(57)【要約】  本発明は、ペプチドリンカーによって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素に、又はアルカリホスファターゼ酵素に連結されたｓｃＦｖからなる融合タンパク質に関する。該融合タンパク質はまた、ヒスチジンタグ、任意で、小胞体残留シグナルを含む。本発明はまた、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された植物細胞及び本発明の融合タンパク質を産生する方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼをコードするポリペプチドと、
（ｉｉ）ペプチドリンカーと、
（ｉｉｉ）ｓｃＦｖをコードするポリペプチドと、
（ｉｖ）任意で、小胞体残留シグナルと、
（ｖ）ヒスチジンタグと、
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５          （Ｉ）
を有する融合タンパク質、あるいは、
式：
Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５          （ＩＩ）
を有する融合タンパク質
（式中、Ｘ１は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼをコードするポリペプチドであり、Ｘ２は、ペプチドリンカーであり、Ｘ３は、ｓｃＦｖをコードするポリペプチドであり、Ｘ４は、小胞体残留シグナルであり、Ｘ５は、ヒスチジンタグであり、ｎは、０又は１である）。
【請求項３】
前記ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼをコードするポリペプチドは、Ｎ末端小胞体ターゲティング配列を含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ｓｃＦｖは、抗マウス、抗ロバ、抗ウサギ、抗ウマ、抗ヒト、抗ニワトリ、抗ヤギ又は抗ヒツジ活性からなる群から選択される免疫グロブリン活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ｓｃＦｖは、抗ウサギ活性を有する、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記小胞体残留シグナルは、ＨＤＥＬ、ＫＤＥＬ、ＳＥＫＤＥＬ又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ヒスチジンタグは、６×ヒスチジンタグである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された植物細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、植物細胞において該融合タンパク質を発現させることと、該融合タンパク質を、該植物細胞から回収することとを含む、方法。
【請求項１３】
前記植物細胞は、ニコチアナ種の植物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１０に記載の発現ベクターを備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドリンカーによって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素に、又はアルカリホスファターゼ酵素に連結されたｓｃＦｖからなる融合タンパク質に関する。該融合タンパク質はまた、ヒスチジンタグ、及び任意で、小胞体残留シグナルを含む。本発明はまた、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された植物細胞及び本発明の融合タンパク質を産生する方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
セイヨウワサビ（アルモラシア・ルスチカナ（Armoracia rusticana）、同義語コクレアリア・アルモラシア（Cochlearia armoracia））は、アブラナ科の多年草である（同様に、アブラナ科には、カラシナ、ワサビ、ブロッコリー、及びキャベツが含まれる）。セイヨウワサビは、香辛料として使用される根菜である。
【０００３】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、セイヨウワサビ（アルモラシア・ルスチカナ）の根から単離される酵素であり、ペルオキシダーゼのフェロプロトポルフィリン群に属する。ＨＲＰタンパク質は、４つのジスルフィド架橋を含有する単鎖ポリペプチドである。
【０００４】
ＨＲＰ酵素は、主に、弱いシグナルを増幅して、標的分子の検出能を高めるその能力のため、生化学用途で広範囲にわたって使用される。ＨＲＰ酵素は、多くのアイソフォームを有する金属酵素であり、そのうちの最も研究されているアイソフォームは、Ｃ型である。
【０００５】
ＨＲＰは、分子にコンジュゲートさせることができる６つのリジン残基を有する４４１７３．９ダルトンの糖タンパク質である。ＨＲＰは、適正な基質とともにインキュベートすると、コンジュゲートされた分子の有色、蛍光又は発光誘導体を産生して、それを検出及び定量化することが可能となる。
【０００６】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、その触媒機能に重要な２つの亜鉛原子を含有する８６キロダルトンのホモ二量体タンパク質酵素である。モノマーはそれぞれ、１つの亜鉛原子を含む。ＡＰは、アルカリ性ｐＨで活性を有する。
【０００７】
ＡＰは、原核生物及び真核生物を含む多くの生物において見いだされている。各種形態は、同じ一般的な機能を有するが、機能する環境に適した異なる構造形態を有し得る。
【０００８】
ＨＲＰ若しくはＡＰ酵素、又はそれらのコンジュゲートの存在は、酸化剤として過酸化水素を使用してＨＲＰ又はＡＰによって酸化される場合に、分光光度法によって検出可能な特徴的な変化をもたらす基質を使用して、可視状態になる。
【０００９】
ＨＲＰはまた、その単量体の性質及び有色産物を産生する容易さに起因して、ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学検査等の技法において一般的に使用される。伝統的には、市販のＨＲＰ又はＡＰ標識二次抗体は通常、ＨＲＰ又はＡＰの、抗体への化学的標識によって作製される。このことは、産物の不均一な組成、並びにＨＲＰ又はＡＰ及び抗体の活性の低減をもたらすことがあり、化学量論は、多くの場合、マーカータンパク質対抗体の所望の１：１の比ではなく、それらの全てが、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットの特異度及び感度に影響を及ぼす。組換えにより産生されるマーカー−抗体産物の遺伝子融合及び発現を用いて、これらの問題は改善される。考え得る解決法は、大腸菌（E. coli）において融合タンパク質を産生することであるが、これに伴う問題は、産物が可溶性ではないこと、大腸菌における翻訳後グリコシル化の欠如が、封入体における発現された組換えタンパク質の凝集を招き、その結果として、ＨＲＰ活性を妨害することである。溶解度の問題を改善するためにピキア・パストリス（Pichia pastoris）において遺伝的に融合された組換えＨＲＰ−抗体（アトラジンに対する抗体のＦａｂ断片（非特許文献１））を産生する幾つかの研究が行われている。
【００１０】
本発明は、上述のＦａｂ断片よりもはるかに小さい抗体の領域である単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合されたマーカータンパク質（ＨＲＰ又はＡＰ）からなる組換え融合産物の産生をもたらす。さらに、本発明は、植物において産生される融合タンパク質に依存する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Koliasnikov et al 2011
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ペプチドリンカーによって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素に、又はアルカリホスファターゼ酵素に連結されたｓｃＦｖからなる融合タンパク質に関する。該融合タンパク質はまた、ヒスチジンタグ、及び任意で、小胞体残留シグナルを含む。
