(57)【要約】  ピシウム・オリガンドラム微生物の安定化された懸濁液を含有するピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品は、培養培地、細胞形態のピシウム・オリガンドラム微生物及び該微生物によって産生された物質を含有物として含む該微生物の培養バイオマスを０．０５〜１０．０重量％と、安定化剤を９０．０〜９９．９５重量％の含有することにより、液体生物学的抗真菌製品の１ｍｌ当たりの休眠状態の卵胞子の所定数（通常の標準化後）が、１×１０３〜２×１０７である。ピシウム・オリガンドラム微生物の安定化された懸濁液を含有するピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品は、培養培地、細胞形態のピシウム・オリガンドラム微生物及び該微生物によって産生された物質を含有物として含む該微生物の培養バイオマスを０．０５〜１０．０重量％と、安定化剤を７９．７７〜９９．９５重量％と、１００重量％までの残部である、充填物、芳香物及びビタミンを含む群から選ばれる少なくとも１つの特性改変用／施用用物質とを含有し、液体生物学的抗真菌製品の１ｍｌ当たりの休眠状態の卵胞子の所定数（通常の標準化後）が、２．５×１０４〜１．０×１０６である。ピシウム・オリガンドラム微生物は、ブルノのマサリク大学のチェコ微生物コレクション（ＣＣＭ）にピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の名称で寄託された、ピシウム・オリガンドラム・ドレシュラー  ＡＴＴＣ  ３８４７２株である。安定化剤は、水、塩溶液、油、又はオスモライトの濃縮溶液であってよい。この液体生物学的抗真菌製品の製造方法も含まれる。
2019530455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品であって、前記液体生物学的抗真菌製品は、ピシウム・オリガンドラム微生物の安定化された懸濁液を含み、ここで
前記液体生物学的抗真菌製品は、培養培地、細胞形態のピシウム・オリガンドラム微生物及びピシウム・オリガンドラム微生物によって産生された物質を含有物として含む、ピシウム・オリガンドラム微生物の培養バイオマスを０．０５〜１０．０重量％、及び安定化剤を９０．０〜９９．９５重量％含有し、
前記液体生物学的抗真菌製品の１ｍｌ当たりの休眠卵胞子の所定数（通常の標準化後）が、１×１０３〜２×１０７であることを特徴とする、液体生物学的抗真菌製品。
【請求項２】
ピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品であって、前記液体生物学的抗真菌製品は、ピシウム・オリガンドラム微生物の安定化された懸濁液を含み、ここで
前記液体生物学的抗真菌製品は、培養培地、細胞形態のピシウム・オリガンドラム微生物及びピシウム・オリガンドラム微生物によって産生された物質を含有物として含む、ピシウム・オリガンドラム微生物の培養バイオマスを０．０５〜１０．０重量％、安定化剤を７９．７７〜９９．９５重量％、及び１００重量％までの残部である、充填物、芳香物及びビタミンＥを含む群から選ばれる少なくとも１つの特性改変用／施用用物質と、を含有し、
前記液体生物学的抗真菌製品の１ｍｌ当たりの休眠卵胞子の所定数（通常の標準化後）が、２．５×１０４〜１．０×１０６であることを特徴とする、液体生物学的抗真菌製品。
【請求項３】
前記ピシウム・オリガンドラム微生物が、ブルノのマサリク大学のチェコ微生物コレクション（ＣＣＭ）にピシウム・オリガンドラムＭ１の名称で寄託されたピシウム・オリガンドラム・ドレシュラー  ＡＴＴＣ  ３８４７２株であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品。
【請求項４】
前記安定化剤が、水、塩溶液、油又はオスモライト溶液を含む群から選ばれる少なくとも１つの成分を含有することを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の液体生物学的抗真菌製品。
【請求項５】
前記安定化剤が、３０．０〜９９．９重量％の量の水であることを特徴とする、請求項４に記載の液体生物学的抗真菌製品。
【請求項６】
前記安定化剤が、９９．９重量％の量の塩溶液であることを特徴とする、請求項４に記載の液体生物学的抗真菌製品。
【請求項７】
前記安定化剤が、６０．０〜６４．９５重量％の量のスクロースの形態のオスモライトであることを特徴とする、請求項４に記載の液体生物学的抗真菌製品。
【請求項８】
前記安定化剤が、７９．７７〜９９．９重量％の量の、パラフィン油、鉱油、グリセロール又はヒマワリ油を含む群から選択される少なくとも１つの油であることを特徴とする、請求項４に記載の液体生物学的抗真菌製品。
【請求項９】
前記ピシウム・オリガンドラム微生物の卵胞子の担体としての１６．０重量％の量の徐放性生分解性マトリックス、例えばポリビニルアルコール、を含有することを特徴とする、請求項２又は請求項３に記載の液体生物学的抗真菌製品。
【請求項１０】
酸化ケイ素をベースとする充填物を１６．０重量％の量で含有することを特徴とする、請求項２又は請求項３に記載の液体生物学的抗真菌製品。
【請求項１１】
０．９６重量％の量のセージ又はミント芳香物及び０．４重量％の量のビタミンＥである、施用用／特性改変用物質を含有することを特徴とする、請求項２又は請求項３に記載の液体生物学的抗真菌製品。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の、ピシウム・オリガンドラム微生物の安定化された懸濁液を含有するピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品を製造する方法であって、
ａ）穀物、サトウキビ糖蜜及び他の必須栄養分の抽出物を含有する液体培地を、液相中でのピシウム・オリガンドラムの卵菌の好気培養のために使用すること、
ｂ）前記液体培地を滅菌すること、
ｃ）冷却後に、前記滅菌された液体培地にピシウム・オリガンドラムの選択された株の１つを接種すること、
ｄ）培養の終了後にバイオマスを回収及び加工すること、
ｅ）その後に、液相中でのピシウム・オリガンドラムの培養段階の終了後に、前記懸濁液中の粒子の９５％以上が、０．０５０〜０．３００ｍｍ、好ましくは０．０５０〜０．１２５ｍｍとなるように、前記バイオマスを前記液体培地で均質化すること、
ｆ）卵胞子の数によって特徴付けられる、得られた前記均質化された懸濁液を、次いで、卵胞子の数に応じて、対象とする液体生物学的抗真菌製品のための卵胞子の所定の濃度まで標準化（濃縮又は希釈）すること、
を特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の、ピシウム・オリガンドラム微生物の安定化された懸濁液を含有するピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品を製造する方法であって、
ｇ）穀粒、好ましくは殻を除去した雑穀粒、例えばキビ種子（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ Ｌ.)を含有する固体基質上で、前記ピシウム・オリガンドラム微生物を培養するための培地を調製すること、ここで前記穀粒は、あるパーセンテージの栄養液体培地と混合される、
ｈ）前記培地を、培養容器中で滅菌すること、
ｉ）冷却後に、ピシウム・オリガンドラムの選択された株の１つを前記培地に接種すること、
ｊ）前記培養処理の終了後に回収された前記バイオマスを懸濁液濃縮物の形態に加工すること、
ｋ）固体基質上でのピシウム・オリガンドラムの前記培養段階の終了後に、前記懸濁液中の粒子の９５％以上が、０．０５０〜０．３００ｍｍ、好ましくは０．０５０〜０．１２５ｍｍのサイズを有するように、前記バイオマスを対応する体積の脱塩水中で均質化すること、
ｌ）卵胞子の数によって特徴付けられる、得られた前記均質化された懸濁液を、次いで、卵胞子の数に応じて、対象とする液体生物学的抗真菌製品の調製ために適切な卵胞子の所定の濃度まで標準化（濃縮又は希釈）すること、
を特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２又は請求項１３に記載のピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品を製造する方法であって、
ｍ）前記ピシウム・オリガンドラム微生物の無水懸濁液の場合、前記懸濁液中の粒子の９５％以上が、０．０５０〜０．３００ｍｍ、好ましくは０．０５０〜０．１２５ｍｍのサイズを有するように、固体基質上又は液相中での前記培養段階の終了後に得られた材料を、均質化すること、
ｎ）その後に、卵胞子の数によって特徴付けられる得られた前記均質な懸濁液を、遠心分離すること、
ｏ）そして、上清の除去後に前記遠心分離された材料に適宜油を加えて、対象とする液体生物学的抗真菌製品の調製のために、卵胞子の所定の濃度を達成すること、
ｐ）その後に、得られた材料を、再懸濁すること、
を特徴とする方法。
【請求項１５】
前記ピシウム・オリガンドラム微生物の粒子の最大許容サイズを確実に０．０５０〜０．３００ｍｍ、好ましくは０．０５０〜０．１２５ｍｍとするために、均質化及び標準化（濃縮又は希釈）の後に、前記懸濁液を所定の粒子サイズに分離する、例えば濾過することを特徴とする、請求項１２〜請求項１４のいずれか１項に記載のピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品を製造する方法。
【請求項１６】
水性懸濁液を、オスモライトの添加物を用いて均質化の間に安定化し、８℃未満の温度で大きい滅菌された容器中で貯蔵する、ことを特徴とする、請求項１２〜請求項１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピシウム・オリガンドラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｏｌｉｇａｎｄｒｕｍ）微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品に関する。
本発明はまた、この製品を製造する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的抗真菌製品は、この数十年、環境に対する、そして実に使用者に対するそれらの負の影響の観点から高まる恐怖を喚起している。それにもかかわらず、これらを、標的化され且つ機転の利く方式でカビを除去できる微生物に基づく効果的な生物学的製品と交換することは所望の程度まで進んでいないと言うことができる。２０１４年のＧｅｒｂｏｒｅら［１］による最近の論文で強調されるように、非常に重点的な研究にもかかわらず、ＥＵの国々において１４種類の微生物のみがこの目的のために現在登録されている。
【０００３】
