(57)【要約】「罹患椎間板の再生」  椎間板変性を有する哺乳動物における、椎間板の再生の方法、または椎間板起因性疼痛の抑制の方法において使用するためのヒドロゲル組成物が記載される。ヒドロゲル組成物は架橋高分子量ヒアルロナンを含む。ヒドロゲル組成物は哺乳動物の椎間板変性部位に移植される。【選択図】図２−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間板変性を持つ哺乳動物において、椎間板起因性疼痛を抑制する方法において使用するための架橋高分子量ヒアルロナン（ＨＡ）ヒドロゲルであって、前記ヒドロゲルが哺乳動物の椎間板変性部位に埋め込まれる、ヒドロゲル。
【請求項２】
前記ＨＡが知覚過神経支配の減弱により椎間板起因性疼痛を抑制する、請求項１記載の使用のための請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項３】
前記ＨＡが熱痛覚過敏または機械的痛覚過敏の逆転により椎間板起因性疼痛を抑制する、請求項１または２に記載の使用のための請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項４】
前記ＨＡが侵害受容の減弱により椎間板起因性疼痛を抑制する、請求項１に記載の使用のための請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項５】
前記ヒドロゲルが単一のゲルネットワークを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用のための請求項１記載のヒドロゲル。
【請求項６】
前記ヒドロゲルが０．１〜１０重量％の架橋ＨＡを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための請求項１または５に記載のヒドロゲル。
【請求項７】
前記ヒドロゲルが０．５〜２重量％の架橋ＨＡを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の使用のための請求項１、５または６に記載のヒドロゲル。
【請求項８】
前記ヒドロゲルが化学的に架橋されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための請求項１，５または７に記載のヒドロゲル。
【請求項９】
前記ＨＡがＰＥＧ-アミンで架橋されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための請求項８ｎに記載のヒドロゲル。
【請求項１０】
１前記ＨＡ架橋がＥＤＣ／ＮＨＳまたはＤＭＴＭＭ化学を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための請求項８または９に記載のヒドロゲル。
【請求項１１】
前記ＨＡが、前記ＨＡに正味の正電荷を付与する部分で誘導体化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルが薬学的または生物学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項１３】
前記薬学的または生物学的に活性な薬剤が、細胞、細胞成分、多糖、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗原、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ナノボディまたはＶＨＶフラグメントなどの単一ドメイン抗体）、抗体（または抗体フラグメント）とタンパク質若しくはペプチドなどの結合パートナーとの複合体、核酸（遺伝子、遺伝子構築物、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸を含む）、成長因子（すなわちＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、ＴＮＦ-α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびインターロイキン）などの細胞産物、または生物学的若しくは非生物学的薬物からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項１４】
前記の高分子量ヒアルロナンヒドロゲルマトリックス全体に分散した高分子量ヒアルロナン粒子を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項１５】
前記ヒドロゲルが注射用に製剤化されて注射によって投与される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜１４のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項１６】
前記ヒドロゲルがインプラントであり、外科的に投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜１４のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項１７】
椎間板変性を伴う哺乳動物の椎間板起因性疼痛の抑制方法に使用するための架橋高分子量ヒアルロナン（ＨＡ）ホモポリマーヒドロゲルであって、前記ヒドロゲルは哺乳動物の椎間板変性部位に移植され、前記ＨＡは痛覚過敏、痛覚鈍麻、知覚過神経支配および／または侵害受容の減弱により椎間板起因性疼痛を抑制する、ヒドロゲル。
【請求項１８】
椎間板変性を伴う哺乳動物における痛覚過敏、痛覚鈍麻、知覚過神経支配および／または侵害受容を減弱する方法において使用するための架橋高分子量ヒアルロナン（ＨＡ）ヒドロゲルであって、前記ヒドロゲルが哺乳動物の椎間板変性部位に移植される、ヒドロゲル。
【請求項１９】
椎間板変性を伴う哺乳動物における椎間板の再生方法において使用するための架橋高分子量ヒアルロナン（ＨＡ）ヒドロゲルであって、前記ヒドロゲルが哺乳動物の椎間板変性部位に移植される、ヒドロゲル。
【請求項２０】
前記ＨＡが、内因性細胞外マトリックス産生を調節して高さを維持または増加させる、請求項１９に記載の使用のための請求項１９に記載のヒドロゲル。
【請求項２１】
前記ヒドロゲルが単一のゲルネットワークを含む、請求項１９または２０に記載の使用のための、請求項１９記載のヒドロゲル。
【請求項２２】
前記ヒドロゲルが０．１〜１０重量％の架橋ＨＡを含む、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９または２１に記載のヒドロゲル。
【請求項２３】
前記ヒドロゲルが０．５〜２重量％の架橋ＨＡを含む、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項２４】
前記ヒドロゲルが化学的に架橋されている、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項２５】
前記ＨＡがＰＥＧ−アミンで架橋されている、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項２６】
前記ＨＡ架橋がＥＤＣ／ＮＨＳまたはＤＭＴＭＭ化学を含む、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項２４〜２５のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項２７】
前記ＨＡが、前記ＨＡに正味の正電荷を付与する部分で誘導体化されている、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜２６のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項２８】
前記ヒドロゲルが薬学的または生物学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項２９】
医薬的または生物学的に活性な薬剤は、細胞、細胞成分、多糖、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗原、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、抗体フラグメント、抗体若しくは抗体フラグメントとタンパク質若しくはペプチドなどの結合パートナーとの複合体、核酸、成長因子等の細胞産物、または生物学的若しくは非生物学的薬剤からなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項３０】
前記高分子量ヒアルロナンヒドロゲルマトリックス全体に分散した高分子量ヒアルロナン粒子を含む、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜２９のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項３１】
