(57)【要約】本発明は、網膜の最外縁部及び鋸状縁領域から単離された幹細胞、前記幹細胞を単離するための方法、並びに目に発症する疾患及び他の病態の治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
出生後哺乳動物の網膜の最外縁部領域及び／又は鋸状縁領域から単離された、単離網膜幹細胞。
【請求項２】
前記最外縁部及び／又は鋸状縁領域を含む網膜の領域から単離され、前記最外縁部及び／又は鋸状縁領域により好ましくは構成され、より好ましくは、前記最外縁部及び／又は鋸状縁領域により本質的に構成され、最も好ましくは、前記最外縁部及び／又は鋸状縁領域によりもっぱら構成され、網膜の他の区域から単離されたものではない、請求項１に記載の単離網膜幹細胞。
【請求項３】
未分化かつ多能性であり、好ましくは、多能性かつすべての異なるタイプの神経網膜細胞に分化可能である、請求項１又は２に記載の単離網膜幹細胞。
【請求項４】
網膜幹細胞を出生後哺乳動物から単離するための方法であって、
（ａ）最外縁部及び／又は鋸状縁の全部又は一部を対象の目から分離することと、
（ｂ）分離した前記最外縁部及び／又は鋸状縁を、網膜幹細胞を含む細胞の球及び／又は小集団（クラスター）の形成をもたらす培地中で培養することと、
（ｃ）得られた細胞の球及び／又はクラスターを、酵素トリプシン及びヒアルロニダーゼを含む培地中に配置することと、
（ｄ）１種又は複数の阻害剤を用いて酵素をブロッキングすることと、
（ｅ）得られた網膜幹細胞を得られた細胞の球及び／又はクラスターから単離することと
を含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法を用いて得られた、単離網膜幹細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載された単離網膜幹細胞若しくは請求項４に記載の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代と、
少なくとも１種の薬学的に許容されるビヒクル及び／又は賦形剤と
を含む医薬組成物。
【請求項７】
硝子体内注射のための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
医薬としての使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載された単離網膜幹細胞若しくは請求項４に記載の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代。
【請求項９】
目の病態又は疾患の治療における使用のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載された単離網膜幹細胞若しくは請求項４に記載の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代。
【請求項１０】
治療される目の病態又は疾患が、網膜色素変性、黄斑症、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症及び網膜ジストロフィーのうちの１つ又は複数を含む、請求項９に記載の使用のための単離網膜幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜の特定の領域から単離された幹細胞、前記幹細胞を単離するための方法、並びに目に発症する疾患及び他の病態の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚の喪失は、網膜又は目の疾患又は損傷により引き起こされうる。たとえば、感染過程、たとえば網膜へのサイトメガロウイルスの感染は、視野の喪失、視力の低下及び失明をもたらしうる。炎症過程、たとえばブドウ膜炎もまた網膜に影響を及ぼしうるのであり、視力の低下をもたらしうる。網膜の癌、たとえば網膜芽細胞腫もまた、視力を悪化させる。他の疾患は、加齢と関連する黄斑変性により生じうる。多くの異なる遺伝病、たとえば網膜色素変性は、網膜損傷及び失明を、他のタイプの網膜変性（網膜ジストロフィー）とともにもたらす。網膜への物理的損傷はまた、網膜剥離から生じうるのであり、これは、網膜変性及び失明をもたらす。
【０００３】
網膜損傷に起因する視力喪失を治療するために利用可能な治療法は、依然として限定的である。
【０００４】
