(57)【要約】  新規な脱細胞化ストラテジーによって作製された臓器特異的なマトリックス抽出物である、肝臓および肺バイオマトリックス足場の基層上にあるときのヒト結腸直腸がん細胞の挙動によって示されるように、臓器特異性の生物学的様相を再現するｉｎ  ｖｉｔｒｏがん転移モデルが本明細書において記載されている。腫瘍細胞は、組織像、バイオロジーならびに遺伝子形質および他の表現型形質に関してｉｎ  ｖｉｖｏ転移巣を模倣するコロニーを自然発生的に形成した。理論に拘束されるものではないが、放射線または化学療法剤に対する腫瘍の反応は、使用されるマトリックス基層に依存することを証明したと想定される。よって、足場は、がん研究および診断のための強力なツールを提供すると考えられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんまたは腫瘍と診断された患者内でがんまたは腫瘍が転移する可能性を判定する方法であって、
１つまたは複数のバイオマトリックス足場に、腫瘍生検材料のまたはがんもしくは腫瘍と診断された患者から採取されたサンプルの細胞を播種するステップ、ここで、１つまたは複数のバイオマトリックス足場のそれぞれが、人体の１つまたは複数の所定の組織または臓器にそれぞれ由来する、と、
成長中の細胞のコロニーを形成する能力について前記細胞を分析するステップと、
を含み、
各バイオマトリックス足場が、それが由来する前記臓器または組織の生物学的様相を再現し、
前記細胞が、前記１つまたは複数の所定の組織または臓器にそれぞれ由来する１つまたは複数のバイオマトリックス足場において成長中の細胞のコロニーを形成する場合、前記１つまたは複数の所定の組織または臓器へのｉｎ  ｖｉｖｏでの転移が予測される、方法。
【請求項２】
前記細胞が、前記１つまたは複数の所定の組織または臓器にそれぞれ由来する１つまたは複数のバイオマトリックス足場の基層において成長中の細胞のコロニーを形成する場合、前記１つまたは複数の所定の組織または臓器への転移が予測される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つまたは複数の所定の組織または臓器に由来する前記１つまたは複数のバイオマトリックス足場のそれぞれが、バイオマトリックス足場の凍結切片、凍結粉砕されたバイオマトリックス足場、およびインタクトなバイオマトリックス足場から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コロニーを、その組織像、エクソソーム産生、マイクロＲＮＡ産生、間葉系細胞との相互作用、および／または遺伝子発現プロファイルに基づいて特徴付けるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤に対する反応性に関して前記コロニーをスクリーニングするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記がん療法および／または化学療法剤が、前記コロニーの組織像、エクソソーム産生、マイクロＲＮＡ産生、間葉系細胞との相互作用、および／または遺伝子発現プロファイルに基づいて選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤が、１回もしくは複数回の放射線療法ならびに／またはアントラサイクリン、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、および有糸分裂阻害剤などの１つもしくは複数の化学療法から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤が、放射線療法、免疫療法、内分泌療法、および分子療法から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
がんまたは腫瘍と診断された患者におけるがんまたは腫瘍に適切な処置を決定する方法であって、
１つまたは複数のバイオマトリックス足場に、（１）腫瘍生検材料のまたはがんもしくは腫瘍と診断された前記患者から採取されたサンプルの細胞、あるいは（２）前記患者と同じがんまたは腫瘍の種類の細胞株の細胞を播種するステップ、ここで、１つまたは複数のバイオマトリックス足場のそれぞれが、人体の１つまたは複数の所定の組織または臓器にそれぞれ由来し、前記細胞が、前記バイオマトリックス足場において成長中の細胞のコロニーを形成する、と、
前記コロニーを、１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤で処置するステップ
を含み、
前記バイオマトリックス足場が、それが由来する前記組織または臓器の生物学的様相を再現し、
前記患者に適切な処置が、前記１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤を用いた処置に対する前記コロニーの反応性に基づいて選択される、方法。
【請求項１０】
前記がん療法および／または化学療法剤が、３次元コロニーの組織像または遺伝子発現プロファイルに基づいて選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤が、１回もしくは複数回の放射線療法ならびに／またはアントラサイクリン、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、および有糸分裂阻害剤などの１つもしくは複数の化学療法から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤が、放射線療法、免疫療法、内分泌療法、および分子療法から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫療法が、樹状細胞療法、抗体依存性療法、Ｔ細胞依存性療法、またはＮＫ細胞依存性療法から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分子療法が、１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
人体の１つまたは複数の所定の組織または臓器にそれぞれ由来する１つまたは複数のバイオマトリックス足場と、前記１つまたは複数のバイオマトリックス足場に細胞を播種するための指示書と、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示書とを含むキット。
【請求項１６】
人体の１つまたは複数の所定の組織または臓器にそれぞれ由来する１つまたは複数のバイオマトリックス足場と、前記１つまたは複数のバイオマトリックス足場に細胞を播種するための指示書と、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示書とを含むキット。
【請求項１７】
１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
人体の１つまたは複数の所定の組織または臓器に特異的な、人工的な腫瘍または転移モデルであって、
１つまたは複数のバイオマトリックス足場に、（１）腫瘍生検材料のまたはがんもしくは腫瘍と診断された患者から採取されたサンプルの細胞、あるいは（２）前記患者と同じがんまたは腫瘍の種類の細胞株の細胞を播種すること、ここで、１つまたは複数のバイオマトリックス足場のそれぞれが、人体の１つまたは複数の所定の組織または臓器にそれぞれ由来する、
によって作製され、
前記細胞が、前記バイオマトリックス足場において成長中の細胞のコロニーを形成し、
前記バイオマトリックス足場が、それが由来する前記組織または臓器の生物学的様相を再現する、人工的な腫瘍または転移モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１６年７月１２日に出願された米国特許出願第６２／３６１，３０６号、および２０１７年２月１６日に出願された米国特許出願第６２／４６０，０５６号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
転移は、がんの罹患率および死亡率の主原因である。がん研究における主な問題は、特に臓器特異性という転移の重要な特徴に関して、がん転移のバイオロジーを再現するｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルがないことであった。したがって、がん研究および治療薬を開発するためのより良好なツールは、転移成長のより良好なモデルを必要とする。
【０００３】
腫瘍細胞はある特定の臓器に転移し易いことが知られているため、臓器特異性は、がん転移の重要な特質である。さらに、転移巣の治療反応は、同一患者内であっても、転移巣が発生する臓器に依存することがある。しかしながら、既存のｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏのモデル系は、おそらくこれらの腫瘍モデルには臓器微小環境における可変要素が存在しないために、そのような臓器特異性を反映していない。遺伝子工学的に作製されたｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルは臓器特異性を有するものの、研究することが難しく、また非常に高価である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
臨床では、どの腫瘍が転移するのか、およびどの組織または臓器に転移するのかを予測するツールが存在しないことが問題であった。転移部位を予測できるアッセイは、臨床的に非常に価値があり、がん管理に変化をもたらす可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様は、がんまたは腫瘍の診断および／または特徴付けに関連する方法、キット、および組成物に関する。本明細書でがんまたは腫瘍に関して記載されている実施形態のいずれにおいても、がんまたは腫瘍は悪性であってもよい。ある特定の実施形態では、がんまたは腫瘍は、それが特異的な組織に転移する可能性ならびに／または本明細書で下記に記載されている１つもしくは複数のがん療法および／もしくは化学療法剤に反応するそのような転移の１つもしくは複数の反応性によって特徴付けることができる。
【０００６】
本明細書において開示されている方法実施形態は、１つまたは複数のバイオマトリックス足場に腫瘍またはがんの細胞を播種するステップを含む。
【０００７】
こうした方法実施形態の一部において、細胞は、（１）腫瘍生検材料のまたはがんもしくは腫瘍と診断された患者から採取されたサンプルの細胞、あるいは（２）該患者と同じがんまたは腫瘍の種類の細胞株の細胞のものであり得る。こうした方法実施形態の一部において、細胞は、成長中の細胞のコロニーを形成する能力に関して分析される。一部の実施形態では、コロニーは、バイオマトリックス足場の基層上にある。こうした方法実施形態の一部において、細胞はコロニーを形成する。こうした方法実施形態の一部において、細胞は、３次元コロニーとなる能力に関して分析される。こうした方法実施形態の一部において、細胞は３次元コロニーを形成する。理論に拘束されるものではないが、そのような３次元コロニー形成は、それぞれのバイオマトリックス足場の基層の化学的性質に影響を受け得ると考えられる。こうした方法実施形態の一部において、細胞は、それらの遺伝子発現能力またはタンパク質もしくは別の因子を分泌する能力に関して分析される。こうした遺伝子の非限定的な例として以下が挙げられる：多能性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＳＡＬＬ４、ＮＡＮＯＧ、ＢＭｉ−１）、幹細胞遺伝子（例えば、ＥｐＣＡＭ、ＬＧＲ５／ＬＧＲ６、ＣＸＣＲ４、ヒアルロナン受容体をコードしている遺伝子のＣＤ４４ファミリーの多くのバリアントのうちの１つまたは複数、多剤耐性遺伝子（例えば、ｍｄｒ遺伝子ファミリー、Ｐ糖タンパク質）、細胞外マトリックス成分（例えばヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、マトリックス分解メタロプロテイナーゼ）を溶解する酵素をコードしている遺伝子；こうしたタンパク質の非限定的な例として以下が挙げられる：上記遺伝子によってコードされているタンパク質（例えばＣＤ４４、Ｐ糖タンパク質、マトリックス分解酵素）；この分析に関連する別の因子の非限定的な例として、エクソソーム産生、マイクロＲＮＡ、および間葉系フィーダー細胞からのパラ分泌シグナル伝達からの質的または量的独立性に関連するものが挙げられる。これらの方法実施形態の一部の実施形態では、細胞が１つまたは複数のバイオマトリックス足場に播種され付着したら、この分析が行われ得る。これらの方法実施形態の一部の実施形態では、細胞を、１つまたは複数のバイオマトリックス足場の組織特異的な形態の基層に付着させ得る。
【０００８】
こうした方法実施形態の一部において、１つまたは複数のバイオマトリックス足場は、人体の１つまたは複数の所定の臓器にそれぞれ由来する。さらなる実施形態では、所定の臓器は、例えばその種類のがんまたは腫瘍の転移と関連することが既知である臓器を含むように、またはそのがんまたは腫瘍が認められた臓器を含むように、患者のがんまたは腫瘍の種類に基づいて選択される。すべての方法実施形態において、それぞれのバイオマトリックス足場は、その由来となった組織の生物学的様相（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆａｃｅｔ）を再現する。
【０００９】
播種方法は、がんまたは腫瘍と診断された患者内で腫瘍が転移する可能性を判定するために任意に使用されてもよい。例えば、腫瘍またはがん細胞がバイオマトリックス足場上で成長中の細胞のコロニーを形成する場合、臓器への転移が予測され得る。予測された転移は、前記足場の由来となった臓器に位置しているとさらに判定され得る。よって、一部の実施形態では、１つまたは複数の所定の臓器にそれぞれ由来する１つまたは複数のバイオマトリックス足場上で細胞が成長中の細胞のコロニーを形成する場合、それらの臓器への転移がｉｎ  ｖｉｖｏで予測される。
【００１０】
この播種方法を使用して、がんまたは腫瘍と診断された患者において腫瘍に適切な処置を決定することもできる。これは、腫瘍が転移する可能性を判定することに加えて、またはそれとは独立に行ってもよい。
【００１１】
上記の開示された方法実施形態はいずれも、コロニーを、その組織像、エクソソーム産生、マイクロＲＮＡ産生、間葉系細胞との相互作用、および／または遺伝子発現プロファイルに基づいて特徴付けるステップをさらに含んでもよい。
【００１２】
上記の開示された方法実施形態はいずれも、１つもしくは複数のがん療法および／もしくは化学療法剤に対する反応性に関してコロニーをスクリーニングするステップ、または１つもしくは複数のがん療法および／もしくは化学療法剤でコロニーを処置するステップをさらに含んでもよい。そのようながん療法および／または化学療法剤は、１回もしくは複数回の放射線療法、免疫療法、内分泌療法、分子療法、および／または例えばアントラサイクリン、アルキル化剤、白金製剤（ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｂａｓｅｄ  ａｇｅｎｔ）、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、もしくは有糸分裂阻害剤などの１つもしくは複数の種類の化学療法を含むが、これらに限定されない。そのようながん療法および／または化学療法剤は、任意に、患者のがんまたは腫瘍の種類に基づいて選択することができる。ある特定の実施形態では、臓器中でのｉｎ  ｖｉｖｏでの１つまたは複数の療法および／または作用物質に対するがんまたは腫瘍の反応性は、その臓器から調製されたバイオマトリックス足場上に播種された場合の、１つまたは複数の療法または作用物質に対するがんまたは腫瘍細胞の反応性と相関し得る。
【００１３】
本開示の態様はまた、人体の１つまたは複数の所定の臓器にそれぞれ由来する１つまたは複数のバイオマトリックス足場と、本明細書において上記で開示されている方法の１つまたは複数を行うための指示書とを含むキットにも関する。さらなる実施形態は、１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤；腫瘍生検材料のまたはがんもしくは腫瘍と診断された患者から採取されたサンプルの細胞を得るためのツールまたは指示書；特定のがんまたは腫瘍の種類の細胞株の細胞；ならびに／あるいは上記の開示されている方法を行うために必要とされる任意の試薬、培地、または別の成分をさらに含むキットを企図する。
【００１４】
本開示のさらなる態様は、本明細書において上記で開示されている播種方法によって作製される、人体の１つまたは複数の所定の臓器に特異的な、人工的な腫瘍または転移モデルを企図する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】バイオマトリックス足場（ＢＭＳ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏで認められる組織特異的な微小環境を再現することを示す図である。（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転移性疾患の研究に使用される手法を示す概略図。（ｂ）肺および肝臓ＢＭＳの走査型電子顕微鏡写真。スケールバー、１００ｎｍ。（ｃ）脱細胞化の前後に肺組織中に存在する成長因子およびサイトカインの分析（ｎ＝４）。シグナル伝達分子の相対的存在量の差は、対応があるｔ検定を使用して決定した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す；＊ｐ＜０．００１；（ｄ）肝臓および肺ＢＭＳ中に存在するタンパク質の組成および相対的存在量を比較するヒートマップ（ｎ＝４）。階層的クラスタリングは、ｚスコア正規化されたラベルフリー定量強度を使用して行った。
【図２】結腸直腸がん細胞が、肝臓および肺ＢＭＳ上で培養された場合に、３Ｄ人工転移を自然発生的に形成することを示す図である。（ａ）プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上で成長させたＨＴ−２９（左）、ＳＷ４８０（中央）、およびＣａｃｏ２（右）細胞の走査型電子顕微鏡写真。スケールバー、５０μｍ。（ｂ）播種効率、および（ｃ）プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上に播種されたＨＴ−２９（左）、ＳＷ４８０（中央）、およびＣａｃｏ２（右）細胞の成長速度（ｎ＝３）。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。播種効率および成長速度の差異は、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した。統計学的有意性は上の文字で示す（Ｐ＜０．０５）。同じ文字を共有する群は、有意な差はない。
【図３】人工肝臓転移が、ｉｎ  ｖｉｖｏで認められる肝臓転移と同等であることを示す図である。（ａ）人工ＨＴ−２９肝臓転移（左パネル）、ＨＴ−２９細胞の脾臓内注射後に形成された肝臓転移（中央パネル）、および末期のヒト結腸直腸がん患者から生検で採取された肝臓転移（右パネル）はすべて、胃腸由来の肝臓転移の典型的な組織学的特徴を示す。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）プラスチック（「プラスチック」）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」）、肝臓ＢＭＳ（「人工肝臓転移」）上で成長させたＨＴ−２９細胞、およびＨＴ−２９細胞の脾臓内注射により得られたｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移（「ｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移」）により示される平均的な網羅的遺伝子発現パターンの階層的クラスター分析（ｎ＝４）。
