(57)【要約】本発明は、血漿、血清、または他のいずれかの体液中のインシュリンまたはインシュリン類似体の検出のための特異的で敏感なバイオ分析方法を提供し、ここで、該インシュリンまたはインシュリン類似体は、タンデムマススペトロメトリック検出を伴う固相抽出および液体クロマトグラフィーを使用することによる検出のために、安定な同位体窒素で標識される。【選択図】図１
2019505786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体マトリックス中のインシュリンまたはインシュリン類似体の定量化および検出のための方法であって、以下の工程：
ｉ．安定同位体によって既知の量のインシュリンまたはインシュリン類似体を標識し、標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を形成すること；
ｉｉ．生体マトリックスに標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を導入すること；
および
ｉｉｉ．液相クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってインタクトなインシュリンまたはインシュリン類似体に関して生体マトリックスを分析すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
標識化インシュリン類似体が、ＩＮ−１０５であり、以下の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【化１】
2019505786.tif 000016
【請求項３】
安定同位体によって既知の量のインシュリンまたはインシュリン類似体を標識し、標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を形成する工程が、発酵プロセスの間にプロインシュリンまたはプロインシュリン類似体の発現をコードする遺伝子を担持するPichia pastorisの組換え株を含む培養培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
同位体が、窒素（１５Ｎ）、硫黄（３４Ｓ）、酸素（１８Ｏ）、水素（２Ｈ）、および炭素（１３Ｃ）のうちの少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
培養培地中の同位体窒素（１５Ｎ）源が、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、メチルアミン、および尿素の少なくとも一つである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
培養培地中の同位体炭素（１３Ｃ）源が、メタノール、グリセロール、グルコース、およびソルビトールの少なくとも１つである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
培養培地中の同位体硫黄（３４Ｓ）源が、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸カリウムの少なくとも１つである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
発酵プロセスが、二相であり、第１の相が、炭素源としてグリセロールを含むことにより細胞量を増加させるためのバッチ相、および、標識化インシュリンまたはインシュリン類似体の前駆体の分泌を誘発するためのメタノール、および発現される標識化インシュリンまたはインシュリン類似体中への封入のための同位体ソースを使用するフィードされたバッチ相である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
標識化インシュリンまたはインシュリン類似体の前駆体を、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢによって処置して、標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を形成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生体マトリックスが、全血、血清、血漿、尿、発酵ブロス、または緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
生体マトリックスが、ジカリウムまたはトリカリウムＥＤＴＡと結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
生体マトリックスが、−２０℃または−８０℃で保存されるか、または、サイクルごとに新たに調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
保存期間が、１日から２５０日間までであった、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）が、オフライン固相抽出（ＳＰＥ）を使用する試料処理、続く９６ウェル形成におけるオンラインＳＰＥをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
標識化インシュリンまたはインシュリン類似体が、外部から送達されたインシュリン類似体を内因性のインシュリンから見分けるために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
生体マトリックス中で、０．２００ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬまでの範囲の同位体標識化インシュリンまたはインシュリン類似体の濃度を決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
