(57)【要約】【課題】観察範囲の設定を容易にする、レーザ走査型顕微鏡装置、その制御方法、及びその制御プログラムを提供する。【解決手段】電動ステージ１５を、対物レンズ１３から離れた退避位置或いはその退避位置から復帰位置へ移動するコントロールユニット１４と、スライドガラスとカバーガラスとで封入された標本１４が載置された電動ステージ１５の、退避位置から復帰位置への移動中に、カバーガラス及びスライドガラスからの反射光の輝度情報を光検出器２１又は２２を介して取得し、その取得した輝度情報を基にＺ方向の観察範囲を決定するＣＰＵ２４と、を有するようにレーザ走査型顕微鏡装置を構成する。【選択図】図１
2006010770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステージ又は及び対物レンズを退避位置へ移動する退避手段と、
第１の部材、標本、及び第２の部材が前記第１の部材、前記標本、前記第２の部材の順に重ねて載置された前記ステージ又は及び前記対物レンズを復帰位置へ移動する復帰手段と、
前記復帰位置への移動中に、前記第１の部材及び前記第２の部材からの反射光の輝度情報を取得する輝度情報取得手段と、
該輝度情報取得手段により取得された輝度情報を基にＺ方向の観察範囲を決定する観察範囲決定手段と、
を有することを特徴とするレーザ走査型顕微鏡装置。
【請求項２】
前記観察範囲決定手段により決定されたＺ方向の観察範囲に従って、前記ステージ又は及び前記対物レンズの可動範囲を制限する、
ことを特徴とする請求項１記載のレーザ走査型顕微鏡装置。
【請求項３】
ステージ又は及び対物レンズを退避位置へ移動し、
第１の部材、標本、及び第２の部材が前記第１の部材、前記標本、前記第２の部材の順に重ねて載置された前記ステージ又は及び前記対物レンズを復帰位置へ移動し、
該復帰位置への移動中に、前記第１の部材及び前記第２の部材からの反射光の輝度情報を取得し、
該取得した輝度情報を基にＺ方向の観察範囲を決定する、
ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡装置の制御方法。
【請求項４】
コンピュータに、
ステージ又は及び対物レンズを退避位置へ移動する機能と、
第１の部材、標本、及び第２の部材が前記第１の部材、前記標本、前記第２の部材の順に重ねて載置された前記ステージ又は及び前記対物レンズを復帰位置へ移動する復帰機能と、
該復帰位置への移動中に、前記第１の部材及び前記第２の部材からの反射光の輝度情報を取得する輝度情報取得機能と、
該取得した輝度情報を基にＺ方向の観察範囲を決定する観察範囲決定機能と、
を実現させるためのレーザ走査型顕微鏡装置の制御プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡装置に関し、更に詳しくは、観察対象である標本の画像を取得するレーザ走査型顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザ走査型顕微鏡装置は、レーザ光源からの光を対物レンズで微小なスポットに絞り、このスポットで標本上を走査し、標本からの蛍光や反射光を光検出器で捕らえて電気信号に変換し、画像モニタ上に標本像を表示するものである。この装置を用いることにより、この装置の持つ共焦点検出法によって、所定の厚さを持つ標本の断層面の断層像を容易に得ることができる。
【０００３】
このレーザ走査型顕微鏡装置に関し、例えば、特許文献１には、標本に対する３次元的な形態を観察するための方法及び装置が提案されている。また、特許文献２には、マイクロプレートウェルの目標層に光学的に焦点合わせをするための方法及び装置が提案されている。
【特許文献１】特開平５−１６４９６９号公報
【特許文献２】特表２００２−５４１４３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、レーザ走査型顕微鏡装置を用いて、標本に対する３次元的な形態を観察しようとする場合、観察者は、まず、あるＺ位置において画像を取得し、その画像を基に、Ｚ方向に対してどこからどこまでの範囲で観察するかを細かく指定しなければならない。従って、複数のポイントにて観察しようとする場合には、各ポイントに対して上記操作が要求されることとなり、設定が非常に煩雑となり、観察者の負担が大きくなる。
【０００５】
一方、特許文献２には、マイクロプレートウェルの目標層に光学的に焦点合わせをするための手法について述べられているものの、これは、観察対象にオートフォーカスすることを目的とするものであり、また、マイクロプレートウェルに限定されたものであるので、前述の問題点を解決し得るものではない。