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼをコードするポリペプチドと、ペプチドリンカーと、ｓｃＦｖをコードするポリペプチドと、任意で、小胞体残留シグナルと、ヒスチジンタグとを含む融合タンパク質が提供される。
【００１４】
本発明の第２の態様は、式Ｉ又は式ＩＩから選択される式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５          （Ｉ）
Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５          （ＩＩ）
を有する融合タンパク質
（式中、Ｘ１は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼをコードするポリペプチドであり、Ｘ２は、ペプチドリンカーであり、Ｘ３は、ｓｃＦｖをコードするポリペプチドであり、Ｘ４は、小胞体残留シグナルであり、Ｘ５は、ヒスチジンタグであり、ｎは、０又は１である）を提供する。
【００１５】
本発明の１つの実施の形態において、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼをコードするポリペプチドは、小胞体ターゲティングシグナルを含む。ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼは、Ｎ末端小胞体ターゲティング配列を含むことが好ましい。
【００１６】
本発明の別の実施の形態において、ｓｃＦｖは、抗マウス、抗ロバ、抗ウサギ、抗ウマ、抗ヒト、抗ニワトリ、抗ヤギ又は抗ヒツジ活性から選択される免疫グロブリン活性を有する。ｓｃＦｖは、抗ウサギ活性を有することが好ましい。
【００１７】
更なる実施の形態において、小胞体残留シグナルは、ＨＤＥＬ、ＫＤＥＬ、ＳＥＫＤＥＬ又はそれらの変異体からなる群から選択される。しかしながら、小胞体残留シグナルが、当該技術分野で既知の小胞体シグナルから選択されてもよいことは、当業者に理解されよう。
【００１８】
融合タンパク質の精製を助長するために、融合タンパク質が、ヒスチジンタグを含むことは理解されよう。ヒスチジンタグは、６×ヒスチジンタグであることが好ましい。
【００１９】
本発明の更なる実施の形態は、ｓｃＦｖに連結された、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域を含むことを包含し得る。定常領域を含むことにより、Ｆｃエフェクター機能が可能になることは理解されよう。
【００２０】
本発明の第２の態様は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００２１】
第３の態様は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００２２】
本発明の更なる態様は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された植物細胞を提供する。
【００２３】
本発明の更に別の態様において、本発明の融合タンパク質を産生する方法であって、植物細胞において該融合タンパク質を発現させることと、該融合タンパク質を、該植物細胞から回収することとを含む、方法が提供される。
【００２４】
好ましい実施の形態において、植物細胞は、ニコチアナ種（Nicotiana sp.：タバコ属の一種）の植物細胞である。
【００２５】
本発明の更なる態様は、本発明の融合タンパク質又は本明細書に記載の発現ベクターを備えるキットを提供する。
【００２６】
ここで、本発明の非限定的な実施形態を、単なる例として、添付の図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＲＰ−Ｉｇ融合構築物の例示的な略図である。融合構築物は、１−ＥＲに対するタンパク質ターゲティングに関与する自然ＨＲＰ  Ｎ末端シグナル配列（ＥＲシグナル）、２−ＨＲＰの成熟部分（成熟ＨＲＰタンパク質）、３−強固なα−ヘリックスリンカー（リンカー）、４−ニワトリ由来ＩｇＹ  ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）、５−ＥＲタンパク質蓄積をもたらすＳＥＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナル（存在するか、又は存在しないかのいずれか）（ＳＥＫＤＥＬ）、及び６−下流のタンパク質精製用のＣ末端Ｈｉｓタグ（ｈｉｓ）で構成される。
【図２】（Ａ）植物により発現されたニワトリ由来ＩｇＹ  ｓｃＦｖ（Ｂ２、Ｂ４及びＦ８）の抗ウサギＩｇＧ結合活性を確認するドットブロットを示す図である。ＰＢＳ対照は、結合を示さなかった（発色なし）のに対して、比色分析の結果により、ｓｃＦｖがウサギＩｇＧに結合した場合に発色が見られることがわかった。陽性対照により、ｓｃＦｖが植物抽出物中に存在することが確認された。（Ｂ）ドットブロットにおけるｓｃＦｖ活性を検出するのに使用される構成成分の略図である。まず、ウサギＩｇＧが膜に結合され、この後、ウサギＩｇＧを認識して、それに結合する、植物により発現されたニワトリ由来ＩｇＹ  ｓｃＦｖを添加する。続いて、結合されたｓｃＦｖは、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ニワトリＩｇＹを使用して検出することができる。アルカリホスファターゼは、基質が添加される場合に発色に関与する。
【図３】ＨＲＰ＿Ｂ２＿ＳＥＫＤＥＬ（左側の粗製）及びＨＲＰ＿Ｂ２（右側の粗製）でインフィルトレートした粗製葉抽出物におけるＨＲＰの存在及び空の構築物（陰性）でインフィルトレートした粗製葉抽出物におけるＨＲＰの存在の欠如を示す迅速なＨＲＰ検査を示す図である。
【図４】１：２０００希釈の抗Ｌ１（ガーダシル）及び１：１０００希釈の抗Ｌ２ウサギ血清でプローブして、市販の抗ウサギＨＲＰ（Ｃ）又は粗製の植物により産生されたＨＲＰ＿Ｂ２＿ＳＥＫＤＥＬ  ｓｃＦｖのいずれかで検出されるＨＰＶ１６  Ｌ１−Ｌ２タンパク質のウェスタンブロットを示す図である。
【図５】組換え構築物：ｐＴＲＡｃ−ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ｈｉｓを使用したＮ．ベンサミアナ（N. benthamiana）におけるＨＲＰ融合ニワトリ由来ＩｇＹ  ｓｃＦｖ（ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ｈｉｓ）発現のタイムトライアル研究を示す図である。融合タンパク質は、抗ｈｉｓ抗体（Ａ）、抗ＨＲＰ抗体（Ｂ）又は抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｃ）のいずれかで検出された。植物は、インフィルトレーションの１日後（レーン１）、２日後（レーン２）、３日後（レーン３）、５日後（レーン４）及び７日後（レーン５）に試料採取した。融合タンパク質（Ｆ）は、ＨＲＰ（Ｈ）及びｓｃＦｖと併せて示される。
【図６】ＨＲＰ＿Ｂ２＿２  ｓｃＦｖを含有する粗製植物抽出物でプローブしたインフルエンザＨ１ｔｒ、ＢＦＤＶ  ＣＰ及びＧＯｘ抗原のウェスタンブロットを示す図である。植物により産生された組換えｓｃＦｖは、二次抗体として使用される場合に、３つ全ての抗原を検出することが可能であった。
【図７】ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬｈｉｓ発現Ｎ．ベンサミアナから抽出した総可溶性タンパク質の硫酸アンモニウム分画を示す図である。レーン：予め染色したタンパク質ラダー（Ｍ）、葉組織からの総可溶性タンパク質抽出物（１）、０％〜４０％の画分（２）、４０％〜６０％の画分（３）、６０％〜８０％の画分（４）、８０％〜９０％の画分（５）。（Ａ）クマシーブルー染色は、抗ｈｉｓ抗体（Ｂ）又は抗ニワトリＩｇＹ抗体のいずれかを使用したウェスタンブロット分析と併せて、４０％〜６０％の画分においてＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬｈｉｓの富化を示す（Ｆ）のに対して、６０％〜８０％の画分において遊離ｓｃＦｖの蓄積を示す。
