(57)【要約】  本発明は、セルラーゼ調節因子1(CLR1)の活性を低減又は消失させ、組換えポリペプチドを発現するように遺伝子改変された糸状菌において組換えポリペプチドを生産する方法に関する。方法は更に、CLR1の活性を低減又は消失させるように遺伝子改変された糸状菌ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、並びに、組換えポリペプチドの生産におけるこの糸状菌の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼ調節因子1(CLR1)の活性を、同じ条件下で培養された、遺伝子改変を有しない糸状菌と比較して低減又は消失させるように遺伝子改変され、組換えポリペプチドを発現するように更に遺伝子改変された糸状菌において前記組換えポリペプチドを生産する方法であって、前記組換えポリペプチドが、CLR1によって活性化可能でないプロモーターの制御下で発現され、前記方法が、
(i)CLR1活性を誘導できるセルロース又はそのいずれかの誘導体を含有しない培養培地中で前記遺伝子改変された糸状菌を増殖させること、及び
(ii)前記培養培地から前記組換えポリペプチドを単離すること
を含む方法。
【請求項２】
前記糸状菌が、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
糸状菌内のセルラーゼ調節因子1(CLR1)の活性を、同じ条件下で培養された、遺伝子改変を有しない糸状菌と比較して低減又は消失させるように遺伝子改変され、組換えポリペプチドを発現するように更に遺伝子改変された、糸状菌ミセリオフトラ・サーモフィラであって、前記組換えポリペプチドが、CLR1によって活性化可能でないプロモーターの制御下で発現される、糸状菌。
【請求項４】
前記組換えポリペプチドが、前記糸状菌に対して異種性のポリペプチドである、請求項1若しくは2に記載の方法又は請求項3に記載の糸状菌。
【請求項５】
前記組換えポリペプチドがヒドロラーゼである、請求項1、2若しくは4のいずれか一項に記載の方法、又は請求項3若しくは4に記載の糸状菌。
【請求項６】
前記遺伝子改変された糸状菌が、前記遺伝子改変された糸状菌と同じ条件下で培養された、前記遺伝子改変を有しない糸状菌よりも高い純度で前記組換えポリペプチドを蓄積できる、請求項1、2、4若しくは5のいずれか一項に記載の方法、又は請求項3〜5のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項７】
前記CLR1の活性の低減又は消失が、CLR1タンパク質をコードする核酸分子の発現の低下又は消失によるものである、請求項1、2若しくは4〜6のいずれか一項に記載の方法又は請求項3〜6のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項８】
前記CLR1タンパク質をコードする前記核酸分子が、
(a)配列番号1若しくは2の核酸配列又はその機能的部分、
(b)配列番号3のポリペプチドをコードする核酸配列又はその機能的部分、及び
(c)CLR1活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号1若しくは2の核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項7に記載の方法又は糸状菌。
【請求項９】
前記糸状菌が少なくとも1つの付加的遺伝子改変を含む、請求項1、2若しくは4〜8のいずれか一項に記載の方法、又は請求項3〜8のいずれか一項に記載の糸状菌。
【請求項１０】
前記少なくとも1つの付加的遺伝子改変が、転写因子及び/又はプロテアーゼの活性を低減又は消失させる、請求項9に記載の方法又は糸状菌。
【請求項１１】
前記転写因子がキシラナーゼ調節因子1(XYR1)である、請求項10に記載の方法又は糸状菌。
【請求項１２】
前記プロテアーゼがアルカリプロテアーゼ1(ALP1)である、請求項10又は11に記載の方法又は糸状菌。
【請求項１３】
糸状菌において生産される組換えポリペプチドの純度及び/又は量を増大させるための、CLR1の活性を低減又は消失させる核酸構築物の使用。
【請求項１４】
CLR1タンパク質をコードする核酸分子の発現の低下によりCLR1の活性が低減する、請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
前記CLR1タンパク質をコードする核酸分子が、
(a)配列番号1若しくは2の核酸配列又はその機能的部分、
(b)配列番号3のポリペプチドをコードする核酸配列又はその機能的部分、及び
(c)CLR1活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号1若しくは2の核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項13又は14に記載の使用。
【請求項１６】
組換えポリペプチドの生産のための、請求項3〜12のいずれか一項で定義される糸状菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼ調節因子1(CLR1)の活性を低減又は消失させ、組換えポリペプチドを発現するように遺伝子改変された糸状菌において前記組換えポリペプチドを生産する方法に関する。方法は更に、CLR1の活性を低減又は消失させるように遺伝子改変された糸状菌ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、並びに、組換えポリペプチドの生産におけるこの糸状菌の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌は、様々なタンパク質の生産のための優れた宿主であることが示されている。アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)及びミセリオフトラ(Myceliophthora)などの真菌株は、それらが発酵培養液中に大量のタンパク質を分泌できるため、広範囲にわたる酵素の工業的生産に適用されている。これらの真菌のタンパク質の分泌能力のため、それらは、特定の酵素又は酵素混合物の標的化された生産のための好ましい宿主とされる。しかしながら、典型的には、これらの宿主は様々な酵素の混合物を分泌するため、粗タンパク質産物が不明確となり、所望のタンパク質のための複雑な精製スキームが必要となる。標的酵素をコードする遺伝子が遺伝子改変によって過剰発現する場合でさえ、標的酵素は、総ての分泌されたタンパク質のほんの一部を構成するに過ぎない。
【０００３】
したがって、高いレベルの他のタンパク質がなく、特定の酵素を多量に分泌させることを可能とする真菌生産系を提供することは非常に望ましい。
【０００４】
そのような生産系は、比較的純粋な酵素の生産及び所望の酵素の簡略化されたラージスケール精製を可能にする。生産された酵素は、例えば、食品及び飼料用途、洗剤又はホームケア、並びに植物バイオマス加水分解(バイオ系燃料及び化学物質)、織物仕上げ及び紙パルプ産業など、様々な用途で使用できる。
【０００５】
WO 2010/107303 A2は、ミセリオフトラ・サーモフィラ株の紫外線による突然変異誘発による内因性セルラーゼ及びプロテアーゼの生産量の少ない分離株の取得を記載している。Visser et al. (2011) Industrial Biotechnology 7(3): 214-223頁は、セルラーゼ生産能のほぼ総てを喪失したLC(低セルラーゼ)株と呼ばれるミセリオフトラ・サーモフィラ株を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
それにもかかわらず、糸状菌における組換えポリペプチドを生産するための効率的方法の必要が未だある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、この必要に応えるものである。本発明者らは、驚くことに、ミセリオフトラ・サーモフィラなどの糸状菌におけるセルラーゼ調節因子1(CLR1)活性を低減させることにより、高い純度で組換えポリペプチドを生産する能力を有する株が得られることを見出した。
【０００８】
よって、一態様において、本発明は、CLR1の活性を、同じ条件下で培養された、遺伝子改変を有しない糸状菌と比較して低減又は消失させるように遺伝子改変され、組換えポリペプチドを発現するように更に遺伝子改変された糸状菌において前記組換えポリペプチドを生産する方法であって、組換えポリペプチドが、CLR1によって活性化可能でないプロモーターの制御下で発現され、前記方法が、
(i)CLR1活性を誘導できるセルロース又はそのセルロース誘導体を含有しない培養培地中で前記遺伝子改変された糸状菌を増殖させること、及び
(ii)培養培地から組換えポリペプチドを単離すること
を含む方法を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、CLR1の活性を、同じ条件下で培養された、遺伝子改変を有しない糸状菌と比較して低減又は消失させるように遺伝子改変され、組換えポリペプチドを発現するように更に遺伝子改変された糸状菌において前記組換えポリペプチドを生産する方法であって、組換えポリペプチドが、CLR1によって活性化可能でないプロモーターの制御下で発現され、前記方法が、
(i)CLR1活性を誘導できるセルロース又はそのセルロース誘導体を含有しない培養培地中で前記遺伝子改変された糸状菌を増殖させること、及び
(ii)培養培地から組換えポリペプチドを単離すること
を含む方法を提供する。
【００１０】
糸状菌は、ミセリオフトラ・サーモフィラとすることができる。
【００１１】
別の態様において、本発明は、糸状菌内のCLR1の活性を、同じ条件下で培養された、遺伝子改変を有しない糸状菌と比較して低減又は消失させるように遺伝子改変され、組換えポリペプチドを発現するように更に遺伝子改変された、糸状菌ミセリオフトラ・サーモフィラであって、組換えポリペプチドが、CLR1によって活性化可能でないプロモーターの制御下で発現される、糸状菌に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、糸状菌内のCLR1の活性を、同じ条件下で培養された、遺伝子改変を有しない糸状菌と比較して低減又は消失させるように遺伝子改変され、組換えポリペプチドを発現するように更に遺伝子改変された、糸状菌ミセリオフトラ・サーモフィラであって、組換えポリペプチドが、CLR1によって活性化可能でないプロモーターの制御下で発現される、糸状菌に関する。
【００１３】
組換えポリペプチドは、異種ポリペプチドとすることができる。
【００１４】
本発明の方法又は糸状菌の一実施形態において、組換えポリペプチドは、ヒドロラーゼである。
【００１５】
一実施形態において、前記遺伝子改変された糸状菌は、遺伝子改変された糸状菌と同じ条件下で培養された、遺伝子改変を有しない前記糸状菌より高い純度で組換えポリペプチドを蓄積できる。
【００１６】
CLR1の活性の低減又は消失は、CLR1タンパク質をコードする核酸分子の発現の低下又は消失によるものであり得る。
【００１７】
一実施形態において、CLR1タンパク質をコードする核酸分子は、以下からなる群から選択される核酸配列を含む:
(a)配列番号1若しくは2の核酸配列又はその機能的部分、
(b)配列番号3のポリペプチドをコードする核酸配列又はその機能的部分、及び
(c)CLR1活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号1若しくは2の核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列。
【００１８】
前記糸状菌は、少なくとも1つの付加的遺伝子改変を含んでもよい。
【００１９】
少なくとも1つの付加的遺伝子改変は、CLR1以外の転写因子、好ましくはキシラナーゼ調節因子1(XYR1)の活性を低減又は消失させるものであってもよい。更に、又はその代わりに、少なくとも1つの付加的遺伝子改変は、プロテアーゼ、好ましくはアルカリプロテアーゼ1(ALP1)の活性を低減又は消失させるものであってもよい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、糸状菌において生産される組換えポリペプチドの純度及び/又は量を増大させるための、CLR1の活性を低減又は消失させる核酸構築物の使用に関する。
【００２１】
CLR1タンパク質をコードする核酸分子の発現の低下によって、CLR1の活性を低減させることができる。
【００２２】
一実施形態において、CLR1タンパク質をコードする核酸分子は、以下からなる群から選択される核酸配列を含む:
(a)配列番号1若しくは2の核酸配列又はその機能的部分、
(b)配列番号3のポリペプチドをコードする核酸配列又はその機能的部分、及び
(c)CLR1活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号1若しくは2の核酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸配列。
【００２３】
更に別の態様において、本発明は、組換えポリペプチドの生産のための、本明細書で定義される糸状菌の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、親株(HC-manT、白四角)及びclr1遺伝子が欠失した株(HC_manT_Δclr1#α、黒丸)における、全マンナナーゼ比活性(U/mgタンパク質)を示す。タンパク質は培養中の幾つかの異なる時点で得た。
【図２】図2は、親株HC_manT及びclr1欠失株HC_manT_Δclr1#αの発酵サンプルから得た上清のSDS-PAGE分析を示す。等量の総タンパク質をロードした。
【図３】図3は、clr1欠失株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δclr1#αから得た等量の上清を用いた、親株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70との比較によるSDS-PAGE分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、CLR1の活性を低減又は消失させ、組換えポリペプチドを発現するように遺伝子改変された糸状菌において組換えポリペプチドを生産可能とする改良された手段及び方法に関する。
【００２６】
本発明は、特定の実施形態に関して記載されるが、この記載は限定の意味で解釈されるべきでない。
【００２７】
