｇＤノブ半抗体、ならびに組み立てた抗Ｋ１１／ｇＤ及び抗Ｋ４８／ｇＤ二重特異性対照抗体の分析的サイズ排除分析。ｂ、親和性精製した抗Ｋ１１ノブ半抗体、抗Ｋ１１ホール半抗体、抗Ｋ４８ホール半抗体、及び抗ｇＤノブ半抗体の質量分析。各半抗体の上部パネルは、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）の不在下のものであり、下部パネルは、ＣＰＢでの消化後のものである。上部パネル内の矢印は、ＣＰＢ処理時に消失する、抗Ｋ１１ノブ半抗体、抗Ｋ１１ホール半抗体、及び抗ｇＤノブ半抗体に対する＋１２８Ｄａの付加を示し、これは、それが抗体の一部分に依然結合したままである重鎖カルボキシ末端リジンによるものであることを示す。ｃ、精製した抗Ｋ１１／ｇＤ及び抗Ｋ４８／ｇＤ対照二重特異性抗体の質量分析。各二重特異性抗体の上部パネルは、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）の不在下のものであり、下部パネルは、ＣＰＢでの消化後のものである。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、ＶＨは、重鎖可変ドメインを指し、ＶＬは、軽鎖可変ドメインを指す。
【００７６】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するＶＬフレームワークまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはそれは、アミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「約」は、述べられる値よりも１０％多いかもしくは少ないか、述べられる値と機能的に同等の結果をもたらすか、または述べられる値へと四捨五入される値を指す。
【００７８】
「親和性」は、ある分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野において既知である一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００７９】
「結合力」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、１つ以上の抗原を含む標的分子）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する結合力は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。二重特異性抗体は一般に、エピトープのうちのいずれかを個々に含む結合パートナーに対するよりも、二重特異性抗体の抗原結合部位の両方によって認識されるエピトープを含む結合パートナーに対する大きな結合力を有するだろう。結合力は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野において既知である一般的な方法によって測定することができる。結合力を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。「機能的親和性」という用語は、当該技術分野において、結合力を指すために使用されることがある。
【００８０】
「親和性成熟」抗体は、そのような改変を所有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の改変を有し、そのような改変により抗体の抗原に対する親和性が改善される抗体を指す。
【００８１】
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」という用語は、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの分子上の２つもしくはそれ以上の異なるエピトープに結合することができるか、または２つもしくはそれ以上の異なる分子上のエピトープに結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「アゴニスト抗体」は、対象となるポリペプチドの機能的活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
【００８３】
「アンタゴニスト抗体」または「遮断抗体」は、それが特異的に結合する抗原の生物学的活性を阻害するか、または低下させる抗体である。特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）という用語は、「免疫コンジュゲート」という用語と等しい。
【００８５】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、無傷抗体が結合する抗原に結合する、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
基準抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、基準抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する基準抗体を指す。例示的な競合アッセイが本明細書に提供される。
【００８７】
「抗混合トポロジーのポリユビキチン抗体」及び「混合トポロジーのポリユビキチンに結合する抗体」という用語は、抗体が混合トポロジーのポリユビキチンを標的とする上で診断剤及び／または治療剤として有用になるように、十分な結合力で混合トポロジー的に連結したポリユビキチンに結合することができる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗混合トポロジーのポリユビキチン抗体の無関係の非混合トポロジー的に連結したポリユビキチンタンパク質への結合の程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定される、その抗体の混合トポロジーのポリユビキチンへの結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態において、抗混合トポロジーのポリユビキチン抗体は、異なる種由来の混合トポロジーのポリユビキチン間で保存される混合トポロジーのポリユビキチンのエピトープに結合する。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「抗ポリユビキチン抗体」という用語は、ポリユビキチン分子に特異的に結合することができる抗体を指す。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「抗ユビキチン抗体」及び「抗モノユビキチン抗体」という用語は、互換的に使用され、ユビキチン分子に特異的に結合することができる抗体を指す。
【００９０】
「がん」及び「がん性」という用語は、未制御の細胞成長／増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的病態を指すか、または説明する。がんの例としては、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、ならびに白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、白血病及び他のリンパ増殖性障害、ならびに様々な種類の頭頸部癌が挙げられる。
【００９１】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００９２】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要なクラスが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「細胞毒性剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは防止する、かつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性剤としては、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアミシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、ミトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片（核酸分解酵素など）、抗生物質、毒素（細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素など）（それらの断片及び／またはバリアントを含む）、ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗がん剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因し得る生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００９５】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。
【００９６】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。
【００９７】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、存在しない場合もある。本明細書において別段明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「第１の」、「第２の」などは、複合体構造、例えば、三次／四次構造を有するタンパク質（抗体またはポリユビキチンなどの他の組み立て体など）の要素を参照して、それらの要素の順序付けまたは位置付け暗示することなく、それらの要素（例えば、モノマー、鎖、ドメイン）を指すために使用され、故に「第１の」要素は、第２の要素に対してＣ末端またはＮ末端であっても、第２の要素よりも構造の一端または別の端の近くであるか、またはそれから離れていてもよい。故に、例えば、二重特異性抗体の半分または混合トポロジーのポリユビキチン内の連結を参照して、半分または連結を第１または第２として表現することは、任意である。
【００９９】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において以下の配列、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で出現する。
【０１００】
「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書において、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために互換的に使用される。
【０１０１】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が挙げられ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
【０１０２】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を所有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【０１０３】
「ウサギ抗体」は、ウサギもしくはウサギ細胞により産生された抗体、またはウサギ抗体レパートリーもしくは他のウサギ抗体コード配列を利用する非ウサギ源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を所有するものである。
【０１０４】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるような下位群である。いくつかの実施形態において、ＶＬでは、下位群は、Ｋａｂａｔら（上記参照）にあるような下位群カッパＩである。いくつかの実施形態において、ＶＨでは、下位群は、Ｋａｂａｔら（上記参照）にあるような下位群ＩＩＩである。
【０１０５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。ＨＶＲは一般に、超可変ループ及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有する、かつ／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）において生じる。（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）。）例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、及びＨ３の９５〜１０２において生じる。（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）。）ＶＨ内のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮−ＣＤＲ、またはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に収容される。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基３１〜３４（Ｌ１）、５０〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜５８（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じる。（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい。）別段示されない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、Ｋａｂａｔら（上記参照）に従って番号付けされる。
【０１０７】
「免疫コンジュゲート」は、細胞毒性剤を含むが、これに限定されない１つ以上の異種分子（複数可）にコンジュゲートされる抗体である。免疫コンジュゲートは、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）という用語と等しい。
【０１０８】
「個体」または「患者」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
【０１０９】
「単離された抗体」は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【０１１０】
「単離された核酸」は、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子である。単離された核酸は、通常核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１１１】
