(57)【要約】  【課題】  リガンドとアナライトとの結合の状態を全反射減衰を利用して測定する測定装置であって、薄膜層にリガンドを固定した検出領域およびリガンドを固定していない参照領域を設け、参照領域の測定結果を用いて、検出領域の測定結果を校正するリファレンス法を用いる測定装置において、測定結果の信頼度を低下させることなく、小型化する。  【解決手段】  リガンド73が固定された検出領域59ｂ下の界面58ｂ、およびリガンドが固定されていない参照領域59ａ下の界面58ａに対して、全反射条件が得られる角度で光ビームＬａおよびＬｂを入射させる際に、シャッタ30により光ビームＬａおよび光ビームＬｂの光路を開閉し、光ビームＬａが界面58ａへ入射するタイミングと光ビームＬｂが界面58ａへ入射するタイミングとを異ならせる。各領域における測定が、他領域に入射した光ビームの影響を受けるが防止できる。【選択図】          図２
2006105912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ビームを発生させる光源と、
該光ビームに対して透明な誘電体ブロック、該誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および該薄膜層上にアナライトを保持するアナライト保持機構を備え、前記薄膜層がその表面上にリガンドが固定された検出領域および前記リガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を有する測定ユニットと、
前記薄膜層の前記検出領域と前記誘電体ブロックとの第１界面、および前記薄膜層の前記参照領域と前記誘電体ブロックとの第２界面の各々に対して、全反射条件が得られる角度で前記光ビームを入射させる第１光学系と、
前記光源と前記測定ユニット間に配置され、前記光ビームが前記第１界面へ入射するタイミングと前記光ビームが前記第２界面へ入射するタイミングとが異なるように、前記光ビームの光路を開閉するシャッタと、
前記第１界面で全反射した光ビームの強度を検出する第１光検出手段と、
前記第２界面で全反射した光ビームの強度を検出する第２光検出手段と、
前記第１光検出手段の検出結果に基づいて前記検出領域の状態を測定し、前記第２光検出手段の検出結果に基づいて前記参照領域の状態を測定し、該参照領域の状態に基づいて、前記検出領域の状態を校正する測定・校正手段とを備えたことを特徴とする測定装置。
【請求項２】
前記第１光検出手段が、前記第２光検出手段を兼ねるものであることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項３】
前記第１光検出手段と前記第２光検出手段とが同一の受光領域で前記光ビームを受光するものであり、
前記第１界面で全反射した光ビームと、前記第２界面で反射した光ビームとを前記光検出手段の同一の受光領域へ入射させる第２光学系を備えたことを特徴とする請求項２記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定ユニットの薄膜層に固定されたリガンドと、リガンドが固定された測定ユニットへアナライトを供給し、リガンドとアナライトとの特異的結合の状態を全反射減衰を使用して測定する測定装置に関するものであり、より詳細には、薄膜層にリガンドを固定した検出領域およびリガンドを固定していない参照領域を設け、参照領域の測定結果を用いて、検出領域の測定結果を校正するリファレンス法を用いる測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、エバネッセント波を利用した測定装置の１つとして、表面プラズモンセンサーが知られている。金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。表面プラズモンセンサーは、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、試料の特性を分析するものであり、種々のタイプのセンサーが提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
上記の系を用いる表面プラズモンセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、該光検出手段の検出結果に基づいて表面プラズモン共鳴の状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【０００４】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサーによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサーによって検出することができる。
【０００５】
上記構成の表面プラズモンセンサーにおいて、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角θＳＰで入射させると、該金属膜に接している試料中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と試料との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。
【０００６】
なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０００７】
この光強度の低下が生じる全反射角以上の特定入射角θＳＰ（以後全反射減衰角θＳＰと記載）より表面プラズモンの波数が解ると、試料の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫＳＰ、表面プラズモンの角周波数をω、ｃを真空中の光速、εｍとεｓをそれぞれ金属、試料の誘電率とすると、以下の関係がある。
【数１】
2006105912.tif 000003
【０００８】
試料の誘電率εｓが分かれば、所定の較正曲線等に基づいて試料の屈折率等が分かるので、結局、全反射減衰角θＳＰを知ることにより、試料の誘電率つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【０００９】