本発明の詳細な例示的実施形態において記載する前に、本発明を理解するために重要な定義を与える。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「1つ(a)」及び1つ(an)」は、そうではないことが明示されない限り、各複数形も含む。本発明の文脈で、用語「約」及び「およそ」は、当業者が問題の特徴の技術的効果をなお保証すると理解する精度の間隔を表す。用語は一般に、示された数値からの±20%、好ましくは±15%、より好ましくは±10%、いっそうより好ましくは±5%の偏差を示す。用語「含む」は、限定されないと理解されるべきである。本発明の目的では、用語「からなる」は、用語「含む」の好ましい実施形態であると見なされる。以下、群が少なくとも特定の数の実施形態を含むように定義されれば、これは、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群を包含することも意味する。更に、明細書及び特許請求の範囲における用語「第1」、「第2」、「第3」、又は「(a)」、「(b)」、「(c)」、「(d)」などは、同様の要素間を区別するために使用され、必ずしも連番又は時系列順を記載するためのものではない。そのように使用される用語は、適当な状況下で互換的であり、本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載又は例示される以外の順序で操作が可能であると理解されるべきである。用語「第1」、「第2」、「第3」、又は「(a)」、「(b)」、「(c)」、「(d)」、「i」、「ii」などは方法又は使用又はアッセイに関し、適時又は工程間の時間間隔の一貫性は無く、すなわち、これらの工程は同時に行ってもよいし、又は本明細書において特に断りのない限り、本明細書の上記又は下記に示されるように、そのような工程間の秒、分、時間、日、週、月又は更には年の時間間隔があってもよい。本発明は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、試薬などは変更可能であるので、これらに限定されないと理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語及び科学用語は、当業者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２８】
上記に示されたように、本発明は、一態様において、CLR1の活性を、遺伝子改変された糸状菌と同じ条件下で培養された、遺伝子改変を有しない糸状菌と比較して低減又は消失させるように遺伝子改変され、組換えポリペプチドを発現するように更に遺伝子改変された糸状菌において組換えポリペプチドを生産する方法であって、
(i)好適な培養培地において、前記遺伝子改変された糸状菌を増殖させること、及び
(ii)培養培地から組換えポリペプチドを単離することと
を含む方法に関する。
【００２９】
本明細書中で使用する「組換えポリペプチド」という用語は、組換え手段によって、すなわち、核酸分子によってコードされる組換えポリペプチドの発現を司る核酸分子による宿主細胞の形質転換によって、宿主細胞において生産されるあらゆるポリペプチドを意味する。一態様において、組換えポリペプチドは、その生産のために使用する細胞によって、天然に発現されるポリペプチドであるが、非形質転換の宿主細胞における量よりも多量に発現される。そのようなポリペプチドは「同種ポリペプチド」とも称される。別の態様において、組換えポリペプチドは、その生産に使用する細胞によって天然には発現されず、形質転換された宿主細胞においてのみ検出可能である。そのようなポリペプチドは「異種ポリペプチド」とも称される。好ましくは、組換えポリペプチドは異種ポリペプチドである。
【００３０】
本発明において、組換えポリペプチドは、組換えヒドロラーゼであってもよい。ヒドロラーゼは、化学結合の加水分解を触媒する酵素である。ヒドロラーゼの例は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ及びペプチダーゼであり、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ及びプロテアーゼが含まれる。リパーゼは、脂質におけるカルボン酸とアルコールとの間のエステル結合を加水分解し、ホスファターゼは同様にリン酸エステルに作用する。ヌクレアーゼは、核酸を加水分解するホスファターゼである。グリコシダーゼは、炭水化物における糖分子間の結合を加水分解する。プロテアーゼは、タンパク質分子中の、一方のアミノ酸のカルボン酸基ともう一方のアミノ基との間のペプチド結合を加水分解する。
【００３１】
グリコシダーゼには、グルコシドの加水分解を触媒するグルコシダーゼ、及びキシロースベースのホモポリマーであるキシランの切断を触媒するキシラナーゼが含まれる。グルコシダーゼの具体例としては、マンナナーゼ、ラクターゼ、ラミナリナーゼ(laminaridase)、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キチナーゼ、サッカラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ、リゾチーム、セルラーゼ及びヘミセルラーゼが挙げられる。
【００３２】
一実施形態において、組換えポリペプチドは、セルラーゼ以外のヒドロラーゼである。
【００３３】
一実施形態において、組換えポリペプチドは、プロモーターの制御下で発現され、すなわち、組換えポリペプチドをコードする核酸配列が前記プロモーターに機能的に連結されるが、このプロモーターは遺伝子改変された糸状菌において機能し、CLR1によって活性化可能でない。CLR1によって活性化される遺伝子であって、これらの遺伝子のプロモーターが本発明の組換えポリペプチドの発現調節に適さない遺伝子は、clr突然変異体において誘導を示さなかった遺伝子として、WO 2013/022594 A1の表1Aにおいて開示される。WO 2013/022594 A1の表1Aにおいて開示される遺伝子には、アミノ酸代謝に関与する遺伝子、セルラーゼ及びヘミセルラーゼ、並びにオリゴ糖及び多糖の分解に関与する他の酵素をコードする遺伝子、デルタアミノレブリン酸デヒドラターゼ、5-アミノレブリン酸シンターゼ、ピリドキサミンリン酸オキシダーゼ、ガラクトキナーゼ、リパーゼ、核分離タンパク質、ドリチルリン酸β-グルコシルトランスフェラーゼ、ミトコンドリアDNA複製タンパク質YHM2、ミトコンドリア内膜プロテアーゼサブユニット2、核伸長及び変形タンパク質1、被時計制御(clock-controlled)フェロモンCCG-4、カルシウムホメオスタシスタンパク質レグカルシン(Regucalcin)エンドチアペプシン、をコードする遺伝子、ヌクレオチド代謝、タンパク質のフォールディング、タンパク質の修飾、rRNA生産、トランスロケーション及び輸送に関与する遺伝子、転写因子が含まれる。
【００３４】
当業者はまた、プロモーターがCLR1によって活性化されるか否かを容易に決定できる。この目的において、試験に供されるプロモーターを、リポータータンパク質(例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質又はβ-グルクロニダーゼ)をコードする核酸配列に機能的に連結し、clr1欠乏宿主細胞に形質転換できる。リポータータンパク質の発現の低下がclr1欠乏宿主細胞において50%未満の場合、プロモーターはCLR1によって活性化されず、従って、遺伝子改変された宿主細胞における組換えポリペプチドの発現に使用できる。リポータータンパク質の発現の低下がclr1欠乏宿主細胞において50%以上の場合、プロモーターはCLR1によって活性化され、従って、遺伝子改変された宿主細胞における組換えポリペプチドの発現に適さない。
【００３５】
CLR1によって発現が活性化されない遺伝子を表1に列記する。これらの遺伝子のプロモーターは、組換えポリペプチドの発現に使用できる。CLR1によって発現が活性化される遺伝子を表2に列挙する。これらの遺伝子のプロモーターは、本発明の組換えポリペプチドの発現に適さない。
【００３６】
【表１】
2019501646.tif 000002
2019501646.tif 000003
2019501646.tif 000004
【００３７】
【表２】
2019501646.tif 000005
2019501646.tif 000006
2019501646.tif 000007
【００３８】
組換えポリペプチドの発現のために使用できる好適なプロモーターとしては、配列番号11のchi1遺伝子プロモーター及び配列番号12の伸長因子1-α遺伝子のプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターは、WO 2010/107303 A2において開示され、hex1プロモーター、his2aプロモーター及びglaプロモーターが含まれる。前述のプロモーターはすべてCLR1によって活性化可能ではない。
【００３９】
当業者であれば、組換えポリペプチドの発現のために典型的に使用できる他の好適なプロモーターを知っている。これらのプロモーターとしては、他の糸状菌由来のプロモーター、例えばアスペルギルス(Aspergillus)属、フザリウム(Fusarium)属、フミコラ(Humicola)属、ミセリオフトラ(Myceliophthora)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ペニシリウム(Penicillium)属、タラロミセス(Talaromyces)属及びトリコデルマ(Trichoderma)属の糸状菌由来の、gpd(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)、pdc(ピルビン酸デカルボキシラーゼ)、eno(エノラーゼ)、trpC(トリプトファン生合成タンパク質)、pda(ピルビン酸デヒドロゲナーゼ)、glaA(グルコアミラーゼ)、tpi(トリオースリン酸イソメラーゼ)、icl(イソクエン酸リアーゼ)、tef1(伸長因子1)及びkdh(ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ)プロモーターなどが挙げられる。
【００４０】
組換えタンパク質の発現に使用する発現構築物は、組換えポリペプチドの培養培地への分泌を可能にするシグナルペプチドをコードする核酸配列、及び糸状菌において機能を有する1つ以上のターミネーターなどの、更なる要素を含んでもよい。
【００４１】
宿主細胞は、ゲノム中に、前記組換えポリペプチドをコードする核酸配列の2以上のコピーを含みうる。
【００４２】
例えば、組換えポリペプチドの発現は、更なる実施形態において、コドン使用頻度の最適化により、例えば、組換えポリペプチドをコードする核酸配列のコドン使用を、その生物において最もよく転写若しくは発現されるか、又は最も発現の高い(βアクチン若しくはβチューブリンなどのハウスキーピング遺伝子と比較して)遺伝子のコドン使用に適合させることによって、導かれ得る。そのような発現の高い遺伝子のコドン使用の例は、糸状菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラの5、10、15、20、25若しくは30又はそれを超える最も発現の高い遺伝子の群のコドン使用を含み得る。
【００４３】
過剰発現は更に、糸状菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラの転写遺伝子の総て又はほとんど総て、又は90%又は80%又は75%、又は70%において全体的コドン使用に関してコドン使用を最適化することによって達成され得る。そのようなアプローチは、遺伝子のコドン使用の調査及び糸状菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラのゲノム配列、特に、前記生物の注釈付きゲノム配列に由来し得るようなその全体的コドン使用との比較を含み得る。
【００４４】
遺伝子改変された糸状菌における組換えポリペプチドの発現は、ウエスタンブロット、ノザンブロット及びRT-PCRなどの当技術分野で公知の任意の方法によって検出及び定量化し得る。組換えポリペプチドが酵素である場合、その発現は、酵素活性を測定することによって検出してもよい。フィターゼ及びマンナナーゼ活性を決定するための好適なアッセイは、本明細書の実施例のセクションに記載されている。
【００４５】
本明細書中で使用する「糸状菌」という用語は、Eumycotina及びOomycota亜門の総ての糸状の真核微生物(Hawksworth et al Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi. 8th edn. CAB International, Wallingfordに記載)を意味する。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される細胞壁を特徴とする。菌糸の伸長によって、栄養成長が行われ、炭素異化は絶対好気的である。糸状菌の菌株としては、限定されないが、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギルス属、アガリクス(Agaricus)属、アウレオバシディウム(Aureobasidium)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、コリナスクス(Corynascus)属、クリソスポリウム(Chrysosporium)属、フィリバシディウム(Filibasidium)属、フザリウム属、フミコラ属、マグナポルテ(Magnaporthe)属、モナスクス(Monascus)属、ムコル(Mucor)属、ミセリオフトラ属、モルティエレラ(Mortierella)属、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)属、ニューロスポラ属、パエシロミセス(Paecilomyces)属、ペニシリウム属、ピロミセス(Piromyces)属、ファネロカエテ(Phanerochaete)属、ポドスポラ(Podospora)属、ピクノポラス(Pycnoporus)属、リゾプス(Rhizopus)属、シゾフィラム(Schizophyllum)属、ソルダリア(Sordaria)属、タラロミセス属、ラサムソニア(Rasamsonia)属、テルモアスクス(Thermoascus)属、チエラビア(Thielavia)属、トリポクラディウム(Tolypocladium)属、トラメテス(Trametes)属及びトリコデルマ属の菌株が挙げられる。本発明において使用できる好ましい糸状菌の株は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・フミガトゥス(Aspergillus fumigatus)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)、アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)、ラサムソニア・エメルソニ(Rasamsonia emersonii、以前はタラロミセス・エメルソニ(Talaromyces emersonii)として公知)、アスペルギルス・ソヤエ(Aspergillus sojae)及びミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophtora thermophila、以前はクリソスポリウム・ルクノウェンゼ(Chrysosporium lucknowense)として公知)の種に属する。最も好ましくは、糸状菌は、ミセリオフトラ・サーモフィラである。
【００４６】
用語「遺伝子改変された糸状菌」は、本明細書で使用される場合、突然変異誘発及び選択並びに/又は遺伝子工学による糸状菌の野生種の改変、又はすでに遺伝子改変されている生物、例えば、clr1遺伝子以外の1つ以上の遺伝子により従前に操作された糸状菌株の更なる改変を意味する。本発明の遺伝子改変は、CLR1活性を低減又は消失させる改変である。
【００４７】
用語「遺伝子改変を有しない糸状菌」は、本明細書で使用される場合、CLR1の活性を低減又は消失させるように遺伝子改変されておらず、それを除いては、本発明において使用する遺伝子改変された糸状菌と同じ遺伝子構成を有する糸状菌、すなわち、本発明の遺伝子改変された糸状菌との唯一の遺伝子の違いが、CLR1活性を低減又は消失させる本発明の遺伝子改変である糸状菌を意味する。従って、遺伝子改変を有しない糸状菌は、CLR1の活性を低減又は消失させる遺伝子改変が導入されている本発明の範囲内の親株である。親株は、組換えポリペプチドを発現する更なる遺伝子改変を少なくとも含むが、付加的遺伝子改変を含んでいてもよい。
【００４８】
