【手続補正書】
【提出日】平成18年11月24日(2006.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  アルツハイマー病セクレターゼ
【特許請求の範囲】
【請求項１】  （ａ）図２（配列番号：６）に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）図３（配列番号：４）に記載のアミノ酸配列；
（ｃ）アスパルチル・プロテアーゼ活性を示す（ａ）または（ｂ）の断片；および
（ｄ）保存置換を除く（ａ）または（ｂ）あるいは（ｃ）に同一のアミノ酸配列を有する（ａ）〜（ｃ）の保存置換変異体（ここに、該保存置換変異体がアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す）
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項２】  図３（配列番号：４）に記載のアミノ酸配列を含むか、またはアスパルチル・プロテアーゼ活性を保持するその断片を含む請求項１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項３】  図２（配列番号：６）に記載のアミノ酸配列を含むか、またはアスパルチル・プロテアーゼ活性を保持するその断片を含む請求項１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項４】  該断片が、Ａｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼ活性部位トリペプチドＤＴＧおよびＤＳＧを含み、該ポリペプチドがＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す請求項２または３のいずれか１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項５】  図２（配列番号：６）または図３（配列番号：４）に記載のアミノ酸配列を含む請求項１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項６】  保存置換変異体が（ａ）または（ｂ）あるいは（ｃ）に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の保存置換変異体である請求項１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項７】  宿主細胞が核酸によりコードされたポリペプチドを発現する条件下、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクションされた該宿主細胞を培養し、ここに、該核酸が、図２（配列番号：６）または図３（配列番号：４）に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、次いで
発現されたポリペプチドを単離する工程を含むプロセスにより生成された請求項１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項８】  配列番号：４または配列番号：６のＡｓｐ２蛋白質アミノ酸配列の断片を含み、ここに、該断片が、該アスパルチル・プロテアーゼ活性部位トリペプチドＤＴＧおよびＤＳＧを含み、かつＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示し、ここに、該ポリペプチドは膜貫通ドメインを欠き、該ポリペプチドは、ＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す請求項１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項９】  配列番号：４のアミノ酸９３〜２９１を含む請求項８記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１０】  配列番号：６のアミノ酸９３〜２６６を含む請求項８記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１１】  図３（配列番号：４）または図２（配列番号：６）に記載のアスパルチル・プロテアーゼアミノ酸配列の断片に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；
ここに、該断片が、該アスパルチル・プロテアーゼ活性部位トリペプチドＤＴＧおよびＤＳＧを含み、かつＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するＡｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼ活性を示し、
ここに、該ポリペプチドのアミノ酸配列と該断片のアミノ酸配列との間の置換の差は保存置換よりなり；および
該ポリペプチドは、ＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す請求項１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１２】  図３（配列番号：４）または図２（配列番号：６）に記載のアスパルチル・プロテアーゼアミノ酸配列の断片に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；
ここに、該断片が、アスパルチル・プロテアーゼ活性部位トリペプチドＤＴＧおよびＤＳＧを含み、かつＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するＡｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼ活性を示し、
ここに、該ポリペプチドのアミノ酸配列と該断片のアミノ酸配列との間の置換の差は保存置換よりなり；および
該ポリペプチドは、ＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す請求項１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１３】  該ポリペプチドが膜貫通ドメインを欠いている請求項１〜７、１１および１２のいずれか１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１４】  該ポリペプチドがさらにシグナルペプチドを含む請求項１〜１３のいずれか１記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１５】  該ポリペプチドが、さらにヘテロローガスなペプチドタグを含む請求項１〜１４記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１６】  配列番号：４または配列番号：６のＡｓｐ２蛋白質アミノ酸配列の断片に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、
ここに、該断片が、アスパルチル・プロテアーゼ活性部位トリペプチドＤＴＧおよびＤＳＧを含み、かつＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示し、
ここに、該ポリペプチドは膜貫通ドメインを欠き、該ポリペプチドはＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１７】  該ポリペプチドがさらにシグナルペプチドを含む請求項１６記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１８】  該ポリペプチドが、さらにヘテロローガスなペプチドタグを含む請求項１６または１７記載の単離もしくは精製ポリペプチド。
【請求項１９】  請求項１〜１８のいずれか１記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離もしくは精製ポリヌクレオチド。
【請求項２０】  該ヌクレオチド配列が配列番号：３のヌクレオチド２７７〜８７３を含む請求項１９記載の単離もしくは精製ポリヌクレオチド。
【請求項２１】  該ヌクレオチド配列が配列番号：５のヌクレオチド２７７〜７９８を含む請求項１９記載の単離もしくは精製ポリヌクレオチド。
【請求項２２】  配列番号：３または配列番号：５の相補体に以下のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：
（１）６×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、次いで
（２）１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中で６５℃で洗浄する
の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、
ここに、該ポリヌクレオチドは、膜貫通ドメインを欠き、かつＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す単離もしくは精製ポリヌクレオチド。
【請求項２３】  該ポリペプチドが、アスパルチル・プロテアーゼ活性部位トリペプチドＤＴＧおよびＤＳＧを含む請求項２２記載の単離もしくは精製ポリヌクレオチド。
【請求項２４】  該コードされたポリペプチドがさらにヘテロローガスなペプチドタグを含む、請求項１９〜２３のいずれか１記載の単離もしくは精製ポリヌクレオチド。
【請求項２５】  該ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にイン・フレーム融合したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
ここに、シグナルペプチドは、該ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた宿主細胞中で細胞外分泌を促し；および
該ポリペプチドは、該宿主細胞により分泌され、かつＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す請求項１９〜２４のいずれか１記載の単離もしくは精製ポリヌクレオチド。
【請求項２６】  請求項１９〜２５のいずれか１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】  該ポリヌクレオチドがヘテロローガスな発現制御配列に作動可能に連結した請求項１９〜２５のいずれか１記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２８】  該ポリヌクレオチドが、哺乳動物宿主細胞中での発現のためのヘテロローガスな制御配列に作動可能に連結した請求項２６記載のベクター。
【請求項２９】  該ポリヌクレオチドが、昆虫宿主細胞中での発現のためのヘテロローガスな制御配列に作動可能に連結した請求項２６記載のベクター。
【請求項３０】  請求項１９〜２５のいずれか１記載のポリヌクレオチドまたは請求項２６〜２９のいずれか１記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３１】  哺乳動物細胞である請求項３０記載の宿主細胞。
【請求項３２】  ヒト細胞系から由来した請求項３０記載の宿主細胞。
【請求項３３】  細胞が該核酸によりコードされたポリヌクレオチドを発現する条件下で請求項３１〜３２のいずれか１記載の宿主細胞を培養することを特徴とするアスパルチル・プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを作成する方法。
【請求項３４】  さらに、細胞または増殖培地からポリペプチドを単離することを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】  アスパルチル・プロテアーゼの蛋白質分解活性を低下させる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）請求項１９〜２５のいずれか１記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、試験薬剤の存在および不存在下で細胞が該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを発現する条件下にて増殖させ、次いで
（ｂ）試験薬剤の存在および不存在下で細胞により発現されたポリペプチドの蛋白質活性を比較し、ここに、試験薬剤の存在下での蛋白質分解活性の低下が、アスパルチル・プロテアーゼポリペプチドの蛋白質分解活性を低下させる薬剤と試験薬剤を同定する工程を含む該方法。
【請求項３６】  ポリペプチドのプロテアーゼ活性を低下させる薬剤を同定する方法であって、
（ａ） 試験薬剤の存在および不存在下にて、請求項１〜１８のいずれか１記載のポリペプチドの蛋白質分解活性を測定し；次いで
（ｂ）試験薬剤の存在および不存在下にて、該ポリペプチドの蛋白質分解活性を比較し、ここに、試験薬剤の存在下の蛋白質分解活性の低下は、アスパルチル・プロテアーゼポリペプチドのプロテアーゼ活性を低下させる薬剤と試験薬剤を同定する工程を含むことを特徴とする該方法。
【請求項３７】  該蛋白質分解活性が、アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）基質へのポリペプチドの蛋白質分解活性を含む請求項３５または３６記載の方法。
【請求項３８】  Ａｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼの活性を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）試験薬剤の存在および不存在下でＡｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼおよびアミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）を接触させ、ここに、該Ａｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼが、ＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するＡｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼ活性を示し、かつポリペプチドをコードし、配列番号：３または配列番号：５の相補体に以下のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：
（１）６×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、次いで
（２）１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中で６５℃で洗浄する
の下でハイブリダイズする核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞により発現された組換えポリペプチドであり； 
（ｂ）試験薬剤の存在および不存在下にてＡｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼのＡＰＰプロセシング活性を測定し；次いで
（ｃ）試験薬剤の存在下のＡｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼのＡＰＰプロセシング活性を試験薬剤の不存在下の活性と比較して、Ａｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼの活性を調節する薬剤を同定し、ここに、Ａｓｐ２阻害剤であるモジュレーターは、ＡＰＰプロセシングを低下させ、Ａｓｐ２アゴニストであるモジュレーターは、かかるプロセシングを増大させる工程を含むことを特徴とする該方法。
【請求項３９】  アミロイド前駆蛋白質がＡＰＰのヒトのアイソフォームであることを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】  アミロイド前駆蛋白質が、スウェーデン突然変異（Ｋ→Ｎ、Ｍ→Ｌ）を含むＡＰＰ β−セクレターゼ切断部位を含むことを特徴とする請求項３８または３９記載の方法。
【請求項４１】  アミロイド前駆蛋白質が、カルボキシ末端ジ−リジン（ＫＫ）を含むことを特徴とする請求項３８〜４０のいずれか１記載の方法。
【請求項４２】  アミロイド前駆蛋白質が、細胞により発現されることを特徴とする請求項３８〜４１のいずれか１記載の方法。
【請求項４３】  工程（ａ）のプロテアーゼが精製および単離されることを特徴とする請求項３８〜４２のいずれか１記載の方法。
【請求項４４】  該接触工程が、試験薬剤の存在および不存在下にてプロテアーゼを発現する形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させることを含み、アミロイド前駆蛋白質が細胞により発現される工程を特徴とする請求項３８〜４３のいずれか１記載の方法。
【請求項４５】  プロテアーゼのＡＰＰプロセシング活性を阻害する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）試験薬剤の存在および不存在下でプロテアーゼをアミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）と接触させ、ここに、該プロテアーゼは、該プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換またはトランスフェクトされた細胞により発現された組換えポリペプチドを含み、ここに、該プロテアーゼは、配列番号：４または配列番号：６に記載のＡｓｐ２アミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列またはＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するＡｓｐ２アスパルチル・プロテアーゼ活性を示すその断片を含み；
（ｂ）試験薬剤の存在および不存在下にてＡＰＰ基質への該プロテアーゼの蛋白質分解プロセシング活性を測定し；次いで
（ｃ） 試験薬剤の存在下の該アスパルチル・プロテアーゼの蛋白質分解プロセシング活性を試験薬剤の不存在下の活性と比較して、該プロテアーゼのＡＰＰプロセシング活性を阻害する薬剤を同定し、ここに、試験薬剤の存在下での活性の低下は、該プロテアーゼのＡＰＰプロセシング活性を阻害する薬剤を同定する工程を含むことを特徴とする該方法。
【請求項４６】  該プロテアーゼが、配列番号：４または配列番号：６に記載のＡｓｐ２アミノ酸配列またはＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するＡｓｐ２プロテアーゼ活性を示すその断片を含むことを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４７】  該プロテアーゼが、配列番号：４または配列番号：６のアスパルチル・プロテアーゼ活性部位トリペプチドＤＴＧおよびＤＳＧを含み、ＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するＡｓｐアスパルチル・プロテアーゼ活性を示す配列番号：４または配列番号：６の断片を含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】  プロテアーゼのＡＰＰプロセシング活性を阻害する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）試験薬剤の存在および不存在下でプロテアーゼとアミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）基質とを接触させ、
ここに、該プロテアーゼは、ＡＰＰのアミロイドベータへのプロセシングに関与するＡｓｐ２プロテアーゼ活性を示し、かつ該プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換またはトランスフェクトされた細胞により発現され、該ヌクレオチド配列は、配列番号：３または配列番号：５に記載されたヌクレオチド配列の相補体に以下のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：
（１）６×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で４２℃でのハイブリダイゼーション、次いで
（２）１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中で６５℃で洗浄する
の下でハイブリダイズし；
（ｂ）試験薬剤の存在および不存在下にて該ＡＰＰ基質への該プロテアーゼの蛋白質分解プロセシング活性を測定し；次いで        
（ｃ）試験薬剤の存在下の該アスパルチル・プロテアーゼの蛋白質分解プロセシング活性を試験薬剤の不存在下の活性と比較して、該プロテアーゼのＡＰＰプロセシング活性を阻害する薬剤を同定し、ここに、試験薬剤の存在下の活性の低下は、該プロテアーゼのＡＰＰプロセシング活性を阻害する薬剤を同定する工程を含むことを特徴とする該方法。
【請求項４９】  工程（ａ）のプロテアーゼが精製および単離されることを特徴とする請求項４５〜４８のいずれか１記載の方法。
【請求項５０】  該プロテアーゼが実質的に他のプロテアーゼを含まないことを特徴とする請求項４９記載の方法。
【請求項５１】  該細胞が該核酸を含むベクターを含むことを特徴とする請求項４５〜５０のいずれか１記載の方法。
【請求項５２】  該接触工程が試験薬剤の存在および不存在下でプロテアーゼを発現する形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させることを特徴とする請求項４５〜５１のいずれか１記載の方法。
【請求項５３】  該ＡＰＰ基質が、細胞により発現されたＡＰＰポリペプチドを含むことを特徴とする請求項４５〜５２のいずれか１記載の方法。
【請求項５４】  該測定工程が、試験薬剤の存在および不存在下にて細胞によりアミロイド・ベータ・ペプチドの産生を測定することを特徴とする請求項４５〜５３のいずれか１記載の方法。
【請求項５５】  該宿主細胞が、ヒト胚腎臓細胞系２９３（ＨＥＫ２９３）細胞であることを特徴とする請求項４５〜５４のいずれか１記載の方法。
【請求項５６】  該ＡＰＰ基質がアミロイドベータ（Ａ−ベータ）プロセシング部位を含むことを特徴とする請求項４５〜５５のいずれか１記載の方法。
【請求項５７】  該ＡＰＰ基質がＡＰＰのβ−セクレターゼ切断部位を含むペプチドであることを特徴とする請求項４５〜５６のいずれか１記載の方法。
【請求項５８】  ＡＰＰ基質が、スウェーデン突然変異（Ｋ→Ｎ、Ｍ→Ｌ）を含むことを特徴とする請求項５７記載の方法。
【請求項５９】  該β−セクレターゼ切断部位が、
式Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１'−Ｐ２'
［式中、Ｐ２は、ＫまたはＮから選択されたアミノ酸；
Ｐ１は、ＭまたはＬから選択されたアミノ酸；
Ｐ１'は、アミノ酸Ｄであって；
Ｐ２'は、アミノ酸Ａである］
を含むことを特徴とする請求項５７記載の方法。
【請求項６０】  該ペプチドが、ＫＭＤＡ（配列番号：５８、第４〜７位）、ＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：５８）、ＮＬＤＡ（配列番号：５４、第４〜７位）およびＳＥＶＮＬＤＡＥＦＲ（配列番号：５４）よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５９記載の方法。
【請求項６１】  該ＡＰＰ基質が、発光発生的（fluorogenic）または色素生産性(chromogenic)の基質であることを特徴とする請求項４５〜６０のいずれか１記載の方法。
【請求項６２】  該ＡＰＰ基質が、該細胞により発現され、かつカルボキシ末端ジ−リジン（ＫＫ）を含み、該接触工程が、試験薬剤の存在および不存在下にてプロテアーゼおよびＡＰＰ基質を発現する細胞を増殖させることを特徴とする請求項４５〜６０のいずれか１記載の方法。
【請求項６３】  さらに、工程（ｃ）においてプロテアーゼ阻害剤と同定された薬剤および医薬上許容される担体を含む組成物を作成することを特徴とする請求項４５〜６２のいずれか１記載の方法。
【請求項６４】  請求項４５〜６３記載の方法によりアスパルチル・プロテアーゼ活性の阻害剤と同定された薬剤を含むアルツハイマー病を治療するための医薬組成物。
【請求項６５】  長さが１５〜１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
ここに、該核酸は、配列番号：３または配列番号：５の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドまたはその相補体に以下のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件：
６×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で２.５時間インキュベートし、次いで
１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中で６５℃で洗浄する
の下でハイブリダイズし；該核酸は、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３−ＳｗＫＫ細胞中のＡベータプロセシングに比較して、該核酸でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＳｗＫＫ細胞中でアミロイドベータ（Ａベータ）プロセシングを低下させる単離核酸。
【請求項６６】  該核酸が、長さが１５〜３０ヌクレオチドである請求項６５記載の単離核酸。