また、エバネッセント波を利用した類似のセンサーとして、漏洩モードセンサーも知られている（例えば非特許文献１参照）。この漏洩モードセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定する光検出手段と、該光検出手段の検出結果に基づいて導波モードの励起状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【００１０】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の試料の屈折率に依存するので、全反射減衰角θＳＰを知ることによって、試料の屈折率や、それに関連する試料の特性を分析することができる。
【００１１】
また、上述した表面プラズモンセンサーや漏洩モードセンサーは、創薬研究分野等において、所望のリガンドに結合するアナライトを見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモンセンサーの場合は金属膜であり、漏洩モードセンサーの場合はクラッド層および光導波層）上にリガンドを固定し、該リガンド上に種々のアナライトを含有するアナライト溶液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角θＳＰを測定している。アナライト溶液中のアナライトが、リガンドと結合するものであれば、この結合によりリガンドの屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角θＳＰを測定し、全反射減衰角θＳＰに変化が生じているか否か測定することにより、アナライトとリガンドの結合が行われているか否か、すなわちアナライトがリガンドと結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このようなアナライトとリガンドとの組み合わせとしては、例えば抗原と抗体あるいは抗体と抗体が挙げられ、そのようなものに関する具体的な測定としては、一例として、リガンドをウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体とし、アナライトであるヒトＩｇＧ抗体との結合の有無検出とその定量分析を行う測定が挙げられる。
【００１２】
なお、アナライト溶液中のアナライトとリガンドの結合状態を測定するためには、必ずしも全反射減衰角θＳＰの角度そのものを検出する必要はない。例えば最初にアナライトを含まないバッファを用いて基準となるベースラインを測定した後、リガンド上にアナライト溶液を添加した際の全反射減衰角θＳＰの角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。
【００１３】
ところで、上記のような表面プラズモンセンサー等の測定装置においては、バルク効果や、リガンドおよびアナライト溶液の温度変化や、光源変動等の外乱による測定結果の誤差をなくすため、リファレンス法と呼ばれる方法を用いて測定精度を向上させる方法が用いられている。
【００１４】
このリファレンス法は、例えば、リガンドとアナライトの結合状態について測定を行う場合に、薄膜層上にリガンドを固定した検出系、および薄膜層上にリガンドを固定していない参照系の２つの系を用意し、例えば、検出系での測定結果から参照系の測定結果を引く等、参照系の測定結果に基づいて検出系の測定結果を校正することによって、上記のような外乱の影響を除外することができるものである。
【００１５】
このリファレンス法をコンパクトな装置で実現するために、本出願人は、誘電体ブロック、該誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および該薄膜層上にアナライト溶液を保持するアナライト溶液保持機構を備えた一つの測定ユニットの薄膜層上に、リガンドが固定された検出領域およびリガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を設け、それぞれの領域毎に測定を行う装置を提案している。
【特許文献１】特開平6−167443号公報
【特許文献２】特開2000−065731号公報
【非特許文献１】「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
近年、上記のような一つの測定ユニットの薄膜層上に、リガンドが固定された検出領域およびリガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を設け、それぞれの領域ごとに測定を行う装置において、より測定装置の小型化が求められている。しかしながら、検出領域および参照領域の微小化を進めると、検出領域と参照領域の測定を同時に行った場合に、互いに、他領域で反射した光ビームの光強度分布の影響を受け、測定結果の信頼度が低下する虞がある。
【００１７】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、一つの測定ユニットの薄膜層上に、リガンドが固定された検出領域およびリガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を設け、それぞれの領域ごとに測定を行う装置において、測定結果の信頼度を低下させることなく、小型化できる測定装置を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明による第１の測定装置は、光ビームを発生させる光源と、
該光ビームに対して透明な誘電体ブロック、該誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および該薄膜層上にアナライト溶液を保持するアナライト溶液保持機構を備え、前記薄膜層がその表面上にリガンドが固定された検出領域および前記リガンドが固定されていない参照領域の２つの領域を有する測定ユニットと、
前記薄膜層の前記検出領域と前記誘電体ブロックとの第１界面、および前記薄膜層の前記参照領域と前記誘電体ブロックとの第２界面の各々に対して、全反射条件が得られる角度で前記光ビームを入射させる第１光学系と、
