(57)【要約】  本発明は、微生物発酵を介してカプサイシノイドおよびノニバミドを含むカプサイシン化合物の生成に関する。
2019528685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となるカプサイシノイドを作製する生合成方法であって、
ａ）形質転換細胞系においてＡＣＳおよびＣＳを発現させることと；
ｂ）前記細胞系を培地中で成長させることと；
ｃ）前記対象となるカプサイシノイドを生成することとを含む方法。
【請求項２】
前記ＡＣＳが、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物からクローニングされる、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項３】
前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物が、ゴーストチリである、請求項２に記載の生合成方法。
【請求項４】
前記発現されたＡＣＳが、ＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づいて、アラビドプシスからクローニングされた遺伝子に由来する、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項５】
前記ＣＳが、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物からクローニングされる、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項６】
前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物が、前記ゴーストチリである、請求項５に記載の生合成方法。
【請求項７】
培地に加えて原材料を前記細胞系に供給することをさらに含む、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項８】
前記原材料が、ノナン酸、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびビニリアミンからなる群から選択される、請求項７に記載の生合成方法。
【請求項９】
前記原材料が、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニリアミンのうちの２つ以上の混合物である、請求項７に記載の生合成方法。
【請求項１０】
前記形質転換細胞系が、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類および細菌を含む群から選択される、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１１】
前記細胞系がＥ．Ｃｏｌｉである、請求項１０に記載の生合成方法。
【請求項１２】
前記原材料がノナン酸である、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１３】
前記対象となるカプサイシノイドが、カプサイシンである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１４】
前記対象となるカプサイシノイドが、ＮＶである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１５】
前記対象となるカプサイシノイドが、ＤＨＣＰである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１６】
前記生成されたカプサイシノイドが、ＣＰ、ＮＶ、およびＤＨＣＰを含む混合物である、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１７】
培地内で成長する形質転換細胞系によって生成される、対象となるカプサイシノイド。
【請求項１８】
前記形質転換細胞系が、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類および細菌からなる群から選択される、請求項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項１９】
前記形質転換細胞系が、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物に由来するＡＣＳおよびＣＳの存在によって形質転換される、請求項１８に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項２０】
前記製造方法が、前記形質転換細胞系に特定の原材料を供給することをさらに含む、請求項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項２１】
前記原材料が、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニルアミンからなる群から選択される、請求項２０に記載のカプサイシノイド。
【請求項２２】
前記原材料が、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニルアミンのうちの２つ以上を含有する混合物から選択される、請求項２０に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項２３】
前記形質転換細胞系が、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物に由来するＡＣＳおよびＣＳの存在によって形質転換される、請求項１８に記載のカプサイシノイド。
【請求項２４】
前記細胞系に形質転換された前記ＡＣＳが、ＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づいて、アラビドプシス由来のＡＣＳである、請求項１８に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項２５】
ＣＰである、請求項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項２６】
ＮＶである、請求項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項２７】
ＤＨＣＰである、請求項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項２８】
生成された前記カプサイシノイドが、ＣＰ、ＮＶ、およびＤＨＣＰの混合物である、請求項１７に記載のカプサイシノイド。
【請求項２９】
前記形質転換細胞系が、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物に由来するＡＣＳおよびＣＳの存在によって形質転換される、請求項１９に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項３０】
前記形質転換細胞系が前記ゴーストチリに由来するＡＣＳおよびＣＳの存在によって形質転換される、請求項２９に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項３１】
利用される前記ＡＣＳが、配列番号３と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＡＣＳである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項３２】
利用される前記ＡＣＳが、配列番号１と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＡＣＳである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項３３】
利用される前記ＣＳが、配列番号４と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣＳである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項３４】
利用される前記ＣＳが、配列番号２と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣＳである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項３５】
前記細胞系が、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の生合成方法。
【請求項３６】
前記カプサイシノイドが、精製されたカプサイシンである、請求項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項３７】
前記カプサイシノイドが、７０％超の純度である、請求項３６に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項３８】
前記カプサイシノイド含量が、乾燥基準で約８５重量％超である、請求項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
【請求項３９】
ステップｃ）が、ｉ）粗生成物を精製することと、ｉｉ）真空下で溶媒を除去して、濃縮カプサイシノイド生成物を提供することとを含む、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項４０】
前記粗生成物が、カラムクロマトグラフィーにより精製される、請求項３９に記載の生合成方法。
【請求項４１】
前記粗生成物が、酸−塩基抽出によって精製される、請求項３９に記載の生合成方法。
【請求項４２】
前記粗生成物が、真空蒸留によって精製される、請求項３９に記載の生合成方法。
【請求項４３】
前記粗生成物が、半分取ＨＰＬＣによって精製される、請求項３９に記載の生合成方法。
【請求項４４】
対象となるカプサイシノイドを生成する方法であって、形質転換微生物培養物に特定の脂肪酸前駆体を供給することを含む方法。
【請求項４５】
前記対象となるカプサイシノイドが、カプサイシンであり、前記脂肪酸前駆体が、６Ｅ−８−メチル−６−ノネン酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象となるカプサイシノイドが、ジヒドロカプサイシンであり、前記脂肪酸前駆体が、８−メチルノナン酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象となるカプサイシノイドが、ノニバミドであり、前記脂肪酸前駆体が、ノナン酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象となるカプサイシノイドが、Ｎ−バニリオクタミドであり、前記脂肪酸前駆体が、オクタン酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象となるカプサイシノイドが、Ｎ−バニリルデカンアミドであり、前記脂肪酸前駆体が、デカン酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記形質転換培養物が、酵母または細菌の微生物培養物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞系が、バニリンのバニリルアミンへの変換を触媒することができるアミノトランスフェラーゼをさらに含む、請求項１０に記載の生合成方法。
【請求項５２】
前記原材料が、中鎖〜長鎖脂肪酸であるＣ６〜Ｃ１２炭化水素からなる群から選択される、請求項７に記載の生合成方法。
【請求項５３】
前記原材料が、中鎖〜長鎖脂肪酸である２種以上のＣ６〜Ｃ１２炭化水素の混合物である、請求項７に記載の生合成方法。
【請求項５４】
前記対象となるカプサイシノイドが、ノルジヒドロカプサイシンである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項５５】
前記形質転換細胞系が、Ｃ．ｒｏｓｅｕｓのＣａＵＧＴ２を含む、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項５６】
前記形質転換細胞系が、配列番号５と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を含む、請求項１〜１６、３１〜３５、および５１〜５５のいずれか１項に記載の生合成方法。
【請求項５７】
