(57)【要約】  ＰＩＫ３ＣＡ関連５過成長症候群の処置のための本発明の方法の要約。本発明は、ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長症候群（ＰＲＯＳ）、とりわけ、先天的脂肪腫性過成長−血管奇形−表皮母斑−脊椎／骨格奇形及び／又は脊椎側湾症（ＣＬＯＶＥＳ）１０症候群を処置する方法に関する。今日まで、ＰＲＯＳ患者のための具体的な処置は存在せず、当該障害の生理病理学をより良好に理解するためのＰＲＯＳの動物モデルも存在しない。本発明者らは、ヒトの疾患を再現するＰＲＯＳの遺伝マウスモデルを開発し、ＢＹＬ７１９の有効性を証明した。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ＢＹＬ７１９を使用して、重篤なＣＬＯＶＥＳ症候群を有する２名の患者（１名は成人、１名は小児）を処置した。当該薬剤は、全ての冒された臓器の急速な回復を誘引して、２名の患者１５における疾患に堅牢な有効性を有した。このため、本発明は、ＰＲＯＳの処置を必要とする対象においてＰＲＯＳを処置する方法であって、この対象に治療上有効量のＢＹＬ７１９を投与する工程を含む、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長症候群（ＰＲＯＳ）の処置を必要とする対象においてＰＲＯＳを処置する方法であって、この対象に治療上有効量のＢＹＬ７１９を投与する工程を含む、
方法。
【請求項２】
ＰＲＯＳ障害が、先天的脂肪腫性過成長−血管奇形−表皮母斑−脊椎／骨格奇形及び／又は脊椎側湾症（ＣＬＯＶＥＳ）症候群である、請求項１記載の処置方法。
【請求項３】
ＰＲＯＳ障害が、クリッペル−トレノニー症候群である、請求項１記載の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長症候群（ＰＲＯＳ）、例えば、先天的脂肪腫性過成長−血管奇形−表皮母斑−脊椎／骨格奇形（ＣＬＯＶＥＳ）の処置のための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長症候群についての「ＰＲＯＳ」という用語は、巨指症、ＦＡＯ、ＨＨＭＬ、ＣＬＯＶＥＳ及び関連する巨脳症を含めた体性ＰＩＫ３ＣＡ変異に関連する公知及び新しい臨床実体の両方を包含すると定められている（Keppler-Noreuil et al 2014）。ＰＩＫ３ＣＡ関連体性過成長障害を有する患者の診断及び処置に関する合意文書を議論し、発展させるためのワークショップが国立衛生研究所（ＮＩＨ）において召集された。
【０００３】
ＣＬＯＶＥＳは、先天的脂肪腫性過成長−血管奇形−表皮母斑−脊椎／骨格奇形及び／又は脊椎側湾症を表わす。この症候群は、稀な障害と考えられ、進行性の複雑で混合性の体幹血管奇形、調節不全の脂肪組織、種々の度合いの脊椎側湾症及び進行性の骨格過成長を伴わない骨格構造肥大により特徴付けられる（Sapp et al 2007；Alomari et al 2009）。この症候群は、ガンとは異なる。実際に、ＣＬＯＶＥＳ症候群では、腫瘍は良性であり、組織は単に過成長なだけであり、対象が変形する。ＣＬＯＶＥＳ症候群は稀であり、出生時に明らかである。ＣＬＯＶＥＳ症候群は、人種又は民族に関わらず、男性及び女性に等しく影響を及ぼす。この症候群を有する患者の多くは誤診されてしまう。
【０００４】
ＣＬＯＶＥＳ症候群は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における体性モザイク変異により生じる。ＰＩＫ３ＣＡは、ＰＩ３Ｋの１１０-kD触媒性アルファサブユニットをコードし、ＰＩ３Ｋは、チロシンキナーゼレセプターリガンド結合に応じて活性化され、ホスファチジルイノシトール（３，４）−ビスホスファート（ＰＩＰ２）をホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスファート（ＰＩＰ３）に変換する。ＰＩＫ３ＣＡにおける活性化変異により、幾つかの種類のガンが説明されているが、ＣＬＯＶＥＳ症候群は説明されていない。２０１２年に、Kurek et alによって、ＤＮＡ又はＲＮＡを配列決定することによりＰＩＫ３ＣＡにおける活性化変異が特定された。しかしながら、今日において、ＣＬＯＶＥＳ症候群のための治癒は存在しない。
【０００５】
Limaye et al 2015には、ＰＩＫ３ＣＡにおける体性変異は、ガン、過成長症候群及びリンパ奇形（ＬＭ）に関与することが開示されている。とりわけ、著者らにより、健康なドナー（ＰＲＯＳを患っていない）から得られ、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と呼ばれ、変異ＰＩＫ３ＣＡによりレトロウイルストランスフェクションされた培養細胞系統が、ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣ経路の活性化を有することが示された。薬剤ＢＹＬ７１９は、予測されたとおり、この人工的なモデルにおいて、ＰＩＫ３ＣＡ変異体誘引ＡＫＴリン酸化を無効にした。このことから、これらのタンパク質が同じシグナル伝達経路に関与していることが示される。ただし、このｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、ＰＲＯＳ患者に関連する任意の症候又は疾患の表現型を再現しておらず、とりわけ、この薬剤がＰＲＯＳを患う患者を処置するのに使用することができるという、証拠を何ら示していない。このため、ＰＲＯＳ、とりわけ、ＣＬＯＶＥＳ症候群又はクリッペル−トレノニー症候群を有する患者におけるＢＹＬ７１９の使用を理解する必要性が存在する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＰＲＯＳの処置を必要とする対象においてＰＲＯＳを処置する方法であって、この対象に治療上有効量のＢＹＬ７１９を投与する工程を含む、方法に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲により定義される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】ＰＲＯＳのマウスモデルの特徴決定及びＢＹＬ７１９の有効性。
【図１Ｂ】ＰＲＯＳのマウスモデルの特徴決定及びＢＹＬ７１９の有効性。
【図１Ｃ】ＰＲＯＳのマウスモデルの特徴決定及びＢＹＬ７１９の有効性。
【図２Ａ】重篤なＣＬＯＶＥＳ症候群を有する成人患者におけるＢＹＬ７１９の有効性。
【図２Ｂ】重篤なＣＬＯＶＥＳ症候群を有する成人患者におけるＢＹＬ７１９の有効性。
【図３】重篤なＣＬＯＶＥＳ症候群を有する小児患者におけるＢＹＬ７１９の有効性。
【０００８】
発明の詳細な説明
