(57)【要約】  本発明は、蛍光撮像に関する。蛍光顕微鏡を較正するための複数の蛍光チャネルとの適合性を高めるため、基板１２及び画素レイアウト１４を含む較正スライド１０が提供される。画素レイアウトは、基板の表面１８に配置された複数の離間した金属ナノ構造体１６を有する。金属ナノ構造体は、プラズモン共鳴を生成するよう構成され、これは、励起波長の光２０を吸収し、蛍光画像を生成するための光ルミネセンス及び／又は蛍光２２を生成することを可能にする。蛍光画像は、蛍光顕微鏡の較正のために提供される複数の画素強度値を有する。
2019505824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡に関する較正スライドであって、
基板と、
前記基板の表面に配置される複数の離間された金属ナノ構造体を含む画素レイアウトとを有し、
前記金属ナノ構造体が、蛍光画像を生成する光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成するため、励起波長の光を吸収することを可能にするプラズモン共鳴を生成し、
前記蛍光画像は、蛍光顕微鏡の較正のために提供される複数の画素強度値を有する、較正スライド。
【請求項２】
前記基板が光学的に透明である、請求項１に記載の較正スライド。
【請求項３】
前記金属ナノ構造体が、互いに結合するよう構成される、請求項１又は２に記載の較正スライド。
【請求項４】
前記画素レイアウトが、少なくとも２つの画素サブレイアウトを有し、前記少なくとも２つの画素サブレイアウトは、明るい照明下で異なる色を生成する、請求項１乃至３の一項に記載の較正スライド。
【請求項５】
前記金属ナノ構造体が、金、銀、銅、及びアルミニウムを含む群から選択される金属を有する、請求項１乃至４の一項に記載の較正スライド。
【請求項６】
各金属ナノ構造体が、３０ｎｍから７００ｎｍの範囲の断面寸法を持ち、
各金属ナノ構造体は、１０ｎｍから１μｍの範囲の厚さを持ち、及び／又は
隣接する金属ナノ構造体間の距離が、１００ｎｍから１μｍの範囲にある可視光波長に匹敵する、請求項１乃至５の一項に記載の較正スライド。
【請求項７】
前記画素レイアウトに加えて、少なくとも１つのレイアウトが、前記較正スライドの前記表面に提供され、前記レイアウトは、
着色マイクロビーズの単層；
解像度及び歪み試験ターゲット；並びに
無機蛍光体の層を含む群から選択される、請求項１乃至６の一項に記載の較正スライド。
【請求項８】
較正システムであって、
蛍光顕微鏡と、
請求項１乃至７の一項に記載の較正スライドとを有し、
前記蛍光顕微鏡が、
光源と、
光検出器とを含み、
前記光源と前記光検出器とが光路に配置され、
較正において、前記光源は、光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成するため、励起波長において前記光路に配置された前記較正スライドの前記金属ナノ構造体により吸収される光を提供し、
前記光検出器は、較正目的のための較正試験データとして蛍光画像データを取得するため、前記生成された光ルミネセンス及び／又は蛍光を検出する、較正システム。
【請求項９】
前記較正システムが、較正デバイスを更に有し、前記較正デバイスは、
記憶ユニットと、
処理ユニットとを含み、
前記記憶ユニットが、少なくとも１つの蛍光チャネルの所定の標準較正データを記憶し、
前記処理ユニットは、前記少なくとも１つの蛍光チャネルの強度補正プロファイルを生成するため、前記取得された較正試験データと前記記憶された所定の標準較正データとを比較し、
前記強度補正プロファイルが、前記少なくとも１つの蛍光チャネルに関して前記蛍光顕微鏡で得られた蛍光病理学的サンプルの蛍光画像データを補正するために提供される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記画素レイアウトに加えて、着色マイクロビーズの単層並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含む群から選択される少なくとも１つのレイアウトが、前記較正スライドの前記表面に提供され、
前記光検出器は、前記少なくとも１つのレイアウトの画像データを更なる較正試験データとして取得し、
前記記憶ユニットが、前記少なくとも１つのレイアウトの更なる所定の標準較正データを記憶し、
前記処理ユニットは、前記蛍光顕微鏡のパラメータを較正するため、前記取得された更なる較正試験データと前記記憶された更なる所定の標準較正データとを比較し、
前記パラメータは、
蛍光顕微鏡の焦点品質；並びに
解像度及びステッチングアーチファクトを含む群から選択される、請求項８又は９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記蛍光顕微鏡が、エピ蛍光顕微鏡である、請求項８乃至１０の任意の一項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記較正スライドが、前記蛍光顕微鏡に恒久的に取り付けられる、請求項８乃至１１の任意の一項に記載のシステム。
【請求項１３】
光路に配置された光源及び光検出器を含む蛍光顕微鏡の較正方法において、
ａ）前記光源から前記光検出器に向かう光で前記光路に配置された較正スライドを照らすステップであって、
前記較正スライドが、基板と、前記基板の表面に配置され、プラズモン共鳴を生成するよう構成される複数の離間した金属ナノ構造体を含む画素レイアウトとを備え、
前記較正スライドを照らす光は、プラズモン共鳴を生成し、これは、励起波長の光を吸収して、蛍光顕微鏡を較正するために提供される複数の画素強度値を含む蛍光画像を生成するため、光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成することを可能にする、ステップと、
ｂ）前記蛍光画像の蛍光画像データを較正試験データとして取得するステップと、
ｃ）前記蛍光顕微鏡の較正目的のため、較正試験データを使用するステップとを有する、方法。
