【手続補正書】
【提出日】平成19年10月19日(2007.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された複合体であって、該複合体が、
(i)  Sen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)、又は、Sen2をコードする核酸(受託番号NM_025265(配列番号１))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)及び異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質、
(ii)  Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、又は、Sen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)若しくは(受託番号AF288394(配列番号79))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
(iii)  Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)、又は、Sen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)若しくは配列番号5)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、及び
(iv)  Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)、又は、Sen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)若しくは配列番号7)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
を含み、ここで、該高ストリンジェントな条件が、6×SSC、50mM Tris-HCl(pH=7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％フィコール(Ficoll)、0.02％BSA及び100μg/ml変性サケ精子DNAからなるバッファ中、65℃で48時間のハイブリダイゼーション、2×SSC、0.01％PVP、0.01％フィコール及び0.01％BSAからなるバッファ中、37℃で45分間の洗浄、並びに0.1×SSCからなるバッファ中、50℃で45分間の洗浄を含む、前記複合体。
【請求項２】
前記複合体がさらに、Clp1(受託番号NP_006822(配列番号10))、又は、Clp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)若しくは配列番号9)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いは、Clp1(受託番号NP_006822(配列番号10))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記複合体がさらに、以下の、
(i)  切断−ポリアデニル化特異性因子、又は、切断−ポリアデニル化特異性因子をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(ii)  切断因子Im、又は、切断因子Imをコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(iii)  切断因子IIm、又は、切断因子IImをコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び
(iv)  切断刺激因子、又は、切断刺激因子をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
の一以上を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記複合体がさらに、以下の、
(i)  CPSF160、又は、CPSF160をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(ii)  CPSF30、又は、CPSF30をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(iii)  CstF64、又は、CstF64をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び
(iv)  シンプレキン(symplekin)、又は、シンプレキンをコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
の一以上を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項５】
前記複合体が、
(i)  Sen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)、
(ii)  Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、
(iii)  Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)、及び
(iv)  Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)
を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記複合体は、融合タンパク質を含み、該融合タンパク質がSen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)及び異種アミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記複合体は、融合タンパク質を含み、該融合タンパク質がSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))及び異種アミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記複合体は、融合タンパク質を含み、該融合タンパク質がSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)及び異種アミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記複合体は、融合タンパク質を含み、該融合タンパク質がSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)及び異種アミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
異種アミノ酸配列は、ペプチドタグである、請求項６に記載の複合体。
【請求項１１】
異種アミノ酸配列は、ペプチドタグである、請求項７に記載の複合体。
【請求項１２】
異種アミノ酸配列は、ペプチドタグである、請求項８に記載の複合体。
【請求項１３】
異種アミノ酸配列は、ペプチドタグである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１４】
前記複合体が、
(i)  Sen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)、
(ii)  Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、
(iii)  Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)、
(iv)  Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)、及び
(v)  Clp1(受託番号NP_006822(配列番号10))
を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項１５】
前記複合体は、RNA分解活性を有する、請求項１、２、５又は１４に記載の複合体。
【請求項１６】
前記複合体は、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１、２、５又は１４に記載の複合体。
【請求項１７】
前記複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１、２、５又は１４に記載の複合体。
【請求項１８】
前記複合体は、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１、２、５又は１４に記載の複合体。
【請求項１９】
(i)  Sen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)と少なくとも65％同一であるタンパク質、
(ii)  Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))と少なくとも65％同一であるタンパク質、
(iii)  Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)と少なくとも65％同一であるタンパク質、及び
(iv)  Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)と少なくとも65％同一であるタンパク質、
を含む精製された複合体。
【請求項２０】
前記複合体がさらに、Clp1(受託番号NP_006822(配列番号10))と少なくとも65％同一であるタンパク質を含む、請求項１９に記載の複合体。
【請求項２１】
前記複合体は、RNA分解活性を有する、請求項１９又は２０に記載の複合体。
【請求項２２】
前記複合体は、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１９又は２０に記載の複合体。
【請求項２３】
前記複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１９又は２０に記載の複合体。
【請求項２４】
前記複合体は、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１９又は２０に記載の複合体。
【請求項２５】
Sen2ΔEx8(配列番号12)、又はSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen2ΔEx8(配列番号12)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質を含む精製された複合体。
【請求項２６】
精製された複合体であって、該複合体が、
(i)  Sen2ΔEx8(配列番号12)、又は、Sen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen2ΔEx8(配列番号12)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、及び
(ii)  Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)、又は、Sen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)若しくは配列番号7)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
を含み、ここで、該高ストリンジェントな条件が、6×SSC、50mM Tris-HCl(pH=7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％フィコール(Ficoll)、0.02％BSA及び100μg/ml変性サケ精子DNAからなるバッファ中、65℃で48時間のハイブリダイゼーション、2×SSC、0.01％PVP、0.01％フィコール及び0.01％BSAからなるバッファ中、37℃で45分間の洗浄、並びに0.1×SSCからなるバッファ中、50℃で45分間の洗浄を含む、前記複合体。
【請求項２７】
前記複合体がさらに、Clp1 (受託番号NP_006822(配列番号10))、又は、Clp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)若しくは配列番号9)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはClp1(受託番号NP_006822(配列番号10))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、を含む、請求項２６に記載の精製された複合体。
【請求項２８】
前記複合体がさらに、以下の、
(i)  切断−ポリアデニル化特異性因子、又は、切断−ポリアデニル化特異性因子をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(ii)  切断因子Im、又は、切断因子Imをコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(iii)  切断因子IIm、又は、切断因子IImをコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び
(iv)  切断刺激因子、又は、切断刺激因子をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
の一以上を含む、請求項２７に記載の複合体。
【請求項２９】
精製された複合体であって、該複合体が、
(i)  Sen2ΔEx8(配列番号12)、又は、Sen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen2ΔEx8(配列番号12)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
(ii)  Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、又は、Sen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)若しくは(受託番号AF288394(配列番号79))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