前記治療法は、多くの場合、外科的処置及び／又は組織移植を伴い、それゆえ、発症対象を有害反応のリスクにさらす。これは、組織移植の場合、異物に対する反応及び移植片の拒絶のリスクを含みうる。さらに、多くの利用可能な治療法が、基礎疾患を治癒又は矯正する代わりに、これらの疾患の症状を単に処置するか又は覆い隠すだけである。目に発症する疾患及び他の病態の治療のための新規治療法が依然として必要とされており、これらの疾患又は病態を効果的且つ恒久的に矯正可能な治療法が特に必要である。有害反応の発生率を最小化可能な治療法もまた必要である。
【０００５】
最外縁部（ｏｒａ  ｔｅｒｍｉｎａｌｉｓ）及び鋸状縁（ｏｒａ  ｓｅｒｒａｔａ）は、近接して接続しているとはいえ、網膜の異なる部分である。図１を参照のこと。鋸状縁（「ｓｅｒｒａｔａ」はラテン語であり、「閉じられた」を意味する）は、機能的網膜と最外縁部（「ｔｅｒｍｉｎａｌｉｓ」はラテン語であり、「外端部」を意味する）との間の接続部である。最外縁部は、網膜の中心から最も外れた境界である（Ｈｏｌｄｅｎら、Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｏｒａ  Ｔｅｒｍｉｎａｌｉｓ：Ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｙｅｓ、Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．２７：１２２９〜１２３５頁、１９８７年）。最外縁部は、鋸状縁の前、ぶどう膜の一部である毛様体扁平部の後ろにある。最外縁部及び鋸状縁は、成体における神経網膜の胚部であり、予定神経網膜全体を覆うために使用される胚性神経上皮胚層の残存部である。
【０００６】
魚類、両生類及び鳥類の最外縁部及び鋸状縁は、様々な刊行物に記載されている増殖帯である。魚類及び両生類では、胚期後も神経発生は停止せず、動物の生存の間じゅう、作用し続ける。魚類又は両生類の最外縁部から単離された幹細胞及び鳥類の鋸状縁から単離された幹細胞が、たとえば、Ａｍａｔｏら、Ｒｅｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ：ｐａｒａｌｌｅｌｓ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｓ、Ｉｎｔ．Ｔ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４８：９９３〜１００１頁、２００４年；Ｃｅｒｖｅｎｙら、Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｎａｍｎｉｏｔｅ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７２：３２８〜３４５頁、２０１２年）により記述されてきた。
【０００７】
最外縁部に隣接する網膜野の境界の領域はまた、哺乳類及び鳥類種において、拡大についての研究の文脈で広く研究されてきた。ヒトにおける鋸状縁及び類人猿、ネコ、ハト、ウシ及びブタにおける最外縁部の解剖学的測定値は、鋸状縁及び最外縁部それぞれの拡大係数の算出の根拠と解されてきた。ヒト及び類人猿の目では、網膜野の最周縁領域での拡大が、後極におけるものよりも実質的に小さいことが見出されてきたのであり、ネコ、ウサギ、ラット及びマウスでは、より低い減少があり、ハト、モリフクロウ及びムクドリでは、拡大は最周縁領域及び後極におけるものと非常に類似する（Ｈｏｌｄｅｎら、Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｏｒａ  Ｔｅｒｍｉｎａｌｉｓ：Ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｙｅｓ、Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．２７：１２２９〜１２３５頁、１９８７年）。
【０００８】
網膜幹細胞は、成体哺乳動物の網膜に存在することが知られており、具体的には、網膜幹細胞は、網膜色素上皮の毛様体縁（米国特許第６，１１７，６７５号及びＣｏｌｅｓら、ＰＮＡＳ  １０１（４４）：１５７７２−１５７７７頁、２００４年を参照のこと）及び神経網膜層（国際公開第０１／５８４６０号を参照のこと）に見出されてきた。
【０００９】
しかしながら、成体哺乳動物の最外縁部及び鋸状縁からの幹細胞の単離はまったく記述されてこなかった。
【発明の概要】
【００１０】
網膜幹細胞を用いた現在の治療は、網膜細胞が損傷したとき、喪失した視覚を回復するのに不適であり、したがって、網膜幹細胞の臨床的応用の潜在性は依然として非常に高い。
【００１１】