【請求項１４】
前記ステップｃ）が、
ｃ１）所定の標準較正データを提供するステップと、
ｃ２）前記取得された較正試験データと前記所定の標準較正データとを比較し、強度補正プロファイルを生成するステップと、
ｃ３）前記強度補正プロファイルを用いて、前記蛍光顕微鏡を用いて得られた蛍光病理サンプルの蛍光画像データを較正するステップとを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記画素レイアウトに加えて、着色マイクロビーズの単層並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含む群から選択される少なくとも１つのレイアウトが、前記較正スライドの表面に提供され、前記方法が、
ｄ）前記少なくとも１つのレイアウトの画像データを更なる較正試験データとして取得するステップと、
ｅ）前記少なくとも１つのレイアウトの更なる所定の標準較正データを提供するステップと、
ｆ）前記蛍光顕微鏡のパラメータを較正するため、前記取得された更なる較正試験データと前記記憶された更なる所定の標準較正データとを比較するステップとを更に有し、
前記パラメータは、
蛍光顕微鏡の焦点品質；並びに
解像度及びステッチングアーチファクトを含む群から選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
複数のレイアウトを備える較正スライドを製造する方法において、前記レイアウトが、基板の表面に配置された複数の離間した金属ナノ構造体を備える画素レイアウト、着色マイクロビーズの単層、並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含み、前記方法は、
ａａ）顕微鏡スライドを形成する基板に着色マイクロビーズの単層を堆積させるステップと、
ｂｂ）２つのカバースリップを形成する２つの異なる基板に画素レイアウト並びに解像度及び歪み試験ターゲットを堆積させるステップと、
ｃｃ）前記顕微鏡スライドに２つのカバースリップを組み立てて、較正スライドを形成するステップとを有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光撮像の分野に関し、特に、較正スライド、蛍光顕微鏡の較正システム、及び蛍光顕微鏡の較正方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光撮像は例えば、生物学、医学、材料工学において使用される。例えば、デジタル病理学では、蛍光撮像は、蛍光標識されたスライドのマルチチャネルスキャンを可能にし、研究がサンプルからより多くの情報を得るのを助ける。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、長期間の使用後、蛍光撮像システムのスキャン精度は、例えば蛍光顕微鏡の誤った光学配置により変動し、又は更には低下する場合がある。従って、蛍光顕微鏡は、性能を保証するために日常的に較正される必要があり得る。較正スライドが、蛍光顕微鏡を較正するために一般的に使用される。例えば、ＵＳ２０１３／０２９２５５９Ａ１号は、蛍光染料ベースの較正スライドを記載する。しかしながら、複数の蛍光チャネルに適合するため、色素ベースの較正スライドには複数の蛍光色素が必要とされる場合がある。
【０００４】
複数の蛍光チャネルに適合する較正スライドを提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は、独立請求項の主題により解決される。更なる実施形態は、従属項に含まれる。本発明の以下に記載される態様は、較正スライド、蛍光顕微鏡の較正システム、及び蛍光顕微鏡を較正する方法にも適用される点に留意されたい。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、蛍光顕微鏡に関する較正スライドが提供される。この較正スライドは、基板と、上記基板の表面に配置される複数の離間された金属ナノ構造体を含む画素レイアウトとを有する。上記金属ナノ構造体が、蛍光画像を生成する光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成するため、励起波長の光を吸収することを可能にするプラズモン共鳴を生成するよう構成される。蛍光画像は、蛍光顕微鏡の較正のために提供される複数の画素強度値を有する。
【０００７】
本発明は、デジタル病理学におけるいわゆるホールスライド撮像に適した任意のタイプの顕微鏡に有利に使用できる点に留意されたい。例えば、本発明は、ラインベーススキャン及びタイルベーススキャン顕微鏡を包含する。
【０００８】
プラズモン共鳴ベースの較正スライドは、広い吸収及び放出スペクトルを示し、これは、対応する励起波長における光で励起されるとき、すべての典型的な蛍光チャネルをカバーし得る。従って、較正スライドの同じ領域は、大きなスペクトル範囲にわたり光ルミネセンス及び／又は蛍光出力を提供することができる。言い換えると、すべての蛍光チャネルを較正するのに、較正スライドにおける１つのタイプのプラズモン構造が使用されることができる。これは、複数の蛍光染料の必要性を置き換えることができる。更に、金属ナノ構造体における励起光の自然共鳴吸収と、異なる波長における励起光の一部の再放出とのため、斯かる較正スライドの光ルミネセンス及び／又は蛍光は、劣化しにくい。例えば、伝統的な染料ベースのサンプルとは対照的に、斯かる較正スライドは、時間的に安定しており、漂白を示さない場合がある。更に、プラズモニクスは時間の経過とともにフェードアウトしないので、較正スライドを、例えば毎年較正する必要はない。
【０００９】
一例によれば、上記基板が光学的に透明である。
【００１０】
従って、蛍光撮像は、明視野撮像と組み合わせられることができる。そこでは、画素レイアウトがカラー画像として可視である。較正スライドの画素レイアウトの視認性は、迅速な位置決め、サンプル位置決め及び視覚的サンプル検査を可能にし、これは較正をより迅速にする。
