(57)【要約】  本開示は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む化合物に関する。本開示は、ナノポア検出可能タグとして、特に、ナノポアベースの核酸検出およびシーケンシングのための化合物を調製およびそれらを使用する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、
Ｎはヌクレオシドであり、
Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、
オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、
Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、
Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたタグであり、ここで、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むものである］
で示される化合物。
【請求項２】
構造式（ＩＩ）
【化１】
2019528359.tif 000043
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、
タグは、負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
構造式（ＩＩＩ）
【化２】
2019528359.tif 000044
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
ＬＢ−Ｘ−ＬＡは、リンカーであり、ここで、（ａ）ＬＡおよびＬＢは各々独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学部分を含み、（ｂ）Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾールおよびジヒドロピリダジンからなる群から選択される化学部分を含み、いくつかの実施形態においては、ＬＡおよびＬＢ、ならびに
タグは、負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
構造式（ＩＩＩａ）
【化３】
2019528359.tif 000045
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
ｐは、２〜１０であり、
タグは、負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］
を有する、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
負電荷を有するポリマー部分が、２０〜５０モノマー単位、任意選択で、２５〜４０モノマー単位、または任意選択で、２７〜３５モノマー単位の共有結合によって連結された鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
モノマー単位が、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）、（１ｍ）、（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）およびそれらの任意の組合せの構造
【化４−１】
2019528359.tif 000046
【化４−２】
2019528359.tif 000047
【化４−３】
2019528359.tif 000048
からなる群から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
負電荷を有するポリマー部分が、式（Ａ）ｍ−（Ｂ）ｎ−（Ｃ）ｐ−（Ｄ）ｑ［式中、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）および（１ｍ）のモノマー単位構造から独立に選択されるモノマー単位であり、ｍ、ｎ、ｐおよびｑの各々は、０〜４０であり、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、１０〜４０であり、任意選択で、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２０〜４０であり、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２５〜３５であり、またはｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２７〜３５である］で示されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
負電荷を有するポリマー部分が、式（Ａ）ｎ［式中、Ａは、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）および（１ｍ）のモノマー単位構造から独立に選択されるモノマー単位であり、ｎは、１０〜４０であり、任意選択で、ｎは、２０〜４０であり、ｎは、２５〜３５であり、またはｎは、２７〜３５である］で示されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
負電荷を有するポリマー部分が、−ＴＴ−（ＳｐＣ２）２８−（配列番号１）、−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−（配列番号２）、−（ＳｐＣ３）３１−（配列番号３）、−ＴＴ−（ｄＳｐ）２６−ＴＴ−（配列番号４）、−ＴＴ−（ＳｐＣ４−Ｆ４）２８−（配列番号５）、−ＴＴ−（ＳｐＣ７−Ｐｒａ２）２８−（配列番号６）、−（ＳｐＣ２）８−Ｔ６−（ＳｐＣ２）１６−（配列番号１２）、−（ＳｐＣ２）８−（Ｎ３ＣＥｄＴ）７−（ＳｐＣ２）１５−（配列番号１３）、−（ＳｐＣ２）６−ＴＴ−（ＢＨＥＢ）−Ｔ−（ＳｐＣ２）２０−（配列番号１４、−（ＳｐＣ２）９−Ｔ−（ＢＨＥＢ）２−Ｔ−（ＳｐＣ２）１７−（配列番号１５）、および−（ＳｐＣ２）８−（Ｓ５００）３−（ＳｐＣ２）１７−（配列番号１６）からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
負電荷を有するポリマー部分が、表３において示されるモノマー単位のアミダイト試薬形態を使用するホスホルアミダイト合成によって形成されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
モノマー単位が、ペプチド共有結合連結を含み、モノマー単位が、式（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）の構造およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項１２】
化合物のセットを含む組成物であって、セットの各化合物が、タグがナノポアに入るときに、ナノポアを通る正イオンの異なる流れをもたらす異なるタグを含み、セットの化合物のうち少なくとも１種が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物である、組成物。
【請求項１３】
化合物のセットを含む組成物であって、セットの各化合物が、タグがナノポアに入るときに、ナノポアを通る正イオンの異なる流れをもたらす異なるタグを含み、化合物のうち少なくとも１種が、正イオンの流れの増大をもたらし、それによって、Ｏ．Ｃ．電流よりも大きいナノポアにわたる測定電流をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグを含む、組成物。
【請求項１４】
セットの化合物のうち少なくとも１種が、−ＴＴ−（ＳｐＣ２）２８−（配列番号１）、−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−（配列番号２）、−（ＳｐＣ３）３１−（配列番号３）、−ＴＴ−（ｄＳｐ）２６−ＴＴ−（配列番号４）、−ＴＴ−（ＳｐＣ４−Ｆ４）２８−（配列番号５）、−ＴＴ−（ＳｐＣ７−Ｐｒａ２）２８−（配列番号６）、−（ＳｐＣ２）８−Ｔ６−（ＳｐＣ２）１６−（配列番号１２）、−（ＳｐＣ２）８−（Ｎ３ＣＥｄＴ）７−（ＳｐＣ２）１５−（配列番号１３）、−（ＳｐＣ２）６−ＴＴ−（ＢＨＥＢ）−Ｔ−（ＳｐＣ２）２０−（配列番号１４、−（ＳｐＣ２）９−Ｔ−（ＢＨＥＢ）２−Ｔ−（ＳｐＣ２）１７−（配列番号１５）、および−（ＳｐＣ２）８−（Ｓ５００）３−（ＳｐＣ２）１７−（配列番号１６）からなる群から選択される負電荷を有するポリマー部分を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
化合物のセットが、以下：
【表１】
2019528359.tif 000049
【化５】
2019528359.tif 000050
のリンカーを指す
を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
核酸の配列を決定する方法であって、
（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を貫通するナノポア、両電極と接触する正イオンを含む電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼ、およびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含むナノポアシーケンシング組成物を用意するステップと、
（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖、および（ｉｉ）タグに共有結合によって連結された異なるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分をそれぞれが含む化合物のセットであって、化合物のセットの各メンバーが、タグがナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの異なる流れをもたらす異なるタグを有し、異なるタグのうち少なくとも１種が、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む、化合物のセットと接触させるステップと、
（ｃ）ナノポア中に異なるタグが入ることに起因する正イオンの異なる流れを継時的に検出し、核酸配列に対して相補的であるポリメラーゼによって組み込まれる異なる化合物の各々と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップであって、セットの化合物の少なくとも１種が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物であるステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本出願は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む化合物に関する。本開示は、ナノポア検出可能タグとして、特に、ナノポアベースの核酸検出およびシーケンシングのためにそれらを使用するために化合物を調製する方法を提供する。
【０００２】
配列表への参照
[0002]配列表の公式コピーが、「０４３３８−５４２ＷＯ１＿Ｓｌ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイル名、２０１７年８月１１日の作製日および１０，７７１バイトの大きさを有するＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして本明細書と同時に提出される。本明細書とともに提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
[0003]核酸（例えば、ＤＮＡ）またはその他の分子を検出するためにナノポアを使用するための多数の方法が、当技術分野で公知である。１つの一般的な方法は、ナノポアにわたって電場をかけて、核酸がナノポアに入り、部分的に遮断することを誘導するステップならびに分子が細孔を通って迅速に入り、移動するときの、電流レベルおよび電流遮断の期間を測定するステップを含む。電流レベルおよび遮断の期間の両方が、分子（通常、ＤＮＡなどのポリマー分子）についての情報を示し得る。この種のナノポア検出法はまた、ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を使用して実施されており、ポリマーの長さは、電流レベルおよび滞留時間の両方に影響を及ぼすとわかった。例えば、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｗ．  Ｆ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｃｌａｕｄｉｏ  Ｇ．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｍ．  Ｓｔａｎｆｏｒｄ、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ａ．  Ｒｕｂｉｎｓｏｎ、Ｏｌｅｇ  Ｖ．  ＫｒａｓｉｌｎｉｋｏｖおよびＪｏｈｎ  Ｊ．  Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第１０４巻；８２０７頁（２００７年）を参照のこと。
【０００４】
[0004]ナノポアを使用して分子を観察する別の方法は、分子に嵩高い部分を結合し、その結果、それが細孔を通過できない、または迅速に通過できないようにすることである。一例として、比較的嵩高いタンパク質、ビオチンと堅固に結合するストレプトアビジンの使用があり、ビオチンは、ＤＮＡに容易に共有結合によって結合させ得る。電場の引力と嵩高いタンパク質の間に保持されるＤＮＡを用いた場合、細孔電流の正確な測定を行うために十分に長く、ナノポア中の固定された位置に留まり得る（数ミリ秒〜数秒）。次いで、分子は放出されることができ（例えば、電場を切るまたは逆転させることによって）、細孔が別の測定のために再度使用される。ストレプトアビジンに加えて、その他のタンパク質および分子が、移動遮断剤として使用され得る。例えば、特定のリガンドと結合する抗体またはＤＮＡポリメラーゼのような酵素が使用され得る。二本鎖ＤＮＡでさえ、Α−溶血素細孔を通過するには大きすぎる場合があり、それもまた、電場の引力下でナノポア中の固定された位置にＤＮＡ（またはその他のポリマー）を保持するために使用され得る。
【０００５】
[0005]核酸シーケンシングは、核酸のヌクレオチド配列を決定するためのプロセスである。このような配列情報は、対象を診断および／または治療するのに役立ち得る。例えば、対象の核酸の配列は、遺伝病を同定し、診断し、潜在的に遺伝病の治療を開発するために使用できる。別の例として、病原体の研究は、伝染病の治療につながり得る。何百万ものヌクレオチドからなる鎖中のわずか１ヌクレオチドの相違を特徴とする疾患もあるので、高度に正確なシーケンシングが必須である。
【０００６】
[0006]ナノポアを使用する単一分子合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＢＳ）技術が開発されている。例えば、米国特許公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号、同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号を参照のこと。ナノポアＳＢＳは、ＤＮＡポリメラーゼ（またはその他の鎖延長酵素）を使用して標的配列鋳型と相補的なＤＮＡ鎖を合成し、伸長している鎖に各ヌクレオチドモノマーが添加されるのと同時に、各ヌクレオチドモノマーのアイデンティティを決定し、それによって標的配列を決定することを含む。添加されるヌクレオチドモノマーはそれぞれ、鎖が合成される時間にわたって、ポリメラーゼ活性部位に隣接して位置するナノポアを通るイオン流によるシグナルをモニタリングすることによって検出される。正確なシグナルを得ることは、ポリメラーゼ活性部位をナノポアの付近に適切に位置させることと、ナノポアに入ることができ、細孔を流れるイオン流の同定可能な変化を提供することができる、付加された各ヌクレオチド上のタグの使用とを必要とする。ヌクレオチドモノマー結合速度、処理能力、トランジション速度および全リード長を含むＤＮＡポリメラーゼ鎖延長反応のパラメータを制御することも必要である。正確なナノポアシーケンシングを提供するために、タグがナノポア中入り、十分な時間ナノポア中に留まること（すなわち「滞留時間」）と、ナノポア中に留まる間に、ナノポアを通るイオン流と関連する、十分に検出可能で同定可能なシグナルを提供することが重要であり、その結果、タグが会合した特定のヌクレオチドを、他のタグ付きヌクレオチドから明白に区別することができる。
【０００７】
[0007]Ｋｕｍａｒら、（２０１２）「ＰＥＧ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＳｙｎｔｈｅｓＩＳ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２：６８４；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００６８４には、ナノポアを使用して、末端５’−ホスホルアミダートを介してｄＧヌクレオチドに付けられた４種の異なる長さのＰＥＧ−クマリンタグを区別することが記載されており、ＤＮＡポリメラーゼによるこれら４種のＰＥＧ−クマリンタグ付きｄＧヌクレオチドの効率的かつ正確な組込みを個々に実証する。２０１３年９月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、２０１３年１０月１０日に公開された同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号および２０１４年５月１４日に公開された同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号も参照のこと。
【０００８】
[0008]ＷＯ２０１３／１５４９９９およびＷＯ２０１３／１９１７９３には、ナノポアＳＢＳのためのタグ付きヌクレオチドの使用が記載されており、分岐ＰＥＧ鎖を含む単一タグに付けられた単一ヌクレオチドの可能性ある使用を開示する。
【０００９】
[0009]ＷＯ２０１５／１４８４０２には、単一タグに付けられた単一ヌクレオチドを含むナノポアＳＢＳのためのタグ付きヌクレオチドであって、タグが、３０モノマー単位またはそれ以上の長さを有する、任意のまたはある範囲のオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド類似体）を含むタグ付きヌクレオチドの使用が記載されている。
【００１０】
[0010]上記の先行開示は、単一タグまたは分岐タグに付けられた単一ヌクレオチド部分を有するタグ付きヌクレオチド構造を教示する。これらの開示の一般的なアプローチは、タグの大きさおよび構造的可変性を増大し、それによって、ＳＢＳのより良好なナノポア検出を容易にすることである。しかし、これらの先に開示されたタグ付きヌクレオチドの大きさの増大は、達成され得る基質濃度を低下させることによってＳＢＳの有用性に対してさらなる障害を作り出す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
[0011]上記の先行開示は、特に、溶液量が最小であり、分子濃度が重要であるナノポア設定で、効率的なＳＢＳにとって望ましい速度でポリメラーゼ伸長反応を駆動するのに十分に高い基質濃度を提供できる特定のタグ付きヌクレオチド構造を教示できていない。したがって、タグ付きヌクレオチド組成物ならびにナノポアＳＢＳおよびその他のシーケンシング技術において効率および処理量を改善するために使用され得る方法が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0012]本開示は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む化合物を提供する。ナノポアを通る正イオンの流れを増大するその能力のために、化合物は、ナノポア検出可能タグとして使用され得る。さらに、正イオンの流れを増大する化合物の能力は、タグが存在しないナノポアの「開口チャネル」（「Ｏ．Ｃ．」）電流シグナルを上回るナノポア検出可能なシグナルまたはＯ．Ｃ．電流シグナルを下回る、公知のナノポア検出可能タグに特有である「遮断性（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）」もしくは「遮断（ｂｌｏｃｋａｄｅ）」シグナルを提供する。Ｏ．Ｃ．電流を上回るナノポア検出可能なシグナルを提供する、本開示のイオン増幅性化合物のこの能力は、検出のための感度およびダイナミックレンジの改善、それによるナノポア検出およびシーケンシング適用における正確性の増大を可能にする。