「混合トポロジーのポリユビキチン」は、２つ以上の異なるＵｂ対Ｕｂ連結、すなわち、ポリユビキチン内の異なる位置での異なる連結を含むポリユビキチンを指し、分岐状（少なくとも１つのモノマーが、少なくとも３つの他のモノマーまたは基質ポリペプチド及び少なくとも２つの他のモノマーに接続される）であっても、非分岐状（モノマーが、３つ以上の他のモノマーまたは２つのモノマー及び基質ポリペプチドに接続されない）であってもよい。故に、分岐状の混合トポロジーのポリユビキチンにおいて、例えば、その前のユビキチンのリジン１１に連結したそのＣ末端との分岐点にユビキチンが存在しながら、例えば、分岐点のユビキチンのリジン１１及びリジン４８の両方が後続するユビキチンに連結され得る。非分岐状の混合トポロジーのポリユビキチンにおいて、ユビキチンのうちのいずれも３つ以上のユビキチンに直接接続はされないが、ユビキチンのうちの少なくとも１つは、２つの異なるユビキチンとユビキチンとの連結に関与し、例えば、そのＣ末端が、その前のユビキチンのリジン１１に連結され得ながら、そのリジン４８が後続するユビキチンに連結される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一である、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能なバリアント抗体を除いて、そのようなバリアントは一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向された異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。故に、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージ提示法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載される。
【０１１３】
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば、細胞毒性部分）または放射標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在し得る。
【０１１４】
「天然抗体」は、異なる構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられ得る。
【０１１５】
「または」は、包括的な意味で使用され、すなわち、別段文脈が必要としない限り、「及び／または」と等しい。
【０１１６】
基準ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、候補配列内のアミノ酸残基が、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一であるパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって記述され、ソースコードは、ユーザ文書とともに米国著作権庁（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定されており、変動しない。
【０１１７】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下、
１００×分数Ｘ／Ｙ
【０１１８】
のように計算され、式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへのアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡへのアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解されるだろう。別段具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【０１１９】
「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。
【０１２０】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「を実質的に含まない」は、言及される実体が不在であるか、または存在する場合、（ｉ）場合によって、組成物、方法、またはステップの機能的特性または結果を著しく改変しないように十分に少ない量であるか、（ｉｉ）質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦもしくは実施例において使用される任意のＭＳ手順）、ブロット法（例えば、ポリペプチドのためのウェスタンブロット法）、または電気泳動法（例えば、クマシーブルーもしくはシルバー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの少なくとも１つの適切な分析方法によって検出不能であるか、あるいは（ｉｉｉ）組成物中の非溶媒材料の総量との比較での体積またはモル分率によって、約２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％以下の量で存在する。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などのその文法的変化形）は、治療されている個体の自然経過を改変する試みの中での臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理過程中のいずれかで実行され得る。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患進行速度の減少、疾患状態の寛解または緩和、及び緩解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体を使用して、疾患の発達を遅延させるか、または疾患の進行を減速させる。
【０１２３】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい。）単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入されている宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが動作可能に連結している核酸の発現を指向することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【０１２５】
ＩＩ．組成物及び方法
いくつかの態様において、混合トポロジーのポリユビキチン鎖に結合する抗体が提供される。そのような抗体は、例えば、混合トポロジーのポリユビキチン鎖の検出、その活性の調節、またはその免疫沈降に有用である。
【０１２６】
Ａ．例示的な抗体
いくつかの実施形態において、抗体は、単一トポロジーのポリユビキチンに対してよりも混合トポロジーのポリユビキチンに対して大きな結合力を有し、混合トポロジーのポリユビキチンは、第１の連結及び第２の連結を含み、第１の連結及び第２の連結は、互いに異なる。いくつかの実施形態において、抗体は、第１の連結及び第２の連結を含む混合トポロジーのポリユビキチンに結合する多重特異性抗体であり、抗体は、第１の連結に特異的な第１のＶＨ／ＶＬ単位及び第２の連結に特異的な第２のＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１の連結及び第２の連結は、互いに異なる。例えば、抗体は、第１の抗原認識部位及び第２の抗原認識部位を含み得、第１の抗原認識部位は、第１の連結に特異的であり、第２の抗原認識部位は、第２の連結に特異的である。両方の抗原認識部位が混合トポロジーのポリユビキチンに特異的に係合し得る一方で、１つの抗原認識部位のみが単一トポロジーのポリユビキチンに特異的に係合し得るため、抗体は、混合トポロジーのポリユビキチンに対してより大きな結合力を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、第１の連結は、Ｋ１１連結、Ｋ４８連結、Ｋ６３連結、またはＣ末端とＮ末端との連結である。いくつかの実施形態において、第２の連結は、Ｋ１１連結、Ｋ４８連結、Ｋ６３連結、またはＣ末端とＮ末端との連結である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の連結は独立して、Ｋ１１連結、Ｋ４８連結、Ｋ６３連結、またはＣ末端とＮ末端との連結である。別段示されない限り、第１及び第２の連結は異なる。
【０１２８】
米国特許第７，７６３，２４５号に開示される抗体、抗体配列、及び配列表が、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、ポリユビキチンに結合する、米国特許第７，７６３，２４５号に開示される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第７，７６３，２４５号に開示されるＨＶＲから選択されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１２９】
米国特許第８，１３３，４８８号に開示される抗体、抗体配列、及び配列表が、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、ポリユビキチンに結合する、米国特許第８，１３３，４８８号に開示される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第８，１３３，４８８号に開示されるＨＶＲから選択されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１３０】
米国特許第８，９９２，９１９号に開示される抗体、抗体配列、及び配列表が、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、ポリユビキチンに結合する、米国特許第８，９９２，９１９号に開示される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及び  ＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第８，９９２，９１９号に開示されるＨＶＲから選択されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１３１】
米国特許第９，３２１，８４４号に開示される抗体、抗体配列、及び配列表が、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、ポリユビキチンに結合する、米国特許第９，３２１，８４４号に開示される抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第９，３２１，８４４号に開示されるＨＶＲから選択されるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１３２】
別段示されない限り、第２の半抗体のＨＶＲのうちの少なくとも１つは、第１の半抗体の対応するＨＶＲと同一ではない。いくつかの実施形態において、第２の半抗体のＨＶＲのうちの少なくとも２つは、第１の半抗体の対応するＨＶＲと同一ではない。いくつかの実施形態において、第２の半抗体のＨＶＲのうちの少なくとも３つは、第１の半抗体の対応するＨＶＲと同一ではない。いくつかの実施形態において、第２の半抗体のＨＶＲのうちの少なくとも４つは、第１の半抗体の対応するＨＶＲと同一ではない。いくつかの実施形態において、第２の半抗体のＨＶＲのうちの少なくとも５つは、第１の半抗体の対応するＨＶＲと同一ではない。いくつかの実施形態において、第２の半抗体のＨＶＲの６つは、第１の半抗体のＨＶＲと同一ではない。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、第１の半抗体はそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４のアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第１の半抗体はそれぞれ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、及び２８のアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第１の半抗体はそれぞれ、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、及び４２を含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第１の半抗体はそれぞれ、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、及び５６を含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、第２の半抗体はそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１４のアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第２の半抗体はそれぞれ、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、及び２８のアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第２の半抗体はそれぞれ、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、及び４２を含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、第２の半抗体はそれぞれ、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、及び５６を含む、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、
（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、
（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、
（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、
（ｉｖ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、配列番号７と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、配列番号３５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、配列番号４９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。
【０１４２】
