(57)【要約】  提供されるのは、光活性フルオロフォア、光活性リガンド、及び光活性複合体である。光活性フルオロフォアは、アゼチジン含有ジャネリア蛍光色素の光活性化可能な誘導体を含む。光活性リガンドは、光活性フルオロフォア及びタンパク質タグを含む。光活性複合体には、タンパク質と結合した光活性リガンドが含まれる。また、光活性フルオロフォア、リガンド、及び複合体を用いるインビボにおける標識、並びに光活性フルオロフォア、リガンド、及び複合体の光活性化の方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゼチジン含有ジャネリア蛍光色素の光活性化可能な誘導体を含む光活性フルオロフォア。
【請求項２】
光が照射されると脱カルボキシル化される、請求項1に記載の光活性フルオロフォア。
【請求項３】
前記光活性化可能な誘導体が、光活性化可能なジャネリア蛍光色素549である、請求項1に記載の光活性フルオロフォア。
【請求項４】
前記光活性化可能な誘導体が、光活性化可能なジャネリア蛍光色素646である、請求項1に記載の光活性フルオロフォア。
【請求項５】
ジャネリア蛍光色素に光解除性保護基を付与することを含む、光活性フルオロフォアを形成する方法。
【請求項６】
前記光解除性保護基を付与することが、
ジャネリア蛍光色素の溶液に塩化オキサリルを添加して、第1の混合物を形成し；
第1の混合物にトリエチルアミン及び（トリメチルシリル）ジアゾメタンを続けて添加して、第2の混合物を形成し；
第2の混合物を濃縮して、濃縮物を形成し；そして
その濃縮物を精製し、光活性フルオロフォアを提供する工程を含む請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記ジャネリア蛍光色素がSi-ローダミンを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
光活性フルオロフォア及びタンパク質タグを含む光活性リガンド。
【請求項９】
前記光活性フルオロフォアが、アゼチジン含有ジャネリア蛍光色素の光活性化可能な誘導体を含む、請求項8に記載の光活性リガンド。
【請求項１０】
前記タンパク質タグがHaloTagリガンドである、請求項8に記載の光活性リガンド。  
【請求項１１】
前記タンパク質タグがSNAP-tagリガンドである、請求項8に記載の光活性リガンド。  
【請求項１２】
光活性リガンドが同族タンパク質と結合すると、光分解後に光活性リガンドの光吸収が増加する、請求項8に記載の光活性リガンド。
【請求項１３】
前記光活性フルオロフォアの輝度が、前記光活性フルオロフォアが由来する親フルオロフォアの輝度と実質的に類似する、請求項8に記載の光活性リガンド。
【請求項１４】
タンパク質と結合した光活性リガンドを含む光活性複合体。
【請求項１５】
前記光活性リガンドがインビボでタンパク質と結合している、請求項14に記載の光活性複合体。
【請求項１６】
前記光活性リガンドが、光活性フルオロフォア及びタンパク質タグを含む、請求項14に記載の光活性複合体。
【請求項１７】
前記光活性フルオロフォアが、光誘導の際に脱カルボキシル化するように配置されている、請求項14に記載の光活性複合体。
【請求項１８】
前記光活性フルオロフォアが、脱カルボキシル化の際にメチル-ジャネリア蛍光化合物を形成するように配置されている、請求項17に記載の光活性複合体。
【請求項１９】
前記光活性フルオロフォアが、脱カルボキシル化の際に蛍光増大をもたらすように配置されている、請求項17に記載の光活性複合体。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、2016年5月20日出願の米国仮特許出願第62／339,643号の優先権を主張するものであり、その全開示は本明細書中に参考として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本明細書に開示されている主題は、一般に、光活性フルオロフォア（発蛍光団（fluorophore））及びインビボにおける標識方法に関する。より具体的には、本明細書で開示される主題は、小分子光活性フルオロフォア、小分子光活性フルオロフォアによるインビボにおける標識方法、及びインビボにおける蛍光化合物の光活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
小分子フルオロフォアは、高度なイメージング実験のための重要なツールである。蛍光タンパク質よりも明るいこれらのフルオロフォアは、現代の顕微鏡観察法の重要な要素である。最近、Johnssonによって開発された自己標識タグの概念のような、新しいタンパク質特異的標識戦略の開発により、生細胞内における蛍光性バイオコンジュゲートの形成が可能になった。：膜透過性の合成色素「リガンド」は、細胞内に受動拡散し、そこでそれらの同族タンパク質「タグ」と共有結合を形成する。このタイプの自己標識タグは、蛍光タンパク質の主な利点の1つである遺伝子のコード化と、有機フルオロフォアの好ましい光物理学を組み合わせている。
【０００４】
これらの高度な結合技術を基礎にして、本発明者らは最近、４員アゼチジン環の組み込みが、小さな細胞透過性フルオロフォアの輝度及び光安定性を実質的に改善し得ることを報告した。これらの「ジャネリア蛍光（Janelia Fluor）」（JF）色素は、生細胞イメージングのための優れた標識であり、特に単一分子追跡実験において、個々の蛍光性コンジュゲートをより長く観察でき、より良好に局在化させる。しかしながら、大部分の光解除性保護基（ケージング基（caging groups））は大きく、疎水性であり、このことが溶解性及び自己標識タグタンパク質との反応性を低下させる。さらに、古典的な光解除性保護戦略は、JF549及びJF646のような完全にN-アルキル化されたローダミン色素とは両立しない。
【０００５】
Hell及び共同研究者は、ローダミン色素を塩化オキサリル及びジアゾメタンで処理することにより、無色で非蛍光性のスピロ環ジアゾケトンを生成する光解除性保護戦略を発見したが、この戦略は環状アミン置換基を有する色素には適用されていない。さらに、得られたジアゾケトンでの光解除性保護色素は、固定細胞のイメージングのための抗体標識として使用されているが、それらは自己標識タグ系に組み込まれておらず、また生細胞でも使用されていない。従って、既存の生細胞標識戦略と両立性があり、JF色素の優れた輝度を維持するJF色素の光活性化可能（PA）型に対するニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書で開示される主題は、本明細書で提供される情報の検討の後に当業者に明らかになるように、上記のニーズの一部または全てを満たす。
【０００７】
この概要は、本明細書に開示される主題のいくつかの実施形態を記載し、多くの場合、これらの実施形態の変形及び置換を列挙する。この概要は、多数の様々な実施形態の単なる例示に過ぎない。所与の実施形態の1つまたは複数の代表的な特徴については、同様に例示的なものである。そのような実施形態は、典型的には、言及された特徴の有無に関わらず存在し得る。同様に、これらの特徴は、本概要に列挙されているか否かに関わらず、現在開示されている主題の他の実施形態にも適用することができる。過度の反復を避けるために、この概要ではそのような機能の可能な組み合わせを全て列挙したり提案したりしていない。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、光活性フルオロフォアに関する。いくつかの実施形態では、光活性フルオロフォアは、アゼチジン含有ジャネリア蛍光色素の光活性化可能な誘導体を含む。いくつかの実施形態では、光活性フルオロフォアは、光が照射されたら脱カルボキシル化される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される主題は、光活性フルオロフォアを形成する方法に関する。いくつかの実施形態では、その方法はジャネリア蛍光色素を光解除的に保護することを含む。いくつかの実施形態において、ジャネリア蛍光色素の光解除的保護は、塩化オキサリルをジャネリア蛍光色素溶液に添加して第一混合物を形成し、トリエチルアミン及び（トリメチルシリル）ジアゾメタンを続けて第一混合物に添加して第二混合物を形成し、濃縮物を形成するために第二混合物を濃縮し、光活性フルオロフォアを証明するためにその濃縮物を精製することを含む。いくつかの実施形態において、光解除的に保護されたジャネリア蛍光色素は、Si-ローダミンを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される主題は、光活性フルオロフォア及びタンパク質タグを含む光活性リガンドに関する。いくつかの実施形態では、光活性フルオロフォアは、アゼチジン含有ジャネリア蛍光色素の光活性化可能な誘導体を含む。適切なタンパク質タグには、HaloTagリガンド、SNAP-tagリガンド、任意の他の適切なタンパク質タグ、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、同種タンパク質に対する光活性リガンドの結合は、光分解の後、光活性リガンドの光吸収を増大させる。いくつかの実施形態では、光活性フルオロフォアの輝度は、光活性フルオロフォアが由来する親フルオロフォアの輝度と実質的に類似している。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、タンパク質と結合した光活性リガンドを含む光活性複合体に関する。いくつかの実施形態では、光活性リガンドはインビボでタンパク質と結合している。いくつかの実施形態において、光活性リガンドは、光活性フルオロフォア及びタンパク質タグを含む。いくつかの実施形態では、光活性フルオロフォアは、光が照射された時に脱カルボキシル化するように配置されている。いくつかの実施形態において、光活性フルオロフォアは、脱カルボキシル化の際にメチル-ジャネリア蛍光化合物を形成するように配置されている。いくつかの実施形態において、光活性フルオロフォアは、脱カルボキシル化の際に蛍光発光を強めるように配置されている。
【００１２】
本発明の新規なる特徴は、詳細に、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の特徴及び利点は、本発明の原理が使用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1A〜Iは、光活性化可能なジャネリア蛍光色素549（PA-JF549）の合成、特徴及び有用性を示すグラフ及び画像を示す。
【図１Ａ】PA-JF549の合成及び光化学。JF549（1）を塩化オキサリル及びTMSジアゾメタンで処理すると、PA-JF549（2）が得られる。光活性化（365nm）は、主要生成物（50％）としてメチル置換JF549（4）及び次位（10％）生成物としてインダノン（indanone）5と共に、微量の所望するフェニル酢酸誘導体（3）を生じる。
【図１Ｂ】正規化された吸収（abs）及び1、3、及び4の蛍光発光（fl）。
【図１Ｃ】PA-JF549-HaloTagリガンド（6）及びPA-JF549-SNAP-tagリガンド（7）の化学構造。
【図１Ｄ】PA-JF549リガンド6で標識されたHaloTag-Sox2の単一粒子軌跡の累積の画像、目盛尺：5μm。
【図１Ｅ】同一のイメージング条件の下で6-HaloTag融合体（マゼンタ、中央値 = 120.7光子）又はmEos3.2融合体（黒、中央値 = 70.9光子）を用いて、Sox2のsptPALMを実施する際に検出された光子／粒子／フレームのヒストグラム。
【図１Ｆ】同一のイメージング条件の下で6-HaloTag融合体（マゼンタ、平均 = 0.20秒）又はmEos3.2融合体（黒、平均 = 0.07秒）を用いて、Sox2のsptPALMを実施する際の軌跡長のヒストグラム。
【図１Ｇ】TOMM20-HaloTagを発現し、PA-JF549リガンド6で標識されたU2OS細胞のPALM画像；検出された268,561個の分子は、それらの局在半値全幅（localization full width at half maximum）に従って表示される。目盛尺：2μm。
【図１Ｈ】同一のイメージング条件の下で、6-HaloTag融合体（マゼンタ、中央値 = 636.6光子）又はmEos3.2融合（黒、中央値 = 266.8光子）を用いて、TOMM20のPALMを実施する際に、検出された光子／局在性／フレームのヒストグラム。
【図１Ｉ】同一のイメージング条件下で、6-HaloTag融合体（マゼンタ、中央値 = 13.5nm）又はmEos3.2融合体（黒、中央値 = 20.2nm）を用いてTOMM20のPALMを実施する際の、計算された局在性の精度のヒストグラム。
【図２】
【図２Ａ】〜
【図２Ｈ】図2A〜Hは、光活性化可能なジャネリア蛍光色素646（PA-JF646）を用いた多色イメージングを明らかにするグラフ及び画像を示す。
【図２Ａ】PA-JF646-HaloTagリガンド（16）及びPA-JF646-SNAP-tagリガンド（17）の構造。
【図２Ｂ】TOMM20-HaloTagを発現し、10nM JF549-HaloTagリガンド8及び10nMのPA-JF646-HaloTagリガンド16で標識されたU2OS細胞の画像。JF549-HaloTagリガンド8からの広域蛍光顕微鏡画像の空間分布は、細胞における典型的なミトコンドリア分布に似ている（目盛尺：5μm）。PA-JF646で標識された単一のTOMM20融合体の軌跡（n = 154）は、平均化された広域TOMM20-JF549シグナル（挿入画像、目盛尺：1μm）上にプロットされる。単一分子軌道の大部分（> 95％）はJF549-HaloTagシグナルと共存しており、このことがPA-JF646の特異的標識を示している。
【図２Ｃ】〜
【図２Ｇ】17で標識されたヒストンH2B-SNAP-tag及びPA-JF549-HaloTagリガンド（6）で標識されたHaloTag-Sox2を発現する生存ES細胞における同時2色sptPALM実験。
【図２Ｃ】17で標識されたヒストンH2B-SNAP-tagのPALM画像；目盛尺：5μm。
【図２Ｄ】ヒストンH2B-SNAP-tagと共存している（6272軌道、マゼンタ）、又はヒストンH2B-SNAP-tagと共存していない（7081軌道、緑）HaloTag-Sox2の単粒子軌道。
【図２Ｅ】Sox2の共存画分の見かけの拡散係数マップ。
【図２Ｆ】Sox2の非共存画分の見かけの拡散係数マップ。
【図２Ｇ】共存Sox2軌道と非共存Sox2軌道における各段階について計算された見かけの拡散係数のヒストグラム。
【図２Ｈ】Htt84Q-mEos3.2-NLSクラスターのPALM画像を、16で標識されたヒストンH2B-HaloTagのPALM画像と重ね合わせたもの。そのPALM画像は同時に記録され、それぞれ連続した10,000フレームで構成されている。検出された128,740個のmEos3.2分子（緑色）及び739,964個のPA-JF646分子（マゼンタ）は、それらの局在半値全幅に従って表示される。1フレームあたりのmEos3.2分子あたりの検出光子数の中央値は115.6であり、１フレームあたりのPA-JF646分子当たりの検出光子の中央値は757.6であった。mEos3.2の計算された局在性誤差の中央値は34.5nmであり、PA-JF646については21.3nmであった。目盛尺：5μm。
【図３】
【図３Ａ】〜
【図３Ｖ】図3A〜Vは、光活性化可能なジャネリア蛍光色素549（PA-JF549）の特性及び性能を説明するグラフ及び画像を示す。
【図３Ａ】HaloTagタンパク質に結合したPA-JF549-HaloTagリガンド（6）の光活性化前（−hv、黒線）及び後（365nm；＋hv、マゼンタ線）の吸光度スペクトル。
【図３Ｂ】JF549-HaloTagリガンド（8）及びTMR-HaloTagリガンド（9）の構造。
【図３Ｃ】HaloTagタンパク質と共にインキュベートした8（5μM）の絶対吸光度スペクトル（黒）、HaloTagタンパク質と共にインキュベートし、その後365nmの光で完全に光活性化した6（5μM）の吸光度スペクトル（マゼンタ）、又はHaloTagタンパク質無しでインキュベートし、その後365nmの光で完全に光活性化した6（5μM）の吸光度スペクトル（マゼンタ点線）の比較。
【図３Ｄ】光活性前（−hv、黒線）及び光活性化後（365nm；＋hv、マゼンタ線）のHaloTagタンパク質と結合したPA-JF549-SNAP-tagリガンド（7）の吸光度スペクトル。
【図３Ｅ】JF549-SNAP-tagリガンド（10）の構造。
【図３Ｆ】SNAP-tagタンパク質と共にインキュベートした10（5μM）の絶対吸光度スペクトル（マゼンタ）、SNAP-tagタンパク質と共にインキュベートしその後365nmの光で完全に光活性化した7（5μM）の吸光度スペクトル（マゼンタ）、又はSNAP-tagタンパク質無しでインキュベートし、その後365nmの光で完全に光活性化した7（5μM）の吸光度スペクトル（マゼンタ点線）の比較。
【図３Ｇ】指数関数のフィッティングカーブ（黒）を併記した、同一のイメージング条件の下（n = 5、陰影は±s.e.m.を示す。）での、生存U2OS細胞におけるPA-JF549-HaloTagリガンド（6）またはヒストンH2B-mEos3.2で標識したヒストンH2B-HaloTagの活性化率。
【図３Ｈ】405nm活性化光の非存在下で、固定したU2OS細胞におけるPA-JF549-HaloTagリガンド（6;マゼンタ）またはTOMM20-mEos3.2（黒）で標識されたTOMM20-HaloTagの自発的活性化を比較するプロット；実線はフィッティング直線を示す。
【図３Ｉ】固定したU2OS細胞におけるPA-JF549-HaloTagリガンド（6）またはTOMM20-mEos3.2で標識されたTOMM20-HaloTagを用いた検出光子／局在性のヒストグラム。
【図３Ｊ】spt-dSTORM（単粒子追跡確率論的光学再構成顕微鏡法）実験（上）及びsptPALM実験（下）の実験作業の流れを示す続き絵図。HaloTag-Sox2を発現するES細胞は、PA-JF549-HaloTagリガンド6またはTMR-HaloTagリガンド8で飽和まで標識され、深さ軸方向〜4μmにわたって9つの焦点面の同時画像化を可能にする多焦点顕微鏡で画像化した。
【図３Ｋ】PA-JF549リガンド6（sptPALM方式、マゼンタ）または市販のTMR-HaloTagリガンド（9；spt-dSTORM方式、黒）で標識されたHaloTag-Sox2を発現するES細胞における1フレームごとに測定された単一分子軌道数のプロット；各リガンドについてn = 5細胞；s.d.をグレーで示す。
【図３Ｌ】〜
【図３Ｍ】フレーム2000-2500の間に画像化された累積単一粒子軌跡の画像（Kにおける点線と点線の間；連続する5つ以上のフレームで観測された軌道のみ示されている）；左下：測定された軌道の数；右下：目盛尺：2μm。
【図３Ｌ】PA-JF549リガンド6で標識した細胞（1544の軌道）。
【図３Ｍ】標準TMRリガンド9で標識された細胞（191の軌道）。
【図３Ｎ】〜
【図３Ｏ】HaloTag-Sox2を発現し、6または9で標識されたES細胞における3D追跡実験からの統計（J〜Mに示される）。
【図３Ｎ】標識6（マゼンタ）または9（黒）を用いて検出された光子／粒子／フレームのヒストグラム。
【図３Ｏ】標識6（マゼンタ）または9（黒）を用いた粒子の局在性／フレームのヒストグラム。
