【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年6月4日(2007.6.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  モノホスホリルリピドＡの水性免疫学的アジュバント組成物
【特許請求の範囲】
【請求項１】  弱毒化リピドＡ誘導体、１つ以上の非免疫刺激界面活性剤、およびグリセロールを含む、水性免疫刺激アジュバント組成物であって、該誘導体は、モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡである、組成物。
【請求項２】  弱毒化リピドＡ誘導体、１つ以上の非免疫刺激界面活性剤、およびグリセロールを含む凍結乾燥されたアジュバント組成物であって、該誘導体が、モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡである、組成物。
【請求項３】  前記弱毒化リピドＡ誘導体がモノホスホリルリピドＡである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】  前記弱毒化リピドＡ誘導体が３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】  前記非免疫刺激界面活性剤が、グリコデオキシコレート、デオキシコレート、スフィンゴミエリン、スフィンゴシン、ホスファチジルコリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン、および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、またはこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】  前記非免疫刺激界面活性剤が１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】  前記弱毒化リピドＡ誘導体と非免疫刺激界面活性剤とのモル比が、約１０：１〜約１０：５である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】  前記弱毒化リピドＡ誘導体と非免疫刺激界面活性剤とのモル比が４：１である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】  請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物であって、ここで、グリセロールが、該組成物の２％容量比〜４０％容量比である、組成物。
【請求項１０】  請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物であって、ここで、グリセロールが、該組成物の２％容量比〜約１０％容量比である、組成物。
【請求項１１】  抗原をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】  水性免疫刺激アジュバント組成物を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）溶媒中に１以上の非免疫刺激界面活性剤を溶解する工程；
ｂ）該溶解した界面活性剤を弱毒化リピドＡ誘導体と混合して、該弱毒化リピドＡ誘導体と該界面活性剤との混合物を得る工程であって、ここで該誘導体は、モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡである、工程；
ｃ）該界面活性剤とリピドＡ誘導体との混合物から該溶媒をエバポレートする工程；
ｄ）該エバポレートした混合物に水を添加し、懸濁液を得る工程；
ｅ）清澄化するまで工程ｄの該懸濁液を加熱しそしてソニケーションする工程；
ｆ）２％〜４０％容量比のグリセロールを添加する工程；および
ｇ）該組成物を凍結乾燥する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】  請求項１２に記載の方法であって、工程（ｆ）において、２〜１０％容量比のグリセロールが添加される、方法。
【請求項１４】  前記溶媒が、クロロホルム、アルコール、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミドまたはこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】  前記溶媒がエタノールである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】  前記懸濁液が６０℃〜８０℃に加熱される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】  前記懸濁液が６０℃に加熱される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】  前記懸濁液が約５〜６０分間ソニケーションされる、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】  医薬品として使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】  免疫応答を刺激するための医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】  前記組成物は、鼻腔内投与のために処方されている、請求項１９に記載の組成物または請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