インシュリンまたはインシュリン類似体の少なくとも１つの追加のタイプを含む生体マトリックス中のＩＮ−１０５インシュリンの安定性を決定するための方法であって、以下：
ｉ）窒素の安定同位体によって既知の量のＩＮ−１０５を標識して、標識化ＩＮ−１０５を形成すること；
ｉｉ）標識化ＩＮ−１０５を、少なくとも１つの追加のインシュリンまたはインシュリン類似体を備える生体マトリックスに導入すること；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）から得られた溶液を、オフライン固相抽出（ＳＰＥ）、続いて９６オンラインＳＰＥウェル形成を使用する、混在モード陰イオン交換逆相固相抽出プロセスに付すこと；
ｉｖ）インタクトな標識化ＩＮ−１０５を、液相クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって、インシュリンまたはインシュリン類似体の少なくとも１つの追加のタイプのそれと比較して分析すること
を含む、前記方法。
【請求項１８】
標識化ＩＮ−１０５が、室温で２４時間安定であった、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＮ−１０５が、以下の構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化２】
2019505786.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿、血清、または他のいずれかの体液中のインシュリンまたはインシュリン類似体の検出のための、特異的で感度が高いバイオ分析方法に関する。それは、特に、安定な同位体窒素による生体化合物の標識化、および、固相抽出とタンデム質量分析検出を伴う液体クロマトグラフィーを使用するバイオ分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質を基礎とした生物学的薬物に関して、タンパク質の機能を解明するために、またはタンパク質の試験およびスクリーニングのために、またはタンパク質の全身曝露を測定するために、タンパク質（血漿、血清、または他のいずれかの体液中に含有されるインシュリン等）を検出し、定量的にそれらを測定することが、必要である。それゆえ、高感度でインシュリン量を定量するためのより一般的な方法が確立される場合、前臨床試験の間または臨床試験において、薬物動力学を推定することが、可能になる。従つて、ヒトにおける薬物動力学を薬物開発の初期に推定することが、可能となる。
【０００３】
典型的には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡ法が、生体試料中のインシュリンを定量するために使用されていた。免疫化サイクルが、ヒトインシュリンおよびＩＮ−１０５に等しい結合を示す抗体を産生し、それは、小さなアルキルポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加が、免疫学的に分子を見分けるのに十分なほど大幅に構造を変化させないことを示唆したので、インシュリン類似体「ＩＮ−１０５」に特異的な抗体を作り出す試みは、成功していなかった。２つの分子間の分子量の違いは、ＩＮ−１０５中のアルキルＰＥＧによって２１７ダルトンである。よって、特異的なＥＬＩＳＡに基づく推定アッセイは、ＩＮ−１０５のために開発されることができなかった。
【０００４】
従来は、二次元電気泳動などの電気泳動を使用する方法が、生体タンパク質を定量するために行われていた。この方法に伴い、検出および定量化は、定量されるべきタンパク質に染色することにより、または、オートラジオグラフィにより、または、特定のタンパク質に特異的な抗体を使用することにより（ウエスタンブロット）、遂行された。
【０００５】
しかしながら、不溶性タンパク質または高分子タンパク質を電気泳動にかけることが可能ではないので、インシュリンまたはインシュリン類似体のような高分子タンパク質を定量するためのこれらの方法を適用することは、困難だった。
【０００６】
他方では、著しい進歩が、マススペクトロメトリー検出法の分野にあり、そして、種々の生体物質を検出または測定するための技術が考察され使用された。典型的には、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ計測は、検体の分離のための液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、続いて、試料が脱溶媒和とイオン化を受けるイオン化チャンバーが関与し、そして、次に質量が、マススペクトロメータによって検出される。マススペクトロメーターにおける設計の進歩は、このようなインタクトな形では大きな分子の一貫した断片化を支持し、複数の反応モニタリングモード（ＭＲＭ）の使用を可能にし、該方法をＩＮ−１０５へ高度に特異的にした。
【０００７】
ヒトインシュリンタンパク質は、５１のアミノ酸から構成され、５８０８Ｄａの分子量を有する。それはＡ鎖およびＢ鎖の２量体であり、それは、ジスルフィド結合により共に連結される。ヒトインシュリンのいくつかの類似体は、ＩＮ−１０５、Insulin Aspart、Insulin Lispro、およびInsulin Glargineなどとして入手できる。これらのインシュリン類似体は、ヒトインシュリンの構造に密接に関連しており、速い作用（食事のインシュリン）および長い作用（基礎のインシュリン）による血糖コントロールの、特異的な側面のために開発された。
【０００８】