前記光源と前記測定ユニット間に配置され、前記光ビームが前記第１界面へ入射するタイミングと前記光ビームが前記第２界面へ入射するタイミングとが異なるように、前記光ビームの光路を開閉するシャッタと、
前記第１界面で全反射した光ビームの強度を検出する第１光検出手段と、
前記第２界面で全反射した光ビームの強度を検出する第２光検出手段と、
前記第１光検出手段の検出結果に基づいて前記検出領域の状態を測定し、前記第２光検出手段の検出結果に基づいて前記参照領域の状態を測定し、該参照領域の状態に基づいて、前記検出領域の状態を校正する測定・校正手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００１９】
なお、ここで「シャッタ」とは、メカニカルな動作により光を開閉するメカニカルシャッタであってもよいし、あるいは光学濃度が変化することにより光路を開閉する光学シャッタであってもよいし、あるいは、偏光特性が変化することにより所望の偏光について光路を開閉する偏光シャッタ等であってもよい。また、第１界面へ入射する光ビームと第２界面へ入射する光ビームとは同一の光ビームが時分割されたものであってもよいし、あるいは予めビームスプリッタ等により２本の光ビームに分割されたものであってもよい。
【００２０】
前記第１光検出手段は、前記第２光検出手段を兼ねるものであってもよい。また、前記第１界面で全反射した光ビームの受光領域と前記第２界面で全反射した光ビームの受光領域とは別個に設けられたものであってもよいし、あるいは同一のものであってもよい。なお、受光領域が同一である場合には、前記第１界面で全反射した光ビームと、前記第２界面で反射した光ビームとを前記光検出手段の同一の受光領域へ入射させる第２光学系を備えたものであってもよい。このような第２光学系は、界面で全反射した光ビームの光路へ設けられるものであってもよいし、第１光学系内に設けられものであってもよい。
【００２１】
また、ここで「リガンド」とは、前記薄膜層に固定される化合物であり、より詳細には生理活性高分子物質であることが望ましい。また、アナライトとは、リガンドと結合する可能性を有する化合物であり、より詳細には生理活性高分子物質であることが好ましい。
【００２２】
なお、化合物とは２種以上の元素から構成されている分子をいう。本発明では主に分子量５０以上、１００万以下の化合物を対象とするが、分子量がそれ以下およびそれ以上の化合物にも適用し得る。また、生理活性高分子物質とは日本工業規格（ＪＩＳ）Ｋ３６１１中に「天然高分子」（記号１１００１〜１１０２５）として記載されている各物質、生物学データ大百科事典（朝倉書店）中の「１．生体物質概論」に記載されている糖，アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、ヘム、キノン、タンパク質、ＲＮＡ，ＤＮＡ、リン脂質、多糖、バイオサイエンス辞典（朝倉書店）中の「II.生物物質と代謝」に記載されているタンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、酵素のうちのいずれか１つ以上を含むものを意味する。
【００２３】
また、本発明の測定装置は、薄膜層を、金属膜からなるものとし、前述の表面プラズモン共鳴による効果を利用して測定を行う、所謂表面プラズモンセンサーとして構成されたものとすることができる。また、薄膜層を、誘電体ブロックの前記一面に形成されたクラッド層とクラッド層上に形成された光導波層からなるものとし、光導波層における導波モードの励起による効果を利用して測定を行う、所謂漏洩モードセンサーとして構成されたものとすることができる。
【００２４】
また、薄膜層上の状態の測定方法は、誘電体ブロックと薄膜層との界面に対して種々の入射角度で入射させた光ビームの該界面での反射光を検出して、全反射減衰角もしくはその角度変化を検出することにより屈折率もしくは屈折率変化を測定するものであってもよいし、また、D.V.Noort,K.johansen,C.-F.Mandenius, Porous Gold in Surface Plasmon Resonance Measurement, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.585-588 に記載されているように、複数の波長の光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させ、各波長毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、各波長毎の全反射減衰の程度を検出することにより屈折率もしくは屈折率変化を測定するものであってもよい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の測定装置によれば、リガンドが固定された検出領域と誘電体ブロックとの第１界面、およびリガンドが固定されていない参照領域と誘電体ブロックとの第２界面の各々に対して、全反射条件が得られる角度で前記光ビームを入射させる際に、シャッタにより光ビームの光路を開閉し、光ビームが前記第１界面へ入射するタイミングと前記光ビームが前記第２界面へ入射するタイミングとを異ならせることにより、検出領域における測定が参照領域に入射した光ビームの影響を受けることも、参照領域の測定が検出領域に入射した光ビームの影響を受けることも防止できるので、測定結果の信頼度を向上させることができる。また、検出領域と参照領域とを近接させることが可能となるため、測定装置を小型することができる。
【００２６】
また、前記第１光検出手段が、前記第２光検出手段を兼ねるものであれば、光検出手段を１つだけ設ければよく、一層測定装置を小型化することができる。
【００２７】
