(57)【要約】  抗炎症特性の促進と、間葉系幹細胞（MSCｓ）含有組織の修復能力の向上のための方法であって、軌道揺動力を吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織に加えることで実施される機械的活性化ステップを少なくとも１つ備えることを特徴とする方法。【選択図】図１Ａ
2019501970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎症特性の促進と、間葉系幹細胞（MSCs）含有組織の修復能力の向上のための方法であって、軌道揺動力を吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織に加えることで実施される機械的活性化ステップを少なくとも１つ備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記軌道揺動力が４０〜１２０×gの強度範囲を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記軌道揺動力が９７×gに等しい強度を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記軌道揺動力が３〜２０分の時間範囲で加えられることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記軌道揺動力が１０分間加えられることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記軌道揺動力を加える機械的活性化ステップが、各ステップに対し等しいか異なる力の強度で、及び／又は各ステップに対し等しいか異なる持続時間だけ力を加えることを、２回以上繰り返すことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記吸引脂肪組織が凍結保存組織であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織（ADSCs）に含まれる間葉系幹細胞を分離して広げるステップを提供することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記前記吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織（ADSCs）に含まれる間葉系幹細胞を分離して広げるステップが、
−２０％ウシ胎児血清で補充された培地「ダルベッコ改変イーグル培地」（DMEM）で完全に満たされた２５ｃｍ２のフラスコ内に２ｍｌの間葉系幹細胞を接種し、
−３７℃で５％CO2内で培養し、
−前記フラスコを上下逆さまにして、細胞が浮かんで前記フラスコの内側天井面に付着するようにし、
−１５日後に前記培地と組織を取り除き、前記フラスコを上下逆さまにして、細胞が底面にくるようにし、
−細胞が９０〜９５％のコンフルエンスに達するまで毎４日培地を置き換えることからなるのを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で得られたことを特徴とする間葉系幹細胞（MSCs）含有の吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織であって、
前記組織が向上した抗炎症特性と、向上した組織の修復能力を有し、なぜなら前記組織が、
−例えば腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）のような、炎症性サイトカインの発現を除去し、
−天然阻害剤TSG-6及びインターロイキン１５の発現がかなり高められ、
−レプチンの発現がかなり向上し、そして、
例えば多能性遺伝子（SOX2、OCT4、Nanog）やβ-チューブリンIII遺伝子の発現やTSG6やｍRNAのように、幹細胞性を形成するパラメータが増加していることを特徴とする脂肪組織。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で得られたことを特徴とする吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織（ADSCs）に含まれる間葉系幹細胞であって、
前記細胞が向上した抗炎症特性と、向上した組織の修復能力を有し、なぜなら前記組織が、
−例えば腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）のような、炎症性サイトカインの発現を除去し、
−天然阻害剤TSG-6及びインターロイキン１５の発現がかなり高められ、
−レプチンの発現がかなり向上し、そして、
例えば多能性遺伝子（SOX2、OCT4、Nanog）やβ-チューブリンIII遺伝子の発現やTSG6やｍRNAのように、幹細胞性を形成するパラメータが増加していることを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で得られたことを特徴とする間葉系幹細胞（MSCs）含有の吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織であって、
前記組織が向上した抗炎症特性と、向上した組織の修復能力を有し、なぜなら前記組織が、
−例えば腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）のような、炎症性サイトカインの発現を除去し、
−天然阻害剤TSG-6及びインターロイキン１５の発現がかなり高められ、
−レプチンの発現がかなり向上し、そして、
例えば多能性遺伝子（SOX2、OCT4、Nanog）やβ-チューブリンIII遺伝子の発現やTSG6やｍRNAのように、幹細胞性を形成するパラメータが増加しており、
前記組織が薬として用いるためのものであることを特徴とする脂肪組織。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組織であって、運動と伝達の機能障害の治療に用いるためのものであることを特徴とする組織。
【請求項１４】
請求項１２に記載の組織であって、パーキンソン病の治療に用いるためのものであることを特徴とする組織。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組織であって、脊髄損傷の治療に用いるためのものであることを特徴とする組織。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で得られたことを特徴とする吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織（ADSCs）に含まれる間葉系幹細胞であって、
前記細胞が向上した抗炎症特性と、向上した組織の修復能力を有し、なぜなら前記細胞が、
−例えば腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）のような、炎症性サイトカインの発現を除去し、
−天然阻害剤TSG-6及びインターロイキン１５の発現がかなり高められ、
−レプチンの発現がかなり向上し、そして、
例えば多能性遺伝子（SOX2、OCT4、Nanog）やβ-チューブリンIII遺伝子の発現やTSG6やｍRNAのように、幹細胞性を形成するパラメータが増加しており、
前記細胞が薬として用いるためのものであることを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の間葉系幹細胞であって、運動と伝達の機能障害の治療に用いるためのものであることを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載の間葉系幹細胞であって、パーキンソン病の治療に用いるためのものであることを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項１９】
