(57)【要約】【課題】  【解決手段】  本発明は、RSウィルス感染治療用化合物及びその調製方法と用途を開示する。前記化合物は、シクロパミンの類縁物質であり、気道RSウィルス複製を抑制する特性を有するが、Hedgehog信号チャネルを抑制する特性をゆうしていない。前記製作方法は、薬物化学合成を通じて、シクロパミンの類縁物質を合成し、並行して実施する二つの対外試験を通じて類縁物質を選別する。前記化合物は、気道のウイルス感染症、パラミクソウイルス感染症、気道RSウィルス感染症、気道RSウィルスによって引き起こされる細気管支炎、気道RSウィルスによって引き起こされる肺炎、気道RSウィルスによって引き起こされる中耳炎の治療に使用することができ、胎児奇形を引き起こす毒性・副作用を有せしないので、シクロパミンの催奇形性特性を克服し、気道RSウィルス感染症の治療薬、特に小児科薬物の空白を埋めることになった。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
前記化合物がシクロパミンの類縁物質であり、気道RSウィルス複製を抑制する特性を有するが、Hedgehog信号チャネルを抑制する特性をゆうしていないことを特徴とする一種のRSウィルス感染治療用化合物。
【請求項２】
前記化合物が一種の新しい化学成分であり、気道RSウィルス複製を抑制する特性を有するが、Hedgehog信号チャネルを抑制する特性を有していいないすべての可能なシクロパミンの類縁物質を含むことを特徴とする請求項1に記載の一種の治療気道RSウィルス感染中の化合物。（S1-2とS1-4はその中の二つの実例である。その中で、前記シクロパミンの類縁物質が公開番号CN101631463Aの中国特許において披露されたシクロパミンの類縁物質を含む。又は、前記シクロパミン及び類縁物質が、式IIで示すような構造を有する化合物を有する。
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式の中で、R1 が、H、OH、アルキル基、アミノ基、スルフェンアミド基、スルホンアミド基、-OC(O)R5、-N(R5)C(O)R5又は糖鎖である。
R2 が、 H、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、ニトリル又は複素環アルキル基である。
R3 が、 H、アルキル基、アルケニル基又はアルキン基である。
R4 が、 H、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、複素環アルキル基、アラルキル基、複素アリール基、複素アラルキル基、ハロゲン化アルキル基、-OR5、-C(O)R5、-CO2R5、-SO2R5、-C(O)N(R5)(R5)、-[C(R)2]q-R5、-[(W)-N(R)C(O)]qR5 、-[(W)-C(O)]qR5 、-[(W)-C(O)O]qR5、-[(W)-OC(O)]qR5 、-[(W)-SO2]qR5 、-[(W)-N(R5)SO2]qR5 、-[(W)-C(O)N(R5)]qR5 、-[(W)-O]qR5 、-[(W)-N(R)]qR5、-W-NR53+X-又は-[(W)-S]qR5である。
その中で、Wが 各自に独立的な二価アルキル基であり、
Rが 各自に独立的なH 又はアルキル基であり、
q が 各自に独立的な1、2、3、4、5 又は6であり、
X-がハロゲンであり、
R5が 各自に独立的なH 、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、複素環アルキル基、アラルキル基、複素アリール基、複素アラルキル基又は-[C(R)2]p-R6である。その中で、pが0-6である。又は同じ置換基上の任意の二つのR5が共同に0-3個のヘテロ原子を含む 4-8 員環 の任意の置換環を形成でき、 前記ヘテロ原子がN、O、S 又はPの中の何れかである。R6 が各自に独立的なヒドロキシ基、-N(R)COR、-N(R)C(O)OR、-N(R)SO2(R)、-C(O)N(R)2、-OC(O)N(R)(R)、-SO2N(R)(R)、-N(R)(R)、-COOR、-C(O)N(OH)(R)、-OS(O)2OR、-S(O)2OR、-OP(O)(OR)(OR)、-NP(O)(OR)(OR)又は-P(O)(OR)(OR)である。
その他の好ましい実施例において、前記式II の中で、R1が、OH、H、置換された又は置換されていないC1-C3 アルキル基の中の何れかである。
R2 が、置換された又は置換されていないC1-C3 アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである。
R3 が、置換された又は置換されていないC1-C3 アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである。
R4 が、置換された又は置換されていないC1-C3 アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである。
その中で、前記の置換が、炭化水素基上の一つ又は複数の水素原子が、次のグループの中の何れかの置換基によって置換されたことを指す：C1〜C10 アルキル基、C3〜C10 環状アルキル基、C1〜C10アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、C1〜C10カルボニル基、C1〜C10 アミド基、C2〜C10 エステル基、C6〜C30 アリール基、ハロゲン原子、シアン基とチオエーテル基。
その他の好ましい実施例において、前記R1 がOHであり、前記R2 がメチル基であり、前記R3がメチル基であり、前記R4がメチル基である。
前記S1-2の構造が式IIIで示すように、前記式II の中で、R1とR4を置換することによって生成された。
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2019501866.tif 000011
前記S1-4の構造が、式IVで示すように、前記式II の中で、R1とR4を置換することによって生成された
前記S1-2と前記S1-4との構造上の差異点が、異なるラジカルでII の中のR1を置換したことである。
【請求項３】
前記製作方法において、薬物化学合成を通じて、シクロパミンの類縁物質を合成し、それに加えて、並行して実施する二つの対外試験を通じて類縁物質を選別する。並行して実施する前記二つの対外試験が下記の通り、即ち、（1）細胞に基づく一種の実験、即ち、気道RSウィルスの感受性細胞における複製能力を測定する実験及び（2）細胞に基づく一種の実験、即ち、一種の分子によるsonic hedgehog経路抑制のレベルを測定する実験（当該種類の抑制効果が、SAGによって誘導されるSmo依存性遺伝子転写事件に対する当該分子の妨害レベルに表れる）であることを特徴とする一種のRSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項４】
前記製作方法が、下記の手順、即ち、
１）化合物の合成と
２）化合物の選別を含むことを特徴とする請求項3に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項５】
前記化合物合成のステップが二つのサブステップ、即ち、
１）中間物の製作と
２）化合物の製作を含むことを特徴とする請求項3又は4に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項６】
前記化合物選別のステップが四つのサブステップ、即ち、
１）化合物による気道RSウィルス複製に対する抑制作用をテストすること、
２）化合物によるHn信号チャネルに対する抑制作用をテストすること、
３）気道RSウィルス複製とHh活性抑制係数を計算すること及び
４）化合物を選別することを含むことを特徴とする請求項3又は4に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項７】
前記材料中間物の製作プロセスが下記の通り、即ち、一つ目が、シクロパミンとトリエチルアミンを、乾いたジクロロメタンDCMに溶解することである。二つ目が、0℃の条件の下で、DCMに溶けたトリフルオロ酢酸無水物を、溶液に入れることである。三つ目が、反応混合物を15℃までゆっくり加熱し、それに加えて、16h持続的にかき混ぜることである。四つ目が、液体クロマトグラフィー法-質量スペクトル法で、出発原料が完全に消耗し尽くしたのを確認することである。五つ目が、反応混合物を濃縮し、それに加えて、メタノールで残渣を希釈することである。六つ目が、得た懸濁液を70℃まで加熱してから1h保温することである。七つ目が、反応混合物を15℃まで冷却することである。最後のステップが、濾過することによって、白色の固体の中間物を得ることであることを特徴とする請求項3、4又は5に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項８】
