(57)【要約】４’−リン酸アナログを有する核酸阻害剤分子などのオリゴヌクレオチド、及び例えば細胞内の標的遺伝子の発現を調節する、それの使用方法が本明細書に開示される。リン酸アナログは、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの糖部分（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはそれらのアナログ）の４’−炭素に結合している。通常は、リン酸アナログは、オキシメチル基の酸素原子が糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合しているオキシメチルホスホナートである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドであって、５’末端ヌクレオチドを含み、前記５’末端ヌクレオチドが、式ＩまたはＩＩ：
【化１】
2019530656.tif 000030
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｍ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’、ＣＲ’Ｒ”であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、もしくはＲ７はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルから選択されるか、またはＲ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７のうちの２つは、一緒になって５〜８員環を形成し、前記環は任意に、ヘテロ原子を含有し、
Ｘ１は、存在しないか、またはＯ、Ｓ、ＮＲ’、もしくはＣＲ’Ｒ”から選択され、
Ｙは、前記５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｒ８は、グルタチオン感受性部分であるか、または存在しない、
Ｒ８がグルタチオン感受性部分である場合、Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、もしくはＮＲ’であるか、またはＲ８が存在しない場合、Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ハロゲン、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルキルチオ、任意に置換されたアルキルアミノもしくはジアルキルアミノであり、前記アルキル、アルケニル、及びアルキニルの１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ’）、Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環もしくは任意に置換されたシクロアルキル、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＨＲ’のうちの１つ以上で干渉されてもよく、
Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換の複素環、または置換もしくは非置換のシクロアルキルである）で表される、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記５’末端ヌクレオチドが、式Ｉで表される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが式Ｉで表され、Ｘ２がＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、もしくはＯＣＨ３であり、且つＲ８が存在しないか、またはＸ２がＯであり、且つＲ８がグルタチオン感受性部分である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドであって、５’末端ヌクレオチドを含み、前記５’末端ヌクレオチドが、式ＩＩＩ：
【化２】
2019530656.tif 000031
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｙは、前記５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｘ２はＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、且つＲ８は存在しないか、またはＸ２はＯであり、且つＲ８はグルタチオン感受性部分である）で表される、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
Ｘ２がＯＨ、Ｆ、またはＯＣＨ３であり、Ｒ８が存在しない、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
Ｒａ及びＲｂが水素であるか、ＲａがＣＨ３もしくはＣＨ２ＣＨ３であり且つＲｂが水素であるか、またはＲａ及びＲｂがそれぞれＣＨ３もしくはＣＨ２ＣＨ３である、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドであって、５’末端ヌクレオチドを含み、前記５’末端ヌクレオチドが、式ＩＶ：
【化３】
2019530656.tif 000032
（式中、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｙは、前記５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である）で表される、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドであって、５’末端ヌクレオチドを含み、前記５’末端ヌクレオチドが、式Ｖ：
【化４】
2019530656.tif 000033
（式中、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｙは、前記５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である）で表される、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドであって、５’末端ヌクレオチドを含み、前記５’末端ヌクレオチドが、式ＶＩ：
【化５】
2019530656.tif 000034
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｖは、Ｏであり、
Ｚは、糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｙは、前記５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｖは、前記糖部分の４’−炭素に結合している）で表される、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記糖部分が、フラノースである、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドであって、５’末端ヌクレオチドを含み、前記５’末端ヌクレオチドが、４’−オキシメチルホスホナートを含み、前記４’−オキシメチルホスホナートが、−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＨ）２または−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ）２であり、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ３、アルキル基、または保護基から選択される、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記アルキル基が、ＣＨ２ＣＨ３である、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子であり、前記第１の鎖が、センス鎖であり、前記第２の鎖が、アンチセンス鎖である、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子が、１５〜４５ヌクレオチドの前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の間の相補的な領域を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の間の前記相補的な領域が、２０〜３０ヌクレオチドである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の間の前記相補的な領域が、２１〜２６ヌクレオチドである、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の間の前記相補的な領域が、１９〜２４ヌクレオチドである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の間の前記相補的な領域が、１９〜２１ヌクレオチドである、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記５’末端ヌクレオチドが、前記アンチセンス鎖に位置する、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記５’末端ヌクレオチドが、前記センス鎖に位置する、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子が、テトラループを含有する、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、一本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子である、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはアプタマーである、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記一本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子が、長さが１４〜５０ヌクレオチドである、請求項２３または２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記一本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子が、長さが約１６〜３０、１８〜２２、または２０〜２２ヌクレオチドである、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが、裸のオリゴヌクレオチドである、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
少なくとも１つの送達剤をさらに含み、前記少なくとも１つの送達剤が、細胞の外膜を超える前記オリゴヌクレオチドの輸送を容易にするように、前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記送達剤が、炭水化物、ペプチド、脂質、ビタミン、及び抗体からなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記送達剤が、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、マンノース−６−リン酸、ガラクトース、オリゴ糖、多糖、コレステロール、ポリエチレングリコール、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リトコール酸、及びカチオン性脂質から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
医薬組成物であって、請求項１３〜３０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む、前記医薬組成物。
【請求項３２】
対象における標的遺伝子の発現を低減させる方法であって、前記標的遺伝子の発現を低減させるのに十分な量で、それを必要とする対象に、請求項３１に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
前記投与することが、全身投与を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ヌクレオシドホスホルアミダイトであって、前記ヌクレオシドホスホルアミダイトが、式Ｘまたは式ＸＩ：
【化６】
2019530656.tif 000035
（式中、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｍ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’、ＣＲ’Ｒ”であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、もしくはＲ７はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルから選択されるか、またはＲ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７のうちの２つは、一緒になって５〜８員環を形成し、前記環は任意に、ヘテロ原子を含有し、
Ｘ１０は、存在しないか、またはＯ、Ｓ、ＮＲ’、もしくはＣＲ’Ｒ”から選択され、
Ｒ１０は、ホスホルアミダイトであり、
Ｒ８は、グルタチオン感受性部分であるか、または存在しない、
Ｒ８がグルタチオン感受性部分である場合、Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、もしくはＮＲ’であるか、またはＲ８が存在しない場合、Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ハロゲン、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルキルチオ、任意に置換されたアルキルアミノもしくはジアルキルアミノであり、前記アルキル、アルケニル、及びアルキニルの１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ’）、Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環もしくは任意に置換されたシクロアルキル、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＨＲ’のうちの１つ以上で干渉されてもよく、
Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換の複素環、または置換もしくは非置換のシクロアルキルである）で表される、前記ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項３５】
Ｍ１がＯであり、Ｘ１０がＯである、請求項３４に記載のヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項３６】
Ｘ２がＯであり、Ｒ８がグルタチオン感受性部分である、請求項３４または３５に記載のヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項３７】
Ｘ２がＦ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、またはＯＣＨ３であり、Ｒ８が存在しない、請求項３４または３５のいずれか１項に記載のヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項３８】
Ｒｃ及びＲｄがそれぞれＣＨ３であるか、またはＲｃ及びＲｄがそれぞれＣＨ２ＣＨ３である、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項３９】
ヌクレオシドホスホルアミダイトであって、前記ヌクレオシドホスホルアミダイトが、式ＸＩＩ：
【化７】
2019530656.tif 000036
（式中、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｒ１０は、ホスホルアミダイトであり、
Ｘ２はＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、且つＲ８は存在しないか、またはＸ２はＯであり、且つＲ８はグルタチオン感受性部分である）で表される、前記ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項４０】
Ｒｃ及びＲｄがそれぞれ独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、または保護基から選択される、請求項３９に記載のヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項４１】
Ｘ２がＦまたはＯＣＨ３であり、Ｒ８が存在しない、請求項３９または４０に記載のヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項４２】
Ｘ２がＯであり、Ｒ８がグルタチオン感受性部分である、請求項３９または４０に記載のヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項４３】
ヌクレオシドホスホルアミダイトであって、前記ヌクレオシドホスホルアミダイトが、式ＸＩＩＩ：
【化８】
2019530656.tif 000037
（式中、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｒ１０は、ホスホルアミダイトであり、
Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である）で表される、前記ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項４４】
ヌクレオシドホスホルアミダイトであって、前記ヌクレオシドホスホルアミダイトが、式ＸＩＶ：
【化９】
2019530656.tif 000038
（式中、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｒ１０は、ホスホルアミダイトであり、
Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である）で表される、前記ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項４５】
ヌクレオシドホスホルアミダイトであって、前記ヌクレオシドホスホルアミダイトが、式ＸＶ：
【化１０】
2019530656.tif 000039
（式中、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｖは、Ｏであり、
Ｚ１は、ホスホルアミダイト及び糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｖは、前記糖部分の４’−炭素に結合している）で表される、前記ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項４６】
前記糖部分が、フラノースである、請求項４５に記載のヌクレオチドホスホルアミダイト。
【請求項４７】
Ｒｃ及びＲｄがそれぞれＣＨ３であるか、またはＲｃ及びＲｄがそれぞれＣＨ２ＣＨ３である、請求項４５または４６に記載のヌクレオチドホスホルアミダイト。
【請求項４８】
前記オリゴヌクレオチドが、第１鎖及び第２鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖が、長さが１５〜１００または１５〜５０ヌクレオチドである、請求項４８に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月２日に提出された米国仮特許出願番号第６２／３８３，２０７号及び２０１６年９月１２日に提出された米国仮特許出願番号第６２／３９３，４０１号出願日の利益を主張し、これに依拠し、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びそれらのアナログ）のポリマー配列である。核酸阻害剤分子は、細胞内ＲＮＡレベルを調節するオリゴヌクレオチドであり、癌、ウイルス感染症、及び遺伝障害の処置において早い段階での将来性を実証している。核酸阻害剤分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む多様な機序を通してＲＮＡ発現を調節し得る。
【０００３】
ＲＮＡｉは、ほとんどの真核生物に見られる保存された経路であり、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡに相補的な配列を有する標的遺伝子の発現を阻害する。代表的なＲＮＡｉ経路では、長いｄｓＲＮＡが、ダイサー酵素により切断されて、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）と呼ばれる短いＲＮＡ二重鎖になる。ｓｉＲＮＡは、ダイサー、トランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、及びアルゴノート２（「Ａｇｏ２」）と結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）と呼ばれることがある複合体を形成することが示されている。Ａｇｏ２は、標的ｍＲＮＡ切断の配列特異性を導くように、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖とも呼ばれる）を使用して標的ｍＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。
【０００４】
様々な二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子構造が、長年にわたって開発されている。例えば、天然のｓｉＲＮＡを模倣する二本鎖核酸分子に焦点を当てたＲＮＡｉ阻害剤分子に関する初期の研究は、各鎖は、１９〜２５ヌクレオチドのサイズを有し、１〜５ヌクレオチドの少なくとも１つの３’−オーバーハングを有する（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照のこと）。その後、ＲＮＡｉ阻害剤分子を活性化するように、ダイサー酵素でｉｎ  ｖｉｖｏで処理される長い二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子が開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照のこと）。後の研究により、鎖の一方が熱力学的に安定化したテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも一方の鎖の少なくとも一端が分子の二本鎖標的領域を越えて伸長する伸長した二本鎖核酸阻害剤分子が開発された（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号、米国特許第８，９２７，７０５号、ＷＯ２０１０／０３３２２５、及びＷＯ２０１６／１００４０１）。それらの構造は、（分子の片側または両側の）一本鎖伸長、及び二本鎖伸長を含む。
【０００５】
一本鎖核酸阻害剤分子もまた、当該技術分野で既知である。例えば、最近の取り組みにより、ｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子の活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，２４（５）：９４６−５５を参照のこと）。また、特定の標的遺伝子の発現を低減させるアンチセンス分子は、数十年間使用されている。Ｐｅｌｅｃｈａｎｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１３，１４：８８０−９３。これらの構造の共通の主題における多数の変形形態が、広範囲の標的に対して開発されている。他の一本鎖核酸阻害剤分子は、例えば、マイクロＲＮＡ、リボザイム、アンタゴミア、及びアプタマーを含み、それらは全て、当該技術分野で既知である。
【０００６】
特定の場合では、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に受けた条件などの特定の条件下で要求され得る特性を導入するために、化学修飾が核酸阻害剤分子に導入されている。このような修飾は、例えば、オリゴヌクレオチドの構造もしくは活性を損なうかもしくは阻害するヌクレアーゼもしくは他の酵素に対し安定化するように、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増加させるように、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するように、設計されたものを含む。
【０００７】
例えば、合成オリゴヌクレオチドは一般に、５’−または３’−ヒドロキシル基で終結する。末端ヒドロキシル基を、リン酸基と置換することが可能であり、これは、例えば、リンカー、アダプター、もしくは標識を結合するために、またはオリゴヌクレオチドの他の核酸との直接ライゲートのために、使用することができる。加えて、５’末端リン酸基が特定の核酸阻害剤分子とＡｇｏ２の間の相互作用を増強することが報告されている。しかし、５’−リン酸基を有するオリゴヌクレオチドは一般に、ホスファターゼまたは他の酵素を介した分解を受けやすく、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的利用能を制限し得る。
【０００８】
従って、リン酸基の機能的効果を提供するが、オリゴヌクレオチドが、対象に投与される時に曝露されるべき環境条件に対してより安定である、核酸阻害剤分子などのオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに対する修飾を開発することが望ましい。このようなリン酸アナログは、オリゴヌクレオチドの機能に対する悪影響を最小限に抑え（例えば、ＲＮＡｉ阻害剤分子に使用される時に遺伝子標的ノックダウンのあらゆる低減を最小限に抑え）ながら、ホスファターゼ及び他の酵素に対して、より高い耐性を示すであろう。
【発明の概要】
【０００９】
本出願は、４’−リン酸アナログを含むオリゴヌクレオチドについて開示する。好適なオリゴヌクレオチドとしては、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンタゴミア、アプタマー、及びｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子などの核酸阻害剤分子が挙げられる。
【００１０】
本開示のリン酸アナログは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド（「Ｎ１ヌクレオチド」）の糖部分（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはそのアナログ）の４’−炭素に結合している。通常は、リン酸アナログは、オキシメチル基の酸素原子が糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合しているオキシメチルホスホナートである。他の実施形態では、リン酸アナログは、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子が糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合しているチオメチルホスホナートまたはアミノメチルホスホナートである。
【００１１】
特定の実施形態では、４’−オキシメチルホスホナートは、ＲがＨ、ＣＨ３、アルキル基、または保護基から独立して選択される−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＨ）２または−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ）２で表される。特定の実施形態では、アルキル基は、ＣＨ２ＣＨ３である。
【００１２】
一態様では、本明細書に記載のリン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子は、細胞における標的遺伝子の発現を調節するために使用することができる。リン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子は、医薬組成物として、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することができ、標的遺伝子の発現を調節するために、且つそれを必要とする患者を処置するために、使用することができる。
【００１３】
特定の態様では、本開示は、４’−オキシメチルホスホナートを含む５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関し、４’−オキシメチルホスホナートは、−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＨ）２または−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ）２であり、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ３、アルキル基、または保護基から選択される。特定の実施形態では、アルキル基は、ＣＨ２ＣＨ３である。
【００１４】
特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるように、式Ｉまたは式ＩＩで表される５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関する。特定の実施形態では、５’末端ヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、式Ｉで表される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式Ｉで表され、Ｘ２はＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、またはＯＣＨ３であり、且つＲ８は存在しないか、またはＸ２はＯであり、且つＲ８はグルタチオン感受性部分である。
【００１５】
