(57)【要約】  本発明は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（好ましくは細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、より好ましくはＣＴＤ）への結合を低減または阻止する化合物をインシリコで同定する方法、ならびに同定された化合物を製造する方法に関する。本発明はまた、前記方法により同定可能および／または製造可能な化合物に関する。本発明はまた、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンド（特に細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、特にＰｏｌ ＩＩのＣＴＤ）への結合部位に対する抗体、ならびに該抗体をコードする核酸、および該核酸を含むベクターに関する。本発明は、前記方法に従って製造可能であり、および／または前記化合物、前記抗体、前記核酸または前記ベクターを含む、医薬組成物に関する。本発明はまた、オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる病状の処置、改善または予防における、前記化合物、前記抗体、前記核酸、前記ベクターまたは前記医薬品の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（特に、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、特にＣＴＤ）への結合を減少させる、または阻止する化合物をインシリコで同定する方法であって、
（ａ）ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの結合部位の立体構造座標に基づいてコンピューターモデルを構築する工程；
（ｂ）以下の方法：
（ｉ）結合部位内の共結晶化リガンドを修飾すること、
（ｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、小分子データベースから化合物をフィルタリングおよび選択すること、および
（ｉｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、前記化合物の新規リガンドを設計すること
からなる群より選択される方法により可能性のある調節化合物を選択する工程；
（ｃ）活性部位における前記化合物のエネルギー最小化立体配置を提供するために、前記化合物と前記結合部位のコンピューターモデル間でフィッティングプログラム操作を実行するための計算手段を用いる工程；および／または、化学物質である前記化合物の合理的な３Ｄ配置を提供するために、前記化合物を前記結合部位に配置するためのコンピュータドッキング方法を用いる工程；ならびに、
（ｄ）前記フィッティング操作および要すれば前記ドッキング方法の結果を評価して、前記化合物と結合部位モデルとの間の関連性を定量化し、それによって前記化合物が前記結合部位と結合する能力を評価する工程
を含む、方法。
【請求項２】
結合部位が、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（配列番号１）のアミノ酸Ｋ６３０、Ｒ６３３およびＥ４４４を含むか；配列番号４４のアミノ酸Ｋ６３５、Ｒ６３８およびＥ４４９を含むか；または、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｅ４４５、Ｋ６３１およびＲ６３４を含むか、あるいはそれらに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの結合部位が、配列番号１のアミノ酸Ｋ２８９、Ｒ４４９およびＥ４５２をさらに含み、要すればアミノ酸Ｆ４４０およびＦ６０７をさらに含み、および要すれば配列番号１のＭ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｉ５４５、Ｍ５４３およびＫ５５４からなる群より選択される１以上のアミノ酸をさらに含み、要すれば配列番号１のアミノ酸Ｇ６２９をさらに含むか、または、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの結合部位が、配列番号４４のアミノ酸Ｋ２８９、Ｒ４５４およびＥ４５７をさらに含み、要すればアミノ酸Ｙ４４およびＦ６１２をさらに含み、および要すれば配列番号４４のＬ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｌ５５０、Ｍ５４８およびＲ５５９からなる群より選択される１以上のアミノ酸をさらに含み、要すれば配列番号４４のアミノ酸Ｇ６３４をさらに含むか、またはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの結合部位が、配列番号２のアミノ酸Ｙ４４１およびＦ６０４をさらに含み、要すれば配列番号２のアミノ酸Ｇ６３０をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
結合部位が、配列番号１のアミノ酸２５８−７１３を含むか、配列番号４４のアミノ酸２０１−７１６を含むか、または配列番号２のアミノ酸２５８−７２２を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
コンピューターモデルが、図１１または１２に示す立体構造座標に基づく、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（好ましくは細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、より好ましくはＣＴＤ）への結合を減少または阻止する化合物を製造する方法であって、
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の方法により該化合物を同定する工程、
（ｂ）該化合物を合成する工程および要すれば該化合物またはその薬学的に許容される塩を、１以上の薬学的に許容される賦形剤および／または担体と共に製剤化する工程、
（ｃ）該化合物をオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程、ならびに
（ｄ）ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンド、好ましくはＣＴＤへの結合を阻止する該化合物の能力を判定する工程
を含む、方法。
【請求項７】
該試験化合物が小分子またはペプチドまたはタンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該化合物が、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの結合を減少または阻止できる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法により同定可能および／または製造可能な化合物。
【請求項９】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの結合部位に対する、抗体。
【請求項１０】
請求項９に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の単離された核酸または請求項１１に記載の組換えベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項１３】
請求項６または７に記載の方法により製造される、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項８に記載の化合物、請求項９に記載の抗体、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の組換え宿主細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる病状を処置、改善または予防するための、請求項８に記載の化合物、請求項９に記載の抗体、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の組換え宿主細胞、または請求項１３もしくは１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae family）由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（好ましくは、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）、より好ましくは、該ポリメラーゼＩＩのＣ末端ドメインであるＣＴＤ）への結合を低減または阻止する化合物をインシリコで同定する方法、ならびに該同定された化合物の製造方法に関する。本発明はまた、該方法により同定可能な、および／または製造可能な化合物に関する。本発明はまた、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの、そのリガンド（特に、細胞性ＲＮＡＰｏｌ ＩＩ、特にＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤ）への結合部位に対する抗体、ならびに該抗体をコードする核酸および該核酸を含むベクターに関する。本発明は、前記方法によって製造可能な医薬組成物、および／または該化合物、該抗体、該核酸または該ベクターを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる病状の処置、改善または予防における、該化合物、該抗体、該核酸、該ベクターまたは該医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インフルエンザは、世界中で高い罹病率および死亡率の原因となり、そして多くの人々によって、ヒトにとって最も重大なウイルスの脅威に属すると考えられている。例年、インフルエンザの流行が世界中を襲い、時に新型ウイルス株が大きな破壊力の大流行（パンデミック）を引き起こすことがある。現在、インフルエンザウイルスの流行を制御する主な手段はワクチン接種である。しかしながら、変異型インフルエンザウイルスは、急速に形成され、それはワクチン接種の影響を逃れる。新しいインフルエンザワクチンを製造するのに約６ヶ月かかるという事実に照らして、代替的治療手段、すなわち抗ウイルス薬が、とりわけ急速に拡がる世界的流行（パンデミック）に対する最初の防衛線として必要とされている。
【０００３】
抗ウイルス薬開発の優れた出発点は、必須ウイルスタンパク質の構造データである。従って、インフルエンザウイルス表面抗原ノイラミニダーゼの結晶構造決定（von Itzstein et al., 1993, Nature 363:418-423）は、細胞からのウイルスの放出を阻止するが、ウイルス産生は阻害しない、抗ウイルス活性を有するノイラミニダーゼ阻害剤の開発に直接的につながった。これらおよびそれらの誘導体は、その後、抗インフルエンザ薬であるザナミビル（Glaxo）およびオセルタミビル（Roche）の開発につながり、それらは現在、いつか起こるパンデミックに対する最初の防衛線として多数の国々に備蓄されている。しかしながら、これらの薬剤は、罹患期間の短縮をもたらすのみである。あるいは、アマンタジンおよびリマンタジンなどの他の抗インフルエンザ化合物は、細胞内のウイルスの被覆を妨害するウイルス膜中のイオンチャネルタンパク質、すなわちＭ２タンパク質を標的とする。しかしながら、それらは、それらの副作用および耐性ウイルス変異体の急速な出現のために広く用いられていない（Magden et al., 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:612-621）。さらに、リバビリンなどのより非特異的なウイルス薬が、インフルエンザ感染症の処置に有効であることが示されている（Eriksson et al., 1977, Antimicrob. Agents Chemother. 11:946-951）。しかしながら、リバビリンは、おそらく重篤な副作用が原因で少数の国でしか承認されていない（Furuta et al., 2005, Antimicrob. Agents Chemother. 49:981-986）。明らかに、新しい抗ウイルス化合物、好ましくは種々の標的に対する化合物が必要とされている。
【０００４】
オルトミクソウイルス科に属するＡ型、Ｂ型、Ｃ型インフルエンザウイルスおよびイサウイルス属ならびにトゴトウイルス属のウイルス、ならびにハンタウイルス属、ナイロウイルス属、オルソブニヤウイルス属、フレボウイルス属およびトスポウイルス属を含むブニヤウイルス科のウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。それらのゲノムは断片化されており、（ｉ）一本鎖ビリオンＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のウイルスｍＲＮＡへの最初のコピー、および（ｉｉ）ｖＲＮＡ複製を実行する、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むリボ核タンパク質粒子になる。ポリメラーゼ複合体は、ウイルスｍＲＮＡの合成およびウイルス複製に必須であり、宿主細胞タンパク質に見出されるものとは顕著に異なると思われる幾つかの機能的活性部位を含むため、適当な抗ウイルス薬標的であると思われる（Magden et al., 前出）。従って、例えば、ＰＢ１内のＰＡ結合ドメインに似た２５アミノ酸ペプチドによってポリメラーゼサブユニットの組み立てを妨害することが試みられてきた（Ghanem et al., 2007, J. Virol. 81:7801-7804）。さらに、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンなどのヌクレオシド類縁体によりウイルス転写を妨害する試みがあり（Tisdale et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:2454-2458）、置換ピラジン化合物であるＴ−７０５は、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼの特異的阻害剤として機能し得ることが示されている（Furuta et al., 前出）。さらに、ポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性が標的とされており、４−置換 ２，４−ジオキソブタン酸化合物類が、インフルエンザウイルスにおけるこの活性の選択的阻害剤として同定されている（Tomassini et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38:2827-2837）。加えて、真菌種のデリツチア・コンファータスポラ（Delitschia confertaspora）の抽出物において同定された、置換２，６−ジケトピペラジンであるフルチミドは、インフルエンザウイルスのエンドヌクレアーゼを阻害することが示されている（Tomassini et al., 1996, Antimicrob. Agents Chemother. 40:1189-1193）。
【０００５】
ポリメラーゼのＰＡサブユニットは、キャップ結合およびエンドヌクレアーゼ活性の両方、ｖＲＮＡ複製ならびに議論の余地があるもののプロテアーゼ活性に関与するが、機能的にはあまり特徴付けられていない。ＰＡ（Ａ型インフルエンザにおける７１６残基）は、トリプシン処理により残基２１３で切断可能である。ＰＢ１ Ｎ末端ペプチドに結合したＰＡのＣ末端側の３分の２の結晶構造により、ＰＡサブユニットの大部分および重要なサブユニット間の相互作用のうちの１つの正確な性質の両方に関する最初の構造上の洞察がもたらされた（He et al., 2008, Nature 454:1123-1126; Obayashi et al., 2008, Nature 454:1127-1131）。ＰＡアミノ末端ドメインにおける保存的残基の系統的突然変異により、ポリメラーゼ複合体のタンパク質安定性、プロモーター結合性、キャップ結合性およびエンドヌクレアーゼ活性に重要な残基が同定された（Hara et al., 2006, J. Virol. 80:7789-7798）。次いで、キャップスナッチング（cap-snatching）エンドヌクレアーゼがＰＡのＮ末端部分（〜残基１−２００）を構成することが知られており（Dias et al Nature 2009, PMID: 19194459、Yuan et al, Nature PMID: 19194459）、これは、エンドヌクレアーゼを標的とする薬物開発に大きな助けとなっている（例えば、Kowalinski et al, PLoS Pathog. 2012, PMID 22876177）。２０１４年の末に、完全なコウモリＡ型インフルエンザ（Pflug et al, Nature 2014）およびヒトＢ型インフルエンザ（Reich et al, 2014 Nature）の結晶構造により、ＰＡが完全なヘテロ三量体にどのように取り込まれ、ｖＲＮＡプロモーターの５'末端に結合するＰＢ１と共に、ＰＢ１サブユニットの安定化においてさらなる役割を有するか否かが示された。
【０００６】
ウイルス複製は、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Pol II）の活発な転写を必要とし（Mahy et al. 1972, PNAS 69:1421-1424）、ＦｌｕＰｏｌ（インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼ）とＰｏｌ ＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）との物理的結合が示されている（Engelhardt et al. 2005, Journal of virology 79:5812-5818; Loucaides et al. 2009, Virology 394:154-163）。ウイルスのこの密接なカップリングおよび細胞内転写は、転写プライミングのために、新生Ｐｏｌ ＩＩ転写物から誘導されたキャップ構造を含む短いオリゴマーを切り取るユニークな機序である、‘キャップスナッチング機構’を可能にすると考えられる（Plotch et al. 1981, Cell 23:847-858; Reich et al. 2014, Nature 516:361-366)。哺乳動物細胞におけるＰｏｌ ＩＩ ＣＴＤは、コンセンサス配列Ｙ１Ｓ２Ｐ３Ｔ４Ｓ５Ｐ６Ｓ７を含む５２個の７残基（ヘプタド）リピート配列（heptad repeat）からなる（Palancade et al. 2003, Eur J Biochem 270:3859-3870）。これらの残基の大部分は、可逆的にリン酸化されることができ、数種のキナーゼおよびホスファターゼの調節された相互作用によって定義される一時的リン酸化パターンは、異なる転写段階と相関している（Lidschreiber et al. 2013, Mol Cell Biol 33:3805-3816; Hsin et al. 2014, Mol Cell Biol 34:2488-2498; Martinez-Rucobo et al. 2015, Mol Cell 58:1079-1089）。ＣＴＤがＳｅｒ５−リン酸化型であるが、Ｓｅｒ２−リン酸化型ではない、エロンゲーション（elongation）のホールマークであるとき、ＦｌｕＰｏｌが開始Ｐｏｌ ＩＩと結合することが示されている（Engelhardt et al. 2005, Journal of virology 79:5812-5818; Loucaides et al. 2009, Virology 394:154-163; Chan et al. 2006, Virology 351:210-217）。実際に、ウイルスポリメラーゼは、Ｐｏｌ ＩＩ分解を誘導するだけでなく、エロンゲーションを阻害する（Rodriguez et al. 2007, Journal of virology 81:5315-5324; Vreede et al. 2010, Virology 396, 125-134）。これは、細胞転写の阻害（‘宿主遮断’）に寄与し、これは抗ウイルス応答に対抗することおよびウイルス転写から複製への切り替え（スイッチ）において重要であると考えられている（Vreede et al. 2010, Virology 396, 125-134）。ウイルス転写と細胞転写の間の十分に確立された機能的カップリングにもかかわらず、２つのポリメラーゼ間の構造的相互作用の正確な性質は不明のままである。従って、ウイルスポリメラーゼの結合部位を標的とする機序および化合物を同定し、それによって細胞ポリメラーゼへの結合を妨害することができるようにするために、如何にしてウイルスＲＮＡポリメラーゼおよび細胞Ｐｏｌ ＩＩが相互作用するかを正確に理解する必要がある。
【０００７】
本発明者らは、全ウイルスポリメラーゼと４反復のＳｅｒ５リン酸化ＣＴＤを含むＰｏｌ ＩＩ ＣＴＤペプチド模倣物との共結晶化により２つのポリメラーゼ間の相互作用を構造的に特徴付けて、それにより該２つのポリメラーゼ間の結合部位を同定した。従って、本発明は、ウイルス複製を標的とする新規抗ウイルス化合物の開発ならびに以前に同定された化合物の最適化をかなり単純化するであろう、２つのポリメラーゼ間の相互作用部位を研究するための独自の機会を提供する。
【０００８】
本発明者らの驚くべき成果は、容易に入手可能な材料を用いてウイルスポリメラーゼ上の相互作用部位の阻害剤についてインビトロのハイスループットスクリーニングを実施することを可能にするシステムを同定することである。さらに、完全なインフルエンザポリメラーゼ、特にＰＡサブユニットに結合したＰｏｌ ＩＩ ＣＴＤの構造データは、阻害剤の直接的設計および該ポリメラーゼ上のＣＴＤ結合部位を標的とする可能性のある治療化合物のインシリコでのスクリーニングを可能にする。最後に、同じシステムを、最終的な阻害剤とウイルスポリメラーゼとの相互作用を構造的に特徴付けるため、およびこのデータをそれらの阻害特性をさらに最適化するために用いることができる。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
第一の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（特に、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、特にＣＴＤ）への結合を低減させる、または阻止する化合物をインシリコで同定する方法であって、
（ａ）ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの１以上の結合部位の立体構造座標に基づいてコンピューターモデルを構築する工程；
（ｂ）以下の方法：
（ｉ）結合部位内の共結晶化リガンドを修飾すること、
（ｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの１以上の結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、小分子データベースから化合物をフィルタリングおよび選択すること、および
（ｉｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの１以上の結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、該化合物の新規リガンドを設計すること
からなる群より選択される方法により可能性のある調節化合物（modulating compound）を選択する工程；
（ｃ）活性部位における前記化合物のエネルギー最小化立体配置を提供するために、前記化合物と前記結合部位のコンピューターモデル間でフィッティングプログラム操作を実行するための計算手段を用いる工程；および／または、化学物質である該化合物の合理的な３Ｄ配置を提供するために、前記化合物を前記１以上の結合部位に配置するためのコンピュータドッキング方法を用いる工程；ならびに、
（ｄ）前記フィッティング操作および／または前記ドッキング方法の結果を評価して、前記化合物と結合部位モデルとの間の関連性を定量化し、それによって前記化合物が前記活性部位と結合する能力を評価する工程
を含む方法に関する。
【００１０】
第二の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（好ましくは細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、より好ましくはＣＴＤ）への結合を低減または阻止する化合物を製造する方法であって、
（ａ）第一の側面に記載の方法により該化合物を同定する工程、
（ｂ）該化合物を合成すること、要すれば該化合物またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の薬学的に許容される賦形剤および／または担体と共に製剤化する工程、
を含む方法に関する。
【００１１】
第三の側面において、本発明は、第一の側面に記載の方法により同定可能な、および／または第二の側面に記載の方法により製造可能な化合物に関し、ここで、該化合物は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（特に、細胞性ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ、特にＰｏｌ ＩＩのＣＴＤ）への結合を低減または阻止することができる。
【００１２】
第四の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科に属するウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（特に、細胞性ＲＮＡＰｏｌ ＩＩ、特にＰｏｌ ＩＩのＣＴＤ）への１以上の結合部位に対する抗体に関する。
【００１３】
第五の側面において、本発明は、本発明の第四の側面に記載の抗体をコードする核酸に関する。
【００１４】
第六の側面において、本発明は、本発明の第五の側面に記載の核酸を含むベクターに関する。
【００１５】
第七の側面において、本発明は、本発明の第五の側面に記載の核酸または第六の側面に記載のベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００１６】
第八の側面において、本発明は、本発明の第二の側面に記載の方法により製造される医薬組成物に関する。
【００１７】
第九の側面において、本発明は、本発明の第三の側面に記載の化合物、本発明の第四の側面に記載の抗体、本発明の第五の側面に記載の核酸、または本発明の第六の側面に記載のベクターを含む、医薬組成物に関する。
【００１８】
第十の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態、特にインフルエンザウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を処置、改善または予防するのに使用するための、本発明の第三の側面に記載の化合物、本発明の第四の側面に記載の抗体、本発明の第五の側面に記載の核酸、発明の第六の側面に記載のベクター、または本発明の第七もしくは第八の側面に記載の医薬組成物に関する。
【００１９】
第十一の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態、特にインフルエンザウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を処置、改善または予防する方法であって、治療的有効量の、本発明の第三の側面に記載の化合物、本発明の第四の側面に記載の抗体、本発明の第五の側面に記載の核酸、本発明の第六の側面に記載のベクター、または本発明の第七もしくは第八の側面に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１：Ｆｌｕ Ａおよび他のＰｏｌ ＩＩ相互作用因子に結合したＣＴＤペプチドの立体配座。ＳｅＰ５またはＳｅＰ２−ＳｅＰ５ ＣＴＤペプチドに結合するタンパク質の構造。全てのタンパク質の構造は灰色の画像で示されており、ペプチドは、それらの位置を強調するために色付けされており、それらの対応する構造の隣に拡大表示されている。ＣＴＤペプチドは、棒状表示（stick representation）されている。Ａ、Ｂ：ＣＴＤ ＳｅＰ５ペプチドの対応する部分とのＦｌｕ Ａポリメラーゼの結合部位１（Ａ）および２（Ｂ）。Ｃ：ペプチジル−プロリルイソメラーゼ Ｐｉｎ１（ＰＤＢ：１Ｆ８Ａ）に結合したＳｅｒ２−Ｓｅｒ５−リン酸化ＣＴＤ。Ｄ：C.albicansのキャッピング酵素Ｃｇｔ１（ＰＤＢ：１Ｐ１６）に結合したＳｅｒ５−リン酸化ＣＴＤ。Ｅ：哺乳動物のキャッピング酵素Ｍｃｅ１（ＰＤＢ：３ＲＴＸ）に結合したＳｅｒ２−Ｓｅｒ５ リン酸化ＣＴＤ。Ｆ：S.pombeのキャッピング酵素Ｐｃｅ１（ＰＤＢ：４ＰＺ６）に結合したＳｅｒ２−Ｓｅｒ５−リン酸化ＣＴＤ。Ｇ。ヒトＳｓｕ７２（ＰＤＢ：３Ｏ２Ｑ）に結合したＳｅｒ５−リン酸化ＣＴＤ。
【図２】図２：Ｓｅｒ５−リン酸化ＣＴＤペプチドに結合したＡ型インフルエンザポリメラーゼの構造。Ａ：結合したＳｅｒ５−リン酸化ＣＴＤペプチド（青色棒）を有するコウモリＡ型インフルエンザポリメラーゼ構造の表面図。２つのペプチド結合部位は、ＰＡのＣ末端ドメイン（ＰＡ−Ｃ）に位置する。Ｂ：５５０ループの移動を示すＣＴＤ結合ペプチドを有する（緑色）または有さない（黄色）、コウモリＦｌｕ ＡポリメラーゼＰＡ−Ｃドメインの重ね合わせ。たった１つの４−反復ペプチドが結合していると仮定すると、連続リピート配列からのＣＴＤ残基は、（Ｎ末端から）青色、白色、マゼンタおよびシアンに色付けされており、破線は、欠けている結合を示す（第２リピート配列のほとんど）。Ｃ、Ｄ：結合部位１（Ｃ）および２（Ｄ）におけるＰＡ残基（緑色）とＣＴＤペプチド（青色）との相互作用の詳細。推定上の水素結合は、破線として描かれている。
【図３】図３：Ｆｌｕ ＢポリメラーゼへのＣＴＤペプチドの結合。Ａ：部位１を形成する残基は、ＦｌｕＡ株およびＦｌｕＢ株において保存されているが、部位２の残基はＦｌｕＡ株にのみ保存されていることを示す、代表的なインフルエンザ株Ａ−Ｄの配列アライメント。Ｂ：上：Ｓｅｒ５−リン酸化ＣＴＤペプチドと共結晶化した完全長Ｆｌｕ Ｂポリメラーゼの表面上に観察された電子密度の差異（Ｆｏ−Ｆｃ、３．０ σ、青色メッシュ）。下：Ｆｌｕ Ａにおける対応する部位１と同じ方向でＦｌｕＢポリメラーゼ の部位１に結合したＣＴＤペプチドの相互作用を示す赤い四角で囲まれた領域の拡大図（図１Ｃ）。ＰＢ２−６２７ドメインにまたがるさらなる追加の電子密度はモデル化できない。Ｃ、Ｄ：２および４−反復蛍光標識されたＳｅｒ５−リン酸化ＣＴＤペプチドの、Ｆｌｕ Ａ（Ｃ）およびＦｌｕ Ｂ（Ｄ）への結合を比較する蛍光異方性データ。エラーバーは、３つの実験のＳＤを示し、ＫＤでは、±の後にfitの誤差を示す。
【００２１】
【図４】図４：種々のインフルエンザ株（コウモリ(bat)Ａ型、ヒト(human)Ａ型、トリ(avian)Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ型）のＰＡサブユニットの配列アライメント。残基２２０からのＰＡ−Ｃ領域のみが示されている。完全に保存された残基は赤色の背景に白色で示され、高度に保存された残基は、青色で囲まれた赤色文字で示される。アミノ酸番号付けおよび二次構造は、コウモリのＦｌｕ Ａポリメラーゼについてである。ＣＴＤ結合部位１の残基は、シアン色の三角形で示され（Ｆｌｕ Ａ株およびＦｌｕ Ｂ株で保存されている）、部位２は黄色の三角形で示されている（重要な残基は、Ｆｌｕ Ａ株でのみ保存されている）。本発明で言及される残基（部位１：Ｃ/Ｒ４４８（Ｈ１Ｎ１ ４５３）、部位２：Ｉ/Ｌ５４５（５５０）、Ｔ/Ｓ５４７（５５２））は、黒色三角形で示されている。
【図５】図５：Ｆｌｕ Ａポリメラーゼについての蛍光異方性。Ａ：置換アッセイ：コウモリポリメラーゼに結合した蛍光標識されたＳｅｒ５−リン酸化ペプチド（４反復）：ｖＲＮＡを同じ標識されていないペプチドで滴定する。見かけのＫＤ（ＫＤ’）が示されている。Ｂ：ｖＲＮＡプロモーターの不存在下でのＳｅｒ５−リン酸化ペプチドの結合。Ｃ：非リン酸化４−反復ＣＴＤペプチド（Ｙ１Ｓ２Ｐ３Ｔ４Ｓ５Ｐ６Ｓ７）との相互作用。結合曲線は、＞１０μＭの範囲の推定ＫＤから推定され得る。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＤを表し、ＫＤでは±の後にfitの誤差を示す。
【図６】図６：ＳｅＰ５結合ポケットの変異分析。Ａ：Ｓｅｒ５−リン酸化４反復ＣＴＤペプチドに対する組換えコウモリＦｌｕＡ変異体について測定されたＫＤを示す表。それぞれの二重変異は、ＦｌｕＡ上の２つのＣＴＤ結合部位（部位１についてＫ２８９ＡおよびＲ４４９Ａ、ならびに部位２についてＫ６３０ＡおよびＲ６３３Ａ、コウモリの番号付け）のうち一方のみに影響を及ぼす。野生型タンパク質（対応する変異体についてはＦｌｕＡまたはＦｌｕＢ）と比較した変化倍も示されている。Ｂ：リン酸化Ｓｅｒ５ ＣＴＤへの結合の低減を伴う単一および二重変異体の活性を比較するミニゲノムアッセイ。エラーバーは、トリプリケートで行った３つの独立した実験のＳＤを示す。Ｃ：野生型ＦｌｕＡを部位１および部位２における対応する二重変異体と比較する、インビトロでのキャップ依存性転写活性アッセイ。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＤを表す。速度定数は、±の後にfitの誤差を示す。
【図７】図７：変異ポリメラーゼタンパク質の４反復 Ｓｅｒ５−リン酸化ＣＴＤペプチドとの相互作用の蛍光異方性。（Ａ）コウモリＦｌｕＡ部位１二重変異Ｋ６３０Ａ/Ｒ６３３Ａ（左）、部位２二重変異Ｋ２８９Ａ＿Ｒ４４９Ａ（右）；（Ｂ）Ｂ型インフルエンザ 部位１二重変異Ｋ６３１Ａ/Ｒ６３４Ａ。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＤを表し、ＫＤは、±の後にfitの誤差を示す。Ｃ。部位１および部位２二重変異体と野生型コウモリＦｌｕＡとを比較した、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡを鋳型として用いたインビトロでの抗原刺激を受けていない（unprimed）複製反応の時間経過。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＤを表す。表は、測定された速度定数では±の後にfitの誤差を示す。
【００２２】