特異的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法は、血漿中のインタクトなＩＮ−１０５分子の測定のために、開発されることができた。試料の調整は、検体のオフラインの固相抽出を使用して実行されることができ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる試料の分析の前に、オンラインの固相抽出が続く。
【０００９】
発明の目的：
本発明の目的は、０．２０ｎｇ／ｍｌ〜５０．０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での、ヒト血漿中のインシュリンまたはインシュリン類似体ＩＮ−１０５の検出および定量化のための、感度が高い分析方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、ヒト血漿中のＩＮ−１０５などの、インシュリンまたはインシュリン類似体の検出のための、バイオ分析方法に関する。
本方法は、窒素、すなわち１５Ｎの安定同位体による、インシュリンまたはインシュリン類似体の標識化を含む。標識化は、増殖および発酵培地中の標識化窒素を提供することによって、窒素（１５Ｎ）の安定同位体によって達成される。該細胞は、それゆえ、インシュリンまたはインシュリン類似体のほとんどすべての窒素原子が、安定同位体１５Ｎにより置換される標識化培地において、増殖される。本方法のために使用される標識化窒素源は、硫酸アンモニウム［（１５ＮＨ４）２ＳＯ４］である。
【００１１】
本発明のもう一つの側面は、固相抽出およびマススペクトロメーターの検出を伴う液体クロマトグラフィーを使用して更に決定される標識化インシュリンまたはインシュリン類似体のインタクトな分子の決定に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、全プロセスのスキームのフローチャートである。
【図２】図２は、上流のプロセスのフローチャートである。
【図３】図３は、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ処置による、ＩＮ−１０５前駆体のＩＮ−１０５への変換のプロセスである。
【図４】図４は、試薬ブランクに関するクロマトグラフィーピークである。
【図５】図５は、二重ブランクに関するクロマトグラフィーピークである。
【図６】図６は、マトリックスブランクに関するクロマトグラフィーピークである。
【００１３】
【図７】図７は、０．２００ｎｇ／ｍＬ  ＬＬＯＱ（定量化の下限）での検量基準である。
【図８】図８は、検量基準５０．０ｎｇ／ｍＬ  ＵＬＯＱ（定量化の上限）である。
【図９】図９は、ＱＣ  ０．２００ｎｇ／ｍＬ  ＬＬＯＱである。
【図１０】図１０は、ＱＣ  ０．６００ｎｇ／ｍＬ  ＬｏＱＣである。
【図１１】図１１は、ＱＣ  ２０．０ｎｇ／ｍＬ  ＭｅＱＣである。
【図１２】図１２は、ＱＣ  ４０．０ｎｇ／ｍＬ  ＨｉＱＣである。
【図１３】図１３は、薬動力学的検討のＡＵＣｔ対用量のグラフである。
【図１４】図１４は、薬動力学的検討のＣｍａｘ対用量のグラフである。
【図１５】図１５は、ＩＮ−１０５  ３０ｍｇに関する平均血漿濃度のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の記載：
本発明は、タンデムマススペクトロメトリー検出法を伴う液体クロマトグラフィーを使用するインシュリンまたはインシュリン類似体の検出のためのバイオ分析方法に関する。
特に、本発明は、生体マトリックス中のＩＮ−１０５の定量化のための、高度に特異的な方法に関する。
態様の１つにおいて、生体マトリックスは、全血、血清、血漿、尿、発酵ブロス、または緩衝液である。
【００１５】
本方法は、疾患状態の多様性のもとで、我々にＩＮ−１０５の曝露を決定することを可能にする。方法は、共に投与されたインシュリン／インシュリン類似体および内因性のインシュリンからＩＮ−１０５を識別することができる。マススペクトロメトリー検出法の使用によって、分子量に違いがある限り、該方法は、同時に異なるインシュリン類似体を決定するために使用されることができる。該方法は、インシュリンまたはその類似体とともに、追加としてＣ−ペプチドのレベルを決定するために、更に開発されることができる。一般に、該方法は、有用な代替手段を免疫学的な方法に提供する。
該プロセスのスキームは、図１中に描かれている。
【００１６】
ＩＮ−１０５は、ＵＳ  ９，１０１，５９６中に開示され記載されているように、経口送達のために開発された、新規な「急速に作用するインシュリン類似体」である。該分子は、Ｂ鎖の第２９番目のリシンのε−アミノ基で短鎖アルキルポリエチレングリコール分子と結合されていることを除き、ヒトインシュリンと同一のアミノ酸配列を有する。
該方法の高度な特異性により、ＩＮ−１０５は、あらゆるヒトインシュリンまたは共に投与されたインシュリン様のインシュリンGlargineの存在のもとで、選択的に定量されることができる。Ｔ１Ｄ（１型糖尿病）を伴う患者への１０ｍｇ投与から得られた薬動力学的プロフィールから実証されるように、これは、該方法を、経口投与の後のＩＮ−１０５の薬動力学的曝露を決定することにおいてきわめて有用にする。
【００１７】
上流のプロセスには、窒素（１５Ｎ）、硫黄（３４Ｓ）、炭素（１３Ｃ）、酸素または水素などの安定なアイソトープの非金属元素によって、インシュリンまたはインシュリン類似体の標識化が、関与する。培養培地の同位体の窒素（１５Ｎ）源は、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、メチルアミン、尿素の少なくとも１つである；培養培地の同位体の炭素（１３Ｃ）源は、メタノール、グリセロール、グルコース、ソルビトールの少なくとも１つである；培養培地の同位体の硫黄（３４Ｓ）源は、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウムの少なくとも１つである；水素標識化に関してはＤ２０、および酸素標識化に関してＨ２Ｏ１８である。該プロセスのスキームは、図２中に描かれている。