【図３Ｐ】TOMM20-mEos3.2融合体を発現する固定したU2OS細胞のPALM画像。目盛尺：2μm。検出された195,422個の分子は、それらの局在半値全幅に従って表示される。計算された局在性誤差の中央値は20.2nmであった。
【図３Ｑ】クラスリン-HaloTag融合体を発現し、リガンド6で標識された固定U2OS細胞の拡大PALM画像。フルチップ画像は、10.8nmの中央値局在性誤差を有する1,048,575個のドット補正された位置特定からなる。データは予想されるクラスリンの環構造を示す；各サブパネルは1μm2である。
【図３Ｒ】エンスコンシン-HaloTag融合体を発現し、リガンド6で標識されたU2OS細胞のPALM画像。画像は、28.7nmの計算上の中央値局在性誤差を有する445,242個の位置特定から構成される。目盛尺：5μm。
【図３Ｓ】Sec6lβ-HaloTag融合体を発現し、リガンド6で標識されたU2OS細胞のPALM画像。画像は、20.9 nmの計算上の中央値局在化誤差を有する29,356個の位置特定から構成される。目盛尺：5μm。
【図３Ｔ】〜
【図３Ｖ】Rに示されているエンスコンシン-HaloTagのPALM中のPA-JF549の点滅挙動の分析。
【図３Ｔ】指数分布へのフィッティング曲線（黒）を併記した、個々の点滅事象の持続時間（マゼンタ）のヒストグラム。
【図３Ｕ】指数分布へのフィッティング曲線（黒）を併記した、点滅事象の間隔の時間（マゼンタ）のヒストグラム。
【図３Ｖ】幾何学的分布へのフィッティング曲線（黒）を併記した１分子当たりの点滅事象数（マゼンタ）のヒストグラム。
【図４】
【図４Ａ】〜
【図４Ｎ】図4A〜Nは、光活性化可能なジャネリア蛍光色素646（PA-JF646）の合成、特性及び性能を示すグラフ及び画像。
【図４Ａ】PA-JF646の合成及び光化学。JF646（11）を塩化オキサリル及びテトラメチルシランジアゾメタンで処理すると、PA-JF646（12）が得られる。光活性化（365nm）は、フェニル酢酸誘導体（13；<1％）及びメチル置換JF549（14；4％）の両方の微量のみを生じる。主要産物はインダノン15（24％；単離された収率）である。
【図４Ｂ】JF646-HaloTagリガンド18及びJF646-SNAP-tagリガンド19の構造。
【図４Ｃ】光活性化前（-hv、黒線）及び後（365nm；+hv、マゼンタ線）のHaloTagタンパク質に結合したPA-JF646-HaloTagリガンド（16）の絶対吸光度スペクトル。
【図４Ｄ】HaloTagタンパク質とインキュベートした18（5μM）の絶対吸光度スペクトル（黒）、HaloTagタンパク質と共にインキュベートし、その後365nmの光で完全に光活性化した16（5μM）の吸光度スペクトル（マゼンタ）、又はHaloTagタンパク質無しでインキュベートし、その後365nmの光で完全に光活性化した16（5μM）の吸光度スペクトル（マゼンタ点線）の比較。
【図４Ｅ】SNAP-tagタンパク質と共にインキュベートした19（5μM）の絶対吸光度スペクトル（黒）、SNAP-tagタンパク質と共にインキュベートしその後365nmの光で完全に光活性化した17（5μM）の吸光度スペクトル（マゼンタ）、又はSNAP-tagタンパク質無しでインキュベートしその後365nmの光で完全に光活性化した17（5μM）の吸光度スペクトル（マゼンタ点線）の比較。
【図４Ｆ】指数関数フィッティング曲線（黒）を併記した、生存U2OS細胞におけるPA-JF646-HaloTagリガンド（6）で標識されたヒストンH2B-HaloTagの活性化率（図3Gと同一の光活性化条件及び同等の励起光強度；n = 5、陰影は±s.e.m.を示す。）。
【図４Ｇ】405nm活性化光の非存在下で、固定U2OS細胞におけるPA-JF646-HaloTagリガンド（16；マゼンタ）またはTOMM20-mEos3.2（黒）で標識されたTOMM20-HaloTagの自発的活性化を比較するプロット；実線はフィッティング直線を示す。
【図４Ｈ】〜
【図４Ｉ】HaloTagリガンド6及び16の背景染色の評価。融合タンパク質発現しない（左パネル）またはヒストンH2B-HaloTag融合体（右パネル）を発現するCOS7細胞を固定し、HaloTagリガンド（100nM；30分）及びHoechst 33342（5μg／mL）で染色し、光活性化（405nm）し、そして同じ設定を用いて画像化した。目盛尺：50μm。
【図４Ｈ】PA-JF549-HaloTagリガンド6。
【図４Ｉ】PA-JF646-HaloTagリガンド16。
【図４Ｊ】〜
【図４Ｋ】PA-JF646-SNAP-tagリガンド（17）で標識されたヒストンH2B-SNAP-tag及びPA-JF549-HaoTagリガンド（6）で標識されたHaloTag-Sox2を発現する2つの生存ES細胞。上の画像は局在性顕微鏡画像（PALM）を、中央の画像は累積単粒子軌道を、下の画像は見かけの拡散係数マップを示す。目盛尺：5μm。
【図４Ｊ】17で標識されたヒストンH2B- SNAP-tag由来の画像。
【図４Ｋ】6で標識されたHaloTag-Sox2由来の画像。
【図４Ｌ】ビメンチン-HaloTag融合体を発現し、リガンド16で標識されたU2OS細胞のPALM画像。そのPALM画像は、計算された局在性誤差の中央値が20.4nmである151,808個の位置特定から構成されている。目盛尺：5μm。
【図４Ｍ】TOMM20-HaloTag融合体を発現し、リガンド16で標識されたU2OS細胞のPALM画像。そのPALM画像は、203,015個の検出分子から構成されている。計算された局在性誤差の中央値は13.8nmである。目盛尺：2μm。
【図４Ｎ】16-HaloTag融合体（マゼンタ、中央値=13.8nm）またはmEos3.2融合体（黒、中央値=20.2nm）を用いてTOMM20のPALMを実施した場合の計算された局在性精度のヒストグラム。
【図５】図5は、PA-JF549誘導体の合成の概要図を示す。
【図６】図6は、PA-JF646誘導体の合成の概要図を示す。
【図７】図7は、JF646-SNAP-tagリガンドの合成の概要図を示す。
【図８】図8は、PA-JF549光反応生成物の合成の概要図を示す。
【図９】図9は、PA-JF646光反応生成物の合成の概要図を示す。
【図１０】
【図１０Ａ】〜
【図１０Ｂ】図10A及び10Bは、PA-JF549及びPA-JF646の化学構造及び吸光度スペクトルを示す。
【図１０Ａ】PA-JF549（2）及び光反応生成物3-5の化学構造と絶対吸光度スペクトル。
【図１０Ｂ】PA-JF646（12）及び光反応生成物13-15の化学構造と絶対吸光度スペクトル。スペクトルは全て、10mMのHEPES、pH7.3中、5μMで採取した。
【図１１】
【図１１Ａ】〜
【図１１Ｄ】図11A〜Dは、様々な化合物の光変換、吸光度、及びHPLCのピーク面積を示す。
【図１１Ａ】光分解（365nm）後のPA-JF549（2）のメチル-JF549（4）への光変換。
【図１１Ｂ】551nmにおける吸光度（A551）対2の照射時間（365nm）のプロット。
【図１１Ｃ】光分解（365nm）後のJF549-フェニル酢酸（3）のメチル-JF549（4）への光変換（2）。
【図１１Ｄ】HPLCの4（λ= 555nm）のピーク面積対3の照射時間（365nm）のプロット。
【発明を実施するための形態】
【具体的な実施形態の説明】
【００１４】
本明細書に開示される内容の1つ以上の実施形態の詳細は、本明細書に記載されている。本明細書及び他の実施形態に記載された実施形態に対する変更は、この文書で提供される情報の調査の後、当業者に明らかになるであろう。本明細書で提供される情報、特に記載された具体的な実施形態の特定なる詳細は、主として、明瞭な理解のために提供され、そこから不必要な制限が解釈されるべきでない。矛盾が生じた場合、定義を含むこの文書の明細書が統制する。
【００１５】
本明細書で使用される用語は、当業者によって十分に理解されると考えられるが、ここに開示された内容の説明を容易にするために特定の定義が示されている。
【００１６】
他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００１７】
他に記載がない限り、本明細書中の全開示を通して言及される全ての特許、特許出願、公開出願及び刊行物、GenBank配列、データベース、ウェブサイト及び他の公表された資料は、その全体が参考として援用される。
【００１８】
URLまたは他のそのような識別子またはアドレスが参照される場合、その識別子は変更されることがあり、インターネット上の特定の情報も追加され削除されることがあると理解されるが、インターネットを検索することによって同等の情報を見つけることができる。それらへの言及は、そのような情報の入手可能性及び一般公開を証明している。
【００１９】
本明細書で使用される場合、任意の保護基、アミノ酸及び他の化合物の略語は、他に示されない限り、それらの一般的な使用法、認識された略語、またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature（Biochem.(1972）11（9）：1726-1732参照）に従う。
【００２０】
本明細書に記載されたものと類似または同等な任意の方法、装置、及び材料は、本明細書に開示される内容の実施または試験において使用され得るが、代表的な方法、装置、及び材料が本明細書に記載されている。
【００２１】
本出願は、本発明の構成要素及び本明細書に記載の他の成分または要素を「含む」（comprise）（制約なく）またはそれらから「本質的になる」ことが可能である。本明細書で使用される場合、「含む」には制約がなく、列挙された手段、またはその構造的や機能的同等物、それに加えて列挙されていない任意の他の要素を意味する。文脈が別途示唆しない限り、用語「有す」及び「含む（include）」もまた制約なしと解釈されるべきである。
【００２２】
長年にわたる特許法の慣習に従い、用語「a」、「an」及び「the」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、「1つまたは複数」を指す。従って、例えば、「一細胞（a cell）」への言及は、そのような細胞の複数などを含む。
【００２３】
他に示されない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などの特性を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。従って、逆に示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本明細書に開示される主題によって得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、値または質量、重量、時間、容量、濃度またはパーセンテージに言及する時の用語「約」は、開示された方法を実施するのに適切であるように、いくつかの実施形態では±20％、いくつかの実施形態では±10％、いくつかの実施形態では±5％、いくつかの実施形態では±1％、いくつかのの実施形態では±0.5％、ある実施形態では±0.1％の指定された量からの変動を包含することを意味する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、範囲は、「約」が付されたある特定値から、及び／または「約」が付された別の特定値までを表し得る。また、本明細書に開示されているいくつかの値があり、各値は、当該値自体ならびに「約」が付された当該特定値として開示されていることも理解されよう。例えば、値「10」が開示されている場合、「約10」も開示される。2つの特定のユニット間の各ユニットもまた開示されることも理解されるであろう。例えば、10及び15が開示されている場合、11、12、13、及び14もまた開示される。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「任意選択の」または「任意選択的」は、その後に記載される事象または状況が起こるかまたは起こらないことを意味し、該記載は、前記事象または状況が起こる場合及び起こらない場合を含む。例えば、任意選択的に変形した部分は、その部分が変形体または非変形体であることを意味する。
【００２７】
本明細書で開示される主題は、光活性フルオロフォア及びインビボにおける標識方法を含む。より具体的には、本明細書で開示される主題は、小分子光活性フルオロフォア、小分子光活性フルオロフォアによるインビボにおける標識方法、及びインビボにおける蛍光化合物の光活性化方法に関する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、光活性フルオロフォアは、1つ以上のフルオロフォアの光活性化可能な誘導体を含む。その光活性化可能な誘導体は、1つ以上の環状アミン置換基を含むフルオロフォア（これに限定されない）のような任意の適切なフルオロフォアから形成される。例えば、一つの実施形態では、光活性フルオロフォアには、アゼチジン含有「ジャネリア蛍光」（JF）色素の光活性化可能な誘導体が含まれる。別の実施形態では、これらのJF色素は、既存のフルオロフォアの遍在性ジメチルアミノ基の代わりに4員アゼチジン環を含み、増加した輝度及び光安定性を有する小さな細胞透過性フルオロフォアを形成する。
【００２９】
以下に示すように、いくつかの実施形態では、光活性フルオロフォアは、光活性化可能なジャネリア蛍光色素549（PA-JF549）、光活性化可能なジャネリア蛍光色素646（PA-JF646）、または他の適切な光活性化可能なジャネリア蛍光色素を含む。これらの光活性化可能な誘導体は、いったん活性化されるとJF色素の輝度及び光安定性を保持し、既存の蛍光タンパク質と比較して増加した輝度を提供する。さらに、これらの化合物の容易な光活性化は、改善された単粒子追跡及び容易な局在性顕微鏡検査実験を提供する。さらに、そのPA-JF化合物の細胞透過性は、インビボにおけるイメージングを容易にする。
【化１】
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【化２】
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【００３０】
いくつかの実施形態において、光活性フルオロフォアを形成する方法は、JF色素の塩化オキサリル及びジアゾメタンでの処理を伴う光解除的保護戦略を含む。例えば、一つの実施形態では、光活性フルオロフォアを形成する方法は、塩化オキサリルをJF色素の溶液に添加し、室温で反応物を撹拌することを含む。次に、トリエチルアミン及び（トリメチルシリル）ジアゾメタンを続けて添加し、室温で反応物を撹拌し、濃縮し、次いで精製する。濃縮及び精製には、減圧下での濃縮、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせなど（これらに限定されない）の、任意の適切な濃縮及び精製方法が含まれる。
【００３１】
予想されるフェニル酢酸誘導体とは対照的に、本明細書に記載の光活性フルオロフォアの光化学は、意外にも主要な光反応生成物（50％）としてメチル-JFを提供する。理論に束縛されることを望むものではないが、そのメチル-JFは、最初の光化学生成物（すなわち、予想されるフェニル酢酸誘導体）の光誘導脱カルボキシル化によって生成されると考えられる。いくつかの実施形態では、PA-JF化合物によって生成されたメチル-JFは、親JF色素の輝度を維持する。いくつかの実施形態では、輝度は親の輝度と実質的に同じである。いくつかの実施形態では、輝度の少なくとも約60、65、70、75、80、85、90、または95％が維持される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、PA-JF化合物は、HaloTag、SNAP-tag、または任意の他の適切なタンパク質タグなどのタンパク質タグと結合して、PA-JFタンパク質タグリガンドを形成する。例えば、以下に示すように、PA-JFタンパク質タグリガンドは、PA-JF549-HaloTagリガンド、PA-JF549-SNAP-tagリガンド、PA-JF646-HaloTagリガンド、及び／またはPA-JF646-SNAP-tagリガンドを含み得るが、それらに限定されない。
【化３】
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【００３３】
いくつかの実施形態では、PA-JF-タンパク質タグリガンドを形成する方法は、所望のJFの6-メトキシカルボニル-JF化合物を形成し、その6-メトキシカルボニル-JF化合物を光活性化可能な6-メトキシカルボニル-JF化合物（6-メトキシカルボニル-PA-JF）に変換し、その6-メトキシカルボニル-PA-JF化合物をPA-JF-N-ヒドロキシスクシンイミド化合物（PA-JF-NHS）に変換した後、そのPA-JF-NHS化合物をPA-JF-タンパク質タグリガンドに変換することを含む。
【００３４】
一つの実施形態では、6-メトキシカルボニル-JF化合物の形成には、開始化合物であるPd2dba3、XPhos及びCs2CO3をバイアルに充填し、バイアルを密閉し、バイアルを窒素で排気／再充填する。次に、ジオキサンをバイアルに加え、反応物を窒素でフラッシュする。次いで、アゼチジンをバイアルに添加し、反応物を、これに限定されるものではないが100℃のような高温で撹拌する。その反応物を高温で撹拌した後、組成物を室温に冷却し、MeOHで希釈し、濾過助剤（例えばセライト）上に沈殿させ、濃縮乾固し、次いで精製して6-メトキシカルボニル-JF化合物を得る。当業者に理解されるように、開始化合物は形成されるPA-JF-タンパク質タグリガンドによって変化する。例えば、PA-JF549-タンパク質タグリガンドのための開始化合物は、3',6'-ジブロモ-6-メトキシカルボニルフルオランを含み得るが、PA-JF646-タンパク質タグリガンドのための開始化合物は、6-メトキシカルボニルシラフルオレセインジトリフレートを含み得る。
【００３５】
6-メトキシカルボニル-JF化合物の形成に続き、6-メトキシカルボニル-JF化合物の6-メトキシカルボニル-PA-JF化合物への変換には、上記で詳述した光解除性保護方法が含まれる。次に、6-メトキシカルボニル-PA-JF化合物のPA-JF-NHS化合物への変換には、窒素下にて、MeOH／THFが2：1である6-メトキシカルボニル-PA-JF化合物溶液にNaOHを添加し、室温で反応物を撹拌することが含まれる。次いで、その反応物を例えば、HCl、水及びCH2Cl2などでそれぞれ酸性化し、希釈し、抽出する。抽出後、有機抽出物を乾燥させ、濾過し、濃縮してカルボン酸を得る。次いで、カルボン酸をDMF中のTSTUと合わせ、DIEAを添加し、反応物を室温で撹拌する。撹拌後、反応物を濃縮乾固し、濾過助剤上に沈殿させ、精製してPA-JF-NHS化合物を得る。
【００３６】
次いで、PA-JF-NHSは、任意の適切な方法によって所望のPA-JF-タンパク質タグリガンドに変換される。例えば、PA-JF-NHS化合物のPA-JF-HaloTagリガンドへの変換は、PA-JF-NHS化合物をDMFに溶解し、DMF中のHaloTag（O2）アミン溶液を添加し、続いてDIEAを添加し、次いで反応物を室温で撹拌することを含む。撹拌後、その反応物を濃縮乾固し、精製してPA-JF-HaloTagリガンドを得る。別の例では、PA-JF-NHS化合物のPA-JF-SNAP-tagリガンドへの変換は、PA-JF-NHS化合物をBG-NH2及びDMFと合わせ、続いてDIEAを添加し、次いで反応物を室温で撹拌することを含む。攪拌後、その反応物を濃縮乾固し、精製してPA-JF-SNAP-tagリガンドを得る。これらの方法は、以下の実施例により詳細に記載されているが、当業者に理解されるように、濃度及び／または反応条件の改変が本明細書中に企図され、本開示の対象となるものとする。