【図４】人工転移が、ｉｎ  ｖｉｖｏで転移する可能性の増加を示したことを示す図である。（ａ、ｃ）プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳから単離されたＨＴ−２９−ｌｕｃ２細胞を（ａ）直接の肝臓注射または（ｃ）尾静脈注射してから３０日後の動物の生物発光イメージ。（ｂ、ｄ）ＨＴ−２９−ｌｕｃ２細胞の（ｂ）直接の肝臓注射または（ｄ）尾静脈注射の後に肝臓および肺転移を発症した動物数をまとめた表。
【図５】異なる基層上で成長させたＣＲＣ細胞が化学療法薬および放射線療法に対して異なる反応をすることを示す図である。（ａ）プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上で成長させたＣＲＣ細胞の、化学療法薬に対する反応（ｎ＝６）。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。治療反応の差異は、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した。統計学的有意性は上の文字で示す（Ｐ＜０．０５）。同じ文字を共有する群は、有意な差はない。（ｂ）プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上で成長させたＣＲＣ細胞の、放射線療法に対する反応（ｎ＝３）。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図６】肺および肝臓組織の脱細胞化により、組織特異的なシグナル伝達分子を含有するＢＭＳが生成されることを示す図である。（ａ）脱細胞化前後の肺（左）および肝臓（右）の肉眼的およびＨ＆Ｅ画像。スケールバー、１３０μｍ。（ｂ）脱細胞化前後の肺および肝臓に存在するＤＮＡ含有量のアセスメント（ｎ＝３）。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＤＮＡ含有量の差異は、ｔ検定を使用して決定した。（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。（ｃ）肺および肝臓ＢＭＳに存在する成長因子およびサイトカインの分析（ｎ＝４）。肝臓ＢＭＳに存在するシグナル伝達分子の平均ピクセル強度値は、以前の研究から得た。
【図７】細胞外マトリックス成分の組成が肝臓ＢＭＳと肺ＢＭＳで異なることを示す図である。肝臓および肺ＢＭＳにおいて示差的に発現されるコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、およびラミニンの相対的存在量を比較したヒートマップ（ｎ＝４）。階層的クラスタリングは、ｚスコア正規化されたラベルフリー定量強度を使用して行った。
【図８】（ａ）コロニーとバイオマトリックス足場との境界面、（ｂ）細胞間のタイトジャンクション、および（ｃ）壊死領域を表す人工肝臓転移の透過型電子顕微鏡写真である。（ａ〜ｂ）スケールバー、２μｍ。（ｃ）スケールバー、１０μｍ。左パネルにおいてバイオマトリックス足場は「Ｂ」で示す。中央パネルにおいてタイトジャンクションは点線の四角で示す。右パネルにおいて壊死領域は「Ｎ」で示す。
【図９】人工転移が、増殖速度の低下のために比較的ゆっくりと成長することを示す図である。（ａ）フローサイトメトリーを使用した、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上で成長させたＣＲＣ培養物中の、アポトーシスを起こしている切断型カスパーゼ３陽性の細胞の定量（ｎ＝３）。（ｂ）フローサイトメトリーでアセスメントした、４時間の標識化期間にわたって異なる基層上で培養された、Ｓ期を経たＥｄＵ陽性の細胞の数の定量（ｎ＝３）。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。アポトーシスおよび増殖速度の差異は、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定を用いた一元配置分散分析を使用してアセスメントした。統計学的有意性は上の文字で示す（Ｐ＜０．０５）。同じ文字を共有する群は、有意な差はない。
【図１０】プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳおよび肺ＢＭＳ上で成長させたＨＴ−２９（左）、ＳＷ４８０（中央）、およびＣａｃｏ２（右）細胞の代表的な画像である。スケールバー、２０μｍ。
【図１１】人工肝臓転移およびｉｎ  ｖｉｖｏ転移が、同等の遺伝子シグネチャーを示すことを示す図である。（ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＴ−２９肝臓転移の、および（ｂ）人工肝臓転移の、網羅的遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイ分析によってアセスメントした（ｎ＝４）。（ａ）において肝臓転移は白い矢印で示す。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）プラスチック上で成長させた細胞と比較した場合に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養物、人工転移、およびｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移において上方制御された遺伝子の数を示すベン図。遺伝子オントロジー分析によれば、共通して上方制御されている遺伝子の多くが、血管新生、細胞接着、および薬物代謝と関連していることが分かる。（ｄ）リアルタイムｑＰＣＲによってアセスメントした、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓および肺ＢＭＳ上で成長させたＨＴ−２９、ＳＷ４８０、およびＣａｃｏ２細胞におけるＴｉｍｐ１遺伝子発現（ｎ＝４）。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。Ｔｉｍｐ１発現の差異は、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した。統計学的有意性は上の文字で示す（Ｐ＜０．０５）。同じ文字を共有する群は、有意な差はない。
【図１２】全臓器（ｗｈｏｌｅ  ｏｒｇａｎ）ｅｘ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングを示す図であり、組織学的分析を使用して、ＨＴ２９−ｌｕｃ２細胞の尾静脈注射（ａ）または直接の肝臓注射（ｂ）の後の動物個体全身（ｗｈｏｌｅ  ａｎｉｍａｌ）の生物発光イメージに基づいて特定された転移巣の存在を確認した。組織学的検査によって特定された代表的な肝臓および肺転移は、矢印で示す。スケールバー、２０μｍ。
【図１３】低酸素プレコンディショニングは、プラスチック上で成長させたＨＴ−２９細胞の転移可能性を高めないことを示す図である。（ａ）通常条件および低酸素条件下で培養されたＨＴ−２９−ｌｕｃ２細胞の尾静脈注射の３０日後の動物の生物発光イメージ。（ｂ）肺転移を発症した動物の数をまとめた表。
【図１４】異なる培養基層上で成長させたＣＲＣ細胞により示される、アノイキスに対する相対的感受性および浸潤能の特徴付けを示す図である。（ａ）ハイドロゲルコートプレート上での培養後の、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上で成長させたＨＴ−２９、ＳＷ４８０、およびＣａｃｏ２細胞の、アノイキスを起こすことに対する相対的耐性（ｎ＝３）。（ｂ）トランスウェル浸潤アッセイを使用して決定した、異なる基層上で成長させたＣＲＣ細胞の浸潤能（ｎ＝３）。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。生存および浸潤の差異は、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定を用いた一元配置分散分析を使用して決定した。統計学的有意性は上の文字で示す（Ｐ＜０．０５）。同じ文字を共有する群は、有意な差はない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示による実施形態を、下記により完全に記載する。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具現化されてもよく、本明細書に記載されている実施形態に限定されると解釈されるべきではない。そうではなく、この開示が、徹底的で完全なものとなり、かつ本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように、これらの実施形態は記載されている。本明細書において説明で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。本明細書でおよび本出願の全体にわたって言及されるすべての参考文献は、参照により組み込まれる。
【００１７】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者により理解されるものと同じ意味を有する。一般に使用される辞書で定義されているものなどの用語は、本出願および関連技術との関連におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明確にそのように定義されていない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解される。下記では明示的に定義されていないが、そのような用語は、それらの一般的な意味に従って解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書において説明で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図していない。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【００１９】
本発明技術の実施には、別途示されない限り、当業者の技能範囲内である組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えＤＮＡの従来技術を用いる。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版；Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）ＰＣＲ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５）ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版；Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン）；ならびにＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。
【００２０】
文脈により特に示されない限り、本明細書に記載されている本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで使用できることが明確に意図される。さらに、本開示はまた、一部の実施形態において、本明細書に記載されている任意の特徴または特徴の組み合わせを排除または除外できることを企図する。説明するために、もし明細書に、ある複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと記述されていれば、Ａ、ＢもしくはＣ、またはそれらの組み合わせのいずれも、単独でまたは任意の組み合わせで、除外および排除することができることが明確に意図される。
【００２１】
範囲を含むすべての数字による呼称、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、適宜１．０もしくは０．１ずつ、または代替として＋／−１５％、もしくは代替として１０％、もしくは代替として５％、もしくは代替として２％の変動分で（＋）または（−）に変わる近似値である。必ずしも明示的に記述されるとは限らないが、すべての数字による呼称の前には「約」という用語が付いていることが理解されるべきである。必ずしも明示的に記述されるとは限らないが、本明細書に記載されている試薬は例示にすぎないこと、および前述の試薬の等価物は当技術分野において知られていることもまた理解されるべきである。
【００２２】
定義
本発明の明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈により明らかに別段示されない限り、複数形もまた含むことを意図する。
【００２３】
測定可能な値に関する場合の本明細書で使用される「約」という用語、例えば、量または濃度（例えば、バイオマトリックス足場における全タンパク質中のコラーゲンのパーセンテージ）などは、明記されている量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動分を包含することを意味する。
【００２４】
「許容できる」、「有効な」、または「十分な」という用語は、本明細書で開示されている任意の成分、範囲、投与形態などの選択を記述するために使用される場合、前記成分、範囲、投与形態などが開示されている目的に好適であることを意図する。
【００２５】
また本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つまたは複数のあらゆる可能な組み合わせ、ならびに択一的に（「または」）解釈された場合は組み合わせを含まないことを指し、かつこれらを包含する。
【００２６】
「バッファー」および／または「すすぎ培地」という用語は、バイオマトリックス足場の調製に使用される試薬を指すために本明細書で使用される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、真核細胞を指す。一部の実施形態では、この細胞は動物由来であり、幹細胞または体細胞であり得る。「細胞集団」という用語は、同じまたは異なる由来を有する同じまたは異なる細胞タイプの１つまたは複数の細胞の群を指す。一部の実施形態では、この細胞集団は細胞株から得ることができ、一部の実施形態では、この細胞集団は、臓器または組織のサンプルから得ることができる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が、列挙されている要素を含むが他の要素を除外しないことを意味するように意図されている。本明細書で使用される場合、「本質的に〜からなる」という移行句（および文法的変形）は、列挙されている実施形態の列挙されている材料またはステップ「および基本的かつ新規な特徴に実質的な影響を及ぼさないもの」を包含すると解釈されるべきである。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９、５５１〜５２、１９０  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（原文では強調）を参照されたい；ＭＰＥＰ  §２１１１．０３．もまた参照されたい。よって、本明細書で使用される「本質的に〜からなる」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であるとは解釈されるべきでない。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、他の成分の微量を超える要素および本明細書で開示されている組成物を投与するための実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。
【００２９】
「培養」または「細胞培養」という用語は、一部の実施形態では接着細胞（例えば単層培養）としてまたはスフェロイドもしくはオルガノイドの浮遊凝集塊培養としての、人工的なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの２次元（２Ｄ、単層）または３次元の（３Ｄ）環境（ある特定の形態のマトリックス上にある場合または浮遊している場合は、細胞の極性化した形状）における細胞の維持を意味する。「スフェロイド」という用語は、すべて同じ細胞タイプの細胞の浮遊凝集塊（例えば、ある細胞株由来の凝集塊）を示し、「オルガノイド」は、複数の細胞タイプで構成される細胞の浮遊凝集塊である。一部の実施形態では、オルガノイドは、上皮と、内皮および／または間質細胞もしくは星状細胞を含む１種または複数の間葉系細胞タイプとの凝集塊であり得る。「細胞培養系」は、細胞集団が生存または成長し得る培養条件を指すために本明細書で使用される。
【００３０】
「培養培地」は、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養液を指すために本明細書で使用される。一部の実施形態では、培養培地は、アミノ酸、ビタミン、塩、脂質、ミネラル、微量元素のうちの１つまたは複数を含み、間質液の化学的構成成分を模倣している。培養培地は、細胞を成熟させるために、場合によっては特に幹／前駆体細胞を特定の系統の細胞に分化させるのを促進するために、特定の状態（例えば、多能性状態、静止状態など）に細胞を維持する能力などであるがこれらに限定されない、機能特性によって特徴付けることができる。幹／前駆体に使用される培養培地の非限定的な例は、Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍであり、これは本明細書において下記でさらに定義されている。一部の実施形態では、培地は、細胞を所与の環境中に提示または導入するために使用される「播種培地」であってもよい。
【００３１】
より詳細には、「基礎培地」は、細胞周囲の間質液の化学的構成成分を模倣する組成物中のアミノ酸、糖、脂質、ビタミン、ミネラル、塩、微量元素および様々な栄養素で構成されるバッファーである。そのような培地は任意選択で、生物学的プロセス（例えば、増殖、分化）を進めさせるために必要とされる必須シグナル伝達分子（ホルモン、成長因子）を提供するために、または細胞懸濁液の調製において通常使用される酵素に対する阻害剤の供給源として、血清を添加してもよい。血清は、培養で使用される細胞タイプの自己由来であってもよいが、最も一般的には、農業または食糧目的のために定期的に屠殺される動物の血清、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの血清である。血清を添加した培地は、場合により血清添加培地（ＳＳＭ）と称される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「分化」は、特定の条件により、細胞が、成熟特異的遺伝子産物を産生する成熟細胞タイプに成熟することを意味する。
【００３３】