前記形質転換細胞系が、配列番号６と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を含む、請求項１〜１６、３１〜３５、および５１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記微生物培養物が、配列番号３と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＡＣＳを発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
前記微生物培養物が、配列番号１と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＡＣＳを発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６０】
前記微生物培養物が、配列番号４と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣＳを発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
前記微生物培養物が、配列番号２と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣＳを発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６２】
前記微生物培養物が、配列番号５と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を発現する、請求項４４および５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記微生物培養物が、配列番号６と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を発現する、請求項４４に記載の生合成方法。
【請求項６４】
疼痛の局所治療のための鎮痛組成物であって、前記組成物は、有効量のカプサイシノイドを含有し、前記鎮痛剤組成物は、請求項１〜１６、３１〜３５、および３９〜６３のいずれか１項に記載の方法によって生成され、改善は、微生物細胞系において前記カプサイシノイドを生成することを含む方法。
【請求項６５】
前記有効量が、対象となるカプサイシノイドの少なくとも０．０１２５パーセントである、請求項６４に記載の鎮痛組成物。
【請求項６６】
請求項１〜１６、３１〜３５および３９〜６３のいずれか１項に記載の方法に従って生成された少なくとも１種のカプサイシノイドを有する、香味剤および芳香剤組成物。
【請求項６７】
前記カプサイシノイドが、ノニバミド、Ｎ−バニリルノナンアミド、Ｎ−バニリルスルホンアミド、Ｎ−バニリルウレア、Ｎ−バニリルカルバメート、Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルキルアミド、メチレン置換Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルカンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］−シス−単飽和アルケンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］二不飽和アミド、３−ヒドロキシアセトアニリド、ヒドロキシフェニルアセトアミド、シュードカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシンＩ、アナンダミド、ピペリン、ジンゲロン、ワーバーガナル、ポリゴジアール、アフラモジアール、シンナモジアール、シンナモスモライド、シンナモライド、シバムド、ノニバミド、オルバニル、Ｎ−オレイル−ホモバニルアミジア、イソベレラル、スカララジアール、アンシストロジアール、およびこれらの任意の組み合わせまたは混合物からなる群から選択される、請求項６６に記載の香味剤および芳香剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３６３，９５１号の優先権を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の援用
２０１６年６月２７日に作成された「Ｃ１４９７．７０００６ＷＯ００．ｔｘｔ」と名付けられたファイルに含まれる配列表は、電子提出（米国特許庁ＥＦＳ−Ｗｅｂ出願システムを使用）によって同時に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明の分野は、カプサイシノイドの微生物生成に有用な方法およびプロセスに関する。より具体的には、いくつかの実施形態において、本発明は、プラントベースのシステムにおいて別様には可能でない収率でノニバミドおよび他の特定のカプサイシノイドを生成する方法を提供する。本発明は、中でも、所望のカプサイシノイドを生合成するように改変された、遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ．株を提供する。所望のカプサイシノイドを生成するように遺伝子改変された微生物を生成する方法、ならびに、特定の出発材料から開始して所望のカプサイシノイドを高収率および高純度レベルで生成するための生成方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
本発明は、いくつかの実施形態において、微生物生成株の特定の供給源を使用して、高収率で所望のカプサイシノイド化合物を生成するための微生物株を修飾する方法に関する。カプサイシノイド化合物（限定することなく、カプサイシン（ＣＰ）、ジヒドロカプサイシン（ＤＨＣＰ）、ノニバミド（ＮＶ）等）は、唐辛子の「スパイシー」成分であり、エネルギー代謝を促進することによっていくつかの病理を予防するのに有効となり得、中枢神経系を刺激し、脂肪分解酵素を活性化させる。加えて、これらの化合物は消化管を滅菌し、消費されるときに免疫を改善し、免疫および疲労を活性化させるのに有効でもある。
【０００５】
カプサイシノイド化学
「スパイシーさ」または刺激性は、カプサイシノイドと呼ばれるアルカロイドを生成するＣａｐｓｉｃｕｍ属における唐辛子特有の特徴である。本質的に、カプサイシノイドは、哺乳動物がそれらの果実を消費すること、および種子を破壊することを抑止するために、植物中に存在する。ヒトは、一過性受容体潜在性チャネル（またはイオンチャネルの「ＴＲＰ」ファミリーの）メンバーに構造的に関連する受容体を介してカプサイシノイドを感知することができる。感覚ニューロンにおいて重要である他の受容体と同様に、カプサイシノイド受容体（「ＴＲＰＶ１」、バニロイドＴＲＰ、バニロイド１受容体またはＴＲＰＶ１とも呼ばれる）は、カプサイシンに対する感度を可逆的に失うことにより、カプサイシンおよびピペリンと関連付けられる刺激性の臭気および痛み／辛み感覚、ならびに同じ刺激への長期的曝露下において他の痛みおよび辛味刺激を媒介する（Ｃａｔｅｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。この現象は、痛みセンサがオフにされ得るため人が辛い食品に堪えることができる、およびさらにはそれを楽しむことができることを一部説明し得る。
【０００６】
カプサイシン（「ＣＰ」）、８−メチル−Ｎ−トランス−６−ノネンアミド、およびジヒドロカプサイシン（「ＤＨＣＰ」）、８−メチル−Ｎ−バニリルノナンアミドは、唐辛子における２つの主要なカプサイシノイドであり、集合的に唐辛子の刺激性の最大９０％の原因である（Ｇａｒｃｅｓ−Ｃｌａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。これらの２つの化合物およびより少ないカプサイシノイド化合物は、世界中で消費される食品およびその他の用途における重要な成分である（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ，２００２）。一般に、唐辛子のカプサイシン含量は、０．１〜１％ｗ／ｗの範囲であり（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ  ａｎｄ  Ｓａｔｈｙａｎａｒａｙａｎａ  １９９１）、多くの用途において、ＣＰおよび／またはＤＨＣＰ化合物を濃縮するための方法の使用が必要とされている。食品、医薬品ならびに他の産業および自己防衛用途におけるカプサイシノイドの幅広い使用に起因して、カプサイシノイド化合物の生成および濃縮の需要が増大している。
【０００７】
Ｃａｐｓｉｃｕｍ属は、２０種を超える唐辛子を含み、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ、Ｃ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ、およびＣ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓが栽培されている（Ｗａｌｓｈ  ａｎｄ  Ｈｏｏｔ，２００１）。様々なレベルおよび種類のカプサイシノイドの存在に起因して、様々なＣａｐｓｉｃｕｍ種にわたり、刺激性またはスパイシーさのレベルにおいて幅広い遺伝子的変動性がある。例えば、Ｃ．ａｎｎｕｕｍからの非刺激性のパプリカのスコアは０．０ＳＨＵ（Ｓｃｏｖｉｌｌｅ  Ｈｅａｔ  Ｕｎｉｔ；カプサイシンの量を示すスケール）であり「ブート・ジョロキア」またはゴーストチリは、インド北東部原産のＣ．ｃｈｉｎｅｎｓｅおよびＣ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓのハイブリッドであり、スコアは最大１，００１，３０４ＳＨＵである（Ｂｏｓｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｂａｒａｌ、２００７）。
【０００８】
植物から抽出された純ＣＰは、典型的には、辛味指数において約１６，０００，０００のスコビル単位を有し、この濃度では、１グラム当たり５０００ＵＳドル超で販売され得る（Ｂａｃｋｅｌｏｒ，２０００）。しかしながら、唐辛子のカプサイシノイドの含量は、一般に非常に低く、環境および成長条件によって大幅に影響を受け、持続可能性および一貫性の問題をもたらす。
【０００９】
植物から抽出される場合、典型的には、ヘキサン、クロロホルム、およびエタノール等の溶媒を使用した固−液抽出がカプサイシノイド回収に一般に使用される（Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしながら、溶媒抽出自体は、エネルギー集約的であり、毒性廃棄物処分の問題をもたらし、植物自体が成長するのに広大なエーカー数を必要とし、また、微量構成物質を回収するためにさらなる精製を必要とする生成物を生成する。したがって、純粋なカプサイシノイドおよび／または他のカプサイシノイドのコストを低減し、大規模栽培および処理の環境影響の低下させるために、新たな生成方法が必要とされている（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。選択された微生物株の遺伝子操作は、これらの必要な改善に対応し、および所望のカプサイシノイドの種類の選択性、存在量および純度を増加させる可能性を有する。
【００１０】
上記に加えて、消費者は、食品、芳香剤、香味剤または医薬構成成分のための自然および生物学的原材料を承認および活発に求める一方で、調達、一貫性のある効力および環境的に持続可能な生成を懸念している。この状況により、本発明の微生物発酵および生成方法は、いくつかの実施形態において、様々な産業および研究に有用な量で生物学的に生成物を生成する能力を有する改変微生物株により生成された化合物を、無機化学合成よりも自然な様式で提供する。
【００１１】
したがって、望ましいカプサイシン化合物を安定して生成することができる改変微生物株を使用した特定の生物学的経路の開発を通して、ＣＰ、ＮＶおよびＤＨＣＰならびに他のカプサイシノイドを生成する新規な方法を開発する必要性が存在する。具体的には、本発明は、中でも、商業的に関連する量で発酵プロセスからＣＰ、ＮＶ、およびＤＨＣＰを生成するための方法を提供する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、カプサイシノイドを生成する改善された方法を包含する。本発明は、酵母または細菌等の細胞系を含む改変微生物中のカプサイシノイドを生成する方法を提供する。出願人らは、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（「ＡＣＳ」）（配列番号１）およびカプサイシンシンセターゼ（「ＣＳ」）（配列番号２）のための遺伝子を単離し、またそれらを対象となる細胞形に挿入し、好ましい実施形態においてはこの細胞系はＥ．ｃｏｌｉである。これらの遺伝子は、発現されると、その系におけるカプサイシノイドの生成を可能にする。本発明によれば、いくつかの実施形態において、このシステムは、実質的な量でＣＰ、ＤＨＣＰ、およびＮＶカプサイシノイドを生成する。
【００１３】
