【手続補正書】
【提出日】平成19年9月27日(2007.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  微生物の不活化方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】  微生物を不活化する方法であって、該微生物に、架橋剤を別の不活化剤と共に同時に適用する工程を含む方法。
【請求項２】  該架橋剤がアルデヒドを含む、請求項１による方法。
【請求項３】  該アルデヒドがジアルデヒドである、請求項２による方法。
【請求項４】  該アルデヒドがホルムアルデヒド（ＦＡ）である、請求項３による方法。
【請求項５】  該不活化剤がアジリジン化合物である、請求項１〜４のいずれか１項による方法。
【請求項６】  該アジリジン化合物がエチレンイミンである、請求項５による方法。
【請求項７】  該エチレンイミンがバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である、請求項６による方法。
【請求項８】  該不活化プロセスを停止する更なる工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項による方法。
【請求項９】  該不活化プロセスを、チオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス緩衝剤）のいずれか１種またはそれ以上の添加により停止させる、請求項８による方法。
【請求項１０】  実質的に本明細書に記載され且つ例示されたようにする、微生物の不活化方法。
【請求項１１】  請求項１〜１０のいずれか１項による方法により不活化された微生物を含むワクチン。
【請求項１２】  ワクチンを製造する方法であって、病原体を提供する工程、及び該病原体に架橋剤を別の不活化剤と同時に適用することにより該病原体を不活化する工程を含む方法。
【請求項１３】  該架橋剤がアルデヒドを含む、請求項１２による方法。
【請求項１４】  該アルデヒドがジアルデヒドである、請求項１３による方法。
【請求項１５】  該アルデヒドがホルムアルデヒド（ＦＡ）である、請求項１４による方法。
【請求項１６】  該不活化剤がアジリジン化合物である、請求項１２〜１５のいずれか１項による方法。
【請求項１７】  該アジリジン化合物がエチレンイミンである、請求項１６による方法。
【請求項１８】  該エチレンイミンがバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である、請求項１７による方法。
【請求項１９】  該不活化プロセスを停止する更なる工程を含む、請求項１２〜１８のいずれか１項による方法。
【請求項２０】  該不活化プロセスを、チオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス緩衝剤）のいずれか１種またはそれ以上の添加により停止させる、請求項１９による方法。
【請求項２１】  実質的に本明細書に記載され且つ例示されたようにする、ワクチンの製造方法。
【請求項２２】  請求項１２〜２１のいずれか１項による方法で製造されたワクチン。
【請求項２３】  ウイルスの不活化及びウイルス性病原体のためのワクチンの製造における、請求項１２〜２１のいずれか１項による方法の使用。
【請求項２４】  該ウイルスがピコルナ・ヴィリダ（picorna viridae）科のウイルスである、請求項２３による使用。
【請求項２５】  請求項１〜１０のいずれか１項により不活化された微生物を含むテストキット。
【請求項２６】  不活化微生物が、ＥＬＩＳＡで使用するためのアレルゲンまたは抗原の形態である、請求項２５によるテストキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【序論および発明の背景】
本発明は、微生物を不活化し且つワクチンを製造する方法、このような方法によって製造されるワクチン、およびこのような不活化微生物を包含するキットに関する。より詳しくは、しかしながら制限するわけではなく、本発明は、ウイルスを不活化し且つウイルスワクチンを製造する方法、およびこのような方法から製造されるワクチンに関する。