【００１１】
一例によれば、上記金属ナノ構造体が、互いに結合するよう較正される。
【００１２】
局在及び結合共鳴を組み合わせることにより、紫外から赤までの共鳴波長を備える較正スライドを設計することが可能である。これは、明るい光照明下で異なる色を作成する柔軟性を提供する。
【００１３】
一例では、較正スライドは、例えば、明視野及び蛍光撮像システムに関して、蛍光応答を較正するためだけでなく、色を較正するためにも提供される。斯かる組み合わせは、較正プロセスの効率を改善し得る。
【００１４】
一例によれば、較正スライドは、着色マイクロビーズの単層、解像度及び歪み試験ターゲット、及び無機蛍光体の層を含む群から選択される少なくとも１つのレイアウトを更に具備する。
【００１５】
言い換えると、較正スライドは、２つ以上の異なるサンプル又はターゲットを含む。一例では、較正スライドは、プラズモン効果からの光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成するための画素レイアウト及び着色マイクロビーズの単層を有する。更なる例では、較正は、画素レイアウト、着色マイクロビーズの単層、並びに解像度及び歪み試験ターゲットを有する。
【００１６】
こうして、蛍光及びファントムの特徴が、プラズモン共鳴で模倣されることができる。焦点及び撮像は、マイクロビーズで評価されることができる。解像度及び歪みターゲットは、解像度及びステッチングアーチファクトを評価する。同じ較正スライドに複数のターゲットを組み合わせることにより、より効率的かつ正確な較正が達成されることができる。
【００１７】
更に、発光スペクトルのある部分の発光を高めるため、無機蛍光体がプラズモニクスと組み合わせられることもできる。
【００１８】
本発明の第４の態様によれば、複数のレイアウトを備える蛍光較正スライドを製造する方法が提供され、上記レイアウトが、基板の表面に配置された複数の離間した金属ナノ構造体を備える画素レイアウト、着色マイクロビーズの単層、並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含み、上記方法は、
ａａ）顕微鏡スライドを形成する基板に着色マイクロビーズの単層を堆積させるステップと、
ｂｂ）２つのカバースリップを形成する２つの異なる基板に画素レイアウト並びに解像度及び歪み試験ターゲットを堆積させるステップと、
ｃｃ）上記顕微鏡スライドに２つのカバースリップを組み立てて、較正スライドを形成するステップとを有する。
【００１９】
言い換えると、３つのプロセスは、これらのプロセスを完了した後に一緒に組み立てられる別々の基板上で行われることができる。
【００２０】
こうして、これら３つの技術（ナノインプリントリソグラフィとドライエッチング、化学結合、及び光リソグラフィ）の製造方法は互いに互換性はないが、１つの較正スライド上で３つすべてを組み合わせることも可能である。
【００２１】
本発明の第２の態様によれば、蛍光顕微鏡の較正システムが提供される。較正システムは、蛍光顕微鏡と、上記及び下記の実施例の１つによる較正スライドとを有する。蛍光顕微鏡は、光源と光検出器とを有する。光源及び光検出器は光路に配置される。較正において、上記光源は、光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成するため、励起波長において上記光路に配置された上記較正スライドの上記金属ナノ構造体により吸収される光を提供するよう構成される。上記光検出器は、較正目的のための較正試験データとして蛍光画像データを取得するため、上記生成された光ルミネセンス及び／又は蛍光を検出するよう構成される。
【００２２】
蛍光顕微鏡は、デジタル病理で使用されることができる。例えば、蛍光顕微鏡は、マルチチャンネル蛍光デジタル病理スキャナ、明視野及び蛍光デジタル病理スキャナ、又は明視野、蛍光、及び蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）デジタル病理スキャナとすることができる。
【００２３】
こうして、蛍光撮像システムは、較正スライドを変更する必要なしに、複数の蛍光チャネルにおいて較正されることができる。これは、較正手順を単純化し、効率を向上させることができる。更に、顕微鏡レベルでの蛍光強度の均一性のため、較正精度も保証され得る。
【００２４】
一例によれば、較正システムは、記憶ユニットと処理ユニットとを含む較正デバイスを更に具備する。上記記憶ユニットが、少なくとも１つの蛍光チャネルの所定の標準較正データを記憶する。上記処理ユニットは、上記少なくとも１つの蛍光チャネルの強度補正プロファイルを生成するため、上記取得された較正試験データと上記記憶された所定の標準較正データとを比較する。上記強度補正プロファイルが、上記少なくとも１つの蛍光チャネルに関して上記蛍光顕微鏡で得られた蛍光病理学的サンプルの蛍光画像データを補正するために提供される。
【００２５】
較正デバイスは、蛍光顕微鏡の不可欠な部分であってもよい。代替的に、較正デバイスはコンピュータであってもよい。
【００２６】
一例によれば、上記画素レイアウトに加えて、着色マイクロビーズの単層並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含む群から選択される少なくとも１つのレイアウトが、上記較正スライドの上記表面に提供される。上記光検出器は、上記少なくとも１つのレイアウトの画像データを更なる較正試験データとして取得する。上記記憶ユニットが、上記少なくとも１つのレイアウトの更なる所定の標準較正データを記憶する。上記処理ユニットは、上記蛍光顕微鏡のパラメータを較正するため、上記取得された更なる較正試験データと上記記憶された更なる所定の標準較正データとを比較する。上記パラメータは、蛍光顕微鏡の焦点品質、並びに解像度及びステッチングアーチファクトを含む群から選択される。
【００２７】
