【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年5月11日(2007.5.11)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】変種に無関係の迅速な植物形質転換方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】遺伝子物質を植物に導入する方法であって、
５’及び３’切り出し可能のフランキング配列を有する異種核酸で形質転換された第１の植物をつくる工程を備え、前記配列は前記異種核酸を一方のゲノムから別のゲノムへ移すことができ、更に
第２の植物と形質転換された第１の植物とを交雑させる工程を備え、前記第１の植物と第２の植物は交雑により不安定な後代をつくりまたは優先分離もしくは選別を示し、更に
前記異種核酸を含む（ｂ）の第２の植物の後代を選定する工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】前記５’及び３’切り出し可能のフランキング配列は転移因子を備え、前記第１の植物、前記第２の植物または前記第１の植物と前記第２の植物の双方は前記転移因子に特異のトランスポザーゼをつくることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記５’及び３’切り出し可能のフランキング配列は組換え座位であり、前記第１の植物、前記第２の植物または前記第１の植物と前記第２の植物の双方は前記組換え座位に特異のリコンビナーゼをつくることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記第１の植物はトリプサカムであり、前記第２の植物はメイズであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記第１の植物はトリプサカムであり、前記第２の植物は小麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記第１の植物はトリプサカムであり、前記第２の植物は大麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記第１の植物はトリプサカムであり、前記第２の植物はオート麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記第１の植物はオリコフラグムスであり、前記第２の植物は十字花科の植物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記第１の植物はアラビドプシスであり、前記第２の植物は十字花科の植物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記十字花科の植物はカノーラであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】前記第１の植物はグリシントメンテラであり、前記第２の植物は大豆であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記第１の植物はソラナムフレジャであり、前記第２の植物はジャガイモであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記第１の植物はメイズであり、前記第２の植物は小麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】前記第１の植物はメイズであり、前記第２の植物は大麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】前記第１の植物はメイズであり、前記第２の植物はオート麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記第１の植物はペニセタムであり、前記第２の植物は小麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】前記第１の植物はペニセタムであり、前記第２の植物は大麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】前記第１の植物はホーデウムブルボサムであり、前記第２の植物は大麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】前記第１の植物はホーデウムブルボサムであり、前記第２の植物は小麦であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】前記第１の植物はオリザミヌタであり、前記第２の植物はイネであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】前記第１の植物はニコチアナディグルタであり、前記第２の植物はニコチアナタバカムであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】前記第１及び第２の植物の一方または双方はＳｅセミガミ突然変異を担持する綿であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】前記第１及び第２の植物の一方は多胚現象を引き起こすｍｓ突然変異を担持する大豆であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】前記第１の植物はアラビドプシスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】遺伝子物質を植物に導入する方法であって、
（ａ）５’及び３’切り出し可能のフランキング配列を有する異種核酸で形質転換された第１の植物の細胞または原形質体をつくる工程を備え、前記配列は前記異種核酸を一方のゲノムから別のゲノムへ移すことができ、更に
（ｂ）前記細胞または原形質体を第２の植物の細胞または原形質体と融合して融合細胞または融合原形質体をつくる工程を備え、前記第１と第２の植物は交雑により不安定な後代をつくりまたは優先分離もしくは選別を示し、更に
（ｃ）融合細胞または融合原形質体から植物全体を再生する工程と、
（ｄ）前記異種核酸を含む工程（ｃ）の前記再生植物の後代を選定する工程とを備えることを特徴とする方法。
【請求項２６】前記５’及び３’切り出し可能のフランキング配列は組換え座位であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記融合は前記組換え座位に特異のリコンビナーゼを含む培地で行われることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】前記第１の植物種、前記第２の植物種または前記第１と第２の植物種の双方は前記組換え座位に特異のリコンビナーゼをつくることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】前記５’及び３’切り出し可能のフランキング配列は転移因子からなり、前記第１の植物、前記第２の植物または前記第１及び第２の植物の双方は前記転移因子に特異のトランスポザーゼをつくることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】前記第１の植物はアラビドプシスであり、前記第２の植物は綿であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】前記第１の植物はアラビドプシスであり、前記第２の植物は大豆であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】前記第１の植物はアラビドプシスであり、前記第２の植物はイネであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】請求項１または２４に記載の方法によりつくられる異種核酸を含む全植物。
【請求項３４】請求項３３に記載の全植物からの種子または種子部分。
【請求項３５】請求項３３に記載の植物の後代。