糸状菌は更に、形質転換細胞の選択を可能にする遺伝子改変を有してもよい。そのような改変の例としては、オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードするpyr4遺伝子及びウリジン5'モノホスフェートシンターゼをコードするpyr5遺伝子の欠失が挙げられる。両遺伝子はウラシルの生合成に関与するため、この欠乏を補うために遺伝子改変されない限り、これらの遺伝子のいずれかの欠失を有する細胞は、ウラシル及びウリジンを欠く培地では増殖できない。糸状菌の他の遺伝子改変は、非相同的末端結合(NHEJ)が媒介する修復に関与するKu70をコードする遺伝子の欠失であってもよい。
【００４９】
用語「前記遺伝子改変された糸状菌を好適な培養培地において増殖させる」とは、本明細書中で使用される場合、本明細書で定義される糸状菌の増殖を可能とし、組換えポリペプチドの生産に好適な、当業者に既知のいずれかの好適な手段及び方法の使用を意味する。この増殖はバッチ法若しくはフェドバッチ法として、又は連続発酵法において行ってよい。好ましくは、培養培地は、CLR1活性を誘導できるセルロース又はその任意の誘導体を含有しない。
【００５０】
バッチ法、フェドバッチ法又は連続発酵法を行うための方法は当業者に周知であり、文献に記載されている。培養は、特定の温度条件下、例えば15℃〜50℃の間、好ましくは20℃〜47℃の間、より好ましくは32℃〜45℃の間、最も好ましくは38℃〜42℃の間で行ってよい。培養は、pH5〜pH8.5の間、好ましくはpH5.5〜7.5の間、より好ましくはpH6〜7の間、最も好ましくは6〜6.7の間のpHで行ってよい。
【００５１】
好適な発酵用培地は、当技術分野で公知のようなC(炭素)源、N(窒素)源、リン酸塩、硫黄及び微量元素を含むが、以下の成分に限定されない:
炭素源として、グルコース、デキストロース、フラクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトースなどの単糖、二糖及び多糖を使用できる。セルロース、ホエイ、コーンスターチ、ブラン、澱粉麦芽エキス、テンサイ糖蜜、廃糖蜜、甘蔗廃糖蜜、脂肪酸又はダイズ油などの複合炭素源も使用できる。限定されないが、コーンスティープリカー/ソリッド、可溶性醸造粕濃縮物(dried distillers solubles)、酵母、魚粉又は骨粉、肉又はイースト抽出物、トウモロコシ胚芽又はグルテンミール、プロテインペプトン、カゼイン、イースト、綿実、乳タンパク質又は大豆タンパク質の加水分解物及び消化物、大豆ミール、ピーナッツミール、米糠又はファーマメディア(pharmamedia)などの当技術分野で公知のいかなる好適な複合窒素源を適用してもよい。あるいは、無機窒素源(例えばアンモニア又はその塩)、尿素などの有機窒素源及び/又はアミノ酸を使用してもよい。炭素源及び窒素源に加え、培地中に、細胞増殖、生存及び所望のタンパク質の生産にとって重要な、硫黄、リン、鉄、マグネシウム、亜鉛及び他の元素を供給する様々な有機又は無機化合物を添加してもよい。好適な培地は、下記の実施例においても記載されている。
【００５２】
「培養培地から組換えポリペプチドを単離する」という言い回しは、本明細書で使用される場合、組換えポリペプチドを細胞残渣及び培養培地の成分から単離するいずれの好適な方法も意味する。当技術分野で公知の好適な単離技術としては、限定されないが、濾過、マイクロフィルトレーション、限外濾過、遠心分離、抽出、噴霧乾燥、蒸発、凍結乾燥及び沈殿が挙げられる。組換えポリペプチドは更に、限定されないが、硫安沈殿又は他のタンパク質沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は電気泳動手順などの当技術分野で公知の様々な手順によって精製できる。
【００５３】
用語「糸状菌を遺伝子改変する」又は「遺伝子改変された糸状菌」とは、本明細書中で使用される場合、糸状菌が当業者に公知の任意の好適な遺伝的手段及び方法により変更されることを意味する。同様に、用語「遺伝子改変された糸状菌」とは、本明細書で使用される場合、糸状菌が、CLR1の活性が低減又は消失し、組換えポリペプチドが発現するように、当業者に公知の任意の好適な遺伝的手段及び方法により、改変又は変更されていることを意味する。
【００５４】
糸状菌を遺伝子改変するための方法は当業者に公知であり、文献に記載されている。それらは、糸状菌内に収容されるように、染色体内若しくは染色体外に組み込まれるように、又は、糸状菌のゲノム中に天然に存在する遺伝要素若しくは配列の除去若しくは破壊、若しくは改変のために、糸状菌に遺伝要素又は材料を導入するための慣用法を含む。
【００５５】
用語「遺伝要素」は、本明細書で使用される場合、遺伝情報を輸送することができる任意の分子単位を意味する。よって、それは遺伝子、好ましくは、天然遺伝子、キメラ遺伝子、外来遺伝子又は導入遺伝子に関する。用語「遺伝子」は、特定のタンパク質又はポリペプチドを発現する核酸分子又はその断片を意味し、好ましくは、遺伝子はコード配列の上流の調節配列(5'非コード配列)及び下流の調節配列(3'非コード配列)を含む核酸分子を意味する。用語「天然遺伝子」は、天然において、例えば、野生型糸状菌にその固有の調節配列とともに見られる遺伝子を意味する。用語「キメラ遺伝子」は、天然では一緒に見られない調節及びコード配列を含む天然遺伝子でないいずれの遺伝子も意味する。よって、キメラ遺伝子は、調節配列とコード配列が同じ生物の異なる遺伝子に由来するように、異なる供与源に由来する調節配列とコード配列、又は同じ供与源に由来するが天然で見られるものとは異なって構成された調節配列とコード配列を含み得る。本発明において、「外来遺伝子」は、糸状菌には通常見られないが、遺伝子操作により糸状菌に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、それらが導入されるもの以外の生物に固有に存在する遺伝子か、又はキメラ遺伝子を含み得る。用語「導入遺伝子」は、形質転換法によりゲノムに導入された遺伝子を意味する。
【００５６】
用語「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を意味する。用語「調節配列」は、コード配列の上流(5'非コード配列)、内部、又は下流(3'非コード配列)に位置し、且つ、転写、RNAプロセシング若しくは安定性、又は関連のコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が含まれ得る。
【００５７】
用語「プロモーター」は、コード配列又は機能性RNAの発現を制御し得るDNA配列を意味する。一般に、コード配列は、プロモーター配列の3'側に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよいし、又は天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよいし、又は合成DNAセグメントさえ含み得る。典型的には、調節配列の正確な境界は完全に定まらないため、様々な長さのDNA断片が、同一のプロモーター活性を有しうる。当業者には、異なるプロモーターは異なる発達段階で、又は異なる環境若しくは生理条件に応答して遺伝子の発現を指示し得ることが理解される。ほとんどの細胞種でほとんどいつでも遺伝子を発現させるプロモーターは一般に、構成的プロモーターと呼ばれる。他方、特定の状況でのみ、例えば、特定の因子、成長段階、温度、pH又は特定の代謝産物の存在などに基づいて遺伝子を発現させるプロモーターは、調節可能なプロモーターとして理解される。
【００５８】
用語「3'非コード配列」は、コード配列の下流に位置するDNA配列を意味する。それには、ポリアデニル化認識配列及びmRNAのプロセシング又は遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体の3'末端へのポリアデニル酸トラクト（tract）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。3'非コード配列は、転写、すなわちRNA転写産物の存在、RNAプロセシング若しくは安定性、又は関連のコード配列の翻訳に影響を及ぼし得る。用語「RNA転写産物」は、RNAポリメラーゼにより触媒されるDNA配列の転写から生じる産物を意味する。RNA転写産物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写産物と呼ばれ、又はそれは一次転写産物の転写後プロセシングに由来するRNA配列であり得、成熟RNAと呼ばれる。用語「mRNA」は、メッセンジャーRNA、すなわち、イントロンがなく、細胞によりタンパク質に翻訳され得るRNAを意味する。
【００５９】
用語「機能的に連結される」とは、一方の機能が他方により影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の関連を意味する。プロモーターに関して、この用語は、コード配列がそのプロモーターの転写制御下にあることを意味する。
【００６０】
本発明の中心的な実施形態の範囲内では、糸状菌の遺伝子改変により、CLR1の活性が低減又は消失する。
【００６１】
用語「CLR1」は、特定の遺伝子のプロモーター領域に結合し、遺伝子発現を刺激する亜鉛二核クラスター転写因子を意味する。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、CLR1の活性は、配列番号3のアミノ酸配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなるポリペプチドにより提供される、あるいは配列番号1若しくは2のヌクレオチド配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなる核酸によりコードされる、あるいは配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも約50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなるポリペプチドにより提供され、あるいは配列番号1若しくは2のヌクレオチド配列と少なくとも約50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える配列同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなり、且つ配列番号3を有するポリペプチドと本質的に同じ活性(すなわち、標的遺伝子のプロモーター領域内のDNAに結合し、転写を活性化させる意味でのCLR1活性)を有するポリペプチドをコードする核酸によりコードされる。
【００６３】
配列番号1の配列はclr1遺伝子のcDNA配列であり、配列番号2の配列はclr1遺伝子を含むゲノム領域である。好ましい実施形態では、配列番号2のヌクレオチド3001から5245に対応するCLR1をコードするゲノム領域のみが使用される。従って、配列同一性(%)に関する上記の値も、配列番号2のヌクレオチド3001から5245を含む配列に適用される。
【００６４】
「機能的断片」又は「機能的部分」という用語は、配列番号3を有するポリペプチドと本質的に同じ活性(すなわち標的遺伝子のプロモーター領域内のDNAに結合し、転写を活性化させる意味でのCLR1活性)を有するポリペプチドの小さい連続した部分を意味することを意図する。
【００６５】
配列番号3のアミノ酸配列の機能的断片は、少なくとも200又は250アミノ酸長、好ましくは少なくとも300又は350アミノ酸、より好ましくは少なくとも400又は450アミノ酸、いっそうより好ましくは少なくとも500又は550アミノ酸、最も好ましくは少なくとも600から650のアミノ酸長を有する。亜鉛(2)-システイン(6)の二核クラスタードメインは、配列番号3の位置135から171に位置し、配列番号4に示される。従って、上記に定義された機能的断片は、好ましくはアミノ酸80〜280又はアミノ酸80〜330の間、より好ましくはアミノ酸80〜380又はアミノ酸80〜430の間、いっそうより好ましくはアミノ酸80〜480、アミノ酸80〜530又はアミノ酸80〜580の間、最も好ましくはアミノ酸80〜630又はアミノ酸80〜680の間に位置する。
【００６６】
代替的な実施形態において、CLR1活性を提供するポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列と、少なくとも約50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなり、配列番号3の位置135から171に対応する位置で、配列番号4のアミノ酸配列を含む。
【００６７】
本発明の意味の範囲内で、「配列同一性」は、ある核酸分子内の5'-3'配列に関して別の核酸分子と比較した場合の一致の程度を表す。配列同一性は、例えばBLASTN、ScanProsite、Laser geneソフトウエアなどの種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムを用いて決定され得る。別法として、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のBLASTプログラムパッケージがデフォルトパラメーターとともに使用され得る。加えて、「ダーティーデータ」、すなわち、配列比較のためのアルゴリズムを用いるプログラムSequencher(Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, USA)が使用され得る。
【００６８】
2つのタンパク質又は核酸配列間の同一性は、2011年4月における入手可能バージョンのプログラムneedleにより算出される同一性として定義される。Needleはフリーで入手できるプログラムパッケージEMBOSSの一部であり、それはウェブサイトhttp://emboss.sourceforge.net/からダウンロードできる。使用する標準パラメーターは、以下の通りである:gapopen 10.0(「ギャップ開始ペナルティー」)、gapextend 0.5(「ギャップ伸長ペナルティー」)、タンパク質の場合データファイルEBLOSUM62(マトリックス)及びONAの場合データファイルEONAFULL(マトリックス)。
【００６９】
配列同一性は、配列番号1又は2の核酸配列の700、800又は900ヌクレオチド、好ましくは1000、1100、1200、1300又は1400ヌクレオチド、より好ましくは1500、1600、1700、1800又は1900ヌクレオチド長、最も好ましくは全長にわたる配列同一性の程度を意味する。
【００７０】
配列同一性は、配列番号3のアミノ酸配列の300、350又は400アミノ酸、好ましくは450、500又は550アミノ酸、より好ましくは600、630、660又は680アミノ酸長、最も好ましくは全長にわたる配列同一性の程度を意味する。
【００７１】
上記のCLR1変異体、すなわち配列番号3のタンパク質の機能的断片又は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質の活性は、当業者に公知であるか又は好適な文献中の記載に基づく好適な試験又はアッセイによって、測定できる。例えば、セルラーゼプロモーターなどのCLR1との結合部位を有することが公知であるプロモーターを、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β-グルクロニダーゼ(GUS)又はルシフェラーゼなどのタンパク質をコードするリポーター遺伝子に機能的に連結させ、活性を試験しようとするCLR1変異体又は野生型CLR1タンパク質をコードする核酸分子と共に好適な宿主細胞にトランスフェクションする。次に、リポーター遺伝子の発現を、変異体をトランスフェクションした細胞と、野生型タンパク質をトランスフェクションした細胞とで比較できる。上記のように、CLR1によって活性化されるプロモーターは、上記の表2、及びWO 2013/022594 A1において開示される。
