【手続補正書】
【提出日】平成19年3月22日(2007.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親サブチラーゼに比較して少なくとも１つの変更された性質を有する、親サブチラーゼの変異体の構成方法であって、
ａ）JP170立体構造に関しての構造の考慮の評価に基づいて、前記性質の変更のために適切なものである、サブチラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基又は少なくとも１つの構造領域を同定するために、親サブチラーゼの立体構造を分析し；
ｂ）前記性質を変更するために、親サブチラーゼに比較して、ａ）において同定されるアミノ酸残基又は構造部分の欠失、置換又は挿入により修飾されている変異体サブチラーゼをコードするポリヌクレオチドを構成するために前記親サブチラーゼをコードするポリペプチドのDNAを修飾し；
ｃ）適切な宿主において前記変異体サブチラーゼを発現し；そして
ｄ）前記性質について、前記得られるサブチラーゼ変異体を試験することを含んで成る方法。
【請求項２】
親サブチラーゼに比較して、少なくとも１つの変更された性質を有するサブチラーゼ変異体の生成方法であって、
ａ）BPN’, TY145又はJP170の立体構造に基づいて親サブチラーゼのモデル構造体を生成するか、又は親サブチラーゼの実際決定された立体構造体を生成し；
ｂ）活性部位残基のCA, CB, C, O及びN原子の整合を通して前記構造体を重ね合わせることにより、前記JP170構造体に対して親サブチラーゼのモデル又は実際の立体構造体を比較し；
ｃ）段階ｂ）における比較に基づいて、親サブチラーゼの少なくとも１つの構造部分を同定し、ここで前記構造体部分における変更が変更された性質をもたらすことが予測され；
ｄ）前記構造部分に対応する位置での１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの欠失又は置換、又は前記構造部分に対応する位置における１又は複数のアミノ酸残基の少なくとも１つの挿入をコードする核酸配列を生成するために、親サブチラーゼをコードする核酸配列を修飾し；
ｅ）段階ｃ）及びｄ）を、N回、反復して実施し、ここでNは１又は複数の値を有する整数であり；
ｆ）段階ａ）−ｅ）に起因する変異体を調製し；
ｇ）前記変異体の性質を試験し；
ｈ）任意には、段階ａ）−ｇ）を、繰り返して反復し；
ｉ）親サブチラーゼに比較して、少なくとも１つの変更された性質を有するサブチラーゼ変異体を選択し；
ｊ）変異体サブチラーゼを生成するために、宿主細胞において修飾された核酸配列を発現し；
ｋ）前記生成されるサブチラーゼ変異体を単離し；
ｌ）前記単離されたサブチラーゼ変異体を精製し；そして
ｍ）前記精製されたサブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る方法。
【請求項３】
前記親JP170サブチラーゼが、全体的なスブチリシン折りたたみ、及び次の構造特徴：
ａ）7個の鎖を有するねじれたβ−シート、
ｂ）６個のαヘリックス、
ｃ）少なくとも３個のイオン−結合部位を含んで成り、そしてBPN’様サブチラーゼの強及び弱イオン−結合部位を包含しない、配列番号１の配列に対して少なくとも58％相同であるJP170様サブチラーゼであり、ここで前記サブチラーゼの立体構造における前記３個のイオン−結合部位の位置が、サブチラーゼの３個の活性部位アミノ酸残基、すなわちSer, His及びAspのｃ−α原子、及び活性部位Ser残基の次のアミノ酸残基（Serの次の）のｃ−α原子への距離により定義され、ここで
I)イオン−結部位１と、
ｉ）Asp c−α原子との間の距離が26.70-28.70Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が22.10−24.10Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が16.95−18.95Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が15.30−17.30Åであり、
II）イオン−結部位２と、
ｉ）Asp c−α原子との間の距離が33.50-35.50Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が37-39Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が29.40-31.40Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が30.70-32.70Åであり、
III ）イオン−結部位３と、
ｉ）Asp c−α原子との間の距離が41.50-43.50Åであり、
ii) His c−α原子との間の距離が42.90-44.90Åであり、
iii) Ser c−α原子との間の距離が34.50-36.50Åであり、
iv) Ser c−α原子の次のアミノ酸残基との距離が35-37Åである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ａ）JP170の立体構造に基づいて親JP170型サブチラーゼのモデル構造体を生成するか、又は親サブチラーゼの実際決定された立体構造体を生成し；
ｂ）活性部位残基のCA, CB, C, O及びN原子の整合を通して前記構造体を重ね合わせることにより、前記BPN’又はTY145構造体に対して親JP170型サブチラーゼのモデル又は実際の立体構造体を比較し；
ｃ）段階ｂ）における比較に基づいて、親JP170型サブチラーゼの少なくとも１つの構造部分を同定し、ここで前記構造体部分における変更が変更された性質をもたらすことが予測され；