化合物モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）および３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）は、細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）のリピドＡ成分の弱毒化誘導体である。ＬＰＳおよびリピドＡは、強力な免疫刺激誘導剤であり、体液性抗体応答および細胞媒介性免疫応答を、その化合物が投与された患者において誘発する。しかし、リピドＡおよびＬＰＳはまた、発熱性および局所的シュワルツマン反応のような毒性の副作用を提示し得る。ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡは、リピドＡ様の分子であり、ＬＰＳの毒性を弱毒化するように改変されている。
【０００２】
リピドＡのように、ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡ分子は、糖骨格を有し、この糖骨格には、長鎖の脂肪酸が付着する。この骨格は、グリコシド結合にある２つの６炭素糖環からなる。ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡは、４位でリン酸化されている。５〜８の長鎖脂肪酸（１２〜１４炭素）がこの糖骨格に付着して、ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡが非常に疎水性な分子となり、これは、容易に水溶性ではなくなる。
【０００３】
弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡは、感染性疾患のための予防的ワクチンならびに癌性腫瘍および慢性感染の処置のための治療的ワクチンにおける免疫学的アジュバントとして使用される。ほとんどのワクチンにおいて含まれる抗原調製物は、しばしば、水溶性タンパク質の複雑な混合物であり、水性ワクチンにおいて水不溶性アジュバントと処方することが困難である。従って、ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡは、まず、溶媒と混合されねばらず、その後、このＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡをその抗原調製物に添加する。しかし、溶媒の存在はさらに、そのワクチンの処方を複雑なものとし得、そしていくつかの場合において、その成分の効力を減弱し得る。さらに、溶媒は、粘膜表面を刺激し得、そして注射の部位で炎症を発生し得る。干渉する共溶媒を含まないＭＬＡまたは３Ｄ−ＭＬＡの単純な処方物は、ワクチン組成物において、アジュバントおよび抗原の両方に由来する利益を最大限にする。本発明はこの要求を満たす。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）および界面活性剤の水性処方物、ならびにその調製および保存のための方法を包含する。本発明に従う弱毒化リピドＡ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）および３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）が挙げられる。ＭＬＡ（ＭＬＡ／ＡＦ）または３Ｄ−ＭＬＡ（３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦ）の水性処方物は、ワクチン調製物のための所望されない溶媒または共溶媒についての必要性を除去する。本発明は、ＡＬＤおよび界面活性剤の安定な水性組成物を提供する。これは、マウスに抗原とともに投与されたとき、その抗原に対するその動物の細胞性および体液性の免疫応答を増強する。驚くべきことに、本発明の水性処方物は、鼻内投与されたとき、免疫された動物において高レベルの血清および粘膜分泌ＩｇＡを誘導する。請求される水性組成物の１つの実施形態は、ＭＬＡまたは３Ｄ−ＭＬＡ対界面活性剤モル比が約４：１を含み、そして約５０〜７０ｎｍの粒子サイズを有する。１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）が好ましい界面活性剤である。予期せぬことに、凍結乾燥前にグリセロールがこの水性処方物に添加されるとき、その組成物は、さらなる超音波処理なしに再構成の際に回復する。凍結乾燥状態のこの組成物の首尾よい保存により、その水性処方物またはその処方物を含むワクチン組成物の簡便な保存および輸送を可能にする。
【０００５】
この水性組成物を調製する方法が開示される。１つの実施形態において、ＡＬＤおよびその界面活性剤は、エタノールに溶解しそして均一に混合する。ついで、このエタノールをエバポレートするとフィルムが残る。水をこのフィルムに添加する。ＡＬＤおよび界面活性剤を、超音波処理によりその水中に懸濁させる。この懸濁物を明澄になるまで超音波処理する。その抗原とともに請求される組成物を投与される動物は、その抗原に対する体液性および細胞性の免疫応答の増強を示す。その組成物を用いて、これらの応答を増強するための方法もまた開示され、そして請求される。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、弱毒化したリピドＡ誘導体（ＡＬＤ）の水性アジュバント処方物を包含する。ＡＬＤおよび界面活性剤を、約４：１のモル比で水中に懸濁し、そして超音波処理して約５０−７０ｎｍの粒子サイズを有する懸濁物を得る。
【０００７】