請求項１６に記載の間葉系幹細胞であって、脊髄損傷の治療に用いるためのものであることを特徴とする間葉系幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells；MSCs）を含む組織の抗炎症特性の促進と修復能力の向上のための方法に関し、該方法で得られた組織と間葉系幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性欠陥、加齢、病気、又はその破壊に起因する欠陥のある生物学的機能及び／又は構造の修復、置換、又は回復ができる組織を準備することが知られている（Haseltine、２００３；Gutmannら、２００５；Greenwoodら、２００６）。
【０００３】
間葉系幹細胞（MSCs）は、複数の効能がある細胞（multi-potent cells）であって、自己再生能力があり、体外で骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞を備えた間葉起源細胞に分化でき、体外で例えば骨、脂肪、軟骨、及び筋肉のような組織を生じさせることができる（Pittengerら、１９９９）。最近の研究では、組織再生能力を人間の脂肪組織由来の間葉系幹細胞（いわゆるhADSCs）を用いて向上させることができることが証明された（Gimbleら、２０１１）。
【０００４】
間葉系幹細胞の数は、脂肪組織のほうが例えば骨髄のような他の組織より大幅に多いと思われる（Biebackら、２００４）。
【０００５】
脂肪組織の自家移植は、組織への幾つかの損傷を修復するために用いられる周知の治療手段である。
【０００６】
また、幾つかの最近の出版物では、人間の脂肪由来の幹細胞（hADSCs）が適切な刺激によって、例えば神経細胞、心筋細胞、膵臓細胞のような異なる種類の細胞に分化可能であり（Schafferら、２００７；Stremら、２００５）、脈管形成（Madonnaら、２００９）や骨形成（Shenaqら、２０１０）、及びニューロン修復モデル（Wakabayashiら、２０１０）に臨床的可能性を有することが開示されている。
【０００７】
機械的力が生体組織の柔軟性にとって非常に重要であることも既知であり、胚形成、組織改造、及び細胞の有糸分裂と運動性挙動の間に発生する（Vogelら、２００６）。
【０００８】
細胞は、外から加えられた力や、細胞のマトリックスや細胞間接触に作用する力を把握し、反応する。
【０００９】
ストレッチ、成長因子、細胞骨格のストランド、細胞外マトリックス、接着斑、及びチロシンキナーゼによって活性化されたイオンチャネルは、機械的刺激の細胞内生化学的信号への変換に関わっており（機械的信号伝達）、下流のイベントを引き起こし、従って細胞の核の運命に対する主要メッセージを導く（El Hajら、１９９９；Naら、２００８；Walkerら、２０００；Venkatesan Iyerら、２０１２；Chenら、２０１３）。
【００１０】
再生医療における重要な課題は、幹細胞の最小限の操作であって、細胞療法における特定の細胞株への容易な変形である。
【００１１】
「最小限の操作」とは、再構築、修復、又は置換のための組織の有用性に関する、組織のオリジナルの関連する特徴を変更しないような処理を意味する（www.ema.europe.eu；www.fda.gov）。
【００１２】
規制機関（FDAとEMA）及び国際幹細胞学会（ISSCR）は、臨床応用を対象とした細胞の１つ以上の「最小限の操作」がある場合、又は、細胞の使用目的が体内での通常の機能と異なる場合は、細胞療法は薬物として考えられるべきである、と述べている（www.ema.europe.eu；www.fda.gov；Hyunら、２００８）。
【００１３】
患者保護がこのようなルールの核心である、と規制機関は述べている。すべての薬物に対して、同じ安全と有効性のルールの適用に加えて、細胞に基づいた製品の品質と生産は、製造管理および品質管理に関する基準（GMP）の要件を満たす必要がある（declared）。生産の品質を保証するためと薬物を管理するために、一般的に認められた基準が存在する。このような細胞に基づく薬物のすべての利用は、それらの製造手順を含む許可と管理に従う（www.ema.europe.eu；www.fda.gov）。規制機関によれば、体外での細胞培養では、許容できるものとして、分離した細胞の成長と操作を保証するために、これらのルールを考慮することが必要である。処理ステップは、細胞の完全性を保ち機能を制御するために、適正に設計される。すべての操作手順は、特定の工程管理に従って、詳細に文書化され、厳重に監視される。細胞培養の継続時間と細胞通過の最大数は、明確に特定され、正当性が立証される。確立された細胞株と派生した細胞クローンの、主要な細胞培養の関連する遺伝子型と遺伝表現型の特性は明らかにされ、培養寿命に関するそれらの安定性が求められる。細胞培養プロセスの一貫性と再現性が立証され、培地と継続時間を含む培養条件が、意図した細胞の臨床用機能に関し最適化される。このような理由から、再生医療に適用される幹細胞の研究は「最小限の操作」という主概念を忠実に守らねばならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
高齢化に伴って、パーキンソン病の取扱いが、神経科医や一般医にとって、医療行為のますます重要かつ厳しい状況になっていることも知られている。
【００１５】
パーキンソン病（PD）は、一般的な神経変性疾患で、シヌクレイノパチー（synucleinopathy）であり、西欧で罹患率が１６０／１０００００ユニットであり、８０歳以上の人口の約４％までが含まれる。
【００１６】
病気の原因の理解は、最近１０年の間に進み、例えば幹細胞からドーパミンを生成する細胞の創出において重要な進展が得られた。
【００１７】
本発明の一般的目的は、非常にシンプルで安価でとりわけ実用的な方法で、例えば脂肪吸引によって取り除いた脂肪細胞を分子レベル及び細胞レベルで活性化することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、組織の化学的消化なしで、細胞の、特に脂肪組織由来の間葉系幹細胞の最小限の操作を行うことである。
【００１９】
本発明のまた別の目的は、脂肪組織の炎症状態を変化させ、具体的には抗炎症性を引き起こすことと、例えば脂肪吸引で得られたヒト脂肪組織において例えばTNF-α（腫瘍壊死因子アルファ）のような炎症性サイトカインの生成を抑制することと、治療目的でヒト脂肪組織から得られた間葉系幹細胞（hADSCsと称す）を用いて最小限の操作手順で組織修復能力を向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記目的を考慮して、本発明によれば、付属の主請求項と従属請求項に開示された特徴を有する、抗炎症特性の促進と、間葉系幹細胞（MSCs）含有組織の修復能力の向上のための方法と、該方法で得られた脂肪組織と、前記組織に由来する間葉系幹細胞とを提供する。
【００２１】
本発明によれば、この方法は軌道揺動力を吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織に加えることで実施される機械的活性化ステップを少なくとも１つ備える。
【００２２】
本発明によれば、吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織に加える軌道揺動力が４０〜１２０×gの強度範囲を有する。
【００２３】
好ましい実施例では、このような加える力は９７×gに等しい強度を有する。
【００２４】
この力は、３〜２０分の時間範囲で加えられる。
【００２５】
例えば、この力は１０分間加えられる。
【００２６】
人体又は動物の身体から脂肪吸引又は何らかの既知の技術で取り除いた脂肪組織であって、適切な容器に収容されたものに力を加えることが可能であり、ただ一度又はこの力を２回以上繰り返すことも可能である。
【００２７】
各繰り返しの間、力の強度と持続時間はそれぞれ同じにすることも異なるようにすることもできる。
【００２８】
本発明に係る方法は、新鮮な脂肪組織にも、凍結保存組織にも適用できる。
