(57)【要約】本発明は、CXCL17の発現または活性を阻害することにより、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pmlおよび他の腫瘍抑制因子の喪失によって特徴付けられるがんを処置する組成物および方法、ならびにマウスプラットフォームを用いてCXCL17アンタゴニストを同定するための方法を特徴とする。2019530733.tif 000022
2019530733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ptenおよびp53の欠損によって特徴付けられるがんを処置する方法であって、
Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、および/またはPml欠損と同定されたがんを有する対象にCXCL17の発現または活性を阻害する作用物質を投与する段階
を含む、方法。
【請求項２】
がんを有する対象を処置する方法であって、
(a) 該対象から生体サンプルを得る段階、
(b) 生体サンプル中のPten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlからなる群より選択される腫瘍抑制因子を検出する段階であって、ここで腫瘍抑制因子の欠損は、該対象がCXCL17阻害から恩恵を受けうることを示す、段階、 ならびに
(c) CXCL17発現または活性を阻害する作用物質を該対象に投与し、それによってがんを処置する段階
を含む、方法。
【請求項３】
前記がんが、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、膵臓がん、または上皮由来の任意の他のがんである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
選択された対象において前立腺がんを処置する方法であって、
Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlからなる群より選択される腫瘍抑制因子が欠損しているがんを有するとして選択されている対象に、CXCL17発現または活性を阻害する作用物質を投与する段階
を含む、方法。
【請求項５】
前記作用物質が抗CXCL17抗体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
抗CXCL17抗体が中和抗体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記作用物質が、CXCL17タンパク質の発現を阻害する阻害性核酸分子である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、siRNA、またはshRNAである、請求項3記載の方法。
【請求項９】
前記作用物質がCID-2745687またはML-145である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
骨髄由来のサプレッサー細胞動員を阻害し、腫瘍成長を低減し、かつ/または対象の生存率を増加させる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記がんは、Ptenおよびp53が欠損している、PtenおよびZbtb7a/Pokemonが欠損している、Pten、Zbtb7a/Pokemon、およびp53が欠損している、またはPten、p53、Zbtb7a/Pokemon、およびPmlが欠損している、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
内因性または組み換えCXCL17を発現する前立腺がんオルガノイドを含む、マウス。
【請求項１３】
Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlからなる群より選択される1つまたは複数の腫瘍抑制因子を発現することができない、または検出不能なレベルで発現する、請求項11記載のマウス。
【請求項１４】
前記細胞が前立腺上皮細胞である、請求項12記載のマウス。
【請求項１５】
薬物スクリーニングのための免疫適格性マウスモデルを得るための方法であって、
(a) 1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有するマウスから、CXCL17を発現する1つまたは複数の新生物細胞を得る段階、
(b) 新生物細胞をインビトロで培養して1つまたは複数のがんオルガノイドを得る段階、
(c) 定義された遺伝子損傷を有しない同系マウスにがんオルガノイドを移植し、それによって薬物スクリーニングのための免疫適格性マウスモデルを得る段階
を含む、方法。
【請求項１６】
1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有する対象のために抗がん治療用作用物質を同定する方法であって、
(a) 1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有するマウスから、CXCL17を発現する1つまたは複数の新生物細胞を得る段階、
(b) 新生物細胞をインビトロで培養して1つまたは複数のがんオルガノイドを得る段階、
(c) 免疫適格性同系マウスにがんオルガノイドを移植する段階、
(c) 該同系マウスに1つまたは複数の候補作用物質を投与する段階、および
(d) 候補作用物質に対するオルガノイドまたは同系マウスの生物学的応答をアッセイする段階
を含む、方法。
【請求項１７】
定義された遺伝子損傷が、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlからなる群より選択される腫瘍抑制遺伝子中にある、請求項15または16記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子損傷が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、挿入、欠失、またはフレームシフトである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
定義された遺伝子損傷が、腫瘍抑制因子における発現または機能の喪失をもたらす、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
候補作用物質が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または低分子化合物である、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドが抗CXCL17抗体である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
生物学的応答をアッセイする段階が、腫瘍血管新生、腫瘍浸潤性骨髄由来サプレッサー細胞のプロファイル、骨髄由来サプレッサー細胞の走化性、Treg数の変化とCXCL17発現レベルの相関関係、Th1対Th2サイトカインプロファイル、腫瘍成長、および/またはマウス生存率を検出することを含む、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有する対象のために抗がん治療用作用物質を同定する方法であって、
(a) それぞれが1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有するマウスのセットから、CXCL17を発現する1つまたは複数の新生物細胞を得る段階、
(b) 新生物細胞をインビトロで培養してがんオルガノイドのセットを得る段階、
(c) 免疫適格性同系マウスに各がんオルガノイドを移植する段階、
(c) 同系マウスに1つまたは複数の候補作用物質を投与する段階、および
(d) 候補作用物質に対するオルガノイドまたは同系マウスの生物学的応答をアッセイする段階であって、ここで腫瘍成長の低減またはマウス生存率の増加は、候補作用物質が、対応する定義された遺伝子損傷を有する対象の処置に有用であることを示す、段階
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年8月30日付で出願された米国仮特許出願第62/381,281号の優先権の恩典を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府支援の研究の下でなされた発明に対する権利の陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号CA102142の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
腫瘍微小環境(TME)は、細胞外マトリックス、線維芽細胞、血管および免疫細胞を含む。これらの成分の全てが腫瘍の進行および治療に対する応答において重要な役割を果たすことがますます明らかになってきている。特に、TME中の免疫細胞は固定された組成のものではなく、むしろ腫瘍の進化の間に有意な形態学的および機能的変化を受ける。例えば、TME中のGr-1+/CD11b+細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)および好中球を含む表現型的に不均一な集団である。MDSCはT細胞活性化を妨害することによって腫瘍免疫監視を妨害するが、好中球は腫瘍抑制機能だけでなく、腫瘍の進行および転移の調節における腫瘍促進機能も有することが示されている。これらのデータは、腫瘍微小環境におけるGr1+/CD11b+細胞の集団が高い表現型の異質性を示すこと、およびそれらの腫瘍進行での役割が強く状況依存的であるように思われることを示唆する。それでも、特定の表現型と生物学的役割を引き起こすと思われる正確な腫瘍の特徴は完全には明らかになっていない。
【０００４】
がんは慢性炎症と関連していることが多いが、「炎症とは無関連の」がんも重大な免疫浸潤を示し、がん細胞における異なる遺伝的事象が潜在的に腫瘍成長を刺激する炎症に基づいたプログラムにつながる可能性を示唆している。しかしながら、免疫ランドスケープのダイナミクスとその進化が、がんの遺伝的構成によって差別的かつ直接的に駆動されるかどうか、およびそれがどのように駆動されるかどうかは、現在のところ不明であり、このことが、可能な治療的免疫介入の精度を制限している。
【０００５】
したがって、がんを特徴付けかつ適切に調整された治療を提供するための組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
以下に記載するように、本発明は、CXCL17発現または活性を阻害することによって、腫瘍抑制因子(例えば、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pml)の喪失により特徴付けられるがんを処置する組成物および方法、ならびにマウスプラットフォームを用いてCXCL17アンタゴニストを同定するための方法を特徴とする。
【０００７】
1つの局面において、本発明は、Ptenおよびp53の欠損により特徴付けられるがんを処置する方法を特徴とし、該方法は、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、および/またはPml欠損と同定されたがんを有する対象にCXCL17発現または活性を阻害する作用物質を投与する段階を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、がんを有する対象を処置する方法を特徴とし、該方法は、該対象から生体サンプルを得る段階; 生体サンプル中のPten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlからなる群より選択される腫瘍抑制因子を検出する段階であって、ここで腫瘍抑制因子の欠損は、該対象がCXCL17阻害から恩恵を受けうることを示す、段階; ならびにCXCL17発現または活性を阻害する作用物質を該対象に投与し、それによってがんを処置する段階を含む。1つの態様において、がんは前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、膵臓がん、または上皮由来の任意の他のがんである。
【０００９】
別の局面において、本発明は、選択された対象において前立腺がんを処置する方法を特徴とし、該方法は、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlからなる群より選択される腫瘍抑制因子が欠損しているがんを有するとして選択されている対象に、CXCL17発現または活性を阻害する作用物質を投与する段階を含む。
【００１０】
別の局面において、本発明は前立腺がんオルガノイドを含むマウスを特徴とし、このオルガノイドは内因性または組み換えCXCL17を発現する。1つの態様において、マウスは、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlからなる群より選択される腫瘍抑制因子の1つまたは複数を発現することができない、または検出不能なレベルで発現する。別の態様において、細胞は前立腺上皮細胞である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、薬物スクリーニングのための免疫適格性マウスモデルを得るための方法を特徴とし、該方法は、1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有するマウスから、CXCL17を発現する1つまたは複数の新生物細胞を得る段階; 新生物細胞をインビトロで培養して1つまたは複数のがんオルガノイドを得る段階; および定義された遺伝子損傷を有しない同系マウスにがんオルガノイドを移植し、それによって薬物スクリーニングのための免疫適格性マウスモデルを得る段階を含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有する対象のために抗がん治療用作用物質を同定する方法を特徴とし、該方法は、1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有するマウスから、CXCL17を発現する1つまたは複数の新生物細胞を得る段階; 新生物細胞をインビトロで培養して1つまたは複数のがんオルガノイドを得る段階; 免疫適格性同系マウスにがんオルガノイドを移植する段階; 同系マウスに1つまたは複数の候補作用物質を投与する段階; および候補作用物質に対するオルガノイドまたは同系マウスの生物学的応答をアッセイする段階を含む。1つの態様において、定義された遺伝子損傷(例えば、ミスセンス変異、ナンセンス変異、挿入、欠失、またはフレームシフト)は、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlからなる群より選択される腫瘍抑制遺伝子中にある。別の態様において、定義された遺伝子損傷は、腫瘍抑制因子における発現または機能の喪失をもたらす。別の態様において、候補作用物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または低分子化合物である。別の態様において、ポリペプチドは抗CXCL17抗体である。別の態様において、生物学的応答をアッセイする段階は、腫瘍血管新生、腫瘍浸潤性骨髄由来サプレッサー細胞のプロファイル、骨髄由来サプレッサー細胞の走化性、Treg数の変化とCXCL17発現レベルの相関関係、Th1対Th2サイトカインプロファイル、腫瘍成長、および/またはマウス生存率を検出することを含む。
【００１３】
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の定義された遺伝子損傷を有する対象のために抗がん治療用作用物質を同定する方法を特徴とし、該方法は、それぞれが1つまたは複数の遺伝子損傷を有するマウスのセットから、CXCL17を発現する1つまたは複数の新生物細胞を得る段階; 新生物細胞をインビトロで培養してがんオルガノイドのセットを得る段階; 免疫適格性同系マウスに各がんオルガノイドを移植する段階; 同系マウスに1つまたは複数の候補作用物質を投与する段階; および候補作用物質に対するオルガノイドまたは同系マウスの生物学的応答をアッセイする段階であって、ここで腫瘍成長の低減またはマウス生存率の増加は、候補作用物質が、対応する定義された遺伝子損傷を有する対象の処置に有用であることを示す、段階を含む。
【００１４】
上記の局面のさまざまな態様において、作用物質は抗CXCL17抗体(例えば、中和抗体)である。上記の局面の他の態様において、作用物質は、CXCL17タンパク質の発現を阻害する阻害性核酸分子(例えば、アンチセンス分子、siRNAまたはshRNA)である。他の態様において、作用物質はCID-2745687またはML-145である。上記の局面の他の態様において、本方法は、骨髄由来のサプレッサー細胞動員を阻害し、腫瘍成長を低減し、かつ/または対象生存率を高める。上記の局面の他の態様において、がんは、Ptenおよびp53が欠損している; PtenおよびZbtb7a/Pokemonが欠損している; Pten、Zbtb7a/Pokemonおよびp53が欠損している; またはPten、p53、Zbtb7a/Pokemon、およびPml)が欠損している。
【００１５】
本発明によって定義される組成物および物品は、単離されたかまたは別の方法で製造された。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１６】
定義
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いられる多くの用語の一般的定義を当業者に提供する: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において用いられる場合、以下の用語は、他に特定されない限り、以下のそれらに帰属する意味を有する。
【００１７】
「ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド17 (CXCL17)ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号Q6UXB2-1に対して少なくとも約85%またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつCXCL17生物学的活性を有したタンパク質またはその断片を意味する。
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【００１８】
「CXCL17ポリヌクレオチド」とは、CXCL17ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。
【００１９】
「CXCL17生物学的活性」とは、ケモカイン活性またはGPR35結合活性を意味する。
【００２０】
「CID 2745687」とは、以下の構造を有する小化合物を意味する。
2019530733.tif 000004
CID 2745687は、例えば、Tocrisから市販されている。
【００２１】
「ML 145」とは、GPR35に拮抗し、以下の構造を有した小化合物を意味する。
2019530733.tif 000005
【００２２】
「腫瘍抑制因子ポリペプチド」とは、腫瘍の発生、成長または増殖を抑制するタンパク質を意味する。
【００２３】
「腫瘍抑制因子ポリヌクレオチド」とは、腫瘍抑制因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的な腫瘍抑制因子としてはPten、Zbtb7a/Pokemon、p53、およびPmlが挙げられる。
【００２４】
「腫瘍抑制因子欠損」とは、腫瘍抑制因子ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルの低減を有することを意味する。1つの態様において、低減は、対応する対照細胞に存在する発現レベルの少なくとも約10、20、25、50、または75%だけである。
【００２５】
PTEN
1つの態様において、PTENをコードするポリヌクレオチドの変異のためにPTEN発現は検出不能である。例示的なPtenポリヌクレオチド配列を以下に提供する。
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【００２６】
Zbtb7a/Pokemon
1つの態様において、Zbtb7a/Pokemonポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異のためにZbtb7a/Pokemon発現は検出不能である。例示的なZbtb7a/Pokemonポリヌクレオチドの配列を以下に提供する。
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【００２７】
例示的なZbtb7a/Pokemonタンパク質の配列を以下に提供する。
ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有タンパク質7A
NCBI参照配列: NM_001317990.1
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【００２８】
P53
1つの態様において、p53ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異のためにp53発現は検出不能である。例示的なp53ポリヌクレオチドの配列を以下に提供する。
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【００２９】
例示的なp53ポリペプチドの配列を以下に提供する。
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【００３０】
Pml
1つの態様において、Pmlポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異のためにPml発現は検出不能である。例示的なPmlポリヌクレオチドの配列を以下に提供する。
2019530733.tif 000014
【００３１】
例示的なPmlポリペプチドの配列を以下に提供する。
2019530733.tif 000015
【００３２】
「作用物質」とは、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【００３３】
「改善する」とは、疾患の発症または進行を減らす、抑制する、減弱する、軽減する、停止させる、または安定化させることを意味する。
【００３４】
「改変」とは、本明細書において記載されるものなどの標準的な当技術分野で公知の方法によって検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化(増加または減少)を意味する。本明細書において用いられる場合、改変は、発現レベルの10%の変化、好ましくは25%の変化、より好ましくは40%の変化、および最も好ましくは50%またはそれ以上の発現レベルの変化を含む。
【００３５】
「類似体」とは、同一ではないが、しかし類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持しながら、天然ポリペプチドと比べて類似体の機能を増強するある種の生化学的修飾を有する。そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変化させることなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を増加させることができる。類似体は、非天然アミノ酸を含みうる。
【００３６】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子をいう。抗体を調製する方法は、免疫学の科学における当業者には周知である。抗体は、天然の供給源に由来するまたは組み換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであることができ、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。四量体は、天然に存在してもよく、または一本鎖抗体もしくは抗体断片から再構築されてもよい。抗体はまた、天然に存在しうるか、または一本鎖抗体もしくは抗体断片から構築されうる二量体を含む。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab') 2、ならびに一本鎖抗体(scFv)、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む種々の形態で存在しうる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。
【００３７】
