(57)【要約】  幹細胞に基づいた治療は、器官機能障害及び疾患を好転させ得る可能性があるが、障害のある組織の切除及び器官の再生につながるプログラムの再活性化は、大きな課題である。マウスにおいて、４日間の断食模倣食（ＦＭＤ）は、膵臓発生の間に認められるものに類似したＳｏｘ１７及びＰｄｘ−１の段階的発現を誘導し、続いてＮｇｎ３が引き起こすインスリン産生β細胞の産生が起こる。ＦＭＤサイクルは、２型糖尿病マウスモデル及び１型糖尿病マウスモデルの両方においてインスリン分泌及びグルコースホメオスタシスを回復させる。ヒト１型糖尿病膵島において、絶食条件は、ＰＫＡ及びｍＴＯＲ活性を低下させ、Ｓｏｘ２発現及びＮｇｎ３発現並びにインスリン産生を誘導する。ＦＭＤの効果は、ＩＧＦ−１処置によって打ち消され、ＰＫＡ阻害及びｍＴＯＲ阻害によって反復される。これらの結果は、マウスモデルにおいて、ＦＭＤが膵臓細胞のリプログラミングを促進して１型糖尿病患者から膵島内のインスリン産生を回復させ、また、１型糖尿病表現型及び２型糖尿病表現型の両方を好転させることを示す。
2019505592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト膵臓β細胞再生及び／又は体細胞リプログラミングを必要とする対象を同定すること；及び
所定の期間にわたり断食模倣食（ＦＭＤ）を前記対象に投与し、及び／又はＰＫＡ及び／又はＴｏｒの阻害剤を前記対象に投与して、膵臓β細胞再生及び体細胞リプログラミングを促進すること、
を含む、膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進する方法。
【請求項２】
前記ＰＫＡ  Ｔｏｒ阻害剤が、ＩＧＦ−ＩＲをブロックする抗体、アンタゴニスト若しくは小分子、ｍＴＯＲを阻害するラパマイシン、ＰＫＡを阻害するＨ８９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
断食模倣食を投与するが、ＰＫＡ及び／又はＴｏｒの阻害剤は投与しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＰＫＡ  Ｔｏｒ阻害剤は投与するが、断食模倣食は投与しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
断食模倣食を投与し、且つ、ＰＫＡ及び／又はＴｏｒの阻害剤を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が１型糖尿病又は２型糖尿病と診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
体細胞の脱分化及び／又はリプログラミングが促進される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
胃腸細胞の脱分化及び／又はリプログラミングが促進される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記断食模倣食が、幹細胞産生を伴う筋肉若返りを促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
インスリン抵抗性が低下する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
高血糖が抑制される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記所定の期間が５〜１０日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記断食模倣食が、
１日目において４０グラム未満の糖、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても３０グラム未満の糖、
１日目において２８グラム未満のタンパク質、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても１８グラム未満のタンパク質、
１日目において２０〜１００グラムの一価不飽和脂肪、
１日目において６〜３０グラムの多価不飽和脂肪、
１日目において２〜１２グラムの飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても１０〜５０グラムの一価不飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても３〜１５グラムの多価不飽和脂肪、
２日目〜５日目又は残りのいずれの日においても１〜３０グラムの飽和脂肪、並びに
毎日及び残りのいずれの日においても微量栄養素組成物、
を提供する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記断食模倣食が、
各食事日につき体重１キログラム当たり８〜２５ｋｃａｌ、
各食事日につき３０グラム未満の糖、
各食事日につき１８グラム未満のタンパク質、並びに
各食事日につき９〜３０グラムの一価不飽和脂肪、各食事日につき２．５〜９グラムの多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１〜１０グラムの飽和脂肪、
を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記断食模倣食が、
各食事日につき体重１キログラム当たり５〜８ｋｃａｌ、
各食事日につき２０グラム未満の糖、
各食事日につき１２グラム未満のタンパク質、並びに
各食事日につき６．５〜１０グラムの一価不飽和脂肪、各食事日につき２．５〜４．５グラムの多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１．５〜４グラムの飽和脂肪、
を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記断食模倣食が、
各食事日につき体重1キログラム当たり０〜３ｋｃａｌ、
各食事日につき５グラム未満の糖、
各食事日につき３グラム未満のタンパク質、並びに
各食事日につき２．５グラム未満の一価不飽和脂肪、各食事日につき１グラム未満の多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１グラム未満の飽和脂肪、
を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
投与スケジュールに従って、所定の期間にわたり対象に投与される第１の食事のための第１の組の配分食、並びに膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進するために対象に食事パッケージを投与するための前記投与スケジュールを含む使用説明を含み、
前記第１の食事は、
１日目において４０グラム未満の糖、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても３０グラム未満の糖、
１日目において２８グラム未満のタンパク質、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても１８グラム未満のタンパク質、
１日目において２０〜１００グラムの一価不飽和脂肪、
１日目において６〜３０グラムの多価不飽和脂肪、
１日目において２〜１２グラムの飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても１０〜５０グラムの一価不飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても３〜１５グラムの多価不飽和脂肪、
２日目〜５日目又は残りのいずれの日においても１〜１２グラムの飽和脂肪、並びに
毎日及び残りのいずれの日においても微量栄養素組成物、
を提供する、
膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進するために断食模倣食を投与するための食事パッケージ。
【請求項１８】
前記断食模倣食が、
各食事日につき体重1キログラム当たり８〜１０ｋｃａｌ、
各食事日につき３０グラム未満の糖、
各食事日につき１８グラム未満のタンパク質、並びに
各食事日につき９〜１５グラムの一価不飽和脂肪、各食事日につき２．５〜４．５グラムの多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１〜５．５グラムの飽和脂肪、
を提供する、請求項１７に記載の食事パッケージ。
【請求項１９】
前記断食模倣食が、
各食事日につき体重1キログラム当たり５〜８ｋｃａｌ、
各食事日につき２０グラム未満の糖、
各食事日につき１２グラム未満のタンパク質、並びに
各食事日につき６．５〜１０グラムの一価不飽和脂肪、各食事日につき２．５〜４．５グラムの多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１．５〜４グラムの飽和脂肪、
を提供する、請求項１７に記載の食事パッケージ。
【請求項２０】
前記断食模倣食が、
各食事日につき体重1キログラム当たり０〜３ｋｃａｌ、
各食事日につき５グラム未満の糖、
各食事日につき３グラム未満のタンパク質、並びに
各食事日につき２．５グラム未満の一価不飽和脂肪、各食事日につき１グラム未満の多価不飽和脂肪、各食事日につき１グラム未満の飽和脂肪、
を提供する、請求項１７に記載の食事パッケージ。
【請求項２１】
第２の期間にわたり前記対象に投与される第２の食事のための第２の組の配分食をさらに含み、前記第２の食事が、前記第１の食事に続く２５〜２６日間、対象の通常のカロリー消費からの差異が１０パーセント以内である全体的カロリー消費を提供する、請求項１７に記載の食事パッケージ。
【請求項２２】
前記第１の組の配分食が、１日目〜５日目において１日につき４００〜８００ｍｇのカルシウム、１日目〜５日目において１日につき７．２〜１４．４ｍｇの鉄分、１日目〜５日目において１日につき２００〜４００ｍｇのマグネシウム、１日目〜５日目において１日につき１〜２ｍｇの銅、１日目〜５日目において１日につき１〜２ｍｇのマンガン、及び１日目〜５日目において１日につき３．５〜７ｍｃｇのセレン、を提供する、請求項１７に記載の食事パッケージ。
【請求項２３】
前記第１の組の配分食が、前記所定の期間における、１日目〜５日目において１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ１を提供し、１日目〜５日目において１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ２、１日目〜５日目において１日につき２０〜３０ｍｇのビタミンＢ３、１日目〜５日目において１日につき１〜１．５ｍｇのビタミンＢ５、１日目〜５日目において１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ６、１日目〜５日目において１日につき２４０〜４８０ｍｃｇのビタミンＢ９、１日目〜５日目において１日につき６００〜１０００ＩＵのビタミンＤ、１日目〜５日目において１日につき１４〜３０ｍｇのビタミンＥ、１日目〜５日目において１日につき８０ｍｃｇ超のビタミンＫ、及び１６〜２５ｍｃｇのビタミンＢ１２を提供する、請求項１７に記載の食事パッケージ。
【請求項２４】
前記第１の組の配分食が、前記所定の期間に６００ｍｇのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、藻類由来）を提供する、請求項１７に記載の食事パッケージ。
【請求項２５】
９００〜１６００ＩＵの量のビタミンＡ、１０〜２０ｍｇの量のアスコルビン酸、６０〜１００ｍｇの量の炭酸カルシウム、３〜６ｍｇの量のフマル酸第一鉄、０．００１〜０．００５ｍｇの量のコレカルシフェロール、３〜７ｍｇの量の酢酸ｄｌ−αトコフェロール、０．１〜０．０４ｍｇの量のフィトナジオン、０．１５〜０．５ｍｇの量のチアミンモノ硝酸塩、０．２〜０．６ｍｇの量のリボフラビン及び３〜７ｍｇの量のナイアシンアミド、を有する成分をさらに含む、請求項１７に記載の食事パッケージ。
【請求項２６】
１．５〜４．０ｍｇの量のパントテン酸カルシウム、０．３〜０．７ｍｇの量の塩酸ピリドキシン、０．０１〜０．０２ｍｇの量のビオチン、０．０７〜０．１４ｍｇの量の葉酸、０．００１〜０．００２ｍｇの量のシアノコバラミン、０．０１４〜０．０２２ｍｇの量のピコリン酸クロム、０．１８〜０．３２ｍｇの量の硫酸第二銅、０．０３〜０．０４５ｍｇの量のヨウ化カリウム、２０〜３２ｍｇの量の酸化マグネシウム、０．３〜０．７ｍｇの硫酸マンガン、０．０１４〜０．０２３ｍｇの量のモリブデン酸ナトリウム、０．０１４〜０．０２３ｍｇの量のセレン酸ナトリウム及び３〜５ｍｇの量の酸化亜鉛、を有する成分をさらに含む、請求項２５に記載の食事パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／２９５，４２２号の利益を主張し、該米国仮出願の内容はその全体が参照により本開示に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって認められた契約番号Ｐ０１  ＡＧ０３４９０６の下で政府支援によって為されたものである。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、ａ）膵臓細胞を再生する、２）糖尿病を治療する、ための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、膵臓β細胞の再生を促進するものであって、細胞及び組織の再生によって疾患表現型の逆転が生じる可能性がある糖尿病及び他の障害を治療するために本発明を用いることができる。
【背景技術】
【０００４】
動物の食物欠乏を乗り切る能力は、エネルギー消費を最小限に抑えるために多くの組織及び器官が萎縮することを伴う適応応答である。この萎縮及び普通食に戻った後のそこからの回復には、造血系及び神経系における幹細胞に基づく再生が関わる（Brandhorst et al., 2015; Cheng et al., 2014）。しかし、長期にわたる絶食及び再摂食が、膵臓再生、及び／又は機能的な系統発生につながる細胞リプログラミングも引き起こし得るかどうかについては知られていない。膵島内に存在するβ細胞は、栄養が利用可能であるかどうかに最も感受性を有するものの内の１つである。１型糖尿病及び２型糖尿病（Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄ）はβ細胞の脱分化及び分化転換を特徴とするものであるが（Cnop et al., 2005, Dor and Glaser, Talchai et al., 2012; Wang et al.）、一方でβ細胞のリプログラミング、β細胞の増殖及び／又は多能性細胞からのβ細胞への段階的再分化が治療的介入として提案されている（Baeyens et al., 2014; Chera et al., 2014; Maehr et al., 2009; Pagliuca et al., 2014; Sneddon et al., 2012; Zhou et al., 2008）。このことは、糖尿病の病因及び治療の両方において系統転換が重要であることを示唆している（Weir et al., 2013）。
【０００５】
インスリン抵抗性及びＩＩ型糖尿病を改善する可能性がある食事による治療介入が何十年も広範囲に研究されてきたが、食事による治療介入がｉＰＳ細胞に基づいた工学によって達成されるものを彷彿とさせる系統リプログラミングを促進する能力を有するかどうかについては不明なままである。我々は、長期にわたる絶食（２〜３日）のサイクルが、化学療法に関連した毒性からマウス及びヒトを保護することが可能であり、造血幹細胞に依存した再生を促進することが可能であることを以前に示した（Cheng et al., 2014; Laviano and Rossi Fanelli; Piran et al., 2014; Raffaghello et al., 2008）。
【０００６】
したがって、細胞再生を促進する方法に対する継続的な要求がある。
【発明の概要】
【０００７】
ヒトにおける長期の絶食に関連する課題及び副作用を考慮して、本発明の一実施形態は、絶食によって引き起こされるものと同様の特定の成長因子、グルコース及びケトン体の濃度の変化を引き起こす低カロリー、低タンパク質、低炭水化物であるが高脂肪の４日間の断食模倣食（ＦＭＤ）を提供する（Brandhorst et al., 2015）（メタボリックケージ研究についての図９も参照）。
【０００８】
ある実施形態において、膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進する方法が提供される。前記方法は、ヒト膵臓β細胞再生及び／又は体細胞リプログラミングを必要とする対象を同定するステップを含む。膵臓β細胞再生及び体細胞リプログラミングを促進するために、所定の期間にわたり断食模倣食（ＦＭＤ）が対象に投与され、且つ／又はＰＫＡ及び／又はＴｏｒの阻害剤が対象に投与される。
他の実施形態において、本開示に記載の方法を実施するための食事パッケージが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｂ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｃ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｄ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｅ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｆ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｇ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｈ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｉ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図１Ｊ】ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こすことを示す図である。
【図２Ａ】ＦＭＤサイクルは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導β細胞欠乏から回復させ、グルコースホメオスタシスを回復することを示す図である。
【図２Ｂ】ＦＭＤサイクルは、ＳＴＺ誘導β細胞欠乏から回復させ、グルコースホメオスタシスを回復することを示す図である。
【図２Ｃ】ＦＭＤサイクルは、ＳＴＺ誘導β細胞欠乏から回復させ、グルコースホメオスタシスを回復することを示す図である。
【図２Ｄ】ＦＭＤサイクルは、ＳＴＺ誘導β細胞欠乏から回復させ、グルコースホメオスタシスを回復することを示す図である。
【図２Ｅ】ＦＭＤサイクルは、ＳＴＺ誘導β細胞欠乏から回復させ、グルコースホメオスタシスを回復することを示す図である。
【図２Ｆ】ＦＭＤサイクルは、ＳＴＺ誘導β細胞欠乏から回復させ、グルコースホメオスタシスを回復することを示す図である。
【図２Ｇ】ＦＭＤサイクルは、ＳＴＺ誘導β細胞欠乏から回復させ、グルコースホメオスタシスを回復することを示す図である。
【図３Ａ】ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌は、β細胞の増殖及び再生を促進することを示す図である。
【図３Ｂ】ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌は、β細胞の増殖及び再生を促進することを示す図である。
【図３Ｃ】ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌は、β細胞の増殖及び再生を促進することを示す図である。
【図３Ｄ】ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌は、β細胞の増殖及び再生を促進することを示す図である。
【図３Ｅ】ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌は、β細胞の増殖及び再生を促進することを示す図である。
【図４Ａ】断食模倣食（ＦＭＤ）は、成体マウスにおいて膵島の代謝リプログラミング及びβ細胞の段階的な再度方向付けされた（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）発生を開始させることを示す図である。
【図４Ｂ】断食模倣食（ＦＭＤ）は、成体マウスにおいて膵島の代謝リプログラミング及びβ細胞の段階的な再度方向付けされた発生を開始させることを示す図である。
【図４Ｃ】断食模倣食（ＦＭＤ）は、成体マウスにおいて膵島の代謝リプログラミング及びβ細胞の段階的な再度方向付けされた発生を開始させることを示す図である。
【図４Ｄ】断食模倣食（ＦＭＤ）は、成体マウスにおいて膵島の代謝リプログラミング及びβ細胞の段階的な再度方向付けされた発生を開始させることを示す図である。
【図５Ａ】ＦＭＤは、Ｎｇｎ３依存性系統リプログラミングを促進して、インスリン産生β細胞を生み出すことを示す図である。
【図５Ｂ】ＦＭＤは、Ｎｇｎ３依存性系統リプログラミングを促進して、インスリン産生β細胞を生み出すことを示す図である。
【図５Ｃ】ＦＭＤは、Ｎｇｎ３依存性系統リプログラミングを促進して、インスリン産生β細胞を生み出すことを示す図である。
【図５Ｄ】ＦＭＤは、Ｎｇｎ３依存性系統リプログラミングを促進して、インスリン産生β細胞を生み出すことを示す図である。