【図８】ＨｉｓＴｒａｐアフィニティークロマトグラフィーカラムでのＨＲＰ＿Ｂ２＿２＿ＳＥＫＤＥＬタンパク質の精製プロファイルを示す図である。
【図９】６×ｈｉｓアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたクマシー染色したＨＲＰ＿Ｂ２＿２＿ＳＥＫＤＥＬ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１０】抗６×ｈｉｓ抗体（１：１０００）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＨＲＰ＿Ｂ２＿２＿ＳＥＫＤＥＬ画分のウェスタンブロットを示す図である。
【図１１】市販の抗ウサギＨＲＰ二次抗体（Ｃ）及び植物により産生されたＨＲＰ−ＩｇＧ二次抗体（Ｐ）でプローブしたＧＯｘタンパク質のウェスタンブロットを示す図である。
【図１２】ＥＬＩＳＡ吸光度読取りのグラフ図である。抗体１〜抗体３は、市販のポリクローナル抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰ（希釈に関しては、表２．３を参照）を使用した検出を表し、レーン４〜レーン１５は、植物により産生された二次ＨＲＰ−ｓｃＦｖを使用した検出を表す。
【図１３】Ａ）Ｌ−アルギニンを用いた場合及び用いない場合の様々な緩衝液中で検査したＨＲＰ活性を示す図である。プレートの左側：陰性対照（−）、プレートの右側＝検査試料（＋）。Ｂ）種々の緩衝液中での粗製抽出物のＨＲＰ活性；＋＝Ｌ−アルギニンを添加した、−＝Ｌ−アルギニンを添加していない。
【図１４】ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を使用してＨＲＰ活性に関して検査した硫酸アンモニウム画分を示す図である。
【図１５】硫酸アンモニウム、透析及び精製からのｓｃＦｖ−ＨＲＰ画分の分析を示す図である。（Ａ）抗ｈｉｓ一次コンジュゲート１：２０００でプローブしたウェスタンブロット及び（Ｂ）染色をしていないＳＤＳゲル。ｓｃＦｖ−ＨＲＰ融合タンパク質及び遊離ｓｃＦｖは、明らかに検出可能である。レーン１４〜レーン１６は、４０％〜６０％の硫酸アンモニウム分画後の部分的に精製されたｓｃＦｖ−ＨＲＰの存在を示す。
【図１６】Ａｍｉｃｏｎ濾過ユニットを使用した、種々の層へのＤＥ試料の濃縮を示す図である。
【図１７】ｓｃＦｖ−ＨＲＰタンパク質及び遊離ＨＲＰの存在を示すウェスタンブロットを示す図である。
【図１８】植物により作製されたグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）のウェスタンブロットを示す図である。一次ウサギ抗ＧＯｘ（１：２０００）を使用して、ｓｃＦｖ−ＨＲＰ融合物の種々の画分及び希釈物を二次プローブとして使用した。矢印は、ＧＯｘを示す。
【図１９】Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質を使用した、硫酸アンモニウム沈殿前の上清試料（右側）の活性分析を示す図である。１×ＰＢＳ緩衝液を陰性対照として使用した（左側）。
【図２０】バッチ結合精製に関する抗ｈｉｓプローブを用いたウェスタンブロットを示す図である。ＦＴ＝カラムフロースルー、Ｗ１．１＝洗浄液１  ５０ｍｌ、Ｗ１．２＝洗浄液１  ５０ｍｌ、Ｗ２．１〜Ｗ２．３＝洗浄液２  ５０ｍｌ、３倍。Ｅ１＝溶出画分１、Ｅ２＝溶出画分２、Ｅ３＝溶出画分３。
【図２１】ＡＫＴＡ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。総計＝総タンパク質、ＦＴ＝カラムフロースルー、Ｗ１＝洗浄液１、Ｗ２＝洗浄液２、Ｗ３＝洗浄液３、Ｅ１＝溶出画分１、Ｅ２＝溶出画分２、Ｅ３＝溶出画分３。最終レーンは、タンパク質分子量マーカーである。
【図２２】ＡＫＴＡ精製の抗Ｈｉｓプローブを用いたウェスタンブロットを示す図である。総計＝総タンパク質、ＦＴ＝カラムフロースルー、Ｗ１＝洗浄液１、Ｗ２＝洗浄液２、Ｗ３＝洗浄液３、Ｅ１＝溶出画分１、Ｅ２＝溶出画分２、Ｅ３＝溶出画分３。最終レーンは、タンパク質分子量マーカーである。
【図２３】（Ａ）ポリクローナルブタ抗ウサギ免疫グロブリン／ＨＲＰ（１／４０００）でプローブした陽性対照ブロット。（Ｂ）精製１からのｓｃＦｖ−ＨＲＰでプローブしたブロット。（Ｃ）精製２（バッチ精製）からのｓｃＦｖ−ＨＲＰでプローブしたブロット。（Ｄ）精製２（カラム精製）からのｓｃＦｖ−ＨＲＰでプローブしたブロット。ブロット上の数字は、使用した種々のウサギ一次抗体を表す。丸は、陽性反応を有したドットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ここで、添付の図面を参照して、本発明をこれ以降でより完全に記載するが、そこでは、本発明の幾つかの実施形態が示され、本発明の全ての実施形態が示されるわけではない。
【００２９】
記載される発明は、開示した特定の実施形態に限定されるものでなく、変更及び他の実施形態も本発明の範囲内に包含されるものと意図される。本明細書には特定の用語が使用されるが、それらは、限定を目的とせず包括的及び記述的な意味でのみ使用される。
【００３０】
本明細書を通じて及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上特に明確に指定されない限り、単数形（the singular forms "a", "an" and "the"）には複数形が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される用語及び表現は、説明を目的とし、限定するとみなされるものではない。本明細書で使用される「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「有する（having）」、「包含する（including）」という用語、及びそれらの変化形の使用は、その前に列挙される項目及びそれらの均等物と、更なる項目とを包含することを意味するものである。
【００３２】
本発明は、抗ウサギ免疫グロブリン（Ｉｇ）活性を有する、植物により産生されたＨＲＰ融合又はＡＰ融合単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（「融合タンパク質」）に関する。しかしながら、ｓｃＦｖが、抗マウス、抗ロバ、抗ウマ、抗ニワトリ、抗ヤギ又は抗ヒツジ免疫グロブリン活性を有し得ることは理解されよう。本発明の融合タンパク質は、ウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡにおいて二次抗体として使用され得る。
【００３３】
「単鎖抗体断片」（ｓｃＦｖ）又は「抗体断片」という用語は、本明細書中で使用する場合、ペプチドリンカー（Ｌ）によって連結される６つ全てのＣＤＲを含有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインに連結された可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含有するポリペプチドを意味する。ＶＬドメイン及びＶＨドメインの順序は、ＶＨ−Ｌ−ＶＬ又はＶＬ−Ｌ−ＶＨとして結合及び表示され得る。抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原と相互作用する。
【００３４】
ｓｃＦｖに関するＤＮＡ配列を含有するベクターを作製するために、これらの領域をコードする遺伝子の供給源が必要とされる。適切なＤＮＡ配列は、公開されている供給源から得られ得るか、又は当該技術分野で既知の標準的な手順によって得られ得る。例えば、The U.S. Department of Health and Human Servicesによって出版されたKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., (1991)は、これまで記載されてきた抗体可変領域のほとんどの配列を開示している。
【００３５】