【請求項６７】  該核酸が、長さが２０〜３０ヌクレオチドである請求項６５記載の単離核酸。
【請求項６８】  該核酸が、配列番号：３に相補的な配列を含む請求項６５〜６７のいずれか１記載の単離核酸。
【請求項６９】  ＤＮＡを含む請求項６５〜６８のいずれか１記載の単離核酸。
【請求項７０】  ＲＮＡを含む請求項６５〜６９のいずれか１記載の単離核酸。
【請求項７１】  該トランスフェクトされていない細胞に比較して少なくとも５０％だけ該トランスフェクトされた細胞中でのＡβ（１−４０）プロセシングを低下させる請求項６５〜７０のいずれか１記載の単離核酸。
【請求項７２】  該トランスフェクトされていない細胞に比較して少なくとも５０％だけ該トランスフェクトされた細胞中でのＡβ（１−４２）プロセシングを低下させる請求項６５〜７０のいずれか１記載の単離核酸。
【請求項７３】  請求項６５〜７２のいずれか１記載の核酸を含むベクター。
【請求項７４】  アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）からのアミロイドベータ（Ａβ）の細胞産生を低下させる方法であって、
細胞中でＡｓｐ２転写または翻訳を低下させることによりＡｓｐ２ポリペプチド産生を低下させるのに有効な量で、請求項６５〜７２のいずれか１記載の核酸または請求項７３記載のベクターを含む組成物でｉｎ ｖｉｔｒｏにて細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程を含み、ここに、該細胞中のＡｓｐ２ポリペプチド産生の低下は、ＡＰＰのＡβへの細胞プロセシングの低下と関連することを特徴とする該方法。
【請求項７５】  アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）からのアミロイドベータ（Ａβ）の細胞産生を低下させる方法であって、
細胞中でＡｓｐ２転写または翻訳を低下させることによりＡｓｐ２ポリペプチド産生を低下できるアンチセンス試薬を含む組成物でｉｎ ｖｉｔｒｏにて細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程を含み、ここに、該細胞中のＡｓｐ２ポリペプチド産生の低下は、ＡＰＰのＡβへの細胞プロセシングの低下と関連することを特徴とする該方法。
【請求項７６】  さらに、該形質転換またはトランスフェクト工程に先立ち、Ａ．ベータを産生する哺乳動物細胞を同定する工程を含むことを特徴とする請求項７４または７５記載の方法。
【請求項７７】  該細胞が、自然の細胞である請求項７４〜７６のいずれか１記載の方法。
【請求項７８】  該アンチセンス試薬が、Ｈｕ−Ａｓｐ ｍＲＮＡに結合できる一本鎖核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含む請求項７５記載の方法。
【請求項７９】  該アンチセンス試薬が、Ｈｕ−Ａｓｐ ＤＮＡに結合できる一本鎖核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含む請求項７５記載の方法。
【請求項８０】  請求項６５〜７２のいずれか１記載の単離核酸または請求項７３記載のベクターを含むアルツハイマー病を治療するための医薬組成物。
【請求項８１】  アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）からのアミロイドベータ（Ａβ）の細胞産生を低下できるアンチセンス試薬を含むアルツハイマー病を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アルツハイマー病、ＡＰＰ、アミロイド・ベータ・ペプチドおよびヒトアスパルチル・プロテアーゼの分野ならびにこれらのポリペプチドの活性を調節する薬剤の同定方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイド斑、神経原線維のもつれ、神経膠症およびニューロン喪失の結果として生じる進行性痴呆を引き起こす。その疾病は、臨床経過および病理学的特徴が全く類似した遺伝的および散発性の形態で生じる。３つの遺伝子が現在までに発見され、それは突然変異した場合、アルツハイマー病の常染色体の支配的な形態を引き起こす。これらはアミロイド蛋白質前駆体（ＡＰＰ）および関連する２つの蛋白質のプレセニリン−１（ＰＳ１）およびプレセニリン−２（ＰＳ２）をコードし、それらの名前が示唆するように、両者は構造上および機能上関連する。その３つのいずれの突然変異も、ＡＤのアミロイド斑の主成分である４０ないし４２個のアミノ酸の長いペプチドのアミロイド・ベータ・ペプチドまたはＡβ（または本明細書中にて時々Ａベータとして）を産生する細胞内経路を介するＡＰＰの蛋白質分解プロセシングを増強する。蛋白質分解プロセシングについての細胞内経路の調節異常は、ＡＤの病態生理学の中心となるかもしれない。斑形成の場合において、ＡＰＰ、ＰＳ１またはＰＳ２における突然変異が、特定のアミロイドを生成するようであり、かくしてＡＤにおいて非常に重要であるＡβの形態であるＡβ１ないし４２の形成を増強するようにＡＰＰの蛋白質分解プロセシングを一貫して変更する。６９５ないし７７０のアミノ酸のサイズ範囲のＡＰＰの異なる形態は、細胞表面に局在し、単一Ｃ末端膜貫通ドメインを有する。そのベータペプチドは、膜貫通ドメインの一部に隣接し、それを含むＡＰＰ領域から由来する。通常、α−セクレターゼ部位でのＡＰＰのプロセシングは、その膜に隣接するＡβ配列の中間領域を切断し、細胞表面からＡＰＰの可溶性細胞外ドメインを遊離する。このα−セクレターゼＡＰＰプロセシングは、可溶性ＡＰＰ−αを創製し、それが通常であり、それがＡＤの一因とは考えられていない。
【０００３】
β−およびγ−セクレターゼでのＡＰＰの病理学的プロセシングは、α部位でのプロセシングとは非常に異なる結果を生じる。β−およびγ−セクレターゼ部位での順次プロセシングは、ＡＤの病因に非常に重要とされ得るペプチドのＡβペプチドを遊離する。β−およびγ−セクレターゼ部位でのプロセシングは、（全細胞における）細胞表面ＡＰＰの再内部化の後に（ニューロン中の）小胞体およびエンドソーム／リソソームの経路の双方で生じ得る。βおよびγの部位にてＡＰＰをプロセシングして、Ａβペプチドを生成するのを担う酵素を同定するために１０年間以上の集中した努力にもかかわらず、本開示までそれらのプロテアーゼは不明のままであった。ここに、初めて、発明者らは、βセクレターゼ酵素の同定および特徴付けを報告する。発明者らは、β−セクレターゼプロテアーゼとして作用できるいくらかの公知のおよびいくらかの新規なヒトアスパラギン酸プロテアーゼを開示し、発明者らは初めてこれらのプロテアーゼがＡＤにおいて有している役割について説明する。発明者らは、それらのユニークな機能に非常に重要なプロテアーゼの領域を記載し、初めてそれらの基質を特徴付ける。これは、有用な細胞系および阻害剤の同定および創製に加えて、発現され、精製され、単離されるこのタイプの活性蛋白質、該蛋白質を用いるアッセイの初めての記載である。
【０００４】
（発明の要約）
ここに、発明者らは、ａｓｐ２の遺伝子およびペプチドの多数の変異体を開示する。
【０００５】
本発明は、２組以上の特定の核酸を含有するＡＰＰのベータ（β）セクレターゼ切断部位を切断できるプロテアーゼをコードするいずれかの単離および精製された核酸ポリヌクレオチド、ここに、特定の核酸は１００ないし３００のアミノ酸位置をコードする核酸によって分離され、ここに、これらの位置のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよく、ここに、第１組の特定のアミノ酸は、ペプチドＤＴＧをコードする核酸よりなり、ここに、第１の特定の組は核酸の第１の核酸が第１の特定の核酸であり、ここに、第２組の核酸はペプチドＤＳＧまたはＤＴＧのいずれかをコードし、ここに、第２組の核酸の最後の核酸は最後の特定の核酸であり、但し、配列番号：１および配列番号：５に開示された核酸を含まない、を提供する。一つの具体例において、２組の核酸はいずれのアミノ酸でもよい約１２５ないし２２２のアミノ酸位置をコードする核酸によって分離される。特定の具体例において、２組の特定の核酸はいずれのアミノ酸であってよい約１５０ないし１７２のアミノ酸位置をコードする核酸により分離される。より特定の具体例において、その２組はいずれのアミノ酸であってよい約１７２のアミノ酸位置をコードする核酸により分離される。例示的なポリヌクレオチドは、配列番号：３に記載される核酸を含む。もう一つの具体例において、２組の核酸は約１５０ないし１９６のアミノ酸位置をコードする核酸によって分離される。もう一つの具体例において、２組のヌクレオチドは約１９６のアミノ酸をコードする核酸によって分離される。例示的なポリヌクレオチドは、配列番号：５の同一組の特定の核酸を分離する同一核酸配列によって分離された２組の核酸を含む。特定の具体例において、２組の核酸は約１５０ないし１９０のアミノ酸をコードする核酸によって分離される。もう一つの具体例において、２組のヌクレオチドは約１９０のアミノ酸をコードする核酸によって分離される。より特定の具体例において、２組のヌクレオチドは配列番号：１の同一組の特定のヌクレオチドを分離する同一の核酸配列によって分離される。一つの具体例において、第１の特定の組のアミノ酸の第１の核酸、すなわち第１の特定の核酸は、そのコドンの核酸が１ないし１０,０００のアミノ酸を含むいずれかのペプチドをコードするいずれかのコドンに操作可能に連結する。一つの変形において、第１の特定の核酸は、いずれかのレポーター蛋白質または精製を促進する蛋白質よりなる群から選択されるいずれかのペプチドをコードする核酸ポリマーに操作可能に連結する。もう一つの変形において、第１の特定の核酸は、免疫グロブリン−重鎖、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェクション、グリーン蛍光蛋白質およびユビキチン（ubiquitin）よりなる群から選択されるいずれかのペプチドをコードする核酸ポリマーに操作可能に連結する。もう一つの具体例において、第２組の特定のアミノ酸の最後の核酸、すなわち、最後の特定の核酸は、１ないし１０,０００のアミノ酸を含むいずれかのペプチドをコードする核酸ポリマーに操作可能に連結する。一つの変形において、最後の特定の核酸は、いずれかのレポーター蛋白質または精製を促進する蛋白質よりなる群から選択されるいずれかのペ��チドをコードする核酸ポリマーに連結したいずれかのコドンに操作可能に連結する。もう一つの具体例において、第１の特定の核酸は、免疫グロブリン−重鎖、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェクション、グリーン蛍光蛋白質およびユビキチンよりなる群から選択されるいずれかのペプチドをコードする核酸ポリマーに操作可能に連結する。
【０００６】
本発明は、２組以上の特定の核酸を含有するＡＰＰのベータセクレターゼ切断部位を切断できるプロテアーゼをコードするいずれかの単離されたまたは精製された核酸ポリヌクレオチド、ここに、特定の核酸は、約１００ないし３００のアミノ酸位置をコードする核酸によって分離され、ここに、それらの位置のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよく、ここに、第１組の特定のアミノ酸は、ＤＴＧをコードする核酸よりなり、ここに、第１の特定の組の核酸の第１の核酸は、第１の特定の核酸であり、ここに、第２組の核酸は、ＤＳＧまたはＤＴＧのいずれかをコードし、ここに、第２組の特定の核酸の最後の核酸は、最後の特定の核酸であり、第１の特定の核酸は、０ないし８１のいずれかの数のアミノ酸をコードする核酸に操作可能に連結し、ここに、これらの各コドンは、いずれのアミノ酸をコードしてもよい、を提供する。ある具体例において、第１の特定の核酸は、６４ないし７７のいずれかの数のアミノ酸をコードする核酸に操作可能に連結し、ここに、各コドンは、いずれのアミノ酸をコードしてもよい。特定の具体例において、第１の特定の核酸は、７１のアミノ酸をコードする核酸に操作可能に連結する。例えば、第１の特定の核酸は、７１のアミノ酸に操作可能に連結し、ここに、それらの７１のアミノ酸の第１のものはアミノ酸Ｔである。もう一つの具体例において、該ポリヌクレオチドは、本明細書に教示されたヒトＡｓｐ１またはＡｓｐ２に少なくとも９５％同一である配列を含む。さらにもう一つの具体例において、第１の特定の核酸は、各コドンがいずれのアミノ酸もコードできる４０ないし５４のいずれかの数のアミノ酸をコードする核酸に操作可能に連結する。特定の具体例において、第１の特定の核酸は、４７のアミノ酸をコードする核酸に操作可能に連結する。例えば、第１の特定の核酸は、第１のそれらの４７のアミノ酸がアミノ酸Ｅである４７のコドンに操作可能に連結し、例えば、実施例１０に記載の配列番号：２９または実施例１０に記載の配列番号：２９の完全なポリヌクレオチドに少なくとも９５％同一である配列を含むポリヌクレオチドである。
【０００７】
もう一つの関連する態様において、本発明は、２組以上の特定の核酸を含有するＡＰＰのベータ（β）セクレターゼ切断部位を切断できるプロテアーゼをコードするいずれかの単離されたまたは精製された核酸ポリヌクレオチド、ここに、特定の核酸は、約１００ないし３００のアミノ酸位置をコードする核酸によって分離され、ここに、これらの位置のアミノ酸は、いずれのアミノ酸であってもよく、ここに、第１組の特定の核酸は、ペプチドＤＴＧをコードする核酸よりなり、ここに、第１の特定の組のアミノ酸の第１の核酸は、第１の特定の核酸であり、ここに、第２組の特定の核酸はペプチドＤＳＧまたはＤＴＧをコードし、ここに、第２組の特定の核酸の最後の核酸の最後の特定の核酸は、５０ないし１７０のいずれかの数のコドンをコードする核酸に操作可能に連結する、を提供する。ある具体例において、最後の特定の核酸は、１００ないし１７０のコドンを含む核酸に操作可能に連結する。特定の具体例において、最後の特定の核酸は、１４２ないし１６３のコドンを含む核酸に操作可能に連結する。もう一つの具体例において、最後の特定の核酸は、約１４２のコドンを含む核酸に操作可能に連結する。例えば、該ポリヌクレオチドは、実施例９に記載の配列番号：２１もしくは実施例１０に記載の配列番号：２９に少なくとも９５％同一である配列または実施例９に記載の配列番号：２１もしくは実施例１０に記載の配列番号：２９の完全なポリヌクレオチドを含む。一つの変形において、最後の特定の核酸は、約１６３のコドンを含む核酸に操作可能に連結する。もう一つの変形において、最後の特定の核酸は、約１７０のコドンを含む核酸に操作可能に連結する。もう一つの具体例において、第２組の特定の核酸は、ペプチドＤＳＧをコードし、所望により、第１組の核酸ポリヌクレオチドは、ペプチド精製タグに操作可能に連結してもよい。例えば、核酸ポリヌクレオチドは６個のヒスチジンであるペプチド精製タグに操作可能に連結する。さらにもう一つの具体例において、第１組の特定の核酸は一つのポリヌクレオチド上であり、第２組の特定の核酸は第２ポリヌクレオチド上であり、ここに、第１および第２の組は共に少なくとも５０のコドンを有する。このタイプの一つの具体例において、第１組の特定の核酸は、１つのポリヌクレオチド上であり、第２組の特定の核酸は、第２のポリヌクレオチド上であり、ここに、第１および第２のポリヌクレオチドは共に少なくとも５０のコドンを有し、ここに、双方の該ポリヌクレオチドは同一溶液中にある。関連する態様において、本発明は、上記に記載されたポリヌクレオチドを含有するベクターおよび上記に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞または細胞系を提供する。
【０００８】
さらにもう一つの態様において、本発明は、２組以上の特定のアミノ酸を含有するＡＰＰのベータ（β）セクレターゼ切断部位を切断できるプロテアーゼであるアミノ酸ポリマーを含むいずれかの単離されたまたは精製されたペプチド、ここに、特定のアミノ酸は、約１００ないし３００のアミノ酸位置によって分離され、ここに、各アミノ酸位置はいずれのアミノ酸であってもよく、ここに、第１組の特定のアミノ酸はペプチドＤＴＧよりなり、ここに、第１の特定の組のアミノ酸の第１アミノ酸は、第１の特定のアミノ酸であり、ここに、第２組のアミノ酸は、ＤＳＧまたはＤＴＧのいずれかを含むペプチドから選択され、ここに、第２組の特定のアミノ酸の最後のアミノ酸は最後の特定のアミノ酸であり、但し、配列番号：２および配列番号：６に開示されたプロテアーゼは含まない、を提供する。ある具体例において、２組のアミノ酸は約１２５ないし２２２のアミノ酸位置によって分離され、ここに、各位置において、それはいずれのアミノ酸であってもよい。特定の具体例において、２組のアミノ酸は約１５０ないし１７２のアミノ酸によって分離される。もう一つの特定の具体例において、２組のアミノ酸は約１７２のアミノ酸によって分離される。例えば、該ポリペプチドは配列番号：４に記載されるプロテアーゼである。もう一つの特定の具体例において、２組のアミノ酸は約１５０ないし１９６のアミノ酸によって分離される。一つの変形において、２組のアミノ酸は約１９６のアミノ酸によって分離される。ある具体例において、２組のアミノ酸は配列番号：６の同一組の特定のアミノ酸を分離する同一アミノ酸配列によって分離される。特定の具体例において、２組のアミノ酸は約１５０ないし１９０のアミノ酸によって分離される。もう一つの特定の具体例において、２組のヌクレオチドは約１９０のアミノ酸によって分離される。例えば、２組のヌクレオチドは配列番号：２の同一組の特定のアミノ酸を分離する同一アミノ酸配列によって分離される。一つの具体例において、第１の特定の組のアミノ酸の第１のアミノ酸、すなわち、第１の特定のアミノ酸は、１ないし１００００のアミノ酸を含むいずれかのペプチドに操作可能に連結する。もう一つの具体例において、第１の特定のアミノ酸はいずれかのレポーター蛋白質または精製を促進する蛋白質よりなる群から選択されるいずれかのペプチドに操作可能に連結する。特定の具体例において、免疫グロブリン−重鎖、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェクション、グリーン蛍光蛋白質およびユビキチンよりなる群から選択されるいずれかのペプチドに操作可能に連結する。さらにもう一つの変形において、第２組の特定のアミノ酸の最後のアミノ酸、すなわち、最後の特定のアミノ酸は、１ないし１００００のアミノ酸のいずれかのアミノ酸を含むいずれかのペプチドに操作可能に連結する。非限定の例として、最後の特定のアミノ酸はいずれかのレポーター蛋白質または精製を促進する蛋白質よりなる群から選択されるいずれかのペプチドに操作可能に連結する。特定の具体例において、第１の特定のアミノ酸は、免疫グロブリン−重鎖、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェクション、グリーン蛍光蛋白質お���びユビキチンよりなる群から選択されるいずれかのペプチドに操作可能に連結する。
【０００９】
また、本発明は、２組以上の特定のアミノ酸を含有するＡＰＰのベータセクレターゼ切断部位を切断できるプロテアーゼをコードするアミノ酸ポリペプチドを含むいずれかの単離されたまたは精製されたペプチドもしくは蛋白質、ここに、特定のアミノ酸は約１００ないし３００のアミノ酸位置によって分離され、ここに、各位置の各アミノ酸はいずれのアミノ酸であってもよく、ここに、第１組の特定のアミノ酸はアミノ酸ＤＴＧよりなり、ここに、第１の特定の組のアミノ酸の第１のアミノ酸は第１の特定のアミノ酸Ｄであり、ここに、第２組のアミノ酸はＤＳＧまたはＤＴＧのいずれかであり、ここに、第２組の特定のアミノ酸の最後のアミノ酸は最後の特定のアミノ酸Ｇであり、ここに、第１の特定のアミノ酸は０ないし８１のいずれかの数のアミノ酸位置のアミノ酸をコードし、ここに、各位置において、それはいずれのアミノ酸であってもよい、を提供する。一つの具体例において、第１のアミノ酸は約６４ないし７７のアミノ酸位置のペプチドに操作可能に連結し、ここに、各アミノ酸位置はいずれのアミノ酸であってもよい。特定の具体例において、第１の特定のアミノ酸は７１のアミノ酸のペプチドに操作可能に連結する。より特定の具体例において、第１の特定のアミノ酸は７１のアミノ酸に操作可能に連結し、それらの７１のアミノ酸の第１のものはアミノ酸Ｔである。例えば、該ポリペプチドは本明細書に記載のアスパルチルプロテアーゼ配列に少なくとも９５％同一の配列を含む。もう一つの具体例において、第１の特定のアミノ酸は４０ないし５４のいずれかの数のアミノ酸に操作可能に連結し、ここに、各アミノ酸位置はいずれのアミノ酸であってもよい。特定の具体例において、第１の特定のアミノ酸は４７のアミノ酸のペプチドをコードするアミノ酸に操作可能に連結する。特に特定の具体例において、第１の特定のアミノ酸は４７のアミノ酸ペプチドに操作可能に連結し、ここに、第１のそれらのアミノ酸はアミノ酸Ｅである。例えば、該ポリペプチドは実施例１０に記載の配列番号：３０に少なくとも９５％同一である配列または実施例１０に記載の配列番号：３０の完全なポリペプチド配列を含む。
【００１０】
さらにもう一つの関連する態様において、２組以上の特定のアミノ酸を含有するＡＰＰのベータ（β）セクレターゼ切断部位を切断できるいずれかの単離されたまたは精製されたアミノ酸ポリヌクレオチド、ここに、特定のアミノ酸は約１００ないし３００のアミノ酸位置によって分離され、ここに、各位置の各アミノ酸は、いずれのアミノ酸であってもよく、ここに、第１組の特定のアミノ酸はＤＴＧをコードするアミノ酸よりなり、ここに、第１の特定の組のアミノ酸の第１のアミノ酸は第１の特定のアミノ酸Ｄであり、ここに、第２組の特定のアミノ酸はＤＳＧまたはＤＴＧのいずれかであり、ここに、第２組の特定のアミノ酸の最後のアミノ酸は最後の特定のアミノ酸Ｇであり、それは５０ないし１７０のアミノ酸のいずれかの数のアミノ酸に操作可能に連結し、それはいずれのアミノ酸であってもよい。一つの具体例において、約１００ないし１７０のアミノ酸のペプチドに操作可能に連結する。特定の具体例において、最後の特定のアミノ酸は約１４２ないし１６３のアミノ酸のペプチドに操作可能に連結する。もう一つの特定の具体例において、最後の特定のアミノ酸は約１４２のアミノ酸のペプチドに操作可能に連結する。例えば、該ポリペプチドは実施例９に記載の配列番号：２２または実施例１０に記載の配列番号：３０に少なくとも９５％同一である配列を含む。一つの特定の具体例において、最後の特定のアミノ酸は約１６３のアミノ酸のペプチドに操作可能に連結する。例えば、該ポリペプチドは実施例９に記載の配列番号：２２または実施例１０に記載の配列番号：３０に少なくとも９５％同一である配列あるいは実施例９に記載の配列番号：２２または実施例１０に記載の配列番号：３０の完全なポリペプチドを含む。もう一つの具体例において、最後の特定のアミノ酸は約１７０のアミノ酸のペプチドに操作可能に連結する。特定の具体例において、第２組の特定のアミノ酸はアミノ酸配列ＤＳＧを持つペプチドを含む。所望により、該アミノ酸ポリペプチドはペプチド精製タグに操作可能に連結し、例えば、６個のヒスチジンであるペプチド精製タグに操作可能に連結する。一つの変形において、第１組の特定のアミノ酸は１つのポリペプチド上であり、第２組の特定のアミノ酸は第２のポリペプチド上であり、第１および第２のポリペプチドの双方は少なくとも５０のアミノ酸を有し、それはいずれのアミノ酸であってもよい。もう一つの変形において、第１組の特定のアミノ酸は、１つのポリペプチド上であり、第２組の特定のアミノ酸は第２のポリペプチド上であり、ここに、第１および第２のポリペプチドの双方は少なくとも５０のアミノ酸であり、ここに、該ポリペプチドは共に同一容器内にある。また、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを含有するベクターを提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞または細胞系を提供する。また、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、ベクターまたは細胞のいずれかの作成方法および本明細書に記載されたベクターまたは細胞のいずれかの作成方法を提供する。
【００１１】
２組以上の特定のアミノ酸を含有するＡＰＰのベータセクレターゼ切断部位を切断できるプロテアーゼをコードするアミノ酸ポリペプチドを含むいずれかの単離されたまたは精製されたペプチドもしくは蛋白質、ここに、特定のアミノ酸は約１００ないし３００のアミノ酸位置によって分離され、ここに、各位置の各アミノ酸はいずれのアミノ酸であってもよく、ここに、第１組の特定のアミノ酸はアミノ酸ＤＴＧよりなり、ここに、第１の特定の組のアミノ酸の第１のアミノ酸は第１の特定のアミノ酸Ｄであり、ここに、第２組のアミノ酸はＤＳＧまたはＤＴＧのいずれかであり、ここに、第２組の特定のアミノ酸の最後のアミノ酸は最後の特定のアミノ酸Ｇであり、ここに、第１の特定のアミノ酸は０ないし８１のいずれかの数のアミノ酸位置のアミノ酸をコードし、ここに、各位置において、それはいずれのアミノ酸であってもよい。
【００１２】
本発明は、本明細書に記載のアミノ酸ポリペプチド、ここに、第１のアミノ酸は約３０ないし７７のアミノ酸位置のペプチドに操作可能に連結し、ここに、各アミノ酸位置はいずれのアミノ酸であってもよい、を提供する。また、本発明は、本明細書に記載のアミノ酸ポリペプチド、ここに、第１の特定のアミノ酸は３５、４７、７１または７７のアミノ酸のペプチドに操作可能に連結する、を提供する。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載のアミノ酸ポリペプチド、ここに、第１の特定のアミノ酸は配列番号：３からの同一の対応するペプチドに操作可能に連結し、それは、配列番号：３のＮ末端の方向に、第１の特定の配列ＤＴＧ上のアミノ酸でカウントを開始する長さが３５、４７、７１または７７のペプチドである、を提供する。
【００１４】
