(57)【要約】  イムノアッセイにおいて使用するために迅速なインキュベート期間及び改善された安定性を示すアルカリホスファターゼの化学発光基質製剤が提供される。
2019530429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じさせる基質製剤であって、水溶液中に、
ａ）０．０１ｍＭ〜５０ｍＭの式Ｉの化学発光化合物又はその塩：
【化１８】
2019530429.tif 000067
（式中、
Ａは、Ｃ１〜６ハロアルキル、ナフチル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロアリールであり、置換フェニルは、１〜３個のハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＣＮ、又はＮＯ２置換基を含み、
Ｒ１は、Ｃ５〜１４アリール、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、及びＣ５〜１４アラルキル基からなる群から選択され、
Ｒ７〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ、Ｃ１〜４アルキルであるか、又はＲ７−Ｒ８若しくはＲ８−Ｒ９若しくはＲ９−Ｒ１０  Ｒ１１−Ｒ１２若しくはＲ１２−Ｒ１３若しくはＲ１３−Ｒ１４は、少なくとも１つの５又は６員環を含む炭素環式又は複素環式環系として互いに結合し得、
Ｒ１５は、Ｃ１〜６アルキルであり、
各Ｍは、独立して、Ｈ、又はアルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、アンモニウム、ホスホニウム、有機アミン塩、アミノ酸から選択されるか、
Ｚは、Ｏ又はＳであり；ｎは、０、１、又は２である）、
ｂ）０．０１〜２００μＭのカチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）、
ｃ）１μＭ〜１０ｍＭのバックグラウンド低減剤、及び
ｄ）０．０５〜２０ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、
を含む、基質製剤。
【請求項２】
請求項１に記載の基質製剤であって、
ＺがＳであり、
Ａが、フェニル又は置換フェニルであり、置換フェニルが、１〜３個のハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、及びＣ１〜６ハロアルキル置換基を含み、
Ｒ１が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、又はｔ−ブチルであり、
Ｒ７〜Ｒ１４が、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロであり、
各Ｍが、独立して、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、又はＬｉであり、
ｎが、０、１、又は２である基質製剤。
【請求項３】
請求項１に記載の基質製剤であって、前記式Ｉの化合物が、以下からなる群から選択される基質製剤：
【化１９】
2019530429.tif 000068
【化２０】
2019530429.tif 000069
【請求項４】
請求項１に記載の基質製剤であって、前記カチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）が、式ＩＩに係る化合物から選択される基質製剤：
【化２１】
2019530429.tif 000070
（式中、
Ｑは、ハロゲン、シアノ、−−ＣＯＯＲ’、−−ＣＯＳＲ’、−−ＣＯＮＲ１Ｒ２、−−ＣＯＮ（Ｒ）ＳＯ２Ｒ”、ナフチル、アントリル、Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリジニル、ハロ置換Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリジニルからなる群から選択され、
Ｒは、Ｃ１〜４アルキルであり、
Ｒ’、Ｒ”は、独立して、Ｃ１〜６アルキル、アリール、アルキル置換アリールから選択され、
Ｒ１、Ｒ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、及びアルキルアリールから選択され、
Ｚ−は、ハロゲン化物又は硝酸であり、Ｙは、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜４アルキルから選択される）。
【請求項５】
請求項４に記載の基質製剤であって、Ｑが、Ｎ−メチルアクリジニル、ハロ置換Ｎ−メチルアクリジニル、ナフチル、又はアントリルであり；Ｒが、Ｃ１〜４アルキルであり；Ｚ−が、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−からなる群から選択され、Ｙが、Ｈ又はハロである、基質製剤。
【請求項６】
請求項５に記載の基質製剤であって、前記ＣＡＣが以下からなる群から選択される基質製剤：
【化２２】
2019530429.tif 000071
【請求項７】
前記バックグラウンド低減剤が、亜硫酸リチウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、重亜硫酸リチウム、重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸リチウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ；２，６−ビス（１，１０−ジメチルエチル）−４−メチルフェノール）、ブチル化ヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）、３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシルアニソール、３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシルアニソール、及び式Ａｒ−Ｂ（ＯＨ）２（式中、Ａｒは、フェニル、置換フェニル、ヘテロ原子を含み得る縮合芳香族環系、ヘテロ原子を含み得る置換縮合芳香族環系であり、置換アリール基は、独立してＣ１〜６アルキル、ハロ、アルコキシカルボニル、又はヒドロキシル基から選択される１〜３個の置換基を有し得る）の芳香族ボロン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の基質製剤。
【請求項８】
前記バックグラウンド低減剤が、フェニルボロン酸、４−トリルボロン酸、４−クロロボロン酸、４−ヨードボロン酸、及び３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、並びに亜硫酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項７に記載の基質製剤。
【請求項９】
前記エーテル結合した非イオン界面活性剤が、式（ＩＩＩ）のものである、請求項１に記載の基質製剤：
【化２３】
2019530429.tif 000072
（式中、Ｒは、Ｃ６〜２２アルキル、シクロアルキル、Ｃ６〜２２アルキル置換シクロアルキル、及びモノ−又はジ−Ｃ６〜２２アルキル置換フェニルから選択され；ｎは、２〜２００の数であり；Ｘは、Ｏ又はＳから選択され；Ｙは、Ｈ又はＣ１〜４アルキルから選択される）。
【請求項１０】
前記エーテル結合した非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（ＢＲＩＪ）、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（ＴＲＩＴＯＮ）、又はポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ）からなる群から選択される、請求項９に記載の基質製剤。
【請求項１１】
前記親水性ポリマーが、式（ＩＶ）に係る、請求項１に記載の基質製剤：
【化２４】
2019530429.tif 000073
（式中、Ｘ１及びＸ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ若しくはＮＨから選択されるか、又は存在せず；Ｙ１及びＹ２は、独立して、Ｈ、Ｈ２、又はＣ１〜４アルキルから選択され；ｎは、２０〜１２，０００の数である）。
【請求項１２】
前記親水性ポリマーが、１，０００〜５１１，０００の範囲内の平均Ｍｗを有するポリ（エチレングリコール）である、請求項１１に記載の基質製剤。
【請求項１３】
Ｃ１０〜２２アルキルサルフェート及びＣ１０〜２２アルキルスルホネートからなる群から選択されるアニオン性界面活性剤を更に含む、請求項１に記載の基質製剤。
【請求項１４】
前記アニオン性界面活性剤が、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及びトリデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の基質製剤。
【請求項１５】
請求項１に記載の基質製剤であって、以下からなる群から選択されるアミンバッファを更に含む基質製剤：トリス（トロメタミン）；ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）；ＤＥＡ（ジエタノールアミン）；ＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）；２２１−アミン（２−アミノ−２−メチルプロパン−１−オール）；ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）；グリシン；及びｐＨ７〜１２のＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）バッファ。
【請求項１６】
０．０５ｍＭ〜１０ｍＭの化合物Ｉ、０．０５〜５０μＭのカチオン性芳香族化合物、１０μＭ〜１０００ｍＭのバックグラウンド低減剤、０．１〜１０ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、０．１〜５ｇ／Ｌのアニオン性界面活性剤、及びｐＨ８〜１１のアミンバッファを含む、請求項１に記載の基質製剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載の基質製剤であって、前記化合物Ｉが、ＣＰＡであり、前記ＣＡＣが、ルシゲニンであり、前記バックグラウンド低減剤が、亜硫酸ナトリウムであり、前記非イオン性界面活性剤が、ＩＧＥＰＡＬ（ＣＯ−９９０、ＤＭ−９７０）、ＴＲＩＴＯＮ（Ｘ−４０５、還元型Ｘ−４０５）、及びＢＲＩＪ（７８、７００）から選択され、前記親水性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１４，０００）、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝３５，０００）及びポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１００，０００）から選択され、前記アニオン界面活性剤が、ＳＤＳ及びＳＴＳから選択され、前記アミンバッファが、ＴＲＩＳ及びＡＭＰＤから選択される基質製剤。
【請求項１８】
請求項１に記載の基質製剤であって、以下のうちの１つ以上を示す基質製剤：
ａ）アルカリホスファターゼ酵素に曝露した後、≦５分間、≦４分間、≦２分間、≦１分間、≦４５秒間、≦３０秒間、≦２０秒間、≦１０秒間、≦５秒間、≦４秒間、≦３秒間、又は≦２秒間に最高強度（Ｉｍａｘ）を達成する、
ｂ）４℃で３００日間保管した後にアルカリホスファターゼ酵素に曝露した後、元のＲＬＵの≦１０％の喪失を示す、
ｃ）４℃で３００日間以上保管したとき、元のＲＬＵと比べて≧９０％又は＞９５％の保持された活性（ＲＬＵ）を示す、
ｄ）４℃で４００日間以上保管したとき、≧９０％の保持された活性を示す、
ｅ）３０℃で保管したとき１５日間後に＜−０．５０％／日の１日あたりのシグナル変化率（％）を示す。
【請求項１９】
ホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じさせる基質製剤であって、組成物が、水溶液中に、
ａ）式Ｉの化学発光化合物又はその塩：
【化２５】
2019530429.tif 000074
（式中、
Ａは、Ｃ１〜６ハロアルキル、ナフチル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロアリールから選択され、置換フェニルは、１〜３個のハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＣＮ、又はＮＯ２置換基から選択され、
Ｒ１は、Ｃ５〜１４アリール、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、及びＣ５〜１４アラルキル基からなる群から選択され、
Ｒ７〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ、若しくはＣ１〜４アルキルであるか、又はＲ７−Ｒ８若しくはＲ８−Ｒ９若しくはＲ９−Ｒ１０  Ｒ１１−Ｒ１２若しくはＲ１２−Ｒ１３若しくはＲ１３−Ｒ１４は、少なくとも１つの５又は６員環を含む炭素環式又は複素環式環系として互いに結合し得、
Ｒ１５は、Ｃ１〜６アルキルであり、
Ｍは、独立して、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫから選択され、
Ｚは、Ｏ又はＳであり；ｎは、０、１、又は２である）、
ｂ）カチオン性芳香族化合物の非存在下で生じるものと比べて化学発光を増加させるのに有効な量の前記カチオン性芳香族化合物、及び
ｃ）バックグラウンド低減剤であって；
改善が含み、
ｄ）前記水溶液中にエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、
を含み、
得られるターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）が、自動イムノアッセイ又は性能試験Ｂにおいてアルカリホスファターゼに曝露した後２分間未満である、基質製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年６月３０日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、２０１６年６月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／３５７，０９１号に対する優先権の利益を主張するものであり、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイにおいて使用するために迅速なインキュベート期間及び改善された安定性を示すアルカリホスファターゼの化学発光基質製剤が提供される。
【０００３】
アルカリホスファターゼは、酵素結合免疫測定法においてマーカー又はラベルとして使用することができる加水分解酵素である。これら酵素の化学発光検出は、サンプル中の酵素の量の又は酵素で標識された分析物の量の定量的尺度を提供するための安全、簡便、かつ高感度の手段を提供する。
【０００４】
アルカリホスファターゼの化学発光基質は、イムノアッセイにおいて検出系として使用される。いくつかのフォーマットでは、分析物は、ホスファターゼ酵素で標識されていてもよく、ホスファターゼで標識された特異的「結合パートナー」を介して特異的に検出されてもよい。ホスファターゼは、分析物結合化合物にラベルとして直接組み込むことができる。あるいは、分析物結合化合物を、当該分析物結合化合物についての少なくとも１つのホスファターゼで標識された特異的結合物質に結合させてもよい。あるいは、分析物結合性化合物を少なくとも１つの第２の特異的結合物質で標識してもよく、次いで、これを第２の特異的結合物質についてのホスファターゼで標識された結合パートナーに結合させる。性能及び安定性を含む様々な要因に応じて、いくつかの基質は、自動イムノアッセイシステムにおいてより有用である。
【０００５】
アルカリホスファターゼ酵素に接触したときに化学発光を生じさせる化合物（又は分析物）は、米国特許第６，０４５，７２７号、同第６，０９０，５７１号、同第６，１３９，７８２号、同第６，２１８，１３７号、同第６，２７０，６９５号、及び同第６，２９６，７８７号に開示されており、これらはそれぞれ参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００６】
ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０（登録商標）（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）は、ＤｘＩ  ａｎｄ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ  ＣＡ）を含む自動イムノアッセイシステムにおいて使用される市販のアルカリホスファターゼ化学発光基質製剤である。ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０（登録商標）は、所望の感度、開栓安定性（ｏｐｅｎ  ｂｏｔｔｌｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、バックグラウンド化学発光、及び較正曲線ドリフトを有するが、これら自動系においてシグナルを発生させるために５〜６分間のインキュベート時間を必要とする。これら自動系におけるターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）がより速いことが望ましい。
【０００７】
Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ（Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ））は、別の市販のアルカリホスファターゼ基質製剤である。Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート分子のＥＬＩＳＡ検出のために使用されるアクリダンベースの化学発光基質組成物である。Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５は、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０（登録商標）よりも少ない温度感受性光出力及び迅速なピーク強度を提供する。発光は、４５０ｎｍにおいて最大である。Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５は、迅速なインキュベート期間及び良好な感度を示すが、開栓安定性、バックグラウンド化学発光、及び較正曲線ドリフトが若干制限されるため、自動イムノアッセイシステムにおいて使用するために修正することができない。したがって、ＡＰＳ−５は、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０（登録商標）に比べて、保管中にシグナル強度が失われ、熱感受性が高くなるという問題がある。図１に示すように、ＡＰＳ−５は、４℃で保管したとき、１２ヶ月間で約３５％のシグナル喪失を示す。
自動イムノアッセイシステムの性能及び効率を改善するために、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０（登録商標）のより長い保管寿命及び改善された安定性を示すと同時に、ＡＰＳ−５によって示される速いターンアラウンドタイムを有するアルカリホスファターゼ基質を有することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，０４５，７２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０９０，５７１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１３９，７８２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２１８，１３７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２７０，６９５号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２９６，７８７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
イムノアッセイシステム、特に自動イムノアッセイシステムにおいて使用するためのアルカリホスファターゼ化学発光基質製剤（「基質製剤」）が提供される。これら水性基質製剤は、ホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じさせる。いくつかの実施形態では、迅速なシグナル生成を示す改善された基質製剤が提供される。本基質製剤は、現行の市販の基質製剤と比べて改善されたシグナル生成時間（又はターンアラウンドタイム）、改善された安定性（例えば、熱感受性の低下）、強化されたアルカリホスファターゼの特異性、及び／又は強化されたアッセイ感度のうちの１つ以上を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、以下を含む：
ａ）式Ｉの化学発光化合物又はその塩：
【００１１】
【化１】
2019530429.tif 000003
（式中、
Ａは、Ｃ１〜６ハロアルキル、ナフチル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロアリールであり、置換フェニルは、１〜３個のハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＣＮ、又はＮＯ２置換基を含み；Ｒ１は、Ｃ５〜１４アリール、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、及びＣ５〜１４アラルキル基からなる群から選択され；Ｒ７〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ、若しくはＣ１〜６アルキルであるか、又はＲ７−Ｒ８若しくはＲ８−Ｒ９若しくはＲ９−Ｒ１０  Ｒ１１−Ｒ１２若しくはＲ１２−Ｒ１３若しくはＲ１３−Ｒ１４は、少なくとも１つの５又は６員環を含む炭素環式又は複素環式環系として互いに結合し得；Ｒ１５は、Ｃ１〜６アルキルであり；各Ｍは、独立して、Ｈ、又はアルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、アンモニウム、ホスホニウム、有機アミンから形成される塩、又はアミノ酸から選択され；Ｚは、Ｏ又はＳであり；ｎは、０、１、又は２である）；
ｂ）カチオン性芳香族化合物の非存在下で生じるものと比べて化学発光を増加させるのに有効な量のカチオン性芳香族化合物；
ｃ）バックグラウンド低減剤；及び
ｄ）エーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー。
【００１２】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、（ａ）０．０１ｍＭ〜５０ｍＭの化合物Ｉ、（ｂ）０．０１〜２００μＭのカチオン性芳香族化合物、（ｃ）１μＭ〜１０ｍＭのバックグラウンド低減剤、及び（ｄ）０．０５〜２０ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、化合物Ｉ（式中、ＺはＳであり；Ａｒは、フェニル又は置換フェニルであり、置換フェニルは、１〜３個のハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、及びＣ１〜６ハロアルキル置換基を含み；Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、又はｔ−ブチルであり；Ｒ７〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロであり；各Ｍは、Ｎａ又はＨであり；ｎは、０、１、又は２である）を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、基質製剤は、以下からなる群から選択される化合物Ｉを含む：
【００１５】
【化２】
2019530429.tif 000004
【００１６】
【化３】
2019530429.tif 000005
【００１７】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、カチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）ＩＩ：
【００１８】
【化４】
2019530429.tif 000006
（式中、Ｑは、ハロゲン、シアノ、−−ＣＯＯＲ’、−−ＣＯＳＲ’、−−ＣＯＮＲ１Ｒ２、−−ＣＯＮ（Ｒ）ＳＯ２Ｒ”、ナフチル、アントリル、Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリジニル、ハロ置換Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリジニルからなる群から選択され；Ｒは、Ｃ１〜４アルキルであり；Ｒ’、Ｒ”は、独立して、Ｃ１〜６アルキル、アリール、アルキル置換アリールから選択され；Ｒ１、Ｒ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、及びアルキルアリールから選択され；Ｚ−は、ハロゲン化物又は硝酸であり；Ｙは、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜４アルキルから選択される）を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、カチオン性芳香族化合物ＩＩ（式中、Ｑは、Ｎ−メチルアクリジニル、ハロ置換Ｎ−メチルアクリジニル、ナフチル、又はアントリルであり；Ｒは、Ｃ１〜４アルキルであり；Ｚ−は、Ｃｌ−、Ｂｒ、Ｉ−、ＮＯ３−からなる群から選択され、Ｙは、Ｈ又はハロである）を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、基質製剤は、以下からなる群から選択されるカチオン性芳香族化合物ＩＩを含む：
【００２１】
【化５】
2019530429.tif 000007
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビアクリジニウムジニトレート（ルシゲニン）、
【００２２】
【化６】
2019530429.tif 000008
【００２３】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルビアクリジニウムジニトレート（ルシゲニン）であるカチオン性芳香族化合物ＩＩを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、亜硫酸リチウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、重亜硫酸リチウム、重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸リチウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ；２，６−ビス（１，１０−ジメチルエチル）−４−メチルフェノール）、ブチル化ヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）、３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシルアニソール、３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシルアニソール、及び式Ａｒ−Ｂ（ＯＨ）２（式中、Ａｒは、フェニル、置換フェニル、ヘテロ原子を含み得る又は含み得ない縮合芳香族環系、ヘテロ原子を含み得る又は含み得ない置換縮合芳香族環系であり、置換アリール基は、独立してＣ１〜６アルキル、ハロ、アルコキシカルボニル、又はヒドロキシル基から選択される１〜３個の置換基を有し得る）の芳香族ボロン酸からなる群から選択されるバックグラウンド低減剤を含む。特定の実施形態では、バックグラウンド低減剤は、フェニルボロン酸、４−トリルボロン酸、４−クロロボロン酸、４−ヨードボロン酸、及び３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、並びに亜硫酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、一般式（ＩＩＩ）に係るエーテル結合した非イオン性界面活性剤：