あるいは、遺伝子配列が未知である場合、ベクターへクローニングするＤＮＡの供給源として逆転写酵素媒介合成によってｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ配列を利用することが、一般的に可能である。ｓｃＦｖに関して、ｍＲＮＡの供給源は、広範なハイブリドーマから得ることができる。多種多様な抗原と反応性であるハイブリドーマ分泌モノクローナル抗体は、本発明において使用可能である。これらの細胞株及び類似の性質を有する他の細胞株を、可変ドメインをコードするｍＲＮＡの供給源として、又は抗体タンパク質を得て、モノクローナル抗体自体のアミノ酸配列を決定するのに利用することができる。
【００３６】
また、抗体の可変領域は、適切な脊椎動物、一般的には家畜を免疫化することによって得ることができ、マウス、ロバ、ウサギ、ウマ、ニワトリ、ヤギ又はヒツジは、最も利便性よく、免疫原で感作され得る。免疫原は、興味（of interest）抗原である。感作は従来、通常２週〜３週間隔で宿主動物への、免疫原の１回以上の反復注射を用いて実施され得る。通常、最終接種（challenge）の３日後に、脾臓を取り出して、細胞融合に使用される単一細胞に解離して、ｍＲＮＡが当該技術分野で既知の標準的な手順によって容易に得ることができるハイブリドーマを提供する。
【００３７】
所定の抗体が得られ、そのアミノ酸配列のみが既知である場合、配列を逆翻訳することが可能である。
【００３８】
本発明の抗体断片を形成するために、適切なペプチドリンカーを有することが必要である。ＶＨドメイン及びＶＬドメインを結合するのに適したリンカーは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを、抗体全体の元の構造に非常に類似している三次元構造を有し、そして、ｓｃＦｖ断片が得られる抗体全体の結合特異性を維持する単鎖ポリペプチドへとフォールディングすることが可能であるリンカーであり得る。ｓｃＦｖを標識するのに適したリンカーは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、免疫グロブリン断片が得られる抗体全体の結合特異性を維持する三次元構造を有するように、２つ以上のｓｃＦｖの標識を可能にするリンカーである。リンカーは、当該技術分野で既知であり、本発明の目的で、任意のリンカーが使用され得る。
【００３９】
ｓｃＦｖ抗体を迅速かつ経済的に産生することができるという点で、ｓｃＦｖ抗体は、ハイブリドーマ技術によって生成されるモノクローナル抗体を上回る幾つかの利点を提供し、機能的に活性であり、かつ遺伝的に安定な抗体を生じる。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「単鎖Ｆｖ」及び「ｓｃＦｖ」という用語は、区別なく使用され、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むポリペプチドを意味し、ここで、これらのドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーによって、単鎖ポリペプチドへと結合される。リンカーにより、ｓｃＦｖは、エピトープ結合のための所望の構造を形成することが可能である。
【００４１】
本発明のｓｃＦｖは、Ｆｃ領域エフェクター機能を可能にするように、それをヒトＩｇＧ１重及び軽鎖定常領域に融合することによって、完全長抗体に変換することができることが理解されよう。完全長抗体は、ｓｃＦｖ−ＨＲＰ又はｓｃＦｖ−ＡＰを、完全長抗体の形成を容易にするベクターにクローニングすることによって作製され得る。ｓｃＦｖ−ＨＲＰ又はｓｃＦｖ−ＡＰは、ｓｃＦｖ−ＨＲＰ又はｓｃＦｖ−ＡＰを提示する完全長組換え抗体が生成されるような位置でクローニングされる。ＨＲＰ又はＡＰの活性は、グアヤコールアッセイを使用して測定されてもよく、二次抗体としての融合タンパク質の機能性は、本明細書中に記載するように、ｓｃＦｖ  ＨＲＰ融合タンパク質単独の機能性を検査するのに使用されたウサギ抗体の同じセットに対して検査され得る。
【００４２】
現在利用可能なＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体が、哺乳動物細胞で産生され、その結果、輸入に関して厳しい規制を受け、またそれらが動物細胞から得られて、他の動物タンパク質による混入の可能性が常に存在するのであまり望ましくないことから、本発明の融合タンパク質は、類似した産物を上回る多くの利益を有する。さらに、哺乳動物細胞において産生されるＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体（又はＡＰ標識抗ウサギ二次抗体）は、非常に高価である。植物におけるＨＲＰ−Ｉｇ又はＡＰ−Ｉｇの産生は、その産物が、いかなる考え得る哺乳動物細胞の混入物もなく、産生するのにより安価であり、したがって、最終使用者に、よりコスト効率のよい試薬を供給することを意味する。
【００４３】
本発明による融合タンパク質として、Ｎ末端ＥＲターゲティング配列と、リンカーと、ｓｃＦｖと、任意で、ＥＲ残留シグナルと、ヒスチジンタグとを含む、成熟ＨＲＰタンパク質又は成熟ＡＰタンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質が挙げられるが、限定されない。ｓｃＦｖは、リンカーを用いてＨＲＰのＣ末端に融合されてもよい。あるいは、ｓｃＦｖが、ＨＲＰペプチドのＮ末端に融合されて、リンカーが、ヒスチジンタグとＨＲＰとの間に挿入されるように、ＨＲＰとｓｃＦｖ遺伝子配列とを交換してもよい。このことにより、アフィニティー精製カラム上で効率的な結合を容易にすることによって、収率が改善されて、また精製が助長され得る。さらに、融合タンパク質が、ＨＲＰとは対照的にＡＰを含む場合、ｓｃＦｖは、リンカーを用いて、ＡＰのＣ末端に融合されてもよい。あるいは、ｓｃＦｖが、ＡＰペプチドのＮ末端に融合されて、リンカーが、ヒスチジンタグとＡＰとの間に挿入されるように、ＡＰとｓｃＦｖ遺伝子配列とを交換してもよい。
【００４４】
「タンパク質」、「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）に関係なく、天然に存在するか、又は天然に存在しないアミノ酸又はアミノ酸類似体を含む２つ以上のアミノ酸の任意の鎖である。
【００４５】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）並びにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の両方を包含する。核酸は、二重鎖又は単鎖であり得る。核酸が単鎖である場合、核酸は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。核酸分子は、天然に存在する又は天然に存在しないヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体若しくは誘導体を含む２つ以上の共有結合されたヌクレオチドの任意の鎖であり得る。「ＲＮＡ」とは、２つ以上の共有結合された天然に存在するリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドの配列を意味する。「ＤＮＡ」という用語は、２つ以上の共有結合された天然に存在するデオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドの配列を指す。「ｃＤＮＡ」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によって、ＲＮＡ鋳型から産生される相補ＤＮＡ又はコピーＤＮＡを意味する。
【００４６】
したがって、「ｃＤＮＡクローン」は、所定のＲＮＡ分子に対して相補性であり、クローニングベクターに保有される二本鎖ＤＮＡ配列を指す。「相補性」という用語は、２つの核酸分子間の二本鎖の領域を産生するようにワトソン−クリック塩基対を形成することが可能な２つの核酸分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを指す。核酸分子における各ヌクレオチドは、二本鎖を形成するのに、反対の相補鎖におけるヌクレオチドと、対応するワトソン−クリック塩基対を形成する必要がないことが当業者に理解されよう。したがって、１つの核酸分子は、高いストリンジェンシーの条件下で、第２の核酸分子とハイブリダイズする場合に、第２の核酸分子に対して「相補性」である。本発明による核酸分子は、両方の相補分子を含む。
【００４７】
