(57)【要約】本開示は、治療剤の標的化送達のための組成物及び方法を提供する。本開示はさらに、治療剤（例えば、免疫療法剤）を負荷した血小板を使用してがんの転移または再発を治療または予防する方法を提供する。【選択図】図１Ａ
2019530673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、を含み、
前記治療剤が、前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合している、組成物。
【請求項２】
前記治療剤が免疫療法剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記免疫療法剤が、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４７抗体、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫療法剤が抗ＰＤＬ１抗体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記化学的リンカー部分が、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記化学的リンカー部分がマレイミドリンカーである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記血小板細胞がヒト血小板細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記血小板細胞が自己由来の血小板細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、
前記治療剤が、前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合している、がんの転移または再発を予防する方法。
【請求項１０】
前記治療剤が免疫療法剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫療法剤が、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４７抗体、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫療法剤が抗ＰＤＬ１抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学的リンカー部分が、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学的リンカー部分がマレイミドリンカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記血小板細胞がヒト血小板細胞である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記血小板細胞が自己由来のヒト血小板細胞である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが固形腫瘍である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが黒色腫である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記がんが乳癌である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、追加の治療剤と組み合わせて投与される、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記追加の治療剤が抗腫瘍剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む組成物を対象に投与することを含み、
前記治療剤が、前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合しており、
前記組成物が、前記血小板細胞の活性化を介して創傷または外科的切除部位を標的とする、治療剤の標的化送達のための方法。
【請求項２３】
前記組成物が、前記血小板細胞の活性化時に、創傷または切除部位で血小板由来マイクロ粒子中でさらに放出される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療剤が免疫療法剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫療法剤が、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４７抗体、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫療法剤が抗ＰＤＬ１抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化学的リンカー部分が、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記化学的リンカー部分がマレイミドリンカーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記血小板細胞がヒト血小板細胞である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記血小板細胞が自己由来の血小板細胞である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、
前記治療剤が、前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合している、血管疾患を治療または予防する方法。
【請求項３２】
前記治療剤が免疫療法剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫療法剤が、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４７抗体、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫療法剤が抗ＰＤＬ１抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記化学的リンカー部分が、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記化学的リンカー部分がマレイミドリンカーである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記血小板細胞がヒト血小板細胞である、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記血小板細胞が自己由来の血小板細胞である、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記血管疾患が、組織損傷、炎症、または心血管疾患である、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が、追加の治療剤と組み合わせて投与される、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、２０１６年９月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／３９３，８３９号の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、治療剤の標的化送達のための組成物及び方法を提供する。本開示はさらに、治療剤（例えば、免疫療法剤）を負荷した血小板を使用してがんの転移または再発を治療または予防する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
手術は、ほとんどの固形腫瘍に対する処置の主な選択肢である。外科的技術の継続的な改善にもかかわらず、腫瘍切除後の残存微小腫瘍及び／または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、依然として課題である。加えて、手術が、がん転移の促進を誘発し得ることもまた示唆されている。多くの患者は、術後に再発性疾患を発症し、これは重大な罹病率と死亡率につながるおそれがある。したがって、術後のがんの再発を防ぐための効果的な戦略構築に多大な関心が寄せられている。それらの中で、がん免疫療法は、近年非常に注目を集めている。免疫療法剤は腫瘍を直接攻撃するのではなく、身体の免疫系を高めてがん細胞を殺す。免疫チェックポイント遮断は、患者のサブセットにおいて長続きする抗腫瘍反応及び長期間の寛解を誘発した。特に、チェックポイント阻害剤は、リンパ球上のプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び腫瘍細胞上のプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤＬ１）の相互作用を遮断し、様々な種類のがんの処置において目を見張る結果を示した。さらに、最初のＰＤ−Ｌ１阻害剤であるアテゾリズマブは、最近ＦＤＡから迅速承認を受けた。著しい進歩にもかかわらず、チェックポイント遮断療法の現在の方法は、多くの患者において治療効果が制限される。臨床試験で観察された最大の制限は、自己免疫疾患などの副作用の重篤度であり得る。免疫チェックポイント遮断療法で処置した場合、グレード３／４の有害事象が時々発生している。その一方で、大多数の患者は、これらの薬剤に反応しなかった。がん免疫療法の客観的奏効率（ＯＲＲ）は、依然として改善が必要である。がん免疫療法をどのように強化するかは、がん免疫学及び免疫療法の分野における中心的テーマの１つとなっている。本明細書に開示される組成物及び方法は、これらのニーズ及び他のニーズに対処する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、疾患、例えばがんの治療及び予防のための血小板組成物及び方法を提供する。本明細書に開示される組成物及び方法では、治療剤（例えば、免疫療法剤）が血小板細胞に共有結合している。本発明者らは、血小板細胞の表面にコンジュゲートした免疫療法剤（例えば、抗ＰＤＬ１）が、原発腫瘍切除後のがんの再発を減少させる（及び／または転移を減少させる）ことを見出した。
【０００５】
一態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含み、
治療剤が前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合している、組成物が、本明細書で提供される。
【０００６】
別の態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、
治療剤が前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合している、がんの転移または再発を予防する方法が、本明細書にて開示される。
【０００７】
さらなる態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む組成物を対象に投与することを含み、
治療剤が前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合しており、
前記組成物が、前記血小板細胞の活性化を介して創傷または外科的切除部位を標的とする、治療剤の標的化送達のための方法が、本明細書にて開示される。
【０００８】
追加の態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、
治療剤が前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合している、治療剤の標的化送達のための方法が、本明細書で提供される。
【０００９】
本願明細書に組み込まれて本願明細書の一部を構成する添付図面は、以下に記載されるいくつかの態様を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ａ〜Ｆ。抗ＰＤＬ１（Ｐ−ａＰＤＬ１）による血小板のｉｎ  ｓｉｔｕ活性化は、治療薬の放出を促進する。（ａ）血小板による原発腫瘍切除部位への抗ＰＤＬ１抗体（ａＰＤＬ１）の送達の模式図である。（ｂ）活性化前（ｉ）及び活性化後（ｉｉ及びｉｉｉ）のＰ−ａＰＤＬ１のＴＥＭ画像である。赤い矢印は、血小板から放出されたＰＭＰを示す。大量の生成されたＰＭＰ粒子が、電子顕微鏡で観察された。スケールバー：０．５μｍ。（ｃ）異なる時点での非活性化血小板及び活性化血小板から放出されたａＰＤＬ１の割合（％）である。（ｄ〜ｅ）異なる時点での非活性化血小板及び活性化血小板から放出されたＴＮＦ−α（ｆ）及びＩＬ−１β（ｇ）の量である。（ｆ）トランスウェルシステム（孔径、１μｍ）中で、非活性化Ｐ−ａＰＤＬ１（左）及び活性化Ｐ−ａＰＤＬ１（右）と同時インキュベートしたＢ１６がん細胞の共焦点免疫蛍光画像である。Ｐ−ａＰＤＬ１及びＢ１６がん細胞を、それぞれ上部区画及び下部区画で培養した。赤色はａＰＤＬ１シグナルを表し、青色蛍光と緑色蛍光は、それぞれＤＡＰＩとＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートコムギ胚芽凝集素による核と原形質膜を表す。スケールバー：２０μｍ。エラーバーは、３反復試料の標準偏差（ＳＤ）に基づく。
【図２】Ａ〜Ｊ。Ｐ−ａＰＤＬ１療法による手術床の再発性黒色腫腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ減少。（ａ）注射後の異なる時点で採取した血液中のａＰＤＬ１レベルを測定することによる、マウスにおけるＰ−ａＰＤＬ１、遊離ａＰＤＬ１、及び血小板＋ａＰＤＬ１混合物の血液循環曲線である。エラーバーは、３反復試料の標準偏差（ＳＤ）に基づく（ｎ＝３）。（ｂ）Ｐ−ａＰＤＬ１または等価用量の遊離ａＰＤＬ１を静脈内注射後のマウスの注射の２時間後の蛍光画像（ａＰＤＬ１−Ｃｙ５．５）である。（ｃ）Ｐ−ａＰＤＬ１または遊離ａＰＤＬ１の静脈内注射から２時間後の残存腫瘍を有する創傷のｅｘ  ｖｉｖｏ画像である。（図２ｄ）（ｃ）に示されるマウスの異なる創傷における平均ａＰＤＬ１−Ｃｙ５．５蛍光シグナル強度である。エラーバーは、３反復試料の標本平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）に基づく。（ｅ）（ｂ）に示されるマウスから撮影した残存腫瘍切片の共焦点画像である。画像中、青と赤は、それぞれＤＡＰＩとＣｙ５．５による核とａＰＤＬ１のシグナルを表す。スケールバー：２０μｍ。（ｆ）不完全手術腫瘍モデルの処置のためのＰ−ａＰＤＬ１療法の模式図である。（ｇ）原発腫瘍の除去後の異なる群のＢ１６Ｆ１０腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光画像である。処置群あたり３匹の代表的なマウスを示す。（ｈ）明記された種々の処置後の異なる群のマウスの定量化された腫瘍シグナルである。（ｉ〜ｊ）処置マウス及び対照マウスの腫瘍増殖曲線（ｉ）及び生存曲線（ｊ）である。生存調査のために処置群あたり８匹のマウスを示す。エラーバーは、標本平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）に基づく。Ｐ値：＊はＰ＜０．０５。
【図３】Ａ〜Ｈ。Ｐ−ａＰＤＬ１は、強固なＴ細胞媒介性の抗腫瘍免疫応答を引き起こした。（ａ）残存腫瘍の免疫蛍光は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を示す。スケールバー：５０μｍ。（ｂ）腫瘍重量、及び（ｃ）腫瘍１グラムあたりのＣＤ３＋細胞の絶対数である。エラーバーは、標本平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）に基づく（ｎ＝４）。（ｄ）全ＣＤ３＋細胞のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）、ならびに明記されたように処置されたマウスの残存腫瘍における代表的なドットプロットである。４つの象限全てにおいてより高い細胞集団は、腫瘍部位において、はるかに多くのＣＤ３＋腫瘍浸潤リンパ球を示した。（ｅ）全ＣＤ３＋細胞のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合（％）、及び明記されたように処置されたマウスの残存腫瘍における代表的なドットプロットである。（ｆ）種々の処置時の腫瘍１グラムあたりのＣＤ８＋細胞の絶対数である。（ｇ〜ｈ）種々の処置時の残存腫瘍における腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞及びエフェクティブＣＤ４＋Ｔ細胞（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）の制御性Ｔ細胞に対する比である。エラーバーは、標本平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）に基づく（ｎ＝４）。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの事後検定を使用して一元配置分散分析によって算出した。Ｐ値：＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００５。
【図４】Ａ〜Ｆ。Ｐ−ａＰＤＬ１療法は、局所的な再発性黒色腫腫瘍及び転移性疾患の増殖に影響を及ぼした。（ａ）マウスの不完全な手術及び転移性腫瘍モデルの処置のためのＰ−ａＰＤＬ１療法の模式図である。（ｂ）異なる時点での原発腫瘍の除去後の異なる群のＢ１６Ｆ１０転移のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光画像である。処置群あたり３匹の代表的なマウスが示される。（ｃ）代表的な肺写真、及び（ｄ）明記された異なる処置後のマウスから収集されたＨ＆Ｅ染色された肺切片である。黒い矢印は、肺の転移性腫瘍を示す。スケールバー：５００μｍ。（ｅ）異なる処置をしたマウスの肺転移小結節の定量化である。結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。（ｆ）処置マウス及び対照マウスの生存曲線である。生存調査のための処置群あたり８匹のマウスを示す。Ｐ値：＊はＰ＜０．０５。
【図５】Ａ〜Ｅ。術後４Ｔ１再発癌を処置するＰ−ａＰＤＬ１。（ａ）異なる時点での原発腫瘍の除去後の異なる群の４Ｔ１転移のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光画像である。（ｂ）手術の２週間後の代表的なマウスの写真である。黒い矢印は、手術床（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｅｄ）の再発腫瘍を示す。（ｃ）明記された異なる処置後のマウスから収集された代表的な肺写真である。赤い矢印は、肺の腫瘍小結節を示す。（ｄ）異なる処置をしたマウスの肺転移小結節の定量化である。結果は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。（ｅ）処置マウス及び対照マウスの生存曲線である。生存調査のための各処置群あたり８匹のマウスを示す。Ｐ値：＊はＰ＜０．０５。
【図６】ａＰＤＬ１結合血小板の共焦点免疫蛍光画像である。ＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体を用いて、血小板上のａＰＤＬ１画像を検出した。スケールバー：２０μｍ。
【図７】ａＰＤＬ１結合血小板のフローサイトメトリーアッセイである。血小板を、異なる実験設定下でａＰＤＬ１と共にインキュベートし、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＦＩＴＣを使用してフローサイトメトリーにより分析した。血小板表面へのａＰＤＬ１の結合の成功は、スルフィドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）及びマレイミドの結合を介して確認された。
【図８】Ａ〜Ｃ。ａＰＤＬ１結合血小板のコンジュゲーション及び安定性。（ａ）様々な量のａＰＤＬ１をコンジュゲーションのために血小板に添加した。血小板へのａＰＤＬ１コンジュゲーションの効率（添加したａＰＤＬ１／コンジュゲートしたａＰＤＬ１）は、血小板あたり０．２ｐｇのａＰＤＬ１を添加した場合に約７５％であった。（ｂ）ａＰＤＬ１修飾後の血小板の安定性。０時間及び２４時間における血小板数分析に基づいてＰ−ａＰＤＬ１の数を測定した。（ｃ）経時的な血小板上ａＰＤＬ１の安定性。エラーバーは、３反復試料の標準偏差（ＳＤ）に基づく（ｎ＝６）。
【図９】未処置の血小板及びａＰＤＬ１コンジュゲート血小板上の表面タンパク質発現である（活性化後にＣＤ６２Ｐ及びＣＤ４０Ｌを調べた）。
【図１０】Ａ〜Ｂ。活性化後のＰ−ａＰＤＬ１の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。（ａ）活性化血小板から出る血小板微粒子（ＰＭＰ）である。（ｂ）Ｐ−ａＰＤＬ１活性化後、多数のＰＭＰがＴＥＭで見られる。サイズバー：ａでは１００ｎｍ、ｂでは２μｍ。
【図１１】活性化後のＰ−ａＰＤＬ１の免疫蛍光画像である。血小板にカルセインを負荷し、緑色蛍光により可視化した。ａＰＤＬ１をＣｙ３ヤギ抗ラットＩｇＧ二次抗体で標識し、赤色蛍光によって可視化した。白い矢印は、血小板から放出されたＰＭＰを示す。
【図１２】Ａ〜Ｂ。トランスウェルシステム中で、Ｐ−ａＰＤＬ１と同時インキュベートしたＢ１６がん細胞の共焦点免疫蛍光画像である。（ａ）トランスウェルシステムの模式図である。Ｐ−ａＰＤＬ１及びＢ１６がん細胞を、それぞれ上部区画及び下部区画で培養した。（ｂ）トランスウェルシステム（孔径、１μｍ）中で、非活性化Ｐ−ａＰＤＬ１及び活性化Ｐ−ａＰＤＬ１と同時インキュベートしたＢ１６がん細胞の共焦点免疫蛍光画像である。赤（Ｃｙ３）蛍光はａＰＤＬ１シグナルを表し、青（ＤＡＰＩ）と緑（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）蛍光は、それぞれ核と細胞膜からのシグナルを表す。スケールバー：２０μｍ。
【図１３】Ａ〜Ｃ。マウスにおけるａＰＤＬ１結合血小板の体内分布である。（ａ）遊離Ｃｙ５．５−ａＰＤＬ１及びＰ−ａＰＤＬ１−Ｃｙ５．５の蛍光スペクトルである。血小板にａＰＤＬ１をコンジュゲートした後、Ｃｙ５．５の強度は、顕著な影響が見られなかった。（ｂ）Ｐ−ａＰＤＬ１及び遊離ａＰＤＬ１の静脈内注射から２時間後のマウスの異なる臓器におけるｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｃｙ５．５−ａＰＤＬ１蛍光画像である。Ｌ：肝臓、Ｌｕ：肺、Ｓｐ：脾臓、Ｈ：心臓、Ｋ：腎臓。（ｃ）（ｂ）に示されるマウスの異なる臓器における平均Ｃｙ５．５蛍光シグナル強度である。各処置群あたり３匹のマウスを示す。結果は、平均±ＳＤとして表した。統計的有意性は、ｔ検定によって算出した。Ｐ値：＊＊＊はＰ＜０．００５。
【図１４】Ａ〜Ｂ。残存腫瘍切片の共焦点画像である。（ａ）残存腫瘍切片の共焦点画像である。画像中、青と赤は、ＤＡＰＩとＣｙ５．５による核とａＰＤＬ１のシグナルを表す。（ｂ）（ａ）のＰ−ａＰＤＬ１中の残存腫瘍切片の高倍率画像である。白い矢印は、血小板から放出されたＰＭＰ及びａＰＤＬ１を示す。
【図１５】マウス尾部切断出血モデルにおける止血効果である。統計的有意性は、ｔ検定によって算出した。ｎ．ｓ．は有意差無し。エラーバーは、３反復試料の標準偏差（ＳＤ）に基づく（ｎ＝１０）。
【図１６】Ａ〜Ｄ。処置後のマウスのサイトカインレベルである。明記された処置後のマウスの、（ａ）局所的サイトカインレベルと（ｂ）全身性サイトカインレベルである。ＰＤ−Ｌ１分析の、（ｃ）代表的なフローサイトメトリー分析画像と（ｄ）免疫蛍光画像である(上部、血小板なし；下部、血小板あり)。（マクロファージは、ＣＤ１１ｂ＋  ＧＦＰ−にゲートをかけ、腫瘍細胞はＧＦＰ＋、ＣＤ４５−にゲートをかけ、Ｂ細胞はＣＤ２０＋  ＧＦＰ−にゲートをかけ、ＤＣはＣＤ１１ｃ＋  ＧＦＰ−にゲートをかけた）。エラーバーは、３反復試料のｓ．ｅ．ｍに基づく。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの事後検定を使用して一元配置分散分析によって算出した。Ｐ値：＊はＰ＜０．０５、ｎ．ｓ．は有意差無し。
