【手続補正書】
【提出日】平成19年7月27日(2007.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及び／又はＬ３を含んでなるポリペプチドであって、該変異型ＣＤＲが溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に変異型アミノ酸を有し、該変異型アミノ酸が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を有する変異型ＣＤＲＨ３領域を含んでなる請求項１に記載のポリペプチドであり、Ｘ１は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝３〜２０であるポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列が(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ−Ｄ−Ｙである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ１が抗体４Ｄ５(配列番号２)のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に一致する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−(Ｘ３)ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を有する変異型ＣＤＲＨ２を含んでなる請求項１に記載のポリペプチドであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝１〜２であるポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−(Ｘ２)ｎ−Ｉ
を有する変異型ＣＤＲＨ１を含んでなる請求項１に記載のポリペプチドであり、Ｘ１及び／又はＸ２が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４であるポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を有する変異型ＣＤＲＬ３を含んでなる請求項１に記載のポリペプチドであり、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４であるポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を有する変異型ＣＤＲＬ２を含んでなる請求項１に記載のポリペプチドであり、Ｘ１及び／又はＸ２は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を有する変異型ＣＤＲＬ１を含んでなる請求項１に記載のポリペプチドであり、Ｘ１が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝３〜５であるポリペプチド。
【請求項１０】
制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである、請求項１ないし９の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ｎ＝７〜２０である、請求項２に従属する請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１００ａの少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ３を含んでなる、請求項１ないし４及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ポリペプチドが、位置９５、９６、９７、９８、９９、１００及び、１００とＣ末端配列ＡＭＤＹの間の位置の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ３を含んでなる、請求項１ないし４及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
変異型ＣＤＲＨ３が一以上の位置への挿入を含み、該一以上の位置が制限コドンセットによりコードされるアミノ酸を含む、請求項１ないし４及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ２を含んでなる、請求項１、５及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置２８、３０、３１、３２及び３３の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ１を含んでなる、請求項１、６及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置９２、９３、９４、９５及び９７の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ３を含んでなる、請求項１、７及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置５１及び５４の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ２を含んでなる、請求項１、８及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置２９、３０、３１、３２及び３３の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ１を含んでなる、請求項１、９及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
さらに、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の付加的な変異体ＣＤＲを含み、少なくとも一のＣＤＲが溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に変異型アミノ酸を有し、該変異型アミノ酸が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化される、請求項１ないし１９の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドが重鎖抗体可変ドメインである、請求項１ないし２０の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
(a) 請求項２ないし６に従属する請求項２ないし６及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチドを含む重鎖抗体可変ドメイン；と
(b) 請求項７ないし９に従属する請求項７ないし９及び１０ないし１１の何れか一に記載のポリペプチドを含む軽鎖抗体可変ドメイン：
を有する少なくとも二つの抗体可変ドメインを含んでなるポリペプチド。
【請求項２３】
さらに、重鎖抗体可変ドメインのＣ末端領域に連結した二量体化ドメインを含む、請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
二量体化ドメインがロイシンジッパードメイン又は少なくとも一のシステイン残基を含む配列を含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
二量体化ドメインが抗体からのヒンジ領域及びロイシンジッパーを含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
二量体化ドメインが単一システインである、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドであり、該ポリペプチドを有する抗体可変ドメインが少なくとも一のウイルスコートタンパク質の一部と融合している融合ポリペプチド。
【請求項２８】
ウイルスコートタンパク質がタンパク質ｐＩＩＩ、主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐｖ1およびそれらの変異体からなる群から選択されたものである、請求項２７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
さらに、可変ドメインとウイルスコートタンパク質との間に二量体化ドメインを含む、請求項２７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
可変ドメインが重鎖のものである、請求項２９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
可変ドメインが軽鎖のものである、請求項２９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
さらに、単一抗体鋳型から得られたＦＲ配列である、変異型ＣＤＲに一致する抗体可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４を含む、請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
各々のＦＲが抗体４Ｄ５の配列（配列番号１）を有する、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
請求項１ないし３３の何れか一に記載のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド分子を含む核酸。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３６】
複製可能な発現ベクターである、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
ウイルス表面上に表出される請求項１ないし３３の何れか一に記載のポリペプチドを含んでなるウイルス。
【請求項３８】
請求項１ないし３３の何れか一に記載の複数の少なくとも１×１０４の異なるポリペプチド配列を有するライブラリ。
【請求項３９】
複数の請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチドを含んでなり、少なくとも１×１０４の異なる抗体可変ドメイン配列を有するライブラリ。
【請求項４０】
請求項５０又は５１に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項４１】
請求項１ないし３３の何れか一の通りに定義される複数のポリペプチドを有する組成物を生成する方法であり、
(a) ＣＤＲＨ１又はＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３の変異型ＣＤＲの少なくとも一又はそれらの混合を含んでなるポリペプチド
(i) 変異型ＣＤＲＨ３を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を有し、Ｘ１が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝３〜２０であるポリペプチド；
(ii) 変異型ＣＤＲＨ２を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−（Ｘ３）ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を有し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝１〜２であるポリペプチド；と
