【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  塩基−スタッキングエネルギーおよび電子的にアドレス可能なマイクロチップを用いる、注目する標的核酸中の単一の核酸多型を決定する方法であって、
ａ．線形増幅用の少なくとも１つの増幅プライマーまたは指数関数的増幅用の少なくとも１対の増幅プライマーのいずれかを用いて、増幅反応に付されるか、あるいは付されない注目する標的核酸を供して、該標的の増幅産物を形成し；
ｂ．該標的核酸または該増幅産物の少なくとも１つの核酸鎖に相補的である第一組の「安定化剤」オリゴヌクレオチドの存在下にて、該標的核酸または該増幅産物を該マイクロチップ上の少なくとも１つの捕捉部位に電子的にアドレス指定し、該安定化剤オリゴヌクレオチドと該安定化剤オリゴヌクレオチドが相補的である標的または増幅産物鎖とがハイブリダイズした複合体をさらに形成し；
ｃ．該ハイブリダイズされた複合体を該捕捉部位に捕捉し；
ｄ．該安定化剤が相補的である該標的核酸または増幅産物の同一鎖に相補的である第二組の「レポーター」オリゴヌクレオチドを該複合体にハイブリダイズして、三次構造を形成し、該レポーターオリゴヌクレオチドが、該安定化剤および該レポーターオリゴヌクレオチドが相互に隣接する位置にて該標的核酸または増幅産物にアニーリングするように、該複合体にさらにハイブリダイズし；
ｅ．該レポーターと該標的核酸または増幅産物との間の少なくとも１つの塩基対ミスマッチがあるならば、該三次構造は該レポーターを該三次構造から分離させるのに十分な不安定化条件に付し；次いで
ｆ．該捕捉部位からの該レポーターの喪失または保持を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２】  該増幅反応が、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ローリングサークル、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６よりなる群から選択される増幅方法を用いて行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】  干渉オリゴヌクレオチドが、請求項１の工程（ｂ）に含まれる請求項１記載の方法であって、該干渉オリゴヌクレオチドが、該安定化剤オリゴヌクレオチドが相補的である同一鎖ではない標的核酸または増幅産物鎖に相補的な配列を有することを特徴とする該方法。
【請求項４】  該増幅反応において用いた少なくとも１つのプライマーがビオチン化されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】  ビオチン化プライマーから誘導されたアンプリコン鎖が、請求項１の工程（ｃ）における該捕捉部位にそのビオチン化部位によって固定されるようになることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】  該安定化剤オリゴヌクレオチドがビオチン化されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】  該ビオチン化安定化剤オリゴヌクレオチドが、そのビオチン部位によって工程中の該捕捉部位に固定されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】  該レポーター・オリゴヌクレオチドが、フルオレセイン誘導体、ボジピー（bodipy）誘導体、ローダミン誘導体およびＣｙ色素よりなる群から選択される標識を用いて標識されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】  該不安定化条件が、電気的バイアスを行う、温度調節する、イオン強度調節を行う、およびｐＨを調節することよりなる群から選択される方法によって生じることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】  該レポーター・オリゴヌクレオチドが、それらの３'、５'または３'および５'の双方の末端塩基として、該標的核酸において判明した野生型塩基または突然変異塩基のいずれかに相補的な核酸塩基を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】  該複合体を形成する複数の該標的核酸または増幅産物が単一捕捉部位に電子的にバイアスがかけられることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】  塩基−スタッキングエネルギーおよび電子的にアドレス可能なマイクロチップを用いる、注目する標的核酸中の単一の核酸多型を決定する方法であって、
ａ．各該領域につき線形増幅用の少なくとも１つの増幅プライマーまたは指数関数的増幅用の少なくとも１対の増幅プライマーを用いて、増幅反応に付されるか、あるいは付されない注目する標的核酸の２つの間隔を空けた別々の領域からの核酸を供して、該領域の増幅産物を形成し、該領域が、さらに、（ｉ）単一核酸多型を含むことに影響を受けやすいおよび／または（ｉｉ）標的特異的な核酸情報を含むことに影響を受けやすい該標的中の配列に３'または５'に位置した標的核酸配列を含み；
ｂ．該標的核酸またはその増幅産物の該領域に相補的である核酸配列を含有する第一組の「安定化剤」オリゴヌクレオチドの存在下にて、標的核酸またはその該増幅産物の該領域を該マイクロチップ上の少なくとも１つの捕捉部位に電子的にアドレス指定し、該安定化剤オリゴヌクレオチドが、該標的核酸またはその増幅産物の該空間を空けた別々の各領域の少なくとも１つの末端部分にわたる核酸配列をさらに含み、該空間を空けた別々の領域間に位置した標的の領域に沿って該標的に相補的な核酸配列をさらに含み、該標的核酸またはその該増幅産物および安定化剤オリゴヌクレオチドが三成分のハイブリダイズした複合体をさらに形成し；