【図５Ｅ】ＦＭＤは、Ｎｇｎ３依存性系統リプログラミングを促進して、インスリン産生β細胞を生み出すことを示す図である。
【図５Ｆ】ＦＭＤは、Ｎｇｎ３依存性系統リプログラミングを促進して、インスリン産生β細胞を生み出すことを示す図である。
【図５Ｇ】ＦＭＤは、Ｎｇｎ３依存性系統リプログラミングを促進して、インスリン産生β細胞を生み出すことを示す図である。
【図６Ａ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｂ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｃ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｄ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｅ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｆ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｇ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｈ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｉ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｊ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図６Ｋ】絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能を示す図である。
【図７】ＳＴＡＲ法及び図６に関するヒト対象のプロファイルを提供する表２である。
【図８−１】ＳＴＡＲ法に関するマウスＦＭＤ成分を示す表３である図８である。
【図８−２】ＳＴＡＲ法に関するマウスＦＭＤ成分を示す表３である図８の続きである。
【図９Ａ】ＦＭＤ及び短期絶食（ＳＴＳ）の代謝効果を示す図である。
【図９Ｂ】ＦＭＤ及び短期絶食（ＳＴＳ）の代謝効果を示す図である。
【図９Ｃ】ＦＭＤ及び短期絶食（ＳＴＳ）の代謝効果を示す図である。
【図９Ｄ】ＦＭＤ及び短期絶食（ＳＴＳ）の代謝効果を示す図である。
【図１０Ａ】Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦＭＤの効果を示す図である。
【図１０Ｂ】Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦＭＤの効果を示す図である。
【図１０Ｃ】Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦＭＤの効果を示す図である。
【図１０Ｄ】Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦＭＤの効果を示す図である。
【図１０Ｅ】Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦＭＤの効果を示す図である。
【図１０Ｆ】Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦＭＤの効果を示す図である。
【図１０Ｇ】Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦＭＤの効果を示す図である。
【図１１Ａ】ＳＴＺ処置マウスに対するＦＭＤサイクルの効果を示す図である。
【図１１Ｂ】ＳＴＺ処置マウスに対するＦＭＤサイクルの効果を示す図である。
【図１１Ｃ】ＳＴＺ処置マウスに対するＦＭＤサイクルの効果を示す図である。
【図１１Ｄ】ＳＴＺ処置マウスに対するＦＭＤサイクルの効果を示す図である。
【図１１Ｅ】ＳＴＺ処置マウスに対するＦＭＤサイクルの効果を示す図である。
【図１１Ｆ】ＳＴＺ処置マウスに対するＦＭＤサイクルの効果を示す図である。
【図１２Ａ】非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果を示す図である。
【図１２Ｂ】非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果を示す図である。
【図１２Ｃ】非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果を示す図である。
【図１２Ｄ】非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果を示す図である。
【図１２Ｅ】非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果を示す図である。
【図１２Ｆ】非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果を示す図である。
【図１２Ｇ】非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果を示す図である。
【図１２Ｈ】非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果を示す図である。
【図１３Ａ】成体マウスにおけるβ細胞の発生マーカーの発現に対するＦＭＤの効果を示す図である。
【図１３Ｂ】成体マウスにおけるβ細胞の発生マーカーの発現に対するＦＭＤの効果を示す図である。
【図１３Ｃ】成体マウスにおけるβ細胞の発生マーカーの発現に対するＦＭＤの効果を示す図である。
【図１４Ａ】対象から得た血清で処置した健康な膵島（ＨＩ）及び１型糖尿病膵島（Ｔ１ＤＩ）の遺伝子発現を示す図である。
【図１４Ｂ】対象から得た血清で処置した健康な膵島（ＨＩ）及び１型糖尿病膵島（Ｔ１ＤＩ）のインスリン産生を示す図である。
【００１０】
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ及び図１Ｊ。ＦＭＤサイクルは、β細胞再生を促進し、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）におけるβ細胞機能不全からの回復を起こす。（Ａ）レプチン受容体欠損（Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ）マウスにおける２型糖尿病に対する定期的ＦＭＤの効果を決定するための実験的スキーム。マウスを高血糖及びインスリン血症について２週間（ベースライン、ＢＬ）モニタし、次いで食餌群に割り当てた。各ＦＭＤサイクルは、４日間のＦＭＤと１０日間以下の再給餌（ＲＦ）とを含む。再給餌の間、マウスは、ＦＭＤの前に与えられていた飼料及び随意摂食（ＡＬ）対照に絶えず与えられた飼料と同じ飼料である、通常の飼料を与えられた。（Ｂ）血漿グルコース濃度、（Ｃ）血漿インスリン濃度；垂直の破線はＦＭＤの各サイクルを示す。水平線は、同齢の健康な野生型同腹仔におけるグルコース濃度の範囲（平均値±ｓ．ｅ．ｍ）を示す。最後の再給餌日／図に記載のサイクルの１日目に血液試料を採取した。血中グルコースの測定のためにマウスを６時間絶食（朝の絶食）させた。（Ｄ）図に記載の時点におけるインスリン抵抗性（ＩＲ）のホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）及び定常状態でのβ細胞機能（％Ｂ）。ＨＯＭＡ−Ｂ＝（２０×空腹時インスリン）／（空腹時グルコース−３．５）％。（Ｅ）６０日目におけるグルコース負荷試験及びインスリン抵抗性試験。（Ｆ）生存曲線。平均値±ｓ．ｅ．ｍ、＊ｐ＜０．０５、傾向についてのログランク（マンテルコックス）検定。１群につきｎ≧１６のマウス；（Ｂ〜Ｅ）について、各点は、平均値±ｓ．ｅ．ｍを示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、２元配置分散分析。（Ｇ）膵島１つ当たりのβ細胞の割合。（Ｈ）膵島１つ当たりのβ細胞の増殖性の割合。（Ｇ〜Ｉ）について、平均値±ｓ．ｅ．ｍ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、１元配置分散分析。（Ｉ）図に記載の時点におけるＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス及びそれらの野生型同腹仔から得られた膵臓切片における免疫染色。８倍に拡大された例の画像中の矢印は、典型的な増殖性β細胞（ＰＣＮＡ＋インスリン＋）を示す。スケールバーは５０μｍを示す。（Ｊ）ＡＬ−ｄｂｄｂマウス及びＦＭＤ−ｄｂｄｂマウスから単離した、大きさを合わせた膵島についての代表的画像、並びにＦＭＤを与えられたか又は随意に摂食したＬｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスから単離した膵島におけるグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験の結果。スケールバーは５０μｍを示す。マウスは、（Ａ）に示した年齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドであり、図に示した食餌以外のさらなる処置は受けていない。（Ｆ〜Ｊ）について、各点は、平均値±ｓ．ｅ．ｍを示す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、２元配置分散分析。１群につきｎ≧６のマウス、サンプル１匹当たりｎ≧１５の膵島。
【００１１】
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ及び図２Ｇ。ＦＭＤサイクルは、ＳＴＺ誘導β細胞欠乏から回復させ、グルコースホメオスタシスを回復する。（Ａ）ＳＴＺ誘導１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に対する定期的なＦＭＤの効果の実験スキーム；ＳＴＺ処置後の５日目にベースライン測定（ＢＬ）を行った。ＦＭＤサイクル（５日目〜３５日目）の間及びＦＭＤサイクルの５５日後の（Ｂ）空腹時グルコース濃度及び（Ｃ）血漿インスリン濃度；垂直の破線は、ＦＭＤの各サイクルを示す；水平線（１２５±１２ｍｇ／ｄｌ）は、未処置の対照マウスの血中グルコースの濃度を示す。（Ｄ）５０日目におけるグルコース負荷試験。（Ｅ）未処置の対照と比較した、ＳＴＺ又はＳＴＺ＋ＦＭＤで処置されたマウスの３０日目におけるサイトカインプロファイル。図に記載の時点で採取した膵臓試料を（Ｆ）β細胞の増殖性割合、及び膵島１つ当たりのインスリン産生β細胞の割合、並びに（Ｇ）ＳＴＺ又はＳＴＺ＋ＦＭＤで処置されたマウスの図に記載の時点における膵臓切片をインスリン、グルカゴン及びＤＡＰＩで免疫染色した代表的顕微鏡写真、について分析した。スケールバーは５０μｍを示す。マウスは、３〜６月齢におけるＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドであり、（Ａ）に示すＳＴＺ処置（１５０ｍｇ／ｋｇ）を施された。（Ｂ〜Ｇ）について、各点は、平均値±ｓ．ｅ．ｍを示し、試料数（ｎ）は、括弧内で示され、（Ｆ及びＧ）については、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、１元配置分散分析である。対照は、ＳＴＺ未処置の対照；ＳＴＺ  ＢＬはＳＴＺ処置マウスの５日目におけるベースライン濃度。１時点につき１群当たりｎ≧６のマウス、マウス１匹につきｎ≧１５の膵島。
【００１２】
図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ及び図３Ｅ。ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌は、β細胞の増殖及び再生を促進する。（Ａ）膵臓切片１つ当たりの膵島の大きさ及び数。（Ｂ）膵島１つ当たりのβ細胞の増殖性割合及びβ細胞の割合。（Ｃ）インスリン、グルカゴン及びＰＣＮＡにより免疫染色された膵島の代表的画像。（Ｄ）α細胞のマーカー及びβ細胞のマーカーの両方を共発現する過渡的細胞の集団：α細胞及びＰｄｘｌ＋α細胞の割合。（Ｅ）ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌が、膵島における細胞変化を誘導したことの概略図。マウスは、３〜６月齢におけるＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドであり、図に示した食餌以外のさらなる処置は受けなかった。図に示した時点、すなわち４日目のＦＭＤの終了時（ＦＭＤ）、再給餌の１日後（ＲＦ１ｄ）及び再給餌の３日後（ＲＦ３ｄ）において、随意摂食（ＡＬ）のマウス又は断食模倣食（ＦＭＤ）を与えられたマウスから膵臓試料を採取した；免疫組織化学的分析及び形態計測分析について（Ａ〜Ｅ）：１群当たりｎ≧６のマウス、１時点につき１染色につきｎ≧３０の膵島。平均値±ｓ．ｅ．ｍ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、１元配置分散分析。＊ｐ＜０．０５、ｔ検定。
【００１３】
図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ及び図４Ｄ。断食模倣食（ＦＭＤ）は、成体マウスにおいて膵島の代謝リプログラミング及びβ細胞の段階的な再度方向付けされた（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）発生を開始させる。（Ａ）膵島内の代謝遺伝子の変化を示すｍＲＮＡ発現プロフィル、及び（Ｂ）４日目のＦＭＤの終了時（ＦＭＤ）及び再給餌の１日後（ＲＦ１ｄ）における膵島内の系統マーカーの変化を示すｍＲＮＡ発現プロフィル（随意摂食（ＡＬ）の対照との比較）、；＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。７７（最大、赤色）〜−４（最小、緑色）の範囲の制御倍数（fold-regulation）を表すＱｉａｇｅｎ  ＲＴ２  ＰＣＲアレイによって作成されたヒートマップ。（Ｃ）ＡＬで摂食した又はＦＭＤを与えられたマウスから図に記載の時点において得られた膵島内の系統マーカーのタンパク質発現細胞の定量。タンパク質発現を、マーカー＋面積／総膵島面積と定義した。図１３Ｂも参照。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。ＡＬ対照と比較するｔ検定。（Ｄ）段階的移行を示すＳｏｘ１７／Ｐｄｘ１及びＰｄｘ１／Ｎｇｎ３の免疫蛍光染色の代表的画像。スケールバーは、５０μｍを示す。マウスは、３〜６月齢におけるＣ５７ＢＬ／５Ｊバックグラウンドであり、図に記載の食餌以外のさらなる処置は受けなかった。図に記載の時点、つまり４日目のＦＭＤの終了時（ＦＭＤ）、再給餌の１日後（ＲＦ１ｄ）及び再給餌の３日後（ＲＦ３ｄ）において、随意摂食（ＡＬ）のマウス又は断食模倣食（ＦＭＤ）を与えられたマウスから膵臓試料を採取した；１群当たりｎ＝６マウス、マーカー１つにつき≧３０の膵島。
【００１４】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ及び５Ｇ。ＦＭＤは、Ｎｇｎ３依存性系統リプログラミングを促進して、インスリン産生β細胞を生み出す。（Ａ）膵臓内のＮＧＮ３発現細胞の系統追跡（ｔｄＴｏｍａｔｏ）を行うために用いられた遺伝子的戦略、及び系統追跡実験のためのタモキシフェン（ＴＡＭ）処置の概略タイムライン。Ａでは、随意摂食のマウスをＴＡＭで処置した；Ｂでは、マウスはＴＡＭ注射の３日後にＦＭＤを与えられた；Ｃでは、マウスはＴＡＭ及びＦＭＤを同時に与えられた；Ｄでは、ＦＭＤ及びビヒクル（トウモロコシ油）を同時に与えられた。ＴＡＭ注射の１１日後に膵臓組織を採取して、Ｎｇｎ３系統発生に対するＦＭＤの効果を分析した。Ｔｄｔｏｍａｔｏ＋細胞（赤色、矢印）は、Ｎｇｎ３由来細胞である；各群についてｎ＝６。（Ｂ）膵島内における標識されたＮｇｎ３系統細胞（赤色、ｔｄＴｏｍａｔｏ）及びインスリン産生β細胞（緑色、Ｉｎｓ）の図に記載の時点における代表的画像。左のパネルにおいて、スケールバーは２００μｍを示す；右のパネルにおいて、スケールバーは１００μｍを示す。（Ｃ）膵島１つ当たりの総ｔｄＴｏｍａｔｏ標識Ｎｇｎ３系統細胞の定量（上）、及び標識されたインスリン産生β細胞（ｉｎｓ＋ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）の割合（下）。平均値±ｓ．ｅ．ｍ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、ｔ検定。（Ｄ）膵臓内におけるジフテリア毒素遺伝子Ａ鎖（ＤＴＡ）媒介Ｎｇｎ３系統アブレーションを行うために用いられた遺伝子的戦略、及び系統アブレーション実験のためのタモキシフェン（ＴＡＭ）処置の概略的タイムライン（左）及びグルコースホメオスタシスの結果（右）。ＦＭＤの前後にマウスにＴＡＭを注射し、ＦＭＤ及び再給餌の早い時期（ＲＦ３ｄ）の間に発現及び／又は拡大したＮｇｎ３系統をアブレーションした。あるいは、マウスにさらなるＳＴＺ注射を行い、次いで、図に記載の食餌群（すなわち、ＡＬ＋ＳＴＺ又はＦＭＤ＋ＳＴＺ）に割り当て、グルコースホメオスタシスにおけるＦＭＤに誘導されるβ細胞変換の寄与を分析した。（Ｅ）β細胞についてインスリン及びＰｄｘ１免疫染色し、核についてＤＡＰＩ染色した膵島の代表的画像。ビヒクル対照の画像については図１３も参照。スケールバーは、５０μｍを示す。（Ｆ）図に記載の群のＮｇｎ３系統アブレーションマウスから得られたインスリン産生β細胞の定量。平均値±ｓ．ｅ．ｍ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｔ検定（上）、対応のあるｔ検定（下）。ＴＡＭ及びＳＴＺについてはｎ＝６、ビヒクル対照についてはｎ＝３。（Ｇ）図に記載の群のホメオスタシスにおけるグルコース濃度及び腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）。平均値±ｓ．ｅ．ｍ、＊＊ｐ＜０．０１、ｔ検定（上）、対応のあるｔ検定（下）。ＴＡＭ及びＳＴＺについてはｎ＝６、ビヒクル対照についてはｎ＝３。（Ａ）〜（Ｃ）について、マウスは、３〜６月齢のＩＣＲ及びＢ６；１２９Ｓ６混合バックグラウンドであり、（Ａ）に示した食餌及び／又はＳＴＺ処置を受けた。（Ｄ）〜（Ｇ）について、マウスは、３〜６月齢のＩＣＲ及びＢ６；１２９Ｓ６混合バックグラウンドであり、（Ｄ）に記載の食餌及び／又はＳＴＺ処置を受けた。
【００１５】
図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、図６Ｈ、図６Ｉ、図６Ｊ及び図６Ｋ。絶食条件に応答してのヒト膵島のＮｇｎ３発現及びインスリン産生機能。（Ａ）ヒト膵島における絶食条件処置についての実験スキーム。健康なヒト対象から得られた膵島（ＨＩ）と１型糖尿病対象から得られた膵島（ＴＩＤＩ）とを、メーカーの使用説明に基づいて別々に培養し、次いで、絶食条件（すなわち、ＳＴＳ培地、ｍＴＯＲ阻害剤及びＰＫＡ阻害剤、並びにＰＫＡ  ｓｉＲＮＡ）又は対照培地で３６時間処置した。（Ｂ）ＦＭＤを受ける前（ベースライン）及びＦＭＤを与えられた後（ＦＭＤ）のヒト対象から得られた血清中のヒトＩＧＦ−１、グルコース、インスリン及びケトン体の濃度。１群当たりｎ＝５。（Ｃ）短期絶食（ＳＴＳ）馴化培地（２％ＦＢＳ及び０．５ｇ／Ｌグルコース）で前処理され、次いで２５ｍＭのグルコースで誘導された、健康なヒト対象から得られた膵島（ＨＩ）および１型糖尿病対象から得られた膵島（ＴＩＤＩ）のインスリン分泌能（標準培地（ＳＴＤ）中で培養されたものとの比較）。１群当たりｎ＝３。ＩＧＦ−１（４０ｎｇ／ｍｌ）の投与をした場合又はしない場合における、ＳＴＳ馴化培地で前処理された健康なヒト対象から得られた膵島（ＨＩ）及び１型糖尿病対象から得られた膵島（ＴＩＤＩ）の（Ｄ）Ｓｏｘ２及び（Ｅ）Ｎｇｎ３の発現。１群当たりｎ＝６。（Ｆ）健康なヒト対象から得られた膵島（ＨＩ）及び１型糖尿病対象から得られた膵島（ＴＩＤＩ）におけるＮｇｎ３タンパク質発現についての免疫染色の定量。１群当たりｎ＝５。スケールバーは、１００μｍを示す。ＩＧＦ−１（４０ｎｇ／ｍｌ）の投与をした場合又はしない場合における、ＳＴＳ馴化培地で前処理された健康なヒト対象から得られた膵島（ＨＩ）及び１型糖尿病対象から得られた膵島（ＴＩＤＩ）における、（Ｇ）インスリン遺伝子発現、（Ｈ）ＰＫＡ活性、及び（Ｉ）ｍＴＯＲ活性；ｍＴＯＲ活性の指標として、総ｐ７０Ｓ６Ｋに対するリン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋの比率を、ＳＴＤ（標準培地）の場合のレベルに正規化して用いた；１群当たりｎ＝６。（Ｊ及びＫ）ＩＧＦ−１シグナル伝達を低下させる阻害剤で処置した健康なヒト対象から得られた膵島（ＨＩ）及び１型糖尿病対象から得られた膵島（ＴＩＤＩ）の系統マーカー（Ｓｏｘ２及びＮｇｎ３）の発現；ラパマイシン、ｍＴＯＲ阻害剤；Ｈ８９、ＰＫＡ阻害剤、及びＰＫＡ  ｓｉＲＮＡ。平均値±ｓ．ｅ．ｍ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、対応のないｔ検定。
【００１６】
図７は、ＳＴＡＲ法及び図６に関するヒト対象のプロファイルを提供する表２である。
【００１７】
図８は、ＳＴＡＲ法に関するマウスＦＭＤ成分を示す表３である。
【００１８】
図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ及び図９Ｄ。Ｓ１、関連のＳＴＡＲ法「食餌：ＦＭＤ」：（Ａ）ＳＴＳ又はＦＭＤの前後、及び再給餌の３日後における、除脂肪質量割合及び脂肪質量割合と共に示す体重に対するＦＭＤ及び短期絶食（ＳＴＳ）の代謝効果。（Ｂ）ＳＴＳの前、間、及び後の水分摂取量、摂餌量（ｋｃａｌ／日）、総移動量及びＶＣＯ２／ＶＯ２、並びに（Ｃ）ＦＭＤの後の水分摂取量、摂餌量（ｋｃａｌ／日）、総移動量及びＶＣ０２／Ｖ０２。（Ｄ）長期絶食中（２４時間、３６時間及び６０時間）のマウスと比較した、ＦＭＤ中、及びＦＭＤ後の再給餌におけるマウスにおける循環インスリン及び循環ケトン体（β−ＨＢ）の濃度。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００５、ｔ検定。