【００２９】
容量は５００ｍｌ以下で、内側には身体から脂肪吸引又は取り除いた脂肪組織を収容した使い捨ての消毒した容器を備え、軌道運動するモータからなる装置によって、身体から脂肪吸引又は取り除いた脂肪組織に軌道揺動力を加えることができる。
【００３０】
本発明は該方法で得られた組織と、該組織から得られた幹細胞にも関し、前記前記吸引脂肪組織又は身体から取り除いた脂肪組織（hADSCs）に含まれる間葉系幹細胞を分離して広げるステップをさらに備える。
【００３１】
具体的には脂肪組織と本発明の方法で得られた間葉系幹細胞は、向上した抗炎症性と向上した修復能を有し、なぜなら該組織と間葉系幹細胞において、
−例えば腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）のような、炎症性サイトカインの発現を除去し、
−天然阻害剤TSG-6及びインターロイキン１５の発現がかなり高められ、
−レプチンの発現がかなり向上し、そして、
例えば多能性遺伝子（SOX2、OCT4、Nanog）やβ-チューブリンIII遺伝子の発現やTSG6やｍRNAのように、幹細胞性を形成するパラメータが増加しているからである。
【００３２】
除去され、容器内に保存され、軌道揺動にさらされた、機械的に活性化した脂肪細胞は、構造的な観点から、生検で得られた組織と完全に類似している。
【００３３】
本発明の目的は、細胞療法において該組織と間葉系幹細胞を使用することでもある。
【００３４】
具体的には、しかし限定するものではないが、脂肪組織に存在する幹細胞、例えば上記１つ以上の特徴と実施例に係る方法で活性化された間葉系幹細胞は、脊髄の内因性幹細胞の活性化に用いられる。
【００３５】
本発明の特徴と長所は、実験結果を示した付属の図面を参照して、以下の詳細な説明の検討から、より明確で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】脂肪吸引した脂肪組織及び本発明に係る機械的活性化後の脂肪吸引した脂肪組織におけるサイトカインの差次的発現を示す。TSG6は、３分間の刺激後にすでに観察可能になり、６〜１０分以内に最大発現を得た。TNF-αは６分間で抑制された。
【図１Ｂ】脂肪吸引した脂肪組織及び本発明に係る機械的活性化後の脂肪吸引した脂肪組織におけるサイトカインの差次的発現を示す。TSG6は、３分間の刺激後にすでに観察可能になり、６〜１０分以内に最大発現を得た。TNF-αは６分間で抑制された。
【図１Ｃ】脂肪吸引した脂肪組織及び本発明に係る機械的活性化後の脂肪吸引した脂肪組織におけるサイトカインの差次的発現を示す。TSG6は、３分間の刺激後にすでに観察可能になり、６〜１０分以内に最大発現を得た。TNF-αは６分間で抑制された。
【図１Ｄ】このような効果が凍結保存脂肪組織でも観察されたことを示す。TQ=time 0、PZA=患者A、PZB=患者B、TNF-α＝腫瘍壊死因子アルファ、LEPT=レプチン、IL15=インターロイキン１５。
【図２】図２は、多能性遺伝子（SOX2、OCT4、Nanog）やβ-チューブリンIII遺伝子、TSG6の発現を示す。実時間RT PCRでテストされ、脂肪吸引し、本発明の方法で機械的に活性化（１０分間）したヒト脂肪組織の生検からサンプルした。研究された遺伝子はすべて、通常の生検組織内でほとんど活性化しておらず、つまり本発明（生検）に係る未処理組織であって、脂肪吸引後に既知のコールマン手順によってわずかに活性化されている。それとは異なり、１０分間の本発明に係る特定の活性化後に、上方調節が比較にならないほど高くなっている。
【図３】図３は、多能性遺伝子のｍRNAの発現レベルの実時間定量的PCT測定結果をしめす。TQ=time 0、PZA=患者A、PZB=患者。
【図４】図４は、脂肪組織への機械的な力の付加が、SOX2及びHuRの特定の遺伝子のプロンプタとの相互作用を修正する様子を示す（bTUBIII=β-チューブリンIII、TSG6、IL15=インターロイキン１５、TNF-α=腫瘍壊死因子アルファ）。
【図５】図５Aと図５Bは、本発明に係る軌道揺動（それぞれ６分間と１０分間）の処理で脂肪組織から得られたhADSCsの生体内での形態（morphology）を示す。
【図６】図６Aと図６Bは、本発明に係る軌道揺動の機械的処理で脂肪組織から得られたhADSCsにおけるβ-チューブリンIII（TUJ 1）とビメンチンの発現を示す。
【図７】図７は、９７×gの力、TQ=time 0で処理又は未処理の脂肪組織から得られた間葉系幹細胞における間葉マーカーの発現のFACS解析を示す。
【図８】図８Aと図８Bは、本発明に係る機械的力で処理された脂肪組織から得られたhADSCs（２〜９継代）における変化しない核型の解析を示す。顕微鏡写真はhADSCsの１つのケースに関連し、及び他の３つのケースに同じ解析が実施されたものを示す。PZ59=患者５９。
【図９】図９は、２１日間ニューロスフェア培地内で培養した後に本発明に係る機械的に活性化した脂肪組織に由来するhADSCsによって形成された球状体を示す。NPCs=成人したネズミの神経前駆細胞。
【図１０】図１０は、９７×gの力で処理して脂肪組織から単離した間葉幹細胞（hADSCs）においてSOX2が特定の遺伝子（bTUBIII=β-チューブリンIII、TSG6、IL15=インターロイキン１５、TNF-α=腫瘍壊死因子アルファ）のプロモータと相互作用している様子を示す。
【図１１】図１１は、本発明に係る機械的に活性化した脂肪組織（hADSCs）から単離した間葉系幹細胞（MSCs）が、THP1細胞からのIL-1βの放出を低減できることを示す。LPS=細菌性リポ多糖内毒素
【図１２】図１２は、本発明に係る機械的に活性化した脂肪組織から単離したhADSCsが、脂肪吸引（LS）からのものとは異なり、LPS媒介増加分を有するTHP1細胞からのIL-1βの放出を効果的に低減することを示す。
【図１３】図１３は、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインのｍRNAのレベルを示す。実験は実時間RT-PCRによって実施された。結果は、実時間RT-PCRの２つの異なる実験の平均である。機械的に活性化した脂肪組織からのhADSCsは、炎症性サイトカインのIL1αとTNF-α＝腫瘍壊死因子アルファをノックダウンし、TSG6を増加させた。
【図１４】図１４は、前肢を使用した場合エラーパーセンテージの評価を示す。このデータは、水平グリッドテストを用いて得られた。本発明に係る方法で得られたhADSCsは、移植後のパーキンソン病の動物モデルのエラーパーセンテージを減少させた。
【図１５】図１５は、垂直グリッドテストにおける垂直グリッドのトップから降りるのに必要な時間の評価を示す。MPTP処理したマウスは、頭を下げて垂直グリッドを降りるのにより長い時間を要した。本発明に係る方法で得られたhADSCsの線条体内への注入によって、時間は大幅に減少した。
【図１６】図１６A〜１６Dは、マウスの脳の領域におけるlnaRNA-COX2の発現を示す。MPTPで誘発したパーキンソン病のマウスに本発明に係る方法で得られたhADSCsの線条体内への注入後４日間、発現が観察された。MPTPは大脳皮質と線条体（MPTP誘発パーキンソン病に関連する領域）においてLinc-COX2の出現を生じさせ、これは本発明に係る活性化された脂肪組織からの間葉幹細胞でマウスを線条体内処理することで除去された。これは、手足の機能の向上に関連する。
【図１７】健康なマウス（NT）と、パーキンソン病を患っているマウス（MPTP）と、本発明の方法で得られたhADSCsで処理されたパーキンソン病のマウス（MPTP＋MSCs）における、脳内のLnRNA-COX2の位置を示す。解析は、hADSCsの線条体内への注入後４日間、実施された。LnRNA-COX2は緑色、hADSCsは赤色で示す（PKH26でマークした）。
【図１８】パーキンソン病を患っているマウス（MPTP）と、本発明の方法で得られたhADSCsで処理されたパーキンソン病のマウス（MPTP＋MSCs）のIL-6 mRNAの発現を示す。解析はhADSCsの線条体内への注入後４日間、実施され、IL-6のノックダウンが示された。