前記ヒドロゲルが注射用に製剤化され、注射によって投与される、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜３０のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項３２】
前記ヒドロゲルがインプラントであり、外科的に投与される、請求項１９または２０に記載の使用のための請求項１９〜３０のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項３３】
椎間板変性を伴う哺乳動物における椎間板の再生方法に使用するための架橋高分子量ヒアルロナン（ＨＡ）ヒドロゲルであって、前記ヒドロゲルは哺乳動物の椎間板変性部位に移植され、前記ＨＡは内因性細胞外マトリックス産生を調節して高さを維持または増加させる、ヒドロゲル。
【請求項３４】
非架橋ヒドロゲルおよび架橋剤が注射により別々に同時投与され、投与中または投与後に混合されてインサイチュで前記ヒドロゲルの架橋が提供される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜３３のいずれか１項に記載の架橋高分子量ヒアルロナン（ＨＡ）ヒドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、罹患椎間板の再生方法に関する。椎間板変性によって引き起こされる椎間板創痛を治療する方法も企図する。
【背景技術】
【０００２】
腰痛（ＬＢＰ）は、人生のある段階で先進国の人口の６０〜８０％が罹患する一般的な健康問題である。患者は慢性的な背中の痛みを発症し、続いて長期の身体障害に至り、社会に深刻な社会経済的影響を与える。ＬＢＰの症例の大部分は椎間板（ＩＶＤ）変性によって引き起こされ、そして大部分の患者は無症候性のままであり、一部は椎間板に起因する疼痛を経験している。ＩＶＤ変性に対する現在の治療法は、前方または側方アプローチによる損傷または罹患椎間板の除去を介して疼痛を軽減することを目的とする、Ｉｎｆｕｓｅ（登録商標）Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ／ＬＴ−Ｃａｇｅ（登録商標）Ｌｕｍｂａｒ  Ｔａｐｅｒｅｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）、ＡｃｃｕＬＩＦ（登録商標）Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｒｙｋｅｒ）、Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  Ｆｕｓｉｏｎ（ＡＬＩＦ）（ＤｅＰｕｙ）、ＸＬＩＦ（登録商標）（ＮｕＶａｓｉｖｅ），Ｍｏｂｉ−Ｃ（登録商標）ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｉｓｃ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｚｉｍｍｅｒ  Ｂｉｏｍｅｔ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ／ＬＤＲ），ＣＡＬＩＢＥＲ（登録商標）（Ｇｌｏｂｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＡＬＰＨＡＴＥＣ  ＳＯＬＵＳ（登録商標）（Ａｌｐｈａｔｅｃ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓ），ＳＫＹＨＡＷＫ（登録商標）Ｌａｔｅｒａｌ  Ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｒｔｈｏｆｉｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）等の脊椎固定装置に重点を置いている。これらの処置は、椎間板の完全な除去および椎間高さを回復し、罹患した椎体を融合するための椎体間固定装置の移植を含む。脊椎固定装置は広範囲の骨の働きを含み、それはより多くの背中の痛みおよびより長い回復時間をもたらす。外側椎間関節および横突起（どちらも各椎骨の側面に位置するあなたの椎骨の特定の部分）は、通常、固定中に露出します。これはより多くの筋肉解剖を必要とする。患者の骨が徐々に融合するのを助けるために、骨移植片または代用骨も脊椎内に配置されるため、それが炎症を引き起こし、より瘢痕化（クモ膜炎）およびその後の痛みをもたらす。加えて、融合セグメントは、隣接セグメント疾患として知られている融合の上下のレベルでより多くのストレスを引き起こす。移動体セグメントの隣の剛体セグメントは、移動体セグメントに追加の応力を引き起こし、その結果、変性が生じる。さらに、ほとんどの融合術は、骨癒合が固くなるまで脊椎を安定させることを目的とするロッドおよびネジを配置することを含み、それが神経刺激および新しいまたは残存する脚の痛み／衰弱を引き起こす。加えて、脊髄固定術後の患者には可動性の限界がある。重要なことに、これらの技術は本質的に再生的ではないため、繰り返し手術が必要となり、根底にある疾患の病状に対処していない。
【０００３】
Ｆｒｉｔｈら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１３，３４、Ｎｏ．３７，９４３０-９４４０）は、ＩＶＤ変性の治療における間葉系前駆細胞のためのデリバリーマトリックスとして用いるために、多硫酸化ペントサン（ＰＰＳ）−低分子量ヒアルロナン−アミン末端８アームポリエチレングリコールを組み込んだ間葉系前駆細胞の製造を開示している。処置した椎間板における軟骨様組織の形成は、ヒドロゲルへのＰＰＳの組み込みによって有意に増強された。
【０００４】
ＵＳ２０１６／０３８６４３は、軟骨組織および神経組織を治療するための架橋性ポリマーマトリックス、特に高分子量ヒアルロン酸を含む埋め込み型ヒドロゲル前駆体組成物を開示している。
【０００５】
Ｃｈｅｎら（Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，２０１３，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．２，５１８１−５１９３）は、髄核再生のために酸化高分子量ヒアルロン酸およびゼラチンからなるｉｎ  ｓｉｔｕ形成ヒドロゲルを開示する。高分子量（１９００ｋＤａ）ヒアルロン酸を様々な濃度のゼラチンと架橋させた注射用酸化ヒアルロン酸−ゼラチン−アジピン酸ジヒドラジド（オキシ−ＨＡＧ−ＡＤＨ）ヒドロゲルを調製した。ヒアルロン酸は賦形剤として記載されており、ヒドロゲルの主成分ではない。さらに、治療作用の様式は、ヒドロゲル中に髄核細胞を封入することによるものである。
【０００６】
ＵＳ２０１０／０２９７８９は、（ａ）光架橋性ヒアルロナンを含む第１の網目構造、および（ｂ）親水性ポリマーまたは好ましくはアクリルアミドであるそのモノマーを含む第２の網目構造を含み、（ａ）と（ｂ）が組み合わさって光架橋されるヒドロゲルを開示する。ヒドロゲルは、耐荷重性整形外科用インプラントおよび／または椎間板代用物として有用である。
【０００７】
ＵＳ２００９／２５２７００は、ポリカルボキシレート、ポリアミン、またはジヒドロキシフェニル結合を介して架橋されているポリヒドロキシフェニル高分子を含み、かつ間葉系幹細胞を組み込んでいる合成髄核の開発を開示する。
【０００８】
ＵＳ２０１６／２４３２８２は、可溶性エラスチン、コラーゲン、および少なくとも１つのグリコサミノグリカンを含むヒドロゲル生体材料を開示し、ここでコラーゲンおよびグリコサミノグリカンは相互に架橋し、可溶性エラスチンは非線維性であり、ヒドロゲル生体材料内にミクロスフェアの形態で存在する該ヒドロゲル生体材料は髄核細胞、幹細胞、自己細胞ならびに細胞増殖因子および／または細胞分化因子を含む。
【０００９】
Ｐｅｒｅｉｒａら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１４，Ｖｏｌ．３５，８１４４−８１５３）は、変性椎間板にヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）を動員するための化学誘引物質送達システムとして、間質細胞由来因子Ｉ（ＳＤＦ−１）を含有する熱可逆性ヒアルロナン−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＨＡＰ）ヒドロゲルを開示する。
【００１０】
Ｉｓａら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１５、１６、１７１４−１７２５）は、髄核（ＮＰ）のインビトロ炎症モデルにおけるＩＬ-１Ｒ１、ＭｙＤ８８の炎症性受容体、ならびに神経成長因子（ＮＧＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のニューロトロフィン発現を調節するための架橋高分子量ＨＡヒドロゲルのインビトロでの使用を開示する。
【００１１】
本発明の目的は、上記の問題の少なくとも１つを克服することである。
【発明の概要】
【００１２】