【００３７】
いくつかの実施形態では、PA-JF-タンパク質タグリガンドの同族タンパク質への結合は、同族タンパク質の非存在下でのPA-JF-タンパク質リガンドと比較して、光分解後の光吸収の実質的な増加を提供する。例えば、同族タンパク質の非存在下の化合物と比較して、PA-JF549-HaloTagリガンドは、同族HaloTagタンパク質に結合された場合、所望の蛍光生成物に対する光化学的効率の少なくとも2倍の増加を示し、PA -JF646-HaloTagリガンドは、同族HaloTagタンパク質に結合された場合、遠赤吸収生成物の生成を少なくとも5倍増加させた。従って、いくつかの実施形態では、PA-JFタンパク質リガンドの同族タンパク質への結合は、所望の蛍光形態に向かう反応の光化学の結果に影響を与える。追加的または代替的に、いくつかの実施形態において、PA-JFタンパク質リガンドは、単一分子追跡、超解像度イメージング、及び／またはインビボにおけるイメージングを容易にする。
【００３８】
PA-JF-タンパク質タグリガンドは細胞透過性JF色素から形成されるので、いくつかの実施形態では、そのPA-JF-タンパク質タグリガンドはインビボにおけるイメージングを容易にする。例えば、PA-JF-タンパク質タグリガンドは、被験体に送達された後に1つ以上の細胞に入り、その際にリガンドは所望のタンパク質に結合し得る。所望のタンパク質に結合されたPA-JF-タンパク質タグリガンドが、その後の光誘導により、蛍光の増大をもたらし、インビボにおけるイメージングを容易にする。いくつかの実施形態では、複数のPA-JFタンパク質タグリガンドを用いて、多色及び／または多分子のイメージングを提供することができる。例えば、第1のPA-JF-タンパク質タグリガンドは、第1の色を示す第1のPA-JFと第1のタンパク質に結合する第1のタンパク質タグとを含み、第2のPA-JF-タンパク質タグリガンドは、第2の色を示す第2のPA-JFと第2のタンパク質に結合する第2のタンパク質タグとを含む。光活性化の際に、第1及び第2のPA-JF-タンパク質タグリガンドは、第1及び第2の色を示し、第1及び第2の色はそれぞれ第1及び第2タンパク質の位置に対応する。
【実施例】
【００３９】
実施例１。
【００４０】
本発明者らによって最近記載されたように、アゼチジン含有「ジャネリア蛍光」（JF）色素の形成は、小さな細胞透過性フルオロフォアの輝度及び光安定性を改善するための一般的な方法を提供する。この例では、確立された生細胞標識戦略に適合する光活性化可能な誘導体の合成を通じて、JF色素の有用性が洗練され、広がる。
【００４１】
より具体的には、この実施例は、JF549及びJF646の光活性化可能（PA）型を記載し、既存の生細胞標識戦略とそれらとの適合性を示し、単一分子追跡及び超解像度イメージングにおけるそれらの有用性を示す。JF549及びJF646は完全にN-アルキル化されたローダミン色素であり、他のローダミン色素では可能な標準的な光解離性基を用いたN-アシル化を用いて光解除的に保護することはできない。このように、JF549及びJF646の光活性化可能な型を形成するために、JF色素の塩化オキサリル及びジアゾメタンでの処理を伴う光解除性保護戦略を使用した。
【００４２】
図1Aに示すように、この光解除性保護戦略とアゼチジニルジャネリア蛍光色素との適合性を試験するために、最初に光活性化可能なJF549（PA-JF549）（2）をJF549（1）から良好な収率で調製した。次に化合物2の光化学を水中で評価した；以前の報告では、メタノール中のジアゾケトンで光解除的に保護された色素の光分解しか記載されていなかった。驚くべきことに、水溶液中での化合物1の徹底的な光分解による主要生成物は、予想されるフェニル酢酸色素（3）ではなくメチル置換JF549（4）と推定される非蛍光「暗生成物」（5）であった。化合物4は、光スイッチ可能な蛍光タンパク質（ΦPC ≒ 1％）と同様に見かけの光化学量子収率（ΦPC）値2.2％で生成された。理論に束縛されることを望むものではないが、この予期しない生成物は、最初の光化学生成物3の効率的な（ΦPC = 15％）光誘導脱カルボキシル反応の結果であると考えられる。
【００４３】
それにも関わらず、図1Bに示すように、2つの光生成物3及び4は、親JF549である化合物1と同様のスペクトル特性を有する高度な蛍光性の分子である。すなわち、これらの化合物は、JF色素の優れた輝度を保持する。前に報告したように、フルオロフォア1は、549nmの吸収極大（λmax）、1.01×105 M -1cm -1の吸光係数（ε）、571nmの発光極大（λem）、及び0.88の蛍光量子収率（ΦF）を示す。フルオロフォア3は、λmax／λem = 553nm／573nmを示し、1の輝度の95％を保持（ε= 9.89×104M -1 cm -1；ΦF = 0.85）する一方、色素4はλmax／λem = 551nm／570nmを与え、1の輝度の75％を保持（ε= 8.59×104M-1cm-1；ΦF = 0.78）した。また、これらの化合物の容易な光活性化は、改善された単粒子追跡及び局在性顕微鏡検査実験を提供する。
【００４４】
得られた光活性化フルオロフォアの輝度を測定した後、PA-JF549（6）のHaloTagリガンドが合成された（図1C）。インビトロ、生細胞、または固定細胞のいずれかでのHaloTagタンパク質の6での標識は、低いバックグラウンド吸収及び1光子照射または2光子照射によって活性化され得る蛍光発光を有する結合体を与えた（図3A）。HaloTagへの6の結合は、遊離PA-JF549リガンドと比較して所望の蛍光生成物の収率を改善することが見出され（図3B-C）、理論に束縛されることを望むものではないが、それは立体配座の柔軟性を制限し、平面状暗生成物5（図1A）の形成を妨げることによると考えられる。図3D-Fでは、タンパク質への結合の際の所望の光化学的結果におけるこの増大は、PA-JF549-SNAP-tagリガンド（7）についても観察され、その合成は（図1C）に示されている。有利ではあるが、結合時の光化学におけるこの改善は、遊離リガンドを洗い流す必要性を排除するのに十分大きいものではない。
【００４５】
PA-JF549-HaloTagリガンド（6）の性能は、遺伝的にコードされたmEos3.2と直接比較された。図3Gに示すように、PA-JF549の活性化率（τ= 94.5s）は、mEos3.2（τ= 107s）と同様であった。そのうえ、図3H及び表1に示すように、オンオフ活性化率も同様であった（〜10-5）。しかし、検出された光子／局在性の中央値（図3I）は、mEos3.2と比較してPA-JF549の方が高かった（JF549 = 870.9、mEos3.2 = 533.7）。
【表１】
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【００４６】
次いで、HaloTag-Sox2融合体またはmEos3.2-Sox2融合体を発現する生存マウス胚性幹（ES）細胞における単粒子追跡光活性化局在性顕微鏡法（sptPALM）実験で、色素を比較した（図1D）。図1E-Fに示すように、PA-JF549は、性能においてmEos3.2フルオロフォアと比較してかなりの改善を示し、mEos3.2（検出された光子／粒子／フレームの中央値 = 70.9；軌跡長の平均 = 0.07秒）よりも高い検出された光子／粒子／フレーム（中央値 = 120.7）及びより長い軌跡（平均 = 0.20秒））を与えている。PA-JF549-HaloTagリガンド（6）の性能は、多焦点顕微鏡（MFM）装置を用いて、市販のテトラメチルローダミン（TMR）HaloTagリガンド（9）とも比較され、3D追跡においてPA-JF549リガンドの優れた性能が観察された（図3J-O）。
【００４７】
次に、固定細胞におけるPALMの標識としてのPA-JF549-HaloTagリガンドの有用性を試験した。mEos3.2（図3P）またはHaloTagタンパク質に融合され、リガンド6（図1G）で標識されたミトコンドリアタンパク質TOMM20を画像化した。予想通り（図3I）、PA-JF549-HaloTag結合体は、mEos3.2（検出された光子／局在性／フレームの中央値 = 266.8；中央値σ = 20.2nm）と比較して、1フレーム当たり局在性事象当たりのより高い光子総数（中央値 = 636.6）（図1H）及び計算された局在性精度（中央値σ = 13.5nm）（図1I）を与えた。色素が、異なる細胞領域において他のHaloTag融合体と共に、PALM標識として機能し得ることも確認された（図3Q-S）。全体的に、PA-JF549標識は、比較的高い光子総数及び計算された局在性精度を与え、わずかな点滅しか示さなかった（図3T-V）。それにも関わらず、遺伝的にコードされた自己標識タグを使用しても、局在性顕微鏡検査における画質の重要な決定要因である標識密度の問題は対処できない。
【００４８】
次に、2つのスペクトル的に異なる光活性化可能なフルオロフォアの不足によって妨げられてきた実験である、2色単粒子追跡PALMを実施した。ジアゾケトンでの同じ光解除性保護戦略を異なるジャネリア蛍光色素に使用することで、両方の標識の疎らな光活性化が同様の効率で可能になり、2色実験が容易になると考えられた。これにより、図4Aに示すように、最初にJF646（11）を光活性化可能なジャネリア蛍光色素646（PA-JF646）（12）に変換し、この光解除性保護戦略がSi-ローダミン足場と適合するかどうかを試験した。興味深いことに、遊離PA-JF646 12の光分解は、予想されるフルオロフォア13及び14のほんのわずかな量（<5％）しか与えず、主要生成物は非蛍光体15（図4A）であった。それにも関わらず、PA-JF549化合物（図3A-F）について観察された光化学における「タンパク質上（on-protein）」の改善に基づいて、PA-JF646は、結合された場合に光活性化可能なフルオロフォアとしてより良好な性能を示すことが予測された。従って、図2Aに示されるPA-JF646のHaloTagリガンド（16）及びPA-JF646のSNAP-tagリガンド（17）が、合成された。これらの化合物は、それらの同族タンパク質への結合に際する光化学的結果の実質的な改善（図4B-E）及び生細胞における高い活性化率（τ= 83.5）（図4F）を示した（図4F）。オンオフ比は、赤色励起光下での自発的活性化率が低いため、実質的に高かった（〜10-6）（図4G、表1）。PA-JF549リガンド6で示された低背景染色もまた、PA-JF646-HaloTagリガンド16（図4H-I）で観察され、このことは生存細胞中のsptPALMを可能にする（図2B）。
【００４９】
2色sptPALMのためのPA-JF646対をさらに検証するために、転写因子Sox2をHaloTagタンパク質との融合体として発現させ、PA-JF549-HaloTagリガンド6で標識した。ヒストンH2BをSNAP-tagとの融合体として同時発現させ、この集団をPA-JF646-SNAP-tagリガンド（17）で標識した。これらの光活性化可能な色素は、405nmの光による光活性化によってH2BとSox2の両方の同時追跡を可能にした。標準的なPALM分析を用いてヒストンH2Bの位置マップ（図2C）を作成し、クロマチンPALMマップ（図2D）における高密度領域と共在しているSox2軌道、または共在していないSox2軌道を規定するために使用した。図2E-G及び4J-Kに示されているように、ヒストンH2Bと共在したSox2の分子は、非共在画分よりも遅い拡散係数を示した。
【００５０】
最後に、多色局在性顕微鏡法についてPA-JF646標識を調べた。いくつかの自己標識タグリガンドがPALMイメージングに使用されているが、以前に報告された分子は比較的短い発光極大を示し、従って光で変換される蛍光タンパク質のような他の局在性顕微鏡標識とは適合しない。同様の波長を有する別の光解除性保護基を付与されたSi-ローダミンを用いた本発明者らの以前の研究に基づいて、PA-JF646がmEos3.2を用いる2色PALMに有用であるほど十分に赤色側にシフトされると推論した。図4L-Mにあるように、HaloTag-ビメンチンまたはHaloTag-TOMM20融合体を発現する細胞において、PA-JF646-HaloTagリガンド16が1色PALMに使用され得ることが最初に示された。PA-JF646リガンド16を用いたTOMM20画像における計算された局在性精度は、PA-JF549と同様であった（中央値σ = 13.8nm）（図1I及び4N）。2色実験のために、変異ハンチントンタンパク質Htt-94QをmEos3.2との融合タンパク質として、ヒストンH2BをHaloTagとの融合体として発現させ、PA-JF646-HaloTagリガンド16で標識した。標識し、固定し、2色PALM（図2H）の後、ヒストンH2B（マゼンタ）及びHtt-94Q凝集体（緑色）は稀にしか重ならない（すなわち、白色スポットはほとんどない）ことが観察され、これは拡大したポリグルタミン領域によって形成された凝集体が細胞核内のクロマチン構造と置換する、という仮説の証拠となる。
【００５１】
結論として、上記の方法は、明るく光安定性のあるジャネリア蛍光色素の光活性化可能な型を提供する。これらのフルオロフォアは、蛍光性JF色素によって示された生細胞における優れた光子収率及び有用性を保持するが、光活性化、洗練された単粒子追跡PALM実験を容易にするという付加的な便益を有する。これらの色素はまた、固定細胞用のPALM標識の色彩拡大に有用な追加を構成する。特に、PA-JF646は、HaloTagまたはSNAP-tagシステムを使用した生細胞標識に適合性のある最初の遠赤色光活性化可能なフルオロフォアであり、多色単粒子追跡実験及び超解像顕微鏡検査を可能にする。
【００５２】
理論に束縛されることは望まないが、これらの小さく明るい光活性化可能な標識は、多くの異なる標識戦略に適合し、従って生細胞及び固定細胞における単一分子イメージングの境界を広げると考えられる。局在性顕微鏡法を超えて、これらの汎用性のある膜透過性標識は、光活性化が特定の細胞または細胞領域を強調するために使用される任意のライブイメージング実験において、光で変換される蛍光タンパク質の好ましい代替物を提供するはずである。
【００５３】
方法
【００５４】
化学合成及び光化学。全ての新規化合物及びその後の分光法及び光化学の実験の詳細及び特徴は、実施例2に見出すことができる。
【００５５】
UV-Vis及び蛍光分光法。分光法は、1-cmの光路長の石英キュベットを用いて行った。全ての測定は周囲温度（22±2℃）で行った。吸収スペクトルをCary Model 100分光計（Agilent）で記録した。蛍光スペクトルをCary Eclipse蛍光計（Varian）で記録した。Quantaurus-QY分光計（モデルC11374、浜松）を用いて、全てのフルオロフォアの絶対蛍光量子収率（ΦF）を測定した。
【００５６】
一般的な顕微鏡法。全てのイメージング実験のための機器パラメータの包括的なリストは、表2に見出すことができる。付加情報は以下に述べる。
【表２−１】
2019530636.tif 000006
【表２−２】
2019530636.tif 000007
【表２−３】
2019530636.tif 000008
【表２−４】
2019530636.tif 000009
【表２−５】
2019530636.tif 000010
【表２−６】
2019530636.tif 000011
【表２−７】
2019530636.tif 000012
【表２−８】
2019530636.tif 000013
【００５７】
細胞培養。マウスD3 ES細胞（ATCC）を、支持細胞の非存在下で0.1％w／vゼラチンコートプレート上に維持した。ES細胞培地は、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Invitrogen）に15％v／vウシ胎仔血清（FBS）、1mMグルタマックス、0.1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2-メルカプトエタノール及び1000単位の白血病阻止因子（LIF；Millipore）を補充して調製した。U20S（ATCC）及びCOS-7（ATCC）細胞を、2mMのL-グルタミンまたは2mMのグルタマックスを補充した10％v／vウシ胎仔血清（FBS）を含むDMEM（Corning）で培養した。ジャネリア細胞培養施設によりマイコプラズマ汚染について細胞を定期的に試験した。
【００５８】
プラスミドの構築。Sox2及びヒストンH2B cDNAをES細胞cDNAライブラリーから増幅した。Htt-94Q cDNAは、Addgene（プラスミド番号23966）から得た。完全長cDNAを、Piggybacトランスポゾンベクター（PB533A-2、System Biosciences）またはPuroRを有する改変Piggybacトランスポゾンベクターにクローニングした。HaloTag（Promega）またはmEos3.2（Addgene：プラスミド番号54525）の配列は、所望のタンパク質のcDNAのN末端（HaloTag-Sox2）またはC末端（ヒストンH2B-HaloTag、ヒストンH2B-SNAP-tag、及びHtt-94Q-mEos3.2-NLS）とインフレームでライゲーションした。mEmeraldの配列の代わりにHaloTagのための配列を用いることにより、エンスコンシン-HaloTag、クラスリン-HaloTag、TOMM20-HaloTag、Sec61β-HaloTag、及びビメンチン-HaloTagをコードするプラスミドを構築した。Nucleofectorキット（Lonza）を用いて各プラスミドをU20S細胞に一時的にトランスフェクトした。
【００５９】
安定な細胞株の生成。Piggybacトランスポゾンベクターを、Piggybacトランスポザーゼ（Super Piggybac Transposase、System Biosciences）を過剰発現するヘルパープラスミドと同時トランスフェクションすることにより、安定な細胞株を作製した。トランスフェクションの48時間後、細胞をネオマイシンまたはピューロマイシン（Invitrogen）選択に付した。トランスフェクションは、Nucleofectorシステム（Lonza）を用いて行った。
【００６０】
ES細胞標識戦略及びイメージングのための準備。イメージングの1日前に、ES細胞を、IMatrix-511（Clontech）でプレコートしたカバーグラス上に蒔いた。FluorBrite培地（Invitrogen）に10％v／v FBS、1mMのグルタマックス、0.1mMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES（pH7.2-7.5）、0.1mMの2-メルカプトエタノール、及び1000単位のLIF（Millipore）を補充することによって調製したES細胞イメージング培地にて、イメージングを行った。PA-JF549またはPA-JF646標識のために、細胞をPA-JF549-HaloTagリガンド（6）またはPA-JF646-HaloTagリガンド（16）と共に100nMの最終濃度で1時間インキュベートした。2色sptPALM生細胞追跡実験のために、標識細胞をイメージングの前にES細胞イメージング培地（3×）で洗浄した。2色固定細胞PALMイメージング実験のために、標識細胞をPBS（4×）で洗浄し、4％w／vのパラホルムアルデヒドで10分間固定し、PBS（3×）で洗浄した。最終的なPALMイメージングをPBS溶液中で行った。