【請求項３６】請求項２５に記載の方法の工程（ｂ）によりつくられる融合細胞または融合原形質体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、関心のある遺伝物質を植物に導入する方法、より特定すると、遺伝子レベルで操作するのが困難であることがわかった植物種の形質転換及び系統転換(line conversion)に関する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
植物を遺伝子工学的に処理する方法が、最近２０年間で発展してきた。一般に、この方法は、植物細胞へのＤＮＡの直接導入によるか、あるいはアグラバクテリウムチュメファシエンス(Agrabacterium tumefaciens)により仲介される間接移行(transfer)に基づく。直接移行に関する方法には、ポリエチレングリコールまたは電気穿孔法(electroporation)を使用した裸の植物細胞、または、原形質体へのＤＮＡ導入及び培養植物組織の粒子衝撃(particle bombardment)が含まれる。例えば、Biotech. Adv.、第１０巻、第３９４乃至４１２頁（１９９２年）に掲載のサワヘル(Sawahel)及びコーブ(Cove)の論文、Cur. Opinion Biotech、第４巻、第１３５−１４１頁（１９９３年）に掲載のクリストウ(Christou)の論文、Cur. Opinion Biotech、第９巻、第２２７−２３２頁（１９９８年）に掲載のゲルビン(Gelvin)の論文、並びに、Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.、第４８巻、第２９７−３２６頁（１９９７年）に掲載のバーチ(Birch)の論文を参照されたい。ほとんどの方法は、変種特異性である(variety-specific)インビトロ成長再生可能植物系の使用に基づくので、変種特異性である。ジャガイモ、トマト及びカノーラ(canola)のような幾つかの経済的に重要な作物を除いて、利用することができる形質転換法は、現時点では、少数の変種だけで実施されている。
【０００３】
従来の戻し交雑育種(backcross breeding)法は、一の系統（ドナー）から別の系統（反復親）への形質転換機構を提供している。J. Heredity、第１３巻、第３１９−３２２頁（１９２２年）に掲載のハーラン(Harlan)及びポウプ(Pope)等の論文を参照されたい。これは、コーン、大豆及び綿に特に有用となっている。戻し交雑育種を首尾よく行うには、予め得られる反復親(recurrent parent)、選定の際の関心のある形質の保持、反復親のゲノムを再構成するのに十分な戻し交雑が必要となる。ワイリー・アンド・サンズ(Wiley and Sons)発行（１９６０年）、アラード(Allard)著の「プリンシプルズ・オブ・プラント・ブリーディング(Principles of Plant Breeding)」を参照されたい。戻し交雑の際に、ハイブリッド集団は、次式
ホモ接合度の割合＝１−０．５ｍ
ｍは戻し交雑世代数である
により示される割合で反復親の遺伝子に関して、次第にホモ接合となる。この式を使用することにより、９８％を越えるハイブリッドゲノムが六世代後に反復親の遺伝子に関してホモ接合となることを計算することができる。しかしながら、この式は、移入されている遺伝子に対して結合されていないゲノムの領域を示すだけである。結合されている領域がホモ接合度に近づく割合は、染色体組換え頻度による。従来の戻し交雑育種の有効性を評価する最も詳細な研究の１つにおいては、トマトの８つのＴｍ−２−転換された同質遺伝子系統が、９つのフランキング制限フラグメント長さ多形(flanking restriction fragment length polymorphism)(RFLP)位置において試験された。Theor. Appl. Genet.、第７７巻第３５３−３５９頁（１９８９年）に掲載のヤング(Young)及びタンクスリ−(Tanksley)の論文を参照されたい。戻し交雑の１０世代後に見出されかつ更なる９世代に亘ってサイズの減少なしに保持された最小ドナー染色体フラグメントは、４ｃＭであり、１１世代後にも見受けられた最大サイズは、５１ｃＭであった（即ち、対応する染色体の半分よりも大きい）。単純シーケンスリピート(simple sequence repeats)(SSR)またはＲＦＬＰに基づくマーカ介助選定(marker-assisted selection)においては、その再構成は、より迅速にかつより明瞭に行われると考えられるが、比較的高価な方法を使用する、後代の相当の大きさの集団のスクリーニングが必要となるとともに、独立した一次形質転換細胞におけるトランスジーン(transgene)のランダムな挿入により複雑になる。
【０００４】
率直に述べると、ほとんどの作物植物に関しては、数百の系統、ハイブリッドまたは変種が同時に必要となるので、戻し交雑は、ささいな作業ではない。例えば、１９９８年には、合衆国の大豆種子市場は、５００を越える変種からなるとともに、合衆国のメイズ種子市場は６００を越えるハイブリッドを含むものであった。戻し交雑方法の別の大きな欠点は、著しく時間がかかることである。反復戻し交雑を介して系統転換するには、通常、３乃至５回の連続する戻し交雑が必要となり、少なくとも２年、多いときには４年以下の年月が変種開発時間に加えることが必要となる。
【０００５】
今日の形質転換方法には、数多くの不利な点がある。例えば、系統転換は、異種のＤＮＡを、種々の形態の生殖（即ち、授粉）または体細胞（即ち、細胞）ハイブリッド形成を使用して、一の植物種または変種から別の植物種または変種に転換する方法である。現在の方法は、種特異性及び変種特異性であるので、一次形質転換細胞から関心のある多重変種へトランスジーン移行させることができる系統転換技術と組み合わせた場合にのみ商業的に使用することができる。更に、現在の方法は、形質転換にトランスジーンを宿主ゲノムにランダムに挿入するものである。従って、安定であり、かつ、遺伝することができるとともに、適正なトランスジーン発現を許容することができる形質転換イベントを識別するために、数多くの独立した形質転換イベントの広範なスクリーニングが必要となる。その後のトランスジーンの挿入は、同じ座位に行うことができず、従って、育種が複雑となる。結合ドラッグ(linkage drag)（即ち、所望しない形質の共遺伝）と、多重独立トランスジーン形質を取り扱う能力の制限とにより、更なる難問が生ずる。
【０００６】
（発明の概要）
本発明によれば、核酸を植物に導入して、遺伝子工学処理された(genetically engineered)植物をつくる方法が提供されている。この方法は、既存の技術によっては遺伝子学的に修正するのが極めて困難であったコーン(corn)及び小麦のような植物に適用することができる。更に、本発明の方法は、遥かに短い時間で同じあるいは一層良好な結果を得ることができるので、戻し交雑方法と比べて有意に改良を行うことができる。
【０００７】
関心のある核酸は、関心のある植物、即ち、受容体(recipient)と呼ばれるものに直接導入されるものではない。核酸は、直接導入されるのではなく、先づ、ドナーまたはクリップボード種(clipboard species)と呼ばれる、受容体とは異なる別の植物に提供される。次に、核酸は、ドナーから受容体に移される。一の方法においては、生殖ハイブリッド形成即ち２つの植物の「交雑」を伴う。ドナーからの花粉は、受容体植物に授粉を行うのに使用される。別の方法は、細胞レベルに対して行われ、ドナーの細胞または原形質体と受容体植物が融合を行う。本発明の一の特徴によれば、核酸は、ドナーの生来のゲノムＤＮＡを動かすことなく、ドナーから受容体へ移ることができる。これは、通常は不安定なハイブリッドを生ずるドナー／受容体対の選定により行われる。これは、それぞれのゲノムが不安定であり、かくして、「ハイブリッド」植物をつくるようには混じり合わないことを意味する。以下、この現象を、「不安定な後代をつくるあるいは優先分離(segregation)または選別(sorting out)を行う」と云う。受容体とドナーの染色体の一時的な共存の際には、関心のある遺伝子または核酸は、受容体植物のゲノムへ移される。本発明の別の特徴は、核酸のランダムな位置への転移を許容する、または、受容体のゲノムにおける特定位置への核酸の挿入を指向するフランキング配列(flanking sequence)で関心のある核酸を包囲することにより、核酸のランダムなまたは座位特異導入を行うことにある。