(iii)  Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)、又は、Sen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)若しくは配列番号5)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、及び
(iv)  Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)、又は、Sen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)若しくは配列番号7)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
を含み、ここで、該高ストリンジェントな条件が、6×SSC、50mM Tris-HCl(pH=7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％フィコール(Ficoll)、0.02％BSA及び100μg/ml変性サケ精子DNAからなるバッファ中、65℃で48時間のハイブリダイゼーション、2×SSC、0.01％PVP、0.01％フィコール及び0.01％BSAからなるバッファ中、37℃で45分間の洗浄、並びに0.1×SSCからなるバッファ中、50℃で45分間の洗浄を含む、前記複合体。
【請求項３０】
前記複合体がさらに、Clp1 (受託番号NP_006822(配列番号10))、又は、Clp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)若しくは配列番号9)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはClp1 (受託番号NP_006822(配列番号10))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、を含む、請求項２９に記載の精製された複合体。
【請求項３１】
前記複合体がさらに、以下の、
(i)  切断−ポリアデニル化特異性因子、又は、切断−ポリアデニル化特異性因子をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(ii)  切断因子Im、又は、切断因子Imをコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(iii)  切断因子IIm、又は、切断因子IImをコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び
(iv)  切断刺激因子、又は、切断刺激因子をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
の一以上を含む、請求項３０に記載の複合体。
【請求項３２】
前記複合体がさらに、以下の、
(i)  CPSF160、又は、CPSF160をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(ii)  CPSF30、又は、CPSF30をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
(iii)  CstF64、又は、CstF64をコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び
(iv)  シンプレキン(symplekin)、又は、シンプレキンをコードする核酸若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、
の一以上を含む、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３３】
精製された複合体であって、該複合体が、
(i)  Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、又は、Sen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)若しくは(受託番号AF288394(配列番号79))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、及び
(ii)  Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)、又は、Sen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)若しくは配列番号5)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
を含む、前記複合体。
【請求項３４】
前記複合体の少なくとも２つのタンパク質が、互いに共有結合されている、請求項１、５、１４、２６、２９又は３３に記載の複合体。
【請求項３５】
請求項１、５、１４、２６、２９又は３３に記載の複合体と免疫特異的に結合する抗体又はその断片であって、該複合体のタンパク質成分のいずれかに対する抗体又はその断片の親和性よりも高い親和性を有する、前記抗体又はその断片。
【請求項３６】
Sen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)、Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)又はSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)に免疫特異的に結合する抗体又はその断片。
【請求項３７】
請求項１、５、１４、２６、２９又は３３に記載の複合体で動物を免疫することを含む、抗体の作製方法。
【請求項３８】
精製された核酸であって、
(a)  前記核酸は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするか、
(b)  前記核酸は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むか、
(c)  核酸は、配列番号１２の280番アミノ酸〜330番アミノ酸を含むポリペプチドをコードする連続したオープンリーディングフレームを含むか、又は
(d)  前記核酸は、その全長にわたって配列番号１１を含む核酸の相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
ここで、該高ストリンジェントな条件が、6×SSC、50mM Tris-HCl(pH=7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％フィコール(Ficoll)、0.02％BSA及び100μg/ml変性サケ精子DNAからなるバッファ中、65℃で48時間のハイブリダイゼーション、2×SSC、0.01％PVP、0.01％フィコール及び0.01％BSAからなるバッファ中、37℃で45分間の洗浄、並びに0.1×SSCからなるバッファ中、50℃で45分間の洗浄を含む、前記精製された核酸。
【請求項３９】
前記核酸は、RNA分解活性を有するポリペプチドをコードする、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
前記核酸は、さらに異種核酸配列を含む、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４１】
請求項３８の核酸を含むベクター。
【請求項４２】
請求項４１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４３】
請求項３８の核酸を含む宿主細胞。
【請求項４４】
請求項４２の宿主細胞を培養することを含むポリペプチド生産方法。
【請求項４５】
請求項４３の宿主細胞を培養することを含むポリペプチド生産方法。
【請求項４６】
配列番号12のアミノ酸配列、或いは、高ストリンジェントな条件下で配列番号11の相補的配列に全長にわたってハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、を含む精製されたポリペプチドであって、ここで、該高ストリンジェントな条件が、6×SSC、50mM Tris-HCl(pH=7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％フィコール(Ficoll)、0.02％BSA及び100μg/ml変性サケ精子DNAからなるバッファ中、65℃で48時間のハイブリダイゼーション、2×SSC、0.01％PVP、0.01％フィコール及び0.01％BSAからなるバッファ中、37℃で45分間の洗浄、並びに0.1×SSCからなるバッファ中、50℃で45分間の洗浄を含む、前記ポリペプチド。
【請求項４７】
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
請求項４６に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体又はその断片。
【請求項４９】
Sen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95))と結合しない、請求項４８に記載の抗体又はその断片。
【請求項５０】
請求項１、５、１４、２６、２９、又は３３に記載の複合体を精製するための方法であって、該方法が、
(a)  細胞から細胞抽出物又は核抽出物を調製する工程であって、ここで、該細胞は該複合体のすべてのタンパク質成分を発現し、また、該タンパク質成分の少なくとも１つがペプチドタグに融合されている、工程、及び
(b)  該ペプチドタグによって該複合体を精製する工程、
を含む、前記方法。
【請求項５１】
請求項１、５、１４、２６、２９、又は３３に記載の複合体と製薬上許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項５２】
請求項３５、３６又は４８に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項５３】
複合体の形成をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  請求項１、５、１４、２６、２９、又は３３に記載の複合体のすべての構成成分を含む細胞に化合物を接触させる工程、及び
(b)  該細胞中で形成される複合体の量を測定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項５４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が293T、HeLa、MCF7、Wi-38、SkBr3、Jurkat、CEM又はTHP1細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法が請求項１、５、１４、２６、２９又は３３に記載の複合体を前記細胞から単離することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記複合体の量がFRETによって測定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が前記複合体のタンパク質成分の少なくとも１つを発現するように操作される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
複合体の形成をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  以下のタンパク質を含む複合体の形成に導く条件下、化合物の存在下で、
(i)  Sen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)、又は、Sen2をコードする核酸(受託番号NM_025265(配列番号１))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen2(受託番号NP_079541(配列番号2)若しくは配列番号95)及び異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質、
(ii)  Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、又は、Sen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)若しくは(受託番号AF288394(配列番号79))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
(iii)  Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)、又は、Sen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)若しくは配列番号5)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、及び
(iv)  Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)、又は、Sen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)若しくは配列番号7)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質
をインキュベートする工程、及び
(b)  該複合体の量を測定する工程、
を含み、ここで、該化合物の不在下で測定された該複合体の量に対する、工程(b)で測定された該複合体の量の差が、該化合物が該複合体の形成をモジュレートすることを示す、前記方法。
【請求項６０】