ウイルスの不活化および安全性試験は、不活化ワクチンの製造において最も臨界的段階である。口蹄疫（ＦＭＤ）ワクチンの場合、特に、どのような発症も、動物および動物製品の全輸出業の封鎖を引き起こすので、安全性保障は不可欠である。
ＦＭＤウイルスを不活化し且つＦＭＤワクチンを製造する古典的方法は、Waldmann et al.: Waldmann O, Pyl G, Hobohm KO, Mohlmann H:“Die Entwicklung des Riemser Adsorbatimpfstoffes gegen Maul- und Klauenseuche und seine Herstellung”. Zbl Baktl Orig 148: 1,1941 によって記載のように、ホルムアルデヒドを用いる。
過去において、この方法は、ＦＭＤワクチンの製造において用いられ、例えば、Frenkel 培養物；Frenkel S:“Modifications de la methode de culture du virus aphteuse selon Frenkel. Valeur des vaccins selon les donnees du laboratoire”. Bull OIE 61:985,1964 に基づくワクチンの製造において応用された。
【０００２】
ホルムアルデヒドは、タンパク質の架橋作用（固定）について知られているが、これが、ＦＡ不活化（Frenkel）ワクチンの、５年間までまたはそれ以上の高い安定性および長い保存寿命をもたらしたと考えられる。
いくつかの研究により、Waldmann によって記載されたＦＡ濃度では、不活化プロットは直線的ではなく、しばしば、不完全な不活化を引き起こすことがありうる“消失（tailing off）”を示すということが分かった。これは、次の公報で示された。
−  Graves JH:“Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth disease virus as applied to vaccine preparation”, Am J Vet Res 24,1131；
−  Weslen,T. and Dinter,Z.:“The inactivation of foot-and-mouth disease virus by formalin”, Arch.Ges.Virusforsch. 1957,7,394；
−  Barteling SJ, Woortmeijer R, Visser N:“Innocuity testing of foot-and-mouth disease vaccines. I. Formaldehyde-inactivated alhydrogel vaccines”, J Biol.Stand. 1983,11,297。
【０００３】
ホルムアルデヒド不活化ワクチンは、充分な免疫を引き起こし、そして充分に規定された条件下では、ＦＡを用いて直線的不活化プロットを得ることができるということが示された（Barteling SJ, Woortmeijer R:“Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth disease virus. Conditions for the preparation of safe vaccine”,Arch Virol. 1984,80,103）。しかしながら、ＦＡを用いた不活化にはまだ疑いがあり、直線的不活化プロットを伴ってより急速に不活化するアジリジン（例えば、アセチルエチレンイミン，ＡＥＩ）による不活化が、選択された方法となった。
ＡＥＩを用いた不活化は、次の公報に記載されている。
−Brown F, Hyslop NSG, Crick J, Morrow AW:“The use of acetyl-ethyleneimine in the production of inactivated foot-and-mouth disease vaccines”, J Hyg (camb) 1963b,61:337。
アジリジンによってＦＭＤウイルスを不活化するのに広く用いられる方法は、H.G.Bahnemann:“Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine”. Vaccine, 1999,8,299 によって記載されている。
【０００４】