【００２６】
【化７】
2019530429.tif 000009
（式中、Ｒは、Ｃ６〜２２アルキル、シクロアルキル、Ｃ６〜２２アルキル置換シクロアルキル、及びモノ−又はジ−Ｃ６〜２２アルキル置換フェニルから選択され；ｎは、２〜２００の数であり；Ｘは、Ｏ又はＳから選択され；Ｙは、Ｈ又はＣ１〜４アルキルから選択される）を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、式（ＩＩＩ）に係るエーテル結合した非イオン性界面活性剤（式中、Ｒは、Ｃ８〜２０アルキル、Ｃ８〜２０置換シクロアルキル、又はモノ−若しくはジ−Ｃ８〜２０アルキル置換フェニルであり、ｎは、８〜１５０の数であり、ＸはＯであり、ＹはＨである）を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、エーテル結合した非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（ＢＲＩＪ）、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（ＴＲＩＴＯＮ）、又はポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ）から選択される。特定の実施形態では、基質製剤はエーテル結合した非イオン性界面活性剤を含む、はＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−９９０、ＩＧＥＰＡＬ  ＤＭ−９７０、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、還元型ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、ＢＲＩＪ  ７８、及びＢＲＩＪ  ７００からなる群から選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、式（ＩＶ）に係る親水性ポリマー：
【００３０】
【化８】
2019530429.tif 000010
（式中、Ｘ１及びＸ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ若しくはＮＨから選択されるか、又は存在せず；Ｙ１及びＹ２は、独立して、Ｈ、Ｈ２、又はＣ１〜４アルキルから選択され；ｎは、２０〜１２，０００の数である）を含む。いくつかでは、１２０〜５，０００、又は２５０〜２，５００である。いくつかの態様では、ｎは＞２０の数である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、式（ＩＶ）に係る親水性ポリマー（式中、Ｘ１及びＸ２は、Ｏであり；Ｙ１及びＹ２は、Ｈであり；ｎは＞２０の数である）を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、１，０００〜５１１，０００、６，０００〜２１８，０００、又は１２，０００〜１０８，０００の範囲内から選択される平均Ｍｗのポリ（エチレングリコール）から選択される親水性ポリマーを含む。いくつかの特定の実施形態では、親水性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１４，０００）、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝３５，０００）及びポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１００，０００）からなる群から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、Ｃ１０〜２２アルキルサルフェート及びＣ１０〜２２アルキルスルホネートからなる群から選択されるアニオン性界面活性剤を更に含む。特定の実施形態では、基質製剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、及びテトラデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択されるアニオン性界面活性剤を含む。存在するとき、基質製剤は、０．０１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは、０．１〜５ｇ／Ｌのアニオン性界面活性剤を含有する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、ｐＨ７〜１２、好ましくは８〜１１のアミンバッファを更に含む。特定の実施形態では、アミンバッファは、トリス（トロメタミン）；ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）；ＤＥＡ（ジエタノールアミン）；ＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）；２２１−アミン（２−アミノ−２−メチルプロパン−１−オール）；ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）；グリシン；又はｐＨ７〜１２のＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）バッファから選択される。特定の実施形態では、基質製剤は、トリス（トロメタミン）又はＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）から選択されるアミンバッファを含む。
【００３５】
いくつかの特定の実施形態では、基質製剤は、０．０１ｍＭ〜５０ｍＭの化合物Ｉ、０．０１〜２００μＭのカチオン性芳香族化合物、１μＭ〜１０ｍＭのバックグラウンド低減剤、０．０５〜２０ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアニオン性界面活性剤、及びｐＨ７〜１２のアミンバッファを含む。
【００３６】
いくつかの特定の実施形態では、基質製剤は、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭの化合物Ｉ、０．０５〜５０μＭのカチオン性芳香族化合物、１０μＭ〜１０００ｍＭのバックグラウンド低減剤、０．１〜１０ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、０．１〜５ｇ／Ｌのアニオン性界面活性剤、及びｐＨ８〜１１のアミンバッファを含む。
【００３７】
いくつかの特定の実施形態の基質製剤では、化合物Ｉは、ＣＰＡ（（（４−クロロフェニル）チオ）（１０−メチルアクリジン−９（１０Ｈ）−イリデン）メチルホスフェート，二ナトリウム塩）であり；ＣＡＣは、ルシゲニンであり；バックグラウンド低減剤は、亜硫酸ナトリウムであり；非イオン性界面活性剤は、ＩＧＥＰＡＬ（ＣＯ−９９０、ＤＭ−９７０）、ＴＲＩＴＯＮ（Ｘ−４０５、還元型Ｘ−４０５）、及びＢＲＩＪ（７８、７００）から選択され；アニオン性界面活性剤は、ＳＤＳ又はＳＴＳであり；アミンバッファは、ＴＲＩＳ又はＡＭＰＤである。
【００３８】
いくつかの特定の実施形態では、基質製剤は、以下を含む：ＣＰＡ；ルシゲニン；亜硫酸ナトリウム；ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１４，０００）、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝３５，０００）及びポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１００，０００）から選択される親水性ポリマー；ＳＤＳ又はＳＴＳであるアニオン界面活性剤；ＴＲＩＳ又はＡＭＰＤであるアミンバッファ。
【００３９】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、０．０１ｍＭ〜５０ｍＭの化合物Ｉ、０．０１〜２００μＭのカチオン性芳香族化合物、１μＭ〜１０ｍＭのバックグラウンド低減剤、０．０５〜２０ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアニオン性界面活性剤、及びｐＨ７〜１２のアミンバッファを含み、組成物は、以下のうちの１つ以上を示す：
ａ）アルカリホスファターゼ酵素に曝露した後、≦５分間、≦４分間、≦２分間、≦１分間、≦４５秒間、≦３０秒間、≦２０秒間、≦１０秒間、≦５秒間、≦４秒間、≦３秒間、又は≦２秒間に最高強度（Ｉｍａｘ）；
ｂ）４℃で３００日間保管した後にアルカリホスファターゼ酵素に曝露した後、元のＲＬＵの≦１０％の喪失；
ｃ）４℃で３００日間以上保管したとき、元のＲＬＵと比べて≧９０％又は＞９５％保持される活性（ＲＬＵ）；
ｄ）４℃で４００日間以上保管したとき、＞９０％保持される活性；
ｅ）３０℃で保管したとき＜−０．５０％／日の１５日間後の１日あたりのシグナル変化率（％）。
【００４０】
いくつかの実施形態では、以下を含む化学発光アッセイ手順によってサンプル中の分析物を検出する方法が提供される：
（ａ）サンプルを本発明の基質製剤と接触させることと、
（ｂ）化学発光を測定することであって、化学発光の存在が分析物の存在と相関している、こと。
【００４１】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、分析物は、ホスファターゼ酵素又はホスファターゼ酵素の阻害剤である。いくつかの実施形態では、当該方法は、サンプル中の分析物を、当該分析物に特異的に結合する分析物結合化合物と反応させることを更に含み、当該分析物結合化合物は、アルカリホスファターゼで標識されている。いくつかの実施形態では、分析物結合化合物は、抗体、抗原、ハプテン及び核酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、当該方法は、サンプル中の分析物を、当該分析物に特異的に結合する分析物結合化合物及び当該分析物結合化合物の少なくとも１つのホスファターゼ標識特異的結合基質と反応させることを更に含む。
【００４２】
当該方法のいくつかの実施形態では、自動イムノアッセイ又は性能試験Ｂにおいて、化合物Ｉがホスファターゼ酵素と接触してから化学発光が生じるまでのターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）は２分間未満である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】４℃で約４００日間保管したとき、経時的な元の性能強度の百分率の観点でＡＰＳ−５基質製剤の相対的安定性が保持されることを示す。
【図２】１ｇ／Ｌ  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＡＰＳ−５製剤と比べた、ＡＰＳ−５製剤に様々な量のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（０〜５ｇ／Ｌ）を添加した後のアッセイ性能に対する効果（性能％）を示す。
【図３】様々な濃度レベルの非イオン性界面活性剤としてのＢＲＩＪ７００を添加した改変ＡＰＳ−５製剤の、市販の標準的ＡＰＳ−５製剤の百分率（性能％）としてのシグナルを示す。
【図４】実施例４に係る０．１５ＣＰＡｇ／Ｌ及びＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５を含む基質製剤の４℃で１２ヶ月にわたる安定性を示す。
【図５】実施例６に記載の市販のＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０  ＡＰ基質と比べた、０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡを含有する基質製剤ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮと共に基質アッセイスクリーニングで使用される商業的アッセイ及びアッセイフォーマットを示す。
【図６Ａ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）におけるジゴキシンスクリーニングＲＬＵデータを示す。
【図６Ｂ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）におけるＰＴＨ（ＩＯ）ＲＬＵデータを示す。
【図６Ｃ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）におけるＴＳＨ（現行）スクリーニングＲＬＵデータを示す。
【図６Ｄ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）におけるＴＳＨ２  ＲＬＵデータを示す。
【図６Ｅ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）におけるＡｃｃｕＴｎＩ＋３スクリーニングＲＬＵデータを示す。
【図６Ｆ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）におけるＢＮＰスクリーニングＲＬＵデータを示す。
【図６Ｇ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）におけるＣＫ−ＭＢスクリーニングＲＬＵデータを示す。
【図６Ｈ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）におけるミオグロビンスクリーニングＲＬＵデータを示す。
【図６Ｉ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）における全ＢＨＣＧ（旧）スクリーニングＲＬＵデータを示す。
【図６Ｊ】Ｌ５（６．３分）におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べた、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤についてのＬ２（２７秒）及びＬ５（６．３分）における全ＢＨＣＧ（新）スクリーニングＲＬＵデータを示す。
【図７】本発明の基質製剤における使用について調べられたアミンバッファの特徴を示す。
【図８】ＡＭＰＤバッファ系を含む参照基質製剤の％としての、様々なバッファ系を含む基質製剤のＡＰによる比較シグナルを示す。重炭酸塩、ホウ酸塩、及び炭酸塩バッファ系を含む試験基質製剤は、それぞれ、ＡＭＰＤ参照と比べてＡＰによるシグナルの減少を示した。グリシン及びＴＲＩＳ−グリシンバッファを含む試験製剤は、ＡＭＰＤ参照と類似のＡＰによるシグナルを示した。ＡＭＰＤ−グリシンを含む試験基質製剤は、ＡＭＰＤ参照と比べてシグナルの増加を示した。
【図９Ａ】ＡＰＳ−５（Ａ）、ＡＭＰＤ−１０（Ｂ）、Ｃ１３（Ｃ）、及びグリシン（Ｄ）の基質製剤についての、５℃で１５日間保管中のＣＰＡの喪失率を示す。
【図９Ｂ】ＡＭＰＤ−１０（Ｂ）、Ｃ１３（Ｃ）、及びグリシン（Ｄ）の基質製剤についての、１８℃で１５日間保管中のＣＰＡの喪失率を示す。
【図９Ｃ】ＡＰＳ−５（Ａ）、ＡＭＰＤ−１０（Ｂ）、Ｃ１３（Ｃ）、及びグリシン（Ｄ）の基質製剤についての、３０℃で１５日間保管中のＣＰＡの喪失率を示す。
【図１０Ａ】０．３２％／日の１日あたりの失われた元のシグナルの強度の勾配を示す、ＡＭＰＤ−１０−対照の９日間にわたるシグナルの相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。
【図１０Ｂ】０．８７％／日の１日あたりの失われた元のシグナルの強度の勾配を示す、ＡＭＰＤ−１０−ｐ−クレゾールの９日間にわたるシグナルのＲＬＵを示す。
【図１０Ｃ】０．０２％／日の１日あたりの失われた元のシグナルの強度の勾配を示す、ＡＭＰＤ−１０−４−ＴＢＡの９日間にわたるシグナルのＲＬＵを示す。
【図１１】対応する４℃のサンプルに対する性能率として、３０℃における（Ａ）０．６×、（Ｂ）０．７×、（Ｃ）１×、及び（Ｄ）１．３×のルシゲニンを含む基質製剤の安定性を示す。より高いＣＡＣ濃度において安定性が低下する傾向がみられた。
【図１２】３０℃で保管したときの０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．８）、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡを含む基質製剤の安定性を示す。
【図１３】市販のＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べた、実施例２３の基質製剤の２３種の自動イムノアッセイにおける結果が出るまでの時間を示す。実施例２３の基質製剤では、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて自動イムノアッセイにおいて１０％〜４０％の時間が節約された。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本開示は、アルカリホスファターゼと反応して迅速に化学発光シグナルを生じさせ、保管中に持続的なシグナル安定性を示す、改善された基質製剤を提供する。いくつかの実施形態では、基質製剤は、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０などの市販されている基質含有化合物と比べて、より速いターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）、並びに熱感受性の低下、ＡＬＰアッセイ特異性の強化、フライアー（ｆｌｉｅｒｓ）の低減、及びアッセイ感度の増大のうちの１つ以上を示す。このような基質製剤は、手動及び自動の両イムノアッセイ、並びにアルカリホスファターゼ基質を使用する他のアッセイ、例えば、核酸プローブアッセイ、細胞受容体アッセイなどで使用するのに望ましい。
【００４５】
定義
用語「ａ」及び「ａｎ」は、列挙される化合物の「１つ以上」を指す。例えば、「ａ」カチオン性芳香族化合物は、１つの化合物、又は２つ以上のカチオン性芳香族化合物を含む混合物を指す。本明細書に列挙される任意の濃度の範囲、百分率の範囲、又は比の範囲は、特に指定しない限り、その範囲内の任意の整数の濃度、百分率、又は比、及びその分数、例えば、整数の十分の一及び百分の一を含むと理解すべきである。また、任意の物理的特徴に関連する本明細書に列挙される任意の数の範囲は、特に指定しない限り、列挙される範囲内の任意の整数を含むと理解すべきである。
【００４６】
用語「化学発光化合物」は、本明細書に提供される適切な条件下において、ホスファターゼ酵素及び酸素の存在下で化学発光を生じさせる化合物を指す。本発明の基質製剤中の化学発光化合物は、本明細書に記載の式Ｉの化合物である。
【００４７】
用語「分析物」は、サンプル中でその存在が検出又は定量され得る物質を意味する。本方法によってアッセイされ得る分析物としては、ホスファターゼ酵素が挙げられるが、この場合、追加のホスファターゼ酵素を添加する必要があるであろう。分析物は、ホスファターゼ酵素の阻害剤であってもよい。分析物は、当該技術分野において一般的に知られており、イムノアッセイ、核酸プローブアッセイ、細胞受容体アッセイなどが挙げられるリガンド−バインダーアッセイで検出され得る様々な分類の有機分子及び生体分子のいずれかであってよい。
【００４８】
用語「バックグラウンド低減剤」は、その存在がホスファターゼ酵素の非存在下で生じる化学発光を低減する化合物を指す。
【００４９】
用語「カチオン性芳香族化合物」（ＣＡＣ）は、１つ以上の単離又は縮合芳香環を含み、正電荷がヘテロ原子のうちの１つ以上に実質的に局在する炭素以外の少なくとも１つの原子（ヘテロ原子）、好ましくは１つ以上の窒素原子を含有する芳香族複素環化合物を含む化合物を指す。ＣＡＣ化合物は、本明細書に提供されるホスファターゼ反応において化学発光を増加させるのに好適な酸化／還元電位を有する。
【００５０】
用語「エーテル結合した非イオン性界面活性剤」は、エーテル結合によって連結されているか又はエーテル結合を含む、疎水性基及び親水性基を含有する非イオン性有機化合物を指す。エーテル結合した非イオン界面活性剤は、硫酸、スルホン酸、リン酸、又はカルボン酸エステル基を含有しない。いくつかの実施形態では、エーテル結合した非イオン性界面活性剤は、式（ＩＩＩ）に係る化合物である：
【００５１】
【化９】
2019530429.tif 000011
（式中、Ｒは、Ｃ６〜２２アルキル、シクロアルキル、Ｃ６〜２２アルキル置換シクロアルキル、及びモノ−又はジ−Ｃ６〜２２アルキル置換フェニルから選択され；ｎは、２〜２００の数であり；Ｘは、Ｏ又はＳから選択され；Ｙは、Ｈ又はＣ１〜４アルキルから選択される）。
【００５２】
いくつかの実施形態では、エーテル結合した非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（ＢＲＩＪ）、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（ＴＲＩＴＯＮ）、又はポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ）から選択される。エーテル結合した非イオン性界面活性剤の更なる例は、本明細書に提供される。
【００５３】
用語「エステル結合した非イオン性界面活性剤」は、エステル結合によって連結されているか又はエステル結合を含む、疎水性基及び親水性基を含有する非イオン性有機化合物を指す。エステル結合した非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレングリコールソルビタンエステル（ポリソルベート、ＴＷＥＥＮ）、ソルビタンアルキルエステル（Ｓｐａｎ）が挙げられる。エーテル結合した非イオン性界面活性剤の更なる例は、本明細書に更に提供される。
【００５４】
用語「フライアー」、「フライアーズ」、「フライヤー」、又は「フライヤーズ」は、偽陽性のイムノアッセイ結果を指す。不要な手順及び反復試験を回避するためにフライヤーの減少が望ましい。
【００５５】
用語「親水性ポリマー」は、疎水性アリールも＞Ｃ４アルキル基も有しない反復Ｃ２〜３アルキルエーテル官能基を有するポリマーを指す。親水性ポリマーは、硫酸、スルホン酸、リン酸、又はカルボン酸エステル基を含有しない。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）から選択される。好ましい実施形態では、親水性ポリマーは、１，０００〜５１１，０００の範囲内で選択される平均Ｍｗを有するポリ（エチレングリコール）である。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、非イオン性である。親水性ポリマーの更なる例は、本明細書に提供される。
【００５６】
用語「均質なアッセイ」は、分析物特異的反応物質と分析物非特異的反応物質との間の分離工程を必要とせずに検出可能なシグナルを調節又は作製するために分析物特異的結合反応を利用する液相の均質な反応を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物及び方法は、均質な液相アッセイにおいて使用することが可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物及び方法は、液相イムノアッセイにおいて使用することが可能である。
【００５７】
用語「不均一性アッセイ」は、分析物に結合している及び遊離している（分析物に結合していない）検出可能に標識された特異的結合パートナーの物理的分離に頼る不均一なフォーマットを指す。分離は、典型的には、ある種の物理的プロセス、例えば、濾過、沈降、凝集、又は磁気分離を使用することができるようにある種の固体基材上に必須反応物質を固定化することを必要とし、典型的には、遊離している検出可能に標識された特異的結合パートナーを除去するための洗浄工程も必要とする。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物及び方法は、不均一なアッセイにおいて使用することが可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物及び方法は、不均一なイムノアッセイにおいて使用することが可能である。
【００５８】
式Ｉの化合物が十分に酸性である場合、「その塩」は塩基塩である。いくつかの実施形態では、化合物Ｉは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、アンモニウム、有機アミン塩、アミノ酸塩、又はホスホニウム塩から選択されるＭを含む。化合物Ｉの例としては、例えばＭがナトリウム、カリウム、又はリチウムから選択されるアルカリ金属塩、例えばＭがカルシウム又はマグネシウムであるアルカリ土類金属塩、例えばＭが亜鉛である遷移金属塩、例えばＭがアンモニウムイオンＮＨ４であるアンモニウム塩、又は例えばトリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ジベンジルアミンから選択される有機アミンから誘導される一級、二級、三級、若しくは四級アンモニウム塩、例えばグリシン若しくはリジン塩などのアミノ酸塩、又はホスホニウム塩が挙げられるがこれらに限定されない。ホスホニウム塩の例としては、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９３，４６９号に開示されているように、水溶性ポリビニルホスホニウム塩ポリマーを含む水溶性ポリマーホスホニウム塩が挙げられるがこれらに限定されない。また、アンモニウム塩の例としては、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，９７８，６１４号に開示されているように、ポリ（ビニル四級アンモニウム塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、化合物Ｉは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｚｎ、ＮＨ４、ＨＮＥｔ３、ＨＯ（ＣＨ２）２ＮＨ４、［ＨＯ（ＣＨ２）２］２ＮＨ２、［ＨＯ（ＣＨ２）２］３ＮＨ、モルホリニウム、Ｎ−メチルピペリジニウム、Ｎ−エチルピペリジニウム、ジベンジルアンモニウム、グリシン、又はリジンの塩から選択されるＭを含む。いくつかの実施形態では、化合物Ｉはを含み、各Ｍが、独立して、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、及びＬｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、各Ｍは独立してＨ及びＮａから選択される。
【００５９】
語句「所望により置換される」は、語句「置換又は非置換の」と互換的に使用される。特に指定しない限り、所望により置換される基は、その基の各置換可能な位置に置換基を有し得、各置換は互いに独立している。また、置換基又は変数の組み合わせは、このような組み合わせから安定な化合物が得られる場合のみ許容可能である。更に、特に指定しない限り、官能基ラジカルは、独立して選択される。「所望により置換される」が読点によって分離された一連の基を修飾する場合（例えば、「所望により置換されるＡ、Ｂ、又はＣ」又は「〜で所望により置換されるＡ、Ｂ、又はＣ」）、基（例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ）のそれぞれが所望により置換されることを意図する。