【図１９】図１９Aと図１９Bは、MPTP処理と、LPS-活性化した初代ミクログリア細胞を示す。
【図２０】図２０は、培養液中のLPSとMPTPで処理したミクログリアのIL6 mRNA、lnRNA COX2、及びln RNA CCND1（負の制御として使用）の実時間RT-PCRを示す。活性化された脂肪（SUP）から得られたhADSC細胞に晒された培地は、IL-6とLn-Cox2の生成をノックダウンした。
【図２１】図２１A〜図２１Cは、外傷から４８時間での脊髄における本発明の組織によってノックダウンされたサイトカインの消炎作用を示す。
【図２２】図２２は、脊髄損傷したマウスの生理食塩水処理と比較した、脂肪吸引した脂肪組織（LS）の移植と、本発明に係る機械的に活性化した脂肪組織（MALS）の移植とによる、後肢の機能回復（BMSスケール）を示す。MALSは漸進的な著しい機能回復を促進する。
【図２３】図２３は、損傷した脊髄への本発明に係る機械的に活性化した脂肪組織の移植を示す。
【図２４】７０Kdyneでの外傷の治療であって、図２４ａは治療無しのNestinの発現制御を示し、図２４ｂは７０Kdyneでの打撲傷、図２４ｃは７０Kdyneでの打撲傷＋LS、図２４ｄは７０Kdyneでの打撲傷＋MALSをそれぞれ示す。
【図２５】図２５ａ〜図２５ｄは、MALSの応用である活性化した脂肪細胞によって活性化された上衣幹細胞の拡大詳細図である。
【図２６】MALSによる活性化から４週間後の状況を示す。
【図２７】図２７ａ〜図２７ｃは、MALSによって活性化された上衣幹細胞の移動による損傷した脊髄の灰白質における新しい神経細胞の形成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の方法は、人体から除去した脂肪組織、具体的にはその中に存在する間葉系幹細胞を機械的に活性化することを可能にする。
【００３８】
既知の技術の１つによれば、本発明に係る方法で処理される脂肪組織は、局所麻酔下で選択的脂肪吸引手術によって得ることができる。
【００３９】
最終生成物を、脂肪吸引された脂肪組織（lipoaspirate）と称す。
【００４０】
明らかに、脂肪組織を抽出するために他の手順（procedures）も用いることができる。
【００４１】
本詳細な説明では、ヒト脂肪組織について申し述べるが、明らかに本発明の方法は動物の脂肪組織にも適用できる。
【００４２】
１つの手順の例は浸潤ステップを含み、そこでは血管収縮剤エピネフリン（２mg/ml）を含有した生理食塩水が脂肪組織に注入されて、末梢血液細胞による血液損失と組織の汚れを最小化する。
【００４３】
本発明の１つの実施例によれば、機械的活性化のために、１０mlの洗浄した脂肪吸引された脂肪組織が５０mlのチューブ内に採取され、９７×gに等しい力で室温で３，６，１０，及び２０分間の異なる時間だけ軌道揺動を受けた。
【００４４】
本発明によれば、脂肪組織、具体的には間葉系幹細胞を含むヒト脂肪組織の抗炎症性は、特定の力（強度）と継続時間を有する特定の運動を加えることで活性化できる。
【００４５】
脂肪組織の蓄積が実際に炎症過程と見なされることを考えて、炎症性因子や抗炎症性因子は同じグループの患者から得られた脂肪吸引された脂肪組織で、様々な時間量に対し特定の機械的な力にさらされて評価された。
【００４６】
非処理の脂肪吸引された脂肪は、対照群（control）として用いられた。
【００４７】
例えば図１に示すように、タンパク質TSG6は3分間の刺激後にすでに観察可能になり、６〜１０分間で最大発現を有し、TNF-αは６分間で抑制された。
【００４８】
実験結果は、９７×g（×gは地球の重力の倍数を示す）の力を加えると：
−例えば腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）のような炎症性サイトカインの脂肪組織の発現を除外し、
−その天然阻害剤であり、処理した組織ではない通常の脂肪組織で限界レベルで存在するTSG6とインターロイキン１５を大幅に増進し、
−脂肪が作り出す食物への要求の抑制遺伝子であるレプチンの発現を大幅に向上させる。
【００４９】
このレプチンの向上した発現は、該力が生体内の身体の表面にも加えることができ、そこで該ホルモンが重要な役割を果たしていることを証明している。
【００５０】
図１を参照して、データは以下のことを示している：
−TSG6の最大発現には９７×gの力での６〜１０分間の機械的活性化で達し（図１ｂ）、
−TNF-αの生成は、同じ条件において６分間で抑制される（図１ｃ）。
【００５１】
また、β-チューブリンIIIの最大発現は９７×gの力での機械的活性化で２０分以内に達している。
【００５２】
より小さな力は、より有効ではない。
【００５３】
本発明によれば、脂肪吸引された脂肪組織の抗炎症性の促進と修復能の向上を得るために、４０〜１２０×gの範囲の強度の力を加えることができる。
【００５４】
抗炎症性プロセスの機械的活性化は、脂肪組織を−８０℃で数カ月凍結保存した場合でさえ有効であり、例えば図１Dに示す。
【００５５】
凍結保存されていた脂肪組織に９７×gの力を３分間加えると、新鮮な細胞のように、TNF-αがキャンセルされる一方で、TSG6とレプチンが大幅に増加した。
【００５６】
シンプルな脂肪吸引手順は、ソフトな機械的活性化を生み出し、それは幾つかの多機能性関連遺伝子（SOX2、OCT4、Nanog）と、β-チューブリンIIIと、TSG6、ｍRNAの発現として実時間RT-PCRを用いて観測された。
【００５７】
生検によるヒト脂肪組織と、脂肪吸引したヒト脂肪組織と、脂肪吸引したヒト脂肪組織を機械的に活性化した（１０分間）ものと、から得られた結果を図２に示す。
【００５８】
図２は、ヒト脂肪組織の生検と、脂肪吸引したヒト脂肪組織と、脂肪吸引したヒト脂肪組織を本発明の方法で機械的に活性化した（１０分間）サンプルにおける、実時間RT-PCRによりテストした、多機能性遺伝子（SOX2、OCT4、Nanog）と、β-チューブリンIIIと、TSG6の発現を示す。すべての調査された遺伝子は、通常の生検による組織でほとんど活性化されていないもの、即ち本発明に係る方法で処理されていないもの（生検）と、既知のコールマン手順によってわずかに活性化されているもの（脂肪吸引）と、これらとは別に本発明の方法で機械的に活性化されたもの（機械的活性化１０分間）では、上方調節が比較にならないほど高くなっている。
【００５９】
すべての調査された遺伝子は、通常の生検による組織でほとんど活性化されていないもの、本発明に係る機械的な操作を行っていないものと、脂肪吸引後に既知のコールマン手順によってわずかに活性化されているもの（脂肪吸引）である。しかし、ここに説明されクレームされている特定の機械的な力の１０分間の付加によって、比較にならないほどより高い上方調節が生じている。
【００６０】
多機能性調節遺伝子SOX2、NANOG、及びOCT4は、９７×gの力で６分間の機械的活性化により完全に活性化される。
【００６１】
従って、抗炎症性に加えて、脂肪組織に存在する間葉系幹細胞の幹細胞性を形成するパラメータも、力と時間に無関係な態様で、機械的活性化によって増加する（図３）。
【００６２】
SOX2は胚幹細胞及び神経幹細胞の維持において決定的な役割を有することが知られている。
【００６３】
SOX2は、胚幹細胞の多機能性と自己再生に必須であるだけでなく、体性幹細胞においてすぐれた展開と分化能力も発現する（Vaiら、２００８）ことも知られている（Goら、２００８）。
【００６４】
SOX2は、DNA結合のためのHMGボックスを含有した転写因子（34kDa）であり、一定数の遺伝子の発現を制御するOCT4と三量体複合体を形成する。
【００６５】
本発明によれば、脂肪組織の特定の機械的活性化は直接、上述のサイトカインをコードする異なる遺伝子のプロモータの領域にある転写因子SOX2に導かれた遺伝子発現を調整する。
【００６６】