【００１８】
下流プロセスには、ヒトの対象からの正常なおよび疾患の血漿の薬動力学的曝露を決定する方法のバリデーションが、関与する。バリデーションの検討は、直線性、正確さおよび精密さ、選択性および特異性、反復性および再現性を含んだ。
【００１９】
上流のプロセスは、種培養の調製により始まり、それには、組換え株（Pichia pastoris）を使用することにより調製される細胞バンクの培養からの、種フラスコの接種が関与する。株は、インシュリン前駆体の発現をコードする遺伝子を担持する。種フラスコは、期間を通じて増殖され、生産発酵槽をスタートさせるための接種菌として使用されるであろう菌体量を増加させた。発酵は、二相、すなわちバッチ相およびフィードされたバッチ相において実行される。バッチ相の間、発酵は、炭素源としてグリセロールを使用して菌体量を増加させるために遂行され、メタノールは、フィードされたバッチ相の間、プロセスの間の唯一の窒素源としての１５Ｎ標識硫酸アンモニウムとともに、インシュリン前駆体の分泌を誘発するために使用される。発酵の間、タンパク質１５Ｎで標識化されたインシュリン前駆体が、上清に放出される。
【００２０】
発酵の後、下流の精製プロセスは、細胞のない上清からインシュリン前駆体を単離し、それを、メトキシ−トリエチレングリコール−プロピオニル−ＮεＢ２９組換え型インシュリン前駆体（トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ触媒反応によってインシュリンに転換される）に転換する役目をする。複数のＨＰＬＣ工程は、このプロセスの間に、生成物に近い関連する不純物を分解するために用いられる。複数のクロマトグラフィー工程は、生成物関連の不純物を分解するために使用される。精製工程の後、生成物は、結晶化され、凍結乾燥される。
【００２１】
インシュリン類似体に特異的な推定方法は、内因性のインシュリンから外部から与えられたインシュリン類似体を見分ける際の臨床的な検査のために有用である。ＩＮ−１０５の文脈において、特異的にＩＮ−１０５を推定する方法は、経口送達において、インシュリン類似体の吸収に関して明解な証拠を提供する。かかる知見の意味するところは、経口インシュリンの臨床的な開発に、計り知れない重要性をもつ。ＩＮ−１０５が急速に作用するインシュリンであり、それは、具体的な治療状態のもとで、基礎のインシュリン（例えばGlargine）と共に投与されることが、予想される。それゆえ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法の特異性は、基礎のインシュリンGlargineの存在のもとで試験された。
【００２２】
インシュリンまたはインシュリン類似体の１５Ｎ標識生成物を得るうえで、該生成物は、血漿中のＩＮ−１０５の決定のための分析方法の内部標準として、使用された。分析方法は、ヒト血漿またはＫ２ＥＤＴＡまたはＫ３ＥＤＴＡ（ジカリウムまたはトリカリウムＥＤＴＡ）を含有している他の体液中のインシュリンまたはインシュリン類似体の決定のために、使用されることができる。
【００２３】
分析は、液体クロマトグラフィー−陽イオンのTurbolonSprayを用いるタンデム型質量分析の複数反応モニタリングモードを用いる。試料は、オフラインの固相抽出（ＳＰＥ）抽出、続く９６穴フォーマットのオンラインＳＰＥを使用して、調製される。
本方法は、ヒト血漿中のインシュリンまたはインシュリン類似体の決定に関する。
好ましくは、本方法は、０．２００ｎｇ／ｍＬ〜５０．０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にわたる、インシュリンまたはインシュリン類似体を決定するために用いる。
【００２４】
上流プロセス：
接種菌フラスコ：標識化のための手順は、表１に示されるのと同様に設計されて、培地を含有する接種菌フラスコの細胞株の播種（直接または種フラスコを通して）で始まる。
【表１】
2019505786.tif 000003
１．すべての３つの成分は、１２１℃で６０分間、別々にオートクレーブ処理した。
２．オートクレーブ処理の後、３つの成分は、２０００ｍＬのフラスコ中で混合し、１つの培養バイアルで接種した。
３．フラスコは、３０℃±１℃で２４±２時間、培養のための振盪機インキュベーターに保った。
【００２５】
発酵手順
ＯＤ（光学密度）が所望のレベル（１０）に達したとき、接種菌フラスコからの接種菌を、発酵のために更に移した。発酵には、バッチ相およびメタノールがフィードされたバッチが関与した。
表２−４中に記載された発酵培地の組成。
【表２】
2019505786.tif 000004
【表３】
2019505786.tif 000005
【表４】
2019505786.tif 000006
【００２６】
ビオチン溶液調製：
ビオチン（０．２ｇ／Ｌ）は、使用の前に、飲料水に溶解し、０．２μでフィルター滅菌した。
手順：
１．発酵培地を、次に、１２１℃で６０分間、オートクレーブ処理した。
２．発酵は、３０℃、３５０  ｒｐｍでスタートした。
３．発酵槽を接続した後に、ｐＨを、２０％ｗ／ｗ  ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）溶液で４．９に調整した。
４．無菌の微量塩液とビオチンを、加えた（それぞれ４．３５ｍｌ／Ｌ）。
微量塩を加えるとすぐに、ＤＯは下がった。
５．メタノール１リットル当たり、１２．０ｍＬの微量塩液、１２ｍＬのＤ−ビオチン溶液、および２．５ｇｍの２０％Ｈ２ＳＯ４（ｗ／ｗ）を加える。
メタノールは、発酵槽にフィードする前に、０．２μでフィルター滅菌する。
６．６．一旦接種菌フラスコ中ＯＤが１０−１５まで達すると、２５０ｍｌの接種菌を加えた。