本発明は、本明細書に記載のアミノ酸ポリペプチド、ここに、該ポリペプチドは配列番号：４の同一の対応するアミノ酸に少なくとも９５％同一である配列、すなわち、配列番号：４の配列の一部のものに同一である配列を含み、第１の特定のアミノ酸の前の７１、４７、３５のアミノ酸を通りかつそれを含む、Ｎ末端方向への第１または第２の特定の核酸の双方からの全配列を含む、を提供する。（実施例１０および１１）
【００１５】
本発明は、本明細書に記載のアミノ酸ポリペプチド、ここに、完全なポリペプチドは７１のアミノ酸のペプチドを含み、ここに、第１のアミノ酸はＴであって、第２がＱである、を提供する。また、本発明は、本明細書に記載の核酸ポリヌクレオチド、ここに、該ポリヌクレオチドは配列番号：３に同一の対応するアミノ酸に少なくとも９５％同一の配列、すなわち、７１のアミノ酸を通りかつそれを含むＮ末端方向への第１および第２の特定の核酸からの配列を含む配列番号：３の配列に同一である配列を含み、ＤＴＧ部位から開始され、７１のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含む実施例１０を参照されたし、を提供する。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載の核酸ポリヌクレオチド、ここに、完全なポリヌクレオチドは、配列番号：３の同一の対応するアミノ酸に同一である、すなわち、７１のアミノ酸を通り、かつそれらを含むＮ末端方向への第１および／または第２の特定の核酸からの配列を含む配列番号：３の配列に同一であるであることを特徴とし、ＤＴＧ部位から開始され、７１のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含む実施例１０を参照されたし、を提供する。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載の核酸ポリヌクレオチド、ここに、第１の特定のアミノ酸は各コドンがいずれのアミノ酸もコードできる約３０ないし５４のいずれかの数のアミノ酸をコードする核酸に操作可能に連結する、を提供する。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載の核酸ポリヌクレオチド、ここに、第１の特定の核酸は４７のコドンに操作可能に連結し、ここに、それらの３５または４７のアミノ酸の最初はアミノ酸ＥまたはＧである、を提供する。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載の核酸ポリヌクレオチド、ここに、該ポリヌクレオチドは、配列番号：３の同一の対応するアミノ酸に少なくとも９５％同一である、すなわち、３５または４７のアミノ酸を通り、かつそれらを含むＮ末端方向への第１および／または第２の特定の核酸の双方からの配列を含む配列番号：３の配列の一部のものに同一である配列を含み、ＤＴＧから開始され、ＤＴＧ部位の前の従前の３５または４７のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含む、４７の実施例についての実施例１１に参照されたし、を提供する。本発明の核酸ポリヌクレオチド、ここに、該ポリヌクレオチドは、配列番号：３の同一の対応するアミノ酸に少なくとも９５％同一である、すなわち、３５または４７のアミノ酸を通り、かつそれらを含むＮ末端方向への第１または第２の特定の核酸の双方からの配列を含む配列番号：３の配列の一部のものに同一である配列を含み、ＤＴＧから開始され、ＤＴＧ部位の前の従前の３５または４７のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含む、４７の実施例についての実施例１１に参照されたし。
【００２０】
ポリヌクレオチドを含む単離核酸分子であって、該ポリヌクレオチドがＨｕ−Ａｓｐポリペプチドをコードし、
（ａ）Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここに、該Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチドは、各々、配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６の完全なアミノ酸配列を有し；および
（ｂ） （ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列よりなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する該核酸分子。
【００２１】
本発明は、該Ｈｕ−ＡｓｐポリペプチドがＨｕ−Ａｓｐ１であって、該ポリヌクレオチド分子が配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸分子；および該Ｈｕ−ＡｓｐポリペプチドがＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）であって、該ポリヌクレオチド分子が配列番号：３のヌクレオチド配列を含む核酸分子；およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）であるＨｕ−Ａｓｐポリペプチドをコードし、該ポリヌクレオチド分子が配列番号：５のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本発明は、ストリンジェントな条件下にて、前記のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。また、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。所望により、ベクターは、Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）のごときＨｕ−Ａｓｐポリペプチドの発現用のプロモーターに操作可能に連結する核酸分子を含む。本発明は、上記に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。また、本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドを獲得する方法であって、上記に記載の宿主細胞を培養し、該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドを単離することを特徴とする該方法を提供する。本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む単離されたＨｕ−Ａｓｐ１ポリペプチド、配列番号：４のアミノ酸配列を含む配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む単離されたＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチド、および配列番号：８のアミノ酸配列を含む配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む単離されたＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）ポリペプチドを提供する。また、本発明は、本明細書に記載のＨｕ−Ａｓｐポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００２２】
ここに、発明者らは酵素をアッセイするための多数の方法を開示する。
本発明は、細胞を同定する方法であって、それを用いて、
（ａ） βセクレターゼ部位にてＡＰＰを切断できるプロテアーゼを発現する細胞を同定し；
i）  同定されるべき細胞または細胞からの上清を集め、
ii） 非常に重要なペプチドの産生を測定し、ここに、非常に重要なペプチドはＡＰＰ Ｃ末端ペプチドまたは可溶性ＡＰＰのいずれかよりなる群から選択され、
iii） 非常に重要なペプチドを産生する細胞を選択することを特徴とするβセクレターゼ活性の阻害剤につきスクリーニングする該方法を提供する。
【００２３】
一つの具体例において、細胞を集め、非常に重要なペプチドが、βセクレターゼ切断の結果として創製されたＡＰＰのＣ末端ペプチドである。もう一つの具体例において、上清は集められ、非常に重要なペプチドは可溶性ＡＰＰであり、ここに、可溶性ＡＰＰはβセクレターゼ切断によって創製されたＣ末端を有する。一つの変形において、細胞が上記に記載の核酸またはポリペプチドのいずれかを含有し、ここに、該細胞は以下のペプチド構造、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１'、Ｐ２'、ここに、Ｐ２はＫまたはＮであり、ここに、Ｐ１はＭまたはＬであり、ここに、Ｐ１'はＤであり、ここに、Ｐ２'はＡである、を有するいずれかのペプチドのβセクレターゼ部位を切断することが示される。もう一つの変形において、Ｐ２はＫであって、Ｐ１はＭであるか、またはＰ２はＮであって、Ｐ１はＬである。
【００２４】
本発明は、上記に記載のいずれかの核酸またはペプチドを含むいずれかの細菌細胞を提供する。例えば、細菌がE. coliである細菌細胞。また、本発明は、上記に記載のいずれかの核酸またはポリペプチドを含むいずれかの真核細胞を提供する。
【００２５】
本発明は、上記に記載のいずれかの核酸またはポリペプチドを含むいずれかの昆虫細胞を提供する。考えられるこれらの昆虫細胞はｓｆ９およびＨｉｇｈ ５を含む。また、本発明は、本明細書に記載のいずれかの核酸またはポリペプチドを含む哺乳動物細胞を提供する。例示的な哺乳動物細胞はヒト、齧歯類、ウサギ、霊長類よりなる群から選択され得る。例示的なヒト細胞は、ＨＥＫ２９３およびＩＭＲ−３２を含む群から選択され得る。例示的な霊長類細胞はＣＯＳ−７細胞であり得る。齧歯類細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｎｅｕｒｏ−２Ａおよび３Ｔ３細胞から選択され得る。また、本発明は、前記のいずれかの核酸またはポリペプチドを含む酵母細胞または鳥類細胞を提供する。
【００２６】
本発明は、そのアイソフォームの最後の２つのカルボキシ末端アミノ酸が共にリジン残基であるＡＰＰのいずれかのアイソフォームを提供する。アイソフォームは、（突然変異を含めた）ＡＰＰ変異体、およびＵＳ５,７６６,８４６（この文書を出典明示して本明細書の一部とみなす）、第７欄４５〜６７行に記載されたもののごときヒトにおいて存在するＡＰＰ断片を含めたいずれかのＡＰＰポリペプチドである。一つの具体例は、その最後の２つがその最後の２つのカルボキシ端末アミノ酸として２つのリジン残基を有するように修飾されたＡＰＰ６９５として知られるアイソフォームを含めた、ＡＰＰのアイソフォームである。例えば、配列番号：１６を含むＡＰＰアイソフォームまたは配列番号：１８および２０を含むＡＰＰアイソフォーム変異体。また、本発明は、修飾されたＡＰＰアイソフォームをコードする核酸または修飾されたＡＰＰアイソフォームを含むポリペプチドを含むいずれかの真核細胞系を提供する。該細胞系は、哺乳動物細胞系（ＨＥＫ２９３、Ｎｅｕｒｏ２ａ）であり得る。また、本発明は、ＡＰＰのベータセクレターゼ切断部位を切断する酵素の阻害剤を同定する方法であって、
ａ） 酵素がＡＰＰのプロセシングおよび培地へのアミロイドベータ−ペプチドの遊離を引き起こし、細胞溶解物中のＡＰＰのＣＴＦ９９断片の蓄積を引き起こす条件下にて培養基中で細胞を培養し、
ｂ） 試験化合物に培養細胞を曝露し；試験化合物が、培地へのアミロイドベータ−ペプチドの量および／または細胞溶解物中のＡＰＰのＣＴＦ９９断片の量を測定することによって酵素の機能を阻害するかを具体的に測定し；
ｃ） Ａｓｐ２阻害剤として、培養基中に存在する可溶性アミロイドベータペプチドの量を減少させるまたは細胞溶解物中のＡＰＰのＣＴＦ９９断片を減少させる試験化合物を同定することを特徴とする該方法を提供する。
【００２７】
例示的な具体例において、培養細胞がヒト、齧歯類または昆虫細胞系である。また、ヒトまたは齧歯類細胞系がβセクレターゼ活性を示し、ここにＡＰＰのプロセシングが培養基へのアミロイドベータ−ペプチドの遊離および細胞溶解物中のＣＴＦ９９の蓄積を生じると考えられ、その考えられる試験化合物のうちβセクレターゼ活性を示す酵素に対して指向されたアンチセンス・オリゴマーは、培養基への可溶性アミロイドベータ−ペプチドの遊離および細胞溶解物中のＣＴＦ９９の蓄積を低下させると考えられる。Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性を低下させる薬剤の同定方法であって、
（ａ） 試験薬剤の存在下および試験薬剤の不存在下にて、該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性を測定し、次いで
（ｂ） 該試験薬剤の存在下にて測定した該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性と該試験薬剤の不存在下にて測定した該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性とを比較し；
それによって、該試験薬剤の不存在下よりも該試験薬剤の存在下にて低レベルの活性は、該試験薬剤が該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性を低下させたことを示すことを特徴とする該方法。本明細書に記載された核酸、ペプチド、蛋白質、ベクター、細胞および細胞系、ならびにアッセイ。
【００２８】
本発明は、ヒトアスパルチル・プロテアーゼよりなる群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を供する。詳細には、ヒトアスパルチル・プロテアーゼ１（Ｈｕ−Ａｓｐ１）、および本明細書中でＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）という２つの代替スプライス変異体のヒトアスパルチル・プロテアーゼ２（Ｈｕ−Ａｓｐ２）。本明細書に用いるごとく、「Ｈｕ−Ａｓｐ」に対する全ての参考文献は、Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）の全てをいうと理解されるべきである。さらに、本明細書に用いるごとく、「Ｈｕ−Ａｓｐ２」に対する全ての参考文献は、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）の全てをいうと理解されるべきである。Ｈｕ−Ａｓｐ１は膵臓および前立腺の組織に最も豊富に発現され、一方、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）は膵臓および脳の組織に最も豊富に発現される。また、本発明は、単離されたＨｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチド、ならびにアスパルチル・プロテアーゼ活性を示すその断片を供する。
【００２９】
好ましい具体例において、該核酸分子は、Ｈｕ−Ａｓｐ１をコードする配列番号：１の残基１〜１５５４、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）をコードする配列番号：３の残基１〜１５０３、およびＨｕ−Ａｓｐ（ｂ）をコードする配列番号：５の残基１〜１４２８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。もう１つの態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下にてＨｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ｂ）またはその断片をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を供する。欧州特許出願ＥＰ ０ ８４８ ０６２は、Ｈｕ−Ａｓｐ１に実質的な相同性を担う「Ａｓｐ １」と引用されるポリペプチドを開示し、一方、国際出願ＷＯ９８／２２５９７は、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）に実質的な相同性を担う「Ａｓｐ ２」と引用されるポリペプチドを開示する。
【００３０】
また、本発明は、本発明の単離核酸分子、かかるベクターが挿入された宿主細胞およびＨｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）またはＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチドを得る組換え方法を含み、上記宿主細胞を培養し、関連したポリペプチドを単離することを特徴とする。
【００３１】
もう１つの態様において、本発明は、単離されたＨｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチド、ならびにその断片を供する。好ましい具体例において、Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチドは、各々、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６に与えられたアミノ酸配列を有する。また、本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ２の活性形態、かかる活性形態の調製方法、可溶性形態の調製方法、Ｈｕ−Ａｓｐ２活性の測定方法およびＨｕ−Ａｓｐ２切断の基質を記載する。また、本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ） ｍＲＮＡ転写体を標的としたアンチセンス・オリゴマー、およびかかるｍＲＮＡおよびその結果としての対応するポリペプチドの産生を記載する。
【００３２】
また、本発明のＨｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチドのいずれかに特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナルの双方の単離された抗体が供される。また、本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）のいずれかの活性を調節する試薬の同定方法を供する。本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ２ポリペプチドが添加された無細胞アッセイにおけるかかる薬剤を試験する方法、ならびにＨｕ−Ａｓｐ２が存在するヒトまたは他の哺乳動物の細胞におけるかかる試薬を試験する方法を記載する。
【００３３】
配列表の簡単な記載
配列番号.１−ヒトＡｓｐ−１、ヌクレオチド配列
配列番号.２−ヒトＡｓｐ−１、アミノ酸配列
配列番号.３−ヒトＡｓｐ−２（ａ）、ヌクレオチド配列
配列番号.４−ヒトＡｓｐ−２（ａ）、予測アミノ酸配列
配列番号.５−ヒトＡｓｐ−２（ｂ）、ヌクレオチド配列
配列番号.６−ヒトＡｓｐ−２（ｂ）、予測アミノ酸配列
配列番号.７−ネズミＡｓｐ−２（ａ）、ヌクレオチド配列
配列番号.８−ネズミＡｓｐ−２（ａ）、予測アミノ酸配列
配列番号.９−ヒトＡＰＰ６９５、ヌクレオチド配列
配列番号.１０−ヒトＡＰＰ６９５、予測アミノ酸配列
配列番号.１１−ヒトＡＰＰ６９５−Ｓｗ、ヌクレオチド配列
配列番号.１２−ヒトＡＰＰ６９５−Ｓｗ、予測アミノ酸配列
配列番号.１３−ヒトＡＰＰ６９５−ＶＦ、ヌクレオチド配列
配列番号.１４−ヒトＡＰＰ６９５−ＶＦ、予測アミノ酸配列
配列番号.１５−ヒトＡＰＰ６９５−ＫＫ、ヌクレオチド配列
配列番号.１６−ヒトＡＰＰ６９５−ＫＫ、予測アミノ酸配列
配列番号.１７−ヒトＡＰＰ６９５−Ｓｗ−ＫＫ、ヌクレオチド配列
配列番号.１８−ヒトＡＰＰ６９５−Ｓｗ−ＫＫ、予測アミノ酸配列
配列番号.１９−ヒトＡＰＰ６９５−ＶＦ−ＫＫ、ヌクレオチド配列
配列番号.２０−ヒトＡＰＰ６９５−ＶＦ−ＫＫ、予測アミノ酸配列
配列番号.２１−Ｔ７−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ、ヌクレオチド配列
配列番号.２２−Ｔ７−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ、アミノ酸配列
配列番号.２３−Ｔ７−カスパーゼ（caspase）−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ、ヌクレオチド配列
配列番号.２４−Ｔ７−カスパーゼ−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ、ヌクレオチド配列
配列番号.２５−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ（低ＧＣ）、ヌクレオチド酸配列
配列番号.２６−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ（低ＧＣ）、アミノ酸配列
配列番号.２７−Ｔ７−カスパーゼ−カスパーゼ８切断−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ、ヌクレオチド酸配列
配列番号.２８−Ｔ７−カスパーゼ−カスパーゼ８切断−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ、アミノ酸配列
配列番号.２９−ヒトＡｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ、ヌクレオチド配列
配列番号.３０−ヒトＡｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ、アミノ酸配列
配列番号.３１−ヒトＡｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ（Ｈｉｓ）６、ヌクレオチド配列
配列番号.３２−ヒトＡｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ（Ｈｉｓ）６、アミノ酸配列
配列番号：３３〜４６は発明の詳細な記載に後記される。
【００３４】
（発明の詳細な記載）
この発明において用いられた少数の定義は以下の通りであり、用いられた大部分の定義は当業者によって用いられるものである。
【００３５】
βアミロイドペプチドの場合、ＡＰＰのベータセクレターゼ切断から生じるいいずれものペプチド。これは、β−セクレターゼ切断部位から３９、４０、４１、４２および４３のアミノ酸まで延びる３９、４０、４１、４２および４３のアミノ酸のペプチドを含む。また、βアミロイド・ペプチドは、１９９８年５月１２日に発行されたＵＳ５,７５０,３４９（この文書を出典明示して本明細書の一部とみなす）の配列番号：１〜６である配列１〜６を意味する。本明細書に開示されたβ−セクレターゼ切断断片は、ＣＴＦ−９９と呼ばれ、それはβセクレターゼ切断部位からＡＰＰのカルボキシ末端まで延びる。
【００３６】
ＡＰＰのアイソフォームを言及する場合、意味するものは、ＵＳ５,７６６,８４６（この文書を出典明示して本明細書の一部とみなす）、第７欄４５〜６７行に記載されたもののごとき、（変異体を含めた）ＡＰＰ変異体、およびヒトにおいて存在するＡＰＰ断片を含めたいずれかのＡＰＰポリペプチドである。
【００３７】
本明細書に用いられる「β−アミロイド前駆蛋白質」（ＡＰＰ）なる用語は、第２１染色体の長腕上のヒトに局在した同一名称の遺伝子によってコードされ、その第三カルボキシル内に、「βＡＰ−ここに、β−アミロイド蛋白質」（上記参照）を含むポリペプチドと定義される。ＡＰＰは、多数の哺乳動物組織における非常に様々な細胞において発現されたグリコシル化された単一膜にわたる蛋白質である。ヒトに存在することが現在知られているＡＰＰの特定のイソタイプの例は、「正常な」ＡＰＰとして命名されているKangら（１９８７） Nature ３２５：７３３−７３６によって記載された６９５個のアミノ酸ポリペプチド； Ponteら（１９８８） Nature ３３１：５２５−５２７およびTanziら（１９８８） Nature ３３１：５２８−５３０によって記載された７５１個のアミノ酸ポリペプチド；およびKitaguchiら（１９８８） Nature ３３１：５３０−５３２によって記載された７７０個のアミノ酸ポリペプチドである。ＡＰＰの特定の変異体の例には、位置および表現型が共に異なり得る点変異が含まれる（公知の変異体の突然変異の概説についてはHardy（１９９２）Nature Genet.１：２３３−２３４を参照）。全ての参考文献をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。本明細書に用いる「ＡＰＰ断片」なる用語は、単独にてβＡＰまたはβＡＰ断片よりなるもの以外のＡＰＰ断片をいう。すなわち、ＡＰＰ断片は、無傷の３ＡＰまたはβＡＰの断片を形成するものに加えてＡＰＰのアミノ酸配列を含有するであろう。
【００３８】
「いずれかのアミノ酸」なる用語を用いる場合、アミノ酸とは、以下の用いることができる次の３文字および１文字略語から選択されるべきものをいい、以下の通り供される：
アラニン、Ala、A；アルギニン、Arg、R；アスパラギン、Asn、N；アスパラギン酸、Asp、D；システイン、Cys、C；グルタミン、Gln、Q；lu；E−グルタミン酸、Glu、E；グリシン、Gly、G；ヒスチジン、His、H；イソロイシン、Ile、I；ロイシン、Leu、L；リジン、Lys、K；メチオニン、Met、M；フェニルアラニン、Phe、F；プロリン、Pro、P；セリン、Ser、S；トレオニン、Thr、T；トリプトファン、Trp、W；チロシン、Tyr、Y；バリン、Val、V；アスパラギン酸またはアスパラギン、Asx、B；グルタミン酸またはグルタミン、Glx、Z；いずれかのアミノ酸、Xaa、X。
【００３９】