【図１７】残存腫瘍の免疫蛍光は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図１８】明記された異なる処置をした、Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合（％）。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの事後検定を使用して一元配置分散分析によって算出した。Ｐ値：＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００５。
【図１９】Ａ〜Ｃ。原発腫瘍除去後のＰＭＰ−ａＰＤＬ１及び高用量のａＰＤＬ１の抗腫瘍効率である。（ａ）原発腫瘍の除去後の異なる群のＢ１６Ｆ１０腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光画像である。（ｂ）明記された種々の処置後の異なる群のマウスの腫瘍増殖曲線である。（ｃ）明記された種々の処置後６０日でのマウスの生存曲線である。各処置群あたり５匹のマウスを示す。
【図２０】肺組織の蛍光画像である。青と緑の蛍光は、それぞれＤＡＰＩによる核とＧＦＰがん細胞を表す。スケールバー：１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、疾患、例えばがんの治療及び予防のための血小板組成物及び方法を提供する。本明細書に開示される組成物及び方法では、治療剤（例えば、免疫療法剤）が血小板細胞に共有結合している。本発明者らは、血小板細胞の表面にコンジュゲートした免疫療法剤（例えば、抗ＰＤＬ１）が、原発腫瘍切除後のがんの再発を減少させる（及び／または転移を減少させる）ことを見出した。
【００１２】
ここで、本発明の実施形態を詳細に参照し、その例を図面及び実施例に例示する。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。
【００１３】
別途定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語及びその変形形態は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語及びその変形形態と同義に使用され、オープンで非限定的な用語である。本明細書では「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語を使用して種々の実施形態を説明しているが、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の代わりに「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語がより具体的な実施形態を提供するために使用することができ、また開示される。
【００１４】
用語
本明細書及び本特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上、別段の明確な指示がない限り、複数形の言及を含む。例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「〜してもよい（ｍａｙ）」、「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」、及び「〜であってもよい（ｍａｙ  ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は、互換的に使用され、その状態が生じる場合だけでなく、その状態が生じない場合も含まれることを意味する。したがって、例えば、ある製剤に「賦形剤を含んでもよい」という記載は、該製剤に賦形剤が含まれる場合だけでなく、該製剤に賦形剤が含まれない場合も含まれることを意味する。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「有益な薬剤」及び「活性剤」という用語は、本明細書で互換的に使用され、有益な生物学的効果を有する化学化合物または組成物を指す。有益な生物学的効果には、治療効果（すなわち、障害または他の望ましくない生理状態の治療）と予防効果（すなわち、障害または他の望ましくない生理状態（例えば、がん）の予防）の両方が含まれる。この用語にはまた、本明細書において具体的に言及される有益な薬剤の薬学的に許容可能な、薬理学的に活性な誘導体が包含され、限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、異性体、断片、類似体などが含まれる。「有益な薬剤」または「活性剤」という用語が使用される場合、または特定の薬剤が具体的に明確にされる場合、この用語には、その薬剤それ自体だけでなく、薬学的に許容可能な、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、コンジュゲート、活性代謝物、異性体、断片、類似体などが含まれると理解されたい。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、対象を「処置すること」または対象の「処置」という用語には、疾患または障害、または疾患もしくは障害の症状を予防する、治す、癒やす、軽減する、緩和する、変化させる、治療する、回復させる、改善する、安定化させる、またはそれに影響を及ぼす目的での対象への薬物の投与が含まれる。「処置する」及び「処置」という用語はまた、症状の重症度及び／または頻度の低減、症状及び／または根本原因の除去、症状及び／またはその根本原因の発生の予防、ならびに損傷の改善または治療を指すことができる。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、対象における障害または望ましくない生理学的事象を「予防する」という用語は、具体的には、症状及び／またはその根本原因の発生の予防を指し、その対象は、その障害または事象に対して高まった感受性を示す場合もあれば示さない場合もある。
【００１９】
治療剤の「有効量」という用語は、無毒であるが、有益な薬剤が所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。「有効」である有益な薬剤の量は、対象の年齢及び全般状態、個々の有益な薬剤（複数可）などに依存して、対象ごとに変動するものである。したがって、正確な「有効量」を特定することは、必ずしも可能ではない。しかしながら、どの対象の症例にも適切な「有効」量は、通常の実験を使用して、当業者により決定され得る。さらに、本明細書中で使用される場合、そして特段明記されない限り、有益なものの「有効量」はまた、治療上有効な量と予防上有効な量の両方を包含する量を指すことができる。
【００２０】
治療効果を達成するのに必要な薬物の「有効量」は、対象の年齢、性別、及び体重のような要素によって変動し得る。投与レジメンは、最適な治療応答をもたらすように調整することができる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与してもよく、治療状況の緊急性により示されるように、その用量を比例的に減らしてもよい。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、治療剤の「治療的有効量」は、所望の治療結果を達成するのに有効である量を指し、治療剤の「予防的有効量」は、望まれない生理状態を予防するのに有効である量を指す。所与の治療剤の治療的有効量及び予防的有効量は、典型的には、処置される障害または疾患の種類及び重症度、ならびに対象の年齢、性別、及び体重のような要素に関連して変動するものである。
【００２２】
「治療的有効量」という用語はまた、所望の治療効果を促進するのに有効な、治療剤の量または治療剤の送達速度（例えば、経時的な量）を指すことができる。所望の正確な治療効果は、処置される状態、対象の忍容性、投与される薬物及び／または薬物製剤（例えば、治療剤（薬物）の効力、製剤中の薬物濃度など）、ならびに当業者によって認識される種々の他の要素にしたがって、変動するものである。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な」成分という用語は、生物学的にもそれ以外でも望ましくないものではない成分を指すことができる。すなわち、その成分は、著しく望ましくない生物学的効果を引き起こすことも、それが含まれる製剤の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することもなく、本発明の医薬製剤に組み込まれ得、本明細書に記載のように対象へ投与され得る。賦形剤へ言及するのに「薬学的に許容可能な」という用語が使用される場合は、その成分が毒性学的試験及び製造試験の要求される基準に合致していること、または米国食品医薬品局によって作成された「不活性成分ガイド（Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ）」にそれが含まれることが通常含意される。
【００２４】
さらに、本明細書中で使用される場合、「薬理学的に活性な」誘導体または類似体にあるような「薬理学的に活性な」（または、単に「活性な」）という用語は、元の化合物と同じ種類かつ、ほぼ同等程度の薬理活性を有する誘導体または類似体（例えば、塩、エステル、アミド、コンジュゲート、代謝産物、異性体、断片など）を指すことができる。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「混合物」という用語には、該混合物の成分が完全に混和する溶液、ならびに該混合物の成分が完全には混和しない懸濁液及びエマルションを含むことができる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、限定されないが、ヒト、家畜類、イヌ、ネコ、及び他の哺乳動物が含まれる哺乳動物のような生物を指すことができる。治療剤の投与は、対象の処置に有効な用量及び期間で実施可能である。いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、本発明のシステムの薬物動態プロファイルは、雄の対象と雌の対象で同様である。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「併用投与」、「組み合わせ投与」、「同時投与」または「同時に投与される」という表現は、化合物が同じ時点で、または互いに直後に投与されることを意味する。後者の場合、２種の化合物は、観察される結果が、それらの化合物が同じ時点で投与される場合に達成される結果と区別がつかないほど十分に近い時点で投与される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、４本のポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖）で構成された免疫グロブリン分子を指す。本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、限定されないが、当技術分野において公知の組換え技術によって生成される組換え抗体が含まれる。「抗体」は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル、もしくはカニクイザル由来などのヒト）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット由来）、ヤギ、ウシもしくはウマの種などの哺乳動物種由来のものを含む任意の起源のもの；またはニワトリ抗体のような鳥種、またはサメ抗体のような魚種由来の任意の起源のものであり得る。「抗体」には、ヒトアイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ及びＩｇＭ、ならびにこれらの修飾変異体を含む任意のアイソタイプの抗体が含まれる。本明細書の抗体は、目的の「抗原」に対する。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物に治療効果をもたらすことができる。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対する抗体もまた、検討される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「抗体断片」という用語は、１つ以上のドメイン、または１つ以上のアミノ酸を欠く天然に存在する抗体を指す。典型的には、抗体断片は、そのような天然に存在する抗体の全抗原結合領域またはその可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆｃ部分を欠く任意の抗体が含まれる。抗体断片の例にはさらに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片；ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；ミニボディ；本質的に１、２または３つの免疫グロブリンドメイン（複数可）からなる抗体、例えばＤｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）；一本鎖抗体；上記のいずれかの二重特異性、三重特異性、四重特異性または多重特異性変異体が含まれる。
【００３０】
組成物
一態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、を含み、
治療剤が前記化学的リンカー部分を介して前記血小板細胞に共有結合している、組成物が、本明細書で提供される。
【００３１】
一実施形態では、治療剤は、免疫療法剤である。一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４７抗体、またはこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤＬ１抗体である。
【００３２】
一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される。一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカーである。
【００３３】
一実施形態では、血小板細胞は、ヒト血小板細胞である。一実施形態では、血小板細胞は、自己由来の血小板細胞である。
【００３４】
一実施形態では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
免疫療法剤と、を含み、
免疫療法剤が、化学的リンカー部分を介して血小板細胞に共有結合している、組成物が、本明細書で提供される。
【００３５】
一実施形態では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
抗ＰＤＬ１抗体と、を含み、
抗ＰＤＬ１抗体が、化学的リンカー部分を介して血小板細胞に共有結合している、組成物が、本明細書で提供される。
【００３６】
一実施形態では、
血小板細胞と、
マレイミドリンカーと、
免疫療法剤と、を含み、
免疫療法剤が、該化学的リンカー部分を介して血小板細胞に共有結合している、組成物が、本明細書で提供される。
【００３７】
一実施形態では、
血小板細胞と、
マレイミドリンカーと、
抗ＰＤＬ１抗体と、を含み、
抗ＰＤＬ１抗体が、該化学的リンカー部分を介して血小板細胞に共有結合している、組成物が、本明細書で提供される。
【００３８】
治療上有効量の１つ以上の開示された血小板組成物及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が開示される。本明細書にて提供される組成物の投与に適した医薬担体には、個々の投与方法に適していると当業者に公知の任意のそのような担体が含まれる。加えて、前記組成物は、医薬組成物中の唯一の薬学的活性成分として処方されてもよく、または他の活性成分と組み合わされてもよい。
【００３９】
活性化合物（例えば、血小板細胞にコンジュゲートされた免疫療法剤）及びある種の賦形剤を含む本明細書に記載される組成物は、種々の用途において有用であり得る。
【００４０】
「賦形剤」には、所望の個々の剤形に適するように、あらゆる溶媒、希釈剤または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤などが含まれる。製剤及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）に見出すことができる。薬学的に許容可能な賦形剤はまた、１つ以上の充填剤、結合剤、滑沢剤、流動化剤、崩壊剤などを含み得る。
【００４１】
例示的な賦形剤には、限定されないが、任意の非毒性の、不活性固体、半固体、または液体の、任意の種類の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤が含まれる。賦形剤として機能し得る材料のいくつかの例としては、限定されないが、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖類；コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及びセルロースアセテートなどのセルロース及びその誘導体；トラガント末；モルト；ゼラチン；タルク；カカオバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油などの油；ベニバナ油；ゴマ油；オリーブ油；コーン油及び大豆油；プロピレングリコールなどのグリコール；エチルオレエート及びエチルラウレートなどのエステル；寒天；Ｔｗｅｅｎ  ８０などの界面活性剤；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；ならびにリン酸緩衝液、ならびにナトリウムラウリルスルフェート及びマグネシウムステアレートなどの他の非毒性適合性滑沢剤、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、防腐剤及び酸化防止剤が含まれ、これらはまた、配合者の判断にしたがって前記組成物中に存在することができる。当業者によって認識され得るように、賦形剤は、組成物が何に有用であるかに基づいて選択され得る。例えば、医薬組成物と共に、賦形剤の選択は、投与経路、送達される薬剤、薬剤の送達のタイムコースなどに左右され得、ヒト及び／または動物に、経口的に、直腸内に、非経口的に、大槽内に、膣内に、鼻腔内に、腹腔内に、局所的に（散剤、クリーム剤、軟膏剤、または点剤(ｄｒｏｐ)による）、口腔内に、または経口スプレーもしくは鼻腔内スプレーとして投与され得る。特定の実施形態では、前記組成物は、腫瘍の切除部位またはその近くに注射される。
【００４２】
例示的な希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖など、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００４３】
例示的な顆粒剤及び／または分散剤には、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカスターチ、ナトリウムデンプングリコレート、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木質生成物、天然スポンジ、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、シリケート、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（ナトリウムデンプングリコレート）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、マグネシウムアルミニウムシリケート（Ｖｅｅｇｕｍ）、ナトリウムラウリルスルフェート、四級アンモニウム化合物など、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００４４】
例示的な界面活性剤及び／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド状粘土（例えば、ベントナイト［アルミニウムシリケート］及びＶｅｅｇｕｍ［マグネシウムアルミニウムシリケート］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、グリセリルモノステアレート、及びプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［Ｔｗｅｅｎ  ２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［Ｔｗｅｅｎ  ６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［Ｔｗｅｅｎ  ８０］、ソルビタンモノパルミテート［Ｓｐａｎ  ４０］、ソルビタンモノステアレート［Ｓｐａｎ  ６０］、ソルビタントリステアレート［Ｓｐａｎ  ６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［Ｓｐａｎ  ８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［Ｍｙｒｊ  ４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、及びＳｏｌｕｔｏｌ）、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［Ｂｒｉｊ  ３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ナトリウムオレエート、カリウムオレエート、エチルオレエート、オレイン酸、エチルラウレート、ナトリウムラウリルスルフェート、プルロニックＦ６８、ポロキサマー１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウムなど、及び／またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００４５】
例示的な結合剤には、デンプン（例えば、コーンスターチ及びデンプンペースト）、ゼラチン、糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトールなど）、天然及び合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワールガム（ｐａｎｗａｒ  ｇｕｍ）、ガティガム、イサポール皮（ｉｓａｐｏｌ  ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、セルロースアセテート、ポリ（ビニル−ピロリドン）、マグネシウムアルミニウムシリケート（Ｖｅｅｇｕｍ）、及びカラマツアラボガラクタン）アルギネート、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩類、ケイ酸、ポリメタクリレート類、ワックス、水、アルコールなど、及び／またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００４６】
例示的な防腐剤には、酸化防止剤、キレート剤、抗菌防腐剤、抗真菌防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、及びその他の防腐剤が含まれる。
【００４７】
例示的な酸化防止剤には、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、アコルビルパルミテート（ａｃｏｒｂｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、ピロ亜硫酸カリウム、プロピオン酸、プロピルガレート、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び亜硫酸ナトリウムが含まれる。
【００４８】