７．７．ＲＰＭを、７〜８段階でで３５０から８００に増やした。
【００２７】
バッチ相
バッチ相発酵のパラメータは、
１．ｐＨ：５．０±０．２
２．温度：３０±２℃
３．溶存酸素（ＤＯ）：３０％
ＤＯは、最初、手動でＲＰＭを増加させることによって維持した。ＤＯが４０％まで達したとき、ＲＰＭは、２００に、１工程で最大まで増やした。
一旦ＲＰＭ（ＲＰＭ）が最大まで達すると、ＤＯ（溶存酸素）は、最小１０％および最大３０％から開始し、ガス混合物のカスケードに置かれ、次に要求に応じて増やした。
ＤＯが急上昇し始めそしてｐＨが上昇し始めたとき、試料を取り、および湿潤細胞重量のための分析を行った。次に、ｐＨは、設定値６．０に変化させ、温度は、２３℃に調整した。
バッチ相が終わったとき、１時間後に、メタノール相をスタートさせた。
【００２８】
メタノールがフィードされたバッチ
メタノールがフィードされたバッチの発酵（メタノール誘導相）のパラメーターは、
１．ｐＨ：６．０±０．２
２．温度：２３±２℃
一旦、ＤＯが、バッチ相において上昇すると、メタノール添加を、スタートした。
（表４を参照）。
メタノールの流速は、天秤（０．８密度ファクター）を使用することにより、周期的にチェックした。
天秤読み取りは、連続的に記録した。
発酵は、表５で述べたとおり、メタノール誘導相の間、メタノール蓄積に関して周期的にチェックした（１−５分）。
【表５】
2019505786.tif 000007
発酵の間、タンパク質１５Ｎで標識化したインシュリンまたはインシュリン前駆体タンパク質が、上清に放出される。
【００２９】
前駆体の処置
発酵の後、最終的なブロスのｐＨは、オルトリン酸でｐＨ  ２．５に調整し、続く遠心分離によって無細胞上清を得て、それをさらに下流の精製プロセスに付し、無細胞上清からインシュリンまたはインシュリン類似体前駆体を単離し、それをメトキシ−トリエチレングリコール−プロピオニル−Ｎ−ε−Ｂ２９組換え型インシュリンまたはインシュリン類似体前駆体に変換し、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで触媒した反応を、それを通して、インシュリンまたはインシュリンに類似体に変換する。ＩＮ−１０５前駆体の変換のプロセスのスキームは、図３において描かれる。
【００３０】
下流プロセス：
ストック溶液、較正標準、および試料の調製
コントロール血漿：
正常で健康なボランティア（ＮＨＶ）からのコントロールヒト血漿（Ｋ２ＥＤＴＡ）が、得られた。
１型（Ｔ１ＤＭ）または２型（Ｔ２ＤＭ）糖尿病のいずれかと診断された患者からのコントロールヒト血漿（Ｋ２ＥＤＴＡまたはＫ３ＥＤＴＡ）も、得られた。
１型および２型糖尿病を有する患者からの血漿は、外部の供給者から調達し、Ｄｉ−カリウムＥＤＴＡ（Ｋ２ＥＤＴＡ）またはＴｒｉ−カリウムＥＤＴＡ（Ｋ３ＥＤＴＡ）も、入手できた。
【００３１】
コントロールヒト血液（Ｋ２ＥＤＴＡまたはＫ３ＥＤＴＡ）は、全血安定性実験用に、そして、溶血（血漿中に２％の全血）の評価において使用するマトリックスの調製用に、ボランティアから得た。
高脂血症血漿は、コントロールヒト血漿（Ｋ２ＥＤＴＡ）に、１：９の比率でのイントラリピッドの添加によって調製し、該方法への高脂血症の影響を評価するために使用した。
溶血した（血漿中に２％の全血）血漿も、得られた。
外部の供給者または社内ボランティアから得られたすべての血漿は、使用の前に−２０℃で保存し、全血は、４℃で保存した。
【００３２】
溶液調製：
２つの別々のストック溶液は、２ｍｇのＩＮ−１０５を溶解し、メタノール：水を３０：７０ｖ／ｖの比率で含有する２％酢酸１ｍＬ中に溶解することによって、調製した。
従つて、２０００μｇ／ｍＬのストック溶液を、調製した。
１つは「較正ストック」と名付け、その他は、「品質管理ストック」と名付けた。ストック溶液は、−２０℃で４０日間保存した。
【００３３】
較正ストック溶液は、ストック溶液５０μＬを加え、希釈液４５０μＬにそれを希釈することによって、調製した（アセトニトリル：水５０：５０ｖ／ｖ中の０．１％ＴＦＡ）。
品質管理（ＱＣ）試料は、０．２（ＬＬＯＱ  ＱＣ）、０．６（ＬｏＱＣ）、２０（ＭｅＱＣ）、４０（ＨｉＱＣ）、および５０（ＵＬＯＱ  ＱＣ）の最終的な濃度を有するやり方で、表６に従って調製した。これらのＱＣ試料は、−２０℃および−８０℃で７３日間保存し、バリデーション目的のためだけに、使用した。
【表６】
2019505786.tif 000008
【００３４】
標準の調製
種々の標準を、分析標準、内部標準、共投与した標準および較正標準を含むバリデーション検討のために、調製した。
●分析標準：９６．３％の純度の標準、ＩＮ−１０５は、その既知の安定期間の間で使用した。
●内部標準：内部標準のストック溶液は、その既知の安定期間において使用し、構成溶液と同じやり方で１５Ｎ標識化ＩＮ−１０５を使用して調製した。内部標準溶液の最終的な濃度は、９６．１％の純度で１００ｎｇ／ｍＬであった。
【００３５】
●共投与した標準：３．６４ｍｇ／ｍＬの濃度で１００％純度の共投与した標準「Ｇlargine」は、その既知の安定性期間の範囲内で使用した。
●較正標準：較正標準は、「較正ストック溶液」から新たに調製した。較正標準は、適切な体積の較正ストックを使用し、それをＫ２ＥＤＴＡまたはＫ３ＥＤＴＡを含有している正常で健康なボランティアからの血漿で希釈して調製した。較正標準は、大量に調製し、最高２４４日まで−２００℃または−８００℃で保存し、そして、ヒト血漿中でＩＮ−１０５の既知の安定性の範囲内で使用することができる。表７は、手順およびその調製のために使用した較正標準を詳述する。
【００３６】
最終的な較正標準の濃度は、０．２、０．４、１、５、１０、２０、４５、および５０ｎｇ／ｍＬであった。
【表７】
2019505786.tif 000009
【００３７】
試料採取