ピシウム・オリガンドラム微生物の抗真菌効果を利用する生物学的製品の実際的応用は１９７０年代から知られており、これに関してここではこの微生物の生物学を対象とし、その菌寄生特性を記載する１９４３年のＤｒｅｓｃｈｌｅｒ［２］及び１９７６年のＤｅａｃｏｎ［３］の古典的仕事を参照することができる。著者Ｖｅｓｅｌｙ及びＨｅｊｄａｎｅｋ、優先日１９７８年７月５日の米国特許第４，２５９，３１７号明細書［４］はその時代のものであり、これは、１グラムの製品あたり１００万個以上の卵胞子、そして１グラムの製品あたり５０００万〜５億個の卵胞子の量が最適レベルと言われる卵胞子の含有量を有する、テンサイの新芽から生じるカビ関連疾患に対する保護のための、ピシウム・オリガンドラム・ドレシュラー（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｏｌｉｇａｎｄｒｕｍ Ｄｒｅｓｃｈｌｅｒ)の卵胞子を含有する乾燥粉末製品を対象とする。乾燥粉末製品への適用可能な代替として、この発明の著者らは、卵胞子の液体懸濁液を許容するが、彼らが調製した適用について多数の欠点を特定しており、特に、そのような製品は不安定で、それらの実際的応用を約２週間に制限する。長い期間の後に、自己分解又は重複寄生体による汚染の結果、菌寄生保護機構の適用のために必須である卵胞子の発生に許容できない低減が生じる。ピシウム・オリガンドラムの個々の株の供給源に関する限り、米国特許第４，５７４，０８３号明細書［５］において著者であるＢａｋｅｒ及びＬｉｆｓｈｉｔｚは、標準的な報告された方法による土壌からの単離を通じて局地的に好適な株を得る可能性を指摘している。それ以来この手順が守られており、異なる地理的場所からの株が公的なコレクションにおいて現在利用可能である。分離株を同定する際に以下の生物学的基準が主に適用された：増殖速度、最適増殖温度（通常、約３０℃）、及び、有性周期及び無性周期の個々の生殖形態の形態。この観点から、後続の特許を画期的とみなすことができ、これに関して、米国特許第５，９６１，９７１号明細書［６］の発明者であるＭａｒｔｉｎは、決定的に重要な遺伝子の精密な逐次的プロトコールに基づいて個々の分離株の分子的特徴付けを導入している。フィールド条件におけるピシウム・オリガンドラム微生物を適用する個々の配合物及び方法が同じ特許文献において詳細に提示されており、発酵させてアルギネートとした後に乾燥させたバイオマスのカプセル化によって調製された、又は乾燥及び粉砕された製品の形態の産業廃棄物材料及び粉末配合物に基づく安価な培地での増殖後の液体配合物が好ましい配合物として述べられている。他の可能な配合物の中には、水和剤、標準粉末、乳化油及び顆粒の形態の配合物がある。ＢＩＯＰＲＥＰＡＲＡＴＹ，ｓｐｏｌ．ｓ．ｒ．ｏ．の２００９年のチェコ共和国特許第３０３  ９０８号明細書及び対応する欧州特許第２  ５０３  ８９２号明細書［７］は、ピシウム・オリガンドラム微生物を使用する収穫物の回収後の保護に焦点を当てている。技術的なセクションにおいて、これらの文献は、他の栄養分を追加せずに穀類含有物を含む液体培地での標準的な発酵槽中でのこの微生物の培養に集中している。製造方法の後期段階における噴霧乾燥オーブン中での乾燥の間に、使い��たされた培地又は菌糸体の残留物を除去し、これらの存在なしに卵胞子の純粋な濃縮物を得る可能性を強めている。ピシウム・オリガンドラム以外の生物の卵胞子の調製に関する知識は、限られた程度で報告されている。２０１２年のＬｉｕ  Ｘ．らの中国特許出願公開第１０２  ８０７  ９５７号明細書［８］には、様々な薬物への抵抗性をモニターするため及び遺伝学的研究のためのＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ微生物の新生卵胞子の調製が記載されている。植物の生物学的保護のための液体製品が２０１４年のＬｕｔｈの米国特許出願第２０１４／０２１２３８７号明細書［９］に特定されているが、これらは排他的に、溶媒として修飾トリシロキサンのポリエーテルを使用する液体製品である。
【０００４】
微小なピシウム・オリガンドラム卵菌の卵胞子及び他の生殖形態の調製及び安定化も非特許文献においてある特定の程度まで論じられている。１９９０年にＭｃＱｕｉｌｋｅｎら［１０］は、経済的に手頃な基質として糖蜜を使用する液体培養物中での卵胞子の調製のための単純且つ再現性のある方法を報告した。しかしながら、調製された卵胞子を維持する理想的な方法の問題は、特許文献又は非特許文献のいずれにおいても満足に解決されていない。１９９２年にＭｃＱｕｉｌｋｅｎら［１１］は、土壌抽出物が示す−０．５ＭＰａの浸透圧との比較により、ピシウム・オリガンドラム卵菌の菌糸の半径方向の伸長速度及び卵胞子の発生に対する、グリセロール、ＮａＣｌ及びＫＣｌなどの異なる浸透物の影響を観察した。オスモライトの追加は半径方向の伸長速度を低減させたが、約−２．０ＭＰａの値に対して発生に対する影響を有しなかった。最適温度（通常３０℃）及びｐＨ６．０〜７．５の酸性度の観点から満たされた条件において適用位置において通常起こる浸透条件の下で、適用された卵胞子の良好な効果が期待できると著者らは結論付けている。得られた卵胞子の貯蔵性の観点から、４℃の冷却器中で蒸留水中に通常の調製による懸濁液を維持した時の３７９日までの期間にわたる高い効果が２０１３年のＴａｋｅｎａｋａ及びＩｓｈｉｋａｗａ［１２］において著者らにより述べられている。
【０００５】
専門家によれば、生物学的防御製品のより大きな普及に対する主な障害は、適用の特定の条件、及び毎日の農作業において植物を保護するための生物学的製品を維持及び調製することに伴う実際的な問題に効果が依存していることであることがかなりはっきりしている。この理由から、ピシウム・オリガンドラム卵胞子の単純且つ効果的な貯蔵及び適用に関連する実際的な問題を解決することが生物学的製品の商業的成功にとって欠かせない。この問題を解決するために、標準的な貯蔵条件下でさえ高い長期安定性を有する、液体状態での生物学的保護の手段を開発することが望ましいであろう。しかしながら、これまでに報告された解決策は、何年もの重点的な努力の後でさえ満足に除去されていない多数の欠点を抱えている。植物を保護するための生物学的調製物の実験室での調製に関与する手順の大部分は複雑であって、実験室レベルでのみ管理できるものであり、このことが、産業上の製造のためにそのような手順を使用することを著しく制約している。チェコ共和国のバイオテクノロジー企業であるＢｉｏｐｒｅｐａｒａｔｙ，ｓｐｏｌ  ｓ．ｒ．ｏ．によって製造された製品（Ｐｏｌｙｖｅｒｓｕｍ（登録商標）、Ｐｏｌｙｇａｎｄｒｏｎ、ＢＩＯＲＥＰＥＬ（登録商標））に適用され、世界中で販売された、水和剤の形態の、現在までの適用の好ましい方法は、防御的介入を標的化し、使用者を保護するという観点からそれ自体の問題を有している。産業上容易に使用できる単純な形態の、ピシウム・オリガンドラム微生物の調製された生殖形態又は卵胞子の充分な貯蔵性を有する配合物のための、単純で、充分に試験され、且つ一貫して定義された手順はこれまで報告されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これまでに適用された生物学的抗真菌製品の特定された欠点は、本発明の下で除去又は制限され、本発明の本質は、独立請求項１によるピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品であって、前記液体生物学的抗真菌製品は、ピシウム・オリガンドラムの安定化された懸濁液を含み、ここで前記液体生物学的抗真菌製品は、培養培地、細胞形態のピシウム・オリガンドラム微生物及びこの微生物によって産生された物質を含有物として含む、この微生物の培養バイオマスを０．０５〜１０．０重量％、及び安定化剤を９０．０〜９９．９５重量％含有し、前記液体生物学的抗真菌製品の１ｍｌ当たりの休眠卵胞子の所定数（通常の標準化後）が、１×１０３〜２×１０７である。
【０００７】
本発明の２つ目の独立請求項によるピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品の本質は、前記液体生物学的抗真菌製品が、ピシウム・オリガンドラムの安定化された懸濁液を含み、ここで前記液体生物学的抗真菌製品は、培養培地、細胞形態のピシウム・オリガンドラム微生物及びこの微生物によって産生された物質を含有物として含む、この微生物の培養バイオマスを０．０５〜１０．０重量％、安定化剤を７９．７７〜９９．９５重量％、及び１００重量％までの残部である、充填物、芳香物、ビタミンＥを含む群から選ばれる少なくとも１つの特性改変用／施用用物質と、を含有し、前記液体生物学的抗真菌製品の１ｍｌ当たりの休眠卵胞子の所定数（通常の標準化後）が、２．５×１０４〜１．０×１０６となる事実に基づく。
【０００８】
ブルノのマサリク大学のチェコ微生物コレクション（Ｃｚｅｃｈ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＣＣＭ））にピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の名称で寄託された、ピシウム・オリガンドラム微生物のピシウム・オリガンドラム・ドレシュラー（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｏｌｉｇａｎｄｒｕｍ Ｄｒｅｓｃｈｌｅｒ)ＡＴＴＣ  ３８４７２株が好ましい。
【０００９】
本発明の主な利点は、長期間の使用のため及び長期間の顕著な安定化効果の達成のために好適であり、それによって、使用される安定化剤が手頃なものとなり、且つピシウム・オリガンドラム微生物の含有されるバイオマスの微生物汚染からの保護においてさらなる利点を提供する、新たな液体生物学的抗真菌製品である。卵胞子の形態の上記に特定される微生物の休眠細胞の請求項中の含有物は、実際的に試験され、且つ経済的に手頃な目的を提供し、これは、広範な必要とされる適用のための簡便な投薬を促進する。好適な調製物を使用して加工された、異なる種類のバイオマスを使用することができる。より低い濃度の休眠卵胞子、例えば数十又は数百の休眠卵胞子もまた、結果をもたらすが、この製品の効果はより低い。必要な場合、通常の標準化によって、すなわち、必要とされる値に希釈又は濃縮することによって、休眠卵胞子の所定数を調節することができる。
【００１０】
安定化剤が、水、塩溶液、油又はオスモライトの溶液を含む群から選択される少なくとも１つの成分を含有する場合が有利であり、前記オスモライトの溶液は、ポリオール溶液、サッカリド又はサッカリドアルコール種の溶液、又は塩溶液であり得る。ポリオール溶液は、マルトデカオース若しくはマルトノナオース若しくはマルトオクタオース若しくはマルトヘルパオース（ｍａｌｔｏｈｅｌｐａｏｓｅ）若しくはマルトヘキサオース若しくはマルトペンタオース若しくはスタキオース若しくはラフィノース又はスクロース若しくはスクラロース、又は分岐サッカリドなどの、最大で１０個のサッカリド単位及び最小で２個のサッカリド単位を含有する様々なオリゴサッカリドの代謝可能又は代謝不可能な溶液を含有する群から選択することができ、使用することができる。
【００１１】