「等価物」または「生物学的等価物」という用語は、特定の分子、生体物質または細胞物質に関する場合、同義で使用され、所望の構造または機能性を依然として維持しながら最低限の相同性を有するものを意図する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織サンプル中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定することができ、さらに、複数の遺伝子の発現レベルを決定して、特定のサンプルに関する発現プロファイルを確立することができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「機能的」という用語を使用して、任意の分子、生体物質または細胞物質を修飾して、それが特定の明記されている作用を実現することを意図することができる。
【００３６】
本明細書において使用される「遺伝子」という用語は、ＲＮＡがコーディング（例えば、ｍＲＮＡ）であるかまたはノンコーディング（例えば、ｎｃＲＮＡ）であるかにかかわらず、ＲＮＡ分子に転写される任意の核酸配列を含むことを広く意味する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「作製する（ｇｅｎｅｒａｔｅ）」という用語およびその等価物（例えば、作製すること、作製された、など）は、特定のモデルコロニー、臓器、またはオルガノイドが得られる方法ステップに関する場合、「生成する（ｐｒｏｄｕｃｅ）」およびその等価物と同義で使用される。
【００３８】
本明細書において使用される「単離された」という用語は、分子または生体物質または細胞物質が他の物質を実質的に含まないことを指す。
【００３９】
本明細書で使用される「Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ」は、内胚葉幹細胞用に設計され、それらが自己複製型の分裂でクローン形成により拡大することを可能にする（特に、ヒアルロナン基層上または３Ｄヒアルロナンヒドロゲル中にある場合）、無血清完全限定培地を指す。Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍは、銅非含有、カルシウム低含有（＜０．５ｍＭ）で、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、精製アルブミンと結合した精製遊離脂肪酸のミックス、および場合により高密度リポタンパク質もまた含有する、任意の基礎培地を指す場合もある。Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍまたはその等価物は、特に内胚葉幹細胞のための培養選択において無血清で使用され、精製されたシグナルの規定のミックス（インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ）、脂質、および栄養素だけを含有する。一部の実施形態では、この培地は、細胞をマトリックス足場中に導入する播種プロセスのために、および細胞懸濁液の調製に使用される酵素を不活性化するために、低レベル（典型的には５％以下）の血清を使用したＳＳＭとして一時的に使用することができ、可能な限り迅速に（例えば５〜６時間以内）無血清Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍに切り替えることが最適である。
【００４０】
ある特定の実施形態では、この培地は、銅非含有、カルシウム低含有（＜０．５ｍＭ）の、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン／Ｆｅ（５μｇ／ｍＬ）、高密度リポタンパク質（１０μｇ／ｍＬ）、セレン（１０−１０Ｍ）、亜鉛（１０−１２Ｍ）、ニコチンアミド（５μｇ／ｍＬ）、および精製アルブミンの形態と結合した精製遊離脂肪酸の混合物を添加した、無血清基礎培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０またはＤＭＥ／Ｆ１２）で構成される。この培地の調製に関する非限定的な例示的な方法は、他で、例えば、それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｕｂｏｔａ  Ｈ、Ｒｅｉｄ  ＬＭ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）２０００；９７：１２１３２〜１２１３７、Ｙ．Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｌ．Ｙａｏ、Ｃ．Ｂ．Ｃｕｉら  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１０；５２（４）：１４４３〜５４、Ｔｕｒｎｅｒら；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０００；８２（１）：１５６〜１６８ページ；Ｙ．Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｌ．Ｙａｏ、Ｃ．Ｂ．Ｃｕｉら  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１０  Ｏｃｔ  ５２（４）：１４４３〜５４で公開されている。無血清条件下での拡大を可能にするさらなる因子およびサプリメントを提供することによって、Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍの変形物をある特定の細胞タイプに使用することができる。例えば、Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍは、一過性増殖細胞（ｔｒａｎｓｉｔ  ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ）または分化決定した前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）（例えば肝芽細胞）および幹細胞集団より後の他の成熟系統段階が、無血清条件下でｅｘ  ｖｉｖｏで生存および拡大できるように変更してもよい。この一例は、肝芽細胞およびそれらの子孫である分化決定した前駆細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで拡大できるように変更されたＫｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍであり、すなわち、無血清Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、および場合によっては血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）をさらに添加される。得られる細胞拡大は、（もしあれば）最低限の自己複製とともに起こる。細胞がＩＶ型コラーゲンおよびラミニンの基層上にある、または５０％超のＩＶ型コラーゲンおよびラミニンを含有する３Ｄヒドロゲル中に包埋されている場合、この培地は特に有効である。
【００４１】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義で使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは任意の３次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。
【００４２】
ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などを含むことができる。存在する場合、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に、ヌクレオチド構造に対する修飾を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。別途明記されているかまたは必要とされない限り、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られているまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態の各鎖との両方を包含する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「臓器」という用語は、個体生物のある特定の機能が局所的に果たされ、かつ形態学的に独立している、その個体生物の特定の部分である構造を指す。臓器の非限定的な例としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、および脳が挙げられる。臓器は、組織供給源として使用されてもよく、例えば、胎児、新生児、小児（子供）、または成人の臓器を使用して、本明細書で開示されている使用のための対象とする細胞集団を得てもよい。「組織」という用語は、生きているもしくは死亡した生物の組織、または生きているもしくは死亡した生物から得られるもしくはそれを模倣するように設計された任意の組織を指すために本明細書で使用される。組織は、健康なもの、罹患したものおよび／または遺伝子変異を有するものでもよい。本明細書で使用される「天然組織」または「生体組織」という用語およびそれらの変形は、その天然なまたは生物から得られたときから変更されてない状態で存在するままの生体組織を指す。「マイクロ臓器」は、「天然組織」を模倣する「バイオ人工（ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）組織」のセグメントを指す。
【００４４】
生体組織は、任意の単一組織（例えば、相互接続していてもよい細胞の集合体）または生物の体の臓器もしくは部分もしくは領域を構成している組織の群を含み得る。組織は、均質な細胞物質を含んでもよく、または組織は、例えば肺組織、骨格組織、および／または筋組織を含み得る胸部を含めた体の領域において見られるものなどの複合構造であってもよい。例示的な組織は、それらの任意の組み合わせを含めて、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸から得られるものを含むがこれらに限定されない。
【００４５】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、同義で使用され、それらの最も広い意味で、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットはペプチド結合によって連結されていてもよい。別の態様では、サブユニットは、別の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されていてもよい。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数は限定されない。本明細書で使用される場合「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤおよびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体ならびにペプチド模倣体を含む天然および／または非天然または合成のアミノ酸を指す。
【００４６】
本明細書で使用される「播種」という用語は、細胞をあるもの、例えば、バイオマトリックス足場上に導入する方法を指す。播種は、プレートおよび／またはバイオリアクターを含むがこれらに限定されない様々な容器において行うことができる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意の動物を意味することが意図されている。一部の実施形態では、対象は哺乳動物であってもよく、さらなる実施形態では、対象は、ヒト、マウス、またはラットであってもよい。
【００４８】
本明細書で使用される場合、対象において疾患を「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、（１）疾患にかかりやすい、もしくは疾患の症状をまだ示していない対象において症状もしくは疾患が発生するのを予防すること；（２）疾患を抑制することもしくはその発症を阻止すること；または（３）疾患もしくは疾患の症状を改善もしくは後退させることを指す。当技術分野において理解されているように、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を含む結果を得るための手法である。本発明の技術の目的のために、有益なまたは所望の結果は、検出可能であるかまたは検出不可能であるかにかかわらず、１つまたは複数の症状の軽減または改善、状態（疾患を含む）の程度の縮小、状態（疾患を含む）の安定した（すなわち、悪化していない）状況、状態（疾患を含む）の進行が遅れるまたは緩徐になること、状態（疾患を含む）の改善または一時的緩和、寛解の状況（部分的か完全かにかかわらず）のうちの１つまたは複数を含むことができるがこれらに限定されない。
【００４９】
バイオマトリックス足場および細胞外マトリックス
本明細書において使用される「細胞外マトリックス、」または「ＥＣＭ」という用語は、細胞により分泌される様々な生物活性分子で構成され、１つまたは複数の細胞表面に隣接し、かつ細胞およびそれらで構成される組織または臓器の構造的および／または機能的支持体に関与する複雑な足場を指す。多くの細胞タイプに共有されるマトリックス成分があるが、ＥＣＭの化学組成は組織特異的である。特異的なマトリックス成分およびその濃度は、特定の組織の種類、組織学的構造、臓器、および他の超細胞構造に関連し得る。本開示に関連する細胞外マトリックスの成分は、コラーゲン、コラーゲン関連マトリックス成分（例えばフィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン）、およびシグナル伝達分子（成長因子、サイトカイン）を含むがこれらに限定されない。
【００５０】
一部の実施形態では、バイオマトリックス足場を単離するためのストラテジーは、組織のすべてのコラーゲン分子を不溶性に保つように主として設計されるため、主な検討事項はコラーゲンおよびそれらに結合している因子である。一般に、コラーゲン分子は、既知のコラーゲンの種類のそれぞれに特有のアミノ酸化学的性質を有する。現在のところ、既知の２９種類のコラーゲンが存在する。すべての既知のコラーゲン分子は、分子の中央に棒状ドメイン、および両端に球状ドメインを有する、ひものような「編まれた（ｗｏｖｅｎ）」３つのアミノ酸鎖で構成される（このように、コラーゲン分子は「ダンベル」状の形状を有する）。棒状ドメインには、アミノ酸の３つ組［グリシン−プロリン−Ｘ］（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）の反復が優位を占めている。球状ドメインは、各コラーゲンの種類に特有のアミノ酸配列で構成される。
【００５１】
コラーゲンは細胞から分泌され、その後、この分子の一方または両方の球状端部が特定のペプチダーゼによって除去され、続いて複数のコラーゲン分子が凝集してコラーゲン原線維を形成する。例外は、球状ドメインを保持し、そして端部同士で凝集して「亀甲金網（ｃｈｉｃｋｅｎ−ｗｉｒｅ）」状構造を有するコラーゲン分子のネットワークを形成する、「網目状コラーゲン」（例えばＩＶ型またはＶＩ型）である。
【００５２】
原線維またはネットワークに凝集した後、コラーゲンは、コラーゲン分子間で（およびエラスチン分子間でも）共有結合を生じる、細胞外銅依存性酵素であるリシルオキシダーゼの作用により架橋されて、非常に安定なコラーゲン分子凝集塊を構成する架橋形態を生成する。原線維のコラーゲンにおける原線維１つ当たりのコラーゲン分子の数、または網目状コラーゲンにおける連結パターンは、具体的なコラーゲンの種類の正確なアミノ酸化学的性質によって規定される。
【００５３】
その細胞外マトリックスを単離するための組織の抽出は、不溶性形態の組織のコラーゲンを単離することに重点をおいたストラテジーによって実現可能である。コラーゲンは、非コラーゲン性マトリックス成分が付着する足場材であることが知られており、シグナル伝達分子は、マトリックス結合成分の多くに結合する。細胞外マトリックス成分の複合体の自己集合は、架橋コラーゲンだけでなく非架橋コラーゲンでも起こる。よって、不溶性形態の組織のコラーゲンのすべてを回収するストラテジーは、マトリックスの既知の成分の大部分を回収するために理想的なストラテジーである。
【００５４】
マトリックスの単離は、中性ｐＨで塩濃度が１Ｍ以上であるバッファーを利用することによって達成することができる。架橋コラーゲンは、蒸留水を用いても単離および保存できるが、非架橋コラーゲンを不溶性として保存するために必要とされる塩の正確な濃度は、コラーゲンの種類に左右される。例えば、皮膚において豊富に見出されるＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンは、不溶性のままであるために約１Ｍの塩を必要とする。対称的に、高レベルのＶ型コラーゲンを含む羊膜中のコラーゲンは、３．５〜４．５Ｍの塩を必要とする。肝臓中の非架橋コラーゲンならびに架橋コラーゲンは、不溶性のままであるために約３．４〜３．５Ｍの塩を必要とする。
【００５５】
細胞外マトリックス中の濃縮された抽出物を調製する大部分の方法は、非架橋コラーゲンおよび関連する成分の、すべてではないが大部分を失う条件を使用する。マトリックス足場単離における最も一般的なストラテジーは、非架橋コラーゲンおよびそれらに結合した任意の因子を溶解させる、ａ）マトリックス成分を分解する酵素、および／またはｂ）低塩もしくは無塩バッファー（例えば蒸留水）の使用、のいずれかを用いる。そのため、架橋コラーゲンおよびそれらの架橋コラーゲンに結合した任意の因子を含有するが、非架橋コラーゲンおよびそれらの関連成分を含まないかまたはその最小限の量を有する、マトリックス足場のための脱細胞化された組織抽出物の複数の形態が存在する。
【００５６】
「バイオマトリックス足場」（ＢＭＳ）という用語は、組織のコラーゲンのすべてを不溶性形態に保つストラテジーによって生成される細胞外マトリックスの単離抽出物を指す。ＢＭＳ抽出物は、それらの化学的性質およびそれらの作用に関して組織特異的である。本明細書に記載されている通り、ＢＭＳは、生体組織において天然に見出されるコラーゲンおよび／またはコラーゲン結合因子の一部を、任意選択で大部分を、保持する。一部の実施形態では、ＢＭＳは、すべてバイオマトリックス足場の一部である（例えば、バイオマトリックス足場という用語に包含される）、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン／エンタクチン、エラスチン、インテグリン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（硫酸化および非硫酸化、ヒアルロナンを含む）およびこれらの任意の組み合わせを含み、これらからなり、または本質的にこれらからなる。
【００５７】
一部の実施形態では、ＢＭＳは、（ｉ）新生（新しく形成された）コラーゲン、（ｉｉ）凝集しているが架橋されていないコラーゲン分子（コラーゲン原線維）、（ｉｉｉ）架橋コラーゲン、（ｉｖ）コラーゲンに結合した非コラーゲン性マトリックス成分（例えばラミニン、フィブロネクチン、ナイドジェン／エンタクチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン）、（ｖ）これらの様々な形態のコラーゲンおよび／またはコラーゲンに結合した非コラーゲン性因子に結合したシグナル伝達分子を含む、組織のコラーゲンを含む。一部の実施形態では、架橋および非架橋ネイティブコラーゲンの両方の大多数が、非コラーゲン性マトリックス分子およびこれらのコラーゲンに結合したシグナル伝達分子と一緒に、組織中に見出される。一部の実施形態では、ＢＭＳは、１つまたは複数のコラーゲン関連マトリックス成分、例えば、ラミニン、ナイドジェン、エラスチン、プロテオグリカン、ヒアルロナン、非硫酸化グリコサミノグリカンおよび硫酸化グリコサミノグリカン、ならびにマトリックス成分に付随する成長因子およびサイトカインを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、ＢＭＳは、ｉｎ  ｖｉｖｏで見出されるマトリックス結合シグナル伝達分子の５０％超を含む。一部の実施形態では、マトリックス結合シグナル伝達分子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ヘパリン結合性成長因子、ＩＧＦ結合タンパク質、胎盤成長因子、およびＷｎｔシグナルであり得る。
