【手続補正書】
【提出日】平成19年9月18日(2007.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の選択マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含む第１のベクターを準備するステップであって、
対象のＤＮＡ配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、
隣接制限酵素部位の少なくとも１つは、第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、
隣接制限酵素部位の少なくとも１つは、第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成し、
第１の制限酵素及び第２の制限酵素部位で第１のベクターを消化することによって、第１の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のＤＮＡ配列を含む第１の線状ＤＮＡ断片が生成される、
第１のベクターを準備するステップと；
ｂ）対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第１の選択マーカー遺伝子及び非必須ＤＮＡ配列から識別可能な第２の選択マーカー遺伝子を含む第２のベクターを準備するステップであって、
非必須配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、
第２のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも１つは、第３の制限酵素の部位であり、第３の制限酵素は、第１の制限酵素によって生成される、第１の線状ＤＮＡ断片中の一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、
第２のベクター中の隣接制限部位の少なくとも１つは、第４の制限酵素の部位であり、第４の制限酵素は、第１の制限酵素又は第３の制限酵素によって生成される末端には相補的でないが第２の制限酵素によって生成された末端には連結できる末端を生成し、かつ
第３の制限酵素及び第４の制限酵素で第２のベクターを消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが第２の選択マーカーを含む第２の線状ＤＮＡ断片が生成され、第２の線状ＤＮＡ断片には、第１の線状ＤＮＡ断片が第２の線状ＤＮＡ断片に一定方向で結合するのを可能にする末端が隣接し、
第２の制限酵素及び第４の制限酵素は、平滑末端を生成する、
第２のベクターを提供するステップと；
ｃ）一定方向で結合している第１の線状ＤＮＡ分子及び第２の線状ＤＮＡ分子を含む第３のベクターを任意選択で含む混合物を産生する消化及び任意選択で連結をもたらすのに効果的な条件下において、適当な緩衝液中で、１つ又は複数の制限酵素、及び任意選択でＤＮＡリガーゼを用いて、第１のベクター及び第２のベクター、第１のベクター及び第２の線状ＤＮＡ断片、又は第２のベクター及び第１の線状ＤＮＡ断片を一体にするステップであって、
第２の制限酵素が平滑末端を生成し、かつ、第１の線状ＤＮＡ断片に第１の一本鎖ＤＮＡオーバーハング及び平滑末端が隣接する、
上記一体にするステップと
を含む、ＤＮＡ断片の方向性サブクローニングの方法。
【請求項２】
第１の制限酵素及び第３の制限酵素が同一でない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の制限酵素及び第４の制限酵素が同一でない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の制限酵素がＳｇｆＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第２の制限酵素がＰｍｅＩである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第３の制限酵素が３’ＴＡオーバーハングを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第３の制限酵素がＰｖｕＩ又はＰａｃＩである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第３のベクターが、対象のアミノ酸配列の発現に適している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
連結及び一定方向での接合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の３’末端の５’側にある核酸配列によってコードされているＮ末端融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の５’末端の３’側にある核酸配列によってコードされているＣ末端融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の３’末端及び５’末端のそれぞれ５’側及び３’側にある核酸配列によってコードされている融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列と、一定方向での結合によって生成された置換部位とによってコードされている融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
連結によって、以下の配列、すなわち、
ＡＡＧＧＡＧＣＧＡＴＣＧＣＹＡＴＧ（配列番号６９）又は
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号７０）（配列中、Ｘ１Ｘ２Ｘ３、Ｘ２Ｘ３Ｇ、又はＸ３ＧＣは、終止コドンではないコドンであり、Ｙは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣである）；
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＴＴＴＹ１Ｙ２（配列中、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Ｙ１及びＹ２がそれぞれＡであるか、Ｙ１＝ＡかつＹ２＝Ｇであるか、Ｙ１＝ＧかつＹ２＝Ａである）；又は