また、免疫沈降したSOX2のChip-Seqは、膠芽腫細胞又はES細胞におけるプロモータIL-6上のSOX2の高い結合効率を示す。β-チューブリンIII、TSG6、TNF-α、IL1B、IL10、IL15、及びレプチンの-3000bpプロモータ領域が、コンピュータ内（in silico）で解析され、SOX2の共通配列がサーチされた。そして、ChIP（クロマチン免疫沈降）テストが、液相での転写因子の結合を検出するために設計された。ChIPテストは、SOX2とHuRがβ-チューブリンIII、IL15、及びTSG6のプロモータ領域と結合し、９７×gの力の機械的付加がこのような相互作用を異なる態様で調整することを示した（図４）。
【００６７】
SOX2は上述の力を２０分間加えた後には、もはやβ-チューブリンIIIプロモータと結合しない。従って、β-チューブリンIIIの転写は向上する。
【００６８】
TSG6の向上した転写は、HuRバインダの損失により調整される一方で、IL15は同様にSOX2やHuRとは異なる他の因子によって調整される。
【００６９】
脂肪組織からの幹細胞は、コールマンマイクロカニューレによる腫瘍性の局所麻酔の下でのマイクロ脂肪吸引によって採取されたヒト脂肪から浄化して得られた。
【００７０】
脂肪組織を除去するための他の手順も用いることができることは明らかである。
【００７１】
この手順に従って脂肪吸引された脂肪細胞は、無菌クローズドシステム内で遠心分離され、そのペレットは37℃で１時間半の間、コラゲナーゼ消化される。
【００７２】
その消化物は成熟脂肪細胞の浮遊群を間質血管断片（SVF）から分離するために遠心分離される。
【００７３】
標準培地（１０％ウシ胎児で補充したダルベッコ変法イーグル培地）内で２４時間の平板培養（plating）の後、非接着性細胞は取り除かれた。
【００７４】
プラスチック接着性細胞群は、脂肪組織由来の間質細胞（ADSCs）を形成する。
【００７５】
９７×gの力にさらされた脂肪組織から始めて、酵素処理を回避してhADSCs（ヒト細胞由来の幹細胞）の分離と展開が再現可能な有効な方法が、Matsumotoら、２００７とPerrini S.ら、２０１３に記載の方法を改変することで開発された。
【００７６】
脂肪吸引され９７×gの力で処理された脂肪組織が、完全に培地で満たされた２５cm2の培養フラスコ（NUNC、Roskilde、Denmark）に置かれた。
【００７７】
２週間の培養の後、脂肪組織は取り除かれ、フラスコは上下逆に返され、細胞は培地内に保持される。
【００７８】
細胞は３０日間で９０％の合流状態（confluence）に達した。
【００７９】
細胞の歩留まりは、２mlの機械的に処理された脂肪組織を含有する各プレートあたり約５．５〜６×１０５細胞数であった。
【００８０】
これらの細胞の体外での形態（EVOS（登録商標）電子顕微鏡、AMG社、米国により撮影）は、従来法によって得られた細胞と比較して線維芽細胞状の表現型を示した（図５Aと図５B）。
【００８１】
このような間葉系幹細胞は、β-チューブリンIII（TUJI）やビメンチンの典型的発現を有する（図６）。
【００８２】
上述の手順で分離されたhADSCs細胞（ヒト脂肪由来の幹細胞）は、FACS解析に係る間葉マーカーを表現し（図７）、既知の一般的な間葉マーカー（例えばCD44、CD37、CD90、CD166）に対し高い値（９０〜１００％）を示し、内皮組織（CD31、CD34、CD144、CD146、KDR）に対し平均的な値を示し、造血組織（CD45、CD133、CD56）に対し最小表現を示した（図７）。これは、これらの細胞が内皮の運命にもさらされていることを示唆している。
【００８３】
本発明に係る機械的に活性化した脂肪細胞から得られたhADSCsの染色体安定性を研究するために、QFQ結合が実施された。細胞は何ら染色体再配置を示さず、染色体数は通常で、培養内９継代（passages）であった（図８A、図８B）。
【００８４】
スフェロイド（spheroids）の生成は通常は神経幹細胞に限定されているが、ここでは本発明に係る活性化した脂肪からのhADSCsも神経幹細胞塊（neurospheres）を形成することが実証された。
【００８５】
hADSCs（ヒト脂肪由来の幹細胞）は、通常神経幹細胞塊を形成するために用いられる血清を含まない培地で培養された（Grittiら、２００２）。
【００８６】
球状体（spheres）を形成するテストが、５×１０３/cm2の平板培養で実施された。本発明に係る機械的に活性化した脂肪細胞から得られたhADSCsの約５０％が、２１培養日で平均直径１００μｍに達する大きな球状体を形成した（図９）。
【００８７】
機械的に活性化した脂肪細胞から得られたhADSCsの約５０％が、２１培養日で平均直径１００μｍに達する大きな球状体を形成し、平均１００．９５±１０．８９個/cm2の球状体数を２１培養日以内に形成した（図９）。
【００８８】
脳室下帯から得た大人のネズミの神経前駆細胞（NPCs）を陽性対照（positive control）として用いた。この場合、球状体の形成は明らかにより高くなった（図９）。
【００８９】
上述のサイトカインの通常発現へのSOX2の含有は、９７×gの力で処理された脂肪組織から分離した細胞内でも研究された。
【００９０】
チップの分析結果は、SOX2がβ-チューブリンIII、IL15、及びTSG6の促進領域（promoting region）と結合することを示している（図１０）。このように、生体内での活性化は、本発明の方法に由来したhADSCsでも維持される。
【００９１】
最近のレポートでは、MSCs（間葉系幹細胞）が炎症を調節できることを示唆している（Prockopら、２０１３）。
【００９２】
THP1は、形態と分化特性において原始的な単球（primary monocytes）やマクロファージに類似した区別できる単球を備えた、丸い単細胞懸濁液のカテゴリーである（Tsuchiyaら、１９８０）。
【００９３】
インターロイキン１βは、炎症及び免疫反応の強力なメディエータで、主に活性化単球によって生成される（Dinarello  １９９４）。
【００９４】
単球の細菌性リポ多糖内毒素（LPS）による刺激は、pro-IL-1遺伝子の活性化によるIL-1βの生成と、pro-IL-1β mRNAの発現と、以下のpro-IL-1βメッセージの翻訳を引き起こす。
【００９５】
pro-IL-1βはシステイン・プロテアーゼインターロイキン−１変換酵素の熟成した生物学的に活性なIL-1βに処理される（Kosturaら、１９８９）。
【００９６】
機械的に活性化した脂肪組織から得られたhADSCsの消炎作用が、LPSと共に活性化されたTHP1細胞（１０マイクログラム／ｍｌ、３時間）での共培養テストで評価された（trans-well登録商標）。
【００９７】
図１１に示すように、IL-1βの放出はLPSでの刺激から３時間後に最大となり、機械的に活性化した脂肪組織から得られたhADSCsの存在は、ケモカインの分泌を大幅に低減する（図１１）。
【００９８】
LPSで活性化されたTHP1単球（１０マイクログラム／ｍｌ、３時間）からのIL-1βの放出反応に基づく類似の実験（CTRL+）が実施され、活性化した脂肪組織から得られたhADSCsの作用（cell 10）が、脂肪吸引された脂肪組織からのもの（LS）と比較された。
【００９９】
図１２は、THP1がIL-1βを放出し、このような放出はLPSの添加によって２倍になることを示す。IL-1β放出の増加は、本発明に係る機械的に活性化した脂肪組織由来の間葉系幹細胞によって除外される一方で、脂肪吸引された脂肪組織からのものは、ほとんど影響を及ぼさない（図１２）。
【０１００】
本発明に係る機械的に活性化した脂肪組織からのhADSCsの消炎作用も、以下に示す実験から浮き彫りにされた。
【０１０１】
LPSによって活性化された単球（THP1 + LPS）が、脂肪吸引された脂肪（LS）由来の幹細胞も存在する下で高いレベルの炎症性サイトカインを示すことを図１３に示す。このようなレベルは、本発明に係る機械的に活性化した脂肪組織から得られたhADSCsの存在の下で単球が培養されると、劇的に減少する（図１３）。本発明の方法によって活性化された脂肪組織由来のhADSCsによって、抗炎症性ペプチドTSG6の生成が強力に行われることも明示している。