【図８】図８：変異ウイルスレスキュー実験。Ａ：逆遺伝学による上清中の組換えＡ/ＷＳＮ/３３ウイルスの力価およびプラーク表現型を示すプラークアッセイ。示したウイルス希釈物で感染させた細胞単層のクリスタルバイオレット染色を示す。野生型（ＷＴ）、Ｍｏｃｋ：それぞれ、野生型ＰＡプラスミドを用いて、またはＰＡプラスミドを用いずに実施した対照。Ｂ：ＭＤＣＫ細胞上の組換えＡ/ＷＳＮ/３３ウイルスの増殖曲線。示された時点で、ウイルス感染力価をＭＯＣＫ細胞におけるプラークアッセイにより決定した。Ｘ軸は、アッセイの検出限界（２５ｐｆｕ/ｍＬ）に設定した。エラーバーは、トリプリケートのＳＤを示す。ウイルス力価は、プラークの極小サイズのために、おそらくＲ４５４Ａ変異体について過小評価されていた。Ｃ：左：Ｒ６３３−ＳｅＰ５相互作用を示す、ＣＴＤペプチドに結合した野生型コウモリＦｌｕＡの構造。右：Ｃ４４８Ｒ／Ｒ６３３Ａ二重変異体は、ＣＴＤ結合コウモリＦｌｕＡ構造（トリ／ヒトＦｌｕＡにおけるＣ４５３Ｒ／Ｒ６３８Ａに対応する）をモデル化し、Ｒ４４８がＲ６３３を補うことができることを示す。二重変異に関与する残基はマゼンタ色で示す。Ｄ：Ｉ５４５およびＴ５４７残基の位置を示すＣＴＤ−ＦｌｕＡ相互作用の図。Ｉ５４５（トリ／ヒト株におけるＬ５５０）は、Ｙ１ｃおよびＰ６ｃと接触している；Ｔ５４７（トリ／ヒトインフルエンザおけるＳ／Ｔ５５２）は、Ｓ７ｂに近い。ＦｌｕＡ ＰＡ−Ｃは緑色、Ｉ５４５およびＴ５４７はマゼンタ色、およびＣＴＤペプチドは青色で示す。
【図９】図９：表１．２８アミノ酸のＳｅＰ５ ＣＴＤペプチドに結合したＦｌｕＡおよびＦｌｕＢポリメラーゼのデータ収集および精密化統計（refinement statistics）。
【図１０】図１０：表２．種々のＣＴＤ相互作用タンパク質のＳｅＰ２／ＳｅＰ５またはＳｅＰ５リン酸化を有するＣＴＤペプチドへの報告された結合親和性。
【図１１】図１１：結合したＣＴＤ（鎖Ｘ）を含む、配列番号１または配列番号２に記載のＰＡサブユニットのＣ末端ドメイン（鎖Ａ）の精密原子構造座標。ファイルヘッダーは、結合したｖＲＮＡプロモーターおよびＣＴＤを用いた完全なヘテロ三量体構造の構造精密化に関する情報を供する。“Atom”とは、その座標が測定される元素を意味する。カラムの最初の文字はエレメントを定義する。それぞれのアミノ酸の３文字コードおよびアミノ酸配列位置が示されている。レーン“Atom”の最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を定義する。４番目の値は占有率に対応し、５番目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有率は、各原子が座標で示された位置を占める分子の割合である。値“１”は、各原子が、結晶の全て等価な分子において、同じ立体配座を有する、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きを測定する熱因子である。この命名法は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応している。図１１は、標準タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式において、結合したＣＴＤを有するコウモリＡ型インフルエンザ／Ｈ１７Ｎ１０のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（残基２５８−７１３）のＣ末端ドメインの立体構造座標を示す。
【図１２】図１２：結合したＣＴＤ（鎖Ｘ）をを含む、配列番号１または配列番号２に記載のＰＡサブユニットのＣ末端ドメイン（鎖Ａ）の精密原子構造座標。ファイルヘッダーは、結合したｖＲＮＡプロモーターおよびＣＴＤを用いた完全なヘテロ三量体構造の構造精密化に関する情報を供する。“Atom”とは、その座標が測定される元素を意味する。カラムの最初の文字はエレメントを定義する。それぞれのアミノ酸の３文字コードおよびアミノ酸配列位置が示されている。レーン“Atom”の最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を定義する。４番目の値は占有率に対応し、５番目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有率は、各原子が座標で示された位置を占める分子の割合である。値“１”は、各原子が、結晶の全て等価な分子において、同じ立体配座を有する、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きを測定する熱因子である。この命名法は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応している。図１２は、標準タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式において、結合したＣＴＤを有するヒトＢ型インフルエンザ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１３／０３のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（残基２５８−７２２）のＣ末端ドメインの立体構造座標を示す。
【図１３】図１３：完全コウモリＦｌｕＡおよびＡ／Ｈ７Ｎ９コアポリメラーゼの、ＰＡ−ＣＴＤ結晶構造の比較。部位１での結合は、おそらくこの領域におけるＰＡの立体配座変化のために、Ｈ７Ｎ９構造において観察されない。ＦｌｕＡ ＰＡは緑色、Ｈ７Ｎ９ ＰＡはシアン、およびＣＴＤペプチドは青色（コウモリＦｌｕＡ部位１および部位２）またはマゼンタ（Ｈ７Ｎ９ 部位２）で示される。
【図１４】図１４：Ａ／Ｈ７Ｎ９トリインフルエンザポリメラーゼのＰＡにおける、部位２のＣＴＤ結合様式およびホスホセリン相互作用塩基性残基の保存。Ｈ７Ｎ９ ＰＡはシアン、およびＣＴＤペプチドマゼンタで示される。推定上の水素結合は黄色点線で示されている。
【図１５】図１５：表３．配列番号１、配列番号２および配列番号４４の対応するアミノ酸位置。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
配列表
配列番号１：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ ＰＡサブユニット Ａ/コウモリ（little yellow-shouldered bat）/Guatemala/060/2010(H17N10)のアミノ酸配列；GenBank: AFC35437.1
配列番号２：ヒトＢ型インフルエンザ/Memphis/13/03のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ ＰＡサブユニットのアミノ酸配列
配列番号３：ペプチドリンカー配列 ＧＭＧＳＧＭＡ
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコールおよび試薬には限定されることなく、改変可能であることが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、それは添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。他にこれと異なる定義がされない限り、全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２５】
幾つかの文献が本明細書中に引用されている。本明細書に引用された文献（全ての特許、特許出願、科学文献、製造者の取扱説明書、指示書などを含む）はそれぞれ、上記のものも下記のものも、その内容全体が引用により本明細書中に包含される。本明細書のいずれも、本発明が先行発明によるそのような開示に先んじる権利を与えられないことを認めると解釈されるものではない。本明細書に引用された文献のいくつかは、“引用により包含される”として特徴付けられる。かかる包含された文献の定義または教示と、本明細書に記載の定義または教示との間に矛盾がある場合、本明細書の記載が優先される。好ましくは、本明細書で用いる用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms： (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載のように定義される。
【００２６】
本発明を実施するために、他に特記しない限り、当該分野の文献に説明されている化学的、生化学的および組換えＤＮＡ技術の従来方法が用いられる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989）。
【００２７】
以下に、本発明の構成要素について記載する。これらの要素は特定の態様で記載されているが、それらは、任意の方法で、および任意の数で組み合わせてさらなる態様を形成し得ることが理解されるべきである。多数の記載された例および好ましい態様は、本発明を明示的に記載された態様のみに限定するように解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載された態様を多数の開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせる態様を支持および包含するものと理解されるべきである。さらに、本発明について記載された全ての要素の任意の置換および組み合わせは、本明細書にこれと異なる記載がない限り、本明細書の記載によって開示されたと見なされるべきである。
【００２８】
定義
用語“含む（comprise）”、ならびに“含む（comprises）”および“包含する（comprising）”などの変形は、記載された整数もしくはステップ、または整数群もしくはステップ群を包含するが、その他の整数もしくはステップ、または整数群もしくはステップ群を除外するものではないと理解されるべきである。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる、単数形“１つの（a）”、１つの（an）”、および“その（the）”は、文脈から明らかにこれと異なることを記載をしない限り、複数形を含む。
【００３０】
本明細書では、濃度、量および他の数値データが、“範囲”の形式で表現され、または提示されることがある。このような範囲形式は単に、便宜上および簡潔にするために使用されているのであり、従って、このような範囲形式は、範囲の境界として明示的に列挙された数値だけではなく、その範囲に包含される全ての個々の数値または部分範囲が明示的に列挙されているかのように、それらの各数値および部分範囲を含むと、柔軟に解釈すべきである。一例として、“１５０ｍｇ〜６００ｍｇ”の数値範囲は、１５０ｍｇ〜６００ｍｇの明示的に列挙された値だけでなく、示された範囲内の個々の数値および下位の範囲も含むと解釈されるべきである。従って、この数値範囲に含まれるのは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、…、５８０、５９０、６００ｍｇなどの個々の値、および１５０〜２００、１５０〜２５０、２５０〜３００、３５０〜６００などの下位の範囲である。この同じ原理は、１つの数値のみを挙げている範囲にもあてはまる。さらに、このような解釈は、記載されている範囲または特性の広がりに関わりなく適用されるべきである。
【００３１】
数値に関連して用いられるとき、用語“約”は、示された数値よりも５％小さい下限を有し、かつ示された数値よりも５％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
【００３２】
用語“核酸”および“核酸分子”は、本明細書中、同義的に用いられ、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖オリゴマーまたはポリマーあるいは両方として理解される。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、五炭糖（例えば、これに限定されないが、リボースまたは２’−デオキシリボース）、および１〜３個のリン酸基からなる。一般的に、核酸は、個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合を介して形成される。本明細書中、核酸という用語は、これらに限定されないが、リボ核酸（ＲＮＡ）分子およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み、また他の結合を含む核酸の合成形態（例えば、Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載のペプチド核酸）も含む。一般的に、核酸は、一本鎖または二本鎖分子であり、天然ヌクレオチドからなる。核酸の一本鎖の記載はまた、相補鎖の配列を（少なくとも部分的に）規定している。核酸は一本鎖または二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含み得る。例として、二本鎖核酸分子は、３’または５’ オーバーハングを有していてよく、それ自体は、それらの全長に亘って完全に二本鎖であることを必要とされないか、または仮定されない。核酸は、増幅方法およびＲＮＡの逆転写方法を含むが、これらに限定されない、生物学的合成法、生化学的合成法または化学的合成法あるいは当技術分野で公知の何れかの方法によって得られ得る。核酸という用語は、染色体または染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸の（naked）ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、プライマー、プローブ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であり得て、特定の長さに限定されない。他に特記しない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された任意の配列に加えて、相補的配列を含むかまたはコードする。
【００３３】
核酸は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによって、特に細胞内に見いだされ得るＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅによって分解され得る。従って、核酸を分解に対して安定化させるために該核酸を修飾し、それによって細胞中で高濃度の核酸が長期間にわたって確実に維持されるようにすることが有利であり得る。一般的には、そのような安定化は、１つ以上のヌクレオチド間リン酸基を導入することによって、または１つ以上のヌクレオチド間非リン酸基を導入することによって得ることができる。従って、核酸は、非天然ヌクレオチドおよび／または天然ヌクレオチドに対する修飾、ならびに／あるいは分子骨格に対する変化から構成することができる。核酸中の修飾されたヌクレオチド間リン酸ラジカルおよび／または非リン酸ラジカルとしては、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエートおよび／またはリン酸エステルが挙げられるが、これらに限定されず、一方、ヌクレオチド間非リン酸類縁体としては、シロキサン架橋、炭酸塩架橋、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート架橋および／またはチオエーテル架橋が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチド修飾のさらなる例としては、エキソヌクレアーゼ分解／ポリメラーゼ伸長のライゲーションまたは阻害をそれぞれ可能にするための、５’または３’ヌクレオチドのリン酸化；共有結合および近共有結合のための、アミノ、チオール、アルキンまたはビオチニル修飾；蛍光体および消光体；ならびに、デオキシイノシン（ｄＩ）、５−ブロモ−デオキシウリジン（５−ブロモ−ｄＵ）、デオキシウリジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、反転（inverted）ｄＴ、反転ジデオキシ−Ｔ、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、５−メチルデオキシシチジン（５−メチルｄＣ）、人工合成（locked）核酸（ＬＮＡ）、５−ニトロインドール、Ｉｓｏ−ｄＣおよび−ｄＧ塩基、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、ヒドロキシメチルｄＣ、５−ヒドロキシ部チル−２’−デオキシウリジン、８−アザ−７−デアザグアノシンおよびフッ素化修飾塩基などの修飾塩基が挙げられるが、これらに限定されない。従って、核酸はまた、ポリアミドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよび人工合成核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を含むが、これらに限定されない、人工核酸であってもよい。
【００３４】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係にあるとき、“作動可能に連結されている”。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすとき、コード配列に作動可能に連結されているか；または、リボソーム結合部位が翻訳を容易にするように配置されているとき、それはコード配列に作動可能に連結されている。
【００３５】
本明細書中、用語“オリゴヌクレオチド”は、約５０ヌクレオチドまで、例えば２から約５０ヌクレオチド長の核酸配列を意味する。
【００３６】
本明細書で用いるとき、用語“ポリヌクレオチド”は、約５０ヌクレオチド長を超える、例えば５１ヌクレオチド長またはそれ以上の長さの核酸を意味する。
【００３７】
オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドは、既存配列または天然配列の単離、ＤＮＡ複製または増幅、逆転写、適当な配列のクローニングおよび制限酵素消化、あるいはNarangらのホスホトリエステル法（Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979）；Brownらのホスホジエステル法（Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979）；Beaucageらのジエチルホスホルアミダイト法（Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981）；Matteucciらのトリエステル法（J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981）；自動化合成法；または、米国特許第４，４５８，０６６号に記載の固相支持法、あるいは当業者に公知の他の方法を含むが、これらに限定されない、好適な方法により調製される。
【００３８】
本明細書で用いる用語“ベクター”は、細胞内に導入される、またはその中に含まれるタンパク質および／もしくは核酸を細胞内に導入することができる、タンパク質またはポリヌクレオチドまたはそれらの混合物を意味する。ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が挙げられるが、それらに限定されない。特に、ベクターは、目的の遺伝子産物、例えば外来ＤＮＡもしくは異種ＤＮＡを、適当な宿主細胞へと導入するために用いられる。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自己複製を促進する“レプリコン”ポリヌクレオチド配列を含み得る。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に天然には見いだされないＤＮＡである異種ＤＮＡとして定義され、これは、例えば、ベクター分子を複製し、選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカーをコードし、または導入遺伝子をコードする。宿主細胞内に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡとは無関係にまたはそれと同時に複製することができ、ベクターおよびその挿入ＤＮＡのいくつかのコピーを生成することができる。さらに、ベクターはまた、挿入ＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、あるいは挿入ＤＮＡの複数コピーのＲＮＡへの複製を引き起こすのに必要な要素を含み得る。ベクターは、目的の遺伝子の発現を調節する“発現制御配列”をさらに含み得る。一般的に、発現制御配列は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター（insulator）、またはリプレッサーなどの、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。目的の１以上の遺伝子産物をコードする２以上のポリヌクレオチドを含むベクターにおいて、発現は、１以上の発現制御配列によって共に、または別々に制御され得る。より具体的には、ベクター上に含まれる各ポリヌクレオチドは、別々の発現制御配列によって制御されてもよく、またはベクター上に含まれる全てのポリヌクレオチドは、たった１つの発現制御配列によって制御されてもよい。単一の発現制御配列によって制御される単一のベクター上に含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成し得る。いくつかの発現ベクターは、発現されたｍＲＮＡの半減期を増加させる、および／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接する配列要素をさらに含む。挿入ＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡおよびポリペプチドの多くの分子は、このようにして迅速に合成され得る。
【００３９】
用語“アミノ酸”は、一般的に、置換または非置換アミノ基、置換または非置換カルボキシ基、および１以上の側鎖基、あるいはこれらの基のいずれかの類縁体を含む任意のモノマー単位を意味する。例示的な側鎖としては、例えば、チオール、セレノ（seleno）、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれらの基の任意の組合せが挙げられる。他の代表的なアミノ酸としては、光活性化可能架橋剤を含むアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合するアミノ酸、光ケージ化および／もしくは光異性化可能なアミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチンもしくはビオチン類縁体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールもしくはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なおよび／もしくは光切断可能なアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で用いる用語“アミノ酸”は、以下の２０個の天然または遺伝的にコードされたアルファ−アミノ酸を含む：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。“Ｘ”残基が定義されないとき、これらは“任意のアミノ酸”として定義されるべきである。これらの２０個の天然アミノ酸の構造は、例えば、Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。セレノシステインおよびピロリジンなどの追加的アミノ酸もまた、遺伝的にコードされ得る（Stadtman (1996) “Selenocysteine,” Annu Rev Biochem. 65:83-100 および Ibba et al. (2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,” Curr Biol. 12(13):R464-R466）。用語“アミノ酸”はまた、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば、修飾側鎖および／または骨格を有する）、およびアミノ酸類縁体も含む。例えば、Zhang et al. (2004) “Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887、Anderson et al. (2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571、Ikeda et al. (2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,” Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706、Chin et al. (2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code,” Science 301(5635):964-967、James et al. (2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991、Kohrer et al. (2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315、Bacher et al. (2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425、Hamano-Takaku et al. (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine,” J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328、および、Budisa et al. (2001) “Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids,” Protein Sci. 10(7):1281-1292を参照のこと。アミノ酸は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質中に含まれ得る。
【００４０】
本明細書中、用語“ペプチド”は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短いポリマーを意味する。それはタンパク質と同じ化学的（ペプチド）結合を有するが、通常、長さが短い。最も短いペプチドはジペプチドであり、単一のペプチド結合によって結合された２つのアミノ酸からなる。トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなどもあり得る。一般的に、ペプチドは、８、１０、１２、１５、１８または２０アミノ酸までの長さを有する。ペプチドは、環状ペプチドでない限り、アミノ末端およびカルボキシル末端を有する。
【００４１】
本明細書中、用語“ポリペプチド”は、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸の単一の直鎖を意味し、一般的に、少なくとも約２１個のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、２本以上の鎖からなるタンパク質の１本の鎖であり得るか、またはタンパク質が１本の鎖からなる場合、それはタンパク質それ自体であり得る。
【００４２】
用語“アミノ酸のストレッチ（stretch）”は、特定のアミノ酸配列を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の一部分を意味する。従って、アミノ酸のストレッチは、該ストレッチに存在するアミノ酸によって最初に定義され、次にそのストレッチに存在するアミノ酸の特定の配列によって定義される。例えば、ポリペプチドが特定のアミノ酸のストレッチを含む場合、ポリペプチドは、そのストレッチに配置される特定の順序でそのストレッチ中に存在することが特定されたアミノ酸を含むことが理解される。しかしながら、特定のアミノ酸のストレッチを含まないポリペプチドは、そのストレッチの個々のアミノ酸を含み得るが、それらがそのストレッチに配置される特定の順序で特定のアミノ酸を含まない。
【００４３】
本明細書中、タンパク質またはポリペプチドの“一次構造”は、ポリペプチド鎖中のアミノ酸の配列である。タンパク質中の“二次構造”は、タンパク質の局所セグメントの一般的な三次元形態である。しかしながら、それは三次元構造であると考えられる三次元空間における特定の原子位置を記載していない。タンパク質において、二次構造は、主鎖アミド基とカルボキシル基との間の水素結合のパターンによって定義される。タンパク質の“三次構造”は、原子座標によって決定されるタンパク質の三次元構造である。“四次構造”は、マルチサブユニット複合体における複数の折り畳まれたまたはコイル状のタンパク質またはポリペプチド分子の配置である。
【００４４】
本明細書で用いる用語“折り畳まれた”または“タンパク質の折り畳み”は、タンパク質がその三次元形状または立体構造をとると仮定する、すなわちそれによってタンパク質が水素結合、金属配位、疎水力、ファンデルワールス力、π−π相互作用、および／または静電効果などの非共有相互作用を介して特定の三次元形状を形成するように向けられるプロセスを意味する。従って、用語“折り畳まれたタンパク質”は、その二次、三次または四次構造などの三次元形状をとるタンパク質を意味する。
【００４５】
本明細書で用いる用語“断片”は、天然断片（例えば、スプライス変異体）ならびに人工的に構築された断片を意味し、特に遺伝子技術的手段によって得られるものを意味する。一般的に、断片は、そのＮ末端および／またはそのＣ末端および／またはその親ポリペプチドと比較して内部に、好ましくはそのＮ末端に、そのＮ末端およびＣ末端に、またはそのＣ末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個までのアミノ酸の欠失を有する。
【００４６】
用語“サブユニット”は、高分子が分割され得るこの高分子の一部（例えば、ポリペプチド、タンパク質またはポリタンパク質）を意味する。高分子は、１以上のサブユニットから構成され得る。そのような分割は、高分子および／または個々のサブユニットの機能的特性（例えば、特定の結合機能または相互作用機能を有する）もしくは構造的特性（例えば、ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列、または二次構造もしくは三次構造）により存在し得る。本明細書中、用語“サブユニット”は、タンパク質またはポリタンパク質の一部を意味することが好ましい。、特に、かかるサブユニットが、タンパク質またはポリタンパク質の残りの部分とは無関係に折り畳まれ、および／または機能することが好ましい。特に、本明細書中、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットは、ＰＡサブユニット、ＰＢ１サブユニットおよびＰＢ２サブユニットを意味する。用語サブユニットにはまた、天然サブユニットの断片、誘導体またはコドン最適化変異体などの変異体も含まれる。好ましくは、そのようなサブユニットの変異体は、天然サブユニットと同じ機能を示す。
【００４７】
用語“ＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片”は、ＰＡサブユニットのカルボキシ末端部分に由来するＰＡサブユニットの断片を意味する。用語“ＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片”は、ＰＡサブユニットのＣ末端が該断片中に存在することを必要としないが、該断片が、ＰＡサブユニットのＣ末端の３分の２の部分に位置するＰＡサブユニットの部分、すなわち、ＰＡサブユニットがトリプシンにより分けられる部分である、アミノ酸残基２５８のＣ末端（Ａ型インフルエンザにおいて７１３個のアミノ酸残基、またはＢ型インフルエンザにおいて７２６個のアミノ酸残基）に由来するという事実を意味する。従って、用語“ＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片”は、Ａ型インフルエンザのＰＡサブユニットのアミノ酸２５８−７１３、またはＢ型インフルエンザのＰＡサブユニットのアミノ酸２５８−７２６、またはそれらに対応するアミノ酸、すなわち、それに整列したＰＡサブユニット中の同様の位置を有するアミノ酸に由来する断片を意味する。
【００４８】
用語“ＣＴＤ”または“Ｐｏｌ ＩＩ ＣＴＤ”または“細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤ”は、真核細胞に存在するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端ドメインを意味する。一般的に、哺乳動物細胞、特にヒト細胞におけるＰｏｌ ＩＩ ＣＴＤは、コンセンサス配列Ｙ１Ｓ２Ｐ３Ｔ４Ｓ５Ｐ６Ｓ７を有する５２個の７残基リピート配列からなる。
【００４９】
本明細書で用いる用語“変異体”は、その長さまたは配列における１以上の変化に由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比べて異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドと理解されるべきである。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド変異体が由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとしても知られている。用語“変異体”は、親分子の“断片”または“誘導体”を含む。一般的に、“断片”は、親分子よりも長さまたはサイズが小さいが、“誘導体”は、親分子と比較してそれらの配列に１以上の相違を呈する。これに限定されないが、翻訳後修飾タンパク質（例えば、グリコシル化、ビオチン化、リン酸化、ユビキチン化、パルミトイル化、またはタンパク質分解的に切断されたタンパク質）などの修飾分子ならびにメチル化ＤＮＡなどの修飾核酸も含まれる。また、これに限定されないが、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド等の異なる分子の混合物も、用語“変異体”に包含される。一般的に、変異体は、好ましくは遺伝子工学的手段により人工的に構築されるが、一方、親タンパク質またはポリヌクレオチドは、野生型タンパク質またはポリヌクレオチド、またはそれらのコンセンサス配列である。しかしながら、天然変異体もまた、本明細書で用いる用語“変異体”に包含されると理解されるべきである。さらに、本発明で使用可能な変異体は、親分子のホモログ、オルソログまたはパラログに由来するものであるか、または人工的に構築された変異体に由来するものであってよい。ただし、変異体は、親分子の少なくとも１つの生物学的活性を示し、すなわち、機能的に活性である。
【００５０】