Novartisにより合成されたＢＹＬ７１９は、進行した固体腫瘍についての第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験中である。本発明者らは、ヒトの疾患を再現するＰＲＯＳの初めての遺伝マウスモデルを開発し、このＰＲＯＳマウスにおいて、全ての臓器機能不全を予防し、改善するのにおける、ＰＩＫ３ＣＡの薬理学的阻害剤であるＢＹＬ７１９の有効性を証明した。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ＢＹＬ７１９を使用して、重篤なＣＬＯＶＥＳ症候群を有する２名の患者（１名は成人、１名は小児）を処置した。この薬剤は、全ての冒された臓器の急速な回復を誘引して、２名の患者における疾患に堅牢な有効性を有した。以前に、難治性の血管腫瘍収縮、うっ血性心不全が完全に回復し、片側肥大が減少し、脊椎側湾症弱まった。この薬剤は、著しい副作用に何ら関連しなかった。まとめると、本研究は、ＰＲＯＳ患者における有望な治療剤としてのＰＩＫ３ＣＡ阻害を支持する初めての直接的な証拠を提供する。
【０００９】
したがって、本発明は、ＰＲＯＳの処置を必要とする対象においてＰＲＯＳを処置する方法であって、この対象に治療上有効量のＢＹＬ７１９を投与する工程を含む、方法に関する。とりわけ、本発明は、ＣＬＯＶＥＳ症候群の処置を必要とする対象においてＣＬＯＶＥＳ症候群を処置する方法であって、この対象に治療上有効量のＢＹＬ７１９を投与する工程を含む、方法に関する。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「処置すること」又は「処置」という用語は、予防的又は防止的処置及び治癒的又は疾患改変処置の両方を指し、疾患にかかるリスクにある対象又は疾患にかかっている疑いがある対象及び病気であるか、もしくは、疾患もしくは健康状態を患っていると診断された対象の処置を含み、臨床的逆行の抑制を含む。処置は、医療的障害を有する対象又は最終的に障害を取得してしまうおそれがある対象に、障害を予防し、治癒し、同障害の１つ以上の症候の開始を遅延させ、同症候の重症度を低下させ、もしくは、同症候を軽減し又は障害を回復させるために、又は、このような処置の不存在において予測されるのを超えて対象の生存を伸ばすために、適用することができる。「治療計画」は、疾患の処置パターン、例えば、治療中に使用される投与パターンを意味する。治療計画は、誘引計画及び維持計画を含むことができる。「誘引計画」又は「誘引期間」という表現は、疾患の初期処置に使用される治療計画（又は治療計画の一部）を指す。誘引計画の一般的な目的は、処置計画の初期の間に、高レベルの薬剤を対象に提供することである。誘引計画は、「負荷計画」を（部分的又は全体的に）利用することができ、同負荷計画は、臨床医が維持計画中に利用するであろうより多くの用量の薬剤を投与すること、臨床医が維持計画中に薬剤を投与するであろうより高頻度に薬剤を投与すること、又は両方を含むことができる。「維持計画」又は「維持期間」という表現は、疾患の処置中に対象を維持するのに、例えば、長期間（数ヶ月又は数年）対象を軽減に維持するのに使用される治療計画（又は治療計画の一部）を指す。維持計画は、連続的な治療（例えば、薬剤を規則的な間隔、例えば、毎週１回、毎月１回、１年に１回等で投与すること）又は断続的な治療（例えば、中断された処置、断続的な処置、逆行時の処置又は特定の所定の評価基準［例えば、疼痛、疾患症候等］の達成による処置）を利用することができる。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「ＰＲＯＳ」という用語は、ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長症候群を指す。ＰＲＯＳは、線維脂肪過成長（ＦＡＯ）、巨頭症−毛細血管奇形（ＭＣＡＰ）症候群、胴体、リンパ、毛細血管、静脈の先天的脂肪腫性非対称過成長及び混合型血管奇形−表皮母斑−骨格及び脊椎奇形（ＣＬＯＶＥＳ）症候群並びに半身過形成多発性脂肪性腫瘍（ＨＨＭＬ）及びクリッペル−トレノニー症候群等の一群の障害である。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「線維脂肪過成長（ＦＡＯ）」という用語は、骨格過成長を伴う、皮下、筋肉及び内蔵の線維脂肪組織の体節進行性過成長の主要所見により特徴付けられる症候群を指す（Lindhurst et al 2012）。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「巨頭症−毛細血管奇形（ＭＣＡＰ）症候群」という用語は、（１）低血圧、脳卒中及び中程度〜重篤な知的障害の神経学的所見に関連する巨頭症（ＭＥＧ）又は半巨頭症（ＨＭＥＧ）並びに（２）在局型又は全身型体性過成長を伴う皮膚毛細血管奇形の主要所見により特徴付けられる症候群を指す（Mirzaa et al 2013）。
【００１４】
特定の実施態様では、ＰＲＯＳ障害は、ＣＬＯＶＥＳである。本明細書で使用する場合、「ＣＬＯＶＥＳ」という用語は、先天的脂肪腫性過成長−血管奇形−表皮母斑−脊椎／骨格奇形及び／又は脊椎側湾症を指す。この症候群は、複雑な先天性過成長（典型的には、体幹脂肪腫性塊として現れる）を示す脂肪腫性組織及び血管とリンパ奇形との組み合わせにより特徴付けられる。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「半身過形成多発性脂肪性腫瘍（ＨＨＭＬ）」という用語は、非対称な非進行性過成長、多発性脂肪腫瘍及び表面血管奇形により特徴付けられる症状を指す（BG et al 2013）。
【００１６】
特定の実施態様では、ＰＲＯＳ障害は、クリッペル−トレノニー症候群である。本明細書で使用する場合、「クリッペル−トレノニー症候群」という用語は、血管及び／又はリンパ管が適切に形成されていない、稀な先天性の医療症状を指す。
【００１７】
このため、本発明の方法を、ＰＲＯＳにおける障害のうちの１つを表わすと診断された対象に提供することができる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、任意のほ乳類、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ及び霊長類を指す。特に、本発明では、対象は、ＰＲＯＳ障害を患っているヒト又はＰＲＯＳ障害を患っていると疑われるヒトである。特定の実施態様では、対象は、ＣＬＯＶＥＳ症候群を患っているヒト又はＣＬＯＶＥＳ症候群を患っていると疑われるヒトである。特定の実施態様では、対象は、クリッペル−トレノニー症候群を患っているヒト又はクリッペル−トレノニー症候群を患っていると疑われるヒトである。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「ＢＹＬ７１９」という用語は、変異ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子により活性化されるｐ１１０αアイソフォームに選択的なＡＴＰ競合的経口ＰＩ３Ｋ阻害剤である（Furet P., et al. 2013；Fritsch C., et al 2014）。この分子は、アルペリシブとも呼ばれ、当技術分野において、下記式：