幾つかの実施形態において、本発明の融合タンパク質として、Ｎ末端ＥＲターゲティング配列と、リンカーと、ｓｃＦｖと、ＥＲ残留シグナル（これは、存在しなくてもよい）と、ヒスチジンタグとを含む、成熟ＨＲＰ又は成熟ＡＰタンパク質を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられ得るが、限定されない。本発明の別の実施形態として、上述の融合タンパク質をコードする核酸分子が挙げられるが、限定されない。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「実質的に同一の」配列は、１つ以上の保存的置換によって、又は発現される融合タンパク質若しくは核酸分子によってコードされるポリペプチドの抗原性を破壊しないか、若しくは実質的に低減しない配列の位置に位置する１つ以上の非保存的置換、欠失若しくは挿入によってのみ、参照配列と異なるアミノ酸又はヌクレオチド配列である。パーセント配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の知識内の様々な方法で達成することができる。これらは、例えば、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ又はＢＬＡＳＴソフトウェア等のコンピューターソフトウェアを使用することを含む。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するのに適したパラメーターを容易に決定することができる。本発明の１つの実施形態において、本明細書中に記載する配列に対する、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、又は約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の配列同一性といった更に大きな配列同一性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列が提供される。
【００４９】
あるいは、又はさらに、２つの核酸配列は、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合、「実質的に同一」であり得る。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、概して、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に応じて経験的に算出される。一般的に、より長いプローブは、適正なアリーリングにより高温を必要としたのに対して、より短いプローブは、より低温を要する。ハイブリダイゼーションは概して、相補鎖が、それらの融点未満の環境に存在する場合、変性されたＤＮＡの、再アニーリングする能力に依存する。かかる「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件の典型的な例は、穏やかに振とうしながら６５℃にて１８時間実施されるハイブリダイゼーション、洗浄緩衝液Ａ（０．５％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ）中で６５℃にて１２分間の第１の洗浄、及び洗浄緩衝液Ｂ（０．１％ＳＤＳ、０．５％ＳＳＣ）中で６５℃にて１０分間の第２の洗浄である。
【００５０】
本発明の１つの実施形態において、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の任意の位置で、核酸を挿入すること、欠失すること又は置き換えることによって作製され得る。
【００５１】
ポリペプチド、ペプチド又はペプチド類似体が、標準的な化学的技法を使用して、例えば、溶液又は固相合成方法論を使用した自動合成によって合成することができることは、当業者に理解されよう。自動ペプチド合成機は、市販されており、当該技術分野で既知の技法を使用する。ポリペプチド、ペプチド及びペプチド類似体はまた、組換えＤＮＡ技術を使用して、それらの対応する核酸分子から作製することもできる。
【００５２】
幾つかの実施形態において、本発明の核酸分子は、他の配列に作動可能に連結され得る。「作動可能に連結される」とは、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子及び調節配列は、適切な分子が調節配列に結合された場合に融合タンパク質の発現を可能にするように結合されることを意味する。かかる作動可能に連結される配列は、発現用の宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトされ得るベクター又は発現構築物中に含有され得る。任意のベクターが、本発明の融合タンパク質を発現する目的で使用され得ることは理解されよう。
【００５３】
「組換え」という用語は、何かが組換えられたことを意味する。核酸構築物に関連して使用する場合、その用語は、分子生物学的技法を用いて、一緒に結合されるか、又は産生される核酸配列を含む分子を指す。「組換え」という用語は、タンパク質又はポリペプチドに関連して使用する場合、分子生物学的技法を用いることで生じる組換え核酸構築物から発現されるタンパク質又はポリペプチド分子を指す。組換え核酸構築物は、事実上ライゲートされないか、又は事実上異なる位置でライゲートされる核酸配列にライゲートされるか、又はライゲートされるよう操作されるヌクレオチド配列を含み得る。したがって、組換え核酸構築物は、核酸分子が、遺伝子操作を使用して、即ち、ヒトの介入によって操作されたことを示す。組換え核酸構築物は、形質転換によって宿主細胞に導入されてもよい。かかる組換え核酸構築物は、同じ宿主細胞種から、又は異なる宿主細胞種から得られる配列を含んでもよい。
【００５４】
「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド又は遺伝子配列を細胞に導入することができる手段を指す。プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ及びコスミドを含む当該技術分野で既知の様々な型のベクターが存在する。概して、ポリヌクレオチド又は遺伝子配列は、カセットを用いてベクターに導入される。「カセット」という用語は、ベクターから発現されるポリヌクレオチド又は遺伝子配列、例えば、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子配列を指す。カセットは概して、ベクターに挿入される遺伝子配列を含み、これが、幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド又は遺伝子配列を発現するための調節配列を提供する。他の実施形態において、ベクターは、融合タンパク質の発現のための調節配列を提供する。更なる実施形態において、ベクターは、幾つかの調節配列を提供し、ヌクレオチド又は遺伝子配列は、他の調節配列を提供する。「調節配列」として、プロモーター、転写終結配列、エンハンサー、スプライスアクセプター、ドナー配列、イントロン、リボソーム結合配列、ポリ（Ａ）付加配列、及び／又は複製起点が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の目的で、発現カセットが、本発明の融合タンパク質の発現に使用されることが好ましい。
【００５５】
上述するように、本発明による融合タンパク質として、Ｎ末端ＥＲターゲティング配列と、リンカーと、ｓｃＦｖと、ＥＲ残留シグナルと、ヒスチジンタグとを含む、成熟ＨＲＰタンパク質又は成熟ＡＰタンパク質のアミノ酸配列が挙げられるが、限定されない。融合タンパク質をコードする発現カセットもまた、本発明の範囲内にあることが理解されよう。
【００５６】
ＥＲ残留シグナルは、アミノ酸配列ＫＤＥＬを含んでもよく、好ましくは、ＥＲ残留シグナルは、ＳＥＫＤＥＬである。本発明の融合タンパク質においてＥＲ残留シグナルを含むことにより、発現されたタンパク質の小胞体残留が可能となる。カセットの構築のためのＥＲにおいて局在化される動物及び植物タンパク質に通常存在する他の残留シグナルもまた、使用することができる。
【００５７】
本発明のｓｃＦｖの利点は、発現、成熟及び精製の容易さである。これらの利点は、植物発現系においてｓｃＦｖを安定に又は一過的に発現する能力に幾分起因する。植物発現系の使用により、標準的なタンパク質精製技法によるｓｃＦｖの精製が容易となる。しかしながら、本発明の融合タンパク質の精製は、ｓｃＦｖの精製を容易にし得る１つ以上のアミノ酸配列を付加することによって更に簡素化され得る。