特に、用語“ペプチド変異体”、“ポリペプチド変異体”、“タンパク質変異体”は、それが由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と比較してアミノ酸配列において１以上の変化により異なるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と理解されるべきである。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質変異体が由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、親ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質としても知られる。さらに、本発明で使用できる変異体はまた、親ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質のホモログ、オルソログもしくはパラログ、または人工的に構築された変異体に由来し得る。ただし、変異体は、親ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示す。アミノ酸配列における変化は、アミノ酸置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断もしくはＣ末端切断、またはこれらの変化のいずれかの組合せであり得て、それは１つまたは複数の部分で起こり得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質変異体は、最大２００個（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００まで）のアミノ酸配列における変化（すなわち、置換、挿入、欠失、Ｎ末端切断、および／またはＣ末端切断）を示す。アミノ酸置換は、保存的および／または非保存的であり得る。あるいは、またはそれに加えて、本明細書で用いる“変異体”は、それが由来する親ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とある程度の配列同一性によって特徴付けられる得る。より正確には、本発明のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質変異体は、その親ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を示す。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質変異体の配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸の連続的な範囲に亘る。
【００５１】
残基がポリペプチド構造中の類似の位置にあるとき、２つ以上のポリペプチド中の残基は、互いに“対応する”と言われる。当技術分野において周知であるように、２つ以上のポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列または構造的類似性に基づいてポリペプチド配列を整列させることによって決定され得る。別の配列（例えば、領域、断片、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置など）に対する“対応する”という用語は、配列同一性の割合を最大にするような方法での、ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の番号付けおよび配列アライメントの恒常性を意味する。所定の“対応する領域”内のすべての位置が同一である必要はないため、対応する領域内の不一致位置を“対応する位置”と見なしてよい。従って、本明細書で用いる、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の“アミノ酸位置［Ｘ］に対応するアミノ酸位置”への言及は、アラインメントに基づいて、それに整列された別のヌクレオチドまたはアミノ酸配列、ならびに構造上のホモログおよびファミリーにおける同等の位置を意味する。本発明のいくつかの態様において、アミノ酸位置の“対応”は、配列番号１、配列番号２または配列番号４４の１以上のモチーフを含む目的の領域に関して決定される。例えば、配列番号１の位置４４９のアミノ酸であるアルギニン（Ｒ４４９）は、配列番号４４の位置４５４のアミノ酸であるアルギニン（Ｒ４５４）に対応する。特に、配列番号１、配列番号２および配列番号４４のＣＴＤ結合部位１および２の対応するアミノ酸位置を図１５に示す。例えばアミノ酸の変化またはアミノ酸の付加もしくは欠失により、ポリペプチド配列が特定の配列と異なるとき、改善された活性に関連する特定の変異は、それが該特定の配列にあるのと同じ位置番号にはない可能性がある。当業者が配列を分析し、対応する位置を同定することを可能にするアライメントツールは、当該分野において周知であり、例えば、ワールドワイドウェブ上で、例えば、標準設定を用いるＣｌｕｓｔａｌＷ （www.ebi.ac.uk/clustalw）またはＡｌｉｇｎ （http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）、好ましくはAlign EMBOSS:needle、Matrix: Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5を入手できる。当業者は、満足のいくアラインメントを生成するためにいずれかの順序でギャップを導入することが必要であり得ることを理解する。２つまたはそれ以上のＰＡサブユニットにおける残基は、該残基が最良の配列アライメントで整列されいているとき、“対応する”と言われる。２つのポリペプチド間の“最良の配列アライメント”は、最大数のアラインメントされた同一残基を生じるアラインメントとして定義される。２つの整列された配列間の配列類似性、好ましくは同一性が、１０、２０または３０アミノ酸の長さに亘って、３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満に低下する場合、“最良の配列アライメントの領域”は終了し、従って、類似性スコアの決定を目的として比較配列の長さの境界（metes and bounds）を決定する。
【００５２】
本発明の方法を用いて化合物を同定するという文脈で用いる用語“結合する”とは、部分（すなわち、化学物質または化合物またはその部分もしくは断片）とＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性部位との間の近接性を意味する。結合は、並置が例えば水素結合、ファンデルワールス、静電相互作用、または疎水性相互作用によってエネルギー的に有利である場合に、すなわち非共有結合であってよいか、または共有結合であってよい。
【００５３】
用語“組換え”は、組換え法によって意図的に修飾されているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。本明細書で用いる用語“組換え核酸”は、インビトロで形成され、場合によりエンドヌクレアーゼによってさらに操作されて、通常は天然には見いだされない核酸分子を形成する、核酸を意味する。例示的な組換え核酸には、直線状のｃＤＮＡ、ならびに通常は連結されていないＤＮＡ分子を連結することによりインビトロで形成されたベクターが含まれる。組換え核酸が作製され宿主細胞に導入されると、それは非組換え的に、すなわち、インビトロ操作よりもむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製することが理解される。従って、組換え的に産生された核酸は、続いて非組換え的に複製され得る。“組換えタンパク質”は、組換え技術を用いて、例えば、上記のように組換え核酸の発現を介して作製されたタンパク質である。本明細書で用いる用語“組換えベクター”としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを含む、当業者に公知の任意のベクターが挙げられる。該ベクターは、発現ベクターおよびクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドならびにウイルスベクターを含み、そして一般的に、特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物）またはインビトロ発現系において、作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必要な所望のコーディング配列および適当なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般的に、特定の所望のＤＮＡ断片を操作し増幅するために使用され、そして、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠失していてよい。
【００５４】
用語“宿主細胞”は、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）を保持する細胞を意味する。かかる宿主細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）または真核細胞（例えば、真菌、植物または動物細胞）のいずれかであり得る。宿主細胞には、単細胞原核生物および真核生物（例えば、細菌、酵母および放線菌）ならびに細胞培養で増殖させるとき、高次植物または動物由来の単一細胞の両方が含まれる。本明細書で用いる“組換え宿主細胞”は、目的のポリペプチド断片、すなわち、本発明によるウイルスＰＡサブユニットまたはその変異体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を意味する。このポリヌクレオチドは、宿主細胞 （ｉ）それ自体自由に分散して、（ｉｉ）組換えベクターに組み込まれて、または（ｉｉｉ）宿主細胞ゲノムもしくはミトコンドリアＤＮＡに組み込まれて、宿主細胞内に見いだされ得る。組換え細胞は、目的のポリヌクレオチドの発現または本発明のポリヌクレオチドもしくは組換えベクターの増幅に用いることができる。用語“組換え宿主細胞”には、本発明のポリヌクレオチドまたは組換えベクターを用いて、形質転換、トランスフェクトまたは感染されている元の細胞の子孫も含まれる。組換え宿主細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞、出芽酵母もしくはメタノール資化性酵母（Pichia pastoris）などの酵母細胞、植物細胞、ＳＦ９もしくはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞などの昆虫細胞、または哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカミドリザルの腎細胞（ＣＯＳ細胞）、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ＨＥＬＡ細胞などである。
【００５５】
“配列同一性の割合（％）”は、比較ウインドウ上の２つの最適に整列させた配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウインドウ内の配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための対象配列（不可または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、その一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、そしてその結果に１００を掛けることによって計算して、配列同一性の割合を得る。
【００５６】
２種またはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の説明における用語“同一の”は、同じである、すなわち、同じヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含む、２種またはそれ以上の配列または部分配列を意味する。配列は、特定の割合の同じ（例えば、特定の領域にわたって、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性）であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する場合、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または手動アラインメントおよび外観検査によって測定された、比較ウインドウまたは指定された領域にわたる最大の対応と比較して整列させたとき、互いに“実質的に同一”である。これらの定義はまた、試験配列の相補体についても言える。場合により、目的のポリペプチドおよび対象ポリペプチドは、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸の連続する範囲に亘って、あるいは対象ポリペプチドの全長に亘って示された配列同一性を示す。場合により、目的のポリヌクレオチドおよび対象ポリヌクレオチドは、６０、９０、１２０、１３５、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上のヌクレオチドの連続する範囲に亘って、あるいは対象ポリヌクレオチドの全長に亘って示された配列同一性を示す。
【００５７】
用語“配列比較”とは、１つの配列が対象配列として作用し、それに対して試験配列が比較されるプロセスを意味する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、必要であれば部分配列座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される場合、試験配列および対象配列はコンピューターに入力される。デフォルトプログラムパラメータが一般的に用いられるか、または代わりのパラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、対象配列に対する試験配列の配列同一性または類似性の割合を計算する。２つの配列が比較され、対象配列が、配列同一性割合が計算されるべきものと比較して特定されない場合、これと異なる説明がなされないとき、配列同一性は比較されるべき２つの配列のより長い方に関して計算されるべきである。対象配列が示されている場合、配列同一性は、これと異なる説明がなされないとき、配列番号によって示される対象配列の全長に基づいて決定される。
【００５８】
配列アライメントにおいて、用語“比較ウインドウ”とは、同じ数の連続する位置を有する基準配列と比較される、ある配列の連続する位置の配列を意味する。選択される連続位置の数は、１０から１０００までの範囲であり得て、すなわち２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００個の連続位置を含み得る。一般的に、連続位置の数は、約２０から８００の連続位置、約２０から６００の連続位置、約５０から４００の連続位置、約５０から約２００の連続位置、約１００から約１５０の連続位置の範囲である。
【００５９】
比較のための配列の整列方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適アライメントは、例えば、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482、1970）、NeedlemanおよびWunschの相同性アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）、PearsonおよびLipmanの類似性方法の検索（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（implementation）（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴ、Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison、Wis.）、または手動アライメントおよび視覚的比較（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995年補足)を参照のこと）により行われ得る。配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適するアルゴリズムは、それぞれAltschul et al. （Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977）およびAltschul et al. （J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）に記載される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワード(配列)と整列したときにある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによってハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., 前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含む長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシードとして機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限りは、両方の方向に、各々の配列に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一対の一致する残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびパラメーターＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各々の方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値からＸ量低下する場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基アラインメント（negative-scoring residue alignment）の累積により、０またはそれ以下になる場合；あるいは、いずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照のこと）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これによって、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標が得られる。例えば、核酸は、対象核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、一般的に約０．０１未満、より一般的には、約０．００１未満であるとき、対象配列と同様であるとみなされる。
【００６０】
本明細書で用いる用語“コンセンサス”は、関連配列が互いに比較された、多重配列アラインメントの結果を表すアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。そのようなコンセンサス配列は、各位置で最も一般的に観察されるアミノ酸またはヌクレオチドからなる。本明細書中、コンセンサス配列を得るための配列アライメントにおいて用いられる配列は、世界中で種々の疾患発症において単離された異なるウイルスサブタイプ株の配列であることが好ましい。配列アライメントにおいて用いられる各個々の配列は、特定のウイルスの“単離体”の配列と称される。
【００６１】
アミノ酸が化学的に関連したアミノ酸で置換されている、半保存的およびとりわけ保存的アミノ酸置換が好ましい。一般的な置換は、脂肪族アミノ酸、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸、酸性残基を有するアミノ酸、アミド誘導体、塩基性残基を有するアミノ酸、または芳香族残基を有するアミノ酸の間で起こる。一般的な半保存的および保存的置換は、以下である：
【表１】
2019528508.tif 000002
【００６２】
新規システインが遊離チオールとして残るとき、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣへの変更は、半保存的である。さらに、当業者は、立体的にかさ高い（sterically demanding）位置にあるグリシンは置換されるべきではなく、Ｐはα−へリックスまたはβ−シート構造を有するタンパク質の一部に導入されるべきではないことを理解し得る。
【００６３】
タグ（またはマーカーまたは標識）は、他の物質または物質の複合体の存在を示すことができるあらゆる種類の物質である。マーカーは、検出しようとする物質に連結されているかまたはそれに導入されている物質であり得る。検出可能なマーカーは、分子生物学およびバイオテクノロジーにおいて、例えばタンパク質、酵素反応の産物、第二のメッセンジャー、ＤＮＡ、分子の相互作用などを検出するために用いられる。好適なタグまたはラベルの例としては、フルオロフォア、発色団、放射性標識、金属コロイド、酵素、または化学発光もしくは生物発光分子が挙げられる。本明細書中、好適なタグは、好ましくは、そのペプチド配列が組換えタンパク質中またはそれに遺伝子的に移植されているタンパク質タグである。タンパク質タグとしては、例えば親和性タグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、または蛍光タグが挙げられる。
【００６４】
“親和性タグ”は、アフィニティー技術を用いてそれらの粗製の生物学的供給源からタンパク質を精製することができるように、該タンパク質に付加される。これらには、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは、金属マトリックスに結合する広く使用されているタンパク質タグである。
【００６５】
“可溶化タグ”は、とりわけシャペロンを欠く種（chaperone-deficient species）で発現される組換えタンパク質に用いられて、タンパク質の適当な折り畳みを助け、それらが沈殿しないようにする。これらには、チオレドキシン（ＴＲＸ）系およびポリ（ＮＡＮＰ）が含まれる。いくつかの親和性タグは、ＭＢＰおよびＧＳＴなどの可溶化剤として二重の役割を果たす。
【００６６】
“クロマトグラフィータグ”は、タンパク質のクロマトグラフィー特性を変えるために用いられて、特定の単離技術に亘って異なる分離能（resolution）をもたらす。多くの場合、これらはＦＬＡＧタグなどのポリアニオン性アミノ酸で構成されている。
【００６７】
“エピトープタグ”は、高親和性抗体が多くの異なる種において確実に産生され得るために選択される短いペプチド配列である。これらは、通常、ウイルス遺伝子に由来し、その高い免疫反応性を説明している。エピトープタグは、Ｖ５タグ、ＭｙｃタグおよびＨＡタグを含む。これらのタグは、特に、ウェスタンブロット、免疫蛍光および免疫沈降実験に有用であるが、抗体精製にも用いられている。
【００６８】
“蛍光タグ”は、タンパク質の視覚的読み取りを与えるために用いられる。ＧＦＰおよびその変異体は、最も一般的に用いられている蛍光タグである。ＧＦＰのより高度な用途は、それを折り畳みレポーターとして用いることを含む（折り畳まれている場合は蛍光性、そうでない場合は無色である）。フルオロフォアのさらなる例としては、フルオレセイン、ローダミンおよびスルホインドシアニン色素Ｃｙ５が挙げられる。
【００６９】
そのようなタグの例としては、ＡｖｉＴａｇ（酵素ＢｉｒＡによるビオチン化およびストレプトアビジンによる単離を可能にするペプチド（配列番号４、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ））、カルモジュリンタグ（タンパク質カルモジュリンによって結合されるペプチド（配列番号５、ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ））、ポリグルタメートタグ（Ｍｏｎｏ−Ｑのような陰イオン交換樹脂に効率的に結合するペプチド（配列番号６、ＥＥＥＥＥＥ））、Ｅ−タグ（抗体により認識されるペプチド（配列番号７、ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ））、ＦＬＡＧ−タグ（抗体によって認識されるペプチド（配列番号８、ＤＹＫＤＤＤＤＫ））、ＨＡ−タグ（抗体によって認識されるペプチド（配列番号９、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ））、Ｈｉｓ−タグ（ニッケルまたはコバルトキレートによって結合された５〜１０個のヒスチジン（配列番号１０、ＨＨＨＨＨＨ））、Ｍｙｃ−タグ（抗体によって認識される短いペプチド（配列番号１１、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ））、Ｓ−タグ（配列番号１２、ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ＳＢＰタグ（ストレプトアビジンに結合するペプチド（配列番号１３、ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ））、Ｓｏｆｔａｇ１（哺乳動物発現用（配列番号１４、ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ））、Ｓｏｆｔａｇ３（原核生物発現用（配列番号１５、ＴＱＤＰＳＲＶＧ））、Ｓｔｒｅｐ−タグ（ストレプトアビジンまたはストレプトアクチンと呼ばれる修飾型ストレプトアビジンに結合するペプチド（Strep-tag II：配列番号１６、ＷＳＨＰＱＦＥＫ））、ＴＣタグ（ＦｌＡｓＨおよびＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグ（配列番号１７、ＣＣＰＧＣＣ））、Ｖ５タグ（抗体によって認識されるペプチド（配列番号１８、ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ））、ＶＳＶ−タグ（抗体によって認識されるペプチド（配列番号１９、ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ））、Ｘｐｒｅｓｓタグ（配列番号２０、ＤＬＹＤＤＤＤＫ）、イソペプタグ（Isopeptag）（ピリン−Ｃタンパク質に共有結合するペプチド（配列番号２２、ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ））、ＳｐｙＴａｇ（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合するペプチド（配列番号２３、ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ））、ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシル担体タンパク質、ストレプトアビジンによる認識を可能にするＢｉｒＡによってビオチニル化されたタンパク質ドメイン）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ（固定化されたグルタチオンに結合するタンパク質）、緑色蛍光タンパク質タグ（自然に蛍光を発し、ナノ粒子に結合することができるタンパク質）、マルトース結合タンパク質タグ（アミロースアガロースに結合するタンパク質）、Ｎｕｓタグ、チオレドキシンタグ、Ｆｃタグ（免疫グロブリンＦｃドメイン由来）、Ｔｙタグ、疾患を促進するアミノ酸（Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｇ、．．）を含む設計された本質的に無秩序なタグ(Designed Intrinsically Disordered tags)Minde, David P; Els F Halff; Sander J Tans (2013-09-01). “Designing disorder: Tales of the unexpected tails”. Intrinsically Disordered Proteins 1 (2): e26790）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書で用いる用語“結晶(crystal)”または“結晶（crystalline）”は、平面が一定の角度で交差し、その構成化学種の規則的な構造（内部構造など）が存在する構造（三次元固体凝集体など）を意味する。用語“結晶”は、実験的に調製された結晶などの固体物理結晶形、結晶から誘導可能な結晶構造（二次および／または三次および／または四次構造要素を含む）、結晶構造ベースの２Ｄおよび／または３Ｄモデル、その模式図または図表などの表示、あるいはコンピューター用のそのデータセットのいずれか１つを含み得る。一側面において、結晶は、Ｘ線結晶学技術において使用可能である。本明細書中、使用される結晶は、Ｘ線ビームへの暴露に耐えることができ、Ｘ線結晶構造を解くために必要な回折パターンデータを生成するために用いられる。結晶は、T. L. Blundell and L. N. Johnson, “Protein Crystallography”, Academic Press, New York (1976)に示される結晶形のうちの１つによって定義されるパターンでＸ線を回折することができると特徴付けられ得る。
【００７１】
用語“単位胞（unit cell）”は、基本的な立方体または平行六面体形状のブロックを意味する。結晶の全体積は、そのようなブロックの規則的な組み立てによって構成することができる。各単位胞は、パターンの単位の完全な表示を含み、その繰り返しが結晶を構成する。
【００７２】
用語“空間群”は、結晶の対称要素の配置を意味する。空間群の指定において、大文字は格子の種類を示し、他の記号は、その外観を変えることなく非対称単位の内容（contents）に対して実行することができる対称操作を表す。
【００７３】
用語“立体構造座標”は、軸系に対応する１つまたは複数のアミノ酸残基の位置を定義する一連の値を意味する（例えば、デカルト座標、温度因子、および占拠率）。この用語は、１つまたは複数の分子の三次元構造を定義するデータセットを意味する。立体構造座標は、わずかに修正することができ、それでもなおほぼ同じ三次元構造を取ることができる。立体構造座標の固有セットの尺度は、得られた構造の二乗平均平方根偏差（root mean square deviation）である。３Å、２Å、１．５Å、１．０Åまたは０．５Å未満の二乗平均平方根偏差で互いに離れる三次元構造（特に、酵素活性中心の三次元構造）をもたらす立体構造座標は、当業者により非常に類似のものとみなされ得る。
【００７４】
用語“二乗平均平方根偏差”は、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。これは、傾向または目標（object）からの偏差または変動を表現する方法である。本発明の目的のために、“二乗平均平方根偏差”は、図１１または１２によるＰＡサブユニットの立体構造座標によって規定されるような、ＰＡサブユニットの骨格またはその中の結合部位（複数可）からの、ＰＡサブユニットの変異体の骨格またはその中の結合部位（複数可）の変動を規定する。
【００７５】
本明細書で用いる用語“コンピューターモデルを構築する”には、原子構造情報および相互作用モデルに基づく分子の構造および／または機能の定量的分析および定性的分析が含まれる。用語“モデリング”には、従来の数値基準の分子動的モデルおよびエネルギー最小化モデル、相互作用的コンピュータグラフィックモデル、改変（modified）分子力学モデル、距離幾何学法、ならびに他の構造基準制約モデルが含まれる。
【００７６】
用語“フィッティングプログラム操作”は、化学物質を酵素活性中心、結合ポケット、分子もしくは分子複合体またはその一部分と会合させるために、該化学物質、酵素活性中心、結合ポケット、分子もしくは分子複合体またはその一部分の立体構造座標を利用する操作を意味する。これは、化学物質を酵素活性中心内で位置決め、回転または平行移動し、酵素活性中心の形状および静電的相補性を適合させることにより、達成することができる。共有的相互作用、非共有的相互作用、例えば水素結合相互作用、静電的相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用などは最適化され、非相補的な静電的相互作用、例えば反発的な電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用および電荷−双極子相互作用などは減らすことができる。あるいは、酵素活性中心または結合部位への化学物質の結合の変形エネルギーを最小化することができる。
【００７７】
用語“コンピュータドッキング方法”は、化学物質および酵素活性中心の立体構造座標、結合ポケット、分子もしくは分子複合体またはその一部分を利用して、該化学物質と酵素活性中心、結合ポケット、分子もしくは分子複合体またはその一部とを関連付ける操作を意味する。これは、化学物質を位置決めし、回転または平行移動し、そのねじれ結合を化学的に合理的な方法で酵素活性中心、結合部位、分子もしくは分子複合体またはその一部分の内部で変えることにより、酵素活性中心、結合部位、分子もしくは分子複合体の形状および静電的相補性を適合させることができる。共有的相互作用、非共有的相互作用、例えば水素結合相互作用、静電的相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用などは最適化され、非相補的な静電的相互作用、例えば反発的な電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用および電荷−双極子相互作用などは減らすことができる。
【００７８】
本明細書で用いる用語“試験化合物”は、目的のポリペプチド断片、例えば、オルトミクソウイルス科またはその変種由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの、そのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻害する能力について試験される化合物、分子または複合体を含む物質を意味する。試験化合物は、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、タンパク質（抗体を含む）、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、ヌクレオシド、核酸、有機小分子または無機小分子、化学化合物、元素、糖類、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、ポリアミン、ならびにそれらの組合せおよび誘導体を含むがこれらに限定されない任意の物質であり得る。
【００７９】