Clp1(受託番号NP_006822(配列番号10))、又は、Clp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)若しくは配列番号9)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いは、Clp1(受託番号NP_006822(配列番号10))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質もまた、工程(a)でインキュベートされる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
複合体の形成をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  以下のタンパク質を含む複合体の形成に導く条件下、化合物の存在下で、
(i)  Sen2ΔEx8(配列番号12)、又は、Sen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen2ΔEx8(配列番号12)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
(ii)  Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、又は、Sen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)若しくは(受託番号AF288394(配列番号79))若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
(iii)  Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)、又は、Sen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)若しくは配列番号5)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、及び
(iv)  Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)、又は、Sen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)若しくは配列番号7)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質、
をインキュベートする工程、及び
(b)  該複合体の量を測定する工程、
を含み、ここで、該化合物の不在下で測定された該複合体の量に対する、工程(b)で測定された該複合体の量の差が、該化合物が該複合体の形成をモジュレートすることを示す、前記方法。
【請求項６２】
Clp1(受託番号NP_006822(配列番号10))、又は、Clp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)若しくは配列番号9)若しくはその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、或いはClp1 (受託番号NP_006822(配列番号10))及び異種アミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質もまた、工程(a)でインキュベートされる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
複合体の安定性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  該複合体の維持を促す条件下において、化合物の存在下で請求項１、５、１４、２６、２９又は３３に記載の複合体をインキュベートする工程、
(b)  該複合体の量を測定する工程、
を含み、ここで、該化合物の不在下で測定された該複合体の量に対する工程(b)で測定された該複合体の量の差が、該化合物が該複合体の安定性をモジュレートすることを示す、前記方法。
【請求項６４】
前記方法が、個々の前記タンパク質の量に対する前記形成された複合体間の比を比較する工程をさらに含む、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６５】
工程(a)中、前記タンパク質を等モル量でインキュベートする、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６６】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  化合物ライブラリーのメンバーを、請求項１又は２１に記載の複合体及びレポーター遺伝子含有核酸と接触させる工程であって、ここで、該レポーター遺伝子がtRNAイントロンを含み、かつ、遺伝子発現に必要なすべての要素が存在する該工程、及び
(b)  該レポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、ここで、化合物の存在下の該レポーター遺伝子の発現が、該化合物の不在下又は対照の存在下の該レポーター遺伝子の発現に対して変化している場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される該工程、
を含む、前記方法。
【請求項６７】
３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  化合物ライブラリーのメンバーを、請求項１、１９又は２９に記載の複合体、及びレポーター遺伝子と３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断部位とを含む核酸と接触させる工程であって、ここで、該レポーター遺伝子が該３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断部位の３'に位置し、かつ、遺伝子発現に必要なすべての要素が存在する該工程、及び
(b)  該レポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、ここで、化合物の存在下の該レポーター遺伝子の発現が、該化合物の不在下又は対照の存在下の該レポーター遺伝子の発現に対して変化している場合、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断活性をモジュレートする化合物が同定される該工程、
を含む、前記方法。
【請求項６８】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  請求項１又は１９に記載の複合体を、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質及び化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここで、該基質は、その５'末端を発蛍光団で及び３'末端を消光剤で標識される該工程、及び
(b)  該tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、蛍光シグナルが、該化合物の不在又は対照の存在に対して該化合物の存在下で変化している場合、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される該工程、
を含む、前記方法。
【請求項６９】
ヒト３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  請求項１、１９又は２９に記載の複合体を、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質及び化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここで、該基質は、その５'末端を発蛍光団で及び３'末端を消光剤で標識される該工程、及び
(b)  該３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、蛍光シグナルが、該化合物の不在又は対照の存在に対して該化合物の存在下で変化している場合、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される該工程、
を含む、前記方法。
【請求項７０】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  請求項１又は１９に記載の複合体を、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの基質及び化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここで、該基質は、その５'末端を蛍光供与体部分で及び３'末端を蛍光受容体部分で標識される該工程、及び
(b)  該tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、該化合物の存在下の該蛍光供与体部分の波長での該蛍光供与体部分の蛍光放射が、該化合物の不在又は対照の存在に対して変化している場合、該tRNAスプライシング活性をモジュレートする化合物が同定される該工程、
を含む、前記方法。
【請求項７１】
ヒト３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法が、
(a)  請求項１、１９又は２９に記載の複合体を、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの基質及び化合物ライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、ここで、該基質は、その５'末端を蛍光供与体部分で及び３'末端を蛍光受容体部分で標識される、該工程、及び
(b)  該３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を測定する工程であって、ここで、該化合物の存在下の該蛍光供与体部分の波長での該蛍光供与体部分の蛍光放射が、該化合物の不在又は対照の存在に対して変化している場合、３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、該工程、
を含む、前記方法。
【請求項７２】
前記化合物を、前記複合体の形成阻害について試験する、請求項５３に記載の方法。
【請求項７３】
前記化合物を、前記複合体の形成阻害について試験する、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項７４】
被験体における増殖性疾患若しくはその徴候の予防、治療又は管理のための薬剤の調合での請求項７２に記載の方法によって同定された化合物、又は製薬上許容可能なその塩の使用。
【請求項７５】
被験体における増殖性疾患若しくはその徴候の予防、治療又は管理のための薬剤の調合での請求項７３に記載の方法によって同定された化合物、又は製薬上許容可能なその塩の使用。
【請求項７６】
前記化合物を、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性の阻害について試験する、請求項６６、６８又は６９に記載の方法。
【請求項７７】
被験体における増殖性疾患若しくはその徴候の予防、治療又は管理のための薬剤の調合での請求項７６に記載の方法によって同定された化合物、又は製薬上許容可能なその塩の使用。
【請求項７８】
前記化合物を、ヒト３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性の阻害について試験する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７９】
前記化合物を、ヒト３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性の阻害について試験する、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
前記化合物を、ヒト３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性の阻害について試験する、請求項７１に記載の方法。
【請求項８１】
被験体における増殖性疾患若しくはその徴候の予防、治療又は管理のための薬剤の調合での請求項７８に記載の方法によって同定された化合物、又は製薬上許容可能なその塩の使用。
【請求項８２】
被験体における増殖性疾患若しくはその徴候の予防、治療又は管理のための薬剤の調合での請求項７９に記載の方法によって同定された化合物、又は製薬上許容可能なその塩の使用。
【請求項８３】
被験体における増殖性疾患若しくはその徴候の予防、治療又は管理のための薬剤の調合での請求項８０に記載の方法によって同定された化合物、又は製薬上許容可能なその塩の使用。
【請求項８４】
前記化合物がtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増強する、請求項６６、６８又は６９に記載の方法。
【請求項８５】
前記化合物が３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を増強する、請求項６７に記載の方法。
【請求項８６】
前記化合物が３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を増強する、請求項６９に記載の方法。
【請求項８７】
前記化合物が３'末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を増強する、請求項７１に記載の方法。
【請求項８８】
前記化合物が前記複合体に直接結合する、請求項６６、６８又は６９に記載の方法。
【請求項８９】
前記化合物が前記複合体に直接結合する、請求項５３に記載の方法。
【請求項９０】
前記化合物が前記複合体に直接結合する、請求項６３に記載の方法。
【請求項９１】
被験者において増殖性疾患をインビトロで診断する方法であって、該方法が、(a)Sen2(受託番号NP_
079541(配列番号2)若しくは配列番号95)、Sen15(受託番号NP_443197(配列番号4)若しくは受託番号AAG60614(配列番号80))、Sen34(受託番号NP_076980(配列番号81)若しくは配列番号6)、Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)若しくは配列番号8)、Clp1(受託番号NP_006822(配列番号10))、SenΔ8Ex(配列番号12)、CPSF、CFIm、CFIIm及びCstFからなる群から選択されるタンパク質に免疫特異的に結合する抗体又はその断片と、該被験者からのサンプルとを接触させる工程、及び(b)該抗体又はその断片を検出する工程であって、ここで、増殖性疾患のない被験者における該タンパク質のレベルと比較して低減したタンパク質レベルが、該被験者が増殖性疾患をもつことを示す、該工程を含む、前記方法。