【化１】
2019505549.tif 000002
を有する。
【００２０】
「治療上有効量」は、対象に治療的利益を付与するのに必要な、最少量の活性剤を意図する。例えば、対象に対する「治療上有効量」は、障害に関連する病的な症候、疾患の進行または生理学的症状における改善又は障害で死ぬのに対する抵抗を誘引し、緩和し、又は何らかの方法で生じさせるような量である。本発明の化合物の総日量は、主治医により適切な医療的判断の範囲内で決定されるであろうことが、理解されるであろう。任意の特定の対象についての具体的な治療上有効な用量レベルは、各種の要因により決まるであろう。同要因は、処置される障害及び障害の重篤性；利用される具体的な化合物の活性；利用される具体的な組成物；対象の年齢、体重、健康全般、性別及び食事；利用される具体的な化合物の投与期間、投与経路及び排出速度；処置期間；利用される具体的な化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬剤；並びに医療分野において同様の周知の要因を含む。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要な用量より少ないレベルで、化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を多くすることは、当業者の十分な範囲内である。ただし、製品の日量は、成人１人当たり１日当たりに０．０１〜１，０００mgの広い範囲で変化させることができる。典型的には、組成物は、処置される対象に対する用量の症候的調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mg 有効成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mg 有効成分、好ましくは、１mg〜約１００mg 有効成分を含有する。有効量の薬剤は、通常、１日当たりに０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg 体重、特に、１日当たりに約０．００１mg/kg〜７mg/kg 体重の用量レベルで提供される。
【００２１】
上記されたＰＩＫ３ＣＡ阻害剤は、医薬組成物を形成するために、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば、生分解性ポリマーと組み合わせることができる。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、哺乳類、特にヒトに適切に投与された場合、有害、アレルギー又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体又は液体の充填材、希釈剤、封入材料又は配合助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与用の本発明の医薬組成物について、活性原理を、単独又は別の活性原理との組み合わせにおいて、単位投与形態において、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、経口経路形態、例えば、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル剤、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下及び鼻内投与形態並びに直腸投与形態を含む。典型的には、医薬組成物は、注入可能な製剤について薬学的に許容し得る媒体を含有する。これらは、特定の等張性で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウム等又はこのような塩の混合物）、又は、ケースバイケースで滅菌水もしくは生理食塩水の添加により、注射液の構成が可能な乾燥、特に、凍結乾燥組成物であることができる。注入用途に適した医薬形態は、無菌の水溶性液剤又は懸濁剤；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射液又は懸濁剤の即席調製用の無菌散剤を含む。全ての場合において、形態は無菌である必要があり、容易な注入性が存在する程度に流動性である必要がある。医薬形態は、製造及び保管の条件下で安定である必要があり、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用に対して保持される必要がある。遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む液剤は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースを適切に混合した水において調製することができる。分散剤も、グリセロール、液状ポリエチレングルコール及びそれらの混合物並びに油において調製することができる。保存及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。ポリペプチド（又はそれをコードする核酸）は、中性又は塩の形態で組成物に配合することができる。薬学的に許容し得る塩は、（タンパク質の遊離アミノ基と形成された）酸付加塩を含む。同酸付加塩は、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸又は有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等により形成される。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄等及び有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等から得ることができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール及び液状ポリエチレングルコール等）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることもできる。適切な流動性を、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散剤の場合に必要とされる粒子サイズの維持により及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合には、等張化剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注射組成物の延長した吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物への使用によりもたらすことができる。