本発明によれば、いくつかの実施形態において、細胞系におけるＡＣＳおよびＣＳを発現することを含む、培地／長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを作製する生合成方法が提供される。いくつかの実施形態において、該システムは、長鎖カルボン酸を必要とし、細胞系が、培地中でＡＣＳおよびＣＳにより形質転換され、かつカルボキシルＣｏＡを生成する。これらの培養物は、改変された微生物株が天然前駆体から供給されるとき、ある特定のカプサイシノイドを生成する。したがって、ノナン酸は、供給前駆体として使用され得、例えば、ペラルゴニウムまたはヨーロッパオリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）の油から得ることができる。本発明の他の供給前駆体としては、オクタン酸、デカン酸、バニリンおよびバニリルアミンが挙げられる。オクタン酸はまた、本発明に従って使用され得、例えば、パームおよびココナッツ油において天然に見出され得る。デカン酸は、Ｃｕｐｈｅａ種の種子に見出される。天然バニリンはまた、微生物発酵によって生成され得る（Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｙｕ，２０１４）。加えて、天然バニリルアミンは、ｐＡＭＴから得ることができる。（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００１４】
本方法は、より費用効果が高く、より容易に得られる特定の出発分子の遺伝子改変および標的供給によって、著しい量のカプサイシノイドを生成することができる細菌株の開発のためのアプローチを提供する。
【００１５】
本発明のある特定の実施形態において、生成された標的カプサイシノイドは、ＮＶ、ＣＰ、およびＤＨＣＰからなる群から選択される。
【００１６】
本開示の実施形態は、中鎖〜長鎖カルボン酸のカルボキシルＣｏＡを作製することによりカプサイシノイドを開発する生合成方法であって、細胞系においＡＣＳを発現させることと、中鎖〜長鎖カルボン酸を細胞系に供給することと、細胞系を培地中で成長させることと、カルボキシルＣｏＡを生成することとを含む生合成方法である。
【００１７】
さらなる実施形態は、ＡＣＳが、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳｌから発現されることである。（参考までに表１を参照されたい。）
【００１８】
代替の実施形態は、ＡＣＳがＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づいてアラビドプシスから発現されることである。別の実施形態において、ＡＣＳは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐｐからクローニングされたＡＣＳ２から発現される。さらに、いくつかの実施形態において、本発明において使用されるＡＣＳは、少なくとも６６％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を共有するＡＣＳであり、ＡＣＳｌは、ゴーストチリペッパーからクローニングされている。別の実施形態において、ＡＣＳは、少なくとも９２％（例えば、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の配列類似性を共有するＡＣＳである。
【００１９】
さらなる実施形態は、中鎖または長鎖カルボン酸が８−メチル−トランス−６−ノネン酸であることである。長鎖カルボン酸は、一般に、１４〜１８個の炭素を有し、中鎖カルボン酸は、一般に、８〜１３個の炭素を有する。
【００２０】
本発明の一実施形態において、中鎖〜長鎖カルボン酸の細胞系への供給は、選択された株による使用のために、中長鎖カルボン酸を細胞系に添加することを含む。
【００２１】
代替の実施形態において、中鎖〜長鎖カルボン酸の細胞系への供給は、細胞系の生合成経路から中鎖〜長鎖カルボン酸を発現させることを含む。
【００２２】
製品／商業的有用性の観点から、米国の市場においてカプサイシンを含有する数十の製品があり、鎮痛剤から害虫忌避剤まで、ならびに食品および補助食品の全てにおいて使用され得る。カプサイシンを含有する製品は、例えば、エアロゾル、液体、または粒状配合物であってもよい。
【００２３】
実施形態における細胞系について、それは、細菌、酵母、およびそれらの組み合わせ、または選択された遺伝子の遺伝子形質転換を可能にし、またその後代替の供給前駆体からの所望のカプサイシノイドの生合成を可能にする任意の細胞系から選択される。最も好ましい微生物系において、所望のカプサイシノイド化合物を生成するためにＥ．ｃｏｌｉが使用される。
【００２４】
本開示の実施形態は、８−メチルノネノイル−ＣｏＡを作製する生合成方法であって、細胞系においてＡＣＳを発現させることと、細胞系に８−メチル−トランス−６−ノネン酸を供給することと、培地中で細胞系を成長させることと、８−メチルノネノイル−ＣｏＡを生成することとを含む生合成方法である。いくつかの実施形態において、本発明のＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳｌから発現される。代替として、ＡＣＳは、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからクローニングされたＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５から発現され得る。
【００２５】
別の実施形態において、本発明のＡＣＳは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐｐからクローニングされたＡＣＳ２から発現される。さらに、いくつかの実施形態において、ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳＩと少なくとも６６％（例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）の配列同一性を共有するＡＣＳである。別の実施形態において、ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳＩとタンパク質レベルで少なくとも９２％（例えば９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の配列類似性を共有するＡＣＳである。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は、対象となるカプサイシノイドを作製する生合成方法であって、形質転換細胞系においてＡＣＳおよびＣＳを発現させることと、細胞系を培地中で成長させることと、対象となるカプサイシノイドを生成することとを含む方法である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＡＣＳは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物からクローニングされる。いくつかの実施形態において、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物は、ゴーストチリである。いくつかの実施形態において、発現されたＡＣＳは、ＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づいて、アラビドプシスからクローニングされた遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＳは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物からクローニングされる。いくつかの実施形態において、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物は、ゴーストチリである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、方法は、培地に加えて原材料を該細胞系に供給することをさらに含む。いくつかの実施形態において、原材料は、ノナン酸、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニリアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、原材料は、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニリアミンのうちの２つ以上の混合物である。いくつかの実施形態において、原材料はノナン酸である。いくつかの実施形態において、該原材料は、中鎖〜長鎖脂肪酸であるＣ６〜Ｃ１２炭化水素から選択される。いくつかの実施形態において、原材料は、中鎖〜長鎖脂肪酸である２種以上のＣ６〜Ｃ１２炭化水素の混合物である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、形質転換細胞系は、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類および細菌を含む群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞系はＥ．Ｃｏｌｉである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、カプサイシンである。いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、ＮＶである。いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、ＤＨＣＰである。いくつかの実施形態において、生成されたカプサイシノイドは、ＣＰ、ＮＶ、およびＤＨＣＰを含む混合物である。いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、ノルジヒドロカプサイシンである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、利用されるＡＣＳは、配列番号３と少なくとも７５％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のＤＮＡ配列類似性を共有するＡＣＳである。いくつかの実施形態において、利用されるＡＣＳは、配列番号１と少なくとも９０％（例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のタンパク質配列類似性を共有するＡＣＳである。いくつかの実施形態において、利用されるＣＳは、配列番号４と少なくとも７５％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のＤＮＡ配列類似性を共有するＣＳである。いくつかの実施形態において、利用されるＣＳは、配列番号２と少なくとも９０％（例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のタンパク質配列類似性を共有するＣＳである。
【００３２】
いくつかの実施形態において、細胞系は、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドを生成することは、ｉ）粗生成物を精製することと、ｉｉ）真空下で溶媒を除去して、濃縮カプサイシノイド生成物を提供することとを含む。いくつかの実施形態において、粗生成物は、カラムクロマトグラフィーにより精製される。いくつかの実施形態において、粗生成物は、酸−塩基抽出によって精製される。いくつかの実施形態において、粗生成物は、真空蒸留によって精製される。いくつかの実施形態において、該生成物は、半分取ＨＰＬＣによって精製される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、細胞系は、バニリンのバニリルアミンへの変換を触媒することができるアミノトランスフェラーゼをさらに含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、形質転換細胞系は、Ｃ．ｒｏｓｅｕｓからのＣａＵＧＴ２を含む。いくつかの実施形態において、形質転換細胞系は、配列番号５と少なくとも７５％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のＤＮＡ配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を含む。いくつかの実施形態において、形質転換細胞系は、配列番号６と少なくとも９０％（例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のタンパク質配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を含む。