【００１３】
[0013]したがって、本開示はまた、ポリメラーゼの基質となることができるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分およびタグを含むタグ付きヌクレオチド化合物であって、タグがナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグ付きヌクレオチド化合物を提供する。本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、ポリメラーゼ基質としてタグ付きヌクレオチドを利用し、ポリメラーゼ伸長反応のタグ付き副生成物のナノポア検出によって未知配列を同定する任意の核酸合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）システムにおいて使用するのに十分に適している。さらに、本開示はまた、このようなイオン流増幅性化合物、タグ付きヌクレオチド化合物を調製し、使用するプロセスならびに核酸のナノポア検出およびナノポアシーケンシングにおいてこれらの化合物を使用する方法を提供する。
【００１４】
[0014]一部の実施形態においては、本開示は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む化合物を提供する。一部の実施形態においては、化合物は、ポリマー部分に共有結合によって連結されたポリメラーゼの基質となることができるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分をさらに含む。
【００１５】
[0015]一部の実施形態においては、本開示は、構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎはヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたタグであり、ここで、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む］
で示される化合物を提供する。
【００１６】
[0016]一部の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、構造式（ＩＩ）
【化１】
2019528359.tif 000002
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分である］
を有する。式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の一部の実施形態においては、リンカーは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される化学基を含む。
【００１７】
[0017]一部の実施形態においては、式（ＩＩ）の化合物は、構造式（ＩＩＩ）
【化２】
2019528359.tif 000003
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、ＬＢ−Ｘ−ＬＡは、リンカーであり、ここで、（ａ）ＬＡおよびＬＢは各々独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学部分を含み、（ｂ）Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾールおよびジヒドロピリダジンからなる群から選択される化学部分を含み、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分である］
を有する。
【００１８】
[0018]一部の実施形態においては、構造式（ＩＩＩ）の化合物は、構造式（ＩＩＩａ）
【化３】
2019528359.tif 000004
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、ｐは、２〜１０であり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分である］
を有する。一部の実施形態においては、構造式（ＩＩＩａ）の化合物は、Ｒ＝Ｈ、ｎ＝４およびｐ＝５である化合物である。
【００１９】
[0019]一般に、本開示のイオン流増幅性化合物は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分の特徴を共有する。本開示は、本明細書において開示される化合物の負電荷を有するポリマー部分を特徴とするさまざまな構造的および機能的パラメータを提供する。
【００２０】
[0020]一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、１５０〜９００個の原子の共有結合によって連結された鎖を含み、負電荷を有する基は、３〜２０個の原子毎の間隔で、任意選択で、３〜１０個の原子毎の間隔で鎖の原子に付けられている。一部の実施形態においては、１５０〜９００個の原子の共有結合によって連結された鎖は、ホスホジエステル、ペプチド、エステル、エーテル、アルキル、アルケニル、アルキニル、全フッ素置換アルキルおよびそれらの任意の組合せから選択される化学基を含む。一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、約８０オングストロームと約２５０オングストロームの間の分子長および約１５オングストローム未満の分子径、任意選択で、約１２オングストローム未満の分子径、または任意選択で、約１０オングストローム未満の分子径を有する。一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、１０オングストロームの分子長あたり少なくとも１の負電荷、任意選択で、７．５オングストロームの分子長あたり少なくとも１の負電荷または３．５オングストロームの分子長あたり少なくとも１の負電荷を有する。一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、（−２５）〜（−５０）の全負電荷、任意選択で、（−３０）〜（−４０）の全負電荷、または任意選択で、（−３１）〜（−３７）の全負電荷を有する。
【００２１】
[0021]一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、２０〜５０モノマー単位、任意選択で、２５〜４０モノマー単位、または任意選択で、２７〜３５モノマー単位の共有結合によって連結された鎖を含む。一部の実施形態においては、モノマー単位は、３〜２０個の原子の共有結合によって連結された鎖、任意選択で、３〜１０個の原子の鎖に付けられた負電荷を有する基を含む。一部の実施形態においては、モノマー単位は、ホスホジエステル、ペプチド、エステル、エーテル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ペルフルオロアルキルおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される共有結合連結を含む。一部の実施形態においては、モノマー単位は、ホスフェート、スルフェート、カルボキシレートおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される負電荷を有する基を含む。一部の実施形態においては、モノマー単位は、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）、（１ｍ）、（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）およびそれらの任意の組合せの構造からなる群から選択される。
【化４−１】
2019528359.tif 000005
【化４−２】
2019528359.tif 000006
【化４−３】
2019528359.tif 000007
【００２２】
[0022]一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、式（Ａ）ｎのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、Ａは、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）および（１ｍ）のモノマー単位構造から独立に選択されるモノマー単位であり、ｎは、１０〜４０であり、任意選択で、ｎは、２０〜４０であり、ｎは、２５〜３５であり、またはｎは、２７〜３５である。一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、式（Ａ）ｍ−（Ｂ）ｎ−（Ｃ）ｐ−（Ｄ）ｑ［式中、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）および（１ｍ）のモノマー単位構造から独立に選択されるモノマー単位であり、ｍ、ｎ、ｐおよびｑの各々は、０〜４０であり、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、１０〜４０であり、任意選択で、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２０〜４０であり、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２５〜３５であり、またはｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２７〜３５である］で示されるオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、−ＴＴ−（ＳｐＣ２）２８−（配列番号１）、−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−（配列番号２）、−（ＳｐＣ３）３１−（配列番号３）、−ＴＴ−（ｄＳｐ）２６−ＴＴ−（配列番号４）、−ＴＴ−（ＳｐＣ４−Ｆ４）２８−（配列番号５）、−ＴＴ−（ＳｐＣ７−Ｐｒａ２）２８−（配列番号６）、−（ＳｐＣ２）８−Ｔ６−（ＳｐＣ２）１６−（配列番号１２）、−（ＳｐＣ２）８−（Ｎ３ＣＥｄＴ）７−（ＳｐＣ２）１５−（配列番号１３）、−（ＳｐＣ２）６−ＴＴ−（ＢＨＥＢ）−Ｔ−（ＳｐＣ２）２０−（配列番号１４、−（ＳｐＣ２）９−Ｔ−（ＢＨＥＢ）２−Ｔ−（ＳｐＣ２）１７−（配列番号１５）、および−（ＳｐＣ２）８−（Ｓ５００）３−（ＳｐＣ２）１７−（配列番号１６）からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
【００２３】
[0023]一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分によって誘導されるイオン流の増大は、Ｏ．Ｃ．電流よりも大きい、任意選択で、Ｏ．Ｃ．電流よりも少なくとも５％大きい、Ｏ．Ｃ．電流よりも少なくとも１０％大きい、Ｏ．Ｃ．電流よりも少なくとも２５％大きいまたはＯ．Ｃ．電流よりも少なくとも５０％大きい、ナノポアにわたる測定電流をもたらす。
【００２４】
[0024]一部の実施形態においては、本開示はまた、少なくとも１種のイオン流増幅性化合物を含む組成物を提供する。一部の実施形態においては、組成物は、化合物のセットを含み、セットの各化合物は、タグがナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの異なる流れをもたらす異なるタグを含み、セットの少なくとも１種の化合物は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらし、それによって、Ｏ．Ｃ．電流よりも大きい、ナノポアにわたる測定電流をもたらす負電荷を有するポリマー部分（本明細書において提供されるような）を含む化合物である。組成物の一実施形態では、化合物のセットは、タグ付きヌクレオチド化合物ｄＡ６Ｐ−（リンカー）−Ｔ３０−Ｃ３、ｄＣ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ｄＳｐ）２６−ＴＴ−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ２）２８−ビオチン、ｄＴ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチンを含み、ここで、「（リンカー）」は、式（ＸＶｄ）
【化５】
2019528359.tif 000008
のリンカーを指す。
【００２５】
[0025]本開示はまた、イオン流増幅性化合物を使用する方法を提供する。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、核酸の配列を決定する方法であって、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を貫通するナノポア、両電極と接触する正イオンを含む電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼ、およびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含むナノポアシーケンシング組成物を用意するステップと、（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖、および（ｉｉ）タグに共有結合によって連結された異なるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分をそれぞれが含む化合物のセットであって、化合物のセットの各メンバーが、タグがナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの異なる流れをもたらす異なるタグを有し、異なるタグのうち少なくとも１種が、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む、化合物のセットと接触させるステップと、（ｃ）ナノポア中に異なるタグが入ることに起因する正イオンの異なる流れを継時的に検出し、核酸配列に対して相補的であるポリメラーゼによって組み込まれる異なる化合物の各々と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップとを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】[0026]実施例２において記載されたようなα−溶血素ナノポアにコンジュゲートされたＰｏｌ６ポリメラーゼを含むナノポアアレイデバイスを使用する合成実験によって、シーケンシングにおいて継時的に検出された一連のイオン流増幅性タグシグナル（開口チャネル電流を超える）のプロットを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
[0027]本明細書における説明および添付の特許請求の範囲について、単数形「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、文脈が明確に別に示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「１種のタンパク質」への言及は、２種以上のタンパク質を含み、「１種の化合物」への言及は、２種以上の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換可能であり、制限であるように意図されない。種々の実施形態の説明が、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合には、当業者ならば、一部の特別な場合においては、実施形態を、代替として、言語「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を使用して説明することができるということは、さらに理解されるべきである。
【００２８】
[0028]さまざまな値が提供される場合には、文脈に明確に別段の定めがない限り、その範囲の上限および下限の間の、値の介在する整数それぞれおよび明確に別段の定めがない限り、値の介在する整数それぞれの１０分の１ならびに任意のその他の示された値またはその示された範囲中の介在する値が、本発明内に包含されるということは理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立に、より小さい範囲中に含まれてもよく、また、本発明内に包含され、示された範囲中の任意の具体的に排除される限界の対象となる。示された範囲が、限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界の（ｉ）いずれか、または（ｉｉ）両方を排除する範囲も、本発明中に含まれる。例えば、「１〜５０」は、「２〜２５」、「５〜２０」、「２５〜５０」、「１〜１０」などを含む。
【００２９】
[0029]図面を含む前記の一般的な説明および以下の詳細な説明は、単に例示的なものおよび説明的なものであって、本開示を制限するものではないということは理解されるべきである。
【００３０】
定義
[0030]「核酸」とは、本明細書において、核酸塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）のうち１種またはそのバリアントを含む１種または複数の核酸サブユニットの分子を指す。核酸は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ）のポリマーを指すこともあり、一本鎖および二本鎖形態両方のＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのハイブリッドを含む。
【００３１】
[0031]「ヌクレオチド」とは、本明細書において、核酸ポリメラーゼの基質または阻害剤として作用可能であるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸化合物またはヌクレオシド−５’−オリゴリン酸の構造的類似体を指す。例示的ヌクレオチドとして、ヌクレオシド−５’−三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰ）、４つ以上のリン酸の長さの５’−オリゴリン酸鎖を有するヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＵ）（例えば、５’−テトラホスフェート（ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−ペンタホスフェート（ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−ヘキサホスフェート（ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−ヘプタホスフェート（ｈｅｐｔａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−オクタホスフェート（ｏｃｔａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ））ならびに修飾塩基部分（例えば、置換プリンまたはピリミジン塩基）、修飾糖部分（例えば、Ｏ−アルキル化糖）および／または修飾オリゴリン酸部分（例えば、チオリン酸、メチレンおよび／またはリン酸間の他の架橋を含むオリゴリン酸）を有し得るヌクレオシド−５’−三リン酸の構造的類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