【００５８】
通常、精製を助長するように本発明の融合タンパク質に付加され得る配列の１つは、ヒスチジンタグ、すなわち「ｈｉｓタグ」である。ヒスチジンタグは概して、複数のヒスチジン残基を含む。タグ付けしたタンパク質を、ニッケルＮ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースマトリクスを含むカラムに通すことにより、ｈｉｓタグを含む融合タンパク質を分離することができる。
【００５９】
下記の実施例は、実例として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。
【実施例】
【００６０】
実施例１
ＨＲＰ−ｓｃＦｖ構築物及びインフィルトレーション
抗ウサギＩｇＧ活性を示すニワトリ由来の免疫グロブリン（ＩｇＹ）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする構築物（Ｂ２）を試験して、ウサギＩｇＧタンパク質に対して高い結合活性が示された。別の２つの構築物であるＢ４及びＦ８もまた、結合活性を有することが示され、クローニング及び発現させたが、精製及び機能性の実験は、Ｂ２のみを用いて実施した。ｓｃＦｖ遺伝子を、間に厳密α−ヘリックスリンカー（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝２）リンカーを用いて、５’末端上でホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）遺伝子に融合させた。ＨＲＰ配列は、小胞体（ＥＲ）へのタンパク質のターゲティングに関与するその自然シグナルペプチドを含んでいた。ＥＲにおけるＨＲＰのプロセシングは、ＨＲＰ活性に必須である。各ｓｃＦｖに関する２つの構築物は、一方はＥＲ残留に関するＳＥＫＤＥＬ配列を用いて（ＨＲＰ−ｓｃＦｖ−ＳＥＫＤＥＬ）、及び一方は用いずに（ＨＲＰ−ｓｃＦｖ）作製した。
【００６１】
ポリヒスチジン−タグ（６×ｈｉｓタグ）を、融合構築物の３’末端に融合させて、下流の精製を容易にした。発現構築物は全て、植物発現ベクターｐＴＲＡｃにクローニングした。図１は、構築物の略図を示す。表１は、作製した構築物について概要する。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
組換え構築物は全て、制限消化、ＰＣＲ及び関係ある場合には配列分析によって確認された。ベクターは全て、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に形質転換した。
【００６４】
ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）の葉を組換えアグロバクテリウム種（Agrobacterium sp.：アグロバクテリウム属の一種）でインフィルトレートして、ＨＲＰ及びｓｃＦｖの発現を、抗ニワトリＩｇＹ抗体又は抗６×ｈｉｓ抗体又は抗ＨＲＰ抗体を用いた、粗製葉抽出物のウェスタンブロットのプロービングによって個々に検証した。
【００６５】
発現されたＨＲＰ−ｓｃＦｖの機能性を検査して、ｓｃＦｖでプローブしたウサギＩｇＧタンパク質（粗製葉抽出物）（図２）及びａｌｋ−ｐｈｏｓ標識抗ニワトリＩｇＹのドットプロット並びにウェスタンブロッティング（データは示していない）によって決定されるように、ウサギＩｇＧに結合することが示された。
【００６６】
さらに、植物抽出物の液滴にＨＲＰ基質を添加することによって、粗製葉抽出調製物における組換え融合タンパク質のＨＲＰ構成成分の予備定性機能性を確立させた。これは、色彩を変化させない対照植物由来の粗製抽出物と比較した比色分析の結果をもたらした（図３）。植物により産生されたＨＲＰ−Ｉｇは、非常に粗製の形態で二次抗体として活性である（即ち、葉から圧搾した粗製植物樹液として使用した場合に、活性は、ウェスタンブロッティングにて検出可能である）ことは非常に驚くべきことである。
【００６７】
しかしながら、ＨＲＰ＿Ｂ２＿ＳＥＫＤＥＬ発現を示すウェスタンブロットの結果（データは示していない）において、多数の「遊離」ＨＲＰが存在することに留意されており、実施される融合タンパク質の幾つかのｉｎ  ｖｉｖｏでのプロセシングが存在することを示唆している。ＨＲＰ−ｓｃＦｖのアミノ酸配列に関するシグナルペプチドの確認により、３つの事例全てにおいて、過剰の「遊離」ＨＲＰ産生量の原因となっている可能性のあるｓｃＦｖ遺伝子配列の開始部位に隣接する切断部位が存在することが示された。遊離ＨＲＰではなく融合タンパク質の産生を支持するように、３つのｓｃＦｖ遺伝子（Ｂ２、Ｂ４及びＦ８）全てに関するシグナル配列を除去するようＰＣＲ及びクローニングを実施して、ＳＥＫＤＥＬ配列を含むもの及び排除するものの両方を含むＨＲＰ−ｓｃＦｖ配列を再構築して、新たな６つの構築物を得た（表２）。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
これらの構築物を使用したインフィルトレーションにより、ウェスタンブロットで可視化されるように、これまでの構築物と比較して、組換え融合タンパク質の発現量が増加されたが、依然として幾らかの「遊離」ＨＲＰが検出されることが示された。図５は、ＥＲ残留シグナルを欠如するＨＲＰ＿Ｂ２＿２ｈｉｓ構築物によってコードされる融合タンパク質（Ｆ）を示す。
【００７０】
概念実証として、新たなＨＲＰ＿Ｂ２＿２及びＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬ融合タンパク質の予備機能性検査を、ウェスタンブロットでウサギ結合抗体（幾つかの異なる抗原に結合されている）を検出する、それらの能力を検査することによって実施した。
【００７１】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、インフルエンザ赤血球凝集素（Ｈ１ｔｒ）、オウム嘴羽病（beak and feather disease）ウイルスコートタンパク質（ＢＦＤＶ  ＣＰ）及びインフルエンザＭ１をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離して、ニトロセルロースに転写して、それら各々のウサギ抗体でプローブした。次に、ブロットを、粗製の植物により産生されたＨＲＰ＿Ｂ２＿２及びＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬの低希釈物でプローブした。図６は、ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ｓｃＦｖでプローブしたウェスタンブロットを示す。組換え二次抗体は、ＧＯｘ（７５ｋＤａ）、Ｈ１ｔｒ（７０ｋＤａ）及びＢＦＤＶ  ＣＰ（２７ｋＤａ）を検出することが可能であった。
【００７２】
分析により、Ｂ２のＥＲ残留された融合タンパク質（ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬ）及びＢ２のＥＲ残留シグナルを欠如する融合タンパク質（ＨＲＰ＿Ｂ２＿２）はともに、同様に良好に発現され、その結果、両方の構築物は、精製プロトコルの開発に関して継続させることが示された。
【００７３】
精製
組換え融合タンパク質を精製することに対する第１の工程として、インフィルトレーションの３日後の葉組織から抽出したＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬｈｉｓ（検査バッチとして使用される）の硫酸アンモニウム分画について研究した。分画により、ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬｈｉｓの大部分が、４０％〜６０％の画分に見出され得る（図７）のに対して、少量が６０％〜８０％及び０％〜４０％の画分中に存在することが示された。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して、４０％〜６０％の画分を更に精製した。
【００７４】