こうして、較正スライドを変更することなしに、蛍光顕微鏡の蛍光、色、焦点、撮像及びステッチング、又はそれらの組み合わせが評価及び較正されることができる。較正プロセスは単純化されることができ、これは、蛍光顕微鏡を較正する効率を高めることもできる。
【００２８】
一例によれば、上記蛍光顕微鏡が、エピ蛍光顕微鏡である。
【００２９】
エピ蛍光法は、高いシグナル対ノイズ比を提供し得る。
【００３０】
本発明の第３の態様によれば、光路に配置された光源及び光検出器を含む蛍光顕微鏡を較正する方法が提供され、この方法は、
ａ）上記光源から上記光検出器に向かう光で上記光路に配置された較正スライドを照らすステップであって、上記較正スライドが、基板と、上記基板の表面に配置され、プラズモン共鳴を生成するよう構成される複数の離間した金属ナノ構造体を含む画素レイアウトとを備え、
上記較正スライドを照明する光は、プラズモン共鳴を生成し、これは、励起波長の光を吸収して、蛍光顕微鏡を較正するために提供される複数の画素強度値を含む蛍光画像を生成するため、光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成することを可能にする、ステップと、
ｂ）上記蛍光画像の蛍光画像データを較正試験データとして取得するステップと、
ｃ）上記蛍光顕微鏡の較正目的のため、上記較正試験データを使用するステップとを有する。
【００３１】
一例によれば、上記ステップｃ）が、
ｃ１）所定の標準較正データを提供するステップと、
ｃ２）上記取得された較正試験データと上記所定の標準較正データとを比較し、強度補正プロファイルを生成するステップと、
ｃ３）上記蛍光顕微鏡を用いて得られた蛍光病理サンプルの蛍光画像データを較正するため、上記強度補正プロファイルを使用するステップとを有する。
【００３２】
一例によれば、上記画素レイアウトに加えて、着色マイクロビーズの単層並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含む群から選択される少なくとも１つのレイアウトが、上記較正スライドの上記表面に提供され、上記方法が、
ｄ）上記少なくとも１つのレイアウトの画像データを更なる較正試験データとして取得するステップと、
ｅ）上記少なくとも１つのレイアウトの更なる所定の標準較正データを提供するステップと、
ｆ）上記蛍光顕微鏡のパラメータを較正するため、上記取得された更なる較正試験データと上記記憶された更なる所定の標準較正データとを比較するステップとを更に有し、
上記パラメータは、
蛍光顕微鏡の焦点品質；及び
解像度及びステッチングアーチファクトを含む群から選択される。
【００３３】
本発明の一態様によれば、蛍光顕微鏡を較正するため、励起波長の光を吸収し、光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成するプラズモン共鳴効果を利用する較正スライドが提供される。較正スライドは、１μｍ未満の厚さを持つ金属ナノ構造体の薄層を含む。薄い厚さは、較正スライド上に焦点外領域が存在しないことを保証し、更に、較正スライドが病理スライドに匹敵する厚さを持つことを保証する。従って、較正スライドは、デジタル病理のような用途にも適している。更に、較正スライドは、顕微鏡レベルで較正スライドにわたって均一な蛍光強度を持つ。較正スライドの蛍光もまた、蛍光染料ベースの較正スライドと比較して、劣化しにくい。製造プロセスのため、均一な蛍光強度は、大きなバッチにわたり保証されることもでき、これはスキャナ毎の変動性を評価するのに適している。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】較正スライドの一例の概略表示を示す図である。
【図１Ｂ】較正スライドの一例の概略表示を示す図である。
【図２Ａ】較正スライドの更なる例を示す図である。
【図２Ｂ】較正スライドの更なる例を示す図である。
【図２Ｃ】較正スライドの更なる例を示す図である。
【図２Ｄ】較正スライドの更なる例を示す図である。
【図３Ａ】較正スライドの蛍光画像の２つの例を示す図である。
【図３Ｂ】較正スライドの蛍光画像の２つの例を示す図である。
【図４Ａ】２つの異なる励起波長に露光されるときの図３Ｂにおける較正スライドの蛍光画像の例を示す図である。
【図４Ｂ】２つの異なる励起波長に露光されるときの図３Ｂにおける較正スライドの蛍光画像の例を示す図である。
【図５】蛍光及び色較正の両方のための較正スライドの更なる例を示す図である。
【図６】複数のレイアウトを有する較正スライドの更なる例を示す図である。
【図７】蛍光顕微鏡の一例を示す図である。
【図８】蛍光顕微鏡を較正する方法の一例の基本的なステップを示す図である。
【図９】方法の更なる例を示す図である。
【図１０】複数のレイアウトを備える蛍光較正スライドを製造する方法の一例の基本ステップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明のこれら及び他の側面は、本書に記載される実施形態から明らかとなり、及び実施形態を参照して説明されることになる。
【００３６】
本発明の例示的な実施形態が、以下の図面を参照して以下に説明される。
【００３７】
これらの図は、概略的にのみ図示されており、正確な縮尺ではない。同じ参照符号は、図面全体にわたって同じ又は同様の特徴を指す。
【００３８】
図１Ｂは、蛍光顕微鏡４２用の較正スライド１０の一例の上面図を示す（図７の例を参照）。図１Ａは、図１Ｂにおける１Ａ−１Ａ線に沿った断面図を示す。
【００３９】
較正スライド１０は、基板１２と、基板１２の表面１８に配置された複数の離間した金属ナノ構造体１６を備える画素レイアウト１４とを有する。金属ナノ構造体１６は、実線の矢印で示される励起波長で光２０を吸収し、蛍光画像を生成するため破線の矢印で示される光ルミネセンス及び／又は蛍光２２を生成することを可能にするプラズモン共鳴を生成するよう構成される。蛍光画像は、蛍光顕微鏡の較正のために提供される複数の画素強度値を有する。
【００４０】
