(57)【要約】  時間分解蛍光イムノアッセイ検出のためのシステム（１００）が開示される。このシステム（１００）は、内部に試料（９９）を受け入れるように適合された試料容積を備える容器（１１０）と、パルス励起光（２００）を放出するように適合された光源（１２０）と、光源（１２０）からパルス励起光（２００）を集光し、該パルス励起光（２００）を容器（１１０）内の試料容積に送出するように適合された照明光学系（１３０）と、少なくとも検出スペクトル範囲内の蛍光放射をゲート検出するように適合された検出デバイス（１４０）と、少なくとも検出スペクトル範囲内で蛍光放射（２１０）を容器（１１０）から集光し、検出デバイス（１４０）に該蛍光放射（２１０）を送出するように適合された検出光学系（１５０）と、励起光（２００）と検出光（２１０）とを分離するように構成された光学フィルタ装置（１６０）と、を含む。光源（１２０）は、３５５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有する発光ダイオードである。このシステム（１００）は、検出サイクルのタイミングを少なくとも制御するように構成された制御ユニット（１０１）を更に含む。検出サイクルは、発光ダイオード（１２０）によって放出された励起パルスと、これに続く、検出デバイス（１４０）による蛍光放射（２１０）の検出のための検出期間とを含み、検出期間は、検出遅延によって励起パルスから分離されている。励起パルスのパルス持続時間は少なくとも１０μｓである。更なる態様によれば、時間分解蛍光イムノアッセイ検出のための方法が提供される。
2019528450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
時間分解蛍光イムノアッセイ検出のために適合されたシステムであって、前記システムは、
−内部に試料を受け入れるように適合された試料容積を備える容器（１１０）と、
−パルス励起光を放射するように適合された光源（１２０）と、
−前記光源から前記パルス励起光を集光し、前記パルス励起光を前記容器内の前記試料容積に送出するように適合された照明光学系（１３０）と、
−少なくとも検出スペクトル範囲内の蛍光放射をゲート検出するように適合された検出デバイス（１４０）と、
−少なくとも前記検出スペクトル範囲内で蛍光放射を前記容器から集光し、前記検出デバイスに前記蛍光放射を送出するように適合された検出光学系（１５０）と、
−励起光と検出光とを分離するように構成された光学フィルタ装置（１６０）と、を有する、システムにおいて、
−前記光源（１１０）は、３５５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有する発光ダイオードであり、
−前記システムは、検出サイクルのタイミングを少なくとも制御するように構成された制御ユニット（１０１）を更に備え、
前記検出サイクルは、前記発光ダイオードによって放出された励起パルスと、それに続く前記検出デバイスによる蛍光放射の検出のための検出期間とを含み、
前記検出期間は、検出遅延によって前記励起パルスから分離されており、
−前記励起パルスのパルス持続時間は少なくとも１０μｓである、ことを特徴とする、システム。
【請求項２】
前記励起パルスの前記パルス持続時間は、少なくとも５０μｓである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記励起パルスの前記パルス持続時間は、最大５００μｓである、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
前記検出遅延は、２００μｓ〜６００μｓ、又は好ましくは３００μｓ〜５００μｓである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
前記検出期間は、１００μｓ〜５００μｓである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記発光ダイオードは、３５０ｎｍ未満、好ましくは３４５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
前記発光ダイオードは、少なくとも３２０ｎｍ、又は少なくとも３３０ｎｍの波長でピーク強度放射を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８】
前記容器（１１０）は、マイクロプレート上のウェルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
前記照明光学系（１３０）は、前記発光ダイオード（１２０）の画像を前記試料容積の画像面（１１１）上に投影する結像光学系である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記画像面（１１１）は、前記容器／ウェル（１１０）の底部面と一致する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
時間分解蛍光イムノアッセイ検出のための方法であって、前記方法は、
−ランタニドキレート系蛍光体により試料（９９）を免疫染色する工程と、
−前記試料を励起パルス（１０１０）により照明する工程と、
−前記励起パルスの終了後に検出遅延（１０２０）を待機する工程と、
−検出期間（１０３０）の間に励起光パルスに応答して、前記試料から放出された蛍光放射を検出する工程と、を含む、方法において、
−前記励起パルスは、３５５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有する発光ダイオード（１２０）から提供され、
−前記励起パルスは、少なくとも１０μｓのパルス持続時間を有する、ことを特徴とする、方法。
【請求項１２】
前記励起パルスは、少なくとも５０μｓのパルス持続時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出遅延は、２００μｓ〜６００μｓ、又は好ましくは３００μｓ〜５００μｓである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出期間は、１００μｓ〜５００μｓである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光体は、ユーロピウム系キレートである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料を照明する工程は、免疫染色された試料（９９）を乾燥状態で試料面に提供する工程と、照明光学系（１３０）によって、前記発光ダイオードの画像（１１１）を前記試料面に生成する工程と、を含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記発光ダイオードは、３５０ｎｍ未満、好ましくは３４５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有する、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記発光ダイオードは、少なくとも３２０ｎｍ、又は少なくとも３３０ｎｍの波長でピーク強度放射を有する、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１つの態様において、時間分解蛍光イムノアッセイ検出のために適合されたシステムに関する。このシステムは、内部に試料を受け入れるように適合された試料容積を備える容器と、パルス励起光を放射するように適合された光源と、光源からパルス励起光を集光し、該パルス励起光を容器内の試料容積に送出するように適合された照明光学系と、少なくとも検出スペクトル範囲内の蛍光放射をゲート検出するように適合された検出デバイスと、容器から少なくとも検出スペクトル範囲内で蛍光放射を集光し、該蛍光放射を検出デバイスに送出するように適合された検出光学系と、
