(57)【要約】  本開示は、トリカルボン酸回路中間体と少なくとも１種の抗酸化剤を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸及びリンゴ酸を抗酸化剤であるアスコルビン酸と組み合わせて含む。本開示は、ミトコンドリア機能と労作後の身体的回復を改善するための方法、及びその改善のための組成物の使用も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸、又はその塩を含む組成物。
【請求項２】
クエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸、又はその塩で本質的に構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
コハク酸を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
２〜４重量部のピルビン酸、２〜８重量部のクエン酸、及び３〜６重量部のリンゴ酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
０．５〜４重量部のアスコルビン酸を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
２００〜４００ｍｇのピルビン酸、２００〜８００ｍｇのクエン酸、及び３００〜６００ｍｇのリンゴ酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
５０〜４００ｍｇのアスコルビン酸又はその塩を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
リンゴ酸：ピルビン酸：クエン酸：アスコルビン酸のモル比は約１：１：１：１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
リンゴ酸：ピルビン酸：クエン酸：アスコルビン酸のモル比は約１．５：１：１：０．５である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
約２００ｍｇのピルビン酸、約３００ｍｇのリンゴ酸、約２００ｍｇのクエン酸、及び約１００ｍｇのアスコルビン酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
１種以上のクエン酸回路前駆体、ビタミン、ミネラル、微量栄養素、電解質、炭水化物、アミノ酸及び／又はタンパク質を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
１種以上の香味剤を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
１種以上の賦形剤を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物は液体、ペースト、ゲル、バー、粉末、錠剤又はカプセルの形態である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
錠剤はトローチ、キャンディ又はチューインガムである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物は炭水化物及び／又はタンパク質を含まない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
対象において労作後の身体的回復を改善する方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法。
【請求項１８】
対象による労作前、労作中又は労作後に組成物を投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象による労作前、労作中及び労作後に組成物を投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象による労作前３０分以内、対象による労作中、及び対象による労作後３０分以内に組成物を投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ミトコンドリア機能の改善を必要とする対象においてミトコンドリア機能を改善する方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法。
【請求項２２】
細胞内乳酸の低減を必要とする対象において細胞内乳酸を低減させる方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法。
【請求項２３】
対象において労作後の身体的回復を改善するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の有効量の使用。
【請求項２４】
対象による労作前、労作中又は労作後に組成物を使用する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
対象による労作前、労作中及び労作後に組成物を使用する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
対象による労作前３０分以内、対象による労作中、及び対象による労作後３０分以内に組成物を使用する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
組成物はクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸、又はその塩で本質的に構成される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
ミトコンドリア機能の改善を必要とする対象においてミトコンドリア機能を改善するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
細胞内乳酸の低減を必要とする対象において細胞内乳酸を低減させるための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年２月２３日出願の米国特許仮出願第６２／２９８，７１５号の優先権の利益を主張するものであり、この出願の全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、トリカルボン酸中間体と少なくとも１種の抗酸化剤を含む組成物を提供する。本開示は、ミトコンドリア機能と労作後の身体的回復を改善するための方法、及びその改善のための組成物の使用も提供する。
【背景技術】
【０００３】
身体的及び精神的労作には細胞代謝準備が要求される。乳清タンパク質単離物等のタンパク質化合物、カゼイン又は個々のアミノ酸を用いて回復を改善する試みが行われている。このような成分は有益ではあるが、筋細胞膜を修復又は増強することが目的であり、ミトコンドリア支持及び回復、又は有酸素機能の改善を間接的に助けるに過ぎない。
【０００４】
多くの様々な剤が運動選手の能力やミトコンドリア機能を改善又は増強することが示唆されている。このような剤としては、補足グルコース、アミノ酸２、４（即ち、Ｌ−アルギニン２７、β−アラニン、シトルリン（リンゴ酸シトルリン又はシトルリン単独２２、３２、グルタミン４、タウリン１３、その他の分岐鎖アミノ酸２９、クレアチン（多くの場合、ピルビン酸クレアチン又はクエン酸クレアチン１５、カルニチン３８、１０、各種ビタミン及び抗酸化剤２５、その他多数、特に植物由来抽出物や天然物（例えば、緑茶１２、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ及びヨヒンビン１１）又は補助炭水化物と共に飲料に混合される植物由来抽出物や天然物の複合誘導体６、３８又はタンパク質単離物３７が挙げられるが、これらに限定されない。このような剤の有益な役割については通常、単一の剤を高投与量で用い、所定の運動プログラムを行うことによって検証されている。
【０００５】
更なる刊行物では、Ｌ−アルギニンの補給によって一酸化窒素レベルを上昇させることによる運動能力の増強２７、４２又は、疲労するまでの時間を延長させることが示された４２シトリルリン２２等のアルギニン前駆体を用いた間接的な運動能力の増強が検討されている。
【０００６】
クレアチンの補給によって持久力や回復が改善することが分かっている。クレアチンは細胞内リン−クレアチンレベルを上昇させ、治療上有意な用量で供給すると運動能力を改善させるエネルギー貯蔵化合物として作用し得る７、３３が、補給を行った運動選手において脂肪値やトリグリセリド値が上昇する場合がある１７。同様に、分岐鎖アミノ酸によって能力や回復は改善する５が、運動による筋損傷は必ずしも改善しないことが分かっている９。