【請求項９２】
被験者において増殖性疾患をインビトロで診断する方法であって、該方法が、請求項１、５、１４、２６、２９又は３３に記載の複合体に免疫特異的に結合する抗体又はその断片と、該被験者からのサンプルとを接触させる工程、及び(b)該抗体又はその断片を検出する工程であって、ここで、増殖性疾患のない被験者における該タンパク質のレベルと比較して低減したタンパク質レベルが、該被験者が増殖性疾患をもつことを示す、該工程を含む、前記方法。
【請求項９３】
請求項１、５、１４、２６、２９又は３３に記載の複合体を、mRNA又はプレ-mRNA分子とともにインキュベートすることを含む、該mRNA又はプレ-mRNA分子を切断する方法。
【請求項９４】
前記mRNAが未成熟ストップコドンを含む、請求項９３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
特定の実施形態においては、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2(受託番号NP_079541(配列番号2))、又は、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79))、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iv) Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。この実施形態によれば、上記複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ-ｍRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
特定の実施形態においては、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2(受託番号NP_079541(配列番号2))、又は、ヒト又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)、又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(v) ヒトClp1(受託番号NP_006822(配列番号10))、又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。この実施形態によれば、上記複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(v) ヒトClp1(受託番号NP_006822(配列番号10))又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vi)、ヒト切断-ポリアデニル化特異性因子(「CPSF」) 又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vii)ヒト切断因子Im(「CFIm」)又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(viii) ヒト切断因子IIm (「CFIIm」)又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(ix)ヒト切断刺激因子(「CSF」) 又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の実施形態においては、上記タンパク質複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
１つの実施形態においては、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2(受託番号NP_079541(配列番号2))、又は、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(v) ヒトClp1(受託番号NP_006822(配列番号10))、又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vi)ヒト切断-ポリアデニル化特異性因子(「CPSF」) 又は、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vii)ヒト切断因子Im(「CFIm」) 又は、ヒトCFIm をコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(viii) ヒト切断因子IIm (「CFIIm」)、又は、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ix)ヒト切断刺激因子(「CSF」)、又は、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。この実施形態によれば、上記複合体はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び/又は３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明は、ヒトSen2のスプライス変異体、すなわちヒトSen2ΔEx8を提供する。特に本発明は、ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体をコードする核酸配列、及びヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体をコードするアミノ酸配列を提供する。特定の実施形態においては、本発明はストリンジェントな条件下で、Sen2ΔEx8をコードする核酸配列の全長にわたってヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を提供する。好ましくは、このような核酸配列はSen2ΔEx8活性（例えばClp1及びSen54と複合体を形成する能力）を有するタンパク質をコードする。別の実施形態においては、本発明は、配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を提供する。ここで、上記タンパク質はSen2(受託番号NP_079541(配列番号2))とは異なり、好ましくは、このタンパク質はSen2ΔEx8活性を有する。別の実施形態においては、本発明は配列番号11の核酸配列を含む核酸配列を提供する。本発明はさらに、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列を含むベクター及びそのベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列を含む宿主細胞をさらに提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
特定の実施形態においては、本発明は、精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、その機能的に活性のある断片、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。別の実施形態においては、本発明は、精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、その機能的に活性のある断片、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iv) ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明は、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、(ii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(v)ヒトClp1(受託番号NP_006822(配列番号10))又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記複合体は、(i)ヒトCPSF160又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトCPSF30又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトCstF64又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片をさらに含んでもよい。本発明はまた、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、(ii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iv)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(v)ヒトClp1(受託番号NP_006822(配列番号10))又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vi)ヒトCSPF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(vii)ヒトCFIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(viii)ヒトCFIIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(ix)ヒトCstF 又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体を提供する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
特定の実施形態においては、本発明は、３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(v) ヒトClp1 (受託番号NP_006822(配列番号10))又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
別の実施形態においては、本発明は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4))、配列番号80)、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(v) ヒトClp1 (受託番号NP_006822(配列番号10))又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vi) ヒトCPSF、又は、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vii) ヒトCFIm、又は、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(viii) ヒトCFIIm、又は、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ix) ヒトCSF、又は、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。本発明は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i)ヒトSen2ΔEx8又はその機能的に活性な誘導体、(ii)ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(iii)ヒトClp1(受託番号NP_006822(配列番号10))又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含み、任意に(i)ヒトCPSF又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(ii)ヒトCFIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、(iii)ヒトCFIIm又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(iv)ヒトCstF 又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を１つ以上又は任意の組合せとして含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態において、本発明は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したヒトSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、又は、ヒトSen54���コードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iii)ヒトClp1 (受託番号NP_006822(配列番号10))又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記複合体は、(i) ヒトCPSF160、又は、ヒトCPSF160をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトCPSF30、又は、ヒトCPSF30をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii) ヒトCstF64、又は、ヒトCstF64をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は(iv) ヒトシンプレキン、又は、ヒトシンプレキンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質をさらに含んでもよい。