(57)【要約】  本発明は、抗哺乳動物ＡＭＨ抗体を調製するための方法に関し、この方法は：（ｉ）ＡＭＨポリペプチド又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで動物を免疫化する工程であって、前記ＡＭＨポリペプチドが、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で５６０個のアミノ酸を含む、工程、（ｉｉ）免疫原を受けた動物のリンパ器官の細胞からハイブリドーマを調製する工程、（ｉｉｉ）配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識するが、（ａ）配列番号１３の配列又は配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１３１個のアミノ酸、及び配列番号１１の配列又は配列番号１１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で１５６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドも、（ｂ）配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置するいずれの線状エピトープも認識しない抗体を分泌するハイブリドーマを選択する工程、並びに（ｉｖ）前記抗体を生成する工程を含む。本発明は、抗体及び抗体断片と、特に受胎能において、ＡＭＨをアッセイするうえでのその使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗哺乳動物ＡＭＨ（哺乳動物抗ミュラー管ホルモン）抗体を調製するための方法であって：
（ｉ）ＡＭＨポリペプチド又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで動物を免疫化する工程であって、前記ＡＭＨポリペプチドが、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で５６０個のアミノ酸を含む、工程、
（ｉｉ）免疫原を受けた動物のリンパ器官の細胞からハイブリドーマを調製する工程、
（ｉｉｉ）配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識するが、（ａ）配列番号１３の配列又は配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１３１個のアミノ酸、及び配列番号１１の配列又は配列番号１１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で１５６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドも、（ｂ）配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置するいずれの線状エピトープも認識しない抗体を分泌するハイブリドーマを選択する工程、並びに
（ｉｖ）前記抗体を生成する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
使用される免疫原が、配列番号１０の配列又は配列番号１０の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも２３０個のアミノ酸、及び配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸を含み、好ましくは配列番号８、配列番号９及び配列番号１０の配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のＡＭＨポリペプチドから選択される、ＡＭＨポリペプチド、又は前記ＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の抗ＡＭＨ抗体を調製するための方法。
【請求項３】
使用される免疫原が、配列番号４の配列又は配列番号４と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも５３５個のアミノ酸を含み、好ましくは配列番号２、配列番号３及び配列番号４の配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のＡＭＨポリペプチドから選択される、ＡＭＨポリペプチド、又は前記ＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の抗ＡＭＨ抗体を調製するための方法。
【請求項４】
抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）が、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される配列及びこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のポリペプチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＡＭＨ抗体を調製するための方法。
【請求項５】
配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列が、配列：配列番号２１、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４から選択される、請求項４に記載の抗ＡＭＨ抗体を調製するための方法。
【請求項６】
抗体によって認識されない線状エピトープ（ｂ）が配列番号４５から配列番号５６の配列である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗ＡＭＨ抗体を調製するための方法。
【請求項７】
−哺乳動物はヒトであり、免疫原は、配列番号１の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と、配列番号２の配列の最大で５６０個のアミノ酸とを含む、ＡＭＨポリペプチド又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号８の配列の最大で２５５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号１３の配列の少なくとも１３１個のアミノ酸と配列番号１１の配列の最大で１５６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はウマであり、免疫原は、配列番号１４の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と、配列番号１５の配列の最大で５７３個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１４の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号１９の配列の最大で２６５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号２２の配列の少なくとも１４４個のアミノ酸と配列番号２１の配列の最大で１６６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はイヌであり、免疫原は、配列番号２３の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と、配列番号２４の配列の最大で５７２個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号２３の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号２８の配列の最大で２６４個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号３１の配列の少なくとも１４４個のアミノ酸と配列番号３０の配列の最大で１６５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、或いは
−哺乳動物はウシであり、免疫原は、配列番号３２の配列の少なくとも１００個のアミノ酸と、配列番号３３の配列の最大で５７５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号３２の配列の少なくとも１００個のアミノ酸と配列番号３９の配列の最大で２７０個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号４４の配列の少なくとも１４６個のアミノ酸と配列番号４２の配列の最大で２７０個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドである、
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗ＡＭＨ抗体を調製するための方法。
【請求項８】
配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識するが、（ａ）配列番号１３の配列又は配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１３１個のアミノ酸、及び配列番号１１の配列又は配列番号１１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で１５６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドも、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置するいずれの線状エピトープも認識しない、抗哺乳動物ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片。
【請求項９】
認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）が、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のポリペプチドである、請求項８に記載の抗哺乳動物ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片。
【請求項１０】
配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列が、配列：配列番号２１、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４から選択される、請求項９に記載の抗哺乳動物ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片。
【請求項１１】
抗体によって認識されない線状エピトープ（ｂ）が配列番号４５から配列番号５６の配列を有する、請求項８から１０のいずれか一項に記載の抗哺乳動物ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片。
【請求項１２】
−哺乳動物はヒトであり、認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号８の配列の最大で２５５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号１３の配列の少なくとも１３１個のアミノ酸と配列番号１１の配列の最大で１５６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はウマであり、認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１４の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号１９の配列の最大で２６５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号２２の配列の少なくとも１４４個のアミノ酸と配列番号２１の配列の最大で１６６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はイヌであり、認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号２３の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号２８の配列の最大で２６４個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号３１の配列の少なくとも１４４個のアミノ酸と配列番号３０の配列の最大で１６５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、或いは
−哺乳動物はウシであり、認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号３２の配列の少なくとも１００個のアミノ酸と配列番号３９の配列の最大で２７０個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号４４の配列の少なくとも１４６個のアミノ酸と配列番号４２の配列の最大で２７０個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドである、
請求項９から１１のいずれか一項に記載の抗哺乳動物ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片。
【請求項１３】
（ｉ）請求項８から１２のいずれか一項に記載の抗ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片、又は請求項１から７のいずれか一項に記載の方法により調製される抗ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片、及び（ｉｉ）検出可能なシグナルの放出を生成することのできる標識を含むコンジュゲートであって、前記シグナルが、このコンジュゲートと生物学的試料のＡＭＨとの間の免疫反応を可視化するためのものである、コンジュゲート。
【請求項１４】
ＡＭＨを含みうる生物学的試料において、サンドイッチイムノアッセイ法により哺乳動物ＡＭＨを定量化するための方法であって：
−前記生物学的試料を二つのＡＭＨ結合パートナーと接触させる工程であって、前記パートナーの少なくとも一方が、請求項８から１２のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片であるか、又は請求項１から７のいずれか一項に記載の方法に従って調製された抗体又は抗体断片であるか、さもなければ請求項１３に記載のコンジュゲートである、工程、
−前記結合パートナーとＡＭＨとの間の結合により放出されるシグナルが存在する場合には、検出可能なシグナルの放出を生成できる標識を用いてそのシグナルを検出する工程、及び
−検出されたシグナルをＡＭＨ濃度へと変換する工程
を含む方法。
【請求項１５】
生物学的試料が、血液、血清又は血漿の試料である、請求項１４に記載の、ＡＭＨを定量化するための方法。
【請求項１６】
第２のＡＭＨ結合パートナーが、配列番号５７の配列又は配列番号５７と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１９６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識するが、（ａ）配列番号１０の配列又は配列番号１０の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも２３０個のアミノ酸、及び配列番号８の配列又は配列番号８と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドも、（ｂ）配列番号５７の配列又は配列番号５７と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置する線状エピトープも認識しない抗体である、請求項１４又は１５に記載の、ＡＭＨを定量化するための方法。
【請求項１７】
妊娠可能年齢の女性における卵巣機能不全に関連付けられる障害の診断の補助としての、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のＡＭＨを定量化するための方法の使用。
【請求項１８】
１２歳以上の若年女子及び女性における卵胞貯蔵を評価するうえでの補助としての、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のＡＭＨを定量化するための方法の使用。
【請求項１９】
性熟期前の男子における性的分化に関連付けられる障害を評価するうえでの補助としての、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のＡＭＨを定量化するための方法の使用。
【請求項２０】
請求項８から１２のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗体断片、又は請求項１から７のいずれか一項に記載の方法に従って調製された抗体若しくは抗体断片、及び／又は請求項１３に記載のコンジュゲートを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＭＨとしても知られる抗ミュラー管ホルモンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出の分野に関する。特に、本発明は、特に出産可能年齢の女性又は雌動物の受胎能に関する試験の文脈における、抗ＡＭＨ抗体の調製、抗ＡＭＨ抗体及びＡＭＨ濃度を決定するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨとしても知られる）は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）ファミリーの１４４ｋＤａの二量体型糖タンパク質であり、このファミリーは、増殖及び分化に作用する多数の因子を含んでいる。ＡＭＨは二量体型プロホルモンであり、ジスルフィド架橋によって結合された二つの同一のサブユニットからなる。このプロホルモンは、生物活性を獲得し、成熟したホルモンへと変換されるために、Ｃ末端の近くでタンパク質分解的切断を受ける。切断後、分子複合体は結合したままであり、出生から閉経までの卵巣予備能の変化を監視するために適した感度性能レベルを可能にするイムノアッセイにより血中でアッセイすることができる（Kelsey TW, et al., 2011）。このタンパク質はＭＩＦ（ミュラー管抑制因子）、ＭＩＨ（ミュラー管抑制ホルモン）及びＭＩＳ（ミュラー管抑制物質）としても知られている。