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部分をいい、無傷の抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、線状抗体、scFv抗体、標的に対して十分な親和性を示すVLまたはVHドメインのどちらかから構成される、ラクダ抗体のような、単一ドメイン抗体(Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38)、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されることはない。抗体断片はまた、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはヒト抗体もしくはヒト化抗体の一部分を含む。
【００３８】
本開示において、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含有する(containing)」、および「有する(having)」などは、米国特許法でそれらに帰属する意味を有することができ、「含む(includes)」、「含む(including)」などを意味することができる; 「から本質的になる」または「から本質的になる」は同様に、米国特許法に基づく意味を有し、この用語は制限がなく、記載されているものの基本のまたは新規の特徴が、記載されているものよりも多くの存在によって変えられるのではなく、先行技術の態様を除外する限り、記載されているものよりも多くの存在を許容する。
【００３９】
「定義された遺伝子損傷」とは、野生型配列または参照配列に対してのポリヌクレオチド配列の変化を意味する。例示的な損傷としては、ミスセンス変異、ナンセンス変異、挿入、欠失、またはフレームシフトが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００４０】
「検出する」とは、検出されるべき分析物の存在、非存在または量を同定することをいう。
【００４１】
「検出可能な標識」とは、関心対象の分子に連結された場合に分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって後者を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位元素、磁性ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて通常用いられるような)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。
【００４２】
「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害を意味する。疾患の例としては、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、卵巣がん、膵臓がん、または上皮由来の任意の他のがんを含むがこれらに限定されない、Ptenおよびp53の欠乏によって特徴付けられる任意のがんが挙げられる。疾患の例としては、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pmlおよび/または他の腫瘍抑制因子の欠乏によって特徴付けられる任意のがんが挙げられる。
【００４３】
「有効量」とは、未処置の患者と比べて疾患の症状を改善するのに必要な量を意味する。疾患の治療的処置のため本発明を実践するために用いられる活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、および全身の健康状態に応じて変わる。最終的には、担当医または獣医が適切な量および投与計画を決定するであろう。そのような量は「有効」量と称する。
【００４４】
本発明は、本明細書において記載される方法によって特徴付けられる障害を処置するための非常に特異的な薬物の開発に有用ないくつかの標的を提供する。さらに、本発明の方法は、対象で用いるのに安全である療法を同定するための容易な手段を提供する。さらに、本発明の方法は、本明細書において記載される疾患に対する効果について実質的に任意の数の化合物を高容量処理、高感度、かつ低複雑度で分析するための経路を提供する。
【００４５】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含有する。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有しうる。
【００４６】
「ハイブリダイゼーション」は相補的核酸塩基間の、ワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対合する相補的核酸塩基である。
【００４７】
「阻害性核酸」とは、哺乳動物細胞に投与された場合に標的遺伝子の発現の減少(例えば10%、25%、50%、75%、またはさらには90〜100%だけの)をもたらす、二本鎖RNA、siRNA、shRNA、もしくはアンチセンスRNA、またはそれらの一部分、またはそれらの模倣体を意味する。典型的には、核酸阻害剤は、標的核酸分子の少なくとも一部分、またはその相同分子種を含み、あるいは標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部分を含む。例えば、阻害性核酸分子は、本明細書において記載される核酸のいずれかまたは全ての少なくとも一部分を含む。
【００４８】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然の状態で見られる通常付随している成分を程度の差はあれ含まない材料をいう。「単離する」とは、元の供給源または周囲からのある程度の分離を示す。「精製する」とは、単離よりも高い分離度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物もタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさない、または他の有害な結果を引き起こさないように、他の材料を十分に含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組み換えDNA技法によって産生される場合には細胞材料、ウイルス材料もしくは培地、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないならば精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを用いて判定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中に本質的に1本のバンドを生じさせることを意味することができる。修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化を受けることができるタンパク質の場合、異なる修飾は、別々に精製することができる異なる単離タンパク質を生じさせうる。
【００４９】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、その遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸(例えば、DNA)を意味する。それゆえ、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれている組み換えDNA; 自律複製プラスミドもしくはウイルスに組み込まれている組み換えDNA; または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれている組み換えDNA; あるいは他の配列とは独立した別個の分子(例えば、cDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるゲノム断片もしくはcDNA断片)として存在するものを含む。さらに、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子、ならびにさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えDNAを含む。
【００５０】
「単離されたポリペプチド」とは、天然に付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に結び付いているタンパク質および天然有機分子を、少なくとも60重量%含まない場合に単離されている。好ましくは、調製物は、本発明のポリペプチドの少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、および最も好ましくは少なくとも99重量%である。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現によって; またはタンパク質を化学合成することによって得てもよい。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはHPLC分析によって測定することができる。
【００５１】
「マーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。本発明のがんは、マーカーPtenおよびp53の低減または喪失によって特徴付けられるものである。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、「作用物質を得ること」のように「得ること」は、作用物質を合成すること、購入すること、または他の方法で取得することを含む。
【００５３】
「低減する」とは、少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の負の変化を意味する。
【００５４】
「参照」とは、標準または対照の状態を意味する。
【００５５】
「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる定義された配列である。参照配列は特定の配列のサブセットまたは全体; 例えば、全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全cDNAもしくは遺伝子配列でありうる。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは概して、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらにより好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸であろう。核酸の場合、参照核酸配列の長さは概して、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらにより好ましくは約100ヌクレオチドまたは約300ヌクレオチドあるいはその付近またはその間の任意の整数であろう。
【００５６】
「siRNA」とは、二本鎖RNAを意味する。最適には、siRNAは長さが18、19、20、21、22、23または24ヌクレオチドであり、その3'末端に2塩基突出部を有する。これらのdsRNAは、個々の細胞にまたは動物全体に導入することができる; 例えば、それらは血流を介して全身的に導入されうる。そのようなsiRNAは、mRNAレベルまたはプロモーター活性を下方制御するために用いられる。
【００５７】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識かつ結合するが、サンプル、例えば本発明のポリペプチドを天然に含む生物学的サンプル中の他の分子を実質的に認識かつ結合しない化合物または抗体を意味する。
【００５８】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、さまざまなストリンジェンシー条件の下で、相補的ポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書において記載する遺伝子)またはその一部分の間に二本鎖分子を形成する対を意味する。(例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照のこと)。
【００５９】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は通常、約750 mM NaClおよび75 mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500 mM NaClおよび50 mMクエン酸三ナトリウム未満、およびより好ましくは約250 mM NaClおよび25 mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方で高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミド、およびより好ましくは少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約30℃の、より好ましくは少なくとも約37℃の、および最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の濃度、および担体DNAの包含または排除のような、さまざまな追加のパラメータは、当業者に周知である。必要に応じてこれらのさまざまな条件を組み合わせることにより、さまざまなレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム、および1% SDS中30℃で行われるであろう。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS, 35%ホルムアミド、および100 μg/mlの変性サケ精子DNA (ssDNA)中37℃で行われるであろう。最も好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS, 50%ホルムアミド、および200 μg/ml ssDNA中42℃で行われるであろう。これらの条件に対する有用な変形は当業者には容易に明らかであろう。
【００６０】
ほとんどの用途の場合、ハイブリダイゼーションに続く洗浄段階もストリンジェンシーが変わるであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げることによってまたは温度を上げることによって高めることができる。例えば、洗浄段階のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30 mM NaClおよび3 mMクエン酸三ナトリウム未満、および最も好ましくは約15 mM NaClおよび1.5 mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。洗浄段階のためのストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約25℃の、より好ましくは少なくとも約42℃の、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含むであろう。好ましい態様において、洗浄段階は、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中25℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄段階は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中42℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄段階は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中68℃で行われるであろう。これらの条件に対するさらなる変形は当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技法は当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【００６１】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書において記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ)または核酸配列(例えば、本明細書において記載される核酸配列のいずれか1つ)に対して少なくとも50%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために用いられる配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸で少なくとも60%、より好ましくは80%もしくは85%、より好ましくは90%、95%またはさらに99%同一である。
【００６２】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、相同性の程度をさまざまな置換、欠失、および/または他の修飾に割り当てることによって同一または類似の配列を一致させる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む: グリシン、アラニン; バリン、イソロイシン、ロイシン; アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン; セリン、トレオニン; リジン、アルギニン; およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を判定するための例示的なアプローチにおいて、e-3とe-100の間の確率スコアが密接に関連した配列を示す、BLASTプログラムを用いてもよい。
【００６３】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコなどを含むが、これらに限定されない、哺乳動物を意味する。
【００６４】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、1から50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分的な範囲を含むと理解される。
【００６５】
本明細書において用いられる場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、障害および/またはそれに関連する症状を低減または改善することをいう。当然のことながら、排除されるものではないが、障害または状態を処置することは、障害、状態またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としない。本明細書において用いられる場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、障害または状態を有するわけではないが、障害または状態を発症するリスクがあるまたは発症しやすい対象において障害または状態を発症する確率を低減することをいう。
【００６６】
本明細書において用いられる場合、特に明記されない限りまたは文脈から明らかでない限り、「または」という用語は包括的であると理解される。本明細書において用いられる場合、特に明記されない限りまたは文脈から明らかでない限り、「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という用語は、単数または複数であると理解される。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、特に明記されない限りまたは文脈から明らかでない限り、「約」という用語は当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の2標準偏差以内と理解される。約は、記載されている値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%内と理解することができる。文脈から他に明らかでない限り、本明細書において提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【００６８】
本明細書における変数の任意の定義における化学基のリストの列挙は、任意の単一の基または列挙された基の組み合わせとしてのその変数の定義を含む。本明細書における変数または局面に関する態様の列挙は、任意の単一の態様として、または任意の他の態様もしくはその一部分と組み合わせたその態様を含む。
【００６９】
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の任意の組成物および方法のうちの1つまたは複数と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図1A〜1Fは、前立腺がんの遺伝的構成が原発腫瘍中の免疫浸潤物の組成を決定することを示す。図1A: 3ヶ月齢の対照、Ptenpc-/-、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-およびPtenpc-/-; Pmlpc-/-マウスの前立腺(前葉)のグラム単位の重量。図1B: 3ヶ月齢の対照、Ptenpc-/-、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-およびPtenpc-/-; Pmlpc-/-マウスの前立腺組織(前葉)におけるヘマトキシリンおよびエオシン染色。黒い矢印は侵襲的な部位を示す。スケールバー, 0.1 mm。図1C: 円グラフは、3ヶ月齢の対照マウスおよび各前立腺腫瘍モデルの前立腺組織中のT細胞(CD45+/CD3+)、B細胞(CD45+/CD19+/B220+)、マクロファージ(CD45+/CD11b+/F4/80+)およびCD45+/Gr-1+/CD11b+細胞の割合を示す。「他の細胞」は前立腺上皮細胞および他の間質細胞を含む。図1D: 図1CからのCD45+/Gr-1+/CD11b+免疫細胞集団の要約された結果。図1E: 6ヶ月齢のPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-およびPtenpc-/-; Pmlpc-/-マウスの全前立腺のグラム単位の重量。図1F: 6ヶ月齢マウスから収集した結果を示す図1Cと同様の円グラフ。データを平均±SEMとして表す。
【図２】図2A〜2Hは、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-前立腺腫瘍におけるGr-1+/CD11b+細胞の特徴付けを示す。図2A: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-前立腺腫瘍(前立腺前葉, 3ヶ月齢時)から選別されたGr-1+/CD11b+細胞のメイ・グリュンワルド・ギムザ(May-Grunwald Giemsa)染色。図2B: Ptenpc-/- (n=2)、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/- (n=3)またはPtenpc-/-; Trp53pc-/- (n=3)腫瘍から選別されたGr-1+/CD11b+細胞の発現分析は、アルギナーゼ1および誘導型一酸化窒素オキシダーゼ(iNOS)の差次的発現を示す。図2C: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍由来のGr-1+/CD11b+細胞におけるS100A9およびIL1bの有意な上方制御を示すグラフであり、図2D: Ptenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍由来のGr-1+/CD11b+細胞におけるIL10およびCD40の有意な上方制御を示すグラフである。図2E: 3ヶ月齢時のPtenpc-/-;Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-;Trp53pc-/-腫瘍におけるフローサイトメトリーおよびメイ・グリュンワルド・ギムザによるCD11b+細胞におけるGr-1エピトープLy-6GおよびLy-6Cの特徴付け。図2F: Ly6G+/Ly6C+およびLy6G-/Ly6C+細胞集団の定量化は、3ヶ月齢で、主にLy6G-/Ly6C+細胞を示すPtenpc-/-;Trp53pc-/-マウス(n=5)と比べてPtenpc-/-;Zbtb7apc-/-(n=5)におけるLy6G+/Ly6C+細胞の有意な増加を示す。図2G: 6ヶ月齢時のPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍におけるLy6G+/Ly6C+およびLy6G-/Ly6C+分析。図2H: Ptenpc-/-;Trp53pc-/-腫瘍由来の選別されたLy6G+/Ly6C+およびLy6G-/Ly6C+細胞のqRT-PCRによる発現分析。データを平均±SEMとして表す。
