(57)【要約】  標的配列に特異的なアクチベーターオリゴヌクレオチドの存在下において、所定の核酸鎖（標的配列）を増加／増幅させることができるということを実質的に利用した、核酸の増幅方法を開示する。標的配列に特異的なアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換によって、新たに合成された相補的プライマー伸長産物の分離が起こり、その結果、新たなプライマーオリゴヌクレオチドが対応する鋳型鎖に結合することができる。このようにして、プライマーオリゴヌクレオチドと鋳型鎖からなる複合体が形成され、新たなプライマーの伸長反応を開始させることができる。さらに、このようにして形成されたプライマー伸長産物は再び鋳型として機能し、その結果、指数関数的な増幅反応が起こる。このとき、アクチベーターオリゴヌクレオチド自体は鋳型として機能せず、プライマー伸長反応に対して不活性であることが好ましい。アクチベーターオリゴヌクレオチドは増幅反応において補因子として機能し、反応に必要とされる鋳型鎖の関連セグメントを一本鎖の形態に戻す。少なくとも１種のプライマーオリゴヌクレオチド、少なくとも１種のポリメラーゼ、ポリメラーゼの一連の基質（たとえばdNTP）および少なくとも１種の特異的アクチベーターオリゴヌクレオチドを含む一連の成分を使用することによって、増幅対象の核酸を線形的に増幅させることができる。このような一連の成分と第２のプライマーオリゴヌクレオチドを使用することによって、増幅対象の核酸を指数関数的に増幅させることができ、得られた特異的プライマー伸長産物は、鋳型として使用されて、さらなるプライマー伸長反応が起こる。
2019530472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法であって、
ａ）標的配列を含む増幅対象の核酸鎖の３’末端セグメントに第１のプライマーオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする工程、
ｂ）ポリメラーゼにより第１のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長して、前記増幅対象の核酸鎖の標的配列（工程ａ）に相補的な配列を含む第１のプライマーの伸長産物を形成させる工程、
ｃ）前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域のポリヌクレオチドテールに、アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させる工程、
ｄ）前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域に相補的な、前記増幅対象の核酸鎖を引き剥がしながら、該第１のプライマー領域に前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させる工程、
ｅ）前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に相補的な、前記増幅対象の核酸鎖を引き剥がしながら、該第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の相補的セグメントに前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させて、該第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントを一本鎖とする工程、
ｆ）第１のプライマーの伸長産物にハイブリダイズすることができる配列を３’末端セグメントに含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、第１のプライマーの伸長産物にハイブリダイズする工程、
ｇ）ポリメラーゼにより第２のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長して、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域を含むように該第１のプライマー領域まで伸長を進めて該第１のプライマー領域を複製するが、第２の領域のポリヌクレオチドテールは複製しないことによって、第２のプライマーの伸長産物を形成させる工程、および
ｈ）所望の増幅度に達するまで工程ａ）〜ｇ）を繰り返す工程
を含み、
第１のプライマーオリゴヌクレオチドが、その３’末端セグメントに、前記増幅対象の核酸鎖に配列特異的に結合することができる第１のプライマー領域を含み、かつ
該第１のプライマー領域の５’末端に直接またはリンカーを介して連結された第２の領域を含むこと、
前記第２の領域が、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドへの結合と該アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換の補助（工程ｃ）に適しているポリヌクレオチドテールを含むこと、
前記ポリヌクレオチドテールが、選択された反応条件下でポリメラーゼによって実質的に複製されないこと、
前記アクチベーターオリゴヌクレオチドが、
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域のポリヌクレオチドテールに結合することができる第１の一本鎖領域、
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域に実質的に相補的であり、該第１の領域に結合することができる第２の一本鎖領域、および
ポリメラーゼによって合成された第１のプライマーの伸長産物の少なくとも１つのセグメントに実質的に相補的な第３の一本鎖領域を含むこと、ならびに
前記アクチベーターオリゴヌクレオチドが、第１のプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー伸長用の鋳型として機能しないこと
を特徴とする方法。
【請求項２】
実質的に一定の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域が、第１のプライマー領域の直後に続くように前記ポリメラーゼによって合成された第１のプライマーの伸長産物の前記少なくとも１つのセグメントに実質的に相補的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｅ）が、前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に相補的な、前記増幅対象の核酸鎖が該第１のプライマーの伸長産物から完全に離れるまで該相補的な核酸鎖を引き剥がしながら、前記伸長産物の相補的セグメントに前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させ、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントを一本鎖とすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｆ）が、第１のプライマーの伸長産物に第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズするのと同時に、鎖置換によって、第１のプライマーの伸長産物に結合している前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを少なくとも部分的に引き剥がすことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｇ）が、ポリメラーゼを使用して、第１のプライマーの伸長産物に結合している前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを引き剥がすことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｈ）が、前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの複製されていないポリヌクレオチドテールに前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させて、第１のプライマーの伸長産物に結合している第２のプライマーの伸長産物を引き剥がしながら、これと同時に、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの特異的な第１の伸長産物のセグメントと相補的二本鎖を形成させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）〜（ｇ）を繰り返すことが可能な条件下で該工程を繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第１のプライマーオリゴヌクレオチド、第２のプライマーオリゴヌクレオチドおよび前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを使用して、第１のプライマーの伸長産物および第２のプライマーの伸長産物を指数関数的反応において同時に増幅することを含み、形成された各プライマーの伸長産物が、同時合成の鋳型として機能する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットの使用であって、該キットが、少なくとも１種の第１のプライマーオリゴヌクレオチド、少なくとも１種のアクチベーターオリゴヌクレオチド、および少なくとも１種の増幅用ポリメラーゼを含むことを特徴とする使用。
【請求項１１】
前記キットが第２のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
今日、核酸鎖合成は生物工学において中心的な役割を果たしている。PCRなどの方法は、研究領域の発展だけでなく、診断を含む医療分野や食品分野での産業利用の進展にも大きく貢献してきた。シーケンシング、リアルタイム検出、マイクロアレイ技術、マイクロ流体操作などの他の技術とPCRを組み合わせることによって、基礎技術の開発がなされてきており、PCR基礎技術におけるいくつかの障壁を一部克服することに成功を収めることができた。また、等温増幅法（LAMP、HDA、RPA、TMA、SDAなど）などのさらなる増幅方法も開発されている。これらの方法は特にPOCT分野での使用が意図されたものである。
【０００２】
この分野において大きな進展がなされているにも関わらず、PCRは、様々な産業利用における技術的な障壁の中心的な要因となっている。
【０００３】
PCRなどの一般的な増幅方法の特性のうちの１つは、核酸の増幅操作中において、両プライマー間で増幅された配列部分が制御されないことである。PCR増幅反応の最適化においては、プライマーの結合が実質的に重要視される。PCR増幅の開始時およびその過程では、ほぼ特異的なプライマーの継続的な結合と、主産物および副産物の合成の開始とが起こる。たとえば、副産物は、合成サイクルにおいてプライマーが非特異的に伸長されることによって生成することがある。逆方向の合成反応が起こった場合、非特異的に伸長されたプライマーが鋳型として読み取られ、通常、完全なプライマー結合部位が形成される。したがって、誤った配列情報が１つの合成サイクルから次の合成サイクルへと伝達され、この結果、合成サイクル全体において副産物の初期生成が起こるだけでなく、副産物が指数関数的に増加してしまう。
【０００４】
このような副反応は、主反応（標的配列の増幅）を妨害する断片の初期生成や指数関数的な増加をもたらす場合があり、その後の解析工程が妨害される場合がある。このような副産物は、通常、プライマー配列と、これに対応する別のプライマー配列を含み、主反応と並行して副産物の増幅が進む場合がある（図１）。しかしながら、このような副産物は、標的配列ではなく別の核酸配列を含む。主産物の合成を最適化し、かつ副産物の生成を最小限にするためには、通常、プライマー配列を最適化し、プライマーの結合の特異性を高めることができる反応条件を選択する。それでもなお副産物の生成が起こった場合、新たに形成された鎖はその組成とは関係なく増幅方法においてすべて変性されるため、通常、主産物と並行して副産物が複製されうる。この工程において、新たな合成を一巡させるために必要な、プライマー結合部位の再生が起こる。PCR、HDA、SDAなどの方法では、配列依存的な鎖分離を引き起こさない手段が使用される（PCRでは昇温が行われ、HDAではヘリカーゼとATPが使用され、SDAでは鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される）。したがって、主産物と副産物のいずれにおいても、新たな結合と後続の合成反応に必要なプライマー結合部位が再生される。１回の合成が開始された後、使用されたプライマーが対応するプライマー結合部位を見つけることができた場合、主産物および副産物の両方が並行して複製されうる。このような副反応を特に起こしやすい増幅方法として、制御が困難となりうる反応条件下で行う必要がある増幅方法（たとえばポイントオブケア検査）や、副反応を起こしやすい要因が存在する傾向が強い増幅方法が挙げられる（たとえば、野生型配列が大量に存在する状況における、わずかな配列の差異（たとえば変異やSNVなど）を有する配列断片の増幅が挙げられ、このような解析は、たとえば、法科学分野、出生前診断や、たとえば、液体生検検査のひとつとしてのctDNA検出において重要である場合がある）。
【０００５】
最優先事項として、標的配列に対するプライマーの結合を最適化することによってPCR増幅の特異性を達成している。このとき、たとえば、プライマーに部分的に結合することができる別のオリゴヌクレオチドを使用することができ、これによって、別の核酸鎖への結合に対してプライマーと競合させることができる。このようなプローブは、通常、プライマー配列に部分的に結合するが、このプローブによって結合されなかった一本鎖配列部分がプライマー上に残る。その結果、このプローブによって結合されなかったこの一本鎖配列部分を介してプライマーが標的核酸に結合し、合成反応を開始することができる。このようにして、プライマーと鋳型の間のミスマッチが、このようなオリゴヌクレオチドによって競合的に取り除くことができるため、プライマー結合の特異性が向上する。その結果、通常、PCR反応を開始させるための特異性を向上させることが可能となる。このようなオリゴヌクレオチドの効果は、プライマー配列との相互作用に限られる。また、このような別のオリゴヌクレオチドは、両プライマーに挟まれた部分にある増幅対象の核酸鎖とは相互作用しない。しかし、プライマーはモル過剰量で使用されるため、プライマーと鋳型との非特異的相互作用が増幅中に起こりうる。プライマーの伸長において、このような非特異的事象（指数関数的な副反応の開始）が起こると、副産物の相補鎖が逆合成されることによって、またはこの逆合成を原因の一部として、十分な機能性を有するプライマー結合部位が形成されてしまう。副産物において、このような完全なプライマー結合部位が存在すると、プライマーへの結合に対する別のオリゴヌクレオチドの競合効果が失われてしまう。したがって、このような別のオリゴヌクレオチドを使用して、鋳型に対するプライマーの結合の特異性を制御すると、副反応が開始されにくくなるが、副産物が生成した後では、副産物の指数関数的な増幅にはほとんど影響を与えることができない。
【０００６】
また、特定の配列を特異的に検出するための解析法の特異性を向上させるため、一般に、標識オリゴヌクレオチドプローブが検出方法の一部として使用されている。このようなプローブは、指数関数的な増幅には実質的影響を与えない。一般に、プローブは十分に高い濃度の核酸鎖を必要とすることから、十分な産物が存在する場合、増幅の最終段階でその効果を発揮する（たとえば、TaqManプローブまたはLightCyclerプローブ）。
【０００７】
一般に、増幅方法の合成の特異性は、標的配列とは異なる副産物の生成と共増幅を抑制することによって向上させることができ、これによって、たとえば、診断法を改善することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、核酸鎖の酵素的合成および増幅を可能にする方法および成分を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、核酸鎖の合成および増幅のための新たな酵素法および成分を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、指数関数的な増幅において標的核酸鎖の合成の特異性を向上させる方法を提供することを別の目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、特異性が向上した合成を利用した指数関数的な増幅方法を実施するための手段を提供することを別の目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、プライマー間で合成された配列部分を検証することによって、合成された配列部分と標的配列のマッチングの程度に応じて、増幅反応の効率または配列の増幅反応時間に影響を与えることができる手段および方法を提供することを別の目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、合成された配列をリアルタイムで検証することができ、これによって、合成された配列をさらなる増幅サイクルに使用可能とするための制御を行う（リアルタイム制御／オンライン品質管理）手段および方法を提供することを別の目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、核酸鎖の塩基組成を検証してフィードバックする機能を備えた指数関数的な核酸鎖の増幅方法を提供するための手段および方法を提供することを別の目的とする。この方法において、核酸鎖の塩基組成を検証してフィードバックする機能は、指数関数的な増幅と並行して行われる。この方法における制御系は、増幅される各成分によって構成される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の方法を使用して、配列組成が定義された核酸鎖を合成および増幅することができる。
【００１５】
本発明の課題は、本発明の増幅方法およびこの方法を実施するための手段を提供することによって解決される。
【００１６】
前記増幅は、両プライマーから新たに合成された産物（プライマー伸長産物）がさらなる合成工程の鋳型として使用される指数関数的な増幅であることが好ましい。この増幅において、各プライマー配列は少なくとも部分的に複製され、その結果、合成直後には二本鎖の配列セグメントとして存在する相補的プライマー結合部位が生成する。この増幅方法では、両鎖の合成工程と新たに合成された配列部分の二本鎖開裂工程が交互に起こる。合成後に二本鎖が十分に分離することは、さらなる合成を行うために必須である。したがって、このように合成工程と二本鎖分離工程とが交互に起こることによって、指数関数的な増幅を達成することができる。
【００１７】
本発明の増幅方法の増幅（標的配列を含む核酸鎖の増幅）において、特に主産物の二本鎖の開裂は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと呼ばれるオリゴヌクレオチドによって行われる。アクチベーターオリゴヌクレオチドは、標的配列に一致する配列セグメントを含むことが好ましい。
【００１８】
詳細に述べると、本発明によれば、鎖分離は、所定の配列を有するアクチベーターオリゴヌクレオチドを使用することによって行われ、このアクチベーターオリゴヌクレオチドは、核酸を介した配列依存的鎖置換によって、両方の特異的プライマーの伸長産物からなる新たに合成された二本鎖を分離することが好ましい。一本鎖に分離されたプライマー伸長産物の一方には標的配列が含まれ、他方にはこの標的配列に対応するプライマー結合部位が含まれ、このプライマー結合部位は、さらなるプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位として機能することができ、その結果、増幅対象の核酸鎖が指数関数的に増幅される。基本的に、プライマー伸長反応と鎖置換反応は同時に進むことが好ましい。増幅は、合成された特異的な両方のプライマー伸長産物が自然に分離することができない反応条件下で起こることが好ましい。
【００１９】
標的配列を含む核酸鎖の特異的かつ指数関数的な増幅は、核酸鎖を増加させるために不可欠な必要条件として、合成工程と二本鎖開裂工程（プライマー結合部位の活性化工程）を繰り返すことを含む。
【００２０】
合成された二本鎖の開裂は、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって配列特異的に行われる反応工程として実施される。この開裂は、両方の相補的プライマー伸長産物が完全に解離するまで行うことができ、または、部分的に行ってもよい。
【００２１】
本発明によれば、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、標的配列と相互作用することができる配列部分と、この相互作用を引き起こしたり、可能としたり、有利なものとするためのさらなる配列部分とを含む。アクチベーターオリゴヌクレオチドとの相互作用の過程において、合成されたプライマー伸長産物の二本鎖部分は、配列特異的な鎖置換によって一本鎖の形態に変換される。このプロセスは配列依存的であり、合成された二本鎖の配列が、アクチベーターオリゴヌクレオチドの対応する配列とある程度の相補性を有している場合においてのみ、十分な二本鎖の開裂が起こり、合成の継続に必須の配列部分（たとえばプライマー結合部位など）が一本鎖の形態に変換され、「活性状態」となる。したがって、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、標的配列を含む新たに合成されたプライマー伸長産物を特異的に「活性化」させて、さらなる合成工程を行うことができる。
【００２２】
これに対して、標的配列を含まない配列部分は一本鎖の形態に変換されず、二本鎖のまま残り、これは「不活性」な状態に相当する。このような二本鎖において、プライマー結合能を備えたプライマー結合部位は、新たなプライマーとの相互作用が阻害されるか、または完全に妨げられるため、このような「非活性化」鎖に対しては、通常さらなる合成工程は起こらない。合成工程後、合成された核酸鎖においてこのような活性化（すなわち一本鎖形態への変換）が欠如または低下していることから、後続の合成工程において、わずかな量のプライマーしか、プライマー伸長反応に関与できなくなる。
【００２３】
目的とする主産物（標的配列を含む増幅対象の核酸鎖）が指数関数的に増幅されることから、数回の合成工程と活性化工程（二本鎖の開裂工程）を１つの増幅方法において組み合わせ、特定の核酸鎖が所望の量で得られるまでこの増幅方法を実施するか、または繰り返し行う。
【００２４】
この増幅方法の反応条件（たとえば温度）は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの非存在下において相補的プライマー伸長産物の自然分離が起こりにくくなるか、または有意に減速されるように設計する。
【００２５】
したがって、標的配列を含む相補的プライマー伸長産物を配列依存的に分離させることによって、目的とする増幅の特異性が高くなる。アクチベーターオリゴヌクレオチドは、自体の配列部分とプライマー伸長産物の所定の配列部分とがマッチすることによって、このような二本鎖の分離を行うことができるか、または促進することができる。このマッチングは、各合成サイクルの後にアクチベーターオリゴヌクレオチドによって検証される。合成プロセスと、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる新たに合成されたプライマー伸長産物の配列特異的な鎖置換とが成功裏に繰り返されることによって、すなわち、「活性化」される（二本鎖開裂／二本鎖分離／鎖置換の結果、対応するプライマー結合部位が一本鎖の形態で生じる）ことによって、指数関数的な増幅が起こる。
【００２６】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの設計および反応条件によって、アクチベーターオリゴヌクレオチドと非特異的プライマー伸長産物との間で様々な相互作用が起こる。アクチベーターオリゴヌクレオチドと非特異的プライマー伸長産物の間の相補性が不十分であると、鋳型鎖からのこのような非特異的プライマー伸長産物の十分な二本鎖分離／鎖置換は見られない。したがって、非特異的産物は、主に「不活性な」二本鎖の形態のまま残る。
【００２７】
したがって、所定のアクチベーターオリゴヌクレオチドを使用することによって、指数関数的な増幅の各合成工程において、プライマー伸長産物の塩基組成の配列依存的な検証が可能となり、後続の合成工程を行うための配列を選択または選別することが可能となる。ここで、アクチベーターオリゴヌクレオチドとの相互作用に成功した結果、新たに合成された一本鎖形態の「活性な」特異的プライマー伸長産物と、アクチベーターオリゴヌクレオチドとの相互作用が欠如していたり、不十分であったり、低減していたり、かつ／または減速された結果、新たに合成された二本鎖形態の「不活性な」非特異的プライマー伸長産物とは、区別することができる。
【００２８】
指数関数的な増幅によって、以下の効果が得られる。
非変性条件下では、特異的に合成された鎖の分離が、アクチベーターオリゴヌクレオチドの協力よって起こる。
【００２９】
標的配列を含む核酸鎖の指数関数的な増幅は、配列によって制御される（主反応）。配列によるこの制御は、各合成工程の後に起こり、プライマー間に存在し、かつ標的配列を含む配列セグメントが関与する。各合成工程の後で合成結果の検証が成功することによって、両方の特異的プライマー伸長産物が分離される。これは、さらなる特異的合成工程を行うための必要条件である。
【００３０】
増幅中、非特異的プライマー伸長産物の初期の生成は基本的に排除することができない（副産物）。鋳型依存性のため、このような非特異的プライマー伸長産物は、合成直後は通常、二本鎖の形態で存在する。しかし、アクチベーターオリゴヌクレオチドとの相互作用を全く行うことができないか、または制限されるため、鎖分離が起こらないか、または主反応と比べて鎖分離が減速する。したがって、誤った配列情報は１つの合成サイクルから次の合成サイクルへと伝達されない。
【００３１】
したがって、反応条件を選択し、かつアクチベーターオリゴヌクレオチドを設計することによって、増幅方法の各合成工程間における正しい核酸鎖鋳型の再生効率に特異的に影響を及ぼすことが可能となる。一般に、合成された配列と所定のアクチベーターオリゴヌクレオチド配列とのマッチングの程度が高いほど、合成された産物の分離が成功することが多く、ひいては、１つの合成工程から次の合成工程への正しい鋳型の再生が成功することが多くなる。一方、副産物において配列の差異が存在することによって、鋳型鎖の再生が不十分となり、したがって、合成の開始が遅くなり、後続の各サイクルにおいて収率が低下する。副産物の指数関数的な増幅は、全体的に進行が遅くなるか、または全く起こらなくなるか、かつ／または検出不能なレベルに留まる。
【００３２】
副産物の増幅速度を低下させ、さらには特定の副産物の形成を阻止することによって、増幅の特異性を高めることができ、したがって、増幅反応を利用した試験全体の特異性に影響を与えることができる。
【００３３】
したがって、本発明の方法は、合成された配列をリアルタイムで、すなわち反応を停止することなく検証することができるため、すべてのアッセイ成分が反応開始時に既に反応混合物中に含まれている均質なアッセイの開発が可能であることを示している。
【００３４】
本発明の方法は、フィードバック機能（制御機能）を有する、核酸鎖の指数関数的な増幅方法である。簡潔に述べると、単一の構造からなるこの機能は、（DIN EN 60027-6に記載のブロック図に従って）以下のように要約することができる。
【００３５】
アクチベーターオリゴヌクレオチドと両方のプライマーは、事前に配列が選択されていることから、増幅中に合成されるべき配列（標的配列を含む増幅対象の核酸鎖）の「設定点」を規定する。各合成サイクルにおいて生成された新たなプライマー伸長産物は、「制御値」（実際値）を構成する。アクチベーターオリゴヌクレオチドは、制御系（「センサー」、「制御因子」および「制御要素」を含む）の一部を構成し、新たに合成された鎖とアクチベーターオリゴヌクレオチド鎖との間の相補性の調整と、（該調整の結果として）「調整可能な変数」の両方に影響を及ぼすことができる。ここで、「調整可能な変数」とは、「実際値」と「設定点」とが十分にマッチした場合は、合成された鎖の一本鎖形態への変換（「プライマー結合部位の活性化」または「鋳型鎖の再生」）を意味し、または十分にマッチしていない場合は、合成された鎖の二本鎖形態の維持（「活性化の失敗」；プライマー結合部位は二本鎖の形態のままであり、したがって、新たなプライマーとの結合には利用できない）を意味する。
【００３６】
合成された配列の組成は、増幅過程／増幅中に継続的に制御されるため、アクチベーターオリゴヌクレオチドを「制御オリゴヌクレオチド」と見なすこともできる。
【００３７】
アクチベーターオリゴヌクレオチドによる合成された配列の制御は、プライマー領域やプライマー結合部位だけに留まらず、両プライマー間に存在する合成された核酸鎖の内部配列領域も含む。一実施形態において、標的配列の配列全体または増幅対象の核酸鎖の配列全体を制御することができる。
【００３８】
前記制御（配列の検証）は、指数関数的な増幅の後で行われるだけでなく、指数関数的な合成の段階で既に起こり、合成反応の結果／収率に影響を与える。
したがって、反応条件と組み合わせて、アクチベーターオリゴヌクレオチドにおいて所定の配列を使用することによって、プライマー領域に留まることなく、指数関数的な増幅に対して影響を及ぼすことができる。このように影響を及ぼすことによって、標的配列内の特定の配列差異を許容することができたり、指数関数的な増幅が完全に阻害されるまで増幅反応の速度を抑制することができる。
【００３９】
用語とその定義：
本発明において使用する用語は以下の意味を有する。
【００４０】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、アクチベーターオリゴヌクレオチド、プローブ、増幅対象の核酸鎖に関して使用され、２個以上、好ましくは３個を超えるデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド修飾および／または非ヌクレオチド修飾を含む分子であると定義される。その全長は、たとえば３〜３００個のヌクレオチド単位またはその類似体を含み、５〜２００個のヌクレオチド単位またはその類似体を含むことが好ましい。その厳密な長さは様々な要因に左右され、さらにはこのオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用にも左右される。
【００４１】
本明細書において「プライマー」は、天然のものであるか（たとえば精製され、制限酵素で切断された天然のプライマー）、合成により作製されたものであるかに関わらず、オリゴヌクレオチドに関する。プライマーは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で使用された場合、すなわち、ヌクレオチドと誘導物質（たとえばDNAポリメラーゼなど）の存在下で適切な温度と適切なｐＨにおいて使用された場合に、合成の開始点として作用することができる。増幅効率を最大とするためには、プライマーは一本鎖であることが好ましい。また、プライマーは、誘導物質の存在下で伸長産物の合成を開始するために、十分な長さを有していなければならない。プライマーの厳密な長さは、様々な要因に左右され、たとえば、反応温度、プライマーの供給源および使用する方法の用途に左右される。たとえば、診断用途で使用する場合、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、標的配列の複雑さに応じて、５〜１００ヌクレオチド長であり、６〜４０ヌクレオチド長であることが好ましく、７〜３０ヌクレオチド長であることが特に好ましい。短鎖のプライマー分子は、通常、プライマーとしての機能を発揮して、鋳型とともに十分に安定な複合体を形成するために低い反応温度を必要とし、あるいは、プライマーと鋳型からなる形成された複合体が十分に長くなるように、その他の反応成分（たとえばDNAポリメラーゼ）が高い濃度で存在することを必要とする。
【００４２】
本発明において使用するプライマーは、増幅対象の特定の各配列の様々な鎖に対して「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーが、対応する鎖とハイブリダイズしてプライマーの伸長反応を開始するために十分な相補性を有しておかなければならないことを意味する。したがって、たとえば、プライマー配列は、標的配列の配列を厳密に反映するものである必要はない。たとえば、非相補的なヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に結合することができ、残りのプライマー配列は、増幅対象の鎖の配列に相補的である。別の一実施形態において、プライマー配列が、増幅対象の鎖の配列と十分に高い相補性を有し、この増幅対象の鎖の配列とハイブリダイズし、伸長産物を合成できるプライマー−鋳型複合体を生成することができる場合、１個の非相補的塩基またはこれよりも長い非相補的配列をプライマーに挿入することができる。
【００４３】
鋳型に相補な鎖の酵素的合成の過程では、この鋳型鎖に完全に相補的なプライマー伸長産物が生成される。
【００４４】
Ｔｍ−融解温度
相補的または部分的に相補的な二本鎖の融解温度は、一般に、鎖の約５０％が二本鎖として存在し、残りの約５０％が一本鎖として存在するときの反応温度の測定値であると解される。このような系は、（２本の鎖の会合と解離の間で）平衡状態にある。
【００４５】
二本鎖のＴｍに影響を与えうる様々な要因（たとえば、配列長、配列のＣＧ含有量、緩衝条件、二価金属カチオン濃度など）が存在するため、増幅対象の核酸のＴｍは、実施する増幅反応と同じ条件下で測定される。
【００４６】
測定可能な融解温度は、複数の反応パラメータ、たとえば、各緩衝条件および各反応パートナーの濃度に依存するため、融解温度は、二本鎖を構成する各相補鎖の濃度を約０．１μｍｏｌ／ｌ〜約１０μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．３μｍｏｌ／ｌ〜約３μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約１μｍｏｌ／ｌとして、指数関数的な増幅と同じ反応緩衝液中で測定した値を意味する。融解温度の各値は、対応する二本鎖の安定性と相関する目安値である。
【００４７】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）であるdATP、dCTP、dGTPおよびTTP（またはdUTP、またはdUTP／TTPの混在）は、合成混合物に十分な量で添加される。一実施形態において、dNTPに加えて、少なくとも１種のdNTP類似体を合成混合物に添加することができる。一実施形態において、このようなdNTP類似体は、たとえば、特徴的な標識（たとえばビオチンや蛍光色素）を含み、dNTP類似体が核酸鎖に組み込まれると、この標識も核酸鎖に組み込まれる。別の一実施形態において、前記dNTP類似体は、ヌクレオチドの糖リン酸部分に少なくとも１つの修飾を含み、このような修飾dNTP類似体として、たとえば、α−ホスホロチオエート−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸（または核酸鎖にヌクレアーゼ耐性を付与するその他の修飾）、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、およびアシクロヌクレオシド三リン酸（または合成を停止させるその他の修飾）が挙げられる。さらなる一実施形態において、前記dNTP類似体は、核酸塩基に少なくとも１つの修飾を含み、このような修飾として、たとえば、イソシトシン、イソグアノシン（または拡張された遺伝子アルファベットを含むその他の核酸塩基修飾）、２−アミノアデノシン、２−チオウリジン、イノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、５−Ｍｅ−シトシン、５−プロピルウリジン、および５−プロピルシトシン（またはポリメラーゼによって天然の核酸塩基に組み込むことができ、鎖の安定性を変化させることができるその他の核酸塩基修飾）が挙げられる。さらなる一実施形態において、dNTP類似体は、核酸塩基の修飾と糖リン酸部分の修飾の両方を含む。さらなる一実施形態において、少なくとも１個の天然のdNTP基質の代わりに、少なくとも１種のdNTP類似体を合成混合物に添加する。
【００４８】
核酸合成を誘導する因子は、プライマーの伸長産物の合成を引き起こす作用を有する酵素含有化合物または酵素含有系であってもよい。この目的に適した酵素としては、たとえば、DNAポリメラーゼ、たとえばBstポリメラーゼおよびその改変体、Ventポリメラーゼなどが挙げられ、好ましくは、ヌクレオチドを正しく組み込むことができ、これによって、合成された各核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成させることができる熱安定性DNAポリメラーゼが挙げられる。通常、この合成は、各プライマーの３’末端から開始され、次いで鋳型鎖に沿って５’方向に伸長した後、合成が完了するか、または中断される。
【００４９】
鎖置換を起こすことができるポリメラーゼを使用することが好ましい。このようなポリメラーゼとしては、たとえば、Bstポリメラーゼの大きい方の断片またはその改変体（たとえば、Bst 2.0 DNAポリメラーゼ）、クレノウ断片、Vent（exo−）ポリメラーゼ、Deep Vent（exo−）DNAポリメラーゼ、Bsu DNAポリメラーゼの大きい方の断片、およびBsm DNAポリメラーゼの大きい方の断片が挙げられる。
【００５０】
一実施形態において、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼ、または５’−３’FEN活性を持たないポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００５１】
一実施形態において、少なくとも２種のポリメラーゼを使用し、たとえば、鎖置換活性を有するポリメラーゼと３’−５’校正活性を有するポリメラーゼを使用する。
【００５２】
好ましい実施形態において、特定の温度に達した後でのみ、その機能を発揮するホットスタート機能を有するポリメラーゼを使用する。
【００５３】
反応条件
反応条件には、緩衝条件、温度条件、反応の持続時間、各反応成分の濃度などが含まれる。
【００５４】
反応中、特異的に生成された増幅対象の核酸の量は、指数関数的に増加する。伸長産物の合成を含む反応は、所望の量の特定の核酸配列が得られるまで実施することができる。本発明の方法は、継続的に実施することが好ましい。好ましい一実施形態において、増幅反応は等温反応温度で進行させ、この温度は５０℃〜７０℃であることが好ましい。別の一実施形態において、反応温度を様々に変更することができ、増幅反応の各工程をそれぞれ異なる温度で進めることもできる。
【００５５】
指数関数的な増幅に必要とされる試薬は、反応の開始時に既に同じバッチに存在していることが好ましい。別の一実施形態において、本発明の方法の後の段階で試薬を添加することもできる。
【００５６】
増幅対象の核酸から新たに合成された二本鎖を分離するために、反応混合物中においてヘリカーゼやリコンビナーゼを使用しないことが好ましい。
【００５７】
好ましい一実施形態において、反応混合物は、ATPなどの、生化学的エネルギーを付与する化合物を含んでいない。
【００５８】
反応の開始時において増幅対象の核酸は、１つのバッチにおいて、数コピー〜数十億コピーの量で存在していてもよい。診断用途で使用する場合、増幅対象の核酸鎖の量は不明であってもよい。
【００５９】
増幅対象でない別の核酸が反応中に存在していてもよい。このような核酸は、天然のDNAもしくは天然のRNAまたはその同等物に由来するものであってもよい。一実施形態において、増幅対象の核酸と並行して増幅する必要のある制御配列を同じバッチに存在させる。
【００６０】
増幅対象の核酸鎖を合成するための、鋳型鎖を含む反応混合物に、使用するプライマーおよびアクチベーターオリゴヌクレオチドを、約１０３：１〜約１０１５：１（プライマー：鋳型）のモル過剰量で添加することが好ましい。
【００６１】
本発明の方法を診断用途で使用する場合、標的核酸の量が不明である場合があり、この場合、相補鎖に対するプライマーの相対量およびアクチベーターオリゴヌクレオチドの相対量を確実に決定することはできない。通常、増幅対象の配列が、複雑な長鎖核酸の混合物中に含まれている場合、プライマーは、相補鎖（鋳型）の量に対してモル過剰量で添加する。本発明の方法の効率を向上させるためには、大幅に過剰なモル量であることが好ましい。
【００６２】
使用するプライマー１、プライマー２およびアクチベーターオリゴヌクレオチドの濃度は、たとえば０．０１μｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌの範囲であり、０．１μｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌであることが好ましく、０．１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌであることが好ましく、０．１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌであることがより好ましい。各成分の濃度が高いと、増幅速度を増加させることができる。所望の反応結果を得るために、各成分の濃度を別々に変更することができる。
【００６３】
ポリメラーゼの濃度は、０．００１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲であり、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌであることが好ましく、０．１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌであることがより好ましい。
【００６４】
各dNTP基質の濃度は、１０μｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌの範囲であり、５０μｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌであることが好ましく、１００μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｍｏｌ／ｌであることがより好ましい。dNTPの濃度は、二価金属カチオンの濃度に影響を及ぼす場合がある。状況に応じて、二価金属カチオンの濃度を任意で調整する。
【００６５】
二価金属カチオンとして、たとえばＭｇ２＋が使用される。対応するアニオンとして、たとえば、Ｃｌ、酢酸アニオン、硫酸アニオン、グルタミン酸アニオンなどを使用することができる。二価金属カチオンの濃度は、たとえば、対応するポリメラーゼに最適な範囲に適合させ、０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ｌの範囲を含み、０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜２０ｍｍｏｌ／ｌであることがより好ましく、１ｍｍｏｌ／ｌ〜１５ｍｍｏｌ／ｌであることが好ましい。
【００６６】
通常、酵素的合成は緩衝水溶液中で行う。緩衝溶液として、Tris HCl、Tris酢酸塩、グルタミン酸カリウム、HEPES緩衝液、グルタミン酸ナトリウムなどの従来の緩衝物質を一般的な濃度で溶解させたものを使用することができる。緩衝溶液のｐＨ値は、通常、７〜９．５であり、約８〜８．５であることが好ましい。緩衝条件は、たとえば、使用するポリメラーゼの製造業者の推奨に従って適合させてもよい。
【００６７】
いわゆるＴｍ降下剤（たとえば、DMSO、ベタイン、TPAC）などのさらなる物質を緩衝液に添加することができる。このような物質は、二本鎖の融解温度を低下させて（「Ｔｍ降下剤」）、二本鎖の開裂に対して有利な効果を与えることができる。また、Tween 20やTriton 100などのポリメラーゼ安定化成分を通常の量で緩衝液に添加することもできる。EDTAまたはEGTAを通常の量で添加して、重金属を錯化することができる。また、トレハロースやPEG 6000などのポリメラーゼ安定化物質を反応混合物に添加することもできる。
【００６８】
反応混合物は、鎖置換反応を阻害する物質や、ポリメラーゼ依存的なプライマーの伸長を阻害する物質を含んでいないことが好ましい。
【００６９】
一実施形態において、反応混合物は、DNA結合性色素、好ましくはEvaGreenやSYBR Greenなどのインターカレート色素を含む。このような色素によって、核酸鎖の再生の検出が可能となってもよい。
【００７０】
反応混合物は、たとえば原材料に由来し、かつ好ましくは増幅に影響を及ぼさないタンパク質またはその他の物質がさらに含まれていてもよい。
【００７１】
温度条件
温度は、二本鎖の安定性に対して大きな影響を与える。
【００７２】
好ましい一実施形態において、増幅反応中、アクチベーターオリゴヌクレオチドの非存在下において、増幅対象の核酸の二本鎖を実質的に分離させる温度条件を使用しない。このようにすれば、増幅全体を通して、アクチベーターオリゴヌクレオチドの存在に応じて、増幅対象の核酸鎖の二本鎖を確実に分離させることができる。
【００７３】
増幅対象の核酸の融解温度（Ｔｍ）の測定値にほぼ等しい温度では、増幅対象の核酸の二本鎖が自然に分離し、合成された鎖の分離に対するアクチベーターオリゴヌクレオチドの影響が最小限に抑制され、ひいては、増幅の配列特異性に対するアクチベーターオリゴヌクレオチドの影響が最小限に抑制される。
【００７４】
配列特異性が低い条件（すなわち、アクチベーターオリゴヌクレオチドへの依存性が低い条件）で進行させる必要のある指数関数的な増幅では、反応温度は、たとえば、増幅対象の核酸の融解温度付近（すなわちＴｍ±３℃〜５℃）であってもよい。このような温度では、鎖置換反応におけるアクチベーターオリゴヌクレオチドと合成されたプライマー伸長産物の間の配列の違いは通常、十分に許容されうる。
【００７５】
Ｔｍ−約３℃〜Ｔｍ−約１０℃の温度範囲でも、効率は低くなるものの、合成されたプライマー伸長産物同士の自然な鎖分離は起こりうる。増幅対象の核酸の配列特異性に対してアクチベーターオリゴヌクレオチドが及ぼす影響は、増幅対象の核酸鎖の融解温度（Ｔｍ）付近の温度条件において大きくなる。
【００７６】
確かに、反応温度を低下させても、新たに合成された二本鎖とアクチベーターオリゴヌクレオチドが相互作用することから、鎖分離が実質的に起こるが、プライマーの二本鎖は、前記条件下の伸長温度において自然に、すなわち、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる配列依存的な鎖置換を伴わずに分解されうる。たとえば、配列特異的が低い増幅における反応温度は、Ｔｍ−約３℃〜Ｔｍ−約１０℃の範囲であり、Ｔｍ−約５℃〜Ｔｍ−約１０℃であることが好ましい。このような温度では、鎖置換反応におけるアクチベーターオリゴヌクレオチドと合成されたプライマー伸長産物の間の配列の違いはあまり許容されない。
【００７７】