【００６０】
用語「ＰＭＰ」は、微小粒子を含むアッセイ支持体を指す。特定の実施形態では、微小粒子は、例えば、強磁性酸化鉄Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３などの常磁性又は超常磁性材料を含む。用語「常磁性」及び「超常磁性」は、磁場勾配において力を受けるが、永久に磁化される訳ではない材料を指す。特定の実施形態では、支持体は、磁赤鉄鉱又はＦｅ２Ｏ３の形態の鉄を含む。様々な実施形態では、微小粒子の平均直径は、１００ｎｍ〜２２，９００ｎｍの範囲である。特定の実施形態では、微小粒子の平均直径は、約７５０ｎｍ〜約３，０００ｎｍの範囲である。別の特定の実施形態では、微小粒子の平均直径は、約９５０ｎｍ〜約１，１５０ｎｍの範囲である。
【００６１】
用語「ＲＬＵ」は、ＡＰの存在下における化学発光シグナル（Ｓ）の観点の相対光単位を指す。いくつかの態様では、ＲＬＵは、ＡＰ、例えば、Ｓ−Ｂの非存在下におけるバックグラウンド化学発光（Ｂ）に対して補正され得る。
【００６２】
用語「ＴＡＴ」は、アルカリホスファターゼ基質がアルカリホスファターゼによって活性化され（と接触し）たときから、性能試験Ｂ又は自動ＡＰイムノアッセイにおいて発光シグナルのプラトーが生じたときまでのターンアラウンドタイムを指す。典型的には、本発明の基質製剤については、ＴＡＴ時間が、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０（登録商標）と比べて少なくとも２倍速い、好ましくは少なくとも５倍速い。あるいは、ＴＡＴ時間は、２分間未満、好ましくは１分間未満、より好ましくは３０秒間未満、最も好ましくは１０秒間未満である。ターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）の短縮は、患者の満足度を高め、患者の流れを増大させ、無駄な時間を減らし、患者の害を減らすことができるので望ましい。
【００６３】
用語「改善された安定性」は、４℃で１２ヶ月間保管し、安定性試験Ａによって試験したとき、標準的なＡＰＳ−５基質製剤よりも高い安定性を示すか又は約３５％未満のシグナル喪失を示すＡＰ基質製剤を指す。
【００６４】
用語「低下した熱感受性」は、本開示の基質製剤に関するとき、ＡＰＳ−５基質と比べたとき、０日目と比べて３０℃で１５日間保管した後に１日あたりの蛍光変化率％によって測定される化合物Ｉの喪失が減少することを意味する。いくつかの実施形態では、本開示の基質製剤は、実施例９の表２４に示すように、１日当たり０．２６５％の喪失を示すＡＰＳ−５と比べて、３０℃で１５日保管した後に１日あたり０．２５％未満の蛍光喪失、１日あたり０．２０％未満の蛍光喪失、又は好ましくは１日あたり０．１０％未満の蛍光喪失を示す。
【００６５】
本明細書に提供される基質製剤に関する用語「強化されたアッセイ特異性」は、同じＡＰアッセイにおいてＡＰＳ−５を用いて得られるものよりも、アルカリホスファターゼアッセイにおける特定の分析物について偽陽性が少ない又はフライヤーの数が少ないことを指す。
【００６６】
用語「強化されたアッセイ感度」は、本開示の基質製剤に関するとき、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べてＳ０／ブランク比が高いことを意味する。実施例６Ｋに示すように、基質試験製剤のＳ０／ブランク比は、同じアッセイにおけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＳ０／ブランク比よりも高かった。
【００６７】
用語「より高いシグナル対ノイズ」は、本開示の基質製剤に関するとき、同じアッセイにおけるＬＰ−５３０基質よりも、ＡＰアッセイにおけるキャリブレータのシグナル対ノイズ比が高いことを指す。一態様では、キャリブレータのシグナル対ノイズ比は、Ｓ／Ｓ０値として計算することができ、「Ｓ」は、分析物を含有するキャリブレータによる化学発光アッセイシグナルであり、「Ｓ０」は、分析物の非存在下においてキャリブレータと共に同じアッセイフォーマットを使用した化学発光アッセイシグナルである。実施例６Ｂ〜６Ｊ、表７〜１５のそれぞれに示すように、本開示の製剤は、ＬＰ−５３０基質よりも高いキャリブレータのシグナル対ノイズ比を示す。
【００６８】
化学的定義
用語「脂肪族」又は「脂肪族基」は、本明細書で使用するとき、完全に飽和しているか若しくは不飽和の１つ以上の単位を含有する直鎖又は分枝鎖のＣ１〜１２炭化水素鎖、又は完全に飽和しているか若しくは不飽和の１つ以上の単位を含有するが芳香族ではなく（本明細書では「炭素環」又は「シクロアルキル」とも称される）、分子の残部への結合点を１つ有し、二環式環系における任意の個々の環が３〜７個の員を有する単環式Ｃ３〜８炭化水素又は二環式Ｃ８〜１２炭化水素を意味する。例えば、好適な脂肪族基としては、（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキル、又は（シクロアルキル）アルケニルなどの直鎖又は分岐鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル基及びこれらのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
単独で使用されるか又はより大きな分子の一部として使用される用語「アルキル」、「アルコキシ」、「ヒドロキシアルキル」、「アルコキシアルキル」、及び「アルコキシカルボニル」は、特に指定しない限り、１〜２２個の炭素原子を含有する（Ｃ１〜２２）直鎖及び分枝鎖の両方を含む。単独で使用されるか又はより大きな分子の一部として使用される用語「アルケニル」及び「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有する直鎖及び分岐鎖の両方を含むものとする。
【００７０】
単独で使用されるか又は他の用語と組み合わせて使用される用語「アリール」は、合計５〜１４個の環員を有する単環式、二環式、又は三環式の炭素環式環系であって、当該系における少なくとも１つの環が芳香族であり、当該系における各環が３〜８個の環員を含有する環系を指す。用語「アリール」は、用語「アリール環」と互換的に使用され得る。用語「アラルキル」は、アリールによって置換されたアルキル基を指す。用語「アラルコキシ」は、アリールによって置換されたアルコキシ基を指す。いくつかの実施形態では、アリールは、フェニル又はナフチルであり、本明細書に示されるように所望により置換され得る。
【００７１】
用語「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」、及び「ハロアルコキシ」は、アルキル、アルケニル、又はアルコキシを意味し、場合によっては、１つ以上のハロゲン原子で置換され得る。
【００７２】
用語「ハロゲン」又は「ハロゲン化物」又は「ハロ」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを意味する。
【００７３】
用語「ヘテロ原子」は、窒素、酸素、又は硫黄を意味し、窒素及び硫黄の任意の酸化形態、並びに任意の塩基性窒素の四級化形態を含む。
【００７４】
用語「複素環式環系」は、本明細書で使用するとき、１つ以上の環員がヘテロ原子である５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個の環員を有する単環式、二環式、又は三環式の縮合環系であって、当該系における各環が３、４、５、６、７、又は８個の環員を含有する環系を意味する。いくつかの実施形態では、複素環式環系は、単独で使用されるか又は他の用語と組み合わせて使用される「ヘテロアリール」を含み、合計５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個の環員を有する単環式、二環式、又は三環式の環系であって、１）当該系における少なくとも１つの環が芳香族であり、２）当該系における少なくとも１つの環が１つ以上のヘテロ原子を含有し、かつ３）当該系における各環が３、４、５、６、又は７個の環員を含有する、環系を指す。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」又は用語「複素環式芳香族」と互換的に使用され得る。ヘテロアリール環の例としては、２−フラニル、３−フラニル、Ｎ−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、５−イミダゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−オキサジアゾリル、５−オキサジアゾリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ピリミジル、３−ピリダジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、５−テトラゾリル、２−トリアゾリル、５−トリアゾリル、２−チエニル、３−チエニル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、イソキノリニル、インダゾリル、イソインドリル、アクリジニル、ベンゾアクリジニル、及びベンゾイソキサゾリルが挙げられるがこれらに限定されない。用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールによって置換されたアルキル基を指す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」は、ヘテロアリールによって置換されたアルコキシ基を指す。
【００７５】
いくつかの態様では、「複素環式環系」は、Ｎ、Ｏ及びＳ原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む少なくとも１つの５又は６員環を含有する所望により置換される複素環式系を指す。いくつかの態様では、複素環式環系は、ヘテロ原子としてＮ原子を１つだけ含有する少なくとも１つの５又は６員複素環式環を含む。好ましい実施形態では、複素環式環系は、アクリダン環系を含む。一態様では、複素環式環系は、Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリダン環系又は置換Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリダン環系を含む。置換複素環式環系は、Ｃ１〜４アルキル、ハロ、Ｃ１〜４アルコキシ、又は１若しくは２個の縮合ベンゾ置換基から選択される１〜４個の置換基を含む。特定の態様では、複素環式環系は、Ｎ−メチルアクリダン環系を含む。
【００７６】
「アリール」（アラルキル、アラルコキシ、アリールオキシアルキルなど）又は「ヘテロアリール」（ヘテロアラルキル、ヘテロアリールアルコキシなど）基は、１つ以上の置換基を含有し得る。アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキル基の不飽和炭素原子における好適な置換基は、以下から選択される：ハロゲン；ハロアルキル；−−ＣＦ３；−−Ｒ；−−ＯＲ；−−ＳＲ；１，２−メチレンジオキシ；１，２−エチレンジオキシ；保護されたＯＨ（例えば、アシルオキシ）；フェニル（Ｐｈ）；Ｒで置換されたＰｈ；−−Ｏ（Ｐｈ）；Ｒで置換された−−Ｏ−（Ｐｈ）；−−ＣＨ２（Ｐｈ）；Ｒで置換された−−ＣＨ２（Ｐｈ）；−−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）；Ｒで置換された−−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）；−−ＮＯ２；−−ＣＮ；−−Ｎ（Ｒ）２；−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ；−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２；−−ＮＲＣＯ２Ｒ；−−ＮＲＮＲＣ（Ｏ）Ｒ；−−ＮＲ−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２；−−ＮＲＮＲＣＯ２Ｒ；−−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ；−−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ；−−ＣＯ２Ｒ；−−Ｃ（Ｏ）Ｒ；−−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２；−−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２；−−Ｓ（Ｏ）２Ｒ；−−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）２；−−Ｓ（Ｏ）Ｒ；−−ＮＲＳＯ２Ｎ（Ｒ）２；−−ＮＲＳＯ２Ｒ；−−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒ）２；−−Ｃ（＝ＮＨ）−−Ｎ（Ｒ）２；−−（ＣＨ２）ｙ  ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ；−−（ＣＨ２）ｙＲ；−−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ；−−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ；−−（ＣＨ２）ｙＮＨＳ（Ｏ）Ｒ；−−（ＣＨ２）ｙＮＨＳＯ２Ｒ；又は−−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（（Ｖ）ｚ−−Ｒ）（Ｒ）（式中、各Ｒは、独立して、水素、所望により置換される脂肪族（好ましくはＣ１〜６）、非置換ヘテロアリール、又は複素環式環（好ましくはＣ５〜６）、フェニル（Ｐｈ）、−−Ｏ（Ｐｈ）、又は−−ＣＨ２（Ｐｈ）−ＣＨ２（Ｐｈ）から選択され、ｙは０〜６であり；ｚは０〜１であり；Ｖはリンカー基である）。Ｒが脂肪族であるとき、それは、−−ＮＨ２、−−ＮＨ（Ｃ１〜４脂肪族）、−−Ｎ（Ｃ１〜４脂肪族）２、−−Ｓ（Ｏ）（Ｃ１〜４脂肪族）、−−ＳＯ２（Ｃ１〜４脂肪族）、ハロゲン、（Ｃ１〜４脂肪族）、−−ＯＨ、−−Ｏ−−（Ｃ１〜４脂肪族）、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＣＯ２Ｈ、−−ＣＯ２（Ｃ１〜４脂肪族）、−−Ｏ（ハロＣ１〜４脂肪族）、又は−ハロ（Ｃ１〜４脂肪族）から選択される１つ以上の置換基で置換され得；各Ｃ１〜４脂肪族は非置換である。
【００７７】
脂肪族基又は非芳香族複素環式環は、１つ以上の置換基を含有し得る。脂肪族基又は非芳香族複素環式環の飽和炭素における好適な置換基は、アリール又はヘテロアリール基の不飽和炭素について上に列挙したもの、並びに以下から選択される：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＨＲ、＝ＮＮ（Ｒ）２、＝Ｎ−−、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、＝ＮＮＨＣＯ２（アルキル）、＝ＮＮＨＳＯ２（アルキル）、又は＝ＮＲ（式中、各Ｒは、独立して、水素又は所望により置換される脂肪族（好ましくはＣ１〜６）から選択される）。Ｒが脂肪族であるとき、それは、−−ＮＨ２、−−ＮＨ（Ｃ１〜４脂肪族）、−−Ｎ（Ｃ１−４脂肪族）２、ハロゲン、−−ＯＨ、−−Ｏ−−（Ｃ１〜４脂肪族）、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＣＯ２Ｈ、−−ＣＯ２（Ｃ１〜４脂肪族）、−−Ｏ（ハロＣ１〜４脂肪族）、又は−ハロ（Ｃ１〜４脂肪族）から選択される１つ以上の置換基で置換され得；各Ｃ１〜４脂肪族は非置換である。
【００７８】
非芳香族複素環式環の窒素における置換基は、−−Ｒ、−−Ｎ（Ｒ）２、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ、−−ＳＯ２Ｒ、−−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）２、−−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−−Ｃ（＝ＮＨ）−−Ｎ（Ｒ）２、又は−−ＮＲＳＯ２Ｒから選択され；式中、各Ｒは、独立して、水素、所望により置換される脂肪族（好ましくはＣ１〜６）、所望により置換されるフェニル（Ｐｈ）、所望により置換される−−Ｏ（Ｐｈ）、所望により置換される−−ＣＨ２（Ｐｈ）、所望により置換される−−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）、又は非置換のヘテロアリール若しくは複素環式環（好ましくは５〜６員）から選択される。ＲがＣ１〜６脂肪族基又はフェニル環であるとき、それは、−−ＮＨ２、−−ＮＨ（Ｃ１〜４脂肪族）、−−Ｎ（Ｃ１〜４脂肪族）２、ハロゲン、（Ｃ１〜４脂肪族）、−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ１〜４脂肪族）、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−−ＣＯ２（Ｃ１〜４脂肪族）、Ｏ（ハロＣ１〜４脂肪族）、又は−ハロ（Ｃ１〜４脂肪族）から選択される１つ以上の置換基で置換され得；各Ｃ１〜４脂肪族は非置換である。
【００７９】
用語「２２１−アミン」は、２−アミノ−２−メチルプロパン−１−オール（２−アミノ−２−メチルプロパノール）、又はその塩若しくは水和物を指す。
【００８０】
用語「ＡＭＰＤ」は、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、又はその塩若しくは水和物を指す。
【００８１】
用語「ＡＭＰＳＯ」は、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、又はその塩若しくは水和物を指す。
【００８２】
用語「ＣＨＥＳ」は、２−（Ｎ−シクロへキシルアミノ）エタンスルホン酸（Ｎ−シクロヘキシルタウリン）、又はその塩若しくは水和物を指す。
【００８３】
用語「ＢＨＴ」は、ジブチルヒドロキシトルエン（２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）を指す。
【００８４】
用語「ＢＨＡ」は、ブチル化ヒドロキシアニソール、一般的には２−及び３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノールの混合物を指す。
【００８５】
用語「ＢＲＩＪ（商標）７８」は、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテルを指す。
【００８６】
用語「ＢＲＩＪ（商標）７００」は、ポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテルを指す。
【００８７】
用語「ＤＥＡ」は、ジエタノールアミン；２，２’−ジヒドロキシジエチルアミン、又はその塩若しくは水和物を指す。
【００８８】
用語「ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−９９０」は、ポリオキシエチレン（１００）ノニルフェニルエーテル、分枝鎖を指す。
【００８９】
用語「ＩＧＥＰＡＬ（商標）ＤＭ−９７０」は、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテルを指す。
【００９０】
用語「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール又はポリ（エチレングリコール）を指す。「ＰＥＧ」の後の数は、平均分子量を指し、Ｍｗは、重量平均分子量を指し、Ｍｎは、数平均分子量を指す。
【００９１】
用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８」は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを指す。
【００９２】
用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１０８」は、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロックポリ（エチレングリコール）、平均Ｍｎ約１４，６００を指す。
【００９３】
用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｐ１０３」は、平均Ｍｗ４９５０のエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーを指す。
【００９４】
用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｐ１０４」は、平均Ｍｗ５９００のエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーを指す。
【００９５】
用語「ＳＴＳ」は、トリデシル硫酸ナトリウム（Ｃ１３Ｈ２７ＯＳＯ３Ｎａ）を指す。
【００９６】
用語「ＴＡＰＳ」は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］プロパン−１−スルホン酸）、又はその塩若しくは水和物を指す。
【００９７】
用語「４−ＴＢＡ」は、４−トリルボロン酸、又はその塩若しくは水和物を指す。
【００９８】
用語「ＴＲＩＳ」又は「トリス」は、トロメタミン（別名トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、又はその塩若しくは水和物を指す。
【００９９】
用語「ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−４０５」は、オクチルフェノールエトキシレートを指す。
【０１００】
用語「還元型ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−４０５」は、ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルシクロへキシルエーテルを指す。
【０１０１】
用語ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０は、ポリソルベート２０としても知られているモノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンを指す。
【０１０２】
アルカリホスファターゼ化学発光基質製剤
本発明の基質製剤は、式Ｉの化学発光化合物、カチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）、エーテル系非イオン界面活性剤又は親水性ポリマー、及びバックグラウンド低減剤を含む。基質製剤は、所望により、アニオン性界面活性剤、バッファ、及び増強剤化合物を含有する。
【０１０３】
本発明の基質製剤は、性能試験Ｂのアッセイ条件を使用して測定されるＬｕｍｉｇｅｎ  ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０（登録商標）よりも速いＴＡＴ時間を示すアルカリホスファターゼと接触して置いたとき、迅速に発光シグナルを生じさせることができる。ＴＡＴ時間は、アルカリホスファターゼ基質がアルカリホスファターゼによって活性化され（と接触し）たときから、性能試験Ｂを使用してシグナルのプラトーが生じたときまで測定される。典型的には、高速基質のＴＡＴは、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０（登録商標）と比べて少なくとも２倍速く、好ましくは３倍、４倍、又は５倍速い。あるいは、上記のこの時間は、２分間未満、好ましくは１分間未満、より好ましくは３０秒間未満、最も好ましくは１０秒間未満である。
【０１０４】
本明細書に提供される基質製剤は、先行技術の市販のアルカリホスファターゼ基質製剤と比べて、アルカリホスファターゼの存在下で迅速に化学発光シグナルを生じさせ、改善された安定性を示すことが示されている。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼアッセイで使用するための１分間未満のシグナル生成時間を示す安定な基質製剤が提供される。いくつかの実施形態では、暗所において４℃で密閉保管したとき、アルカリホスファターゼアッセイで使用するために１２ヶ月間にわたって＜１５％、＜１０％、＜５％、又は≦３％のシグナル変化を示す安定な基質製剤が提供される。
【０１０５】
化学発光化合物
本製剤において有用な化学発光化合物は、アルカリホスファターゼと接触したとき、化学発光を生じさせることができる。このような化合物は、それぞれが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，０４５，７２７号、同第６，０９０，５７１号、同第６，１３９，７８２号、同第６，２１８，１３７号、同第６，２７０，６９５号、及び同第６，２９６，７８７号に記載のとおり合成することができる。
【０１０６】
本基質製剤では、化学発光化合物又はその塩は、式（Ｉ）を有する：
【０１０７】
【化１０】
2019530429.tif 000012
（式中、Ａは、Ｃ１〜６ハロアルキル、ナフチル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロアリールであり、置換フェニルは、１〜３個のハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＣＮ、又はＮＯ２置換基を含み；Ｒ１は、Ｃ５〜１４アリール、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、及びＣ５〜１４アラルキル基からなる群から選択され；Ｒ７〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ、若しくはＣ１〜４アルキルであるか、又はＲ７−Ｒ８若しくはＲ８−Ｒ９若しくはＲ９−Ｒ１０  Ｒ１１−Ｒ１２若しくはＲ１２−Ｒ１３若しくはＲ１３−Ｒ１４は、少なくとも１つの５又は６員環を含む炭素環式又は複素環式環系として互いに結合し得；Ｒ１５は、Ｃ１〜６アルキルであり；各Ｍは、独立して、Ｈ、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、アンモニウム、有機アミン、又はアミノ酸から選択され；Ｚは、Ｏ又はＳであり；ｎは、０、１、又は２である）。いくつかの実施形態では、各Ｍは、独立して、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫから選択される。
【０１０８】
化合物Ｉの特定の実施形態では、Ｒ１はメチルであり、ＺはＯ又はＳであり、Ａはフェニル、ナフチル、置換フェニル、置換ナフチルであり、当該置換基は、１〜３個のハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシから選択され；Ｒ７〜Ｒ１４は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルコキシ、ハロであり、各ＭはＮａであり、ｎは２である。
【０１０９】
化合物Ｉは、化学発光シグナルを生じさせるのに有効な濃度、好ましくは基質製剤中０．０１〜５０ｍＭ、より好ましくは０．０５〜１０ｍＭ、最も好ましくは０．１〜５ｍＭで使用される。
【０１１０】
特定の実施形態では、化合物Ｉは、以下から選択される：
【０１１１】
【化１１】