無菌注射液は、活性なポリペプチドを上記想定された幾つかの他の成分をと共に、適切な溶媒に必要量で包含させ、必要に応じて続けて、滅菌ろ過することにより調製される。一般的には、分散剤は、種々の無菌有効成分を基礎的な分散媒体を含有する無菌媒体及び上記想定されたものから必要とされる他の成分に包含させることにより調製される。無菌注射液の調製用の無菌散剤の場合には、好ましい調製法は、有効成分と任意の更なる所望の成分の散剤を予め滅菌ろ過したその溶液から生成する、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。配合後に、液剤は、製剤に適合可能な様式及び治療上有効な量で投与されるであろう。製剤は、各種の投与形態、例えば、上記されたある種の注射液で容易に投与される。ただし、薬剤放出カプセル剤等も利用することができる。水性液剤における非経口投与について、例えば、液剤は、必要に応じて適切に緩衝化される必要があり、液体の希釈剤をまず十分な生理食塩水又はグルコースにより等張性にする。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。この点について、利用することができる無菌水性媒体は、本開示を考慮すれば、当業者に公知であろう。例えば、ある用量を、等張性のＮａＣｌ溶液 １mLに溶解させることができ、皮下点滴流体 １０００mlに加えるか又は注入の目的部位に注射されるかのいずれかをすることができる。用量の一部の変形例が、処置される対象の症状に応じて必然的に生じるであろう。いずれにして、投与を担う人物は、個々の対象に適した用量を決定するであろう。
【００２２】
本発明は、下記図面及び実施例により更に例証されるであろう。ただし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するとは全く解釈されるべきではない。
【００２３】
図面
図１：ＰＲＯＳのマウスモデルの特徴決定及びＢＹＬ７１９の有効性。Ａ）タモキシフェン投与後のＰＩＫ３ＣＡＷＴ及びＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスのカプラン−マイヤー生存曲線。Ｂ）タモキシフェン投与後にＢＹＬ７１９で処置した又は処置しなかった、ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスのカプラン−マイヤー生存曲線。処置の４０日後に、ＢＹＬ７１９を休薬する。Ｃ）タモキシフェン投与の１０日後にＢＹＬ７１９で処置した又は処置しなかった、ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスのカプラン−マイヤー生存曲線。スケールバー１０μm。
【００２４】
図２：重篤なＣＬＯＶＥＳ症候群を有する成人患者におけるＢＹＬ７１９の有効性。Ａ）ＢＹＬ７１９開始前後での患者１の臨床パラメータ（体重、胸囲及び腹囲）。Ｂ）ＢＹＬ７１９開始前後での脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）及び血清クレアチニンレベル。
【００２５】
図３：重篤なＣＬＯＶＥＳ症候群を有する小児患者におけるＢＹＬ７１９の有効性。ＢＹＬ７１９開始前後での患者２の臨床パラメータ（大腿中央囲及び腹囲）。
【００２６】
実施例
材料及び方法  動物
この研究のために、Jackson Laboratoriesから取得したＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに、ホモ接合性Ｒ２６ＳｔｏｐＦＬＰ１１０＊（Stock# 012343）及びヘテロ接合性ＣＡＧＧＣｒｅ−ＥＲＴＭ（Stock# 004682）を挿入した。Ｒ２６ＳｔｏｐＦＬＰ１１０＊＋／−×ＣＡＧＧＣｒｅ−ＥＲＴＭ＋（ここでは、ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲと呼ばれる）及びＲ２６ＳｔｏｐＦＬＰ１１０＊＋／＋×ＣＡＧＧＣｒｅ−ＥＲＴＭ−（ここでは、ＰＩＫ３ＣＡＷＴと呼ばれる）を得た。動物に自由に食餌を与え、一定の周囲温度で１２時間の光サイクルで収容した。動物の取扱いは、the Departmental Director of 「Services Veterinaires de la Prefecture de Police de Paris」及びParis Descartes Universityの倫理委員会の承認を得た。タモキシフェンの単回用量（４０mg×kg-1）を２１日齢において経口強制栄養により投与した。生存研究のために、マウスを、タモキシフェン強制栄養後に毎日フォローした（ＰＩＫ３ＣＡＷＴ  ｎ＝１６及びＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲ  ｎ＝１６）。治療研究のために、マウスをＰＩ３ＫＣＡ阻害剤ＢＹＬ７１９（Chem Express；０．５％ カルボキシメチルセルロース（Sigma）中の５０mg×kg-1、毎日ｐ．ｏ．）又は媒体（０．５％ カルボキシメチルセルロース（Sigma）、毎日ｐ．ｏ．）により処置した。処置を予防研究（ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲ  ｎ＝１８）についてのタモキシフェン強制栄養の合間又は治療研究（ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲ  ｎ＝６）についての１０日後に開始した。ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲの媒体群において、合計６匹のマウスをタモキシフェン強制栄養後５１日目に殺処分し、予防的ＢＹＬ７１９群において、６匹のマウスをタモキシフェン強制栄養後５１日目に殺処分し、組織検査のためのＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲの治療研究において、６匹のマウスをタモキシフェン強制栄養後７０日目に殺処分した。
【００２７】
細胞培養
乳癌細胞系統Ｔ−４７ＤをSigma Aldrichから取得した。細胞を、ＤＭＥＭ＋２mM グルタミン＋１０％ 牛胎児血清（ＦＢＳ）を含む媒体において培養した。ＢＹＬ７１９実験（Chem Express）のために、細胞を、上昇する濃度のＢＹＬ７１９（０、０．５、１及び５μmol/L）で、ウェスタンブロットを行う前の２、４及び６時間処理した。各実験をダプリケートで行い、少なくとも３回繰り返した。
【００２８】
形態分析
マウス組織を４％ パラホルムアルデヒドにおいて固定し、パラフィンに包埋した。肝臓の４μm切片を過ヨウ素酸シッフ反応（ＰＡＳ）により染色した。脾臓又は肝臓の４μm切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色し、腎臓の４μm切片をマッソントリクロームにより染色した。
【００２９】
免疫組織化学及び免疫蛍光