【０００６】
本発明は、上記実情に鑑み、観察範囲の設定を容易にする、レーザ走査型顕微鏡装置、その制御方法、及びその制御プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の第１の態様に係るレーザ走査型顕微鏡装置は、ステージ又は及び対物レンズを退避位置へ移動する退避手段と、第１の部材、標本、及び第２の部材が前記第１の部材、前記標本、前記第２の部材の順に重ねて載置された前記ステージ又は及び前記対物レンズを復帰位置へ移動する復帰手段と、前記復帰位置への移動中に、前記第１の部材及び前記第２の部材からの反射光の輝度情報を取得する輝度情報取得手段と、該輝度情報取得手段により取得された輝度情報を基にＺ方向の観察範囲を決定する観察範囲決定手段と、を有する構成である。
【０００８】
本構成によれば、退避手段により、ステージ又は及び対物レンズが退避位置へ移動され、復帰手段により、第１の部材、標本、及び第２の部材が第１の部材、標本、第２の部材の順に重ねて載置されたステージ又は及び対物レンズが復帰位置へ移動され、輝度情報取得手段により、復帰位置への移動中に、第１の部材及び第２の部材からの反射光の輝度情報が取得され、観察範囲決定手段により、輝度情報取得手段により取得された輝度情報を基にＺ方向の観察範囲が決定される。
【０００９】
本発明の第２の態様に係るレーザ走査型顕微鏡装置は、前述の第１の態様において、前記観察範囲決定手段により決定されたＺ方向の観察範囲に従って、前記ステージ又は及び前記対物レンズの可動範囲を制限する、構成である。
【００１０】
また、本発明は、これらのレーザ走査型顕微鏡装置に限らず、その制御方法、及びその制御プログラムとして構成することも可能である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、自動的にＺ方向の観察範囲が設定されるようになるので、観察者がその都度Ｚ方向の観察範囲を設定しなくても、３次元観察を容易かつ着実に実行することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施例を図面を参照しながら説明する。
【実施例１】
【００１３】
図１は、本発明の実施例１に係るレーザ走査型顕微鏡装置の構成を示す図である。
同図に示したように、本実施例に係る装置は、レーザ走査型顕微鏡１とコンピュータシステム２とを有し、両者が接続インターフェース３を介して接続されている。
【００１４】
レーザ走査型顕微鏡１は、コンピュータシステム２の制御の基にレーザ走査型顕微鏡１全体の動作を制御するコントローラユニット４と、Ａｒレーザを発するレーザ光源５と、ＨｅＮｅ−Ｇレーザを発するレーザ光源６と、ＨｅＮｅ−Ｒレーザを発するレーザ光源７と、ミラー８，１１，１８と、合成用ダイクロイックミラー９，１０と、レーザを二次元走査する走査ユニット１２と、対物レンズ１３と、標本１４が載置される電動ステージ１５と、分光フィルタ１６，１７と、ピンホール１９，２０と、光検出器２１，２２と、を有する。
【００１５】
一方、コンピュータシステム２は、レーザ走査型顕微鏡１の制御に必要な情報や、レーザ走査型顕微鏡１から得られた画像情報や、制御プログラム等が記憶される記憶媒体２３と、その制御プログラムを読み出し実行することによりこのレーザ走査型顕微鏡装置全体の動作を制御するＣＰＵ２４と、ユーザからの各種入力や指示を受け付けるキーボード２５及びマウス２６と、画像等を表示するモニタ２７と、を有する。
【００１６】
尚、コンピュータシステム２の記憶媒体２３において、不図示ではあるが、走査に必要な条件等のレーザ走査型顕微鏡１の制御に必要な情報は、当該記憶媒体２３の第１のメモリ部に記憶され、レーザ走査型顕微鏡１から得られた画像情報は、当該記憶媒体２３の第２のメモリ部に記憶され、制御プログラムは、当該記憶媒体２３の第３のメモリ部に記憶される。
【００１７】
このような構成のレーザ走査型顕微鏡装置において、レーザ走査型顕微鏡１のコントロールユニット４は、コンピュータシステム２からの走査指示司令が入力されると、走査制御信号を走査ユニット１２に出力する。また、コントロールユニット４は、レーザ光源５，６，７に接続されており、走査に使用するレーザを選択する。
【００１８】
走査ユニット１２は、コントロールユニット４によって選択されたレーザ光源５，６，又は７から出射し、ミラー８，合成用ダイクロイックミラー９，１０によって集光され、ミラー１１を介して入力された光を、コントロールユニット４からの走査制御信号に基づいて、走査ユニット１２内のＸ走査ガルバノミラーとＹ走査ガルバノミラーを駆動して、対物レンズ１３を通して電動ステージ１５上に載置された標本１４上に、スポット光としてＸＹ走査する。