前記化合物の製作プロセスが下記の通り、即ち、一つ目が、中間物とトリエチルアミンを、DCMに溶解してから氷浴で冷却することである。二つ目が、DCMに溶けたイソシアネート基エタンを、溶液に入れることである。三つ目が、45℃の条件の下で、反応混合物を48 hかき混ぜることである。四つ目が、薄層クロマトグラフィー法で、出発原料がすでに完全に消耗し尽くしたのを確認することである。五つ目が、反応物を真空環境の下で濃縮することである。六つ目が、メタノールで残渣を洗浄することである。七つ目が、濾過することによって、白色の固体の化合物を得ることであることを特徴とする請求項3、4又は5に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項９】
前記テスト対象化合物による気道RSウィルス複製に対する抑制作用が下記のプロセス、即ち、一つ目が、ヒト気道RSウィルスLong株とHEp-2細胞を採用して感染実験を行うことである。二つ目が、HEp-2細胞にDMEM培地を使用し、それに加えて、ペニシリン/ストレプトマイシン及び10%胎児ウシ血清FBSを加えた後、37℃、5% CO2の環境の下で細胞を培養することである。三つ目が、Hep-2細胞の中で、ウイルスの継代培養を行い、胎児ウシ血清の濃度が2%であり、前記と異なることを除いて、その培養条件を前記正常細胞と同じにすることである。四つ目が、ウイルス種を製作する際に、単層Hep-2細胞に対して低感染複数MOIの方式で感染を行い、MOI=0.1にし、二三日培養した後、細胞及びウイルスを含有する上澄み液を、-80℃の条件の下に置いて十分な冷凍を行い、それに加えて、室温の下で十分に溶解することによって、ウイルス培養物を十分に釈放させることである。五つ目が、前記ウイルス培養物を、4℃の条件の下で、2000 × gの回転速度で10分間遠心してから、上澄み液を均質化して個別包装した後、-20℃の環境の下で貯蔵することである。六つ目が、スポット形成試験を通じて、更にスポット低減の程度化合物の潜在的な抗ヒト気道RSウィルスの効力を評価し、スポット計数の時に、スポット数が50-100である穴で計数を行うことである。その上、化合物に対するテストについて、4℃の条件の下で、ウイルス吸着段階の化合物を1時間処理することによって、ウイルス侵入プロセス中における化合物の作用を分析することができる。更に、37℃の条件の下で、ウイルス吸着後の段階における化合物を72時間処理することによって、ウイルス複製プロセス中における化合物の作用を分析することができる。その上、ウイルス感染の全プロセスの段階において、化合物処理を行うことによって、ウイルス感染全プロセス中における化合物の作用を分析することができる。50%ウイルスの複製を抑制する効き目を達成する化合物の濃度（IC50）の計算について、スポット計数又はスポット寸法測定を行い、それに加えて、Graphpad prismソフトウェアの助けを借りて非線形特性回帰分析で確定することである。七つ目が、化合物中の細胞毒性を評価する時に、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay試薬キットを使用し、それに加えて、試薬キットの取扱説明によって、前記試験条件における検査待ち化合物による細胞活力に対する影響を分析することであるという七つのプロセスを含むことを特徴とする請求項3、4又は6に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項１０】
前記テスト対象化合物によるHn信号チャネルに対する抑制作用が下記のプロセス、即ち、一つ目が、一日前もってNIH3T3細胞を、6穴板又は12穴板に接種し、5%胎児ウシ血清を含有しているが、抗生物質を含有していないDMEM培地で培養することによって、トランスフェクション時に90-95%の合流を達成するのを確保することである。二つ目が、血清がない培地で希釈されたリポソーム2000と希釈された後のプラスミドを均一に混ぜ、且つ、孵化してから、これを、細胞と培地を含有する穴に入れた後、オリフィス板を、CO2インキュベータに置き、37℃条件の下で48h孵化することである。三つ目が、トランスフェクション48h後、濃度が0.5uMに達するまでSAGを加えると同時に、各種の濃度のシクロパミン類縁物質を加えることである。四つ目が、引き続き48h培養した後、細胞を洗浄し、クラッキングを行なってから、一つの96穴のブランク板に移すことである。五つ目が、LAR II試薬を加え、それに加えて、発光リーダーでサンプルの数値を読み取ることである。その上、Hh信号チャネル抑制試験において、入れるシクロパミン類縁物質が、前記抗気道RSウィルス複製試験から選定された類縁物質であり、即ち、気道RSウィルス複製を有効に抑制できるシクロパミン類縁物質である。Hh信号チャネル抑制試験を通じて、これらの類縁物質によるSAGによって誘導されるSmo依存性遺伝子表現に対する抑制効果、即ち、シクロパミンと類似する作用効果をテストし、これらの抑制レベルの高さを分析することであるという五つのプロセスを含むことを特徴とする請求項3、4又は6に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項１１】
前記化合物選別のステップを、化合物の抑制係数によって実施すること。化合物の抑制係数が1を上回る場合、この化合物を選定し、化合物の抑制係数が1を下回る場合、この化合物を削除することであることを特徴とする請求項3、4又は6に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項１２】
前記化合物が、気道のウイルス感染症による疾病の治療に使用することができ、それに加えて、患者の毒性と 副作用を引き起こさないことを特徴とする一種のRSウィルス感染治療用化合物の用途。
【請求項１３】
前記化合物が気道のウイルス感染症、パラミクソウイルス感染症、気道RSウィルス感染症、気道RSウィルスによって引き起こされる細気管支炎、気道RSウィルスによって引き起こされる肺炎及び気道RSウィルスによって引き起こされる中耳炎の治療に使用することができることを特徴とする請求項12に記載の一種の治療気道RSウィルス感染中の化合物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬技術分野に係り、具体に一種の気道RSウィルス感染治療用化合物及びその製作方法と用途に係る。
【背景技術】
【０００２】
細気管支炎は、一種の厳重な下気道感染症であり、主にパラミクソウイルスにより引き起こされる。ヒト気道RSウィルス（Human respiratory syncytial virus ，hRSV）は、2歳以下の子供、高齢者、免疫力が弱い者と移植患者の発症を引き起こす主要な原因である。いままで、hRSVの感染を予防・治療するワクチン又は批准された有効的な薬物がない。免疫性薬物Palivizumab （パリビズマブ）単クローン抗体は、ハイリスク患者用薬物として批准された。これらの患者は、早産児と原発性疾病に罹る乳幼児だけを含む。広域抗ウイルス薬リバビリン(Ribavirin)小分子は、感染治療に使用できるが、十分に大きな副作用があり、それに加えて、治療効果が不十分である。過去十年間で、hRSVの細胞侵襲及び複製段階を対象とする候補薬物は、すでに臨床前又は臨床開発段階に発展した。
【０００３】
hRSVのゲノムRNA（vRNA）は、ウイルス郵便小包（N）によって包まれて一つのN:RNA化合物を形成した。これは、ヌクレオカプシド と称される。 RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）は、当該種類のリボース核蛋白質複合体を、伝令リボ核酸 （mRNA）の転写及びゲノム又はアンチゲノムのリボ核酸RNAの複製の為のテンプレートとする。RdRpは、二つの主なウイルスタンパク質、即ち、リン酸化タンパク質PとポリメラーゼLから構成される。ポリメラーゼLを核蛋白質Nと結合させ、それに加えて、ポリメラーゼLをvRNAと結合させる。このプロセスにおいて、RdRp複合体におけるリン酸化タンパク質Pは、ポリメラーゼLに欠くことができない補助因子である。ウイルスのライフサイクルにおいて、RdRpは、RNAを高効率に処理できる。その一方で、M2-1とM2-2は、RdRpの二つの補助因子である。M2-1は、一つの 四量体転写用伸長因子であり、核心分野を通じて、競争の方式で、RNA及びリン酸化タンパク質Pと結びつく。M2-1は、抗転写終結因子であり、遺伝子内及び遺伝子間の転写の中途終結を防止する。体外実験は、M2-1が積極的なウイルス遺伝子端末（gene end 、GE）とポリアデニル（poly-A）配列と優先に結びつくことを表明したが、M2-1が転写効率を向上する確実な仕組みは、まだ完全に分かっていない。
【０００４】