別の実施形態においては、本発明は３’末端プレ- mRNAエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したSen2ΔEx8複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、又は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号1１)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii) ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、又は、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトClp1 (受託番号NP_006822(配列番号10))又は、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83)、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iv) ヒトCPSF、又は、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(v) ヒトCFIm、又は、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(vi) ヒトCFIIm、又は、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(vii) ヒトCstF、又は、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明はまた、プレ-リボソームRNA切断活性をもつタンパク質複合体を提供する。特に、本発明は、(i)ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び(ii)ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、プレ-リボソームRNA切断活性をもつタンパク質複合体を提供する。さらに具体的には、本発明は、プレ-リボソームRNA切断活性をもつタンパク質複合体であって、上記複合体が、(i) ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、又は、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(ii) ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、又は、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。このタンパク質複合体を異なったリボソームRNAの生合成に用いてもよい。例えば、28S、18S、5.5S及び5SリボソームRNAの生成は、このタンパク質複合体の調節によって変化し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
本発明は、ヒトSen2のスプライス変異体、すなわちヒトSen2ΔEx8を提供する。特に、本発明はヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体、及びヒトSen2ΔEx8をコードするアミノ酸配列又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体を提供する。特定の実施形態においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で、Sen2ΔEx8をコードする核酸配列の全長にわたってハイブリダイズする核酸配列を提供する。別の実施形態においては、本発明は、配列番号12のアミノ酸配列と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、上記タンパク質がSen2（受託番号:NP_079541(配列番号2)）とは異なる、タンパク質をコードする核酸配列を提供する。別の実施形態においては、本発明は、配列番号11の核酸配列を含む核酸配列を提供する。本発明は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列を含むベクター及び上記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。本発明は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸を含む宿主細胞をさらに提供する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
本発明は、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸配列又はその機能的に活性な断片又は機能的に活性な誘導体を提供する。特に本発明は、配列番号11のヌクレオチド配列と同一の連続ヌクレオチド配列を含む核酸配列を提供する。本発明はまた、配列番号11のヌクレオチド配列もしくはその相補的核酸と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは少なくとも99.8%同一の核酸配列をも提供する。本発明は、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50もしくはそれ以上の、配列番号11もしくはその相補的核酸のヌクレオチドのヌクレオチド配列における連続ヌクレオチドを含み、ここで上記ヌクレオチド配列が、配列番号11もしくはその相補的核酸のヌクレオチド910からヌクレオチド960を含む、核酸配列を提供する。本発明はまた、高ストリンジェントな条件下で、配列番号11もしくはその相補的核酸のヌクレオチド配列に対して、配列番号1の核酸配列の全長にわたってハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む、核酸配列を提供する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
特に、本発明は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。1つの実施形態においては、本発明はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、（i）ヒトSen2（受託番号NP_079541(配列番号2)）、或いは、ヒトSen2をコードする核酸（受託番号NM_025265(配列番号1)）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（ii）ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸（受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iii）ヒトSen34（受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6）、或いは、ヒトSen34をコードする核酸（受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び（iv）ヒトSen54（受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8）、或いは、ヒトSen54をコードする核酸（受託番号XM_0208944(配列番号82)、配列番号7）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、を含む、上記複合体を提供する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
1つの実施形態においては、本発明はtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2（受託番号NP_079541(配列番号2)）、或いは、ヒトSen2をコードする核酸（受託番号NM_025265(配列番号1)）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（ii）ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸（受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iii）ヒトSen34（受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6）、或いは、ヒトSen34をコードする核酸（受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iv）ヒトSen54（受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8）、或いは、ヒトSen54をコードする核酸（受託番号XM_0208944(配列番号82)、配列番号7）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び（v）ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸（受託番号NM_006831(配列番号83)、配列番号9）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、RNA-核酸分解活性を有する。特定の実施形態においては、上記Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は３’末端mRNAプロセシング活性を有する。特定の実施形態においては、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。特定の実施形態においては、上記複合体は（i）ヒトCPSF160或いは、ヒトCPSF160をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（ii）ヒトCPSF30或いは、ヒトCPSF30をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iii）ヒトCstF64或いは、ヒトCstF64をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は（iv）ヒトシンプレキン或いは、ヒトシンプレキンをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、をさらに含んでもよい。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
本発明は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ、精製したタンパク質複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（ii）ヒトSen15又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（iii）ヒトSen34又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（iv）ヒトSen54又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（v）ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（vi）ヒト切断-ポリアデニル化特異性因子（「CPSF」）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（vii）ヒト切断因子Im（「CFIm」）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、（viii）ヒト切断因子IIm（「CFIIm」）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片、及び（ix）ヒト切断刺激因子（「CSF」）又はその機能的に活性な誘導体又は機能的に活性な断片を含む、上記複合体を提供する。特定の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。別の実施形態においては、上記タンパク質複合体は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性及び３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
特定の実施形態においては、CPSF及びCstFの全てのサブユニットは、各々、本発明の複合体中に存在する。
【表１】
2007529992.tif 000001
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