【０００３】
ＡＭＨはすべての動物中に存在する。そのアミノ酸の長さ及び配列は種に依存する。即ち、ヒトＡＭＨは５６０個のアミノ酸を有し、短いシグナルペプチド（アミノ酸１−１８）、前駆体部分（アミノ酸１９−２５）、Ｎ末端部分（アミノ酸２６−４５１）及びＣ末端部分（アミノ酸４５２−５６０）から作られている。ウマＡＭＨは５７３個のアミノ酸を有し、短いシグナルペプチド（アミノ酸１−２２）、Ｎ末端部分（アミノ酸２３−４５１）及びＣ末端部分（アミノ酸４６５−５７３）から作られており、前駆体部分は含まない。イヌＡＭＨは５７２個のアミノ酸を有し、短いシグナルペプチド（アミノ酸１−２１）、Ｎ末端部分（アミノ酸２２−４６３）及びＣ末端部分（アミノ酸４６４−５７２）から作られており、前駆体部分は含まない。ウシＡＭＨは、その一部に５７５個のアミノ酸を有し、短いシグナルペプチド（アミノ酸１−１７）、前駆体部分（アミノ酸１８−２４）、Ｎ末端部分（アミノ酸２５−４６６）及びＣ末端部分（アミノ酸４６７−５７５）から作られている。種に関係なく、ＡＭＨのＮ末端部分は「プロ領域」と呼ばれ、Ｃ末端部分は「成熟領域」と呼ばれる。
【０００４】
ＡＭＨは、シグナルペプチドとそれに続くプレプロホルモン（ヒト及びウシの場合）又はプロホルモン（ウマ又はイヌの場合）とを含むポリペプチド前駆体の形態に合成される。小胞体へのトラフィッキングを可能にするシグナルペプチドは、転座に続いて切断される。小胞体中で、ポリペプチド前駆体は翻訳語修飾、即ちその天然立体配座に到達するための（ｉ）ホモ二量体化及び（ｉｉ）グリコシル化を受ける。ヒトにおいて、これはアミノ酸２６−５６０に対応する１４４ｋＤａの二量体型糖タンパク質である。ヒトの７２ｋＤａの各単量体は、プロ領域（ヒトの場合５８ｋＤａ）とそれに続く成熟領域（ヒトの場合１２ｋＤａ）とを含む。細胞外の媒質及び血流に分泌される前に、ＡＭＨ糖タンパク質には切断により最終的な翻訳後成熟が起こる。即ち、ヒト及びウシにおいては、プレプロホルモンが前駆体部分の切断によりプロホルモンに変換される。プロホルモンも、成熟ホルモン（生物活性を有する）を取得するためにＮ末端部分とＣ末端部分との間で切断される。しかしながら、これら二つの部分は非共有結合的に結合したままである（Zec I., et al., 2011）。ヒトにおいては、研究によってさまざまな度合いの切断が報告されており、Zec et al.により５％から２０％が、Pankhurst et al. （2016）により、男子の場合６７％及び女性の場合８１％が、それぞれ報告されている。そのため、切断ＡＭＨと非切断ＡＭＨが血流中に見られる。
【０００５】
ＡＭＨは、セルトリ細胞により男性に生成され、その生命の開始期において男性生殖管の分化に関与する。女性においては、ＡＭＨは、増殖する小卵胞の顆粒膜細胞によって生成されるため、男性とは異なり性熟期から始まる。したがって、女性の場合、ＡＭＨは特に受胎能に関与する様々な分野において、それ自体が有用であることが分かっている（Dewailly D, et al. 2014）。例えば、循環するＡＭＨのアッセイにより、周期とは無関係に卵巣中に存在する胞状及び前胞状卵胞の数を推定することができる（Dewailly D, et al., 2014）。さらに、卵巣予備能の自然な低下、したがって不妊の固有リスクの指標として、女性が自身の妊娠計画を管理する上で助けとするためにＡＭＨをアッセイすることの必要性が示されている。生殖補助医療の面で、ＡＭＨのアッセイは、特に卵巣を制御下で刺激する工程を最適化すると同時に過刺激を回避することにより、患者にとって最良の戦略を選択することに寄与する（Arce JC, et al., 2014）。ＡＭＨのアッセイは、例えばがんの場合に性腺刺激治療を受けた若年女子又は女性における卵巣予備能の変化を監視することも可能にする（Chai J and Howie AF., 2014）。排卵障害を有する女性の場合、血清ＡＭＨレベルを決定することにより、卵巣の機能不全の種類、特に多嚢胞性卵巣症候群といった卵巣不全に関連付けられる性腺刺激ホルモン過剰無排卵をよりよく特徴付けることが可能になる（Fong SL, et al., 2015）。若年男子において、ＡＭＨは、新生の胎児の睾丸により極めて大量に生成され、即ち男性生殖管の分化に早くから関与している。したがって、ＡＭＨをアッセイすることは、性的分化に関連付けられる障害に関して、性熟期前の男子に有用であることが分かっている。
【０００６】
ＡＭＨのアッセイは、サンドイッチイムノアッセイ法によって実施され、同時に感受性で、特異的で、且つ再現可能である試験の使用を必要とする。しかしながら、文献に提案される種々の方法（Hudson, 1990; Long, 2000）や、それ以外の市販の様々なキットがあるとはいえ、これら特性のすべてを結合するアッセイは依然として存在しない。解決するべき主な困難性の一つは、１９９６年に既に同定されており、それは生物学的試料中におけるＡＭＨの見掛け上の安定性の欠如である。即ち、貯蔵条件（時間、継続時間、冷凍周期など）により、測定される濃度に変動が生じうる（Lee, 1996）。このような変動は、言うまでもなく人工産物であり、生物学的結果の不正確な解釈を招きうる。
【０００７】
様々なキットが市販されている。これらキットに使用される抗体は、ＡＭＨの異なる領域を認識する。ＡＭＨアッセイの第１世代はＥＩＡ／ＭＩＳ／ＡＭＨ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）及びＡｃｔｉｖｅ  ＭＩＳ／ＡＭＨ  ＥＬＩＳＡキット（ＤＳＬ）に相当する。これらキットに使用される抗体は、同じものではないが、各々がＡＭＨのプロ領域を認識する第１の抗体を使用し、他方の抗体は成熟領域を認識する。２０１０年に、それらキットを販売するＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社は、それらを、同社によれば性能レベルが向上した第２世代のキット（ＡＭＨ  Ｇｅｎ  ＩＩ  Ａｓｓａｙ）で置き換えた。実際、作製者によれば、このキットは高度に特異的であり、使用される二つのモノクローナル抗体はそれぞれ成熟領域を認識するため、測定されるＡＭＨはタンパク質分解による影響を受けないと思われる（Kumar, 2015；米国特許第７８９７３５０号）。作製者の考えでは、複数のシステイン残基を含む成熟領域は、タンパク質分解が起こる際にはプロ領域より安定しているであろうとのことであった。常套的臨床用途において現場で用いてみると、ＡＭＨ  Ｇｅｎ  ＩＩキットは約束されたようなものではないことがすぐに判明した。過去にさかのぼって広く調べたところ、試料管を貯蔵するための条件の観点からＡＭＨアッセイの安定性の欠如が確認され（Rustamov O, 2012）、ＡＭＨ  Ｇｅｎ  ＩＩキットがそれら変動に極めて感受性であることが示された。観察される変動を説明するために複数の仮説が提案された。可能な解釈の一つは、血液試料が採取された後でＡＭＨ分子が個体によって異なりうる配座変化を経るという事実に関連している。
【０００８】
このような結果は、独立のチームにより迅速に反復されて確認された（Xan et al., 2014）。さらに、このチームは、試料の貯蔵期間におけるＡＭＨの安定性を助長するための解決法について記載した。即ち、彼らは、Ｇｅｎ  ＩＩによるＡＭＨアッセイの全般的再現性を向上させることができる、アッセイ前の前希釈を実施した。しかしながら、この解決法は、実施が容易であると認められるものの、いくつかの欠点を有している。即ち：
（ｉ）前希釈の後で測定されるＡＭＨ濃度が上昇する。この上昇は、個体によって異なる（利用可能なデータによれば１．３５倍から３．０６倍）。したがって、広いコホートにわたって実験により参照値を再定義し、さらには臨床的解釈のルールを再定義することが必要である。
（ｉｉ）実施される希釈は無視できるものでない（１／５、即ち３００μｌｌのバッファー中６０μｌｌの試料）。この解決法は確かに観察される干渉をなくすことができるが、その結果多くの臨床使用にとって重要なアッセイの感度の低下を招く。
（ｉｉｉ）ＡＭＨ不安定性の理由が依然として特定されていない。結果として、希釈がすべての試料について安定性の欠如という問題を解決すると確信することはできない。
【０００９】
さらに、Lukaszuk et al. （2014）は、ＡＭＨ  Ｇｅｎ  ＩＩ  Ａｓｓａｙキットによって測定される平均ＡＭＨ濃度の低下及び感度の低下について記載している。彼らの結論は、「Ｇｅｎ  ＩＩキットの結果に基づいて刺激プロトコールを実施することは極めて危険である」ということである。
【００１０】
したがって、試料の採取からアッセイの実施までの時間に関係なく、且つ貯蔵条件に関係なく（分析前条件とは無関係の用量）測定されるＡＭＨ濃度が正確且つ再現可能な頑強なキットを提供することが必須である。
【００１１】
親出願である国際公開第２０１４／０７４８３５号は、特定のアイソフォーム又はアイソフォームによる変化が臨床的に意味を持ちうるかどうかを決定するために、様々なＡＭＨアイソフォーム（二量体型ＡＭＨのみ、非切断ＡＭＨ、切断後再会合されたＡＭＨなど）をアッセイするための様々な方法を提案している。即ち、この出願は、ＡＭＨのプロ領域又は成熟領域内に位置する多数の線状エピトープに対して向けられた抗体について記載している。開示される組成物及び方法が、正確且つ再現可能で標準化されたアッセイの要件に対応するとの主張がなされている。この出願は、１８のエピトープ、即ちこれらエピトープを認識する抗体を組み合わせることによりサンドイッチイムノアッセイ法を構築するための即ち合計で３２４（１８×１８）の方法を開示する。様々なＡＭＨアッセイに生じる多数の分析前の問題を考慮すると、実験による実証なしに、これらエピトープの組み合わせ、即ち抗体の組み合わせの各々が頑強な試験を取得することを可能にすると信じることは難しい。さらに、この親出願のデータはいずれも、記載される抗体の使用が、頑強、正確、再現可能で標準化された、特にその結果が分析前の条件とは無関係な、一般の医療行為に使用できるアッセイを可能にすることを示すものではない。この出願に含まれる唯一のデータは、「単一のエピトープサンドイッチ又はＳＥＳ」型のアッセイ、即ち捕捉及び検出のために同じモノクローナル抗体を使用するアッセイに基づく安定性データに関するものである。さらに、これら試験はＡＭＨのダイマー形態のみを検出し、その臨床的利益は現在のところ未知である（測定される濃度が、一般の医療行為に用いられるものである総ＡＭＨアッセイで得られる濃度とは極めて異なるため）。
【発明の概要】
【００１２】
本出願人は、予期せずに、非線状エピトープのみを、特にＡＭＨのプロ領域のメジアン部分（ヒトのアミノ酸１５７〜２５５）に位置するＡＭＨの特定のゾーン内において認識する新規の抗体を調製することにより、先行技術の欠点を克服できることを発見した。この抗体は、一般の医療行為に使用することが可能で、試料の分析前条件又は貯蔵条件に関係なく頑強且つ正確で再現可能な、安定で信頼できるＡＭＨアッセイの実施を可能にする。切断ゾーンを有すると記載されている（国際公開第２０１４／０７４８３５号）ＡＭＨのこの特定のゾーンを選択するうえで、驚くべきことに且つあらゆる予想に反して、規定されたゾーンから非線状エピトープを認識するこれら抗体を用いたＡＭＨのアッセイは、生物学的試料中に存在する生物学的利益を有するすべてのＡＭＨを検出する。
【００１３】
したがって、本発明の第１の課題は、抗哺乳動物ＡＭＨ（抗ミュラー管ホルモン）抗体を調製するための方法に関し、この方法は、
（ｉ）ＡＭＨポリペプチド又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで動物を免疫化する工程であって、前記ＡＭＨポリペプチドが、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で５６０個のアミノ酸を含む、工程、
（ｉｉ）免疫原を受けた動物のリンパ器官の細胞からハイブリドーマを調製する工程、
（ｉｉｉ）配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識するが、（ａ）配列番号１３の配列又は配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１３１個のアミノ酸、及び配列番号１１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で１５６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドも、（ｂ）配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置するいずれの線状エピトープも認識しない抗体を分泌するハイブリドーマを選択する工程、並びに
（ｉｖ）前記抗体を生成する工程
を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の第２の課題は、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識するが、（ａ）配列番号１３の配列又は配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１３１個のアミノ酸、及び配列番号１１の配列又は配列番号１１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で１５６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドも、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置するいずれの線状エピトープも認識しない抗哺乳動物ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片に関する。
【００１５】
本発明の第３の課題は、（ｉ）上記に規定される又は上記に規定される方法に従って調製された抗ＡＭＨモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片、及び（ｉｉ）検出可能なシグナルの放出を生じさせることができる標識を含むコンジュゲートに関し、前記検出可能なシグナルは、このコンジュゲートと生物学的試料のＡＭＨとの間の免疫反応を可視化する。
【００１６】
本発明の第４の課題は、ＡＭＨを含みうる生物学的試料において、サンドイッチイムノアッセイ法により哺乳動物ＡＭＨを定量化するための方法に関し、この方法は、
−前記生物学的試料を二つのＡＭＨ結合パートナーと接触させる工程であって、前記パートナーの少なくとも一方が、上記に規定される又は上記に規定される方法に従って調製された抗体又は抗体断片であるか、さもなければ上記に規定されるコンジュゲートである、工程、
−前記結合パートナーとＡＭＨとの間の結合により放出されるシグナルが存在する場合には、検出可能なシグナルを放出することのできる標識を用いてそのシグナルを検出する工程、並びに
−検出されたシグナルをＡＭＨ濃度へと変換する工程
を含む。
【００１７】
本発明の第５の課題は、妊娠可能年齢の女性における卵巣機能不全に関連付けられる障害の診断の補助としての、又は１２歳以上の若年女子及び女性における卵胞貯蔵の評価の補助としての、さもなければ性熟期前の男子における性的分化に関連付けられる障害の評価の補助としての、上記に規定されるＡＭＨを定量化するための方法の使用に関する。
【００１８】
終わりに、本発明の最後の課題は、上記に規定される又は上記に規定される方法に従って調製された抗体又は抗体断片、さもなければ上記に規定されるコンジュゲートを含むキットに関する。
【００１９】
本発明者は、予期せずに、その調製過程で抗ＡＭＨモノクローナル抗体を選択するためにＡＭＨのプロ領域のメジアン部分を使用すると同時に、この部分の線状エピトープを認識する抗体を廃棄することにより、このように選択されたこれら抗体がＡＭＨのアッセイに使用されるときには、信頼性及び再現性のあるアッセイを可能にすることを発見した。
【００２０】
抗原決定基としても知られるエピトープは、パラトープによって認識されうる抗原の最小部分であり、抗体の可変部分である。エピトープの構造は抗体のパラトープと相補性である。含まれる構造は、連続エピトープ（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ又はｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ）としても知られる線状エピトープの場合、重要な（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｉｖｅ）アミノ酸を含むため一次構造であるか、又は非線状エピトープとしても知られる不連続エピトープである場合には三次構造でありうる。本件の場合のように抗原がタンパク質の性質を有するとき、線状エピトープは可変長のペプチド配列に相当する。
【００２１】
線状エピトープの配列は、特異性の観点からエピトープと抗体との間の結合を有意に変更することのない「保存的」修飾を含むことができる。
【００２２】
したがって、本発明の方法に従って調製された抗体は、ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分の線状エピトープを認識しないが、このメジアン部分は認識する。
【００２３】
「ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分を認識するモノクローナル抗体」という表現は、抗体が、この部分が存在するときにはＡＭＨに、例えばＡＭＨ全体に結合できるが、この部分が存在しないときはＡＭＨポリペプチドに結合できないことを意味する。
【００２４】
理論に拘束されることを望むものではないが、帰納的な一の仮説として、抗体が向けられるＡＭＨのプロ領域のメジアン部分は、アッセイされる生物学的試料、例えば血漿中において、ＡＭＨがタンパク質分解を受けるゾーンに対応し、このゾーンはその元の立体配座に明らかに存在したままであるか、さもなければその立体配座が分子の周囲のゾーンに影響を与える修飾によって影響されないと考えることができる。