2019530429.tif 000013
【０１１２】
【化１２】
2019530429.tif 000014
【０１１３】
式Ｉの化合物の調製は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，０９０，５７１号の実施例１〜１３に記載されている。
【０１１４】
好ましい実施形態では、化合物ＩはＣＰＡであり、これは、下記スキーム１に示すように、アルカリホスファターゼに曝露されたときに蛍光剤を形成する。
【０１１５】
【化１３】
2019530429.tif 000015
【０１１６】
Ｎ−メチルアクリドンからの蛍光の増加の測定は、機能的ＲＬＵ試験に加えて、本発明の基質製剤の安定性試験のための有用なツールとして確立されている。
【０１１７】
本発明の化学発光化合物は、典型的には、１００〜２００ｎｍの広い発光帯にわたって光を発生させ、これは、電磁スペクトルの近紫外から可視の領域の波長で最大強度を示す。最大強度ラムダｍａｘの典型的な波長は、３５０〜５００ｎｍの範囲内である。リン酸ビニル部分の二重結合と共役していない共有結合されたフルオロフォアを有する式Ｉのリン酸化合物は、励起された生成物ＶＩ＊が形成されたとき、励起状態のフルオロフォアからより長い波長において発光させる分子内エネルギー移動を経験し得ると想到される。
【０１１８】
ホスファターゼ酵素の作用によって光を生じさせる方法において、１超の化学発光化合物Ｉを併用してもよい。いくつかの例では、２つ以上の式Ｉの化合物をホスファターゼ酵素と同時に反応させることが有益であり得る。２つ以上の化合物が異なる発光特性又は物性を有するとき、任意の１つの化合物の使用を通じて容易に達成することができない特徴を有する発光反応を生じさせるために２つの組み合わせが望ましい場合がある。化合物Ｉ間で異なり得る発光特性又は物性の例としては、発光スペクトル、発光の持続時間、酵素のターンオーバー、最大までの発光の上昇率、疎水性／親水性、及び溶解性が挙げられる。本方法では式Ｉの化合物によって具体的な発光特性が異なり得るが、特性のばらつきは化合物の基本的有用性を損なわせるものではなく、本明細書に記載される教示及び方法によって所望の特性を有する具体的な化合物を選択することができる。
【０１１９】
カチオン性芳香族化合物
上記反応系にカチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）を添加することにより、発生する光の量及び／又は強度を大きく増大させることができる。更に、ホスファターゼ酵素の非存在下で式Ｉの化合物にＣＡＣを添加しても、対応して自発的（バックグラウンド）化学発光が増加することはないが、その理由は、ＣＡＣが化合物Ｉから誘導される脱リン酸化された中間体に対してはその効果を発揮するが、化合物Ｉ自体には効果を発揮しないためである。ホスファターゼ酵素の検出の感度の大きな増大は、シグナル／バックグラウンドの増大によって生じる。発光は励起状態のＶＩから生じ続け、ＣＡＣからは生じないことが重要である。
【０１２０】
様々なＣＡＣが、生成される光の量及び／又は強度を増大させる機能を有することが判明している。ＣＡＣは、置換基が不飽和環原子と共役している限り、芳香環若しくは環系に少なくとも１つの正電荷を有するか、又は環のうちの１つにおける置換基に存在する芳香族化合物である。
【０１２１】
本発明のＣＡＣは、本発明の反応において化学発光の増大を引き起こすのに好適な酸化／還元電位を有する化合物である。ＣＡＣとしての化合物の好適性は、以下の具体例に記載される方法を用いて容易に決定することができる。任意の特定の機械論的解釈によって束縛されるものではないが、Ｉの脱リン酸化の中間生成物は、可逆的又は不可逆的であり得るレドックス反応を受けると考えられる。分子酸素は、ＣＡＣ、ＣＡＣの還元形態、あるいは化合物Ｉの脱リン酸化された中間体又はその酸化若しくは還元形態から選択される反応における反応種のうちの１つ以上と反応して、最終的に、化合物Ｉから誘導される酸素化反応生成物を形成する。酸素化反応生成物は化学発光反応を受けるが、これはＯ−−Ｏ結合破壊反応である可能性が高い。
【０１２２】
本発明のＣＡＣは、正電荷がヘテロ原子のうちの１つ以上に実質的に局在する炭素以外の少なくとも１つの原子（ヘテロ原子）、好ましくは１つ以上の窒素原子を含有する１つ以上の単離又は縮合芳香環を含む芳香族複素環化合物であってよい。この分類のＣＡＣの例は、シアニン色素、チアシアニン色素、カルボシアニン色素、チアカルボシアニン色素、セレナカルボシアニン色素、アゾ色素、及び式ＩＩのアクリジニウム誘導体である：
【０１２３】
【化１４】
2019530429.tif 000016
（式中、Ｑは、電子求引性基であり、Ｚ−は、非干渉アニオン性対イオンであり、Ｒは、アルキル又はアラルキル基であり、これらはそれぞれ所望により非干渉置換基を含有し得、Ｙは任意の置換基である）。環水素の一部が他の置換基によって置換されたアクリジニウム誘導体も、機能性ＣＡＣの範囲内である。電子求引性基Ｑは、ハロゲン、シアノ、カルボニル基、例えば、エステル基−ＣＯＯＲ’、チオエステル基−ＣＯＳＲ’、アミド基−−ＣＯＮＲ１Ｒ２、スルホンイミド基−−ＣＯＮ（Ｒ）ＳＯ２Ｒ’、又はアリール、Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリジニル、又は置換Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリジニル置換基から選択され得る。Ｙは、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜４アルキルから選択される。いくつかの実施形態では、アリール置換基は、フェニル、ナフチル、又はアントリルから選択される。同様に、ＣＡＣは、フェナントリジニウム又はフェナントロリニウム化合物の誘導体であってもよく、式中、Ｒ’、Ｒ”は、独立して、Ｃ１〜６アルキル、アリール、アルキル置換アリールから選択される。Ｒ１、Ｒ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、及びアルキルアリールから選択される。いくつかの態様では、Ｚ−は、ハロゲン化物又は硝酸である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＣは、式ＩＩの化合物である（式中、Ｑは、Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリジニウム、ハロ置換Ｎ−Ｃ１〜４アルキルアクリジニル、ナフチル、アントリルであり；Ｒは、Ｃ１〜４アルキルであり；Ｚ−は、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−からなる群から選択され、Ｙは、Ｈ又はハロである）。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＣは、式ＩＩの化合物である（式中、Ｑは、Ｎ−メチルアクリジニル、ナフチル、又はアントリルであり；Ｒは、Ｃ１〜４アルキルであり；Ｙは、Ｈ又はＣｌであり、Ｚ−は、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−からなる群から選択される）。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＣは、式ＩＩの化合物である（式中、Ｑは、Ｎ−メチルアクリジニルであり；Ｒは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、又はｔ−ブチルであり；Ｙは、Ｈ又はＣｌであり、Ｚ−は、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−からなる群から選択される）。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＣは、式ＩＩの化合物である（式中、Ｑは、Ｎ−メチルアクリジニルであり；Ｒはメチルであり；ＹはＨであり；Ｚ−はＮＯ３−である）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＣは、カチオン性部位が芳香環と共役している限り、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する少なくとも１つのカチオン性置換基を有する１つ以上の単離又は縮合炭素環式芳香環を含む芳香環化合物であり得る。後者の分類のＣＡＣでは、ヘテロ原子が窒素又は硫黄原子であることが好ましい。例としては、メチレンブルー（３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−５−イウムクロリド）及びナイルブルー（５−アミノ−９−（ジエチルアミノ）ベンゾ（ａ）フェノキサジン−７−イウムクロリド）が挙げられる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＣは、１超の正電荷を有し得る。例えば、ジカチオン性化合物は本発明の範囲内である。この種の例示的な化合物としては、一般的にルシゲニン（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビアクリジニウムジニトレート）として知られているＮ，Ｎ’−ジメチルビアクリジニウムジニトレート、及び一般的にメチルビオロゲンジクロリド又はパラコートジクロリドとして知られている１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジニウムジクロリドが挙げられる。
【０１３０】
本発明のＣＡＣ成分として有用な更なる化合物としては、一例であるが、アシッドイエロー、ベーシックブルー４１、ベーシックブルー６６、ベーシックレッド２９、３−ベンジル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムクロリド、［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］１，３，３−トリメチルインドリウムパークロレート、｛ＩＲ−７８６パークロレート｝、ｔｒａｎｓ−４−［４−（ジブチルアミノ）スチリル］−１−メチルピリジニウムヨージド、５，５’−ジクロロ−１１−ジフェニルアミノ−３，３’−ジエチル−１０，１２−エチレンチアトリカルボシアニンパークロレート、｛ＩＲ−１４０｝、３，３’−ジエチル−９−メチルチアカルボシアニンヨージド、１，１’−ジエチル−２，２’キノトリカルボシアニンヨージド、３，３’−ジエチルセレナカルボシアニンヨージド、３，３’−ジエチルチアシアニンヨージド、３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージド、２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−エチルベンゾチアゾリウムヨージド、３，６−ジメチル−２−（４−ジメチルアミノフェニル）−ベンゾチアゾリウムブロミド、３，４−ジメチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウムヨージド、４−［２−［３−［（２，６−ジフェニル−４Ｈ−チオピラン−４−イリデン）エチリデン］−２−フェニル−１−シクロ−ヘキセン−１−イル］エテニル］−２，６−ジフェニル−チオピリリウムテトラフルオロボレート｛ＩＲ−１０４０｝、５−［３−エトキシ−４−（３−エチル−５−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリル−イデン）−２−ブテニリデン］−３−エチル−２−［（３−エチル−４，５−ジフェニル−２（３Ｈ）−チアゾリリデン）メチル］−４，５−ジヒドロ−４−オキソチアゾリウムヨージド、３−エチル−２−（２−ヒドロキシ−１−プロペニル）ベンゾチアゾリウムクロリド、３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウムヨージド、３−エチル−２−メチルベンズオキサゾリウムヨージド、１−エチル−３−メチル−１Ｈ−イミダゾリウムクロリド、メチレンブルー、ナイルブルーＡ、及びトリホスホピリジンヌクレオチド，ナトリウム塩水和物が挙げられる。
【０１３１】
ＣＡＣは、基質製剤中で０．０１〜２００μＭ、好ましくは、０．０５〜５０μＭ、より好ましくは０．１〜２５μＭの濃度で使用され得る。
【０１３２】
好ましい実施形態では、ＣＡＣは、１つのカチオン性電荷又は２つのカチオン性電荷を有するアクリジニウム化合物である。一実施形態では、ＣＡＣは、以下から選択される：
【０１３３】
【化１５】
2019530429.tif 000017
【０１３４】
一態様では、ＣＡＣは、一般的にルシゲニンとして知られているＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビアクリジニウムジニトレート）である。
【０１３５】
バックグラウンド低減剤
基質製剤の課題の１つは、低いバックグラウンド化学発光を有することである。先行技術のＡＰＳ−５ベースの製剤におけるバックグラウンド化学発光は、一般的に、経時的にバックグラウンドを上昇させ得る溶液中の酸化種の存在によって引き起こされると考えられる。
【０１３６】
バックグラウンド低減剤（ＢＲＡ）は、ホスファターゼ酵素の非存在下で組成物によって生成される化学発光を低減する化合物である。これら剤は、長期間にわたってバックグラウンド化学発光の蓄積を防止することによっても機能することができる。また、これら剤は、組成物とホスファターゼ酵素との反応によって生成される特異的シグナルのバックグラウンド化学発光に対する比を改善することによっても機能することができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、バックグラウンド低減剤は、亜硫酸塩（例えば、亜硫酸、重亜硫酸、及びメタ重亜硫酸のナトリウム、カリウム又はリチウム塩）、有機抗酸化剤ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ；２，６−ビス（１，１０−ジメチルエチル）−４−メチルフェノール）、ブチル化ヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）、３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシルアニソール、又は３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシルアニソールである。いくつかの特定の実施形態では、バックグラウンド低減剤としては、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む、亜硫酸、重亜硫酸、及びメタ重亜硫酸の塩が挙げられる。いくつかの態様では、バックグラウンド低減剤は、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ；２，６−ビス（１，１０−ジメチルエチル）−４−メチルフェノール）、ブチル化ヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）、３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシルアニソール、又は３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシルアニソールである。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、バックグラウンド低減剤は、Ａｒ−Ｂ（ＯＨ）２（式中、Ａｒは、フェニル、置換フェニル、ヘテロ原子を含み得る縮合芳香環系、ヘテロ原子を含み得る置換縮合芳香環系であり、置換アリール基は、独立してＣ１〜６アルキル、ハロ、アルコキシカルボニル、又はヒドロキシル基から選択される１〜３個の置換基を有し得る）の芳香族ボロン酸であってよい。芳香族ボロン酸の例としては、フェニルボロン酸、４−トリルボロン酸、４−クロロボロン酸、４−ヨードボロン酸、及び３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸が挙げられる。
【０１３９】
いくつかの態様では、バックグラウンド低減剤は、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）、４−トリルボロン酸（４−ＴＢＡ）、４−クロロフェニルボロン酸（４−ＣＰＢＡ）、４−ヨードフェニルボロン酸（４−ＩＰＢＡ）、又は３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸（３−ＭＣＰＢＡ）である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、化合物Ｉの製剤中に１つ以上のバックグラウンド低減剤が存在する。
【０１４１】
バックグラウンド低減剤は、１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１０〜１０００μＭの濃度で使用され得る。いくつかの実施形態では、バックグラウンド低減剤は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、又は５〜１５ｍｇ／Ｌから選択される濃度で製剤中に存在する。
【０１４２】
本発明の基質製剤での使用に加えて、亜硫酸ナトリウムに代えて又は加えて、アリールボロン酸がＡＰＳ−５ベースの製剤（６，０４５，７２７、６，０９０，５７１、６，１３９，７８２、６，２１８，１３７、６，２７０，６９５、及び６，２９６，７８７に記載されているものなど）のバックグラウンド化学発光を著しく低減することも判明した。いくつかの実施形態では、ＢＲＡは、フェニルボロン酸、４−トリルボロン酸、４−クロロボロン酸、４−ヨードボロン酸、及び３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸から選択される。様々な程度に、シグナル化学発光は、より低いがそれほど著しくはないレベルであることが認められた。これは、低濃度のボロン酸で特に当てはまる。ボロン酸を使用することの１つの考えられる利点は、還元剤としてのみ機能し、酸化剤である潜在的リスクがないという事実にある。また、有機ボロン酸を添加すると、実施例に示すように、製剤の安定性が著しく改善されることも認められた。亜硫酸、重亜硫酸、及びメタ重亜硫酸の塩と組み合わせて使用されるとき、芳香族ボロン酸は、改善されたＳ／Ｎ比及び安定性を含む更なる効果をもたらす。
【０１４３】
非イオン性界面活性剤
いくつかの実施形態では、化合物Ｉ、カチオン性芳香族化合物、及びエーテル結合した非イオン性界面活性剤、又は親水性ポリマーを含む改善された基質製剤が提供される。
【０１４４】
非イオン性界面活性剤を含む基質製剤は、ピーク光強度に迅速に到達し、これを維持する増大した発光を提供する。
【０１４５】
一実施形態では、エーテル結合した非イオン性界面活性剤を含む基質製剤は、当該基質製剤の安定性を著しく改善した。いくつかの態様では、本明細書に提供される基質製剤は、エステル結合した非イオン性界面活性剤を含有しない。一態様では、本明細書に提供される基質製剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有しない。
【０１４６】
別の実施形態では、親水性ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む基質製剤は、市販の標準的な基質組成物と比べて改善された安定性及び他の性能効果を示した。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の代わりに、エーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマーを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、エーテル結合した非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、エーテル結合した非イオン性界面活性剤は、Ｉｇｅｐａｌ、ＴＲＩＴＯＮ、又はＢＲＩＪ界面活性剤から選択される。いくつかの実施形態では、基質製剤は、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−９９０、Ｉｇｅｐａｌ  ＤＭ−９７０、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、還元型ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、ＢＲＩＪ  ７８、及びＢＲＩＪ  ７００から選択される１つ以上のエーテル結合した非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−９９０、Ｉｇｅｐａｌ  ＤＭ−９７０、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、還元型ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、ＢＲＩＪ  ７８、及びＢＲＩＪ  ７００から選択されるエーテル結合した非イオン性界面活性剤の基質製剤製剤が提供される。いくつかの実施形態では、基質製剤は、ＩＧＥＰＡＬ、ＴＲＩＴＯＮ、及びＢＲＩＪ型のエーテル結合した非イオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含み、当該製剤は、エステル結合した非イオン性界面活性剤を含有しない。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、従来の界面活性剤構造に典型的な疎水性部分を有しない、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、これらの組み合わせ、又はこれらの誘導体から選択される親水性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、基質製剤は、１，０００〜５１１，０００の範囲内で選択される平均Ｍｗを有する有するポリ（エチレングリコール）である親水性ポリマーを含む。２．５ｇ／Ｌのポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１４，０００）を含有する基質製剤は、参照物質に対して９４％のシグナルを示し、４℃で１３ヶ月間後のシグナル変化が非常に少なかった。分子量３５，０００及び１００，０００のポリ（エチレングリコール）を１．０ｇ／Ｌ含有する類似の組成物は、類似の挙動を示した。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、式（ＩＶ）に係る親水性ポリマーを含む：
【０１５１】
【化１６】
2019530429.tif 000018
（式中、Ｘ１及びＸ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ、若しくはＮＨから選択されるか、又は存在せず、Ｙ１及びＹ２は、Ｈ、Ｈ２、又は合計炭素数＜４の小さなアルキル基であり、ｎは、２０〜１２，０００若しくは１２０〜５，０００若しくは２５０〜２，５００の数であるか、又はｎは＞２０の数である）。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、１，０００〜５１１，０００、６，０００〜２１８，０００、又は１２，０００〜１０８，０００の範囲内から選択される平均分子量Ｍｗのポリ（エチレングリコール）である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１４，０００）、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝３５，０００）、及びポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１００，０００）からなる群から選択される親水性ポリマーを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、基質製剤は、親水性ポリマーを含み、当該製剤は、エステル結合した非イオン性界面活性剤を含有しない。いくつかの実施形態では、基質製剤は、親水性ポリマーを含み、当該製剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有しない。
【０１５４】
好ましい非イオン性界面活性剤及びポリ（エチレングリコール）親水性ポリマーを含有する組成物は、強い化学発光シグナルを生成し、また、保管中に長期にわたって所望の安定性を示す。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ポロキサマー及び／又はポリソルベート界面活性剤を含有しない基質製剤が提供される。いくつかの実施形態では、ポロキサマー及び／又はポリソルベート界面活性剤を含有する基質製剤が提供される。特定の態様では、ポリソルベートを含有しない基質製剤が提供される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤及び親水性ポリマーの濃度は、本組成物において、０．０５〜２０ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．２〜５ｇ／Ｌの濃度で使用される。
【０１５７】
アニオン性界面活性剤
本発明の基質製剤は、所望により、アニオン性界面活性剤を含有し得る。アニオン性界面活性剤は、最高化学発光強度に達する速度を実質的に増大させる機能を有する。本製剤において有用なアニオン性界面活性剤は、少なくとも１０個の炭素のアルキル基を有するアルキルサルフェート及びアルキルスルホネートを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、アニオン性界面活性剤は、少なくとも１０個の炭素原子を含有するアルキルサルフェート及び少なくとも１０個の炭素原子を含有するアルキルスルホネートから選択される。いくつかの実施形態では、アニオン性界面活性剤は、１０〜２２個の炭素原子を含有するアルキルサルフェート及び１０〜２２個の炭素原子を含有するアルキルスルホネートから選択される。いくつかの実施形態では、アニオン性界面活性剤はＣ１２〜Ｃ１４アルキルサルフェートから選択される。特定の実施形態では、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及びトリデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）のうちの１つ以上がアニオン性界面活性剤として使用される。ＳＤＳ及びＳＴＳが、この目的のために好ましい２つの化合物である。好適な態様では、アニオン界面活性剤はＳＴＳである。
【０１５９】
アニオン性界面活性剤は、好ましくは、０．０１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜３ｇ／Ｌの量で基質製剤において使用される。
【０１６０】
バッファ
本発明の基質製剤は、典型的には、水性である。アルカリホスファターゼ酵素は、通常、非リン酸塩基性バッファを必要とする。本発明において好ましいバッファは、ｐＨ７〜１２、８〜１１、又は９〜１０のｐＨ値を有するアミンベースのバッファである。一態様では、バッファは、ｐＨ８．０超のアミンバッファである。いくつかの実施形態では、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）アミンバッファを含む基質製剤は、市販の標準品と比べて基質製剤における安定性を著しく改善する。
【０１６１】
本発明の基質製剤の性能は、バッファ系の影響を受け得る。ｐＨ及びモル濃度の変化は、シグナル、バックグラウンド、及び安定性に直接影響を与えることが判明している。化学的に類似しているバッファを用いた場合であっても、最適なｐＨ及びモル濃度はバッファ系によって異なる。広範囲にわたって適合する（性能を有する）バッファは、特に安定性について、最適化のための最大の機会を可能にする。