【００６１】
3D spt-dSTORM及びspt-PALM追跡実験。PA-JF549-HaloTagリガンド（6）またはTMR-HaloTagリガンド（9）のいずれかで標識された蛍光標識HaloTag-Sox2分子を、特注の多焦点顕微鏡を使用して、生存ES細胞にて3Dで追跡した15。30msのフレーム時間で、iXon Ultra EMCCDカメラ（DU-897U-CS0-＃BV、17MHz EM増幅器、プリアンプ設定1、ゲイン300）を用いて、9つの焦点面からの蛍光を同時に記録した。
【００６２】
1色PALM標識及び固定。細胞を、予め洗浄した直径25mmのカバーグラス、または基準マーカーとしての金ナノロッド（Gleb Shtengel、Janeliaの厚意による寄贈）を含有するように埋め込まれた、予め洗浄した直径25mmのカバーグラス上で増殖させた。固定前に、10nMのHaloTagリガンドで37℃、5％CO2で30分間細胞を標識した。次いで、細胞を、10％FBSを含有する予め加温したDMEM緩衝液で3回洗浄した。固定の前に、カバーグラスを塩化マグネシウムも塩化カルシウムも含まない予め加温したPBS溶液で2回洗浄した。PBS中の8％ホルムアルデヒド溶液1mLを、1mLのPBSを含む皿にゆっくり加え、得られた4％ホルムアルデヒド溶液を室温で10分間インキュベートした。カバーグラスをPBSで2回洗浄し、PBS溶液中の0.1％v／v Triton X-100中で4分間インキュベートした。カバーグラスをPBSで2回洗浄し、次いでPBS中の1％w／v BSA中にて周囲温度で1時間インキュベートした。PBSでさらに2回洗浄した後、カバーグラスをPALMイメージングのために金属セルチャンバーに据え付けた。
【００６３】
2色sptPALM生細胞追跡実験。PA-JF549-HaloTagリガンド（6）で標識されたHaloTag-Sox2融合体及びPA-JF646-SNAP-tagリガンド（17）で標識されたSNAP-tag-ヒストン H2B融合体の両方を発現するES細胞を、特注の3-カメラ顕微鏡を用いて同時に追跡した21。2つのiXon Ultra EMCCDカメラ（DU-897-CS0-BV及びDU-897U-CS0-EXF、共に−80℃に冷却、17MHz EM増幅器、プリアンプ設定3、ゲイン400）を、National InstrumentsのDAQボード（NI-DAQ-USB-6363）を使用して、10msのフレーム時間で同期させた。555nmレーザー（TTL変調を備えるCL555-1000-O、CrystaLaser）及び639nmレーザー（Stradus 637-140、Vortran）の5msストロボ励起を、LabVIEW 2012（National Instruments）を介して2台のカメラそれぞれのフレーム時間に同期させた。2つのレーザーは、核のHiLo照射を用いて〜1.7kW／cm2のピーク出力密度を用いて、試料をストロボ照明した。PA-JF549及びPA-JF646標識は、毎秒100μs長の407nm光（50W／cm2）励起パルスによって光変換された。画像取得の間、パルス長は200μs長パルスに増加させた。撮像中、細胞は、東海ヒットのステージトップインキュベーター及び対物レンズヒーターを用いて37℃及び5％CO2で維持した。以前に発表された分析を用いて、本発明者らの生細胞実験における共局在化Sox2及びヒストンH2B軌道を決定した。手短に言えば、粒子を位置決め、両方のチャネルに別々に軌道を構築した。次に、少なくとも10ms間、互いに320nm以内に存在する共局在化軌道として割り当てた。次に、Grimm、English et al.に記載されているように、拡散係数マップ及びヒストグラムを計算した。
【００６４】
背景染色の決定。 COS-7細胞をヒトヒストンH2B-HaloTagタンパク質融合体を発現するプラスミドで安定にトランスフェクトした。トランスフェクトされていないCOS-7細胞及び安定なヒストンH2B-HaloTag発現細胞を、10％FBS及びグルタマックスを含む、フェノールレッドを含まないDMEM中、1プレートあたり2×105細胞で35mmのMatTekガラスボトムディッシュに蒔いた。24時間後、細胞をPBSで濯ぎ、0.1Mのリン酸緩衝液中（pH7.4）の新鮮な4％w／vパラホルムアルデヒド2mLで30分間固定し、続いてPBSで2回洗浄した。ヒストンH2B-HaloTagタンパク質を、PBS中の5μg／mLのHoechst 33342（Invitrogen）と共に、100nMのPA-JF549-HaloTagリガンド（6）またはPA-JF646-HaloTagリガンド（16）で30分間染色した。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、0.1％v／v Triton X-100及び3％w／v BSAを含むPBSで20分間洗浄し、続いてPBSでさらに2回洗浄した。Zeiss 710 LSMを用いて細胞を撮像した。Z-次元スタック限界は、405nm励起及び410-485nmの発光を使用して画像撮影されたHoechst 33342核参照染色を使用して設定した。PA-JF549及びPA-JF646の部分光活性化は、75％のレーザー出力で405nmを60回反復して行った。活性化されたJF549の画像は、561nmの励起及び566-685nmの発光を用いて収集した。JF646の画像は、633nmの励起及び638-759nmの発光を用いて収集した。Hoechst 33342及びJF色素の軌跡は別々に収集した。Fijiを用いて画像解析を行った。共焦点スタックは最大投影画像として表示される。実験画像及び対照画像は、同じ輝度／コントラストスケールに設定した。
【００６５】
2色固定細胞PALMイメージングの取得。 PA-JF646-HaloTagリガンド（16）で標識されたHtt94Q-mEos3.2及びヒストンH2B-HaloTagの両方を発現するES細胞を、先に記載した特注の3-カメラ顕微鏡を用いて、555nm及び639nm両方の励起レーザーの場合、50msのフレーム時間及び約4kW／cm2の一定の照明パワー密度で画像撮影した。mEos3.2及びPA-JF646は、毎秒100μs長の407nm光（100W／cm2）励起パルスによって光変換された。mEos3.2は115.6の検出された光子／局在化／フレームを放出し、分子は、固定された粒子を選択するために厳しい変位パラメータを用いて追跡することによって決定されるように、4つのフレームについて平均して放出する。したがって、各mEos3.2は、約460個の検出光子を放出し、文献報告と一致する。JF646によってもたらされる1.7倍高い解像度向上は、6.5倍以上の検出光子／局在化／フレーム（757.6）及びJF646の赤色側にシフトしたスペクトルに基づいて予想されるものよりも小さい。これは、主に、調光タンパク質フルオロフォア及び明るい焦点外JF646分子によって生成された増大した蛍光背景に対して最適化されたカメラの画素サイズに起因する。
【００６６】
PALM及びsptPALM追跡画像分析。2-カメラの同時イメージング及び追跡のために、2つの16ビットTIFFスタックを、記述子を基にしたFijiプラグインを使用する類似性（2d）変換モデルを使用して登録した。超解像度画像は、8方向の隣接粒子検出、20のGLRT、及び1.3画素のPSFを有するDedeckerらによるソフトウェアパッケージLocalizerを用いて描画された。粒子軌跡の連結には、5画素の最大飛距離、3フレームの最小軌跡長、及び15のGLRT感度の設定が選択された。結果として得られた軌跡はテキストファイルとしてエクスポートされ、拡散マッピングはIgor Pro 6.36（WaveMetrics）で書かれたコードで実行された。このコードは、フレーム時間の時間尺度の平均二乗変位から、20nm×20nmのグリッドで評価された局所的な見かけの拡散係数を計算する。Zeiss Zhen 2.1ソフトウェアを使用して、Zeiss Elyra顕微鏡から得た画像を解析した。
【００６７】
多焦点画像処理。以前に説明したようにビーズキャリブレーションデータを使用して、同時に得られた9つの焦点面を互いに重ね合わせることによって3Dスタックを組み立てた。3Dの粒子追跡では、16ビットTIFFスタックをDiaTrack 3.04 Proにインポートし、それは、強度スポットを識別して事前に決定されたPSFと一致する3Dガウス関数とフィットさせる。3D粒子追跡では、背景を差し引き、1.05のフィルタデータ、1.3画素のPSF、15の薄暗さ（dim）を除去し、0.05の不鮮明（blurred）を除去する設定が選択された。結果として得られた3Dの軌跡は、Igor Pro 6.36で書かれたコードと共に、検出された全ての点のx、y、z座標だけでなくフレーム番号も含む1つのテキストファイルとしてエクスポートされた。我々は、検出された全ての粒子の位置マップを、高さ（z）について色分けされたx-y平面にプロットし、3D sptPALMデータ取得の過程で検出された粒子数のヒストグラムを算出した。中央の2つの焦点面（多焦点面4及び5）で検出された粒子からの積分された蛍光強度を計算し、Igor Proバージョン6.36で書かれた分析ルーチンを用いて光子総数に変換した。局在化誤差は、Mortensenらの式（6）を用いて計算した。
【００６８】
活性化率の測定。リガンド6及び16で標識されたヒストンH2B-mEos3.2またはヒストンH2B-HaloTagのいずれかを発現する生存U20S細胞（n = 各フルオロフォアのための5個の細胞）を、励起光（PA-JF549及びmEos3.2の場合561 nm；PA-JF646の場合637nm）及び活性化光（405nm）の同時照射の下で300秒間（フレームあたり300ms）画像撮像した。時定数（τ）は、蛍光対時間の指数関数へのフィッティングによって決定した（図3G及び4F）。
【００６９】
オンオフ比及び光子総数推定。オンオフ比は、Wangらの方法を用いて決定し、データのまとめを表1に示す。簡単に説明すると、リガンド6及び16で標識されたTOMM20-mEos3.2またはTOMM20-HaloTagのいずれかを発現しているU20S細胞を、10分間、4％PFAで固定し、次いで上記のように洗浄した。その後、細胞は励起レーザーのみ（PA-JF549及びmEos3.2では561nm；PA-JF646では637nm；フレーム当たり300ms）でPBS中にて画像撮影した（図3H及び4G）。〜300フレーム後、光活性化レーザー（405nm）をオンにし、光活性化プロセスが徹底されるまで強度を徐々に増加させた。特注のソフトウェア（Airlocalize）を用いて蛍光スポットを計数した。
【００７０】
オン率は、光活性化の前段階でのフレーム当たりの光活性化スポットの平均数を、動画全体にわたって検出された蛍光スポットの総数で割ったものとして計算した。オフ率を測定するために、光活性化の前段階からのスポットを最初に単離した。これらの中で、1画素未満離れたスポットは、個々の分子に対応する軌道に組み立てられた。1画素の閾値は、光活性化段階の全スポットにわたって計算された対相関関数の幅に基づいて決定された。フレーム内のフルオロフォアの平均寿命（オフ率の逆数）μを得るために、1分子当たりのフレーム数nの分布を指数関数の積分（式1）に当てはめた。
【数１】
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最後に、オンオフ比をオン率とフルオロフォアの平均寿命の積として計算した。各値は2〜4の別々の細胞の平均値である。この点に関して、オンオフ比mEos3.2固定細胞の推定値は、以前の生細胞の測定値よりも高かったことは留意されたい。光物理学におけるこの差は、実験条件（PBS対生細胞）の違いに起因すると思われる。これらの実験から、検出光子／分子の総数はまた、各分子のスポット強度を合計し、その結果をEM-CCDの利得変換因子について調節することによって計算された（図3I）。
【００７１】
PALMイメージング中のPA-JF549-HaloTagリガンドの点滅動態の特徴決定。発光体の低密度を特色とするPALMイメージング動画の一部が、エンスコンシン-HaloTag-PA-JF549実験（図3R）から選択された。それらの位置は、動画の一部の最大強度投影についての2次元ガウスマスク位置特定アルゴリズムを使用して決定された。続いて、動画の個々のフレーム上で同じ位置特定ソフトウェアが実行され、最大強度投影で識別された各スポットの時間軌道が生成された：所与のフレームで最大投影にて特定されたスポットの1画素内にスポットが検出された場合、それらは同じ粒子を表すと仮定され、対応する位置、強度及びフレーム番号をその時間軌道に含ませた。ドリフトを説明するために1画素の閾値が選択された；相互相関分析に基づいて、ドリフトは、動画の継続時間にわたり、各次元において〜0.25画素の変位よりも少ない寄与であると推定された。閾値の控えめな選択により、わずかの偽陽性点滅事象がもたらされる可能性があり、したがって、測定値は、色素の点滅傾向をわずかに過大評価する可能性があることに留意されたい。各粒子の時間軌跡を用いて、個々の点滅事象を単離し、定量化した。得られた統計は、PA-JF549フルオロフォアがほとんど点滅しないことを示す（平均1.4点滅事象、図3T-V）。
【００７２】
実施例2
【００７３】
合成のための一般的な実験情報。
【００７４】
市販の試薬は信頼のおける供給業者から入手し、受け取ったそのままを使用した。全ての溶媒は、不活性雰囲気下で貯蔵されたセプタム密封ボトルで購入した。全ての反応は、別段の記載がない限り、セプタムで密封し、該セプタムを通して窒素雰囲気を導入した。反応は、テフロン被覆磁気攪拌棒を含む丸底フラスコまたはセプタムキャップ付きクリンプトップバイアル中で行った。反応の加熱は、指示された温度を維持するために、電子接触温度計を備えた攪拌ホットプレートの上にシリコンオイルバスまたはアルミニウム反応ブロックを用いて達成された。
【００７５】
反応は、プレコートしたTLCガラスプレート上での薄層クロマトグラフィー（TLC）（シリカゲル60F254、250μm厚）またはLC／MS（Phenomenex Kinetex 2.1mm×30mm 2.6μm C18カラム；5μL注入；5-98％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v HCO2H添加剤を含む；分析時間6分；送液量0.5mL／分；ESI；陽イオンモード）によりモニターした。TLCクロマトグラムをUV照射によって可視化するか、またはｐ-アニスアルデヒド、モリブデン酸アンモニウムセリウム、もしくはKMnO4染色で発色させた。反応生成物を、予備充填シリカゲルカラムを使用する自動精製システムでのフラッシュクロマトグラフィー、または分取HPLC（Phenomenex Gemini-NX 30×150mm 5μm C18カラム）によって精製した。分析用HPLC分析は、示された条件下でAgilent Eclipse XDB 4.6×150mm 5μm C18カラムを用いて行った。高分解能質量分析は、アイオワ大学の高分解能質量分析装置によって得られた。
【００７６】
NMRスペクトルは400MHz分光計で記録した。1H及び13Cの化学シフト（δ）はTMSまたは残留溶媒ピークを基準とし、19Fの化学シフト（δ）はCFCl3を基準とした。1H NMRスペクトルのデータは、化学シフト（δppm）、多重度（s = 一重項、d = 二重項、t = 三重項、q = 四重項、dd = 二重項の二重項、m = 多重項）、結合定数（Hz）、積分値が報告された。13 C NMRスペクトルのデータは、DEPTスペクトルから得られた水素多重度（C、CH、CH2、CH3）情報による化学シフト（δppm）が報告された。
【００７７】
PA-JFプローブの合成。
【化４】
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【００７８】
PA-JF549（2）（図1A、8、及び10A）：CH2Cl2（30mL）中のジャネリア蛍光色素5491（JF549）（1）（450mg、1.10mmol）の溶液に塩化オキサリル（111μL、1.32mmol、1.2当量）を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した後、トリエチルアミン（229μL、1.64mmol、1.5当量）及び（トリメチルシリル）ジアゾメタン（Et2O中2.0M、3.29mL、6.58mmol、6当量）を続けて添加した。反応物を室温で1時間撹拌し、減圧下で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（0-20％EtOAc／トルエン、リニアグラジエント）により精製して333mg（70％）の2を黄色固体として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ 7.83 - 7.79 (m, 1H), 7.46 (td, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H), 7.39 (td, J = 7.4, 1.0 Hz, 1H), 7.07 - 7.03 (m, 1H), 6.69 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.16 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.07 (dd, J = 8.5, 2.3 Hz, 2H), 3.88 (t, J = 7.5 Hz, 8H), 2.36 (p, J = 7.2 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 187.4 (C), 156.4 (C), 152.7 (C), 152.1 (C), 134.69 (CH), 134.66 (C), 128.8 (CH), 128.4 (CH), 125.5 (CH), 122.3 (CH), 109.7 (C), 107.9 (CH), 98.3 (CH), 77.4 (C), 52.3 (CH2), 49.4 (C), 16.9 (CH2)；C27H23N4O2[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値435.1816、実測値435.1820であった。
【化５】
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【００７９】