励起光と検出光とを分離するように構成された光学フィルタ装置と、を有する。
【０００２】
更なる態様によれば、本発明は、時間分解蛍光イムノアッセイ検出方法に関する。この方法は、ランタニドキレート系蛍光体により試料を免疫染色する工程と、試料を励起パルスにより照明する工程と、励起パルスの終了後に検出遅延を待機する工程と、
検出期間の間に励起光パルスに応答して、試料から放出された蛍光放射を検出する工程と、を含む。
【背景技術】
【０００３】
蛍光イムノアッセイは、診断分析において極めて有用で信頼性の高いツールである。単なる例として、トロポニンなどの心臓マーカの濃度を検出し、信頼性をもって測定することは、急性心臓疾患を同定するのに極めて有用である。したがって、このような測定を、高度に特化された精巧な実験室環境で利用できるようにするだけでなく、試料採取から短い所要時間で、診療現場において有用な測定結果を提供する技術が所望される。このような診療現場での装置は、典型的には、誤った測定結果を提供せず、容易に動作可能で信頼性の高いデバイスを必要とする。更に、このような分析のための装置は、専用の実験室に存在するのか、又は診療現場に存在するのかにかかわらず、試料採取、取り扱い、および調製のための標準化された、または少なくとも一般的に使用される実験器具と互換性があることが好ましい。試料採取、試料取り扱い、及び試料調製用の実験器具のための業界標準又は少なくともデファクトスタンダードとの互換性は、装置自体においてもまた重要である。これは、自動化装置内で蛍光イムノアッセイに基づいた測定値を統合するのに適するようにするためである。このことは、自動化機器が複数のパラメータを測定するように適合されている場合にはなおさらである。
【０００４】
蛍光イムノアッセイは、例えば生物学的試料において関連する（非常に低い）濃度で所定のターゲット物質の存在を検出するのに必要な感度に関して非常に魅力的である。時間分解蛍光は、免疫分析の検出に使用すれば、短寿命のバックグランド蛍光を抑制し、高感度を可能にする強力なツールである。これは、長い蛍光寿命を有する高蛍光蛍光体と、これら蛍光体の蛍光寿命よりも著しく短い励起パルスを放射する光源とを用いることによる。短い励起パルスを基準にして数マイクロ秒だけ遅延された時間ゲート蛍光検出は、定常的な測定と比較して信号対雑音比（ＳＮＲ）の改善を示す。これは、ナノ秒の範囲にある典型的な蛍光寿命のバックグランドを低減するからである。長い蛍光寿命を有する多くの蛍光体は、ランタニド系に属する。ユーロピウムはランタノイドイオンであり、そのストークスシフトが大きく、蛍光寿命がマイクロ秒（μｓ）〜ミリ秒（ｍｓ）の期間と長いため、時間分解蛍光法の装置においてマーカとして使用されている。時間分解検出技術のためのランタニド系蛍光体の励起は、パルスＵＶ光源を必要とする。例えば、ユーロピウムはＵＶ−Ａ領域で励起され、６１６ｎｍの発光ピークで蛍光を放射する。
【０００５】
しかしながら、上述のように、蛍光イムノアッセイは、有用な診断ツールを提供するために、関連する濃度で所定のターゲット物質の存在を検出するのに必要な感度に関して非常に魅力的である。結果として、検出すべき光信号のスペクトル範囲内で、ノイズとバックグランド放射の両方が競合するレベルにおいて極めて低い光信号の検出が要求され、ターゲット蛍光体の効率的な励起も必要である。したがって、キセノンフラッシュランプが、時間分解蛍光イムノアッセイ検出のための励起源として一般的に使用される。ナノ秒期間におけるそれらの短いパルスの放射が強力だからであり、更に、例えば、光学的バンドパスフィルタを使用して所定の蛍光体に合わせて調整することができる比較的広い帯域発光から得られるそれらのスペクトルが汎用的だからである。しかし、フラッシュランプを使用する場合の主な問題点は、パルス後の数百マイクロ秒に及ぶ長い残光の長い立下りであり、これはバックグランド放射の一因となり、ＳＮＲを低減する。代替的な励起光源として窒素レーザーが使用されてきたが、それらは嵩張り、高価であり、低い反復周波数で動作する。最近では、ＵＶ  ＬＥＤが、蛍光マーカの時間分解励起のための光源として登場した。しかしながら、このようなＵＶ  ＬＥＤは低電力の評価に悩まされ、比較的濃度の高い蛍光体マーカが存在する用途においてのみ成功しており、したがって、例えば、蛍光体の蛍光寿命の顕微鏡画像又は直接的測定に関連して、豊富な信号が利用可能である用途においてのみ成功している。
【０００６】
このため、自動化された分析装置における実現と互換性があるように時間分解蛍光イムノアッセイ検出を改善する必要がある。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、上述の欠点の少なくとも一部を克服する、時間分解蛍光イムノアッセイ検出のための改善された又は少なくとも代替のシステム及び方法を提供することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明の一実施例は、例えば、時間分解蛍光イムノアッセイ検出のためのシステム及び方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、時間分解蛍光イムノアッセイ検出に適合されたシステムに関する。このシステムは、
−内部に試料を受け入れるように適合された試料容積を備える容器と、
−パルス励起光を放射するように適合された光源と、
−光源からパルス励起光を集光し、該パルス励起光を容器内の試料容積に送出するように適合された照明光学系と、
−少なくとも検出スペクトル範囲内の蛍光放射をゲート検出するように適合された検出デバイスと、
−少なくとも検出スペクトル範囲内の蛍光放射を容器から集光し、検出デバイスに該蛍光放射を送出するように適合された検出光学系と、
−励起光と検出光とを分離するように構成された光学フィルタ装置と、を有し、
−光源は、３５５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有する発光ダイオードであり、
−システムは、検出サイクルのタイミングを少なくとも制御するように構成された制御ユニットを更に備え、
検出サイクルは、発光ダイオードによって放出された励起パルスと、これに続く検出デバイスによる蛍光放射の検出のための検出期間とを含み、
検出期間は、検出遅延によって励起パルスから分離されており、
−励起パルスのパルス持続時間は少なくとも５０μｓである。
【００１０】
これまで、本発明者らが知る限りでは、ＵＶ  ＬＥＤをパルス励起源として使用した時間分解蛍光イムノアッセイ検出の成功実現例は報告されていない。これは、ＵＶ放射帯域用の発光ダイオードが、例えばフラッシュランプと比較して周知のように低いピーク出力を有するからである。このような低い出力は、十分な総パルスエネルギー、すなわちフラッシュランプによって提供されるものと少なくとも同等の総パルスエネルギーを達成するために、非常に長いパルスを必要とする。一方、非常に長い励起パルスは励起効率に強く影響を与える。本発明の驚くべき洞察は、励起パルスエネルギーの合計と励起効率とのこのような均衡を、そのようなＬＥＤによって放射される非常に低いピーク出力にもかかわらず、３５５ｎｍ未満のピーク強度放射波長を有するＬＥＤを使用して、実際に打撃できることである。更なるステップで驚くことには、蛍光体の蛍光寿命と同等のミリ秒期間のパルス持続時間が、時間分解蛍光イムノアッセイ検出システムにおいて信頼性のある励起を達成できることが発見された。そして、時間分解蛍光イムノアッセイ検出システムに基づくフラッシュランプと比較して、信号対雑音比の改善さえも達成することができる。更に驚くべきことに、ランタニド系蛍光体、特にユーロピウム系（Ｅｕ−ＩＩＩ）蛍光体を使用すれば、３５５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有するＬＥＤを、少なくとも１０μｓ、好ましくは少なくとも５０μｓのパルス持続時間、好ましくは５００μｓ未満のパルス持続時間で用いることにより、時間分解蛍光イムノアッセイ検出システムは、非常に良好な結果が達成されることが発見された。これは、このような波長期間のＵＶ  ＬＥＤは、前に述べたように低出力であることが周知であるため、特に驚くものである。パルス持続時間の下限は、十分な総パルスエネルギーを達成することを考慮することによって規定されるが、パルス持続時間の上限は、十分な励起効率を達成することを考慮することによって規定される。更に好ましくは、３５５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有するＵＶ  ＬＥＤのパルス持続時間を１００μｓ〜４００μｓの間で選択することにより、総パルスエネルギーと励起効率の均衡が更に最適化される。