【００５９】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているＢＭＳは、架橋および非架橋コラーゲンの両方を保存するために、低イオン強度バッファーを避けて調製される。一部の実施形態では、ＢＭＳは、検出可能な量の特定のコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン／エンタクチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよび／またはこれらの任意の組み合わせを含まなくてもよい。一部の実施形態では、コラーゲンおよびコラーゲン結合因子の本質的にすべてが保持される。別の実施形態では、ＢＭＳは、組織中にあることが知られているコラーゲンのすべてを含む。
【００６０】
ＢＭＳは、天然の生体組織において見出される、任意の組み合わせのコラーゲン、コラーゲン関連マトリックス成分および／またはマトリックス結合シグナル伝達分子（例えば、成長因子、ホルモンおよび／またはサイトカイン）の、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＳは、生体組織のコラーゲンの少なくとも９５％、ならびにコラーゲン関連マトリックス成分およびマトリックス結合シグナル伝達分子の大部分を含む。本明細書に記載のコラーゲンは、凝集して原線維を形成しているがまだ架橋されていない新生（新しく形成された）コラーゲンであってもよく、一部は、これらの架橋された形態であってもよい。例示的なコラーゲンおよびその抽出方法は、本明細書において下記で簡潔に記載されている。
【００６１】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているバイオマトリックス足場は、新生（新しく形成された）コラーゲン、架橋前に自己集合して原線維を形成している凝集したコラーゲン分子、加えて架橋コラーゲンを含むコラーゲンの本質的にすべてを含有する。加えて、バイオマトリックス足場は、他のマトリックス成分に加えてこれらのコラーゲンにまたは結合したマトリックス成分に結合したシグナル伝達分子を任意に含んでもよい。一部の実施形態では、バイオマトリックス足場中のコラーゲンの比率は、バイオマトリックス足場が得られる組織中の比率とほぼ同等または同一である。元の組織を模倣するための好適な新生コラーゲンおよび凝集した非架橋コラーゲンのパーセンテージの非限定的な例は、少なくとも約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％を含むがこれらに限定されない。
【００６２】
本明細書で記載されているように、生体組織のコラーゲン関連マトリックス成分ならびにマトリックスに結合した成長因子、ホルモンおよび／またはサイトカインの大部分は、天然の（例えば、未処理の）生体組織において見出されるコラーゲン関連マトリックス成分ならびにマトリックスに結合した成長因子、ホルモンおよび／またはサイトカインの約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％を保持するバイオマトリックス足場を指す。「粉末化された」または「微粉砕された」という用語は、本明細書において同義で使用されて、粉砕されて粉末になったバイオマトリックス足場を表す。「３次元バイオマトリックス足場」という用語は、そのネイティブな３次元構造を保持する脱細胞化された足場を指す。そのような３次元足場は、足場全体（ｗｈｏｌｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）またはその凍結切片のいずれであってもよい。いくつかの目的のために、足場は液体窒素温度で微粉砕することができる（凍結粉砕と呼ばれるプロセス）。
【００６３】
例示的なコラーゲンは、Ｉ型〜ＸＸＩＸ型コラーゲンと現在同定されているものなどであるがこれらに限定されない、よってさらに他の種類のコラーゲンが将来認識されることを考慮した、すべての種類のコラーゲンを含む。バイオマトリックス足場は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上の、ネイティブな生体組織において見出されるコラーゲンの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、コラーゲンは架橋および／または非架橋である。バイオマトリックス足場中のコラーゲンの量は、ヒドロキシプロリン含有量の決定などであるがこれらに限定されない、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている様々な方法によって決定することができる。その溶解特性の観察に依拠するものなどの、コラーゲンの架橋または非架橋特徴のどちらかを判定する例示的な方法もまた存在する。例えば、Ｄ．Ｒ．Ｅｙｒｅ、＊Ｍ．ＷｅｉｓおよびＪ．Ｗｕ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ  ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００９；４５（１）：６５〜７４（コラーゲン化学の分野での標準的な方法による架橋の分析を記載している）を参照されたい。例えば、コラーゲンは、１Ｍ以下の塩濃度のバッファー中に溶解するかどうかに基づいて、架橋されていると判定することができる。
【００６４】
例示的なコラーゲン関連マトリックス成分は、接着分子（フィブロネクチンおよびラミニンのファミリー）；ＬおよびＰセレクチン；ヘパリン結合成長関連分子（ＨＢ−ＧＡＭ）；トロンボスポンジンタイプＩリピート（ＴＳＲ）；アミロイドＰ（ＡＰ）；ナイドジェン／エンタクチン；エラスチン；ビメンチン；プロテオグリカン（ＰＧ）；コンドロイチン硫酸ＰＧ（ＣＳ−ＰＧ）；デルマタン硫酸−ＰＧ（ＤＳ−ＰＧ）；スモールロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーのメンバー、例えばバイグリカンおよびデコリンなど；ヘパリン−ＰＧ（ＨＰ−ＰＧ）；ヘパラン硫酸−ＰＧ（ＨＳ−ＰＧ）、例えばグリピカン、シンデカン、およびパールカンなど；ならびにグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えばヒアルロナン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、およびヘパリンなどを含むがこれらに限定されない。
【００６５】
一部の実施形態では、バイオマトリックス足場は、様々なマトリックス成分に結合した、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン／エンタクチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、成長因子、ホルモン、およびサイトカイン（任意の組み合わせで）を含むか、これらからなるか、または本質的にこれらからなる。バイオマトリックス足場は、少なくとも約５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上の、天然の生体組織において見出されるコラーゲン関連マトリックス成分、ホルモンおよび／またはサイトカインの１つまたは複数を含んでもよく、かつ／または天然の生体組織において見出される濃度の少なくとも約５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上の濃度で存在するこれらの成分の１つまたは複数を有してもよい。
【００６６】
一部の実施形態では、バイオマトリックス足場は、組織中にあることが知られているコラーゲン関連マトリックス成分、ホルモンおよび／またはサイトカインのすべてまたは大部分を含む。別の実施形態では、バイオマトリックス足場は、天然の生体組織において見出される濃度に近い濃度（例えば、天然組織において見出される濃度の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）の、コラーゲン関連マトリックス成分、ホルモンおよび／またはサイトカインの１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。
【００６７】
例示的なマトリックス結合シグナル伝達分子は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ヘパリン結合性成長因子、ＩＧＦ結合タンパク質、胎盤成長因子、Ｗｎｔシグナルを含むがこれらに限定されない。
【００６８】
例示的なサイトカインは、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含むがこれらに限定されない。バイオマトリックス足場は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、１００％またはそれ以上の（任意の組み合わせで）、天然の生体組織において見出されるマトリックス結合成長因子および／またはサイトカインの１つまたは複数を含んでもよく、かつ／または天然の生体組織において見出される濃度の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、１００％またはそれ以上の濃度で存在する、これらの成長因子および／またはサイトカイン（任意の組み合わせで）の１つまたは複数を有してもよい。
【００６９】
一部の実施形態では、バイオマトリックス足場は、生理的レベルまたはほぼ生理的レベルの、天然組織中にあり、かつ／または組織中で検出されることが知られている、マトリックスに結合した成長因子、ホルモンおよび／またはサイトカインの多くまたは大部分を含み、別の実施形態では、バイオマトリックス足場は、天然の生体組織において見出されるそれらの生理的濃度に近い（例えば、比較すると約３０％、２５％、２０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％以下の差で異なる）濃度の、マトリックスに結合した成長因子、ホルモンおよび／またはサイトカインの１つまたは複数を含む。バイオマトリックス足場中に存在する成長因子またはサイトカインの量または濃度は、様々な抗体アッセイおよび成長因子アッセイなどであるがこれらに限定されない、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている様々な方法によって決定することができる。
【００７０】
バイオマトリックス足場およびその単離に関する方法および組成物は、例えば、米国特許第８，８０２．０８１号、米国特許第９，１０２，９１３号、米国特許第７，４５６，０１７号、および米国特許仮出願第６２／３３５，０１３号において論じられている。
【００７１】
本明細書で開示されているバイオマトリックス足場は、バイオマトリックス足場の凍結切片、凍結粉砕されたバイオマトリックス足場、またはインタクトなバイオマトリックス足場を含むがこれらに限定されない、様々な形態で使用することができる。
【００７２】
がんおよび腫瘍
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、体の任意の部分または任意の細胞タイプに由来するがんを指す。この用語は、癌腫、肉腫、血管腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、および芽細胞種を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、体の特定の場所または特定の疾患に関連する。本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、良性または悪性の任意のタイプの腫瘍組織を指す。ある特定の腫瘍を処置するためにがん療法および／または化学療法剤を使用することができることが十分に理解される。
【００７３】
一般に、がんは、組織／臓器内の細胞同士の関係に影響を及ぼす遺伝的および／またはエピジェネティックな異常を伴う、組織の疾患である。最も一般的なものの１つは、後生動物、組織で構成される生物、細胞の組織化されたコミュニティ内の基礎的な細胞間の関係を構成する上皮−間葉系細胞の関係の異常である。すべての正常な組織は、間葉系細胞の成熟系統と、および成熟過程において互いに同等な系統と組になった上皮細胞の成熟系統で構成される。上皮−間葉系の関係は、細胞外マトリックス複合体とシグナル伝達分子との動的および相乗的な相互作用からなるパラ分泌シグナル伝達によって仲介される。先天性の遺伝的欠陥によって、または放射線によって、または環境有害物質（化学物質）によって引き起こされる細胞の１つまたは複数の変異により、上皮細胞は間葉系細胞から質的または量的に独立し得る。癌腫は上皮の悪性腫瘍であり、肉腫は間葉系細胞の悪性腫瘍であり、血管腫は内皮の悪性腫瘍であり、白血病およびリンパ腫は血液細胞の悪性腫瘍の代表であるなど、悪性細胞はあらゆる年齢のドナーにおいてあらゆる組織で生じる可能性があり、悪性腫瘍が最初に発生する部位である原発部位において破壊を引き起こす可能性がある。悪性腫瘍は拡散し、すなわち体内の他の部位に転移し、遠位部位において破壊を引き起こす可能性がある。一部の実施形態では、がんは、体の特定の場所または特定の疾患に関連する。
【００７４】
細胞の悪性転換には、細胞における１つまたは複数の遺伝的および／またはエピジェネティックな変化が伴い、これは、特定の腫瘍の種類に特異的である。悪性腫瘍における、特に転移可能性における既知の遺伝的およびエピジェネティックな変化についての考察は、非常に多くの最近の総説において記載されている。例えば、Ｔｕｒａｊｌｉｃ  Ｓ、Ｓｗａｎｔｏｎ  Ｃ．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６年４月８日；３５２（６２８２）：１６９〜７５．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｓｕｖａ  ＭＬ、Ｒｉｇｇｉ  Ｎ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＢＥ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３年３月２９日；３３９（６１２７）：１５６７〜７０．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｖａｎｈａｒａｎｔａ  Ｓ、Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ．Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｒａｉｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１３年１０月１４日；２４（４）：４１０〜２１．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ１、Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ＶＥ、Ｚｈｏｕ  Ｓ、Ｄｉａｚ  ＬＡ  Ｊｒ、Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ．Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３年３月２９日；３３９（６１２７）：１５４６〜５８．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｍａｒｑｕａｒｄｔ  ＪＵ、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＭ、Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ  ＳＳ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１０年９月；５３（３）：５６８〜７７．Ｒｅｖｉｅｗを参照されたい。
【００７５】
悪性転換を起こさせる１つまたは複数の遺伝的またはエピジェネティックな変化の存在は、悪性細胞と近傍の細胞との相互作用に変化をもたらす可能性がある。通常は組織の細胞コミュニティの活性と連係して働くパラ分泌シグナルに対する、悪性細胞の依存度が低くなる可能性がある。近年、こうした変化の一部が、悪性細胞から放出される、細胞膜に包まれた球体である「エクソソーム」に関与することが分かった。エクソソームは、間質液中に、血液中に、および／または近傍の細胞からなる微小環境中に放出され得る。エクソソームは、悪性細胞の細胞質成分、マイクロＲＮＡ、および酵素活性の部分を含有し、近傍の細胞の細胞膜と融合することができ、そのためエクソソームの内容物を近傍の細胞に送達することができる。このプロセスは、近傍の細胞の生物学的活性を変え得る。エクソソームはまた、リンパ管または血流を介して原発性腫瘍部位から遠位の部位に分散され、それらの部位の細胞と融合し、それらの遠位部位における細胞の生物学的活性を変える可能性がある。実際に、近傍の細胞または遠位部位の細胞のこの変更は、浸潤または転移の前段階であることがある。
【００７６】
大部分の悪性腫瘍の致死的な側面は、それらの転移する能力である。腫瘍が遠位部位に拡散する能力は、細胞がどこに向かうかに関してパターンを示すと長い間理解されてきた。乳がんおよび前立腺がんは骨、肝臓、肺および脳に転移し、結腸がんは肝臓、肺および腹膜に転移し、甲状腺がんは肝臓、肺および骨に拡散するなどである。転移の初期段階では、限られた一連の組織が転移巣を有するが、がんの後期段階では全身にわたって拡散する。
【００７７】
転移のプロセスに大きな影響力を持つ可変要素としては、腫瘍細胞による酵素の産生が挙げられ、これは細胞外マトリックスの成分を溶解させることができ、遠位部位への腫瘍細胞の浸潤および分散を可能にする。酵素のレパートリーは、様々な分類の腫瘍において特異である。例えば、肉腫は、腫瘍細胞が血管中に迅速に拡散し、そのため血行性（血管）経路によって腫瘍が他の部位に容易に拡散することを可能にする酵素を産生する。対称的に、癌腫は、典型的には、腫瘍細胞がリンパ管路の中に、および後期段階においてのみ血管路の中に、拡散することを可能にする酵素を産生する。
【００７８】
拡散または転移の経路（例えば、血行性経路に対するリンパ管経路）により、二次的に、多様な組織中に腫瘍細胞が播種されることになる。腫瘍細胞がある組織に拡散している、および付着していることが分かっている場合であっても、それらの腫瘍細胞は必ずしもその組織において成長およびコロニー形成するわけではない。がんにおける初期および中期段階において、腫瘍はある特定の遠位部位においてのみ、優先的に成長またはコロニー形成する。対称的に、がんの後期段階では、腫瘍細胞は通常、ほとんどの組織において見出され得、存在するいかなる「バリア」も破ってそれらの組織内で腫瘍細胞は成長する。
【００７９】