【図３】図3A〜3Hは、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍におけるGr-1+/CD11b+細胞動員の異なる機構を示す。図3A: qRT-PCRによる3ヶ月齢時のPtenpc-/-(n=3)、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-(n=4)およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-(n=3)マウスの前立腺腫瘍組織(前葉)におけるケモカインの発現分析。図3B: 3ヶ月齢のPtenpc-/-、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-マウス(n=3)におけるCXCL5タンパク質発現レベルは、CXCL5がPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-前立腺腫瘍において上方制御されることを示す。図3C: RWPE-1ヒト前立腺上皮細胞におけるクロマチン免疫沈降(ChIP)分析は、Zbtb7a免疫沈降物におけるCXCL5遺伝子座MiaおよびH19の濃縮が陽性対照としての役割を果たすことを示す。図3D: RWPE-1細胞におけるZbtb7a過剰発現がCXCL5 mRNAレベルの減少をもたらす。図3E: RWPE-1細胞において、Sox9ノックダウンがCXCL5 mRNAレベルの減少をもたらし、Zbtb7aノックダウンがCXCL5 mRNAレベルの増加をもたらす。図3F: RWPE-1細胞におけるChIP分析はSox9免疫沈降物におけるCXCL5遺伝子座の濃縮を示す。図3G: RWPE-1細胞におけるp53ノックダウンがCXCL17 mRNAレベルの増加をもたらす。p21は陽性対照としての役割を果たす。図3H: RWPE-1細胞におけるChIP分析がp53免疫沈降物におけるCXCL17遺伝子座の濃縮を示し、p21は陽性対照としての役割を果たす。インビトロ細胞株実験のデータは、3つの独立した生物学的複製物の平均±SEMとして表される。
【図４】図4A〜4Kは、CXCL5およびCXCL17がそれぞれ多形核白血球(PMN)細胞および単球に対する化学誘引物質であることを示す。図4A: GM-CSF、IL-6補充培地に加え組み換えCXCL5または組み換えCXCL17のいずれかの中で4日間のGr1+細胞培養物のLy6G+/Ly6C+およびLy6G-/Ly6C+フロー分析は有意な変化を示さなかった。図4B: 健常マウスの骨髄から単離された単球(図4C)、およびGr1+細胞のトランスウェル遊走アッセイ法は、漸増濃度の組み換えCXCL5またはCXCL17のいずれかを補充した培地に対しての異なる遊走を示す(n=3)。図4D: ウエスタンブロット分析により、本発明者らの前立腺がんマウスモデルから単離されたオルガノイドにおける腫瘍抑制遺伝子Zbtb7a、PTENおよびTrp53の特異的欠失が確認される。図4E: 3ヶ月齢Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-;Trp53pc-/-マウスの前立腺から作製されたオルガノイドにおける同様のホスホ-AKTおよびKi67染色を示すヘマトキシリン(Haemotoxylin)およびエオシン(H&E)染色ならびに免疫組織化学(IHC)染色。図4F: 野生型、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-マウスの前立腺から作製されたオルガノイドにおけるCXCL17 qRT-PCR発現分析。図4G: オルガノイド馴化培地を用いてトランスウェル遊走アッセイ法を実施するために用いられた実験戦略の略図。図4H: 健常マウスから単離した単球のトランスウェル遊走アッセイ法は、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-オルガノイドからの馴化培地に対しての遊走の増加を示す(n=3)。図4I: Ptenpc-/-; Trp53pc-/-オルガノイドにおけるCXCL17 qRT-PCR発現分析は、CXCL17 shRNA媒介ノックダウンの有効性を示す。図4J: スクランブルshRNAまたはCXCL17 shRNAのいずれかを発現するPtenpc-/-;Trp53pc-/-オルガノイドからの馴化培地を用いて実施したトランスウェル遊走アッセイ法における、Gr1+細胞のではなく、単球の、遊走の低減(図4K) (n=3)。データを平均±SEMとして表す。
【図５】図5A〜5Hは、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-前立腺腫瘍におけるGr-1+/CD11b+細胞が腫瘍成長を促進することを示す。図5A: 3ヶ月齢時のPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-の前立腺腫瘍におけるCD4+/Foxp3+細胞のフローサイトメトリー分析(n=3)。図5B: 精製CD4+ T細胞をPtenpc-/-;Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍(n=3)由来のGr-1+/CD11b+細胞と3日間共培養し、引き続きフローサイトメトリーを行ってCD4+/Foxp3+ Treg細胞の存在を評価した。図5C: 左パネル: 対照IgG (n=3)または抗CXCL5抗体(n=3)で処置したPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-マウスでのMRIによる腫瘍成長の測定。右パネル: 抗CXCL5抗体による処置後のPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-前立腺腫瘍のフローサイトメトリー分析から、より少ないGr-1+/CD11b+顆粒球が明らかである(n=3)。図5D: 抗CXCL5による処置後のPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-前立腺腫瘍におけるCD45+/CD8+ T細胞(左)およびCD45+/CD4+/FoxP3+ Treg細胞(右)のフローサイトメトリー分析(n=3)。図5E: 左パネル: 対照IgG (n=3)または抗Gr1抗体(n=3)で処置したPtenpc-/-; Trp53 pc-/-マウスでのMRIによる腫瘍成長の測定。右パネル: 抗Gr1抗体による処置後のPtenpc-/-; Trp53pc-/-前立腺腫瘍のフローサイトメトリー分析から、より少ないGr-1+/CD11b+顆粒球が明らかである(n=3)。図5F: 抗Gr1抗体による処置後のPtenpc-/-; Trp53pc-/-前立腺腫瘍におけるCD45+/CD8+ T細胞(左)およびCD45+/CD4+/FoxP3+ Treg細胞(右)のフローサイトメトリー分析(n=3)。図5G: CXCR2アンタゴニストSB225002 (CXCR2i)による処置後のPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-およびPtenpc-/-; Pmlpc-/-前立腺腫瘍のフローサイトメトリー分析。図5H: 左パネル: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-の媒体(n=3)またはCXCR2アンタゴニストSB225002 (CXCR2i) (n=3)処置マウスにおける腫瘍成長は、両モデルでの腫瘍成長の有意な増加を示すが、Ptenpc-/-; Pmlpc-/-マウスはいかなる有意な応答も示さなかった(n=2)。右パネル: 処置0日目(ベースライン)および3週の時点のPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-、処置0日目(ベースライン)および2週の時点のPtenpc-/-; Trp53pc-/-ならびに処置0日目(ベースライン)および2週の時点のPtenpc-/-; Pmlpc-/-の媒体またはSB225002 (CXCR2i)処置マウスにおける前立腺がんの代表的なMRI。ImageJソフトウェアを用いることによって腫瘍体積(点線の円で囲むように描いた領域)を定量した。星印は膀胱の位置を表す。全てのデータを平均±SEMとして表す。
【図６】図6A〜6Hは、前立腺腫瘍モデルの遺伝子型-ケモカイン-免疫表現型軸の臨床的関連性を示す。図6A: 左パネル: 多形核白血球骨髄由来サプレッサー細胞(PMN-MDSC)に対する遺伝子シグネチャを用いてPMN-高、PMN-中およびPMN-低群に分類されたTGCA仮前立腺腺がんデータセット(499サンプル)のヒートマップ。右パネル: CXCL5は、PMN-シグネチャのより高い発現を示したサンプルの群において有意により多く発現されている。図6B: 上パネル: 単球MDSC/M2マクロファージの遺伝子シグネチャを用いてMo-高、Mo-中およびMo-低群に分類されたTGCA仮前立腺腺がんデータセット(499サンプル)のヒートマップ。下パネル: CXCL17は、Mo-シグネチャのより高い発現を示したサンプルの群において有意により多く発現されている。図6C: PTENの状態(変化なし/変化)およびZbtb7aの発現レベル(低/高)によって分類された、ロビンソン(Robinson)データセット(転移性前立腺がん, n=150)のサンプルにおけるCXCL5およびCXCL17の発現レベル。図6D: PTENおよびp53 (変化なし/変化)によって分類されたロビンソンデータセットのサンプルにおけるCXCL17およびCXCL5の発現レベル。図6E: 3群PMN-高、PMN-中およびPMN-低(上パネル)への、ならびに3群T細胞-高、T細胞-中およびT細胞-低(下パネル)へのロビンソンのクラスタリング。図6F: PMN-シグネチャおよびT細胞-シグネチャによって作製された異なるクラスタにおけるPTEN、p53、Zbtb7aおよびPMLの示された状態を有する患者の分布。図6G: PML発現レベルは、それぞれの高シグネチャ群と比較した場合にPMN-低群およびT細胞-低群に分類される患者において有意に低い。図6H: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-マウスにおけるGr-1+/CD11b+細胞による腫瘍進行についての免疫表現型モデル。
【図７】図7A〜7Dは、3ヶ月齢時の各マウスモデルの脾臓および前立腺組織における免疫細胞の浸潤を示す。図7A: 3ヶ月齢時の対照マウスおよび各前立腺腫瘍モデル(n≧3)の脾臓におけるGr-1+/CD11b+細胞、T細胞(CD3+)、B細胞(CD19+/B220+)およびマクロファージ(CD11b+/F4/80+)の割合。図7B: 3ヶ月齢時の対照マウスおよび各前立腺腫瘍モデル(n≧3)の腫瘍におけるT細胞(CD3+)、B細胞(CD19+/B220+)およびマクロファージ(CD11b+/F4/80+)の割合。データを平均±SEMとして表す。図7C: 本発明者らの免疫ランドスケープ分析に用いられたゲーティング戦略。図7D: Gr-1+/CD11b+細胞に対するゲーティング戦略。3ヶ月齢の前立腺Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-およびPtenpc-/-; Pmlpc-/-マウスにおけるGr-1+/CD11b+細胞の代表的なフローサイトメトリーブロット。
【図８】図8A〜8Fは、3ヶ月齢時の各マウスモデルの脾臓および前立腺組織における免疫細胞の浸潤を示す。図8A: 6ヶ月齢時の前立腺腫瘍モデル(n=3)の脾臓におけるGr-1+/CD11b+細胞、T細胞(CD3+)、B細胞(CD19+/B220+)およびマクロファージ(CD11b+/F4/80+)の割合。図8B: 6ヶ月齢時の前立腺がんモデル(n≧3)の腫瘍におけるGr-1+/CD11b+細胞、T細胞(CD3+)、B細胞(CD19+/B220+)およびマクロファージ(CD11b+/F4/80+)の割合。データを平均±SEMとして表す。図8C、図8D、図8E、および図8F: 6ヶ月齢Ptenpc-/-;Trp53pc-/-マウス(n=3)の前立腺腫瘍から単離された表示の細胞集団の代表的なフローサイトメトリーブロット(上パネル)および定量(下パネル)である。
【図９】図9A〜9Cは、前立腺腫瘍組織における免疫細胞の局在を示す。図9A: Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-;Trp53pc-/-前立腺腫瘍(前立腺前葉, 3ヶ月齢時)におけるLy6GエピトープのIHCは、Ly6G+細胞が前立腺の内腔に主に局在し、がん細胞に近接していること(黒い矢印)を示す。スケールバー, 0.05 mm。図9B: 3ヶ月齢時のPtenpc-/-;Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-;Trp53pc-/-前立腺腫瘍(前立腺前葉)におけるCD45R (B220)およびCD3エピトープのIHCから、B細胞およびT細胞が前立腺腫瘍組織の間質に主に局在することが示される。スケールバー, 0.05 mm。図9C: Ly6GおよびLy6Cエピトープの陽性についてのゲーティング戦略。
【図１０】図10A〜10Cは、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/- and Ptenpc-/-; Trp53 pc-/-腫瘍において異なる腫瘍促進活性を示すGr-1+/CD11b+細胞のグラフを提供する。図10A: Ptenpc-/- (n=2)、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-(n=3)およびPtenpc-/-; Trp53pc-/- (n=3)腫瘍から選別されたGr-1+/CD11b+細胞の発現分析により、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍からの顆粒球におけるS100A8の特異的な上方制御が示される。データを平均±SEMとして表す。図10B: 末梢血(血液) (n=4)またはPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍(n=3)から選別されたGr-1+/CD11b+細胞の発現分析により、原発腫瘍部位からの顆粒球におけるS100A9、S100A8およびIL1bの発現の増加が示される。図10C: Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-(n=3)腫瘍から選別されたCD11b+/Gr1+細胞および腫瘍細胞(CD45-/CD49f+)の発現分析により、Gr-1+/CD11b+細胞におけるS100A9、IL1bおよびS100A8の特異的な発現が示される。データを平均±SEMとして表す。
【図１１】図11A〜11Dは、CXCL5発現がPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍において上方制御されることを示す。図11A: 3ヶ月齢Ptenpc-/-およびPtenpc-/-;Zbtb7apc-/-マウス由来の前立腺腫瘍(前葉)から得られたマイクロアレイデータを用いたCXCおよびCCファミリーのケモカインの発現分析。図11B: マイクロアレイによって測定された3ヶ月時のPtenpc-/-;Zbtb7apc-/- vs Ptenpc-/-マウスにおける上方制御された遺伝子の遺伝子ランクリスト。図11C: Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-(n=3)腫瘍から選別されたCD11b+/Gr1+細胞および腫瘍細胞(CD45-/CD49f+)の発現分析により、腫瘍細胞におけるCXCL5の特異的な発現が示される。図11D: qRT-PCRによる3ヶ月齢の、対照(n=3)、Zbtb7apc-/- (n=3)マウスの前立腺組織におけるおよびPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-(n=3)マウス由来の前立腺腫瘍組織(前葉)におけるCXCL5の発現分析。
【図１２Ａ】GM-CSF、IL-6補充培地に加え組み換えCXCL5または組み換えCXCL17のいずれかの中で4日間のBM細胞培養物のLy6G+/Ly6C+およびLy6G-/Ly6C+フロー分析を示すグラフを提供する。
【図１２Ｂ】図12A中の実験および図4A中の実験からのBMおよびGr1+細胞のqRT-PCR遺伝子発現分析を示す2つのグラフを提供する。データを平均±SEMとして表す。
【図１２Ｃ】健常マウスの骨髄から単離されたGr1+細胞および単球の代表的なフローサイトメトリーブロットを示す。
【図１３】図13A〜13Cは、Gr-1+/CD11b+細胞の枯渇は、Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-;Trp53pc-/-マウスにおける全身腫瘍組織量を減少させることを示す。図13A: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-マウス(4ヶ月齢)を、腹腔内注射(300 μg/マウス)によって10日間1日おきにLy6G枯渇抗体または対照IgG抗体で処置し、腫瘍組織を組織学的分析に供した。黒い矢印は低減された全身腫瘍組織量の領域を示す。スケールバー, 0.02 mm。図13B: 媒体またはSB225002 (CXCR2i)で処置したPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍(前立腺前葉)の組織学的分析は、CXCR2阻害後の低減された全身腫瘍組織量を示す(黒い矢印)。スケールバー, 0.02 mm。図13C: 腹腔内注射による10日間毎日のSB225002 (CXCR2i) (n=5)および媒体(n=5)を用いた処置後のPtenpc-/-; Trp53pc-/-前立腺腫瘍のフローサイトメトリー分析は、より少ないFoxp3+細胞を示す。全てのデータを平均±SEMとして表す。
【図１４】図14A〜14Dは、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍においてNFκB経路がGr-1+/CD11b+細胞を通じて著しく活性化されることを示す。図14A: 3ヶ月齢Ptenpc-/-およびPtenpc-/-;Zbtb7apc-/-マウスに由来する腫瘍から得られたマイクロアレイデータを用いたNFκB標的についての遺伝子セット濃縮分析。図14B: 3ヶ月齢Ptenpc-/-、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-、およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-マウス(n=3)の前立腺腫瘍におけるpIRAK4 (全IRAK4で正規化)およびIκBα(β-アクチンで正規化)のタンパク質レベル。図14C: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-マウスにおいて媒体(n=2)またはSB225002 (CXCR2i) (n=3)で処置した前立腺腫瘍におけるIκBα(β-アクチンで正規化)のタンパク質レベル。図14D: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-マウスにおいて媒体(n=3)またはSB225002 (CXCR2i) (n=4)で処置した前立腺腫瘍におけるCXCL5の発現。
【図１５】図15Aおよび15Bは、Ptenpc-/-; Pmlpc-/-マウスにおけるホスホ-ERKおよびβ-カテニンの上方制御を示す。図15A: 3ヶ月齢時のPtenpc-/-およびPtenpc-/-;Pmlpc-/-前立腺腫瘍(前立腺前葉)におけるホスホ-ERKおよびβ-カテニンのIHCを示す。スケールバー, 0.1 mm。図15B: Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/-;Trp53pc-/-およびPtenpc-/-;Pmlpc-/-マウスにおいて観察された3つの異なる免疫ランドスケープの略図。
【図１６】対照、Ptenpc-/-、Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/-;Trp53pc-/-およびPtenpc-/-;Pmlpc-/-実験マウスの遺伝的背景を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明は、CXCL17活性または発現を阻害する作用物質を特徴とする組成物および方法、CXCL17発現または活性を阻害することにより前立腺がん、乳がん、ならびにPten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pml、および他の腫瘍抑制因子の喪失により特徴付けられる他のがんを処置するためのそのような作用物質の使用; ならびにマウスプラットフォームを用いてCXCL17アンタゴニストを同定するための方法を提供する。
【００７２】
本発明は、少なくとも部分的には、p53の喪失がGr-1+/CD11b細胞誘引物質CXCL17の発現増加をもたらすという発見に基づく。前立腺がんにおけるさまざまな遺伝的背景が、腫瘍微小環境の組成に影響を与えることが分かった。これらの変化は、Ptenの喪失、またはZbtb7a/Pokemon、p53、Pmlおよび他の腫瘍抑制因子とともにPtenの複合損失によってのみ駆動される前立腺がんの忠実に遺伝子操作されたマウスモデル(GEMM)の免疫細胞成分を系統的に分析するための包括的な共臨床プラットフォームを用いて特徴付けられた。この分析は、原発腫瘍の遺伝的構成に基づいてGr-1+/CD11b+細胞の浸潤および腫瘍促進機能における顕著な定量的かつ定性的不均一性を明らかにした。
【００７３】
Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-腫瘍において、浸潤性Gr-1+/CD11b+細胞は、S100A9およびIL1βの非細胞自律分泌を通してNFκBシグナル伝達経路に影響を与えることにより腫瘍進行を直接促進する好中球表現型を示した。対照的に、S100A9発現およびそれに続くNFκBシグナル伝達活性化は、顆粒球骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を主に動員するPtenpc-/-;p53pc-/-腫瘍では上方制御されなかった。したがって、このモデルにおけるGr-1+/CD11b+細胞の腫瘍促進効果は、Treg媒介抗腫瘍免疫抑制に基づいていた。p53を欠損したヒト前立腺および乳がん標本では、CXCL17の有意に高い発現が示された。Zbtb7aまたはp53の喪失は、CXCL17の過剰発現およびその結果としての腫瘍促進顆粒球の異常な動員をもたらす。したがって、本発明は、CXCL17の発現または活性を低減する組成物および方法を提供する。1つの態様において、本発明は、対象に抗CXCL17抗体の有効量を投与することによりZbtb7aまたはp53の喪失によって特徴付けられるがんを処置する方法を提供する。
【００７４】
ヒトがんにおけるCXCL17に対する抗体
CXCL17 mRNAの発現増加は、PTENおよびp53欠損であるヒト前立腺および乳がんサンプルにおいて見出された。これらの知見に基づいて、CXCL17は、結腸直腸がんを含む他のがん型において機能する可能性が高い。CXCL17は、Pten-/-; Trp53-/-モデルにおけるMDSCの動員および腫瘍の進行に重要であり、それゆえ、CXCL17を特異的に中和する治療用抗体は、MDSC蓄積を阻害し、腫瘍成長を制限し、かつ生存の増加をもたらす可能性が高い。したがって、本発明は、腫瘍間質内のCXCL17にアクセスして、そこでそれを結合かつ中和する治療用抗体を提供する。1つの態様において、中和抗体はCXCL17の受容体GPR35へのCXCL17の結合をかく乱する。
【００７５】
抗体は、免疫原として、CXCL17ポリペプチドまたはその免疫原性断片を利用し当技術分野において公知の任意の方法によって作製される。抗体を得る1つの方法は、免疫原で適当な宿主動物を免疫すること、およびポリクローナルまたはモノクローナル抗体産生のための標準的な手順に従うことである。免疫原は細胞表面上の免疫原の提示を容易にするであろう。適当な宿主の免疫付与はいくつかの方法で行うことができる。本発明のポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列は、宿主の免疫細胞によって取り込まれる送達媒体中で宿主に提供され得る。細胞は次に、細胞表面上に受容体を発現し、宿主において免疫原性応答を生じる。あるいは、ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列をインビトロにおいて細胞内で発現させ、続いてポリペプチドの単離および抗体を作製する適当な宿主へのポリペプチドの投与を行うことができる。
【００７６】
