【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)宿主細胞を培養して目的とするポリヌクレオチドを生成し、必要により細胞を回収し、再懸濁させる工程、
b)細胞をアルカリ溶解により崩壊する工程、
c)溶解産物を中和することにより細胞デブリ及び不純物を沈殿させる工程、
d)目的とするポリヌクレオチドを含む溶解産物を工程c)で得られた沈殿から分離する工程、
e)目的とするポリヌクレオチドを精製する工程
を含み、
工程d)で、沈殿及び溶解産物を含む混合物を、下部で、保持材料で部分的に充填されている清澄化反応器中を下方に穏やかに流し、それにより沈殿を保持材料の層の上部及びその中に保持し、透明にされた溶解産物が反応器の下部を通って反応器から出ることを特徴とする、目的とするポリヌクレオチドの生成方法。
【請求項２】
工程d)の反応器中の保持層が粒状材料を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程d)の反応器中の保持層が硬質保持材料を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程d)で、増大する圧力を清澄化反応器の上部から混合物に適用し、それによりその方法を促進し、溶解産物の一定の流出を確実にする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
加圧ガスを適用することにより、圧力を増大する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
一つ以上の洗浄工程を工程d)とe)の間に挿入する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
工程b)で、a)で得られた細胞懸濁液及びアルカリ溶解溶液を粒状材料で充填されている溶解反応器に流し、それにより細胞懸濁液の流れをアルカリ溶解溶液の流れと接触させ、穏やかに混合する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
細胞懸濁液の流れとアルカリ溶解溶液の流れを、溶解反応器に入る前に、更に混合しないで、合わせ、こうして溶解反応器中の粒状材料に流入する場合に充分かつ穏やかに混合されている単一の流れを形成する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞懸濁液と溶解溶液を二つの独立の流れの形態で溶解反応器に導入する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記二つの流れを特定の流量の比で輸送し、それにより細胞懸濁液容積と溶解溶液容積の一定の比を確実にする、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
工程c)で、工程b)で得られた溶解された細胞溶液を連続様式で中和溶液と混合する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
溶解された細胞溶液と中和溶液を一定の流量の比で合わせ、それにより工程b)と工程d)の間の輸送中の混合、中和及び沈殿を確実にする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
濃縮及び／又は状態調節工程を工程d)と工程e)の間に挿入する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
目的とするポリヌクレオチドがプラスミドDNAである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
任意の状態調節工程を含む、工程b)〜e)から選ばれた少なくとも一つの工程を、連続かつ自動化様式で行なう、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
任意の状態調節工程を含む、工程b)〜e)から選ばれた二つの工程の少なくとも組み合わせを、二つ以上の個々の工程を連結することにより、連続かつ自動化様式で行なう、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
加えて、工程a)を工程b)に連結されることにより連続様式で行なう、請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
a)下部にある保持層、
b)保持層より上の位置にある入口、
c)保持層の下の出口、及び
d)保持層の表面に達し、かつアルカリ溶解及び中和後に得られた沈殿及び溶解産物の混合物を反応器に均等かつ穏やかに分配する一つ以上の分配装置