用語“小分子”は、５０〜約２，５００ダルトンの分子量、好ましくは２００〜８００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を意味する。加えて、本発明の試験化合物は、検出可能な標識を任意に含み得る。このような標識としては、酵素標識、放射性同位体または放射性化合物もしくは放射性元素、蛍光化合物もしくは蛍光金属、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられるが、これらに限定されない。このような検出可能な標識を試験化合物に結合するために、既知の方法が用いられ得る。本発明の試験化合物は、天然物または混合コンビナトリアル合成の生成物を含む抽出物等の物質の複雑な混合物も含み得る。これらも試験することができ、ＰＡサブユニットのカルボキシ末端ドメインの結合を阻害する成分を、その後の工程で混合物から精製することができる。試験化合物は、合成または天然化合物のライブラリーから誘導するか、または選択することができる。例えば、合成化合物ライブラリーは、Enamine Ltd (Kiev、Ukraine)、ChemBridge Corporation (San Diego、CA)、またはLabNetwork Inc. (South Portland, ME, USA)から市販されている。天然化合物ライブラリーは、例えば、TimTec LLC (Newark, DE, USA)から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物および動物細胞および組織抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを用いることができる。さらに、試験化合物は、個々の化合物または混合物として、コンビナトリアルケミストリーを用いて、合成的に製造することができる。コンビナトリアルケミストリーを用いて作製した化合物の集合物（collection）は、本明細書中でコンビナトリアルライブラリと呼ばれる。
【００８０】
本明細書中、“オルトミクソウイルス科またはその変種由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの、そのリガンドへの結合を減少させる化合物”は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの、その細胞内リガンドへの、特に細胞性ポリメラーゼ Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少させる。そのような化合物は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体のＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片に特異的であり得て、他のポリメラーゼを調節しない、好ましくは他のポリメラーゼ、特に哺乳動物ポリメラーゼの活性を調節しない。一般的に、活性は、当該化合物を含まない活性と比較して、８０〜１００％、特に９０〜１００％減少する。
【００８１】
本明細書中、“オルトミクソウイルス科またはその変種由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの、そのリガンドへの結合を阻害する化合物”は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの、その細胞性リガンドへの、特に細胞性ポリメラーゼ Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を完全になくす。そのような化合物は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはまたはその変異体のＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片に特異的であり得て、他のポリメラーゼを調節しない、好ましくは他のポリメラーゼ、特に哺乳動物ポリメラーゼの活性を調節しない。
【００８２】
用語“ハイスループット設定における”は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのそのリガンドへの結合を減少または阻止するその能力に関して試験化合物のライブラリーをスクリーニングするために用いられる、ハイスループットスクリーニングアッセイおよび様々な種類の技術を意味する。一般的には、ハイスループットアッセイはマルチウェル形式で行われ、無細胞アッセイならびに細胞ベースアッセイを含む。
【００８３】
ポリペプチドに関して用語“精製（purified）”は、均質調製物のように絶対的に純粋であることを要せず、むしろそのポリペプチドが天然環境中よりも相対的に純度が高いことを表す。概して、精製ポリペプチドは、好ましくは機能的に顕著なレベルで、例えば少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９０％または９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度で、該ポリペプチドが自然に結合する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に有しない。“結晶化に適する程度まで精製された”という表現は、ポリペプチドが８５％〜１００％、好ましくは９０％〜１００％、より好ましくは９５％〜１００％または９８％〜１００％の純度であり、沈殿することなく３ｍｇ／ｍｌ超、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ超、より好ましくは１８ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮され得るポリペプチドを意味する。当業者は、タンパク質精製のための標準的技術を用いて、ポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主バンドを生じ得る。
【００８４】
一般的に、本明細書で用いる用語“抗体”は、膜貫通領域を欠失し、従って血流および体腔内に放出され得る、分泌型免疫グロブリンを意味する。ヒト抗体は、それらが有する重鎖に基づいて異なるアイソタイプに分類される。ギリシャ文字で表される５種のヒトＩｇ重鎖がある：α、γ、δ、εおよびμ。存在する重鎖の種類は抗体のクラスを定義する、すなわちこれらの鎖はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ抗体それぞれに見いだされ、異なる役割を果たし、異なる種類の抗原に対して適当な免疫応答を指示する。異なる重鎖はサイズおよび組成が異なり、約４５０アミノ酸を含み得る（Janeway et al. (2001) Immunobiology、Garland Science）。ＩｇＡは、腸、気道および泌尿生殖路などの粘膜領域、ならびに唾液、涙液および母乳中に見出され、病原体による定着（colonization）を阻止する（Underdown ＆ Schiff (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:389-417）。ＩｇＤは、抗原に曝されていないＢ細胞上の抗原受容体として主に機能し、好塩基球および肥満細胞を活性化して抗菌因子を産生させることに関与している（Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437; Chen et al. (2009) Nat. Immunol. 10:889-898）。ＩｇＥは、肥満細胞および好塩基球からのヒスタミンの放出を引き起こすアレルゲンへの結合を介してアレルギー反応に関与している。ＩｇＥは寄生虫からの保護にも関与している（Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press）。ＩｇＧは、侵入する病原体に対する抗体に基づく免疫の大部分を提供し、胎盤を通して胎児に受動免疫を与えることができる唯一の抗体アイソタイプである（Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press）。ヒトには、血清中に豊富に存在する順に命名された４つの異なるＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３および４）があり、ＩｇＧ１が最も豊富（約６６％）であり、次いでＩｇＧ２（約２３％）、ＩｇＧ３（約７％）、ＩｇＧ４（約４％）と続く。異なるＩｇＧクラスの生物学的プロファイルは、それぞれのヒンジ領域の構造によって決まる。ＩｇＭは、非常に高い結合活性を有する単量体型および分泌された五量体型でＢ細胞の表面に発現される。ＩｇＭは、十分なＩｇＧが産生される前のＢ細胞介在性（体液性）免疫の初期段階における病原体の排除に関与している（Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437）。抗体は単量体として見出されるだけでなく、２つのＩｇ単位の二量体（例えばＩｇＡ）、４つのＩｇ単位の四量体（例えば、硬骨魚のＩｇＭ）、または５つのＩｇ単位の五量体（例えば、哺乳動物ＩｇＭ）を形成することも知られている。抗体は、一般的に、ジスルフィド結合を介して連結され、“Ｙ”字型の高分子に似ている、２つの同一の重鎖および同一の２つの軽鎖を含む４つのポリペプチド鎖からなる。鎖のそれぞれは、そのうちのいくつかが定常ドメインであり、他のものが可変ドメインである、複数の免疫グロブリンドメインを含む。免疫グロブリンドメインは、２枚のシートに配置された７から９個の逆平行β鎖の２層サンドイッチからなる。一般的に、抗体の重鎖は、４つのＩｇドメインを含み、そのうちの３つは定常（ＣＨドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインであり、そして１つは可変（ＶＨ）ドメインである。軽鎖は一般的には１つの定常Ｉｇドメイン（ＣＬ）および１つの��変Ｉｇドメイン（ＶＬ）を含む。例示されるように、ヒトＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にＶｗＣＨ１-ＣＨ２-ＣＨ３（ＶｗＣｙ１-Ｃｙ２-Ｃｙ３とも呼ばれる）の順で連結された４つのＩｇドメインからなるが、ヒトＩｇＧ軽鎖は、カッパ型またはラムダ型のいずれかであるＶＬ−ＣＬの順でＮ末端からＣ末端に連結した２つの免疫グロブリンドメイン（ＶＫ−ＣＫまたはＶＡ−ＣＡ）からなる。例示されるように、ヒトＩｇＧの定常鎖は４４７アミノ酸を含む。本明細書中および特許請求の範囲において、免疫グロブリン中のアミノ酸位置の番号付けは、Kabat, E. A., Wu, T.T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C., (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5thed. U.S. Department of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDにおけるような、“ＥＵインデックス”のものである。“ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス”は、ヒトＩｇＧ １ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。従って、ＩｇＧにおけるＣＨドメインは以下の通りである：“ＣＨ１”は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従いアミノ酸位置１１８〜２２０を示す；“ＣＨ２”は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従いアミノ酸位置２３７〜３４０を示す；そして、“ＣＨ３”は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従いアミノ酸位置３４１〜４４７を示す。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を有する“Ｆａｂフラグメント”と呼ばれる（“Ｆａｂ部分”または“Ｆａｂ領域”とも呼ばれる）２つの同一の抗原結合フラグメント、およびその名前が容易に結晶化する能力を反映している、１つの“Ｆｅフラグメント”（“Ｆｅ部分”または“Ｆｅ領域”とも呼ばれる）を生じる。ヒトＩｇＧ Ｆｅ領域の結晶構造は決定されている（Deisenhofer (1981) Biochemistry 20:2361-2370）。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプにおいて、Ｆｅ領域は、抗体の２本の重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに由来する２つの同一のタンパク質フラグメントからなる。ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプにおいて、Ｆｅ領域は、各ポリペプチド鎖中に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２−４）を含む。さらに、より小さい免疫グロブリン分子は天然に存在するかまたは人工的に構築されている。用語“Ｆａｂ’フラグメント”は、Ｉｇ分子のヒンジ領域をさらに含むＦａｂフラグメントを意味し、一方、“Ｆ（ａｂ'）２フラグメント”は、ジスルフィド結合を介して化学結合または連結している２つのＦａｂ’フラグメントを含むと理解される。“単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）”（Desmyter et al. (1996) Nat. Structure Biol. 3:803-811）および“ナノボディ”は、ＶＨドメインを１つ含むだけであり、一方、“一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）”フラグメントは、短いリンカーペプチドを介して軽鎖可変ドメインに結合された重鎖可変ドメインを含む（Huston et al. （1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883）。二価の一本鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって作製することができる（ｓｃＦｖＡ−ｓｃＦｖＢ）。これは、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域とを有する単一のペプチド鎖を作製することにより、“タンデムｓｃＦｖ”（ＶＨＡ−ＶＬＡ−ＶＨＢ−ＶＬＢ）を得ることができる。別の可能性は、短すぎて２つの可変領域が折り重なることはできず、ｓｃＦｖに二量体化を強いるようなリンカーを用いた、ｓｃＦｖの作製である。通常、５残基の長さを有するリンカーを用いて、これらの二量体を生成させる。このタイプは“ダイアボディ”と呼ばれている。ＶＨドメインとＶＬドメインの間のさらに短いリンカー（１個または２個のアミノ酸）は、単一特異性三量体、いわゆる“トリアボディ”または“トリボディ”の形成をもたらす。二重特異性ダイアボディは、それぞれＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡまたはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡという配置の鎖を発現させることによって形成される。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、１２〜２０アミノ酸、好ましくは１４アミノ酸のリンカーペプチド（Ｐ）によって連結されたＶＨＡ−ＶＬＢフラグメントとＶＨＢ−ＶＬＡフラグメントとを含む（ＶＨＡ−ＶＬＢ−Ｐ−ＶＨＢ−ＶＬＡ）。“二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（bi-specific T-cell engager）（ＢｉＴＥ)”は、異なる抗体の２つのｓｃＦｖからなる融合タンパク質であって、一方のｓｃＦｖはＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方は腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合するものである（Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol. 22:238-244）。二重親和性再標的化分子（dual affinity retargeting molecule）（“ＤＡＲＴ”分子）は、Ｃ末端ジスルフィド架橋によってさらに安定化されたダイアボディである。
【００８５】
用語“結合親和性”は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的相互作用の総合的な強度を意味する。他に特に明記しない限り、“結合親和性”は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；および、競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ）を含むが、これらに限定されない、当業者に公知の方法により測定することができる。低親和性抗体は、一般的に、抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は、抗原により長く結合した状態を続ける。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野において公知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用することができる。結合親和性を測定するための特定の例および例示的態様を以下に記載する。
【００８６】
本発明の“Ｋｄ”または“Ｋｄ値”は、以下のアッセイに記載されるように、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて行われる放射能標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、滴定のための一連の非標識抗原の存在下でＦａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原と平衡化させ、続いて結合抗原を抗Ｆａｂ抗体被覆プレートで捕捉することによって測定される（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)）。アッセイの条件を確立するために、マイクロタイタープレート（DYNEX Technologies, Inc.）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）で一晩コーティングし、続いてＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで、室温（約２３℃）にて２〜５時間ブロッキングする。非吸着プレート（Nunc ＃269620)において、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を目的のＦａｂの連続希釈物と混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と同じように）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が確実に達成されるよう、より長時間（例えば、約６５時間）継続され得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％のＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μl／ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）、Packard）を添加し、プレートをTOPCOUNT（商標）ガンマカウンター（Packard）上において１０分間カウントする。最大結合の２０％以下または２０％を与える各Ｆａｂ濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
【００８７】
ＫｄまたはＫｄ値はまた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００装置（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、１０反応単位（response unit：ＲＵ）の抗原が固定されたＣＭ５チップを用いて２５℃にて、測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5、BIAcore Inc.）を、供給者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈し、その後５μｌ／分の流速で注入することにより、およそ１０応答単位（ＲＵ）のタンパク質をカップリングさせる。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍエタノールアミンを注入する。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％ＴＷＥＥＮ ２０（商標）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃にて、およそ２５μｌ／分の流速で注入する。単純１対１ラングミュア結合モデル（BIAcore（登録商標）評価ソフトウェア・バージョン３．２）を用いて、結合および解離センサーグラムを同時に適合させることにより、結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えばChen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイでオンレート（on-rate）が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合は、抗原の濃度を増加させながら、ストップトフロー付き（stop-flow-equipped）分光光度計（Aviv Instruments）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズ ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ThermoSpectronic）などの分光計で測定される、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の、２５℃での、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；蛍光＝３４０ｎｍ、帯域幅１６ｎｍ）の増減を測定する蛍光消光技術を用いて、該オンレートを決定することができる。
【００８８】
“オンレート”、“結合の速度”、“結合速度”または“ｋｏｎ”もまた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００システム（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を用いて上記のように決定され得る。
【００８９】
一般的に、抗体は、それらの標的への十分な結合親和性を有して、例えば、５００ｎＭ〜１ｐＭ、すなわち５００ｎＭ、４５０ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１ｐＭで結合する。
【００９０】
用語“薬学的に許容される塩”は、本発明の方法により同定可能な化合物または本発明の化合物の塩を意味する。好適な薬学的に許容される塩としては、例えば、本発明の化合物の溶液を、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸などの薬学的に許容される酸の溶液と混合することにより形成され得る、酸付加塩が挙げられる。さらに、化合物が酸性部分を有するとき、その好適な薬学的に許容される塩には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩）；ならびに、好適な有機配位子と形成される塩（例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対アニオンを用いて形成された、アンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオンおよびアミンカチオン）が含まれ得る。薬学的に許容される塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、カルシウムエデト酸塩、カンホウ酸塩、カンフルスルホン酸塩、炭酸塩、塩酸塩、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート（estolate）、エシレート（esylate）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニレート（glycollylarsanilate）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシノール酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデレート、メシレート、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩（mucate）、２-ナフタレンスルホン酸塩、ナプタンニコチン酸、硝酸、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（embonate）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、亜酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシラート(tosylate)、トリエチオダイド（triethiodide）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれるが、これらに限定されない（例えば、S. M. Berge et al., “Pharmaceutical salts”, J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977)を参照のこと）。
【００９１】
本明細書で用いる用語“賦形剤”は、例えば、担体、結合剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤または着色剤などの有効成分ではない医薬製剤中のすべての物質を意図する。
【００９２】
用語“薬学的に許容される担体”には、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどが含まれる。
【００９３】
用語“個体”または“対象”は、本明細書中互換的に用いられ、本発明から利益を得うる全ての哺乳動物、爬虫類または鳥類を意味する。特に、個体は、実験動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）、家畜動物（例えば、モルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ラクダ、ネコ、イヌ、カメ、ウミガメ、ヘビもしくはトカゲ）、またはチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびヒトを含む霊長動物からなる群より選択される。特に、“個体”はヒトである。
【００９４】
用語“疾患”および“障害”は、本明細書において互換的に用いられ、異常な状態、とりわけ疾患または傷害などの異常な医学的状態であって、組織、臓器または個体がもはやその機能を効率的に果たすことができない状態を意味する。必ずではないが一般的には、疾患は、かかる疾患の存在を示す特定の症状または徴候と関連している。従って、そのような症状または徴候の存在は、疾患に罹患している組織、臓器または個体の指標となる得る。これらの症状または徴候の変化は、そのような疾患の進行の指標となり得る。疾患の進行は、一般的に、疾患の“悪化”または“改善”を示し得る、そのような症状または徴候の増加または減少により特徴付けられる。疾患の“悪化”は、組織、臓器または生物がその機能を効率的に果たす能力の低下を特徴とし、一方、疾患の“改善”は、一般的に、組織、臓器または個体がその機能を効率的に果たす能力の増加により特徴付けられる。疾患を“発症するリスク”を有する組織、臓器または個体は、健康な状態にあるが、疾患が出現する可能性を示している。一般的に、疾患を発症するリスクは、そのような疾患の早期のもしくは弱い徴候または症状と関連している。そのような場合、疾患の発症は依然として処置によって予防され得る。疾患の例としては、感染症、外傷性疾患、炎症性疾患、皮膚疾患、内分泌疾患、腸疾患、神経疾患、関節疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患および種々のタイプの癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
用語“感染”は、病原体による生物体組織の侵襲、それらの増殖、ならびにこれらの生物およびそれらが産生する毒素に対する宿主組織の反応を意味する。伝染性疾患（transmissible disease or communicable disease）としても知られている“感染症”は、そのような感染の結果生じる疾患である。感染は、ウイルス、ウイロイド(Viroid)、プリオン、細菌、寄生性、回虫などの線虫、マダニ、ダニ、ノミ、シラミなどの節足動物、白癬などの真菌、ならびにサナダ虫および他の蠕虫等の他の大寄生生物を含む病原体によって引き起こされる。感染症は、以下の感染した解剖学的位置または臓器系によって分類することができる：呼吸器感染症、尿路感染症、皮膚感染症、歯性感染症（歯の内部または周囲の組織に起因する感染症）、膣感染症、羊膜腔感染症（intra-amniotic infection）。さらに、感染が最も一般的な原因である炎症の部位としては、肺炎、髄膜炎および耳管炎が挙げられる。
【００９６】
“呼吸器感染症”は、気道を含むあらゆる感染症を意味する。このタイプの感染症は、一般的に、上気道感染症（ＵＲＩもしくはＵＲＴＩ）または下気道感染症（ＬＲＩもしくはＬＲＴＩ）にさらに分類される。肺炎などの下気道感染症は、一般的な風邪などの上気道感染症よりもはるかに深刻な病状になる傾向がある。
【００９７】
オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、レトロウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルスおよびアルファウイルスなどの“エンベロープウイルス”は、宿主の原形質膜を起源とする脂質二重層に囲まれている。エンベロープウイルスには、非セグメント化およびセグメント化一本鎖ネガティブセンスＲＮＡウイルスが含まれるが、これに限定されない。非セグメント化一本鎖ネガティブセンスＲＮＡウイルスには、ボルナウイルス科（Bornaviridae）、フィロウイルス科（Filoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）およびラブドウイルス科（Rhabdoviridae）を含むモノネガウイルス目（Mononegavirale）が含まれる。セグメント化された一本鎖ネガティブセンスＲＮＡウイルスには、Ａ型インフルエンザウイルス属、Ｂ型インフルエンザウイルス属、Ｃ型インフルエンザウイルス属、トゴウイルス属およびイサウイルス属を含むオルトミクソウイルス科、ならびにハンタウイルス属、ナイロウイルス属、オルトブニウイルス属、フレボウイルス属およびトスポウイルス属を含むアレナウイルス科およびブニヤウイルス科が含まれる。本明細書中、セグメント科された一本鎖ネガティブセンスＲＮＡウイルスは、好ましくは、オルトミクソウイルス科のもの、より好ましくは、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、クアルジャウイルスまたはイサウイルス、特にＡ型インフルエンザウイルスである。
【００９８】
Ａ型インフルエンザサブタイプには、鳥類および哺乳動物サブタイプが含まれるが、これに限定されない。哺乳動物サブタイは、ヒト、ブタ、ウマおよびコウモリのサブタイプを含む。Ａ型インフルエンザサブタイプは、Ｈ１Ｎ１からＨ１８Ｎ１１のすべてのサブタイプ、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ８、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ８、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ８、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ８Ｎ４、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７，Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ３、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１６Ｎ３、Ｈ１７Ｎ１０およびＨ１８Ｎ１１を含むが、これらに限定されない。
【００９９】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１００】
態様
第一の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの結合を低減させる、または阻止する化合物をインシリコで同定する方法であって、
（ａ）ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの結合部位の１以上の立体構造座標に基づいてコンピューターモデルを構築する工程；
（ｂ）以下の方法：
（ｉ）１以上の結合部位内の共結晶化リガンドを修飾すること、
（ｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの１以上の結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、小分子データベースから化合物をフィルタリングおよび選択すること、および
（ｉｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、該化合物の新規リガンドを設計すること
からなる群より選択される方法により可能性のある調節化合物を選択する工程；
（ｃ）活性部位における前記化合物のエネルギー最小化立体配置を提供するために、前記化合物と前記１以上の結合部位のコンピューターモデル間でフィッティングプログラム操作を実行するための計算手段を用いる工程；および／または、化学物質である該化合物の合理的な３Ｄ配置を提供するために、前記化合物を前記結合部位に配置するためのコンピュータドッキング方法を用いる工程；ならびに、
（ｄ）前記フィッティング操作および要すれば前記ドッキング方法の結果を評価して、前記化合物と１以上の結合部位モデルとの間の関連性を定量化し、それによって前記化合物が前記結合部位と結合する能力を評価する工程
を含む、方法に関する。
【０１０１】