1つの態様において、本発明は、ヒト-げっ歯類交差反応性CXCL17中和抗体を提供する。1つの態様において、CXCL17ポリペプチドに対する抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリに由来する。バクテリオファージは、ヒト抗体遺伝子と組み合わせると、ヒト抗体タンパク質をディスプレイするように操作できる細菌内で感染および複製することができる。ファージディスプレイは、ファージがその表面上にヒト抗体タンパク質を「ディスプレイ」するようにされるプロセスである。ヒト抗体遺伝子ライブラリ由来の遺伝子をファージの集団に挿入する。各ファージは異なる抗体の遺伝子を保有しているため、その表面上に異なる抗体をディスプレイする。
【００７７】
1つの態様において、ヒトファージディスプレイscFvライブラリは、所望の特性を有する抗体についてスクリーニングされる。交差反応性抗体の選択を推進するためにヒトおよびマウス抗原を用いて選択するためのスキームを図1Oに提供する。1つの態様において、マウス抗原のみの選択が行われる。そのようなマウス特異的抗体は、ヒト特異的抗体の代わりとして用いてもよい。ヒトCXCL17とカニクイザルCXCL17との間の高度な相同性を考慮すると、ヒトCXCL17を結合する抗体は、カニクイザル相同分子種を同様に結合する可能性が高い(図1P)。しかしながら、ヒト/カニクイザル交差反応性を確実とするために、ヒトおよびカニクイザルタンパク質が選択のために交互に用いられる別の選択分岐が行われるであろう(図1O)。
【００７８】
ファージスクリーニングのための一般的フォーマットでは、ビオチン化抗原およびプルダウン戦略を利用する。1つの態様において、CXCL17タンパク質は化学的にビオチン化される。別の態様において、CXCL17タンパク質はビオチン修飾部位(Avi-タグ)を含む。ファージバインダが単離されたら、さらなる結合および機能アッセイ法(例えば、ELISAおよびOctetバイオレイヤ干渉法結合フォーマット(直接結合アッセイ法およびリガンド競合アッセイ法)を用いて精製またはペリプレップ(peri-prepped) scFVを評価する。中和抗体を同定するために、機能的中和アッセイ法および細胞に基づくリガンド結合競合アッセイ法が用いられる。CXCL17およびその受容体GPR35の活性化についての多機能アッセイ法は、公表されており(Pisabarro et al., The Journal of Immunology; 176(4): 2069-2073, 2006; Wang et al., The Journal of Biological Chemistry; 281(31) 22021-22028, 2006; Matsui et al., PLoS ONE; 7(8): e44080, 2012; Burkhardt et al., Journal of Immunology; 188(12): 6399-6406, 2012; Lee et al., American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism 304: E32-E40, 2013; Maravillas-Montero et al., J Immunol. 2015 Jan 1;194(1):29-33)、走化性、カルシウム動員、転写応答、殺菌性、およびシグナル伝達アッセイ法を含む。1つの態様において、中和抗体は、未改変ヒト単球細胞株THP1、および操作細胞株におけるCXCL17受容体の活性を反映するカルシウム動員アッセイ法を用いて特徴付けられる(Wang et al., The Journal of Biological Chemistry; 281(31) 22021-22028, 2006; Lee et al., American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism 304: E32-E40, 2013; Maravillas-Montero et al., J Immunol. 2015 Jan 1;194(1):29-33)。カルシウム動員アッセイ法は、通常ハイスループット形式で実行することができ、粗ファージscFv含有ペリプレップと適合する可能性が高い。上記のように選択された中和抗体を配列決定し、ユニーククローンを分析する。中和抗体を多反応性についてスクリーニングし、多反応性結合剤を除外する。中和抗体もエピトープビニングし、各ビンから選択されたヒットをCXCL17結合および中和活性についてアッセイする。適切な特徴を有する有望なscFvクローンを、細胞溶解および細胞傷害機能を欠くよう(例えば、エフェクタ機能ヌル)に操作された完全ヒトIgGに再フォーマットする。
【００７９】
抗体は、抗体を発現するように操作されたハイブリドーマ細胞から簡便に産生することができる。ハイブリドーマを作製する方法は当技術分野において周知である。ハイブリドーマ細胞を適当な培地中で培養することができ、使用済み培地を抗体源として用いることができる。関心対象の抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体を産生するハイブリドーマから順に得ることができ、次いで抗体はこれらのDNA配列から合成によりまたは組み換えにより産生されうる。大量の抗体の産生の場合、通常、腹水を得ることがより便利でありうる。腹水を作製する方法は通常、ハイブリドーマ細胞を免疫学的にナイーブな組織適合性または免疫寛容性の哺乳動物、特にマウスに注射することを含む。哺乳動物は、適当な組成物(例えば、プリスタン(Pristane))の事前投与によって腹水産生のために予備刺激されうる。
【００８０】
さまざまな態様において、CXCL17に結合する抗体はモノクローナルである。あるいは、抗CXCL17抗体はポリクローナル抗体である。本発明はまた、一方の対の重鎖および軽鎖が第1の抗体から得られ、他方の対の重鎖および軽鎖が異なる第2の抗体から得られるハイブリッド抗体も包含する。そのようなハイブリッドはまた、ヒト化重鎖および軽鎖を用いて形成されうる。そのような抗体は「キメラ」抗体と称されることが多い。本発明の方法によって産生されたモノクローナル抗体(Mab)は、当技術分野において公知の方法によって「ヒト化」することができる。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部がその初期形態から改変されて、それをヒト免疫グロブリンにより近くさせた抗体である。抗体をヒト化する技法は、非ヒト動物(例えば、マウス)抗体が作製される場合に特に有用である。マウス抗体をヒト化するための方法の例は、米国特許第4,816,567号、同第5,530,101号、同第5,225,539号、同第5,585,089号、同第5,693,762号および同第5,859,205号において提供されている。
【００８１】
通常、無傷の抗体は「Fc」および「Fab」領域を含むといわれている。Fc領域は補体活性化に関与しており、抗原結合には関与していない。「F(ab')2」断片と指定される、Fc'領域が酵素的に切断された、またはFc'領域なしで産生された抗体は、無傷の抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、「Fab'」断片と指定される、Fc領域が酵素的に切断された、またはFc領域なしで産生された抗体は、無傷の抗体の抗原結合部位の1つを保持する。Fab断片は、「Fd」と表される、共有結合した抗体軽鎖および抗体重鎖の一部分からなる。Fd断片は抗体特異性の主要決定基である(単一のFd断片は抗体特異性を変えることなく最大10個の異なる軽鎖と会合しうる)。単離されたFd断片は、免疫原性エピトープに特異的に結合する能力を保持している。本発明の抗体は、全自然抗体、二重特異性抗体; キメラ抗体; Fab、Fab'、単鎖V領域断片（scFv）、融合ポリペプチド、および非従来型抗体を含む。
【００８２】
非従来型抗体は、ナノボディ、直鎖状抗体(Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062,1995)、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、および複数の価数を有する抗体(例えば、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、およびペンタボディ)を含むが、これらに限定されることはない。ナノボディは、軽鎖の非存在下で完全に機能的になるように進化した、天然に存在する重鎖抗体の最小の断片である。ナノボディは、従来の抗体の親和性および特異性を有するが、それらは一本鎖Fv断片の半分のサイズにすぎない。このユニークな構造の結果は、それらの極度の安定性およびヒト抗体フレームワークとの高度な相同性と相まって、ナノボディは従来の抗体には接近できない治療標的に結合できるということである。多価を有する組み換え抗体断片は、高い結合活性およびがん細胞に対するユニークな標的化特異性を提供する。これらの多量体scFv (例えば、ダイアボディ、テトラボディ)は、サイズがおよそ60〜100 kDaの小分子がより速い血液クリアランスおよび迅速な組織取り込みを提供するので、親抗体を超える改善を供与する。Powerら(Generation of recombinant multimeric antibody fragments for tumor diagnosis and therapy. Methods Mol Biol, 207, 335-50, 2003); およびWuら(Anti-carcinoembryonic antigen (CEA) diabody for rapid tumor targeting and imaging. Tumor Targeting, 4, 47-58, 1999)を参照されたい。
【００８３】
非従来型抗体を作製および使用するためのさまざまな技法が記載されている。ロイシンジッパーを用いて産生された二重特異性抗体が、Kostelnyら(J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992)によって記載されている。ダイアボディ技術が、Hollingerら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993)によって記載されている。一本鎖Fv (sFv)二量体(diners)の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略が、Gruberら(J. Immunol. 152:5368, 1994)によって記載されている。三重特異性抗体がTuttら(J. Immunol. 147:60, 1991)によって記載されている。一本鎖Fvポリペプチド抗体は、Hustonら(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)によって記載されているように、直接連結されているかまたはペプチドコードリンカーによって連結されているVH-およびVL-コード配列を含む核酸から発現されうる共有結合VH::VLヘテロ二量体を含む。また、米国特許第5,091,513号、同第5,132,405号および同第4,956,778号; ならびに米国特許出願公開第20050196754号および同第20050196754号を参照されたい。
【００８４】
当技術分野において公知の任意の方法によって作製された抗体は、次いで宿主から精製することができる。抗体精製法は、塩沈殿(例えば、硫酸アンモニウムを用いる)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換カラムまたは陰イオン交換カラムにて、好ましくは中性pHで行い、イオン強度を増加させる段階勾配で溶出させる)、ゲルろ過クロマトグラフィー(ゲルろ過HPLCを含む)、ならびにプロテインA、プロテインG、ヒドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリンのような親和性樹脂でのクロマトグラフィーを含みうる。
【００８５】
GPR35アンタゴニスト
CXCL17はGタンパク質共役型受容体GPR35に結合する(Maravillas-Montero et al., J Immunol. 2015 Jan 1;194(1):29-33)。GPR35-CLXL17媒介機能的応答は、50 nMの範囲で報告されている(Maravillas-Montero et al., 前記)。GPR35に拮抗する作用物質は、CD11b+Ly6G+Ly6Clo細胞の腫瘍への走化性を妨げ、腫瘍成長を阻害する可能性が高い。GPR35アンタゴニストが記載されている(Wang et al., The Journal of Biological Chemistry; 281(31) 22021-22028, 2006; Tanaguchi et al., FEBS Letters; 580(21):5003-5008, 2006; Zhao et al., Molecular Pharmacology; 78(4): 560-568, 2010; Jenkins et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics; 343(3): 683-695, 2012)。さらに、ML145およびCID2745687は、ヒトおよびマウスの両方のGPR35においてインビトロアンタゴニスト活性を有することが示されており(Zhao et al., Molecular Pharmacology; 78(4): 560-568, 2010; Jenkins et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics; 343(3): 683-695, 2012)、それゆえ、PTENおよびp53欠損しているがんの処置に有用であると期待されている。
【００８６】
阻害性核酸
阻害性核酸分子は、CXCL17ポリペプチドの発現または活性を阻害するオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、CXCL17ポリペプチドをコードする核酸分子に結合する一本鎖および二本鎖核酸分子(例えば、DNA、RNA、およびその類似体) (例えば、アンチセンス分子、siRNA、shRNA)ならびにポリペプチドに直接結合してその生物学的活性を調節する核酸分子(例えば、アプタマー)を含む。1つの態様において、本発明は、Pten-/-; Trp53-/-腫瘍においてCxcl17発現をノックダウンするためのウイルス媒介shRNAアプローチを提供する。
【００８７】
siRNA
短い21〜25ヌクレオチド二本鎖RNAは、遺伝子発現を下方制御するのに有効である(参照により本明細書に組み入れられるZamore et al., Cell 101: 25-33; Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001)。哺乳動物におけるsirNAアプローチの治療有効性は、McCaffreyら(Nature 418: 38-39.2002)によりインビボで実証された(Nature 418: 38-39.2002)。
【００８８】
標的遺伝子の配列を考慮して、siRNAはその遺伝子を不活性化するようにデザインされうる。そのようなsiRNAは、例えば、罹患組織に直接投与することも、または全身投与することもできる。遺伝子の核酸配列は、低分子干渉RNA (siRNA)をデザインするために用いることができる。21〜25ヌクレオチドのsiRNAは、例えば、がんを処置するための治療用物質として用いてもよい。
【００８９】
本発明の阻害性核酸分子は、RNA干渉(RNAi)媒介性発現ノックダウンのための二本鎖RNAとして利用されうる。1つの態様において、CXCL17ポリペプチドの発現は、PTENおよびp53欠損であるがんを有する対象において低減される。RNAiは、関心対象の特定のタンパク質の細胞発現を減少させるための方法である(Tuschl, Chembiochem 2:239-245, 2001; Sharp, Genes & Devel. 15:485-490, 2000; Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Devel. 12:225-232, 2002; おおびHannon, Nature 418:244-251, 2002に概説されている)。dsRNAのトランスフェクションによるまたはプラスミドに基づく発現系を用いたsiRNAの発現による細胞へのsiRNAの導入は、哺乳動物細胞において機能喪失表現型を作製するためにますます用いられている。
【００９０】
本発明の1つの態様において、本発明の核酸塩基オリゴマーの8〜19個の連続した核酸塩基を含む二本鎖RNA (dsRNA)分子が作製される。dsRNAは、二重鎖を有する2本の異なるRNA鎖、または自己二重鎖を有する1本のRNA鎖(小型ヘアピン(sh)RNA)であることができる。典型的には、dsRNAは約21または22塩基対であるが、しかし必要に応じてより短くてもより長くてもよい(最大で約29核酸塩基)。dsRNAは標準的な技法(例えば、化学合成またはインビトロ転写)を用いて作製することができる。キットは、例えば、Ambion (Austin, Tex.)およびEpicentre (Madison, Wis.)から入手可能である。哺乳動物細胞においてdsRNAを発現させるための方法は、Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002. Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al. Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; およびLee et al. Nature Biotechnol. 20:500-505 2002に記載されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９１】
低分子ヘアピンRNA (shRNA)は、ステム-ループ構造を有するRNA配列を含む。「ステム-ループ構造」とは、片側で主に一本鎖ヌクレオチドの領域(ループ部分)によって連結されている二本鎖または二重鎖(ステム部分)を形成することが知られているまたは予測されるヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸をいう。「ヘアピン」という用語はまた、ステム-ループ構造をいうために本明細書において用いられる。そのような構造は当技術分野において周知であり、この用語は当技術分野におけるその既知の意味と一貫して用いられる。当技術分野において公知であるように、二次構造は正確な塩基対合を必要としない。したがって、ステムは1つまたは複数の塩基ミスマッチまたはバルジを含むことができる。あるいは、塩基対合は正確であることができ、すなわち、いかなるミスマッチも含まない。複数のステム-ループ構造は、例えば、核酸リンカー、miRNAフランキング配列、他の分子、またはそれらのいくつかの組み合わせのような、リンカーを通じて互いに連結することができる。
【００９２】
本明細書において用いられる場合、「低分子ヘアピンRNA」という用語は、前駆体miRNA (プレmiRNA)を形成する従来のステム-ループshRNAを含む。範囲にいくらかのバラツキがありうるが、従来のステム-ループshRNAは、19から29 bpに及ぶステム、および4から30 bpに及ぶループを含むことができる。「shRNA」はまた、マイクロRNA埋め込みshRNA (miRNAに基づくshRNA)を含み、ここでmiRNA二重鎖のガイド鎖およびパッセンジャ鎖は、既存の(もしくは天然の) miRNAにまたは修飾もしくは合成(デザインされた) miRNAに組み込まれる。場合によっては、前駆体miRNA分子は、2つ以上のステム-ループ構造を含むことができる。マイクロRNAは、約22ヌクレオチド長であり、通常、高度に組織特異的または発生段階特異的な形で発現され、かつ標的遺伝子を転写後に調節する内在的にコードされたRNA分子である。植物および動物において200種を超える異なるmiRNAが同定されている。これらの小さな調節RNAは、2つの優勢な作用様式によって: (1) 標的mRNAの翻訳を抑制することによって、ならびに(2) RNA干渉(RNAi)、すなわち、mRNAの切断および分解を通じて重要な生物学的機能を果たすと考えられる。後者の場合、miRNAは低分子干渉RNA (siRNA)と同様に機能する。したがって、既存のmiRNA遺伝子の特徴に基づいて人工miRNAをデザインおよび発現することができる。
【００９３】
shRNAをDNAベクターから発現させて、持続的サイレンシングおよび高収率送達をほとんどいなかる細胞型にも提供することができる。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスおよびトリウイルスベクターを含めて、ならびに安定な単一コピーゲノム組み込みを可能にするそのようなベクターを含めて、レトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスプラスミドベクターが由来しうるレトロウイルスは、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスを含むが、これらに限定されることはない。レトロウイルスプラスミドベクターを利用してパッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成させることができる。トランスフェクトすることができるパッケージング細胞の例としては、参照により全体が本明細書に組み入れられるMiller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990)に記載されているようにPE50l、PA3l7、R-2、R-AM、PA12、T19-14x、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびDAN細胞株が挙げられるが、これらに限定されることはない。ベクターは、当技術分野において公知の任意の手段によってパッケージング細胞に形質導入することができる。プロデューサー細胞株は、DNA複製タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子を利用して、インビトロまたはインビボのいずれかで真核細胞に形質導入することができる。形質導入された真核細胞はDNA複製タンパク質を発現するであろう。
【００９４】
本発明のアンチセンス配列を含む触媒RNA分子またはリボザイムは、インビボで核酸分子(例えば、CXCL17をコードする核酸)の発現を阻害するために用いることができる。アンチセンスRNA内にリボザイム配列を含めて、それらにRNA切断活性を与え、それによって構築体の活性を増加させる。標的RNA特異的リボザイムのデザインおよび使用は、Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988、および米国特許出願公開第2003/0003469 A1号に記載されており、これらの各々は参照により組み入れられる。
【００９５】
したがって、本発明はまた、結合アーム中に、8〜19個の連続した核酸塩基を有するアンチセンスRNAを含む触媒RNA分子を特徴とする。本発明の好ましい態様において、触媒核酸分子はハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフ中に形成される。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992によって記載されている。ヘアピンモチーフの例は、1988年9月20日付で出願された米国特許出願第07/247,100号の一部継続出願である1989年9月20日付で出願されたHampel et al.,「RNA Catalyst for Cleaving Specific RNA Sequences」、Hampel and Tritz, Biochemistry, 28:4929, 1989、およびHampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990によって記載されている。これらの特定のモチーフは本発明を限定するものではなく、当業者なら、本発明の酵素的核酸分子において重要な全てのことは、それが標的遺伝子RNA領域の1つまたは複数に相補的である特異的基質結合部位を有すること、およびそれが分子にRNA切断活性を付与するその基質結合部位内または周囲のヌクレオチド配列を有することを認識するであろう。
【００９６】