本発明に従って、弱毒化したリピドＡ誘導体を水性組成物中に処方して強力なアジュバントを提供し得る。弱毒化したリピドＡ誘導体は、リピドＡ様の化合物であり、リピドＡの有利な免疫賦活特性を示すが、その化合物よりも少ない有害副作用を示すものをいう。例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）および３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）は、強力な免疫賦活剤であるが、リピドＡより驚くほど毒性の少ないＡＬＤである。ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡはともに、本発明の組成物において使用され得、そして公知であり、そして本明細書において詳細に記載する必要はない。例えば、米国特許第４，４３６，７２７号（１９８４年３月１３日）（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．に譲渡された）（これは、モノホスホリルリピドＡおよびその製造を開示する）。米国特許第４，９１２，０９４号および再審査証明Ｂ１  ４，９１２，０９４（Ｍｙｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．）（これもまた、Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．に譲渡された）は、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびその製造の方法を具体化する。これらの特許の各々の開示は、ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡに関して、参考として本明細書において援用される。
【０００８】
参考の特許により援用される先行技術の詳細には立ち入らないが、本明細書において使用されるモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）は、リピドＡに由来する。リピドＡは、腸内菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の成分であり、強力であるが高度に毒性である免疫系のモデュレーターである。Ｅｄｇａｒ  Ｒｉｂｉおよび彼の協力者は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）（もとは、精製された脱毒性化エンドトキシンと呼ばれた）の生産を達成した。ＭＬＡは、約３０分間の期間にわたり、中程度の強度の無機酸溶液（例えば、０．１Ｎ  ＨＣｌ）中のグラム陰性細菌の、ヘプトースなしの変異体から得られるエンドトキシン抽出物（ＬＰＳまたはリピドＡ）を還流することによって生産される。この処理により、還元末端グルコサミンの１位でリン酸部分が欠如する。
【０００９】
偶然にも、中心の糖は、この処理により非還元グルコサミンの６位から取り出される。得られる産物（ＭＬＡ）は、発熱性、局所シュワルツマン反応および毒性（トリ胚５０％致死用量アッセイ（ＣＥＬＤ50）で評価される）のようなエンドトキシン出発物質に通常伴うエンドトキシン活性レベルの顕著な減弱を示す。しかし、これは、予想外に、免疫モデュレーターとしてのリピドＡおよびＬＰＳの機能を保持する。
【００１０】
本発明の実施において利用され得る別の弱毒化リピドＡ誘導体は、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）と呼ばれる。３Ｄ−ＭＬＡは、米国特許第４，９１２，０９４号（再審査証明Ｂ１  第４，９１２，０９４号）（’０９４特許）において示されるように公知であり、そしてＭＬＡ分子から、他の基に有害な影響を与えない条件下で、３位の還元末端グルコサミンに連結しているエステルであるβヒドロキシミリスチルアシル残基が選択的に取り除かれる点において、ＭＬＡとは異なる。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡは、Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ  ５９８４０から入手可能である。
【００１１】
ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡの分子は、多様な脂肪酸鎖長を有する多数の脂肪酸置換パターン（すなわち、ヘプタアシル、ヘキサアシル、ペンタアシルなど）の複合物または混合物である。従って、これらの種々の形態のＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡが本発明に包含される。さらに、合成手段または半合成手段によって生産される化合物の形態の混合物および個々の化合物は、本発明により包含される。−０９４特許において例示されるリピドＡ骨格は、Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒ５９５からのヘプタアシルリピドＡの３-脱アシル化によって得られる産物に対応する。他の脂肪酸置換パターンが本開示に包含される。この本質的な特徴は、その物質が３−Ｏ−脱アシル化されていることである。
【００１２】
本発明において利用される改変された３Ｄ−ＭＬＡは、ＭＬＡをリピドＡ骨格の３位から単一の脂肪酸以外の欠失を生じる条件下でアルカリ加水分解に供することによって調製される。３位のβヒドロキシミリスチン脂肪酸は、アルカリ媒体において異常に不安定である。これは、リピドＡを完全に３−脱アシル化する非常に緩和なアルカリ処理のみを要求する。リピドＡにおける他のエステル結合は、加水分解が起きる前の条件ではいくらかより強く、その結果、その分子の残りに有意な影響を与えることなく３位でこれらの物質を選択的に脱アシル化することが可能である。３位にエステル結合したβヒドロキシミリスチン脂肪酸のアルカリ媒体への異常な感受性の原因は、現時点では分かっていない。