【０００７】
細胞の発電所であるミトコンドリアを直接標的にするため、様々な個々の代謝中間体が検証されてきたが、成功の度合いも様々であった。ミトコンドリア機能と労作後回復を改善するための改良組成物と方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、１種以上のトリカルボン酸中間体又はその塩と１種以上の抗酸化剤を含む組成物を提供する。
【０００９】
一実施形態では、１種以上のトリカルボン酸中間体はクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、コハク酸及び／又はその対応する塩から選択される。一実施形態では、組成物はクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びコハク酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。一実施形態では、組成物はクエン酸、リンゴ酸及びピルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。
【００１０】
他の実施形態では、１種以上の抗酸化剤はアスコルビン酸、その塩、ビタミンＥ及びＬ−システインから選択される。一実施形態では、抗酸化剤はアスコルビン酸又はその塩である。
【００１１】
一実施形態では、組成物はクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成され、必要に応じてコハク酸を含む。
【００１２】
一実施形態では、組成物は２〜４重量部のピルビン酸、２〜８重量部のクエン酸及び３〜６重量部のリンゴ酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。他の実施形態では、組成物は０．５〜４重量部のアスコルビン酸を含む。必要に応じて、組成物は０．１〜２重量部のコハク酸を含む。
【００１３】
他の実施形態では、リンゴ酸：ピルビン酸：クエン酸：アスコルビン酸のモル比は約１：１：１：１である。一実施形態では、リンゴ酸：ピルビン酸：クエン酸：アスコルビン酸のモル比は約１：１：０．５：１である。他の実施形態では、リンゴ酸：ピルビン酸：クエン酸：アスコルビン酸のモル比は約１．５：１：１：０．５である。一実施形態では、リンゴ酸：ピルビン酸：クエン酸：アスコルビン酸のモル比は、約１：１：１：１〜１：１：０．５：１、又は約１：１：１：１〜１．５：１：１：０．５である。
【００１４】
他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、有効量のＴＣＡ回路中間体とそれを必要とする対象での使用に適した抗酸化剤を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。例えば、一実施形態では、組成物は２００〜４００ｍｇのピルビン酸、２００〜８００ｍｇのクエン酸及び３００〜６００ｍｇのリンゴ酸を含む。一実施形態では、組成物は１００〜４００ｍｇのアスコルビン酸を含む。必要に応じて、組成物は１０〜２００ｍｇ又は５０〜１５０ｍｇのコハク酸を更に含む。
【００１５】
一実施形態では、組成物は約２００ｍｇのピルビン酸、約３００ｍｇのリンゴ酸、約２００ｍｇのクエン酸及び約１００ｍｇのアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。必要に応じて、組成物は約１００ｍｇのコハク酸を更に含むか、本質的にこれで構成されるか、又はこれのみで構成される。一実施形態では、組成物は約４００ｍｇのピルビン酸、約６００ｍｇのリンゴ酸、約４００ｍｇのクエン酸及び約２００ｍｇのアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。必要に応じて、組成物は約２００ｍｇのコハク酸を更に含むか、本質的にこれで構成されるか、又はこれのみで構成される。
【００１６】
他の実施形態では、組成物は１種以上のクエン酸回路前駆体、ビタミン、ミネラル、微量栄養素、電解質、炭水化物、アミノ酸及び／又はタンパク質を更に含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。
【００１７】
他の実施形態では、組成物は１種以上の香味剤を更に含む。
【００１８】
他の実施形態では、組成物は１種以上の賦形剤を更に含む。
【００１９】
他の実施形態では、組成物は液体、ペースト、ゲル、バー、粉末、錠剤又はカプセルの形態である。他の実施形態では、錠剤はトローチ、キャンディ又はチューインガムである。
【００２０】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物はショ糖やグルコース等の炭水化物又はタンパク質を含まない。
【００２１】
本開示は、ミトコンドリア機能の改善を必要とする対象においてミトコンドリア機能を改善する方法であって、本明細書に開示の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法も提供する。本開示は、ミトコンドリア機能の改善を必要とする対象におけるミトコンドリア機能を改善するための本明細書に開示の組成物の使用も更に提供する。
【００２２】
本開示は、細胞内乳酸の低減を必要とする対象において細胞内乳酸を低減させる方法であって、本明細書に開示の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法も提供する。本開示は、細胞内乳酸の低減を必要とする対象における細胞内乳酸を低減させるための本明細書に開示の組成物の使用も更に提供する。
【００２３】
本開示は、対象において労作後の回復を改善する方法であって、本明細書に開示の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法も提供する。本開示は、労作後の回復の改善を必要とする対象における労作後の回復を改善するための本明細書に開示の組成物の使用を更に提供する。一実施形態では、対象による労作前、労作中及び／又は労作後に組成物を投与又は使用する。一実施形態では、対象による労作前３０分以内、労作中及び／又は労作後３０分以内に組成物を投与又は使用する。
【００２４】
本開示は、対象においてピークパワー出力を改善する方法であって、本明細書に開示の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法も提供する。本開示は、対象におけるピークパワー出力を改善するための本明細書に開示の組成物の使用を更に提供する。
【００２５】
本開示は、身体的労作を行う対象が疲労するまでの時間を延長する方法であって、本明細書に開示の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法も提供する。本開示は、対象における疲労までの時間を延長するための本明細書に開示の組成物の使用を更に提供する。一実施形態では、身体的労作を行う前に組成物を対象に投与及び／又は使用する。
【００２６】
一実施形態では、対象は哺乳動物であり、必要に応じてヒトである。
【００２７】
他の実施形態では、対象による身体的又は精神的労作前、労作中及び／又は労作後に組成物を使用又は投与する。一実施形態では、対象による身体的又は精神的労作前、労作中及び労作後に組成物を使用又は投与する。一実施形態では、労作前３０分以内、労作中及び労作後３０分以内に組成物を使用又は投与する。
【００２８】
他の実施形態では、対象による身体的又は精神的労作の２時間、９０分、５０分又は２５分以内に組成物を投与又は使用する。
【００２９】
本開示の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この詳細な説明から本開示の精神及び範囲内で様々な変更や改変が当業者には明らかになるため、本開示の好ましい実施形態を示しつつなされる詳細な説明や具体的な例示はほんの一例に過ぎないことは理解されたい。
以下、図面と関連させて本開示の説明を行う。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＢＨＫ細胞における乳酸産生率に対する各種クレブス回路中間体の効果を示す。
【図２】Ｃ２Ｃ１２培養筋細胞における乳酸産生に対する各種基質の効果を示す。「全て」という基質条件には１ｍＭのクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸が含まれる。同様の条件下で１ｍＭのグルコースのみにＣ２Ｃ１２細胞を曝露させた結果、細胞がプレートから剥離し、代謝ストレスを示した。
【図３】本明細書に記載のクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸を含む製剤を用いて行った６ヶ月間のトレーニングセッションで試験対象が持ち上げたデッド重量（１回のヘビーリフト）の増加を示す。