ラットにおける針穿刺による椎間板変性の以前の研究は、損傷後３０日にわたる進行性の椎間板変性への明らかな傾向を示している（Ｉｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｒ；４６（３））。出願人は、損傷を受けた椎間板を高分子量ヒアルロナンヒドロゲルインプラントで治療することによって、この動物モデルにおける進行性の椎間板変性を阻止し、さらには逆転させることができることを発見した（図１および３）。本出願人はまた、高分子量ヒアルロナンヒドロゲルが、機能的細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成による椎間板再生を促進するために、同じＩＶＤ変性モデルにおいて、髄核（ＮＰ）および線維輪（ＡＦ）の両方における細胞のプロテオームシグネチャーを調節することを発見した（図２）。本出願人はまた、高分子量ＨＡインプラントが、痛覚過敏、侵害受容、過神経支配および／または痛覚鈍麻の減弱によって、椎間板の周辺領域における疼痛感作を抑制し、ＩＶＤのラット尾部モデルにおける疼痛プロセスを抑制できることを発見した（図４〜９）。
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、哺乳動物における、椎間板の再生または椎間板起因性疼痛の抑制の方法において使用するための高分子量ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物が提供される。一般に、哺乳動物は椎間板（ＩＶＤ）疾患、例えばＩＶＤ変性に罹患している。典型的には、ヒドロゲル組成物は哺乳動物の椎間板疾患または変性の部位に移植される。適切には、ヒアルロナンは架橋されている。
【００１４】
一実施形態では、治療は、５６日の治療期間の後、未治療の椎間板と比較して治療された椎間板の高さの減少を引き起こさない。
【００１５】
一実施形態では、治療は、５６日の治療期間の後、未治療の椎間板と比較して治療を受けた椎間板の高さの増加を引き起こす。
【００１６】
一実施形態では、本発明の使用はまた、ＩＶＤ疾患、特にＩＶＤ変性に関連する椎間板起因の疼痛の軽減におけるその使用も含む。
【００１７】
一実施形態では、ＩＶＤ疾患に罹患している哺乳動物は椎間板ヘルニアを有する。
【００１８】
関連する態様において、本発明は、哺乳動物、典型的にはＩＶＤ疾患、特にＩＶＤ変性を患っている哺乳動物における椎間板起因の疼痛を抑制する方法において使用するための高分子量ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物に関する。
【００１９】
関連する態様において、本発明は、鎮痛薬として使用するための高分子量ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物に関する。
【００２０】
関連する態様において、本発明は、哺乳動物のある場所で疼痛を抑制する方法において使用するための高分子量ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物に関し、そのヒドロゲル組成物は典型的にはその場所に埋め込まれる。一実施形態では、ヒドロゲルは疼痛を軽減するためにその場所での熱痛覚過敏、機械的痛覚過敏及び／または痛覚鈍麻を元に戻す。
【００２１】
関連する態様において、本発明は哺乳動物のある場所で痛覚過敏または痛覚鈍麻を減弱する方法において使用するための高分子量ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物に関し、ここでヒドロゲル組成物は典型的にはその場所に埋め込まれる。一実施形態では、ヒドロゲル組成物は痛覚過敏または痛覚鈍麻を元に戻す。一実施形態では、痛覚過敏は、熱痛覚過敏および機械的痛覚過敏から選択される。
【００２２】
関連する態様において、本発明は、抗炎症薬として使用するための高分子量ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物に関し、ここでヒドロゲル組成物は典型的には全身性炎症誘発性サイトカインを減弱させて痛みを軽減する。
【００２３】
関連する態様において、本発明は、哺乳動物における炎症性障害を治療または予防する方法において使用するための高分子量ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物に関する。一実施形態では、ヒドロゲル組成物は通常、全身性炎症誘発性サイトカインのレベルまたは発現を減弱させる。一実施形態では、炎症性障害は全身性炎症誘発性サイトカインのレベルの上昇を特徴とする。
【００２４】
関連する態様において、本発明は、哺乳動物、特に関節疾患を患っている哺乳動物における疼痛を抑制する方法において使用するための高分子量ヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物に関する。関節疾患は、変性状態または外傷によって引き起こされる状態、あるいはその両方であり得る。一実施形態では、関節疾患は関節軟骨損傷を含む。一実施形態では、関節疾患は関節炎、例えば慢性関節リウマチである。
【００２５】
一実施形態では、ＨＡヒドロゲルは架橋されている。ヒドロゲルマトリックスにおける異なる架橋剤の使用は、調整されたＨＡ分解プロファイルを有する組成物を提供し、そして調整可能なＨＡヒドロゲル足場を提供するための異なる架橋剤の使用を可能にする。一実施形態では、ヒドロゲルは体内の場所でその場で架橋される。これは、注射の前にヒドロゲルと架橋剤を別々に保ち、それらが注射器から放出されるときにそれらを混合する双胴シリンジ（すなわちＤｕｐｌｏｊｅｃｔシステム）を使用することによって達成され得る。
【００２６】
一実施形態では、ＨＡは化学的に架橋されている。一実施形態では、架橋部分（薬剤）は官能化ＰＥＧ、例えばＰＥＧ−アミンである。一実施形態では、架橋開始は、ＥＤＣ／ＮＨＳまたは４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学で行われる。架橋の他の方法は熱架橋を含む。一実施形態では、ＨＡに対する架橋剤の比率は、１：１から１：１０（重量）、典型的には１：１から１：５、そして好ましくは約１：１から１：３である。一実施形態では、ＨＡに対する架橋剤の比率は、約１：２（重量基準）である。
【００２７】
一実施形態において、ヒアルロナン（ＨＡ）は正に帯電している。これは、ＨＡ分子に正味の正電荷を付与する部分（例えばカチオン）でＨＡを誘導体化することによって達成することができる。ＨＡを誘導体化するために使用することができる部分の例は、アミノプロピルイミダゾールを含む。本明細書において、ＨＡという用語は、誘導体化ＨＡおよび非誘導体化ＨＡの両方を含む。陽イオン化ＨＡ、例えばカチオン化ＨＡの製造方法は文献に記載されており、これには四級アンモニウム含有基を用いたカルボキシルおよびヒドロキシル基の修飾が含まれる（ＵＳ２００９／０２８１０５６およびＵＳ２０１０／０１９７９０４）。
【００２８】
一実施形態では、組成物は治療有効量のＨＡを含む。一実施形態では、組成物は約０．１％から約１０％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．５％から約５％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．１％から約１％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態において、組成物は約１．０％から約１０％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．５％から約２％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約５．０％から約１０％のＨＡ（重量％）を含む。
【００２９】
一実施形態では、ヒドロゲル組成物は、任意選択で追加の成分、例えば、細胞、薬物、またはＨＡ粒子などの薬学的または生物学的に活性な薬剤と組み合わされたヒドロゲルである。一実施形態では、ヒドロゲル中のヒアルロナンはヒアルロナンホモポリマーである。一実施形態では、ヒドロゲルは単一のポリマーネットワークを含む。一実施形態では、ＨＡはＣＤ４４を含む細胞表面受容体に結合する。
【００３０】
一実施形態では、治療方法は、治療期間中に定期的に組成物を投与することを含む。投与頻度は、疾患の状態、患者の年齢、治療の有効性など、幾つかの要因によって異なる。一実施形態では、組成物は、週１回、月１回、６ヶ月１回、または年１回投与される。一実施形態では、組成物は月２回投与される。一実施形態では、組成物は月１回投与される。一実施形態では、組成物または粒子は治療期間中に１〜１０回投与される。一実施形態では、治療期間は１週間から６ヶ月の間である。
【００３１】
一実施形態では、疼痛を軽減するために、知覚過神経支配および侵害受容を抑制すること、および／または全身性炎症誘発性サイトカインを減弱させることによって、疼痛（例えば、椎間板性または関節痛）が抑制される。
【００３２】