この転移の臓器部位特異性は、「種と土壌」説として、この現象に言及したＳｔｅｐｈｅｎ  Ｐａｇｅｔによって１８８９年に記載されていた。これにより、Ｐａｇｅｔ博士は、「種」（腫瘍細胞）および「土壌」（組織の微小環境）において可変要素が存在すると述べた。Ｉｓａｉａｈ  Ｆｉｄｌｅｒ博士による最近の総説（Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ｔｈｅ‘ｓｅｅｄ  ａｎｄ  ｓｏｉｌ’  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；３，４５３〜４５８）に概説されているように、これは１００年以上にわたって研究の対象となっている。
【００８０】
所与の腫瘍により産生される酵素のレパートリーは、拡散経路における、およびある程度は所与の組織にコロニー形成する能力においても、可変要素であることが知られているが、この酵素のレパートリーは、転移の臓器部位特異性という現象を説明するには不十分である。出願人らは、以下の実験において、別の可変要素の組が、組織特異的な形態の細胞外マトリックスの化学的性質の中に存在することを示す。マトリックスの化学的性質は、それぞれの組織に特有であり、組織の微小環境中で腫瘍細胞が生存および成長する能力を規定する。理論に拘束されるものではないが、出願人らは、Ｐａｇｅｔが「土壌」のものとした可変要素のいくつかは、細胞外マトリックスに起因し得るものであると仮定する。疾患の初期から中期段階において、マトリックスの化学的性質による調節により、腫瘍細胞が生存および成長するかどうかを支配および規定することができる。また、後期段階において、腫瘍細胞は非常に多量の（および非常に多数の）酵素を産生するため、マトリックス内の可変要素および腫瘍細胞成長の制御は弱まるかまたは消滅し、腫瘍細胞が大部分の組織において成長する能力をもたらす。
【００８１】
がん療法および化学療法剤
本明細書で使用される場合、「がん療法」という用語は、寒冷療法、温熱療法、光線力学的療法、レーザー療法、放射線療法、がん特異的抗体療法、化学療法、養子細胞移植、サイトカイン療法、免疫療法、ワクチン接種、カルメット−ゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、ＣＡＲ細胞療法、内分泌療法（ホルモン療法としても知られている）、幹細胞療法（自家、同種異系、または同系）、および他の種類の標的または非標的療法を含むがこれらに限定されない、がんに使用される任意の既知の処置レジメンを意図する。ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖの米国国立がん研究所ウェブサイト（最終訪問日２０１６年５月６日）を参照されたい。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「化学療法剤」という用語は、がんを処置するために使用される小分子化合物などのがんを処置するために有用な部分を指し、すべての剤形、製剤、およびがんを処置するために有用な多数の既知の作用物質を包含する。化学療法剤の非限定的な例としては、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、またはこれらの誘導体など；抗生物質、例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、またはこれらの誘導体など；アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、メコールレタミン（ｍｅｃｈｏｌｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ベンダムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、アルトレタミン、またはこれらの誘導体など；白金製剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、またはこれらの誘導体など；代謝拮抗物質、例えば、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、ペメトレキセド、ペントスタチン、チオグアニン（ｔｈｏｇｕａｎｉｎ）、またはこれらの誘導体など；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、ミトキサントロン、またはこれらの誘導体など；有糸分裂阻害剤、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、イザベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、エストラムスチン、またはこれらの誘導体などが挙げられる。
【００８３】
細胞減少剤、例えば、細胞増殖を減少させるように作用する作用物質などは、当技術分野において知られており、広く使用されている。それらが分裂しているときにだけがん細胞を死滅させる作用物質は、「細胞周期特異的」と呼ばれ、Ｓ期において作用する作用物質（例えば、トポイソメラーゼ阻害剤および代謝拮抗物質）を含む。
【００８４】
トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｓｉｏｍｅｒａｓｅ）阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ）の作用を妨げる薬物である。化学治療のプロセスの間、トポイソメラーゼ酵素は、複製に必要なＤＮＡ構造の操作を制御しており、よって細胞周期特異的である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の例は、上記で列挙されたカンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）類似体、イリノテカンおよびトポテカンを含む。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の例は、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、およびテニポシドを含む。
【００８５】
代謝拮抗物質は一般に、染色体複製に関与するプロセスをしばしば妨げる、通常の代謝基質の類似体である。これらの代謝拮抗物質は、周期中の非常に特殊な局面で細胞を攻撃する。代謝拮抗物質は、葉酸拮抗薬、例えば、メトトレキセート；ピリミジン拮抗薬、例えば、５−フルオロウラシル、フォクスウリジン（ｆｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン；プリン拮抗薬、例えば、６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン；アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えば、クラドリビン、フルダラビン、ネララビンおよびペントスタチン；などを含む。
【００８６】
植物アルカロイドは、ある特定の種類の植物から得られる。ビンカアルカロイドはニチニチソウ植物（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅａ）から作られる。タキサンは、タイヘイヨウイチイ樹木（イチイ属植物）の樹皮から作られる。ビンカアルカロイドおよびタキサンは、抗微小管剤としても知られている。ポドフィロトキシンは、メイアップル（ポドフィルム）植物から得られる。カンプトテカン類似体は、アジアの「カンレンボク（キジュ）」（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）から得られる。ポドフィロトキシンおよびカンプトテカン類似体は、トポイソメラーゼ阻害剤にも分類される。植物アルカロイドは一般に、細胞周期特異的である。
【００８７】
これらの作用物質の例としては、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビン；タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル；ポドフィロトキシン、例えば、エトポシドおよびテニソピド（ｔｅｎｉｓｏｐｉｄｅ）；ならびにカンプトテカン類似体、例えば、イリノテカンおよびトポテカンが挙げられる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「内分泌療法」という用語は、内分泌療法のすべての方法、すなわち、ホルモンを追加、遮断または除去する処置を指す。ある特定の状態（糖尿病または更年期障害など）では、ホルモンを投与して低いホルモンレベルを調整する。ある特定の状態では、ある特定のがん（前立腺および乳がん）の成長を緩徐にするまたは停止させるために、合成ホルモンまたは別の薬物を投与して体の天然のホルモンを遮断することができる。ＮＣＩ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｅｒｍｓを参照されたい。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「免疫療法」という用語は、免疫系を刺激または抑制して体ががん、感染、および他の疾患と闘うのを助ける物質を使用する生物学的療法の種類を指す。いくつかの種類の免疫療法は、免疫系のある特定の細胞だけを標的化する。別の免疫療法は、全般的に免疫系に影響を及ぼす。免疫療法の非限定的な例としては、サイトカイン、ワクチン、カルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）、およびいくつかのモノクローナル抗体が挙げられる。ＮＣＩ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｅｒｍｓを参照されたい。一部の実施形態では、免疫療法は、樹状細胞療法、抗体依存性療法、Ｔ細胞依存的療法、またはＮＫ細胞依存的療法であってもよい。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「分子療法」という用語は、がん成長を進ませる特有の分子異常を中断することによってがんを処置するように設計された個別化療法を指す。阻害性またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、任意のタイプの干渉ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）など）などであるがこれらに限定されない薬物および／または分子剤を、特定のがんの発症、成長、および拡散の中心となる特定の生化学的経路を妨げるように設計された標的療法において使用することができる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「放射線療法」という用語は、外照射放射線療法、密封放射線源療法（ｓｅａｌｅｄ  ｓｏｕｒｃｅ  ｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、および全身的放射性同位体療法を含む放射線療法のすべての方法を指す。一部の実施形態では、放射線を、腫瘍部位などの標的部位に局所的に集中させる。一部の実施形態では、放射線療法は、プロドラッグコンジュゲートの投与前に行われる。放射線療法を使用する任意の実施形態では、放射線療法は、ガンマナイフ放射線、サイバーナイフ放射線、および／または高密度焦点式超音波放射線を含み得る。
【００９２】
「ファーストライン」または「セカンドライン」または「サードライン」という語句は、患者が受ける処置の順序を指す。ファーストライン療法レジメンは、最初に行われる処置であり、一方、セカンドまたはサードライン療法はそれぞれ、ファーストライン療法の後、またはセカンドライン療法の後に行われる。米国国立がん研究所は、ファーストライン療法を、「疾患または状態の最初の処置」と定義している。がん患者において、一次治療は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの療法の組み合わせであり得る。ファーストライン療法は、当業者に「一次療法および一次治療」とも呼ばれている。ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖの米国国立がん研究所ウェブサイト（最終訪問日２０１６年５月６日）を参照されたい。典型的には、患者がファーストライン療法に対して陽性の臨床的または準臨床的反応を示さなかった、またはファーストライン療法が中止されたという理由から、患者はその次の化学療法レジメンを受ける。
【００９３】
略語
以下の略語が、本開示の全体にわたって出現する。
【００９４】
以下は本明細書で使用される略語の非限定的なリストであり、成長因子およびサイトカインに関して使用されるものとは無関係である。頭字語が因子を示し、イタリック体で示されている場合、これは、遺伝子を指す。標準フォントの場合、これは、その遺伝子によってコードされているタンパク質を示す。頭字語が細胞集団に関するものである場合、細胞が得られた種は、頭字語の前の小文字で示されている。例えば、ｍ＝マウスの（マウス）；ｒ＝ラット；ｈ＝ヒト。
【００９５】
ＢＭＳ、バイオマトリックス足場、細胞外マトリックス中の濃縮された組織特異的抽出物    ；Ｃａｃｏ−２、Ｊｏｒｇｅｎ  Ｆｏｇｈ博士（Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＮＹＣ、ＮＹ）によって確立された上皮結腸直腸−腺癌細胞株（これは、別個の条件下で、この細胞株が培養条件に応じて小腸様細胞か大腸（結腸）細胞かのいずれかに系統制限できるようにする腸管幹細胞特性を有する）；ＣＤ、共通の決定因子；ＣＤ３４、造血幹／前駆体細胞抗原；ＣＤ４５、大部分の造血細胞亜集団において見出される共通白血球抗原；ＣＲＣ、結腸直腸がん；ＣＹＰ、薬物代謝ならびに／またはコレステロール、ステロイドおよび脂質の合成に関連する多くの反応を触媒する、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ；ＣＫ、サイトケラチン；ＣＫ７、胆管細胞に関連するサイトケラチン；ＣＫ８およびＣＫ１８、すべての上皮に関連するサイトケラチン；ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着分子；ＦＢＳ、ウシ胎児血清；ＧＡＧ、グリコサミノグリカン、二量体（ウロン酸およびアミノ糖）のポリマーである糖鎖、それらの大部分が、シグナル伝達プロセスにおいてタンパク質と協調して多様な役割を果たす特定の硫酸化パターンを有する；ＨＤＬ、高密度リポタンパク質；ＨＤＭ、特定の細胞タイプの維持または分化に使用される無血清のホルモン添加限定培地（ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリンおよびエオシン；ＨＴ−２９、ある条件下では未分化細胞として挙動する一方、分化条件下では極性形態を有する細胞を生じる、結腸直腸腺癌細胞株、膜抗原の再分布および頂端刷子縁膜の発生によって特徴付けられる；ＫＭ、Ｋｕｂｏｔａ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、内胚葉幹細胞用に設計された無血清培地であり、一部を変更すれば肝芽細胞などの幹細胞の成熟子孫または分化決定した前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）にも使用することができる；ＬＧＲ５、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５、腸、肝臓および膵臓における重要な幹細胞マーカー；ＭＭＰ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（またはペプチダーゼ）；ＭＭＰ２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２、７２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼまたはゼラチナーゼＡ（ＧＥＬＡ）；９２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼまたはゼラチナーゼＢ（ＧＥＬＢ）としても知られている、ＭＭＰ９、マトリックスメタロペプチダーゼ９は、細胞外マトリックスの分解に関与する亜鉛メタロプロテイナーゼファミリーの酵素のクラスであるマトリキシンである；ＰＡＳ、過ヨウ素酸シッフ；ＳＤＣ、デオキシコール酸ナトリウム；ＳＥＭ、走査型電子顕微鏡；ＳＷ４８０、転移巣（疾患：デュークス分類Ｂ）から得られるヒト結腸直腸腺癌細胞株；ＴＥＭ、透過型電子顕微鏡。
【００９６】
シグナル（成長因子、ホルモン、サイトカイン）に関する頭字語
ＢＭＰ、骨形成タンパク質は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する多機能成長因子である；ｂＦＧＦ、塩基性線維芽細胞成長因子；ＥＧＦ、上皮成長因子；ＥＧＦＲ、上皮成長因子受容体；ＦＧＦ、線維芽細胞成長因子（例えばＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７）；ＦＧＦ−４、線維芽細胞成長因子−４；ＦＧＦ−６、線維芽細胞成長因子−６；ＦＧＦ−７、線維芽細胞成長因子−７；ＧＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子；ＧＤＮＦ、グリア由来神経栄養因子；ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモン；ＨＧＦ、肝細胞成長因子；ＨＢ−ＥＧＦ、ヘパリン結合上皮成長因子；ＩＧＦＢＰ−１、インスリン様成長因子結合タンパク質１；ＩＧＦＢＰ−３、インスリン様成長因子結合タンパク質３；ＩＧＦＢＰ−４、インスリン様成長因子結合タンパク質４；ＩＧＦＢＰ−６、インスリン様成長因子結合タンパク質６；ＩＧＦ−Ｉ、インスリン様成長因子Ｉ；ＩＧＦ−１  ＳＲ、インスリン様成長因子Ｉ受容体；ＩＧＦ−ＩＩ、インスリン様成長因子ＩＩ；ＩＬ、インターロイキン（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１１）；Ｍ−ＣＳＦ、マクロファージコロニー刺激因子；Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、マクロファージコロニー刺激因子受容体；ＮＴ−３、ニューロトロフィン−３；ＮＴ−４、ニューロトロフィン−４；ＰＤＧＦ  Ｒ  ａ、血小板由来成長因子受容体α；ＰＤＧＦ  Ｒ  ｂ、血小板由来成長因子受容体β；ＰＤＧＦ−ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＡ；ＰＤＧＦ−ＡＢ、血小板由来成長因子ＡＢ；ＰＤＧＦ−ＢＢ、血小板由来成長因子ＢＢ；ＰＩＧＦ、ホスファチジルイノシトールグリカンアンカー生合成クラスＦ；ＳＣＦ、間質細胞由来因子−１；ＳＣＦ  Ｒ、間質細胞由来因子受容体；ＴＧＦ−α、トランスフォーミング成長因子α；ＴＧＦ−β、トランスフォーミング成長因子β；ＴＧＦ−β２、トランスフォーミング成長因子β２；ＴＧＦ−β３、トランスフォーミング成長因子β３；ＶＥＧＦ、血管内皮成長因子；ＶＥＧＦ  Ｒ２、血管内皮成長因子受容体２；ＶＥＧＦ  Ｒ３、血管内皮成長因子受容体３；ＶＥＧＦ−Ｄ、血管内皮成長因子受容体Ｄ。
【００９７】
本開示を実施するための方法