1つの実施形態においては、本発明は、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をもつ精製した複合体であって、上記複合体が、（i）ヒトSen2（受託番号NP_079541(配列番号2)）、或いは、ヒトSen2をコードする核酸（受託番号NM_025265(配列番号1)）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（ii）ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸（受託番号NM_052965(配列番号3))、配列番号79）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iii）ヒトSen34（受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6）、或いは、ヒトSen34をコードする核酸（受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（iv）ヒトSen54（受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8）、或いは、ヒトSen54をコードする核酸（受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（v）ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸（受託番号NM_006831(配列番号83))、配列番号9）又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（vi）ヒト切断-ポリアデニル化特異性因子（「CPSF」）或いは、ヒトCPSF又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（vii）ヒト切断因子Im（「CFIm」）或いは、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、（viii）ヒト切断因子IIm（「CFIIm」）或いは、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び（ix）ヒト切断刺激因子（「CSF」）或いは、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質を含む、上記複合体を提供する。この実施形態によれば、上記複合体は、３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有してもよい。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
4.2.2  3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ複合体
本発明は、以下の2つ以上を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する、精製されたタンパク質複合体を提供する：(i)ヒトSen2又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片、(iii)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vi)ヒトCPSF160又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vii)ヒトCPSF30又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(viii)ヒトCstF64又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び/又は(ix)ヒトシンプレキン又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(x)ヒトCPSF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(xi)ヒトCFIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(xii)ヒトCFIIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(xiii)ヒトCstF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
特に、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたタンパク質複合体を提供する：(i)ヒトSen2又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトSen15又は機能的に活性名誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片、(iii)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vi)ヒトCPSF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vii)ヒトCFIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(viii)ヒトCFIIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(ix)ヒトCstF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
一つの実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製された複合体を提供する：(i)ヒトSen2(受託番号NP_079541(配列番号2))、或いは、ヒトSen2をコードする核酸(受託番号NM_025265(配列番号1))又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen15(受託番号NP_443197  (配列番号4)、配列番号80)、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iv)Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83))、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、RNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。ある実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。ある実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトCPSF30又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトCstF64又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。他の実施形態において、複合体は、(i)ヒト切断−ポリアデニル化特異性因子（CPSF）、或いは、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒト切断因子Im(CFIm)、或いは、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒト切断因子IIm(CFIIm)、或いは、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(iv)ヒト切断刺激因子（CSF）、或いは、ヒトCSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、を更に含む。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(ii)ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。別の実施形態において、本発明は、以下を含む精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii)ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iv)Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。これらの実施形態に従って、ヒトSen2ΔEx8複合体は、tRNAを複数の部位で切断する。これらのヒトSen2ΔEx8複合体は、3’エンドヌクレアーゼのプロセシングとRNA構造のマッピングに有用である。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体はRNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体はtRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。ある実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。一定の実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトCPSF30又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトCstF64又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
本発明はまた、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトSen15又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iv)ヒトSen34又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(v)Clp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vi)ヒトCPSF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(vii)ヒトCFIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(viii)ヒトCFIIm又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(ix)ヒトCstF又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iv)ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83))、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。ある実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい；(i)ヒトCPSF160、又はヒトCPSF160をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii)ヒトCPSF30、又はヒトCPSF30をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトCstF64、又はヒトCstF64をコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は(iv)ヒトシンプレキン、又はヒトシンプレキンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
別の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iv)ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(v)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83))、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(vi)ヒトCPSF（構成成分の受託番号は表１を参照）、或いは、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(vii)ヒトCFIm（構成成分の受託番号は表１を参照）、或いは、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(viii)ヒトCFIIm（構成成分の受託番号は表１を参照）、或いは、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(ix)ヒトCstF（構成成分の受託番号は表１を参照）、或いは、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によって
コードされるタンパク質。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8又は機能的に活性なその誘導体；(ii)ヒトSen54又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び(iii)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体はRNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、RNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。一定の実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。ある実施形態において、複合体は、更に以下を含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(ii)ヒトCPSF30又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；(iii)ヒトCstF64又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片；及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又は機能的に活性な誘導体、或いは、機能的に活性なそれらの断片。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(iii)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83))、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