一実施形態では、ヒドロゲル組成物は、痛みを軽減するために、侵害受容の分子マーカー、典型的にはサブスタンスＰおよび／またはｃ−Ｆｏｓを下方制御する。
【００３３】
一実施形態では、ヒドロゲル組成物は、疼痛を軽減するために熱性痛覚過敏、機械的痛覚過敏および／または痛覚鈍麻を軽減（例えば、逆転）させる。
【００３４】
一実施形態では、ヒドロゲル組成物は、傷害または外傷によって誘発された全身性炎症反応を軽減するために、循環炎症誘発性サイトカインを下方制御する。
【００３５】
一実施形態では、ヒドロゲル組成物は内因性細胞外マトリックス産生を調節して椎間板の高さを維持または増加させる。
【００３６】
一実施形態では、ヒドロゲル組成物は、椎間板のグリコシル化プロファイルを調節する。
【００３７】
一実施形態では、本発明のヒドロゲル組成物は高分子量ヒアルロナン粒子を含む。
【００３８】
一実施形態では、ＨＡ粒子はナノサイズの粒子であり、典型的には１００〜９００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子は３００〜７００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子は４００〜６００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子はナノサイズのＨＡ粒子の凝集体であり、その凝集体は５００ｎｍから１０ミクロンの平均寸法を有することができる。
【００３９】
本発明の組成物／ヒドロゲルは追加の成分を含み得る。したがって、ＨＡ粒子は１つ以上の追加の成分を含み得る。担体相（すなわちヒドロゲル）は１つ以上の追加の成分を組み込んでもよい。ＨＡ粒子と担体相の両方が、独立して、１つ以上の追加の成分を組み込んでもよい。成分は、薬学的または生物学的に活性な薬剤であり得る。成分は、細胞、細胞成分、多糖、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗原、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ナノボディまたはＶＨＶフラグメントなどの単一ドメイン抗体）、抗体（または抗体フラグメント）とタンパク質若しくはペプチドなどの結合パートナーとの複合体、核酸（遺伝子、遺伝子構築物、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸を含む）であってもよい。成分は、増殖因子（すなわち、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびインターロイキン）などの細胞産物であり得る。成分は、薬物、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（イブプロフェン、ケトプロフェンまたはナプロキセンなど）、アスピリン、アセトアミノフェン、コデイン、ヒドロコドンなどの鎮痛薬、ステロイド系抗炎症薬、抗鬱剤、抗ヒスタミン薬、または鎮痛薬などの抗炎症薬であってもよい。細胞は自己由来、同種異系、異種であり得る。細胞は幹細胞であり得る。幹細胞は、サイドポピュレーション、内皮、造血、筋芽細胞、胎盤、臍帯血、脂肪細胞および間葉系幹細胞を含む群から選択することができる。細胞は、生物学的産物、例えば成長因子などの治療用生物学的産物を発現するように操作することができる。
【００４０】
一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：９〜９：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：５から５：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：４から４：１である。一実施形態において、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：３から３：１である。一実施形態において、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：２から２：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子はＨＡゲルに懸濁されている。
【００４１】
一実施形態では、ＨＡ粒子は架橋部分で架橋されている。一実施形態では、ＨＡ粒子は化学的に架橋されている。一実施形態では、架橋部分（薬剤）は官能化ＰＥＧ、例えばＰＥＧ−アミンである。一実施形態では、架橋開始は、ＥＤＣ／ＮＨＳまたは４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学で行われる。他の架橋方法は熱架橋を含む。一実施形態では、架橋剤とＨＡとの比は１：１から１：１０（重量基準）である。典型的には１：１から１：５、そして好ましくは約１：１から１：３である。一実施形態では、ＨＡに対する架橋剤の比率は、約１：２（重量）である。ＨＭＷ  ＨＡをＰＥＧ−アミンで架橋する方法は、以下およびＩｓａら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１５、１６、１７１４−１７２５）に記載されている。
【００４２】
一実施形態では、ＨＡ粒子の架橋部分は、ＨＡヒドロゲルマトリックスの架橋部分とは異なる。粒子およびヒドロゲルマトリックスにおける異なる架橋剤の使用は、調整されたＨＡ分解プロファイルを有する組成物を提供し、そして調整可能なＨＡヒドロゲル足場を提供するための異なる架橋剤の使用を可能にする。
【００４３】
本発明の他の態様および好ましい実施形態は、以下に示される他の特許請求の範囲において定義され説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１：ラット尾部椎間板損傷モデルにおける椎間板高さの変化：棒グラフは、７日間および２８日間にわたる偽処置群、損傷群および損傷群のＨＡ処置群間の％椎間板高さの変化を表す。平均±ＳＤ。＊ｐ＜０．０５対傷害。
【図２−１】図２：質量分析法による椎間板のプロテオーム解析。（Ａ）移植後のＨＡヒドロゲルに関連する線維輪および髄核組織における総タンパク質の分布を示すベン図（左）。偽、損傷および移植ＨＡヒドロゲルにおけるＡＦおよびＮＰ組織のプロテオームシグネチャーを表したヒートマップ（右）（Ｂ）ＮＰ（ａ）およびＡＦ（ｃ）における細胞外マトリックス沈着の調節。タンパク質発現は、ＰＥＡＫＳを使用してｌｏｇ２（比）として提示された、１ユニットペプチドの誤発見率≦１％、Ｎ＝５）。
【図２−２】同上。
【図３】図３：ラット尾部椎間板損傷モデルにおける椎間板高さの変化：棒グラフは、７日、２８日および５６日にわたる偽処置群、損傷群および損傷群のＨＡ処置群間の％椎間板高さ変化を表す。平均±ＳＤ。＊ｐ＜０．０５対傷害。
【図４】図４：損傷前および損傷後の疼痛行動評価の前に、ラットの尾のモデルにおける皮下移植ＨＡハイドロゲルの実験計画の概要。
【図５】図５：ＨＡヒドロゲルの移植は、２９日目までハーグリーブス試験において潜伏時間の増加を示し、これは、ＨＡが陽性対照としてモルヒネ治療に匹敵するほどに熱痛覚過敏を軽減することを示唆する。＊ｐ＜０．０５、一元配置分散分析反復測定、Ｎ＝１０〜２０。データは平均値±標準誤差の平均値として表した。
【図６−１】図６：ＨＡヒドロゲルは、穿刺誘導性ＩＶＤ損傷後の疼痛表現型を軽減した。（Ａ）ハーグリーブス試験は、偽と比較して治療群における潜伏時間を減少させた。（Ｂ）ＨＡヒドロゲルの移植は、術後２９日目まで機械的異痛症を軽減した。（Ｃ）テールフリック試験は、動物の移植群においてより低い潜伏時間を示した。（Ｄ〜Ｅ）侵害受容、サブスタンスＰおよびｃ-Ｆｏｓの分子マーカーは、移植ＨＡヒドロゲルにおいてそれぞれ下方制御された。＊異なる群間で有意差が認められた（ｎ＝１０〜２０一元配置分散分析反復測定ｐ＜０．０５）。データは平均値±標準誤差の平均値として表した。
【図６−２】同上。
【００４５】
【図７】図７：ＨＡヒドロゲルは、ＡＦおよびＮＰ組織において末梢感作を減弱させた。（Ａ）共焦点顕微鏡写真は、黄色の標識を有するＧＡＰ４３によって染色された神経内方成長、紫色の標識を有するＣＧＲＰ抗体を用いる感覚神経ペプチド、および緑色標識を有するイオンチャネルＴＲＰＶ１の侵害受容器はＨＡヒドロゲルの移植後に蛍光の減衰を提示する証拠を示した。（Ｂ）ＨＡヒドロゲルの移植後にＡＦおよびＮＰ組織において減少したＧＡＰ４３、ＣＧＲＰおよびＴＲＰＶ１の体積分率の定量。＊異なる群間で有意差が認められた（ｎ＝３〜５の一元配置分散分析、ｐ＜０．０５）。データは平均値±標準誤差の平均値として表した。スケールバー＝５０μｍ。
【図８】図８：ＨＡヒドロゲルの移植（Ａ−Ｄ）時の疼痛に関連する循環炎症性サイトカインの調節は、循環炎症促進性サイトカイン（ＩＬ-６、ＩＬ-１β、ＩＦＮ-ΥおよびＴＮＦ-α）を下方制御することによって全身性炎症を減少させた。（Ｅ）血漿中に抗炎症マーカー（ＩＬ−１０）の増加が見られた。＊異なる群間で有意差が認められた（ｎ＝３〜５の一元配置分散分析、ｐ＜０．０５）。データは平均値±標準誤差の平均値として表した。