特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるように、式ＩＩＩで表される５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドの特定の実施形態では、Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、またはＯＣＨ３であり、Ｒ８は、存在しない。
【００１６】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは水素であるか；ＲａはＣＨ３もしくはＣＨ２ＣＨ３であり、且つＲｂは水素であるか；またはＲａ及びＲｂはそれぞれＣＨ３もしくはＣＨ２ＣＨ３である。
【００１７】
特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるように、式ＩＶで表される５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関する。
【００１８】
特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるように、式Ｖで表される５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関する。
【００１９】
特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されるように、式ＶＩで表される５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに関する。特定の実施形態では、糖部分は、フラノースである。
【００２０】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ阻害物質分子であり、第１の鎖は、センス鎖であり、第２の鎖は、アンチセンス鎖である。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子は、１５〜４５ヌクレオチドの、センス鎖及びアンチセンス鎖の間の相補的な領域を含む。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の間の相補的な領域は、２０〜３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の間の相補的な領域は、２１〜２６ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の間の相補的な領域は、１９〜２４ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の間の相補的な領域は、１９〜２１ヌクレオチドである。
【００２１】
特定の実施形態では、５’末端ヌクレオチドは、アンチセンス鎖に位置する。特定の実施形態では、５’末端ヌクレオチドは、センス鎖に位置する。
【００２２】
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子は、テトラループを含有する。
【００２３】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはアプタマーである。
【００２４】
特定の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子である。特定の実施形態では、一本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子は、長さが１４〜５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、一本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子は、長さが約１６〜３０、１８〜２２、または２０〜２２ヌクレオチドである。
【００２５】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの送達剤をさらに含み、少なくとも１つの送達剤は、オリゴヌクレオチドの、細胞の外膜を越えた輸送を促進するために、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。特定の実施形態では、送達剤は、炭水化物、ペプチド、脂質、ビタミン、及び抗体からなる群より選択される。特定の実施形態では、送達剤は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、マンノース−６−リン酸、ガラクトース、オリゴ糖、多糖、コレステロール、ポリエチレングリコール、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リトコール酸、及びカチオン性脂質から選択される。
【００２６】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に含有される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、裸のオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
ある態様では、本開示は、本明細書に記載されるように、４’−リン酸アナログを含むオリゴヌクレオチド（例えば、核酸阻害剤分子）、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物、ならびに、標的遺伝子の発現を低減させるのに十分な量で医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における標的遺伝子の発現を低減させるそれの使用方法、に関する。特定の実施形態では、投与することは、全身投与を含む。
【００２８】
特定の態様において、本開示は、ヌクレオシドホスホルアミダイトに関し、ヌクレオシドホスホルアミダイトは、本明細書に記載されるような式Ｘまたは式ＸＩで表される。ヌクレオシドホスホルアミダイトの特定の実施形態では、Ｍ１は、Ｏであり、Ｘ１０は、Ｏである。ヌクレオシドホスホルアミダイトの特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ８は、グルタチオン感受性部分である。ヌクレオシドホスホルアミダイトの特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｆ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、またはＯＣＨ３であり、Ｒ８は、存在しない。ヌクレオシドホスホルアミダイトの特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ、ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３である。
【００２９】
特定の態様では、本開示は、ヌクレオシドホスホルアミダイトに関し、ヌクレオシドホスホルアミダイトは、本明細書に記載されるような式ＸＩＩで表される。ヌクレオシドホスホルアミダイトの特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、または保護基から選択される。ヌクレオシドホスホルアミダイトの特定の実施形態では、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３であり、Ｒ８は、存在しない。ヌクレオシドホスホルアミダイトの特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ８は、グルタチオン感受性部分である。
【００３０】
特定の態様では、本開示は、ヌクレオシドホスホルアミダイトに関し、ヌクレオシドホスホルアミダイトは、本明細書に記載されるような式ＸＩＩＩで表される。
【００３１】
特定の態様では、本開示は、ヌクレオシドホスホルアミダイトに関し、ヌクレオシドホスホルアミダイトは、本明細書に記載されるような式ＸＩＶで表される。
【００３２】
特定の態様では、本開示は、ヌクレオシドホスホルアミダイトに関し、ヌクレオシドホスホルアミダイトは、本明細書に記載されるような式ＸＶで表される。特定の実施形態では、糖部分は、フラノースである。特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ、ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】実施例に記載されるような２つの代表的な対照二本鎖ＲＮＡｉ制御分子阻害剤：対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ、及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆを示す。対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ、及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆは、ガイド鎖のＮ１ヌクレオチドの５’−ＯＨまたは５’−ＰＯ４を除いて同一である。
【図１Ｂ】実施例に記載されるような２つの代表的な二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子：試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆを示す。試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆは、ガイド鎖のＮ１ヌクレオチドの４’−オキシメチルホスホナート基を除いて同一であり、前者の試験化合物は完全脱保護されたホスホナート基を有し、後者の試験化合物は、ホスホナート部分にモノメチル保護基を有する。試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆは、ガイド鎖のＮ１ヌクレオチドを除いて、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ（図１Ａ）と同一であり、対照化合物は、５’−ＯＨまたは５’−ＰＯ４のいずれかを有し、試験化合物は、４’−オキシメチルホスホナートを有する。
【図１Ｃ】実施例に記載されるような２つの代表的な対照二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子：対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅを示す。対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅは、ガイド鎖のＮ１ヌクレオチドの５’−ＯＨまたは５’−ＰＯ４を除いて同一である。
【図１Ｄ】実施例に記載されるような２つの代表的な二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子：試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅを示す。試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅは、ガイド鎖のＮ１ヌクレオチドの４’−オキシメチルホスホナート基を除いて同一であり、前者の試験化合物は完全脱保護されたホスホナート基を有し、後者の試験化合物は、ホスホナート部分にモノメチル保護基を有する。試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅは、ガイド鎖のＮ１ヌクレオチドを除く、対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅ（図１Ｃ）と同一であり、対照化合物は、５’−ＯＨまたは５’−ＰＯ４のいずれかを有し、試験化合物は、４’−オキシメチルホスホナートを有する。
【図２Ａ】実施例８に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，メリーランド州ロックビル）を含む化合物をトランスフェトした４８時間後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ（図２Ａ）及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ（図２Ｂ）と比較した、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ（図２Ｃ）及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ（図２Ｄ）のポテンシー（ＩＣ５０）を示す。
【図２Ｂ】実施例８に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，メリーランド州ロックビル）を含む化合物をトランスフェトした４８時間後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ（図２Ａ）及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ（図２Ｂ）と比較した、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ（図２Ｃ）及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ（図２Ｄ）のポテンシー（ＩＣ５０）を示す。
【図２Ｃ】実施例８に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，メリーランド州ロックビル）を含む化合物をトランスフェトした４８時間後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ（図２Ａ）及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ（図２Ｂ）と比較した、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ（図２Ｃ）及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ（図２Ｄ）のポテンシー（ＩＣ５０）を示す。
【図２Ｄ】実施例８に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，メリーランド州ロックビル）を含む化合物をトランスフェトした４８時間後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ（図２Ａ）及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ（図２Ｂ）と比較した、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ（図２Ｃ）及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ（図２Ｄ）のポテンシー（ＩＣ５０）を示す。
【図３Ａ】実施例９に記載されるように、カチオン性脂質トランスフェクション剤を用いずにトランスフェクトした２４時間後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、サル肝細胞における試験化合物完全脱保護、２’−Ｆのポテンシー（ＩＣ５０）を示す。
【図３Ｂ】実施例９に記載されるように、カチオン性脂質トランスフェクション剤を用いずにトランスフェクトした２４時間後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、サル肝細胞における試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆのポテンシー（ＩＣ５０）を示す。
【図４Ａ】実施例１０に記載されるように、カチオン性脂質トランスフェクション剤を用いずにトランスフェクトした４８時間後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、ヒト肝細胞における試験化合物完全脱保護、２’−Ｆのポテンシー（ＩＣ５０）を示す。
【図４Ｂ】実施例１０に記載されるように、カチオン性脂質トランスフェクション剤を用いずにトランスフェクトした４８時間後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、ヒト肝細胞における試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆのポテンシー（ＩＣ５０）を示す。
【図５Ａ】実施例１１に記載されるように、ラット肝臓トリトソームにインキュベートした後の、対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ；対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅ；試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ；及び５’−ＰＯ４（「Ｍ１」）の代わりに５’−ＯＨを有する対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅの代謝産物のガイド鎖の相対存在量を示す。
【図５Ｂ】実施例１１に記載されるように、ラット肝臓トリトソームにインキュベートした後の、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ及びその代謝産物の混合物のガイド鎖の相対的存在量を示す。代謝産物混合物は、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆのガイド鎖と同じ構造を有する主な代謝産物を含む。
【図５Ｃ】実施例１１に記載されるような、体重１キログラム当たり３ミリグラム（「ｍｐｋ」）の試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅのｉｎ  ｖｉｖｏ投与後のマウス肝臓試料における試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅ及びその代謝産物（「Ｍ２」）のガイド鎖の相対存在量を示す。Ｍ２は、試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅのガイド鎖と同じ構造を有する。
【図６Ａ】実施例１２に記載されるような、対照ＰＢＳ注射と比較した、体重１キログラム当たり１ミリグラム（「ｍｐｋ」）の対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ；対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ；または試験化合物完全脱保護、２’−Ｆをｉｎ  ｖｉｖｏ投与した３日後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、マウスにおけるポテンシーを示す。
【図６Ｂ】実施例１２に記載されるような、対照ＰＢＳ注射と比較した、体重１キログラム当たり１ミリグラム（「ｍｐｋ」）の対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅまたは試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅをｉｎ  ｖｉｖｏ投与した４日後に標的遺伝子ＢのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、マウスにおけるポテンシーを示す。
【図７】実施例１２に記載されるような、体重１キログラム当たり０．３ミリグラム（「ｍｐｋ」）、１ｍｐｋ、及び３ｍｐｋで投与される試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆをｉｎ  ｖｉｖｏ投与した１０日後に標的遺伝子ＡのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、用量反応研究におけるマウスのｉｎ  ｖｉｖｏポテンシーを示す。
【図８】実施例１２に記載されるような、体重１キログラム当たり０．３ミリグラム（「ｍｐｋ」）または１ｍｐｋで投与される試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅをｉｎ  ｖｉｖｏ投与した３及び１０日後に標的遺伝子ＢのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏポテンシーを示す。
【図９Ａ】実施例１３に記載されるような、キログラム当たり３ミリグラムの対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ及び試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅをｉｎ  ｖｉｖｏ投与した１４、２８、及び５６日後に標的遺伝子ＢのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、カニクイザルにおける経時変化研究の結果を示す。
【図９Ｂ】実施例１３に記載されるような、キログラム当たり３ミリグラムの試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅをｉｎ  ｖｉｖｏ投与した１４、２８、及び５６日後に標的遺伝子ＢのｍＲＮＡのノックダウンにより測定される場合の、カニクイザルにおける経時変化試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
本開示をより容易に理解するために、特定の用語は、最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語に対するさらなる定義は、本明細書を通して説明され得る。以下に記載される用語の定義が、参照により組み込まれる出願または特許における定義と矛盾する場合、本出願に記載される定義は、用語の意味を理解するために使用されるべきである。
【００３５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、「方法」への言及は、１つ以上の方法、及び／または本明細書に記載の、且つ／もしくは本開示などを読む時に当業者らに明らかになるであろう種類のステップを含む。
【００３６】
５’末端ヌクレオチド：
本明細書中で使用される場合、「５’末端ヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチドの５’末端に位置するヌクレオチドを指す。５’末端ヌクレオチドは、本出願では、「Ｎ１ヌクレオチド」とも呼ばれ得る。
【００３７】
アシル：
本明細書で使用される場合、「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、及びアリールカルボニル部分を指す。
【００３８】
脂肪族基：
本明細書で使用される場合、「脂肪族基」という用語は、１つ以上の官能基で任意に置換される、飽和及び不飽和の両方の直鎖（すなわち、非分枝鎖）または分枝鎖の炭化水素を指す。「置換脂肪族」という用語は、置換基を有する脂肪族部分を指す。
【００３９】
アルコキシ：
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して分子部分に結合したアルキル基を指す。
【００４０】
アルケニル：
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、且つ約２〜約２０の範囲の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。「置換アルケニル」は、１つ以上の置換基をさらに有するアルケニル基を指す。本明細書で使用される場合、「低級アルケニル」は、約２〜約６の炭素原子を有するアルケニル部分を指す。
【００４１】
アルキル：
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１〜約２０の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。本明細書に現れる時はいつでも、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」のような数値範囲は、アルキル基が、１つのみの炭素原子、２つの炭素原子、３つの炭素原子など、６つ以下の炭素原子を含んでもよいが、「アルキル」という用語は、数値範囲の炭素原子が指定されていない場合も含む。例えば、「アルキル」という用語は、Ｃ１−Ｃ１０間のサブレンジ（例えば、Ｃ１−Ｃ６）を指し得る。「置換アルキル」は、置換基を有するアルキル部分を指す。本明細書で使用される場合、「低級アルキル」は、１〜約６つの炭素原子を有するアルキル部分を指す。
【００４２】
アルキルアミノ：
本明細書で使用される場合、「アルキルアミノ」という用語は、アミン官能基を有するアルキルラジカルを指す。アルキルアミノは、置換されても、置換されなくてもよい。
【００４３】
アルキニル：
本明細書中で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、且つ約２〜約２０の範囲の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。「置換アルキニル」は、１つ以上の置換基をさらに有するアルキニル基を指す。本明細書で使用される場合、「低級アルキニル」は、約２〜約６つの炭素原子を有するアルキニル部分を指す。
【００４４】
およそ：
本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つ以上の値に適用される場合、所定の参照値と同様の値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途記載のない限り、または別途文脈から明らかでない限り、記載の参照値のいずれかの（より大きいまたはより小さい）方向に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る幅広い値を指す（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００４５】
アプタマー：
本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、核酸、タンパク質、特定の全細胞、または特定の組織を含む特定の標的に対して結合親和性を有するオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーは、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、核酸の大きなランダム配列プールからｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択することにより、得られてもよい。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２００４，３２：Ｄ９５−Ｄ１００。
【００４６】
アンタゴミア：
本明細書で使用される場合、「アンタゴミア」という用語は、外因性ＲＮＡｉ阻害剤分子または天然のｍｉＲＮＡのガイド鎖を含む特定の標的に対する結合親和性を有するオリゴヌクレオチドを指す（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３８（７０６８）：６８５−６８９）。
【００４７】
アンチセンス鎖：
二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子は、２つのオリゴヌクレオチド鎖：アンチセンス鎖及びセンス鎖、を含む。アンチセンス鎖またはその領域は、標的核酸の対応する領域と、部分的に、実質的に、または完全に相補的である。加えて、二本鎖ＲＮＡｉ阻害物質分子またはその領域のアンチセンス鎖は、二本鎖ＲＮＡｉ阻害物質分子またはその領域のセンス鎖と、部分的に、実質的に、または完全に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、標的核酸配列と非相補的であるヌクレオチドを含有してもよい。非相補的ヌクレオチドは、相補配列のどちら側にあってもよく、または相補配列の両側にあってもよい。特定の実施形態では、アンチセンス鎖またはその領域は、センス鎖またはその領域と部分的にまたは実質的に相補的である場合、非相補的ヌクレオチドは、１つ以上の相補的な領域（例えば、１つ以上のミスマッチ）の間に位置してもよい。二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子のアンチセンス鎖は、ガイド鎖とも呼ばれる。
【００４８】
芳香族基：
本明細書で使用される「芳香族基」という用語は、４ｎ＋２π電子（式中、ｎは整数である）を含有する非局在化π電子系を有する平面環を指す。芳香環は、５、６、７、８、９、または９つを超える原子から形成することができる。「芳香族」という用語は、炭素環式アリール（例えば、フェニル）及び複素環式アリール（または「ヘテロアリール」もしくは「ヘテロ芳香族」）基（例えば、ピリジン）の両方を包含するものである。用語は、単環式または縮合環式多環式環、すなわち、炭素原子の隣接対を共有する環、を含む。「置換芳香族」は、１つ以上の置換基をさらに有する芳香族基を指す。
【００４９】
アリール：
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、５〜１９までの範囲の炭素原子を有する芳香族単環式または多環式基を指す。「置換アリール」は、１つ以上の置換基をさらに有するアリール基を指す。
【００５０】
標準的ＲＮＡ阻害剤分子：
本明細書で使用される場合、「標準的ＲＮＡ阻害剤分子」という用語は、核酸の２つの鎖を指し、それぞれは、二本鎖核酸の形成のための１９塩基対長である中央の相補的な領域及び３’末端のそれぞれの２つのヌクレオチドオーバーハングを有する２１ヌクレオチド長である。
【００５１】
相補的：
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを許容する（例えば、２つの対向する核酸上または単一の核酸鎖の対向領域上の）２つのヌクレオチドの間の構造的関係を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的な１つの核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより、一緒に塩基対合してもよい。一部の実施形態では、相補的ヌクレオチドは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で、または安定な二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対合し得る。「完全な相補性」または１００％の相補性は、第１のオリゴヌクレオチド鎖または第１のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントの各ヌクレオチドモノマーが、第２のオリゴヌクレオチド鎖または第２のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントの各ヌクレオチドモノマーを有する塩基対を形成し得る状態を指す。１００％未満の相補性は、２つのオリゴヌクレオチド鎖（または２つのオリゴヌクレオチド鎖の２つのセグメント）の一部であるが、全部ではないヌクレオチドモノマーが互いに塩基対を形成し得る状況を指す。「実質的相補性」は、互いに９０％以上の相補性を示す２つのオリゴヌクレオチド鎖（または２つのオリゴヌクレオチド鎖のセグメント）を指す。「十分に相補的」とは、標的ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の量が低減するような、標的ｍＲＮＡと核酸阻害剤分子の間の相補性を指す。