【００１１】
最も好ましくは、ＬＥＤ励起パルスのそれぞれは、容器に送出される最小パルスエネルギーを有し、この最小パルスエネルギーは、少なくとも２μＪ、少なくとも５μＪ、又は更には少なくとも１０μＪである。試料に適時に送出されるこのような最小パルスエネルギーは、蛍光イムノアッセイ検出の非常に低い信号レベルに対して有用な信号対雑音比を達成するための十分な励起を達成するための必要条件である。
【００１２】
上述したように、いくつかの実施形態による時間分解蛍光イムノアッセイ検出システムは、容器、光源、照明光学系、検出デバイス、検出光学系、光学フィルタ装置、及び制御ユニットを含む。容器は、免疫染色された試料を受け入れるためのものであり、免疫染色はランタニド系キレートを蛍光体として使用して行われる。好ましくは、蛍光体はユーロピウム系である。動作中、光源は、パルス励起光を発生し、この励起光は照明光学系によって集光され、内容積または空洞内の試料容積あるいは容器の底部に調製され配置された染色試料に送出される。励起光パルスによるパルス励起に応答して、免疫染色された試料中の蛍光マーカ分子は、励起波長（ストークスシフト）よりも波長の長い特徴的なスペクトル放出特性を有する蛍光放射を放出し、励起光と蛍光放射とをスペクトル的に区別することができる。したがって励起光および蛍光放射は、光学フィルタ装置、例えばダイクロイックフィルタセットを使用して互いに分離される。検出光学系は、容器内の試料により放出された少なくとも検出スペクトル範囲内の蛍光放射を集光し、該蛍光放射を、検出スペクトル範囲内の蛍光放射を検出するように適合された検出デバイスに送出する。
【００１３】
パルス励起した後、蛍光放射の放出は、特徴的寿命時間により減衰する。多くのバックグランド放射の特徴的寿命時間は、ランタニド系キレート蛍光体、特に、ユーロピウム系キレート蛍光体からの放射よりもはるかに速い速度で減衰する。これによりバックグランド蛍光と免疫染色された試料から由来する所望の信号蛍光放射とを、ゲート検出によって適時に分離することができる。したがって、検出のタイミングは、検出サイクルに従って制御ユニットにより管理される。制御ユニットは、励起フェーズと、これに続く検出期間を含む検出サイクルのタイミングを制御するように構成されている。この検出期間は、励起フェーズから検出遅延だけ離れている。励起フェーズは、励起光源、ここではＬＥＤが励起光を放射し始める時（すなわち、励起フェーズの立ち上がり縁）に開始し、制御ユニットによって制御されるパルス持続時間後に終了する。検出遅延は、励振フェーズの終了時に開始し、蛍光放射のゲート検出の開始時に終了する。蛍光放射のゲート検出の開始は、測定窓の開始をマークする。この測定窓は、ゲート検出の終了によって決定される検出期間の満了後に閉じる。このようにして測定は、予め決められた反復周波数で典型的に提供される励起パルスのパルス列から周期的に取得される。検出後遅延は、検出期間の終了（すなわち、測定窓の閉鎖）と新たな後続の励起パルスの開始との間の時間間隔を特定することができる。したがって検出サイクル全体の長さは、後続の検知サイクルにおける対応のポイント間の時間的距離によって定義される。例えば、第１の励起パルスの立ち上がりエッジから第２の後続のパルスの立ち上がりエッジまでに経過する時間である。典型的には、励起パルスは、パルス持続時間、検出遅延、検出期間、及び検出後遅延の和によって決定される所定の周波数で周期的に送出される。
【００１４】
有利には、検出サイクルは、数ミリ秒のオーダであり、例えば、少なくとも１ｍｓ、好ましくは少なくとも２ｍｓ、又は少なくとも３ｍｓ、又は少なくとも４ｍｓ、又は少なくとも６ｍｓ、又は更には少なくとも８ｍｓである。したがって励起パルスは、１０Ｈｚ〜１ｋＨｚの間、または５０Ｈｚ〜５００Ｈｚの間、または１００Ｈｚと４００Ｈｚの間の範囲の所定の周波数で発射してもよい。所与の検出遅延及び検出期間に対して、検出サイクルがより長いことは、より長い検出後遅延を意味する。より長い検出後遅延は、後続の励起パルスが発射される前に長寿命のバックグランド蛍光が十分に減衰することができるという利点を有し、これにより信号対雑音比を更に向上させる。適切なタイミングを達成するために、制御ユニットは、励起パルスに関連して、検出サイクルのために選択された遅延に従ってゲート検出をトリガ／同期する。
【００１５】
検出サイクルの長さに対する上限、ひいては検出後遅延の長さに対する上限は、所定の時間内に可及的に多くの信頼できる測定が蓄積されものであることが望ましいことを述べておく。すなわち、所定の時間内で可及的に多くの可能な検出サイクルを実行できるものであることが望ましい。このような所定の時間は、例えば、信頼できる結果がシステムによって提供される前に指定された総測定時間によって決定することができる。
【００１６】
蛍光イムノアッセイ検出を伴う測定の大多数は、信号対雑音比により決定された検出感度限界で実行されるが、例えば特定の病理学的状態の患者からの試料においては生物学的マーカの濃度が非常に高いため、非常に高い信号レベルが稀に発生することがある。検出感度限界に近接する極端に小さな蛍光放射信号を収集することができるようにするため、検出装置は非常に高い感度に合わせて用意されるので、マーカのそのような高濃度は検出装置を飽和させる信号レベルにつながり、又は少なくとも検出出力の非線形挙動につながる場合がある。フラッシュランプベースの励起システムをＬＥＤベースの励起システムと置き換える本システムは、これにより励起パルスエネルギーの調整を容易に行うことができるので、ここでは特に有利である。結果として、試料中の蛍光マーカの濃度が特に上昇している稀な場合、検出デバイスを線形状態に維持するために、ＬＥＤ励起パルスのパルスエネルギーを容易に低減することができる。したがってＬＥＤベースの励起を使用するシステムは、信号レベルのダイナミックレンジの向上を達成し、この信号レベルは、フラッシュランプベースのシステムと比較して所与のシステムにより取り扱うことができる。
【００１７】
有利には、システムは、データプロセッサを更に含むことができる。このデータプロセッサは、検出ユニットによって検出された蛍光放射を表す、検出ユニットから受信された出力信号を収集し、処理するように適合されている。
【００１８】
有利には、いくつかの実施形態によれば、発光ダイオードのピーク放射強度は３２０ｎｍ〜３５５ｎｍの間、更に有利には３３０ｎｍ〜３５０ｎｍの間である。更に有利には、いくつかの実施形態によれば、発光ダイオードは、半値全幅（ＦＷＨＭ）が１０ｎｍ〜２０ｎｍであるスペクトル放射を有する。これによりランタニド系キレート蛍光体、特にユーロピウム系キレート蛍光体との良好なスペクトルの重なり合いが実現される。
【００１９】
更に、システムの一実施形態によれば、励起パルスのパルス持続時間は、最大５００μｓである。更に、システムの一実施形態によれば、励起パルスのパルス持続時間は、最大４００μｓである。更に有利には、いくつかの実施形態によれば、励起パルスのパルス持続時間は、少なくとも１００μｓであり、最大で３００μｓである。このパルス持続時間の選択により、上記ランタニニドキレート系蛍光体の蛍光寿命と励起パルス持続時間とを両立させて励起効率を最適化し、驚くほど良好な信号対雑音比が達成される。上記のように、最も好ましくは、ＬＥＤ励起パルスのそれぞれは、容器に送出される最小パルスエネルギーを有し、この最小パルスエネルギーは、少なくとも３μＪ、少なくとも５μＪ、又は更には少なくとも１０μＪである。試料に適時に送出されるこのような最小パルスエネルギーは、蛍光イムノアッセイ検出の非常に低い信号レベルに対して有用な信号対雑音比を達成するための十分な励起を達成するための必要条件である。