別段示されない限り、第２の半抗体のＶＬ及びＶＨ配列のうちの少なくとも１つは、第１の半抗体内の対応物と同一ではない。いくつかの実施形態において、第２の半抗体のＶＬ配列は、第１の半抗体のＶＬ配列と同一ではない。いくつかの実施形態において、第２の半抗体のＶＨ配列は、第１の半抗体のＶＨ配列と同一ではない。いくつかの実施形態において、第２の半抗体のＶＬ及びＶＨ配列は、第１の半抗体のＶＬ及びＶＨ配列と同一ではない。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、ａ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号３５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号３６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列、及び配列番号５０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第７，７６３，２４５号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第７，７６３，２４５号に開示されるＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第８，１３３，４８８号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第８，１３３，４８８号に開示されるＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第８，９９２，９１９号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第８，９９２，９１９号に開示されるＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第９，３２１，８４４号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第９，３２１，８４４号に開示されるＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第７，７６３，２４５号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第７，７６３，２４５号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、ポリユビキチンに結合する、米国特許第８，１３３，４８８号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第８，１３３，４８８号に開示されるＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、ポリユビキチンに結合する、米国特許第８，９９２，９１９号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第８，９９２，９１９号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、ポリユビキチンに結合する、米国特許第９，３２１，８４４号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１または第２の半抗体は、米国特許第９，３２１，８４４号に開示される抗体のＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを含み、半抗体は、ポリユビキチンに結合する。
【０１５２】
特定の実施形態において、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、ポリユビキチンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０個のアミノ酸が、ＶＨ配列において置換、挿入、及び／または欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域内で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。任意で、本抗体は、上記に考察されるＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
【０１５３】
特定の実施形態において、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、ポリユビキチンに結合する能力を保持する。特定の実施形態において、合計１〜１０個のアミノ酸が、ＶＬ配列において置換、挿入、及び／または欠失されている。特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域内で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。任意で、本抗体は、上記に考察されるＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態において、本抗体は、上記の実施形態のいずれかにおけるようなＨＶＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを更に含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、上記の実施形態のいずれかにおけるようなＨＶＲ、及びウサギフレームワーク領域を含む。
【０１５５】
いくつかの態様において、本明細書に提供される二重特異性抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。例えば、特定の実施形態において、第１及び第２の半抗体を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供され、
ａ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含むか、
ｂ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含むか、
ｃ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号７のＶＬ配列及び配列番号８のＶＨ配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含むか、
ｄ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含むか、
ｅ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２１のＶＬ配列及び配列番号２２のＶＨ配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含むか、または
ｆ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号３５のＶＬ配列及び配列番号３６のＶＨ配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４９のＶＬ配列及び配列番号５０のＶＨ配列を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチンへの結合について、直前の段落のａ）〜ｆ）のうちの１つのようなＶＨ及びＶＬ配列を含む二重特異性抗体と競合する抗体が提供される。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本抗体は、抗体断片、例えば、二量体ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態において、本抗体は、実質的に完全長の抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本抗体は、Ｃ末端リジンを有する少なくとも１つの重鎖を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、Ｃ末端リジンを欠く少なくとも１つの重鎖を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、Ｃ末端リジンを有さない重鎖のみを含む。Ｃ末端リジンは、例えば、カルボキシペプチダーゼ処理などによって酵素的に、または重鎖コード配列の３’末端でのリジンコドンの欠失もしくは置換によって遺伝的に除去され得る。重鎖Ｃ末端リジンは、抗原結合部位から離れて位置し、結合活性には不要であり、それらの除去は、より均質な抗体調製物を提供し得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１または第２の半抗体は、
ａ）配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、
ｂ）配列番号１６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１または第２の半抗体は、
ａ）配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｂ）配列番号１６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列、
ｃ）配列番号３０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列、または
ｄ）配列番号４４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の鎖から欠損している。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、
ａ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号１６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｂ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｃ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｄ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号１６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｅ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｆ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｇ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号１６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｈ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号１６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号１８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｉ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号３０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｊ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号１６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号３０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、
ｋ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号１６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号２０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含むか、または
ｌ）第１及び第２の半抗体のうちの一方は、配列番号３０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号３４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
第１及び第２の半抗体のうちの他方は、配列番号４４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖配列、及び配列番号４６と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含み、
任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の鎖から欠損している。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号２の軽鎖配列及び配列番号６の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号１８の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４８の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３２の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号１６の軽鎖配列及び配列番号２０の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、配列番号３０の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含み、第２の半抗体は、配列番号４４の軽鎖配列及び配列番号４６の重鎖配列を含み、任意で、Ｃ末端リジンは、１つ以上の重鎖から欠損している。
【０１７４】
更なる一態様において、上記の実施形態のいずれかに従う抗体は、以下の節１〜７に記載される特徴のうちのいずれかを、単独で、または組み合わせて組み込むことができる。
【０１７５】
１．抗体親和性
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、かつ任意で、１０−１３Ｍ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、Ｋｄは、以下のアッセイによって説明されるように、対象となる抗体のＦａｂ版及びその抗原によって実行される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、Ｆａｂを、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートと結合した抗原を捕捉することによって、測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後ＰＢＳ中２重量／体積％のウシ血清アルブミンで２〜５時間室温（およそ２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を対象となるＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一貫する）。その後、対象となるＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）継続して、平衡に達することを確実にしてもよい。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移動させる。その後、溶液を除去し、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を用いてプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを１０分間計数する２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択する。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップによって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、供給業者の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって活性化される。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで希釈した後に、５μＬ／分の流量で注入して、およそ１０の応答単位（ＲＵ）の共役タンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃、およそ２５μＬ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．２版）を使用して、会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時に適合することによって、計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、会合速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを有する８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用して決定することができる。
