【手続補正書】
【提出日】平成19年2月15日(2007.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
実施例
実施例１
図１１は結合研究の研究結果を示しており、ここでは、抗体８Ｈ．８と抗体１５Ａ．２を別々に分析し、アフィニティ精製したイヌＩｇＥ固定化した固相に対するそれらの結合能力を測定した。これらの結果は、これらの８Ｈ．８および１５Ａ．２が固相に固定化されている場合に天然ＩｇＥと結合することを示している。これらの研究の結果は、これらの抗体の各々の表面結合ＩｇＥへの結合が匹敵する親和性であることを示唆している。各抗体の結合親和性が、実際に匹敵するか否かを決定するために、さらなる研究を実施した。
図１２は、シグナル部分と抱合した抗体８Ｈ．８を種々の濃度で，種々のペプチドを固定化した固相と反応させた研究のデータを示す。黒菱形で示すデータはイヌＩｇＥを固定化した固相のデータを表し、黒四角で示すデータはＥ３ａ．５を固定化した固相のデータを示す。白三角で示すデータはＥ３ａ．５伸長ペプチドを固定化した固相のデータであり、Ｘで示すデータはＥ３ａ．５スクランブルペプチドを固定化した固相のデータであり、黒丸で示すデータは８Ｈ．８が結合するファージディスプレー技術で同定された７アミノ酸ペプチドが固定化された固相のデータである。すなわち、８Ｈ．８は、Ｅ３ａ．５スクランブルペプチドを有する固相を除く各固相と結合することが分かる。
モノクローナル抗体１４Ｋ２は、専らイヌＩｇＥエキソン４と結合することが知られている。このモノクローナル抗体は異なるペプチドを固定化した種々の固相と反応した。黒菱形で示したデータはイヌＩｇＥを固定化した固相のデータを示す。黒四角はＥ３ａ．５を固定化した固相のデータを示す。白三角で示すデータはＥ３ａ．５伸長ペプチドを固定化した固相のデータであり、Ｘで示すデータはＥ３ａ．５スクランブルペプチドを固定化した固相のデータであり、黒丸で示すデータは８Ｈ．８が結合するファージディスプレー技術で同定された７アミノ酸ペプチドが固定化された固相のデータである。すなわち、１４Ｋ２は、全長イヌＩｇＥ分子が固定化された固相のみと結合することが分かる。このデータを図１３に示す。
モノクローナル抗体１５Ａ．２は、イヌＩｇＥエキソン３のみと結合すると考えられる。図１４は、１５Ａ．２の種々のペプチドとの結合を評価した研究のデータである。黒菱形で示したデータはイヌＩｇＥを固定化した固相のデータを示す。黒四角はＥ３ａ．５を固定化した固相のデータを示す。白三角で示すデータはＥ３ａ．５伸長ペプチドを固定化した固相のデータであり、Ｘで示すデータはＥ３ａ．５スクランブルペプチドを固定化した固相のデータであり、黒丸で示すデータは８Ｈ．８が結合するファージディスプレー技術で同定された７アミノ酸ペプチドが固定化された固相のデータである。これらの結合研究は、１５Ａ．２が、全長イヌＩｇＥ分子が固定化された固相のみと結合することを示している。このデータは１５Ａ．２が８Ｈ．８が結合する同じエピトープとは結合しないことを示している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
図１５は、８Ｈ．８または組換えヒトＩｇＥに対して作出されたポリクローナル抗体の、ペプチドＥ３ａ．５または、ペプチドＳ３ａ．５と称されるヒトＩｇＥをコードするヒトゲノム中の配列により類似するようにアミノ酸を置換したペプチドＥ３ａ．５に対する結合を比較した研究のデータを示す。図１５中、黒菱形で示したデータは８Ｈ．８と対比した置換３ａ．５のデータを示す。黒四角は置換ペプチド３ａ．５とＲｅ−Ｈｕ  ＩｇＥのデータを示す。黒三角で示すデータはペプチドＥ３ａ．５および８Ｈ．８のデータであり、Ｘで示すデータはペプチドＥ３ａ．５およびポリクローナルＲｅ  Ｈｕ  ＩｇＥのデータである。これらのデータは、８Ｈ．８のみが固相上のＥ３ａ．５と結合し、他の組み合わせは結合を示さないことを示している。
図１６は、８Ｈ．８の固相に固定化された種々のペプチドとの結合を比較する研究のデータを示す。図１８中、黒菱形で示したデータはイヌＩｇＥを固定化した固相についてのデータを示す。白四角はペプチドＥ３ａ．５伸長を固定化した固相についてのデータを示す。黒三角で示すデータはヒトＩｇＥを固定化した固相についてのデータであり、Ｘで示すデータは８Ｈ．８ペプチドを固定化した固相のデータである。かくして、８Ｈ．８は、イヌＩｇＥ、ペプチドＥ３ａ．５伸長、またはファージディスプレー技術により８Ｈ．８の結合エピトープとして同定された７アミノ酸ペプチドと、これらのペプチドが固相に固定化されている場合に結合することが分かる。加えて、８Ｈ．８はヒトＩｇＥとは結合しないことが分かる。