例示的なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ならびにその塩及び水和物（例えば、エデト酸ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二カリウムなど）、クエン酸ならびにその塩及び水和物（例えば、クエン酸一水和物）、フマル酸ならびにその塩及び水和物、リンゴ酸ならびにその塩及び水和物、リン酸ならびにその塩及び水和物、ならびに酒石酸ならびにその塩及び水和物が含まれる。例示的な抗菌防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、フェニル水銀ニトレート、プロピレングリコール、及びチメロサールが含まれる。
【００４９】
例示的な抗真菌防腐剤には、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、カリウムベンゾエート、カリウムソルベート、ナトリウムベンゾエート、ナトリウムプロピオネート、及びソルビン酸が含まれる。
【００５０】
例示的なアルコール防腐剤には、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、及びフェニルエチルアルコールが含まれる。
【００５１】
例示的な酸性防腐剤には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及びフィチン酸が含まれる。
【００５２】
他の防腐剤には、トコフェロール、トコフェロールアセテート、デテロキシムメシレート（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ナトリウムラウリルスルフェート（ＳＬＳ）、ナトリウムラウリルエーテルスルフェート（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、Ｇｌｙｄａｎｔ  Ｐｌｕｓ、Ｐｈｅｎｏｎｉｐ、メチルパラベン、Ｇｅｒｍａｌｌ  １１５、Ｇｅｒｍａｂｅｎ  ＩＩ、Ｎｅｏｌｏｎｅ、Ｋａｔｈｏｎ、及びＥｕｘｙｌが含まれる。特定の実施形態では、防腐剤は、抗酸化剤である。他の実施形態では、防腐剤は、キレート剤である。
【００５３】
例示的な緩衝剤には、シトレート緩衝液、アセテート緩衝液、ホスフェート緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、カルシウムグルセプテート、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、カルシウムグリセロホスフェート、乳酸カルシウム、プロパン酸、カルシウムレブリネート、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質非含有水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００５４】
例示的な滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、モルト、グリセリルベハネート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈａｎａｔｅ）、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、マグネシウムラウリルスルフェート、ナトリウムラウリルスルフェートなど、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００５５】
例示的な天然油には、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、ブラックカラントシード、ルリヂサ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマ、シナモン、カカオバター、ココナッツ、タラ肝、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュ、ユーカリ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ウリ（ｇｏｕｒｄ）、ブドウ種子、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、イソプロピルミリステート、ホホバ、ククイナッツ、ラバンディン、ラベンダー、レモン、ｌｉｔｓｅａ  ｃｕｂｅｂａ、マカダミアナッツ、マロウ、マンゴー種子、メドウフォーム種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、モモ核、ピーナッツ、ポピーシード、カボチャ種子、菜種、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サスカナ（ｓａｓｑｕａｎａ）、セイボリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、シスル、ツバキ、ベチバー、クルミ、及び小麦胚芽の油が含まれる。例示的な合成油には、これらに限定されないが、ブチルステアレート、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、ジエチルセバケート、ジメチコン３６０、イソプロピルミリステート、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーンオイル、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００５６】
加えて、組成物は、ポリマーをさらに含んでよい。本明細書で検討される例示的なポリマーには、これらに限定されないが、セルロース系ポリマー及びコポリマー、例えばメチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルヒドロキシエチルセルロース（ＭＨＥＣ）、メチルヒドロキシプロピルセルロース（ＭＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及びその種々の塩（例えば、ナトリウム塩を含む）、ヒドロキシエチルカルボキシメチルセルロース（ＨＥＣＭＣ）及びその種々の塩、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（ＣＭＨＥＣ）及びその種々の塩などのセルロースエーテル、他の多糖類及び多糖類誘導体（デンプン、デキストラン、デキストラン誘導体、キトサン、ならびにアルギン酸及びその種々の塩など）、カラギーナン、種々のガム（キサンタンガム、グアーガム、アラビアガム、カラヤガム、ガティガム、コンニャク、及びトラガカントガムを含む）、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカン（ヒアルロン酸及びその塩など）、タンパク質（ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、及びフィブリン）、他のポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）及びポリ（ε−カプロラクトン−コ−グリコリド）などのポリヒドロキシ酸）、カルボキシビニルポリマー及びこれらの塩（例えばカルボマー）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリル酸及びその塩、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸／アクリルアミドコポリマー、ポリアルキレンオキシド（ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）、及びプルロニックポリマー、ポリオキシエチレン（ポリエチレングリコール）、ポリ無水物、ポリビニルアルコール、ポリエチレンアミン及びポリピリジン、ＰＥＧ化脂質（例えば、ＰＥＧ−ステアレート、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］）などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、これらのコポリマー及び塩が含まれる。
【００５７】
加えて、組成物は、乳化剤をさらに含んでよい。例示的な乳化剤には、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン及びそれらのコポリマー、ポロキサマー非イオン性界面活性剤、中性水溶性多糖類（例えば、デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ、セルロース）、非カチオン性ポリ（メタ）アクリレート、非カチオン性ポリアクリレート、例えばポリ（メタ）アクリル酸、ならびにこれらのエステルアミド及びヒドロキシアルキルアミド、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド状粘土（例えば、ベントナイト［アルミニウムシリケート］及びＶｅｅｇｕｍ［マグネシウムアルミニウムシリケート］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、グリセリルモノステアレート、及びプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［Ｔｗｅｅｎ  ２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［Ｔｗｅｅｎ  ６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［Ｔｗｅｅｎ  ８０］、ソルビタンモノパルミテート［Ｓｐａｎ  ４０］、ソルビタンモノステアレート［Ｓｐａｎ  ６０］、ソルビタントリステアレート［Ｓｐａｎ  ６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［Ｓｐａｎ  ８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［Ｍｙｒｊ  ４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、及びＳｏｌｕｔｏｌ）、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［Ｂｒｉｊ  ３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ナトリウムオレエート、カリウムオレエート、エチルオレエート、オレイン酸、エチルラウレート、ナトリウムラウリルスルフェート、プルロニックＦ６８、ポロキサマー１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウムなど、及び／またはこれらの組み合わせが含まれる。ある特定の実施形態では、乳化剤は、コレステロールである。
【００５８】
液体組成物には、エマルション剤、マイクロエマルション剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が含まれる。活性化合物（例えば、血小板細胞にコンジュゲートした免疫療法剤）（血小板細胞にコンジュゲートした免疫療法剤）に加えて、液体組成物は、当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマ、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール類及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物などを含有してもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物には、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤のような補助剤もまた含むことができる。
【００５９】
注射用組成物、例えば、注射用水性または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を使用して公知の技術にしたがって製剤化してもよい。無菌注射製剤はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の注射液、懸濁液、またはエマルション、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。使用され得る医薬組成物または化粧品組成物のための許容可能な媒体及び溶媒は、水、リンゲル液、米国薬局方等張食塩液である。加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油が使用可能である。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製に使用される。ある特定の実施形態では、粒子が、１％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースナトリウム及び０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ８０を含むキャリア流体中に懸濁される。注射用組成物は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することによって、または使用前に滅菌水または他の無菌注射媒体に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、組成物または治療剤（例えば、本明細書に開示の組成物と組み合わせて与えられる追加の治療剤）は、固形組成物で投与することができる。固体組成物には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤が含まれる。そのような固体組成物では、粒子は、少なくとも１つの賦形剤及び／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸などの充填剤または増量剤、ｂ）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、及びアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカスターチ、アルギン酸、ある特定のシリケート、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、ｈ）カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤、ならびにｉ）タルク、カルシウムステアレート、マグネシウムステアレート、固体ポリエチレングリコール、ナトリウムラウリルスルフェート、及びこれらの混合物などの滑沢剤と共に混合される。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。ラクトースまたは乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、類似の種類の固体組成物を、軟充填ゼラチンカプセル剤及び硬充填ゼラチンカプセル剤の充填剤として用いてもよい。
【００６１】
錠剤、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤は、腸溶性コーティング及び医薬品製剤分野において周知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。これらは任意に乳白剤を含んでもよく、これらが活性成分（複数可）のみを、優先的には腸管のある特定の部分に、任意には遅延した様式で放出する組成物のものであることができる。使用可能な包埋組成物の例には、高分子物質及びワックスが含まれる。
【００６２】
ラクトースまたは乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、類似の種類の固体組成物を、軟充填ゼラチンカプセル剤及び硬充填ゼラチンカプセル剤の充填剤として用いてもよい。
【００６３】
局所投与または経皮投与用の組成物には、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤、またはパッチが含まれる。活性化合物（例えば、血小板細胞にコンジュゲートした免疫療法剤）は、必要に応じて、賦形剤、及び任意の必要な防腐剤または緩衝剤と混合される。
【００６４】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、及びゲル剤は、活性化合物（例えば、血小板細胞にコンジュゲートした免疫療法剤）に加えて、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン類、ベントナイト、ケイ酸、タルク、及び酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤を含有してもよい。
【００６５】
散剤及びスプレー剤は、活性化合物／組成物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、カルシウムシリケート、及びポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレー剤はさらに、クロロフルオロ炭化水素のような慣用の噴射剤を含有することができる。
【００６６】
経皮パッチは、身体への化合物の制御送達を提供するというさらなる利点を有する。このような剤形は、適切な媒体にナノ粒子を溶解または分散させることによって作製することができる。吸収促進剤もまた、皮膚全体にわたって化合物の流動を高めるために使用することができる。速度制御膜を設ける、またはポリマーマトリックスもしくはゲルに粒子を分散させるかのいずれかによって、速度を制御することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、治療剤はナノ粒子にカプセル化することができる。一実施形態では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、を含み、
治療剤が、ナノ粒子内にカプセル化される組成物が、本明細書で提供される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、化学的リンカー部分を介して共有結合する。いくつかの実施形態では、化学的リンカー部分は任意であり、ナノ粒子は血小板細胞に共有結合していない。
【００６９】
ナノ粒子は、１以上のポリマーから作製することができる。いくつかの例では、ポリマーには、ポリカルボン酸またはその塩、カルボン酸無水物（例えば、無水マレイン酸）と他のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸など）、親水性ビニルポリマー（ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（ビニルピロリドン−コ−ビニルアセテート）など）、ポリメタクリレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリカプロラクタム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、セルロース誘導体（ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど）が含まれる。一例では、ポリマーは５０：５０のＰＬＧＡコポリマーである。他の例では、ポリマーには、キトサン、コラーゲン、アルギネート、ゼラチン、ヒアルロン酸、及びこれらの無毒の金属塩などの天然ポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリマーはハイドロゲル、例えばアルギン酸ハイドロゲルである。親水性ポリマー及び他の媒体は、単独でまたは組み合わせて使用することができ、部分的結晶化、イオン結合、架橋などによって増強された構造的完全性を媒体に付与することができる。
【００７０】
薬物または治療剤を粒子にカプセル化する方法は、当技術分野において公知である。一般的なカプセル化技術には、これらに限定されないが、噴霧乾燥、界面重合、ホットメルトカプセル化、相分離カプセル化（自発的エマルションマイクロカプセル化、溶媒蒸発マイクロカプセル化、及び溶媒除去マイクロカプセル化）、コアセルベーション、低温マイクロスフェア形成、及び転相ナノカプセル化（ＰＩＮ）が含まれる。これらの方法の概要を以下に述べる。
【００７１】
ある特定の実施形態では、本明細書で論じられている組成物に組み込まれるナノ粒子は、多層ナノ粒子である。本明細書に開示される組成物において有用な多層ナノ粒子は、例えば、「連続転相ナノカプセル化」（ｓＰＩＮ）を使用して調製することができる。
【００７２】
１．噴霧乾燥
噴霧乾燥技術を使用して、マイクロスフェア／ナノスフェアを形成するための方法は、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚらの米国特許第６，６２０，６１７号に記載されている。この方法では、ポリマーを塩化メチレンのような有機溶媒または水中に溶解する。粒子に組み込まれる既知量の１以上の活性剤を、ポリマー溶液中に懸濁する（不溶性活性剤の場合）か、または共溶解する（可溶性活性剤の場合）。圧縮ガスの流れにより駆動するマイクロ化ノズルを通じて溶液または分散液を注入し、得られたエアロゾルを加熱された空気のサイクロンに懸濁し、溶媒をマイクロ液滴から蒸発させて、粒子を形成する。この方法を使用して、０．１〜１０ミクロンの範囲のマイクロスフェア／ナノスフェアを得ることができる。
【００７３】
２．界面重合
界面重合もまた、１以上の活性剤をカプセル化するために使用することができる。この方法を使用して、モノマー及び活性剤（複数可）を溶媒に溶解する。第２のモノマーを、第１の溶媒と不混和性の第２の溶媒（典型的には水性）に溶解する。エマルションは、第２の溶液中での撹拌により第１の溶液を懸濁することによって形成される。エマルションが安定化したら、開始剤を水相に添加し、エマルションの各液滴の界面で界面重合を引き起こす。
【００７４】
３．ホットメルトマイクロカプセル化
マイクロスフェアは、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，６：２７５（１９８７）に記載されているホットメルトマイクロカプセル化法を使用して、ポリエステル及びポリ無水物などのポリマーから形成することができる。この方法では、３〜７５，０００ダルトンの間の分子量を有するポリマーの使用が好ましい。この方法では、ポリマーは最初に溶融され、次に、５０ミクロン未満に篩分けされた組み込まれる１以上の活性剤の固体粒子と混合される。混合物を（シリコンオイルのような）非混和性溶媒に懸濁し、そして連続的に撹拌しながら、ポリマーの融点より５℃高く加熱する。エマルションが安定化したら、ポリマー粒子が固化するまで冷却する。得られたマイクロスフェアを石油エーテルでデカントすることにより洗浄して、流動性のある粉末を得る。
【００７５】
４．相分離マイクロカプセル化
相分離マイクロカプセル化技術では、ポリマー溶液を、任意に、カプセル化する１以上の活性剤の存在下で撹拌する。撹拌により材料を均一に懸濁し続けながら、ポリマーに対する非溶媒を前記溶液へとゆっくり添加し、ポリマーの溶解度を低下させる。溶媒及び非溶媒中のポリマーの溶解度に応じて、ポリマーは沈殿するか、またはポリマー濃厚相とポリマー希薄相とに分離する。適切な条件下で、ポリマー濃厚相中のポリマーは、連続相との界面に移動し、活性剤（複数可）を、外側ポリマーシェルを有する液滴中にカプセル化する。
【００７６】
ｉｎ．自発的エマルションマイクロカプセル化
自発的乳化は、温度の変化、溶媒の蒸発、または化学架橋剤を添加することによって、上で形成された乳化液体ポリマー液滴を固化させることを含む。カプセル化材料（ｅｎｃａｐｓｕｌａｎｔ）の物理的及び化学的性質、ならびに発生しようとする粒子に任意に組み込まれる１以上の活性剤の性質が、カプセル化の適切な方法を決定づける。疎水性、分子量、化学的安定性、及び熱安定性などの要素がカプセル化に影響する。
【００７７】
ｉｉ．溶媒蒸発マイクロカプセル化