【００２５】
そのＡＭＨのプロ領域のそれらのメジアン部分に対する抗体を生成することが望ましい哺乳動物は、ＡＭＨのアッセイが補助となるあらゆる哺乳動物である。例として、ヒト（男子を含む女性及び男性）、ウマ（特に雌）、イヌ（特に雌）、ウシ、ヒツジ種のメンバー、及びネコのファミリーを挙げることができる。
【００２６】
哺乳動物によって分泌されるＡＭＨは、同一ではないが、近い。少なくとも７５％の配列同一性が、ヒトＡＭＨと、ＡＭＨのアッセイが補助となる他の哺乳動物のＡＭＨとの間に観察される。本発明において標準とするＡＭＨはヒトＡＭＨである。
【００２７】
二つ以上のポリペプチド配列の文脈における用語「同一性」又は「パーセント同一性」は、比較される二つの配列が、最大に対応するように整列されたとき、整列されうる最大長において同一である特定のパーセンテージのアミノ酸残基を有することを意味する。このような整列及びパーセント同一性の計算は、配列比較アルゴリズム及び／又はソフトウエア（Ｅｍｂｏｓｓ  Ｎｅｅｄｌｅ、ＬＡｌｉｇｎ、Ｂｌａｓｔ、Ｃｌｕｓｔａｌなど）を用いて、又は単純には目視検査により、行うことができる。
【００２８】
先述のように、ＡＭＨはプロ領域及び成熟領域からなる。ヒトにおいて、プロ領域は４５１位で終わり、成熟領域は４５２位で始まる。本発明により調製された抗体によって認識されるＡＭＨのプロ領域のメジアン部分は、ヒトにおいて、１５７位で始まり２５５位で終わる。これは配列番号１の配列の９９個のアミノ酸からなる。ウマの場合、本発明により調製された抗体によって認識されるＡＭＨのプロ領域のメジアン部分は、１６７位で始まり、２６５位で終わり、配列番号１４の配列の９９個のアミノ酸に対応する。本発明により調製された抗体によって認識されるイヌＡＭＨのプロ領域のメジアン部分は、部分的に、１６６位で始まり、２６４位で終わり、配列番号２３の配列の９９個のアミノ酸に対応する。ウシに関しては、本発明により調製された抗体によって認識されるＡＭＨのプロ領域のメジアン部分は、１７１位で始まり、２７０位で終わり、配列番号３２の配列の１００個のアミノ酸に対応する。
【００２９】
これら特定の有利な抗ＡＭＨ抗体を生成するために、本発明の方法は、第１の工程として、動物を免疫原で免疫化することを含む。この免疫原は、ＡＭＨポリペプチド又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、少なくとも抗体が間違いなく認識するゾーン、即ち少なくともＡＭＨのプロ領域のメジアン部分を含んでいなければならない。したがって、使用される免疫原は、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸を含む。
【００３０】
免疫原はまた、最大で、問題の種のＡＭＨ全体又は問題の種のＡＭＨ全体をコードするポリヌクレオチド、即ち、ヒトＡＭＨの場合、配列番号２（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号ＫＢ  Ｆ２ＹＭＭ５）の配列の５６０個のアミノ酸を含み、他のＡＭＨは配列番号２の配列と少なくとも７５％の同一性を有する。例えば、ウマのＡＭＨ全体ポリペプチドは、配列番号１５（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号ＫＢ  Ｆ２ＹＭＭ５）の配列の５７３個のアミノ酸を含み、イヌのＡＭＨ全体ポリペプチドは、配列番号２４（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号ＫＢ  Ａ０Ａ０Ｅ３Ｎ０Ｉ３）の配列の５７２個のアミノ酸を含み、ウシのＡＭＨ全体ポリペプチド（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号ＫＢ  Ｐ０３９７２）は配列番号３３の配列の５７５個のアミノ酸を含む。
【００３１】
特定の一実装態様によれば、使用される免疫原は、ＡＭＨ全体配列に対し、ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分の後に位置するすべてのアミノ酸を欠くＡＭＨポリペプチド、又はこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、即ち、少なくとも配列番号１０の配列又は配列番号１０の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の２３０個のアミノ酸と、配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸とを含み、好ましくは配列番号８、配列番号９及び配列番号１０の配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のＡＭＨポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチド又は前記ＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。配列番号８の配列は、ヒトＡＭＨのアミノ酸１−２５５に対応し（ＡＭＨ−２と呼ばれる）、配列番号９の配列は、ヒトＡＭＨのアミノ酸１９−２５５、即ち、シグナルペプチドを含まない配列番号８の配列に対応し（シグナルペプチドを含まないＡＭＨ−２と呼ばれる）、配列番号１０の配列はヒトＡＭＨのアミノ酸２６−２５５、即ちシグナルペプチドを含まない配列番号８の配列又は前駆体部分に対応する（シグナルペプチド又は前駆体部分を含まないＡＭＨ−２と呼ばれる）。
【００３２】
別の実施態様によれば、使用される免疫原は、シグナルペプチドの全部又は一部と、任意選択的に前駆体部分の全部又は一部とを含むＡＭＨ全体に対応する、ＡＭＨポリペプチド、又はこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。したがって、ＡＭＨポリペプチドは、配列番号４の配列又は配列番号４と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも５３５個のアミノ酸を含み、好ましくは配列番号２、配列番号３及び配列番号４の配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のＡＭＨポリペプチドから選択される。配列番号２の配列はヒトＡＭＨのアミノ酸１−５６０に対応し、配列番号３の配列はヒトＡＭＨのアミノ酸１９−５６０、即ちシグナルペプチドを含まない配列番号２の配列に対応し、配列番号３の配列はヒトＡＭＨのアミノ酸２６−５６０、即ちシグナルペプチド又は前駆体部分を含まない配列番号２の配列に対応する。
【００３３】
別の実施態様によれば、使用される免疫原は、シグナルペプチドの全部又は一部と、任意選択的に前駆体部分の全部又は一部とを含むが成熟領域は含まないＡＭＨ全体に対応する、ＡＭＨポリペプチド、又はこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。したがって、ＡＭＨポリペプチドは、配列番号７の配列又は配列番号７と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも４２６個のアミノ酸と、配列番号５の配列又は配列番号５と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で４５１個のアミノ酸とを含み、好ましくは、配列番号５、配列番号６及び配列番号７の配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のＡＭＨポリペプチドから選択される。配列番号５の配列は、ヒトＡＭＨのアミノ酸１−４５１に対応し（ＡＭＨ−３と呼ばれる）、配列番号６の配列は、ヒトＡＭＨのアミノ酸１９−４５１、即ちシグナルペプチドを含まない配列番号５の配列に対応し（シグナルペプチドを含まないＡＭＨ−３と呼ばれる）、配列番号７の配列は、ヒトＡＭＨのアミノ酸２６−４５１、即ちシグナルペプチド又は前駆体部分を含まない配列番号５の配列に対応する（シグナルペプチド又は前駆体部分を含まないＡＭＨ−３と呼ばれる）。
【００３４】
以下の表（表１）は、本発明の状況において、特に一部の免疫源として有用な様々なＡＭＨポリペプチドを挙げて、哺乳動物の種によりアミノ酸の位置と対応する配列番号（括弧内）を示している。
【００３５】
2019528676.tif 000002
2019528676.tif 000003
ＮＡ＝問題のＡＭＨ中に前駆体部分が存在しないため該当しない
【００３６】
言うまでもなく、これら配列に記載されたアミノ酸に加えて、ポリペプチド形態であるときには、免疫原は他のポリペプチドの生成とその精製のために使用される他のアミノ酸、例えばポリヒスチジンテールも含むことができる。
【００３７】
ポリペプチドを生成するための方法は、当業者に広く知られている。例えば、ＡＭＨポリペプチドは、当業者に慣習的に知られている、以下の工程を用いる遺伝子工学により得ることができる：
−ＡＭＨポリペプチドをコードするＤＮＡを利用可能にする工程であって、前記ＤＮＡは一般的な方法により得られる工程、
−このＤＮＡを、クローニングにより、プラスミド、コスミド、λファージ又はウイルスベクター（バキュロウイルス（オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス）、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなど）といった発現ベクターに挿入する工程であって、このベクターが、宿主細胞中でのその増幅を可能にする複製開始点（プラスミドコスミドの）又は複製系及びタンパク質へと翻訳されるメッセンジャーＲＮＡの転写を可能にする一又は複数のプロモーターも含む、工程、
−発現させる対象の遺伝子を含むベクターを宿主細胞中に導入する工程であって、例えば、原核細胞（例えば細菌、例えば大腸菌、バシラスサチリス）中に形質転換又は感染により、又は真核細胞（例えば酵母（サッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ５細胞）、哺乳動物細胞（ＣＨＯ、２９３、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＢＨＫ−２１、Ｖｅｒｏなど））中に一過性又は持続性のトランスフェクション、さもなければウイルス感染により、導入する工程、
−発現ベクターを含む宿主細胞を、培養し、任意選択的に宿主細胞中のベクターの増幅により、任意選択的に増殖する工程、
−必要に応じて、組み換えＡＭＨポリペプチドの生成のための転写及びタンパク質合成を誘導すること、並びに
−例えばポリヒスチジンテールを用いて、前記ポリペプチドを抽出するために、精製する工程。ポリペプチドはその後組み換えと呼ばれる。
【００３８】
免疫原がポリヌクレオチドであるとき、遺伝子工学によりＡＭＨポリペプチドを調製するために使用されるものと同じＤＮＡが、例えば使用されるであろう。
【００３９】
免疫化のために使用される動物は、モノクローナル抗体を得るために通常使用されるいずれかの動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はヒツジなどである。
【００４０】
免疫化のための条件及びパラメータ、例えば免疫原濃度、免疫化モードなどは、既に１９７５年にKohler and Milsteinによって記載された手順、特にマニュアルCurrent protocols in Cell Biology （Yokoyama WM, 2001）を参照できる当業者に広く既知である。
【００４１】
本発明の方法の第２の工程は、一般的な工程であり、免疫原を受けた動物のリンパ器官、例えばスプリーン（ｓｐｌｉｎｅ）、リンパ節及び扁桃腺などの細胞からハイブリドーマを調製することからなる。このような工程は、いずれかのモノクローナル抗体生成マニュアルに記載されている。しかしながら、それぞれの種に適した融合パートナーを使用することが必要である。したがって、例えばマウスにはｃＧＰＳ ＣＨＯ−Ｓａ株を使用することができ、ウサギには２４０Ｅ−Ｗ株を使用することができ（米国特許第７４２９４８７号）、ヒツジにはＳＦＰ１株を使用することができる（国際公開第９２／１５６９９号）。
【００４２】
本方法の第３の工程は、得られたハイブリドーマの特定の選択からなる。これを行うために、まず、ハイブリドーマを、特にそれを増殖させるための栄養分と増殖因子とを含む、当業者に周知の適切な培地で培養する。次いで、対象の抗体を分泌するクローンを、標識を用いない直接的検出（抗原抗体反応後の自然沈殿）、間接的検出（例えばＥＬＩＳＡ又は他の種類のイムノアッセイ）、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））及び干渉法（オクテット）といった当業者に既知の技術により、抗体によって認識される抗原を用いて選択する。この工程の独創性は、特定のポリペプチド及びペプチドを用いる、順序を問わない２つの連続的スクリーニングにおいて実施することのできるハイブリドーマの特定の選択にある。
【００４３】
スクリーニング１と呼ばれる第１のスクリーニングは、先述のように、プロ領域のメジアン部分を認識する抗体を生成するハイブリドーマのみを保持することにある。しかしながら前記ゾーンは切断部位を有することがしられており、これは排除されなければならない。これを行うために、以下二つの方法が可能である：
方法１：
−まず、ＡＭＨ−２、即ち、ヒトＡＭＨ−２の場合、アミノ酸１−２５５（配列番号８）（適切である場合はシグナルペプチドの全部又は一部と前駆体部分の全部又は一部を含まない）、又はこの配列と少なくとも７５％の同一性を有する任意の配列を認識する抗体を分泌するハイブリドーマを選択する。一実施態様によれば、抗体によって認識されるＡＭＨ−２ポリペプチドは、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択される配列及びこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のポリペプチドである。
−次いで、ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分の前に位置するＡＭＨの部分、即ち、ヒトＡＭＨの場合、アミノ酸１−１５６（配列番号１１）（適切である場合はシグナルペプチドの全部又は一部と前駆体部分の全部又は一部を含まない）、及びこの配列と少なくとも７５％の同一性を有する任意の配列を認識する抗体を生成するハイブリドーマを廃棄する。このＡＭＨポリペプチドは、本発明により調製された抗体により認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）と呼ばれる。一実施態様によれば、抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される配列及びこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のポリペプチドである。配列番号１１の配列は、ヒトＡＭＨのアミノ酸１−１５６に対応し（ＡＭＨ−１と呼ばれる）、配列番号１２の配列は、ヒトＡＭＨのアミノ酸１９−１５６、即ちシグナルペプチドを含まない配列番号１１の配列（シグナルペプチドを含まないＡＭＨ−１と呼ばれる）に対応し、配列番号１３の配列はヒトＡＭＨのアミノ酸２６−１５６、即ちシグナルペプチド又は前駆体部分を含まない配列番号１１に対応する（シグナルペプチド又は前駆体部分を含まないＡＭＨ−１と呼ばれる）。
方法２：
−ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分、即ち、ヒトＡＭＨの場合、アミノ酸１５７−２５５（配列番号１）及びこの配列と少なくとも７５％の同一性を有する任意の配列を認識する抗体を分泌するハイブリドーマを選択する。
【００４４】
以下の表（表２）は、本発明の状況において有用な、認識されない様々なＡＭＨポリペプチド（ａ）を挙げて、動物の種によりアミノ酸の位置と対応する配列番号（括弧内）とを示している。
【００４５】
2019528676.tif 000004
ＮＡ＝問題のＡＭＨ中に前駆体部分が存在しないため該当しない
【００４６】
このように、特定の一実施態様によれば、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列が、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４の配列から選択される。
【００４７】
ＡＭＨポリペプチド（ａ）は、前述のように調製することができ、ＡＭＨに属さない他のアミノ酸を含むことができる。
【００４８】
スクリーニング２と呼ばれる第２のスクリーニングは、ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分、即ち配列番号１の配列又は配列番号１と７５％の同一性を有する任意の配列中の線状エピトープを認識する抗体を生成するハイブリドーマを廃棄することからなる。これらエピトープは線状エピトープ（ｂ）と呼ばれる。
【００４９】
アミノ酸配列上の線状エピトープの決定は当業者に周知である。これは、対象の配列を、所与の長さ、例えば１０、１２又は１５アミノ酸の重複ペプチドへと切断し、次いでこれらペプチドの中から、モノクローナル又はポリクローナル抗体によって認識されるものを同定することからなる。言うまでもなく、その定義のために、線状エピトープは対象の配列の連続するアミノ酸を有する。
【００５０】
以下の表（表３）は、本発明の状況において有用な、ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分に決定された様々な線状エピトープ（ｂ）を挙げて、哺乳動物の種による配列番号を示している。
【００５１】
2019528676.tif 000005
【００５２】
このように、一実施態様によれば、抗体によって認識されない線状エピトープ（ｂ）は、配列番号４５から配列番号５６の配列を有する。
【００５３】
先述のように、エピトープは一般的な方法により生成される。それらはペプチド合成によっても生成することができ、時にこれが好まれる。
【００５４】
特定の一実施態様は、選択工程（ｉｉｉ）のために少なくとも以下の特性を有する：