理想的な実施では、安定化剤は、例えば３０．０〜９９．９重量％の量の、水、又は例えば９９．９重量％の量の、塩溶液、又は例えば６０．０〜６４．９５重量％の量の、スクロースの形態のオスモライト、又は例えば７９．７７〜９９．９重量％の量の、パラフィン油、鉱油、グリセロール、ヒマワリ油を含む群から選択される少なくとも１つの油である。
【００１２】
液体生物学的抗真菌製品は、使用の特定の領域のための他の特性改変用物質又は施用用物質を含有してもよく、その例としては、例えば１６．０重量％の量のピシウム・オリガンドラム微生物の卵胞子の担体（例えば、ポリビニルアルコール）などの徐放性生分解性マトリックス、又は例えば１６．０重量％の量の酸化ケイ素をベースとする充填物、又は例えば０．９６重量％の量のセージ又はミント芳香物、若しくは例えば０．４重量％の量のビタミンＥなどの他の施用用／特性改変用物質が挙げられる。
【００１３】
そのような施用用／特性改変用物質の使用は、生物学的抗真菌製品の用途に依存する。
【００１４】
結果として、ピシウム・オリガンドラム微生物の卵胞子の安定化された懸濁液は、一般的な水又は油、又は異なる手頃なオスモライトの溶液などの、親水性又は疎水性の性質の広範な安定化剤を使用することができる。
【００１５】
オスモライトは、異なる塩の溶液などのイオン性のものであってもよいし、又はポリオール溶液などの非イオン性のものであってもよいことが示されているので、オスモライトの化学的性質を通じて、必要とされる応用に対してオスモライトを完全に適合させることができる。例えば、異なる規定されるオリゴサッカリドの代謝可能又は代謝不可能な溶液として、ポリオールを代表することができるという事実は、必要とされる特性の好適な天然又は合成の物質の混合物をこの目的のために使用できるので、多数の応用にとって有益である。スクロースなどの一般に利用可能な物質も本発明者らの利点のために使用することができるが、必要な場合には、一般に利用可能な代謝不可能なアナログでさえも使用することができる。液体懸濁液の組成物は、例えば、充填物としての酸化ケイ素、ビタミンＥ酢酸塩及び他の物質といった、酸化防止物質、天然の活性化物質及びビタミンの形態の、組成物の利用特性又は応用を修飾する広範な他の物質と互いに相いれる。
【００１６】
いくらか驚くべきことに、調製の終了後に固体又は液体培養によって製造された細胞パーセンテージを懸濁液又は濃縮懸濁液の形態にした場合、ピシウム・オリガンドラム微生物の生殖形態は、実験室温度での通常の貯蔵をされた場合に、少なくとも６ヶ月間そのような懸濁液における元々の発生を保持する。刊行された文献において提示された再現性がなく変動する結果を考慮した時に、この結果はいっそうより顕著なものとなる。例えば、蒸留水中で調製され、１８８日又は３８４日の期間にわたり貯蔵された卵胞子の懸濁液は、４℃で冷却器中に貯蔵された時に元々の発生を保持したことが文献に記載されている。それにもかかわらず、そのような記載された調製物を調製する方法の記載が全くないことにより、農場での作業条件下で４℃の貯蔵温度が利用可能でさえないかもしれない時に、それらの実際的な利用可能性はもちろん、それらの科学的な妥当性を評価することはほぼ不可能である。
【００１７】
ピシウム・オリガンドラム微生物を含有する液体生物学的抗真菌製品は、本発明による製造方法を使用して得られ、前記製造方法の本質は、穀物、サトウキビ糖蜜及び他の必須栄養分の抽出物を含有する液体培地が、液相中でのピシウム・オリガンドラム卵菌の好気培養によって蒸気滅菌器中で滅菌されるという事実にある。冷却後に、ピシウム・オリガンドラムの選択された株の１つが接種される。数日、好ましくは１３日を要する、培養の終了後に、バイオマスを回収し、加工する。液相中でのピシウム・オリガンドラムの培養段階の終了後に、懸濁液中の粒子の９５％以上が０．０５０〜０．３００ｍｍ、好ましくは０．１２５ｍｍのサイズを有するように、バイオマスを、液体培地を用いて均質化する。卵胞子の数に応じて特徴付けられる均質な懸濁液を、生物学的抗真菌製品中の卵胞子の所定の濃度まで、溶液中の卵胞子の数に応じて濃縮又は希釈する。均質化及び濃縮又は希釈の段階の後に、懸濁液を好ましくは濾過する。
【００１８】
水性懸濁液は、オスモライトの添加物を用いて均質化の間に安定化され、８℃未満の温度で大きい滅菌された容器中で貯蔵される。
【００１９】
ピシウム・オリガンドラム微生物の無水懸濁液の場合、固体基質上又は液相での培養段階の終了後に得られた材料を、懸濁液中の粒子の９５％以上が０．０５０〜０．３００ｍｍ（好ましくは０．１２５ｍｍ）のサイズに達するまで均質化する。卵胞子の数に応じて特徴付けられる得られた均質な懸濁液は、遠心分離機にかけられる。上清の除去後に、生物学的抗真菌製品中の卵胞子の結果として得られる濃度が所望の濃度となるような量で、遠心分離された材料に適宜油を添加して、生物学的抗真菌製品の製造のための卵胞子の所定の濃度が達成され、その後、このようにして得られた材料は、均質化によって再懸濁される。
【００２０】
提示される解決策は、ピシウム・オリガンドラム微生物を調製するバイオテクノロジーの方法の有意な単純化、及びしたがってそのような製品の製造者にとってのランニングコストの有意な低減の観点からも好適であると思われる。製造培地からの培養されたバイオマスの濾過又は分離、その乾燥及び粒子の必要とされるサイズへのその後の粉砕は、エネルギー及び技術を比較的要求し、制御が難しく且つ汚染を受けやすい可能性があるいくつもの加工を必要とし、精密に規定された産業上要求される条件下で実行されない場合、最終結果として、得られる製品に著しい損傷を与える可能性がある。対照的に、オスモライトの密なビスコース溶液中で得られたバイオマスの技術的に単純な懸濁液は、広範な実際的応用のために直ちに好適な非常に安定な製品を結果としてもたらす。実際的観点から、ピシウム・オリガンドラム微生物の調製された懸濁液を培養皿又は発酵槽からほとんど廃棄なしで移せることは顕著な利点であり、これは、それらの洗浄及び維持の費用を最小化し、且つ製造構内の作業環境中に製品が漏れる可能性も最小化する。さらに、このようにして得られる製品が、通常温度での貯蔵の間でさえ、長期間にわたり安定であるという事実もまた、ランニングコストを著しく低減し、且つ製品の取り扱いをより容易にする。
【００２１】
驚くべきことに、オスモライトの濃縮溶液の安定化効果以外に、製造及び一般的な実施から周知であるそのような溶液の保存効果は、本発明者らが調べた微小な卵菌ピシウム・オリガンドラムの卵胞子の懸濁液の特定の場合に顕著であることも発見された。したがって、このようにして貯蔵された製品は、望ましくない微生物による汚染から保護され、これらの微生物は、そのような安定化された懸濁液の透過の可能性が非常に低い場合とはいえ、提案される化学的環境中で繁殖することができず、したがって最終製品を汚染することができない。この利点は、特に、殺虫剤、殺傷剤及び美容製品における偶発的な汚染のレベルに対するいっそう厳格な必要条件に照らせば、現行の製造実施において根本的なものである。
【００２２】
安定化剤の役割及び保存物質の役割に加えて、オスモライト溶液はまた粘着剤の役割も果たし、これは、最適濃度への卵胞子の安定化された懸濁液の希釈後の、浸漬による応用を有する水溶液の形態であろうと、又は微小な粒子の穏やかな分散による応用（いわゆる、ミスティング）のための水溶液の形態であろうと、多くの応用において実際的に応用できるという事実である。したがって、上記に特定された応用の例の全てにおいて、ポリオール溶液は、処置される領域、植物又は作物への効果的な粘着及びその後の適用さえも補助する。
【００２３】
最後になるが大事なこととして、代謝可能なオスモライトを使用する場合、これらの物質は、直接的に適用の場所における標的場所のコロニー形成及び定着の間に重要な栄養分として働くことがあり、それによって、これは特に、卵胞子の菌糸形態への移行と結び付いた最初の段階の間に、重要な栄養分であることを述べなければならない。これらの物質はその後に、バイオテクノロジーによる培養の間の卵胞子のバイオテクノロジーによる増殖及び生殖の間に使用される不完全に発酵した基質により表される、より複雑な性質の栄養分の適用の場所における微小な卵菌ピシウム・オリガンドラムの長期間の増殖及び保存のために重要な栄養分の役割を引き受けることがある。
【００２４】
提示される解決策による懸濁液中の微小な卵菌の卵胞子及び他の生殖形態の特定の含有量は、以前に試験されて販売されたルーズな製品と同等であるか又はより高く、これは、このようにして作られた製品の分配の物流及び経済学の観点から重要である。しかしながら、新たな配合物はまた、以前の解決策と比較してより低い濃度で使用することもできる。
【００２５】
このように配合される液体製品の機能又は効果においていかなる制限も結び付けられることなく、使用される技術的手順との関連で新たな液体生物学的抗真菌製品における組成の複雑性の有意な低減を本発明者らは実際に見た。新たに提案される製品の細胞及び粒子組成に関する限り、これは、菌糸断片、粉砕されたキビ及び他の成分の非常に低いパーセンテージを有する安定化された卵胞子をほぼ全体的に伴う。明らかに、これらの成分は、濃縮されたオスモルによって作り出される密な環境中で沈殿せず、これは、驚くべきことに、調製物がそれに含まれる粒子の大きさの観点から非常に不均質な時に、水性懸濁液の形態で適用される水和剤の場合とは比べることができない程に良好な製品の均質性を保証する。これは、これまでに作られた製品中に含有される酸化ケイ素の粒子に特に当てはまり、対照的に、酸化ケイ素は、提出される発明（酸化ケイ素が擦傷剤として使用される、歯磨き剤を例外とする）による解決策においては大抵の場合に存在しない。結果として、実際的応用の必要性の観点から、製品の適用の間にフィルター及び他の技術的設備の詰まりがない。
【００２６】
より低量の代謝可能なオスモライトの存在がある特定の適用に対して有害な場合、製品の最も重要な特性にいかなる形でも影響することなく化学的に類似の代謝不可能なオスモライトでこれらを容易に置き換えることができる。
【００２７】
得られる製品を乾燥させることが技術的観点からより適切な場合、凍結乾燥の間の凍結保存剤及び保護物質としてのオスモライトの濃縮溶液の使用は周知且つ広く使用されているので、高い真空値を有する装置中での凍結乾燥がここでは好適であると思われる。例としては、例えば２００４年のＷｒｉｇｈｔによる論文［１５］に記載された、ヒト卵母細胞の凍結保存などの、多数の傷付きやすい応用における保護用凍結保存剤として広く使用されているオスモライトが参照される。
【００２８】
提出される発明にしたがって得られる製品のかなりの利点は、ピシウム・オリガンドラム微生物の抗カビ、菌寄生、誘出及び増殖特性を使用することが有益と思われる全ての応用のためにそのような製品は好適であることである。したがって、特に、植物の生物系殺真菌剤（ｂｉｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅ）としてのこの製品の使用、ヒト及び獣医のためのピシウム・オリガンドラム微生物の使用、様々な医療診断の場合に起こるバイオフィルムの破壊及びディスバイオシスの除去のため、そしてまた生活及び／又は仕事環境において起こるカビからの市民の保護のためでもある。液体懸濁液濃縮物において使用されるマトリックスに応じて、保護因子として及び徐々に分解するマトリックスとして、すなわち活性微生物ピシウム・オリガンドラムの卵胞子を有するＰＯＬＹＶＥＲＳＵＭ材料の「担体」として作用する分解性バイオポリマーの存在下での植物の保護用噴霧剤として使用することができる。