【図９−１】図９：ＩＶＤ損傷に関連した疼痛の新規ラットモデルにおけるＨＡヒドロゲルの移植に応答した糖シグネチャー。（Ａ）共焦点画像は、細胞内に提示されたケラタン硫酸の黄色蛍光および細胞外マトリックス中のコンドロイチン硫酸の紫色標識を示す。（Ｂ）ＡＦ組織およびＮＰ組織中の陽性染色コンドロイチン硫酸の定量体積分率は偽物と同様に維持されたが、ＨＡヒドロゲル移植後にケラタン硫酸が減少した。（Ｃ）α−ガラクトースへのＧＳＩＢ４結合の反復的な増加が損傷時に観察され、ＨＡヒドロゲルに応答して減少した。（Ｄ−Ｅ）２８日目にＮＰおよびＡＦ組織中の健康、傷害および移植後のＨＡヒドロゲルにおいて、それぞれＳＮＡ-ＩおよびＷＧＡによって検出されたα２ａ６シアリル化Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびシアリル化Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンモチーフ。（Ｆ）移植後のＨＡヒドロゲルの平均グリコシル化プロファイルのクラスター分析。＊異なる群間で有意差が認められた（ｎ＝３〜５の一元配置分散分析、ｐ＜０．０５）。データは平均値±標準誤差の平均値として表した。スケールバー＝５０μｍ。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】同上。
【図９−５】同上。
【図１０】図１０：カップリング試薬として（ａ）ＥＤＣ／ＮＨＳ、（ｂ）ＤＭＴＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４-メチルモルホリン）を使用した架橋粒子のＮＭＲ−Ｈ。
【図１１】図１１：１５００ｒｐｍで遠心分離した後の３つの異なる反応条件下で得られた最終生成物のＮＭＲ-Ｈ。紫：対照反応、カップリング試薬は使用しなかった；赤：ＥＤＣをカップリング試薬として使用した。緑色：ＤＭＴＭＭをカップリング試薬として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書で言及された全ての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的に個別に全部に列挙された参考文献および内容が参照することによって組み込まれるのと同様に、あらゆる目的のために参照により全部が本明細書に援用される。
定義と一般的な好み
【００４７】
本明細書で使用される場合、そして特に断りがない限り、以下の用語は、当該用語が当該技術分野において享受し得る任意のより広い（またはより狭い）意味に加えて以下の意味を有することを意図する。
【００４８】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書における単数形の使用は複数形を含むと解釈されるべきであり、逆もまた同様である。ある実体に関して使用される「ａ」または「ａｎ」という用語は、その実体の１つまたは複数を指すと解釈されるべきである。そのように、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に使用される。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその変形は、任意の列挙された整数（例えば、特徴、要素、特性、属性、方法／処理工程または制限）または整数のグループ（例えば、特徴、要素、特性、属性、方法／処理工程または制限）を包含するが、他のいずれかの整数または整数のグループを排除することは決してないことを暗に意味することは理解されるであろう。したがって、本明細書で使用されるとき、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は包括的または無制限であり、追加、列挙されていない整数または方法／処理工程は排除されない。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「疾患」は、生理学的機能を損ない、そして特定の症状と関連する任意の異常な状態を定義するために使用される。この用語は、病因の性質にかかわらず生理学的機能が損なわれている（または実際に疾患の病因学的根拠が確立されているかどうかにかかわらず）あらゆる障害、病気、異常、病理、病気、状態または症候群を包含するために広く用いられる。それゆえ、用語「疾患」は、感染、外傷、傷害、手術、放射線焼灼、中毒または栄養欠乏から生じる状態を包含する。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」または「ｔｒｅａｔｉｎｇ」は、疾患の症状を治癒、改善または軽減する介入（例えば、対象への薬剤の投与）、またはその原因を取り除く（またはその影響を軽減する）介入（例えば、椎間板の痛覚過敏の逆転）を指す。この場合、この用語は「治療」という用語と同義に使用される。
【００５２】
さらに、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」または「ｔｒｅａｔｉｎｇ」という用語は、疾患の発症または進行を防止または遅延させるか、または治療された集団内でのその発生率を低下させる（または根絶する）介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、治療という用語は、「予防」という用語と同義で使用される。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、薬剤の有効量または治療有効量は、妥当な利益／リスク比と釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに被験体に投与され得る量であるが、所望の効果、例えば、対象の状態の恒久的または一時的な改善によって示される治療または予防を提供するのに十分な量を定義する。前記量は、個体の年齢および一般的状態、投与方法および他の要因に応じて、被験体ごとに変わるであろう。したがって、正確な有効量を特定することは不可能であるが、当業者は日常的な実験および背景の一般的な知識を用いて任意の個々の場合において適切な「有効」量を決定することができるであろう。これに関連した治療結果は、症状の根絶または軽減、痛みまたは不快感の軽減、生存期間の延長、運動性の改善および他の臨床的改善のマーカーを含む。治療結果は完全な完治である必要はない。
【００５４】
上記で定義された治療および有効量の文脈において、対象（文脈が許す場合には「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」を含むと解釈される）という用語は、治療が指示されている任意の対象、特に哺乳動物対象を定義する。哺乳動物の対象としては、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、スポーツ動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、ネズミ、ウマ、畜牛、乳牛などの愛玩動物；類人猿、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類；イヌやオオカミなどのイヌ科動物；ネコ、ライオン、トラなどの猫科の動物；馬、ロバ、シマウマなどのウマ科の動物；牛、豚、羊などの食用動物；鹿やキリンなどの有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯動物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、椎間板に適用される「再生」という用語は、椎間板変性の抑制、椎間板変性速度の減速または減衰、またはより好ましくは変性が完全に抑制され椎間板の再生が起こる椎間板変性の逆転を意味する。椎間板変性の抑制および逆転は、本明細書に記載のラット尾部モデルを含む様々な方法を用いて対象で測定することができる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「椎間板疾患」は、外傷または椎間板変性状態によって引き起こされる損傷した椎間板組織を指す。椎間板変性は、しばしば老化に関連して自然に起こり得るか、または脊椎狭窄および不安定性、神経根症、骨髄症および椎間板ヘルニアを含む多くの臨床状態において現れることがある。椎間板変性は一般に腰痛と関連しているが、必ずしもそうではない。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「椎間板変性」または「ＩＶＤ変性」は、一般にＩＶＤの経時的変性を含む病理学的プロセスを指し、通常、１つ以上の線維軟骨の変性、髄核要素のヘルニア形成、髄核の収縮をもたらす線維輪の分裂によって特徴付けられる。炎症は頻繁に関与し、また椎間板変性はしばしば腰痛を引き起こす。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、ヒドロゲルの投与に適用されるときの用語「移植された」とは、椎間板疾患または変性の場所でヒドロゲルを体内に移植することをいう。