【００５２】
相補鎖：
本明細書で使用される場合、「相補鎖」という用語は、他の鎖と、部分的に、実質的に、または完全に相補的である二本鎖核酸阻害剤分子の鎖を指す。
【００５３】
従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
本明細書で使用される場合、「従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、以下の機序：（１）立体障害、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子の転写、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング、及びｍＲＮＡの翻訳を直接干渉することによる遺伝子発現及び／またはコードされたタンパク質の産生に関与する事象のシーケンスにおける一部のステップを妨げる；（２）ＲＮａｓｅ  Ｈによる標的遺伝子のＲＮＡ転写物の酵素消化の誘導；（３）ＲＮａｓｅ  Ｌによる標的遺伝子のＲＮＡ転写物の酵素消化の誘導；（４）ＲＮａｓｅ  Ｐによる標的遺伝子のＲＮＡ転写物の酵素消化の誘導；（５）二本鎖ＲＮａｓｅによる標的遺伝子のＲＮＡ転写物の酵素消化の誘導；ならびに（６）組み合わされた立体障害及び同じアンチセンスオリゴでの酵素消化活性の誘導、のうちの１つにより標的遺伝子の発現を阻害する一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ阻害剤分子のようなＲＮＡｉ作用機序を有さない。ＲＮＡｉ阻害剤分子は、アンチセンス鎖がＡｇｏ２タンパク質を目的の標的（複数可）に向けるように、ＲＮＡｉアンチセンス鎖と結合するＡｇｏ２の要件を含むいくつかの方法で、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドと区別することができ、Ａｇｏ２は、標的のサイレンシングに必要とされる。
【００５４】
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ：
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（「ＣＲＩＳＰＲ」）は、侵入するファージ及びプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼ系である。Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１６，１６４：２９−４４。本原核生物系は、真核生物細胞のゲノムにおいて目的の標的核酸配列を編集することに使用されるために適合されている。Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９：８１９−２３；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９：８２３−２６；Ｗｏｏ  Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（３）：２３０−２３２。本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」という用語は、「ＣＲＩＳＰＲ」ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分及び／またはトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分を含む核酸を指し、ＣＲＩＳＰＲ部分は、トレーサーメイト配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分がハイブリダイズしてガイドＲＮＡを形成するように、標的核酸と部分的に、実質的に、または完全に相補的である第１の配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分と十分に相補的である第２の配列（トレーサーメイト配列とも呼ばれる）を有する。ガイドＲＮＡは、ＣＡＳエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、標的核酸の切断を媒介するヌクレアーゼを導く。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ部分は、キメラガイドＲＮＡを形成するように、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分に融合される。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７：８１６−２１。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ部分の第１の配列は、標的核酸にハイブリダイズする約１６〜約２４ヌクレオチド、好ましくは、約２０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、約１０〜５００ヌクレオチドである。他の態様では、ガイドＲＮＡは、約２０〜１００ヌクレオチドである。
【００５５】
シクロアルキル：
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、３〜１２の炭素、例えば、３〜８つの炭素、例えば、３〜６つの炭素、を含有する環状（即ち、環含有）炭化水素基を指す。「置換シクロアルキル」は、１つ以上の置換基をさらに有するシクロアルキル基を指す。
【００５６】
送達剤：
本明細書で使用される場合、「送達剤」という用語は、オリゴヌクレオチドと複合化または結合され、且つ細胞への移入を媒介するトランスフェクション剤またはリガンドを指す。本用語は、例えば、オリゴヌクレオチドの負電荷に結合する正味の正電荷を有するカチオン性リポソームを包含する。本用語は、ＧａｌＮＡｃ及びコレステロールなどの、本明細書に記載されるようなコンジュゲートも包含し、これは、特定の組織への送達を導くように、オリゴヌクレオチドに共有結合させることができる。さらなる特定の好適な送達剤もまた、本明細書に記載される。
【００５７】
デオキシリボヌクレオチド：
本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、糖部分の２’位に水素基を有するヌクレオチドを指す。
【００５８】
ジスルフィド：
本明細書で使用される場合、「ジスルフィド」という用語は、基
【化１】
2019530656.tif 000002
を含有する化合物を指す。通常は、各硫黄原子は、炭化水素基に共有結合している。特定の実施形態では、少なくとも１つの硫黄原子は、炭化水素以外の基に共有結合している。結合は、ＳＳ結合またはジスルフィド架橋とも呼ばれる。
【００５９】
二重鎖：
本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して「二重鎖」という用語は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合を通して形成される二重らせん構造を指す。
【００６０】
賦形剤：
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の粘稠性または安定化効果を提供するためか、またはこれに寄与するために、組成物中に含まれ得る非治療薬を指す。
【００６１】
フラノース：
本明細書で使用される場合、「フラノース」という用語は、５員環構造を有する炭水化物を指し、環構造は、４つの炭素原子及び１つの酸素原子を有し、式ＸＶＩＩ：
【化２】
2019530656.tif 000003
で表される。式ＸＶＩＩでは、数字は、５員環構造中の４つの炭素原子の位置を表す。
【００６２】
グルタチオン：
本明細書で使用される場合、「グルタチオン」（ＧＳＨ）という用語は、以下の式ＸＶＩＩＩの構造を有するトリペプチドを指す。ＧＳＨは、およそ１〜１０ｍＭの濃度で細胞中に存在する。ＧＳＨは、ジスルフィド結合を含むグルタチオン感受性結合を還元する。過程で、グルタチオンは、酸化型であるグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）に変換される。酸化されると、グルタチオンは、電子供与体としてＮＡＤＰＨを使用して、グルタチオン還元酵素により還元することができる。
【化３】
2019530656.tif 000004
【００６３】
グルタチオン感受性化合物またはグルタチオン感受性部分：
本明細書で使用される場合、「グルタチオン感受性化合物」または「グルタチオン感受性部分」という用語は互換的に使用され、ジスルフィド架橋またはスルホニル基などの、少なくとも１つのグルタチオン感受性結合を含有する任意の化合物（例えば、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、もしくはヌクレオシド）または部分を指す。本明細書で使用される場合、「グルタチオン感受性オリゴヌクレオチド」は、グルタチオン感受性結合を含有する少なくとも１つのヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドである。
【００６４】
ハロ：
本明細書で使用される場合、「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、互換性であり、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される原子を指す。
【００６５】
ハロアルキル：
本明細書で使用される場合、「ハロアルキル」という用語は、それに取り付けられた１つ以上のハロゲン原子を有するアルキル基を指し、クロロメチル、ブロモエチル、トリフルオロメチル等のような基により例示される。
【００６６】
ヘテロアリール：
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、及び硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する芳香環系を指す。ヘテロアリール環は、１つ以上のヘテロアリール環、芳香族、もしくは非芳香族炭化水素環またはヘテロシクロアルキル環に縮合することができるか、または別の方法で結合することができる。
【００６７】
複素環：
本明細書で使用される場合、「複素環」または「複素環式」という用語は、環構造の部分として１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓなど）を含有し、且つ３〜１４の炭素原子の範囲を有する非芳香族環式（すなわち、環含有）基を指す。「置換複素環式」または「置換複素環」は、１つ以上の置換基をさらに有する複素環式基を指す。
【００６８】
ヌクレオチド間結合基：
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド間結合基」または「ヌクレオチド間結合」という用語は、２つのヌクレオシド部分を共有結合することが可能な化学基を指す。通常は、化学基は、ホスホまたはホスファイト基を含有するリン含有結合基である。ホスホ結合基は、ホスホジエステル結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホロチオアート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホナート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、ホスホルアミダイト結合、ホスホナート結合、及び／またはボラノホスファート結合を含むものとする。多くのリン含有結合は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号、及び同第５，６２５，０５０号に開示されるように、当該技術分野で周知である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン原子を含有しない１つ以上のヌクレオチド間結合基、このような短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合したヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、または限定されないが、シロキサン主鎖；硫化物、スルホキシド、及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファマート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホナート及びスルホンアミド主鎖；ならびにアミド主鎖を有するものを含む、１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオチド間結合を含有する。非リン含有結合は、例えば、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，７９２，６０８号；同第５，６４６，２６９号；及び同第５，６７７，４３９号に開示されるように、当該技術分野で周知である。
【００６９】
ループ：
本明細書で使用される場合、「ループ」という用語は、核酸の一本鎖により形成される構造を指し、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補的領域は、相補的領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が二重鎖形成またはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合から除外されるようにハイブリダイズする。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例としては、ヘアピン及びテトラループのような構造中に存在する不対合のヌクレオチドが挙げられる。
【００７０】
マイクロＲＮＡ：
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」、「成熟マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、及び「ｍｉＲ」という用語は、互換性であり、植物及び動物のゲノムにおいてコードされる非コードＲＮＡ分子を指す。通常は、成熟マイクロＲＮＡは、長さが約１８〜２５ヌクレオチドである。特定の場合では、高度に保存された、内因的に発現されたマイクロＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に結合することにより遺伝子の発現を制御する。特定の成熟マイクロＲＮＡは、長さが数百ヌクレオチドであることが多い、長い内因性プライマリーマイクロＲＮＡ転写物（ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ、ｐｒｉ−マイクロＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉｒ、ｐｒｉ−ｍｉＲ、またはｐｒｉ−ｐｒｅ−マイクロＲＮＡとしても知られる）に由来するようにみえる（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２００２，２１（１７），４６６３−４６７０）。
【００７１】
修飾ヌクレオシド：
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオシド」という用語は、修飾もしくはユニバーサル核酸塩基または修飾糖のうちの１つ以上を含有するヌクレオシドを指す。修飾またはユニバーサル核酸塩基（本明細書では塩基アナログとも呼ばれる）は一般に、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置し、１’位のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の核酸塩基を指す。特定の実施形態では、修飾またはユニバーサル核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含有しない。例えば、米国特許出願第２００８０２７４４６２号を参照のこと。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含有しない（無塩基）。修飾糖（本明細書では糖アナログとも呼ばれる）は、例えば、修飾が糖の２’−、３’−、４’−、または５’−炭素の位置で起こる場合、修飾デオキシリボースまたはリボース部分を含む。修飾糖は、ロック核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，３６０７−３６３０を参照のこと）；架橋型核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号及びＭｉｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７（４）：１２２５−３８）；ならびにアンロック核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２，ｅ１０３（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１３．３６））中に存在するような非天然代替炭素構造も含んでもよい。本開示の文脈における好適な修飾もしくはユニバーサル核酸塩基または修飾糖は、本明細書に記載される。
【００７２】
修飾ヌクレオチド：
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾またはユニバーサル核酸塩基、修飾糖、または修飾リン酸のうちの１つ以上を含有するヌクレオチドを指す。修飾またはユニバーサル核酸塩基（本明細書では塩基アナログとも呼ばれる）は一般に、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置し、１’位のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の核酸塩基を指す。特定の実施形態では、修飾またはユニバーサル核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含有しない。例えば、米国特許出願第２００８０２７４４６２号を参照のこと。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（無塩基）。修飾糖（本明細書では糖アナログとも呼ばれる）は、例えば、修飾が糖の２’−、３’−、４’−、または５’−炭素の位置で起こる場合、修飾デオキシリボースまたはリボース部分を含む。修飾糖は、ロック核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，３６０７−３６３０を参照のこと）、架橋型核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号及びＭｉｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７（４）：１２２５−３８）；ならびにアンロック核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２，ｅ１０３（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１３．３６））中に存在するような非天然代替炭素構造も含んでもよい。修飾リン酸基は、天然のヌクレオチドには存在しないリン酸基の修飾を指し、本明細書に記載されるような天然に存在しないリン酸模倣体を含む。修飾リン酸基は、本明細書に記載のように、リン含有ヌクレオチド間結合基及び非リン含有結合基の両方を含む天然に存在しないヌクレオチド間結合基も含む。本開示の文脈における好適な修飾もしくはユニバーサル核酸塩基、修飾糖、または修飾リン酸は本明細書に記載される。
【００７３】
裸のオリゴヌクレオチド：
本明細書で使用される場合、「裸のオリゴヌクレオチド」という用語は、保護脂質ナノ粒子または他の保護製剤に製剤化されておらず、且つそれにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された時に、血液及びエンドソーム／リソソーム区画に露出されるオリゴヌクレオチドを指す。
【００７４】
天然ヌクレオシド：
本明細書で使用される場合、「天然ヌクレオシド」という用語は、糖（例えば、デオキシリボースもしくはリボースまたはそれらのアナログ）とのＮ−グリコシド結合における複素環式窒素塩基を指す。天然の複素環式窒素塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及びチミンを含む。
【００７５】
天然ヌクレオチド：
本明細書で使用される場合、「天然ヌクレオチド」という用語は、リン酸基に結合している糖（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはそれらのアナログ）とのＮ−グリコシド結合中の複素環式窒素塩基を指す。天然の複素環窒素塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及びチミンを含む。
【００７６】
核酸阻害剤分子：
本明細書で使用される場合、「核酸阻害剤分子」という用語は、標的遺伝子の発現を低減または排除するオリゴヌクレオチド分子を指し、オリゴヌクレオチド分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列を特異的に標的とする領域を含有する。通常は、核酸阻害剤分子の標的領域は、核酸阻害剤分子の効果を特定の標的遺伝子に向けるために、標的遺伝子のｍＲＮＡ上の配列と十分に相補的な配列を含む。核酸阻害剤分子は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【００７７】
ヌクレオシド：
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオシドを指す。
【００７８】
ヌクレオチド：
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを指す。
【００７９】
ヌクレオチド位置：
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド位置」という用語は、５’末端のヌクレオチドから数えられた場合、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの位置を指す。例えば、ヌクレオチド位置１は、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドを指す。
【００８０】
オリゴヌクレオチド：
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２〜２５００ヌクレオチドの範囲であるポリマー形態のヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは通常、例えば、オリゴヌクレオチドが遺伝子療法に使用される場合、５００〜１５００ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、７〜１００ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、１５〜１００ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは通常、例えば、オリゴヌクレオチドが核酸阻害剤分子である場合、１５〜５０ヌクレオチドを有する一本鎖または二本鎖である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは通常、例えば、オリゴヌクレオチドが核酸阻害剤分子である場合、２５〜４０ヌクレオチドを有する一本鎖または二本鎖である。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、１９〜４０または１９〜２５ヌクレオチドを有し、通常は、例えば、オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸阻害剤分子であり、少なくとも１８〜２５の塩基対の二重鎖を形成する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖であり、１５〜２５ヌクレオチドを有し、通常は、例えば、オリゴヌクレオチドヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子である。通常は、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、１つ以上のリン含有ヌクレオチド間結合基を含有する。他の実施形態では、ヌクレオチド間結合基は、本明細書に記載されるような非リン含有結合である。
【００８１】
オーバーハング：
本明細書で使用される場合、「オーバーハング」という用語は、二本鎖核酸阻害剤分子のいずれかの鎖のいずれかの末端の、末端の塩基対合しないヌクレオチド（複数可）を指す。特定の実施形態では、オーバーハングは、第１の鎖または領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を越えて伸長する１つの鎖または領域からもたらされる。塩基対の水素結合により二重鎖を形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチド領域の一方または両方は、２つのポリヌクレオチドまたは領域で共有される相補性の３’末端及び／または５’末端を越えて伸長する５’末端及び／または３’末端を有してもよい。二重鎖の３’末端及び／または５’末端を越えて伸長する一本鎖領域は、オーバーハングと呼ばれる。
【００８２】
医薬組成物：
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬理学的有効量のリン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」、または「有効量」は、意図される薬理学的、治療的、または予防的結果を生じるのに有効な本開示のリン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドの量を指す。
【００８３】
薬学的に許容される賦形剤：
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、賦形剤が、妥当な利益／危険率に見合って、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、及びアレルギー反応）がなく、ヒト及び／または動物での使用に適することを意味する。
【００８４】
ホスホルアミダイト：
本明細書で使用される場合、「ホスホルアミダイト」という用語は、窒素含有三価リン誘導体を指す。好適なホスホルアミダイトの例は、本明細書に記載される。
【００８５】
ポテンシー：
本明細書で使用される場合、「ポテンシー」は、細胞において意図された標的に対する特定のレベルの活性を得るために、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与されなければならないオリゴヌクレオチドまたは他の薬物の量を指す。例えば、１ｍｇ／ｋｇの用量で対象においてその標的の発現を９０％抑制するオリゴヌクレオチドは、１００ｍｇ／ｋｇの用量で対象においてその標的の発現を９０％抑制するオリゴヌクレオチドよりも高いポテンシーを有する。
【００８６】
保護基：
本明細書で使用される場合、「保護基」という用語は、所望の反応の特定の条件下で官能基に非反応性を可逆的に与える基として、従来の化学的意味で使用される。所望の反応の後、保護基は、保護官能基を脱保護するために除去され得る。全ての保護基は、合成される分子の実質的な割合を劣化させない条件下で除去可能であるべきである。
【００８７】
リボヌクレオチド：
本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」という用語は、糖部分の２’位にヒドロキシル基を有する天然または修飾ヌクレオチドを指す。
【００８８】
リボザイム：
本明細書で使用される場合、「リボザイム」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る、異なる標的核酸配列を特異的に認識及び切断する触媒核酸分子を指す。各リボザイムは、触媒的構成要素（「触媒ドメイン」とも呼ばれる）及び触媒ドメインの両側に１つずつある２つの結合ドメインからなる標的配列結合構成要素を有する。
【００８９】
ＲＮＡｉ阻害剤分子：
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ阻害剤分子」という用語は、（ａ）アンチセンス鎖もしくはアンチセンス鎖の一部が標的ｍＲＮＡの切断においてアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより使用されるセンス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖核酸阻害剤分子（「ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子」）または（ｂ）アンチセンス鎖（もしくはそのアンチセンス鎖の一部）が標的ｍＲＮＡの切断においてＡｇｏ２エンドヌクレアーゼにより使用される単一のアンチセンス鎖を有する一本鎖核酸阻害剤分子（「ｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子」）、のいずれかを指す。
【００９０】
センス鎖：