【００２０】
更に、システムの一実施形態によれば、検出遅延は、２００μｓ〜６００μｓ、又は好ましくは３００μｓ〜５００μｓである。検出遅延をこのように選択することにより、特に検出期間の長さに対する上方及び下方の特定された範囲との組み合わせで驚くほど良好なＳＮＲが達成される。これらの範囲から選択される検出遅延は、免疫染色蛍光体の寿命に応じた減衰を考慮して短寿命のバックグランド蛍光と、長寿命のバックグランド蛍光との間のＳＮＲを最適化する。したがって遅延は、適切な信号レベルを維持するために、短寿命のバックグランドは減衰するが、それでも蛍光体の寿命が許容する範囲を超えないように十分に長く選択される。
【００２１】
更に、システムの一実施形態によれば、検出期間は１００μｓ〜５００μｓである。検出期間の長さをこのように選択することにより信号を蓄積することができるが、この検出期間は、ＳＮＲに影響を与える長寿命のバックグランド蛍光からの関与を回避するために過度に長くてはならない。これは、長寿命のバックグランド蛍光と比較したランタニド系蛍光体の信号減衰のためである。
【００２２】
更に、システムの一実施形態によれば、容器はウェルである。ウェルは、マイクロプレートから知られるウェルのタイプと同様である。
【００２３】
有利には、受器は、いわゆるマイクロプレート内のウェルである。更に有利には、マイクロプレートは、規格ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ  １−２００４からＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ  ４−２００４を次のように満たす。ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ  １−２００４：マイクロプレート−フットプリント寸法；ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ  ２−２００４：マイクロプレート−高さ寸法；ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ  ３−２００４：マイクロプレート−底部外側フランジ寸法；及び／またはＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ  ４−２００４：マイクロプレート−ウェル位置。更に有利には、マイクロプレートは、規格ＡＮＳＩ／ＳＬＡＳ  ６−２０１２：マイクロプレート−ウェル底部高さを満たす。
【００２４】
本明細書で使用される用語「マイクロプレート」とは、小試験管として用いられる複数の「ウェル」を備える平板を指す。蛍光イムノアッセイ検出のための容器としてマイクロプレートウェルを使用することの利点は、マイクロプレート（「マイクロタイタープレート」、「マイクロウェルプレート」、又は「マルチウェルプレート」としても知られる）は、分析研究及び臨床診断試験、例えば、試料採取、取り扱い、及び調製に広く使用されているツールであることである。したがってマイクロプレートのウェルを容器として使用するように構成された蛍光イムノアッセイ検出システムは、実験室用機器の共通の自動化デザインと両立するので、これにより自動化された分析装置での組み込み／実現が促進される。
【００２５】
しかしながら、マイクロプレートウェルに対する蛍光イムノアッセイのこのような適応は、例えば、規格又は類似の適合性制約によって規定されるウェル自体の幾何学的形状によって光学的アクセスが制限されるという事実により、光学的構成に更なる課題を持ち込む。更に、例えば、容器にアクセスする装置の他の構成要素の空間的要件により、更なる課題が生じ得る。
【００２６】
更に、システムの一実施形態によれば、照明光学系は、試料容積内の画像面上に発光ダイオードの画像を投影する結像光学系である。したがって、照明光学系は、照明源の像を試料と重なる画像面に投影するように構成されている。これにより、上記の課題を光学的構成に合わせることができ、既存の分析装置、特に自動分析装置と蛍光イムノアッセイ検出システムとの統合及び／又は互換性を促進することができる。
【００２７】
更に、本システムの一実施形態によれば、画像面は、容器／ウェルの底面と一致する。この構成は、容器／ウェルの底部に位置する乾燥した蛍光免疫染色試料に関連して特に有用である。乾燥した蛍光免疫染色試料は、例えば、液体試料に発生し得る蛍光体に対する非蛍光減衰経路を回避するために調製され、これにより蛍光体の量子効率を高めることができる。
【００２８】
有利には、システムの一実施形態によれば、励起結像光学系は、５０ｍｍ超の画像側焦点距離、及び０．４未満の画像側開口数、あるいは択一的に６０ｍｍ超の画像側焦点距離、及び０．３未満の画像側開口数を有する。これにより、励起光学系と所与の試料面との間の最小間隔が機械的に制約されても、試料容積における試料の遠隔励起を可能にする光学的設計が達成される。
【００２９】
更に有利には、照明光学系は、発光ダイオードから容器に、すなわち試料に送出される総エネルギーを最大にするために、所定の画像側開口数の機械的制約の下で、集光効率に対して倍率を均衡させることによって最適化される。これらの考察及び発光ダイオードは平面ランバート放射体として記述できるという想定に基づいて、市販の光線追跡ソフトウエアを最適化の実行のために使用することができる。
【００３０】
本発明の第２の態様は、時間分解蛍光イムノアッセイ検出方法に関する。この方法は、
−ランタニドキレート系蛍光体により試料を免疫染色する工程と、
−試料を励起パルスにより照明する工程と、
−励起パルスの終了後に検出遅延を待機する工程と、
−検出期間の間に励起光パルスに応答して、試料から放出された蛍光放射を検出する工程とを備え、
励起パルスは、３５５ｎｍ未満の波長でピーク強度放射を有する発光ダイオードから提供され、励起パルスは少なくとも５０μｓのパルス持続時間を有する。
【００３１】
更に、本方法の一実施形態によれば、蛍光体は、ユーロピウム系キレートである。ユーロピウム系キレート蛍光体の寿命は、励起パルス、検出遅延、検出期間、検出後遅延および／または検出サイクルに対して上に特定された所定範囲による時間分解蛍光イムノアッセイ検出に特に良く適合されている。更に、ユーロピウム系キレート蛍光体は、ＵＶ−Ａ帯域での励起、特に３２０ｎｍ〜最大３５５ｎｍまでのＵＶ−Ａ帯域の範囲で満足のいく蛍光応答を提供する。
【００３２】
更に本方法の一実施形態によれば、試料を照明する工程は、免疫染色された試料を乾燥状態で試料面に提供する工程と、照明光学系によって、試料面に発光ダイオードの画像を生成する工程と、を含む。
【００３３】
有利には、いくつかの実施形態によれば、励起パルスは、少なくとも１００μｓ、及び／又は最大４００μｓ、又は更には最大５００μｓの持続時間を有する。
【００３４】
有利には、いくつかの実施形態によれば、発光ダイオードは、少なくとも３５０ｎｍ、又は少なくとも３４５ｎｍの波長でピーク強度放射を有する。
【００３５】
有利には、いくつかの実施形態によれば、発光ダイオードは、少なくとも３２０ｎｍ、又は少なくとも３３０ｎｍの波長でピーク強度放射を有する。
【００３６】
有利には、一実施形態によれば、蛍光放射を検出する工程は、検出光学系によって、励起光パルスに応答して試料から放出された蛍光放射を集光する工程と、集光した蛍光放射を検出装置に送出する工程とを含む。
【００３７】