【０１６２】
最適化されたＴＲＩＳ及びＡＭＰＤ系は、多くのアッセイにおいて現行の市販の標準品と比べて改善された結果が得られ、２〜８℃及び３０℃の両方において基質製剤の安定性を改善することが判明した。
【０１６３】
一実施形態では、基質製剤は、ＴＲＩＳ、ＡＭＰＤ、ＤＥＡ、ＡＭＰＳＯ、２２１−アミン、ＣＨＥＳ、グリシン、若しくはＴＡＰＳ、又はこれらのうちの２つ以上のアミンバッファの組み合わせから選択されるアミンバッファを含む。
【０１６４】
別の実施形態では、基質製剤は、ＡＭＰＤ、ＤＥＡ、ＡＭＰＳＯ、２２１−アミン、ＣＨＥＳ、若しくはＴＡＰＳ、又はこれらのうちの２つ以上のアミンバッファの組み合わせから選択されるアミンバッファを含む。
【０１６５】
一態様では、基質製剤は、アミンバッファを含み、当該製剤は、ＴＲＩＳを含有しない。
【０１６６】
アミンバッファを含有する実施形態では、アミンバッファのモル濃度は、０．０２５Ｍ〜０．６５Ｍ、０．０５Ｍ〜０．５Ｍ、又は０．１〜０．３Ｍである。一態様では、アミンバッファのモル濃度は、０．１Ｍ及び０．２Ｍから選択される。
【０１６７】
増強剤化合物
所望により、発せられる光の量を増加させるために、本発明の基質製剤において少なくとも１つの増強剤化合物を使用することもできる。本方法において有効な増強剤は、光を発する励起状態の生成分子の割合を増加させることによって、励起状態で形成される生成分子の割合を増加させることによって、酵素の反応速度若しくはターンオーバーを増大させることによって、後続の化学反応工程の速度を増大させることによって、酵素の安定性を改善することによって、酵素と化合物Ｉとの会合を促進することによって、競合する非発光副反応を阻害若しくは防止することによって、又はこれら機序の任意の組み合わせによって機能し得る。増強剤は、化学発光を増強するのに有効な量、好ましくは最終反応溶液中０．００１〜５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０１〜２．５ｍｇ／ｍＬで使用される。
【０１６８】
本方法の実施において有効な増強剤化合物は、典型的には、界面活性剤化合物、すなわち、表面活性特性、例えば、表面張力の低下、表面の湿潤、又は洗浄力を示す化合物である。界面活性剤は、極性及び／若しくはイオン性基を含有する親水性領域、炭化水素基若しくはアルキレンオキシ基を主に含有する疎水性領域、又は両方を含む。界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、非イオン性、及び双極性として分類され、単量体であっても重合体であってもよい。本発明の実施において有用であることが判明しているカチオン性界面活性剤増強剤は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９３，４６９号に開示されているペンダント四級ホスホニウム基を有するポリビニル型ポリマーを含む。この種の例示的なポリマーとしては、ポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロリド及び（ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド）を含むポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドコポリマーが挙げられる。ペンダント四級アンモニウム基を有するポリビニル型ポリマーも、本発明において増強剤として有用である。このようなポリマーの例は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，１１２，９６０号に開示されており、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド及びポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリドを含む。
【０１６９】
塩
一実施形態では、アルカリホスファターゼとの化学発光反応のための基質製剤は、マグネシウム又は亜鉛の塩を更に含み得る。いくつかの態様では、塩は、酵素の活性を増大させるために、０．０１〜５０ｍＭ、０．０１〜１０ｍＭ、又は０．１〜１．０ｍＭの濃度で製剤中に存在する。いくつかの態様では、マグネシウム塩は、ＭｇＣｌ２又は酢酸マグネシウムである。いくつかの態様では、亜鉛塩は、ＺｎＣｌ２である。いくつかの態様では、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムが製剤中に存在する。いくつかの態様では、基質製剤は、１０μＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．８８ｍＭ、又は１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、基質製剤は、０．０１〜１０ｍＭ、０．０５〜０．５ｍＭ、又は０．１ｍＭのＺｎＣｌ２を含む。
【０１７０】
好ましい基質製剤
一態様では、アルカリホスファターゼアッセイで使用するための基質製剤であって、化合物Ｉ、カチオン性芳香族化合物、バックグラウンド低減剤、エーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、アニオン性界面活性剤、及びｐＨ７〜１２、８〜１１、又は８．５〜１０のアミンバッファを含む製剤が提供される。
【０１７１】
一態様では、基質製剤のＩｍａｘは、ホスファターゼ酵素に曝露した後＜５分間、＜４分間、＜２分間、＜１分間、＜４５秒間、＜３０秒間、＜２０秒間、＜１０秒間、＜５秒間、＜４秒間、＜３秒間、又は＜２秒間に生じる。別の態様では、基質製剤は、４℃の保管条件下で安定であり、４℃で３００日間保管した後、元のＲＬＵの＜１０％の喪失を示す。
【０１７２】
いくつかの態様では、本開示の基質製剤は、４℃で３００日間保管したとき、元のＲＬＵと比べて＞９０％又は＞９５％保持された活性を示す。
【０１７３】
いくつかの態様では、本開示の基質製剤は、４℃で４００日間以上保管したとき、＞９０％保持された活性を示す。
【０１７４】
別の態様では、本開示の基質製剤は、アルカリホスファターゼ酵素に曝露した後、３０℃で保管したとき１５日間後に＜−０．６０％／日、＜−０．５０％／日、＜−０．４０％／日、又は＜−０．３０％／日の１日あたりの化学発光シグナルの強度変化率（％）を示す。
【０１７５】
別の態様では、本開示の基質製剤は、アルカリホスファターゼ酵素に曝露した後、４℃で保管したとき１２ヶ月後に≦−１．０％／月、≦−０．９％／月、又は≦−０．８０％／月の１ヶ月あたりの化学発光シグナルの強度変化率（％）を示す。
【０１７６】
一態様では、基質製剤は、０．０１ｍＭ〜５０ｍＭの化合物Ｉ、０．０１〜２００μＭのカチオン性芳香族化合物、１μＭ〜１０ｍＭのバックグラウンド低減剤、０．０５〜２０ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、０．０１〜１０ｇ／Ｌのアニオン性界面活性剤、及び０．０２５Ｍ〜０．６５ＭのｐＨ７〜１２のアミンバッファを含む。
【０１７７】
一態様では、基質製剤は、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭの化合物Ｉ、０．０５〜５０μＭのカチオン性芳香族化合物、１０μＭ〜１０００ｍＭのバックグラウンド低減剤、０．１〜１０ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、０．１〜５ｇ／Ｌのアニオン性界面活性剤、及び０．０５Ｍ〜０．５ＭのｐＨ８〜１１のアミンバッファを含む。
【０１７８】
一態様では、基質製剤は、０．１ｍＭ〜５ｍＭの化合物Ｉ、０．１〜２５μＭのカチオン性芳香族化合物、５０〜５００μＭのバックグラウンド低減剤、０．２〜５ｇ／Ｌのエーテル結合した非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマー、０．１〜５ｇ／Ｌのアニオン性界面活性剤、及び０．１Ｍ〜０．４ＭのｐＨ８〜１１のアミンバッファを含む。
【０１７９】
いくつかの特定の実施形態では、基質製剤は、ＣＰＡ（化合物Ｉとして）、ルシゲニン（ＣＡＣとして）、亜硫酸ナトリウム（バックグラウンド低減剤）、ＩＧＥＰＡＬ（ＣＯ−９９０、ＤＭ−９７０）、ＴＲＩＴＯＮ（Ｘ−４０５、還元型Ｘ−４０５）、及びＢＲＩＪ（７８、７００）からなる群から選択されるエーテル結合した非イオン性界面活性剤、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１４，０００）、ポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝３５，０００）、及びポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１００，０００）からなる群から選択される親水性ポリマー、ＳＤＳ又はＳＴＳであるアニオン性界面活性剤、０．０２５Ｍ〜０．６５Ｍの濃度及びｐＨ８〜１１のＴＲＩＳ又はＡＭＰＤであるアミンバッファを含む。
【０１８０】
一態様では、基質製剤は、０．３０ｇ／ＬのＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌのルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌの亜硫酸ナトリウム、１．０ｇ／ＬのＰＥＧ（Ｍｗ  ３５Ｋ）、１．０ｇ／ＬのＳＤＳ、及び０．３ＭのＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．２）を含む。
【０１８１】
別の態様では、基質製剤は、０．３０ｇ／ＬのＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌのルシゲニン、５ｍｇ／Ｌの亜硫酸ナトリウム、２．０ｇ／ＬのＴＲＩＴＯＮ−Ｘ−４０５、１．０ｇ／ＬのＳＤＳ、及び０．１ＭのＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）を含む。
【０１８２】
別の態様では、基質製剤は、０．３０ｇ／ＬのＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌのルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌの亜硫酸ナトリウム、１．５ｇ／ＬのＢＲＩＪ  ７８、１．０ｇ／ＬのＳＤＳ、及び０．３ＭのＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．３５）を含む。
【０１８３】
別の態様では、基質製剤は、０．１５ｇ／ＬのＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌのルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌの亜硫酸ナトリウム、２．０ｇ／ＬのＩＧＥＰＡＬ  ＤＭ−９７０、１．０ｇ／ＬのＳＤＳ、及び０．３ＭのＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．３５）を含む。
【０１８４】
一態様では、基質製剤は、０．１５ｇ／ＬのＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌのルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌの亜硫酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／ＬのＳＤＳ、及び０．１ＭのＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）を含む。
【０１８５】
別の態様では、基質製剤は、０．１５ｇ／ＬのＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌのルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌの亜硫酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＰＥＧ（Ｍｗ  ３５Ｋ）、０．５ｇ／ＬのＳＴＳ、及び０．１ＭのＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）を含む。
【０１８６】
別の態様では、基質製剤は、ＴＲＩＳバッファ（ｐＨ  ９．２）中にＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ  １００Ｋ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）を含む。
【０１８７】
別の態様では、基質製剤は、０．３０ｇ／ＬのＣＰＡ、２．４５ｍｇ／Ｌのルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌの亜硫酸ナトリウム、０．０５ｍＭの４−トリルボロン酸、１ｇ／ＬのＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／ＬのＳＤＳ、及び０．１ＭのＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）を含む。
【０１８８】
別の態様では、基質製剤は、０．１５ｇ／ＬのＣＰＡ（（（４−クロロフェニル）チオ）（１０−メチルアクリジン−９（１０Ｈ）−イリデン）メチルホスフェート二ナトリウム塩）、３．２６ｍｇ／Ｌのルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌの亜硫酸ナトリウム、１ｇ／ＬのＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／ＬのＳＤＳ、及び０．１ＭのＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）を含む。
【０１８９】
基質製剤の使用方法
したがって、本発明の別の態様は、検出可能な化学発光をホスファターゼ酵素との反応によって生じさせる方法における、式Ｉのいずれかの化合物及びＣＡＣの使用である。水性バッファ溶液中においてＣＡＣの存在下で式Ｉの化合物をホスファターゼ酵素と反応させると、容易に検出される化学発光が励起状態のＶＩから生じる。アルカリ性のｐＨで反応を実施したとき、室温で数秒間〜数分間以内に光強度が最高レベルに達する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、天然又は組み換えアルカリホスファターゼと共に使用するのに適切な、アルカリホスファターゼアッセイで使用するための基質製剤が提供される。化学発光反応を受け得るホスファターゼ酵素は、大腸菌などの細菌源から単離されたアルカリホスファターゼ、又は哺乳動物のアルカリホスファターゼ、又は植物若しくは哺乳動物源由来の酸性ホスファターゼを含み得る。一態様では、アルカリホスファターゼは、天然アルカリホスファターゼ、例えば、天然子ウシ腸アルカリホスファターゼであってよい。別の態様では、ホスファターゼ酵素は、組み換えホスファターゼ酵素、例えば、組み換えアルカリホスファターゼであってよい。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）又はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの商業的供給業者から購入される。アルカリホスファターゼは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現する組み換えアルカリホスファターゼ、例えばＲｏｃｈｅ又はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な、例えばピキア・パストリスで発現する組み換えウシアルカリホスファターゼであってよい。アルカリホスファターゼは、例えばＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ（Ｔｒｏｍｓｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から入手可能な、例えばピキア・パストリスで生成される組み換えエビアルカリホスファターゼであってよい。
【０１９１】
ホスファターゼ活性、すなわち、リン酸モノエステルを加水分解する能力を示す場合に限り、化学発光を生じさせる方法においてホスファターゼ酵素及び生体分子のコンジュゲートを使用することもできる。ホスファターゼ酵素の１つ以上の分子にコンジュゲートすることができる生体分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンが挙げられる。生体分子に付着させるために官能化される、リポソーム、ミセル、ベシクル、及びポリマーなどのホスファターゼ酵素が含まれた又は組み込まれた複合体も、本発明の方法において使用され得る。
【０１９２】
化学発光を生じさせるための本発明の組成物とホスファターゼ酵素との反応は、ホスファターゼ酵素の存在又は量を検出するための迅速かつ高感度な方法を構成する。したがって、サンプルと式Ｉの化合物との反応によって生じる光の量又は強度を測定することによって、サンプル中のホスファターゼ酵素の存在又は量を決定する目的のために本方法を使用することができる。
【０１９３】
酵素アッセイを実施するための技術は周知である。本明細書に教示される実施例によって提供される指針によれば、サンプルを調製する、試薬、反応時間の適切な量及び比率を決定する、較正曲線を構築するためなどの手順の変形は、日常的な実験の問題として考案する当業者の能力の範囲内である。
【０１９４】
本発明の方法及び組成物は、タンパク質−タンパク質アフィニティアッセイ、タンパク質−リガンドアフィニティアッセイ、核酸アフィニティアッセイ、間接蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、磁気微小粒子に基づく化学発光酵素イムノアッセイ、直接又は間接アッセイ、競合アッセイ、サンドイッチアッセイなどを含むが、これらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の好適なアッセイ、例えば、アルカリホスファターゼ及び基質製剤を有利に使用することができる当該技術分野において公知の任意の好適なアフィニティアッセイ又はイムノアッセイと共に使用することができる。好適なアッセイフォーマットとしては、本明細書における実施例で使用されるアッセイ及びフォーマットが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
本発明の基質製剤は、以下を含む自動イムノアッセイシステムと共に使用することが可能である：Ａｃｃｅｓｓ  ２  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＩ  ６００  Ａｃｃｅｓｓ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＩ  ８００  Ａｃｃｅｓｓ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＣ  ６００ｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＣ  ６６０ｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＣ  ６８０ｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，；ＵｎｉＣｅｌ（登録商標）ＤｘＣ  ８６０ｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＵｎｉＣｅｌ（登録商標）ＤｘＣ  ８８０ｉ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（全てＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ，ＣＡ）から入手可能）；Ｃｏｂａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手可能）；Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｂｂｏｔｔ（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手可能）；及びＣｅｎｔａｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｉｅｍｅｎｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能）。
【０１９６】
化合物Ｉとホスファターゼ酵素との反応から光を生じさせる好ましい方法では、当該反応は、５℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃の温度で、ｐＨ７〜１２、８〜１１、又は好ましくは８．５〜１０の水性バッファ溶液中で実施される。酵素は、好ましくは、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼコンジュゲートである。
【０１９７】
本方法によって発せられる光は、照度計、ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンタ、化学光量計、又は目視などの任意の好適な公知の手段によって検出することができる。各検出手段は、異なるスペクトル感度を有する。人間の目は、緑色光に対して最適に感受性であり、ＣＣＤカメラは、赤色光に対して最高感度を示し、ＵＶから青色光又は緑色光に対して最大応答を有するｘ線フィルムが利用可能である。検出装置の選択は、用途、並びにコスト、利便性、及び永続的な記録の作成が必要かどうかについてを検討することによって決定される。
【０１９８】
最大発光をより長い波長にシフトする（レッドシフト）ために蛍光エネルギー受容体を使用できることが想到される。発光をレッドシフトさせるための様々な技術は、化学発光反応及びアッセイの技術分野において公知である。上記のように共有結合したフルオロフォアが一例である。別の種として反応溶液に蛍光剤を添加してもよい。蛍光剤を化合物に密接させるために、蛍光剤を、カチオン性ポリマーなどの増強剤物質に結合させてもよく、あるいはミセル又はポリマーなどの増強剤物質と会合させてもよい。あるいは、蛍光剤は、酵素反応期間中にリン酸基を除去することによって蛍光形態に変換可能な非蛍光形態で提供されてもよい。後者の種類の化合物の例としては、フルオレセインジホスフェート、４−メチルウンベリフェロンホスフェートなどのクマリンホスフェート、ＡＴＴＯＰＨＯＳ（登録商標）（ＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，Ｃａｌｉｆ．））などのベンゾチアゾールホスフェートが挙げられる。
【実施例】
【０１９９】
実施例
安定性試験Ａ
ＡＰ基質製剤のアリコート（１００μＬ）を、マイクロタイタープレートのウェル（各製剤につき８つの複製物）に添加した。当該プレートを蛍光プレートリーダー（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ，Ｌａｂｔｅｃｈ）に入れ、各ウェルに、２０μＬのＡＰ溶液（２ｎｇ／ｍＬ）を注入した。３０秒間後に発光シグナルを読み取り、２秒間積分した（ｉｎｔｅｒｇｒａｄｅｄ）。
【０２００】
性能試験Ｂ
ＡＰ酵素溶液（２ｎｇ／ｍＬ）のアリコート（５μＬ）をポリエチレン製チューブに入れた。当該チューブを照度計（２０／２０ｅ、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）に入れ、１００μＬの基質を各ウェルに注入した。注入直後、発光シグナルを６０秒間読み取った。
【０２０１】
ＡＰＳ−５製剤
Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５  ＡＰ化学発光基質試薬（「ＡＰＳ−５」、製品番号ＡＰＳ−５−１０１、Ｌｕｍｉｇｅｎ（Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，ＭＩ））は、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ルシゲニン、ＳＤＳ、及びＮａ２ＳＯ３を含有する０．３Ｍ  ＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．３５）中に化合物ＩとしてＣＰＡを含む。
【０２０２】
実施例１．ＡＰＳ−５製剤の安定性
安定性試験Ａを用いて、経時的な性能安定性について様々なロットのＡＰＳ−５を評価した。これら代表的なロットの相対安定性を図１に示す。４℃で１００日間後、性能の著しい低下がみられた。
【０２０３】
安定性の限界の主な原因となった製剤成分を特定するために、追加量（５０％多い）の各成分をＡＰＳ−５の単一ロットに添加し、安定性試験Ａを用いてこれら改変製剤を試験した。結果を表１に示す。
【０２０４】
【表１】
2019530429.tif 000019
【０２０５】
ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０が、アッセイ性能に対して最大の影響を示した。様々な量のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を用いて同じ実験を再度繰り返した。アッセイ性能を、１ｇ／ＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（０．１％ｗ／ｖ）を含む標準的なＡＰＳ−５製剤と比較した。図２に示すように、０．５、０．７５、０．９、１、１．５、及び２ｇ／ＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０はそれぞれ、１ｇ／ＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０と比べて少なくとも９０％の性能を示した。
【０２０６】
ＡＰＳ−５の性能におけるＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の役割を確認するために、４℃で様々な日数保管され、様々な程度のシグナル劣化を示していた数ロットのＬｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５に、更に０．５ｇ／ＬのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を添加した。ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の添加後、安定性試験Ａを用いて改変ＡＰＳ−５を再度試験した。結果を表２に示す。
【０２０７】
【表２】
2019530429.tif 000020
【０２０８】
いずれの場合も、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の添加によって性能が改善された。疑わしい不安定性の原因はＡＰＳ−５固体及びＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含んでいたが、ＡＰＳ−５固体は＜５％性能劣化／年の原因となり、一方、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０は＞２０％性能劣化／年を引き起こすことが判明した。
【０２０９】
次いで、ＡＰＳ−５製剤を表３に示すように改変し、安定性試験Ａを用いて試験した。表３は、新たに調製された標準的なＡＰＳ−５と比較した改変ＡＰＳ−５の初期性能％を示す。
【０２１０】
【表３】