[0032]「ヌクレオシド」とは、本明細書において、糖部分（例えば、リボースまたはデオキシリボース）に付けられた天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基を含む分子部分を指す。
【００３３】
[0033]「オリゴリン酸」とは、本明細書において、リン酸基のオリゴマーを含む分子部分を指す。例えば、オリゴリン酸は、２〜２０のリン酸のオリゴマー、３〜１２のリン酸のオリゴマー、３〜９のリン酸のオリゴマーを含み得る。
【００３４】
[0034]「ポリメラーゼ」とは、本明細書において、ヌクレオチドモノマーの核酸ポリマーを形成する重合などの重合反応を触媒可能である、任意の天然の、または天然に存在しない酵素または他の触媒を指す。本開示の組成物および方法において使用できる例示的ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼが挙げられる。
【００３５】
[0035]「部分」とは、本明細書において、分子の一部を指す。
【００３６】
[0036]「リンカー」とは、本明細書において、２以上の分子、分子基および／または分子部分の間の幾分かの空間を有する結合取付けを提供する任意の分子部分を指す。
【００３７】
[0037]「タグ」とは、本明細書において、タグと連結された分子または分子複合体を直接または間接的に検出および／または同定する能力を可能にする、または増強する部分または分子の一部を指す。例えば、タグは、立体容積または容量、帯電、電気化学電位、光学的および／または分光学的特徴などの検出可能な特性または特徴を提供することができる。
【００３８】
[0038]「ナノポア」とは、本明細書において、約１オングストローム〜約１０，００００オングストロームの特徴的な幅または直径を有する膜または他のバリア材料中に形成される、または別に提供される細孔、チャネルまたは通路を指す。ナノポアは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素などの天然に存在する細孔形成性タンパク質またはα−ＨＬ−Ｃ４６などの天然に存在しない（すなわち、操作された）または天然に存在するいずれかの、野生型細孔形成性タンパク質の変異体またはバリアントから作製することができる。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、天然に存在しないポリマー材料から作製された合成膜であってもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などのセンサー、検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。
【００３９】
[0039]「ナノポア検出可能なタグ」とは、本明細書において、ナノポア中に入ることができる、ナノポア中に配置するようになることができる、ナノポアによって捕捉され得る、ナノポアを通って移動することができる、および／またはナノポアを横切ることができ、それによってナノポアを通る電流の検出可能な変化をもたらすタグを指す。例示的なナノポア検出可能なタグとして、検出可能なナノポア電流の変化をもたらし得る、いずれも任意選択で、色素部分またはフルオロフォアなどの化学基を用いて修飾されてもよく、それらと連結されてもよい、ポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、ペプチド核酸ポリマー、ロックド核酸ポリマーなどの天然または合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
[0040]「イオン流」とは、本明細書において、アノードとカソードの間の電位などの起電力による、通常、溶液中でのイオンの移動を指す。イオン流は、通常、電流または静電電位の減衰として測定され得る。
【００４１】
[0041]「イオン流増幅性」または「イオン流増強性」とは、本明細書において、ナノポア検出に関連して、その「開口チャネル」（Ｏ．Ｃ．）状態におけるナノポアを通るイオン流よりも大きい、ナノポアを通るイオン流の増大をもたらすという特徴を指す。
【００４２】
[0042]「開口チャネル電流」、「Ｏ．Ｃ．電流」または「バックグラウンド電流」とは、本明細書において、電位が印加され、ナノポアが開口である（例えば、ナノポア中にタグが存在しない）ときにナノポアにわたる測定される電流レベルを指す。
【００４３】
[0043]「タグ電流」とは、本明細書において、電位が印加され、ナノポア中にタグが存在するときにナノポアにわたる測定される電流レベルを指す。通常、ナノポア中のタグの存在は、ナノポアを通るイオン流の遮断およびタグ電流レベルの測定における結果の減少をもたらす。しかし、本開示のイオン流増幅性タグは、ナノポア中に存在するときに、Ｏ．Ｃ．電流より大きい、ナノポアにわたる測定されるタグ電流レベルにおいて示されるイオン流の増大をもたらす。
【００４４】
[0044]「滞留時間」とは、本明細書において、ナノポアにおけるタグの捕捉に関連して、タグ電流によって検出されるような、タグが、ナノポア中で過ごす時間を指す。
【００４５】
[0045]「分子長」とは、本明細書において、分子（または部分）が、その平均溶液コンホメーションにあるときの、その最長軸方向での分子（または部分）の平均長さを指す。
【００４６】
[0046]「分子径」とは、本明細書において、分子（または部分）が、その平均溶液コンホメーションにあるときの、その最短軸方向での分子（または部分）の平均長さを指す。
【００４７】
[0047]「全体的な電荷」とは、本明細書において、分子（または部分）を構成する正電荷を有するおよび負電荷を有する化学基の合計を指す。例えば、３０個のホスホジエステル基（その各々は、ｐＨ７で（−１）の電荷を有する）を有する３０モノマー単位のポリマーを含むタグ部分は、（−３０）の全体的な電荷を有する負電荷を有するポリマーである。
【００４８】
[0048]「負電荷を有する」とは、本明細書において、タグ部分に関連して、負である全体的な電荷を有するタグ部分を指す。
【００４９】
[0049]種々の実施形態の詳細な説明
[0050]概要：イオン流増幅性タグおよびナノポアシーケンシング
[0051]本開示は、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物の組成物ならびに核酸のナノポア検出およびシーケンシングにとって有用である関連する方法、デバイスおよびシステムを記載する。イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、鋳型核酸鎖と相補的である成長する鎖中への核酸ポリメラーゼによる個々のヌクレオチド組込みを正確に検出するための方法において使用され得る。
【００５０】
[0052]一般に、ナノポアベースのヌクレオチド酸シーケンシングは、成長する鎖中に酵素によって組み込まれ得る４種のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＡ６Ｐ、ｄＣ６Ｐ、ｄＧ６ＰおよびｄＴ６Ｐ）の混合物を使用する。各ヌクレオチド類似体は、ナノポアを用いて検出されるときに同定可能な、識別可能な特徴を提供する、共有結合によって付けられたタグ部分を有する。鎖延長酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、その活性部位で成長する核酸鎖とハイブリダイズされる、鋳型核酸鎖に対して相補的である（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）タグ付きヌクレオチド化合物と特異的に結合する。鎖延長酵素は、次いで、タグ付きヌクレオチオド化合物の相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ヌクレオチド部分を、成長する核酸鎖の末端に触媒によって連結する（すなわち、組み込む）。触媒的組込み事象の完了は、タグ部分およびオリゴリン酸部分（成長する鎖中に組み込まれた１つのリン酸を引いた）の放出をもたらし、これは、次いで隣接するナノポアを通過する。タグ付きヌクレオチド化合物のタグ部分は、組み込まれたヌクレオチドからそれを放出する触媒的プロセスを受ける前であっても、電位の下でナノポアの細孔に入り、それによって、ナノポアを通るバックグラウンド正イオン流を変化させる。一般に、ナノポア中のタグ部分の存在は、ナノポアを通る正イオンの流れの減少（または遮断）をもたらす。この「遮断電流」は、タグ部分が存在しないナノポアを通る正イオン流に起因する「開口チャネル」（または「Ｏ．Ｃ．」）電流の（またはそれを下回る）パーセンテージであるシグナルとして検出される。今日まで、タグ部分の種々の分子特性が修飾されており（例えば、質量、容量、３−Ｄ構造、帯電）、細孔とのその相互作用に影響を及ぼし、それによって、各々が異なるヌクレオチドに対応し得る異なるタグ部分を区別するためのナノポア検出を可能にするとわかった。核酸シーケンシングのためのタグ付きヌクレオチドを含むタグ付き分子を検出するためにそれらを使用するための、さまざまなナノポアシステムおよび方法が、当技術分野で公知である。例えば、それぞれ、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００９年５月１８日に出願された米国特許出願第１２／３０８，０９１号、Ｊｕら；２０１３年６月１４日に出願された米国特許出願第１３／９９４，４３１号、Ｊｕら；２０１３年９月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号；２０１３年１０月１０日に公開された米国特許公開第２０１３／０２６４２０７  Ａ１号および２０１４年５月１４日に公開された米国特許公開第２０１４／０１３４６１６  Ａ１号；２０１３年４月８日に出願されたＰＣＴ国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６３５号、Ｊｕら；および２０１３年４月８日に出願されたＰＣＴ国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６４０号、ＪｕらおよびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１５／１４８４０２、２０１５年９月３０日に出願された米国仮特許出願番号第６２／２３５，５５１号、および２０１５年９月１０日に出願された同第６２／２１６，６３４号を参照のこと。
【００５１】
[0053]しかし、ナノポア検出のために使用されるすべてのこれまでに知られているタグ部は、ナノポアを通る正イオン流の減少に起因する「遮断」電流シグナルをもたらす。本開示によって提供される驚くべき結果は、負電荷を有するポリマーを含む特定のタグ部分構造は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらすことである。これらのイオン流増幅性タグ部分構造は、当技術分野で公知の検出のための開口チャネル電流を上回り、「遮断」シグナルレンジを下回る全く新しい範囲のナノポア検出可能なシグナルを提供する。
【００５２】
[0054]タグ付きヌクレオチド化合物構造
[0055]本開示は、タグとして有用であるイオン流増幅性化合物およびさまざまな構造および部分構造を特徴とし得るイオン流増幅性タグ付き化合物実施形態（例えば、タグ付きヌクレオチド）を提供する。一般に、本開示のイオン流増幅性タグ付き化合物は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む。
【００５３】
[0056]一般に、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結されたイオン流増幅性タグ部分を含み、ここで、タグ部分は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む。一部の実施形態においては、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドは、イオン流増幅性化合物（例えば、イオン流増幅性タグ）を含み、ポリマー部分に共有結合によって連結されたポリメラーゼの基質となることができるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分をさらに含む。
【００５４】
[0057]本明細書において別の場所に記載されるように、本開示のイオン流増幅性タグ部分は、Ｏ．Ｃ．シグナルよりも大きい測定される電流シグナルをもたらすその能力のために、タグ付き化合物（例えば、タグ付きヌクレオチド）のナノポア検出のためのダイナミックレンジおよび感度の増大を含む技術的利点をもたらす。一部の実施形態においては、イオン流の増大は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％またはナノポアにわたるＯ．Ｃ．シグナルより大きいナノポアにわたる測定される電流の増大をもたらす。
【００５５】
[0058]本開示は、本開示のイオン流増幅性タグ部分が、ナノポアベースの合成時解読（ＳＢＳ）法のタグ付きヌクレオチド化合物において使用され得る多数の実施形態を記載するが、イオン流増幅性タグ部分は、その他の種類の化合物にコンジュゲートされ、タグ付き化合物のナノポア検出を含む任意の方法においてタグとして使用され得ることも考慮される。タグ付き化合物のナノポア検出を使用するアッセイのいずれも、イオン流増幅性タグ部分を使用するように容易に適応され得ることも考慮される。したがって、当業者ならば、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を調製するために、本明細書において開示されるイオン増幅性タグ部分構造を使用してその他のタグ付き化合物を調製するために、本明細書において開示される合成法を使用できる。
【００５６】
[0059]一部の実施形態においては、本開示は、構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎはヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、Ｔは、リンカーに共有結合によって付けられたタグであり、ここで、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む］
で示されるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を提供する。
【００５７】
[0060]ヌクレオシド（Ｎ）は、ヌクレオシドが、三リン酸などのオリゴリン酸（Ｐ）に共有結合によって結合されている場合にポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能な任意のヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基およびリボースまたはデオキシリボース基などの天然に存在するまたは天然に存在しない糖部分を含み得る。一部の実施形態においては、核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンからなる群から選択される。糖部分は、鎖延長酵素によって触媒的に組み込まれる場合に、成長するポリヌクレオチド鎖とリン酸ジエステル結合を形成できる位置に遊離ヒドロキシル基（例えば、３’−ＯＨ基）を提供しなくてはならない。ヌクレオシド糖部分もまた、オリゴリン酸部分の共有結合取付けを可能にする基（例えば、５’−Ｏ基）を提供しなくてはならない。
【００５８】
[0061]一部の実施形態においては、本開示は、構造式（ＩＩ）
【化６】
2019528359.tif 000009
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］
で示されるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を提供する。
【００５９】
[0062]一部の実施形態においては、核酸塩基（「塩基」）は、ポリメラーゼ等の鎖延長酵素によって組み込まれることが可能である任意の天然に存在する、または天然に存在しない（例えば、化学修飾された）塩基であり得る。一部の実施形態においては、核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンからなる群から選択される。
【００６０】
[0063]イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物のオリゴリン酸（Ｐ）部分は、ヌクレオシドの５’−Ｏに付けられている場合に、得られたヌクレオチドが、依然としてポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能であることを可能にする任意のオリゴリン酸であり得る。一般に、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素は、３〜１２個のリン酸基の鎖を有するオリゴリン酸を含むヌクレオチドを組み込むことが可能である。したがって、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物）においては、オリゴリン酸（Ｐ）基は、３〜１２個のリン酸基を含み得る。
【００６１】
[0064]構造式（ＩＩ）の化合物に表されるように、３〜１２個のリン酸基のオリゴリン酸は、ｎ＝１〜ｎ＝１０の値によって表される。したがって、本開示の一部の実施形態においては、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、３〜９個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝１〜７）を含むオリゴリン酸（Ｐ）基を含む。一部の実施形態においては、オリゴリン酸基は、４〜６個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝２〜４）を含む。一部の実施形態においては、オリゴリン酸基は、６個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝４）を含む。
【００６２】
[0065]他の実施形態においては、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、４〜２０個のリン酸、４〜１２個のリン酸、４〜９個のリン酸、４〜６個のリン酸のオリゴリン酸鎖を含むことができ、鎖は、ヌクレオシドの５’位に付けられる（例えば、５’−四リン酸、５’−五リン酸、５’−六リン酸、５’−七リン酸、５’−八リン酸、５’−九リン酸、５’−十リン酸など）。
【００６３】
[0066]本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、修飾リン酸基、リン酸類似体または他の非リン酸化学基を含むオリゴリン酸部分を含み得ることがさらに考慮され、但し、このようなリン酸基を含むことが、オリゴリン酸がヌクレオシドの５’−Ｏに付けられている場合に、得られたイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドが鎖延長酵素によって組み込まれることを妨げないことを条件とする。典型的には、鎖延長酵素による組込みは、α−位の天然に存在するリン酸基およびオリゴリン酸のα−位とβ−位の間のリン酸ジエステル結合を必要とする。したがって、一部の実施形態においては、オリゴリン酸は、三リン酸基を含み得る。さらに、オリゴリン酸は、リン酸またはメチレンなどの１つもしくは複数の非リン酸基を有するリン酸類似体基および／または２つ以上のリン酸基の間の架橋基のオリゴマーを含み得るということが考慮される。
【００６４】
[0067]リンカー
[0068]広範なリンカーが、本開示のイオン流増幅性タグ部分を、ナノポア検出のためにタグが付けられることが望まれる化合物（例えば、タグ付きヌクレオチド化合物）に共有結合によって連結するために使用され得るということも考慮される。一般に、リンカーは、化合物と、特定のナノポア検出法のために望まれるタグ部分の間の共有結合性連結および空間または構造を提供可能である任意の分子部分を含み得る。このようなリンカーパラメータは、当技術分野で公知の方法を使用して当業者によって日常的に決定され得る。
【００６５】