【００２９】
カビ又は真菌又は病原性細菌又は病原性酵母又は微生物ディスバイオシスを被った領域への、希釈されていない又は希釈された形態の、そのような安定化された濃縮懸濁液の適用からなる、ピシウム・オリガンドラム微生物の卵胞子の安定化された濃縮懸濁液の使用によるカビ、真菌、病原性細菌及び酵母からの保護は、安定化された液体濃縮物のための広範囲の応用を定義することを可能とする。
【００３０】
植物保護の領域では、希釈されていない又は希釈された形態の、安定化された濃縮懸濁液が、回収前又は回収後に例えば倉庫において、植物若しくはそれらの周囲環境又は種子又は作物又は果物に適用されるように組成物を使用して、カビ、真菌又は病原性細菌及び酵母からの保護を提供することができ、これには、濃縮懸濁液を含有するエアゾール、自己溶解性カプセルの形態の適用、植物の根元での追加の肥料付与、作物の浸漬、作物への噴霧、種子の処理、作物へのミスト適用、包括的な肥料の成分部分としての肥料付与及び追加の肥料付与、及び水栽培の形態の適用が含まれる。
【００３１】
口腔の保護の場合、口腔内プラーク又は歯周疾患、感染した非治癒創傷（特に糖尿病性）の発生、皮膚糸状菌又は酵母関連の感染性疾患の発生、並びに皮膚及びヒト表面膜の微生物ディスバイオシスと結び付いた他の症状の発生を被った場所に、希釈されていない又は希釈された形態の安定化された濃縮懸濁液を適用することができる。
【００３２】
市民の保護における使用のために、真菌の発生を被った壁上及び石材中の場所に、希釈されていない又は希釈された形態の安定化された濃縮懸濁液を適用することができる。他の画期的な使用の領域としては、冷却設備、空調、洪水及び大洪水を被った領域、及びピシウム・オリガンドラム微生物によって標的化される真菌の頻繁な発生を伴う他の場所の抗真菌保護が挙げられる。
【００３３】
本発明を例示的な実施形態において詳細にさらに説明し、また添付の図式的な図面においてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃは、ピシウム・オリガンドラム微生物の存在なしでの及びその微生物が存在する時の植物病原性真菌フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  Ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の増殖速度の比較をより詳細に解明する。  これらは具体的には以下を示す。  図１Ａは、植物病原性真菌フザリウム・グラミネアラムの、それ自体（四角）の、及び、休眠状態の卵胞子から並びに液体及び固体培養から（星及び三角）のピシウム・オリガンドラムの同時接種による、コロニーの増殖である。  図１Ｂは、休眠状態の卵胞子からのピシウム・オリガンドラム微生物が左側に接種され、植物病原性真菌フザリウム・グラミネアラム（上段）が右側に接種され、対照皿にはフザリウム・グラミネアラム真菌のみが接種されたペトリ皿の写真であり、増殖は４日後に記録された。  図１Ｃは、植物病原性（ｐｈｙｔｏｐａｔｏｇｅｎｉｃ）真菌フザリウム・グラミネアラムを、休眠状態の卵胞子からのピシウム・オリガンドラム微生物と同時接種したペトリ皿の写真であり、増殖は１１日後に記録された。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、植物病原性真菌フザリウム・グラミネアラム、ピシウム・オリガンドラム微生物、及びこれらの２つの微生物の組合せの存在下での小麦の成長の実験室実験の結果を示す。  これらは具体的には以下を示す。  図２Ａは、小麦の新芽における接種の２０日後に記録された、小さい白色の点である植物病原性真菌フザリウム・グラミネアラムのみの存在下で寒天土壌上で小麦が成長したエルレンマイヤーフラスコである。  図２Ｂは、植物病原性真菌フザリウム・グラミネアラム及びピシウム・オリガンドラム微生物の両方の存在下で寒天土壌上で小麦が成長したエルレンマイヤーフラスコであり、フラスコは小麦の新芽における同時接種の２０日後に記録された。  図２Ｃは、ピシウム・オリガンドラム微生物のみの存在下で、寒天土壌上で小麦が成長したエルレンマイヤーフラスコであり、フラスコは小麦の新芽におけるこの真菌の接種の２０日後に写真撮影された。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅは、例示的な実施形態１による植物保護のための抗真菌製品の適用、及び、遺伝子発現及び真菌汚染のレベルの遺伝学的観察によってモニターされた真菌の存在への反応などの、小麦及び隣接する土壌に対するフィールド実験において観察されたピシウム・オリガンドラム微生物の集団動態のその後の解析を示す。  これらは具体的には以下を示す。  図３Ａは、適用後の異なる時点における植物（ライトグレーのカラム）及び周囲の隣接する土壌（ダークグレーのカラム）の遺伝学的試験によって決定されたピシウム・オリガンドラム微生物の含有量である。  図３Ｂは、サンプリングの時点においてまさに現場にあった放射温度計を使用して測定された温度（ライトグレーのカラム）及び局所気象ステーションから得られた温度記録（ダークグレーのカラム）の進展である。  図３Ｃは、６〜１２０時間の時点で観察された植物の個々の部分及び周囲の土壌（Ｓｏ−土壌、Ｒ−根、Ｓｔ−茎、Ｌ−葉）におけるセルラーゼ（ＰＯＣＥＬＬ）、エンド−  −グルカナーゼ（ＰＯＥＮＤＯ）、及び、セリン及びスレオニンに富んだ構造タンパク質（ＰＯＳＴＲＵ）の遺伝子発現の経過であり、遺伝子発現のレベルを構成遺伝子  −チューブリン（ＰＯＴＵＢＵ）の発現に対して標準化し、引用した方法論［１２］にしたがって製品の適用なしで表す。  図３Ｄは、真菌の増幅用の汎用増幅プライマーを用いる定量ＰＣＲを使用して測定されたパネルＣと同一の試料における真菌汚染のレベルである。  図３Ｅは、セルラーゼ（ＰＯＣＥＬＬ）の遺伝子発現のレベルと真菌汚染のレベルとの相関をモニターした相関グラフである。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄは、例示的な実施形態４による歯磨き剤の効果の試験を、図の上部における健常個体からの唾液の使用及び図の下部における歯周疾患を患う個体からの唾液の使用によるセラミックヒドロキシルアパタイトプレート上に人工的に作り出したバイオフィルムを除去するそれらの能力の観点から示す。  これらは具体的には以下を示す。  図４Ａは、溶液中でリンスしたバイオフィルムの放出、及び、ペースト剤なし、Ｏｄｏｌ歯磨き剤、Ｅｎｚｙｃａｌ歯磨き剤、ピシウム・オリガンドラム微生物の追加なしの例示的な実施形態４によるグリセロールを含有するペースト剤、酸化ケイ素の追加なしの例示的な実施形態４によるグリセロールを含有するペースト剤、及び例示的な実施形態４によるグリセロールを含有する完全なペースト剤を有するブラシで以前に洗浄されたセラミックヒドロキシルアパタイトプレートの除去の後の、健常個体からの唾液を使用した６穴プレートの写真である。  図４Ｂは、５６２ｎｍの波長でのプレート分光光度計による図１Ａの個々の穴における発色の強度を測定することによるバイオフィルムの含有物の定量評価である。  図４Ｃは、溶液中でリンスしたバイオフィルムの放出、及び、ペースト剤なし、Ｏｄｏｌ歯磨き剤、Ｅｎｚｙｃａｌ歯磨き剤、ピシウム・オリガンドラム微生物の追加なしの例示的な実施形態４によるグリセロールを含有するペースト剤、酸化ケイ素の追加なしの例示的な実施形態４によるグリセロールを含有するペースト剤、及び例示的な実施形態４によるグリセロールを含有する完全なペースト剤を有するブラシで以前に洗浄されたセラミックヒドロキシルアパタイトプレートの除去の後の、歯周疾患を有する個体からの唾液を使用した６穴プレートの写真である。  図４Ｄは、５６２ｎｍの波長でのプレート分光光度計による図１Ｃの個々の穴における発色の強度を測定することによるバイオフィルムの含有物の定量評価である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
液体生物学的抗真菌製品はピシウム・オリガンドラム微生物を含有し、全ての例示的な実施形態においてピシウム・オリガンドラム微生物はピシウム・オリガンドラム・ドレシュラー  ＡＴＴＣ  ３８４７２株であり、この株は、ブルノのマサリク大学のチェコ微生物コレクション（ＣＣＭ）にピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の名称で寄託されており、この株は以下の例示的な実施形態ではこの名称で表される。
【００３６】
下記は、ＳＴ２５  ＰＣＴにしたがったこの微生物の配列プロトコールである。
【００３７】
【化１】
2019530455.tif 000003
【００３８】
（実施例１）
高い重量パーセンテージのバイオマスの作物への噴霧を意図した液体生物学的抗真菌製品
調製：
固体基質上でのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の培養を通じて得られたバイオマスをホモジナイザー容器（工業用ミキサー）中で脱塩水と混合し、均質化した。均質化は３，０００〜５，０００回転／分で３分間行った。その後に、結果として６０重量％の重量濃度及び卵胞子の必要とされる数に対応する量でオスモライト（スクロース）を未希釈の開始懸濁液に加えた。その後に、オスモライト（スクロース）を含む懸濁液をミキサーで２，０００回転／分で１分間均質化した。次いで、懸濁液を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。
【００３９】
固体培養を通じて得られたバイオマスが工業用ホモジナイザーの容器中のオスモライト溶液（６５％スクロース溶液）中で均質化されるように、脱塩水中での均質化の工程及びその後のオスモライト（スクロース）の追加の工程を１つに合わせることによって液体生物学的抗真菌製品を調製することがより有益であった。均質化は３，０００〜５，０００回転／分で３分間行った。開始懸濁液中の卵胞子の数を決定した後、製品中の卵胞子の必要とされる濃度が達成されるような標準的な方法でこの懸濁液をオスモライト（６５％スクロース溶液）で希釈した。次いで、懸濁液を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。
【００４０】
セジウィックラフター（Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ−Ｒａｆｔｅｒ）計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００４１】
製品の組成：
安定化剤としてのスクロース  ６０重量％