本発明の方法において配列特異性の高い増幅は、特に、反応条件下において増幅対象の核酸から新たに合成された鎖が一本鎖の形態へと自然に解離することができない場合に達成される。このような場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる配列特異的な鎖置換によって配列特異的な鎖分離が行われ、このアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換が増幅反応の配列特異性を主に担う。これは、通常、反応温度が、増幅対象の核酸を構成する両鎖の融解温度よりも有意に低く、かつ鎖分離のためのさらなる成分（たとえばヘリカーゼまたはリコンビナーゼ）が使用されない場合に達成することができる。たとえば、配列特異的な増幅における反応温度は、Ｔｍ−約１０℃〜Ｔｍ−約５０℃の範囲であり、Ｔｍ−約１５℃〜Ｔｍ−約４０℃であることが好ましく、Ｔｍ−約１５℃〜Ｔｍ−約３０℃であることがより好ましい。
【００７８】
増幅の好ましい一実施形態において、増幅反応全体における反応温度の最大値を、増幅対象の核酸鎖の融解温度よりも高い温度へと上昇させない。
【００７９】
増幅のさらなる一実施形態において、反応温度を、増幅対象の核酸鎖の融解温度よりも高い温度に少なくとも１回上昇させることができる。この温度の上昇は、たとえば増幅反応の開始時に行ってもよく、これによってゲノムDNAの二本鎖が変性する。このような工程において、アクチベーターオリゴヌクレオチドの効果に依存的な二本鎖分離は、解除されるか、または少なくとも有意に低下することに注意されたい。
【００８０】
増幅反応の各工程の反応温度は、約１５℃〜約８５℃の範囲であってもよく、約１５℃〜約７５℃の範囲がより好ましく、約２５℃〜約７０℃の範囲が好ましい。
【００８１】
後述する実施例２および実施例３では、増幅反応の反応温度を６５℃とし、増幅対象の核酸のＴｍは約７５℃〜約８０℃であった。したがって、増幅対象の核酸の二本鎖はこの反応条件下で安定であり、増幅反応は配列特異的であった（実施例３参照）。
【００８２】
通常、反応温度は、各反応工程において前述のような温度が得られるように、各反応工程において最適に調整することができる。したがって、増幅反応は、温度を繰り返し変更することを含み、温度変更は周期的に行われる。本発明の方法の有利な一実施形態において、温度を変更する工程の数が反応工程の数より少なくなるように、いくつかの反応工程の反応条件を統一する。本発明のこのような好ましい一実施形態において、増幅における複数の工程のうちの少なくとも１つは、増幅における他の工程の反応温度とは異なる反応温度で行われる。したがって、反応は等温で進行せず、反応温度が周期的に変更される。
【００８３】
増幅中、たとえば、少なくとも２つの温度範囲を使用し、交互に変更する（ある温度範囲と別の温度範囲の間で温度を周期的に変化させる）。一実施形態において、低温側の温度範囲は、たとえば２５℃〜６０℃の範囲を含み、３５℃〜６０℃であることがより好ましく、５０℃〜６０℃であることが好ましく、高温側の温度範囲は、たとえば６０℃〜７５℃の範囲を含み、６０℃〜７０℃であることがより好ましい。
【００８４】
さらなる一実施形態において、低温側の温度範囲は、たとえば１５℃〜５０℃の範囲を含み、２５℃〜５０℃であることがより好ましく、３０℃〜５０℃であることが好ましく、高温側の温度範囲は、たとえば５０℃〜７５℃の範囲を含み、５０℃〜６５℃であることがより好ましい。
【００８５】
さらなる一実施形態において、低温側の温度範囲は、たとえば１５℃〜４０℃の範囲を含み、２５℃〜４０℃であることがより好ましく、３０℃〜４０℃であることが好ましく、高温側の温度範囲は、たとえば４０℃〜７５℃の範囲を含み、４０℃〜６５℃であることがより好ましい。
【００８６】
これらの温度は、各温度範囲において一定に維持してもよく、あるいは変化させて（低下または上昇させて）温度勾配を形成してもよい。
【００８７】
温度の調節に関しては、以下の実施形態においてさらに詳細に説明する。
【００８８】
設定された各温度は、特定の時間にわたって維持することができ、このようにして、インキュベーション工程が行われる。したがって、増幅において、反応混合物を、選択された温度で特定の時間にわたってインキュベートすることができる。このインキュベーション時間は、インキュベーション工程ごとに異なっていてもよく、所定の温度における各反応の進行（たとえば、プライマーの伸長または鎖置換など）に左右されうる。インキュベーション工程の時間は、0.1秒間〜10,000秒間の範囲を含んでいてもよく、0.1秒間〜1000秒間の範囲であることがより好ましく、１秒間〜300秒間の範囲であることが好ましく、１秒間〜100秒間の範囲であることがより好ましい。
【００８９】
このような温度変更により、各反応工程を選択された温度で好適に実施することができる。このようにすれば、各反応工程の収率を向上させることができる。特定の温度範囲から別の温度範囲への温度変更または温度調節は、任意で、１つの合成サイクルにおいて数回行うことができる。したがって、１つの合成サイクルは少なくとも１回の温度変更を含むことができる。このような温度変更は、たとえば、PCR機器／サーモサイクラーにおいて、日常的に行われるように時間プログラムによって実施することができる。
【００９０】
一実施形態において、鎖置換を含む少なくとも１つの工程と、プライマーの伸長反応を含む少なくとも１つの工程を、同時にまたは並行して、同じ反応条件下で行う増幅方法が好ましい。このような一実施形態において、たとえば、少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド（たとえば第１のプライマーオリゴヌクレオチド）のプライマー伸長反応を、低い温度範囲の温度条件で好適に行うことができる。一方、アクチベーターオリゴヌクレオチドと、別のプライマー（たとえば第２のプライマーオリゴヌクレオチド）の伸長反応とを含む鎖置換を、高い温度範囲の反応工程において行うことが好ましい。
【００９１】
さらなる一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換を含む少なくとも１つの工程と、プライマーの伸長反応を含む少なくとも１つの工程を、異なる温度で行う増幅方法が好ましい。このような一実施形態において、たとえば、少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド（たとえば第１のプライマーオリゴヌクレオチドおよび／または第２のプライマーオリゴヌクレオチド）のプライマー伸長反応を、低い温度範囲の温度条件で好適に行うことができる。一方、アクチベーターオリゴヌクレオチドの協力による鎖置換を、高い温度範囲の反応工程において行うことが好ましい。
【００９２】
さらに好ましい一実施形態において、増幅反応のすべての工程を同じ反応条件下で進行させる。
【００９３】
このような一実施形態において、増幅方法は等温条件下で実施することができ、すなわち、増幅方法を実施する際に温度を変更する必要はない。本発明のこのような好ましい一実施形態において、増幅反応全体が一定の温度で行われ、すなわち、反応は等温で行われる。このような反応の持続時間は、たとえば、100秒間〜30,000秒間の範囲が含まれ、100秒間〜10,000秒間の範囲であることがより好ましく、100秒間〜1000秒間の範囲であることがさらにより好ましい。
「実施例」において、等温反応が可能となるように、各反応成分の構造および関連する反応工程を互いに適合させることが可能であることを示す。
【００９４】
本発明の方法のすべての工程を行うことによって、増幅対象の核酸鎖の量を倍加させることができる操作を、「合成サイクル」と呼ぶことができる。このような合成サイクルは状況に応じて等温で進行させることができ、またはその過程において温度を変更することを特徴とすることもできる。温度の変更は周期的に繰り返すことができ、温度を等温とすることもできる。
【００９５】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の５個を超えるヌクレオチドが第１のプライマーの伸長産物に相補的に結合できる場合、より好ましくはアクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の１０個を超えるヌクレオチドが第１のプライマーの伸長産物に相補的に結合できる場合、さらにより好ましくはアクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の２０個を超えるヌクレオチドが第１のプライマーの伸長産物に結合する場合、達成可能な最高温度においてのみ、アクチベーターオリゴヌクレオチドの協力によって鎖分離が実質的に可能となる増幅方法が特に有利である。通常、合成された鎖が反応条件下で解離する前において、増幅に必要な、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物の相補鎖とが結合した鎖の長さが長いほど、増幅反応がより特異的となる。詳細に述べると、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域を長くするか、または短くすることによって、特異性の程度を所望のものとすることができる。
【００９６】
本発明の方法の工程を繰り返す場合、本発明の方法の持続時間全体を一定の温度で行うことができ、異なる温度で行うこともできる。
【００９７】
本発明の方法の各工程は、各成分を連続的に添加することによって実施することができる。有利な一実施形態において、増幅を実施するために必要なすべての反応成分を、増幅の開始時に１つの反応混合物中に存在させる。
【００９８】
増幅反応は、１種の成分を添加することによって開始することができ、たとえば、標的配列を含む核酸鎖（たとえば出発核酸鎖）、ポリメラーゼまたは二価金属イオンを添加することによって開始することができ、あるいは、増幅に必要とされる反応条件を達成することによって開始することができ、たとえば、本発明の方法の１つ以上の工程において、必要な反応温度に調整することによって開始することができる。
【００９９】
増幅は、増幅対象の核酸が所望の量で得られるまで実施することができる。別の一実施形態において、増幅反応は、増幅対象の核酸の存在下において十分な量を得るために十分であると予測された時間にわたって実施される。別の一実施形態において、増幅反応は、増幅対象の核酸の存在下において十分な量を得るために十分であると予測された十分な回数の合成サイクル（複製時間）で実施される。
【０１００】
反応は、様々な介入によって停止させることができる。たとえば、温度を変更することによって反応を停止させることができ（たとえば、冷却または加熱することによって反応を停止させることができ、この場合、たとえば、ポリメラーゼの機能が妨害される）、またはポリメラーゼによる反応を停止させる物質（たとえばEDTAまたはホルムアミド）を添加することによって反応を停止させることができる。
【０１０１】
増幅後、増幅された核酸鎖をさらなる解析に使用することができる。この場合、合成された核酸鎖を様々な検出方法で解析することができる。たとえば、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ、シーケンシング法（Sangerシーケンシングまたは次世代シーケンシング）、固相解析（たとえばマイクロアレイ解析またはビーズアレイ解析）などを使用することができる。合成された核酸鎖は、さらなるプライマー伸長反応の基質／鋳型として使用することもできる。
【０１０２】
有利な一実施形態において、反応中の合成反応の進行をモニタリングする。これは、たとえば、インターカレート色素（たとえば、SYBR GreenまたはEva Green）、標識プライマー（たとえば、LUXプライマーまたはScorpionプライマー）、または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって行うことができる。
【０１０３】
本発明の増幅方法を、診断方法において、生体試料中または診断材料中の標的核酸鎖の有無を確認するために使用することができる。
【０１０４】
第１のプライマーオリゴヌクレオチド：
第１のプライマーオリゴヌクレオチド（図５および図６）は、第１のプライマー領域および第２の領域を含む。第１のプライマー領域は、増幅対象の核酸内の実質的に相補的な配列またはその同等物に結合し、プライマーの伸長反応を開始することができる。第２の領域は、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合することができるポリヌクレオチドテールを含み、このポリヌクレオチドテールによって、第１のプライマーの伸長産物のその他の部分をアクチベーターオリゴヌクレオチドに空間的に近接させて、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換を開始させるのに十分な距離とすることができる。第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、ポリメラーゼ依存的合成の継続を阻害することによってポリメラーゼによるポリヌクレオチドテールの複製を阻止することができる少なくとも１つの修飾（ヌクレオチド修飾または非ヌクレオチド修飾）をさらに含む。この修飾は、たとえば、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域の移行部に位置する。したがって、第２のプライマーの伸長産物の合成中に、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域が、ポリメラーゼによって複製され、該ポリメラーゼによって第１の領域に相補的な配列を形成させることができる。第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域のポリヌクレオチドテールは、ポリメラーゼによって複製されないことが好ましい。一実施形態において、これは、ポリヌクレオチドテールの手前でポリメラーゼを停止させる修飾を第２の領域に付加することによって達成することができる。さらなる一実施形態において、ポリヌクレオチドテールの全長がこのような修飾ヌクレオチドで実質的に構成されるように、第２の領域にヌクレオチド修飾を付加することによって、ポリメラーゼによるポリヌクレオチドテールの複製を阻止することができる。
【０１０５】
一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドはそれぞれ、増幅対象である１つの核酸に特異的である。
【０１０６】
一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドはそれぞれ、実質的に異なる配列を含む少なくとも２種の、増幅対象の核酸に特異的である。
【０１０７】
一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは特徴的なマーカーで標識され、このようなマーカーとして、たとえば、蛍光色素（たとえば、TAMRA、フルオレセイン、Cy3、Cy5）、親和性マーカー（たとえば、ビオチン、ジゴキシゲニン）、およびたとえば検出、固相化またはバーコード標識を目的として特定のオリゴヌクレオチドプローブを結合するためのさらなる配列断片が挙げられる。
【０１０８】
第２のプライマーオリゴヌクレオチド：
第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、その３’末端セグメントを介して、増幅対象の核酸内の実質的に相補的な配列またはその同等物に結合し、第２のプライマーの特異的な伸長反応を開始することができる。したがって、この第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの特異的な伸長産物の３’末端セグメントに結合することができ、これによって、第２のプライマーの伸長産物のポリメラーゼ依存的な合成が開始される。
【０１０９】
第２のプライマーオリゴヌクレオチドの長さは、１５〜１００ヌクレオチド長であってもよく、２０〜６０ヌクレオチド長であることが好ましく、３０〜５０ヌクレオチド長であることが特に好ましい。
【０１１０】
一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドはそれぞれ、増幅対象である１つの核酸に特異的である。
【０１１１】
一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドはそれぞれ、実質的に異なる配列を含む少なくとも２種の、増幅対象の核酸に特異的である。
【０１１２】
一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは特徴的なマーカーで標識され、このようなマーカーとして、たとえば、蛍光色素（たとえば、TAMRA、フルオレセイン、Cy3、Cy5）、親和性マーカー（たとえば、ビオチン、ジゴキシゲニン）、およびたとえば、検出、固相化またはバーコード標識を目的として特定のオリゴヌクレオチドプローブを結合するためのさらなる配列断片が挙げられる。
【０１１３】
プライマー伸長産物：
プライマー伸長産物（本明細書において“primer extension product”とも“primer elongation product”とも呼ぶ）は、ポリメラーゼの触媒作用による鋳型依存的合成の結果、プライマーオリゴヌクレオチドが酵素（ポリメラーゼ依存的作用）により伸長されることによって生成される。
【０１１４】
プライマー伸長産物は、５’末端セグメントのプライマーオリゴヌクレオチド配列と、ポリメラーゼによって鋳型依存的に合成された伸長産物配列（本明細書において“extension product”とも“elongation product”とも呼ぶ）とを含む。ポリメラーゼによって合成された伸長産物は、合成の元となった鋳型鎖に相補的である。
【０１１５】
特異的なプライマー伸長産物（図１２〜１４）（主産物）は、増幅対象の核酸鎖の配列を含む。このような特異的なプライマー伸長産物は、特異的に増幅される核酸鎖を鋳型として、特異的な合成、すなわち目的とするプライマー伸長反応が正しく行われることによって得られる。好ましい一実施形態では、合成されたプライマー伸長産物の配列は、増幅対象の核酸の予想される配列に完全に相補的である。別の一実施形態において、得られた配列と理論上予想される配列との間の差異が許容される。一実施形態において、増幅の結果得られた配列と理論上予想される増幅対象の核酸の配列の一致度は、たとえば、（合成された全塩基の）９０％〜１００％であり、前記一致度が９５％を超えることが好ましく、９８％を超えることが理想的である。
【０１１６】
特異的なプライマーの伸長における伸長産物の長さは、１０〜３００ヌクレオチド長であってもよく、１０〜１８０ヌクレオチド長であることがより好ましく、２０〜１２０ヌクレオチド長であることが好ましく、３０〜８０ヌクレオチド長であることが特に好ましい。
【０１１７】
非特異的なプライマー伸長産物（副産物）は、たとえば、非特異的な、あるいは不正確な、あるいは意図しないプライマー伸長反応が起こったことによって生成された配列を含む。このような非特異的なプライマー伸長産物には、たとえば、誤った複製の開始（誤ったプライミング）の結果生成されたプライマー伸長産物、または塩基置換や塩基欠失などのポリメラーゼ依存的な配列変化などのその他の副反応の結果生成されたプライマー伸長産物が含まれる。非特異的なプライマー伸長産物の配列は、通常、二本鎖副産物を鋳型から引き剥がすことができるアクチベーターオリゴヌクレオチドの能力が及ばないほどに逸脱していることから、このような副産物の増幅の進行は遅くなり、あるいは増幅が起こらない。配列の逸脱が許容される程度または許容限界は、たとえば、反応温度および配列の差異の種類に左右される。非特異的なプライマー伸長産物の例としては、増幅対象の核酸ではないプライマーダイマーまたは配列バリアント、たとえば標的配列を含まない配列が挙げられる。
【０１１８】
増幅反応における十分な特異性は、その目的に関連して評価されることが多い。多くの増幅方法において、所望の結果を得ることができる限り、増幅反応における非特異性はある程度許容することができる。好ましい一実施形態において、増幅反応の最終的な結果における増幅対象の核酸鎖の割合は、新たに合成された核酸鎖の全量の１％を超え、１０％を超えることがより好ましく、３０％を超えることがより好ましい。
【０１１９】
増幅対象の核酸
増幅対象の核酸は、プライマーとアクチベーターオリゴヌクレオチドを使用して行われる指数関数的な増幅反応において、ポリメラーゼによって配列特異的あるいは少なくとも実質的に配列特異的に増幅される核酸鎖である。
【０１２０】
増幅対象の核酸の長さは、２０〜３００ヌクレオチド長であってもよく、３０〜２００ヌクレオチド長であることが好ましく、４０〜１５０ヌクレオチド長であることが好ましく、５０〜１００ヌクレオチド長であることが特に好ましい。
【０１２１】
増幅対象の核酸鎖は、１つ以上の標的配列またはその同等物を含んでいてもよい。さらに、増幅対象の核酸は、標的配列に実質的に相補的であり、かつ増幅反応において標的配列と同程度の効率で増幅される配列を含んでいてもよく、標的配列またはその一部を含んでいてもよい。増幅対象の核酸は、標的配列に加えて、配列セグメントを含んでいてもよく、たとえばプライマー配列、プライマー結合部位を含む配列、検出プローブに結合する配列セグメント、バーコード配列をコードする核酸鎖配列の配列セグメント、および／または固相に結合させるための配列セグメントをさらに含んでいてもよい。たとえば、前記プライマー配列またはその配列部分および前記プライマー結合部位またはその配列部分は、標的配列の一部を構成していてもよい。
【０１２２】
一実施形態において、増幅対象の核酸は標的配列に相当する。
【０１２３】
別の一実施形態において、標的配列は、増幅対象の核酸鎖の配列の一部を構成している。このような標的配列は、その３’末端側および／または５’末端側において別の配列と隣接していてもよい。このような隣接する別の配列は、たとえば、プライマー結合部位もしくはその一部、プライマー配列もしくはその一部、検出プローブ結合部位、（たとえば、マイクロアレイや、ビーズを使用した解析において）固相に相補的に結合させるためのアダプター配列、および／または配列をデジタル署名するためのバーコード配列を含んでいてもよい。
【０１２４】
増幅を開始させるためには、増幅対象の核酸鎖を合成するための最初の鋳型として機能する核酸鎖を、反応の開始時に反応混合物に添加する必要がある。このような核酸鎖を「出発核酸鎖」と呼ぶ。出発核酸鎖によって、増幅対象の核酸鎖の形成／合成／指数関数的な増幅に関与する各配列要素の配置が決まる。
【０１２５】
好ましい一実施形態において、増幅反応の開始時に添加されるか、または反応混合物に添加される最初の鋳型（出発核酸鎖）は、増幅対象の核酸鎖の配列組成に相当する配列組成を有する。
【０１２６】
増幅反応の初期段階およびその以降の過程において、各プライマーは、出発核酸鎖内の対応する結合部位に結合し、特異的なプライマー伸長産物の合成が開始される。増幅反応において、このような特異的なプライマー伸長産物は指数関数的に蓄積し、蓄積されたプライマー伸長産物が、指数関数的な増幅において、相補的なプライマー伸長産物を合成するための鋳型として次々と利用される。
【０１２７】
したがって、指数関数的な増幅において鋳型依存的な合成プロセスが繰り返され、増幅対象の核酸鎖が形成される。
【０１２８】
増幅反応が終了に近づくにつれて、反応の主産物（増幅対象の核酸）は、主に一本鎖の形態をとってもよく、主に相補的二本鎖の形態をとってもよい。主産物がどちらの形態であるかは、たとえば、両プライマーの相対濃度および適切な反応条件によって決定することができる。
【０１２９】
増幅対象の核酸の同等物は、増幅対象の核酸と実質的に同一の情報量の核酸を含む。たとえば、増幅対象の核酸の相補鎖は同一の情報量を有することから、「同等物」と呼んでもよい。
【０１３０】
標的配列
一実施形態において、標的配列は、増幅対象の核酸に特徴的な配列として機能することが可能な、増幅対象の核酸鎖のセグメントである。標的配列は、別の核酸の有無を示すマーカーとして機能することができる。したがって、この別の核酸は、標的配列の供給源として機能し、たとえば、ゲノムDNAもしくはゲノムRNAまたはその一部（たとえば、mRNA）；生物由来のゲノムDNAまたはゲノムRNAの同等物（たとえば、cDNA、修飾RNA（たとえば、rRNA、tRNA、マイクロRNAなど））；生物由来のゲノムDNAまたはゲノムRNAの定義された改変、たとえば、変異（たとえば、欠失、挿入、置換、付加、配列の増加（たとえば、マイクロサテライト不安定性検査における反復回数のばらつきの増加））；スプライスバリアント；再編成バリアント（たとえば、Ｔ細胞受容体バリアント）などを含んでいてもよい。これらの標的配列は、たとえば抗生物質耐性や予後の情報などの表現型の特徴を示すものであってもよく、したがって、診断用アッセイまたは診断検査を目的としたものであってもよい。標的配列の供給源あるいは起源としての核酸は、たとえば、標的配列を配列要素として含んでいてもよい。したがって、標的配列は、別の核酸由来の特定の配列組成の有無を示す特徴的なマーカーとして機能することができる。
【０１３１】
標的配列は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。標的配列は、増幅対象の核酸と実質的に同一のものであってもよく、増幅対象の核酸の一部であってもよい。
【０１３２】
標的配列の同等物は、標的配列と実質的に同一の情報量の核酸を含む。たとえば、標的配列の相補鎖は同一の情報量を有することから、「同等物」と呼んでもよい。同一の情報量の一例として、特定の配列のRNAバリアントおよびDNAバリアントが挙げられる。
【０１３３】
増幅反応のための材料の調製において、前述したような標的配列は、この配列が由来する環境から単離することができ、増幅反応を行うために調製することができる。
【０１３４】
好ましい一実施形態において、増幅対象の核酸は標的配列を含む。一実施形態において、前記標的配列は増幅対象の核酸に相当する。さらに好ましい一実施形態において、出発核酸鎖は標的配列を含む。一実施形態において、前記標的配列は出発核酸鎖に相当する。
【０１３５】
出発核酸鎖
増幅を開始させるためには、増幅対象の核酸鎖を合成するための最初の鋳型として機能する核酸鎖を、反応の開始時に反応混合物に添加する必要がある（図２３Ｂ）。このような核酸鎖を「出発核酸鎖」と呼ぶ。出発核酸鎖によって、増幅対象の核酸鎖の形成／合成／指数関数的な増幅に関与する各配列要素の配置が決まる。
【０１３６】
このような出発核酸鎖は、反応の開始時において、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。反応の開始時において出発核酸鎖が二本鎖であったか、それとも一本鎖であったかに関わらず、出発核酸鎖の相補二本鎖は分離されて、特異的な相補的プライマー伸長産物を合成するための鋳型として機能することができる。
【０１３７】
アクチベーターオリゴヌクレオチド：
アクチベーターオリゴヌクレオチド（図１０）は、増幅対象の核酸の増幅において特異的に生成された第１のプライマーの伸長産物の一部に実質的に相補的な所定の配列を含む一本鎖核酸鎖であることが好ましい。したがって、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドと、第１のプライマーオリゴヌクレオチドから伸長された特異的な伸長産物の少なくとも５’末端セグメントとに実質的に相補的に結合することができる。一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドがアクチベーターオリゴヌクレオチドに相補的に結合する場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、アクチベーターオリゴヌクレオチドを鋳型としたポリメラーゼによる相補鎖の合成を阻止するヌクレオチド修飾をその内部配列セグメントに含む。さらに、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、選択された反応条件下において、特異的な第１のプライマー伸長産物に結合している特異的な第２のプライマー伸長産物を、鎖置換によって完全にまたは部分的に引き剥がすことができる。この際、相補的な領域を有するアクチベーターオリゴヌクレオチドは、特異的な第１のプライマー伸長産物に結合する。アクチベーターオリゴヌクレオチドと特異的な第１のプライマー伸長産物が結合に成功すると、特異的な第２のプライマー伸長産物の３’末端側のセグメントが、第１のプライマーオリゴヌクレオチドとの結合に適した一本鎖の形態に戻り、新たなプライマー伸長反応を行うことができる。第２のプライマーの伸長産物の合成過程において、たとえばポリメラーゼおよび／または第２のプライマーオリゴヌクレオチドを介した鎖置換によって、第１のプライマーの伸長産物と結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドを、第１のプライマーの伸長産物から分離することができる。
【０１３８】
鎖置換法（strand displacement）：
鎖置換法とは、適切な手段によって、第１の二本鎖（たとえば、Ａ１鎖とＢ１鎖からなる二本鎖）が完全または部分的に分離され、これと同時にまたは並行して新たな第２の二本鎖が形成される方法を指し、この方法においては、少なくとも一方の鎖（Ａ１鎖またはＢ１鎖）が新たな第２の二本鎖の形成に関与する。鎖置換法には、２種の方法がある。
【０１３９】
１つ目の鎖置換法では、鎖置換反応の開始時に通常一本鎖として存在する相補鎖を利用して新たな第２の二本鎖を形成することができる。この方法では、鎖置換の手段（たとえば、Ａ１鎖に相補的な配列を有する事前に作製された一本鎖Ｃ１）が、（Ａ１鎖とＢ１鎖からなる）既存の第１の二本鎖に作用してＡ１鎖に相補的に結合し、これによって、Ａ１鎖に結合しているＢ１鎖が引き剥がされる。Ｂ１鎖が完全に引き剥がされた場合、Ｃ１鎖の作用によって新たな二本鎖（Ａ１：Ｃ１）が形成され、一本鎖Ｂ１が生じる。Ｂ１鎖の引き剥がしが不完全に起こった場合、いくつかの要因によって結果が左右される。たとえば、Ａ１：Ｂ１とＡ１：Ｃ１からなる部分的二本鎖の複合体が中間産物として存在しうる。
【０１４０】
２つ目の鎖置換法では、相補鎖の酵素的合成が進むのと同時に、新たな第２の二本鎖が形成される。この方法においては、事前に作製された第１の二本鎖を構成する２本の鎖のうちの一方が、ポリメラーゼによる合成の鋳型となる。この方法では、鎖置換の手段（たとえば、鎖置換活性を有するポリメラーゼ）が、事前に作製された（Ａ１鎖とＢ１鎖からなる）二本鎖に作用してＡ１鎖に相補的な新たなＤ１鎖を合成し、これと同時に、Ａ１鎖に結合しているＢ１鎖が引き剥がされる。
【０１４１】
科学論文では、鎖置換法を含む自然生物学的技術および分子生物学的技術またはバイオナノテクノロジーの様々な例が報告されている。タンパク質または酵素を使用した鎖置換法や、核酸鎖を使用した鎖置換法の例が報告されている。また、事前に作製された一本鎖核酸を使用した鎖置換法や、鎖置換が起こって初めて新たな鎖が合成される鎖置換法の例が報告されている。
【０１４２】
タンパク質または酵素を使用した鎖置換法（たとえばポリメラーゼまたはヘリカーゼを使用した鎖置換法）では、タンパク質または酵素の補助によって二本鎖が分離される。鎖置換増幅法（SDA）では、DNAポリメラーゼを使用した鎖置換が、たとえば相補鎖の合成と同時に起こる（米国特許第5,455,166号およびWalker et al. PNAS 89, 1992, 392-396）。使用するポリメラーゼは、核酸の重合を引き起こすとともに、下流の鎖を引き剥がすことができ、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が低下しているものでなければならない。このような特性を有するものとしては、たとえば、大腸菌のポリメラーゼＩから得られるクレノウ断片、Bsuポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のポリメラーゼの大きい方の断片（Bstポリメラーゼおよびその改変体）、Ventポリメラーゼ、Deep Ventポリメラーゼ、および鎖置換活性を有するその他のポリメラーゼが挙げられる。
【０１４３】
ポリメラーゼを使用した鎖置換の別の例として、LAMP増幅法（Loop mediated isothermal amplification）が挙げられる。タンパク質または酵素を使用した鎖置換法の別の例として、たとえばRecAなどを用いたリコンビナーゼ反応が挙げられる。この反応では、タンパク質−核酸鎖複合体と二本鎖の間で相互作用が起こることによって、二本鎖が部分的に鎖置換されるとともに、タンパク質−核酸鎖複合体が解離する。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA）ではこのプロセスが利用されている。RPA法は特許出願WO 2008035205に記載されている。タンパク質または酵素を使用した鎖置換法は、エネルギー消費を伴うことがほとんどであり、たとえばRPA法ではATPが消費される。
【０１４４】
核酸を介した鎖置換では（図４および図２２）、同一または類似した鎖の置換と同時に、または並行して新たな二本鎖が形成される。学術文献において、この反応は一般に鎖置換と呼ばれる。この現象は、相同な二本鎖の交叉点移動に関与あるいは大きく関わっており、内部分子がヘアピン構造を取らないように、一本鎖オリゴヌクレオチド、DNAクローニング、DNAを使用した「足がかり配列（toehold）」によるカスケード反応、およびSNP解析が利用されている。核酸を使用したあるいは核酸を介した鎖置換現象の特性は、４０年以上にわたり詳細に研究されており、様々な学術文献において報告されている（“The Kinetics of Oligonucleotide Replacement”, Reynaldo et al. J.Mol.Biol. 2000, 297, 511-；“Formation of a single base mismatch impedes spontaneous DNA branch migration” Panyutin et al. J.Mol.Biol. 1993, 230, 413-；“The kinetics of spontaneous DNA branch migration” Panyutin et al. PNAS 1994, 91,2021-；“Programmable energy landscapes for Kinetic control of DNA strand displacement” Machinek et al. Nature Commun 2014, 5, 5324-；“Remote Toehold: A mechanism for flexible control of DNA hybridization Kinetics” Genot et al. JACS, 2011, 133, 2177-；“A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacement hybridization” Li et al. NAR, 20102, v30, No.2 e5；“On the biophysics and kinetics of toehold-mediated DNA strand displacement”, Srinivas et al. NAR 2013, 10641-58；“Modelling toehold-mediated RNA strand displacement” Sulc et al. Biophysical Journal, 2015, 1238-；“Branch Migration through DNA sequence heterology” Biswas et al. J.Mol.Biol. 1998, 279, 795-；“Toehold-mediated nonenzymatic DNA strand displacement as a platform for DNA genotyping” Khodakov et al. JACS 2013, 135, 5612-；“Protected DNA Strand Displacement for enhanced single nucleotide discrimination in double stranded DNA” Khodakov et al. Nature, Scientific Reports, 2015, 5, 8721-；“Allele-Specific Holliday Junction Formation: a new mechanism of allelic discrimination for SNP Scoring” Yang et al. Genome Research 2003, 1754-；“Conditionally fluorescent molecular probes for detecting single base changes in double-stranded DNA” Chen et al. Nature Chemistry, 2013, 782-；“Optimizing the specificity of nucleic acid hybridization” Zhang et al. Nature Chemistry, 2012, 208-）。これらの従来技術およびその他の文献において、鎖置換法を成功させるために、使用する核酸鎖の構造に必要とされる条件、鎖置換の開始、鎖置換の速度論、反応条件や、使用する構造物の各セクションにおける配列差異が鎖置換に及ぼす影響が研究されており、詳細に報告されている。これらの報告において、鎖置換法の配列依存性は特に大きな役割を果たしている。核酸を介した鎖置換法に、既に配列の決まった特定の核酸鎖を使用する場合があることから、鎖置換法の結果も配列に特異的なものとなる。交叉点移動を利用した過去の報告では、配列依存性によって核酸鎖に差が見られることが実証されている。（交叉点移動は鎖置換に関連する方法であり、Lishanskiらによる米国特許出願第6,232,104号に記載されている。交叉点移動における修飾核酸鎖の使用は、Wetmurらによる米国特許第5,958,681号に記載されている。）
【０１４５】
学術文献において報告されている核酸を介した鎖置換法は、競合分子の誘導による分子複合体の解離の一例であると認識されている。“A general mechanism for competitor-induced dissociation of molecular complexes”, Paramanathan et al. Natur Commun, 2014, 5207-を参照されたい。
【０１４６】
核酸を介した鎖置換法がいくつか知られており、たとえば、「足がかり配列を介した」鎖置換（“toehold-mediated” strand displacement）または「３交叉点移動（3-branch-migration）」が当業者に知られている。
【０１４７】
「核酸を介した鎖置換法」では、互いに平衡状態になりうるすべて／一連の中間工程を組み合わせて実施することによって、事前に作製された（相補的なＡ１鎖とＢ１鎖からなる）第１の二本鎖を一時的または永続的に開裂し、（相補的なＡ１鎖とＣ１鎖からなる）新たな第２の二本鎖を形成する。この方法において、Ａ１鎖とＣ１鎖は相補的である。この方法を実施例１に示す（下記参照）。
【０１４８】
鎖置換を開始するための構造的な必須要件として、二本鎖の末端（事前に作製されたＡ１鎖とＢ１鎖からなる第１の二本鎖）と、鎖置換を開始するための一本鎖（Ｃ１）とを空間的に近接させる必要があることが知られている（これによって、Ａ１鎖とＣ１鎖が相補的二本鎖を形成することができる）。このような空間的近接は、一本鎖（Ｃ１）に一時的または永続的に相補的に結合することができる一本鎖オーバーハングによって好適に達成することができ（学術文献では、この一例として短いオーバーハングを使用することが知られており、英語では「toehold」と呼ばれる（前記文献参照））、これによって、Ｃ１鎖とＡ１鎖の相補的なセグメント同士を十分に近接させて、Ｂ１鎖の鎖置換を成功裏に開始させることができる。通常、Ａ１鎖とＣ１鎖の相補的なセグメント同士が近接していればいるほど、核酸を介した鎖置換の開始の効率が高くなる。
【０１４９】
内部セグメントにおいて、核酸を介した鎖置換を効率的に継続させるためのさらなる構造的な必須要件として、新たな二本鎖を形成する一方の鎖と他方の鎖（たとえばＡ１鎖とＣ１鎖）の間の相補性が高いことが必要とされる。そのため、たとえば、（Ｃ１鎖内に）ヌクレオチド変異があると、鎖置換が阻害されることがある（たとえば、交叉点移動でこのような事例が報告されている）。
【０１５０】
本発明では、相補的な核酸の能力を利用して、核酸を介した配列依存的な鎖置換を行う。
【０１５１】
本発明の好ましい実施形態を以下の図面および実施例において詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】PCRによる核酸増幅の問題点を示す。理論上は、所望の標的配列のみが増幅される。しかし、プライマーは、反応混合物中に含まれる核酸の無関係な他の部分にも結合することができるため、（望ましくない）副反応が起こり、増幅結果に干渉しうる副産物が生成される。
【図２】第１のプライマーオリゴヌクレオチドおよび第２のプライマーオリゴヌクレオチドを使用した、増幅対象の核酸の増幅を示す。
【図３】図２に示した構造の各成分を示す。
【図４】鎖置換の機構を示す概略図である。
【図５−６】第１のプライマーオリゴヌクレオチドの構造を示す概略図である。
【図７−８】第１のプライマーオリゴヌクレオチドと鋳型の相互作用および第１のプライマーの伸長産物の合成を示す概略図である。
【図９】第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の構造を示す概略図である。
【図１０】アクチベーターオリゴヌクレオチドの構造を示す概略図である。
【図１１−１２】第１のプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー伸長反応における各構造間の相互作用を示す概略図である。
【図１３−１４】第２のプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー伸長反応における各構造間の相互作用を示す概略図である。
【図１５−２１】増幅における各成分の領域間の相互作用を示す概略図である。
【図２２】鎖置換における各構造の相互作用を示す概略図である。
【図２３Ａ】核酸増幅における、第１のプライマーオリゴヌクレオチドと第２のプライマーオリゴヌクレオチドの増幅による各構造物の相互作用、アクチベーターオリゴヌクレオチドの作用、および結果として起こる鎖置換を示す概略図である。
【図２３Ｂ−２３Ｄ】出発核酸鎖の構造と、反応開始時の鋳型としてのその使用の実施形態のいくつかを示す概略図である。
【図２４−２９】実施例１における鎖置換の結果を示す。
【図３０】実施例２に記載の指数関数的な増幅におけるシグナル強度の傾向を示す。
【図３１】実施例２に記載の指数関数的な増幅後のキャピラリー電気泳動の経過を示す。
【図３２】実施例３に記載の本発明の増幅におけるシグナル強度の傾向を示す。
【図３３】実施例４に記載の本発明の増幅におけるシグナル強度の傾向を示す。矢印１は、完全にマッチした鋳型（配列番号２６）を10pmol/lの濃度で使用した反応を示す。矢印２は、ミスマッチを有する鋳型（配列番号２７）を10pmol/lの濃度で使用した反応を示す。矢印３は、ネガティブコントロールを使用した反応を示す。
【図３４】実施例５に記載の本発明の増幅におけるシグナル強度の傾向を示す。
【図３５】実施例６に記載の本発明の増幅におけるシグナル強度の傾向を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５３】
本発明の方法（図８〜２１）において、一本鎖の形態に変換された二本鎖核酸または一本鎖核酸鎖は、出発物質として使用することができる。前記増幅は配列特異的であることが好ましく、すなわち、増幅対象の核酸が増加することが好ましい。
【０１５４】
本発明の増幅系の成分は、増幅対象の核酸鎖、特異的な第１のプライマーオリゴヌクレオチド、第２のプライマー、および新たに合成された鎖の分離に関与するアクチベーターオリゴヌクレオチド、ならびに適切なポリメラーゼおよび基質（たとえばdNTP）である。本発明の増幅は、両方のプライマーのプライマー伸長反応を実施することができ、かつアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換を介した両方のプライマーの伸長産物の分離を補助することが可能な条件下において、緩衝溶液で行われる。
【０１５５】
一実施形態において、適切なアクチベーターオリゴヌクレオチドの非存在下では合成されたプライマー伸長産物が分離しない条件下において、本発明の方法のすべての工程を実施する。たとえば、両方のプライマーの伸長産物からなる二本鎖のＴｍが反応温度よりも有意に高くなるように、反応液の温度が選択される。
【０１５６】
このような条件下では、両方のプライマーの伸長産物の分離は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの効果に依存して起こる。アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーの伸長産物に相補的に結合し、これによって、第１のプライマーの伸長産物と結合している第２のプライマーの伸長産物を引き剥がすことができる。鎖置換反応を開始させるため、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域には、反応条件下でアクチベーターオリゴヌクレオチドと一時的に結合することができるポリヌクレオチドテールが付加されており、これによって、第１のプライマーの伸長ヌクレオチドのその他の領域をアクチベーターオリゴヌクレオチドに空間的に近接させることができる。アクチベーターオリゴヌクレオチドにより鎖置換が開始されると、第１のプライマーの伸長産物と結合している第２のプライマーの伸長産物が引き剥がされる。これによって、第１のプライマーの伸長産物の３’末端側セグメントが遊離状態となり、さらなる結合に利用可能となる。
【０１５７】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチドテールは、ポリメラーゼによって複製できないことが好ましい。これは、ポリヌクレオチドテールの領域内に適切な修飾を付加することによって、または第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域と第２のプライマー領域の間に第１のブロッキングユニットを挿入することによって達成することができる。
【０１５８】
第２のプライマーの伸長産物の合成は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドが第１のプライマーの伸長産物の３’末端側セグメントに結合した後に開始される。第１のプライマーの伸長産物の３’末端側セグメントは、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合せず、かつ第２のプライマーオリゴヌクレオチドに結合して該プライマーの伸長反応を補助できるように十分に長いことが好ましい。第２のプライマーの伸長産物の合成は、第１のプライマーの伸長産物と結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドが引き剥がされることによって開始される。これは、たとえば、ポリメラーゼに依存的な鎖置換によって、または第２のプライマーによる鎖置換によって行うことができる。
【０１５９】