【００１３】
アルカリ加水分解手順は公知であるが、３位でβヒドロキシミリスチル酸へのエステル結合を超えてさらに加水分解は生じない条件を選択することが重要である。一般に、この加水分解は、水性媒体または有機媒体において実施され得る。後者の場合、溶媒としては、メタノール（アルコール類）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム、ジクロロメタンなど、ならびにそれらの混合物が挙げられる。水および１つ以上の言及した有機媒体の組合せもまた、使用され得る。
【００１４】
このアルカリ塩基は、種々のヒドロキシド、炭水化物、ホスフェートおよびアミンのなかから、選択され得る。例示的な塩基としては、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウムなど）、および有機塩基（例えば、アルキルアミン）などが挙げられ、そしてジエチルアミン、トリエチルアミンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００１５】
水性媒体において、ｐＨは、代表的には約１０と約１４との間であり、約１２〜約１３．５が好ましい範囲である。加水分解反応は、代表的には、約２０℃〜約８０℃までの温度、好ましくは約５０℃〜６０℃であり、約１０分〜約３０分の期間にわたって行われる。例えば、加水分解は、室温（２２℃〜２５℃）で、４８時間にわたり、水中で３％のトリエチルアミン中で行われ得る。加水分解の温度および時間の選択における唯一の要件は、脱アシル化が３位のβヒドロキシミリスチン酸のみを除去するように生じることである。
【００１６】
実際は、特に所望される加水分解方法は、リピドＡまたはモノホスホリルリピドＡをクロロホルム：メタノール２：１（ｖ／ｖ）に溶解すること、この溶液を０．５Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3からなる水性緩衝液中にｐＨ１０．５で飽和させること、および次いで減圧下またはアスピレーター（約１００ｍｍＨｇ）のもとで、４５℃〜５０℃でその溶媒をフラッシュエバポレートすることを包含する。得られた材料は、３位で選択的に脱アシル化される。このプロセスはまた、上記に列挙される無機塩基のいずれかを用いて行われ得る。水性緩衝液での飽和の前に有機溶媒に位相移入触媒（例えば、テトラブチルアンモニウムブロミド）を添加することは、いくつかの場合において所望され得る。
【００１７】
本発明の組成物を調製するにおいて、一般に、弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）は、界面活性剤と合わされる。ここで、各々は、溶媒中に溶解されている。この溶媒をエバポレートしてフィルムを残す。水をこのフィルムに添加し、そして得られる懸濁物を超音波処理し、他方で加熱して明澄化する。最終懸濁物は、約４０〜１５０ｎｍの粒子サイズを有し、そして好ましくは約５０〜約７０ｎｍの粒子サイズを有する。
【００１８】
ＡＬＤおよび界面活性剤を、約１０部のＡＬＤ対約１部〜約５部の界面活性剤のモル比で合わせる。好ましくは、この成分は、約４部のＡＬＤ対１部の界面活性剤のモル比で合わせる。本発明の組成物において使用するために企図される界面活性剤は、非免疫賦活性または非反応性であり、ほとんどまたは全く、独立した生物学的活性を示さない。本明細書において使用されるように、用語非免疫賦活性または非反応性とは、その界面活性剤が非免疫コントロールを超える見かけ上の生物学的活性をほとんどまたは全く示さないことを意味する。本発明に従って有用な非免疫賦活性界面活性剤としては、胆汁酸塩、天然のリン脂質およびスフィンゴ脂質が挙げられるがそれらに限定されない。胆汁酸塩（例えば、グリコデオキシコレートおよびデオキシコレート）は、請求される組成物における界面活性剤として有用である。他の適切な界面活性剤としては、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリンおよびスフィンゴシン）およびリン脂質（例えば、卵ホスファチジルコリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン、および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンまたはそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態において、リン脂質１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）が界面活性剤である。ＤＰＰＣは、ヒトにおける使用に受容され、そしてその処方物が鼻内に投与されるときに特に有効である。
【００１９】
そのＡＬＤおよび界面活性剤は溶媒中に溶解され、そして完全に混合される。本発明に従って有用な水性溶媒または有機溶媒としては、クロロホルム、アルコール（例えば、エタノール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）など、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００２０】