【００７２】
「本質的に同じ活性」という用語は、配列番号3のポリペプチドの、少なくとも50%又は55%、好ましくは少なくとも60、65又は70%、より好ましくは少なくとも75、80、85又は90%、最も好ましくは少なくとも92、94、96、98又は99%のCLR1活性を有する、すなわち、変異体と共に上記のリポーター構築物をインキュベートすることにより生産されるリポータータンパク質の量が、配列番号3のポリペプチドと共に同じリポーター構築物をインキュベートすることにより生産されるリポータータンパク質の量に対して、少なくとも50%又は55%、好ましくは少なくとも60、65又は70%、より好ましくは少なくとも75、80、85又は90%、最も好ましくは少なくとも92、94、96、98又は99%又はそれ以上であるポリペプチドを意味する。
【００７３】
用語「活性の低減」又は「量の低減」は、本明細書で使用される場合、CLR1タンパク質をコードする遺伝要素、例えば、分子ベースで、遺伝要素により発現される転写産物、又は前記遺伝要素によりコードされるタンパク質若しくは活性の任意の改変を意味し、これが前記CLR1活性の低減、細胞内の前記CLR1活性の濃度の低減及び/又は前記CLR1活性の機能の低減をもたらす。
【００７４】
本明細書中で使用する「消失した活性」という用語は、CLR1活性の完全な排除をもたらす、CLR1をコードする遺伝要素のあらゆる改変を意味し、すなわち、リポーター遺伝子構築物を、活性を消失させるための遺伝子改変を有する細胞由来のタンパク質又は抽出物と共に、本明細書に記載の条件下でインキュベートしたとき、リポータータンパク質は検出できない。
【００７５】
活性をコードする遺伝要素の改変は、本発明の遺伝子改変を有しない生物、好ましくは、親生物として使用され、本発明の遺伝子改変が導入された生物、と比較して、例えば約5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%、又はこれらの値の間の任意の値のCLR1活性の低減をもたらす。好ましい実施形態では、そのような活性の低減は、配列番号3のアミノ酸配列又は本明細書の上記に定義されるようなその変異体により表される、を含む、から本質的になる、又はからなる。
【００７６】
特定の実施形態では、活性の低減は、その発現が前述のように活性をもたらす遺伝要素の発現が低下又は消失することによるものである。用語「発現」は、本明細書で使用される場合、本明細書に述べられるように核酸分子又は遺伝子に由来するセンス鎖(mRNA)の転写及び蓄積を意味する。より好ましくは、この用語はまた、mRNAのポリペプチド又はタンパク質への翻訳及び細胞内でのそのようなポリペプチド又はタンパク質の対応する供給を意味する。用語「発現の低下」は、同じ生物に関して、発現時にそのポリペプチド又はタンパク質を生じる遺伝要素の内因性コピーよりも低減した転写産物及び/又は低減したポリペプチド若しくはタンパク質に関する。
【００７７】
特に好ましい実施形態において、CLR1活性の低減は、CLR1タンパク質をコードする核酸分子の発現低下による。
【００７８】
好ましい実施形態では、前述のような発現低下は、本発明の遺伝子改変を有しない生物、好ましくは、親生物として使用され、本発明の遺伝子改変が導入された生物、と比較して、約5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%、又はこれらの値の間の任意の値の遺伝子転写速度の低減をもたらし得る。好ましい実施形態では、遺伝子の転写速度におけるそのような低減は、本明細書の上記に定義されるような配列番号1若しくは2、又はその変異体のヌクレオチド配列の転写産物について提供され得る。
【００７９】
更に好ましい実施形態において、発現の低減は、本発明の遺伝子改変を有しない生物、好ましくは、親生物として使用され、本発明の遺伝子改変が導入された生物、と比較して、約5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%、又はこれらの値の間の任意の値の遺伝子のmRNAの量の低減をもたらし得る。好ましい実施形態では、遺伝子のmRNAの量におけるそのような低減が、本明細書の上記に定義されるような配列番号1若しくは2、又はその変異体のヌクレオチド配列の転写産物について提供され得る。好ましい実施形態では、低減するmRNAの量は、本明細書の上記に定義されるような配列番号1若しくは2のヌクレオチド配列又はその変異体を含む、から本質的になる、又はからなるmRNAを意味する。
【００８０】
更に別の好ましい実施形態では、発現の低減は、本発明の遺伝子改変を有しない生物、好ましくは、親生物として使用され、本発明の遺伝子改変が導入された生物、と比較して、約5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%、又はこれらの値の間の任意の値のCLR1ポリペプチド又はタンパク質の量の低減をもたらし得る。好ましい実施形態では、その量が低減するポリペプチドは、本明細書の上記に定義されるような配列番号3のアミノ酸配列又はその変異体により表される、を含む、から本質的になる、又はからなる。
【００８１】
本明細書で使用される「対照生物」という用語は、野生型生物、すなわちいかなる遺伝子改変も有しない生物、及び、本発明の遺伝子改変(すなわちCLR1活性を低減又は消失させる遺伝子改変)以外の1つ以上の遺伝子改変を有する生物、の両者を含むことを意図するものである。
【００８２】
一実施形態では、内因性clr1遺伝子のプロモーターを弱いプロモーターに置き換えることによって、CLR1の発現を低下させることができる。本発明により想定され、遺伝子の発現の低減に使用され得るプロモーターは、構成的プロモーター又は調節可能なプロモーターのいずれかであり得る。プロモーターは、ミセリオフトラ属の内因性のプロモーターであることが好ましい。特定の実施形態では、プロモーターはまた、異種プロモーター又は合成プロモーター、例えば、弱い異種プロモーター又は調節可能な異種プロモーターでもあり得る。プロモーターは、コード配列(例えばCLR1をコードする核酸配列)と機能的に連結され得る。好ましい実施形態では、用語「プロモーター」は、コード配列の発現を制御し得る、糸状菌において、より好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラにおいて活性なDNA配列を意味する。
【００８３】
本発明の意味の範囲内で、用語「弱いプロモーター」は、その活性が野生型生物において発現される核酸分子と機能的に連結されているプロモーターの活性よりも低いプロモーター、すなわち、内因性clr1遺伝子のプロモーターよりも低い活性を有するプロモーターを意味するものとする。好ましくは、弱いプロモーターの活性は、野生型生物で発現される核酸分子と機能的に連結されているプロモーター、すなわち内因性clr1遺伝子のプロモーター、の活性よりも約5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%低い。
【００８４】
当業者であれば、どのようにしてプロモーター活性を決定するか、そして異なるプロモーターの活性を比較するかを知っている。この目的で、プロモーターは一般に、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質又はβ-グルクロニダーゼなどのリポータータンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結され、リポータータンパク質の活性が決定される。あるいは、又はそれに加えて、内因性遺伝子のmRNAレベルを、例えば定量的リアルタイムPCR又はノザンブロットによって、各々比較できる。これらのアッセイにおいて、本発明への使用に好適である弱いプロモーターは、内因性clr1遺伝子のプロモーターよりも低いマーカータンパク質の発現又は低いmRNAレベルをもたらす。
【００８５】
更なる実施形態において、CLR1活性は、clr1遺伝子の機能的破壊によって、好ましくはヌクレオチドの欠失によって、低減し得る。欠失は、遺伝要素のコード(ORF)内又は非コード部分における2以上の残基、例えば、2個から全遺伝子又は遺伝子座までの残基の任意の領域を包含し得る。特定の実施形態では、欠失は、例えばドメイン、タンパク質の下位部分、繰り返し配列又は約50未満の連続する塩基対の断片などのより小さな領域に影響を及ぼすことができるが、より大きな欠失が好ましい。欠失又は機能的破壊は、好ましくはclr1遺伝子のコード配列又はORF中で行われる。配列番号1若しくは2のclr1コード配列、又は上記で定義されたその変異体を完全に欠失させるのが特に好ましい。また、clr1遺伝子のコード配列の機能的部分(すなわちCLR1活性に必要な部分)の欠失も好ましい。上記のように、亜鉛(2)-システイン(6)二核クラスタードメインは、配列番号3の位置135から171に位置する。従って、clr1遺伝子のコード配列の機能的部分の欠失は、亜鉛(2)-システイン(6)二核クラスタードメインをコードする配列の一部、すなわち、配列番号3の配列中の、配列番号3のアミノ酸135から171を含む部分の欠失を含む。また、本明細書の上記に定義されるようなclr1遺伝子の3'非コード配列における、本明細書の上記に定義されるようなclr1遺伝子のプロモーター配列(5'非コード領域も)における、又は本明細書の上記に定義されるようなclr1遺伝子に関連する調節配列における機能的破壊も想定される。そのような機能的破壊又は改変は、例えば、発現の低減又は転写産物の不安定性、転写開始の困難などをもたらし、従って、酵素活性の量の低下又は完全な不在をもたらし得る。
【００８６】
糸状菌のゲノムから、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラのゲノムから、内因性clr1遺伝子(好ましくは配列番号1若しくは2のコード配列又は本明細書で定義される変異体)の一部又は全体を欠失させるために、内因性clr1遺伝子の配列に相同な配列に隣接する好適な選択マーカーのコード配列を含む構築物を作製してもよい。相同配列は、約1000〜2000bpの長さを有してもよい。しかしながら、基本的には、より小さな、又はより大きな配列を使用することもできる。前記構築物の細胞への導入後、相同配列が内因性遺伝子の対応する配列と組換えを起こし、選択マーカーをコードする配列と内因性遺伝子との置換が生じる。次に、clr1コード配列が欠失された菌株を、選択マーカーを使用して同定できる。構築物は、相同配列と選択マーカーのコード配列との間に位置する、ゲノムへの導入後に選択マーカーのコード配列の欠失を可能にする、lox又はFRT部位などの更なる配列を含んでもよい。場合により、選択マーカーのコード配列を、選択マーカーをコードする遺伝子の5'部分を第1のプラスミドに持たせ、前記遺伝子の3'部分を第2のプラスミドに持たせるように分割(split)してもよい。両方のプラスミドが細胞内に存在するときに、選択マーカーをコードするコード配列の重複部分が、選択マーカーが機能的になるように組換えを起こす。第1のプラスミドはclr1遺伝子の5'隣接領域を保持し、第2のプラスミドはclr1遺伝子の3'隣接領域を保持する。
【００８７】
更なる実施形態では、不活性化は、clr1の遺伝要素のコード(ORF)及び/又は非コード領域における突然変異、再配列及び/又は挿入によるものであってもよい。突然変異は、例えば、コードされるアミノ酸配列の改変をもたらす点突然変異又は2若しくは3ヌクレオチド変化、又はORFへの1以上のフレームシフトの導入、又は未熟終止コドンの導入、又はORFからの終止コドンの除去、及び/又は細胞機構、例えば、ポリアデニル化機構に対する認識シグナルの導入、又はタンパク質分解機構に対する破壊シグナルの導入などであり得る。そのような改変配列部分は、そのタンパク質の野生型の活性をもはやもたらさないタンパク質を生じ得る。従って、タンパク質は例えば、それらの活性に必要とされる領域内での置換を有し、これにより機能の喪失がもたらされてもよく、又は、異なるアミノ酸から構成され(フレームシフトによる)、従って適切に機能できないものであってもよい。改変配列部分は更に、分解を受けやすい不安定な転写産物を生じ得る。更に、タンパク質の標的化が損なわれる場合もある。
【００８８】
糸状菌の細胞の、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ細胞のゲノムに点突然変異を導入する技術の1つは、RNAによりガイドされる部位特異的DNA切断を促進することが知られており、且つ、ゲノム工学に使用され得るCRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系である(例えば、Sander and Young (2014)Nature Biotechnol. 32: 347-355参照)。この系は、特定のDNA配列を切断するために、crRNA及びtracrRNAによってガイドされるヌクレアーゼとして、Cas9を使用する。成熟したcrRNA:tracrRNA複合体は、crRNA上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する標的DNA上のプロトスペーサーとの間の塩基対合を介して標的DNAにCas9を導く。その後、Cas9は標的DNAの切断を媒介して、プロトスペーサー内で二本鎖切断を作り出す。crRNA及びtracrRNAの代わりに、ガイドRNAは、tracrRNA-crRNA複合体を模倣するヘアピンを含むように設計され得る (Jinek et al. (2012) Science 337 (6096): 816-821)。
【００８９】
更に別の実施形態において、内因性clr1コード配列を、コード配列の突然変異形態、すなわち、転写及び翻訳により元のCLR1タンパク質と比較して1つ以上のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、元のCLR1タンパク質より活性が低いタンパク質が産生されるコード配列と置換してもよい。上記のように、CLR1タンパク質内の、配列番号3のアミノ酸135から171間の領域は保存される。この領域中の1つ以上のアミノ酸の置換又は欠失は、活性の低減又は消失につながる。これ故、本発明の一実施形態において、内因性clr1コード配列は、前記生物のゲノム内の配列番号3のアミノ酸135から171に対応するアミノ酸残基をコードする、5、6、7又は8、好ましくは9、10、11又は12、より好ましくは13、14、15、16、17又は18、最も好ましくは19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又は31位に突然変異を有するclr1コード配列の突然変異形態と置換される。
【００９０】
更に別の実施形態において、内因性clr1コード配列を、遺伝子改変されている糸状菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラにおいて、より好ましくないコドンを使用する他のコード領域と置換してもよい。当業者であれば、細胞内に存在するtRNAのプールに依存して、特定のアミノ酸のための幾つかのコドンのコードが、同じアミノ酸のための他のコドンのコードよりも好ましくないことを知っている。従って、より好ましくないコドンを使用することにより、遺伝子の発現を低減させることができる。
【００９１】
CLR1の活性を低減させるための遺伝子改変、例えば、本明細書の上記又は下記で述べられるような遺伝子の発現低減をもたらす改変は、当業者に公知の任意の好適なアプローチで実施され得る。
【００９２】