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＴＴＴＹ１Ｙ２（配列中、Ｘ１Ｘ２Ｘ３、Ｘ２Ｘ３Ｇ、又はＸ３ＧＴが、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Ｙ２がＡ又はＧである場合にＹ１がＡでないか、或いは、Ｙ２がＡである場合にＹ１がＧでない）
が第３のベクター中に生成される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第２のベクターは、分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片を含む対抗選択可能な遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第１の制限酵素によって切断されたヌクレオチドの５’側に、適切に配置されたリボソーム結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法によって調製された第３のベクターである、組換えベクター。
【請求項１７】
第１の選択マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含むベクターであって、対象のＤＮＡ配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、５’隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ３’ＴＡオーバーハングを生成し、３’隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、平滑末端を生成する、上記ベクター。
【請求項１８】
第１の制限酵素の認識部位を含む方向性クローニング用ベクターであって、第１の制限酵素は、平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成し、
前記ベクターは、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化すると、ベクターバックボーンであって、ＳｇｆＩによって生成された末端及び第３の制限酵素であって、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有しかつ平滑末端を生成する、第３の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片に連結されたときに、前記オープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生する、ベクターバックボーンを産生し、
３’ＴＡオーバーハング及びＳｇｆＩによって生成された末端の連結によって形成された組み換えベクター中の部位が、オープンリーディングフレームの５’側であり、かつ
前記ベクターバックボーンが、前記部位の５’側にあってかつ前記部位の３’側のオープンリーディングフレームとインフレームであるオープンリーディングフレームを、有する場合に、前記ベクターバックボーンが、前記部位の５’にあるオープンリーディングフレームと作用可能に連結されたプロモーターを含む、
上記方向性クローニング用ベクター。
【請求項１９】
第１の制限酵素がＳｇｆＩ又はＰａｃＩである、請求項１７又は１８に記載のベクター系。
【請求項２０】
第２の制限酵素がＰｍｅＩ又はＰｖｕＩである、請求項１７又は１８に記載のベクター系。
【請求項２１】
ＡＡＧＧＡＧＣＧＡＴＣＧＣＸ１ＡＴＧＸ２（配列番号１）（配列中、Ｘ１及びＸ２は個々にＡ、Ｔ、Ｇ又はＣである）を含む、請求項１７又は１８のベクター。
【請求項２２】
第２の制限酵素が、
【化１】
2007508012.tif 000001
である、請求項１７又は１８に記載のベクター。
【請求項２３】
ＳｇｆＩ部位を含むオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２４】
ＳｇｆＩによって切断されたヌクレオチドの５’側にリボソーム結合部位を含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２５】
第２の制限酵素が、
【化２】
2007508012.tif 000002
である、請求項１７又は１８に記載のベクター。
【請求項２６】
第１の制限酵素の認識部位を含むオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１７又は１８に記載のベクター。
【請求項２７】
ラムノース異化作用を欠失しており、かつ異種ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームに作用可能に連結したラムノース誘導プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子を有する組換え宿主細胞を、ラムノース、及び、対象のＤＮＡ配列に作用可能に連結した異種ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む発現ベクターに接触させるステップを含む、対象のＤＮＡ配列の発現を宿主細胞中で誘導する方法。
【請求項２８】
対象のＤＮＡ配列に２つの制限酵素部位が隣接しており、隣接制限酵素部位の１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、別の隣接制限酵素部位は第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片を含むベクターを、原核細胞で構成的に発現されるプロモーターからバルスターを発現する組換え宿主細胞中に導入するステップを含む方法。
【請求項３０】
複数の組換えベクターを含む支持体であって、前記組換えベクターのうち２つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも１つの組換えベクターが、プロモーターと、２つの置換部位が隣接した第１のオープンリーディングフレームとを含み、
平滑末端を生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側に前記プロモーターを含むベクターであって、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化されたベクターと、
ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接した第１のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する、ＤＮＡ配列と