ヒドロゲルは、椎間板の周囲に埋め込まれか、または罹患椎間板と隣接する椎骨との間の脊椎に埋め込まれてもよい。一実施形態では、ヒドロゲルは、罹患椎間板に隣接する腰椎関連筋組織（例えば、大腰筋、多裂筋、横突棘筋または仙棘筋）に埋め込まれる。ヒドロゲルは、任意の適切な手段によって、例えば適切なシリンジを使用する注射によって、または外科的移植によって移植することができる。外科的移植用のヒドロゲルは、一般に、注射用のヒドロゲルよりも高い粘度を有する。一実施形態では、ヒドロゲルおよび架橋剤は別々に注入されて、例えば、Ｄｕｐｌｏｊｅｃｔ注入システムを使用して標的部位でヒドロゲルをその場で架橋させる。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒアルロナン」または「ヒアルロン酸」または「ＨＡ」は、ヒトの細胞外マトリックスの一部を形成するアニオン性非硫酸化グリコサミノグリカンを指し、反復二糖→４）−β−ｄ−ＧｌｃｐＡ−（１→３）-β-ｄ-ＧｌｃｐＮＡｃ-（１→からなる。ヒアルロナンはヒアルロン酸の共役塩基であるが、２つの用語は互換的に使用され、そして両方とも本発明において使用され得る。ヒアルロン酸の塩を使用する場合、塩は一般にナトリウム塩であるが、カルシウム塩またはカリウム塩などを使用することができる。ヒアルロン酸またはヒアルロナンは、細菌供給源を含む任意の供給源から得ることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉからのヒアルロン酸ナトリウム塩は、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈによって製品参照番号５３７４７-１Ｇおよび５３７４７-１０Ｇの下で販売されている。ヒアルロン酸の微生物生産は、Ｌｉｕら（Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．２０１１；１０：９９）に記載されている。この用語はまた、ＨＡの誘導体、例えばＵＳ２００９／０２８１０５６およびＵＳ２０１０／０１９７９０４に開示されているようなカチオン基で誘導体化されたＨＡ、およびＭｅｎａａら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓ３：００１（２０１１））、Ｓｃｈａｎｔｅら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８５（２０１１））、ＥＰ０１３８５７２、ＥＰ０２１６４５３、ＥＰ１０９５０６４、ＥＰ０７０２６９９、ＥＰ０３４１７４５、ＥＰ１３１３７７２およびＥＰ１３３９７５３に開示されている誘導体などの他のタイプの官能化誘導体を含む。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒアルロナンヒドロゲル」または「ヒアルロナンヒドロゲルマトリックス」は、水分散媒体中のヒアルロナンポリマーの三次元ネットワークを意味する。一実施形態では、ヒアルロナンポリマーは架橋されて三次元ネットワークを形成する。典型的には、ヒドロゲルマトリックスは、ヒアルロナン含有コポリマーではなく、ヒアルロナンホモポリマーから形成される。一実施形態において、ヒドロゲルは注射可能である（すなわち、注射によるインビボでのヒドロゲルの送達を可能にする粘度を有する）。一実施形態では、ヒドロゲルは移植に適している。ＨＭＷ  ＨＡヒドロゲルを生成する方法は、以下およびＩｓａら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１５，１６，１７１４−１７２５）に記載されている。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、ヒアルロン酸に適用される「高分子量」という用語は、典型的には５００ＫＤａを超える分子量を意味する。一実施形態では、高分子量は、６００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は７００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は８００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は９００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は１０００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は１１００ＫＤａより大きい分子量を有する。一実施形態では、高分子量ヒアルロナンは、５００〜５０００ＫＤａの分子量を有する。一実施形態では、高分子量ヒアルロナンは、５００〜２０００ＫＤａの分子量を有する。一実施形態では、高分子量ヒアルロナンは、５００〜１５００ＫＤａの分子量を有する。一実施形態では、高分子量ヒアルロナンは、５００〜１０００ＫＤａの分子量を有する。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、ヒアルロン酸に適用される用語「架橋された」は、ヒアルロン酸ポリマー鎖が架橋剤と共有結合的に架橋されて三次元ネットワークを形成することを意味する。架橋ＨＡヒドロゲルは、例えば、Ｋｅｎｎｅら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｖｏｌ．９１，Ｉｓｓｕｅ  １（２０１１））、Ｓｅｇｕｒａら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ．２６，Ｉｓｓｕｅ  ４（２００５））、Ｙｅｏｍら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２１（２）２０１０）、ＵＳ８１２４１２０、およびＵＳ６０１３６７９の文献に記載されている。用語「架橋剤」は、一般に、ＨＡと反応することができる２つ以上の官能基を含有する分子を意味する。架橋剤の例としては、官能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧ−アミンおよびＰＥＧジグリシジルエーテル（ＥＸ８１０）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボイミド（ＥＤＣ）、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）ならびにエチレングリコールジアクリレートおよびジメタクリレート、メチレンビスアクリルアミドの誘導体（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むエチレングリコール架橋剤を挙げることができる。ＨＭＷ  ＨＡをＰＥＧ−アミンで架橋する方法は、以下およびＩｓａら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１５，１６，１７１４−１７２５）に記載されている。本発明のヒドロゲルは架橋されていてもよい。ヒドロゲルは、投与前に架橋されてもよく、または投与中または投与後に架橋されてもよい。例えば、ヒドロゲルおよび架橋剤は、ヒドロゲルのインサイチュ架橋を可能にするために成分が混合される送達まで２つの成分を別々に保つシリンジを使用して投与され得る。これはＤｕｐｌｏｊｅｃｔ注入システムを使用して達成することができる。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、ヒアルロナン粒子に適用される「ナノサイズ」という用語は、ナノメートル範囲の平均寸法を有することを意味する。例えば、ＨＡ粒子は、１〜１０００ｎｍ、典型的には１００〜９００ｎｍ、典型的には２００〜８００ｎｍ、好ましくは３００〜７００ｎｍ、そしてより好ましくは４００〜６００ｎｍの平均サイズを有し得る。一実施形態では、ＨＡ粒子は５００±１００ｎｍの平均粒径を有する。粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（ナノ範囲）を用いて測定される。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「椎間板創傷性疼痛」は、損傷を受けた椎間板から生じる疼痛を指す。これらは、ペプチド作動性小ニューロンの神経付近椎間板への神経分布を促進し、そして疼痛伝達のためのプロ侵害受容器（ＴＲＰＶ１およびＴｒｋ  Ａ）の感作を誘発するニューロトロフィン（β神経成長因子（β-ＮＧＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を含む）ならびに神経ペプチド（カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）およびサブスタンスＰを含む）の放出から生じる。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「侵害受容」は、感覚神経系が潜在的に有害な刺激に反応する痛みの知覚または感覚を一般的に指す。