本発明の態様は、がんまたは腫瘍の診断および／または特徴付けに関連する方法、キット、および組成物に関する。本明細書でがんまたは腫瘍に関して記載されている実施形態のいずれにおいても、がんまたは腫瘍は悪性であってもよい。ある特定の実施形態では、がんまたは腫瘍は、それが特異的な組織に転移する可能性および／または本明細書で下記に記載されている１つもしくは複数のがん療法および／もしくは化学療法剤に反応するそのような転移の１つもしくは複数の反応性によって特徴付けることができる。
【００９８】
本明細書において開示されている方法実施形態は、１つまたは複数のバイオマトリックス足場に腫瘍またはがんの細胞を播種するステップを含む。
【００９９】
こうした方法実施形態の一部において、細胞は、（１）腫瘍生検材料のまたはがんもしくは腫瘍と診断された患者から採取されたサンプルの細胞、または（２）患者のものと同じがんまたは腫瘍の種類の細胞株の細胞のものであってもよい。こうした方法実施形態の一部において、細胞は、成長中の細胞のコロニーを形成する能力に関して分析される。一部の実施形態では、コロニーは、バイオマトリックス足場の基層上にある。こうした方法実施形態の一部において、細胞はコロニーを形成する。こうした方法実施形態の一部において、細胞は、成長中の細胞の３次元コロニーとなる能力に関して分析される。こうした方法実施形態の一部において、細胞は、成長中の細胞の３次元コロニーを形成する。こうした方法実施形態の一部において、細胞は、それらの遺伝子発現能力またはタンパク質もしくは別の因子を分泌する能力に関して分析される。こうした遺伝子の非限定的な例として以下が挙げられる：多能性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＳＡＬＬ４、ＮＡＮＯＧ、ＢＭｉ−１）、幹細胞遺伝子（例えば、ＥｐＣＡＭ、ＬＧＲ５／ＬＧＲ６、ＣＸＣＲ４、ヒアルロナン受容体をコードしている遺伝子のＣＤ４４ファミリーの多くのバリアントのうちの１つまたは複数、多剤耐性遺伝子（例えば、ｍｄｒ遺伝子ファミリー、Ｐ糖タンパク質）、細胞外マトリックス成分を溶解させる酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、マトリックス分解性メタロプロテイナーゼ）をコードしている遺伝子；こうしたタンパク質の非限定的な例として以下が挙げられる：上記遺伝子によってコードされているタンパク質（例えば、ＣＤ４４、Ｐ糖タンパク質、マトリックス分解酵素）；この分析に関連する別の因子の非限定的な例としては、エクソソーム産生、マイクロＲＮＡ、間葉系フィーダー細胞からのパラ分泌シグナル伝達からの質的または量的独立性が挙げられる。これらの方法実施形態の一部の実施形態では、細胞が１つまたは複数のバイオマトリックス足場に播種され付着したら、この分析が行われ得る。これらの方法実施形態の一部の実施形態では、細胞を、１つまたは複数のバイオマトリックス足場の組織特異的な形態の基層に付着させ得る。
【０１００】
こうした方法実施形態の一部において、１つまたは複数のバイオマトリックス足場は、人体の１つまたは複数の所定の臓器にそれぞれ由来する。さらなる実施形態では、所定の臓器は、例えばその種類のがんまたは腫瘍の転移と関連することが既知である臓器を含むように、またはそのがんまたは腫瘍が認められた臓器を含むように、患者のがんまたは腫瘍の種類に基づいて選択される。すべての方法実施形態において、それぞれのバイオマトリックス足場は、その由来となった組織の生物学的様相を再現する。
【０１０１】
播種方法は、がんまたは腫瘍と診断された患者内で腫瘍が転移する可能性を判定するために任意に使用されてもよい。例えば、腫瘍またはがん細胞がバイオマトリックス足場上で成長中の細胞のコロニーを形成する場合、臓器への転移が予測され得る。予測された転移は、前記足場の由来となった臓器に位置しているとさらに判定され得る。よって、一部の実施形態では、１つまたは複数の所定の臓器にそれぞれ由来する１つまたは複数のバイオマトリックス足場上で細胞が成長中細胞のコロニーを形成する場合、それらの臓器への転移がｉｎ  ｖｉｖｏで予測される。
【０１０２】
この播種方法を使用して、がんまたは腫瘍と診断された患者において腫瘍に適切な処置を決定することもできる。これは、腫瘍が転移する可能性を判定することに加えて、またはそれとは独立に行ってもよい。
【０１０３】
上記の開示された方法実施形態はいずれも、コロニーを、その組織像、エクソソーム産生、マイクロＲＮＡ産生、間葉系細胞との相互作用、および／または遺伝子発現プロファイルに基づいて特徴付けるステップをさらに含んでもよい。
【０１０４】
上記の開示された方法実施形態はいずれも、１つもしくは複数のがん療法および／もしくは化学療法剤に対する反応性に関してコロニーをスクリーニングするステップ、または１つもしくは複数のがん療法および／もしくは化学療法剤でコロニーを処置するステップをさらに含んでもよい。そのようながん療法および／または化学療法剤は、１回もしくは複数回の放射線療法、免疫療法、内分泌療法、分子療法、および／またはアントラサイクリン、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、もしくは有糸分裂阻害剤のうちの１つもしくは複数を含むが、これらに限定されない。そのようながん療法および／または化学療法剤は、任意に、患者のがんまたは腫瘍の種類に基づいて選択することができる。ある特定の実施形態では、臓器中でのｉｎ  ｖｉｖｏでの１つまたは複数の療法および／または作用物質に対するがんまたは腫瘍の反応性は、その臓器のバイオマトリックス足場上に播種された場合の、１つまたは複数の療法または作用物質に対する前記がんまたは腫瘍細胞の反応性と相関し得る。
【０１０５】
本開示の態様はまた、人体の１つまたは複数の所定の臓器にそれぞれ由来する１つまたは複数のバイオマトリックス足場と、本明細書において上記で開示されている方法の１つまたは複数を行うための指示書とを含むキットにも関する。さらなる実施形態は、１つまたは複数のがん療法および／または化学療法剤；腫瘍生検材料またはがんもしくは腫瘍と診断された患者から採取されたサンプルの細胞を得るためのツールまたは指示書；特定のがんまたは腫瘍の種類の細胞株の細胞；ならびに／あるいは上記の開示されている方法を行うために必要とされる任意の試薬、培地、または別の成分をさらに含むキットを企図する。
【０１０６】
本開示のさらなる態様は、本明細書において上記で開示されている播種方法によって作製される、人体の１つまたは複数の所定の臓器に特異的な、人工的な腫瘍または転移モデルを企図する。
【０１０７】
実施例
以下の実施例は非限定的なものであり、本開示を実施する際の様々な場合において使用できる手順を例示するものである。加えて、下記の本明細書に開示されているすべての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【実施例１】
【０１０８】
バイオマトリックス足場の作製および特徴付け
すべての動物実験は、ノースカロライナ大学動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に定められたガイドラインに従った。
【０１０９】
組織脱細胞化方法、特に灌流プロトコールによって行われるものによって調製される細胞外マトリックス抽出物を使用することは、組織工学の分野での飛躍的進歩であった。脱細胞化プロトコールは、臓器または組織からその細胞を化学的に取り除き、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化学組成とほぼ同等の化学組成を有する細胞外マトリックス抽出物を残すものである。重要なことに、脱細胞化は、細胞外マトリックスの複雑な組成、さらには合成技術を使用して再現するのはほぼ不可能であろう、正常な臓器において認められるそれらの解剖学的特徴を保つ。出願人らは、脱細胞化された組織からのマトリックス抽出物を使用して、がん「転移」を人工的に作製するための組織特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養プラットホームを作ることができるという仮説を立てた（図１ａ）。以前の研究は、様々な方法を使用して、組織を脱細胞化することならびに肝臓および肺を含む複雑な臓器を人工的に作製することに成功してきたが、これらの方法を使用して細胞シグナル伝達分子がどの程度保存されるのかは、ほとんど不明のままである７。例外が１つあり、「バイオマトリックス足場」を調製するためのプロトコールは、生理的レベルの、肝臓組織において認められるすべての既知のシグナル伝達分子を保持することが示された１２。しかしながら、そのようなバイオマトリックス足場において保存されているシグナル伝達分子の組が組織特異的であるかどうかは不明であった。出願人らは、組織のマトリックス成分の９８％超を保持し、かつ生理的レベルのマトリックス結合成長因子およびサイトカインを保存する、バイオマトリックス足場（ＢＭＳ）を調製するためのプロトコールを利用した。概念実証として、出願人らは、この培養プラットホームを使用して転移ＣＲＣ細胞を研究した。ＣＲＣ患者において肝臓および肺が最も一般的な転移部位であることからして、出願人らは、肝臓および肺転移をｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的に作製することを目的とした。
【０１１０】
肝臓および肺の灌流に基づく脱細胞化によって調製されるバイオマトリックス足場
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄、２５０〜３００ｇ）を使用して、以前に確立されたプロトコールを使用して肝臓および肺バイオマトリックス足場を生成した。脱細胞化試薬を用いて灌流するために、門脈（肝臓ＢＭＳ）または下大静脈（肺ＢＭＳ）にカニューレ挿入することによって、バイオマトリックス足場（ＢＭＳ）を調製した。血液が排出されるまで血管系を基礎培地（例えば無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で灌流し、次いで３６単位／Ｌのホスホリパーゼを含有する１％デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）２５０ｍＬで灌流した。次に、臓器を無血清基礎培地ですすぎ、次いで、吸光度（ＯＤ２８０）でアセスメントしたタンパク質に関して灌流液が陰性になるまで、３．５ＭのＮａＣｌ（調製された基礎培地）で灌流した。最後に、ＢＭＳサンプルを基礎培地ですすぎ、急速凍結した。冷凍粉砕機（Ｓｐｅｘ  ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ  ６７７０、Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）を使用して、凍結したＢＭＳサンプルを微粉砕して微粉末にした。処理したＢＭＳ粉末を−８０℃で保存した。
【０１１１】
バイオマトリックス足場粉末でコートした組織培養プレートの調製
ＢＭＳサンプルを、４ＭのグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、および２５ｍＭのＥＤＴＡで構成され、プロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する溶液中に溶解させた。次いでＢＣＡアッセイを実施して全タンパク質濃度を決定した。ＢＭＳサンプルを含有する培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を、組織培養プレートに、またはＮｕｎｃ  Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上に添加し、終夜乾燥させた。プレートを、１００Ｇｙの外部照射（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘ−Ｒａｙ，Ｉｎｃ、Ｎｏｒｔｈ  Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）を使用して滅菌した。
【０１１２】
成長因子抗体アレイ
組織（肺、肝臓）およびそれらの組織のＢＭＳサンプルを、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）に送り、そこでそれらを処理し成長因子アレイ分析に供した。詳細には、ＲａｙＢｉｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  Ｇ−Ｓｅｒｉｅｓ  １（Ｃａｔ＃ＡＡＨ−ＧＦ−Ｇ１−８）によって、成長因子およびサイトカインの相対レベルを定量した。データは、正規化されたシグナル強度で表した。
【０１１３】
質量分析
肺ＢＭＳ（ｎ＝４）および肝臓ＢＭＳ（ｎ＝４）を微粉砕し、以前に記述されている２２のようにタンパク質を抽出および精製した。各サンプル（５０μｇ）を５ｍＭのＤＴＴで還元し、１５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で３７℃で終夜消化した。Ｃ１８スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してペプチドサンプルを脱塩した。ＱＥｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に接続したＥａｓｙ  ｎＬＣ  １０００を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってペプチドサンプル（１μｇ）を分析し、２時間の方法にわたって分離した。分離のための勾配は、２５０ｎｌ／ｍｉｎの流速で５〜３２％の移動相Ｂからなり、移動相Ａは水中の０．１％ギ酸であり、移動相ＢはＡＣＮ中の０．１％ギ酸からなっていた。ＱＥｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦをデータ依存的に作動させ、上位１５位までの強度の前駆体をその後の断片化のために選択した。前駆体スキャン（ｍ／ｚ４００〜１６００）のための分解能は１２０，０００に設定し、目標値は３×１０６イオンであった。ＭＳ／ＭＳスキャン分解能は１５，０００に設定し、目標値は５×１０４イオンであった。正規化された衝突エネルギーは、ＨＣＤに関して２７％に設定した。ペプチドマッチはプリファード（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）に設定し、電荷が不明な、または電荷状態が１および７以上である前駆体は除外した。
【０１１４】
生データファイルは、ＭａｘＱｕａｎｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．３．１７を使用して処理し、ＭａｘＱｕａｎｔ内のＡｎｄｒｏｍｅｄａを使用して、ＵｎｉＰｒｏｔラットデータベース（２０１６年１２月ダウンロード、２９，７９５エントリを含む）に対して検索をかけた。酵素特異性はトリプシンとし、最大で２個のミスクリーベージサイト（ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）を許容し、Ｃｙｓのカルボアミドメチル化を固定修飾（ｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）として設定し、Ｍｅｔの酸化を可変修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）として設定した。１％の偽発見率（ＦＤＲ）を使用してすべてのデータをフィルタリングした。剃刀＋ユニークペプチド（ｕｎｉｑｕｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）および試験間のマッチ（１ｍｉｎのタイムウィンドウ）を使用したラベルフリー定量が可能であった。定量には、タンパク質１個当たり最低で３個のユニークペプチドが必要であった。欠測値が６０％を超えるタンパク質は除去した。統計分析は、ＡＮＯＶＡを使用してＰｅｒｓｅｕｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．６．０において実施し、ｐ＜０．０５を有意とみなした。有意なタンパク質のｚスコア正規化されたＬＦＱ強度を使用した階層的クラスタリングを実施した。
【０１１５】
細胞培養
ヒト結腸直腸がん細胞株（ＨＴ−２９、Ｃａｃｏ２およびＳＷ４８０）は、ＵＮＣのＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから取得した。ルシフェラーゼ発現細胞株であるＨＴ−２９−ｌｕｃ２は、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。細胞株はショートタンデムリピートを用いて確認し、マイコプラズマ汚染に関して試験した。ＨＴ−２９、ＨＴ−２９−ｌｕｃ２、およびＳＷ４８０細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養した。Ｃａｃｏ２細胞は、２０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。標準的な組織培養プレート、またはコラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ（１００μｇ／ｃｍ２）をコートした組織培養プレートにおいて細胞を継代した。
【０１１６】
細胞播種効率
ＣＲＣ細胞を、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ（１００μｇ／ｃｍ２）をコートしたプレートにおいて播種した。２４時間後に、培養物をＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＤＮＡ溶解液中に溶解した。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用してアセスメントした。
【０１１７】
細胞成長速度
ＣＲＣ細胞を、６ウェルプレートにおいてプラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、または肺ＢＭＳ（１００μｇ／ｃｍ２）上で成長させた。播種後の様々な時点で細胞を回収し、ＤＮＡ溶解液に入れた。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用してアセスメントした。経時的な成長速度は、播種効率に基づいて標準化した。
【０１１８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖およびアポトーシスのアセスメント
増殖アッセイのために、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、または肺ＢＭＳ（１００μｇ／ｃｍ２）上で成長させたＣＲＣ細胞を１０μＭの５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）と一緒に４時間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴｒｙｐＬＥを用いて処理して単一細胞にし、製造業者の使用説明書に従ってフローサイトメトリー用Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｐｌｕｓ  ＥｄＵ  Ａｓｓａｙキット（カタログ番号Ｃ１０６４６）を使用してＥｄＵについて染色した。次いで細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で３回洗浄し、フローサイトメトリー分析に出した。
【０１１９】