解剖学的には、機能的網膜のより深くにおいて単離された細胞は、幹細胞のソースとなる可能性がより低い。
【００１２】
驚くべきことに、本出願人は、成体哺乳動物の網膜の最外縁部及び鋸状縁領域から網膜幹細胞を単離した。本出願人により単離された幹細胞は、成体哺乳動物の全生存期間にわたって、分化多能性細胞を生成可能であり、機能的網膜への前継代である。
【００１３】
本発明による最外縁部の網膜幹細胞（ＯＴＲＳＣ）及び鋸状縁の網膜幹細胞（ＯＳＲＳＣ）は、幹の外周の周囲に細胞の円環の層を形成することにより成長する木において生じるのと類似した仕方で、神経網膜幹細胞において成長及び出芽可能である。前記ＯＴＲＳＣ及びＯＳＲＳＣは、健常ヒト成体及び網膜疾患に罹患したヒトの両方において、網膜細胞の置換及び再成長に耐えることができる。
【００１４】
前に引用した米国特許第６，１１７，６７５号及びＣｏｌｅｓら（２００４）は、哺乳動物の網膜の毛様体縁の領域、すなわち、最外縁部及び鋸状縁から非常に離れた領域から単離された網膜幹細胞を記述し、さらに、そこに記述された網膜細胞は前駆細胞であり、それゆえ単能性であって、単一のタイプの分化神経網膜細胞をもたらす後代しか生成できない。
【００１５】
前に引用した国際公開第０１／５８４６０号は、哺乳動物の神経網膜組織の解剖学的に不明瞭な領域から単離された網膜幹細胞を記述し、網膜の最外縁部又は鋸状縁領域の単離は、この特許出願において言及されていない。
【００１６】
反対に、本発明において記述される網膜幹細胞は、解剖学的に明確な領域、すなわち、成体哺乳動物の網膜の最外縁部及び鋸状縁領域からそれぞれ単離され、多能性である。
【００１７】
したがって、本発明の第１の目的は、出生後哺乳動物の網膜の最外縁部及び／又は鋸状縁領域から単離された、単離網膜幹細胞である。
【００１８】
本発明の第２の目的は、網膜幹細胞を出生後哺乳動物から単離するための方法であって、
（ａ）最外縁部及び／又は鋸状縁の全部又は一部を対象の目から分離することと、
（ｂ）分離した前記最外縁部及び／又は鋸状縁を、網膜幹細胞を含む細胞の球及び／又は小集団（クラスター）の形成をもたらす培地中で培養することと、
（ｃ）得られた細胞の球及び／又はクラスターを、酵素トリプシン及びヒアルロニダーゼを含む培地中に配置することと、
（ｄ）１種又は複数の阻害剤を用いて酵素をブロッキングすることと、
（ｅ）得られた網膜幹細胞を得られた細胞の球及び／又はクラスターから単離することと
を含む、方法である。
【００１９】
本発明の第３の目的は、上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞である。
【００２０】
本発明の第４の目的は、
上に定義した若しくは上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代と、
少なくとも１種の薬学的に許容されるビヒクル及び／又は賦形剤と
を含む医薬組成物である。
【００２１】
本発明の第５の目的は、医薬としての使用のための、上に定義した単離網膜幹細胞若しくは上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代である。
【００２２】
本発明の第６の目的は、目の病態又は疾患の治療における使用のための、上に定義した単離網膜幹細胞若しくは上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代である。
【００２３】
本発明の第７の目的は、目の病態又は疾患の治療のための薬剤を製造するための、上に定義した単離網膜幹細胞若しくは上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代の使用である。
【００２４】
本発明の第８の目的は、対象における目の病態又は疾患の治療のための方法であって、前記治療を必要とする前記対象に、有効量の上に定義した単離網膜幹細胞若しくは上述の方法により得られる単離網膜幹細胞及び／又はそれらの後代を投与するステップを含む、方法である。
【００２５】
定義
最外縁部から単離された網膜幹細胞は、「最外縁部網膜幹細胞」又は「ＯＴＲＳＣ」と本明細書において称する。
【００２６】
前記ＯＴＲＳＣは、出生後の最初の段階から始まり８０歳代まで続き、時にはそれを超えるまでの期間の哺乳動物の目から単離される。
【００２７】
鋸状縁から単離された網膜幹細胞は、「鋸状縁網膜幹細胞」又は「ＯＳＲＳＣ」と本明細書において称する。前記ＯＳＲＳＣは、出生後の最初の段階から始まり８０歳代まで続き、時にはそれを超えるまでの期間における哺乳動物の目から単離される。
【００２８】