を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法の工程d)を行なうための反応器。
【請求項１９】
単一分配装置が反応器の中央に垂直に配置されている、請求項１８記載の反応器。
【請求項２０】
前記分配装置が前記混合物を入口に送出する供給装置の延長である、請求項１９記載の反応器。
【請求項２１】
分配装置がアパーチャを有する管である、請求項１８から２０のいずれか１項記載の反応器。
【請求項２２】
前記管がその中央にロッドを有する、請求項２１記載の反応器。
【請求項２３】
分配装置がアパーチャを有するコイルである、請求項１８から２０のいずれか１項記載の反応器。
【請求項２４】
前記分配装置がシュートである、請求項１８記載の反応器。
【請求項２５】
圧縮ガスの供給のための装置を更に含む、請求項１８記載の反応器。
【請求項２６】
粒状材料で充填されているフロースルー容器を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法の工程b)を行なうための溶解反応器。
【請求項２７】
容器がシリンダの形態である、請求項２６記載の反応器。
【請求項２８】
粒状材料がガラスビーズを含む、請求項２６又は２７記載の反応器。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
pDNAに基づく治療処置は古典的化学薬物又は組換えタンパク質による処置の別法であると考えられる。予備臨床試験及び臨床試験に必要とされるpDNAの増大する量のために、製造規模で行ない得る方法についての要望がある。これらの生産方法は規制要件（FDA、EMEA）を満足する必要があり、経済的に実現可能であるべきである。
従来、バイオテクノロジー的生産方法の大半は精製された組換えタンパク質の製造のために開発されていた。ポリヌクレオチドとタンパク質の間の物理化学的性質の相違のために、これらの方法はポリヌクレオチドの生産に容易には適し得ない。こうして、ポリヌクレオチドに適用し得る方法、特に製造規模のプラスミドDNAの生産についての要望がある。
簡単に言えば、組換え生物分子（これらは宿主により分泌されない）、特にDNA及び大きいタンパク質の生産方法は下記の工程に従う。
a)  発酵（目的とする生物分子を有する細胞の培養及び必要により発酵ブロースからの細胞の回収）、
b)  細胞の崩壊（細胞からの目的とする生物分子の放出）、
c)  単離及び精製（不純物からの目的とする生物分子の分離）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
これらの工程は更に詳しくは以下のように、ポリヌクレオチドの生産、特にpDNAの生産について特徴づけられる。
現在、E.coliがpDNA生産に最も普通に使用される宿主である。その他のバクテリア、酵母、哺乳類及び昆虫の細胞がまた発酵工程における宿主細胞として使用されてもよい。好適な宿主株の選択がpDNA品質に大いに重要である。高い細胞密度及びプラスミドコピー数並びに発酵中のその安定な管理が強い経済的方法に重要である。この目的のために、良く特定された培地が必要とされる。発酵の終点及び細胞回収（これは通常発酵に続く）中の条件が、ポリヌクレオチドの品質に寄与する（Werner RG, Urthaler J, Kollmann F, Huber H, Necina R, Konopitzky K (2002) Contract Services Europe, Pharm. Technol. Eur.の補遺 34頁）。
発酵後に、細胞が、たいていは遠心分離により、通常回収される。回収された湿潤バイオマスが適当な緩衝液中で再懸濁される。タンパク質、gDNA、RNA及びその他の宿主関連不純物からの目的とするポリヌクレオチドの最終の単離（例えば、カラムクロマトグラフィー、超ダイアフィルトレーション、抽出又は沈殿）の前に、細胞が直接に、又は凍結そして解凍後に、プロセシングされる必要がある。更なるプロセシングの前に細胞を回収し、再懸濁させることとは別に、発酵ブロースそれ自体が更なるプロセシングにかけられてもよい（WO 97/29190）。
プロセシングは細胞の崩壊で始まり、目的とするポリヌクレオチドの最初の単離工程（これはまた“捕捉工程”と称される）で終了する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