−スクリーニング１は方法１を使用する；
−スクリーニング１はスクリーニング２の前に実施される。
【００５５】
二つのスクリーニング工程の間に、必要に応じて、ハイブリドーマの上清に含まれる抗体を、一般的な技法、例えばプロテインＡに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。選択の実施後及び／又は必要に応じて、二つのスクリーニング工程の間に、安定且つ均一の株を保証するためにハイブリドーマをクローニングする。これは当業者に広く知られている。
【００５６】
本発明の方法の最後の工程は、当業者に周知であり、すべてのモノクローナル抗体生成マニュアル、例えばCurrent Protocols in Cell Biologyに記載されている工程である、対象の抗体の生成からなる。
【００５７】
その一般的手順が広く記載されている上記工程に加えて、本発明の方法は、洗浄、貯蔵及び抗体の断片への変換のための工程といった他の工程も含むことができる。
【００５８】
本発明の抗ＡＭＨ抗体調製方法では、免疫原（配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸と、配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で５６０個のアミノ酸とを含む、ＡＭＨポリペプチド又はこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）、ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分（配列番号１の配列、又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の、少なくとも９９個のアミノ酸と、配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチド）、対象の抗体によって認識されないポリペプチド（ａ）（配列番号１３の配列又は配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１３１個のアミノ酸と、配列番号１１の配列又は配列番号１１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で１５６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチド）、及び線状エピトープ（配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置する）は、好ましくは同じ種に属する。
【００５９】
一実施態様によれば：
−哺乳動物はヒトであり、免疫原は、配列番号１の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と、配列番号２の配列の最大で５６０個のアミノ酸とを含む、ＡＭＨペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号８の配列の最大で２５５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号１３の配列の少なくとも１３１個のアミノ酸と配列番号１１の配列の最大で１５６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はウマであり、免疫原は、配列番号１４の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と、配列番号１５の配列の最大で５７３個のアミノ酸とを含む、ＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１４の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号１９の配列の最大で２６５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号２２の配列の少なくとも１４４個のアミノ酸と配列番号２１の配列の最大で１６６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はイヌであり、免疫原は、配列番号２３の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と、配列番号２４の配列の最大で５７２個のアミノ酸とを含む、ＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号２３の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号２８の配列の最大で２６４個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号３１の配列の少なくとも１４４個のアミノ酸と配列番号３０の配列の最大で１６５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、或いは
−哺乳動物はウシであり、免疫原は、配列番号３２の配列の少なくとも１００個のアミノ酸と、配列番号３３の配列の最大で５７５個のアミノ酸とを含む、ＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号３２の配列の少なくとも１００個のアミノ酸と配列番号３９の配列の最大で２７０個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号４４の配列の少なくとも１４６個のアミノ酸と配列番号４２の配列の最大で２７０個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドである。
【００６０】
特に：
−哺乳動物はヒトであり、免疫原は、配列番号２から１０の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１及び配列番号８から１０の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号１１から１３の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はウマであり、免疫原は、配列番号１５から２０の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１４、１９及び２０の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号２１及び２２の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はイヌであり、免疫原は、配列番号２４から２９の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号２３、２８及び２９のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号３０及び３１の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチドであるか、或いは
−哺乳動物はウシであり、免疫原は、配列番号３３から４１の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号３２及び配列番号３９から４１の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチドであり、ハイブリドーマによって分泌される抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号４２から４４の配列のポリペプチドから選択されるＡＭＨポリペプチドである。
【００６１】
本発明の方法を用いて生成される抗体は、新規であり、同じ特性を維持する限り、別の方法によって生成されてもよい。したがって、本発明の別の課題は、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも９９個のアミノ酸、及び配列番号８の配列又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で２５５個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識するが、（ａ）配列番号１３の配列又は配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１３１個のアミノ酸、及び配列番号１１の配列又は配列番号１１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で１５６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドも、配列番号１の配列又は配列番号１の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置するいずれの線状エピトープも認識しない抗哺乳動物ＡＭＨモノクローナル抗体又は抗体断片に関する。
【００６２】
用語「モノクローナル抗体断片」は、それが得られた抗体と同じ免疫学的認識特性を有する抗体のいずれかの部分を意味するものであり、本件の場合、ＡＭＨのプロ領域のメジアン部分と、さらにはＡＭＨ全体とを認識することができる。断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、さらにはｓｃＦｖ（単鎖可変断片）及びｄｓＦｖ（二本鎖可変断片）断片を挙げることができる。これら機能的断片は、特に、遺伝子工学により、さもなければ特異的タンパク質分解性消化とそれに次ぐ精製により得ることができる。
【００６３】
本発明の方法について上述した特徴及び定義は、本発明の抗体にも当てはまる。
【００６４】
したがって、本発明の抗体は、以下の条件のうちの一又は複数を満たすことができる：
−認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から選択される配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のポリペプチドである、
−配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４の配列から選択される、
−抗体によって認識されない線状エピトープ（ｂ）は、配列番号４５から配列番号５６の配列を有する。
【００６５】
特に、
−哺乳動物はヒトであり、認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号８の配列の最大で２５５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号１３の配列の少なくとも１３１個のアミノ酸と配列番号１１の配列の最大で１５６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はウマであり、認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号１４の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号１９の配列の最大で２６５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号２２の配列の少なくとも１４４個のアミノ酸と配列番号２１の配列の最大で１６６個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、
−哺乳動物はイヌであり、認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号２３の配列の少なくとも９９個のアミノ酸と配列番号２８の配列の最大で２６４個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号３１の配列の少なくとも１４４個のアミノ酸と配列番号３０の配列の最大で１６５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであるか、或いは
−哺乳動物はウシであり、認識されるＡＭＨポリペプチドは、配列番号３２の配列の少なくとも１００個のアミノ酸と配列番号３９の配列の最大で２７０個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドであり、認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号４４の配列の少なくとも１４６個のアミノ酸と配列番号４２の配列の最大で２７０個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドである。
【００６６】
本発明の抗ＡＭＨ抗体は、ＡＭＨを含みうる生物学的試料中でのＡＭＨのアッセイに特に有用である。それらは、完全体又は断片の形態で、及び／又は試料とＡＭＨとの結合後の免疫反応の可視化のための検出可能なシグナルの放出を生成することのできる標識とコンジュゲートさせた形態で、そのまま使用することができ、それにより本発明の別の課題を構成する。
【００６７】
免疫反応の可視化のための検出可能なシグナルの放出を生成することのできる発現標識は、化学修飾なしで直接的に、又はそのような群を含めるための化学修飾後に、一群の抗体又は抗体断片と反応する一群を含むいずれかの分子を意味し、この分子は、求められる量を示すために使用される検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生成することができる。
【００６８】
標識と本発明の抗体又は抗体断片との間の結合は、当業者に既知の任意の方法により、特にカップリングにより行うことができる。
【００６９】
標識の例には特に以下が含まれる：
例えば比色定量、蛍光光度又はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの発光により検出することのできるシグナルを生成する酵素、
・蛍光性、発光性又は色素化合物といった発色団、
・Ｐ３２、Ｓ３５又はＩ１２５などの放射性分子、
・Ａｌｅｘａｓ又はフィコシアニンなどの蛍光性分子、及び
・アクリジニウムベース又はルテニウムベースの有機金属系誘導体といった電気化学発光塩。
【００７０】
間接的検出系の例には、例えばアンチリガンドと反応できるリガンドが含まれる。この場合リガンドは標識に相当し、抗体又は抗体断片と共にコンジュゲートを構成する。
【００７１】
リガンド／アンチリガンドの対は、当業者には周知であり、例えば以下の対を含む：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチドに相補的な配列。
【００７２】
この場合、アンチリガンドは、先述の直接的な検出標識によって直接検出可能でありうるか、又はそれ自体が別のリガンド／アンチリガンド対によって検出可能でありうるなどである。
【００７３】
ＡＭＨのアッセイは、当業者に広く知られルアッセイである、サンドイッチイムノアッセイ法によって行われる。簡単に説明すると、このアッセイは、被分析物、本件の場合は哺乳動物ＡＭＨを、二つの被分析物−結合パートナー、本件の場合は少なくとも一つの本発明の抗体又は抗体断片を用いて決定することからなる。
【００７４】
言うまでもなく、例えば用語「イムノアッセイ」中の接頭語「イムノ」は、本出願においては、本発明の抗体又は抗体断片以外の結合パートナーが、必然的に抗体又は抗体断片といった免疫学的起源のパートナーであることを厳密に示していると解釈されるべきではない。実際、当業者に周知であるように、この用語はもっと広く使用されており、結合パートナーが免疫学的起源／性質のパートナーではなく、例えば、検出及び／又は定量化が望まれる被分析物の受容体からなる試験及び方法を意味するためにも使用される。必須条件は、問題の結合パートナーが求められる被分析物、本件の場合はＡＭＨに、好ましくは特異的に結合できることである。したがって、用語「イムノ」は、詳細には頭字語ＥＬＩＳＡに対応する名称に含まれるものであるが、もっと広く「リガンド結合アッセイ」と呼ばれる、厳密な意味で免疫学的ではない結合パートナーを使用するアッセイのために、ＥＬＩＳＡアッセイという用語を使用することは既知の慣行である。明瞭さと均一性のために、本出願において、用語「イムノ」は、本発明の抗体又は抗体断片以外の結合パートナーが性質又は起源の観点から厳密な意味で免疫学的ではない場合も、求められる被分析物への結合及びその定量化に適した少なくとも一つの結合パートナーを好ましくは特異的に使用する任意の生物学的分析を意味するために用いられる。
【００７５】
したがって、本発明の別の課題は、ＡＭＨを含みうる生物学的試料において、サンドイッチイムノアッセイ法により哺乳動物ＡＭＨを定量化するための方法に関し、この方法は、
−前記生物学的試料を二つのＡＭＨ結合パートナーと接触させる工程であって、前記パートナーのうちの少なくとも一方が、本発明の抗体、抗体断片又はコンジュゲートである、工程、
−前記結合パートナーとＡＭＨとの間の結合により放出されるシグナルが存在する場合には、検出可能なシグナルの放出を生成できる標識を用いてそのシグナルを検出する工程、並びに
−検出されたシグナルをＡＭＨ濃度へと変換する工程
を含むかこれら工程からなる。
【００７６】
この定量化方法の第１の工程は、生物学的試料を二つのＡＭＨ結合パートナーと接触させる工程であって、前記パートナーのうちの少なくとも一方が本発明の抗体、抗体断片又はコンジュゲートである工程を含むか又は同工程からなる。
【００７７】
哺乳動物ＡＭＨを含みうる生物学的試料は、血液、血清、血漿、濾胞性の流体及び精子の試料である。一実施態様によれば、生物学的試料は、血液、血清又は血漿の試料である。
【００７８】
任意選択的にコンジュゲートの形態の、本発明の抗体又は抗体断片以外の結合パートナーは、ＡＭＨに結合することのできるいずれかの分子を含む。このような結合パートナーの例として、抗ＡＭＨポリクローナル抗体、抗ＡＭＨモノクローナル抗体、抗ＡＭＨモノクローナル抗体断片、抗体アナログ（抗体を模倣できる分子）、例えばＮａｎｏｆｉｔｉｎｓ、アプタマー、さもなければ「ＤＡＲＰｉｎｓ」、又はＡＭＨとの相互作用を有することが知られているいずれかの他の分子を挙げることができる。
【００７９】