【００１９】
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ及び図１０Ｇ。Ｓ２、図１及びＳＴＡＲ法に関係。Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦＭＤの効果。（Ａ）膵島１つ当たりの図に記載された細胞型の細胞数、（Ｂ）膵島１つ当たりの図に記載された細胞型の増殖性割合、（Ｃ）体重、並びに（Ｄ）非インスリン／グルカゴン産生細胞（非α／β）及びＰｄｘ１＋α細胞の増殖性割合及び細胞数並びに（Ｅ）例示的画像。（Ｆ）腹腔内グルコース負荷試験の間の循環インスリンの濃度。（Ｇ）膵島試料採取の図示。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、１元配置分散分析
【００２０】
図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ及び図１１Ｆ。図２に関連。ＳＴＺ処置マウスに対するＦＭＤサイクルの効果。（Ａ）体重、１サイクルのＦＭＤ、（Ｂ）膵島１つ当たりの図に記載の細胞型の細胞数、（Ｃ）膵島１つ当たりの図に記載の細胞型の増殖性割合、（Ｄ）膵島１つ当たりのα細胞の増殖性割合及びＰｄｘ１＋α細胞の細胞数、並びに（Ｅ）非インスリン／グルカゴン産生細胞（非α／β）の増殖性割合及び細胞数、並びに（Ｆ）循環サイトカインの濃度。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、ｔ検定。
【００２１】
図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１２Ｆ、図１２Ｇ及び図１２Ｈ。図３に関連。非糖尿病性野生型マウスに対するＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の効果。（Ａ）膵臓切片１つ当たりの膵島の数及び面積。（Ｂ）膵島１つ当たりの図に記載の細胞型の細胞数。（Ｃ）増殖性の割合、及び（Ｄ）膵島１つ当たりの図に記載の細胞型の細胞数。（Ｅ）膵島１つ当たりのＰｄｘ１＋αの過渡期細胞の細胞数、（Ｆ）Ｐｄｘ１＋α過渡期細胞の代表的画像。（Ｇ）Ｇｌｕｃ＋Ｉｎｓ＋細胞のｚスタック共焦点顕微鏡画像、（Ｈ）ＳＴＺ処置を受けていない野生型マウスにおける非インスリン／グルカゴン産生細胞（非α／β）の増殖性割合及び細胞数。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、１元配置分散分析。
【００２２】
図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃ。図４及び図５に関連。成体マウスにおけるβ細胞の発生マーカーの発現に対するＦＭＤの効果。（Ａ）ＡＬと比較して、ＦＭＤ又はＲＦ１ｄで有意に（＊ｐ＜０．０５）上方制御又は下方制御された遺伝子の制御倍数。対照群及び処置群における各遺伝子についての複数サンプル（replicate）の２∧（−ΔＣｔ）値のスチューデントｔ検定に基づいてp値を計算する。（Ｂ）膵島における系統マーカーのタンパク質発現についての免疫染色。（Ｃ）図５Ｆに示したＮｇｎ３系統アブレーション実験についてのトウモロコシ油（ビヒクル対照）処置の概略的タイムライン及び代表的画像。
【００２３】
図１４Ａ及び図１４Ｂ。図６に関連する。対象から得た血清で処置した健康な膵島（ＨＩ）及び１型糖尿病膵島（Ｔ１ＤＩ）の図に記載の時点における（Ａ）遺伝子発現及び（Ｂ）インスリン産生。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ここで、現時点で本発明者が知っている、本発明を実施する最良の形態を構成する、本発明の現時点で好ましい組成物、実施形態及び方法について詳細に説明する。なお、図面は、必ずしも原寸比例ではない。しかし、ここに開示する実施形態は、種々の代替的形態で具現化してもよい本発明の単なるに例示に過ぎないことを理解すべきである。ゆえに、本開示において開示される具体的詳細は限定的に解釈されてはならず、単に、本発明の任意の態様のための代表的基礎として、及び／又は当業者に種々の態様で本発明を使用することを教示するための代表的基礎として解釈されるべきである。
【００２５】
異なる意味であることが明示的に記載されている場合あるいは実施例を除いて、本開示中における材料の量又は反応及び／若しくは使用の条件を示す全ての数量は、本発明の最も幅広い範囲を記載する場合においては「約」の語により修飾されているものとして理解されるべきである。規定された数値限界の範囲内において実施することが一般的に好ましい。また、異なる意味であることが明示的に記載されていない限り、パーセント、「部」及び比の値は重量基準であり；また、本発明に関連してある群又はクラスの材料が特定の目的のために適切又は好ましいとして記載されている場合、前記群又は前記クラスの構成要素の内の任意の２つ以上の混合物も等しく適切又は好ましいことも意味しており；また、化学的用語による成分の記載は、本開示に記載の任意の組み合わせ物に加える際の成分を指すものであって、混合後の混合物における成分同士が化学的に相互作用することを必ずしも排除するものではなく；また、頭字語又は他の略語についての最初に記載された定義は、本開示中においてその後に記載された同じ略語の全てに当てはまり、また、最初に定義した略語の通常の文法上の派生形に準用され；異なる解釈が明示的に記載されていない限り、特性の測定は、その記載より前又は後に同じ特性について説明されている手法と同じ手法によって決定される。
【００２６】
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」又は「特徴とする（characterized by）」と同義である。これらの用語は、端点も含む意味であって、且つ開放的な意味を有し、記載されていない追加的要素又は方法ステップの存在を排除しない。
【００２７】
「からなる（consisting of）」という句は、請求項に記載されていない如何なる要素、ステップ又は成分も排除する。この句が、プリアンブルの直後ではなく、請求項のボディの節に現れる場合、当該句は、当該節に記載された要素のみを限定するものであって、他の要素は請求項全体から排除されない。
【００２８】
「実質的になる（consisting essentially of）」という句は、記載された材料又はステップに加えて、請求項に記載された発明の基本的且つ新規な特徴に実体的な影響を及ぼさないものも含む範囲に、請求項の範囲を限定する。
【００２９】
具体的な成分及び／又は条件が変化してももちろん構わないので、本発明は以下に記載される特定の実施形態及び方法に限定されるものではないことも理解すべきである。さらに、本開示に用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためにだけ用いられるものであって、いかなる形であれ限定することを意図するものではない。
【００３０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「前記（the）」が用いられる場合、これらは、文脈が明らかに異なる解釈を示唆してない限り、対象物が複数存在する場合をも含むことにも注意しなければならない。例えば、ある成分が単数形で記載されている場合、複数の成分が存在する場合をも含むことが意図される。
【００３１】
本出願の全体にわたって、刊行物が参照されている場合、当該刊行物の開示は、本発明が関係する技術の水準をより完全に記載するために、その全体が本出願中に参照により取り込まれる。
【００３２】
「キロカロリー」（ｋｃａｌ）及び「カロリー」という用語は、食物カロリーを指す。「カロリー」という用語は、いわゆる小カロリーを指す。
【００３３】
「断食模倣食」という用語（ＦＭＤ）は、典型的には、対象を完全に飢えさせず且つ絶食が模倣されるように、通常のカロリー摂取量の５０％以下をある程度の栄養成分と共に対象に提供することによって、絶食の効果を模倣する食事を意味する。本発明の文脈における、有用な絶食模倣増強食、及びＩＧＦ−１やＩＧＦＢＰ１などのマーカーに対するこれらの食事の効果をモニタする方法の例は、２０１４年５月９日に出願された米国特許出願第１４／２７３９４６号、２０１４年９月２６日に出願された米国特許出願第１４／４９７７５２号、２０１０年１０月２２日に出願された米国特許出願第１２／９１０５０８号、２０１２年１０月２６日に出願された米国特許出願第１３／６４３６７３号、２０１３年７月２９日に出願された米国特許出願第１３／９８２３０７号、２０１３年１０月２２日に出願された米国特許出願第１４／０６０４９４号、２０１４年２月１２日に出願された米国特許出願第１４／１７８９５３号、２０１４年７月１日に出願された米国特許出願第１４／３２０９９６号、２０１５年３月２７日に出願された米国特許出願第１４／６７１６２２号に記載されており、これらの特許出願の開示はその全体が参照により本開示に取り込まれる。米国特許出願第１４／０６０４９４号及び米国特許出願第１４／１７８９５３号に示されている断食模倣食は、本発明において特に有用であることが見いだされた。
【００３４】
ある実施形態では、膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進する方法が提供される。前記方法は、ヒトの膵臓β細胞再生及び／又は体細胞のリプログラミングを必要とする対象を同定するステップを含む。対象に断食模倣食（すなわち第１の食事）、及び／又はＰＫＡ及び／又はＴｏｒの阻害剤を投与して、膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進する。ＰＫＡ  Ｔｏｒ阻害剤の例としては、ＩＧＦ−ＩＲをブロックする抗体、アンタゴニスト又は小分子、ｍＴＯＲを阻害するラパマイシン、ＰＫＡを阻害するＨ８９、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。所定の期間にわたりＦＭＤを対象に投与する。ある変形例において、前記所定の期間は、好ましさが増大する順に、３日間以上、５日間以上、６日間以上又は７日間以上である。また、前記所定の期間は、好ましさが増大する順に、２０日間以下、１５日間以下、１０日間以下又は８日間以下である。ある調整例において、前記所定の期間は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間である。他の調整例において、前記所定の期間は、５〜１０日間である。本開示に記載の方法のある変形例においては、断食模倣増強食を所定の間隔で繰り返す。例えば、対象の処置の期間の間、月１回、断食模倣増強食を開始することができ、対象の処置の期間は、３ヵ月〜１年又は１年超（例えば、１〜５年）であってもよい。
【００３５】
ある変形例においては、断食模倣食及びＰＫＡ  Ｔｏｒ阻害剤の両方を投与する。他のある変形例においては、断食模倣食は投与するが、ＰＫＡ  Ｔｏｒ阻害剤は投与しない。他のある変形例においては、ＰＫＡ  Ｔｏｒ阻害剤は投与するが、断食模倣食は投与しない。
【００３６】
断食模倣食及び／ＰＫＡ  Ｔｏｒ阻害剤の投与は、１型糖尿病又は２型糖尿病と診断された対象の症状を軽減する（すなわち、当該対象を治療する）ことが見いだされる。ある状況において、断食模倣食及び／ＰＫＡ及び／又はＴｏｒの阻害剤の投与は、体細胞の脱分化及び／又はリプログラミングを促進することが有益又は必要であると同定された対象の症状を軽減する（すなわち、当該対象を治療する）ことが見いだされる。特に、胃腸細胞の脱分化及び／又はリプログラミングを促進することができる。他のある状況においては、断食模倣食及び／ＰＫＡ及び／又はＴｏｒの阻害剤の投与は、幹細胞産生を伴う筋肉若返りの促進が有益又は必要と同定された対象の症状を軽減する（すなわち、当該対象を治療する）ことが見いだされる。さらに他のある状況においては、断食模倣食及び／ＰＫＡ及び／又はＴｏｒの阻害剤の投与は、インスリン抵抗性の低下が有益又は必要と同定された対象の症状を軽減する（すなわち、当該対象を治療する）ことが見いだされる。さらに他のある状況においては、断食模倣食及び／ＰＫＡ  Ｔｏｒ阻害剤の投与は、高血糖の抑制が有益又は必要と同定された対象の症状を軽減する（すなわち、当該対象を治療する）ことが見いだされる。
【００３７】
ある変形例において、本開示に記載の方法の各々のための断食模倣食は、好ましさが増大する順に、対象の通常のカロリー摂取量の５０％以下、４０％以下、３０％以下又は１００％以下を提供する。ある調整例において、断食模倣食は、好ましさが増大する順に、対象の通常のカロリー摂取量の５％以上、１０％以上又は２０％以上を提供する。対象の通常のカロリー摂取量とは、対象が自己の体重を維持するために消費するｋｃａｌ数である。対象の通常のカロリー摂取量は、対象を問診することによって、又は対象の体重を考慮することによって推定してもよい。大まかな指針として、対象の通常のカロリー摂取量は、平均して、男性について２６００ｋｃａｌ／日、女性について１８５０ｋｃａｌ／日である。ある例において、断食模倣食は、対象に７００〜１２００ｋｃａｌ／日を提供する。特に有用なある調整例において、断食模倣食は、平均的な体重の男性対象に対して１１００ｋｃａｌ／日以下を提供し、平均的な体重の女性対象に対して９００ｋｃａｌ／日以下を提供する。ある調整例において、断食模倣食は、好ましさが増大する順に、１５００ｋｃａｌ／日以下、１４００ｋｃａｌ／日以下、１３００ｋｃａｌ／日以下、１２００ｋｃａｌ／日以下、１１００ｋｃａｌ／日以下、１０００ｋｃａｌ／日以下、９００ｋｃａｌ／日以下、８００ｋｃａｌ／日以下、７００ｋｃａｌ／日以下、６００ｋｃａｌ／日以下、５００ｋｃａｌ／日以下又は２５００ｋｃａｌ／日以下を提供する。さらなる調整例において、断食模倣食は、好ましさが増大する順に、０ｋｃａｌ／日以上、１０ｋｃａｌ／日以上、１００ｋｃａｌ／日以上、２００ｋｃａｌ／日以上、３００ｋｃａｌ／日以上、４００ｋｃａｌ／日以上又は５００ｋｃａｌ／日以上を提供する。
【００３８】
ある変形例において、断食模倣増強食は、１日目（Ｄａｙ１）に対象１ポンドにつき４．５〜７キロカロリーを提供し、次いで、２日目〜最終日に１日当たり対象１ポンドにつき３〜５キロカロリーを提供する。断食模倣増強食のサイクルの後、第２の期間にわたり第２の食事を対象に投与する。ある調整例において、第２の食事は、断食模倣増強食の後（例えば、直後）の１０〜２６日間、対象の通常のカロリー消費からの差異が２０パーセント以内の全体的カロリー消費を提供する。
【００３９】
ＦＭＤについての消費ガイドラインは、カロリー、主要栄養素及び微量栄養素に関する栄養成分表を含む。カロリーは、使用者の体重に従って消費される。総カロリー消費は、１日目において１ポンドにつき４．５〜７カロリー（又は１キログラムにつき１０〜１６カロリー）であり、２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても１ポンドにつき３〜５カロリー（又は１キログラムにつき７〜１１カロリー）である。上記の実施形態のある変形例においては、断食模倣食は、
１日目において４０グラム未満の糖、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても３０グラム未満の糖、
１日目において２８グラム未満のタンパク質、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても１８グラム未満のタンパク質、
１日目において、より高いカロリー消費に到達するために（すなわち、より高い所定のカロリー消費に到達するために）２０〜１００グラム若しくはそれ以上又は２０〜３０グラム若しくはそれ以上の一価不飽和脂肪、
１日目において、より高いカロリー消費に到達するために６〜３０グラム若しくはそれ以上又は６〜１０グラム若しくはそれ以上の多価不飽和脂肪、
１日目において、より高いカロリー消費に到達するために２〜１２グラム若しくはそれ以上の飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても、より高いカロリー消費に到達するために１０〜５０グラム若しくはそれ以上又は１０〜１５グラム若しくはそれ以上の一価不飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても、より高いカロリー消費に到達するために３〜１５グラム若しくはそれ以上又は３〜５グラム若しくはそれ以上の多価不飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても、より高いカロリー消費に到達するために１〜１２グラム若しくはそれ以上又は１〜６グラム若しくはそれ以上の飽和脂肪、並びに
毎日及び残りのいずれの日においても微量栄養素組成物
を提供する。通常のカロリー摂取量と同程度に高いことも可能な前記のより高いカロリー消費に到達するために、等量の上記脂肪及び特許の他の部分に記載されている野菜由来炭水化物源（野菜スープ及び野菜チップ）を用いることができる。５０％制限〜通常量の範囲内のカロリーを有するＦＭＤは、有効であるとは期待されるが、本出願に記載の５０％以上制限食ほどは有効ではない。
【００４０】
上記の実施形態の他のある変形例において、断食模倣食は、各食事日につき、体重１キログラム当たり８〜１０ｋｃａｌを提供する。
【００４１】
この変形例において、断食模倣食は、各食事日につき３０グラム未満の糖、各食事日につき１８グラム未満のタンパク質、各食事日につき９〜１５グラムの一価不飽和脂肪、各食事日につき２．５〜４．５グラムの多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１〜５．５グラムの飽和脂肪を提供する。
【００４２】
上記の実施形態のさらに他のある変形例において、断食模倣食は、各食事日につき、体重１キログラム当たり５〜８ｋｃａｌを提供する。この変形例において、断食模倣食は、各食事日につき２０グラム未満の糖、各食事日につき１２グラム未満のタンパク質、各食事日につき６．５〜１０グラムの一価不飽和脂肪、各食事日につき２．５〜４．５グラムの多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１．５〜４グラムの飽和脂肪を提供する。
【００４３】
上記の実施形態のさらに他のある変形例において、断食模倣食は、各食事日につき、体重１キログラム当たり０〜３ｋｃａｌを提供する。この変形例において、断食模倣食は、各食事日につき５グラム未満の糖、各食事日につき３グラム未満のタンパク質、各食事日につき２．５グラム未満の一価不飽和脂肪、各食事日につき１グラム未満の多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１グラム未満の飽和脂肪を提供する。
【００４４】
迅速模倣食は、実質的に任意の脂肪源を含むことができるが、一価不飽和脂肪源及び多価不飽和脂肪源などの、不飽和脂肪が多い脂肪源が特に有用である。一価不飽和食料源の好適な例としては、ピーナッツバター、オリーブ、ナッツ（例えば、アーモンド、ペカン、クルミ、ピスタチオ、カシュー、マカダミヤ）、アボカド、シード（例えば、ゴマ）、油（例えば、オリーブ、ゴマ、ピーナッツ、キャノーラ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。多価不飽和食料源の好適な例としては、クルミ、シード（例えば、カボチャ、ヒマワリ）、亜麻仁、魚（例えば、サケ、マグロ、サバ）、油（例えば、ベニバナ、大豆、トウモロコシ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。第１の食事は、野菜抽出物、ミネラル、オメガ−３／６必須脂肪酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含む。一つの調整例において、そのような野菜抽出物は、推奨された１日当たりの野菜分量の５日分と同等量を提供する。野菜抽出物の適切な源としては、チンゲン菜、ケール、レタス、アスパラガス、ニンジン、バターナッツカボチャ、アルファルファ、グリーンピース、トマト、キャベツ、カリフラワー、ビートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。オメガ−３／６必須脂肪酸のための適切な源としては、魚、例えば、サケ、マグロ、サバ、アミキリ、メカジキなどが挙げられる。
【００４５】