2019530429.tif 000021
【０２１１】
様々なより低いＭｎのＰＥＧを評価することを含む他の改変を行ったが、それは示さない。ＰＥＧ  Ｍｎ１４，０００によって最良の性能が示された。ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ、０．１Ｍ  ＴＲＩＳを含む改変ＡＰＳ−５製剤は、それぞれ、元の濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む元のＡＰＳ−５製剤以下の性能安定性を示した。ＰＥＧ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、追加のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、又はより低いｐＨを有する改変ＡＰＳ−５製剤は、未改変ＡＰＳ−５よりも優れた性能安定性を示した。
【０２１２】
改変ＡＰＳ−５製剤を使用して性能試験Ｂによりカスタマーサンプルを試験した。３つの異なるｐＨレベル（ｐＨ９．０、ｐＨ９．１、及びｐＨ８．９ｐＨ）の２ｇ／Ｌ  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＡＰＳ−５製剤は全て、＜３０秒の時間枠の性能速度を示した。ｐＨ９．２の２．５ｇ／Ｌ  ＰＥＧ  Ｍｎ＝１４，０００を含み、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含まない改変ＡＰＳ−５製剤は、＜１０秒の所望のシグナル強度プラトー（ＴＡＴ）及び良好なリアルタイム安定性を示すことが判明し、４℃で１３ヶ月間後に元の性能の９９．７％を示す。要約すると、現行のＡＰＳ−５製剤の安定性の問題は、ＡＰＳ−５バッファ条件下におけるＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の劣化によって主に引き起こされることが判明した。
【０２１３】
実施例２．代替非イオン性界面活性剤
エーテル結合した非イオン性界面活性剤の安定性に対する効果を判定するために実験を実施した。以下の界面活性剤について調べた：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１０３、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１０５、並びにＩｇｅｐａｌ  ＣＯ−９９０、Ｉｇｅｐａｌ  ＤＭ−９７０、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、還元型ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、ＢＲＩＪ  ７８、及びＢＲＩＪ  ７００を含むエーテル結合した非イオン性界面活性剤。
【０２１４】
以下からなる組成物を試験のために使用した：ＣＰＡ（０．３０ｇ／Ｌ）、０．３Ｍ  ＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．３５）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ＳＤＳ（１ｇ／Ｌ）、及び指定の濃度の非イオン性界面活性剤。組成物を４℃で保管し、保管中に時々試験した。試験組成物の参照標準組成物（市販のＡＰＳ−５）の百分率としての相対シグナル強度、シグナルプロファイル、及びバックグラウンドを決定した。試験組成物中０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、及び３．０ｇ／Ｌの非イオン性界面活性剤で、各代替非イオン性界面活性剤を試験した。図３に示すように、代表的なＢＲＩＪ７００試験組成物は、ＡＰＳ−５と類似のシグナルプロファイル（すなわち、最高シグナル強度になるまでの時間、Ｉｍａｘ；バックグラウンド）を示した。
【０２１５】
驚くべきことに、ＩＧＥＰＡＬ（ＣＯ−９９０、ＤＭ−９７０）、ＴＲＩＴＯＮ（Ｘ−４０５、還元型Ｘ−４０５）、及びＢＲＩＪ（７８、７００）を用いて調製された製剤からは、標準的なＡＰＳ−５以上のシグナル強度が生じたが、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｆ６８、Ｆ１０８、Ｐ１０３、及びＰ１０５）を用いて調製されたものからは、表４に示すように、標準的なＡＰＳ−５よりも低いシグナルが生じることが観察された。
【０２１６】
４℃で１０６又は１２４日間にわたってＡＰＳ−５中で代替非イオン性界面活性剤を使用して、各製剤について安定性試験を実施した。表４では、標準的なＡＰＳ−５のシグナル百分率としてデータを示す。
【０２１７】
【表４−１】
2019530429.tif 000022
【０２１８】
【表４−２】
2019530429.tif 000023
ＮＴ＝未試験
【０２１９】
エーテル結合した非イオン性界面活性剤を用いて調製された改変製剤はそれぞれ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有する市販の参照基質ＡＰＳ−５よりも優れた安定性を示した。シグナル強度は変化したが、これら全ての製剤が、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む基質製剤と比べて、４℃で３ヶ月間保管した後に安定性の著しい改善を示した。代替非イオン性界面活性剤を含む改変製剤は、現行の製剤と比べて類似のバックグラウンド及びシグナルプロファイルを示した。試験した製剤のうち、ＩＧＥＰＡＬ、ＴＲＩＴＯＮ、及びＢＲＩＪ型の界面活性剤を含むものからは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０以上のシグナル強度が得られた。最初の実験中に特定された最適濃度のＩＧＥＰＡＬ、ＴＲＩＴＯＮ、及びＢＲＩＪ型の界面活性剤を含む製剤を、それぞれを対応する新たに調製された製剤と比較することによって、４℃で経時的にシグナル安定性に関して更にモニタリングした。試験した６つの製剤のうちの５つが、１５ヶ月間後に１０％未満のシグナル喪失を示した。
【０２２０】
基質製剤中で他の非イオン性界面活性剤を試験したが、シグナル強度及び保管安定性の特徴を両方維持する組成物を提供することはできなかった。これら非イオン性界面活性剤としては、ポロキサマー型のＰｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤Ｆ６８、Ｆ１０８、Ｐ１０３、Ｐ１０５、ポリソルベート型の界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０が挙げられる。ＡＰＳ−５製剤は、０．１％ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有する。ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０又はＴＷＥＥＮ（登録商標）８０で作製された組成物からは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０以下のプロファイルが得られた。いくつかの実施形態では、ポロキサマー型のＰｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤Ｆ６８、Ｆ１０８、Ｐ１０３、Ｐ１０５、又はポリソルベート型の界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含有しない基質製剤が提供される。
【０２２１】
実施例３．ＡＰＳ−５製剤中の選択された非イオン性界面活性剤の更なる評価
表４中にイタリック体で示したエーテル結合した非イオン性界面活性剤を、更なる試験のために選択した。市販の標準的なＡＰＳ−５に対する活性の比較を表５に示す。
【０２２２】
【表５】
2019530429.tif 000024
【０２２３】
表５の６つの製剤を４℃で保管し、安定性試験Ａに供した。結果を表６Ａに示す。
【０２２４】
【表６−１】
2019530429.tif 000025
【０２２５】
２．５ｇ／Ｌのポリ（エチレングリコール）（Ｍｗ＝１４，０００）を含有する類似の組成物は、参照物質に対して９４％のシグナル、及び４℃で１３ヶ月間後に非常に小さなシグナル変化を示した。１．０ｇ／Ｌの分子量３５，０００及び１００，０００を有するポリ（エチレングリコール）を含有する類似の組成物は、類似の挙動を示した。
【０２２６】
表６Ａに示すように、エーテル結合した非イオン性界面活性剤を含む試験組成物は、４℃で保管したとき３００日間後に＞９０％及び＞９５％保持された活性を示すか、又は４℃で４００日間以上保管したとき、＞９０％保持された活性を示した。対照的に、図１に示すように、市販の標準的な組成物ＡＰＳ−５は、４℃で３００日間後に約６５％の性能しか保持しておらず、４℃で約４００日間後に＜６５％の活性を保持していた。
【０２２７】
親水性部分及び疎水性部分がエーテル結合を介して連結している非イオン性界面活性剤でＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を置き換えると、安定性が著しく増大した。具体的には、エーテル結合した非イオン性界面活性剤を含む基質組成物は、図１に示す市販の標準的なＡＰＳ−５と比べて、表６Ａに示すように改善された保管安定性を示した。４８個の新規製剤のうちの６個は、現行のＡＰＳ−５製剤と同等のシグナル強度を示し、連続してモニタリングしたところ、１５ヶ月間で１０％未満のシグナル喪失を示した。
【０２２８】
実施例４．２つの化合物Ｉ濃度において代替非イオン性界面活性剤又は親水性ポリマーを用いた安定性試験
この実施例では、安定性試験のために，４つの新たに作製された製剤を調製した。０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．８）バッファの１つのロット（２０Ｌ）を調製した。ＳＤＳ、亜硫酸ナトリウム、及びルシゲニンを添加し、次いで、製剤を２つの部分に分割した。２種の濃度のＣＰＡを添加した（０．１５ｇ／Ｌ及び０．３３ｇ／Ｌ）。これら２つの製剤を分割し、ＰＥＧ１００Ｋを製剤のうちの２つに添加し、１．５ｇ／Ｌ  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５を他の２つの製剤に添加した。
【０２２９】
これら４ロットを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ−６Ｌ機器においてＡＰを用いて測定した（注入の３０秒間後）。ＰＭＴ（Ｃ）のみを使用した。ＡＬＰはＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（コードＡＬＰ１１２５、ロット１６９８ＡＤＲ）から入手し、平底９６ウェル白色プレート（Ｍｉｃｒｏｌｉｔｒｅ  １、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐａｒｔ  ７４１６）を使用した。２０マイクロリットルのＡＬＰ溶液（１．５ｎｇ／ｍＬ）を、当該機器のマイクロタイターウェル内の２００マイクロリットルの基質製剤に注入し、光子計数モード下で１秒間読み取ることによって試験を実施した。各製剤を、９６ウェルプレートにおいて４８個の複製物で試験した。
【０２３０】
製剤を４℃（２〜８℃）で保管し、１ヶ月間隔で活性を評価した。ＰＥＧ１００を含む０．１５ＣＰＡ製剤は、１ヶ月あたり−０．７％の強度低下を示し、ｐ値は０．００２であった。
【０２３１】
図４は、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５を含む０．１５ＣＰＡ製剤の安定性を示す。製剤を２〜８℃で保管したとき、１ヶ月あたり−０．９％の強度低下の勾配（ｐ値０．０１６）が決定された。代表的な図４に示すように、親水性ポリマーＰＥＧ１００Ｋ（データ不図示）又はエーテルベースの非イオン性界面活性剤ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５のいずれかを含む両製剤は、図１に示すＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む標準的なＡＰＳ−５製剤と比べて改善された安定性を示した。
【０２３２】
【表６−２】
2019530429.tif 000026
【０２３３】
この実施例の基質組成物は、アルカリホスファターゼ酵素に曝露した後、４℃で保管したとき１２ヶ月間後に、≦−１．０％／月、≦−０．９％／月、又は≦−０．８０％／月の１ヶ月あたり蛍光シグナルの強度変化率（％）を示した。
【０２３４】
図４及び表６Ｂ〜６Ｅに示すように、エーテル結合した非イオン性界面活性剤ＴＲＩＴＯＮＸ−４０５及び親水性ポリマーＰＥＧ１００Ｋを含む製剤は、４℃で保管したとき３００日間後に＞９０％保持された活性を示した。対照的に、図１に示すように、ＡＰＳ−５は、４℃で３００日間後に約６５％の性能しか保持していなかった。
【０２３５】
実施例５．代表的な基質製剤
以下の材料から様々な基質製剤を調製した。
【０２３６】
製剤Ａ：０．３０ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１．０ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、１．０ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ９．２）バッファ。
【０２３７】
製剤Ｂ：０．３０ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、５ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、２．０ｇ／Ｌ  ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ−４０５、１．０ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．１Ｍ  ＡＭＰＤ（ｐＨ９．７）バッファ。
【０２３８】
製剤Ｃ：０．３０ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌ  ＢＲＩＪ  ７８、１．０ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ９．３５）バッファ。
【０２３９】
製剤Ｄ：０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、２．０ｇ／Ｌ  ＩＧＥＰＡＬ  ＤＭ−９７０、１．０ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ９．３５）バッファ。
【０２４０】
製剤Ｅ（ＡＭＰＤ−１０）：０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．１Ｍ  ＡＭＰＤ（ｐＨ９．７）バッファ。
【０２４１】
製剤Ｆ：０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、０．５ｇ／Ｌ  ＳＴＳ、及び０．１Ｍ  ＡＭＰＤ（ｐＨ９．７）バッファ。
【０２４２】
製剤Ｇ（ＳＭＳ−ＰＥＧ−ＴＲＩＳ）：０．３Ｍ  ＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．２）中０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、１０ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ  １００Ｋ、及び０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳ。
【０２４３】
製剤Ｈ：０．３０ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、２．４５ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  ４−トリルボロン酸、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．１Ｍ  ＡＭＰＤ（ｐＨ９．７）バッファ。
【０２４４】
製剤Ｉ（ＳＭＳ−ＰＥＧ−ＡＭＰＤ）：０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．１Ｍ  ＡＭＰＤ（ｐＨ９．７）バッファ。
【０２４５】
製剤Ｊ（ＳＭＳ−ＰＥＧ）：０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１．０ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、１．０ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．３  Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ９．２）バッファ。
【０２４６】
製剤Ｋ（ＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮ）：０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、２．０ｇ／Ｌ  ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ−４０５、１．０ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ９．２）バッファ。
【０２４７】
実施例６．基質アッセイスクリーニング
感度及び精度を維持しながら既存のイムノアッセイの実行可能性を証明するために基質製剤を評価した。それぞれ０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡを含有するＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮを用いてスクリーニングを行った。また、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０を対照として用いた。基質の添加後、それぞれＬ１＝９秒、Ｌ２＝２７秒、Ｌ５＝６．３分で発光シグナルを読み取る３つの照度計を備えるＤｘＩ  ６０００１９で基質製剤のスクリーニングを実施した。既存のアッセイプロトコルを図５に列挙する。商業的イムノアッセイにおけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０基質を２つの基質製剤に置き換え、Ｌ５＝６．３分に加えて、Ｌ１＝９秒及びＬ２＝２７秒においてもシグナルを読み取ったことを除いて、製造業者のプロトコルに従って旧ＢＨＣＧ、新ＢＨＣＧ、ＡｃｃｕＴｎＩ＋３、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、ＢＮＰ、ジゴキシン、ＴＳＨ、ＴＳＨ２、及びＰＴＨ（１Ｏ）の商業的アッセイを使用した。図５中の「ＰＭＰ」は、常磁性粒子を指す。ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０を使用する標準的な商業的アッセイを比較のための対照として用いた。
【０２４８】
各基質製剤ごとに、Ｓ０キャリブレータの１０個の複製物、全ての他のキャリブレータレベルの４個の複製物、Ｂｉｏ−Ｒａｄ対照の５個の複製物、並びに各低及び高患者のプールされた血清サンプルの６個の複製物について実施した。
【０２４９】
表７〜１５に示すアッセイ結果のそれぞれについて、化学発光アッセイシグナル比Ｓｘ／Ｓ０（式中、ｘは、１、２、３、４、又は５から選択される）によって、キャリブレータのシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を計算した。したがって、それぞれ、「Ｓ１」のＳ／Ｎ比は、Ｓ１／Ｓ０を指し；「Ｓ２」は、Ｓ２／Ｓ０を指し；「Ｓ３」は、Ｓ３／Ｓ０を指し；「Ｓ４」は、Ｓ４／Ｓ０を指し；「Ｓ５」は、Ｓ５／Ｓ０を指す（式中、Ｓ０は、分析物を含まないキャリブレータであり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５は、漸増量の分析物を含むキャリブレータである）。
【０２５０】
実施例６Ａ．ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、ＢｉｏＲａｄ  Ｌｉｑｕｉｃｈｅｋ対照サンプル１、２、及び３、並びに血清プール１及び血清プール２のサンプルのジゴキシンスクリーニング比較を実施した。図６Ａに示すように、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの両基質製剤のＬ２及びＬ５におけるＲＬＵは、Ｌ５におけるＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０のＲＬＵと比べて低下し、ＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮが最も低いＲＬＵを示した。しかし、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０に類似のＢ／Ｂ０シグナルが観察された。品質管理分析は、全てのサンプルが両基質製剤について規定の範囲内であったことを示した（データ不図示）。
【０２５１】
実施例６Ｂ．図６Ｂに示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢｉｏＲａｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ＬＴＡ、ＢｉｏＲａｄ  Ｌｉｑｕｉｃｈｅｋサンプル１、２、及び３、並びに血清プール１及び血清プール２のサンプルの副甲状腺ホルモンＰＴＨ（ＩＯ）スクリーニング比較を実施した。対照は、ＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮ基質製剤と比べてＳＭＳ−ＰＥＧによるＲＬＵシグナルにおいて若干異なる応答を示した。表７に示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、両基質製剤において、Ｓ／Ｓ０として計算されたキャリブレータのシグナル対ノイズ比の改善がみられた。品質評価に関しては、全ての対照が両基質製剤について規定の範囲内に留まっていた。しかし、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０は、ＬＴＡ及びレベル１サンプルについて範囲外であった。
【０２５２】
【表７】
2019530429.tif 000027
【０２５３】
実施例６Ｃ．ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢｉｏＲａｄ  ＱＣ  １、２、及び３、並びに血清プール１及び血清プール２のサンプルによるチロトロピン（甲状腺刺激ホルモン）ＴＳＨスクリーニング比較を実施した。図６Ｃに示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ基質はより高いシグナルを示し、ＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮではより低いシグナルがみられた。表８に示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、両基質製剤はより良好なシグナル対ノイズ比を示した。品質評価に関しては、全てのＢｉｏＲａｄ  ＱＣ対照が本発明の両基質製剤について規定の範囲内に留まっていた。
【０２５４】
【表８】
2019530429.tif 000028
【０２５５】
実施例６Ｄ．ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢｉｏＲａｄ  ＱＣ  １、２、及び３、並びに血清プール１及び血清プール２のサンプルのチロトロピン（甲状腺刺激ホルモン）ＴＳＨ２スクリーニングが比較を実施し、は実施した。図６Ｄに示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧは類似のＲＬＲを示し、一方、ＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮ基質はより低いシグナルを示した。Ｌ２（２７秒）は、両基質についてＬ５（６．３分）よりも高いシグナルを示す。表９に示すように、両基質製剤はより良好なシグナル対ノイズ比を示し、ＳＭＳがＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮよりも優れていた。ＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮのＱＣ２を除いて、全ての対照が範囲内に留まっていた。
【０２５６】
【表９】
2019530429.tif 000029
【０２５７】
実施例６Ｅ．ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢｉｏＲａｄＣａｒｄ−０１、−０２、及び−０３、並びに血清プール−低、血清プール−高、及び陰性血清−全のサンプルによるＡｃｃｕＴｎＩ＋３スクリーニングを実施した。図６Ｅに示すように、両基質製剤についてＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、血清はキャリブレータと異なる応答を示し得る。Ｌ２と比べてＬ５におけるＳＭＳ−ＰＥＧでより高いＳ０がみられた。本発明の両基質製剤については、Ｓ０のばらつきがより大きかった。表１０に示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、両基質製剤はより良好なシグナル対ノイズを示した。
【０２５８】
【表１０】
2019530429.tif 000030
【０２５９】
実施例６Ｆ．図６Ｆに示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢＢＮＰ−ＱＣ  １、ＢＮＰ−ＱＣ  ２、ＢＮＰ−ＱＣ  ３、並びに血清プール１及び血清プール２によるＢＮＰ（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）スクリーニングを実施した。表１１に示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、本発明の両基質製剤ではシグナル対ノイズ比の改善がみられた。血清サンプルは、本発明の両基質製剤についてキャリブレータと比べて低いＲＬＵを示し、ＥＤＴＡ血漿が唯一の承認されたサンプル種であることが留意された。
【０２６０】
【表１１】
2019530429.tif 000031
【０２６１】
実施例６Ｇ．図６Ｇに示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  １、ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  ２、及びＢｉｏＲａｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  ３、並びに血清プール１及び血清プール２によるＣＫ−ＭＢ（クレアチンキナーゼ−ＭＢ）スクリーニングを実施した。図６Ｇに示すように、両基質製剤について類似のＳ０  ＲＬＵがみられた。ＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮでは、全てのキャリブレータレベルについてはるかに低いＲＬＵ値がみられた。表１２に示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、両基質製剤ではより良好なシグナル対ノイズ比がみられた。
【０２６２】
【表１２】
2019530429.tif 000032
【０２６３】