その溶媒は、ＡＬＤと界面活性剤との混合物からエバポレートされ、フィルムが残る。水がそのフィルムが添加され、そして得られた懸濁物が超音波処理され、他方で加熱して明澄化する。その懸濁物が水浴ソニケーター中で超音波処理されることが好ましい。その水浴の温度は、４０℃〜８０℃であり得、そして好ましくは、約６０℃であり得る。その懸濁物は、５分間〜約１時間の期間にわたり、超音波処理されて明澄化される。超音波処理の期間は、懸濁物の容量および濃度に依存するが、当業者には容易に決定され得る。最終懸濁物は、約４０〜１５０ｎｍの粒子サイズを有し、好ましくは、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍの粒子サイズを有する。
【００２１】
本発明の水性処方物は、搬送および保存のために凍結乾燥され得る。その組成物がグリセロールの存在下で凍結乾燥されるとき、予想外に、さらなる超音波処理なしに再構成され得る。約２％〜約４０％で、好ましくは約２％〜約１０％（容量対容量）でその組成物に存在するグリセロールは、凍結乾燥された組成物が水の添加の際に回復することを可能にする。単なる水の添加により水性処方物をそのもとの粒子サイズへと再構成する能力は、研究室の装置から離れた野外におけるワクチン接種について顕著な利点である。凍結乾燥された形態で本発明の組成物を搬送することができるというさらなる利点としては、負荷重量の減少、冷凍が不要になることおよび安定性の増加が挙げられる。本発明の組成物に存在するＡＬＤは、この凍結乾燥された状態において加水分解から保護されると考えられる。さらに、ワクチンにおいて提示されるＡＬＤの濃度は、再構成のための容量を調整することにより変動され得る。例えば、１ｍｇ／ｍｌのＡＬＤを含む１０ｍｌの組成物は、凍結乾燥および１ｍｌの水を用いて再構成して、１０ｍｇ／ｍｌ  ＡＬＤの水性組成物を得ることができる。グリセロールはまた、凍結乾燥の間、本発明のワクチン組成物に存在するタンパク質抗原を安定化する。凍結乾燥のために本発明の組成物を安定化するために使用され得る他の成分としては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールまたは非経口使用に適切な他のポリアルコールが挙げられるがそれらに限定されない。
【００２２】
本発明の有効量の組成物は、温血動物に抗原とともに投与されて、その動物のその抗原に対する免疫応答が増強される。本発明の組成物は、抗原に対する動物の体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を増強する。所望の応答を惹起するように投与される抗原の量は、当業者によって容易に決定され得、そして投与される抗原の型、投与経路および免疫スケジュールによって変動する。例えば、２１日離して２回の免疫でマウスに、請求される組成物とともに皮下に投与される０．１μｇの破傷風トキソイドは、その抗原に対する体液性免疫応答を惹起する。鼻内投与されると、本発明の組成物および抗原は、細胞傷害性Ｔリンパ球の産生を刺激する。請求された組成物中で、０日目および２１日目に鼻内に投与されたＢ型肝炎表面抗原（２．５μｇ）は、免疫された動物中に細胞傷害性Ｔリンパ球の産生を刺激した。さらに、本発明の組成物は、鼻内に投与されるとき、免疫された動物においてＩｇＡを惹起するにおいて特に有効である。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦ）の水性処方物中の０．５〜１２．５μｇの破傷風トキソイドが投与されたマウスは、その抗原に対するＩｇＡ力価の増加を示した。有効量の本発明の組成物は、免疫応答を刺激または増強するその量である。例えば、有効量の請求される組成物は、代表的な７０ｋｇの成人患者に対する投与に基づいて、１〜約２５０μｇの弱毒化リピドＡ誘導体を含み得、そして好ましくは、約２５〜約５０μｇを含み得る。
【００２３】
以下の実施例は、さらに例示するために提供されるが、本発明の組成物および方法の両方を限定するものではない。本明細書において提示されたマウスモデルは、温血動物の代表であり、そして他の温血動物（ヒトを含む）についての事象と合理的に相関づけられることが理解されるべきである。そうではないと記さない限り、全ての％は、重量％であり、そしてすべての溶媒混合物の比は、容量％である。
【００２４】
（実施例１：弱毒化リピドＡ誘導体の水性処方物の調製）
１０００μｇ／ｍｌ  ３Ｄ−ＭＬＡ（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ  ５９８４０）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒ５９５からの弱毒化形態のリピドＡ、および１１８μｇ／ｍｌ  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を注射用水中に含む、本発明に従う、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦ）の水性調製物を以下のように調製した。
【００２５】
ＤＰＰＣの溶液をエタノール中で４ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、そして明澄化するまでボルテックスした。ＤＰＰＣ溶液の２．７ｍｌのアリコートを１００ｍｇの凍結乾燥した３Ｄ−ＭＬＡを含むバイアルへと加え、そして緩和に振って３Ｄ−ＭＬＡを湿潤化した。このエタノールを、そのバイアルへフィルタリングした窒素流を緩和に流し込むことにより除いた。注射用水（９１．７ｍｌ）をそのバイアルに加え、次いでこれを混ぜ合わせ、封入し、そしてＬａｂｌｉｎｅ９３０３水浴ソニケーター中に懸濁した。この懸濁物を、１０分間６０℃で超音波処理して明澄化した。得られた水性処方物は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＰＳＣ１００比色計によって測定される、７０ｎｍの粒子を含み、そして０．２μｍフィルターを通じて濾過滅菌した。