Ｎａｎｏｆｉｔｉｎ抗体アナログは、抗体と同様に、生物学的標的に結合することができ、したがって生物体内部において、それを検出、捕捉又は極めて単純に標的化することを可能にする小タンパク質である。
【００８０】
アプタマー抗体アナログは、“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment” （Ellington AD and Szostak JW., 1990）のＳＥＬＥＸとして知られるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の組み合わせ方式により、最大１０１５の異なる配列を含むライブラリにおいて同定されるオリゴヌクレオチド、通常はＲＮＡ又はＤＮＡである。多くのアプタマーは、変化した複雑な構造に適合し、それによりその構造に変化する寸法の空洞を形成することを可能にし、様々なリガンドに結合することを可能にするＲＮＡの能力により、ＲＮＡから構成される。それらは、生物工学的、診断的又は治療的用途に使用することのできる、対象の生化学的ツールである。その選択性及びリガンド結合特性は、抗体に匹敵する。
【００８１】
「ＤＡＲＰｉｎｓ」抗体アナログは、Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  ＰｒｏｔｅＩＮＳ（Ｂｏｅｒｓｍａ  ＹＬ  ａｎｄ  Ｐｌｕｔｃｋｔｈｕｎ  Ａ，２０１１）を指すＤＡＲＰｉｎｓであり、抗体を模倣し、高い親和性及び高い選択性で標的タンパク質に結合することを可能にする別のクラスのタンパク質である。それらは、複合膜タンパク質を細胞原形質膜の「脊柱」を構成するスペクトリン／アクチン網に結合することを可能にするアダプタータンパク質である、アンキリンタンパク質のファミリーに由来する。アンキリンの構造は、約３３個のアミノ酸のモチーフの反復に基づいており、ＤＡＲＰｉｎｓについてもそれがいえる。各モチーフは、ヘリックス−ターン−ヘリックス型の二次構造を有する。ＤＡＲＰｉｎｓは、少なくとも三つ、好ましくは四つから五つの反復単位を含み、スクリーニングコンビナトリアルライブラリによって得られる。
【００８２】
抗ＡＭＨポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗体断片は、当業者に広く知られる一般的な方式で調製することができる。いくつかの抗体が、例えばＡｎｓｈＬａｂｓ（ＵＳ）社から、市販されている。
【００８３】
本発明者は、抗体認識ゾーンが、ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分、即ち、ヒトＡＭＨの場合、アミノ酸２５６から４５１（１９６個のアミノ酸配列番号５７）；ウマＡＭＨの場合、アミノ酸２６６から４６４（１９９個のアミノ酸配列番号５８）、イヌＡＭＨの場合、アミノ酸２６５から４６３（１９９個のアミノ酸配列番号５９）、及びウシＡＭＨの場合、アミノ酸２７１から４６６（１９９個のアミノ酸配列番号６０）であること以外、本発明について先述したものと同じモノクローナル抗体調製方法を用いて、ＡＭＨのアッセイにおいて特に有用である他のモノクローナル抗体も調製した。したがって、対象のプロ領域のＣ末端部分は、配列番号５７の配列又は配列番号５７と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１９６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドである。予期されなかったことに、ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分を認識する抗体は、先行技術の抗体とは異なり、それらが用いられるアッセイにおいて大量に使用される必要がない。
【００８４】
ＡＭＨのＣ末端部分を認識するこれら抗体を調製するために、使用される免疫原は、ＡＭＨポリペプチド、又はこのＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、これは、少なくとも抗体が間違いなく認識する部分、即ち少なくともＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分、即ち配列番号５７の配列又は配列番号５７と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１９６個のアミノ酸を含まなければならない。免疫原は、最大で問題の種のＡＭＨ全体又は問題の種のＡＭＨ全体をコードするポリヌクレオチド、即ち、ヒトＡＭＨの場合、配列番号２の配列の５６０個のアミノ酸も含み、他のＡＭＨは配列番号２の配列と少なくとも７５％の同一性を含む。特定の免疫原は、以下から選択することができる：
−ＡＭＨの配列全体に対し、ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分の後ろに位置するすべてのアミノ酸を欠くＡＭＨポリペプチド、又はこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、即ち、配列番号７の配列又は配列番号７と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも４２６個のアミノ酸と、配列番号５の配列又は配列番号５と少なくとも７５％の同一性を有する配列の最大で４５１個のアミノ酸とを含み、好ましくは配列番号５、配列番号６及び配列番号７の配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列、例えば配列番号１７、１８、２６、２７、３６、３７又は３８の配列のＡＭＨポリペプチドから選択される、ＡＭＨポリペプチド、又は前記ＡＭＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（これは、適切である場合はシグナルペプチドを含まず、任意選択的に前駆体部分を含まないＡＭＨ−３に相当する）；
−シグナルペプチドの全部又は一部及び任意選択的に前駆体部分の全部又は一部を含むＡＭＨ全体に相当する、即ち配列番号４の配列又は配列番号４と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも５３５個のアミノ酸を含み、好ましくは配列番号２、配列番号３及び配列番号４の配列又はこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列、例えば配列番号１５、１６、２４、２５、３３、３４又は３５の配列のＡＭＨポリペプチドから選択される、ＡＭＨポリペプチド、又はこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００８５】
また、ハイブリドーマの選択は、特定のポリペプチド及びペプチドを用いる順序を問わない２つのスクリーニング工程を用いて実施される。
【００８６】
スクリーニング１と呼ばれる第１のスクリーニングは、前述のように、プロ領域のＣ末端部分を認識する抗体を生成するハイブリドーマのみを保持することからなる。これを行うために、以下二つの方法が可能である：
方法１：まず、ＡＭＨ−３、即ち、ヒトＡＭＨ−３の場合、アミノ酸１−４５１（配列番号５）（適切である場合はシグナルペプチドの全部又は一部と前駆体部分の全部又は一部を含まない）、又はこの配列と少なくとも７５％の同一性を有する任意の配列を認識する抗体を分泌するハイブリドーマを選択する。一実施態様によれば、抗体によって認識されるＡＭＨ−３ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６及び配列番号７の配列及びこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列から選択される配列のポリペプチドである。次いで、ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分の前に位置するＡＭＨの部分、即ち、ヒトＡＭＨの場合、アミノ酸１−２５５（配列番号８−ＡＭＨ−２）（適切である場合はシグナルペプチドの全部又は一部と前駆体部分の全部又は一部を含まない）、及びこの配列と少なくとも７５％の同一性を有する任意の配列を認識する抗体を生成するハイブリドーマを廃棄する。このＡＭＨポリペプチドは、本発明により調製された抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）と呼ばれる。一実施態様によれば、抗体によって認識されないＡＭＨポリペプチド（ａ）は、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択される配列及びこれら配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のポリペプチドである。
【００８７】
方法２：ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分、即ち、ヒトＡＭＨの場合、アミノ酸２５６−４５１（配列番号５７）、又はこの配列と少なくとも７５％の同一性を有する任意の配列を認識する抗体を分泌するハイブリドーマを選択する。
【００８８】
スクリーニング２と呼ばれる第２のスクリーニングは、ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分、即ち配列番号５７の配列又は配列番号５７について７５％を有する任意の配列中の線状エピトープ（ｂ）を認識する抗体を生成するハイブリドーマを廃棄することからなる。
【００８９】
以下の表（表４）は、これら抗体の調製に有用な、ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分に決定された様々な線状エピトープ（ｂ）を挙げて、哺乳動物の種による配列番号を示している。
【００９０】
2019528676.tif 000006
【００９１】
このようにして調製された抗ＡＭＨ抗体は、以下の特性を有する：配列番号５７の配列又は配列番号５７と少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１９６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識し、（ａ）配列番号１０の配列、又は配列番号１０の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の、少なくとも２３０個のアミノ酸と、配列番号８の配列、又は配列番号８の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の、最大で２５５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドも、（ｂ）配列番号５７の配列又は配列番号５７と少なくとも７５％の同一性を有する配列、例えば配列番号６１から８５の配列中に位置する線状エピトープも認識しない。
【００９２】
本発明の抗体調製方法及び本発明の抗体について前述したすべての特徴及び定義はここでも当てはまる。
【００９３】
二つの結合パートナーのうちの一方は、コンジュゲート又はトレーサーを形成するように標識に結合してもよい。他方の結合パートナーは、直接的又は間接的に、固体支持体に捕捉させてもよい。次に、後者について捕捉パートナーに、前者について検出パートナーに言及する。
【００９４】
本発明のＡＭＨ定量化方法に使用されるＡＭＨ結合パートナーの対は、特に本発明の抗体と共に、プロ領域のＣ末端部分を認識する抗ＡＭＨ抗体を使用するとき、ＡＭＨのプロ領域及び成熟領域、又はプロ領域のみを認識することができる。したがって、特定の一実施態様によれば、本定量化方法に使用される第２のＡＭＨ結合パートナーは、配列番号５７の配列又は配列番号５７と少なくとも７５％の同一性を有する配列の、少なくとも１９６個のアミノ酸を含むＡＭＨポリペプチドを認識するが、（ａ）配列番号１０の配列又は配列番号１０の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列の、少なくとも２３０個のアミノ酸と、配列番号８の配列又は配列番号８と少なくとも７５％の同一性を有する配列の、最大で２５５個のアミノ酸とを含むＡＭＨポリペプチドも、（ｂ）配列番号５７の配列又は配列番号５７と少なくとも７５％の同一性を有する配列中に位置する線状エピトープも認識しない抗体であり、後者は、このコンジュゲートと生物学的試料のＡＭＨとの間の免疫反応の可視化のための検出可能なシグナルの放出を生成することのできる標識を有する断片及び／又はコンジュゲートの形態でもよい。
【００９５】
生物学的試料を二つのＡＭＨ結合パートナーと接触させることは、当業者に広く知られているように、一工程又は二工程で行うことができる。簡単に説明すると、一工程のイムノアッセイは、本発明の抗体、抗体断片又はコンジュゲートを含む被検試料を、同時に二つの結合パートナーと接触させることを含むが、二工程のイムノアッセイは、被検試料をまず第１の結合パートナーと、次いで被分析物と接触させることを含み、このように形成された第１の結合パートナー複合体を第２の結合パートナーと接触させる。二つの結合パートナーのうちの一つは言うまでもなく上記に規定された本発明の抗体、抗体断片又はコンジュゲートである。
【００９６】
本方法は、洗浄工程及びインキュベーション工程といった当業者に既知の他の工程も含むことができる。
【００９７】
本発明の定量化方法の第２の工程は、前記結合パートナーとＡＭＨとの間の結合により放出されるシグナルが存在する場合には、上記に規定された検出可能なシグナルの放出を生成できる標識を用いてそのシグナルを検出する工程を含むか又は同工程からなる。この標識は、前記ＡＭＨ結合パートナーのうちの一つにコンジュゲートさせることができる。
【００９８】
使用される標識の種類に応じて、当業者は、いずれかの種類の適切な測定装置、例えば分光光度計、分光蛍光光度計、濃度計、ルミノメーター、さもなければ高解像度カメラを用いて、標識の可視化又は検出可能なシグナルの放出を可能にする試薬を加える。
【００９９】
ＡＭＨの定量化方法の最終工程は、検出されたシグナルをＡＭＨ濃度へと変換することを含むか又は変換することからなる。ＡＭＨのレベル又は量にも言及する。一般原理は、イムノアッセイの間に放出されたシグナルの測定値が生物学的試料のＡＭＨの量に比例するということである。
【０１００】
検出されたシグナルをＡＭＨ濃度へと変換するこの工程は、当業者に広く知られている。これは、標準レンジに基づいて予め設定した数学モデルを用いることである。この標準レンジは、既知の方式で事前に取得される。簡単に説明すると、標準レンジを取得することは、標的の被分析物（ＡＭＨ）の量又は濃度を増加させることにより生成されたシグナルを測定すること、ＡＭＨのレベルの関数としてシグナルを示す曲線を描画すること、及びこのような関係をできる限り忠実に表す数学モデルを発見することかならなる。数学モデルは、試験される生物学的試料に含まれるＡＭＨの不明な量、力価又は濃度を決定するために使用される。
【０１０１】
ＡＭＨ濃度の決定は、複数の点で、特に女性の受胎能に関して、女性の卵巣予備能を推定するために、例えば卵胞を破壊する危険のある高度な治療を受けなければならない女性において使用することができ、さらには性熟期前の男子において、例えば性的分化に関連付けられる障害の場合に使用することができる。
【０１０２】
したがって、本発明の別の課題は、本発明の方法、或いは補助としての本発明の定量化方法を使用して調製されたかどうかに関係なく：
−妊娠可能年齢の女性における卵巣機能不全に関連付けられる障害の診断のための、又は
−１２歳以上の若年女子及び女性における卵胞貯蔵の評価における、又は
−性熟期前の男子における性的分化に関連付けられる障害の評価における、
本発明の抗体、抗体断片又はコンジュゲートの使用に関する。
【０１０３】
特に上述の使用に従って使用される本発明の方法を実施するために、本発明の抗体、断片又はコンジュゲートはキットに収容することができる。
【０１０４】
したがって、本発明の別の課題は、上記に規定又は調製される抗体又は抗体断片及び／又は上記に規定されるコンジュゲートを含むキットに関する。
【０１０５】
ここでも、本発明の抗体及び方法に関して上記に記載された特徴及び定義は、本発明のキットに当てはまる。
【０１０６】
特定の一実施態様によれば、キットは少なくとも一つのポジティブコントロールも含有又は収容する。このポジティブコントロールは、キットの使用の間に用いられる結合パートナーに結合することのできる化合物を含み、この化合物は所定の量で存在する。
【０１０７】
このような化合物の非限定的な例として、適切である場合はシグナルペプチドの全部又は一部及び任意選択的に前駆体部分の全部又は一部を含む、配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列のＡＭＨ全体を挙げることができる。
【０１０８】
キットは、結合パートナーとＡＭＨとの間の反応を実証するために必要とされるすべての化合物、例えば洗浄バッファー又は標識の可視化又は検出可能なシグナルの放出を可能にする試薬も収容することができる。
【０１０９】
本発明は、非限定的な例示として提供される以下の実施例と、図１から４とにより、さらに明瞭に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ヒトＡＭＨタンパク質と、それに由来するヒトＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２及びＡＭＨ−３タンパク質コンストラクトの構造を表す模式図である。
【図２】ビス−Ｔｒｉｓ４−１２％ゲル上での電気泳動により分離された後の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体遺伝子コンストラクトのトランスフェクションにより得られた細胞溶解物のウェスタンブロット分析である。ウェル１、２：ネガティブコントロールの溶解物（空のプラスミドでトランスフェクトされた細胞）；ウェル３、４：ＡＭＨ−１溶解物；ウェル５、１２：分子量標準；ウェル６、７：ＡＭＨ−２溶解物；ウェル８、９：ＡＭＨ−３溶解物；ウェル１０、１１：ＡＭＨ全体溶解物。ウェル１、３、６、８及び１０は条件Ａに対応する：ローディングされた試料は加熱及び還元した。ウェル２、４、７、９及び１１は条件Ｂに対応する：ローディングされた試料は加熱したが還元しなかった。Ａは、抗βアクチン抗体で試験した膜の写真であり、当量の総タンパク質が各ウェルにローディングされたことを確認するものである。Ｂは、抗ヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ）で試験した膜の写真である。ＡＭＨで構築された発現生成物に対応するバンドが四角で囲まれている。