溶媒蒸発技術を使用してマイクロスフェアを形成する方法は、Ｅ．Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，４：３２９（１９９０）；Ｌ．Ｒ．Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．，３１：５４５（１９７９）、Ｌ．Ｒ．Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １３５（３）（１９７９）、Ｓ．Ｂｅｎｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７３：１７２１（１９８４）、及びＭｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第３，９６０，７５７号に記載されている。ポリマーを塩化メチレンのような揮発性有機溶媒に溶解する。組み込まれる１以上の活性剤を、任意に溶液に添加し、該混合物をポリ（ビニルアルコール）のような界面活性剤を含有する水溶液中に懸濁する。得られたエマルションを大部分の有機溶媒が蒸発するまで撹拌し、固体のマイクロスフェア／ナノスフェアを残す。この方法は、ポリエステル及びポリスチレンのような比較的安定なポリマーに有用である。しかしながら、ポリ無水物のような不安定なポリマーは、水が存在するために製造プロセス中に劣化するおそれがある。これらのポリマーについては、完全に無水の有機溶媒中で実施される以下の方法のいくつかがより有用である。
【００７８】
ｉｉｉ．溶媒除去マイクロカプセル化
溶媒除去マイクロカプセル化技術は、主にポリ無水物のために設計されており、例えば、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＷＯ９３／２１９０６に記載されている。この方法では、塩化メチレンのような揮発性有機溶媒中の選択したポリマーの溶液に、組み込まれる物質を分散または溶解する。この混合物を、シリコンオイルのような有機油中に撹拌することによって懸濁し、エマルションを形成する。この手順によって、１〜３００ミクロンの間の範囲のマイクロスフェアを得ることができる。マイクロスフェアに組み込むことができる物質には、医薬品、殺虫剤、栄養素、造影剤、及び金属化合物が含まれる。
【００７９】
５．コアセルベーション
コアセルベーション技術を使用する種々の物質のカプセル化手順は、当技術分野、例えば、ＧＢ−Ｂ−９２９  ４０６、ＧＢ−Ｂ−９２９  ４０  １、ならびに米国特許第３，２６６，９８７号、第４，７９４，０００号，及び第４，４６０，５６３号において公知である。コアセルベーションは、高分子溶液を２つの不混和性液相に分離することを含む。１つの相は、濃厚なコアセルベート相であり、これは高濃度のポリマーカプセル化材料（及び任意には１以上の活性剤）を含有し、一方、第２の相は低濃度のポリマーを含有する。濃厚なコアセルベート相内では、ポリマーカプセル化材料は、ナノスケールまたはマイクロスケールの液滴を形成する。コアセルベーションは、温度変化、非溶媒の添加もしくはマイクロ塩の添加（単純コアセルベーション）、または別のポリマーの添加によりインターポリマー複合体が形成され得ること（複合コアセルベーション）により誘発することができる。
【００８０】
６．マイクロスフェアの低温キャスティング
制御放出マイクロスフェアの極低温キャスティングの方法が、Ｇｏｍｂｏｔｚらの米国特許第５，０１９，４００号に記載されている。この方法では、ポリマーを、任意には１以上の溶解または分散した活性剤と共に溶媒に溶解する。次いで、混合物を、ポリマー液滴を凍結させるポリマー−物質溶液の凝固点未満の温度で、液体非溶媒を含有する容器に噴霧する。該液滴、及び該ポリマーに対する非溶媒が温められると、液滴中の溶媒が解凍され、非溶媒中に抽出され、その結果、マイクロスフェアが固化する。
【００８１】
７．転相ナノカプセル化（ＰＩＮ）
ナノ粒子はまた、転相ナノカプセル化（ＰＩＮ）法を使用して形成することができる。この方法では、ポリマーを「良」溶媒に溶解し、薬物のような組み込まれる物質の微粒子をポリマー溶液に混合または溶解し、そして該混合物をポリマーに対する強力な非溶媒へと注ぎ入れると、ポリマーマイクロスフェアを好ましい条件下で自発的に生成し、該ポリマーは、粒子で被覆されるか、または粒子がポリマー中に分散される。例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚらの米国特許第６，１４３，２１１号を参照のこと。この方法は、例えば、約１００ナノメートル〜約１０ミクロンを含む広範囲のサイズのナノ粒子及びマイクロ粒子の単分散集団を製造するために使用することができる。
【００８２】
有利には、エマルションを沈殿前に形成する必要はない。このプロセスは、熱可塑性ポリマーからマイクロスフェアを形成するために使用することができる。
【００８３】
８．逐次転相ナノカプセル化（ｓＰＩＮ）
多層ナノ粒子はまた、本明細書で「連続転相ナノカプセル化」（ｓＰＩＮ）と呼ばれるプロセスによって形成することもできる。ｓＰＩＮは、単分散のナノ粒子集団を形成するのに特に適しており、単分散のナノ粒子集団を実現するための追加の分離ステップを必要としない。
【００８４】
ｓＰＩＮでは、コアポリマーが、第１の溶媒に溶解される。活性剤は、コアポリマー溶媒に溶解または分散される。コアポリマー、コアポリマー溶媒、及びカプセル化される薬剤は、連続相を有する混合物を形成し、該コアポリマー溶媒は連続相である。シェルポリマーは、コアポリマーに対して非溶媒であるシェルポリマー溶媒に溶解する。コアポリマー及びシェルポリマーの溶液を共に混合する。その結果、シェルポリマー溶媒の存在によりコアポリマーの曇点での溶解度が低下し、これによりコアポリマーが優先的に相分離し、任意には薬剤がカプセル化する。コアポリマー及びシェルポリマーに対する非溶媒が、この不安定な混合物に添加されると、転相が完了した際にシェルポリマーがコアポリマーを包み込み、二層ナノ粒子が形成される。
【００８５】
ｓＰＩＮは、二層ナノ粒子などの多層粒子の調製のための１ステップ手順を提供し、これは、ほぼ瞬間的であり、溶媒の乳化を必要としない。多層粒子を形成するための方法は、Ｃｈｏらの米国特許出願公開第２０１２−０００９２６７号に開示されている。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
粒子は、デンドリマー粒子であり得る。デンドリマーは、シェルまたは分岐分子の層を中心コアに連続的に付加することによって成長する三次元ポリマーである。デンドリマーは、制御可能な構造、分散した分子量ではなく単一の分子量、及び多数の制御可能な表面官能基、及び特定のサイズに達すると球状構造を採用する傾向を有するため、直鎖状ポリマーに優る幾つかの利点を有する。デンドリマーは、高度分岐モノマーを共に反応させて単分散、樹木状及び／または世代構造のポリマー構造を作製することによって調製される。個々のデンドリマーは、各官能部位に結合した樹状楔状部を有する中心コア分子からなる。デンドリマー表面層は、調製中に使用されるアセンブリモノマーに応じて、デンドリマー表面層上に配置された種々の官能基を有することができる。一般に、デンドリマー官能基は、個々のデンドリマー型の特性を決定づける。これらの設計の結果として、デンドリマーコアは広い空間をとり、そしてコア、シェル、及び特に表面層の化学的性質を改変することによって、これらの物理的性質が微調整され得る。調整可能な性質には、溶解度、毒性、免疫原性、及び生体結合能が含まれる。
【００８７】
ポリアミドアミン、ポリプロピレンイミン、ポリアリールエーテル及びポリエチレンイミンは、バイオ医薬品用途について研究されているデンドリマーの例である。ポリアミドアミンデンドリマーは、エチレンジアミンコア及びアミドアミン繰り返し分岐構造をベースとしている。これらは、種々の明確に定義された分子量で合成することができる。これらのサイズ及び表面官能基（一級アミン）は、モノマー単位の制御された繰り返し付加の数によって定義され、異なる半世代またはフル世代を生じさせる。これらは水溶性であり、唯一の種類の単分散したデンドリマーであると報告されている。さらに、これらは分子表面に限定される高い電荷密度を示す。
【００８８】
デンドリマーは、デンドリマー内の空洞に薬物を捕捉することによって、または薬物分子を表面に共有結合させることによって、治療用化合物の担体として使用されてきた。これは、Ｓｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ（２００９）  ７１：４４５−４６２及びＣｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２００７）  ９７：１２３−１４３にて概説されている。デンドリマー空洞内の捕捉は小分子に限定され、そして共有結合アプローチは、これまで小薬物がデンドリマー表面から加水分解的または酵素的に切断される系に限定されている。
【００８９】
方法
一態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、
治療剤が、化学的リンカー部分を介して血小板細胞に共有結合している、がんの転移または再発を予防する方法が、本明細書にて開示される。
【００９０】
一実施形態では、治療剤は、免疫療法剤である。一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４７抗体、またはこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤＬ１抗体である。
【００９１】
一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される。一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカーである。
【００９２】
一実施形態では、血小板細胞は、ヒト血小板細胞である。一実施形態では、血小板細胞は、自己由来の血小板細胞である。
【００９３】
一実施形態では、がんは、固形腫瘍である。一実施形態では、がんは、黒色腫である。一実施形態では、がんは、乳癌である。一実施形態では、組成物は、追加の治療剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、追加の治療剤は、抗腫瘍剤である。
【００９４】
一態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、
治療剤が、化学的リンカー部分を介して血小板細胞に共有結合している、がんを治療または予防する方法が、本明細書にて開示される。
【００９５】
さらなる態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む組成物を対象に投与することを含み、治療剤が、化学的リンカー部分を介して血小板細胞に共有結合しており、
組成物が、血小板細胞の活性化を介して創傷または外科的切除部位を標的とする、治療剤の標的化送達のための方法方法が、本明細書にて開示される。
【００９６】
一実施形態では、該方法は、血小板細胞の活性化時に、創傷または切除部位で血小板由来マイクロ粒子中でさらに放出される治療剤を提供する。
【００９７】
一実施形態では、治療剤は、免疫療法剤である。一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４７抗体、またはこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤＬ１抗体である。
【００９８】
一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される。一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカーである。
【００９９】
一実施形態では、血小板細胞は、ヒト血小板細胞である。一実施形態では、血小板細胞は、自己由来の血小板細胞である。
【０１００】
がん及び固形腫瘍
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血小板組成物及び方法は、がんの転移または再発を治療または予防するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血小板組成物及び方法は、切除された固形腫瘍の再発の予防に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、切除された固形腫瘍の転移の予防に有用である。別の実施形態では、予防されるがんの再発は、黒色腫である。別の実施形態では、予防されるがんの再発は、乳癌である。さらなる実施形態では、予防されるがんの再発は、前立腺癌である。
【０１０１】
一態様では、本明細書に記載の方法は、固形腫瘍の再発または転移を予防するために使用され、例えば、固形腫瘍は、とりわけ、黒色腫、肺癌（肺腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、大細胞癌、細気管支肺胞癌、気管支原性癌、非小細胞癌、小細胞癌、中皮腫を含む）；乳癌（乳管癌、小葉癌、炎症性乳癌、明細胞癌、粘液癌、漿膜腔乳癌を含む）；大腸癌（結腸癌、直腸癌、大腸腺癌）；肛門癌；膵臓癌（膵臓腺癌、膵島細胞癌、神経内分泌腫瘍を含む）；前立腺癌；前立腺腺癌；卵巣癌（漿液性腫瘍、類内膜腫瘍及び粘液性嚢胞腺癌を含む卵巣上皮癌または表層上皮性・間質性腫瘍、性索間質性腫瘍）；肝臓及び胆管癌（肝細胞癌、胆管癌、血管腫を含む）；食道癌（食道腺癌及び扁平上皮癌を含む）；口腔及び中咽頭扁平上皮癌；唾液腺腺様嚢胞癌；膀胱癌；膀胱癌腫；子宮の癌（子宮内膜腺癌、眼性、子宮体部漿液性腺癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫、平滑筋肉腫、ミュラー管混合腫瘍を含む）；神経膠腫、膠芽腫、髄芽腫、及び脳の他の腫瘍；腎臓癌（腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムス腫瘍を含む）；頭頸部の癌（扁平上皮癌を含む）；胃の癌（胃癌、胃腺癌、消化管間質腫瘍）；精巣癌；胚細胞腫瘍；神経内分泌腫瘍；子宮頸癌；消化管、乳房、及び他の器官のカルチノイド；印環細胞癌；肉腫、線維肉腫、血管腫、血管腫症、血管周皮腫、偽血管腫様間質過形成、筋線維芽細胞腫、線維腫症、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、脂肪腫、血管脂肪腫、顆粒細胞腫、神経線維腫、神経鞘腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、皮膚、黒色腫を含む、頸部、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓、脳、甲状腺、精巣、腎臓、膀胱、軟部組織、副腎、尿道、陰茎癌、粘膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、悪性線維性組織球腫、リンパ管肉腫、中皮腫、扁平上皮癌を含む間葉系腫瘍；類表皮癌、悪性皮膚付属器腫瘍、腺癌、肝癌、肝細胞癌、腎細胞癌、腎腺癌（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｍａ）、胆管癌、移行上皮癌、絨毛癌、精上皮腫、胚細胞癌、退形成性神経膠腫；多形膠芽腫、神経芽腫、髄芽腫、悪性髄膜腫、悪性神経鞘腫、神経線維肉腫、副甲状腺癌、甲状腺髄様癌、気管支カルチノイド、褐色細胞腫、膵島細胞癌、悪性カルチノイド、悪性傍神経節腫、黒色腫、メルケル細胞新生物、葉状嚢胞肉腫、唾液癌（ｓａｌｉｖａｒｙ  ｃａｎｃｅｒｓ）、胸腺癌、ならびに膣癌である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血小板組成物及び方法は、がんの治療または予防に有用である。いくつかの場合では、がんは循環がん細胞（循環腫瘍細胞）である。いくつかの場合では、がんは転移がん細胞である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血小板組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を除去または減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血小板組成物は、腫瘍の転移を著しく抑制することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血小板組成物は、がんの再発を著しく抑制することができる（例えば、固形腫瘍切除後に）。
【０１０４】
血小板
血小板は、巨核球から放出される無核細胞断片であり、止血におけるそれらの機能について最もよく知られている。循環血小板の平均寿命は８〜９日であり、これは静脈内注射された治療薬の薬物動態を大きく改善し得る。さらに、輸血された血小板は、残存腫瘍が手術後に残る可能性がある外科的創傷部位へと遊走し得る。他方では、血小板が、原発腫瘍から血管系に流れ込み、そして転移をもたらした循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を認識及び相互作用する能力を有するという証拠が示されている。これらの固有の創傷及びＣＴＣ向性特性に加えて、血小板はまた、多くの炎症状態を惹起及び改善する免疫「細胞」と考えることができる。
【０１０５】
いくつかの場合では、血小板組成物は自己由来、すなわち対象から得られた血小板から産生される。いくつかの場合では、血小板組成物は異種由来、すなわち処置される対象以外の供給源から得られた血小板から産生される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、全血小板細胞を、治療剤にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態では、治療剤を血小板由来のマイクロ粒子で送達することができる。血小板由来マイクロ粒子（ＰＭＰＳ）は、血小板活性化時に原形質膜から誘導され、活性化血小板は、接着分子及びケモカインを運ぶＰＭＰを放出し、ＰＭＰ沈着部位での単球捕捉を促進する。これらのＰＭＰは、血小板の活性化（例えばトロンビンによる）後に、血小板から放出される。
【０１０７】
治療剤
一実施形態では、リンカーを介して血小板にコンジュゲートする治療剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、核酸または治療薬物（例えば、小分子）からなる群から選択することができる。
【０１０８】
一実施形態では、治療剤は、免疫療法剤である。一実施形態では、治療剤は、抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態では、治療剤は、抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態では、血小板組成物は、血管疾患を処置するための治療剤の送達をターゲットとすることができる。
【０１０９】
免疫療法剤
一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ４７抗体、またはこれらの組み合わせから選択される。
【０１１０】
一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤＬ１抗体である。一実施形態では、抗ＰＤＬ１抗体は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブから選択される。一実施形態では、抗ＰＤＬ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）（Ｒｏｃｈｅ）である。一実施形態では、抗ＰＤＬ１抗体は、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）である。一実施形態では、抗ＰＤＬ１抗体は、アベルマブ（ＭＳ００１０７１８Ｃ）である。
【０１１１】
一実施形態では、免疫療法剤は、プログラム死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤またはプログラム死タンパク質リガンド１または２阻害剤である。ＰＤ−１阻害剤は、当技術分野において公知であり、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ）、ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ピジリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ／Ｔｅｖａ）、ＡＭＰ−２４４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ／ＧＳＫ）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＢＭＳ）、及びＭＥＤＩ４７３６（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。
【０１１２】
一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤ１抗体である。一実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、ニボルマブである。一実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、ペンブロリズマブである。
【０１１３】
一実施形態では、免疫療法剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体である。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、追加の治療剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、抗腫瘍剤と組み合わせて投与される。
【０１１５】
抗腫瘍剤