【００１９】
尚、ここで、電動ステージ１５は、コントロールユニット４によってＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動制御され、コンピュータシステム２の制御により、標本１４上の任意の位置にフォーカスを合わせることができるようになっている。
【００２０】
このようにして、標本１４上を走査するスポット光によって標本１４から発生した蛍光もしく反射光は、入射した光路を逆に戻り、その蛍光成分は、分光フィルタ１６により検出光路へ反射され、さらに分光フィルタ１７によって長波長と短波長とに波長選択され、一方はピンホール１９を通り、他方はミラー１８により反射された後ピンホール２０を通り、２つの光検出器２１，２２により電気信号に変換されてコントロールユニット４に入力される。
【００２１】
そして、コントロールユニット４は、上記で得られた光検出器２１，２２からの観察標本１４の画像情報（画像データ）をコンピュータシステム２に転送し、コンピュータシステム２は、それらを記憶媒体２３に転送するとともに、モニタ２７に画像表示する。
【００２２】
次に、上述の如く構成されたレーザ走査型顕微鏡装置の一動作として、観察前に行われる、Ｚ方向の観察範囲を取得する動作について説明する。
一般に、観察を始めるにあたり、標本を顕微鏡にセットする場合には、まず、ステージを対物レンズから離れた位置へ退避させた状態にして標本を置き、その後、元のステージの位置に復帰させることが行われる。
【００２３】
そこで、このステージの退避から復帰動作を行う際に、レーザを標本に照射して、そのときの画像情報を取得するようにすれば、ステージの移動に伴う輝度の変化を示すグラフ（以下「Ｉ−Ｚカーブ」という）を得ることができる。
【００２４】
ここで、観察の対象物である標本は、通常、スライドガラスとカバーガラスとの間に封入されているため、得られたＩ−Ｚカーブは、まず、カバーガラス面にて、その反射光に
より大きな輝度値を示し、続いて、スライドガラス面にて、その反射光により大きな輝度値を示す。
【００２５】
従って、得られたＩ−Ｚカーブから、輝度変化のあった２つのＺ位置を求め、それらを基に、Ｚ方向の観察範囲を自動的に設定してやれば、Ｚ方向の観察すべき範囲を漏れなく指定することが可能となる。
【００２６】
そこで、本装置に係る、Ｚ方向の観察範囲を取得する動作では、上記のようにしてＺ方向の観察範囲を取得するものである。
より詳しくは、まず、観察者（ユーザ）は、標本１４をレーザ走査型顕微鏡１にセットするため、キーボード２５或いはマウス２６を介してコンピュータシステム２に電動ステージ１５の退避要求を行うと、コンピュータシステム２の制御の基、コントロールユニット４により、電動ステージ１５が対物レンズ１３から離れる方向の退避位置へ移動される。そして、電動ステージ１５が停止した後、観察者は、標本１４を電動ステージ１５上にセットする。尚、このとき、標本１４は、スライドガラス（第１の部材の一例）とカバーガラス（第２の部材の一例）との間に挟まれて載置されるものであり、電動ステージ１５上に、スライドガラス，標本１４，カバーガラスの順に重ねて載置される。
【００２７】
続いて、観察者は、キーボード２５或いはマウス２６を介してコンピュータシステム２に電動ステージ１５の復帰要求を行うと、コンピュータシステム２の制御の基、コントロールユニット４により、電動ステージ１５が対物レンズ１３に近づく方向の復帰位置への移動が開始され、また同時に、走査ユニット１２に走査指令が出され、画像情報の取得が行われる。
【００２８】
このようにして、退避位置から復帰位置への移動中に、電動ステージ１５の位置を変えながら画像情報を取得することにより、各Ｚ位置の輝度情報を得ることができる。
図２は、その各Ｚ位置の輝度情報に基づいて得られたＩ−Ｚカーブの一例を示す図である。
【００２９】
同図に示したように、Ｉ−Ｚカーブは、２つのピーク３１ａ，３１ｂを有することとなる。すなわち、最初のピーク３１ａは、カバーガラスでの反射光によるもので、もう一方のピーク３１ｂは、スライドガラスでの反射光によるものである。
【００３０】
ここで、観察対象である標本１４はスライドガラスとカバーガラスとの間にあることから、これらのピークによって求まる２つのＺ位置の間を、３次元観察の際のＺ範囲として設定することができる。
【００３１】