核酸構築体を細胞に導入するための本質的に任意の方法を利用することができる。核酸を導入する物理的方法は、構築体を含有する溶液の注入、構築体によって覆われた粒子による衝撃、細胞、組織サンプル、もしくは生物を核酸の溶液中に浸すこと、または構築体の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む。ウイルス粒子にパッケージングされたウイルス構築体を用いて、細胞への発現構築体の効率的な導入とコードされたshRNAの転写の両方を達成することができる。脂質媒介性の担体輸送、リン酸カルシウムのような化学物質媒介性の輸送などのような、核酸を細胞に導入するための当技術分野において公知の他の方法を用いることができる。したがって、shRNAをコードする核酸構築体は、以下の活性の1つまたは複数を実行する: 細胞によるRNA取り込みを増強する、二重鎖のアニーリングを促進する、アニーリングされた鎖を安定化する、またはそれ以外の場合は標的遺伝子の阻害を増大する、成分とともに導入することができる。
【００９７】
細胞内での発現の場合、DNAベクター、例えばRNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターのいずれかを含むプラスミドベクターを利用することができる。内因性miRNAの発現はRNAポリメラーゼII (Pol II)プロモーターにより制御され、場合によっては、shRNAはRNAポリメラーゼIIIプロモーターと比較して、Pol IIにより最も効率的に駆動される(Dickins et al., 2005, Nat. Genet. 39: 914-921)。いくつかの態様において、shRNAの発現は、非限定的に、RNAポリメラーゼII型プロモーターを含む、誘導性プロモーターまたは条件付き発現系によって制御することができる。本発明との関連で有用なプロモーターの例は、テトラサイクリン誘導性プロモーター(TRE-tightを含む)、IPTG誘導性プロモーター、テトラサイクリントランス活性化系、および逆テトラサイクリントランス活性化(rtTA)系である。細胞または組織特異的プロモーターと同様に、構成的プロモーターも使用することができる。多くのプロモーターは遍在しているので、それらは全ての細胞および組織型において発現される。ある種の態様では、インビトロおよびインビボ研究において最も効果的な条件付き遺伝子発現系の1つであるテトラサイクリン応答性プロモーターを用いる。誘導性shRNAの説明については、国際特許出願PCT/US2003/030901 (公開番号WO 2004-029219 A2)およびFewell et al., 2006, Drug Discovery Today 11: 975-982を参照されたい。
【００９８】
ポリヌクレオチドの送達
裸のポリヌクレオチド、またはその類似体は、哺乳動物細胞に侵入し、関心対象の遺伝子の発現を阻害しうる。それにもかかわらず、細胞へのオリゴヌクレオチドまたは他の核酸塩基オリゴマーの送達を補助する処方物を利用することが望ましい可能性がある(例えば、米国特許第5,656,611号、同第5,753,613号、同第5,785,992号、同第6,120,798号、同第6,221,959号、同第6,346,613号、および同第6,353,055号を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる)。
【００９９】
治療方法
本明細書において提供される方法および組成物は、腫瘍抑制因子(例えば、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pml)の喪失によって特徴付けられるがんの進行を処置または予防するために用いることができる。特定の態様において、CXCL17アンタゴニストは、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、膵臓がん、またはPtenおよびZbtb7a/Pokemonもしくはp53が欠損している上皮由来の任意の他のがんを処置するために用いられる。通常、CXCL17ポリペプチドに特異的な抗体は、治療的および/または予防的に投与することができる。
【０１００】
処置は、そのようながんに罹患している、そのようながんを有する、そのようながんにかかりやすい、またはそのようながんを発症するリスクがある対象、特にヒトに適当に投与されるであろう。「リスクがある」対象の判定は、医療提供者または対象の診断試験または意見による任意の客観的または主観的な判定(例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、家族歴など)によって行うことができる。本明細書における方法はまた、本明細書において記載される抗CXCL17抗体の有効量を対象(そのような処置を必要とすると同定された対象を含む)に投与する段階を含む。そのような処置を必要とする対象を同定することは、対象または医療専門家の判断であることができ、主観的(例えば意見)または客観的(例えば試験もしくは診断方法により測定可能)であることができる。
【０１０１】
いくつかの局面において、本発明は、対象におけるがんを処置または予防する方法であって、抗CXCL17抗体を含む組成物の有効量を対象に投与する段階を含む該方法を特徴とする。任意で、本発明の抗CXCL17治療用物質(例えば、本明細書において記載される抗CXCL17抗体)は、他の任意の標準的な抗がん療法のうちの1つまたは複数と組み合わせて投与されうる。例えば、本明細書において記載される抗CXCL17抗体は、標準の化学療法薬と組み合わせて投与されうる。併用療法を(例えば、同時にまたはそれ以外の方法で)投与するための方法は、当業者に公知であり、例えばE. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【０１０２】
薬学的組成物
本発明は、腫瘍抑制因子(例えば、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pml)の喪失により特徴付けられるがんを処置するのに有用な組成物を特徴とする。本方法は、生理学的に許容される担体中で個体に本明細書において提供されるCXCL17発現または活性を阻害するCXCL17抗体または他の作用物質の有効量を投与する段階を含む。
【０１０３】
典型的には、本明細書において提供される組成物のための担体または賦形剤は、滅菌水、生理食塩水溶液、緩衝生理食塩水溶液、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、またはそれらの組み合わせのような、薬学的に許容される担体または賦形剤である。無菌性、pH、等張性、および安定性を確実にするそのような溶液の調製は、当技術分野において確立されたプロトコルにしたがって行われる。通常、担体または賦形剤は、アレルギーおよび他の望ましくない作用を最小限に抑えるために、および特定の投与経路、例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内などに適するように選択される。そのような方法はまた、水中油型乳濁液、サポニン、コレステロール、リン脂質、CpG、多糖類、それらの変種、およびそれらの組み合わせのような、アジュバントを本発明の組成物とともに投与する段階を含む。
【０１０４】
がんの処置または予防のための本明細書における抗CXCL17抗体または他の作用物質(例えば、CXCL17発現または活性を阻害する作用物質)を含む組成物の投与は、他の成分と組み合わせて、対象における疾患症状を改善、低減、または安定化させるのに有効な濃度の治療用物質をもたらす任意の適当な手段によるものでありうる。組成物は全身投与されてもよく、例えば、生理食塩水のような薬学的に許容される緩衝液中に処方されてもよい。好ましい投与経路には、例えば、患者において連続的で持続的なレベルの作用物質を提供する皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、髄腔内または皮内注射が含まれる。投与される治療剤の量は、投与方法、患者の年齢および体重、ならびにがんの臨床症状に応じて変わる。通常、量は、がんの処置において用いられる他の作用物質のために用いられるものの範囲内であろうが、ある場合には作用物質の特異性が増すので、より少ない量が必要とされるであろう。組成物は、当業者に公知の方法によって判定されるようにがんの影響を改善または減少させる投与量で投与される。
【０１０５】
治療用または予防用組成物は、任意の適当な担体物質中に任意の適切な量で含まれていてもよく、概して組成物の総重量の1〜95重量%の量で存在する。組成物は、非経口(例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内)投与経路に適した投与量形態で提供されうる。薬学的組成物は、従来の薬務にしたがって処方されうる(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと)。
【０１０６】
本発明による薬学的組成物は、投与したら実質的にすぐに、または投与から任意の所定の時間後もしくは期間後に活性剤を放出するように処方されうる。後者のタイプの組成物は通常、制御放出処方物として知られており、これには、(i) 長期間にわたって実質的に一定濃度の薬物を体内にもたらす処方物; (ii) 所定の遅延時間の後、長期間にわたって実質的に一定の濃度の薬物を体内にもたらす処方物; (iii) 活性物質の血漿レベルの変動(鋸歯状動態パターン)に関連する望ましくない副作用を同時に最小化しながら、体内で比較的一定の有効レベルを維持することによって所定の期間に作用を持続させる処方物; (iv) 例えば心臓のような臓器に隣接または接触して制御放出組成物を空間的に配置することによって、作用を局所化する処方物; (v) 例えば、1週間または2週間に1回用量が投与されるように、便利な投薬を可能にする処方物; および(vi) 治療剤を特定の細胞型に送達するために担体または化学的誘導体を用いて疾患を標的とする処方物が含まれる。いくつかの用途の場合、制御放出処方物は、血漿レベルを治療レベルに維持するために日中に頻繁に投薬する必要性をなくす。
【０１０７】
放出速度が問題の作用物質の代謝速度を上回る制御放出を得るために、いくつかの戦略のうちのいずれかを追求することができる。1つの例では、制御放出は、例えばさまざまなタイプの制御放出組成物およびコーティングを含む、さまざまな処方物パラメータおよび成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療用物質は、投与時に、制御された方法で治療用物質を放出する薬学的組成物に適切な賦形剤とともに処方される。例としては、単一または複数単位の錠剤またはカプセル組成物、油性溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。
【０１０８】
薬学的組成物は非経口的に注射、注入もしくは移植(皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鞘内など)により投与量形態、処方物中で、または従来の無毒性の薬学的に許容される担体および補助剤を含有する適当な送達装置もしくはインプラントを介して投与されうる。そのような組成物の処方および調製は、薬学的処方の分野の当業者に周知である。処方は、前記のRemington: The Science and Practice of Pharmacyにおいて見出すことができる。
【０１０９】
非経口使用のための組成物は、単位投与量形態で(例えば、単回用量アンプル中で)、または数回の用量を含有し、かつ適当な保存料が添加されてもよいバイアル中で提供されうる(下記参照)。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、注入装置、もしくは移植用の送達装置の形態であってもよく、または使用前に水もしくは別の適当な媒体で再構成される乾燥粉末として提供されてもよい。心機能障害または心疾患を低減または改善する活性剤とは別に、組成物は適当な非経口的に許容される担体および/または賦形剤を含みうる。活性治療剤(例えば、本明細書において記載される抗CXCL17剤)は、制御放出のためにミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれうる。さらに、組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、pH調整剤、張度調整剤(tonicity adjusting agent)、および/または分散剤を含みうる。
【０１１０】
いくつかの態様において、活性治療用物質(すなわち、本明細書における抗CXCL17抗体)を含む組成物は、静脈内送達用に処方される。上記のように、本発明による薬学的組成物は無菌注射に適した形態でありうる。そのような組成物を調製するためには、適当な治療用物質を非経口的に許容される液体媒体に溶解または懸濁させる。利用されうる許容される媒体および溶媒のなかには、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウムまたは適当な緩衝液の添加によって適当なpHに調整された水、1,3-ブタンジオール、リンゲル溶液、ならびに等張塩化ナトリウム溶液およびデキストロース溶液がある。水性処方物はまた、1つまたは複数の保存料(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、エチルまたはn-プロピル)を含有しうる。作用物質の1つが水に少ししかまたはわずかしか溶解しない場合、溶解促進剤もしくは可溶化剤を添加することができ、または溶媒が10〜60% w/wのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
【０１１１】
CXCL17療法をスクリーニングするためのマウスプラットフォーム
本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞株または原発性ヒト腫瘍を移植された免疫不全マウス(PDXモデル)における抗CXCL17療法を特徴付けるための方法を提供する(図1)。特定の態様において、移植された腫瘍は、CXCL17を構成的に過剰発現し、CXCL17を過剰発現するように操作され、または低減された(例えばshRNAノックダウンを介して) CXCL17を有するように操作されている(Matsui et al., PLoS ONE; 7(8): e44080 2012)。そのような免疫不全マウスは通常、適応免疫系成分を欠いているが、比較的無傷の自然免疫系を有する。それゆえ、腫瘍形成時に、マウスMDSCの浸潤をそれらの表現型特性(免疫抑制マーカー、細胞表面マーカー、免疫抑制効力)とともに評価する。同系宿主のマウス腫瘍株についても同様のアプローチが取られる。異種移植片モデルまたは同系モデルのいずれにおいても、ヒトまたはマウスCXCL17を過剰発現する腫瘍細胞株が評価される。そのようなマウスは、中和抗体または他の抗CXCL17療法に対する生物学的応答を評価するために用いられる。例えば、抗CXCL17抗体投与の効果は、腫瘍血管新生(Matsui et al., 前記)、腫瘍浸潤性MDSCおよび他の免疫細胞のプロファイル、Treg数もしくはTh1 対 Th2サイトカインプロファイルの変化とのCXCL17発現レベルの相関、腫瘍成長、および/またはマウス生存をアッセイすることによって評価される。
【０１１２】
ヒト腫瘍によるCXCL17の病理学的発現は、免疫抑制骨髄細胞を腫瘍微小環境に動員する。したがって、MDSCに及ぼす抗CXCL17抗体の効果を評価する。走化性アッセイ法(例えば、トランスウェルアッセイ法)を用いて、MDSC遊走に及ぼす抗CXCL17抗体の効果をアッセイする。初代MDSCはPten-/-; Trp53-/-マウスモデルからまたはヒト患者から得ることができる。
【０１１３】
別の態様において、マウスに、CXCL17を内因的に発現するか、またはそうするように操作されているかのいずれかのオルガノイドを移植する。オルガノイドを作製するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Boj et al., Cell; 160: 324-338, 2015; Gao et al., Cell; 159: 176-187, 2014; Linde et al., PLoS ONE; 7(7): e40058, 2012により記載されている。別の態様において、オルガノイドは、腫瘍組織および同じヒト患者由来のPBMCを用いて、自己PBMCとの共培養で維持される。
【０１１４】
GEMMプラットフォームは、当技術分野において公知の実質的に任意のマウスモデルとともに用いることができる。1つの態様において、本明細書において記載の療法はKOMPコレクション(https://www.komp.org/geneinfo.php?geneid=29373 (Burkhardt et al., 2012)の一部であるCxcl17条件付きノックアウトマウスにおいて評価される。この条件付き対立遺伝子は、前立腺上皮において全3つの遺伝子を欠いている前立腺特異的Pten-/-; Trp53-/-を作製するために用いられる。別の態様において、Pten-/-; Trp53-/-モデルからの原発腫瘍を、同様にKOMPコレクションの一部として利用可能であるCXCL17受容体(Gpr35; Maravillas-Montero et al., J Immunol. 2015 Jan 1;194(1):29-33)ノックアウトマウスに移植する。
【０１１５】
患者層別化
薬理学の進歩にもかかわらず、多くのがん患者は標準的な抗がん療法から恩恵を受けることができないか、または受ける投薬に対して有害な反応を経験する。明らかに類似した臨床疾患に罹患しているが、その分子的基盤が異なる患者の多くのサブセットが存在している。そのような患者を迅速に同定できないと、適切な有効な療法を遅らせ、それらのがんを未チェックのまま進行させる。本発明は、腫瘍抑制因子(例えば、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pml)欠損がんの根底にある疾患機序および薬物作用についての洞察を提供する。これに関連して、本発明は、腫瘍抑制因子(例えば、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pml)の喪失によって特徴付けられるがんを有する対象の同定を提供する。1つの態様において、PtenおよびZbtb7a/Pokemonおよび/またはp53は、抗CXCL17療法に応答する患者を同定するためのバイオマーカーとして用いることができる。バイオマーカーPtenおよびZbtb7a/Pokemonおよび/またはp53を用いて、個人化された、予防的または治療的戦略を開発するために、臨床応答に関して異なる患者群を層別化することができる。したがって、本発明は、対象から得られた生体サンプル中の腫瘍抑制因子(例えば、Pten、Zbtb7a/Pokemon、p53、Pml)を特徴付けるための方法を提供し、ここで低減されたまたは検出不能なレベルの腫瘍抑制因子発現の同定により、対象が抗CXCL17療法から恩恵を受けることが示される。
【０１１６】
本発明は、診断および処置プロセスへの特定の処置(有効量の抗CXCL17抗体の投与)の組み入れを提供する。診断段階および処置段階の組み合わせは日常的かつ慣習的なものではないが、誤診断され、効果的でない療法が投与されるのとは対照的に、特定の種類のがん(例えば、PtenおよびZbtb7a/Pokemonおよび/またはp53が欠損している)を有する患者が正確に診断される(かつ抗CXCL17抗体で適切に処置される)ことを確実にする。
【０１１７】
本発明は、抗CXCL17抗体または本明細書におけるCXCL17の発現または活性をそれ以外の方法で阻害する作用物質を含む薬学的組成物の治療的有効量を対象(例えば、ヒトのような哺乳動物)に投与する段階を含む、PtenおよびZbtb7a/Pokemonおよび/またはp53欠損がんまたはその症状を処置する方法を提供する。本明細書における方法は、そのような効果を生じるために本明細書において記載される化合物、または本明細書において記載される組成物の有効量を対象(そのような処置を必要とすると同定された対象を含む)に投与する段階を含む。そのような処置を必要とする対象を同定することは、対象または医療専門家の判断であることができ、主観的(例えば意見)または客観的(例えば試験もしくは診断方法により測定可能)であることができる。
【０１１８】
本発明の治療方法(これは予防的処置を含む)は概して、本明細書における式の化合物のような、本明細書における化合物の治療的有効量の、哺乳動物、特にヒトを含む、それを必要とする対象(例えば、動物、ヒト)への投与を含む。そのような処置は、疾患、障害もしくはその症状に罹患している、疾患、障害もしくはその症状を有する、疾患、障害もしくはその症状にかかりやすい、または疾患、障害もしくはその症状のリスクがある対象、特にヒトに適当に投与されるであろう。「リスクがある」対象の判定は、医療提供者または対象の診断試験または意見による任意の客観的または主観的な判定(例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、マーカー(本明細書において定義される)、家族歴など)によって行うことができる。
【０１１９】
1つの態様において、本発明は、処置の進行をモニタリングする方法を提供する。本方法は、腫瘍抑制因子欠損がんに関連する障害またはその症状に罹患しているまたはかかりやすい対象において、診断マーカー(マーカー)のレベル(例えば、腫瘍抑制因子または診断測定(例えば、スクリーニング、アッセイ法)を含め、本明細書における化合物、タンパク質またはそのインジケータによって調節される本明細書に記載の任意の標的を判定する段階を含み、ここで疾患またはその症状を処置するのに十分な本明細書における化合物の治療量が対象に投与されている。本方法において判定されたマーカーのレベルを、健康な正常対照または他の罹患患者のいずれかにおける既知のマーカーレベルと比較して、対象の疾患状態を確定することができる。好ましい態様において、対象における第2のマーカーレベルは、第1レベルの判定よりも遅い時点で判定され、2つのレベルは疾患の経過または治療の有効性をモニターするために比較される。ある種の好ましい態様において、対象における処置前のマーカーレベルは、本発明による処置を開始する前に判定される; 次いで、この処置前のマーカーレベルを、処置の開始後の対象におけるマーカーレベルと比較して、処置の有効性を判定することができる。
【０１２０】
キット
本発明は、がんの処置または予防のためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、単位投与量形態の中に抗CXCL17作用物質(例えば、抗CXCL17抗体)の有効量を含有する治療用または予防用組成物を含む。他の態様において、キットは無菌容器中に単位投与量形態での抗CXCL17作用物質の有効量を含有する治療用組成物を含む。そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスタパック、または当技術分野において公知の他の適当な容器形態であることができる。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または医薬(medicament)を保持するのに適した他の材料で作ることができる。
【０１２１】
必要に応じて、本発明の薬学的組成物は、がんを有するまたはがんにかかるもしくはがんを発症するリスクがある対象に薬学的組成物を投与するための使用説明書とともに提供される。使用説明書は通常、がんの処置または予防のための組成物の使用についての情報を含むであろう。他の態様において、使用説明書は以下のうちの少なくとも1つを含む: 治療/予防剤の記載; がんもしくはその症状の処置もしくは予防のための投与スケジュールおよび投与; 用法注意; 警告; 適応症; 禁忌; 過量服薬情報; 有害反応; 動物薬理学; 臨床試験; および/または参照。使用説明書は、(存在する場合)容器に直接印刷されても、あるいは容器に貼られたラベルとして、または容器内もしくは容器とともに供給される別のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダとして印刷されてもよい。
【０１２２】
本発明の実践では、別段の指示がない限り、分子生物学(組み換え技法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を利用し、それらは十分に当業者の管理範囲内である。そのような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, second edition (Sambrook, 1989); 「Oligonucleotide Synthesis」 (Gait, 1984); 「Animal Cell Culture」 (Freshney, 1987); 「Methods in Enzymology」 「Handbook of Experimental Immunology」 (Weir, 1996); 「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」 (Miller and Calos, 1987); 「Current Protocols in Molecular Biology」 (Ausubel, 1987); 「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis, 1994); 「Current Protocols in Immunology」 (Coligan, 1991)のような、文献において十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、例えば、本発明の作製および実践において考慮されうる。特定の態様のための特に有用な技法は、以下の節で論じられるであろう。