試料は、９６ウェル形成のオフライン固相抽出（ＳＰＥ）、続くオンラインＳＰＥによって、生体マトリックス中の標識化インシュリンまたはインシュリン類似体を使用して、得られた。
試料採取は、毎日（２４時間ごと）を基本として、無菌性、湿潤細胞重量（ＷＣＷ）、力価、ｐＨ、および伝導率について行った。
品質管理試料は、分析日に、ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ、５０：５０中のＴＦＡ（０．１％）の品質管理使用液中で新たに調製した。
【００３８】
試料の一定分量（各々３００μＬ）を、２ｍＬの９６ウェルプレートにおいて調製した。これらの一定分量に、内部標準（１００ｎｇ／ｍＬ）２５μＬを、加えた。ブランクのいずれも、内部標準によってスパイクされなかった。プレートは、１０００ｒｐｍで２分間ボルテックスした。これに、６ＭグアニジンＨＣｌ  ５０μＬを加え、そして、該プレートは、１０００ｒｐｍで２分間ボルテックスし、続いて１０分間超音波処理した。ウェルに、１０ｍＭトリス緩衝液３００μＬを加え、そして、該プレートは、混合のために７５０ｒｐｍで２分間ボルテックスした。
【００３９】
１つの態様において、純度９６．３％および９６．１％をそれぞれ有する窒素同位体標識されたインシュリンを、更なる分析のための分析標準および内部標準として使用した。純度１００％のGlargine（３．６４ｍｇ／ｍＬ）を、分析手順において共投与標準として使用した。保存安定性および溶液安定性を理解するための安定性検討を実行した。
【００４０】
安定性検討
１つの態様において、全血中のＩＮ−１０５の安定性評価については、ＩＮ−１０５は、ＬｏＱＣおよびＨｉＱＣの濃度で、全血試料においてスパイクされた。該試料は、室温かつ氷上で、再等分し、保存した。全血の一定分量を、最高２時間までとった。試料は、２０℃、４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離によって、分析のために処理した。分離血漿は、収集し、分析時間まで−８０℃で保存した。
表（８）（容認判定基準を、名目上スパイクされた濃度の±１５％の範囲内に回復した濃度として定義した）に従って、保存（保存安定性）上の試料安定性の評価を、実行した。すべての標準は、その安定期間の範囲内で使用した。
【表８】
2019505786.tif 000010
【００４１】
システム適合性を、実行の前にテストした。ＬＬＯＱでのシグナルは、ノイズのそれより少なくとも５倍大きくあるべきであり、そして、クロマトグラフィーおよび保持時間は、以前見られたものと一致しているべきである。ＬＬＯＱの２０％より大きいキャリーオーバーが、バリデーションの範囲内で観察され、したがって、システム適合性試料の範囲内のキャリーオーバーは予想されるが、ＵＬＯＱの直後のときにはＬＬＯＱの５０％以下でなければならず、ブランク注入においてはＬＬＯＱの２０％より少なくなければならない。該試料を、各濃度レベルでの各タイプのバリデーション試料が実行の全体にわたって分配されるように、注入した。
【表９】
2019505786.tif 000011
【００４２】
ＳＰＥ抽出：
固相抽出は、ウォーターズOasis Max（１０ｍｇ）ＳＰＥプレートを使用して実行した。試料を、オフラインＳＰＥ続いて抽出オンラインＳＰＥを使用して、調製した。標識化インシュリンが得られた際、較正標準および品質管理標準を調製した。
各バリデーションの実行の前に、システム適合性試料を、分析した。これらの試料は、典型的には、ＬＬＯＱ、ＵＬＯＱでの試料、および２つのブランクマトリックス試料から成り、これにより、クロマトグラフィー、感度、およびキャリーオーバーの品質の定量評価を可能にする；ただしＵＬＯＱ試料の後で１つのみのマトリックスブランク試料を注入した分析実行１〜７を除く（表７で述べたとおり）。これは、分析方法からの逸脱であったが、観察したいかなるキャリーオーバーも、分析実行に影響を与えたとは考えなかった。
【００４３】
ＳＰＥ条件：
ＳＰＥカートリッジを、メタノール（３００μＬ）によって調節して、３００μＬの水によって平衡化した。試料を、プレートに載せ、十分な混合を確実にするために、それらを吸引および吐出させた。該プレートは、ＭｅＣＮ：水（１：１０：９０ｖ／ｖ／ｖ）中１Ｍの酢酸アンモニウム５００μＬによって洗浄し、続いてＭｅＣＮ：水（１：５０：５０ｖ／ｖ／ｖ）中１Ｍの酢酸アンモニウム５００μＬによって洗浄した。充填材料は、最大圧力を使用して乾燥させた。０．１％のトリトンＸ−１００を、新たな１ｍＬウェルプレートへ加えた。該試料は、トリトンＸ−１００を含有しているプレートに、ＭｅＣＮ：水（５０：５０のｖ／ｖ）中の２％ギ酸２５０μＬによって溶出させた。
これらの溶出液のそれぞれに、水中の０．１％ＴＦＡ３００μＬを、加え、吸引および吐出により混合した。試料は、蓋をして、分析に供した。
【００４４】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件：
クロマトグラフィーの条件：
移動相Ａは、アセトニトリル：水（１０：９０ｖ／ｖ）中の０．０２％ＴＦＡであった；移動相Ｂは、アセトニトリル：水（９０：１０ｖ／ｖ）中の０．０２％ＴＦＡであった；移動相Ａの初期濃度は、３０秒まで８５％であり、３０秒から４分３０秒まで８５％から６０％に直線的に変化し、次の１０秒間にわたって移動相Ａは、１０％に変化し、そして５分３０秒まで１０％にとどまった。平衡化のために、次の１０秒間にわたって、移動相Ａは、８５％に戻るように変化した。実行時間は、６分３０秒で完了した。溶出の温度は、５０℃に維持した。溶出は、０．５ｍＬ／分の流速を使用して実行した。注入体積は、５００μＬであった。試料は、シークエンスの間、１０℃に維持した。洗浄溶媒１は、アセトニトリル：水（１０：９０ｖ／ｖ）中の０．０１％ＴＦＡであり、洗浄溶媒２は、メタノール：水：トリトン−Ｘ１００（７０：３０：０．０５ｖ／ｖ／ｖ）中の０．０１％ＴＦＡであり、洗浄溶媒３は、メタノール：水（８０：２０ｖ／ｖ）中のアンモニア（２８％の０．５％）であった。