時間分解蛍光イムノアッセイ検出のための方法の上記の実施形態により、時間分解蛍光イムノアッセイ検出のためのシステムに関して上述した実施形態によって達成されるのと同じ又は類似の利点が達成される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明の好ましい実施形態を、概略的に示された添付図面に関連してより詳細に説明する。
【図１】本発明の一実施形態による、時間分解蛍光イムノアッセイ検出のためのシステムを示す図である。
【図２】図１の実施形態による照明光学系を示す図である。
【図３（ａ）】照明光学系の画像面に形成された励起光源の画像を示す図である。
【図３（ｂ）】ｘ方向及びｙ方向に沿った対応する断面正規化強度分布を示す図であり、シミュレートされたＬＥＤ（図３）、実験的ＬＥＤ（図４）、及び実験的キセノン閃光ランプアーク（図５）である。
【図４（ａ）】照明光学系の画像面に形成された励起光源の画像を示す図である。
【図４（ｂ）】ｘ方向及びｙ方向に沿った対応する断面正規化強度分布を示す図であり、シミュレートされたＬＥＤ（図３）、実験的ＬＥＤ（図４）、及び実験的キセノン閃光ランプアーク（図５）である。
【図５（ａ）】照明光学系の画像面に形成された励起光源の画像を示す図である。
【図５（ｂ）】ｘ方向及びｙ方向に沿った対応する断面正規化強度分布を示す図であり、シミュレートされたＬＥＤ（図３）、実験的ＬＥＤ（図４）、及び実験的キセノン閃光ランプアーク（図５）である。
【図６】ユーロピウム系キレート蛍光体（キレート）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、及びバンドパスフィルタリングされたフラッシュランプ（ＤＵＧ１１）のスペクトル特性の線図である。
【図７】ＬＥＤ電流の関数として、図６のＬＥＤによって放出されたパルスエネルギーの線図である。
【図８】フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）からのトリガパルス、ＦＰＧＡによって制御されるパルス発生器（ＰＧ）からのトリガパルス、ＬＥＤ回路（Ｉ）に生じる電流、及びＬＥＤ出力電力パルス（Ｏ）を表す信号を上から下に、時間の関数として示す複合線図である。
【図９】キセノンフラッシュランプの出力を時間に依存して示す線図である。
【図１０】２つの異なる励起パルスに関して、励起された蛍光体分子の数について算出された曲線を備える検出サイクルの線図である。
【図１１】２つの異なる励起パルスに関して、励起パルスの終了直後に励起された蛍光体分子の算出された数の線図である。
【図１２】バックグランドカウントへの異なる寄与度の反復測定の線図である。
【図１３】３つの異なる励起モードに関して、バックグランドカウントへの４つの異なる寄与を分解した線図である。
【図１４】目標濃度が既知の溶液から誘導された試料を含む１５回の反復試験と、ブランク容器の１５回の反復試験に対する蛍光応答を示す線図である。
【図１５】励起パルスエネルギー（ＬＥＤ電流）の関数としての信号対雑音比の線図である。
【図１６】ブランク容器及び空容器からの、ＬＥＤ電流の関数としてのバックグランドカウントの線図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下では、３４０ｎｍにピーク放射を有する発光ダイオードを使用した時間分解蛍光イムノアッセイ検出のためのシステム１００の一実施形態について詳細に論じる。このシステム１００は、光学系と容器１１０との間の最小距離に対して機械的制約を有する自動化機械において標準マイクロプレート容器１１０と共に使用するのに適している。以下では、用語「容器」１１０及び「試験カップ」、又は単に「カップ」という用語は、互換的に使用される。更に、本発明の一実施形態に係る３４０ｎｍ発光ダイオードによる励起に基づくシステムと、キセノンフラッシュランプを用いたシステムとを比較する比較研究のデータが提示される。キセノンフラッシュランプは、従来技術で一般的に使用される形式のものである。励起光学系は、ランベルト放射特性を備える１×１ｍｍ２正方形の放出面のＬＥＤチップにより放出される光の８０％までを集光するように設計されている。容器（カップ）内に形成されたＬＥＤ画像は、５×５ｍｍ２の大きさであり、これは比較に使用されるキセノンフラッシュランプの画像よりも３倍大きい。ＬＥＤは、２００μｓのパルス幅により３７０ｍＡで作動され、これらの動作パラメータにおいて、ＬＥＤはキセノンフラッシュランプと同じエネルギーを送出する。ユーロピウム系キレートのＬＥＤ励起の時間的、スペクトル的及び空間的特性が調査され、以下に考察する。
【００４０】
図１および図２を参照して、時間分解蛍光イムノアッセイ検出のためのシステム１００の光学系を説明する。光学系は、反射型蛍光システムであり、照明光学系１３０によって提供される励起光路及び検出光学系１５０によって提供される検出光路を有する２つのサブシステムを含み、二色性ビームスプリッタ１６０が、励起光路と検出光路とを分離する。
【００４１】
照明光学系１３０の第１のサブシステムでは、発光ダイオード１２０（ＬＥＤ）からの光を集光する。この発光ダイオードは、焦点距離８ｍｍと０．６３の開口数（ＮＡ）を備える非球面レンズ１３１により面積１×１ｍｍ２のランバート放射体と見なされる。焦点距離６０ｍｍの次の２つの平凸レンズ１３２、１３３及び焦点距離６７ｍｍの両凸レンズ１３４が、画像を６５ｍ遠方に形成する。照明光学系１３０のすべてのレンズ１３１、１３２、１３３、１３４は、ＵＶグレードの溶融シリカから作製され、ＵＶ領域で高い透過率を保証し、レンズ材料の自家蛍光を最小化する。照明光学系サブシステム１３０の倍率は５であり、物体及び画像側の開口数によって制限される。画像が試験カップ１１０の底部に形成され、試験カップはポリスチレンから作製され、ＵＶ吸収である。カップ底部は直径６．７ｍｍであり、カップ１１０の周壁は１０．６ｍｍの高さであり、したがって、中心点に対する画像側開口数（ＮＡ）を０．３の値又は１７．５度に制限する。照明光学系サブシステム１３０は、最大集光効率が８０％に達するように設計されている。システム倍率を低減するために、第１のレンズ１３１は、より大きな焦点距離、したがってより小さい物体側のＮＡを有する必要があるか、又は最後のレンズ１３４は、より短い焦点距離を有する必要があり、したがってより大きい画像側のＮＡを有する必要がある。第１の選択肢は、集光効率を低下させる。試験カップの許容角度が小さいこと、及びビームスプリッター１６０と試験カップ１１０との間の最小距離の機械的要件は、第２の選択肢を実行不可能にする。したがって、倍率および集光効率との間にトレードオフがある。励起光２００が、照明光学系１３０によって容器１１０内に位置する蛍光染色された試料９９に送出されると、これは、励起に応答して蛍光体からの蛍光放射２１０の放出を引き起こす。二色性ビームスプリッタ１６０は、励起光路２００と検出光路２１０とを分離する。放出された蛍光光２１０は、１：１の倍率の配置された２つの非球面ＰＭＭＡレンズ１５１、１５２によって集光され、光電子増倍管１４０（ＰＭＴ）のフォトカソードに集束される。８×２４ｍｍ２のフォトカソード有効面積を備えるＰＭＴが光子計数モードにおいて使用される。励起サブシステム及び検出サブシステム１３０、１５０内にそれぞれ配置された２つのバンドパスフィルタ１６１、１６２は、放出された蛍光光２１０のみが検出器１４０に到達することを確実にする。基準フォトダイオード９８は励起光２００の強度をモニタするために使用される。
【００４２】