【０００８】
従って、本発明の一の観点によれば、遺伝子物質を植物に導入する方法が提供されている。この方法は、
異種核酸の一のゲノムから別のゲノムへの移行を許容する５’及び３’切り出し可能の(excisable)フランキング配列(flanking sequence)を有する該異種核酸で形質転換された第１の植物をつくる工程と、
第２の植物及び形質転換された第１の植物を交雑させる工程とを備え、第１と第２の植物は、交雑を行うと、不安定な後代をつくりまたは優先分離もしくは選別を行い、更に
異種核酸を含む（ｂ）の第２の植物の後代を選定する工程を備えている。
【０００９】
好ましい実施の形態においては、５’及び３’切り出し可能フランキング配列は、転移因子(transposable element)からなり、第１の植物、第２の植物または第１の植物と第２の植物の双方は、転移因子に特異のトランスポザーゼ(transposase)を生産する。別の好ましい実施の形態においては、５’及び３’切り出し可能フランキング配列は、組換え座位であり、第１の植物、第２の植物または第１と第２の植物の双方は組換え座位に特異のリコンビナーゼ(recombinase)を生産する。
【００１０】
本発明の別の好ましい実施の形態においては、ドナーまたはクリップボード種とも云う第１の植物は、トリプサカム(Tripsacum)であり、受容体とも云う第２の植物は、メイズ(maize)、小麦、大麦またはオート麦である。別の好ましい実施の形態においては、ドナーは、オリコフラグムス(Orychophragmus)であり、受容体はカノーラのような十字花科の植物(crucifer)である。別の好ましいドナー／受容体の対は、グリシントメンテラ(Glycine tomentella)／大豆、ソラナムフレジャ(Solanum phreja)／ジャガイモ、メイズ／小麦、メイズ／大麦、メイズ／オート麦、ペニセタム(Pennisetum)／小麦、ペニセタム／大麦、ホーデウムブルボサム(Hordeum bulbosum)／大麦、ホーデウムブルボサム／小麦、ニコチアナディグルタ(Nicotiana digluta)／ニコチアナタバカム(Nicotiana tabacum)及びオリザミヌタ(Oryza minuta)／イネである。
【００１１】
別の好ましい実施の形態においては、ドナー及び／または受容体植物は、Ｓｅセミガミ(Se semigamy)突然変異を担持する。更に別の好ましい実施の形態においては、ドナー及び／または受容体植物は、多胚現象を引き起こすｍｓ突然変異を担持する大豆である。
【００１２】
方法の別の好ましい実施の形態においては、トランスジーンは、インテグレイティブ遺伝子座(integrative locus)として、目標とされる組換えを介して特異の所定のゲノム座位に向けられる。
【００１３】
本発明の関連する観点によれば、体細胞レベルで行われる、遺伝子物質を植物に導入する方法が提供されている。この方法は、
異種核酸の一のゲノムから別のゲノムへの移行を許容する５’及び３’切り出し可能のフランキング配列を有する該異種核酸で形質転換された第１の植物の細胞または原形質体をつくる工程と、
この細胞または原形質体を第２の植物の細胞または原形質体と融合させて融合細胞または融合原形質体をつくる工程とを備え、第１と第２の植物は、交雑すると、不安定な後代をつくりあるいは優先分離または選別を行い、
融合細胞または融合原形質体から植物全体を再生する工程と、更に
異種核酸を含む再生植物の後代を選定する工程とを備えている。融合細胞または融合原形質体自体もまた、提供されている。更に、本発明の方法は、本発明の方法の最終生成物が、一次形質転換細胞（即ち、ドナー）の内在するＤＮＡを遺伝子学的に欠いている個々の植物であるので、他の方法によりつくられる遺伝子組換え植物とは異なる遺伝メイクアップ(genetic make-up)を有する植物を生産する。植物の後代、植物の部分並びに植物からの種子及び種子部分もまた、提供されている。
【００１４】
本発明の方法は、実質上全ての作物種、特に、経済的に重要な変種におけるトランスジーン操作を行うものである。この方法は、実質上全ての作物種に広く適用することができるだけでなく、結合ドラッグ及び変種独立性のない迅速（１つまたは２つの交雑）な方法である。更に、本発明の方法は、他の変種との交雑後に回収することができない複雑な系統／ハイブリッドの遺伝子工学処理に使用することができる形質転換及び系統変換の変種独立方法のみである。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、好ましくはトランスポゾン(transposon)仲介のまたは相同のもしくは非相同の組換え機構により切り出し／再挿入可能な構造体を有するドナー種または突然変異体を形質転換し、ドナーを受容体と交雑させ、受容体からの異種核酸の切り出し及びドナー親染色体(donor parental chromosome)への組込みのために誘起または選定を行い、最後に関心のあるトランスジーンを運ぶまたは担持する実質上遺伝子学的に純粋な受容体植物である後代を選定することにより、形質転換された植物をつくるものであり、ドナー及び受容体生物は、不安定でありかつゲノム不安定性と一方または双方の純粋な親の遺伝子型の分離とを示すハイブリッドを、生殖／体細胞ハイブリッド形成によりつくる種／突然変異組み合わせ体から選ばれる。異種遺伝子物質の流れは、相同／相同染色体間の組換えを示さず、かつ、不安定であり、しかも有子分裂または減数分裂により一方のタイプまたは双方のタイプの純粋な親ゲノムを選別するハイブリッドを生殖／体細胞ハイブリッド形成によりつくる受容体及びドナー生物の種または突然変異体の組み合わせを利用することにより、遺伝子操作の際に常在の(resident)遺伝子の流れから完全に分離される。
【００１６】
「植物」("plant")とは、全ての顕花植物、並びに、植物の全ての形態、系統及び変種を含むものである。本明細書における「形質転換される」("transformed")とは、異種のＤＮＡを細胞に組み込むことにより遺伝子学的に修正されることを意味する。「異種の」("heterologous") とは、受容体植物においては通常みられないＤＮＡを意味する。
【００１７】
種間／属間ハイブリッドにおける種特異染色体除去（ゲノム分離）は、周知の現象である。しかしながら、多くの場合においては、主な育種努力は、外来の染色体物質の移入の方法として２つの親ゲノム間の染色体交換に向けられているので、不安定なハイブリッドは重要性が制限されていた。本発明がなされる以前は、親ゲノムを分離する不安定なハイブリッドは、半数体植物をつくるシステム（半数体小麦、大麦、ジャガイモ生産の種間、属間交雑）に関して、あるいは（トリプサカムからメイズまたはグリシントメンテラから大豆へのような）野生種から栽培作物への染色体物質の移入を行う試みの負の結果に関してのみ説明されていた。
【００１８】
一般に、作物種（その全ての変種及び系統を含む）ごとに、ハイブリッド形成が行われると、不安定なハイブリッドを形成するとともに、本明細書において定義されているようなドナーまたはクリップボード植物として作用することができる野生の類縁(relative)または変異体形態物がある。かかる生物を識別する実験方法として、関心のある作物種を数多くの間連種と交雑させかつ得られる後代の遺伝学上のメークアップを試験する方法がある。主として単親(uniparental)である後代を予め識別する方法が、文献において公知となっており、これは、異なる選択的または非選択的な特徴に基づくものである。後代の広範かつ信頼性のある遺伝子型を定める方法は数多くあり、簡単であり、ゲノムＤＮＡにおける種々のマーカを分析するものである。このような最初にスクリーン処理し、次いで遺伝子型を定める方法によれば、適宜のクリップボード生物を素早く識別することができる。このような基本的な基準を越えて、一次ハイブリッドまたはその後代の細胞において十分な持続時間のハイブリッド状態を提供するように、ドナー／受容体対が選ばれる。完全な除去が所望の最終状態であるが、同じ細胞における双方の種の染色体の共存の相対的な持続時間は、「クリップボード」生物からのトランスジーン遺伝子座位の切り出し及び受容体染色体の染色体へのその組込みに十分な時間を提供することができるので、重要である。