【図４】本明細書に記載のクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸を含む製剤を用いて行った６ヶ月間のトレーニングセッションでの試験対象によるスクワット重量（１回のヘビーリフト）の増加を示す。
【図５】本明細書に記載のクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸を含む製剤を用いて行った６ヶ月間のトレーニングセッションでの試験対象によるベンチプレス重量（１回のヘビーリフト）の増加を示す。
【図６】本明細書に記載のクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸を含む製剤を用いて行った６ヶ月間のトレーニングセッションでの試験対象による１回のヘビーリフトの向上をまとめたものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明者らは、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路中間体を抗酸化剤と併用することによって細胞内乳酸産生が抑制されることを実証した。実施例１に示すように、アスコルビン酸と共にピルビン酸、リンゴ酸、クエン酸及びコハク酸の存在下で培養したＢＨＫ細胞では、細胞内乳酸値が有意に低下した。理論によって限定されるものではないが、複数のＴＣＡ回路中間体と抗酸化剤を組み合わせると、個々のＴＣＡ中間体及び／又は抗酸化剤を使用する場合と比べてミトコンドリア機能と細胞能力が改善されると考えられる。
【００３２】
実施例３〜６に示すように、本明細書に記載のＴＣＡ中間体とアスコルビン酸を含む製剤を用いたヒト対象では、労作後の回復及び能力の改善が示された。理論によって限定されるものではないが、対象による労作前、労作中及び／又は労作後に本明細書に記載の組成物を使用すると、ミトコンドリア機能と細胞能力の改善によって回復を改善することができる。一実施形態では、対象による労作前、労作中及び労作後に本明細書に記載の組成物を使用することによって、生理学的回復プロセスが促進され、労作後の身体的回復に要する時間が短くなると考えられる。
【００３３】
従って、本開示は、１種以上のトリカルボン酸中間体又はその塩を少なくとも１種の抗酸化剤と組み合わせて含む組成物を対象とする。ある実施形態では、組成物はミトコンドリア機能の改善及び／又は細胞内乳酸の低減に有用である。ある実施形態では、組成物は労作後の対象の回復を改善するのに有用である。ある実施形態では、本明細書に記載の組成物は、グルコース等の炭水化物及び／又はタンパク質を添加することなく、対象における労作後の能力及び／又は回復を改善するのに有用である。
【００３４】
本明細書で使用される「トリカルボン酸回路中間体」、「ＴＣＡ中間体」又は「クレブス回路中間体」という用語は、クエン酸回路（クレブス回路）の前駆体、中間体及び基質を意味する。トリカルボン酸回路中間体の例としては、ピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸及びその塩が挙げられるが、これらに限定されない。トリカルボン酸中間体の他の例としては、イソクエン酸、オキソグルタル酸、フマル酸、オキサロ酢酸及びその塩が挙げられる。従って、一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、イソクエン酸、オキソグルタル酸、フマル酸及びオキサロ酢酸から選択される１種以上のトリカルボン酸中間体を含む。一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸及びコハク酸から選択される２種以上のトリカルボン酸中間体を含む。一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸及びコハク酸から選択される３種以上のトリカルボン酸中間体を含む。一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、イソクエン酸、オキソグルタル酸、フマル酸及びオキサロ酢酸から選択される４種以上のトリカルボン酸中間体を含む。一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、イソクエン酸、オキソグルタル酸、フマル酸及びオキサロ酢酸から選択される５種以上、６種以上、７種以上又は８種のトリカルボン酸中間体を含む。一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸及びリンゴ酸を含む。一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸及びコハク酸を含む。より明確にするために、本明細書に記載の有機酸（例えば、ピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸及び／又はアスコルビン酸を指すが、これらに限定されない）としてはその塩、例えば、ピルビン酸塩（例えば、ピルビン酸カルシウム）、クエン酸塩（例えば、クエン酸カルシウム）、リンゴ酸塩（例えば、リンゴ酸ナトリウム）及び／又はアスコルビン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載の１種以上のトリカルボン酸回路中間体又はその塩及び／又は抗酸化剤の有効量を提供する剤形である。本明細書で使用される「有効量」という用語は、投与時及び所望の結果を得るのに必要な期間に亘って有効な組成物又は組成物の成分の量である。例えば、ある物質の有効量は、個体の身体的状態、年齢、性別及び重量等の因子やその物質が個体で所望の反応を引き起こす能力に応じて変わり得る。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＴＣＡ中間体と抗酸化剤の組み合わせの有効量を含んでおり、ミトコンドリア機能を改善し、及び／又は細胞内乳酸を低減させる。
【００３６】
本明細書で使用される「約」、「実質的に」及び「およそ」等の程度を表す用語は、最終結果が大きく変化しない程度に、修飾された用語から逸脱する量が妥当であることを意味する。これらの程度を表す用語は、修飾する単語の意味がこの逸脱によって否定されない場合には、修飾された用語の少なくとも±５％の逸脱を含むものと解釈されるべきである。
【００３７】
一実施形態では、組成物はピルビン酸又はその塩を含む。解糖系の最終生成物であるピルビン酸は脱炭酸され、アセチル補酵素Ａの形態でクレブス回路に入る。この炭素数２の誘導体はオキサロ酢酸（この回路の最後の炭素数４の中間体）と相互作用してクエン酸を再生する。従って、ピルビン酸を開示組成物に供給し、アセチル補酵素Ａの形成によってクエン酸回路にクエン酸を補充するのに役立たせることができる。また、ピルビン酸はオキサロ酢酸への転換を介して補充反応にも関与し、オキサロ酢酸はその後、必須アミノ酸のメチオニン、スレオニン、イソロイシン及びリジンの前駆体であるアスパラギン酸の生成用基質となり得る。
【００３８】
理論によって拘束されるものではないが、開示組成物にピルビン酸を含有させて得られる更なる望ましい効果としては、有酸素代謝の刺激によって起こり得る余剰体重や脂肪量の利用増大を挙げることができるが、この効果の機序についてはまだ十分に解明されていない８、１６、２８、３０。更なる有益な効果としては、疲労及び活力の気分状態スコアの改善を挙げることもできる１６。また、労作中及び労作後に更なるピルビン酸を供給することによって、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）を長期間に亘って酵素的に活性な状態に維持することができ、回復と労作後の乳酸利用を増強させることができる２４。
【００３９】
従って、一実施形態では、組成物は有効量のピルビン酸又はその塩を含む。一実施形態では、ピルビン酸の有効量は、ピルビン酸の有効血中濃度が約１００〜５００マイクロモル、必要に応じて約１００〜４００マイクロモル、１５０〜５００マイクロモル、３００〜５００マイクロモル、１５０〜４００マイクロモル、１５０〜３００マイクロモル、１５０〜２５０マイクロモル又は約２００マイクロモルとなる量である。当業者であれば、体重、血液量、労作の程度又は年齢が必要有効濃度に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。例えば、血液量が約５Ｌで７０ｋｇの個体の場合、ピルビン酸の用量が約５０〜１０００ｍｇ、約１００〜５００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、２００〜４００ｍｇ、１５０〜２５０ｍｇ又は約２００ｍｇであれば、ピルビン酸の有効血中濃度を得ることができる。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は約１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ又は６５０ｍｇのピルビン酸を含む。一実施形態では、ピルビン酸はピルビン酸カルシウムである。