パラフィン包埋腎臓の４μm切片を抗Ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Cell Signaling Technology, ref# 4060）、抗Ｐ−Ｓ６ＲＰ抗体（Cell Signaling Technology, ref# 5364）及び抗ＣＤ３４抗体（eBioscience, ref# 14-0341）と共にインキュベーションした。免疫蛍光研究を、共焦点顕微鏡Zeiss LSM 700を使用して分析した。
【００３０】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットを以前に記載２１されたように行った。簡潔に、肝臓、筋肉、心臓、腎臓及びＴ−４７Ｄ細胞からのタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後に、適切なメンブラン上にトランスファーし、抗Ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Cell Signaling Technology, ref# 4060）抗Ｐ−ＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）抗体（Cell Signaling Technology, ref# 13038）、抗Ｐ−Ｓ６ＲＰ抗体（Cell Signaling Technology, ref# 5364）、抗ＧＡＰＤＨ（Merck Millipore, ref#374）及び抗β−アクチン抗体（Sigma-Aldrich, ref#A2228）と共に、続けて、適切なペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と共にインキュベーションした。化学発光を、Fusion FX7カメラ（Vilbert Lourmat）を使用して取得し、密度測定を、Bio1Dソフトウェア（Certain Tech）を使用して行った。
【００３１】
患者
この研究を、the Renal Division of Necker Hospitalにおいて、２０１５年９月から開始して行った。ＣＬＯＶＥＳ症候群を有する患者は、処置開始前に臨床検査、腫瘍測定、母斑測定を有した。ＢＹＬ７１９処置を１日当たりに経口用量２５０mgで開始した。本研究を２名の患者（１名の成人及び１名の小児）について行い、Necker Hospitalにおいてフォローした。このプロトコールは、ANSMにより承認され（許可Ｎｏ５５３９８４−９８６及びＮｏ５８４０１８）、書面によるインフォームドコンセントを各患者又はその法定代理人から取得した。ＢＹＬ７１９は、Novartisにより特例で提供された。第１の患者に２５０mg/日で受けさせ、第２の患者に５０mg/日で受けさせた。ＢＹＬ７１９を毎朝朝食前に経口送達した。糖血症を２ヶ月の間は任意の食後にモニタリングし、その後、次第に間隔をあけた。
【００３２】
データ解析及び統計学
データを平均±ＳＥＭとして表現した。生存曲線をマンテル−コックス（ロングランク）検定により解析した。実験群間の差異を、ＡＮＯＶＡを使用し、続けて、テューキー−クレーマー検定により有意（Ｐ＜０．０５）であるかどうかを評価した。２つの群のみを比較した場合、マン−ホイットニー検定を使用した。統計学的解析を、Graph Prismソフトウェアを使用して行った。
【００３３】
腎機能
血清クレアチニンレベルを１年目の間は毎週及びその後は３ヶ月毎にSynchron Cx4 autoanalyzer（Beckman Coulter, Villepinte, France）を使用して測定した。糸球体ろ過速度を、ＭＤＲＤ式（ｅＧＦＲ）を使用して見積もった。
【００３４】
生検サンプル及び形態分析
腎生検標本をアルコール−ホルマリン−酢酸溶液において固定し、パラフィンに包埋した。４マイクロメートル切片を過ヨウ素酸シッフ反応（ＰＡＳ）染料、マッソントリクローム並びにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色した。電子顕微鏡分析を行った。
免疫組織化学及び免疫蛍光
パラフィン包埋腎臓の４つの切片を抗ネフリン抗体（Progen）、抗ＷＴ１抗体（Dako）、抗ポドシン抗体（Sigma）及び抗シナプトポジン抗体（Novus Biologicals）と共にインキュベーションした。総糸球体面積に応じて、各生検について、全ての糸球体切片を定量した。一次抗体を適切なAlexa 488又は555コンジュゲート二次抗体（Molecular Probes）により明らかにした。免疫蛍光染色を、Zeiss LSM 700共焦点顕微鏡を使用して可視化した。ポドサイト染色面積を、NikonデジタルカメラDx/m/1200及びImage Jソフトウェアを使用して自動的に定量し、％  ポドサイト染色面積として表現した。
【００３５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
アルコール−ホルマリン−酢酸溶液固定、パラフィン包埋組織をＰＩ３ＫＣα  ＲＮＡ発現について、先に記載されたジゴキシゲニン抗ジゴキシゲニン技術を使用してアッセイした。ニトロブルー  テトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファートトルジニウム（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ）を使用して、組織における冒された細胞を可視化した。ハイブリダイゼーションシグナルの特異性を、センスプローブを平行切片とハイブリダイゼーションさせ、アンチセンスプローブを冒されていない腎臓組織とハイブリダイゼーションさせることにより体系的に確認した。ＩＳＨ染色組織を可視化し、Olympus Proxis顕微鏡及びZeiss Axio Cam ICc1により撮影した。
【００３６】
細胞培養
ヒト繊維芽細胞を、１５％ ＦＢＳ、ペニシリン（５０IU/ml）／ストレプトマイシン（５０μg/ml）及び非必須アミノ酸（Invitrogen）を加えたＤＭＥＭにおいて増殖させた。
【００３７】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットを先に記載されたように、ヒトホスホ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）に対するウサギ抗体（Cell Signaling Technologies）を１：１０００で、続けて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ二次抗体（Dako）を１：１０，０００で使用して行った。ｐ７０  Ｓ６キナーゼのＴｈｒ３８９におけるリン酸化状態は、ｍＴＯＲリン酸化に特異的である。マウスモノクローナル抗ｂ−アクチン抗体（Sigma-Aldrich, Lyon, France）を対照として使用した。タンパク質のリン酸化レベルをｂ−アクチンの一致した密度測定値に対して正規化した。