本実施例では、その一例として、最初のピーク３１ａの終わり側のエッジ部のＺ位置となるＺ２と、もう一方のピーク３１ｂの始まり側のエッジ部のＺ位置となるＺ３との間Ｚｒを、３次元観察する際のＺ範囲として設定する。
【００３２】
図３は、上記一連の動作を処理フローとして示したものである。
同図に示したように、この処理フローでは、まず、現在の電動ステージ１５のＺ位置を復帰位置として記憶し（Ｓ１）、電動ステージ１５を退避位置まで下げる（Ｓ２）。
【００３３】
電動ステージ１５が退避位置まで下げられると、電動ステージ１５上にスライドガラス，標本１４，カバーガラスが、その順に重ねて載置される（Ｓ３）。
電動ステージ１５上に標本１４等が載置されると、復帰位置（Ｓ１で記憶した位置）への電動ステージ１５の移動を開始する（Ｓ４）。
【００３４】
続いて、現在の電動ステージ１５の位置にて画像情報を取得し（Ｓ５）、電動ステージ１５を１ステップ分上げる（Ｓ６）。
続いて、現在の電動ステージ１５の位置が復帰位置であるか否かを判定し（Ｓ７）、その判定結果がＹｅｓの場合にはＳ８へ進み、Ｎｏの場合にはＳ５へ戻る。これにより、電動ステージ１５の位置が、復帰位置になるまで、Ｓ５乃至６の処理が繰り返され、退避位置から復帰位置までの各Ｚ位置における画像情報が取得される。尚、本実施例では、退避位置から復帰位置への移動中に、ＸＹ方向への走査は行われず、一定のポイント（ＸＹ位置）でのみ走査が行われるものとする。
【００３５】
そして、電動ステージ１５の位置が復帰位置となると、続いて、Ｓ５で取得された各Ｚ位置の画像情報からＩ−Ｚカーブを求め、Ｚ２，Ｚ３（図２参照）を決定し（Ｓ８）、このＺ２とＺ３の間をＺ方向の観察範囲として設定して（Ｓ９）、本フローが終了する。
【００３６】
以上、本実施例によれば、観察者がＺ方向の観察範囲を設定しなくとも良くなり、かつ、それはスライドガラスとカバーガラスとの位置を考慮したものであるので、データ漏れの無い着実な設定を行うことができると共に、無駄な観察をしなくても済む。
【００３７】
また、さらに、得られたＩ−Ｚカーブから、２つのピークの間において輝度値が最大となるところを求め、その位置へ電動ステージ１５を移動させて、電動ステージ１５の復帰動作を完了させることとすることにより、観察対象である標本１４のフォーカス位置に、電動ステージ１５の位置が設定されるようになるので、その後、その位置にて走査したときの像探しや、光検出器２１，２２の感度調整を、容易に行うことができる。
【００３８】
さらには、上記で決定した２つのＺ位置（Ｚ２，Ｚ３）を、電動ステージ１５の可動限界としてプログラム上で制限をかけるようにすれば、観察者が不用意に電動ステージ１５の位置を大きく変更しようとした場合においても、標本１４に対物レンズ１３が衝突することを避けることができる。
【００３９】
尚、本実施例では、図２に示したように、最初のピーク３１ａの終わり側のエッジ部のＺ位置となるＺ２と、もう一方のピーク３１ｂの始まり側のエッジ部のＺ位置となるＺ３との間Ｚｒを、３次元観察する際のＺ範囲として設定するようにしたが、基本的には、最初のピーク３１ａともう一方のピーク３１ｂとの間を、３次元観察する際のＺ範囲として設定すれば良く、例えば、最初のピーク３１ａの終わり側のエッジ部のＺ位置であるＺ２に対して適当にオフセットしたＺ位置をＺ５として、Ｚ５とＺ３との間を、３次元観察の際のＺ範囲として設定するようにすることも可能である。
【実施例２】
【００４０】
次に、本発明の実施例２に係るレーザ走査型顕微鏡装置ついて説明する。
本実施例に係る装置の構成は、実施例１に係る装置のものと同じであるので、ここでは、その説明を省略する。
【００４１】
一方、本実施例に係る装置の一動作である、Ｚ方向の観察範囲を取得する動作は、実施例１に係る装置のものとほぼ同じになるが、次の点で異なる。実施例１では、電動ステージ１５が退避位置から復帰位置への移動中に、ＸＹ方向の走査は行わず、一定のポイント（ＸＹ位置）にて得られた画像情報からＩ−Ｚカーブを求めたが、本実施例では、その移動中に、各Ｚ位置において、Ｘ方向若しくはＹ方向、又はＸＹ両方向に走査しながら画像情報を取得し、そのようにして得られた画像情報から、各Ｘライン上若しくは各Ｙライン上、又はＸＹの矩形上における輝度情報から平均値を求め、その平均値からＩ−Ｚカーブを求めるようにしたものである。
【００４２】
以上、本実施例によれば、Ｚ位置（Ｚ２，Ｚ３）を決定する上で、ノイズ分による影響を減少させることができる。
【実施例３】
【００４３】