しかしながら、ＦＡとは異なり、アジリジンには架橋反応性がなく、若干不安定なＦＭＤ（ワクチン）株から製造されるワクチンは、短い保存寿命を示した。したがって、若干の反応活性ワクチン株を、最初に、ＦＡを用いて固定した後、ＢＥＩのようなアジリジン化合物を用いて不活化を完了する。この方法は、次の３件の公報に記載されている。
−Rowlands et al. (1972) - Stabilizing the immunizing antigen of foot-and-mouth disease virus by fixation with formaldehyde. Arch.Ges.Virusforsch. 39,274-283；
−Mowat et al. (1973) - Enhancement of immunizing potency of foot-and-mouth disease virus for cattle by treatment of the antigen with formaldehyde. Arch.ges.Virusforsch. 41,365-370；および
−M M Rweyemamu et al. (1989) - Effect of formaldehyde (FA) and binary ethyleneimine (BEI) on the integrity of foot-and-mouth disease virus capsid. Rev.sci.tech.Off.Int.Epiz. 8,747-767。
【０００５】
最初にＢＥＩを用いてウイルスを不活化し、その後、ＦＡを用いて不活化ウイルス粒子または抗原、例えば、ＳＡＴ２  Ｚｉｍ７／８３株のＦＭＤウイルス抗原を架橋または固定することも知られている。
既知の方法の欠点は、納得のいく不活化レベルを得るのに、比較的長時間（＋／−２日間）を要し、ウイルス抗原の一部分が分解するかもしれない結果を伴うということである。したがって、このような不活化ウイルス抗原から製造されるワクチンは、比較的使用にあまり有効ではない。
更に、ＢＥＩは、必ずしも納得のいく不活化を生じるとは限らない。実際上、推定される結果は、時々、不活化の最後に（４８時間に）、生存ウイルスがなおバッチ中に存在する可能性があるということを示している。これは、このようなバッチは許容できないし、破棄されなければならないということを意味する。
【０００６】
【発明の目的】
本発明の目的は、微生物を不活化する方法とワクチンを製造する方法を提供すること、このような方法によって製造されるワクチンを提供すること、およびこのような不活化微生物を包含するキットを提供することであり、これらは、既知の方法、ワクチンおよびキットの改良である。
【発明の要旨】
本発明の第１の側面により、微生物を不活化する方法であって、この微生物に、架橋剤を別の不活化剤と共に同時に適用する工程を含む方法を提供する。
本出願人は、驚くべきことに、架橋剤を不活化剤と共に同時に用いることにより、相乗的なまたは増加的な作用を達成し、それによって微生物が、より完全に不活化されるみならず、先行技術の方法と比較して相対的に非常に短時間で不活化されることを発見した。
本出願人は、更に、本発明によって製造されるワクチンは、おそらくは、不活化時間が比較的短く且つ架橋剤で微生物の抗原が固定されることに起因して、それらが利用可能になるので、使用に効果的であることを発見した。本出願人は、それら抗原がこのようにして保存されて分解されないので、本発明によって製造されるワクチンは、公知のワクチンより長い保存寿命で一層安定であることが期待されると考えている。更に、本出願人は、これらワクチンは、当該技術分野における輸送および使用中に厳しいコールドチェーン条件に左右されなくなるであろうとも考えている。
【０００７】
その架橋剤は、アルデヒドを含むことができる。
そのアルデヒドは、ジアルデヒドであり得る。
好ましくは、アルデヒドはホルムアルデヒド（ＦＡ）である。
本出願人は、更に、少なくともＦＡの場合、その架橋剤で、不活化剤による不活化のためのウイルスが調製されると考えている。
その不活化剤は、アジリジン化合物であることができる。アジリジン化合物はエチレンイミンであり得る。
好ましくは、エチレンイミンはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である。
この方法は、不活化プロセスを停止する更なる工程を含むことができる。