【０１２３】
以下の実施例は、当業者に本発明のアッセイ法、スクリーニングおよび治療方法を生成および使用する方法の完全な開示および記載を提供するために提示されており、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することが意図されるものではない。
【実施例】
【０１２４】
実施例1: 前立腺がんの遺伝的構成は原発腫瘍における免疫浸潤物の組成を決定する
がんの遺伝的構成がTMEの成分に影響を及ぼすかどうかを検討するために、「Co-Clinicalプラットフォーム」をChen, Z.ら(Nature. 2005. 436, 725-30.)によって記載されているように利用した。そのなかでは異なる遺伝子変化によって駆動される遺伝子操作されたマウスモデル(GEMM)が、定常状態でまたは治療的摂動時に体系的に分析されている。Ptenは前立腺がんにおいて最も頻繁に喪失し関連性のある腫瘍抑制因子の1つであるので、ヒト前立腺がんを代表する遺伝的複雑性が非致死性Pten喪失駆動マウスモデル(PtenLx/Lx; プロバシン-Cre, PTENの前立腺特異的喪失; 本明細書においてPtenpc-/-と称する)に加えられた。この目的のために、本実施例の実験によって得られたデータは、全て非常に侵襲性の表現型を示すPtenLx/Lx ;PmlLx/Lxプロバシン-Cre (Ptenpc-/-;Pmlpc-/-と称する); PtenLx/Lx ; Zbtb7aLx/Lxプロバシン-Cre (Ptenpc-/- Zbtb7apc-/-と称する)およびPtenLx/Lx;Trp53Lx/Lxプロバシン-Cre (Ptenpc-/- Trp53pc-/-と称する)マウスの免疫細胞の組成を特徴付けた。
【０１２５】
本実施例の実験は、3ヶ月齢の時点で前立腺腫瘍組織全体の単個細胞浮遊液中のT細胞(CD3+)、B細胞(CD19+/B220+)、マクロファージ(CD11b+/F480+)、およびGr-1+/CD11b+骨髄細胞(未熟骨髄細胞、単球、好中球)を最初に分析した。この年齢では、分析されたGEMMの全てが高悪性度前立腺上皮内腫瘍を発症し、Ptenpc-/- Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/- ; Trp53pc-/-およびPtenpc-/- ; Pmlpc-/-マウスでは部分的に局所浸潤性の前立腺腺がんのみ観察された(図1Aおよび図1B, 黒矢印)。腫瘍担持マウスが末梢において変化した免疫細胞集団を示すかどうかを評価するために、前述の免疫細胞集団の存在を古典的な造血器官である脾臓においてさらに分析した。対照マウスと腫瘍担持マウスとの間、または異なるモデル間で脾臓の変化は検出されなかったが(図7A)、原発性腫瘍組織のプロファイリングは、さまざまなGEMMにおける免疫細胞浸潤物に大きな差異を示した(図1Cおよび図7B)。最も驚くべきことに、Gr-1+/CD11b+細胞(図1C、図1D、図7C、および図7D)は、対照マウスと腫瘍担持マウスとの間、ならびに異なるモデル間で有意に変動した。以前の報告(Di Mitri, D. et al. Nature 515, 134-137 (2014))と一致して、Gr-1+/CD11b+細胞の浸潤は対照前立腺と比較してPtenpc-/-前立腺腫瘍において増加し、原発性前立腺がんとGr-1+/CD11b+細胞との間の明確な相互作用を示していた。さらに、Zbtb7aまたはp53の複合喪失はPtenpc-/-マウスと比較した場合にPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-マウスにおいて特に、Gr-1+/CD11b+細胞の蓄積を劇的に増加させた。対照的に、T細胞と同様にGr-1+/CD11b+細胞の浸潤は、Ptenpc-/- ; Pmlpc-/-マウスがまた、非常に侵襲性かつ致死性の前立腺がんを発症したとはいえ(図1Aおよび図1B)、他のモデルと比べてPtenpc-/- ; Pmlpc-/-において減少した(図1C、図1D、および図7B)。
【０１２６】
次に、疾患の進行中に免疫ランドスケープがどのように進化するかを理解するために、本実施例の実験では6ヶ月齢の前立腺がんモデルを分析した。この段階では、Ptenpc-/- ; Trp53pc-/-マウスは、Ptenpc-/- ; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/- ; Pmlpc-/-モデルと比べてはるかに大きい腫瘍を示した(図1E)。注目すべきことに、これらの腫瘍担持マウスの脾臓における大きな変化は、検出されず(図8A)、3つのモデルの免疫ランドスケープは3ヶ月齢で観察されたプロファイルにしたがってさらに分岐した(図1F、および図8B)。Ptenpc-/-; Pmlpc-/-腫瘍は依然として「免疫枯渇」しているように見えたが、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-免疫ランドスケープはGr-1+/CD11b+細胞で多数を占められていた。Gr-1+/CD11b+細胞集団も、T細胞およびマクロファージの著しい動員とともにPtenpc-/- ; Trp53pc-/-マウスにおいて増加した。興味深いことに、さらなる分析によって、大多数のマクロファージがM2様表現型(CD11b+/F4/80+/CD206+)を有すること(図8C)が明らかにされ、かつCD3+細胞の増加は細胞傷害性T細胞を抑制しうるCD4+/FoxP3+ T調節細胞(Treg)の動員を反映しており、がん免疫回避のための潜在的に好ましい微小環境を規定していること(図8D、図8E、および図8F)が明らかにされた。これらのデータは、前立腺がんの遺伝的背景が原発腫瘍における免疫浸潤の組成を決定し、原発性腫瘍病変の組織学的特徴とは無関係に、腫瘍部位に浸潤するGr-1+/CD11b+細胞の集団に特に影響を及ぼすことを示す。
【０１２７】
実施例2: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-前立腺腫瘍におけるGr-1+/CD11b+細胞の特徴付け
Gr-1+/CD11b+細胞の集団は不均一であり、成熟好中球、単球および未熟骨髄細胞(iMC)を含む。後者は、細胞傷害性T細胞を抑制することができる場合、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)として機能的に分類される。MDSCは、形態学的分析に基づいてならびにマーカーLy6CおよびLy6Gの発現に基づいて、多形核MDSC (PMN-MDSC)および単球MDSC (Mo-MDSC)にさらに分類することができる。本実施例の実験は、2つのモデルにおける腫瘍浸潤Gr-1+/CD11b+細胞の形態が、3ヶ月齢で最高レベルの骨髄細胞浸潤を示したことを実証した(図2A)。この分析により、PMN-MDSCおよび好中球に特徴的な、Ptenpc-/- ; Zbtb7apc-/-前立腺腫瘍におけるGr-1+/CD11b+細胞の部分的に過分葉の顆粒球表現型が確認された。対照的に、Ptenpc-/- ; Trp53pc-/-浸潤Gr-1+/CD11b+細胞集団は、不均一であるように見え、多形核細胞および単核細胞の両方を含んでいた。これらの細胞の局在化は、Ly6Gエピトープの免疫組織化学(IHC)によって判定された(補足図3a)。この分析により、この細胞集団がPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍の粘膜上皮内に主に存在することが明らかにされた。驚くほどに、間質に主として位置していた他の免疫細胞浸潤物のIHC (図9B)と比較して、Ly6G+細胞だけが腫瘍細胞に近接して検出された。
【０１２８】
次に、本実施例の実験では、骨髄細胞の腫瘍促進性機能に関与する遺伝子の一団の発現レベルを調べた。Ptenpc-/-マウスにおけるGr-1+/CD11b+細胞は、老化応答に反対することによって、またアルギナーゼ1 (ARG1)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)発現を介した古典的免疫抑制によっても、前立腺腫瘍を支持することが最近示された(Di Mitri, D. et al. Nature 515, 134-137 (2014); Garcia, A. J. et al. Mol. Cell. Biol. 34, 2017-2028 (2014))。興味深いことに、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍から選別されたGr-1+/CD11b+細胞は、Arg1およびiNOSの低発現を示したが、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍由来のGr-1+/CD11b+細胞は、Ptenpc-/-腫瘍から選別されたGr-1+/CD11b+細胞と比較した場合にArg1の高発現およびiNOSの低発現を示した(図2B)。特に、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍から選別されたGr-1+/CD11b+細胞は、Ptenpc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍由来のGr-1+/CD11b+細胞と比較した場合に腫瘍促進遺伝子S100A9、S100A8およびIL1bの有意に高い発現を示した(図2Cおよび図10A)。Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍内Gr-1+/CD11b+細胞は、末梢血由来のGr-1+/CD11b+細胞と比較した場合(図10B)に、またはCD49f+腫瘍細胞(マウス前立腺基底および管腔細胞)と比較した場合(図10C)に、これらの遺伝子の特異的な上方制御を示した。
【０１２９】
次に、本実施例の実験では、ともにTreg細胞活性化に関連するIL10およびCD40の発現レベルを試験した。それらはともに、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-腫瘍から選別されたものと比較した場合、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍から選別されたGr-1+/CD11b+細胞において上方制御されており(図2D)、骨髄細胞によって媒介される腫瘍促進の遺伝子型特異的モードを示唆していた。これらの細胞の表現型をさらに特徴付けるために、Ly6GおよびLy6Cエピトープの発現を調べた(図2Eおよび図9C)。驚くほどに、3ヶ月齢での原発腫瘍のフローサイトメトリー分析によって、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍におけるCD11b+細胞が有意に異なることが明らかにされた(図2E、図2F)。Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍は、PMN-MDCS/好中球の免疫表現型の特徴を有するCD11b+/Ly6G+/Ly6Cint細胞を主に含んでいたが、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍は、Mo-MDSC/単球の免疫表現型の特徴を有するCD11b+/Ly6G-/Ly6Chi細胞を主に動員する(Brandau, S. et al. Nature Communications 7, 1-10 (2016))。Ptenpc-/- ; Zbtb7apc-/-マウスにおける6ヶ月齢での原発腫瘍の骨髄浸潤物は、依然として多形核細胞で多数を占められていた(図2G)。比較すると、Ptenpc-/-; Trp53pc-/- CD11b+細胞は、単球集団のわずかな減少を伴うCD11b+/Ly6G+/Ly6Cint細胞の増加を、潜在的にこれらの細胞のマクロファージへの分化に続発して示し、これは実際この時点で劇的に増加する(図1Gおよび図2F)。3ヶ月齢でのPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍において検出された単球およびPMN集団の役割へのさらなる洞察を得るために、本発明者らは、CD11b+/Ly6G-/Ly6ChiおよびCD11b+/Ly6G+/Ly6Cint選別細胞において上記の遺伝子発現分析を繰り返した(図2H)。Ly6G+/Ly6Cint細胞は、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍から収集したGr-1+/CD11b+細胞と同様に、S110A8/A9およびIL1bのより高い発現を示したが、Ly6G-/Ly6Chi集団は免疫抑制遺伝子Arg1、IL10およびCD40レベルの上昇の主な原因として出現した。
【０１３０】
実施例3: 遺伝子型特異的ケモカイン発現パターンは、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍と比べてPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍における遺伝子損失により直接影響を受ける
偏りのない方法でGr1+/CD11b+細胞の動員の機構を調べるために、本実施例の実験では最初に、3ヶ月齢でのPtenpc-/-腫瘍と比べてPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-におけるサイトカインの発現について利用可能なマイクロアレイデータセットを分析した。2つのモデル間でさまざまなサイトカインが異なって調節され、Pten欠損の設定でのZbtb7aの喪失は非常に特異的な炎症プログラムの上方調節を導く(図11A、図11B、図11C、および図11D)。これらのデータに基づいて、1つの目的は、CXCファミリー(図3A左パネル)およびCCファミリー(図3A、右パネル)からの選択されたケモカインのmRNA発現分析を行うこと、ならびにその発現をPtenpc-/-、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-由来前立腺腫瘍において比較することであった。ケモカイン分析実験により、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍と比べてPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍における炎症性メディエータの異なるパターンが明らかにされた(図3A、図3B、図3C、図3D、図3E、および図3F)。具体的には、単球細胞の誘引物質として報告されたCXCL17 (Pisabarro, M. T. et al. The Journal of Immunology 176, 2069-2073 (2006))は、他のモデルと比較してPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍において明らかに上方制御されていることが見出された。したがって、p53がCXCL17を転写的に抑制することができるかどうかを調べた。この目的のために、RWPE1細胞におけるsiRNA処理によるp53発現のノックダウンを実施した。興味深いことに、p53のノックダウンはCXCL17の発現を誘導した(図3G)。さらに、内因性p53がCXCL17のプロモーターに結合する能力を、RWPE1細胞におけるChIP分析によって確認した(図3H)。まとめると、これらのデータは、p53が前立腺上皮細胞におけるCXCL17の発現を差別的に調節し、p53の喪失がPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍におけるCXCL17の特異的な上方制御をもたらすことを示唆する。
【０１３１】
実施例4: Ptenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍と比べてPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍におけるGr-1+/CD11b+細胞動員の異なる機構
骨髄中に存在する未熟骨髄細胞は、培地へのGM-CSFおよびインターロイキン-6 (IL6)の添加時にMDSCの表現型の特徴を獲得するように培養かつ誘導することができる。TMEの形成におけるCXCL5およびCXCL17の潜在的な役割を分析するために、全骨髄(BM)マウス細胞を最初に培養し、Gr1+細胞をIL6およびGM-CSF単独でまたはCXCL5もしくはCXCL17のいずれかの存在下でBMから単離した。4日間の培養後、この実験では、Ly6CおよびLy6Gマーカーの発現の、または試験された遺伝子の発現プロファイルの、いかなる有意差も観察されず(図4A、図12A、および図12B)、これらの2つのケモカインは未熟骨髄細胞表現型の決定における主要な因子ではないことを示唆していた。それにもかかわらず、以前の研究(Wang, G. et al. Cancer Discov 6, 80-95 (2016); Pisabarro, M. T. et al. The Journal of Immunology 176, 2069-2073 (2006))にしたがって、本実施例の実験では、それぞれPMN細胞および単球細胞に対する化学誘引物質としてのCXCL5およびCXCL17の機能を検証することができた。トランスウェル遊走アッセイ法を、組み換えタンパク質および健常マウスの骨髄から単離されたGr1+細胞(これはほとんどがLy6G+/Ly6Cint PMN細胞である)または単球のいずれかを用いることによって実施した(図11B)。CXCL17は単球に対してのみ濃度依存的効果を示した(図4B, 図4C)。
【０１３２】
インビボでの使用に利用可能な信頼できる抗CXCL17抗体は現在存在しないので、オルガノイド培養物を樹立することによりPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍におけるCXCL17の役割をさらに評価することが求められた。前立腺細胞を3ヶ月齢のPtenpc-/-; Trp53pc-/-、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-、および野生型マウスから単離し、最近発表された3D培養法を用いることによりインビトロで増殖させた(Karthaus, W. R. et al. Cell 159, 163-175 (2014); Drost, J. et al. Nat Protoc 11, 347-358 (2016))。ウエスタンブロット分析により、遺伝的に標的化された腫瘍抑制遺伝子がほぼ完全に存在しないことが確認された(図4D)。さらに、IHCにより、マウス起源モデルと同様の組織学的パターン、ならびにpAKTおよびKi67の両方のレベル上昇を有するPtenpc-/-; Trp53pc-/-、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-オルガノイドが示された(図4E)。重要なことに、CXCL17発現は、Ptenpc-/- ; Zbtb7apc-/-および野生型オルガノイドと比較した場合、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-オルガノイドにおいて著しく高かった(図4F)。
【０１３３】
腫瘍-TME相互作用研究のための適当なツールとしての3D培養アプローチを検証するために、トランスウェル遊走アッセイ法を、オルガノイド馴化培地(CM)および3ヶ月齢マウスの骨髄から単離された単球を用いて実施した(図4Gおよび図12C)。特に、前立腺がんマウスモデルで観察されたことと一致して、単球細胞の遊走は、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-および野生型オルガノイドからのCMと比較した場合にPtenpc-/-; Trp53pc-/-オルガノイドからのCMにおいて増強された(図4H)。CXCL17がPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍による単球の動員において重要であるかどうかを調べるために、次に、CXCL17に対するshRNAを安定的に発現するPtenpc-/-; Trp53pc-/-オルガノイドを作製した(図4I)。CXCL17ノックダウンは、単球の遊走を、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-オルガノイドについて観察されたのと同様の程度まで低減させた(図4Jおよび図4H)が、BMから単離されたGr1+細胞の遊走には影響を及ぼさなかった(図4K)。まとめると、本実施例の結果は、CXCL17がPtenpc-/- ; Trp53pc-/-腫瘍モデルにおけるMo-MDSCの化学誘引物質として作用しうるという考えを支持する。
【０１３４】
実施例5: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-におけるGr-1+/CD11b+細胞の選択的遮断は腫瘍形成に影響を及ぼす
Gr-1+/CD11b+細胞は、多くの場合、腫瘍の進行に関与している; しかしながら、それらががん細胞に及ぼす完全な影響は、依然として活発に研究されている。さらに、腫瘍成長および転移に対するGr-1+/CD11b+細胞の寄与に関する研究は、状況依存的な機能を示し、場合によっては、矛盾する(Colombo, M. P. et al. Journal of Experimental Medicine 173, 889-897 (1991); Pekarek, L. A. et al. Journal of Experimental Medicine 181, 435-440 (1995); Mittendorf, E. A. et al. Cancer Res. 72, 3153-3162 (2012); Cools-Lartigue, J. et al. J. Clin. Invest. 123, 3446-3458 (2013); Granot, Z. et al. Cancer Cell 20, 300-314 (2011); Haverkamp, J. M. et al. Immunity 41, 947-959 (2014))。本実施例における遺伝子発現分析(図2B、図2C、および図2D)に基づき、ならびに3ヶ月齢および6ヶ月齢の両方でのPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍におけるTreg細胞の存在(図5Aおよび図8E)に基づき、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-またはPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍のいずれかから選別されたGr1+/CD11b+細胞とのCD4+ T細胞のエクスビボ共培養を実施した。特に、Ptenpc-/- ; Trp53pc-/-マウスから選別されたGr1+/CD11b+細胞のみが、Treg細胞の拡張を有意に誘導することができた(図5b)。それゆえ、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の命名法に関する最近発表された提言(Brandau, S. et al. Nature Communications 7, 1-10 (2016)）に従って、3ヶ月齢の時点でPtenpc-/-; Trp53pc-/- TMEはMo-MDSCの存在によって特徴付けられるが、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍はPMN-MDSC様細胞(PMN-MDSC-LC)によって浸潤されている。
【０１３５】
次に、Ptenpc-/- ; Trp53pc-/-マウスモデルにおけるGr-1+/CD11b+細胞の役割を評価するため、抗Gr1モノクローナル抗体を、Ly6G+細胞およびLy6C+細胞の両方の枯渇に用いた。3週間の処置後、腫瘍の有意な体積低減が観察され、腫瘍内Gr-1+/CD11b+細胞の有意な枯渇が確認された(図5Eおよび表1)。抗Gr1処置Ptenpc-/-; Trp53pc-/-マウスは、CD8+ T細胞の増加と関連するTreg細胞の減少によって特徴付けられる免疫ランドスケープの変化を示した(図5F)。この分析により、Mo-MDSCとしてのPtenpc-/- ; Trp53pc-/-骨髄浸潤物が確認された。