【０１０２】
本発明は、本発明の方法によって機械的に活性化したヒト又は動物の脂肪組織から得られた間葉系幹細胞であるhADSCsを薬として用いることに関する。
【０１０３】
具体的には、ヒト及び動物の両方の細胞療法に適用される。
【０１０４】
本発明は、本発明の方法によって機械的に活性化したヒト又は動物の脂肪組織から得られた間葉系幹細胞であるhADSCsを、例えばパーキンソン病を患っている患者のような運動障害又は協調障害の治療に用いることにも関する。
【０１０５】
パーキンソン病モデルにおいて運動機能障害の回復が、水平及び垂直グリッドテスト（「水平グリッドテスト」及び「垂直グリッドテスト」）によって調査された。
【０１０６】
図１４のグラフは、MPTP暴露後にネズミの前肢と後肢の協調が迅速に失われることを示し、受傷後１０日目に細胞線条体内移植を実施すると、このような機能障害は統合される。
【０１０７】
移植後３日（第１３日）で、本発明の方法で得られたhADSCsは肢の協調において段階的改善をすでに生じさせ、前肢における動作エラーのパーセンテージの減少を示し、１０日後でMPTP動物では６０〜７０％であって、本発明の方法で機械的に活性化した脂肪組織から得られたhADSCs処理した動物では約２５％であった。
【０１０８】
これらの肯定的な結果は、「垂直グリッド」テストを実施することでも観察された。
【０１０９】
垂直グリッド上で回転したり登り降りしたりすることによって、controlに対してMPTP処理したマウスに相当により長い時間が検出された（図１５）。
【０１１０】
本発明に係る方法で機械的に処理した脂肪組織から得られたhADSCsで処理したマウスは、注入後３日ですでに改善を示した（図１５）。
【０１１１】
それに続く日々で、動物のパフォーマンスも相当に改善した。
【０１１２】
脳内の小グリア細胞、固有の自然免疫細胞は、神経変性病におけるニューロン損傷への積極的貢献に関係があることが知られており、そこでは小グリアの過剰活性化と異常調節が、悲惨な進行性神経毒という結果をもたらす。
【０１１３】
炎症は神経変性病とその関連する神経病理学の広範囲における基礎成分（base component）で、多くの証拠が小グリアがこのようなプロセスの原因となる鍵となる要因であることを示唆している。
【０１１４】
活性化した小グリアは、パーキンソン病を患った患者や他のパーキンソン病様疾患を患った患者の黒質の変性ニューロンの近くに存在する（McGeerら、１９８８、Langstonら、１９９９、Inamuraら、２００３）。
【０１１５】
このような病気における小グリアの活性化は、黒質に限定されず、果核、海馬、transentorhinal皮質、帯状皮質、及び側頭皮質でも見出される（Inamuraら、２００３）。
【０１１６】
黒質内のドーパミン作動性ニューロン（DA）の選択的損失は、多くの悪い出来事によるものであり、例えば、ドーパミン作動性ニューロンに対するグルタチオン枯渇（抗酸化作用の低減をもたらす）、黒質のニューロンにおける高含有量DA（酸化還元活性化分子）（Zigmundら、２００２）、高鉄分濃度（酸化還元活性エレメント）（Zeccaら、２００４）、及び、（他の領域に対して）黒質内での小グリアの増加（Lawsonら、１９９０）である。
【０１１７】
従って、黒質内のドーパミン作動性ニューロンは、不安定な酸化還元バランスと多くの小グリアとの共存によって非常に炎症による攻撃に対して弱い。
【０１１８】
本発明の方法で機械的に活性化した脂肪組織から得られたhADSCsのネズミへの移植は、ネズミの脳の遺伝子プロファイルを変化させる。
【０１１９】
具体的には、例えばlincRNA-Cox2のような、炎症過程に含まれる長いノンコーディングRNAの規則に効果が観察された（Gomezら、２０１３）。
【０１２０】
哺乳類ゲノム「ジャンクDNA」は、大きな遺伝子間non-coding RNAs (lincRNAs)のクラスを含む何千もの大きなnon-coding転写産物（transcripts）をエンコードする。それらのうちの幾つかは、Guttmanと貢献者によって生物学的役割が機能的に特徴付けられ、マウスのES細胞（ESCs）に発現するlincRNAsの機能消失の研究を実施し、遺伝子発現への効果を特徴付けている（Guttmanら、２０１１）。
【０１２１】
最近の研究で、哺乳類ゲノム（Birneyら、２００７、Guttmanら、２００９−２０１２）の数千の長いnon-coding RNAs (LncRNAs)が、異なる生物学的過程において遺伝子発現を調整することが判った（Guttmanら、２０１１）。リポ多糖（LPS）刺激に追従して、ウイルス感染細胞内で、及び樹枝状細胞内で、LncRNAsが異なって調整される。
【０１２２】
lincRNAs発現は、脳の異なる領域でRT-PCRによって研究された（MPTP誘導パーキンソン病の動物の皮質、線条体、海馬を、幹細胞注入後４日）。lincRNAsの発現はパーキンソン病のネズミに誘導され、その発現は、均質化された線条体上で実施されたRIP分析における免疫共沈降（RNA免疫沈降）で示されたように、HuRの存在と関係がありそうだった。
【０１２３】
lncRNA-COX2の発現は、本発明の方法で機械的に活性化した脂肪組織から得られたhADSCsの線条体内注入によって大幅に下方制御される（MPTP/MSC；図１６A〜１６D）。lncRNA-COX2の下方制御は、たとえば行動試験に見られるように、動物の機能回復に厳密に関連している（図１６A〜１６D）。
【０１２４】
lncRNA-COX2の発現は、FISH（蛍光インシトゥハイブリデーション法）によっても研究され（図１７）、これは細胞、循環がん細胞、及び組織サンプル内の特定のRNAターゲット（mRNA, IncRNA 及びmiRNA）を検出し局在化することが可能なアプローチである。
【０１２５】
近年、linRNA-COX2がそのプロモータに作用することで、IL-6の発現を上方制御することが実証された（Carpenterら、２０１３）。
【０１２６】
IL-6 mRNAの発現レベルが、パーキンソン病を患ったマウスと、パーキンソン病に冒され本発明のhADSCsによって処置されたマウスの大脳領域への実時間RT-PCRによって研究された。
【０１２７】
図１８にも示すように、IL-6の発現は相当に増加し、本発明のhADSCsの線条体内注入によって大きく反対した。
【０１２８】
レシピエント（受容者）の損傷した脳への移植後にhADSCsがlincRNA-COX2の発現を下方制御し、回復プロセスへ導く機構が研究されてきた。
【０１２９】
lincRNA-COX2が、MPTPで活性化した当初グリア（primary glia）への体外実験で研究されてきた。
【０１３０】
lnc-RNA-COX2の発現がRT-PCRで研究されて、当初グリア培養のMPTP処理（３７℃３時間）によって誘導された。
【０１３１】
ポジティブGFAP細胞（即ちグリア細胞）内でlnc-RNA-COX2が発現すること、及び、その細胞の局在がHuR細胞分布に関連することがFISH解析で確認された。
【０１３２】
RNA結合タンパク質HuR/ELAVL1は、一定数のmRNAsの安定化と行先を決定して（dictating their fate）細胞質への変換を促進する金リッチエレメント（AREs）に結合する（D’Agostinoら、２０１３）。
【０１３３】
実施された実験は、HuRとの相互作用にはIBA1染色（staining）が示すように小グリアの活性化も必要と思われることを示す。
【０１３４】
IBA1はマクロファージ／小グリア内で特異的に発現したタンパク質であって、神経損傷、中枢神経系局所貧血、及び、幾つかの他の脳疾患に追従して小グリアにおいて上方制御される。MPTP又はLPSによるグリア細胞の３時間の初代培養は、特定のアンチIBA1抗体の染色を相当に高める（図１９A-B）。
【０１３５】