【００４０】
他の実施形態では、組成物はクエン酸又はその塩を含む。クエン酸は脱水段階を含むクエン酸媒介反応に関与し、脱炭酸可能なシスアコニット酸を形成する。ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）が同時に還元されて高エネルギー中間体ＮＡＤＨとなる。
【００４１】
クエン酸はミトコンドリア内に輸送され、クエン酸回路に直接関与する。また、クエン酸は脂肪酸生合成に関与するアセチルＣｏＡへの転換によって、更にイソクエン酸及びオキソグルタル酸への転換によって補充反応にも関与する。オキソグルタル酸はグルタミン酸と関連アミノ酸（例えば、プロリン）の形成に必要な前駆体である。理論によって拘束されるものではないが、このような補充効果をクエン酸で補うことによって運動後の補水や血液緩衝能が改善され、トレーニング後１６時間を超えて運動回復が改善される３４。クエン酸の補充のみで２００ｍ競技用の水泳能力に改善がもたらされることが示された２６。
【００４２】
従って、一実施形態では、組成物は有効量のクエン酸又はその塩を含む。一実施形態では、クエン酸の有効量は、クエン酸の有効血中濃度が約５０〜５００マイクロモル、必要に応じて約１００〜５００マイクロモル、１００〜４００マイクロモル、７５〜２５０マイクロモル、１５０〜４００マイクロモル、１５０〜３００マイクロモル、１５０〜２５０マイクロモル又は約２００マイクロモルとなる量である。当業者であれば、体重、血液量、労作の程度又は年齢が必要有効濃度に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。一実施形態では、血液量が約５Ｌで７０ｋｇの個体の場合、クエン酸の用量がおよそ５０〜２０００ｍｇ、必要に応じて５０〜１５００ｍｇ、７５〜１０００ｍｇ、１００〜８００ｍｇ、２００〜７００ｍｇ、２００〜６００ｍｇ、２００〜５００ｍｇ、１５０〜２５０ｍｇ又はおよそ２００ｍｇであれば、クエン酸の有効血中濃度を得ることができる。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は約１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ又は８００ｍｇのクエン酸を含む。一実施形態では、クエン酸はクエン酸カルシウムである。
【００４３】
他の実施形態では、組成物はリンゴ酸又はその塩を含む。リンゴ酸は、アセチルＣｏＡとの組み合わせによってクエン酸を再生するのに重要且つ必要なオキサロ酢酸補充代謝物である。この脱水素反応時に、リンゴ酸の脱水素によってＮＡＤＨの１分子が生成し、これが次に酸化反応で用いられてＡＴＰを生成することができる。同様に、リンゴ酸のオキサロ酢酸への脱水素によって、アスパラギン酸と関連アミノ酸の産生に必要な前駆体が生成する。理論によって拘束されるものではないが、強制水泳プロトコル中にマウスの身体的スタミナがリンゴ酸によって改善されることが示された４１。また、リンゴ酸をクレアチンと組み合わせると、短距離走者において有意なエルゴジェニック効果が示され、これによって無酸素指標及び形態学的指標の上昇が評価された３６。同様に、リンゴ酸をシトルリンと組み合わせると、運動能力が改善されると共に運動後の筋肉痛が緩和され２２、スタミナが改善され、乳酸が低減し、レジスタンス能力が改善され、身体的損傷が抑制され、有酸素エネルギー産生が促進される２、３９、４０、４１。
【００４４】
従って、一実施形態では、組成物は有効量のリンゴ酸又はその塩を含む。一実施形態では、リンゴ酸はＬ−リンゴ酸が５０％、７５％、８０％、９０％、９５％又は９９％を超える。一実施形態では、リンゴ酸の有効量は、リンゴ酸の有効血中濃度が約１〜１００マイクロモル、１〜５０マイクロモル、１〜２５マイクロモル、１〜２０マイクロモル、２〜１５マイクロモル、３〜１５マイクロモル、５〜１５マイクロモル又は約１０マイクロモルとなる量である。当業者であれば、体重、血液量、労作の程度又は年齢が必要有効濃度に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。一実施形態では、血液量が約５Ｌで７０ｋｇの個体の場合、リンゴ酸の用量が約５０〜１５００ｍｇ、必要に応じて１００〜１５００ｍｇ、２００〜１２００ｍｇ、２５０〜１０００ｍｇ、２５０〜８００ｍｇ、２５０〜６５０ｍｇ、３００〜６００ｍｇ又はおよそ４５０ｍｇであれば、リンゴ酸の有効血中濃度を得ることができる。一実施形態では、本明細書に開示の組成物は約１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ又は８５０ｍｇのリンゴ酸を含む。
【００４５】
他の実施形態では、組成物はコハク酸又はその塩を含む。コハク酸のフマル酸への転換はＦＡＤのＦＡＤＨへの還元に直接寄与し、ＦＡＤＨを用いてリンゴ酸のオキサロ酢酸への転換と同様に電子伝達系によってＡＴＰが産生し、ＮＡＤからＮＡＤＨが産生し得る。これらの分子は中間体の産生に必要な力を抑制させ、酸化的代謝において重要な役割を果たす。コハク酸の血中濃度はおよそ２３．５マイクロモルであることが示された４３。
【００４６】
一実施形態では、コハク酸の有効量は、コハク酸の有効血中濃度が約５〜１００マイクロモル、必要に応じて約５〜８０マイクロモル、８〜５０マイクロモル、１０〜５０マイクロモル、１５〜４０マイクロモル、１０〜３５マイクロモル、１５〜３５マイクロモル又は約１５マイクロモルとなる量である。当業者であれば、体重、血液量、労作の程度又は年齢が必要有効濃度に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。一実施形態では、血液量が約５Ｌで７０ｋｇの個体の場合、コハク酸の用量が約５〜２００ｍｇ、必要に応じて１０〜１５０ｍｇ、１５〜１５０ｍｇ、５０〜１５０ｍｇ、７５〜１２５ｍｇ、２０〜４０ｍｇ、１０〜４０ｍｇ、８０〜１４０ｍｇ又は約１００ｍｇであれば、コハク酸の有効血中濃度を得ることができる。一実施形態では、本明細書に開示の組成物は約ｍｇのコハク酸を含む。
【００４７】
更に他の実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸及びリンゴ酸の各々又はその塩を含む。他の実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸及びコハク酸の各々又はその塩を含む。理論によって拘束されるものではないが、ピルビン酸、クエン酸及びリンゴ酸（及び必要に応じてコハク酸）はまとまって互いに補完し合い、ミトコンドリアの能力を増強及び／又は補助し、有酸素エネルギー産生を促進する。更に、これらの中間体は、細胞維持及び細胞修復に必要な使用済又は消耗済代謝物を補充するのに必要な生合成炭素骨格中間体をもたらす補充反応に同時に関与し得る。
【００４８】
一実施形態では、組成物は２〜４重量部のピルビン酸、２〜８重量部のクエン酸及び３〜６重量部のリンゴ酸を含む。一実施形態では、組成物は約２００〜４００ｍｇのピルビン酸、２００〜８００ｍｇのクエン酸、２００〜６００ｍｇのリンゴ酸、及び必要に応じて５０〜１５０ｍｇのコハク酸を含む。
【００４９】
開示組成物は抗酸化剤を更に含む。本明細書で使用される「抗酸化剤」という用語は、例えば、フリーラジカル又は他の酸化剤に電子を供与して他の分子の酸化を阻害する物質を意味する。抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸又はその塩、ビタミンＥ及びＬ−システインが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、抗酸化剤はアスコルビン酸である。
【００５０】
一実施形態では、開示組成物はアスコルビン酸又はその塩を含む。理論によって拘束されるものではないが、アスコルビン酸は、まとまった中間体に対して抗酸化剤の役割を果たすと共に水溶性細胞抗酸化剤として機能する。特に、解糖由来のＡＴＰ産生期間後の酸化的代謝の再構築時に酸化的フリーラジカルを抑えるのにも使用される。この抗酸化剤は、激しい消耗運動時の筋細胞損傷を最小限に抑え、ミトコンドリア機能を保存し、カルボニル含量等の酸化的損傷マーカーを抑制し、抗酸化能を高めることが示された２５。
【００５１】