本明細書において使用する「単離する」という用語は、これらの細胞をそれらのネイティブ組織又はそれらの環境から物理的に分離又は選別することを指す。同様に、「単離すること」という用語は、一般に、１つ又は複数の細胞を細胞集団（たとえばニューロスフェア）から、たとえば前記細胞の特徴又は１種若しくは複数の細胞マーカー若しくは生物学的マーカーの発現に応じて、物理的に分離又は選別することを指す。
【００２９】
本明細書において使用する「哺乳動物」という用語は、哺乳動物、すなわちヒト、非ヒト霊長目、たとえばチンパンジー、及び他の類人猿種、家畜動物、たとえばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ペット、たとえばウサギ、イヌ及びネコ、ネズミ目動物を含む実験動物、たとえばラット、マウス及びモルモット等のクラスの任意のメンバーを指す。
【００３０】
本明細書において使用する「未分化」という用語は、まだ分化していないか、又はさもなければ、あるタイプの特殊化した細胞へとまだ発生していない細胞を指す。幹細胞は未分化である。未分化幹細胞は、１つ又は複数のタイプの特殊化した細胞（たとえば、神経網膜の細胞）に分化する能力を維持する。
【００３１】
本明細書において使用する「多能性」又は「多分化能性」という用語は、細胞が位置する組織の分化細胞の主要なタイプのうちの１つをそれぞれもたらす後代を生成可能な細胞を意味する。
【００３２】
成体幹細胞は多能性であり、機能的由来細胞のみを生成可能である。たとえば、成体網膜幹細胞は多能性であり、そのようなものとして、１つ又は複数の特殊化した神経網膜細胞（たとえばアマクリン細胞、水平／オフ型双極細胞、光受容体桿体、桿体の外部円板のタンパク質、ミュラーアストロサイト／グリア、ＲＰＥ、色素細胞、未分化及びミュラー神経グリア、ＲＰＣ及びアマクリン細胞、ＲＰＣ及び双極桿体細胞）に分化可能である。
【００３３】
本明細書において使用する「単能性」という用語は、１つのタイプの細胞しか生成可能でない細胞を指し、前駆細胞とも称される。
【００３４】
本明細書において使用する「後代」という用語は、多能性幹細胞に由来する特殊化した細胞を指す。
【００３５】
本発明の第１の目的による治療有効量の単離網膜幹細胞は、前記化合物を用いた治療から利益を得る疾患又は望ましくない病態を対象が有すると決定したあとに、対象に投与できる。医学又は臨床人員は、対象における疾患又は病態の診断の一部としてこの決定を下すことができる。化合物はまた、これらの病態の予防において使用でき、これは、対象が１つ又は複数の病態を有する可能性を低減することとして考慮できる。
【００３６】
本明細書において使用する「治療有効量」は、意図された目的を達成するのに十分な量を指す。有効量の決定は、所望の効果の達成に基づいて、当業者の技術の範囲内である。有効量は、これらに限定するものではないが、対象のサイズ及び／又は対象が発症する疾患又は望ましくない病態の進行の程度を含む要因に依存する。有効量はまた、化合物が対象に単一用量で又は経時的に定期的に投与されるという事実に依存する。本発明の第１の目的による単離網膜幹細胞は、対象の治療のために設計される。本明細書において使用する「対象」という用語は、哺乳動物及び非哺乳動物を含む。
【００３７】
哺乳動物の例は、これらに限定するものではないが、哺乳動物、すなわちヒト、非ヒト霊長目、たとえばチンパンジー、及び他の類人猿種、家畜動物、たとえばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ペット、たとえばウサギ、イヌ及びネコ、ネズミ目動物を含む実験動物、たとえばラット、マウス及びモルモット等のクラスの任意のメンバーを含む。非哺乳動物の例は、これらに限定するものではないが、鳥類、魚類等を含む。本明細書において理解されるように、前記対象は、出生後の最初の段階から８０歳代を超えるまでの生存期間にあることができる。
【００３８】
本明細書において使用する「治療」又は「治療する」又は「治療される」という用語は、治療効果を得るための、病理学的障害の治癒又は消散を含み、治療効果は、治療される基礎障害の根治又は改善を指すと理解される。さらに、治療効果は、基礎障害と関連する生理学的症状のうちの１つ又は複数の根治又は改善とともに達成され、結果として、患者が依然として基礎障害に罹患している可能性があるという事実にもかかわらず、患者の改善が観察される。
【００３９】
本明細書において使用する「目の病態又は疾患」は、目の病因を有する疾患又は病態及び心血管性又は代謝性疾患（たとえば高血圧症、脂質異常症又は真性糖尿病）にとって二次的な目の要素を有する疾患又は病態を含む。