図３〜５を参照すると、照明光学系の画像面内に形成された励起光源の画像が特徴付けられている。図３ａは、１×１ｍｍ２の寸法を有する平坦な正方形ＬＥＤのシミュレートされた画像を示す。光源（ＬＥＤ）の画像は、市販の光線追跡ソフトウェアを使用して得られた。画像は、面積５×５ｍｍ２内にパワーの９０％が取り囲まれた正方形の形状である。図４ａは、１×１ｍｍ２の寸法を有する平坦な正方形のＬＥＤの実験的画像を示す。この実験的画像は、容器の底部に生成され、カメラを用いて得られた。ＬＥＤの実験的画像は、５×５ｍｍ２の寸法を有する正方形であり、カメラのダイナミックレンジが制限されているため、低強度減衰エッジが見えない。図５ａは、キセノンフラッシュランプアークの実験的画像を容器の底部に示す。この画像は、同じカメラを用いて得られた。図３ｂ、４ｂ、及び５ｂは、それぞれ、図３ａ、４ａ、および５ａの画像から取り込まれた画像面におけるｘ方向およびｙ方向に沿った対応する断面正規化強度分布を示す。フラッシュランプアークの画像は２×４ｍｍ２であり、したがって、カップ底部面積の７１％を覆う４重対称ＬＥＤ画像の１／３である照明面積を覆う。照明光学系の画像面は、容器の試料容積内に配置されている。平面試料の場合、画像面は、好ましくは、平面試料が位置する容器内の試料面と一致するように、例えば、容器１１０の底部にある乾燥試料に対して配置されている。
【００４３】
図６〜１１を参照すると、免疫染色された試料におけるランタニド系蛍光体の励起が詳細に記述される。時間分解蛍光分光法に基づく検出システムでは、試料は励起パルスの形態の励起光により照射される。励起パルスの光は試料中の蛍光体分子によって吸収され、これにより複数の蛍光体分子が励起状態にもたらされる。この励起状態から蛍光体分子は、蛍光放射を放出することによって、蛍光体の特性により決定される寿命で緩和することができる。放出された蛍光放射は、照明励起光からスペクトル的に分離され、集光され、検出器に送出され、そこで測定される。ランタニド系キレートは、数百マイクロ秒（μｓ）〜数ミリ秒（ｍｓ）まで範囲の典型的な寿命を有する。
【００４４】
励起システムのスペクトル特性を図６に示す。「キレート」と標識された曲線は、ランタニド系キレート蛍光体の励起スペクトル６１０の例を提供する。本明細書に示される特定の蛍光体は、トロポニン−Ｉ心臓マーカのためのＲａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ｔｕｒｋｕ社、Ｆｉｎｌａｎｄのユーロピウム系キレート「ａ−Ｇａｌ  ＴＥＫＥＳ」であり、以下、「ＴｎＩキレート」とも呼ぶ。ＴｎＩキレートの励起スペクトル６１０は、３２５ｎｍにピークを有し、６４ｎｍの半値全幅（ＦＷＨＭ）を備える。励起スペクトル６１０は、その最大値に正規化されている。異なるキレートは、ピーク波長が変化する僅かに異なる励起スペクトルを有することがあることに注意されたい。したがって、アッセイの性能は、ＬＥＤなどの狭帯域光源を使用する場合に変化する。「ＬＥＤ」と標識された曲線は、発光ダイオードの放射スペクトル６２０の例を提供する。放射スペクトル６２０も、その最大値に正規化されている。ＬＥＤ放射スペクトル６２０は、１０ｎｍのＦＷＨＭで３４３ｎｍを中心とする。パルスモードでＬＥＤ電流を１００ｍＡ〜１Ａに増大しても、ピーク波長の視覚的シフトは観察されなかった。ここで使用される特定のＬＥＤ放射スペクトル６２０の分析は、正規化されたＬＥＤ放射照度が対数スケールで、３７２ｎｍと４０４ｎｍにおいてはピーク放射の１％と０．１％にそれぞれ低下することを示す。「ＵＧ１１  １ｍｍ」と標識された曲線は、キセノンフラッシュランプベースの照明システムとの組み合わせで共通に使用されるバンドパス光学フィルタの透過スペクトル特性、特に、Ｓｃｈｏｔｔ社の１ｍｍ厚のＤＵＧ１１フィルタの透過スペクトルを提供する（Ｓｃｈｏｔｔ社オンラインライブラリ）（実際には、我々は厚さ２ｍｍのフィルタを使用するが、これはおそらくは重要ではなく、これについて何かを行うには遅すぎる）。Ｓｃｈｏｔｔ社のＤＵＧ１１フィルタは、フラッシュランプスペクトルの１１０ｎｍ窓をフィルタリング除去する。したがって、「ＵＧ１１  １ｍｍ」と標識された曲線は、広帯域キセノンフラッシュランプベースの照明システムの放射スペクトル６３０を示す。ＬＥＤ放射スペクトル６２０は、パルスエネルギーが一定であると仮定すれば、フラッシュランプ照明スペクトル６３０よりもキレート励起スペクトル６１０と１９％大きく重なっている。
【００４５】
図７は、容器に送出することのできるパルスエネルギーを示す線図である。７２０（ＬＥＤ）と標識されたデータセットは、励起パルスエネルギーをＬＥＤ電流の関数として示す。このＬＥＤ電流は、パルス持続時間が２００μｓ、デューティ比が０．０５の励起パルスを使用する場合に、ＬＥＤにより容器に送出される。キセノンフラッシュランプベースの照明システムは、実線７３０よって示されるように、パルス毎に５μＪを試料に送出する。３７０ｍＡの電流において、ＬＥＤから送出される励起パルスエネルギーは、キセノンフラッシュランプベースのく照明システムと同等である。オーバードライブすることによりＬＥＤは、１．５Ａの電流で最大１５μＪを送出することができる。これは、データシートに指定された５００ｍＡの最大注入電流の３倍である。
【００４６】
図８と図９は、ＬＥＤ及びキセノンフラッシュランプによりそれぞれ発生されたパルスの時間特性を示す。図８は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）からのトリガパルス８１０、ＦＰＧＡによって制御されるパルス発生器（ＰＧ）からのトリガパルス８２０、ＬＥＤ回路（Ｉ）に生じるＬＥＤ電流パルス８３０、ＬＥＤ出力パルス８４０（Ｏ）を表す信号を時間の関数として（上から下に）示す複合線図である。ＬＥＤ出力は、例えば図１に示すようにフォトダイオード９８を用いてセットアップにおいて監視することができる。ＬＥＤ出力８４０は、ＬＥＤ電流８３０によって決定される。ＬＥＤ出力パルス８４０は、立ち上がりエッジ８４１、出力が実質的に一定のプラトー領域８４２、及び立ち下がりエッジ８４３を有する箱形の形状である。第１の立ち上がりエッジ８４１と最後の立ち下がりエッジ８４３との間の持続時間は、パルス持続時間と呼ばれる。ＬＥＤは、検出計数システムに同期したＬＥＤドライバによって制御される。Ｔｈｏｒｌａｂｓ社から市販のドライバを使用した。ＦＰＧＡは、励起及び検出システムの両方をトリガパルストレインにより制御する。トリガパルストレインは、パルス発生器（ＰＧ）を通してＬＥＤドライバに至り、ＬＥＤがスイッチオンされる。ＬＥＤパルスの持続時間は２００μｓであり、これは、フラッシュランプのパルス持続時間２００ｎｓよりも３桁長い大きさである。図９および下記参照。ＬＥＤパルスの持続時間は蛍光体寿命より短くなければならず、同時に十分な数の蛍光体分子を励起状態にもたらし、検出可能な光信号を発生させるために、十分な励起エネルギーを送出する。ここで使用されるドライバ回路は、最小パルス幅が約５μｓである。しかしながら、必要ならば、特殊なドライバ回路を用いて、より短いパルス持続時間を達成することができる。トリガパルス８１０とＬＥＤ電流８３０との間に８μｓの遅延が観測された。ＬＥＤパルスの立ち下がり時間は、３μｓ未満である。図９は、キセノンフラッシュランプの照明システムの出力を時間に依存して示す線図である。フラッシュランプは、２００ｎｓのパルス持続時間及び４００ｎｓの降下時間（９０％〜１０％）を有する。
【００４７】
図１０と図１１を参照して、励起された蛍光体分子の数に対するパルス持続時間および蛍光寿命の作用を論議する。上述のように、励起のタイミングと検出サイクルに対して有用な範囲を特定するためには、特にＬＥＤ励起パルスのパルス持続時間に対する有用な範囲を決定するためには、この関係の関連性を理解することが重要である。上述したように、非常に長いＬＥＤパルス持続時間は、キレートの励起効率に影響を与える。ＬＥＤパルス持続時間は、ランタニド系キレート蛍光体の蛍光寿命と同等であり、これは数百マイクロ秒の範囲にある。一方、フラッシュランプパルスは数百ナノ秒の範囲である。第１のケースにおいて、以下に詳細に述べるように、励起分子の数は小さい。励起分子Ｎの数は、以下のレート式に従う。
【００４８】
【数１】
2019528450.tif 000003
式中、Ｐ（ｔ）は励起パルスのピーク出力；ｋは、蛍光体の速度定数（蛍光寿命τに反比例する）である。励起パルスがスイッチオフされた場合の分子数Ｎ０は、
【００４９】
【数２】
2019528450.tif 000004
である。
【００５０】