細胞の崩壊は物理的方法、化学的方法又は酵素的方法により達成し得る。現在利用できる操作の殆どが細胞からのタンパク質の放出のために開発され、或る種の適合化なくしてはポリヌクレオチドに使用し得ない。確立された技術の制限はタンパク質とポリヌクレオチドの間の物理化学的性質の相違のためである。タンパク質の回収に最も普通の技術である、高圧均一化は、ポリヌクレオチドのサイズ依存性せん断力感受性及びgDNAの可能な分解のためにそれらに使用し得ない（Carlson A, Signs M, Liermann Lら, (1995) Biotechnol Bioeng 48:303）。化学的方法（Foster D (1992) Biotech 10, (12):1539）及び酵素的方法（Asenjo JA, Andrews BA (1990) Bioprocess Techmol 9:143）は最小の機械的応力及びプラスミドの最小の不可逆的劣化を生じる。それは最も穏やかな方法であるので、リゾチームを利用する酵素的崩壊が実験規模の特別な方法である。典型的には、リゾチームは動物由来であり（最も普通にはニワトリ卵白から）、それ故、その使用は潜在的な健康リスク（プリオン）であり、FDA又はEMEAのような規制当局により問題と考えられている。組換えリゾチームの使用は高い原料コスト及び分析努力を伴う。細胞の熱処理が、WO 02/057446 A2及びWO 96/36706に記載されているように、せん断力を回避する崩壊技術の別の選択肢である。微生物の懸濁液がシンクヒーター又はフィルター（濾過助剤とともに）中の80℃への短時間暴露（30秒〜数分）によりプロセシングされる。この方法は洗剤（例えば、トリトン（登録商標））及びリゾチームと組み合わせて通常行なわれる。
通常、バクテリア細胞からのプラスミドDNAの崩壊及び放出はBirnboim及びDoly（Birnboim HC, Doly J (1979) Nucl Acids Res 7:1513）により記載されたようにアルカリ溶解（化学的方法）により行なわれる。
そこに記載された崩壊／放出方法は二つの工程に分けられ、最初の工程は固有の細胞崩壊又は溶解工程であり、第二の工程は中和工程である。
アルカリ溶解中に、細胞が洗剤（好ましくはSDS）と組み合わせてアルカリ溶液（好ましくはNaOH）に暴露される。この環境では、細胞壁構造が分解され、それにより目的とするポリヌクレオチド及びその他の細胞関連化合物を放出する。最後に、その溶液が酸性塩、好ましくは酢酸塩、特に酢酸カリウム（KAc）又は酢酸ナトリウム（NaAc）の溶液の添加により中和される。アルカリ条件はスーパーコイル構造を巻き戻すことによりpDNAの変性をもたらす。12〜12.5のpH値まで、相補ストランドの完全分離が防止される。これは、pHが再度低下される場合に、プラスミド分子の完全再生を可能にする。pH値が再生限界を超える場合、分離されなかった領域が失われ、pDNAが不可逆的に変性される。この段階で、ポリヌクレオチドは一本鎖物質の大きいドメインを含む（疎水性塩基の大きい暴露により）（Diogo MM, Queiroz JA, Monteiro GA, Prazeres DMF (1999) Analytical Biochemistry 275:122）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
その後の状態調節工程において、塩組成及び／又は透明にされた溶解産物の導電率及び／又はpH値がその後の捕捉工程で樹脂への結合を確実にする値（実験により測定されるべきである）に調節される。幾つかの状態調節方法が、例えば、WO 97/29190 A1、WO 02/04027 A1及びWO 98/11208 A1に記載されていた。EP 0814156 A2、WO 93/11218 A1、EP 0616638 B1及びEP 087527 A2に記載された方法では、状態調節工程は先の工程が行なわれたのと同じ装置中で洗浄かつ溶離工程として行なわれる。
更に、最終の精製の前の前処理として、“エンドトキシン除去(ER)緩衝液”（キアゲン（登録商標））（WO 00/09680 A1）又はトリトンX-114（登録商標）（WO 99/63076 A1）の添加が示唆されていた。
操作工程を連結しないそれらの操作の非連続かつ非自動化様式が記載された方法の全てに共通である。
目的とするポリヌクレオチドの捕捉について、幾つかの技術、例えば、接線流濾過（WO 01/07599 A1）、サイズ排除クロマトグラフィー（WO 96/21729 A1、WO 98/11208）、陰イオン交換クロマトグラフィー（WO 00/09680 A1、米国特許第6,410,274 B1号、WO 99/16869）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（WO 02/04027 A1）が当業界で知られている。
例えば、EP 081456 A2、WO 93/11218 A1、EP 0616638 B1及びEP 0875271に記載された方法について、上記工程の幾つかを組み合わせることが既に示唆されており、これらによれば、細胞溶解、中和、清澄化、洗浄、必要により状態調節及び捕捉が同じ装置中で行なわれる。典型的には、これらの方法は幾つかの保持工程を含む非自動化／非連続様式で操作される開放系である。装置は実験規模についてのみ好適であり、製造規模に転用し得ない。また、これらの技術はcGMP大規模生産について再現性及び適性を欠如している。