(iii) 変異型ＣＤＲＨ１を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−（Ｘ２）ｎ−Ｉ
を有し、Ｘ１及び／又はＸ２が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝２〜４であるポリペプチド
を複数生成することを含む方法。
【請求項４２】
(i) 変異型ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３又はそれらの混合を含み、該変異型ＣＤＲが溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に変異を有し、該変異型アミノ酸が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化される複数のポリペプチドを生成する
ことをさらに含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＣＤＲＬ１又はＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の変異型ＣＤＲの少なくとも一又はそれらの混合を含んでなるポリペプチド
(i) 変異型ＣＤＲＬ３を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を有し、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４であるポリペプチド；
(ii) 変異型ＣＤＲＬ２を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を有し、Ｘ１及び／又はＸ２は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるポリペプチド；と
(iii) 変異型ＣＤＲＬ１を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を有し、Ｘ１が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝３〜５であるポリペプチド
を複数生成することを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
(a) 請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し；
(b) 前記組成物から標的抗原に結合するポリペプチド結合体を選別し；
(c) 非結合体からポリペプチド結合体を単離し；
(d) 単離したポリペプチド結合体から所望の親和性を有する結合体を同定する
ことを含む、標的抗原へ結合するポリペプチドの選別方法。
【請求項４５】
(a) 請求項３９に記載の抗体可変ドメインのライブラリに標的抗原を接触させ；
(b) 非結合体から結合体を分離して、標的抗原の結合体を溶出して、そして約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度の減少した量の標的抗原を含む溶液中で結合体をインキュベートし；
(c) 最も低い濃度の標的抗原に結合することができる、約０．１ｎＭ〜２００ｎＭの親和性を有する結合体を選別する
ことを含む、抗体可変ドメインのライブラリから標的抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選別する方法。
【請求項４６】
(a) 請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し；
(b) 非結合体からライブラリ中のポリペプチド結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して結合体豊富なサブ集団を得て；
(c) 場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団を用いて(a)〜(b)の工程を少なくとも二度繰り返す
ことを含む、ポリペプチドのライブラリから標的抗原に結合するポリペプチドを選別する方法。
【請求項４７】
(f) 結合体が混合物を形成するのに適した条件下で０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃縮した標識した標的抗原とともにポリペプチド結合体のサブ集団をインキュベートし；
(g) 標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を前記混合物に接触させ；
(h) 標識した標的抗原に結合したポリペプチド結合体を検出して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を溶出し；
(i) 場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標識標的抗原を用いて、(f)〜(i)の工程を少なくとも二度繰り返す
ことをさらに含む、請求項４６に記載の選別方法。
【請求項４８】
さらに、過剰量の非標識標的抗原を混合物に添加して、十分な時間インキュベートして標識標的抗原から親和性の低い結合体を溶出することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
(a) 請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリに少なくとも約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し；
(b) 標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、ポリペプチド結合体豊富なサブ集団を得て；
(c) 場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて(a)〜(b)の工程を少なくとも二度繰り返して、もっとも低い濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を単離する
ことを含む、標的抗原への高い親和性を有する結合体を単離する方法。
【請求項５０】
(a) 結合に適した条件下にてライブラリに０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度の標識した標的抗原を接触させて、ポリペプチド結合体と標識した標的抗原との複合体を形成させ；
(b) 複合体を単離して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、結合体豊富なサブ集団を得て；
(c) 場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて(a)〜(b)の工程を少なくとも二度繰り返す
ことを含む、請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリからポリペプチド結合体を選別する方法。
【請求項５１】
さらに、ポリペプチド結合体と標的抗原の複合体に過剰な非標識標的抗原を加えることを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
工程を二度繰り返し、第一回目の選別の標的の濃度が約１００ｎＭ〜２５０ｎＭであり、第二回目の選別では約２５ｎＭ〜１００ｎＭであり、第三回目の選別では約０．１ｎＭ〜２５ｎＭである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
(a) ポリペプチドと標的抗原との結合に適した条件下にて、ライブラリの第一試料を濃縮した標的抗原とともにインキュベートし；
(b) 標的抗原なしでライブラリの第二試料をインキュベートし；
(c) ポリペプチドと固定した標的抗原との結合に適した条件下にて、第一及び第二試料のそれぞれと固定した標的抗原とを接触させ；
(d) 各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドを検出し；
(e) 第二試料からの結合ポリペプチドの量に対する第一試料の結合ポリペプチドの量の割合を算出することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を測定する
ことを含む、請求項１ないし２２の何れか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリのスクリーニング方法。
【請求項５４】
(a) ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３からなる群から選択した起源抗体の少なくとも１、２、３、４、５又はすべてのＣＤＲを含む起源抗体のうちの軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、又はその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを構築し；
(b) １０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットを用いて、溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に起源抗体の少なくとも１、２、３、４、５又はすべてのＣＤＲを変異させる
ことを含む方法。
【請求項５５】
変異型ＣＤＲＨ３が、アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を含み、Ｘ１は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝３〜２０である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
変異型ＣＤＲＨ２が、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−(Ｘ３)ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝１〜２である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
変異型ＣＤＲＨ１が、アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−(Ｘ２)ｎ−Ｉ
を含み、Ｘ１及び／又はＸ２が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
変異型ＣＤＲＬ３が、アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を含み、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
変異型ＣＤＲＬ２が、アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を含み、Ｘ１及び／又はＸ２は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
変異型ＣＤＲＬ１が、アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を含み、Ｘ１が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝３〜５である、請求項５４に記載の方法。