さらに、前記第１光検出手段と前記第２光検出手段とが同一の受光領域で前記光ビームを受光するものであれば、光検出素子の受光感度のばらつきの影響を抑制でき、測定結果の信頼度が一層向上する。また測定に必要な受光領域の面積が小さくなり、光検出素子を小型でき、一層測定装置を小型化することができる。なお、この場合には、ライン状の光検出素子を用いることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。図１は本発明の測定装置を適用した本発明の第１の実施の形態である表面プラズモン測定システムの概略構成図である。本測定システムは、本発明の測定装置である表面プラズモンセンサー１Ａ、１Ｂ…が並列して多数並べられている。例えば、各表面プラズモンセンサー１Ａ、１Ｂ…の測定ユニット10へ同一のリガンドを固定し、センサー毎に異なるアナライト溶液を添加して測定を行うことにより、リガンドと結合するアナライトの分析を同時に行うことができる。なお、各測定ユニット10へ異なるリガンドを固定して、各センサーへ同一のアナライト溶液を供給するなど、リガンドとアナライト溶液の組み合わせは任意に決定することができる。
【００２９】
各表面プラズモンセンサー１Ａ、１Ｂ…の測定ユニット10は、測定ユニットアレイ９として一体形成されている。図２はこの表面プラズモンセンサーの平面図、図３はこの表面プラズモンセンサーの側面図、図８は図２中のVIII−VIII線断面図である。各表面プラズモンセンサーの構成について、個別の要素を表す符号であるＡ、Ｂ…の符号は省略して説明する。
【００３０】
図２、図３および図８に示すように、各表面プラズモンセンサーは、測定ユニット10と、１本の光ビームＬを発生させる半導体レーザ等からなる光源14（以下、レーザ光源14という）と、上記光ビームＬを2本の光ビームＬａおよびＬｂへ分割し、該光ビームＬａおよびＬｂを測定ユニット10に通し、流路60（測定部）の下の誘電体ブロック50と金属膜55との２箇所の界面58ａおよび58ｂに対して、種々の入射角が得られるように並列的に入射させる入射光学系15と、光ビームＬａが界面58ａへ入射するタイミングと光ビームＬｂが界面58ｂへ入射するタイミングとが異なるように、光ビームＬａおよびＬｂの光路を開閉するシャッタ30と、上記界面58ａおよび58ｂで全反射した光ビームＬａおよびＬｂを各々平行光化する２つのコリメーターレンズ16と、この平行光化された光ビームＬａおよびＬｂを各々検出する2次元CCD撮像素子40と、該2次元CCD撮像素子40に接続された測定・校正部45と、該測定・校正部45へ接続された表示部17と、シャッタ30、2次元CCD撮像素子40および測定・校正部45と接続されている制御部18とを備えている。
【００３１】
まず、測定ユニット10について説明する。図４は測定ユニット10の斜視図、図５は上記測定ユニットの分解斜視図、図６は上記測定ユニットの上面図、図７は図６中のVII−VII線断面図である。
【００３２】
測定ユニット10は、光ビームに対して透明であり、平滑な上面50ａに薄膜層としての金属膜55が形成された誘電体ブロック50と、この誘電体ブロック50の金属膜55上に密接される流路部材51と、誘電体ブロック50と係合して、流路部材51を誘電体ブロック50の上面50ａ上に保持する保持部材52とから構成される。
【００３３】
誘電体ブロック50は、例えば透明樹脂等からなるものであり、長手方向に直交する断面が上底よりも下底の方が短い台形状の本体を有し、この本体の長手方向の両端部に上面（もしくは下面）方向から見たときの幅が本体よりも薄く形成された保持部50ｂが形成されたもので、後述の測定部の光源から出射された光ビームを誘電体ブロック50と金属膜55との界面に入射させるとともに、この界面で全反射した光ビームを測定部の光検出手段に向けて出射させるプリズム部が一体的に形成されたものである。本体の長手方向の両側面には後述の保持部材52に形成された係合孔52ｃに係合させるための係合凸部50ｃと側面が垂直に形成された垂直凸部50ｄとが両側面で各々互いに対向するように形成されており、底面には長手方向に平行に延びる摺動溝50ｅが形成されている。
【００３４】
流路部材51は、入口61から測定部63に至る供給路62、および測定部63から出口65に至る排出路64から構成される流路60が、流路部材51の長手方向に渡って複数形成されており、この複数の流路60は直線状に配置されている。
【００３５】
図７に示すように、流路部材51の下部部分には、供給路62の出口と排出路64の入口が開口され、また流路部材51の下面に位置する金属膜55の表面と接する領域に、この供給路62の出口と排出路64の入口を囲むシール部51ａが形成されており、このシール部51ａの内側が測定部63となる。このため、流路部材51を誘電体ブロック50の金属膜55上に密接させた場合に、このシール部51ａ内の測定部63が流路として機能するようになる。なお、シール部51ａは、流路部材51の上部部分と一体形成されたものであってもよいし、上部部分とは異なる素材により形成され、後付されたものであってもよく、例えばＯリング等を流路部材51の下部部分に取り付けたものであってもよい。
【００３６】
本発明の測定ユニットを使用する表面プラズモン測定装置等では、タンパクを含むアナライト溶液が使用されることが想定されるが、流路60内でアナライト溶液中のタンパクが固着してしまうと測定を正確に行うことが困難となってしまうため、流路部材51の材料としてはタンパクに対する非特異吸着性を有しないことが好ましく、具体的にはシリコン、ポリプロピレン等を用いるとよい。さらに、これらの部材に親水化処理を施してもよい。また、流路部材51をこのような弾性材料からなるものとすることにより、流路部材51を金属膜55上に確実に密接させることができるため、接触面からの溶液の液漏れを防止することができる。
【００３７】
保持部材52は、ポリプロピレン等の弾性材料からなり、長手方向と直交する方向の断面が略冂字形状をしており、保持部材52の上板（保持板部）の流路部材51の入口61および出口65と対向する位置には流路部材51に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔52ａが形成されており、保持部材52の上面の各ピペット挿入孔52ａの中間、および両端のピペット挿入孔52ａのさらに外側には位置決め用のボス52ｂが形成されている。
【００３８】