また、異なる装置を利用する組み合わせが記載されており、この場合、個々の工程が互に直接連結される。
二つ以上の工程の連続の組み合わせが幾つかの特許明細書に記載されていた。WO 96/02658 A1は熱溶解と遠心分離による清澄化の組み合わせを記載し、WO 00/09680 A1及びWO 02/26966 A2はアルカリ溶解と中和を組み合わせることを示唆している。米国特許第2001/0034435 A1号及びWO 97/23601 A1に記載された方法は三つの工程、細胞の再懸濁、アルカリ溶解及び中和を組み合わせる。WO 00/05358 A1及びWO 99/37750 A1はアルカリ溶解、中和及び遠心分離による清澄化の組み合わせを記載している。
これらの方法のいずれもが単離操作の三つより多い工程を組み合わせておらず、最初の工程が再懸濁工程であり、最後の工程が捕捉工程である。溶解及び中和中に溶液を接触させるためにこれらの方法に使用される装置は均一な混合を保証しないし、又は不利なせん断力を溶質に適用するかもしれない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の目的は既知の方法の制限を解消する、目的とする生物分子、特にポリヌクレオチドを細胞培養液から単離する方法を提供することであった。このような方法は治療上適用し得るポリヌクレオチドの生産に好適であるべきである。こうして、このような方法はRNase及びリゾチームのような酵素の使用又はSDSとは別の洗剤の使用を必要とすべきではない。
特に、本発明の目的は、細胞崩壊工程として、改良されたアルカリ溶解方法を含む製造規模で、目的とするポリヌクレオチド、特にプラスミドDNAを単離するための自動化可能かつスケールアップ可能な方法を提供することであった。アルカリ溶解工程に加えて、その方法は中和工程、清澄化工程、及び必要により状態調節工程及び／又は濃縮工程を含むべきである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の基礎にある課題を解決するために、下記の工程が採用された。
溶解産物の清澄化は連続かつ自動化された方法で目的とする生物分子を単離する方法を行なうのに制限工程であると考えられたので、一連の実験において、幾つかの異なる方法が清澄化の問題に取り組むために研究された。驚くことに、或るレベルまでガラスビーズで充填され、下部に出口を有するタンクが、優れた清澄化結果を与え、全プロセスの自動化を可能にすることがわかった。
更に、改良された清澄化工程と組み合わされてもよいアルカリ溶解によりバクテリア細胞の崩壊を達成するための改良された方法を提供することが探究された。この目的のために、幾つかの混合技術が異なって着色された試験溶液を使用する予備実験で試験された。
驚くことに、ガラスビーズで充填された管がこの管中をポンプ輸送することにより一緒にされる場合に２種の溶液の充分な混合及び接触をもたらすことがわかった。この知見は、２種の溶液として、再懸濁された細胞懸濁液及び溶解溶液を使用する場合に確かめられた。
溶解された細胞溶液を中和溶液と混合するための操作が試験された場合に、更に予期されない結果が得られた。ポンプ輸送された溶解された細胞溶液の流れを通常のＴコネクターによりポンプ輸送された中和溶液の流れと連結した後に、特別に延伸された管が溶液の満足な混合及びコンパクトな容積の大きいフロックの形成をもたらし、これらが強いせん断力により影響されないことがわかった。
これらの知見が単一工程を連続様式で操作でき、かつ自動化し得る系に組み合わせることにより更に発展された。
本発明は
a)細胞を培養して目的とする生物分子を生成し、必要により細胞を回収し、再懸濁させる工程、
b)細胞をアルカリ溶解により崩壊する工程、
c)溶解産物を中和することにより細胞デブリ及び不純物を沈殿させる工程、
d)溶解産物を工程c)で得られた沈殿から分離する工程、
e)目的とする生物分子を精製する工程
を含み、
工程d)で、沈殿及び溶解産物を含む混合物を、下部で保持材料で部分的に充填されている清澄化反応器中を下方に穏やかに流し、それにより沈殿を保持材料の層の上部及びその中に保持し、透明にされた溶解産物が反応器の下部中の出口を通って反応器から出ることを特徴とする、宿主細胞により分泌されない生物分子の生成方法に関する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
工程a)〜c)及び工程e)は既知の方法、好ましくは連続的に運転でき、かつ自動化し得る方法に従って行なわれてもよい。