第１のプライマーと第２のプライマーの各プライマー伸長産物は、複製可能な領域を含み、交互に鋳型として機能する。一方、アクチベーターオリゴヌクレオチドは鋳型として機能しない。これは、第１のプライマーの伸長産物に相補的に結合することができるが、ポリメラーゼによって鋳型として利用されないヌクレオチド修飾を使用することによって好適に達成することができる。このようなヌクレオチド修飾としては、修飾されたリン酸糖からなる主鎖部分を有するヌクレオチド化合物が挙げられ、たとえば、２’−Ｏ−アルキルRNA修飾（たとえば２’−ＯＭｅ）、LNA修飾、モルホリノ修飾などが挙げられる。通常、鎖内にこのような修飾が存在することによって、DNA依存的ポリメラーゼによる鎖の読み取りが阻止される。このような修飾の数は様々であってよく、ポリメラーゼによる鎖の読み取りを阻止するためには、通常、数個（１〜２０個）の修飾で十分であると考えられる。このようなヌクレオチド修飾は、たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドに対する第１のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位もしくはその周辺部位において使用することができ、かつ／または第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域の構成ヌクレオチドとして使用することができる。
【０１６０】
このような修飾を使用することによって、ポリメラーゼの機能が局所的に阻害され、これによって、使用する構造の特定のセグメントがポリメラーゼによって複製されなくなり、主として一本鎖のまま残される。この一本鎖の形態では、別の反応成分にさらに結合することが可能となり、これにより、その機能を発揮することができる。
【０１６１】
二本鎖が変性されない反応条件下では、核酸を介した配列依存的な鎖置換を使用することによって、本発明の方法の増幅反応において、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物が配列特異的に分離される。本発明の方法では、プライマーオリゴヌクレオチドから新たに合成された伸長断片と、増幅の開始時に添加されたアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列との間に十分な相補性があることが鎖置換の達成に必要とされ、したがって、この相補性は、（第１のプライマーの伸長産物および第２のプライマーの伸長産物からなる）二本鎖の鎖分離の効率にも影響を及ぼしうる。これらの配列の間にわずかな差異がある場合、鎖置換の速度が低下し、したがって鎖分離の速度も低下する。この結果、反応全体の速度も低下する。新たに合成された伸長産物の配列と、反応の開始時に添加されたアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列との間の差異が大きくなればなるほど、鎖置換が起こりにくくなり、最終的には第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物を十分に分離することができなくなる。新たに合成されたこれらの鎖は十分に分離することができなくなり、その結果、各伸長産物の結合部位にプライマーオリゴヌクレオチドが結合できなくなる。通常、配列に差異がある場合、このようにして配列の増幅が停止する。
【０１６２】
要約すれば、第１のプライマーまたは第２のプライマーとその鋳型の結合における特異性だけでなく、各プライマーの配列セグメントの特性も増幅に影響を及ぼしうる。すなわち、反応の開始時に添加されたアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列と各プライマーの配列セグメントとの間のマッチングの程度に応じて、各プライマーの配列セグメントの十分な鎖置換が達成可能であるかどうかが決まる。これに基づき、本発明の方法は、従来の増幅方法よりも全体的に高い特異性を達成することができる。
【０１６３】
本発明の方法では、アクチベーターオリゴヌクレオチドと二本鎖との間で鎖置換を起こすために特定のタンパク質（たとえばRecAなど）を使用しないことが好ましい。本発明の方法では、反応の開始時に添加した核酸鎖（アクチベーターオリゴヌクレオチド）による鎖置換と、これと並行したポリメラーゼによる鋳型依存的な鎖重合とを一時的に組み合わせて実施する。各成分の配列特異的な構造（配列特異的なアクチベーターオリゴヌクレオチドと配列特異的なプライマー）とこのような成分の特定の組み合わせによって、鎖置換と鎖重合とを組み合わせて同時に実施することができる。一方、ポリメラーゼの活性は、配列特異的に制御される。たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドは鋳型としては機能せず、第２のプライマーの伸長産物の合成は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドにおいて位置特異的に停止する。
【０１６４】
新たに合成されたプライマー伸長産物を好ましくは自然に分離させない反応条件において各成分を使用することによって、特異的な増幅がさらに達成される。
【０１６５】
驚くべきことに、本発明者らは、前述した鎖置換と鎖重合を好適に組み合わせることに成功した。すなわち、これらの反応（配列特異的な鎖置換とプライマーの伸長）を１つのバッチで好適に進行させることに成功した。このように、配列特異的プライマーオリゴヌクレオチド、配列特異的アクチベーターオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼおよびヌクレオチド基質（dNTP）を含む均質な増幅系を構築することができる。このような増幅系を使用して、増幅対象の核酸を増幅させることができる。各プライマーオリゴヌクレオチドの配列とアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列は、増幅対象の核酸とマッチしている。
【０１６６】
本発明の方法（図２３）は、後述するいくつかのプロセスを含む。これらのプロセスは、１つのバッチで行ってもよく、別々のバッチで行ってもよい。これらのプロセスを１つのバッチで行う場合、これらのプロセスは同じ条件下、たとえば等温条件で行うことができ、あるいは異なる条件下、たとえば周期的に温度を変更して行うこともできる。プライマーオリゴヌクレオチドおよびアクチベーターオリゴヌクレオチドは、反応の開始時に存在することが好ましい。しかし、各試薬を連続して添加することも可能である。
【０１６７】
さらに、たとえばPCRなどの他の増幅方法と組み合わせることも可能であり、たとえば、まず、PCRを１〜１０サイクル行い、次に、たとえば、等温条件下で反応を行うこともできる。
【０１６８】
有利な一実施形態において、核酸鎖を特異的に増幅する前記方法は、
ａ）標的配列を含む増幅対象の核酸鎖の３’末端セグメントに第１のプライマーオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする工程、
ｂ）ポリメラーゼにより第１のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長して、前記増幅対象の核酸鎖および／またはその標的配列（工程ａ）に相補的な配列部分を含む第１のプライマーの伸長産物を形成させる工程、
ｃ）前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域のポリヌクレオチドテールに、アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させる工程、
ｄ）前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域に相補的な、前記増幅対象の核酸鎖を引き剥がしながら、該第１のプライマー領域に前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させる工程、
ｅ）前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に相補的な、前記増幅対象の核酸鎖を引き剥がしながら、該第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の相補的セグメントに前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させて、該第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントを一本鎖とする工程、
ｆ）第１のプライマーの伸長産物にハイブリダイズすることができる配列を３’末端セグメントに含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、第１のプライマーの伸長産物にハイブリダイズする工程、
ｇ）ポリメラーゼにより第２のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長して、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域を含むように該第１のプライマー領域まで伸長を進めて該第１のプライマー領域を複製するが、第２の領域のポリヌクレオチドテールは複製しないことによって、第２のプライマーの伸長産物を形成させる工程、および
ｈ）所望の増幅度に達するまで工程ａ）〜ｇ）を繰り返す工程
を含み、
第１のプライマーオリゴヌクレオチドが、その３’末端セグメントに、前記増幅対象の核酸鎖に配列特異的に結合することができる第１のプライマー領域を含み、かつ
該第１のプライマー領域の５’末端に直接またはリンカーを介して連結された第２の領域を含むこと、
前記第２の領域が、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドへの結合と該アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換の補助（工程ｃ）に適しているポリヌクレオチドテールを含むこと、
前記ポリヌクレオチドテールが、選択された反応条件下でポリメラーゼによって実質的に複製されないこと、
前記アクチベーターオリゴヌクレオチドが、
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域のポリヌクレオチドテールに結合することができる第１の一本鎖領域、
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域に実質的に相補的であり、該第１の領域に結合することができる第２の一本鎖領域、および
ポリメラーゼによって合成された第１のプライマーの伸長産物の少なくとも１つのセグメントに実質的に相補的な第３の一本鎖領域を含むこと、ならびに
前記アクチベーターオリゴヌクレオチドが、第１のプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー伸長用の鋳型として機能しないこと
を特徴とする。
【０１６９】
一実施形態において、前記方法は、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの非存在下において増幅対象の核酸の相補鎖同士の分離が起こらない条件下で行う。
【０１７０】
一実施形態において、第２のプライマー領域の前記ポリヌクレオチドテールの複製は、第１の領域と第２の領域との間に位置するポリメラーゼ停止領域において起こる。
【０１７１】
一実施形態において、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域は、第１のプライマー領域の直後に続くように前記ポリメラーゼによって合成された、第１のプライマーの伸長産物の前記少なくとも１つのセグメントに実質的に相補的である。
【０１７２】
一実施形態において、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域は、第１のプライマーの伸長産物の伸長された部分の前記５’セグメントに完全に相補的であり、この相補配列部分の長さは、少なくとも３〜７０ヌクレオチド長であり、少なくとも５〜５０ヌクレオチド長がより好ましく、５〜４０ヌクレオチド長であることが好ましく、５〜３０ヌクレオチド長であることがさらに好ましく、５〜２０ヌクレオチド長であることが特に好ましい。
【０１７３】
さらなる一実施形態において、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域の配列と、第１のプライマーの伸長産物の伸長された部分の前記５’末端セグメントの対応する配列は、（ワトソン・クリック型塩基対の定義による）非相補的塩基対を有する１つの配列位置（ヌクレオチド対／塩基対）を除き、少なくとも３〜７０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド長、特に好ましくは１０〜２０ヌクレオチド長の相補的配列を含む。
【０１７４】
さらなる一実施形態において、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域の配列と、第１のプライマーの伸長産物の伸長された部分の前記５’末端セグメントの対応する配列は、（ワトソン・クリック型塩基対の定義による）非相補的塩基対を有する２つの配列位置（ヌクレオチド対／塩基対）を除き、少なくとも３〜７０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド長、特に好ましくは１０〜２０ヌクレオチド長の相補的配列を含む。
【０１７５】
さらなる一実施形態において、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域の配列と、第１のプライマーの伸長産物の伸長された部分の前記５’末端セグメントの対応する配列は、少なくとも３〜７０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド長、特に好ましくは１０〜２０ヌクレオチド長の（ワトソン・クリック型塩基対の定義による）相補的配列を含み、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域の配列と、第１のプライマーの伸長産物の伸長された部分の前記５’末端セグメントの対応する配列は、少なくとも３つの配列位置に非相補的塩基対をさらに含み、これらの位置は、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の５’末端セグメント内にある。
【０１７６】
さらなる一実施形態において、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域の配列と、第１のプライマーの伸長産物の伸長された部分の前記５’末端セグメントの配列は、（ワトソン・クリック型塩基対の定義による）非相補的塩基対を有する少なくとも１箇所から最大で１０箇所の配列位置を除き、少なくとも３〜７０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド長、特に好ましくは１０〜２０ヌクレオチド長の相補的配列を含み、（ワトソン・クリック型塩基対の定義による）非相補的塩基対を有する配列位置に、修飾核酸塩基を有する少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。このような修飾核酸塩基には、たとえば、天然の核酸塩基の結合力を向上させた核酸塩基（たとえば２−アミノアデニン）、または天然の核酸塩基の結合力を低下させた、イノシンや５−ニトロインドールなどのいわゆるユニバーサル塩基が含まれる。修飾核酸塩基は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の配列領域に位置することが好ましい。
【０１７７】
前記方法のさらなる一実施形態において、前記工程（ｅ）が、前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に相補的な、前記増幅対象の核酸鎖が該第１のプライマーの伸長産物から完全に離れるまで該相補的な核酸鎖を引き剥がしながら、前記伸長産物の相補的セグメントに前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させ、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントを一本鎖とすることを含むように、該工程をさらに変更する。
【０１７８】
前記方法のさらなる一実施形態において、前記工程（ｆ）が、第１のプライマーの伸長産物に第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズするのと同時に、鎖置換によって、第１のプライマーの伸長産物に結合している前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを少なくとも部分的に引き剥がすことを含むように、該工程をさらに変更する。
【０１７９】
前記方法のさらなる一実施形態において、前記工程（ｇ）が、ポリメラーゼを使用して、第１のプライマーの伸長産物に結合している前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを引き剥がすことを含むように、該工程をさらに変更する。
【０１８０】
前記方法のさらなる一実施形態において、前記工程（ｈ）が、前記伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの複製されていないポリヌクレオチドテールに前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを結合させて、第１のプライマーの伸長産物に結合している第２のプライマーの伸長産物を引き剥がしながら、これと同時に、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの特異的な第１の伸長産物のセグメントと相補的二本鎖を形成させることを任意で含むように、該工程をさらに変更する。
【０１８１】
前記方法のさらなる一実施形態において、ｈ）前記工程（ａ）〜（ｇ）を繰り返すことが可能な条件下で前記反応を継続する工程を含むように、前記方法をさらに変更する。
【０１８２】
前記方法のさらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチド、第２のプライマーオリゴヌクレオチドおよび前記アクチベーターオリゴヌクレオチドを使用して、第１のプライマーの伸長産物および第２のプライマーの伸長産物を指数関数的反応において同時に増幅することを含み、形成された各プライマーの伸長産物が、同時合成の鋳型として機能するように、前記方法をさらに変更する。
【０１８３】
出発核酸鎖の好ましい実施形態：
増幅反応の開始時に使用された核酸鎖または増幅反応の開始時に使用する核酸鎖を、以下、出発核酸鎖とも呼ぶ（図２３Ｂ〜２３Ｄ）。
【０１８４】
出発核酸鎖は、プライマーを正しい位置に配置することができ、両プライマー間の合成部位を提供することができ、結合反応および伸長反応の開始を可能とする最初の鋳型として機能する。好ましい一実施形態において、出発核酸鎖は標的配列を含む。
【０１８５】
各プライマーがそれぞれのプライマー結合部位（PBS1およびPBS2）と結合し、適切なプライマー伸長反応が開始されることによって、第１のプライマーの伸長産物が生成される。第１のプライマーの伸長産物は、反応の開始時に存在している核酸鎖の特異的な複製物として合成される。
【０１８６】
一実施形態において、増幅反応の開始前の反応混合物に加えられるこの核酸鎖（出発核酸鎖）は、増幅対象の核酸鎖と同一のものであってもよい。増幅反応によって、この核酸鎖の量だけが増加する。
【０１８７】
さらなる一実施形態において、増幅対象の核酸と出発核酸鎖は異なるものであってもよく、出発核酸鎖によって増幅対象の核酸鎖に含まれる各配列要素の配置が決まるが、出発核酸鎖の配列組成は、増幅対象の核酸鎖の配列と異なっていてもよい。たとえば、増幅反応におけるプライマーの結合と伸長によって、（出発核酸鎖には含まれない）新たな配列組成が、増幅対象の核酸鎖に組み込まれてもよい。さらに、増幅対象の核酸鎖に含まれる配列要素は、出発核酸鎖の配列要素とその組成（たとえばプライマー結合部位またはプライマー配列）が異なっていてもよい。出発核酸のみが、増幅対象の核酸鎖を特異的に合成するための最初の鋳型として機能することができる。この最初の鋳型は、増幅終了時まで反応混合物中に残存していてもよい。しかしながら、指数関数的に増幅が進むことから、増幅反応の終了時における増幅対象の核酸鎖の量は、反応に添加した出発核酸鎖の量よりも多くなる。
【０１８８】
さらなる一実施形態において、出発核酸鎖は、増幅されない少なくとも１つの配列部分を含んでいてもよい。したがって、このような出発核酸鎖は、増幅対象の配列と同一ではない。出発核酸鎖中の増幅されないこのような配列部分は、たとえば、配列の調製工程または事前の配列操作工程によって構築された配列部分であってもよい。
【０１８９】
好ましい一実施形態において、反応の開始前に反応混合物に添加される出発核酸鎖は、少なくとも１つの標的配列を含む。
【０１９０】
さらなる一実施形態において、前記出発核酸鎖は、少なくとも１つの標的配列と、非標的配列である別の配列とを含む。増幅反応において、標的配列を含む配列セグメントは指数関数的に増幅されるが、前記別の配列セグメントは、指数関数的な増幅が全く認められないか、または部分的にしか指数関数的に増幅されない。
【０１９１】
出発核酸鎖の構造
前述の出発核酸鎖の一例として、標的配列、配列断片Ａおよび配列断片Ｂを含む核酸鎖が挙げられる。
【０１９２】
出発核酸鎖の配列断片Ａは、増幅に使用されるプライマーのうちの一方の配列と有意な相同性を有する配列、または一方のプライマーの３’末端セグメントの複製可能な部分と実質的に同一である配列を含む。このセグメントに相補的な鎖の合成では、各プライマー結合部位となる相補的配列が生成される。
【０１９３】
出発核酸鎖の配列断片Ｂは、対応する他方のプライマーまたはその３’末端セグメントに相補的に結合して伸長可能なプライマー−鋳型複合体を形成するのに適した配列を含む。配列断片Ａと配列断片Ｂは、大部分において互いに相補的ではないか、または互いに相補的ではないことが好ましい。
【０１９４】
好ましい一実施形態において、以下の特性を有する出発核酸鎖を増幅方法の反応混合物に添加する。
【０１９５】
配列断片Ａは、出発核酸鎖の５’末端セグメントに位置することが好ましい。この配列断片Ａは、出発核酸鎖の５’方向において境界を形成することが好ましい。
【０１９６】
配列断片Ｂは、配列断片Ａの下流に位置することが好ましい。
【０１９７】
好ましい一実施形態において、前記配列断片Ｂは、前記核酸鎖の３’方向において境界を形成する。さらなる一実施形態において、前記配列断片Ｂは、該核酸鎖の３’方向において境界を形成せず、３’側の別の配列に隣接している。前記別の配列は標的配列ではなく、指数関数的な増幅に関与しないことが好ましい。
【０１９８】
一実施形態において、標的配列は、配列断片Ａおよび配列断片Ｂのうちの少なくとも１つを含む。さらなる一実施形態において、標的配列は、配列断片Ａと配列断片Ｂの間に位置する。
【０１９９】
一実施形態において、前述のような出発核酸鎖は、第１のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として機能することができる（図２３Ｂ）。この出発核酸鎖は、たとえば、第２のプライマーオリゴヌクレオチドを使用したプライマーの伸長反応を行う場合、指数関数的な増幅を行う前の調製工程において、出発核酸鎖を含む長い配列セグメント（図２３Ｂ、Ａ））として提供することができ、一本鎖の形態に変換することができる。たとえば、出発核酸鎖はゲノムDNAであってもよく、ゲノムRNAであってもよく、標的配列の供給源として使用することができる（図２３ＢのＡ）に二本鎖として模式的に示す）。出発核酸鎖は、５’末端側から順に、出発核酸鎖の５’方向の境界を形成し、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分を含むセグメント１（図２３Ｂ、Ｂ））；標的配列またはその一部を含むセグメント２；第１のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含むセグメント３；および出発核酸鎖の３’末端に位置し、セグメント３の３’末端側に隣接し、非標的配列を含むセグメント４を含む。
【０２００】
増幅の開始時において、第１プライマーは、少なくともその第１の領域の３’末端セグメントにおいて、出発核酸鎖のセグメント３に結合することができ（図２３Ｂ、Ｃ））、適切なポリメラーゼとヌクレオチドの存在下で伸長することができる。これによって、出発核酸鎖の鋳型鎖に相補的であり、鋳型鎖の長さに制限された第１のプライマーの伸長産物が生成される（図２３Ｂ、Ｄ））。増幅反応において、このようなプライマー伸長産物は、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって鋳型鎖から配列特異的に引き剥がされ（図２３Ｂ、Ｅ〜Ｆ））、合成された第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントの対応する配列部分が、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位として使用される（図２３Ｂ、Ｆ））。
【０２０１】
したがって、好ましい一実施形態において、出発核酸鎖は以下の配列断片を含む（図２３Ｂ）。
・配列セグメント１（図２３Ｂにおいてセグメント１と呼ぶ）。このセグメントは、第２のプライマーの配列と有意な相同性を有する配列、または第２のプライマーの３’末端セグメントの複製可能な部分と実質的に同一の配列を含む。この配列セグメント１は、出発核酸鎖の５’末端セグメントに位置し、５’方向において該核酸鎖の境界を形成することが好ましい。
・配列セグメント３（図２３Ｂにおいてセグメント３と呼ぶ）。このセグメントは、第１のプライマーの第１の領域またはその３’末端セグメントに相補的に結合し、伸長可能なプライマー−鋳型複合体を形成するのに適した配列を含む。配列セグメント３は、配列セグメント１の下流に位置することが好ましい。
・標的配列。セグメント１〜セグメント３の一部またはその全体にわたる配列である（図２３Ｂにおいて標的配列の一部をセグメント２と呼ぶ）。好ましい一実施形態において、標的配列は、セグメント１および／またはセグメント３の少なくとも１つを含む。
・出発核酸鎖に任意で含まれる３’末端セグメント。このセグメントは、増幅されないフランキング配列部分を含む（図２３Ｂにおいてセグメント４と呼ぶ）。
【０２０２】
さらなる一実施形態において、このような出発核酸鎖は、第２のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として機能することができる（図２３Ｃ）。
【０２０３】
この出発核酸鎖は、たとえば、第１のプライマーオリゴヌクレオチドを使用したプライマーの伸長反応を行う場合、指数関数的な増幅を行う前の調製工程において、出発核酸鎖を含む長い配列セグメント（図２３Ｃ、Ａ））として提供することができ、一本鎖の形態に変換することができる。たとえば、出発核酸鎖はゲノムDNAであってもよく、ゲノムRNAであってもよく、標的配列の供給源として使用することができる（図２３ＣのＡ）に二本鎖として模式的に示す）。出発核酸鎖（図２３Ｃ、Ｂ））は、５’末端セグメント側から順に、出発核酸鎖の５’方向の境界を形成し、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分を含むセグメント５；標的配列またはその一部を含むセグメント６；第２のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含むセグメント７；および出発核酸鎖の３’末端に位置し、セグメント７の３’末端側に隣接し、非標的配列を含むセグメント８を含む。
【０２０４】
増幅の開始時において、第１プライマーは、少なくともその第１の領域の３’末端セグメントにおいて、出発核酸鎖のセグメント７に結合することができ（図２３Ｃ、Ｃ））、適切なポリメラーゼとヌクレオチドの存在下で、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの停止部分まで伸長することができる。これによって、出発核酸鎖の鋳型鎖に相補的であり、鋳型鎖の長さに制限された第２のプライマーの伸長産物が生成される（図２３Ｃ、Ｄ））。増幅反応において、このようなプライマー伸長産物は、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって鋳型鎖から配列特異的に引き剥がされ（図２３Ｃ、Ｅ〜Ｆ））、合成された第２のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントの対応する配列部分が、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位として使用される（図２３Ｃ、Ｆ））。
【０２０５】
したがって、この好ましい実施形態において、出発核酸鎖は以下の配列断片を含む（図２３Ｃ）。
・配列セグメント５（セグメント５と呼ぶ）。このセグメントは、第１のプライマーの領域配列と有意な相同性を有する配列、または第１プライマーの第１の領域の複製可能な部分と実質的に同一の配列を含む。この配列セグメント７は、出発核酸鎖の５’末端セグメントに位置し、（第１のプライマーオリゴヌクレオチドと同様に）複製されないオリゴヌクレオチドテールに隣接する。この配列セグメント７は、５’方向において、この複製可能な核酸鎖の境界を形成することが好ましい。
・配列セグメント７（セグメント７と呼ぶ）。このセグメントは、第２のプライマーまたはその３’末端セグメントに相補的に結合し、伸長可能なプライマー−鋳型複合体を形成するのに適した配列を含む。この配列セグメント７は、配列セグメント５の下流に位置することが好ましい。
・標的配列。セグメント５〜セグメント７の一部またはその全体にわたる配列である（図２３において標的配列の一部をセグメント６と呼ぶ）。好ましい一実施形態において、標的配列は、セグメント５および／またはセグメント７の少なくとも１つを含む。
・出発核酸鎖に任意で含まれる３’末端セグメント。このセグメントは、増幅されないフランキング配列部分を含む（図２３Ｃにおいてセグメント８と呼ぶ）。
【０２０６】
出発核酸鎖の機能方法
増幅反応の開始時、出発核酸鎖は、各プライマーの伸長産物を最初に生成するための鋳型として機能する。したがって、出発核酸鎖は、増幅対象の核酸鎖を得るための出発鋳型となる。出発核酸鎖は、増幅対象の核酸鎖と必ずしも同一のものでなくてもよい。増幅反応において両方のプライマーが結合して伸長することにより、増幅対象の核酸鎖の両末端セグメントにおいて、どの配列が増幅中に生成されるのかが実質的に決まる。
【０２０７】
本発明の方法の好ましい一実施形態において、指数関数的な増幅プロセスにおいて、二本鎖を変性させない反応条件が維持される。したがって、出発核酸鎖は、ポリメラーゼによって伸長することができる５’配列セグメント内に、ポリメラーゼによる各プライマーの伸長を停止させるような制限を有していると有利である（たとえば、図２３Ｄのセグメント１、セグメント５、セグメント９またはセグメント１２）。したがって、反応条件下で生成されるプライマー伸長断片の長さが制限される。これは、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換において有利な効果をもたらし、各鎖を解離させて、プライマー結合部位を一本鎖の形態に変換し、これにより、該プライマー結合部位にプライマーが新たに結合することが可能となる。
【０２０８】
本発明の方法のさらに好ましい一実施形態において、初期の合成工程（たとえば、最初の１〜１０回の反復合成）では、二本鎖に対して変性反応条件（たとえば、最高で９０℃の温度）が使用されるが、これに続く反復合成工程の指数関数的な増幅プロセスでは、非変性条件が維持される。このような温度条件の組み合わせでは、出発核酸鎖がその５’末端配列セグメントに制限を有しているか否かは重要ではない。PCRと同様に、最初に変性した後に合成された鎖の分離は、その長さとは無関係に起こる。
【０２０９】
出発核酸鎖の設計
出発核酸鎖は、指数関数的な増幅を行う前に別の反応工程において設計することができる。標的配列を含む核酸鎖を設計して、それを使用する様々な方法、および事前に設計されるさらなる配列部分は当業者に公知である。出発核酸鎖の設計において、たとえば、鋳型依存的なプライマーの伸長工程、制限酵素による消化工程、ライゲーション工程、ポリアデニル化工程などを含む方法を使用することができる。これらの製造工程は、単独で、または組み合わせて使用することができる。このような反応において、様々な構造を有する出発核酸鎖を設計することができる（図２３Ｄ）。
【０２１０】
出発物質（Ａ）として使用される二本鎖のDNAを図２３Ｄに模式的に示す。このDNAの配列の一部は、標的配列を含む出発核酸鎖を調製するための材料または鋳型として機能する。適切な方法を使用して、このような材料から、様々な構造の適切な出発核酸鎖を調製することができる。
【０２１１】
調製される出発核酸鎖（図２３ＤのＢ））に含まれていてもよい配列セグメントとしては、たとえば、５’方向の境界を形成し、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分を含む、出発核酸鎖の５’末端のセグメント１；標的配列またはその一部を含むセグメント２；第１のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含むセグメント３；および出発核酸鎖の３’末端に位置し、セグメント３の３’末端側に隣接する、非標的配列を含むセグメント４が挙げられる。このような出発核酸鎖は、たとえばプライマーの伸長反応によって合成することができ、または１種以上の制限酵素を使用した制限酵素消化または制限酵素切断によって作製することができる。
【０２１２】
さらに、設計される出発核酸鎖（図２３ＤのＣ））に含まれていてもよい配列セグメントとしては、たとえば、５’方向の境界を形成し、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分を含む、出発核酸鎖の５’末端のセグメント５；標的配列またはその一部を含むセグメント６；第２のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含むセグメント７；および出発核酸鎖の３’末端に位置し、セグメント７の３’末端側に隣接する、非標的配列を含むセグメント８が挙げられる。このような出発核酸鎖は、たとえば、プライマーの伸長反応によって合成することができる。
【０２１３】
さらに、設計される出発核酸鎖（図２３ＤのＤ））に含まれていてもよい配列セグメントとしては、５’方向の境界を形成し、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分を含む、出発核酸鎖の５’末端のセグメント９；標的配列またはその一部を含むセグメント１０；および第２のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含むセグメント１１が挙げられる。このような出発核酸鎖は、１種以上の制限酵素を使用した制限酵素消化または制限酵素切断によって作製することができる。
【０２１４】
さらに、設計される出発核酸鎖（図２３ＤのＥ））に含まれていてもよい配列セグメントとしては、５’方向の境界を形成し、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分を含む、出発核酸鎖の５’末端のセグメント１２；標的配列またはその一部を含むセグメント１３；および第２のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含むセグメント１４が挙げられる。このような出発核酸鎖は、１種以上の制限酵素を使用した制限酵素消化または制限酵素切断を行い、それぞれの部位に対応するリガーゼ酵素系を使用して、セグメント１２および／またはセグメント１４の少なくとも１つをセグメント１３にライゲートすることによって作製することができる。
【０２１５】
出発核酸鎖の設計において、得られる出発核酸鎖は、二本鎖の形態で存在していてもよく、一本鎖の形態で存在していてもよい。出発核酸鎖の構造およびその設計方法に応じて、増幅前に出発核酸鎖を一本鎖の形態に変換することが必要となる場合がある。これは、たとえば、別の工程において行うことができ、または夾雑成分から出発核酸鎖を分離するためのクリーンアップ操作中に行うこともできる。
【０２１６】
たとえば、出発核酸鎖は、指数関数的な増幅に使用されるプライマー（たとえば、第１のプライマーオリゴヌクレオチドまたは第２のプライマーオリゴヌクレオチド）、標的配列を含む一本鎖のDNAもしくはRNA、ポリメラーゼおよびdNTPを用いた別のプライマー伸長反応において合成することができる。このような方法によって、鋳型に結合する出発核酸鎖を得ることができる。指数関数的な増幅に使用する場合、指数関数的な増幅を行う前に、出発核酸鎖を一本鎖の形態に変換することができる。このような一本鎖への変換は、様々な公知の方法を使用して行うことができ、たとえば、温度による変性、アルカリ変性、および（たとえば、RNase H、DNaseまたは５’エキソヌクレアーゼを使用した）部分的または完全な鎖分解が挙げられる。さらに、上流に位置する別のプライマー（いわゆるバンパープライマーまたはアウタープライマー）を使用して、別のプライマー伸長反応を行うこともでき、その結果、ポリメラーゼに依存的な鎖置換によって出発核酸鎖が一本鎖の形態に変換される。
【０２１７】
出発核酸鎖を一本鎖の形態に変換するため、二本鎖核酸を一本鎖の形態に変換することができる別の酵素系とその補因子またはエネルギー源を増幅混合物に添加することによって、二本鎖の形態で作製された出発核酸鎖を一本鎖の形態に変換することができる。このような酵素系として、たとえば、（エネルギー源としてATPまたはdATPを使う）ヘリカーゼおよびリコンビナーゼが挙げられる。好ましい一実施形態において、増幅反応中にこのような酵素が配列に非特異的な鎖解離を引き起こさないように、指数関数的な増幅反応を行う前にこれらの酵素を不活性化させる。
【０２１８】
有利な一実施形態において、指数関数的な増幅を行う前にこのような出発核酸鎖を設計するが、別個に処理を行う必要はない。
【０２１９】
有利なさらなる一実施形態において、増幅反応の成分または増幅反応を行うために提供される反応混合物の存在下において出発核酸鎖を設計する。この方法では、設計した出発核酸鎖を直接そのまま指数関数的な増幅反応に円滑に移行させることができる。このような実施形態において、均質なアッセイを設計することができる。
【０２２０】
有利な一実施形態において、このような出発核酸鎖を得るための出発物質は、ゲノムDNAまたはその断片、プラスミドDNAまたはその断片、mRNAまたはその断片、ならびにマイクロRNAおよびその断片からなる群から選択される。出発物質としての機能を有する核酸は、たとえば、臨床材料の供給源に由来するものであってもよい。
【０２２１】
本発明の方法の好ましい一実施形態において、増幅反応の開始時に使用される出発核酸鎖の配列は、増幅対象の核酸鎖の配列と同一である。この場合、増幅バッチにおける増幅の開始時に、（第１のプライマーの伸長産物または第２のプライマーの伸長産物として）増幅対象の核酸鎖の一方の鎖のみを使用してもよく、または両方の鎖を使用してもよい。
【０２２２】
本発明の方法の一実施形態において、相補鎖の合成中に、選択された温度でアクチベーターオリゴヌクレオチドの協力によって一本鎖に解離することができる二本鎖断片が生成されるように、増幅反応に添加する出発核酸鎖は、少なくとも一方の末端においてその長さが制限されていることが好ましい。
【０２２３】
これは、たとえば、増幅混合物に添加される出発核酸鎖が、増幅プライマーまたはその一部に対応する少なくとも１つの配列断片を５’末端セグメントに含むとともに、プライマー結合部位に相当するか、または増幅方法において適切なプライマーが結合することができるプライマー結合部位として機能し、ポリメラーゼ依存的合成反応によって出発核酸鎖に相補的な鎖を生成することができる下流の別の配列断片を含むことによって達成することができる。
【０２２４】
第１のプライマーオリゴヌクレオチド（プライマー１）の好ましい実施形態
第１のプライマーオリゴヌクレオチド（プライマー１）は、少なくとも以下の領域を含む核酸鎖である（図５および図６）。
・第１のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端セグメントに位置する第１のプライマー領域。この第１のプライマー領域は、増幅対象の核酸鎖に実質的に配列特異的に結合することができる。
・第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域の５’末端に直接またはリンカーを介して連結された第２の領域。この第２の領域は、アクチベーターオリゴヌクレオチドへの結合と該アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換の補助（工程ｃ）に適したポリヌクレオチドテールを含む。このポリヌクレオチドテールは、反応条件下で実質的に複製されずに一本鎖として残り、すなわち、安定したヘアピン構造やds構造を形成せず、好ましくはポリメラーゼによって複製されない。
【０２２５】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの全長は、１０〜８０個のヌクレオチド、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチド、より好ましくは２０〜３０個のヌクレオチド、またはこのような長さの同等物（たとえば、修飾ヌクレオチド）で構成される。第１のプライマーオリゴヌクレオチドの構造は、選択された反応条件下でアクチベーターオリゴヌクレオチドに可逆的に結合できるように構成されている。また、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの構造は、プライマー機能を発揮するのに適するように構成されている。さらに、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの構造は、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換を行えるように構成されている。したがって、第１の領域および第２の領域の構造は、指数関数的な増幅を行えるように構成されている。
【０２２６】
本発明の有利な一実施形態において、第１のプライマーの第１の領域と第２の領域は、通常の５’末端と３’末端で連結される。本発明のさらなる一実施形態において、第１の領域と第２の領域は、５’末端同士で連結され、この場合、第２の領域は第１の領域と反対方向になる。
【０２２７】
第１の領域と第２の領域の間の結合は、共有結合により行われることが好ましい。一実施形態において、第１の領域と第２の領域の間の結合は、DNAにおいて通常見られる５’−３’ホスホジエステル結合である。さらなる一実施形態において、第１の領域と第２の領域の間の結合は、５’−５’ホスホジエステル結合である。さらなる一実施形態において、第１の領域と第２の領域の間の結合は、第１の領域と第２の領域の隣接する末端ヌクレオチド同士の間または末端修飾ヌクレオチド同士の間に少なくとも１つのリンカー（たとえば、C3リンカー、C6リンカー、C12リンカー、HEGリンカー、または塩基を含まない修飾）が存在する５’−３’ホスホジエステル結合である。
【０２２８】
第１の領域と第２の領域は様々なヌクレオチド修飾を含むことができる。この場合、ヌクレオチドの各構成要素、すなわち、核酸塩基および主鎖を修飾することができる（糖部分および／またはリン酸部分）。さらに、標準的なヌクレオチド単位の少なくとも１つの部分が欠失または修飾されている修飾（たとえばPNA）を使用することもできる。
【０２２９】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合しない別の配列を含む。このような配列は、その他の目的のため、たとえば、固相に結合させるために使用することができる。このような配列は、ポリヌクレオチドテールの５’末端に位置することが好ましい。
【０２３０】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、特徴的な標識を含むことができる。このような標識としては、色素（たとえば、FAM、TAMRA、Cy3、Alexa 488など）、ビオチン、特異的に結合させることができるその他の基（たとえばジゴキシゲニン）が挙げられる。
【０２３１】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域の配列長は、約３〜３０ヌクレオチド長、好ましくは５〜２０ヌクレオチド長であり、この第１のプライマー領域の配列は、その大部分が、増幅対象の核酸鎖の３’末端セグメントに相補的である。詳細に述べると、第１のプライマー領域は、第２のプライマーの伸長産物の相補的な３’末端セグメントに特異的に結合できるものでなければならない。第１の領域は逆方向の合成で複製することができ、第２鎖の鋳型として機能する。各ヌクレオチド単位は、通常の５’−３’ホスホジエステル結合またはホスホチオエステル結合によって互いに連結されていることが好ましい。
【０２３２】
第１のプライマー領域は、ポリメラーゼの機能に影響を及ぼさないか、またはわずかにしか影響を及ぼさないヌクレオチドモノマーを含んでいることが好ましい。このようなヌクレオチドモノマーとして、たとえば、
・天然のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧなど）または塩基対が変化しないように修飾された天然のヌクレオチド、
・修飾ヌクレオチド（２−アミノ−ｄＡ、２−チオ−ｄＴなど）または塩基対が異なるその他の修飾ヌクレオチド
が挙げられる。
【０２３３】
好ましい一実施形態において、第１のプライマー領域の３’−ＯＨ末端は修飾されていないことが好ましく、ポリメラーゼによって認識することができる機能性の３’−ＯＨ基を有する。第１のプライマー領域は、増幅反応において、第１のプライマーの伸長産物の合成の開始剤として機能する。さらに好ましい一実施形態において、第１の領域は、ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性によって第１のプライマーの３’末端が分解されないように、少なくとも１つのホスホロチオエート化合物を含む。
【０２３４】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列とアクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列は、互いに相補的であることが好ましい。
【０２３５】
一実施形態において、第１のプライマー領域またはその３’末端セグメントは、標的配列の配列セグメントに結合することができる。
【０２３６】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、少なくとも１つのポリヌクレオチドテールを含む核酸配列であることが好ましく、このポリヌクレオチドテールは、合成反応においてポリメラーゼによって複製されず、かつアクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合することができることが好ましい。第２の領域において、主にアクチベーターオリゴヌクレオチドに結合するセグメントをポリヌクレオチドテールと呼ぶことができる。
【０２３７】
さらに、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、反応条件下でアクチベーターオリゴヌクレオチドに特異的に結合することが必要とされるだけでなく、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換に関与することが必要とされる。したがって、第２の領域は、アクチベーターオリゴヌクレオチドを、これに対応する二本鎖末端（より詳しくは、第２のプライマーの伸長産物の３’末端）に空間的に近接させるのに適した構造を有していなければならない。