オプションで、カバースリップ２６は、画素レイアウト１４を覆い及び保護するために設けられる。オプションのカバースリップ２０を取り付けるため、接着剤、樹脂、又は金属ナノ構造体１６の間に入る他の任意の適切な物質を使用することが可能である。
【００４１】
更なるオプションは、金属ナノ構造体１６を光学的に透明な酸化物層（図示省略）で覆うことである。酸化物層を用いて、金属ナノ構造体１６がコンフォーマルに覆われることができる。酸化物層は例えば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、ＳｉＯ２及びＳｉ３Ｎ４の混合物（ＳｉＯｘＮｙ）又は他の任意の適切な酸化物若しくは物質で作られることができる。オプションの酸化物層は、より優れた保護及びカバースリップ取り付けの容易さを提供することができる。
【００４２】
基板１２は、誘電体基板とも呼ばれ、任意の適切な物質で作られることができる。
【００４３】
一例では、基板１２は、光に対して非透過性（又は透過性が低い）である。例えば、基板１２は、シリコン（Ｓｉ）基板、シリコンオンインシュレータ（ＳＯＩ）基板又はゲルマニウム（Ｇｅ）基板である。
【００４４】
別の例では、基板１２は、動作波長において光学的に透明であり、かなりの散乱又は吸収なしに光を透過させることを可能にする。基板１２は完全に透明であってもよい。例えば、基板１２は９０％以上の光を透過させることができる。基板１２は、部分的に透明であってもよい。例えば、基板１２は光の６０％を透過させることができる。例えば、基板は、二酸化ケイ素、二酸化チタン、窒化ケイ素、石英、溶融シリカ、プラスチック、サファイアなどから作られることができる。
【００４５】
基板１２の透明性は、較正スライド１０が透過モードで動作することを可能にし、これは、明視野撮像との組み合わせを可能にする。こうして、サンプル（又は画素レイアウト）は、明視野顕微鏡法において可視であり、これは、迅速な位置決め、サンプル位置決め及び視覚的サンプル検査を可能し、及び従って較正をより迅速にする。
【００４６】
更なる例では、基板１２は、低自己蛍光を備える基板とすることもできる。しかしながら、斯かる基板の自己蛍光は、プラズモン生成光ルミネセンス及び／又は蛍光のコントラストにはあまり影響を与えずに十分に低くなければならない。
【００４７】
金属ナノ構造体１６は、金、銀、銅及びアルミニウムを含む群から選択される金属を有することができる。プラズモン共鳴を生成するのに適した他の金属もまた考慮され得る。オプションで又は好ましくは、金属はアルミニウム又はアルミニウム合金である。アルミニウムは、プラズモン共鳴を紫外線（ＵＶ）に変換する（support）ことができ、これは銀と金には不可能である。更に、アルミニウムは、環境中で安定しており、銀及び金よりも安価である。
【００４８】
用語「ナノ構造体」は、ナノスケールにおける少なくとも１つの寸法を備える構造に関する。
【００４９】
一例では、各金属ナノ構造体は、３０ｎｍから７００ｎｍ、好ましくは６０ｎｍから４５０ｎｍの範囲の断面寸法２８を持つ。断面寸法２８は、金属ナノ構造体１６が配置される基板１２の表面１８に沿った寸法に関する。図１Ｂにおいて、金属ナノ構造体１６は、円形の形状の断面を持つものとして示される。この場合、断面寸法２８は、円形形状の直径に関する。
【００５０】
一例では、各金属ナノ構造体は、１０ｎｍから１μｍ、好ましくは２５ｎｍから１５０ｎｍの範囲の厚さ３０を持つ。用語「厚さ」は、基板１２の表面１８から延びる金属ナノ構造体１６の高さに関する。
【００５１】
図１Ａに示されるように、金属ナノ構造体１６は、基板１２の表面１８に突起を形成することができる。別の例（図示省略）では、金属ナノ構造体１６は、基板１２の表面１８にリセスを形成することができる。
【００５２】
金属ナノ構造体１６は、基板１２の表面１８に沿って周期的に配置されることができる。例えば、図１Ｂにおいて、金属ナノ構造体１６は、２次元正方格子状に配置される。金属ナノ構造体１６はまた、例えば２次元六方格子といった異なる態様で配置されてもよい。
【００５３】
別の例（図示省略）では、金属ナノ構造体１６は、不規則な周期性を備える準周期的態様で配置される。
【００５４】
一例では、隣接する金属ナノ構造体１６の間の距離３２は、１００ｎｍから１ｆＥｆＡｆＣ、好ましくは１８０ｎｍから６５０ｎｍの範囲にある可視光波長に匹敵する。距離３２は、隣接する２つの金属ナノ構造体の中心間の距離であるピッチとも呼ばれる。オプションとして、金属ナノ構造体１６は、互いに結合するよう構成されることができる。
【００５５】
「結合する」という用語は、隣接する金属ナノ構造体間の結合された共鳴に関する。
【００５６】
局在及び結合共鳴の組合せは、広い波長範囲をカバーする異なる色を作成することを可能にする。斯かる組み合わせは、蛍光及び色応答の両方を較正するための較正スライドを設計する柔軟性を提供し得る。
【００５７】
基板１８の表面１８における金属ナノ構造体１６の配置は、画素レイアウト１４を規定する。
【００５８】
図２Ａから図２Ｄは、較正スライド１０の画素レイアウト１４の更なる例の上面図を示す。
【００５９】
図２Ａにおいて、画素レイアウト１４は、単一サイズの金属ナノ構造体１６の格子を有する。各金属ナノ構造体１６は、画素を画定する。
【００６０】
図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄにおいて、色は、複数の金属ナノ構造体ユニット３４の周期性によって設定されるので、各金属ナノ構造体ユニットは大きな画素を規定する。
【００６１】
図２Ｂ及び図２Ｃにおいて、各金属ナノ構造体ユニット３４は、異なる断面寸法を備える金属ナノ構造体１６を有する。
【００６２】
図２Ｄでは、金属ナノ構造体ユニット３４は、画素レイアウト１４の残りの部分とは異なる断面寸法を備える金属ナノ構造体１６を有する。
【００６３】
こうして、較正スライドの表面に様々な特徴がパターン形成されることができる。
【００６４】