ｃ．該三成分のハイブリダイズされた複合体を該捕捉部位に捕捉し；
ｄ．２つの間隔を空けた別々の領域に相補的である安定化剤の一部分間にある該安定化剤のセクションに沿って安定化剤オリゴヌクレオチドの一部分または全部に相補的である少なくとも１つの第二組の「レポーター」オリゴヌクレオチドを該三元複合体にハイブリダイズして、少なくとも四次構造を形成し、該レポーターオリゴヌクレオチドが、該間隔を空けた別々の領域間に隣接しその中にある位置にて、該安定化剤にアニーリングし；
ｅ．該レポーターと安定化剤オリゴヌクレオチドとの間の少なくとも１つの塩基対ミスマッチがあるならば、該四次構造はいずれかの該レポーターを該四次構造から分離させるのに十分な不安定化条件に付し；次いで
ｆ．該捕捉部位からの該レポーターの喪失または保持を検出することを特徴とする該方法。
【請求項１３】  該増幅反応が、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ローリングサークル、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６よりなる群から選択される増幅方法を用いて行われることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】  干渉オリゴヌクレオチドが、請求項１２の工程（ｂ）に含まれる請求項１２記載の方法であって、該干渉オリゴヌクレオチドが、該安定化剤オリゴヌクレオチドが相補的である同一鎖ではない標的核酸または増幅産物鎖に相補的な配列を有することを特徴とする該方法。
【請求項１５】  該増幅反応において用いた少なくとも１つのプライマーがビオチン化されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】  ビオチン化プライマーから誘導されたアンプリコン鎖が、請求項１２の工程（ｃ）における該捕捉部位にそのビオチン化部位によって固定されるようになることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】  該安定化剤オリゴヌクレオチドがビオチン化されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】  該ビオチン化安定化剤オリゴヌクレオチドが、そのビオチン部位によって該捕捉部位に固定されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】  該レポーター・オリゴヌクレオチドが、フルオレセイン誘導体、ボジピー誘導体、ローダミン誘導体およびＣｙ色素よりなる群から選択される標識を用いて標識されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項２０】  該不安定化条件が、電気的バイアスを行う、温度調節する、イオン強度調節を行う、およびｐＨを調節することよりなる群から選択される方法によって生じることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項２１】  該レポーター・オリゴヌクレオチドが、それらの３'、５'または３'および５'の双方の末端塩基として、該標的核酸において判明した野生型塩基、該標的核酸において判明した突然変異塩基または該安定化剤オリゴヌクレオチド中の塩基のいずれかに相補的な核酸塩基を有することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項２２】  該複合体を形成する複数の該標的核酸またはその増幅産物が単一捕捉部位に電子的にバイアスをかけられることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項２３】  塩基−スタッキングエネルギーおよび電子的にアドレス可能なマイクロチップを用いる、注目する標的核酸中の単一の核酸多型を決定する方法であって、
ａ．各遺伝子座につき線形増幅用の少なくとも１つのプライマーまたは指数関数的増幅用の少なくとも１対の増幅プライマーを用いて、増幅反応に付されるか、あるいは付されない注目する標的核酸の少なくとも２つの遺伝子座からの核酸配列を供して、該遺伝子座の増幅産物を形成し、該遺伝子座が、（ｉ）単一核酸多型を含むことに影響を受けやすいおよび／または（ｉｉ）標的特異的な核酸情報を含むことに影響を受けやすい該標的中の配列に対して３'または５'に位置した標的核酸配列をさらに含み；
ｂ．該標的遺伝子座またはその増幅産物に相補的である核酸配列を含有する第一組の「安定化剤」オリゴヌクレオチドの存在下にて、該標的遺伝子座またはその増幅産物を該マイクロチップ上の少なくとも１つの捕捉部位に電子的にアドレス指定し、該安定化剤オリゴヌクレオチドが、該標的遺伝子座またはその増幅産物の５以上の５'または３'末端領域塩基に相補的である核酸配列をさらに含み、該安定化剤が、少なくとも１つの第二組のレポーターオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列をさらに含み、該標的遺伝子座またはその増幅産物および該安定化剤オリゴヌクレオチドが三成分のハイブリダイズした複合体をさらに形成し；
ｃ．該三成分のハイブリダイズした複合体を該捕捉部位に捕捉し；
ｄ．少なくとも１つの該組の「レポーター」オリゴヌクレオチドを該三元複合体にハイブリダイズして、少なくとも四次構造を形成し、該レポーターオリゴヌクレオチドが、該標的遺伝子座またはその増幅産物の各々からの配列および該レポーターオリゴヌクレオチドが、相互に隣接する該安定化剤上の位置にて該安定化剤オリゴヌクレオチドにアニーリングするように該三元の複合体にさらにハイブリダイズし、該レポーターオリゴヌクレオチドが、該標的遺伝子座または増幅産物配列間の該安定化剤オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし；