アスコルビン酸は、抗酸化剤としての役割とは関係なくミトコンドリアエネルギー論にも寄与し、好気性ストレス時の細胞呼吸とミトコンドリア能力の再活性化にも寄与し得る４４。アスコルビン酸は細胞酸化還元状態を維持して更なる効果を発揮することもある４５。
【００５２】
従って、一実施形態では、組成物は有効量のアスコルビン酸又はその塩を含む。一実施形態では、アスコルビン酸の有効量は、アスコルビン酸の有効血中濃度が１０〜２０００マイクロモル、必要に応じて５０〜１０００マイクロモル、５０〜７５０マイクロモル、５０〜５００マイクロモル、７５〜２５０マイクロモル、２０〜１００マイクロモル、５０〜１００マイクロモル、６０〜９０マイクロモル又は約８０マイクロモルとなる量であるが、当業者であれば、体重、血液量、労作の程度又は年齢が必要有効濃度に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。一実施形態では、血液量が約５Ｌで７０ｋｇの個体の場合、アスコルビン酸の用量が５０〜１５００ｍｇ、必要に応じて５０〜７５０ｍｇ、５０〜５００ｍｇ、７５〜２５０ｍｇ又はおよそ１００ｍｇであれば、アスコルビン酸の有効血中濃度を得ることができる。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は約５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ又は５００ｍｇのアスコルビン酸を含む。
【００５３】
一実施形態では、組成物は２〜４重量部のピルビン酸又はその塩、２〜８重量部のクエン酸又はその塩、２〜６重量部のリンゴ酸又はその塩、及び０．５〜１．５重量部のアスコルビン酸又はその塩を含む。他の実施形態では、組成物は、約１００〜３００ｍｇのピルビン酸又はその塩、１００〜３００ｍｇのクエン酸又はその塩、２００〜４００ｍｇのリンゴ酸又はその塩、及び５０〜１５０ｍｇのアスコルビン酸又はその塩を含む。
【００５４】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物は約等モル量のＴＣＡ回路中間体と必要に応じて等モル量の抗酸化剤（アスコルビン酸等）を有する。一実施形態では、リンゴ酸：クエン酸：ピルビン酸：アスコルビン酸のモル比は約１：１：１：１である。一実施形態では、本明細書に記載の組成物はコハク酸を含み、リンゴ酸：クエン酸：ピルビン酸：アスコルビン酸：コハク酸のモル比は約１：１：１：１：１〜１：１：１：１：０．０５である。一実施形態では、本明細書に記載の組成物はコハク酸を含み、リンゴ酸：クエン酸：ピルビン酸：アスコルビン酸：コハク酸のモル比は約１：１：１：１：１〜１：１：１：１：０．５である。
【００５５】
一実施形態では、リンゴ酸：クエン酸：ピルビン酸：アスコルビン酸のモル比は約１．５：１：１：０．５である。一実施形態では、本明細書に記載の組成物はコハク酸を含み、リンゴ酸：クエン酸：ピルビン酸：アスコルビン酸：コハク酸のモル比は約１．５：１：１：１：１〜１：１：１：０．５：０．０５又は約１．５：１：１：１：１〜１．５：１：１：０．５：０．５である。
【００５６】
他の実施形態では、開示組成物は更なる成分を含み、組成物の有効性を更に向上又は増強する。開示組成物に有用な更なる成分の例としては、更なるクエン酸回路前駆体、中間体及び基質、ビタミン、ミネラル、微量栄養素、電解質、炭水化物、アミノ酸及び／又はタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の例としては、乳清単離物、カゼイン、大豆由来タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
一実施形態では、開示組成物は香味剤を更に含む。香味剤の例は当技術分野で周知である。
【００５８】
本明細書に開示の組成物は、対象に投与するための組成物及び／又はインビボ投与に適した生物学的に適合した形態で対象に使用するための組成物に処方することができる。特に、開示組成物は薬学的に許容し得る賦形剤又は担体を含むことができる。適切な薬学的に許容し得る賦形剤又は担体としては、組成物の生物活性の有効性を妨害しない本質的に化学的に不活性で無毒性の組成物が挙げられる。適切な媒体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ，２０００）に記載されている。これに基づき、組成物としては、１種以上の薬学的に許容し得る媒体又は希釈剤に関連し、生理液と等張で適切なｐＨを有する緩衝液に含有される物質の溶液が挙げられるが、これに限定されない。適切な賦形剤の例としては、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスホチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。このような組成物には、有効量の各種成分と共に適量の賦形剤を含有させて対象へ直接投与するための形態を得る必要がある。
【００５９】
開示組成物は必要に応じて、液体（例えば、飲料）、ペースト、ゲル、バー、粉末、錠剤又はカプセルの形態をとる。錠剤の例としては、トローチ、キャンディ、ソフトチュー又はチューインガムが挙げられるが、これらに限定されない。錠剤又はカプセルは、必要に応じて組成物の全用量又は全用量未満（例えば、半用量）を含む。
【００６０】
組成物としては、凍結乾燥粉末、水性又は非水性の滅菌注射用溶液又は懸濁液が更に挙げられるが、これらに限定されず、対象レシピエントの組織又は血液に組成物を実質的に適合させる更なる抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び溶質を更に含むことができる。このような組成物に存在し得る他の成分としては、例えば、水、界面活性剤（例えば、ツイーン）、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油が挙げられる。滅菌粉末、顆粒、錠剤、又は濃縮溶液又は懸濁液から即時の注射溶液及び懸濁液を調製することができる。タンパク質を例えば、患者に投与する前に滅菌水又は生理食塩水で再構成する凍結乾燥粉末として供給することができるが、これに限定されない。
【００６１】
本開示の他の実施形態では、組成物は食品成分又は食品添加物である。
【００６２】
液状の滅菌製剤を臨床の場で治療に用いて、例えば、外傷や乳酸アシドーシス時に緊急症例、急性症例又は処方症例において代謝サポートが得られることが予想され得る。生理学的ｐＨ値の静脈内滅菌製剤を医療専門家が規定するように調製及び投与できることが予想される。
【００６３】
一実施形態では、組成物はハイパーメロース、微結晶性セルロース及び／又はステアリン酸マグネシウムを含むことができる。一実施形態では、組成物は微量（例えば、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満又は０．０１％未満）のハイパーメロース、微結晶性セルロース及び／又はステアリン酸マグネシウムを含む。一実施形態では、組成物はピルビン酸、クエン酸、リンゴ酸及びアスコルビン酸で本質的に構成されており、微量の賦形剤、担体又は化合物、例えば、ハイパーメロース、微結晶性セルロース及び／又はステアリン酸マグネシウムを有する。
【００６４】
好ましい実施形態では、組成物はヒトが経口摂取するのに適した剤形で提供される。一実施形態では、剤形はリンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸及びアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される小袋、カプセル又は錠剤である。一実施形態では、投与量は約５００ｍｇ〜１５００ｍｇ、必要に応じて約７５０ｍｇ〜１０００ｍｇ又は約８００ｍｇである。
【００６５】
一実施形態では、剤形は１５０〜２５０ｍｇのクエン酸、２５０〜３５０ｍｇのリンゴ酸、１５０〜２５０ｍｇのピルビン酸及び５０〜１５０ミリグラムのアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。一実施形態では、剤形は約２００ｍｇのクエン酸、約３００ｍｇのリンゴ酸、約２００ｍｇのピルビン酸及び約１００ミリグラムのアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。
【００６６】
一実施形態では、組成物又は剤形は１５０〜２５０ｍｇのクエン酸カルシウム、２５０〜３５０ｍｇのＬ−リンゴ酸、１５０〜２５０ｍｇのピルビン酸カルシウム及び５０〜１５０ミリグラムのアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。一実施形態では、組成物又は剤形は、２００ｍｇのクエン酸カルシウム、３００ｍｇのＬ−リンゴ酸、２００ｍｇのピルビン酸カルシウム及び１００ミリグラムのアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。