ある変形例において、断食模倣食は、以下の微量栄養素（９５％以上が非動物系）を含む：１日につき５，０００ＩＵ超のビタミンＡ（１日目〜最終日）、１日につき６０〜２４０ｍｇのビタミンＣ（１日目〜最終日）、１日につき４００〜８００ｍｇのカルシウム（１日目〜最終日）、１日につき７．２〜１４．４ｍｇの鉄分（１日目〜最終日）、１日につき２００〜４００ｍｇのマグネシウム（１日目〜最終日）、１日につき１〜２ｍｇの銅（１日目〜最終日）、１日につき１〜２ｍｇのマンガン（１日目〜最終日）、１日につき３．５〜７ｍｃｇのセレン（１日目〜最終日）、１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ１（１日目〜最終日）、１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ２（１日目〜最終日）、１日につき２０〜３０ｍｇのビタミンＢ３（１日目〜最終日）、１日につき１〜１．５ｍｇのビタミンＢ５（１日目〜最終日）、１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ６（１日目〜最終日）、１日につき２４０〜４８０ｍｃｇのビタミンＢ９（１日目〜最終日）、１日につき６００〜１０００ＩＵのビタミンＤ（１日目〜最終日）、１日につき１４〜３０ｍｇのビタミンＥ（１日目〜最終日）、１日につき８０ｍｃｇ超のビタミンＫ（１日目〜最終日）、５日の期間全体で１６〜２５ｍｃｇのビタミンＢ１２が提供され、５日の期間全体で６００ｍｇのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、藻類由来）が提供される。断食模倣増強食は、大部分（すなわち、５０重量パーセント超）が以下に掲げるものなどの天然源に由来する微量栄養素を高含有率で提供する：ケール、カシュー、黄ピーマン、タマネギ、レモンジュース、酵母及びターメリック。キノコ、ニンジン、オリーブオイル、ビートジュース、ホウレンソウ、トマト、コラード、イラクサ、タイム、塩、コショウ、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、ビート、バターナットカボチャ、コラード、トマト、オレガノ、トマトジュース、オレンジジュース、セロリ、ロメインレタス、ホウレンソウ、クミン、オレンジの皮、クエン酸、ナツメグ、丁子及びそれらの組み合わせ。表１は、ＦＭＤ食に与えられてもよいさらなる微量栄養素補充分の例を提供するものである。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
ある変形例において、第２の期間にわたり第２の食事を対象に投与する。第２の食事は、対象の通常のカロリー消費量からの差異が１０パーセント以内である全体的カロリー消費を提供する。本発明は第２の期間によって有意に限定されないが、第２の期間は、７日間〜６ヵ月間又はそれ以上としてもよい。典型的には、第２の食事は、断食模倣増強食の後に続く２５〜２６日間又はそれ以上投与することができる。ある調整例において、第２の食事は、好ましさが増大する順に、２５００ｋｃａｌ／日以下、２４００ｋｃａｌ／日以下、２３００ｋｃａｌ／日以下、２２００ｋｃａｌ／日以下、２１００ｋｃａｌ／日以下、２０００ｋｃａｌ／日以下、１９００ｋｃａｌ／日以下、１８００ｋｃａｌ／日以下、１７００ｋｃａｌ／日以下、１６００ｋｃａｌ／日以下又は１５００ｋｃａｌ／日以下を提供する。さらなる調整例において、第２の食事は、好ましさが増大する順に、１２００ｋｃａｌ／日以上、１３００ｋｃａｌ／日以上、１４００ｋｃａｌ／日以上、１５００ｋｃａｌ／日以上、１６００ｋｃａｌ／日以上、１７００ｋｃａｌ／日以上又は１８００ｋｃａｌ／日以上を提供する。
【００４８】
他の実施形態において、膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進するための食事パッケージが提供される。ある変形例において、食は、上記の方法及び投与スケジュールに従って、カロリー、食物及び栄養についての上記の仕様を含む。例えば、食事パッケージは、投与スケジュールに従って所定の期間にわたり対象に投与される第１の食事のための第１の組の配分食を含む。第１の食事は、
１日目において４０グラム未満の糖、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても３０グラム未満の糖、
１日目において２８グラム未満のタンパク質、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においても１８グラム未満のタンパク質、
１日目においてより高いカロリー摂取量に到達するために２０〜１００グラム又は２０〜３０グラム若しくはそれ以上の一価不飽和脂肪、
１日目においてより高いカロリー摂取量に到達するために６〜３０グラム又は６〜１０グラム若しくはそれ以上の多価不飽和脂肪、
１日目においてより高いカロリー摂取量に到達するために２〜１２グラム若しくはそれ以上の飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においてもより高いカロリー摂取量に到達するために１０〜５０グラム又は１０〜１５グラム若しくはそれ以上の一価不飽和脂肪、
２日目〜５日目及び残りのいずれの日においてもより高いカロリー摂取量に到達するために３〜１５グラム又は３〜５グラム若しくはそれ以上の多価不飽和脂肪、
２日目〜５日目又は残りのいずれの日においてもより高いカロリー摂取量に到達するために１〜３０グラム又は１〜６グラム若しくはそれ以上の飽和脂肪、並びに
毎日及び残りのいずれの日においても微量栄養素組成物
を提供する。ある調整例において、食事パッケージは、本開示の方法に係る断食模倣食を投与するための使用説明を含み、特に、投与スケジュールを含む使用説明も有する、膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進するために対象に食事パッケージを投与するための使用説明を含む。通常のカロリー摂取量と同じ程度に高くてもよい上記のより高いカロリー消費に到達するために、等量の上記脂肪及び特許の他の部分に記載されている野菜由来炭水化物源（野菜スープ及び野菜チップ）を用いることができる。５０％制限〜通常量の範囲内のカロリーを有するＦＭＤは、有効であるとは期待されるが、本出願に記載の５０％以上制限食ほどは有効ではない。
【００４９】
ある変形例において、食事パッケージの断食模倣食は、
各食事日につき体重１キログラム当たり８〜２５ｋｃａｌ又は８〜１０ｋｃａｌ、
各食事日につき３０グラム未満の糖、
各食事日につき１８グラム未満のタンパク質、
各食事日につき９〜３０グラム又は９〜１５グラムの一価不飽和脂肪、
各食事日につき２．５〜９グラム又は２．５〜４．５グラムの多価不飽和脂肪、及び
各食事日につき１〜１０グラム又は１〜５．５グラムの飽和脂肪
を提供する。他のある変形例において、食事パッケージの断食模倣食は、
各食事日につき体重１キログラム当たり５〜８ｋｃａｌ、
各食事日につき２０グラム未満の糖、
各食事日につき１２グラム未満のタンパク質、
各食事日につき６．５〜１０グラムの一価不飽和脂肪、
各食事日につき２．５〜４．５グラムの多価不飽和脂肪、及び
各食事日につき１．５〜４グラムの飽和脂肪
を提供する。さらに他のある変形例において、食事パッケージは、各食事日につき体重１キログラム当たり０〜３ｋｃａｌ、各食事日につき５グラム未満の糖、各食事日につき３グラム未満のタンパク質、各食事日につき２．５グラム未満の一価不飽和脂肪、各食事日につき１グラム未満の多価不飽和脂肪、及び各食事日につき１グラム未満の飽和脂肪を提供する。
【００５０】
第１の組の配分食は、
１日目〜５日目において１日につき４００〜８００ｍｇのカルシウム、
１日目〜５日目において１日につき７．２〜１４．４ｍｇの鉄分、
１日目〜５日目において１日につき２００〜４００ｍｇのマグネシウム、
１日目〜５日目において１日につき１〜２ｍｇの銅、
１日目〜５日目において１日につき１〜２ｍｇのマンガン、及び
１日目〜５日目において１日につき３．５〜７ｍｃｇのセレン
を提供することもできる。ある調整例において、第１の組の配分食は、１日目〜５日目において１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ１を提供し、
１日目〜５日目において１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ２、
１日目〜５日目において１日につき２０〜３０ｍｇのビタミンＢ３、
１日目〜５日目において１日につき１〜１．５ｍｇのビタミンＢ５、
１日目〜５日目において１日につき２〜４ｍｇのビタミンＢ６、
１日目〜５日目において１日につき２４０〜４８０ｍｃｇのビタミンＢ９、
１日目〜５日目において１日につき６００〜１０００ＩＵのビタミンＤ、
１日目〜５日目において１日につき１４〜３０ｍｇのビタミンＥ、並びに
１日目〜５日目において１日につき８０ｍｃｇ超のビタミンＫ及び１６〜２５ｍｃｇのビタミンＢ１２
が、所定の期間にわたり提供される。さらなる調整例において、第１の組の配分食は、所定の期間に６００ｍｇのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、藻類由来）を提供する。ある調整例において、第１の組の配分食は、
９００〜１６００ＩＵの量のビタミンＡ、
１０〜２０ｍｇの量のアスコルビン酸、
６０〜１００ｍｇの量の炭酸カルシウム、
３〜６ｍｇの量のフマル酸第一鉄、
０．００１〜０．００５ｍｇの量のコレカルシフェロール、
３〜７ｍｇの量の酢酸ｄｌ−αトコフェロール、
０．１〜０．０４ｍｇの量のフィトナジオン、
０．１５〜０．５ｍｇの量のチアミンモノ硝酸塩、
０．２〜０．６ｍｇの量のリボフラビン、及び
３〜７ｍｇの量のナイアシンアミド、を有する成分も提供する。ある調整例において、第１の組の配分食は、
１．５〜４．０ｍｇの量のパントテン酸カルシウム、
０．３〜０．７ｍｇの量の塩酸ピリドキシン、
０．０１〜０．０２ｍｇの量のビオチン、
０．０７〜０．１４ｍｇの量の葉酸、
０．００１〜０．００２ｍｇの量のシアノコバラミン、
０．０１４〜０．０２２ｍｇの量のピコリン酸クロム、
０．１８〜０．３２ｍｇの量の硫酸第二銅、
０．０３〜０．０４５ｍｇの量のヨウ化カリウム、
２０〜３２ｍｇの量の酸化マグネシウム、
０．３〜０．７ｍｇの硫酸マンガン、
０．０１４〜０．０２３ｍｇの量のモリブデン酸ナトリウム、
０．０１４〜０．０２３ｍｇの量のセレン酸ナトリウム、及び
３〜５ｍｇの量の酸化亜鉛、を有する成分も提供する。
【００５１】
ある変形例において、食事パッケージは、第２の期間にわたり対象に投与するための第２の食事のための第２の組の配分食を含む。第２の食事は、第１の食事の後に続く２５〜２６日間、対象の通常のカロリー消費からの差異が１０パーセント以内である全体的カロリー消費を提供する。特に、第２の食事は、対象の通常の食事についてのカロリー、食物及び栄養についての上記の仕様を提供する。
【００５２】
断食模倣食の特に有用な態様は、２０１７年２月１４日に出願された米国特許出願第１５／４３２８０３号に開示されており、該米国特許出願の開示はその全体が参照により本開示に組み込まれる。特に、本開示に記載の方法において断食模倣食を実行するための特定の食事成分を有する食事パッケージが提供される。ある調整例において、食事パッケージは、本開示の方法に係る断食模倣食を投与するための使用説明、特に、投与スケジュールを含む使用説明も有する膵臓β細胞再生及び体細胞のリプログラミングを促進するための対象に食事パッケージを投与するための使用説明も含む。一変形例において、断食模倣食パッケージ及びそれに関連する断食模倣食は、前記所定の日数（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日又は１０日）分の、一日用配分食を提供する。断食模倣食パッケージは、ケールクラッカー組成物、第１の野菜ブロス組成物、キノコスープ組成物、トマトスープ組成物、キノア含有ミネストローネスープ組成物、豆含有ミネストローネスープ組成物及びカボチャスープ組成物を含む。特徴的なこととして、前記一日用配分食は、各食分毎にパッケージされるか、又は一日分全体がまとめてパッケージされてそれをそれぞれの食事に分割するようになっている。ある調整例において、断食模倣食パッケージ及びそれに関連する断食模倣食は、さらに、ナッツ含有栄養バー、ココア含有栄養バー、第１のオリーブ含有組成物、第１の野菜ブロス組成物、スペアミントを含む茶組成物、エナジードリンク組成物、微量栄養組成物及び藻類油組成物を含む。さらなる調整例において、断食模倣食パッケージ及びそれに関連する断食模倣食は、さらに、第２のオリーブ含有組成物、第２の野菜ブロス組成物、スペアミント及びレモンを含む茶組成物、並びにハイビスカスを含む茶組成物を含む。本開示に記載のスープ組成物、ブロス組成物、茶組成物及びエナジー組成物は、それぞれ、消費される際に水が添加されるように設計される。
【００５３】
断食模倣食パッケージの他のある変形例において、食事パッケージは、ナッツ含有栄養バー、ココア含有栄養バー、第１のオリーブ含有組成物、ケールクラッカー組成物、野菜スープ組成物、第１の野菜ブロス組成物、スペアミントを含む茶組成物、エナジードリンク組成物、微量栄養組成物及び藻類油組成物を含む。特徴的なこととして、一日用配分食は、各食分毎にパッケージされるか、又は一日分全体がまとめてパッケージされてそれをそれぞれの食事に分割するようになっている。該食事パッケージは上記所定の日数分の一日用配分食も含む、一日用配分食は、各食分毎にパッケージされるか、又は一日分全体がまとめてパッケージされてそれをそれぞれの食事に分割するようになっている。ある調整例において、断食模倣食パッケージは、さらに、キノコスープ組成物、トマトスープ組成物、キノア含有ミネストローネスープ組成物及びカボチャスープ組成物を含む。さらなる調整例において、断食模倣食パッケージは、さらに、第２のオリーブ含有組成物、第２の野菜ブロス組成物、豆含有ミネストローネスープ組成物、スペアミント及びレモンを含む茶組成物、並びにハイビスカスを含む茶組成物を含む。
【００５４】
上記で示されるように、断食模倣食パッケージは、断食模倣食のために投与される特定の食事成分を含む。典型的には、組成物は、以下の通りである。ナッツ含有栄養バーは、アーモンドミール及びマカデミアナッツを含む。ココア含有栄養バーは、アーモンドバター、アーモンド及び玄米クリスプ（例えば、パフ玄米）を含む。キノコスープ組成物は、玄米パウダー、ニンジン、イヌリン及びキノコを含む。豆含有ミネストローネスープ組成物は、ホワイトビーンズ、キャベツ及びジャガイモを含む。第１の野菜ブロス組成物は、ニンジン、マルトデキストリン、セロリ、ホウレンソウ及びトマトを含む。第２の野菜ブロス組成物は、ニンジン、マルトデキストリン、セロリ、ホウレンソウ、ダイズレシチン及びトマトを含む。エナジードリンク組成物は、グリセリン及び水を含む。藻類油組成物は、シゾカトリウム（schizocatrium）藻類油を含む。微量栄養素組成物は、ビート根パウダー、炭酸カルシウム、ニンジン、コラード葉、ケール葉及びトマトを含む。ある調整例において、微量栄養素組成物は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、Ｃａ、Ｆｅ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｉ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｓｅ及びＺｎを含む。
【００５５】
ある調整例において、ナッツ含有栄養バー（Ｌ−ｂａｒ  Ｎｕｔ  ｂａｓｅｄ）は、アーモンドミール及びマカデミアナッツを含む。ある調整例において、ナッツ含有栄養バー（Ｌ−ｂａｒ  Ｎｕｔ  ｂａｓｅｄ）は、アーモンドミールを好ましくは２０〜３５重量％の量、ココナッツを好ましくは２〜１０重量％の量、ココナッツ油を好ましくは１〜８重量％の量、フラックスシードミールを好ましくは１〜８重量％の量、蜂蜜を好ましくは１０〜３０重量％の量、マカデミアナッツを好ましくは１０〜３０重量％の量、ペカンを好ましくは１０〜２５重量％の量、塩を好ましくは０．１〜０．８重量％の量、及び、所望によりバリーキを好ましくは０．３〜１．５重量％の量、含む。
【００５６】
ある調整例において、ココア含有栄養バー（Ｌ−Ｂａｒ  ＣｈｏｃｏＣｒｉｓｐ）は、アーモンドバター、アーモンド、及び玄米クリスプ（ＰＧＰ１０２３５）を含む。ある調整例において、ココア含有栄養バー（Ｌ−Ｂａｒ  ＣｈｏｃｏＣｒｉｓｐ）は、アーモンドバターを好ましくは１０〜２５重量％の量、アーモンドを好ましくは３〜１２重量％の量、玄米クリスプ（ＰＧＰ１０２３５）を好ましくは１０〜２５重量％の量、玄米シロップを好ましくは２〜８重量％の量、チョコレートリカーを好ましくは１〜４重量％の量、ココアバターを好ましくは０．４〜１．６重量％の量、ココアパウダーを好ましくは４〜１２重量％の量、ファイバーシロップＳＦ７５を好ましくは１８〜３８重量％の量、亜麻仁油を好ましくは１〜３重量％の量、塩を好ましくは０．１〜０．４重量％の量、及び糖を好ましくは１〜６重量％の量、含む。
【００５７】
ある調整例において、第１のオリーブ含有組成物（海塩バージョン）は、オリーブ、オリーブオイル及び海塩を含む。ある調整例において、第１のオリーブ含有組成物（海塩）は、乳酸を好ましくは０．３〜１重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは２〜６重量％の量、オリーブ（生、種抜きグリーンオリーブ）を好ましくは５０〜９７重量％の量、塩（レギュラーソルト、コーシャソルト、海塩）を好ましくは０．８〜３重量％の量、及びタイムを好ましくは０．１〜０．５重量％の量、含む。
【００５８】
ある調整例において、第２のオリーブ含有組成物（ニンニクバージョン）は、オリーブ、オリーブオイル及びニンニクを含む。ある調整例において、第２のオリーブ含有組成物（ニンニク）は、ニンニクを好ましくは０．１〜０．６重量％の量、乳酸を好ましくは０．３〜１重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは２〜６重量％の量、オリーブ（生、種抜きグリーンオリーブ）を好ましくは５０〜９７重量％の量、塩（レギュラーソルト、コーシャソルト、海塩）を好ましくは０．８〜３重量％の量、タイムを好ましくは０．１〜０．５重量％の量、含む。
【００５９】
ある調整例において、ケールクラッカー組成物は、ケール、アーモンド、タピオカ粉及び所望によりセサミシードを含む。他の調整例において、ケールクラッカー組成物は、アーモンドを好ましくは１５〜４０重量％の量、黒コショウを好ましくは０．１〜０．４重量％の量、チアシードを好ましくは３〜１０重量％の量、唐辛子を好ましくは０．４〜１．２重量％の量、クミンシードを好ましくは０．３〜０．９重量％の量、フラックスシードを好ましくは３〜１０重量％の量、ニンニクを好ましくは０．０２〜０．０４重量％の量、ケールを好ましくは２〜６重量％の量、油（ヒマワリ）を好ましくは２〜７重量％の量、タマネギ（パウダー、みじん切り）を典型的には０．３〜０．９重量％の量、オレガノを好ましくは０．０１〜０．０６重量％の量、塩を好ましくは１〜４重量％の量、セサミシードを好ましくは１５〜３５重量％の量、糖（ココナッツ）を好ましくは１〜５重量％の量、タピオカ粉を好ましくは１０〜３０重量％の量、酢（ココナッツ）を好ましくは１〜４重量％の量、水（精製水）を好ましくは２〜１２重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．３〜１重量％の量、含む。
【００６０】
他の調整例において、ケールクラッカー組成物は、ケール、ゴールデンフラックスシード、セサミシード及びヒマワリ種子を含む。他のある調整例において、アップルサイダー（ａｐｐｌｅ  ｃｉｄｅｒ  ｖｉｎｅｇａｒ）を好ましくは１〜３重量％の量、黒コショウを好ましくは０．４〜１．３重量％の量、カシューを好ましくは４〜１３重量％の量、ディルウィードを好ましくは０．４〜１．３重量％の量、ゴールデンフラックスシードを好ましくは１３〜４０重量％の量、ヘンプシードを好ましくは０．７〜２重量％の量、ケールを好ましくは１４〜４２重量％の量、乾燥ホワイトオニオン（パウダー、みじん切り）を好ましくは０．５〜１．６重量％の量、パンプキンシードを好ましくは０．７〜２重量％の量、塩（レギュラーソルト、コーシャソルト、海塩）を好ましくは０．７〜２重量％の量、セサミシードを好ましくは２〜８重量％の量、ヒマワリ種子を好ましくは１０〜３０重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは１〜５重量％の量、含む。
【００６１】
ある調整例において、野菜スープ組成物は、タマネギ、トマト、ホウレンソウ、緑茶抽出物、所望により米粉、所望により玄米粉、所望によりニンジン、及び所望によりイヌリン、リーキを含む。ある調整例において、野菜スープ組成物は、バジル（全葉、乾燥）を好ましくは０．３〜０．９重量％の量、玄米粉（全粒）を好ましくは３〜１２重量％の量、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは４〜１４重量％の量、緑茶抽出物を好ましくは０．０２〜０．０６重量％の量、イヌリンを好ましくは５〜１５重量％の量、リーキ（顆粒−１０＋４０）を好ましくは１〜５重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは１〜６重量％の量、タマネギ（パウダー、みじん切り）を好ましくは４〜１５重量％の量、パセリを好ましくは０．３〜０．８重量％の量、赤ピーマンを好ましくは１〜５重量％の量、米粉を好ましくは１８〜５０重量％の量、塩を好ましくは２〜７重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは０．４〜１．５重量％の量、トマト（果物粉、日干し、顆粒）を好ましくは４〜１４重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．５〜１．８重量％の量、含む。野菜スープ組成物、及び米粉を有する本開示に記載の組成物のうち任意のものにおいて、米粉は、もち米粉でもうるち米粉でもよく、挽かれていても挽かれてなくてもよい。
【００６２】
他の調整例において、野菜スープ組成物は、ニンジン、イヌリン、リーキ、タマネギ及び米粉を含む。ある調整例において、野菜スープ組成物は、乾燥した全葉バジルを好ましくは０．３〜１重量％の量、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは４〜１２重量％の量、イヌリンを好ましくは６〜１８重量％の量、リーキを１〜５重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは１〜３重量％の量、乾燥したホワイトオニオン（パウダー、みじん切り）を好ましくは１０〜３０重量％の量、パセリを好ましくは０．３〜１重量％の量、ジャガイモを好ましくは１〜５重量％の量、トウガラシを好ましくは１〜６重量％の量、米粉を１３〜４０重量％の量、塩（レギュラーソルト、コーシャソルト、海塩）を４〜１２重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは０．２〜１重量％の量、及びトマト（果物粉、日干し顆粒）を好ましくは３〜１３重量％の量、含む。