【００３６】
他の態様において、本発明は、培地内で成長する形質転換細胞系によって生成される対象となるカプサイシノイドを提供する。いくつかの実施形態において、形質転換細胞系は、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類および細菌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、形質転換細胞系は、ＡＣＳおよびＣａｐｓｉｃｕｍ属の植物に由来するＡＣＳの存在によって形質転換される。いくつかの実施形態において、細胞系に形質転換されたＡＣＳは、ＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づいてアラビドプシスに由来するＡＣＳである。いくつかの実施形態において、形質転換細胞系は、ＡＣＳおよびＣａｐｓｉｃｕｍ属の植物に由来するＣＳの存在によって形質転換される。いくつかの実施形態において、形質転換細胞系は、ＡＣＳおよびゴーストチリに由来するＣＳの存在によって形質転換される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、生成する方法は、さらに、形質転換細胞系に特定の原材料を供給することを含む。いくつかの実施形態において、原材料は、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニリアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、原材料は、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニリアミンのうちの２つ以上を含有する混合物から選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、カプサイシノイドは、ＣＰである。いくつかの実施形態において、該カプサイシノイドは、ＮＶである。いくつかの実施形態において、カプサイシノイドは、ＤＨＣＰである。いくつかの実施形態において、カプサイシノイドは、ＣＰ、ＮＶおよびＤＨＣＰの混合物である。いくつかの実施形態において、カプサイシノイドは、７０％超（例えば７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の純度を有する。いくつかの実施形態において、カプサイシノイド含量は、乾燥基準で約８５重量％超（例えば約８５重量％超、約９０重量％超、約９５重量％超、約９８重量％超、または約９９重量％超）である。いくつかの実施形態において、カプサイシノイドは、精製カプサイシンである。
【００３９】
さらに他の態様において、本発明は、対象となるカプサイシノイドを生成する方法であって、形質転換微生物培養物に特定の脂肪酸前駆体を供給することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、カプサイシンであり、脂肪酸前駆体は、６Ｅ−８−メチル−６−ノネン酸である。いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、ジヒドロカプサイシンであり、脂肪酸前駆体は、８−メチルノナン酸である。いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、ノニバミドであり、脂肪酸前駆体はノナン酸。いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、Ｎ−バニリオクタミドであり、脂肪酸前駆体は、オクタン酸である。いくつかの実施形態において、対象となるカプサイシノイドは、Ｎ−バニリルデカンアミドであり、前駆体は、デカン酸である。いくつかの実施形態において、形質転換培養物は、酵母または細菌の微生物培養物である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、微生物培養物は、配列番号３と少なくとも７５％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のＤＮＡ配列類似性を共有するＡＣＳを発現する。いくつかの実施形態において、微生物培養物は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のタンパク質配列類似性を共有するＡＣＳを発現する。いくつかの実施形態において、微生物培養物は、配列番号４と少なくとも７５％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のＤＮＡ配列類似性を共有するＣＳを発現する。いくつかの実施形態において、微生物培養物は、配列番号２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のタンパク質配列類似性を共有するＣＳを発現する。いくつかの実施形態において、微生物培養物は、配列番号５と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のＤＮＡ配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を発現する。いくつかの実施形態において、微生物培養物は、配列番号６と少なくとも９０％（例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％）のタンパク質配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を発現する。
【００４１】
他の態様において、本発明は、疼痛の局所治療のための鎮痛組成物を提供し、組成物は、有効量のカプサイシノイドを含有し、該鎮痛剤組成物は、本明細書に記載の方法のいずれかによって生成され、改善は、微生物細胞系において該カプサイシノイドを生成することを含む。いくつかの実施形態において、有効量は、対象となるカプサイシノイドの少なくとも０．０１２５パーセントである。いくつかの実施形態において、カプサイシノイドは、ノニバミド、Ｎ−バニリルノナンアミド、Ｎ−バニリルスルホンアミド、Ｎ−バニリルウレア、Ｎ−バニリルカルバメート、Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルキルアミド、メチレン置換Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルカンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］−シス−単飽和アルケンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］二不飽和アミド、３−ヒドロキシアセトアニリド、ヒドロキシフェニルアセトアミド、シュードカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシンＩ、アナンダミド、ピペリン、ジンゲロン、ワーバーガナル、ポリゴジアール、アフラモジアール、シンナモジアール、シンナモスモライド、シンナモライド、シバムド、ノニバミド、オルバニル、Ｎ−オレイル−ホモバニルアミジア、イソベレラル、スカララジアール、アンシストロジアール、およびこれらの任意の組み合わせまたは混合物を含む群から選択される。
【００４２】
他の態様において、本発明は、香味剤および芳香剤組成物を提供し、香味剤および芳香剤組成物は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って生成された少なくとも１つのカプサイシノイドを有する。いくつかの実施形態において、カプサイシノイドは、ノニバミド、Ｎ−バニリルノナンアミド、Ｎ−バニリルスルホンアミド、Ｎ−バニリルウレア、Ｎ−バニリルカルバメート、Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルキルアミド、メチレン置換Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルカンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］−シス−単飽和アルケンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］二不飽和アミド、３−ヒドロキシアセトアニリド、ヒドロキシフェニルアセトアミド、シュードカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシンＩ、アナンダミド、ピペリン、ジンゲロン、ワーバーガナル、ポリゴジアール、アフラモジアール、シンナモジアール、シンナモスモライド、シンナモライド、シバムド、ノニバミド、オルバニル、Ｎ−オレイル−ホモバニルアミジア、イソベレラル、スカララジアール、アンシストロジアール、およびこれらの任意の組み合わせまたは混合物を含む群から選択される。
【００４３】
本開示は様々な修正および代替形態をとり得るが、その特定の実施形態が図面において例として示され、本明細書において詳細に説明される。しかしながら、本明細書において示される図面および詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定するものではなく、逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲内の全ての修正、均等物、および代替物を包含するものであることを理解されたい。
【００４４】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照してなされる、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明において明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】カプサイシノイド生合成経路を示す図である。アミノトランスフェラーゼ（ｐＡＭＴ）は、バニリンからのバニリアミンの形成を触媒する。
【図２】本発明の形質転換細胞系の一実施形態による特定のカプサイシノイド化合物の生成レベルを示す図である。それぞれ６Ｅ（６Ｅ−８−メチルノネン酸）、Ｃ８：０（オクタン酸またはカプリル酸）、Ｃ９：０（ノナン酸またはペラルゴン酸）およびＣ１０：０（デカン酸またはカプリン酸）からの、ＣＰ（カプサイシン）、ＣＰ８（Ｎ−バニリオクタミド）、ＣＰ９（ノニバミド）またはＣＰ１０（Ｎ−バニリルデカンアミド）の生成。実験は、３連で行われた。各対における左のバーは、１日である。各対における右のバーは、２日である。
【図３】好ましい細胞系のＨＰＬＣプロファイル、特にそれぞれＣ８：０、Ｃ９：０およびＣ１０：０が供給されたＥ．ｃｏｌｉ培養物からの粗酢酸エチル抽出物のＨＰＬＣプロファイルである。ＣＰ８（Ｎ−バニリオクタミン）、ＣＰ９（ノニバミド）およびＣＰ１０（Ｎ−バニリルデカンアミド）は、それぞれ１０．９、１１．３、および１１．８分の保持時間を有していた。挿入された写真は、それらのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルである。図３は、基質および生成物の読取値であり、ピーク面積は２８０ｎｍで測定した。
【図４】本発明の細胞系の実施形態と比較するためのノニバミド標準のＨＰＬＣプロファイルである。
【図５】ｐＡＭＴシンターゼの存在下での、バニリンからのカプサイシンの生成を示す図である。
【図６】ＣａＵＧＴ２のＮｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーを示す図である。Ｐｒｅ、カラム前；ｐｏｓｔ、カラム後；Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、カラムから収集された分画。Ｈｉｓタグ付きＣａＵＧＴ２は、約５８ｋＤの分子量を有する。
【図７】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣａＵＧＴ２によるカプサイシン−ｇｌｕおよびノニバミド−ｇｌｕの生成を示す図である。
【図８】ノルジヒドロカプサイシン（７Ｍ−ＣＰ）の構造を示す図である。ノルジヒドロカプサイシン（７Ｍ−ＣＰ）は、全カプサイシノイドの約７％を占める、唐辛子中で３番目に最も豊富なＣＰである。
【図９】７Ｍ−ＣＰおよびＣ９−ＣＰ生成のＨＰＬＣプロファイルである。
【図１０】同じ培養系におけるＣ９−ＣＰおよび７Ｍ−ＣＰ生成の比較を示す図である。実験は、二連で行われた。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下の略語は、明細書において特定された意味を有する。
【００４７】
本明細書において使用される用語の説明：