いくつかの実施形態では、治療剤は、抗腫瘍剤である。例えば、抗腫瘍剤は、アビラテロンアセテート、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、Ａｂｒａｘａｎｅ（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ−ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ−Ｔ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブベドチン）、ＡＤＥ、アドトラスツズマブエムタンシン、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（ドキソルビシン塩酸塩）、Ａｄｒｕｃｉｌ（フルオロウラシル）、アファチニブジマレエート、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ａｋｙｎｚｅｏ（ネツピタント・パロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｄａｒａ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、Ａｌｉｍｔａ（ペメトレキセド二ナトリウム）、Ａｌｏｘｉ（パロノセトロン塩酸塩）、Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ（クロラムブシル）、Ａｍｂｏｃｌｏｒｉｎ（クロラムブシル）、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、Ａｒｅｄｉａ（パミドロン酸二ナトリウム）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（エキセメスタン）、Ａｒｒａｎｏｎ（ネララビン）、三酸化ヒ素、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、アキシチニブ、アザシチジン、ＢＥＡＣＯＰＰ、Ｂｅｃｅｎｕｍ（カルムスチン）、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベバシズマブ、ベキサロテン、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ・ヨウ素  Ｉ  １３１  トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン），ブレオマイシン、ブリナツモマブ、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、Ｂｏｓｕｌｉｆ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（ブスルファン）、カバジタキセル、カボザンチニブ―Ｓ―マレート、ＣＡＦ、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カルボプラチン、カルボプラチン−ＴＡＸＯＬ、カルフィルゾミブ、Ｃａｒｍｕｂｒｉｓ（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチン・インプラント、Ｃａｓｏｄｅｘ（ビカルタミド）、ＣｅｅＮＵ（ロムスチン）、セリチニブ、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（ダウノルビシン塩酸塩）、Ｃｅｒｖａｒｉｘ（組換えＨＰＶ２価ワクチン）、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル−プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、Ｃｌａｆｅｎ（シクロホスファミド）、クロファラビン、Ｃｌｏｆａｒｅｘ（クロファラビン）、Ｃｌｏｌａｒ（クロファラビン）、ＣＭＦ、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（カボザンチニブ−Ｓ―マレート）、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ−ＡＢＶ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（ダクチノマイシン）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、Ｃｙｆｏｓ（イホスファミド）、Ｃｙｒａｍｚａ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビン、リポソーマル、Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（シタラビン）、Ｃｙｔｏｘａｎ（シクロホスファミド）、ダブラフェニブ、ダカルバジン、Ｄａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンディフティトックス、デノスマブ、ＤｅｐｏＣｙｔ（リポソーマルシタラビン）、ＤｅｐｏＦｏａｍ（リポソーマルシタラビン）、デキスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、Ｄｏｘｉｌ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ−ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、Ｅｆｕｄｅｘ（フルオロウラシル）、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（エピルビシン塩酸塩）、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、Ｅｍｅｎｄ（アプレピタント）、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、エリブリンメシレート、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、Ｅｒｗｉｎａｚｅ（アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー）、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（エトポシドホスフェート）、エトポシド、エトポシドホスフェート、Ｅｖａｃｅｔ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、Ｅｖｉｓｔａ（ラロキシフェン塩酸塩）、エキセメスタン、Ｆａｒｅｓｔｏｎ（トレミフェン）、Ｆａｒｙｄａｋ（パノビノスタット）、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（フルベストラント）、ＦＥＣ、Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール）、フィルグラスチム、Ｆｌｕｄａｒａ（フルダラビンホスフェート）、フルダラビンホスフェート、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、Ｆｏｌｅｘ（メトトレキサート）、Ｆｏｌｅｘ  ＰＦＳ（メトトレキサート）、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＩＲＩ−ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ−セツキシマブ、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ、Ｆｏｌｏｔｙｎ（プララトレキセート）、ＦＵ−ＬＶ、フルベストラント、Ｇａｒｄａｓｉｌ（組換えＨＰＶ４価ワクチン）、Ｇａｒｄａｓｉｌ  ９（組換えＨＰＶ９価ワクチン）、Ｇａｚｙｖａ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン−シスプラチン、ゲムシタビン−オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン塩酸塩）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（アファチニブジマレエート）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（イマチニブメシレート）、Ｇｌｉａｄｅｌ（カルムスチン・インプラント）、Ｇｌｉａｄｅｌ  ｗａｆｅｒ（カルムスチン・インプラント）、グルカルピダーゼ、ゴセレリンアセテート、Ｈａｌａｖｅｎ（エリブリンメシレート）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、ＨＰＶ２価ワクチン、組換え，ＨＰＶ９価ワクチン、組換え，ＨＰＶ４価ワクチン、組換え，Ｈｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン塩酸塩）、Ｈｙｐｅｒ−ＣＶＡＤ、Ｉｂｒａｎｃｅ（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、Ｉｃｌｕｓｉｇ（ポナチニブ塩酸塩）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、Ｉｆｅｘ（イホスファミド）、イホスファミド、Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｕｍ（イホスファミド）、イマチニブメシレート、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（イブルチニブ）、イミキモド、Ｉｎｌｙｔａ（アキシチニブ）、インターフェロンアルファ−２ｂ、組換え，Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（組換えインターフェロンアルファ−２ｂ）、ヨウ素  Ｉ  １３１  トシツモマブ・トシツモマブ、イピリムマブ、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、Ｉｓｔｏｄａｘ（ロミデプシン）、イクサベピロン、Ｉｘｅｍｐｒａ（イクサベピロン）、Ｊａｋａｆｉ（ルキソリチニブホスフェート）、Ｊｅｖｔａｎａ（カバジタキセル）、Ｋａｄｃｙｌａ（アドトラスツズマブエムタンシン）、Ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（パリフェルミン）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペンブロリズマブ）、Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（カルフィルゾミブ）、ランレオチドアセテート、ラパチニブジトシレート、レナリドミド、レンバチニブメシレート、Ｌｅｎｖｉｍａ（レンバチニブメシレート）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（クロラムブシル）、ロイプロリドアセテート、Ｌｅｖｕｌａｎ（アミノレブリン酸）、Ｌｉｎｆｏｌｉｚｉｎ（クロラムブシル）、ＬｉｐｏＤｏｘ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、リポソーマルシタラビン、ロムスチン、Ｌｕｐｒｏｎ（ロイプロリドアセテート）、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（ロイプロリドアセテート）、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ−Ｐｅｄ（ロイプロリドアセテート）、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ−３  Ｍｏｎｔｈ（ロイプロリドアセテート）、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ−４  Ｍｏｎｔｈ（ロイプロリドアセテート）、Ｌｙｎｐａｒｚａ（オラパリブ）、Ｍａｒｑｉｂｏ（ビンクリスチンスルフェートリポソーム）、Ｍａｔｕｌａｎｅ（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、Ｍｅｇａｃｅ（メゲストロールアセテート）、メゲストロールアセテート、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（トラメチニブ）、メルカプトプリン、メスナ、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ）、Ｍｅｔｈａｚｏｌａｓｔｏｎｅ（テモゾロミド）、メトトレキサート、Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ＬＰＦ（メトトレキサート）、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、Ｍｅｘａｔｅ−ＡＱ（メトトレキサート）、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、Ｍｏｚｏｂｉｌ（プレリキサホル）、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（メクロレタミン塩酸塩）、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（マイトマイシンＣ）、Ｍｙｌｅｒａｎ（ブスルファン）、Ｍｙｌｏｓａｒ（アザシチジン）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（ビノレルビンタルタレート）、ネララビン、Ｎｅｏｓａｒ（シクロホスファミド）、ネツピタント・パロノセトロン塩酸塩、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（フィルグラスチム）、Ｎｅｘａｖａｒ（ソラフェニブトシレート）、ニロチニブ、ニボルマブ、Ｎｏｌｖａｄｅｘ（タモキシフェンシトレート）、Ｎｐｌａｔｅ（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、Ｏｄｏｍｚｏ（ソニデジブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オマセタキシンメペスクシナート、Ｏｎｃａｓｐａｒ（ペグアスパラガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、Ｏｎｔａｋ（デニロイキン・ディフティトックス）、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩・ネツピタント、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、Ｐａｒａｐｌａｔ（カルボプラチン）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ペグアスパラガーゼ、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（ペグインターフェロンアルファ−２ｂ）、ペンブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサホル、ポマリドミド、Ｐｏｍａｌｙｓｔ（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキセート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）、Ｐｒｏｌｉａ（デノスマブ）、Ｐｒｏｍａｃｔａ（エルトロンボパグオラミン）、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（シプロイセル−Ｔ）、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（メルカプトプリン）、Ｐｕｒｉｘａｎ（メルカプトプリン）、塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ−ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）２価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）９価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）４価ワクチン、組換えインターフェロンアルファ−２ｂ、レゴラフェニブ、Ｒ−ＥＰＯＣＨ、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（レナリドミド）、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（メトトレキサート）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、リツキシマブ、ロミデプシン、ロミプロスチム、Ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ（ダウノルビジン塩酸塩）、ルキソリチニブホスフェート、Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ  Ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ  Ａｅｒｏｓｏｌ（タルク）、シルツキシマブ、シプロイセル−Ｔ、Ｓｏｍａｔｕｌｉｎｅ  Ｄｅｐｏｔ（ランレオチドアセテート）、ソニデジブ、ソラフェニブトシレート、Ｓｐｒｙｃｅｌ（ダサチニブ）、ＳＴＡＮＦＯＲＤ  Ｖ、Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｔａｌｃ  Ｐｏｗｄｅｒ（タルク）、Ｓｔｅｒｉｔａｌｃ（タルク）、Ｓｔｉｖａｒｇａ（レゴラフェニブ）、スニチニブマレート、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブマレート）、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（ペグインターフェロンアルファ−２ｂ）、Ｓｙｌｖａｎｔ（シルツキシマブ）、Ｓｙｎｏｖｉｒ（サリドマイド）、Ｓｙｎｒｉｂｏ（オマセタキシンメペスクシナート）
、ＴＡＣ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（ダブラフェニブ）、タルク、タモキシフェンシトレート、Ｔａｒａｂｉｎｅ  ＰＦＳ（シタラビン）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ塩酸塩）、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（ベキサロテン）、Ｔａｓｉｇｎａ（ニロチニブ）、Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ドセタキセル）、Ｔｅｍｏｄａｒ（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（サリドマイド）、チオテパ、Ｔｏｐｏｓａｒ（エトポシド）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、トシツモマブ・ヨウ素  Ｉ  １３１  トシツモマブ、Ｔｏｔｅｃｔ（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラメチニブ、トラスツズマブ、Ｔｒｅａｎｄａ（ベンダムスチン塩酸塩）、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（三酸化二ヒ素）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブジトシレート）、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ（ジヌツキシマブ）、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、Ｖｅｌｂａｎ（ビンブラスチンスルフェート）、Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ）、Ｖｅｌｓａｒ（ビンブラスチンスルフェート）、ベムラフェニブ、ＶｅＰｅｓｉｄ（エトポシド）、Ｖｉａｄｕｒ（ロイプロリドアセテート）、Ｖｉｄａｚａ（アザシチジン）、ビンブラスチンスルフェート、Ｖｉｎｃａｓａｒ  ＰＦＳ（ビンクリスチンスルフェート）、ビンクリスチンスルフェート、ビンクリスチンスルフェートリポソーム、ビノレルビンタルタレート、ＶＩＰ、ビスモデギブ、Ｖｏｒａｘａｚｅ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（パゾパニブ塩酸塩）、Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ（ロイコボリンカルシウム）、Ｘａｌｋｏｒｉ（クリゾチニブ）、Ｘｅｌｏｄａ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、Ｘｇｅｖａ（デノスマブ）、Ｘｏｆｉｇｏ（塩化ラジウム２２３）、Ｘｔａｎｄｉ（エンザルタミド）、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）、Ｚａｌｔｒａｐ（Ｚｉｖ−アフリベルセプト）、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（ベムラフェニブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｉｎｅｃａｒｄ（デクスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ−アフリベルセプト、Ｚｏｆｒａｎ（オンダンセトロン塩酸塩）、Ｚｏｌａｄｅｘ（ゴセレリンアセテート）、ゾレドロン酸、Ｚｏｌｉｎｚａ（ボリノスタット）、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）、Ｚｙｄｅｌｉｇ（イデラリシブ）、Ｚｙｋａｄｉａ（セリチニブ）、及びＺｙｔｉｇａ（アビラテロンアセテート）からなる群から選択することができる。
【０１１６】
血管疾患の処置方法
血小板はまた、損傷した血管を封止し、出血を止める栓を形成することによって、止血及び血栓症などのいくつかの生理学的及び病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすため、このプラットフォームは、関連する血管疾患の処置のために使用することもできる。
【０１１７】
本明細書に開示される血小板組成物を対象に投与することを含む、対象における血管疾患の処置方法が、本明細書にて開示される。これらの実施形態では、血小板は、血管疾患、例えば凝固障害または冠動脈再狭窄を処置するための薬物を送達する。例えば、薬物はヘパリンまたはドキソルビシンであり得る。
【０１１８】
一態様では、
血小板細胞と、
化学的リンカー部分と、
治療剤と、
を含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、
治療剤が、化学的リンカー部分を介して血小板細胞に共有結合している、、血管疾患を治療または予防する方法が、本明細書に提供される。
【０１１９】
一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される。一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカーである。
【０１２０】
一実施形態では、血小板細胞は、ヒト血小板細胞である。一実施形態では、血小板細胞は、自己由来の血小板細胞である。
【０１２１】
一実施形態では、血管疾患は、組織損傷、炎症、または心血管疾患である。一実施形態では、組成物は、追加の治療剤と組み合わせて投与される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、血小板組成物は、血管疾患、例えば凝固障害または冠動脈再狭窄を治療または予防するための治療剤の送達をターゲットとすることができる。
【０１２３】
例えば、いくつかの場合、治療剤は、Ａｄｃｉｒｃａ（タダラフィル）、Ａｄｅｍｐａｓ（リオシグアト）、Ａｇｒｙｌｉｎ（アナグレリド  ＨＣＬ）、Ａｎｇｉｏｍａｘ（ビバリルジン）、Ａｔａｃａｎｄ（カンデサルタンシレキセチル）、Ａｔｒｙｎ（再構成用アンチトロンビン組換え凍結乾燥粉末）、Ａｚｏｒ（アムロジピンベシレート；オルメサルタンメドキソミル）、Ｂａｙｃｏｌ（セリバスタチンナトリウム）、ＢｉＤｉｌ（イソソルビドジニトレート／ヒドララジン塩酸塩）、Ｂｒｉｌｉｎｔａ（チカグレロル）、Ｃａｄｕｅｔ（アムロジピン／アトルバスタチン）、カプトプリル、Ｃａｒｄｉｚｅｍ（Ｒ）（注射用ジルチアゼムＨＣ１）  Ｍｏｎｖｉａｌ（Ｒ）、ＣｅｌｌＣｅｐｔ、Ｃｌｅｖｉｐｒｅｘ（クレビジピン）、Ｃｏｒｌａｎｏｒ（イバブラジン）、Ｃｏｒｌｏｐａｍ、Ｃｏｒｖｅｒｔ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（イブチリドフマレート注射液）、Ｃｏｖｅｒａ−ＨＳ（ベラパミル）、Ｃｒｅｓｔｏｒ（ロスバスタチンカルシウム）、ジルチアゼムＨＣＬ、Ｄｉｏｖａｎ（バルサルタン）、ドキソルビシン、ＤｙｎａＣｉｒｃ  ＣＲ、Ｅｄａｒｂｉ（アジルサルタンメドキソミル）、Ｅｄａｒｂｙｃｌｏｒ（アジルサルタンメドキソミル・クロルタリドン）、Ｅｆｉｅｎｔ（プラスグレル）、Ｅｌｉｑｕｉｓ（アピキサバン）、Ｅｎｔｒｅｓｔｏ（サクビトリル・バルサルタン）、Ｅｐａｎｏｖａ（オメガ−３−カルボン酸）、フェノフィブラート、ヘパリン、Ｉｎｎｏｈｅｐ（チンザパリンナトリウム）注射液、Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ、Ｊｕｘｔａｐｉｄ（ロミタピド）、Ｋｅｎｇｒｅａｌ（カングレロル）、Ｋｙｎａｍｒｏ（ミポメルセンナトリウム）、Ｌｅｓｃｏｌ（フルバスタチンナトリウム）、Ｌｅｓｃｏｌ（フルバスタチンナトリウム）カプセル、Ｒｘ、Ｌｅｔａｉｒｉｓ（アンブリセンタン）、Ｌｅｖｉｔｒａ（バルデナフィル）、Ｌｅｘｘｅｌ（エナラプリルマレエート−フェロジピンＥＲ）、Ｌｉｐｉｔｏｒ（アトルバスタチンカルシウム）、Ｌｉｐｔｒｕｚｅｔ（エゼチミブ・アトルバスタチン）、Ｌｉｖａｌｏ（ピタバスタチン）、Ｍａｖｉｋ（トランドラプリル）、Ｍｉｃａｒｄｉｓ（テルミサルタン）、Ｍｉｃａｒｄｉｓ  ＨＣＴ（テルミサルタン・ヒドロクロロチアジド）、Ｍｉｃｒｏｚｉｄｅ（ヒドロクロロチアジド）、Ｍｕｌｔａｑ（ドロネダロン）、Ｎａｔｒｅｃｏｒ（ネシリチド）、Ｎｉａｓｐａｎ、Ｎｏｒｍｉｆｌｏ、Ｎｙｍａｌｉｚｅ（ニモジピン）、Ｏｐｓｕｍｉｔ（マシテンタン）、ペントキシフィリン、Ｐｉｎｄｏｌｏｌ、Ｐｌａｖｉｘ（クロピドグレルバイサルフェート）、Ｐｌａｖｉｘ（クロピドグレルバイサルフェート）、Ｐｏｓｉｃｏｒ、Ｐｒａｄａｘａ（ダビガトランエテキシラートメシレート）、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（プラバスタチンナトリウム）、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（プラバスタチンナトリウム）、Ｐｒｅｓｔａｌｉａ（ペリンドプリルアルギニン・アムロジピンベシレート）、ＰｒｉｎｉｖｉｌまたはＺｅｓｔｒｉｌ（リシノプリル）、ＰｒｏＡｍａｔｉｎｅ（ミドドリン）、Ｒａｎｅｘａ（ラノラジン）、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎ（トレプロスチニル）、ＲｅｏＰｒｏ、ＲＥＰＲＯＮＥＸ（注射液用メノトロピン、ＵＳＰ）、Ｒｅｔａｖａｓｅ��レテプラーゼ）、Ｒｙｔｈｍｏｌ、Ｓａｖａｙｓａ（エドキサバン）、Ｓｏｌｉｒｉｓ（エクリズマブ）、Ｔｅｃｚｅｍ（エナラプリルマレエート／ジルチアゼムマレート）、Ｔｅｋａｍｌｏ（アリスキレン＋アムロジピン）、Ｔｅｋｔｕｒｎａ（アリスキレン）、Ｔｅｖｅｔｅｎ（エプロサルタンメシレート＋ヒドロクロロチアジド）、Ｔｅｖｅｔｅｎ（エプロサルタンメシレート）、Ｔｉａｚａｃ（ジルチアゼム塩酸塩）、Ｔｉａｚａｃ（ジルチアゼム塩酸塩）、Ｔｉａｚａｃ（ジルチアゼム塩酸塩）、Ｔｏｐｒｏｌ−ＸＬ（メトプロロールサクシネート）、Ｔｒｉｂｅｎｚｏｒ（オルメサルタンメドキソミル＋アムロジピン＋ヒドロクロロチアジド）、Ｔｒｉｃｏｒ（フェノフィブラート）、Ｔｒｉｌｉｐｉｘ（フェノフィブリン酸）、Ｔｙｖａｓｏ（トレプロスチニル）、Ｖａｒｉｔｈｅｎａ（ポリドカノール注射泡剤）、Ｖａｓｃｅｐａ（イコサペントエチル）、Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（イオジキサノール）、Ｘａｒｅｌｔｏ（リバーロキサバン）、Ｘａｒｅｌｔｏ（リバーロキサバン）、Ｚｏｃｏｒ、Ｚｏｎｔｉｖｉｔｙ（ボラパキサル）からなる群から選択することができる。