a)  発酵／培養
本発明の方法において、特に目的とする生物分子がpDNAである場合に、E.coliが宿主として使用されることが好ましい。
本発明の一実施態様において、連続運転される装置、例えば、管遠心分離機又はセパレーターが、細胞を培地から分離するのに使用される。細胞（バイオマス）が更なるプロセシングの前に凍結される場合、細胞が回収後に直接に、又は好適な緩衝液、典型的にはpH 8で0.05Mトリス、0.01M EDTAを含む緩衝液中の細胞の再懸濁後に凍結し得る。この場合、再懸濁緩衝液はアルカリ溶解の前に添加されるべきではなく、又はそれは一層低い量で必要とされる。
発酵で得られるバイオマスは、更にプロセシング（再懸濁、溶解等）される前に、凍結、特に低温ペレット化されてもよい。低温ペレット化は細胞を貯蔵のために調製するのに有利な方法である。この方法は細胞の速い凍結を保証するので、バイオマス内の、望ましくない温度勾配が回避し得る。通常の冷蔵庫中の遅い凍結は不均一な凍結及び氷結晶の構築をもたらすことがあり、これは細胞を損傷し、それらの貯蔵寿命及び目的とするポリヌクレオチドの品質を低下し得る。バイオマスが再度解凍される場合に、同じことが観察されるかもしれない。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
溶解反応器（これはまた本発明の主題である）は、粒状材料で充填されている通気容器、好ましくはシリンダー又は管として形成された中空ボディ、特にガラス又はステンレス鋼管である。管はまたプラスチック又は生物医薬製造に許されるあらゆるその他の材料からつくられてもよい。粒子、特にビーズ（これらはガラス製であることが好ましいが、ステンレス鋼、プラスチック又はその他の材料からなることができる）が、ランダム様式で反応器に詰められ、その結果、それが粒子間のランダムなサイズ及び形状の自由空間で完全に、又は実質的に完全に充填される。このために、溶解反応器の機能性は２種の溶液が溶解反応器に入る前にそれらの溶液の流れが連結されるか否か、そしてその方法とは独立である。溶液が装置中で直接合わされることがまさに可能である。ビーズは等しい直径又は異なる直径のものであってもよく、それらのサイズはその方法が行なわれる規模に依存し、一般に約1mmから約100mmまでの範囲である。好ましい実施態様において、ビーズの直径は5mmである。ビーズに代えて、充分な混合を与えるその他の充填要素、例えば、ロッド、ガラス繊維のような繊維材料、シフトされた層中のグリッド、ネット、又は不規則な形状の粒子が使用し得る。溶液の混合は装置中の流れの方向により制限されず、それはあらゆる方向、例えば、垂直に上向き又は下向き、水平又はあらゆる角度で行なわれてもよい。
工程b)のパラメーター及び本明細書に使用される装置の寸法は均一な混合が保証され、かつ所望のポリヌクレオチドの変性を避けるために接触時間が５秒から５分以上までの或る範囲、好ましくは１〜３分に保たれるように設計されることが有利である。これらのパラメーターは装置の寸法、詰められたビーズ間の自由体積及び流量により調節し得る。細胞の適当なアルカリ溶解に関する接触時間は宿主株に依存し、目的とする生物分子とは独立であり、pDNAの場合には、それはプラスミドサイズ又はプラスミドコピー数(PCN)とは独立である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
d)  分離／清澄化及び必要により洗浄
工程d)において、沈殿及び溶解産物を含む工程c)で得られた混合物（これはpDNAの場合、通常タンパク質の場合には目的とする生物分子を含む）が、下部に、保持層を含む清澄化反応器に下向きに穏やかに流され、それにより沈殿が保持層の上及び中に保持され、透明にされた溶解産物が反応器の下部中の出口を通って反応器から出る。清澄化反応器の上部の通気弁が、通常の場合には、完全に閉じられている場合、清澄化反応器中の自由体積がフロック／溶解産物混合物の増大するレベルのためにその方法の経過中に減少する。それ故、反応器中の圧力が時間につれて絶えず増大する。これが更に取り扱わないで得られる一定の流出をもたらす。
好ましい実施態様において、工程d)では、清澄化反応器中の保持層が粒状材料を含む。
別の実施態様において、その方法を促進するために、増大する圧力が、例えば、加圧ガス、特に空気を反応器の上部から適用することにより、清澄化反応器中の混合物に適用される。通常、圧力の適用はその方法の開始時に必要とされないが、その方法が進行する時に必要とされる。通常、圧力は段階的に、例えば、0.2バールの範囲で増大され、その間隔は沈殿／溶解産物混合物の前もって決めたアリコートが反応器に入った時点により特定される。また、圧力は連続的に増大されてもよい。