diidrotransione（DI）、細胞質の誤った局在化を導くHuR結合RNAsの阻害剤は、MPTP又はLPSによって処理された細胞のlnRNA-COX2下方制御を生じさせる（図１９A-B）。このような減少は、IL-6 mRNA増加の縮小に対応する（図１９A-B）。
【０１３６】
また、BAY11-7083処理、NFkBをブロックすることによる特定のlnRNA-COX2阻害剤は、IL-6 mRNAのレベルの増加に反対する。
【０１３７】
また、同じ実験条件で、小グリア細胞はhADSCs培養の上澄みと共に培養された。
【０１３８】
図２０に、機械的に活性化した脂肪由来のhADSCsで調節された上澄みが、MPTP又はLPSによって活性化された小グリア細胞においてlnRNA-COX2及び IL-6の発現に個別に反対することができることを示す。
【０１３９】
負の制御として用いられるサイクリンD1のプロモータに付託される長いノンコーディングRNAであるlnRNA CCND1の発現は、すべての実験条件において変化しなかった。
【０１４０】
脊椎損傷後の後肢の運動機能の回復は、機械的に活性化した脂肪組織（MALS）の移植後のネズミで観察された一方で、脂肪吸引された脂肪では効果がなかった（図２１，２２）。
【０１４１】
胸髄にレベルT9で７０Kdyneの力で１秒間ヒットした直径１ｍｍの衝撃部材による打撲傷が誘発する脊椎損傷は、後肢のまひを引き起こすがBMS（Basso Mouse Scale）において３ポイント以下で部分的に改善する。脂肪吸引された脂肪（LS）の移植は大幅な改善を生じさせないが、一方でMALSでの処置はBMSにおいて６ポイントを超える大幅な改善を生じさせる。９ポイントは正常な歩行を意味する。
【０１４２】
本発明の機械的に活性化した脂肪組織（MALS）は脊髄損傷の表面に付加されたが、そこで徐々に浸透する一方で損傷領域を満たし、脊髄損傷の２箇所を接合することで神経再生を許容する。
【０１４３】
機械的に活性化した脂肪組織（MALS）の消炎作用は迅速で、脊髄損傷における炎症性サイトカインの生成を抑制する。損傷から４８時間後に、脊髄損傷から放出された因子は、損傷部位における、及び、脊髄損傷の吻側と尾側の部分におけるIL-1αとIL-1βとIL-6の生成を下げる。
【０１４４】
以上述べたことと参照した図面から、記載され本発明でクレームされた強度と時間だけ軌道揺動力を加えることが、脂肪吸引又は他の手順で人体から取り出した脂肪組織に存在する間葉系幹細胞の抗炎症特性と幹特性（stem properties）を、細胞の最小限の操作で活性化できることは明らかである。
【０１４５】
従って、本発明の脂肪組織及び／又は幹細胞は、治療目的又は美容目的で用いることができ、細胞治療の際に薬として用いるために準備できる。
【０１４６】
本発明の方法によって得られた組織及び／又は間葉系幹細胞は、
−薬として用いることができ、
−運動機能障害及び協調性障害の治療のために用いることができ、
−パーキンソン病の治療のために用いることができ、
−脊髄損傷の治療のために用いることができる。
【０１４７】
具体的には、ここで記載しクレームした機械的に活性化した脂肪組織hADSCs由来の組織及び／又は間葉系幹細胞の移植は、例えばパーキンソン病を患った患者のような、移動性が消失又は低減した患者における運動機能障害の迅速な回復を促進できる。また、活性化した脂肪組織は、その抗炎症特性と、損傷部への浸透性と、神経再生の促進性によって、脊椎損傷後の運動機能回復の促進に非常に有効である。
【０１４８】
［実験手順］
（細胞培養）
機械的に活性化した脂肪組織の２ｍｌが、２０％ウシ胎仔血清（FBS, JRH Bioscience, Lenexa, KS, Lot 6G2146）で補充された「ダルベッコ改変イーグル培地」（DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA）として知られた培地で完全に満たされた２５ｃｍ２のフラスコに植菌され、５％CO2内、３７℃で培養された。フラスコを上下逆さまにして、細胞が浮かんでフラスコの内側天井面に付着するようにした。１５日後、培地と組織が取り除き、フラスコを上下逆さまにして、細胞が底面にくるようにした。細胞が合流状態に達するまで（３０日後に９０〜９５％）、４日毎に培地を置き換えた。
【０１４９】
（組織学的制御の分析と、機械的に処理した組織の脂肪吸引）
同一の被験者のサンプル上の新鮮な脂肪組織（機械的に処理したものと未処理のもの）に組織学的分析を実施した。簡潔に述べると、ホルマリンで固定したパラフィン包埋組織が、従来の組織病理学試験及び免疫組織化学のために処理された。ヘマトキシリンとエオシン（H&E）で染色した標準４μｍ厚の組織切片が、直接広視野光学顕微鏡で検査された。免疫組織化学のために、４パターンのサンプルが分割され（４μｍ厚）、脱パラフィン処理され、蒸留水にキシレンと段階的な濃度のエタノールで再水和処理された。次に、PBSでリンスされ、ブロッキング溶液（PBS＋１％V/Vウシ胎仔血清、室温で一時間）で処理され、４℃で一次抗体と共に一晩中培養された。一次抗体と共に処理した後、切片はPBSで洗われ、適切な二次抗体と共に培養された。内在性ペルオキシダーゼ活性は、蒸留水中の３％過酸化水素で急冷された。クロモゲン（DAKOエンビジョン検出キット）としての3,3'ジアミノベンジジン(DAB)で染色が実施された。制御決定に、一次抗体が省略され、同等の濃度の同じサブクラスの無関係のIgGで置換された。以下の一次抗体が用いられた：Vimentin (1:5000; Dako Cytomatic) ; S100 (1: 2000; Novocastra) ; β-チューブリンIII (1:6000; Covance) ; ヒトネスチン (1:2000; Millipore) ; Nanog (1:1000; Novus)。
【０１５０】
免疫蛍光研究のために、細胞はPBSで洗われ、パラホルムアルデヒド（PBS中に４％）で固定され、ブロッキング溶液で処理され、一次抗体アンチβ-チューブリンIII (1:6000; Covance)と共に4℃で一晩中培養された。
【０１５１】
一次抗体と共に処理した後、切片はPBSで洗われ、二次抗体（Alexa Fluor（登録商標） 555 goat anti-mouse 1 : 200 Molecular Probes（登録商標）, Invitrogen, Life Technologies Italia, Monza, Italy）と共に室温で2時間培養された。核はDAPI（Hoechst 1/1000）で染色され、FluorSave試薬 (Calbiochem, Merck Chemical, Darmstadt, Germany)を用いてマウントされ、免疫蛍光顕微鏡検査法(Leica 5500)で分析された。共焦点解析のための負のリファレンスとして、省略した一次抗体アンチβ-チューブリンIIIで染色した連続的切片を用い、それを同等の濃度の同じサブクラスの無関係のIgGで置換した。
【０１５２】
（RNAの抽出とqRT-PCR分析）
細胞のRNAは、製造元の指示に従ってTRI Reagent（登録商標）（Sigma-Aldrich , St. Luis, MO, USA）を用いて抽出した。RNAの純度と量は、Nanodrop (Fisher Scientific) (追加の分析にはA260/A280 1.8-2 が適切と考えられた)によって評価され、汚染の可能性のあるDNAは除去され、相補DNAはRNA１ｍｇから「大容量RNA-to- cDNA」キット(Applied Biosysterns, Foster City, CA, USA)を用いて準備された。
【０１５３】
（脂肪組織の遺伝子発現）
TRI Reagent（登録商標） (Sigma-Aldrich , St- Luis, MO, USA)を用いて抽出され、DNasi I - Rnasi free (Ambion inc. Foster City, CA, USA)で処理され、製造元が提案するように「high Capacity cDNA Reverse kit Transcription」 kit (Ambion Inc. Foster City, CA, USA)を用いて逆転写された全RNAの定量的結果が、実時間SYBR-Green assay (Euroclone spa Milano, ITALIA)によって得られた。差次的に発現された遺伝子が、不等分散でｔテスト上に有意の閾値を加えることで認識された。