本発明は、アスパルチル・プロテアーゼの単一の活性部位モチーフ特性につき遺伝子データ・ベースを走査する方法を記載する。ペプシンとレニンのごとき真核生物アスパルチル・プロテアーゼは、活性部位内の接近へ２つのアスパルチル残基をもたらすように折りたたむ２つのドメイン構造を保有する。これらは短いトリペプチドモチーフＤＴＧまたは例外的に、ＤＳＧに埋め込まれている。大部分のアスパルチル・プロテアーゼは、活性化のためにＮ末端を切断しなければならないプロ酵素として生じる。ＤＴＧまたはＤＳＧの活性部位モチーフは、プロ酵素（レニン、ペプシノーゲン）において約残基６５〜７０にて現れるが、Ｎ末端プロドメインの切断後の活性酵素において約残基２５〜３０にて現われる。制限された長さの活性部位モチーフは、新規なアスパルチル・プロテアーゼについての短く発現された配列・タグ（ＥＳＴ）の収集を検索することを困難にする。ＥＳＴ配列は典型的には２５０個以下のヌクレオチドを平均とし、したがって、８０〜９０個以下のアミノ酸残基をコードするだろう。それがあまりにも短い配列であるので、２つの活性部位モチーフにまたがることができない。好ましい方法は、仮説のまたは組立てられた蛋白質をコードする配列のデータベースを走査することである。本発明は、蛋白質配列データベースにおける候補アスパルチル・プロテアーゼを同定するためのコンピューター方法を記載する。該方法を用いて、Caenorhabditis elegansゲノム中の７つの候補アスパルチル・プロテアーゼ配列を識別した。次いで、これらの配列を用いて、Ｈｕ−Ａｓｐ１と、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）として本明細書に命名されるＨｕ−Ａｓｐ２の２つの代替スプライス変異体を相同性検索によって同定する。
【００４０】
本明細書に記載された発明の主要な態様において、発明者らはＡＰＰプロセシングについて新しい情報を供する。Ａβ経路を介するアミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）の病原性プロセシングは、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼという２つのプロテアーゼの順次作用を必要とする。β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、各々、ＡβペプチドのＮ末端およびＣ末端を生成する。Ａβペプチド、特にＡβ１−４２のオーバープロダクションがアルツハイマー病の開始に関連付けられてきているので、β−セクレターゼおよび／またはγ−セクレターゼのいずれかの阻害剤は、アルツハイマー病の治療に潜在性を有する。ＡＰＰの病原性プロセシングにおけるβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼの重要性にも拘らず、これらの酵素の分子的な定義は今日まで達成されていない。すなわち、酵素がβ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼの切断部位のいずれかにて切断に必要とされるものは不明である。その部位は、それ自体が、ＡＰＰが公知であり、Ａβ１−４２ペプチドが公知であるために知られ、ＵＳ５,７６６,８４６およびＵＳ５,８３７,６７２（「可溶性」ペプチドの引用を除いて、出典明示して本明細書の一部とみなす）を参照されたし。しかし、Ａβ１−４２ペプチドの産生において含まれる酵素は不明であった。
【００４１】
本発明は、いくつかの新規なヒトアスパルチル・プロテアーゼを含み、Ｈｕ−Ａｓｐ−２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）というこれらの１つを詳細に特徴付けてきた。ａｓｐ１およびａｓｐ２の従前の形態は開示され、Smith Kline Beecham Corp.に譲渡された発明者David PowelらのＥＰ０８４８０６２Ａ２およびＥＰ０８５５４４４Ａ２（出典明示して本明細書の一部とみなす）を参照されたし。ここに、Ｈｕ−Ａｓｐ２の古いおよび新しい形態を開示する。初めて、それらは活性形態において表され、それらの基質は開示され、それらの特異性は開示される。この開示の細胞および細胞抽出物がβセクレターゼ部位を切断するのを必要とするのに先立ち、現在の精製された蛋白質がアッセイに用いることができ、また本明細書に記載できる。（１）アンチセンスノックアウト実験、（２）実験における一過性のトランスフェクション・ノック、および（３）精製された組換えＨｕ−Ａｓｐ−２を用いる生化学的実験の結果に基づいて、発明者らはＨｕ−Ａｓｐ−２がＡＰＰのプロセシングに関与するβ−セクレターゼであることを示す。Ｈｕ−Ａｓｐ−２（ａ）のヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列は報告されている（前記参照、ＥＰ ０８４８０６２Ａ２およびＥＰ０８５５４４４Ａ２を参照）が、該酵素の機能的な特徴付けは開示されなかった。ここに、発明者らはＨｕ−Ａｓｐ−２酵素を特徴付けし、それがＡβ１−４２ペプチドの形成において非常に重要で本質的な酵素であり、ＡＤの発生において非常に重要なステップを可能とするかを説明できる。
【００４２】
また、もう一つの具体例において、本発明は今まで開示されていないＨｕ−Ａｓｐ−２（ｂ）というＨｕ−Ａｓｐ２の新規なスプライス変異体を記載する。
【００４３】
もう一つの具体例において、本発明は、ヒトアスパルチル・プロテアーゼ１（Ｈｕ−Ａｓｐ１）ならびにＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）として本明細書に命名されたヒトアスパルチル・プロテアーゼ２（Ｈｕ−Ａｓｐ２）の２つの代替スプライス変異体よりなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリペプチドを含む単離核酸分子を供する。本明細書に用いられるごとく、「Ｈｕ−Ａｓｐ２」なる全ての引用は、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）の双方をいうと理解されるべきである。Ｈｕ−Ａｓｐ１は膵臓および前立腺の組織に最も豊富に発現され、一方、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）は膵臓および脳の組織に最も豊富に発現される。また、本発明は、単離されたＨｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）ポリペプチド、ならびにアスパルチル・プロテアーゼ活性を示すその断片を供する。
【００４４】
Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）の予測アミノ酸配列は、ペプシノーゲンＡ、ペプシノーゲンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥおよびレニンのごとき従前に同定された哺乳動物アスパルチル・プロテアーゼとかなり相同性を共有する。P.B.Szecs、Scand. J. Clin. Lab. Invest. ５２：（Suppl.２１０ ５−２２（１９９２）。これらの酵素は、二連のＤＴＧ／ＤＳＧ配列モチーフの存在によって特徴付けられる。また、本明細書に開示されたＨｕ−Ａｓｐ１およびＨｕ−Ａｓｐ２のポリペプチドは、SwissProtデータ・ベースから抽出されたアスパルチル・プロテアーゼについてのProSiteコンセンサス・モチーフと非常に高い相同性を示す。
【００４５】
配列番号：１の残基１〜１５５４として与えられたヌクレオチド配列は、Ｈｕ−Ａｓｐ１をコードするヌクレオチド配列に対応し、配列番号：３の残基１〜１５０３として与えられたヌクレオチド配列はＨｕ−Ａｓｐ２（ａ）をコードするヌクレオチド配列に対応し、配列番号：５の残基１〜１４２８として与えられたヌクレオチド配列はＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）をコードするヌクレオチド配列に対応する。Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ−２（ｂ）をコードするＤＮＡの単離および配列決定は、実施例１および２に後記される。
【００４６】
実施例１および２に記載のごとく、自動配列決定法を用いて、Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ−２（ｂ）のヌクレオチド配列を得た。本発明のＨｕ−Ａｓｐヌクレオチド配列は、両ＤＮＡ鎖について得られ、１００％正確であると考えられている。しかしながら、当該技術分野において知られるごとく、かかる自動化された方法によって得られたヌクレオチド配列は、いくらかの誤りを含有しかねない。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、所与の核酸分子の実際のヌクレオチド配列に典型的には少なくとも９０％、より典型的には少なくとも９５％ないし少なくとも９９.９％同一である。実際の配列は、当該技術分野においてよく知られたマニュアルの配列決定法を用いてより正確に決定できる。１以上のヌクレオチドの挿入および欠失を生じる配列の誤りの結果、予測アミノ酸が突然変異の点から開始する核酸分子の実際のヌクレオチド配列から予測されるものとは異なるであろうように翻訳においてフレームシフトを生じかねない。本発明のＨｕ−ＡｓｐＤＮＡには、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそれの組合せが含まれる。ゲノムＨｕ−ＡｓｐＤＮＡは、当該技術分野においてよく知られる方法を用いることによって、本明細書に記載されたＨｕ−Ａｓｐ２ ｃＤＮＡで、またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を活性化するであろうＨｕ−Ａｓｐ２配列から選ばれたオリゴヌクレオチドでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。また、Ｈｕ−ＡｓｐＤＮＡから転写されたＲＮＡは、本発明によって包含される。
【００４７】
遺伝暗号の縮重により、２つのＤＮＡの配列は異なり、依然として同一のアミノ酸配列をコードするかもしれない。かくして、本発明は、本発明のＨｕ−Ａｓｐポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を供し、ここに、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６またはその断片の完全なアミノ酸配列を有するＨｕ−Ａｓｐポリヌクレオチドをコードする。
【００４８】
また、組換え体および非組換え体の双方の精製されたＨｕ−Ａｓｐポリペプチドがここに供される。最も重要なことには、活性形態のＨｕ−Ａｓｐ２ポリペプチドを産生する方法が供されることである。これらには、細菌細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞における、また、細菌、昆虫および哺乳動物の細胞から培養基へのＨｕ−Ａｓｐ２ポリペプチドの分泌を可能とする形態におけるＨｕ−Ａｓｐ１ポリペプチドおよびその変異体の産生、また、順次精製を促進するアミノ酸タグを取り込むＨｕ−Ａｓｐ２ポリペプチドの変異体を精製する方法が含まれる。本発明の好ましい実施例において、Ｎ末端配列TQHGIR（配列番号：５６）またはETDEEP（配列番号：５７）で開始されるＨｕ−Ａｓｐ２ポリペプチドの活性形態のごとく、形質転換細胞において、または無細胞系における精製および第２のプロテアーゼによる切断後のいずれかにて蛋白質分解的に活性な形態に変換される。また、Ｈｕ−Ａｓｐのいずれかの生物学的活性を保持する配列番号：２、４および６に与えられる天然のアミノ酸配列を有するＨｕ−Ａｓｐ蛋白質の断片を含めた変異体および誘導体も本発明の範囲内である。もちろん、当業者ならば、Ｈｕ−Ａｓｐ蛋白質の変異体、誘導体または断片が、その変異体、誘導体または断片を標準的なアスパルチル・プロテアーゼアッセイに付すことによってＨｕ−Ａｓｐ活性を示すかどうかを容易に決定できるであろう。本発明の範囲内のＨｕ−Ａｓｐの断片には、アミノ酸配列ＤＴＧを含有する活性部位ドメインを含有するもの、活性部位ドメインアミノ酸配列ＤＳＧを含有する断片、ＤＴＧおよびＤＳＧ活性部位配列の双方を含む断片、ＤＴＧおよびＤＳＧ活性部位配列のスプライシングが延ばされた断片、スプライシングが短くされた断片が含まれる。また、膜貫通ドメインを除去して可溶性形態におけるＨｕ−Ａｓｐ２の産生を可能とするＨｕ−Ａｓｐの断片も本発明の範囲内である。本発明のもう一つの具体例において、各々が単一活性部位のＤＴＧまたはＤＳＧ配列を含有するＨｕ−Ａｓｐ２の２つの半分は、組換え体ポリペプチドとして独立して産生でき、次いでそれらが活性プロテアーゼを再構築する溶液に合わせることができる。
【００４９】
Ｈｕ−Ａｓｐ変異体は、例えば、天然のＨｕ−Ａｓｐをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることできる。本明細書に引用されるごとく、Ｈｕ−Ａｓｐ変異体は、天然のＨｕ−Ａｓｐポリペプチドに実質的に相同性のポリペプチドであるが、それはアミノ酸配列において１以上の欠失、挿入または置換のために天然のＨｕ−Ａｓｐのものとは異なるアミノ酸配列を有する。変異体アミノ酸またはヌクレオチド配列は、天然のＨｕ−Ａｓｐ配列に好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、および最も好ましくは少なくとも９５％同一である。かくして、例えば、天然のＨｕ−Ａｓｐ遺伝子に比較して１００個のヌクレオチド毎に５つの点変異を含有する変異体ヌクレオチド配列は、天然の蛋白質に９５％同一であろう。また、天然および変異のＨｕ−Ａｓｐ配列間の相同性とも呼ばれる配列同一性のパーセンテージは、例えば、SmithおよびWatermanのアルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2： 482-489（1981））を用いるＧａｐプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin）のごときこの目的に共通して使用されるコンピュータープログラムのいずれを用いても２つの配列を比較することによって決定できる。
【００５０】
天然のアミノ酸配列の変更は、多数の公知の技術のうちのいずれによっても達成できる。例えば、突然変異は、Walderら（Gene 42：133（1986））；Bauerら（Gene 37：73（1985））；Craik（BioTechniques, January 1985, pp. 12-19）；Smith ら（Genetic Engineering： Principles and Methods, Plenum Press（1981））：米国特許第４,５１８,５８４号および第４,７３７,４６２号によって記載されるオリゴヌクレオチド指令した突然変異のごとき当業者によく知られた手法によって特定の位置にて導入できる。
【００５１】
発明の範囲内のＨｕ−Ａｓｐ変異体は、保存的に置換された配列を含むことができ、これはＨｕ−Ａｓｐポリペプチドの１以上のアミノ酸残基がＨｕ−Ａｓｐポリペプチドの二次および／または三次の構造を変更しない異なる残基によって置換されることを意味する。かかる置換は、脂肪族残基（Ile、Val、LeuまたはAla）を他のものと置換する、または塩基性残基SerおよびArg、酸性残基GluおよびAsp、アミド残基GlnおよびAsn、ヒドロキル残基SerおよびTyr、または芳香族残基PheおよびTyr間の置換のごとき同様な物理化学的特性を有する残基によるアミノ酸の置換を含み得る。サイレントアミノ酸交換を表現型的に行うことに関するさらなる情報は、Bowieら, Science 247：1306-1310（1990）に見出すことができる。Ｈｕ−Ａｓｐの生物学的活性を実質的に保持できる他のＨｕ−Ａｓｐ変異体は、アミノ酸置換が蛋白質の機能領域の外側の領域においてなされるものである。
【００５２】
もう一つの態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下にて、前記の核酸分子の一部、例えば、先に記載された核酸分子のちの一つの少なくとも約１５個のヌクレオチド、好ましくは約２０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約３０個のヌクレオチド、さらにより好ましくは３０ないし少なくとも約１００個のヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を供する。記載された長さを有する核酸分子のかかる一部は、例えば、参照核酸分子の少なくとも約１５個の隣接するヌクレオチドをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６×ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳ中での約４２℃にて約２.５時間の一晩のインキュベーション、続いて６５℃の１.０×ＳＳＣ中のフィルターの洗浄を示す。
【００５３】
本明細書に記載されたＨｕ−Ａｓｐをコードする核酸分子の断片ならびにかかる核酸分子にハイブリダイズできるポリヌクレオチドをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）におけるプローブまたはプライマーとして用いることができる。かかるプローブを用いて、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、ならびにサーザンおよびノーザンブロットにおいてＨｕ−Ａｓｐ核酸の存在を検出できる。また、Ｈｕ−Ａｓｐを発現する細胞タイプは、かかるプローブを用いて同定できる。かかる手法はよく知られており、当業者ならば特定の適用に適した長さのプローブを選定できるであろう。ＰＣＲでは、所望のＨｕ−Ａｓｐ核酸分子の末端に対応する５'および３'プライマーを使用して、従来技術を用いてその配列を単離し増幅する。
【００５４】
Ｈｕ−Ａｓｐ核酸分子の他の有用な断片は、（センス鎖を用いる）標的のＨｕ−Ａｓｐ ｍＲＮＡまたは（アンチセンス鎖を用いる）Ｈｕ−Ａｓｐ ＤＮＡ配列に結合できる一本鎖核酸配列を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドである。本発明の好ましい具体例において、これらのＨｕ−Ａｓｐアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｈｕ−Ａｓｐ ｍＲＮＡおよびＨｕ−Ａｓｐポリヌクレオチドの結果的な産生を低下させる。
【００５５】
もう一つの態様において、本発明は、関連した天然のパターンのグリコシル化を含むまたは含まないＨｕ−Ａｓｐポリペプチドを含む。Ｈｕ−Ａｓｐ１およびＨｕ−Ａｓｐ２の双方は、Asn−リンクした糖についての標準的受容体部位を有し、Ｈｕ−Ａｓｐ１はかかる部位の２つを有し、Ｈｕ−Ａｓｐ２は４つを有する。酵母または哺乳動物発現系（後記）において発現されたＨｕ−Ａｓｐは、分子量およびグリコシル化パターンにおける天然のＨｕ−Ａｓｐポリペプチドに類似するかまたはかなり異なっていてもよい。細菌発現系におけるＨｕ−Ａｓｐの発現は、非グリコシル化Ｈｕ−Ａｓｐを供するであろう。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、単離された形態において好ましくは供され、好ましくは実質的に精製される。Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノールの沈殿、アニオンまたはカチオンイオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含めたよく知られた方法によって、組織、培養細胞または組換え細胞培養物から回収でき精製できる。好ましい具体例において、アミノ酸タグは、当該技術分野の実践者によく知られた遺伝子工学技術を用いてＨｕ−Ａｓｐポリペプチドに付加され、それは６個のヒスチジン残基の付加を含み、適当な支持体、限定されるものではないが、Ｔ７エピトープ、ｍｙｃエピトープおよびＶ５ａエピトープを含めたポリクローナルおよびモノクローナル抗体についてのエピトープ上に固定されたニッケルに結合させることによって、および限定されるものではないが、グルタチオンＳトランスフェラーゼまたはマルトース結合蛋白質を含めた適当な蛋白質パートナーに対するＨｕ−Ａｓｐ２の融合によって精製できる。好ましい具体例において、これらのさらなる配列は、Ｈｕ−ＡｓｐのＣ末端に付加されるが、Ｎ末端またはＨｕ−Ａｓｐポリペプチド内の介在位置にて付加されてもよい。
【００５７】
また、本発明は、本発明のポリペプチド分子を含むベクター、ならびにかかるベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明のいずれのポリヌクレオチドも一般的に宿主の増殖につき選択的マーカーおよび複製の起源を含むベクターに連結できる。また、本発明は前記のポリヌクレオチド分子から発現されたＨｕ−Ａｓｐポリペプチドを供するために、Ｈｕ−Ａｓｐの発現のベクターが好ましい。ベクターには、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子から由来するもののごとき適当な転写または翻訳の調節配列に操作可能に連結する前記または後記のＨｕ−ＡｓｐポリペプチドのいずれかのＨｕ−ＡｓｐをコードするＤＮＡが含まれる。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボゾーム結合部位、ならびに転写および翻訳を制御する適当な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がＨｕ−ＡｓｐをコードするＤＮＡに機能的に関連する場合に操作可能に連結する。かくして、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列がＨｕ−Ａｓｐ配列の転写を指令するならばＨｕ−Ａｓｐ ＤＮＡ配列に操作可能に連結する。
【００５８】
Ｈｕ−Ａｓｐをコードするポリヌクレオチド分子のクローニングについて、またはＨｕ−Ａｓｐポリペプチドの発現について用いられるべき適当なベクターの選定は、もちろん、ベクターが形質転換するであろう宿主、適当な場合には、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドが発現されるべきである宿主細胞に依存するであろう。Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの発現についての適当な宿主細胞には、各々が後記される原核、酵母および高等真核の細胞が含まれる。
【００５９】
また、かかる宿主細胞において発現されるべきＨｕ−Ａｓｐポリペプチドは、ヘテロローガスな（heterologous）蛋白質からの領域を含む融合蛋白質であり得る。かかる領域は、ポリペプチドの分泌、改善された安定性または精製の促進を可能とすることを含み得る。例えば、適当なシグナルペプチドをコードする配列は発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチドについてのＤＮＡ（分泌リーダー）は、Ｈｕ−Ａｓｐがシグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳されるようにＨｕ−Ａｓｐ配列にイン・フレーム融合できる。示された宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの細胞外分泌を促す。好ましくは、シグナル配列は、細胞からのＨｕ−Ａｓｐの分泌に際してＨｕ−Ａｓｐポリペプチドから切断されるであろう。本発明を実施するのに用いることができるシグナル配列の非限定例には、ｓｆ９昆虫細胞における酵母Ｉ因子およびミツバチメラチンリーダーが含まれる。
【００６０】
好ましい具体例において、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドは、ポリペプチドの精製を促進するのに用いたヘテロローガスな領域を含む融合蛋白質であろう。かかる機能につき用いた多数の入手可能なペプチドは、融合蛋白質と結合パートナーとの選択的な結合を可能とする。例えば、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドはペプチドを含むように修飾して、結合パートナーまたはペプチドタグに特異的に結合する融合蛋白質を形成できる。かかるペプチドタグの非限定例には、６−Ｈｉｓタグ、チオレドキシンタグ、ヘマグルチニンタグ、ＧＳＴタグおよびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。当業者によって理解されるごとく、ペプチドを認識し、結合する結合バートナーは、金属イオン（例えば、金属アフィニティーカラム）、抗体またはその断片を含めたいずれの分子または化合物、ならびにＦＬＡＧタグのごときペプチドに結合するいずれの蛋白質またはペプチドであり得る。
【００６１】
Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドについての適当な宿主細胞には、原核、酵母および高等真核の細胞が含まれる。Ｈｕ−Ａｓｐの発現につき用いられるべき適当な原核生物宿主には、Escherichia、BacillusおよびSalmonella属ならびにPseudomonas、StreptomycesおよびStaphylococcus属のメンバーが含まれる。例えば、E. coliにおける発現では、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドには、真核生物宿主における組換え体ポリペプチドの発現を促進するためにＮ末端メチオニン残基が含まれてもよい。次いで、Ｎ末端Ｍｅｔは、発現したＨｕ−Ａｓｐポリペプチドから所望により切断できる。他のＮ末端アミノ酸残基をＨｕ−Ａｓｐポリペプチドに付加して、限定されるものではないが、Ｔ７リーダー配列、Ｔ７−カスパーゼ８リーダー配列、ならびに６−Ｈｉｓタグのごとき精製用のタグを含む他のリーダーを含めてEscherichia coliにおける発現を促進できる（実施例９）。E. coliにおいて発現されたＨｕ−Ａｓｐポリペプチドは、細胞質テール、膜貫通ドメインまたは膜近位領域の除去によって短くできる。E. coliにおいて発現されたＨｕ−Ａｓｐポリペプチドは、可溶性形態または不溶性形態のいずれでも得ることができ、それは封入体として存在しても存在しなくてもよい。不溶性ポリペプチドは、グアニジンＨＣｌ、尿素または他の蛋白質変性剤によって可溶性にでき、適当な水性緩衝液への希釈または透析によって精製前後の可溶性形態に再度折りたたまれた。Ｈｕ−Ａｓｐの不活性プロ形態は、組換え法を用いて産生されたならば、それは、ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼのごとき適当なプロテアーゼでプロセグメントを切断して除くことによって活性とできる。