ＨＲＰ＿Ｂ２＿２及びＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬの両方に関する精製プロトコルは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００）によって作動されるＨｉｓＴｒａｐカラム（GE Lifesciences社）を使用して開発された。多大な試行錯誤後、１０ｍＭイミダゾールを使用して溶出される比較的純粋なタンパク質を産生する精製プロトコルが確立された。図８は、画分１５〜画分１９に及ぶタンパク質吸光度ピークを有するＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬの溶出プロファイルを示す。
【００７５】
画分２、画分１６、画分１７、画分１８及び画分１９を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、クマシーブルーで染色した（図９）のに対して、画分２、画分７及び画分１４〜画分１９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ニトロセルロース上にブロットして、抗６×ｈｉｓ抗体でプローブした（図１０）。
【００７６】
クマシー染色したゲルは、特に画分１７〜画分１９において、タンパク質の良好な精製を示した（レーン６〜レーン８）。
【００７７】
ウェスタンブロットにより、図９におけるクマシーブルー染色によって可視化されたバンドが、組換え融合タンパク質のバンドであることが確かめられた。最も高濃度のタンパク質は、画分１７及び画分１８に存在するようであった。続いて、ＨＲＰ活性を決定して、ＥＬＩＳＡにおいて、及びウェスタンブロットで組換え融合タンパク質の機能性を検査するように、これら２つの画分をプールして、リン酸カリウム緩衝液へと透析させた。
【００７８】
ＨＲＰ活性実験及びイムノアッセイ実験
精製してプールした試料に対して、ＨＲＰアッセイを実施して、非常に低いが、活性であり、０．２１４Ｕ／ｍｌ（タンパク質）の比活性を有することが示された。組換えＨＲＰのこれまでの活性測定は、それ自体で、９Ｕ／ｍｌ〜７５０Ｕ／ｍｌの範囲であった。タンパク質の濃度は、ブラッドフォードのアッセイによって１．３７ｍｇ／ｍｌであると測定された。
【００７９】
精製した組換え融合タンパク質の活性は、ウェスタンブロッティングにおいてＧＯｘ抗原のみを使用して検査した。ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬ  ｓｃＦｖは、１：１００の希釈で使用した場合に、ウサギ抗ＧＯｘ抗体を検出することが可能であり（図１１）、それは非常に有望である。
【００８０】
精製したＨＲＰ融合タンパク質を、結合抗原としてＧＯｘを使用したＥＬＩＳＡにおいて機能性に関して更に検査した。表３は、検査した種々の二次抗体希釈物の吸光度値を示す。市販のポリクローナルブタ抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰと比較して、検出シグナルは、かなり低かった（図１２）。しかしながら、植物により産生されたＨＲＰ−ｓｃＦｖの結合は、１：１００の希釈が使用された場合に起こり、組換えタンパク質が機能性であることを示した。ＨＲＰの活性が低かったので、シグナルは非常に低かったと考えられる。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
実施例２
種々の緩衝液中でのｓｃＦｖ−ＨＲＰの安定性及び活性
実施例１におけるｓｃＦｖ−ＨＲＰの小規模の精製を、ＮａＰＯ４  ｐＨ７．０の緩衝液を使用して実施した。どの緩衝液が、ＨＲＰ活性を保持するのに最も適しているかを研究することにした。４つの更なる緩衝液中での精製したｓｃＦｖ−ＨＲＰの濃度の安定性についても簡単に調べた（表４）。予め精製したｓｃＦｖ−ＨＲＰ試料（１００μｌ）を、表４に示すような幾つか異なる緩衝液へと透析させた。
【００８３】
【表４】
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【００８４】
Ｌ−アルギニンを含む上記緩衝液及びＬ−アルギニンを含まない上記緩衝液の両方を全て検査した。４℃で２時間の透析後に、試料を、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を使用してＨＲＰ活性に関して検査した。図１３で見られるように、１×ＰＢＳ  ｐＨ７．６及びＮａＰＯ４  ｐＨ７．０は、最も著しい比色反応をもたらし、それは、より高いＨＲＰ活性を示す（図１３Ａ）。しかしながら、ＨＲＰ活性は、グアヤコールアッセイによって測定される場合、１×ＰＢＳが最も高い活性を付与したことを示し（図１３Ｂ）、したがって、この緩衝液は、ｓｃＦｖ−ＨＲＰの大規模な抽出及び精製に関して継続させた。
【００８５】
実施例３及び実施例４に詳述するような２つの大規模な精製（精製１及び精製２）を、ｐＴＲＡｃ−ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬでインフィルトレートした葉に対して実施して、植物により産生されたｓｃＦｖ−ＨＲＰのパイロットスケールの産生の実現可能性を決定した。
【００８６】
実施例３
大規模精製１
精製１に関して、６４個の植物を、培養ＯＤ  ０．２５でｐＴＲＡｃ−ＨＲＰ＿Ｂ２＿２ＳＥＫＤＥＬを保有する組換えアグロバクテリウム属（Agrobacterium）でインフィルトレートした。インフィルトレートしたＮ．ベンサミアナの葉３００グラムを細かく切って、１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７）中で１：３（質量：容量）の比で均質化させた。抽出物を３層のミラクロスに通して濾過した後、１００００ｇで１０分間、２回遠心分離して、残存する粒子状物質を全て取り除いた。上清を、４℃で攪拌しながら、０％〜４０％の硫酸アンモニウム沈殿工程に２時間付して、その後、それを１００００ｇで１０分間遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化した。上清を、第２の一晩の４０％〜６０％の硫酸アンモニウム沈殿工程に付して、１００００ｇで１０分間、更に遠心分離した。得られた上清に対して、６０％〜９０％の分画を実施した。続いて、ペレットを１×ＰＢＳ中に再懸濁させた。これらの手順からの試料を、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を用いて検査して、ＨＲＰ活性を予備決定した（図１４）。
【００８７】
ｓｃＦｖ−ＨＲＰ試料を、バッチ精製方法を使用して精製した。上清を、４℃で一晩、続いて室温で２時間、ニッケル負荷樹脂１．５ｍｌに結合させた。バッチ精製は、５ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳの１０倍カラム容量の洗浄液及び２０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳの１０倍カラム容量の洗浄液を用いて実施した。ニッケル負荷樹脂からの最終溶出は、１２０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを用いて実施した。
【００８８】
画分を収集して、ＢＳＡ標準曲線を用いたブラッドフォードアッセイを使用して、タンパク質濃度を測定した。試料はまた、ローディング緩衝液で処理して、１０％アクリルアミドゲル上でＰＡＧＥによって分離させた。ゲルの１つを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ  １０×、５％無脂肪乳、１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄したニトロセルロース上にブロットして、ブロッキング緩衝液中で１：２０００希釈した抗ポリヒスチジン抗体でプローブした。ゲルを一晩インキュベートして、ブロッキング緩衝液を用いて１５分間、３回洗浄した後、１：１００００希釈した二次アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体でプローブした（図１５Ａ）。ニトロセルロース上へブロッティングした後、タンパク質を検出するために、ポリアクリルアミドゲルを可視化した（図１５Ｂ）。４０％〜６０％の硫酸アンモニウム分画後の３つの部分的に精製されたｓｃＦｖ−ＨＲＰ溶出画分をプールして、続いて濃縮工程に付した。
【００８９】
精製されたｓｃＦｖ−ＨＲＰの濃縮