図３Ａ及び図３Ｂは、較正スライド１０の蛍光画像の２つの例を示す。図１において、較正スライド１０は小さなスケールの特徴でパターン化される。図２では、較正スライド１０は、大きなスケールの特徴でパターン化される。
【００６５】
金属ナノ構造体１６の画素レイアウト１４は、ナノインプリントリソグラフィ及びドライエッチングを有する群から選択される方法を使用することにより製造されることができる。製造プロセスのため、大きなバッチにわたり、均一性が保証されることができる。これは、標準化の目的に適している。製造プロセスはまた、カスタム蛍光パターン（例えば、図３Ａ及び図３Ｂを参照）を用いて較正スライドをパターン化する際の柔軟性を確実にすることができる。
【００６６】
更に、画素レイアウト１４の同じ領域は、異なる励起波長に曝されるとき大きなスペクトル範囲にわたり蛍光出力を提供することができる点に留意されたい。
【００６７】
図４Ａ及び図４Ｂは、異なる２つの励起波長を備える光に曝されるときの図３Ｂにおける画素レイアウト１４の蛍光画像の２つの異なる例を示す。
【００６８】
言い換えると、同じ較正スライドは、対応する励起波長で励起されるとき、すべての典型的な蛍光チャネルをカバーし得る広い吸収及び発光スペクトルを示すことができる。
【００６９】
「蛍光チャネル」という用語は、４'、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、及びシアニン（Ｃｙ）といった染料に特異的な励起波長及び発光波長の光を選択的に透過する一対の励起及び発光フィルタに関する。
【００７０】
こうして、複数の蛍光染料が必要とされなくてもよい。１つのタイプのプラズモン金属ナノ構造体が、すべての蛍光チャネルを較正することができる。
【００７１】
更に、較正スライドが透過モードで動作し、及び画素が明るい照明下で色を生成することもできるので、同じ較正スライドが、色較正の手段を提供することもできる。
【００７２】
図５は、蛍光及び色較正の両方のための較正スライド１０の例を示す。較正スライド１０は、少なくとも２つの画素サブレイアウト３６を有する。少なくとも２つの画素サブレイアウト３６は、例えば、異なるサイズ及び／又は異なる配列を備える金属ナノ構造体１６を用いて、明るい照明下で異なる色（異なるグレイレベルとして示される）を生成するよう構成される。
【００７３】
これは、選択された色較正方法に関するカラーチャート（又は色目標）の柔軟な設計を提供することができる。例えば、画素レイアウト１４は、２４のグレーフィールド及び２６４のカラーフィールドを備えるＩＴ８色目標を画素サブレイアウト３０の形態で表すことができる。画素レイアウト１４はまた、画素レイアウト３０の形態の８つのカラーフィールドを備えるＭＧＨ（マサチューセッツ総合病院）色目標を表すことができる。従って、画素サブレイアウトは、カラーサンプルとも呼ばれる。
【００７４】
図６は、画素レイアウト１４に加えて、少なくとも１つのレイアウト３８、４０が較正スライド１０の表面１８に設けられる更なる例を示す。少なくとも１つのレイアウト３８、４０は、着色されたマイクロビーズの単層並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含む群から選択される。オプションとして、両方のレイアウト３８、４０が表面１８に設けられる。レイアウト３８は、着色マイクロビーズの単層を有する。レイアウト４０は、解像度及び歪み試験ターゲットを有する。
【００７５】
言い換えると、較正スライド１０は、２つ以上の異なるサンプル又はターゲットを有することができる。例えば、較正スライド１０は、プラズモン効果から生成される光ルミネセンス及び／又は蛍光を備える蛍光ターゲット、着色マイクロビーズの単層、解像度及び歪み試験ターゲット、又はそれらの組み合わせを有することができる。
【００７６】
こうして、蛍光及びファントムの特徴が、プラズモン共鳴で模倣されることができる。焦点及び撮像は、マイクロビーズで評価されることができる。解像度及び歪みターゲットは、解像度及びステッチングアーチファクトを評価する。従って、較正プロセスの効率が改善されることができる。更に、これは、ユーザが、この複雑なサンプルをスキャナ又はスキャナステージに埋め込むことも可能にする。
【００７７】
複数のレイアウトが、任意の適切な方法で基板に堆積されることができる。図６におけるオプションとして示される例では、レイアウト３８のマイクロビーズは、基板１２に化学的に付着される。一方、画素レイアウト１４の金属ナノ構造体、及びレイアウト４０の解像度及び歪みターゲットは、例えば光リソグラフィプロセスにより２つのカバースリップ２６に堆積される。
【００７８】
これは、異なる製造方法で複数のレイアウトを組み合わせることを可能にする。
【００７９】
更に別のオプションとして、画素レイアウト１４に加えて、セリウムをドープしたイットリウム・アルミニウム・ガーネット（ＹＡＧ：Ｃｅ）などの無機蛍光体（図示省略）又はナノ粒子のライン発光体の層が設けられることができる。無機蛍光体の層は、画素レイアウトとオーバレイ又はオーバーラップする態様で構成されることができる。無機蛍光体は、ミクロンからサブ２００ｎｍの範囲の粒径を持つことができる。
【００８０】
こうして、金属ナノ構造体は、例えばナノ蛍光体といった無機蛍光体の共鳴励起を可能にすることができる。これは、光の変換を促進する。更に、それらの高い化学的安定性のため、無機蛍光体は、経時的に劣化しない（又は劣化しにくい）場合がある。
【００８１】
図７は、蛍光顕微鏡の較正システム１００の一例を概略的に示す。較正システム１００は、蛍光顕微鏡４２と、上述の例の１つによる較正スライド１０とを有する。
【００８２】
蛍光顕微鏡４２は、光源４４と、オプションの光学要素４６と、光検出器４８とを有する。光学要素４６は例えば、励起フィルタ５０、ダイクロイックミラー５２（又はダイクロイックビームスプリッタ）、発光フィルタ５４、及び対物レンズ５６（又は複数のレンズ）を有することができる。光源４４、光学要素４６、及び光検出器４８は、光路に配置される。
【００８３】