【００３８】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡを、標準的な技術を使用して患者から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び腫瘍領域における皮膚生検から抽出した。変異スクリーニングを全てのＰＩ３ＫＣαエキソン及び隣接するイントロン領域の直接シーケンシングにより行った。
【００３９】
体積測定
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して、各腫瘍の体積を測定した。ＭＲＩをＢＹＬ７１９開始の０日目及びその後は毎月行った。簡潔に、体積を、面積測定値とスライス厚との積を合計することにより算出した。
【００４０】
データ解析及び統計学
データを平均±ＳＤとして表現した。実験群間の差異を、ＡＮＯＶＡを使用し、続けて、テューキー−クレーマー検定により有意であったかどうかを評価した。２つの群のみを比較した場合、マン−ホイットニー検定を使用した。確率値＜０．０５を統計学的に有意であると考えた。解析を、GraphPad Prism 5（GraphPad software, La Jolla, CA）により行った。
【００４１】
結果
ＢＹＬ７１９を投与された対象における過成長組織のサイズの有意な低下が観察された。１ヶ月の処置後、患者の体重は、８３．５kgから７３．５kgに減少した。この体重減少は、浮腫の劇的な減少及び全心機能速度の改善（処置前の２０１５年１２月に心拍出量が２２l/分であったのが、２月８日には８l/分と測定された）に関連した。血漿中の脳性ナトリウム利尿ペプチドレベルは、３０日目に２５００pg/分から２４０pg/分に低下した。このことから、心不全の改善が確認される。皮下腫瘍サイズは、ＣＴスキャン及び核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により評価した場合、処置後３０日で１０％の全体的な減少を示した。患者のカルノフスキー・パフォーマンスステータススケールは、３０日目において、４０から６０％に改善した。ヘモグロビンレベルは、８g/dlから１１．８g/dlに上昇した。
【００４２】
処置前に加速された加齢の表現型を示した一部の皮膚領域（左耳）は、１ヶ月のＢＹＬ７１９投与後に改善された。更に、幾つかの大きな母斑は、処置の開始後に脱色を示した。
【００４３】
ＰＲＯＳのマウスモデル
この研究をＰＲＯＳのマウスモデルを開発することにより開始した。この目的を達成するために、トランスジェニックマウス系統Ｒ２６ＳｔｏｐＦＬＰ１１０＊を利用した。これらのマウスでは、組織特異的な様式で、活性化ＰＩ３ＫＣＡヘテロ二量体の誘引性発現が可能である。Ｒ２６ＳｔｏｐＦＬＰ１１０＊マウスをＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスと交配させて、タモキシフェン投与によりＰＩＫ３ＣＡを遍在性に過剰発現するＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲ動物を発生させた。３週齢のマウスを４０mg.kg-1 タモキシフェンの単回投与により処置して、Ｃｒｅ組換えを誘引した１６。対照ＰＩＫ３ＣＡＷＴマウスと比較して、ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスがＣｒｅ誘引後３日目（Ｃｒｅ組換え後平均６日）に死に始めたのが観察された（図１Ａ）。突然生じた死亡の大部分は、検死により、腹膜内及び肝臓の出血によると明らかになった（データを示さず）。肥大性腰筋により歩行困難を表わした一部のマウスを核磁気共鳴画像法（ＭＥＩ）により評価した（データを示さず）。加えて、全身のＭＲＩから、脊椎側湾症、血管異常、腎嚢胞及び筋肥大の急速な発生が示された（図１Ｃ）。組織学的検査から、血管破壊を伴う重篤な脂肪肝（データを示さず）、脾臓の微小構造の完全性の喪失（データを示さず）、特発性出血、迷入血管を含む腎臓の線維症を含む、複数の臓器異常が明らかとなった。血管異常を更に特徴付けるために、ＣＤ３４免疫染色を行って、重篤な血管拡張の存在が確認された。予測されたとおり、ウェスタンブロット及び免疫蛍光研究から、全ての検査した臓器においてＡＫＴ／ｍＴＯＲＣ経路活性化が示された。したがって、ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスは、ヒトＰＲＯＳ表現型を再現すると結論付けられた。
【００４４】
ＢＹＬ７１９はマウスにおけるＰＲＯＳを予防し、ＰＲＯＳに有効な治療法である
ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスにおけるＢＹＬ７１９の影響を検査するのを決定した。この目的で、まず、Ｃｒｅ誘引直後に開始してＢＹＬ７１９を経口投与する予防研究を行った（データを示さず）。ＢＹＬ７１９の毎日投与により動物の生存が劇的に改善されたのが観察された（図１Ｃ）。実際に、プラセボ群における全てのＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスが２１日以内に死んだが、ＢＹＬ７１９により処置されたＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスは、明らかに正常な外観で４０日後に生きていた。重要なことには、Ｃｒｅ組換え後４０日目での処置中断により、全てのＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲ動物が死んでしまった。ＢＹＬ７１９を受けさせた数匹のＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスをＣｒｅ誘引後４０日目に殺処分した。組織学的検査から、ＢＹＬ７１９により処置されたマウスは、保存された組織（データを示さず）及び正常な血管（データを示さず）を有した。ウェスタンブロット及び免疫蛍光から、ＰＩ３ＫＣＡ活性化の阻害おけるＢＹＬ７１９の有効性が確認された（データを示さず）。
【００４５】
次に、プラセボ又はＢＹＬ７１９のいずれかをＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスにＣｒｅ誘引後１０日（マウスが死に始めた時点）で与えることにより、治療研究を行った（図１Ｃ）。Ｃｒｅ誘引後１０日目に、ＭＲＩにより、先に記載された組織異常の存在を確認した（データを示さず）。プラセボ群のマウスは翌日には死んでしまったが、ＢＹＬ７１９により、ＰＩＫ３ＣＡＣＡＧＧ−ＣｒｅＥＲマウスの生存が劇的に改善された（図１Ｊ）。処置開始後１２日目（Ｃｒｅ誘引後２２日目）に行ったＭＲＩから、脊椎側湾症、筋肥大及び血管異常の非常に急速な改善が証明された（データを示さず）。組織学的分析から、ＢＹＬ７１９処置マウスは、組織変化なし又は少しのみの組織変化を表わしたことが証明された（データを示さず）。予防研究におけるのと同様に、ウェスタンブロット及び免疫蛍光から、ＰＩＫ３ＣＡ阻害が確認された（データを示さず）。