[0069]一部の実施形態においては、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物の特定の使用のために、所望の空間または構造を選択し、最適化することができる。例えば、複数のタグ付きヌクレオチドのいずれか１つが隣接するポリメラーゼと三元複合体を形成するときに、イオン流増幅性タグ部分がナノポアに入り、ナノポア中にあることを可能にする空間を提供するリンカーを選択することができる。一般に、イオン流増幅性タグ部分の負電荷を有するポリマー構造は、ナノポアに入ることが可能であり、ほぼナノポアの長さにわたる長さを有する、細い、引き伸ばされた棒状コンホメーションをとらなければならない。ポリメラーゼがナノポアに連結される方法に応じて、タグ付きヌクレオチドがポリメラーゼ活性部位で適切な三元複合体を形成する場合に、イオン流増幅性タグ部分が、このナノポア中にわたる位置を達成する（および最適イオン流増強関連シグナルを提供する）ことを可能にするために、わずかに短いまたは長い長さのリンカーを選択してもよい。
【００６６】
[0070]一般に、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）を用いた場合に有用なリンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含む。一部の実施形態においては、２〜１００個の原子のリンカー鎖は、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の化学部分を含む。本開示のイオン流増幅性タグ付き化合物において有用であるさまざまな化学部分を含むさまざまなリンカーを、本明細書において記載し、例示する。
【００６７】
[0071]典型的には、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド実施形態において、リンカーは、タグに、またはタグに付けられる、もしくはタグに共有結合によって付けられ得るリンカー部分に、オリゴリン酸部分の末端リン酸（またはリン酸類似体）を共有結合により連結する化学反応における、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の調製の際に形成される。より詳しくは、この化学反応は、典型的には、反応性リンカー形成基およびオリゴリン酸部分を含むヌクレオチドを用いて修飾されたタグ部分を含み、オリゴリン酸の末端もまた、反応性リンカー形成基を用いて修飾される。この種のリンカー形成性化学反応を、スキーム１におけるような式（ＩＩＩ）のタグ付きヌクレオチド化合物において表すことができる。
【化７】
2019528359.tif 000010
【００６８】
[0072]スキーム１において表されるように、ＸＡおよびＸＢは、反応性リンカー形成基であり、ＬＡおよびＬＢは、式（ＩＩＩ）のタグ付きヌクレオチド化合物において見られる構造−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−の最終的に形成されるリンカーへの前駆体リンカー部分である。したがって、ＸＡおよびＸＢは、複数のヌクレオチドのうち１つとタグの間の共有結合性連結をもたらす化学反応を起こすことが可能である化学部分である。リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢの間の各共有結合性連結反応の生成物は、一般構造−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−を含むリンカーである。したがって、本開示の一部の実施形態においては、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物におけるようなリンカー「Ｌ」または「リンカー」は、スキーム１に表されるような構造式「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」のリンカーである。
【００６９】
[0073]化学部分、構造式（ＩＩＩ）の「Ｘ」（「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」の）は、リンカー形成性反応において生成される新規化学リンカー部分である。特定の化学基Ｘの名称は、リンカーの種類を表すために使用されることが多いが、ＬＡおよびＬＢによって提供されるリンカーのその他の部分は、実質的にリンカーの全体的な構造に寄与し得る。一部の実施形態においては、リンカーは、リンカー形成性試薬、ＸＡおよびＸＢの間のリンカー形成反応において生成した化学部分、Ｘを含み、Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステルおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される化学部分である。
【００７０】
[0074]化学部分、ＬＡおよびＬＢは、ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分またはタグ部分とそのリンカー形成試薬基、ＸＡおよびＸＢの間のリンカーまたはスペーサーとして有効に作用できる化学基である。典型的には、ＬＡおよびＬＢは、リンカー形成反応において反応しないが、最終的に形成されるリンカーにさらなる空間または構造を提供する化学部分である。ＬＡおよびＬＢ部分は、同一であっても、異なっていてもよい。一部の実施形態においては、ＬＡまたはＬＢは、もう一方よりもかなり長いまたは短いこともあり、および／または異なる構造的特徴、例えば、多かれ少なかれコンホメーション的可動性をもたらす特徴を提供する。したがって、一部の実施形態においては、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物において有用なＬＡおよびＬＢ部分は、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖および任意選択で、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の化学部分を含む。
【００７１】
[0075]したがって、一部の実施形態においては、本開示は、構造式（ＩＩＩ）
【化８】
2019528359.tif 000011
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、ＬＢ−Ｘ−ＬＡは、リンカーであり、（ａ）ＬＡおよびＬＢは各々独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１−Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１−Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学部分を含み、（ｂ）Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾールおよびジヒドロピリダジンからなる群から選択される化学部分を含む］
で示されるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を提供し、一部の実施形態においては、ＬＡおよびＬＢならびにタグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグである。
【００７２】
[0076]一部の実施形態においては、特徴的なリンカー部分Ｘは、トリアゾール基である。このようなトリアゾール基は、アジドリンカー形成試薬とアルキンリンカー形成試薬の間の「クリック」反応において形成され得る。さらに、トリアゾール基Ｘを含む構造式（ＩＩＩ）の化合物中のリンカーは、トリアゾール基の片側または両側に直鎖アルキルおよび／またはアミド基をさらに含み得るということが考慮される。したがって、一実施形態において、本開示は、構造式（ＩＩＩａ）
【化９】
2019528359.tif 000012
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは１〜４であり、ｐは、２〜１０であり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］
で示されるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を提供する。構造式（ＩＩＩａ）のタグ付きヌクレオチド化合物の一部の実施形態においては、化合物は、構造パラメータ、ＲはＨであり、ｎ＝４およびｐ＝５を含み、式（ＩＩＩｄ）
【化１０】
2019528359.tif 000013
の化合物をもたらす。
【００７３】
[0077]例示的リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢ、リンカー前駆体部分、ＬＡおよびＬＢならびにそれらが式−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−を形成する得られるリンカーは、以下の表１に示されている。
【００７４】
[0078]
【表１−１】
2019528359.tif 000014
【表１−２】
2019528359.tif 000015
【表１−３】
2019528359.tif 000016
【表１−４】
2019528359.tif 000017
【００７５】
[0079]表１は、共有結合性連結リンカーをもたらす反応を起こす、リンカーおよび対応する反応性リンカー形成基の範囲を例示する。これらの種々のリンカーおよび反応は、当技術分野で周知である。当業者ならば、これらの反応に必要な試薬を同定し、それらを合成するか、または商業的に入手することができるであろう。例えば、ポリペプチド（またはタンパク質）を、他の生体分子にコンジュゲートまたは架橋するための試薬を、リンカー形成基として使用して、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド構造を調製することができる。（例えば、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍでＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡから、またはｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍでＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡから入手可能な「ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ」のカタログを参照のこと）。同様に、末端リン酸修飾ヌクレオシドおよび／またはアジドもしくはアルキン基（または他のリンカー形成基）を用いるこのような修飾のための試薬は市販されている（例えば、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇｍｂｈ、ドイツ、イェーナを参照のこと）。さらに、ポリペプチドの自動固相合成において使用できるアジドまたはアルキン基（または他のリンカー形成基）を用いて修飾された、広範なＦＭＯＣ保護アミノ酸残基が市販されている（例えば、ＡｎａＳｐｅｃ、米国カリフォルニア州、フレモントを参照のこと）。
【００７６】
[0080]構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）および（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）のリンカー形成基の対のいずれも、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、式（ＩＩＩ）の化合物）において有用なリンカーを調製することにおいていずれかの配置で使用できるということが考慮される。すなわち、リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢのいずれも、リンカー形成基が、リンカー部分Ｘを形成するリンカー反応を提供するために対合される限り、タグまたはヌクレオチドのいずれでも使用できる。したがって、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）のリンカー形成基のいずれも、タグまたはヌクレオチドのいずれかに付けることができ、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）のコンジュゲートリンカー形成基を、もう一方に付ける。したがって、表１において形態Ｒ１−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−Ｒ２のリンカーにおいて表されるような基Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、タグおよびヌクレオチドまたはヌクレオチドおよびタグのいずれかを表すことができる。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、式（ＩＩＩ）のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を提供し、化合物は、式Ｒ１−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−Ｒ２の化合物を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、ヌクレオチドおよびタグであるか、またはＲ１およびＲ２は、タグおよびヌクレオチドであり、−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−は、表１における構造式（ＩＶｃ）〜（ＸＶＩＩｃ）の部分から選択される化学部分を含む。
【００７７】
[0081]上記のように、リンカーを構成する化学部分ＬＡおよびＬＢはそれぞれ独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、カーボネート、カルバメート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せを含む化学部分を含み得る。リンカー形成基ＸＡおよびＸＢと同様に、リンカーを構成する化学部分ＬＡおよびＬＢのいずれも、リンカー形成基のいずれともにそれぞれ独立に使用されてもよく、タグまたはヌクレオチドのいずれかで使用されてもよいということが考慮される。さらに、化学部分ＬＡおよびＬＢは、同一である場合も、異なる場合もあるということが考慮される。
【００７８】
[0082]一実施形態において、タグ付きヌクレオチド化合物において使用されるリンカー、式（ＩＩＩ）は、いずれかの側に部分ＬＡおよびＬＢを有するトリアゾール基Ｘを含む式（ＸＶｃ）中のリンカーであり、以下に示される式（ＸＶｄ）のリンカーをもたらす。
【化１１】
2019528359.tif 000018
【００７９】
[0083]式（ＩＩＩ）のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物の一部の実施形態においては、ＬＡおよびＬＢ化学部分は、表２におけるような式（ＸＶＩＩＩａ）〜式（ＸＶＩＩＩｄ）の部分構造からなる群から独立に選択される化学部分を含む。
【００８０】
[0084]
【表２】
2019528359.tif 000019
【００８１】
[0085]スキーム１は、タグから分離した部分として、形成される「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」リンカーを表すが、一部の実施形態においては、リンカーは、タグの一部を含み得るリンカー形成基との反応において形成され得るということが考慮される。例えば、タグは、オリゴヌクレオチドを含むことができ、ここで、オリゴヌクレオチドは、アジド−アルキン「クリック」反応によって所望のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）に共有結合によって連結され得るプロパルギルまたはその他のアルキニル基を用いて修飾されたモノマー単位を含む。タグの一部とも考えられ得るこのプロパルギル基は、リンカー形成基（すなわち「ＸＢ」）として作用することができ、ヌクレオチドに付けられたリンカー形成基とリンカー形成反応を起こす。
【００８２】
[0086]分岐または樹状リンカー
[0087]複数の分子部分と共有結合により連結可能な２つの反応性末端を有する広範なリンカーに加えて、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドは、一般に、３つまたはそれ以上の反応性末端を有するリンカー部分の１種である少なくとも１種の「分岐」または「樹状」リンカーを含む。分岐または樹状リンカー部分を含むリンカーの使用は、単一タグの、２つまたはそれ以上のヌクレオチドとの共有結合連結を容易にする。ポリメラーゼ基質として特性が改善されたタグ付きヌクレオチド化合物におけるこのようなリンカーの使用は、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｔａｇｇｅｄ  Ｍｕｌｔｉ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題された、２０１６年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３４２，７９６号に記載されている。
【００８３】
[0088]本開示のタグ付きヌクレオチド化合物において使用できる、３つまたはそれ以上の反応性末端を提供可能な分岐または樹状リンカー部分は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ａｓ  ｐｏｌｙｌａｂｅｌｌｅｄ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７年、第２５巻、２２号、４４４７〜４４５４頁を参照のこと。本開示の化合物において有用な３つまたはそれ以上の反応性末端を提供する分岐または樹状リンカー部分は、ＤＮＡ合成試薬の種々のベンダー、例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ＵＳＡ；  ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）から市販されている。
【００８４】
[0089]したがって、一部の実施形態においては、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）は、リンカーを含むことができ、ここで、リンカーは、３個以上の分子部分との共有結合による連結を形成することができる分岐部分または樹状部分を含む。
【００８５】
[0090]リンカーが分岐部分または樹状部分を含む本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を調製するのに有用な例示的試薬は、以下に示される保護されたホスホロアミダイト試薬化合物（１９）および（２０）を含む。
【化１２】
2019528359.tif 000020
【００８６】
[0091]化合物（１９）および（２０）の分岐または樹状ホスホロアミダイト「ダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）」および「トレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）」単位は、オリゴヌクレオチド鎖の末端に容易に付けられ、２つまたはそれ以上の分子部分に取付け可能なオリゴヌクレオチドのリンカー末端が生成する。したがって、天然および／または非天然モノマー単位を含むオリゴヌクレオチドを、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドのタグとして使用できる。
【００８７】
[0092]本開示の一部の実施形態において、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、分岐または樹状「ダブラー」リンカー部分を含み、構造式（ＩＩＩｂ）を有する：
【化１３】
2019528359.tif 000021
［式中、「塩基」は、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｍは、２〜１２であり、ｐは、２〜１０であり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］。