最近に、シクロパミン（cyclopamine、CPM）とバイケイソウのアルカロイド（ジェルヴィン）は、hRSVin vitro複製における効率的且つ特異的な抑制剤として確定された。CPMは、一種のsmoothened蛋白（SMO）受容体遮断薬であり、 SMOは、Sonic Hedgehog信号チャネル（Sonic hedgehog signaling pathway ，Shhp）の7-膜貫通受容体である。Sonic Hedgehog信号チャネル（Shhp）は、胚発育、細胞分化と癌発生プロセス中に役割を果たす。シクロパミンは、一種の自然に発生する化学物質であり、ステロイドに属するバイケイソウのウアルカロイド類である。トウモロコシユリ（カリフォルニアのバイケイソウ）から分離された催奇形性薬剤であり、致命的な先天性欠陥を引き起こすことができ、 胎児患者の前脳の脳裂無し奇形及び独眼奇形を引き起こすことができる。シクロパミン化合物が、前記悪い結果を引き起こすことは、Hedgehog信号チャネル（Hh）に対する抑制を通じて実現する。
【０００５】
シクロパミンの催奇形性特性により、大きな程度で、hRSV感染治療用小児科薬物として開発することを妨げる。これらの特性は、治療を受ける患者に重篤な副反応が発生する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
シクロパミンの催奇形性特性を克服し、気道RSウィルス（RSV）感染症治療薬物、特に小児科薬物の空白を埋める為に、本発明は、一種のRSウィルス感染治療用化合物及びその製作方法と用途を提供する。前記化合物は、気道RSウィルス複製を特異に抑制できると同時に、Hedgehog(Hh)信号チャネルを抑制する特性を有していいないので、気道RSウィルス感染症を治療すると同時に、シクロパミンの催奇形性特性を取り除く目的を達成できる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成する為に、本発明は、下記の技術案を採用する。
【０００８】
一種のRSウィルス感染治療用化合物であり、前記化合物がシクロパミンの類縁物質であり、気道RSウィルス複製を抑制する特性を有するが、Hedgehog信号チャネルを抑制する特性をゆうしていない。
【０００９】
前記化合物は、一種の新しい化学成分であり、S1-2とS1-4、及び気道RSウィルス複製を抑制する特性を有するが、Hedgehog信号チャネルを抑制する特性を有していいないすべての可能なシクロパミンの類縁物質を含む。
【００１０】
公開番号CN101631463Aの中国特許においてシリーズのシクロパミン及びその類縁物質の構造を公開した。このような構造上類縁物質は、米国特許出願US20080293754 A1にも記載されている。
【００１１】
一種の典型的なシクロパミン構造は、式1の通りである。
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【００１２】
その他の好ましい実施例において、前記シクロパミンの類縁物質の構造は、式1の通りである。
2019501866.tif 000004
【００１３】
式の中で、R1 が、H、アルキル基、アミノ基、スルフェンアミド基、スルホンアミド基、-OC(O)R5、-N(R5)C(O)R5又は糖鎖である。
【００１４】
R2 が、 H、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、ニトリル基又は複素環アルキル基である。又はR1とR2が共同に＝O、＝S、＝N(R)、＝N(NR2)又は＝C(R)2を形成する。
【００１５】
R3 が、 H、アルキル基、アルケニル基又はアルキン基である。
【００１６】
R4 が、 H、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、複素環アルキル基、アラルキル基、複素アリール基、複素アラルキル基、ハロゲン化アルキル基、-OR5、-C(O)R5、-CO2R5、-SO2R5、-C(O)N(R5)(R5)、-[C(R)2]q-R5、-[(W)-N(R)C(O)]qR5 、-[(W)-C(O)]qR5 、-[(W)-C(O)O]qR5 、-[(W)-OC(O)]qR5 、-[(W)-SO2]qR5 、-[(W)-N(R5)SO2]qR5 、-[(W)-C(O)N(R5)]qR5 、-[(W)-O]qR5 、-[(W)-N(R)]qR5、-W-NR53+X-又は-[(W)-S]qR5である。
【００１７】
その中で、Wが 各自に独立的な二価アルキル基であり、
【００１８】
Rが 各自に独立的なH 又はアルキル基であり、
【００１９】
q が 各自に独立的な1、2、3、4、5 又は6であり、
【００２０】
X-がハロゲンである。
【００２１】
R5が 各自に独立的なH 、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、複素環アルキル基、アラルキル基、複素アリール基、複素アラルキル基又は-[C(R)2]p-R6である。その中で、pが0-6である。又は同じ置換基上の任意の二つのR5が 共同に0-3個のヘテロ原子を含む 4-8 員環 の任意の置換環を形成でき、 前記ヘテロ原子がN、O、S 又はPの中の何れかである。R6 が各自に独立的なヒドロキシ基、-N(R)COR、- N(R)C(O)OR、-N(R)SO2(R)、-C(O)N(R)2、-OC(O)N(R)(R)、-SO2N(R)(R)、-N(R)(R)、-COOR、-C(O)N(OH)(R)、-OS(O)2OR、-S(O)2OR、-OP(O)(OR)(OR)、-NP(O)(OR)(OR)又は-P(O)(OR)(OR)である。制限条件としては、R2、R3 とR4 がH である場合、R1 がヒドロキシ基又は糖鎖ではないことである。もう一つの制限条件としては、R4 がヒドロキシである場合、R1 が糖鎖又はヒドロキシ基ではないことである。もう一つの制限条件としては、R4 がヒドロキシである場合、R1とR2が共にC＝Oではないことである。
【００２２】
その他の好ましい実施例において、前記シクロパミン及び類縁物質が、式IIのような構造を有する化合物を有する。
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【００２３】
式の中で、R1 が、H、OH、アルキル基、アミノ基、スルフェンアミド基、スルホンアミド基、-OC(O)R5、-N(R5)C(O)R5又は糖鎖である。
【００２４】
R2 が、 H、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、ニトリル基又は複素環アルキル基である。
【００２５】
R3 が、 H、アルキル基、アルケニル基又はアルキン基である。
【００２６】
R4 が、 H、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、複素環アルキル基、アラルキル基、複素アリール基、複素アラルキル基、ハロゲン化アルキル基、-OR5、-C(O)R5、-CO2R5、-SO2R5、-C(O)N(R5)(R5)、-[C(R)2]q-R5、-[(W)-N(R)C(O)]qR5 、-[(W)-C(O)]qR5 、-[(W)-C(O)O]qR5、-[(W)-OC(O)]qR5 、-[(W)-SO2]qR5 、-[(W)-N(R5)SO2]qR5 、-[(W)-C(O)N(R5)]qR5 、-[(W)-O]qR5 、-[(W)-N(R)]qR5、-W-NR53+X-又は-[(W)-S]qR5である。
【００２７】
その中で、Wが 各自に独立的な二価アルキル基であり、
【００２８】
Rが 各自に独立的なH 又はアルキル基であり、
【００２９】
q が 各自に独立的な1、2、3、4、5 又は6であり、
【００３０】
X-がハロゲンである。
【００３１】
R5が 各自に独立的なH 、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、複素環アルキル基、アラルキル基、複素アリール基、複素アラルキル基又は-[C(R)2]p-R6である。その中で、pが0-6である。又は同じ置換基上の任意の二つのR5が共同に0-3個のヘテロ原子を含む 4-8 員環 の任意の置換環を形成でき、 前記ヘテロ原子がN、O、S 又はPの中の何れかである。R6 が各自に独立的なヒドロキシ基、-N(R)COR、-N(R)C(O)OR、-N(R)SO2(R)、-C(O)N(R)2、-OC(O)N(R)(R)、-SO2N(R)(R)、-N(R)(R)、-COOR、-C(O)N(OH)(R)、-OS(O)2OR、-S(O)2OR、-OP(O)(OR)(OR)、-NP(O)(OR)(OR)又は-P(O)(OR)(OR)である。
【００３２】
その他の好ましい実施例において、前記式II の中で、R1が、OH、H、置換された又は置換されていないC1-C3 アルキル基の中の何れかである。
【００３３】
R2 が、置換された又は置換されていないC1-C3 アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである。
【００３４】