【００４５】
オンライン抽出条件：
カートリッジを、メタノール５００μＬを使用して、５ｍＬ／分の流速で調節した。オンラインカートリッジは、ＭｅＣＮ：水（１０：９０ｖ／ｖ）中の（０．１％ＴＦＡ）５００μＬによって平衡化した。バックフラッシュ洗浄は、２ｍｌ／分の流速で、ＭｅＣＮ：水（１０：９０ｖ／ｖ）中の（０．１％のＴＦＡ）１ｍＬを使用して与えた。それに続いてカートリッジは、５ｍｌ／分の流速で、ＭｅＣＮ：水（２０：８０ｖ／ｖ）中の（０．１％ＴＦＡ）１ｍＬを使用して洗浄した。クランプフラッシュ１は、５ｍＬ／分の流速で、ＭｅＣＮ：水（１０：９０ｖ／ｖ）中の（０．１％のＴＦＡ）５００μＬを使用して実行し、クランプフラッシュ２は、５ｍｌ／分の流速で、ＭｅＣＮ：水（９０：１０ｖ／ｖ）中の（０．１％のＴＦＡ）を使用して実行し、クランプフラッシュ３は、５ｍｌ／分の流速で、ＭｅＣＮ：水（１０：９０ｖ／ｖ）中の（０．１％のＴＦＡ）５００μＬを使用して実行した。
【００４６】
ＭＲＭ移行：
ＩＮ−１０５に関して、親イオンとして１５０６．９ｍ／ｚの四電荷状態を単離し、その１８２０ｍ／ｚの娘イオンへの移行をモニターした。１５Ｎ標識化ＩＮ−１０５に関して、１５２０ｍ／ｚを単離し、その１８３８．５ｍ／ｚの娘イオンへの移行を、定量化のためにモニターした。分子量および移行に伴うヒトインシュリンの電荷状態は、ＭＲＭモードにおいてモニターし、そして、表１０において、以下の通りに要約した。
【表１０】
2019505786.tif 000012
【００４７】
バリデーション
バリデーションの検討は、直線性、正確さおよび精密さ、選択性および特異性、反復性および再現性を含んだ。バリデーションは、実行内の精度およびバイアス、実行間の精度およびバイアス、希釈の妥当性、イオン化修飾に関連したマトリックス、自動注入装置のキャリーオーバー、室温および氷上の全血の安定性、５サイクル以上の血漿の凍結解凍安定性、血漿の２４ｈの室温安定性、−２０および−８０℃での７３日間の血漿における凍結安定性、１０℃での回収、および１０℃での抽出物安定性からなった。
【００４８】
追加のバリデーション実行を、精度およびバイアスを評価するために使用する実行の範囲内で適合しない、追加の実験を実行するために、分析した。精度およびバイアスを評価する実行は、潜在的な検討試料の実行と同じ規模（９６の試料）で設計した。追加試料を、検討試料の実行と同じ規模のバリデーション実行を行うことが要求される場合には、コントロールヒト血漿試料をこの目的のために使用した。
【００４９】
バリデーション検討設計
以下の表１１は、バリデーション検討のパラメーターを詳述する。
【表１１】
2019505786.tif 000013
△正常で健康なボランティア（ＮＨＶ）およびＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭを伴う患者からの血漿において調べた。
【００５０】
最初の分析実行において、較正標準は、検討計画に従って４５．０ｎｇ／ｍＬでなく４０．０ｎｇ／ｍＬの濃度で調製した。他の全ての実行は、検討計画の範囲内で特定した濃度での較正標準を含有した。平均の実行内の精度は１１．１％以下とわかり、平均の実行内のバイアスは０．４％と３．０％の間にあった。実行間の精度およびバイアスは、ＬＬＯＱ  ＱＣ濃度で、１６．５％および２．５％であり、他の全てのレベルで、実行間の精度は８．９％以下であり、実行間のバイアスは０．３％と２．０％の間にあった。
【００５１】
上記の実験に加えて、異なる供給源からの血漿（Ｋ２ＥＤＴＡ／Ｋ３ＥＤＴＡ）における方法の選択性、脂肪血症および溶血の効果、Glargine存在下でのインシュリンの選択性およびイオン化修飾、およびインシュリンまたはインシュリン類似体溶液の安定性を、調べた。
徹底的なチェックを、種々の条件で、血漿の安定性に関して遂行した。
【００５２】
較正曲線を受け入れ可能なものとするために、較正標準の１２（７５％）が、ＩＮ−１０５の逆算濃度を名目上の値の±１５％（ＬＬＯＱに関して±２０％）の範囲内で有しなければならなかった。与えられた較正曲線に関して、逆算濃度が、１５％以下（ＬＬＯＱで２０％）の名目から逸脱した場合、較正標準は、回帰に含まれなければならなかった。ＩＮ−１０５の算出濃度が、名目上の（ＬＬＯＱの２０％）ものから１５％以上逸脱した場合、較正標準は回帰から落とさなければならなかった。
【００５３】
容認判定基準を達成するために、最高４つの較正標準（２５％）を、較正曲線から外すことができた；さもなければ、該実行は、拒絶された。平均の実行内および実行間の精度に関する容認判定基準は、ＬＬＯＱで精度が２０％以上良好でなければならなかった以外では、すべてのレベルで１５％以下であった。平均の実行内および実行間のバイアスは、ＬＬＯＱでバイアスが名目上の濃度の±２０％の範囲内でなければならなかったが以外では、すべてのレベルで名目上の濃度の±１５％の範囲内でなければならなかった。
【００５４】
これらの追加のバリデーションのための検討設計を、以下の表１２において詳述する：
【表１２】
2019505786.tif 000014
△正常で健康なボランティア（ＮＨＶ）からの血漿において調べた
＊ただし、分析方法に対して行った改変の妥当性を決定する検討設計の一部では、改変された分析方法を使用して調べたわけではない
【００５５】
図４−１２は、試料のＬＣ／ＭＳ／ＭＳの間に得たピークを示す。
該方法は、個人間の多様性、脂肪血症、および溶血によって、または、Glargineの存在によって影響を受けなかった。該観察により、方法が十分に正確で精密であり、調査した範囲にわたってヒト血漿試料中のインシュリンの決定を可能にする充分な選択性および信頼性を有すると推察される。
【００５６】