【００６２】
真核生物宿主において用いる発現ベクターは、一般的には、１以上の表現型の選択可能なマーカー遺伝子を含む。かかる遺伝子は、一般的には、例えば、抗生物質耐性を与える、または栄養要求性の要求を供給する蛋白質をコードする。非常に広範囲のかかるベクターは、商業的な源から容易に入手可能である。実施例には、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Promega）、ｐＰＲＯＥＸベクター（LTI, Bethesda, MD）、Bluescriptベクター（Stratagene）、ｐＥＴベクター（Novagen）およびｐＱＥベクター（Qiagen）が含まれる。
【００６３】
また、Ｈｕ−Ａｓｐは、Saccharomyces、PichiaおよびKluveromycesを含めた属からの酵母宿主細胞において発現できる。好ましい酵母宿主は、S. cerevisiae およびP. pastorisである。酵母ベクターは、しばしば、２Ｔ酵母プラスミド、自律複製配列（ARS）、プロモーター領域、ポリアデニール化のための配列、転写終結配列、選択可能なマーカー遺伝子からの複製配列の起源を含む。また、（シャトルベクターという）酵母およびE. coliの双方において複製可能なベクターを用いることができる。また、酵母ベクターの前記の特徴に加えて、シャトルベクターは、大腸菌における応答および選択のための配列を含むであろう。酵母宿主において発現されたＨｕ−Ａｓｐポリペプチドの直接的分泌は、Ｈｕ−Ａｓｐをコードするヌクレオチド配列の５'末端にて酵母I−因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列の切断によって達成できる。
【００６４】
また、昆虫宿主細胞系は、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの発現のために用いることができる。好ましい具体化において、本発明のＨｕ−Ａｓｐポリペプチドは昆虫細胞発現系を用いて発現される（実施例１０参照）。さらに、バキュロウイルス発現系は、LuckowおよびSummers, Bio／Technology 6：47（1988）によって概説されるごとき昆虫細胞における発現のために用いることができる。
【００６５】
もう一つの好ましい具体例において、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドは哺乳動物宿主細胞において発現される。適当な哺乳動物細胞系の非限定例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（Gluzmanら、Cell 23：175（1981））、ヒト胚腎臓細胞系２９３、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、Ｈｕ−Ａｓｐ蛋白質の発現のために用いられる（実施例１１）。
【００６６】
本発明のＨｕ−Ａｓｐポリペプチドの発現のための適当な発現ベクターの選択は、もちろん、用いられるべき特定の哺乳動物宿主細胞に依存し、当業者の技量内にある。適当な発現ベクターの実施例には、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）およびｐＳＶＬ（Pharmacia Biotech）が含まれる。Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの発現用の好ましいベクターはｐｃＤＮＡ３.１−Ｈｙｇｒｏ（Invitrogen）である。哺乳動物宿主細胞に用いる発現ベクターは、ウイルスのゲノムに由来した転写および翻訳の制御配列を含むことができる。本発明において用い得る共通して用いられたプロモーター配列およびエンハンサー配列には、限定されるものではないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来したものが含まれる。哺乳動物発現ベクターの構築方法は、例えば、OkayamaおよびBerg（Mol. Cell. Biol. 3：280（1983））；Cosmanら.（Mol. Immunol. 23：935（1986））；Cosman ら（Nature 312：768（1984））；EP-A-0367566；および WO 91／18982に記載されている。
【００６７】
また、本発明のポリペプチドを用いて、Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチド発現は検出するための診断的分析において有用であるポリクローナルおよびモノクローナルの抗体を生起できる。かかる抗体は従来技術によって調製できる。例えば、Antibodies： A Laboratory Manual, Harlow and Land（編）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,（1988）；Monoclonal Antibodies, Hybridomas： A New Dimension in Biological Analyses, Kennetら（編）, Plenum Press, New York（1980）参照。また、５ないし２０個のアミノ酸を含有するＨｕ−Ａｓｐの一部を含む合成ペプチドは、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、またはペプチドがシステインを含有するならば、Ｎ−メチルマレイミドを含めた種々の架橋試薬を用いて、限定されるものではないが、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ・オバルブミンまたはウシ血清アルブミンを含めた適当なキャリアー蛋白質に結合後にポリクローナルおよびモノクローナルの抗体の産生のために用いることができる。ＫＬＨをコンジュゲートする場合の免疫化に好ましいペプチドは、各々、QRRPRDPEVVNDESSLVRHRWK（配列番号：５０）またはLRQQHDDFADDISLLK（配列番号：５１）を含むＨｕ−Ａｓｐ１またはＨｕ−Ａｓｐ２のＣ末端を含む。
【００６８】
また、本発明のＨｕ−Ａｓｐ核酸分子は、それらがヒト染色体上の特定の位置とハイブリダイズできるので染色体同定のために価値がある。Ｈｕ−Ａｓｐ１は第２１染色体に局在し、一方、Ｈｕ−Ａｓｐ２は染色体１１ｑ２３.３−２４.１に局在している。実際の配列データ（反復多型）に基づいたほとんどの染色体マーキング試薬が、染色体の位置をマークするために現在入手できないので、染色体上の特定の部位を同定する現在の要求がある。一旦配列が正確な染色体位置にマップされたならば、染色体上の配列の物理的な位置は遺伝地図データと関連付けることができる。次いで、同一染色体領域にマップされた遺伝子と疾病との関係は、連鎖解析を通して同定でき、ここに、物理的に隣接した遺伝子の共遺伝は決定される。次いで、特定の疾患と関係するらしい遺伝子が、事実疾患の原因であるかどうかは、影響を受けた個人と影響されない個人との間の核酸配列を比較することによって決定できる。
【００６９】
もう一つの具体例において、本発明は、限定されるものではないが、ＡＰＰのβ−セクレターゼ切断部位を含有する合成ペプチド、好ましくは、ＫＭをＮＬに変化させる遺伝的ＡＤを持つスウェーデン血族内で見出された突然変異を含むものを含む適当な基質とＨｕ−Ａｓｐポリペプチドを溶液中にてインキュベートすることを含むＨｕ−Ａｓｐ機能、とりわけＨｕ−Ａｓｐ２機能をアッセイする方法に関し、かかるペプチドは、Ｈｕ−Ａｓｐ蛋白質分解活性の尺度として高速液体クロマトグラフィーによってモニターされるペプチドの切断を用いて、酸性緩衝溶液、好ましくはｐＨ５.５（実施例１２参照）の酸性緩衝溶液中の配列SEVNLDAEFR（配列番号：５４）を含む。蛋白質分解活性についての好ましいアッセイは、内部クエンチしたペプチドアッセイ基質を利用する。かかる適当な基質には、限定されるものではないが、Ｈｕ−Ａｓｐによるペプチドの切断がフルロフォア（flurophore）および消去剤の物理的な分離により蛍光の増大を生じるような、各々、クマリンおよびジニトロフェノールを含めた対のフルロフェアおよび消去剤を結合したペプチドが含まれる。Ｈｕ−Ａｓｐ蛋白質分解活性の好ましい熱量計アッセイは、Ｐ２とＰ１のアミノ酸を含む他の適当な基質を利用し、それはＨｕ−Ａｓｐによる切断がアルカリ性ｐＨにアッセイ緩衝液を変更した後の光学密度における増加を生じさせるようなアミド結合によってo−ニトロフェノールと結合した切断についての認識部位を含む。
【００７０】
もう一つの具体例において、本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐポリペプチド活性を増大させる薬剤の同定方法に関し、該方法は、
（ａ） 試験薬剤の存在下および試験薬剤の不存在下にて、該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性を測定し、次いで
（ｂ） 該試験薬剤の存在下にて測定した該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性と該試験薬剤の不存在下にて測定した該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性とを比較し；
それによって、該試験薬剤の不存在下よりも該試験薬剤の存在下にての高レベルの活性は、該試験薬剤が該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性を増大させたことを示すことを特徴とする。かかる試験は、無細胞系のＨｕ−ＡｓｐポリペプチドおよびＨｕ−Ａｓｐならびに変異体またはそのアイソフォームを発現する培養細胞で行うことができる。
【００７１】
もう一つの具体例において、本発明は、Ｈｕ−Ａｓｐ１、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）よりなる群から選択されるＨｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性を低下させる薬剤の同定のための方法に関し、該方法は、
（ａ） 試験薬剤の存在下および試験薬剤の不存在下にて、該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性を測定し、次いで
（ｂ） 該試験薬剤の存在下にて測定した該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性と該試験薬剤の不存在下にて測定した該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性とを比較し；
それによって、該試験薬剤の不存在下よりも該試験薬剤の存在下にての低レベルの活性は、該試験薬剤が該Ｈｕ−Ａｓｐポリペプチドの活性を低下させたことを示すことを特徴とする。かかる試験は、無細胞系のＨｕ−ＡｓｐポリペプチドおよびＨｕ−Ａｓｐならびにそのアイソフォームの変異体を発現する培養細胞で行うことができる。
【００７２】
もう一つの具体例において、本発明は、アミロイド蛋白質前駆体（ＡＰＰ）からのアミロイドβペプチド（Ａβ）のプロセシングを測定するための新規な細胞系（ＨＥＫ１２５.３細胞）に関する。該細胞は、第２のシストロン中に修飾されたヒトＡＰＰ ｃＤＮＡ、内部リボゾーム・エントリー部位、および増強されたグリーン蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）ｃＤＮＡを含むｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Clontech）に由来するビシストロンのベクターでのヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）の安定した形質転換体である。該ＡＰＰ ｃＤＮＡは、ＡＰＰコード配列のカルボキシル末端に２つのリジンコドンを付加することによって修飾された。これはヒトＡＰＰからのＡβペプチドのプロセシングを２〜４倍増加させる。Ａβペプチドのプロセシングのこの増大は、形質転換されていないＨＥＫ２９３細胞で見られるより６０倍高かった。ＨＥＫ１２５.３細胞はＡβペプチドプロセシングを阻害する化合物のアッセイに有用であろう。また、本発明は、７５１および７７０のアミノ酸アイソフォームを含む他のＡＰＰアイソフォームのＣ末端に、スウェーデン突然変異配列ＫＭ→ＮＬおよびＶ７１７→Ｆを含むヒトＡＤに判明した突然変異を有するＡＰＰのアイソフォームに、β−セクレターゼ切断部位で開始されるものとごときＡＰＰのＣ末端断片に、膜挿入および分泌のためのＮ末端シグナルペプチドに操作可能に連結したβ−セクレターゼ切断部位を含むＡＰＰのＣ末端断片に、およびβ−セクレターゼ切断が該ポリペプチドを発現する細胞の表面からレポーター蛋白質を遊離するように、膜挿入および分泌のためのＮ末端シグナルペプチドおよび限定されるものではないが、グリーン蛍光蛋白質またはアルカリ性ホスファターゼを含むレポーター配列に操作可能に連結したＡＰＰのＣ末端断片に２つのリジン残基の付加を含む。
本発明について一般的に記載すると、本発明は、以下の実施例を参照してより容易に理解され、それは例示的に提供され、限定を意図するものではない。
【００７３】
実施例
実施例１： Ｗｏｒｍｐｅｐ １２におけるアスパルチル・プロテアーゼの同定およびC. elegansアスパルチル・プロテアーゼ遺伝子の同定に有用な検索アルゴリズムの開発：
【００７４】
材料および方法：
ペプシンおよびレニンのごとき古典的なアスパルチル・プロテアーゼは、活性部位内に接近して２つのアスパルチル残基をもたらすために折りたたまれた２−ドメイン構造を保有する。これらは、短いトリペプチドモチーフＤＴＧまたはよりまれに、ＤＳＧに埋め込まれている。ＤＴＧまたはＤＳＧの活性部位モチーフは酵素の約残基２５〜３０にて現われるが、プロ酵素（レニン、ペプシノーゲン）では約６５〜７０にて現れる。このモチーフは、再度、下流の約１５０〜２００残基に現れる。プロ酵素は、Ｎ末端のプロドメインの切断によって活性化される。このパターンは、遺伝子複製および分岐によって明らかに生起された現代のアスパルチル酵素の二重ドメイン構造を例示する。
かくして；
NH２------------X------D25TG ------------Y------------DY+25TG----------------C
ここに、Ｘは酵素の開始、続いてＮ末端プロドメインを示し、Ｙは遺伝子反復が再度開始される分子の中心を示す。
【００７５】
ＨＩＶプロテアーゼのごときレトロウイルスの酵素の場合において、それらは、ペプシン、カテプシンＤ、レニン等のごときよく知られた酵素の２−ドメイン構造の半分だけを表わす。それらはプロセグメントを有しないが、ウイルスのｇａｇおよびｐｏｌ蛋白質を含有するポリプロテイン前駆体から作成される。それらは：
NH２---------D２５TG--------------------- C100
によって表すことができる。
この「モノマー」は約１００個のａａを単に有し、Ｎ末端プロドメインをカウントできない約３３０個程度のａａ（Ｎ末端の領域支持を数えずに）を有している他のアスパルチル・プロテアーゼ「二量体」と比較して非常に節減されている。
【００７６】
真核生物のアスパルチル・プロテアーゼ活性部位モチーフの制限された長さは、新規な配列についてのＥＳＴ収集を検索することを困難にする。典型的には、
ＥＳＴ配列は２５０個のヌクレオチドが平均であり、この場合には両アスパルチル・プロテアーゼ活性部位モチーフにわたりそうにない。代わりに、本発明者らはC. elegansゲノムに変えた。C. elegansゲノムは約１３,０００の遺伝子を含有すると推測されている。これらのうち、約１２,０００は配列決定され、対応する仮説のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）はデータベースＷｏｒｍｐｅｐ１２に入れた。本発明者らは本発明者らが特にこの目的のために開発したアルゴリズムを用いて、新規なアスパルチル・プロテアーゼのための高等真核生物の全ゲノム走査の基礎としてこのデータ・ベースを用いた。２つのＤＴＧまたはＤＳＧのモチーフを含む蛋白質の位置を確認するための以下のＡＷＫスクリプトを検索に用い、それをそのアスパルチルモチーフの全てのペアの組合せを回収するために４回反復した。
{RS="＞"}を開始せよ（BEGIN{RS="＞"}）／*ＦＡＳＴＡ形式用の記録セパレーターとして">"を定義せよ（defines "＞" as record separator for PASTA format）*／{pos=index（＄０,"ＤＴＧ"）／*記録中に"ＤＴＧ"を見出せ（finds "DTG" in record）*／
（pos＞０）ならば（if (pos＞0)）{
rest = substr（$0,pos＋3） ／*第１のＤＴＧ後の記録のrestを得よ（get rest of record after first DTG）*／
pos2 = index（rest,"DTG"） ／*第２のＤＴＧを見出せ（find second DTG）*／
（pos2＞０）ならば（"%s%s＼n","＞",$0）を印刷せよ}（if (pos2＞0) printf ("%s%s\n","＞",$0) }）／*ヒットを報告せよ（report hits）*／
}
}
【００７７】
前記のＡＷＫスクリプトを用いて、少なくとも２つのＤＴＧまたはＤＳＧのモチーフを含んでいる、配列エントリーについてのftp.sanger.ac.uk/pub
/database/wormpepからダウンロードされたＷｏｒｍｐｅｐ１２を調べた。ＡＷＫを用いて、各レコードを３０００以下の文字に制限した。かくして、いずれの場合にもアスパルチル・プロテアーゼをコードしそうにないので、３５個程度のより大きなレコードを手動でＷｏｒｍｐｅｐ１２から取り除いた。
【００７８】
結果および考察：
これらのうちのいくつか（<１０％）は同一遺伝子からの別法のスプライスされた転写体を表すので、Ｗｏｒｍｐｅｐ１２データ・ベースは１２,１７８のエントリーを含む。C. elegansゲノム中でコードされた遺伝子数の推定は、約１３,０００の遺伝子のオーダーであり、したがって、Ｗｏｒｍｐｅｐ１２はC. elegans ゲノムの９０％以上をカバーすると推測できる。
真核生物のアスパルチル・プロテアーゼは、祖先遺伝子複製からおそらく発生する２−ドメイン構造を含む。各ドメインは、２０〜２５のアミノ酸残基から各ドメインへ位置した活性部位モチーフＤ（Ｓ／Ｔ）Ｇを含む。レトロウイルス（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ）またはレトロトランスポソンプロテアーゼは単一の真核生物アスパルチル・プロテアーゼドメインに相同性であるサブユニットのホモダイマーである。ＡＷＫスクリプトを用いて、Ｄ（Ｓ／Ｔ）Ｇモチーフが少なくとも２度生じる蛋白質についてのＷｏｒｍｐｅｐ１２データ・ベースを検索した。これは２つのＤＴＧまたはＤＳＧのモチーフを持つ＞６０の蛋白質を同定した。視覚的な検査を用いて、アスパルチルドメインの位置が前記の基準に合う２−ドメイン構造を示唆する蛋白質を選択した。
【００７９】
さらに、ＰＲＯＳＩＴＥの真核生物およびウイルスのアスパルチル・プロテアーゼ活性部位パターンＰＳ００１４１を用いて、候補アスパルチル・プロテアーゼにつきＷｏｒｍｐｅｐ１２を検索した。（Bairoch A., Bucher P., Hofmann K., The PROSITE database： its status in 1997, Nucleic Acids Res. 24：217-221（1997））。これはＷｏｒｍｐｅｐ１２配列のオーバーラップする組を生成した。これらのうち、７つの配列は２つのＤＴＧまたはＤＳＧのモチーフ、およびPROSITEアスパルチル・プロテアーゼ活性部位パターンを含有した。これらの７つのうち、３個は、それらが祖先遺伝子複製によって生起した蛋白質の族を表わすことを示唆する同一コスミッドクローン（Ｆ２１Ｆ８.３、Ｆ２１Ｆ８.４およびＦ２１Ｆ８.７）において判明した。しかしながら、Ｆ２１Ｆ８.３、Ｆ２１Ｆ８.４およびＦ２１Ｆ８.７に広範囲な相同性を持つ他の２つのＯＲＦは、同一遺伝子クラスタ（Ｆ２１Ｆ８.２およびＦ２１Ｆ８.６）において存在し、これらは単一のＤＴＧモチーフだけを含有する。Ｗｏｒｍｐｅｐ１２に対するこれらの７つの配列を持つ徹底的なＢＬＡＳＴ検索は、ＤＴＧおよびＤＳＧのモチーフの２つの繰り返しを含有するC. elegansゲノムにおいてさらなる候補アスパルチル・プロテアーゼを明らかにしなかった。
【００８０】
SWISS−PROT、GenPepおよびTREMBLに対する各C. elegans配列を持つＢＬＡＳＴＸ検索は、Ｒ１２Ｈ７.２が公知の哺乳動物アスパルチル・プロテアーゼに最も接近している昆虫相同体であり、Ｔ１８Ｈ９.２が多少より離れて関連付けられ、一方、CEASP１、Ｆ２１Ｆ８.３、Ｆ２１Ｆ８.４およびＦ２１Ｆ８.７が哺乳動物配列に最小の配列相同性を有するサブクラスタを形成することを明らかとした。
【００８１】
考察：
ＡＰＰ、プレセニリンおよびｐ３５、ｃｄｋ５のアクチベーターは全てＨＩＶプロテアーゼの基質特異性に一致する部位にて細胞内の蛋白質分解プロセシングを受ける。同一基質特異性を持つ細胞アスパルチル・プロテアーゼの調節障害は、ＡＤにおけるプラークおよびもつれの病理の原因につき統一する機構を供するかもしれない。したがって、本発明者らは、新規なヒトアスパルチル・プロテアーゼを同定するために調べた。C. elegansにおける全ゲノムの走査は、本発明者らが同定したアスパルチル・プロテアーゼ・プロフィールを支持する７つのオープン・リーディング・フレーム構造を同定した。これらの７つのアスパルチル・プロテアーゼは、たぶん単純な多細胞の真核生物におけるかかるプロテアーゼの完全な相補体を含む。これらは、祖先遺伝子の複製によってたぶん生起したC. elegansに特有の４つの密接に関連するアスパルチル・プロテアーゼを含む。他の３つの候補アスパルチル・プロテアーゼ（Ｔ１８Ｈ９.２、Ｒ１２Ｈ７.２およびＣ１１Ｄ２.２）は、哺乳動物遺伝子の配列に対して相同性を有することが判明した。
【００８２】
実施例２：ゲノムブリッジングによってミニングするデータ・ベースを用いる新規なヒトアスパルチル・プロテアーゼの同定
材料および方法：
ＥＳＴデータ・ベース、ｃＤＮＡおよび予測ポリペプチド配列のコンピューター支援分析：
CEASP１、Ｆ２１Ｆ８.３、Ｆ２１Ｆ８.４およびＦ２１Ｆ８.７配列を持つＥＳＴデータベースの徹底的な相同性検索は、いずれの新規な哺乳動物相同体を明らかにしなかった。Ｒ１２Ｈ７.２でのＴＢＬＡＳＴＮ検索は特に活性部位内のＤＴＧモチーフの周囲のカテプシンＤ、カテプシンＥ、ペプシノーゲンＡ、ペプシノーゲンＣおよびレニンに対して相同性を示したが、いずれのさらなる新規な哺乳動物アスパルチル・プロテアーゼも同定しなかった。これは、C. elegansゲノムが哺乳動物において祖先遺伝子の複製および結果的な修飾を通して生起した遺伝子族によって表わされる単一のリソソームのアスパルチル・プロテアーゼだけをたぶん含有することを示す。
【００８３】
残っているC. elegans配列のＴ１８Ｈ９.２でのＴＢＬＡＳＴＮ検索は、新規なヒトアスパルチル・プロテアーゼ（Ｈｕ−Ａｓｐ１）をコードするコンティグ（contig）に組立てたいくつかのＥＳＴを同定した。実施例１に前記のごとく、SWISS−PROTに対するＨｕ−Ａｓｐ１コンティグでのＢＬＡＳＴＸ検索は、配列の活性部位モチーフが他のアスパルチル・プロテアーゼの活性部位と整列することを明らかとした。LifeSeq、LifeSeqFLおよび公のＥＳＴコレクションに対するＢＬＡＳＴＮ検索の徹底的な反復のラウンドは、単一のコンティグに組立てた複数のｃＤＮＡライブラリーから１０２個のＥＳＴを同定した。また、公のＥＳＴコレクションにおいて判明したこのコンティグにおける５１個の配列は、The Institute for Genome Research（TMR）によって単一のコンティグ（THC２１３３２９）へ組み立てられた。TIGRの注解は、それらがコンティグにつきデータベース内でいずれのヒットも見出されなかったことを示す。TIGRコンティグが本発明者らが組み立てたLifeSeqコンティグの逆の相補体であることに注意されたし。ZooSeqにおけるラットおよびマウスのＥＳＴ配列に対するＨｕ−Ａｓｐ１のＢＬＡＳＴＮ検索は、各データベースにおける１つの相同性ＥＳＴを明らかにした（各々、Incyte clone 700311523 および IMAGE クローン 313341, GenBank 受入番号 W10530）。
【００８４】
LifeSeqFLおよび公のデータベースの双方に対してＨｕ−Ａｓｐについての組立てられたＤＮＡ配列でのＴＢＬＡＳＴＮ検索は、単一のＥＳＴ（２６９６２９５）によって表わされる第２の関連したヒト配列（Ｈｕ−Ａｓｐ２）を同定した。この部分的なｃＤＮＡ配列の翻訳は、ウシアスパルチル・プロテアーゼＮＭ１の活性部位モチーフに相同性を有する単一のＤＴＧモチーフを明らかとする。
【００８５】
ＢＬＡＳＴ検索、コンティグ・アセンブリおよび複数の配列整列は、IncyteからのLifeSeq、LifeSeqFLおよびLifeSeq Assembledデータベースで提供された生物学的情報（bioinformatics）ツールを用いて行った。予測蛋白質モチーフは、ProSite辞書（GCG ９におけるMotif）またはPfamデータベースのいずれかを用いて同定した。
