【手続補正書】
【提出日】平成19年6月29日(2007.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
ａ）天然のまたはリコンビナント細菌株から単離したＮ−アセチルヘパロサン多糖のＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化、
ｂ）グルクロニルＣ５−エピメラーゼ酵素を用いた酵素的エピマー化、
ｃ）部分的Ｏ−硫酸化とそれに続く部分的Ｏ−脱硫酸化、
ｄ）部分的６Ｏ−硫酸化、
ｅ）Ｎ−再硫酸化、
を含み、さらに工程ｂ）、ｃ）、ｄ）のいずれかの後に制御された解重合工程を含む、アセチルＮ−ヘパロサンを原料としてグリコサミノグルカン−硫酸塩を製造する方法であって、
前記方法は、工程ｃ）の部分的Ｏ−硫酸化が１０時間未満の時間で、かつ前記硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンのモル比が５以下で実施されること、および、工程ｄ）の部分的６Ｏ−硫酸化が２時間以下の時間で、かつ硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンの水酸基のモル比が２以下で実施されることを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ｄ）とｅ）の順番を逆にして実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
中間的な解重合が、工程ｂ）のエピマー化の後に実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）のＯ−硫酸化は、硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンのモル比が２．５未満で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記モル比が、１．５以下である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｄ）の部分的Ｏ−硫酸化が、６時間以下の時間で実施される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｄ）の部分的Ｏ−硫酸化が、１．５以下の硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンの水酸基のモル比を用いて実施される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）の６Ｏ−硫酸化が、６０分以下の時間で実施される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
硫酸化が、３０分以下の時間で実施される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）のＮ−アセチルヘパロサン多糖が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ５から単離される、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項１１】
アンチトロンビンIIIまたはその断片を結合した基質上で実施される親和性選択工程ｆ）を追加で含むことを特徴とする、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｃ）の部分硫酸化および工程ｄ）の６Ｏ−硫酸化が、トリエチルアミン−ＳＯ3、トリメチルアミン−ＳＯ、ピリジン−ＳＯ3からなる群から選ばれる硫酸化剤を非プロトン性極性溶媒中で使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
非プロトン性極性溶媒が、ホルミル基を供給しない溶媒である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
非プロトン性極性溶媒が、テトラメチレンサルフォン、２，４−ジメチルスルフォラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、またはＮ,Ｎ−ジエチルアセトアミドの中から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｄの部分的Ｏ−硫酸化が、４℃から３０℃の範囲の温度で実施される、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度が、１０℃から２５℃である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
中間的な制御された解重合が、化学的または物理的方法により実施される、請求項１〜１６いずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記物理的方法がガンマ線照射を含み、かつ前記化学的方法が、亜硝酸若しくはその塩での処理、またはベータ解離、または過ヨウ素酸またはフリーラジカル処理である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
解重合が、亜硝酸またはその塩により実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
亜硝酸またはその塩と多糖の比が多糖１ｇあたり１から１００ｍｇであり、かつ、反応が４℃から１０℃の温度で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
制御された解重合が、亜硝酸またはその塩の存在下で、かつ３０分未満の時間で実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
亜硝酸塩が、亜硝酸ナトリウムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
解重合が、モル過剰のホウ化水素を加えることで停止される、請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
下記の工程：
ａ）天然のまたはリコンビナント細菌株から分離したＮ−アセチルヘパロサン多糖のＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化、
ｂ）グルクロニルＣ５−エピメラーゼ酵素を用いた酵素的エピマー化、
ｃ）部分的脱Ｏ−硫酸化と組み合わせた部分的Ｏ−硫酸化、
ｄ）部分的６Ｏ−硫酸化、
を含み、かつ、工程ｂ）、ｃ）、ｄ）のいずれかの後に制御された解重合工程を含む、アセチルＮ−ヘパロサンを原料として硫酸化グリコサミノグルカンを製造する方法であって、
工程ｃ）の部分的Ｏ−硫酸化が１０時間以下の時間で、かつ前記硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンのモル比を５以下として実施されること、および、工程ｄ）の部分的６Ｏ−硫酸化が２時間以下の時間で、かつ前記硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンの水酸基のモル比が２以下で実施されること、および、工程ｃ）とｄ）のＯ−硫酸化がトリエチルアミン−ＳＯ3、トリメチルアミン−ＳＯ、ピリジン−ＳＯ3の中から選ばれた硫酸化剤を使用して非プロトン性極性溶媒中で実施されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
工程ｃ）のＣ５エピマー化反応が、３５℃以下の温度で実施されることを特徴とし、かつグルクロニルＣ５−エピメラーゼは、抽出またはリコンビナントであって、固定相に固定化されたものである、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
リコンビナントＣ５エピメラーゼが、昆虫または酵母細胞で発現したマウス酵素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記温度が、１５℃から３０℃である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記温度が、２０℃から２５℃である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固定相が、ＣＮＢｒで活性化されたエポキシ基またはジオール基を有するポリスチレンまたはポリメタクリル樹脂であり、かつＣ５エピメラーゼの固定化が、１００から３００ｍＭ濃度の炭酸水素ナトリウムを含む緩衝液中または１０から５０ｍＭ濃度のリン酸緩衝液中で、７．０から８．３の範囲のｐＨで、４℃から２５℃の範囲の温度で、１２から７２時間の範囲の時間で実施される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｃ）のエピマー化が、１０から３０ｍＭのＥＤＴＡ、７０から１５０ｍＭのＣａＣｌ2を含み、ｐＨが５．５から８．０の範囲であるＨＥＰＥＳ緩衝液中で実施される、請求項２５〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０に記載の方法で得られ得る変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３２】