アポトーシスアッセイのために、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、または肺ＢＭＳ（１００μｇ／ｃｍ２）上で成長させたＣＲＣ細胞を回収し、処理して単一細胞にし、４％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間、固定化した。細胞懸濁液を、Ｄａｋｏブロック（ｃａｔ）において終夜ブロッキングした。次いで細胞を、一次コンジュゲートした切断型カスパーゼ３（１：１００）で室温で２時間にわたって染色し、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリー分析に出した。すべてのフローサイトメトリー分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣｙＡｎ  ＡＤＰを使用して行い、ソフトウェアＳｕｍｍｉｔ  ５．２を使用して分析した。
【０１２０】
アノイキスアッセイ
プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳまたは肺ＢＭＳ上で成長させたＣＲＣ細胞を、Ａｎｃｈｏｒａｇｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｐｌａｔｅ（接着妨害プレート）（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）または対照９６ウェル細胞培養プレートに、１×１０４／ウェルで播種した。細胞を４８時間培養させた。生細胞をカルセインＡＭで検出し、マイクロプレートリーダーを用いて蛍光発光を読み取った。
【０１２１】
浸潤アッセイ
無血清培地においてプラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、または肺ＢＭＳ上で成長させたＣＲＣ細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコートされたインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上部チャンバー内に入れた。下部チャンバーには、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２が入っていた。１６時間の培養後、非浸潤細胞をコットンスワブで除去し、膜の下部表面上の細胞を１００％メタノールで固定化し、１％トルイジンブルーで染色した。倒立顕微鏡を用いて５つの視野で細胞を計数した。
【０１２２】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
カバーガラスを、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳまたは肺ＢＭＳでコートした。これらの基層上で成長させた培養物を、３％グルタルアルデヒドを含有する０．１５Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）溶液中で、４℃で終夜、固定化した。サンプルをＰＢＳで３回すすぎ、次いで、次第に濃縮されるエタノール溶液（３０％、５０％、７５％〜１００％）中で、それぞれ１０分間ずつ、連続的にインキュベーションして脱水した。カバーガラスをＳａｍｄｒｉ−７９５臨界点乾燥器に移し、移行溶媒としてＣＯ２を用いて乾燥した（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。次いで、両面炭素接着タブを有し、１０ｎｍの金パラジウム合金（６０Ａｕ：４０Ｐｄ、Ｈｕｍｍｅｒ  Ｘ  Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒ、Ａｎａｔｅｃｈ  ＵＳＡ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でスパッタコーティングされた１３ｍｍのアルミニウムサンプル台に、カバーガラスをのせた。５ｋＶ、作動距離５ｍｍ、および絞り１０μｍで作動するＺｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ  ２５  ＦＥＳＥＭ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を用いて、画像を取得した。
【０１２３】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
細胞コロニーを、３％グルタルアルデヒドを含有する０．１５Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）溶液中で、室温で１時間、固定化した。次いでサンプルをＰＢＳですすぎ、１％四酸化オスミウム／１．２５％フェロシアン化カリウム／０．１５Ｍ  ＰＢＳで１時間、後固定した。後固定に続いて、サンプルを脱イオン水ですすぎ、次第に濃縮されるエタノール溶液（３０％、５０％、７５％〜１００％）中で連続的にインキュベーションして、それぞれ（３０％、５０％、７５％、〜１００％）１０分間、脱水した。次いでサンプルを、プロピレンオキシド／Ｐｏｌｙｂｅｄ  ８１２エポキシ樹脂（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）の１：１混合物中で終夜、続いて１００％樹脂で２４時間、インキュベートした。次いでサンプルを新しいＰｏｌｙｂｅｄ  ８１２エポキシ樹脂中に置き、ダイヤモンドナイフおよびＬｅｉｃａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  ＵＣＴミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して７０ｎｍで横方向に切断した。切片を銅メッシュグリッドに載せ、４％酢酸ウラニル水溶液およびＲｅｙｎｏｌｄのクエン酸鉛で染色した。ＬＥＯ  ＥＭ９１０透過型電子顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＳＭＴ、ＬＬＣ）を使用して８０ｋＶでグリッドを観察した。ＤｉｇｉｔａｌＭｉｃｒｏｇｒａｐｈ  ３．１１．０ソフトウェア（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）とともにＧａｔａｎ  Ｏｒｉｕｓ  ＳＣ  １０００  ＣＣＤカメラを使用して画像を取得した。
【０１２４】
組織学的検査
細胞コロニーを、４％パラホルムアルデヒド中で室温で１時間、固定化しパラフィン包埋し、４μｍの切片に切断した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で切片を染色した。
【０１２５】
脾臓内注射
無胸腺Ｎｕ／Ｎｕマウス（雄、８〜１０週齢）を、ＵＮＣの動物繁殖施設から得た。ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびデクスドミトール（１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射でマウスに麻酔をかけた。腹部の左側において切開を行って脾臓を露出させた。次いでマウス１匹当たり５０μｌのＰＢＳ懸濁液中５×１０６のＨＴ−２９またはＨＴ−２９−ｌｕｃ２細胞を脾臓内注射した。すべての動物実験は、ＵＮＣ施設内動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
【０１２６】
遺伝子発現マイクロアレイ
製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスチック、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、および肝臓ＢＭＳ上で成長させたＨＴ−２９細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはまた、ＨＴ−２９細胞の脾臓内注射の後に作製された肝臓転移からも単離した。各条件下で成長させた細胞の４つの生物学的反復（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）を使用した。ＲＮＡの質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００によって評価した。チャペルヒルのノースカロライナ大学のＬｉｎｅｂｅｒｇｅｒ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＣｏｒｅにＲＮＡサンプルを送った。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ８ｘ６０Ｋ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ヒトＧ４８５８Ａ）を使用してサンプルを分析した。ハイブリダイゼーションの前にｃＤＮＡをＣｙ３−ＣＴＰで標識した。
【０１２７】
マイクロアレイデータ分析は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  １２．６  ＧＸソフトウェアを使用して行った。未加工のシグナル値を分位数正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）し、フラグ値に基づいてプローブセットをフィルタリングした。正規化された強度値はユークリッド距離を使用した階層的クラスタリング分析を行ってエンティティおよびサンプルの両方を選別する。統計学的（一元配置分散分析  ｐ＜０．０５）および変化倍率（≧４）閾値に基づいて、異なって発現される遺伝子を選択した。人工肝臓転移およびｉｎ  ｖｉｖｏ転移の両方において上方制御される遺伝子を、遺伝子オントロジーを用いて分析した。データは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓデータベースに提出されている（アクセッション番号ＧＳＥ７６１８０）。
【０１２８】
リアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、および肝臓ＢＭＳ上で成長させたＣＲＣ細胞から全ＲＮＡを単離した。Ｑｕａｎｔｉｔｅｋ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。Ｔｉｍｐ１転写産物の定量は、β−アクチンをノーマライザーとして使用した２−ΔΔＣｔ法によって行った。Ｔｉｍｐ１遺伝子発現に使用したプライマーの配列は以下の通りであった：フォワードプライマー５’−ＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＴＧＡＧ−３’；リバースプライマー５’−ＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧ−３’。
【０１２９】
薬物反応アッセイ
コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳおよび肺ＢＭＳ（１００μｇ／ｃｍ２）でコートした９６ウェルプレートにおいて、２×１０４細胞／ウェルでＣＲＣ細胞を播種した。播種の１日後、細胞を化学療法薬で２４時間処置した。次いで化学療法薬を除去し、細胞は、標準的な培養培地中でさらに２４時間、培養を続けた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ＭＴＳ［（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）］細胞増殖アッセイによって細胞生存可能性を決定した。各培養条件に対する処置反応を、未処理の培養物に対して標準化した。
【０１３０】
クローン原性アッセイ
各細胞株のコロニー形成率（ｐｌａｔｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＰＥ）を決定した。プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上で成長させた細胞を、０、２、４、６、および８Ｇｙで照射した。照射後、１００〜２５０，０００の範囲の密度で２５ｍＬフラスコ中に細胞をプレーティングした。細胞を１４日間インキュベートし、固定化し、次いで、４％ホルムアルデヒド、８０％メタノール、および０．２５％クリスタルバイオレットで構成される溶液で染色した。３０以上の細胞を含むコロニーだけを計数した。生存率（ＳＦ）は、式：（形成したコロニーの数）／（プレーティングした細胞の数）（コロニー形成率）を用いて計算した。ＳＦは、対数目盛りで放射線量に対してプロットした。線形二次式ＳＦ＝ｅ＾（−αＤ−βＤ２）を使用して、Ｒパッケージ「ＣＦＡｓｓａｙ」を用いて生存曲線を作成した。
【０１３１】
転移可能性のｉｎ  ｖｉｖｏアセスメント
プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、または肺ＢＭＳ上で成長させたＨＴ−２９−ｌｕｃ２細胞をトリプシン処理し、回収し、処理して単一細胞懸濁液とした。低酸素細胞培養のために、３７℃で１％Ｏ２および５％ＣＯ２を含む低酸素インキュベーターチャンバー中で２４時間、ＨＴ−２９−ｌｕｃ２細胞を培養した。細胞をＰＢＳ中に懸濁し、尾静脈注射（１×１０６／マウス）によってまたは直接の肝臓注射（２×１０３／マウス）によって、無胸腺Ｎｕ／Ｎｕマウス（雄、８〜１０週齢）に投与した。ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、週に１回、生物発光を測定した。マウスをランダムに群に割り当てた。細胞注入および生物発光イメージングは、研究者らに対して割当てが明らかにされた。統計分析から除外された動物はなかった。各時点でのルシフェラーゼ強度は、０日目でのそれぞれの強度値に対して正規化した。屠殺されたマウスから肺および肝臓を取り出し、ｅｘ  ｖｉｖｏ生物発光によって検査した。
【０１３２】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）またはＲ統計ソフトウェアのいずれかを使用して、データ分析を行った。一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙ‘ｓ  Ｈｏｎｅｓｔｌｙ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ事後検定によって、細胞成長速度、播種効率、ＭＴＳ、フローサイトメトリー、アノイキスアッセイ、浸潤アッセイおよびリアルタイムＰＣＲによる結果を分析した。クローン原性アッセイでは、Ｒパッケージ「ＣＦＡｓｓａｙ」を使用して線形二次細胞生存曲線を分析した。サンプルサイズを事前に決めるための統計学的方法は使用しなかった。２つの分散が等しいことを検定するためにＦ検定を使用した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【０１３３】
データ利用可能性
マイクロアレイデータは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓにおいてこの試験に関するアクセッション番号で利用可能である：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ｔｏｋｅｎ＝ｓｄｍｌｕｙａｑｐｌｇｖｔｕｚ＆ａｃｃ＝ＧＳＥ７６１８０
【０１３４】
考察
転移は、がん患者において罹患率および死亡率の主な原因であり、転移のバイオロジーを理解することは、がん治療における大きな改善をもたらす可能性がある。がん転移の特質の１つは臓器特異性である。どの種類のがんも、臓器が近接していることまたは血流に規定される部位であることによっては完全に説明できない転移拡散の特有のパターンを有する。正常な組織微小環境が、転移の成長および発生を調節するのに重要な役割を果たすことは一般に受け入れられているが、この相互作用の根底にあるバイオロジーの理解は不十分である２。これは、主として、簡便で、がん転移における臓器特異性のバイオロジーを完全に再現する実験モデルがないためである。既存のｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏモデル系は、臓器微小環境中に存在する成分が存在しないために、臓器特異性を有さない。コラーゲンおよびＭａｔｒｉｇｅｌを使用して部分的に３次元の（３Ｄ）培養基層を提供することができるが、これらの基層の組成は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、転移が遭遇する組織特異的な微小環境とは大きく異なったものである。ｉｎ  ｖｉｖｏで転移を発症する遺伝子工学的に作製された動物モデルを使用して、組織特異的に転移がんを研究することができるが、それらのモデルは費用がかかり、かつ使いにくい。先の研究により転移の処置反応は転移部位間で異なり得ることが確定されたため、転移と、転移が存在する組織微小環境との間の相互作用の根底にあるバイオロジーを理解することは、転移がん患者のためのより有効ながん治療につながる可能性がある。
【０１３５】
したがって、がん転移のｉｎ  ｖｉｖｏでのバイオロジーを再現できるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルが強く必要とされている。そのようなモデルは、がん転移に対する有効な療法の開発を容易にすることができる。転移の処置反応は、転移部位間で異なることが知られており、また原発性腫瘍の処置反応とは異なり得ることを考えれば、このことは特に重要である２〜５。したがって、本発明者らは、臓器特異性を有する新規なｉｎ  ｖｉｔｒｏがん転移モデルを開発することを目的とした。
【０１３６】
臓器微小環境は、臓器特異的転移モデルの開発に組み込むための不可欠な構成要素であると仮定する。脱細胞化プロセスによって調製されたマトリックス抽出物が、複雑な臓器を生物工学的に作製するために利用されてきたということからして、既存のプロトコールのいずれかによって生成されるこれらのマトリックス抽出物は、がん転移を人工的に作製するための優れた基層をもたらすことを証明し得る６〜８という学説を立てた（図１ａ）。しかしながら、化学組成に関してならびに機能的に組織特異性を保持する組織脱細胞化のための唯一の方法は、「バイオマトリックス」と称されるマトリックス抽出物である、ＲｏｊｋｉｎｄおよびＲｅｉｄによって記載されているものである。
【０１３７】
臓器特異的バイオマトリックス足場はｉｎ  ｖｉｖｏでの生化学的環境を再現する
Ｒｏｊｋｉｎｄ−Ｒｅｉｄプロトコールの大幅改良型が、Ｗａｎｇらによって開発され、組織のコラーゲンおよびコラーゲン関連マトリックス成分（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカンなど）の９８％超を保持する、「バイオマトリックス足場」と称されるマトリックス抽出物をもたらすことが示された。加えて、バイオマトリックス足場は、組織のマトリックス成分のいずれかと結合した、ｉｎ  ｖｉｖｏで認められるものとほぼ同等のレベルの、すべての既知のシグナル伝達分子（成長因子、サイトカイン）を含有することが示されている。マトリックス成分および結合したシグナルは、組織学的に正確な場所に保持されていることが示された。バイオマトリックス足場は、Ｗａｎｇらのプロトコールを使用してラット肝臓から調製した。同様のプロトコールを用いて、肺バイオマトリックス足場を調製した。
【０１３８】
脱細胞化試薬を注入するためにラットの下大静脈（ＩＶＣ）にカニューレ挿入し、血管クリップを使用して上大静脈（ＳＶＣ）をクランプした。流出用にラットの頸動脈に開口部を作った。ラット肺の色の変化（白色からほぼ透明まで）により、脱細胞化が成功するという予備的な徴候が得られた図６ａ）。脱細胞化試薬を注入するために肝門脈にカニューレ挿入することによって、脱細胞化された肝臓ＢＭＳを調製した（図６ｂ）。組織学的に、およびＢＭＳ材料の核酸含有量をアセスメントすることによって、完全な脱細胞化を裏付けた（補足図１ａ、ｂ）。注目すべきことに、これらのＢＭＳは、組織培養プレートを完全に被覆する、繊維状タンパク質および炭水化物の網目構造を天然に形成した（図１ｂ）。