【図３】ビス−Ｔｒｉｓ４−１２％ゲル上での電気泳動により分離された後の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中での遺伝子コンストラクトのトランスフェクションの上清から精製されたＡＭＨ−２及びＡＭＨ−３タンパク質のウェスタンブロット分析である。ウェル１：ネガティブコントロール（空のプラスミドでトランスフェクトされた細胞）；ウェル２：ＡＭＨ−２；ウェル３：ＡＭＨ−３；ウェル５：分子量標準。ローディングされた試料は加熱したが還元しなかった。五つの同じ膜（図３Ａから３Ｅ）を調製し、各々を、抗ＡＭＨ抗体又は抗ヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ）で試験した。
【図４】アフィニティークロマトグラフィーによって精製された組み換えＡＭＨタンパク質ＣＨＯ−ＡＭＨ５  ３Ｆ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。総タンパク質を可視化するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを硝酸銀で染色した。ウェル１：分子量標準；ウェル２：加熱したが還元していない組み換えＡＭＨ；ウェル３：加熱及び還元した組み換えＡＭＨ。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：ヒトＡＭＨの全配列又は切断配列に対応するＤＮＡ断片のクローニング、及びＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞中での一過性のトランスフェクション
１．１．遺伝子コンストラクト
発現されるＡＭＨ全体配列は、５６０個のアミノ酸（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢデータベースの受入番号Ｐ０３９７１に対応する配列番号２）を含むヒトＡＭＨのものである；このコンストラクトをＡＭＨ−５６０と呼ぶ。これは、タンパク質の翻訳後成熟の間に切断された前駆体部分（アミノ酸１９−２５）とシグナルペプチド（アミノ酸１−１８）とを含んでいる。
【０１１２】
ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２及びＡＭＨ−３と呼ばれ、それぞれＡＭＨのアミノ酸１−１５６（配列番号１１）、１−２５５（配列番号８）及び１−４５１（配列番号５）の配列に対応する他の三つのタンパク質コンストラクトを調製した。精製を容易にするために、ポリヒスチジン（８−Ｈｉｓ）タグをこれら４つのコンストラクトのＣ末端側に付加した（配列表にはタグは付加されていない）。
【０１１３】
以下の表５にその配列を示すＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体のコンストラクトに対応するＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から合成遺伝子の形態で得られた。各ＤＮＡ断片（ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体）を、ＣＭＶプロモーターの制御下においてｐＣＭＶ６−ＸＬ５ベクターのＥｃｏ ＲＩ部位とＮｏｔ Ｉ部位との間でクローニングした。エラーを含んでいないことを確認するために、得られたプラスミドをインサートのレベルで配列決定することにより検証した。
【０１１４】
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【０１１５】
１．２．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中での一過性のトランスフェクション
培養：ＨＥＫ−２９３Ｔ／１７  ＳＦ細胞（ＡＴＣＣ  ＡＣＳ−４５００ＴＭ）を、製造者の指示に従って、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＃  ２５００３０．２４）を用いて濃縮したＨＥＫ  Ｐｌｕｓ  ＳＦＭ培地（ＡＴＣＣ  ＃  ８００６３８６５９７）において無血清で培養した。トランスフェクションの前に、細胞をＦ７５培養フラスコ内で培養し、インキュベーター内で３７℃及び５％  ＣＯ２に維持した。
【０１１６】
トランスフェクション：ＨＥＫ２９３Ｔ  ＳＦ細胞（１０６個の細胞）を、Ａｍａｘａヌクレオフェクター装置（Ｌｏｎｚａ）を用いたヌクレオフェクションにより、Ａｍａｘａ細胞株ヌクレオフェクターキットＶ（＃ＶＣＡ−１００３）を供給し、１回のトランスフェクション当たり１００万個の細胞に５μｇのＤＮＡを用いるプロトコールを適用することにより、トランスフェクトした。簡単に説明すると、１００万個の細胞を、それらを収集するために２００ｇで１０分間遠心分離する。次いで細胞ペレットを、１００μｌの溶液Ｖ（キットで供給される）に再懸濁する。５μｇのプラスミドを細胞懸濁液に加える。混合物全体を、穏やかに混合し、Ａｍａｘａキュベット（これもキットで供給される）に移す。キュベットを、Ａｍａｘａ  Ｑ−００１プログラムに設定したヌクレオフェクター装置に挿入し、次いでヌクレオフェクションを活性化する。次いで試料を、直ちに６ウェル細胞培養プレート内の温かい培地に移し、それを３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートする。ＨＥＫ２９３Ｔ  ＳＦ細胞を４８時間培養する。
【０１１７】
溶解及び収集：トランスフェクションの４８時間後、上清を収集し、次いでプロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット／Ｒｏｃｈｅ）を加えた後で-８０℃で凍結する。トランスフェクトされた細胞ペレット（６×１０６個の細胞／ペレット）を、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、０．４８ Ｇ／ＬのＭｇＣｌ２及びプロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット、Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．０４５−６６４２、１タブレット／５０ｍｌ、ｐＨ７．４）を含む１．８ｍｌの５．５ｍＭホスフェート溶解バッファーを用いて採取する。次いで細胞溶解物を氷上に３０分間置き、次いで１５分間１３０００ｇ、４℃で遠心分離する。得られた上清は、ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体タンパク質を含んでおり、-８０℃で貯蔵される。
【０１１８】
１．３．タンパク質発現のウェスタンブロット分析
工程１．２．の間に得られた発現産物の第１の特徴づけを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ビス−Ｔｒｉｓ４−１２％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により実施した。ゲル（１４μｌｌ／ウェル）上にローディングする前に、トランスフェクションの上清及び溶解物を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ  ４Ｘ試料バッファー４Ｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（３／１、体積／体積）に希釈し、様々な処理を行った。最終濃度５５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）の付加によって還元を実施した。加熱は５分間７５℃で行った。
条件Ａ：加熱済及び還元済（ＤＴＴにより）
条件Ｂ：加熱済及び非還元（ＤＴＴを用いない）。
【０１１９】
ゲルの泳動後、電気泳動によって分離したタンパク質を、２０％のメタノールを含む１Ｘ  Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー中において３５０ｍＡの一定電流で５０分間０．４５μｌｍのニトロセルロース膜上に移す。膜のパッシベーションを、１３０ｍＭのＮａＣｌを含む５．５ｍＭのリン酸バッファー中、３％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の存在下において、＋２／８℃で一晩実施する。パッシベーション後、マウス抗ヒスチジンモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３４６６０）を、１３０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む５．５ｍＭのリン酸バッファー中において１／２０００に希釈し、次いでこの希釈液１０ｍｌを、膜と共に１時間＋１８／２５℃でインキュベートする。まったく同じように調製した第２の膜を、同じ時間及び同じ条件下で、抗ヒスチジン抗体の代わりにマウス抗βアクチンモノクローナル抗体（クローンＡＣ−１５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＭ４３０２）と共にインキュベートする。この膜は、各ウェル内で、同等の量の総タンパク質が分析に供されることを検証するために役立つ（等価モード制御）。
【０１２０】
未結合の抗体を除去するために膜をすすいだ後（１３０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む５．５ｍＭのリン酸バッファー中において５分間に５回の洗浄）、それらを、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１Ｘ  ＰＢＳ中において１／２００００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス二次抗体（Ｊａｃｓｋｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５−０３６−００３）と共に１時間インキュベートする。０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む１Ｘ  ＰＢＳ中での５分間で５回の洗浄後、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液（Ｂｉｏｒａｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７０−５０６１）中において、撹拌しながら５分間膜をインキュベートすることにより、化学発光（Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ、Ｂｉｏｒａｄ）による獲得前に可視化を実施する。
【０１２１】
結果を図２に示す。抗βアクチン抗体（図２Ａ）を用いて可視化した膜では、ウェル当たり一つのバンドを観察している。これらバンドの強度は、やや強度が小さいＡＭＨ−１のウェル（３及び４）を除いて同等である。このように、このコントロールは検証される。抗ヒスチジン抗体（図２Ｂ）を用いて可視化した膜では、バンドは、ネガティブコントロールのウェルに上昇を示す。しかしながら、前記ウェルは、プラスミドを含まないブランクでトランスフェクトされた細胞の溶解物を含む。これは、すべてのウェル内にある溶解物中の特定のタンパク質に対する抗ヒスチジン抗体の非特異的な反応性に当てはまる。このような非特異的バンドに加えて、ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体のウェルは、特異的なバンド、即ちネガティブコントロールのウェルには存在しないバンドを含む。これら特異的バンドは、図２Ｂで四角に囲まれている。これらの見かけの分子量は、加熱済及び還元済の条件の場合、ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体コンストラクト（ウェル３、６、８、１０）についてそれぞれ約２０、３０、５５及び６５ｋＤａである。加熱済且つ非還元の条件の場合の見かけの分子量は、ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体コンストラクト（ウェル４、７、９、１１）についてそれぞれ約３６、５０、１００及び１２０ｋＤａである。これら分子量の推定値は、非還元条件におけるＡＭＨコンストラクトの二量体化と矛盾しない。重要であるのは、成熟領域の非存在下において、ＡＭＨ−１及びＡＭＨ−２コンストラクトにおいて大量のランダムなＣ末端トランケーションが生じるにも関わらず、二量体化が起こることである。
【０１２２】
結論として、このウェスタンブロット分析は、ヌクレオチド配列により、ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体プラスミドコンストラクトが明らかにヒスチジンタグを含むタンパク質の発現を可能にし、その見かけの分子量が予想された分子量に相当することを示すものである。
【０１２３】
実施例２：ＣＨＯ細胞におけるＡＭＨタンパク質の安定な発現及び精製
ＡＭＨ全体を発現する組み換えＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞の安定なクローンを、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社のｃＧＰＳ  ＣＨＯ−Ｓａ  ＣＥＭＡＸキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＨＯＳａ−００１１−０５及びＣＨＯＳａ−００１１−１０）を使用し、関連するプロトコールに従って得た。このキットは、標的とされる、ＣＨＯ細胞における外来性遺伝子の染色体内組み込みを可能にする。キットは、ｃＧＰＳ  ＣＨＯ−Ｓａ細胞株（接着細胞）、対象の遺伝子がその中にクローニングされる組み込み型ベクター、メガヌクレアーゼＩ−Ｓｃｅ  Ｉを恒常的に発現するベクター、及びＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０１５２５）から構成される。遺伝的に修飾されたｃＧＰＳ  ＣＨＯ−Ｓａ細胞株は、そのゲノム中に、エンドヌクレアーゼ活性を有するメガヌクレアーゼＩ−Ｓｃｅ Ｉによって認識される大きな独特の特定部位を含むという特異性を有している。
【０１２４】
２．１．クローニング
Ｃ末端８−ヒスチジンタグに結合した全ヒトＡＭＨタンパク質（ａａ  １−５６０）をコードする合成遺伝子をＧｅｎｅａｒｔ社に発注した。この遺伝子を、ＣＨＯ宿主での発現のために最適化した。このＡＭＨ遺伝子を、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社によって販売されるｐＩＭ．ＬＰ２．Ｚｅｏ組み込み型ベクターのＥｃｏ  ＲＩ部位とＮｏｔ  Ｉ部位の間に、ＣＭＶプロモーターの制御下でクローニングした。ｐＩＭ．ＬＰ２．Ｚｅｏ組み込み型ベクターは、ＣＨＯゲノム内でメガヌクレアーゼＩ−Ｓｃｅ  Ｉによって認識される独特の部位のそれぞれ上流及び下流の領域と相同の２つの領域を含むという特異性を有している。これら２つの特定の領域は、ＡＭＨをコードする遺伝子が挿入されたマルチクローニングサイトを画定する。さらに、この組み込みプラスミドは、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞に２つの選択的利点を提供する。１つ目は、ＣＭＶプロモーターによって制御されるゼオシン耐性遺伝子である。２つ目は、ＳＶ４０プロモーターによって制御されるネオマイシン耐性遺伝子である。この遺伝子は、ネオマイシンに近い抗生物質として、ジェネテシン（Ｇ４１８）耐性も可能にする。
【０１２５】
２．２．トランスフェクション
トランスフェクションの前日（Ｄ−１）、１０ｃｍのペトリ皿一つにつき、２×１０５個のｃＧＰＳ  ＣＨＯ−Ｓａ  ＣＥＭＡＸ接着細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００  ＵＩ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（Ｆｏｎｇｉｚｏｎｅ）（０．２５μｇ／ｍｌ）及び１０％のウシ胎児血清を補ったＦ−１２Ｋ培地中に播種する。
【０１２６】
トランスフェクション（Ｄ）当日、ＡＭＨ遺伝子を含む１μｇの組み込み型ベクター（ｐＩＭ．ＬＰ２．Ｚｅｏ）と１μｇのメガヌクレアーゼｍＲＮＡとを、ＥＣ−Ｒバッファー（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒＴＭトランスフェクション試薬キットに含まれる）中に希釈する。次いで４μｌｌのエンハンサー試薬を加える［核酸（ｍｇ）／エンハンサー（ｍｌ）比＝１／２］。総反応体積は１００μｌｌでなければならない。次いで溶液を５分間常温でインキュベートする。次に１６μｌのＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒＴＭ試薬を加え、次いで混合物全体を１０分間＋１８／２５℃でインキュベートし、その後２×１０５個の細胞上に堆積させる。その培地は事前に９００μｌｌの血清と抗生物質とを含まないＦ−１２ｋ培地で置き換えておく。
【０１２７】
２．３．クローン選択及びクローンの特徴づけ
ＡＭＨ組み換えクローンを、ゼオシン及びジェネテシン（Ｇ４１８）に対するそれらの耐性に従って選択した。
【０１２８】
トランスフェクションの２４時間後（Ｄ＋１）、０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補った１０ｍｌの完全培地で培地を置き換え、次いで、６日目（Ｄ＋６）から始めて、０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８及び０．４ｍｇ／ｍｌのゼオシンを補った新鮮な培地で定期的に培地を置き換える。トランスフェクションの１５日後（Ｄ＋１５）、細胞を、９６ウェルプレート内で限界希釈する。この細胞クローニングの後、クローンを培養により増幅し、次いで：
−ＡＭＨ遺伝子の５’及び３’末端に特異的なプライマーを用いた、ＣＨＯ細胞から抽出したゲノムＤＮＡ上でのＰＣＲにより、