ある態様において、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型もしくはＤ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、またはその変異体である。特に、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１０２】
ある態様において、１以上の結合部位は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのそのリガンドへの結合部位である。
【０１０３】
特定の態様において、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットは、それぞれ配列番号１、配列番号２または配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１０４】
特に、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体のリガンドは、細胞性ポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）である。特に、リガンドは、Ｐｏｌ ＩＩのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）である。
【０１０５】
特に、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットまたはその変異体のリガンドは、細胞性ポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）である。特に、リガンドは、Ｐｏｌ ＩＩのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）である。
【０１０６】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの結合を減少または阻止する化合物を同定するためのインシリコの方法は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの１以上の結合部位、特にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのそのリガンドへの結合部位の立体構造座標に基づいてコンピューターモデルを構築する工程（ａ）を含む。
【０１０７】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の１以上の結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号１または配列番号４４）またはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号２）の第一および／または第二結合部位のアミノ酸を含むか、またはそれと整列されたＰＡサブユニットの配列において類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１０８】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの（特に、配列番号１の）Ｋ６３０、Ｒ６３３およびＥ４４４からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか；配列番号４４のＫ６３５、Ｒ６３８およびＥ４４９からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１０９】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（配列番号１）のアミノ酸Ｋ６３０、Ｒ６３３およびＥ４４４を含むか；配列番号４４のＰＡサブユニットのアミノ酸Ｋ６３５、Ｒ６３８およびＥ４４９を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１１０】
特定の態様において、型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号１のＫ２８９、Ｒ４４９およびＥ４５２からなる群より選択される１以上のアミノ酸をさらに含むか、または配列番号４４のＫ２８９、Ｒ４５４およびＥ４５７からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含む。
【０１１１】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号１のアミノ酸Ｋ２８９、Ｒ４４９およびＥ４５２をさらに含む。
【０１１２】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号４４のアミノ酸Ｋ２８９、Ｒ４５４およびＥ４５７をさらに含む。
【０１１３】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号１のアミノ酸Ｆ４４０および／またはＦ６０７をさらに含む。
【０１１４】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号４４のアミノ酸Ｙ４４５および／またはＦ６１２をさらに含む。
【０１１５】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号１のＭ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｉ５４５、Ｍ５４３およびＫ５５４からなる群より選択される１以上のアミノ酸をさらに含む。
【０１１６】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号４４のＬ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｌ５５０、Ｍ５４８およびＲ５５９からなる群より選択される１以上のアミノ酸をさらに含む。
【０１１７】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号１のアミノ酸Ｍ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｉ５４５、Ｍ５４３およびＫ５５４をさらに含む。
【０１１８】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号４４のアミノ酸Ｌ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｌ５５０、Ｍ５４８およびＲ５５９をさらに含む。
【０１１９】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号１のアミノ酸Ｇ６２９をさらに含む。
【０１２０】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号４４のアミノ酸Ｇ６３４をさらに含む。
【０１２１】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの（特に、配列番号１の）アミノ酸Ｆ４４０、Ｅ４４４、Ｆ６０７、Ｇ６２９、Ｋ６３０およびＲ６３３を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｙ４４５、Ｅ４４９、Ｆ６１２、Ｇ６３４、Ｋ６３５およびＲ６８３を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１２２】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの（特に、配列番号１の）アミノ酸Ｍ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｒ４４９、Ｅ４５２、Ｍ５４３、Ｋ５５４およびＩ５４５を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｌ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｍ５４８、Ｋ５５９およびＬ５５０を含むか、または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１２３】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの（特に、配列番号１の）アミノ酸Ｍ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｆ４４０、Ｅ４４４、Ｒ４４９、Ｅ４５２、Ｍ５４３、Ｋ５５４、Ｉ５４５、Ｆ６０７、Ｇ６２９、Ｋ６３０およびＲ６３３を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｌ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｙ４４５、Ｅ４４９、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｍ５４８、Ｋ５５９、Ｌ５５０、Ｆ６１２、Ｇ６３４、Ｋ６３５およびＲ６３８を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１２４】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号１のアミノ酸２５８−７１３を含むか、または配列番号４４のアミノ酸２０１−７１６を含み、要すれば、アミノ酸配列ＧＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーを含む。
【０１２５】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの該結合部位は、図１１に示す立体構造座標により定義される構造を有する。
【０１２６】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの（特に、配列番号２の）Ｅ４４５、Ｋ６３１およびＲ６３４からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１２７】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの（特に、配列番号２の）アミノ酸Ｅ４４５、Ｋ６３１およびＲ６３４を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１２８】
特定の態様において、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号２のアミノ酸Ｙ４４１および／またはＦ６０４をさらに含む。
【０１２９】
特定の態様において、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号２のアミノ酸Ｇ６３０をさらに含む。
【０１３０】
特定の態様において、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの（特に、配列番号２の）アミノ酸Ｙ４４１、Ｅ４４５、Ｆ６０４、Ｇ６３０、Ｋ６３１およびＲ６３４を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１３１】
特定の態様において、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号２のアミノ酸２５８−７２２を含み、要すればアミノ酸配列ＧＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーを含む。
【０１３２】
特定の態様において、該Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、図１２に示す立体構造座標により定義される構造を有する。
【０１３３】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの１以上の結合部位は、単離されており、すなわち、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの他の部分と相互作用しないか、または結合されていない。
【０１３４】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの１以上の結合部位は、該ＰＡサブユニットのさらなる部分、ＰＢ１サブユニットの全部もしくは部分、および／またはＰＢ２サブユニットの全部もしくは部分とさらに相互作用するか、またはそれに結合し得る。特に、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの１以上の結合部位は、完全なヘテロ三量体ポリメラーゼに結合し得る。特に、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの１以上の結合部位は、完全なヘテロ三量体ポリメラーゼの統合された部分である。
【０１３５】
例えば図１１および１２に示す立体構造座標を取得する方法、本明細書に記載の該座標の解釈およびタンパク質構造の理解におけるそれらの有用性は、以下のような標準的な文献を参照することにより当業者に一般に理解される。J. Drenth, “Principles of protein X-ray crystallography”、2nd Ed., Springer Advanced Texts in Chemistry、New York (1999)；および、G. E. Schulz and R. H. Schirmer、“Principles of Protein Structure”、Springer Verlag, New York (1985)。例えば、Ｘ線回折データを、しばしば、１００Ｋに凍結した凍結保護結晶（例えば、２０％〜３０％グリセロールを含む）を用いて、例えば、Ｘ線源としてシンクロトロン施設のビームラインまたは回転陽極を用いて最初に取得する。その後、位相問題（phase problem）を、一般的に公知の方法、例えば、多波長異常散乱（ＭＡＤ）法、多重同型置換（ＭＩＲ）法、単一波長異常分散（ＳＡＤ）法または分子置換（ＭＲ）法によって解決する。部分構造（sub-structure）を、ＳＨＥＬＸＤ（Schneider and Sheldrick, 2002, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. (Pt 10 Pt 2)、1772-1779）、ＳＨＡＲＰを用いて計算した相（Vonrhein et al., 2006, Methods Mol. Biol. 364:215-30）、および溶媒領域平滑化（solvent flattening）および非結晶学的対称平均化による改善法、例えば、ＲＥＳＯＬＶＥ（Terwilliger, 2000, Acta Cryst. D. Biol. Crystallogr. 56:965-972）を用いて解くことができる。モデルの自動構築は、例えば、ＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Perrakis et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:458-63）および改良法、例えばＲＥＦＭＡＣ（Murshudov ,1997, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 53: 240-255）を用いて行うことができる。
【０１３６】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結晶は、ハンギング法およびシッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法、透析法ならびにマイクロバッチ装置またはマイクロチューブバッチ装置を含むが、これらに限定されない、当業者に公知の任意の方法によって成長させることができる。オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、単独または化合物との複合体での、結晶を生成する他の結晶化条件を同定するために、上記の結晶化条件を変えることは当業者に容易に明らかであり得る。そのような変形法としては、ｐＨ、タンパク質濃度および／または結晶化温度の調整、用いる塩および／または沈殿剤の種類または濃度の変更、結晶化のための異なる方法の使用、あるいは界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０（モノラウレート）、ＬＤＯＡ、Ｂｒｉｊ ３０（４ラウリルエーテル)）、糖類（例えば、グルコース、マルトース)、有機化合物（例えば、ジオキサン、ジメチルホルムアミド）、ランタニドイオンまたは結晶化を助けるポリイオン化合物などの添加剤の導入が挙げられるが、これらに限定されない。結晶化条件の発見または最適化を助けるために、ハイスループット結晶化アッセイもまた使用され得る。
【０１３７】
マイクロシード（microseeding）を用いて結晶のサイズと質を高めることができる。簡潔には、微結晶を粉砕してストックシード溶液を得る。ストックシード溶液を連続希釈する。針、ガラス棒または一本の髪の毛を用いて、各希釈用液からの少量のサンプルを、シードの存在なしに結晶を生成するのに必要なタンパク質濃度またはそれ以下のタンパク質濃度を含む平衡化液滴（equilibrated drops）のセットに添加する。目的は、液滴中の結晶成長を核にするように作用する単一の種（シード）結晶を得ることである。
【０１３８】
特定の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、（ｉ）１０ｍＭ〜３Ｍ、特に１０ｍＭ〜２Ｍ、特に２０ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度のＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝剤中（ｐＨ３〜ｐＨ９、特にｐＨ４〜ｐＨ９、特にｐＨ７〜ｐＨ９）、５〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５または２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８〜１５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜１５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する、タンパク質水溶液、すなわち結晶化溶液、ならびに（ｉｉ）ギ酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガンまたはエチレングリコールなどの１以上の物質を含む沈殿剤／リザーバー溶液、を用いて結晶化することができる。
【０１３９】
要すれば、タンパク質溶液は、１０ｍＭ〜１Ｍ、特に２０ｍＭ〜５００ｍＭ、特に５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度の一価の塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌ、特にＮａＣｌ、および／または０．１〜５０ｍＭ、特に０．５〜２５ｍＭ、特に１〜１０ｍＭまたは１〜５ｍＭの範囲の濃度の二価の塩、例えばＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２またはＣｏＣｌ２、特にＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２などの１以上の塩類を含んでいてよい。
【０１４０】
ある態様において、沈殿剤／リザーバー溶液は、０．５〜２Ｍ、特に１〜１．８Ｍの範囲の濃度のギ酸ナトリウム、１０ｍＭ〜１Ｍ、特に５０ｍＭ〜５００ｍＭ、特に７５〜１５０ｍＭの範囲の濃度のＨＥＰＥＳなどの緩衝系（好ましくは、ｐＨ４〜８、特にｐＨ５〜７）、および／または１％〜２０％、特に２％〜８％、特に２〜５％の範囲の濃度のエチレングリコールを含む。
【０１４１】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、好ましくは結晶化溶液中、好ましくは８５％〜１００％純度、特に９０％〜１００％純度、特に９５％〜１００％純度である。結晶を製造するために、結晶化に適するタンパク質溶液を等容量の沈殿剤溶液と混合することができる。
【０１４２】
特定の態様において、結晶化媒体は、同様のものと、特に、１．０〜２．０Ｍギ酸ナトリウム、８０〜１２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５）、および２〜５％グリコールを含む、当容量の沈殿剤溶液と混合された、結晶化に適した０．０５〜２μｌ、特に０．８〜１．２μｌのタンパク質溶液を含む。
【０１４３】
さらなる態様において、沈殿剤溶液は、１．６Ｍギ酸ナトリウム、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）および５％グリコールを含む、好ましくは本質的にそれからなる、またはそれからなり、結晶化／タンパク質溶液は、好ましくは、１０〜１５ｍｇ／ｍｌの、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＭｎＣｌ２および２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２から本質的になるか、またはそれからなる。
【０１４４】
別の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、化合物と共結晶化可能である。特定の態様において、該化合物は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの天然リガンド、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤである。別の態様において、該化合物は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を調節、好ましくは減少または阻止する。特定の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、該化合物と共に、（ｉ）１０ｍＭ〜３Ｍ、特に１０ｍＭ〜２Ｍ、特に２０ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度のＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝剤中（ｐＨ３〜ｐＨ９、特にｐＨ４〜ｐＨ９、特にｐＨ７〜ｐＨ９）、５〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５または２０ｍｇ／ｍｌ、特に８〜１５ｍｇ／ｍｌ、特に１０〜１５ｍｇ／ｍｌのＰＡサブユニットの断片および／または全体ポリペプチド５〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５または２０ｍｇ／ｍｌ、特に８〜１５ｍｇ／ｍｌ、特に１０〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度を有するタンパク質水溶液、ならびに（ｉｉ）ギ酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン、エチレングリコールまたはＰＥＧなどの１以上の物質を含む沈殿剤／リザーバー溶液中で、結晶化可能である。特定の態様では、該化合物は、０．５〜５ｍＭ、特に１．５〜５ｍＭ、すなわち０．５、１、１．５、２、２．５、３、４．５または５ｍＭの終濃度まで、共結晶化のためにタンパク質水溶液に添加される。
【０１４５】
要すれば、タンパク質溶液は、１０ｍＭ〜１Ｍ、特に２０ｍＭ〜５００ｍＭ、特に５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度で一価の塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌ、特にＮａＣｌ、および／または０．１〜５０ｍＭ、特に０．５〜２５ｍＭ、特に１〜１０ｍＭまたは１〜５ｍＭの範囲の濃度で二価の塩、例えば、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２またはＣｏＣｌ２、特にＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２などの１以上の塩類を含んでいてよい。
【０１４６】
特定の態様において、沈殿剤／リザーバー溶液は、０．１から２．５Ｍ、特に０．１から２．０Ｍの範囲の濃度の硫酸アンモニウム、１０ｍＭから１Ｍ、特に５０ｍＭから５００ｍＭ、特に７５から１５０ｍＭの範囲の濃度のＢｉｓ−Ｔｒｉｓなどの緩衝系（好ましくは、ｐＨ４〜７、特にｐＨ５〜６）、および／または１％〜３０％、特に１５％〜３０％、特に２０〜２５％の範囲の濃度のＰＥＧ３３５０などのＰＥＧを含む。
【０１４７】
特定の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、タンパク質溶液中、好ましくは８５％〜１００％純度、より好ましくは９０％〜１００％純度、さらにより好ましくは９５％〜１００％純度である。共結晶化のために、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体、およびリガンドを含むタンパク質水溶液を、等容量の沈殿剤溶液と混合することができる。
【０１４８】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの結合を減少または阻止する化合物を同定するためのインシリコの方法は、可能性のある調節化合物を選択する工程（ｂ）をさらに含む。該化合物は、特に、以下：
（ｉ）結合部位内の共結晶化リガンドを修飾すること、
（ｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、小分子データベースから化合物をフィルタリングおよび選択すること、ならびに
（ｉｉｉ）化合物 共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位との相互作用プロファイルに基づき、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づき、該化合物の新規リガンドを設計すること
により選択され得る。
【０１４９】
本発明は、図１から３に示される（天然）結合部位の立体構造座標に基づき、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのカルボキシ末端ドメインのそのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止する可能性のある化合物を同定、選択または設計するための分子設計技術の使用を可能にする。該立体構造座標は、結合化合物、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤと共結晶化されている本発明のＲＮＡ依存性ポリメラーゼのＰＡサブユニットのカルボキシ末端ドメインから達成されている。
【０１５０】
このような予測モデルは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片に結合する可能性がある多くの種々の化合物の調製および試験に関連するより高いコストを考慮すると価値がある。
【０１５１】
ＰＡサブユニットとそのリガンドとの間の正確な結合領域を、コンピューター可視化プログラム、特にＳＹＢＹＬ−Ｘ（SYBYL-X 1.3、Tripos、1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA）およびＢｅｎｃｈｗａｒｅ ３Ｄ−Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Benchware-3D-Explorer 2.7, Tripos, 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA）からなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて分析した。それによって、２つの異なる結合領域が、図１から３に示されるように同定される。
【０１５２】
ＰＡサブユニット中の各結合部位について、別々の三次元コンピューターモデルを作成した。これは、上記の市販のソフトウェアを使用することによって達成される。
【０１５３】
作成された三次元コンピューターモデルは、
（ｉ）リガンドと１以上の結合部位との間の相互作用プロファイルの正確な分析のため（特に、水素結合、ファンデルワールス相互作用および／または静電相互作用の分析による）
（ｉｉ）結合可能性を改善するために共結晶化したリガンドを修飾するため（特に、リガンドとそれぞれの結合部位との間の相互作用を増大させること、および／またはリガンドの自由度を減少させることにより）
（ｉｉｉ）化合物を結合部位に配置するためにコンピュータドッキングアプローチを適用するため、および１以上の結合部位における該化合物の適合性を評価するため、ならびに／または
（ｉｖ）１以上の結合部位に適合し、該１以上の結合部位と優位に相互作用することができる化合物の新規設計のための
インプットとして役立った。
【０１５４】
上記の項目（ｉｉｉ）に記載の試験化合物は、商業的供給者から提供されている小分子の分子ライブラリーから選択することができる。これらの市販品から、共結晶化したリガンドを最もよく模倣することができる下位構造要素、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤに見られるリン酸化セリン基を模倣するものを有する化合物を選ぶことができる。このフィルタリングは、周知の化学情報学的ツール、特にＳＹＢＹ-Ｘのソフトウェアスイート（SYBYL-X 1.3, Tripos, 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA）を用いて行うことができる。
【０１５５】
このスクリーニングにおいて、かかる化合物の活性部位への適合の質は、形状相補性または推定相互作用エネルギーのいずれかによって判断することができる（Meng et al., 1992, J. Comp. Chem. 13:505-524）。
【０１５６】
適当な化合物または断片が選択されたら、それらを単一の化合物または複合体に設計または集合させることができる。この手動モデル構築は、ＳＹＢＹＬ−Ｘ（SYBYL-X 1.3, Tripos, 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA)、ＭＯＥ（Molecular Operating Environment (MOE), 2013.08; Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite ＃910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2016）またはＭａｅｓｔｒｏ（Schroedinger Release 2016-1: Maestro, version 10.5, Schroedinger, LLC, New York, NY, 2016）などのソフトウェアを用いて行われる。個々の化合物または断片を連結する際に当業者を補助する有用なプログラムとしては、例えば、（ｉ）ＬＵＤＩ（Bohm, 1992, J. Comp. Aid. Mol. Des. 6:61-78）, （ｉｉ）Ｍｕｓｅ Ｉｎｖｅｎｔ（2012、Certara、USA、Inc.）；（ｉｉ）ＣＡＶＥＡＴ（Bartlett et al., 1989, in Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Special Publication, Royal Chem. Soc. 78:182-196; Lauri and Bartlett, 1994, J. Comp. Aid. Mol. Des. 8:51-66；ＣＡＶＥＡＴは、カリフォルニア大学バークレー校から入手可能である）、（ｉｉ）ＩＳＩＳなどの３Ｄデータベースシステム（MDL Information Systems, San Leandro, CA; reviewed in Martin, 1992, J. Med. Chem. 35:2145-2154）、および（ｉｉｉ）ＨＯＯＫ（Eisen et al., 1994, Proteins: Struct., Funct., Genet. 19:199-221；ＨＯＯＫは、Molecular Simulations Incorporated、San Diego、CAから入手可能である）が挙げられる。
【０１５７】
本発明によって可能にされた別のアプローチは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片の結合部位に全体的または部分的に結合することができる化合物についての小分子データベースのコンピューターによるスクリーニング／ドッキングである。計算的ドッキング手順のために利用可能ないくつかのプログラムがあり、例えばＦｌｅｘＸ（Rarey et al., J Mol Biol. 1996 Aug 23;261(3):470-89）、Ｇｌｉｄｅ（Friesner et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 1739−1749）、ＳｕｒｆｌｅｘＤｏｃｋ（Jain et al., J. Computer-Aided Molecular Design. 2007, 21, 281-306）である。
【０１５８】
あるいは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片のそのリガンドへの、特にＰｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合の可能性のある阻害剤は、図１から３のＰＡポリペプチド断片の３Ｄ構造に基づいて新規に設計することができる。当業者に利用可能な様々な新規のリガンド設計方法がある。そのような方法としては、（ｉ）ＬＵＤＩ（Bohm, 1992, J. Comp. Aid. Mol. Des. 6:61-78）；（ｉｉ）Ｍｕｓｅ Ｉｎｖｅｎｔ（2012, Certara, USA, Inc.）；（ｉｉｉ）ＬＥＧＥＮＤ（Nishibata and Itai, Tetrahedron 47:8985-8990; ＬＥＧＥＮＤは、Molecular Simulations Incorporated（San Diego、CA）から入手可能である）、（ｉｉｉ）ＬｅａｐＦｒｏｇ（Tripos Associatesから入手可能、St. Louis, MO)、（ｉｖ）ＳＰＲＯＵＴ（Gillet et al., 1993, J. Comp. Aid. Mol. Des. 7:127-153; ＳＰＲＯＵＴは、リード大学（ＵＫ）から入手可能である）、（ｖ）ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（Rotstein and Murcko, 1993, J. Med. Chem. 36:1700-1710)、および（ｖｉ）ＧＲＯＷ（Moon and Howe, 1991, Proteins 11:314-328）が挙げられる。