【００８８】
[0093]本開示の一部の実施形態においては、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、分岐または樹状「トレブラー」リンカー部分を含み、構造式（ＩＩＩｃ）を有する：
【化１４】
2019528359.tif 000022
［式中、「塩基」は、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｍは、２〜１２であり、ｐは、２〜１０であり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］。
【００８９】
[0094]さらに、化合物（１９）の分岐または樹状ホスホルアミダイト「ダブラー」単位および化合物（２０）の「トレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）」単位を容易に組み合わせて、単一分子部分（例えば、タグ）を、４、６、８、９、１２またはそれ以上のヌクレオチドと共有結合連結可能なリンカーを作製できる。例えば、タグを、標準ホスホルアミダイト合成法によって、化合物（１９）と、次いで化合物（２０）と連結させて、化合物（２１）を作製でき、これは、少なくとも６つのさらなる分子部分、例えば、６つのヌクレオチドとさらに連結可能である。
【化１５】
2019528359.tif 000023
【００９０】
[0095]１つのＤＭＴ保護基および１つのＦＭＯＣ保護基を有する、  化合物（１９）の３末端ホスホルアミダイト「ダブラー」単位も調製できる（または商業的に入手できる）。次いで、２つの異なる保護基を有するこの「ダブラー」単位を使用して、続いて、２つの異なる分岐または樹状単位を付けることができる。例えば、化合物（１９）の「ダブラー」単位および化合物（２０）の「トレブラー」単位を、連続様式で、先に単一タグに付けられたＤＭＴおよびＦｍｏｃ保護基を有する「ダブラー」単位に共有結合によって付けてもよい。このような組合せは、単一タグに、少なくとも５つのさらなる分子部分、例えば、５つのヌクレオチドとさらに連結可能であるリンカー部分を提供する。
【００９１】
[0096]当業者ならば、化合物（１９）および（２０）の分岐もしくは樹状ホスホルアミダイト単位または他のこのような分岐もしくは樹状リンカー部分を多数の方法で組み合わせて、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を作製できることを直ちに認識するであろう。
【００９２】
[0097]イオン流増幅性タグ
[0098]本明細書において別の場所に記載されるように、ナノポア検出のために使用されるこれまでに知られているタグ部分は、ナノポアに入る際に、ナノポアを通る正イオン流の減少を引き起こし、これが、Ｏ．Ｃ．シグナルを下回るナノポアにわたる測定される「遮断」電流シグナルをもたらす。本開示のタグ部分は、ナノポアに入る際に、ナノポアを通る正イオンの流れの増大の驚くべき技術効果をもたらす。正イオンのこの増大された流れは、あらゆるタグが存在しないナノポアのＯ．Ｃ．シグナルを上回るナノポアにわたる測定されるタグ電流シグナルをもたらす。したがって、本明細書において開示されるイオン流増幅性タグ部分は、「遮断」電流シグナルをもたらさないが、イオン流増幅性タグ電流シグナルをもたらす。イオン流増幅のこの驚くべき技術効果は、Ｏ．Ｃ．シグナルを上回る全く新しいレンジのナノポア検出可能シグナルを切り開く。この検出レンジでは、一般に、Ｏ．Ｃ．シグナルを下回るレンジよりもバックグラウンドノイズが少ない。したがって、イオン流増幅性タグは、Ｏ．Ｃ．シグナルを上回るおよび下回る両方のダイナミックレンジを増大するならびにこのレンジでのタグ電流シグナルの検出におけるより低いバックグラウンドノイズのためにより高い感度提供するという利点を示す。したがって、本開示の化合物およびタグ付きヌクレオチドにおいて有用なイオン流増幅性タグの一部の実施形態においては、正イオン流の増大は、Ｏ．Ｃ．電流より大きい、任意選択で、Ｏ．Ｃ．電流より少なくとも５％大きい、Ｏ．Ｃ．電流より少なくとも１０％大きい、Ｏ．Ｃ．電流より少なくとも２５％大きいまたはＯ．Ｃ．電流より少なくとも５０％大きいナノポアにわたる測定される電流をもたらす。
【００９３】
[0099]一般に、本開示のイオン流増幅性タグの構造は、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む。提案される機序に捉われることを意図するものではないが、このようなタグの長い伸長された薄いポリアニオン構造は、ナノポアデバイスのシス側の多数の正イオンと迅速に結合でき、次いで、タグが、印加された電位によってナノポア中に引きこまれるにつれて、正イオンをデバイスのトランス側に効果的に、それらが自身によってナノポアを通って移動し得るよりも迅速に送達すると考えられる。
【００９４】
[0100]上記で記載されたように、イオン流増幅性タグ部分は、水溶液中で細い、引き伸ばされた棒状コンホメーションをとり得る負電荷を有し、ほぼナノポアの長さにわたることが可能な分子長を有するポリマーを含む構造を有さなくてはならない。一般に、標準ＤＮＡ鎖は、１０ヌクレオチドあたり３．４ｎｍ（または３４オングストローム）または３０ヌクレオチドあたり約１０２オングストロームの分子長を有する。天然ヌクレオチドＴは、約１８オングストロームの分子径を有するが、「Ｓｐ２」、「Ｓｐ３」、「ｄＳｐ」などの非天然脱塩基ヌクレオチド（オリゴヌクレオチド合成技術においては、「スペーサー」とも呼ばれる）は、約１０オングストローム（またはそれより小さい）のより狭い分子径を有する。
【００９５】
[0101]したがって、本開示の化合物およびタグ付きヌクレオチドにおいて有用なイオン流増幅性タグは、一般に、約８０オングストローム〜約２５０オングストロームの分子長および約８オングストローム〜約１８オングストロームの分子径を有する負電荷を有するポリマー部分を含む。一部の実施形態においては、タグ付きヌクレオチドは、約８０オングストロームと約２５０オングストロームの間の分子長および約１５オングストローム未満の分子径、任意選択で、約１２オングストローム未満の、もしくは約１０オングストローム未満の分子径を有する負電荷を有するポリマー部分を含む。
【００９６】
[0102]本開示のイオン流増幅性タグは、ナノポアを通る正イオンの適切で効率的な輸送を可能にする、その長さに沿って規則的に分布する負電荷を有する。したがって、一部の実施形態においては、本開示の化合物およびタグ付きヌクレオチドにおいて有用なイオン流増幅性タグは、一般に、負電荷を有するポリマー部分を含み、負電荷を有するポリマー部分は、１０オングストロームの分子長あたり少なくとも１つの負電荷、任意選択で、７．５オングストロームの分子長あたり少なくとも１つの負電荷または３．５オングストロームの分子長あたり少なくとも１つの負電荷を有する。
【００９７】
[0103]イオン流増幅性タグ構造上の負電荷の密度は、別法として、ポリマー鎖中の原子数あたりの負電荷の観点で記載されることもある。したがって、一部の実施形態においては、本開示の化合物およびタグ付きヌクレオチドにおいて有用なイオン流増幅性タグは、３〜２０個の原子毎の間隔で、任意選択で、３〜１０個の原子の間隔で鎖の原子に付けられた負電荷を有する基を有する１５０〜９００個の原子の共有結合によって連結された鎖を含む、負電荷を有するポリマー部分を含む。一部の実施形態においては、１５０〜９００個の原子の共有結合によって連結された鎖は、ホスホジエステル、ペプチド、エステル、エーテル、アルキル、アルケニル、アルキニル、全フッ素置換アルキルおよびそれらの任意の組合せから選択される化学基を含む。一部の実施形態においては、負電荷を有する基は、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロチオエート、スルフェート、スルホネート、カルボキシレートおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００９８】
[0104]一般に、イオン増幅性タグの全負電荷は、タグの長さにわたる長さおよび電荷分布に基づいて変わり得る。このようなパラメータは、タグ電流シグナルを変更するように変わり得る。本開示の化合物およびタグ付きヌクレオチドにおいて有用なイオン流増幅性タグの一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、（−２０）〜（−６０）の全負電荷、任意選択で、（−２５）〜（−５０）の全負電荷、任意選択で、（−３０）〜（−４０）の全負電荷、または任意選択で、（−３１）〜（−３７）の全負電荷を有する。
【００９９】
[0105]イオン流増幅性タグは、一般に、負電荷を有するポリマー構造を含む。そのポリマー構造は、その構成モノマー単位の数および種類の観点でさらに記載され得る。一般に、本開示のタグの負電荷を有するポリマー部分において有用なモノマー単位は、３〜２０個の原子の共有結合によって連結された鎖、任意選択で、３〜１０個の原子の鎖に付けられた負電荷を有する基を含む。したがって、本開示の化合物およびタグ付きヌクレオチドにおいて有用なイオン流増幅性タグの一部の実施形態においては、負電荷を有するポリマー部分は、１０〜６０のモノマー単位、任意選択で、２０〜５０のモノマー単位、任意選択で、２５〜４０のモノマー単位、または任意選択で、２７〜３５のモノマー単位の共有結合によって連結された鎖を含む。
【０１００】
[0106]一般に、モノマー単位は、ポリマー部分内のその共有結合連結構造の観点で記載される。したがって、一部の実施形態においては、ポリマー部分のモノマー単位は、ホスホジエステル、ペプチド、エステル、エーテル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ペルフルオロアルキルおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される共有結合連結を含む。一部の実施形態においては、モノマー単位は、ホスフェート、スルフェート、カルボキシレートおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される負電荷を有する基を含む。
【０１０１】
[0107]本開示のイオン流増幅性タグの負電荷を有するポリマー部分の成分として有用である特定のモノマー単位は、表３に提供されている。したがって、一部の実施形態においては、本開示の化合物およびタグ付きヌクレオチドにおいて有用なイオン流増幅性タグは、モノマー単位を含む負電荷を含むポリマー部分を含み、モノマー単位は独立に、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）、（１ｍ）、（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）、（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）およびそれらの任意の組合せの構造からなる群から選択される。
【０１０２】
[0108]
【表３−１】
2019528359.tif 000024
【表３−２】
2019528359.tif 000025
【表３−３】
2019528359.tif 000026
【表３−４】
2019528359.tif 000027
【０１０３】
[0109]オリゴヌクレオチドタグ
[0110]本明細書において背景および別の場所において記載されるように、広範なオリゴヌクレオチドが調製され、ナノポア検出のためのタグ部分として使用されている。しかし、これらのこれまでに知られているオリゴヌクレオチドタグは、Ｏ．Ｃ．シグナルより低いタグ電流シグナルを生成するとだけ知られており、これは、それらが正イオン流の減少をもたらすことを示す。本開示は、イオン流を増幅可能であるオリゴヌクレオチドタグを提供する。一般に、イオン流増幅性オリゴヌクレオチドタグは、非天然脱塩基ヌクレオチド類似体構造である、２５〜３５モノマー単位のポリマーを含む。これらのアミダイト（ａｍｉｄｉｔｅ）試薬は、標準自動化アミダイトカップリング化学反応によってポリマーに容易に合成され、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを調製するために使用される。このようなモノマー単位構造は、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）および（１ｍ）の構造として表３に示されている。したがって、一部の実施形態においては、本開示の化合物およびタグ付きヌクレオチドにおいて有用なイオン流増幅性タグは、負電荷を有するポリマーを含み、ポリマーは、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）、（１ｍ）およびそれらの任意の組合せの構造から選択されるモノマー単位を含む。
【０１０４】
[0111]表３のホスホジエステル結合を含むモノマー構造および広範な他のこのような非天然脱塩基ヌクレオチド類似体（スペーサー単位と呼ばれることも多い）は、アミダイト試薬形態（例えば、ホスホルアミダイトまたはホスホンアミダイト）で市販されている（例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国、バージニア州、スターリング、２２８２５デイビスドライブから）。この範囲のホスホジエステル連結されたモノマー単位を含むさらなるイオン流増幅性タグが、これらのアミダイト試薬および標準自動化アミダイト合成法を使用して使用調製され得るということが考慮される。
【０１０５】
[0112]表３のホスホジエステル結合を有するモノマー単位に対応するアミダイト試薬を使用して、標準アミダイトカップリング化学反応によってポリマー構造を有するイオン流増幅性タグを調製できる。すなわち、ホスホルアミダイト（またはホスホンアミダイト）試薬の各々は、アミダイトカップリング反応において、ヌクレオチドポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）と反応して、その特定の構造を有するモノマー単位をポリマー中に挿入する。この得られたポリマー構造は、ポリマー中の隣接するモノマー単位とホスフェート（またはホスホネート）結合を有する。次いで、このようなポリマーを使用して、本明細書において開示され、当業者に周知の連結化学によって本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを調製できる。したがって、本開示は、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を有する）を提供し、タグは、表３のモノマー単位に対応するアミダイト試薬の反応に起因する少なくとも１つのモノマー単位を有する負電荷を有するポリマー構造を含む。
【０１０６】
[0113]一般に、本明細書において開示されるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物の実施形態のいずれかにおいて、タグは、少なくとも１０マー、１５マー、２０マー、２５マー、３０マー、３５マー、４０マー、５０マー、６０マーまたはそれ以上のモノマー単位の長さのオリゴヌクレオチドを含んでもよく、任意選択で、オリゴヌクレオチドは、表３から選択されるモノマー単位を含む。
【０１０７】
[0114]当業者ならば、表３に開示されるモノマー単位の一部はまた、商業的なオリゴヌクレオチド合成カタログにおいて、「スペーサー」（例えば、「ＳｐＣ３」、「ｄＳｐ」）と呼ばれることは認識するであろう。当業者ならば、本明細書において（実施例においてを含めて）記載されるオリゴヌクレオチドタグの一部は、周知のオリゴヌクレオチド合成命名法（一般的に使用されるオリゴヌクレオチド合成命名法のさらなる説明については、例えば、ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのウェブサイトを参照のこと）を使用して言及されるということも認識するであろう。例えば、本明細書において別の場所で開示されるオリゴヌクレオチド実施形態の関連で、表３のホスホジエステル連結されたモノマー単位構造、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）および（１ｍ）の構造は、本明細書において表４のオリゴヌクレオチド合成関連名称によって呼ばれる。
【０１０８】
[0115]
【表４】
2019528359.tif 000028
【０１０９】
[0116]一部の実施形態においては、本開示は、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の）を提供し、ここで、負電荷を有するポリマー部分は、式（Ａ）ｍ−（Ｂ）ｎ−（Ｃ）ｐ−（Ｄ）ｑのオリゴヌクレオチドを含み、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）および（１ｍ）のモノマー単位構造から独立に選択されるモノマー単位であり、ｍ、ｎ、ｐおよびｑの各々は、０〜４０であり、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、１０〜４０であり、任意選択で、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２０〜４０であり、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２５〜３５であるか、またはｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑは、２７〜３５である。
【０１１０】
[0117]一部の実施形態においては、本開示は、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の）を提供し、ここで、負電荷を有するポリマー部分は、式（Ａ）ｎのオリゴヌクレオチドを含み、Ａは、式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｄ）、（１ｅ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）、（１ｌ）および（１ｍ）のモノマー単位構造から独立に選択されるモノマー単位であり、ｎは、１０〜４０であり、任意選択で、ｎは、２０〜４０であり、ｎは、２５〜３５であるか、またはｎは、２７〜３５である。
【０１１１】
[0118]一部の実施形態においては、本開示は、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の）を提供し、ここで、負電荷を有するポリマー部分は、表５から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１２】
[0119]
【表５】
2019528359.tif 000029
【０１１３】
[0120]タグがオリゴヌクレオチドを含む、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、同様に実施例において開示され、例示される化合物を含む。
【０１１４】
[0121]イオン流増幅性化合物として有用である例示的な負電荷を有するポリマー部分は、一般に、約８０オングストローム〜約１５０オングストロームの分子長および約１５オングストローム未満の分子径を有する。
【０１１５】
[0122]オリゴヌクレオチドを含む負電荷を有するポリマー部分は、３’末端基をさらに含み得ることが考慮される。このような３’末端基は、ポリメラーゼ酵素の存在下で消化からタグを保護するように作用すると知られている。例えば、ＷＯ２０１５／１４８４０２に開示されるような保護的３’末端基を参照のこと。本開示のイオン流増幅性タグにおいて有用な例示的３’末端基として、プロパノール（「Ｃ３」）およびビオチンが挙げられるが、当業者ならば、多数の他の基が利用可能であるということは認識するであろう。
【０１１６】
[0123]本開示は、当業者に、広範なナノポアデバイスおよび検出システムにわたって有用なイオン流増幅特徴を提供するタグ部分を有するイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを調製するためのツールを提供する。
【０１１７】