侵害受容器は、知覚神経線維の末端にある受容体であり、危険な信号を脳に送ることによって有害／痛みを伴う刺激に反応する。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「痛覚過敏」は、一般に、侵害受容器の感作または末梢神経の損傷によって引き起こされる疼痛に対する感受性の増加を指す。本発明のＨＡヒドロゲルは、損傷部位周辺の熱痛覚過敏を軽減する。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「痛覚鈍麻ｈｙｐｏａｌｇｅｓｉａ」（または「痛覚鈍麻ｈｙｐａｌｇｅｓｉａ」）は、痛みを伴う刺激に対する感受性の低下を意味する。痛みを伴う刺激が傷害部位の遠位にある受容野の外側に加えられると、それは痛みが痛みを抑制する現象を引き起こすことがある。この内因性疼痛調節の変化は、痛覚鈍麻として臨床的に提示されている。ＨＡヒドロゲル治療は、痛みを伴う刺激が損傷部位から遠く（遠位）に加えられたときに痛覚過敏現象を抑制する。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「過剰神経支配」は、侵害受容器または末梢神経への損傷によって引き起こされる痛みに対する感受性の増加を指す。過剰神経支配は、組織への神経線維の神経支配の増大（神経内方成長）を伴う。知覚過神経支配は、椎間板組織への知覚神経線維の分布または集団の増加を指す。神経内方成長の増加は過神経支配として定義される。移植されたＨＡヒドロゲルは、椎間板における損傷誘発性末梢感覚神経支配を阻害する。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、用語「炎症性障害」は、哺乳動物、特にヒトに影響を及ぼし、そして一般に１つ以上のサイトカインの発現調節異常を特徴とする免疫媒介性炎症状態を意味する。炎症性疾患の例には、皮膚炎症性疾患、関節の炎症性疾患、椎骨および／または椎間板の炎症性疾患、心血管系の炎症性疾患、ある種の自己免疫疾患、肺および気道の炎症性疾患、腸の炎症性疾患が含まれる。皮膚の炎症性障害の例には、皮膚炎、例えばアトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎、尋常性ざ瘡、および乾癬が含まれる。関節の炎症性障害の例には、慢性関節リウマチが含まれる。椎間板の炎症性障害の例には、椎間板変性が含まれる。心血管系の炎症性障害の例は、心血管疾患およびアテローム性動脈硬化症である。自己免疫疾患の例としては、１型糖尿病、グレーブス病、ギラン・バレー病、紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。肺および気道の炎症性障害の例には、喘息、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、気腫、および急性呼吸窮迫症候群が含まれる。腸の炎症性障害の例には、大腸炎および炎症性腸疾患が含まれる。他の炎症性疾患には、癌、花粉症、歯周炎、アレルギー、過敏症、虚血、鬱病、全身性疾患、感染後炎症および気管支炎が含まれる。本明細書において、用語「代謝障害」は、糖尿病前症、糖尿病；１型糖尿病；２型糖尿病；メタボリック症候群；肥満；；糖尿病性脂質異常症；脂質異常症；高血圧；高トリグリセリド血症；高脂肪血症；高コレステロール血症；高インスリン血症、およびＭＯＤＹを含むと理解されるべきである。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、用語「身体内の場所」とは、身体内の特定の場所、例えば、関節、椎間板、椎骨、骨、歯、四肢もしくは四肢の一部、または膀胱、心臓、血管系、肝臓、腎臓、脳などの器官をいう。
例示
【００７１】
本発明を特定の実施例を参照して説明する。これらは単なる例示であり説明の目的のためだけである：それらは特許請求の範囲または記載された発明の範囲を決して限定することを意図しない。これらの実施例は、本発明を実施するために現在考えられている最良の形態を構成する。
【００７２】
実施例１：非架橋、架橋ＨＡヒドロゲルのプロトコル
材料仕様：
材料仕様：ヒアルロン酸：高分子量（ＨＭ  Ｗｔ）ヒアルロン酸ナトリウム１Ｍ．Ｄａ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＵＳＡ）。ＣＡＳ番号：９０６７−３２−７。
ＰＥＧ−アミン：Ｍｗ２０００Ｄａ、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ（Ａｌｌｅｎ、ＴＸ）から購入。ＣＡＳ番号：２５３２２-６８-３、純度＞９５％。
Ｎ-（３-ジメチルアミノプロピル）-Ｎ’-エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）ＣＡＳ番号２５９５２-５３-８、純度〜１００％。
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＵＳＡ）。ＣＡＳ番号６０６６−８２−６、純度９８％。
リン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）ＣＡＳ番号Ｐ４４１７−５０ＴＡＢ（ｐＨを６．５に調整）
【００７３】
非架橋ゲルの製剤または配合手順：
１．蒸留水２００ｍｌに１錠を溶解することによりリン酸緩衝生理食塩水を調製し、ｐＨを６．５に調整する。
２．２５℃以下でリン酸緩衝生理食塩水に必要量のヒアルロン酸ナトリウム塩（３ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ）をゆっくり追加する。
３．２５℃以下で、マグネチックスターラー上で上記溶液を一晩撹拌する。ｐＨが６．５〜７．５の範囲内にあるかを確認する。
４．さらに使用するため低温室条件（４℃）でヒドロゲルを保管する。
【００７４】
架橋ゲルの製剤または配合手順：
１．１．０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中に９ｍｇ／ｍｌでヒアルロン酸ナトリウム塩をゆっくりと添加する。
２．上記溶液に、ＭＥＳ緩衝液中（ＨＡの繰り返し単位の各モノマーに対して）ＥＤＣ（４．５ｍｇ）およびＮＨＳ（２．７ｍｇ）を加え、１５分間撹拌した。混合を続け、架橋のために必要量のＰＥＧアミン（ＨＡに対して１：１．３２の比）を添加し、そして反応物を≦２５℃で一晩撹拌した。
３．完了した後、反応混合物は、６０００〜８０００ＭＷ透析膜を用いて蒸留水で２４〜４８時間透析し、任意の未反応の出発物質および塩を除去した。
透析後、サンプルを真空凍結乾燥して純粋な架橋ＨＡヒドロゲルを得た。凍結乾燥粉末をＰＢＳに再分散して同じ濃度のゲルを得た。
【００７５】
実施例２：ＨＡの架橋のためのプロトコル
材料仕様
ヒアルロン酸：高分子量（ＨＭｗｔ）ヒアルロン酸ナトリウム１．２×１０６Ｄａ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＵＳＡ）。ＣＡＳ番号：９０６７−３２−７。
ＰＥＧ−アミン：Ｍｗ２０００Ｄａ、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ（Ａｌｌｅｎ、ＴＸ）から購入。ＣＡＳ番号：２５３２２−６８−３、純度＞９５％
【００７６】
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｓｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＵＳＡ）ＣＡＳ番号２５９５２−５３−８、純度約１００％
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＵＳＡ）。ＣＡＳ番号６０６６−８２−６、純度９８％
溶媒：蒸留水中の２０重量％硫酸ナトリウム溶液および０．１Ｍ  ＭＥＳ（２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液
【００７７】
ＨＡ（ＥＤＣ／ＮＨＳ）の架橋のための合成プロトコルの評価
１．１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＨＡを０．１  Ｍ  ＭＥＳ緩衝液に室温で２時間溶解した。
ａ．ＭＥＳ緩衝液は均一溶液を得るためにＨＡの迅速な溶解を促進する。
ｂ．ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ〜６）は均質な溶液を得るためにＨＡのカルボキシル基のイオン化も促進する（ｐＫａ〜３−４）。
２．次に、中性イオン塩の２０重量％Ｎａ２ＳＯ４溶液を加えて、ＨＡのイオン化をさらに誘導した。
３．この溶液に、ＭＥＳ緩衝液中のＥＤＣ（４６ｍｇ、０．２Ｍ）及びＮＨＳ（２７ｍｇ、０．２Ｍ）の溶液を添加し、１５分間撹拌した。
ａ．ＭＥＳ緩衝液は、架橋効率および収率を増加させることが文献に報告されている。
４．次に、ＰＥＧ（５ｍｇ、１：２、ＨＡに対する比率）を架橋のために加え、反応物を室温で一晩撹拌した。
５．完了後、反応混合物を、６０００〜８０００ＭＷの透析膜を用いて蒸留水で４８時間透析し、あらゆる未反応の出発物質および塩を４８時間除去した。
