【手続補正書】
【提出日】平成19年4月6日(2007.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化ヒト肝細胞を使用してタンパク質を生成する方法であって、
（ａ）タンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含む不死化ヒト肝細胞を用意するステップ、
（ｂ）前記タンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子が、前記タンパク質が前記不死化肝細胞中で生成されプロセシングされるように発現されるような条件下で、前記不死化肝細胞を培養するステップ、及び
（ｃ）前記不死化肝細胞から前記プロセシングされたタンパク質を単離するステップ
を含み、必要な場合プロセシングされグリコシル化されるように前記タンパク質を発現させ、そのｉｎ  ｖｉｖｏ機能がその単離後実質的に保たれる方法。
【請求項２】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成される血漿タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されないタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって通常生成されるタンパク質のムテインである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用タンパク質が治療用血漿タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、α−１−抗トリプシン、増殖因子、第ＶＩＩＩ因子のムテイン、第ＩＸ因子のムテイン、ヒト成長ホルモンのムテイン、α−１−抗トリプシンのムテイン、及び増殖因子のムテインからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質がＩαＩｐタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質、並びにアルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のムテインである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
肝細胞中に本来存在する遺伝子によってタンパク質を発現させ、前記タンパク質をコードする本来存在する遺伝子の発現が高レベルのプロモーターを前記肝細胞中に導入することによって増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（１）発現させるタンパク質、発現させるタンパク質のサブユニット、又は発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子、及び（２）前記遺伝子の転写に影響を与える少なくとも１つの制御要素であって、前記遺伝子と動作可能に連結した制御要素を含む１つ又は複数の組換えベクターを使用することによって、前記発現させるタンパク質、前記発現させるタンパク質のサブユニット、又は前記発現させるタンパク質の前駆体をコードする遺伝子の多数のコピーを導入することによって発現を増強させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えベクターがＳＶ４０由来ベクター、ネズミポリオーマ由来ベクター、ＢＫウイルス由来ベクター、エプスタインバーウイルス由来ベクター、アデノウイルス由来ベクター、アデノ関連ウイルス由来ベクター、バキュロウイルス由来ベクター、ヘルペスウイルス由来ベクター、レンチウイルス由来ベクター、レトロウイルス由来ベクター、アルファウイルス由来ベクター、及びワクシニアウイルス由来ベクターからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターが１つ又は複数のレポーター遺伝子を取り込む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現したタンパク質が細胞から周囲の培養培地に分泌される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質がグリコシル化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が翻訳後にプロセシングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が切断可能なタグと融合した形で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記切断可能なタグがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＭａｌＥマルトース結合タンパク質、及びポリヒスチジン配列からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が少なくとも２つの異なるサブユニットを含み、前記不死化肝細胞を少なくとも２つのベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトし、それぞれのベクターが
（１）前記タンパク質の少なくとも１つのサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ；及び
（２）前記タンパク質のサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子をコードする前記ＤＮＡと動作可能に連結した少なくとも１つの制御要素
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記不死化ヒト肝細胞をウイルスにより不死化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
実質的に純粋なシミアンウイルス（ＳＶ４０）のＤＮＡを用いた形質転換又はトランスフェクションによって前記肝細胞を不死化させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記実質的に純粋なＳＶ４０のＤＮＡがラージＴ抗原及びスモールｔ抗原（Ｔａｇ）をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記不死化ヒト肝細胞が低温保存した初代ヒト肝細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記肝細胞が、腫瘍抑制遺伝子をコードする実質的に純粋なＤＮＡを前記肝細胞から単離し精製することができるようにＤＮＡをコードする腫瘍抑制遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記肝細胞が、Ｒｂ又はｐ５３をコードする実質的に純粋なＤＮＡを前記肝細胞から単離し精製することができるようにＲｂ又はｐ５３をコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記肝細胞が非腫瘍形成性であり、無血清培地中に保たれる能力を有し、血漿タンパク質を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記肝細胞がＦａ２Ｎ−４細胞系の肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記肝細胞がＥａ１Ｃ−３５細胞系の肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト肝細胞以外の真核細胞を使用してＩαＩｐタンパク質を生成する方法であって、