【００６３】
ある調整例において、キノコスープ組成物は、キノコ、緑茶抽出物、所望により玄米粉、所望によりニンジン、及び所望によりイヌリンを含む。ある調整例において、キノコスープ組成物は、玄米粉（全粒）を好ましくは１０〜３０重量％の量、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは３〜１２重量％の量、緑茶抽出物を好ましくは０．０２〜０．０６重量％の量、イヌリンを好ましくは３〜１２重量％の量、キノコ（ヨーロッパキノコ混合物、パウダー、部分片）を好ましくは６〜１８重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは１〜６重量％の量、タマネギ（パウダー、みじん切り）を好ましくは３〜１２重量％の量、パセリを好ましくは０．１〜０．５重量％の量、米粉を好ましくは１８〜５０重量％の量、塩を好ましくは２〜８重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．５〜１．５重量％の量、含む。
【００６４】
他の調整例において、キノコスープ組成物は、ニンジン、イヌリン、キノコ、タマネギ及び米粉を含む。他の調整例において、キノコスープ組成物は、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは７〜２２重量％の量、イヌリンを好ましくは７〜２２重量％の量、脱水されたキノコ（ヨーロッパキノコ混合物）（パウダー及び部分片）を好ましく７〜２２重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは０．６〜２重量％の量、乾燥したホワイトオニオン（パウダー、みじん切り）を好ましくは７〜２２重量％の量、パセリを好ましくは０．３〜０．９重量％の量、ジャガイモを好ましくは０．６〜２重量％の量、米粉を好ましくは１５〜４５重量％の量、塩（レギュラーソルト、コーシャソルト、海塩）を好ましくは６〜１８重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．７〜２．２重量％の量、含む。
【００６５】
ある調整例において、トマトスープ組成物は、トマト、緑茶抽出物、所望によりイヌリン、及び所望によりタマネギを含む。ある調整例において、トマトスープ組成物（新規）は、バジル（全葉、乾燥）を好ましくは０．２〜０．７重量％の量、玄米粉（全粒）を好ましくは１〜５重量％の量、緑茶抽出物を好ましくは０．０２〜０．０６重量％の量、イヌリンを好ましくは７〜２０重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは３〜９重量％の量、タマネギ好ましくは（パウダー、みじん切り）を好ましくは４〜１２重量％の量、パセリを好ましくは０．１〜０．６重量％の量、米粉を好ましくは１８〜５０重量％の量、塩を好ましくは２〜９重量％の量、トマト（果物粉、日干し、顆粒）を好ましくは１２〜３６重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．５〜３重量％の量、含む。
【００６６】
他の調整例において、トマトスープ組成物は、トマト、イヌリン、オリーブ、タマネギ、ジャガイモ及び米粉を含む。さらに他の調整例において、トマトスープ組成物は、バジル（全葉、乾燥）を好ましくは０．３〜１重量％の量、イヌリンを好ましくは６〜１８重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは４〜１４重量％の量、乾燥したホワイトオニオン（パウダー、みじん切り）を好ましくは８〜２４重量％の量、パセリを好ましくは０．３〜０．９重量％の量、ジャガイモを好ましくは６〜１８重量％の量、米粉を好ましくは９〜２７重量％の量、塩（レギュラーソルト、コーシャソルト、海塩）を好ましくは４〜１４重量％の量、トマト（果物粉、日干し顆粒）を好ましくは８〜２４重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．７〜２．２重量％の量、含む。
【００６７】
ある調整例において、キノア含有ミネストローネスープ組成物は、キノア、緑茶抽出物、所望によりオリーブオイル、所望によりキャベツ、所望によりジャガイモ、所望により米粉、及び所望によりトマトを含み、所望によりターメリックを含まない。ある調整例において、キノア含有ミネストローネスープ組成物は、バジル（全葉、乾燥）を好ましくは０．７〜２重量％の量、ブロッコリーパウダーを好ましくは０．６〜２重量％の量、ホワイトキャベツ（フレーク）を好ましくは３〜１０重量％の量、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは３〜１０重量％の量、セロリを好ましくは１〜４重量％の量、セロリシード（パウダー）を好ましくは０．０７〜０．２重量％の量、ニンニクを好ましくは０．７〜２重量％の量、緑茶抽出物を好ましくは０．０２〜０．０６重量％の量、イヌリンを好ましくは１〜５重量％の量、リーキ（顆粒−１０＋４０）を好ましくは０．７〜２重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは０．６〜２重量％の量、タマネギ（パウダー、みじん切り）を好ましくは２〜８重量％の量、エンドウを好ましくは３〜１０重量％の量、ジャガイモを好ましくは７〜２０重量％の量、キノアを好ましくは７〜２０重量％の量、米粉を好ましくは７〜２０重量％の量、塩を好ましくは１〜６重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは０．５〜２重量％の量、トマト（果物粉、日干し、顆粒）を好ましくは２〜６重量％の量、酵母抽出物を好ましくは０．６〜２重量％の量、及びズッキーニ（パウダー、さいの目切り）を好ましくは２〜８重量％の量、含む。
【００６８】
他の調整例において、キノア含有ミネストローネスープは、キノア、キャベツ、ジャガイモ及び米粉を含む。さらに他の調整例において、キノア含有ミネストローネスープは、乾燥した全葉バジルを好ましくは０．７〜２．２重量％の量、ブロッコリーパウダーを好ましくは０．７〜２．２重量％の量、ホワイトキャベツ（フレーク）を好ましくは０．６〜２．２重量％の量、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは３〜１０重量％の量、セロリアックを好ましくは２〜６重量％の量、セロリシードパウダーを好ましくは０．６〜１．８重量％の量、ニンニクを好ましくは１〜３重量％の量、乾燥したホワイトオニオン（パウダー、みじん切り）を好ましくは３〜９重量％の量、エンドウを好ましくは３〜１０重量％の量、ジャガイモを好ましくは６〜２０重量％の量、キノアを好ましくは８〜２３重量％の量、米粉を好ましくは７〜２２重量％の量、塩（レギュラーソルト、コーシャソルト、海塩）を好ましくは２〜７重量％の量、サボイキャベツを好ましくは３〜１０重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは０．７〜２．２重量％の量、ターメリックを好ましくは０．６〜１．８重量％の量、酵母抽出物を好ましくは３〜１０重量％の量、及びズッキーニ（パウダー、さいの目切り）を好ましくは１〜５重量％の量、含む。
【００６９】
ある調整例において、豆含有ミネストローネスープ組成物は、ホワイトビーンズ（例えば、グレートノーザンビーン）、緑茶抽出物、所望によりキャベツ、及び所望によりジャガイモを含む。ある調整例において、豆含有ミネストローネスープ組成物は、豆（グレートノーザン）を好ましくは３〜１０重量％の量、ホワイトキャベツ（フレーク）を好ましくは２〜８重量％の量、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは２〜８重量％の量、セロリを好ましくは１〜４重量％の量、緑茶抽出物を好ましくは０．０２〜０，０６重量％の量、イヌリンを好ましくは２〜１０重量％の量、リーキ（顆粒−１０＋４０）を好ましくは２〜７重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは２〜７重量％の量、タマネギ（パウダー、みじん切り）を好ましくは２〜７重量％の量、パセリを好ましくは０．２〜１重量％の量、エンドウを好ましくは３〜９重量％の量、ジャガイモを好ましくは１５〜４５重量％の量、米粉を好ましくは６〜１８重量％の量、塩を好ましくは２〜８重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは０．５〜１．５重量％の量、トマト（果物粉、日干し、顆粒）を好ましくは２〜７重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．５〜１．５重量％の量、含む。
【００７０】
ある調整例において、豆含有ミネストローネスープ組成物は、ブラウンビーンズ、ニンジン、エンドウ、ジャガイモ及び米粉を含む。他のある調整例において、豆含有ミネストローネスープ組成物は、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは４〜１４重量％の量、セルリアックを好ましくは１〜５重量％の量、セロリを好ましくは０．５〜１．６重量％の量、リーキを好ましくは２〜８重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは２〜８重量％の量、乾燥したホワイトオニオン（パウダー、みじん切り）を好ましくは３〜１０重量％の量、パセリを好ましくは０．５〜１．５重量％の量、エンドウを好ましくは５〜１８重量％の量、ジャガイモを好ましくは８〜２４重量％の量、米粉を好ましくは５〜１８重量％の量、塩（レギュラーソルト、コーシャソルト、海塩）を好ましくは４〜１４重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは０．５〜１．５重量％の量、トマト（果物粉、日干し顆粒）を好ましくは０．９〜２．８重量％の量、ターメリックを好ましくは０．３〜１．２重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．５〜１．５重量％の量、含む。
【００７１】
ある調整例において、カボチャスープ組成物は、カボチャ、緑茶抽出物、所望により米粉、所望によりニンジン、及び所望により玄米粉を含む。ある調整例において、カボチャスープ組成物（新規）は、玄米粉（全粒）を好ましくは３〜９重量％の量、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは２〜８重量％の量、緑茶抽出物を好ましくは０．０２〜０．０６重量％の量、イヌリンを好ましくは２〜１０重量％の量、油（オリーブ）を好ましくは１〜７重量％の量、タマネギ（パウダー、みじん切り）を好ましくは１．０〜３重量％の量、カボチャパウダーを好ましくは２０〜６０重量％の量、米粉を好ましくは１５〜４５重量％の量、塩を好ましくは２〜１０重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは０．３〜１重量％の量、含む。
【００７２】
ある調整例において、第１の野菜ブロスは、ニンジン、マルトデキストリン、セロリ、ホウレンソウ及びトマトを含む。ある調整例において、第１の野菜ブロスが、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは６〜１８重量％の量、セロリを好ましくは３〜１０重量％の量、ニンニクを好ましくは３〜１０重量％の量、マルトデキストリンを好ましくは８〜２５重量％の量、油（キャノーラ）を好ましくは０．５〜２重量％の量、タマネギ（パウダー、みじん切り）を好ましくは６〜１８重量％の量、パセリを好ましくは３〜１０重量％の量、ジャガイモを好ましくは１〜３重量％の量、塩を好ましくは７〜２１重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは３〜１０重量％の量、トマト（果物粉、日干し、顆粒）を好ましくは６〜１８重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは１〜６重量％の量、含む。
【００７３】
ある調整例において、第２の野菜ブロス（チキン風味）は、ニンジン、チキン香味料、マルトデキストリン、セロリ、ホウレンソウ、ダイズレシチン及びトマトを含む。ある調整例において、第２の野菜ブロス組成物は、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは３〜１０重量％の量、セロリを好ましくは３〜１２重量％の量、ニンニクを好ましくは３〜９重量％の量、マルトデキストリンを好ましくは８〜２５重量％の量、油（キャノーラ）を好ましくは０．５〜２重量％の量、タマネギ（パウダー、みじん切り）を好ましくは３〜１２重量％の量、パセリを好ましくは３〜１０重量％の量、ジャガイモを好ましくは１〜６重量％の量、塩を好ましくは８〜２５重量％の量、ダイズレシチンを好ましくは０．５〜３重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは３〜１２重量％の量、トマト（果物粉、日干し、顆粒）を好ましくは６〜１８重量％の量、キサンタンガムを好ましくは０．５〜４重量％の量、及び酵母抽出物を好ましくは４〜１２重量％の量、含む。
【００７４】
ある調整例において、エナジードリンク組成物は、グリセリンを好ましくは２０〜６０重量％の量、及び水（精製）を好ましくは４０〜８０重量％の量、含む。
【００７５】
ある調整例において、スペアミントを含む茶組成物は、有機スペアミント葉を好ましくは７０〜１００重量％の量で含む。
【００７６】
ある調整例において、レモン及びスペアミントを含む茶組成物は、有機レモンマートルを好ましくは３〜１２重量％の量、有機レモン果皮を好ましくは１０〜２５重量％の量、及び有機スペアミント葉を好ましくは５０〜９５重量％の量、含む。
【００７７】
ある調整例において、ハイビスカスを含む茶組成物は、有機ハイビスカス茶葉を好ましくは８０〜１００重量％の量で含む。
【００７８】
ある調整例において、藻類油組成物は、シゾカトリウム（schizocatrium）藻類油（ＤＨＡオメガ−３）を好ましくは８０〜１００重量％の量で含む。
【００７９】
ある調整例において、栄養素補充組成物（ＮＲ−１）は、ビート根パウダー、炭酸カルシウム、ニンジン、コラード葉、ケール葉及びトマトを含む。ある調整例において、栄養素補充組成物（ＮＲ−１）は、アスコルビン酸を好ましくは１〜３重量％の量、ビート根パウダーを好ましくは６〜２０重量％の量、βカロチンを好ましくは０．０５〜０．１５重量％の量、炭酸カルシウムを好ましくは６〜２０重量％の量、ニンジン（脱水、パフ、パウダー、部分片）を好ましくは６〜２０重量％の量、コレカルシフェロール（cholecaliciferol）を好ましくは０．００重量％の量、ピコリン酸クロムを好ましくは０．００重量％の量、コラード葉パウダーを好ましくは６〜２０重量％の量、硫酸第二銅を好ましくは０．０１〜０．０６重量％の量、０．００のシアノコバラミン、酢酸Ｄｌ−α−トコフェロールを好ましくは０．３〜１重量％の量、フマル酸第一鉄を好ましくは０．２〜１重量％の量、葉酸を好ましくは０．００重量％の量、ケール葉を好ましくは６〜２０重量％の量、ステアリン酸マグネシウムを好ましくは１〜６重量％の量、硫酸マンガンを好ましくは０．０４〜０．０８重量％の量、ナイアシンアミドを好ましくは０．３〜１重量％の量、パントテン酸を好ましくは０．１〜０．６重量％の量、フィトナジオンを好ましくは０．００重量％の量、カリウムヨウ素を好ましくは０重量％の量、ピリドキシン塩酸塩を好ましくは０．０３〜０．１重量％の量、リボフラビンを好ましくは０．０２〜０．１重量％の量、モリブデン酸ナトリウムを好ましくは０．００重量％の量、セレン酸ナトリウムを好ましくは０．００重量％の量、ホウレンソウ（葉、パウダー）を好ましくは６〜２０重量％の量、チアミンモノ硝酸塩を好ましくは０．０２〜０．１重量％の量、トマト（果物粉、日干し、顆粒）を好ましくは６〜２０重量％の量、第三リン酸カルシウムを好ましくは０．５〜２重量％の量、及び酸化亜鉛を好ましくは０．２〜０．８重量％の量、含む。
【００８０】
ある変形例において、断食模倣食パッケージの構成要素の各々は（ゆえに、断食模倣食は）、実質的にグルテンを含まない（例えば、各成分は２０ｐｐｍ未満のグルテンを有する）か、又は非常に低グルテンである（例えば、各成分は２０〜１００ｐｐｍを有する）。他のある変形例において、構成要素の各々は、２０〜６０ｇを一食分の分量として提供される。他のある変形例において、ナッツ含有栄養バーは３０〜６０ｇを一食分として提供され、ココア含有栄養バーは１５〜４０ｇを一食分として提供され、オリーブ含有組成物（海塩バージョン）は１０〜２０ｇを一食分として提供され、オリーブ含有組成物（ニンニクバージョン）は１０〜２０ｇを一食分として提供され、ケールクラッカー組成物は３０〜６０ｇを一食分として提供される。他のある変形例において、ケールクラッカー組成物は、２０〜５０ｇを一食分として提供され、野菜スープ組成物は、２０〜５０ｇを一食分として提供され、キノコスープ組成物は、２０〜５０ｇを一食分として提供され、トマトスープ組成物は、２０〜５０ｇを一食分として提供され、豆含有ミネストローネスープ組成物は、２０〜５０ｇを一食分として提供され、キノア含有ミネストローネスープ組成物は、２０〜５０ｇを一食分として提供され、カボチャスープ組成物は、２０〜５０ｇを一食分として提供され、第１の野菜ブロス組成物は、５〜１５ｇを一食分として提供され、第２の野菜ブロス組成物は、３〜１５ｇを一食分として提供され、エナジードリンク組成物は、１〜５ｏｚを一食分として提供される。
【００８１】
本発明は、細胞のリプログラミングを促進して多分化能細胞を作製し、また、神経系、造血系、肝臓、筋肉、消化器系、心臓、肺、腎臓及び骨などの多くの系及び／又は器官における再生を、これらの系を回復させ且つ当該系に影響を及ぼす疾患を治療する目的で促進するために、上記で説明した方法、食事組成物、及び薬物の組み合わせを提供するものである。
【００８２】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示するものである。当業者は、本発明の精神の範囲内であり且つ請求項の範囲内である多くの変形例を認識するであろう。
【００８３】
断食模倣食（ＦＭＤ）のサイクルは後期２型糖尿病からマウスを救出する
【００８４】
インスリン抵抗性の結果として、機能的インスリン産生β細胞の細胞数の減少は、最終的にインスリン欠乏につながることによって２型糖尿病の病態生理に寄与する（Cnop et al., 2005; Dor and Glaser, 2013）。以前、我々は、４日間の断食模倣食（ＦＭＤ）が、長期にわたる絶食によって引き起こされるものと同様の代謝性変化を誘導することが可能であり、ケトン体及びｉｇｆｂｐ１を増加させる一方、インスリン濃度及びグルコース濃度を低下させることが可能であることを示した（Brandhorst et al., 2015）（図９）。インスリン機能に対する定期的絶食及び断食模倣食の役割は不明であるが、間欠的な絶食及び持続性カロリー制限（ＣＲ）のインスリン感受性に対する効果が以前に報告されている（Barnosky et al., 2014）。我々はインスリン抵抗性に対するＦＭＤの効果も検討したが、ここでは、我々は、β細胞再生を促進する上でのＦＭＤの推定効果に焦点を当てる。
【００８５】
β細胞は成人の膵臓において極めて低い速度で自己複製し（Meier et al., 2008; Teta et al., 2005）、β細胞の新生はめったに起こらない（Xiao et al., 2013）ことを考慮すると、β細胞の枯渇、及びその結果としての後期糖尿病の際のインスリン分泌の喪失は、多くの場合、回復させるためには膵島及び幹細胞の移植を必要とする状態であると考えられてきた（Fiorina et al., 2008; Kroon et al., 2008; Milanesi et al., 2012; Pipeleers et al., 2002; Villani et al., 2014）。我々は、ＦＭＤが２型糖尿病に関連付けられたβ細胞欠乏に影響を与えうるかについて決定するため、レプチン受容体遺伝子（Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ）における点突然変異を有するマウスに対するＦＭＤの効果について検討した。レプチン受容体遺伝子（Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ）における前記点突然変異は、インスリン抵抗性及び後期におけるインスリン分泌の喪失を引き起こす。他人によって報告されているように、ｄｂ／ｄｂマウスは、１０週齢で高血糖を発症した。この１０週齢を、我々はベースライン（ＢＬ）と呼ぶ（図１Ａ）。これに付随して、初期にはインスリン抵抗性を補償する高インスリン濃度を伴うが、その後、１２週齢で、インスリン分泌の低下によって引き起こされる重度の高血糖の発症が生じた（図１Ｂ〜１Ｃ）（Arakawa et al., 2001）。その結果、ｄｂ／ｄｂマウスは、約４月齢で死に始めた。我々は、４日間のＦＭＤを含む週サイクル（図１Ａ）で１２週齢のマウス（高血糖の安定、つまりベースライン、の１４日後）を処置することによってこれらの後期２型糖尿病表現型を好転させることを試みた。ＦＭＤサイクルによって、６０日目までに、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースの濃度が大きく低下し、ほぼ正常濃度に戻った（図１Ｂ）。ＦＭＤサイクルは、３０日目でインスリン分泌の低下からも回復させ、９０日目で血漿インスリン濃度も向上させた（図１Ｃ）。定常状態のβ細胞機能（％Ｂ）及びインスリン感受性（％Ｓ）を見積もるために、先に記載された（Hsu et al., 2013; Matthews et al., 1985）ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）を行った。結果は、高血糖からの回復は、インスリン抵抗性のわずかな軽減に加えて、主に定常状態のβ細胞機能（％Ｂ）の誘導によって引き起こされたことが示している（ＨＯＭＡ−ＩＲ）（図１Ｄ）。とはいえ、ＦＭＤを与えられたマウスは、高められたインスリン分泌機能（図１０Ｆ）に一部起因して、随意摂食（ＡＬ）の対照と比較して耐糖能及びインスリン抵抗性の改善を示した（図１Ｅ）。とりわけ、ＦＭＤ食を与えられたｄｂ／ｄｂマウスは、通常食を与えられた場合と比較して体重の増加が小さかったが、実験の全体を通じて、ｄｂ／ｄｂマウスの健康な野生型（ＷＴ）同腹仔よりも約２２％大きい体重を維持した（図１０Ｃ）。全体として、これらの結果は、ＦＭＤサイクルが、インスリン分泌の回復及びインスリン抵抗性の低下によって後期２型糖尿病からマウスを救出し、生存期間の大きな向上につながったことを示している（図１Ｆ、＊ｐ＜０．０５、傾向についてのログランク検定）。