3',6'-ジブロモ-6-メトキシカルボニルフルオラン（S2）（図5）：3',6'-ジブロモ-6-カルボキシフルオラン2（S1）（1.50g、2.99mmol）をMeOH（50mL）に懸濁し、H2SO4（293mg、2.99mmol、1当量）を添加した。反応物を還流下で72時間撹拌した。続いてそれを減圧下で濃縮し、得られた残渣を飽和NaHCO3で希釈し、15％i-PrOH／CHCl3（2×）で抽出した。合わせた有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー（0-10％EtOAc／ヘキサン、リニアグラジエント、一定の40％v／v CH2Cl2を含む）により、1.49g（97％）のS2を白色固体として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.31 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.10 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.76 (dd, J = 1.2, 0.8 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.20 (dd, J = 8.5, 1.9 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 168.1 (C), 165.3 (C), 153.1 (C), 151.2 (C), 137.0 (C), 131.6 (CH), 129.24 (C), 129.21 (CH), 127.8 (CH), 125.7 (CH), 125.1 (CH), 124.6 (C), 120.7 (CH), 117.4 (C), 81.5 (C), 53.0 (CH3)；C22H13Br2O5[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値514.9124、実測値514.9141であった。
【化６】
2019530636.tif 000017
【００８０】
6-メトキシカルボニル-JF549（S3）（図5）：バイアルに、S2（400mg、775μmol）、Pd2dba3（71mg、77.5μmol、0.1当量）、XPhos（111mg、232μmol、0.3当量）、及びCs2CO3（707mg、2.17mmol、2.8当量）を加えた。バイアルを密閉し、窒素で排気／再充填した（3回）。
ジオキサン（6mL）を加え、反応物に窒素を再びフラッシュした（3回）。アゼチジン（115μL、1.70mmol、2.2当量）の添加後、反応物を100℃で3時間撹拌した。次いで、これを室温に冷却し、MeOHで希釈し、セライトに沈着させ、濃縮乾固させた。シリカゲルクロマトグラフィー（0-10％MeOH（2MのNH3）／CH2Cl2、リニアグラジエント；セライトによる乾燥負荷）による精製より、S3（312mg、86％）を紫色の固体として得た。1H NMR (MeOD, 400 MHz)  8.24 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz, 1H), 8.12 (dd, J = 8.1, 0.4 Hz, 1H), 7.83 - 7.80 (m, 1H), 7.16 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.56 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 2H), 6.48 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.32 - 4.22 (m, 8H), 3.90 (s, 3H), 2.54 (p, J = 7.6 Hz, 4H)；分析用HPLC：tR = 12.7分、> 99％純度（5μL注入；10-95％（MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFA添加物を含む；分析時間20分；送液量1mL／分；ESI；陽イオンモード；550nmでのUV検出）；C28H25N2O5 [M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値469.1758、実測値469.1766であった。
【化７】
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【００８１】
6-メトキシカルボニル-PA-JF549（S4）（図5）：2について記載した手順を使用して、S3を表題化合物（38％、黄色固体）に変換した。1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ 8.07 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 1.4, 0.6 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.18 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.07 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 2H), 3.96 - 3.84 (m, 8H), 3.82 (s, 3H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 186.2 (C), 166.2 (C), 156.3 (C), 152.8 (C), 152.2 (C), 138.4 (C), 135.8 (C), 129.8 (CH), 128.7 (CH), 126.9 (CH), 122.3 (CH), 108.8 (C), 108.0 (CH), 98.5 (CH), 78.4 (C), 52.5 (CH3), 52.3 (CH2), 49.5 (C), 16.9 (CH2)；C29H25N4O4[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値493.1870、実測値493.1877であった。
【化８】
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【００８２】
PA-JF549-NHS（S5）（図5）：窒素下、2：1のMeOH／THF（7.5mL）中のS4（53mg、108μmol）の溶液に、1MのNaOH（538μL、538μmol、5当量）を加えた。反応物を室温で24時間撹拌した。続いて1MのHCl（575μL）で酸性化し、水で希釈し、CH2Cl2（2×）で抽出した。有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮してカルボン酸を黄色固体として得た（47mg、91％）。
【００８３】
DMF（3mL）中で酸（47mg、98.2μmol）をTSTU（44mg、147μmol、1.5当量）と合わせ、DIEA（51μL、295μmol、3当量）を添加した。反応物を室温で1時間撹拌した後、濃縮乾固し、セライト上に沈着させた。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（10-100％EtOAc／ヘキサン、リニアグラジエント；セライトによる乾燥負荷）により、黄色固体のS5（40mg、71％）を得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz)  8.16 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 1.4, 0.6 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.16 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.09 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.86 (s, 4H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 185.5 (C), 169.0 (C), 161.2 (C), 156.4 (C), 153.0 (C), 152.1 (C), 140.0 (C), 130.6 (CH), 130.4 (C), 128.5 (CH), 127.9 (CH), 122.8 (CH), 108.3 (CH), 108.1 (C), 98.5 (CH), 78.7 (C), 52.3 (CH2), 49.7 (C), 25.8 (CH2), 16.9 (CH2)；C32H26N5O6[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値576.1878、実測値576.1890であった。
【化９】
2019530636.tif 000020
【００８４】
PA-JF549-HaloTagリガンド（6）（図1C及び5）：NHSエステルS5（15mg、26.1μmol）をDMF（1mL）に溶解した。DMF（250μL）中のHaloTag（O2）アミン（S6、11.7mg、52.1μmol、2当量）の溶液を添加し、続いてDIEA（22.7μL、130μmol、5当量）を添加した。反応物を室温で2時間撹拌した後、濃縮乾固させ、シリカゲルクロマトグラフィー（0-100％EtOAc／トルエン、リニアグラジエント）で精製して、6を黄色泡状物（15.9mg、89％）として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz)  7.86 (dd, J = 7.9, 0.6 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.43 (dd, J = 1.4, 0.6 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.59 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 6.16 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.07 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 2H), 3.95 - 3.83 (m, 8H), 3.64 - 3.48 (m, 10H), 3.39 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.78 - 1.69 (m, 2H), 1.55 - 1.48 (m, 2H), 1.46 - 1.36 (m, 2H), 1.36 - 1.27 (m, 2H)；分析用HPLC：tR = 17.1分、> 99％純度（5μL注入；10-95％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFA添加物を含む；分析時間20分；送液量1mL／分；ESI；陽イオンモード；254nmでのUV検出）；C38H43ClN5O5[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値684.2947、実測値684.2952であった。
【化１０】
2019530636.tif 000021
【００８５】
PA-JF549-SNAP-tagリガンド（7）（図1C及び5）：NHSエステルS5（10mg、17.4μmol）及びBG-NH2（S7、7.0mg、26.1μmol、1.5当量）を、DMF（1mL）中で合わせ、DIEA（15.1μL、86.9μmol、5当量）を加えた。反応物を室温で1時間撹拌した後、濃縮乾固し、セライト上に沈殿させ、シリカゲルクロマトグラフィー（0-10％MeOH／EtOAc、リニアグラジエント、セライトによる乾燥負荷）で精製し、黄色固体（11.2mg、88％）として7を得た。1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.94 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.85 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.53 (dd, J = 1.4, 0.5 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.64 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.16 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.12 (dd, J = 8.5, 2.3 Hz, 2H), 5.46 (s, 2H), 4.43 (s, 2H), 3.90 - 3.77 (m, 8H), 2.34 (p, J = 7.2 Hz, 4H)；分析用HPLC：tト、一定の0.1％v／v TFA添加物を含む；分析時間20分；送液量1mL／分；ESI；陽イオンモード；254nmでのUV検出）；C41H35N10O4[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値731.2837、実測値731.2852であった。
【化１１】
2019530636.tif 000022
【００８６】
PA-JF646（12）（図4A、9及び10B）：2について記載した手順を用いて、ジャネリア蛍光色素646（JF646）（11）を表題化合物（37％、黄色固体）に変換した。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.87 - 7.82 (m, 1H), 7.42 (td, J = 7.4, 1.5 Hz, 1H), 7.37 (td, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 6.93 - 6.89 (m, 1H), 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.56 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 6.33 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 2H), 3.89 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 2.36 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 0.57 (s, 3H), 0.46 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 188.4 (C), 157.8 (C), 149.9 (C), 135.2 (C), 134.6 (CH), 134.4 (C), 134.0 (C), 130.1 (CH), 127.9 (CH), 125.5 (CH), 122.6 (CH), 114.4 (CH), 114.1 (CH), 79.1 (C), 57.5 (C), 52.3 (CH2), 17.0 (CH2), 1.0 (CH3), 0.2 (CH3)；C29H29N4OSi[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値477.2105、実測値477.2104であった。
【化１２】
2019530636.tif 000023
【００８７】
6-メトキシカルボニルシラフルオレセイン ジトリフレート（S9）（図6）：CH2Cl2（20mL）中に6-tert-ブトキシカルボニルシラフルオレセイン ジトリフレート1（S8；400mg、541μmol）を取り、 TFA（4mL）を加えた。反応物を室温で5時間撹拌した。トルエン（20mL）を加えた；反応物を濃縮乾固し、次いでMeOHで3回共沸させた。得られたカルボン酸を4：1のTHF／MeOH（10mL）に溶解した。（トリメチルシリル）ジアゾメタン（Et2O中2.0M、406μL、812μmol、1.5当量）を加え、反応物を室温で15分間撹拌した。次いで、黄色溶液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（0-25％EtOAc／ヘキサン、リニアグラジエント）で精製して、344mg（91％）のS9を白色泡状物として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ。 8.28 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.08 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 8.03 (dd, J = 1.2, 0.8 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.20 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 0.81 (s, 3H), 0.71 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -73.27 (s); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 168.5 (C), 165.3 (C), 152.6 (C), 149.6 (C), 144.0 (C), 138.7 (C), 136.2 (C), 131.3 (CH), 128.81 (CH), 128.75 (C), 127.0 (CH), 126.7 (CH), 125.4 (CH), 123.1 (CH), 118.9 (q, 1JCF = 320.7 Hz, C), 88.7 (C), 53.1 (CH3), 0.0 (CH3), -1.3 (CH3)；C26H19F6O10S2Si[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値697.0088、実測値697.0097であった。
【化１３】
2019530636.tif 000024
【００８８】
6-メトキシカルボニル-JF646（S10）（図6）：S3について記載した手順を用いて、ジトリフレートS9を表題化合物に変換した（86％、黄色固体）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ 8.18 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.94 (dd, J = 1.2, 0.8 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.26 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 3.894 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 3.892 (s, 3H), 3.95 - 3.83 (m, 11H), 2.36 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 0.64 (s, 3H), 0.58 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.9 (C), 166.0 (C), 155.0 (C), 151.1 (C), 136.7 (C), 135.2 (C), 132.2 (C), 130.2 (C), 130.0 (CH), 127.8 (CH), 125.9 (CH), 125.8 (CH), 115.7 (CH), 112.5 (CH), 92.2 (C), 52.7 (CH3), 52.4 (CH2), 17.0 (CH2), 0.4 (CH3), -1.2 (CH3)；C30H31N2O4Si[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値511.2048、実測値511.2057であった。