【０１２４】
リンカー
共有結合アプローチを、化学的リンカーを介して血小板を修飾するために用いることができる。化学的リンカーを使用する利点の１つは、遺伝的変化の必要性が回避されることである。このような二官能性化学的リンカーは、治療剤を血小板細胞に連結することができる。二官能性リンカー基の例には、これらに限定されないが、糖、アミノ酸、アミノアルコール、カルボキシアルコール、アミノチオールなどのような部分が含まれる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカー、ＰＥＧリンカー、ＰＡＳ化、及びＨＥＳ化から選択される。一実施形態では、化学的リンカー部分は、マレイミドリンカーである。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、開示された主題による組成物、方法、及び結果を例示するために以下に記載される。これらの実施例は、本明細書に開示された主題の全態様を含むことを意図するものではなく、むしろ代表的な方法及び結果を例示することを意図している。これらの実施例は、当業者に明らかである本発明の均等物及び変形形態を除外することは意図されない。
【０１２７】
実施例１．術後がん免疫療法のためのチェックポイント阻害剤による血小板のｉｎ  ｓｉｔｕ活性化
手術は、ほとんどの固形腫瘍に対する処置の主な選択肢である。外科的技術の継続的な改善にもかかわらず、腫瘍切除後の残存微小腫瘍及び／またはＣＴＣは、依然として課題である１−３。加えて、手術が、がん転移の促進を誘発し得ることもまた示唆されている４，５。多くの患者は、術後に再発性疾患を発症し、これは重大な罹病率と死亡率につながるおそれがある。したがって、術後のがんの再発を防ぐための効果的な戦略構築に多大な関心が寄せられている。それらの中で、がん免疫療法は、近年非常に注目を集めている６。免疫療法剤は腫瘍を直接攻撃するのではなく、身体の免疫系を高めてがん細胞を殺す７。免疫チェックポイント遮断は、患者のサブセットにおいて長続きする抗腫瘍反応及び長期間の寛解を誘発した８−１０。特に、チェックポイント阻害剤は、リンパ球上のプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び腫瘍細胞上のプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤＬ１）の相互作用を遮断し、様々な種類のがんの処置において刺激的な結果を示した１１−１４。さらに、最初のＰＤ−Ｌ１阻害剤であるアテゾリズマブが、最近、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から迅速承認を受けた１５。著しい進歩にもかかわらず、チェックポイント遮断療法の現在の方法は、多くの患者において治療効果が制限される。臨床試験で観察された最大の制限は、自己免疫疾患などの副作用の重篤度であり得る１６−１８。免疫チェックポイント遮断療法で治療した場合、グレード３／４の有害事象が時々発生している１５，１９。その一方で、大多数の患者は、これらの薬剤に反応しなかった８，１０，１５。抗ＰＤ療法の客観的奏効率には、依然として改善が必要である。抗ＰＤ療法をどのように強化するかは、がん免疫学及び免疫療法の分野における中心的テーマの１つとなっている６，１１。
【０１２８】
抗ＰＤ療法の損なわれた処置有効性を説明し得る１つのメカニズムは、静脈内注入された際の正常組織に対するオフターゲット抗体である１６，１８，２０，２１。このような状況では、今後のがん免疫療法は、免疫系の全身的活性化よりもむしろ腫瘍部位に特に注目することが望ましい２０。さらに、制限された有効性はまた、不十分な腫瘍リンパ球浸潤及びＴ細胞炎症性腫瘍の微小環境（抗ＰＤ療法による臨床的効果に正に関連するＰＤＬ１のより高度な発現を含む）に起因し得る２２−２５。
【０１２９】
細胞ベースシステムは、赤血球、バクテリアゴースト、ならびに遺伝子操作された幹細胞及び免疫細胞を含む、生物学的薬物担体として最近登場した。２６，２７それらの中で、血小板は、巨核球から放出される無核細胞断片であり、止血におけるそれらの機能について最もよく知られている２８−３１。循環血小板の平均寿命は８〜９日であり２７，３２、これは静脈内注射された治療薬の薬物動態を大きく改善し得る。さらに、輸血された血小板は、残存腫瘍が術後に残る可能性がある外科的創傷部位へと遊走し得る３３。他方では、血小板が、原発腫瘍から血管系に流れ込み、そして転移をもたらしたＣＴＣを認識及び相互作用する能力を有するという新たな証拠が示されている３４−３６。血小板を利用して、ａＰＤＬ１は、治療薬のオフターゲット効果を低減しながら、術後のがん細胞を標的とすることができる。これらの固有の創傷及びＣＴＣ向性特性に加えて、血小板はまた、多くの炎症状態を惹起及び改善する免疫「細胞」と考えられる３７−３９。血小板由来ケモカインは、Ｔ細胞及び他の免疫細胞を動員して目覚めさせる。可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）の主な供給源として、血小板は、Ｔ細胞免疫を高めることができ、樹状細胞（ＤＣ）の成熟、及び免疫グロブリンＧの産生のためのＢ細胞アイソタイプスイッチングを誘導するために必要である４０。ＰＤＬ１及びＰＤＬ２が炎症に応答して上方制御され、これによりＰＤＬ１陽性腫瘍がもたらされ、その腫瘍は抗ＰＤ療法に対してより感受性が高く、潜在的にＯＲＲを改善することもまた報告されている４１−４２。
【０１３０】
この実施例では、術後の腫瘍の再発を防ぐために抗ＰＤＬ１（ａＰＤＬ１）を血小板の表面に負荷した（図１ａ）。驚くべきことに、本発明者らは、非活性化血小板へのａＰＤＬ１の結合が非常に安定であると同時に、ａＰＤＬ１の放出が血小板の活性化時に著しく促進され得ることを見出した。したがって、ａＰＤＬ１放出は、活性化血小板の原形質膜から生成される血小板由来マイクロ粒子（ＰＭＰ）に起因し得る４３。このような構造的変化は、ａＰＤＬ１がＡＰＣ及び腫瘍細胞に結合するのを促進することができる。原発腫瘍の切除後、Ｂ１６黒色腫及び４Ｔ１乳癌腫瘍保持マウスへのａＰＤＬ１コンジュゲート血小板（Ｐ−ａＰＤ１）の静脈内注射により、ａＰＤＬ１が残存微小腫瘍を有する手術床及び血中のＣＴＣに向かって輸送及び蓄積するのを、血小板が助けることができることが示された。Ｔ細胞炎症性腫瘍微小環境はまた、腫瘍部位でのＰＤＬ１発現の増加と共に、活性化時の血小板によっても生じた。その間、ａＰＤＬ１は、免疫細胞及び腫瘍細胞上のＰＤＬ１を遮断するために、血小板活性化後に放出され得る。これらの結果は、血小板が、標的化放出及び制御放出様式で治療剤（例えば、ａＰＤＬ１）を送達するための担体として機能することができ、術後のがんの再発を予防することができることを示す。
【０１３１】
ａＰＤＬ１で装飾された操作された血小板
共有結合アプローチを用いて、二官能性マレイミドリンカーを介してａＰＤＬ１により血小板を扱いやすいように修飾し、遺伝子改変の必要性を回避する４４。血小板へのａＰＤＬ１の結合を、免疫蛍光法によって調べた（図６）。加えて、マレイミド不含ａＰＤＬ１は、血小板に対してわずかな非特異的結合を示した（図７）。酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）は、血小板が、血小板あたり最大約０．３ｐｇまでａＰＤＬ１と容易に結合できることを示した（図８ａ）。血小板あたり０．１ｐｇ及び０．２ｐｇのａＰＤＬ１を結合しても、これらの生存力に有意な影響を及ぼさないこともまた見出された（図８ｂ）。このような共有結合は非常に安定であり、２日以内に有意な放出を示さなかった（図８ｃ）。さらに、細胞接着及び遊走を調節する血小板のいくつかの表面タンパク質を調べた（図９）。まとめると、ａＰＤＬ１とのコンジュゲーションは、これらの血小板細胞に著しい損傷を生じなかった。
【０１３２】
血小板の活性化は治療薬の放出を促進する
血小板の活性化は、接着が起こった後に生じる４５。血小板は、免疫機能を持つ多くの分子を含む約６０の顆粒を含有する３８。活性化すると、これらの顆粒は、それらの内包物質を細胞外環境に放出する。これらの内容物の多くは免疫分子としての役割を果たす。例えば、これらは他の免疫細胞を動員して活性化し、Ｔ細胞の遊走を誘導し、単球のＤＣへの分化を増加させることができる。加えて、ＰＭＰは、血小板活性化時に原形質膜から誘導され４３、活性化血小板は、接着分子及びケモカインを運ぶＰＭＰを放出し、ＰＭＰ沈着部位での単球捕捉を促進する４６。ａＰＤＬ１修飾血小板（Ｐ−ａＰＤＬ１）が刺激時に活性化され得るかどうかを調査するために、トロンビンを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰ−ａＰＤＬ１を活性化した。活性化前後のＰ−ａＰＤＬ１の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像の観察から、大量の生成されたＰＭＰが電子顕微鏡下で検出された（図１ｂ、図１０）。血小板の樹状かつ広がった形態変化もまた観察された。さらに興味深いことに、活性化血小板からのａＰＤＬ１の顕著な放出が、ＥＬＩＳＡアッセイによってモニターされた（図１ｃ）。顕著なａＰＤＬ１放出は、血小板活性化時の原形質膜からの解離したＰＭＰに起因するとした。この仮説を試験するために、活性化Ｐ−ａＰＤＬ１の免疫蛍光イメージングを実施した。血小板をカルセインで染色し、ａＰＤＬ１を蛍光二次抗体で染色した（図１１）。血小板の活性化後、ａＰＤＬ１がＰＭＰ上に存在することが検出された。
【０１３３】
注目すべきことに、いくつかの炎症誘発性サイトカインもまた、活性化時にａＰＤＬ１と共に放出された（図１ｄ〜ｅ）。ＰＭＰ生成による血小板からのａＰＤＬ１の放出をさらに調べるために、トランスウェル培養システムを導入した。ａＰＤＬ１コンジュゲート血小板をトランスウェル培養システムの上部区画で培養し、一方、Ｂ１６がん細胞を下部区画で増殖させた（図１２）。インサート膜の微小孔は１μｍの直径を有し、ＰＭＰが膜を自由に横切ることを可能にした。免疫染色の１２時間前に、Ｂ１６がん細胞を非活性化血小板及び活性化血小板と同時インキュベートした。図１ｆ及び図１２に示されるように、血小板が活性化されると、ａＰＤＬ１は、がん細胞の膜に結合することが見出された。非活性化血小板とインキュベートされたがん細胞に関しては、下部区画のがん細胞でほとんどシグナルが検出されなかった。まとめると、当該データは、ａＰＤＬ１が、活性化血小板から放出され、がん細胞に結合し得ることを示す。
【０１３４】
再発腫瘍に対するｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｐ−ａＰＤＬ１療法
血小板表面へのａＰＤＬ１の結合は、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ挙動を変える可能性を有する。したがって、全身投与後のＰ−ａＰＤＬ１のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態を健康なマウスで評価した。ａＰＤＬ１、Ｐ−ａＰＤＬ１、及び同時注射の非コンジュゲート血小板＋ａ−ＰＤＬ１を、同等のａＰＤＬ１用量でマウスに静脈内注射した。血液からのａＰＤＬ１のＥＬＩＳＡ分析は、遊離ａＰＤＬ１（５．２時間）及び混合物（５．５時間）と比較して、血小板に結合したａＰＤＬ１については非常に長期間の血液循環半減期（３４．８時間）が達成されたことを示した（図２ａ）。臨床における治療用抗体と比較して比較的短い血液循環時間は、ラット抗マウスＩｇＧのより高い免疫原性及び非特異的結合に起因する。手術により原発腫瘍を不完全に切除した後、それらの創傷向性能を試験した。ａＰＤＬ１をＣｙ５．５によって標識し、次いで血小板にコンジュゲートした。ｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングのために主要な臓器を収集して、Ｐ−ａＰＤＬ１または遊離ａＰＤＬ１の注射の２時間後にｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを実施した（図１３）。血小板にコンジュゲートした場合、ａＰＤＬ１は、残存腫瘍を有する外科的創傷付近に豊富に存在していたが、遊離ａＰＤＬ１の創傷部位では顕著な蛍光シグナルが検出されなかった（図２ｂ）。主要な臓器、及び残存微小腫瘍を有する創傷のｅｘ  ｖｉｖｏイメージングにより、Ｐ−ａＰＤＬ１の創傷向性能がさらに確認された（図２ｃ、図１３）。圧倒的なａＰＤＬ１蛍光シグナルが、遊離ａＰＤＬ１を注射したマウスの肝臓で検出されたのに対し、Ｐ−ａＰＤＬ１は、同じａＰＤＬ１用量で、遊離ａＰＤＬ１を注射したマウスからのシグナルよりも著しく低いａＰＤＬ１シグナルを肝臓で示した。このことは、Ｐ−ａＰＤＬ１の血液循環時間がより長いことを示す。その一方で、顕著な強いａＰＤＬ１シグナルが、残存微小腫瘍を有する外科的創傷付近で検出されたのに対し、遊離ａＰＤＬ１に関連する試料では顕著な蛍光シグナルが検出されなかった。蛍光シグナルの定量化により、静脈内注射の２時間後、Ｐ−ａＰＤＬ１の創傷での蓄積が、遊離ａＰＤＬ１のものと比較して、９．４倍超効果的であることが示された（図２ｄ）。微小腫瘍切片の共焦点画像により、血小板上にコンジュゲートされた場合に、ａＰＤＬ１の腫瘍取り込みが顕著に増加することがさらに確認された（図２ｅ、図１４ａ）。さらに、血小板から放出されたａＰＤＬ１は、蛍光イメージングによってｉｎ  ｖｉｖｏで明らかに観察された（図１４ｂ）。修飾血小板の止血効果もまた調べた。輸血後のマウス尾部出血時間により、Ｐ−ａＰＤＬ１処置マウスは、未処置の血小板の輸血で処置したマウスと比較して、出血時間に統計学的に有意な差がないことが示された（図１５）。
【０１３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症誘発性環境を調査するために、手術部位におけるサイトカインレベルを評価した。原発腫瘍を外科的に除去した後、マウスに血小板を静脈内注射した。２時間後、創傷組織を集め、培地で２４時間培養した。次いで、創傷組織の培地をサイトカインの活性について試験した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びｓＣＤ４０Ｌのレベルは、全て、未処置の対照マウス及び創傷を有するマウスのものと比較して、明らかな上昇を示すことが見出された（図１６ａ）。血清のサイトカインもまた試験した。興味深いことに、血小板は、血清中のこれらの炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導しなかった（図１６ｂ）。これらの結果は、全身性炎症よりもむしろ局所的炎症環境が、血小板注射により誘発され得ることを示している。局所的炎症誘発性環境は、腫瘍部位で静止前駆リンパ球を活性化リンパ球に変換することによって、ａＰＤＬ１免疫療法に寄与する４７。加えて、腫瘍部位におけるＰＤＬ１発現もまた調査した。血小板誘導性炎症負荷は、腫瘍浸潤免疫細胞及び腫瘍細胞のＰＤＬ１発現を上方制御し得ることが見出された（図１６ｃ〜ｄ）。腫瘍内のＰＤＬ１陽性細胞の増加は、抗ＰＤＬ１免疫療法をさらに増強し、ＯＲＲを向上させることができる。４１，４２
【０１３６】
術後に残った残存微小腫瘍を処置するために、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫不完全腫瘍切除モデルを使用して、術後性の局所再発を模倣した（図２ｆ）。外科的に大部分の腫瘍を切除した後（約９９％）、マウスに、単回用量のＰＢＳ、血小板、ａＰＤＬ１またはＰ−ａＰＤＬ１（ａＰＤＬ１＝１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。腫瘍増殖をＢ１６Ｆ１０細胞の生物発光シグナルによってモニターした。Ｐ−ａＰＤＬ１を投与されたマウスが、最小の再発性腫瘍の体積を示したことが示された。８匹のマウスのうち６匹が、検出可能な腫瘍なく、強い反応を示した。一方で、遊離ａＰＤ１処置マウスは、腫瘍増殖のわずかな遅延を示したが、手術床での腫瘍の再発は妨げなかった。血小板のみで処置したマウスにおける腫瘍の再発の予防は、ＰＢＳ対照のものと同様の効果を示した（図２ｇ〜ｈ）。マウスにおける腫瘍のサイズもまた、それらの生存と相関していた。マウスの約７５％が、Ｐ−ａＰＤＬ１による処置後６０日生存した。対照的に、全ての対照群で、いずれのマウスも６０日後に生存しなかった（図２ｉ）。
【０１３７】
Ｐ−ａＰＤＬ１療法によって引き起こされるＴ細胞媒介性免疫応答
加えて、再発腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を採取し、１６日目に免疫蛍光法及びフローサイトメトリーによって分析した。免疫蛍光染色は、対照群の残存腫瘍が、Ｔ細胞浸潤を制限していることを明らかにした。対照的に、Ｐ−ａＰＤＬ１処置マウスの残存腫瘍は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方によって著しく浸潤されていた（図３ａ、図１７）。腫瘍重量は、１０日目のＰ−ａＰＤＬ１処置マウスにおいて有意に低く（図３ｂ）、これはまた、残存腫瘍におけるＣＤ３＋細胞の絶対数の増加に対応した（図３ｃ）。より顕著なことには、ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数／腫瘍グラムは、ＰＢＳ対照と比較してＰ−ａＰＤＬ１処置マウスにおいてほぼ１０倍増加し、遊離ａＰＤＬ１処置マウスに対して３倍増加した（図３ｄ〜ｆ）。加えて、腫瘍浸潤ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞を調べた（図３ｅ）。Ｔエフェクター細胞対制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の腫瘍内比率は、Ｐ−ａＰＤＬ１療法後のマウスにおいて有意に高まった（図３ｆ−ｈ）。加えて、細胞周期関連タンパク質Ｋｉ６７の発現によって測定されるように、Ｐ−ａＰＤＬ１マウスの腫瘍内でのＣＤ８＋及びＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の高増殖が観察された。エフェクターＴ細胞とは対照的に、Ｐ−ａＰＤＬ１療法を用いた腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞による増殖の有意な増加はなかった（図１８）。総合すれば、これらの観察結果は、Ｐ−ａＰＤＬ１が、ａＰＤＬ１を腫瘍微小環境に効果的に送達し、強固かつＴ細胞媒介性の抗腫瘍免疫応答を引き起こすことができることを示している。
【０１３８】
転移性疾患に対するＰ−ａＰＤＬ１療法
ＣＴＣの処置に対するＰ−ａＰＤＬ１の効力をさらに示すために、Ｐ−ａＰＤＬ１が、まず、術後にマウスにＢ１６Ｆ１０細胞を静脈内注射することによって、実験的転移腫瘍モデルで試験され、これはＣＴＣが原発腫瘍から血液循環へ逃げるのを模倣した（図４ａ、図１９）４８。手術直後に、マウスに、単回用量のＰＢＳ、血小板、ａＰＤＬ１（ａＰＤＬ１＝１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ）またはＰ−ａＰＤＬ１（ａＰＤＬ１＝１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。マウスにおけるＢ１６Ｆ１０細胞の生物発光シグナル（図４ｂ、図１９）によれば、遊離ａＰＤＬ１処置により転移癌を予防することができたが、手術部位での局所的な腫瘍の再発は、２ｍｇ／ｋｇの高用量であっても予防できなかったことが示された。これは、おそらく、ａＰＤＬ１の蓄積が術後のそれらの残存微小腫瘍に対して不十分なためである（図１３）。対照的に、肺全体の写真とそれらのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色イメージング（図４ｃ〜ｄ）ならびに肺組織の蛍光イメージング（図２０）によって確認されるように、手術床での腫瘍の再発及び肺転移が、Ｐ−ａＰＤＬ１治療後に著しく減少した。肺における転移部位の平均数は、Ｐ−ａＰＤＬ１で処置した場合に劇的に減少した（図４ｅ）。さらに、処置マウスの生存期間は、対照群と比較して有意に増加した（図４ｆ）。遊離ａＰＤＬ１と比較したＰ−ａＰＤＬ１のより良好な抗癌効果は、がん細胞周辺の抗体の局所濃度の増加に部分的に起因していた（図１３）。その一方で、血小板活性化はまた、抗癌効果の機能的要素でもあった。活性化により、コンジュゲートされたａＰＤＬ１を放出することができただけでなく、他の多くの免疫細胞を動員してＴＭＥに浸潤させるのにも役立つことができたためである。ＰＤＬ１遮断により、これらの免疫細胞が強力な抗癌免疫反応を誘導し得る。
【０１３９】
Ｐ−ａＰＤＬ１のｉｎ  ｓｉｔｕ活性化が、抗癌効果に寄与したかどうかをさらに確認するために、ＰＭＰを収集し、ａＰＤＬ１で修飾した（図１９）。これらのマイクロ粒子を直接注射すると、そのままの血小板と比較して抗癌効果が制限され、遊離ａＰＤＬ１よりもさらに優れていないことが明らかに示された（図４）。このことは、循環への導入後にＰＭＰが迅速に除去される可能性があることを確認した従来の研究によって説明され得る４９，５０。これらの結果は、腫瘍部位におけるＰ−ａＰＤＬ１のｉｎ  ｓｉｔｕ活性化が、Ｐ−ａＰＤＬ１の抗癌効果を増強するための必須の構成要素であることを実証した。
【０１４０】
術後の４Ｔ１再発癌に対するＰ−ａＰＤＬ１
別の種類の癌の術後の再発防止におけるＰ−ａＰＤＬ１の効力を評価するために、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）４Ｔ１癌腫瘍モデルで試験を実施した。この実験では、ＢＡＢＬ／ｃマウスに４Ｔ１腫瘍細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。皮下に腫瘍を接種した１４日後、原発腫瘍を手術で切除し、残存微小腫瘍を約１％残した。ａＰＤＬ１と結合した治療用血小板を手術直後にマウスに静脈内注射した。このモデルでは、１コースのＰ−ａＰＤＬ１療法が、術後の残存腫瘍の増殖に影響を与えるのに十分意味があった（図５ａ−ｂ）。加えて、遊離ａＰＤＬ１処置マウスに中央値１６個の小結節ならびに血小板処置マウス及び未処置のマウスにおいて約３０個の小結節が見られたのとは対照的に、Ｐ−ａＰＤＬ１処置マウスの肺では、ほんのわずかな小結節しか見られなかったため、肺転移に対する治療の効果もまた印象的であった（図５ｃ〜ｄ）。術後にＰ−ａＰＤＬ１療法を受けたマウスは、対照群とは対照的に実質的な延命効果が得られた。マウスの７５％が、腫瘍接種後６０日生存した（図５ｅ）。
【０１４１】