[0124]イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを調製する方法
[0125]本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の化合物）の調製において、標準合成法を使用できる。標準アジド−アルキンクリック反応は、上記で（例えば、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、（ＸＸＩ）または（ＸＸＩＩ）の化合物）および実施例において記載されている。表１および２は、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドの調製において使用され得るさまざまなリンカーおよびリンカー形成基反応を例示する。一実施形態では、表１に示される構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）のリンカー形成基のいずれも、タグに付けられた分岐もしくは樹状リンカーに、またはヌクレオチドの末端リン酸基に付けてもよく、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応するコンジュゲートリンカー形成基を、他のものに付ける。マルチヌクレオチド−オリゴリン酸−リンカー−タグ化合物を形成する得られる共有結合リンカー構造を、表１において構造式（ＩＶｃ）〜（ＸＶＩＩｃ）によって例示する。共有結合連結構造は、トランス−シクロオクテン（ＸＶＩＩａ）およびテトラジン（ＸＶＩＩｂ）  リンカー形成基のクリック反応に起因するジヒドロピラジジン基構造（ＸＶＩＩｃ）を含む。
【０１１８】
[0126]したがって、本開示は、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを調製する方法であって、（ａ）（ｉ）５’位に３〜１２個のリン酸が付けられ、末端リン酸が第１のリンカー形成基（例えば、ＸＡまたはＸＢ）に連結されたヌクレオチド、および（ｉｉ）第１のリンカー形成基と反応して、リンカー（例えば、−Ｘ−）を形成可能である第２のリンカー形成基（例えば、ＸＢまたはＸＡ）に連結されているイオン流増幅性タグとを提供するステップと、（ｂ）第１のリンカー形成基を第２のリンカー形成基と反応させて、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを形成するステップとを含む方法を提供する。反応してリンカーを形成可能である第１および第２のリンカー形成基が、上記の表１において例示されている。したがって、方法の一部の実施形態においては、第１のリンカー形成基は、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基は、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物であるか、あるいは、第１のリンカー形成基は、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基は、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物である。
【０１１９】
[0127]一部の実施形態においては、本開示は、構造式（ＩＩ）
【化１６】
2019528359.tif 000030
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むイオン流増幅性タグである］
で示されるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を調製する方法を提供し、方法は、
（ａ）（ｉ）５’位に３〜１２個のリン酸が付けられ、末端リン酸が第１のリンカー形成基に連結されたヌクレオチド、および（ｉｉ）第１のリンカー形成基と反応して、ヌクレオチドとタグの間に共有結合リンカーを形成可能である少なくとも第２のリンカー形成基を含む、検出可能なシグナルを生成可能である分子部分を含むイオン流増幅性タグとを提供するステップであって、
（１）第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物である、または
（２）第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物であるステップと、
（ｂ）第１のリンカー形成基を、第２のリンカー形成基と反応させ、それによって、ヌクレオチドとイオン流増幅性タグの間に共有結合連結を形成するステップと
を含む。
【０１２０】
[0128]イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を調製する方法の一部の実施形態においては、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、アジド基であり、タグに付けられた第２のリンカー形成基は、アルキンである。他の実施形態では、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、アルキン基であり、タグに付けられた第２のリンカー形成基は、アジドである。
【０１２１】
[0129]イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを調製する方法の一部の実施形態においては、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、テトラジンであり、タグに付けられた第２のリンカー形成基は、トランス−シクロオクテンである。他の実施形態においては、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、トランス−シクロオクテンであり、タグに付けられた第２のリンカー形成基は、テトラジンである。
【０１２２】
[0130]本明細書において別の場所に記載されるように、タグ付きヌクレオチドを調製する方法の一部の実施形態において、分岐または樹状リンカー構造を使用して、単一イオン流増幅性タグを用いてタグが付けられたマルチヌクレオチドを形成できる。例えば、リンカー構造は、化合物（１９）または（２０）のダブラーまたはトレブラーリンカー単位を使用して作製できる。一部の実施形態においては、ダブラーまたはトレブラーリンカー単位を連続的に連結して、４つまたはそれ以上の利用可能な反応性リンカー形成基を有する（例えば、化合物（２１）におけるような）分岐または樹状リンカーを作製できる。
【０１２３】
[0131]ナノポアシーケンシングにおけるタグ付きヌクレオチドの使用
[0132]本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を、既知ナノポアシーケンシング法において使用でき、これでは、ナノポアが、相補的ヌクレオチドに付けられたタグの存在を、ナノポアの近位に位置し、標的核酸配列に相補的なプライマーを延長する鎖延長酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ）によってそれが組み込まれるときに（または組み込まれ、放出された後に）検出する。タグ付きヌクレオチドを使用してナノポアシーケンシングを実施するための一般的な方法、材料、デバイスおよびシステムは、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７  Ａ１号、同第２０１４／０１３４６１６  Ａ１号、同第２０１５／０１１９２５９  Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願されたＵＳＳＮ１４／６６６，１２４号に記載されており、それらの各々は、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。核酸のナノポアシーケンシングのためにタグ付きヌクレオチドを使用するために、これらの一般的な方法において、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを使用できる。実際、本明細書において実施例において例示されるように、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、イオン流を増大し、ナノポア単独の開口チャネル（Ｏ．Ｃ．）電流を上回るナノポア検出可能タグ電流をもたらすという改善された特徴を有する。これらの上記のＯ．Ｃ．シグナルは、より低いノイズを示し、それによって対応する非イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物よりも、ナノポアシーケンシングにおいてより正確な配列読み出しを可能にする検出レンジ中にある。
【０１２４】
[0133]したがって、一実施形態では、本開示は、核酸の配列を決定する方法であって、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を貫通するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼ、およびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含む、ナノポアシーケンシング組成物を提供するステップと、（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖、および（ｉｉ）各々、タグに共有結合によって連結された異なるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分を含む化合物のセットであって、化合物のセットの各メンバーが、タグがナノポアに入るときにナノポアを通る正イオンの異なる流れをもたらす異なるタグを有し、異なるタグのうち少なくとも１つが、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む、化合物のセットと接触させるステップと、（ｃ）ナノポア中の異なるタグの侵入に起因する正イオンの異なる流れを経時的に検出し、核酸配列と相補的であるポリメラーゼによって組み込まれる異なる化合物の各々と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップとを含む方法を提供する。
【０１２５】
[0134]一部の実施形態においては、本開示は、核酸の配列を決定する方法であって、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を貫通するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼ、およびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含む、ナノポアシーケンシング組成物を提供するステップと、（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖、および（ｉｉ）各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットと接触させるステップであって、各異なるタグが、ナノポア中に位置するときに電極間にわたる異なるタグ電流レベルを引き起こし、セットが、構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎは、ヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分の数を示し、Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたイオン流増幅性タグであり、タグは、正イオンの存在下でナノポアに入る際に、ナノポアを通る正イオンの増大した流れをもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む］
で示される少なくとも１種の化合物を含む、タグ付きヌクレオチドのセットと接触させるステップと、（ｄ）電極間にわたる電流レベルを経時的に検出することによってナノポアを通る正イオンの流れを検出し、核酸配列と相補的であるポリメラーゼによって組み込まれる異なるタグ付きヌクレオチドの各々と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップとを含む方法を提供する。
【０１２６】
[0135]核酸の配列を決定する方法の一部の実施形態においては、各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットは、式（ＩＩ）：
【化１７】
2019528359.tif 000031
［式中、塩基アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］
で示される構造を含む、少なくとも１種のイオン流増幅性タグ付き化合物を含む。
【０１２７】
[0136]式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を含むイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、核酸の配列を決定する方法において使用される場合には、本明細書において別の場所に開示される化合物実施形態の範囲のいずれも含み得る。例えば、式（Ｉ）のヌクレオシド（Ｎ）は、ヌクレオシドが、三リン酸などのオリゴリン酸（Ｐ）に共有結合によって連結される場合に、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能である任意のヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基およびリボースまたはデオキシリボース基などの天然に存在するまたは天然に存在しない糖部分を含み得る。
【０１２８】
[0137]タグ付きヌクレオチドのセット
[0138]本明細書において別の場所に記載されるように、ナノポア検出使用して核酸の配列を決定する方法は、一般に、それぞれ鎖延長酵素の基質となることができ、それぞれ検出されることが望まれるヌクレオチドと会合した異なるタグを含むタグ付きヌクレオチド化合物のセットを必要とする。ＤＮＡ鎖をシーケンシングするための標準実施形態では、本方法は、少なくとも４種の標準デオキシ−ヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴのセットを必要とし、異なるヌクレオチドはそれぞれ、ヌクレオチドが近位の鎖延長酵素によって組み込まれるときに検出されることが可能である異なるタグに付けられ、さらに、各タグのナノポア検出可能なシグナル（例えば、タグ電流）は、他の３種のタグそれぞれのナノポア検出可能シグナルから識別可能であり、それによって、酵素によって組み込まれる特定のヌクレオチドの同定が可能となる。一般に、セット中の異なるタグ付きヌクレオチドのそれぞれは、タグが鎖延長酵素によって新規相補鎖中に組み込まれるときに生成する特有の検出可能なシグナルによって識別される。
【０１２９】
[0139]ナノポア検出法においてタグ付きヌクレオチドを識別するために使用できる、単独または組み合わせた検出可能シグナル特徴の中に、ナノポア中のタグの存在によって引き起こされるイオン流の変化があり、これは、次いで、ナノポア検出システムの電極間にわたる電流レベル尺度の変化（ＤＣまたはＡＣ電位のいずれかのもとで）をもたらす。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、各々異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットを提供し、各異なるタグは、ナノポア中に位置するときに、細孔を通る異なるイオン流を引き起こし、電極間にわたる異なる検出可能タグ電流レベルをもたらし、セットは、構造式（Ｉ）
Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎは、ヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分の数を示し、Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたタグであり、Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたイオン流増幅性タグであり、タグは、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの増大した流れをもたらす負電荷を有するポリマー部分を含む］
で示される少なくとも１種の化合物を含む。
【０１３０】
[0140]各々異なるタグを有するイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドのセットの一部の実施形態においては、セットは、式（ＩＩ）：
【化１８】
2019528359.tif 000032
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子の共有結合によって結合した鎖を含むリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、タグは、ナノポアに入ることが可能であり、正イオンの存在下でナノポアに入る際にナノポアを通る正イオンの流れの増大をもたらす負電荷を有するポリマー部分を含むタグである］
で示される構造を含む少なくとも１種の化合物を含む。
【０１３１】
[0141]本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを、ナノポアを通るイオン流を増幅するというよりも遮断するタグ付きヌクレオチドも含むタグ付きヌクレオチドのセットならびに／またはオリゴヌクレオチドタグおよびポリペプチドタグの両方などの異なる種類のタグを有するタグ付きヌクレオチドを有するセットにおいて使用してもよいということが考慮される。例えば、一部の実施形態においては、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドのセットは、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを含んでもよく、セット中の他のタグ付きヌクレオチドは、イオン流を増幅しない、ナノポアＯ．Ｃ．シグナルレベルを下回るタグ電流シグナルをもたらすオリゴヌクレオチドタグに付けられたヌクレオチドを含んでもよい。ナノポアＯ．Ｃ．シグナルレベルを下回るタグ電流シグナルをもたらすこのようなオリゴヌクレオチドタグ付きヌクレオチドは、当技術分野で公知であり、本明細書において開示されるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドとともに、セットにおいて使用され得る（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号、同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号、同第２０１５／０１１９２５９Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願されたＵＳＳＮ第１４／６６６，１２４号を参照のこと）。
【０１３２】
[0142]あるいは、一部の実施形態においては、セットタグ付きヌクレオチドは、表３のモノマー単位、例えば、オリゴヌクレオチドタグ、ポリペプチドタグおよび／またはポリエチレングリコールタグを使用して入手可能なものなどのさまざまな負電荷を有するポリマー部分構造中から得られるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを含み得る。
【０１３３】