【０１３９】
肺ＢＭＳが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの肺微小環境内に存在するシグナル伝達分子を含有するかどうかをアセスメントするために、本発明者らは、半定量的ＥＬＩＳＡを使用して、脱細胞化後に本発明者らの肝臓ＢＭＳが保持する成長因子およびサイトカインの相対的存在量を評価した。細胞外マトリックス結合シグナル伝達分子は肝臓脱細胞化後に保持されることを示す以前のデータ１２と一致して、肺バイオマトリックス足場は、ほぼ生理学的レベルにおいて分析された成長因子およびサイトカインのほとんどすべて（９３％）を保持した（図１ｃ）。これらのシグナル伝達分子の相対的存在量は、それらの組織特異的な性質と一致して、肝臓ＢＭＳと肺ＢＭＳとで変わることに留意されたい（図６ｃ）。
【０１４０】
肝臓ＢＭＳと肺ＢＭＳとの間の存在する分子の差異をさらに評価するために、本発明者らは、質量分光分析を行った。細胞外マトリックス結合成長因子およびサイトカインと同様に、本発明者らは、細胞外マトリックス自体の相対組成もまた肝臓ＢＭＳと肺ＢＭＳとの間で異なることを見出した（図１ｄ；図７）。
【０１４１】
ＣＲＣ細胞株はｉｎ  ｖｉｔｒｏで肝臓および肺「転移」を形成する
組織特異的なＣＲＣがん転移を人工的に作製するために、本発明者らは、肝臓および肺ＢＭＳでコートした組織培養皿においてＣＲＣ細胞株（ＨＴ−２９、ＳＷ４８０、およびＣａｃｏ２）を培養した。興味深いことに、３つすべてのＣＲＣ細胞株が、タイトジャンクションを介して一緒に結合した腫瘍細胞で構成される３次元（３Ｄ）スフェロイドコロニーを、自然発生的に形成した（図２ａ；図７ａ、ｂ）。これらの「転移」は規模が比較的大きく、最大で１ミリメートルの直径に達する。５００マイクロメートルより大きい直径に達する腫瘍スフェロイドは、酸素および栄養素を一般に利用できないため、ならびに細胞毒性代謝産物の内部蓄積のために、壊死コアを含有する。この観察結果と一致して、ＢＭＳ上で人工的に作製された転移もまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移において認められる低酸素および壊死領域と類似した壊死領域を含む（図７ｃ）。
【０１４２】
本発明者らの人工転移の挙動を特徴付けるために、本発明者らは、肝臓および肺ＢＭＳ上で成長させたＣＲＣ細胞の播種効率および成長速度を、プラスチック、コラーゲン、およびＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長させた細胞のものと比較した。出願人らは、プラスチック上で成長させた細胞と比較した場合に、ＣＲＣ細胞はコラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳにおいて播種効率の減少を示すことを見出した（図２ｂ）。さらに、出願人らは、コラーゲン、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上で成長させた細胞が、プラスチックおよびＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長させた細胞よりも成長が遅いことを見出した（図２ｃ）。人工転移において観察されるより遅い成長速度は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移がん細胞の挙動と一致する。
【０１４３】
次に出願人らは、肝臓および肺の人工転移によって示された比較的遅い成長速度が、アポトーシス速度の増加または増殖速度の低下によるものであるかどうかを判定しようと試みた。異なる基層上で成長させたがん細胞におけるアポトーシスを特徴付けるために、出願人らは、フローサイトメトリーを使用して、アポトーシスのマーカーである切断型カスパーゼ３の発現をアセスメントした。出願人らは、すべての培養条件におけるＣＲＣ細胞が同等のアポトーシス速度を示すことを見出した（図９ａ）。異なる基層上で成長させたがん細胞の相対的増殖速度をアセスメントするために、本発明者らは、ＥｄＵ細胞増殖アッセイを行った。出願人らは、細胞がＳ期に入るときにＤＮＡ中に組み込まれるチミジン類似体であるＥｄＵと一緒に培養物を４時間インキュベートした。続いて、出願人らは、フローサイトメトリーを使用して、Ｓ期を経た（ＥｄＵ陽性）細胞の数を定量した。出願人らは、肝臓および肺バイオマトリックス足場上で成長させた腫瘍細胞が、３つすべての細胞株にわたって、試験したすべての培養条件のうちで最も遅い増殖速度を示すことを見出した（図８ｂ）。累積的に、これらのデータにより、ＢＭＳ上に播種されたＣＲＣ細胞は、別の培養プラットホームによって生成される培養物よりもｉｎ  ｖｉｖｏ転移と同等の、比較的大きなゆっくりと成長する培養物を作製することが示される。
【０１４４】
人工肝臓転移はｉｎ  ｖｉｖｏで認められる転移と酷似している
ＢＭＳおよび従来の基層上で成長させたがん細胞が共有する、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移との類似度をさらにアセスメントするために、出願人らは組織病理学的分析を行った。プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、および肝臓バイオマトリックス上で成長させた細胞の組織学的検査を、ヌードマウスに存在するｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移および転移性ＣＲＣがんを有する患者の肝臓転移と比較した。ｉｎ  ｖｉｖｏで認められる胃腸由来の肝臓転移の典型的な組織学的特徴は以下を含む：（１）印環細胞、（２）奇異な有糸分裂像、（３）壊死性破片（好酸球および核破片の細胞外蓄積）、（４）細胞の大きさおよび形状の多形性、ならびに（５）多核細胞。出願人らは、ＨＴ−２９、ＳＷ４８０、およびＣａｃｏ２  ＣＲＣ細胞から作製された人工肝臓転移においてこれらの特徴のすべてを特定することができた（図３ａ；図８）。対照的に、コラーゲンおよびＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長させたＣＲＣ細胞は、奇異な有糸分裂像および多核細胞を示しただけであり、標準的なプラスチック培養皿上で成長させたＣＲＣ細胞は、これらの組織学的特徴を１つも含まなかった（図３ａ；図８）。印環細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏモデル系で報告されたことがない、ｉｎ  ｖｉｖｏでの病理所見である。これらのデータにより、人工転移は、ｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移において認められる同じ病理学的特徴を含むことが示される。
【０１４５】
【表１】
2019528682.tif 000003
【０１４６】
異なる基層上で成長させたがん細胞とｉｎ  ｖｉｖｏ転移とに共有されている組織学的特性の調査に加えて、出願人らはまた、それらのそれぞれのトランスクリプトーム間の類似度を調べようと試みた。詳細には、出願人らは、プラスチック、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、および肝臓ＢＭＳ上で培養したＨＴ−２９細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルを、ＨＴ−２９細胞の脾臓注射によって形成されたｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移と比較した（図９ａ、ｂ）。階層的クラスタリング分析により、本発明者らの人工肝臓転移の遺伝子発現シグネチャーは、プラスチックまたはＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長させたＨＴ−２９細胞よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移と同等であることが明らかとなった（図３ｂ）。人工転移およびＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長させたＣＲＣ細胞の遺伝子発現プロファイルを、プラスチック上で成長させた細胞と比較することによって、人工転移とｉｎ  ｖｉｖｏ転移とに共有されている比較的高い類似度をさらにアセスメントした。
【０１４７】
プラスチック上で成長させた細胞と比較した場合、合計で７９１の遺伝子が、バイオ人工転移およびｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移の両方において上方制御されることが観察された。これらの共通して上方制御される遺伝子の多くは、酸化ストレスおよび低酸素に対する生物学的反応に関与することが分かった。
【０１４８】
プラスチックおよびＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長させた細胞と比較した場合、合計で６１９の遺伝子が、人工転移およびｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓転移において個別的に上方制御されることが観察された（図１１ｃ）。共通して上方制御される遺伝子は、血管新生、細胞接着、および薬物代謝の機能に関連することが分かった（図１１ｃ）。
【０１４９】
出願人らはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび人工肝臓ＣＲＣ転移は、Ｍａｔｒｉｇｅｌおよびプラスチック上で培養されたＣＲＣ細胞より高いレベルのＴｉｍｐ１を発現することを観察した（補足図５ｄ）。この所見は、ＣＲＣ患者の原発性腫瘍と比較して肝臓転移においてより高度なＴＩＭＰ１発現を示す以前の研究と一致する。まとめると、これらのデータにより、人工転移は、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移を表現型的および生物学的に厳密に模倣していることが示される。
【０１５０】
人工転移はｉｎ  ｖｉｖｏでの転移可能性の増加を示す
出願人らは、人工転移が共有するｉｎ  ｖｉｖｏ転移との組織学的および分子類似性が、機能において、それぞれのｉｎ  ｖｉｖｏでの組織内で成長する能力の増加へと転換されるかどうかを判定しようと試みた。すなわち、出願人らは、ＢＭＳが組織特異的な微小環境を再現するなら、ＢＭＳ上で成長させた細胞はそれらの対応するｉｎ  ｖｉｖｏでの微小環境において生存および成長することができるであろうと仮定した。例えば、肝臓ＢＭＳ上で成長させた細胞は、肝臓組織においてより成長しやすいはずである。この仮説を試験するために、出願人らは、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳ、および肺ＢＭＳ上で成長させたＨＴ−２９−ｌｕｃ２細胞をホストの肝臓および肺に送達し、その後、生物発光イメージングを使用して、それらのｉｎ  ｖｉｖｏで転移を形成する能力をアセスメントした（図４ａ、ｃ；図１２）。人工肝臓転移が肝臓組織において成長する相対的能力を決定するために、出願人らは、直接の肝臓注射を使用して、異なる培養条件で成長させたＣＲＣ細胞を肝臓に送達し、人工肝臓転移から単離した細胞は、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、または肺ＢＭＳ上で成長させた細胞よりもｉｎ  ｖｉｖｏで肝臓転移をより形成可能であることを見出した（図４ａ、ｂ、図１１）。
【０１５１】
人工肺転移が肺組織において成長する相対的能力をアセスメントするために、本発明者らは、尾静脈注射を使用して、異なる基層上で成長させたＣＲＣ細胞を肺に送達した。出願人らは、肺ＢＭＳで成長させた細胞が、すべての従来の培養基層上で成長させた細胞よりも高い肺転移形成能力を示すことを見出した（図４ｃ、ｄ；図１２）。予想外に、出願人らは、肝臓ＢＭＳ上で成長させた細胞は肺転移も形成できることを見出した。さらに、出願人らは、肝臓ＢＭＳからの細胞、およびより少ない程度であるが肺ＢＭＳが、尾静脈注射後に肝臓転移を形成することを見出した（図４ａ、ｂ；図１２）。
【０１５２】
低酸素条件に曝露させたがん細胞は、生存およびアポトーシスを起こすことに対する耐性の向上を示し得る。人工転移によって示される肺転移可能性の増加が低酸素細胞の存在に起因するかどうかを判定するために、出願人らは、低酸素条件においてプラスチック上で成長させた細胞を、尾静脈注射を使用して肺に送達した。出願人らは、プラスチック上で成長させたＣＲＣ細胞の低酸素プレコンディショニングは、それらの肺転移形成能力を向上させないことを見出した（図１３）。加えて、尾静脈注射を使用して送達された細胞は、アノイキスを回避し、かつ肺組織にコロニー形成した後に肺転移を発症するはずである。重要なことに、出願人らは、肝臓および肺ＢＭＳ上で成長させたＨＴ−２９細胞により示された肺転移可能性の増加は、アノイキスに対する耐性の増加または浸潤能力の増強のいずれにも起因しないことを見出した（図１４ａ、ｂ）。まとめると、これらのデータにより、人工転移は、従来の基層上で成長させた培養物よりも、それらの対応するｉｎ  ｖｉｖｏでの微小環境においてより成長可能であることが示される。
【０１５３】
人工転移は臓器特異的な治療反応を示す
同一患者の異なる臓器における転移は、同じ治療レジメンに対して異なる反応をすることがあるため、組織特異的に転移を処置するために有効な処置レジメンの特定は、依然として興味深い活発な領域である。ＣＲＣ細胞を成長させる基層が処置反応に影響を及ぼすかどうかを判定するために、本発明者らは、プラスチック、コラーゲン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肝臓ＢＭＳおよび肺ＢＭＳ上で成長させたＣＲＣ細胞を、標準的なＣＲＣ化学療法レジメンならびに放射線療法で処置した。転移性ＣＲＣのために一般に使用される４つの化学療法処置レジメンを調査した：イリノテカン単独、イリノテカン＋５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、オキサリプラチン単独、およびオキサリプラチン＋５−ＦＵ。出願人らは、化学療法および放射線療法に対するＣＲＣ細胞株の反応は、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ微小環境に強く影響を受けることを見出した（図５ａ）。例えば、人工Ｃａｃｏ２肺転移は一様に、人工Ｃａｃｏ２肝臓転移よりも、化学療法レジメンに対してより感受性である（図５ａ）。加えて、出願人らは、放射線療法に対するＣＲＣ細胞培養物の反応が、それらの培養基層に依存的であることを見出した（図５ｂ）。重要なことに、出願人らは、人工肝臓および肺転移の処置反応が異なることを観察した。これらの結果により、ＣＲＣ細胞の処置反応は、それらが培養される細胞外マトリックスの臓器特異的な組成に影響を受けることが示される。
【０１５４】
転移の挙動は、それらが存在する組織特異的な微小環境に強い影響を受ける。この相互作用の重要性を認識していたことから、出願人らは、組織特異的に転移性疾患を研究するために、脱細胞化された臓器のマトリックス抽出物を使用して、新規な３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養プラットホームを開発した。原理証明として、出願人らは、ＣＲＣ細胞株から肝臓および肺転移を人工的に作製した。腫瘍微小環境を再構築するために共培養を使用する研究もあるが、このデータにより、出願人らは、無細胞の生化学的環境を再現することによって、組織学的特徴を有する転移およびｉｎ  ｖｉｖｏで転移巣において存在するものに類似した遺伝子発現プロファイルを人工的に作製することが可能であることが実証されている。例えば、出願人らは、人工肝臓転移において印環細胞を特定したが、この観察結果は、いずれのｅｘ  ｖｉｖｏがんモデル系においてもこれまで報告されたことがないものである。重要なことに、人工転移は、従来の培養基層上で成長させた細胞と比較した場合、それらのそれぞれのｉｎ  ｖｉｖｏでの組織特異的な微小環境において成長するようにより適合されていることが、出願人らにより示されている。人工肝臓転移が肺において転移を形成可能であることもまた出願人らにより観察された。この観察結果についての可能性がある解釈は、肺は一般に肝臓よりも「許容的な」環境であるというもの、または肝臓微小環境において成長させた腫瘍細胞は、それらの肺内で成長する能力を促進する特性を発達させるというもののいずれかである。
【０１５５】
このデータにより、標準的な処置レジメンに対するＣＲＣ細胞の治療反応は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらが曝露される組織特異的な微小環境に依存することが実証される。肺ＢＭＳで成長させた細胞は一般に、肝臓ＢＭＳ上で成長させた細胞よりも処置に対して感受性であることは興味深い。このデータは、肝臓および肺転移はともにこの疾患状況において一般的であるが、肝臓転移は転移性ＣＲＣ患者における罹患率および死亡率の主な原因であるという臨床的観察結果と一致する。
【０１５６】
理論に拘束されるものではないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転移を人工的に作製できるこの培養プラットホームは、組織特異的に転移がんのバイオロジーを研究するための強力なツールとなると出願人らは考える。そのような評価は新規な治療標的を明らかにし得るため、さらなる研究では、がん細胞挙動に影響を及ぼす特異的なＥＣＭ成分を特定するであろう。このモデルはまた、転移の組織特異的な処置反応の研究にも有用である。注目すべきことに、このモデルは、転移性疾患のための新たに開発された治療薬を試験するための薬物スクリーニングアッセイに利用することができる。重要なことに、これは、臓器特異的に転移を処置するように設計された治療薬を特定することを目的とした、ハイスループットスクリーニングアッセイを可能にする唯一の系である。
【０１５７】
がん細胞と臓器特異的な環境との相互作用は、がん細胞が臓器にコロニー形成し、その後転移に成長する能力を調節するために重要な役割を果たすと考えられる（「種と土壌」説２）。微小環境である「土壌」の重要性を認識していたため、組織特異的なバイオマトリックス足場を使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏ転移を挙動的に、組織学的に、および生物学的に厳密に模倣した。加えて、治療的処置に対する人工転移の反応は、腫瘍細胞が成長する臓器特異的なマトリックスの化学的性質に依存的であった。重要なことに、バイオマトリックス足場において細胞を培養することにより、がん細胞の転移可能性は増加し、組織特異的な組織コロニー形成傾向が付与され得る。これらの知見は、転移がん患者のための新規な予後および治療ストラテジーを開発する可能性を意味し、また、ｅｘ  ｖｉｖｏで臓器特異的な微小環境を再現する現在利用可能な唯一の培養系であるということを考えると、類がないものである。
【０１５８】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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