カプサイシンまたはＣＰは無色の刺激性フェノール性アミドＣ１８Ｈ２７ＮＯ３であり、様々なＣａｐｓｉｃｕｍ種およびそれらのハイブリッドにおいて見出される一連のフェノール性アミドであり、唐辛子にその辛さまたは刺激性を与え、食品、医薬品、および安全性用途に使用される。純粋なＣＰは、揮発性、疎水性、無色、無臭、結晶性〜ロウ状化合物である。
【００４８】
本明細書において使用される場合、カプサイシノイドは、唐辛子の辛味に関与するカプサイシンに関連する刺激性化合物のクラスを指す。それらは、ヒトを含む哺乳動物に対する刺激物であり、それらが接触するあらゆる組織に焼ける感覚をもたらし得る。カプサイシノイドは、ある特定の哺乳動物および菌類に対する抑止剤として、唐辛子による二次代謝産物として生成され得る。例示的なカプサイシノイドとしては、これらに限定されないが、ノニバミド、Ｎ−バニリルノナンアミド、Ｎ−バニリルスルホンアミド、Ｎ−バニリルウレア、Ｎ−バニリルカルバメート、Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルキルアミド、メチレン置換Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルカンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］−シス−単飽和アルケンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］二不飽和アミド、３−ヒドロキシアセトアニリド、ヒドロキシフェニルアセトアミド、シュードカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシンＩ、アナンダミド、ピペリン、ジンゲロン、ワーバーガナル、ポリゴジアール、アフラモジアール、シンナモジアール、シンナモスモライド、シンナモライド、シバムド、ノニバミド、オルバニル、Ｎ−オレイル−ホモバニルアミジア、イソベレラル、スカララジアール、アンシストロジアール、およびこれらの任意の組み合わせまたは混合物が挙げられる。ある特定のカプサイシノイドは、表２にさらに説明されている。
【００４９】
細胞系は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。これは、細菌、酵母、植物細胞および動物細胞を含む。これは、原核細胞および真核細胞の両方を含む。また、これは、リボソーム等の細胞成分に基づくタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を含む。
【００５０】
脂肪酸、Ｃ６〜Ｃ１２。本発明によれば、様々な脂肪酸が出発源材料として使用され得る。原材料としては、バニリン、バニリルアミン、またはメチル化、エチル化、もしくはグリコシル化等の芳香環における修飾を有するそれらの誘導体が挙げられ、より具体的には、６〜１２炭素直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸、またはヒドロキシ脂肪酸等のそれらの誘導体（例えば、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、およびドデカン酸）は、直鎖脂肪酸または分岐鎖脂肪酸であってもよく、本発明のカプサイシノイドを作製するために使用され得る。
【００５１】
細胞系の成長成長は、細胞を増幅および分化させる適切な培地を提供することを含む。これはまた、細胞または細胞成分が、組換えタンパク質を翻訳および作製できるような源を提供することを含む。
【００５２】
タンパク質発現。タンパク質生成は、遺伝子発現後に生じ得る。これは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階からなる。次いで、ｍＲＮＡは、ポリペプチド鎖に翻訳され、最終的にタンパク質に折り畳まれる。ＤＮＡは、核酸を細胞中に意図的に導入するプロセスであるトランスフェクションを介して細胞中に存在してもよい。この用語は、多くの場合、真核細胞の非ウイルス法に使用される。これはまた、他の方法および細胞型を指す場合があるが、他の用語が好ましい。「形質転換」は、細菌、植物細胞を含む非動物真核細胞における非ウイルスＤＮＡ移送を説明するためにより頻繁に使用される。動物細胞では、形質転換はまたこれらの細胞におけるがん性状態（発がん性）への進行を指すために使用されるため、トランスフェクションが好ましい用語である。形質導入は、しばしば、ウイルス媒介ＤＮＡ移送を説明するために使用される。形質転換、形質導入、およびウイルス感染は、本出願においてトランスフェクションの定義に含まれる。
【００５３】
酵母本発明によれば、本明細書において特許請求される酵母は、真菌界のメンバーとして分類される真核生物の単一細胞微生物である。酵母は、多細胞性の祖先進化した単細胞生物であるが、本発明に有用ないくつかの種は、仮性菌糸または偽菌糸として知られる接続した出芽性細胞のストリングを形成することにより多細胞の特性を発達させる能力を有するものである。
頭字語：
Ｐａｌ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；
Ｃａ４Ｈ、桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ；
４ＣＬ、４−クマレートＣｏＡリガーゼ；
ＨＣＴ、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ；
Ｃ３Ｈ、クマロイルシキメート／キネート３−ヒドロキシラーゼ；
ＣＯＭＴ、カフェイン酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、ｐＡＭＴ、アミノトランスフェラーゼ；
ＢＣＡＴ、分岐鎖アミノ酸トランスフェラーゼ；
Ｋａｓ、３−ケタ−アシルＡＣＰシンターゼ；
ＡＣＬ、アシルキャリアタンパク質；
ＦａｔＡ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ；
ＡＣＳ、アシル−ＣｏＡシンターゼ、および
ＣＳ、カプサイシン合成酵素。
【００５４】
［発明を実施するための形態］
本発明は、いくつかの実施形態において、特定の供給前駆体から開発された、ＣＰ、ＤＨＣＰおよびＮＶの改善された生成方法のためのシステムに関する。
【００５５】
ペラルゴン酸バニリルアミドまたはＰＡＶＡとも呼ばれるノニバミド（ここでは「ＮＶ」）は、唐辛子において特定される微量のカプサイシノイドの１つである（図２、Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。これは、刺激性香味料用の食品添加剤として使用される。これはまた、製薬産業においてカプサイシンの代替として使用される。しかしながら、唐辛子中のノニバミドの極めて低い含量に起因して、現在の植物抽出方法の使用は商業的に実行可能ではなく、したがって化学合成によってのみ作製されている。化学的に合成されたノニバミドは容易に入手可能であり、安価であり、非天然化合物は、自然製品の需要が好ましい消費者には快く受け入れられていない。天然であるためには、化学物質は、本発明の方法において提供されるように、天然材料の抽出により得られる、または酵素もしくは微生物によって天然前駆体から形質転換される必要がある。
【００５６】
本発明の一態様は、本発明のＡＣＳおよびＣＳのＤＮＡおよび対応するタンパク質配列である。ＡＣＳおよびＣＳのＤＮＡ配列は、ゴーストチリペッパーから特定および取り出され、本発明における使用のためにプラスミドに挿入された。そのような配列は、本明細書において、それぞれ配列番号３および配列番号４として提供される。
【００５７】
本発明は、核酸分子および本明細書に記載の方法におけるその使用を含み、核酸分子は、それぞれ配列番号１および配列番号２にハイブリダイズする核酸配列、またはそれらの任意の補体、またはそれらの任意のシスエレメントを有する。本発明また、核酸分子および本明細書に記載の方法におけるその使用を提供し、核酸分子は、本発明のＡＣＳおよびＣＳ配列に対する配列番号３から配列番号４、それらの任意の補体、またはそれらの任意のシスエレメント、またはそれらに任意の断片からなる群から選択される核酸配列を含む。（表１、配列番号３および４を参照されたい）。
【００５８】
追加の実施形態は、形質転換された植物の過剰発現の標準的な既知の技法を利用してＡＣＳｌを過剰発現することによって、唐辛子植物におけるカプサイシノイドのレベルを変更するためのＡＣＳｌの使用を含む。別の実施形態は、遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンするための標準的な既知の技法を利用してＡＣＳｌをノックアウトまたはノックダウンすることにより、唐辛子植物におけるカプサイシノイドのレベルを変更するためのＡＣＳＩの使用を含む。この場合も、過剰発現またはノックアウト／ノックダウンは、当業者によって知られている標準的な分子細胞戦略および技法によるものである。別の実施形態は、ＡＣＳｌの発現または過剰発現を伴う脂肪酸を含むアシル−ＣｏＡおよびそれらの下流代謝産物を生成するためのＡＣＳｌの使用を含む。別の変形例は、アシル−ＣｏＡ、およびノックアウトまたはノックダウンＡＣＳｌを含む脂肪酸を含むそれらの下流代謝産物のレベルを調節するためのＡＣＳＩ使用である。生成された異なる特定のカプサイシノイドは、培養物に供給される異なる脂肪酸によって決定される。（表３を参照されたい）。
【００５９】
本明細書の方法によって作製されるアシルＣｏＡは、対象となるカプサイシノイドを作製するために利用され得、それらは一般に、中鎖の種類のものである。この場合も、ＡＣＳｌは中鎖および長鎖カルボン酸の両方のアシル−ＣｏＡへの変換を媒介し得るが、中鎖活性は今日のバイオ燃料産業において必須の成分であるため、中鎖活性は長鎖活性よりもはるかに重要である。ＡＣＳｌに関して上述されるような他の重要性は、トランスジェニック技術によって植物におけるカプサイシノイドレベルを変更するために使用され得ることである。しかしながら、ＡＣＳｌは、長鎖アシル−ＣｏＡに関する使用から除外されない。一実施形態において、細菌ベースの系または酵母ベースの系等の細胞系が、ＡＣＳを発現するように修飾され得る。ＡＣＳは、ゴーストペッパーからクローニングされたＡＣＳ１であってもよい。他の好適なＡＣＳは、アラビドプシスからのＬＣＡＳ４およびＬＣＡＳ５に基づくものである。他の既知のＡＣＳ１およびＡＣＳ２もまた、細胞系において発現され得る。次いで、８−メチル−トランス−６−ノネン酸および８−メチルノナン酸等の適切な基質が、細胞系に供給され得る。基質はまた、細胞系内の生合成経路の一部として発現され得る。次いで、細胞系は、８−メチル−トランス−６−ノネノイル−ＣｏＡまたは８−メチルノナノイル−ＣｏＡの生合成生成を可能にするためにインキュベートされる。
【００６０】
本発明の別の実施形態によれば、微生物系における異種タンパク質生成の効率は、生成される最終的ポリペプチドを変化させることなく、発現に使用される細胞系に好ましくなり得るが元の遺伝子源生物とは異なるものにＤＮＡ配列を改変するコドン変化により向上され得る。この問題を克服するために通常使用されるアプローチは、対象となるポリペプチドを生成する宿主生物に好ましいコドン配列に指向させるために、特定の細胞株において稀なコドンを除去する、または稀なコドンｔＲＮＡの付加のための標的化突然変異誘発を含む。近年、そのような「コドン最適化」技術における改善は、合成遺伝子の費用効果の高い生成を可能にし、それによってこれは本発明のために実行可能な代替物および潜在的に有用なものとなる。
【００６１】
同一性および類似性
同一性は、配列の整列（配列情報もしくは構造情報のみ、またはいくつかの他の情報を使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）後に配列の対の間で同じであるアミノ酸の割合であり、類似性は、いくつかの類似性マトリックスを使用した整合に基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、タンパク質の配列整列のために当業者により使用される以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０もしくはＧＯＮＮＥＴ、または任意のマトリックスのうちのいずれか１つであり得る。
【００６２】
同一性は、２つの下位配列間の対応度である（配列間にギャップはない）。２５％以上の同一性は、機能の類似性を示し暗示し、一方で１８〜２５％は構造または機能の類似性を暗示する。２つの完全に無関係なまたはランダム配列（１００残基を超える）が２０％超の同一性を有し得ることに留意されたい。類似性は、それらが比較される場合に、２つの配列間の類似度である。これは、それらの同一性に依存する。
【００６３】
ハイブリダイゼーション技法を使用した配列類似性の決定