[0143]一部の実施形態においては、タグ付きヌクレオチドのセットは、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の少なくとも２種の、少なくとも３種のまたは少なくとも４種のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物を含み、ここで、セット中の少なくとも２種の、少なくとも３種のまたは少なくとも４種のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物の異なるタグの各々は、セット中の他のものから識別可能であるナノポア検出可能シグナルを生成する。タグ電流および／または滞留時間などのナノポア検出可能シグナル特徴を決定するための方法および技術は、当技術分野で公知である（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号、同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号、同第２０１５／０１１９２５９Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願されたＵＳＳＮ第１４／６６６，１２４号を参照のこと）。このような方法は、本明細書において実施例において記載されるようなナノポアアレイを使用するＡＣ電位下でのナノポアシーケンシング実験を含む。
【０１３４】
[0144]したがって、一部の実施形態においては、本開示は、各々異なるタグを有する少なくとも２種の異なるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを含むタグ付きヌクレオチドのセットを提供し、ここで、少なくとも２種の異なるタグは、識別可能なレベルの増幅された正イオン流を示し、ナノポアＯ．Ｃ．電流レベルを上回る異なる測定可能なタグ電流レベルをもたらす。一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドは、構造（Ｉ）、構造（ＩＩ）または構造（ＩＩＩ）の化合物を含む。一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドは各々、異なる負電荷を有するポリマー部分を含み、任意選択で、各ポリマー部分は、表４の表３から選択されるモノマー単位の異なる配列を含む。一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるタグは、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または少なくとも７５％異なるＯ．Ｃ．電流レベルを上回るタグ電流レベルを示す。タグ電流レベル間の相違の測定は、任意の適したナノポア検出法を使用して行うことができる。例えば、少なくとも２種の異なるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド各々のタグ電流レベルは、本明細書において実施例において一般的に記載されるように、ナノポアシーケンシング実験において測定できる。
【０１３５】
[0145]一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドは、４種のタグ付きヌクレオチド化合物：ｄＡ６Ｐ−（リンカー）−Ｔ３０−Ｃ３、ｄＣ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ｄＳｐ）２６−ＴＴ−Ｃ３、ｄＧ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ２）２８−ビオチンおよびｄＴ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチンの上記セットを含み、ここで、「（リンカー）」とは、式（ＸＶｄ）のリンカーを指す（上記を参照のこと）。
【０１３６】
[0146]ナノポアデバイス
[0147]ナノポアデバイスおよびそれらを作製し、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを使用するナノポアシーケンシングなどのナノポア検出適用において使用するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第７，００５，２６４Ｂ２号、同第７，８４６，７３８号、同第６，６１７，１１３号、同第６，７４６，５９４号、同第６，６７３，６１５号、同第６，６２７，０６７号、同第６，４６４，８４２号、同第６，３６２，００２号、同第６，２６７，８７２号、同第６，０１５，７１４号、同第５，７９５，７８２号および米国特許出願公開第２０１５／０１１９２５９号、同第２０１４／０１３４６１６号、同第２０１３／０２６４２０７号、同第２０１３／０２４４３４０号、同第２００４／０１２１５２５号および同第２００３／０１０４４２８号を参照のこと、それらのそれぞれは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）。ナノポア検出を測定するのに有用なナノポアデバイスもまた、本明細書において開示される実施例において記載する。一般に、ナノポアデバイスは、脂質二重膜中に埋め込まれた細孔形成性タンパク質を含み、膜は、ウェルまたはリザーバーを含む固体基板に固定化される、または付けられる。ナノポアの細孔は、膜を貫通し、膜のシス側とトランス側の間の流体連絡を作り上げる。典型的には、固体基板は、ポリマー、ガラス、シリコンおよびそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。さらに、固体基板は、ナノポアに隣接する、センサー、検出回路または検出回路に連結された電極、任意選択で、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路を含む。典型的には、ＤＣまたはＡＣ電位が、膜にわたって設定されることを可能にする膜のシスおよびトランス側の電極があり、これが、ナノポアの細孔を通るベースライン電流（またはＯ．Ｃ．電流レベル）を生成する。本開示のイオン流増幅性タグなどのタグの存在は、ナノポアを通る正イオン流において変化をもたらし、それによって、ナノポアのＯ．Ｃ．電流に対する電極間にわたる電流レベルにおける測定可能な変化を生成する。
【０１３７】
[0148]本開示のイオン流増幅性タグ化合物を、天然に存在する、および天然に存在しない（例えば、操作された、または組換え）細孔形成性タンパク質の両方によって作製されたナノポアを含む広範囲のナノポアデバイスとともに使用できることが考慮される。本開示のイオン流増幅性タグのナノポア検出にとって有用なナノポアを作製するために使用できる広範な細孔形成性タンパク質は、当技術分野で公知である。代表的な細孔形成性タンパク質として、α−溶血素、β−溶血素、γ−溶血素、アエロリジン、溶血毒、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリンおよびポリンＡが挙げられるが、これらに限定されない。細孔形成性タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素（本明細書において、「α−ＨＬ」とも呼ばれる）は、細孔形成性タンパク質のクラスの最も研究されたメンバーのうち１種であり、ナノポアデバイスの作製において広範に使用されてきた。（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１１９２５９号、同第２０１４／０１３４６１６号、同第２０１３／０２６４２０７号および同第２０１３／０２４４３４０号を参照のこと）。α−ＨＬもまた、配列決定され、クローニングされ、部位特異的突然変異誘発および化学標識を含む広範な技術を使用して構造的および機能的に広く特性決定されている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）およびそれに引用される参考文献を参照のこと）。本明細書において記載される化合物は、天然に存在するα−ＨＬ細孔形成性タンパク質、天然に存在しないα−ＨＬ細孔形成性タンパク質またはそれらの組合せから形成されるα−ＨＬ七量体ナノポアとともに使用できるということが考慮される。一実施形態において、天然に存在する（すなわち、野生型）α−ＨＬ細孔形成性タンパク質サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号２２として示されている（本明細書において記載される置換の位置を決定するのに適した成熟配列であり、したがって、最初のメチオニン残基を含まない）。天然に存在しないα−ＨＬ細孔形成性タンパク質は、以下の置換：Ｈ３５Ｇ、Ｈ１４４Ａ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、Ｄ１２７Ｇ、Ｄ１２８Ｇ、Ｔ１２９Ｇ、Ｋ１３１Ｇ、Ｋ１４７ＮおよびＶ１４９Ｋのうち１つまたは複数を含むバリアント細孔ポリペプチドを含むが、限定されない。その他の適したα−ＨＬ細孔ポリペプチドは、米国特許出願公開第２０１７−００８８５８８号ならびに米国特許出願第１５／４９２，２１４号、同第１５／２７４，７７０号および同第１５／６３８，２７３号に記載されており、それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
[0149]α−ＨＬモノマーの七量体複合体は、脂質二重膜中に埋め込まれ、脂質二重膜を通って細孔を作製するナノポアを自発的に形成する。６：１天然α−ＨＬ対変異体α−ＨＬの比を含むα−ＨＬの七量体は、ナノポアを形成できることがわかっている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐｔａｍｅｒｉｃ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ  ｐｏｒｅ  −  Ａ  ｄｏｍｉｎｏ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．第２７６巻（１８号）：１４８３５〜１４８４１頁およびそれに引用される参考文献のこと）。さらに、α−ＨＬは、多数の位置でシステイン残基置換が挿入されて操作されており、マレイミドリンカー化学（同書）によるタンパク質の共有結合修飾が可能となっている。例えば、操作されたα−溶血素−Ｃ４６（「α−ＨＬ−Ｃ４６」）は、一般的なクリック反応化学を使用して、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素を共有結合によって付けるために使用できるリンカーを用いる修飾を可能にする、Ｋ４６Ｃアミノ酸残基置換を含む。あるいは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１４８４０２に記載されるように、α−ＨＬ七量体を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーション法を使用してＤＮＡ−ポリメラーゼを用いて共有結合によって修飾できる（ＺａｋｅｒｉおよびＨｏｗａｒｔｈ（２０１０年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１３２巻：４５２６〜７頁も参照のこと。
【０１３９】
[0150]一実施形態において、七量体α−ＨＬナノポアは、少なくとも１種の天然に存在するタンパク質（すなわち、野生型）および少なくとも１種の天然に存在しないタンパク質を含む。別の実施形態では、天然に存在しないタンパク質は、Ｈ１４４Ａアミノ酸置換を含む。１つの他の実施形態では、ナノポアは、１つの野生型タンパク質およびＨ１４４Ａ置換を有する６つのタンパク質を含む。他の実施形態では、天然に存在しないタンパク質は、Ｈ１４４Ａアミノ酸置換およびＨ３５Ｇ置換を含む。一部の実施形態においては、ナノポアは、１つの野生型タンパク質ならびにＨ１４４ＡおよびＨ３５Ｇ置換を有する６つのタンパク質を含む。別の実施形態では、七量体α−ＨＬナノポアは、２以上の天然に存在しないタンパク質を含む。一実施形態では、ナノポアは、第１および第２の天然に存在しないタンパク質を含む。１つの他の実施形態では、第１の天然に存在しないタンパク質は、Ｈ１４４Ａ、Ｈ３５Ｇ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、Ｋ１４７Ｎ、Ｄ１２７Ｇ、Ｄ１２８Ｇ、Ｔ１２９Ｇ、Ｋ１３１ＧおよびＶ１４９Ｋ置換を含む。別の実施形態では、第２の天然に存在しないタンパク質は、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、Ｋ１４７Ｎ、Ｄ１２７Ｇ、Ｄ１２８Ｇ、Ｔ１２９ＧおよびＫ１３１Ｇ置換を含む。一部の実施形態においては、ナノポアは、６つの第１の天然に存在しないタンパク質および１つの第１の天然に存在しないタンパク質を含む。
【０１４０】
[0151]したがって、一部の実施形態においては、本開示のイオン流増幅性タグ化合物を、ナノポアデバイスとともに使用でき、ここで、ナノポアは、６：１の天然α−ＨＬ対α−ＨＬの修飾された、または操作されたものを有し、修飾されたα−ＨＬは、ＤＮＡポリメラーゼなどの鎖延長酵素に共有結合によってコンジュゲートされる七量体α−ＨＬ複合体を含む。例えば、操作されたα−ＨＬ−Ｃ４６を、ＤＮＡポリメラーゼのＢｓｔ２．０バリアントを、七量体６：１ナノポアに共有結合によって付けるために、テトラジン−トランス−シクロオクテンクリック化学反応の使用を可能にするリンカーを用いて修飾できる。このような実施形態は、各々が本明細書において参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年３月９日に出願された米国特許仮出願第６２／１３０，３２６号および米国特許出願公開第２０１７−０１７５１８３号に記載されている。
【０１４１】
[0152]本明細書において提供されるイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド、関連する組成物および方法は、当技術分野で公知のポリメラーゼおよびリガーゼなどの広範な鎖延長酵素とともに使用できる。
【０１４２】
[0153]ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型として一本鎖ＤＮＡを使用して、相補的ＤＮＡ鎖を合成する酵素のファミリーである。ＤＮＡポリメラーゼは、新規に形成する鎖の３’末端に遊離ヌクレオチドを付加して、５’から３’方向への新規鎖の延長をもたらす。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼはまた、エキソヌクレアーゼ活性も有する。例えば、多数のＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。このような多機能性ＤＮＡポリメラーゼは、不正確に組み込まれたヌクレオチドを認識し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して、不正確なヌクレオチドを切り出すことができる、プルーフリーディングとして知られる活性。ヌクレオチド切り出し後、ポリメラーゼは、正確なヌクレオチドを再挿入でき、鎖延長を継続できる。いくつかのＤＮＡポリメラーゼはまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も有する。
【０１４３】
[0154]ＤＮＡポリメラーゼは、ナノポアベースの合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む多数のＤＮＡシーケンシング技術において使用される。しかし、ＤＮＡ鎖は、ナノポアを通って迅速に移動することができ（例えば、１塩基あたり１〜５μｓの速度で）、これは、ポリメラーゼによって触媒される各組込み事象のナノポア検出を測定することを困難にすることがあり、高いバックグラウンドノイズを生じやすく、その結果、単一ヌクレオチド分離を得ることが困難になることがある。ＤＮＡポリメラーゼ活性の速度を制御する能力ならびに正しい組込みから得られたシグナルレベルを増大する能力は、合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の際に、特に、ナノポア検出を使用する場合に重要である。実施例において示されるように、本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物は、より良好なシグナル分離およびより低いノイズレベルを提供し、それによって、より正確なナノポアベースの核酸検出およびシーケンシングを可能にする、Ｏ．Ｃ．シグナルを上回る広範な検出可能タグ電流シグナルを提供する。
【０１４４】
[0155]イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物および本開示の方法とともに使用してもよい例示的ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼが挙げられる。
【０１４５】
[0156]一部の実施形態においては、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドとともに有用なポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、セクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）、ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（エキソ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９ＶまたはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）である。
【０１４６】
[0157]一部の実施形態においては、イオン流増幅性タグ付きヌクレオチドを組み込む鎖延長酵素は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態においては、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼの大断片。一実施形態においては、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ  ２．０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡから市販されている）である。
【０１４７】
[0158]一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｐｏｌ６  ＤＮＡポリメラーゼまたは変異Ｄ４４Ａを有するＰｏｌ６などのＰｏｌ６のエキソヌクレアーゼ欠損バリアントである。本開示のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドとともに有用なさまざまなさらなるＰｏｌ６バリアントは、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる２０１６年１１月１７日に公開された米国特許公開第２０１６／０３３３３２７  Ａ１号に記載されている。
【実施例】
【０１４８】
[0159]本開示の種々の特徴および実施形態を、以下の代表的な例において例示するが、これらは、例示であるよう意図され、制限ではない。当業者ならば、具体例は単に、以下の特許請求の範囲において、より十分に記載するような本発明の例示であることを容易に理解するであろう。本出願に記載されるどの実施形態および特徴も、含有されるどの実施形態とも互換可能であり、組合せ可能であると理解されなければならない。
【０１４９】
実施例１
イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物の調製
[0160]この実施例は、構造式（ＩＩＩｄ）のタグ付きヌクレオチド化合物の調製のための一般的な方法を例示し、化合物は、ヌクレオシド−５’−六リン酸を含み、末端リン酸基は、オリゴヌクレオチドを含むイオン流増幅性タグに連結される。より詳しくは、この実施例は、表６に示される以下の３種のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物の調製を記載する。
【０１５０】
【表６】
2019528359.tif 000033
【０１５１】
[0161]スキーム２に全体的に示されるように、合成法は、オリゴヌクレオチドであるイオン流増幅性タグの５’末端を、ヌクレオチド六リン酸（ｄＮ６Ｐ）の末端リン酸基に共有結合によって連結するために、標準Ｃｕ触媒されるアジド−アルキンクリック反応を使用する。
【化１９】
2019528359.tif 000034
【０１５２】