不活化プロセスは、チオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス緩衝剤）のいずれか１種またはそれ以上の添加により停止することができる。
【０００８】
本発明の第２の側面により、本発明の第１の側面による上の方法によって不活化される微生物を含めたワクチンを提供する。
本発明の第３の側面により、ワクチンを製造する方法であって、
−病原体を提供し；
−その病原体に、架橋剤を別の不活化剤と共に同時に適用することによってその病原体を不活化する工程を含み；
−その架橋剤も、病原体を（その架橋活性によって）不活化することができる方法を提供する。
【０００９】
その架橋剤は、アルデヒドを含むことができる。
アルデヒドは、ジアルデヒドであり得る。
好ましくは、アルデヒドはホルムアルデヒド（ＦＡ）である。
その不活化剤はアジリジン化合物であり得る。アジリジン化合物はエチレンイミンであり得る。
好ましくは、エチレンイミンはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）である。
この方法は、不活化プロセスを停止する追加の工程を含むことができる。
不活化プロセスは、チオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス緩衝剤）のいずれか１種またはそれ以上の添加によって停止することができる。
【００１０】
本出願人は、更に、本発明による上の方法が、ウイルスの不活化およびウイルス病原体のためのワクチンの製造において特に有効であるということを発見した。
そのウイルスは、ピコルナ・ヴィリダ（picorna viridae）科であることができる。
好ましくは、ウイルスは口蹄疫ウイルスであるが、本発明による方法が、大部分のウイルスに関しておよび他の微生物にも有効であると理解されるであろう。
本発明のもう１つの側面により、本発明の上の方法によって不活化される微生物を含めたテストキットを提供する。不活化微生物は、ＥＬＩＳＡで用いるためのアレルゲンまたは抗原の形態であり得る。
【００１１】
本発明の好適な態様を、非制限実施例によってここに記載する。
ＢＥＩの作用をＦＭＤウイルスへのＦＡと比較して研究するために、二つの群のウイルス、すなわち、試験群および対照群を下記のように不活化した。
【実施例】
ホルムアルデヒド（FA）とバイナリーエチレンイミン（binary ethyleneimine：BEI）との組み合わせによる口蹄疫ウイルス（FMDV）の不活化の本発明による方法を以下に述べる。FMDワクチンを製造する目的のためにFMDVを不活化する標準操作手順（SOP）も以下において詳細に説明される。試験群において取られた手順だけに言及される。しかし、試験群の場合と対照群の場合で、試験群ではBEIとFAとが同時に適用され、一方対照群ではBEIがそれだけで不活化剤として用いられたことを除けば、実質的に同じ手順が取られた。
【００１２】
使用される定義および略号：以下の通り
BEI：    バイナリーエチレンイミン
BEA：   ２−ブロモエチルアミン・ヒドロブロミド
NaOH：  水酸化ナトリウム
STS：    チオ硫酸ナトリウム
FA：     ホルムアルデヒド
ITT 1：  第１不活化タンク
ITT 2：  第２不活化タンク
化学薬品：
水酸化ナトリウムペレット（NaOH）p.a.−メルク社（Merck）
２−ブロモエチルアンモニウムブロミド（BrCH2CH2NH3Br）−メルク社
β−ナフトールバイオレット溶液
約３７％のホルムアルデヒドを含むホルマリンp.a.溶液−メルク社
材料および装置
メスシリンダー、１０００ｍＬ
５リットルの滅菌試薬瓶
滅菌攪拌磁石
滅菌蒸留水
１０ｍＬの滅菌マッカーシー（McCarthy）瓶
ヒュームフード
ｐＨメーター（コンバインド電極：combined electrode）・オリオン（Orion）
秤量天秤
磁気攪拌子
オートクレーブ
【００１３】
方法
濾過したクロロホルム処理SAT 2−Zim 7/83ウイルス培養物を３０℃の温度にし、次いでBEIとFAとの組み合わせ（BEI−FA）により不活化する。この組み合わせはFMDを非常に速やかに（＞２log10ＩＤ５０／時）不活化する。