実施例６Ｈ．図６Ｈに示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  １、ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  ２、及びＢｉｏＲａｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  ３、並びに血清プール１及び血清プール２によるミオグロビンスクリーニングを実施した。ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧによって全てのキャリブレータレベル、ＱＣ、及び血清サンプルでＲＬＵシグナルの増加がみられた。表１３に示すように、ＳＰ−５３０と比べて、本発明の両基質製剤でシグナル対ノイズ比の改善がみられた。このスクリーニングアッセイは、様々なスクリーニングアッセイのうち今までに観察された最も高いＳ０値を示した。全ての対照が、本発明の両基質製剤について規定の範囲内に留まっていた。
【０２６４】
【表１３】
2019530429.tif 000033
【０２６５】
実施例６Ｉ．図６Ｉに示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢｉｏＲａｄ−０１、−０２、−０３、並びに陰性患者血清の全ＢＨＣＧ（旧）（ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン）スクリーニングを実施した。ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて本発明の両基質製剤のＲＬＵは低かった。表１４に示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、本発明の両基質製剤はシグナル対ノイズ比がより良好であった。全ての対照が、本発明の両基質製剤について規定の範囲内に留まっていた。
【０２６６】
【表１４】
2019530429.tif 000034
【０２６７】
実施例６Ｊ．図６Ｊに示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０市販基質製剤と比べて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの基質製剤を用いて、キャリブレータＳ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５、対照ＢｉｏＲａｄ−０１、−０２、−０３、並びに陰性患者血清の全ＢＨＣＧ（新）スクリーニングを実施した。ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて本発明の両基質製剤のＲＬＵは低かった。表１５に示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて、本発明の両基質製剤はシグナル対ノイズ比がより良好であった。全ての対照が、本発明の両基質製剤について規定の範囲内に留まっていた。
【０２６８】
【表１５】
2019530429.tif 000035
【０２６９】
実施例６Ａ〜６Ｊ、表７〜１５のそれぞれにおいて、ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮを含む基質製剤は、ＬＰ−５３０基質よりも高いキャリブレータのシグナル対ノイズ比を示した。
【０２７０】
実施例６Ｋ．表１６及び１７に示すように、全てのアッセイは、Ｌｕｍｂｌａｎｋ比よりも高いＳ０値を示す。各アッセイの結果を比較した結果、表１７に示すように、ＴＳＨ２は、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０で最も低いＳ０  ＲＬＵを示す。
【０２７１】
【表１６】
2019530429.tif 000036
【０２７２】
【表１７】
2019530429.tif 000037
【０２７３】
ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮの試験製剤を、ＡｃｃｕＴｎＩ＋３、ＮｅｘｔＧｅｎＴｎＩ＋３、ＢＮＰ、ＣＫＭＢ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、旧ＢＨＣＧ、新ＢＨＣＧ、ＰＴＨ−ＩＯ、ＴＳＨ、及びＴＳＨ２アッセイにおけるＲＬＵ  Ｓ０／ブランク比の観点でＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比較した。全ての場合において、Ｓ０  ＲＬＵはブランクＲＬＵよりも高かった。本発明の基質製剤ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮ試験製剤のＳ０／ブランク比は、ＣＫＭアッセイ（本発明の基質製剤から得られた比がＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０から得られた比と等しかった）及び新ＢＨＣＧアッセイ（本発明の基質製剤から得られた比がわずかに低かった、１．２５対１．５）を除いて、全てＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０よりも高かった。ミオグロビンは、本発明の基質製剤で最も高いＳ０／ブランク比を示した。高感度アッセイの開発には、Ｓ０／ブランク比が高い方が望ましい。
【０２７４】
サンドイッチアッセイによるシグナル対ノイズ比は、本発明の両基質製剤について現行のＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０以上であった。高速基質ＲＬＵ  Ｓ０のばらつきは、ジゴキシン及び旧ＢＨＣＧを除いてほとんどのアッセイでＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０よりも高かった。
【０２７５】
本発明の両基質製剤ＳＭＳ−ＰＥＧ及びＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮについてＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べた高及び低血清プールによる用量のばらつきを図１０に示し、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べた用量の差％についてのばらつきチャートを提供する。ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて低い用量の差％は、本発明の両基質製剤を用いて低い及び高い血清プールにおいてＢＮＰ、ジゴキシン、ミオグロビンでみられる。ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて高い用量の差％は、本発明の両基質製剤を用いてより低い及び高い血清プールにおいてＡｃｃｕ  ＴｎＩ＋３、ＣＫＭＢ、ＰＴＨ（ＩＯ）、ＴＳＨ、及びＴＳＨ２でみられる。
【０２７６】
要約すると、ＲＬＵシグナルは、ＳＭＳ−ＰＥＧを用いたミオグロビン及びＴＳＨを除いて、本発明の両基質製剤についてのほとんどのアッセイでＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０よりも低い。一般に、ＳＭＳ−ＰＥＧは、全てのアッセイについてＳＭＳ−ＴＲＩＴＯＮよりも高いＲＬＵを示す。更に、Ｌ１（９秒）は、試験したアッセイのいずれかについてのシグナル生成のピークではない。
【０２７７】
バックグラウンドに関しては、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べて本発明の両基質製剤は低いｌｕｍｂｌａｎｋを示し、Ｓ０値はＬｕｍｂｌａｎｋよりも決して低くならなかった。Ｓ０  ＲＬＵは、本発明の両基質製剤についてＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０よりも低かった。シグナル対ノイズは、全てのアッセイについてＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０よりも良好であった。
【０２７８】
不正確さに関しては、本発明の両基質製剤についてより大きなＬｕｍｂｌａｎｋのばらつきがみられた。サンドイッチアッセイは、ＳＭＳ−ＰＥＧを用いた旧ＢＨＣＧを除いて、本発明の両基質製剤でより大きなＳ０不正確さを示す。曲線適合は、全てのアッセイについて許容可能であることが判明した。しかし、いくつかのアッセイについて対照及び患者サンプルで用量バイアスがみられた。
【０２７９】
実施例７．代替バッファ系
アルカリホスファターゼ酵素は、通常、非リン酸塩基性バッファを必要とする。本発明において好ましいバッファは、８．０超のｐＨ値を有するアミンベースのバッファである。安定性を改善し、シグナルを維持するために代替バッファについて調べた。図７は、ＴＲＩＳ、ＡＭＰＤ、ＤＥＡ、ＡＭＰＳＯ、２２１−アミン、ＣＨＥＳ、又はＴＡＰＳ含む代替アミンバッファとして調べたバッファパラメータを示す。シグナルに対するモル濃度及びｐＨの影響を評価するために複数のバッファ系を調べた。この実験では、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレート読み取り照度計においてシグナルを測定し、以下のように０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．８）を含む標準的な高速基質製剤と比べた。
【０２８０】
表１８Ａに示す様々なバッファ中ＣＰＡ−０．１５ｇ／Ｌ、ルシゲニン−３．２６ｍｇ／Ｌ、亜硫酸ナトリウム−１０ｍｇ／Ｌ、ＰＥＧ  Ｍｗ＝３５Ｋ−１ｇ／Ｌ、ＳＤＳ−０．９ｇ／Ｌを用いて様々なバッファ系を使用する製剤を調製した。表１８Ａは、０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．８）中参照製剤に対するシグナル（％）を示す。
【０２８１】
【表１８Ａ】
2019530429.tif 000038
＊シグナルは、０．３Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ８．８）中参照製剤に対する（％））
【０２８２】
ｐＨ及びモル濃度の使用可能な範囲が狭いことから、表１８Ｂに示すようにこれら各バッファ系につき１つの製剤を選択した。
【０２８３】
【表１８Ｂ】
2019530429.tif 000039
【０２８４】
２２１−アミンの強度は、調製ごとに著しく変動したが、モル濃度に対する性能の依存度が最も高いことに起因している可能性が最も高い。ＴＡＰＳバッファは、冷凍後に沈殿を引き起こした。ＡＭＰＳＯバッファは、試験において最も高いＣ．Ｖ．を示した。したがって、これら５つのＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、２２１−アミン、ＤＥＡ、又はＡＭＰＳＯバッファのいずれについても更には調べなかった。
【０２８５】
ＡＭＰＤバッファは、表１９に示すように、広範囲のｐＨ及びモル濃度にわたってシグナル強度及びバックグラウンドの観点でＴＲＩＳバッファと同等の性能を示した。
【０２８６】
【表１９】
2019530429.tif 000040
【０２８７】
ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）のみを含むＡＭＰＤバッファ系を、様々なバッファ：ＡＭＰＤ−グリシン、重炭酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、グリシン、及びトリス−グリシンと比較し、調べた。ＡＭＰＤ参照の％としてのＡＰによるシグナルを図８に示す。重炭酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩は、それぞれ、ＡＭＰＤと比べてＡＰによるシグナルが著しく減少した。グリシン及びトリス−グリシンバッファは、ＡＭＰＤと類似のシグナルを示した。ＡＭＰＤ−グリシンは、ＡＭＰＤ参照と比べてシグナルの増加を示した。
【０２８８】
９つの異なるｐＨ及びモル濃度の組み合わせでＡＭＤＰバッファ中ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）を用いてＡＭＰＤ製剤を調製し、表２０に示すように３０℃における安定性について試験した。
【０２８９】
【表２０】
2019530429.tif 000041
【０２９０】
全ての勾配のｐ値が統計的有意性を示した。
【０２９１】
モル濃度及びｐＨに関して、ＴＲＩＳバッファを更に調べた。表２１に示す指定のモル濃度のＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．２）中ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）を含む組成物を調製した。１行目にイタリック体で示す対照ＴＲＩＳバッファに対する性能を表２１に示す。
【０２９２】
【表２１】
2019530429.tif 000042
【０２９３】
表２１に示すように、ＴＲＩＳは、広範囲のｐＨ及びモル濃度にわたって同等の性能を示した。ｐＨは９．２に限定されていたが、その理由は、より高いｐＨはＴＲＩＳの緩衝能の範囲外だったためである。４つの製剤の組み合わせを３０℃で安定性について試験した。結果を表２２に示す。
【０２９４】
【表２２】
2019530429.tif 000043
【０２９５】
４つのバッファ系について更に調べた：１０ｍｇ．Ｌ亜硫酸ナトリウムを含むＡＭＰＤバッファ；２５ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウムを含むＡＭＰＤバッファ；トリス１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム；及びトリス２５ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム。一般に、ＴＲＩＳバッファを２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）バッファで置き換えると、本発明の基質製剤の安定性が改善した。
【０２９６】
実施例８．アルカリホスファターゼの比較
Ｂｉｏｚｙｍｅ  ＡＬＰ、組み換えＡＬＰ、及び天然ＡＬＰを用いて、アルカリホスファターゼの比較を行った。ＳＭＦ−ＰＥＧ−ＡＭＰＤ（ＡＭＰＤ−１０）又はＳＭＦ−ＰＥＧ−ＴＲＩＳを含有する高速基質試験製剤の性能をＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０と比べた。ＳＭＦ−ＰＥＧ−ＡＭＰＤ（ＡＭＰＤ−１０）製剤は、０．１Ｍ  ＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）中にＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ  ３５Ｋ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）を含有していた。ＳＭＦ−ＰＥＧ−ＴＲＩＳ製剤は、０．３Ｍ  ＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．２）中にＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ  ３５Ｋ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）を含有していた
【０２９７】
各製剤（２００μＬ）を、２４個の複製物を用いてＳｐｅｃｔｒａＭａｘにおいて２０μＬのＡＬＰを用いて試験した。Ｂｉｏｚｙｍｅ  ＡＬＰは１．８ｎｇ／ｍＬで使用し、組み換え及び天然ＡＬＰは２ｎｇ／ｍＬで使用した。結果を表２２Ａ〜Ｄに示す。
【０２９８】
【表２２Ａ】
2019530429.tif 000044
【０２９９】
【表２２Ｂ】
2019530429.tif 000045
【０３００】
【表２２Ｃ】
2019530429.tif 000046
【０３０１】
【表２２Ｄ】
2019530429.tif 000047
【０３０２】
本発明の各基質製剤は、Ｂｉｏｚｙｍｅ  ＡＬＰ、組み換えＡＬＰ、又は天然ＡＬＰと共に使用することが可能であった。表２２Ａ〜２２Ｃに示すように、ＳＭＦ−ＰＥＧ−ＡＭＰＤ（ＡＭＰＤ−１０）及びＳＭＦ−ＰＥＧ−ＴＲＩＳを含む２つの基質製剤は、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０よりも低い％ＣＶを示した。
【０３０３】
実施例９．代替アニオン性界面活性剤
元のＡＰＳ−５製剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）アニオン性界面活性剤を含む。ＡＭＰＤバッファ並びにＳＤＳ又はＳＴＳアニオン性界面活性剤を使用する代替製剤の比較安定性について調べた。表２３は、ＣＰＡと共に使用するための本発明の３つの代替基質製剤を示す。
【０３０４】
【表２３】
2019530429.tif 000048
【０３０５】
スキーム１に示すように、機序の研究は、Ｎ−メチルアクリドンが化合物Ｉ  ＣＰＡの分解の生成物であることを示した。製剤中のＮ−メチルアクリドンの分解物の蛍光強度を、この試験において製剤安定性の別の指標として使用した。以下のとおり３つの試験製剤を調製し、ＡＰＳ−５製剤と比較した。
【０３０６】
製剤ＡＰＳ−５：ＣＰＡ、０．３Ｍ  ＴＲＩＳバッファ（ｐＨ９．３５）、ルシゲニン、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ＳＤＳ（１ｇ／Ｌ）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ｗ／ｖ、２ｇ／Ｌ）；
製剤ＡＭＰＤ−１０：ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、０．１Ｍ  ＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（Ｍｗ  ３５Ｋ、１．０ｇ／Ｌ）；
製剤ＳＴＳ：ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、０．１Ｍ  ＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ＳＴＳ（０．５ｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（Ｍｗ  ３５Ｋ、１．０ｇ／Ｌ）；
製剤グリシン：ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、０．０５Ｍ  ＡＭＰＤ−グリシンバッファ（ｐＨ９．７）、ルシゲニン（２．０ｍｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（５ｍｇ／Ｌ）、ＳＴＳ（０．５ｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（Ｍｗ  ３５Ｋ、１．０ｇ／Ｌ）。
【０３０７】
５℃、１８℃、又は３０℃で１５日間にわたって保管したとき、ＡＭＰＤ−１０、Ｃ１３、及びグリシンの製剤をＡＰＳ−５と比較した。各時点における蛍光を０日目と比較した。４つの製剤：Ａ＝ＡＰＳ−５、Ｂ＝ＡＭＰＤ−１０、Ｃ＝Ｃ１３、及びＤ＝グリシンのそれぞれについて、５℃、１８℃、又は３０℃で１５日間、０日目と比べた蛍光のグラフとして結果を図９Ａ〜９Ｃに示す。
【０３０８】
図９Ａは、５℃で１５日間保管中のＣＰＡ喪失率を示す。５℃では、グリシン製剤（勾配＝０．００２９％  ＣＰＡ喪失／日、Ｒ２  ０．８５、Ｐ＜０．００１）が、最も低いＣＰＡ喪失率％の観点で最良の安定性を示し、続いて、Ｃ１３（勾配＝０．００５４、Ｒ２  ０．９７、Ｐ＜０．００１）、ＡＭＰＤ−１０（勾配＝０．００６７、Ｒ２  ０．９６、Ｐ＜０．００１）、及びＡＰＳ−５（勾配０．０３０、Ｒ２  ０．９９、Ｐ＜０．００１）であった。
【０３０９】
図９Ｂは、１８℃で１５日間保管中のＣＰＡ喪失率を示す。１８℃では、グリシン製剤（勾配＝０．０１０％  ＣＰＡ喪失／日、Ｒ２  ０．６５、Ｐ＜０．００１）が、最も低いＣＰＡ喪失率％の観点で最良の安定性を示し、続いて、Ｃ１３（勾配＝０．０１８、Ｒ２  ０．９８、Ｐ＜０．００１）及びＡＭＰＤ−１０（勾配＝０．０２２、Ｒ２  ０．９９、Ｐ＜０．００１）であった。
【０３１０】
図９Ｃは、３０℃で１５日間保管中のＣＰＡ喪失率を示す。３０℃では、グリシン製剤（勾配＝０．０５４％  ＣＰＡ喪失／日、Ｒ２  ０．９９、Ｐ＜０．００１）が、最も低いＣＰＡ喪失率％の観点で最良の安定性を示し、続いて、Ｃ１３（勾配＝０．０８２、Ｒ２  ０．９９、Ｐ＜０．００１）、ＡＭＰＤ−１０（勾配＝０．０８９、Ｒ２  ０．９９、Ｐ＜０．００１）、及びＡＰＳ−５（勾配０．２６５、Ｒ２  ０．９９、Ｐ＜０．００１）であった。
【０３１１】
３０℃で１５日間後の１日あたりの蛍光変化を表２４に示す。
【０３１２】
【表２４】
2019530429.tif 000049
【０３１３】
図９Ａ〜図９Ｃに示し、表２４に要約するように、ＡＰＳ−５製剤と比べて０日目からの蛍光変化が減少したことによって示されるとおり、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含まない代替ＡＭＰＤ−１０、Ｃ１３、及びグリシン製剤はそれぞれ、５℃、１８℃、及び３０℃で１５日間にわたるＣＰＡ安定性の実質的な増大を示した。
【０３１４】
実施例１０．ＡＭＰＤ−１０中のボロン酸バックグラウンド低減剤
アリールボロン酸から選択されるバックグラウンド低減剤が添加されたＡＭＰＤ−１０製剤の安定性試験を実施した。フェニルボロン酸、４−トリルボロン酸、４−クロロボロン酸、４−ヨードボロン酸、及び３−メトキシカルボニルフェニルボロン酸を含むアリールボロン酸について調べた。
【０３１５】
以下のとおりＡＭＰＤ−１０製剤を調製し、ボロン酸を添加した：０．１５ｇ  ＣＰＡ、１．０ｇ／Ｌ  ＰＥＧ  ３５Ｋ、０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、１０ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＳＯ３、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、０．１Ｍ  ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）（ｐＨ９．７）バッファ。ボロン酸は、０．２５ｍＭ（ＤＭＦ中原液から）で使用した。添加されたボロン酸の効果を表２５に示す。
【０３１６】
【表２５】
2019530429.tif 000050
【０３１７】
ＡＭＰＤ−１０に添加されたとき、アリールボロン酸は、バックグラウンド及びＣＬ（ＲＬＵ）を両方低減した。バックグラウンド低減がより著しいので、改善されたＳ／Ｎ比が得られる。
【０３１８】
実施例１１．ポリマーに結合したボロン酸
ポリマービーズを２．６〜３．２ｍｍｏｌ／ｇフェニルボロン酸でロードした。ＡＭＰＤ−１０に（それぞれ、０．０５、０．２０、１．０、及び５０ｍｇ／ｍＬのポリマーに結合したフェニルボロン酸を添加することによって、４つの製剤を調製した。対照としてのＡＭＰＤ−１０と共にこれら４つの製剤を３０℃に置いた。試験２、６、７、８、１０、及び１２日目において、３０℃の製剤及び４℃のＡＭＰＤを取り出し、室温に平衡化した。試験後、ボトルを保管温度に戻した。５．０ｍｇ．ｍＬ以下のポリマーに結合したボロン酸を添加すると、シグナルＲＬＵに著しい影響を与えることなくバックグラウンドＲＬＵを低減したが、５ｍｇ／ｍＬでさえも安定性に改善はみられなかった（データ不図示）。
【０３１９】
実施例１２．ＡＭＰＤ−１０中の４−トリルボロン酸の安定性試験
ＡＭＰＤ−１０にそれぞれ０．０５、０．２５、１．０ｍＭの４−トリルボロン酸（４−ＴＢＡ）を添加することによって３つの製剤を調製した。製剤Ａ：２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）バッファ（０．１Ｍ、ｐＨ９．７）中ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（Ｍｗ＝３５Ｋ、１．０ｇ／Ｌ）、ＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、及びルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）。
【０３２０】
対照としてのＡＭＰＤ−１０と共にこれら製剤を８ｍＬの琥珀色ＨＤＰＥボトルに入れ、３０及び４℃に置き、様々な日に試験して３０℃を４℃と比較した。表２６は、３０℃対４℃から得られたシグナルＲＬＵの変化率として安定性を示す。
【０３２１】
【表２６】
2019530429.tif 000051
【０３２２】
４−ＴＢＡが溶解しているＡＭＰＤ−１０は、ＡＭＰＤ−１０対照に対して若干の改善を示した。
【０３２３】
実施例１３．４−トリルボロン酸及びｐ−クレゾールを添加したＡＭＰＤ−１０の安定性試験
追加の候補バックグラウンド低減剤を含有するＡＭＰＤ−１０を用いてアイソクロナス試験を行った。本発明の３つの基質製剤を試験した：ＡＭＰＤ−１０（ＤＬＳ０８１１１４）、０．０５ｍＭ  ｐ−クレゾールを含むＡＭＰＤ−１０、及び０．０５ｍＭ  ４−トリルボロン酸（４−ＴＢＡ）を含むＡＭＰＤ−１０。これら製剤を８ｍＬ琥珀色ＨＤＰＥボトルに入れた。ボトルを４℃から取り出し、様々な日数３０℃に置いて、３０℃で様々な時間保管した製剤を得た。３７℃（３０分間平衡）でＢＭＧにおいてＡＰの存在下でＲＬＵを読み取ることによって同じプレートでこれら製剤を試験した。０、１、２、３、６、及び９日目に安定性を判定した。各製剤の平均シグナル及びバックグラウンドＲＬＵを表２７Ａ〜２７Ｃに示す。
【０３２４】
【表２７Ａ】
2019530429.tif 000052
【０３２５】
【表２７Ｂ】
2019530429.tif 000053
【０３２６】
【表２７Ｃ】
2019530429.tif 000054
【０３２７】
図１０Ａは、９日間モニタリングしたＡＭＰＤ−１０−対照シグナルＲＬＵを示す。−０．３２％／日の１日あたりの元のシグナル強度の喪失の勾配を示した。
【０３２８】
図１０Ｂは、ＡＭＰＤ−１０−ｐ−クレゾールが、−０．８７％／日の元のシグナル強度の喪失の勾配を示したことを示す。
【０３２９】
図１０Ｃは、ＡＭＰＤ−１０−４−ＴＢＡが、−０．０２％／日の１日あたりの元のシグナル強度の喪失の勾配を示したことを示す。
【０３３０】
４−トリルボロン酸（４−ＴＢＡ）では安定性及びＳ／Ｎの改善が示されたが、４−クレゾールではみられなかった。０．０５ｍＭ  ４−ＴＢＡ基質製剤を含むＡＭＰＤ−１０は、ＡＭＰＤ−１０−対照よりも約２５〜３０％低いシグナルＲＬＵ、及び約４５〜５０％低いバックグラウンドＲＬＵを示した。ＡＭＰＤ−１０−対照製剤と比べて、この試験方法下ではＡＭＰＤ−１０−４−ＴＢＡ  ０．０５ｍＭ基質製剤で著しい安定性の改善が観察された。
【０３３１】
実施例１４．代替バックグラウンド低減剤
以下の組成物を用いて、様々な追加のバックグラウンド低減剤（ＢＲＡ）の試験を実施した：ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、０．１Ｍ  ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）バッファ（ｐＨ９．７）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（Ｍｗ＝３５，０００、１．０ｇ／Ｌ）、ＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）、及び表２８に示される指定濃度のＢＲＡ。
【０３３２】
【表２８】
2019530429.tif 000055