R3 が、置換された又は置換されていないC1-C3 アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである。
【００３５】
R4 が、置換された又は置換されていないC1-C3 アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである。
【００３６】
その中で、前記の置換が、炭化水素基上の一つ又は複数の水素原子が、次のグループの中の何れかの置換基によって置換されたことを指す。C1〜C10 アルキル基、C3〜C10 環状アルキル基、C1〜C10アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、C1〜C10カルボニル基、C1〜C10 アミド基、C2〜C10 エステル基、C6〜C30 アリール基、ハロゲン原子、シアン基とチオエーテル基。
【００３７】
その他の好ましい実施例において、前記R1 がOHであり、前記R2 がメチル基であり、前記R3がメチル基であり、前記R4がメチル基である。
【００３８】
前記S1-2の構造が式IIIで示すように、前記式II の中で、R1とR4を置換することによって生成された。
【００３９】
前記S1-4の構造が、式IVで示すように、前記式II の中で、R1とR4を置換することによって生成された。
【００４０】
前記S1-2と前記S1-4との構造上の差異点が、異なるラジカルでIIの中のR1を置換したことである。
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【００４１】
一種のRSウィルス感染治療用化合物の製作方法であり、前記製作方法において、薬物化学合成を通じて、シクロパミンの類縁物質を合成し、それに加えて、並行して実施する二つの対外試験を通じて類縁物質を選別する。並行して実施する前記二つの対外試験が下記の通り、即ち、（1）細胞に基づく一種の実験、即ち、感受性細胞におけるRSV複製能力を測定する実験及び（2）細胞に基づく一種の実験、即ち、一種の分子によるsonic hedgehog (Hh)経路の抑制レベルを測定する実験である（当該種類の抑制効果が、SAGによって誘導されるSmo依存性遺伝子転写事件に対する当該分子の妨害レベルに表れる）。
【００４２】
一種のRSウィルス感染治療用化合物の製作方法であり、前記製作方法が、下記の手順、即ち、
【００４３】
１）化合物の合成と
【００４４】
２）化合物の選別を含む
【００４５】
前記化合物合成のステップが二つのサブステップ、即ち、
【００４６】
１）中間物の製作と
【００４７】
２）化合物の製作を含む
【００４８】
前記化合物選別のステップが四つのサブステップ、即ち、
【００４９】
１）化合物による気道RSウィルス複製に対する抑制作用をテストすること、
【００５０】
２）化合物によるHn信号チャネルに対する抑制作用をテストすること、
【００５１】
３）気道RSウィルス複製とHh活性抑制係数を計算すること及び
【００５２】
４）化合物の選別を含む
【００５３】
前記中間物の製作プロセスが下記を含む。一つ目が、シクロパミンとトリエチルアミンを、乾いたジクロロメタンDCMに溶解することである。二つ目が、0℃の条件の下で、DCMに溶けたトリフルオロ酢酸無水物（TFAA）を、溶液に入れることである。三つ目が、反応混合物を15℃までゆっくり加熱し、それに加えて、16h持続にかき混ぜること。四つ目が、液体クロマトグラフィー法-質量スペクトル法（LCMS）で、出発原料が完全に消耗し尽くしたのを確認することである。五つ目が、反応混合物を濃縮し、それに加えて、メタノールで残渣を希釈することである。六つ目が、得た懸濁液を70℃まで加熱してから1h保温することである。七つ目が、反応混合物を15℃まで冷却することである。最後のステップが、濾過することによって、白色の固体の中間物を得ることである
【００５４】
前記化合物の製作プロセスが下記を含む。一つ目が、中間物とトリエチルアミンを、DCMに溶解してから氷浴で冷却することである。二つ目が、DCMに溶けたイソシアネート基エタンを、溶液に入れることである。三つ目が、45℃の条件の下で、反応混合物を48 hかき混ぜることである。四つ目が、薄層クロマトグラフィー法（TLC）で、出発原料がすでに完全に消耗し尽くしたのを確認することである。五つ目が、反応物を真空環境の下で濃縮することである。六つ目が、メタノールで残渣を洗浄することである。七つ目が、濾過・収集することによって、白色の固体の化合物を得ることである。
【００５５】
前記テスト対象化合物による気道RSウィルス複製に対する抑制作用が下記のプロセスを含む。一つ目が、ヒト気道RSウィルスLong株（米国モード培養物倉庫-ATCCコード：VR-26）とHEp-2細胞（ATCCコードCCL-23）を採用して感染実験を行うことである。二つ目が、HEp-2細胞にDMEM培地を使用し、それに加えて、ペニシリン/ストレプトマイシン及び10%胎児ウシ血清FBSを加えた後、37℃、5% CO2の環境の下で細胞を培養することである。三つ目が、Hep-2細胞の中で、ウイルスの継代培養を行い、胎児ウシ血清の濃度が2%であり、前記と異なることを除いて、その培養条件を前記正常細胞と同じにすることである。四つ目が、ウイルス種を製作する際に、単層Hep-2細胞に対して低感染複数（MOI）の方式で感染を行い、MOI=0.1にし、二三日培養した後、細胞及びウイルスを含有する上澄み液を、-80℃の条件の下に置いて十分な冷凍を行い、それに加えて、室温の下で十分に溶解することによって、ウイルス培養物を十分に釈放させることである。五つ目が、前記ウイルス培養物を、4℃の条件の下で、2000 × gの回転速度で10分間遠心してから、上澄み液を均質化して個別包装した後、-20℃の環境の下で貯蔵することである。六つ目が、スポット形成試験を通じて、更にスポット低減の程度化合物の潜在的な抗hRSVの効力を評価し、スポット計数の時に、スポット数が50-100である穴で計数を行うことである。その上、化合物に対するテストにおいて、4℃の条件の下で、ウイルス吸着段階用化合物を1時間処理することによって、ウイルス侵入プロセス中における化合物の作用を分析することができる。更に、37℃の条件の下で、ウイルス吸着後の段階用化合物を72時間処理することによって、ウイルス複製プロセス中における化合物の作用を分析することができる。その上、ウイルス感染の全プロセスの段階において、化合物処理を行うことによって、ウイルス感染全プロセス中における化合物の作用を分析することができる。50%ウイルスの複製を抑制する効き目を達成する化合物の濃度（IC50）の計算について、スポット計数（ウイルス吸着段階分析）又はスポット寸法測定（ウイルス複製段階分析）を行い、それに加えて、Graphpad prismソフトウェア（GraphPad Software、米国カリフォルニア州のラホヤ市）の助けを借りて非線形特性回帰分析で確定することである。七つ目が、化合物中の細胞毒性を評価する時に、我々は、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay試薬キットを使用し（米国ウィスコンシン州マディソンのPromega社製）、それに加えて、試薬キットの取扱説明によって、前記試験条件における検査待ち化合物による細胞活力に対する影響を分析することである。
【００５６】
前記テスト対象化合物によるHn信号チャネルに対する抑制作用が下記のプロセスを含む。一つ目が、一日前もってNIH3T3細胞を、6穴板（3×105細胞/穴）又は12穴板（1.5×10105細胞/穴）に接種し、5%胎児ウシ血清を含有しているが、抗生物質を含有していないDMEM培地で培養することによって、トランスフェクション時に90-95%の合流を達成するのを確保することである。二つ目が、血清がない培地で希釈されたリポソーム2000と希釈された後のプラスミドを均一に混ぜ（総容量100-1000ul）、且つ、孵化してから、これを、細胞と培地を含有する穴に入れた後、オリフィス板を、CO2インキュベータに置き、37℃条件の下で48h孵化することである。三つ目が、トランスフェクション48h後、濃度が0.5uMに達するまでSAGを加えると同時に、各種の濃度のシクロパミン（CPM）類縁物質を加えることである。四つ目が、引き続き48h培養した後、細胞を洗浄し、クラッキングを行なってから、一つの96穴のブランク板に移すことである。五つ目が、LAR II試薬（Promega、ダブル・フルオレセイン酵素報告システム、E1910）を入れ、それに加えて、発光リーダーでサンプルの数値を読み取ることである。
【００５７】
その上、Hh信号チャネル抑制試験において、入れるシクロパミン（CPM）類縁物質が、前記抗気道RSウィルス（RSV）試験から選定された類縁物質であり、即ち、気道RSウィルス（RSV）複製を有効に抑制できるシクロパミン（CPM）類縁物質である。Hh信号チャネル抑制試験を通じて、これらの類縁物質によるSAGによって誘導されるSmo依存性遺伝子表現に対する抑制効果、即ち、シクロパミンと類似する作用効果をテストし、これらの抑制レベルの高さを分析することである。