二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子は、２つのオリゴヌクレオチド鎖：アンチセンス鎖及びセンス鎖、を含む。センス鎖またはその領域は、二本鎖ＲＮＡｉ阻害物質分子またはその領域のアンチセンス鎖と部分的に、実質的に、または完全に相補的である。特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖と非相補的であるヌクレオチドも含有してもよい。非相補的ヌクレオチドは、相補配列のどちら側にあってもよく、または相補配列の両側にあってもよい。特定の実施形態では、センス鎖またはその領域は、アンチセンス鎖またはその領域と部分的にまたは実質的に相補的である場合、非相補的ヌクレオチドは、１つ以上の相補的な領域の間に位置してもよい（例えば、１つ以上のミスマッチ）。センス鎖は、パッセンジャー鎖とも呼ばれる。
【００９１】
置換基または置換された：
本明細書で使用される「置換基」または「置換」という用語は、所与の構造中の水素ラジカルの、置換基のラジカルとの置換を指す。任意の所与の構造中の２つ以上の位置が２つ以上の置換基で置換され得る時、置換基は、別途指示のない限り、全ての位置で同じか、または異なっていてもよい。本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、有機化合物と相溶性のある全ての許容される置換基を含むと考えられる。許容される置換基は、有機化合物の非環式及び環式、分岐及び非分岐、炭素環及び複素環、芳香族及び非芳香族置換基を含む。本開示は、有機化合物の許容される置換基によるいかなる手法でも限定されるものではない。
【００９２】
スルホニル基：
本明細書で使用される場合、「スルホニル基」という用語は、二価の基、−ＳＯ２−を含有する化合物を指す。特定の実施形態では、硫黄原子は、２つの炭素原子及び２つの酸素原子に共有結合している。他の実施形態では、硫黄原子は、炭素原子、窒素原子、及び２つの酸素原子に共有結合している。
【００９３】
全身投与：
本明細書で使用される場合、「全身投与」という用語は、血流中の薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ全身吸収または蓄積、続く、全身への分布を指す。
【００９４】
対象部位：
本明細書で使用される場合、「標的部位」、「標的配列」、「標的核酸」、「標的領域」、「標的遺伝子」という用語は、互換的に使用され、例えば、その標的配列と部分的に、実質的に、または完全に、もしくは十分に相補的であるガイド／アンチセンス領域内に配列を含有するＲＮＡｉ阻害剤分子により媒介される切断のために、「標的」とされるＲＮＡまたはＤＮＡ配列を指す。
【００９５】
テトラループ：
本明細書で使用される場合、「テトラループ」という用語は、隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋハイブリダイズしたヌクレオチドの安定性に寄与する安定な２次構造を形成するループ（一本鎖領域）を指す。理論に限定されることなく、テトラループは、スタッキング相互作用により隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を安定化し得る。加えて、テトラループにおけるヌクレオチド間の相互作用は、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用を含むが、これらに限定されない（Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；  ３４６（６２８５）：６８０−２；Ｈｅｕｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５３（５０１６）：１９１−４）。テトラループは、ランダム塩基からなる単純なモデルループ配列から予想されるよりも高い、隣接する二重鎖の融解温度（Ｔｍ）の増加をもたらす。例えば、テトラループは、長さが少なくとも２塩基対の二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨＰＯ４中で、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、または少なくとも７５℃の融解温度をもたらし得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含有してもよい。特定の実施形態では、テトラループは、４つのヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、テトラループは、５つのヌクレオチドからなる。
【００９６】
ＲＮＡテトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループを含む（Ｗｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９０，８７（２１）：８４６７−７１；Ａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９１，１９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ）、ｄ（ＧＮＲＡ））ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（４８）：１４２８１−１４２９２．Ｓｈｉｎｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ，２０００，７８（２）：７３１）。
【００９７】
Ｉ．緒言
本出願は、核酸阻害剤分子などのリン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドを提供する。目的のオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、本明細書に記載されるようにリン酸含有部分で修飾される。本修飾は、血中及び／または細胞内、例えば、細胞のエンドソーム／リソソーム区画内に存在する、ホスファターゼ及び／またはヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼ、に対しオリゴヌクレオチドを保護することを助け得るので、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に特に適する。通常は、リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、ｍｉＲＮＡ、及びｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子などの核酸阻害剤分子である。
【００９８】
本開示によるリン酸アナログを含有する５’末端ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを合成するために使用され得るホスホルアミダイト部分を含むリン酸アナログ修飾ヌクレオシドもまた提供される。
ＩＩ．リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチド
【００９９】
一態様は、核酸阻害剤分子などのオリゴヌクレオチドに関し、オリゴヌクレオチドは、通常は５’末端ヌクレオチドに、４’−リン酸アナログを含む。通常は、４’−リン酸アナログは、オキシメチル基の酸素原子が糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合しているオキシメチルホスホナートである。他の実施形態では、リン酸アナログは、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子が糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合しているチオメチルホスホナートまたはアミノメチルホスホナートである。
【０１００】
特定の実施形態では、４’−リン酸アナログは、オキシメチルホスホナートである。通常は、オキシメチルホスホナートは、−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＨ）２または−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ）２で表され、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ３、アルキル基、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択される。特定の実施形態では、アルキル基は、ＣＨ２ＣＨ３である。より一般的には、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３から選択される。
【０１０１】
１．式Ｉ及びＩＩ
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式Ｉまたは式ＩＩ：
【化４】
2019530656.tif 000005
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｍ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’、ＣＲ’Ｒ”であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、もしくはＲ７はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルからなる選択されるか、またはＲ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７のうちの２つは、一緒になって５〜８員環を形成し、環は任意に、ヘテロ原子を含有し、
Ｘ１は、存在しないか、またはＯ、Ｓ、ＮＲ’、もしくはＣＲ’Ｒ”から選択され、
Ｙは、５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｒ８は、グルタチオン感受性部分であるか、または存在しない、
Ｒ８がグルタチオン感受性部分である場合、Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、もしくはＮＲ’であるか、またはＲ８が存在しない場合、Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ハロゲン、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルキルチオ、任意に置換されたアルキルアミノもしくはジアルキルアミノであり、アルキル、アルケニル、及びアルキニルの１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ’）、Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環もしくは任意に置換されたシクロアルキル、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＨＲ’のうちの１つ以上で干渉されてもよく、
Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換の複素環、または置換もしくは非置換のシクロアルキルである）で表される５’末端ヌクレオチドを含む。
【０１０２】
特定の実施形態では、５’末端ヌクレオチドは、式Ｉで表される。
【０１０３】
特定の実施形態では、５’末端ヌクレオチドは、式ＩＩで表される。
【０１０４】
特定の実施形態では、Ｂは、天然核酸塩基である。
【０１０５】
特定の実施形態では、Ｍ１は、Ｏである。
【０１０６】
特定の実施形態では、ハロゲンは、フッ素である。
【０１０７】
特定の実施形態では、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立して、水素、フッ素、ＣＨ３、またはＣ１−Ｃ６アルキルから選択される。通常は、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、水素である。
【０１０８】
特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｏである。
【０１０９】
特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、水素である。特定の実施形態では、Ｒａは、ＣＨ３であり、Ｒｂは、水素である。特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、ＣＨ３である。特定の実施形態では、Ｒａは、ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒｂは、水素である。特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、ＣＨ２ＣＨ３である。
【０１１０】
特定の実施形態では、Ｍ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、水素である。
【０１１１】
特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、ＳｅもしくはＮＨＲ’であり、Ｒ’は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換脂肪族、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環、または置換もしくは非置換のシクロアルキルから選択され、Ｒ８は、グルタチオン感受性部分である。通常は、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ８は、グルタチオン感受性部分であり、５’末端ヌクレオチドは、式Ｉで表される。
【０１１２】
特定の実施形態では、Ｘ２は、ハロゲンまたは任意に置換されたアルコキシであり、Ｒ８は、存在しない。通常は、Ｘ２は、Ｆ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、またはＯＣＨ３であり、Ｒ８は、存在せず、５’末端ヌクレオチドは、式Ｉで表される。
【０１１３】
特定の実施形態では、Ｍ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、水素であり、Ｂは、天然の核酸塩基であり；Ｘ１は、存在しないか、またはＯであり、５’末端ヌクレオチドは、式Ｉで表される。
【０１１４】
２．式ＩＩＩ
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式ＩＩＩ：
【化５】
2019530656.tif 000006
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｙは、５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｘ２はＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、且つＲ８は存在しないか、またはＸ２はＯであり、且つＲ８はグルタチオン感受性部分である）で表される５’末端ヌクレオチドを含む。
【０１１５】
特定の実施形態では、Ｂは、天然核酸塩基である。
【０１１６】
特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、ＣＨ３、及びＣＨ２ＣＨ３から選択される。
【０１１７】
特定の実施形態では、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３であり、Ｒ８は、存在しない。
【０１１８】
特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ８は、グルタチオン感受性部分である。
【０１１９】
特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、水素であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１２０】
特定の実施形態では、Ｒａは、ＣＨ３であり、Ｒｂは、水素であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１２１】
特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、ＣＨ３であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１２２】
特定の実施形態では、Ｒａは、ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒｂは、水素であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１２３】
特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１２４】
３．式ＩＶ
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式ＩＶ：
【化６】
2019530656.tif 000007
（式中、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｙは、５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である）で表される５’末端ヌクレオチドを含む。
【０１２５】
特定の実施形態では、Ｂは、天然核酸塩基である。
【０１２６】
特定の実施形態では、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
４．式Ｖ
【０１２７】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式Ｖ：
【化７】
2019530656.tif 000008
（式中、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｙは、５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である）で表される５’末端ヌクレオチドを含む。
【０１２８】
特定の実施形態では、Ｂは、天然核酸塩基である。
【０１２９】
特定の実施形態では、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１３０】
５．式ＶＩ
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドを含み、５’末端ヌクレオチドは、式ＶＩ：
【化８】
2019530656.tif 000009
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立して、水素、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｖは、Ｏであり、
Ｚは、糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｙは、５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｖは、糖部分の４’−炭素に結合している）で表される。
【０１３１】
通常は、糖部分は、フラノースであり、Ｖは、フラノースの４’−炭素に結合している。
【０１３２】
特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、水素である。特定の実施形態では、Ｒａは、ＣＨ３であり、Ｒｂは、水素である。特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、ＣＨ３である。特定の実施形態では、Ｒａは、ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒｂは、水素である。特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは、ＣＨ２ＣＨ３である。
【０１３３】
６．式ＶＩＩ
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドを含み、５’末端ヌクレオチドは、式ＶＩＩ：
【化９】
2019530656.tif 000010
（式中、Ｒ１は、ＯまたはＳであり、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＯＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、及びＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３から選択され、Ｒ９は、アルキルであり、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２は、任意に保護基で保護され、
Ｖは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’、ＣＲ’Ｒ”であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換脂肪族、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環、または置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｚは、糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｙは、５’末端ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、
Ｖは、糖部分の４’−炭素に結合している）で表される。
【０１３４】
通常は、糖部分は、フラノースであり、Ｖは、フラノースの４’−炭素に結合している。
【０１３５】
特定の実施形態では、Ｒ２またはＲ３はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＯＣＨ３、またはＯＲ９から選択され、Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ９は、ＣＨ２ＣＨ３である。
【０１３６】
通常は、Ｒ１は、Ｏである。
【０１３７】
特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、ＯＨ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ３は、ＯＨ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ３である。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、ＯＨであり、Ｒ３は、ＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ３は、ＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、ＯＣＨ３であり、Ｒ３は、ＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２及びＲ３は、ＯＣＨ３である。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、ＯＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ３は、ＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２及びＲ３は、ＯＣＨ２ＣＨ３である。
【０１３８】
７．式ＶＩＩＩまたはＩＸ
一部の実施形態では、本開示は、式ＶＩＩＩまたは式ＩＸ：
【化１０】
2019530656.tif 000011
（式中、Ｒ１は、ＯまたはＳであり、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＯＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、及びＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３から選択され、Ｒ９は、アルキルであり、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２は、任意に保護され、
Ｗは、ＮまたはＳであり、
Ｂ、Ｍ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｘ１、Ｘ２、及びＹは、式Ｉまたは式ＩＩに記載の通りである）で表される５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１３９】
特定の実施形態では、Ｗは、Ｎである。
【０１４０】
特定の実施形態では、Ｗは、Ｓである。
【０１４１】
特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏである。
【０１４２】
特定の実施形態では、Ｒ２またはＲ３はそれぞれ独立して、ＯＨ、ＯＣＨ３、またはＯＲ９から選択され、Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ９は、ＣＨ２ＣＨ３である。
【０１４３】
通常は、Ｒ１は、Ｏである。
【０１４４】
本明細書に記載されるような４’−リン酸アナログを含むオリゴヌクレオチドは、目的の任意のヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのオリゴヌクレオチドは、７〜１００ヌクレオチドを有する。他の実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのオリゴヌクレオチドは、１５〜５０ヌクレオチドを有する。他の実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのオリゴヌクレオチドは、２５〜４０ヌクレオチドを有する。さらに別の実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのオリゴヌクレオチドは、１９〜２５ヌクレオチドを有する。
【０１４５】
Ａ．核酸阻害剤分子
特定の実施形態では、４’−リン酸アナログを含むオリゴヌクレオチドは、核酸阻害剤分子である。種々のオリゴヌクレオチド構造は、一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドを含む核酸阻害剤分子として使用されており、これらの種々のオリゴヌクレオチドのいずれかは、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つの５’末端ヌクレオチドを含む、本明細書に記載されるような４’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドを含むように修飾することができる。
【０１４６】
二本鎖核酸阻害剤分子
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸阻害剤分子は、センス（またはパッセンジャー）鎖及びアンチセンス（またはガイド）鎖を有し、且つ本明細書に記載されるような、４’−リン酸アナログを有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子である。上記のように、例えば、（ａ）各鎖が、１９〜２５ヌクレオチドのサイズを有し、１〜５ヌクレオチドの少なくとも１つの３’−オーバーハングを有する、二本鎖核酸分子（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照のこと）；（ｂ）ダイサー酵素によりｉｎ  ｖｉｖｏでプロセシングされて、ＲＮＡｉ阻害剤分子を活性化する長い二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照のこと）；及び（ｃ）鎖の１つが、熱力学的に安定化するテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも１つの鎖の少なくとも一端が分子の二本鎖標的領域を越えて伸長する二本鎖核酸阻害剤分子（例えば、これらの二本鎖の核酸阻害剤分子の開示について参照により取り込まれる米国特許第８，５１３，２０７号、米国特許第８，９２７，７０５号、ＷＯ２０１０／０３３２２５、及びＷＯ２０１６／１００４０１を参照のこと）を含む様々な二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子構造が当該分野で既知である。
【０１４７】
ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子の一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１５〜６６、２５〜４０、または１９〜２５ヌクレオチドの範囲である。一部の実施形態では、センス鎖は、長さが１８〜６６ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖は、長さが１８〜２５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖は、長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドである。それらの実施形態の一部では、センス鎖は、長さが２５〜４５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖は、長さが３０〜４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖は、長さが３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖は、長さが２５〜３０ヌクレオチドである。それらの実施形態の一部では、センス鎖は、長さが２５、２６、または２７ヌクレオチドである。
【０１４８】
ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子の一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１８〜６６ヌクレオチドである。通常は、アンチセンス鎖は、核酸阻害剤分子の効果を標的遺伝子に向けるために、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の配列と十分に相補的な配列を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、完全に相補的な配列が１８〜４０ヌクレオチド長である、標的遺伝子のｍＲＮＡに含まれる配列と完全に相補的である配列を含む。それらの実施形態の一部では、アンチセンス鎖は、長さ２０〜５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２０〜３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８ヌクレオチドである。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが３５〜４０ヌクレオチドである。それらの実施形態の一部では、アンチセンス鎖は、長さが３６、３７、３８、または３９ヌクレオチドである。