【０２３８】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域の構造の構成を、実施形態のいくつかで詳細に説明する。これらの構造では、ポリメラーゼの触媒による合成を停止させるためのオリゴヌクレオチドセグメントの配置および修飾の使用を考慮に入れている。
【０２３９】
第２の領域の全長は、３〜６０個のヌクレオチド、好ましくは５〜４０個のヌクレオチド、好ましくは６〜１５個のヌクレオチド、またはこのような長さの同等物で構成される。
【０２４０】
第２の領域の配列は無作為に選択してもよい。第２の領域の配列は、増幅対象の核酸、第２のプライマーオリゴヌクレオチドおよび／または第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域に非相補的であることが好ましい。さらに、第２の領域の配列は、ヘアピン構造やステムループなどの自己相補的セグメントを含んでいないことが好ましい。
【０２４１】
第２の領域の配列は、反応条件下でアクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列に結合できるように、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列に適合したものであることが好ましい。好ましい一実施形態において、第２の領域とアクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の結合は、反応条件下で可逆的であることから、互いに結合している状態と結合していない状態の間で平衡が存在する。
【０２４２】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合することができる相補的塩基の数が１〜４０個、より好ましくは３〜２０個、好ましくは６〜１５個となるように選択することが好ましい。
【０２４３】
第２の領域は、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合することを主な機能とする。一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域が特定のアクチベーターオリゴヌクレオチドに結合することができるように、第２の領域とアクチベーターオリゴヌクレオチドの結合は特異的であることが好ましい。別の一実施形態において、第２の領域は、反応条件下で１つを超えるアクチベーターオリゴヌクレオチドに結合することができる。
【０２４４】
通常、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列とアクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列が完全にマッチしている必要はない。第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域とアクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域との間の相補性の程度は、２０％〜１００％であってもよく、５０％〜１００％であることがより好ましく、８０％〜１００％であることが好ましい。それぞれの相補的な領域は互いに直接隣接していてもよく、相補的な領域と別の相補的な領域の間に非相補的な配列セグメントを含んでいてもよい。
【０２４５】
一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、Ｔｍを変化させる修飾を少なくとも１つ含んでいてもよい。このような修飾を組み込むことによって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域とアクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域との間の結合の安定性を変化させることができる。たとえば、Ｔｍを上昇させる修飾（ヌクレオチド修飾または非ヌクレオチド修飾）を使用してもよく、このような修飾として、LNAヌクレオチド、２−アミノアデノシン、MGB修飾などが挙げられる。一方、Ｔｍを低下させる修飾を使用することもでき、このような修飾として、イノシンヌクレオチドなどが挙げられる。また、第２の領域の構造に、リンカー（たとえばC3リンカー、C6リンカー、HEGリンカーなど）を組み込むこともできる。
【０２４６】
鎖置換を行うためには、アクチベーターオリゴヌクレオチドが増幅対象の核酸の二本鎖の末端に空間的に近接する必要がある。増幅対象の核酸の二本鎖の末端は、第１のプライマーの伸長産物の第１のプライマー領域のセグメントと、これに対応する、第２のプライマーの伸長産物の相補的な３’末端セグメントからなる。
【０２４７】
反応条件下でポリヌクレオチドテールは、主として、アクチベーターオリゴヌクレオチドに相補的に結合し、これによって、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域と、伸長された第１のプライマー伸長産物の第１の領域とが一時的に接近し、その結果、鎖置換反応において、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域と第１のプライマー伸長産物の第１の領域の間で相補的結合の形成を開始することができる。
【０２４８】
一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチドテールにアクチベーターオリゴヌクレオチドが結合すると直ちに、両者が接触する。これは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドにおいてポリヌクレオチドテールと第１のプライマー領域とが互いに直接連結されていなければならないことを意味する。このような配置になっていることから、アクチベーターオリゴヌクレオチドが第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合すると、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域の相補的塩基と、第１のプライマー領域の対応する塩基とが直接接触し、鎖置換を開始することができる。
【０２４９】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチドテール構造と第１のプライマー領域構造との間に別の構造として第２の領域が存在する。したがって、アクチベーターオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドテールに結合した後、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１のプライマー領域に直接近接せず、第１のプライマー領域との間にある程度の距離が存在する。第１のプライマーオリゴヌクレオチドの複製不可能なポリヌクレオチドテールと複製可能な第１のプライマー領域との間の前記構造によってこのような距離が生じる。この距離は、０．１〜２０ｎｍであり、０．１〜５ｎｍであることが好ましく、０．１〜１ｎｍであることがより好ましい。
【０２５０】
このような構造として、たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドに相補的でない（たとえば、非相補的で複製不可能な修飾ヌクレオチドの形態の）リンカー（たとえばC3リンカー、C6リンカーまたはHEGリンカー）またはセグメントが挙げられる。このような構造の長さは、通常、鎖長としての原子数で測定することができる。この構造の長さは、鎖長として１〜２００原子であり、１〜５０原子であることが好ましく、１〜１０原子であることがより好ましい。
【０２５１】
増幅条件下においてポリヌクレオチドテールがポリメラーゼによって複製されないように維持するため、通常、第１のプライマー領域を複製した後のポリメラーゼによる第２のプライマーの伸長産物の合成を停止させることができる配列配置または配列構造を、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域に含む。このような構造によって、第２の領域のポリヌクレオチドテールの複製を阻止することができる。したがって、ポリヌクレオチドテールはポリメラーゼによって複製されないことが好ましい。
【０２５２】
一実施形態において、前記構造は、第１のプライマー領域とポリヌクレオチドテールの間に位置する。
【０２５３】
さらなる一実施形態において、ポリヌクレオチドテールの配列は、ポリメラーゼを停止させるヌクレオチド修飾を含んでいてもよい。この場合、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列セグメントは、ポリヌクレオチドテールとしての機能と、ポリメラーゼを停止させる修飾ヌクレオチド配列としての機能を有する。
【０２５４】
本明細書において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域に含まれ、合成を停止させることによりポリヌクレオチドテールの複製を阻止する修飾を、「第１のブロッキングユニットまたは第１の停止領域」とまとめて呼ぶ。
【０２５５】
以下、第２鎖の合成を停止することができる構造のさらなる実施形態を示す。
オリゴヌクレオチドの合成において、ポリメラーゼによる鋳型の読み取りを阻害し、ポリメラーゼによる合成を停止させることができる構成単位がいくつか知られている。たとえば、複製不可能なヌクレオチド修飾または非ヌクレオチド修飾が知られている。また、オリゴヌクレオチドにおいて、ポリメラーゼを停止させる合成ヌクレオチドモノマーや、そのような機能を発揮する配置も知られている（たとえば、５’末端同士を連結する配置または３’末端同士を連結する配置）。さらに、複製不可能なポリヌクレオチドテールを有するプライマーオリゴヌクレオチドも先行技術において知られている（たとえば、Scorpionプライマー構造または固相に結合させるためのプライマー）。第１のプライマーおよび第２のプライマーのバリアントは、プライマー伸長反応を起こして鎖合成を開始させることができるプライマーオリゴヌクレオチド構造として機能する。伸長反応によって、テールを有するプライマー構造がプライマー伸長産物に組み込まれた第１鎖が得られる。第１のプライマーの伸長産物に相補的な鎖の合成（たとえばPCR反応）では、第１のプライマー構造の「ブロッキングユニット／停止構造」まで第２鎖が伸長される。第１のプライマー構造および第２のプライマー構造は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端部分が一本鎖のまま、ポリメラーゼによって複製されないように設計される。
【０２５６】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域はポリヌクレオチドテールを含み、このポリヌクレオチドテールは、その全長にわたって通常の５’末端から３’末端の方向の配置を有し、複製不可能なヌクレオチド修飾を含む。このような複製不可能なヌクレオチド修飾としては、たとえば、２’−Ｏ−アルキルRNA修飾、PNA、モルホリノが挙げられる。このような修飾は、第２のプライマー領域において様々に分配される。
【０２５７】
ポリヌクレオチドテールに含まれる複製不可能な修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド単位の２０％〜１００％を占め、５０％を超える割合を占めることが好ましい。このような修飾ヌクレオチドは、第２の領域の３’末端セグメントに位置することが好ましく、したがって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域との境界に位置することが好ましい。
【０２５８】
一実施形態において、複製不可能な修飾ヌクレオチドの配列は、鋳型鎖の配列に少なくとも部分的に相補的であり、この修飾ヌクレオチドの少なくとも一部を介して第１のプライマーが鋳型に結合する。さらなる一実施形態において、複製不可能な修飾ヌクレオチドの配列は、鋳型鎖の配列に非相補的である。
【０２５９】
複製不可能な修飾ヌクレオチドは、互いに共有結合で連結されていることが好ましく、したがって、第２の領域において配列セグメントを形成する。この修飾ヌクレオチドからなるセグメントの長さは、１〜４０ヌクレオチド長の範囲を含み、１〜２０ヌクレオチド長であることが好ましく、３〜１０ヌクレオチド長であることがより好ましい。
【０２６０】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域はポリヌクレオチドテールを含み、このポリヌクレオチドテールは、その全長にわたって通常の５’末端から３’末端の方向の配置を有し、複製不可能なヌクレオチド修飾（たとえば２’−Ｏ−アルキル修飾）と少なくとも１つの非ヌクレオチドリンカー（たとえばC3リンカー、C6リンカー、HEGリンカー）を含む。非ヌクレオチドリンカーは、隣接するヌクレオチド同士または修飾ヌクレオチド同士を共有結合により連結させ、これと同時にポリメラーゼの合成能を部位特異的に阻害する機能を有する。
【０２６１】
このような非ヌクレオチドリンカーは、ポリヌクレオチドテール構造と第１のプライマー領域構造とを互いに遠ざけすぎないものである。むしろ、ポリヌクレオチドテールは、第１のプライマー領域と空間的に近接して位置する。非ヌクレオチドリンカーは、２００原子以下の鎖長の修飾であり、その鎖長は５０原子以下であることがより有利であり、１０原子以下の鎖長が特に好ましい。このリンカーの長さは最短で１原子であってもよい。このような非ヌクレオチドリンカーの一例として、少なくとも１個、有利には少なくとも２〜３０個、より好ましくは４〜１８個の炭素原子を含むアルキル鎖を有する直鎖または分枝鎖のアルキルリンカーが挙げられる。このようなリンカーは、オリゴヌクレオチド化学においてよく知られており（たとえば、C3リンカー、C6リンカー、C12リンカーなど）、オリゴヌクレオチドの固相合成工程において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチドテールの配列と第１の領域の配列との間に組み込むことができる。このような非ヌクレオチドリンカーの別の例として、直鎖状または分枝鎖状のポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。オリゴヌクレオチド化学において知られているものとしては、ヘキサエチレングリコール（HEG）が挙げられる。このような非ヌクレオチドリンカーとしては、さらに、塩基を含まない修飾（たとえば、Ｄ−リボースの類似体であるTHF修飾）が挙げられる。
【０２６２】
１つ以上の前記修飾が第２の領域に組み込まれている場合、ポリメラーゼによる第２のプライマーの伸長産物の合成の際に、この修飾によってポリメラーゼの複製能を効果的に阻害することができ、この修飾以降の下流のセグメントは複製されなくなる。第２の領域に含まれるこのような修飾の数は、１〜１００個であってもよく、１〜１０個であることが好ましく、１〜３個であることがより好ましい。
【０２６３】
このような非ヌクレオチドリンカーは、第２の領域の３’末端に位置していてもよく、したがって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域の間の移行部を形成してもよい。
【０２６４】
また、第２の領域の中央のセグメントに非ヌクレオチドリンカーを配置することもできる。これによって、ポリヌクレオチドテールが少なくとも２つのセグメントに分割される。この実施形態において、ポリヌクレオチドテールの３’末端セグメントは、少なくとも１個の複製不可能なヌクレオチド修飾を含み、複製不可能なヌクレオチド修飾の数は多いほど好ましく、たとえば２〜２０個、好ましくは２〜１０個である。このような複製不可能なヌクレオチド修飾は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域の間の移行部に位置することが好ましい。
【０２６５】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドテールを含み、このポリヌクレオチドテールは、その全長にわたって５’末端から３’末端の方向の配置を有し、３’末端から５’末端の「逆」方向の配置の少なくとも１つのヌクレオチドモノマーを含み、この逆方向の配置のヌクレオチドモノマーは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域の間の移行部に位置している。
【０２６６】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドテールを含み、このポリヌクレオチドテールは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域の境界に隣接して逆方向の配置で位置するヌクレオチドのみからなり、そのため、第１の領域と第２の領域が５’末端同士で連結されている。このような配置の利点としては、第１の領域を複製した後のポリメラーゼが「逆」方向の配置のヌクレオチドに遭遇し、これによって、通常、この部位で合成が停止することが挙げられる。
【０２６７】
ポリヌクレオチドテールの全長が「逆」方向の配置のヌクレオチドで構成されている場合、副反応を阻止するためには、ポリヌクレオチドテールの３’末端ヌクレオチドにおいて３’−ＯＨ末端をブロックすることが好ましい。別の方法では、３’−ＯＨ基を有していない末端ヌクレオチド（たとえばジデオキシヌクレオチド）を使用することもできる。
【０２６８】
このような実施形態でも、このようなヌクレオチドの配置に対応するようにアクチベーターオリゴヌクレオチドを適合させることができることは言うまでもない。この場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は、３’末端同士で連結する必要がある。
【０２６９】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドテールを含み、このポリヌクレオチドテールは、その全長にわたって通常の５’末端から３’末端の方向の配置を有し、天然のdNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTPまたはdUTP）のみを用いて合成を行う場合、ポリメラーゼに相補的な核酸塩基ではない少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む。
【０２７０】
たとえば、Iso-dGヌクレオチド修飾またはIso-dCヌクレオチド修飾を第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域に単独で組み込むことができるが、数個（少なくとも２〜２０個）のIso-dGまたはIso-dCヌクレオチド修飾を組み込むことが好ましい。核酸塩基修飾の別の例として、拡張された遺伝子アルファベットを使用した様々な修飾が挙げられる。このようなヌクレオチド修飾は、天然のヌクレオチドとの相補的な塩基対合を形成しないものであることが好ましく、これによって、ポリメラーゼは（少なくとも理論的には）天然の一連のヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、dTTPまたはdUTP）を挿入することがない。しかし、実際には、特に、dNTP基質濃度を高くし、かつインキュベーション時間を長くした場合（たとえば６０分以上）では、痕跡的な挿入が起こりうる。したがって、このような数個のヌクレオチド修飾を隣接する部位で使用することが好ましい。このような修飾を付加することによって、適切な相補的基質を欠失させることにより、ポリメラーゼによる合成を停止することができる。Iso-dCまたはIso-dGを有するオリゴヌクレオチドは、標準的な方法を用いて合成することができ、いくつかの製造会社（たとえば、Trilink-Technologies、Eurogentec、Biomers GmbH）からも入手可能である。別の方法では、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列を、このような第２のプライマー領域の配列に適合させることもできる。したがって、この場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドの化学合成中に、拡張された遺伝子アルファベットからなる相補的な核酸塩基をアクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域に組み込むことができる。たとえば、Iso-dGを第１のプライマーヌクレオチドの第２の領域に組み込むことができ、その相補的ヌクレオチド（Iso-dC-5-Me）を、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域内の適切な部位に配置することができる。
【０２７１】
要約すれば、様々な方法を使用して、第２の領域でのポリメラーゼによる合成を停止させることができる。しかし、ポリメラーゼが第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域を複製した後においてのみ、ポリメラーゼによる合成を停止させることが好ましい。このようにすれば、第２のプライマーの伸長産物がその３’末端セグメントにおいて適切なプライマー結合部位を持つことができる。このプライマー結合部位は、鎖置換中に露出され、さらなる第１のプライマーオリゴヌクレオチドを新たに結合することができる。
【０２７２】
第１のプライマーの伸長産物に相補的な鎖の合成では、プライマーの伸長反応はポリヌクレオチドテールの手前で停止する。このようにすれば、ポリヌクレオチドテールの一本鎖の形態が維持され、アクチベーターオリゴヌクレオチドと相互作用して結合することができるため、ポリヌクレオチドテールは、アクチベーターオリゴヌクレオチドの対応する相補的セグメントを適切な二本鎖の末端と近接させて、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換反応の開始を補助することができる。このような方法では、アクチベーターオリゴヌクレオチドの相補的部分（第２の領域）と、伸長されたプライマーオリゴヌクレオチドの相補的部分（第１の領域）との距離が最短になる。このように空間的に近接させることによって、鎖置換の開始が容易となる。
【０２７３】
核酸を介した鎖置換反応の概略図では、このとき、アクチベーターオリゴヌクレオチドの相補的配列は、適切な二本鎖の末端に近接した状態である。これによって、アクチベーターオリゴヌクレオチド鎖と第１のプライマーに相補的な鋳型鎖との間において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域との結合に対する競合が起こる。第１のプライマーの第１の領域とアクチベーターオリゴヌクレオチドの相補的セグメント（アクチベーターヌクレオチドの第２の領域）とが繰り返し近接して塩基対合が形成され、または第１のプライマーの第１の領域と鋳型鎖の相補的セグメントとが繰り返し近接して塩基対合が形成されることによって、核酸を介した鎖置換が開始される。
【０２７４】
一般に、第１のプライマーの第１の領域の相補的セグメントと、アクチベーターオリゴヌクレオチドの対応する相補的な配列部分とが近接すればするほど、鎖置換の開始の収率は高くなる。一方、両者の間隔が大きくなればなるほど、鎖置換の開始の収率は低下する。
【０２７５】
本発明において、鎖置換の開始を最大収率で実施することは必須ではない。したがって、アクチベーターオリゴヌクレオチドが、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域のポリヌクレオチドテールに結合した場合、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域の５’末端セグメント（鋳型の相補鎖に結合して相補的二本鎖を形成するセグメント）と、アクチベーターオリゴヌクレオチドの対応する相補的な配列部分との間の距離は、０．１〜２０ｎｍであってもよく、０．１〜５ｎｍであることがより好ましく、０．１〜１ｎｍであることがさらに好ましい。好ましい実施形態において、この距離は１ｎｍ未満である。別の単位で表した場合、前記距離は、２００原子未満に相当し、５０原子未満であることがより好ましく、１０原子未満であることがさらに好ましい。好ましい実施形態では、前記距離は１原子である。これらの距離に関する情報は、これらの構造間の距離が短いほどより好ましいことを示すことのみを目的としたものである。前記距離は、オリゴヌクレオチドの構造を厳密に解析して、配列同士の距離またはリンカーの長さの測定値を評価することによって決定されることが多い。
【０２７６】
第１のプライマーは、アクチベーターオリゴヌクレオチドや鋳型鎖との相互作用に必要とされないさらなる配列部分を含んでいてもよい。このような配列部分は、たとえば、検出プローブまたは固相との結合における固相化パートナーとして使用される別のオリゴヌクレオチドに結合することができる。
【０２７７】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドのプライマーとしての機能
第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの工程で使用してもよい。まず、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅においてプライマーとしての機能を発揮する。これによって、第２のプライマーの伸長産物を鋳型として使用して、プライマーの伸長反応が行われる。さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅反応の開始時に出発核酸鎖を鋳型として使用することができる。さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、出発核酸鎖の設計／提供に使用することができる。
【０２７８】
増幅反応において、第１のプライマーは、第２のプライマーの伸長産物を鋳型として使用することにより、第１のプライマーの伸長産物の合成の開始剤として機能する。第１のプライマーの３’末端セグメントは、第２のプライマーの伸長産物に大部分が相補的に結合することができる配列を含む。第２のプライマーの伸長産物を鋳型として使用して第１のプライマーオリゴヌクレオチドが酵素的に伸長されることによって、第１のプライマーの伸長産物が形成される。このような第１のプライマーの伸長産物は、標的配列またはその配列部分を含む。第２のプライマーの伸長産物の合成において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの複製可能な部分の配列がポリメラーゼによって鋳型として認識され、対応する相補的配列が合成されて、第１のプライマーオリゴヌクレオチドに対応するプライマー結合部位が生じる。第１のプライマーの伸長産物の合成は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントを含むように該５’末端セグメントまで行われる。第１のプライマーの伸長産物が合成された直後、該第１のプライマーの伸長産物は第２のプライマーの伸長産物に結合し、二本鎖複合体を形成する。第２のプライマーの伸長産物は、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって前記複合体から配列特異的に引き剥がされる。これによって、アクチベーターオリゴヌクレオチドが第１のプライマーの伸長産物に結合する。アクチベーターオリゴヌクレオチドによって鎖置換が成功裏に行われた後、第２のプライマーの伸長産物自体が、第１のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として機能することができる。次いで、第１のプライマーの伸長産物の遊離状態の３’末端セグメントは、別の第２のプライマーオリゴヌクレオチドに結合することができ、これによって、第２のプライマーの伸長産物の新たな合成を開始することができる。
【０２７９】
さらに、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅の開始時において、出発核酸鎖から開始される第１のプライマーの伸長産物の合成の開始剤として機能することができる。一実施形態において、第１のプライマーの配列は、出発核酸鎖の対応する配列セグメントに完全に相補的である。さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列は、出発核酸鎖の対応する配列セグメントに部分的にのみ相補的である。このように一部が相補的でなくても、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの主として配列特異的なプライマー伸長反応の開始は妨げられない。第１のプライマーオリゴヌクレオチドと、出発核酸鎖の対応する位置の間の相補性の差異は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域の５’末端セグメントに存在することが好ましく、これによって、３’末端セグメントでは、相補的な塩基対合が大部分を占めることになり、合成の開始が可能となる。合成を開始させるためには、たとえば、特に３’末端セグメントの最初の４〜１０番目の位置が鋳型（出発核酸鎖）と完全に相補的でなければならない。他の位置のヌクレオチドは、完全な相補性を有していなくてもよい。したがって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域の５’末端セグメントにおいて、塩基組成の５０％〜１００％が完全な相補性を有していてもよく、塩基組成の８０％〜１００％が完全な相補性を有していることがより好ましい。第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域の長さに応じて、１箇所から最大で１５箇所の位置に配列の差異が見られてもよく、配列の差異は、１箇所から最大で５箇所の位置に留まることがより好ましい。したがって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、出発核酸鎖の合成を開始することができる。これに続く第２のプライマーの伸長産物の合成では、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの複製可能な配列部分がポリメラーゼによって複製され、次の合成サイクルにおいて、第１のプライマーオリゴヌクレオチドに結合する完全に相補的なプライマー結合部位が第２のプライマーの伸長産物に形成され、さらなる合成サイクルにおいて使用される。
【０２８０】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドを、出発核酸鎖の調製において使用することができる。この場合、この第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、核酸（たとえば、標的配列を含む一本鎖のゲノムDNAもしくはRNAまたはその同等物）にその大部分が／好ましくは配列特異的に結合し、ポリメラーゼの存在下で鋳型依存的なプライマー伸長反応を開始することができる。結合する位置は、プライマー伸長産物が所望の標的配列を含むように選択される。第１のプライマーオリゴヌクレオチドが伸長されると、鋳型に相補的な配列を有する核酸鎖が得られる。この核酸鎖は、（たとえば熱またはアルカリによって）鋳型から解離させ、一本鎖の形態に変換することができる。このようにして得られた一本鎖核酸は、増幅の開始時に出発核酸鎖として機能することができる。この出発核酸鎖は、その５’末端セグメントに、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分を含み、標的配列またはその同等物と第２のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位をさらに含む。さらなる工程は「出発核酸鎖」の節で説明している。
【０２８１】
第１のプライマーの伸長産物の合成はプライマーの伸長反応であり、増幅反応の一工程である。この工程の反応条件は、状況に応じて適宜調整される。反応温度および反応時間は、反応が連続的に進むことができるように選択する。この工程での好ましい反応温度は、使用するポリメラーゼと、第１のプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー結合部位に対する結合強度に依存し、たとえば１５℃〜７５℃の範囲を含み、２０〜６５℃であることがより好ましく、２５℃〜６５℃であることが好ましい。第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度は、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲を含み、０．１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌであることがより好ましく、０．１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌであることが好ましい。
【０２８２】
一実施形態において、非特異的産物／副産物の形成を阻止するか、またはこれらの形成を遅延させるストリンジェントな条件下において増幅反応のすべての工程を実施する。このような条件としては、たとえば高温条件、たとえば５０℃よりも高い温度が挙げられる。
【０２８３】
一実施形態において、１つのバッチで２種以上の特定の核酸鎖を増幅対象として使用する場合、配列特異的プライマーオリゴヌクレオチドを使用して、各標的配列を増幅することが好ましい。
【０２８４】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列およびアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列は、副反応（たとえばプライマーダイマーの形成）が最小限となるように互いに適合させることが好ましい。これを達成するため、たとえば、適切な鋳型および／または標的配列および／または出発核酸鎖の非存在下において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドおよび第２のプライマーオリゴヌクレオチドが増幅反応を開始したり補助したりすることがないように、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列と第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列を互いに適合させる。これは、たとえば、第２のプライマーオリゴヌクレオチドが第１のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含まず、かつ第１のプライマーオリゴヌクレオチドが第２のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含まないことによって達成することができる。さらに、各プライマー配列が、伸長された自己相補的構造（自己相補鎖）を含まないようにする必要がある。
【０２８５】
一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物の合成および第２のプライマーの伸長産物の合成は同じ温度で進行する。さらなる一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物の合成および第２のプライマーの伸長産物の合成は異なる温度で進行する。さらなる一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物の合成およびアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換は同じ温度で進行する。さらなる一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物の合成およびアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換は異なる温度で進行する。
【０２８６】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの好ましい実施形態
アクチベーターオリゴヌクレオチド（図１０）は、
・第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域のポリヌクレオチドテールに結合することができる第１の一本鎖領域、
・第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域に実質的に相補的に結合することができる第２の一本鎖領域、および
・第１のプライマーの伸長産物の伸長された部分の少なくとも１つのセグメントに実質的に相補的な第３の一本鎖領域
を含む。
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドまたは第２のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長するための鋳型として機能しない。
【０２８７】
通常、増幅対象の核酸は、第１のプライマーの伸長産物においてヌクレオチドの順序を決める鋳型となることから、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の配列を、増幅対象の核酸の配列に適合させる。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列は、第１のプライマー領域の配列に適合させる。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の構造は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列、特に、ポリヌクレオチドテールの特性に適合させる。
【０２８８】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１の領域、第２の領域、第３の領域のいずれにも属さないさらなる配列セグメントを含むこともできる。このような配列は、たとえばフランキング配列として３’末端および５’末端に付加することができる。このような配列セグメントは、アクチベーターオリゴヌクレオチドの機能を阻害しないことが好ましい。
【０２８９】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの構造は、以下の特性を有することが好ましい。
【０２９０】
各領域は互いに共有結合されている。この結合は、たとえば、通常の５’−３’結合でであってもよい。たとえば、ホスホジエステル結合またはヌクレアーゼ耐性ホスホチオエステル結合を使用してもよい。
【０２９１】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、その第１の領域を介して、第１のプライマーオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチドテールに結合することができ、この結合は、主に、相補的塩基をハイブリダイズすることによって行われる。前記第１の領域の長さは、３〜８０ヌクレオチド長であり、４〜４０ヌクレオチド長であることが好ましく、６〜２０ヌクレオチド長であることが特に好ましい。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列と第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列との間のマッチングの程度は、２０％〜１００％であってもよく、５０％〜１００％であることが好ましく、８０％〜１００％であることが特に好ましい。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の結合は、反応条件下において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域に特異的であることが好ましい。
【０２９２】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域に相補的に結合することができる相補的塩基の数が１〜４０個、より好ましくは３〜２０個、好ましくは６〜１５個となるように選択することが好ましい。
【０２９３】
アクチベーターオリゴヌクレオチドはポリメラーゼの鋳型としては機能しないため、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの機能を補助しないヌクレオチド修飾を含んでいてもよく、このようなヌクレオチド修飾は、塩基修飾および／または糖リン酸主鎖修飾であってもよい。アクチベーターオリゴヌクレオチドは、その第１の領域に、たとえば、DNA、RNA、LNA（「ロックド核酸」；糖残基に２’−４’架橋型結合を有する類似体）、UNA（「アンロックド核酸」；糖残基の２’−３’原子間に結合を有していない類似体）、PNA（「ペプチド核酸」類似体）、PTO（ホスホロチオエート）、モルホリノ類似体、２’−Ｏ−アルキルRNA修飾（たとえば２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−プロパルギル、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−Ｏ−プロピルアミン）、２’−ハロRNA、２’−アミノRNAなどから選択されるヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド修飾を含んでいてもよい。このようなヌクレオチドまたはヌクレオチド修飾は、たとえば、通常の５’−３’結合または５’−２’結合によって互いに連結されている。たとえば、ホスホジエステル結合またはヌクレアーゼ耐性ホスホチオエステル結合を使用することができる。
【０２９４】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、その第１の領域に、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド修飾を含んでいてもよく、この場合、核酸塩基は、アデニンおよびその類似体、グアニンおよびその類似体、シトシンおよびその類似体、ウラシルおよびその類似体、チミンおよびその類似体、イノシンまたはその他のユニバーサル塩基（たとえば、ニトロインドール）、２−アミノアデニンおよびその類似体、イソシトシンおよびその類似体、イソグアニンおよびその類似体から選択される。
【０２９５】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、その第１の領域に、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドの間の結合強度に影響を及ぼしうるインターカレート物質（たとえばMGB、ナフタレンなど）から選択される非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。また、同じ成分を第１のプライマーの第２の領域において使用することもできる。
【０２９６】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、その第１の領域に、第１の領域の各セグメントを互いに連結することができる非ヌクレオチド化合物、たとえば、C3リンカー、C6リンカー、HEGリンカーなどのリンカーを含んでいてもよい。
【０２９７】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、その第２の領域を介して、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域に結合することができ、この結合は、相補的塩基のハイブリダイゼーションを実質的に介して行われる。
【０２９８】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域の長さは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域の長さに適合されており、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域に一致することが好ましい。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域の長さは、約３〜３０ヌクレオチド長であり、５〜２０ヌクレオチド長であることが好ましい。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域に相補的であることが好ましい。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域と第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域との間の相補性のマッチングの程度は、８０％〜１００％であり、９５％〜１００％であることが好ましく、１００％であることが好ましい。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域は、ポリメラーゼによる第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長を阻止するが相補的二本鎖の形成を阻害したり実質的に妨害したりしないヌクレオチド修飾を含んでいることが好ましく、このようなヌクレオチド修飾として、たとえば、２’−Ｏ−アルキルRNA類似体（たとえば、２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオチド修飾、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチド修飾、２’−Ｏ−プロピルヌクレオチド修飾、２’−Ｏ−プロパルギルヌクレオチド修飾）、LNAヌクレオチド修飾、PNAヌクレオチド修飾またはモルホリノヌクレオチド修飾が挙げられる。各ヌクレオチドモノマーは、５’−３’結合で連結されていることが好ましいが、各ヌクレオチドモノマー間の結合に５’−２’結合を使用することもできる。
【０２９９】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域の配列長およびその特性は、反応条件下でのこれらの領域の第１のプライマーオリゴヌクレオチドへの結合が、本発明の方法の少なくとも１つの反応工程において可逆的となるように選択することが好ましい。これによって、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、確実に特異的に結合することができるが、この結合は、反応条件下で永続的に安定な、アクチベーターと第１のプライマーからなる複合体を形成するものではない。むしろ、反応条件下での少なくとも１つの反応工程において、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドが結合した複合体の形態と、これらの成分が遊離した形態との間で平衡が存在するか、またはこのような平衡状態をとることが可能である。このようにすることによって、反応条件下において第１のプライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が遊離形態で存在し、鋳型と相互作用してプライマー伸長反応を確実に開始することができる。また、このような方法では、アクチベーターオリゴヌクレオチドの各配列領域を、伸長されたプライマーオリゴヌクレオチドと確実に結合させることができる。
【０３００】