【００８６】
ＦＭＤのサイクルは２型糖尿病におけるβ細胞機能不全からの回復を起こす
【００８７】
膵島内における非ホルモン産生細胞の増加をもたらすβ細胞の脱分化は、糖尿病性β細胞機能不全の特徴である（Dor and Glaser, 2013; Kim-Muller et al., 2014; Talchai et al., 2012）。以前に他人によって報告されたことと同様に、我々は、後期２型糖尿病マウスの膵島における、インスリンもグルカゴンも産生しない細胞（すなわち、非α／β）の増加、及びβ細胞の細胞数の低下を見い出したが、ＷＴ／ＡＬ健康対照においては認められなかった（図１Ｇ及び図１０、ＷＴ／ＡＬと比較したｄｂ／ｄｂ  ＢＬ）。また、我々は、β細胞の増殖が疾患の後期において低いことも見出した（図１Ｈ、ＢＬと比較したＡＬ  ６０日目）。随意摂食のｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ：ＡＬ）は、６０日目において６０〜８０％のβ細胞カウントの減少を示したが、一方でＦＭＤサイクルを受けたｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ：ＦＭＤ）は、インスリン産生β細胞の細胞数及び増殖の大きな向上を示したが（ｄｂ／ｄｂ  ＢＬと比較、図１Ｇ〜図１Ｉ）、非α／β細胞の細胞数の向上は示さなかった（図１０、６０日目）。ＦＭＤサイクルで処置されたｄｂ／ｄｂマウス（６０日目）から採取された膵島は、ｄｂ／ｄｂ：ＡＬマウスから得られた膵島と比較して増大したグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を示した（図１Ｊ）。また、我々は、ｄｂ／ｄｂ：ＡＬ群マウスから得られた膵島の機能とｄｂ／ｄｂ：ＦＭＤ群マウスから得られた膵島の機能とを区別するために、より長い曝露時間（１２０で示される時点）が必要であるとも決定した（図１Ｊ）。全体として、これらの結果は、ＦＭＤが、インスリン感受性を向上させるのに加えて、β細胞再生を誘導してβ細胞喪失から回復させ、それによって後期２型糖尿病の症状及び死亡率を軽減し得ることを示唆している。
【００８８】
ＦＭＤサイクルは、ＳＴＺ誘導１型糖尿病におけるインスリン依存性グルコースホメオスタシスを回復させる
【００８９】
β細胞再生の刺激におけるＦＭＤサイクルの役割をさらに検討するため、我々は、高用量ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置がインスリン分泌β細胞の欠乏を引き起こす１型糖尿病モデルにＦＭＤサイクルを適用した（Wu and Huan, 2008; Yin et al., 2006）。ＡＬで給餌されたマウスと、７日毎に４日間のＦＭＤのサイクルを複数回（各回のサイクルにおける７日毎に、４日間のＦＭＤとそれに続く３日間の再給餌）に供したマウスの両方においてＳＴＺ処置の５日後に開始する高血糖（＞３００ｍｇ／ｄｌ）が認められた（図２Ａ及び図２Ｂ）。ＳＴＺ処置の５日後を我々はベースライン（ＳＴＺ  ＢＬ）と呼ぶ。血中グルコースの濃度は、ＡＬ食を与えられたＳＴＺ処置マウスで増加し続け、３０日目及び５０日目の両方において４５０ｍｇ／ｄｌを上回る濃度に到達した。他方で、ＦＭＤサイクルを与えられたマウスにおいては、高血糖及びインスリン欠乏の両方が３０日目において著しく軽減された。（図２Ｂ、括弧内にはサンプル数を記した）。より注目すべきことに、ＦＭＤのサイクルの後、５０日目〜６０日目までに、これらの生理的パラメータの値はほぼ正常範囲に戻った（図２Ｂ及び図２Ｃ、括弧内にはサンプル数を記した）。５０日目における腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）において、ＦＭＤサイクルを受けたＳＴＺ処置マウスでは、通常の飼料（ＡＬ）を与えられたマウスと比較して、外来の血中グルコースを除去する能力が向上したことが確認された（図２Ｄ）。
【００９０】
１型糖尿病を最近発症した患者における膵島の病理学的状態を決定する指標として、ある種の循環サイトカインの濃度が用いられている（Baeyens et al., 2014; Grunnet et al., 2009; Lebastchi and Herold, 2012）。我々は、炎症マーカーにおけるＦＭＤの効果を決定するために２３ｐｌｅｘイムノアッセイを行った。我々は、ＦＭＤサイクルが、β細胞傷害関連の循環サイトカイン（例えば、ＴＮＦα及びＩＬ−１２）を抑制しただけでなく、β細胞再生関連循環サイトカイン（例えば、ＩＬ−２及びＩＬ−１０）を増加させたことを見出した（図２Ｅ、３０日目）（Dirice et al., 2014; Rabinovitch, 1998; Zhernakova et al., 2006）。
【００９１】
まとめると、これらの結果は、ＦＭＤサイクルが炎症を抑制し、サイトカイン及び他のタンパク質の濃度の変化を促進することを示しており、これらはインスリン分泌の回復及び高血糖からの回復に有益となりうる。
【００９２】
ＦＭＤサイクルはＳＴＺ誘導β細胞欠乏からの回復を起こす
【００９３】
膵島細胞の特性決定により、ＦＭＤサイクルを受けている動物における回復したグルコースホメオスタシスと膵臓β細胞の補充との間の強い関連が示される。ＳＴＺ処置によって、非α／β細胞の増加（図１１）、及びインスリン分泌β細胞の約８５％の欠乏が生じた（図２Ｆ、ＳＴＺ  ＢＬ）。非α／β細胞の一過性増加は、両群において３０日目までに打ち消された（図１０Ｄ及び図１０Ｅ）。ＦＭＤの週サイクルを受けたマウスは、増殖性β細胞の大きな増加を示し、それに続いて５０日目までにインスリン産生β細胞の濃度がほぼ正常な濃度に戻った（図２Ｆ及び図２Ｇ）。それに対して、通常飼料に随意アクセスしたマウス（ＡＬ）は、５０日を超えてβ細胞が欠乏したままであった（図２Ｆ及び図２Ｇ）。全体として、β細胞の増殖より前に非α／βが増加したことは、ＦＭＤの週サイクルが非α／β細胞からβ細胞への運命の変換を媒介し、ＳＴＺ誘導β細胞欠乏からの回復を引き起こしたという可能性を高める。ただし、他のシナリオも可能である。
【００９４】
ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌は、非糖尿病性マウスにおけるβ細胞再生を促進する
【００９５】
我々は、ＦＭＤ、及びＦＭＤ後の再給餌の期間が、膵島内における細胞集団を制御し、糖尿病とは無関係にβ細胞再生を促進することが可能であるのか、及びどのようにしてそれを行うのかについて調べた。その際に、非α／β細胞及び増殖性β細胞に焦点を当てた。細胞及びホルモンの変化を特性解析するために、ＦＭＤを４日間給餌した野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスの膵臓試料及び末梢血を、食餌の前（ＢＬ）、食餌の終了時（４日目）、及びマウスが通常の食餌に戻った１日後又は３日後（ＲＦ１ｄ又はＲＦ３ｄ）に採取した。ＦＭＤによって、膵島の数及び大きさが減少する傾向が生じ（図３Ａ）、β細胞の割合が３５％低下した（図３Ｂ及び図３Ｃ、絶対数については図１２も参照）。これらの効果は、再給餌の３日間の中で打ち消された（図３Ａ及び図３Ｃ）。非α／β細胞は、ＦＭＤ終了時に増殖を開始し、この増殖は、再給餌の１日後（ＲＦ１ｄ）まで持続し、それによって、ＲＦ１ｄにおいて非α／β細胞が２．５倍増加した（膵島１つ当たりにおける割合）（図１２）。ＲＦ３ｄまでに、非α／β細胞の細胞数が減少し、β細胞の細胞数が基底レベル（ＢＬ）に戻ったが、ＦＭＤ群においては、β細胞はより強く増殖性の状態のままであった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。増殖マーカーＰＣＮＡの発現は、β細胞では上昇したが、ＦＭＤ後の再給餌後のα細胞では上昇しなかった（図３Ｂ、図３Ｃ及び図１２）。膵島１つ当たりの細胞は同じままであったが、α細胞（すなわち、グルカゴン）マーカー及びβ細胞（すなわち、Ｐｄｘ−１又はインスリン）マーカーの両方を共発現するαからβへの過渡期細胞又はβからαへの過渡期細胞は、ＦＭＤを与えられたマウスで増加した（図３Ｄ）。つまり、ＦＭＤは、分化細胞又は運命が決まった細胞の細胞数の減少を促進し、それに続いて過渡期細胞の誘導が生じ、それによって、インスリン産生β細胞の増殖及び細胞数が大きく増加する（図３Ｅ）。
【００９６】
ＦＭＤは、胚発生及び胎児発生の間に認められるものと同様の遺伝子発現プロファイルを成体マウスにおいて促進する
【００９７】
ＦＭＤ誘導膵臓再生を媒介し得る遺伝子を同定するために、我々は、ＦＭＤの終了時、及びＦＭＤ後の再給餌の終了時に、膵島における遺伝子発現を測定した。両方の時点において、ＦＭＤを与えられたマウスに見出された代謝性変化（図９）と整合するように、Ｆｏｘｏ１の一過性上方制御（ＡＬと比較して、ＦＭＤにおいて６．９倍、ＲＦ１ｄにおいて５．３倍、＊ｐ＜０．０５）、及び哺乳動物細胞における脂質代謝及び運命決定の両方についての二重の制御因子として以前に同定されている一組の遺伝子（Cook et al., 2015; Haeusler et al., 2014; Johnson et al., 2004; Kim-Muller et al., 2014; Mu et al., 2006; Stanger, 2008; Talchai et al., 2012; Talchai and Accili, 2015; Tonne et al.）（図４Ａ）の一過性上方制御を我々は見出した。ＦＭＤによって引き起こされた代謝リプログラミングが膵島における系統決定に影響を及ぼすかどうかについて、我々はさらに検討した。図４Ｂにおいて、系統マーカーの発現は、随意摂食（ＡＬ）のマウス又はＦＭＤにおけるマウスから得られた精製膵島のｍＲＮＡ発現によって決定された。ｑＰＣＲアレイによる結果は、以下の遺伝子の上方制御が統計的に有意であった（ＡＬと比較して＊ｐ＜０．０５、図４Ｂ；また、図１３も参照）ことを示す：ｉ）多能性マーカー（例えば、Ｌｅｆｔｙｌは、ＦＭＤの間は３．０倍、ＲＦ１ｄでは７．０倍；Ｐｏｄｘ１は、ＦＭＤの間は３．９倍、ＲＦ１ｄでは９．８倍；Ｎａｎｏｇは、ＦＭＤの間は２．６倍、ＲＦ１ｄでは５．４倍；Ｄｎｍｔ３ｂは、ＦＭＤの間は３１．６倍、ＲＦ１ｄでは１８．３倍）、ｉｉ）胚発生マーカー（例えば、Ｓｏｘ１７は、ＦＭＤの間は３．４倍；Ｇａｔａ６は、ＦＭＤの間は３．１倍、ＲＦ１ｄでは２．７倍）、ｉｉｉ）膵臓胎児段階マーカー、及びｉｖ）β細胞リプログラミングマーカー（例えば、Ｍａｆａは、ＲＦ１ｄでは４．７倍；Ｐｄｘ−１は、ＦＭＤの間は３倍、ＲＦ１ｄでは５．０７倍；Ｎｇｎ３は、ＦＭＤの間は２１．５倍、ＲＦ１ｄでは４５．６倍）（図４Ｂ）（Zhou et al., 2008）。遺伝子発現のこれらの変化は、ＦＭＤが、ｉ）食餌終了時に多能性の方向へ膵臓細胞を脱分化させ、それに続いて再給餌の早い時期（ＲＦ１ｄ）の間に膵臓β細胞系統への再分化が起こる、又はｉｉ）これらの特徴を有する細胞を膵島の外側からリクルートすることを示唆する。膵臓発生に関連する主要タンパク質についての免疫染色によって、膵島内の細胞のタンパク質発現の評価も行った（図４Ｃ及び図４Ｄ）。ｑＰＣＲアレイの結果と整合するように（図４Ｂ）、我々は、早期系統マーカーとしてのＳｏｘ１７のタンパク質レベルがＦＭＤの終了時（ＦＭＤ−４ｄ）に上昇し、内分泌前駆細胞のマーカーであるＮｇｎ３のタンパク質レベルが再給餌の早い時期の間（ＦＭＤ−４ｄ〜ＲＦ１ｄ）一過性に上方制御されたことを見出した（図４Ｃ）。
【００９８】
脱分化細胞からの段階的β細胞変換が再給餌の早い時期の間に生じるかどうかを決定するために、我々は、ＦＭＤにおける複数の時点にわたって、標的とする発生マーカー（すなわち、Ｓｏｘ１７、Ｐｄｘ−１、Ｎｇｎ３）についての二重染色を行った。また、我々は、Ｆｏｘｏ−１関連糖尿病性β細胞脱分化に関連して成体膵島の核に発現することが以前に報告されているＯｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）の発現も測定した（Talchai et al., 2012; Xiao et al., 2013）。Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）ｍＲＮＡ発現は、ＦＭＤが与えられたマウスにおいて増加の傾向を示したが、その傾向は有意ではない（図４Ｃ、ｐ＞０．０５）。免疫染色の結果は、Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）及びＳｏｘ１７が一晩再給餌した後に非常に一時的に共発現し得るのみであり（図１３Ｂ、ＲＦ１２ｈｒ）、その後はＲＦ１ｄにおいてＳｏｘ１７＋Ｐｄｘ１＋細胞の強固な増殖が起こり、次いでＰｄｘ１＋Ｎｇｎ３＋細胞の強固な増殖が生じることを示す（図４Ｄ、全ての時点については図１３Ｂも参照）。Ｎｇｎ３＋細胞はＡＬマウスにおいても検出可能だったが、以前の研究（Baeyens et al., 2014; Gomez et al., 2015）で報告されたのと整合するように、Ｎｇｎ３＋細胞は主に膵島の外側又は端面に位置していた（図４Ｄ）。Ｎｇｎ３＋細胞の細胞数は、ＦＭＤ及び再給餌の間、膵島の内側及び外側の両方で増加した（図４Ｄ）。
【００９９】
これらの結果は、ＦＭＤ及び再給餌サイクルの結果、膵島が、分化してインスリン産生細胞を生み出し得る前駆細胞の特徴を有する、増大した数の細胞を含むことを示唆する。
【０１００】
ＦＭＤはＮｇｎ３発現を誘導してインスリン産生β細胞を生み出す
【０１０１】
膵島内のＮｇｎ３＋細胞は、インスリン産生β細胞を含む内分泌細胞の全ての系統を作製することが可能な前駆細胞として以前に記載されているが、成体のβ細胞の再生におけるＮｇｎ３の役割は不明なままである（Baeyens et al., 2014; Van de Casteele et al., 2013; Xu et al., 2008）。ＦＭＤがＮｇｎ３の新規発現を引き起こすかどうか、及びＮｇｎ３＋細胞がＦＭＤ誘導β細胞再生に寄与し得るかどうかを検討するため、我々は、Ｎｇｎ３−ＣｒｅＥＲ；ｔｄＴｏｍａｔｏＬＳＬ−レポーターマウスを作製し、ＦＭＤで処置した成体マウスにおける推定上のＮｇｎ３発現細胞及びその子孫の系統を追跡した（図５Ａ）。系統追跡のためのｌｏｘＰ組換えを開始するため、組換え（４８時間で最大となり、１週間以内に最小化する）を誘導する低用量タモキシフェンの注射（１日につき２ｍｇ、３日間）を、ＦＭＤの前又は後のマウス、及び随意摂食のマウス（ＡＬ対照）に行った（図５Ａ）。組織採取の時点は、注射の時間、及びＦＭＤ処置の時間に対して相対的である（図５Ａ）。結果は、ＦＭＤがＮｇｎ３由来系統の増殖を誘導したことを示す（図５Ｂ及び図５Ｃ）。免疫染色によりｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を特徴付けると、ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞はＦＭＤの後において全体的β細胞プールの５０．８±８．３％をなすことを示す（図５Ｃ、群Ｃ）。
【０１０２】
インスリン分泌β細胞を再構成する上でのＦＭＤ誘導Ｎｇｎ３系統の寄与を確認するため、我々は、別のマウスモデル（Ｎｇｎ３−ＣｒｅＥＲ／ＬＳＬ−Ｒ２６ＲＤＴＡ）を作製し、野生型非糖尿病性マウス及びＳＴＺ処置マウスの両方において系統アブレーション実験を行った（図５Ｄ）。結果は、Ｎｇｎ３＋系統のアブレーションにより、未処置野生型マウスにおけるＦＭＤ誘導β細胞再生及び空腹時グルコース濃度に対するその効果を打ち消し（図５Ｅ、図５Ｆ及び図１３）、ＳＴＺ処置糖尿病マウスにおけるグルコースクリアランス能（腹腔内グルコース負荷試験アッセイ）に対する効果を打ち消した（図５Ｇ）ことを示している。このことにより、ＦＭＤがＮｇｎ３系統の産生を誘導することが確認され、グルコースホメオスタシスにおけるこのＮｇｎ３依存性β細胞新生の重要な役割が示唆される。
【０１０３】
絶食条件又は栄養素シグナリング経路の阻害は、ヒト膵臓細胞におけるＮｇｎ３発現及びインスリン産生を促進する
【０１０４】
マウス及びヒトの両方において、Ｎｇｎ３発現は、内分泌細胞産生の直前及び内分泌細胞産生の間に生じる。発生中のマウスの膵臓におけるＮｇｎ３  ｍＲＮＡ発現は、ヒト発生における第７週〜第８週（カーネギー段階２１〜２２）にほぼ同等であるＥ１５．５程度でピークに達する。成体マウス膵島におけるＮｇｎ３の発現は、稀ではあるが、厳密な系統レポーター分析によって示されている（Wang et al., 2009）。他人による結果と整合するように、我々のデータ（図５及び図１３）は、成体の膵臓の膵島におけるＮｇｎ３＋細胞がマウスにおけるβ細胞再生にとって重要であることを示す。他方で、成人期におけるヒトの膵島発生及びβ細胞再生におけるＮｇｎ３の役割についての理解は乏しいままである（McKnight et al., 2010）。
【０１０５】
断食模倣条件がどのようにしてヒト膵臓細胞におけるＮｇｎ３発現及びβ細胞機能に影響を及ぼすのかについて検討するため、我々は、ヒト一次膵島を用いてエクスビボで実験を行った（図６Ａ）。簡潔に言えば、製造者による使用説明に従って、健康な対象及び１型糖尿病の対象から得られた膵島（それぞれＨＩ及びＴ１ＤＩ）を培養した。次いで、培養された膵島を、５日間続く低タンパク質及び低カロリーのＦＭＤの効果を試験する臨床試験に参加した対象から得られた血清で処置した（ＮＣＴ０２１５８８９７）１７。５人の対象において、ベースライン及び断食模倣食の５日目に血清試料を採取した。次いで、我々は、ＩＧＦ−１、グルコース及びケトン体を測定し、ヒト膵島を対象由来の血清で処置した（図６Ｂ、表２（図７））。ＦＭＤ処置対象の血清に曝露させた健康膵島及び１型糖尿病膵島の両方において、我々は、Ｓｏｘ２及びＮｇｎ３の発現においてグルコース依存性で誘導が起こる傾向を見出した（図１４Ａ）。
【０１０６】
次いで、我々は、培養膵島に低グルコースで低血清な断食模倣培地（ＳＴＳ）を適用し、ＨＩ及びＴ１ＤＩの両方において低グルコースで低血清な断食模倣培地がインスリンの分泌を著しく促進したことを見出した（図６Ｃ）。我々はさらに、系統リプログラミングマーカーの発現を検討し、ＦＭＤ処置の結果、系統リプログラミングマーカーがマウスにおいて上方制御されることを見出した（すなわち、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ２、Ｎｇｎ３及びＩｎｓ）。結果は、断食模倣条件が、健康対象から得られたヒト膵島（健康膵島、ＨＩ）及び１型糖尿病対象から得られたヒト膵島（１型糖尿病膵島、Ｔ１ＤＩ）においてＳｏｘ２、Ｎｇｎ３及びインスリンの発現を誘導する強い効果を有したことを示す（図６Ｄ〜図６Ｆ）。正常なヒト対象から得られた細胞において、これらの効果は、ＩＧＦ−１処置によって打ち消された（図６Ｇ）。特筆すべきこととして、ヒト１型糖尿病細胞において、ＩＧＦ−１は、増加したインスリン及びＳｏｘ２遺伝子発現を打ち消したが、ＳＴＳ培地によって引き起こされたＮｇｎ３発現は打ち消さなかった（図６Ｇ対図６Ｄ及び図６Ｅ）。将来の研究により、系統リプログラミングマーカーの発現及びインビボにおける膵島細胞の再生における循環ＩＧＦ−１の役割がさらに調べられるであろう。
【０１０７】