【００４６】
ＢＹＬ７１９によりＰＲＯＳマウスを劇的に改善することができたことと結論付けられた。これにより、ＢＹＬ７１９は現在治療薬が存在しないＰＲＯＳ患者のための有効な治療選択肢となる可能性があることが示唆される。
【００４７】
ＰＩＫ３ＣＡ変異を有するヒト細胞におけるＢＹＬ７１９の効果
次に、ヒト細胞においてＰＩＫ３ＣＡ経路を阻害するのにおけるＢＹＬ７１９の有効性を試験した。この目的で、乳ガンから得られたＴ−４７Ｄヒト細胞を使用した。これらの細胞は、ＰＩＫ３ＣＡ  ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ（Ｈ１０４７Ｒ）のヘテロ接合性変異を有する。この機能変異の取得は、ＰＲＯＳ患者において観察される最も高頻度な変異でもある６。
【００４８】
まず、これらの細胞において、残基Ｔｈｒ３０８及びＳｅｒ４７３におけるＡＫＴのリン酸化状態だけでなく、Ｓ６ＲＰタンパク質のリン酸化によっても評価した場合の、ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣ経路の自発的活性化を確認した（データを示さず）。ついで、細胞を上昇する濃度のＢＹＬ７１９に曝した。濃度１μmol/LでのＢＹＬ暴露の２時間後に、ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣ経路が完全に阻害されたことが観察された（データを示さず）。この効果は、細胞をＢＹＬ７１９に４及び６時間曝した場合と同様であった。
これらのデータは、ＢＹＬ７１９が、ＰＩＫ３ＣＡ  ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ（Ｈ１０４７Ｒ）突然変異とともに、ヒト細胞におけるＰＩＫ３ＣＡの活性化を阻害することができることを示している。
【００４９】
ＰＲＯＳを有する患者におけるＢＹＬ７１９の劇的な影響
これらの結果に基づいて、ＣＬＯＶＥＳ症候群の極度に重篤な臨床症候を患い、治療の失敗及び生命を脅かす合併症を経験した２名の患者（１名の成人及び１名の小児）のための救済使用として、ＢＹＬ７１９を投与することを決定した。患者１は、２９歳の男性であり、モザイク現象及び生検から、機能変異ＰＩＫ３ＣＡ  ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ（Ｈ１０４７Ｒ）の獲得が証明された。患者１は、左脚の肥大、脊椎側湾症、多発性母斑及び極度に重篤な血管異常により特徴付けられる過成長症候群を有した（データを示さず）。患者１は、腹部及び背中の血管腫瘍を除去するために複数回の侵襲的な減量手術を受け、かつ、腫瘍成長を制限するために塞栓療法による複数回の血管造影検査を受けていた。患者１は、脊髄圧迫により２０歳で対まひになり、尿を排出するための膀胱ステント留置が必要となった。患者１は、全ての通常の薬剤に対して抵抗性の、測定心拍出量１８l/分及び脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）レベルが常に２５００pg/mL超（Ｎ＜１００pg/mL）を伴って、進行的に悪化する重篤な収縮期心不全に進行した。心不全が血管シャントの存在、心筋細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ変異又は両方によるものであったか否かは不明である。５年の間、この患者は、腫瘍成長進行を制限するためにラパマイシンを受けたが、何ら効果はなかった。最後に、この患者は、重篤なタンパク質尿を伴う腎機能障害に進行した。腎生検から、広範な線維症を伴う糸球体病変が明らかとなった。腎臓病変は、心機能障害、ラパマイシンの使用１１及び／又は腎臓表皮細胞におけるＰＩＫ３ＣＡ変異の結果である可能性がある。ＣＴスキャン（データを示さず）及びＭＲＩ（データを示さず）から、重篤な血管異常が示されたが、ＰＥＴスキャンは陰性であった。乏しい予後を有する症例の重大性のために、医師、外科医及びレントゲン技師は、任意の介在的処置を中止し、支持療法及び緩和ケアのみを患者に提供することを決定した。患者の生命予後は、数か月と推定された生存に掛かっていた。
【００５０】
検査知見及び倫理的考慮の後に、ＢＹＬ７１９をこの患者に提案することを決定した。Novartis及びランス監督当局（Agence nationale de securite du medicament et des produits de sante, ANSM）から、ＢＹＬ７１９を救済使用として投与することの許可を得た。ラパマイシンを中断し、１ヶ月後に、ＢＹＬ７１９を開始した。この薬剤を毎日経口送達した。開始用量として、臨床試験に使用された最低用量であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータに基づいて、１日当たりに２５０mgを選択する。最初の数日以内に、患者の全身状態の劇的な改善が観察された。患者は、より良好で、より快適に感じ始めた。腫瘍サイズ、静脈拡張及び皮膚の態様における薬剤の劇的な効果を毎週目的とすることができた（データを示さず）。患者は、浮腫の除去によるだけでなく、全ての血管腫瘍異常のかなりの減少によっても、１２ヶ月の間に２３kg減量した（データを示さず）。胸囲及び腹囲はそれぞれ、１２ヶ月の間にΔ−２０％及びΔ−３５％劇的に低下した（図２Ａ）。ＣＴスキャン及びＭＲＩから、１２ヶ月の間に６３％の体積減少を伴う全体的な血管腫瘍の収縮及び皮下浸潤消失が確認された（データを示さず）。心機能における薬剤の効果は顕著であった。４週間の経過において、ＢＮＰレベルは完全に修正された（図２Ｂ）。心拍出量は、３l/分に低下し、心臓のサイズは、ＣＴスキャンにより測定した場合、２５％減少した（データを示さず）。身体表面積に相関する左心室量は、２５０g/m2から１４８g/m2に減少した。腎機能も、急速に改善した。推定糸球体濾過速度は、３３から５２ml/分/1.75m2に上昇した（図３Ｄ）。肥大した左脚の体積も減少した（データを示さず）。神経着色の変化及び耳のサイズの減少を伴って、皮膚肥大の劇的な改善が観察された（データを示さず）。最後に、ＢＹＬ７１９開始後６ケ月で、患者は、サドル麻酔の改善を伴って膀胱機能を部分的に獲得し始めた。ＭＲＩから、脊髄を圧迫していた静脈奇形のサイズが６０％減少したことが証明された。１２ヶ月後、患者には、高血糖を除いて副作用が無かった。同高血糖は、計画により十分抑制された。患者は、今でもＢＹＬ７１９を受けている。
【００５１】