安定化剤としての水  ３０重量％
培養バイオマス  １０重量％
ピシウム・オリガンドラム微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり５×１０５個
【００４２】
特性：
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
【００４３】
（実施例２）
低い重量パーセンテージのバイオマスの作物への噴霧を意図した液体生物学的抗真菌製品
調製：
液体培養によって得られたピシウム・オリガンドラムバイオマスをホモジナイザー（工業用ミキサー）の容器中でオスモライト（スクロース）と混合し、卵胞子の必要とされる数及びオスモライト（スクロース）の濃度が達成されるように均質化した。均質化は３，０００〜５，０００回転／分の速度で３分間行った。次いで、懸濁液を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００４４】
組成：
安定化剤としてのスクロース  ６４重量％
安定化剤としての水  ３５．９重量％
培養バイオマス  ０．１重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり５×１０５個
【００４５】
特性：
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
【００４６】
（実施例３）
種子のコーティングを意図した液体生物学的抗真菌製品
調製：
固体基質上でのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の培養を通じて得られたバイオマスをホモジナイザー容器（工業用ミキサー）中で脱塩水と混合し、均質化した。均質化は３，０００〜５，０００回転／分で３分間行った。その後に、結果として６０重量％の重量濃度及び卵胞子の必要とされる数に対応する量でオスモライト（スクロース）を未希釈の開始懸濁液に加えた。その後に、オスモライト（スクロース）を含む懸濁液をミキサーで１分間均質化した。
【００４７】
固体培養を通じて得られたバイオマスが工業用ホモジナイザーの容器中のオスモライト溶液（６５％スクロース溶液）中で均質化されるように、脱塩水中での均質化の工程及びその後のオスモライト（スクロース）の追加の工程を１つに合わせることによって製品を調製することがより有益であった。均質化は３，０００〜５，０００回転／分で３分間行った。開始懸濁液中の卵胞子の数を決定した後、製品中の卵胞子の必要とされる濃度が達成されるような標準的な方法でこの懸濁液をオスモライト（６５％スクロース溶液）で希釈した。次いで、懸濁液を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。
【００４８】
次いで、得られた懸濁液を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００４９】
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
組成：
安定化剤としてのスクロース  ６０重量％
安定化剤としての水  ３６重量％
培養バイオマス  ４重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり２．５×１０６個
【００５０】
（実施例４）
低い水含有量の懸濁液濃縮物としての液体生物学的抗真菌製品
調製：
液体培養からのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスを回収後に遠心分離機にかけた。遠心分離後に上清を除去し、結果としての卵胞子の数が製品１ｍｌあたり５００，０００個の卵胞子となるように遠心分離した材料にパラフィン油を添加した。その後に、混合物を工業用ミキサーで３分間均質化した。懸濁液を滅菌された容器中で８℃未満の温度で貯蔵した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００５１】
組成：
培養バイオマス  ０．１重量％
安定化剤としてのパラフィン油  ９９．９重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり５×１０５個
【００５２】
特性：
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
【００５３】
（実施例５）
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物のための徐放分解性マトリックスを構成するナノファイバーの形態で適用された液体生物学的抗真菌製品
調製：
液体培養からのピシウム・オリガンドラムバイオマスを回収後に遠心分離機にかけた。上清を除去し、遠心分離した材料にオスモライト（６５％スクロース）及びバイオポリマーを添加し、その後にそれを非毒性の生分解性ポリマーポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用する静電スピニングの技術を使用して加工した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００５４】
組成：
主要成分（ピシウム・オリガンドラム微生物の液体懸濁液）  ８４重量％
そのうち：
安定化剤としてのスクロース  ６３重量％
安定化剤としての水  ３６重量％
培養バイオマス  １重量％
【００５５】
２．ＰＶＡ担体
分解性担体としてのＰＶＡ  １６重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり５×１０６個
【００５６】
特性：
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
【００５７】
（実施例６）
含浸コーティング又は噴霧の形態で適用される液体生物学的抗真菌製品
調製：
液体培養からのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスを回収し、３００  ｍまでの大きさを有する粒子を分離する濾過技術を使用して濾過した後に均質化した。遠心分離後に、製品１ｍｌ中の卵胞子の必要とされる数が達成されるように、この調製されたバイオマスを低粘度の鉱油と混合した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００５８】
組成：
培養バイオマス  ０．１重量％
安定化剤としての鉱油  ９９．９重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり２×１０５個
【００５９】
特性：
安定性：１０〜４５℃の温度で６ヶ月（二次的物質の種類による）
【００６０】
（実施例７）
空調のための衛生用製品として適用される液体生物学的抗真菌製品
調製：
液体培養からのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスを回収し、１００  ｍまでの大きさを有する粒子を分離する濾過技術を使用して濾過した後に均質化した。遠心分離後に、製品１ｍｌあたりの卵胞子の必要とされる数までバイオマスを塩溶液で希釈した。適用の原理は、空調又は冷却ユニットのフィルター又はパイプのリンス又はそれへの噴霧である。ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の存在は、カビ及び真菌疾患への抵抗を保証する。
【００６１】
ポーレンフィルターの洗浄：
フィルターを衛生溶液に浸漬し、１０〜３０分間そのままにした後、リンスした。代替は、稼働位置にあるフィルターへの同じ溶液の噴霧である。汚れ及び剤の残留物を圧縮空気によって吹き飛ばす。
【００６２】
気化器及びフィルターの衛生：
気化器及び／又はフィルターの洗浄後に、リンスなしで製品の溶液を適用する。製品のみを洗浄用洗剤として使用した時でさえ、優れた衛生効果が達成される。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００６３】
組成：
培養バイオマス  ０．１重量％
安定化剤としての塩溶液  ９９．９重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり５×１０５個
【００６４】
特性：
安定性：１０〜４５℃の温度で６ヶ月（二次的物質の種類による）
【００６５】
（実施例８）
沈殿物の処理のため（泥の堆積及び洪水の領域のため）の衛生用製品として適用される液体生物学的抗真菌製品
調製：
液体培養からのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスを回収し、４００  ｍまでの大きさを有する粒子を分離する濾過技術を使用して濾過した後に均質化した。遠心分離後に、製品１ｍｌあたりの卵胞子の必要とされる数までバイオマスを蒸留脱塩水を使用して希釈した。作用の原理は、下記に特定される希釈にしたがって水懸濁液を作り、土壌及び地面の特性の改善のための強化及び改善手順としての、泥及び沈殿物による汚染の堆積を被った領域に適用することである。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００６６】
組成：
培養バイオマス  ０．１重量％
安定化剤としての蒸留水  ９９．９重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり５×１０５個
適用可能な用途は、１ｍｌあたり５００，０００個の卵胞子の濃度での１ヘクタールあたり２５０ｇからである。
【００６７】
特性：
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
【００６８】
（実施例９）
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の卵胞子の安定化された水性懸濁液としての液体生物学的抗真菌製品
調製：
液体培養によって得られるピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスを滅菌された蒸留水と混合し、遠心分離機（４，０００回転／分、５分）にかけて上清を除去した後に均質化する。均質化は１分間の高速回転（２０，０００回転／分）で行う。その後に、元々の培地の残留物又は菌糸体の残留物の存在なしで、１ｍｌ中にピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の卵胞子の必要とされる数を含有する懸濁液濃縮物を達成する目的からの必要に応じて、懸濁液を濾過及び濃縮することができる。得られた懸濁液材料を１〜８℃の温度で滅菌されたタンク中に貯蔵することができる。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００６９】
組成：
安定化剤としての滅菌蒸留水  ９９．９重量％
培養バイオマス  ０．１重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり５×１０５個