核酸ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ操作の当業者に周知の技法である。核酸の所与の対のハイブリダイゼーション特性は、それらの類似性または同一性の指標である。
【００６４】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、一般に、相補的塩基鎖対合を介して結合する核酸分子の能力を指す。そのようなハイブリダイゼーションは、核酸分子が、適切な条件下で接触する場合に生じ得る。「特異的にハイブリダイズ」とは、逆平行二本鎖核酸構造を形成する２つの核酸分子の能力を指す。核酸分子は、それらが「完全な相補性」を示す場合、別の核酸分子の「補体」であると言われ、すなわち、１つの配列内の各ヌクレオチドは、別の配列におけるその塩基対合パートナーヌクレオチドと相補的である。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたままであることを許すのに十分な安定性をもって互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、分子は、少なくとも従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたままであることを許すのに十分な安定性をもって互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言われる。例えば少なくとも低ストリンジェンシー条件下で他の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、他の核酸分子の「ハイブリダイズ可能な同族体」と言われる。従来の低ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシー条件は、本明細書において、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．‘Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）およびＨａｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）により説明されている。完全相補性からの逸脱は、そのような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に除外しない限りは許容され得る。
【００６５】
低ストリンジェンシー条件は、標的核酸配列に対するより低い配列同一性を有する核酸配列を選択するために使用され得る。約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩化ナトリウム等の条件を採用することが望ましい場合がある。高ストリンジェンシー条件は、開示された核酸配列に対するより高い同一性の程度を有する核酸配列を選択するために使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。高ストリンジェンシー条件は、典型的には、約２×〜約１０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む２０×ＳＳＣ原液、ｐＨ７．０から蒸留水中に希釈）、約２．５×〜約５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、１％（ｗ／ｖ）ｆｉｃｏｌｌ、および１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドンを含有する５０×原液から蒸留水中に希釈）、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの魚精子ＤＮＡ、ならびに約０．０２％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、約５０℃〜約７０℃で数時間から一晩のインキュベーション下での核酸ハイブリダイゼーションを含む。高ストリンジェンシー条件は、好ましくは、５５℃で数時間のインキュベーション下での６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００ｍｇ／ｍＬの魚精子ＤＮＡ、および０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにより提供される。ハイブリダイゼーションに続いて、一般にいくつかの洗浄ステップが行われる。。洗浄組成物は、一般に、約２０℃〜約７０℃で１５分間のインキュベーション下での、０．５×〜約１０×ＳＳＣおよび０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む。好ましくは、核酸セグメントは、０．１×ＳＳＣ中６５℃で少なくとも１回の洗浄後、ハイブリダイズした状態を維持する。
【００６６】
核酸分子は、好ましくは、低または高ストリンジェンシー条件下、配列番号３および配列番号４、それらの任意の補体、またはそれらの任意の断片、またはそれらの任意のシスエレメントとハイブリダイズする核酸配列を含む。核酸分子は、最も好ましくは、高ストリンジェンシー条件下、配列番号３および配列番号４、それらの任意の補体、またはそれらの任意の断片、またはそれらの任意のシスエレメントとハイブリダイズする核酸配列を含む。
【００６７】
同一性スコア化を使用した配列類似性の分析
本明細書において使用される場合、「配列同一性」とは、２つの最適に整列したポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸の整列のウィンドウ全体にわたり不変である程度を指す。試験配列および参照配列の整列セグメントの「同一性割合」は、２つの整列した配列により共有される同一成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体または参照配列のより小さい画定部分における成分の総数で除した値である。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適に整列した場合の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した、参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直線ポリヌクレオチド配列における同一ヌクレオチドのパーセンテージを指す（比較ウィンドウにわたり、合計して参照配列の２０パーセント未満である適切なヌクレオチド挿入、欠失、またはギャップを有する）。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的ホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジー整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法等のツールによって、ならびに好ましくはＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ等のアルゴリズムのコンピュータ実装により行われてもよい。試験配列および参照配列の整列されたセグメントの「同一性割合」は、２つの整列した配列により共有される同一成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体または参照配列のより小さい画定部分における成分の総数で除した値である。配列同一性パーセントは、１００を乗じた同一性割合として表現される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列にわたってもよい。本発明の目的において、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用して、またポリヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。
【００６９】
配列同一性のパーセントは、好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定される。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムを利用して、マッチの数を最大化してギャップの数を最小化する２つの配列の整列を見つける。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＳ，２：４８２−４８９，１９８１、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １１：２２０５−２２２０，１９８３）の局所的ホモロジーアルゴリズムを使用して、２つの配列間の類似性の最善のセグメントの最適な整列を実行し、マッチの数を最大化するためにギャップを挿入する。同一性パーセントは、最も好ましくは、「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」プログラムを使用して決定される。
【００７０】
配列同一性を決定するための有用な方法はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から公的に利用可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムにおいて開示されている。ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２１５：４０３−４１０（１９９０）を参照されたい。ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０以降では、整列内にギャップ（欠失および挿入）を導入することができる。ペプチド配列に対してはＢＬＡＳＴＸを使用して配列同一性を決定することができ、ポリヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性を決定するこことができる。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「実質的な配列同一性パーセント」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらにより高い配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性の配列同一性パーセントを指す。したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらにより高い配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本発明のＡＣＳおよびＣＳ遺伝子の活性を有するポリヌクレオチド分子は、様々なカプサイシノイドの生成を導くことができ、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列に対し実質的な配列同一性パーセントを有し、本発明の範囲内に包含される。
【００７２】
「相同性」とは、位置同一性（すなわち配列類似性または同一性）のパーセントに関する２つ以上の核酸またはアミノ酸配列間の類似性のレベルを指す。相同性はまた、異なる核酸またはタンパク質間の類似の官能特性の概念を指す。
【００７３】
代替の実施形態において、核酸分子は、配列番号３および配列番号４、それらの任意の補体、それらの任意の断片、またはそれらの任意のシスエレメントからなる群から選択される核酸分子に対して、７０％以上の同一性、より好ましくは少なくとも８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を示す。核酸分子は、好ましくは、配列番号３および配列番号４、それらの任意の補体、それらの任意の断片、またはそれらに任意のシスエレメントからなる群から選択されるポリヌクレオチドと、７５％以上の配列同一性を示す核酸配列を含む。核酸分子は、より好ましくは、配列番号３および配列番号４、それらの任意の補体、それらの任意の断片、またはそれらの任意のシスエレメントからなる群から選択されるポリヌクレオチドとの８０％以上の配列同一性を示す核酸配列を含む。核酸分子は、最も好ましくは、配列番号３および配列番号４、それらの任意の補体、それらの任意の断片、またはそれらの任意のシスエレメントからなる群から選択されるポリヌクレオチドとの８５％以上の配列同一性を示す核酸配列を含む。
【００７４】
本発明の目的において、「同一性パーセント」は、また翻訳されたヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用して、またポリヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。本発明の好ましい実施形態において、本明細書において開示されるトウモロコシゲノムプロモーター配列は、それぞれのホモログに関して２００超のＢＬＡＳＴスコア、好ましくは３００超のＢＬＡＳＴスコア、さらにより好ましくは４００超のＢＬＡＳＴスコアを有する核酸分子または断片を含む。