【０１５４】
（脂肪組織上のチップ）
Haim et al . , 2013に記載のように、脂肪吸引された脂肪組織を機械的に処理したもの又はしなかったもの１０ｍｌに、クロマチン免疫沈降を実施した。
【０１５５】
（G-banding 核型分析）
細胞遺伝学的解析を、培地（αMEM）２ｍｌを含むペトリ皿の内側のカバースリップに直接hADSCsを植菌することによって「その場で」培養に実施した。細胞はColcemid (0.02 ml/ml) (Life Technologies a Carlsbad, California, United States of America) で９０分間、hypotonic solution (1:1 Na citrate 1%: NaCl 0,3%) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 及び 3:1 メタノール : 酢酸の固定液(VWR International Radnor, Pennsylvania, USA)で2回置換した。少なくとも２５の中期QFQ bandingが各サンプルで観察された。画像は蛍光顕微鏡(BX 60 Olympus)を用いて取得され、Powergene PSI システムで分析された。
【０１５６】
（球状体（spheroids）の形成）
機械的に活性化した脂肪組織由来のhADSCsがウシ胎仔血清（２０％）のα-MEM培地で培養され、継代1（passage 1）で85％の合流状態に達した。α-MEM培地は取り除かれ、細胞は滅菌PBSで２度洗われ、bFGF (20 ng/ml) と FEG (10 ng/ml) を含有し血清を含有しないニューロスフェア（neurospheres）の為の培地が加えられた (Gritti et al . , 2002)。
【０１５７】
（細胞培養THP-1培養細胞およびLPSでの活性化）
THP-1細胞（202-TIB; ATTC, Rockville, MD）が１５０ｃｍ２フラスコ内の１０％ウシ胎仔血清（FCS）と50 U/mLペニシリンと50 g/mLストレプトマイシンで補充されたRPMI 1640培地の懸濁液中で育てられた。細胞培養とすべての実験は、３７℃で5％のC02と95％の室内空気中で実行された。細胞を３日ごとに継代し、継代3と12との間を使用した。hADSCs細胞の抗炎症作用は、６つのプレート上でtrans-well（登録商標）培養システムで分析した。
【０１５８】
hADSCsはα-MEM培地内に1.5 / 104細胞／ウエル（well）の密度でウエルの下にプレートされた（plated）。それらの付着後２４時間でTHP-1細胞がそのウエルの上に密度７５×１０４細胞／ウエルで加えられた。IL-1βの放出を誘発するために、リポ多糖（LPS）が、10μｇ／ｍｌの最終濃度で投与された。３時間の培養後、上澄みを氷の中に収穫し、直ちに凍結した。IL-1βの放出は、免疫ブロット法により研究された。
【０１５９】
（パーキンソン病のための実験動物モデルおよび細胞注入）
MPTP（1-メチル-４-フェニル-1, 2,3,6-テトラヒドロピリジン）はMPP＋への神経毒の前駆体であって、脳の黒質におけるドーパミン作動性ニューロンを破壊することによってパーキンソン病の永久的な症状を引き起こす。それは様々な動物実験に疾患モデルを研究するために使用されてきた。
【０１６０】
MPTPの注入はパーキンソン症候群の急速な発症の原因となるので、MPTPで汚染されたMPPPのユーザは、これらの症状を発症する。２か月後、C5BL / 6Jマウスには、MPTPの最初の腹腔内注射が施された（36mg/kg）。運動機能障害は、続く7日間、2日毎に評価され、次に動物には、二回目の注射が施された（20mg/kg）。３日後（１０日目）に、細胞が定位手術によって線条体に注入された。ブレグマ（bregma）に関連した座標は、後部0.1ｍｍ、内外2.4ｍｍ、背側3.6ｍｍであった。制御グループには滅菌PBS又は機械的に活性化した脂肪組織から得られたhADSCsを5mlのみ注入した。
【０１６１】
（PKH26細胞の標識）
「PKH26 Cell Linker」キットは、明白な毒性作用無しで長期間にわたって生細胞の蛍光標識を提供する。「Fluorescent Linker」キットは、様々な細胞のタイプに効果的で、有意な漏れ又は細胞から細胞への転移を示さない。このキットは、細胞の、安定したクリアな、強力な、正確で再現性ある蛍光標識を提供する。移植実験のために、１×１０５細胞が各動物に注入された。
【０１６２】
各移植前に、hADSCsはPKH26でラベル付けされ、製造業者（Sigma-Aldrich（登録商標））のプロトコルに従って染色が実施された。PKH26注入のために、陽性細胞を滅菌PBSに濃度1×１０５細胞／５μｌで溶解した。
【０１６３】
（運動機能障害の評価）
運動機能障害のレベルの変化は、1-メチル-４-フェニル-1, 2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）を全身に投与されたネズミのようなPD動物モデルのDArgicニューロンの数及び／又はDA量の変化を評価するための非侵襲的な方法として用いることができる。この研究では、DA関連運動機能障害が「垂直グリッドテスト」と「水平グリッドテスト」ひよって評価された。
【０１６４】
「水平グリッド試験」デバイスでは、ひとたびネズミがしっかりとすべての4本の足でグリッド上を掴むと、装置は、上下逆さまになり、動物を30秒の最大持続時間ビデオテープに録画した。
【０１６５】
各ステップで、グリッドのワイヤ間で足が落ちるか又は滑る可能性がある。これは、「フットフォールト」として記録された。グリッドを横断しようとするネズミのステップの総数（各前肢の動き）をカウントし、各前肢のフットフォールトの総数を記録した。
【０１６６】
垂直グリッド試験は垂直グリッドの上からネズミを上向きに3センチ置くことによって行い、ネズミが振り向いてグリッドを降りる間にビデオ撮影した。上端から出発して降りるために必要な時間が測定された。
【０１６７】
レベルT9で７０Kdyneの力で１秒間ヒットした直径１ｍｍの衝撃部材による打撲傷が誘発した脊髄損傷の後に、後肢の運動機能の回復が「自由運動（free locomotion）」テストにおける後肢の使用を観察することで評価された。使用されたスケール（BMS、Basso Mouse Scale）は、後肢の麻痺状態を意味する０から正常な運動状態を意味する９までの運動のいくつかの回復レベルを記述する。生理食塩水と脂肪吸引物による治療によって達した値は約３ポイント（身体を支える能力が乏しい足底の位置決め）であり、一方、MALSは頻繁な又は一貫した足底位置で身体のサポートと足の主に協調された位置決めに対応する、このスケールで６ポイントの障害の克服を導いた。
【０１６８】
図２４〜２７に、本発明の用途の追加の実施例を示し、そこでは活性化脂肪細胞、即ちMALSが、脊髄の治療のために脊髄の内在性幹細胞が活性化することを許容する。７０Kdyneでの脊髄の打撲傷としての損傷の存在は明らかである。図２４ｄはMALSで治療した打撲傷を示す。図２５ａ〜２５ｄは、MALSの用途である活性化した脂肪細胞によって活性化された上衣幹細胞の拡大詳細図である。
【０１６９】
MALSによる活性化から４週間後、治療は図２６と２７に目に見える結果を提供した。損傷した脊髄の灰白質における新たな神経細胞の形成が、MALSによって活性化された上衣幹細胞の移動に起因することが注目される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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