反応温度を選択することによって、一本鎖の遊離成分、すなわち反応性成分に影響を与えることができる。すなわち、温度を低下させることによって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドをアクチベーターオリゴヌクレオチドに結合させて、両者を相補的二本鎖複合体の形態にすることができる。このような方法では、一本鎖形態の各成分の濃度を低下させることができる。また、温度を上昇させることによって、両成分を解離して一本鎖の形態とすることができる。前記複合体（アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドからなる複合体）の融解温度の範囲では、約５０％が一本鎖の形態で存在し、残りの約５０％が二本鎖複合体として存在する。したがって、適切な温度を使用することによって、反応混合物中の一本鎖形態の濃度を変化させることができる。
【０３０１】
各反応工程間で温度を変化させることを含む本発明の増幅方法の実施形態において、反応工程ごとに所望の反応条件を構築することができる。たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドを含む複合体の融解温度付近の温度範囲を使用することによって、これらの成分を遊離形態とすることができる。このとき、使用した前記温度によって、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドを含む複合体が不安定になり、その結果、この反応工程において、複合体の各成分が少なくとも一時的に一本鎖の形態となり、他の反応パートナーと相互作用することが可能となる。たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の配列領域は、伸長されていない第１のプライマーと形成された二本鎖複合体から解離することができ、これにより、伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の配列領域と相互作用することが可能となり、この結果、鎖置換を開始することができる。一方、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドを含む複合体から伸長されていない第１のプライマーオリゴヌクレオチドが解離することによって、この第１のプライマー領域が一本鎖となり、鋳型と相互作用することが可能となり、その結果、ポリメラーゼによるプライマーの伸長を開始することができる。このとき、使用する反応温度は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドを含む複合体の融解温度に厳密に一致していなければならない。１つの反応工程で使用される温度が融解温度付近の範囲にあれば十分である。たとえば、１つの反応工程の温度は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドを含む複合体のＴｍ±１０℃の範囲を含み、Ｔｍ±５℃であることがより好ましく、Ｔｍ±３℃であることが好ましい。
【０３０２】
このような温度は、たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる配列特異的な鎖置換を含む反応工程において調整することができる。
【０３０３】
各反応工程間で温度を変化させず、増幅反応の持続時間全体にわたって等温条件を維持しながら増幅を進行させる実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドからなる複合体の形態と、これらの各成分の遊離形態との間で平衡状態をとることが可能である。
【０３０４】
アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドからなる複合体の形態と、これらの各成分の遊離の形態との比率は、反応条件（たとえば、温度およびＭｇ２＋濃度）ならびに各成分の構造と濃度によって影響を受けることがある。
【０３０５】
一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域および第２の領域の配列長およびその特性は、所定の反応条件下（たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換反応工程）において、遊離状態のアクチベーターオリゴヌクレオチドと、第１のプライマーオリゴヌクレオチドと複合体を形成している状態のアクチベーターオリゴヌクレオチドとの比率が１：１００〜１００：１、好ましくは１：３０〜３０：１、特に好ましくは１：１０〜１０：１となるように選択する。遊離状態の第１のプライマーオリゴヌクレオチドと、アクチベーターオリゴヌクレオチドと複合体を形成している状態の第１のプライマーオリゴヌクレオチドとの比率は、１：１００〜１００：１であってもよく、１：３０〜３０：１であることが好ましく、１：１０〜１０：１であることが特に好ましい。
【０３０６】
一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの濃度よりも高い。この場合、反応において第１のプライマーが過剰に存在することから、適切な反応温度を選択することによって、第１のプライマーと結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドを解離させる必要がある。これは、通常、遊離形態のアクチベーターオリゴヌクレオチドが十分な濃度に達するまで温度を上昇させることによって行われる。
【０３０７】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの濃度よりも低い。この場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドが過剰に存在することから、適切な反応温度を選択することによって、アクチベーターオリゴヌクレオチドと結合している第１のプライマーオリゴヌクレオチドを解離させる必要がある。これは、通常、遊離形態の第１のプライマーオリゴヌクレオチドが十分な濃度に達するまで温度を上昇させることによって行われる。
【０３０８】
等温条件では平衡が存在し、反応において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの一部とアクチベーターオリゴヌクレオチドの一部は互いに結合しており、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの残りの一部とアクチベーターオリゴヌクレオチドの残りの一部は一本鎖の形態で存在する。
【０３０９】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、その第３の領域を介して、第１のプライマーオリゴヌクレオチドから特異的に合成された伸長産物の少なくとも１つのセグメントに結合することができる（図１１〜２１）。この結合は、ポリメラーゼによって合成された伸長産物とアクチベーターオリゴヌクレオチドとの間の相補的塩基のハイブリダイゼーションによって行われることが好ましい。
【０３１０】
鎖置換反応を補助するため、第３の領域の配列は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物と高い相補性を有することが好ましい。一実施形態において、第３の領域の配列は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に対して１００％の相補性を有する。
【０３１１】
第３の領域は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域の直後に続く伸長産物セグメントに結合することが好ましい。したがって、この伸長産物セグメントは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の全長の５’末端セグメントに位置することが好ましい。
【０３１２】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の全長にわたって結合しないことが好ましい。第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の３’末端セグメントは未結合のまま残ることが好ましい。この３’末端セグメントは、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの結合に必要とされる。
【０３１３】
したがって、第３の領域の長さは、第３の領域が第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の５’末端側のセグメントに結合するが、該伸長産物の３’末端側のセグメントには結合しないような長さとする。
【０３１４】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の全長は、２〜１００個のヌクレオチド、好ましくは６〜６０個のヌクレオチド、特に好ましくは１０〜４０個のヌクレオチド、またはこのような長さの同等物で構成される。アクチベーターオリゴヌクレオチドは、この長さにわたって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の前記セグメントに相補的に結合し、これによって、相補的鋳型鎖に結合している該伸長産物の５’末端側セグメントを引き剥がすことができる。
【０３１５】
アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合しない前記伸長産物の３’末端側のセグメントの長さは、たとえば、５〜６０ヌクレオチド長の範囲を含み、１０〜４０ヌクレオチド長であることが好ましく、１５〜３０ヌクレオチド長であることが好ましい。
【０３１６】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の３’末端側のセグメントは、鋳型鎖と結合したままの状態を保ち、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって引き剥がされることはない。また、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域が前記伸長産物の相補的セグメントに完全に結合している場合、第１のプライマーの伸長産物の３’末端側のセグメントは、鋳型鎖と結合したままの状態を保つことができる。この複合体の結合強度は、たとえば、反応条件下においてこの複合体が自然に解離することができるように（工程ｅ））選択することが好ましい。これは、たとえば、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の３’末端側のセグメントと鋳型鎖からなる複合体の融解温度が、反応工程（反応工程ｅ）の反応温度範囲とほぼ同じであるか、あるいはこの反応温度よりも低いことによって達成することができる。前記伸長産物の３’末端セグメントと鋳型鎖の複合体の安定性が低い場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域は、前記伸長産物の５’末端側のセグメントと完全に結合することができ、これによって、第１のプライマーの伸長産物が、鋳型鎖から急速に解離する。
【０３１７】
したがって、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、その機能の発揮に適した構造を有している。すなわち、各反応条件下で、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドを鋳型鎖との結合から配列特異的に引き剥がすことができ、この結果、鋳型鎖が一本鎖の形態に変換される。したがって、一本鎖の形態になった鋳型鎖は、新たな第１のプライマーオリゴヌクレオチドとさらに結合し、ポリメラーゼによって標的配列に特異的な伸長が可能となる。
【０３１８】
アクチベーターオリゴヌクレオチドが鎖置換の機能を発揮するためには、反応条件下においてアクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域、第２の領域および第３の領域が主として一本鎖の形態である必要がある。したがって、自己相補的な二本鎖構造（たとえばヘアピン構造）がこれらの領域に存在すると、アクチベーターオリゴヌクレオチドの機能性が低下する場合があるため、可能であれば、このような自己相補的な二本鎖構造を回避すべきである。
【０３１９】
本発明の方法では、反応条件下において第１のプライマーオリゴヌクレオチドがアクチベーターオリゴヌクレオチドに結合している場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって伸長されるべきではないため、アクチベーターオリゴヌクレオチドは鋳型として機能してはならない。
【０３２０】
これは、ポリメラーゼによるアクチベーターオリゴヌクレオチドの複製を阻止するヌクレオチド修飾を使用することによって達成することが好ましい。反応条件下において第１のプライマーオリゴヌクレオチドがアクチベーターオリゴヌクレオチドに結合している場合、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端は伸長されないことが好ましい。
【０３２１】
反応のブロッキング／阻害／減速／妨害の程度は、これらのブロック／阻害／減速／妨害が十分に達成されてもよく（たとえば、所定の反応条件下で１００％のブロッキングが達成されてもよく）、これらのブロック／阻害／減速／妨害が一部達成されてもよい（たとえば、所定の反応条件下で３０〜９０％のブロッキングが達成されてもよい）。修飾ヌクレオチドを単独で、または複数個を連結させて（たとえば修飾ヌクレオチドからなる配列断片として）使用することによって、第１のプライマーの伸長が７０％を超えないように、好ましくは９０％を超えないように、より好ましくは９５％を超えないように、特に好ましくは１００％を超えないようにすることが好ましい。
【０３２２】
前記修飾ヌクレオチドは、塩基修飾および／または糖リン酸残基修飾を含んでいてもよい。修飾された糖リン酸残基と通常の核酸塩基を組み合わせることによって、アクチベーターオリゴヌクレオチドの相補的配列を自由に構成することができるため、修飾された糖リン酸残基が好ましい。ポリメラーゼによる合成を阻害またはブロッキングすることができる糖リン酸残基修飾を有するヌクレオチドとしては、たとえば、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド（たとえば、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−プロピル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−プロパルギル修飾ヌクレオチド）、２’−アミノ−２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、２’−アミノ−アルキル−２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、PNA、モルホリノ修飾ヌクレオチドなどが挙げられる。
【０３２３】
ブロッキングは、１個の修飾ヌクレオチドを使用することによって行うことができ、またはいくつかの修飾ヌクレオチドを連結させて（たとえば修飾ヌクレオチドからなる配列断片として）使用することによっても行うことができる。たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドにおいて、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、特に好ましい少なくとも１０個の修飾ヌクレオチドを隣接するもの同士で互いに連結させることができる。
【０３２４】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、同じ種類のヌクレオチド修飾を有していてもよく、少なくとも２種の異なるヌクレオチド修飾を含んでいてもよい。
【０３２５】
アクチベーターオリゴヌクレオチドにおけるこのようなヌクレオチド修飾の位置は、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合した第１のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端がポリメラーゼによって伸長されることを阻止することができる位置であることが好ましい。
【０３２６】
一実施形態において、このようなヌクレオチド修飾は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域に位置する。さらなる一実施形態において、このようなヌクレオチド修飾は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域に位置する。さらなる一実施形態において、このようなヌクレオチド修飾は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域および第３の領域に位置する。
【０３２７】
たとえば、このような修飾ヌクレオチドは、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列内の位置の少なくとも２０％を占め、少なくとも５０％を占めることが好ましい。
【０３２８】
たとえば、このような修飾ヌクレオチドは、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の配列内の位置の少なくとも２０％を占め、少なくとも５０％を占めることが好ましい。
【０３２９】
このような修飾ヌクレオチドの核酸塩基の配列は、各領域の配列に必要とされる要件に適合させる。
【０３３０】
前記修飾ヌクレオチド以外の残基は、たとえば、ポリメラーゼの機能を全く阻害しないか、またはわずかにしか阻害しない天然のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであり、このようなヌクレオチドとして、たとえば、DNAヌクレオチド、PTOヌクレオチド、LNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドが挙げられる。このようなヌクレオチドにさらに修飾を付加することによって、アクチベーターオリゴヌクレオチドの各領域の結合強度を調整することができ、たとえば、２−アミノアデノシン、２−アミノプリン、５−メチルシトシン、イノシン、５−ニトロインドール、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、５−プロピルシトシン、５−プロピルウリジンなどの修飾塩基；および色素、MGB修飾などの非ヌクレオチド修飾が挙げられる。各ヌクレオチドモノマーは、通常の５’−３’結合によって互いに連結させることができ、５’−２’結合によっても互いに連結させることができる。
【０３３１】
アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合している第１のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端がポリメラーゼによって伸長されることを阻止するヌクレオチド修飾を有するアクチベーターオリゴヌクレオチドのセグメントを、「第２のブロッキングユニット」と呼ぶ。このセグメントは、１〜５０ヌクレオチド長、好ましくは４〜３０ヌクレオチド長の修飾ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。このセグメントは、たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合した第１のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端がこのセグメントに位置するように、アクチベーターオリゴヌクレオチド内に配置することができる。したがって、このセグメントは第２の領域および第３の領域にわたって配置されてもよい。
【０３３２】
一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合した第１のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を阻止するために、C3リンカー、C6リンカー、HEGリンカーなどのリンカー構造やスペーサー構造を使用しないことが好ましい。
【０３３３】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１の領域、第２の領域および第３の領域に加えて、これらの領域に隣接するさらなる配列セグメントを、たとえばアクチベーターオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントまたは３’末端セグメントにさらに含んでいてもよい。このような配列要素は、たとえば、プローブとの相互作用や固相との結合などのさらなる機能を発揮させるために使用することができる。このような領域は、第１〜第３の領域の機能を阻害しないことが好ましい。このようなフランキング配列の長さは、たとえば１〜５０ヌクレオチド長であってもよい。さらに、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、固相に固定するための少なくとも１つの要素、たとえばビオチン残基を含んでいてもよい。さらに、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、検出するための少なくとも１つの要素、たとえば蛍光色素を含んでいてもよい。
【０３３４】
配列依存的鎖置換による二本鎖分離に対するアクチベーターオリゴヌクレオチドの効果（模式的説明）
以下に、アクチベーターオリゴヌクレオチドの作用機構を模式的に説明する。
【０３３５】
プライマー結合部位を含む新たに合成された鎖は、合成された直後に鋳型に結合するため、別のプライマーとは実質的に直接結合することはない。二本鎖の分離もしくは開裂、またはプライマー結合部位を有する配列部分同士の分離または開裂が起こった場合にのみ（たとえば、鎖置換反応の最中もしくは鎖置換反応の後、または二本鎖の解離の後）、プライマー結合部位を有するこのような配列部分が新たなプライマーオリゴヌクレオチドに結合することができ、これによって、合成反応をさらに一巡させることができる。
【０３３６】
したがって、プライマー結合部位を有する新たに合成された配列部分同士をそれぞれ一本鎖の形態に変換することは、合成プロセスを繰り返すために必須であり、したがって、増幅させるために必須である。合成プロセスに対して影響を及ぼしうる要因は、増幅にも影響を与えうる。
【０３３７】
本発明による第２のプライマーの伸長産物の鎖置換は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの協力によって、または第１のプライマーの伸長産物にアクチベーターオリゴヌクレオチドが結合することによって行われる。
【０３３８】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーの配列以降の伸長された部分にも結合する。この場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーの伸長産物の新たに合成された鎖セグメントに結合して、鋳型鎖（たとえば第２のプライマーの伸長産物）との結合から第１のプライマーの伸長産物の新たに合成された鎖セグメントを引き剥がすことができる。
【０３３９】
この鎖置換によって、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物からなる二本鎖が開裂する。この二本鎖の開裂は局所的であってもよく（たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって直接的に引き剥がされる配列セグメントのみで二本鎖の開裂が起こってもよく）、あるいは、この二本鎖の開裂は、直接的に引き剥がされる配列セグメントからさらに先に進んでもよい。たとえば、直接的に引き剥がされる配列セグメント以降の二本鎖がさらなる影響要因によって不安定化し、この結果、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物が完全な分離してもよい（第２のプライマーの伸長産物の完全な分離）。このような要因としては、たとえば、所定の反応条件下で二本鎖の安定性に影響を与える温度による効果であってもよい。別の要因としては、たとえば、二本鎖を不安定化もしくは開裂させることができる酵素（たとえば、ヘリカーゼまたはリコンビナーゼ）、または鎖置換によって二本鎖を開裂させることができる別のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０３４０】
鎖置換の結果、第１のプライマーの結合部位および第２のプライマーの結合部位は、二本鎖の形態から一本鎖の形態に変換される。このようにして、これらのプライマー結合部位のプライマー結合能が回復する。
【０３４１】
このプロセスに影響を及ぼし、増幅にも影響を及ぼす要因としては、たとえば、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物の完全な分離が挙げられる。
【０３４２】
第１のプライマーの伸長産物から第２のプライマーの伸長産物が完全に解離／分離することによって（完全な鎖解離）、各工程の反応速度に対して有利な効果を与えることができる。これは特に、反応混合物中の第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物の濃度が微量である場合に顕著である。このような場合、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物が二本鎖に再結合する速度が低下し、各プライマー結合部位は長時間にわたって一本鎖の形態のまま残される。
【０３４３】
アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換の平衡／可逆性
第１のプライマーの伸長産物へのアクチベーターオリゴヌクレオチドの結合は、これらの鎖の間で相補的塩基対が形成されることによって起こり、したがって、この結合は、反応条件下で可逆的である。
【０３４４】
第１のプライマーの伸長産物へのアクチベーターオリゴヌクレオチドの結合は、いくつかの要因によって元に戻すことができる。このような要因としては、たとえば、
・第１のプライマーの停止部位まで第２のプライマーの伸長産物が合成された際の、ポリメラーゼ依存的鎖置換、
・第２のプライマーの伸長産物による鎖置換を介した、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物からなる相補的二本鎖の形成、および
・アクチベーターオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントによる引き剥がしを介した、第２のプライマーの３’末端セグメントの部分的鎖置換および第２のプライマーと第１のプライマーの伸長産物の結合
が挙げられる。
【０３４５】
第２のプライマーの伸長産物は、第１のプライマーの伸長産物に結合して相補的塩基対合を形成し、これによって、アクチベーターオリゴヌクレオチドを引き剥がすことができる。したがって、第１のプライマーの伸長産物との結合に対して、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第２のプライマーの伸長産物との間に競合が存在する。これら３種の鎖すべてからなる三本鎖複合体が形成される限り（この複合体は、相補的配列部分を介して第２のプライマーの伸長産物とアクチベーターオリゴヌクレオチドに結合した第１のプライマーの伸長産物を含む）、鎖置換反応は両方向であってもよい。すなわち、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第２のプライマーの伸長産物を引き剥がすことができ、第２のプライマーの伸長産物が、アクチベーターオリゴヌクレオチドを引き剥がすこともできる。これらの鎖置換反応は平衡状態にある。この複合体において起こる鎖置換は、所定の反応条件下において、三本鎖複合体から特定の鎖を完全に解離／分離させる配列位置まで進む場合がある（図２２）。
【０３４６】
これは特に、（たとえば、適切な反応温度、Ｍｇ２＋濃度、およびＴｍを変化させる物質を使用した）反応条件によって二本鎖が不安定になっており、かつ、たとえば各配列部分の安定性の調整などによって、配列部分の構造がこのような分離／解離に有利に働く場合に見られる。この場合、各配列部分からなる各複合体の安定性が重要となり、より具体的には、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域と第１のプライマーの第２の領域からなる複合体の安定性、および第２のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を有する第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントと第２のプライマーオリゴヌクレオチドまたは第２のプライマーの伸長産物からなる複合体の安定性が重要となる。これらの複合体の安定性は、三本鎖複合体の平衡状態に対して影響を及ぼすことがある。すなわち、通常、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーからなる複合体の安定性が高ければ高いほど、第２のプライマーの伸長産物の鎖置換が起こりやすい。一方、通常、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントと第２のプライマーオリゴヌクレオチドの間の安定性が高ければ高いほど、アクチベーターオリゴヌクレオチドの鎖置換が起こりやすい。
【０３４７】
各配列部分の安定性は、たとえば、各配列部分の長さを短くしたり、長くしたりすることによっても影響を受ける。通常、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域と、これに対応する第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域の長さを長くすると、合成される第２のプライマーの伸長産物の鎖置換がより起こりやすくなる。一方、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントと、これに対応する第２のプライマーの伸長産物の長さを長くすると、アクチベーターオリゴヌクレオチドの鎖置換がより起こりやすくなる。
【０３４８】
三本鎖複合体の鎖置換反応において中間段階が存在することがあり、この中間段階では、鎖置換に関与する鎖のうちの１種が所定の反応条件下で特に容易に分離／解離する。
【０３４９】
特定の場合、第１のプライマーの伸長産物と結合している第２のプライマーの伸長産物が完全に分離され、別の場合では、第１のプライマーの伸長産物と結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドを完全に分離することができる。
【０３５０】
３種の鎖すべてが三本鎖複合体の形態で結合されている限り、両方向に進行する鎖置換にはある平衡が成り立つ。
【０３５１】
この平衡は、いくつかの要因の影響を受けることがある。
【０３５２】
前記平衡に影響を及ぼす要因としては、たとえば、鎖の分離、各構造間の相補性の程度または配列の差異（たとえば変異）の有無、核酸鎖同士の相補的結合に対して安定化効果または不安定化効果を与えるヌクレオチド修飾または非ヌクレオチド修飾の使用が挙げられる。
【０３５３】
前記平衡に特に重要であるのは、アクチベーターオリゴヌクレオチドと、ポリメラーゼによって合成された二本鎖との間の相補性の程度であり、１個のヌクレオチドのみが配列間で異なる場合、増幅が遅くなる可能性があり、３個のヌクレオチドが異なる場合、増幅が停止する可能性がある。
【０３５４】
通常、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物との間で配列に差異があると、第１のプライマーの伸長産物と二本鎖を形成するアクチベーターオリゴヌクレオチドの能力に対して負の効果が見られる。
【０３５５】
これに対して、第２のプライマーの伸長産物は、通常、第１のプライマーの伸長産物を使用して、ポリメラーゼにより完全にマッチした産物として合成される。通常、この場合、二本鎖が容易に形成される。
【０３５６】
アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物との間に配列の差異がある場合、三本鎖複合体の鎖置換の平衡状態がシフトする可能性がある。
【０３５７】
第１のプライマーの伸長産物との結合に対する競合の結果、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物との間において、ミスマッチ二本鎖の形成よりも、完全にマッチした二本鎖の形成の方が起こりやすくなる。これによって、第２のプライマーの伸長産物の鎖置換の速度が低下し、さらにはこの鎖置換が阻害される。この結果、増幅の速度または増幅の収率が低下し、さらには増幅が阻害される可能性がある。
【０３５８】
このような配列依存性（第１のプライマーの伸長産物とアクチベーターオリゴヌクレオチドの間において配列が完全にマッチしているのか、それともミスマッチが存在するのか）によって、鎖置換の平衡状態がシフトするため、反応に影響が見られることがある。たとえば、反応速度に影響が見られる場合があり、第１のプライマーの伸長産物とアクチベーターオリゴヌクレオチドの間で完全にマッチしている二本鎖が増幅により利用され、ミスマッチが増幅から排除される場合がある。
【０３５９】
配列依存性によるこのような影響を、実施例１、実施例３および実施例４に具体的に示す。
【０３６０】
前記平衡が変化することによって、第１のプライマーの伸長産物および第２のプライマーの伸長産物の解離反応が加速したり、減速したり、さらには停止する場合がある。したがって、増幅は、加速したり、減速したり、さらには全く起こらない場合がある。
【０３６１】
したがって、（オリゴヌクレオチドの設計および化学合成の際に）アクチベーターオリゴヌクレオチド内の相補的配列部分を設計することによって、所定の配列を有する核酸鎖を増幅することができる。配列に差異を有する他の核酸鎖は、増幅から排除されたり、または増幅速度が低下しうる。
【０３６２】
特に驚くべきことに、アクチベーターオリゴヌクレオチドにおけるこのような配列による効果は第３の領域において非常に顕著であった。本発明のアクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域は、第１のプライマーの伸長産物の、ポリメラーゼによって合成された配列部分に結合する。したがって、第１のプライマーの伸長産物のこの配列部分は、増幅対象の核酸鎖の中央のセグメントに位置する。たとえば、この配列部分は標的配列を含んでいてもよい。
【０３６３】
したがって、増幅は、この配列セグメントの配列組成によって常に制御される。すなわち、第２のプライマーの伸長産物の鎖置換、つまり第２のプライマーの伸長産物の一本鎖形態への変換は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物の相補性のマッチングの程度に依存する。
【０３６４】
したがって、各プライマーが伸長された後、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって配列が制御される。
【０３６５】
この制御によって、いくつかの状態を得ることができる。
・合成された鎖とアクチベーターオリゴヌクレオチドとが完全にマッチしている場合、鎖置換が起こり、第２のプライマーの伸長産物の解離まで反応を進行させることができる。この結果、プライマー結合部位を有する対応する配列部分が一本鎖の形態に変換され、合成反応をさらに一巡させることができる。
・合成された鎖とアクチベーターオリゴヌクレオチドとの間でミスマッチがある場合（たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の所定のヌクレオチド配列と配列が一致していない場合）、鎖置換が負の影響を受ける場合がある。平衡は、第１のプライマーの伸長産物とこれに対応する鋳型との間での二本鎖形成の方向にシフトする。鎖置換反応は遅延するか、または部分的にしか進行せず、さらなる合成に利用可能な、遊離のプライマー結合部位を有する配列部分が減少する。したがって、ミスマッチによって増幅の速度が低下するか、または増幅が起こらなくなる。
【０３６６】
このようにして、反復して行われる合成工程ごとに制御ループを確立することができる。
【０３６７】
プライマーが結合し、伸長された後、所定の反応条件下においてアクチベーターオリゴヌクレオチドの非存在下で十分に安定な二本鎖が形成され、自然解離は起こらない。形成された二本鎖において、プライマー結合部位を有する配列部分は、新たなプライマーとの相互作用が阻止されている。この系では、合成はこれ以上進まない。
【０３６８】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの存在下では、新たに合成された配列は、アクチベーターオリゴヌクレオチドとの相互作用によって、その配列組成が確認される。
・所定の配列組成のアクチベーターオリゴヌクレオチドと正しくマッチする場合、鎖置換が起こり、新たに合成された鎖によって鋳型鎖が置換される。これによって、プライマー結合部位が一本鎖の形態に変換され、プライマーとの新たな相互作用に利用可能となり、さらなる合成を行うことができる。したがって、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物とを含むこの系は活性状態となる。このように、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、この系に対して活性化作用を有する。
・所定の配列組成のアクチベーターオリゴヌクレオチドとマッチしない場合、新たに合成された鎖による鋳型鎖の鎖置換が影響を受ける。鎖置換および／または鎖分離が定量的に減速するか、または全く起こらなくなる。これによって、プライマー結合部位は一本鎖の形態に全く変換されないか、または低い頻度で変換される。したがって、プライマーとの新たな相互作用に利用可能なプライマー結合部位は全く存在しないか、または定量的に減少する。この結果、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物とを含むこの系は、低い頻度でしか活性状態になることができないか、または全く活性状態にならない。
【０３６９】
各合成工程後に新たに合成された第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物からなる二本鎖の開裂の効率は、これに続くサイクルにおいて得られる収率に影響を及ぼす。すなわち、合成工程の開始時に、増幅対象の核酸鎖に対して提供される遊離／一本鎖のプライマー結合部位が少なければ少ないほど、合成工程において増幅対象の核酸鎖から新たに合成される鎖の数が少なくなる。換言すれば、合成サイクルの収率は、対応する相補的プライマーとの相互作用に利用可能なプライマー結合部位の量に比例する。したがって、このようにして制御ループを実現することができる。
【０３７０】
前記制御ループは、合成された断片をリアルタイム／オンラインで制御するものである。配列制御は、増幅が進行中の反応混合物において行われる。この配列制御は、所定のパターンに従って行われ、（アクチベーターオリゴヌクレオチドの鎖開裂効果による）オリゴヌクレオチド系が「正しい」状態であるか、「誤った」状態であるのかを、外的介入を行わずに識別することができる。正しい状態では配列の合成が継続され、誤った状態では合成が減速するか、または完全に阻害される。各工程を行った後の「正しい」配列の収率と「誤った」配列の収率の差は、このような工程を複数含む増幅全体に対して影響を及ぼす。
【０３７１】
指数関数的な増幅では、前記配列依存性は指数関数的であり、配列の差異によって１つの合成サイクルでの効率がわずかに異なっても、増幅時間全体では有意な遅延を意味しうるか、または所定の時間枠における検出可能な増幅が全く見られなくなる場合がある。
【０３７２】
新たに合成された核酸鎖のリアルタイム制御が有するこのような効果は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの使用と関連しており、したがって、増幅中のアクチベーターオリゴヌクレオチドによる影響は、プライマーオリゴヌクレオチドの長さによる影響よりも有意に大きい。
【０３７３】
さらなる影響要因
通常、鎖置換反応に対して影響を及ぼしうる要因、たとえば、鎖置換反応の程度、平衡および／または速度に影響を及ぼしうる要因は、指数関数的な増幅にも影響を及ぼしうる。
【０３７４】
このような要因としては、たとえば、反応条件（たとえば、温度、Ｍｇ２＋濃度、DMSO、ベタイン、TPAC、緩衝成分）；アクチベーターオリゴヌクレオチドにおける二次構造の存在（たとえば、ヘアピン構造またはＧ四重鎖）；アクチベーターオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド修飾の使用（二本鎖を安定化させるヌクレオチド修飾、たとえば、２−アミノ−ｄＡ、５−プロパルギル−ｄＣもしくはLNAヌクレオチド、または二本鎖を不安定化させるヌクレオチド修飾、たとえばイノシン）；二本鎖を安定化させる非ヌクレオチド修飾（たとえばMGB）；二本鎖を不安定化させる非ヌクレオチド修飾（たとえば、Ａ型核酸鎖またはＢ型核酸鎖の幾何構造に影響を及ぼす立体的に「嵩高い基」（たとえば、ヌクレオチドに結合させた色素またはリガンド））；またはインターカレート物質（たとえば、SYBR Green色素、Eva Green色素）が挙げられる。
【０３７５】
それぞれの場合において、このような要因を使用して、鎖置換の平衡に正または負の影響を与えることができ、したがって、特定の配列の増幅を促進したり、減速させたり、阻止したりすることができる。前記要因による影響の程度は実験により測定することができる。
【０３７６】
鎖置換反応の反応条件
第１のプライマーの伸長産物と結合している第２のプライマーの伸長産物を、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる配列依存的な鎖置換を利用して引き剥がす反応は、増幅の一工程で行われる。この工程の反応条件は、状況に応じて適宜調整される。反応温度および反応時間は、反応が成功するように選択する。
【０３７７】
好ましい一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、第１のプライマーの伸長産物に結合している第２のプライマーの伸長産物が分離／解離するまで進行する。第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物の温度依存的な／温度と関連する分離において、第２のプライマーの伸長産物の相補的部分からの第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントの解離は自然に起こってもよい。このような解離は、増幅反応の速度に対して有利に作用し、たとえば温度条件などの反応条件の選択による影響を受けることがある。したがって、温度条件は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが相補的に結合することによって鎖置換が成功裏に行われ、これが、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントからの第２のプライマーの伸長産物の解離に有利に働くように選択される。
【０３７８】
この工程の温度は、たとえば１５℃〜７５℃の範囲を含み、３０℃〜７０℃であることがより好ましく、５０℃〜７０℃であることが好ましい。
【０３７９】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域と第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域が所定の長さを有していれば（たとえば、３〜２５個のヌクレオチドモノマー、より好ましくは５〜１５個のヌクレオチドモノマーを含む）、通常、鎖置換反応をうまく開始させることができる。アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物の対応する部分とが完全に相補的である場合、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメント以外の部分で第１のプライマーの伸長産物に結合し、第２のプライマーの伸長産物を引き剥がすことができる。したがって、第２のプライマーの伸長産物は、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントに結合したままとなる。この結合の強度は、温度による影響を受けうる。臨界温度に達すると、この結合は解除されて、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物を解離させることができる。３’末端セグメントの配列が短ければ短いほど、結合はより不安定となり、自然解離が引き起こされる温度が低くなる。
【０３８０】
自然解離は、たとえば、融解温度付近の温度範囲で起こりうる。一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換工程の温度は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合していない第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントと第２のプライマーオリゴヌクレオチドまたは第２のプライマーの伸長産物とを含む複合体の融解温度付近（Ｔｍ±３℃）である。
【０３８１】
一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換工程の温度は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合していない第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントと第２のプライマーオリゴヌクレオチドまたは第２のプライマーの伸長産物とを含む複合体の融解温度付近（Ｔｍ±５℃）である。
【０３８２】
一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換工程の温度は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合していない第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントと第２のプライマーオリゴヌクレオチドまたは第２のプライマーの伸長産物とを含む複合体の融解温度よりも高い温度である。このような温度は、Ｔｍ＋約５℃〜Ｔｍ＋約２０℃の範囲を含み、Ｔｍ＋５℃〜Ｔｍ＋１０℃であることがより好ましい。融解温度よりも高い温度を使用することによって、この反応工程における平衡を解離の方向にシフトさせることができる。これによって、この反応の速度に有利な影響を与えることができる。アクチベーターオリゴヌクレオチドを利用したこの鎖置換工程において温度が低すぎると、増幅が有意に減速しうる。
【０３８３】
また、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換工程の温度を近似的に概算し、解離温度とすることもできる。
【０３８４】
さらなる一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合せず、かつ４〜約８ヌクレオチド長の配列を含む３’末端セグメントを含む。この実施形態では、通常、１５℃〜５０℃の温度範囲において自然解離を起こすことができる。さらに高い温度でも解離を起こすことができる。
【０３８５】
一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合せず、かつ９〜約１８ヌクレオチド長の配列を含む３’末端セグメントを含む。この実施形態では、通常、４０℃〜６５℃の温度範囲において自然解離を起こすことができる。さらに高い温度でも解離を起こすことができる。