【０１５９】
加えて、結合部位の潜在的阻害剤の新規設計およびモデリングにおいて当業者を支援し得るいくつかの分子モデリング技術（引用により本明細書中に包含される）が記載されており、例えば、Cohen et al., 1990, J. Med. Chem. 33:883-894; Navia and Murcko、1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:202-210; Balbes et al., 1994, Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5、Lipkowitz and Boyd, Eds., VCH, New York, pp. 37-380; Guida, 1994, Curr. Opin. Struct. Biol. 4:777-781が挙げられる。
【０１６０】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位に結合するように設計または選択された分子は、その結合状態において、それが、好ましくは標的領域との反発的静電相互作用を欠くように、さらに計算上最適化され得る。そのような非相補的（例えば、静電的）相互作用としては、反発し合う電荷−電荷（repulsive charge-charge）、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用が挙げられる。具体的には、結合状態における結合化合物と結合ポケットとの間のすべての静電相互作用の合計が、結合エンタルピーに中立的または有益な寄与をすることが好ましい。化合物のひずみエネルギーおよび静電相互作用を評価することができる特定のコンピュータープログラムは当技術分野で利用可能である。適切なプログラムの例には、（ｉ）Ｇａｕｓｓｉａｎ ０９、Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｅ.０１（Frisch, M. J.; et al. (2016), AMBER 2016, University of California, San Francisco.）；（ｉｉｉ）ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA）、（ｉｖ）ＯＰＬＳ−ＡＡ（Jorgensen, 1998, Encyclopedia of Computational Chemistry、Schlyeyer, Ed., Wiley, New York, Vol. 3, pp. 1986-1989）、および（ｖ）Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Biosysm Technologies Incorporated, San Diego, CA）が含まれる。これらのプログラムは、３Ｄ可視化を可能にするハードウェア（例えば、ＮＶＩＤＩＡ Ｑｕａｄｒｏグラフィックボード、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション、ＩＲＩＳ ４Ｄ／３５またはＩＢＭ ＲＩＳＣ／６０００ワークステーションモデル５５０）を含む最先端のコンピューター上で実施することができる。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは当業者に知られている。
【０１６１】
上記のように目的の分子が選択または設計されると、その結合特性を改善または修正するために、その原子または側基のいくつかにおいて置換が行われてもよい。一般的に、最初の置換は保存的であり、すなわち、置換基は元の基とほぼ同じサイズ、形状、疎水性および電荷であり得る。当然のことながら、立体配座を変えることが当該技術分野において知られている構成要素は避けられるべきであることを理解されたい。次いで、そのような置換化合物を、上記に詳細に記載したのと同じコンピューター法によって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片の結合部位への適合効率について分析することができる。
【０１６２】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの結合を減少または阻止する化合物を同定するためのインシリコの方法は、活性部位における該化合物のエネルギー最小化配置を提供するための、該化合物のコンピューターモデルと該活性部位のコンピューターモデルとの間でフィッティングプログラム操作を行うための計算手段を用いる工程（ｃ）をさらに含む。
【０１６３】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの結合を減少または阻止する化合物を同定するためのインシリコの方法はさらに、該フィッティング操作の結果を評価する工程（ｅ）、および場合により、該化合物と結合部位モデルとの間の結合を定量化し、それにより該化合物が該結合部位と結合する能力を評価する、該ドッキング方法を含む。この評価は、（ｉ）試験化合物が結合部位とどの程度良好に相互作用するかを反映するスコアを提供するそのようなドッキングプログラムからの出力に基づいて達成することでき、および／または（ｉｉ）試験化合物が結合部位をどれだけ良好に満たしており、好ましい形状を採用しているかを当業者による視覚的比較によって判断することができる
【０１６４】
第二の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（特に、細胞性Ｐｏｌ ＩＩ、特にＣＴＤ）への結合を減少または阻止する化合物を製造する方法であって、以下の工程
（ａ）上記の第一の側面に記載の方法を介して該化合物を同定すること、および
（ｂ）該化合物を合成すること、および
（ｃ）要すれば、該化合物またはその薬学的に許容される塩を１以上の薬学的に許容される賦形剤および／または担体と共に製剤すること
を含む方法に関する。
【０１６５】
特定の態様において、該化合物またはその薬学的に許容される塩またはそれらの製剤の、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片のそのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止する能力は、インビトロまたはインビボで試験される。従って、ある態様において、第二の局面の方法はさらに、以下の工程
（ｃ）該化合物をオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと接触させること、および
（ｄ）ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンド、好ましくは細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止する該化合物の能力を判定すること
を含む。
【０１６６】
そのような化合物の結合部位への適合の質は、形状相補性または推定相互作用エネルギーのいずれかによって判断することができる（Meng et al., 1992, J. Comp. Chem. 13:505-524）。該化合物を合成するための方法は、当業者に周知である。
【０１６７】
特定の態様において、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの、特にＣＴＤへの結合を減少または阻止する化合物は、該結合を減少するか、または完全になくす。特に、この化合物は、該化合物なしで、特にその他は同じ反応条件での、すなわち緩衝条件、反応時間および温度での、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合と比較して、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの結合を５０％、特に６０％、特に７０％、特に８０％、特に９０％、および特に１００％減少させる。この化合物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの、特にＣＴＤへの結合を特異的に減少または阻止するが、他のポリメラーゼの、特に哺乳動物ポリメラーゼの結合を同程度減少または阻止しないか、好ましくは全く減少または阻止しないことが特に好ましい。
【０１６８】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止する化合物の能力を、容易に評価することができる。例えば、第一工程において、精製したオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体を、種々の量の試験化合物の存在下または非存在下で、そのリガンド、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤと接触させて、一定時間、例えば、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０または９０分間インキュベートする。反応条件は、精製したオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、そのリガンドに、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤに結合し得るように選択される（試験化合物なし）。次に、第二工程において、試験化合物が、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止するかどうかについて、該混合物を分析する。結合の分析は、当該分野で公知の任意の方法によって、特に以下に詳細に記載されるような１以上の方法によって行われ得る。
【０１６９】
特定の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体と試験化合物との間の相互作用は、プルダウンアッセイ法にて分析することができる。例えば、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、精製されてもよく、そして例えばビーズ等の固体表面上に固定化され得る。一態様において、ビーズ上に固定化されたオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、例えば、（ｉ）別の精製されたタンパク質、ポリペプチド断片またはペプチド、（ｉｉ）タンパク質、ポリペプチド断片またはペプチドの混合物、あるいは（ｉｉｉ）細胞または組織抽出物と接触されてよく、そしてタンパク質、ポリペプチド断片またはペプチドの結合は、クマシー染色またはウエスタンブロッティングと組み合わせたポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認され得る。未知の結合パートナーは、質量分析によって同定することができる。
【０１７０】
別の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体と試験化合物との相互作用は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法に基づく実験の形式で分析することができる。一態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、ＥＬＩＳＡプレートなどの固体表面に固定化されて、試験化合物と接触させることができる。試験化合物の結合は、例えば、試験化合物またはエピトープタグに特異的な抗体によって、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび該エピトープタグを付した化合物について確認することができる。これらの抗体は、酵素に直接結合し得るか、または化学発光反応（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）または比色反応（例えば、アルカリホスファターゼ）を起こす好適な基質と組み合わせて、該酵素に結合した二次抗体を用いて検出することができる。別の態様において、抗体によって検出することができない化合物の結合は、試験化合物に直接結合した標識によって確認することができる。そのような標識としては、酵素標識、放射性同位体または放射性化合物または元素、蛍光化合物または金属、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられ得る。別の態様において、試験化合物を、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、本発明のＰＡポリペプチド断片またはその変異体と接触させることができる。該ポリペプチドの結合は、ＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片に特異的な抗体および上記のような化学発光反応または比色反応によって確認することができる。
【０１７１】
さらなる態様において、精製したオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体をペプチドアレイと共にインキュベートし、ＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片の、特定のペプチド配列に対応する特定のペプチドスポットへの結合を、例えば、オルソミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体に特異的な抗体、オルソミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体に融合したエピトープタグに対する抗体、あるいはオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体に結合した蛍光タグによって発せられる蛍光シグナルによって分析することができる。
【０１７２】
別の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体を発現する組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる。これは、試験タンパク質またはポリペプチドの同時発現および相互作用の確認により、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または免疫共沈降法により、達成することができる。別の態様において、直接標識された試験化合物を、組換え宿主細胞の培地に添加し得る。試験化合物が膜を通過し、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体に結合する可能性は、多分、例えば、該ポリペプチドの免疫沈降および標識の存在の確認によって確認することができる。
【０１７３】
特定の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体に結合する化合物を同定するための上記の方法は、ハイスループット設定で行われる。特定の態様において、該方法は、本発明のオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体および標識した試験化合物を用いて、上記のようにマルチウェルマイクロタイタープレートで行われる。
【０１７４】
特定の態様において、試験化合物は、合成または天然化合物のライブラリーに由来する。例えば、合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co.（Trevillet, Cornwall, UK）、ChemBridge Corporation （San Diego, CA）、またはAldrich （Milwaukee, WI）から市販されている。天然化合物ライブラリーは、例えばTimTec LLC （Newark, DE）から入手可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを用いることができる。さらに、試験化合物は、個々の化合物または混合物としてのいずれかで、コンビナトリアルケミストリーを用いて合成的に製造することができる。
【０１７５】
別の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合に対する、同定された化合物の阻害効果は、インビボ設定で試験することができる。２９３Ｔヒト胎児腎細胞、イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞またはニワトリ胚線維芽細胞などのインフルエンザウイルス感染に感受性の細胞株は、同定された化合物の存在下または不存在下でインフルエンザウイルスに感染させることができる。好ましい態様において、同定された化合物を、種々の濃度で細胞の培養培地に添加することができる。ウイルスのプラーク形成は、ウイルス性プラーク形成は、インフルエンザウイルスの感染力について読み出される情報（read out）として使用され得て、そして同定された化合物で処理された細胞と処理されていない細胞との間で比較され得る。
【０１７６】
本発明のさらなる態様において、上記の方法のいずれかに適用される試験化合物は小分子である。特定の態様において、該小分子は、ライブラリー、例えば、小分子阻害剤ライブラリーから誘導される。
【０１７７】
さらなる態様において、該試験化合物は、ペプチドまたはタンパク質である。特定の態様において、該ペプチドまたはタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質ライブラリーに由来する。
【０１７８】
第三の側面において、本発明は、本発明の第一の側面のインシリコスクリーニング方法によって同定可能な化合物および／または第二の側面の製造方法によって製造可能な化合物に関し、ここで、該化合物は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの、特に細胞性ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止することができる。
【０１７９】
オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止する化合物の能力は、容易に評価することができる。例えば、第一工程において、精製したオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体を、種々の量の試験化合物の存在下または不存在下で、そのリガンドと、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤと接触させて、一定時間、例えば５、１０、１５、２０、３０、４０、６０または９０分間インキュベートする。反応条件は、精製したオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、そのリガンドに、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤに結合し得るように（試験化合物なし）選択される。第二の工程において、試験化合物が、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体のそのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止するかどうかに関して該混合物を分析する。結合の分析は、当技術分野において公知の任意の方法により、特に上記により詳細に記載されている１以上の方法により実施することができる。
【０１８０】
特定の態様において、該化合物は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位に結合し、それにより、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンドへの、特に細胞性ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止することができる。
【０１８１】
別の態様において、該化合物は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの異なる部分と相互作用し、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの、特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を立体構造的にブロックすることにより、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの、好ましくは細胞性ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤへの結合を減少または阻止することができる。
【０１８２】
特定の態様において、該試験化合物またはオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼもしくはその変異体のリガンドは、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体に結合するとシグナルを呈するが、結合しないとシグナルを呈さない、検出可能な標識を含んでいてよい。例えば、試験化合物は、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体に結合したときシグナルを呈するが、離れたときシグナルを呈さない、蛍光ラベルで標識され得る。さらなる態様において、試験化合物は、蛍光標識で標識することができ、洗浄工程をインキュベーション工程と分析工程との間に挿入して、非結合試験化合物の蛍光を除くことができる。特定の態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体は、固体表面に固定化され得る。特に、試験化合物の、ＰＡサブユニットのカルボキシ末端断片への結合は、本発明の第八の側面に関して以下に記載される方法のいずれかをにより分析され得る。
【０１８３】
本発明の化合物は、ペプチド、ペプトイド（peptoid）、ポリペプチド、タンパク質（抗体を含む）、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、有機または無機小分子、化合物、元素、糖類、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、ポリアミンならびにそれらの組合せおよび誘導体を含むが、これらに限定されない、任意の物質であり得る。用語“小分子”は、５０から２，５００ダルトンの、好ましくは２００−８００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を意味する。さらに、本発明の試験化合物は、要すれば検出可能な標識を含み得る。そのような標識としては、酵素標識、放射性同位体または放射性化合物または元素、蛍光化合物または金属、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
第四の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科に属するウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（特に細胞性Ｐｏｌ ＩＩ、特にＰｏｌ ＩＩのＣＴＤ）への１以上の結合部位に対する抗体に関する。
【０１８５】
ある態様において、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型またはＤ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるか、またはそれらの変異体である。特に、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１８６】
ある態様において、１以上の結合部位は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのそのリガンドへの結合部位（複数可）である。
【０１８７】
特定の態様において、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットは、それぞれ配列番号１、配列番号２または配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１８８】
特に、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体のリガンドは、細胞性ポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）である。特に、リガンドは、Ｐｏｌ ＩＩのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）である。
【０１８９】
特に、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットまたはその変異体のリガンドは、細胞性ポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）である。特に、該リガンドは、Ｐｏｌ ＩＩのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）である。
【０１９０】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の１以上の結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号１または配列番号４４）またはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号２）の第１および／または第２結合部位のアミノ酸を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１９１】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号１）のＫ６３０、Ｒ６３３およびＥ４４４からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか；配列番号４４のＫ６３５、Ｒ６３８およびＥ４４９からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１９２】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（配列番号１）のアミノ酸Ｋ６３０、Ｒ６３３およびＥ４４４を含むか；配列番号４４のアミノ酸Ｋ６３５、Ｒ６３８およびＥ４４９を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０１９３】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号１のＫ２８９、Ｒ４４９およびＥ４５２からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか、または配列番号４４のＫ２８９、Ｒ４５４およびＥ４５７からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含む。
【０１９４】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号１のアミノ酸Ｋ２８９、Ｒ４４９およびＥ４５２を含む。
【０１９５】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号４４のアミノ酸Ｋ２８９、Ｒ４５４およびＥ４５７を含む。特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号１のアミノ酸Ｆ４４０および／またはＦ６０７を含む。
【０１９６】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号１のアミノ酸Ｙ４４５および／またはＦ６１２を含む。
【０１９７】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号１のＭ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｉ５４５、Ｍ５４３およびＫ５５４からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含む。
【０１９８】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号４４のＬ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｌ５５０、Ｍ５４８およびＲ５５９からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含む。
【０１９９】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号１のアミノ酸Ｍ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｉ５４５、Ｍ５４３およびＫ５５４を含む。
【０２００】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号４４のアミノ酸Ｌ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｌ５５０、Ｍ５４８およびＲ５５９を含む。
【０２０１】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号１のアミノ酸Ｇ６２９を含む。
【０２０２】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号４４のアミノ酸Ｇ６３４を含む。
【０２０３】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号１）のアミノ酸Ｆ４４０、Ｅ４４４、Ｆ６０７、Ｇ６２９、Ｋ６３０およびＲ６３３を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｙ４４５、Ｅ４４９、Ｆ６１２、Ｇ６３４、Ｋ６３５およびＲ６８３を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０２０４】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号１）のアミノ酸Ｍ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｒ４４９、Ｅ４５２、Ｍ５４３、Ｋ５５４およびＩ５４５を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｌ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｍ５４８、Ｋ５５９およびＬ５５０を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０２０５】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号１）のアミノ酸Ｍ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｆ４４０、Ｅ４４４、Ｒ４４９、Ｅ４５２、Ｍ５４３、Ｋ５５４、Ｉ５４５、Ｆ６０７、Ｇ６２９、Ｋ６３０およびＲ６３３を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｌ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｙ４４５、Ｅ４４９、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｍ５４８、Ｋ５５９、Ｌ５５０、Ｆ６１２、Ｇ６３４、Ｋ６３５およびＲ６３８を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０２０６】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号１のアミノ酸２５８−７１３を含むか、または配列番号４４のアミノ酸２０１−７１６を含み、要すれば、アミノ酸配列ＧＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーを含む。
【０２０７】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの該結合部位は、図１１に示されるような立体構造座標により定義される構造を有する。ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号２）のＥ４４５、Ｋ６３１およびＲ６３４からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０２０８】
ある態様において、オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の結合部位は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号２）のアミノ酸Ｅ４４５、Ｋ６３１およびＲ６３４を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０２０９】
特定の態様において、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号２のアミノ酸Ｙ４４１および／またはＦ６０４を含む。
【０２１０】
特定の態様において、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位はさらに、配列番号２のアミノ酸Ｇ６３０を含む。
【０２１１】
特定の態様において、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（特に、配列番号２）のアミノ酸Ｙ４４１、Ｅ４４５、Ｆ６０４、Ｇ６３０、Ｋ６３１、Ｒ６３４を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む。
【０２１２】
特定の態様において、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、配列番号２のアミノ酸２５８−７２２を含み、要すればアミノ酸配列ＧＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーを含む。
【０２１３】
特定の態様において、該Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位は、図１２に示されるような立体構造座標によって定義される構造を有する。