【００４０】
本明細書及び特許請求の範囲において使用する冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、特に明確な指示のない限り、複数の指示対象を含むと理解されなければならない。ある群の１つ又は複数のメンバーの間に「又は／若しくは」を含む本特許請求の範囲又は明細書は、特に指示のない限り、又は、そうでないことが文脈から明らかでない限り、その群の１つ、２つ以上、又はすべてのメンバーが、所定の生成物又は方法に存在するか、そこに使用されるか又はさもなければそれに適する場合に、満足させられると考えられる。本発明は、その群の正確に１つのメンバーが所定の生成物又は方法に存在するか、そこに使用されるか又はさもなければそれに適する実施形態を含む。本発明はまた、その群の２つ以上又はすべてのメンバーが所定の生成物又は方法に存在するか、そこに使用されるか、又はさもなければそれに適する実施形態を含む。さらに、本発明が、特に指示のない限り、又は、そこから導かれる可能性のある矛盾や不整合が当業者に明らかでない限り、列挙された請求項のうちの１つ又は複数における、１つ又は複数の限定、要素、節、記述用語等が、同じ請求項に従属する別の従属請求項（又は、適するものとして、任意の他の請求項）に導入される、すべての変形形態、組合せ及び順列を含むことが理解されると考えられる。要素が（マルクーシュ群又は類似のフォーマットで）リストとして表されるとき、この要素の下位群もまた記述されており、任意の要素（複数可）をその群から除去できることが理解されるはずである。一般に、本発明又は本発明の態様が、特定の要素、特徴等を含むものとして記述されるとき、本発明のいくつかの実施形態又はその態様が、前記要素、特徴等からなるか、又はそれらから本質的になることも理解されるはずである。単純さのため、これらの実施形態は、あらゆる場合に具体的に示されたわけではない。本発明の任意の実施形態又は態様を、本明細書において具体的な除外が指示されるかどうかの事実にかかわらず、本特許請求の範囲から明示的に排除できることも理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】鋸状縁、最外縁部及び網膜毛様体縁の位置をそれぞれ明示する、目の矢状図の詳細の図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、目の組織、特に出生後哺乳動物の網膜の最外縁部及び鋸状縁の領域の色素及び非色素上皮層が、網膜幹細胞を含有するという事実の証拠を提供する。
【００４３】
本明細書に記載の最外縁部の網膜幹細胞（ＯＴＲＳＣ）及び鋸状縁の網膜幹細胞（ＯＳＲＳＣ）は、多能性であり、網膜の解剖学的に明確な領域から単離され、したがって、米国特許第６，１１７，６７５号及びＣｏｌｅｓら（２００４）により記述された、前駆細胞であり、したがって単能性である、毛様体縁（ぶどう膜の一部である毛様体扁平部及び毛様体突起）の領域から単離される網膜幹細胞とは区別できる。
【００４４】
前に引用した国際公開第０１／５８４６０号は、哺乳動物の神経網膜組織の解剖学的に不明瞭な領域から単離された網膜幹細胞を記述し、網膜の最外縁部又は鋸状縁領域からの単離は、この特許出願において言及されていない。
【００４５】
本発明の第１の目的は、出生後哺乳動物の網膜の最外縁部領域及び／又は鋸状縁領域から単離された、単離網膜幹細胞である。
【００４６】
本発明の第１の目的による一実施形態では、前記網膜幹細胞は、前記最外縁部及び／又は鋸状縁領域を含む網膜の領域から単離される。前記網膜幹細胞は、前記最外縁部及び／又は鋸状縁領域により構成される網膜の領域から単離されることが好ましい。前記網膜幹細胞は、前記最外縁部及び／又は鋸状縁領域により本質的に構成される網膜の領域から単離されることがより好ましい。前記網膜幹細胞は、前記最外縁部及び／又は鋸状縁領域により排他的に構成される網膜の領域から単離され、網膜の他の区域からは単離されないことが最も好ましい。
【００４７】
本明細書において使用する「から本質的に」という表現は、網膜幹細胞が単離される網膜の領域のうちの７５％超、好ましくは８０％超、８５％超、９０％超、９５％超が、最外縁部及び／又は鋸状縁により構成されることを示す。
【００４８】
本明細書において使用する「から排他的に」という表現は、網膜幹細胞が単離される網膜の領域のうちの９６％超、好ましくは９９％超が、最外縁部及び／又は鋸状縁により構成されることを示す。
【００４９】