これに関して使用され得る典型的なアプローチは、標的相同組換えである。例えば、clr1遺伝子の改変形態、例えば元のプロモーターの代わりに弱いプロモーターを含む形態又は選択マーカーのコード配列は、挿入が起こるべき場所である標的内因性ポリヌクレオチド配列(例えば、遺伝子のコード領域又は調節領域)と相同なDNAと隣接している。そのような構築物は、糸状菌、具体的にはミセリオフトラ・サーモフィラの細胞に形質転換するために選択マーカーとともに若しくは伴わずに、及び/又は陰性選択マーカーとともに若しくは伴わずに使用され得る。標的相同組換えによるDNA構築物の挿入の結果は、元の遺伝子の遺伝子座における標的遺伝子の改変形態の挿入、又は内因性遺伝子の欠失をもたらし得る。
【００９３】
用語「形質転換」は、遺伝要素、一般に、核酸分子、例えば、相同組換え用構築物を含む特定のカセット、又は、ベクター若しくはプラスミドなどの染色体外要素の糸状菌、具体的にはミセリオフトラ・サーモフィラの細胞内への移入を意味し、前記移入は、遺伝的に安定な遺伝をもたらす。糸状菌の形質転換のための条件及び対応する技術は当業者に公知である。これらの技術には、化学的形質転換、好ましくはポリエチレングリコールにより媒介されるプロトプラストの形質転換、酢酸リチウム形質転換、胞子又は発芽分生子のエレクトロポレーション、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換、プロトプラスト融合、弾道衝撃形質転換、マイクロインジェクション、又は目的の遺伝子若しくは核酸分子を真菌細胞に導入する他の任意の方法が含まれる。
【００９４】
好ましくは、形質転換細胞は、導入された遺伝要素上に含まれるマーカーを選択することにより同定され得る。あるいは、独立したマーカー構築物が所望の遺伝要素とともに共形質転換されてもよい。一般に、形質転換細胞は、選択培地上でのそれらの増殖能に関して選択することができる。選択培地は抗生物質を組み込むか、又は例えば栄養素若しくは増殖因子などの、非形質転換細胞の増殖に必要な因子を欠くものであり得る。導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質耐性を付与してもよいし、又は必須増殖因子若しくは酵素をコードしてもよく、それにより、形質転換宿主で発現させた場合に選択培地上での増殖が可能となる。発現されたマーカータンパク質が直接又は間接的に検出され得る場合、形質転換細胞はマーカータンパク質を検出することによって、選択できる。
【００９５】
マーカータンパク質は、単独で又は別のタンパク質との融合物として発現させ得る。マーカータンパク質は、例えばその酵素活性により検出され得る。あるいは、例えば、目的のタンパク質上のマーカータンパク質又は分子タグを検出するために抗体を用いてもよい。マーカータンパク質又はタグを発現する細胞は、例えば、視覚的に、又はFACS若しくは抗体を用いるパニングなどの技術によって選択され得る。好ましくは、当業者に公知であるように、糸状菌の細胞で機能するいずれの好適なマーカーを用いてもよい。より好ましくは、カナマイシン、ハイグロマイシン、アミノグルコシドG418、又はノルセオトリシン(nourseothricin、NTC又はClonNATとも呼ばれる)に対して耐性を与えるマーカー、並びに、窒素、ウラシル、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、リシン又はトリプトファンを欠く培地での増殖能が使用可能である。前述のような選択マーカー、例えばアセトアミダーゼ又はG418若しくはClonNAT耐性マーカー、又は他の任意の好適なマーカーを使用する場合、例えばCre-lox系などのリコンビナーゼ認識配列を、マーカーの両端に隣接させて用い得る。認識配列を認識する対応するリコンビナーゼの発現により、この系は、構築物の挿入後、選択マーカーの排除とそれに続く再利用を可能とする。また、当業者に公知の他の同様のリコンビナーゼ系の使用も想定される。
【００９６】
特定の実施形態では、マーカーはまた、in vivoにおいて特定のDNA標的配列の切断能を持つ部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)又はメガヌクレアーゼの標的部位と組み合わせてもよい。そのような系の具体例が、TALEN(転写アクベーター様エフェクターヌクレアーゼ(Transcription Activator-Like Effector Nuclease))系、すなわち、TALエフェクターDNA結合ドメインとDNA切断ドメインを融合させることにより作出される人工制限酵素である。TALエフェクターは、一般にキサントモナス菌若しくは関連種により分泌されるか、又はそれに由来し、改変されているタンパク質である。TALエフェクターのDNA結合ドメインは、変動性の高い12番目と13番目のアミノ酸(Repeat Variable Diresidue又はRVD)以外は、例えば約33〜34アミノ酸の保存性の高い配列を含み、一般に特定のヌクレオチド認識と強力な相関を示す。この原理に基づき、DNA結合ドメインは、標的遺伝子DNA配列に相当するRepeat Variable Diresidue含有リピートセグメントの組合せを選択することにより操作され得る。TALEN DNA切断ドメインは、好適なヌクレアーゼに由来し得る。例えば、FokIエンドヌクレアーゼ又はFokIエンドヌクレアーゼ変異体由来のDNA切断ドメインが、ハイブリッドヌクレアーゼを構築するために使用され得る。TALENは好ましくは、二量体として機能するFokIドメインの独自性のために独立した実体として提供され得る。
【００９７】
特定の実施形態では、TALEN DNA結合ドメインとFokI切断ドメインの間のアミノ酸残基の数、及び2つの各TALEN結合部位間の塩基の数は変更可能であり、高レベルの活性を得るために糸状菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラのゲノムに挿入される構築物の配列に従って最適化され得る。TALEN又はTALEN成分は、任意の所望のDNA配列、例えば、生物のゲノムに挿入される遺伝子の相同末端間に選択マーカーを含むDNA配列を標的とするために操作又は改変され得る。組換えに必要とされる酵素活性は、それ自体提供されてもよく、又はその酵素活性は構築物に選択カセットとともに提供されてもよく、これにより、ヌクレアーゼ活性の開始時にその除去に至る。操作は好適な方法論、例えば、Zhang et al. (2011) Nature Biotechnol. 29: 143-148頁又はReyon et al. (2012) Nature Biotechnol. 30: 460-465頁に記載の方法論に従って実施され得る。
【００９８】
糸状菌細胞(好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラの細胞)のゲノムからマーカー配列を除去するための別の系は、上記のCRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系である。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態では、相同組換えは、本明細書の下記の実施例に記載されるように行うことができる。後述するように、無窒素培地上での増殖を可能にする、アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)由来のスプリット型のアセトアミダーゼ遺伝子を有する形質転換カセットの使用が特に好ましい。
【０１００】
一般に、遺伝要素は、形質転換カセット又は発現カセットの助けで糸状菌細胞(好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラの細胞)に導入され得る。本発明では、用語「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、且つ、その外来遺伝子に加えて、糸状菌細胞(好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ細胞)の形質転換を促進する要素を備えた特定のベクターを意味する。用語「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、且つ、その外来遺伝子に加えて、外来遺伝子及び外来宿主、特に、糸状菌細胞、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ細胞においてその遺伝子の発現を可能とする要素を備えた特定のベクターを意味する。
【０１０１】
従って、本明細書で定義されるようなCLR1活性の低減をもたらす核酸配列は、本明細書の上記に定義されるような発現カセット又は形質転換カセット、特に、相同組換えを介したゲノム組み込みのために作製された発現カセット又は形質転換カセットの形態で、遺伝要素上に提供され得る。また、プラスミド又はベクターに対する提供も想定される。用語「プラスミド」及び「ベクター」は、多くの場合、細胞の中枢代謝の一部でない遺伝子を、通常は環状二本鎖DNA断片の形態で運ぶ染色体外要素を意味する。より好ましくは、用語プラスミドは、当業者に公知の糸状菌細胞(好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ細胞)の形質転換に好適な任意のプラスミド、及び特に、糸状菌細胞(好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ細胞)におけるタンパク質の発現に好適な任意のプラスミド、例えば、他の生物、好ましくは細菌、特に大腸菌で自律的複製能を持ち、且つ、糸状菌細胞(好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ細胞)のゲノム挿入形質転換のために作製、例えば、消化が可能なプラスミドを意味する。
【０１０２】
遺伝要素の機能的破壊又は欠失、並びに上記で概説したようなこれらの遺伝要素への点突然変異の導入は、例えば、本明細書の上に記載されるような相同組換えによるなど、当業者に公知のいずれの好適なアプローチによって行ってもよい。
【０１０３】
更なる特定の実施形態では、不活性化は、RNA転写産物のレベルで起こる特定の不活性化プロセスによるものであり得る。そのような不活性化は、clr1遺伝子のRNA転写産物の配列特異的認識と続いてのこれらの転写産物の分解によるものであり得る。このアプローチには、高等真核生物から知られているようなRNA干渉又はアンチセンス方法が使用され得る。例えば、糸状菌におけるRNAi経路は、Liu (2010) Cell Mol. Life Sci. 67 (22): 3849-3863頁において、議論されている。よって、本発明は、clr1転写産物に特異的なsiRNA種の提供を想定する。
【０１０４】
用語「siRNA」は、特定のタイプのアンチセンス分子、すなわち、RNA干渉(RNAi)経路を誘導する小分子阻害RNA二本鎖を意味する。これらの分子の長さは様々であり、約18〜28ヌクレオチド長の間であり得、例えば、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27又は28ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、この分子は21、22又は23ヌクレオチドの長さを有する。本発明によるsiRNA分子は、それらの標的mRNAに対して、好ましくは、アンチセンス鎖において、様々な程度の相補性を含み得る。siRNAは、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の5'又は3'末端に不対合のオーバーハング塩基を有し得る。用語「siRNA」は、2つの別個の鎖の二重鎖、並びに二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る一本鎖を含む。好ましくは、siRNAは二本鎖であってよく、ここで、この二本鎖siRNA分子は第一鎖と第二鎖を含み、siRNA分子の各鎖は約18〜約23のヌクレオチド長であり、siRNA分子の第一鎖は、RNA干渉を介した標的RNAに対して十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、前記siRNA分子の第二鎖が、第一鎖と相補的なヌクレオチド配列を含む。そのような干渉分子の生産は更に、調節可能なプロモーターからのsiRNAの生産を介して制御及び調節され得る。
【０１０５】
本発明の更に別の特定の実施形態では、不活性化は、タンパク質又は酵素のレベルで起こる特異的不活性化プロセスによるものであり得る。この不活性化は、例えばCLR1タンパク質に対する小分子などの特異的結合分子の結合によるものであり得る。
【０１０６】
本発明に関して「小分子」は、好ましくは生物学的に活性な小有機分子、すなわち、生体分子を意味するが、好ましくは、ポリマーではない。そのような有機化合物は、いずれの好適な形態又は化学的適性を有していてもよい。この化合物は、天然化合物、例えば、二次代謝産物、又は新たに設計及び作出された人工化合物であってもよい。本発明の一実施形態では、小分子は、標的遺伝子のプロモーター領域へのCLR1の結合を遮断し得るか、又はCLR1の転写活性を遮断し得る。例えば、小分子は、CLR1に結合し、それにより、分子とタンパク質の間の強固な又は不可逆的な相互作用を誘導し、従って、例えば、酵素コア又は結合ポケットが関与する場合には、そのタンパク質又は酵素の正常な(野生型)機能の喪失又は低減をもたらし得る。そのような小分子の同定及び調製のための方法及び技術、並びに小分子の試験のためのアッセイは当業者に公知で有り、本明細書でも想定される。
【０１０７】
特定の実施形態では、遺伝要素は、微生物発現系を含み得る。そのような発現系及び発現ベクターは、外来タンパク質の高レベル発現を指示する調節配列を含み得る。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書の上記に定義されるような遺伝子改変生物、例えば、前記生物におけるCLR1の活性を低減又は消失させる改変を有する生物、例えば、ゲノムからCLR1をコードする内因性の核酸分子が欠失された、又はclr1のコード配列が弱いプロモーターに機能的に連結された生物は、本発明において遺伝子改変のない対照生物よりも多くの組換えポリペプチドを蓄積することができる。用語「対照生物」とは、本明細書で使用される場合、遺伝子改変の開始生物として使用され、組換えポリペプチドを発現するために遺伝子改変されている生物と同じ又は極めて類似した遺伝的背景を有する生物を意味する。好ましくは、対照生物は、本明細書に記載されるような遺伝子改変に使用される生物であり得る。
【０１０９】
本発明は、CLR1活性を低減又は消失させるように遺伝子改変されていない糸状菌と比較して、遺伝子改変された糸状菌により生産される組換えポリペプチドの純度の増大をもたらす。「純度の増大」という用語は、組換えポリペプチドの量が、糸状菌により生産される総タンパク質の少なくとも約50%、好ましくは糸状菌により生産される総タンパク質の少なくとも55又は60%、より好ましくは糸状菌により生産される総タンパク質の少なくとも65%又は70%、最も好ましくは糸状菌により生産される総タンパク質の少なくとも75%、77%又は80%であることを意味する。
【０１１０】
組換えポリペプチドが酵素である場合、組換えポリペプチドの純度の増大は、遺伝子改変された糸状菌により生産される総タンパク質量当たりの酵素比活性の増大をもたらし、酵素比活性は、タンパク質のグラム当たりの酵素活性の単位として表されうる。従って、組換えタンパク質の純度は、組換え酵素の比活性を決定することにより測定できる。総タンパク質量当たりの酵素比活性は、少なくとも約30%又は40%、好ましくは少なくとも50%、60%又は70%、より好ましくは少なくとも70%、80%又は90%、最も好ましくは少なくとも100%、120%又は150%増大し、酵素活性は、遺伝子改変された糸状菌を80〜240時間培養した後で決定される。