上記培養物はタンクの中に入っていた。BEI−FAは浸漬パイプのようなタンクのある部分に入ることはないだろうということのために、上記ウイルスは完全には不活化されないかもしれないし、またこのプロセスの終点においては不活化されたウイルス抗原を汚染するかもしれない。従って、約４時間後に、この不活化混合物全体を（２４時間後にはBEIだけを有する）第２不活化タンクに移す。
不活化を監視し、そして回帰直線の正しい形を確かめるために、試料を２０分毎に採取する。本発明の方法では、１５０リットルのバッチで、外挿不活化プロットは不活化の終点（２４時間時点）において−６．３log10ＩＤ５０より下に達しなければならない。不活化はBEIを中和する２％のSTSの添加によって停止される。
【００１４】
BEIおよびホルムアルデヒドは共に有毒な物質であり、従って注意して取り扱われるべきである。BEIはヒュームフード中で製造される。BEI溶液は極めて有毒で、おそらくは発癌性であるので、環化（以下を参照されたい）後にその溶液は最高度に注意して取り扱われるべきである。残るBEIはそれを捨てる前に２０％STS溶液で中和されなければならない。
注：例えばｐＨの補正のためにトリス（Tris）または他の四級アンモニウム塩を使用することは、それら塩はFAと反応するので控えるべきである。トリスは、また、FAによるさらなる架橋／不活化を停止させるために使用することもできる。
【００１５】
BEIおよびBEI−FAの調製（３００Ｉウイルス収穫のため）
BEI−FA溶液の調製は、ヒュームフード（室温）中で、次のように行われなければならない：
−２９７０ｍＬの滅菌蒸留水を５リットルの滅菌試薬瓶に配分する。
−２１ｇのNaOHを上記３リットルの蒸留水に加える。
−滅菌磁石を加え、そしてNaOHが全て溶解されるまで攪拌する。（時間を節約するために、NaOHはBEIが必要とされる前日に調製することができる。）
−NaOH溶液のｐＨを測り、その実測ｐＨ値をその瓶および記録シートに書き留める。
−６１．５ｇのBEIを上記３リットルのNaOH溶液に加える。
−１．５ｍＬの１％β−ナフトールバイオレット溶液を上記BEIに加える。
−BEIの環化を磁気攪拌子で３７℃において１時間行わせる。
−環化後のｐＨを測定する。（１０〜１１のｐＨ範囲。）
−溶液の色をチェックする。
−環化後にβ−ナフトールバイオレットの色は紫色からオレンジ色に変化している。
−BEI−FAの組み合わせによる不活化のために、３０ｍＬのホルマリン溶液を加える。
【００１６】
BEIだけによる不活化の手順
−ウイルス収穫物１リットルにつき１０ｍＬの０．１Ｍ BEIを加えて１ｍＭの最終濃度に達せしめる。
−不活化の初めの６時間中に試料（３０ｍＬ、以下を参照されたい）を１時間毎に採取する。
−ウイルスの力価がゼロより低く（ウイルス粒子１個／ｍＬ未満に）なると予想されるときは、２４時間の不活化後に同量のBEIを加え、そしてその不活化混合物を第２不活化タンク（ITT 2）に移す。
−１００ｍＬの試料を採取する。
−試料のｐＨをチェックする。
−４８時間時点に１０％の２０％STS溶液を加え、そして攪拌する（最終STS濃度：２％）。
−ｐＨをチェックするために、また「試験管内」安全性、１４６Ｓおよび滅菌の各試験（それぞれのSOPを参照されたい）のために６００ｍＬの試料を採取する。
−ITT 2を、そのジャケットを通して冷水をどっと流すことによって冷却する。
−今や、不活化された抗原はさらに処理するための「検疫ゾーン」に移すことができる。
【００１７】
BEI−FAの組み合わせによる不活化の手順
−ウイルス収穫物１リットル当たり１０ｍＬの０．１Ｍ BEI−FAを加えて、１ｍＭ BEIおよび０．０４％FA（約１ｍＭ）の最終濃度に達せしめる。
−初めの３時間中に２０分毎に試料を採取する。
−ウイルスの力価がゼロより低く（ウイルス粒子１個／ｍＬ未満に）なると予想されるときは、４時間の不活化後にその不活化混合物を第２不活化タンク（ITT 2）に移す。
−１００ｍＬの試料を採取する。
−２０時間の不活化後に１０％の２０％STS溶液を加え、そして攪拌する（最終STS濃度：２％）。
−ｐＨをチェックするために、また「試験管内」安全性、１４６Ｓおよび滅菌の各試験（それぞれのSOPを参照されたい）のために６００ｍＬの試料を採取する。
−ITT 2を、そのジャケットを通して冷水をどっと流すことによって冷却する。
−今や、不活化された抗原はさらに処理するための「緩衝液ゾーン」に移すことができる。
【００１８】
不活化プロセスの監視
一般原則