−ＡＭＨタンパク質の発現を検証するためのウェスタンブロット法により
試験した。
【０１２９】
ＰＣＲ及びウェスタンブロット法の両方でポジティブであったクローンの中から、ＡＭＨ５  ３Ｆ１クローンを選択した。このクローンについて、ＡＭＨ遺伝子の増幅により得られたＰＣＲ産物を、遺伝子の一体性を検証するため、及び選択の間に変異が導入されなかったことを確認するために、その全体について配列決定した。
【０１３０】
２．４．安定なＣＨＯ−ＡＭＨ５  ３Ｆ１クローンを用いる組み換えＡＭＨの発現
ＡＭＨ５  ３Ｆ１クローンを、２２５ｃｍ２の培養皿で、１％  ｖ／ｖの抗生物質及び抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１５２４０）、１２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０）、６ｇ／ｌのグルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ８７６９）、０．４ｍＭのクエン酸鉄（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ６１２９）、２％のヒポキサンチン−チミジン（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４１０６５）、１％のグリセロール及び１ｍｇ／ｌのペプスタチンＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４２６５）を補った６０ ｍｌのＥｘ細胞３０２培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４３２４Ｃ）中、９×１０６個の細胞という割合で培養する。培養皿を、インキュベーター内で、７．５％  ＣＯ２の雰囲気下において３７℃でインキュベートする。４日間の培養（増幅）後、得られた細胞懸濁液（約６６×１０６個の細胞）を、同じプロトコールに従って、７Ｆ２２５培養皿に再度播種する。これら培養物の上清を収集し、次いで５０００ｇで遠心分離し、精製まで-２５℃で凍結する。
【０１３１】
２．５．組み換えＡＭＨタンパク質ＣＨＯ−ＡＭＨ５  ３Ｆ１の精製
以前に収集した培養上清を、解凍し、プールする。次いで５リットルの容積の上清を、０．８μｍの膜（Ｎａｌｇｅｎｅ、ＶＷＲ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７３４５０８４）で、次いで０．２２μｍの膜（Ｎａｌｇｅｎｅ  ａＰＥＳ  Ｒａｐｉｄ  Ｆｌｏｗ）で濾過する。次いで試料を、３０ｋＤａのカットオフ閾値を有する中空ファイバ（ＧＥ  Ｃａｔ．Ｎｏ．５６４１１０−１８）上で２０倍に濃縮する。次いで、約１００ｍｌの残余分を、その体積の５倍に対し、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．９ｇ／ｌのアジドを含む、５０ｍＭのカリウムナトリウムホスフェートバッファー（ｐＨ７．８）を用いて透析濾過する。２つのＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤のタブレット（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１１  ８７３  ５８０  ００１）を加える。この残余分を、供給者のプロトコール（ＧＥ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０７１６−０１）に従ってゲル１ｍｌ当たり１０ｍｇ  の抗体の割合で、抗ＡＭＨ（ポリクローナル又はモノクローナル）抗体に連結されたＨｉ−ｔｒａｐ  ＮＨＳ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。アフィニティカラムをダイアフィルトレーションバッファーで平衡化し、次いで５０ｍｌの残余分を０．５ ｍｌ／分の速度でカラムに注入する。次いで、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．９）中において洗浄を行う。次いでＡＭＨタンパク質の溶出を、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．９）を用いて、０．５ ｍｌ／分の速度で実施する。収集された溶出画分は、直ちにｐＨ７−８に中和し、プロテアーゼ阻害剤をそれに加え、画分をプールし、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）及び２０％のエタノールを含む０．２ＭのＮａＨＣＯ３貯蔵バッファー中に-８０℃で貯蔵する。図４は、実施例１．３．のプロトコールによる組み換えＡＭＨタンパク質ＣＨＯ−ＡＭＨ５  ３Ｆ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後の膜の写真である。ウェスタンブロットの代わりに、総タンパク質を硝酸銀で染色した。精製されたタンパク質は極めて純粋である。
【０１３２】
実施例３：マウスの免疫化による本発明の抗ＡＭＨ抗体の調製
３．１．免疫原
実施例１で得られたＡＭＨ全体及びＡＭＨ−３  プラスミドを、大腸菌での培養により増幅し、次いでＱｉａｇｅｎ社のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３８１）又は同等のキットを用いて精製した。Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎカートリッジ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の調製のために、２μｇのプラスミドＤＮＡを、ＣａＣｌ２及びスペルミジンの存在下で、供給者の指示に従い、０．２２ｍｇの直径１μｍの金ビーズ上に沈殿させた。このように調製されたビーズは、吸湿剤（乾燥サシェ剤）の存在下で暗所で＋２／８℃で貯蔵することができる。
【０１３３】
実施例２で得られた組み換えＡＭＨタンパク質ＣＨＯ−ＡＭＨ５  ３Ｆ１を、油中水エマルションの形態で調製された、良好なアジュバント能を有することが知られているフロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）と容量を合わせて混合した。このような調製は、各注入の前にその場で実施された。
【０１３４】
３．２．免疫化
免疫化実験を、最初の免疫化の時点で週齢六から八の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスにおいて実施した。種々のプロトコールを実施する：
・０、２、４及び６週の４回でＡＭＨ  ＤＮＡ全体の注入１回当たり４μｇを投与
・０、２、４及び６週の４回でＡＭＨ−２  ＤＮＡの注入１回当たり４μｇを投与
・０、２、４及び６週の４回でＡＭＨ−３  ＤＮＡの注入１回当たり４μｇを投与
・０、２、及び４週の３回でＡＭＨタンパク質の注入１回当たり１０μｇを投与
【０１３５】
ＤＮＡ免疫化の場合、マウスの腹部の毛を刈り込んだ。Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を２７５０ｋＰａの圧力で使用し、ＤＮＡでコーティングした金ビーズをマウスの皮膚に注入した。タンパク質免疫化のために、注入は皮下に行われた。
【０１３６】
抗体の外観を監視するために、マウスから周期的に血液試料を採取する。これら血清中の抗ＡＭＨ抗体の存在を、９６ウェルマイクロプレートでＥＬＩＳＡを実施することにより試験する。組み換えＡＭＨタンパク質ＣＨＯ−ＡＭＨ５  ３Ｆ１が捕捉モードで使用される（１μｇ／ウェル）；飽和後、この抗原を、試験する血清の様々な希釈液と反応させる（３７℃で１時間のインキュベーション）。血清中に存在する抗ＡＭＨ抗体を、求める抗体（０．１μｇ／ウェル）に結合するアルカリホスフェートにコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ、Ｊａｃｓｋｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１１５−０５５−１４６）を使用して明らかした。免疫化したマウスの中で、抗ＡＭＨ抗体を生じたマウスはこのように同定される。
【０１３７】
１回目の注入後５０から７０日の間に、抗ＡＭＨ体液性反応を生じたマウスを、１００μｇのＡＭＨタンパク質の静脈内注入により再度刺激した。
【０１３８】
３．３．ハイブリドーマの調製
この最後の注入の三日後、反応したマウスを屠殺した：血液及びスプリーン（ｓｐｌｉｎｅ）を除去した。スプリーン（ｓｐｌｉｎｅ）から得られた脾細胞を、それらが融合して不死化するように、Kohler and Milsteinによって記載されたプロトコール（Kohler and Milstein 1975, Kohler et al., 1976）に従って、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞で培養した。１２−１４日の培養期間の後、得られたハイブリドーマの上清をスクリーニングして、上記セクションに記載したＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗ＡＭＨ抗体の存在を決定した。
【０１３９】
３．４．ヒトＡＭＨタンパク質の１５７−２５５領域又は２５６−４５１領域を認識するハイブリドーマの上清の選択
ウサギ抗６ヒスチジン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＡＢ４３０１１３４又は等価物）を、１Ｘ  ＰＢＳに希釈し、＋１８／２５℃で一晩インキュベートすることにより、９６ウェルマイクロタイトレーションプレートに１μｇ／ウェルの割合で吸着させた。次いでプレートを、ＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ２０バッファー（ＰＢＳ−Ｔ）中で３回洗浄し、次いで、１０ｇ／ｌのＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔバッファー中でのインキュベーションによりパッシベートし、再びＰＢＳ−Ｔバッファー中で３回洗浄した。
【０１４０】
実施例１で得られ、-８０℃で貯蔵した溶解物を、解凍し、１Ｘ  ＰＢＳバッファー中において１／２と１／１０の間に希釈する。１００μｌｌの各溶解物（ネガティブコントロール、ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体）を、プレートの複数のウェルに分配し、２時間３７℃でインキュベートする。次いでプレートを空にし、３００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ−Ｔバッファー中で４回洗浄する。次いで、試験するハイブリドーマ上清（１００μｌｌ）を５つの異なる溶解物の各々に加え、１時間３７℃でインキュベートする。３００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ−Ｔ中で４回の洗浄を行うさらなる工程の後、ヤギにおいて生成され、ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗マウスＩｇＧである二次抗体（Ｈ＋Ｌ、Ｊａｃｓｋｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１１５−０３５−１６６）を加える。３００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ−Ｔ中で３回の洗浄を行うさらなる工程の後、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ基質（ＫＬＰ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５２−００−０１）の存在下で１０分間＋１８／２５℃でプレートをインキュベートすることにより反応を可視化する。プレートは、４５０及び６３０ｎｍでＯＤを測定することにより読み取る。
【０１４１】
１５７−２５５領域を認識するハイブリドーマの上清の選択：ＥＬＩＳＡの結果から選択されたハイブリドーマは、その上清が、ＡＭＨ−２溶解物を認識するがＡＭＨ−１溶解物を認識しない抗体を含むものである。言うまでもなく、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体溶解物も、選択されたハイブリドーマの上清によって認識される。このようにして５Ｇ５  １Ｂ１１ハイブリドーマが選択された。
【０１４２】
２５６−４５１領域を認識するハイブリドーマの上清の選択：ＥＬＩＳＡの結果から選択されたハイブリドーマは、その上清が、ＡＭＨ−３溶解物を認識するがＡＭＨ−２溶解物又はＡＭＨ−１溶解物を認識しない抗体を含むものである。言うまでもなく、ＡＭＨ全体溶解物も、選択されたドーマの上清によって認識される。このようにして３Ｈ８、４Ｃ７及び４Ｇ１０ハイブリドーマが選択された。
【０１４３】
選択後、クローナリティを確認するために、選択されたハイブリドーマを、当業者に周知の限界希釈技術に従ってクローニングした。このようにして、以下の抗ＡＭＨ抗体を分泌するモノクローナルハイブリドーマを取得することができた：
−ヒトＡＭＨの１５７−２５５領域を認識する５Ｇ５Ａ１０及び１Ｂ１１Ｂ１、
−ヒトＡＭＨの２５６−４５１領域を認識する３Ｈ８Ｅ２、４Ｃ７Ｅ１２及び４Ｇ１０Ｅ１２。
【０１４４】
Ｆａｌｋｅｎｂｅｒｇ（１９９８）による出版物から得られるプロトコールに従ってｍｉｎｉＰＥＲＭＴＭバイオリアクター中でハイブリドーマを培養することにより、モノクローナル抗体の大規模生産を実施した。次いで、モノクローナル抗体を、プロテインＡ上でのアフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製した。
【０１４５】
実施例４：非線状エピトープを認識する抗ＡＭＨモノクローナル抗体の選択
実施例３で得られたモノクローナル抗体の中から、非線状エピトープを認識するものを選択するために、線状エピトープ対して向けられたものを決定した。これを行うために、ヒトＡＭＨのアミノ酸配列の全体をカバーする８０個の合成ペプチドを合成した。抗体の、これらペプチドの各々に対する結合を、ＥＬＩＳＡにより試験した。
【０１４６】
４．１．ペプチド合成
１６個のアミノ酸の８０個のペプチドを合成した。１６個のアミノ酸のうち１２個がＡＭＨ配列に対応し且つアミノ酸と５個だけ重複していることにより、ヒトＡＭＨ配列（アミノ酸１−５６０）の全体がカバーされる。ビオチン、次いでＳＧＳＧ配列（スペーサーアーム）を、ＥＬＩＳＡによるこれらペプチドの分析を容易にするために、Ｎ末端に加えた。これらペプチドは、精製せず、溶液中におく（水／アセトニトリル）。これらをＬＣ／ＭＳ質量分析により検証した。合成された配列を表６に示す。
【０１４７】
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【０１４８】
４．２．ＥＬＩＳＡ
９６ウェルマイクロプレートを、１Ｘ  ＰＢＳバッファー中のストレプトアビジン（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ウェル）で１時間３７℃でコーティングし、次いで１０ｇ／ｌのＢＳＡを含むＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０バッファー（ＰＢＳ−Ｔ）中において一晩常温でパッシベートする。パッシベーション溶液を除去し、次いでビオチン化ペプチドを分配し（１Ｘ  ＰＢＳバッファー中１０μｇ／ｍｌ、１ウェル当たり１μｇ）、１時間３７℃でインキュベートする。ＰＢＳ−Ｔ中で４回洗浄した後、試験するモノクローナル抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で加える。１時間３０分にわたる３７℃でのインキュベーション及び４回のＰＢＳ−Ｔによる洗浄後、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を加える。ＴＭＢ基質を用いて可視化を実施し、その際４５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）が測定される。
【０１４９】
ＥＬＩＳＡフォーマットを検証するために、市販の抗ＡＭＨ抗体をポジティブコントロールとして使用した。これは、ＡｎｓｈＬａｂｓ社のＡＡ０１１クローンである。この抗体は、ペプチド５２（配列番号１３７）を特異的に認識し、得られるＯＤシグナルは１を上回る。実施例３で得られた５個のモノクローナル抗体の中で、４Ｃ７Ｅ１２クローンもペプチド５２を認識する。したがって、４Ｃ７Ｅ１２クローンはＡＡ０１１クローンと同じエピトープを認識する。これは保持されない。モノクローナル抗体５Ｇ５Ａ１０、１Ｂ１１Ｂ１、３Ｈ８Ｅ２及び４Ｇ１０Ｅ１２は、試験した８０個のＡＭＨペプチドをいずれも認識しない。したがって、これらのエピトープは線形でない。生物学的試料中のＡＭＨタンパク質の定量化方法を開発するために選択されたのは、これら四つの非線状抗体、即ち５Ｇ５Ａ１０、１Ｂ１１Ｂ１、３Ｈ８Ｅ２及び４Ｇ１０Ｅ１２である。
【０１５０】
実施例５：抗ＡＭＨ抗体５Ｇ５Ａ１０、１Ｂ１１Ｂ１、３Ｈ８Ｅ２及び４Ｇ１０Ｅ１２の特徴づけ
５．１．ＥＬＩＳＡによる抗ＡＭＨ抗体５Ｇ５Ａ１０、１Ｂ１１Ｂ１、３Ｈ８Ｅ２及び４Ｇ１０Ｅ１２の捕捉能力の比較
２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．２）中で５μｇ／ｍｌに希釈した捕捉抗体（５Ｇ５Ａ１０、１Ｂ１１Ｂ１、３Ｈ８Ｅ２及び４Ｇ１０Ｅ１２）を、９６ウェルマイクロタイトレーションプレートに０．５μｇ／ウェルの割合で分配し、１時間３０分にわたり３７℃でインキュベートする。次いでプレートをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０バッファー（ＰＢＳ−Ｔ）中において３回洗浄し、次いで１０ｇ／ｌのＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔバッファー中での２時間のインキュベーションによりパッシベートし、再度ＰＢＳ−Ｔバッファー中で３回洗浄する。
【０１５１】