１５０００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項３１に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３３】
３０００から９０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項３２に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３４】
分子中にホルミル基を含まないことを特徴とする、請求項１３に記載の方法で得られ得る変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３５】
還元末端に硫酸化２,５無水マンニトール残基を有することを特徴とする、請求項３１〜３４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３６】
無水マンニトールの位置１，３および６の水酸基が部分的に硫酸化されている、請求項３５に記載のＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項３７】
無水マンニトールの位置１および６の水酸基が部分的に硫酸化されている、請求項３６に記載のＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項３８】
位置１の水酸基の硫酸化比率が２０％から８５％の範囲である、請求項３７に記載のＮ−アセチルヘパロサンのＫ５ＯＳ６ＯＳＮＳ−ｅｐｉ。
【請求項３９】
グルコサミンの位置６の水酸基の硫酸化比率が４０％より高い、請求項３７に記載のＮ−アセチルヘパロサンのＫ５ＯＳ６ＯＳＮＳ−ｅｐｉ。
【請求項４０】
硫酸化比率が５０％から８５％の範囲である、請求項３９に記載のＮ−アセチルヘパロサンのＫ５ＯＳ６ＯＳＮＳ−ｅｐｉ。
【請求項４１】
グルコサミンの位置３の水酸基の硫酸化比率が６０％より低い、請求項３６に記載のＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項４２】
請求項２４に記載の方法で得られ得るＫ５ＯＳ６ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ。
【請求項４３】
請求項２４の工程ａ）〜ｃ）記載の方法で得られ得るＫ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ。
【請求項４４】
血漿の存在下で測定した抗因子Xa活性が、５０  ＩＵ／ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項３１〜４１に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４５】
抗因子Xa活性と因子IIa阻害活性の比率が、１．０以上であることを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４６】
抽出ヘパリンと比較して、ＴＦＰＩ活性化活性度が同等以上であることを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４７】
抽出ヘパリンより高いヘパリナーゼＩ耐性を有することを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４８】
トロンビンとXa因子プロテアーゼの生成を抑制することを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４９】
抽出ヘパリンと比較して、ＰＦ４因子に対する低い親和性を有することを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５０】
抽出ヘより高いパリンＨＣII因子により特徴づけられる、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５１】
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの多重シグナルが７９から８９ｐｐｍの領域で無水マンニトールのシグナルと比較して多く、かつ５１および１６５ｐｐｍにはシグナルが無いこと、および、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルが７−９．５ｐｐｍの領域にシグナルが無いこと、を特徴とする、請求項４４〜５０に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５２】
図２に対応する1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する請求項５１に記載のＫ５ＯＳ６ＯＳＮ−ｅｐｉ。
【請求項５３】
図７に対応する13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する請求項５１に記載のＫ５ＯＳ６ＯＳＮ−ｅｐｉ。
【請求項５４】
薬理学用途のための請求項３１〜４１および４４〜５３に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５５】
ヘパリン様の抗血栓活性と抗凝固活性を有する薬剤の製造用途への、請求項５４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５６】
線溶活性と抗凝集活性を有する薬剤の製造用途への、請求項５４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５７】
不安定な狭心症、心筋心臓発作、深刻な静脈血栓症、肺塞栓症、および虚血症諸症状に対する予防と治療用の薬剤の製造用途への、請求項５５に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５８】
敗血症および汎発性血管内凝固症候群（ＣＩＤ）のような併発症の治療用の薬剤の製造用途への、請求項５５〜５６のいずれかに記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５９】
不安定な狭心症、心筋急性心臓発作、静脈および動脈血栓症、肺塞栓症、虚血症諸症状および動脈硬化に対する予防と治療用の薬剤の製造用途への、請求項５６に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項６０】
先天的または後天的なアントロビンIII欠乏症に起因する血栓症症状に対する予防と治療用の薬剤の製造用途への、請求項５５また５６に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項６１】
適切な賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて、請求項３１〜４１および４４〜５３に記載の製品のいずれかを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項６２】
経口投与用に適切な組成の、請求項６１に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
自然界のヘパリンは、グリコサミノグリカン構造を持つ高分子で、３０００から３００００Ｄａの可変的な分子量を有し、ウロン酸（Ｌ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸）とアミノ糖（グルコサミン）が互いにβ−１，４−結合で結ばれた二糖類単位の繰り返し連鎖からなっている。ウロン酸は位置２で硫酸化されていてもよく、グルコサミンはＮ−アセチル化またはＮ−硫酸化され６−Ｏ−硫酸化されていてもよい。さらに、グルコサミンは、位置３にも硫酸基を含んでいてもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
ａ）多糖の調製
Ｎ−アセチルヘパロサン多糖を大腸菌、Ｂｉ８３３７／４１（Ｏ１Ｏ：Ｋ５：Ｈ４）（ＡＴＣＣ  ２３５０６）の発酵により得、特許ＷＯ０１／０２５９７号明細書に記述された方法に従って培養液からの抽出と精製を実施した。使用した培養液の組成は、大豆小麦粉 ２g/ｌ、 K2HP04 ９.７g／l 、 KH2P０4  ２ｇ/ｌ、 MgCl2 ０.１１ g／l 、クエン酸ナトリウム０.５g／l 、硫酸アンモニウム１g／l  、ブドウ糖（あらかじめ殺菌されたもの） g/ｌ、水１０００ml q.b、ｐＨ７.３。