患者２は、この研究の２年前にＣＬＯＶＥＳ症候群であると診断された９歳の少女であった。生検により、ＰＩＫ３ＣＡ  ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ（Ｈ１０４７Ｒ）における機能モザイク変異の獲得が確かめられた。患者は、脊椎側湾症、左脚肥大、血管異常及び背中の筋肥大を有した（データを示さず）。重要なことに、患者２は、左側の腎臓及び消化管に関連する大きな嚢胞性リンパ管腫を有した。ＰＥＴスキャンから、胸腺、背中の筋肉及び左脚の代謝固定が示された（データを示さず）。腹腔内腫瘍は急速に成長しており、手術又は介在的放射線医学は不可能であると考えられた。倫理的考慮の後に、Novartis及びフランス監督当局（ANSM）から、ＢＹＬ７１９を提供する認可を得た。この薬剤は小児に試験されたことがなかったため、最少利用可能用量である５０mg/日で開始するのを決定した。患者１と同様に、処置開始後、急速に劇的な臨床改善が観察された（データを示さず）。この患者により、１２０日目において、快適さの改善が報告され、左脚体積の１５％減少、左足（１シューズサイズの低下）及び腹囲の８％低下が観察された（データを示さず）。背中の筋肥大は急速に収縮し、予期しなかったことに、患者２の脊椎側湾症は、何ら他の介在なしに、１２０日目において退行した（図３）。より重要なことに、ＭＲＩから、腹腔内腫瘍の体積がほんの４ヶ月の間に６０％減少したことが示された。処置開始後４ヶ月で行われたＰＥＴスキャンから、ほとんど全ての組織における疾患の減少が確認された。フォローアップの間に、この患者の正常な成長がＢＹＬ７１９により影響を受けなかったことが見出された。患者２からは、副作用は報告されなかった。この患者は、今でも処置を受けている。
【００５２】
議論
ここから、ヒトの表現型を再現するＰＲＯＳの最初のマウスモデル、当該マウスモデルにおけるＰＩ３ＣＡ阻害剤ＢＹＬ７１９による処置によるＰＲＯＳの救済及びＰＲＯＳ患者におけるＢＹＬ７１９の有効性を証明した変換アプローチの使用を報告する。この研究から、ＰＩＫ３ＣＡ阻害を以前は処置不可能であったＰＲＯＳにおける堅牢かつ有効な治療戦略として支持する最初の直接的証拠が提供される。
【００５３】
ＢＹＬ７１９処置により、処置開始後に急速に観察可能な陽性の臨床的影響を伴って、２名の患者（成人１名及び小児１名）の回復が促進された。マウスモデルにおけるのと同様に、この薬剤により、ＰＲＯＳに関連する全ての臓器機能不全が改善された。重要なことに、この薬剤は、処置期間全体を通して、奇形を改善する友好性を維持した。この薬剤は、ｍＴＯＲ阻害剤とは対照的に何ら著しい副作用なしに十分許容可能であった。予測されたとおりに、ＰＩ３ＫＣＡがインスリンレセプターの下流であるとすると、患者１において生じた高血糖は、長期副作用の所定の可能性を注意喚起する必要があり、特に、成長中の小児、受胎及び思春期に影響を及ぼすおそれがあることを示している。ただし、処置期間中に、小児の成長は影響を受けず、任意の有害作用は、この以前はひどく難治性であった疾患における利益に対して比較検討されるべきである。処置を開始すべき最良の期間及び治療を中断するおそれがある場合を含めて、幾つかの疑問が残っている。マウスのデータからすると、結節性硬化症を有する患者においても見られたように１７、薬剤の休薬は疾患の再開に関連するであろう可能性が高いと考えられる。
【００５４】
ＰＩＫ３ＣＡは、ヒトのガンにおいて最も一般的に変異したガン遺伝子のうちの１つであり、同様の変異は、ＰＲＯＳ患者において見出されている６。ガンにおけるのと同様に、ＰＩＫ３ＣＡ変異を、この遺伝子のコード配列全体にわたって検出することができ、大部分の変異は、螺旋ドメイン（Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ）及びキナーゼドメイン（Ｈ１０４７Ｒ）における３つの主なホットスポットクラスターに見出される。これらの変異はそれぞれ、ＰＩＫ３ＣＡ経路の機能獲得型活性化をもたらす。重要なことに、ガンモデルにおいて、ＢＹＬ７１９は、変異の種類に関わらず、この経路の活性を完全に遮断することができる１４。加えて、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のコピー数増大に基づく本発明者らのＲＯＳのマウスモデルは、ＢＹＬ７１９により救済される。まとめると、これらのデータから、この薬剤は、全ての形態のＰＲＯＳに確かに有効であり、Ｈ１０４７Ｒ変異においてのみ作用するものではないことが示唆される。
【００５５】
この知見は、広い臨床的影響を有するかもしれない。重要なことに、ＰＲＯＳが稀であっても、例外ではない。ＰＲＯＳ患者数は、誤診をもたらす表現型の不均質性のために、相当少なく見積もられていると推測される。モザイク現象は、多くの場合、ＰＩＫ３ＣＡ体性改変を検出するための高感度な技術の使用を必要とする６。発生率が１／１００，０００であるとすると、クリッペル−トレノニー症候群を有する患者をＰＲＯＳに含めた最近の提唱により、ＢＹＬ７１９による利益を受けることができる相当数の患者が強調される。重要なことに、ＰＲＯＳは、ますます多くの疾患、例えば、単離型静脈奇形もＰＩＫ３ＣＡ変異に関連する可能性があるため８、１８、１９、発展している実体である。
【００５６】
本発明者らのマウスモデルにより、ＰＲＯＳの生理病理学をより良好に理解するための唯一の機会が提供される。このモデルは、血管異常、筋肥大、腎機能障害、脂肪肝、胸腺破壊及び脊椎側湾症を有するＰＲＯＳを再現する。重症度は、タモキシフェン処置により誘引された高い割合のＣｒｅ組換えイベントに関連した。特に腸間膜及び肝臓の血管からの重篤な出血のために、マウスは死んだ。重篤な合併症の中でも、出血及び漏出が、ＣＬＯＶＥＳ症候群を有する患者において観察された６。また、肝臓におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の過剰発現により、ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣの遺伝的過剰活性化におけるのと同様に脂肪肝がもたらされることも見出された２０。マウスは、Ｃｒｅ組換え後非常に素早く、脊椎側湾症に進行した。この病変は、確かに肥大傍脊椎体幹柔組織塊の進行による。ＢＹＬ７１９がこの異常を素早く退行させることができたためである。脊椎側湾症の改善も、筋腫溜及び代謝亢進シグナルの減少を伴って、２名の患者において視認することができた。ＢＹＬ７１９は、任意の組織異常の進行を予防し又は疾患が達成される間の全ての欠陥を救済するかのいずれかをすることができた。
【００５７】
まとめると、本研究の結果から、ＰＩＫ３ＣＡ阻害は、ＰＲＯＳ患者の健康及び生活の質を改善するための、安全かつ有効な手段である可能性があることが示される。明らかに、これらの結果は、患者のより大きなコホートにおいて確認される必要があるであろうが、ＰＲＯＳを有する患者に対して最も有望で利用可能な治療を表わす。
【００５８】
本願全体を通して、種々の参考文献は、本発明が属する技術分野の水準を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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