励起分子の減衰は以下の通りである。
【００５１】
【数３】
2019528450.tif 000005
【００５２】
励起パルスが長くなると、パルスエネルギーが等しくても励起分子の数が少なくなる。図１０は、２００ｎｓ及び２００μｓの励起パルス（それぞれ曲線１１００と１０００）によって照射されたときの励起分子の数Ｎを時間に依存して示す。Ｎは、パルス中に励起ピーク出力に比例する係数により指数関数的に上昇し、パルスがスイッチオフされると、寿命τ、ここでは１ｍｓで指数関数的に減衰を開始する。この曲線は、励起パルス及び蛍光減衰の畳み込みによっても得ることができる。この場合におけるパルス持続時間の３桁の大きさの差は、励起分子の数、したがって蛍光信号の１０％の減少に相当する。パルス持続時間と、励起パルスの終了時の励起分子の数Ｎ０の減少との関係を図１１に示す。０．５ｍｓと１ｍｓの２つの異なる蛍光寿命値についての曲線が示されている。図１１では、パルス持続時間は、総パルスエネルギーを一定に維持するという制約下で変化する。励起パルスが長くなると、励起パルスの終了時における励起分子の数が小さくなる。
【００５３】
ゲート信号を検出装置に送信し、検出期間中に計数システムを起動することにより、検出遅延１０２０後に測定窓１０３０が開かれる。典型的には、フラッシュランプベースの照明システムを使用する場合、短寿命のバックグランド蛍光の十分な減衰を達成するために、４００μｓの検出遅延が用いられる。したがって、ＬＥＤ励起を使用する比較測定もまた、４００μｓの検出遅延で実施される。４００μｓの検出遅延が、励起パルス１０１０と、測定窓１０３０をマーキングする検出期間との間にある。驚くべきことに、本発明者らは、ＬＥＤベースの照明を使用する場合、４００μｓを基準にして検出遅延を短縮できることを発見した。これは、ＬＥＤにより励起する場合、バックグランドカウントが「許容できる」レベルまで、より急速に減衰すると思われるからである。検出遅延が短いため、測定窓を開いたときに、ランタニド系トレーサ蛍光体からの蛍光信号がさほど減衰しておらず、したがってＬＥＤ励起により得られる信号対雑音比が更に向上する。例えば、検出遅延は、３００μｓまで短縮してもよい。
【００５４】
以下、特に図１２〜１６を参照すると、濃度２００ｎｇ／Ｌの心臓マーカ、トロポニンＩ（ＴｎＩ）を試料とする蛍光イムノアッセイ検出に対する詳細な例が与えられている。この例は、一方では蛍光イムノアッセイ検出のためのシステムの上記実施形態によるＬＥＤベースの励起と、他方では伝統的なキセノンフラッシュランプベースの励起との比較を含む。システムのバックグランドは、ＰＭＴダークカウント、光学ユニット自体からの自己蛍光、ポリスチレン及び非特異的結合を含む。ゼロ濃度の溶液で処理されたブランクカップで測定されたバックグランドは、ＬＥＤにより励起される場合、低下する。これは、フラッシュランプの減衰エッジがなく、励起パルス持続時間が長く、バックグランドの蛍光寿命が短く、より広帯域のフラッシュランプスペクトル（１００ｎｍ）と比較して狭帯域ＵＶ光（１０ｎｍ）とバックグランド励起スペクトルとのスペクトル整合が悪化するからである。したがって、信号対バックグランド比は１８％だけ改善される。この特定の構成では、同じ露出エネルギー（すなわち同じ総パルスエネルギー）でも、ＬＥＤベースのシステムにより励起された場合、蛍光信号が２６％だけ低減されたことを述べておく。ＬＥＤベースのシステムの３桁長い励起パルスは、信号を１０％だけ減少させる。容器内に蛍光性キレートが空間的に非均一に分布していると、蛍光応答が更に減少される。したがって、システムのＳＮＲは、１５％だけ低下した。一般的に、ＳＮＲは、励起光のエネルギーを増大することにより改善することができる。励起エネルギーが一定であれば、ＳＮＲは、照明面積を低減し、より短い励起パルス幅を使用し、可能であれば、キレート励起スペクトルと更に良好にスペクトル整合することにより改善することができる。信号とブランクカップの標準偏差はフラッシュランプと同じ範囲にある。以下の実施例で更に詳述するように、本発明は、時間分解蛍光イムノアッセイ検出においてフラッシュランプ励起の代わりにＬＥＤベースの励起を使用するための可能な解決策を提供する。
【実施例】
【００５５】
この実施例では、ＬＥＤベースのシステムは、トロポニンＩ（ＴｎＩ）心臓マーカの時間分解蛍光イムノアッセイ測定におけるその能力を試験するために使用される。ＴｎＩイムノアッセイによる実験のために、１５個の試料カップと１５個のブランクカップを作製した。ＴｎＩカップは、ストレプトアビジンによってコーティングされたポリスチレンで作製され、トレーサ抗体の非特異的結合をブロックする。底部における捕捉抗体の層は、トレーサと捕捉抗体との間で試料中の抗原を捕捉するために使用される。ユーロピウム蛍光マーカはトレーサ抗体に結合され、このトレーサ抗体は、側部に近いカップ内に配置される。絶縁層が捕捉およびトレーサ抗体間の接触を防止する。試料カップを、２００ｎｇ／ＬのＴｎＩ濃度を有する１０μＬの参照溶液で処理する。培養中は、３６℃で１５分間加熱し、シェークし、反応時間を短縮する。反応後、カップを洗浄し、非結合トレーサ抗体を洗い流す。標識されたトレーサ抗体は抗原と結合され、その後、ＵＶ光源により励起され、６１６ｎｍにおけるピーク放射により発光する。ブランクカップは、同じ方法で処理されるが、ＴｎＩ濃度ゼロの溶液で処理される。ブランクカップで測定されたカウントは、バックグランドカウントと呼ばれる。現在使用されているキセノンフラッシュランプに基づく光学ユニットを比較のために使用した。このユニットは異なる励起光学系を有するが、検出光路は同じである。スタンドアロンのフラッシュランプユニットを、実験前に既知の標準に調整し、較正した。ＬＥＤベースの光学ユニットのＬＥＤ電流は、フラッシュランプユニットと同じエネルギーをパルス毎に送出するように調整された。したがって各カップは、フラッシュで測定され、ＬＥＤは同じカップホルダー内にあり、回転はしない。
【００５６】
文献で使用されるＳＮＲの定義には相違がある。我々はＳＮＲを、平均バックグランド値について補正された信号として定義し、信号とバックグランド変動の和により除算した。
【００５７】
【数４】
2019528450.tif 000006
式中、
【００５８】
【数５】
2019528450.tif 000007
は、Ｎ個のサンプルカップにわたって平均化された信号であり、
【００５９】
【数６】
2019528450.tif 000008
は、Ｎ個のブランクカップにわたって平均化されたバックグランドであり、σ、及びσＢは、それぞれ信号及びバックグランドの標準偏差である。したがって、信号とバックグランド変動の両方が考慮されている。ＰＭＴのダークカウントは、式中において無視される。次に、我々は、信号対バックグランド比を信号平均対平均バックグランドの関係として定義する
【００６０】
【数７】
2019528450.tif 000009
【００６１】
システムのバックグランドは、ＰＭＴダークカウント（１０／２５℃未満）、光学ユニット自体（材料および汚染物質からの自己蛍光）からのバックグランド、及びカップ（ポリスチレン、ストレプトアビジンコーティング、非特定結合、汚染物質）からのバックグランドを含む。更に、我々は、空カップ（ポリスチレンのみ）からのバックグランドとブランクカップ（濃度ゼロ溶液で処理した）からのバックグランドを区別する。後者は上記のように底部に抗体を有する化学層を含み、全てのトレーサ抗体は理想的に洗浄される。
【００６２】