インシュリンは、５回の凍結／解凍サイクルの後、そして−２０℃および−８０℃の両方で２４４日間の保存の後に、室温で最高２４時間まで保存する場合に、血漿中で安定であることが見出された。１０℃でほぼ８５時間保存する場合に、抽出物中で安定であることも見出された。
標識化インシュリンは、−２０℃で最高４０日間まで保存した場合、および、室温で最高２４時間まで保存した場合、メタノール：水（３０：７０のｖ／ｖ）中の酢酸（２％）中で安定であった。
【００５７】
例１：同位体窒素標識化ＩＮ−１０５の検出
血液試料は、Ｋ２−ＥＤＴＡを含有しているチューブ中に収集した。１５Ｎ標識化ＩＮ−１０５は、内部標品（ＩＳＴＤ）として使用し、血清または血漿の分離の後、チューブに加えた。ＩＳＴＤスパイク試料は、９６ウェルフォーマットにおける混在モード陰イオン交換−逆相固相抽出プロセスに付した。混在モードＳＰＥからの溶出液は、９６ウェルフォーマットにおいてセットアップした逆相（Ｃ８）ＳＰＥに移す。このＲＰ  ＳＰＥは、分析逆相ＨＰＬＣシステムを伴うセットアップオンラインであった。
ＲＰ  ＳＰＥから溶出液は、Ｃ１８分析クロマトグラフィーカラムにオンラインで移し、逆相ＨＰＬＣに付した。
【００５８】
分析クロマトグラフィーカラムからの溶出液は、３重の４重極マススペクトロメーター（ここでＥＳＩプロセスが、溶出液から気相イオンを作り出す）の中へと通る。これらの気相イオンを、次に以下の通りにＭＲＭモードにおいて分析した。
該イオンは、狭い範囲のｍ／ｚ値を有するイオンが選択される第１の４重極子の中へと通る。この狭いｍ／ｚ範囲内のイオンは、第２の４重極子へと通りぬけることを許容される。
【００５９】
第２の４重極子で、インタクトなＩＮ−１０５およびＩＳＴＤ分子（および同じ範囲のｍ／ｚ値を有する他のいずれかのイオン）は、不活性気体の存在下で衝突誘発断片化プロセスに付される。これは、第２の４重極子の中を通ることを許容された親の種に特有の断片イオンを作り出す。これらの断片化された種は、次に第３の４重極子へと通る。
【００６０】
ＭＲＭモードにおいて、第３の４重極子は、ＩＮ−１０５およびＩＳＴＤから生み出される断片に特有のｍ／ｚ値を有するイオンを選択するためにセットされるであろう。たまたまＩＮ−１０５およびＩＳＴＤと同じインタクトのｍ／ｚを有する他の種からの断片は、この段階で除去されるであろう。
第３の４重極子を通ることが許容された断片だけを、次にイオン電流として検出する。
ＩＮ−１０５およびＩＳＴＤのピークに関する抽出したイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）は、両方とも統合するとわかった。統合した領域のＩＳＴＤに対するＩＮ−１０５の比率は、試料中に存在するＩＮ−１０５の基準として使用した。
【００６１】
例２：薬動力学検討
それが、バリデーションプロトコールのすべての所定の判定基準に合格したので、該方法は、首尾よく検証されたと考えた。検証した方法は、その後１型糖尿病を伴う患者において実行した正常血糖クランプ検討におけるＩＮ−１０５レベルの測定のために、使用した。ヒト血漿中のＩＮ−１０５の決定のための方法は、０．２００ｎｇ／ｍｌ〜５０．０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲を通じて首尾よく検証されていた。
各患者および処置に関する血漿濃度データは、非コンパートメント法によって分析した。ＡＵＣ０−ｔのための血漿レベル曲線の下の領域は、台形公式によって算出した。主要な薬動力学的パラメーター（平均値±ＳＤ）は、Ｃｍａｘ、ＡＵＣｌａｓｔ、Ｔｍａｘであり、ＰＤパラメーターは、Ｔｍｉｎ、Ｃｍｉｎ、ＡＵＣｌａｓｔであった。幾何平均の比率および９０％ＣＩは、ＰＫおよびＰＤパラメーターに関して、シークエンス、期間、および処置のための固定した効果を伴う混合効果モデル、そして、ログ変換ＣｍａｘおよびＡＵＣのためのランダムな効果としてのシークエンスの範囲内の患者から算出した。ＩＮ−１０５の最大血漿濃度ならびにＰＫ曲線下の領域は、用いた用量と有意に（ｐ＜０．０５）線形に相関している（下記の表１６のとおり）。
ボランティアにおけるＩＮ−１０５錠剤の投与後に得られた、ＩＮ−１０５の平均血漿中濃度時間プロフィールを、図１３〜１４において示した。
【表１３】
2019505786.tif 000015
＊ＡＵＣｌａｓｔに関する面積単位／ｍｇおよびＣｍａｘに関する濃度単位／ｍｇ
＊＊ＡＵＣｌａｓｔに関する面積単位およびＣｍａｘに関する濃度単位
投与後の時間の関数としての平均血漿濃度のプロットは、血漿中の薬物濃度の予想した時間プロフィールを示す。３０ｍｇ／ｋｇ用量に関するプロットは、図１５において示し、ここで、明確に定義したピーク濃度およびその後のクリアランスは、明らかである。
【図１】
2019505786.tif 000018
【図２】
2019505786.tif 000019
【図３】
2019505786.tif 000020
【図４】
2019505786.tif 000021
【図５】
2019505786.tif 000022
【図６】
2019505786.tif 000023
【図７】
2019505786.tif 000024
【図８】
2019505786.tif 000025
【図９】
2019505786.tif 000026
【図１０】
2019505786.tif 000027
【図１１】
2019505786.tif 000028
【図１２】
2019505786.tif 000029
【図１３】
2019505786.tif 000030
【図１４】
2019505786.tif 000031
【図１５】
2019505786.tif 000032
【国際調査報告】
2019505786.tif 000033
2019505786.tif 000034
2019505786.tif 000035