較正では、光源４４は、実線の矢印で示される光２０を提供するよう構成される。これは、光学要素４６を通過し、破線の矢印で示される光ルミネセンス及び／又は蛍光２２を生成するため、光路に配置された較正スライド１０の金属構造１６（図示省略）により励起波長で吸収される。光検出器４８は、較正試験データとして蛍光画像データを取得するため、光ルミネセンス及び／又は蛍光２２を検出するよう構成される。
【００８４】
図７においてオプションとして示される例では、蛍光顕微鏡４２は、エピフルオレッセンス顕微鏡である。そこでは、励起波長の光２０が、対物レンズ５６を介して較正スライド１０に集束される。較正スライド１０により放出された光ルミネセンス及び／又は蛍光２２は、励起に使用されるのと同じ対物レンズ５６により光検出器４８に集束される。言い換えると、反射された励起光２０のみが、放出された光ルミネセンス及び／又は蛍光と一緒に対物レンズ５６に到達する。従って、エピ蛍光法は、高い信号対雑音比を与えることができる。
【００８５】
蛍光顕微鏡４２は、デジタル病理で使用されることができる。例は、マルチチャンネル蛍光デジタル病理スキャナ、明視野及び蛍光デジタル病理スキャナ、又は明視野、蛍光、及びＦＩＳＨデジタル病理スキャナを含む。
【００８６】
オプションとして、図７に示されるように、較正システム１００は、較正デバイス５８を更に具備する。較正デバイス５８は、記憶ユニット６０及び処理ユニット６２を有する。
【００８７】
記憶ユニット６０は、少なくとも１つの蛍光チャネルの所定の標準較正データを記憶するよう構成される。処理ユニット６２は、取得された較正試験データと記憶された所定の標準較正データとを比較し、少なくとも１つの蛍光チャネルの強度補正プロファイルを生成するよう構成される。強度補正プロファイルは、少なくとも１つの蛍光チャネルについて蛍光顕微鏡で得られた蛍光病理サンプルの蛍光画像データを補正するために提供される。
【００８８】
一例では、強度補正プロファイルは強度補正値である。
【００８９】
更なる例では、強度補正プロファイルは、強度補正マトリクスである。
【００９０】
一例では、較正デバイス５８は、蛍光顕微鏡４２と一体化される。別の例では、較正デバイス５８は、蛍光顕微鏡４２から較正試験データを受信するコンピュータである。
【００９１】
更なるオプションとして、画素レイアウト１４に加えて、少なくとも１つのレイアウト３８、４０が、較正スライド１０の表面１８に設けられ、これは、着色マイクロビーズの単層並びに解像度及び歪み試験を含むグループから選択される（図６参照）。光検出器４８は更に、更なる較正試験データとして少なくとも１つのレイアウト３８、４０の画像データを取得するよう構成される。記憶ユニット６０は、少なくとも１つのレイアウト３２、３４の更なる所定の標準較正データを記憶するよう構成される。処理ユニット６２は、蛍光顕微鏡４２のパラメータを較正するために、取得された更なる較正試験データと記憶された更なる所定の標準較正データとを比較するよう構成される。パラメータは、蛍光撮像システムの焦点品質と、解像度及びステッチングアーチファクトとを含む群から選択される。
【００９２】
蛍光顕微鏡の焦点品質の較正は、強度、面積、密度及び分布を含む群から選択されるマイクロビーズ画像の特性の測定に基づかれることができる。次いで、測定された特性の値は、蛍光顕微鏡を較正するため、更に所定の標準較正データ、即ち既知の値と比較される。
【００９３】
こうして、蛍光、色、焦点品質、解像度及びステッチングアーチファクトを較正するのに、同じ較正スライドが使用されることができる。従って、較正プロセスの効率が改善されることができる。
【００９４】
一例では、較正スライド１０は、蛍光顕微鏡４２に永久的に取り付けられる。
【００９５】
言い換えると、較正スライドは、蛍光顕微鏡４２に一体化されることができる。これは、時間の非常に高い品質を保証することができる。
【００９６】
図８は、光路に配置された光源及び光検出器を含む蛍光顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡を較正する方法２００を示す。
【００９７】
方法２００は、以下のステップを有する。
【００９８】
ステップａ）とも呼ばれる第１のステップ２１０では、較正スライドが、光路内に配置され、光源から光検出器に向かう光で照射される。較正スライドは、基板と、基板の表面に配置された複数の離間した金属ナノ構造体を含む画素レイアウトとを有し、金属ナノ構造体はプラズモン共鳴を生成するよう構成される。較正スライドを照射する光は、プラズモン共鳴を生成する。これは、励起波長の光を吸収し、蛍光顕微鏡を較正するために提供される複数の画素強度値を含む蛍光画像を生成するための光ルミネセンス及び／又は蛍光を生成することを可能にする。
【００９９】
ステップｂ）とも呼ばれる第２のステップ２２０では、蛍光画像の蛍光画像データが較正試験データとして取得される。
【０１００】
ステップｃ）とも呼ばれる第３のステップ２３０において、較正試験データは、蛍光顕微鏡の較正目的のために使用される。
【０１０１】
図５においてオプションとして示される例では、方法ステップｃ）が、以下のサブステップを更に有する。
【０１０２】
サブステップｃ１）とも呼ばれる第１のサブステップ２３２では、所定の標準較正データが提供される。
【０１０３】
サブステップｃ２）とも呼ばれる第２のサブステップ２３４では、取得された較正試験データが、所定の標準較正データと比較され、強度補正プロファイルが生成される。
【０１０４】
サブステップｃ３）とも呼ばれる第３のサブステップ２３６では、蛍光顕微鏡で得られた蛍光病理サンプルの蛍光画像データを較正するため、強度補正プロファイルが使用される。
【０１０５】
図９は、画素レイアウトに加えて、少なくとも１つのレイアウトが較正スライドの表面に設けられる更なるオプションを示す。これは、着色されたマイクロビーズの単層並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含む群から選択される。