【０１７８】
２．抗体断片
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２断片、二量体一本鎖Ｆｖ、及び以下に記載される他の断片が挙げられる。特定の抗体断片に関する概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、またＷＯ９３／１６１８５、及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。エピトープ残基に結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、本抗体は、ダイアボディである。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。
【０１８０】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む、抗体断片である。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。
【０１８１】
抗体断片は、本明細書に記載されるように、無傷抗体のタンパク質消化及び組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって作製され得る。
【０１８２】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類（サルなど）に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる一例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０１８３】
特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上の可変ドメインを含み、そのＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）は、非ヒト抗体に由来し、そのＦＲ（またはそれらの部分）は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むだろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体内のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換される。
【０１８４】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を説明）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を説明）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を説明）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを説明）に更に記載されている。
【０１８５】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、「最良適合」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））、ヒト成熟（体細胞変異型）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞株フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８））、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）が挙げられる。
【０１８６】
４．ヒト抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知である様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０１８７】
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法に関する概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を説明）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を説明）、米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を説明）、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号（ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を説明）も参照されたい。そのような動物によって生成された無傷抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって更に修飾され得る。
【０１８８】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体もまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を説明）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを説明）に記載される方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。
【０１８９】
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージ提示ライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望されるヒト定常ドメインと組み合わされ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術を、以下に記載する。
【０１９０】
５．ライブラリ由来抗体
抗体は、所望される活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージ提示ライブラリを生成し、所望される結合特性を保有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が、当該技術分野において既知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説され、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に更に記載されている。
【０１９１】
特定のファージ提示法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連結反応（ＰＣＲ）により別個にクローニングされ、ファージライブラリ内で無作為に組み換えられ、これがその後、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片を提示する。免疫化源に由来するライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、高親和性抗体を免疫原に提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されるように、ナイーブレパートリーは、（例えば、ヒトから）クローニングされて、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原及びまた自己抗原に対する抗体の単一源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、かつインビトロで再配置を達成することによって、合成的にも作製され得る。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０１９２】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１９３】
６．多重特異性抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。
【０１９４】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、ならびに「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本抗体は、第１及び第２の半抗体を含み、第１の半抗体は、ノブ変異を含む第１の重鎖定常領域を含み、第２の重鎖は、ホール変異を含む第２の重鎖定常領域を含むか、または第１の半抗体は、ホール変異を含む第１の重鎖定常領域を含み、第２の重鎖は、ノブ変異を含む第２の重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１抗体であり、ノブ変異は、Ｔ３６６Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１抗体であり、ホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの変異を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ４抗体であり、ノブ変異は、Ｔ３６６Ｗ変異を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ４抗体であり、ホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの変異を含む。変異（複数可）の位置の前述の番号付けは、ＥＵ番号付けである。重鎖配列内の変異（複数可）の実際の位置（複数可）は、例えば、先行する可変領域の長さに応じて変動し得る（最大１０位置分だけなど）。
【０１９５】
多重特異性抗体はまた、静電ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体断片を作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、ならびに一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、ならびに例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載される三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。いくつかの実施形態において、本抗体は、ダイアボディである。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。
【０１９６】
トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。いくつかの実施形態において、本抗体は、トリアボディである。いくつかの実施形態において、トリアボディは、第１の抗原認識部位、第２の抗原認識部位、及び第３の抗原認識部位を含み、抗原認識部位のうちの少なくとも１つは、他の抗原認識部位とは異なる。いくつかの実施形態において、トリアボディは、３つの異なるポリユビキチンに結合する第１、第２、及び第３の抗原認識部位を含む。いくつかの実施形態において、トリアボディは、Ｋ１１連結ポリユビキチン、Ｋ４８連結ポリユビキチン、Ｋ６３連結ポリユビキチン、及びＣ末端とＮ末端との連結ポリユビキチンから選択される任意の３つのポリユビキチンに結合する第１、第２、及び第３の抗原認識部位を含む。各抗原認識部位は、上記に考察されるＨＶＲまたはＶＬ及びＶＨの組み合わせを含み得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、本抗体は、テトラボディである。いくつかの実施形態において、テトラボディは、第１の抗原認識部位、第２の抗原認識部位、第３の抗原認識部位、及び第４の抗原認識部位を含み、抗原認識部位のうちの少なくとも１つまたは少なくとも２つは、他の抗原認識部位とは異なる。いくつかの実施形態において、テトラボディは、３つの異なるポリユビキチンに結合する第１、第２、及び第３の抗原認識部位を含む。いくつかの実施形態において、テトラボディは、Ｋ１１連結ポリユビキチン、Ｋ４８連結ポリユビキチン、Ｋ６３連結ポリユビキチン、及びＣ末端とＮ末端との連結ポリユビキチンから選択される任意の３つのポリユビキチンに結合する第１、第２、及び第３の抗原認識部位を含む。いくつかの実施形態において、テトラボディは、４つの異なるポリユビキチンに結合する第１、第２、第３、及び第４の抗原認識部位を含む。いくつかの実施形態において、テトラボディは、Ｋ１１連結ポリユビキチン、Ｋ４８連結ポリユビキチン、Ｋ６３連結ポリユビキチン、及びＣ末端とＮ末端との連結ポリユビキチンに結合する第１、第２、第３、及び第４の抗原認識部位を含む。各抗原認識部位は、上記に考察されるＨＶＲの組み合わせまたはＶＬ及びＶＨの組み合わせを含み得る。
【０１９８】
「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。オクトパス抗体という用語は、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１において考察されるものの意味で使用され、タコによって産生される抗体またはタコから得られる抗体を指すことは意図されない。
【０１９９】
本明細書の抗体または断片はまた、２つの異なる抗原に結合する２つの抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。例えば、２つの異なる抗原は、Ｋ１１−、Ｋ４８−、Ｋ６３−、またはＣ末端とＮ末端との−連結ポリユビキチンなどの上記に考察されるポリユビキチンのうちのいずれであってもよい。
【０２００】
７．抗体バリアント
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基からの欠失、及び／またはそこへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせによって、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望される特性、例えば、抗原結合を所有することを条件とする。
【０２０１】
ａ）置換、挿入、及び欠失バリアント
特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発の対象となる部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１の「例示的な置換」の見出しの下に示され、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に記載する通りである。アミノ酸置換が対象となる抗体に導入され得、その産物が、所望される活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。
表１
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【０２０２】