【００１９】
物理的な相互作用、特に、ハイブリッドにおける親ゲノム間の染色体物質交換は、数多くの異なる方法で、除去しまたは最小にすることができる。最も周知の方法は、種間または属間ハイブリッド形成の使用に基づくものである、得られるハイブリッドは、相同染色体の対形成をほとんど示さず、かくして、交差(crossover)を制限している。更に、かかるハイブリッドの多くは、幾分遺伝学的に不安定であるとともに、１つの親ゲノムの迅速除去の傾向を示す。従って、このような交雑を使用することにより、２つの遠い親生物の染色体をハイブリッドの核に配置することにより、親間でのトランスジーン物質のやりとりに対してハイブリッド状態をつくることができる。しかしながら、２つの親の常在染色体物質は実質上相互作用を行わず、その後の染色体の除去により、Ｆ０、Ｆ１またはＢＣ１後代ですぐに、１つの親の除去を行うことができる。
【００２０】
一時的なハイブリッド状態を許容し、次いで、純粋な親ゲノムの迅速な回収を行う方法としての、遠い種間でのハイブリッド形成のほかに、同様の結果を得ることができる他の方法がある。一のかかる方法として、染色体交差を少なくしもしくはなくす変異体及び／または種内及び種間交雑における純粋な親ゲノム分離を引き起こす変異体の使用に基づくものがある。一例として、綿のセミガミがあり、精子核が卵細胞に入ってその後に核融合を行わせる突然変異は行われないものと考えられ、双方の核は独立して分割して、父性及び母性型の半数体組織のセクタに関してキメラルである(chimeral)Ｆ１植物を得る。J. Hered、第５８巻、第５５−５７頁（１９６７年）に掲載のターコット(Turcotte)及びフィースタ(Feaster)の論文を参照されたい。別の方法として、全半数体数の染色体を含むリングを還元分裂において有する正常な群体とＦ１が交雑するように全ての染色体が転位に関連している、十分に特徴づけられたオエノテラ系(Oenothera system)がある。更に別の方法として、照射（N.Z.J. Bot.、第１８巻、第２０３−２０９頁（１９８０年）に掲載のパンディ(Pandy)の論文）などのような化学的／物理的処理を使用するものがあり、一方の親は、損傷を受け、その後、損傷を受けたゲノムが優先除去される。かかる方法は、ガンマ線照射花粉を用いた受粉を行った後の雌性発生タマネギ植物の生産において用いられている。Plant Breeding、第１１１巻、第１４２−１４７頁（１９９３年）に掲載のドア(Dore)及びマリエ(Marie)の論文を参照されたい。
【００２１】
ある所定の植物に関して本発明を実施する場合には、迅速ゲノム分離に特徴がある遺伝子学的に不安定なハイブリッドを許容することができる野生のまたは遠い類縁を見出すことができる。経済的に重要な作物を含む十分に特徴づけられた組み合わせを、以下において説明する。
【００２２】
双子葉植物の作物について説明すると、ジャガイモに関して最も研究された事例は、商業的な編集のジャガイモのソラナムチュベロサム(Solanum tuberosum)と野生種のソラナムフレジャ(Solanum phureja)とのハイブリッド形成である。ハイブリッド胚における早期のフレジャ染色体除去の結果として、高頻度の半数体の生産がもたらされる。Crop.Sci.、第４巻、第５９３−５９５頁（１９６４年）に掲載のヒューガス(Hougas)等の論文及びTheor. Appl. Genet.、第８２巻、第５４５−５５１頁（１９９１年）に掲載のクルロウ(Clulow)等の論文を参照されたい。カノーラ／ナタネに関しては、ブラシカナパス(Brassica napus)とオリコフラグムスビオラシアス(Orychophragmus violaceous)とのハイブリッドにおける親ゲノムの体細胞分離が、Theor. Appl. Genet.、第９１巻、第１３１−１３６頁（１９９５年）に掲載のリ、ズィー(Li, Z.)等の論文、Hereditas、第１２５巻、第６９−７５頁（１９９６年）に掲載のリ(Li)等の論文、Theor. Appl. Genet.、第９６巻、第２５１−２６５頁（１９９８年）に掲載のリ、ズィー(Li, Z.)等の論文、Plant Breeding、第１１６巻、第２５１−２５７頁（１９９７年）に掲載のウ、ジェイ(Wu, J.)等の論文に記載されている。このハイブリッドは、形態学的には中間であるが、自家受精であり、自家受精すると、ほとんどの場合、ブラシカナパス(B. napus)を生ずる。オリコフラグムス(Orychophragmus)法は、経済的に重要な２つの他のブラシカ種であるブラシカジュンシア(Brassica juncea)及びブラシカカリナタ(Brassica carinata)とともに実施される。これはまた、ブラシカオレラシア(B. oleracea)、ブラシカカンペストリス(B. campestris)、ラファヌスサティブス(Raphanus sativus)のような他の経済性のある十字架花科の植物とともに実施される。大豆に関しては、大豆とグリシントメンテラ(Glycine tomentella)とのハイブリッドの後代における野生種ゲノムの除去が、Theor. Appl. Genet.、第８０巻、第１７−２３頁（１９９０年）に掲載のシューメイカ(Shoemaker)等の論文に掲載されている。傾母植物の更に別の例が、フラガリアベスカ(Fragaria vesca)（いちご）とフラガリアチロエンス(Fragaria chiloens)またはフラガリアバージニアナ(F. virginiana)との交雑から得られる（Genetics、第１１巻、第５９０−６０４頁（１９２６年）に掲載のイチジマ(Ichijima)の論文）とともに、ニコチアナディグルタ(Nicotiana digluta)とニコチアナタバカム(N. tabacum)との交雑による傾父植物もある（タバコ、Amer. Nat.、第６３巻第２７９−３２２頁（１９２９年）に掲載のクラウゼン(Clausen)及びラマーツ(Lammerts)の論文）。
【００２３】
単子葉植物に関しては、Ann. Rev. Genet.、第５巻、第４４７−４７８頁（１９７１年）に掲載のガリナット(galinat)の論文及びEvolution、第２７巻、第６４４−６５５頁（１９７３年）に掲載のガリナットの論文には、二倍体メイズと二倍体トリプサカムダクチロイデス(Tripsacum dactyloides)との交雑において、Ｆ１ハイブリッドが予期された両性半数体染色体数を有していることが記載されている。しかしながら、トリプサカムの染色体は、減数分裂で対を形成せず、しかもトリプサカム染色体は減数分裂だけでなく、有糸分裂の際にも失われる傾向があるので、二倍体メイズはＢＣ１ですぐに回収された。これらの結果は、世界中の数多くの生育実験において日常的に再現されている。小麦または大麦が野生種のホーデウムブルボサムと交雑されると、受精及びその後のブルボサムゲノムの除去の結果として、高頻度の半数体が得られる（Nature、第２２５巻、第８７４−８７６頁（１９７０年）に掲載のカシャ(Kasha)及びカオ(Kao)の論文、Nature、第２５６巻、第４１０−４１１頁（１９７５年）に掲載のバークレイ(Barclay)の論文）。この方法は、双方の作物の数多くの変種の半数体の生産に広く使用されている。ブルボサム法の代わりに種々の交雑が行われていて、この場合には、小麦（トリチカムエスチバム(Triticum estivum)及びトリチカムターギダム(T. turgidum)の双方）、トリチケール(triticale)または大麦植物を、メイズ、モロコシ、トウジンヒエまたはトリプサカムの花粉により授粉させる。得られるハイブリッドは、著しく不安定であり、原則として、得られる植物は母性ゲノムだけを保持する。この半数体法は、多数の小麦変種を用いて行われ、実質上変種独立性である。Theor. Appl. Genet.、第７６巻、第３９３−３９７頁（１９８８年）に掲載のラウリー(Laurie)及びベネット(Bennett)の論文、Jap. J. Breed.、第４２巻、第８９１−８９４頁（１９９２年）に掲載のオーカワ(Ohkawa)の論文、Jap. J. Breed.、第４１巻、第３５３−３５７頁（１９９１年）に掲載のウシヤマ(Ushiyama)等の論文、Jap. J. Breed.、第４１巻、第１７５−１７９頁（１９９１年）に掲載のフルショ(Furusho)等の論文、Genome、第３２巻、第１０６３−１０６７頁（１９８９年）に掲載のラウリー(Laurie)の論文を参照されたい。この方法はまた、オート麦における半数体の生産にも適用することができる。優先ゲノム分離はまた、オリザサチバ(Oryza sativa)及びオリザミヌタ(O. minuta)のような種間イネ（オリザ）組み合わせの後代においても起こる。Theor. Appl. Genet.、第９３巻、第６６４−６７１頁（１９９６年）を参照されたい。