[0162]スキーム２のこの合成法を、特定のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチン（すなわち、式（ＩＩＩａ）［式中、塩基はＴであり、タグは、オリゴヌクレオチド、ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチンである］で示される化合物の調製のために以下に説明する。この同一方法は、表６に列挙される他のタグ付きヌクレオチドを調製するために使用される。
【０１５３】
[0163]Ａ．合成ｄＴ６Ｐ−アジド（化合物（１））
【化２０】
2019528359.tif 000035
【０１５４】
[0164]１１−アジド−１−ウンデカノールの調製：１１−アジド−１−ウンデカノールを、反応スキーム３および以下の手順に従って調製する。
【化２１】
2019528359.tif 000036
【０１５５】
[0165]乾燥丸底フラスコ中で、無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の１１−ブロモ−１−ウンデカノール（１．８４ｇ、７．３８ｍｍｏｌ）の溶液にナトリウムアジド（１．４４ｇ、２２ｍｍ）を添加した。得られた白色懸濁液を、窒素雰囲気下、周囲温度で一晩撹拌した。懸濁液を濾過し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）を用いてすすいだ。溶液を真空濃縮すると、黄色を帯びたオイルが得られた。化合物は、さらなる精製を用いずに、以後のステップにおいて使用できる。
【０１５６】
[0166]１１−アジド−１−ウンデカニル三リン酸の調製：１１−アジド−１−ウンデカニル三リン酸を、反応スキーム４および以下の手順に従って調製する。
【化２２】
2019528359.tif 000037
【０１５７】
[0167]乾燥丸底フラスコ中で、１１−アジド−１−ウンデカノール（０．２０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中に溶解した。サリチルクロロホスファイト（０．２０ｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた溶液を、周囲温度で、窒素下、４５分間撹拌した。別のフラスコ中で、無水ＤＭＦ中のピロホスフェートトリブチルアミン（０．５６６、１．０３ｍｍｏｌ）およびトリブチルアミン（１．３９ｇ、７．５１ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、次いで、反応溶液に添加した。得られた混合物を１時間撹拌し、２０ｍＭヨウ素溶液（８０ｍＬ、１．５５ｍｍｏｌ）を用いて酸化させると、環状メタ三リン酸中間体が得られ、これは質量分析計によって解析できた。さらに１時間撹拌した後、反応を、まずＮａ２ＳＯ３（１０％、４ｍＬ）を用いてクエンチし、２０分間撹拌したままにし、ＴＥＡＢ（０．１０Ｍ、２０ｍＬ）を続けた。得られた混合物を、周囲温度で一晩撹拌した。粗生成物を、ＣＨ３ＣＮ／０．１ＴＥＡＡ（１６分で０％〜５０％  ＣＨ３ＣＮ）を用いて溶出する３０ｇのＨＰ  Ｃ１８カラムを使用するＴｅｌｅＤｙｎｅ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ＲＦ＋カラムシステムによって精製した。生成物を真空濃縮し、凍結乾燥機で乾燥した。
【０１５８】
[0168]ｄＴ６Ｐ−アジド（化合物（１））の調製：ｄＴ６Ｐ−アジドを、反応スキーム５および以下の手順に従って調製する。
【化２３】
2019528359.tif 000038
【０１５９】
[0169]１１−アジド−１−ウンデカニル三リン酸（０．０９１ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解し、カルボニルジイミダゾール（「ＣＤＩ」）（０．０７８ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を用いて周囲温度で４時間活性化した。過剰のＣＤＩを、メタノール（０．０２９ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を用いてクエンチし、さらに３０分撹拌した。次いで、無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中のｄＴＴＰ＋３ＢＵ４Ｎ（０．２０ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、ＭｇＣｌ２（０．１１４ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を続けた。得られたスラリー溶液を、周囲温度で２４〜３６時間撹拌した。反応を、ＴＥＡＢ  ０．１Ｍ（２０ｍＬ）を用いてクエンチし、３０分撹拌した。粗化合物（１）を、イオン交換クロマトグラフィー（３０分で０．１Ｍ〜１Ｍ）によって、続いてＲＰ−Ｃ１８  ＨＰＬＣ（３５分で１０〜４５％  ＣＨ３ＣＮ）によって精製すると、１５〜３０μｍｏｌの生成物が得られた。化合物（１）の形成は、質量分析（陰イオンについて、理論値９１７．０６、実測値９１６．０３）によって確認した。
【０１６０】
[0170]Ｂ．５’−プロパルギル−ＴＴ−（Ｓｐ３）２８−ビオチンオリゴヌクレオチド（化合物（２））の合成
【化２４】
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【０１６１】
[0171]タグとして使用される５’−プロパルギル−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチンオリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ  ３９００  ＤＮＡシンセサイザーで標準固相ホスホロアミダイト化学プロトコールおよび脱塩基３炭素スペーサーアミダイト、（ＳｐＣ３）、およびビオチンアミダイト試薬（例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国、バージニア州、スターリング、２２８２５デイビスドライブから入手可能）を含む市販の試薬を使用して合成した。最後の自動化オリゴヌクレオチド合成ステップにおいて、プロパルギル−Ｃ５−ホスホルアミダイトリンカーを最後から２番目のＴヌクレオチドの５’−リン酸に付加し、化合物（２）のプロパルギル修飾されたオリゴヌクレオチドを得た。
【０１６２】
[0172]Ｃ．タグ付きヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチンを形成するためのクリック反応
[0173]イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド化合物、ｄＴ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチンを形成するクリック反応を、スキーム２の反応および以下の手順に従って実施する。ｄＴ６Ｐ−アジド（化合物（１））（３００ｎｍｏｌ）および５’−プロパルギル−ＴＴ−（Ｓｐ３）２８−ビオチンオリゴヌクレオチド（化合物（２））（１００ｎｍｏｌ）を、ＤＩ−水（１００μＬ）中に混合する。ＤＭＳＯ／ｔ−ブタノール（３：１）の混合物溶液中で臭化Ｃｕ（Ｉ）（６０００ｎｍｏｌ）およびＴＨＰＴＡ（４０００ｎｍｏｌ）を使用する標準文献手順に従って、銅触媒されたアジド−アルキンクリック反応を開始する。反応溶液を、シェーカー上で周囲温度で一晩混合する。粗混合物を、ＲＰ  Ｃ１８−ＨＰＬＣ（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ／ＣＨ３ＣＮ）によって精製する。所望のコンジュゲート生成物、ｄＴ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチンの形成は、質量分析計によって確認される（陰イオンについて、ＭＳ理論値５９３９．８、ＭＳ実測値５９４０．９）。
【０１６３】
[0174]表６の他の２種のタグ付きヌクレオチドの形成も、以下のように質量分析計によって確認される：ｄＣ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ｄＳｐ）２６−ＴＴ−Ｃ３（陰イオンについて、ＭＳ理論値７０３７．７、ＭＳ実測値７０３８．０）、ｄＧ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ２）２８−ビオチン（陰イオンについて、ＭＳ理論値５５７１．９、ＭＳ実測値５５７３．０）。
【０１６４】
実施例２
ナノポアシーケンシングのためのイオン流増幅性タグ付きヌクレオチドの使用
[0175]この実施例は、ポリメラーゼによって組み込まれ得る、４種の基準ヌクレオチド、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧの各々に対応する、４種の異なるタグ付きヌクレオチド化合物（表７中に示される）のセットの改善されたナノポア検出特徴を例示する。
【０１６５】
[0176]
【表７】
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【０１６６】
[0177]セット中、ヌクレオチド六リン酸化合物、ｄＣ６Ｐ、ｄＧ６ＰおよびｄＴ６Ｐは各々、異なるイオン流増強性タグを用いてタグが付けられる。これらの３種の各々は、実施例１に記載されるように形成されたトリアゾールリンカーを介してヌクレオチド六リン酸の末端リン酸に共有結合によって連結された３０のホスホジエステル連結されたモノマー単位（すなわち、オリゴヌクレオチド）の負電荷を有するポリマーを含む。セット中の４番目のタグ付きヌクレオチド六リン酸は、Ｔ３０−Ｃ３オリゴヌクレオチドを用いてタグが付けられたｄＡ６Ｐである。このタグ付きヌクレオチドは、ナノポアを通るイオン流の増大をもたらさないが、むしろ、イオン流の減少が示されるＯ．Ｃ．を下回る遮断電流をもたらすと知られている。
【０１６７】
[0178]手短には、４種のタグ付きヌクレオチドのセットのナノポア検出は、各々Ｐｏｌ６ポリメラーゼにコンジュゲートされたα−ＨＬナノポアのアレイを使用して実施される。α−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポアコンジュゲートは、個別にアドレス可能な集積回路チップのアレイにわたって形成される膜中に埋め込まれる。このα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポアアレイは、ＤＮＡ鋳型および表７中に示される異なるイオン流増強性タグを用いてタグが付けられた３種の異なるヌクレオチド基質のセットに曝露される。ＤＮＡ鋳型と相補的である特異的タグ付きヌクレオチドが捕捉され、Ｐｏｌ６ポリメラーゼ活性部位に結合するので、イオン流増強性タグ部分は、付近にコンジュゲートされたα−ＨＬナノポア中に位置するようになる。ＡＣ電位が印加されている下では、細孔中のタグの存在は、ナノポアを通る正イオン流の増大を引き起こし、Ｏ．Ｃ．電流（すなわち、ナノポア中にタグを有さない電流）よりも大きい、ナノポアデバイス電極で測定される特有の電流をもたらす。相補的ＤＮＡ延長鎖のＰｏｌ６合成の際に、種々のタグ部分がナノポアに入るときに測定される特有のＯ．Ｃ．を上回る電流が、ＤＮＡ鋳型を検出し、同定するために使用され得る。
【０１６８】
[0179]ナノポア検出システム：ナノポアイオン流測定は、浅いウェル内に１２８，０００の銀電極のアレイを有するＣＭＯＳマイクロチップを含むナノポアアレイマイクロチップ（Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡによって製作されたチップ）を使用して実施される。このようなナノポアアレイマイクロチップを製作し、使用するための方法はまた、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、ＵＳ２０１３／０２６４２０７Ａ１号およびＵＳ第２０１４／０１３４６１６Ａ１号に見出すことができ、それらのそれぞれは、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。アレイ中の各ウェルは、生物学的試薬および伝導性塩との一定の接触を可能にする表面修飾を用いて、標準的なＣＭＯＳプロセスを使用して製造される。各ウェルは、ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートが中に埋め込まれたリン脂質二重膜を支持できる。各ウェルの電極は、コンピュータインターフェースによって個々にアドレス可能である。使用されるすべての試薬は、コンピュータによって制御されたシリンジポンプを使用してアレイマイクロチップの上の簡単なフローセル中に入れられる。チップは、アナログからデジタルへの変換を支持し、１秒あたり１０００点を超える速度ですべての電極からの電気的測定値を独立に報告する。ナノポア遮断電流測定は、ミリ秒（ｍｓｅｃ）毎に少なくとも１回、アレイ中の１２８Ｋのアドレス可能なナノポアを含有する膜のそれぞれで非同期的に行い、インターフェースで接続したコンピュータに記録することができる。
【０１６９】
[0180]チップ上での脂質二重層の形成：１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用してチップ上にリン脂質二重膜を調製する。脂質粉末を１５ｍＭでデカンに溶解し、次いで、チップ上のウェルにわたって塗布して層にする。次いで、アレイウェルのシス側を通って空気をポンプで送り、こうして多重層脂質膜を単一二重層に減少することによって、薄化プロセスを開始する。
【０１７０】
[0181]膜へのα−ＨＬ−Ｐｏｌ６コンジュゲートの挿入：脂質二重層がアレイチップのウェル上に形成した後、すべて、２０℃の３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび３００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ、ｐＨ８のバッファー溶液中の、０．１μＭの６：１  α−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲート、０．４μＭの所望のＤＮＡ鋳型を、チップのシス側に添加する。混合物中のナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートは、脂質二重層中に電気穿孔する、または自発的に挿入する。非ポリメラーゼ修飾α−ｈｌナノポア（すなわち、６：１ヘプタマーの６サブユニット）は、Ｈ１４４Ａ突然変異を含む。
【０１７１】
[0182]ＤＮＡ鋳型は、以下の配列を有するダンベル型円形鋳型である：
ＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１１）
【０１７２】
[0183]ナノポアイオン流測定：複合体を膜中に挿入した後、シス側の溶液を、２０℃で３００ｍＭのグルタミン酸カリウム、ｐＨ８、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＬｉＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＴＣＥＰ、１０μＭの４種の異なったタグが付けられたヌクレオチドのセット（そのうち３種は、異なるイオン流増強性タグを用いてタグが付けられている）１０μＭの、イオン遮断性タグを用いてタグが付けられた１種のヌクレオチドによって置き換える。トランス側バッファー溶液は、３８０ｍＭグルタミン酸カリウム、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＬｉＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８である。これらのバッファー溶液を、ナノポアイオン流測定のための電解質溶液として使用する。Ｐｔ／Ａｇ／ＡｇＣｌ電極設定を使用し、−１０ｍＶ〜２００ｍＶ矩形波形のＡＣ電流を５０Ｈｚで印加した。ＡＣ電流は、タグが、反復的にナノポア中に導かれ、次いで、ナノポアから排出されることを可能にし、それによって、ナノポアを通るイオン流に起因するシグナルを測定するより多くの機会を提供するので、ナノポア検出にとって特定の利点を有する。また、正および負のＡＣ電流サイクルの間のイオン流は互いに対抗して、シス側からのイオン枯渇の正味の速度、およびこの枯渇に起因するシグナルに対する可能性ある有害な効果を低減する。
【０１７３】
[0184]４種の別個のイオン流事象を表すタグ電流シグナルが、４種のタグ付きヌクレオチドのセットから、それらが、ＤＮＡ鋳型を用いてプライムされたα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートによって捕捉されるときに観察される。これらの事象のプロットは、経時的に記録され、解析される。一般に、１０ｍＳより長く持続する事象は、鋳型鎖と相補的な正しい塩基のポリメラーゼ組込みと一致する生産的ヌクレオチド捕捉を示す。
【０１７４】
[0185]結果
[0186]図１に示されるように、３種の別個のイオン流増強事象およびイオン流遮断事象を表すシグナルが、４種のタグ付きヌクレオチドのセットから、それらが、ＤＮＡ鋳型を用いてプライムされたα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートによって捕捉されるときに観察される。タグ付きヌクレオチドのセットを用いて実施された関連ナノポアアレイの平均タグ電流値尺度が、表８に示されている。
【０１７５】
[0187]
【表８】
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【０１７６】
[0188]図１のプロットおよび表８中の結果によって示されるように、３種のイオン流増幅性タグ付きヌクレオチド（ｄＣ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ｄＳｐ）２６−ＴＴ−Ｃ３、ｄＴ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ３）２８−ビオチンおよびｄＧ６Ｐ−（リンカー）−ＴＴ−（ＳｐＣ２）２８−ビオチン）は、ナノポアの開口チャネル電流を上回るタグ電流シグナルレベルを示し、これは、ナノポア中のタグの存在が、正イオン流の増大をもたらすことを示す。存在する第４のタグ付きヌクレオチド、ｄＡ６Ｐ−（リンカー）−Ｔ３０−Ｃ３は、開口チャネル電流を下回るタグ電流シグナルレベル（すなわち、遮断電流）を示し、これは、ナノポア中のタグの存在が、ナノポアを通る正イオン流の減少をもたらすことを示す。開口チャネルを上回るタグ電流シグナルを提供する能力は、タグのナノポア検出のためのより広いダイナミックレンジを提供する。このタグのセットに起因するイオン流事象間の広範な広い分離は、ナノポアデバイスを使用する核酸の検出および／またはシーケンシングにおいてより高い正確性を可能にする。
【０１７７】
実施例３
イオン流増幅性タグ付きヌクレオチド
[0189]開口チャネルを上回る検出を可能にするイオン流増幅性特徴を有するさらなるタグ付きヌクレオチド化合物を同定するために、ナノポア検出実験を使用できる。
【０１７８】
[0190]実施例２において記載される一般法に従って実施されるナノポア検出実験は、表９に示されるタグ付きヌクレオチドを同定した。これらのタグ付きヌクレオチドは、ポリメラーゼによって組み込まれることができ、開口チャネルを上回るタグ電流シグナル提供する。
【０１７９】
[0191]
【表９】
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【０１８０】
[0192]本出願中に引用されるすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、すべての目的のために参照により組み込まれるように個別に示されるかのように同程度に、すべての目的のために、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
[0193]種々の特定の実施形態を例示し、記載してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の変法を行うことができるということは認められよう。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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