【０１４９】
ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子の一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１５〜５０塩基対を有する二重鎖構造を形成する。特定の実施形態では、二重鎖領域は、長さが１５〜４５塩基対、より一般的には、長さが１５〜３０塩基対、例えば、１８〜３０、より一般的には、１８〜２６または２１〜２６、例えば、１９〜２３、特定の場合では、長さが１９〜２１塩基対である。特定の実施形態では、二本鎖領域は、長さが１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６塩基対である。
【０１５０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング（複数可）をさらに含んでもよい。通常は、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、１〜１０、１〜４、または１〜２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。一本鎖オーバーハングは通常、センス鎖の３’末端及び／またはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。特定の実施形態では、１〜１０、１〜４、または１〜２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の５’末端に位置する。特定の実施形態では、１〜１０、１〜４、または１〜２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の５’末端に位置する。特定の実施形態では、１〜２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に位置する。特定の実施形態では、１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の５’末端に位置する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は通常、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１５１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、センス及びアンチセンス鎖、ならびに１９〜２１ヌクレオチドの二重鎖領域を含み、センス鎖は、長さが１９〜２１ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、長さが２１〜２３ヌクレオチドであり、３’末端に１〜２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む。
【０１５２】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、長さが２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び長さが２１ヌクレオチドのセンス鎖を有し、分子の右側の２ヌクレオチドの３’センス鎖オーバーハング（センス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端）及びアンチセンス鎖の３’末端の２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングがある。このような分子では、１９塩基対の二重鎖領域がある。
【０１５３】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、長さが２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び長さが２１ヌクレオチドのセンス鎖を有し、分子の右側の平滑末端（センス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端）及び分子の左側の２ヌクレオチドの３’センス鎖オーバーハング（センス鎖の５’末端／アンチセンス鎖の３’末端）がある。このような分子では、２１塩基対の二重鎖領域がある。
【０１５４】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、センス及びアンチセンス鎖、ならびに１８〜３４ヌクレオチドの二重鎖領域を含み、センス鎖は、長さが２５〜３４ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、長さが２６〜３８ヌクレオチドであり、３’末端に１〜５つの一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖は、２６ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、３８ヌクレオチドであり、３’末端の２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハング及び５’末端の１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、センス鎖及びアンチセンス鎖は、２６ヌクレオチドの二重鎖領域を形成する。特定の実施形態では、センス鎖は、２５ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、２７ヌクレオチドであり、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、センス鎖及びアンチセンス鎖は、２５ヌクレオチドの二重鎖領域を形成する。
【０１５５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、ステム・ループを含む。通常は、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子のパッセンジャー鎖の３’末端領域または５’末端領域がステム・ループ構造を形成する。
【０１５６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、ステム・テトラループを含有する。ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子がステム・テトラループを含有する実施形態では、パッセンジャー鎖は、ステム・テトラループを含有し、長さが２０〜６６ヌクレオチドの範囲である。通常は、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、別々の鎖であり、それぞれは、連続するオリゴヌクレオチドを形成しない５’及び３’末端を有する（「ニックの入った」構造と呼ばれる場合がある）。
【０１５７】
それらの実施形態の一部では、ガイド鎖は、長さが１５〜４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ステム・テトラループを含有するパッセンジャー鎖の伸長部分は、鎖の３’末端にある。特定の実施形態では、ステム・テトラループを含有するパッセンジャー鎖の伸長部分は、鎖の５’末端にある。
【０１５８】
特定の実施形態では、ステム・テトラループを含有するｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子のパッセンジャー鎖は、長さが３４〜４０ヌクレオチドであり、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子のガイド鎖は、２０〜２４ヌクレオチドを含有し、パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、１８〜２４ヌクレオチドの二重鎖領域を形成する。
［０１］特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、（ａ）５’末端から最初の２０ヌクレオチドがガイド鎖に相補的であり、且つ続く１６ヌクレオチドがステム・テトラループを形成するステム・テトラループを含有し、且つ長さが３６ヌクレオチドであるパッセンジャー鎖、及び、（ｂ）ガイド鎖及びパッセンジャー鎖が、連続するオリゴヌクレオチドを形成しない別々の鎖である、長さ２２ヌクレオチドであり、且つ３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有するガイド鎖（例えば、図１Ａ〜１Ｄを参照のこと）、を含む。
【０１５９】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。通常は、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、５未満のデオキシリボヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、１つ以上のリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子のヌクレオチドの全ては、リボヌクレオチドである。
【０１６０】
一部の実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのうちのいずれか１つに記載の５’末端ヌクレオチドは、二本鎖核酸阻害剤分子、例えば、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子、のパッセンジャー鎖に位置する。別の実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに記載の５’末端ヌクレオチドは、ガイド鎖に位置する。別の実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに記載の５’末端ヌクレオチドは、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方に位置する。一実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに記載の５’末端ヌクレオチドは、二重鎖領域に位置する。一部の実施形態では、式Ｉ〜ＩＸのうちのいずれか１つに記載の５’末端ヌクレオチドは、オーバーハング領域に位置する。
【０１６１】
一本鎖核酸阻害剤分子
特定の実施形態では、核酸阻害剤分子は、式Ｉ〜ＩＸのいずれか１つに記載の５’末端ヌクレオチドを含む一本鎖核酸阻害剤分子である。一本鎖核酸阻害剤分子は、当該技術分野で既知である。例えば、最近の取り組みにより、ｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子の活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６，２４（５）：９４６−５５を参照のこと）。また、特定の標的遺伝子の発現を低減させるアンチセンス分子は、数十年間使用されている。Ｐｅｌｅｃｈａｎｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１３，１４：８８０−９３。これらの構造の共通の主題における多数の変形形態が、広範囲の標的に対して開発されている。一本鎖核酸阻害剤分子としては、例えば、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、アンタゴミア、及びｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子が挙げられ、これらは全て、当該技術分野で既知である。
【０１６２】
特定の実施形態では、核酸阻害剤分子は、１４〜５０、１６〜３０、または１５〜２５ヌクレオチドを有するｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子である。他の実施形態では、ｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、１８〜２２または２０〜２２ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、ｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、２０ヌクレオチドを有する。他の実施形態では、ｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、２２ヌクレオチドを有する。
【０１６３】
特定の実施形態では、核酸阻害剤分子は、外因性ＲＮＡｉ阻害剤分子または天然のｍｉＲＮＡを阻害する一本鎖オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、核酸阻害剤分子は、８〜８０、１４〜５０、１６〜３０、１２〜２５、１２〜２２、１４〜２０、１８〜２２、または２０〜２２ヌクレオチドを有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８〜２２、例えば、１８〜２０ヌクレオチドを有する。
【０１６４】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその一部は、標的核酸またはその特定部分と完全に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその一部は、標的核酸の少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的である。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸またはその部分に対して５、４、３、２、または１以下の非相補的ヌクレオチドを含有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを短くすること、及び／または活性を排除することなくミスマッチ塩基を導入することが可能である。
【０１６５】
Ｂ．ヌクレオチド修飾
本開示の修飾オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の４’−リン酸アナログに加えて、修飾を含んでもよい。通常は、核酸阻害剤分子の複数のヌクレオチドサブユニットは、ヌクレアーゼに対する耐性または免疫原性の低下などの分子の種々の特徴を改善するように修飾される。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７，２８６７−２８８１を参照のこと。多くのヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチド分野で、特に、核酸阻害剤分子に、使用されている。このような修飾は、糖部分、ホスホエステル結合、及び核酸塩基を含む、ヌクレオチドの任意の部分に対して行うことができる。核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、１ヌクレオチドから全ヌクレオチドは、例えば、当該技術分野で既知及び本明細書に記載の２’−炭素修飾を使用して、糖部分の２’−炭素で修飾される。２’−炭素修飾の代表例としては、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」または「２’−ＯＣＨ３」）、２’−Ｏ−メトキシエチル（「２’−ＭＯＥ」または「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾は、本明細書に記載されるように、ヌクレオチドの糖部分の他の部分、例えば、５’−炭素、においても起こり得る。
【０１６６】
特定の実施形態では、上述のように、限定されないが、ロック核酸（「ＬＮＡ」）構造、架橋型核酸（「ＢＮＡ」）構造、及びアンロック核酸（「ＵＮＡ」）構造を含む糖部分の環構造が修飾される。
【０１６７】
修飾核酸塩基は、当該技術分野で知られているように、且つ本明細書に記載されるように、１’位にアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の核酸塩基を含む。修飾核酸塩基の代表例は、５’−メチルシトシンである。
【０１６８】
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に存在するヌクレオチド間結合は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。修飾ホスホジエステル結合は、当技術分野で知られているように、且つ本明細書に記載されるように、リン原子を含有するヌクレオチド間結合及びリン原子を含有しないヌクレオチド間結合を含む、天然に存在しないヌクレオチド間結合基を含む。通常は、核酸阻害剤分子は、本明細書中に記載されるように、１つ以上のリン含有ヌクレオチド間結合基を含有する。他の実施形態では、核酸阻害剤分子の１つ以上のヌクレオチド間結合基は、本明細書に記載されるような非リン含有結合である。特定の実施形態では、核酸阻害剤分子は、１つ以上のリン含有ヌクレオチド間結合基及び１つ以上の非リン含有ヌクレオチド間結合基を含有する。
【０１６９】
特定の実施形態では、核酸阻害剤分子の１または２ヌクレオチドが、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾される。通常は、グルタチオン感受性部分は、糖部分の２’−炭素に位置し、スルホニル基またはジスルフィド架橋を含む。特定の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、例えば、全体が本明細書で参照により組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４８２３９号に記載されるようなホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成方法と適合性がある。特定の実施形態では、核酸阻害剤分子の３つ以上のヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾される。特定の実施形態では、ヌクレオチドの大部分は、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾される。特定の実施形態では、核酸阻害剤分子の全部または実質的に全部のヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾される。
【０１７０】
少なくとも１つのグルタチオン感受性部分は通常、一本鎖核酸阻害剤分子の５’もしくは３’末端ヌクレオチドまたは二本鎖核酸阻害剤分子のパッセンジャー鎖もしくはガイド鎖の５’または３’末端ヌクレオチドに位置する。しかし、少なくとも１つのグルタチオン感受性部分は、核酸阻害剤分子中の目的の任意のヌクレオチドに位置し得る。
【０１７１】
特定の実施形態では、核酸阻害剤分子は、完全に修飾されており、完全修飾核酸阻害剤分子の全ヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、完全修飾核酸阻害剤分子は、可逆的修飾を含まない。一部の実施形態では、一本鎖核酸阻害剤分子、または二本鎖核酸阻害剤分子のガイド鎖もしくはパッセンジャー鎖の少なくとも１、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドが修飾される。
【０１７２】
特定の実施形態では、完全修飾核酸阻害剤分子は、１つ以上の可逆的グルタチオン感受性部分で修飾される。特定の実施形態では、核酸阻害剤分子の実質的に全てのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、核酸阻害剤分子のヌクレオチドの半分以上が、可逆的修飾以外の化学修飾で修飾される。特定の実施形態では、核酸阻害剤分子のヌクレオチドの半分未満が、可逆的修飾以外の化学修飾で修飾される。修飾が核酸阻害剤分子上で群状で起こり得るか、または異なる修飾ヌクレオチドが点在し得る。
【０１７３】
核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、１ヌクレオチドから全ヌクレオチドが、２’−炭素で修飾される。特定の実施形態では、核酸阻害剤分子（またはセンス鎖及び／もしくはそのアンチセンス鎖）は、例えば、当該技術分野で既知及び本明細書に記載の２’−炭素修飾を使用して、２’−炭素で部分的にまたは完全に修飾される。核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、１から全てのリン原子が修飾され、１ヌクレオチドから全ヌクレオチドが２’−炭素で修飾される。特定の実施形態では、２’−炭素における修飾は、２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、及び／または２’−ＭＯＥのうちの１つ以上である。特定の実施形態では、２’−炭素での修飾は、２’−Ｆ及び／または２’−ＯＭｅである（すなわち、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス及び／もしくはアンチセンス鎖）は、２’−Ｆ及び／または２’−ＯＭｅで部分的にまたは完全に修飾される。特定の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾される１つ以上のヌクレオチドを含有する。
【０１７４】
Ｃ．他の４’−リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチド
本明細書に開示の４’−リン酸アナログは通常、核酸阻害剤分子に組み込まれるが、他の核酸は、本明細書に記載の４’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドを含むように修飾することができる（例えば、式Ｉ〜ＩＸのうちのいずれか１つに記載の５’末端ヌクレオチド）。本開示の修飾オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドにおけるリン酸アナログの存在が望ましい、目的の任意のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。例として、本出願の教示に従って修飾することができる他の核酸は、他の治療用核酸、例えば、遺伝子治療または遺伝子編集のためのオリゴヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲ核酸分子を含む。例えば、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９：８１９−２３；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９：８２３−２６；Ｗｏｏ  Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（３）：２３０−２３２を参照のこと。加えて、本開示のリン酸アナログを含むオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することもできる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、プローブ、プライマー、リンカー、アダプター、または遺伝子フラグメントを含む。
【０１７５】
ＩＩＩ．リン酸アナログを含むヌクレオシドホスホルアミダイト
本開示の別の態様は、標準的なオリゴヌクレオチド合成方法に使用することができる、本明細書に記載の４’−リン酸アナログを含むヌクレオシドホスホルアミダイトに関する。通常は、リン酸アナログは、オキシメチル基の酸素原子が糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合しているオキシメチルホスホナートである。他の実施形態では、リン酸アナログは、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子が糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合しているチオメチルホスホナートまたはアミノメチルホスホナートである。
【０１７６】
特定の実施形態では、オキシメチルホスホナートは、−Ｏ−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ）２で表され、Ｒは独立して、ＣＨ３、アルキル基、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択される。特定の実施形態では、アルキル基は、ＣＨ２ＣＨ３である。より一般的には、Ｒは独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、または保護基から選択される。
【０１７７】
１．式Ｘ及びＸＩ
一部の実施形態では、本開示のヌクレオシドホスホルアミダイトは、式Ｘまたは式ＸＩ：
【化１１】
2019530656.tif 000012
（式中、Ｂ、Ｍ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＸ２は、式ＩまたはＩＩに記載される通りであり、
Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｘ１０は、存在しないか、またはＯ、Ｓ、ＮＲ’、もしくはＣＲ’Ｒ”から選択され、
Ｒ１０は、ホスホルアミダイトである）で表される。
【０１７８】
特定の実施形態では、リン酸アナログ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、式Ｘで表される。
【０１７９】
特定の実施形態では、リン酸アナログ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、式ＸＩで表される。
【０１８０】
特定の実施形態では、Ｂは、天然核酸塩基である。
【０１８１】
特定の実施形態では、Ｍ１は、Ｏである。
【０１８２】
特定の実施形態では、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は独立して、水素、フッ素、ＣＨ３、またはＣ１−Ｃ６アルキルから選択される。通常は、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、水素である。
【０１８３】
特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｏ、ハロゲン、または任意に置換されたアルコキシである。
【０１８４】
特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、ＣＨ３である。特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、ＣＨ２ＣＨ３である。
【０１８５】
特定の実施形態では、Ｍ１は、Ｏであり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、水素である。
【０１８６】
特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、ＳｅもしくはＮＨＲ’であり、Ｒ’は、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換脂肪族、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環、または置換もしくは非置換のシクロアルキルから選択され、Ｒ８は、グルタチオン感受性部分である。通常は、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ８は、グルタチオン感受性部分である。
【０１８７】
特定の実施形態では、Ｘ２は、ハロゲンまたは任意に置換されたアルコキシであり、Ｒ８は、存在しない。通常は、Ｘ２は、Ｆ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、またはＯＣＨ３であり、Ｒ８は、存在しない。
【０１８８】
特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、ＣＨ３であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１８９】
特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１９０】
特定の実施形態では、ホスホルアミダイトは、式−Ｐ（ＯＲｘ）−Ｎ（Ｒｙ）２を有し、Ｒｘは、任意に置換されたメチル、２−シアノエチル、及びベンジルからなる群より選択され、Ｒｙは、任意に置換されたエチル及びイソプロピルからなる群より選択される。
【０１９１】
特定の実施形態では、リン酸アナログ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、ヌクレオシドの糖部分に結合している酸素原子が硫黄または窒素原子で置換されることを除いて、式ＸまたはＸＩと同一である。
【０１９２】
２．式ＸＩＩ
一部の実施形態では、本開示のヌクレオシドホスホルアミダイトは、式ＸＩＩ：
【化１２】
2019530656.tif 000013
（式中、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｒ１０は、ホスホルアミダイトであり、
Ｘ２はＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、且つＲ８は存在しないか、またはＸ２はＯであり、且つＲ８はグルタチオン感受性部分である）で表される。
【０１９３】
特定の実施形態では、Ｂは、天然核酸塩基である。
【０１９４】
特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ独立して、ＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ３から選択される。
【０１９５】
特定の実施形態では、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３であり、Ｒ８は、存在しない。
【０１９６】
特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｏであり、Ｒ８は、グルタチオン感受性部分である。
【０１９７】
特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、ＣＨ３であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１９８】