【００２４】
以上のように、文献には、本発明に従って使用されたときに、異種の遺伝子物質が交換され得る一時的なハイブリッド状態を形成することができる、数多くの十分に特徴づけられたハイブリッド形成組み合わせ体の例が提供されている。更に、多くの野生種は、重要な作物の多数の種への迅速かつ結合ドラッグのないトランスジーンの移入のトランスジーンドナーとして使用することができる。野生種には、（例えば、メイズ、小麦、大麦及びオート麦の）トリプサカム、（例えば、イネ）のオリザミヌタ、（例えば、カノーラその他の経済的に重要な十字花科の植物の）オリコフラグムス、（例えば、ジャガイモの）ソラナムフレジャ及び（例えば、大豆の）グリシントメンテラが含まれる。綿のセミガミ変異体のような変異体または大豆において多胚現象を引き起こすｍｓ突然変異もまた、同じ目的に使用することができる。同様の種の組み合わせまたは変異体を、サトウキビ、さや豆植物及びトマトを含む他の重要な作物種に関して容易に識別することができる。ドナー種を、遺伝子情報、関心のあるトランスジーンの切り出しを行うのに必要な遺伝子指示及び相同または非相同組換え機構に基づく他の染色体への再組込み並びに関心のあるＤＮＡを含む外因性または異種の構造体を用いて形質転換される。望ましい形質転換細胞の選定を容易にするために、構造体はまた、監視されるべき特徴（例えば、抗生物質もしくは除草剤耐性または表現型マーカ、特に、ベータ−グルクロニダーゼ及び／または緑蛍光タンパク質）のような選択性マーカをエンコードするＤＮＡを含む。関心のあるＤＮＡは、異なるタンパク質をエンコードする１つ以上の遺伝子を含むことができる。受容体植物の後代における遺伝子の発現により、菌、ウイルス及び／または細菌による疾病、ペスト、殺虫剤または環境ストレスに対する耐性を一層大きくすることができ、あるいは風味特性、貯蔵特性または栄養特性を改良することができる。受容体生物は、未形質転換植物とすることができ、あるいはドナーのゲノムの外因性のＤＮＡ挿入との相同組換え交換に必要なゲノム特異座位に含むように形質転換された植物とすることができる。
【００２５】
好ましい実施の形態においては、異種ＤＮＡは、（１）トランスポゾン仲介の非相同トランスジーンの移入または（２）相同組換え機構を利用する目標にされた移行に基づく系を介してドナーから受容体に移される。トランスポゾンは、植物のゲノムの実質的な部分からなるとともに、著しい表現型の多様性をつくることができる移動可能の遺伝子因子である。転移因子は、切り出すことができるとともに、染色体の別の遺伝子座に再挿入することができるＤＮＡの移動可能のセグメントである。植物のトランスポゾンは、説明している第１の移動可能なＤＮＡ因子の中にあり、Ａｃ／ＤＳ、Ｍｕ及びＥｎ／Ｓｐｍのようなクローン処理された多数の植物の転移因子を本発明において使用するのが好ましい。これらの転移因子は、現在は、植物の分子生物学及びバイオテクノロジにおいて遺伝子ツールとして使用されている。かかる転移因子は、植物開発研究並びにいわゆる挿入突然変異誘発及び標識処理を介しての植物遺伝子単離及び植物ゲノム分析に関して非常に貴重なツールとして作用する。例えば、Ann. Rev. Plant Mol. Biol.、第４３巻、第４９−８２頁（１９９２年）に掲載のウォルボット(Wolbot)の論文を参照されたい。本発明において使用する転移因子の別の例が、フェドロフ(Fedoroff)の米国特許第４，７３２，８５６号、ドゥーナーク(Doonerk)等のＰＣＴ出願ＷＯ９１／１５６０７４号など、ヨーダー(Yoder)及びラスナー(Lassner)のＰＣＴ出願ＷＯ９２／０１３７０号、並びに、エビヌマ等のＰＣＴ出願ＷＯ９６／１５２５２号に記載されている。
【００２６】
本発明の目的においては、トランスジーンのトランスポゾンに基づく切り出し及び再挿入は、交雑の際に常在する植物遺伝子の動きからトランスジーンの動きを断絶させることができるとともに、１つだけの遺伝子構造体において１つの形質転換工程を介してトランスジーンの切り出し及び再挿入を行わせる完全な指示を与えるという更なる重要な利点を提供する系である。かくして、この系は、受容体生物におけるランディング座位の遺伝子工学を必要としない。
【００２７】
別の好ましい実施の形態においては、異種ＤＮＡは、リコンビナーゼ(recombinase)と組換え座位との組み合わせを使用することにより、受容体のゲノムの特異座位において組み込まれる。バクテリオファージ及び酵母からの座位特異リコンビナーゼは、試験管及び生きている生物の双方においてＤＮＡを操作するツールとして広く使用されている。本発明において使用するのが好ましいリコンビナーゼ／組換え座位の組み合わせは、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ、ＦＬＰ−ＦＲＴ及びＲ−ＲＳであり、Ｃｒｅ、ＦＬＰ及びＲは、リコンビナーゼであり、Ｌｏｘ、ＦＲＴ及びＲＳは組換え座位である。イントロンエンコードされた酵母エンドヌクレアーゼＩ−Ｓｃｅｌを含む他の適宜の系を使用することができる。Mol. Cell Biol.、第１５巻、第１９６８−１９７３頁（１９９５年）に掲載のクーリカ(Choulika)等の論文を参照されたい。植物において機能するためには、これらの座位は、１２乃至１３塩基対（ｂｐ）逆方向反復間でコア配列の７−８のｂｐを必要とし、非対称コア座位が、座位の配向、従って、組換え生成物のタイプを決定する。組換え座位が正面配向または反対配向状態で１つのＤＮＡ分子上または内にあるのか、あるいは未結合の線形または円形のＤＮＡ分子に配置されているのかに拘わらず、対応するリコンビナーゼは、往復交換に対して触媒作用を行うことにより、除去、反転、転位または共組込みを行うことができる。Ann. Rev. Genet.、第２３巻、第１９９−２２５頁（１９８９年）に掲載のボラッグ(Bollag)等の論文、Trends Genet.、第９巻、第４１３−４２１頁（１９９３年）に掲載のキルビー(Kilby)等の論文及びCurr. Opinion Biotech.、第７巻、第１８１−１８６頁（１９９６年）に掲載のオウ(Ow)の論文を参照されたい。本発明においては、リコンビナーゼ仲介の座位特異転位は、異なる、特に、非相同の染色体間で生ずる。このイントランス(in-trans)リコンビナーゼ作用は、ハイブリッドにおける異なる親に属する２つの染色体間のトランスジーンの移入を行わせるために重要である。Gene、第９１巻、第７９−８５頁（１９９０年）に掲載のデイル(Dale)及びオウ(Ow)の論文、Mol. Gen. Genet.、第２２３巻、第３６９−３７８頁（１９９０年）に掲載のオウデル(Odell)等の論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８８巻、第１０５５８−１０５６２頁（１９９１年）に掲載のデイル (Dale)及びオウ(Ow)の論文、Mol. Gen. Genet.、第２３４巻、第４９−５９頁（１９９２年）に掲載のラッセル(Russell)等の論文、Plant J.、第８巻、第１７７−１８６頁（１９９５年）に掲載のリズニック(Lyznik)等の論文、Plant J.、第７巻、第６４９−６５９頁に掲載のアルバート(Albert)等の論文及びProc. Natl. Acad. Sci. USA、第９２巻、第７３７６−７３８０頁（１９９５年）に掲載のドイエルセン(Deuersen)等の論文を参照されたい。
【００２８】