また、この保持部材52の上面には、蒸発防止部材54が両面テープ（接着部材）53により貼付されている。図５に示すように、両面テープ53のピペット挿入孔52ａと対向する位置にはピペット挿入用の孔53ａが形成され、ボス52ｂと対向する位置には位置決め用の孔53ｂが形成されており、同様に、蒸発防止部材54のピペット挿入孔52ａと対向する位置にはスリット54ａが形成され、ボス52ｂと対向する位置には位置決め用の孔54ｂが形成されており、ボス52ｂに両面テープ53の孔53ｂおよび蒸発防止部材54の孔54ｂを挿通した状態で、蒸発防止部材54を保持部材52の上面に貼付することにより、蒸発防止部材54のスリット54ａと流路部材51の入口61および出口65とが対向するように構成される。この蒸発防止部材54は、スリット54ａからピペットを挿入できるように弾性を有する材料である必要があり、具体的にはシリコンまたはポリプロピレン等を用いるとよい。なお、上記の保持部材52と蒸発防止部材54とは一体的に形成してもよく、これに加えてさらに流路部材51も一体的に形成してもよい。
【００３９】
さらに、保持部材52の長手方向側板には、誘電体ブロック50に形成された係合凸部50ｃに係合させるための係合孔52ｃが形成されており、この係合孔52ｃを係合凸部50ｃに係合させて保持部材52と誘電体ブロック50とを係合させた状態で、流路部材51が保持部材52と誘電体ブロック50とに挟持され、流路部材51が誘電体ブロック50の上面50ａ上に保持されるように構成されている。
【００４０】
図７に示すように、流路部材51が保持部材52と誘電体ブロック50とに挟持された状態では、流路部材51の入口61および出口65は、蒸発防止部材54のスリット54ａにより外気から遮断され、流路60内に注入された溶液の蒸発を防止するように構成されている。
【００４１】
また、図８に示すように、本実施の形態において、測定ユニット10の各流路60の測定部63には２箇所の界面58ａおよび58ｂに対して光ビームＬａおよびＬｂが並列的に入射されるが、このうち一方の界面58ａ上の金属膜55上は何も固定していない参照領域59ａとし、他方の界面58ｂ上の金属膜55上はリガンド73を固定した検出領域59ｂとし、後述のリファレンス法による測定結果の校正を行うことができるようにしている。
【００４２】
入射光学系15は、レーザ光源14から発散光状態で出射した光ビームＬを光ビームＬａおよびＬｂへ分割するハーフミラー15ａと、該ハーフミラー15ａで反射した光ビームＬｂを測定ユニット10方向へ反射させるミラー15ｂと、シャッタ30を通った光ビームＬａおよびＬｂを平行光化する２つのコリメーターレンズ15cと、光ビームＬａおよびＬｂを上記界面58ａおよび58ｂ上で各々収束させる２つの集光レンズ15ｄとから構成されている。なお、ハーフミラー15ａを透過した光ビームＬａと、ミラー15ｂで反射した光ビームＬｂとが、4.5mmの間隔で平行に並ぶように、ハーフミラー15ａおよびミラー15ｂは配置されている。
【００４３】
光ビームＬａおよびＬｂは、上述のように集光されるので、界面58ａおよび58ｂに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム13は界面58ａおよび58ｂで全反射し、この反射した光ビーム13には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。なお、上記光学系15は、光ビームＬａおよびＬｂを界面58ａおよび58ｂにデフォーカス状態で入射させるように構成されてもよい。そのようにすれば、表面プラズモン共鳴の状態検出の誤差が平均化されて、測定精度が高められる。
【００４４】
なお光ビームＬａおよびＬｂは、界面58ａおよび58ｂに対してｐ偏光で入射させる。そのようにするためには、予めレーザ光源14をその偏光方向が所定方向となるように配設すればよい。その他、波長板で光ビームＬａおよびＬｂの偏光の向きを制御してもよい。
【００４５】
シャッタ30は、図９に示すような回転板31および該回転板31を回転させる駆動部32から構成されている。回転板31は半径27.5mmの円盤状であり、中心から20.5mmのところへ光ビームＬａを透過させるための穴33が設けられ、また中心から22mmのところへ光ビームＬｂを透過させるための穴34が設けられている。なお、穴33と穴34は図１０へ示すように168.5度ずれた位置に配されている。光ビームＬａを通す場合には、図１０の（A）に示す位置穴33がくるように回転制御され、また光ビームＬｂを通す場合には、図１０の（B）へ示す位置に穴34がくるように回転制御される。なお、駆動部32は回転板31を1秒間に２０回転させる。
【００４６】
２次元ＣＣＤ撮像素子40は、図１１に示すように、垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)が縦n列、横m列に配列されたフルフレーム型のＣＣＤ撮像素子である。垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)の各電極はポリシリコン等の透明電極であり、垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)自体で光電変換を行う。光電変換により、各垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)に蓄積された信号電荷は、垂直転送された後、水平転送ＣＣＤ42により水平転送され、出力回路43から測定・校正部45へ出力される。なお、垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)の横方向が光ビームＬａおよびＬｂの反射光の光軸方向（図３中Ｙ方向）と垂直な方向である図３中のＸ方向となるように、２次元ＣＣＤ撮像素子40は配置されている。このため、垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)の縦方向は、ＸＹ平面と垂直な方向であるＺ方向となる。なお、各垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)の縦一列に配置された垂直転送ＣＣＤに蓄積された信号電荷は、ビニング処理により、対応する水平転送ＣＣＤに加算され、その後順次水平転送されて、出力回路43から測定・校正部45へ出力される。なお、２次元ＣＣＤ撮像素子40は、制御部18の制御により0.025秒間隔で信号電荷の読み出しを行うものである。