特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ８は、存在せず、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０１９９】
３．式ＸＩＩＩ
特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホルアミダイトは、式ＸＩＩＩ：
【化１３】
2019530656.tif 000014
（式中、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｒ１０は、ホスホルアミダイトであり、
Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である）で表される。
【０２００】
特定の実施形態では、Ｂは、天然核酸塩基である。
【０２０１】
特定の実施形態では、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０２０２】
４．式ＸＩＶ
特定の実施形態では、ヌクレオシドホスホルアミダイトは、式ＸＩＶ：
【化１４】
2019530656.tif 000015
（式中、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、ユニバーサル塩基であるか、または存在せず、
Ｒ１０は、ホスホルアミダイトであり、
Ｘ２は、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である）で表される。
【０２０３】
特定の実施形態では、Ｂは、天然核酸塩基である。
【０２０４】
特定の実施形態では、Ｘ２は、ＦまたはＯＣＨ３である。
【０２０５】
５．式ＸＶ
一部の実施形態では、本開示のリン酸アナログ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、式ＸＶ：
【化１５】
2019530656.tif 000016
（式中、Ｒｃ及びＲｄはそれぞれ独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択され、
Ｖは、Ｏであり、
Ｚ１は、ホスホルアミダイト及び糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｖは、糖部分の４’−炭素に結合している）で表される。
【０２０６】
通常は、糖部分は、フラノースであり、Ｖは、フラノースの４’−炭素に結合している。
【０２０７】
特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、ＣＨ３である。特定の実施形態では、Ｒｃ及びＲｄは、ＣＨ２ＣＨ３である。
【０２０８】
６．式ＸＶＩ
一部の実施形態では、本開示のリン酸アナログ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、式ＸＶＩ：
【化１６】
2019530656.tif 000017
（式中、Ｒ１は、ＯまたはＳであり、
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、保護されたＯＨ、保護されたＳＨ、または保護されたＮＨ２、ＯＣＨ３、ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＯＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、及びＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３から選択され、Ｒ９は、アルキルであり、
Ｖは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’、ＣＲ’Ｒ”であり、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、置換もしくは非置換脂肪族、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環、または置換もしくは非置換シクロアルキルであり、
Ｚ１は、ホスホルアミダイト及び糖部分を含むヌクレオシドであり、
Ｖは、糖部分の４’−炭素に結合している）で表される。
【０２０９】
通常は、糖部分は、フラノースであり、Ｖは、フラノースの４’−炭素に結合している。
【０２１０】
通常は、Ｖは、Ｏである。
【０２１１】
特定の実施形態では、Ｒ２またはＲ３はそれぞれ独立して、保護されたＯＨ、ＯＣＨ３、またはＯＲ９から選択され、Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ９は、ＣＨ２ＣＨ３である。
【０２１２】
通常は、Ｒ１は、Ｏである。
【０２１３】
特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、保護されたＯＨ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ３は、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、保護されたＯＨであり、Ｒ３は、保護されたＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ３は、保護されたＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、ＯＣＨ３であり、Ｒ３は、保護されたＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２及びＲ３は、ＯＣＨ３である。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２は、ＯＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ３は、保護されたＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｏであり、Ｒ２及びＲ３は、ＯＣＨ２ＣＨ３である。
【０２１４】
保護基
４’−リン酸アナログ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトの一部の実施形態では、保護基は、Ｂ、すなわち、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、またはユニバーサル核酸塩基、に結合している。Ｂに対する好適な保護基としては、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、及びＮ，Ｎ−ジフェニルカルバマートが挙げられる。
【０２１５】
一部の実施形態では、保護基は、上記のヌクレオシドホスホルアミダイト中のヒドロキシル基に結合している。上記のヌクレオシドホスホルアミダイトのヒドロキシル基に対する好適な保護基としては、限定されないが、ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、及び／またはトリチル基を含む、固相オリゴヌクレオチド合成と適合性のある任意の保護基が挙げられる。代表例は、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴｒ）基であり、これは、酸性条件下（例えば、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、または酢酸の存在下）で容易に切断され得る。
【０２１６】
他の代表的なヒドロキシル保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）などのトリアルキルシリル基を含む。ＴＢＤＭＳ基は、合成サイクル中にＤＭＴ基を除去するために使用される酸性条件下で安定であるが、ＲＮＡオリゴマーの切断及び脱保護の後、例えば、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液またはトリエチルアミンフッ化水素酸塩を用いる種々の方法で除去することができる。他の代表的なヒドロキシル保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル（ＴＢＤＰＳ）が含まれ、これは、例えば、フッ化アンモニウムで除去され得る。
【０２１７】
ＩＶ．核酸塩基
上記の４’−リン酸アナログ含有オリゴヌクレオチド及びヌクレオシドでは、Ｂは、天然核酸塩基、修飾核酸塩基、またはユニバーサル核酸塩基を表す。好適な天然核酸塩基は、プリン及びピリミジン塩基、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはウラシル（Ｕ）を含む。好適な修飾核酸塩基としては、ジアミノプリン及びその誘導体、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、チオール化プリンまたはピリミジンなどが挙げられる。
【０２１８】
他の好適な修飾核酸塩基としては、プリン及びピリミジンのアナログが挙げられる。好適なアナログとしては、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、１−メチルシュードウラシル、ケトシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、ニトロピロリル、ニトロインドリル及びジフルオロトリル、６−チオプリン及び２，６−ジアミノプリンニトロピロリル、ニトロインドリル、ならびにジフルオロトリルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
通常は、核酸塩基は、窒素含有塩基を含有する。特定の実施形態では、核酸塩基は、窒素原子を含有しない。例えば、米国特許出願第２００８０２７４４６２号を参照のこと。ユニバーサル核酸塩基は、天然に存在する核酸に通常見られる複数の塩基と対合し得、それにより、二重鎖中でこのような天然に存在する塩基の代わりになり得る塩基を指す。塩基は、天然に存在する塩基のそれぞれと対合することが可能である必要はない。例えば、特定の塩基は、プリンとのみ、もしくはプリンと選択的に、または、ピリミジンとのみ、もしくはピリミジンと選択的に対合する。ユニバーサル核酸塩基は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用または非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用（例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用）を介して水素結合を形成することにより塩基対合し得る。代表的なユニバーサル核酸塩基は、イノシン及びその誘導体を含む。
【０２２０】
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは、糖環の１’位に結合した核酸塩基を有さない。このようなヌクレオチドは、無塩基と呼ばれる。
【０２２１】
Ｖ．式Ｉ〜ＸＶＩの他の置換基
式Ｉ〜ＸＶＩでは、必要に応じて、好適な脂肪族基は、通常は、約２〜約１０炭素原子、より一般的には、約２〜約６炭素原子、例えば、約２〜約５炭素原子、を含有する。
【０２２２】
式Ｉ〜ＸＶＩでは、必要に応じて、好適なアルキル基は、通常は、約１〜約１０炭素原子、より一般的には、約２〜約６炭素原子、例えば、約２〜約５炭素原子、を含有する。
【０２２３】
式Ｉ〜ＸＶＩでは、必要に応じて、好適なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ネオペントキシ、及びｎ−ヘキソキシなどが挙げられる。
【０２２４】
式Ｉ〜ＸＶＩでは、必要に応じて、好適なシクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが挙げられる。
【０２２５】
式Ｉ〜ＸＶＩでは、必要に応じて、好適なヘテロ原子としては、酸素、硫黄、及び窒素が挙げられる。代表的な複素環としては、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、及びテトラヒドロフリルが挙げられる。代表的なヘテロアリールとしては、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルが挙げられる。
【０２２６】
式Ｉ〜ＸＶＩでは、必要に応じて、好適なアルケニル基としては、ビニル、アリル、及び２−メチル−３−ヘプテンが挙げられ、好適なアルキニル基としては、プロピン及び３−ヘキシンが挙げられる。
【０２２７】
式Ｉ〜ＸＶＩでは、必要に応じて、好適なアリール基としては、フェニル、ナフチルなどが挙げられるが、好適なヘテロアリール基としては、ピリジル、フラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリルなどが挙げられる。
【０２２８】
式Ｉ〜ＸＶＩでは、必要に応じて、好適なアルキルアミノとしては、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−が挙げられる。
【０２２９】
ＶＩ．オリゴヌクレオチドの合成方法
本出願に記載の４’−リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドは、標準的なホスホルアミダイト法を含む、当該技術分野で既知の様々な合成方法を使用して作製することができる。任意のホスホルアミダイト合成方法は、本発明の４’−リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドを合成するために使用することができる。特定の実施形態では、ホスホルアミダイトを固相合成法で使用して、反応性中間体ホスファイト化合物を得、その後、既知の方法を使用して、これを酸化し、ホスホジエステルまたはホスホロチオアートヌクレオチド間結合を通常有するホスホナート修飾オリゴヌクレオチドを生成する。本開示のオリゴヌクレオチド合成は、当該技術分野で既知の方法を使用して、５’から３’へ、または３’から５’へのいずれかの方向に実施することができる。
【０２３０】
従って、別の態様では、本開示は、上述した、例えば、式Ｘ〜ＸＶＩで表されるような４’−リン酸アナログ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトを使用してオリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。通常は、４’−リン酸アナログ修飾ヌクレオシドは、合成オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドとして組み込まれる。より一般的には、リン酸アナログ修飾ヌクレオシドは、合成オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとして組み込まれる。
【０２３１】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、（ａ）共有結合を介してヌクレオシドを固体支持体に結合させること；（ｂ）ヌクレオシドホスホルアミダイトを、ステップ（ａ）のヌクレオシド上の反応性ヒドロキシル基にカップリングさせて、それらの間にヌクレオチド間結合を形成させること（固体支持体上の任意のカップリングされていないヌクレオシドはキャッピング剤でキャッピングされる）；（ｃ）酸化剤で該ヌクレオチド間結合を酸化すること；及び（ｄ）後続のヌクレオシドホスホルアミダイトと共に、反復してステップ（ｂ）から（ｃ）を繰り返して、オリゴヌクレオチドを形成すること、を含み、少なくともステップ（ａ）のヌクレオシド、ステップ（ｂ）のヌクレオシドホスホルアミダイト、またはステップ（ｄ）の後続のヌクレオシドホスホルアミダイトのうちの少なくとも１つは、本明細書に記載されるようなホスホナート含有部位を含む。通常は、カップリング、キャッピング／酸化ステップ、及び任意に、脱保護ステップは、オリゴヌクレオチドが所望の長さ及び／または配列に達するまで繰り返され、その後、それは、固体支持体から切断される。
【０２３２】
ＶＩＩ．医薬組成物
本開示は、４’−リン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０２３３】
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤及び治療的有効量の核酸阻害剤分子を含み、核酸阻害剤分子は、本明細書に記載のリン酸アナログを含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
【０２３４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤及び治療的有効量の核酸阻害剤分子を含み、核酸阻害剤分子は、上述のように、式Ｉ〜式ＩＸのいずれか１つで表される少なくとも１つの４’−リン酸アナログ含有ヌクレオチドを含む。
【０２３５】
医薬組成物は通常、核酸阻害剤分子を含むが、医薬組成物は、本明細書中に記載されるような４’−リン酸アナログで修飾されている他の治療用核酸（例えば、遺伝子治療オリゴヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオリゴヌクレオチド）を使用して調製することもできる。
【０２３６】
ＶＩＩＩ．薬学的に許容される賦形剤
本開示に有用な薬学的に許容される賦形剤は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）は、１つ以上の治療用組成物の薬学的送達に適する組成物及び製剤について記載する。薬学的に許容される賦形剤として役立ち得る材料の一部の例としては、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；麦芽；ゼラチン；カカオバター及び座薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油などの油；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（等張食塩水；リンガー液）；エチルアルコール；ｐＨ緩衝溶液；グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；ならびに医薬製剤に用いられる他の非毒性適合物質が挙げられる。
【０２３７】
ＩＸ．剤形
４’−リン酸アナログ含有オリゴヌクレオチド（例えば、核酸阻害剤分子）を含む医薬組成物は、任意の意図された投与経路のために従来の賦形剤と共に製剤化されてもよい。
【０２３８】
通常は、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されるような４’−リン酸アナログ含有核酸阻害剤分子を含み、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射により、非経口投与用の液体形態で製剤化される。非経口投与に適した剤形は通常、例として、無菌水溶液、食塩水、低分子量アルコール、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、脂肪酸エステル、例えば、エチルオレアートなど、を含む非経口投与に適する１つ以上のビヒクルを含む。非経口製剤は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有してもよい。適切な流動性は、例えば、界面活性剤の使用により維持することができる。液体製剤は、後に、滅菌注射用溶液で再構成する際に使用するために凍結乾燥及び貯蔵することができる。
【０２３９】
医薬組成物はまた、局所もしくは経皮投与、直腸もしくは膣内投与、眼内投与、経鼻投与、口腔投与、または舌下投与を含む他の投与経路用に製剤化されてもよい。
【０２４０】
Ｘ．送達剤
４’−リン酸アナログ含有オリゴヌクレオチド（例えば、核酸阻害剤分子）は、取り込み、分布、もしくは吸収を助けるための、例えば、米国特許第６，８１５，４３２号、同第６，５８６，４１０号、同第６，８５８，２２５号、同第７，８１１，６０２号、同第７，２４４，４４８号、及び同第８，１５８，６０１号に開示されるようなリポソーム及び脂質；米国特許第６，８３５，３９３号、同第７，３７４，７７８号、同第７，７３７，１０８号、同第７，７１８，１９３号、同第８，１３７，６９５号、ならびに米国公報特許出願第２０１１／０１４３４３４号、同第２０１１／０１２９９２１号、同第２０１１／０１２３６３６号、同第２０１１／０１４３４３５号、同第２０１１／０１４２９５１号、同第２０１２／００２１５１４号、同第２０１１／０２８１９３４号、同第２０１１／０２８６９５７号、及び同第２００８／０１５２６６１号に開示されるようなポリマー材料；カプシド、カプソイド、または受容体標的化分子を含む他の分子、分子構造、または化合物類の混合物と混合され、カプセル化され、コンジュゲートされ、または別の方法で結合されてもよい。
【０２４１】
特定の実施形態では、４’−リン酸アナログ含有オリゴヌクレオチド（例えば、核酸阻害剤分子）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内で製剤化される。脂質−核酸ナノ粒子は通常、脂質を核酸と混合して複合体を形成する時に自発的に形成される。所望の粒度分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、ＬＩＰＥＸ（登録商標）Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して任意に押し出すことができる。治療的使用のための脂質ナノ粒子を調製するために、ナノ粒子を形成するために使用される溶媒（例えば、エタノール）及び／または交換緩衝液を除去することが望ましく、これは、例えば、透析またはタンジェンシャルフロー濾過により達成することができる。核酸阻害剤分子を含有する脂質ナノ粒子を製造する方法は、例えば、米国公開特許出願第２０１５／０３７４８４２号及び同第２０１４／０１０７１７８号に開示されるように、当該技術分野で知られている。
【０２４２】
特定の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性リポソーム及びペグ化脂質を含む脂質コアを含む。ＬＮＰは、カチオン性脂質、構造もしくは中性脂質、ステロール、ペグ化脂質、またはそれらの混合物などの１つ以上のエンベロープ脂質をさらに含み得る。
【０２４３】
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、目的の組織へのオリゴヌクレオチドの送達を導くように、リガンドに共有結合的にコンジュゲートされる。多くのこのようなリガンドが、調査されている。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．，２０１３，４（７）：７９１−８０９を参照のこと。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの肝臓への取り込みを導くように、複数の糖リガンド部分（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））にコンジュゲートすることができる。例えば、ＷＯ２０１６／１００４０１を参照のこと。使用することができる他のリガンドとしては、マンノース−６−リン酸、コレステロール、葉酸、トランスフェリン、及びガラクトースが挙げられるが、これらに限定されない（他の特定の例示的なリガンドについては、例えば、ＷＯ２０１２／０８９３５２を参照のこと）。通常は、オリゴヌクレオチドがリガンドにコンジュゲートされる場合、オリゴヌクレオチドは、裸のオリゴヌクレオチドとして投与され、オリゴヌクレオチドはまた、ＬＮＰまたは他の保護コーティング内で製剤化されない。特定の実施形態では、裸のオリゴヌクレオチド内の各ヌクレオチドは、糖部分の２’位において、通常は、２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾される。
【０２４４】
これらの医薬組成物は、従来の滅菌技術により滅菌されても、滅菌濾過されてもよい。得られる水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化されても、凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性賦形剤と混合される。調製物のｐＨは通常、３〜１１、より好ましくは、５〜９または６〜８、最も好ましくは、７〜７．５などの７〜８であろう。固体形態の医薬組成物は、複数の単回用量単位でパッケージ化されてもよく、それぞれは、錠剤またはカプセルの密封包装のような、上述した薬剤（複数可）の一定量を含有する。固体形態の医薬組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏のために設計された圧搾可能なチューブなどの、可変量用の容器にパッケージ化することもできる。
【０２４５】
本開示の医薬組成物は、治療的使用に適用される。従って、本開示の一態様は、限定されないが、疾患または状態に罹患するヒトを含む対象を、有効量の本開示の医薬組成物を該対象に投与することにより、処置するために使用され得る医薬組成物を提供する。
【０２４６】
特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者を処置するための薬品を製造するために本明細書に記載されるような治療的有効量の医薬組成物の使用を特徴とする。
【０２４７】
ＸＩ．使用方法
本明細書に記載の４’−リン酸アナログ含有核酸阻害剤分子は、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する方法に使用することができる。通常は、このような方法は、標的遺伝子の発現を調節するのに十分な量で、４’−リン酸アナログ含有核酸阻害剤分子を細胞に導入することを含む。特定の実施形態では、この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施することもできる。特定の実施形態では、細胞は、限定されないが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。
【０２４８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の４’−リン酸アナログ含有オリゴヌクレオチド（例えば、核酸阻害剤分子）は、それを必要とする患者を処置する方法に使用することができる。通常は、このような方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載されるような４’−リン酸アナログ含有核酸阻害剤分子を含む、治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。
【０２４９】
特定の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、それを必要とする患者のウイルス感染症に関連する症状の処置または予防に有用であり得る。一実施形態は、本明細書に記載されるような、治療有効量の、４’−リン酸アナログ含有オリゴヌクレオチド（例えば、核酸阻害剤分子）を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、ウイルス感染症の処置方法に関する。このようなウイルス感染の非限定例は、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、またはＨＩＶ感染を含む。
【０２５０】
特定の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、それを必要とする患者の癌に関連する症状の治療または予防に有用であり得る。一実施形態は、本明細書に記載されるような、４’−リン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子を含む、治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、癌を処置する方法に関する。このような癌の非限定例としては、胆管癌、膀胱癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳癌、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生癌、子宮頸癌、子宮頸部扁平上皮癌、直腸癌、結腸直腸癌、結腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道癌、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼内メラノーマ、ブドウ膜メラノーマ、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性（ＣＭＭＬ）、肝癌、肝癌腫、肝癌、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌腫（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、口腔咽頭癌、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵管腺癌、偽乳頭状腫瘍、腺房細胞癌、前立腺癌、前立腺腺癌、皮膚癌、メラノーマ、悪性メラノーマ、皮膚メラノーマ、小腸癌、胃癌、胃癌腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮癌、または子宮肉腫が挙げられる。通常は、本開示は、治療的有効量の、本明細書に記載の医薬組成物を投与することにより、肝癌、肝癌腫、肝癌、肝細胞癌、胆管癌、及び肝芽腫を処置する方法を特徴とする。
【０２５１】
特定の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、増殖性、炎症性、自己免疫性、神経性、眼性、呼吸性、代謝性、皮膚病学的、聴覚性、肝臓、腎臓、または感染性疾患に関連する症状の処置または予防に有用であり得る。一実施形態は、本明細書に記載されるような、治療的有効量の４’−リン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、増殖性、炎症性、自己免疫性、神経性、眼性、呼吸性、代謝性、皮膚病学的、聴覚性、肝臓、腎臓、または感染性疾患を処置する方法に関する。通常は、疾患または状態は、肝臓の疾患である。
【０２５２】
一部の実施形態では、本開示は、標的遺伝子の発現を低減させるのに十分な量で、それを必要とする対象に、医薬組成物を投与することを含む、対象における標的遺伝子の発現を低減する方法を提供し、医薬組成物は、本明細書に記載されるような４’−リン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子及び本明細書にも記載されるような薬学的に許容される賦形剤を含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、４’−リン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子は、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子またはｓｓＲＮＡｉ阻害剤分子を含む、本明細書に記載されるようなＲＮＡｉ阻害剤分子である。