次に、本発明の実施例３に係るレーザ走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施例に係る装置の構成は、実施例１に係る装置のものと同じであるので、ここでは、その説明を省略する。
【００４４】
一方、本実施例に係る装置の一動作である、Ｚ方向の観察範囲を取得する動作は、実施例１に係る装置のものとほぼ同じになるが、次の点で異なる。実施例１では、電動ステージ１５が退避位置から復帰位置への移動中に、一定のポイント（ＸＹ位置）の走査により得られた画像情報からＩ−Ｚカーブを求めたが、本実施例では、その移動中に、各Ｚ位置において、標本１４上の２つの対角線上にライン走査しながら画像情報を取得し、そのようにして得られた画像情報から、ＸＹ位置の異なる複数の位置のＩ−Ｚカーブを得るようにしたものである。そして、このＸＹ位置の異なる複数の位置のＩ−Ｚカーブから、各位置のＺ方向の観察範囲を求め、それらの差から電動ステージ１５の傾き分を求め、ＸＹ方向の各観察位置に対して、この求めた傾き分を考慮したＺ方向の観察範囲を設定するようにしたものである。
【００４５】
以上、本実施例によれば、標本１４上の任意の観察位置に対する、電動ステージ１５の傾きによるＺ方向の観察範囲のズレを補正することが可能になる。
尚、本実施例において、２つの対角線の画像情報と共に、その２つの対角線の近傍における画像情報をも取得し、それらの画像情報から、その２つの対角線の輝度情報を、実施例２と同様に平均により求め、その平均により求めた２つの対角線の輝度情報からＩ−Ｚカーブを求めるようにすれば、更に、ノイズ分の影響を減少させることもできる。
【実施例４】
【００４６】
次に、本発明の実施例４に係るレーザ走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施例に係る装置の構成は、実施例１に係る装置のものと同じであるので、ここでは、その説明を省略する。
【００４７】
一方、本実施例に係る装置の一動作である、Ｚ方向の観察範囲を取得する動作は、実施例１に係る装置のものとほぼ同じになるが、退避位置から復帰位置への移動中に使用するレーザ光源を、実際の観察に使用するものとレーザ波長が異なるものを使用するようにした点が異なるものである。
【００４８】
例えば、実際の観察に使用するレーザ光源としてＡｒレーザを発するレーザ光源５を使用する場合には、復帰位置への移動中に使用するレーザ光源としてＨｅＮｅ−Ｒレーザを発するレーザ光源７を使用して画像情報を取得し、その画像情報からＩ−Ｚカーブを求めるようにする。
【００４９】
以上、本実施例によれば、復帰位置への電動ステージ１５の移動中に、レーザ照射による標本１４への余計な褪色の発生を避けることができる。
尚、上述した実施例１乃至４では、退避位置及び復帰位置への移動を、電動ステージ４の移動により行うようにしたが、これを、対物レンズ１３の移動により、或いは電動ステージ４及び対物レンズ１３の移動により行うようにすることも可能である。
【００５０】
以上、本発明について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良及び変更を行っても良いのはもちろんである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１に係るレーザ走査型顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図２】各Ｚ位置の輝度情報に基づいて得られたＩ−Ｚカーブの一例を示す図である。
【図３】実施例１に係る、Ｚ方向の観察範囲を取得する動作の処理フローを示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
１      レーザ走査型顕微鏡
２      コンピュータシステム
３      接続インターフェース
４      コントロールユニット
５      Ａｒレーザ
６      ＨｅＮｅ−Ｇレーザ
７      ＨｅＮｅ−Ｒレーザ
８      ミラー
９，１０  合成用ダイクロイックミラー
１１    ミラー
１２    走査ユニット
１３    対物レンズ
１４    標本
１５    電動ステージ
１６，１７  分光フィルタ
１８    ミラー
１９，２０  ピンホール
２１，２２  光検出器
２３    記憶媒体
２４    ＣＰＵ
２５    キーボード
２６    マウス
２７    モニタ
【図１】
2006010770.tif 000003
【図２】
2006010770.tif 000004
【図３】
2006010770.tif 000005