ｄ）前記構造部分に対応する位置での１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの欠失又は置換、又は前記構造部分に対応する位置における１又は複数のアミノ酸残基の少なくとも１つの挿入をコードする核酸配列を生成するために、親JP170型サブチラーゼをコードする核酸配列を修飾し；
ｅ）段階ｃ）及びｄ）を、N回、反復して実施し、ここでNは１又は複数の値を有する整数であり；
ｆ）段階ａ）−ｅ）に起因するJP170型サブチラーゼ変異体を調製し；
ｇ）前記変異体の性質を試験し；
ｈ）任意には、段階ａ）−ｇ）を、繰り返して反復し；
ｉ）親サブチラーゼに比較して、少なくとも１つの変更された性質を有するJP170型サブチラーゼ変異体を選択し；
ｊ）変異体サブチラーゼを生成するために、宿主細胞において修飾された核酸配列を発現し；
ｋ）前記生成されるJP170型サブチラーゼ変異体を単離し；
ｌ）前記単離されたサブチラーゼ変異体を精製し；そして
ｍ）前記精製されたサブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る、親サブチラーゼに比較して、少なくとも１つの変更された性質を有する、JP170型サブチラーゼ変異体を低めるための請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
イオン−結合部位に対して10Å又はそれ以下の距離に位置する位置、好ましくは６Å又はそれ以下の距離に位置する位置におけるアミノ酸残基に少なくとも１つの修飾を含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。
【請求項６】
修飾が、次の位置：
ａ）イオン−結合部位１：183,184, 185,186, 187,188, 189,191, 193,195, 196,197, 198, 199,200, 201,202, 203,224 及び 225、
ｂ）イオン−結合部位２：378,379, 380,381, 382,383, 384,385, 386,387, 388,389, 390, 391,392 及び 393、
ｃ）イオン−結合部位３：348,350, 352,363, 364,365, 366,367, 369,370, 380,381, 382, 383,391, 392,393, 394,395,396, 397,398, 399,400, 414,415, 416,417, 418,419, 420の少なくとも１つで行われ、好ましくは前記修飾は、S193Q, Y;H200D, N;H200D,N+D196N ; N390D;N391 D ; G394N, Q, F, Y, S 及び W392S, N, Qである請求項５記載の変異体。
【請求項７】
BPN’様ファミリーのサブチラーゼの強いイオン−結合部位に対応するイオン−結合部位の導入を包含するJP170型サブチラーゼ変異体であって、前記変異体が配列番号１の領域N79−N82の部分的又は完全な欠失、及び１又は複数のアミノ酸残基の挿入、好ましくは配列LNNSIQV（配列番号５）の挿入、続く置換A45D、N及び任意には、置換E44、T及び/又はR47Qを有することを特徴とする変異体。
【請求項８】
１又は複数のイオン−結合部位が除去されているJP170型サブチラーゼ変異体であって、前記変異体が配列番号１の領域N186−N199の部分的又は完全な欠失、及び１又は複数のアミノ酸残基の続く挿入、好ましくは配列SSN（配列番号６）の挿入を包含し、そして好ましくは、置換17Q及びV3Yの１つ又は両者をさらに含んで成ることを特徴とする変異体。
【請求項９】
イオン−結合部位が除去されているBPN’型サブチラーゼ変異体であって、前記変異体が、
ａ）領域A194−L196（BPN’番号付けにおけるサビナーゼ）又はもう１つのBPN’様サブチラーゼにおける対応する領域の部分的又は完全な欠失、及び３又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、好ましくはJP170からのP209−P217又はもう１つのJP170様サブチラーゼにおける対応する領域の挿入、及び
領域L75−L82（BPN’番号付けにおけるサビナーゼ）又は前記他のBPN’様サブチラーゼにおける対応する領域の部分的又は完全な欠失、及び１又は複数のアミノ酸残基の挿入、好ましくはTY145からのH83−’122’又はもう１つのTY145様サブチラーゼにおける対応する領域の挿入、又は
ｂ）領域A194−L196（BPN’番号付けにおけるサビナーゼ）又はもう１つのBPN’様サブチラーゼにおける対応する領域の部分的又は完全な欠失、及び３又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、好ましくはJP170からのP209−P217又はもう１つのJP170様サブチラーゼにおける対応する領域の挿入、及び
領域L75−L82（BPN’番号付けにおけるサビナーゼ）又は前記他のBPN’様サブチラーゼにおける対応する領域の部分的又は完全な欠失、及び１又は複数のアミノ酸残基の挿入、好ましくはJP170からのN79-K83又はもう１つのJP170様サブチラーゼにおける対応する領域の挿入を含んで成ることを特徴とする変異体。
【請求項１０】
下記位置：