【００２６】
（実施例２：水性処方物の凍結乾燥および再構成）
２％のグリセロールを、実施例１のように調製したＭＬＡの水性処方物に加えた。この混合物は、１〜１０ｍｌの容量でバイアル中にアリコートした。バイアルを、−４５℃の庫内温度で凍結乾燥機中で凍結させた。２時間後、濃縮機および真空機を動かし、そして庫内温度を−１０℃に設定した。庫内温度を４８時間後に＋１０℃へと変化させ、そして２４時間にわたりこの新たな温度を維持した。次いで、最後の２４時間にわたり庫内温度を＋２５℃に設定した。凍結乾燥後、バイアルを、１ｍｌの注射用水（ＷＦＩ）で再構成した。再構成は、水をバイアル中でかき回すことによって行った。全てのバイアルは、可視の沈澱もなく明澄であった。濃縮処方物の一部をＷＦＩ中で希釈して、粒子サイズ決定の前に１ｍｇ／ｍｌの最終溶液を得た。
【００２７】
【表１】
2003502388.tif 000001
表１は、本発明の水瀬尾処方物が、水の添加による凍結乾燥後のそのもとの粒子サイズへと回復したことを示す。
【００２８】
（実施例３  抗体応答の刺激）
本発明の水性処方物中の破傷風トキソイド（ＴＴ）で免疫したマウスは、破傷風トキソイド特異的抗体を生成した。ＴＴ特異的な総ＩｇＧ力価およびＩｇＧアイソタイプ（２ａ、２ｂ、１）力価を、免疫後のマウスの血清における酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
【００２９】
雌性ＩＣＲマウスを、０．１ｇの破傷風トキソイド（ＴＴ）＋５０μｇの３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦを含むかまたは生理食塩水中の０．１μｇの破傷風トキソイドを含む、一定用量のワクチンで免疫した。３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦは、実施例１においてと同様に調製した。このワクチンは、０日目および２１日目に皮下注射により投与した。二次免疫の１４日後に血清を収集し、この血清を標準的ＥＬＩＳＡ技術によりアッセイして、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびＩｇＧ2bのアイソタイプならびに総ＩｇＧの破傷風トキソイド特異的抗体の相対量を記録した。
【００３０】
図１は、３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦにより生じた破傷風トキソイド特異的抗体を示す。この破傷風トキソイド抗原とともに投与した場合、３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦは、免疫した動物にてＩｇＧ抗体の産生を刺激し、特にＩｇＧ2産生を活発に刺激した。
【００３１】
（実施例４−細胞増殖の刺激）
本発明のアジュバント組成物および精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）（ツベルクリン）で免疫することにより刺激されたマウスは、脾細胞をその抗原で処理した場合に、インビトロで増殖性応答を示した。
【００３２】
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０μｇのＰＰＤ＋５０μｇの３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦを含む、一定用量のワクチンで、皮下注射により免疫した。３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦは、実施例１においてと同様に調製した。免疫の１４日後に脾細胞を収集し、この脾細胞を増殖アッセイにおいてリンパ球の供給源として使用した。この脾細胞を、０．１μｇ  ＰＰＤ／ｍｌ、１μｇ  ＰＰＤ／ｍｌまたは１０μｇ  ＰＰＤ／ｍｌを含む培地中にて、濃度１０6細胞／ｍｌで、マイクロタイターウェル中で９６時間培養した。トリチウムチミジンを、インキュベーションの最後の２４時間の間、培養物に添加した。その細胞をガラスファイバーフィルター上に収集し、そしてトリチウム取り込みを決定した。刺激指数を、ＰＰＤで刺激した細胞の１分当たりの計数（ＣＰＭ）を培地のみにて培養した細胞のＣＰＭで除算することによって決定した。得られたデータを、図２に示す。
【００３３】
（実施例５−細胞傷害性Ｔリンパ球応答の刺激）
本発明の水性アジュバント組成物およびタンパク質抗原の投与後の細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導を、細胞傷害性アッセイにより決定した。Ｃ５７／ＢＬ／６マウスに、３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦ中に処方した２５μｇオボアルブミン（ＯＶＡ）を、皮下（鼡径部）に一次免疫した。３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦは、実施例１においてと同様に調製した。注射した容量は２００μｌであった。２１日後、実験群１つあたり３匹のマウスを殺傷し、そして脾臓を取り出し、単一細胞懸濁物としてプールし計数した。
【００３４】