要約すると、この例は、ａＰＤＬ１の送達促進のために血小板のｉｎ  ｓｉｔｕ活性化を利用し、術後の残存腫瘍細胞を実質的に一掃し、癌の再発を予防することができる。Ｐ−ａＰＤＬ１療法は、外科的処置の有効性を最大化することができ、原発腫瘍切除後の癌の再発及び転移のリスクを減少させることができる。ａＰＤＬ１送達のための血小板の使用を超えて、この送達方法はまた、標的化送達及び治療剤の生体応答性放出のためにバイオ微粒子を応用する他の治療剤及び治療にも適用される５１。
【０１４２】
方法及び材料
細胞株
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０及びマウス乳癌細胞株４Ｔ１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃ−ＧＦＰ及び４Ｔ１−ｌｕｃ−ＧＦＰ細胞は、Ｃｈａｐｅｌ  ＨｉｌｌのＴｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  ＣａｒｏｌｉｎａのＤｒ．Ｌｅａｆ  Ｈｕａｎｇから贈与された。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。４Ｔ１細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。マスターセルバンク及びワーキングセルバンクを、受領後すぐに作製した。第３継代及び第４継代が、腫瘍実験に使用された。細胞は、マイコプラズマの可能性について３ヶ月毎に試験された。受領後、細胞の再認証は実施しなかった。
【０１４３】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ（ＵＳＡ）から購入した。全ての実験を通じて、同齢の（６〜１０週）雌動物を使用した。全てのマウス研究は、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌのｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ及びＮｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの所内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された動物プロトコルの範疇で実施した。実験群のサイズは、統計的検出力、実現可能性、及び倫理的側面のバランスをとるように定義された後、動物福祉に関する規制当局によって承認された。全てのマウスは、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌのｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ及びＮｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験に関する連邦及び州の方針にしたがって飼育された。
【０１４４】
抗体
ｉｎ  ｖｉｖｏで使用する抗ＰＤＬ１抗体（ａＰＤＬ１）を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃから購入した（Ｃａｔ．＃１２４３２９，Ｃｌｏｎｅ：  １０Ｆ．９Ｇ２）。染色抗体には、製造元の指示にしたがって、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析のために、ＣＤ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃Ａ１８６４４）、ＣＤ４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃Ａ１８６６７）、ＣＤ８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃Ａ１８６０９）、ＰＤ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１３５２２７）、ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１１７３０９）、ＰＤＬ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１２４３１１）、ＣＤ２０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１５０４１１）、ＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１０１２１１）、ＣＤ９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１２４８０５），ＣＤ４１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１３３９０５）、ＣＤ６１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１０４３０７）、ＣＤ６２Ｐ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１４８３０５）、ＣＤ４０Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１０６５０５）、細胞内Ｋｉ６７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃６５２４０５）、及び細胞内Ｆｏｘｐ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．＃．７１−５７７５−４０）が含まれた。染色細胞をＣａｌｉｂｕｒ  ＦＡＣＳ装置（ＢＤ）で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０）を使用して分析した。ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃Ａ１８８６６）、ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃Ａ１８９２０）、ヤギ抗ラットＩｇＧ（ｍｉｎｉｍａｌ  ｘ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃４０５４０８）を免疫染色に使用した。
【０１４５】
ａＰＤＬ−１コンジュゲート血小板の調製
記載のように、マウス血小板を単離した。５２手短に言えば、全血をＣ５７ＢＬ／６（またはＢＡＬＢ／ｃ）マウスから採取（眼窩静脈叢または伏在静脈からの非ターミナル採血、２０匹のマウスを採血に使用）し、１．０ｍＬのクエン酸−リン酸−デキストロース（１６ｍＭ  クエン酸、９０ｍＭ  ナトリウムシトレート、１６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４２ｍＭ  デキストロース、ｐＨ７．４）を含有するプラスチックシリンジに入れ、中断することなく、室温において２０分間１００ｇで回転させた。多血小板血漿（ＰＲＰ）をトランスファーピペット（ワイドオリフィス）を使用して別のチューブに移し、ＰＧＥ１を各チューブに１μＭの最終濃度まで添加した。（注意：ＰＲＰの色が赤みがかっている場合は、これらの試料を廃棄すること）。１０分間８００ｇで回転（中断なし）させることにより、血小板をＰＲＰから単離した。血漿を廃棄し、血小板をタイロード緩衝液（１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭ  ＫＣｌ、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）、またはＰＧＥ１を含むＰＢＳ（１μＭの最終濃度）に慎重にゆっくりと再懸濁させた（注意：チューブの壁に沿ってゆっくりと緩衝液を流し、撹拌量を最小限に抑えること）。各ｉｎ  ｖｉｖｏ注射には５００〜６００μｌの全血が必要であった。
【０１４６】
次いで、血小板の表面を、３ステップでａＰＤＬ−１によって官能化した。最初に、１００μＬの血小板（１×１０８）を、ＰＧＥ１（１μＭ）を含む４００μＬのＰＢＳ（ｐＨ＝８）に再懸濁し、室温（ＲＴ）で３０分間、トラウト試薬（０．１ｍｇ／ｍｌ）（２−イミノチオラン、Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベートした。３０分反応させた後、余分なトラウト試薬を１０分間８００ｇで遠心分離により除去し、タイロード緩衝液（ＰＧＥ１（１μＭ）を含む）で３回洗浄した（不要な血小板活性化を避けるために再懸濁せず）。その間、ａＰＤＬ−１をＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中のスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ）と、１：１．２のモル比で、４℃で２時間混合した。遠心濾過装置（分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）＝１０ｋＤａ）を使用して、余分なＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去して、ＳＭＣＣ活性化抗体を精製した。最後に、血小板及び抗体をタイロード緩衝液（ＰＧＥ１（１μＭ）を含む）中で混合した。室温で２時間反応させた後、余分な抗体を遠心分離（８００ｇで１０分間）によって除去した。沈殿画分を保持し、タイロード緩衝液（ＰＧＥ１（１μＭ）を含む）で２回洗浄した。血小板数分析に基づくと、結合後の血小板の回収は８０％より高かった。得られたａＰＤＬ１−血小板は、使用するまでタイロード緩衝液（ＰＧＥ１（１μＭ）を含む）に室温で保存した。非コンジュゲート血小板は、コンジュゲート血小板から分離しなかった。血小板へのａＰＤＬ１の最終コンジュゲート量をＥＬＩＳＡ（Ｒａｔ  ＩｇＧ  ｔｏｔａｌ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８８−５０４９０−２２）によって測定した。新たに単離した血小板を６時間以内に使用した。血小板活性化マーカーＣＤ６２Ｐを血小板活性化を評価するために使用した。全ての血小板操作は、室温で実施した。コンジュゲーション効率について調査するために、様々な量のａＰＤＬ１をコンジュゲーションのために血小板に添加した。上清中で遠心分離することにより（８００ｇで１０分間）、非コンジュゲートａＰＤＬ１を除去した。次いで、沈殿したＰ−ａＰＤＬ１をタイロード緩衝液（ＰＧＥ１（１μＭ）を含む）によって、２回遠心分離（８００ｇで１０分間）して洗浄した。その後、Ｐ−ａＰＤＬ１を１００μｌの脱イオン水に溶解し、細胞溶解のために超音波で処置してａＰＤＬ１を放出させた。血小板へのａＰＤＬ１のコンジュゲート量をＥＬＩＳＡ分析によって測定した。血小板へのａＰＤＬ１コンジュゲーションの効率（添加したａＰＤＬ１／コンジュゲートしたａＰＤＬ１）は、血小板あたり０．２ｐｇのａＰＤＬ１を添加した場合に約７５％であった。ａＰＤＬ１修飾後の血小板の安定性を試験するために、０時間及び２４時間における血小板数分析に基づいてＰ−ａＰＤＬ１の数を測定した。経時的な血小板に対するａＰＤＬ１の安定性について調査するために、Ｐ−ａＰＤＬ１をタイロード緩衝液（ＰＧＥ１（１μＭ）を含む）に室温で保存した。５０μｌのＰ−ａＰＤＬ１を異なる時点で抽出した。上清中の放出されたａＰＤＬ１を遠心分離（８００ｇで１０分間）によって除去���た。Ｐ−ａＰＤＬ１を１００μｌの脱イオン水に溶解し、溶解のために超音波で処置してａＰＤＬ１を放出させた。血小板へのａＰＤＬ１のコンジュゲート量をＥＬＩＳＡ分析によって測定した。血小板を活性化するために、０．５Ｕトロンビン／ｍＬを血小板懸濁液に添加した。血小板活性化の前にＰＧＥ１を除去した。血小板を３７℃で３０分間、活性化した。
【０１４７】
ＰＭＰは、既に記載されているように血小板から調製した。５３実験前に、血小板濃縮物をトロンビン（２Ｕ／ｍＬ）によって３０分間活性化し、１０分間８００ｇで遠心分離し、ＰＭＰの豊富な上清を収集した。抗マウスａＩＩｂｂ３抗体及び抗マウスＣＤ６２Ｐ（Ｐセレクチン）抗体を使用したフローサイトメトリー分析により、上清を調べた。次に、ＰＭＰを上述のようにａＰＤＬ１と結合させた。結合効率及び安定性をＥＬＩＳＡによって調べた。
【０１４８】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
その後の調製ステップによる血小板の形状変化を回避するために、血小板を１０％の緩衝ホルムアルデヒド溶液と混合することにより血小板の前固定を実施した。前固定の直後に、試料を室温において１０分間８００ｇで遠心分離した。上清の廃棄後、血小板を４℃で９０分間、カコジル酸緩衝液、ｐＨ７．２中の２．５％グルタルアルデヒドで固定した（活性化血小板については、上清もＴＥＭイメージングのために収集した）。固定後、血小板を４℃において１０分間８００ｇで遠心分離することにより２回洗浄した。次いで、血小板を２％の酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で５分間、順次染色し、次いで銅グリッドに移した。５４血小板のＴＥＭ画像を、８０ｋＶでＪＥＯＬ  ２０００ＦＸ  ＴＥＭ装置によって得た。
【０１４９】
血小板からの抗ＰＤＬ１及びサイトカインの放出
Ｐ−ａＰＤＬ１を活性化するために、０．５Ｕのトロンビン／ｍＬをＰ−ａＰＤＬ１（５００μＬのタイロード緩衝液中に約１×１０８の血小板、ｎ＝３）懸濁液に３７℃で３０分間添加した。５０μｌのＰ−ａＰＤＬ１を異なる時点で抽出した。上清中の血小板から放出されたａＰＤＬ１及びサイトカインを、１０分間８００ｇで遠心分離することにより収集した。非活性化Ｐ−ａＰＤＬ１を対照とした。上清溶液中の放出されたａＰＤＬ１及びサイトカインの量をＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８８−５０４９０−２２（ｒａｔ  ＩｇＧ）、８８−７０１３−２２（ＩＬ１β）、８８−７０６４−２２（ＩＬ６）、８８−７３２４−２２（ＴＮＦ−α）、ＢＭＳ６０１０（ｓＣＤ４０Ｌ））。吸光度は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００  ＰＲＯプレートリーダーで読み取った。
【０１５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態
３匹のマウスに、遊離ａＰＤＬ１、Ｐ−ａＰＤＬ１または非コンジュゲート血小板＋ａ−ＰＤＬ１混合物（各マウスにつき、２００μＬのＰＢＳ中のａＰＤＬ１、２ｍｇ／ｋｇ、血小板、２×１０８）を静脈内注射した。抗凝固チューブを使用して、異なる時点で尾から１０μＬの血液を抽出した。各試料を１００μｌの水（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｗ４５０２）に溶解し、細胞溶解のために超音波で処置してコンジュゲートａＰＤＬ１を放出させた。ａＰＤＬ１をＲａｔ  ＩｇＧ  ｔｏｔａｌ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８８−５０４９０−２２）によって測定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ体内分布調査のために、約１％の残存組織を残して原発腫瘍を除去した後、マウスにＣｙ５．５標識した遊離ａＰＤＬ１またはＰ−ａＰＤＬ１を静脈内注射した。ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光画像をＩＶＩＳシステム（付属のＣｙ５．５用の励起／発光フィルターを用いて、露光時間、１秒）により記録した。ｅｘ  ｖｉｖｏイメージングのために、処置マウスを注射の２時間後に屠殺した。主要臓器及び組織を収集し、ＩＶＩＳイメージングシステム（付属のＣｙ５．５用の励起／発光フィルターを用いて、露光時間、１秒）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ）で撮像した。
【０１５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデル
癌の再発に対する効果を測定するために、７日後、１×１０６の、Ｂ１６Ｆ１０（または４Ｔ１）またはルシフェラーゼタグ付きＢ１６Ｆ１０（または４Ｔ１）腫瘍細胞のいずれかを、マウスの右側腹部に移植した（腫瘍は約３００ｍｍ３に達する）。手術床内の残存微小腫瘍を模倣するために、約１％の残存組織を残して腫瘍を切除した３。簡単に記せば、動物を、チャンバー導入によるイソフルラン（維持１〜３％、導入最大５％）麻酔で麻酔し、ノーズコーンを介して維持した。腫瘍領域を留め、無菌的に準備した。滅菌器具を使用して、腫瘍の約９９％を切除した。創傷をＡｕｔｏｃｌｉｐ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃｌｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍによって閉じた。実験的転移モデルのために、２００μＬのＰＢＳ中の１×１０５のルシフェラーゼタグ付きＢ１６Ｆ１０（または４Ｔ１）腫瘍細胞を、原発腫瘍の切除後、尾静脈を介してマウスに静脈内注入した。マウスの体重を量り、異なる群にランダムに分けた（ｎ＝８）。手術後、マウスに異なる薬物製剤をその直後に静脈内注射した（マウスあたり２００μＬのＰＢＳ中にａＰＤＬ１＝１ｍｇ／ｋｇ、１〜２×１０８の血小板）（ここで使用した新たに調製した血小板は、健康なマウスの同じ系統から収集した）。腫瘍負荷をがん細胞の生物発光シグナルによってモニターした。イメージングの前に、マウスを留め、除毛クリームを使用して剃毛した。ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ，ＵＳＡ）を使用して画像を撮影した。腫瘍はまた、デジタルノギスでも測定された。腫瘍体積（ｍｍ３）は、（長径×短径２）／２として計算された。転移負荷を生物発光により評価した。肺の重さを量り、微小転移を数えた。動物は、健康障害の徴候を示した場合、または腫瘍の体積が２ｃｍ３を超えた場合、安楽死させた。
【０１５２】
図５ｃの転移性肺腫瘍については、標準的なプロトコルにしたがって、インディアインクを使用して肺転移をよりよく可視化した。５５マウスを屠殺し、気管内インク（８５ｍｌのＨ２Ｏ、１５ｍｌのインク、２滴のアンモニア水）注射及びＦｅｋｅｔｅ溶液（５ｍｌの７０％エタノール、０．５ｍｌのホルマリン、及び０．２５ｍｌの氷酢酸）での固定後、腫瘍負荷を非盲検で定量した。２〜６時間後、腫瘍病変は漂白されたが、正常な肺組織は染色されたままだった。
【０１５３】
加えて、腫瘍を処置後にマウスから切り出し、免疫蛍光染色のために最適切断培地（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）中で急速凍結した。蛍光標識二次抗体を使用して、ａＰＤＬ１及び血小板またはＰＭＰを検出した。Ｈ＆Ｅ染色のために、肺腫瘍を有する動物を分析のために屠殺した。肺組織切片を、標準的なプロトコルにしたがってＨ＆Ｅで染色した。全てのＨ＆Ｅ染色切片をＬｅｉｃａ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ５５００  Ｂ）で調べた。
【０１５４】
サイトカイン検出
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びｓＣＤ４０Ｌの局所レベル及び血漿レベルをＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。創傷における異なるサイトカインの濃度を測定するため、血小板注射の６時間後、創傷組織を収集し、３７℃で１２時間培養した。分析のために、１００μＬの培地を除去し、−８０℃で凍結した。血漿中のサイトカインレベルを測定するため、血小板注射の６時間後、分析のために、種々の処置後にマウスから血漿試料を単離し、希釈した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びｓＣＤ４０Ｌの濃度をＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。全ての測定を３回実施した。
【０１５５】
共焦点顕微鏡
腫瘍をマウスから切り出し、Ｏ．Ｃ．Ｔで急速凍結した。クリオトームを使用して、いくつかのマイクロメートル切片を切断し、スライド上に載せた。切片を氷冷アセトン中で１０分間固定した後、ＰＢＳで再水和した。ＢＳＡ（３％）でブロッキング後、切片を一次抗体によって４℃で一晩染色した。蛍光標識二次抗体の添加後、スライドを、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０）を使用して分析した。
【０１５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光と撮像
生物発光画像を、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ）によって収集した。ＤＰＢＳ（１５ｍｇ／ｍＬ）中のｄ−ルシフェリン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ（商標），Ｃａｔ＃ＰＩ８８２９１）を、動物に腹腔内注射（１０μＬ／ｇ体重）した１０分後に、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ）を使用してデータを取得した。生物発光撮像のための露光時間は５分であった。（読み取り時間を最適化するため、ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して１分間の露光時間で生物発光強度を３０分間得た。）関心領域（ＲＯＩ）は、平均放射輝度（カラーバーで表される光子  秒−１ｃｍ−２ｓｒ−１）として定量化された（ＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．２）。
【０１５７】
尾部出血アッセイ
尾部出血時間を、末端マウス尾部の先端から３ｍｍを取り除き、直ちに尾部を３７℃のＰＢＳに浸すことによって測定した。出血の完全な停止を出血時間のエンドポイントとして定義した。
【０１５８】
統計分析
全ての結果は、明記されるように平均値±ｓ．ｄ．、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として表す。特に明記しない限り、生物学的反復実験を全ての実験で使用した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を３つ以上の群を比較した場合に実施し、有意（Ｐ≦０．０５）と判定された場合、Ｔｕｋｅｙの事後検定を使用して多重比較を実施した。延命効果はログランク検定により測定した。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（５．０）によって実施した。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１。動物実験または他の実験のための試料サイズを予め決定するための統計学的手法は使用しなかった。
【０１５９】
参考文献
１．Ｂａｋｅｒ，Ｄ．，Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ，Ｔ．，Ｐａｃｅ，Ｒ．，Ｃｏｎｓｔａｂｌｅ，Ｗ．＆  Ｗａｎｅｂｏ，Ｈ．Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｏｎ  ｌｏｃａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  １０６，５２５−５３２（１９８９）．
２．Ｌｕｋｉａｎｏｖａ−Ｈｌｅｂ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｍｉｃｒｏｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  ｎａｎｏｂｕｂｂｌｅｓ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１６）．
３．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，９７−１０１（２０１５）．