【０３８６】
一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合せず、かつ１５〜約２５ヌクレオチド長の配列を含む３’末端セグメントを含む。この実施形態では、通常、５０℃〜７０℃の温度範囲において自然解離を起こすことができる。さらに高い温度でも解離を起こすことができる。
【０３８７】
一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合せず、かつ２０〜約４０ヌクレオチド長の配列を含む３’末端セグメントを含む。この実施形態では、通常、５０℃〜７５℃の温度範囲において自然解離を起こすことができる。さらに高い温度でも解離を起こすことができる。
【０３８８】
温度の選択に影響を及ぼしうるものとしては、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントの組成、任意で付加され、融解温度に影響を与えるオリゴヌクレオチド修飾（たとえばMGB）、および任意で付加され、反応条件に影響を与えるオリゴヌクレオチド修飾（たとえば、TPAC、ベタイン）が挙げられる。したがって、これに応じて適宜調整することができる。
【０３８９】
一実施形態において、非特異的産物／副産物の形成を阻止するか、またはこれらの形成を遅延させるストリンジェントな条件下において増幅反応のすべての工程を実施する。このような条件としては、たとえば高温条件、たとえば５０℃よりも高い温度が挙げられる。
【０３９０】
一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換の各工程は、第１のプライマーの伸長産物の合成および第２のプライマーの伸長産物の合成が実施される温度と同じ温度で行われる。さらなる一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換の各工程は、第１のプライマーの伸長産物の合成および第２のプライマーの伸長産物の合成が実施される温度とは異なる温度で行われる。さらなる一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物の合成およびアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換は同じ温度で行われる。さらなる一実施形態において、第２のプライマーの伸長産物の合成およびアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換は同じ温度で行われる。
【０３９１】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの濃度は、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲を含み、０．１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌであることがより好ましく、０．１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌであることが好ましい。
【０３９２】
第２のプライマーオリゴヌクレオチド（プライマー２）の好ましい実施形態
第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、その３’末端セグメントを介して、増幅対象の核酸内の実質的に相補的な配列またはその同等物に結合し、第２のプライマーの特異的な伸長反応を開始することができる（図１３）。したがって、この第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの特異的な伸長産物の３’末端セグメントに結合することができ、これによって、第２のプライマーの伸長産物のポリメラーゼ依存的な合成が開始される。一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドはそれぞれ、増幅対象である１つの核酸に特異的である。第２のプライマーオリゴヌクレオチドは逆方向の合成で複製することができ、第１のプライマーの伸長産物の合成において鋳型として機能する。
【０３９３】
第２のプライマーオリゴヌクレオチドの長さは、１５〜１００ヌクレオチド長であってもよく、２０〜６０ヌクレオチド長であることが好ましく、３０〜５０ヌクレオチド長であることが特に好ましい。各ヌクレオチド単位は、通常の５’−３’ホスホジエステル結合またはホスホチオエステル結合によって互いに連結されていることが好ましい。このようなプライマーオリゴヌクレオチドは、所望の方法で化学合成することができる。
【０３９４】
一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの機能に影響を及ぼさないか、またはわずかにしか影響を及ぼさないヌクレオチドモノマーを含んでいてもよい。このようなヌクレオチドモノマーとして、たとえば、
・天然のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧなど）または塩基対合が変化しないように修飾された天然のヌクレオチド、および
・修飾ヌクレオチド（２−アミノ−ｄＡ、２−チオ−ｄＴなど）または塩基対合が異なるその他の修飾ヌクレオチド（たとえば、ユニバーサル塩基対、たとえば、イノシン、
５−ニトロインドールなど）
が挙げられる。
【０３９５】
好ましい一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの３’−ＯＨ末端は修飾されていないことが好ましく、ポリメラーゼによって認識することができ、かつ鋳型依存的に伸長することができる機能性の３’−ＯＨ基を有する。さらに好ましい一実施形態において、第２のプライマーの３’末端セグメントは、ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性によって第２のプライマーの３’末端が分解されないように、少なくとも１つのホスホロチオエート化合物を含む。
【０３９６】
第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの工程で使用することができる。まず、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅においてプライマーとしての機能を発揮する。これによって、第１のプライマーの伸長産物を鋳型として使用して、プライマーの伸長反応が行われる。さらなる一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅反応の開始時に出発核酸鎖を鋳型として使用することができる。さらなる一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、出発核酸鎖の設計／提供に使用することができる。
【０３９７】
増幅反応において、第２のプライマーは、第１のプライマーの伸長産物を鋳型として使用することにより、第２のプライマーの伸長産物の合成の開始剤として機能する。第２のプライマーの３’末端セグメントは、第１のプライマーの伸長産物に大部分が相補的に結合することができる配列を含む。第１のプライマーの伸長産物を鋳型として使用して第２のプライマーオリゴヌクレオチドが酵素的に伸長されることによって、第２のプライマーの伸長産物が形成される。このような合成は、通常、第１のプライマーの伸長産物と結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドが引き剥がされるのと並行して起こる。この引き剥がしは、主にポリメラーゼによるものであるが、第２のプライマーオリゴヌクレオチドによって部分的に行うこともできる。このような第２のプライマーの伸長産物は、標的配列またはそのセグメントを含む。第２のプライマーの伸長産物の合成において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの複製可能な部分の配列がポリメラーゼによって鋳型として認識され、対応する相補的配列が合成される。前記配列は、第２のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントに存在し、第１のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含む。第２のプライマーの伸長産物の合成は、第１のプライマーオリゴヌクレオチド内の停止位置まで行われる。第２のプライマーの伸長産物が合成された直後、該第２のプライマーの伸長産物は第１のプライマーの伸長産物に結合し、二本鎖複合体を形成する。第２のプライマーの伸長産物は、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって前記複合体から配列特異的に引き剥がされる。アクチベーターオリゴヌクレオチドによって鎖置換が成功裏に行われた後、第２のプライマーの伸長産物自体が、第１のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として機能することができる。
【０３９８】
さらに、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅の開始時において、出発核酸鎖から開始される第２のプライマーの伸長産物の合成の開始剤として機能することができる。一実施形態において、第２のプライマーの配列は、出発核酸鎖の対応する配列セグメントに完全に相補的である。さらなる一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列は、出発核酸鎖の対応する配列セグメントに部分的にのみ相補的である。このように一部が相補的でなくても、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの主として配列特異的なプライマー伸長反応の開始は妨げられない。第２のプライマーオリゴヌクレオチドと、出発核酸鎖の対応する位置の間の相補性の差異は、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントに存在することが好ましく、これによって、３’末端セグメントでは、相補的な塩基対合が大部分を占めることになり、合成の開始が可能となる。合成を開始させるためには、たとえば、特に３’末端セグメントの最初の４〜１０番目の位置が鋳型（出発核酸鎖）と完全に相補的でなければならない。他の位置のヌクレオチドは、完全な相補性を有していなくてもよい。したがって、５’末端セグメントにおいて、塩基組成の１０％〜１００％が完全な相補性を有していてもよく、塩基組成の３０％〜１００％が完全な相補性を有していることがより好ましい。第２のプライマーオリゴヌクレオチドの長さに応じて、５’末端セグメントにおいて完全に相補的ではないヌクレオチドは、１〜４０箇所に含まれ、１〜２０箇所に留まることがより好ましい。さらなる一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、その３’末端セグメントのみを介して出発核酸鎖に結合し、その５’末端セグメントを介して出発核酸鎖に結合することはない。出発核酸鎖に完全に相補的な、第２のプライマーオリゴヌクレオチドのこの３’末端セグメントの長さは、６〜４０ヌクレオチド長の範囲を含み、６〜３０ヌクレオチド長であることがより好ましく、６〜２０ヌクレオチド長であることが好ましい。これに応じて、出発核酸鎖に非相補的な、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントの長さは、５〜６０ヌクレオチド長の範囲を含み、１０〜４０ヌクレオチド長であることがより好ましい。したがって、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、出発核酸鎖の合成を開始することができる。これに続く第１のプライマーの伸長産物の合成では、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分がポリメラーゼによって複製され、次の合成サイクルにおいて、第２のプライマーオリゴヌクレオチドに結合する完全に相補的なプライマー結合部位が第１のプライマーの伸長産物に形成され、さらなる合成サイクルにおいて使用される。
【０３９９】
さらなる一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドを、出発核酸鎖の調製において使用することができる。この場合、この第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、核酸（たとえば、標的配列を含む一本鎖のゲノムDNAもしくはRNAまたはその同等物）にその大部分が／好ましくは配列特異的に結合し、ポリメラーゼの存在下で鋳型依存的なプライマー伸長反応を開始することができる。結合する位置は、プライマー伸長産物が所望の標的配列を含むように選択される。第２のプライマーオリゴヌクレオチドが伸長されると、鋳型に相補的な配列を有する鎖が得られる。この核酸鎖は、（たとえば熱またはアルカリによって）鋳型から解離させ、一本鎖の形態に変換することができる。このようにして得られた一本鎖核酸は、増幅の開始時に出発核酸鎖として機能することができる。この出発核酸鎖は、その５’末端セグメントに、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列部分を含み、標的配列またはその同等物と第１のプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位をさらに含む。さらなる工程は「出発核酸鎖」の節で説明している。
【０４００】
好ましい一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、少なくともその３’末端セグメントにおいて、標的配列の配列セグメントに相補的であることから、この配列セグメントに配列特異的に結合してポリメラーゼによるプライマー伸長反応を開始／補助することができる配列部分を含む。このような配列セグメントの長さは、６〜４０ヌクレオチド長の範囲を含み、８〜３０ヌクレオチド長であることがより好ましく、１０〜２５ヌクレオチド長であることが好ましい。
【０４０１】
一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、その３’末端セグメントおよび５’末端セグメントに、第１のプライマーの伸長産物の合成においてポリメラーゼによって複製される複製可能な配列部分を含む。したがって、第２のプライマーのすべての配列部分がポリメラーゼによって複製される。これによって、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントにプライマー結合部位が形成される。
【０４０２】
さらなる一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、複製可能な配列部分を有する５’末端セグメントと隣接した位置に、複製不可能な部分を含むさらなる配列セグメントを含んでいてもよい。このようなプライマーを、たとえば、検出において「Scorpionプライマー」として使用することができる。このような一実施形態において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる前記隣接配列セグメント（フランキング配列セグメント）の複製を妨害する修飾を含む。このような修飾には、たとえば、C3リンカーもしくはHEGリンカー、またはポリメラーゼを停止させるその他の修飾が含まれる。このような修飾のさらなる例は、「第１のプライマーオリゴヌクレオチドの実施形態」の節に記載しているため、これらを参照されたい。
【０４０３】
一実施形態において、複製可能な部分を有する第２のプライマーオリゴヌクレオチドの長さは、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合しない、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントの長さと一致する（図１４Ｂ、プライマー５Ｃ）。第２のプライマーオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物を含む複合体において、この第２のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端は、第１のプライマーの伸長産物に結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドの末端と同じ位置にある。この第２のプライマーの伸長は、第１のプライマーの伸長産物を鋳型として使用することによって行われる。第２のプライマーが伸長されると、ポリメラーゼ依存的鎖置換によって、第１のプライマーの伸長産物に結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドが引き剥がされる。得られる第２のプライマーの伸長産物（プライマー伸長産物６Ｃ）を図１４Ｃに示す。
【０４０４】
さらなる一実施形態において、複製可能な配列部分を有する第２のプライマーオリゴヌクレオチドの長さは、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合しない、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントよりも短い（図１４Ｂ、プライマー５Ｂ）。したがって、第２のプライマーオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物を含む複合体において、第２のプライマーの３’末端と、第１のプライマーの伸長産物に結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドの末端との間に、第１のプライマーの伸長産物の一本鎖部分が存在する。この第２のプライマーの伸長は、第１のプライマーの伸長産物を鋳型として使用することによって行われる。第２のプライマーが伸長されると、ポリメラーゼ依存的鎖置換によって、第１のプライマーの伸長産物に結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドが引き剥がされる。得られる第２のプライマーの伸長産物（プライマー伸長産物６Ｂ）を図１４Ｃに示す。
【０４０５】
さらなる一実施形態において、複製可能な部分を有する第２のプライマーオリゴヌクレオチドの長さは、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合しない、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントよりも長い（図１４Ｂ、プライマー５Ａ、５Ｄ、５Ｅ）。第２のプライマーオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物を含む複合体において、第２のプライマーの３’末端セグメントとアクチベーターオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントは、第１のプライマーの伸長産物に対する結合において競合する。合成の開始に必要とされる第１のプライマーの伸長産物に第２のプライマーの３’末端セグメントが結合し、これと同時に、アクチベーターオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントが部分的に引き剥がされる。
【０４０６】
第１のプライマーの伸長産物を鋳型として使用してポリメラーゼによる合成が開始された後、第２のプライマーが引き剥がされる。第２のプライマーが伸長されると、ポリメラーゼ依存的鎖置換によって、第１のプライマーの伸長産物に結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドが引き剥がされる。得られる第２のプライマーの伸長産物（プライマー伸長産物６Ａ、６Ｄ、６Ｅ）を図１４Ｃに示す。アクチベーターオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントを引き剥がすことができる第２のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端セグメントの配列の長さは、１〜５０ヌクレオチド長であってもよく、３〜３０ヌクレオチド長であることがより好ましく、５〜２０ヌクレオチド長であることが好ましい。第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントの長さよりも長い第２のプライマーオリゴヌクレオチドを使用すると、いくつかの実施形態において、たとえば有利である場合がある。このような実施形態には、たとえば、アクチベーターオリゴヌクレオチドが結合しない５〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長の３’末端セグメントを有する第１のプライマーの伸長産物が含まれる。特に、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントが短く、第２のプライマーオリゴヌクレオチドが長いほど、合成の開始時に配列特異性が向上する。
【０４０７】
プライマー結合部位に対する第２のプライマーオリゴヌクレオチドの結合力は、自体の長さに依存する。通常、第２のプライマーオリゴヌクレオチドが長いほど、より高い反応温度で使用することができる。
【０４０８】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列およびアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列は、副反応（たとえばプライマーダイマーの形成）が最小限となるように互いに適合させることが好ましい。これを達成するため、たとえば、適切な鋳型および／または標的配列および／または出発核酸鎖の非存在下において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドおよび第２のプライマーオリゴヌクレオチドが増幅反応を開始することがないように、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列と第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列を互いに適合させる。これは、たとえば、第２のプライマーオリゴヌクレオチドが第１のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含まず、かつ第１のプライマーオリゴヌクレオチドが第２のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するプライマー結合部位を含まないことによって達成することができる。さらに、各プライマー配列が、伸長された自己相補的構造（自己相補鎖）を含まないようにする必要がある。
【０４０９】
第２のプライマーの伸長産物の合成はプライマーの伸長反応であり、増幅反応の一工程である。この工程の反応条件は、状況に応じて適宜調整される。反応温度および反応時間は、反応が成功するように選択する。この工程での好ましい反応温度は、使用するポリメラーゼと、第２のプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー結合部位に対する結合強度に依存し、たとえば１５℃〜７５℃の範囲を含み、２０〜６５℃であることがより好ましく、２５℃〜６５℃であることが好ましい。第２のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度は、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲を含み、０．１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌであることがより好ましく、０．１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌであることが好ましい。
【０４１０】
一実施形態において、非特異的産物／副産物の形成を阻止するか、またはこれらの形成を遅延させるストリンジェントな条件下において増幅反応のすべての工程を実施する。このような条件としては、たとえば高温条件、たとえば５０℃よりも高い温度が挙げられる。
【０４１１】
一実施形態において、１つのバッチで２種以上の特定の核酸鎖を増幅対象として使用する必要がある場合、配列特異的プライマーオリゴヌクレオチドを使用して各標的配列を増幅することが好ましい。
【０４１２】
一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物の合成および第２のプライマーの伸長産物の合成は同じ温度で行われる。さらなる一実施形態において、第１のプライマーの伸長産物の合成および第２のプライマーの伸長産物の合成は異なる温度で行われる。さらなる一実施形態において、第２のプライマーの伸長産物の合成およびアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換は同じ温度で行われる。さらなる一実施形態において、第２のプライマーの伸長産物の合成およびアクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換は異なる温度で行われる。
【０４１３】
指数関数的な増幅と線形増幅の対比
両方の相補鎖（第１のプライマーの伸長産物および第２のプライマーの伸長産物のそれぞれが鋳型となって相補鎖を合成することができる）が同じバッチ内で実質的に互いに並行して合成される場合、このような反応において、これらのプライマー伸長産物の指数関数的な増幅が起こりうる。
【０４１４】
合成プロセスにおいて新たに合成されたプライマー伸長産物は、それぞれの相補的配列部分を使用されるプライマーに近接させて、新たなプライマー結合部位を生成する。この方法では、新たに合成された鎖自体が、さらなる合成プロセスにおける鋳型として機能することができる。
【０４１５】
合成プロセスを周期的に繰り返すことによって、実質的に一方のプライマー伸長産物のみが合成された場合、このプライマーの伸長産物の線形増幅が起こる。
【０４１６】
指数関数的な増幅の速度は、一般に、出発核酸鎖の初期量が非常に少なく、かつ反応速度に対する反応産物の影響が無視できるほど小さい場合、特に増幅の開始時において線形増幅の速度よりも速くなりうる。通常、反応速度は、合成産物の量の多くなればなるほど低下し、増幅速度が遅くなると予測される。詳細に述べると、各反応工程の効率および速度は、本発明の方法の速度全体に対して影響を及ぼす。各工程の効率を変更／調整することによって、本発明の増幅方法の速度および効率に影響を及ぼすことができる。
【０４１７】
以下に、本発明の方法の好ましい一実施形態、すなわち、増幅対象の核酸鎖の指数関数的な増幅を一例として詳細に説明する。
【０４１８】
指数関数的な合成反応（増幅）によって、新たに合成された第１のプライマーの伸長産物および第２のプライマーの伸長産物が蓄積され、これらの伸長産物は、増幅対象の核酸鎖と見なされる。このような伸長産物の蓄積は、各プライマー伸長産物の合成プロセスが周期的に繰り返されることと、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる第２のプライマーの伸長産物の配列特異的な鎖置換（各プライマー結合部位同士の開裂を伴う）を少なくとも部分的な条件とする鎖置換反応が起こることを条件とする。
【０４１９】
この結果、第１のプライマーの伸長産物にアクチベーターオリゴヌクレオチドが相補的結合することによって第２のプライマーの伸長産物の鎖置換が起こり、第１のプライマーの伸長産物および第２のプライマーの伸長産物を永続的または一時的に分離することができる。この分離は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが配列特異的に関与することによって完全または部分的に行うことができる。
【０４２０】
アクチベーターオリゴヌクレオチドが第１のプライマーの伸長産物への結合に成功すると、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物との間の相補的な塩基対合の数は減少する。所定の反応条件では、これによって、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物がそれぞれ分離することができる程度まで第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物との間の結合の安定性が低下することが好ましい（この工程の反応温度は、たとえば、反応中に残った、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物の複合体の融解温度付近である）。この結果、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物が完全に解離する。
【０４２１】
反応の開始時は、合成されたプライマー伸長産物の濃度が低いため、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物の再会合の速度は有意に低い。合成産物の濃度は、たとえば、フェムトモル単位以下からナノモル単位までの濃度範囲であってもよい。この濃度範囲では相補鎖同士の再会合が遅いことが知られている。このような濃度範囲にすれば、第１のプライマーの伸長産物から第２のプライマーの伸長産物が完全に分離することによって、反応速度に対して有利な効果を得ることができる。第１のプライマーおよび第２のプライマーがモル過剰量で存在することによって、遊離状態となった各プライマー結合部位に第１のプライマーおよび第２のプライマーが結合し、新たな合成を開始することができる。
【０４２２】
好ましい一実施形態において、アクチベーターオリゴヌクレオチドによって、第２のプライマーの伸長産物を第１のプライマーの伸長産物から分離させる鎖置換は、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメント領域において温度依存的な鎖分離が有利に補助される反応条件で行われる。
【０４２３】
ただし、このような反応条件は、アクチベーターオリゴヌクレオチドが第１のプライマーの伸長産物に結合しないか、または不完全にしか結合しない場合に第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物との間で完全な鎖解離が起こらないように選択される。
【０４２４】
これら２種のプライマーの伸長産物が完全に分離すると、第２のプライマーの伸長産物は反応液中で一本鎖の形態で存在し、新たな第１のプライマーが第２のプライマーの伸長産物の対応するプライマー結合部位に実質的に妨害されることなく結合する。通常、これは、第１のプライマーの伸長産物の合成反応の開始時の反応速度に対して有利な効果を有する。
【０４２５】
すなわち、いくつかの場合では、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換工程の反応条件と、第２のプライマーの伸長産物の鎖置換の進行度／程度とを組み合わせると有利であり、この場合、反応中に残った、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントと第２のプライマーの伸長産物とからなる二本鎖の不安定性が増して、このような反応条件下で非常に分離しやすくなる配列位置まで第２のプライマーの伸長産物の鎖置換を進めることによって、第１のプライマーの伸長産物を完全に分離させる。
【０４２６】
反応の開始時の合成産物の濃度が低く、合成された両方の鎖の再会合が無視できるほど少ないため、両鎖の合成速度に対して有利な効果が発揮される。
【０４２７】
通常、新たに合成された鎖の濃度が高くなるにつれて、反応速度は低下する。このような影響は、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物の再会合が増加することによって、プライマー結合部位の露出が少なくなることに少なくとも一部起因する。
【０４２８】
このような再会合を抑制する反応条件を変更することによって、反応速度に有利に働く場合がある。たとえば、第２のプライマーの濃度を上昇させることができ、これによって、第２のプライマーの結合部位に対して競合反応が起こりうる。一方、本発明の方法を行う温度を上昇させると、反応の進行を早めることができる。
【０４２９】
本発明の方法の有利な一実施形態において、第１のプライマーおよび第２のプライマーは、実質的に等しい高濃度またはほぼ同等の高濃度範囲で使用される。
【０４３０】
本発明の方法のさらなる有利な一実施形態において、第１のプライマーおよび第２のプライマーの少なくとも一方は、他方よりも高い濃度で使用される。このときの濃度の差は、１：２〜１：５０の範囲であってもよく、有利には１：２〜１：１０の範囲であってもよい。
【０４３１】
このようにすることによって、一方のプライマー伸長産物の濃度が他方のプライマー伸長産物よりも高くなる非対称な増幅反応を達成することができる。
【０４３２】
以下の実施例は、本発明の方法を実証することのみを目的として記載されたものであり、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【０４３３】
以下の実施例に示す構造、配列および反応条件は、本発明の方法における操作を示し、これを説明することのみを目的としたものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０４３４】
材料と方法
試薬は以下の販売会社から購入した。
・非修飾オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチド（ユーロフィンMWG、Eurogentec、Biomers、Trilink Technologies、IBA Solutions for Life Sciences）
・ポリメラーゼNEB（ニュー・イングランド・バイオラボ）
・dNTP：Jena Bioscience
・EvaGreenインターカレート色素：Jena Bioscience
・緩衝物質およびその他の化学物質：シグマ アルドリッチ
・プラスチック製品：Sarstedt
溶液１（緩衝溶液１）：
・グルタミン酸カリウム、50mmol/l、pH8.0
・酢酸マグネシウム、10mmol/l
・TritonX-100、0.1%(v/v)
・EDTA、0.1mmol/l
・TPAC（テトラプロピルアンモニウムクロリド）、50mmol/l、pH8.0
・EvaGreen色素（この色素はメーカーの説明書に従い1:50に希釈して使用した）
溶液２（増幅反応溶液２）（標準反応）：
・グルタミン酸カリウム、50mmol/l、pH8.0
・酢酸マグネシウム、10mmol/l
・dNTP（dATP、dCTP、dTTP、dGTP）、各200μmol/l
・ポリメラーゼ（Bst 2.0 WarmStart、120,000U/ml、NEB）、12U/10μl
・Triton X-100、0.1%(v/v)
・EDTA、0.1mmol/l
・TPAC（テトラプロピルアンモニウムクロリド）、50mmol/l、pH8.0
・EvaGreen色素（この色素はメーカーの説明書に従い1:50に希釈して使用した）
・プライマー１：10μmol/l
・プライマー２：10μmol/l
・アクチベーターオリゴヌクレオチド：10μmol/l
・鋳型鎖−実施例に示す様々な濃度で使用した
【０４３５】
濃度はいずれも各反応における最終濃度を示す。標準的な反応からの変更はその都度示す。
【０４３６】
使用した核酸成分の融解温度（Ｔｍ）は、溶液１中の各核酸成分の濃度を1μmol/lとして測定した。変更したパラメータは各実施例に示す。
【０４３７】
各反応に関する一般的な情報
プライマーの伸長反応および増幅は、標準的な方法において６５℃の反応温度で行った。変更した場合は別途に示す。
【０４３８】
Bst 2.0 Warmstartポリメラーゼは、（メーカーの説明書によれば）温度感受性オリゴヌクレオチドであり、低温ではその機能が大幅に抑制されることから、前記増幅反応溶液を前記反応温度に加熱することによって増幅反応を開始した。このポリメラーゼは、温度が約４５℃以上になると急速に活性が上昇し、６５℃ではBst 2.0ポリメラーゼとBst 2.0 Warmstartポリメラーゼの間に差はほとんど見られない。反応の調製段階における様々な副産物（たとえばプライマーダイマー）の形成を阻止するためにBst 2.0 Warmstartポリメラーゼを使用した。変更した場合は別途に示す。
【０４３９】
反応溶液を８０℃よりも高い温度に加熱する（たとえば９５℃で１０分間）ことによって増幅反応を停止させた。この温度において、Bst 2.0ポリメラーゼは不可逆的に変性し、合成反応の結果を後から変更することはできない。
【０４４０】
増幅反応は、フルオロメーターを備えた恒温装置で行った。この恒温装置として、市販のリアルタイムPCR装置であるStepOne Plus（アプライドバイオシステムズ、サーモフィッシャー）を使用した。反応量はデフォルト設定の10μlとした。変更した場合は別途に示す。
【０４４１】
エンドポイントの検出と反応速度解析を行った。エンドポイントの検出では、たとえば核酸に結合する色素のシグナルを記録し、この色素として、たとえばTMR（テトラメチルローダミン（TAMRAとも呼ぶ）やFAM（フルオレセイン）を使用した。FAMの蛍光シグナルおよびTMRの蛍光シグナルの励起波長および測定波長は、StepOne PlusリアルタイムPCR装置の工場出荷時の設定をそのまま使用した。さらに、たとえば融解曲線の測定などにおいてエンドポイントを測定するため、インターカレート色素（EvaGreen）を使用した。EvaGreenは、インターカレート色素であり、よく使用されるSYBR Green色素の類似体であるが、SYBR Green色素と比べてポリメラーゼの阻害がわずかに少ない。SYBR Greenの蛍光シグナルおよびEvaGreenの蛍光シグナルの励起波長および測定波長は同一であり、StepOne PlusリアルタイムPCR装置の工場出荷時の設定をそのまま使用した。蛍光は、PCR装置に内蔵されている検出器を用いて連続的に、すなわち「オンライン」あるいは「リアルタイム」で検出することができる。また、前記ポリメラーゼは、合成反応において二本鎖を合成することから、これらの色素を利用した技術を、この反応の反応速度解析（リアルタイム解析）に使用することができる。TMR標識プライマーを1μmol/lを超える濃度（たとえば10μmol/l）で使用した測定などでは、StepOne Plus装置に搭載されたカラーチャンネル間のクロストークによりベースシグナルの強度に部分的な上昇が観察された。SYBR Greenチャンネルで測定したTMRシグナルは、基底値の上昇を起こすことが分かった。基底値の上昇を考慮に入れて算定を行った。
【０４４２】
増幅反応の反応速度解析を行うため、フルオレセイン（FAM-TAMRAからなるFRETペア）またはインターカレート色素（EvaGreen）の蛍光シグナルを定期的に記録した。シグナルの時間経過を検出した（StepOne Plus PCR装置におけるリアルタイムシグナル検出）。コントロール反応との比較により検出された反応中のシグナルの上昇は、バッチの構成に従って解釈した。たとえば、EvaGreen色素を使用した際のシグナルの上昇は、増幅反応における二本鎖核酸の量の増加を示すものとして解釈し、したがって、DNAポリメラーゼによる合成がなされたと判断した。
【０４４３】
いくつかの反応では、増幅反応の実施後に融解曲線を決定した。この測定によって、二本鎖の存在を確認することができ、たとえばインターカレート色素を取り込むことによって該色素のシグナル強度を有意に上昇させることができる二本鎖の存在を確認することができる。温度を上昇させると、二本鎖の割合が低下し、シグナル強度も低下する。シグナル強度は、核酸鎖の長さおよび配列組成に左右される。このような技術は当業者によく知られている。
【０４４４】
修飾された核酸鎖（たとえばアクチベーターオリゴヌクレオチドまたはプライマー）が多くの割合を占める反応において融解曲線解析を行ったところ、EvaGreen色素のシグナルが異なる挙動を示す場合があり、たとえばB型DNAと修飾されたA型核酸鎖の間で異なる挙動を示す場合があることが分かった。たとえば、（通常、古典的なDNA構造を取る）B型の二本鎖核酸は、（たとえばヌクレオチドのいくつかが２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されていることによって）A型様の構造を持つ同じ核酸塩基配列の二本鎖核酸よりも高いシグナル強度を示した。インターカレート色素を使用した場合、このような観察結果を考慮に入れた。
【０４４５】
必要に応じて、キャピラリー電気泳動を用いて増幅反応を解析し、形成された断片の長さを標準品と比較した。キャピラリー電気泳動を実施するため、標識された核酸の濃度が約20nmol/lとなるように、緩衝液（Tris-HCl、20mmol/l、pH8.0およびEDTA、20 mmol/l、pH8.0）中に反応混合物を希釈した。キャピラリー電気泳動は、契約サービスを利用してGATC-Biotech社（ドイツ国コンスタンツ）において行った。キャピラリー電気泳動による標準的な条件のサンガーシーケンシングは、メーカーの説明書に従って、POP7ゲルマトリックスおよびABI 3730 Cappilary Sequencerを使用して、約５０℃、定電圧（約１０ｋＶ）の条件で行った。この条件において二本鎖は変性し、キャピラリー電気泳動において一本鎖の核酸鎖が分離された。電気泳動は遺伝子分析において標準的な技術である。全自動キャピラリー電気泳動は、現在、サンガーシーケンシング法において日常的に使用されている。キャピラリー電気泳動（通常、バーチャルフィルターを使用）の際に、蛍光シグナルを連続的に記録し、電気泳動時間とシグナル強度を関連付けた電気泳動図を作製する。短い断片（たとえば未使用のプライマー）は、初期のシグナルピークに観察され、伸長断片では、伸長領域の長さに比例した一時的なシグナルのシフトが観察される。長さが判明しているコントロールから、伸長断片の長さを測定することができる。このような技術は当業者に公知であり、一般に断片長多型の検出に使用されている。
【０４４６】
実施例１：
等温条件下での核酸依存的鎖置換
本実施例では、鎖分離活性を有するタンパク質または酵素（たとえばヘリカーゼまたはリコンビナーゼ）の非存在下において、相補的一本鎖核酸が、ATPの形態で蓄積されたエネルギーを化学的に消費することなく、核酸依存的に、特に配列特異的に鎖置換を行う基本的な能力について示す。反応条件下で安定な二本鎖（この二本鎖を構成する各鎖をＡ１およびＢ１と呼び、したがって、これらから構成される二本鎖をＡ１：Ｂ１と呼ぶ）は、Ａ１鎖の特定のセグメントに実質的に相補的な一本鎖核酸鎖によって開裂することができることが示された（この一本鎖核酸鎖をＣ１オリゴヌクレオチドと呼ぶ）。この二本鎖が開裂した結果、Ｂ１鎖は一本鎖に変換され、これと同時に二本鎖Ａ１：Ｃ１が新たに形成される。本実施例において使用されるＣ１核酸鎖の配列は、等温条件下の二本鎖DNA断片に対して、核酸鎖を介した配列特異的な鎖置換反応が起こるように構築されたものである。本実施例において、ポリメラーゼは反応に加えず、したがって、新たな核酸鎖は合成されず、核酸鎖の増幅も起こらなかった。
【０４４７】
事前に作製した二本鎖の鎖置換および鎖分離を検出するため、この二本鎖から分離する両鎖を蛍光色素で標識し、（フルオレセインおよびTAMRAからなる）FRETペアが形成されるようにした。蛍光色素はＡ１：Ｂ１二本鎖の末端、すなわち、両鎖の相補的末端に配置した。ここで使用する各核酸鎖は化学的に合成されたものであり、化学合成の際に蛍光色素を対応する鎖末端に化学的に結合させた。両鎖が互いに相補的である場合の蛍光色素の間の距離は、TAMRA色素によってフルオレセインの蛍光が効果的にクエンチされるように選択した。二本鎖を構成する各鎖がなんらかの作用（たとえば温度や鎖置換）によって分離された場合、蛍光色素間の距離が遠くなり、フルオレセインマーカーの蛍光シグナルの強度が増加する。両鎖（Ａ１およびＢ１）が完全に分離されると、フルオレセインマーカーの強度が最大となる。蛍光強度と、各種パラメータの作用（たとえば、温度、鎖置換を行うための相補的配列または非相補的配列の添加など）に対する蛍光強度の依存性を観察することによって、互いに結合したままの標識された両鎖の量を知ることができる。
【０４４８】
実施例１において、核酸依存的かつ配列特異的な鎖置換反応の原理を示す。反応中の蛍光シグナルを記録することによって、鎖置換反応の速度と、事前に作製した二本鎖（Ａ１：Ｂ１）の開裂の温度依存性を解析した。等温反応条件と温度勾配条件の両方で試験を行った。
【０４４９】
出発物質の調製：
各配列および配列番号を示すとともに、研究室で使用した名称を示した。
【０４５０】
二本鎖（Ａ１：Ｂ１）
二本鎖Ａ１：Ｂ１の配列は無作為に選択した人工配列であり、この際、大きなヘアピン構造と長いＧセグメントやＣセグメントが含まれないように注意した。この二本鎖の各鎖は、相補的二本鎖を形成することができる。二本鎖のＴｍは約７５℃であり（別の二本鎖のＴｍは約７７℃（下記参照）であり）、これは反応温度（６５℃）よりも高い。したがって、この二本鎖は反応条件下で安定である。Ａ１鎖は各Ｂ１鎖よりも長いため、５’オーバーハングが発生する。Ａ１鎖の５’オーバーハングは、第１のプライマーの伸長産物のポリヌクレオチドテールと相似性を有するように設計した。ただし、合成を容易にするために、この５’オーバーハングには、ポリメラーゼ活性をブロックする修飾を含めなかった。本実施例の反応においては、ポリメラーゼを使用しなかったため、このような修飾の有無はそれほど重要ではない。前記５’オーバーハングは、一本鎖核酸（Ｃ１）の第１の領域に相補的であり、反応条件下において、Ｃ１核酸鎖が前記５’オーバーハングに特異的に結合することができる。この結合によって、Ａ１：Ｂ１二本鎖の一方の末端と一本鎖核酸Ｃ１の対応する相補的セグメントとが空間的に十分に近接し、鎖置換反応を起こすことができる。この鎖置換反応によって、新たな二本鎖Ａ１：Ｃ１を発生させ、Ｂ１鎖を一本鎖に変換することができる。
【０４５１】
2019530472.tif 000003
この配列はDNAからなる。３’末端のTAMRAによる修飾（末端TMR修飾）は、合成の際に付加した。
【０４５２】
2019530472.tif 000004
これらの鎖はいずれもDNAからなる。５’末端のフルオレセイン色素による修飾（末端FAM修飾）はレポーターとして選択し、オリゴヌクレオチド化学による従来の方法で合成の際に各鎖に付加した。
【０４５３】
２種の二本鎖バリアントを作製した。バリアント１は、Ａ１鎖の５’セグメントに短いオーバーハング（６ヌクレオチド）を有する二本鎖を含み、この二本鎖は配列番号１と配列番号２からなる。バリアント２は、Ａ１鎖の５’セグメントに長いオーバーハング（９ヌクレオチド）を有する二本鎖を含み、この二本鎖は配列番号１と配列番号３からなる。各相補的セグメントは下線で示す。Ａ１鎖の３’セグメントのオーバーハングは合成を行うために設計されたものであり、本実施例においてはそれほど重要ではない。
2019530472.tif 000005
【０４５４】
一本鎖核酸（Ｃ１オリゴヌクレオチド）：
特定の条件下において、一本鎖核酸（本実施例においてＣ１オリゴヌクレオチドと呼ぶ）によって、Ａ１：Ｂ１鎖の鎖置換反応を起こすことができ、これと同時にＡ１とＣ１オリゴヌクレオチドからなる新たな二本鎖（Ａ１：Ｃ１二本鎖）を形成することができる。このとき、Ｂ１鎖は少なくとも部分的に一本鎖形態に変換される。極端な場合、鎖置換によってＡ１：Ｂ１を完全に解離させ、Ａ１鎖からＢ１鎖を完全に分離することができる。
【０４５５】