【００４７】
測定・校正部45は、図１２に示すように、２次元ＣＣＤ撮像素子40の出力をデジタル化するＡ／Ｄ変換器46およびＡ／Ｄ変換器46に接続された信号処理部47とから構成されている。
【００４８】
信号処理部47は、参照領域59ａおよび検出領域59ｂの各々について、測定開始から0.05秒間隔で、全反射減衰角θＳＰの経時変化を反映する変化量ＲａおよびＲｂを算出し、さらにレファレンス処理として変化量Ｒｂから変化量Ｒａを減算した変化量Ｒを算出し、不図示の記憶部へ記憶し、また表示部17へ出力する。
【００４９】
変化量Ｒは、リガンド73とアナライト溶液中のアナライトと結合状態の経時変化または解離状態の経時変化を示すものであり、表示部17には、変化量Ｒの経時変化を示すセンサーグラムが表示される。なお、信号処理部48では、測定終了後に、変化量Ｒの経時変化を示すセンサーグラムに基づいて、該センサーグラムへフィッティングする速度方程式である結合曲線および解離曲線を求める。また、センサーグラム、結合曲線、解離曲線、結合曲線から求めた結合速度定数および解離曲線から求めた解離速度定数を表示部17へ出力する。表示部17では、これらを表示する。
【００５０】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサーにおける測定動作について説明する。測定に先立ち、恒温室２からチップ保持部11上の測定位置へ向けて測定ユニットアレイ９が移動される。チップ保持部11には誘電体ブロック50に形成された摺動溝50ｅと係合するレール11ａが形成されており、測定ユニットアレイ９を移動させる際に高い位置精度を確保することができるようになっている。さらに、測定ユニットアレイ９がチップ保持部11上に載置された後、誘電体ブロック50に形成された垂直凸部50ｄが不図示の固定機構により挟持されてチップ保持部11上の測定位置に固定される。その後、図８に示すように流路部材51の入口61に液供給用ピペットチップ70を挿入し、出口65に液吸入用ピペットチップ71を挿入し、液供給用ピペットチップ70から測定用バッファ液を注入し、測定を開始する。次いで、ピペットチップ70を新しいピペットチップ70と交換する。これでアナライトをバッファ液で溶かしたアナライト溶液72を吸引して流路60の測定部63に供給する。
【００５１】
まず、レーザ光源14から射出された光ビームＬは、ハーフミラー15ａおよびミラー15ｂにより光ビームＬａおよびＬｂへ分割され、それぞれ測定部63の下の誘電体ブロック50と金属膜55との界面58ａおよび58ｂへ全反射条件が得られる角度で入射する。なお、光ビームＬａおよびＬｂの光路には、シャッタ30の回転板31が配置され、回転板31が図９の（Ａ）に示すような回転位置にきた場合に、光ビームＬａが界面58ａへ入射し、回転板31が図９の（ｂ）に示すような回転位置にきた場合に、光ビームＬｂが界面58ｂへ入射する。なお、光ビームＬａおよびＬｂは、界面58ａおよび58ｂ上で収束し、界面58ａおよび58ｂに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。そこで、光ビームＬａおよびＬｂは、界面58ａおよび58ｂで全反射し、この反射した光ビームＬａおよびＬｂ は、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。
【００５２】
界面58ａおよび58ｂで全反射した後、コリメーターレンズ16によって平行光化された光ビームＬａおよびＬｂは、２次元ＣＣＤ撮像素子40により各々検出される。
【００５３】
２次元ＣＣＤ撮像素子40の垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)は、前述したように横方向の配列方向が、図３中Ｘ方向となるように配設されている。したがって、界面58ａまたは58ｂにおいて種々の反射角で全反射した光ビームＬａおよびＬｂの各反射角毎の成分を、それぞれ異なる縦方向の垂直転送ＣＣＤ列が受光することになる。また、光ビームＬａおよびＬｂは、それぞれ受光領域の略半分で受光する。すなわち、図１２に示すように光ビームＬａのある角度で反射された成分は、ｉ列目の垂直転送ＣＣＤ41(ｉ,１)〜41(ｉ,n/2)が受光し、わずかに異なる角度で反射された成分はｉ+１列目の垂直転送ＣＣＤ41(ｉ+１,１)〜41(ｉ+１,n/2)が受光し、順次各反射角毎の成分を縦方向の垂直転送ＣＣＤ列が受光する。また、光ビームＬｂのある角度で反射された成分は、ｉ列目の垂直転送ＣＣＤ41(ｉ,n/2)〜41(ｉ,n)が受光し、わずかに異なる角度で反射された成分はｉ+１列目の垂直転送ＣＣＤ41(ｉ+１,n/2)〜41(ｉ+１,n)が受光し、順次各反射角毎の成分を縦方向の垂直転送ＣＣＤ列が受光する。
【００５４】
光ビームＬａまたはＬｂが入射された後、シャッタ30の回転板31により一旦光ビームＬａも光ビームＬｂも遮られる。制御部18は、シャッタ30の回転と連動して、光ビームＬａも光ビームＬｂも遮られている間の、２次元ＣＣＤ素子40から信号電荷を読み出す。各垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)の縦一列に配置された垂直転送ＣＣＤに蓄積された信号電荷は、ビニング処理により、対応する水平転送ＣＣＤに加算され、その後順次水平転送されて、出力回路43から測定部45へ出力される。なお、各垂直転送ＣＣＤ41(1,1)〜41(m,n)の電荷信号を個々に読み出す場合に比べ、このようにビニング処理を行った上で電荷信号を読み出す場合には、読み出し時間が１／１０以下に短縮される。また、通常、信号電荷を読み出す際には、出力回路43によりノイズが重畳されることが避けられない。しかし、上記のビニング処理により、より大きな電荷に加算された後に出力されるため、出力回路43から出力された信号のＳ／Ｎが向上する。
【００５５】
縦方向の垂直転送ＣＣＤ列の各出力は、所定の順序に従ってＡ／Ｄ変換器54に入力する。Ａ／Ｄ変換器54はこれらの出力をデジタル化して信号処理部65に入力する。