本発明において使用するのに適した相同組換え系の例が、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系（サウア(Sauer)の米国特許第４，９５９，３１７号、オウデル(Odell)等の米国特許第５，６５８，７７２号、オウデル等のＰＣＴ出願ＷＯ９１／０９９５７号）及びＦＬＰ−ＦＲＴ系（ホッジズ(Hodges)とリズニック(Lyznik)の米国特許第５，５２７，６９５号）を含み、文献に記載されている。植物におけるトランスジーン管理に関する公知の組換え系の一の特定の利用が、商業的な変種からの抗生選択マーカのような所望しない異種遺伝子物質の除去を許容する手順である、植物ゲノムからのトランスジーンの切り出しに向けられている（オウ(Ow)及びダール(Dale)のＰＣＴ出願ＷＯ９３／０１２８３号）。しかしながら、これらの系は、全く異なる利用領域に関するものであり、即ち、トランスジーン及び常在する植物の遺伝子の流れの分離を管理するのではなく、異種ＤＮＡの所望しない部分を除去するために相同組換えを使用するものである。別の利用が、フーイカース(Hooykaas)及びモゾ(Mozo)の米国特許第５，６３５，３８１号及びオフリンガ(Offringa)等の米国特許第５，５０１，９６７号に記載されており、アグロバクテリウム(Agrobacterium)仲介の形質転換を介して植物ゲノムの中にＤＮＡの座位に向けられた目標とされる組込みを行うのに、相同組換え系を使用するものである。これらの事例は、２つの植物生物間ではなく、細菌と植物細胞との間の目標とされる移行に限定される。
【００２９】
相同組換えに基づくトランスジーンの移行は、大きなはっきりとした利点を有している。相同が行われるＤＮＡの座位を介して行われる正確な目標化を使用することにより、前もって入念に選定されかつ特徴づけられたトランスジーン「ランディング座位」("landing site")をつくることができる。従って、遺伝率、発現レベル、サイレンシング(silencing)の欠如などを含むトランスジーンの挙動のより高いレベルの予測可能性及び再現性を得ることができる。更に、トランスジーンカセットの後のバージョンを同じ座位に向けることにより、トランスジーンの古いバージョンを新しいものと置き換えることができる。所定の、決定されかつマッピングされた組込み座位を用いてこの物質をその後育種することが、著しく容易かつ簡単になる。当業者であれば、この系が、全ての受容体が組込み座位を含むように「プリワイヤされている」("prewired")場合にのみ使用することができることがわかる。かかる移入は、他の移行機構、例えば、トランスポゾン仲介移行または戻し交雑による古典的な移入を使用することにより可能となる。より特異な事例においては、リコンビナーゼを、組換え座位のほかにアクセプタ種に導入することができる。このような場合には、リコンビナーゼ遺伝子は、人工転写因子仲介プロモータの制御の下におかれ、転写因子は、ドナー（クリップボード）植物に配置されている遺伝子により構造的に発現される。リコンビナーゼは、不安定なハイブリッドに２つのゲノムが共存する際にだけつくることができる。あるいは、リコンビナーゼは、クリップボード植物に配置することができるが、転写因子は、受容体植物において構造的に発現される。
【００３０】
異種ＤＮＡは、標準的な技術に従ってドナー植物に導入することができる。双子葉植物に関する形質転換技術は本技術分野において周知であり、この技術には、アグロバクテリウム(Agrobacterium)に基づく技術及びアグロバクテリウムを必要としない技術が含まれる。非アグロバクテリウム技術は、原形質体または細胞により、外因性の遺伝子物質を直接取り込むものである。これらの技術には、ＰＥＧまたは電気穿孔仲介取り込み、粒子衝撃仲介配給及びミクロ注入がある。これらの技術の例が、EMBO J、第３巻、第２７１７−２７２２頁（１９８４年）に掲載のパスツコウスキー(Paszkowski)等の論文、Mol. Gen. Genet.、第１９９巻、第１６９−１７７頁（１９８５年）に掲載のポトリキス(Potrykis)等の論文、Biotechnology、第４巻、第１００１−１００４頁（１９８６年）に掲載のライヒ(Reich)等の論文及びNature、第３２７巻、第７０−７３頁（１９８７年）に掲載のクライン(Klein)等の論文に記載されている。いずれの場合にも、形質転換された細胞は、標準的な技術を使用して全植物に再生される。
【００３１】
アグロバクテリウム仲介の形質転換は、形質転換の効率が高くかつ多くの異なる種とともに広く利用することができるので、双子葉植物の形質転換に好ましい技術である。アグロバクテリウムにより通常形質転換することができる多くの作物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、脂肪種子アブラナ、ジャガイモ、大豆、アルファルファ及びポプラが含まれる（ＥＰ０３１７５１１号（綿）、ＥＰ０２４９４３２号（トマト）、ＷＯ８７／０７２９９号（アブラナ植物）、米国特許第４，７９５，８５５号（ポプラ））。アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、共在するプラスミドに対しあるいは染色体（例えば、ｐＣＩＢ２００に対して細胞株ＣＩＢ５４２（Plant Cell、第５巻、第１５９−１６９頁（１９９３年）に掲載のユークネス(Uknes)等の論文））により宿主アグロバクテリウム細胞株により運ばれるｖｉｒ遺伝子の補体に依存することができる適宜のアグロバクテリウム細胞株（例えば、ｐＣＩＢ２００またはｐＣＩＢ２００１）に関心のある外来ＤＮＡを運ぶバイナリベクタの移行を必要とする。組換え体のバイナリベクタ(binary vector)のアグロバクテリウムへの移行は、組換え体バイナリベクタを運ぶ大腸菌(E. coli)、組換え体バイナリベクタを目標のアグロバクテリウム細胞株に動かすことができるｐＲＫ２０１３のようなプラスミドを運ぶヘルパ大腸菌細胞株を使用する、三親交配(triparental mating)処理により行うことができる。あるいは、組換え体バイナリベクタは、ＤＮＡ形質転換によりアグロバクテリウムに移行される（Nucl. Acids Res.、第１６巻、第９８７７頁（１９８８年）の掲載のホフゲン(Hofgen)及びビルミッツァ(Willmitzer)の論文）。
【００３２】
組換え体アグロバクテリウムによる目標植物種の形質転換には、通常、アグロバクテリウムの植物からの外植片との共培養(co-cultivation)が必要となり、本技術分野において公知のプロトコールに従う。形質転換された組織は、バイナリプラスミドＴ−ＤＮＡボーダ間に存在する抗生物質または殺虫剤耐性マーカを含む選択可能の培地で再生される。
【００３３】
単子葉植物に好ましい形質転換技術には、ＰＥＧまたは電気穿孔技術及びカルス(callus)組織への粒子の衝撃を使用する原形質体への遺伝子の直接移行がある。形質転換は、１つのＤＮＡ種または複数のＤＮＡ種を用いて行うことができ（共形質転換）、これら技術は、双方とも、本発明に関して使用するのに適している。共形質転換(co-transformation)は、複雑なベクタ構造を避けるとともに、関心のある遺伝子と選択可能なマーカに関して、未結合の遺伝子座位を有するトランスジーン植物を発生させるという利点を有するとともに、その後の世代において選択可能なマーカの除去が所望と見なされる場合にはかかる除去を行うことができるという利点を有している。しかしながら、共形質転換を使用する場合の欠点として、別のＤＮＡ種がゲノムに組み入れられる頻度が１００％よりも低いということがある（Biotechnology、第４巻、第１０９３−１０９６頁（１９８６年）に掲載のショッハー(Schocher)等の論文）。
【００３４】
公開された特許出願ＥＰ０２９２４３５号、ＥＰ０３９２２２５号及びＷＯ９３／０７２７８号には、メイズのカルス及び原形質の調製、ＰＥＧまたは電気穿孔を使用した原形質体の形質転換及び形質転換された原形質体からのメイズ植物の再生の技術が記載されている。Plant Cell、第２巻、第６０３−６１８頁（１９９０年）に掲載のゴーデオン−カム(Gordeon-Kamm)等の論文及びBiotechnology、第１１巻、第１９４−２００頁（１９９３年）に掲載のフロム(Fromm)等の論文には、粒子衝撃によるメイズのエリート同血統繁殖系統(elite inbred line)の形質転換の技術が記載されている。
【００３５】