Ｃ１オリゴヌクレオチドとアクチベーターオリゴヌクレオチドは類似した機能を有しており、核酸依存的に二本鎖の鎖置換を媒介する。本実施例ではＣ１オリゴヌクレオチドという名称を使用する。Ｃ１オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼをブロックするヌクレオチド修飾を含んでいてもよいが、本実施例ではポリメラーゼを使用しないため、このような修飾は鎖置換の実施に必須ではない（下記参照）。アクチベーターオリゴヌクレオチドという名称は、ポリメラーゼが含まれる反応混合物において指数関数的な増幅を行う実施例において使用する。アクチベーターオリゴヌクレオチドを使用する場合は、Ｃ１オリゴヌクレオチドを使用する場合とは異なり、ポリメラーゼをブロックするヌクレオチド修飾を含んでいなければならない。
【０４５６】
Ｃ１オリゴヌクレオチドとアクチベーターオリゴヌクレオチドは類似した機能を持つことから、Ｃ１オリゴヌクレオチドは、アクチベーターオリゴヌクレオチドの構造とよく似た配列組成を持つように設計している。鎖置換を実施できるように、Ｃ１オリゴヌクレオチドは、Ａ１鎖に相補的なセグメントを含んでいなければならない。Ｃ１オリゴヌクレオチドは、いずれも一本鎖の第１の領域、第２の領域および第３の領域を持つ（アクチベーターオリゴヌクレオチドの構造を参照されたい）。アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物の結合のように、Ｃ１オリゴヌクレオチドの第１の領域は、Ａ１鎖の一本鎖５’オーバーハングに結合することができ、第２の領域および第３の領域は、Ａ１鎖の内部セグメントに結合することができる。
【０４５７】
本実施例においては、アクチベーターオリゴヌクレオチド構造が、効果的な鎖置換活性を発揮することも示す。この理由から、いくつかのＣ１核酸鎖は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと同一の配列を有するように設計した（たとえば配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７）。その他のＣ１核酸鎖（配列番号８、配列番号９および配列番号１０）は、本実施例において鎖置換を実証することのみを目的として使用され、これらのＣ１核酸鎖はDNAからなり、ポリメラーゼ活性をブロックすることができる内部修飾を含んでいない。本発明のこの実施例の反応においては、ポリメラーゼを使用しなかったため、このような修飾の有無はそれほど重要ではない。各一本鎖核酸（Ｃ１オリゴヌクレオチド）の構造を以下にまとめる。
【０４５８】
Ｃ１オリゴヌクレオチド（グループ１、アクチベーターオリゴヌクレオチドの構造を有するオリゴヌクレオチド）：
以下の４種のＣ１オリゴヌクレオチドは、アクチベーターオリゴヌクレオチドとして使用することができる。
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【０４５９】
配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示される各配列は、アクチベーターオリゴヌクレオチドとして構築された。これらの配列は、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド（角括弧（［］）内に示す）とDNAヌクレオチド（３’セグメントおよび場合に応じて５’セグメント）を含み、３’末端ヌクレオチドの３’−ＯＨ基は、リン酸残基でブロックした。これらのオリゴヌクレオチドは、製造会社によって化学的に合成されたものであった。Ａ１鎖に相補的に結合することができる配列を下線で示す。配列番号４、配列番号５および配列番号６に示される各核酸は、第１の領域、第２の領域および第３の領域でＡ１鎖の配列に相補的である（第２の領域の相補配列は、第３の領域の相補配列と連続している）。相補的な核酸塩基がこのように連続的に並んでいることによって、鎖置換が可能となる。
【０４６０】
配列番号７に示される核酸は、第１の領域および第２の領域（３３番目〜４９番目）においてＡ１鎖の配列に相補的であるが、Ａ１鎖に相補的でない配列（１番目〜１８番目および２７番目〜３２番目）も含んでいる。この非相補的配列の一部は、第２の領域の５’末端セグメントの直前に配置されており、この領域以降の鎖置換の進行を阻止するために配置した。この核酸鎖はネガティブコントロールとして機能した。
【０４６１】
Ｃ１オリゴヌクレオチド（グループ２、アクチベーターオリゴヌクレオチドの構造を持たないオリゴヌクレオチド）：
さらに、以下の３種のオリゴヌクレオチドも鎖置換反応に使用した。
2019530472.tif 000007
【０４６２】
配列番号８〜１０に示される配列は、前記アクチベーターオリゴヌクレオチドと同様の核酸塩基組成で構築した。ただし、これらのオリゴヌクレオチドでは、ポリメラーゼ活性をブロックすることができる残基を内部セグメントの対応する部位に挿入しなかった。また、これらの配列の内部領域の糖リン酸主鎖には修飾（ポリメラーゼをブロックする修飾）を付加せず、３’末端のブロッキング基も付加しなかった。これらのＣ１オリゴヌクレオチドは、DNAヌクレオチドのみからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、製造会社によって化学的に合成されたものであった。Ａ１鎖に相補的に結合することができる配列を下線で示す。前記Ｃ１オリゴヌクレオチドのうち、配列番号８は一続きの相補的セグメントを含む。このセグメントは、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域、第２の領域および第３の領域に相当する。配列番号９に示される核酸および配列番号１０に示される核酸は、Ａ１鎖に相補的な一続きの配列の２種のバリエーションを示す。配列番号９の１８番目および３６番目には、Ｃヌクレオチドの代わりにＡヌクレオチドが含まれる。これらの位置のヌクレオチドは、Ａ１鎖の対応する位置の核酸塩基に対して相補性を示さない。配列番号１０に示される核酸鎖は、相補的配列の別のバリエーションを示し、特定の残基が欠失しており、すなわち２６番目と２７番目の間で２個のヌクレオチド（ＣＴ）が欠失している。この欠失により、二本鎖Ａ１：Ｃ１の形成において相補的配列に分断が生じる。
【０４６３】
第１のプライマーオリゴヌクレオチド（プライマー１）
第１のプライマーオリゴヌクレオチドを反応に使用して、温度依存的な鎖置換反応を開始させた。
2019530472.tif 000008
【０４６４】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド（角括弧（［］）内に示す）とDNAヌクレオチド（３’セグメントおよび場合に応じて５’セグメント）を含み、３’末端ヌクレオチドの３’−ＯＨ基はブロックされていなかった。このオリゴヌクレオチドは、TAMRA色素で修飾されたｄＴヌクレオチド（配列においてＴ＊で示す）を１１番目に有する。このオリゴヌクレオチドは、製造会社によって化学的に合成されたものであった。この配列を有するプライマーは、Ｃ１オリゴヌクレオチドに相補的に結合することができる。プライマー１とＣ１オリゴヌクレオチドの間のこの結合によって、（室温で行われる）反応混合物の調製の際に、各Ｃ１オリゴヌクレオチドの特定の配列セグメントが二本鎖を形成するが、このＣ１オリゴヌクレオチドの特定の配列セグメントは、Ａ１鎖の一本鎖オーバーハングとは相互作用を起こすことはできない。
【０４６５】
相補的二本鎖（Ａ１およびＢ１）の調製
各相補的核酸鎖（Ａ１およびＢ１）を、（EvaGreen色素を含んでいない）緩衝溶液１にそれぞれ１μmol/lの濃度で混合し、短時間加熱し、室温に放置して冷却することによって、相補的な領域で二本鎖（Ａ１：Ｂ１）を形成させた。この結果、以下の２種の二本鎖バリアントが生じた。
バリアント１は、配列番号１と配列番号２からなる配列を含む。
バリアント２は、配列番号１と配列番号３からなる配列を含む。
【０４６６】
一本鎖核酸（Ｃ１）の調製（プライマー１との複合体化なし）
各一本鎖核酸（Ｃ１）は、（EvaGreen色素を含んでいない）緩衝溶液１中に10μmol/lの濃度で調製した。
【０４６７】
一本鎖核酸（Ｃ１）とプライマー１からなるＣ１：プライマー１複合体の調製
一本鎖核酸（Ｃ１）の第１の領域と第２の領域を可逆的にブロックするため、各Ｃ１オリゴヌクレオチドにプライマー１を等モル濃度で加えることによって、部分的に二本鎖となったＣ１：プライマー１複合体を形成することができた。プライマー１は、Ｃ１オリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域に特異的に結合することによって、（室温での）反応混合物の調製の際にＡ１鎖のオーバーハングと相互作用しうる配列セグメントをブロックする。この複合体は室温で安定であり、反応条件下においてのみそれぞれの鎖に解離して、一本鎖になったＣ１オリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域を、二本鎖（Ａ１：Ｂ１）の対応する構造と相互作用させることができる。Ｃ１オリゴヌクレオチドとプライマー１の複合体も、（EvaGreen色素を含んでいない）緩衝溶液１中に10μmol/lの濃度で調製した。
【０４６８】
反応混合物の調製、反応の開始および反応条件
二本鎖（Ａ１：Ｂ１）を含む溶液と、Ｃ１オリゴヌクレオチドまたはＣ１−プライマー１複合体を含む溶液とを等量（各5μl）で混合することによって、室温で試験を行うための反応混合物を調製した。得られた反応混合物には、各鎖が以下の濃度で含まれていた。
・0.5μmol/lの濃度の二本鎖Ａ１：Ｂ１
・5μmol/lの濃度の一本鎖（Ｃ１）またはＣ１−プライマー１複合体
・0.5μmol/lの濃度の（FAMシグナルコントロールとしての）一本鎖Ｂ１
【０４６９】
６５℃の等温条件下における鎖置換の経時観察
前述のようにして調製した反応混合物を、蛍光検出機能を備えた恒温装置中の適切な反応容器（マイクロウェルプレート）に移した。恒温装置として、リアルタイムPCR装置（「StepOne Plus」、StepOneソフトウェアv2.1、ABI、サーモフィッシャー）を使用した。まず、反応混合物を５０℃で約５０秒間（１〜５サイクル）予熱し、次いで６５℃で加熱した。この温度で約１０分間維持し（６〜３０サイクルを記録）、鎖置換反応を等温条件下で進行させ、経過を観察した。FAM蛍光シグナルを、（前記装置のリアルタイム機能を利用して）経時的に記録した。前記リアルタイムPCR装置を使用したことから、メーカーから提供された適切に調整されたFAMフィルターとソフトウェアプログラムとを使用することができた。メーカーによって指定された２つの測定間の時間間隔の最小値（設定可能な時間間隔の最小値）は１０秒であったため、前記装置を使用した測定サイクルは約１５〜１８秒とした。FAMの経時シグナルはこの最大記録サイクルで記録した。
【０４７０】
Ｃ１オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下での温度勾配（５０℃〜９５℃）におけるＡ１とＢ１の分離の観察
さらなる実験では、反応混合物を５０℃から９５℃へと連続的に加熱した（温度勾配）。この加熱過程においても、温度を０．５℃上昇させるごとにFAMシグナルを測定することによりFAMシグナルを検出した。測定されたFAMシグナル強度を温度ごとに記録した反応混合物の温度プロファイルが得られた。さらに、リアルタイムPCR装置（StepOne Plus）を用いて同じ実験を行い、プログラム（メーカーによってプリインストールされていたStepOneソフトウェアv2.1）を使用して融解曲線を決定した。
【０４７１】
いずれの実験も各反応混合物について評価を行った。結果を以下に示す。各反応物の組成は適切な箇所に記載する。
【０４７２】
結果：
１．検出システムの試験：
２つのコントロールバッチにおいて、FAMとTAMRAからなるFRETペアの機能性を試験した。第１のコントロールバッチは、FAM色素で標識したＢ１鎖のみを含んでいた（図２４、矢印１）。第２のコントロールバッチは、TAMRAで標識したＡ１鎖と、FAMで標識したＢ１鎖の両方を含んでいた（Ａ１：Ｂ１二本鎖）（図２４、矢印２）。等温条件下でのシグナルの経時変化（図２４Ａ）と温度勾配下でのシグナルの挙動（図２４Ｂ）を記録した。いずれのコントロールバッチでも、等温条件下（６５℃）において安定なシグナルが示されている（図２４Ａ）。二本鎖（矢印２）を温度勾配下で記録した場合（図２４Ｂ）、約７０℃からFAMレポーターの蛍光の増加が観察される。シグナルは約８０℃で最大に達し、その後は一本鎖のような挙動を示している（矢印１参照）。算出されたこの鎖（９ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有するＡ１鎖を含む二本鎖Ａ１：Ｂ１のバリアント２）の融解温度は、約７５℃である（矢印３）。定義によれば、この温度において、二本鎖の５０％が解離しており、したがって、Ａ１鎖およびＢ１鎖のそれぞれ５０％が一本鎖である。６ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有するＡ１鎖を含む二本鎖Ａ１：Ｂ１のバリアント１のコントロールバッチも類似の挙動を示し、このバリアント１のＴｍは約７７℃である。
【０４７３】
後掲の図２４〜２９においても、矢印１は、FAMで標識した一本鎖Ｂ１鎖のみを含むコントロールバッチを示し（矢印１）、矢印２は、標識した二本鎖Ａ１：Ｂ１を含むコントロールバッチを示す（矢印２）。
【０４７４】
２．相補的一本鎖オリゴヌクレオチドによる鎖置換
連続した相補的残基を配列中に含むＣ１オリゴヌクレオチドとＡ１鎖を反応させた場合（たとえば、Ａ１：Ｂ１のバリアント２とＣ１オリゴヌクレオチド（配列番号５、A6 8504）の反応）、非常に速い速度でＢ１鎖の鎖置換が起こり、反応混合物の調製中あるいは記録の開始前に既にＢ１鎖の大部分が一本鎖の形態で存在する場合があることが観察された。これは、図２５（矢印３）におけるシグナル強度の増加から見ることができる。既に最初の測定（サイクル１）において、Ｃ１オリゴヌクレオチドを含まないＡ１：Ｂ１二本鎖のコントロール反応よりも有意に高いシグナル量が観察されている。したがって、Ｂ１鎖は、最初の測定よりも前に一本鎖の形態で既に存在していたと認められる。Ａ１：Ｂ１二本鎖のバリアント１の反応も類似した挙動を示す。
【０４７５】
一続きの相補的セグメントを含む別のＣ１オリゴヌクレオチド（たとえば配列番号４、配列番号６または配列番号８）を使用した場合のＣ１オリゴヌクレオチドによる置換でも、基本的に類似した挙動が示される。測定の開始時において既にFAMレポーターの蛍光シグナル強度が高いことから、最初の測定の前にＢ１鎖が既に一本鎖の形態で存在していたと見られる。各Ｃ１オリゴヌクレオチドの挙動から、本実施例における糖リン酸主鎖によって組成が違っていても（すなわち、DNAであるか、２’−Ｏメチル修飾を有しているかに関わらず）、一本鎖Ｃ１オリゴヌクレオチドによる鎖置換に有意な差は認められないことが示された。２’−Ｏ−Ｍｅで修飾された長いセグメントを有するオリゴヌクレオチドでも、DNAのみからなるオリゴヌクレオチドでも、同じ結果が得られた。相補塩基が連続している場合、特にＣ１オリゴヌクレオチドの第２の領域と第３の領域において相補塩基が連続している場合、鎖置換が高収率で起こる。
【０４７６】
相補的な第３の領域が短いものの、全領域にわたって連続した相補的配列を有する配列番号４（8504、短鎖）のＣ１鎖を使用した場合、図２６に示す結果が得られた。Ａ１：Ｂ１二本鎖のバリアント１およびＣ１を使用したバッチと、Ａ１：Ｂ１二本鎖のバリアント２およびＣ１を使用したバッチは類似した挙動を示し（矢印３）、温度を６５℃に上昇させた後でしか鎖置換が起こらなかった。
【０４７７】
Ｃ１配列の５’末端を短くすると（アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域に相当）（配列番号４）、Ａ１鎖の３’末端セグメント中の長い配列部分が、Ｃ１オリゴヌクレオチドと相補的に結合せず、Ａ１鎖のこの３’末端側のセグメントが、Ｂ１鎖の５’末端セグメントに接触したまま残った（Ｂ１鎖の５’末端セグメントの１番目〜１８番目）。この二本鎖断片は、５０℃で十分に安定であり、Ａ１：Ｂ１二本鎖の標識された末端が５０℃でも十分に接触を維持することができ、この温度においてFAMのシグナルは十分にクエンチされる（矢印３、１〜５サイクル、図２６）。温度を６５℃に上昇すると（矢印３Ｂ、図２６）、Ｃ１オリゴヌクレオチドの存在によって、Ａ１：Ｂ１二本鎖集団の半分程度が一本鎖に解離した。Ａ１：Ｂ１二本鎖形態と一本鎖形態のＢ１鎖との間で平衡に達する（三本鎖複合体）。このバッチ中のFAMレポーターの蛍光強度から、約５０％が遊離鎖であることが認められる。Ｃ１オリゴヌクレオチドによる鎖置換が完全に起こったと想定すると（すなわち、Ａ１鎖の相補的領域とＣ１オリゴヌクレオチドの相補的領域が完全に結合したと想定すると）、この平衡挙動は、Ａ１鎖の３’末端セグメントとＢ１鎖の５’末端セグメントとの間で維持されていた接触が、前記温度ではもはや十分に安定ではなく、このセグメントにおいてＡ１鎖とＢ１鎖が温度依存的に自然に分離したということに起因する。反応条件下において、一本鎖Ｂ１鎖は次いでＡ１鎖の３’末端セグメントに結合し、Ｃ１オリゴヌクレオチドの鎖置換が起こりうる。したがって、この系は、Ａ１：Ｂ１二本鎖、Ｃ１：Ａ１二本鎖およびこれらの中間体の間で平衡状態にある（三本鎖複合体）。
【０４７８】
３．配列組成に差異を有する一本鎖オリゴヌクレオチドによる鎖置換
第２の領域または第３の領域の核酸塩基組成に２個以上の非相補的塩基を含むＣ１オリゴヌクレオチドを使用して、配列の差異の影響を試験した。このように塩基組成が一部異なるＣ１を使用したところ、Ａ１：Ｃ１からなると予想された二本鎖において連続した相補的な塩基対合は発生しなかった。
【０４７９】
Ｃ１オリゴヌクレオチド（配列番号５）とＡ１：Ｂ１二本鎖のバリアント１の相互作用の結果を図２７に示す。前述の連続した相補的配列との違いは、１８番目と３６番目（配列番号９）に見られるか、または２６番目と２７番目（配列番号１０）の欠失に見られる。これらのＣ１オリゴヌクレオチドを使用したところ、FAMレポーターの蛍光にわずかな変化が認められた（図２７、矢印３）。FAMレポーターのシグナル強度がこのような低い値を示したことは、Ｂ１鎖の大部分がＡ１鎖に結合していたことによるものである。換言すれば、第２の領域および第３の領域において核酸塩基の組成が一部異なるＣ１オリゴヌクレオチドでは、鎖置換における収率が低下した。すなわち、Ａ１：Ｂ１二本鎖はほとんど開裂せず、わずかな量のＢ１鎖のみが一本鎖の形態に変換された。反応の平衡状態は、主にＡ１：Ｂ１二本鎖側にシフトした。
【０４８０】
核酸塩基組成においてさらに多くの差異があると、鎖置換が全く起こらなくなった。配列番号７で示されるＣ１オリゴヌクレオチドは、第１の領域と第２の領域において連続した相補的な核酸塩基配列を含むが、第３の領域において塩基組成が大幅に異なっている。これらの配列差異の一部は、Ｃ１オリゴヌクレオチドの第３の領域の３’末端セグメント（２６番目〜３２番目）にあり、したがって、第２の領域の直前に配置されている。このようなＣ１オリゴヌクレオチドを、前記Ａ１：Ｂ１二本鎖に添加しても、６５℃よりも低い温度では、FAMレポーターの蛍光の測定可能な変化は認められず、結合した状態を保ったままのＡ１：Ｂ１二本鎖を示すシグナルが維持された。すなわち、Ｃ１オリゴヌクレオチドが第１の領域と第２の領域（これらの領域は、Ｃ１鎖とＡ１鎖との間で相補的配列を含む）においてＡ１鎖と相補的に結合できたとしても、第３の領域における配列組成の違いによって、所定の反応条件下での鎖置換は全く起こらなくなり、Ａ１：Ｂ１二本鎖の大部分は、結合した状態を保ったまま維持していた。これは、維持されたＡ１：Ｂ１二本鎖が安定であることに関連する。このＣ１オリゴヌクレオチドの第１の領域および第２の領域のＡ１鎖に対する相補的結合では、Ａ１鎖とＢ１鎖が、有意に長いセグメントを介して互いに相補的な結合を維持していた。所定の条件下では、引き剥がされることなく維持されたこの二本鎖セグメント（Ａ１：Ｂ１）の安定性は、十分に高く、両鎖を結合したまま維持し、Ａ１鎖とＢ１鎖の測定可能な分離を阻止することができる。この場合、反応の平衡状態は、Ａ１：Ｂ１二本鎖のみにおいて見られ、Ａ１鎖とＢ１鎖の測定可能な分離は起こらない。
【０４８１】
４．鎖置換の速度論
鎖置換の速度を測定するため、Ｃ１：プライマー１複合体と調製されたＡ１：Ｂ１二本鎖を使用した。Ｃ１−プライマー１複合体を使用することの利点としては、鎖置換の実施前にＣ１オリゴヌクレオチドの相補的領域にプライマー１が既に結合しているため、室温で安定な二本鎖が得られることが挙げられる。このような反応構成のため、反応条件下で初めて、たとえば反応温度を６５℃（プライマー１のＴｍ付近の温度（Ｔｍ±５℃）に相当）に上昇してから初めてＣ１鎖からプライマー１が分離し、鎖置換が開始される。Ｃ１オリゴヌクレオチドの相補的な領域からプライマー１が解離すると、プライマー１が反応条件下でＡ１：Ｂ１二本鎖と相互作用することができ、鎖置換を起こすことができる。
【０４８２】
配列依存的鎖置換の速度論を実証するため、前記と同様に、Ａ１：Ｂ１鎖のバリアント１をＣ１−プライマー１複合体（配列番号５および配列番号１１からなる）と接触させ、まず５０℃（１〜５サイクル）に加熱し、次いで６５℃（６サイクル以上）で加熱した。FAMレポーターの経時シグナルを図２８に示す。FAMレポーターの蛍光は、１〜５サイクル（５０℃）ではほぼ一定レベルに保たれているものの、次の６サイクル目の測定（６５℃）からFAMレポーターの蛍光が急激に増加していることが分かる。その後の１０サイクル（６〜１６サイクル）では、FAMレポーターのシグナル強度は約９０％の最大可能蛍光強度に達する。シグナル強度の増加は、Ａ１鎖からＢ１鎖が分離したことを示唆する。Ａ１：Ｂ１二本鎖の分離までの半減期を測定結果から算出したところ、約４０〜５０秒であった。一方、Ａ１：Ｂ１鎖のバリアント２と、同じＣ１：プライマー１複合体（配列番号５および配列番号１１からなる）とを使用した場合、FAMレポーターの蛍光の増加は、バリアント１を使用した場合よりも有意に速かった（図２９、矢印３）。このバッチにおいて所定の反応条件下でのＡ１：Ｂ１二本鎖の分離までの半減期を算出したところ、１０秒未満であった。
【０４８３】
Ａ１：Ｂ１二本鎖のバリアント１とバリアント２の差異としては、まず、Ｃ１オリゴヌクレオチドと最初に接触するＡ１鎖の５’オーバーハングの長さが挙げられる。バリアント１のＢ１鎖はバリアント２のＢ１鎖よりも長いことから、バリアント１の５’オーバーハングは６ヌクレオチド長となり、バリアント２の５’オーバーハングは９ヌクレオチド長となる。Ｃ１オリゴヌクレオチドの対応するセグメントの相補的な塩基組成による結合は、６ヌクレオチド長のオーバーハングに対する結合よりも、９ヌクレオチド長のオーバーハングに対する結合の方がある程度安定であると考えられる。
【０４８４】
Ａ１：Ｂ１二本鎖のバリアント１とバリアント２の間での蛍光の増加速度を比較したところ、Ａ１鎖の５’オーバーハングの長さが関与しており、したがって、反応中に形成されるＡ１鎖のオーバーハングとＣ１オリゴヌクレオチドからなる中間複合体の安定性が関与することが分かった。同じパラメータで反応を行った場合、Ａ１鎖のオーバーハングとＣ１オリゴヌクレオチドからなる複合体が安定しているほど、より効果的またはより速い鎖置換が起こる。Ａ１鎖のオーバーハングとＣ１オリゴヌクレオチドの第１の領域からなるこの中間複合体は、Ｃ１オリゴヌクレオチドを、Ａ１：Ｂ１オリゴヌクレオチドの対応する二本鎖末端に空間的に十分に近接させることができ、これによって鎖置換が起こる。本実施例のバッチでは、Ｃ１オリゴヌクレオチドとＡ１鎖の５’オーバーハングの結合によって複合体が形成され、バリアント１を使用した場合とバリアント２を使用した場合のいずれでも、複合体化したＣ１オリゴヌクレオチドは、ほぼ同程度の距離でＡ１：Ｂ１二本鎖の末端に空間的に近接した。しかし、鎖置換の速度に差が見られたことから、同じ空間的近さでも、中間複合体の結合の安定性が高いほど、鎖置換反応の効率が増加しうることが示された。これによって、平衡はより速くにシフトしうる。
【０４８５】
以下の実施例において、指数関数的な増幅の実施形態をそれぞれ示す。これらの実施例は、指数関数的な増幅の各要素の機能を説明することを目的として示したものであり、本発明をなんら限定するものではない。以下の方法は等温条件で実施される。
【０４８６】
指数関数的な増幅において、ポリメラーゼ依存的核酸合成は、核酸依存的鎖置換と同時に進行させる。反応バッチは、ポリメラーゼと、基質としてのdNTPを含む。Ｃ１オリゴヌクレオチドの代わりに、ポリメラーゼ活性を局所的にブロックするヌクレオチド修飾を含むアクチベーターオリゴヌクレオチドを使用するが、このヌクレオチド修飾が含まれていることによって、増幅中にアクチベーターオリゴヌクレオチドが鋳型として作用することが阻止される。各増幅反応において２種のプライマー、すなわち第１のプライマーオリゴヌクレオチドと第２のプライマーオリゴヌクレオチドを使用する。第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、アクチベーターオリゴヌクレオチドに特異的に結合することができるポリヌクレオチドテールを含み、これによって、増幅対象の核酸の二本鎖末端に空間的に近接することができ、第２のプライマーの伸長産物の鎖置換を行うことができる。第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントに結合することができ、これによって、第２のプライマーの伸長産物の合成が開始される。
【０４８７】
実施例２：
本実施例は、等温条件下における人工のDNA断片の指数関数的増幅を実証する。この増幅において、新たに合成された鎖は、相補的パートナー鎖を合成するための鋳型として機能する。この合成は、特異的な鋳型の存在に依存して起こる。増幅対象の核酸は、使用した鋳型の最初の量の約１０９倍に増幅される。
【０４８８】
出発物質：
鋳型：
増幅対象の核酸の一部として、一本鎖DNAの鋳型を使用した。鋳型001（配列番号１２）の配列を無作為に選択し、いわゆるヘアピン構造の形成を阻止するため、自己を鋳型として二本鎖を形成するような極端に長い（６塩基を超える）配列が含まれていないことを確認した。このDNA配列は、製造会社によって人工的に合成されたものであった。また、このDNA配列は、ヌクレオチド修飾を含んでいない。この鋳型鎖の３’末端は遊離の状態であり、３’末端のブロックは行わなかった。この鋳型は、増幅対象の一本鎖核酸の一例として機能するものである。
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【０４８９】
一方の鎖として鋳型001を含む二本鎖DNAにおいて測定された融解温度は、７７℃である（溶液１中で測定したＴｍ）。
【０４９０】
プライマー１（第１のプライマーオリゴヌクレオチド）
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第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド（角括弧（［］）内に示す）とDNAヌクレオチド（３’セグメントおよび場合に応じて５’セグメント）を含み、３’末端ヌクレオチドの３’−ＯＨ基はブロックされていなかった。このオリゴヌクレオチドは、TAMRA色素で修飾されたｄＴヌクレオチド（配列においてＴ＊で示す）を１１番目に有する。
【０４９１】
プライマー２（第２のプライマーオリゴヌクレオチド）
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このプライマーは、第２鎖の合成を開始するために必要である。９番目〜２７番目のヌクレオチド配列は鋳型001と同一である。
【０４９２】
アクチベーターオリゴヌクレオチド001-01
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このアクチベーターオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド（角括弧（［］）内に示す）と、（３’末端セグメントに）DNAヌクレオチドを含む。３’末端ヌクレオチドの３’−ＯＨ基は、リン酸残基（配列中にＸで示す）でブロックした。このオリゴヌクレオチドは、製造会社によって化学的に合成されたものであった。第１のプライマーの伸長産物に相補的に結合することができる配列を下線で示す。相補的な核酸塩基がこのように連続的に並んでいることによって、鎖置換が可能となる。各ヌクレオチドおよび各修飾ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で互いに連結されている。
【０４９３】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは以下の３つの領域を含む。
第１の領域＝３５番目〜５０番目
第２の領域＝２８番目〜３４番目
第３の領域＝１番目〜２７番目
【０４９４】
以下の成分を使用して反応混合物を調製した。
・鋳型001：                               2fmol/l
・アクチベーターオリゴヌクレオチド001-01：10μmol/l
・プライマー001-01：                       10μmol/l
・プライマー001-02：                       10μmol/l
以下のさらなる反応成分を増幅反応溶液２として使用した。
・グルタミン酸カリウム、50mmol/l、pH8.0
・酢酸マグネシウム、10mmol/l
・dNTP（dATP、dCTP、dTTP、dGTP）、各200μmol/l
・ポリメラーゼ（Bst 2.0 WarmStart、120,000U/ml、NEB）、12U/10μl
・TritonX-100、0.1%(v/v)
・EDTA、0.1mmol/l
・TPAC（テトラプロピルアンモニウムクロリド）、50mmol/l、pH8.0
・EvaGreen色素（この色素はメーカーの説明書に従い1:50に希釈して使用した）
【０４９５】
反応の開始および反応条件
反応混合物の調製は室温で行った。鋳型は最後に反応バッチに添加した。コントロールバッチには鋳型を加えなかった。
【０４９６】
このようにして調製した各反応混合物を、蛍光検出機能を備えた恒温装置中の適切な反応容器（マイクロウェルプレート）に移した。恒温装置として、リアルタイムPCR装置（「StepOne Plus」、StepOneソフトウェアv2.1、ABI、サーモフィッシャー）を使用した。反応混合物を６５℃に加熱することによって反応を開始した。
【０４９７】
増幅工程全体（４０分間）を通して反応温度を一定（６５℃）に保った（等温増幅）。次に反応混合物を９５℃で１０分間加熱した。反応中、EvaGreen色素の蛍光シグナル強度を記録した。測定間の時間間隔は１分間とした。
【０４９８】
評価：
予想されるプライマー伸長産物：
鋳型001を元に第１のプライマーを伸長した後に得られることが予想される第１のプライマーの伸長産物001-01（配列番号１６）を以下に示す。
2019530472.tif 000013
第１のプライマーオリゴヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅで修飾した領域を下線で示す。下線を引いていない領域は２’−デオキシリボヌクレオチド（DNA）である。
【０４９９】
この第１のプライマーの伸長産物は、３’末端領域において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドと相補的に結合することができ、したがって、第２のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として機能する。
【０５００】
第２のプライマーの伸長産物の合成は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの修飾領域まで行われる。この合成では、修飾領域の直前において、またはいくつかの修飾ヌクレオチドが複製された後にポリメラーゼを停止させることができる。第１のプライマーの伸長産物を鋳型として使用して得られることが予想される第２のプライマーの伸長産物001-02（配列番号１７）を以下に示す。
2019530472.tif 000014
この配列において、第１のプライマーの伸長産物の配列を元に第２のプライマーの伸長産物を最大限に伸長した場合に予想される３’末端側の４個のヌクレオチドを下線で示す。これらのヌクレオチドは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドのいくつかに相補的な残基である。ポリメラーゼによる合成は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの修飾領域の手前、またはいくつかの修飾ヌクレオチドが複製された後に停止することができるため、ポリメラーゼは、反応条件下で前記配列よりも短い鎖を合成する場合があり、この結果、様々なプライマー伸長産物の混合物が生じることがある。したがって、このようなプライマー伸長産物は短いものとなる（プライマー伸長産物の混合物は、たとえば、１番目〜５２番目の残基からなる伸長産物、１番目〜５３番目の残基からなる伸長産物、１番目〜５４番目の残基からなる伸長産物、または１番目〜５５番目の残基からなる伸長産物を含む）。増幅可能な第２のプライマーの伸長産物がいずれも第１のプライマーオリゴヌクレオチドと結合することができ、かつ第１のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として機能する限り、第２のプライマーの伸長産物の合成の終点の正確な位置、すなわち、合成が終了した時点での第２のプライマーの伸長産物の３’末端までの正確な長さは、それほど重要ではない。第２のプライマーの伸長産物がポリメラーゼ依存的に複製されることによって、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントに相補的な配列を含むさらなる第１のプライマーの伸長産物が形成される。
【０５０１】
指数関数的な増幅の結果、相補的二本鎖を形成することができる２種のプライマー伸長産物が形成される。
【０５０２】
最大限に伸長された前記２種のプライマー伸長産物からなる二本鎖の予想される構造を以下に示す。
2019530472.tif 000015
【０５０３】
指数関数的な増幅が起こる過程で、指数関数的な増幅の主産物であるこれらのプライマー伸長産物が蓄積する。したがって、増幅された鎖は、増幅対象の核酸の配列を示す。増幅された鎖は、反応で使用した鋳型の配列も含む。２’−Ｏ−Ｍｅで修飾された領域を下線で示す。下線を引いていない領域は２’−デオキシリボヌクレオチド（DNA）である。
【０５０４】
反応中に形成された二本鎖は、EvaGreen色素に結合することができることから、反応が進むに従ってEvaGreen色素のシグナル強度が上昇する。
【０５０５】
シグナル強度の経過を図３０に示す。矢印１は、鋳型との反応のシグナルの経過を示す。矢印２は、鋳型を使用していない反応の経過を示す。鋳型001を含む反応において、初期のプラトー段階の後、約３０分後から蛍光シグナルの増加が観察された。鋳型001を使用していないコントロール反応では、４０分間の記録時間全体を通してシグナル強度の変化は観察されなかった。基底レベルの蛍光強度の連続的な上昇は、プライマー001-01に蛍光マーカー（１１番目のdT-TMR）が含まれていることによる。
【０５０６】
シグナルの由来を確認するため、両方の反応から得たアリコートをキャピラリー電気泳動（CE）で解析した。第１のプライマーオリゴヌクレオチドは蛍光マーカー（１１番目のdT-TMR）を含んでいたことから、キャピラリー電気泳動（CE）において蛍光シグナルを記録することができた。キャピラリー電気泳動（CE）の結果を図３１に示す。
【０５０７】
図３１（Ａ）において、コントロール反応のキャピラリー電気泳動（CE）の経過を示す。未反応のプライマー001-01に帰属するピークが確認できる。図３１（Ｂ）において、鋳型との反応におけるキャピラリー電気泳動（CE）の経過を示す。未反応のプライマー001-01に相当するピーク（１）と、右方向に約４６０CEユニット分シフトした別のピーク（２）（プライマー001-01よりも長い分子に相当）が確認できる。並行して行ったコントロール実験において、所定のCE条件下では、約１０．２〜１０．３CEユニット長が１ヌクレオチドの配列差に相当することが分かった。したがって、キャピラリー電気泳動（CE）において測定されたピーク（１）とピーク（２）の間の距離から、分離された標識配列間の長さが約４４〜４５ヌクレオチド長であることが分かる。この配列の長さの差は、指数関数的な増幅において予想される第１のプライマーの伸長産物（配列番号２０）の伸長された部分の長さに相当し、この伸長された部分の長さは４５ヌクレオチド長である。
2019530472.tif 000016
【０５０８】
ピーク（２）のシグナルの強度から、最初に使用したプライマー001-01の５０％未満が反応において伸長されたことが分かる。消費されたプライマーのシグナル強度から、増幅産物の濃度は約１μmol/l〜２μmol/lであると推定された。したがって、プライマー001-01の消費量から測定された収率は、約１０〜２０％であった。
【０５０９】
したがって、この指数関数的な増幅では、増幅対象の配列の増幅が鋳型の誘導によって起こり、鋳型001の初期濃度は２fmol/lに相当し、増幅反応産物の濃度は約１〜２μmol/lと推定された。したがって、この結果から算出された増幅率は約５×１０８〜１０９である。この指数関数的な増幅は等温条件下で進行した。
【０５１０】
指数関数的な反応の結果は、鋳型およびアクチベーターオリゴヌクレオチドの存在だけでなく、プライマー１、プライマー２、ポリメラーゼ、dNTPおよび適切な緩衝条件にも左右される。さらに、指数関数的な反応は、反応に関与する各核酸成分、すなわち、アクチベーターオリゴヌクレオチド、プライマー１およびプライマー２の配列組成にも左右される。以下、これらの成分の構造と作用の原理について説明する。
【０５１１】
配列の設計に関する説明
鋳型：
増幅対象の核酸の配列を出発点として、プライマー１、プライマー２およびアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列を設計する。増幅対象のこの核酸は、特異的な増幅の対象となる標的配列を含む。
【０５１２】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドから伸長されることが予想される伸長産物の配列の長さは、４５ヌクレオチド長である。第１のプライマーの伸長産物の全長は６５ヌクレオチド長である。予想される伸長産物の長さは２５〜２９ヌクレオチド長である。第２のプライマーの伸長産物の全長は、（第２のプライマーの伸長産物の合成におけるポリメラーゼターミネーターの位置によれば）５２〜５６ヌクレオチド長である。増幅対象の核酸の相補的二本鎖は、第１のプライマーの伸長産物および第２のプライマーの伸長産物から構成されるため、その全長は５２〜５６ヌクレオチド長である。第１のプライマーの伸長産物は、その５’末端セグメントに、第１のプライマーオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチドテールに相当する一本鎖領域を有する。
【０５１３】
本実施例における増幅対象の核酸の配列の長さは十分に長いため、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物の反応において形成される特異的な二本鎖の融解温度は約７８℃となり、これは、６５℃の反応温度よりも高い。この反応において形成される二本鎖は実質的に安定であり、自然には一本鎖に解離しないと考えられる。
【０５１４】
プライマー１
第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマー領域と第２の領域を含み、第２の領域は、ポリメラーゼによって複製されず、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合することができるポリヌクレオチドテールを含む。
【０５１５】
第１のプライマー領域：
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの１４番目〜２０番目が第１のプライマー領域を構成する。
【０５１６】
プライマー001-01の３’末端側のヌクレオチド（１４番目〜２０番目）は、鋳型に特異的に結合し、プライマー伸長反応を起こす。したがって、この位置の配列は鋳型001（３８番目〜４４番目）に適合する。３’末端のこの７個のヌクレオチドはDNAヌクレオチドであり、ホスホジエステル化合物によって連結されている。このセグメントは、第１鎖の合成においてポリメラーゼによるプライマーの伸長を開始し、ポリメラーゼによる第２鎖の合成の鋳型として機能することによって、このセグメントに対応する相補鎖を形成することができる。
【０５１７】
第２のプライマー領域：
５’末端側の第２の領域（１番目〜１３番目）は、第１のプライマー領域に付加されている。第２の領域の構造は、特に、ポリメラーゼによるポリヌクレオチドテールの複製によって第２鎖が合成されることを阻止することができる。さらに、第２の領域の構造は、アクチベーターオリゴヌクレオチドに結合して、鎖置換を補助することができる。これらの理由から５’−３’ホスホジエステル結合で互いに連結された２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを主に使用した（４番目〜１０番目および１２番目〜１３番目）。この２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、ポリメラーゼによるポリヌクレオチドテールの複製を阻害することができる修飾の一例である。
【０５１８】
プライマー001-01の５’末端側ヌクレオチド（１番目〜９番目）の配列は、無作為に選択し、この際、広範な自己相補型セグメントが存在しないこと、増幅対象の鋳型に相補的な結合部位を持たないこと、および隣接した複数のＧヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、Ｇ四重鎖が形成されないことに注意を払った。１０番目〜１３番目は鋳型001に相補的であり、特に、第１の領域と鋳型の結合を補助することができる。
【０５１９】
１番目〜９番目の配列はポリヌクレオチドテールとして機能し、反応中にアクチベーターオリゴヌクレオチドと結合することができ、これによって、アクチベーターオリゴヌクレオチドを二本鎖末端に空間的に近接させて、鎖置換を行うことができる。１〜３番目はDNAヌクレオチドで構成され、４〜９番目は２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドである。各ヌクレオチドまたは各修飾ヌクレオチドは、互いにホスホジエステル結合で連結されている。
【０５２０】
本実施例において、ポリヌクレオチドテールを有する第２の領域と第１のプライマー領域の間の移行部は滑らかであり、第２の領域は、ホスホジエステル結合によって第１の領域に直接連結されている。このような構成であると、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる二本鎖末端の鎖置換の開始に有利である。第１の領域と第２の領域は同じ方向、すなわち、５’末端から３’末端の方向に整列している。ポリヌクレオチドテールを有する第２の領域は５’末端セグメントに位置し、第１のプライマー領域は３’末端セグメントに位置する。
【０５２１】
第２の相補鎖の合成中、ポリメラーゼは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの１３番目において、ポリメラーゼの合成の進行をブロックまたは抑制する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドに遭遇する。（２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドが鋳型鎖に挿入されている場合において）１個の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドに遭遇したとしても、ポリメラーゼによる合成が必ずしも完全にブロックされるわけではないが、これ以降の合成は難しくなるか、あるいは減速する。複数の修飾ヌクレオチドが連続して結合されていることから、ポリメラーゼの合成能を抑制することができ、以降のポリヌクレオチドテールは複製されない。第２の領域（ポリヌクレオチドテール）において複製されていないヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドが十分に残されており、反応条件下でアクチベーターオリゴヌクレオチドに結合して鎖置換を成功裏に開始することができるのであれば、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域において１個の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが複製された後にポリメラーゼが完全に阻害されるのか、あるいは、複数個の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが複製された後にポリメラーゼが完全に阻害されるのかということは二次的な重要性しかない。
【０５２２】
説明のための一例として、ポリメラーゼは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの１０番目までを含むように複製することができるが、これに限定されない。すなわち、第１のプライマー領域に隣接する第２の領域のセグメントは、ポリメラーゼによって部分的に複製される。したがって、図面では、第２の領域の４番目までのヌクレオチドがポリメラーゼによって複製されると考えられる。第２の領域の残りの位置のヌクレオチドは複製されず、アクチベーターオリゴヌクレオチドに特異的に結合することができる。
【０５２３】
プライマー２：
プライマー２は第２鎖の合成の開始に必要である。９番目〜２７番目のヌクレオチド配列は鋳型001と同一である。増幅の開始時において、これらの位置のヌクレオチドは、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントに相補的に結合し、これによって、第２鎖の合成が開始される。プライマー２は、通常の５’−３’ホスホジエステル結合で互いに連結されたDNAヌクレオチドからなる。本実施例において、第２のプライマーの５’末端セグメントは、増幅の開始時にオーバーハング（１番目〜８番目）を形成しているが、このオーバーハングは、ポリメラーゼによって複製することができる。反応過程において、増幅対象の核酸鎖は、第２のプライマーの５’オーバーハングによって伸長される。
【０５２４】
プライマー２は、第１のプライマーの伸長産物を鋳型として使用するため、第１のプライマーの伸長産物の複製可能な部分はポリメラーゼによって複製される。その結果、第２のプライマーは伸長され、第１のプライマーの伸長産物の複製可能なセグメントにおいて二本鎖が形成される。しかしながら、第１のプライマーの第２の領域のポリヌクレオチドテールは複製されない。第２のプライマーの伸長産物は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドに相補的に結合可能な配列を３’末端セグメントに含む。
【０５２５】
アクチベーターオリゴヌクレオチド：
第１の領域：
第１の領域（３５番目〜５０番目）は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域（１番目〜１３番目）に相補的な配列（３５番目〜４７番目）を含む。３’末端の３個のヌクレオチドが３’オーバーハングを形成し、本発明の実施例では、特別な機能を有していない。本実施例における第１の領域は、通常の５’−３’ホスホジエステル結合によって連結された２’−デオキシリボヌクレオチドからなる。３’末端のＯＨ基はリン酸残基によってブロックされており、したがって、ポリメラーゼによって伸長することができない。