【００５６】
図１３は、界面12ａで全反射した光ビーム30の入射角θ毎の光強度と、２次元ＣＣＤ撮像素子40の出力との関係を説明するものである。ここで、光ビーム30の界面12ａへの入射角θと上記光強度Ｉとの関係は、同図（Ａ）のグラフに示すようなものであるとする。
【００５７】
界面12ａにある特定の入射角θＳＰで入射した光は、金属膜12とセンシング物質14との界面に表面プラズモンを励起させるので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。つまりθＳＰが全反射減衰角であり、この角度θＳＰにおいて反射光強度Ｉは最小値を取る。この反射光強度Ｉの低下は、図３にＤで示すように、反射光中の暗線として観察される。
【００５８】
また図１３の（Ｂ）は、２次元ＣＣＤ撮像素子40の垂直転送ＣＣＤの横方向を示しており、先に説明した通り、これらの垂直転送ＣＣＤの横方向位置は、上記入射角θと一義的に対応している。
【００５９】
信号処理部47は、Ａ／Ｄ変換器46から入力された反射光強度Iの値に基づいて、全反射減衰角θＳＰを算出する。前述したように測定ユニット10の金属膜55（図３参照）に固定されているリガンド73とアナライト溶液72中のアナライトとが結合すると、リガンド73の屈折率が変化して、全反射減衰角θＳＰの角度も変化する。ここで、測定ユニット10の流路60にアナライト溶液を供給して、検出領域59ｂの最初の測定を行ったときの全反射減衰角θＳＰをθＳＰ（０s）とし、測定開始からt秒経過後の全反射減衰角θＳＰをθＳＰ（ｔs）とし、θＳＰ（ｔs）とθＳＰ（０s）との差分を求め全反射減衰角θＳＰの変化量Ｒａと定義する。すなわち
時間ｔにおける  Ｒａ＝θＳＰ（ｔs）−θＳＰ（０s）
とする。測定を行う毎の変化量Ｒａを算出する。また、同様に参照領域59ａの全反射減衰角θＳＰの変化量である変化量Ｒｂも、参照領域59ａの測定を行う毎に算出する。また、参照領域59ａの測定および検出領域59ｂの測定を１回ずつ行った後、検出領域59ｂの変化量Ｒｂから参照領域59ａの変化量Ｒａを減算した変化量Ｒを算出する。この減算により、変化量Ｒは、バルク効果や、リガンドおよびアナライト溶液の温度変化や、光源変動等の外乱による誤差の影響が抑制された、高い信頼度を有する値となる。また、この変化量Ｒは、全反射減衰角θＳＰの経時変化を示すもの、すなわちリガンドとアナライト溶液中のアナライトとの結合状態の経時変化を反映するものとなる。なお、測定毎に変化量Ｒはそのときの測定時間ｔと対応して、信号処理部47の不図示の記憶部へ記憶される。また、同時に表示部17へも出力され、図１４に示すような経過時間ｔと変化量Ｒの関係を示す図（センサーグラム）が順次表示される。すなわち測定中は測定が行われた時点までの変化量Ｒが表示される。なお、図１４では、横軸（時間）の単位は秒であり、縦軸（変化量Ｒ）の単位はRU（レゾナンスユニット）であり、1000RUが角度0．1度に対応している。
【００６０】
さらに、制御部18は、測定ユニット10の測定開始から所定時間経過後に結合状態の測定を終了する。信号処理部47では、センサーグラムへ速度方程式をフィッティングして結合曲線を求め、また該結合曲線から結合速度定数を取得し、結合曲線および結合定数を表示部17へ出力する。表示部17では、センサーグラムに加え、結合曲線および結合速度定数を表示する。なお、必要に応じて、リガンド情報や、アナライト溶液情報等の種々の情報を表示することが好ましい。また、必要に応じて、流路60へアナライトが含まれていないバッファ液を供給し、リガンドとアナライトとの解離状態の経時変化を測定してもよい。図１４に示すような解離曲線を求め、解離曲線および解離定数を算出して表示してもよい。
【００６１】
なお、本実施の形態において金属膜55上の参照領域59ａには何も固定していないが、参照領域59ａはアナライト溶液72中のアナライトと結合しない機能を有している方が好ましい。そのような態様とするためには、例えばアルキルチオール、アミノアルコールまたはアミノエーテル等を金属膜55上に固定すればよい。また参照領域59ａでは、タンパクの固定機能を失わせた有機膜や、アナライトと結合しないタンパクを固定してもよい。
【００６２】
また、測定装置については、複数の表面プラズモン表面プラズモンセンサーにより測定ユニットに設けられた全ての流路に対して同時に測定を行う態様に限定されるものではなく、一つの表面プラズモン表面プラズモンセンサーのみを備え、測定ユニットの位置を表面プラズモンセンサーに対して相対的に移動させることによって測定ユニットに設けられた複数の流路の測定を順次行う態様としてもよい。
【００６３】
以上の説明で明らかなように、本発明の測定装置によれば、リガンド73が固定された検出領域59ｂと誘電体ブロック50との界面58ｂ、およびリガンドが固定されていない参照領域59ａと誘電体ブロック50との界面58ａに対して、全反射条件が得られる角度で光ビームＬａおよびＬｂを入射させる際に、シャッタ30により光ビームＬａおよび光ビームＬｂの光路を開閉し、光ビームＬａが界面58ａへ入射するタイミングと光ビームＬｂが界面58ａへ入射するタイミングとを異ならせることにより、検出領域59ｂにおける測定が参照領域59ａに入射した光ビームＬａの影響を受けることも、参照領域59ａの測定が検出領域59ｂに入射した光ビームＬｂの影響を受けることも防止できるので、測定結果の信頼度が向上する。また、検出領域59ｂと参照領域59ａとを近接させることが可能となるため、測定装置を小型することができる。また、レーザ光源14をオンオフする必要がないため、レーザ光源14から射出される光ビームＬの光強度が不安定なる虞もない。
【００６４】
さらに、光ビームＬａと光ビームＬｂとが２次元ＣＣＤ撮像素子40へ入射する間に、光が入射しない時間が十分に確保されているため、その間に信号電荷を読み出すことができるので、撮像感度のよいフルフレーム型のＣＣＤ撮像素子を使用することができる。
【００６５】
また、光ビームＬａと光ビームＬｂとを１つのＣＣＤ撮像素子40で受光することができ、測定装置を小型化することができる。
【００６６】