【０２１４】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの１以上の結合部位は単離されており、すなわち、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの他の部分により相互作用していないか、または結合していない。
【０２１５】
特定の態様において、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの１以上の結合部位は、ＰＡサブユニットのさらなる部分、ＰＢ１サブユニットの全部もしくは一部、および／またはＰＢ２サブユニットの全部もしくは一部とさらに相互作用または結合し得る。特に、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの１以上の結合部位は、完全なヘテロ三量体ポリメラーゼに結合し得る。特に、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットの１以上の結合部位は、完全なヘテロ三量体ポリメラーゼの統合された部分である。
【０２１６】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはそれらの部分であり得る。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。ある態様において、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体などのキメラ抗体、二重特異性抗体（ダイアボディ）ならびにポリペプチドに結合する特異的抗原を提供するのに十分な抗体の少なくとも一部分を含むポリペプチドを含む。本発明の抗体は標準プロトコールに従って作製される。例えば、ポリクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシまたはウマなどの動物を、当業者に周知の標準的方法により、必要に応じてフロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバントなどのアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）と組み合わせて免疫化することによって作製することができる。本発明の第一の側面のポリペプチドに対するポリクローナル抗血清は、免疫された動物から採血するか、または屠殺することによって得られる。（ｉ）血清は動物から得られるものを用いてもよく、（ｉｉ）免疫グロブリン画分は血清から得られてもよく、または（ｉｉｉ）本発明の第一の側面のポリペプチドに特異的な抗体は血清から精製されてもよい。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって作製することができる。すなわち、免疫化後に動物を屠殺し、リンパ節および／または脾Ｂ細胞を当該分野で公知の任意の手段により不死化する。細胞を不死化する方法としては、それらの細胞に癌遺伝子をトランスフェクトし、発癌性ウイルスを感染させ、そして不死化細胞を選択する条件下で培養し、それらを発癌性化合物または変異誘発化合物に暴露し、不死化細胞、例えば骨髄腫細胞と融合させて、腫瘍抑制遺伝子を不活性化することが挙げられるが、これに限定されない。不死化細胞は、本発明の第一の側面のポリペプチドを用いてスクリーニングされる。本発明の第一の側面のポリペプチドに対する抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマを選択し、クローニングし、さらにロバストな増殖、高い抗体産生および望ましい抗体特性を含む望ましい特性についてさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、（ｉ）同系（syngeneic）動物においてインビボで、（ｉｉ）免疫系を欠く動物、例えばヌードマウスにおいて、または（ｉｉｉ）インビトロでの細胞培養において、増殖させることができる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、そして増殖させる方法は当業者によく知られている。当業者は、抗体の産生に関するサポートとして、“Antibody : A Laboratory Manual”, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1990) のような標準テキストを参照することができ、これは引用により本明細書中に包含される。
【０２１７】
第五の側面において、本発明は、本発明の第四の側面に記載の抗体をコードする核酸に関する。そのような単離されたヌクレオチド断片を得るために適用される分子生物学的方法は、一般的に、当業者に知られている（標準的な分子生物学的方法については、Sambrook et al., Eds., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York (1989)を参照のこと、引用により本明細書中に包含させる）。例えば、ＲＮＡをインフルエンザウイルス感染細胞から単離し、ランダムプライマー（例えば、十量体のランダム六量体）または目的の断片の生成に特異的なプライマーのいずれかを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を適用してｃＤＮＡを生成する。次いで、目的の断片を、断片特異的プライマーを用いて標準的ＰＣＲにより増幅することができる。
【０２１８】
第六の側面において、本発明は、本発明の第五の側面に記載の核酸を含むベクターに関する。当業者は、目的のポリヌクレオチド配列をベクターに組み込むために用いられる技術をよく知っている（Sambrook et al., 1989、前出も参照）。かかるベクターには、 any ベクターs known to the skilled person including プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージのようなファージベクター、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体ベクターが含まれる。該ベクターは、原核生物または真核生物の発現に適した発現ベクターであり得る。該プラスミドは、複製起点（ｏｒｉ）、マルチクローニング部位およびプロモーター（構成的または誘導的）などの調節配列、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写終結部位、ポリアデニル化シグナル、ならびに変異もしくは欠失の相補性に基づく抗生物質耐性または栄養要求性マーカーなどの選択マーカーを含み得る。一態様において、目的のポリヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結されている。
【０２１９】
別の態様において、該ベクターは、目的のポリペプチド断片の精製を容易にするエピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグをコードするヌクレオチド配列を含む。かかるエピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグとしては、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ポリＨｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ＮｕｓＡタグ、およびチオレドキシンタグ、または（強化）緑色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＧＦＰ）、（強化）黄色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＹＦＰ）、Discosoma種由来（ＤｓＲｅｄ）もしくは単量体（ｍＲＦＰ）の赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）のような蛍光タンパク質タグなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、エピトープタグ、ペプチドタグまたはタンパク質タグは、例えば、トロンビン、第Ｘａ因子、PreScissionプロテアーゼ、ＴＥＶプロテアーゼなどのようなプロテアーゼを用いて、目的のポリペプチド断片から切断することができる。好ましくは、タグは、ＴＥＶプロテアーゼを用いて切断することができる。そのようなプロテアーゼの認識部位は、当業者に周知である。例えば、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位の７アミノ酸コンセンサス配列は、Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であってよい）であり、本明細書中、好ましくはＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号２１）である。別の態様において、ベクターは、目的のポリペプチド断片を組換え宿主細胞の培養培地または細菌のペリプラズム空間（細胞周辺腔）に分泌させる機能的配列を含む。シグナル配列断片は、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地中（グラム陽性菌）または細胞の内膜と外膜との間に位置するペリプラズム空間内（グラム陰性菌）に分泌される。好ましくは、シグナルペプチド断片と外来遺伝子との間にコードされる、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、プロセシング部位がある。
【０２２０】
第七の側面において、本発明は、該単離されたポリヌクレオチドまたは該組換えベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。組換え宿主細胞は、古細菌細胞および細菌細胞などの原核細胞または酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。当業者は、該単離されたポリヌクレオチドまたは該組換えベクターを該宿主細胞に導入するための方法をよく知っている。例えば、細菌細胞は、例えば化学的形質転換法、例えば塩化カルシウム法、またはエレクトロポレーション法を用いて容易に形質転換することができる。酵母細胞は、例えば、酢酸リチウム形質転換法またはエレクトロポレーション法を用いて形質転換することができる。他の真核細胞は、例えば、リポフェクトアミン（商標）（Invitrogen）のような市販のリポソームベースのトランスフェクションキット、Ｆｕｇｅｎｅ（Roche Diagnostics）のような市販の脂質ベースのトランスフェクションキット、ポリエチレングリコールベースのトランスフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃（バイオリスティック）、エレクトロポレーション、またはウイルス感染を用いて、形質転換することができる。
【０２２１】
第八の側面において、本発明は、本発明の第七の側面に記載の方法により製造可能な医薬組成物に関する。
【０２２２】
第九の側面において、本発明は、本発明の第三の側面に記載の化合物、本発明の第四の側面に記載の抗体、本発明の第五の側面に記載の核酸、または本発明の第六の側面に記載のベクターを含む医薬組成物に関する。
【０２２３】
特定の態様において、医薬組成物はさらに、１以上の薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含む。
【０２２４】
本発明により企図される医薬組成物は、当業者に周知の様々な方法で製剤することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤（軟質ゲルカプセル剤を含む）、カシェ剤、ロゼンジ剤、卵型剤（ovules）、粉剤、顆粒剤もしくは坐剤の形態などの固体形態、または例えばエリキシル剤、液剤、乳剤もしくは懸濁剤の形態の液体形態であり得る。
【０２２５】
固体投与形態は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、グリシンおよびデンプン（好ましくは、コーン、ジャガイモもしくはタピオカデンプン）などの賦形剤、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアなどの造粒結合剤を含んでいてよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクなどの滑沢剤が含まれてもよい。同様の種類の固体組成物はゼラチンカプセルの充填剤としても用いることができる。これに関して好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２２６】
経口投与に適した水性懸濁剤、液剤、エリキシル剤、および乳剤については、化合物を、種々の甘味剤または香味剤、色素または染料、乳化剤および／または懸濁剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、およびそれらの組み合わせなどの希釈剤と組み合わせることができる。
【０２２７】
本発明の医薬組成物は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、カルボマー（Carbomer）、アンモニオメタクリレートコポリマー、硬化ヒマシ油、カルナバワックス、パラフィンワックス、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、およびそれらの混合物を含む放出速度調節剤を含んでいてよい。
【０２２８】
本発明の医薬組成物は、速分散性または速溶性投与製剤（ＦＤＤＦ）の形態であってよく、以下の成分を含んでいてよい：アスパルテーム、アセスルファムカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ジアスコルビン酸、エチルアクリレート、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、ミント香料、ポリエチレングリコール、フュームドシリカ、二酸化ケイ素、デンプングリコール酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ソルビトール、キシリトール。
【０２２９】
坐剤を調製するために、脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物などの低融点ワックスを先ず溶融し、有効成分を撹拌などによってその中に均一に分散させる。次いで、溶融した均質混合物を都合の良い大きさの型に注ぎ込み、冷却させ、それによって固化させる。
【０２３０】
非経腸投与に適した本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含み得る滅菌水溶液の形態で最もよく用いられる。該水溶液は、必要ならば、適切に（好ましくはｐＨ３から９の間に）緩衝されるべきである。
【０２３１】
鼻腔内投与および吸入による投与に適した医薬組成物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ（商標））または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ（商標））などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、または他の好適なガスを用いて、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーから乾燥粉末吸入器またはエアロゾルスプレーの形態で最もよく送達される。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えば、溶媒としてエタノールと噴射剤との混合物を用いて、有効化合物の溶液または懸濁液を含有してもよく、それらはさらに滑沢剤、例えば、ソルビタントリオレエートを含有してもよい。
【０２３２】
特定の態様において、医薬組成物は単位投与量形態である。そのような形態では、製剤は、適当な量の有効成分を含む単位用量形態に小分けされる。単位投与量形態は包装された調製物であってよく、この包装は、包装された錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル中の粉末などの、個別の量の調製物を含む。また、単位投与量形態は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤またはトローチ剤それ自体であってよく、または包装形態の適当な数のこれらのいずれかの剤形であり得る。
【０２３３】
本発明の使用において投与される単位用量調製物中の有効成分の量は、特定の用途および有効成分の効力に応じて、１ｍ２当たり、約１ｍｇから約１０００ｍｇ、好ましくは１ｍ２当たり、約５ｍｇから約１５０ｍｇの間で変動または調整することができる。
【０２３４】
第十の側面において、本発明は、オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる病状を処置、改善または予防するのに使用するための、本発明の第三の側面に記載の化合物、本発明の第四の側面に記載の抗体、本発明の第五の側面に記載の核酸、本発明の第六の側面に記載のベクター、または本発明の第七もしくは第八の側面に記載の医薬組成物に関する。
【０２３５】
特定の態様において、該病状は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる。
【０２３６】
特定の態様において、該病状を処置、改善または予防するのに使用するための、本発明の第七もしくは第十の側面に記載の化合物、本発明の第十一もしくは第十三の側面に記載の医薬組成物、または本発明の第二十の側面に記載の抗体は、罹患動物、特に罹患哺乳動物、特にヒト患者に、経口、口腔内、舌下、鼻腔内、吸入などの肺経路を介して、直腸経路を介して、または非経腸的に、例えば、海綿体内（intracavernosally）、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与され、それらは、点滴または無針注射技術によって投与され得る。
【０２３７】
第十一の側面において、本発明は、治療的有効量の、本発明の第三の側面に記載の化合物、本発明の第四の側面に記載の抗体、本発明の第五の側面に記載の核酸、本発明の第六の側面に記載のベクター、または本発明の第七もしくは第八の側面に記載の医薬組成物を投与することを含む、オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる病状を改善または予防する方法に関する。
【０２３８】
特定の態様において、該病状は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる。
【０２３９】
特定の態様において、本発明の第三の側面に記載の化合物、本発明の第四の側面に記載の抗体、本発明の第五の側面に記載の核酸、本発明の第六の側面に記載のベクター、または本発明の第七もしくは第八の側面に記載の医薬組成物は、罹患動物、特に罹患哺乳動物、特にヒト患者に、、経口、口腔内、舌下、鼻腔内、吸入などの肺経路を介して、直腸経路を介して、または非経腸的に、例えば、海綿体内（intracavernosally）、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与され、それらは、点滴または無針注射技術によって投与され得る。
【０２４０】
特定の態様において、１日１回、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの初期投与量が投与される。約０．０５ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇの範囲の１日用量が好ましく、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの範囲の１日用量が最も好ましい。しかしながら、投与量は、患者の要求、処置されている病状の重症度、および用いられている化合物によって変わり得る。特定の状況に対する適当な投与量の決定は、医師（医療実施者）の技量の範囲内である。一般的に、処置は、化合物の最適用量より少ない、より少ない投与量で開始される。その後、状況下で最適な効果が得られるまで、投与量を少しずつ増加させる。便宜上、所望であれば、１日の総投与量を分割して、その日中に数回投与してもよい。
【０２４１】
本発明の範囲から逸脱することのない、本発明の様々な修飾および変形が当業者には明らかであり得る。本発明は、特定の好ましい態様に関連して記載されているが、特許請求の範囲に記載の本発明は、そのような特定の態様に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、本発明によって包含されることが意図される。
【０２４２】
特に、本発明は以下の側面に関する：
１．オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（特に、細胞性ポリメラーゼＩＩ、特にＣＴＤ）への結合を減少させる、または阻止する化合物をインシリコで同定する方法であって、
（ａ）ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンドへの結合部位の立体構造座標に基づいてコンピューターモデルを構築する工程；
（ｂ）以下の方法：
（ｉ）結合部位内の共結晶化リガンドを修飾すること、
（ｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、小分子データベースから化合物をフィルタリングおよび選択すること、および
（ｉｉｉ）共結晶化リガンドとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位との相互作用プロファイルに基づいて、および／または共結晶化リガンドに対する３Ｄ類似性に基づいて、該化合物の新規リガンドを設計すること
からなる群より選択される方法により可能性のある調節化合物を選択する工程；
（ｃ）活性部位における前記化合物のエネルギー最小化立体配置を提供するために、前記化合物と前記結合部位のコンピューターモデル間でフィッティングプログラム操作を実行するための計算手段を用いる工程；および／または、化学物質である該化合物の合理的な３Ｄ配置を提供するために、前記化合物を前記結合部位に配置するためのコンピュータドッキング方法を用いる工程；ならびに、
（ｄ）前記フィッティング操作および要すれば前記ドッキング方法の結果を評価して、前記化合物と結合部位モデルとの間の関連性を定量化し、それによって前記化合物が前記結合部位と結合する能力を評価する工程
を含む、方法。
２．オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型もしくはＤ型インフルエンザウイルスまたはその変異体由来である、特にＡ型インフルエンザウイルス由来である、項目１に記載の方法。
３．結合部位が、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（配列番号１）のアミノ酸Ｋ６３０、Ｒ６３３およびＥ４４４を含むか；配列番号４４のＫ６３５、Ｒ６３８およびＥ４４９からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか；または、それらに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む、項目１または２に記載の方法。
４．結合部位がさらに、配列番号１のアミノ酸Ｋ２８９、Ｒ４４９およびＥ４５２を含むか、または配列番号４４のＫ２８９、Ｒ４５４およびＥ４５７からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含む、項目３に記載の方法。
５．結合部位がさらに、配列番号１のアミノ酸Ｆ４４０およびＦ６０７を含むか、または配列番号４４のアミノ酸Ｙ４４５およびＦ６１２を含む、項目３または４に記載の方法。
６．結合部位がさらに、配列番号１のＭ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｉ５４５、Ｍ５４３およびＫ５５４からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むか、または配列番号４４のＬ２８８、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｌ５５０、Ｍ５４８およびＲ５５９からなる群より選択される１以上のアミノ酸を含む、項目３から５のいずれかに記載の方法。
【０２４３】
７．結合部位がさらに、配列番号１のアミノ酸Ｇ６２９を含むか、または配列番号４４のアミノ酸Ｇ６３４を含む、項目３〜６のいずれかに記載の方法。
８．結合部位が、配列番号１のアミノ酸Ｆ４４０、Ｅ４４４、Ｆ６０７、Ｇ６２９、Ｋ６３０およびＲ６３３を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｙ４４５、Ｅ４４９、Ｆ６１２、Ｇ６３４、Ｋ６３５およびＲ６８３を含むか、またはそれらに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む、項目１から７のいずれかに記載の方法。
９．結合部位が、配列番号１のアミノ酸Ｍ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｒ４４９、Ｅ４５２、Ｍ５４３、Ｋ５５４およびＩ５４５を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｌ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｍ５４８、Ｋ５５９およびＬ５５０を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む、項目１から８のいずれかに記載の方法。
１０．Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位が、配列番号１のアミノ酸Ｍ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｆ４４０、Ｅ４４４、Ｒ４４９、Ｅ４５２、Ｍ５４３、Ｋ５５４、Ｉ５４５、Ｆ６０７、Ｇ６２９、Ｋ６３０およびＲ６３３を含むか、配列番号４４のアミノ酸Ｌ２８８、Ｋ２８９、Ｌ２９０、Ｓ２９１、Ｔ３１３、Ｆ３１４、Ｙ４４５、Ｅ４４９、Ｒ４５４、Ｅ４５７、Ｍ５４８、Ｋ５５９、Ｌ５５０、Ｆ６１２、Ｇ６３４、Ｋ６３５およびＲ６３８を含むか、またはそれに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む、項目１から９のいずれかに記載の方法。
１１．結合部位が、配列番号１のアミノ酸２５８−７１３を含むか、または配列番号４４のアミノ酸２０１−７１６を含む、項目１から１０のいずれかに記載の方法。
１２．結合部位が、Ｂ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｅ４４５、Ｋ６３１およびＲ６３４を含むか；または、それに整列させたＰＡサブユニットの配列中の類似の位置にあるアミノ酸を含む、項目１または２に記載の方法。
１３．結合部位がさらに、配列番号２のアミノ酸Ｙ４４１およびＦ６０４を含む、項目１２に記載の方法。
１４．結合部位がさらに、配列番号２のアミノ酸Ｇ６３０を含む、項目３または４に記載の方法。
１５．結合部位が、配列番号２のアミノ酸２５８−７２２を含む、項目１２から１４のいずれかに記載の方法。
１６．コンピューターモデルが、３．５Åまたはそれ以上、好ましくは、３．０Åまたはそれ以上、好ましくは２．５Åまたはそれ以上の分解能でＸ線を回折する結晶の立体構造座標に基づくものである、項目から１５のいずれかに記載の方法。
【０２４４】
１７．該コンピューターモデルが、図１１または１２に示す立体構造座標に基づく、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
１８．オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（好ましくは細胞性ポリメラーゼＩＩ、より好ましくはＣＴＤ）への結合を低減または阻止する化合物を製造する方法であって、
（ａ）項目１から９のいずれかに記載の方法により該化合物を同定する工程、および
（ｂ）該化合物を合成する工程、および要すれば該化合物またはその薬学的に許容される塩を、１以上の薬学的に許容される賦形剤および／または担体と共に製剤化する工程、
を含む、方法。
１９．さらに以下の工程：
（ｃ）該化合物をオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程、および
（ｄ）ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのそのリガンド、好ましくはＣＴＤへの結合を阻止する該化合物の能力を判定する工程
を含む、項目１８に記載の方法。
２０．該試験化合物が小分子である、項目１から１９のいずれかに記載の方法。
２１．該試験化合物がペプチドまたはタンパク質である、項目１から１９のいずれかに記載の方法。
２２．試験化合物が、抗体、好ましくはオルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（好ましくは、細胞性Ｐｏｌ ＩＩ、より好ましくはＣＴＤ）への結合部位に対する抗体である、項目２１に記載の方法。
２３．該化合物が、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（好ましくはＣＴＤ）への結合を減少または阻止することができる、項目１から１８のいずれかに記載の方法により同定可能および／または製造可能な化合物。
２４．オルトミクソウイルス科由来のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体の、そのリガンド（好ましくは細胞性Ｐｏｌ ＩＩ、より好ましくはＣＴＤ）への結合部位に対する、抗体。
２５．該抗体が、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の５〜１５アミノ酸長のポリペプチドを認識し、ここで、このポリペプチドが、配列番号１のＡ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのＫ６３０、Ｒ６３３およびＥ４４４からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含むか；または、配列番号２のＢ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのＥ４４５、Ｋ６３１およびＲ６３４からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含む、項目２４に記載の抗体。
【０２４５】
２６．項目２４または２５のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。
２７．項目２６に記載の核酸を含むベクター。
２８．項目２６に記載の単離された核酸または項目２７に記載の組換えベクターを含む、組換え宿主細胞。
２９．項目１８から２２のいずれかに記載のにより製造可能な医薬組成物。
３０．項目２３に記載の化合物、項目２４もしくは２５に記載の抗体、項目２６に記載の核酸、項目２７に記載のベクター、または項目２８に記載の組換え宿主細胞を含む、医薬組成物。
３１．オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる病状を処置、改善または予防するのに使用するための、項目２３に記載の化合物、項目２４もしくは２５に記載の抗体、項目２６に記載の核酸、項目２７に記載のベクター、項目２８に記載の組換え宿主細胞、または項目２９もしくは３０に記載の医薬組成物。
３２．該病状が、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる、項目３１に記載の使用のための、項目２３に記載の化合物、項目２４もしくは２５に記載の抗体、項目２６に記載の核酸、項目２７に記載のベクター、項目２８に記載の組換え宿主細胞、または項目２９もしくは３０に記載の医薬組成物。
３３．治療的有効量の、項目２３に記載の化合物、項目２４もしくは２５に記載の抗体、項目２６に記載の核酸、項目２７に記載のベクター、項目２８に記載の組換え宿主細胞、または項目２９もしくは３０に記載の医薬組成物を投与することを含む、オルトミクソウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる病状の処置、改善または予防方法。
３４．該病状が、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる、項目３３に記載の方法。
【０２４６】
添付の図面および以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、いかなる場合も、添付の特許請求の範囲によって示されるように本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２４７】
実施例
実施例は、本発明をさらに説明し、そしてより良い理解に役立つように意図されている。それらは、いかなる場合も、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２４８】
実施例の概要
コウモリＡ型インフルエンザ（Ｈ１７Ｎ１０）由来のポリメラーゼおよびヒトＢ型インフルエンザ（Ｍｅｍｐｈｉｓ／13／03）由来のポリメラーゼならびにそれら各々の変異体を、既報の通りに発現させ、精製した（Plotch et al. 1981 Cell 23:847-858; Pflug et al. 2014 Nature, 516:355-360）。両方のポリメラーゼを、ＳｅＰ５ ２８マー（４つのヘプタドリピート）ＣＴＤペプチドと共に共結晶化し、回折データをＥＳＲＦで収集し、構造を標準的方法を用いて決定した。結合アッセイを、ＦＡＭで蛍光標識された２または４つのヘプタドリピートを含むＣＴＤペプチドを用いる蛍光異方性測定により野生型または変異型ポリメラーゼに対して行った。インビトロ転写／複製アッセイを、野生型または変異型ポリメラーゼを用いて、キャップを付加したプライマーを用いてまたは用いずに別々の短いｖＲＮＡまたはｃＲＮＡの５’末端（アクティベーター）および’末端（テンプレート）を用いる蛍光アッセイを用いて、実施した。ミニゲノムアッセイのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリメラーゼサブユニット、核タンパク質およびｐＰｏｌＩをコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を負極性で発現し、核タンパク質セグメントの５’末端および３’末端を担持するｐｃＤＮＡ３プラスミドでトランスフェクトした。組換えウイルスを、リバースジェネティクス法によって生成し、そしてウイルス複製効率をプラークアッセイによって決定した。