【００８６】
Ｈｕ−Ａｓｐ１の全長ｃＤＮＡクローニング
C. elegans配列のＴ１８Ｈ９.２ＣＥのオープン・リーディング・フレームを用いて、Incyte LifeSeqおよびLifeSeq−FLデータベースを調べ、１８６３９２０ＣＥ１という単一電子アセンブリを検出した。このコンティグ、１８６３９２０における５'の大部分のｃＤＮＡクローンをIncyteから得て、両鎖に対して完全に配列決定した。クローン１８６３９２０内に含有されたオープン・リーディング・フレームの翻訳は、二連のアスパルチル・プロテアーゼ活性部位モチーフ（ＤＴＧ／ＤＳＧ）の存在を明らかにしたが、５'端は不完全であった。Ｈｕ−Ａｓｐ１をコードする配列の残りは、ヒト胎盤Marathon ready ｃＤＮＡテンプレート（Clonetech）を用いる５' Marathon ＲＡＣＥ分析によって決定した。クローン１８６３９２０の５'端に特異的な３'−アンチセンスのオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲにおけるMarathon readyｃＤＮＡ合成アダプターに特異的な５'−センスプライマーとペアにした。特定のＰＣＲ産物は、サイクル配列決定法によって直接的に配列決定し、得られた配列をクローン１８６３９２０で組立て、Ｈｕ−Ａｓｐ１（配列番号：１）の完全なコード配列を得た。
【００８７】
いくつかの興味深い特徴は、Ｈｕ−Ａｓｐ１（図１、配列番号：２）の主要なアミノ酸配列に存在する。該配列には、シグナルペプチド（配列番号：２の残基１〜２０）、プロセグメントおよび２コピーのアスパルチル・プロテアーゼ活性モチーフ（ＤＴＧ／ＤＳＧ）を含有する触媒ドメインを含む。第１および第２の活性部位モチーフ間の間隔は、単一の真核生物のアスパルチル・プロテアーゼ・ドメインの予期されたサイズに対応すべき約２００の残基である。より興味深いことには、該配列には、そのＣ末端付近に予測膜貫通ドメイン（配列番号：２における残基４６９〜４９２）を含み、これはプロテアーゼが膜に固定されていることを示唆する。この特徴はいずれの他のアスパルチル・プロテアーゼインヒビターにおいても見出されていない。
【００８８】
全長Ｈｕ−Ａｓｐ２ ｃＤＮＡのクローニング
実施例１に前記のごとく、推定アスパルチル・プロテアーゼについてのCaenorhabditis elegansデータベースWormPep12のゲノムの広範囲の走査およびヒトＥＳＴデータベースの続いてのミニングは、Ｈｕ−Ａｓｐ１というC. elegans 遺伝子Ｔ１８Ｈ９.２に対するヒト・オルソログ（ortholog）を明らかとする。Ｈｕ−Ａｓｐにつき組立てられたコンティグを用いて、ヒトＥＳＴデータベースにおけるＢＬＡＳＴ検索ツールを用いてヒトパラログにつき調べ、約６０％共有する同一性を持つ単一のかなりのマッチ（２６９６２９５ＣＥ１）をLifeSeq FLデータベースにおいて見出した。ＴＩＧＲから入手可能なｇｂ１０５ＰｕｂＥＳＴまたはヒトデータベースの族のいずれかの同様な質問は同様なＥＳＴクローンを同定しなかった。ヒト子宮ｃＤＮＡライブラリーからの単一パス配列分析によって同定されたｃＤＮＡクローン２６９６２９５をIncyteから入手し、両鎖に対して完全に配列決定した。このクローンは、４２２個のアミノ酸ポリペプチドをコードするが、５'末端にイニシエーターＡＴＧを欠く不完全な１２６６ｂｐのオープン・リーディング・フレームを含む。推定配列の検査は、１９４個のアミノ酸によって分けられた二連のアスパルチル・プロテアーゼ活性部位モチーフＤＴＧ／ＤＳＧの存在を明らかとした。LifeSeq ＥＳＴデータベースの後の遊離の続いての質問は、ヒト星状細胞ｃＤＮＡライブラリー（４３８６９９３）から配列決定された細胞なるＥＳＴを同定し、それはクローン２６９６２９５に対しさらなる５'配列を含有するようであった。クローン４３８６９９３をIncyteから得て、両鎖に対して完全に配列決定した。クローン４３８６９９３およびクローン２６９６２９５の比較分析は、クローン４３８６９９３が２つのインフレーム翻訳開始コドンを含む３１のアミノ酸残基によってオープン・リーディング・フレームを延ばすことを確認した。２つのインフレームＡＴＧの存在にもかかわらず、インフレーム停止コドンは、ＡＴＧに上流に観察されず、これは４３８６９９３が全長ではないであろうことを示す。さらに、クローン２６９６２９５および４３８６９９３の配列の整列は、２６９６２９５における２５個のさらなるアミノ酸残基の挿入を生じるクローン４３８６９９３に対するクローン２６９６２９５における７５個の塩基対挿入を明らかにした。Ｈｕ−Ａｓｐ２コード配列の残りは、ヒト海馬のMarathon ready cDNA テンプレート（Clonetech）を用いる５' Marathon RACE分析によって決定した。クローン２６９６２９５および４３８６９９３の共有した５'領域に特異的な３'−アンチセンスのオリゴヌクレオチド・プライマーをＰＣＲにおけるMarathon ready cDNA 合成アダプターについて特異的な５'−センスプライマーとペアとした。特異的ＰＣＲ産物は、サイクル配列決定法によって直接的に配列決定し、得られた配列をクローン２６９６２９５および４３８６９９３の配列で組み立て、各々、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）（配列番号：３）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）（配列番号：５）の完全なコード配列を得た。
【００８９】
いくつかの興味深い特徴は、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）（図３および配列番号：４）およびＨｕ−Ａｓｐ２（ｂ）（図２、配列番号：６）の主要なアミノ酸配列に存在する。両配列は、シグナルペプチド（配列番号：４番および配列番号：６の残基１〜２１）、プロセグメント、および２コピーのアスパルチル・プロテアーゼ活性部位モチーフ（ＤＴＧ／ＤＳＧ）を含む触媒ドメインを含む。第１と第２の活性部位モチーフ間の間隔は、各々、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ｂ）およびＨｕ−Ａｓｐ−２（ａ）につき、Ｈｕ−Ａｓｐ−２（ｂ）における２５のアミノ酸残基の欠失のために可変であり、１６８−対−１９４のアミノ酸残基から成る。より興味深いことには、両配列には、それらのＣ末端付近での推定膜貫通ドメイン（配列番号：４における残基４５５〜４７７および配列番号：６における残基４３０〜４５２）を含み、これはプロテアーゼが膜に固定されていることを示唆する。この特徴はＨｕ−Ａｓｐ１以外のいずれの他のアスパルチル・プロテアーゼにおいても見出されていない。
【００９０】
実施例３．マウスＡｓｐ２ ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの分子クローニング。
ネズミＡｓｐ２ ｃＤＮＡのクローニングおよび特徴付け−Ｈｕ−Ａｓｐ２のネズミオルソログをｃＤＮＡライブラリー・スクリーニング、ＰＣＲおよびゲノムクローニングの組合せを用いてクローニングした。マウス脳ｃＤＮＡライブラリーからの約５００,０００個の独立したクローンは、Ｈｕ−Ａｓｐ２から調製した３２Ｐ標識コード配列プローブを用いてスクリーニングした。複製陽性物をＤＮＡ配列決定分析に付し、最長のｃＤＮＡは、コード領域において、全３'非翻訳領域および４７個のアミノ酸を含有した。前記に決定された５'−大部分のｃＤＮＡ配列について特異的なアンチセンス・プライマーおよびヒトＡｓｐ２配列の５'領域に特異的なセンス・プライマーでの同一マウス脳ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅に続いてのＤＮＡ配列決定分析は、さらなる９８０ｂｐのコード配列を与えた。ネズミＡｓｐ−２の５'配列の残りは、ゲノム配列由来であった（後記参照）。
【００９１】
ネズミＡｓｐ２遺伝子の単離および配列決定分析−ネズミＡｓｐ２ ｃＤＮＡの一部をコードするネズミＥＳＴ配列をＢＬＡＳＴ検索ツールおよび質問としてＨｕ−Ａｓｐ２コード配列を用いてGenBank ＥＳＴデータベースにおいて同定した。クローンｇ３１６０８９８は、３５２ｂｐを超えるヒト配列に８８％共有して同一性を示した。次いで、ネズミＡｓｐ２のこの領域に特異的なオリゴヌクレオチド・プライマー・ペアを合成し、それを用いてネズミ遺伝子の領域を増幅した。１２９／Ｓｖｊに由来したネズミゲノムＤＮＡは、ネズミＡｓｐ２に特異的な種々のプライマーセットを用いてＰＣＲ（２５サイクル）および産物をアガロース・ゲル電気泳動によって分析した。プライマー・セットＺｏｏ−１およびＺｏｏ−４は、公知のｃＤＮＡ配列に対する比較に基づいたイントロン配列の約６００ｂｐを含有する７５０ｂｐの断片を増幅した。次いで、このプライマーセットを用いて、ＰＣＲによってネズミＢＡＣライブラリーをスクリーニングし、単一のゲノムクローンを単離し、クローニングし、ＤＮＡ配列分析によってネズミＡｓｐ２遺伝子が含むことを確認した。このＡｓｐ２のゲノムのクローンのショットガンＤＮＡ配列決定およびＨｕ−Ａｓｐ２および部分的ネズミｃＤＮＡ配列の双方のｃＤＮＡ配列の比較は、ネズミＡｓｐ２（配列番号：７）の全長配列を規定した。ネズミＡｓｐ２（配列番号：８）の予測アミノ酸配列は、ヒト配列（図４）と比較した１８／５０１アミノ酸残基置換と９６.４％共有する同一性（GCG BestFitアルゴリズム）を示した。
【００９２】
実施例４：Ｈｕ−Ａｓｐ２転写体発現の組織分布
材料および方法：
Ｈｕ−Ａｓｐ−２発現の組織分布は、Clonetech（Palo Alto, CA）から入手した複数の組織ノーザンブロットを用いて決定した。ベクターｐＩＮＣＹにおけるIncyteクローン２６９６２９５は、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで完了まで消化し、１.８ｋｂのｃＤＮＡインサートを分取用アガロース・ゲル電気泳動によって精製した。この破片は、［３２Ｐ−ｄＡＴＰ］（>3000 Ci／ミリモル, Amersham, Arlington Heights, IL）およびＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片の存在下にて無作為なプライミングによって比活性＞１×１０９ｄｐｍ／μｇまで放射性標識した。異なるヒト組織から単離された変性しサイズ分取されたポリＡ＋ＲＮＡを含有するナイロンフィルターをExpressHyb緩衝液（Clonetech,Palo Alto, CA）中の２×１０６ｄｐｍ／ｍｌプローブと６８℃にて１時間ハイブリダイズし、製造者によって推奨されるごとく洗浄した。ハイブリダイゼーション・シグナルを−８０℃にて増感紙を含むBioMax XRフィルム（Kodak, Rochester, NY）を用いてオートラジオグラフィーによって視覚化した。
【００９３】
結果および考察：
Ｈｕ−Ａｓｐ２転写体の発現の組織分布に対する限定された情報は、前記の方法を用いて検出した相対的に少数のＥＳＴのために、データベース分析から得られた（＜５）。Ｈｕ−Ａｓｐ２遺伝子の発現についてさらに詳しい情報を得るために、ノーザンブロットを用いて、Ｈｕ−Ａｓｐ２転写体のサイズおよび豊富さを決定した。一連の末梢組織および脳領域から単離されたＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡは、変性条件下の分離に続いて固体支持体上に示され、Ｈｕ−Ａｓｐ２転写体は、クローン２６９６２９５からの放射性標識インサートに高ストリンジェントなハイブリダイゼーションによって視覚化した。２６９６２９５ｃＤＮＡプローブは、３.０ｋｂ、４.４ｋｂおよび８.０ｋｂの見かけ上のサイズで移動する転写体の一群を視覚化し、後者の２つの転写体が最も豊富であった。
【００９４】
調査された組織を横切るＨｕ−Ａｓｐ２転写体は、膵臓と脳において最も豊富であったが、胸腺とＰＢＬ以外で調べられた全ての他の組織においてより低いが、検出可能なレベルが観察された。また、脳におけるＨｕ−Ａｓｐ２転写体の相対的な豊富さを仮定すれば、脳領域の領域発現が確立された。同様の一群の転写体サイズを調べた全ての脳領域［小脳、大脳皮質、後頭部柱、前頭葉、側頭葉および果核］おいて検出し、毛髄および脊髄において最高に豊富であった。
【００９５】
実施例５：ヒト細胞系におけるＨｕ−Ａｓｐ−１およびＨｕ−Ａｓｐ−２の転写体のノーザンブロット検出：
様々なヒト細胞系をＨｕ−Ａｓｐ１およびＡｓｐ２ ｍＲＮＡを産生する能力につきテストした。ヒト胚腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞、アフリカミドリザル（Ｃｏｓ−７）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＬＡ細胞および神経芽細胞腫細胞系ＩＭＲ−３２はすべてＡＴＣＣから入手した。細胞は、密集付近まで５％ ＣＯ２、３７℃にて、ＣＨＯ細胞以外は１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥ中で培養し、α−ＭＥＭ／１０％ＦＣＳに維持した。細胞（３×１０７）の洗浄された単層を皿上で溶解し、Qiagen Oligotex Direct mRNAキットを用いてポリＡ＋ＲＮＡを抽出した。各細胞系からの２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含む試料は、変性条件（グリオキサル処理）下にて分別し、毛管作用によって固体ナイロン細胞膜支持体に移し、転写体をＨｕ−Ａｓｐ１またはＨｕ−Ａｓｐ２のいずれかから由来する無作為プライムド標識（３２Ｐ）コード配列プローブとのハイブリダイゼーションによって視覚化した。放射性シグナルは、Ｘ線フィルムへの曝露およびPhosphorImagerでの画像分析によって検出した。
【００９６】
Ｈｕ−Ａｓｐ１ ｃＤＮＡプローブは、ヒト組織において従前に検出された転写体（２.６ｋｂおよび３.５ｋｂ）の類似発現を視覚化した。放射性シグナルの定量によって測定された相対的な豊富さはＣｏｓ−７＞ＨＥＫ２９２=ＨＥＬＡ＞ＩＭＲ３２であった。
また、Ｈｕ−Ａｓｐ２ ｃＤＮＡプローブは、組織（３.０ｋｂ、４.４ｋｂおよび８.０ｋｂ）に比較した同様の一群の転写体を視覚化し、以下の相対的豊富さであった；ＨＥＫ２９３＞Ｃｏｓ−７＞ＩＭＲ３２＞ＨＥＬＡ。
【００９７】
実施例６：ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングのためのＡβプロセシングを増大させるＡＰＰの修飾
ＡＰＰからＡβペプチドにプロセシングするヒト細胞系は、βおよびγ−セクレターゼの阻害剤用の細胞アッセイ方法においてスクリーニングする手段を供する。培養上清へのＡβペプチドの産生および遊離は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によってモニターする。ＡＰＰの発現は広範囲であり、神経性および非神経性の細胞系ペプチドを共にプロセシングし、Ａβペプチドを遊離するが、内因性ＡＰＰプロセシングのレベルは低く、ＥＩＡによって検出するのを困難とする。Ａβプロセシングは、形質転換した細胞系において、Ａβプロセシングを増強するＡＰＰの突然変異を発現させることによって増大できる。本発明者らは、さらに依然として、ＡＰＰ６９５のカルボキシル末端への２つのリジン残基の付加がＡβプロセシングを増大させるという思いがけない観察をした。これは、発明者らが、顕著なレベルの２０,０００ｐｇ／ｍｌにて培養基にＡβペプチドを遊離する形質転換細胞系を創製するのを可能とした。
【００９８】
材料および方法
材料：
ヒト胚腎臓細胞系２９３（ＨＥＫ２９３細胞）は内部で入手した。ベクターｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰはClontechから購入した。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いる突然変異用のオリゴヌクレオチドはGenosysから購入した。ヒトＡＰＰ６９５（配列番号：９［ヌクレオチド］および配列番号：１０［アミノ酸］）を含有するプラスミドは、Northwestern University Medical Schoolから入手した。これは、Ｎｏｔ１部位にてｐＳＫ（Stratagene）にサブクローンし、プラスミドｐＡＰＰ６９５を創製した。
【００９９】
突然変異プロトコール：
スウェーデン突然変異（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）をStratagene Quick Change Mutagenesis キットを用いてpＡＰＰ６９５に導入して、プラスミドｐＡＰＰ６９５ＮＬ（配列番号：１１［ヌクレオチド］および配列番号：１２［アミノ酸］）を創製した。ＡＰＰ６９５のＣ末端のジ−リジンモチーフを導入するために、順方向プライマー＃２７６ ５'GACTGACCACTCGACCAGGTTC（配列番号：４７）を＃２７６「パッチ」プライマー＃２７４ ５'
CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTACTTCTTGTTCTG
CATCTCAAAGAAC（配列番号：４８）およびフランキング・プライマー＃２７５ CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTA（配列番号：４９）と共に用いて、ＡＰＰ６９５ ｃＤＮＡ（配列番号：１５［ヌクレオチド］および配列番号：１６［アミノ酸］）の３'端を修飾した。また、これは、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの複数のクローニング部位にてＢｓｔＸ１部位と互換性であろうＢｓｔＸ１制限部位を付加した。ＰＣＲ増幅は、製造者によって供給されたポリメラーゼ・ミックスおよび緩衝液を用いて、Clontech HF Advantage cDNA PCRキットで行った。「パッチ」ＰＣＲでは、パッチ・プライマーは、フランキング・プライマーの１／２０のモル濃度にて用いた。ＰＣＲ増幅産物は、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製した。制限酵素で消化後、産物を０.８％のアガロース・ゲル上で分離し、次いで、削り取ったＤＮＡ破片をQIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製した。
【０１００】
修飾したＡＰＰ６９５−Ｓｗ ｃＤＮＡを再組み立てするために、ＰＣＲによって得られたＡＰＰ６９５−Ｓｗ ｃＤＮＡの５'のＮｏｔ１−Ｂｇｌ２断片および３'のＢｇｌ２−ＢｓｔＸ１ ＡＰＰ６９５ ｃＤＮＡ断片を、Ｎｏｔ１とＢｓｔＸ１の部位で開かれたｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡに連結した。連結はRapid DNA Ligationキット（Boehringer Mannheim） を用いて室温にて５分間行い、Library Efficiency DH5a Competent Cells（GibcoBRL Life Technologies）に形質転換した。細菌コロニーは、プライマー＃２７６および＃２７５を用いるＰＣＲ増幅によるインサートにつきスクリーニングした。プラスミドＤＮＡは、QLAprep Spin Miniprep キット（Qiagen）を用いて哺乳動物細胞トランスフェクションのために精製した。得られた構築体は、ｐＭＧ１２５.３（ＡＰＰＳｗ−ＫＫ、配列番号：１７［ヌクレオチド］および配列番号：１８［アミノ酸］）と命名された。
【０１０１】
哺乳動物細胞トランスフェクション：
トランスフェクション用のＨＥＫ２９３細胞は、１０％胎仔ウシ血清を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）において８０％密集まで増殖した。共トランスフェクションは、１０×１０６細胞当り３μｇのｐＭＧ１２５.３ ＤＮＡおよび９μｇのｐｃＤＮＡ３.１ ＤＮＡを含むLipofectAmine（Gibco-BRL）を用いて行った。トランスフェクションの３日後、細胞は４００μｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８を含有する培地に継代した。選択培地における３日間の増殖後、細胞をそれらの蛍光によって分類した。
【０１０２】
ＦＡＣＳによる１２５.３細胞のクローン選択：
細胞試料は、空気冷却アルゴンレーザーによって供給された４８８ｎｍの励起線を装備したEPICS E1ite ESP フローサイトメーター（Cou1ter, Hialeah, FL）で分析した。ＥＧＦＰ発光は５２５ｎｍのバンド通過フィルターを通して測定し、前方および右角度の光散乱によって測定されるごとき生存細胞にゲーティング後に蛍光強度は４０対数スケールで表示された。単一の緑色細胞はＧ４１８のない増殖培地を含む１つの９６ウェルプレートの各ウェルに分けた。４日間の回復期間後に、Ｇ４１８を最終濃度４００μｇ／ｍｌまで培地に添加した。選択後、３２％のウェルがクローンの拡大があった。クローンを持つウェルを９６ウェルプレートから２４ウェルプレート、次いで６ウェルプレートに拡大させ、各継代の最終拡大につき選択されたコロニーは最も急増殖のコロニーであった。選択された最終の細胞系は、最終の６継代されたものが最も急増殖していた。
１２５.３と呼ばれるこのクローンは、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８に維持され、４日毎に新たな培地で継代された。ＥＧＦＰ蛍光のＡβ産生の喪失は、２３継代を超えて見られなかった。
【０１０３】
ＡβＥＩＡ分析（ｈＡβ１−４０／４２についての二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）：
トランスフェクションの４８時間後に採取した細胞培養上清を標準的ＡβＥＩＡにおいて以下の通り分析した。ヒトＡβ１−４０または１−４２は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）６Ｅ１０（Senetek, St. Louis, MO）およびビオチン化したウサギ抗血清１６２または１６４（New York State Institute for Basic Research, Staten Island, NY）を用いて、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて測定した。捕獲抗体６Ｅ１０は、ｈＡβのＮ末端アミノ酸残基１〜１６上に存在するエピトープに特異的である。コンジュゲートした検出用抗体１６２および１６４は、各々、ｈＡβ １−４０および１−４２に特異的である。略言すれば、Nunc Maxisorp ９６ウェルイムノプレートをｐＨ９.６の０.１Ｍ炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液に希釈した１００μｌ／ウェルｍＡｂ ６Ｅ１０（５ｐｇ／ｍｌ）でコートし、４℃にて一晩インキュベートした。０.０５％のＴｗｅｅｎ−２０（DPBST）を含む０.０１Ｍ ＤＰＢＳ（Pierce, Rockford, Ilからの修飾ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（０.００８Ｍリン酸ナトリウム、０.００２Ｍ燐酸カリウム、０.１４Ｍ塩化ナトリウム、０.０１Ｍの塩化カリウム、ｐＨ７））で３回プレートを洗浄した後、プレートは非特異的結合を防止するために２００μｌの１０％正常ヒツジ血清（Sigma）で６０分間ブロックした。培養基中のＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌのストック溶液から希釈したヒトＡβ１−４０または１−４２標準品１００μｌ／ウェル（Bachem, Torrance, CA）ならびに１００μｌ／ウェルの試料、例えば、形質転換細胞のならし培地を洗浄後に添加した。プレートを室温にて２時間、次いで４℃にて一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄した後、ＤＰＢＳＴ＋０.５％ＢＳＡに希釈した１００μｌ／ウェルのビオチン化ウサギ抗血清１６２  １：４００または１６４  １：５０を添加し、室温にて１時間１５分間インキュベートした。洗浄に続いて、ＤＰＢＳＴにおいて１：１０,０００で希釈した１００μｌ／ウェルのニュートラアビジン−西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（Pierce, Rockford, Il）を適用し、室温にて１時間インキュベートした。最終の洗浄後、ｐＨ５の５０ｍＭクエン酸／１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（Sigma Chemicals, St. Louis, MO）中の二塩酸o-フェニレンジアミン（Sigma Chemicals, St. Louis, MO）を基質として添加し、発色をSoft max Pro ソフトウエアを用いて、２０分間および速度論的マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍにてモニターした。全標準品を三連にて試行した。標準曲線内にある吸光度値を持つ試料は、Soft max Pro ソフトウエアを用いて標準曲線から外挿し、ｐｇ／ｍｌ培養基で表示した。
【０１０４】
結果：
ＡＰＰ６９５のカルボキシル末端への２つのリジン残基の付加は、一過性発現によって示されるごとく、ＨＥＫ２９３細胞のＡβプロセシングを大きく増大させる（表１）。ＡＰＰ６９５に対するジ−リジンモチーフの付加は、スウェーデン突然変異を含むＡＰＰ６９５で見られたものへのＡβプロセシングを増大させる。スウェーデン突然変異とジ−リジンモチーフとの組合せは、さらに２.８倍までプロセシングをさらに増大させる。