【００５８】
シクロパミン（CPM）類縁物質(cpd)によるHh経路に対する抑制作用と気道RSウィルス（RSV）複製に対する抑制作用との差異を評価する為に、我々は、抑制係数(ICrh)を定義した。
2019501866.tif 000008
【００５９】
前記公式での分母がシクロパミン（CPM）の抑制比であり、即ち、RSV複製に対する抑制能力とHh信号チャネルに対する抑制能力との比であり、分子がCPM類縁物質の抑制比であり、即ち、製作する化合物の抑制比である。前記抑制係数の定義から、下記の事実を得ることができる。測定対象化合物がCPMである場合、抑制係数が1である。測定対象化合物がシクロパミン（CPM）類縁物質である場合、1を下回る係数は、一種の好ましくない抑制特性を表す（例えば、抗気道RSウィルス（RSV）活性が比較に低いが、Hhチャネルに対する抑制性が依然として強いである）。1を上回る係数は、一種の好ましい抑制特性を表す。
【００６０】
前記化合物選別するのサブステップは、抑制係数が1を上回る化合物を選び、抑制係数が1を下回る化合物を濾過して取り、それに加えて、係数が大きい化合物を好ましいものとして選択することを指す。
【００６１】
前記化合物が、気道のウイルス感染症による疾病の治療に使用することができる。具体に下記を含む。気道ウィルス感染症、パラミクソウイルス感染症、気道RSウィルス（RSV）感染症、気道RSウィルスによって引き起こされる細気管支炎、気道RSウィルスによって引き起こされる肺炎、気道RSウィルスによって引き起こされる中耳炎。前記化合物は、胎児奇形を引き起こす毒性・副作用を有しない。
【発明の効果】
【００６２】
本発明利点及び有益効果は、下記の通りである。
【００６３】
１）本発明で提供された化合物が、下記の病気を有効に治療することができること。気道ウィルス感染症、パラミクソウイルス感染症、気道RSウィルス（RSV）感染症、気道RSウィルスによって引き起こされる細気管支炎、気道RSウィルスによって引き起こされる肺炎と気道RSウィルスによって引き起こされる中耳炎。
【００６４】
２）本発明で提供された化合物が、胎児奇形を引き起こす毒性・副作用を有しないこと。
【００６５】
３）本発明で提供された製作方法が、多種のRSウィルス感染治療用化合物を製作でき、それに加えて、製作される化合物が、胎児奇形を引き起こす毒性・副作用を有しないのを保証できること。
【００６６】
４）本発明で提供された製作方法が簡単で実行し易く、材料の源が広範で、製作コストが比較的に低いので、十分に高い経済的価値を有していること。
【００６７】
５）本発明で提供された化合物が、気道RSウィルス感染症の治療薬、特に小児科薬物の空白を埋めることになったので、重大な社会価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明に述べられている製作方法フローの見取り図である。
【図２】本発明に述べられている中間物製作プロセスの見取り図である。
【図３】本発明に述べられている化合物製作プロセスの見取り図である。
【図４】本発明に述べられている化合物による気道RSウィルス（RSV）複製に対する抑制効果である。図によると、気道RSウィルス（RSV）複製測定実験における二種の濃度（2 μm、8 μm）の化合物の効果を監視する。対照群（如何なる化合物を入れていない）における複製率が100%である。シクロパミン（CPM）を入れた場合、複製率が0%である。対照群と比べると、シクロパミン類縁物質s2-6とC2-2 〜C2-4を入れることによって、皆一定の百分比の複製率を抑制できる。
【図５】図5は、本発明に述べられている化合物によるSMO関連抗原誘導遺伝子表現に対する抑制作用を表す。図によると、hedgehog（Hh）信号チャネル試験において、濃度が10μMである各種類の化合物に対して試験を行ったことが分かる。対照群（如何なる化合物を入れていない）における遺伝子表現率が100%である。シクロパミン（CPM）が存在する場合、遺伝子表現が56%まで著しく低減した。シクロパミンの類縁物質S1-2とS1-4による遺伝子表現に対する抑制作用が著しくなく、抑制率がそれぞれ36%と5%である。これらのデータは、下記の原理を表す。シクロパミンから派生するステロイド類アルカロイド分子の抗気道RSウィルス（RSV）活性とSmo依存性Hh信号チャネルに対する抑制活性を分離することができること。
【図６】本発明で提供される各種のシクロパミン(CPM)類縁物質の抑制係数(ICrh)である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６９】
一種のシクロパミン（CPM）類縁物質を製作する。添付図1、添付図2と添付図3を参照してください。製作プロセスは、下記の通りである。
【００７０】
１）中間物の製作。一つ目が、シクロパミン（498.06mg，1.21mmol/L，1.00eq）とトリエチルアミン（489.76mg，4.84mmol/L，4.00eq）を、乾いたジクロロメタンDCM（4mL）に溶解することである。二つ目が、0℃の条件の下で、DCM(1mL)に溶けたトリフルオロ酢酸無水物(762.41mg, 3.63mmol, 3.00eq)を、溶液に入れることである。三つ目が、反応混合物を15℃までゆっくり加熱し、それに加えて、16h持続的にかき混ぜることである。四つ目が、液体クロマトグラフィー法-質量スペクトル法（LCMS）で、出発原料が完全に消耗し尽くしたのを表示することである（目標製品RT = 0.996 min、25%、副産物トリフルオロペルオキシ酢酸RT = 1.125 min、47%となる）。五つ目が、反応混合物を濃縮し、それに加えて、メタノール（15ml）で残渣を希釈することである。六つ目が、得た懸濁液を70℃まで加熱してから1h保温することである。七つ目が、反応混合物を15℃まで冷却することである。最後のステップが、溶けない固体を濾過・収集することによって、白色の固体中間物を得ることである（346.00mg、681.60umol、収率56.33%となる）。
【００７１】
２）化合物S1-2の製作。一つ目が、中間物(130.00mg, 256.09umol, 1.00eq)とトリエチルアミン(182.00mg, 1.80mmol, 7.02eq)を、DCM(2mL)に溶解してから氷浴で冷却することである。二つ目が、DCM(0.5mL)に溶けたイソシアネート基エタン(125.00mg, 1.76mmol, 6.87eq)を、溶液に入れることである。三つ目が、45℃の条件の下で、反応混合物を48 hかき混ぜることである。薄層クロマトグラフィー法（TLC）で、出発原料がすでに完全に消耗し尽くしたのを確認することである。四つ目が、反応物を真空環境の下で濃縮することである。五つ目が、メタノール(2.5ml)で残渣を洗浄することである。六つ目が、濾過することによって、白色の固体という目標製品S1-2 (30.00 mg, 51.84umol, 20.24%収率)を得ることである。
【００７２】
３）S1-2による気道RSウィルス複製に対する抑制作用をテストすること。ヒト気道RSウィルス（hRSV）Long株（米国モード培養物倉庫-ATCCコード：VR-26）とHEp-2細胞（ATCCコードCCL-23）を採用して感染実験を行う。HEp-2細胞にDMEM培地を使用し、それに加えて、ペニシリン/ストレプトマイシン及び10%胎児ウシ血清FBSを加えた後、37℃、5% CO2の環境の下で細胞を培養する。Hep-2細胞の中で、ウイルスの継代培養を行い、胎児ウシ血清の濃度が2%であり、前記と異なることを除いて、その培養条件を前記正常細胞と同じにする。ウイルス種を製作する際に、単層Hep-2細胞に対して低感染複数（MOI）の方式で感染を行い、MOI=0.1にし、二三日培養した後、細胞及びウイルスを含有する上澄み液を、-80℃の条件の下に置いて十分な冷凍を行い、それに加えて、室温の下で十分に溶解することによって、ウイルス培養物を十分に釈放させる。前記ウイルス培養物を、4℃の条件の下で、2000 × gの回転速度で10分間遠心してから、上澄み液を均質化して個別包装した後、-20℃の環境の下で貯蔵する。スポット形成試験を通じて、更にスポット低減の程度によって化合物の潜在的な抗hRSVの効力を評価し、スポット計数の時に、スポット数が50-100である穴で計数を行う。その上、化合物に対するテストにおいて、4℃の条件の下で、ウイルス吸着段階用化合物を1時間処理することによって、ウイルス侵入プロセス中における化合物の作用を分析することができる。更に、37℃の条件の下で、ウイルス吸着後の段階用化合物を72時間処理することによって、ウイルス複製プロセス中における化合物の作用を分析することができる。その上、ウイルス感染の全プロセスの段階において、化合物処理を行うことによって、ウイルス感染全プロセス中における化合物の作用を分析することができる。50%ウイルスの複製を抑制する効き目を達成する化合物の濃度（IC50）の計算について、スポット計数（ウイルス吸着段階分析）又はスポット寸法測定（ウイルス複製段階分析）を行い、それに加えて、Graphpad prismソフトウェア（GraphPad Software、米国カリフォルニア州のラホヤ市）の助けを借りて非線形特性回帰分析で確定することである。化合物中の細胞毒性を評価する時に、我々は、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay試薬キットを使用し（米国ウィスコンシン州マディソンのPromega社製）、試薬キットの取扱説明によって、前記試験条件における検査待ち化合物による細胞活力に対する影響を分析することである。