本発明の第１の態様による一実施形態では、前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、色素又は非色素上皮層から単離される。好ましくは、ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、色素層から単離される。
【００５０】
本発明の第１の目的による別の一実施形態では、前記単離ＯＴＲＳＣ及び／又は前記ＯＳＲＳＣは、神経幹細胞である。
【００５１】
本発明の第１の目的による一実施形態では、前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、対象の寿命の任意の期間中に、又はいくつかの場合では、死亡対象から単離される（たとえば、前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、対象の死亡後およそ１、２、３、４、６、８、１２、２４、３６、４８又は７２時間以内に単離される）。前記対象はヒト対象であることが好ましい。
【００５２】
前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、ヒト対象から、出生後の最初の段階から始まり８０歳代まで続き、時にはそれを超えるまでの期間に単離されることが好ましい。
【００５３】
本発明の第１の目的による一実施形態では、前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、未分化及び多能性である。前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、多能性であり、すべての異なるタイプの神経網膜細胞に分化可能であることが好ましい。
【００５４】
本発明の第１の目的による別の一実施形態では、前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、前駆細胞でない。本発明の第１の目的による別の一実施形態では、前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、単能性でない。
【００５５】
本発明の第２の主題は、網膜幹細胞を出生後哺乳動物から単離するための方法であって、
（ａ）最外縁部及び／又は鋸状縁の全部又は一部を対象の目から分離することと、
（ｂ）分離された前記最外縁部及び／又は鋸状縁を、網膜幹細胞を含む細胞の球及び／又は集団（クラスター）の形成をもたらす培地中で培養することと、
（ｃ）得られた細胞の球及び／又は得られたクラスターを、酵素トリプシン及びヒアルロニダーゼを含む培地中に配置することと、
（ｄ）１種又は複数の阻害剤を用いて酵素をブロッキングすることと、
（ｅ）得られた網膜幹細胞を細胞の球及び／又は得られたクラスターから単離することと
を含む、方法である。
【００５６】
本発明の第２の目的による一実施形態では、対象は、ヒト哺乳動物、たとえばドナー又は死体である。
【００５７】
本発明の第２の目的による別の一実施形態では、培地は、１種又は複数の外因性成長因子を含む。別の一実施形態では、前記培地は、外因性成長因子を含まない。
【００５８】
本発明の第２の目的による一実施形態では、ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、対応する得られた細胞の球及び／又はクラスターから、およそ１：５００又は少なくとも１：５００の頻度で、常法、たとえばピペッティングを使用することにより単離される。
【００５９】
本発明の第３の目的は、上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞である。
【００６０】
本発明の第４の目的は、
上に定義した若しくは上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代と、
少なくとも１種の薬学的に許容されるビヒクル及び／又は賦形剤と
を含む医薬組成物である。
【００６１】
本発明の第４の目的による医薬組成物は、経眼、髄腔内、局所、経皮、口腔、舌下、経口又は非経口投与のうちの１つ又は複数を含む、任意の好適な投与経路を通じて対象に投与できることに留意すべきである。
【００６２】
本発明の第４の目的による一実施形態では、前記医薬組成物は、吸入により投与できる。別の一実施形態では、前記医薬組成物は、硝子体内注射により投与される。
【００６３】
本発明の第４の目的による一実施形態では、医薬組成物は、溶液又は懸濁液であり、好ましくは、経眼投与に好適であり、より好ましくは、硝子体内投与に好適である。硝子体に投与される場合、この組成物は、平衡生理食塩水又はダルベッコリン酸緩衝食塩水を含みうる。