６．透析後、サンプルを真空凍結乾燥し、純粋な架橋ＨＡ粒子を得た。
７．ゼータ電位とＳＥＭによる特徴付け。
ａ．サイズの増加とゼータ電位の減少が観察されたが、これは遊離カルボキシル基の数および粒子の長さが減少したためで架橋効率の増加に起因する。
８．ゼータ電位：−２４．８（平均）、２．１７（標準偏差）、−２１．６（最大）、−２７．３（最小）。
【００７８】
ＨＡ架橋用合成プロトコル（ＤＭＴＭＭ）の評価
１．５００ｍｇのＨＡを０．１ＭのＭＥＳ緩衝液に室温で２時間溶解した。
ａ．ＭＥＳ緩衝液は均質な溶液を得るためにＨＡの迅速な溶解を促進する。
ｂ．ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ〜６）はＨＡのカルボキシル基のイオン化も促進する（ｐＫａ〜３−４）。
２．次に、中性イオン塩の２０重量％Ｎａ２ＳＯ４溶液を加えて、ＨＡのイオン化をさらに誘導した。
３．この溶液にＤＭＴＭＭ（３８５ｍｇ）の溶液を加える。
ａ．ＭＥＳ緩衝液は、架橋効率および収率を増加させることが文献に報告されている。
４．次に、ＰＥＧ（２５０ｍｇ）を架橋のために加え、反応物を一晩室温で撹拌した。
５．ＤＭＴＭＭおよびＰＥＧアミンを０．１ＭのＭＥＳ緩衝液に溶解して、総最終反応容量を１２５ｍＬとした。
６．この反応液を８体積％飽和塩化ナトリウムで強化した。
７．生成物を９６％エタノール（１０ｍｌ）を用いて沈殿させた。
８．反応液を放置し、完全に沈殿させるために３０分間攪拌した。
９．１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、生成物を収集した。
１０．続けて数回の洗浄工程を行い、次に生成物を濾過し、４８時間真空下に保った。
１１．このサンプルは、純度をＮＭＲ、架橋をＴＮＢＳＡ、形態学的評価をＳＥＭによって特徴づけた。
【００７９】
実施例３  椎間板の高さデータ（図１および図３）
ヒアルロン酸（ＨＡ）ミクロゲルの抗炎症効果を調べるために、ラット尾部モデルでインビボ試験を行った。この研究に使用された動物は、２５０〜３５０ｇの１２週齢の雌ラットＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙであった。実験計画は、偽、損傷および損傷＋移植可能なＨＡヒドロゲル群から構成し、各ラットに対してＣ４〜Ｃ５、Ｃ５〜Ｃ６、およびＣ６〜Ｃ７の椎間板レベルで行った。損傷は、刃を使用して１×１×１ｍｍ（幅、高さおよび深さ）の組織を切除することによって行った。次いで、損傷を誘発した後、実験群に応じて、椎間板をそのままにするか、またはＨＡヒドロゲルを移植した。傷口は、非吸収性縫合糸を使って最初に結合組織層を縫合し、次いで皮膚を縫合して層状に閉じることで椎間板を被覆した。回数を増やす必要がある場合は、術後および次の数日間（通常７２時間）に鎮痛薬のブプレノルフィン塩酸塩０．０２５ｍｇ／ｋｇを１２時間ごとに投与する。術後２８日後、免疫組織化学分析のためにラットを瘢痕化して椎間板組織を採取した。椎間板の高さを０、７、２８および５６日目に測定した。測定結果は、ＨＡはなんら有意な損失なしに最大２８日間、椎間板の高さを維持していることを示す（図１および３）。
【００８０】
ＨＡヒドロゲルは細胞および細胞外マトリックスでプロテオームシグネチャーを調節する（図２）
細胞および細胞外シグナル伝達経路に関与するタンパク質に関する機構的洞察をさらに得るために、経路分析のみならずタンパク質の同定と定量化は質量分析を採用した。非標識（Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオーム解析に基づいて、それぞれ合計２００個および３８６個のタンパク質が、移植後のＨＡヒドロゲル状態と関連してＥＣＭ  ＡＦおよびＮＰで同定された。ヒートマップ分析から、ＥＣＭ分子がＡＦ組織とＮＰ組織の両方で豊富に検出された（図２Ａ）。コラーゲンＩＩは損傷群とＨＡヒドロゲル群の両方で上方制御された。
【００８１】
実施例４
ラットを３つのグループ、すなわち偽（ｎ＝２０）、損傷（ｎ＝２０）および治療用植込み型ＨＡヒドロゲルを付帯した損傷（ｎ＝２０）に分けた。傷害が誘発された直後に傷害部位にヒドロゲルを移植し、１、７、１４および２８日目に術後の疼痛行動についてラットを評価した。その後、７日目および２９日目にラットを安楽死させ、分析のために椎間板、脊髄および血漿を採取した。ｃ‐ＦｏｓとサブスタンスＰの分子痛マーカーをｑＲＴ‐ＰＣＲにより測定した。免疫組織化学を用いて、椎間板内のＧＡＰ４３、ＣＧＲＰタンパク質およびＴＲＰＶ１に対する反応性、神経支配、感覚神経ペプチドおよび侵害受容体マーカーを同定した。レクチン組織化学法を採用して、椎間板におけるグリカン発現を分析した。血漿中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０の循環サイトカインをマルチプレックスＥＬＩＳＡによって測定した。試験デザインの概略図を図４に示す。ＨＡヒドロゲルの移植は、２９日目までのハーグリーブス試験において潜伏時間の増加を示したが、これはＨＡが陽性対照と同様にモルヒネ治療に匹敵するほど熱痛覚過敏を軽減することを示唆する（図５、図６（ａ））。フォンフレイ試験でも同様のパターンが観察され、ＨＡ群は損傷群と比較して増強された応答を示し、これはＨＡヒドロゲルがモルヒネに匹敵する機械的異痛を減少させたことを示す（図６（ｂ））。テールフリック試験では、ＨＡは、低用量のモルヒネに匹敵する偽のものと同様の値に潜伏時間を減らすことによって痛覚過敏を抑制した。（図６（ｃ））。中枢神経系における分子レベルでは、遺伝子発現分析により、脊髄中のＨＡ弱毒化損傷誘導サブスタンスＰ（図６（ｄ）およびｃ−Ｆｏｓ（図６（ｅ））が明らかになった。ＧＡＰ４３、ＣＧＲＰおよびＴＲＰＶ１の免疫染色は、ＨＡがＡＦおよびＮＰ組織における傷害誘導性末梢感覚神経支配、感覚神経ペプチドおよび疼痛受容体を阻害することを実証した。（図７）。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ−αの循環サイトカインは、ＨＡヒドロゲルの移植時に減少した（図８）。これは、ＨＡが疼痛に関連する全身性炎症を軽減することを示唆しており、この所見は抗炎症マーカーＩＬ−１０の増加によって支持されていた。コンドロイチン硫酸含有量は、椎間板へのＨＡヒドロゲルの移植後に増加した。対照的に、ケラタン硫酸の発現は、ＨＡヒドロゲルの移植に応答して減少した（図９）。
【００８２】
実施例５
ＤＭＴＭＭ架橋データ
溶液のｐＨの変化に敏感ではないため、ＥＤＣ：Ｎ−（３-ジメチルアミノプロピル）-Ｎ’-エチルカルボジイミド；ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）の代わりに（４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリン）（ＤＭＴＭＭ）を使用することで架橋度が高まることが見出された（図１０）。ＤＭＴＭＭ（ｂ）を用いた場合の３．１５ｐｐｍにおけるより広いシグナルは、より高度の架橋を示唆する。
図１１に示すように、次のことが確認された。
・ＤＭＴＭＭは、ＥＤＣ／ＮＨＳよりもポリマーを架橋するためのより効率的な試薬であった。
・架橋試薬を使用しない対照反応と同様に精製後のＮＭＲスペクトルでヒアルロン酸ナトリウムのピークしか見られないことから精製方法も効率的であった。
均等論
【００８３】
前述の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮すると、当業者にはその実施における多数の修正および変形が想起されると予想される。それらの修正および変形は、本出願に添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。
【図１】
2019528982.tif 000003
【図２−１】
2019528982.tif 000004
【図２−２】
2019528982.tif 000005
【図３】
2019528982.tif 000006
【図４】
2019528982.tif 000007
【図５】
2019528982.tif 000008
【図６−１】
2019528982.tif 000009
【図６−２】
2019528982.tif 000010
【図７】
2019528982.tif 000011
【図８】
2019528982.tif 000012
【図９−１】
2019528982.tif 000013
【図９−２】
2019528982.tif 000014
【図９−３】
2019528982.tif 000015
【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０】
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【図１１】
2019528982.tif 000019
【国際調査報告】
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