【００７３】
詳細的な操作手順は次のとおりである。
【００７４】
第一日：細胞接種-Hep2細胞を2E5/穴の密度で24穴板に接種し、0.5 mlの10%胎児ウシ血清を含有するDMEM培地で培養する（培養条件が37℃、5% CO2であり、培養時間が16〜24 hである）。
【００７５】
第二日：薬物処理とウイルス感染。
【００７６】
１．薬物希釈：希釈液が25% DMSOを含有するDMEMであり、薬物濃度を800 μM と200 μMまで希釈する。
【００７７】
２．ウイルス希釈：希釈液が2% 胎児ウシ血清を含有するDMEMであり、hRSVウイルスのウイルス種がhRSV Long-P9（2.9E7 pfu/ml）であり、-80℃で保存し、ウイルス種の融化と使用を、氷で実施し、MOI=0.1となる。
【００７８】
３．薬物処理とウイルス感染：24穴板の元の培地を捨て、PBS細胞を一回で洗浄し、希釈されたウイルス液を0.5 ml入れる。希釈された薬物を5 μl入れることによって、ウイルスが複数MOI=0.1を感染することにし、それに加えて、薬物の最終的な濃度を8 μM又は 2 μMにする。
【００７９】
４．前記細胞板を、37℃, 5% CO2条件の下で3日培養し、それに加えて、細胞病変を観察する。
【００８０】
第四日：新しいHep2細胞敷板を、滴定量測定に使用する。
【００８１】
Hep-2細胞を、1.5E5/穴の密度で、24穴板に接種し、37℃, 5% CO2条件の下で16〜24 h培養する。
【００８２】
第五日：ウイルスを収集し、それに加えて、ウイルス滴定量測定を行う。
【００８３】
１．第二日で処理した24穴板を-80℃の超低温冷蔵庫に1 h置いてから、氷に置いて融け、穴の中のウイルス液を、遠心管（氷で行う）に収集する。以上の遠心管に対して、8000rpm遠心操作を5 min行なってから、50 μlの上澄み液を取り出してウイルス滴定量測定に用いた後、残りのウイルスサンプルを、-80℃の超低温冷蔵庫に保存する。
【００８４】
２．ウイルス希釈：六つの1.5 mlの遠心管を準備し、標記した後、氷に置き、270 μlの2%胎児ウシ血清を含有するDMEM培地を入れた後、測定するウイルスサンプル原液から始まり、30μl を270μl希釈液に入れる。この方式で引き続き希釈することによって、10-1〜10-6のウイルス希釈液を得る。
【００８５】
３．細胞培地を捨て、PBSで細胞を一回で洗浄する。
【００８６】
４．200μlのウイルス希釈液を、相応に単層のHEp-2細胞に入れる。
【００８７】
５．37℃, 5% CO2条件の下で11.5 h培養する。それに加えて、15 min毎に細胞培養皿を一回振とうする。
【００８８】
６．その期間において、0.8% CMCと2% 胎児ウシ血清を含有するDMEMを37℃の水浴鍋に1h置く。ウイルス感染が1.5hになった後、ウイルス液を捨てた後、PBSで細胞を二回で洗浄する。最終的に500μl の0.8% CMCと2%胎児ウシ血清を含有するDMEM培地を入れた後、37℃, 5% CO2条件の下で3日培養する。
【００８９】
第八日：
【００９０】
１．CMCを含むCMC培地を捨て、氷上で、PBSで細胞を一回で洗浄する。
【００９１】
２．4%のポリホルムアルデヒド固定剤で細胞を20min固定した後、PBSで1回洗浄した後、陰干する。
【００９２】
３．0.25% tritonX-100を含有するPBSで細胞を20 min処理した後、PBSで三回洗浄し、毎回4 minとする。
【００９３】
４．穴に、200μlの希釈された一次抗体  （hRSV-F抗体、1:1000）を入れた後、5%脱脂ミルクを含有するPBSで一次抗体を希釈してから、室温で1h孵化する。
【００９４】
５．0.02%Tween20を含有するPBSでオリフィス板を洗浄し、合計三回洗浄し、毎回4 minとする。
【００９５】
６．穴に、200μlの希釈された二次抗体  （HRP-conjugated goat  anti-mouse，1:6000）を入れてから、二次抗体を、5%脱脂ミルクを含有するPBSで希釈した後、室温の下で1h孵化する。
【００９６】
７．0.02%Tween20を含有するPBSでオリフィス板を洗浄し、合計三回洗浄し、毎回4 minとする。
【００９７】
８．穴に、200μlのTrue Blue substrateを入れてから、 室温日光避け反応を、10 min以上実施し、青色スポットが出るまで操作する。
【００９８】
９．流れ水でオリフィス板を洗い流す。
【００９９】
１０．オリフィス板を乾かしてから、青色スポットの計数を行う。
【０１００】
添付図4を参照すると、化合物S1-2による気道RSウィルス複製に対する抑制比率の最大値が99%であることが分かる。
【０１０１】
４）S1-2によるHn信号チャネルに対する抑制作用をテストすること。一日前もってNIH3T3細胞を、6穴板（3×105細胞/穴）又は12穴板（1.5×105細胞/穴）に接種し、5%胎児ウシ血清を含有しているが、抗生物質を含有していないDMEM培地で培養することによって、トランスフェクション時に90-95%の合流を達成するのを確保する。血清がない培地で希釈されたリポソーム2000と希釈された後のプラスミドを均一に混ぜ（総容量100-1000ul）、且つ、孵化してから、これを、細胞と培地を含有する穴に入れた後、オリフィス板を、CO2インキュベータに置き、37℃条件の下で48h孵化する。トランスフェクション48h後、濃度が0.5μMに達するまでSAGを加えると同時に、各種の濃度のシクロパミン（CPM）類縁物質を加える。引き続き48h培養した後、細胞を洗浄し、クラッキングを行なってから、一つの96穴のブランク板に移す。LAR II試薬（Promega、ダブルフルオレセイン報告システム、E1910）を加え、それに加えて、発光リーダーでサンプルの数値を読み取る。
【０１０２】
詳細的な操作手順は次のとおりである。
【０１０３】
第一日：トランスフェクションの一日前に、NIH3T3を、12穴板に接種し、細胞密度を1.5E5cell/wellにし、培地を、5% FBSを含有するDMEMにする （二重抗体がなく、 トランスフェクションまで培養する細胞の密度が90-95%である）。
【０１０４】
第二日：Lipofectamine 2000の取扱説明書によって、下記のようにトランスフェクション試薬とプラスミドの準備を行う。
【０１０５】
１．Opti-MEMで希釈されたDNAを250 μl使用し（Gli-binding site-luciferase 表現プラスミドとRenilla表現プラスミドpRL-TKを含み、両者間の比例が50:1である）、軽く均一に混ぜる。
【０１０６】
２．Lipofectamine 2000を軽く均一に混ぜてから、新しい無菌遠心管において250 μlのOpti-MEMで希釈した後、軽く均一に混ぜる。
【０１０７】
３．Lipofectamine 2000の孵化時間が5-30 minの範囲内にある時に、希釈されたDNAと希釈されたLipofectamine 2000を軽く均一に混ぜた後、室温の下で20 min反応することによって、両者が安定な複合体を形成することにする。
【０１０８】
４．DNA-Lipofectamine 2000複合体を細胞に入れてから、板を前後に軽く振とうして均一に混ぜる。
【０１０９】
５．複合体と細胞を4-6h孵化した後、細胞培地を捨て、成長培地を入れ、それに加えて、37℃、5% CO2条件の下で48 h培養する。
【０１１０】
第四日：トランスフェクション48h後、薬物の希釈を行う（希釈液が0.5%FBS、0.25%DMSOを含有するDMEM培地である）。SAG化合物を、濃度1μMまで希釈し、それに加えて、CPM及びその類縁物質を、濃度20μMまで希釈する。250μl 1μM SAGと250μl 20μM CPM（又はその類縁物質）を取って同じ穴に入れ、SAGの最終的な濃度を0.5μMにし、それに加えて、CPM又はその類縁物質の最終的な濃度を10μMにする。
【０１１１】
第五日：
【０１１２】
１．成長培地を捨て、PBSで細胞を一回で洗浄した後、これを捨てる。
【０１１３】
２．ダブル・フルオレセイン酵素報告用遺伝学的検査試薬キット（Promega、E1910）の製品取扱説明書によって細胞クラッキングを行い、各穴に、100μlクラッキング液を入れてから、室温の下で培養皿を15 min揺れる。