【０１１１】
本明細書において記載されているCLR1の活性を低減又は消失させる遺伝子改変は、この生物により生産又は蓄積される組換えポリペプチドの量を、同じ条件下で培養された、CLR1活性を低減又は消失させる前記遺伝子改変を有しない生物における量と比較して増大させうる。特定の実施形態において、増大は、改変が行われる生物の遺伝的バックグラウンドに、及び/又は改変の数に、及び/又は活性を低減又は消失させる技術に、及び/又は他の要因(例えば培養条件、培養培地条件など)に、又は、上記パラメーター及び要因のいずれかの組合せに、依存しうる。特定の実施形態において、生物により生産又は蓄積される組換えポリペプチドの量の増大は、本発明の遺伝子改変を有しないが、組換えポリペプチドを発現するように遺伝子改変され、本発明の遺伝子改変された生物と同じ条件下で培養される生物と比較して、少なくとも0.3%、0.5%、0.7%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%であるか又は300%を超える。
【０１１２】
組換えポリペプチドの生産又は蓄積の決定、及び従って対照生物と比較した場合の改変生物におけるこの生産の増大の決定は、上記のように実施され得る。
【０１１３】
更なる実施形態において、本発明は、本明細書の上記に定義されるような遺伝子改変生物又は前記遺伝子改変生物を使用する組換えポリペプチドの生産方法に関し、前記生物は好ましくは、本明細書において上記で詳述した、CLR1の活性を低減又は消失させる遺伝子改変、及び組換えポリペプチドを発現する遺伝子改変を含み、前記生物は少なくとも1つの付加的遺伝子改変を含む。
【０１１４】
用語「付加的遺伝子改変」とは、本明細書で使用される場合、上記に定義される生物の任意の更なる遺伝子的又は生化学的改変、例えば、遺伝子又はゲノム領域の欠失、本発明の遺伝子改変以外の遺伝子又は遺伝子断片の過剰発現などの改変を意味する。この付加的遺伝子改変は、本発明の遺伝子改変生物において、すでに存在してもよく、又は、生物が本発明により遺伝子改変された後で導入してもよい。
【０１１５】
好ましい実施形態では、上記に定義される生物の付加的遺伝子改変は、前記組換えポリペプチドの純度及び/又は量に影響を持つ要素に関する。そのような要素には、糸状菌において、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラにおいて、高発現する遺伝子の発現に関与する転写因子、並びに内因性及び組換えポリペプチドの分解に関与するプロテアーゼが含まれる。
【０１１６】
そのような転写因子の一例は、キシラナーゼの発現調節に関与するXYR1(キシラナーゼ調節因子1)である(Rauscher et al. (2006) Eukaryote Cell 5(3): 447-456頁)。他の例は、セルラーゼの発現調節に関与するCLR2である。
【０１１７】
本発明において、使用できるプロテアーゼとしては、ALP1プロテアーゼ及びWO 2012/048334 A2及びWO 2013/048661 A1において開示されるプロテアーゼが挙げられる。
【０１１８】
よって、付加的遺伝子改変は好ましくは、糸状菌の、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラの遺伝子xyr1又はalp1のうち1以上で行うことができる。
【０１１９】
更に好ましい実施形態では、付加的遺伝子改変は、下記の変更のうちの少なくとも1つをもたらし得る:(i)XYR1活性が低減又は消失する、及び/又は、(ii)ALP1活性が低減又は消失する。
【０１２０】
更に好ましい実施形態では、XYR1の活性は、配列番号7のアミノ酸配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなるポリペプチドにより提供され、あるいは、配列番号5若しくは6のヌクレオチド配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなる核酸によりコードされる、あるいは配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなるポリペプチドにより提供され、あるいは配列番号5若しくは6のヌクレオチド配列と少なくとも約50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える配列同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなる核酸によりコードされる。
【０１２１】
配列番号5の配列はxyr1遺伝子のcDNA配列であり、配列番号6の配列はxyr1遺伝子を含むゲノム領域である。好ましい実施形態において、XYR1をコードする、配列番号6のヌクレオチド3001〜6016に対応するゲノム領域のみが使用される。従って、同一性(%)に関する上記の値も、配列番号6のヌクレオチド3001〜6016を含む配列に適用される。
【０１２２】
更に好ましい実施形態では、ALP1の活性は、配列番号10のアミノ酸配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなるポリペプチドにより提供され、あるいは、配列番号8若しくは9のヌクレオチド配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなる核酸によりコードされる、あるいは配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも約50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になるか、又はからなるポリペプチドにより提供され、あるいは配列番号8若しくは9のヌクレオチド配列と少なくとも約50%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれを超える配列同一性を有するヌクレオチド配列又はその機能的部分若しくは断片を含む、から本質的になる、又はからなる核酸によりコードされる。
【０１２３】
配列番号8の配列はalp1遺伝子のcDNA配列であり、配列番号9の配列はalp1遺伝子を含むゲノム領域である。好ましい実施形態において、ALP1をコードする、配列番号9のヌクレオチド5001〜6547に対応するゲノム領域のみが使用される。従って、同一性(%)に関する上記の値も、配列番号9のヌクレオチド5001〜6547を含む配列に適用される。
【０１２４】
用語「その機能的部分又は断片」は、本明細書に記載の配列に関して使用する場合、それぞれ、全長ポリペプチドと本質的に同じ活性を示すことが可能な、又は全長ポリペプチドと本質的に同じ活性を示すことが可能なポリペプチドをコードする、ポリペプチド及びコードヌクレオチド配列の連続する部分又は一部を意味する。ポリペプチドの機能的部分又は断片の活性は、全長ポリペプチドの活性に対し、少なくとも10%、20%、30%又は40%、好ましくは少なくとも45%、50%、55%又は60%、より好ましくは少なくとも65%、70%、75%又は80%、いっそうより好ましくは少なくとも82%、85%、88%又は90%、最も好ましくは少なくとも92%、94%、96%、98%又は100%である。ポリペプチドが転写アクチベーター(例えばCLR1、CLR2及びXYR1)である場合、このポリペプチドの機能的部分又は断片は、全長ポリペプチドと本質的に同じ転写活性化活性を示す。ポリペプチドがALP1などのプロテアーゼである場合、このポリペプチドの機能的部分又は断片は、全長ポリペプチドと本質的に同じタンパク分解性活性を示す。
【０１２５】
特定の実施形態において、CLR1活性及びXYR1活性は、上記の技術のいずれかによって、好ましくは相同組換えによって、低減又は消失させることができる。
【０１２６】
他の特定の実施形態において、CLR1活性及びALP1活性は、上記の技術のいずれかによって、好ましくは相同組換えによって、低減又は消失させることができる。
【０１２７】
他の特定の実施形態において、CLR1活性、ALP1活性及びXYR1活性は、上記の技術のいずれかによって、好ましくは相同組換えによって、低減又は消失させることができる。
【０１２８】
他の特定の実施形態において、CLR1活性、CLR2活性及びXYR1活性は、上記の技術のいずれかによって、好ましくは相同組換えによって、低減又は消失させることができる。
【０１２９】
他の特定の実施形態において、CLR1活性、CLR2活性、ALP1活性及びXYR1活性は、上記の技術のいずれかによって、好ましくは相同組換えによって、低減又は消失させることができる。
【０１３０】
糸状菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラが、別個の複製ベクターによって、2以上のタンパク質の活性を低減又は増大させるように遺伝子改変されている場合、各ベクター又はプラスミドは異なる手段の選択を有することが望ましく、且つ、安定な発現を維持し及び構築物間の要素の遺伝子再集合を防ぐために他の構築物と相同性を欠くべきである。
【０１３１】
本発明は更に、前記組換えポリペプチドを発現する糸状菌における組換えポリペプチドの純度及び/又は量を増大させるための、CLR1の活性を低減又は消失させる核酸構築物の使用を想定する。核酸構築物は、コードされたCLR1ポリペプチド及び活性が、細胞内において、低い量又は濃度で提供され得るように使用され得る。CLR1の活性は、好ましくは、内因性のclr1プロモーターを弱いプロモーターで置換することによって、又は、生物のゲノムからCLR1をコードする遺伝子又はその機能的部分を欠失させることによって、低減させることができる。プロモーター、及び遺伝子の欠失方法などは、本明細書の上に記載されている。
【０１３２】
更なる特定の実施形態では、糸状菌における組換えポリペプチドの純度及び/又は量を増大させるために付加的遺伝子が使用され得る。これらの遺伝子は、xyr1、alp1、及びalp1以外のプロテアーゼを含み得る。XYR1活性が低減又は消失するようにxyr1が不活性化されること、及び/又はALP1活性及び/又は他の1つ以上のプロテアーゼの活性が低減又は消失するようにalp1及び/又は他の1つ以上のプロテアーゼが不活性化されることが特に好ましい。特定の実施形態では、これらの遺伝子は、本明細書において上記したとおりに不活性化できる。
【０１３３】
生物は、本明細書の上記で記載されるような任意の糸状菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラであり得る。組換えポリペプチドの純度及び/又は量を増大させるための糸状菌の、具体的にはミセリオフトラ・サーモフィラの使用は、好適な発酵環境、栄養素の使用、発酵バイアルからのタンパク質の抽出などを含み得る。従って、本発明は、本明細書の上記に定義されるような組換えポリペプチドの生産のための対応する方法を想定する。更なる実施形態では、糸状菌は、遺伝子改変された生物であってもよい。遺伝子改変は、本明細書に記載される改変であり得、例えば、組換えポリペプチドの純度及び/又は量に直接的な影響を持つか、又は異なる効果を持つ、例えば、他の経路にあってもよく、又は組換えポリペプチドに加え、他の生化学実体の生産に関するか、特定の炭素源を使用する可能性に関するか、特定の窒素源を使用するなどの可能性に関するか、ゲノム若しくはゲノム領域の安定性に関するか、相同組換えの工程を可能とする若しくは改善するか、異種遺伝子若しくはプロモーターなどの発現を可能とするか、フィラメンテーション、菌糸体の断片化、pH耐性、密度耐性、塩の使用、耐塩性などの細胞の培養挙動を改善するか、細胞の世代速度に関するか、抗生物質に対する耐性に関するか、又は組換えポリペプチドの生産に有利であり得る他の任意の形質である。
【０１３４】
更なる態様において、本発明は、組換えポリペプチドの生産のための、例えば、CLR1活性の低減又は消失をもたらす上述の遺伝子改変、及び場合により、遺伝子xyr1、alp1、及び/又は本明細書の上記に定義されるようなALP1以外のプロテアーゼをコードする遺伝子に対する改変などの更なる遺伝子改変を含む、本明細書の上記に定義されるような生物、特に、遺伝子改変生物の使用に関する。
【０１３５】
以下の実施例及び図面は例示のために示される。従って、実施例及び図面は限定として解釈されるべきでないと理解される。当業者ならば、本明細書で展開された原理の更なる改変を明示的に企図できるであろう。
【０１３６】
[実施例]
[実施例1]
ミセリオフトラ・サーモフィラの形質転換
M.サーモフィラのプロトプラストの形質転換のための方法が幾つか文献に記載されている(WO 00/20555、US 2012/0005812、Verdoes et al. (2007) Industrial Biotechnology 3(1): 48-57頁)。
【０１３７】
250mlの振盪フラスコ中、100mlの真菌増殖用の標準培地に、106胞子/mlを35℃及び250rpmで24時間かけて植え込み、M.サーモフィラ株のプロトプラストを調製した。無菌のMyraclothフィルター(Calbiochem)による濾過によって、菌糸を回収し、1700mosmolの100mlのNaCl/CaCl2で洗浄した。洗浄された菌糸を50mlの試験管に移入し、秤量した。3mlの新たに調製されたCaylase(Cayla、フランス)溶液(1700mosmolのNaCl/CaCl2中20mg/mlのCaylase)を、3gの菌糸及び15mlの1700mosmolのNaCl/CaCl2と合わせ、混合した。プロトプラストが顕微鏡下で可視できるまで、菌糸懸濁液を2〜4時間、37℃及び70rpmでインキュベートした。無菌Myraclothフィルターによりプロトプラストを濾過し、無菌の50mlの試験管中に回収した。フロースルーに25mlの氷冷STC溶液(1.2Mのソルビトール、50mMのCaCl2、35mMのNaCl、10mMのトリス/HCl、pH7.5)を添加した後、プロトプラストを遠心分離(2500rpm、10分間、4℃)によって、回収した。プロトプラストを50mlのSTCにおいて再び洗浄し、1mlのSTCに再懸濁した。
【０１３８】
形質転換のために、5〜10μgの直鎖状DNA(2つのDNA断片の共形質転換の場合には、マーカー断片と発現カセット断片を1:5の比率で使用した一方、スプリットマーカー構築物の2つの断片の場合には、1:1の比率で使用した)、1μlのアウリントリカルボン酸(ATA)及び100μlのプロトプラスト懸濁液を混合し、室温で25分間インキュベートした。次に、1.7mlのPEG溶液(60%のPEG4000[ポリエチレングリコール]、50mMのCaCl2、35mMのNaCl、10mMのトリス/HCl、pH7.5)を添加し、穏やかに混合した。室温で20分間のインキュベート後、試験管をSTC溶液で満たし、遠心分離し(10分、4℃、2500rpm)、上清を除去した。ペレットを残りのSTCに再懸濁し、当技術分野で公知の選択培地プレート(組成は使用するマーカーに依存)に播種した。37℃で3〜6日間、プレートをインキュベートした後、形質転換体を取得し、選択培地上に再ストリークした。
【０１３９】
選択培地プレート
更なる窒素源を含まず、20mMのアセトアミドを補充した富化最少培地を使用して、選択マーカーとしてamdSを使用するときの陽性形質転換体の選択を行う。pyr4又はpyr5遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、ウリジン及びウラシルを含まない富化最少培地を使用して、陽性形質転換体の選択を行う。ノルセオトリシン耐性選択マーカーを使用する場合、培地中にノルセオトリシンを含有させる。アセトアミダーゼ機能性を喪失したクローンの選択は、FAC培地寒天プレート上での培養により行う。