【０１３６】
最後に、本実施例の実験の目的は、Gr-1+/CD11b+細胞誘引を阻害することが知られているCXCR2アンタゴニストSB225002処置時の腫瘍成長速度を判定することであった。実際、CXCR2阻害は、試験した全てのモデルにおいてGr-1+/CD11b+細胞の減少をもたらした(図5G)。腫瘍成長に及ぼすGr-1+/CD11b+細胞枯渇の効果を評価するために、前葉病変の腫瘍体積を、CXCR2阻害剤処置後のMRIにより毎週定量化した。CXCR2阻害はPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍の両方の腫瘍成長を有意に抑制するが、「免疫枯渇された」Ptenpc-/-; Pmlpc-/-腫瘍の腫瘍成長を抑制しないことが観察された(図5Hおよび表1)。Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-マウスにおけるその後の組織学的分析により、媒体処理腫瘍は、PIN病変および複雑な腺構造を含む大きな腫瘍領域を示すが、CXCR2阻害剤処置マウスは、腫瘍病変および大きな腫瘍嚢胞が有意に減少した前立腺を示すことが実証された(図13B)。さらに、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-前立腺腫瘍は、SB225002による処置後により少ないTreg細胞を示した(図13C)。まとめると、これらのデータから、Ptenpc-/-; Pmlpc-/-腫瘍ではなく、Ptenpc-/- ; Zbtb7apc-/-腫瘍でのおよびPtenpc-/- ; Trp53pc-/-腫瘍でのGr-1+/CD11b+細胞が腫瘍の進行および維持において重要な役割を果たすことが明らかである。
【０１３７】
実施例6: Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-におけるGr-1+/CD11b+細胞は、NFκBシグナル伝達経路に影響を及ぼすことにより腫瘍の進行を促進する
Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍と同様に、PMN細胞は最近、前立腺がんの異なるマウスモデルであるPtenpc-/-; Smad4pc-/-マウスモデルにおいて観察されている(Wang, G. et al. Cancer Discov 6, 80-95 (2016))。しかしながら、その特定の場合において、ならびに他の腫瘍型において(Kumar, V. et al. Trends in Immunology 37, 208-220 (2016))、PMN浸潤物は免疫抑制活性を示した。それゆえ、本実施例の実験では、PMN-MDSC-LCがPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍成長を促進する機構をさらに調べた。図2に示されるように、これらの細胞は高レベルのS100A8、S100A9およびIL1bを発現した。S100A9は以前に、RAGE/TLR4受容体の活性化を通じたNFκBシグナル伝達を含めて、いくつかの腫瘍形成促進性シグナル伝達経路の上方制御を通じた腫瘍進行に関連付けられている(Markowitz, J. et al. Biochim. Biophys. Acta 1835, 100-109 (2013))。同様に、IL1bは炎症応答の調節因子および腫瘍形成促進性サイトカインとして知られている。それはまた、その1型受容体を通じてNFκBシグナル伝達を等しく活性化する。これと一致して、3ヶ月齢Ptenpc-/-およびPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-の腫瘍から得られたマイクロアレイデータの遺伝子セット濃縮分析により、特にPtenpc-/- ; Zbtb7apc-/-腫瘍における、NFκB標的遺伝子の濃縮(図14A)が示され、これは、Ptenpc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍と比べてPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍における増加したpIRAK4発現および減少したIκBα発現のウエスタンブロット分析(図14B)によって検証されうる。逆に、CXCR2アンタゴニストSB225002で処置したPtenpc-/- ; Zbtb7apc-/-腫瘍のウエスタンブロット分析により、IκBαタンパク質レベルの増加(図14C)、ならびに既知のNFκB標的遺伝子CXCL5の発現上昇(図14D)が示された。この結果から、Gr-1+/CD11b+細胞動員の阻害後のNFκBシグナル伝達の負の調節が示され、それによって腫瘍促進性NFκB活性化とGr-1+/CD11b+細胞活性とが結び付けられる。これらのデータからさらに、Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍のTMEにおけるGr-1+/CD11b+細胞がPtenpc-/-およびPtenpc-/-; Trp53pc-/-腫瘍と比較した場合に特異的な表現型および腫瘍促進活性を呈することが示される。
【０１３８】
実施例7: ヒトサンプルにおける腫瘍遺伝的構成と差別的免疫浸潤との間の関連性の検証
遺伝子発現シグネチャ分析は、TMEを特徴付けるのに有効な方法であることが示されており、重大な予後の可能性を有しうる(Gentles, A. J. et al. Nat. Med. 1-12 (2015))。本実施例の実験では、ヒトサンプルにおいて、CXCL5/17と腫瘍関連免疫細胞との間の関連性を検証するためにそのようなアプローチを利用した。この目的のために、本実施例の実験では、PMN細胞に対する遺伝子シグネチャ(PMN-シグネチャ)ならびに単球MDSCおよびM2様マクロファージに対する遺伝子シグネチャ(Mo-Signature)を用いて、「The Cancer Genome Atlas」(TGCA)仮前立腺腺がんデータセットの499サンプルを調べた(表2)。以下の表2は、図6中の分析に用いられた遺伝子シグネチャを示す。
【０１３９】
（表２）
2019530733.tif 000016
（表２）続き
2019530733.tif 000017
（表２）続き
2019530733.tif 000018
【０１４０】
PMN遺伝子シグネチャは、最近発表された39遺伝子のMDSCシグネチャを修正することによって作製された(Wang, G. et al. Cancer Discov 6, 80-95 (2016))。このシグネチャは、TGCAサンプルを3つの群: PMN-高、PMN-中、およびPMN-低にクラスタ化した。Mo-シグネチャは文献検索から作製され(Ugel, S. et al. Journal of Clinical Investigation 125, 3365-3376 (2015))、TGCA仮前立腺腺がんデータセットを3つの群: Mo-高、Mo-中およびMo-低に分類するために用いられた(図6B)。CXCL17はMo-高群においてより高い発現レベルを示し、これは本開示の知見と直接相関した(図6A、図6B)。
【０１４１】
腫瘍抑制遺伝子PTENおよびTP53の同時調節不全は、進行したヒト前立腺がんの共通する特徴である。同様に、変化したPTENを有する患者では、低レベルのZbtb7aが侵攻性の去勢抵抗性前立腺がんと関連していることが最近示された(Lunardi, A. et al. Nat. Genet. 45, 747-755 (2013))。それゆえ、本実施例の実験では、これらの遺伝的構成とヒト前立腺がんにおけるCXCL5およびCXCL17の発現との間の可能な関連性を探った。この目的のために、本実施例の実験では最初に、公的に入手可能な転移性前立腺がんデータセットを調べた(Robinson et al. (n=150) (Robinson, D. et al. Cell 161, 1215-1228 (2015))。Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-モデルから得られたデータと一致して、PTENが変化(欠失または変異)し、かつZBTB7Aが低い状態のコホートではCXCL5の発現がより高い(図6C)が、CXCL17の発現はそうでないことが示された。PTENおよびp53喪失に関連するCXCL17発現のヒト関連性について調べるために、本実施例の実験では、4つの患者コホート: 野生型PTENおよびTP53 (変化なし)、PTENホモ接合性変化(PTEN変化)、TP53ホモ接合性変化(p53変化)、ならびにホモ接合性欠失または変異に基づく同時PTENおよびTP53欠損(PTEN変化; p53変化)に関する分析に焦点を合わせた。この結果もまた、マウスモデルにおけるこの開示の知見と一致していた。PTEN変化; p53変化の患者のコホートでは、CXCL17の最大発現が示されたが、CXCL5発現は異なる群間で有意差がなかった(図6D)。
【０１４２】
次に、本実施例の実験では、異なる免疫ランドスケープに対しての前立腺がんの遺伝学に関する分析に焦点を合わせた。本実施例の実験では、前述のPMN-シグネチャおよび以前に公表されたT細胞シグネチャ(Spranger, S. et al. Nature 523, 231-235 (2015)) (表2)を用いて、ロビンソンデータセットの150例の転移性前立腺がんサンプルを分類した。配列決定プロファイルを、高浸潤物、中浸潤物、および低浸潤物クラスタに分類し(図6E)、本開示の研究において調べられたマウスモデルと同様の遺伝学を有する患者が異なる群間でどのように分布したかを分析した。注目すべきことに、変化したPTENおよびZbtb7aを有する患者9名のうち1名(11.1.%)だけが低いPMN浸潤物を示し、PML欠失患者18名のうち2名(11.1%)だけがPMN高型に分類された。PMLの喪失と非炎症「コールド」TMEとの間の関連性をさらに確認するために、18中1サンプル(5.6%)だけがT細胞シグネチャの高い発現を示した(図6F)。さらに、PML発現レベルを異なるクラスタにおいて分析した。有意にいっそう低いレベルのPML発現が、いっそう少ないPMNおよびT細胞浸潤物を有するサンプルにおいて観察された(図6G)。最近の広範囲のがん-免疫プロファイル研究により、Ptenpc-/-; Pmlpc-/-前立腺がんモデルにおける本開示に記載のものと同様、「コールド」非炎症性の、腫瘍微小環境によって特徴付けられる免疫デザート型(immune-desert)の表現型の同定がもたらされたので(Chen, D. S. et al. Nature 541, 321-330 (2017))、PMLの遺伝的状態および発現レベルを含む関連データは、特に関連性がある。この表現型は抗-PD-L1/PD1療法に対して耐性があるように思われるため、これは臨床的に関連性がある。2つの主要な腫瘍発がん経路、すなわちβ-カテニンおよびMAPKシグナル伝達経路が、免疫デザート型の表現型に直接関連している(Spranger, S. et al. Nature 523, 231-235 (2015); Seliger, B. et al. Exp. Hematol. 24, 1275-1279 (1996); Seliger, B. et al. Eur. J. Immunol. 28, 122-133 (1998); Atkins, D. et al. Int. J. Cancer 109, 265-273 (2004); Bradley, S. D. et al. Cancer Immunology Research 3, 602-609 (2015))。特に、3ヶ月齢時のPtenpc-/-; Pmlpc-/-前立腺がんは、β-カテニンおよびホスホ-ERKの両方の上方制御を示した(図15)。要約すると、GEMMから得られた本実施例の実験のデータは、ヒト臨床がんサンプルにおいて観察されたものと相関し、患者層別化に対する本開示のアプローチの関連性を強調している。
【０１４３】
多様な免疫細胞型が固形および液体腫瘍に浸潤して相互作用する可能性があり、非常に状況特異的であると思われる複数の機構によって、実質的にあらゆる治療アプローチに影響を及ぼす。本開示の実験では、特定の転写およびシグナル伝達プログラムから生じる別個のケモカインプールに基づいて、別個のゲノム変化が遺伝子型特異的様式でTMEを形成しうるという仮説を立てた。本明細書において実証されるように、前立腺がんの多様な遺伝的背景は、直接的かつ細胞自律的に、TMEにおける免疫細胞の示差的浸潤および組成を決定し(図6H、図15B)、ならびに免疫細胞浸潤の抑制を決定しうる。
【０１４４】
本明細書において開示されるように、前立腺腫瘍への異なるGr-1+/CD11b+細胞の動員は、マウスモデルにおいて、ならびにヒトがんにおいて遺伝的構成により直接調節される。具体的には、本開示の実験は、p53の喪失が既知のGr-1+/CD11b細胞誘引物質CXCL17の発現の上方制御をもたらすことを示した。これらの知見と一致して、p53およびPTENが欠損しているヒト前立腺がん検体は、有意に高いCXCL17発現を示す。
【０１４５】
本開示の実験ではさらに、腫瘍関連Gr-1+/CD11b+細胞が、薬理学的に遮断されうるPtenpc-/-; p53pc-/-およびPtenpc-/-; Zbtb7apc-/-の両方において腫瘍促進表現型を示すことが示される。しかしながら、腫瘍促進の機構は劇的に異なる。Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-腫瘍では、浸潤Gr-1+/CD11b+細胞は、S100A9およびIL1bの分泌を通じてNFκBシグナル伝達経路に影響を与えることによって直接的に腫瘍進行を促進するPMN-MDSC-LC表現型を示す(図6H)。
【０１４６】
Ptenpc-/-; Zbtb7apc-/-モデルの「腫瘍促進」免疫ランドスケープおよびPtenpc-/-;p53pc-/-腫瘍の「免疫抑制」表現型に加えて、本明細書において記載するのは第3のシナリオ: Ptenpc-/-;Pmlpc-/-前立腺がんの「免疫デザート型」の表現型である。侵攻性かつ致死的ではあるが、このモデルは他のモデルおよび対照マウスと比較した場合に非常に限られた腫瘍内免疫浸潤物を示した。重要なことに、Ptenpc-/-;Pmlpc-/-マウスはCXCR2i処置に応答しなかった。これらの知見と一致して、およびそのような表現型についての可能性のある説明として、Pmlの喪失は最近になってサイトカイン産生の減少と関連付けられており(Lunardi, A. et al. Genes & Cancer 2, 10-19 (2011))、β-カテニンの上方制御およびMAPK経路の活性化は、抗腫瘍免疫の抑制に関係している(Spranger, S. et al. Nature 523, 231-235 (2015); Seliger, B. et al. Exp. Hematol. 24, 1275-1279 (1996); Seliger, B. et al. Eur. J. Immunol. 28, 122-133 (1998); Atkins, D. et al. Int. J. Cancer 109, 265-273 (2004); Bradley, S. D. et al. Cancer Immunology Research 3, 602-609 (2015))。PTEN/PMLモデルは、抗PD-L1/PD-1療法に耐性があることが知られている、患者において観察された免疫デザート型の「コールド」な表現型を模倣しており(Chen, D. S. et al. Nature 541, 321-330 (2017))、本開示のPTEN/PMLモデルは現在、この重要ながん免疫表現型の調査に利用可能な唯一の前立腺がん前臨床モデルである。
【０１４７】
本明細書において開示されるように、前立腺がんに誘引されたGr-1+/CD11b+細胞の質的な相違に関するデータは、免疫療法を調整するのに特に関連性がありうる。T細胞活性化を促進することによって、免疫チェックポイント標的化阻害剤は複数のタイプのがんにおいて印象的な結果をもたらし、普遍的な抗腫瘍アプローチへの期待が高まる。しかしながら、最近の臨床試験において、大多数の前立腺がん患者はそのような処置に対して耐性を示した(Small, E. J. et al. Clin. Cancer Res. 13, 1810-1815 (2007); Slovin, S. F. et al. Ann. Oncol. 24, 1813-1821 (2013); Kwon, E. D. et al. Lancet Oncol. 15, 700-712 (2014))。本開示の知見は、併用免疫療法のための応答性患者集団の層別化に関連しうる。例えば、免疫チェックポイント標的化阻害剤とMDSC枯渇戦略との組み合わせは、変化したPTEN/TP53およびPTEN/SMAD4を有する患者において極めて有効でありうるが、変化したPTEN/ZBTB7aまたはPTEN/PMLを有する患者において同じようにはうまくいかないこともある。
【０１４８】
同様に、本開示および共臨床プラットフォームの予想外の知見は、選択されていない患者を用いた臨床試験において陽性の結果を示さなかった他の化合物についての作用機構および応答者集団を決定する能力に大きく寄与しうる。S100A9阻害剤タスキニモドは最近になって、前立腺がんの第III相臨床試験で明確な生存利益を示すことができなかった(Williamson, S. C. et al. Drug Des Devel Ther 7, 167-174 (2013); Pili, R. et al. J. Clin. Oncol. 29, 4022-4028 (2011))。本開示の分析によって明らかに示されるように、そのような作用物質は、S100A9分泌Gr-1+/CD11b+細胞を動員する腫瘍の特定の亜集団のみを妨害しうる。さらに、CXCR2アンタゴニストは現在臨床試験で研究中であり、Gr-1+/CD11b+細胞を動員しない腫瘍では効果がないことが判明した。
【０１４９】
患者間のがんの遺伝的異質性は、がん処置の成功にとって大きな障害であり、本明細書において開示されたデータにより、より良い患者層別化に基づく次世代臨床試験が、細胞自律性および非細胞自律性の両方の腫瘍促進性機構を標的とする組み合わせ個別がん療法の有効性を試験するために不可欠であることが、強く示唆される。本明細書において開示された結果は、それゆえ、がん患者のTME組成の系統的評価の重要性を強調している。重要なことに、免疫ランドスケープとがんの遺伝的構成との間に観察された直接的な関係は、より効果的な臨床試験のための患者層別化を大いに促進することができる。この系統的プロファイリングはこれから、がん遺伝子MycおよびArの増幅のような、前立腺がんにおいて頻繁に観察される他の遺伝子異常を含むさらなるマウスモデルに拡大される必要がある。さらに、異なる遺伝的構成とがん免疫表現型との間の関連性を徹底的に調査し、前臨床設定における探索的がん処置の状況に統合する必要がある。近刊において、Patnaikらは、Ptenpc-/-; p53pc-/-マウスモデルにおけるチロシンキナーゼ阻害剤カボザンチニブの有効性およびPMN細胞の大量の処置後動員が顕著な抗がん応答にいかに重要であるかを示している(Patnaik, A. et al. Cancer Discov CD-16-0778 (2017))。逆に、Pten、p53およびSmad4の遺伝的喪失を組み合わせたマウスモデルでは、カボザンチニブ処置は腫瘍内PMN細胞の数を低減させ、これが次に免疫チェックポイント遮断の抗腫瘍効力を大幅に増強させた(Lu, X. et al. Nature 543, 728-732 (2017))。
【０１５０】
まとめると、本開示の結果は、がんの遺伝的特徴ががんの免疫表現型を形成する上で直接的かつ重要な役割を果たすこと、およびそれゆえ併用免疫療法の結果が腫瘍の遺伝子型によって影響されることを強く示唆し、統合された遺伝子型-免疫表現型分析の必要性を強く支持している。重要なことに、本発明者らの知見は、がんの遺伝的多様性およびさまざまな遺伝的構成が与えるTMEの示差的応答によって決定される腫瘍形成についての細胞自律性-非自律性モードを支持する(図6H、図15B)。
【０１５１】
結論として、遺伝子操作されたマウスモデル(GEMM)から得られたデータは、ヒト臨床がんサンプルにおいて観察されたものと相関し、この共臨床的アプローチの関連性を強調している。
【０１５２】
本明細書において記載される結果は、以下の材料および方法を用いて得られた。
【０１５３】
マウス
対照、Ptenpc-/-、Ptenpc-/-;Zbtb7apc-/-、Ptenpc-/-; Trp53pc-/-、およびPtenpc-/- ; Pmlpc-/-マウスを、Trotman, L.C. et al. (PLoS Biol. 2003. 1, e59.)、Wang, G. et al. (Nat. Genet. 2013. 45, 739-46.)、Chen, Z. et al. (Nature. 2005. 436, 725-30.) 、およびChen & Pandolfi (原稿は改訂中)によって記載されているように利用した。実験動物の管理に関する施設の規則および倫理指針にしたがって、マウスをBeth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC)/Harvard Medical Schoolの動物施設内で維持した。全ての動物実験は、BIDMC IACUCプロトコル066-2011および082-2014によって承認された。マウスの遺伝的背景は図16に記載されている。
【０１５４】
インビボ薬物および抗体処置ならびにMRI測定
マウスを実験群に無作為に割り当て、研究を混合なしのやり方で実施した。CXCR2アンタゴニストによる処置の場合、インビボ投与のためにSB225002 (Cayman Chemical #13336)をDMSO (10 mg/ml)に溶解し、媒体(0.9% NaCl, 0.3% Tween 80)中で希釈した。マウス(4ヶ月齢)を腹腔内注射(5 mg/kg)によって10日間毎日処置し、前立腺腫瘍組織(前葉)をフローサイトメトリーおよび組織学的分析に供した。MRI分析の場合、マウス(4ヶ月齢)を21日間(Ptenpc-/-; Zbtb7a pc-/-)、14日間(Ptenpc-/-; Trp53pc-/-)または14日間 (Ptenpc-/-; Pmlpc-/-)腹腔内注射(5 mg/kg)によって毎日処置した。Gr-1+/CD11b+細胞の枯渇の場合、Ly6G枯渇抗体(1A8, BioXcell)および対照ラットIgG2a抗体(BioXcell)をインビボ投与のためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で希釈した。マウス(4ヶ月齢)を腹腔内注射(200〜300 μg/マウス)によって10日間1日おきに処置した。InVivoMAb抗マウスLy6G/Ly6C (Gr-1)抗体、クローンRB6-8C5 (BE0075, BioXcell)、および対照ラットIgG2b抗体(BE0090, BioXcell)をPBS中で希釈し、Ptenpc-/ -; Trp53pc-/-マウスを14日間1日おきに腹腔内注射(200 μg/マウス)によって処置した。CXCL5の中和の場合、抗マウスCXCL5抗体(Leinco Technologies)および対照ラットIgG2a抗体(BioXcell)をPBS中で希釈し、21日間1日おきに腹腔内注射(20 μg/マウス)によって注射した。腫瘍体積の定量化は、VivoQuantおよびImage Jソフトウェアを用いることによって実施した。全てのマウス前立腺MRI画像化分析をBIDMCのSmall Animal Imaging Coreで実施し、ASPECT Model M2 1T卓上スキャナにて取得した。
【０１５５】
ウエスタンブロット分析および免疫組織化学