【０２５４】
標的遺伝子は、ヒト標的遺伝子などの任意の哺乳動物由来の標的遺伝子であってよい。本発明の方法によれば、いかなる遺伝子もサイレンシングされてもよい。例示的な標的遺伝子としては、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、βカテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢＩ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制遺伝子の変異、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、ＬＤＨＡ、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５５】
一部の実施形態では、４’−リン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子は、標的遺伝子をサイレンシングし、それにより、標的遺伝子の望ましくない発現を特徴とする障害を有するか、またはそのリスクがある対象を処置するために使用することができる。例えば、一部の実施形態では、本４’−リン酸アナログ修飾核酸阻害剤分子は、β−カテニン遺伝子をサイレンシングし、それにより、望ましくないβ−カテニン発現を特徴とする障害、例えば、腺癌または肝細胞癌、を有するか、またはそのリスクがある対象を処置するために使用することができる。
【０２５６】
通常は、本発明の４’−リン酸アナログ含有オリゴヌクレオチド（例えば、核酸阻害剤分子）は、静脈内または皮下投与される。しかし、本明細書に開示の医薬組成物は、例えば、経口、口腔、舌下、経直腸、膣内、尿道内、局所、眼内、鼻腔内、及び／または耳介内を含む、当該技術分野で既知の任意の方法によっても投与されてもよく、投与は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁剤、ゲル剤、スプレー剤、坐剤、塗剤、軟膏剤などを含んでもよい。
【０２５７】
特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与（静脈内または皮下投与など）を介して、肝臓などの対象または生物の関連組織または細胞に送達される。他の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与により送達される。特定の実施形態では、医薬組成物は、肺細胞及び組織などの関連組織または細胞への局所投与を介して、例えば、肺送達を介して、送達される。
【０２５８】
本明細書に開示の治療的有効量の化合物は、投与経路ならびに患者の体格、例えば、対象のサイズ及び重量、疾患の進行または浸透の程度、対象の年齢、健康状態、及び性別に依存し得る。
【０２５９】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるような４’−リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドは、１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり２０マイクログラム〜１０ミリグラム、１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり１００マイクログラム〜５ミリグラム、または１日当たりのレシピエントの体重１キログラム当たり０．５〜２．０ミリグラムの用量で投与される。
【０２６０】
本開示の医薬組成物は、毎日または断続的に投与されてもよい。例えば、本開示の化合物の断続的投与は、週に１〜６日、月に１〜６日、週に１回、隔週に１回、月に１回、隔月に１回、または年に１回もしくは２回投与されても、年に、月に、週に、または週に複数回の投与に分けられてもよい。一部の実施形態では、断続的投与は、周期的な投与（例えば、１日間、１週間、または連続した２〜８週間に毎日投与し、次に、残りの期間は、多くとも１週間、多くとも１ヶ月、多くとも２ヶ月、多くとも３ヶ月、または多くとも６ヶ月以上全く投与しない）を意味し得るか、あるいは、１日置きに、１週置きに、１月置きに、または１年置きに投与することを意味し得る。
【０２６１】
本発明の処置方法のいずれにおいても、化合物は、単独療法として単独で、または当該技術分野で既知のさらなる治療法と組み合わせて、対象に投与されてもよい。
【実施例】
【０２６２】
実施例１：ホスホルアミダイト１の合成
下記のスキーム１は、以下の、ジエチル保護されたオキシメチルホスホナートを含むヌクレオシドホスホルアミダイト：（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３−（（ベンジルオキシ）メチル）−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ジエトキシホスホリル）メトキシ）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ホスホルアミダイト１）の合成を示す。
【化１７】
2019530656.tif 000018
【０２６３】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イルベンゾアート（１Ｂ）の合成
２’−Ｏ−メチルウリジン（１５０ｇ、５８０．９ｍｍｏｌ）のピリジン（１．５Ｌ）溶液を、氷浴中で冷却した。溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルクロロジメチルシラン（９６．３ｇ、６３９．０ｍｍｏｌ）を、数回に分けて、１５分で添加した。反応混合物を、室温で５時間撹拌した。次に、反応混合物を、氷浴中で冷却した。塩化ベンゾイル（１６５．５ｇ、１．２ｍｏｌ）を、１５分で反応混合物に滴加した。反応混合物を、室温で１２時間連続撹拌した後、酢酸エチル（２Ｌ）で希釈した。溶液を、水（３Ｌ×３）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１Ｌ×２）、及び食塩水（１Ｌ）で洗浄した。有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空濃縮して、１Ｂ（５００ｇ、粗製）の淡黄色残渣を得、これを、次のステップに直接使用した。
【０２６４】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３−（（ベンジルオキシ）メチル）−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イルベンゾアート（１Ｃ）の合成
前のステップ（１Ｂ）からの生成物（５００ｇ、粗製）を、ＤＭＦ（５Ｌ）に溶解した。溶液を、氷浴中で冷却した。ベンジルクロロメチルエーテル（７４．２ｇ、１．１６ｍｏｌ）及びＤＢＵ（２３９．８ｇ、１．５８ｍｏｌ）を加え、反応混合物を、室温まで温め、１６時間撹拌した。反応を、０．１ＮのＨＣｌ（２Ｌ）でクエンチし、酢酸エチル（２Ｌ）で希釈した。有機層を、分離した。次に、それを、水、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗物質を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（２０：１）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題生成物１Ｃ（５００ｇ、８３７．９ｍｍｏｌ）を黄色油状物として得た。
【０２６５】
１Ｈ ＮＭＲ ： （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）： δ ７．９３ − ７．９５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．８５ − ７．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．５０ − ７．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．３６ − ７．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．１２ − ７．１９ （ｍ， ５ Ｈ）， ５．９０ − ５．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．５４ − ５．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．３５ （ｓ， ２ Ｈ）， ５．２４ − ５．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．５５ （ｄ， Ｊ ＝ １．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ４．２８ − ４．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．９３ − ４．０１ （ｍ， １ Ｈ）， ３．８１ − ３．９３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．３２ （ｓ， ３ Ｈ）， ０．８１ − ０．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １０ Ｈ）， ０．００ （ｓ， ６ Ｈ）； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝５９７．２
【０２６６】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３−（（ベンジルオキシ）メチル）−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（ヒドロキシメチル）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イルベンゾアート（１Ｄ）の合成
１Ｃ（２５０ｇ、４１９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１．５Ｌ）溶液を、氷浴中に置き、塩化アセチル（２４．９ｇ、５０２．７ｍｍｏｌ）を、１５分で滴加した。反応物を、室温まで温め、２時間撹拌した。Ａｇ２ＣＯ３（１３８．６ｇ、５０２．７ｍｍｏｌ）を、反応物に加え、１時間撹拌した。反応混合物を、濾過し、真空濃縮して、表題化合物１Ｄ（４００ｇ、粗製）を黄色油状物として得た。
【０２６７】
１Ｈ ＮＭＲ ： （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）： δ ８．０２ − ８．０５ （ｍ， ３ Ｈ）， ７．５７ − ７．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．４４ − ７．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．１９ − ７．２７ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ５ Ｈ）， ６．０３ − ６．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．７２ − ５．７４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．４１ − ５．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ４．６３ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．２９ − ４．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．１７ − ４．１９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．７９ − ３．８８ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．３７ （ｓ， ３ Ｈ）； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝４８２．２
【０２６８】
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（ベンゾイルオキシ）−５−（３−（（ベンジルオキシ）メチル）−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メトキシテトラヒドロフラン−２−カルボン酸（１Ｅ）の合成
［アセトキシ（フェニル）−ヨードニル］アセタート（２９３．７ｇ、９１２ｍｍｏｌ）を、水（１Ｌ）及びＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）中の１Ｄ（２００ｇ、４１４．５ｍｍｏｌ）及びＴＥＭＰＯ（１５．６４ｇ、９９．４８ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。反応混合物を、室温で１２時間撹拌し、次に、酢酸エチルで希釈した。有機層を、分離し、水、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空濃縮した。粗物質を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（２０：１）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題生成物１Ｅ（１５０ｇ、８３７．９ｍｍｏｌ）を黄色油状物として得た。
【０２６９】
１Ｈ ＮＭＲ： （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）： δ ８．２１ − ８．２３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ７．９３ − ７．９７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．５２ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３７ − ７．４１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１０ − ７．２０ （ｍ， ４ Ｈ）， ７．０２ − ７．０６ （ｍ， ２ Ｈ）， ６．９５ （ｓ， １ Ｈ）， ６．０８ − ６．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．６９ − ５．７１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．６０ − ５．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．３１ − ５．３６ （ｔ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ４．５４ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．１１ − ４．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．２９ （ｓ， ３ Ｈ）； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝４９７．２
【０２７０】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−アセトキシ−５−（３−（（ベンジルオキシ）メチル）−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イルベンゾアート（１Ｆ）の合成
乾燥フラスコに、１Ｅ（２０ｇ、４０．３ｍｍｏｌ）及びＰｂ（ＯＡｃ）４（５３．６ｇ、１２０．８ｍｍｏｌ）を入れた。反応混合物をアルゴンでパージした後、ＤＭＦ（１５０ｍＬ）を加えた。反応物を、遮光し、室温で１６時間撹拌した。それを、水（６００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（４００ｍＬ）で希釈した。得られた懸濁液を、セライトパッドで濾過した。固体を、酢酸エチルですすいだ。有機層を、分離し、真空濃縮した。粗物質を、石油エーテル：酢酸エチル（３：１）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標題生成物１Ｆ（７ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）をα／β混合物として得た。
【０２７１】
１Ｈ ＮＭＲ： （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）： δ ８．１０ − ８．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ７．６５ − ７．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ７．５４ − ７．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ７．２６ − ７．３５ （ｍ， ９ Ｈ）， ６．３５ − ６．３７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ５．８９ − ５．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．６８ − ５．６９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．４８ − ５．５０ （ｔ， Ｊ ＝ １．６ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ４．６８ − ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ４．５４ − ４．５７ （ｑ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．４４ （ｓ， ４ Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３ Ｈ）； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝５１１．２
【０２７２】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）‐５‐（３−（（ベンジルオキシ）メチル）‐２，４‐ジオキソ‐３，４‐ジヒドロピリミジン‐１（２Ｈ）−イル）‐２−（（ジエトキシホスホリル））メトキシ）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イルベンゾアート（１Ｇ）の合成
反応を、アルゴン下で実施した。ジエチル（ヒドロキシメチル）ホスホナート（２６．４ｇ、１５６．７ｍｍｏｌ）及び三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（２７．８ｇ、１９６．０ｍｍｏｌ）を、１Ｆ（２０ｇ、３９．２ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１３０ｍＬ）溶液に加えた。反応液を、室温で１６時間撹拌した。反応を、水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を、分離し、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空濃縮した。粗物質を、石油エーテル：酢酸エチル（３：１〜１：１）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題化合物１Ｇ（７ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）を白色泡状物として得た。
【０２７３】
１Ｈ ＮＭＲ： （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）： δ ８．１０ − ８．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ７．６５ − ７．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ７．５４ − ７．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ７．２６ − ７．３５ （ｍ， ９ Ｈ）， ６．３５ − ６．３７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ５．８９ − ５．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．６８ − ５．６９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．４８ − ５．５０ （ｔ， Ｊ ＝ １．６ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ４．６８ − ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ４．５４ − ４．５７ （ｑ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．４４ （ｓ， ４ Ｈ）， ２．２１ （ｓ， ３ Ｈ）； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝６１９．２
【０２７４】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（ジエトキシホスホリル）メトキシ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イルベンゾアート（１Ｈ）の合成
１Ｇ（９ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）のＴＦＡ（９０ｍＬ）溶液を、８０℃で３０分間撹拌し、次に、真空濃縮した。粗物質を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（７０：１）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題化合物１Ｈ（６．８ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）を白色泡状物として得た。
【０２７５】
１Ｈ ＮＭＲ： （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）： δ １１．５４ （ｓ， １ Ｈ）， ８．０３ − ８．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．６１ （ｓ， ５ Ｈ）， ６．２６ − ６．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．７３ − ５．７６ （ｍ， １ Ｈ）， ５．５５ − ５．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．３９ （ｓ， １ Ｈ）， ４．４９ − ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．０２ − ４．１４ （ｍ， １１ Ｈ）， ３．１８ （ｓ， ３ Ｈ）， １．２４ − １．３０ （ｍ ，６Ｈ）； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝４９９．２
【０２７６】
ジエチル（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−ヒドロキシ−４−メトキシテトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）メチル）ホスホナート（１Ｉ）の合成
１Ｈ（５ｇ、１０ｍｍｏｌ）のアンモニア・メタノール（７Ｎ、５０ｍＬ）溶液を、室温で１６時間撹拌した。反応混合物を、真空濃縮した。粗物質を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（７０：１）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題化合物１Ｉ（３．３ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）を白色泡状物として得た。
【０２７７】
１Ｈ ＮＭＲ： （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）： δ １１．５３ （ｓ， １ Ｈ）， ８．０２ − ８．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ７．５９ − ７．７４ （ｍ， ４ Ｈ）， ６．２７ − ６．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．７４ − ５．７６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．５５ − ５．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．３９ （ｓ， １ Ｈ）， ４．４９ − ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．０２ − ４．１３ （ｍ， ７ Ｈ）， ３．３２ （ｓ， ３ Ｈ）， １．２５ − １．３０ （ｍ， ７ Ｈ）； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝３９５．１
【０２７８】
２−シアノエチル（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（ジエトキシホスホリル）メトキシ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ホスホルアミダイト１）の合成
ＤＩＰＥＡ（２．４ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）を、１Ｉ（４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）溶液に加え、続いて、３−［クロロ−（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル］オキシプロパンニトリル（３．４ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、室温で２時間撹拌し、次に、ＭｅＯＨでクエンチした。反応混合物を、酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、水、及び食塩水で洗浄した。有機層を真空濃縮した。粗物質を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（７０：１）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、表題化合物ホスホルアミダイト１（２．９ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を白色固体として得た。
【０２７９】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）： δ ９．１３ （ｓ， １ Ｈ）， ７．５４ − ７．５９ （ｑ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １ Ｈ）， ６．１７ − ６．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．６８ − ５．７０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １ Ｈ）， ５．０８ − ５．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ２８．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．３８ − ４．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ４．０７ − ４．１２ （ｍ， ５ Ｈ）， ３．８３ − ３．８６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．６３ （ｓ， ５ Ｈ）， ３．３３ − ３．３７ （ｄ， Ｊ ＝ １４．４ Ｈｚ， ３ Ｈ）， ２．６６ − ２．７０ （ｑ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２ Ｈ）， １．２７ − １．３０ （ｍ， ６ Ｈ）， １．１７ − １．２１ （ｑ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２ Ｈ）． ３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤ３ＣＮ， １６２ ＭＨｚ）： δ １５１．５４， １５０．５７， １９．８４； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝５９５．２
【０２８０】
実施例２：ホスホルアミダイト２の合成
下記のスキーム２は、以下の、ジエチル保護されたオキシメチルホスホナートを含むヌクレオシドホスホルアミダイト：２−シアノエチル（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（ジエトキシホスホリル）メトキシ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−フルオロテトラヒドロフラン−３−イル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ホスホルアミダイト２）の合成を示す。実施例１に記載の手順に従って、ホスホルアミダイト２を調製した。
【化１８】