【００６７】
運動選手による使用又は労作前、労作中又は労作後の摂取に向けて市販されている多くの栄養補助食品には、グルコースやショ糖等の炭水化物及び／又はタンパク質が含まれている。本明細書に記載の組成物の１つの利点は、炭水化物及び／又はタンパク質が無添加で回復改善に特に有効であることである。更に、対象の中には多量の炭水化物及び／又はタンパク質の摂取を望んではいないが、労作後の能力及び／又は回復の改善を望んでいるものもいる。従って、一実施形態では、本明細書に記載の組成物にはショ糖、デキストロース又はグルコース等の炭水化物が添加されていない。一実施形態では、本明細書に記載の組成物にはタンパク質が添加されていない。実施例６に示すように、炭水化物及び／又はタンパク質が無添加の本明細書に記載の組成物を使用すると、能力及び／又は身体的回復を改善することができる。
方法及び使用
【００６８】
本開示は開示組成物の使用と方法、及び本明細書に記載の使用のための組成物も対象とする。
【００６９】
特に、本開示は、ミトコンドリア機能の改善を必要とする対象においてミトコンドリア機能を改善する方法であって、開示組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法を提供する。本開示は、ミトコンドリア機能の改善を必要とする対象においてミトコンドリア機能を改善するための開示組成物の使用を提供すると共に、ミトコンドリア機能の改善を必要とする対象においてミトコンドリア機能を改善するための本明細書に記載の組成物も提供する。
【００７０】
本明細書で使用される「ミトコンドリア機能を改善する」という表現は、対象においてミトコンドリア機能を少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００又は２００％改善することを包含する。ミトコンドリア機能は当技術分野で既知のいずれの方法でも評価することができる。例えば、ミトコンドリア機能はクラーク酸素電極４６を用いた酸素消費呼吸研究によって評価することができる。
【００７１】
一実施形態では、細胞内乳酸産生量又は産生率をモニターしてミトコンドリア機能を評価する。ここで、乳酸量の低下又は乳酸産生率の低下はミトコンドリア機能の改善を示す。必要に応じて、乳酸産生量又は産生率は、本明細書に記載の組成物を使用しない対照と比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００又は２００％低下する。
【００７２】
本開示は、細胞内乳酸の低減を必要とする対象において細胞内乳酸を低減させる方法であって、開示組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法も提供する。本開示は、細胞内乳酸の低減を必要とする対象において細胞内乳酸を低減させるための開示組成物の使用を提供すると共に、細胞内乳酸の低減を必要とする対象において細胞内乳酸を低減させるための本明細書に記載の組成物も提供する。
【００７３】
乳酸をアッセイする様々な方法が当技術分野で知られている（例えば、実施例１に記載の方法）。蛍光検出４７、比色評価４８、又はアセトアルデヒドへの化学的転換４９を用いて細胞内乳酸をアッセイすることもできる。一実施形態では、細胞内乳酸は、本明細書に記載の組成物を使用しない対照と比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００又は２００％低減する。
【００７４】
本開示は、身体的労作からの回復の増強又は改善を必要とする対象において身体的労作からの回復を増強又は改善する方法であって、開示組成物の有効量を対象に投与する段階を含む方法を更に提供する。本開示は、労作からの身体的回復の増強又は改善を必要とする対象において労作からの身体的回復を増強又は改善するための開示組成物の使用も提供する。身体的労作からの回復を増強又は改善するための本明細書に記載の組成物も提供する。
【００７５】
本明細書で使用される「身体的回復を増強する」又は「身体的回復を改善する」という表現は、身体的労作後の対象の身体的状態における如何なる改善をも意味する。「身体的回復を増強する」という表現は、疲労の軽減、エネルギーの改善、筋肉疲労の軽減、筋肉痛の軽減、安静時心拍数及び安静時呼吸に戻るまでの時間の短縮、及び持久力の増加を包含し得るが、これらに限定されない。一実施形態では、身体的回復の尺度は、本明細書に記載の組成物を使用しない場合の身体的回復に比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００又は２００％増加する。一実施形態では、「身体的回復」とは、対象の生理状態が労作前と同様の生理状態に戻ることで特徴付けられる労作後の期間を意味する。一実施形態では、対象の労作後の「身体的回復」は、ピーク能力又は最適能力（パワー出力等）の回復を包含する。一実施形態では、「身体的回復」は、労作のストレスや強制後の筋骨格機能の回復、労作で使い切った保存エネルギーの回復、及び／又は細胞中及び／又は血中の乳酸／乳酸塩濃度の低下を包含する。一実施形態では、「身体的回復を改善する」とは、対象の生理状態及び／又は能力レベルが労作前と同様の生理状態及び／又は能力レベルに戻るのに必要な時間の短縮を意味する。
【００７６】
本明細書で使用される「身体的労作」という用語は、対象が身体的に疲労又は疲弊する原因となる如何なる活動（例えば、運動）をも意味する。身体的労作としては、有酸素活動、無酸素活動（例えば、筋力トレーニング）、持久力トレーニング、ストレッチング及び心肺運動が挙げられるが、これらに限定されない。身体的労作を引き起こし得る活動の例としては、ウォーキング、ランニング、水泳、ダンス、登山、及び団体競技や個人競技への参加が挙げられる。一実施形態では、身体的労作は、対象の安静時と比べて骨格筋によるエネルギーの消費が増加することを包含する。労作の生理学的特徴としては、心拍数の増加、呼吸数の増加、発汗、細胞中及び／又は血中の乳酸／乳酸塩濃度の上昇、及び／又は体温の上昇を挙げることができる。
【００７７】
開示組成物の他の方法及び使用としては、ミトコンドリアの有酸素容量と共に能力の回復の増強、無酸素性作業閾値までの時間の延長１９、疲労までの時間の遅延が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、組成物は、身体的回復を急がせる、痛みを最小限に抑える、及び／又は微小損傷の修復を促進するのに有用となり得る１、２０。組成物は、精神的敏捷性の向上、高齢時の能力の増強、及び受精状態の低下にミトコンドリアのエネルギー論が関与する場合には受精率の改善にも有用となり得る３。
【００７８】
本明細書に開示の組成物は、ヒトを含む生体及び動物に投与又は使用することができる。本明細書で使用される「対象」又は「動物」という用語は、動物界の如何なる一員をも意味し、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。
【００７９】
組成物の「有効量」の投与は、投与時及び所望の結果を得るのに必要な期間に亘って有効な量として定義される。例えば、組成物又は組成物の成分の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び重量等の因子や、その組成物又は成分が個体で所望の反応を引き起こす能力に応じて変わり得る。投与計画を調整して最適な治療反応を得ることができる。例えば、用量を数回に分けて毎日投与してもよく、治療状況の要件で示されるように用量を相対的に低減させてもよい。
【００８０】
対象による身体的又は精神的労作前、労作中及び／又は労作後に開示組成物を投与又は使用することができる。一実施形態では、対象による身体的又は精神的労作の２年、９０分、１時間、５０分、３０分又は２５分以内に本明細書に開示の組成物を投与する。
【００８１】
一態様では、身体的労作前、労作中及び労作後の本明細書に記載の組成物の使用は、身体的回復の改善に特に有効である。一実施形態では、労作後の回復を改善するため、身体的労作前、労作中及び労作後に同じ組成物を使用する。これに対し、身体的回復を試みて改善するため、対象は労作前、労作中及び労作後に前もって異なる組成物を使用することができる。一実施形態では、労作期間前、労作期間中及び労作期間後に同用量の組成物を対象に使用又は投与する。
【００８２】
従って、一実施形態では、労作期間後の対象における身体的回復を改善するための方法であって、
労作期間前、必要に応じて労作の３０分、１５分、１０分又は５分前に本明細書に記載の組成物の第１の用量を対象に投与する段階と、