【０２４９】
実施例１：組換えタンパク質の発現および精製
Ａ型インフルエンザ／アメリカケンショウコウモリ（little yellow-shouldered bat）／グアテマラ共和国／０６０／２０１０（Ｈ１７Ｎ１０）由来のヘテロ三量体ポリメラーゼ、およびヒトＢ型インフルエンザ／メンフィス/１３／０３由来のヘテロ三量体ポリメラーゼ、ならびにそれらの対応する変異体を、既報の通りに発現させ、精製した（Pflug et al. 2014, Nature 516:355-360; Reich, et al. 2014, Nature 516:361-366）。
【０２５０】
実施例２：結晶化、データ収集および構造解析
コウモリＦｌｕＡポリメラーゼ−ｖＲＮＡ結晶を、Ｓｅｒ−５−リン酸化２８マー ＣＴＤペプチド（Covalab）をポリメラーゼ複合体に対して１：１の割合で添加した以外、既報の通りに製造した（Pflug et al. 2014, Nature 516:355-360）。凍結保護の前に結晶を追加のペプチドで浸した後に凍結することによって、ペプチドの占拠率を高めた。回折データを、欧州シンクロトロン放射光研究所（ＥＳＲＦ）のｂｅａｍｌｉｎｅ ＩＤ２９で収集し、そしてＸＤＳスイートと統合させて、スケーリングした（Kabsch 2010、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:133-144）。構造は、元のコウモリＦｌｕＡポリメラーゼ構造（ＰＤＢコード：４ＷＳＢ）を用いた分子置換によって解析され、ペプチドは明確な密度差で手動でモデル化された（図１Ａ）。ＦｌｕＢポリメラーゼ−ｖＲＮＡ複合体を、１：１５の比でＳｅｒ−５リン酸化２８アミノ酸のＣＴＤペプチドと共結晶化させて、既報の通りに（Reich, et al. 2014, Nature 516：361-366）ＦｌｕＢ１結晶形を得た。回折データは、ＥＳＲＦのｂｅａｍｌｉｎｅ ＩＤ２３−１で収集された。この構造は、Ｂ型インフルエンザの構造（ＰＤＢコード：４ＷＳＡ）のモデルによる分子置換によって解析された。両構造は、Ｒｅｆｍａｃ５４およびＰｈｅｎｉｘ５を用いて精緻化された。より低い分解能のＦｌｕＢ構造については、ＴＬＳパラメーターのみが改良された。構造図を、Ｐｙｍｏｌ（DeLano 2002; PyMOL Molecular Graphics System、http://www.pymol.sourceforge.netでオンラインにて利用可能）を用いて描いた。４つのヘプタドリピートのＳｅｒ５−リン酸化（ＳｅＰ５）ＣＴＤペプチドを有する共結晶化ｖＲＮＡ−プロモーター結合コウモリＦｌｕＡポリメラーゼの構造を、２．５Åの分解能で決定した。ペプチドの明白な余分な電子密度がポリメラーゼ表面上の２つの別個の部位で明らかに観察され、１６／２８残基を構造中でモデル化することができた（図１Ａ）。ＣＴＤペプチドは、プロモーター結合部位、ポリメラーゼ活性部位ならびにキャップ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインから離れた、ＰＡのＣ末端ドメイン（ＰＡ−Ｃ）に結合し（図２Ａ）、これらは撹乱を免れた。１つのＣＴＤリピートからの６つの残基（Ｙ１ａＳ２ａＰ３ａＴ４ａＳｅＰ５ａＰ６ａ）は、ＰＡヘリックスα１６、α２０、α２１およびへリックスα１５とα１６を連結するループ（部位１（ｓｉｔｅ １）と示される）よって形成された溝に６７２Å２の相互作用表面で結合する（図２Ｂ）。部位２（ｓｉｔｅ ２）は、３つの連続したリピートからの残基（Ｐ６ｂＳ７ｂ−Ｙ１ｃＳ２ｃＰ３ｃＴ４ｃＳｅＰ５ｃＰ６ｃＳ７ｃ−Ｙ１ｄ）を収容し、それは結合すると１１６８Å２の表面積を埋める。ペプチドは、β１９−β２０リボンおよび突出した５５０ループ上にある（Pflug et al. 2014, Nature 516:355-360）。部位１および部位２のペプチドを連結する電子密度はないが、それらは、欠失している残基（−Ｓ７ａ−Ｙ１ｂ−Ｓ２ｂ−Ｐ３ｂ−Ｔ４ｂ−ＳｅＰ５ｂ−）によってもっともらしく結合され得る（図２Ｂ）。
【０２５１】
部位１のＣＴＤペプチドは、タンパク質と相互作用するか（Ｙ１ａ、Ｐ３ａ、ＳｅＰ５ａ）または溶媒中に突出する（Ｓ２ａ、Ｔ４ａおよびＰ６ａ）いずれかの交互の残基を有する伸長されたベータ様立体配置をとる（図２Ｃ）。タンパク質パートナーに結合したＣＴＤの他の構造において、同様の立体配置が観察されたが、特定の相互作用は異なっている（図１Ｂ−Ｅ）Ｙ１ａは、ＰＡ残基であるＦ４４０およびＦ６０７（コウモリＦｌｕＡの番号付け）によって形成された疎水性ポケットに収容され、そのヒドロキシル基は、Ｅ４４４と水素結合を形成する。Ｐ３ａは、非極性残基Ｌ４１２およびＡ４４３とファンデルワールス力で連結している。ＳｅＰ５ａのリン酸基は、Ｋ６３０およびＲ６３３によって形成された正に帯電したポケット内の複数の水素結合によって結合されており、これは次に、Ｅ４４４と相互作用して配置されている。部位２へ結合しているＣＴＤリピートは、５５０ループをクランプする伸長領域に隣接するβ−ターンを形成する（図２Ｂ、２Ｄ）。β１８−β１９リボンおよび５５０ループは、ペプチドを含まない構造と比較して、最大６Åまで変位している（図２Ｂ）。β−ターンは、Ｓ２ｃＰ３ｃＴ４ｃＳｅＰ５ｃによって形成され、Ｓ２ｃのヒドロキシル基とＴ４ｃのヒドロキシル基およびＳｅＰ５ｃのアミド基の両方との間、ならびにＴ４ｃのヒドロキシル基とＳｅＰ５ｃのリン酸基の間の３つの内部水素結合により安定化される。これらの相互作用は、この立体配置におけるＳ２ｃまたはＴ４ｃのいずれかのリン酸化を排除し、これは、Ｓｅｒ５−リン酸化ＣＴＤ２に対するポリメラーゼの既知の特異性と一致する。ＳｅＰ５ｃのリン酸基が、塩基性残基Ｋ２８９およびＲ４４９と荷電水素結合を形成し、後者はＥ４５２により安定化されている。２つのチロシン（Ｙ１ｃおよびＹ１ｄ）ならびにＰ６ｃは、Ｉ５４５およびＫ５５４の脂肪族側鎖（Ｙ１ｃのための）；Ｍ５４３およびＭ２８８（Ｐ６ｃ）；Ｍ５４３、Ｌ２９０およびＦ３１４（Ｙ１ｄ）によって形成された疎水性ポケットに結合している。Ｙ１ｄ ヒドロキシル基はまた、Ｔ３１３の側鎖およびＳ２９１の主鎖アミドに２つの水素結合を作る。
【０２５２】
Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型インフルエンザからの配列アライメントは、全ての重要な部位１残基が、全てのＦｌｕＡ株で高度に保存されており、コウモリ（鳥類／ヒト）において、Ｆ４４０（Ｙ４４５）、Ｅ４４４（４４９）、Ｆ６０７（６１２）、Ｇ６２９（６３４）、Ｋ６３０（６３５）、Ｒ６３３（６３８）、ならびにＦｌｕＢ株で高度に保存されているが、Ｙ４４１、Ｅ４４５、Ｆ６０４、Ｇ６３０、Ｋ６３１およびＲ６３４、ＦｌｕＣまたはＤ株では保存されていないことを示す（図３Ａ、図４）。対照的に、重要な部位２残基は、ＦｌｕＡ株のみで保存されている。これらの観察を確認するために、本発明者らは、同じ２８マーのＳｅＰ５ペプチドと共結晶化させたＦｌｕＢポリメラーゼの３．５Å分解能の構造を決定した。予想通り、本発明者らは、部位１での結合を観察したが、Ｓ７ａ−Ｙ１ｂがさらに観察されることを除いて、相互作用様式はコウモリＦｌｕＡと同じであった（図３Ｂ,３Ｃ）。しかしながら、 ＰＢ２ ６２７ドメインを横切って部位１の近くから（部位１に結合されてはいない）伸長している、追加のペプチド様の異なる電子密度も観察され（図３Ｂ）、これは、コウモリＦｌｕ構造では観察されない。これらの結果は、部位１が、全てのＡ型およびＢ型インフルエンザ株に対する普遍的なＣＴＤ結合部位であるのに対して、部位２はＦｌｕＡに特異的であると考えられ、ＦｌｕＢ株には別の第２の部位があり得ることを示唆する。
【０２５３】
実施例３：蛍光異方性
ＣＴＤとＦｌｕＡポリメラーゼおよびＦｌｕＢポリメラーゼとの相互作用をさらに特徴付けるために、２つ（１４マー）または４つ（２８マー）のリピートを有するフルオロフォア標識ペプチドを用いて、蛍光異方性結合実験を行った。Ｎ末端をＦＡＭで蛍光標識した、コンセンサス配列（Ｙ１Ｓ２Ｐ３Ｔ４Ｓ５Ｐ６Ｓ７）の異なる数のリピートからなるＣＴＤペプチドを用いて、結合アッセイを行った。２−および４−のリピート（それぞれ、１４アミノ酸および２８アミノ酸）のＳｅｒ−５リン酸化ペプチドならびに４−リピートの非リン酸化ペプチドを用いた（Ｃｏｖａｌａｂ）。ペプチドを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ｐＨ７．５中、漸増濃度の野生型ポリメラーゼまたは対応する変異体を用いて滴定した。タンパク質を、ｖＲＮＡプロモーターとして、コウモリＦｌｕＡについて、５’−ｐＡＧＵＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧ−３’（配列番号２４）および３’ＯＨ−ＧＣＣＵＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−５’（配列番号２５）ならびにＦｌｕＢについて、５’ −ｐＡＧＵＡＧＵＡＡＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号２６）および３’ＯＨ−ＣＵＣＵＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−５’（配列番号２７）と予め混合した（１つの例外を除いて（示される））。蛍光異方性を、蛍光分光計（Photon Technology International）を用いて２３℃にて測定した。観察された蛍光異方性をプロットした。以下の式を用いて、データを１：１結合モデルに当てはめることにより解離定数を得た：
【表６】
2019528508.tif 000007
（ｆｂ−結合ペプチドの分画濃度、Ｌ−蛍光ペプチドの全濃度、Ｐ−タンパク質の全濃度、ＫＤ−解離定数）。置換アッセイについて、０．５μＭ ＦｌｕＡポリメラーゼ：ｖＲＮＡ複合体を、０．５μＭの蛍光標識されたＳｅｒ−５リン酸化ＣＴＤペプチドと共にインキュベートし、漸増量の標識していないＳｅｒ−５リン酸化ＣＴＤペプチドで滴定した。見かけのＫＤを、同じ結合モデル式を用いて計算した。
【０２５４】
本発明者らは、コウモリＦｌｕＡポリメラーゼ−ｖＲＮＡプロモーター複合体に結合する２８マーのＳｅＰ５ペプチドについて０．９μＭのＫＤを導き出した（図３Ｃ）。同様のＫＤが、結合した標識ペプチドを非標識ペプチドで置換することにより得られた（図５Ａ）。結合はｖＲＮＡプロモーター結合とは無関係であり（図５Ｂ）、ペプチド結合部位はポリメラーゼの構造的に安定なコアの外側にあり、ｖＲＮＡ結合部位およびフレキシブルに連結された周辺のドメイン１８から離れていることと一致し、またｖＲＮＡがＣＴＤ結合に必要ではないことを示す以前の結果とも一致する（Engelhardt et al. 2005, Journal of virology 79:5812-5818； Loucaides et al. 2009, Virology 394:154-163）。１４マーのＳｅＰ５および非リン酸化２８マーＳｅｒ５ペプチドについて、本発明者らは、それぞれ６．１マイクロＭおよび＞１０μＭのＫＤを導き出した（図３Ｃ、図５Ｃ）。このことは、Ｓｅｒ５がリン酸化されていないＣＴＤリピートと比較してリン酸化されたＳｅｒ５に対する親和性が１０倍を超えて高く、２つのリピートと比較して４つリピートへのより強い結合を意味する。後者の結果は結晶構造と一致しており、これは、４つの連続したリピートが両方の部位にまたがって結合することができ、独立したリガンドを融合することの予期される結合親和性（avidity effect）と一致することを示唆する。ＦｌｕＢポリメラーゼは、異なる長さのＳｅｐ５ペプチドを区別しなかった（２８マーのＳｅＰ５および１４マーのＳｅＰ５について、それぞれ２．９μＭおよび４．２μＭのＫＤ）（図３Ｄ）。
【０２５５】
実施例４：インビトロでのポリメラーゼ活性アッセイ
ウイルス複製のためのＣＴＤ相互作用の重要性を評価するために、本発明者らは、正電荷を帯びたホスホセリン結合部位を形成する保存された塩基性残基を変異させた。本発明者らは最初に、部位１（Ｋ６３０Ａ＋Ｒ６３３Ａ）または部位２（Ｋ２８９Ａ＋Ｒ４４９Ａ）のいずれかに二重変異を有するコウモリの組換えポリメラーゼを発現させ、精製した。４−リピートのＳｅＰ５ペプチドに対する親和性は、Ｋ２８９Ａ＋Ｒ４４９Ａ変異体およびＫ６３０Ａ＋Ｒ６３３Ａ変異体それぞれで、約４倍および７．５倍減少した（図６Ａ、図７Ａ）。ＦｌｕＢにおける対応する変異（Ｋ６３１Ａ＋Ｒ６３４Ａ）は、ＣＴＤに対する結合親和性が２．５倍減少した（図６Ａ、図７Ｂ）。４つ全ての変異を含むポリメラーゼ（Ｋ２８９Ａ、Ｒ４４９Ａ、Ｋ６３０ＡおよびＲ６３３Ａ）は、組換えにより産生することができず、哺乳動物細胞で発現された蛍光標識ポリメラーゼサブユニットを用いた研究は、他の変異体とは異なり、それが核内に適切に局在化されていないことを示した（データは示さず）。
【０２５６】
ＦｌｕＡポリメラーゼＣＴＤ結合変異体：テンプレートとしてｖＲＮＡまたはｃＲＮＡを用いたキャップ刺激された転写様のおよび刺激されていない複製様の、内生酵素活性を比較するために、３種類のＲＮＡ合成アッセイを行った。各アッセイについて、５’ｖＲＮＡ（５’−ｐＡＧＵＡＧＵＡＡＣＡＡＧＡＧ−３’）（配列番号２８）または５’ｃＲＮＡ（５’−ｐＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号２９）と予め混合した０．２５μＭのコウモリＦｌｕＡポリメラーゼを、０．１５μＭの蛍光標識したテンプレート ３’ｖＲＮＡ（５’−ＦＡＭ−ＵＡＵＡＣＣＵＣＵＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−３’）（配列番号３０）またはｃＲＮＡ（５’−ＦＡＭＵＡＣＣＣＵＣＵＵＧＵＵＡＣＵＡＣＵ−３’）（配列番号３１）に添加した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ｐＨ７．５中、０．０２５ｍＭまたは０．５ｍＭ ＮＴＰと共に（それぞれキャッププライマーの存在下または不存在下）、反応を行った。キャップ依存性転写反応のために、０．５μＭのキャップドプライマー（５’−ｍ７ＧｐｐｐＡＡＵＣＵＡＵＡＡＵＡＧ−３’）（配列番号３２）を添加した。アッセイを２４℃にて行った。ＮａＣｌ中で反応を停止させ、二本鎖の生成物−テンプレートに対応する蛍光偏光シグナルをＣｌａｒｉｏｓｔａｒマイクロプレートリーダー（BMG Germany）を用いて検出した。刺激されていない（unprimed）複製反応について得られた時間経過は、単独指数関数式にフィットし：
【表７】
2019528508.tif 000008
キャップ依存型転写の場合は、二重指数関数にフィットした：
【表８】
2019528508.tif 000009
（式中、ＡおよびＣは、観察された偏光振幅であり、ＢおよびＤは、対応する位相の最終偏光値であり、ｔは時間であり、そしてｋｎは、それぞれの観測された速度定数である。）。
【０２５７】
実施例５：ミニゲノムアッセイ
次に本発明者らは、ヒトＦｌｕＡポリメラーゼおよび核タンパク質が負極性のレポータールシフェラーゼをコードするＲＮＡと共に発現されるミニゲノムアッセイを用いて、細胞環境におけるポリメラーゼ活性に対する全体的な効果をアッセイした。機能的レポータータンパク質は、活発に転写されているリボ核タンパク質複合体によってのみ産生され得る。
【０２５８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種し、ＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションを行った。各ウェルを、１００ｎｇのｐｃＤＮＡ３発現核タンパク質（ＮＰ）、１０ｎｇのｐｃＤＮＡ３プラスミド発現ＰＡまたは対応する変異体、Ａ型インフルエンザ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ/３／１９７５（Ｈ３Ｎ２）ポリメラーゼのＰＢ１およびＰＢ２サブユニット（Ortin et al. 2015, Virology 479-480:532-544）、ならびに１００ｎｇの、負極性のホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードし、ＮＰセグメントの５’領域および３’領域に隣接するｐＰｏｌＩ−ＮＰ−Ｌｕｃ（Palancade et al. 2003, Eur J Biochem 270:3859-3870）を用いてトランスフェクトした。ＰＡを含まないトランスフェクションミックスを陰性対照として用いた。ｐＲｅｎｉｌｌａ−ＴＫプラスミド（Promega）を用いて、トランスフェクション効率を補正した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を溶解させ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０ ルミノメーター（Promega）を製造者のプロトコールに従って用いて、ＦｉｒｅｆｌｙおよびＲｅｎｉｌｌａシフェラーゼ活性を測定した。実験を、生物学的にトリプリケートで行った。変異体の発現レベルのウェスタンブロット検出のために、１μｇのＰＡまたは対応する変異体を、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトし、マウス抗ＰＡ抗体（J.Ortinにより提供された）を用いて検出した。それぞれの細胞溶解物中の総タンパク質量の正規化のために、βアクチン抗体（Abcam、UK）を用いた。
【０２５９】
本発明者らは、二重変異体（部位１：Ｋ６３５Ａ＋Ｒ６３８Ａおよび部位２：Ｋ２８９Ａ＋Ｒ４５４Ａ）それぞれの活性の、それぞれの野生型の活性の０．３％および２％への大幅な減少を観察した（図６Ｂ）。本発明者らはまた、各個々のアルギニンまたはリシンの単一のアラニン変異を別個に作製し、野生型の活性の６〜６０％への減少を観察した（図６Ｂ）。興味深いことに、同等の二重変異を有する精製した組換えコウモリＦｌｕＡポリメラーゼは、インビトロでのキャップ依存性転写アッセイ（図６Ｃ）またはテンプレートとしてｖＲＮＡもしくはｃＲＮＡを用いた刺激されていないウイルス複製アッセイ（図７Ｃ）において野生型と比較して活性に差がないことが示され、このことは、全ての内生ポリメラーゼ酵素活性が突然変異によって影響されないことを確認する。これらの結果は、おそらくポリメラーゼＩＩ ＣＴＤへの結合の減少のために、変異型ポリメラーゼが細胞状況（cellular context）においてのみ損なわれることを示している。
【０２６０】
実施例６：逆遺伝学による組換えウイルスの製造
本発明者らは、逆遺伝学を用いて、ＰＡサブユニット中にＫ６３５Ａ＋Ｒ６３８Ａ（部位１）またはＫ２８９Ａ＋Ｒ４５４Ａ（部位２）の二重変異を有するか、またはＫ２８９Ａ、Ｒ４５４Ａ、Ｋ６３５ＡもしくはＲ６３８Ａの単一変異を有する、組換えヒトインフルエンザウイルスを作製した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグルス培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＭＤＣＫ細胞を、５％ＦＣＳを添加した修飾イーグル培地中で培養した。組換えＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスは、以前の研究から適合された手法を用いて逆遺伝学によって産生された（Fodor et al. 2003, Journal of virology 77:5017-5020；Eisfeld et al. 2015, Nat Rev Microbiol 13:28-41）。以前の研究から適合させたプラークアッセイ法（Resa-Infante et al. 2011, RNA Biol 8:207-215）を用いて、ＭＤＣＫ細胞上の上清を滴定することにより、逆遺伝学の効率を評価した。ＭＤＣＫ細胞上でのプラーク精製および増幅の際に、ＱＩＡａｍｐ ウイルスＲＮＡミニキット（QIAGEN）を用いてウイルスＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Invitrogen）、ならびにそれぞれＰＡセグメントの５’または３’部分を増幅する、オリゴヌクレオチド ５’−ＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＧＧ−３’（配列番号３３）および５’−ＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧ−３’（配列番号３４）または５’−ＡＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号３５）および５’−ＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＧＴＡＣＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号３６）を用いて、逆転写および増幅を行った。増幅産物を、ゲルおよびＰＣＲクリーンアップキット（Macherey-Nagel）を用いて精製し、内部オリゴヌクレオチドを用いて配列決定した。
【０２６１】
二重変異ウイルスのどちらも、救済できなかった。図８Ａに示すように、単一のＰＡ変異体の上清の逆遺伝学は、野生型ウイルスの＞１０７ｐｆｕ／ｍｌと比較して＜１０３ｐｆｕ／ｍｌの力価、およびより小さいプラーク（Ｒ４５４変異体の場合はピンポイントプラーク）を示した。各ＰＡ変異について、単一プラークからのウイルスを精製し、ＭＤＣＫ細胞上で増幅させた。得られたウイルスストックは、予期されるＰＡ配列および小さいプラーク表現型を示した（データ示さず）。変異型ウイルスおよび野生型ウイルスの増殖特性を比較するために、ＭＤＣＫ細胞を０．００１の感染効率で感染させ、培養上清中、様々な時点で、ウイルス力価を決定した（図８Ｂ）。Ｋ６３５ＡおよびＲ６３８Ａ変異体は、野生型と比較して著しく弱毒化されていた。Ｒ４５４変異体はさらに弱毒化されていたが、Ｋ２８９Ａ変異体は、これらの条件下で検出可能なレベルで増殖しなかった。
【０２６２】
実施例７：ＦｌｕＰｏｌに結合し、それにより細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）のＣＴＤドメインとおよびＦｌｕＰｏｌとの間の相互作用をブロックする化合物のバーチャルスクリーニング
結晶構造は、ＦｌｕＰｏｌ中に少なくとも２つの異なる結合領域が存在することを明らかにしており、それらは両方とも、Ｐｏｌ ＩＩのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の一部分を収容している。構造情報は、Ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤのこれらのアミノ酸とＦｌｕＰｏｌとの正確な相互作用プロファイルの分析を可能にした。
【０２６３】
両方の相互作用部位を別々に分析して、その知識を、両方のアプローチに従ってウイルスタンパク質と細胞タンパク質との間の相互作用をブロックする化合物を探索するためのいくつかのバーチャルスクリーニング法に適用した：
１．ＦｌｕＰｏｌと重要な相互作用をしている化合物の生物活性立体配座においてＣＴＤアミノ酸を模倣することができるリガンドベースのバーチャルスクリーニングおよびそれらの化合物の検出。
ａ．これは、部位１における結合に対して行われる。
ｂ．これは、部位２における結合に対して行われる。
２．構造ベースのバーチャルスクリーニング：
ａ．ＣＴＤリピートの一部について、結合部位１に市販の化合物をドッキングさせる。これにより、ウイルスタンパク質と相互作用するＳｅＰ５基を最もよく模倣することができる部分構造を有する化合物を優先するためにバイアスが含まれた。
ｂ．ＣＴＤリピートの一部について、結合部位２に市販の化合物をドッキングさせる。これにより、ウイルスタンパク質と相互作用するＳｅＰ５基を最もよく模倣することができる部分構造を有する化合物を優先するためにバイアスが含まれた。
【０２６４】
結論
本発明者らは、ＦｌｕＡポリメラーゼが、インビトロで、複数のＳｅｒ５リン酸化Ｐｏｌ ＩＩ ＣＴＤリピートに直接結合すること、および２つの保存されたホスホセリン結合部位の破壊が、ポリメラーゼの固有ＲＮＡ合成活性に影響を及ぼすことなくウイルス感染性に高度に有害であることを示した。
【０２６５】
本発明者らのＣＴＤ結合ＦｌｕＡポリメラーゼ構造に基づくモデリングは、置換Ｃ４５３Ｒ（コウモリＦｌｕＡではＣ４４８Ｒ）の高度の空間的近接性が、ホスホセリン結合におけるＲ６３８の欠失を如何に補うことができるかを示唆している（図８Ｃ）。第二に、ＰＡ置換Ｌ５５０Ｉは、Ａ型インフルエンザ／ＰＲ／８／３４株にＰｏｌ ＩＩ分解を減少させた低毒性表現型を付与するのに十分であることが示されている（Llompart et al. 2014, Journal of virology 88:3455-3463；Rolling et al. 2009, Journal of virology 83:6673-6680）。ＰＡ Ｌ５５０は、ヒト／鳥類のＡ型インフルエンザ株において高度に保存されており（９９．６％）、コウモリＦｌｕＡの残基に対応し、これはＣＴＤ結合部位２におけるＣＴＤ残基Ｔｙｒ１ｃおよびＰｒｏ６ｃとの重要な疎水性相互作用を生じる（図２Ｄ、８Ｄ）。これらの観察は、この残基の保存的置換が、結果としてポリメラーゼ活性、Ｐｏｌ ＩＩ分解および毒性に対するノックオン効果を伴ってＣＴＤ結合を微妙に調節し得ること（排除することなく）を示唆する。第三に、鳥類（およびコウモリ、Ｔ５４７）ではほぼ例外なくスレオニン、またはヒトＦｌｕＡポリメラーゼではセリンである、５５０ループの先端付近のＰＡ残基５５２もまた結合部位２の一部であり、これはＣＴＤ残基Ｓｅｒ７ｂに非常に近い（図８Ｄ）。単一のＰＡ変異Ｔ５５２Ｓ（鳥類からヒトへのシグネチャー）は、ヒト細胞において他の点では損なわれている鳥類ポリメラーゼの活性を２０倍増強するのに十分である（Mehle et al. 2012, Journal of virology 86:1750-1757)。まとめると、本発明者らは、ＣＴＤ結合部位残基におけるわずかな変動（例えば、Ｉ５５０ＬまたはＴ５５２Ｓ）のみが、生物学的に有意な影響を及ぼし得ると結論付ける。これは、比較的大幅な変異（例えば、両方のホスホセリン結合塩基性残基の二重ノックアウト）が生存不可能なウイルスをもたらし、単一突然変異体でさえも高度に弱毒化されたウイルスをもたらし、それにもかかわらず、二重変異ポリメラーゼのＣＴＤへのインビトロでの結合は４〜８倍しか減少しないという本発明者らの発見と一致する（図６Ａ、７Ａ）。これらの考察は、競合する宿主因子と比較して、Ｐｏｌ ＩＩ ＣＴＤに対するウイルスポリメラーゼの親和性の微調整の必要性を指摘している。ＦｌｕＡポリメラーゼのＳｅＰ５ ＣＴＤペプチドリピート（０．９μＭ）への結合についてのＫＤと、他の関連するＣＴＤ結合タンパク質、例えば、哺乳動物キャッピング酵素（Ｍｃｅ１）、ＫＤ 〜１３９μＭ、Ｐｉｎ１プロリンイソメラーゼ、ＫＤ 〜３０μＭ（Verdecia et al. 2000、Nat Struct Biol 7:639-643）およびＳｓｕ７２ Ｓｅｐ５ホスファターゼ、ＫＭ 〜２８０μＭ（Xiang et al. 2010、Nature 467:729-733; Hausmann et al. 2005、The Journal of biological chemistry 280:37681-37688）についてのＫＤとの比較。表２は、ＣＴＤに対するウイルスポリメラーゼの親和性が、これまでに報告された中で最も高いもののうちに当たることを示している。これは、ＦｌｕＰｏｌがＣＴＤ結合について強く競合し、他の因子結合、特に伸長期への移行を促進するもの（例えばＳｓｕ７２およびＰｉｎ１）を潜在的に妨げる可能性があることを示唆している。
【０２６６】
実施例８：Ｈ７Ｎ９ポリメラーゼコアのコンストラクト（構築物）設計／クローニング
Ａ型インフルエンザ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／ＤＴＩＤ−ＺＪＵ０１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）ポリメラーゼコアのための共発現構築物を、市販のバキュロウイルス発現ベクター ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Thermo Fisher）に基づいて作製した。完全なＰＢ１タンパク質をコードする配列（配列番号４１、合成、GenBank:AGJ51960.1）を、制限部位ＢａｍＨＩおよびＲｓｒＩＩを用いてＰｏｌＨ−ＭＣＳに挿入し、そして、ＴＥＶ切断可能なポリヒスチジンタグ（配列番号４３、ＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ）を付加したタンパク質ＰＢ２の残基１−１２７をコードする配列（配列番号４２、合成、GenBank:KJ633805.1）を、制限部位ＢｂｓＩおよびＸｈｏＩを用いてＰ１０−ＭＣＳに挿入した。タンパク質ＰＡの残基２０１−７１６をコードする配列（配列番号４４、合成、GenBank:AGJ51952.1）を、まず初めに、制限部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを介してベクター ｐＡＣＥＢａｃ中にクローニングし、その後、ＰｏｌＨプロモーターおよびＳＶ４０ ｐｏｌＡシグナルを含むこの構築物から増幅させ、ユニークなＡｖｒＩＩ制限部位およびＳＬＩＣクローニング技術を用いて、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ＿ＰＢ１＿ＰＢ２構築物にサブクローニングした。
【０２６７】
実施例９：組換えタンパク質の発現および精製
Ｈ７Ｎ９コアを、バキュロウイルス発現系を用いてＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞中で産生させた。細胞を緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中で超音波処理することによって溶解し、細胞片をスピンオフ（３０分、４℃、３５，０００ｇ）し、上清に硫酸アンモニウム（０．５ｇ／ｍｌ）を添加して、タンパク質を溶液から取り出した。沈殿したタンパク質を遠心分離（３０分、４℃、３５，０００ｇ）により回収し、緩衝液Ａに再懸濁し、最後に、遠心分離（３０分、４℃、３５，０００ｇ）により清澄化して、固定化した金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）にかけた。ポリメラーゼタンパク質を含有する溶出画分をプールし、それをＴＥＶプロテアーゼを用いて消化した（５ｍＭ β−メルカプトエタノールを添加した緩衝液Ａ中）。消化したタンパク質サンプルを透析して緩衝液Ａに戻した後、不純物、未切断ポリメラーゼタンパク質、および切断されたポリヒスチジンタグを除去するために、ＩＭＡＣカラムに２回通した。サンプルを、ヘパリンカラム（HiPrep Heparin HP、GE Healthcare）に充填する前に、２５０ｍＭ ＮａＣｌの塩濃度に希釈した。カラムを、最初に、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、２ｍＭ ＴＣＥＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、その後、１Ｍ ＮａＣｌでプラトーに達する塩勾配によってタンパク質を溶出した。単量体およびＲＮＡを含まないポリメラーゼを約９ｍｇ／ｍｌに濃縮し、急速冷凍し、そして−８０℃で保存した。
【０２６８】
実施例１０：結晶化
Ｈ７Ｎ９コアは、一般的に、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、８−１３％ ＰＥＧ ８Ｋ、０．２Ｍ ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ塩酸グアニジンの条件下で；４℃にて、１：２〜１：３（タンパク質：ウェル）の滴下比で、４−５日以内に結晶化した。この結晶は、非対称単位に２つの錯体を含む空間群Ｐ２１２１２１（セル寸法ａ〜７６．５、ｂ〜１４４．１、ｃ〜３３６．２）のものである。共結晶化実験のために、５’ ｖＲＮＡ（配列番号４５、５’−ｐＡＧＵＡＧＵＡＡＣＡＡＧ）をタンパク質に対して１．１を超えて添加した。ヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩのタンパク質ＲＰＢ１のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を模倣するＳｅｒ５リン酸化ペプチド（４つのＣＴＤヘプタッドを含む２８マー、Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＳｅｒＰ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）を、２４時間かけて２ｍＭの濃度で存在する結晶に浸した。欧州シンクロトロン放射光施設のビームラインでのデータ収集のために、結晶を、２５％グリセロールを添加したウェル溶液中で急速冷凍した。
【０２６９】
結論
構造は、コウモリポリメラーゼ構造において観察されるのと全く同様に、ＰＡの部位２におけるＣＴＤペプチド結合を示し、鍵となる塩基性残基Ｌｙｓ２８９およびＡｒｇ４５４はホスホセリンのリン酸と相互作用している（図１３、１４）。しかしながら、部位１では結合は観察されず、このことは、ペプチド結合に影響を及ぼす結晶充填によるか、またはＰＢ２の切断によるＰＡ部位１の観察された歪み（図１３）により説明できる。後者は、完全なヘテロ三量体が完全なＣＴＤ結合に必要であるという以前の報告と一致している。
【０２７０】
これらの結果は、配列保存から予測されるように、ＣＴＤ結合部位２がコウモリとトリ／ヒトＡ型インフルエンザポリメラーゼとの間で完全に保存されていることを確認する。さらに、高収量のＨ７Ｎ９コアポリメラーゼ構築物は、これをＣＴＤ結合親和性および特異性、ならびに部位２でのＣＴＤ結合を排他的に阻害する化合物のバーチャルスクリーニングおよび生化学的スクリーニングのさらなる検討を有用にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１１】
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【図１１−１４】
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【図１１−５１】
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【図１２−１】
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【図１２−４８】
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【図１２−４９】
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【図１２−５０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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