両不活化タンクに、サンプリング間に蒸気滅菌されるサンプリング装置を備え付ける。
サンプリングおよび滴定
−少なくとも３０ｍＬの試料を採取する（以下を参照されたい）。
−各試料を直ちに８ｍＬずつの３つの分量に分割し、そして、それらを、１ｍＬの２０％STS、および抗FMDウイルス活性がない１ｍＬのウシ胎児血清を含んでいる試料瓶に加えると、FBS１０％およびSTS２％の最終濃度が与えられる。１つの試料を４℃で、また２つの試料を予備として残すために−７０℃で貯蔵する。
−４時間の時点において１００ｍＬの試料を採取し、その後に不活化混合物を第２不活化タンクに移し、そしてｐＨを測定する。
−不活化の終点において６００ｍＬの最終試料を採取する。
−微量定量プレート中でIBRS細胞により滴定することによりウイルス力価の低下を監視する。力価は１０のlog単位／ｍＬとして表され（例えば、１００万感染用量／ｍＬは力価６となる）、そしてグラフとしてプロットされる。
下流の処理
不活化ウイルス抗原を通常の限外濾過により約２リットルまで濃縮した。この濃縮抗原の試料を採取し、そして通常の検査および対照（滅菌、１４６Ｓ抗原収量、およびELISA）のために出した。他の試料、および濃縮抗原の大部分を−７０℃で貯蔵した。
【００１９】
実験ワクチン
全５株のFA−BEI不活化ワクチン株の混合物から実験用Al(OH)3−サポニンワクチンを調製した。これらワクチンは、１．６μｇが加えられたSAT3 KNP90/3を除けば、用量３ｍＬ当たり各ワクチン株の１４６Ｓ抗原０．８μｇを含んでいた。５匹のウシにある用量（０．７５ｍＬ）の１／４をワクチン注射した。このワクチン注射後に採取した血清試料をウイルス中和検定法で試験した。
【００２０】
本発明で得られた結果
ＢＥＩ単独で得られた代表的な不活化プロットを図１ａに示す。我々の実験では、ＢＥＩ単独で、不活化速度は、１時間あたり０．４および１．０対数の間で異なり（Ｂａｈｎｅｍａｎｎ、１９９０も参照されたい）、そしてときに、低い不活化速度では、一次プロットは、ある程度の「減少（ｔａｉｌｉｎｇ  ｏｆｆ）」を示唆する。
通常、不活化は４８時間行う。２４時間で、ＢＥＩの第２の部分を添加する。したがって、最低不活化速度であっても、十分な安全性を期待することが可能であり、そして最後の安全性試験を通過する。
添付の図１ａからｆに、ＳＡＴワクチン株の１つについてのＢＥＩ単独で得られた不活化プロット（ａ）と、５つのワクチン株についてのＢＥＩ−ＦＡで得られた不活化プロット（ｂ−ｆ）を示す。
不活化速度は、１時間あたり２．０（ＳＡＴ１−ＳＡＲ９／８１、図１ｂ）から３対数以上（ＳＡＴ２−ＺＩＭ  ７／８３およびＳＡＴ２  ＫＮＰ−１９／８９／２、それぞれ図１ｄおよび１ｅ、表１）まで異なった。したがって、不活化は、ＦＡを添加すると、２０倍以上から１００倍以上である。
【００２１】
【表１】
2003517834.tif 000001
【００２２】
何がこの相乗効果を引き起こすのか述べるのは難しい。最適条件下で、ＦＡ単独では、およそ０．３対数／時間の速度でしか不活化しない（Ｂａｒｔｅｌｉｎｇ、１９８４）。したがって、いかなる付加も、ＢＥＩのより速い不活化が予期されるものではない。
これらのグラフから、ＦＡ−ＢＥＩの組み合わせにより、直線プロットが得られ、そしてウイルス力価は、１時間あたり２対数以上減少することが見出されたことが明らかである。したがって、すでに８時間以内に、許容しうる安全性で、十分な不活化に達した。したがって、６時間後に採取された多量（２００ｍｌ）の試料中に生存しているウイルスはなく、最終試料（２０時間時点のもの）の場合も同様であった。
【００２３】
マイクロタイター系において、未希釈および１０倍希釈試料が細胞変性効果を引き起こしたことに注目すべきであるが、これは、ホルムアルデヒドの毒性（またはＦＡ−ＢＥＩの組み合わせ）のためであり、そしてこれらのカップから、ウイルスは増殖不能であった。
したがって、この不活化は、ＢＥＩ単独での不活化に必要とされる４８時間の代わりに、作業日またはたった一晩の時間内で行うことが可能である。これは、毎週の産生計画により大きな融通性を与える。
ＢＥＩ単独では、抗原収量（ＳＡＴ株のもの）は、しばしば、不活化４８時間中に、１０から３０パーセント減少した。ＦＡ−ＢＥＩでの不活化２４時間後に、１４６  Ｓ抗原濃度の減少は観察されなかった。条件が他の点で同一であった場合、ＢＥＩで観察されるところのおよそ半分の減少を期待することができた。最適収量は、おそらく、ＦＡの架橋作用による抗原の固定化に起因する（Ｂａｒｔｅｌｉｎｇ、１９８４）。