【００７０】
特性：
安定性：２５℃までの温度で最低６ヶ月
【００７１】
（実施例１０）
高濃度のピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の卵胞子を含む安定化された水性懸濁液としての液体生物学的抗真菌製品
調製：
液体培養を通じて得られたピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスをホモジナイザー容器（工業用ミキサー）中で均質化した。均質化は２０，０００回転／分で３分間行った。次いで、懸濁液を遠心分離機にかけ、上清を除去した後、オスモライト（６５％スクロース）と混合することによって製品１ｍｌ中の卵胞子の必要とされる数にバイオマスを濃縮した。懸濁液濃縮物を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００７２】
組成：
安定化剤としてのスクロース  ６０重量％
安定化剤としての水  ３５重量％
培養バイオマス  ５重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり２×１０７個
【００７３】
特性：
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
【００７４】
（実施例１１）
グリセロールをベースとするペーストの形態の生物学的抗真菌製品
調製：
医薬品品質のグリセロール（グリセロール９９％  ＰｈａｒｍＥｕｒ）１１９７．１ｇを実験室ホモジナイザーに注ぎ入れ、２３９．４ｇの酸化ケイ素Ｓｉｄｅｎｔ（登録商標）２２Ｓ、４３．１ｇの培養バイオマス、１４．４ｇのビタミンＥ及び６ｇのセージ芳香物を慎重にふりかけた。混合物を実験室の温度にて６０回転／分で１０分間混合した。その後、混合物を栓付きのプラスチックチューブ中に１回に７５ｇで入れ、このようにして合計で２０個のそのようなチューブを充填した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００７５】
組成：
安定化剤としてのグリセロール９９％  Ｐｈａｒｍ  Ｅｕｒ  ７９．７７重量％
酸化ケイ素をベースとする充填物としてのＳｉＯ２  Ｓｉｄｅｎｔ（登録商標）２２Ｓ  １６．００重量％
培養バイオマスピシウム・オリガンドラム  Ｍ１  ２．８７重量％
適用材料としてのビタミンＥ酢酸  ０．９６重量％
芳香物としてのＦＣＯ２  Ｂｉｏ  ３５％セージ芳香物  ０．４０重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり２．５×１０４個
【００７６】
特性：
安定性：２５℃の温度で最低６ヶ月
【００７７】
（実施例１２）
オリーブ油をベースとするペーストの形態の生物学的抗真菌製品
調製：
６００ｇのバージンオリーブ油を実験室ホモジナイザーに注ぎ入れ、１２０ｇの酸化ケイ素Ｓｉｄｅｎｔ（登録商標）２２Ｓ、２１．６ｇの培養バイオマス、７．２ｇのビタミンＥ及び３ｇのミント芳香物を慎重にふりかけた。混合物を実験室の温度にて２０回転／分で１０分間混合した。その後、混合物を栓付きのプラスチックチューブ中に１回に７５ｇで入れ、このようにして合計で１０個のそのようなチューブを充填した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。
生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００７８】
組成：
安定化剤としての精製オリーブ油  ７９．７７重量％
酸化ケイ素をベースとする充填物としてのＳｉＯ２  Ｓｉｄｅｎｔ（登録商標）２２Ｓ  １６．００重量％
培養バイオマスピシウム・オリガンドラム  Ｍ１  ２．８７重量％
適用材料としてのビタミンＥ酢酸塩  ０．９６重量％
芳香物としてのＨＮＡペパーミント精油  ０．４０重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり２．５×１０４個
【００７９】
特性：
安定性：２５℃の温度で６ヶ月
【００８０】
（実施例１３）
水生生物の保護のための液体生物学的抗真菌製品
広範な真菌疾患（特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）からの魚及び稚魚（コイ、ローチ、ブリーム）の予防的保護のために製品を設計する。製品を飼育槽中で予防的に適用する。製品は、広範な真菌疾患（特に、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）の攻撃からの魚卵の予防的保護も意図する。
【００８１】
調製：
液体培養を通じて得られたピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスをホモジナイザー容器（工業用ミキサー）中で均質化した。均質化は２０，０００回転／分で３分間行った。次いで、懸濁液を遠心分離機にかけ、上清を除去した後、オスモライト（６５％スクロース）と混合することによって製品１ｍｌ中の卵胞子の必要とされる数にバイオマスを濃縮した。懸濁液を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００８２】
組成：
安定化剤としてのスクロース  ６３重量％
安定化剤としての水  ３６重量％
培養バイオマス  １重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり５×１０６個
【００８３】
特性：
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
【００８４】
（実施例１４）
ミツバチの巣を処置するための液体生物学的抗真菌製品
広範な真菌、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ科及びＦｕｓａｒｉｕｉｍ科の真菌の攻撃からミツバチの巣を予防的処置するために製品を設計する。ミツバチの巣箱の外側での貯蔵を意図したハチの巣の処置、及びハチがいないミツバチの巣箱内でのハチの巣の処置のために製品を使用することができる。
【００８５】
調製：
液体培養によって得られたピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスをホモジナイザー（工業用ミキサー）の容器中でオスモライト（スクロース）と混合し、卵胞子の必要とされる数及びオスモライト（スクロース）の濃度が達成されるように均質化した。均質化は２０，０００回転／分で３分間行った。次いで、懸濁液を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【００８６】
組成：
安定化剤としてのスクロース  ６４重量％
安定化剤としての水  ３５．９重量％
培養バイオマス  ０．１重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり１×１０６個
【００８７】
特性：
安定性：２５℃までの温度で６ヶ月
【００８８】
（実施例１５）
作物への噴霧を意図した無水懸濁液濃縮物としての液体生物学的抗真菌製品
固体基質上でのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の培養を通じて得られたバイオマスをホモジナイザー容器（工業用ミキサー）中で脱塩水と混合し、均質化した。均質化は３，０００〜５，０００回転／分で３分間行った。均質化後に、得られた懸濁液を無機担体（Ｓｉｐｅｒｎａｔ）と混合し、乾燥し、切断ミル中で粉砕して３５０μｍまでの結果としての粒径を達成した。次いで、製品中の卵胞子の必要とされる濃度を達成するように、担体を含む乾燥培養バイオマスをパラフィン油と混合した。懸濁液を滅菌された容器中で２５℃までの温度で貯蔵した。
【００８９】
実施例１に対するこの製品の利点は製品のより長い安定性であり、これは水の存在によって確実になる。酸化ケイ素をベースとする無機担体は、製品中の固体粒子（バイオマス）の良好な懸濁性を確実にする。
【００９０】
セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を決定した。
【００９１】
組成：
培養バイオマス  １．５重量％
無機担体としてのＳｉｐｅｒｎａｔ２２    ６．５重量％
安定化剤としてのパラフィン油  ９２.０重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり１×１０６個
【００９２】
特性：
安定性：２５℃までの温度で２４ヶ月
【００９３】
（実施例１６）
農産物の有機製造における作物への噴霧を意図した無水懸濁液濃縮物としての液体生物学的抗真菌製品
固体基質上でのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の培養を通じて得られたバイオマスをホモジナイザー容器（工業用ミキサー）中で脱塩水と混合し、均質化した。均質化は３，０００〜５，０００回転／分で３分間行った。均質化後に、得られた懸濁液を無機担体（Ｓｉｐｅｒｎａｔ）と混合し、乾燥し、切断ミル中で粉砕して３５０μｍまでの結果としての粒径を達成した。次いで、製品中の卵胞子の必要とされる濃度を達成するように、担体を含む乾燥培養バイオマスをヒマワリ油と混合した。懸濁液を滅菌された容器中で２５℃までの温度で貯蔵した。
【００９４】
実施例１に対するこの製品の利点は製品のより長い安定性であり、これは水の存在によって確実になる。酸化ケイ素をベースとする無機担体は、製品中の固体粒子（バイオマス）の良好な懸濁性を確実にする。
【００９５】
セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を決定した。
【００９６】
組成：
培養バイオマス  １．５重量％
無機担体としてのＳｉｐｅｒｎａｔ２２   ６．５重量％
安定化剤としてのヒマワリ油  ９２.０重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり１×１０６個
【００９７】
特性：
安定性：２５℃までの温度で２４ヶ月
【００９８】
（実施例１７）
卵胞子の濃度が低減された液体生物学的抗真菌製品
液体培養によって得られたピシウム・オリガンドラム  Ｍ１バイオマスをホモジナイザー（工業用ミキサー）の容器中でオスモライト（スクロース）と混合し、卵胞子の必要とされる数及びオスモライト（スクロース）の濃度が達成されるように均質化した。均質化は２０，０００回転／分で３分間行った。その後に、製品中の卵胞子の濃度が製品の必要条件と合致するように懸濁液をオスモライト（６５％スクロース）と混合した。次いで、懸濁液を滅菌されたステンレス鋼タンク中で８℃未満の温度で貯蔵した。
【００９９】
セジウィックラフター計数チャンバーを使用して顕微鏡下で休眠状態の卵胞子の数を決定し、２０１１年のＥｔｘｅｂｅｒｒｉａらによる報告［１３］にしたがって、原形質分離法を使用して生存可能な卵胞子の数の顕微鏡観察に基づいて安定性を測定した。休眠状態の卵胞子の数を必要に応じて標準的な方法で安定化させる。