【０５２６】
第２の領域：
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域（１４番目〜２０番目）に相補的な配列（２８番目〜３４番目）を含む。アクチベーターオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントにある第２の領域は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド（２８番目〜３２番目）を含む。３４番目と３５番目は、２’−デオキシリボヌクレオチドで構成されている。各ヌクレオチドまたは各修飾ヌクレオチドは、通常の５’−３’ホスホジエステル結合で互いに連結されている。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は、通常の５’−３’ホスホジエステル結合で互いに滑らかに連結されている。
【０５２７】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域と第２の領域の配列の長さおよびその特性は、反応条件下において第１のプライマーオリゴヌクレオチドがアクチベーターオリゴヌクレオチドに可逆的に結合することができるように、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの相補的領域に適合している。したがって、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドにおいて、遊離状態の一本鎖形態と、結合状態の二本鎖形態の間で平衡が成り立つ。
【０５２８】
第３の領域：
アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域は、増幅中にポリメラーゼによって合成されると予想される第１のプライマーの伸長産物（２１番目〜３９番目）のセグメントに相補的な配列（９番目〜２７番目）を含む。第３の領域は、その全長にわたって２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド（１番目〜２７番目）からなる。各修飾ヌクレオチドは、通常の５’−３’ホスホジエステル結合で互いに連結されている。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域と第３の領域は、通常の５’−３’ホスホジエステル結合で互いに滑らかに連結されている。５’末端の８個の修飾ヌクレオチド残基は、第１のプライマーの伸長産物に非相補的な５’オーバーハングを形成している。
【０５２９】
アクチベーターオリゴヌクレオチドの９番目〜４７番目の配列は、第１のプライマーの伸長産物の一部（１番目〜３９番目）と相補的二本鎖を形成することができるように構成されている。アクチベーターオリゴヌクレオチドの１番目〜９番目および４８番目〜５０番目は、第１のプライマーの伸長産物との二本鎖の形成に関与しない。これと同時に、アクチベーターオリゴヌクレオチドの２８番目〜４７番目の配列は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドと相補的二本鎖を形成することができるように構成されている。したがって、第１のプライマーの３’末端は、アクチベーターオリゴヌクレオチドに相補的に結合することができる。ポリメラーゼによって第１のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端が伸長されないように、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの合成作用を阻止するヌクレオチド修飾を含んでいる。本実施例において、ポリメラーゼの合成作用を阻止するヌクレオチド修飾は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド修飾である。本実施例において、アクチベーターオリゴヌクレオチドの１番目〜３２番目は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドからなる。したがって、正確なハイブリダイゼーションが行われた場合、第１のプライマーの３’末端は、ヌクレオチド修飾を含む配列セグメントに結合する。アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドの間の相互作用がこのように構成されているため、アクチベーターオリゴヌクレオチドに相補的に結合した第１のプライマーオリゴヌクレオチドの望ましくない伸長を阻止することができる。アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域は修飾が付加されていることから、ポリメラーゼによる非特異的な伸長が起こる可能性を予防的に大幅に低減することもできる。鎖置換を促進するために、第１のプライマーの伸長産物の配列内の結合パートナーに相補的な配列を、アクチベーターオリゴヌクレオチドの各セグメントにおいて使用している。配列のミスマッチや、核酸塩基を持たない修飾（たとえばC3リンカーやC18リンカー）による核酸鎖の乱れが存在すると、鎖置換の効率および／またはその速度が低下することがあるため、このような構造バリアントは本実施例において使用しなかった。
【０５３０】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、反応条件下において、第１のプライマーの伸長産物のポリヌクレオチドテールとの結合を介して、増幅対象の核酸の二本鎖と接触する。本実施例において、反応条件下の結合は可逆的であることが好ましい。したがって、反応の初期では、第１のプライマーの伸長産物と鋳型001からなる二本鎖が形成され、反応の後期では、第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物からなる二本鎖が形成される。
【０５３１】
アクチベーターオリゴヌクレオチドは、十分な収率でプライマー伸長産物同士を分離させる鎖置換を実施するのに十分な特性および長さを有する。プライマー伸長産物同士が十分に分離されることによって、プライマー結合部位を有する配列部分を持つ各プライマー伸長産物の配列セグメントが、それぞれに対応する相補的プライマーオリゴヌクレオチドに確実に結合することができる。本実施例において、アクチベーターオリゴヌクレオチドの長さは５０ヌクレオチド長であり（デオキシリボヌクレオチドと修飾ヌクレオチドからなり）、このうちの３９残基は第１のプライマーの伸長産物に相補的に結合することができる。したがって、アクチベーターオリゴヌクレオチドは、反応条件下での鎖置換を介して、反応の初期において鋳型001を少なくとも部分的に引き剥がすことができ、反応の後期では、第１のプライマーの伸長産物に結合している第２のプライマーの伸長産物を引き剥がすことができる。
【０５３２】
したがって、鋳型001および第２のプライマーの伸長産物はそれぞれ、完全または部分的に一本鎖の形態になり、この結果、第１のプライマーオリゴヌクレオチドが相補的配列セグメントに新たに結合することができ、ポリメラーゼによって伸長することが可能となる。本実施例では、第３の領域は、第１のプライマーの伸長産物の５’末端側のセグメントにのみ結合することができる。本実施例では、この相補的セグメントの長さは１９ヌクレオチド長である。
【０５３３】
第１のプライマーの伸長産物の３’末端側の配列部分は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと結合しなかった。第１のプライマーの伸長産物の３’末端側セグメントは一本鎖の形態であり、第２のプライマーオリゴヌクレオチドと結合して、プライマー伸長反応を起こすことができる。この反応において、別の第２のプライマーオリゴヌクレオチドを第１のプライマーの伸長断片に結合させるためには、第１のプライマーの伸長産物の３’末端側のセグメントを一本鎖の形態に変換し、鋳型または第２のプライマーの伸長産物との結合から分離する必要がある。本実施例では、反応条件下の等温反応において、合成された第１のプライマーの伸長産物および合成された第２のプライマーの伸長産物をそれぞれ分離することによってこれを達成している。アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換反応において、第１のプライマーの伸長産物、アクチベーターオリゴヌクレオチドおよび第２のプライマーの伸長産物からなる、鎖置換反応の中間産物が形成される。この中間産物中において、第２のプライマーの伸長産物は、第１のプライマーの伸長産物の３’末端側のセグメントに相補的に結合している。しかし、この二本鎖の安定性は、完全に結合した第２のプライマーの伸長産物と比較して大幅に低い。反応条件下では、この二本鎖は自然に分離し（第１のプライマーの伸長産物と第２のプライマーの伸長産物の解離）、第２のプライマーの伸長産物が第１のプライマーの伸長産物から完全に分離する。第２のプライマーの伸長産物から分離した直後の第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントは一本鎖の形態をとる。
【０５３４】
第１のプライマーの伸長産物の３’末端の一本鎖セグメントは、鋳型と第２のプライマーの伸長産物の両方に接触することができ、第２のプライマーオリゴヌクレオチドに結合することができる。使用する第２のプライマーオリゴヌクレオチドがモル過剰量で存在するため、第２のプライマーオリゴヌクレオチドと接触する可能性の方がかなり高くなる。特に、これは反応の初期において顕著であり、本実施例では鋳型を１fmol/lの濃度で使用して反応を開始する。指数関数的な増幅の１回目の複製サイクルでは、合成された第２のプライマーの伸長産物の濃度は、長時間にわたって１μmol/lを下回る大幅に低い濃度のままである。これに対して、第２のプライマーオリゴヌクレオチドは10μmol/lの濃度で使用される。したがって、特に指数関数的な増幅の初期において、鋳型や合成された第２のプライマーの伸長産物と比べて第２のプライマーオリゴヌクレオチドが１０１０倍の過剰量となる。増幅の後期では、高濃度で存在する第２のプライマーの伸長産物が、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントに対する結合において競合し、反応を減速させることができる。
【０５３５】
実施例３：
増幅反応の特異性の検証
本実施例では、鋳型配列の変更が増幅に及ぼす影響を調査した。鋳型の中央の領域から３個のヌクレオチドを欠失させた。プライマーの結合に必須の末端領域は実施例２と同じ設計とした。第１のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長すると、鋳型の配列に相補的な相補鎖が形成され、したがって、この相補鎖の配列中にも前記欠失が含まれる。このようにして、形成された第１のプライマーの伸長産物とアクチベーターオリゴヌクレオチドの間でのこのようなミスマッチが増幅に及ぼす影響を検証した。これらの配列の設計は実施例２に記載した通りに行った。
【０５３６】
以下の鋳型を使用した。
・アクチベーターオリゴヌクレオチドと完全にマッチする第１のプライマーの伸長産物を形成する配列組成を有する鋳型（配列番号２１）：
2019530472.tif 000017
・アクチベーターオリゴヌクレオチドとミスマッチを有する第１のプライマーの伸長産物を形成する配列組成を有する鋳型（配列番号２２）：
2019530472.tif 000018
【０５３７】
これらの鋳型において、各プライマー結合部位は同一であり、プライマーオリゴヌクレオチドによる第１のプライマーの伸長反応を開始できると予想される。
【０５３８】
これらの鋳型は１箇所のみで異なる。
2019530472.tif 000019
【０５３９】
したがって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドおよび第２のプライマーオリゴヌクレオチドの各プライマー伸長産物においても相違する位置が出てくると予想される。また、この相違する残基は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の５’末端セグメントに位置する。
【０５４０】
以下のプライマーを使用した。
・第１のプライマーオリゴヌクレオチド（配列番号２３）：
2019530472.tif 000020
・第２のプライマーオリゴヌクレオチド（配列番号２４）：
2019530472.tif 000021
【０５４１】
以下のアクチベーターオリゴヌクレオチド002-01（配列番号２５）を使用した。
2019530472.tif 000022
【０５４２】
各ヌクレオチドまたは各修飾ヌクレオチドは、互いにホスホジエステル結合で連結されている。ポリメラーゼによる伸長を阻止するため、３’末端はリン酸基でブロックされている。
【０５４３】
完全にマッチした配列組成を有する鋳型は、１nmol/l、１pmol/lおよび１fmol/lの濃度で使用した。
【０５４４】
ミスマッチを有する配列組成の鋳型は、１nmol/lの濃度で使用した。
【０５４５】
コントロール反応では、鋳型を使用しなかった。その他の反応条件は実施例２と同様とした。反応の結果を図３２に示す。
【０５４６】
完全にマッチした鋳型（配列番号２１）を使用した場合、プライマー伸長産物の相補鎖が合成される。この伸長産物は、完全にマッチした鋳型および使用したアクチベーターオリゴヌクレオチドの両方に相補的である。このような構成については、実施例２において詳細に述べている。このような構成の使用は、増幅を成功させるための基礎となる。
【０５４７】
これに対して、第１のプライマーの伸長産物の合成においてミスマッチ配列（配列番号２２）を使用した場合、伸長産物の相補鎖は形成されるものの、ミスマッチを有する鋳型に完全に相補的であることから、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域には相補的でなくなる。このような部分的に非相補的な配列は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと反応して鎖置換を進行させることができる部位である、第１のプライマーの伸長産物の５’末端側セグメントにおいて見られる。本実施例で示したように、アクチベーターオリゴヌクレオチドに対応する部位において３個のヌクレオチドが欠失していることから、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換が妨害される。
【０５４８】
図３２は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の間での配列の差異が及ぼす影響を示す。ミスマッチを有する鋳型を元に合成されたプライマー伸長産物の配列とアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列との間で３つの残基位置に差異があったことから、アクチベーターオリゴヌクレオチドと鋳型または第１のプライマーの伸長産物との間における相補塩基の順序のマッチングの程度に増幅が依存することが示された。伸長産物の前記領域から３個の塩基を欠失しただけで、増幅量が抑制され、本実施例では、ネガティブコントロールよりも低くなった。
【０５４９】
完全にマッチした鋳型を使用したコントロール反応（矢印１〜３）から、増幅が濃度依存性に進行することが示された。濃度を低下させた反応では、ベースラインレベルを超えるシグナルが得られる十分な量にまで増幅対象の核酸を合成するのにより長い時間を要した。
【０５５０】
鋳型を使用しなかったネガティブコントロール反応でも、シグナルの増加が示されたが、シグナルが増加するまでの時間は、完全にマッチした鋳型を使用した反応と比べて有意に遅延した。
【０５５１】
図３２の矢印はそれぞれ以下を示す。
・１nmol/lの濃度の完全にマッチした鋳型（配列番号２１）（矢印１）
・１pmol/lの濃度の完全にマッチした鋳型（配列番号２１）（矢印２）
・１fmol/lの濃度の完全にマッチした鋳型（配列番号２１）（矢印３）
・ネガティブコントロール：鋳型なしの反応（矢印４）
（２つのコントロール反応を示し、いずれも鋳型を使用せずに行った）
・１nmol/lの濃度の、ミスマッチを有する鋳型（配列番号２２）（矢印５）
【０５５２】
この結果から、アクチベーターオリゴヌクレオチドの塩基組成が重要であることが示された。すなわち、アクチベーターオリゴヌクレオチドとプライマー伸長産物との間において相補性が部分的に失われると、増幅速度が低下したり、さらには増幅が阻害されうる。
【０５５３】
本実施例において、完全にマッチした鋳型とミスマッチを有する鋳型の間で末端の配列が同じ場合、プライマーオリゴヌクレオチドはいずれの鋳型にも同等に結合することができるが、これらの鋳型による反応は全く異なることが示された。アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の５’末端セグメントとの間で完全な相補性がある場合、増幅は計画したように進行した。一方、配列差異（本実施例の場合、第１のプライマーの伸長産物の５’末端セグメントにおいて３個のヌクレオチドが欠失している）によって鎖置換が阻害され、この結果、増幅が大幅に抑制された。
【０５５４】
実施例４：
別の適切なアクチベーターオリゴヌクレオチドと別の鋳型配列の使用
まず、プライマー１結合部位とプライマー２結合部位の間にレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）のMIP遺伝子配列を含む、４９ヌクレオチド長の人工配列（配列番号２６）（鋳型003-01）を合成した（ユーロフィン）。コントロールとして、アクチベーターオリゴヌクレオチドとミスマッチ（５個のヌクレオチド）を有する第１のプライマーの伸長産物を生じる配列組成を有する鋳型003-02（配列番号２７）を合成した（ユーロフィン）。この新たな鋳型003を増幅するため、２種のプライマー（プライマー１、すなわち第１のプライマーオリゴヌクレオチド（実施例２の配列番号１３と同一）と、プライマー２、すなわち第２のプライマーオリゴヌクレオチド（配列番号２８））、および鋳型003-01に適したアクチベーターオリゴヌクレオチド（配列番号２９）を作製した。これらの配列の設計は実施例２と同様に行った。
【０５５５】
以下の鋳型を使用した。
・アクチベーターオリゴヌクレオチドと完全にマッチする第１のプライマーの伸長産物を形成する配列組成を有する鋳型003-01（配列番号２６）：
2019530472.tif 000023
Ｌ．ニューモフィラのMIP遺伝子の配列セグメントを下線で示す。この鋳型はDNAヌクレオチドからなる。
・アクチベーターオリゴヌクレオチドとミスマッチを有する第１のプライマーの伸長産物を形成する配列組成を有する鋳型（配列番号２７）：
2019530472.tif 000024
Ｌ．ニューモフィラのMIP遺伝子の配列セグメントを下線で示す（このセグメントは配列番号２６よりも５ヌクレオチド短い）。この鋳型はDNAヌクレオチドからなる。
【０５５６】
これらの鋳型において、各プライマー結合部位は同一であり、各プライマーオリゴヌクレオチドによる第１のプライマーの伸長反応を開始できると予想することができる。
2019530472.tif 000025
【０５５７】
これらの鋳型は一箇所のみが異なる。
2019530472.tif 000026
【０５５８】
この相違する位置は、第１のプライマーの伸長産物の合成において、ポリメラーゼによって合成される領域内にある。また、この相違する残基は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の５’末端セグメントに位置する。したがって、第１のプライマーオリゴヌクレオチドおよび第２のプライマーオリゴヌクレオチドの各プライマー伸長産物においても相違する位置が出てくると予想される。
【０５５９】
以下のプライマーを使用した。
第１のプライマーオリゴヌクレオチド（配列番号１３）は、実施例２のプライマー１と同一のものである。
プライマー１
プライマー001-01（２０ヌクレオチド長）：
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
2019530472.tif 000027
２’−Ｏ−Ｍｅで修飾された領域を下線で示す。下線を引いていない領域は２’−デオキシリボヌクレオチド（DNA）である。
・第２のプライマーオリゴヌクレオチド（配列番号２８）：
2019530472.tif 000028
【０５６０】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドおよび第２のプライマーオリゴヌクレオチドは、両方の鋳型（配列番号２６および配列番号２７）の各プライマー結合部位に結合することができる。
【０５６１】
以下のアクチベーターオリゴヌクレオチド003（配列番号２９）を使用した。
2019530472.tif 000029
３’末端側のセグメントの配列はDNAヌクレオチドからなる。
Ａ＝２’−デオキシアデノシン
Ｃ＝２’−デオキシシトシン
Ｇ＝２’−デオキシグアノシン
Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０５６２】
角括弧（［］）内に示した配列（９番目〜５８番目）は、ホスホジエステル結合で連結された２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドで構成されており、それぞれ、２’−ＯＭｅ Ａ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）、２’−ＯＭｅ Ｃ（２’−Ｏ−メチルシトシン）、２’−ＯＭｅ Ｇ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）および２’−ＯＭｅ Ｕ（２’−Ｏ−メチルウリジン）を示す。
【０５６３】
５’末端側のヌクレオチド間（１番目〜８番目）は、ホスホロチオエート結合（PTO）によって連結されており、ホスホロチオエート結合の位置をアスタリスク（＊）で示す。
【０５６４】
Ｘは、ポリメラーゼによる伸長をブロックするための３’末端リン酸基を示す。
【０５６５】
ポリメラーゼによる伸長を阻止するため、３’末端はリン酸基でブロックされている。
【０５６６】
反応開始時の鋳型（完全にマッチした鋳型およびミスマッチを有する鋳型）の濃度は10pmol/lであった。別のコントロール反応では鋳型を使用しなかった。反応は６５℃で６０分間行った。その他の反応条件は実施例１と同様とした。
【０５６７】
結果
反応の経過を図３３に示す。完全にマッチした鋳型を使用した反応では、３５分後に蛍光シグナルの増加が観察される（矢印１）。ミスマッチを有する鋳型を使用した反応およびネガティブコントロールを使用した反応でもシグナルは検出されたが、シグナルの発生は有意に遅延した（それぞれ約４５分後または約５０分後）。
【０５６８】
評価：
図３３に示したシグナルの増加は、完全にマッチした鋳型003-01の存在と相関する。５個のヌクレオチドが欠失しているものの、同じプライマー結合部位および有意に類似したプライマー結合部位間セグメントを有する非常に類似した配列では、増幅の経過が異なり、ネガティブコントロールの範囲内に含まれた。
【０５６９】
この差は以下の状況に起因する。完全にマッチした鋳型（配列番号２６）を使用した場合、プライマー伸長産物の相補鎖が合成される。この伸長産物は、完全にマッチした鋳型および使用したアクチベーターオリゴヌクレオチド（配列番号２９）の対応する部位の両方に相補的である。このような構成については、実施例１において詳細に述べている。このような構成の使用は、増幅を成功させるための基礎となる。
【０５７０】
以下では、各配列を比較し、反応において適切な反応パートナーと相補的二本鎖を形成する各セグメントを明示した。
鋳型
2019530472.tif 000030
プライマー１およびプライマー２：
2019530472.tif 000031
（下線で示した第２のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントは、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントに相補的に結合することができるが、この第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントは、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域に非相補的である。）
アクチベーターオリゴヌクレオチド
2019530472.tif 000032
（鋳型003-01（配列番号１４）を元に伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に完全にマッチする、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の位置を下線で示す。）
2019530472.tif 000033
（鋳型003-01（配列番号１４）を元に伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に完全にマッチする、アクチベーターオリゴヌクレオチドの位置を下線で示す。）第１のプライマーオリゴヌクレオチドのプライマー伸長産物は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドとその伸長産物からなるため、このアクチベーターオリゴヌクレオチド断片は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物と相互作用する断片よりも長くなっている。
【０５７１】
（完全にマッチした鋳型003-01から合成された）第１のプライマーの伸長産物と、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域および第３の領域からなるセグメントとの間において完全な相補性があることが分かる。このような構成であることから、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーの伸長産物との間で新たな二本鎖が形成され、これによって、鋳型鎖の鎖置換が十分に進行することができ、あるいは、第２のプライマーの伸長産物を形成することができる。この結果、増幅を達成することができる。
【０５７２】
これに対して、第１のプライマーの伸長産物の合成においてミスマッチ配列（配列番号１５）を使用した場合、伸長産物の相補鎖は形成されるものの、ミスマッチを有する鋳型に完全に相補的であることから、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域に部分的に相補的ではなくなる。このような部分的に非相補的な配列は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと反応して鎖置換を進行させることができる部位である、第１のプライマーの伸長産物の５’末端側セグメントにおいて見られる。本実施例で示したように、アクチベーターオリゴヌクレオチドに対応する部位において５個のヌクレオチドが欠失していることから、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換が妨害され、その結果、増幅が阻害される。
2019530472.tif 000034
（鋳型003-02（配列番号２６）を元に伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に完全にマッチする、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域の位置を下線で示す。）
2019530472.tif 000035
（鋳型003-01（配列番号２７）を元に伸長された第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物に完全にマッチする、アクチベーターオリゴヌクレオチドの位置を下線で示す。）
【０５７３】
ミスマッチを有する鋳型を元に形成された第１のプライマーの伸長産物と、アクチベーターオリゴヌクレオチド003との間では、相補的二本鎖の結合が阻害されると予想される。この阻害は、鋳型003-02（配列番号２７）を元に伸長されたプライマー伸長産物の、鋳型003-02の欠失セグメントに相当する部位において起こる。この欠失部位に相当するプライマー伸長産物の部位は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域と第３の領域の間に相当する。
【０５７４】
アクチベーターオリゴヌクレオチド003（配列番号２９）との二本鎖形成の相補性において、完全にマッチした鋳型003-01を元に伸長された第１のプライマーの伸長産物と、ミスマッチを有する鋳型003-02を元に伸長された第１のプライマーの伸長産物との間で差が生じることが予想されることから、鎖置換反応においても差が生じると考えられ、ひいては増幅が阻害されると考えられる。
【０５７５】
この結果から、アクチベーターオリゴヌクレオチドの塩基組成が重要であることが示された。すなわち、アクチベーターオリゴヌクレオチドとプライマー伸長産物との間において相補性が部分的に失われると、増幅が阻害されうる。
【０５７６】
本実施例において、完全にマッチした鋳型とミスマッチを有する鋳型の間で末端の配列が同じ場合、プライマーオリゴヌクレオチドはいずれの鋳型にも同等に結合することができるが、これらの鋳型による反応は全く異なることが示された。アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の５’末端セグメントとの間で完全な相補性がある場合、増幅は計画したように進行した。一方、前述したように、配列差異（本実施例の場合、第１のプライマーの伸長産物の５’末端セグメントにおいて５個のヌクレオチドが欠失している）によって鎖置換が阻害され、この結果、増幅が抑制された。
【０５７７】
実施例５：
本実施例では、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの別の構造バリアントを使用して、増幅対象の核酸鎖を指数関数的に増幅させることが可能であることを示す。これらの構造バリアントは、第２のプライマーの伸長産物の合成においてポリメラーゼを停止させるために使用される基が異なる。C3リンカー、C18リンカー（HEGリンカー（ヘキサエチレングリコールリンカー）としても知られている）またはIso-dC-5-Meのいずれか１つの修飾を、ポリメラーゼを停止させる基として使用した。
【０５７８】
さらに、本実施例では、第１のプライマーの伸長産物に相補的な３’末端セグメントを有するプライマー２によって、第１のプライマーの伸長産物に結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドを部分的に引き剥がすことができ、これによって増幅を達成できることを示す。
【０５７９】
この試験を行うため、実施例２に記載したものと同じ核酸を増幅対象の核酸として使用した。
2019530472.tif 000036
【０５８０】
アクチベーターオリゴヌクレオチド：
実施例２に記載したものと同じアクチベーターオリゴヌクレオチド001-01を使用した。
2019530472.tif 000037
このアクチベーターオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド（角括弧（［］）内に示す）と、（３’末端セグメントに）DNAヌクレオチドを含む。３’末端ヌクレオチドの３’−ＯＨ基は、リン酸残基（配列中にＸで示す）でブロックした。
【０５８１】
以下の第１のプライマーオリゴヌクレオチドのバリアントを使用した。
2019530472.tif 000038
【０５８２】
以降の各位置は以下を示す。
Ａ＝２’−デオキシアデノシン
Ｃ＝２’−デオキシシトシン
Ｇ＝２’−デオキシグアノシン
Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
修飾：
５＝２’−ＯＭｅ Ａ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）
６＝２’−ＯＭｅ Ｇ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）
７＝２’−ＯＭｅ Ｃ（２’−Ｏ−メチルシトシン）
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端はTAMRA色素で修飾した（TMR修飾）。
【０５８３】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域をそれぞれ下線で示す。
【０５８４】
隣接する各ヌクレオチドおよび各修飾ヌクレオチドは、通常の５’−３’結合で連結した。前記修飾も５’末端から３’末端の方向に付加した。いずれの配列も、標準的な合成化学法（ホスホロアミダイト法）を使用して製造会社によって合成されたものであった。
【０５８５】
以下の第２のプライマーオリゴヌクレオチドを使用した。
2019530472.tif 000039
この第２のプライマーはDNAからなる。
【０５８６】
反応混合物の調製および反応の開始は、実施例２と同様にして行った。
【０５８７】
以下の成分を使用して反応混合物を調製した。
・鋳型001-01：                            10pmol/l
・アクチベーターオリゴヌクレオチド001-01：10μmol/l
・各プライマー１：                         10μmol/l
・プライマー001-02：                       10μmol/l
【０５８８】
以下のさらなる反応成分を、増幅反応溶液２として使用した。
・グルタミン酸カリウム、50mmol/l、pH8.0
・酢酸マグネシウム、10mmol/l
・dNTP（dATP、dCTP、dTTP、dGTP）、各200μmol/l
・ポリメラーゼ（Bst 2.0 WarmStart、120,000U/ml、NEB）、12U/10μl
・TritonX-100、0.1%(v/v)
・EDTA、0.1mmol/l
・TPAC（テトラプロピルアンモニウムクロリド）、50mmol/l、pH8.0
・EvaGreen色素（この色素はメーカーの説明書に従い1:50に希釈して使用した）
【０５８９】
６５℃の等温反応条件下で（図に示した）所定の時間にわたり増幅反応溶液２中で反応を行った。実施例２と同様にして反応中のEvaGreenの蛍光シグナルを記録した。反応中のシグナル強度を記録した結果を図３４に示す。
【０５９０】
評価：
前述した第１のプライマーオリゴヌクレオチドを使用することによって、以下の第１のプライマーの伸長産物が形成されると予想される。
2019530472.tif 000040
それぞれの第１のプライマーオリゴヌクレオチドに対応する配列を「XXXXXXX」で示す。この配列の直後の予想される第１の伸長産物の配列（４１ｎｔ）を示している。伸長産物を下線で示す。
【０５９１】
等温条件下の指数関数的な増幅を補助する能力について、様々なプライマー１構造を試験した。この試験を行うため、ポリメラーゼを停止させる様々な基を第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域に組み込んだ。ポリメラーゼを停止させる様々な基として、C3リンカー、C18リンカー（HEGリンカー（ヘキサエチレングリコールリンカー）としても知られている）またはIso-dC-5-Meを使用した。第２のプライマーの伸長産物の合成において、第２のプライマーの伸長産物の合成が位置特異的に阻害され、第２の領域に含まれるポリヌクレオチドテールは複製されなかった。
【０５９２】
各反応のシグナルプロファイルを図３４に示す。配列番号３０に示されるプライマー１（C3リンカー）を使用した反応を図３４（Ａ）に示す。配列番号３１に示されるプライマー１（C18リンカー）を使用した反応を図３４（Ｂ）に示す。配列番号３２に示されるプライマー１（Iso-dC-5-Me）を使用した反応を図３４（Ｃ）に示す。
【０５９３】
第１のプライマーオリゴヌクレオチドの前記構造バリアントのいずれを使用した場合でも、指数関数的な増幅を達成することができた。第１のプライマーオリゴヌクレオチドを設計する際には、以下の点を考慮に入れた。
・第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域は、増幅対象の核酸に特異的に結合することができ、かつ使用するポリメラーゼによって伸長される検出可能なプライマー伸長反応を開始できるものでなければならない。
・第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー領域は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第２の領域に相補的に結合でき、これによって鎖置換反応が効果的に実施できるものでなければならない。
・第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第１の領域に特異的に結合するポリヌクレオチドテールを含む。
・ポリメラーゼ依存的合成をブロックして合成を終わらせることができるか、あるいはポリメラーゼ依存的合成を停止させることができる第１のブロッキングユニットを、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域と、第２の領域のポリヌクレオチドテールとの間に組み込むことによって、ポリメラーゼによるポリヌクレオチドテールの複製を阻止する。
・第１のプライマーオリゴヌクレオチドとアクチベーターオリゴヌクレオチドの結合は、使用する等温条件下で可逆的であると考えられる。したがって、選択された反応条件下において、第１のプライマーオリゴヌクレオチドは、一本鎖形態と、アクチベーターオリゴヌクレオチドに相補的に結合した形態との間で平衡状態にあると考えられる。
【０５９４】
第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列長および配列組成を選択する際には、以下の点を考慮に入れた。
・第２のプライマーの全長に３０個のヌクレオチドを含む。第２のプライマーオリゴヌクレオチドの配列の５番目〜３０番目は、第１プライマーの伸長反応の後に形成された第１のプライマーの配列特異的な伸長産物に相補的である。したがって、プライマー２は、第２のプライマーの伸長産物を形成させるためのプライマー伸長反応を開始することができる。
・本実施例の第２のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端セグメント（２３番目〜３０番目）は、第１のプライマーの配列特異的な伸長産物に対する結合において、アクチベーターオリゴヌクレオチドと競合する。この３’末端セグメントは、アクチベーターオリゴヌクレオチドの対応するセグメントの核酸依存的鎖置換を引き起こすことができる。このような鎖置換において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、第１のプライマーの配列特異的な伸長産物と接触し、これによってポリメラーゼが、第２のプライマーの配列特異的な伸長反応を効果的に開始することができ、配列特異的な第２鎖を合成することができる。この合成は、ポリメラーゼによるアクチベーターオリゴヌクレオチドの鎖置換と同時に起こる。本実施例の前記３’末端セグメントの長さは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドと相補的配列部分が重複しないように選択した。
・本実施例において、第２のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端セグメント（２２ヌクレオチド、１番目〜２２番目）は、第１のプライマーの配列特異的な伸長産物の３’末端セグメントに相補的に結合することができる。この５’末端セグメントは、第１のプライマーの伸長産物に対する結合において、アクチベーターオリゴヌクレオチドと競合しないため、第１のプライマーの伸長産物に結合しているアクチベーターオリゴヌクレオチドの鎖置換を起こさない。第２のプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端セグメントのＴｍは、第１のプライマーの配列特異的な伸長産物にアクチベーターオリゴヌクレオチドが完全に結合すると、第１のプライマーの配列特異的な伸長産物に結合している第２のプライマーの配列特異的な伸長産物が特定の温度下で自然に分離するように選択する。これらの鎖が分離されることによって、第１のプライマーの伸長産物の３’末端セグメントが一本鎖の形態になる。
【０５９５】
実施例６：
鋳型中のヌクレオチドの変更が増幅反応速度に及ぼす影響
本実施例では、鋳型配列の変更が増幅に及ぼす影響を調査した。この実験では、１個のヌクレオチドモノマーを別のヌクレオチドモノマーと置換した。プライマーの結合に関与する末端領域は同一の設計とした。このようにして、形成された第１のプライマーの伸長産物と所定のアクチベーターオリゴヌクレオチドの間でのこのようなミスマッチの位置が増幅に及ぼす影響を検証した。配列の設計は、実施例２および実施例３と同様に行った。
【０５９６】
以下の鋳型を使用した。
・アクチベーターオリゴヌクレオチドと完全にマッチする第１のプライマーの伸長産物を形成する配列組成を有する鋳型（配列番号２１）：
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第１のプライマーオリゴヌクレオチドと結合する配列を下線で示す
【０５９７】
さらに、アクチベーターオリゴヌクレオチドとミスマッチを有する第１のプライマーの伸長産物を形成する配列組成を有する別の複数の鋳型（配列番号３６〜３８）を使用した。
2019530472.tif 000042
【０５９８】
これらの鋳型（完全にマッチした鋳型およびミスマッチが組み込まれた鋳型）のいずれでも、各プライマー結合部位は同一であり、各プライマーオリゴヌクレオチドによる第１のプライマーの伸長反応を開始することができる。
【０５９９】
ポリメラーゼを使用して増幅を行い、変更を加えていない鋳型（配列番号２１）を使用した場合と比較すると、増幅された配列に差が見られる。この差異は、第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の５’末端セグメントに位置する。
【０６００】
以下のプライマーを使用した。
・第１のプライマーオリゴヌクレオチド（配列番号２３）
2019530472.tif 000043
・第２のプライマーオリゴヌクレオチド（配列番号２４）：
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【０６０１】
以下のアクチベーターオリゴヌクレオチド002-01（配列番号２５）を使用した。
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【０６０２】
各ヌクレオチドまたは各修飾ヌクレオチドは、互いにホスホジエステル結合で連結されている。ポリメラーゼによる伸長を阻止するため、３’末端はリン酸基でブロックされている。
【０６０３】
完全にマッチした配列組成を有する鋳型は、１nmol/l、１pmol/lおよび１fmol/lの濃度で使用した。ミスマッチを有する配列組成の鋳型は、１nmol/lの濃度で使用した。
【０６０４】
コントロール反応では、鋳型を使用しなかった。その他の反応条件は実施例２と同様とした。反応の結果を図３５に示す。
【０６０５】
完全にマッチした鋳型（配列番号２１）を使用した場合、プライマー伸長産物の相補鎖が合成される。この伸長産物は、完全にマッチした鋳型および使用したアクチベーターオリゴヌクレオチドの両方に相補的である。このような構成については、実施例２において詳細に述べている。このような構成の使用は、増幅を成功させるための基礎となる。
【０６０６】
これに対して、第１のプライマーの伸長産物の合成においてミスマッチ配列（配列番号３５〜３８）を使用した場合、伸長産物の相補鎖は形成されるものの、ミスマッチを有する鋳型に完全に相補的であることから、アクチベーターオリゴヌクレオチドの第３の領域には完全には相補的でなくなる。このような部分的に非相補的な配列は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと反応して鎖置換を進行させることができる部位である、第１のプライマーの伸長産物の伸長された部分の５’末端側セグメントにおいて見られる。本実施例で示したように、対応する部位間でミスマッチが存在することから、アクチベーターオリゴヌクレオチドによる鎖置換が妨害されうる。したがって、増幅は全体的に遅い速度で進行する。
【０６０７】
図３５は、アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の間での配列の差異が及ぼす影響を示す。ミスマッチを有する鋳型を元に合成されたプライマー伸長産物の配列とアクチベーターオリゴヌクレオチドの配列との間において１つの位置にのみ差異があったことから、アクチベーターオリゴヌクレオチドと鋳型または第１のプライマーの伸長産物との間における相補塩基の順序のマッチングの程度に増幅が依存することが示された。それぞれの変異によって増幅反応の速度が低下する。
【０６０８】
完全にマッチした鋳型を使用したコントロール反応（矢印１〜３、図３５Ａ）から、増幅が濃度依存性に進行することが示された。濃度を低下させた反応では、ベースラインレベルを超えるシグナルが得られる十分な量にまで増幅対象の核酸を合成するのにより長い時間を要した。
【０６０９】
鋳型を使用しなかったネガティブコントロール反応でも、シグナルの増加が示されたが、シグナルが増加するまでの時間は、完全にマッチした鋳型を使用した反応と比べて有意に遅延した。
【０６１０】
図３５Ａの矢印はそれぞれ以下を示す。
・１nmol/lの濃度の完全にマッチした鋳型（配列番号２１）（矢印１）
・１pmol/lの濃度の完全にマッチした鋳型（配列番号２１）（矢印２）
・１fmol/lの濃度の完全にマッチした鋳型（配列番号２１）（矢印３）
・ネガティブコントロール：鋳型なしの反応（矢印４）
【０６１１】
図３５Ｂの矢印はそれぞれ以下を示す。
・１nmol/lの濃度の完全にマッチした鋳型（配列番号２１）（矢印１）
・ネガティブコントロール：鋳型なしの反応（矢印４）
・１nmol/lの濃度の、ミスマッチを有する鋳型（配列番号３５）（矢印５）T-A6P-15-4401-1
・１nmol/lの濃度の、ミスマッチを有する鋳型（配列番号３６）（矢印６）T-A6P-15-4401-2
・１nmol/lの濃度の、ミスマッチを有する鋳型（配列番号３７）（矢印７）T-A6P-15-4401-3
・１nmol/lの濃度の、ミスマッチを有する鋳型（配列番号３８）（矢印８）T-A6P-15-4401-4
【０６１２】
この結果から、アクチベーターオリゴヌクレオチドの塩基組成が重要であることが示された。すなわち、アクチベーターオリゴヌクレオチドとプライマー伸長産物との間において１つの相補的塩基が異なるだけで、指数関数的な増幅が有意に遅延する場合がある。
【０６１３】
本実施例において、完全にマッチした鋳型とミスマッチを有する鋳型の間で末端セグメントの配列が同じ場合、指数関数的な増幅において、プライマーオリゴヌクレオチドはいずれの鋳型にも同等に結合することができるが、これらの鋳型による反応は異なることが示された。アクチベーターオリゴヌクレオチドと第１のプライマーオリゴヌクレオチドの伸長産物の５’末端セグメントとの間で完全な相補性がある場合、増幅は計画したように進行した。一方、アクチベーターオリゴヌクレオチドとプライマー伸長産物の間でミスマッチが存在すると、指数関数的な増幅反応の速度が低下する場合がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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