を連結することによって置換部位が形成される支持体。
【請求項３１】
前記ベクターが、プロモーターの３’側に、第１の制限酵素の認識部位を含む第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、第２のオープンリーディングフレームは、第１のオープンリーディングフレームに連結された際に、融合ペプチド又はタンパク質をコードする第３のオープンリーディングフレームを形成する、請求項３０に記載の支持体。
【請求項３２】
連結によって、以下の配列の一つ、すなわち、
ＡＡＧＧＡＧＣＧＡＴＣＧＣＹＡＴＧ、又は
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧ（配列中、Ｘ１Ｘ２Ｘ３、Ｘ２Ｘ３Ｇ、又はＸ３ＧＣは、終止コドンではないコドンであり、ＹはＡ、Ｔ、Ｇ又はＣである）；
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＴＴＴＹ１Ｙ２（配列中、Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Ｙ１及びＹ２がそれぞれＡであるか、Ｙ１＝ＡかつＹ２＝Ｇであるか、Ｙ１＝ＧかつＹ２＝Ａである）；
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＴＴＴＹ１Ｙ２（配列中、Ｘ１Ｘ２Ｘ３、Ｘ２Ｘ３Ｇ、又はＸ３ＧＴは、オープンリーディングフレーム中の、終止コドンではないコドンであり、Ｙ２がＡ又はＧである場合にＹ１がＡでないか、或いはＹ２がＡである場合にＹ１がＧでない）
が組換えベクター中に生成される、請求項３０に記載の支持体。
【請求項３３】
平滑末端を生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側にＳｇｆＩ認識部位を含むベクターをＳｇｆＩ及び第１の制限酵素で消化すること、並びに、３’ＴＡオーバーハングを生成する第２の制限酵素によって生成された末端及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片に、消化されたベクターを連結することによって調製された組換えベクターであって、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する組換えベクター。
【請求項３４】
複数の組換えベクターを含む支持体であって、前記組換えベクターのうち１つ又は複数が、異なるオープンリーディングフレームを含み、平滑末端を生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側にＳｇｆＩ認識部位を含むベクターをＳｇｆＩ及び第１の制限酵素で消化すること、並びに、３’ＴＡオーバーハングを生成する第２の制限酵素によって生成された末端及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片に、消化されたベクターを連結することによって各組換えベクターが調製され、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する支持体。
【請求項３５】
前記支持体がマルチウェルプレートであり、その各ウェルが、任意選択で、それぞれ異なった組換えベクターを含む、請求項３４に記載の支持体。
【請求項３６】
前記異なるオープンリーディングフレームが、選択されたオープンリーディングフレームのヌクレオチド置換を有するオープンリーディングフレームを含み、前記異なるオープンリーディングフレームが、選択されたオープンリーディングフレームへの変異導入によって調製される、請求項３４に記載の支持体。
【請求項３７】
ａ）複数の組換えベクター又は組換えベクターを含む組換え細胞を選択するステップであって、前記組換えベクターのうち２つ以上が異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも１つの組換えベクターが、プロモーター、及び、２つの置換部位が隣接した第１のオープンリーディングフレームを含み、
平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側にある、前記プロモーターを含むベクターであって、そのベクターは、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化される上記ベクターと、
ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接した第１のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する上記ＤＮＡ配列と
を連結することによって置換部位が形成される、ステップ、並びに、
ｂ）選択された組換えベクター又は組換え細胞を前記支持体の１つ又は複数の容器内に導入するステップ
を含む、複数の組換えベクター又は組換え細胞を含む支持体を調製する方法。
【請求項３８】
ａ）複数の組換えベクター又は組換えベクターを含む組換え細胞を選択するステップであって、前記組換えベクターのうち２つ以上が異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも１つの組換えベクターが、プロモーター、及び、２つの置換部位が隣接した第１のオープンリーディングフレームを含み、
平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側にある、ＳｇｆＩである第１の制限酵素の認識部位の５’側にある、前記プロモーターを含むベクターであって、そのベクターは、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化される上記ベクターと、
ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接した第１のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する上記ＤＮＡは配列と
を連結することによって置換部位が形成される、ステップ、並びに、
ｂ）選択された組換えベクター又は組換え細胞を前記支持体の１つ又は複数の容器内に導入するステップ
を含む、複数の組換えベクター又は組換え細胞を含む支持体を調製する方法。
【請求項３９】