【０１００】
組成：
安定化剤としてのスクロース  ６４．９５重量％
安定化剤としての水  ３５.０重量％
培養バイオマス  ０．０５重量％
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の休眠状態の卵胞子の数  １ｍｌあたり１×１０３個
【０１０１】
特性：
安定性：２〜８℃の温度で１２ヶ月、２５℃までの温度で６ヶ月
【０１０２】
（実施例１８）
菌寄生実験における液体生物学的抗真菌製品の効果の実験室試験
例示的な実施形態１による懸濁液濃縮物の休眠状態の卵胞子からのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の増殖及び植物病原性真菌フザリウム・グラミネアラムへのその後の菌寄生の実験室試験を、麦芽抽出物をベースとする栄養培地を含む滅菌された寒天プレート上で実行した。適用レベル、すなわち水１リットルあたり０．２ｍｌの濃縮物で希釈濃縮物を寒天プレートに適用し、このプレートの一部を発芽後に取り出し、異なる寒天に移し、この寒天にフザリウム・グラミネアラム真菌を同時接種した。
【０１０３】
この試験の結果を図１に示し、図１は、標準的な増殖と比較してピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の追加後に植物病原性真菌フザリウム・グラミネアラムの増殖の有意な停止を示す（図１Ａ）。４日後に写真撮影した一連のペトリ皿を使用してこの状況をさらに例証し、これは、一方では両方の微生物の連携的増殖を示し、他方では植物病原性真菌の増殖を示す（図１Ｂ）。培養の１１日後に、植物病原性真菌の有意な抑制がピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の増殖と共に明らかである。生存可能な卵胞子の数が初期値の９０％より低くない場合、製品を安定とみなした。
【０１０４】
（実施例１９）
小麦を用いる実験室実験において実証された植物病原性真菌に対する抗真菌効果
作物（小麦）種子をＳＡＶＯの溶液（塩素酸ナトリウム溶液）（１〜５％溶液）で処理し、寒天土壌抽出物上で発芽させた。発芽後に新芽を再び１％  Ｓａｖａ溶液で処理し、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のフィトアガーの層上に置いた。１リットルあたり０．２ｍｌの適用濃度及び０．２ｍｌの体積で植物病原体フザリウム・グラミネアラム又はピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物（懸濁液濃縮物中の休眠状態の卵胞子）を含む寒天（５ｍｍ）を以下の種類：１）植物病原体；２）植物病原体＋ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１；３）ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１のみ；接種されない対照試料でフラスコに接種した。フラスコをセルロース及びガーゼの薄層で密封した。培養は２４℃の温度の部屋で行った。植物病原体及びピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物のコロニーの成長を植物の状態と共にモニターした。
【０１０５】
この実験室実験の結果を図２に示す。実際の植物病原体の追加に関する限り、成長する小麦の周囲におけるその有意な増殖はかなりはっきりしており、この病原体によって引き起こされた植物への損傷も同様である（図２Ａ）。植物病原性真菌に加えてピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物も加えた場合、植物病原体の存在は見られず、培養された植物はよく成長した（図２Ｂ）。ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物単独の存在下で実行された対照実験は、いかなる微生物も加えていない実験と同等の小麦植物の通常の成長を示した（図２Ｃ）。
【０１０６】
（実施例２０）
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）菜種に対する温室実験における例示的な実施形態２による作物への噴霧を意図した液体生物学的抗真菌製品の効果の試験
Ｌｏｈａｎａ  ＣＩの種類である生育するセイヨウアブラナ菜種を含有するウヘルツェにある会社の温室の４つのセクターを使用し、ＢＢＣｈ  １５〜２１で適用を開始した。菌寄生微生物ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１（Ｐｏｌｙｖｅｒｓｕｍ（登録商標））を含むルーズな生物系殺真菌剤を第１のセクターに、本発明の例示的な実施形態１による新たな液体殺真菌剤をセクター２に、本発明の例示的な実施形態２による新たな液体抗真菌製品をセクター３に、本発明の例示的な実施形態４による新たな液体抗真菌製品をセクター４に適用した。全ての場合において適用濃度は１リットルあたり０．５ｇ又は１リットルあたり０．５ｍｌであり、処理する領域の１平方メートルあたり１００ｍｌのそのような濃縮製品の分散であった。植物及び列の間の土壌を包含する試料の回収について回収位置を各セクター中に印をした。写真による記録及び回収の時点における温室中の温度の読取りも各回収の間に取った。回収した試料を１時間以内に実験室に移し、解析の時まで−２０℃の冷凍器中で貯蔵した。抗真菌製品の適用の前、そして適用の１時間後、２時間後、７時間後、２０時間後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、１１日後、１４日後、１７日後及び２０日後に試料を回収した。
【０１０７】
試料の実験室処理は、個々の植物の写真による記録、葉及び根の分離、試料の湿重量の決定、ＤＮＡ抽出緩衝液中での試料の均質化、遠心分離及び分子解析の実行を伴った。ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の存在の定量的な決定は、ＩＴＳ配列を標的化したプローブを用いるｑＰＣＲ法を使用して実行し、菜種のＤＮＡの定量的な決定は、Ｆａｔ（Ａ）Ａ配列を標的化したプローブを用いる同一の方法を使用して実行した。定量的な決定は、標準的な条件下での５０サイクルのＤＮＡ増幅の実施及びキャリブレーション曲線を使用する標的配列の濃度の算出を含んだ。真菌の寄生レベルは、標準的なプロトコールに基づく類似の方法で検出した。
【０１０８】
効果試験の結果を下記の表１に示す。本発明による新たな液体抗真菌製品によって達成された効果は、全ての場合に、固体のルーズな製品の効果と同等又はそれより良好である。適用の場所においてピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物のコロニー形成及び増幅に応じて外来の真菌は常に抑制された。その後、実験の終了時にピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の濃度を低減した後でさえ真菌による低レベルの汚染が維持された。ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の集団の動態は１５日の期間にのみこの実験中にモニターした結果、長期間の効果については、何らコメントはない。それにもかかわらず、製品の抗真菌効果の観点から、真菌を抑制する能力は有意且つ長期間のものであることに疑いはなく、適用の２４時間後に約１桁のそのような真菌の発生の低減があり、さらなる２４時間後にほぼ１桁のさらなる低減があった。
【０１０９】
【表１】
2019530455.tif 000004
【０１１０】
温室実験における菜種の葉に関するピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の含有量の測定及び真菌の含有量の測定。結果は、菜種の宿主ＤＮＡの１□ｇあたりの検出された二倍体ゲノムの数として示す。
【０１１１】
（実施例２１）
パン小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）に対するフィールド試験における例示的な実施形態１による作物への噴霧を意図した液体生物学的抗真菌製品の効果の試験
Ｕｈｅｒｃｅ  ｕ  Ｌｏｕｎの村の近くの会社のフィールドにおいて２０１５年の１０月に秋まき小麦Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍを蒔いた。農業規格及び植物保護についてのＰｏｌｙｖｅｒｓｕｍ（登録商標）抗真菌調製物の認可登録にしたがって１ヘクタールあたり１００ｍｌの量で標準的な噴霧方法を使用して２０１５年１１月に指定した小道に本発明の例示的な実施形態１による抗真菌製品を適用した。適用の前及び適用後の異なる日数で４つの指定した回収位置から試料を採取し、成長する小麦植物及び試料に近接する土壌を回収した。試料を回収後に直ちに冷凍し、解析の時まで密封されたバッグ中又は試験チューブ中に−２０℃で貯蔵した。報告された方法（Ｋｌｉｍｅｓ  Ｒ、Ｓｕｃｈａｎｅｋ  Ｍ、Ｍａｓｔａｌｋｏｖａ  Ｌら／２０１６年／Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｓ：ｓｏｉｌ  ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｅ  Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｏｌｉｇａｎｄｒｕｍ  ｉｓ  ａｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｅｎｉｌｃｏｎａｚｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍｏｄｅｌ、Ｖｅｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、印刷物）を使用して回収された試料から核酸を抽出し、分子解析のために使用した。
【０１１２】
例示的な実施形態１による液体製品の噴霧後のピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の発生の動態に関する限り、植物及び周囲の土壌の標準化された濃度は類似の依存性を示した。
【０１１３】
試料１ｇあたり個々の細胞のみが適用の前にｑＰＣＲ遺伝学的試験によって同定できたが、この数は、通常の標準化された量に対応する液体製品の適用後に試料１ｇあたり数百の細胞に増加した。４８時間後に行った実験条件下でピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の倍化が見られ、このポジティブな傾向は、２０１５年１２月に始まった霜の発生による特定の実験の条件下で妨げられ、その後に動的な集団成長は回復しなかった（図３Ａ及び図３Ｂを比較されたい）。
【０１１４】