４．Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ，Ｒ．，Ｒｅｔｓｋｙ，Ｍ．，Ｈｒｕｓｈｅｓｋｙ，Ｗ．，Ｂａｕｍ，Ｍ．＆  Ｇｕｋａｓ，Ｉ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ：  ａ  ｃｅｎｔｕｒｙ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｍｄｎ３８６（２００８）．
５．Ｃｅｅｌｅｎ，Ｗ．，Ｐａｔｔｙｎ，Ｐ．＆  Ｍａｒｅｅｌ，Ｍ．Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ，ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  Ｒｅｃｅｎｔ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８９，１６−２６（２０１４）．
６．Ｋｌｅｖｏｒｎ，Ｌ．Ｅ．＆  Ｔｅａｇｕｅ，Ｒ．Ｍ．Ａｄａｐｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅａｌ  Ｗｏｒｌｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６）．
７．Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｄ．＆  Ｐｅａｒｃｅ，Ｅ．Ｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６，７１−８０（２０１５）．
８．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７２，２５２１−２５３２（２０１５）．
９．Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ａｎｄ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｖｅｒｓｕｓ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７２，２００６−２０１７（２０１５）．
１０．Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．＆  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，５６−６１（２０１５）．
１１．Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｙｅ，Ｙ．，Ｈｏｃｈｕ，Ｇ．Ｍ．，Ｓａｄｅｇｈｉｆａｒ，Ｈ．＆  Ｇｕ，Ｚ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ  Ｐａｔｃｈ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＰＤ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１６，２３３４−２３４０（２０１６）．
１２．Ｚｏｕ，Ｗ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．＆  Ｃｈｅｎ，Ｌ．ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）  ａｎｄ  ＰＤ−１  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．８，３２８ｒｖ３２４（２０１６）．
１３．Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ，Ｅ．Ｉ．＆  Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ２０１５：  Ｉｍｍｕｎｅ−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  −  ｄｕｒａｂｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３，７７−７８（２０１６）．
１４．Ｓｍｙｔｈ，Ｅ．Ｃ．＆  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｅｎｃｏｕｒａｇｉｎｇ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｏｒ  ＰＤ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．（２０１６）．
１５．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｈｏ  ｈａｖｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ａｒｍ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｐｈａｓｅ  ２  ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３８７，１９０９−１９２０（２０１６）．
１６．Ｎａｉｄｏｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｍｄｖ３８３（２０１５）．
１７．Ｍｅｌｌａｔｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−ＰＤＬ−１  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｃａｕｓｉｎｇ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ３８，ｅ１３７−１３８（２０１５）．
１８．Ｂｏｕｔｒｏｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１６）．
１９．Ｌａｒｋｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ａｎｄ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｏｒ  Ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７３，２３−３４（２０１５）．
２０．Ｃｈｅｎ，Ｌ．＆  Ｈａｎ，Ｘ．Ａｎｔｉ−ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ：  ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５，３３８４−３３９１（２０１５）．
２１．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｋａｈｌｅｒ，Ｋ．Ｃ．＆  Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ，Ａ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｗｉｔｈ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０，２６９１−２６９７（２０１２）．
２２．Ｗｏｏ，Ｓ．Ｒ．，Ｃｏｒｒａｌｅｓ，Ｌ．＆  Ｇａｊｅｗｓｋｉ，Ｔ．Ｆ．Ｔｈｅ  ＳＴＩＮＧ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６，２５０−２５６（２０１５）．
２３．Ｈｅｇｄｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｋａｒａｎｉｋａｓ，Ｖ．＆  Ｅｖｅｒｓ，Ｓ．Ｔｈｅ  ｗｈｅｒｅ，ｔｈｅ  ｗｈｅｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｏｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒａ  ｏｆ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２，１８６５−１８７４（２０１６）．
２４．Ｓｐｒａｎｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤ−Ｌ１，ＩＤＯ，ａｎｄ  Ｔｒｅｇｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｓ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２００ｒａ１１６−２００ｒａ１１６（２０１３）．
２５．Ｇａｊｅｗｓｋｉ，Ｔ．Ｆ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｈ．＆  Ｆｕ，Ｙ．Ｘ．Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，１０１４−１０２２（２０１３）．
２６．Ｆｅｓｎａｋ，Ａ．Ｄ．，Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．＆  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂ．Ｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １６，５６６−５８１（２０１６）．
２７．Ｙｏｏ，Ｊ．Ｗ．，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．＆  Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｓ．Ｂｉｏ−ｉｎｓｐｉｒｅｄ，ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１０，５２１−５３５（２０１１）．
２８．Ｔａｍａｇａｗａ−Ｍｉｎｅｏｋａ，Ｒ．Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．７７，９３−１０１（２０１５）．
２９．Ｆｒａｎｃｏ，Ａ．Ｔ．，Ｃｏｒｋｅｎ，Ａ．＆  Ｗａｒｅ，Ｊ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｌｏｏｄ  １２６，５８２−５８８（２０１５）．
３０．Ｈｕ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｉｎｇ  ｂｙ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｌｏａｋｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２６，１１８−１２１（２０１５）．
３１．Ｔｅｘｔｏｒ，Ｊ．ｉｎ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ  ６１−９４（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１４）．
３２．Ｈａｒｋｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｉｆｅ  ｓｐａｎ，ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９５，２５１４−２５２２（２０００）．
３３．Ｎｕｒｄｅｎ，Ａ．Ｔ．，Ｎｕｒｄｅｎ，Ｐ．，Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｍ．，Ａｎｄｉａ，Ｉ．＆  Ａｎｉｔｕａ，Ｅ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．１３，３５３２−３５４８（２００８）．
３４．Ｇａｙ，Ｌ．Ｊ．＆  Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １１，１２３−１３４（２０１１）．
３５．Ｎａｓｈ，Ｇ．Ｆ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｌ．Ｆ．，Ｓｃｕｌｌｙ，Ｍ．Ｆ．＆  Ｋａｋｋａｒ，Ａ．Ｋ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．３，４２５−４３０（２００２）．
３６．Ｈｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  Ｎａｎｏｖｅｈｉｃｌｅｓ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２７，７０４３−７０５０（２０１５）．
３７．Ｇａｒｒａｕｄ，Ｏ．Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ：  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，１−３（２０１５）．
３８．Ｍｏｒｒｅｌｌ，Ｃ．Ｎ．，Ａｇｇｒｅｙ，Ａ．Ａ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｌ．Ｍ．＆  Ｍｏｄｊｅｓｋｉ，Ｋ．Ｌ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １２３，２７５９−２７６７（２０１４）．
３９．Ｓｅｍｐｌｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｉｔａｌｉａｎｏ，Ｊ．Ｅ．＆  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，２６４−２７４（２０１１）．
４０．Ｅｌｚｅｙ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：  Ａ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９，９−１９（２００３）．
４１．Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｖｉａ  ＣＸＣＬ１  ａｎｄ  Ｍｉｎｃｌｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３２，２４５−２４９（２０１６）．
４２．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．＆  Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＰＤ−１／Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，２０７−２１２（２０１２）．
４３．Ｓｉｌｊａｎｄｅｒ，Ｐ．Ｒ．Ｍ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ−ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２７，Ｓ３０−Ｓ３３（２０１１）．
４４．Ｌｉ，Ｊ．，Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｃ．Ｃ．，Ｗｕｎ，Ｂ．，Ｌｉｅｓｖｅｌｄ，Ｊ．Ｌ．＆  Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｒ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｔｏ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２２８，３８−４７（２０１６）．
４５．Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．＆  Ｍｅｎｄｏｌｉｃｃｈｉｏ，Ｇ．Ｌ．Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１００，１６７３−１６８５（２００７）．
４６．Ｍａｕｓｅ，Ｓ．Ｆ．，ｖｏｎ  Ｈｕｎｄｅｌｓｈａｕｓｅｎ，Ｐ．，Ｚｅｒｎｅｃｋｅ，Ａ．，Ｋｏｅｎｅｎ，Ｒ．Ｒ．＆  Ｗｅｂｅｒ，Ｃ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ−Ａ  ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＡＮＴＥＳ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２５，１５１２−１５１８（２００５）．
４７．Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｓ．＆  Ｇｕｌｅｒｉａ，Ｉ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＰＤ１／ＰＤＬ１  ｐａｔｈｗａｙ，ａｎｄ  ＴＨ１７  ａｎｄ  ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｅｔｕｓ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｊ．３８，２５−３１（２０１５）．
４８．Ｈｅａｄｌｅｙ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｐｉｏｎｅｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３１，５１３−５１７（２０１６）．
４９．Ｆｌａｕｍｅｎｈａｆｔ，Ｒ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．３６，１８２−１８７（２００６）．
５０．Ｒａｎｄ，Ｍ．Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｂａｎｇ，Ｋ．Ｗ．，Ｐａｃｋｈａｍ，Ｍ．Ａ．＆  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒａｐｉｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔｓ．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ４，１６２１−１６２３（２００６）．
５１．Ｌｕ，Ｙ．，Ａｉｍｅｔｔｉ，Ａ．Ａ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．＆  Ｇｕ，Ｚ．Ｂｉｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １，１６０７５（２０１６）．
５２．Ｃａｚｅｎａｖｅ，Ｊ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｓｈｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｒｏｄｅｎｔ  ｂｌｏｏｄ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  １：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓａｙｓ，１３−２８（２００４）．
５３．Ｊａｎｏｗｓｋａ−Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅｉｒ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ９８，６４５ａ−６４５ａ（２００１）．
５４．Ｃｈｅｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｆ．＆  Ｓｔａｓｋｏ，Ｊ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５１，２８−４１（２０１４）．
５５．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｍ．，Ｈｕ，Ｘ．＆  Ｌｉｕ，Ｋ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ＣＴＬ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ：  ＪｏＶＥ（２０１０）．
５６．Ｗａｎｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｄａｔａｓｅｔ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｔ−Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｉｇｓｈａｒｅ  ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．６０８４／ｍ９．ｆｉｇｓｈａｒｅ．４２３１７６６（２０１６）．
【０１６０】
別途定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示された発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用した刊行物、及びそれらが引用されている資料は、参照により明確に組み込まれる。
【０１６１】
当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に対して多数の変更及び修正を行うことができ、本発明の趣旨から逸脱することなく、そのような変更及び修正を行うことができることを理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲内に含まれるような全てのそのような同等の均等物を網羅することが意図される。
【図１−１】
2019530673.tif 000003
【図１−２】
2019530673.tif 000004
【図２−１】
2019530673.tif 000005
【図２−２】
2019530673.tif 000006
【図２−３】
2019530673.tif 000007
【図２−４】
2019530673.tif 000008
【図２−５】
2019530673.tif 000009
【図３−１】
2019530673.tif 000010
【図３−２】
2019530673.tif 000011
【図３−３】
2019530673.tif 000012
【図３−４】
2019530673.tif 000013
【図３−５】
2019530673.tif 000014
【図４−１】
2019530673.tif 000015
【図４−２】
2019530673.tif 000016
【図４−３】
2019530673.tif 000017
【図４−４】
2019530673.tif 000018
【図５−１】
2019530673.tif 000019
【図５−２】
2019530673.tif 000020
【図５−３】
2019530673.tif 000021
【図６】
2019530673.tif 000022
【図７】
2019530673.tif 000023
【図８−１】
2019530673.tif 000024
【図８−２】
2019530673.tif 000025
【図９】
2019530673.tif 000026
【図１０】
2019530673.tif 000027
【図１１】
2019530673.tif 000028
【図１２】
2019530673.tif 000029
【図１３】
2019530673.tif 000030
【図１４】
2019530673.tif 000031
【図１５】
2019530673.tif 000032
【図１６Ａ】
2019530673.tif 000033
【図１６Ｂ】
2019530673.tif 000034
【図１６Ｃ】
2019530673.tif 000035
【図１６Ｄ】
2019530673.tif 000036
【図１７】
2019530673.tif 000037
【図１８】
2019530673.tif 000038
【図１９−１】
2019530673.tif 000039
【図１９−２】
2019530673.tif 000040
【図２０】
2019530673.tif 000041
【国際調査報告】
2019530673.tif 000042
2019530673.tif 000043
2019530673.tif 000044