図１２及び１３は、ＬＥＤベース及びフラッシュランプベースのシステムのバックグランドを比較する。図１２は、ブラックＰＯＭ閉容積固定具で測定した光学ユニット自体からのバックグランド、及び１２５Ｈｚでのフラッシュランプ励起とＬＥＤ励起で測定した空カップからのバックグランドの反復測定データを示す。図１３は、ＬＥＤ  １２５Ｈｚ、２５０Ｈｚ、及びフラッシュランプ励起に対するバックグランドを示し、４つの寄与が区別されている：すなわち、ＰＭＴダークカウント、光学ユニット、空カップ（ポリスチレンのみ）及び濃度ゼロで処理されたカップである。光学ユニット自体のバックグランドは、ブラックポリオキシメチレン（ＰＯＭ）製の特別な遮光固定具で測定した。この固定具は閉じた容積であり、内部にカップを有していない。１２５Ｈｚで動作するＬＥＤベースの光学ユニットに関して、ブラックＰＯＭにより測定されたユニット自体からのバックグランドは、２６±７カウント（ダークカウントを含む）であり、空カップにより測定されたのは５１±４カウントであり、ブランクカップで測定した場合には６２±９カウントである（図１２）。図のポイントは、ブラックＰＯＭと空カップに対して１つの固定具で実施された反復測定である。図１３では、平均値及び標準偏差は、密閉容積のブラックＰＯＭ及び空カップを用いた１０の反復測定値から計算され、ブランクカップについては１５回の反復が行われる。光学ユニットに基づくフラッシュランプは、ユニット自体からは５１±５カウントを示し、空カップを含めると９５±２１カウントであり、処理されたカップにより測定すると１１９±２２を示す。４つの寄与の割合は、２つの光源についてほぼ同じであるが、ＬＥＤユニットのバックグランドは、それぞれ１２５Ｈｚ及び２５０Ｈｚの動作に対して５２％及び３９％だけ低減される。このバックグランドの減少は、フラッシュランプと比較して残光のないＬＥＤによって部分的に説明される。キセノンフラッシュランプは、数百マイクロ秒の残光を示し、バックグランドに加え、ＳＮＲを低下させる。時間ゲート測定に寄与するバックグランドの長寿命部分の強度は、励起パルス幅に依存する。パルス幅が長くなると、望ましくない光を放出する分子の数が減少し、この分子数は、バックグランド寿命が蛍光体寿命よりも短い場合にはより速く低下する。更に、ＬＥＤ放射スペクトルは、フラッシュランプベースのシステムのスペクトルよりも１０倍狭い。バックグランドの励起スペクトルが広帯域である場合、広帯域フラッシュランプ励起とのスペクトル整合がより良好である。
【００６３】
図１４は、ＴｎＩ  ２００ｎｇ／Ｌ濃度による１５回の反復蛍光応答を示し、１５のブランクカップが濃度ゼロの溶液により処理され、フラッシュランプシステム及び同等の励起エネルギーを使用するＬＥＤシステムによって励起された。線図上の各ポイントは、７７７パルスによる１つのカップの１つの測定値を表す。
【００６４】
濃度２００ｎｇ／Ｌの心臓マーカを備える試料カップが、同じ露出エネルギーを備える両方の光学ユニットにより測定された。上述したように、図１４は、３０のカップ（１５の試料カップ及び１５のブランクカップ）に関するデータを提示し、表１は、光源及び統計データのパラメータを示す。試料は、パルスエネルギーがそれぞれ５．１μＪで、２５０Ｈｚ（１２５Ｈｚ）の反復周波数の７７７個のパルスに曝された。これは、１．２７ｍＷ（０．６４ｍＷ）の平均パワーに相当する。ＬＥＤベースの光学ユニットを２つの反復周波数で試験した。試料平均に対して信頼区間により平均カウントが与えられた。この平均カウントは、スチューデントのｔパラメータを
【００６５】
【数８】
2019528450.tif 000010
として、
【００６６】
【数９】
2019528450.tif 000011
を試料平均として、ｓを試料の標準偏差として用い、ｎはサンプルサイズである。パラメータｔは、９５％の信頼水準に対応する２．５％のＰにより計算される。試料の標準偏差ｓは、信頼間隔によって与えられた。この信頼間隔は、Ｘ２分布を用いて計算された。
【００６７】
【数１０】
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式中、αは信頼水準である。９５％のα及び１５の試料に対して、標準偏差信頼区間は［０．７３・ｓ；１．５８・ｓ］であり、をテーブル１に示されている。なお１５カップの試料サイズは、高い統計精度を得るには十分ではないが、これは本調査の目的ではなかったことに注意されたい。９５％の信頼水準で標準偏差［０．９１・ｓ；１．０８・ｓ］に対する信頼区間を達成するためには、約２００回の反復が必要となろう。ＣＶＳとＣＶＢは、それぞれ、２００ｎｇ／Ｌの濃度のカップ及びブランクカップに対する変動係数である。そして、その平均に対する試料の標準偏差の関係として計算された。信号対バックグランド比は１８％だけ改善される。これは、上記のように、ＬＥＤ励起によりバックグランドが低減されるためである。試料カップの蛍光応答は、ＬＥＤユニットにより励起される場合、２６％低くなる。したがって、信号が減少するため、ＳＮＲが低下する。光源における３つの相違は、信号レベルの変化に寄与する、すなわち、励起パルス幅の増大、異なる空間およびスペクトル分布に寄与する。上述のように、パルス幅の増大は、１０％の信号低下に相当する。他のパラメータが一定の場合、スペクトルの重なり合いはＬＥＤ励起により１９％だけ改善される。照明面積が拡大されると、カップ内のキレート分布が不均一な場合、更なる信号低下を引き起こすことがある。正確なキレート分布に応じて、中心にキレートがより集中する場合、３倍大きい照明面積は不利になる。フラッシュランプ画像が数ミリメートルだけ器具内で位置ずれしていると、フラッシュランプ画像がセンタリングされず、カップのエッジに配置される。これにより信号が、位置合わせされたセットアップと比較して最大３０％だけ減少することが観察された。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
励起エネルギーを一定に維持し、カップ内の照明面積を低減することにより、ＳＮＲを改善することができ、より多くの蛍光信号が獲得される。励起パルス幅の減少は、信号を増加させるが、最大でも１０％の改善にしか達しない。３４０ｎｍを中心としたキレート励起スペクトルとの良好なスペクトル重なり合いは、信号を更に改善することになる。ＳＮＲはまた、励起エネルギーの増大により改善することができる。図１５は、２００ｎｇ／ＬのＴｎＩ濃度に関して、４つのカップに対して平均化された信号対雑音比とＬＥＤ電流（励起パルスエネルギー）とを対比して示す。ＳＮＲは、励起電力と共に二乗で増大する。四角形及びひし形は、フラッシュランプ及びＬＥＤベースのユニットについて、１５回の反復による実験に対する平均値を示す。図１５は、２００ｎｇ／ＬのＴｎＩ濃度においてＳＮＲをＬＥＤ電流の関数として示し、ここでＳＮＲは、平方根依存（適合された実線曲線）で増大する。ＳＮＲは、４回の反復に対して算出されており、円として示されている。この挙動は、システム内のポアソン分布信号及びノイズによって説明され、分布の標準偏差はその平均と等しい。１５回の反復による実験により計算された値（テーブル１）は、フラッシュランプ励起に対しては正方形として、２５０ＨｚのＬＥＤユニットに対してはひし形として、それぞれで示される。より多くの試料数を調査すれば、より高い統計的精度を達成することができる。式４でバックグランド変化のみが考慮される場合、信号が検出システムのノイズと同等であれば、ＳＮＲは急速に増大し、励起電力に依存しない場合にプラトーに達する。これは、トレーサ分子がカップ壁に結合されると、バックグランドの有意な部分が非特異的結合に由来するために起こる。この場合、キレート濃度は極めて低く、バックグランド変動は平方根曲線の一部であり、これは直線として近似することができる。バックグランドは励起電力と共に線形に増大するため、信号対バックグランド比もまた、励起電力に依存しない。図１６は、ブランクカップ及び空カップからのバックグランドカウントをＬＥＤ電流（ＬＥＤ励起）の関数として示している。ブランクカップ及び空カップのバックグランドは、図１６に示すように励起電力と共に増大する。したがってＳＮＲ比は、励起電力を上昇させ、試料照明のスペクトル的、空間的及び時間的特性を切り替えることによって改善することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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