【化１４】
2019530636.tif 000025
【００８９】
6-メトキシカルボニル-PA-JF549（S11）（図6）：2について記載した手順を用いてS10を表題化合物（39％、黄色固体）に変換した。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.03 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.88 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 1.4, 0.6 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.58 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 6.33 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 2H), 3.94 - 3.85 (m, 8H), 3.80 (s, 3H), 2.36 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 0.63 (s, 3H), 0.48 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 187.3 (C), 166.2 (C), 157.6 (C), 150.1 (C), 138.6 (C), 135.5 (C), 134.7 (C), 133.3 (C), 129.7 (CH), 129.2 (CH), 126.9 (CH), 122.7 (CH), 114.8 (CH), 114.1 (CH), 79.7 (C), 57.8 (C), 52.4 (CH3), 52.3 (CH2), 17.1 (CH2), 0.9 (CH3), 0.2 (CH3)；C31H31N4O3Si[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値535.2160、実測値535.2172であった。
【化１５】
2019530636.tif 000026
【００９０】
PA-JF646-NHS（S12）（図6）：S5について記載した手順を使用して、S11を表題化合物に変換した（2工程で69％、黄橙色固体）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.13 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.94 (dd, J = 8.0, 0.5 Hz, 1H), 7.66 - 7.62 (m, 1H), 6.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.58 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 6.35 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 2.93 - 2.78 (m, 4H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 0.60 (s, 3H), 0.47 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 186.6 (C), 169.1 (C), 161.2 (C), 157.7 (C), 150.3 (C), 140.2 (C), 134.6 (C), 132.5 (C), 130.1 (C), 129.9 (CH), 129.6 (CH), 127.8 (CH), 123.1 (CH), 115.0 (CH), 114.4 (CH), 80.2 (C), 57.9 (C), 52.4 (CH2), 25.7 (CH2), 17.0 (CH2), 0.8 (CH3), 0.3 (CH3)；C34H32N5O5Si[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値618.2167、実測値618.2179であった。
【化１６】
2019530636.tif 000027
【００９１】
PA-JF646-HaloTagリガンド（16）（図6）：5について記載した手順を使用して、S12を表題化合物（74％、黄色固体）に変換した。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.87 (dd, J = 8.0, 0.5 Hz, 1H), 7.76 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 1.4, 0.6 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.57 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.52 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 6.32 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 7.6 Hz, 8H), 3.62 - 3.49 (m, 10H), 3.39 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.79 - 1.69 (m, 2H), 1.55 - 1.48 (m, 2H), 1.47 - 1.37 (m, 2H), 1.36 - 1.27 (m, 2H), 0.62 (s, 3H), 0.46 (s, 3H)；分析用HPLC：tR = 16.2分、> 99％純度（5μL注入；10-95％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFA添加物を含む；分析時間20分；送液量1mL／分；ESI；陽イオンモード；254nmでのUV検出）；C40H49ClN5O4Si[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値726.3237、実測値726.3253であった。
【化１７】
2019530636.tif 000028
【００９２】
PA-JF646-SNAP-tagリガンド（17）（図6）：7について記載した手順を使用して、S12を表題化合物（71％、黄色固体）に変換した。1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.90 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.43 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.37 (dd, J = 1.3, 0.8 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.73 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.40 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 2H), 5.50 (s, 2H), 4.44 (s, 2H), 3.85 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.34 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 0.55 (s, 3H), 0.44 (s, 3H)；分析用HPLC：tR = 11.9分、> 99％純度（5μL注入；10-95％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFA添加物を含む；分析時間20分；送液量1mL／分；ESI；陽イオンモード；254nmでのUV検出）；C43H41N10O3Si[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値773.3127、実測値773.3141であった。
【化１８】
2019530636.tif 000029
【００９３】
JF646-SNAP-tagリガンド（19）（図7）：6-カルボキシ-JF646（S13、 TFA塩；25mg、40.9μmol）をDSC（23.1mg、90.1μmol、2.2当量）とDMF（2mL）中で合わせた。Et3N（34μL、246μL、6当量）及びDMAP（0.5mg、4.09μmol、0.1当量）を加えた後、反応物を遮光しながら室温で1時間撹拌した。次いでBG-NH2（S7,28mg、102μmol、2.5当量）を添加した。反応物を室温でさらに2時間撹拌した。その後、飽和NaHCO3で希釈し、CH2Cl2（2×）で抽出した。合わせた有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（0-10％MeOH／EtOAc、リニアグラジエント）により24.7mg（80％）の19が青色固体として得られた。1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.02 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.67 - 7.64 (m, 1H), 7.46 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.73 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.70 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.32 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 2H), 5.51 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.87 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.35 (p, J = 7.1 Hz, 4H), 0.58 (s, 3H), 0.51 (s, 3H)；分析用HPLC：> 99％純度（4.6mm×150mm5μmC18カラム；5μL注入；10-95％CH3CN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFA添加物を含む；分析時間20分；送液量1mL／分；ESI；陽イオンモード；650nmでのUV検出）；C42H41N8O4Si[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値749.3015、実測値749.2971であった。
【００９４】
光生成物の合成：PA-JFプローブの予備光活性化。
【化１９】
2019530636.tif 000030
【００９５】
PA-JF549（水性）の光分解（図1A）：ジアゾケトン2（50mg、115μmol）を、窒素下、石英フラスコ中のMeCN（120mL）に取った。緩衝液（10mMのHEPES pH7.3、120mL）を添加し、得られた黄色溶液に窒素を30分間注入することでかき混ぜた。反応混合物を室温で8時間撹拌しながら照射した（Luzchem LZC 4V光反応器、365nmランプ）。次いでこれを濃縮乾固し、セライトに沈着させた。0-10％EtOAc／ヘキサン（リニアグラジエント）で先ず溶離することにより、シリカゲルクロマトグラフィー（セライトによる乾燥負荷）を行って暗生成物5を単離した。さらに0-15％MeOH／CH2Cl2（リニアグラジエント、一定の1％v／v AcOHを含む）で溶離することにより、濃紫色固体（酢酸塩、25.3mg、50％）として蛍光生成物4を得た。その濃紫色生成物をフラッシュクロマトグラフィー（0-10％EtOAc／トルエン、リニアグラジエント）で再度精製して、4.6mg（9.8％）の5を黒色固体として得た。逆相HPLC（10-75％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFAを含む）によって、分光学的特性決定用に4の分析的に純粋な試料を得た。
【００９６】
蛍光生成物4：（50％、濃紫色固体）1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.55 (td, J = 7.5, 1.3 Hz, 2H), 7.51 - 7.42 (m, 2H), 7.22 (dd, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.64 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 2H), 6.56 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.38 - 4.27 (m, 8H), 2.57 (p, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (s, 3H), 1.90 (s, 3H); 13C NMR (CD3OD, 101 MHz) δ 159.4 (C), 159.0 (C), 158.2 (C), 137.2 (C), 133.4 (C), 132.5 (CH), 131.8 (CH), 131.2 (CH), 130.1 (CH), 127.3 (CH), 114.7 (C), 113.8 (CH), 95.2 (CH), 52.9 (CH2), 19.6 (CH3), 16.8 (CH2)；C26H25N2O[M]+についてのHRMS（ESI）の計算値381.1961、実測値381.1973であった。
【００９７】
暗生成物5：( 9.8％、黒色固体）1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.55 - 7.50 (m, 1H), 7.41 - 7.37 (m, 1H), 7.34 (td, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 7.22 (td, J = 7.3, 1.2 Hz, 1H), 6.33 - 6.26 (m, 4H), 3.99 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 3.92 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 2.43 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 2.38 (p, J = 7.3 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 195.8 (C), 159.5 (C), 158.2 (C), 155.3 (C), 153.9 (C), 150.4 (C), 144.2 (C), 132.9 (CH), 132.8 (C), 129.8 (CH), 128.3 (CH), 127.5 (C), 122.6 (CH), 121.1 (CH), 115.7 (C), 114.8 (C), 108.5 (CH), 107.5 (CH), 104.2 (CH), 103.6 (CH), 52.4 (CH2), 52.1 (CH2), 16.9 (CH2), 16.8 (CH2)；C27H23N2O2[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値407.1754、実測値407.1772であった。
【化２０】
2019530636.tif 000031
【００９８】
PA-JF549（メタノール）の光分解（図8）：ジアゾケトン2（75mg、173μmol）を、窒素下、石英フラスコ中のMeOH（300mL）に取り、得られた黄色溶液に窒素を30分間注入することでかき混ぜた。反応混合物を室温で8時間撹拌しながら照射した（Luzchem LZC 4V光反応器、365nmランプ）。次いでそれを濃縮乾固した。0-50％EtOAc／ヘキサン（リニアグラジエント）で先ず溶離することにより、シリカゲルクロマトグラフィーを行い、黒色固体（14mg、20％）として暗生成物5を単離した。さらに0-15％MeOH／CH2Cl2（リニアグラジエント、一定の1％v／v AcOHを含む）で溶離することにより、濃赤紫色固体（酢酸塩、56mg、65％）として蛍光生成物S14を得た。逆相HPLC（10-75％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFAを含む）によって、分光学的特性決定用にS14の分析的に純粋な試料を得た。
【００９９】
蛍光生成物S14：（65％、暗紫色固体）1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.68 - 7.52 (m, 3H), 7.29 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.63 (dd, J = 9.2, 2.1 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 7.7 Hz, 8H), 3.42 (s, 2H), 3.35 (s, 3H), 2.57 (p, J = 7.7 Hz, 4H); 13C NMR (CD3OD, 101 MHz) δ 172.5 (C), 158.9 (C), 158.2 (C), 157.9 (C), 134.3 (C), 133.8 (C), 132.7 (CH), 131.4 (CH), 130.6 (CH), 128.8 (CH), 114.9 (C), 113.7 (CH), 95.2 (CH), 52.9 (CH2), 52.4 (CH3), 39.5 (CH2), 16.8 (CH2)；C28H27N2O3[M]+についてのHRMS（ESI）の計算値 439.2016、実測値439.2017であった。
【化２１】
2019530636.tif 000032
【０１００】