【０１４０】
amdS選択用の富化最少培地:
グルコース  10g/l
スクロース  229.3g/l
Mg2SO4  0.24g/l
KCl  0.52g/l
KH2PO4  0.22g/l
CuSO4*5H2O  1.6mg/l
FeSO4*7H2O  5mg/l
ZnSO4*7H2O  22mg/l
MnSO4*H2O  4.3mg/l
CoCl2*6H2O  1.6mg/l
Na2MoO4*2H2O  1.5mg/l
H3BO3  11mg/l
EDTA  50mg/l
ウラシル  1.12g/l
ウリジン  2.44g/l
CsCl  2.52g/l
ペニシリン  20mg/l
ストレプトマイシン  50mg/l
アセトアミド  0.6g/l
寒天  16g/l
【０１４１】
pyr4又はpyr5選択用の富化最少培地:
グルコース  10g/l
スクロース  229.3g/l
Mg2SO4  0.24g/l
KCl  0.52g/l
KH2PO4  0.22g/l
NaNO3  1.4g/l
CuSO4*5H2O  1.6mg/l
FeSO4*7H2O  5mg/l
ZnSO4*7H2O  22mg/l
MnSO4*H2O  4.3mg/l
CoCl2*6H2O  1.6mg/l
Na2MoO4*2H2O  1.5mg/l
H3BO3  11mg/l
EDTA  50mg/l
ペニシリン  20mg/l
ストレプトマイシン  50mg/
カザミノ酸  0.1%(w/v)
寒天  16g/l  pH6.5に設定
【０１４２】
ノルセオトリシン選択用の富化最少培地:
グルコース  10g/l
スクロース  229.3g/l
Mg2SO4  0.24g/l
KCl  0.52g/l
KH2PO4  0.22g/l
NaNO3  1.4g/l
CuSO4*5H2O  1.6mg/l
FeSO4*7H2O  5mg/l
ZnSO4*7H2O  22mg/l
MnSO4*H2O  4.3mg/l
CoCl2*6H2O  1.6mg/l
Na2MoO4*2H2O  1.5mg/l
H3BO3  11mg/l
EDTA  50mg/l
ウラシル  1.12g/l
ウリジン  2.44g/l
CsCl  2.52g/l
ペニシリン  20mg/l
ストレプトマイシン  50mg/l
カザミノ酸  0.1%(w/v)
ノルセオトリシン  100mg/l
寒天  16g/l  pHを6.5に設定
【０１４３】
amdSマーカー除去の選択用のFAC培地
グルコース  10g/l
スクロース  229.3g/l
Mg2SO4  0.24g/l
KCl  0.52g/l
KH2PO4  0.22g/l
CuSO4*5H2O  1.6mg/l
FeSO4*7H2O  5mg/l
ZnSO4*7H2O  22mg/l
MnSO4*H2O  4.3mg/l
CoCl2*6H2O  1.6mg/l
Na2MoO4*2H2O  1.5mg/l
H3BO3  11mg/l
EDTA  50mg/l
ウラシル  1.12g/l
ウリジン  2.44g/l
CsCl  2.52g/l
ペニシリン  20mg/l
ストレプトマイシン  50mg/
尿素  0.3g/l
フルオロアセトアミド  5g/l
寒天  16g/l
【０１４４】
amdSマーカー除去の選択
欠失された遺伝子座におけるマーカーの除去のための、5'-繰り返し配列が隣接するamdS遺伝子が正しく組み込まれた、試験後の陽性クローンを、amdSマーカー除去について選択した。amdS-隣接5'-配列を使用して、欠失された遺伝子座のスカーレス(scarless)な隣接非コード5'-及び3'-配列を残す相同組換えによって、amdSノックアウトカセットを除去する。アセトアミダーゼ機能性を喪失したクローンの選択は、FAC培地寒天プレート上での培養により行う。アセトアミダーゼ発現クローンは、フルオロアセトアミドを、増殖を防止する毒性化合物フルオロアセテートに変換する。FAC培地で増殖可能なクローンを、amdS選択用の富化最少培地上での増殖の喪失について試験した。試験後の陽性クローンを、amdSマーカーの喪失をもたらす、欠失された遺伝子座における正しい組換えイベントについてPCRによって分析した。amdSスプリットマーカー構築物を使用した更なるノックアウト用に、正しいマーカー除去を有するクローンを選択した。
【０１４５】
[実施例2]
欠失構築物の作出
当技術分野で公知のスプリットマーカー法を使用して、様々な遺伝子のノックアウト突然変異体を作製した。破壊しようとする遺伝子の1000〜2000bpの5'及び3'相同領域(「flank_A」及び「flank_B」)を、ミセリオフトラ・サーモフィラのゲノムDNAからPCRによって増幅し、当技術分野で公知の標準法を使用してスプリットマーカー遺伝子の一部を保持するプラスミドにクローニングした。各マーカー断片は、それ自体では機能を発揮せず、2つのプラスミドに分割された2つのマーカー断片の重複部分の組換えの後、機能を発揮する。当技術分野で公知であるアスペルギルス・ニドゥランス由来のアセトアミダーゼをコードするamdS遺伝子を選択マーカーとして使用した。
【０１４６】
場合により、amdSスプリットマーカーのC末端部分を保持する欠失プラスミドを、わずかに異なる方法により構築した。flank_B(欠失カセットを標的とする)の代わりに、プラスミドは、直接接触するflank_A及びflank_Bを含むものとした。この構築物の使用により、スプリットマーカーシステムの両方の部分の標的相同的組み込みの後、ゲノムにおけるflank_Aの複製がもたらされる。この場合、amdSマーカーカセットは、場合により、当技術分野で公知のようにフルオロアセトアミドにより2回目の相同組換え工程及び選択を介して除去できる。
【０１４７】
当技術分野で公知の標準的な分子生物学的技術を使用して、amdSマーカー断片のPCR増幅のテンプレートとしてベクターpH305(配列番号15)及びpGBAAS-1(配列番号16)をベースとして、一般的なamdSスプリットマーカー欠失プラスミドpDB40-amdS-5'(配列番号13)及びpDB41-amdS-3'(配列番号14)をクローニングした。
【０１４８】
amdSスプリットマーカーベクター構築物の構築
当技術分野で公知の標準的な技術を使用して、プラスミドpGBAAS-1(構築の詳細についてはWO 98/46772及びEP 0 635 574(pGBLA50はpGBAAS-1と同一)を参照)(配列番号16)をテンプレートとして使用し、アスペルギルス・ニドゥランスのgpdAプロモーター及びamdSスプリットマーカーのN末端部分を含む約1.8kbをPCR増幅し、プラスミドpH305(配列番号14)にクローニングした。得られるプラスミドpDB40-amdS-5'(配列番号13)は、塩基142〜1044からのgpdAプロモーター、及び塩基1045〜1959からのamdSスプリットマーカーのN末端部分を含むものであった。
【０１４９】
同様の方法により、プラスミドpGBAAS-1(配列番号16)をテンプレートとして使用し、C末端amdSスプリットマーカーのC末端部分及びamdSターミネーターを含む約1.7kbをPCR増幅し、プラスミドpH305(配列番号15)にクローニングした。得られるプラスミドpDB41-amdS-3'(配列番号14)は、塩基321〜1626からのamdSスプリットマーカーのC末端部分、及び塩基1627〜1976からのamdSターミネーターを含むものであった。
【０１５０】
clr1欠失プラスミド
当技術分野で公知の標準的な技術を使用して、約1.3kbのclr1遺伝子の5'-隣接領域(clr1_flank_A)をPCR増幅し、gpdAプロモーター及びamdSスプリットマーカーのN末端部分を保持するプラスミドpDB40-amdS-5'(配列番号13)にクローニングした。得られるプラスミドpMT122-Dclr1-A(配列番号17)は、塩基95〜1378からのclr1_flank_A、並びに塩基1389〜3206からの、gpdaプロモーター及び5'-amdS配列を含むマーカー断片を含むものであった。
【０１５１】
同様の方法により、約1.3kbのclr1遺伝子の3'-隣接領域(clr1_flank_B)をPCR増幅し、amdSのスプリットマーカーのC末端部分及びターミネーター領域を保持するプラスミドpDB41-amdS-3'(配列番号14)にクローニングした。得られるプラスミドpMT120-Dclr1-B(配列番号18)は、塩基3637〜5292からのマーカー断片及び塩基6〜1260からのclr1_flank_Bを含むものであった。
【０１５２】
プラスミドをSwaIによって消化してベクターバックボーンを除去し、欠失カセットを含む断片をアガロースゲルから単離した。単離されたDNA断片のみを後で形質転換に使用した。
【０１５３】
xyr1欠失プラスミド
当技術分野で公知の標準的な技術を使用して、約1.5kbのxyr1遺伝子の5'-隣接領域(xyr_flank_A)をPCR増幅し、amdSスプリットマーカーのgpdA-プロモーター及びN末端部分を保持するプラスミドpDB40-amdS-5'(配列番号13)にクローニングした。得られるプラスミドpDB45_Dxyr1_A(配列番号19)は、塩基66〜1593からのxyr1_flank_A及び塩基1601〜3418からのマーカー断片を含むものであった。
【０１５４】
同様の方法により、約1.5kbのxyr1遺伝子の3'-隣接領域(xyr1_flank_B)をPCR増幅した。オーバーラッププライマーによる標準的なPCR融合技術を使用して、約3kbのxyr1_flank_A/flank_B融合断片を、5'-及び3'-隣接領域のPCR断片をテンプレートとして使用して増幅し、amdSスプリットマーカーのC末端部分及びターミネーター領域を保持するプラスミドpDB41-amdS-3'(配列番号14)にクローニングした。得られるプラスミドpDB58_Dxyr1_AB(配列番号20)は、塩基321〜1976からのマーカー断片及び塩基2055〜5100からのxyr1_flank_A/flank_Bを含むものであった。
【０１５５】
両プラスミドをSwaIによって消化してベクターバックボーンを除去し、欠失カセットを含む断片をアガロースゲルから単離した。単離されたDNA断片のみを後で形質転換に使用した。
【０１５６】
alp1欠失プラスミド
プラスミドpDalp1-amdS(配列番号21)を使用して、M.サーモフィラの上清中の主要なプロテアーゼ(ALP1)の欠失を行った。プラスミドの詳細な説明は、WO 2010/107303及びVisser et. al. (2011) Industrial Biotechnology 7(3): 214-223頁に記載されている。プラスミドは、cbh座に由来する短い反復DNA断片が隣接するamdSマーカー遺伝子を含むものであった。このダイレクトリピートを使用することにより、相同組換え及び当技術分野で公知のフルオロアセトアミドによる選択を介して、amdS遺伝子を除去できる。この欠失マーカーカセットは、alp1座における標的組み込み用の、alp1遺伝子の大きなゲノム断片(1.6及び3.6kb)が隣接する。この欠失カセットによる形質転換により、0.7kbの5'-コード領域及び0.2kbのalp1遺伝子の5'-UTRが除去され、それによりプロテアーゼが不活性化される。
【０１５７】
プラスミドをHindIII及びNotIによって消化して、ベクターバックボーンを除去した。欠失カセットを含む断片をアガロースゲルから単離し、形質転換に使用した。
【０１５８】
Ku70欠失プラスミド
当技術分野で公知の標準的な技術を使用して、約1kbのku70遺伝子の5'-隣接領域(ku70_flank_A)(表示名XP_003660551.1)をPCR増幅し、amdSスプリットマーカーのgpdA-プロモーター及びN末端部分を保持するプラスミドpDB40-amdS-5'(配列番号13)にクローニングした。得られるプラスミドpMT123-Dku70-A(配列番号22)は、塩基269〜1291からのku70_flank_A、並びに塩基1299〜3116からのgpda-プロモーター及び5'-amdS配列を含むマーカー断片を含むものであった。
【０１５９】
同様の方法により、約1.1kbのku70遺伝子の3'-隣接領域(ku70_flank_B)をPCR増幅した。オーバーラッププライマーを用いた標準的なPCR融合技術を使用して、約2.1kbのku70_flank_A/flank_B融合断片を、5'-及び3'-隣接領域のPCR断片をテンプレートとして使用して増幅し、amdSスプリットマーカーのC末端部及びターミネーター領域を保持するプラスミドpDB41-amdS-3'(配列番号14)にクローニングした。得られるプラスミドpMT124_Dku70_AB(配列番号23)は、塩基366〜2021からのマーカー断片及び塩基2015〜4150からのku70_flank_A/flank_Bを含むものであった。
【０１６０】
すべてのプラスミドをSwaIによって消化してベクターバックボーンを除去し、欠失カセットを含む断片をアガロースゲルから単離した。単離されたDNA断片のみを、後で形質転換に使用した。
【０１６１】
[実施例3]
酵素発現カセットの作出
a)manT発現プラスミド
コドンを適合した合成遺伝子(GeneArt、ThermoFisher Scientific、米国)manT(配列番号24)は、元々トリコデルマ・レエセイ由来のマンナナーゼ(配列番号25)の、操作された短縮化変異体をコードするが、それはCBMドメインを欠き、また天然のシグナルペプチドがM.サーモフィラのセルラーゼ由来のシグナルペプチドと置換されている。
【０１６２】
マンナナーゼmanTの過剰発現のため、一般的な発現ベクターpPchi(1.8)-Tcbh1_NotIを使用した。プラスミドは、目的の遺伝子の発現を駆動するためにM.サーモフィラ由来のchi1遺伝子のプロモーター及びcbh1遺伝子のターミネーターを使用した。プラスミドの詳細な説明は、WO 2010/107303に記載されている。標準的なクローニング技術を使用し、manT発現プラスミドpChi1-manT(配列番号26)を構築した。プラスミドは、塩基6871〜1813からのプロモーター配列Pchi、塩基1815〜2930からのシグナル配列を含むmanTコード配列、及び塩基2938〜3961からのcbh1ターミネーター配列を含むものであった。
【０１６３】
プラスミドをSmaI及びNotIによって消化してベクターバックボーンを除去し、manT発現カセットを含む断片をアガロースゲルから単離した。単離されたDNA断片のみを後で形質転換に使用した。
【０１６４】
b)フィターゼ発現プラスミド
細菌由来の合成フィターゼ(フィターゼPhV-99としてWO 2012/143862に開示、配列番号28)をコードする合成遺伝子(GeneArt、ThermoFisher Scientific、米国)(配列番号27)を使用して、フィターゼ発現プラスミドを構築した。フィターゼの分泌のため、M.サーモフィラ由来のシグナルペプチドをコードするシグナル配列をフィターゼの成熟型配列に追加した。TEF(伸長因子1-α)をコードする遺伝子の上流領域から増幅されたプロモーター配列、及びM.サーモフィラ由来のCbh1コード遺伝子の下流領域から増幅されたターミネーター配列を、フィターゼの発現を駆動する調節エレメントとして使用した。標準的なPCR融合及びクローニング技術を使用して、発現プラスミドpMT873(配列番号29)を、大腸菌用の標準的なクローニングベクターpBSK+(colE1複製起点、アンピシリン耐性、青/白スクリーニング用のlacZ)をベースに構築した。プラスミドは、塩基255〜2733からのプロモーター配列Ptef(伸長因子1-αのプロモーター)、塩基2734〜4076からのシグナル配列を含むフィターゼ、及び塩基4077〜5070からのcbh1ターミネーター配列を含むものであった。