【００６４】
本発明の第４の目的によれば、医薬組成物は、０．５μｌ当たりおよそ細胞１０，０００個の濃度で平衡生理食塩水中に懸濁された本発明の単離細胞及び／又はそれらの後代を含む水性組成物であることが好ましい。
【００６５】
本発明の第４の目的によれば、医薬組成物は、硝子体内注射のために設計されることが好ましい。
【００６６】
本発明による医薬組成物を調製するための方法並びに薬学的に許容されるビヒクル及び／又は賦形剤の選択は、たとえばＬ．Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、（２０００年）に詳細に記述されている。
【００６７】
本発明の第５の目的は、医薬としての使用のための、上に定義した単離網膜幹細胞若しくは上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代である。
【００６８】
本発明の第６の目的は、目の病態又は疾患の治療における使用のための、上に定義した単離網膜幹細胞若しくは上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代である。
【００６９】
本発明の第７の目的は、目の病態又は疾患を治療するための薬剤の製造のための、上に定義した単離網膜幹細胞若しくは上述の方法を用いて得られた単離網膜幹細胞、及び／又はその後代の使用にある。
【００７０】
本発明の第８の目的は、対象における目の病態又は疾患を治療するための方法であって、前記治療を必要とする前記対象に、有効量の上に定義した単離網膜幹細胞若しくは上述の方法により得られる単離網膜幹細胞、及び／又はそれらの後代を投与するステップを含む、方法である。
【００７１】
本発明の第６、第７及び第８の目的による一実施形態では、治療される目の病態又は疾患は、これらに限定するものではないが、網膜色素変性、黄斑症、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症及び網膜ジストロフィーのうちの１つ又は複数を含む。
【００７２】
本発明の第８の目的による一実施形態では、対象は哺乳動物、好ましくはヒト、より好ましくはヒトの青年である。
【００７３】
本発明の第８の目的による一実施形態では、治療方法は、本発明による単離細胞、又は上述の方法により得られる単離網膜幹細胞及び／若しくはその後代を、注射により硝子体に投与するステップを含む。
【００７４】
本発明の第８の目的による一実施形態では、治療方法は、本発明による単離細胞、又は上述の方法により得られる単離網膜幹細胞及び／若しくはその後代の、対象内への自家移植を含む。この実施形態では、前記単離細胞（ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣ）は、対象から単離され、培養され、次に、異物に対する有害反応のリスクを最小化又は排除するよう同じ対象に移植されるか又は戻される。
【００７５】
代替案として、本発明の第８の目的による別の一実施形態では、前記ＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣは、ドナー（たとえば哺乳動物の死体）から単離され、続いて、目の病態又は疾患を治療するよう対象に移植又は投与（たとえば硝子体内への注射による）される。
【実施例】
【００７６】
実施例１
ヒトの目の最外縁部からの網膜幹細胞の単離を、本実験において実施した。
【００７７】
最外縁部を分離し、幹細胞がクローンに由来する球を形成する、クローン球を形成するためのアッセイを使用して培養した。
【００７８】
幹細胞が、強角膜縁よりも解剖学的に下の組織から、実際には最外縁部において排他的に単離されることに留意すべきである。これらの細胞を、およそ１：５００の頻度で単離した。
【００７９】
次に、組織の生検を、酵素トリプシン及びヒアルロニダーゼを含有する試験管内に置き、３７℃の水浴中で１５分間インキュベートした。次に、阻害剤により酵素をブロッキングし、続いて細心の注意を払ったピペッティングによる機械的単離を用いて単一の網膜幹細胞を単離した。次に、血球計算チャンバー内で細胞を計数し、遠心によりペレット化し、０．５μｌ当たりおよそ細胞１０，０００個の濃度に達するよう、適量のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中に再懸濁させた。
【００８０】
前述のものと同じ手順により、ヒトの目の鋸状縁からの網膜幹細胞の単離を実施した。
【００８１】
実施例２