５つのＢＥＩ−ＦＡ不活化抗原から調製したワクチンでの５頭のウシのワクチン接種後に得られた結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
2003517834.tif 000002
【００２５】
曝露（ワクチン接種３週間後）は、ＳＡＴ  １  ＫＮＰ  １９６／９１−１で行った。５頭の動物のうち２頭が保護され、そして１頭が部分的に保護された（１病変）。
ワクチン中に取り込まれた抗原（およびアジュバント）が少量であったことを考慮すると、ワクチンは非常によく機能した。ワクチンは、ＦＭＤワクチン株あたり、３ｍｌ用量あたり、０．８μｇを含み、そして用量の１／４（０．７５ｍｌ）を注射した。
ワクチン接種２週間後、最低中和抗体反応は、ＳＡＴ  １  ＫＮＰ  ９１／１に対してであり（１．８対数の平均力価）、そしてしたがって、この株を曝露株として選択した（表２）。２頭の動物は保護され、そして１頭は部分的に保護され、保護レベルがおよそ５０％（１  ＰＤ  ５０）であることが示された。注射されたワクチン用量は、ＦＭＤウイルス種（例えばＳＡＴ１）あたりおよそ０．４μｇを含んだため、これらの結果は、（最も弱い抗原に関して）１μｇあたり、産業標準に比較して、驚くほど優れた、およそ２．５  ＰＤ  ５０の保護レベルを期待することが可能であることを示す。
【００２６】
１４６  Ｓ抗原の安定性は、新規ワクチン株を選択するのに重要なパラメーターである。１４６  Ｓ抗原を安定化させる、ＦＡの架橋作用により、このパラメーターは、より重要でなくなり、そしてしたがって、ＢＥＩ−ＦＡ不活化法は、比較的早く、新規ワクチン株の迅速な導入を行うであろう。
ＦＡの架橋作用による抗原の固定化のため、出願者らは、ワクチンがより優れた安定性のものであることを予期する。これは、コールドチェイン条件の維持が常に可能ではない発展途上国（例えばアフリカ）で特に重要である。
【００２７】
本発明にしたがった不活化法は、不活化速度を非常に増大させ、既知の方法での＋／−２時間に比較し、およそ８時間以下で、十分な安全性レベルに達する、非常に増大した不活化速度を示す。したがって、本発明の方法での２０時間の不活化は、バッチの安全性に対して、いかなる論争の可能性も残さない。
本発明にしたがった新規不活化法は、少なくとも１日、ワクチン製造過程を短くする。これは、ワクチン製造システムをよりはるかに融通の効くものにし、そしてこの過程を（クロロホルム処理も含む）週４日作業内に収める。
出願者らはさらに、本発明にしたがった方法に際し、不活化の間にＦＡがウイルス抗原を固定化するので、比較的長い貯蔵寿命を持ち、相対的にはより有効なワクチンをもたらすであろうと考える。
【００２８】
ＢＥＩ単独での不活化が、好ましい条件下で１時間あたり０．５−１．０対数の不活化速度を生じるところにおいて（Ｒｗｅｙｅｍａｍｕら）、これまで研究した５つのワクチン株では、本発明にしたがった方法が２．０から３．３対数（図２ｂ−２ｆ、表１）の不活化速度を示すと示された。したがって、本発明の方法は、８時間以内に十分な不活化の保証を与えることが可能である。これはまた、作業日の時間枠内で、不活化を行うことが可能であることも意味する。これは、先行技術にしたがって、現在まで、週全作業時間内になんとか収まるのみであったワクチン産生過程（ワクチン産生、採取、清澄化、不活化、および抗原濃縮）において、非常に有益である。
出願者らは、本発明の上述の方法にしたがって不活化した微生物を含むテストキットを調製することが可能であることを予測する。テストキットにおいて、不活化微生物は、アレルゲンの形態であっても、またはＥＬＩＳＡで使用するための抗原の形態であってもよい。
付随する請求項の範囲から逸脱することなく、本発明にしたがった方法、ワクチン、およびキットに、細部に渡る変動が可能であることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１ａ〜ｆは、ＳＡＴワクチン株の１つに関してＢＥＩ単独で得られた不活化プロット（ａ）と、５つのワクチン株に関してＢＥＩ−ＦＡで得られた不活化プロット（ｂ−ｆ）を示す。図１ａは、ＢＥＩ単独で得られた代表的な不活化プロットを示す。