【０１６５】
プラスミドをEcoRI、SacI及びXhoIによって消化してベクターバックボーンを除去し、フィターゼ発現カセットを含む断片をアガロースゲルから単離した。単離されたDNA断片のみを後で形質転換に使用した。
【０１６６】
[実施例4]
選択マーカー発現カセットの作出
CloneNatマーカープラスミド
GENEART AG(レーゲンスブルグ、ドイツ)(配列番号30)により、合成遺伝子カセットPtrpC-Pcnat1が、合成オリゴヌクレオチド及び/又はPCR産物から構築された。カセットは、ストレプトマイセス・ノルセイ(Streptomyces noursei)のnat1遺伝子を含むものであり(Krugel et al. (1993) Gene 127: 127-131頁)、糸状菌のためにコドン最適化され、アスペルギルス・ニドゥランスのtrpCプロモーター制御下であり、FLPにより媒介される組換えに使用できるFRT部位が隣接するものである。その断片を、SfiI/SfiIクローニング部位を使用して、標準的なプラスミドMA-RQ(GENEART AG、レーゲンスブルグ、ドイツ)にクローニングした。このプラスミドは、Col E1複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。プラスミドは、塩基370〜787からのA.ニドゥランスのプロモーター配列trpC(インドール-3-グリセロール-ホスフェートシンターゼ)、及び塩基787〜1410からのターミネーター領域を含むノルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼを含む。プラスミドをSac1及びKpn1によって消化してベクターバックボーンを除去し、ノルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ発現カセットを含む断片をアガロースゲルから単離した。単離されたDNA断片のみを後で形質転換に使用した。
【０１６７】
[実施例5]
manTを発現するM.サーモフィラ株の構築
ウラシル栄養要求性及び低プロテアーゼ活性を有する株(WO 2008/073914において、詳細に記載)であるC1系統由来のM.サーモフィラ宿主株UV18#100.fΔpyr5Δalp1を、実施例1に記載したように、プラスミドpChi1-manTからSmaI及びNotIで消化され単離されたmanT(実施例3を参照)発現構築物(配列番号26)、及び単離されたpyr5マーカー構築物を用いて共形質転換した。pyr5マーカー断片を、プラスミドpMBL71[pyr5](配列番号31)、すなわちC1ゲノムDNA及び標準的な大腸菌クローニングベクターから構築したゲノムライブラリークローンから単離した。8kbのBglII断片は、プロモーター及びターミネーター配列を含むpyr5遺伝子を含むものであった。
【０１６８】
当技術分野で公知のように、共形質転換されたpyr5マーカーによるpyr5欠失の補完により、回復したウラシル原要求性を選択するために、pyr4/5選択用の富化最小培地上、37℃で3〜6日間、形質転換体をインキュベートした。当技術分野で公知のように、コロニーを再ストリークし、manT発現カセットに特異的なプライマー対によるPCRを使用して、manT発現カセットの共組み込みを確認した。manT発現構築物について陽性を示す試験後の形質転換体を選択し、HC_manTと命名した。
【０１６９】
Clr1の欠失
プラスミドpMT122-Dclr1-A(配列番号17)及びpMT120-Dclr1-B(配列番号18)由来の2つの単離されたSwaI断片を1:1の比率で用い、実施例1に記載したように、様々なM.サーモフィラ宿主株を共形質転換した。amdS選択用の富化最少培地をインキュベーションに使用した。再ストリークの後、標的clr1座における欠失カセットの正しい組み込みに関して、また完全なclr1遺伝子の消滅に関して、形質転換体をPCRによって分析した。試験後の陽性クローンを、更なる特徴解析のために選択した。
【０１７０】
上記方法において、M.サーモフィラC1株であるUV18-25、UV18#100.f(その構築はWO 2008/073914で詳細に記載)、UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70及びHC_manTにおいて、clr1を欠失させ、株UV18-25_Δclr1#α、UV18#100.f_Δclr1#α、UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δclr1#α及びHC_manT_Δclr1#αを作り出した。
【０１７１】
ku70の欠失
非相同的末端結合(NHEJ)修復系に欠陥のある株は、高い相同組換え率を示し、Ku70の欠失によって、得ることができる。宿主株M.サーモフィラのKu70欠失突然変異体は、プラスミドpMT123-Dku70-A(配列番号22)及びpMT124_Dku70_AB(配列番号23)由来の2つの単離されたSwaI断片の1:1の比率による共形質転換によって、取得できる。amdS選択用の富化最少培地をインキュベーションに使用した。再ストリークの後、標的ku70座における欠失カセットの正しい組み込みに関して、また完全なku70遺伝子の消滅に関して、形質転換体をPCRによって分析することができる。FACによる対抗選抜によって、amdSマーカー遺伝子カセットの除去に関して、試験後の陽性クローンを選択する。
【０１７２】
選択された開始宿主株のマーカーを再利用したΔku70突然変異体を、更なる遺伝子改変に使用できる。
【０１７３】
xyr1の欠失
プラスミドpDB45_Dxyr1_A(配列番号19)及びpDB58_Dxyr1_AB(配列番号20)由来の2つの単離されたSwaI断片を1:1の比率で用い、M.サーモフィラ宿主株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70を、実施例1に記載したように共形質転換し、マーカーの後除去を可能にした。amdS選択用の富化最少培地をインキュベーションに使用した。再ストリークの後、標的xyr1座における欠失カセットの正しい組み込みに関して、また完全なxyr1遺伝子の消滅に関して、形質転換体をPCRによって分析した。試験後の陽性クローンをUV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δxyr1#βと表し、更なる特徴解析及びマーカー除去のために選択した。
【０１７４】
xyr1ノックアウト株におけるclr1の欠失
UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δxyr1#βからのamdS選択マーカーのマーカー除去が成功したことにより、M.サーモフィラ株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δxyr1が得られ、それを実施例1に記載したように、プラスミドpMT122-Dclr1-A及びpMT120-Dclr1-B由来の2つの単離されたSwaI断片を1:1の比率で用い、共形質転換した。amdS選択用の富化最少培地をインキュベーションに使用した。再ストリークの後、標的clr1座における欠失カセットの正しい組み込みに関して、また完全なclr1遺伝子の消滅に関して、形質転換体をPCRによって分析した。試験後の陽性クローンをUV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δxyr1Δclr1#αと表し、更なる特徴解析のために選択した。
【０１７５】
[実施例6]
フィターゼ産生M.サーモフィラ株の作出
フィターゼの発現のために、様々なM.サーモフィラ株を、実施例1に記載したように、プラスミドpMT873(配列番号29)由来のEcoRI、ScaI及びXhoI消化かつ単離されたフィターゼ(実施例3参照)発現構築物、及びプラスミドPtrpC-Pcnat1(配列番号30)由来のSac1及びKpn1消化かつ単離されたnat1マーカー発現構築物により共形質転換した。当技術分野で公知のようにノルセオトリシン耐性について選択するため、ノルセオトリシン選択用富化最少培地上、37℃で3〜6日間、形質転換体をインキュベートした。コロニーを再ストリークし、当技術分野で公知のフィターゼ発現カセットに特異的なプライマー対を用いたPCRを使用して、フィターゼ発現カセットの共組み込みについて確認した。フィターゼ発現構築物に関して陽性を示す試験後の形質転換体を、更なる特徴解析のために選択した。
【０１７６】
[実施例7]
酵素活性アッセイ
a)フィターゼ活性アッセイ
マイクロタイタープレートにおいて、フィターゼ活性を決定した。測定結果がアッセイにおける線形範囲中に留まるように、フィターゼを含有する上清を反応緩衝液(250mMの酢酸Na、1mMのCaCl2、0.01%のTween 20、pH5.5)で希釈した。酵素溶液10μlを、140μlの基質溶液(反応緩衝液中、6mMのフィチン酸Na(シグマP3168))と共に37℃で1時間インキュベートする。トリクロロ酢酸溶液(15%w/w)を150μl添加し、反応をクエンチする。遊離したリン酸塩を検出するために、クエンチした反応溶液20μlを、作製直後の発色試薬(60mMのL-アスコルビン酸(シグマA7506)、2.2mMのモリブデン酸アンモニウム四水和物、325mMのH2SO4)280μlで処理し、50℃で25分間インキュベートし、次に820nmの吸光度を決定する。ブランク値として、基質緩衝液を37℃で単独でインキュベートし、酵素サンプル10μlのみを、トリクロロ酢酸によるクエンチ後に添加する。残りの測定は同様の呈色反応により行う。遊離したリン酸塩の量を、既知濃度のリン酸塩溶液による呈色反応の較正曲線を介して決定する。
【０１７７】
b)マンナナーゼ活性アッセイ
マンナナーゼ活性は、当技術分野で公知のようにガラクトマンナンからの還元糖の遊離として定義した。詳細には、50mMのNaOAc、0.5mg/mLのBSA、pH5.0におけるマンナナーゼ含有サンプルの希釈系列を作製し、アッセイにおける線形範囲中の少なくとも2つのサンプルを測定した。1%のイナゴマメガラクトマンナン(低粘性、Megazyme)、50mMのNaOAc、pH5.0の溶液を作製した。17μlの希釈酵素、76.5μlのガラクトマンナン溶液及び15.3μlの緩衝液(250mMのNaOAc、pH5.0、0.025%のTrition-X-100)を混合し、50℃で2時間インキュベートした。インキュベートの工程後、ジニトロサリチル酸溶液による検出工程の直前に、希釈酵素を添加したサンプルを、マンナナーゼ活性算出用のブランクとして用いた。
【０１７８】
インキュベートの工程後、還元糖の量を以下の通り決定した。ガラクトマンナンアッセイ、又は較正に使用した所定のマンノース希釈系列の一部を、1%(w/v)のジニトロサリチル酸(DNSA)、30%(w/v)の酒石酸カリウムナトリウム及び0.4MのNaOHを含有する溶液の一部と混合した。混合液を99℃で10分間、及び4℃で5分間インキュベートした。最後に540nmの吸光度を測定した。マンノース濃度に対するマンノース標準サンプルの吸光度データをプロットすることにより、還元糖相当量(マンノース相当量として)を算出した。マンノース標準サンプルのデータの適当なカーブフィッティングによって作成された式を使用して、サンプルの還元糖相当量の量を算出した。
【０１７９】
[実施例8]
撹拌槽型培養装置におけるM.サーモフィラの培養によるマンナナーゼの生産
1Lの振盪フラスコに、175mLの前培養培地に104胞子/mLを植え込み、35℃及び250rpmで72時間インキュベートし、M.サーモフィラの前培養を調製した。あるいは、いかなるプロセスの遂行又はタンパク質の収量にも影響しないM.サーモフィラの菌糸体の凍結ストックから植え込んで前培養を行うこともできる。詳細な前培養培地組成については表3を参照のこと。
【０１８０】
【表３】
2019501646.tif 000008
【０１８１】
【表４】
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【０１８２】
長時間のフェドバッチ培養を、5Lワーキングボリューム用のガラス製培養装置(Sartorius、BiostatB)で行った。前培養を撹拌槽型培養装置に無菌的に移入した。使用した典型的な植え込み量は、開始量3.5Lに対し5〜10%とした。フェドバッチ培養に使用する培地組成を、表5に示す。
【０１８３】
【表５】
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【０１８４】
38℃の温度、300rpmの初期撹拌速度、1vvm(培養液体積に対する空気体積/分)で空気を通しながら培養を行った。撹拌速度の調整によって、DOT(溶存酸素分圧)を>20%に制御した。25%のNH4OH溶液を使用してpHの変動をpH6.0〜pH6.7の間に制御した。バッチ段階の終了時にpHがpH=7.0まで上昇したとき、50%(w/w)のグルコース溶液の供給を開始した。供給速度を、初期量に対して3〜5g/L/時となるように算出し、設定した。
【０１８５】
発酵期間全体にわたり培養液サンプルを取得した。セルフリーの上清を0.22μmフィルターを用いた培養液の濾過によって得、タンパク質濃度及びマンナナーゼ活性の分析に使用した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準とする当技術分野で公知のブラッドフォード法を使用して決定した。マンナナーゼ活性は、上記の通り決定した。
【０１８６】
図1に示すように、clr1の欠失により、親株と比較して、発酵培養液中のマンナナーゼの純度が高くなる(比活性が高くなる)。HC_manT_Δclr1#α株の培養において生産されるManTの比活性は、HC_manT親株と比較して2.5倍高く、そして、164時間後に最高値の275U/gタンパク質に達した。
【０１８７】
2つの異なる時点のセルフリーの上清をSDS-PAGEによって分析した。SDS-PAGEでは、総ての場合において、タンパク質濃度の測定から決定した等量のタンパク質をロードした。ゲルをクーマシー・ブルー染色した(図2)。バックグラウンドのタンパク質に対する良好なマンナナーゼの比率(約50kDaのグリコシル化されたマンナナーゼの幅広いタンパク質のバンド)への明らかなシフトが、clr1欠失株において、示される。
【０１８８】
[実施例9]
タンパク質発現の分析
作出した突然変異株を小規模培養で発酵し、上清を分析した。48ウェルマイクロタイタープレート中の、表6に示す培地1mlにM.サーモフィラ株を植え込んだ。マイクロタイタープレートシェーカー上、37℃で3〜6日間、900rpm及び85%の湿度にて、菌株を発酵した。セルフリーの上清を培養終了後回収し、等量の上清をSDS-PAGEによって分析した。ゲルをクーマシー・ブルーで染色した。
【０１８９】
UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δclr1#α株では、対応する親株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70と比較して細胞外タンパク質量が大幅に低下していることが明確に示されている(図3)。この結果は、clr1欠失株が高純度での組換えタンパク質の生産により適することを示すものである。
【０１９０】
【表６】
2019501646.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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