清澄化反応器〔その中で、フロック（これらは、pDNAの場合には、gDNA、タンパク質、細胞デブリ及びSDSの共沈である）を含む混合物が更にプロセシングされ、またこれは本発明の主題である〕は、ガラス、ステンレス鋼、プラスチック又は医薬製造に許されるあらゆるその他の材料からつくられてもよい。好ましい形状は円筒形であるが、原則として夫々のその他の中空ボディが可能である。本発明の方法における工程d)は反応器の形状とは独立である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
分離プロセスの経過中に、フロックが反応器中で浮遊し、一方、透明な溶解産物が保持層中を通過する。浮遊していないフロックが保持層により保持される。フロックの浮遊を改良するために、清澄化反応器は保持材料の下もしくはその中、又はそれの直接上に、圧縮ガス、例えば、空気の供給のための連結部分を備え得る。ガスを液体／フロック混合物に穏やかに供給することにより、フロックが一層有効に浮遊し得る。
好ましい実施態様において、圧縮ガス、例えば、空気の供給のための連結部分は清澄化反応器の上部に配置される。この場合、清澄化反応器は耐圧性であるべきである（上部の通気弁が閉じられる場合に、圧縮ガスがたとえ供給されなくても、反応器中の圧力が増大するので、反応器は６バールまで耐圧性であるべきである）。圧縮ガスを適用することにより、清澄化プロセスが促進でき、これは出口の流れを増大すると、同時に生物分子を損傷し得るせん断力を回避する非常に穏やかな方法である。
圧力はフロックが、特に操作の終了時に、保持材料中に押しやられないような範囲であるべきである。適用圧力は好ましくは0.1〜３バール、最も好ましくは２バールまでの範囲である。得られる中和された溶解産物は目視で透明であり、通常クロマトグラフィー技術により直接に更に捕捉され、プロセシングし得る。
分離／清澄化工程d)の終了時に、フロック（これらは、特に一層大きい粒状材料又は一層大きい細孔を有する硬質保持材料を使用する場合に、保持層の上そしておそらくまたその中に存在する）の間の残留液体が、圧力を適用することにより回収し得る。これはフロックの排出をもたらす。
これは目的とする生物分子、例えば、プラスミドDNAを含み、通常回収し得ず、又はほんの不十分に回収し得るフロック間の残留液体が、最大の収率で得られる点で利点を与える。こうして、実際に全溶解産物が透明な溶液として得られる。
加えて、一つ以上の洗浄工程が工程d)とe)の間に挿入されてもよい。この場合、工程d)の終了時に、フロックが溶液を二つの方向のいずれか又は両方の方向で、即ち、反応器の入口及び／又は出口からフロック中に連続的又は同時にポンプ輸送することにより、フロックを再溶解しない好適な緩衝液、例えば、pH 5.5の3M酢酸カリウム、又は再懸濁、溶解（SDSを用いない）及び中和工程に使用された溶液の、例えば、1:1:1の比の混合物で洗浄される。ポンプ輸送が入口から行なわれる場合、洗浄工程は連続的又はバッチ式であってもよい。それが出口から行なわれる場合（これが好ましい）、洗浄緩衝液が入口までのタンクにポンプ輸送されてもよいが、これを必要としない。次いで溶液が上記されたのと同じ方法（圧縮空気）を適用して、出口で回収される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
e)  精製
本発明の工程a)〜d)後のプロセスはその後のクロマトグラフィー工程における目的とする生物分子の単離（捕捉）及び精製を促進する。
樹脂による捕捉／精製の前に、溶液のパラメーター（塩組成、導電率、pH値のような）を調節してクロマトグラフィー支持体、通常樹脂への所望の生物分子の結合を確実にすることが必要であるかもしれない（この工程が、本発明の意味で、“状態調節工程”と称される）。最も簡単な状態調節操作は、特にその後の捕捉工程におけるクロマトグラフィー樹脂が陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られる場合（WO 97/29190 A1）、水又は低塩緩衝液による透明にされた溶解産物の希釈である。更に、特に疎水性相互作用クロマトグラフィーが最初の精製工程として使用される場合には、高濃度の塩溶液が添加されてもよく、おそらく得られる沈殿（これは溶液中の或る塩濃度が越えられる場合に存在する）が濾過又は遠心分離により分離される（WO 02/04027 A1）。硫酸アンモニウムが高濃度で使用される場合には、この処理はRNA含量を低下する（WO 98/11208 A1）。