アミノ酸は、以下の一般的な側鎖特性に従って群分けされ得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２０３】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うだろう。
【０２０４】
１種類の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、更なる研究のために選択される、結果として得られるバリアント（複数可）は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有する、かつ／または実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有するだろう。一例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージ提示に基づく親和性成熟技術を使用して好都合に生成され得る、親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０２０５】
改変（例えば、置換）がＨＶＲ内で行われて、例えば、抗体親和性が改善され得る。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）内で行われ得、結果として得られるバリアントＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態において、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のうちのいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。その後、二次ライブラリが作製される。その後、ライブラリがスクリーニングされて、所望される親和性を有する任意の抗体バリアントが特定される。多様性を導入する別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に特定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、多くの場合、標的となる。
【０２０６】
特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が、抗体が抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）がＨＶＲ内で行われ得る。そのような改変は、例えば、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であってもよい。上記に提供されるバリアントＶＨ配列及びＶＬ配列の特定の実施形態において、各ＨＶＲは、改変されないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【０２０７】
変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法において、残基または標的残基の群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により置き換えられて、抗体と抗原との相互作用に影響が及ぼされたかが決定される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点が特定される。そのような接触残基及び隣接する残基は、置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。バリアントは、スクリーニングされて、それらが所望される特性を含有するかが決定され得る。
【０２０８】
アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲のアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端もしくはＣ末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増加させる。
【０２０９】
ｂ）グリコシル化バリアント
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体を改変して、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって好都合に達成することができる。
【０２１０】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖としては、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」内のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを挙げることができる。いくつかの実施形態において、抗体内のオリゴ糖の修飾は、改善された特定の特性を有する抗体バリアントを作製するために行われ得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体内のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体におけるわずかな配列多様性のため、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４〜３００位の間に位置してもよい。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１（Ａｄａｍｓら、特に実施例１１））、ならびにアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
【０２１２】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗体バリアントが更に提供される。そのような抗体バリアントは、低下したフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）、及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントもまた、提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２１３】
ｃ）Ｆｃ領域バリアント
特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域内に導入され得、それによりＦｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２１４】
特定の実施形態において、抗体バリアントは、全てではないがいくつかのエフェクター機能を所有し、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、更に特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要であるか、または有害である用途に対して望ましい候補となる。インビトロ及び／またはインビボ細胞毒性アッセイを実行して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低下／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞が、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約される。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価されてもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイが実行されてもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半��期決定もまた、当該技術分野において既知である方法を使用して実行することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
【０２１５】
低下したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２１６】
ＦｃＲへの改善または縮小した結合を有する特定の抗体バリアントが、記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。）
【０２１７】
特定の実施形態において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載される、改変（すなわち、改善または縮小のいずれか）されたＣ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域内で行われる。
【０２１９】
母体ＩｇＧの胎児への移入に関与する、増加した半減期及び新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、米国公開特許第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載される。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０２２０】
また、Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０２２１】
ｄ）システイン操作された抗体バリアント
特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の到達可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の到達可能な部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を他の部分（薬物部分またはリンカー−薬物部分など）にコンジュゲートして、本明細書に更に記載される免疫コンジュゲートを作製することができる。特定の実施形態において、以下の残基、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、軽鎖のＫ１４９（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のいずれか１つ以上が、システインで置換され得る。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０２２２】
ｅ）抗体誘導体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するように更に修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造する上で有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、２つ以上のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で療法に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない、考慮すべき要因に基づいて決定され得る。
【０２２３】
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る、抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであり得、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これらに限定されない。
【０２２４】
Ｂ．組み換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組み換え法及び組成物を使用して産生され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。更なる一実施形態において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる一実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。いくつかのそのような実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それで形質転換されている）。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核生物のもの、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体を作製する方法であって、上記に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、その抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意で、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む、方法が提供される。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、多重特異性抗体の構成成分（例えば、第１の半抗体及び第２の半抗体）は、別個の細胞内または細胞培養物中で発現され、その後、インビトロで組み合わされる。他の実施形態において、多重特異性抗体の全ての構成成分が、同じ細胞内または細胞培養物中で発現される。
【０２２６】
抗体の組み換え産生のために、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、１つ以上のベクター内に挿入されて、宿主細胞内で更にクローニング及び／または発現される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０２２７】
抗体をコードするベクターのクローン化または発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載される原核生物細胞または真核生物細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について説明している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。）発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
【０２２８】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターにとって好適なクローニングまたは発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
【０２２９】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と組み合わせて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
【０２３０】
植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を説明）を参照されたい。
【０２３１】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肺細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されるもの）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞が挙げられる。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適な特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０２３２】
Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定、スクリーニング、または特徴付けされてもよい。
【０２３３】
いくつかの態様において、抗体は、その抗原結合活性について、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、またはウェスタンブロットなどの既知の方法によって試験される。
【０２３４】
別の態様において、競合アッセイを使用して、混合トポロジーのポリユビキチンへの結合について本明細書に記載される抗体のうちのいずれかと競合する抗体を特定することができる。特定の実施形態において、そのような競合抗体は、本明細書に記載される抗体によって結合される、同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
【０２３５】
例示的な競合アッセイにおいて、固定化された混合トポロジーのポリユビキチンは、混合トポロジーのポリユビキチンに結合する第１の標識抗体（例えば、本明細書に記載される抗体のいずれか）、及び混合トポロジーのポリユビキチンへの結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の未標識抗体を含む溶液とともにインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、混合トポロジーのポリユビキチンを、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の混合トポロジーのポリユビキチンへの結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体を除去し、固定化され混合トポロジーのポリユビキチンと会合した標識の量を測定する。試験試料中の固定化された混合トポロジーのポリユビキチンと会合した標識の量が、対照試料と比較して実質的に低下した場合、それは、第２の抗体が混合トポロジーのポリユビキチンへの結合において第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
【０２３６】
Ｄ．免疫コンジュゲート
化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、あるいは放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの、１つ以上の細胞毒性剤コンジュゲートされる、本明細書に開示される抗体を含む免疫コンジュゲートが提供される。
【０２３７】
免疫コンジュゲートによって、腫瘍または他の疾患細胞もしくは組織に対して薬物部分の送達を標的とすることが可能となり、かついくつかの実施形態において、非コンジュゲート薬物の全身投与が、正常な細胞にとって許容できないレベルの毒性をもたらし得る場合に、その中の細胞内蓄積が可能となる（Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ５：３８２−３８７）。
【０２３８】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、強力な細胞毒性薬の標的を抗原発現腫瘍細胞に向け（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ９：９８２−１００４）、それにより有効性を最大化し、オフターゲット毒性を最小化することで治療指数を増強することによって、抗体及び細胞毒性薬の両方の特性を組み合わせる標的化学療法分子である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ  Ｐ．Ｄ．（２００８）Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒ．１４（３）：１５４−１６９、Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．（２００８）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１：９８−１０７）。
【０２３９】
ＡＤＣ化合物は、抗がん活性を有するものを含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ化合物は、薬物部分にコンジュゲートされた、すなわち、共有結合された抗体を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、は、リンカーを通して薬物部分に共有結合される。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、有効用量の薬物を腫瘍組織に選択的に送達し得、それによって治療指数（「治療濃度域」）を増加させながら、より高い選択性（すなわち、より低い効果的用量）が達成され得る。
【０２４０】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）は、細胞毒性効果または細胞増殖抑制性効果を有する任意の化合物、部分、または基を含み得る。薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合または挿入、ならびにＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質合成、及び／またはトポイソメラーゼの阻害を含むが、これらに限定されない機構によって、それらの細胞毒性効果及び細胞増殖抑制性効果を付与し得る。例示的な薬物部分としては、マイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ネモルビシン及びその誘導体、ＰＮＵ−１５９６８２、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カンプトテシン、エリナフィド、ならびに細胞毒性活性を有するそれらの立体異性体、同配体、類似体、及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４１】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体はいずれも、生体試料中の混合トポロジーのポリユビキチンの存在の検出に有用である。本明細書で使用される場合、「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。「生体試料」は、例えば、細胞または組織（例えば、がん性または潜在的にがん性である結腸、結腸直腸、小腸、子宮内膜、膵臓、乳、肺、前立腺、または卵巣組織を含む生検材料）を含む。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、診断または検出の方法における使用のためのものである。更なる一態様において、生体試料中の混合トポロジーのポリユビキチンの存在を検出する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、抗体の混合トポロジーのポリユビキチンへの結合を許容する条件下で、生体試料を、本明細書に記載される抗体と接触させることと、抗体と生体試料中の混合トポロジーのポリユビキチンとの間に複合体が形成されたかを検出することとを含む。そのような方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、混合トポロジーのポリユビキチンが患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗体を使用して、抗混合トポロジーのポリユビキチン抗体での療法に適格な対象を選択する。いくつかの実施形態において、生体試料は、例えば、細胞または組織（例えば、がん性または潜在的にがん性である組織を含む生検材料）を含む。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、生体試料中のポリユビキチン化タンパク質を検出する方法であって、ポリユビキチン化タンパク質が、２つ以上の位置において少なくとも第１及び第２のポリユビキチンでポリユビキチン化され、第１及び第２のポリユビキチンが、異なる連結を有する、方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、抗体のポリユビキチン化タンパク質への結合を許容する条件下で、生体試料を、本明細書に記載される抗体と接触させることと、抗体と生体試料中のポリユビキチン化タンパク質との間に複合体が形成されたかを検出することとを含む。そのような方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、２つ以上の位置において異なる連結を有する少なくとも第１及び第２のポリユビキチンでポリユビキチン化されたポリユビキチン化タンパク質が、患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗体を使用して、本明細書に開示される抗体での療法に適格な対象を選択する。いくつかの実施形態において、生体試料は、例えば、細胞または組織（例えば、がん性または潜在的にがん性である組織を含む生検材料）を含む。
【０２４４】
更なる一実施形態において、本明細書に開示される抗体をインビボで使用して、例えば、疾患の診断、予後診断、もしくは段階分け、適切な療法過程の決定、または療法に対する応答の監視の目的のために、例えば、インビボ画像化によって、混合トポロジーのポリユビキチン、または２つ以上の位置において異なる連結を有する少なくとも第１及び第２のポリユビキチンでポリユビキチン化されたポリユビキチン化タンパク質を対象において検出する。インビボ検出のための当該技術分野で既知の１つの方法は、例えば、ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ１２：１３７９−１３８９（２００７）及びＶｅｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１２７１−１２８１（２００３）に記載される免疫ポジトロン放出断層撮影（免疫−ＰＥＴ）である。そのような実施形態において、対象において混合トポロジーのポリユビキチンを検出するための方法であって、標識された抗体を対象に投与することと、対象において標識された抗混合トポロジーのポリユビキチン抗体を検出することとを含む、方法が提供される。そのような実施形態のうちの特定のものにおいて、標識された抗体は、６８Ｇａ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ、及び１２４Ｉなどのポジトロン放出体を含む（例えば、それにコンジュゲートされる）。特定の一実施形態において、ポジトロン放出体は、８９Ｚｒである。８９Ｚｒ標識された抗体を作製及び使用する非限定な例示的な方法は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０５６９８３号に記載されている。いくつかの実施形態において、標識された抗体は、１つ以上のジルコニウム複合体にコンジュゲートされたシステイン操作された抗体である。例えば、ＷＯ２０１１／０５６９８３を参照されたい。
【０２４５】
更なる一実施形態において、診断及び検出の方法は、基質に固定化された第１の本明細書に開示される抗体を、混合トポロジーのポリユビキチン、または２つ以上の位置において異なる連結を有する少なくとも第１及び第２のポリユビキチンでポリユビキチン化されたポリユビキチン化タンパク質の存在について試験される生体試料と接触させることと、基質を、混合トポロジーのポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質に結合する第２の抗体に曝露することと、第２の抗体が、第１の抗体と生体試料中の混合トポロジーのポリユビキチンまたはポリユビキチン化タンパク質との複合体に結合されているかを検出することとを含む（サンドイッチアッセイと称されることもある）。基質は、任意の支持培地、例えば、ガラス、金属、セラミック、ポリマービーズ、スライド、チップ、及び他の基質であり得る。特定の実施形態において、生体試料は、例えば、細胞または組織（例えば、がん性または潜在的にがん性である結腸、結腸直腸、小腸、子宮内膜、膵臓、または卵巣組織を含む生検材料）を含む。特定の実施形態において、第１または第２の抗体は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかである。
【０２４６】
特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体は、標識される。標識としては、直接的に検出される標識または部分（蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識など）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を通して間接的に検出される部分（酵素またはリガンドなど）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア（希土類キレートまたはフルオレセインなど）及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼなどの過酸化水素を用いて染料前駆体を酸化する酵素と共役した複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、ならびに安定フリーラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、標識は、ポジトロン放出体である。ポジトロン放出体としては、６８Ｇａ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ、及び１２４Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。特定の一実施形態において、ポジトロン放出体は、８９Ｚｒである。
【０２４７】
ある試料中の混合トポロジーのポリユビキチンまたは２つ以上の位置において異なる連結を有する少なくとも第１及び第２のポリユビキチンでポリユビキチン化されたポリユビキチン化タンパク質の存在は、本明細書に開示される抗体を使用して、いくつかの方法論によって分析することができ、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）、定量的血液系アッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡなど）を含むが、これらに限定されない、これらのうちの多くは、当該技術分野において既知であり、当業者によって理解されている。タンパク質の状態を評価するための典型的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ１５（免疫ブロット）に見出される。（「ＭＳＤ」）から入手可能なアッセイなどの多重免疫アッセイもまた、使用され得る。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、単一特異性抗体、未組み立て半抗体、または単一特異性抗体及び未組み立て半抗体の両方を実質的に含まない、組成物が提供される。単一特異性抗体は、２種類以上の抗原認識部位を含まない抗体、例えば、６つのＣＤＲのうちの一組のみを有する抗体または６つのＣＤＲの各組が同一である抗体である。第１の組のＣＤＲが、例えば、少数のアミノ酸残基に関して任意の他の組のＣＤＲとわずかにだけ異なる抗体（差異は異なる抗原への優先的な結合はもたらさない）もまた、単一特異性であると見なされる。未組み立て半抗体は、別の半抗体と安定的に会合（共有結合的または非共有結合）しておらず、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、または電気泳動法などの適切な技術によって分析したとき、単一重鎖／軽鎖単位に見える。