それら実験群由来の脾細胞（３〜４ｍｌの培地中７５×１０6細胞）２５ｃｍ2のＴ字フラスコに配置した。次いで、５×１０6／ｍｌの照射（２０，０００ラド）Ｅ．Ｇ７（ＯＶＡ）細胞１．０ｍｌを、そのフラスコに添加した。その体積を１０ｍｌにした。そのＴ字フラスコを３７℃、５％  ＣＯ2インキュベーター中にて直立させて４日間配置することによって、培養物を維持した。４日目に、生存細胞をフラスコから回収し、１回洗浄し、５．０ｍｌ中に再懸濁し、そして計数した。
【００３５】
回収したエフェクター細胞を、５×１０6生存細胞／ｍｌに調整し、そして１００μｌの体積を、９６ウェルの丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ２５８５０）のウェル中で３連で、１００μｌ／ウェルの培地を希釈物として使用して連続希釈した。次いで、51Ｃｒ標識した（下記を参照のこと）標的（Ｅ．Ｇ７（ＯＶＡ）−オボアルブミン遺伝子でトランスフェクトしたＥＬ−４細胞株）を１×１０5細胞／ｍｌで１００μｌ容量、ウェルに添加した。自然放出（ＳＲ）ウェルは、標的１００μｌおよび培地１００μｌを含んだ。最大放出（ＭＲ）ウェルは、標的１００μｌおよび界面活性剤１００μｌを含んだ（２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）。エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比は、５０：１、２５：１、１２．５：１、６．２５：１であった。プレートを４００×ｇで遠心分離し、そして３７℃、５％  ＣＯ2にて４時間インキュベートした。このインキュベーションの後、ウェル上清を、Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して収集した。
【００３６】
比溶解％＝１００×［（実験放出−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）］。
【００３７】
標的細胞Ｅ．Ｇ７（ＯＶＡ）を、以下のような51Ｃｒ（クロム酸ナトリウム）で標識した。総容量１．０ｍｌにて、５×１０6標的細胞および２５０μＣｉ  51Ｃｒを１５ｍｌコニカルチューブ中で混合した。その細胞懸濁物を、３７℃の水浴中で、１５分ごとにおだやかに混合しながら９０分間インキュベートした。インキュベーション後、標識細胞を遠心分離により３回洗浄し、そして１５ｍｌ容量の培地をデカントした。３回目の遠心分離の後、細胞を新鮮な培地１０ｍｌ中に再懸濁し、そして室温にて３０分間間静置し、次いで遠心分離した。その細胞を、最終的に培地中に再懸濁して、１×１０5細胞／ｍｌにした。その細胞傷害性アッセイの結果を表２に示す。
【００３８】
（表２）
【００３９】
【表２】
2003502388.tif 000002
（実施例６  水性ＡＬＤ処方物の鼻内投与による抗体応答の刺激）
３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦ中の破傷風トキソイド（ＴＴ）を鼻内投与したマウスは、血清および糞便抽出物の両方において検出可能なＩｇＡ力価を生じた。さらに、本発明の水性処方物およびＴＴの鼻内投与により、高力価のＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ2aおよびＩｇＧ2b）が生じた。
【００４０】
ＩＣＲマウスの群に、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中にあるかまたは２５μｇ  ３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦと混合した、０．５μｇ、２．５μｇ、１０μｇもしくは１２．５μｇの破傷風トキソイドを鼻内投与した。３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦを実施例１においてと同様に調製した。マウスを０日目に刺激し、１０日目（ｄ１０Ｐ１°）に採血し、１４日目にブーストし、２４日目（ｄ１０Ｐ２°）に採血し、２８日目にブーストし、３８日目（ｄ１０Ｐ３°）に採血した。ＩｇＧ特異的抗破傷風トキソイド抗体およびＩｇＡ特異的抗破傷風トキソイド抗体についてのＥＬＩＳＡを、各採血からプールした血清に対して行った。糞便抽出物を２２日目（ｄ７Ｐ２°）に試験した。免疫したマウスの血清および糞便抽出物のＩｇＧ力価およびＩｇＡ力価を表３〜６に示す。
【００４１】
（表３）
【００４２】
【表３】
2003502388.tif 000003
（表４）
（表３におけるｄ１０Ｐ３°採血由来の血清のＩｇＧアイソタイプ分析）
【００４３】
【表４】
2003502388.tif 000004
（表５）
【００４４】
【表５】
2003502388.tif 000005
（表６）
（表５における１０Ｐ３°からの血清のＩｇＧアイソタイプ分析）
【００４５】
【表６】
2003502388.tif 000006
（実施例７  水性ＡＬＤ処方物の鼻内投与によるＢ型肝炎表面抗原に対する免疫応答の刺激）
本発明の組成物中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡＧ）を鼻内投与したマウスは、その抗原に対して血清ＩｇＧ力価およびＩｇＡ力価を生じた。分泌性ＩｇＡを膣洗浄物にて検出し、そして細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を細胞傷害性アッセイにより検出した。