【００７５】
前述の説明から明らかであるように、本開示のある特定の態様は、本明細書において例示される例の特定の詳細によって限定されず、したがって、当業者は、他の修正および用途、またはそれらの均等物を思いつくことが企図される。したがって、特許請求の範囲は、本開示の趣旨および範囲から逸脱しない全てのそのような修正および用途を網羅するものであることが意図される。
【００７６】
さらに、別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される、またはそれらと同様もしくは同等であるいずれの方法および材料も、本開示の実践または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料が上で説明されている。
【００７７】
上記発明は、理解の目的のために図解および例示としてある程度詳細に説明されているが、ある特定の変更および修正が実践され得ることが当業者には明らかであろう。したがって、説明および例は、添付の特許請求の範囲により説明される本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００７８】
したがって、特定のカプサイシノイドの生成を提供する本明細書における本発明の実施形態は、単に本発明の原理の例示であることを理解されたい。上記説明から、開示される生成方法の形態、使用方法、および要素の用途、ならびに選択された微生物株の変更が、本発明の趣旨から逸脱することなく使用され得ることが明らかであろう。
【００７９】
実施例１
５００ｍｇ／Ｌのバニリルアミンおよび５００ｍｇ／Ｌの個々の脂肪酸を、ゴーストチリＡＣＳ１およびＣＳ遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ培養物に供給した。生成物試料を、基質供給から１日後および２日後に採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した（図２を参照されたい）。
【００８０】
図１および２に見られるように、この実験の結果として、ノニバミドおよび他のカプサイシノイドが生成された。ＮＶは、ペラルゴン酸（ｎ−ノナン酸）およびバニリルアミンのアミドである。ノニバミドは、スパイシーな香味を付与するための食品添加剤として、ならびに関節炎および筋肉痛を緩和するための医薬品として広く使用されている。
【００８１】
本明細書において生成されるＣＰ、ＤＨＣＰ、およびＮＶカプサイシノイドは、ゴーストチリペッパーからＡＣＳおよびＣＳ遺伝子を運搬するように改変された改変Ｅ．ｃｏｌｉ培地中で合成された。これらの遺伝子は、適切に供給された選択された株が、８−メチルノネノイル部分を８−メチルノネノイル−ＣｏＡからバニリルアミンに送達してアミドコンジュゲートを形成する挿入アシルトランスフェラーゼＣＳを介してカプサイシノイドを合成するのを可能にした。バニリルアミンは、フェニルプロパノイド経路から形成されるが、分岐鎖脂肪酸は、分岐鎖アミノ酸、例えばバリンから誘導される（Ｃｕｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｚｏｕｒｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。アミノトランスフェラーゼ（ｐＡＭＴ）は、バニリン（図１）のバニリアミンの形成を触媒する。ＡＣＳ１およびＣＳを共過剰発現するＢＬ２１のグリセロール原液（ＤＥ３）培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカーベニシリンおよび１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する５ｍｌのＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）培地を播種し、培地を、３７℃で一晩振盪した。次いで、一晩培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカーベニシリンおよび１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する２０ｍｌのＴＢ培地を接種した。培養物を、まず３７℃で０．４のＯＤ６００まで成長させ、２５℃まで冷却した。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、ＡＣＳ１およびＣＳの発現を誘導した。２５℃で３時間のインキュベーション後、５００ｍｇ／ＬのＶＮおよび５００ｍｇ／Ｌの各個々の脂肪酸を培養物に添加し、培養物を引き続き２５℃でインキュベートした。基質の供給から２４時間後および４８時間後に試料を採取した。酢酸エチルにより培養物からカプサイシノイドを抽出し、酢酸エチル相をＨＰＬＣにより分析した。実験は３連で行った。
【００８２】
我々の以前の出願において、対応する基質の供給後にゴーストチリペッパーからＡＣＳ１およびＣＳ遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ培養物中のＣＰおよびＤＨＣＰの生成のためのプロセスを説明した（表１；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。本発明により、我々は、ＮＶの生成を報告する。本発明によれば、形質転換培養物には、そのような培養物によって生成される生成物が単一のカプサイシノイドの種であるように特定の脂肪酸が供給される（表３を参照されたい）。これは、当然ながら、様々なカプサイシノイドとＣＰおよびＤＨＣＰとの混合物が生成および抽出される植物系生成に対する効率の改善である。
【００８３】
ノニバミドが天然に存在するカプサイシノイド種（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）として特定されているが、含量が非常に低いため、商業的には天然のノニバミドは使用されていない。
【００８４】
カプサイシンおよびその類似体の合成のための無機または非生物学的プロセスは、例えばＣｒｏｍｂｉｅら（Ｊ．ＣＨＥＭ  ＳＯＣ．，１０２５−２７（１９５５））によって報告されており、これは、赤唐辛子の有効成分であるカプサイシン、Ｎ−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジル）−８−メチルノン−トランス−６−エナミドの明確な合成を説明している。他の有機経路は、ＬａＨａｎｎらに対して発行された米国特許第４，４９３，８４８号、およびＣｈｅｎらに対して発行された米国特許第５，０９４，７８２号において示されている。
【００８５】
カプサイシノイドは、痛みを信号伝達すると考えられる小径求心性神経線維Ｃ繊維およびＡ−デルタ繊維に対するその選択的作用のため、実験ツールとして長い間使用されてきた。動物における研究から、カプサイシノイドは、カルシウムおよびナトリウム透過性のカチオンチャネルを開くことにより、Ｃ−繊維膜脱分極を誘引すると思われる。最近、カプサイシノイド効果のための受容体の１つがクローニングされている。
【００８６】
ほとんどの唐辛子において、バニリルアミンは、フェルリン酸、バニリン、および関連化合物を介してフェニルアラニンから形成され、カプサイシノイドは、カプサイシンシンターゼによりバニルアミンおよび分岐鎖肪酸から生成される（図１）。
【００８７】
合成生物学
遺伝子操作された微生物は、再生可能源からの薬物、化学物質およびバイオ燃料の生成のための益々重要なプラットホームとなってきている（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらのバイオ技術製品は、食品において使用される場合、現在の規制に従って食品セクターにおいて「天然」と標示され得る（Ｈａｕｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｎｃｈ，１９９７）。
【００８８】
例示的なカプサイシノイドとしては、これらに限定されないが、ノニバミド、Ｎ−バニリルノナンアミド、Ｎ−バニリルスルホンアミド、Ｎ−バニリルウレア、Ｎ−バニリルカルバメート、Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルキルアミド、メチレン置換Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルカンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］−シス−単飽和アルケンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］二不飽和アミド、３−ヒドロキシアセトアニリド、ヒドロキシフェニルアセトアミド、シュードカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシンＩ、アナンダミド、ピペリン、ジンゲロン、ワーバーガナル、ポリゴジアール、アフラモジアール、シンナモジアール、シンナモスモライド、シンナモライド、シバムド、ノニバミド、オルバニル、Ｎ−オレイル−ホモバニルアミジア、イソベレラル、スカララジアール、アンシストロジアール、およびこれらの任意の組み合わせまたは混合物が挙げられる。
【００８９】
以前に、脂肪酸およびバニリルアミン／バニリンの供給後に様々なカプサイシノイドが生成され得るＥ．ｃｏｌｉ発酵プラットホームが開発された（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。本明細書に記載のように、この系によるノニバミドの生成もまた可能である（図２）。
【００９０】
Ａｃｙｌ−ＣｏＡの生成：クローニング
出願人らは、ＡＣＳｌ−ｓｕｍｏ−Ｆ：ＣＧＣ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧおよびＡＣＳｌ−ｓｕｍｏ−Ｒ：ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＴのプライマーを使用して、ゴーストチリペッパーの緑色の果実のｃＤＮＡからＡＣＳＩ遺伝子を増幅した。結果として生じたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製し、直鎖ｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ  Ｋａｎ発現ベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）と混合した。ＤＮＡ混合物を使用して、ヒートショック（Ｌｕｃｉｇｅｎ）によってＨ１−コントロール１０Ｇ化学的コンピテント細胞を形質転換した。遺伝子挿入を完全に配列決定し、コードされたアミノ酸配列をＡＣＳｌのものと整列させた。以前に示されたように（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、これらの２つの配列は、既知のＣａｐｓｉｃｕｍ配列におけるＩｌｅ４７６がゴーストペッパーＡＣＳｌ（本明細書に記載の配列番号１）におけるバリン残基により置き換えられる置換突然変異のため、新規のものである。ゴーストペッパーＡＣＳｌの配列を使用して、アラビドプシスデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）およびホモログとして特定されたＬＣＡＳ４およびＬＣＡＳ５をブラストした。以前に示されたように、これらの３つの配列は、６６％の配列同一性および９２％の配列類似性を共有する。ＬＣＡＳ４およびＬＣＡＳ５は両方とも、脂肪酸およびグリセロ脂質代謝に関与する長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼとして生化学的に特徴付けられている（Ｓｈｏｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ  ａｌ．，２００３）。近年、ＬＣＡＳ４は、アラビドプシスにおける花粉コート脂質の形成に必要であることが実証されている（Ｂｅｌｚａ  ａｎｄ  Ｊｅｓｓｅｎ，２００５）。
【００９１】
発現