本実験では、単離最外縁部網膜幹細胞（ＯＴＲＳＣ）のインビトロ増殖、長期自己再生及び分化能を評価した。球形成アッセイ及び単層アッセイの両方を使用した。
【００８２】
最外縁部から得られた単一の初代細胞を、クローン由来球を形成するよう単離ＯＴＲＳＣが増殖可能かどうかを試験可能なよう、９６ウェルを有するプレートに１ウェル当たり１細胞の密度でプレートした。ＯＴＲＳＣは、色素及び非色素細胞の両方を含有するクローン球をもたらした。単一球継代アッセイを使用して、初代球を分離及び再移植し、個別の球は自己再生能を示し、各単一球は、以降の各継代において１つ又は複数の新しい球をもたらした。ヒトの目の最外縁部領域は、ウサギの目の最外縁部から単離された網膜幹細胞のものと類似するインビトロ成長因子との適合を実証する網膜幹細胞を含有する。
【００８３】
クローン球を分化条件下にプレートし、それらの後代の分化能を評価した。球は、すべての異なる網膜タイプ（たとえば光受容細胞）を生成し、それゆえ、神経網膜の胚域に由来することによって光受容体へと転換するよう生来デザインされた、単離ＯＴＲＳＣの多分化能を実証する。
【００８４】
上述のものと同じ手順に従うことにより、鋸状縁の単離網膜幹細胞（ＯＳＲＳＣ）のインビトロでの増殖、長期自己再生及び分化能を研究した。
【００８５】
実施例３
本実験では、単離ＯＴＲＳＣ及びそれらの後代のインビボでの能力を評価した。
【００８６】
ＯＴＲＳＣを含有する球状分離ヒト網膜細胞を、成体ウサギの目に移植した。ＯＴＲＳＣ及びそれらの後代を宿主ウサギの目に移植するためにそれらを視覚化するため、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を含有するレンチウイルスコンストラクトを調製した。ＯＴＲＳＣにレンチウイルス粒子を感染させ、これは、緑色蛍光球の発生をもたらす。
【００８７】
次に、緑色蛍光球を個別の細胞へと分離し、１μｌ当たり細胞２０，０００個の濃度で平衡ハンク生理食塩水中に再懸濁させた。続いて、硝子体内注射により、０．５μｌ当たりおよそ細胞１０，０００個を、プロパラカイン液滴を用いて前もって局所麻酔した成体ウサギの目の硝子体腔に移植した。これらのＯＴＲＳＣを、口腔投与のためのピペットを使用することにより注射し、宿主ウサギのＯＴＲＳＣが汚染されないことを保証するよう、障壁で修飾した。次に宿主ウサギのまぶたを合わせて再配置し、覚醒した動物をそれらのケージに戻した。移植３０日後、ウサギを屠殺し、それらの目を摘出して４％ＰＦＡ（ホスホノギ酸）中に固定した。Ｂｒｉｇｈｔクリオスタット上で目を１４μｍに切断した。次に、ＥＧＦＰ陽性細胞、すなわちＯＴＲＳＣ及びそれらの後代の存在を明らかにするため、蛍光顕微鏡下で目の切片を視覚化した。
【００８８】
上述のものと同じ手順に従うことにより、単離ＯＳＲＳＣ及びそれらの後代のインビボでの能力を評価した。
【００８９】
実施例４
ブタ及びウサギの目から単離されたＯＴＲＳＣのインビトロでの分化能を、本実験において評価した。
【００９０】
ＯＴＲＳＣを実施例１に記載のとおり単離し、次に、それらの分化能を実施例２に記載のとおり評価した。
【００９１】
ＯＴＲＳＣ球から移動した細胞のうちの一定のパーセンテージは、３週後にも未分化のままだったが、分化細胞のほとんどは光受容細胞だった。
【００９２】
上に引用した実験は、哺乳動物の最外縁部及び鋸状縁が、インビトロでの増殖、長期自己再生及び分化能により特徴づけられる真正な網膜幹細胞の豊かなソースであることを実証する。
【００９３】
前述の実験は、ＯＴＲＳＣ、ＯＳＲＳＣ及びそれぞれの後代が、インビトロで生存、移動、統合及び神経網膜の細胞、特に光受容体（すなわち、桿体細胞及び錐体細胞）へと分化可能であることをさらに実証し、それゆえ、目の疾患又は病態の治療のためのＯＴＲＳＣ及び／又はＯＳＲＳＣの有用性を支持する。
【００９４】
さらに、実施例２に記載の実験は、球形成アッセイにおいて、各球が単一細胞に由来することを実証し、毛様体縁における稀有な色素細胞は未分化幹細胞であることを示唆する。球における色素細胞のほとんどが、色素網膜上皮の前駆体だった。
【００９５】
ヒト神経網膜は、それが、ウサギの目から単離された網膜前駆細胞と類似する網膜前駆細胞を含有することを示したのであり、これは、成体哺乳動物の目が、前に導出された網膜幹細胞を含有しうるという考えへの支持を保証する。
【図１】
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【国際調査報告】
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