健康ヒト膵島及び１型糖尿病ヒト膵島の両方において、ＳＴＳ培地はＰＫＡの活性を著しく低下させたが、この効果はＩＧＦ−１処置によって打ち消された（図６Ｈ）。また、ＳＴＳ培地は、アミノ酸シグナル伝達の重要なメディエータであるｍＴＯＲの活性も低下させた（図６Ｉ）。系統マーカー（すなわち、Ｓｏｘ２及びＮｇｎ３）の発現を制御する上でのこれらの栄養素検知シグナル伝達経路の役割をさらに検討するため、我々は、膵臓細胞のリプログラミングにおけるＴｏｒ−Ｓ６Ｋ経路及びＰＫＡ経路の役割を検証した。Ｔｏｒ−Ｓ６Ｋ経路及びＰＫＡ経路は、ＩＧＦ−１の下流で機能する経路である。標準培地中で培養されたヒト膵島を、ｍＴＯＲを阻害するラパマイシン、及びＰＫＡを阻害するＨ８９で処置した。ｍＴＯＲ及びＰＫＡは、我々のグループ及び他人によって、他の細胞型についてはその再生に関連付けられている（Cheng et al., 2014; Yilmaz et al., 2012）。我々は、１型糖尿病対象から得られたヒト膵島（Ｔ１ＤＩ）において、必須の系統マーカーＳｏｘ２及びＮｇｎ３の発現は、ｍＴＯＲ又はＰＫＡのいずれか一方の阻害によっては誘導されなかったが、ｍＴＯＲ及びＰＫＡの両方が阻害された場合に著しく誘導されたことを見出した（図６Ｊ及び図６Ｋ）。興味深いことに、構成的なｍＴＯＲの活性は、Ｔ１ＤＩ細胞と比較して、ＨＩにおいてより高い傾向があるが、ＰＫＡではそのような傾向は無い（両方の組におけるｍＴＯＲ活性については図６Ｉのレーン１、ＰＫＡ活性については図６Ｈ）。このことは、図６Ｊに示されるＳｏｘ２及びＮｇｎ３の発現におけるＨＩとＴ１ＤＩとの総体的差異を説明し得る。まとめると、これらの結果は、絶食が膵島細胞における系統リプログラミング及びインスリン産生を促進する上で有効であり得ること、このことは部分的には絶食がＩＧＦ−１を減少させ、Ｔｏｒシグナル伝達及びＰＫＡシグナル伝達の両方を阻害することによること、を示している。１型糖尿病対象から得られた膵臓細胞は、Ｔｏｒ−Ｓ６Ｋ及びＰＫＡの活性の構成的上昇を示した。このことは、両方の経路に対する阻害剤が、Ｎｇｎ３媒介系統リプログラミングを誘導する潜在力を有することを示している。これらの結果は、これらの経路の薬理学的阻害によって１型糖尿病対象における膵臓再生に対するＦＭＤの効果を模倣又は増強し得るかもしれないという可能性を高めるものである。
【０１０８】
考察
【０１０９】
マウス発生の間、胎生８．５日目（Ｅ８．５）において、膵臓前駆細胞は、ＳＲＹ関連ＨＭＧ−Ｂｏｘ転写因子Ｓｏｘ１７及びホメオドメイン転写因子Ｐｄｘ１を共発現する。次いで、これらの多分化能膵臓前駆細胞は、ｂＨＬＨ因子ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）を発現する内分泌前駆細胞の一過性集団又は胆管細胞を生み出す二分化能上皮細胞に変換される。Ｎｇｎ３＋内分泌前駆細胞は、グルカゴン＋α細胞及びインスリン＋β細胞を含む全ての主要な膵内分泌細胞を生じる（Arnes et al., 2012）。マウスにおいて、発生中の膵臓におけるＮｇｎ３の発現は、一過性で、Ｅ１１．５とＥ１８との間で検出可能である（Arnes et al., 2012）。Ｓｏｘ１７、Ｐｄｘ−１及びＮｇｎ３を含む発生遺伝子を活性化して成体における機能的β細胞を作製することができるのかどうかについては、これまで不明であった。
【０１１０】
細胞に基づいた治療、並びにβ細胞の自己複製を刺激するサイトカイン及びホルモンの使用は、どちらも、糖尿病患者におけるインスリン産生β細胞を回復させる可能性がある（Dirice et al., 2014）。しかし、移植に基づいた治療におけるいくらかの成功にもかかわらず、ドナー膵臓の供給不足に加えて幹細胞を特殊な派生体への変換の非効率さは、臨床応用に対する障害を代表している。このことは、成功裏にβ細胞を再生するには、内生的前駆細胞の調和した活性化及びリプログラミングに依存する可能性があることを示唆している（Blum et al., 2014; Sneddon et al., 2012; Wang et al.; Xiao et al., 2013）。最近では、このインビボにおける系統リプログラミング又は分化転換は、β細胞を再生させるための新興戦略になってきた（Cohen and Melton, 2011; Heinrich et al., 2015）（Abad et al., 2013; Xu et al., 2015）。
【０１１１】
この研究において、我々は、低タンパク質且つ低糖な断食模倣食（ＦＭＤ）によって、β細胞の細胞数が一時的に減少した後、再給餌後にその細胞数が正常レベルに戻るということを発見したが、このことはインビボにおける系統リプログラミングを示唆している。我々は、後期Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂＴ２マウス糖尿病モデル及びＳＴＺ処置Ｔ１マウス糖尿病モデルの両方における重度の高血糖及びインスリン血症には、膵島における重度のβ細胞欠乏が関連していることを示した。β細胞量（ｍａｓｓ）及びインスリン分泌機能を回復させ、且つ６時間絶食血中グルコースをほぼ正常な濃度に戻すためには、ＦＭＤ及び再給餌を６〜８サイクル行うことが必要であった。非糖尿病性野生型マウスにおいては、膵臓１つ当たりのβ細胞の総細胞数だけでなく、膵島１つ当たりのβ細胞の部分も４日間のＦＭＤ終了時に約６０％減少していたが、再給餌の３日後〜５日後の間にそれらの正常レベルに完全に回復した。また、インスリン濃度及び血中グルコース濃度も、ＦＭＤ期間の終了時には７０％以上低下していたが、再給餌２４〜３６時間の間に正常濃度に戻った。興味深いことに、糖尿病マウスにおいては、膵島内に存在している大部分の細胞はインスリンもグルカゴンも発現しなかった（すなわち、非α／β）。この表現型は、ＦＭＤの間に非糖尿病性野生型マウスでも見出され、他の過渡期細胞型（すなわち、Ｐｄｘ１＋グルカゴン＋細胞及びインスリン＋グルカゴン＋）の増加を伴ったが、続いて再給餌の際に著しいβ細胞再生が起こった。このことは、ＦＭＤが、通常はβ細胞の産生を抑制している遺伝子発現プロファイルを改変することを示唆している。さらに重要なことに、これらの結果は、β細胞増殖の前に生じる食事に誘導された系統変換が、糖尿病性マウスモデル及び非糖尿病性マウスモデルのどちらでもβ細胞再生に重要な役割を果たし得ることを示唆している。１つの可能性は、ＦＭＤの間にα細胞及びβ細胞においてグルカゴン発現及びインスリン発現が一過性に抑制された後、運命が決定済みの細胞において系統リプログラミングが生じるという可能性である。別の可能性は、ＦＭＤが細胞死を引き起こし、次いで、前駆体又は他の細胞を刺激してβ細胞を再生させるという可能性である。
【０１１２】
ＦＭＤは、若年成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）に関連し、Ｆｏｘｏ１によって制御された多くの遺伝子についての脱分化発現プロファイルを逆転させた（Kim-Muller et al., 2014）。ＦＭＤによって、膵島が、最初にＦｏｘｏ１及びその転写標的の発現を増加させ、次いで、過渡的に、再給餌の際に前駆体細胞マーカーＮｇｎ３＋の発現を誘導し、それによってβ細胞再生が生じると思われる。我々は、ＦＭＤ及びＦＭＤ後の再給餌が、β細胞再生に関連する広範囲のサイトカインを変化させると共に、安定なインスリン産生β細胞の産生を促進して重度のβ細胞欠乏を解消させる、複雑で且つ高度に調和した条件を生じさせると結論する。ＦＭＤの間に膵島細胞を再生へとプライム刺激する重要な変化は、ＩＧＦ−１濃度の低下、並びにその結果としてのＰＫＡ及びｍＴｏｒ活性の下方制御であると思われる。このことは、造血幹細胞の自己複製（Cheng et al., 2014）及び腸管幹細胞の自己複製（Yilmaz et al., 2012）におけるＰＫＡ及びｍＴｏｒの経路の役割と整合している。β細胞の一過性脱分化が、β細胞のインビボにおける動態に役割を果たす可能性があることが提案された（Kim-Muller et al., 2014; Weinberg et al., 2007）。これらの脱分化細胞が再分化する能力は、β細胞再生を促進し、１型糖尿病症状を好転させる上での既存の細胞の治療上の潜在力を根本的に変えるものである（Blum et al., 2014; Wang et al., 2014）。したがって、我々の研究は、細胞運命決定に対する、食事による強力で且つ調和した制御の例を提供するものである。この制御は、糖尿病及び他の変性疾患を治療する治療的介入としての役割を果たす潜在力を有する。パイロット臨床試験から得られた我々の予備的結果は、１型糖尿病及び２型糖尿病の両方の治療のためにインスリン抵抗性及び膵臓β細胞再生の両方に対する効果を目的としての、長期的なＦＭＤの定期的サイクルの使用も実現可能であり、大規模無作為臨床試験において試験できる状態にあることも示している。
【０１１３】
実験モデル及び対象詳細マウスモデル。
全ての動物プロトコルは、南カリフォルニア大学（ＵＳＣ）の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。全てのマウスを、病原体フリーの環境内に維持し、１つのケージにつき５匹の動物の群にて、透明な靴箱形のケージ内に収容した。温度及び湿度は一定とし、１２時間／１２時間の光／暗サイクルとした。残留する飼料及び食糞を摂食することを避けるために、ＦＭＤ食を供給する前に動物を新しいケージに移した。全ての動物は、常時飲水可能とした。実験食を与えたとき以外は、マウスに通常の飼料（例えば、ＡＩＮ９３Ｇ）を随意摂食させた。
【０１１４】
１型糖尿病：１型糖尿病を誘導するための高用量ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）注射（１５０ｍｇ／ｋｇ）を行って、β細胞欠乏（＞７０％の喪失）及び高血糖（＞２５０ｄｌ／ｍｌ）を生じさせた（Wu and Huan, 2008）。雄性Ｃ５７Ｂ１６マウス（１６週、ｎ＝１８）を秤量し、ＳＴＺ注射の４〜６時間前に絶食させた。簡潔に言えば、ＳＴＺを使用直前に１０ｍｇ／ｍｌの濃度でクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、新たに調製）に溶解し、マウスの体重に合わせて調製から５分以内にＳＴＺ溶液を腹腔内（ＩＰ）投与した。健康対照として用いられた雄性及び雌性Ｃ５７Ｂ１６マウス（４〜８月齢、ｎ＝１８）に等体積のクエン酸緩衝液を注射した。マウスをそれらのケージに戻し、食物を取り替え、ＳＴＺ注射の直後の日に低血糖を防ぐために１０％スクロース水を与えた。
２型糖尿病：１０週齢の雄性ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｃｌ（ｄｂ／ｄｂ）マウス及びＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／ｍ＋／Ｊｃｌ（ｍ／ｍ）対照マウス（ｄｂ／ｄｂについてはｎ＝１５、対照についてはｎ＝７）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。同齢の野生型同腹仔を健康対照として用いた。
特に断らない限り、組織採取時にはマウスを絶食させなかった。全ての実験及び手法は、南カリフォルニア大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。
【０１１５】
系統追跡及び系統アブレーション。
ヘミ接合性トランスジェニックＮｇｎ３−ＣｒｅＥＲマウスを、系統追跡実験のためにＲ２６ＲＣＡＧ−ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスと交配させるか、又は系統アブレーション実験のためにＲ２６ＲＤＴＡマウスと交配させた（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。以前に記載されたやり方で、タモキシフェン（ＴＡＭ）注射を行った（Madisen et al., 2010）。簡潔に言えば、（図５Ｂ及び図５Ｆに示す）対象となる時点で７５ｍｇ／ｋｇのＴＡＭを腹腔内注射した。両方の性別のマウス（１２〜１６週齢）を、各群についてｎ＝６で用い、ビヒクル対照についてはｎ＝３で用いた。
【０１１６】
ヒト膵島：ヒト膵臓１型ランゲルハンス細胞（＃３５００１−０３）及び非糖尿病性対照（＃３５００２−０４）を商業的供給源Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州トランス）から購入した。細胞を８０％コンフルエンスで接種し、標準培地（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、健康膵島についてはＭ３５００２−０４Ｓ、及び１型糖尿病膵島についてはＭ３５００１−０３Ｓ）で培養した。細胞を１ｍｌ当たり１０５の密度で平板培養し、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中の適切な大きさのフラスコ内で３７℃でインキュベートした。４８時間毎に培地を交換した。６５〜７５％コンフルエンスに到達した際、Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｔ１５０９−０１４）で細胞の継代を行い、継代培養して増殖させた。
【０１１７】
ヒト対象（ＦＭＤ）：確立された選択基準及び除外基準に基づいて、南カリフォルニア大学（ＵＳＣ）の治験審査委員会（ＩＲＢ）によって承認されたプロトコル（承認＃ＨＳ−１２−００３９１）の下で試験対象を募集した。全ての対象からインフォームドコンセントを得た。検査及び試験は、限定されるものではないが、１回目のＦＭＤサイクルの前（ＡＬ）及び後（ＦＭＤ）並びに３回目の食事介入サイクルの完了の５〜８日後（ＲＦ）における静脈穿刺による採血を含んだ。６〜８人の健康対象の組の予備的結果を示す（これらの個人のプロファイルについては表２（図７）参照）。
【０１１８】
ヒト対象の選択基準：概して健康な成人志願者、１８〜７０歳の対象、ボディマスインデックスは１８．５以上、文書でのインフォームドコンセントを提供する能力及び意欲、５日間の食事レジメンの複数のサイクルを受ける能力及び意欲、静脈穿刺による血液試料を提供する能力及び意欲。
除外基準：何らかの主要な医学的状態及び慢性疾患、重度のうつ病及び認知症などの精神疾患、薬物依存、ホルモン補充療法（ＤＨＥＡ、エストロゲン、甲状腺、テストステロン）、重度の高血圧（収縮期血圧＞２００ｍｍ  Ｈｇ及び／又は拡張期血圧＞１０５ｍｍ  Ｈｇ）、過少体重（ＢＭＩ＜１８．５ｋｇ／ｍ２）、妊娠している又は授乳中の女性、試験介入に不適合の特別な食事要件又は食物アレルギー、アルコール依存）。
プロファイル：本試験における対象は、４９．１±６．９歳、身長が１６６．７±４．７ｃｍ、体重が、ベースラインで６３．３２±４．８ｋｇ及びＦＭＤ終了時に６１．３６±４．３である。
【０１１９】
方法の詳細
【０１２０】
マウス断食模倣食（ＦＭＤ）：ＦＭＤのマウスバージョンは、ヒトＦＭＤと同様の成分を用いた４日のレジメンである（表３（図８）参照）（Brandhorst et al., 2015）。全ての食餌成分を完全に混合し、次いで加熱ヒドロゲル（ＣｌｅａｒＨ２Ｏ、メイン州）と共にブレンドした。マウスに対して、１日目に通常の一日分カロリー摂取量の５０％を給餌し、２日目〜４日目に通常の一日分カロリー摂取量の１０％を給餌した。午前中（午前８時〜午前１０時）に新鮮な食餌を全てのマウスに与えた。当然、ＦＭＤマウスは空腹であり、概して、光サイクルの中の数時間以内に、与えられた食餌を食べきった。対照給餌動物は、通常は暗時間の間に、与えられた食餌を食べきった。
ＦＭＤ後の再給餌：２〜４日間の食餌が終了した後、別のＦＭＤサイクルを開始する前に体重を取り戻すために、最長１０日間、通常の飼料をマウスに随時摂食させた。
【０１２１】
血中グルコース及びインスリンの測定
異なる内容が規定されない限り、血中グルコースの測定前の６時間（朝の絶食）、マウスを絶食させた。ＯｎｅＴｏｕｃｈ  ＵｌｔｒａＭｉｎｉ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｓｃａｎ、米国カリフォルニア州ミルピタス）を用いて、尾静脈からの採血によって血中グルコースを測定した。製造者による使用説明に従って、マウス酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、米国ノースカロライナ州ウィンストンセーラム）によって血漿インスリン濃度を測定した。顔面静脈から全血を採取し、リチウムヘパリンを含む血漿分離器チューブ（ＢＤ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）に格納して、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによって血漿を分離した。簡潔に言えば、マウスモノクローナル抗インスリン抗体で被覆した９６ウェルプレート内に１０ｍＬの血漿試料及び校正物質を分注した。次いで、ペルオキシダーゼ結合抗インスリン抗体を含有する標準溶液を各ウェルに加え（1ウェルにつき１００ｍＬ）、プレートを、室温（ＲＴ）で２時間、振盪条件下に置いた。洗浄緩衝液で６回洗浄した後、２００ｍＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質を各ウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。０．５モル／ＬのＨ２ＳＯ４で反応を止め、Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルプレートリーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読み取った。校正物質のＯＤ４５０及びインスリン濃度をＳｉｇｍａｐｌｏｔ１１データ分析ソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ、米国カリフォルニア州サンノゼ）を用いてプロットすることにより標準曲線を作成し、インシュリン濃度についてサンプル値を外挿するための参照として用いた（Milanesi et al., 2012; Villani et al., 2014）。ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）は、インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）及びβ細胞機能（％Ｂ）を定量するために用いられる方法である。以下の式：
ＨＯＭＡ−Ｂ＝（空腹時グルコース×インスリン）／２２．５
を用いて、ＨＯＭＡ−ＩＲを計算した。以下の式：
ＨＯＭＡ−Ｂ＝（２０×空腹時インスリン）／（空腹時グルコース−３．５）％
を用いて、ＨＯＭＡ％Ｂを計算した（Matthews, 2001）。
【０１２２】
腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）及びインスリン抵抗性試験：
マウスを１匹ずつケージに入れ、注射前の４時間、絶食させた。グルコース（１．５ｍｇ／ｇ）又はインスリン（０．７５ユニット／ｋｇ）を腹腔内注射した。注射の５分後、１５分後、３０分後、６０分後、及び９０分後に血中グルコース濃度を測定した。
【０１２３】
免疫蛍光分析
簡潔に言えば、膵臓試料を、以前に記載されているやり方で、食塩水の潅流なしで採取し、パラフィン包埋及び組織学的検査のために直ちに処理した（Milanesi et al., 2012; Villani et al., 2014）。組織を１０％中性リン酸塩緩衝液ホルマリン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国ペンシルバニア州ウォリントン）中、４℃で１時間固定し、７０％エタノール中に４℃で一晩保存した。続いて、組織を、段階的エタノール、トルエンによって脱水し、最後にパラフィンに包埋した（ＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ペンシルバニア州）。膵臓切片（５μｍ）を、Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５回転式ミクロトームを用いてスライスし、一晩乾燥した。翌日、切片をＨｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ組織透明化剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で脱パラフィンし、段階的エタノールシリーズ（１００％、９０％、７０％、５０％及び３０％）で再水和した後、使用前に蒸留水ですすいだ。抗原アンマスキング溶液（Ｈ−３３００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて熱による抗原賦活化を行い、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で切片を室温で３０分間ブロッキングした。以下の一次抗体を用いた：抗インスリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ８３０４）、抗グルカゴン（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０５５）、抗ＰＣＮＡ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４２６）、抗ＰＤＸ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ４７３８３）。発生マーカーに用いられるさらなる抗体は、抗−Ｏｃｔ４抗体−ＣｈＩＰ  Ｇｒａｄｅ（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１９８５７）及び抗−Ｏｃｔ−４Ａ（Ｃ３０Ａ３）ウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２８４０Ｐ）、抗−Ｓｏｘ１７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＃ｓｃ−１７３５５）及び抗−ＮＧＮ３（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃ＬＳ−Ｃ９７６９２）である。切片を、室温で１時間、加湿室内で一次抗体とインキュベートした。ＰＢＳ洗浄の後、切片を、室温で３０分間、二次抗体（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ５５５ロバ抗マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ抗ヤギ６４７（希釈１／５００））と、それぞれインキュベートした。全ての二次蛍光色素結合抗体（secondary fluorochrome-conjugated anitbodies）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。切片を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）とマウントした。染色された切片の画像を、Ｌｅｉｃａ  ＡＦ６０００蛍光顕微鏡を用いて、図の説明（Figure Legend）に示す１０倍、２０倍又は４０倍の対物レンズを用いて取り込んだ。Ｐｄｘ１＋グルカゴン＋細胞、インスリン＋グルカゴン＋細胞及びＮｇｎ３−ｔｄＴｏｍａｔｏ＋グルカゴン＋細胞についての二重染色を共焦点イメージング（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０）によって確認した。１群当たり３〜５匹のマウス、マウス１匹当たり６〜８個の膵臓切片、１時点当たり１条件につき２０〜３０の膵島として、これらのマウスから細胞の数又は対象の面積を測定した。以前に記載されているやり方で（Brereton et al., 2014）、「膵島面積」を測定した。基本的に、我々は、２．５ｍｍ２の膵臓切片当たりの総膵島断面積（％）を測定する。膵島１つ当たりの細胞カウントの絶対数、膵臓切片１つ当たりの膵島の数及び／又は面積については、図１０〜図１２も参照されたい。