【０１１４】
３．20μlのクラッキング生成物を取って96穴のブランク板に入れてから、50μlのLAR IIを入れ、ホタルのフルオレセイン酵素の信号値を読み取る。
【０１１５】
４．これから50ul のstop&Glo試薬を入れてナマコのフルオレセイン酵素の信号値を読み取る。
【０１１６】
以上のデータを記録し、それに加えて、比の計算を行う。すべての数値から、ブランク穴の背景値を差し引いた後、SAGだけを含有する（DMSO対照群）グループにおけるホタルのフルオレセイン酵素の信号値を1と見なし、その他のグループで計算される比を、比1と標記した後、SAGだけを含有する（DMSO対照群）グループにおけるナマコのフルオレセイン酵素の信号値を1と見なし、その他のグループで計算される比を、比2と標記し、最後に比1と比2との比を計算すると、得るデータが、本グループ処理のホタルフルオレセイン酵素の相対的な表現レベル（百分比）である。
【０１１７】
添付図5を参照すると、シクロパミンの類縁物質S1-2による遺伝子表現に対する抑制作用が著しくなく、抑制率が僅かに36%であることが分かる。これらのデータから見ると、シクロパミン（CPM）から派生するステロイド類アルカロイド分子の抗気道RSウィルス（RSV）活性とSmo依存性Hh信号チャネルに対する抑制活性を分離することができることが分かる。
【０１１８】
５）気道RSウィルス複製とHh活性抑制係数を計算すること。添付図6を参照すると、化合物S1-2の気道RSウィルス複製とHh活性抑制係数が1.44596であり、1を上回るので、好ましい抑制特性を表すことが分かる。
【０１１９】
６）化合物S1-2の選別。添付図6を参照すると、化合物S1-2が一種の好ましい抑制特性を表しているので、気道RSウィルス感染治療用化合物としても良いことが分かる。
【実施例２】
【０１２０】
一種のシクロパミン（CPM）類縁物質S1-4を製作する。添付図1、添付図2と添付図3を参照してください。製作プロセスは、下記の通りである。
【０１２１】
１）中間物の製作。製作プロセスは、実施形態1と同じである。
【０１２２】
２）化合物S1-4の製作。製作プロセスは、実施形態1と同じである。
【０１２３】
３）S1-4による気道RSウィルス複製に対する抑制作用をテストすること。試験（テスト）プロセスは、実施形態1と同じである。添付図4を参照すると、化合物S1-4による気道RSウィルス（RSV）複製に対する抑制比率の最大値が88%であることが分かる。
【０１２４】
４）S1-4によるHn信号チャネルに対する抑制作用をテストすること。試験（テスト）プロセスは、実施形態1と同じである。添付図5を参照すると、シクロパミン（CPM）の類縁物質S1-4による遺伝子表現に対する抑制作用が著しくなく、抑制率が僅か5%であることが分かる。これらのデータから見ると、シクロパミン（CPM）から派生するステロイド類アルカロイド分子の抗気道RSウィルス（RSV）活性とSmo依存性Hh信号チャネルに対する抑制活性を分離することができることが分かる。
【０１２５】
５）化合物S1-4による気道RSウィルス複製とHh活性抑制係数を計算すること。添付図6を参照すると、化合物S1-4による気道RSウィルス複製とHh活性抑制係数が1.6172823であり、1を上回るので、好ましい抑制特性を表すことが分かる。
【０１２６】
６）化合物S1-4の選別。添付図6を参照すると、化合物S1-4が一種の好ましい抑制特性を表し、それに加えて、その抑制係数がすべての測定対象化合物の中で一番高いので、気道RSウィルス感染治療用好ましい化合物としても良いことが分かる。
【０１２７】
最後に、説明すべきなこととしては、勿論、前記実施形態は、僅かに本発明をはっきりと説明する為に上げられた例であり、実施方式に対する限定ではない。本分野における普通技術者にとって、前記説明の基礎の上に、その他の異なる形式の変化又は変動を行なっても良い。ここで、すべての中の実施方式を積尽法で説明する必要がなく、それに加えて、これを実施することができない。これで派生する一目でわかる変化又は変動は、相変わらず本発明の保護範囲に属する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月24日(2018.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式IIIで示すS1-2又は式IVで示すS1-4の通式を有し、又は、式IIで示す構造を有する化合物であり、
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2019501866.tif 000019
2019501866.tif 000020
式の中で、R1が、H、OH、アルキル基、アミノ基、スルフェンアミド基、スルホンアミド基、-OC(O)R5、-N(R5)C(O)R5又は糖鎖である；
R2が、H、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、ニトリル又は複素環アルキル基である；
R3が、H、アルキル基、アルケニル基又はアルキン基である；
R4が、H、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、複素環アルキル基、アラルキル基、複素アリール基、複素アラルキル基、ハロゲン化アルキル基、-OR5、-C(O)R5、-CO2R5、-SO2R5、-C(O)N(R5)(R5)、-[C(R)2]q-R5、-[(W)-N(R)C(O)]qR5、-[(W)-C(O)]qR5、-[(W)-C(O)O]qR5、-[(W)-OC(O)]qR5、-[(W)-SO2]qR5、-[(W)-N(R5)SO2]qR5、-[(W)-C(O)N(R5)]qR5、-[(W)-O]qR5、-[(W)-N(R)]qR5、-W-NR53+X-又は-[(W)-S]qR5である；
その中で、Wが各自に独立的な二価アルキル基であり、
Rが各自に独立的なH 又はアルキル基であり、
qが各自に独立的な1、2、3、4、5 又は6であり、
X-がハロゲンであり、
R5が各自に独立的なH、アルキル基、アルケニル基、アルキン基、アリール基、環状アルキル基、複素環アルキル基、アラルキル基、複素アリール基、複素アラルキル基又は-[C(R)2]p-R6である；その中で、pが0-6である；又は同じ置換基上の任意の二つのR5が共同に0-3個のヘテロ原子を含む4-8員環の任意の置換環を形成でき、前記ヘテロ原子がN、O、S又はPの中の何れかである；R6が各自に独立的なヒドロキシ基、-N(R)COR、-N(R)C(O)OR、-N(R)SO2(R)、-C(O)N(R)2、-OC(O)N(R)(R)、-SO2N(R)(R)、-N(R)(R)、-COOR、-C(O)N(OH)(R)、-OS(O)2OR、-S(O)2OR、-OP(O)(OR)(OR)、-NP(O)(OR)(OR)又は-P(O)(OR)(OR)である；
ことを特徴とする一種の気道RSウィルス感染治療用化合物。
【請求項２】
式IIで示す構造を有する化合物であり、
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前記式IIの中で、R1が、OH、H、置換された又は置換されていないC1-C3アルキル基の中の何れかである；
R2が、置換された又は置換されていないC1-C3アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである；
R3が、置換された又は置換されていないC1-C3アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである；
R4が、置換された又は置換されていないC1-C3アルキル基、アルケニル基とアルキン基の中の何れかである；
その中で、前記の置換が、炭化水素基上の一つ又は複数の水素原子が、次のグループの中の何れかの置換基によって置換されたことを指す：C1〜C10アルキル基、C3〜C10環状アルキル基、C1〜C10アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、C1〜C10カルボニル基、C1〜C10アミド基、C2〜C10エステル基、C6〜C30アリール基、ハロゲン原子、シアン基とチオエーテル基である；
ことを特徴とする一種の気道RSウィルス感染治療用化合物。
【請求項３】
前記R1がOHであり、前記R2がメチル基であり、前記R3がメチル基であり、前記R4がメチル基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物。
【請求項４】