図１７は、ポリクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体の、固定化された種々のペプチドを有する固相に対する結合能力を比較する研究のデータを示す。黒菱形で示したデータは固定化されたイヌＩｇＥを有する固相のデータを示す。白四角はペプチドＥ３ａ．５伸長を固定化した固相についてのデータを示す。黒三角で示すデータはヒトＩｇＥを固定化した固相のデータであり、Ｘで示すデータは８Ｈ．８ペプチドを固定化した固相についてのデータである。かくして、抗ヒトＩｇＥポリクローナル抗体は、固相上に固定化されている場合にヒトＩｇＥと結合することが分かった。また、ポリクローナル抗体が非常に高い濃度で存在する場合、ポリクローナル抗血清がペプチドＥ３ａ．５伸長に対して制限された結合を示すことも分かった。これは高い抗体濃度による結合人為現象によるものと考えられた。すなわち、ヒトＩｇＥに対する抗体はイヌＩｇＥまたは本発明のペプチドと特異結合しないことを見出した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａは、４本アームのＭＡＰ蛋白、すなわち４−ＭＡＰ蛋白のコア構造を示す。図１Ｂは、８本アームのＭＡＰ蛋白、すなわち８−ＭＡＰ蛋白のコア構造を示す。
【図２】  図２は、表面結合ＩｇＥ（例えば、Ｂ細胞表面上に発現されたＩｇＥのアナログ）；ＩｇＥ受容体（例えば、肥満細胞上のＦｃ受容体のアナログ）；およびＩｇＥ受容体が結合した場合のＩｇＥのコンビネーションへのいくつかのモノクローナル抗体の結合特性を比較したデータである。
【図３】  図３は、抱合抗体８Ｈ．８または抱合抗体１５Ａ．２のＩｇＥ固相への結合を阻害する組み換エキソン３の能力を示す。８Ｈ．８に関するデータを斜線入りの棒で示し、１５Ａ．２に関するデータを斑点入りの棒で示す。
【図４】  図４は、モノクローナル抗体８Ｈ．８（２．５μｇ／ｍｌ）またはモノクローナル抗体１５Ａ．２（２．５μｇ／ｍｌ）のイヌＩｇＥ固相への結合を阻害する可溶性の精製イヌＩｇＥの能力を示す。８Ｈ．８に関するデータを斜線入りの棒で示し、１５Ａ．２に関するデータを斑点入りの棒で示す。
【図５】  図５は、固相に固定化された組み換えＩｇＥ受容体へのＩｇＥの結合を阻害するモノク−ナル抗体１５Ａ．２またはモノクローナル抗体８Ｈ．８の能力を、モノクローナル抗体Ｄ９により検出して示す。
【図６】  図６は、モノクローナル抗体１５Ａ．２により結合されたNew England Biolabs PhDc7cファージディスプレイライブラリーのアミノ酸配列を示す。これらの配列お、イヌＩｇＥの蛋白配列と並置して示す。
【図７】  図７は、７種の異なる哺乳動物：イヌ、ヒト、ミドリザル、ネコ、ブタ、マウスおよびウマ由来の１５Ａ．２結合領域の並置を示す。
【図８】  図８は、固相上の１５Ａ．２モノクローナル抗体へのイヌＩｇＥの結合を阻害する、ファイジディスプレイしている１５Ａ．２ミモトープペプチドの能力を示す。
【図９】  図９は、１５Ａ．２ミモトープモノクローナル抗体に結合する、固相に結合された特異的１５Ａ．２ミモトープペプチド配列の能力を示す。
【図１０Ａおよび図１０Ｂ】  図１０Ａおよび図１０Ｂは、１５Ａ．２モノクローナル抗体の固相上のイヌＩｇＥへの結合を妨げる、１５Ａ．２ミモトープペプチドの能力を示す。
【図１１】  図１１は、固相上に固定化された精製イヌＩｇＥに結合する、モノクローナル抗体８Ｈ．８およびモノクローナル抗体１５Ａ．２の能力を示す。
【図１２】  図１２は、固定化された種々のペプチドを有する固相に結合する、シフナル部分と抱合された抗体１５Ａ．２の能力を評価する研究から得られたデータを示す。
【図１３】  図１３は、イヌＩｇＥエキソン４に結合することが知られているモノクローナル抗体１４Ｋ２の、固相上に固定化された種々のペプチドに結合する能力を評価する研究から得られたデータを示す。
【図１４】  図１４は、イヌＩｇＥエキソン３に結合することが知られているモノクローナル抗体１５Ａ．２の、固相上に固定化された種々のペプチドに結合する能力を評価する研究から得られたデータを示す。
【図１５】  図１５は、モノクローナル抗体８Ｈ．８または組み換えＩｇＥ（Ｒｅ−ｈｕ ＩｇＥ）に対して生成したポリクローナル抗体の、固定化されたペプチドＥ３ａ．５または置換ペプチドＥ３ａ．５（ペプチドＳ３ａ．５と命名）を有する固相に結合する能力を比較する研究似関するデータを示す。
【図１６】  図１６は、シグナル部分と抱合した抗体８Ｈ．８の、種々のペプチドが固定化された固相への結合能を評価する研究から得られたデータを示す。
【図１７】  図１７は、固相に固定化された種々のペプチドに結合するポリクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体の能力を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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