実施例１で得られ、-８０℃で貯蔵した溶解物を、解凍し、１Ｘ  ＰＢＳ中において１／２０に希釈する。１００μｌｌの各溶解物（ネガティブコントロール、ＡＭＨ−１、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体）を、分配し、一晩３７℃でインキュベートする。次いでプレートを空にし、３００ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ−Ｔバッファー中で４回洗浄する。パッシベーションバッファー中で１／１０００に希釈したビオチン化抗ヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３４４４０）を、分配し、次いで１時間３０分にわたり３７℃でインキュベートする。再度プレートを３回洗浄した後、パッシベーションバッファー中で１／２０００に希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔ．Ｎｏ．０１６−０３０−０３４）と共に１時間３０分にわたり３７℃でインキュベートする。ＰＢＳ−Ｔ中で３回の洗浄を行うさらなる工程の後、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ基質（ＫＬＰ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５２−００−０１）の存在下においてプレートを１０分間＋１８／２５℃でインキュベートすることにより、反応を可視化する。プレートを、４５０及び６３０ｎｍでのＯＤを測定することにより読み取る。
【０１５２】
得られた結果を表７に示す。ＰＢＳ及びプラスミドなしでトランスフェクトされた溶解物であるネガティブコントロールについて測定されたＯＤ値は最大で０．２８であり、これは非特異的シグナルに相当する。
【０１５３】
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【０１５４】
表７の結果は、１Ｂ１１Ｂ１及び５Ｇ５Ａ１０抗体が、ＡＭＨ−２、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体の溶解物を捕捉することを示している（ＯＤ＞３）。３Ｈ８Ｅ２及び４Ｇ１０Ｅ１２抗体は、ＡＭＨ−３及びＡＭＨ全体溶解物を捕捉する（ＯＤ＞１．６）。ＡＭＨ−１溶解物（アミノ酸１−１５６）は、試験したモノクローナル抗体のうちのいずれによっても捕捉されない。
【０１５５】
さらに、ヒトＡＭＨタンパク質の１５７−２５５領域を認識する１Ｂ１１Ｂ１及び５Ｇ５Ａ１０抗体は、２５６−４５１領域を認識する３Ｈ８Ｅ２及び４Ｇ１０Ｅ１２抗体の捕捉能力を上回る同能力を有している。実際、認識の場合（表７の網掛け部分）、いずれの溶解物についても、１Ｂ１１Ｂ１及び５Ｇ５Ａ１０抗体に得られたＯＤ値は、３Ｈ８Ｅ２及び４Ｇ１０Ｅ１２抗体によって得られたものよりも高い。したがって、捕捉モードでは、１Ｂ１１Ｂ１抗体又は５Ｇ５Ａ１０抗体を優先的に用いることが賢明であろう。
【０１５６】
５．２．ウェスタンブロット特徴づけ
抗ＡＭＨモノクローナル抗体の反応性のよりよい特徴づけを行うために、ウェスタンブロット分析を実施した。
【０１５７】
タンパク質の精製：ＡＭＨ−２及びＡＭＨ−３コンストラクトをコードするプラスミドとさらにはネガティブコントロール（プラスミドなし）を用いる実施例１のプロトコールに従って、トランスフェクションを実施した。培養上清を収集し、その中に見つかるＡＭＨタンパク質を、それらのポリヒスチジンタグを利用して、バッチ単位の金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。これを行うために、トランスフェクション上清を、２６０ｍＭのＮａＣｌを含む１１ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５−２６−７０）と共に、一晩＋２／８℃で撹拌しながらインキュベートする。次いでこの樹脂を、３０００ｇでの３分間の遠心分離により収集し、吸収されない物質を含む上清を除去する。平衡化バッファーで３回洗浄した後、タンパク質を、１３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含み、且つ５００ｍＭのイミダゾール、及びプロテアーゼ阻害剤を含む５．５ｍＭのリン酸バッファーで溶出し、そのｐＨを７．６に調節する。溶出は、＋２／８℃で撹拌しながら一晩インキュベートすることにより実施する。次いでＡＭＨを含む上清を、３０００ｇ．で３分間樹脂を遠心分離した後に収集する。 この精製工程は、ＡＭＨタンパク質を濃縮するため、及び特に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの移動を妨害する上清中に存在する大量のＢＳＡを除去するために必要である。
【０１５８】
ウェスタンブロット：この分析は、抗ヒスチジン抗体を使用して又はそれを抗ＡＭＨ抗体に置き換えて（１つの膜につき１μｇ）、実施例１、セクション１．３に記載されたプロトコールに従って実施された。
【０１５９】
結果：この分析の結果を図３に示す。試料は、加熱後、還元せずに分析した。二つの精製済みタンパク質ＡＭＨ−２及びＡＭＨ−３が、抗ヒスチジン抗体（図３Ａ）を用いて可視化された膜上に示されている。予想通り、ネガティブコントロールウェルに反応性は観察されない。試験される抗ＡＭＨ抗体はすべてＡＭＨ−３タンパク質を認識するが、ＡＭＨ−２タンパク質も認識するのは１Ｂ１１Ｂ１クローンのみであり、しかもその反応性はＡＭＨ−３の場合よりずっと低い。４Ｇ１０Ｅ１２及び３Ｈ８Ｅ２のクローンの場合、この結果は、ＥＬＩＳＡによって得られる結果と一致する。実際、これら抗体の結合ゾーンは、ＡＭＨ−２コンストラクトには存在しないＡＭＨの２５６−４５１領域内にある。ＥＬＩＳＡにより、１Ｂ１１Ｂ１及び５Ｃ５Ａ１０のクローンは同様の反応性を呈し、ＡＭＨ−２及びＡＭＨ−３を良好に認識する。抗−Ｈｉｓ抗体で可視化された膜上に見ることができるように、ウェスタンブロットにより、１Ｂ１１Ｂ１０抗体は、ＡＭＨ−３には強いシグナルを出し、ＡＭＨ−２に得られるシグナルは、タンパク質が同等の量で存在していても、それよりもずっと弱い。このことから、部分的変性技術であるウェスタンブロット法が、ＡＭＨ−２タンパク質の抗原性の試験に適していないと結論付けることができる。ＥＬＩＳＡにより極めて良好な反応性を示す５Ｇ５Ａ１０抗体は、ウェスタンブロット法ではシグナルをほとんど又はまったく出さない。この実験条件下におけるＡＭＨ−３との結合が弱いことを考慮すると、ＡＭＨ−２との反応性がまったく観察されないことは普通である。全体として、この実験は、５Ｇ５Ａ１０又はある程度において１Ｂ１１Ｂ１などの熱変性に感受性の非線状抗体の認識の研究に、ウェスタンブロット法が適さないことを示している。したがって、文献において抗ＡＭＨ抗体に対してウェスタンブロット法により実施される分析は、十分に注意して解釈しなければならず、可能であれば、ウェスタンブロット法よりもＥＬＩＳＡによる分析が好ましい。
【０１６０】
実施例６：サンドイッチイムノアッセイ法によるＡＭＨの検出
市販のＡＭＨキットで、試料が採取された後アッセイが実施されるまでの時間の関数として試料について取得される濃度の間には、有意な差が観察された。この種の変動性は、臨床においては受け入れられず、したがって、測定されるＡＭＨ濃度が正確で再現性を有し、アッセイの前に試料を＋２／８℃又は−１９／−３１℃で貯蔵することができる頑強なキットが利用可能であることが必須である。このようなアッセイが、ヒトＡＭＨのアミノ酸１５７−２５５に向けられた抗体を選択することにより実施された。
【０１６１】
６．１．自動化イムノアッセイの手順
ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動免疫分析機器（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いる一工程式のサンドイッチイムノアッセイ法により、生物学的試料中におけるＡＭＨの検出を実施した。単回使用チップは、反応の固体相及びそのピペットシステムの両方として作用する。この自動機器のカートリッジは、シール及び標識されたアルミニウム箔で覆われた１０個のウェル（Ｘ０からＸ９）から構成される。第１のウェル（Ｘ０）は、試料の導入を容易にするために事前にカットされた部分を含む。最後のウェル（Ｘ９）は、その中で基質の蛍光光度が測定される光学キュベットである。分析に必要とされる種々の試薬が中間ウェルに収容される。アッセイのすべての工程は、このようにして、機器により自動的に実施される。それらは反応媒体の吸引／放出のサイクルの連続からなる。
【０１６２】
チップの感受性増加及びパッシベーション：それぞれＴｒｉｓバッファー（ｐＨ６．２）中、７μｇ／ｍｌで、Ｃ１対については５Ｇ５Ａ１０モノクローナル抗体の又はＣ２対については８Ｃ５Ｂ１０Ｈ５モノクローナル抗体の、２７０μｌｌの溶液を用いて、チップの感受性を増加させた。感光液と共に＋１８／２５℃で約２０時間インキュベートした後、チップを空にした。次いで、５ｇ／ｌ  のウシアルブミンを含むこれと同じ溶液３００μｌを加え、＋１８／２５℃で約２０時間チップのパッシベーションを行った。次いでチップを空にし、乾燥させ、その後使用まで防湿して＋４℃で貯蔵する。
【０１６３】
コンジュゲート抗体溶液の調製：Ｃ１対の場合、コンジュゲート溶液は、アルカリホスファターゼに結合した、Ｆａｂ’断片の形態の４Ｇ１０Ｅ１２モノクローナル抗体を含む。Ｃ２対の場合、コンジュゲート溶液は、アルカリホスファターゼに結合した、Ｆａｂ’断片の形態の５Ｇ５Ａ１０モノクローナル抗体を含む。コンジュゲートした抗体は、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ  ＢＳＡバッファー（ｐＨ６．５）中において約０．１μｇ／ｍｌに希釈された。
【０１６４】
イムノアッセイ：ＶＩＤＡＳ（登録商標）チップが試料と接触するとすぐに、捕捉抗体がこのチップに固定化されているため、免疫反応が開始される。自動機器は試験試料（８９．６μｌｌ）を２２６μｌｌのコンジュゲート溶液と混合する。インキュベーションは約１０分間３７℃で続き、ＡＭＨの、一方でコーンに吸着された抗体に対する特異的結合を、他方でコンジュゲートした抗体（検出抗体）への結合を可能にする。次いで未結合成分を、１５４ｍＭのＮａＣｌ及び０．５５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む５４ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．３）での３回の洗浄により除去する。最後の可視化工程の間に、４−メチルウンベリフェリルホスフェート基質を吸引し、次いでチップ中に放出する；コンジュゲート抗体の酵素は、この基質の４−メチルウンベリフェロンへの加水分解のための反応を触媒し、それにより発せられる蛍光光度を４５０ｎｍで測定する。蛍光光度シグナルの値（ＲＦＶ ＝ 相対的蛍光光度値）は、試料中に存在する抗原の濃度に比例する。
【０１６５】
６．２．種々の貯蔵条件を経た試料のＡＭＨアッセイ
年齢１９から５２の女性に由来する天然試料の８つのプールを、市販のＡＭＨ  Ｇｅｎ  ＩＩ  Ａｓｓａｙキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）及び二対の抗体（Ｃ１及びＣ２）をＶＩＤＡＳ（登録商標）自動機器に用いて並行してアッセイした。各試料プールは、ローヌアルプス地域圏のＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ（ＥＦＳ）［フランス国血液銀行］から得た女性由来の３つの血清からなる。
【０１６６】
これら試料を、試料採取後４時間以内に（時間Ｔ０に対応）、次いで、＋２／８℃で２４時間貯蔵後、＋２／８℃で７日間貯蔵後、及び-１９／-３１℃で７日間貯蔵後に（これら試料の種々の貯蔵条件に対応）試験した。
【０１６７】
マイクロプレート形態のキットの場合、それぞれの用量を、生産者により推奨されるレンジの関数として計算した。次いで、Ｔ０において得られた用量に対する各貯蔵条件について得られた用量の比を計算した。ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動機器の場合、各貯蔵条件について、２対の抗体の各々に得られた蛍光光度シグナル（ＲＦＶ＝相対的蛍光光度値）を使用して、Ｔ０で得られた蛍光光度シグナルに対する比を計算した。得られた結果を表８に示す。
【０１６８】
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Ｃ１：捕捉抗体としての５Ｇ５Ａ１０及び検出抗体としての４Ｇ１０Ｅ１２を用いたＶＩＤＡＳ（登録商標）アッセイ；Ｃ２：捕捉抗体としての８Ｃ５Ｂ１０Ｈ５及び検出抗体としての５Ｇ５Ａ１０を用いたＶＩＤＡＳ（登録商標）アッセイ；ＲＥＦ：ＡＭＨ  Ｇｅｎ  ＩＩマイクロプレートアッセイ
【０１６９】
Ｔ／Ｔ０比が１に近づく程、経時的に又は貯蔵条件に従って、検出されるＡＭＨの量の変動性は小さくなる。Ｃ１又はＣ２対を用いるＡＭＨアッセイは、先行する試料の貯蔵条件に関係なく常に同じ結果を生じる：試料を＋２／８℃で２４時間貯蔵したとき、Ｔ／Ｔ０比は、平均で０．９９（Ｃ１）及び１．０２（Ｃ２）である。これら値は極めて１に近く、一方参照キットは平均比１．３３を呈し、これは、測定される用量が平均して１．３３倍となることを示す。同じ種類の観察を、試験される他の貯蔵条件について行う。
【０１７０】
つまり、５Ｇ５Ａ１０抗体はヒトＡＭＨの１５７−２５５ゾーンの非線状エピトープを認識し、４Ｇ１０Ｅ１２抗体はヒトＡＭＨの２５６−４５１ゾーンの非線状エピトープを認識し、８Ｃ５Ｂ１０Ｈ５抗体はＡＭＨの成熟領域内の線状エピトープを認識し（ヒトＡＭＨの５０８−５１９）、ＡＭＨ  Ｇｅｎ  ＩＩ  Ａｓｓａｙキットの抗体は共に成熟領域の線状エピトープに向けられる。
【０１７１】
抗体対Ｃ１及びＣ２は、頑強で、その結果が先行する試料の貯蔵条件により変動しないＡＭＨイムノアッセイの開発を可能にする。
【０１７２】
実施例７：ＶＩＤＡＳ（登録商標）ＡＭＨの分析感度
実施例６に記載されたＶＩＤＡＳ（登録商標）ＡＭＨイムノアッセイ（対Ｃ１）の分析感度を、先行技術によるアッセイのそれと比較した。同様の条件下でそれら抗体対を比較できるように、実験全体を、ＶＩＤＡＳ（登録商標）自動機器で実施した。チップを、実施例６において説明した手順に従って、５Ｇ５Ａ１０抗体（ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分を認識する抗体）、又はＡＡ０１２抗体（市販の抗体−ＡｎｓｈＬａｂｓ）でコーティングした。検出工程のために、二つのコンジュゲート、即ち４Ｇ１０Ｅ１２抗体とＡＡ０１１抗体（市販の抗体−ＡｎｓｈＬａｂｓ）とを比較した。両者は、実施例６の手順によりアルカリホスファターゼにコンジュゲートした。４Ｇ１０Ｅ１２コンジュゲートは１８０ ｎｇ／ｍｌで、ＡＡ０１１コンジュゲートは５００ｎｇ／ｍｌで、それぞれ使用した。このように、ＡＭＨのプロ領域のＣ末端部分を認識する４Ｇ１０Ｅ１２コンジュゲートは、市販の抗体と比較してずっと少ない量で使用される。このことは完全に予想外である。
【０１７３】
０．０５５から１１ｎｇ／ｍｌにわたるＡＭＨの標準レンジを、ＡＭＨ濃度が既知である血清を、閉経期の女性由来の血清中において希釈することにより調製し（無視できるＡＭＨ濃度）、次いで以下３つのアッセイフォーマットを用いて測定した：
対Ｃ１：捕捉５Ｇ５Ａ１０＋検出４Ｇ１０Ｅ１２
ＡｎｓｈＬａｂｓ対：捕捉ＡＡ０１２＋検出ＡＡ０１１
混合対：捕捉５Ｇ５Ａ１０＋検出ＡＡ０１１
結果を表９に示す。
【０１７４】
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Ｓ／Ｎ＝「シグナル／ノイズ」比。所与のアッセイフォーマットについての、レンジのポイント０（ＡＭＨを含まない）のＲＦＶ  シグナルに対するＲＦＶシグナルの比。
【０１７５】
対Ｃ１（５Ｇ５Ａ１０＆４Ｇ１０Ｅ１２）は、極めて良好なシグナルダイナミクスと、極めて低いバックグラウンドノイズ（ポイント０において１ＲＦＶ）を呈する。先行技術による対ＡＡ０１２＆ＡＡ０１１は、それよりも不良のシグナルダイナミクス（１１ｎｇ／ｍｌで、対Ｃ１の場合の６３３５ＲＦＶに対し、５３９２ＲＦＶ）と、特に大きなバックグラウンドノイズ４５ＲＦＶを呈する。混合対（５Ｇ５Ａ１０＆ＡＡ０１１）は、対Ｃ１（同じ捕捉抗体）と同等のシグナルダイナミクスを有する。バックグラウンドノイズ（７ＲＦＶ）は、対ＡＡ０１２＆ＡＡ０１１の場合よりかなり低いが、対Ｃ１より高いままである。したがって、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比の点で、分析的に最も感度の高いアッセイは、対Ｃ１を用いるものであり、次いで混合対を用いるもの、そして最後にＡｎｓｈＬａｂｓ対を用いるものである。
【０１７６】
実施例８：ＶＩＤＡＳ  ＡＭＨアッセイの分析的特異性
実施例６に記載されたＶＩＤＡＳ  ＡＭＨアッセイ（対Ｃ１）の分析的特異性を、交差反応性を有する化合物を分析することにより確立した。これら化合物を、１ｎｇ／ｍｌ及び４ｎｇ／ｍｌのＡＭＨを含む血清試料に過負荷量で加えた。この試験の結果を表１０にまとめる。
【０１７７】
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試験した濃度で有意な交差反応性は検出されなかった。ＶＩＤＡＳ  ＡＭＨアッセイは、極めて良好な分析的特異性を呈する。
【０１７８】
実施例９：ＶＩＤＡＳ  ＡＭＨアッセイの精度
ＶＩＤＡＳ  ＡＭＨアッセイ（対Ｃ１）の精度の試験を、測定値レンジの５つの濃度レベルを代表するヒト試料のパネルを用いて実施した。各濃度レベルについて、再現性（シリーズ内精度）、バッチ内精度及び実験室内精度（機器内バッチ内精度）を予測した。この試験の間に得られらた値を表１１に報告する：
【０１７９】
2019528676.tif 000019
【０１８０】
この極めて広範な試験が示すように、ＶＩＤＡＳ  ＡＭＨアッセイは、良好な再現性を呈する：異なるバッチ間の変動係数（ＣＶ）は、１１％を超えない。
【０１８１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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