13,14, 15,16, 17,18, 37,38, 39,40, 41,42, 43,47, 48,49, 50,58, 59,60, 67,96, 97,98, 99,107, 108,109, 110,111, 131,132, 133,134, 152,153, 163,164, 165,166, 188,189, 190,191, 193,195, 210,234, 235,236, 237,238, 239,240, 241,242, 243,244, 245,326, 327,328, 329,330, 331,332, 337,338, 339,340, 342,355, 356,357, 359,360, 372,373, 374,375, 376,377, 378, 384, 385,387, 388,389, 390,391, 392,404, 405,406, 407,408, 409,410, 411 及び 419を包含する群から選択された位置に少なくとも１つの修飾を含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。
【請求項１１】
JP170の活性部位に結合されるC12インヒビターから10Åの距離以内に存在する１又は複数の位置に変更を含んでなる変異体サブチラーゼであって、配列番号１において特定されるように、前記位置は、
29,30,31, 32,64, 67,68, 69,70, 71,72,93, 96,97, 98,107,108,109, 110,113, 114, 127,128, 129,130, 131,132, 133,134, 136,138, 139,140, 141,144, 157,174, 180,181, 182,183, 191,193, 202,203, 205,206, 207,211, 223,224, 225,226, 234,235, 236,237, 238,239, 240,241,249, 250,251, 252,253, 254,257, 258であり、好ましくは置換W129Lを含んでなる変異体。
【請求項１２】
１又は複数の次の修飾：
G21C+A86C, V26C+A265C, G57C+G105C, G74C+A229C, Q111C+N143C, G160C+S170C, A286C+V349C, A27C+A122C, A45C+G78C, V72C+P258C, G78C+A229C, D98C+G104C, Q111C+Y147C, G135C+G167C, R142C+P354C, V144C+A178C, G182C+P217C, A183C+G223C, A195C+Y225C, F271 C+P279C, A287C+A430C, A293C+T310C, E322C+S428C, S324C+A332C, S327C+P424C, D352C+N397C, G355C+T362C, G291C+S314C；
好ましくは１又は複数の置換：
G21C+A86C, V26C+A265C, G57C+G105C, G74C+A229C, Q111C+Y143C, G160C+S170C, A286C+V349C, A4C+P222C及びA27C+A117C（ここで位置は、配列番号１における位置に対応する）に導入される１又は複数のジスルフィド架橋を含んで成るJP170様サブチラーゼ変異体。
【請求項１３】
１又は複数の位置N79, N316, L381, K9及びK313に変更を含んで成り、好ましくは配列番号１の１又は複数の置換を含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。
【請求項１４】
１又は複数の位置22,44, 110,139, 140,166, 198,201, 203,231, 282,356, 357 及び 378に変更を含んで成り、好ましくは１又は複数の置換：Q22P, E44P,L110P, T139P, D140P,S166P 1198P, V201P, Q203P,S231 P, S282P, S356P, T357P 及び K378Pを含んで成るJP170型サブチラーゼ変異体。
【請求項１５】
領域311−433の欠失、好ましくは位置317−433又は315−433の欠失を含んで成り、さらに１又は複数の置換L283N, Q; A290S, N 及びW306H,Y, Kを含んで成るJP170様サブチラーゼ変異体。
【請求項１６】
請求項５〜15のいずれか１項において定義されるか又は生成されるサブチラーゼ変異体をコードする核酸配列を含んで成る単離された核酸配列。
【請求項１７】
前記核酸配列が、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも58％の相同性を有する酵素をコードする核酸配列、及び
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも58％の相同性を有する酵素をコードする核酸配列の相補的鎖と、低い緊縮条件下で、好ましくは中くらいのの緊縮条件下で、特に高い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列、又は
ｃ）少なくとも100個のヌクレオチドのａ）又はｂ）のいずれかの副配列から成る群から選択される請求項33記載の単離された核酸配列。
【請求項１８】
適切な発現宿主においてポリペプチドの発現を指図することができる１又は複数の制御配列に操作可能に連結された、請求項16又は17記載の核酸配列を含んで成る単離された核酸構造体。
【請求項１９】
請求項18記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項２０】
請求項５〜15のいずれか１項記載の変異体の生成方法であって、
ａ）請求項19記載の組換え宿主細胞を、サブチラーゼ変異体の生成の助けとなる条件下で培養し；そして
ｂ）前記変異体を回収することを含んで成る方法。
【請求項２１】
請求項５〜15のいずれか１項記載のJP170型サブチラーゼ変異体又はBPN’型サブチラーゼ変異体を含んで成る洗剤組成物。
【請求項２２】
清浄又は清浄用途への請求項５〜15のいずれか１項記載のJP170型サブチラーゼ変異体又はBPN’型サブチラーゼ変異体の使用。