ウエスタンブロッティングの場合、細胞溶解物を、プロテアーゼ(Roche)およびHALTホスファターゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific)を補充したNP40緩衝液(Boston Bioproducts)で腫瘍組織をホモジナイズすることによって調製し、引き続いてSDS-Gel分離(Invitrogen)およびウエスタンブロッティングに供した。以下の抗体をウエスタンブロッティングに用いた: β-アクチン(AC-74; Sigma)、CXCL5 (R & D Systems # AF433)、pIRAK4 (Cell Signaling Technology # 11927S)、IRAK4 (Cell Signaling Technology # 4363P)、IκBα (Cell Signaling Technology # 4812S)、Zbtb7a (ハムスター抗Zbtb7aクローン13E9)、PTEN (Cell Signaling Technology # 9559S)、p53 (Cell Signaling Technology # 2524S)、p21 (Santa Cruz Biotechnology sc-6246)、およびHSP90 (BD Biosciences BDB610419)。ウエスタンブロットをImage Jソフトウェアを用いて定量した。免疫組織化学の場合、組織およびオルガノイドを4%パラホルムアルデヒド中で固定し、標準的な手順にしたがいパラフィン中で包埋した。切片の包埋ならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色は、BIDMCのHistology Coreにより実施され、病理学者によって分析された。切片を製造元の推奨にしたがい抗LY6G (BioLegend # 127603)、抗CD45R (Abcam # ab64100)、抗CD3 (Abcam # ab5690)、抗βカテニン(Abcam #32572)、抗ホスホERK (Cell Signaling Technology # 4376)、抗ホスホAKT Ser473 (Cell Signaling Technology # 4060)、および抗Ki67 (Thermo Scientific #RM-9106)で染色した。
【０１５６】
細胞株およびsiRNAトランスフェクション
RWPE1不死化前立腺上皮細胞をATCCから入手し、MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza)を用いマイコプラズマについて試験した。RWPE1細胞を、ウシ下垂体抽出物(0.05 mg/ml)およびヒト組み換え上皮成長因子(5 ng/ml)を補充したケラチノサイト無血清培地中で維持した。Zbtb7a、Sox9およびp53を標的とするSiRNA (SIGMA; 最終20 nmol/L)ならびに非標的siRNA対照(Thermo Fisher Scientific; 最終20 nmol/L)を、リポフェクトアミン(Lipofectamine) RNAiMAX (Invitrogen)を用いてRWPE1細胞にトランスフェクトした。48時間後、細胞をmRNA発現分析に供した。Zbtb7aの一過性過剰発現は、Wang, G.ら(Nat. Genet. 2013. 45, 739-46)によって以前に記載されているように行った。
【０１５７】
クロマチン免疫沈降
クロマチン免疫沈降(ChIP)は、製造元の推奨にしたがい酵素クロマチン免疫沈降キット(Enzymatic Chromatin Immunoprecipitation Kit) (Cell Signaling Technology # 9003)を用いて行った。免疫沈降の場合、Zbtb7a抗体(Bethyl Laboratories # A300-549A)、Sox9抗体(Millipore #AB5535)、p53抗体(Cell Signaling Technology # 2524)、マウス対照IgG (Santa Cruz Biotechnology # sc-2025)、およびウサギ対照IgG (Santa Cruz Biotechnology # sc-2027)を用いた。免疫沈降したDNAの分析は、SYBRグリーン法を用い、Applied BiosystemのステップワンプラスリアルタイムPCRシステム(Step One Plus Real Time PCR System)にて行った。ChIP実験の濃縮倍率を示す。MiaおよびH19遺伝子座の検出のためのプライマーは、Wang, G.ら(Nat. Genet. 2013. 45, 739-46)によって以前に記載されている。他の遺伝子は、下記の表3に記載するように検出された。
【０１５８】
（表３）プライマー配列
2019530733.tif 000019
【０１５９】
オルガノイド培養
マウス前立腺がんオルガノイドの作製のため、Drost and Karthausら(Karthaus, W. R. et al. Cell 159, 163-175 (2014); Drost, J. et al. Nat Protoc 11, 347-358 (2016))によって記載されているように前立腺細胞を単離し、培養した。簡潔に説明すると、3ヶ月齢のマウスの前立腺を解剖し、II型コラゲナーゼ溶液中で消化した。単細胞をマトリゲル中に再懸濁し、完全前立腺オルガノイド培地(アドバンスドDMEM/F12、GlutaMAX、ペニシリン-ストレプトマイシン、(ジヒドロ)テストステロン、B27、N-アセチルシステイン、EGF、R-スポンジン、ノギン、A83-01、Y27632)中で液滴として培養した。
【０１６０】
Gr1+細胞および単球の単離、培養、および遊走アッセイ法
MACS Myltenyi Biotec Cell Isolationシステムを製造元の使用説明書にしたがい用いて、C57BL/6野生型、3ヶ月齢マウスの骨髄(脛骨および大腿骨)から、Gr1+細胞および単球を単離した。単球の単離の場合、単球単離キット(Monocyte Isolation Kit) (BM) (Miltenyi 130-100-629)を用いたが、Gr1陽性細胞は、抗体の抗Gr-1-ビオチン、クローンRB6-8C5 (Miltenyi 130-101-894)を用いて単離した。赤血球をACK溶解緩衝液(ThermoFisher Scientific A1049201)で溶解した。全骨髄細胞およびGr1+細胞を4日間培養した。簡潔に説明すると、40 ng/ml GM-CSF (PeproTech #315-03)および40 ng/ml IL-6 (PeproTech #216-16)を、ペニシリン-ストレプトマイシン、10% FBS、10 mM HEPES、20 μM 2-メルカプトエタノールを補充した対照培地RPMI 1640 (ThermoFisher Scientific 11875-093)に添加した。組み換えマウスCXCL5 (BioLegend #573302)または組み換えマウスCXCL17 (BioLegend #585402)のいずれかを、実験の開始時に添加した(200 nM)。遊走アッセイ法の場合、MACS選別細胞2.5×105個を、RPMI 1640対照培地またはオルガノイド完全培地のいずれか100 μL中に再懸濁し、トランスウェルシステム(5 μm, Corning #160241)の上部ウェルに配置した。示された量のCXCL5またはCXCL17のいずれかを補充したRMPI1640対照培地600 μLを底部ウェルに添加することによって、組み換えタンパク質を用いた遊走アッセイ法を実施した。示された遺伝子型を有する前立腺オルガノイドの5日間の培養にわたって収集された培地600 μLを底部ウェルに添加することによって、オルガノイド馴化培地を用いた遊走アッセイ法を実施した。細胞の遊走を、BD LSR IIフローサイトメーターを用いて15秒の取得時間でフローサイトメトリーにより定量した。
【０１６１】
サイトスピン
サイトスピンを実施するために、選別された顆粒球2×105個を、2%ウシ胎児血清(FBS)を含有するPBS (2% FBS/PBS)中に再懸濁し、スライド遠心分離機において250 rpmで3分間スライド上に回転させた。スライドを続いてメタノール中で固定し、May Grunwald/GIEMSAで染色した。
【０１６２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーの場合、脾臓およびリンパ節の単細胞懸濁液を、2% FBS/PBS中で組織をすりつぶすことによって調製した。腫瘍および対照前立腺組織(前葉由来)の単細胞懸濁液を、腫瘍を細かく刻み、10% DMEM (GIBCO)中のコラゲナーゼI型(Life Technologies # 17018029)で37℃にて1時間消化することによって調製した。細胞懸濁液を100 μMセルストレーナに通して単細胞懸濁液を得た。血液サンプルおよび単細胞懸濁液をACK赤血球溶解緩衝液(GIBCO) 1〜2 mlに再懸濁し、氷上で1分間溶解した。次いで細胞懸濁液を2% FBS/PBS中で洗浄し、遠心分離し、2% FBS/PBS 0.5〜1 ml中に再懸濁した。フローサイトメトリーの場合、細胞懸濁液100 μlを96ウェルU底プレート中で染色し、以下の抗体を用いた: CD45.2-Pacific Blue (BioLegend #109820)、CD45.2-APC (eBioscience #17-0454-82)、CD45.2-FITC (eBioscience #11-0454-85)、Gr-1-FITC (eBioscience #11-5931)、Gr-1-PE (eBioscience #12-5931-81)、CD11b-PECy7 (eBioscience # 25-0112)、CD11b-FITC (eBioscience # 11-0112-82)、Ly6C-PE (eBioscience #12-5932-80)、Ly6G-APC-Cy7 (BioLegend #127623)、Ly6G-APC (BioLegend #127613)、CD3-PE (eBioscience #12-0031)、CD4-APC (BioLegend #100515)、CD4-PE-Cy7 (eBioscience #25-0042-82)、CD8-APC (BioLegend #100721)、CD8-FITC (eBioscience #11-0081-85)、B220-FITC (eBioscience #11-0452)、CD19-PerCP-Cy5.5 (eBioscience #45-0193)、F4/80-APC (eBioscience #17-4801)、CD44-FITC (BD Pharmingen #561859)、CD62L-APC (BioLegend #104411)、CD206-PE (BioLegend #141705)、およびCD49f-APC (eBioscience #17-0495)。全ての抗体を1：100で用いた。細胞生存性を評価するため、細胞をFACS分析の前にDAPIまたはTO-PRO 3のいずれかとともにインキュベートした。FOXP3 Fix/Perm Buffer Set (BioLegend)を用いてFoxp3染色を行い、Foxp3-FITC抗体(eBioscience # 11-5773)によって細胞を染色した。全ての染色混合物をBD LSR IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)にて分析した。得られたプロファイルをさらに処理し、FlowJo 8.7ソフトウェアを用いて分析した。
【０１６３】
細胞選別
Gr-1+/CD11b+細胞集団、CD45-/CD49f+細胞集団、およびCD4+細胞集団の細胞選別の場合、腫瘍組織、血液、および脾臓を上記のように調製した。ACK溶解緩衝液1〜2 ml中での赤血球溶解後、細胞を抗CD45-Pacific Blue、抗Gr-1-FITC、抗CD11b-PECy7、抗CD49f-APC、およびCD4-APCで免疫染色し、洗浄し、BD(商標) FACSAria IIu SORP細胞選別機(Becton Dickinson)にて選別した。Ly6C+/Ly6G-およびLy6C+/Ly6G+細胞集団の細胞選別の場合、細胞を抗CD11b-FITC、抗Ly6C-PE、および抗Ly6g-APCで免疫染色した。
【０１６４】
インビトロTreg細胞誘導アッセイ法
CD4+ T細胞を、上記のように無腫瘍対照マウスの脾臓から選別した。精製CD4+ T細胞を3ヶ月齢時のPtenpc-/-;Zbtb7apc-/-およびPtenpc-/-;Trp53pc-/-腫瘍由来のGr1+/CD11b+細胞とともに4:1 (T細胞/Gr-1+/CD11b+細胞)の比率で組み換えマウスインターロイキン2 (10 ng/ml, R&D Systems)の存在下において共培養した。4日間の培養後、細胞を収集し、上記のようにフローサイトメトリー分析に供した。
【０１６５】
RT-PCRおよびマイクロアレイ分析
マウス腫瘍組織についてのマイクロアレイ分析および遺伝子セット濃縮分析を、Palucka, A. K.ら(Palucka, A. K. et al. Cell 164, 1233-1247 (2016))によって以前に記載されているように行い分析した。mRNA発現レベルの場合、指示されたマウスからの組織をTRIZOL (Life Technologies #15596026)中でホモジナイズし、製造元の推奨にしたがってRNAを抽出した。製造元の推奨にしたがいPure Link RNA Mini Kit (Life Technologies #12183025)を用いてRNAをさらに精製した。ヒト細胞株または分離されたGr-1陽性細胞のmRNA発現分析の場合、製造元の推奨にしたがいPure Link RNA Mini Kitを用いてRNAを単離した。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies #4368814)によってRNAをcDNAに逆転写した。発現レベルは、SYBRグリーン法を用い、Applied BiosystemのステップワンプラスリアルタイムPCRシステム(Step One Plus Real Time PCR System)での相対的定量化によって測定した。データは、表示の通り変化倍率または発現値として示される。プライマー配列は以下の表4および表5に含まれる。
【０１６６】
（表４）qRT-PCRに用いられるマウス遺伝子を標的とするプライマー配列
2019530733.tif 000020
【０１６７】
（表５）qRT-PCRに用いられるマウス遺伝子を標的とするプライマー配列
2019530733.tif 000021
【０１６８】
遺伝子発現プロファイリング
cbioportalウェブサイト(http://www.cbioportal.org/)から、がんゲノムアトラス前立腺腺がん(Cancer Genome Atlas Prostate Adenocarcinoma; TCGA-PRAD)データおよびロビンソン転移性前立腺がんデータをダウンロードした。Cerami, E.ら(Cancer Discov. 2012. 2, 401-4.)、Gao, J.ら(Sci. Signal. 2013. 6, 11)を参照されたい。正規化された遺伝子発現データは、底2を用いて対数変換された。ボックスプロットおよび階層的クラスタリング分析はRプログラミングを用いて行われた。分位数0.205未満のZBTB7A発現を有するサンプルは、低いとカウントされ、分位数0.795を超えると高いとカウントされた。PTEN、TP53、またはPMLのホモ接合性欠失を有するサンプルは、変化した「変化(alt)」とカウントされた。ボックスプロットで異なるカテゴリに分類されるサンプル数の有意性を計算するために、標準t検定またはウイルコクソン(Wilcoxon)の符号付き検定を行った。2つの集団比率についてのZスコア検定を比率間、例えばPML-変化群におけるPMN-高比率 vs 「Pten-変化、Zbtb7a-低」群におけるその比率の間で、図6Fについて行った。バイオインフォマティクス分析に用いられる遺伝子シグネチャを作製するために用いられる遺伝子のリストは、表2中にある。PMNシグネチャは、Wangら(Wang, G. et al. Cancer Discov. 6, 80-95 (2016))によって用いられたMDSC遺伝子シグネチャをわずかに修正することによって作製された。最近、Bronteおよびその同僚らによって刊行された総説(Ugel, S., et al. Journal of Clinical Investigation 125, 3365-3376 (2015))の図1中で強調されているMo-MDSCおよびM2様TAMヒト遺伝子を含むMo-MDSCシグネチャが作製されている。T細胞シグネチャは、Sprangerら(Spranger, S. et al. Nature 523, 231-235 (2015))によって使用されているものである。
【０１６９】
統計分析
サンプルサイズを予め決定するために統計的方法は使われなかった。実験から除外されたマウスはなかった。全ての統計分析のために、GraphPad Prism 6ソフトウェアを用い、分析は両側の対応のないスチューデントt検定によって行った。高発現のCXCL5およびCXCL17を有する検体の分析は、フィッシャーの直接確率検定を行って実施された。p<0.05の値を統計学的に有意と見なした。＊P<0.05; ＊＊P<0.01; ＊＊＊P<0.001 (t検定)。
【０１７０】
他の態様
前述の説明から、本明細書において記載された発明をさまざまな用法および条件に取り入れるように変形および修正がなされうることが明らかであろう。そのような態様も以下の特許請求の範囲内にある。
【０１７１】
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素または列挙された要素の組み合わせ(もしくは部分的組み合わせ)としてのその変数の定義を含む。本明細書における態様の列挙は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部分との組み合わせでのその態様を含む。
【０１７２】
本明細書において言及された全ての特許および刊行物は、あたかもそれぞれの独立した特許および刊行物が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
2019530733.tif 000023
【図１Ｂ】
2019530733.tif 000024
【図１Ｃ】
2019530733.tif 000025
【図１Ｄ】
2019530733.tif 000026
【図１Ｅ】
2019530733.tif 000027
【図１Ｆ】
2019530733.tif 000028
【図２Ａ】
2019530733.tif 000029
【図２Ｂ】
2019530733.tif 000030
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2019530733.tif 000032
【図２Ｅ】
2019530733.tif 000033
【図２Ｆ】
2019530733.tif 000034
【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
2019530733.tif 000036
【図３Ａ】
2019530733.tif 000037
【図３Ｂ】
2019530733.tif 000038
【図３Ｃ】
2019530733.tif 000039
【図３Ｄ】
2019530733.tif 000040
【図３Ｅ】
2019530733.tif 000041
【図３Ｆ】
2019530733.tif 000042
【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
2019530733.tif 000044
【図４Ａ】
2019530733.tif 000045
【図４Ｂ】
2019530733.tif 000046
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2019530733.tif 000048
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
2019530733.tif 000050
【図４Ｇ】
2019530733.tif 000051
【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図５Ａ】
2019530733.tif 000056
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
2019530733.tif 000060
【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
2019530733.tif 000063
【図６Ａ−１】
2019530733.tif 000064
【図６Ａ−２】
2019530733.tif 000065
【図６Ｂ−１】
2019530733.tif 000066
【図６Ｂ−２】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2019530733.tif 000069
【図６Ｅ−１】
2019530733.tif 000070
【図６Ｅ−２】
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【図６Ｆ】
2019530733.tif 000072
【図６Ｇ】
2019530733.tif 000073
【図６Ｈ】
2019530733.tif 000074
【図７Ａ】
2019530733.tif 000075
【図７Ｂ】
2019530733.tif 000076
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2019530733.tif 000078
【図８Ａ】
2019530733.tif 000079
【図８Ｂ−１】
2019530733.tif 000080
【図８Ｂ−２】
2019530733.tif 000081
【図８Ｃ】
2019530733.tif 000082
【図８Ｄ】
2019530733.tif 000083
【図８Ｅ】
2019530733.tif 000084
【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
2019530733.tif 000086
【図９Ｂ】
2019530733.tif 000087
【図９Ｃ−１】
2019530733.tif 000088
【図９Ｃ−２】
2019530733.tif 000089
【図１０Ａ】
2019530733.tif 000090
【図１０Ｂ】
2019530733.tif 000091
【図１０Ｃ】
2019530733.tif 000092
【図１１Ａ】
2019530733.tif 000093
【図１１Ｂ】
2019530733.tif 000094
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2019530733.tif 000096
【図１２Ａ】
2019530733.tif 000097
【図１２Ｂ】
2019530733.tif 000098
【図１２Ｃ】
2019530733.tif 000099
【図１３Ａ】
2019530733.tif 000100
【図１３Ｂ】
2019530733.tif 000101
【図１３Ｃ】
2019530733.tif 000102
【図１４Ａ】
2019530733.tif 000103
【図１４Ｂ】
2019530733.tif 000104
【図１４Ｃ】
2019530733.tif 000105
【図１４Ｄ】
2019530733.tif 000106
【図１５Ａ】
2019530733.tif 000107
【図１５Ｂ】
2019530733.tif 000108
【図１６−１】
2019530733.tif 000109
【図１６−２】
2019530733.tif 000110
【図１６−３】
2019530733.tif 000111
【図１６−４】
2019530733.tif 000112
【図１６−５】
2019530733.tif 000113
【図１６−６】
2019530733.tif 000114
【図１６−７】
2019530733.tif 000115
【図１６−８】
2019530733.tif 000116
【図１６−９】
2019530733.tif 000117
【図１６−１０】
2019530733.tif 000118
【図１６−１１】
2019530733.tif 000119
【図１６−１２】
2019530733.tif 000120
【図１６−１３】
2019530733.tif 000121
【図１６−１４】
2019530733.tif 000122
【図１６−１５】
2019530733.tif 000123
【図１６−１６】
2019530733.tif 000124
【図１６−１７】
2019530733.tif 000125
【図１６−１８】
2019530733.tif 000126
【図１６−１９】
2019530733.tif 000127
【図１６−２０】
2019530733.tif 000128
【図１６−２１】
2019530733.tif 000129
【図１６−２２】
2019530733.tif 000130
【図１６−２３】
2019530733.tif 000131
【図１６−２４】
2019530733.tif 000132
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月8日(2019.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019530733000001.app
【国際調査報告】
2019530733.tif 000133
2019530733.tif 000134