【０１０６】
この方法は、以下のステップを更に有する。
【０１０７】
ステップｄ）とも呼ばれる第４のステップ２４０では、少なくとも１つのレイアウトの画像データが、更なる較正試験データとして取得される。
【０１０８】
ステップｅ）とも呼ばれる第５のステップ２５０では、少なくとも１つのレイアウトの更なる所定の標準較正データが提供される。
【０１０９】
ステップｆ）とも呼ばれる第６のステップ２６０では、取得された更なる較正試験データ及び記憶された更なる所定の標準較正データが、蛍光顕微鏡のパラメータを較正するために比較され、上記パラメータは、上記蛍光顕微鏡の焦点品質；並びに解像度及びステッチングアーチファクトを含む群から選択される。
【０１１０】
図１０は、複数のレイアウトを備える較正スライドを製造する方法３００を示し、このレイアウトは、基板の表面に配置された複数の離間した金属ナノ構造体を備える画素レイアウト、着色マイクロビーズの単層、並びに解像度及び歪み試験ターゲットを含み、この方法は、
ａａ）顕微鏡スライドを形成する基板に着色マイクロビーズの単層を堆積させるステップ３０２と、
ｂｂ）２つのカバースリップを形成する２つの異なる基板に画素レイアウト並びに解像度及び歪み試験ターゲットを堆積させるステップ３０４と、
ｃｃ）上記顕微鏡スライドに２つのカバースリップを組み立てて、較正スライドを形成するステップ３０６とを有する。
【０１１１】
金属ナノ構造体は、ナノインプリントリソグラフィ及びドライエッチングを使用して調製されることができる。例えば、基板コンフォーマルインプリントリソグラフィ（ＳＣＩＬ）を使用して、連続的なアルミニウム層上にエッチングマスク（例えばシリカベースのゾルゲル）が規定され、その後、塩素化学に基づかれる異方性反応性イオンエッチングを用いて、このパターン（patter）がアルミニウムに転写される。
【０１１２】
解像度及び歪み目標は、光学リソグラフィプロセスを介して製造されることができる。
【０１１３】
着色マイクロビーズの単層を製造するため、表面にビーズを印刷／スポッティングするステップと、続いて過剰のビーズを洗い流すステップとを含む、特別な化学プロセスが通常必要とされる。
【０１１４】
しかしながら、ＳＣＩＬ又は光学リソグラフィの後に同じスライドにマイクロビーズ単層を作製することは、不可能である。なぜなら、ＳＣＩＬが化学的表面改質を破壊するからである。マイクロビーズの後にＳＣＩＬを作製することも不可能である。なぜなら、ＵＶステップは、表面へのマイクロビーズの結合を破壊し、表面改質は、アルミニウムの堆積を不可能にするからである。ＳＣＩＬ後の光学リソグラフィも不可能である。なぜなら、ＳＣＩＬエッチングは、光学リソグラフィで作られた特徴を破壊するからである。
【０１１５】
すべてのターゲット（画素レイアウト、着色マイクロビーズ、並びに解像度及び歪み試験ターゲット）は非常に異なるプロセスを介して作成され、これらのプロセスは互いに互換性がないが、これらのターゲットは、それらを異なる基材に製造することにより、単一の較正スライドにおいて組み合わせられることができる。
【０１１６】
本発明の実施形態が異なる主題を参照して記載される点に留意されたい。特に、ある実施形態は、方法タイプの請求項を参照して説明されるが、他の実施形態は、デバイスタイプの請求項を参照して説明される。しかしながら、当業者であれば、他の記載がない限り、あるタイプの主題に属する特徴の任意の組合せに加えて、異なる主題に関する特徴間の任意の組合せが、本願に開示されると考えられる点を上記又は下記の説明から推察するであろう。しかしながら、すべての特徴は、これらの特徴の単純な合計より多くの共同効果を提供する態様で、結合されることができる。
【０１１７】
本発明が図面及び前述の説明において詳細に図示され及び説明されたが、斯かる図示及び説明は、説明的又は例示的であると考えられ、本発明を限定するものではない。本発明は、開示された実施形態に限定されるものではない。図面、開示及び従属項の研究から、開示された実施形態に対する他の変形が、請求項に記載の本発明を実施する当業者により理解され、及び実行されることができる。
【０１１８】
請求項において、単語「有する」は他の要素又はステップを除外するものではなく、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数性を除外するものではない。単一のプロセッサ又は他のユニットが、請求項に記載されるいくつかのアイテムの機能を果たすことができる。特定の手段が相互に異なる従属項に記載されるという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを意味するものではない。請求項における任意の参照符号は、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2019505824.tif 000003
【図１Ｂ】
2019505824.tif 000004
【図２Ａ】
2019505824.tif 000005
【図２Ｂ】
2019505824.tif 000006
【図２Ｃ】
2019505824.tif 000007
【図２Ｄ】
2019505824.tif 000008
【図３Ａ】
2019505824.tif 000009
【図３Ｂ】
2019505824.tif 000010
【図４Ａ】
2019505824.tif 000011
【図４Ｂ】
2019505824.tif 000012
【図５】
2019505824.tif 000013
【図６】
2019505824.tif 000014
【図７】
2019505824.tif 000015
【図８】
2019505824.tif 000016
【図９】
2019505824.tif 000017
【図１０】
2019505824.tif 000018
【国際調査報告】
2019505824.tif 000019
2019505824.tif 000020
2019505824.tif 000021