ａ）ＳｇｆＩ認識部位及び第１の制限酵素の部位が隣接した複数の変異型オープンリーディングフレームを含むＤＮＡを準備するステップであって、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するステップと、
ｂ）ＳｇｆＩ及び第１の制限酵素で前記ＤＮＡを消化し、プロモーターを含むベクターに、消化されたＤＮＡを連結して、複数の変異型組換えベクターを産生するステップであって、前記プロモーターは、平滑末端を生成する第３の制限酵素の認識部位の５’側にある３’ＴＡオーバーハングを生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側にあり、前記ベクターが第２の制限酵素及び第３の制限酵素で消化されるステップと
を含む、複数の変異型組換えベクターを調製する方法。
【請求項４０】
ａ）３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素によって生成される末端、及び第２の制限酵素の部位が隣接した、複数の変異型オープンリーディングフレームを含むＤＮＡを準備するステップであって、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する、ＤＮＡを準備するステップと、
ｂ）第１の制限酵素及び第２の制限酵素でＤＮＡを消化して、消化されたＤＮＡを、平滑末端を生成する第４の制限酵素の認識部位の５’側にあるＳｇｆＩである第３の制限酵素の認識部位の５’側にあるプロモーターを含むベクターであって、そのベクターが第３及び第４の制限酵素で消化される、上記ベクターに連結して、複数の変異型組換えベクターを産生するステップと
を含む、複数の変異型組換えベクターを調製する方法。
【請求項４１】
第１の制限酵素がＰｍｅＩである、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えベクターのうち２つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも１つの組換えベクターが、プロモーターと、２つの置換部位が隣接した第１のオープンリーディングフレームとを含み、
平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側に前記プロモーターを含むベクターであって、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化されたベクターと、
ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接した第１のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するＤＮＡ配列と
を連結することによって置換部位が形成される、ライブラリー。
【請求項４３】
組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えベクターの複数が、選択されたオープンリーディングフレームの変異型オープンリーディングフレームを含む変異型組換えベクターを含み、少なくとも１つの変異型組換えベクターが、プロモーターと、２つの置換部位が隣接した変異型オープンリーディングフレームとを含み、
平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側に前記プロモーターを含むベクターであって、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化されたベクターと、
ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接した変異型オープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するＤＮＡ配列と
を連結することによって置換部位が形成されるライブラリー。
【請求項４４】
少なくとも２つの異なる制限酵素の認識部位を少なくとも２つ、オープンリーディングフレームの両端に導入する方法であって、
ａ）それぞれがオープンリーディングフレームを含む１つ又は複数の核酸配列を準備するステップと；
ｂ）各核酸配列を、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドで増幅して、前記１対のオリゴヌクレオチド中の配列を含む増幅された核酸を産生するステップであって、前記１対のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のオープンリーディングフレームにある配列にアニールする配列を有し、前記１対のオリゴヌクレオチドのうち一方の配列に対応する増幅された核酸の配列は、前記オープンリーディングフレームにアニールする配列の５’側にＳｇｆＩの制限酵素部位を含み、前記１対のオリゴヌクレオチドのもう一方の配列に対応する増幅された核酸の配列は、第１の制限酵素の制限酵素部位を含み、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、第１の制限酵素部位は、前記オープンリーディングフレームにアニールする配列の３’側にあり、前記オリゴヌクレオチドの配列に対応する増幅された核酸の配列がＳｇｆＩ及び第１の制限酵素で消化できるステップと
を含む方法。
【請求項４５】
増幅された核酸の３’末端にアデニンを付加して、修飾された増幅核酸断片を産生することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
２つの置換部位が隣接したオープンリーディングフレームを、前記少なくとも１つの組換えベクターが含み、
平滑末端を生成する制限酵素の認識部位の３’に第４の制限酵素及び第５の制限酵素の認識部位を含む組換えベクターであって、第４の制限酵素は、３’ＴＡオーバーハングを生成し、かつ、第１の制限酵素とは異なり、第５の制限酵素は平滑末端を生成し、第４の制限酵素及び第５の制限酵素によって、消化された組換えベクターと、
ＳｇｆＩによって生成された末端及び第６の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームをさらに含むＤＮＡ配列であって、第６の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するＤＮＡ配列と
を連結することによって置換部位が形成される、請求項４２又は４３に記載のライブラリー。