イネの形質転換もまた、原形質体または粒子衝撃を利用した直接遺伝子移行技術により行われている。原形質体仲介形質転換は、ジャポニカタイプ及びインディカタイプに関して記載されている（Plant Cell Rep.、第７巻、第７３９−３８４頁（１９８８年）に掲載のザンゲ(Zhange)等の論文、Nature、第３３８巻、第２７４−２７７頁（１９８９年）に掲載のシマモト(Shimamoto)等の論文、Biotechnology、第８巻、第７３６−７４０頁（１９９０年）に掲載のダッタ(Datta)等の論文））。双方のタイプとも、粒子衝撃を使用して日常的に形質転換することができる（Biotechnology、第９巻、第９５７−９６２頁（１９９１年）に掲載のクリストウ(Christou) 等の論文）。
【００３６】
特許出願ＥＰ０３３２５８１号には、ポオイデアエ(Pooideae)原形質体の発生、形質転換及び再生の技術が記載されている。更に、小麦の形質転換が、タイプＣ長期間再生可能カルスの細胞中への粒子衝撃を使用したBiotechnology、第１０巻、第６６７−６７４頁（１９９２年）に掲載のバジル(Vasil)等の論文、Biotechnology、第１１巻、第１５５３−１５５８頁（１９９３年）に掲載のバジル等の論文及びPlant Physiol.、第１０２巻、第１０７７−１０８４頁（１９９３年）に掲載のウイークス(Weeks)等の論文に記載されていて、これらの論文には、幼若の胚及び幼若胚誘導カルスの粒子衝撃が記載されている。
【００３７】
トウモロコシの種子(Zea mays)のような単子葉植物の形質転換は、単子葉植物の細胞を、この細胞が刺し通される複数の針状体と接触させ、細胞壁を破壊することにより、形質転換ＤＮＡを細胞内に入れることにより行われる。米国特許第５，３０２，５２３号を参照されたい。双子葉植物と単子葉植物の双方に適用することができる形質転換技術もまた、米国特許第５，２４０，８５５号（粒子ガン）、米国特許第５，２０４，２５３号（冷気体衝撃により加速されるミクロ弾丸）、米国特許第５，１７９，０２２号（バイオリスティック(biolistic)装置）、米国特許第４，７４３，５４８及び５，１１４，８５４号（ミクロ注入）、米国特許第５，１４９，６５５及び５，１２０，６５７号（加速粒子仲介形質転換）、米国特許第５，０６６，５８７号（気体駆動のミクロ弾丸加速器）、米国特許第５，０１５，５８０号（大豆植物の粒子仲介形質転換）、米国特許第５，０１３，６６０号（レーザビーム仲介形質転換）、米国特許第４，８４９，３５５号、並びに、米国特許第４，６６３，２９２号に開示されている。
【００３８】
このようにして形質転換された植物細胞または植物組織は、次に、標準的な技術に従って完全な植物に成長される。遺伝子組換え種子は、標準的な技術に従って遺伝子組換え顕花植物から得ることができる。同様に、ジャガイモ及びさとうきびのような隠花植物は、種々の公知の手順により繁殖させることができる。例えば、（茎培養によるジャガイモの形質転換を開示する）Plant Cell Rep.、第１０巻、第３０−３４頁（１９９１年）に掲載のニュエル(Newell)等の論文を参照されたい。
【００３９】
本発明の別の実施の形態においては、異種核酸が、ドナーから体細胞または原形質体の融合を介して受容体植物のゲノムに移される。この実施の形態の利点は、生殖交雑を制限するハイブリッド形成バリヤの幾つかが回避されることにある。この技術は、生殖交雑よりも複雑であるが、原形質体から再生することができる種間の交雑にのみ使用することができる。かくして、関連のないドナーと受容体植物を使用するのが好ましい。かかる対には、例えば、アラビドプシス(Arabidopsis)／綿、アラビドプシス／大豆、アラビドプシス／イネ及びタバコ／大豆が含まれる。一方、遠い関係にある種間（属間、種族間、家族間）のハイブリッドは、原形質体のハイブリッド形成を使用してつくられるが、２つの形態分類的に遠いゲノムがハイブリッド細胞において協働する能力は限定され、ハイブリッド細胞はしばしば不安定となり、一方の親種の遺伝子物質を素早く失う。Monogr. Theor. Appl. Genet.、第８巻、第１−２２０頁（１９８４年）に掲載のグレバ(Gleba)及びシトニック(Sytnik)の論文、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、第８４巻、第８４３４−８４３８頁（１９８７年）に掲載のデュティッツ(Dudits)等の論文及びMol. Gen. Genet.、第８４巻、第８７−９１頁（１９９２年）に掲載のバビチャック(Babiychuck)等の論文を参照されたい。かくして、遠い関係にあるドナー及び受容体植物の対が、より好ましい。
【００４０】
以下において説明する実施例は、特異種ハイブリッド形成組み合わせと、トランスポゾンに基づくまたは相同組換えに基づくトランスジーン切り出し／再挿入とによる４つの重要な作物種（カノーラ、ジャガイモ、メイズ及び小麦）に関する成功した形質転換及び系統転換の概要を示すものである。これらの実施例は、本発明の特定の実施の形態を単に例示するものであって、特許請求の範囲に記載の本発明に何らの限定も与えるものではない。
【００４１】
実施例
実施例１
アブラナ属植物の形質転換／系統転換
構造体の構成
Ｔ−ＤＮＡボーダ(border)内にトウモロコシの種子(Z. mays)の転移因子Ｓｐｍの成分を含むバイナリベクタを以下のようにしてつくった。
【００４２】
プラスミドｐＩＣ０１２をＸｈｏ１及びＳｍａ１で消化させ(digest)、大きなフラグメントをゲル精製するとともに、Ｘｈｏ１及びＣｌａ１／クレノウ(Klenow)処理により得られたＲＳフラグメントと結合させた。ｐＵＣ１１８にｐＮＯＳ−ＲＳ−３’ＯＣＳを含む、得られたプラスミドｐＩＣ０１３を、Ｐｓｔ１及びＢｃｌ１で消化させ、ゲル精製し、同じ酵素で消化させたｐＩＣ０１７の大きなフラグメントと結合させた。従って、ｐＮＯＳ−ＲＳ−３’ＯＣＳを有するｄＳｐｍ因子を含むプラスミドｐＩＣ２３を、ＨｉｎｄＩＩＩ／クレノウ及びＢａｍＨ１／クレノウで処理して、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨ１の座位を除去した。ｐＩＣ２３（−ＢａｍＨ１、−ＨｉｎｄＩＩＩ）の大きなＣｌａ１フラグメントをｐＩＣ２０１のＣｌａ１座位にクローン処理して、ｐ３５Ｓ及びＧＵＳ−３’ＮＯＳ（ｐＩＣ１３２）によりフランキングしたｄＳｐｍ因子を得た。プラスミドｐＩＣ１３２を、ＥｃｏＲ１及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。大きなフラグメントをゲル精製するとともに、ｐＲＫ２９０に基づきかつ植物形質転換マーカとしてＮＰＴＩＩ遺伝子を運ぶバイナリベクタのＥｃｏＲ１及びＨｉｎｄＩＩＩ座位にクローン処理した。得られたプラスミドｐＩＣ１４１を、Ｅｃｌ１３６ＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、ｐＩＣ０２２の０．３ｋｂＸｈｏ１−ＢａｍＨ１フラグメント及びｐＩＣ０２３の７．７ｋｂＸｈｏ１−Ｓｍａ１フラグメントと結合させて、３５Ｓプロモータの制御の下でＳｐｍトランスポザーゼをバイナリベクタに導入した。プラスミドｐＩＣ１５６を得て、形質転換実験に使用した。プラスミドｐＩＣ２１６を同様にしてつくったが、ｐＩＣ０２２のＸｈｏ１−ＢａｍＨ１フラグメントの代わりに、ｐＩＣ６１の０．２ｋｂＸｈｏ１−ＢｇｌＩＩフラグメント（ｐＳｐｍ）を使用した。
【００４３】
別の４つのベクタに関するクローン工程は、ｄＳｐｍ因子にｐＮＯＳ：ＢＡＲ−ＯＣＳ３’またはｐＮＯＳ：ＢＡＲ−ＯＣＳ３’を設ける段階だけが上記とは異なり、ＢＡＲは２つのＲＳ座位によりフランキングした。プラスミドｐＩＣ１３２を、Ｐｓｔ１、Ｂｃｌ１で消化させ、ゲル精製し、ｐＩＣ０１６の１．５ｋｂのＰｓｔ１、Ｂｃｌ１フラグメントと結合させて、ｐＮＯＳ：ＢＡＲ−ＯＣＳ３’を有するｄＳｐｍ因子を得た。
【００４４】
構造体ｐＩＣ４０１とｐＩＣ４１１に関しては、ｐＩＣ０１の大きなＸｈｏ１−Ｎｃｏ１フラグメントを、ｐＩＣ０１８のＢｓｐＨ１−ＢａｍＨ１フラグメントの小さいフラグメントと結合させ、２つのＲＳフラグメントをＮｃｏ１−ＢｓｐＨ１及びＢｇｌ１１−Ｘｈｏ１でフランキングした。得られたプラスミドｐＩＣ３８は、２つのＲＳ座位によりフランキングされたＢＡＲ遺伝子からなるものであった。ｐＩＣ３６の小さなＸｈｏ１フラグメントは、ｐＩＣ３３４のＸｈｏ１座位に再クローン処理し、ｐＮＯＳ：ＲＳ−ＢＡＲ−ＲＳ−ＯＣＳ３’を有するプラスミドｐＩＣ３４２を得た。最後のカセットを、上記のようにしてｄＳｐｍ因子に再クローン処理した。