出願人は、ｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ−ゴーストペッパーＡＣＳｌを使用して、ＨＩ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を形質転換し、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧにより１６℃で２０時間Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＡＣＳｌの発現を誘導した。融合タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラムにより精製した。ＡＣＳｌは、約７３．５Ｋｄの分子量を有し、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯタグのサイズは、約１２Ｋｄである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ゴーストペッパーＡＣＳｌ融合タンパク質は、予測サイズ近くまで移動した。
【００９２】
生成物
出願人らは、ゴーストペッパーＡＣＳｌ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）の活性を測定するために、ＨＰＬＣベースの方法を使用した。簡潔に説明すると、反応混合物（４００μＥ）は、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣｏＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ、および２００μＭのカルボン酸を含有していた。２０の精製酵素を添加することにより反応を開始し［１］、３０分後に２０マイクロモル酢酸を添加することにより停止した。Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）１２０  ＣＩ８逆相カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；３μ、１２０Ａ、１５０×３ｍｍ）を使用したＵｌｔｉＭａｔｅ（著作権）３０００  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ＨＰＬＣを行った。移動相は、溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル）からなっていた。勾配溶出手順は以下の通りであった。０〜５分、５％のＢ；５から９分、５〜８０％のＢの直線勾配；９〜１１分、８０％のＢ；１１〜１２分、５％のＢ。流速は０．６ｍｌ／分であった。ダイオードアレイ検出器は、２００〜４００ｎｍの範囲でデータを収集した。基質および生成物の検出および定量化のために、ピーク面積を２５７ｎｍで測定した。
【００９３】
図８に示すように、ＡＣＳ１は、カプリン酸（ＣＩＯ）との最高活性を有する長鎖カルボン酸に対して様々な培地中で活性を有した。対照的に、ＡＣＳ１は、酢酸（Ｃ２）または酪酸（Ｃ４）短鎖カルボン酸に対してはいかなる活性も示さなかった。
【００９４】
次いで出願人は、ＡＣＳ１活性をアッセイするための基質として、８−メチル−トランス−６−ノネン酸（６Ｅ）、カプサイシノイド生合成経路における内因性中間体またはその還元生成物、８−メチルノナン酸（８Ｍ）を使用した。図２に示されるように、ＡＣＳ１は両方の基質との活性を示し、６Ｅに対してより高い活性を有していた。出願人らは、生成物ピークに対して対応するＨＰＬＣ分画を収集し、さらなるＭＳ／ＭＳ特定のためにそれらをＳｐｅｅｄＶａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ上で乾燥させた。
【００９５】
生成物の確認
メタノール：水：アセトニトリル緩衝液。ＴｒｉＶｅｒｓａ  Ｎａｎｏｍａｔｅ（登録商標）（Ａｄｖｉｏｎ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）を使用した直接注入に、１０μＥを使用した。質量分析計、ＬＴＱ  −Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を陰イオン化モードで操作した。ＭＳ調査スキャンは、３００〜２，０００ｍ／ｚの質量範囲からＦＴ細胞内で実行した。分解能は、４００ｍ／ｚで６０，０００に設定された。ＣＩＤ断片化をＭＳ／ＭＳに使用し、検出をイオントラップで１．５ｍ／ｚの単離ウィンドウで行った。断片化は、３５％の正規化された衝突エネルギーで行った。以前に示されたように、ＭＳデータは、それぞれ、８−メチル−トランス−６−ノネノイル−ＣｏＡおよび８−メチルノナノイル−ＣｏＡの分子量に一致した。
【００９６】
８−メチルノナン酸に対するＡＣＳ１の最適ｐＨも調査した。アセテート、ホスフェート、トリス、およびグリシン／ＮａＯＨ緩衝液を使用して、４．０〜１０．５のｐＨ範囲を提供した。ＡＣＳ１の光学ｐＨは、約９．５である。したがって、出願人は、カプサイシンシンターゼの基質を提供するゴーストホットペッパー中の新規の培地／長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼを特定した。加えて、新規の酵素はまた、中鎖脂肪酸誘導体を作製するためのバイオ燃料産業における用途も有し得る。
【００９７】
Ｃ．  ｒｏｓｅｕｓからのＣａＵＧＴ２の添加によるノルジヒドロカプサイシンの生成
本発明によれば、様々な選択されたカプサイシノイドは、選択された出発材料を使用して生成され得る。本発明はまた、特定の酵素を使用することによる特定のカプサイシノイド化合物の生成を提供する。このプロセスにより、出願人は、医薬、食品、および芳香剤用途が完全に確定され、可溶化および投薬を補助するために改変が行われ得るように、以前には不可能であった量で、特定の、および所望のカプサイシノイドを生成することができる。
【００９８】
本発明によれば、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓの培養細胞によるカプサイシンおよび８−ノルジヒドロカプサイシンのグリコシル化が報告されている（Ｓｈｉｍｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。しかしながら、この特定の活性に関与する遺伝子は以前に特定されていない。他の研究者（Ｋａｍｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４））は、Ｃ．ｒｏｓｅｕｓからのＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ、ＣａＵＧＴ１およびＣａＵＧＴ２をコードする２つの遺伝子を特定し、それらがクルクミンからのクルクミンモノグルコシドの形成、およびクルクミンモノグルコシドからクルクミンジグルコシドへの変換を触媒することを実証したが、カプサイシノイド活性については言及していない。実際には、これらの著者は、カプサイシンに対するＣａＵＧＴ２の活性も試験したが、それはカプサイシンをグリコシル化できないことが分かった（Ｋａｍｉｎａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。しかしながら、本発明によれば、ＣａＵＧＴ２がカプサイシングルコシドの形成を触媒できることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において実証された。
【００９９】
本発明によれば、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ  ＣａＵＧＴ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ１５９２１３．１）が合成され、Ｅ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化され、ｐＤＥＳＴ１７ベクター内にクローニングされた（表５を参照されたい）。得られたｐＤＥＳＴ１７−ＣａＵＧＴ２プラスミドを使用して、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。形質転換培養物を、まずＯＤ６００＝０．４までＬＢ（ＡＭＰ＋）培地中で３７℃で成長させ、次いで１６℃に冷却し、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、ＣａＵＧＴ２タンパク質の発現を誘導した。誘導から１６時間後に細胞を遠心分離によって回収し、可溶性タンパク質を  Ｂ−ＰＥＲ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により製造者の説明に従って抽出し、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによりさらに精製した（図６）。この改変酵素の使用は、対象となるカプサイシノイドを生成し得ることが確定された（図７〜１０）。
【０１００】
加えて、カプサイシン−ｇｌｕおよびノニバミド−ｇｌｕの生成のために、それぞれＣａＵＧＴ２を過剰発現するＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）培養物を約５ｍｇ／Ｌの力価で使用して、カプサイシンおよびノニバミドのｉｎ  ｖｉｖｏバイオ形質転換を行った。さらに、７Ｍ−ＣＰの脂肪酸鎖を、脂肪酸、７−メチルオクタン酸（７Ｍ）またはイソペラルゴン酸から誘導した。７Ｍをこの培養系に供給すると、７Ｍ−ＣＰが生成された（図９および１０）。図９に示されるように、７Ｍ−ＣＰの保持時間（１０．０７７分）は、Ｃ９−ＣＰの保持時間（１０．１９０分）とは若干異なり、それらのＵＶスペクトルがほぼ同一である（図９中の挿入写真を参照されたい）。培養物中の７Ｍ−ＣＰおよびＣ９−ＣＰのレベルも定量化された（図１０）。７Ｍ−ＣＰの力価は、Ｃ９−ＣＰの力価より若干低い。
【０１０１】
カプサイシノイドの生成
図２に示されるように、我々の培養系は、ＣＰの力価と同様のＣＰ９力価を有していたが、ＣＰ８およびＣＰ１０の力価が若干低かった。ＨＰＬＣでは、ＣＰ８（Ｎ−バニリオクタミド）、ＣＰ９（ノニバミド）またはＣＰ１０（Ｎ−バニリルデカンアミド）は、それぞれ１０．９、１１．３および１１．８分の保持時間を有していた。しかしながら、それらのＵＶスペクトルは互いに非常に類似している（図３）。ＣＰ９の保持時間およびＵＶスペクトルは、ノニバミド標準のものと非常に良好に一致する（図４）。
【０１０２】
Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）１２０  Ｃ１８逆相カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；３μ、１２０Å、１５０×３ｍｍ）を使用したＤｉｏｎｅｘ−ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ＨＰＬＣを行った。移動相は、溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル）からなっていた。勾配溶出手順は以下の通りであった。０〜５分、５％のＢ；５から９分、５〜８０％のＢの直線勾配；９〜１１分、８０％のＢ；１１〜１２分、５％のＢ。流速は０．６ｍｌ／分であった。ダイオードアレイ検出器は、２００〜４００ｎｍの範囲でデータを収集した。基質および生成物の検出および定量化のために、ピーク面積を２８０ｎｍで測定した（図３および４）。
産業上の利用可能性／技術分野の記述
【０１０３】
本開示は、食品、医薬、および薬理学的産業における利用可能性を有する。本開示は、一般に、改変微生物株を介したカプサイシノイドの生合成生成のための方法に関する。
明細書中で参照される表
表１．ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１およびＣＳのアミノ酸配列。
2019528685.tif 000003
上記のタンパク質配列において、ＡＣＳは、配列番号１とみなされ、ＣＳは、配列番号２とみなされるものとする。
表１（続き）ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳｌおよびＣＳの核酸配列。
2019528685.tif 000004
2019528685.tif 000005
上記の核酸配列において、ＡＣＳは、配列番号３とみなされ、ＣＳは、配列番号４とみなされるものとする。
表２．
2019528685.tif 000006
表３．特定のカプサイシノイドの生成のための供給スケジュール
2019528685.tif 000007
表４．カプサイシノイド試料の１３Ｃ同位体分析
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＊実験で使用されるチャイニーズファーンから採取される
表５．コドン最適化ＣａＵＧＴ２の配列
2019528685.tif 000009
上記のＣａＵＧＴ２の核酸およびアミノ酸配列において、ＤＮＡは、配列番号５とみなされ、タンパク質配列は、配列番号６とみなされるものとする。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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