【０１０５】
ｐＭＧ１２５.３およびｐｃＤＮＡ３.１でのＨＥＫ２９３細胞の共トランスフェクションは、Ｇ４１８耐性およびＥＧＤＰの高レベル発現についての形質転換細胞の二重選択を可能とする。ＦＡＣＳによるクローン選択の後、得られた細胞系は、２４ウェルプレートにおいて３６時間増殖させた後の培養基のｍｌ当り顕著には２０,０００ｐｇ Ａβペプチドを産生した。様々な増殖条件下のＡβペプチドの産生を表２にまとめた。
【０１０６】
【表１】
2002526081.tif 000001
【０１０７】
実施例７：ＨＥＫ１２５.３細胞におけるＡベータプロセシングのアンチセンス・オリゴマー阻害
Ｈｕ−Ａｓｐ１およびＨｕ−Ａｓｐ２の配列は、標的配列の選択および専売技術（Sequitur Ver. D Pat pending #3002）を用いる第２世代のキメラ・アンチセンス・オリゴマーの設計のために、Sequitur, Inc（Natick, MA）に供給された。アンチセンス・オリゴマー・ロット＃Ｓ６４４、Ｓ６４５、Ｓ６４６およびＳ６４７はＡｓｐ１に対する標的とした。アンチセンス・オリゴマー・ロット＃Ｓ６４８、Ｓ６４９、Ｓ６５０およびＳ６５１は、Ａｓｐ２に対する標的とした。対照のアンチセンス・オリゴマー・ロット＃Ｓ６５２、Ｓ６５３、Ｓ６５５およびＳ６７４は、無関係の遺伝子に対する標的とし、アンチセンス・オリゴマー・ロット#Ｓ６５６、Ｓ６５７、Ｓ６５８およびＳ６５９は第２の無関係の遺伝子に対する標的とした。
【０１０８】
アンチセンス・オリゴマーでのトランスフェクションについては、ＨＥＫ１２５.３細胞は、１０％胎仔ウシ血清を補足したMinimal Essential Medium（MEM）中の６ウェルプレートにおいて約５０％密集まで増殖した。２ｍｇ／ｍｌのオリゴフェクチンＧ（oligofectin G）（Sequitur Inc., Natick, MA）のストック溶液を無血清ＭＥＭ中に５０μｇ／ｍｌまで希釈した。別に、１００μＭのアンチセンス・オリゴマー・ストック溶液をOpti−MEM（GIBCO-BRL, Grand Island, NY）中に８００ｎＭまで希釈した。次いで、オリゴフェクチンＧおよびアンチセンス・オリゴマーの希釈ストックは１：１の比で混合し、室温にてインキュベートした。１５分間の培養後、試薬を１０％胎仔ウシ血清を含有するＭＥＭに１０倍希釈し、まず古い培地を除去した後、６ウェルプレートの各ウェルに２ｍｌを添加した。トランスフェクション後に、細胞をオリゴフェクチンＧ／アンチセンス・オリゴマーを継続的に存在させて増殖させた。Ａβペプチド遊離をモニターするために、２４時間から開始して、４００μｌのならし培地を培養ウェルから周期的に取出し、トランスフェクション後新たな培地で置き換えた。報告したデータは、トランスフェクション４８時間後に採取した培養上清からのものである。
【０１０９】
結果：
Sequitur社から得られた１６個の異なるアンチセンス・オリゴマーを別々にＨＥＫ１２５.３細胞にトランスフェクトして、Ａβペプチドプロセシングに対するそれらの影響を決定した。Ａｓｐ１およびＡｓｐ２に対して標的とされたアンチセンス・オリゴマーだけが、ＨＥＫ１２５.３細胞によってＡベータ・プロセシングを低下させ、Ａｓｐ２に対して標的とされたものはより大きな阻害効果を有した。Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）は共に、同程度まで阻害された。表３において、パーセント阻害をトランスフェクトしていない細胞に関して計算する。５０％を超える阻害を与えるアンチセンス・オリゴマー試薬は、星印でマークした。試験した試薬のうち、ＡＳＰ１に対して標的とされた４つのアンチセンス・オリゴマーのうちの３つは、Ａβ １−４０プロセシングの平均５２％の阻害、およびＡβ １−４２プロセシングの平均４７％の阻害を与えた。ＡＳＰ２では、４つのアンチセンス・オリゴマーのうちの４つが５０％を超える阻害を与え、Ａβ １−４０プロセシングでは６２％の平均阻害であり、Ａβ １−４２プロセシングでは６０％であった。
【０１１０】
【表２】
2002526081.tif 000002
【０１１１】
実施例８．  培養細胞におけるＨｕ−Ａｓｐ２β−セクレターゼ活性の証明
アルツハイマー病の初期の開始に関連したＡＰＰにおけるいくつかの突然変異は、Ａβペプチド・プロセシングを変化されることが示されている。これらは、ＡＰＰからＡβを遊離するＮおよびＣ末端切断部位を近接する。これらの切断部位は、各々、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼの切断部位と呼ばれる。β−セクレターゼ部位でのＡＰＰの切断は、１１,１４５ダルトンの分子量の９９個のアミノ酸を含むＡＰＰのＣ末端断片を創製する。β−セクレターゼ切断部位のすぐ上流のスウェーデンＫＭ→ＮＬ突然変異は、Ａβの１−４０および１−４２の両アミノ酸形態の産生において全般的な増大を引き起こす。ロンドンＶＦ突然変異（ＡＰＰ７７０アイソフォームにおけるＶ７１７→Ｆ）は、合計Ａβペプチド産生に対してほとんど影響を有しないが、ＡＰＰプロセシングの間に用いたγ−セクレターゼ切断部位の選択に影響することによってＡβペプチドのより長い１−４２アミノ酸形態のパーセンテージを優先的に増大させるようである。かくして、本発明者らは、これらの突然変異が、Ｈｕ−Ａｓｐ２の発現を指令する構築体で共トランスフェクトされた培養細胞によって産生されたＡβペプチドの量およびタイプを変更するかを決定するために調べた。
【０１１２】
２つの実験を行い、培養細胞中のＨｕ−Ａｓｐ２ β−セクレターゼ活性を証明する。第１の実験において、実施例７に記載されるＨｕ−Ａｓｐ２転写体に対して指令されたアンチセンス・オリゴマーでのＨＥＫ１２５.３細胞の処理は、β−セクレターゼ切断（ＣＴＰ９９）によって創製されたＡＰＰのＣ末端の断片量を低下させることが判明した（図９）。これは、Ｈｕ−Ａｓｐ２が、直接的または間接的に作用して、β−セクレターゼ切断を促すことを示す。第２の実験において、トランスフェクトしたマウスＮｅｕｒｏ２A細胞におけるＨｕ−Ａｓｐ２発現の増大は、ＣＴＰ９９ β−セクレターゼ切断断片の蓄積を増大させることを示す（図１０）。Ｃ末端のジ−リジンモチーフを含有する突然変異体ＡＰＰ−ＫＫクローンがトランスフェクションに用いられる場合、この増大は最も容易に見られる。Ｈｕ−Ａｓｐ２がスウェーデン突然変異ＫＭ→ＮＬを含有するＡＰＰ−Ｓｗ−ＫＫで共トランスフェクトする場合、一層の増大が見られる。スウェーデン突然変異はβ−セクレターゼによるＡＰＰの切断を増大させることが知られている。
【０１１３】
第２組の実験は、Ｈｕ−Ａｓｐ２がヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３細胞での共トランスフェクション実験においてγ−セクレターゼ活性を促進することを示す。ＡＰＰ−ＫＫクローンでのＨｕ−Ａｓｐ２の共トランスフェクションは、ＨＥＫ２９３細胞からの可溶性Ａβ１−４０およびＡβ１−４２ペプチドの産生および遊離を大きく増大させる。Ａβ１−４２の遊離に比例してより大きな増大がある。Ｈｕ−Ａｓｐ２が、ロンドンＶ７１７→Ｆ突然変異を含有するＡＰＰ−ＶＦ（配列番号：１３［ヌクレオチド］および配列番号：１４［アミノ酸］）またはＡＰＰ−ＶＦ−ＫＫ 配列番号：１９［ヌクレオチド］および配列番号：２０［アミノ酸］）クローンで共トランスフェクトされる場合、Ａβ１−４２の産生におけるさらなる増大が見られる。そのV７１７→Ｆ突然変異は、Ａβ４２部位での切断の優先性が増大するようにＡＰＰγ−セクレターゼの切断特異性を変更することが知られている。かくして、Ａｓｐ２は、直接または間接的に作用して、β４２切断部位でのＡＰＰのγ−セクレターゼ・プロセシングを促す。
【０１１４】
材料
抗体６Ｅ１０および４Ｇ８はSenetek（St. Louis, MO）から購入した。抗体３６９はロックフェラー大学のPaul Greengard研究室から入手した。抗体Ｃ８はHarvard Medical School and Brigham and Women's HospitalのDennis Selkoe研究室から入手した。
【０１１５】
用いたＡＰＰ構築体
トランスフェクション実験に用いたＡＰＰ構築体には以下のものが含まれる。
ＡＰＰ              野生型ＡＰＰ６９５（配列番号：９および１０）
ＡＰＰ−Ｓｗ        スウェーデンＫＭ→ＮＬ突然変異を含むＡＰＰ６９５
（配列番号：１１および１２）
ＡＰＰ−ＶＦ        ロンドンＶ→Ｆ突然変異を含むＡＰＰ６９５
（配列番号：１３および１４）
ＡＰＰ−ＫＫ        Ｃ末端ＫＫモチーフを含むＡＰＰ６９５
（配列番号：１５および１６）
ＡＰＰ−Ｓｗ−ＫＫ  Ｃ末端ＫＫモチーフを含むＡＰＰ６９５−Ｓｗ
（配列番号：１７および１８）
ＡＰＰ−ＶＦ−ＫＫ  Ｃ末端ＫＫモチーフを含むＡＰＰ６９５−ＶＦ
（配列番号：１９および２０）
【０１１６】
これらは、ＰＣＲで導入された適当なリンカー配列を用いるＮｏｔ１とＢｓｔＸ１との間のベクターｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Clontech, Palo A1to CA）に挿入された。
【０１１７】
ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ１２５.３細胞およびＮｅｕｒｏ−２A細胞におけるアンチセンス・オリゴマーまたはプラスミドＤＮＡ構築体のトランスフェクション
ヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３細胞およびマウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を、Gibco／BRLからのLipofectamine Plus試薬を用いる発現構築体でトランスフェクトした。細胞は、７０〜８０％密集密度まで２４ウェル組織培養プレート内にまいた。プレート当り４ウェルをOptiMEM中の２μｇのＤＮＡ（３：１、ＡＰＰ：共トランスフェクタント）、８μｌのPlus試薬および４μｌのリポフェクタミンでトランスフェクトした。OptiMEMを１ｍｌの合計容量まで添加し、ウェル当り２００μｌを分配し、３時間培養した。共トランスフェクションに用いた２つのプラスミドの比、ならびにトランスフェクションに用いたＤＮＡの合計量を一定に保持することに注意した。トランスフェクション培地を抗生物質／抗真菌剤を含むＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウムで置き換え、細胞を標準条件（３７°、５％ ＣＯ２）下にて４８時間培養した。ならし培地をポリプロピレン試験管に移し、先の実施例に記載のごときＥＩＡによってＡβ１−４０およびＡβ１−４２の含量につきアッセイするまで−８０℃にて貯蔵した。ＨＥＫ１２５.３細胞へのアンチセンス・オリゴマーのトランスフェクションは実施例７に記載に同じであった。
【０１１８】
細胞抽出物の調製、ウェスタンブロット・プロトコール
細胞は、約６０時間プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした後に採取した。最初に、細胞はプレートから１５ｍｌのコニカルチューブに移し、１,５００ｒｐｍにて５分間遠心して、培地を取り除いた。細胞ペレットをＰＢＳで１回洗浄した。次いで、本発明者らは、溶解緩衝液（ｐＨ７.９の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＭバナジウム酸ナトリウムおよび１％ ＮＰ−４０）で細胞を溶解した。溶解した細胞混合物は、５０００ｒｐｍにて遠心し、上清を細胞抽出物として−２０℃にて貯蔵した。ＨＥＫ１２５.３細胞からの等量の抽出物をＡｓｐ２のアンチセンス・オリゴマーでトランスフェクトし、対照をＡＰＰのＣ末端を認識する抗体３６９で沈降させ、次いで、ＣＴＦ９９を抗体６Ｅ１０で免疫沈降において検出した。実験は、さらにＡＰＰのＣ末端を認識する第２の沈降抗体Ｃ８を用いて繰り返した。Ｈｕ−Ａｓｐ２およびＡＰＰ−ＫＫ、ＡＰＰ−Ｓｗ−ＫＫ、ＡＰＰ−ＶＦ−ＫＫまたはＡＰＰ−ＶＦで共トランスフェクトしたマウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞からの抽出物のウェスタンブロットでは、等量の細胞抽出物が４〜１０％または１０〜２０％のトリシン（Tricine）勾配ゲル（NOVEX, San Diego, CA）を介して電気泳動された。全長ＡＰＰおよびＣＴＦ９９ β−セクレターゼ産物は抗体６Ｅ１０で検出した。
【０１１９】
結果
Ａｓｐ２−１またはＡｓｐ２−２のアンチセンス・オリゴマーでのＨＥＫ１２５.３細胞のトランスフェクションは、逆配列（Ａｓｐ２−１の逆およびＡｓｐ２−２の逆）を有する対照オリゴマーで同様にトランスフェクトした細胞に比較して、ＣＴＦ β−セクレターゼ産物の産生を低下させた。共トランスフェクション実験において、ＡＰＰ−ＫＫ構築体でのマウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞へのＨｕ−Ａｓｐ２の共トランスフェクションは、ＣＴＦ９９の形成を増大させた。これは、Ｈｕ−Ａｓｐ２がβ−セクレターゼ・プロセシングを増大させるスウェーデンＫＭ→ＮＬ突然変異を含む突然変異形態であるＡＰＰ−Ｓｗ−ＫＫで共発現された場合、これはさらに増大した。
【０１２０】
ＡＰＰでのＨｕ−Ａｓｐ２の共トランスフェクションは、Ａβ４０産生に対してほとんど効果かなかったが、背景より上にＡβ４２産生を増大させた（表４）。ＡＰＰのＣ末端へのジ−リジン・モチーフの付加は、約２倍Ａβペプチド・プロセシングを増大するが、Ａβ４０およびＡβ４２産生は、全く低いままである（各々、３５２ｐｇ／ｍｌおよび２１ｐｇ／ｍｌ）。ＡＰＰ−ＫＫでのＡｓｐ２の共トランスフェクションは、Ａβ４０およびＡβ４２産生を共にさらに増大させる。Ｈｕ−Ａｓｐ２によるＡβ４０産生の刺激は３倍を超え、一方、Ａβ４２の産生は１０倍を超えて増大した。かくして、Ｈｕ−Ａｓｐ２およびＡＰＰ−ＫＫ構築体の共トランスフェクションはＡβ４２産生を優先的に増大させる。
【０１２１】
ＡＰＰ Ｖ７１７→Ｆ突然変異は、Ａβ４２切断部位でのγ−セクレターゼ・プロセシングを増大させることが示されている。ＡＰＰ−ＶＦまたはＡＰＰ−ＶＦ−ＫＫ構築体でのＨｕ−Ａｓｐ２の共トランスフェクションは、ｐｃＤＮＡ共トランスフェクション対照に比較して、Ａβ４２産生を増大するが（ＡＰＰ−ＶＦで２倍の増大およびＡＰＰ−ＶＦ−ＫＫで４倍の増大、表４）、Ａβ４０産生に対して混合効果を有した（ＡＰＰ−ＶＦでわずかな低下およびＡＰＰ−ＶＦ−ＫＫで２倍の増大）。かくして、Ａβ４２産生に対するＡｓｐ２の効果は、Ａβ４２／合計Ａβの比の増大に比例してより大きく導かれる。実際には、Ａβ４２／合計Ａβの比は、Ｈｕ−Ａｓｐ２およびＡＰＰ−ＶＦ−ＫＫで共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において４２％という非常に高い値に達する。
【０１２２】
ウェスタンブロットは、Ｈｕ−Ａｓｐ２ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス・オリゴマーでトランスフェクトしたＨＥＫ１２５.３細胞によるＣＴＦ９９産生の低下を示す。（右側の）ウェスタンブロットは、Ｈｕ−Ａｓｐ２およびＡＰＰ−ＫＫで共トランスフェクトしたマウスＮｅｕｒｏ−２ａ 細胞におけるＣＴＦ９９産生の増大を示す。ＣＴＰ９９産生のさらなる増大は、Ｈｕ−Ａｓｐ２およびＡＰＰ−Ｓｗ−ＫＫで共トランスフェクトした細胞において見られる。
【０１２３】
【表３】
2002526081.tif 000003
【０１２４】
実施例９．ヒトＡｓｐ２Ｌの細菌性発現
E. coliにおける組換え体Ｈｕ−Ａｓｐ２Ｌの発現。
Ｈｕ−Ａｓｐ２Ｌは、Ｔ７タグ（配列番号：２１および２２）またはＴ７タグに続くカスパーゼ ８リーダー配列（配列番号：２３番および２４）のごときＮ末端配列の付加後、E. coliにおいて発現できる。あるいは、突然変異を指令する部位によって５'配列のＧＣ含量をの低下を用いて、Ｈｕ−Ａｓｐ２（配列番号：２５および２６）の収量を増大できる。加えて、Ａｓｐ２は、蛋白質分解の切断部位（配列番号：２７番および２８）で作成できる。発現および再折りたたみ後の可溶性蛋白質を産生させるために、膜貫通ドメインおよび細胞質テールの欠失、または膜近位領域、膜貫通ドメインおよび細胞質テールの欠失が好ましい。
【０１２５】
方法
適当なリンカー配列を含むプライマーでのＰＣＲを用いて、Ｔ７タグ（配列番号：２１および２２）またはＴ７−カスパーゼ ８つのリーダー（配列番号：２３および２４）を含むＮ末端の配列修飾とのＡｓｐ２コード配列の融合体を組み立てた。これらの構築体は、Ｔ７プロモーターが複数のクローニング部位の配列に先行してＴ７タグの発現を指令する発現ベクターｐｅｔ２３ａ（＋）［Novagen］でクローニングした。ｐｅｔ２３ａ＋のＴ７リーダーの後のＨｕ−Ａｓｐ２配列をクローニングするために、以下のオリゴヌクレオチドは、選択されたＨｕ−Ａｓｐ２配列の増幅のために用いられた：
＃５５３=GTGGATCCACCCAGCACGGCATCCGGCTG（配列番号：３５）、
＃５５４=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG（配列番号：３６）
それは、各々、インサートの５'および３'端を隣接して挟むＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIの部位を位置させた。Ａｓｐ２配列は、２５サイクルの２工程ＰＣＲサイクルにおける６８℃でのアニーリングおよび伸長を用いる製造者が供給したプロトコールに従って、Advantage-GC cDNA PCR［Clontech］を用いてｐｃＤＮＡ３.１にクローニングした全長Ａｓｐ２（ｂ）ｃＤＮＡから増幅した。インサートおよびベクターはＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、アガロース・ゲルを介する電気泳動によって精製し、次いで、Rapid DNA Ligationキット［Boerhinger Manaheim］を用いて連結した。連結反応体を用いて、E. coli株ＪＭ１０９（Promega）を形質転換し、コロニーをプラスミド精製（Qiagen,Qiaprep minispin）およびＤＮＡ配列決定分析のために採取した。イソプロピルb−D−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導を用いる誘導可能な発現では、発現ベクターをE. coli株ＢＬ２１（Statagene）に移した。細菌培養は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下にてＬＢ培地において増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで０.６〜１.０のＯＤ６００にてログ・フェーズ増殖に３７℃にて４時間誘導した。細胞ペレットは、遠心によって採取した。
【０１２６】
Ｔ７タグおよびカスパーゼリーダー（配列番号：２３および２４）の後のＨｕ−Ａｓｐ２配列をクローニングするために、Ｔ７−Ｈｕ−Ａｓｐ２配列（配列番号：２１および２２）を含む前記の創製した構築体をＢａｍＨ１部位にて開き、次いで、燐酸化されたカスパーゼ ８リーダー・オリゴヌクレオチド＃５５９=GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCGTGAACAGGACG（配列番号：３７）、＃５６０=GATCCGTCCTGTTCACGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC（配列番号：３８）をアニーリングし、ベクターＤＮＡに連結した。オリゴヌクレオチドの各セットについての５'突出部をＢａｍＨＩ部位にそれが連結するが、ＢａｍＨＩで続いて消化されないことを可能とするように設計した。連結反応体は、E. coli株ＢＬ２１へ移した後の蛋白質発現の分析につき前記のごとくＪＭ１０９に形質転換した。ａｓｐ２の５'末端のGC含量を低下させるために、１対の逆平行のオリゴを、G／CからA／Tまでの１５のアミノ酸位置の縮重したコドン塩基を変更するように設計した（配列番号：２５および２６）。ａｓｐ２の５'端の新しいヌクレオチド配列はコードされたアミノ酸を変化させず、E. coli発現を最適化するために選定した。センス・リンカーの配列は、５'
CGGCATCCGGCTGCCCCTGCGTAGCGGTCTGGGTGGTGCTCCACTGGGTCTGCGTCTGCCCCGGGAGACCGACGAA G３'（配列番号：３９）である。アンチセンス・リンカーの配列は、５'
CTTCGTCGGTCTCCCGGGGCAGACGCAGACCCAGTGGAGCACCACCCAGACCGCTACGCAGGGGCAGCCGGATGCCG ３'（配列番号：４０）である。０.１Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ７.４の１０ｍＭトリスにおいて燐酸化されたリンカーを一緒にアニーリングした後、それらはベクターｐＴＡＣにおけるＨｕ−Ａｓｐ２中のユニークなＣｌａＩおよびＳｍａＩ部位に連結した。イソプロピル b−D−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導を用いる誘導可能な発現では、細菌培養は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下にてＬＢ培地において増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで０.６〜１.０のＯＤ６００にてログ・フェーズ増殖において３７℃にて４時間誘導した。細胞ペレットは、遠心によって採取した。
【０１２７】
リーダー配列が、これがＮ末端配列ＧＳＦＶで開始されるＨｕ−Ａｓｐ２ポリペプチド（配列番号：２７および２８）を遊離させるようにカスパーゼ８での制限された蛋白質分解によって取り出せるベクターを創製するために、以下の手法に従った。カスパーゼ ８切断部位IETDを含む２つの燐酸化されたオリゴヌクレオチド、＃５７１=５'
GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCTGGACTCTGGTATCGAAACCGACG（配列番号：４１）、および＃５７２
=GATCCGTCGGTTTCGATACCAGAGTCCAGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC（配列番号：４２）をアニーリングし、ＢａｍＨＩで開かれたｐＥＴ２３ａ＋に連結した。ＪＭ１０９への形質転換後、精製したベクターＤＮＡを回収し、インサートの起源をＤＮＡ配列分析によって確認した。＋、以下のオリゴヌクレオチドを選択したＨｕ−Ａｓｐ２配列の増幅のために用いた：
＃５７３=５'AAGGATCCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTG（配列番号：４３）、
＃５５４=GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG（配列番号：４４）
それらを各々、インサートの５'および３'端を隣接して挟むＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIの部位を位置させた。Ａｓｐ２配列は、２５サイクルの２工程ＰＣＲサイクルにおける６８℃でのアニーリングおよび伸長を用いる製造者が供給したプロトコールに従って、Advantage-GC cDNA PCR［Clontech］を用いてｐｃＤＮＡ３.１にクローニングした全長Ａｓｐ２（ｂ）ｃＤＮＡから増幅した。インサートおよびベクターはＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、アガロース・ゲルを介する電気泳動によって精製し、次いで、Rapid DNA Ligationキット［Boerhinger Manaheim］を用いて連結した。連結反応体を用いて、E. coli株ＪＭ１０９［Promega］を形質転換し、コロニーをプラスミド精製（Qiagen,Qiaprep minispin）およびＤＮＡ配列決定分析のために採取した。イソプロピルb−D−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導を用いる誘導可能な発現では、発現ベクターが、E. coli株ＢＬ２１（Statagene）に移された。細菌培養は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下にてＬＢ培地において増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで０.６〜１.０のＯＤ６００にてログ・フェーズ増殖において３７℃にて４時間誘導した。細胞ペレットは、遠心によって採取した。
【０１２８】
精製を支援するために、６−Hisタグは、ＢａｍＨＩ部位にて構築体を開き、次いで、アニーリングし６個のヒスチジン配列を含有する燐酸化されたオリゴヌクレオチド
＃５６５＝GATCGCATCATCACCATCACCATG（配列番号：４５）、 
＃５６６＝GATCCATGGTGATGGTGATGATGC（配列番号：４６）
において連結することによって、Ｔ７リーダーに続いて前記の構築体のいずれにも導入できる。各セットのオリゴヌクレオチドについての５'突出部は、ＢａｍＨＩ部位に結合するが、ＢａｍＨＩで続いて消化されないことを可能とするように設計した。
【０１２９】
細菌ペレットの調製：
１０.８Ｌの増殖を表す３６.３４ｇの細菌ペレットは、２Ｍ ＫＣｌ、０.１Ｍトリス、０.０５Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ中で３０００ないし５０００ｒｐｍにて２０ｍｍの組織ホモジナイザー・プローブを用いて、２００ｍｌの合計容量に分散させた。伝導率は水で約１９３ｍＭｈｏｓに調整した。ペレットを分散させた後、さらなる量のＫＣｌ溶液を添加し、合計容量を５００ｍｌとした。この懸濁物を同一プローブを用いて５０００ｒｐｍにてさらに約３分間ホモジナイズした。次いで、混合物は１００００ｐｓｉにてRannie高圧ホモジナイザーを通過させた。