別の実施形態において、本発明は、以下を含む、3’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトClp1（受託番号NP_006822(配列番号10)）、或いは、ヒトClp1をコードする核酸(受託番号NM_006831(配列番号83))、配列番号9)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iv)ヒトCPSF、或いは、ヒトCPSFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(v)ヒトCFIm、或いは、ヒトCFImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(vi)ヒトCFIIm、或いは、ヒトCFIImをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(vii)ヒトCstF、或いは、ヒトCstFをコードする核酸又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
ある実施形態において、本発明は、以下に挙げるうちの２つ以上を含む複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(ii)ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；(iii)ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6))、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(iv)ヒトSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
特定の実施形態において、本発明は、以下を含む、プレ-tRNA切断活性を有する精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質；及び(ii)ヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。別の実施形態において、本発明は、以下を含む、精製されたヒトSen2ΔEx8複合体を提供する：(i)ヒトSen2ΔEx8(配列番号12)、或いは、ヒトSen2ΔEx8をコードする核酸(配列番号11)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii)ヒトSen15（受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80）、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び(iv)Sen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、或いは、ヒトSen54をコードする核酸(受託番号XM_208944(配列番号82)、配列番号7)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。ある実施形態において、Sen2ΔEx8複合体はRNA核酸分解活性を有する。特定の実施形態において、Sen2ΔEx8複合体は、tRNAエンドヌクレアーゼ及び/又は3’末端mRNAプロセシング活性を有する。ある実施形態において、Sen2ΔEx8含有複合体のtRNA切断活性の忠実度と精度は、全長Sen2含有複合体のtRNA切断活性と比較して低下している。ある実施形態において、複合体は、以下を更に含んでもよい：(i)ヒトCPSF160又はCPSF160をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(ii)ヒトCPSF30又はCPSF30をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、(iii)ヒトCstF64又はCstF64をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及び/又は(iv)ヒトシンプレキン又はシンプレキンをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。それらの実施形態に従って、ヒトSen2ΔEx8複合体は、tRNAを複数の部位で切断する。これらのヒトSen2ΔEx8複合体は、3’エンドヌクレアーゼのプロセシングとRNA構造のマッピングに有用である。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
特に、本発明は、プレ-リボソームRNA切断活性を有する複合体を提供し、ここでこの複合体は、以下を含む：ヒトSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、或いは、ヒトSen34をコードする核酸(受託番号NM_024075(配列番号93)、配列番号5)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質、及びヒトSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、或いは、ヒトSen15をコードする核酸(受託番号NM_052965(配列番号3)、配列番号79)又はその相補的核酸に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
１つ以上の構成成分を組換えDNA技術で発現する場合、組換えタンパク質を製造するのに当業者に知られている方法を使用できる。本発明のタンパク質複合体の構成成分タンパク質の核酸配列とアミノ酸配列は、本明細書で提供されており（表１及び配列番号11-12参照）、当該技術分野で知られている方法、例えば、各配列の3’と5’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを用いたPCR増幅、及び/又は各ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたcDNA又はゲノムライブラリーからのクローニングにより、構成成分タンパク質の核酸配列とアミノ酸配列を得ることができる。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０７】
ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体サブユニットは、タンパク質のHsSen2(受託番号NP_079541(配列番号2))、HsSen34(受託番号NP_076980(配列番号81)、配列番号6)、HsSen54(受託番号XP_208944(配列番号94)、配列番号8)、HsSen15(受託番号NP_443197(配列番号4)、配列番号80)、およびHsClp1(受託番号NM_006822(配列番号10))を含む。HsSen2、HsSen2ΔEx8、HsSen34、HsSen54、HsSen15、およびHsClp1のオープンリーディングフレームを特定のプライマーを用いてPCR増幅によって作製し、His−Flag−pcDNA3.1/Hygroベクターにクローン化した。ヒスチジンおよびflagエピトープをフレーム内に有する、種々のtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体サブユニットcDNAを含むHis−Flag−pcDNA3.1/Hygroプラスミドで、293細胞を形質移入させ、安定なクローンをハイグロマイシン耐性で選択した。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】HTS蛍光スクリーニングの基質である。エンドヌクレアーゼtRNAはパネルA
中に示され、ハイブリダイズしたtRNA基質はパネルBに示される。環状に順序を変えたtRNA基質はパネルCに示される。５’ssは５’スプライス部位を示し、３’ssは３’スプライス部位を示す。
【図２】酵母でのプレ-tRNAからのイントロンの除去の概略図である。酵母でのtRNA
イントロンの除去には、3つの酵素の作用が必要である。第1のステップにおいては、tRNAエンドヌクレアーゼは前駆体tRNAを５’及び３’スプライス部位で認識し切断する。この酵素は、SEN54、SEN2、SEN34及びSEN15タンパク質からなるヘテロ四量体である。上記産物である５’エクソン及び３’エクソンが一連の酵素の段階を通じてtRNAリガーゼによって連結し、最終的には2つのエクソンがスプライス部位で２’リン酸と共に結合する。この特異なtRNA中間体は、２’リン酸をNAD受容体に転移する２’ホスホトランスフェラーゼによってプロセシングされて成熟tRNAを生じる。
【図３】酵母tRNAスプライシングホロ酵素の概略図である。古細菌の構造研究及びそ
れに続く酵母のサブユニットを用いたツーハイブリッド相互作用実験を通じて、酵母tRNAエンドヌクレアーゼの4つのサブユニットの相互作用モデルが提唱された(Li et al., 1998 Science 280,279-284)。異種サブユニットであるSEN54及びSEN15と活性部位サブユニットSEN2及びSEN34との各々の二量化は、各サブユニットのC末端に保存されているβシートの相互作用によって達成される。二量体を含む活性部位は、その後2つの活性部位含有サブユニット中にある、N末端及びC末端ドメインの間に形成された、塩基性グルーヴをもつ保存された荷電ループL10の相互作用を通して集まる。
【図４】酵母tRNAエンドヌクレアーゼによるtRNAの切断モデルである。tRNAの切断は
、Sen2サブユニットに含まれる活性部位による５’スプライス部位の触媒反応及びSen34による３’スプライス部位の触媒反応を通じて起こる。
【図５】ヒト(Hs)Sen2（配列番号162）及び変異HsSen2（配列番号263）、並びに酵母
Saccaromyces cerevisiae（ScSen2p（配列番号364））tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼSen2サブユニットのアミノ酸配列の整列である。四角で囲んであるアミノ酸残基は、YPGGY（配列番号492）活性部位モチーフを示し、丸く囲んであるアミノ酸残基は活性部位ヒスチジンを示し、下線を引いたアミノ酸残基は、酵母の推定される膜貫通ドメインを示す。
【図６】ヒトと酵母との間における、tRNAエンドヌクレアーゼ活性部位サブユニット
Sen2及びSen34の配列の保存である。Aは、Saccaromyces cerevisiae（ScSen2(配列番号65)）、Schizosaccaromyces pombe (SpSen2(配列番号66))及びH. sapiens (HsSen2(配列番号95))中におけるSen2アミノ酸配列の比較である。Bは、S. cerevisiae (ScSen34(配列番号67))、S. pombe (SpSen34(配列番号68)) 及びH. sapiens (HsSen34(配列番号96))中のSen34アミノ酸配列の比較である。
【図７】ヒトと酵母との間における、tRNAエンドヌクレアーゼサブユニットSen15及
びSen54の配列の保存である。Aは、S. cerevisiae（ScSen54(配列番号69)）、S. pombe (SpSen54(配列番号70))及びH. sapiens (HsSen54(配列番号8))中におけるSen54アミノ酸配列の比較である。Bは、S. cerevisiae（ScSen15(配列番号71)）、S. pombe (SpSen15(配列番号72))及びH. sapiens (HsSen15(配列番号4)中におけるSen15アミノ酸配列の比較である。
【図８】種々の種(配列番号10、及び配列番号73〜78)由来のClp1のタンパク質の配列
の整列である。hClp1は進化的に保存されており、ATP/GTP結合モチーフを有している。H. sapiens (tr: Q92989(配列番号10))、D. melanogaster (tr:Q9V6Q1(配列番号73))、C. elegant (sp: P52874(配列番号74))、A. thalana 1 (gb:AB010077(配列番号75))、 A. thaliana 2 (tr: QSR06(配列番号76))、S. pombe (tr: Q10299(配列番号77)) 及びS. cerevisiae (tr: Q08685(配列番号78)) のClp1p配列の整列を、clustalxで作成した。黒及び灰色の四角はそれぞれ、同一残基及び類似残基を示す。コンセンサス配列-A/G-X-X-X-X-G-K- S/T-をもつWalker Aモチーフ及びWalker Bモチーフを示す。
【図９】tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体のタンパク質成分の同定であ
る。His-Flag-Sen2又はHis-Flag-Sen34又はHis-Flag-Senl5又はHis-Flag-Clpl又はHis-Flag-Sen54又はHis-Flag-Sen2ΔEx8タンパク質を、実施例5.1.2.に記載のとおりに精製した。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen34、His-Flag-Senl5、His-Flag-Clpl、His-Flag-Sen54、His-Flag-Sen2ΔEx8と同時精製したタンパク質は、SDS-PAGE、続いて銀染色法で解析した。Sen2、Sen34、Senl5、Sen54及びClplはtRNAスプライシング複合体のタンパク質成分として同定される。トランスフェクトされていない293細胞からの抽出物は、陰性対照として用いた。
【図１０Ａ−Ｂ】tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を含む細胞抽出物分画
の精製。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen34及びHis-Flag-Senl5タンパク質を実施例5.1.2.に記載のとおりに精製した。トランスフェクトされていない293細胞からの抽出物を、陰性対照として用いた。酵母のエンドヌクレアーゼを、エンドヌクレアーゼ活性の陽性対照として用いた。A: His-Flag-Sen2又はHis-Flag-Sen34と同時精製した分画は、エンドヌクレアーゼ活性を示し、標識されたtRNAをイントロン/エクソン境界で切断する。B: His-Flag-Senl5と同時精製した分画は、エンドヌクレアーゼ活性を示し、標識されたtRNAをイントロン/エクソン境界で切断する。