JF549-フェニル酢酸（初期光分解生成物）（3）（図1A、8及び10A）：ローダミンS14（50mg、100μmol）をMeOH（5mL）に溶解し、1MのNaOH（1.00mL、1.00mmol、10当量）を添加した。反応物を室温で18時間撹拌した；次いでそれを2MのHCl（510μL）で酸性化し、逆相HPLC（10-75％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFAを含む）によって、直接精製して、濃赤色固体として3を22mg（TFA塩、41％）得た。1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.66 - 7.58 (m, 2H), 7.54 (td, J = 7.3, 1.7 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.61 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 7.7 Hz, 8H), 3.37 (s, 2H), 2.57 (p, J = 7.6 Hz, 4H); 13C NMR (CD3OD, 101 MHz) δ 173.8 (C), 159.0 (C), 158.21 (C), 158.20 (C), 134.7 (C), 133.8 (C), 132.8 (CH), 132.7 (CH), 131.3 (CH), 130.5 (CH), 128.6 (CH), 115.0 (C), 113.6 (CH), 95.2 (CH), 52.9 (CH2), 39.5 (CH2), 16.8 (CH2)；C27H25N2O3[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値425.1860、実測値425.1865であった。
【化２２】
2019530636.tif 000033
【０１０１】
PA-JF646（水性）の光分解（図4A）：ジアゾケトン12（25mg、52.5μmol）を、窒素下、石英フラスコ中のMeCN（60mL）に取った。緩衝液（10mMのHEPES pH7.3、60mL）を添加し、得られた黄色溶液に窒素を30分間注入することでかき混ぜた。反応混合物を室温で8時間撹拌しながら照射した（Luzchem LZC 4V光反応器、365nmランプ）。次いでそれを濃縮乾固し、セライトに沈着させた。0-50％EtOAc／ヘキサン（リニアグラジエント）で先ず溶離することにより、シリカゲルクロマトグラフィー（セライトによる乾燥負荷）を行い、黒色固体（9mg、24％）として暗生成物15を単離した。さらに0-15％MeOH／CH2Cl2（リニアグラジエント、一定の1％v／v AcOHを含む）で溶離することにより、濃青色の固体（酢酸塩、1.1mg、4.3％）として少量の蛍光生成物14を得た。逆相HPLC（10-75％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFAを含む）によって、分光学的特性決定用に14の分析的に純粋な試料を得た。
【０１０２】
蛍光生成物14：（4.3％、濃青色固体））1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.45 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 1H), 7.42 - 7.33 (m, 2H), 7.09 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.35 (dd, J = 9.4, 2.6 Hz, 2H), 4.37 (t, J = 7.5 Hz, 8H), 2.55 (p, J = 7.7 Hz, 4H), 2.01 (s, 3H), 0.56 (s, 3H), 0.55 (s, 3H); 13C NMR (CD3OD, 101 MHz)δ 170.3 (C), 154.6 (C), 149.0 (C), 141.9 (CH), 140.3 (C), 136.9 (C), 131.3 (CH), 130.1 (CH), 130.0 (CH), 128.4 (C), 126.8 (CH), 120.1 (CH), 113.0 (CH), 53.0 (CH2), 19.4 (CH3), 16.9 (CH2), -1.2 (CH3), -1.4 (CH3)；C28H31N2Si[M]+についてのHRMS（ESI）の計算値423.2251、実測値423.2260であった。
【０１０３】
暗生成物15：（24％、黒色固体）1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.58 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.34 (td, J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 7.27 - 7.20 (m, 2H), 6.60 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 8.4, 2.6 Hz, 1H), 6.49 (dd, J = 8.5, 2.5 Hz, 1H), 3.96 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 3.90 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.40 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 2.38 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 0.74 (s, 3H), 0.15 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 197.4 (C), 154.0 (C), 152.5 (C), 151.6 (C), 146.5 (C), 141.4 (C), 139.7 (C), 133.1 (CH), 132.4 (C), 131.4 (CH), 131.3 (C), 128.7 (CH), 128.2 (CH), 126.1 (C), 125.3 (C), 122.7 (CH), 122.0 (CH), 114.3 (CH), 114.2 (CH), 112.2 (CH), 111.2 (CH), 52.5 (CH2), 52.2 (CH2), 17.1 (CH2), 17.0 (CH2), -3.6 (CH3), -5.2 (CH3)；C29H29N2OSi[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値449.2044、実測値449.2046であった。
【化２３】
2019530636.tif 000034
【０１０４】
PA-JF646（メタノール）の光分解（図9）：ジアゾケトン12（75mg、157μmol）を窒素下、石英フラスコ中のMeOH（300mL）に取り、得られた黄色溶液に窒素を30分間注入することでかき混ぜた。反応混合物を室温で3時間撹拌しながら照射した（Luzchem LZC 4V光反応器、365nmランプ）。次いでそれを濃縮乾固した。0-50％EtOAc／ヘキサン（リニアグラジエント）で先ず溶離することにより、シリカゲルクロマトグラフィーを行い、黒色固体（16mg、23％）として暗生成物15を単離した。さらに0-15％MeOH／CH2Cl2（リニアグラジエント、一定の1％v／v AcOHを含む）で溶離することにより、濃青色の固体（酢酸塩、36mg、42％）として蛍光生成物S15を得た。逆相HPLC（10-75％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFAを含む）によって、分光学的特性決定用にS15の分析的に純粋な試料を得た。
【０１０５】
蛍光生成物S15：（42％、濃青色固体）1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.57 - 7.45 (m, 3H), 7.17 - 7.13 (m, 1H), 6.97 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 6.33 (dd, J = 9.4, 2.6 Hz, 2H), 4.37 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 3.39 (s, 2H), 3.32 (s, 3H), 2.55 (p, J = 7.7 Hz, 4H), 0.58 (s, 3H), 0.54 (s, 3H); 13C NMR (CD3OD, 101 MHz) δ 172.6 (C), 168.3 (C), 154.5 (C), 149.0 (C), 142.2 (CH), 140.6 (C), 133.9 (C), 132.5 (CH), 130.7 (CH), 130.2 (CH), 128.5 (C), 128.2 (CH), 120.2 (CH), 112.8 (CH), 53.1 (CH2), 52.3 (CH3), 39.6 (CH2), 16.8 (CH2), -0.9 (CH3), -1.9 (CH3)；C30H33N2O2Si[M]+ についてのHRMS（ESI）の計算値481.2306、実測値481.2305であった。
【化２４】
2019530636.tif 000035
【０１０６】
JF646-フェニル酢酸（初期光分解生成物）（13）（図4A、9及び10B）：ジアゾケトン12（75mg、157μmol）を、窒素下、石英フラスコ中のMeCN（294mL）に取った；2-(トリメチルシリル）エタノール（6mL）を添加し、得られた黄色溶液に窒素を30分間注入することでかき混ぜた。反応混合物を室温で4時間撹拌しながら照射した（Luzchem LZC 4V光反応器、365nmランプ）。次いでそれを濃縮乾固した。0-50％EtOAc／ヘキサン（リニアグラジエント）で先ず溶離することにより、シリカゲルクロマトグラフィーを行い、黒色固体（16mg、23％）として暗生成物15を単離した。さらに0-15％MeOH／CH2Cl2（リニアグラジエント、一定の1％v／v AcOHを含む）で溶離することにより、濃青色の固体（酢酸塩、35mg、35％）として2-(トリメチルシリル）エチルエステル蛍光光生成物16を得た。
【０１０７】
エステル光生成物S16（35mg、55.8μmol）をCH2Cl2（3mL）に溶解し、TFA（1.5mL）を添加した。反応物を室温で8時間撹拌した後、トルエン（5mL）で希釈し、濃縮乾固させた。得られた残渣を飽和NaHCO3で希釈し、15％i-PrOH／CHCl3（2×）で抽出した。合わせた有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。粗生成物を、逆相HPLC（30-70％MeCN／H2O、リニアグラジエント、一定の0.1％v／v TFAを含む）により精製した。生成物画分を合わせ、部分的に濃縮してMeCNを除去し、飽和NaHCO3で中和し、CH2Cl2（2×）で抽出した。有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて青色固体として10mg（38％）の13を得た。1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.54 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.48 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 1H), 7.34 (td, J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.06 - 7.02 (m, 1H), 6.89 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 6.31 (dd, J = 9.4, 2.5 Hz, 2H), 4.35 (t, J = 7.6 Hz, 8H), 3.23 (s, 2H), 2.54 (p, J = 7.7 Hz, 4H), 0.55 (s, 3H), 0.53 (s, 3H); 13C NMR (CD3OD, 101 MHz) δ 170.1 (C), 154.6 (C), 148.9 (C), 142.9 (CH), 140.2 (C), 137.5 (C), 132.1 (CH), 130.0 (CH), 129.7 (CH), 129.0 (C), 126.8 (CH), 119.9 (CH), 112.8 (CH), 53.0 (CH2), 43.0 (CH2), 16.9 (CH2), -1.2 (CH3), -1.3 (CH3)；C29H31N2O2Si[M+H]+についてのHRMS（ESI）の計算値467.2149、実測値467.2156であった。
【０１０８】
分光及び光化学に関する一般的な実験情報
【０１０９】
総体。分光法のための蛍光分子及び蛍光発生分子をDMSO中のストック液として調製し、DMSO濃度が1％v／vを超えないように希釈した。10mMのHEPES緩衝液、pH7.3を1Mの市販のストック（Fisher）の希釈によって調製した。ジャネリア蛍光色素549（JF549）（1）、JF549-HaloTagリガンド（6）、JF549-SNAP-tagリガンド（10）、ジャネリア蛍光色素646（JF646）（11）及びJF646-HaloTagリガンド（18）は先の作業から使用可能であた。テトラメチルローダミンHaloTagリガンド（9）はPromega製であった。
【０１１０】
UV-Vis及び蛍光分光法。分光法は、Starna Cells製の1-cmの光路長、3.5mL石英キュベット、またはHellma製の1-cmの光路長、1.0mL石英マイクロキュベットを使用して行った。全ての測定は周囲温度（22±2℃）で行った。吸収スペクトルをCary Model 100分光計（Agilent）で記録した。最大吸収波長（λmax）及び吸光係数（ε）を10mMのHEPES、pH7.3緩衝液中で測った。；報告されたεの値は平均（n = 3）である。蛍光スペクトルをCary Eclipse蛍光計（Varian）で記録した；明確にするために正規化されたスペクトルが示されている。
【０１１１】
蛍光量子収率（ΦF）の測定。報告された全ての量子収率値は、同一条件下で我々の研究室で測定された。絶対量子収率は、Quantaurus-QY分光計（モデルC11374、浜松）を用いて測定した。この装置は、積分球を使用して、試料によって吸収される光子及び放出される光子を決定する。希釈サンプル（A<0.1）を用いて測定を行い、機器ソフトウェアを用いて自己吸収補正3を行った。報告された値は平均値（n = 3）である。
【０１１２】
光化学量子収率（ΦPC）の測定。光化学は、365nm UVランプ、回転台、及びタイマーを備えたLuzchem LZC 4V光反応器中、1-cmの光路長／3.5mLの石英キュベット（Starna）で行った。強度は、シュウ酸鉄（III）カリウム光量計によって較正した4。光反応器の設定を用いて、60mMのK3Fe(C2O4)3溶液を照射し、1,10フェナントロリンとの錯滴定により放出されたFe2+を測定した。このプロセスの既知の光化学量子収率（ΦPC = 1.21）を用いて、光子束（I）= 3.88×10 -7ein／分・cm2を決定した。PA-JF549（2）のメチル-JF549（4）への変換のために、試料（10mMのHEPES pH7.3中5μM、3.0mL）を照射し、551nmにおける吸光度の増加を測定した。フェニル酢酸-JF549（3）のメチル-JF549（4）への変換のために、試料を照射し、少量のアリコート（50μL）と褐色ガラス製高回収HPLCバイアルに入れた。これらの試料を、HPLC（Agilent 1200 Analytical HPLCシステム、自動サンプラー及びダイオードアレイ検出器（λabs = 550nm）を備えたもの；Phenomenex 4.6×150mm、5μm、Kinetex C18カラム；0.1％v／v TFAを含むH2O中の10-95％勾配のMeCN）で分析した。光化学量子収率（ΦPC、mol／ein）は、吸光度の増加またはHPLCピーク積分シグナル（S）対照射時間のプロットを式2によって表される1相の関係に当てはめることによって決定した。：
【数２】
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Smax = 最大蛍光、t = 時間（分）、St = 時間tにおけるシグナル、I = 照射（ein／分・cm2）、及びσ = 常用対数吸光係数（単位cm2／mol；キュベットの形状に基づいてM-1cm-1の単位でε値より1000倍高い）である。化合物2の化合物4への変換のために、ΦPC = 2.2％であることが測定された（図11A-B）。3を光誘導脱カルボキシル化して4を生成するためにはΦPC = 15％であった（図11C〜D）。
【０１１３】
HaloTagタンパク質の存在下及び非存在下でのHaloTagリガンド6及び16の光化学。HaloTagタンパク質はAdam Berro及びEric Schreiter（Janelia Research Campus、HHMI）から厚意で寄贈されたものであり、20％v／vグリセロールを含む75mMのNaCl、50mMのトリスHCl、pH7.4（TBS-グリセロール）中100μM溶液として使用した。吸光度の測定は、1mL石英キュベットで行った。HaloTagリガンド6及び16（5μM）を0.1mg mL-1のCHAPSを含む10mMのHEPES、pH7.3に溶解した。HaloTagタンパク質のアリコート（1.5当量）または等容量のTBS-グリセロールブランクを加え、得られた混合物を遮光しながら室温で1時間インキュベートした。初期吸光度を記録し、試料を光反応器（Luzchem LZC 4V、365nmランプ）中で室温にて照射した。t = 5、10、15、20、25、30、40、50、及び60分で吸光度スキャンを行い、その後追加の照射により吸光度に追加の増加はなかった。
【０１１４】
SNAP-tagタンパク質の存在及び非存在におけるSNAP-tagリガンド7及び17の光化学。 SNAP-tagタンパク質（SNAPf-6×His）は、Eric Schreiter（Janelia Research Campus、HHMI）から厚意により寄贈されたものあり、1mMのDTTを含む1×PBS中2.8mg mL -1（142μM）溶液として用いた。吸光度の測定は、1mL石英キュベットで行った。SNAP-tagリガンド7及び17（5μM）を、0.1mg mL-1のCHAPSを含む10mMのHEPES、pH7.3に溶解した。SNAP-tagタンパク質のアリコート（1.5当量）または等容量の緩衝液を加え、得られた混合物を遮光しながら4℃で18時間インキュベートした。初期吸光度を記録し、試料を光反応器（Luzchem LZC 4V、365nmランプ）中で室温にて照射した。t = 5、10、15、20、25、30、及び60分で吸光度スキャンを行い、その後追加の照射により吸光度に追加の増加はなかった。
【０１１５】
PA-JF色素光化学の結果及び考察
【０１１６】