【０１３０】
全ての場合には、ペレット物質を進展させ、一方、可溶性画分は廃棄した。得られた溶液をＧＳＡローター中で１２５００ｒｐｍにて１時間遠心した。ペレットは、２０００ｒｐｍにて同一組織ホモジナイザー・プローブを用いて、（ＤＴＴなくして）同一溶液中に再懸濁した。３０００ｒｐｍにて５分間ホモジナイズの後、容量を同一溶液で５００ｍｌに調整し、１２５００ｒｐｍにて１時間回転させた。次いで、前記のごとくペレットを再懸濁したが、この時、最終的な容量は同一溶液で１.５Ｌに調整し、５分間ホモジナイズした。３０分間同一速度にて遠心した後、この手順を繰り返した。次いで、ペレットは、約１５０ｍｌの冷水に再懸濁し、ＧＳＡローターで用いた６本の遠心試験管からペレットをプールした。ペレットは３,０００ｒｐｍにて５分間ホモジナイズし、容量を冷水で２５０ｍｌに調整し、次いで、３０分間回転させた。得られたペレットの重量は１７.７５ｇであった。
【０１３１】
まとめ：ＫＣｌ溶液中の細菌ペレットの溶解、続いてのＧＳＡローターにおける遠心を用いて、ペレットを最初に調製した。次いで、同一溶液を用いて、さらに３回再懸濁／ホモジナイズした。次いで、最終的な水洗浄／ホモジナイズを行い、過剰なＫＣｌおよびＥＤＴＡを除去した。
【０１３２】
ｒＨｕ−Ａｓｐ２Ｌの可溶化：
ペレットの９〜１０ｍｌ／グラムの比率は、先に記載されたペレットからのｒＨｕ−Ａｓｐ２Ｌを可溶化するために利用された。１７.７５ｇのペレットを解凍し、１５０ｍｌの８ＭグアニジンＨＣｌ、５ｍＭ βＭＥ、０.１％ＤＥＡを添加した。３Ｍトリスを用いて、ｐＨを８.６に調整した。ペレットは、最初に１０００ｒｐｍにて２０ｍｍの組織ホモジナイザー・プローブを用いて、グアニジン溶液に再懸濁した。次いで、混合物は４℃にて１時間撹拌し、ＧＳＡローター中で１２,５００ｒｐｍにて１時間遠心した。次いで、得られた上清をＳＳ−３４ローター中で４０,０００×ｇにて３０分間遠心した。次いで、最終上清は５０ｍｌを除いて、２０℃にて貯蔵した。
【０１３３】
可溶化されたｒＨｕＡｓｐ２Ｌの固定化ニッケル・アフィニティークロマトグラフィー：
以下の溶液を利用した：
Ａ）６ＭグアニジンＨＣｌ、０.１Ｍ ＮａＰ、ｐＨ８.０、０.０１Ｍトリス、５ｍＭ、βＭＥ、０.５ｍＭイミダゾール、
Ａ'）６Ｍ尿素、２０ｍＭ ＮａＰ、ｐＨ６.８０、５０ｍＭ ＮａＣｌ
Ｂ'）６Ｍ尿素、２０ｍＭ ＮａＰ、ｐＨ６.２０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ イミダゾール 
Ｃ'）６Ｍ尿素、２０ｍＭ ＮａＰ、ｐＨ６.８０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール
注：緩衝液Ａ'およびＣ'を適当な比で混合して、中間濃度のイミダゾールを得た。
５０ｍｌの可溶化された材料を５０ｍｌの緩衝液Ａと合わせ、５×１０ｃｍのBio-Rad econoカラム中の１００〜１２５ｍｌの（緩衝液Ａで予め平衡させた）Qiagen Ni-NTA SuperFlowに添加した。これを冷室内で４℃にて一晩ゆっくり振盪した。
【０１３４】
クロマトグラフィー工程：
１） 得られたフロー・スルー画分を排出する。
２） （フロー・スルー画分を集めて）５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄する
３） ２５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄する（洗浄１）
４） ２５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄する（洗浄２）
５） ２５０ｍｌの緩衝液Ａ'で洗浄する
６） ２５０ｍｌの緩衝液Ｂ'で洗浄する
７） ２５０ｍｌの緩衝液Ａ'で洗浄する
８） ２５０ｍｌの７５ｍＭイミダゾールで溶出する
９） ２５０ｍｌの１５０ｍＭイミダゾールで溶出する（１５０−１）
１０） ２５０ｍｌの１５０ｍＭイミダゾールで溶出する（１５０−２）
１１） ２５０ｍｌの３００ｍＭイミダゾールで溶出する（３００−１）
１２） ２５０ｍｌの３００ｍＭイミダゾールで溶出する（３００−２）
１３） ２５０ｍｌの３００ｍＭイミダゾールで溶出する（３００−３）
【０１３５】
クロマトグラフィー結果：
ｒＨｕ−Ａｓｐは、７５ｍＭイミダゾールから３００ｍＭイミダゾールまでにて溶出した。７５ｍＭ画分ならびに第１の１５０ｍＭイミダゾール（１５０−１）画分は、クーマシーブルー染色ゲル上で視覚化される汚染蛋白質を含有した。従って、画分１５０−２および３００−１は、それらが最大量の蛋白質を含有するために再折りたたみ実験に利用されるだろう（クーマシーブルー染色ゲルを参照）。
【０１３６】
ｒＨｕＡｓｐ２Ｌの再折りたたみ実験：
実験１：
４０ｍｌの１５０−２は、１Ｍ ＤＴＴ、ｐＨ７.４の３ＭトリスおよびＤＥＡで、各々、６ｍＭ、５０ｍＭおよび０.１％の最終濃度までスパイクした。これを（撹拌しつつ）２００ｍｌの（４℃の）冷却したｐ６.８の２０ｍＭ ＮａＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌで突然に希釈した。この希釈は、１Ｍの最終尿素濃度を与えた。室温または４℃にて空気に曝露してもこの溶液は透明のままであった。
【０１３７】
次いで、４℃にて４〜５時間空気に曝露した後、この溶液をｐＨ７.４の２０ｍＭ ＮａＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％のグリセロールに対して一晩透析した。この方法は、蛋白質を沈殿させることなく溶液中の尿素を効果的に除去した。
【０１３８】
実験２：
いくらかの１５０−２溶出液をAmicon Centriprep, １０,０００MWCO上で２回濃縮し、次いで、実施例１のごとく処理した。また、この材料を可視の沈殿なく、溶液中にとどめた。
【０１３９】
実験３：
８９ｍｌの１５０−２溶出液は、１Ｍ ＤＴＴ、ｐＨ７.４の３ＭトリスおよびＤＥＡで、各々、６ｍＭ、５０ｍＭおよび０.１％の最終濃度までスパイクした。これを（撹拌しつつ）４４５ｍｌの（４℃の）冷却したｐ６.８の２０ｍＭ ＮａＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌで突然に希釈した。この溶液は透明であり、明白な沈殿はなかった。この溶液を室温まで戻し、１０分間撹拌し、０.１ｍＭの最終濃度までＭＥＡを添加した。これを室温にて１時間ゆっくり撹拌した。次いで、シスタミンおよびＣｕＳＯ４を、各々、最終濃度の１ｍＭおよび１０μＭまで添加した。溶液を室温にて１０分間ゆっくり撹拌し、４℃の冷室に移し、一晩ゆっくり撹拌し、空気に開けた。
【０１４０】
翌日、（依然とした透明で、明らかな沈殿はない）溶液を１００,０００×ｇにて１時間遠心した。複数の試行からの上清をプールし、大量の安定化した蛋白質をｐＨ７.４の２０ｍＭ ＮａＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％のグリセロールに対して透析した。透析後、材料を−２０℃にて貯蔵した。
いくらか（約１０ｍｌ）の蛋白質溶液（依然として１Ｍ尿素中）を生化学的分析のために戻し保存し、貯蔵のために−２０℃にて凍結した。
【０１４１】
実施例１０．昆虫細胞におけるＨｕ−Ａｓｐ２および誘導体の発現
バキュロウイルス感染による発現−Ｈｕ−Ａｓｐ２およびいくつかの誘導体のコード配列をＰＣＲを用いて昆虫細胞における発現のために作成した。全長配列では、翻訳開始部位を修飾してKozakコンセンサス配列に適合する５'−センス・オリゴヌクレオチド・プライマーは、Ｈｕ−Ａｓｐ２配列中の天然の翻訳停止コドンを含む、３'−アンチセンス・プライマーとペアとした。ｐｃＤＮＡ３.１（hygro）／Ｈｕ−Ａｓｐ２テンプレートのＰＣＲ増幅（実施例１２を参照）。また、Ｃ末端の膜貫通ドメインを欠失する（配列番号：２９および３０）、または膜貫通ドメインを欠失し、Ｃ末端にてヘキサ−ヒスチジンタグを導入する（配列番号：３１および３２）Ｈｕ−Ａｓｐ２の２つの誘導体をＰＣＲを用いて作成した。前記の同一５'−センス・オリゴヌクレオチド・プライマーは、テンプレートとしてｐｃＤＮＡ３.１（hygro）／Ｈｕ−Ａｓｐ−２Ｌを用いるＰＣＲにおいて、（１）コドン４５３（配列番号：３）後の翻訳停止を導入する、または（２）ヘキサ−ヒスチジンタグに続いて翻訳停止コドンを組込むいずれかの３'−アンチセンス・プライマーとペアとした。すべての場合に、ＰＣＲ反応は、供給者によって概説されたごときPwoI ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim）を用いて、１５サイクルにて増幅して行った。反応産物はＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで完了まで消化し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ消化したトランスファー・ベクターｐＶＬ１３９３（Invitrogen）に連結した。部分連結を用いて、コンピテントであるE. coliDH５α細胞を形質転換し、続いてＬＢ−Ａｍｐで抗生物質選択をした。プラスミドＤＮＡを標準的アルカリ性溶解によって調製し、ＣｓＣｌにバンドさせて、バキュロウイルス・トランスファー・ベクターｐＶＬ１３９３／Ａｓｐ２、ｐＶＬ１３９３／Ａｓｐ２ΔＴＭおよびｐＶＬ１３９３／Ａｓｐ２ΔＴＭ（His）６を得た。組換え体バキュロウイルスの創製およびｓｆ９昆虫細胞の感染は、標準的方法を用いて行った。
【０１４２】
トランスフェクションによる発現−Ｈｉｇｈ ５昆虫細胞におけるＨｕ−Ａｓｐ２ΔＴＭおよびＨｕ−Ａｓｐ２ΔＴＭ（His）６の一過性および安定した発現を昆虫発現ベクターｐＩＺ／V５Hisを用いて行った。発現プラスミド・ベクターｐＶＬ１３９３／Ａｓｐ２、ｐＶＬ１３９３／Ａｓｐ２ΔＴＭおよびｐＶＬ１３９３／Ａｓｐ２ΔＴＭ（His）６からのＤＮＡインサートは、標準的方法を用いて、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで二重消化によって切り取り、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＩＺ／V５−Hisにサブクローニングした。ｐＩＺ／Ｈｕ−Ａｓｐ２ΔＴＭ、およびｐＩＺ／Ｈｕ−Ａｓｐ２ΔＴＭ（His）６という、得られた発現プラスミドは、前記のごとく調製した。
【０１４３】
トランスフェクションでは、Ｈｉｇｈ５昆虫細胞は、密閉フラスコ中で２７℃にて１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足したＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ無血清培地中で培養した。トランスフェクションは、標準的方法を用いて、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足したＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ無血清培地およびInsectinPlusリポソーム（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて行った。
【０１４４】
大規模な一過性のトランスフェクションでは、１.２×１０７個のｈｉｇｈ ｆｉｖｅ細胞を１５０ｍｍの組織培養皿で培養し、室温にて１５〜３０分間付着させた。付着時間の間、ＤＮＡ／リポソーム混合物を６ｍｌの無血清培地、６０μｇのＡｓｐ２ΔＴＭ／ｐＩＺ（+／−His）ＤＮＡおよび１２０μｌのInsectin Plusを混合することによって調製し、室温にて１５分間培養した。平板培養培地を細胞の皿から取出し、室温にて４時間ＤＮＡ／リポソーム混合物で置き換え、２ｒｐｍにて一定に振盪させた。さらなる６ｍｌの培地を皿に添加し、湿潤培養器中で２７℃にて４日間培養した。トランスフェクション４日後に、培地を採取し、５００×ｇでの遠心によって透明とし、ウェスタンブロットによってＡｓｐ２発現につきアッセイした。安定した発現では、細胞を５０μｇ／ｍｌＺｅｏｃｉｎで処理し、生存プールを用いて、限界希釈法に続いて、前記のごとき発現レベルの分析によってクローン細胞を調製した。
【０１４５】
Ｈｕ−Ａｓｐ２ΔＴＭおよびＨｕ−Ａｓｐ２ΔＴＭ（His）６の精製−Ｈｕ−Ａｓｐ２からの膜貫通セグメントの除去の結果、ポリペプチドが培養基へ分泌された。バキュロウイルスの感染またはトランスフェクションのいずれかによる蛋白質産生に続いて、ならし培地を採取し、遠心によって透明とし、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に対して透析した。次いで、この材料は、ＮａＣｌ勾配を用いるアニオン交換クロマトグラフィー（トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０）に続いてカチオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ４.５の酢酸緩衝液）によって順次クロマトグラフィーによって精製した。この溶出プロフィールは、（１）ウェスタンブロットおよび（２）実施例１２に記載のペプチド基質を用いる活性アッセイ方法によってモニターした。Ｈｕ−Ａｓｐ２ΔＴＭ（His）６では、ならし培地をトリス緩衝液（ｐＨ８.０）に対して透析し、IＭAC樹脂に続いてアニオン交換クロマトグラフィーの順次クロマトグラフィーによって精製した。
精製したＨｕ−Ａｓｐ２ΔＴＭ（His）６蛋白質の配列分析は、シグナルペプチドが切断されたことを明らかにした［TQHGIRLPLR（配列番号：５２）］。
【０１４６】
実施例１１．ＣＨＯ細胞におけるＨｕ−Ａｓｐ２の発現
ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＨｕ−Ａｓｐ２の不均―発現−Ｈｕ−Ａｓｐ２の全コード配列は、過発現を駆動するためのＣＭＶ即時型プロモーターおよびｂＧＨポリアデニル化シグナルを含有する哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１（＋）Ｈｙｇｒｏ（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングした。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３.１（＋）Ｈｙｇｒｏ／Ｈｕ−Ａｓｐ２は、アルカリ性溶解によって調製し、ＣｓＣｌ中でバンドし、両鎖に対して完全に配列決定して、コード配列の完全性を確認した。
【０１４７】
野生型チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）はＡＴＣＣから入手した。該細胞は５％ＣＯ２の３７℃にて１０％ＦＣＳを含有するα−ＭＥＭ中の単層培養において維持した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（６０％密集）の２つの１００ｍｍ皿は、供給者から推奨されたカチオン性リポソームDOTAPを用いて、ｐｃＤＮＡ３.１（＋）／Ｈｙｇｒｏ単独（モック）またはｐｃＤＮＡ３.１（＋）Ｈｙｇｒｏ／Ｈｕ−Ａｓｐ２でトランスフェクトした。細胞は、プラスミドＤＮＡ／リポソーム混合物で１５時間処理し、次いで、培地を５００単位／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有する増殖培地で置き換えた。ｐｃＤＮＡ３.１（＋）Ｈｙｇｒｏ／Ｈｕ−Ａｓｐ２で形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞の場合には、個々のハイグロマイシンＢ耐性細胞は、限界希釈法によってクローニングした。個々の細胞系のクローン発現後、Ｈｕ−Ａｓｐ２蛋白質の発現は、E. coliにおける発現によって調製された組換え体Ｈｕ−Ａｓｐ２に対して生起されたポリクローナルウサギ抗血清を用いるウェスタンブロット分析によってアクセスした。密集付近の皿の各細胞系をＰＢＳに廃棄することによって採取し、細胞を遠心によって回収した。細胞ペレットは、プロテアーゼインヒビターを含有する冷溶解緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（８.０）／５ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、細胞を音波処理によって溶解した。可溶性および膜の画分は、遠心（１０５,０００×ｇ、６０分間）によって分離し、次いで、各画分からの標準化された量の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。の分離したポリペプチドのPVDF膜へ電気移動の後、Ｈｕ−Ａｓｐ２Ｌ蛋白質をウサギ抗−Ｈｕ−Ａｓｐ２抗血清（１／１０００希釈液）を用いて検出し、抗体−抗原複合体をヤギ抗ウサギ抗体（１／２５００）でコンジュゲートしたアルカリ性フォスファターゼを用いて視覚化した。６５ｋＤａの見掛けのＭｒ値を持つ特異的な免疫反応蛋白質をｐｃＤＮＡ３.１（＋）Ｈｙｇｒｏ／Ｈｕ−Ａｓｐ２をトランスフェクトした細胞中で検出したが、モックでトランスフェクトした細胞においては検出されなかった。また、Ｈｕ−Ａｓｐ２ポリペプチドは、推定配列における単一ペプチドおよび単一膜貫通ドメインの存在と一致する膜画分中にだけ検出された。これらの分析に基づき、クローン＃５は、高発現レベルのＨｕ−Ａｓｐ２蛋白質を有し、この産生細胞系をスケールアップして、精製用の材料を供した。
【０１４８】
ＣＨＯ−Ｋ１／Ｈｕ−Ａｓｐ２クローン＃５からの組換え体Ｈｕ−Ａｓｐ−２Ｌの精製−典型的な精製において、２０個の１５０ｍｍ皿の密集細胞から由来するクローン＃５細胞ペレットを出発材料として用いた。細胞ペレットは、前記のごとき５０ｍｌの冷溶解緩衝液に再懸濁させた。細胞をポリトロン均質化（２×２０秒）によって溶解し、溶解物を３３８,０００×ｇにて２０分間遠心した。次いで、膜ペレットは、５０ｍＭ β−オクチルグルコシドを含有する２０ｍｌの冷溶解緩衝液に再懸濁し、４℃にて１時間振盪させた。洗浄抽出物を３３８,０００×ｇにて２０分間遠心して透明とし、上清をさらなる分析のために取った。
【０１４９】
β−オクチルグルコシド抽出物は、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）／５０ｍＭ β−オクチルグルコシドで予め平衡化したMono Qアニオン交換カラムに適用した。試料の適用後、カラムは線形勾配のＮａＣｌ濃度（３０分にわたる０〜１.０Ｍ）で溶出し、個々の画分をウェスタンブロット分析によっておよびβ−セクレターゼ活性につきアッセイした（以下参照）。Ｈｕ−Ａｓｐ２Ｌ免疫反応性およびβ−セクレターゼ活性の双方を含有する画分をプールし、２５ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４.５）／５０ｍＭ β−オクチルグルコシドに対して透析した。透析後、沈殿した材料を遠心によって取出し、可溶性材料を２５ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４.５）／５０ｍＭ β−オクチルグルコシド中に予め平衡化したMonoSカチオン交換カラムのクロマトグラフィーに付した。そのカラムを線形勾配のＮａＣｌ濃度（３０分にわたる０〜１.０Ｍ）で溶出し、個々の画分をウェスタンブロット分析によっておよびβ−セクレターゼ活性につきアッセイした。Ｈｕ−Ａｓｐ２免疫反応性およびβ−セクレターゼ活性を共に含む画分を合わせ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色によって＞９０％純粋であると決定した。
【０１５０】
実施例１２．ペプチド基質を用いるＨｕ−Ａｓｐ２β―セクレターゼ活性のアッセイ
β−セクレターゼ・アッセイ−β−セクレターゼ活性はＵＶで検出するＲＰ−ＨＰＬＣによりＡＰＰスウェーデン突然変異を含有する合成ペプチドの加水分解を定量することによって測定された。各反応物は５０ｍＭ Ｎａ−ＭＥＳ（ｐＨ５.５）、１％ β−オクチルグルコシド、ペプチド基質（SEVNLDAEFR、７０μＭ；配列番号：５４）、および酵素（１〜５μｇ蛋白質）を含有した。反応は、３７℃にて種々の回数でインキュベートし、反応産物を３０分間にわたる０〜７０Ｂの線形勾配を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（Ａ＝水中０.１％ＴＦＡ、Ｂ＝）.１％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡｃＣＮ）。溶出プロフィールは、２１４ｎｍでの吸光度によってモニターした。予備的実験において、無傷のペプチド基質の前に溶出した２つの生成物ピークが、エドマン配列決定法およびＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ質量分析の双方を用いて配列DAEFRおよびSEVNLを有することを確認した。ペプチド基質のパーセント加水分解は、２１４ｎｍでの吸光度から誘導された２つの生成物ペプチドおよび出発物質についての統合ピーク面積を比較することにより計算した。プロテアーゼ切断反応の特異性は、プロテアーゼインヒビターのカクテル（８μＭペプスタチＡ、１０μＭロイペプチン、１０μＭ Ｅ６４および５ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下にてβ−セクレターゼ・アッセイを行うことによって決定した。
【０１５１】
代替的なβ−セクレターゼ・アッセイは内部クエンチした蛍光基質を利用して、単一試料または複数ウェル形式における蛍光分光学を用いて酵素活性をモニターする。各反応物は５０ｍＭ Ｎａ−ＭＥＳ（ｐＨ５.５）、ペプチド基質ＭＣＡ−EVKMDAEF［K−DNP］（配列番号：５８）（BioSource International）（５０μＭ）および精製したＨｕ−Ａｓｐ２酵素を含有した。これらの成分は、種々の回数にて３７℃に平衡化され、反応を基質添加によって開始した。励起は３３０ｎｍにて行い、反応速度は、３９０ｎｍでの蛍光発光を測定することによってモニターした。Ｈｕ−Ａｓｐ−２活性を調節する化合物を検出するために、試験化合物を、反応のプレインキュベーション相の間に添加し、反応速度を前記のごとくモニターした。アクチベーターは、蛍光出現速度を増大させる化合物として評価し、一方、阻害剤は、蛍光出現速度を低下させる化合物として評価した。
【０１５２】
本発明は、これまでの記載および実施例に特に記載されたものとは別の方法で実施できることも明らかであろう。
本発明の多数の修飾および変形は、前記教示に徴して可能であり、したがって、本発明の範囲内である。
本明細書に引用された全刊行物の全ての開示を出典明示して本明細書の一部とみなす。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＡｓｐ１のヌクレオチド（配列番号：１）および予測アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図２】
図２は、ヒトＡｓｐ２（ｂ）のヌクレオチド（配列番号：５）および予測アミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図３】
図３は、ヒトＡｓｐ２（ａ）のヌクレオチド（配列番号：３）、および予測アミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【図４】
図４は、ネズミＡｓｐ２（ａ）のヌクレオチド（配列番号：７）および予測アミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【図５】
図５は、Ｈｕ−Ａｓｐ２（ａ）（配列番号：４）およびネズミＡｓｐ２（ａ）（配列番号：８）の予測アミノ酸配列のBestFit整列を示す。
【図６】
図６は、Ｔ７−ヒト−プロ−Ａｓｐ２（ａ）ΔＴＭのヌクレオチド（配列番号：２１）および予測アミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。
【図７】
図７は、Ｔ７−カスパーゼ−ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭのヌクレオチド（配列番号：２３）および予測アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図８】
図８は、ヒト−プロ−Ａｓｐ−２（ａ）ΔＴＭ（低ＧＣ）のヌクレオチド（配列番号：２５）および予測アミノ酸配列（配列番号：２６）を示す。
【図９】
Ｈｕ−Ａｓｐ２ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス・オリゴマーでトランスフェクトしたＨＥＫ１２５.３細胞によるＣＴＦ９９産生の低下を示すウエスタンブロット。
【図１０】
Ｈｕ−Ａｓｐ２で共トランスフェクトしたこれらの細胞においてのみ、Ｈｕ−Ａｓｐ２を含むまたは含まないＡＰＰ−ＫＫで共トランスフェクトしたマウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞におけるＣＴＦ９９産生の増大を示すウェスタンブロット。ＣＴＦ９９産生のさらなる増大はＨｕ−Ａｓｐ２で共トランスフェクトしたそれらの細胞においてのみ、Ｈｕ−Ａｓｐ２を含むまたは含まないＡＰＰ−Ｓｗ−ＫＫで共トランスフェクトした細胞に見られた。
【図１１】
図１１は、ヒトＡｓｐ２（ａ）ΔＴＭの予測アミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。
【図１２】
図１２は、ヒト−Ａｓｐ（ａ）ΔＴＭ（Ｈｉｓ）６の予測アミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。