労作期間中に本明細書に記載の組成物の第２の用量を対象に投与する段階と、
労作期間後、必要に応じて労作期間後３０分、１５分、１０分又は５分以内に本明細書に記載の組成物の第３の用量を対象に投与する段階とを含む方法を提供する。
【００８３】
労作期間後の対象における身体的回復を改善するための組成物の使用であって、労作前、必要に応じて労作の３０分、１５分、１０分又は５分前に本明細書に記載の組成物の第１の用量を使用することと、労作期間中に本明細書に記載の組成物の第２の用量を使用することと、必要に応じて労作期間後３０分、１５分、１０分又は５分以内に本明細書に記載の組成物の第３の用量を使用することとを含む使用も提供する。
【００８４】
一実施形態では、第１、第２及び第３の用量はクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。一実施形態では、第１、第２及び第３の用量は同じである。
【００８５】
一実施形態では、各用量は本明細書に記載の組成物を約５００ｍｇ〜７５００ｍｇ、約８００ｍｇ〜６０００ｍｇ、約８００ｍｇ〜５０００ｍｇ、約８００〜４８００ｍｇ、約８００〜４０００ｍｇ、約８００ｍｇ〜３２００ｍｇ、約８００〜２４００ｍｇ、約８００〜１６００ｍｇ又は約８００ｍｇ含む。
【００８６】
一実施形態では、各用量は１種以上の剤形、例えば、カプセル、錠剤又は摂取に適した他の剤形を含み、１５０〜２５０ｍｇのクエン酸、２５０〜３５０ｍｇのリンゴ酸、１５０〜２５０ｍｇのピルビン酸及び５０〜１５０ミリグラムのアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。一実施形態では、各用量は約２００ｍｇのクエン酸、約３００ｍｇのリンゴ酸、約２００ｍｇのピルビン酸及び約１００ミリグラムのアスコルビン酸を含むか、本質的にこれらで構成されるか、又はこれらのみで構成される。
【００８７】
以下の非限定的実施例は本開示を説明するものである。
実施例１
【００８８】
各種クレブス回路中間体の効果を、試験時にコンフルエントになるように新たに播種した初代ＢＨＫ細胞を用いた細胞培養モデルで試験した。ｐＨ変化を緩衝するリン酸緩衝食塩水中で調製した試験基質（ｎ＝３）を培養物に添加した。プロトコルとしては、Ｍｅｒａｎｔｅら、１９９８１８が提示したプロトコルの修正版が有効であった。乳酸濃度は基本的にはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ乳酸アッセイ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｂｉｏｐｈａｒｍ．ｃｏｍ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／４０５０／Ｌａｃｔｉｃ−ａｃｉｄ−Ｌ＿ＥＮ＿１０１３９０８４０３５＿２０１３−０３．ｐｄｆ）で提示されたように求めた。
【００８９】
即ち、細胞培養上清を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中で保持して細胞内グリコーゲン貯蔵を枯渇させた。インキュベーション後、試験基質を培養物に添加した。各々の濃度は次の通りであった。１ｍＭグルコース、０．５ｍＭグルコース＋０．５ｍＭリンゴ酸、０．５ｍＭグルコース＋０．５ｍＭクエン酸、０．５ｍＭグルコース＋０．５ｍＭピルビン酸、０．５ｍＭグルコース＋０．５ｍＭコハク酸、０．５ｍＭグルコース＋０．５ｍＭアスコルビン酸、及びグルコース非存在下での基質の組み合わせ（各々０．２ｍＭのピルビン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸及びアスコルビン酸）。基質を細胞と共に３０分間インキュベートし、インキュベーション後、培養上清を回収して酵素的な乳酸の定量に備えた。タンパク質含量を標準的な技法（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ）によって求め、試験した条件当たりの乳酸産生率を計算した。
【００９０】
グルコースの存在下でも、細胞をクレブス回路基質と共にインキュベートすると乳酸濃度が低下する傾向が見られた。しかし、Ｔ検定分析で有意な（＊）乳酸低下が見られたのは、グルコース＋コハク酸を含む試験基質（ｐ＝０．０３）とグルコース非存在下のピルビン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸及びアスコルビン酸の組み合わせ（ｐ＝０．０１６）のみであった。注目すべきことに、ピルビン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸及びアスコルビン酸の組み合わせで最大の乳酸低下が示された。
【００９１】
ＢＨＫ細胞は不死化細胞株であり、高解糖作用を有する。従って、初代細胞系又は全生物では代謝増強の傾向と有意性がより顕著となり得る。理論によって拘束されるものではないが、これらの結果から、ミトコンドリアクエン酸回路及びミトコンドリア呼吸鎖によるフラックスの低下の重要な指標１８である乳酸の低減で例示されるミトコンドリア機能の改善を介し、重要な代謝中間体が細胞能力の向上を促進し得ることが分かる。特に、ピルビン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸及びアスコルビン酸の組み合わせがミトコンドリア機能の改善と乳酸値の低下に対して有意な効果を示すことが分かる。抗酸化剤としての役割とミトコンドリアを活性化し得る役割に加えて、アスコルビン酸は、食事からの鉄の吸収を促進するような食事に関する役割を果たすと共に、組織酸素化の改善に寄与する鉄代謝の増強をもたらし得る５０。
【００９２】
図１に示すように、クレブス回路基質を細胞に添加すると、グルコースが存在していても乳酸の産生が低下する傾向が見られたが、これはミトコンドリアクエン酸回路及び／又はミトコンドリア呼吸鎖によるフラックスの持続及び／又は改善を示唆する。
実施例２
材料及び方法
【００９３】
最小必須培地（ＭＥＭ）＋１０％ウシ血清を含む６ウェルプレート中でＣ２Ｃ１２筋細胞をコンフルエントになるまで増殖させた。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＰＢＳ中３７℃で３０分間インキュベートして細胞内グリコーゲンを枯渇させた。インキュベーション後、ＰＢＳを除去し、１ｍＬの各基質（１ｍＭ）（各条件に対しｎ＝６）で置換した。「全て」と記された条件には、リンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸及びアスコルビン酸全て（１ｍＭ）と必要に応じてグルコース（１ｍＭ）が含まれる。インキュベーションを３７℃で３０分間行った後、５０μＬの１．６Ｍ過塩素酸を添加して代謝を停止させ、上清を除去し、即座に冷凍した。
【００９４】
インキュベーション期間中に培養上清内で産生した乳酸の量を酵素的に求め、細胞内総タンパク質量と相関させて乳酸産生率（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ）を求めた。
結果
【００９５】
図２に示すように、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸基質に関して乳酸産生に有意差が見られた（＊ｐ＜０．０５（ｔ検定による）、全て＋グルコースとの比較）。このことは、上述の成分によって乳酸値が調節され、最も重要なことには、グルコースが存在しても「全て」の条件で示されるこれらの成分の組み合わせによって乳酸が低減することを示しており、これはミトコンドリアクエン酸回路及び／又は酸化的代謝によるフラックスの増加を示唆する。１ｍＭのリンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸及びアスコルビン酸を存在させず同一条件下でグルコースのみにＣ２Ｃ１２細胞を曝露させた結果、細胞が培養プレートから剥離し、細胞死を含む代謝ストレスの徴候を示した。
実施例３
【００９６】
トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路中間体とアスコルビン酸から成る製剤の能力に対する効果を評価するため、能力の高い運動選手に対して６ヶ月間に亘って研究を行った。この製剤を使用することによって回復とピークパワー出力に改善が見られた。
材料及び方法
【００９７】
重量挙げ選手として１１年間活動している２６歳の男性を対象とした。クエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸及びアスコルビン酸を含むカプセルを対象に供給した。各カプセルには２００ミリグラムのクエン酸、３００ミリグラムのリンゴ酸、２００ミリグラムのピルビン酸及び１００ミリグラムのアスコルビン酸が含まれていた。