ジアゾケトン光解除性保護戦略と、鮮やかなアゼチジン含有ジャネリア蛍光色素との適合性を試験するために、JF549（1）1をまず塩化オキサリル、TEA、次いでTMS -ジアゾメタンで処理して、所望の光活性化可能なJF549（PA -JF549）（2）を70％収率で得た（図1A）。JF549（図1B）の強い可視吸収とは対照的に、PA-JF549は可視領域で低い吸収を示した（図10A）。次いで、この分子の光化学を水（1：1v／v MeCN：10mMのHEPES pH7.3）の存在下で調べた；これまでの実験では、メタノール中のみでこの光化学を調べた。4,5MeCN共溶媒の添加は、水中での2の高くない（modest）溶解度により、この反応を分取スケールで行うために必要であった。以前の報告に基づいて、2つの主要生成物、フェニル酢酸誘導体3とインダノン「暗生成物」5、が予想された。驚くべきことに、主要な光生成物（50％）は、予想されたフェニル酢酸誘導体3ではなく、メチル-JF549（4）（図1A）であり、これも親1と同様のスペクトル特性を示す（図1B、図10A及び表3）。この結果は、MeCN共溶媒なしの希水性サンプル（0.1％v／v DMSOを含む10mMのHEPES pH7.3）（ここではメチル-JF549（4）がまたLC−MSにより主要生成物として観察された（データ示さず））中で確認された。この化合物は、最初の光化学生成物3の光誘導脱カルボキシル反応の結果である。光化学反応の過程全体にわたって3は痕跡量しか観察されず（データ示さず）、脱カルボキシル反応が最初の光化学転位より速いことを示唆した。少量（10％）の「暗生成物」S16もまた単離され、低いが広い吸収グラフを示す（図10A）。次いで、このプロセスの光化学量子収率を決定することにより、2についての保護基の光解除（uncaging）の効率を定量化した（光化学量子収率（ΦPC）の測定参照）。2から4への変換のために、ΦPC = 2.2％であることが見出された（図11A-B）。
【表３】
2019530636.tif 000037
【０１１７】
メチル-JF549生成物4が推定上の初期光化学生成物3の光誘導脱カルボキシル反応から生じることを確認するために、我々は2から段階的に3を、独立して合成した（図8）。メタノール中での2の光分解は、予想された5,6フェニル酢酸メチルS14を生成し、次に鹸化してJF549-フェニル酢酸3を生成した。このフルオロフォアは、親JF549（図1B、表3）と同様のスペクトル特性を示す。365nmの光での3の照射により、水溶液中での2の光分解から得られた同じ生成物である4への迅速な変換を達成した（図11C-D）。重要なことに、同じ緩衝液（10mMのHEPES pH7.3）中の3の試料は、暗所で熟成した時には、測定できる4への変換を示さなかった。図11Dにおけるプロットが示すように、脱カルボキシル化の光化学量子収率はΦPC = 15％であると決定された。脱カルボキシル化の光化学量子収率は、2の初期の保護基の光解除（2.2％）に比べて約7倍高く、2の光分解中に観察された3の量が無視できる量であることと一致した。
【０１１８】
次に、同じ光解除性保護戦略を、アゼチジニルSi-ローダミンJF646（11）に適用した。以前に使用したのと同じTMS-ジアゾメタンプロトコル（図4A）により、ローダミン11を合理的な収率（37％）でジアゾケトン12（PA-JF646）に変換した。PA-JF549（2）について観察されたように、PA-JF646は、可視領域において最小の吸収を示した（図10B）。しかしながら、水溶液（1：1v／v MeCN：10mMのHEPES pH7.3）中で照射した場合、12から少量の蛍光性光生成物14（〜4％）しか得られなった。我々は、反応中のフェニル酢酸13のレベルが低く、−これは反応が完了すると大部分が消失する−最も顕著な単離生成物はインダノン15（24％）であることを観察した。MeCNが存在しない場合にも同様の結果が見られた（すなわち、LC−MSによって分析された希釈水性サンプル）。
【０１１９】
PA-JF646の光分解を介して、予想される初期光生成物13を単離し特徴付けることができなかったので、本発明者らは、3の調製と同様の経路（図9）を介してこの化合物を別々に合成しようとした。水溶液中での12の光分解とは異なり、メタノール中で同じ反応を実施して、フェニル酢酸メチル光生成物S15を中程度（42％）の収率で得た。しかし、種々の条件下（NaOH、LiOH等）でメチルエステルを加水分解する試みは成功せず、出発物質または分解物しか得られなかった。代わりに、2％v／v 2-（トリメチルシリル）エタノールを含むMeCN中で12の光分解を行い、2-（トリメチルシリル）エチルエステル光生成物S16（収率35％）を生成した。表3に示すように、PA-JF646光生成物14及びS15ならびに予想される初期光生成物13は全て、JF646と同様の優れた輝度及びスペクトルを示した（図10B）。PALMのように、より複雑なイメージング実験の、より微細な照明条件の下でどの光生成物（13または14）が優勢であるかを予測することは困難であったが、両種の比較的良好なスペクトル特性により、いずれの場合も明るいフルオロフォアが得られることが確認された。遊離のPA-IF646の光分解では、水溶液中では蛍光光生成物はほんの少量しか得られなかったが、このプローブ（例えば、HaloTag、SNAP-tag）のタンパク質結合体は光化学的挙動が改善されることが予想された（下記参照）。
【０１２０】
タンパク質との結合の保護の光解除反応への影響を調べ、細胞イメージングに対するPA-JF549及びPA-JF646の性能を評価するために、本発明者らは、これらの化合物のHaloTag（6、16）及びSNAP-tag（7、17）リガンドを合成した（図5及び図6）。アゼチジン環は、ジブロモフルオランS2またはシラフルオレセイン ジトリフレートS9のC-Nクロスカップリングによって設置された。塩化オキサリル、続いてTMS-ジアゾメタンで処理してジアゾケトンS4及びS11を得た。6位のメチルエステルの加水分解の後、HaloTag（S6）及びSNAP-tag（S7）リガンド断片へのアミドカップリングにより、4つの所望の標識、PA-JF549-HaloTagリガンド（6）、PA-JF549-SNAP-tagリガンド（7）、PA-JF646-HaloTagリガンド（16）、及びPA-JF646-SNAP-tagリガンド（17）が得られた。
【０１２１】
次いで、リガンドの光化学を同族タンパク質（HaloTagまたはSNAP-tag）の存在下または非存在下で評価して、タンパク質への結合が光化学的結果にどのように影響するかを試験した。まず、PA-JF549-HaloTagリガンド（6）を過剰のHaloTagタンパク質と共にインキュベートし（1時間）、次いで365nm光で徹底的に光分解した（図3A）。その結合体は、光分解前に低い可視吸収を示したが、365nmの光による光分解後に〜550nmでの吸収の実質的な増加を示した（吸光スペクトルは、5〜60分の照射時間から一定間隔で記録した）。6の光変換結合体（「6+HaloTag+hv」、図3C）の吸光度は、従来の光活性化能を持たないJF549-HaloTag（「8+HaloTag」、図3B及び3C）の強度と同様であった。リガンド6をHaloTagタンパク質の非存在下で光活性化すると、550nmで実質的に減少した吸収が観察された（図1C）。これらの結果を比較すると、HaloTagタンパク質への結合は550nmを吸収する生成物の量をほぼ2倍に増加させることが見出された。これは、タンパク質への結合が、光化学的効率を高め、所望の蛍光生成物に分割することができることを実証した。これは、平面状の暗生成物5に向かう経路を嫌い、その形成を妨げることがある酵素によって色素に課せられた立体配座の偏りまたは制限に起因し得る。PA-JF549-SNAP-tagリガンド（7）を用いて同じ実験を行ったところ、同様の結果が見られた（図3D及び3F）。非結合7の光活性化と比較した場合、7のSNAP-tag結合体（「7+SNAP-tag+hv」）の光分解は蛍光生成物の量を1.6倍増加させた；比較のために、標準的なJF549-SNAP-tagの吸光度スペクトル（「10+SNAP-tag」、図3E及び3F）を示す。
【０１２２】
酵素上のPA-JF549の改善された挙動は、遊離PA-JF646の劣った光化学的挙動（上記参照）にも関わらず、PA-JF646リガンドを追求するように我々を促した。PA-JF646-HaloTagリガンド（16）をHaloTag酵素と共にインキュベートし、365nmの光で光活性化した。光分解前のHaloTag結合体は低吸光度であっても、UV光照射により遠赤色（〜650nm）吸収種が実質的に増加することが観察された（図4C）。HaloTagタンパク質の存在下での16（「16+HaloTag+hv」）及び非存在下での16（「16+hv」）の光化学の比較により、タンパク質の結合は、遠赤色吸収化合物の生成を約5倍改善することが明らかになり（図4D）、このPA-JFリガンドがタンパク質と結びついた場合、所望の光化学的結果が増強されることを示唆している。PA-JF 646-SNA-タグリガンド（17）についても、効果の大きさ（2.4倍）はそれほど大きくはなかったが、タンパク質への結合時の光化学的結果の有意な改善が見られた（図4E）。光活性化結合体（「16+HaloTag+hv」及び「17+SNAP-tag +hv」）の吸光度スペクトルは、非光活性化可能なリガンド18（JF646-HalTagリガンド）（図4B及びD）及び19（JF646-SNAP-tagリガンド）（図4B及び4E）の結合体にも匹敵する。各PA-JFリガンドについて、活性化後の吸光度と対応する遊離メチル-JF光生成物（メチル-JF549 4またはメチル-JF646 14）の吸光度とを比較することにより、蛍光生成物への光変換効率も推定した（表3-4）。HaloTagリガンド6及び16の結合体については、90％（PA-JF549-HaloTag）及び76％（PA-JF646-HaloTag）の変換を推定した。7及び17のSNAP-tag結合体の効率は、45％（PA-JF549-SNAP-tag）及び39％（PA-JF646-SNAP-tag）の推定蛍光生成物収率であり、幾分低かった。それにも関わらず、これらの値は全て、遊離PA-JF549（2では50％）及びPA-JF 646（12では4％）で測定された光変換効率よりもはるかに大きい。
【表４−１】
2019530636.tif 000038
【表４−２】
2019530636.tif 000039
【０１２３】
この実施例の結果は、ジアゾケトン戦略を用いて、ジャネリア蛍光色素を光活性化可能にすることができることを実証する。PA-JF549及びPA-JF646の活性化は、親化合物の輝度を維持する予期せぬ蛍光生成物、メチル-JF549（4）及びメチル-JF646（14）を生じる。さらに重要なことに、タンパク質への結合は、好ましい蛍光形態に向かう反応の光化学的結果に影響を与え得ることが示された。同族のHaloTagタンパク質に対するPA-JF549HaloTagリガンド（6）の結合は、可視吸収生成物の収量を増加させ、その結合体は標準的なJF549-HaloTagリガンドとの結合体と同様の吸収性を有する（図3C）。同様に、PA-JF646HaloTagリガンド（16）は、HaloTagタンパク質に結合した場合、遠赤色吸収生成物において実質的に5倍の増加を示す（図4D）。この効果の一般性は、これらプローブ（7,17）のSNAP-tagリガンドでも確認され、タンパク質上で光活性化すると蛍光生成物の収率が改善されることも示されている。全体として、これらの結果は、PA-JF色素の有用性を、特にタンパク質結合体に関して実証している。
【０１２４】
個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることを具体的及び個別に示しているように、本明細書に記載されている刊行物、特許及び特許出願の全ては、 次のリストに記載されている。
参考文献
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29      Grimm, J.B., English, B.P., Chen, J. et al., Nat. Methods 12, 244-250 (2015).
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36      Los, G.V., Encell, L.P., Mcdougall, M.G. et al., ACS Chem. Biol. 3, 373-382 (2008).
36      Hatchard, C. and Parker, C., Proc. R. Soc. A 235, 518-536 (1956).
【０１２５】
本明細書に開示された主題の様々な詳細は、本明細書に開示された主題の範囲から逸脱することなく変更可能であることが理解されよう。
さらに、前述の記述は、説明のためのものであって、限定を目的とするものではない。
【図１Ａ】
2019530636.tif 000040
【図１Ｂ】
2019530636.tif 000041
【図１Ｃ】
2019530636.tif 000042
【図１Ｄ】
2019530636.tif 000043
【図１Ｅ】
2019530636.tif 000044
【図１Ｆ】
2019530636.tif 000045
【図１Ｇ】
2019530636.tif 000046
【図１Ｈ】
2019530636.tif 000047
【図１Ｉ】
2019530636.tif 000048
【図２Ａ】
2019530636.tif 000049
【図２Ｂ】
2019530636.tif 000050
【図２Ｃ】
2019530636.tif 000051
【図２Ｄ】
2019530636.tif 000052
【図２Ｅ】
2019530636.tif 000053
【図２Ｆ】
2019530636.tif 000054
【図２Ｇ】
2019530636.tif 000055
【図２Ｈ】
2019530636.tif 000056
【図３Ａ】
2019530636.tif 000057
【図３Ｂ】
2019530636.tif 000058
【図３Ｃ】
2019530636.tif 000059
【図３Ｄ】
2019530636.tif 000060
【図３Ｅ】
2019530636.tif 000061
【図３Ｆ】
2019530636.tif 000062
【図３Ｇ】
2019530636.tif 000063
【図３Ｈ】
2019530636.tif 000064
【図３Ｉ】
2019530636.tif 000065
【図３Ｊ】
2019530636.tif 000066
【図３Ｋ】
2019530636.tif 000067
【図３Ｌ】
2019530636.tif 000068
【図３Ｍ】
2019530636.tif 000069
【図３Ｎ】
2019530636.tif 000070
【図３Ｏ】
2019530636.tif 000071
【図３Ｐ】
2019530636.tif 000072
【図３Ｑ】
2019530636.tif 000073
【図３Ｒ】
2019530636.tif 000074
【図３Ｓ】
2019530636.tif 000075
【図３Ｔ】
2019530636.tif 000076
【図３Ｕ】
2019530636.tif 000077
【図３Ｖ】
2019530636.tif 000078
【図４Ａ】
2019530636.tif 000079
【図４Ｂ】
2019530636.tif 000080
【図４Ｃ】
2019530636.tif 000081
【図４Ｄ】
2019530636.tif 000082
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
2019530636.tif 000084
【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
2019530636.tif 000086
【図４Ｉ】
2019530636.tif 000087
【図４Ｊ】
2019530636.tif 000088
【図４Ｋ】
2019530636.tif 000089
【図４Ｌ】
2019530636.tif 000090
【図４Ｍ】
2019530636.tif 000091
【図４Ｎ】
2019530636.tif 000092
【図５】
2019530636.tif 000093
【図６】
2019530636.tif 000094
【図７】
2019530636.tif 000095
【図８】
2019530636.tif 000096
【図９】
2019530636.tif 000097
【図１０Ａ】
2019530636.tif 000098
【図１０Ｂ】
2019530636.tif 000099
【図１１Ａ】
2019530636.tif 000100
【図１１Ｂ】
2019530636.tif 000101
【図１１Ｃ】
2019530636.tif 000102
【図１１Ｄ】
2019530636.tif 000103
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月4日(2019.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゼチジン含有ジャネリア蛍光色素の光活性化可能な誘導体を含む光活性フルオロフォア。
【請求項２】
光が照射されると脱カルボキシル化される、請求項1に記載の光活性フルオロフォア。
【請求項３】
前記光活性化可能な誘導体が、光活性化可能なジャネリア蛍光色素549、または光活性化可能なジャネリア蛍光色素646である、請求項1又は2に記載の光活性フルオロフォア。
【請求項４】
ジャネリア蛍光色素に光解除性保護基を付与することを含む、光活性フルオロフォアを形成する方法。
【請求項５】
前記光解除性保護基を付与することが、
ジャネリア蛍光色素の溶液に塩化オキサリルを添加して、第1の混合物を形成し；
第1の混合物にトリエチルアミン及び（トリメチルシリル）ジアゾメタンを続けて添加して、第2の混合物を形成し；
第2の混合物を濃縮して、濃縮物を形成し；そして
その濃縮物を精製し、光活性フルオロフォアを提供する工程を含む請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記ジャネリア蛍光色素がSi‐ローダミンを含む、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項７】
アゼチジン含有ジャネリア蛍光色素の光活性化可能な誘導体を含む光活性フルオロフォアと、タンパク質タグとを含む光活性リガンド。
【請求項８】
前記タンパク質タグがHaloTagリガンドまたはSNAP‐tagリガンドである、請求項7に記載の光活性リガンド。
【請求項９】
光活性リガンドが同族タンパク質と結合すると、光分解後に光活性リガンドの光吸収が増加する、請求項7又は8に記載の光活性リガンド。
【請求項１０】
前記光活性フルオロフォアの輝度が、前記光活性フルオロフォアが由来する親フルオロフォアの輝度と実質的に類似する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の光活性リガンド。
【請求項１１】
タンパク質と結合した光活性リガンドを含み、該光活性リガンドがインビボでタンパク質と結合している光活性複合体。
【請求項１２】
前記光活性リガンドが、光活性フルオロフォア及びタンパク質タグを含む、請求項11に記載の光活性複合体。
【請求項１３】
前記光活性フルオロフォアが、光誘導の際に脱カルボキシル化するように配置されている、請求項12に記載の光活性複合体。
【請求項１４】
前記光活性フルオロフォアが、脱カルボキシル化の際にメチル‐ジャネリア蛍光化合物を形成するように配置されている、請求項13に記載の光活性複合体。
【請求項１５】
前記光活性フルオロフォアが、脱カルボキシル化の際に蛍光増大をもたらすように配置されている、請求項13又は14に記載の光活性複合体。
【国際調査報告】
2019530636.tif 000104