【０２４９】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載される抗体またはコンジュゲートの薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するそのような抗体または免疫コンジュゲートを、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は一般に、レシピエントに対し、用いられる投薬量及び濃度で無毒であり、緩衝液（リン酸、クエン酸、及び他の有機酸など）、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルもしくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、ならびに／または非イオン性界面活性剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）など）などの介在性薬物分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。いくつかの態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０２５０】
例示的な凍結乾燥抗体または免疫コンジュゲート製剤が、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤または免疫コンジュゲート製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが挙げられ、後者の製剤にはヒスチジン−酢酸緩衝液が含まれる。
【０２５１】
本明細書における製剤はまた、治療されている特定の適応症に必要とされる２つ以上の活性成分、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。
【０２５２】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル内、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、またはマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２５３】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、抗体または免疫コンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。
【０２５４】
インビボ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成され得る。
【０２５５】
Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書に提供される抗体または免疫コンジュゲートのうちのいずれも、方法、例えば、治療方法において使用することができる。
【０２５６】
別の態様において、薬物としての使用のための本明細書に開示される抗体または免疫コンジュゲートが提供される。更なる態様において、治療方法における使用のための本明細書に開示される抗体または免疫コンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、混合トポロジーのポリユビキチン陽性がんの治療における使用のための本明細書に開示される抗体または免疫コンジュゲートが提供される。
【０２５７】
更なる一態様において、薬物の製造または調製における本明細書に開示される抗体または免疫コンジュゲートの使用が提供される。
【０２５８】
上記の実施形態のいずれかに従う「個体」は、ヒトであり得る。
【０２５９】
更なる一態様において、例えば、上記の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される抗体または免疫コンジュゲートのいずれかを含む薬学的製剤が提供される。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗体または免疫コンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。
【０２６０】
本明細書に提供される抗体または免疫コンジュゲートは、療法において、単独で、または他の薬剤との組み合わせでのいずれかで使用することができる。例えば、本明細書に提供される抗体または免疫コンジュゲートは、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与され得る。
【０２６１】
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別個の製剤中に含まれる場合）、ならびに本明細書に提供される抗体または免疫コンジュゲートの投与が、追加の治療剤及び／またはアジュバントの投与の前、それと同時、及び／またはそれに続いて生じ得る、別個投与を包含する。
【０２６２】
抗体または免疫コンジュゲート（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所治療で所望される場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、部分的には、投与が短時間であるか、または慢性的であるかに応じて、例えば、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるものであり得る。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない、様々な投薬スケジュールが本明細書において企図される。
【０２６３】
抗体または免疫コンジュゲートは、良好な医療慣例と一致する様式で、製剤化、投薬、及び投与されるだろう。この文脈において考慮すべき要因としては、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に既知である他の要因が挙げられる。抗体または免疫コンジュゲートは、任意で、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化されるが、その必要はない。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体または免疫コンジュゲートの量、障害または治療の種類、ならびに上記に考察される他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるものと同じ投薬量及び投与経路で使用されるか、または本明細書に記載される投薬量の約１〜９９％、もしくは経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【０２６４】
疾患の予防または治療のために、抗体または免疫コンジュゲートの適切な投薬量（単独で、または１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗体または免疫コンジュゲートの種類、疾患の重症度及び経過、抗体または免疫コンジュゲートが予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴、及び抗体または免疫コンジュゲートへの応答、ならびに主治医の裁量に依存するだろう。抗体または免疫コンジュゲートは、一度に、または一連の治療にわたって患者に好適に投与される。
【０２６５】
上記の製剤または治療方法のうちのいずれも、免疫コンジュゲート及び抗体の両方を使用して実行され得ることが理解される。
【０２６６】
Ｈ．製造品
別の態様において、上述の障害の治療、予防、及び／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のもしくは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、または別の組成物との組み合わせで、障害の治療、予防、及び／または診断に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に開示される抗体または免疫コンジュゲートである。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択される病態を治療するために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）抗体または免疫コンジュゲートを含む組成物を内部に収容した第１の容器と、（ｂ）更なる細胞毒性剤またはさもなければ治療剤を含む組成物を内部に収容した第２の容器とを含み得る。この実施形態における製造品は、組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、または加えて、製造品は、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器を更に含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【０２６７】
ＩＩＩ．実施例
以下は、本明細書に提供される方法及び組成物の実施例である。上記に提供される概要を考慮して、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０２６８】
Ａ．分析方法
サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱。５０μｇの抗体を、３．５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍのＸＢｒｉｄｇｅタンパク質ＢＥＨ分析ＳＥＣ２００Åカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に、２０ｍＭのヒスチジンアセテート、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を移動相として有するＡｇｉｌｅｎｔ１２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣを使用して、１ｍＬ／分で注入した。分析ＳＥＣカラムから溶出したタンパク質を、Ｗｙａｔｔ  ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ  ＩＩ／Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ多角度光散乱検出器に直接注入して、モル質量及び多分散を測定した。
【０２６９】
質量分析。質量分析の前に、２単位のカルボキシペプチダーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下または不在下、３７℃で、３０μｇの抗体を２単位のＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ）で一晩脱グリコシル化した。その後、２μｇの抗体を、３μｍ、４．６×５０ｍｍの逆相クロマトグラフィーＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）に、Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＨＰＬＣを使用して、１ｍＬ／分で注入した。３分間にわたる０〜１００％の緩衝液Ｂ勾配を、水中０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（緩衝液Ａ）及びアセトニトリル中０．０５％のＴＦＡ（緩衝液Ｂ）によって実行し、その後、１分間の１００％の緩衝液Ｂ洗浄を続けた。逆相カラムから溶出したタンパク質を、インタクト質量測定のために、Ａｇｉｌｅｎｔ６２３０エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計（ＥＳＩ−ＴＯＦ）に直接注入した。
【０２７０】
Ｂ．抗体クローニング、発現、及びアニーリング
ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化アプローチを使用して、二重特異性抗体を生成した。このアプローチについての一般的な概説については、Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１６，６７７−６８１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ０７９８−６７７（１９９８）を参照されたい。
【０２７１】
Ｔ３６６Ｗ（ノブ）またはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ホール）変異を、抗Ｋ１１及び抗Ｋ４８ポリユビキチン連結特異的抗体のＣＨ３ドメインに導入した。対照として、無関係のタンパク質を認識する抗ｇＤ抗体を使用した。抗体のそれぞれの重鎖の優先的なヘテロ二量体化を可能にするために、ノブ及びホール変異を選択した。
【０２７２】
重鎖可変ドメインは、（抗Ｋ１１ポリユビキチン連結特異性では）配列番号８、（抗Ｋ４８ポリユビキチン連結特異性では）配列番号２２、及び非特異的抗ｇＤ対照抗体のものであった。これらの可変ドメインを、ＣＨ３ドメイン内にノブ（Ｔ３６６Ｗ）変異またはホール（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）変異のいずれかを有するヒトＩｇＧ１重鎖定常メインを含有する修飾ｐＲＫベクター（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）へとサブクローニングした。
【０２７３】
可変領域の長さのために、ノブ及びホール変異の実際の位置は、例えば、１〜１０位置だけ、わずかに変動し得る。例えば、配列番号４及び６、それぞれＴからＷ及びＴからＳへの置換は、第３６６アミノ酸残基ではなく第３６９アミノ酸残基に反映される。重鎖の３６６、３６８、及び４０７などの位置でのノブ及びホール変異への言及は、適切な場合、可変領域の長さに照らして調節して解釈されるべきであることが理解される。
【０２７４】
軽鎖可変ドメインを、ヒトカッパ軽鎖定常ドメインを含有する修飾ｐＲＫベクター（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）へと同様にサブクローニングした。ｐＲＫベクターは、哺乳動物細胞内での細胞外発現のための恒常的強度シグナルペプチドを担持する。抗Ｋ１１抗体を（配列番号４及び６をそれぞれ含む重鎖をコードする）ノブ及びホール変異体の両方としてクローニングし、抗Ｋ４８を（配列番号２０）を含む重鎖をコードする）ホール変異体としてクローニングし、抗ｇＤをノブ変異体としてクローニングした。
【０２７５】
配列表はまた、抗Ｋ１１抗体のノブ変異体（配列番号１８）、抗Ｋ６３重鎖のノブ及びホール変異体（それぞれ配列番号３２及び３４）、ならびに抗直鎖状ポリユビキチン重鎖のノブ及びホール変異体（それぞれ配列番号４６及び４８）も提供する。
【０２７６】