前記請求項１乃至３のいずれか一項に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の薬物化学合成を通じて、シクロパミンの類縁物質を合成し、それに加えて、並行して実施する二つの対外試験を通じて類縁物質を選別する；並行して実施する前記二つの対外試験が下記の通り、即ち、（1）細胞に基づく一種の実験、即ち、気道RSウィルスの感受性細胞における複製能力を測定する実験及び（2）細胞に基づく一種の実験、即ち、一種の分子によるsonic hedgehog経路抑制のレベルを測定する実験（当該種類の抑制効果が、SAGによって誘導されるSmo依存性遺伝子転写事件に対する当該分子の妨害レベルに表れる）であることを特徴とする一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項５】
前記製作方法が、下記のステップ、即ち、
1)  化合物の合成と
2)  化合物の選別と
を含むことを特徴とする請求項４に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項６】
前記化合物合成のステップが二つのサブステップ、即ち、
1)  中間物の製作と
2)  化合物の製作と
を含むことを特徴とする請求項５に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項７】
前記化合物選別のステップが四つのサブステップ、即ち、
1)  化合物による気道RSウィルス複製に対する抑制作用をテストすること、
2)  化合物によるHn信号チャネルに対する抑制作用をテストすること、
3)  気道RSウィルス複製とHh活性抑制係数を計算すること及び
4)  化合物を選別すること
を含むことを特徴とする請求項５に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項８】
前記中間物の製作ステップが下記の通り、即ち、一つ目が、シクロパミンとトリエチルアミンを、乾いたジクロロメタンDCMに溶解することである；二つ目が、0℃の条件の下で、DCMに溶けたトリフルオロ酢酸無水物を、溶液に入れることである；三つ目が、反応混合物を15℃までゆっくり加熱し、それに加えて、16h持続的にかき混ぜることである；四つ目が、液体クロマトグラフィー法-質量スペクトル法で、出発原料が完全に消耗し尽くしたのを確認することである；五つ目が、反応混合物を濃縮し、それに加えて、メタノールで残渣を希釈することである；六つ目が、得た懸濁液を70℃まで加熱してから1h保温することである；七つ目が、反応混合物を15℃まで冷却することである；最後のステップが、濾過することによって、白色の固体の中間物を得ることであることを特徴とする請求項６に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項９】
前記化合物の製作ステップが下記の通り、即ち、一つ目が、中間物とトリエチルアミンを、DCMに溶解してから氷浴で冷却することである；二つ目が、DCMに溶けたイソシアネート基エタンを、溶液に入れることである；三つ目が、45℃の条件の下で、反応混合物を48hかき混ぜることである；四つ目が、薄層クロマトグラフィー法で、出発原料がすでに完全に消耗し尽くしたのを確認することである；五つ目が、反応物を真空環境の下で濃縮することである；六つ目が、メタノールで残渣を洗浄することである；七つ目が、濾過することによって、白色の固体の化合物を得ることであることを特徴とする請求項６に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項１０】
前記化合物による気道RSウィルス複製に対する抑制作用をテストするステップが下記のプロセス、即ち、一つ目が、ヒト気道RSウィルスLong株とHEp-2細胞を採用して感染実験を行うことである；二つ目が、HEp-2細胞にDMEM培地を使用し、それに加えて、ペニシリン/ストレプトマイシン及び10%胎児ウシ血清FBSを加えた後、37℃、5%CO2の環境の下で細胞を培養することである；三つ目が、Hep-2細胞の中で、ウィルスの継代培養を行い、胎児ウシ血清の濃度が2%であり、前記と異なることを除いて、その培養条件を前記正常細胞と同じにすることである；四つ目が、ウィルス種を製作する際に、単層Hep-2細胞に対して低感染複数MOIの方式で感染を行い、MOI=0.1にし、二三日培養した後、細胞及びウィルスを含有する上澄み液を、-80℃の条件の下に置いて十分な冷凍を行い、それに加えて、室温の下で溶解することによって、ウィルス培養物を釈放させることである；五つ目が、前記ウィルス培養物を、4℃の条件の下で、2000×gの回転速度で10分間遠心してから、上澄み液を均質化して個別包装した後、-20℃の環境の下で貯蔵することである；六つ目が、スポット形成試験を通じて、更にスポット低減の程度化合物の潜在的な抗ヒト気道RSウィルスの効力を評価し、スポット計数の時に、スポット数が50-100である穴で計数を行うことである；その上、化合物に対するテストについて、4℃の条件の下で、ウィルス吸着段階の化合物を1時間処理することによって、ウィルス侵入プロセス中における化合物の作用を分析することができる；更に、37℃の条件の下で、ウィルス吸着後の段階における化合物を72時間処理することによって、ウィルス複製プロセス中における化合物の作用を分析することができる；その上、ウィルス感染の全プロセスの段階において、化合物処理を行うことによって、ウィルス感染全プロセス中における化合物の作用を分析することができる；50%ウィルスの複製を抑制する効き目を達成する化合物の濃度（IC50）の計算について、スポット計数又はスポット寸法測定を行い、それに加えて、Graphpad prismソフトウェアの助けを借りて非線形特性回帰分析で確定することである；七つ目が、化合物中の細胞毒性を評価する時に、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay試薬キットを使用し、それに加えて、試薬キットの取扱説明によって、前記試験条件における検査待ち化合物による細胞活力に対する影響を分析することであるという七つのプロセスを含むことを特徴とする請求項７に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項１１】
前記化合物によるHn信号チャネルに対する抑制作用をテストするステップが下記のプロセス、即ち、一つ目が、一日前もってNIH3T3細胞を、6穴板又は12穴板に接種し、5%胎児ウシ血清を含有しているが、抗生物質を含有していないDMEM培地で培養することによって、トランスフェクション時に90-95%の合流を達成するのを確保することである；二つ目が、血清がない培地で希釈されたリポソーム2000と希釈された後のプラスミドを均一に混ぜ、且つ、孵化してから、これを、細胞と培地を含有する穴に入れた後、オリフィス板を、CO2インキュベータに置き、37℃条件の下で48h孵化することである；三つ目が、トランスフェクション48h後、濃度が0.5uMに達するまでSAGを加えると同時に、各種の濃度のシクロパミン類縁物質を加えることである；四つ目が、引き続き48h培養した後、細胞を洗浄し、クラッキングを行なってから、一つの96穴のブランク板に移すことである；五つ目が、LAR II試薬を加え、それに加えて、発光リーダーでサンプルの数値を読み取ることである；その上、Hh信号チャネル抑制試験において、入れるシクロパミン類縁物質が、前記抗気道RSウィルス複製試験から選定された類縁物質であり、即ち、気道RSウィルス複製を有効に抑制できるシクロパミン類縁物質である；Hh信号チャネル抑制試験を通じて、これらの類縁物質によるSAGによって誘導されるSmo依存性遺伝子表現に対する抑制効果、即ち、シクロパミンと類似する作用効果をテストし、これらの抑制レベルの高さを分析することであるという五つのプロセスを含むことを特徴とする請求項７に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項１２】
前記化合物選別のステップを、化合物の抑制係数によって実施すること；化合物の抑制係数が1を上回る場合、この化合物を選定し、化合物の抑制係数が1を下回る場合、この化合物を削除することであることを特徴とする請求項７に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の製作方法。
【請求項１３】
前記化合物が、気道のウィルス感染症による疾病の治療に使用することができ、それに加えて、患者の毒性と副作用を引き起こさないことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の用途。
【請求項１４】
前記化合物が気道のウィルス感染症、パラミクソウィルス感染症、気道RSウィルス感染症、気道RSウィルスによって引き起こされる細気管支炎、気道RSウィルスによって引き起こされる肺炎及び気道RSウィルスによって引き起こされる中耳炎の治療に使用することができることを特徴とする請求項１３に記載の一種の気道RSウィルス感染治療用化合物の用途。
【国際調査報告】
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