捕捉及び精製について、幾つかの工程が適用されて医薬に関する要件を満足する高度に精製された生物分子を得る。先の工程について、酵素、洗剤及び有機溶媒が避けられるべきである。単離及び精製は当業界で知られている方法に従って、特に異なるクロマトグラフィー技術（陰イオン交換クロマトグラフィーAIEC、疎水性相互作用クロマトグラフィーHIC、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)）、限外濾過（ダイアフィルトレーション）、濾過又は沈殿及び抽出の組み合わせにより行なわれる。特に治療適用のためのpDNAを得るための、有利に使用し得る方法は、異なるクロマトグラフィー原理に基づく二つの工程の組み合わせを含み、その二つの工程のいずれかは疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、極性相互作用クロマトグラフィー(PIC)及び陰イオン交換クロマトグラフィー(AIEC)から選ばれ、二つの工程の少なくとも一つ、好ましくは両方の工程において、クロマトグラフィー支持体は多孔性モノリス床、好ましくはモノリスカラムの形態の硬質メタクリレートをベースとするモノリスである。好適なモノリスカラムがトレードマークCIM（登録商標）としてBIAセパレーションズから市販されている。この精製プロセスは管中管系を含む単一モノリス床の形態のクロマトグラフィー支持体で有利に行なわれてもよく、その外管及び内管は異なる機能性部分を有する。このような系では、モノリス管の一つが一つの工程のクロマトグラフィー原理のための支持体に相当し、別の管が別の工程のクロマトグラフィー原理のための支持体に相当する。好ましくは、捕捉／精製工程は環状クロマトグラフィー、カロセル(carousel)クロマトグラフィー又は模擬移動床方法の如き技術を使用して、バッチ様式又は準連続様式もしくは連続様式で行ない得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明の方法はせん断力に感受性である生物分子、好ましくはポリヌクレオチド、特にプラスミドDNA、及び大きいタンパク質、例えば、抗体に適しているが、これらに限定されない。
本発明の方法は目的とするあらゆる生物分子について使用し得る。タンパク質の生成について、それは目的とするタンパク質の特別な要望が満足されるように設計されてもよい。本発明の方法は発酵方法及びタンパク質の起源（例えば、バクテリア、酵母）とは独立である。
細胞崩壊及びその後のプロセシング工程に適した特別な方法の選択は発酵後の細胞中のタンパク質の状態により強く影響される。
タンパク質が過剰発現される場合、それは所謂“封入体”の形態で存在してもよい。この場合、例えば、溶解中の還元剤（例えば、DTT）と組み合わせて強アルカリによる処理がタンパク質（これは、この段階では、変性された形態である）の再可溶化をもたらす。
タンパク質の自然構造を再生するために、再折り畳みが中和反応器中又は溶解反応器と同様の第二反応器中で中和（例えば、リン酸の添加による）により達成し得る。不溶性成分が清澄化反応器中でタンパク質含有溶液から分離される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
目的とするタンパク質が細胞中で可溶性である場合、細胞が上記と同様の様式で溶解反応器中で崩壊される。
溶解反応器中で、条件（接触時間、溶解溶液の濃度）はタンパク質が可溶性に留まるような方法で選ばれてもよく、又は、パラメーターがタンパク質を特別に変性し、沈殿させるように設定される。最初の場合には、溶液が中和反応器（これは、構造に関して、溶解反応器又はポリヌクレオチドに使用された中和反応器と同様である）及び可溶化封入体について記載されたような清澄化反応器中で更にプロセシングされる。タンパク質がその変性状態である場合、沈殿が既に溶解反応器中で、又はその後に中和反応器（中和剤及び／又は沈殿剤の添加による）中で行ない得る。両方の場合、沈殿に関する条件は目的とするタンパク質を特別に沈殿させるように選ばれることが好ましい（一方、例えば、RNA、エンドトキシン、及びDNAのような望ましくない不純物は可溶性に留まる）。沈殿は続いて清澄化反応器中で溶液から分離される。その後、沈殿は清澄化反応器から除去され（例えば、吸引又は適当な緩衝液によるフラッシングアウトにより）、又はこの装置中で直接に更にプロセシングされる。それが反応器から除去された後に、沈殿が好適な緩衝液（これはケースバイケース基準で実験により決められる）を使用してセパレート容器中で再可溶化される。沈殿が清澄化反応器中に残る場合、再可溶化がそこで行なわれる（好適な緩衝液の添加及び必要により混合による）。沈殿（特に目的とするタンパク質）が再可溶化されるとすぐに、それが下部中の出口を通って清澄化反応器から容易に除去し得る。
得られるタンパク質溶液を更にプロセシングすることに関する選択肢がタンパク質の生成における本発明の方法の全ての変化に共通である。付加的な再折り畳み工程の他に、ポリヌクレオチド溶液のプロセシングについて記載されたのと同じ工程（連続又は非連続の濃縮、状態調節、濾過、捕捉）が行なわれてもよい。