同族軽鎖及び重鎖の対合を保存するために、それらのそれぞれの軽鎖が別個にＣＨＯ細胞内にあるノブまたはホール重鎖変異体のいずれかを発現させ、それらを個々に親和性精製した（図１ａ）。以前に記載されるようにＰＥＩを使用（Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｂａｇｉｎｓｋｉ，Ｔ．Ｋ．＆Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｅ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ＦＵＴ８−ｄｅｌｅｔｅｄ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ１０６，７５１−７６３，ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２２７４９（２０１０）を参照されたい）して、所与のノブまたはホール半抗体の軽鎖及び重鎖プラスミドを、ＣＨＯ細胞内に一過的に同時トランスフェクトした。半抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出させ、その後、１０体積／体積％の２００ｍＭのアルギニン、１３７ｍＭのコハク酸（ｐＨ９．０）で５．０にｐＨ調節した。
【０２７７】
親和性精製したノブ及びホール抗体は、以前に記載されているノブ及びホール抗体と一貫して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、及び液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）（図１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、表２、３）によって見られるようなモノマー（半抗体）とホモ二量体との混合物である。例えば、Ｓｈａｔｚ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｕｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＭＡｂｓ５，８７２−８８１，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２６３０７（２０１３）、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ＣＨ２−ＣＨ３ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ４２６，１９４７−１９５７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１４．０２．０１５（２０１４）、Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，７５３−７５８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６２１（２０１３）を参照されたい。モノマー、ホモ二量体、及びヘテロ二量体ピークを図１ｃ及び２ａに示し、分子量を光散乱で検証した（表１を参照されたい）。
【０２７８】
抗Ｋ４８ホール／抗Ｋ１１ノブ二重特異性抗体の理論上の質量は、１４４，６１３．１９Ｄａであり、図１ｄの主要ピークに対応する。抗Ｋ４８ホール及び抗Ｋ１１ノブホモ二量体の予測されたピーク位置を、それぞれ１４４，４８５．９０Ｄａ及び１４４，７４０．４８Ｄａのそれらの理論上の質量に基づいて示す。ＣＰＢでの処理は、１４４，７４５．２６Ｄａのピークの喪失をもたらし、これは、それが抗Ｋ１１ノブホモ二量体ではなく、むしろカルボキシ末端リジン残基が依然として結合している二重特異性抗体の一部分であることを示す。抗Ｋ１１／ｇＤ二重特異性抗体の理論上の質量は１４５，６２３．１４Ｄａであり、抗Ｋ４８／ｇＤ二重特異性抗体の理論上の質量は１４５，７０１．１１Ｄａであり、図２ｃのそれぞれのパネルの主要ピークに対応する。抗Ｋ１１ホールホモ二量体、抗Ｋ４８ホールホモ二量体、及び抗ｇＤノブホモ二量体の予測されたピーク位置を、それぞれ１４４，３２９．９６Ｄａ、１４４，４８５．９０、及び１４６，９１６．３２Ｄａのそれらの理論上の質量に基づいて示す。
【０２７９】
表２．精製された半抗体及び組み立てた二重特異性抗体のモル質量。
2019528040.tif 000003
モル質量及び多分散測定のために、抗体を、ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ  ＩＩ多角度光散乱検出器に結合したＸＢｒｉｄｇｅタンパク質ＢＥＨ分析ＳＥＣカラムに注入した。ＳＥＣカラムからの個々のピークの溶出時間を、分で示す。
【０２８０】
表３．半抗体及び組み立てた二重特異性抗体の質量分析。
2019528040.tif 000004
抗体をＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化し、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって分析した。理論上の質量は、未還元の脱グリコシル化抗体のものであり、哺乳動物細胞発現中のカルボキシ末端リジン残基の完全な除去を想定する。質量差を、実験上の質量と理論上の質量との間の差異として報告する。Ｎ／Ｏａ、観察されず。
【０２８１】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって、抗Ｋ４８ホール抗体は、およそ２０％のホモ二量体及び８０％のモノマーを示す（図１ｃ、表２）。割合の明確さは抗Ｋ１１ノブ抗体についてより低く、これはホモ二量体及びモノマーがＳＥＣで同時溶出するためであり、ＭＡＬＳによる高い多分散を示す遅滞した端の肩部を含有する幅広い溶出ピークによって証拠付けられる（図１ｃ、表２）。ノブ及びホールホモ二量体の両方は、ＬＣ−ＭＳの逆相クロマトグラフィーステップにおいて撹乱され、ＭＳによってモノマーのみが検出されるため、それらは、天然において非共有結合的である（すなわち、ヒンジジスルフィドは形成されない）（図２ｂ、表３）。これは、ホモ二量体のＸ線結晶構造に見られるノブ／ノブまたはホール／ホールＦｃドメインの逆平行の配向と一貫している。Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ＣＨ２−ＣＨ３ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ４２６，１９４７−１９５７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１４．０２．０１５（２０１４）を参照されたい。
【０２８２】
アニーリング、還元、及び酸化を使用して、二重特異性抗体を半抗体からインビトロで組み立てた。以前に記載されているアニーリング、還元、及び酸化の方法の修正版を使用して、親和性精製した抗Ｋ１１ノブ及び抗Ｋ４８ホール抗体から、抗Ｋ１１／Ｋ４８二重特異性抗体をインビトロで組み立てた（Ｓｈａｔｚ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｕｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＭＡｂｓ５，８７２−８８１，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２６３０７（２０１３）．）（図１ａ）。簡潔には、所望されるノブ及びホール半抗体を１：１の質量比で混合し、混合物のｐＨを１５体積／体積％の８００ｍＭのアルギニン（ｐＨ１０．０）で８．５に調節した。８００ｍＭのアルギニン中２００倍のモル過剰の還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｐＨ１０．０）を添加し、ノブ及びホール半抗体のアニーリングならびにヒンジジスルフィドの形成を可能にするために、空気に曝露した状態で、組み立て反応物を室温で７２時間インキュベートした。抗Ｋ１１／ｇＤ及び抗Ｋ４８／ｇＤ対照二重特異性抗体を同様に組み立てた。
【０２８３】
疎水性相互作用（ＨＩＣ）及びカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを使用して、結果として得られるヘテロ二量体を更に精製して、いかなる過剰な半抗体及びホモ二量体も除去した。二重特異性抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約１５０ｋＤａのバンドとして移動し、分析ＳＥＣ上で急激なピークとして溶出し、モル質量が完全抗体のモル質量と一貫して単分散である（図１ｂ、１ｃ、２ａ、表２）。
【０２８４】
Ｃ．抗体精製及び特徴付け
組み立てた二重特異性抗体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製した。簡潔には、組み立て反応物を、０．７５Ｍの硫酸アンモニウムの最終濃度になるまで、３体積の緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．５））で条件付けした。組み立て反応物を濾過し、５μｍ、７．８×７５ｍｍのＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）に充填し、その後、緩衝液Ａで洗浄した。４０カラム体積（ＣＶ）にわたる０〜１００％の緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、２５％のイソプロパノール）直線勾配を実行して、いかなる未反応の半抗体または凝集タンパク質からも二重特異性抗体を分離させた。溶出ピークの同一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によって監視した（方法の詳細については以下を参照されたい）。
【０２８５】
二重特異性抗体を、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって更に精製した。簡潔には、ＨＩＣプール材料を２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）へと透析し、１０μｍのＭｏｎｏ  Ｓ５／５０ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、緩衝液Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０））で洗浄した。４０ＣＶにわたる０〜１００％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１ＭのＮａＣｌ）直線勾配を実行し、所望される画分をプールした。精製した二重特異性抗体を、２０ｍＭのヒスチジンアセテート、２４０ｍＭのスクロース、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ５．５）中に製剤化した。
【０２８６】
ＬＣ−ＭＳを使用して、精製及びアニーリングした種の同一性を確認した（図１ｄ、２ｃ、表３）。不均質性を低下させるために、分析前に抗体をＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化した。抗Ｋ１１／Ｋ４８組み立て体中の主要な種は、実際、理論上の質量（１４４，６１３．１９Ｄａ）の４．１１Ｄａ以内である１４４，６１７．３０Ｄａの観察質量を有する二重特異性抗体である。
【０２８７】
１４４，４８５．９０Ｄａの理論上の質量を有する抗Ｋ４８ホールホモ二量体は観察されなかった。１４４，７４５．２６Ｄａの追加のピークが見られ、これは抗Ｋ１１ノブホモ二量体の理論上の質量（１４４，７４０．４８Ｄａ）に近い。この追加のピークは、抗Ｋ１１／Ｋ４８ヘテロ二量体について観察された１４４，６１７．３０Ｄａの実験上の質量よりも大きい１２８Ｄａである。発現中のカルボキシペプチダーゼの活性ために、哺乳動物細胞から精製した組み換え抗体は、典型的には、重鎖上のカルボキシ末端リジン残基が除去される。Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｊ．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ７０５，１２９−１３４（１９９５）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．＆Ｓｐｅｌｌｍａｎ，Ｍ．Ｗ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＣＤ４−ＩｇＧ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ１９４，６１１−６２０（１９９０）を参照されたい。
【０２８８】
本明細書で計算される組み換え抗体の理論上の質量は、カルボキシ末端リジンの完全な除去を想定する。このリジンの除去が不完全であり、追加の残基を含有する１つの重鎖を有する二重特異性抗体の画分がもたらされる場合、リジン残基の質量に対応して＋１２８Ｄａでもピークが見られることが予想されるだろう。半抗体の更なる分析は、抗Ｋ１１ノブ、抗Ｋ１１ホール、及び抗ｇＤノブが全て、わずかな画分のカルボキシ末端リジンが依然として結合している抗体を含有することを明らかにする（図２ｂ）。
【０２８９】
精製した抗Ｋ１１／Ｋ４８二重特異性抗体に観察された１４４，７４５．２６Ｄａでのピークが、抗Ｋ１１ノブホモ二量体の混入によるものではなく、むしろ１つの重鎖カルボキシ末端リジン残基が依然として結合している二重特異性抗体の一部分によるものであることを実証するために、抗体をカルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）で処理した。これは１４４，７４５．２６Ｄａのピークの喪失をもたらし、それがカルボキシ末端リジン残基の存在によるものであることを確認する。故に、抗Ｋ１１／Ｋ４８二重特異性抗体は、高度に純粋であり、いかなるホモ二量体も含まない。
【０２９０】
Ｄ．ホモ二量体の蛍光標識
抗Ｋ１１単一特異性抗体及び抗Ｋ１１／Ｋ４８二重特異性抗体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）タンパク質標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、製造業者の指示書に従って、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６でそれぞれ標識した。未反応の遊離染料を、広範囲の透析を通して除去した。１モルの抗体当たりそれぞれ６及び８モルのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６をコンジュゲートさせた。
＊＊＊
【０２９１】
前述の発明は、明確な理解のために例証及び実施例によって多少詳細に記載されているが、これらの説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
配列表
2019528040.tif 000005
2019528040.tif 000006
2019528040.tif 000007
2019528040.tif 000008
2019528040.tif 000009
2019528040.tif 000010
ＨＣ＝重鎖、ＬＣ＝軽鎖、ＨＣＶＲ＝重鎖可変領域、ＬＣＶＲ＝軽鎖可変領域、ＨＶＲ＝超可変領域。
【図１ａ−ｂ】
2019528040.tif 000011
【図１ｃ−ｄ】
2019528040.tif 000012
【図２ａ】
2019528040.tif 000013
【図２ｂ】
2019528040.tif 000014
【図２ｃ】
2019528040.tif 000015
【配列表】
2019528040000001.app
【国際調査報告】
2019528040.tif 000016
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