【００４５】
以上のように、得られた構造体は、形質転換マーカ（カナマイシンに対する耐性を提供するＮＰＴＩＩ遺伝子）と、３５Ｓまたはそのプロモータの制御の下にあるＳｐｍトランスポザーゼ源と、ｐ３５Ｓ：ＧＵＳ切り出しマーカ内に挿入された非自律(non-autonomous)ｄＳｐｍ因子とからなる。ｄＳｐｍ因子の以下の３つの異なるバージョンをつくった。
【００４６】
ａ）ｄＳｐｍは、ＯＣＳ遺伝子の転写のターミネータからＲＳ座位（Z.rouxiiからのＲリコンビナーゼにより認識される組換え座位）により分離されたＮＯＳプロモータを含む（ｐＩＣ１５６及びｐＩＣ２１６、図１及び２参照）。
【００４７】
ｂ）ｄＳｐｍは、ｐＮＯＳ：ＢＡＲ−ＯＣＳ３’を含む（ｐＩＣ３１２、ｐＩＣ３１Ａ２、図３及び４）。
【００４８】
ｃ）ｄＳｐｍは、ｐＮＯＳ：ＢＡＲ−ＯＣＳ３’を含むが、ＢＡＲ遺伝子は、２つの一方向ＲＳ座位によりフランキングされている（ｐＩＣ４０１、ｐＩＣ４１１、図５及び６）。
【００４９】
構造体を、プランタ(planta)形質転換処理において使用するアラビドプシス(Arabidopsis)において試験に供した。ｄＳｐｍの切り出しは、Ｘ−ｇｌｕｃによる植物組織の染色後にＧＵＳ＋セクタの存在により一次形質転換細胞において容易に監視することができる。全ての構造体は、アラビドプシスにおいて高い転位活性を示し、幾つかのオリコフラグムスビオラシウス(Orychophragmus violaceus)形質転換細胞を得て、特徴づけるのに使用した。
【００５０】
オリコフラグムスビオラシウスを使用した系統転換
オリコフラグムスビオラシウスの種子を、殺菌し、インビトロ発芽に供した。この種のインビトロ成長植物の形質転換を、アブラナ属植物の種に関して上記したようにして行った（Plant Physiol.、第９１巻、第６９４−７０１頁（１９８９年）に掲載のデ・ブロック(De Block)等の論文）。使用される構造体は、３５ＳＣａＭＶプロモータとＧＵＳ遺伝子との間に挿入された非自律ｄＳｐｍの異なるバージョンとともにＳｐｍトランスポザーゼを運ぶアグロバクテリウムに基づくものであった（図１参照）。プラスミドは、形質転換されたオリコフラグムス植物をつくるのに使用した。幾つかの遺伝子組換え植物をつくって、特徴づけを行った。１つのコピー挿入を含む２つの独立した形質転換細胞を、上記したように、異なるアブラナ属植物種（ブラシカニグラ(B.nigra)、ブラシカジュンシア(B.juncea)、ブラシカナパス(B.napus)、ブラシカカリナタ(B.carinata)）及びシナプシスアルバ(Sinapsis alba)に雄親として交雑させた。全体で、約６００の交雑が行われた。得られたハイブリッドは、自己授粉(self)に供され、ｄＳｐｍ因子の存在確認のためにＦ１後代を選択した（ＰＣＲ分析またはホスフィノトリシン耐性）。これらの生き残り選定は、純粋なアブラナ属植物の表現型をみるとともに、ＧＵＳ活性の欠如をみるために更にスクリーン処理するとともに、更に、トランスポザーゼ配列または種特異オリコフラグムス繰り返しの欠如の試験に供した。最後に、アブラナ属植物染色体特異ＲＦＬＰパターンを有するｄＳｐｍの共分離を、Ｆ２後代を分析することにより確かめた。
【００５１】
アラビドプシスタリアナ(Arabidopsis thaliana)を使用した系統転換
以下の実施例においては、全ての実験を、オリコフラグムスビオラシアス(O.violaceous)の代わりに、アラビドプシスタリアナ(A. thaliana)植物を雄親として使用した点を除き、上記のようにして行った。アラビドプシスは、形質転換が容易で、短いライフサイクルを有している。これらの特徴により、アラビドプシスを、クリップボード種の優れた候補としている。
【００５２】
実施例ＩＩ
ブラシカナパスの形質転換／系統転換
ブラシカナパスの種子、変種及びオリコフラグムスビオラシアスの種子及び変種を殺菌し、インビトロ発芽に供した。形質転換を、Plant Physiol.、第９１巻、第６９４−７０１頁（１９８９年）に掲載のデ・ブロック(De Block)等の論文に記載のようにして行った。オリコフラグムスの種子を、Ｒリコンビナーゼに関する遺伝子及び２つのｒｓｘ組換え座位によりフランクされたハイグロマイシン耐性に関するプロモータのない遺伝子(promoterless gene)を含むアグロバクテリウムベースのベクタｐＩＩ２を用いる形質転換に供した。ナタネ生物を、ＲＳ組換え体座位を有する３５ＳＣａＭＶプロモータを含むベクタｐＩＩ３を用いた形質転換に供して、適正な組換えにより、ハイグロマイシン耐性を有する活性ＨＰＴ遺伝子をつくった。各種の２つの独立した形質転換植物を、遺伝子組換えの分子分析に基づいて選定した。後代の交雑及び分析を、実施例ＩＩと同様にして行った。
【００５３】
実施例ＩＩＩ
じゃがいもの形質転換／系統転換
実験を、遺伝子組換えソラナムフレジャが花粉パートナとして使用された点を除いて、上記（実施例Ｉ）のようにして行った。交雑は、Euphytica、第２２巻、第２４４−２５９頁（１９７３年）に掲載のハームセン(Hermsen)の論文に記載のようにして行い、一次転換系統を、Ｆ０複相化ジハプロイド(diploidized dihaploid)として選定した。
【００５４】
実施例ＩＶ
メイズの形質転換／系統転換
トリプサカムダクチロイデス(Tripsacum dactyloides)系統を、この実験において、トランスジーンドナーとして使用した。使用した構造体は、３５ＳＣａＭＶプロモータとＧＵＳ遺伝子との間に挿入された非自律ｄＳｐｍ因子とともにＳｐｍトランスポザーゼを運ぶ、図１に示すようなアグロバクテリウムベースのものであった。ｄＳｐｍは、１つのＲＳ組換え座位または（ｐＩＣ４０１、ｐＩＣ４１１）ＲＳ座位を有し、（ｐＩＣ３１２、ｐＩＣ３１Ａ２）ＲＳ座位をもたない１つの選択可能のマーカ（ＢＡＲ）を含むものであった。親物質の形質転換は、Plant Mol. Biol.、第３５巻、第２０５−２１８頁（１９９７年）に掲載のヒエイ(Hiei)等の論文に記載のようにして実質上行った。遺伝子組換え植物は、メイズ、変種と交雑させ、得られた後代を自己授粉させた。純粋のメイズタイプの分離体を、フィオスフィノトリシン耐性またはｄＳｐｍ−特異ＰＣＲシグナルを示すＢＣ１の中からスクリーン処理した。これらの生き残り選定(surviving selection)は、純粋なメイズの表現型をみるとともに、ＧＵＳ活性の欠如をみるために更にスクリーン処理するとともに、更に、トランスポザーゼ配列または種特異トリプサカム繰り返しの欠如の試験に供した。最後に、ホスフィノトリシン耐性またはメイズ染色体特異ＲＦＬＰパターンを有するｄＳｐｍ特異ＰＣＲシグナルの共分離を、ＢＣ／Ｆ２後代を分析することにより確かめた。
【００５５】
実施例Ｖ
小麦の形質転換／系統転換
交雑を、Crop Sci.、第３３巻、第９７３−９７６頁（１９９３年）に掲載のリエラ−リザラル(Riera-Lizararu)及びムジーブ−カジ(MUjeeb-Kazi)の論文に記載のようにして行った点を除いて、上記実施例（実施例ＩＶ）と同様に行った。一次転換系統を、交雑から得られたＦ０複相化ジハプロイドとして選定した。
【００５６】
（産業上の利用可能性）
本発明は、ウイルス、かび類、細菌による病気、ペスト、殺虫剤または環境ストレスに対して、高い耐性をはじめとする種々の特性を発揮する遺伝子工学処理された植物の生産において有用であるとともに、改良された風味、貯蔵性または栄養特性のような他の商業上望ましい特性を高めることができる。
【００５７】
本明細書において述べた全ての刊行物は、当業者のレベルを示すものである。本明細書においては、これら全ての刊行物を引用してその説明に代える。
【００５８】
上記した本発明の種々の変更は、当業者に明らかになるものである。かかる変更は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐＩＣ１５６のリニアプラスミドマップである。
【図２】
ｐＩＣ２１６のリニアプラスミドマップである。
【図３】
ｐＩＣ３１２のリニアプラスミドマップである。
【図４】
ｐＩＣ３１Ａ２のリニアプラスミドマップである。
【図５】
ｐＩＣ４０１のリニアプラスミドマップである。
【図６】
ｐＩＣ４１１のリニアプラスミドマップである。