ｅ．該レポーターと該安定化剤との間または該安定化剤と該標的遺伝子座または増幅産物との間に少なくとも１つの塩基対ミスマッチがあるならば、該四次構造はいずれかの該レポーターを該四次構造から分離させるのに十分な不安定化条件に付し；次いで
ｆ．該捕捉部位からの該レポーターの喪失または保持を検出することを特徴とする該方法。
【請求項２４】  該増幅反応が、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ローリングサークル、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６よりなる群から選択される増幅方法を用いて行われることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】  干渉オリゴヌクレオチドが、請求項２３の工程（ｂ）に含まれる請求項２３記載の方法であって、該干渉オリゴヌクレオチドが、該安定化剤オリゴヌクレオチドが相補的である同一鎖ではない標的遺伝子座または増幅産物核酸鎖に相補的な配列を有することを特徴とする該方法。
【請求項２６】  該増幅反応において用いた少なくとも１つのプライマーがビオチン化されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２７】  ビオチン化プライマーから誘導されたアンプリコン鎖が、請求項２３の工程（ｃ）における該捕捉部位にそのビオチン化部位によって固定されるようになることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】  該安定化剤オリゴヌクレオチドがビオチン化されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２９】  該ビオチン化安定化剤オリゴヌクレオチドが、そのビオチン部位によって該捕捉部位に固定されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】  該レポーター・オリゴヌクレオチドが、フルオレセイン誘導体、ボジピー誘導体、ローダミン誘導体およびＣｙ色素よりなる群から選択される標識を用いて標識されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３１】  該不安定化条件が、電気的バイアスを行う、温度調節する、イオン強度調節を行う、およびｐＨを調節することよりなる群から選択される方法によって生じることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３２】  該レポーター・オリゴヌクレオチドが、それらの３'、５'または３'および５'の双方の末端塩基として、該標的遺伝子座において判明した野生型塩基、該標的遺伝子座において判明した突然変異塩基または該安定化剤オリゴヌクレオチドのいずれかに相補的な核酸塩基を有することを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３３】  該複合体を形成する複数の該標的核酸またはその増幅産物が単一捕捉部位に電子的にバイアスをかけられることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３４】  塩基−スタッキングエネルギーおよび電子的にアドレス可能なマイクロチップを用いる、注目する標的核酸中の単一核酸多型の多重分析をする方法であって、
ａ．注目する標的核酸を含有する複数の試料を供し；
ｂ．該試料を増幅反応に付して、該試料中の該標的核酸の増幅産物を生成し；
ｃ．該増幅産物に相補的な配列を有する安定化剤プローブの存在下にて、該増幅産物を特異的な捕捉部位に電子的にアドレス指定し、該増幅産物と該安定化剤との間のハイブリダイゼーション複合体を形成し；
ｄ．該複合体を捕捉部位に固定させ；
ｅ．該増幅産物または安定化剤プローブのいずれかにアニーリングし、さらに、各々、該安定化剤プローブに隣接してまたは該増幅産物に隣接してアニーリングするレポータープローブのハイブリダイゼーションの安定化を検出することによって該複数の試料の核酸中のＳＮＰの存在を同時または順次に検出することを特徴とする該方法。
【請求項３５】  塩基−スタッキングエネルギーおよび電子的にアドレス可能なマイクロチップを用いる、注目する標的核酸中の単一の核酸多型を決定する方法であって、
ａ．線形増幅用の少なくとも１つの増幅プライマーまたは指数関数的増幅用の少なくとも１対の増幅プライマーのいずれかを用いて、増幅反応に付されるか、あるいは付されない注目する標的核酸を供して、該標的の増幅産物を形成し；
ｂ．該標的核酸または該増幅産物の少なくとも１つの核酸鎖に相補的である第一組の「安定化剤」オリゴヌクレオチドの存在下にて、該標的核酸または該増幅産物を該マイクロチップ上の少なくとも１つの捕捉部位にアドレス指定し、該安定化剤オリゴヌクレオチドと該安定化剤オリゴヌクレオチドが相補的である標的または増幅産物鎖とがハイブリダイズした複合体をさらに形成し；
ｃ．該ハイブリダイズされた複合体を該捕捉部位に捕捉し；
ｄ．該安定化剤が相補的である該標的核酸または増幅産物の同一鎖に相補的である第二組の「レポーター」オリゴヌクレオチドを該複合体にハイブリダイズして、三次構造を形成し、該レポーターオリゴヌクレオチドが、該安定化剤および該レポーターオリゴヌクレオチドが相互に隣接する位置にて該標的核酸または増幅産物にアニーリングするように、該複合体にさらにハイブリダイズし；
ｅ．該レポーターと該標的核酸または増幅産物との間の少なくとも１つの塩基対ミスマッチがあるならば、該三次構造は該レポーターを該三次構造から分離させるのに十分な不安定化条件に付し；次いで
ｆ．該捕捉部位からの該レポーターの喪失または保持を検出することを特徴とする該方法。