【００４６】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群に、２．５μｇのＨＢｓＡｇ＋１０μｇの３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦを２０μｌの容積で鼻内に一次免疫（１°）した。３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦは、実施例１においてと同様に調製した。２１日後、７．５μｇのＨＢｓＡｇ＋１０μｇの３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦを２０μｌで鼻内に二次免疫（２°）した。二次免疫と同一の組成の三次免疫を、二次免疫の２８日後に投与した。二次免疫の１６日後（ｄ１６、２°後）および三次免疫の８日後（ｄ８、３°後）に、細胞傷害性Ｔリンパ球活性を検出するためのアッセイを実行した。血清抗体力価および粘膜抗体力価を、二次免疫の２２日後（ｄ２２、２°後）および三次免疫の２１日後（ｄ２１、３°後）に評価した。すべてのアッセイは、当該分野で標準的でありそして前記実施例３および実施例５にて記載される方法によって、実行した。この実験の結果を表７〜９に示す。
【００４７】
（表７）
【００４８】
【表７】
2003502388.tif 000007
（表８）
【００４９】
【表８】
2003502388.tif 000008
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群に、２．５μｇ  ＨＢｓＡｇ＋１０μｇ  ３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦを鼻内免疫し、そして２１日後に７．５μｇ  ＨＢｓＡｇ＋１０μｇ  ３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦを鼻内免疫した。膣サンプルをブースター免疫の１０日後に収集した。
【００５０】
（表９）
【００５１】
【表９】
2003502388.tif 000009
本発明の組成物中のＨＢｓＡｇの鼻内投与は、その抗原に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を刺激した。３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦ中に処方した抗原での鼻内免疫は、細胞傷害性Ｔリンパ球応答および抗原特異的体液性免疫応答および抗原特異的粘膜性免疫応答を誘導した。
【００５２】
（実施例８  水性ＡＬＤ処方物の鼻内投与によるインフルエンザに対する防御免疫応答の生成）
本発明の組成物中にて処方した血球凝集素抗原を含むＦＬＵＳＨＩＥＬＤインフルエンザワクチンを鼻内免疫したマウスは、ＩｇＧおよびＩｇＡの両方を産生し、これらＩｇＧおよびＩｇＡを膣内洗浄物から回収した。免疫したマウスはまた、後のインフルエンザチャレンジから１００％防御された。
【００５３】
ＩＣＲマウスに、０．３μｇ血球凝集素抗原（ＨＡ）＋１０μｇ  ３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦを含むＦＬＵＳＨＩＥＬＤインフルエンザワクチン（Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅ）を、２１日間隔で３回鼻内免疫した。３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦは実施例１と同じように調製した。膣洗浄物を、最後の免疫の１４日後に収集した。最後の免疫の３５日後に、１０ＬＤ50（半数致死量）の感染性インフルエンザＡ／ＨＫ／６８でマウスにチャレンジし、致死性についてモニターした。
【００５４】
（表１０）
【００５５】
【表１０】
2003502388.tif 000010
（実施例９  モノホスホリルリピドＡの組成物）
モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）を、本発明の水性組成物へと処方し得、そして実施例１〜７においてと同じ量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）および量（ａｍｏｕｎｔ）にて、類似の結果を得るように投与し得る。
【００５６】
上記の実施例は本発明を単に例示するに過ぎないことが理解される。使用される組成物および／または方法の特定の改変がなされ得、そしてなお本発明の目的が達成される。このような改変は、本発明の範囲内にあると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａ−ｄは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの水性処方物（３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦ）中の破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原（星印）または生理食塩水中の破傷風トキソイド抗原（白菱形）を投与したマウスの抗体力価を示す。図１ａは、破傷風トキソイド抗原を投与されたマウスのＩｇＧ抗体総力価を示す。図１ｂは、破傷風トキソイド抗原を投与されたマウスのＩｇＧ２ａ抗体力価を示す。図１ｃは、破傷風トキソイド抗原を投与されたマウスのＩｇＧ２ｂ抗原を示す。そして図１ｄは、この動物についてのＩｇＧ１抗原力価を示す。
【図２】
図２は、精製したタンパク質誘導体で免疫したマウスにおけるＴ細胞増殖応答を示す。３Ｄ−ＭＬＡ／ＡＦ（星印）中の破傷風トキソイドを投与したマウスにおける増殖応答、および正常のコントロール（白菱形）は、一次ワクチン接種後１４日で示される。