（ａ）ＩαＩｐタンパク質複合体を形成するタンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含むヒト肝細胞以外の真核細胞を用意するステップであって、（１）ＩαＩｐタンパク質の一部であるタンパク質前駆体の少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ；及び（２）少なくとも１つの前駆体遺伝子をコードする前記ＤＮＡと動作可能に連結して前記前駆体遺伝子の発現を増強させる、少なくとも１つの制御要素を含む少なくとも１つのベクターを用いて、前記真核細胞が形質転換又はトランスフェクトされているステップ；
（ｂ）ＩαＩｐタンパク質を形成するタンパク質をコードする遺伝子が、ＩαＩｐタンパク質が生成されるように発現されるような条件下で、前記形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞を培養するステップ；及び
（ｃ）前記形質転換又はトランスフェクトされた真核細胞から前記発現されたＩαＩｐタンパク質を単離するステップ
を含む方法。
【請求項３０】
前記真核細胞がＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及び酵母菌細胞からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
２つのベクター：
（１）遺伝子Ｈ３及びＡＭＢＰを含む第一のベクター；及び
（２）遺伝子Ｈ２及びＨ１を含む第二のベクター
を用いて、前記真核細胞を形質転換又はトランスフェクトする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
タンパク質をコードし発現することができるＤＮＡを含む不死化ヒト肝細胞であって、
（１）タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ；及び
（２）前記タンパク質をコードするＤＮＡと動作可能に連結して前記タンパク質の発現を増強させる少なくとも１つの制御要素
を含む少なくとも１つのベクターを用いて、形質転換又はトランスフェクトされており、必要な場合プロセシングされグリコシル化されるように前記細胞によって前記タンパク質を発現させ、したがってそのｉｎ  ｖｉｖｏ機能が前記タンパク質の単離後実質的に保たれている、上記不死化ヒト肝細胞。
【請求項３３】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されるタンパク質である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって自然に生成されないタンパク質である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３５】
前記タンパク質がヒト肝細胞によって通常生成されるタンパク質のムテインである、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３７】
前記治療用タンパク質が治療用血漿タンパク質である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記タンパク質が第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、α−１−抗トリプシン、増殖因子、第ＶＩＩＩ因子のムテイン、第ＩＸ因子のムテイン、ヒト成長ホルモンのムテイン、α−１−抗トリプシンのムテイン、及び増殖因子のムテインからなる群から選択される治療用血漿タンパク質である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記血漿タンパク質がＩαＩｐタンパク質である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項４０】
前記タンパク質がアルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質、並びにアルブミン、トランスコバラミンＩＩ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブロネクチン、セルロプラスミン、及び構造活性、酵素活性、又は輸送活性を有する他のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のムテインである、請求項３２に記載の細胞。
【請求項４１】
活性タンパク質の投与によって治療可能な疾患又は状態を治療するための薬剤を調製するための、請求項１に記載の方法に従って生成される活性タンパク質の使用。
【請求項４２】
前記疾患又は状態が肝臓に影響を与える疾患又は状態である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記肝臓に影響を与える疾患又は状態が敗血症、癌、肝炎、及び肝不全からなる群から選択される、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記疾患又は状態が肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４５】
前記疾患又は状態が癌、関節炎症、及び関節炎からなる群から選択される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
疾患又は状態を治療するための医薬組成物であって、
（ａ）疾患又は状態を治療するのに治療上有効な量の真核細胞によって生成されたＩαＩｐタンパク質；及び
（ｂ）薬剤として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項４７】
前記疾患又は状態が肝臓に影響を与える疾患又は状態である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記肝臓に影響を与える疾患又は状態が敗血症、癌、肝炎、及び肝不全からなる群から選択される、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記疾患又は状態が肝臓以外の臓器に影響を与える疾患又は状態である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記疾患又は状態が癌、関節炎症、及び関節炎からなる群から選択される、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記活性タンパク質が活性のある血漿タンパク質である、請求項４１に記載の使用。
【請求項５２】
前記活性のある血漿タンパク質が第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、α−１−抗トリプシン、及び増殖因子からなる群から選択される、請求項５１に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
本発明の方法において有用な不死化ヒト肝細胞は、低温保存した初代ヒト肝細胞に由来することが好ましい。本発明の方法において有用な不死化ヒト肝細胞は、実質的に純粋なＳＶ４０のＤＮＡを導入することによって不死化させることが好ましい。実質的に純粋なＳＶ４０のＤＮＡは、野生型ＳＶ４０のラージＴ抗原及びスモールｔ抗原（ＴＡｇ）を含むことが好ましい。典型的には肝細胞は、そこから腫瘍抑制遺伝子をコードする実質的に純粋なＤＮＡを単離することができるＤＮＡを含む。ＤＮＡによってコードされる腫瘍抑制遺伝子は、ヒトＲｂであることが好ましい。好ましくは肝細胞は、そこからヒトｐ５３をコードする実質的に純粋なＤＮＡを単離することができるＤＮＡも含む。