【０１２４】
膵島の単離。膵島は、以前に記載されたやり方で（Li et al., 2009）、マウスから単離した。手短に言えば、マウスをＣＯ２吸入によって屠殺し、直ちに、膵臓灌流のために処理した。ＨＢＳＳ中に溶解した３ｍｌのコラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ、１〜１．５ｍｇ／ｍｌ、約１，０００Ｕ／ｍＬ）で膵臓を灌流させた。解剖顕微鏡下で３０Ｇ１／２−Ｇ針を肝管の接続部位を通して総胆管に挿入することによって、コラゲナーゼ溶液を注入した。完全に膵臓が拡延した後、合計２ｍｌの消化溶液で、３７℃で３０分間のインキュベーションによって組織を消化した。消化された組織を激しく振盪し、続いて、ＣａＣｌ２を含有するＨＢＳＳ中で２回洗浄した。膵島を、Ｆａｌｃｏｎセルストレーナ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製し、解剖顕微鏡下でつまみ上げて選別した。膵島をＰＢＳで洗浄し、（＞４０ｕＭのサイズの場合）ｑＰＣＲ分析のためのトータルＲＮＡを抽出するために用いるか、又は（平均のサイズが４０〜７０ｕＭの場合）加湿インキュベータ（９５％空気、５％ＣＯ２）内でＧＳＩＳアッセイ用ＨＢＳＳ溶液中３７℃でインキュベートした。
【０１２５】
細胞系統同定ｑＰＣＲアレイ
【０１２６】
トータルＲＮＡを、製造者による使用説明に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いたカラム法によって精製膵島から抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて定量した。抽出されたＲＮＡから、製造者による使用説明に従って、ＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて逆転写によりｃＤＮＡを得た。次いで、各試料のｃＤＮＡをＲＴ２  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに加え、マウス細胞系統同定のための特定アレイ上に遺伝子発現分析のために分注した（ＰＡＭＭ−５０８Ｚ、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって提供されるオンラインツール（ｗｗｗ．ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒａｒｒａｙｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓ．ｐｈｐ）によって、有意値及び変化比を含む遺伝子分析を行った。
【０１２７】
グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイ
単離された精製膵島を、ＲＰＭＩ１６４０培地（１１ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含み、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、２ｍｍｏｌ／ｌのグルタミン及び１０％のＦＢＳで補充されている）中において３７℃（５％ＣＯ２）で一晩インキュベートし、次いで、ＧＳＩＳアッセイのためにつまみ上げて以下の培地に移した：ＨＥＰＥＳ緩衝液中の「グルコース飢餓調製物」（ｐＨ７．４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５．９ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２及び１．２８ｍＭのＣａＣｌ２を含有、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に４５分間、次いで、基礎「グルコース馴化培地」（２．５Ｇ）（１ウェル当たり１０の膵島を２．５ｍＭのグルコースを含有する５００μｌアッセイ培地へ）に６０分間。次いで、膵島をグルコース飢餓培地中で５分間洗浄し、次いで、２５ｍＭのグルコースを含む「グルコース刺激培地」（２５Ｇ）に６０分間移した。図に記載の時点で培地を回収した（図１Ｋ）。１ウェル当たり大きさが同じ膵島１０個として、２４ウェル組織培養プレートでＧＳＩＳ実験を３連で少なくとも３回行った。アッセイを通して膵島の数を保存するために、処置の間の洗浄は解剖顕微鏡下で行った。
【０１２８】
サイトカインプロファイリング
単一の血清試料から複数の分析物を同時定量検出するためにマウスサイトカイン２３ｐｌｅｘイムノアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ、米国）を用いた。
【０１２９】
ヒト膵島処置及びｑＰＣＲ：
標準培地で細胞を３６時間処置した。標準培地としては、Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎのうち、健康膵島に対してはＭ３５００２−０４Ｓを、１型糖尿病膵島に対してはＭ３５００１−０３Ｓを用いた。
ＳＴＳ条件（０．５ｇ／リットルのグルコース；２％ＦＢＳ）、Ｈ８９（２０ｕＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ラパマイシン（ＲＡＰＡ）（２０ｎＭ）（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国マサチューセッツ州ウォーバーン）、ＩＧＦ１（４０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｒｏＳｐｅｃ、米国ニュージャージー州イーストブランズウィック）及びＰＫＡ  ｓｉＲＮＡ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、６５７４Ｓ）。
ＰＫＡサイレンシングのために、細胞を８０％コンフルエンスで播種し、２４時間後、製造者による使用説明に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡｘ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、１００ｎＭ  ＰＫＡ  ｓｉＲＮＡ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、６５７４Ｓ）により細胞を４８時間トランスフェクトした。トータルＲＮＡを、製造者による使用説明に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて定量した。簡潔に言えば、トータルＲＮＡの１μｇを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅトランスクリプターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、製造者による使用説明に従って、Ｋａｐａ  ｓｙｂｒ  ｆａｓｔ  ｑＰＣＲキット（ＫＡＰＡ  ＢＩＯ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて、異なる転写物（参照遺伝子としてのＮｇｎ３、Ｓｏｘ２、Ｉｎｓｕｌｉｎ及び１８Ｓ）の検出を行った。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩで定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により発現レベルを分析した。比較Ｃｔ法を用いて遺伝子発現を定量した。
【０１３０】
ウエスタンブロッティング：
製造者による使用説明に従って、Ｍ−Ｐｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国イリノイ州ロックフォード）を用いて、総細胞溶解物を調製した。ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってタンパク質濃度を測定した。レーンマーカー還元性試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で等量のタンパク質（６０μｇ）を熱変性させ、Ｎｏｖｅｘ４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＭｉｎｉＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ダルムシュタット、ドイツ）に移した。フィルタを、室温で１時間、５％ＢＳＡでブロッキングし、次いで、ｐ７０  Ｓ６  Ｋｉｎａｓｅ及びホスホｐ７０  Ｓ６  Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ３８９）に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  ＳｉｇｎａｌｉｎｇウサギｍＡｂ＃２７０８、ウサギｍＡｂ＃９２３４）、及び抗β−チューブリン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃０５−６６１）と共に４℃で一晩インキュベートした。ペルオキシダーゼ結合ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、米国カリフォルニア州）を二次抗体として用いた。光子感受性フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、イタリア、ミラノ）を用い、超高感度増強化学発光システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって膜に結合した免疫複合体を検出した。ＩｍａｇｅＪ６４ソフトウェアを用いてデンシトメトリー分析によって定量を行った。
【０１３１】
ＰＫＡ活性：製造者による使用説明に従って、ＰＫＡキナーゼ活性キット（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、米国ニューヨーク州ファーミンデール）を用いてＰＫＡ活性を測定した。
【０１３２】
ヒトの断食模倣食：ＦＭＤのヒトバージョンは、Ｌ−Ｎｕｔｒａ（ｈｔｔｐ：／／ｌ−ｎｕｔｒａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｌｏｎ／）に帰属する権利保護された調製物である。そのＦＭＤのヒトバージョンは、絶食の負担と悪影響を最小限に抑えるために主要栄養素及び微量栄養素の両方を提供し、且つＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ１、グルコース及びケトン体の血清中濃度に対する絶食様効果を達成するように設計された植物系食である（Brandhorst et al., 2015）。ＦＭＤの１日目は、約４６００ｋＪ（１１％のタンパク質、４６％の脂肪、４３％の炭水化物）を供給し、２日目〜５日目は、１日当たり約３０００ｋＪ（９％のタンパク質、４４％の脂肪、４７％の炭水化物）を提供する。ＦＭＤは、高濃度のミネラル、ビタミン及び必須脂肪酸を提供する野菜系スープ、エナジーバー、エナジードリンク、チップスナック、茶及びサプリメントの権利保護された調製物を含む（図１１）。１日当たりに消費される全ての品目は、対象が食べる時期について選択することができるようすると共に、誤って翌日の分を消費することを回避するために個別に箱に入れられた。ヒト対象については、試験食物を朝食、昼食、おやつ及び夕食として消費されるように割り当てる、提案ＦＭＤ食事計画が提供された。成分及びサプリメントについては、以下の一覧を参照のこと。
【０１３３】
ＦＭＤ成分：
【０１３４】
キノコスープ：米粉、ニンジンパウダー、乾燥タマネギ、シャンピニオンマッシュルームパウダー、イヌリン（チコリ繊維）、乾燥シャンピニオンマッシュルーム、塩、酵母抽出物、ジャガイモ澱粉、オリーブオイル、乾燥パセリ、天然香料。
【０１３５】
野菜スープ：米粉、乾燥タマネギ、イヌリン（チコリ繊維）、乾燥トマト、乾燥ニンジン、塩、乾燥トウガラシ、乾燥リーキ、ジャガイモ澱粉、オリーブオイル、凍結乾燥バジル、ホウレンソウパウダー、乾燥パセリ、天然香料。
【０１３６】
トマトスープ：米粉、乾燥トマトパウダー、乾燥タマネギ、乾燥トマト片、乾燥ニンジン、チコリ繊維、ジャガイモ澱粉、オリーブオイル、塩、酵母抽出物、乾燥バジル、乾燥パセリ、天然香料。
【０１３７】
カボチャスープ：カボチャパウダー、米粉、イヌリン（チコリ繊維）、乾燥ニンジン、塩、酵母抽出物、ジャガイモ澱粉、オリーブオイル、乾燥タマネギ、乾燥パセリ、天然香料。
【０１３８】
エナジーバー：アーモンドミール、マカデミアナッツバター、蜂蜜、ペカン、ココナッツ、フラックスシードミール、ココナッツ油、バニラ抽出物、海塩。
【０１３９】
ケールクラッカー：ケール、ゴールデンフラックスシード、ヒマワリ種子、カシュー、セサミシード、栄養性酵母、アップルサイダー（ａｐｐｌｅ  ｃｉｄｅｒ  ｖｉｎｅｇａｒ）、ヘンプシード、パンプキンシード、海塩、オニオンパウダー、ディルウィード、黒コショウ
【０１４０】
藻類油カプセル：藻類油、ゼラチン、グリセリン、精製水、ターメリック、アナトー（Ａｎｎａｔｔｏ）抽出物
【０１４１】
茶：カモミール、スペアミント又はレモン
【０１４２】
エナジードリンク：精製水、天然野菜グリセリン、ポリリジン。
【０１４３】
サプリメント：
【０１４４】
ビタミンＡ（βカロチンとして）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（コレカルシフェロールとして）、ビタミンＥ（酢酸ＤＬ−αトコフェロールとして）、ビタミンＫ（フィトナジオンとして）、チアミン（チアミンモノ硝酸塩として）、リボフラビン、ナイアシン（ナイアシンアミドとして）、ビタミンＢ６（塩酸ピリドキシンとして）、葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミンとして）、ビオチン、パントテン酸（Ｄ−パントテン酸カルシウムとして）、カルシウム（炭酸カルシウム及び第三リン酸カルシウムとして）、鉄分（フマル酸第一鉄として）、リン（第三リン酸カルシウムとして）、ヨウ素（ヨードカリウムとして）、マグネシウム（酸化マグネシウムとして）、亜鉛（酸化亜鉛）、セレン（セレン酸ナトリウムとして）、銅（硫酸第二銅として）、マンガン（硫酸マンガンとして）、クロム（ピコリン酸クロムとして）、モリブデン（モリブデン酸ナトリウムとして）。権利保護されたブレンド品：ビート根パウダー、ホウレンソウ葉パウダー、トマト果実パウダー、ニンジン根パウダー、コラードグリーンパウダー、コラード（ケール）葉パウダー。他の成分：ステアリン酸、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、薬用光沢剤（Pharmaceutical Glaze）。
【０１４５】
メタボリックケージ：
ＬＦ９０タイムドメイン核磁気共鳴スキャナ（Bruker Optics, Inc）を用いて全身脂肪質量及び除脂肪質量を非侵襲的に測定した。メタボリックケージ（ＴＳＥ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、米国ミズーリ州チェスターフィールド）を用いて、１０日間、食物／水分摂取量、エネルギー消費量、呼吸交換比（ＲＥＲ）、及び身体活動度を含む、間接熱量パラメータ及びエネルギーバランスパラメータを非侵襲的に評価した。
【０１４６】
定量及び統計分析。図１〜図４に報告された全ての実験は、少なくとも３つの独立した時に繰り返され、図５及び図６に報告された実験は２回繰り返された。全ての試料は、生物学的反復を示す。図の説明（Ｌｅｇｅｎｄ）に特に断らない限り、グラフに示される全ての中心値は平均値を指す。２つの群の平均値の差の統計的有意性について、我々は、両側スチューデントｔ検定を用いた。各群についての平均値のＡＮＯＶＡ多重比較を行うことによって、複数の群（≧３）の間の差の統計的有意性を計算した。分析から除外された試料や動物は無く、標本サイズ推計を用いなかった。動物は、複数の群に無作為に割り付けられた。全ての組織学的分析を除いては、試験は盲検とはしなかった。
【０１４７】
例示的な実施形態を上に記載したが、これらの実施形態は、本発明の全ての可能な形態を記載することを意図するものではない。むしろ、本明細書において使用される用語は、限定する用語ではなく、説明する用語であり、本発明の精神と範囲から逸脱することなく各種の変更を行ってもよいことが理解される。さらに、実施のための種々の実施形態の特徴を組み合わせて、本発明のさらなる実施形態を形成してもよい。
【０１４８】
参考文献
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【図１Ａ】
2019505592.tif 000004
【図１Ｂ】
2019505592.tif 000005
【図１Ｃ】
2019505592.tif 000006
【図１Ｄ】
2019505592.tif 000007
【図１Ｅ】
2019505592.tif 000008
【図１Ｆ】
2019505592.tif 000009
【図１Ｇ】
2019505592.tif 000010
【図１Ｈ】
2019505592.tif 000011
【図１Ｉ】
2019505592.tif 000012
【図１Ｊ】
2019505592.tif 000013
【図２Ａ】
2019505592.tif 000014
【図２Ｂ】
2019505592.tif 000015
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2019505592.tif 000017
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
2019505592.tif 000019
【図２Ｇ】
2019505592.tif 000020
【図３Ａ】
2019505592.tif 000021
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
2019505592.tif 000035
【図５Ｇ】
2019505592.tif 000036
【図６Ａ】
2019505592.tif 000037
【図６Ｂ】
2019505592.tif 000038
【図６Ｃ】
2019505592.tif 000039
【図６Ｄ】
2019505592.tif 000040
【図６Ｅ】
2019505592.tif 000041
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
2019505592.tif 000043
【図６Ｈ】
2019505592.tif 000044
【図６Ｉ】
2019505592.tif 000045
【図６Ｊ】
2019505592.tif 000046
【図６Ｋ】
2019505592.tif 000047
【図７】
2019505592.tif 000048
【図８−１】
2019505592.tif 000049
【図８−２】
2019505592.tif 000050
【図９Ａ】
2019505592.tif 000051
【図９Ｂ】
2019505592.tif 000052
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2019505592.tif 000054
【図１０Ａ】
2019505592.tif 000055
【図１０Ｂ】
2019505592.tif 000056
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2019505592.tif 000058
【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
2019505592.tif 000074
【図１２Ｈ】
2019505592.tif 000075
【図１３Ａ】
2019505592.tif 000076
【図１３Ｂ】
2019505592.tif 000077
【図１３Ｃ】
2019505592.tif 000078
【図１４Ａ】
2019505592.tif 000079
【図１４Ｂ】
2019505592.tif 000080
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