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の最も高い増殖となる実験の「ピーク」相において実行したＲＴ−ｑＰＣＲ法を使用した遺伝子発現プロファイルの解析を通じて多くの価値ある情報が得られた。転写物の濃度の値は、最初の相において真菌病原体の発生に対して迅速な反応を示し（セルラーゼの遺伝子の有意な発現）、その後に遊走子の発生（エンドグルカナーゼの発現）が増加した。４８時間後及び１２０時間後になって初めて、主に周囲の土壌及び根において、胞子形成に特徴的な遺伝子マーカーが高くなった（図３Ｃ）。同時に、適用の４８時間後に真菌の相対含有量の有意な低減を観察することができ（図３Ｄ）、この低減は、ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の菌寄生作用の間の真菌の表面サッカリドの分解に関与するセルロースの遺伝子の発現に逆相関した（図３Ｅ）。
【０１１５】
（実施例２２）
機械的なプラーク除去を伴う口腔バイオフィルムモデルにおける歯磨き剤の効果試験
調製した歯磨き剤の効果をモニターするために、プラークの機械的な除去を伴う口腔バイオフィルムモデルを使用する実験室試験を２０１０年のＶｅｒｋａｉｋ  ＭＪらの報告［１４］にしたがって実行した。上記報告されたプロトコールのバージョン（Ｂ）を使用し、これは、２時間の付着、終夜のその後の増殖（１６時間のバイオフィルム）及び機械的な洗浄からなるものであった。歯垢の微生物の除去におけるピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物を含有するグリセロール歯磨き剤並びにオリーブ油及びピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物を含む歯磨き剤の効果を一般に利用可能な２種類の歯磨き剤（Ｏｄｏｉ及びＥｎｚｙｃａｌ）、及び対照としていかなるペーストも含まない歯ブラシを用いる機械的な洗浄（対照とする）と比較した。いかなるピシウム・オリガンドラム含有物も含まず且つ擦傷剤として酸化ケイ素を使用しない同一のペーストを対照実験において使用した。
【０１１６】
この試験の結果を図２における結果の表に記載する。これは、例示的な実施形態４によるペーストが、歯周疾患を罹患した個体においてさえ、歯科用バイオフィルム及びプラークの除去において、使用した代替的な製品よりもかなり高い効果を呈したことを示す（図４Ａ〜図４Ｄ）。これまでに一般に使用されているペーストは、約半分までバイオフィルム形成の強度を低減させたが、本発明による新たなペーストは、最大１０分の１まで低減させた。ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物含有物を何ら含まない対照ペーストにおける効果は一般的なペーストと同等であったが、酸化ケイ素を含まない対照ペーストにおいて効果は有意に高かった。歯周疾患を有する患者におけるバイオフィルム形成の全体的なレベルは有意に高く、また個々のペーストの効果の差異を観察するためにはるかに良好であった。
【０１１７】
（実施例２３）
真菌胞子からの生活空間の保護における例示的な実施形態１による液体生物学的抗真菌製品の効果の試験
例示的な実施形態１による抗真菌製品を適用溶液１リットルあたり３３０，０００個の卵胞子の濃度まで水で希釈し、すなわち、０．６６ｍｌの液体濃縮物を１リットルの溶液に加えた。同一条件下で対照溶液も調製したが、ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物含有物なしで、バイオマスを水と置き換えた。このようにして調製した溶液を、アトマイザーを使用して微細な霧の噴霧の形態でＵｈｅｒｃｅ  ｕ  Ｌｏｕｎ  Ｎｏ．２の農場の２つの小さい閉じられた部屋で適用した。適用後に、両方の部屋を不透過性となるように閉じ、Ｏｍｅｌｊａｎｓｋｙの方法を使用して胞子の含有量に対する落下試験を実行した。プラハにあるチェコ科学アカデミー・微生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）のＤｒ．Ｍｉｒｏｓｌａｖ  Ｋｏｌａｆｉｋの実験室において結果を評価した。
【０１１８】
実験の結果を下記の表２に示す。実験はいかなる空気の流れもない閉じた部屋で実行し、この理由のために、観察される変化はゆっくりしたものであり、数ヶ月後にのみ観察された。それにもかかわらず、補助物質の適用を伴う対照部屋１では特定された胞子の数は変動したが、いかなる観察時点でも空気１立方メートルあたり５００胞子というＷＨＯ（世界保健機関による限度）を下回らないことが結果から明らかである。対照的に、部屋２での適用の３ヶ月後に胞子の統計的に有意な減少があり、その後にこれは適用の日の６ヶ月後にＷＨＯによる限度を下回った。
【０１１９】
【表２】
2019530455.tif 000005
【０１２０】
（実施例２４）
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１を含有する液体生物学的抗真菌製品の製造方法
本発明によるピシウム・オリガンドラム  Ｍ１を含有する液体生物学的抗真菌製品の詳細な性質は、先行する例示的な実施形態において詳細に実証された。
【０１２１】
本発明によるピシウム・オリガンドラム  Ｍ１を含有する液体生物学的抗真菌製品の製造方法の例を以下に示す。
【０１２２】
穀物、サトウキビ糖蜜及び他の必須栄養分の抽出物を含有する培地が、ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１卵菌の好気培養のために使用される。液体培地が、蒸気滅菌器中で滅菌される。冷却後に、液体培地にピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の選択された株の１つが接種される。約１３日を要する処理である培養の終了後に、バイオマスが回収され、例示的な実施形態において上に示した方法で加工される。
【０１２３】
穀粒、好ましくは殻を除去した雑穀粒、例えばキビ種子（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ  Ｌ．）を含有する固体基質上で、ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物を培養するための培地が調製される。ここで、前記穀粒は、あるパーセンテージの栄養液体培地と混合される。培地が、蒸気滅菌器中の培養容器において滅菌される。冷却後に、ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の選択された株の１つが培地に接種される。約８日を要する処理である培養の処理の終了後に、例示的な実施形態において上記した通り、回収されたバイオマスが懸濁液濃縮物の形態にさらに加工される。
【０１２４】
液相中及び固相中でのピシウム・オリガンドラムの培養段階の終了後に、懸濁液中の粒子の９５％以上が０．０５〜０．３０ｍｍ、好ましくは０．０５０〜０．１２５ｍｍのサイズを有するように、バイオマスを液体培地を用いて均質化される。その後に、均質な懸濁液が卵胞子の数に応じて特徴付けされる。対象とする液体生物学的抗真菌製品の調製のために適切な卵胞子の所定の濃度まで、卵胞子の数に応じて懸濁液が標準化（濃縮又は希釈）される。
【０１２５】
固体基質上でのピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の培養段階の終了後に、懸濁液中の粒子の９５％以上が、０．０５０〜０．３００ｍｍ、好ましくは０．０５０〜０．１２５ｍｍのサイズを有するように、好ましくは工業用ミキサーを用いて、バイオマスを対応する体積の脱塩水中で均質化する。その後に、均質な懸濁液が卵胞子の数に応じて特徴付けされる。対象とする液体生物学的抗真菌製品の調製のために適切な卵胞子の所定の濃度まで、卵胞子の数に応じて、得られた懸濁液が濃縮又は希釈される。
【０１２６】
均質化及び濃縮、又は希釈の段階の後に、懸濁液が分離されて、例えば濾過されて、妥当な範囲内の粒子の最大許容サイズを確実にする。約０．０５ｍｍ〜０．１２５ｍｍの粒子サイズを達成する場合、ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１の卵胞子の濃縮懸濁液、又はほぼ純粋な濃縮懸濁液を得る確率が高い。上記に示した例示的な実施形態のほとんどは、主に０．０５０〜０．１２５ｍｍの粒子のサイズを有した。
【０１２７】
水性懸濁液は、オスモライトの添加物を用いて均質化の間に安定化されてよく、８℃未満の温度で大きい滅菌された容器中で貯蔵することができる。
【０１２８】
ピシウム・オリガンドラム  Ｍ１微生物の無水懸濁液の場合、懸濁液中の粒子の９５％以上が０．０５０〜０．３００ｍｍ、好ましくは０．０５０〜０．１２５ｍｍのサイズを有するように、固体基質上又は液相中での培養段階の終了後に得られた材料が、好ましくは工業用ミキサーを用いて、均質化される。卵胞子の数に応じて特徴付けられる、得られた均質な懸濁液がその後に遠心分離機にかけられ、且つ上清の除去後に、遠心分離された材料に適宜油を加えて、対象とする液体生物学的抗真菌製品の調製のために、卵胞子の所定の濃度を達成する。その後に、得られた材料が、例えば工業用ミキサーを使用して、再懸濁される。
【０１２９】
製造の特定の可能な方法を上記に示す例示的な実施形態において特定するが、方法はこれらに限定されない。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
卵胞子の安定化された懸濁液を含有する新たな液体抗真菌製品は、かなり大きな体積で作ることができ、これは主に、発酵製造段階及び配合段階の両方が技術的観点から管理しやすいためである。新たな液体製品は、これまでにピシウム・オリガンドラムの微小な卵菌の他の形態が適用及び使用されてきた全ての領域、特に、植物の生物学的保護において、真菌から建物及び住宅を保護するため、真菌及び酵母を抑制するため、及びヒト及び獣医学の応用において微小植物の生理学的バランスを確立するための領域において、応用を見出すことができる。保護因子として及びピシウム・オリガンドラム微生物の徐放性の分解性マトリックス「担体」として作用する、分解性ポリマーを用いる植物のための保護用噴霧剤としてのその使用は非常に革新的である。本発明による製品はまた、製品の油成分がまた、木の効果的な含侵に繋がる時に、木の構造物へのコーティング又は噴霧のためにも有益に使用することができる。微生物の存在は、真菌及び真菌疾患及び木への「傷」に対する抵抗を保証する。１つの完全に新たな使用は、空気処理設備、空調及び冷却ユニットの効果的な保全である。洪水を被った領域において、乾ききった領域において、及び水の耕作領域の周囲において、真菌汚染のレベルを低減する目的のために特別に設計された製品を使用することも有利であると思われる。
【０１３１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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