次に、透析した溶出液（ＤＥ）１５ｍｌを、３０００ＭＷカットオフ点を有するＡｍｉｃｏｎフィルターチューブを使用して１．２ｍｌにまで濃縮した。これは、４０００ｒｐｍで３７分間の遠心分離によって行った。この時点で、２つの層、即ち、より薄い上層（ＤＥｃｓ−上清）及びより濃い下層（ＤＥｃｐ−ペレット）は、チューブ中で可視化された（図１６）。これらを取り出して、分離状態にした。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上に流した（図１７）。ＤＥ  ｓｃＦｖ−ＨＲＰの一部を凍結乾燥させて（１ｍｌ）、タンパク質が、このプロセス中及び再構成後に、安定性かつ活性を残しているかどうかを決定した。続いて、凍結乾燥させたタンパク質を、１×ＰＢＳ＋Ｌ−アルギニン１００μｌ（０．１）中で再構成させて、ＨＲＰ活性に関して検査した。凍結乾燥させたタンパク質の試料を、１０％ポリアクリルアミドゲル上に流した（図１７のレーン４）。
【００９０】
ｓｃＦｖ−ＨＲＰの機能性検査
異なる処理を行った精製ｓｃＦｖ−ＨＲＰ試料の機能性を、ウェスタンブロットで、ウサギ抗ＧＯＸ抗体に結合して、それを検出するその能力に関して検査して、それを、市販のＨＲＰコンジュゲートウサギ抗体（図１８−レーン２）と比較した。全ての型のタンパク質（凍結乾燥させた型及び両方の濃縮型）は、検査した全ての状態において抗体を検出することに成功した。
【００９１】
植物により産生されたｓｃＦｖ−ＨＲＰ（ＤＥ試料）の機能性を、ウェスタンブロッティングによって更に６つのウサギ抗体で検査した。結果を表５に概要する。総計７つから、３つのウサギ抗体が、ｓｃＦｖ−ＨＲＰによって認識された。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
ＨＲＰの活性検査（グアヤコールアッセイ）
ｓｃＦｖ−ＨＲＰのＤＥ試料のＨＲＰ活性を、グアヤコールアッセイを使用して測定した。ＨＲＰ活性は、１ｍｌ当たり２７０４２ｍＵであると算出された。タンパク質濃度は、０．７ｍｇ／ｍｌであると測定され、その結果として、ＨＲＰの比活性は、２７０４２Ｕ／０．７ｍｇ＝３８６３１Ｕ／ｍｇであると算出された。
【００９４】
実施例４
大規模精製２
第２の精製は、実施例３に記載するように４０個のＮ．ベンサミアナの植物のインフィルトレーションを含んでいた。植物の葉材料（２６４ｇ）を、より小さい細片へと細かく刻み、１×ＰＢＳ緩衝液を３：１（緩衝液：植物の質量）の比で添加した。植物物質を、手持ちブレンダーを使用して１×ＰＢＳ中で均質化させた。均質化させた材料を、３層のミラクロスに通して濾過し、濾液をＪＡ１４  ベックマンローターにおいて８０００ｇで１５分間、２回遠心分離して、残存する植物の葉の残骸を全て除去した。上清を予備検査して、ＨＲＰ活性が、硫酸アンモニウム沈殿前に試料中に存在したことを決定した（図１９）。
【００９５】
上清の容量を記録して（８００ｍｌ）、０％〜３５％の沈殿に要される硫酸アンモニウムの量を算出した。硫酸アンモニウムをスプーン一杯分、一度に上清に添加して、４℃で一晩沈殿を実施した。１４０００ｇで２０分間、溶液を遠心分離して、３５％〜７５％の硫酸アンモニウム沈殿用に、上清を保持した。再び、硫酸アンモニウムをスプーン一杯分、一度に上清に添加して、４℃で一晩沈殿を実施した。１４０００ｇで２０分間の遠心分離後、２つのペレットを−２０℃で保管した。
【００９６】
翌日、ペレットの１つを、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒによって作動されるＨｉｓ  Ｔｒａｐ  ＦＦアフィニティーカラムを使用したニッケルアフィニティーカラム精製に付し、残りの半分は、精製に関して記載するように、バッチ結合に付した。
【００９７】
バッチ精製に関して、下記の通りのバッチ精製プロトコルを使用した第１の精製用に、ペレット１つを冷凍庫から取り出した：ペレットを、５ｍＭイミダゾールを含有する１×ＰＢＳ  １００ｍｌ中に再懸濁して、１４０００ｇで４５分間の遠心分離に付した。上清を、４℃で一晩、続いて室温で２時間、ニッケル負荷樹脂１．５ｍｌに結合させた。バッチ精製は、５ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳの１００倍カラム容量の洗浄液、２０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳの１００倍カラム容量の洗浄液を用いて実施した。ニッケル負荷樹脂からの最終溶出は、１２０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを用いて実施した。バッチ精製からの画分を収集して、抗ｈｉｓウェスタンブロットにより分析した（図２０）。
【００９８】
カラム精製に関して、下記の通りのＡＫＴＡプロトコルを使用した第１の精製用に、ペレット１つを冷凍庫から取り出した：ペレットを、５ｍＭイミダゾールを含有する１×ＰＢＳ  １００ｍｌ中に再懸濁して、１４０００ｇで４５分間の遠心分離に付した。上清を、１分当たり１ｍｌで、１ｍｌのニッケル負荷カラムに結合させた。精製は、５ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳの１５倍カラム容量の洗浄液、１５ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳの１５倍カラム容量の洗浄液及び３５ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳの１５倍カラム容量の洗浄液を用いて、１分当たり２ｍｌで実施した。カラムからの最終溶出は、１２０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳを用いて実施した。カラム精製からの画分を収集して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２１）及び抗ｈｉｓウェスタンブロット（図２２）により分析した。
【００９９】
所定のタンパク質を含有する溶出画分をプールして、ＰＢＳ緩衝液に対して、４℃で３回透析して、０．４５μｍフィルターに通して濾過した。
【０１００】
ＨＲＰの活性検査（グアヤコールアッセイ）
ｓｃＦｖ−ＨＲＰ精製（精製１、精製２−バッチ精製、及び精製２−カラム精製）全てに関して、グアヤコールアッセイを実施した。
【０１０１】
この実施例における試料中のタンパク質濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌであると測定された。カラム精製した（ＡＫＴＡ）試料は、１ｍｌ当たり２９５０７ｍＵの活性を有すると算出された。その結果として、ＨＲＰの比活性は、５９０１４ｍＵ／ｍｇであると算出された。バッチ精製したＨＲＰ（実施例４）活性は、１ｍｌ当たり１７８５７ｍＵであると算出され、その結果として、ＨＲＰの比活性は、３５７１４ｍＵ／ｍｇであった。結果を以下の表６に概要する。
【０１０２】
【表６】
2019528036.tif 000007
【０１０３】
ｓｃＦｖ−ＨＲＰの機能性
精製したタンパク質の結合／機能性を、時間的な制約に起因して、ウェスタンブロッティングではなくドットブロットを使用して検査した。
【０１０４】
種々の一次ウサギ抗体を、各抗体に関してニトロセルロース膜上にドットして（１×ＰＢＳ中の１／５００希釈物を２μｌ）、乾燥させた。ニトロセルロースをブロッキング緩衝液中でブロックした（実施例３におけるウェスタンブロッティングに関して記載するように）。続いて、ブロットを、１：５００希釈したｓｃＦｖ−ＨＲＰでプローブした（実施例３、実施例４−バッチ精製及び実施例４−カラム精製からのバッチそれぞれに関して）。ブロットを洗浄した後、ＢＭブルーＰＯＤ基質を用いて発色させた。陽性対照は、即座に紫色になった。しかしながら、他のドットは、色彩の変化がほんのわずかに増加したに過ぎなかった。結果を図２３に示す。
【０１０５】
結果の概要の表もまた、以下で見ることができる（表７）。表中の＋の記号は、可視化された有色ドットの強度の表示を付与する（即ち、＋非常に低いシグナル、及び＋＋＋＋非常に高いシグナル）。
【０１０６】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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