【００９８】
デッドリフト、スクワット及びベンチプレスについて対象の能力を６ヶ月間に亘って評価した。本明細書に記載の製剤の使用以外、対象の食事や栄養補助食品に使用に関する変更は６ヶ月間なされなかった。自動調節を用いて運動強度と運動量を変えた。
【００９９】
各トレーニングセッションの１５分前、トレーニング中及びトレーニング直後に対象は３用量（カプセル）（各々がおよそ８００ｍｇ）を摂取した。
結果
デッドリフト
【０１００】
トレーニング可能な１８７日間の内、対象は７４回のデッドリフトセッションをこなし、１週当たり平均２．８回のデッドリフトセッションを行った。これらのセッションの内、３６回で１回のヘビーリフトまで行い、その結果、自己新記録を８回出した。図３に示すように、製剤を使用した６ヶ月間に亘り、対象はデッドリフト能力で一貫した改善を示した。
スクワット
【０１０１】
トレーニング可能な１８７日間の内、対象は４１回のスクワットセッションをこなし、１週当たり平均１．５回のスクワットセッションを行った。これらのセッションの内、２０回で１回のヘビースクワットまで行い、その結果、自己新記録を１０回出した。図４に示すように、製剤を使用した６ヶ月間に亘り、対象はスクワット能力で有意な向上を示した。
ベンチプレス
【０１０２】
トレーニング可能な１８７日間の内、対象は６０回のベンチプレスセッションをこなし、１週当たり平均２．２回のベンチプレスセッションを行った。これらのセッションの内、２９回で１回のヘビーリフトまで行い、その結果、自己新記録を１０回出した。図５に示すように、製剤を使用した６ヶ月間に亘り、対象はスクワット能力で有意な向上を示した。
能力及び回復に対する総合的効果
【０１０３】
製剤を使用した場合には、製剤を使用しなかった以前のトレーニングに比べて、トレーニングセッション中のセット間及びトレーニングセッション間の両方において回復が有意に改善したと対象は報告した。また、製剤使用後に見られる回復の改善によって、１ヶ月のトレーニング日数を増やすことができたと対象は報告した。具体的には、製剤を使用しなかった以前の６ヶ月のトレーニング期間と比べて、研究期間中にヘビーリフトトレーニングの日数を２０〜３０日増やすことができたと対象は報告した。
【０１０４】
１回のヘビーリフトのピークの上昇が見られたことからも実証されるように、製剤の使用によってピークパワー出力に対しても有意な効果がもたらされた。
実施例４
【０１０５】
重量挙げを２年半行っていて国内レベルで競技している２２歳の男性（２０５ポンド）に対する組成物の効果を評価した。
【０１０６】
各カプセルには２００ミリグラムのクエン酸、３００ミリグラムのリンゴ酸、２００ミリグラムのピルビン酸及び１００ミリグラムのアスコルビン酸が含まれていた。
【０１０７】
対象は重量挙げ選手として週に４回、１セッション当たり２〜３時間のトレーニングを行った。対象はトレーニング前に５カプセル、トレーニング中に５カプセル、トレーニング後に５カプセルを摂取した。対象は組成物を１ヶ月間使用した。
結果
【０１０８】
組成物を使用しなかった以前のトレーニングセッションと比べて、トレーニング翌日の痛みが抑えられたと対象は報告した。回復時間が組成物を使用する最大の利点であると対象は指摘した。また、セット間の休憩時間の短縮、運動能力の向上、そして１週間当たりの容量負荷（持ち上げる重量）の増加率が以前よりも早くなったことについても対象は報告した。回復時間の改善、ヘビーリフトがより頻繁にできるようになったこと、そして１週間当たりのスクワット、ベンチプレス及びデッドリフトを行う時間がカプセルを使用する前と比べて２倍近くになったことについて対象は報告した。
実施例５
【０１０９】
本明細書に記載の２００ミリグラムのクエン酸、３００ミリグラムのリンゴ酸、２００ミリグラムのピルビン酸及び１００ミリグラムのアスコルビン酸を含むカプセルの試験をリフティング／パワートレーニングに従事している更なる対象で行った。
【０１１０】
対象１は運動前に５カプセル（４グラム）、運動中に５カプセル、運動直後に５カプセルを摂取した。対象はカプセルによって「回復が持続し生理的に「フレッシュ」な状態が持続した」と報告しており、更に「疲労を残さずに回復することによって、計画に従って、その日の所定の量と強度をこなすことができ、自分の能力が継続的に向上し、自分のトレーニングを継続的に進めるのに役立つ」と報告した。
【０１１１】
対象２は運動前に５カプセル（４グラム）を摂取した。対象２は、「私は空手のトレーニングを２６年間、週に６日行っている。（カプセルによって）回復が早くなり、強度が向上し、エネルギーが改善する。また、トレーニング時間が約６０％増え、遅発性筋肉痛の症状がない」と報告した。
【０１１２】
対象３は運動前に３カプセル（２．４グラム）、運動中に３カプセル（２．４グラム）、運動後に３カプセル（２．４グラム）を摂取した。対象３は「私の目標は、自己最高記録を出し、ジムで自分の時間を楽しむことである。（カプセルは）私が優れた運動選手として必要な強み、即ち、持久力及び回復の向上、筋肉痛の抑制、運動セット間の休憩時間の短縮、より爆発的な力を得るのに役立った」と報告した。
【０１１３】
対象４は運動前に４カプセル（３，２グラム）、運動後に４カプセル（３．２グラム）を摂取した。対象４は、「私は常に１回の最大６５〜８５％、中〜高強度でトレーニングする傾向にある。私のトレーニング目標は、継続してより強くなり、けがをしないようにして、毎年自分の総量にウエイトを無制限に加えることである。（カプセルを）摂取すると、製品に刺激物が入っていなくてもエネルギーが持続的に放出されることが分かり、セッションを通じて努力を惜しまずにトレーニングすることができる。私の回復は（カプセルを）常に摂取する際に考えるものではないが、（カプセルの）摂取を忘れると回復時の痛みに気づく」と報告した。
実施例６
【０１１４】
本明細書に記載の２００ミリグラムのクエン酸、３００ミリグラムのリンゴ酸、２００ミリグラムのピルビン酸及び１００ミリグラムのアスコルビン酸を含む組成物を更なる対象において次の３条件下で試験した。（１）水のみで摂取、（２）グルコースと共に摂取、及び（３）タンパク質粉末等のタンパク質製剤又はアミノ酸と共に摂取。
【０１１５】
「乳酸」閾値まで又はそれを超えるまで運動するように対象に要請した。乳酸閾値は筋肉が燃焼する程度〜運動選手がこれ以上運動を続けることができない程度として定義した。
【０１１６】
条件１（水のみで摂取）の組成物は、条件２（グルコースと共に摂取）の組成物よりも良い結果を示し、条件３（タンパク質粉末等のタンパク質製剤又はアミノ酸と共に摂取）の組成物よりも良い結果を示した。
【０１１７】
能力の増分は２０％〜５０％の範囲で差があった。
【０１１８】
これらのインビボでの結果は培養筋細胞を用いてインビトロで行った実験を反映しており、グリコーゲン貯蔵を枯渇させてグルコースを再供給すると、ミトコンドリアストレスの増加に起因する可能性の高い不健康な細胞代謝状態がもたらされた。
【０１１９】
現在好ましいと考えられる実施例を参照しながら本開示について説明してきたが、本開示がここに開示された実施例に限定されないことを理解されたい。逆に、本開示は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる様々な変形例と均等物を網羅することを意図する。
【０１２０】
本明細書に記載の刊行物、特許及び特許出願はいずれも、各々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別的にその全体が参照によって組み込まれることが示された場合と同程度に、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１２１】
参考文献一覧
【表１】
2019505593.tif 000003
2019505593.tif 000004
2019505593.tif 000005
2019505593.tif 000006
2019505593.tif 000007
2019505593.tif 000008
【図１】
2019505593.tif 000009
【図２】
2019505593.tif 000010
【図３】
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【図４】
2019505593.tif 000012
【図５】
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【図６】
2019505593.tif 000014
【国際調査報告】
2019505593.tif 000015
2019505593.tif 000016
2019505593.tif 000017
2019505593.tif 000018