【図１０Ｃ】tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を含む細胞抽出物分画の精
製。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen34及びHis-Flag-Senl5タンパク質を実施例5.1.2.に記載のとおりに精製した。トランスフェクトされていない293細胞からの抽出物を、陰性対照として用いた。酵母のエンドヌクレアーゼを、エンドヌクレアーゼ活性の陽性対照として用いた。C: Flag-His-HsClplと同時精製したタンパク質は、プレ-tRNAエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【図１１】ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ活性部位サブユニットは、細
胞核に局在している。Myc-Sen2 (上部パネル) 及び GFP-Sen34 (下部パネル) ベクターを、Hela細胞に一時的にトランスフェクトし、免疫蛍光法で視覚化する。
【図１２】エンドヌクレアーゼ活性部位サブユニットSen2pは2つの明確に異なった形
態へと選択的にスプライスされる。Sen2p WTは、全ての13のSen2pエクソンを含み、一方そのスプライス変異体であるSen2ΔEx8は（これもSen2ΔEx8と表す）、エクソン8以外の全てのエクソンを含む。古細菌のエンドヌクレアーゼとヒトSen2ΔEx8サブユニットとの活性部位の整列は、エクソン8のアミノ酸配列が、古細菌エンドヌクレアーゼの保存されたαへリックスにぴったりと対応することを意味する。上記のαへリックスは、活性部位サブユニットのN末端及びC末端ドメインを正しい位置に置く役割を果たして塩基性グルーヴを形成し、この塩基性グルーヴに対して異種Sen15サブユニットのループL10が相互作用すると提案されている。
【図１３】選択的にスプライスされたエンドヌクレアーゼサブユニットSen2ΔEx8は
、多くのヒト組織で発現している。A :実施例5.2.3に記載される、Hela細胞及び白血病組織、肝臓、腎臓、骨髄、リンパ球、脳、胃、脂肪細胞組織中の野生型Sen2及びスプライス変異Sen2ΔEx8の発現のPCR解析。B : Sen2ΔEx8に特異的なオリゴヌクレオチドでプローブした70組織種のノーザンブロット解析によって、組織のアレイ中でSen2ΔEx8が発現していることが明らかになる。
【図１４】Sen2ΔEx8はSen15及びSen34への結合能が低下している。実施例5.1.2のと
おりに、His-Flag-Sen2ΔEx8、His-Flag-Sen34又はHis-Flag-Sen2タンパク質を精製した。293細胞から調製した抽出物を陰性対照として使用した。His-Flag-Sen2ΔEx8又はHis-Flag-Sen34又はHis-Flag-Sen2と同時精製したタンパク質を、SDS-PAGEに続いて銀染色法で解析した。
【図１５】Sen2ΔEx8を含むエンドヌクレアーゼは、プレ-tRNA切断活性が欠損してい
る。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen34及びHis-Flag-Sen2ΔEx8タンパク質を、実施例5.1.2のとおりに精製した。トランスフェクトされていない293細胞からの抽出物を陰性対照として用いた。酵母エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性の陽性対照として用いた。His-Flag-Sen2又はHis-Flag-Sen34と同時精製した分画は、標識されたtRNAをイントロン/エクソン境界で切断し、エンドヌクレアーゼ活性を示すが、His-Flag-Sen2ΔEx8と同時精製した分画は、エンドヌクレアーゼ活性を欠失していることを示す。
【図１６】ヒトエンドヌクレアーゼ複合体の、2つの異なる複合体の会合モデル。ヒ
トホロ酵素は5つのサブユニットからなると考えられ、保存された相互作用エレメントが存在しているために、上記酵素は酵母tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼに類似した方法でへテロ四量体化することができる。Sen2ΔEx8はSen54タンパク質と共に二量体化することができるが、Sen34、Sen15と安定した相互作用を形成することはできない。この精製酵素は、in vitroでプレ-tRNAを切断することができるが、切断様式は異常である。従って、この酵素は、in vivoではプレ-mRNAといった他の種類のRNA基質をプロセシングする機能を果たす可能性がある。
【図１７Ａ】ヒトエンドヌクレアーゼ複合体は、プレ-mRNA３’末端プロセシング因
子に関与する。His-Flag-Sen2、His-Flag-Sen2ΔEx8 、His-Flag-Sen34、His-Flag-Clp1、His-Flag-Sen15と同時精製したタンパク質をSDS-PAGEで解析し、CPSF30、シンプレキン、CstF64といった３’末端プレ-mRNAプロセシング複合体のタンパク質成分に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングした。プレ-mRNAスプライシングSmB/B’タンパク質を認識するY12抗体を、陰性対照として用いた。His-Flag-Sen2ΔEx8は、 CPSF30、シンプレキン、CstF64と強く関連し、Flag-Sen2ΔEx8が主にプレ-mRNAプロセシングに関わっていることを示す。
【図１７Ｂ】His-Flag-HsSen2、His-Flag-HsSen2ΔEx8、His-Flag-HsSen34、His-Fl
ag-HsSen15及びHis-Flag-HsClp1、と同時精製したタンパク質をSDS-PAGEで解析し、シンプレキン、CstF64に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングした。SmB/B’タンパク質を認識するY12抗体を陰性対照として用いた。Cstf-64タンパク質の2つのイソ型を認識する、CstF64に対する抗体が293細胞株に存在することに留意されたい(Wallace et al., 1999, PNAS 96:6763-6768)。
【図１８】ヒトエンドヌクレアーゼは異なった種類のRNAをプロセスする。Sen2タン
パク質は、Sen54、Sen34、Sen15およびClp1と複合体を形成し、プレ-tRNAからイントロンを除去する。Clp1タンパク質はまた、プレ-mRNAの成熟に関与する別の複合体の一部分ともなり得るので、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼの全てのサブユニットが、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに関与する因子と複合体を形成することが示唆される。Sen2ΔEx8は、Sen34及びSen15と共に複合体を形成することはできず、プレ-tRNA切断は欠損しているが、Clp1と相互作用することはできる。この相互作用の結果、Sen2ΔEx8は、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに関与する。
【図１９】３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼの例示的な基質を表す。プレ-mRN
A分子を線で示す。３’末端プレ-mRNAエンドヌクレアーゼ切断部位の位置及び内部リボソーム侵入部位を示す。2つのレポーター遺伝子、蛍ルシフェラーゼ（FLuc）又はウミシイタケルシフェラーゼ（RLuc）の読み取り枠を四角で表す。
【図２０】ヒトSen2の核酸配列(配列番号1)及びアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
【図２１】ヒトSen2ΔEx8核酸配列(配列番号11)及びアミノ酸配列(配列番号12)を示
す。
【図２２】ヒトSen15の核酸配列(配列番号3)及びアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
【図２３】ヒトSen34の核酸配列(配列番号5)及びアミノ酸配列(配列番号6)を示す。
【図２４】ヒトSen54の核酸配列(配列番号82の7〜1938)及びアミノ酸配列(配列番号
93)を示す。
【図２５】ヒトClp1の核酸配列(配列番号83)及びアミノ酸配列(配列番号10)を示す。
【図２６】ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットの局在。Hela細
胞を、GFP-HsSen34（左パネル）、Myc-HsSen2（中央パネル）又はMyc-HsSen2ΔEx8（右パネル）をコードするベクターで一過的にトランスフェクトし、myc-エピトープに対する抗体を用いて間接的な免疫蛍光顕微鏡検査法で解析した。
【図２７】ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合体のタンパク質成分の同
定。His-Flag-HsSen2及びHis-Flag-HsSen34（A）と共に、又はHis-Flag-HsSen2ΔEx8及びHis-Flag-HsSen2（B）と同時精製したタンパク質をSDS-PAGE及びそれに続く銀染色法で解析した。パネルA、レーン3及びパネルB、レーン2の大きいバンドは各々、His-Flag-HsSen2及びHis-Flag-HsSen2ΔEx8に対応する。これらのバンドは、内在性のHsSen54と重複する。星印で印を付けた幾つかのバンドは、コントロールである、トランスフェクトされていない293細胞の精製において検出され、これによって精製プロトコルの非特異性の混入物を示す（Hu et al., 2003）。バンド1及び2は、タンパク質配列によってHsSen15及びHsClp1として各々同定された。（C）His-Flag-HsSen15と共に同時精製した細胞抽出物分画のエンドヌクレアーゼ活性を、標識したプレ-tRNApheを用いて試験した。切断産物を、変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。293細胞抽出物を陰性対照として使用した。（D）His-Flag-HsSen54と同時精製したタンパク質を、上記のとおりにSDS-PAGE及びそれに続く銀染色法で解析した。HsSen54精製物に存在する、幾つかの付加的なバンドについては、現在検討中であることに留意されたい。
【図２８】HsClp1及びHsSen15は、ヒトtRNAスプライシングエンドヌクレアーゼ複合
体の純粋なタンパク質成分である。（A）His-Flag-HsSen15及びHis-Flag-HsClp1と同時精製したタンパク質をSDS-PAGE及びそれに続く銀染色法で解析した。His-Flag-HsSen2と同時精製するタンパク質（左パネル）を、His-Flag-HsSen15及びHis-Flag-HsClp1との比較のために示す。（B）His-Flag-HsSen15と同時精製した細胞抽出物分画のエンドヌクレアーゼ活性を、標識したプレ-tRNApheを用いて試験した。切断産物を変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。293細胞抽出物を陰性対照として用いた。
【図２９】ヒトエンドヌクレアーゼは、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに不可欠
な因子と関連する。His-Flag-HsSen2、His-Flag-HsSen2ΔEx8、His-Flag-HsSen34、 His-Flag-HsSen15及びHis-Flag-HsClp1と同時精製したタンパク質をSDS-PAGE及びそれに続く、シンプレキン、CstF64に対する抗体を用いたウエスタンブロッテイング法で解析した。SmB/B’タンパク質を認識するY12抗体を陰性対照として用いた。使用したCstf-64に対する抗体は、293細胞株中に存在する、このタンパク質の2つのイソ型を認識することが注目される(Wallace et al., 1999)。
【図３０Ａ−Ｃ】ヒトエンドヌクレアーゼは、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに
関与する。(A) SEN2エクソン8に特異的なsiRNA-A、又はSEN2エクソン9に特異的なSiRNA-Bを安定して発現している幾つかの293細胞株を、His-Flag-HsSen2（レーン1-3）又はHis-Flag-HsSen2ΔEx8のいずれかを用いてトランスフェクトした。全ての細胞抽出物は、これらの細胞から調製し、抗-FLAG（上）抗体又は抗-アクチン（下）抗体を用いたウェスタンブロット解析によって解析した。(B) siRNA-A又はsiRNA-Bを安定して発現している293細胞の定量的RT-PCR解析をパネルAに示す。白いバーは対照siRNAに対応し、黒いバーは対照siRNA-A1に対応し、灰色のバーはsiRNA-B2に対応する。(C)（上）EF1A及びGAPDH３’-伸張mRNAのリボヌクレアーゼ保護アッセイ。10マイクログラムの酵母総RNA（レーン6）、293細胞から得たmRNA（レーン5）又は293細胞が安定して発現している、siRNA-B1（レーン2）、siRNA-A1（レーン3）又はsiRNA-A2（レーン4）は、EF1A又はGAPDH３’末端切断及びポリアデニル化部位のいずれかの下流のアンチセンスに対応するリボプローブにハイブリダイズし、リボヌクレアーゼで消化された。レーン1は、EF1A又はGAPDH各々のための投入プローブの1:250又は1:100希釈を示す。（下）ホスフォイメージャーを用いた定量化による、３’末端伸張EF1A（灰色のバー）及びGAPDH（黒いバー）のプレ-mRNAの存在量の測定。データは、293の総RNA保護産物（レーン5）に対する倍率差としてプロットされた。
【図３０Ｄ】ヒトエンドヌクレアーゼは、プレ-mRNAの３’末端プロセシングに関与
する。（D）siRNA実験に用いるプライマーの概略図。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007529992000001.app