ＳＳ：亜硫酸ナトリウム；ＳＢＳ：重亜硫酸ナトリウム；ＳＭＢＳ：メタ重亜硫酸ナトリウム；ＢＨＴ：ジブチルヒドロキシトルエン
【０３３３】
バックグラウンドＲＬＵ及びシグナルＲＬＵを、表２８中の対照１０ｍｇ／Ｌ  亜硫酸ナトリウムと比較した。漸増濃度のＳＢＳ又はＳＭＢＳを使用すると、バックグラウンドが低くなっただけでなく、シグナルも若干減少した。
【０３３４】
ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、０．１Ｍ  ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）バッファ（ｐＨ９．７）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（Ｍｗ＝３５，０００、１．０ｇ／Ｌ）、ＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）、及び指定濃度のＢＲＡを用いて、様々なＢＲＡを含有する典型的な組成物の安定性を実施した。３０℃で保管中のシグナル変化率（％）を表２９に示す。
【０３３５】
【表２９】
2019530429.tif 000056
【０３３６】
また、ＢＲＡは、Ａｒ−Ｂ（ＯＨ）２（式中、Ａｒは、フェニル、置換フェニル、ヘテロ原子であり得るか若しくはヘテロ原子を含み得る縮合芳香環系、又はヘテロ原子であり得るか若しくはヘテロ原子を含み得る置換縮合芳香環系である）の一般化学構造を有するものから選択されるアリールボロン酸を含む。亜硫酸、重亜硫酸、及びメタ重亜硫酸の塩と組み合わせて使用するとき、実施例１０に示すように、これらアリールボロン酸は、改善されたＳ／Ｎ比及び安定性を含む更なる効果をもたらす。
【０３３７】
実施例１５．ＡＭＰＤバッファ中の様々な量のＣＰＡによる安定性。
ＡＭＰＤバッファ中の様々な量のＣＰＡによる３０℃における製剤安定性試験を実施した。以下のとおり製剤を調製した：ＡＭＰＤバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ９．７）中ＣＰＡ（様々な濃度）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）。３０℃で１５日間後の１日あたりのシグナル変化率％として１５日間後の結果を表３０に示す。
【０３３８】
【表３０】
2019530429.tif 000057
【０３３９】
実施例１６．ＴＲＩＳバッファ中の様々な量のＣＰＡによる安定性
ＴＲＩＳバッファ中の様々な量のＣＰＡによる３０℃における製剤安定性を決定した。以下から製剤を調製した：ＴＲＩＳバッファ（０．３Ｍ、ｐＨ９．２）中ＣＰＡ（様々な濃度）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）。３０℃で１５日間後の１日あたりのシグナル変化率％として１５日間後の結果を表３１に示す。
【０３４０】
【表３１】
2019530429.tif 000058
【０３４１】
各ＣＰＡ濃度において、表３０のＡＭＰＤ製剤は、表３１のＴＲＩＳ製剤よりも安定であった。
【０３４２】
実施例１７．ＴＲＩＳバッファ中の様々なＰＥＧによる製剤安定性
ＴＲＩＳバッファ中様々なポリ（エチレングリコール）を用いて３０℃で１４日間の製剤安定性試験を実施した：ＴＲＩＳバッファ（０．３Ｍ、ｐＨ８．８）中ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、上に指定したＰＥＧ及びＳＤＳ。結果を表３２に示す。
【０３４３】
【表３２】
2019530429.tif 000059
【０３４４】
実施例１８．様々なアニオン性界面活性剤による３０℃における製剤安定性
ＳＤＳ又はＳＴＳを含む製剤を以下のとおり調製した。製剤−ＳＤＳ：ＡＭＰＤバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ９．７）中ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）。製剤−ＳＴＳ：ＡＭＰＤバッファ（０．１Ｍ、ｐＨ９．７）中ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＴＳ（０．５ｇ／Ｌ）。２９日間後の評価の結果を表３３に示す。
【０３４５】
【表３３】
2019530429.tif 000060
【０３４６】
ＳＴＳ基質製剤は、対応するＳＤＳ製剤よりも高い安定性を示した。
【０３４７】
実施例１９．ＡＭＰＤバッファ中のＳＴＳによる３０℃における製剤安定性
表３４に示す様々なモル濃度のＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）中ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＴＳ（０．５ｇ／Ｌ）を含むＡＭＰＤバッファ中で、３０℃における基質製剤安定性試験を実施した。
【０３４８】
【表３４】
2019530429.tif 000061
【０３４９】
１２日目におけるＲＬＵ％としてのシグナル変化は、２５ｍＭ〜２００ｍＭのＡＭＰＤバッファのモル濃度にわたってかなり一貫していた。
【０３５０】
実施例２０．様々なｐＨにおけるＡＭＰＤ中のＳＴＳによる安定性
様々なｐＨのＡＭＰＤバッファ中３０℃で製剤安定性試験を実施した。表３５に示す様々なｐＨの０．１Ｍ  ＡＭＰＤバッファ中ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、ルシゲニン（３．２６ｍｇ／Ｌ）、ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、及びＳＴＳ（０．５ｇ／Ｌ）。
【０３５１】
【表３５】
2019530429.tif 000062
【０３５２】
９．６３〜９．８５のより高いｐＨでは安定性がより高くなる傾向が示された。
【０３５３】
実施例２１．代替カチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）
Ｎ，Ｎ’−ジメチルビアクリジニウムジニトレート（一般的にルシゲニンとして知られている）のような１つのカチオン性電荷又は２つのカチオン性電荷のいずれかを有するアクリジニウム化合物が、特に好ましいＣＡＣである。表３６に示すように製剤中で様々な代替ＣＡＣを試験した。
【０３５４】
【表３６】
2019530429.tif 000063
【０３５５】
表３６に示すように、ルシゲニンは、試験したＣＡＣの中で最も高いＩｍａｘを示した。
【０３５６】
実施例２２．様々な量のルシゲニンを含む製剤
安定性、バックグラウンド、及びシグナル強度に対する様々な量のルシゲニンの効果を判定するために、０．３Ｍトリスバッファ（ｐＨ９．２）中にＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、３５Ｋ  ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、ＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）を含む試験組成物を、表３７に示すように様々な量のＣＡＣルシゲニンを用いて調製した。バックグラウンド及びシグナルのＲＬＵを表３７に示すように評価した。最も高いＣＡＣ濃度において、バックグラウンドが高くなり、Ｓ／Ｎが若干低下する傾向がみられた。
【０３５７】
【表３７】
2019530429.tif 000064
＊Ｔｕｒｎｅｒ  ２０／２０及びＳｐｅｃｔｒａＭａｘ−Ｌからそれぞれ得られたバックグラウンドＲＬＵ及びシグナルＲＬＵ
【０３５８】
０．６×、０．７×、１×、及び１．３×ルシゲニンを含有する試験組成物を調製し、１×ルシゲニン＝３．２６ｍｇ／Ｌを含む組成物と比較した。他の成分は、ＣＰＡ（０．１５ｇ／Ｌ）、３５Ｋ  ＰＥＧ（１．０ｇ／Ｌ）、ＳＤＳ（０．９ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（１０ｍｇ／Ｌ）、及び０．１Ｍ  ＡＭＰＤバッファ（ｐＨ９．７）であった。０．６×（１．９６ｍｇ／Ｌ）、０．７×（２．２８ｍｇ／Ｌ）、１×（３．２６ｍｇ／Ｌ）、及び１．３×（４．２４ｍｇ／Ｌ）ルシゲニンを含む製剤を、安定性試験で評価した。各製剤を４℃及び３０℃で保管し、４時点で試験した。３０℃における０．６×、０．７×、１×、及び１．３×ルシゲニンを含む基質製剤の安定性を、図１１における対応する４℃のサンプルに対する性能率として示す。図中、Ａは、勾配（０．６×）＝０．３２％／日であり、Ｂは、勾配（０．７×）＝０．３５％／日であり、Ｃは、勾配（１×）＝０．３４％／日であり、Ｄは、勾配（１．３×）＝０．４０％／日である。より高いＣＡＣ濃度において安定性が低下する傾向がみられた。
【０３５９】
実施例２３．高速基質製剤は、最初の結果が出るまでの時間を短縮する。
０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡ、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．１Ｍ  ＡＭＰＤ（ｐＨ９．７）バッファ系を含む試験基質製剤を調製した。
【０３６０】
様々な分析物を定量的に測定するための製造業者のプロトコルに従って改良型自動ＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＩ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  ５３０（登録商標）（Ａｃｃｅｓｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅカタログ番号８１９０６、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）の代替物として試験基質製剤を２３種の自動アッセイで使用した：ＴＳＨ−ｆａｓｔ、ＴＳＨ−Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（チロトロピン、ｈＴＳＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｒｅｆ．３３８２０）、ＦＴ４（Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｏｔａｌ  Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ（Ｔ４）Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ３３８００）、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（Ａｃｃｅｓｓ  Ｆｅｒｒｉｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｒｅｆ．３３０２０）、ＡｃｃｕＴｎＩ（Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ（ｃＴｂＩ）Ｒｅａｇｅｎｔ、３３３４０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＶｉｔＢ１２（Ａｃｃｅｓｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ３３０２０）、ＰＳＡ（Ａｃｃｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ  ＰＳＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ３７２００）、ＦＯＬ（Ａｃｃｅｓｓ  Ｆｏｌａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａ９８０３２）、ＦＴ３（Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｏｔａｌ  Ｔ３  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ３３８３０）、ＴＢｈＣＧ２（Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏｔａｌ  ｂｅｔａ  ｈｕｍａｎ  Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ，ｈＣＧ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａ８５２６４）、ＣＫ−ＭＢ（Ａｃｃｅｓｓ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ−ＭＢ  Ｒｅａｇｅｎｔ、３８６３７１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、ＢＮＰ２（Ａｃｃｅｓｓ  Ｂ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ、９８２００；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）；ＡＦＰ（Ａｃｃｅｓｓ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅａｇｅｎｔ、３３２１１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、ＣＥＡ２（Ａｃｃｅｓｓ  Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、３３２００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｄｉｌ−ｈＣＧ２（Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏｔａｌ  ｂｅｔａ  ｈｕｍａｎ  Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、３３５００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）；ｈＦＳＨ（Ａｃｃｅｓｓ  ｈｕｍａｎ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ、３３５２０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、ＰＴＨ（ＩＯ）（Ａｃｃｅｓｓ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ｉｎｔａｃｔ−Ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅモード、インサートＡ３８４１２Ｂ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、ＰＴＨ  ｒｏｕｔｉｎｅ（Ａｃｃｅｓｓ  ｉｎｔａｃｔ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａ１６９７２、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、ｈＬＨ（Ａｃ��ｅｓｓ  ｈｕｍａｎ  Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ、３３５１０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｔｅｓｔｏ（Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ、３３５６０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、Ｃｏｒｔｉｓｏｌ（Ａｃｃｅｓｓ  Ｃｏｒｔｉｓｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ、３３６００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｅ２（Ａｃｃｅｓｓ  Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ、３３５４０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、及びＩｎｈｉｂｉｎＡ（Ａｃｃｅｓｓ  Ｉｎｈｉｂｉｎ  Ａ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａ３６０９７、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）。
【０３６１】
標準的なＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０アッセイ基質と比べて、試験基質製剤を用いて各自動アッセイにおける結果が出るまでの時間を判定した。結果を図１３に示す。
【０３６２】
本発明の基質製剤は、図１３に示すように、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ（登録商標）５３０基質製剤と比べて、自動アッセイにおいて結果が出るまでの時間が１０〜４１％短縮された。図１３に示すように、上位２３種のアッセイのうちの８種において本発明の基質製剤を使用すると、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０アッセイ基質系と比べて、最初の結果が出るまでの時間が少なくとも３０％節約された。上位２３種のアッセイで節約された時間率％を図１３にグラフで示す。
【０３６３】
実施例２４．代表的な自動イムノアッセイ。
以下のプロトコルは、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）酵素を検出するために、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０を本基質製剤で置換するのに好適な自動イムノアッセイの代表的なものである。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、本質的に検出可能であるか又はコンジュゲートした検出可能なホスファターゼ酵素などのシグナル生成系に共有結合している検出可能なラベル（例えば、Ｆｒｅｅ  Ｔ４については競合イムノアッセイにおけるＴ４−ＡＬＰ又はＴ３−ＡＬＰ）は、捕捉リガンド（例えば、Ｔ４特異的モノクローナル抗体）に対する結合について分析物（例えば、流体サンプル中のＦｒｅｅ  Ｔ４）と競合する。
【０３６５】
この例では、Ａｃｃｅｓｓ  Ｆｒｅｅ  Ｔ４アッセイ（ＢＣＩ）は、２段階酵素イムノアッセイである。ＢＣＩのＡｃｃｅｓｓ  Ｆｒｅｅ  Ｔ４アッセイシステム（ＢＣＩ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して、被験体の血清又は血漿中のタンパク質に結合していない遊離チロキシンの濃度を測定する。ビオチンにカップリングしているモノクローナル抗チロキシン（Ｔ４）抗体（ＢＣＩ）、Ｔ４を含有する生体サンプル、安定化剤を含有する緩衝されたタンパク質溶液、及びストレプトアビジンでコーティングされた固相を反応容器に添加する。この第１のインキュベート中、ビオチンにカップリングしている抗Ｔ４抗体は、固相及びサンプル中の遊離Ｔ４に結合する。反応容器内でインキュベートした後、固相に結合している材料は磁場に保持されるが、結合していない材料は洗い流される。
【０３６６】
次に、緩衝されたタンパク質溶液及びトリヨードチロニン（Ｔ３）−アルカリホスファターゼコンジュゲートを反応容器内に添加する。Ｔ３−アルカリホスファターゼコンジュゲートは、空の抗Ｔ４抗体結合部位に結合する。反応容器内でインキュベートした後、固相に結合している材料は磁場に保持されるが、結合していない材料は洗い流される。
【０３６７】
そして、化学発光基質Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ（登録商標）５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，ＭＩ））又は本発明の基質製剤を容器に添加し、反応によって生成される光を照度計で測定する。光生成は、サンプル中の遊離Ｔ４の濃度に逆比例する。サンプル中の分析物の量は、保存された多点較正曲線から決定される。血清及び血漿（ヘパリン）が、推奨サンプルである。
【０３６８】
ＢＣＩのＡｃｃｅｓｓ  Ｆｒｅｅ  Ｔ４  Ａ３３０７０Ａアッセイキットは、Ａｃｃｅｓｓ  Ｆｒｅｅ  Ｔ４  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋカタログ番号３３８８０：１００回測定、２パック、５０試験／パックを含む。これは、使用準備が整った状態で提供される。試薬パックは、以下の試薬Ａ〜Ｅを含んでいる。
【０３６９】
試薬Ａ：タンパク質（トリ）、界面活性剤、０．１２５％  ＮａＮ３、及び０．１２５％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手可能）を含むＴＲＩＳバッファ中のストレプトアビジンでコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）常磁性粒子。
【０３７０】
試薬Ｂ：タンパク質（トリ）、界面活性剤、＜０．１％  ＮａＮ３、及び０．１％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００を含むＴＲＩＳ緩衝整理食塩水。
【０３７１】
試薬Ｃ：タンパク質（トリ）、界面活性剤、０．１２５％  ＮａＮ３、及び０．１２５％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００を含むＴＲＩＳ緩衝整理食塩水。
【０３７２】
試薬Ｄ：タンパク質（トリ）、界面活性剤、＜０．１％  ＮａＮ３、及び０．１％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００を含むＴＲＩＳバッファ中トリヨードサイロニン−アルカリホスファターゼ（ウシ）コンジュゲート。
【０３７３】
試薬Ｅ：タンパク質（トリ及びマウス）、界面活性剤及び安定剤、＜０．１２５％  ＮａＮ３、並びに０．１２５％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＴＲＩＳバッファ中のビオチンにカップリングしているマウスモノクローナル抗チロキシン（Ｔ４）。
【０３７４】
第１の反応は、反応容器に以下を逐次添加することを含む：
１）５０μＬの試薬Ｅ、
２）３０μＬの分析物含有サンプル、
３）３０μＬのシステム洗浄バッファ、
４）３０μＬの試薬Ｂ、
５）５０μＬの試薬Ａ。
【０３７５】
インキュベート期間及び反応容器の洗浄後、第２の反応は、反応容器に以下を逐次添加することを含む：
６）２２０μＬの試薬Ｃ、
７）５０μＬの試薬Ｄ、
８）８０μＬのシステム洗浄バッファ、
９）インキュベート、
１０）ＬｕｍｉＰｈｏｓ−５３０又は本発明の基質製剤の添加、
１１）６．３分間のインキュベート、
１２）検出。
【０３７６】
インキュベート及び反応容器の洗浄後、サンプル中の遊離分析物の濃度を検出系を用いて測定する。
【０３７７】
実施例２５．３０℃におけるＰＥＧ  ３５Ｋによる製剤安定性
０．３Ｍトリス（ｐＨ８．８）、３．２６ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（３５Ｋ）、０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、及び０．１５ｇ／Ｌ  ＣＰＡを含む基質製剤を調製した。３０℃における基質製剤の安定性を判定した。劣化プロファイルを図１２に示す。０．９ｇ／Ｌ  ＳＤＳと共にＰＥＧ  ３５Ｋを含む組成物について、勾配は、３０℃において１日あたり−０．５％であると決定され、ｐ値は＜０．００１であった。
【０３７８】
実施例２６．様々な化学発光化合物Ｉを含む追加製剤
式Ｉの様々な化合物を用いて２つの基質製剤を調製した。第１の製剤は、ＡＰＳ−５と共に使用される先行技術の系に基づいており、１ｇ／Ｌ  ＳＤＳ、１ｇ／Ｌ  Ｔｗｅｅｎ−２０、３．２５ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウムを含有する０．３Ｍトリス（ｐＨ９．３５）を含有していた。第２の製剤は、本発明に基づいており、０．５ｇ／Ｌ  ＳＴＳ、１ｇ／Ｌ  ＰＥＧ（Ｍｗ＝３５，０００）、３．２５ｍｇ／Ｌルシゲニン、１０ｍｇ／Ｌ亜硫酸ナトリウムを含有する０．１Ｍ  ＡＭＰＤ（ｐＨ９．７０）を含んでいた。以下に示す様々な化学発光化合物Ｉを、０．１５ｇ／Ｌの各バッファの２００ｍＬのアリコートに添加した。
【０３７９】
【化１７】
2019530429.tif 000065
【０３８０】
各製剤を半分の約１００ｍＬずつに分け、一方を約５℃で維持し、他方を約３０℃で保持した。
【０３８１】
材料を２週間にわたって定期的に試験し、２つの保管条件間のシグナルＲＬＵの相対変化を測定した。酵素／温度／日に関連するばらつきを減らすために、２つの温度で保管されたサンプルを比較することによって、９６ウェルプレートで製剤を試験した。機器において３７℃で３０分間サンプルをインキュベートした。２０μＬの酵素（１ｍＬのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｈｅｃｋ  ＡＬＰを６４０ｍＬのＳａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒと混合することによって調製される）を２００μＬの製剤に注入した。ＡＬＰ溶液の注入後約２９秒で速度シグナルを測定した。各バッファ／温度／時点について１５〜１６データ点（ウェル）を測定した（ウェルＡ１は、注入体積がばらつくため除外する）。データを線形回帰でプロットし、３０℃における表３８に示すような１日あたりの喪失率％として勾配を報告した。
【０３８２】
【表３８】
2019530429.tif 000066
【０３８３】
ＡＭＰＤバッファ系で調製された製剤は、ＴＲＩＳ−Ｔｗｅｅｎバッファ系における対応する製剤よりも少ないシグナル喪失を示した。
【図１】
2019530429.tif 000075
【図２】
2019530429.tif 000076
【図３】
2019530429.tif 000077
【図４】
2019530429.tif 000078
【図５】
2019530429.tif 000079
【図６Ａ】
2019530429.tif 000080
【図６Ｂ】
2019530429.tif 000081
【図６Ｃ】
2019530429.tif 000082
【図６Ｄ】
2019530429.tif 000083
【図６Ｅ】
2019530429.tif 000084
【図６Ｆ】
2019530429.tif 000085
【図６Ｇ】
2019530429.tif 000086
【図６Ｈ】
2019530429.tif 000087
【図６Ｉ】
2019530429.tif 000088
【図６Ｊ】
2019530429.tif 000089
【図７】
2019530429.tif 000090
【図８】
2019530429.tif 000091
【図９Ａ】
2019530429.tif 000092
【図９Ｂ】
2019530429.tif 000093
【図９Ｃ】
2019530429.tif 000094
【図１０Ａ】
2019530429.tif 000095
【図１０Ｂ】
2019530429.tif 000096
【図１０Ｃ】
2019530429.tif 000097
【図１１】
2019530429.tif 000098
【図１２】
2019530429.tif 000099
【図１３】
2019530429.tif 000100
【国際調査報告】
2019530429.tif 000101
2019530429.tif 000102
2019530429.tif 000103