なお、本実施の形態の変形例として図１５に示すような、光ビームＬａおよび光ビームＬｂの反射光が同一の受光領域で受光されるよう、即ち、光ビームＬａと光ビームＬｂの光路が２次元ＣＣＤ撮像素子40上で一致するように、ハーフミラー15ｅおよびミラー15ｂにより光ビームＬａおよび光ビームＬｂを反射させた装置も考えられる。同一の受光領域を用いて測定を行うことができるため、光電変換素子のばらつきの影響を受けることがなく、検出した光ビーム強度の信頼性が向上する。また、このような構成であれば、光検出素子としてライン状の光検出素子を使用することもでき、測定装置を一層小型化することができる。
【００６７】
次に、図１６を参照して本発明の第２の実施の形態について説明する。なおこの図１１において、図３中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。この第２の実施の形態の測定ユニットは漏洩モードセンサーに対応したものであり、表面プラズモンセンサーは第１の実施の形態の表面プラズモンセンサーと同じ構成である。
【００６８】
この測定ユニット90の誘電体ブロック50の一面（図中の上面）には薄膜層としてのクラッド層56および光導波層57が順に積層されている。誘電体ブロック50は、例えば合成樹脂やＢＫ７等の光学ガラスを用いて形成されている。一方クラッド層56は、誘電体ブロック50よりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層57は、クラッド層56よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いてこれも薄膜状に形成されている。クラッド層56の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で36.5ｎｍ、光導波層57の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で700ｎｍ程度とされる。
【００６９】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、レーザ光源14から出射した光ビーム13を誘電体ブロック50を通してクラッド層56に対して全反射角以上の入射角で入射させると、光ビーム13が誘電体ブロック50とクラッド層56との界面58ａおよび58ｂで全反射するが、クラッド層56を透過して光導波層57に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層57を導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層57に取り込まれるので、上記界面58ａおよび58ｂで全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００７０】
光導波層57における導波光の波数は、該光導波層57の上のアナライト溶液72もしくはリガンド73の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、リガンド73とアナライト溶液72中のアナライトとの結合の状態を知ることができる。また、上記第２の実施の形態においても第１の実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の第１の実施の形態による表面プラズモン測定システムの概略構成を示す平面図
【図２】表面プラズモンセンサーの平面図
【図３】上記表面プラズモンセンサーの側面図
【図４】上記表面プラズモンセンサーの測定ユニットの斜視図
【図５】上記測定ユニットの分解斜視図
【図６】上記測定ユニットの上面図
【図７】図６中のVII−VII線断面図
【図８】図２中のVIII−VIII線断面図
【図９】シャッタの概略構成図
【図１０】回転板の回転位置の説明図
【図１１】２次元ＣＣＤ撮像素子の概略説明図
【図１２】上記表面プラズモンセンサー測定系のブロック図
【図１３】上記表面プラズモンセンサーにおける光ビーム入射角と検出光強度との関係および２次元ＣＣＤ撮像素子のＣＣＤ配置との関係を示す図
【図１４】センサーグラムを示す図
【図１５】上記表面プラズモンセンサーの変形例の平面図
【図１６】本発明の第２の実施形態による漏洩モードセンサーの要部を示す図
【符号の説明】
【００７２】
９    測定ユニットアレイ
10    測定ユニット
14    レーザ光源
15    光学系
16    コリメーターレンズ
17    表示部
18    制御部
30    シャッタ
31    回転板
40    ２次元ＣＣＤ撮像素子
45    測定部
47    信号処理部
50    誘電体ブロック
52    保持部材
53    両面テープ
54    蒸発防止部材
55   金属膜
56   クラッド層
57   光動波層
58ａ,58ｂ    界面
59ａ    参照領域
59ｂ    検出領域
60   流路
61   入口
62   供給路
63   測定部
64   排出路
65   出口
70、71   ピペット
72    アナライト溶液
73    リガンド
Ｌ，Ｌａ，Ｌｂ  光ビーム
【図１】
2006105912.tif 000004
【図２】
2006105912.tif 000005
【図３】
2006105912.tif 000006
【図４】
2006105912.tif 000007
【図５】
2006105912.tif 000008
【図６】
2006105912.tif 000009
【図７】
2006105912.tif 000010
【図８】
2006105912.tif 000011
【図９】
2006105912.tif 000012
【図１０】
2006105912.tif 000013
【図１１】
2006105912.tif 000014
【図１２】
2006105912.tif 000015
【図１３】
2006105912.tif 000016
【図１４】
2006105912.tif 000017
【図１５】
2006105912.tif 000018
【図１６】
2006105912.tif 000019