2019530656.tif 000019
【０２８１】
ホスホルアミダイト２の１ＨＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＣＮ、４００ＭＨｚ）は以下の通りである：δ ７．５７ − ７．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ） ６．２６ − ６．３５ （ｍ， １Ｈ） ５．７０ − ５．７３ （ｑ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ） ５．２１ − ５．３４ （ｍ， ２Ｈ） ４．４５ （ｍ， １Ｈ） ４．１３ − ４．１７ （ｍ， ５Ｈ） ４．１３ （ｍ， ３Ｈ） ３．７０ − ３．７２ （ｍ， ２Ｈ） ２．６９ − ２．７４ （ｍ， ２Ｈ） １．３１ − １．３５ （ｍ， ６Ｈ） １．２１ − １．２４ （ｑ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １３Ｈ）。ホスホルアミダイト２の１９Ｆ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、３７６ＭＨｚ）スペクトルは以下の通りである：δ −２１２．０４， −２１２．０４ （ｍ， ０．６Ｆ）； −２１５．００， −２１５．０２ （ｍ， ０．４Ｆ）。ホスホルアミダイト２の３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）スペクトルは以下の通りである：δ １９．３９， １９．２６， １５１．９，１５１．３； ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ［Ｍ＋Ｈ］＋＝５８３．２。
【０２８２】
実施例３：ホスホルアミダイト３の合成
下記のスキーム３は、以下の、ジメチル保護されたオキシメチルホスホナートを含むヌクレオシドホスホルアミダイト：（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（３−（（ベンジルオキシ）メチル）−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ジメトキシホスホリル）メトキシ）−４−メトキシテトラヒドロフラン−３−イル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ホスホルアミダイト３）の合成を示す。実施例１に記載の手順に従って、ホスホルアミダイト３を調製した。
【化１９】
2019530656.tif 000020
【０２８３】
実施例４：ホスホルアミダイト４の合成
下記のスキーム４は、以下の、ジメチル保護されたオキシメチルホスホナートを含むヌクレオシドホスホルアミダイト：２−シアノエチル（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（ジメトキシホスホリル）メトキシ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−フルオロテトラヒドロフラン−３−イル）ジイソプロピルホスホルアミダイトの合成を示す。実施例１に記載の手順に従って、ホスホルアミダイト４を調製した。
【化２０】
2019530656.tif 000021
【０２８４】
実施例５：ホスホルアミダイト５及びホスホルアミダイト５’の合成
４’−オキシメチルホスホナートを有する炭素環式ヌクレオシドホスホルアミダイトを合成した。炭素環式ヌクレオシドは、ヌクレオシドアナログに抗ウイルス性を付与することができる修飾である、ヌクレオシドのテトラヒドロフラン環の代わりにシクロペンタン環を有するヌクレオシドアナログの部類を表す。例えば、米国特許第６，００１，８４０号を参照のこと。換言すれば、炭素環式ヌクレオシドは、糖部分のフラノース環の酸素原子が炭素原子で置換されるヌクレオシドアナログである。
【０２８５】
下記のスキーム５は、以下の、ジエチル保護されたオキシメチルホスホナートを含む炭素環式ヌクレオシドホスホルアミダイトエナンチオマー：１）２−シアノエチル（（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−２−（（ジエトキシホスホリル）メトキシ）−４−（２、４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）シクロペンチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ホスホルアミダイト５）、及び、２）２−シアノエチル（（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−２−（（ジエトキシホスホリル）メトキシ）−４−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）シクロペンチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ホスホルアミダイト５’）の合成を示す。
【化２１】
2019530656.tif 000022
【０２８６】
５Ｉ及び５Ｉ’を合成するための試薬及び条件（スキーム５のステップａ〜ｉ）は、Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，１９９６，２７３９に開示され、以下の通りである：ａ）ｍ−ＣＰＢＡ、ＤＣＭ；ｂ）Ｋ２ＣＯ３、Ａｃ２Ｏ、Ｈ２Ｏ、ＤＭＳＯ；ｃ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ；ｄ）ｔ−ＢｕＳｉ（ＯＴｆ）２、ルチジン、ＤＭＦ；ｅ）（ＥｔＯ）２ＰＯＣＨ２ＯＴｆ、ｎ−ＢｕＬｉ、ＴＨＦ；ｆ）ＮＨ４Ｆ、ＭｅＯＨ；ｇ）３−ベンゾイル−２Ｈ−１ｌ２−ピリミジン−２，４（３Ｈ）−ジオン；ＰＰｈ３、ＤＩＡＤ；ｈ）ＮＨ４ＯＨ、ＭｅＯＨ；及びｉ）ＳＦＣ分離。最終ステップは、５Ｉ及び５Ｉ’を、ｊ）３−（（クロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）プロパンニトリル、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭと反応させて、ホスホルアミダイト５及びホスホルアミダイト５Ｉ’を形成することを含む。
【０２８７】
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ ９．０２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．６２ （ｄｄ， Ｊ＝１．６， ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．６２ （ｄ， Ｊ＝８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３２ − ５．１４ （ｍ， １Ｈ）， ４．４６ （ｂｒ ｄ， Ｊ＝９．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２０ − ４．０８ （ｍ， ４Ｈ）， ４．０６ − ３．９６ （ｍ， １Ｈ）， ３．９４ − ３．７３ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７２ − ３．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７６ − ２．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５９ − ２．４８ （ｍ， １Ｈ）， ２．３３ − ２．１９ （ｍ， ２Ｈ）， １．７５ （ｂｒ ｄ， Ｊ＝１３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， １．３２ （ｂｒ ｔ， Ｊ＝７．０ Ｈｚ， ６Ｈ）， １．２５ − １．１５ （ｍ， １２Ｈ）； ３１Ｐ ＮＭＲ （１６２ＭＨｚ， ＣＤ３ＣＮ） δ １４７．５３， ２０．４５， ２０．３６； ｍ／ｚ実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝５６３．５
【０２８８】
実施例６：ジメチルホスホナートエステルホスホルアミダイトを使用した、５’末端に４’−オキシメチルホスホナートを含有するオリゴヌクレオチドの合成
２’−修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト、すなわち、２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトを使用して、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ；対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ；対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ；及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅ（図１Ａ及び１Ｃ）を合成した。２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト使用して、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ；試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ；試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ；及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅ（図１Ｂ及び１Ｄ）も合成した。各化合物は、２２ヌクレオチドのガイド鎖及び３６ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を含み、パッセンジャー鎖は、ポリエチレングリコール−ＧａｌＮＡｃリガンドにそれぞれコンジュゲートされるテトラループに４ヌクレオチドを含む。図１Ａ〜Ｄを参照のこと。対照及び試験化合物は、遺伝子ＡのｍＲＮＡを標的とする同じ一次配列、同一のパッセンジャー鎖、及びヌクレオチド位置１を除くガイド鎖上の同じ化学修飾パターンを共有し、特定の化合物は、２’−Ｆを含有し、他のものは、２’−ＯＭｅを含有し、各試験化合物は、対照化合物には存在しないリン酸アナログ（４’−オキシメチルホスホナート）を含有する。図１Ａ〜Ｄを参照のこと。各化合物中のヌクレオチドの全てを、糖環の２’−炭素で修飾した。
【０２８９】
市販のオリゴ合成装置を使用して、オリゴヌクレオチド合成を、３’から５’方向に固体支持体上で実施した。標準的なオリゴ合成プロトコールを用いた。アクチベーターとして５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）を用いるカップリング時間は３００秒であった。ヨウ素溶液を、ホスファイトトリエステル酸化に使用した。
【０２９０】
ガイド鎖のＮ１ヌクレオチドにリン酸アナログを有する試験化合物のガイド鎖を合成するために、４’−オキシメチルホスホナートを含有する２’−修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトを、各ガイド鎖の５’末端にカップリングさせた。より具体的には、以下に示されるホスホルアミダイト３（実施例３）またはホスホルアミダイト４（実施例４）を、各試験化合物のガイド鎖の５’末端にカップリングさせた。
【化２２】
2019530656.tif 000023
【０２９１】
ホスホルアミダイト３及びホスホルアミダイト４のホスホナート基はそれぞれ、２つのメチル保護された酸素原子を含有する。しかし、使用される脱保護ステップに応じて、メチル基の一方または両方のいずれかが除去されて、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅ（図１Ｂ及び１Ｄを参照のこと）で表されるようなホスホナート基中の１つのメチル基が保護された酸素原子、または、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ（図１Ｂ及び１Ｄを参照のこと）で表されるような（メチル保護された酸素原子を全く有しない）完全に脱保護されたホスホナート基を有する５’末端ヌクレオチドがもたらされる。
【０２９２】
モノメチル保護された４’−オキシメチルホスホナートオリゴヌクレオチドは、アンモニアを使用して調製することができる。試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅのガイド鎖を調製するために、ホスホルアミダイト３または４がカップリングされている固体支持体結合オリゴヌクレオチドを、濃アンモニアの混合物（２８〜３０ｗｔ％）に懸濁し、５５℃で１７時間加熱して、固体支持体からの切断、及びホスホナート基の１つのメチル基を含む、オリゴヌクレオチド上の保護基の除去を完了させた。試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅのガイド鎖の５’末端ヌクレオチド（図１Ｂ及び１Ｄを参照のこと）は、以下に示され、Ｒはそれぞれ、Ｆ及びＯＭｅである。
【化２３】
2019530656.tif 000024
【０２９３】
ヨウ化トリメチルシリル試薬（「ＴＭＳＩ」）を使用して、完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートオリゴヌクレオチドを調製することができる。試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅのガイド鎖を調製するために、ホスホルアミダイト３または４がカップリングされている固体支持体結合オリゴヌクレオチドを、室温でＴＭＳＩ／ピリジンのＣＨ２Ｃｌ２溶液で処理した。３０〜４５分後、反応を、１Ｍの２−メルカプトエタノールのＴＥＡ／ＣＨ３ＣＮ（１：１）溶液でクエンチした。脱保護及び固体支持体からの切断のための標準的なオリゴヌクレオチド手順を、ＴＭＳＩステップの後に適用して、完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートオリゴヌクレオチドガイド鎖を得た。試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅのガイド鎖の５’末端ヌクレオチド（図１Ｂ及び１Ｄを参照のこと）は、以下に示され、Ｒはそれぞれ、Ｆ及びＯＭｅである。
【化２４】
2019530656.tif 000025
【０２９４】
脱保護及び切断の後、粗オリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州コーラルビル）で分析及び精製した。得られたオリゴヌクレオチド溶液を、プール及び濃縮し、水で脱塩した。最終的に、オリゴヌクレオチドを、凍結乾燥して粉末にした。
【０２９５】
次に、上記のプロセスを繰り返して、ヌクレオチド位置２７〜３０のそれぞれに一価のＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドを有する相補的オリゴヌクレオチドパッセンジャー鎖を調製した。クリックケミストリー、または当該技術分野で既知の方法を使用して、ＧａｌＮＡｃリガンドを２’−炭素に結合させるアセタールリンカーのいずれかを使用して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートホスホルアミダイトシントンを調製した（例えば、ＷＯ２０１６／１００４０１を参照のこと）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートホスホルアミダイトシントンを、パッセンジャー鎖の４つの連続した位置（２７〜３０）に組み込んだ。パッセンジャー鎖は、４’−オキシメチルホスホナートを含有しなかった。
【０２９６】
２つの相補鎖（ガイド及びパッセンジャー）のそれぞれを１：１のモル比で混合することにより二重鎖を形成して、４つのｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子：試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ：試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ：試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ；及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅを得た。図１Ｂ及び１Ｄを参照のこと。
【０２９７】
対照化合物のヌクレオチドのいずれもが、４’−オキシメチルホスホナートを含んでいなかったことを除いて上記のように、４つの対照ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子（対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ；対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ；対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ；及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅ）も調製した。図１Ａ及び１Ｃを参照のこと。ガイド鎖の５’末端ヌクレオチドの５’−炭素の天然のリン酸（５’−ＰＯ４２−）を用いて、対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ及び対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅを合成したが、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ及び対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅは、ガイド鎖の５’末端ヌクレオチドの５’−炭素に遊離ヒドロキシル基（５’−ＯＨ）を含有していた。
【０２９８】
実施例７：ジエチルホスホナートエステルホスホルアミダイトを使用した、５’末端に４’−オキシメチルホスホナートを含有するオリゴヌクレオチドの合成
ジエチルホスホナートエステルホスホルアミダイトを用いて、実施例６に記載のオリゴヌクレオチド合成手順を繰り返して、さらなるｄｓＲＮＡ阻害剤分子を合成した。より具体的には、以下に示されるホスホルアミダイト１（実施例１）またはホスホルアミダイト２（実施例２）を、オリゴヌクレオチドガイド鎖の５’末端にカップリングさせた。
【化２５】
2019530656.tif 000026
【０２９９】
ホスホルアミダイト１及びホスホルアミダイト２のホスホナート基はそれぞれ、２つのエチル保護された酸素原子を含有する。しかし、使用される脱保護ステップに応じて、エチル基の一方または両方のいずれかが除去されて、ホスホナート基中に１つのエチル保護された酸素原子を有する５’末端ヌクレオチドまたは（エチル保護された酸素原子を全く有しない）完全に脱保護されたホスホナート基がもたらされる。
【０３００】
モノメチル保護された４’−オキシメチルホスホナートオリゴヌクレオチドは、アンモニアを使用して調製することができる。モノエチル保護された５’末端ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドガイド鎖を調製するために、ホスホルアミダイト１または２がカップリングされている固体支持体結合オリゴヌクレオチドを、濃アンモニアの混合物（２８〜３０ｗｔ％）に懸濁し、５５℃で１７時間加熱して、固体支持体からの切断、及びオリゴヌクレオチドから、ホスホナート基の１つのエチル基を含む保護基の除去を完了させた。モノエチル保護されたホスホナート基を有するガイド鎖の５’末端ヌクレオチドが以下に示される。
【化２６】
2019530656.tif 000027
【０３０１】
ヨウ化トリメチルシリル試薬（「ＴＭＳＩ」）を使用して、完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートオリゴヌクレオチドを調製することができる。完全に脱保護された５’末端ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドガイド鎖を調製するために、ホスホルアミダイト１または２がカップリングされていた固体支持体結合オリゴヌクレオチドを、室温のＴＭＳＩ／ピリジンのＣＨ２Ｃｌ２溶液で処理した。３０〜４５分後、反応を、１Ｍの２−メルカプトエタノールのＴＥＡ／ＣＨ３ＣＮ（１：１）溶液でクエンチした。脱保護及び固体支持体からの切断のための標準的なオリゴヌクレオチド手順を、ＴＭＳＩステップの後に適用して、完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートオリゴヌクレオチドガイド鎖を得た。完全に脱保護されたガイド鎖の５’末端ヌクレオチドが以下に示される。
【化２７】
2019530656.tif 000028
【０３０２】
脱保護及び切断の後、粗オリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州コーラルビル）で分析及び精製した。得られたオリゴヌクレオチド溶液を、プール及び濃縮し、水で脱塩した。最終的に、オリゴヌクレオチドを、凍結乾燥して粉末にした。
【０３０３】
次に、上記のプロセスを繰り返して、ヌクレオチド位置２７〜３０のそれぞれに一価のＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドを有する相補的オリゴヌクレオチドパッセンジャー鎖を調製した。クリックケミストリー、または当該技術分野で既知の方法を使用して、ＧａｌＮＡｃリガンドを２’−炭素に結合させるアセタールリンカーを使用して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートホスホルアミダイトシントンを調製した（例えば、ＷＯ２０１６／１００４０１を参照のこと）。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートホスホルアミダイトシントンを、パッセンジャー鎖の４つの連続した位置（２７〜３０）に組み込んだ。パッセンジャー鎖は、４’−オキシメチルホスホナートを含有しなかった。
【０３０４】
２つの相補鎖（ガイド及びパッセンジャー）のそれぞれを１：１のモル比で混合することにより、二重鎖を形成して、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子を得た。各ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、ヌクレオチド位置１に４’−オキシメチルホスホナートを有する２２塩基対ガイド鎖及び４’−オキシメチルホスホナートを有しない３６塩基対パッセンジャー鎖を含有し、パッセンジャー鎖は、それぞれポリエチレングリコール−ＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされるテトラループに４ヌクレオチドを含有する。
【０３０５】
実施例８：カチオン性脂質トランスフェクション剤を使用する、細胞にトランスフェクトした試験化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏポテンシー（ＩＣ５０）
実施例６で調製したｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子を、製造者のプロトコールに従って、９６ウェルプレート中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞にリバーストランスフェクトした。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）は、様々な細胞型にわたってＲＮＡｉ阻害剤分子のトランスフェクション効率を高めるように設計されたカチオン性脂質製剤である。さらに、ＨＥＫ２９３細胞に、遺伝子Ａプラスミドをトランスフェクトした。ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子の最終濃度は、１０００ｐＭ〜０．０１２８ｐＭの範囲であった。ＨＥＫ２９３細胞を、１２０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、プレートを、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、１ウェル当たり３０μｌのＩＳＣＲＩＰＴ（商標）溶解緩衝液（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ヘラクレス）を添加することにより、細胞を溶解した。次に、２２μｌの溶解物を新しいプレートに移し、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して、ｃＤＮＡを調製した。５５℃で、ヒトＳＦＲＳ９−Ｆ５６９（ＨＥＸ）遺伝子に対して正規化された標的配列を用いて、定量ＰＣＲを実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、グラフをプロットし、ＩＣ５０値を算出した。
【０３０６】
図２Ａ〜Ｄは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，メリーランド州ロックビル）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした後の、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ；対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ；試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ；及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す。５’−ＯＨを有する対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆは、約１０．３ｐＭのＩＣ５０を有し、これらは、５’−ＯＨの代わりに５’−ＰＯ４を有する対照化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆの活性（７ｐＭのＩＣ５０）に匹敵した。図２Ａ〜Ｂ。５’−ＰＯ４は、Ａｇｏ２への積み込みにとって重要であると考えられるので、これらの結果は、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆの５’−ＯＨが、トランスフェクトされた細胞のサイトゾル中のキナーゼにより５’−ＰＯ４に変換されたことを示唆する。試験化合物完全脱保護、２’−Ｆは、対照化合物と同様の活性（７．８ｐＭのＩＣ５０）を有し、完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートが効率的なリン酸アナログであることを示した。図２Ｃ。試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆは、本アッセイで、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ（７．８ｐＭのＩＣ５０）より低い活性（２４．８ｐＭのＩＣ５０）を示した。これは、これらのアッセイ条件下で、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆのメチル保護基の非効率的な除去によるものと考えられ得る。図２Ｄ。いかなる理論にも束縛されるものではないが、（完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートを生じる）試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆの４’−オキシメチルホスホナートからのメチル保護基の除去により、より効率的なＡｇｏ２への積み込みが可能になることが考えられる。
【０３０７】
実施例９：カチオン性脂質トランスフェクション剤を使用せずに、サル肝細胞にトランスフェクトされた試験化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏポテンシー
初代サル肝細胞を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手し、製造者のプロトコールに従って、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）ＢＩＯＣＯＡＴ（商標）９６ウェルプレート中で解凍及びプレーティングした。４〜６時間プレーティングした後、培地を、１ウェル当たり９０μｌのＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅインキュベーション培地と交換した。試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆを、１μＭの濃度で開始して１２．８ｐＭまで連続希釈した（５倍低減）。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ，Ｉｎｃ．）などのカチオン性脂質トランスフェクション剤の非存在下で、１０μｌの試験化合物をそれぞれのウェルに加えた。プレートを、３７℃で２４時間インキュベートし、ＲＮＡ標的のノックダウンを試験した。製造者のプロトコールに従って、ＳＶ９６全ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、標的ＲＮＡを抽出及び精製した。大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して、ｃＤＮＡを調製した。ホモサピエンスペプチジルプロリルイソメラーゼＢ  ＰＰＩＢに対して正規化されたＲＮＡ標的を用いて、定量的ＰＣＲを６０℃で行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、グラフをプロットし、ＩＣ５０値を算出した。
【０３０８】
図３Ａ〜Ｂは、カチオン性脂質トランスフェクション剤を用いずにトランスフェクト（「自己送達」）した後の初代サル肝細胞における、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆの活性を示す。これらの条件は、実施例８で使用したトランスフェクションプロトコールよりも、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子でみられるｉｎ  ｖｉｖｏ条件をより密接に表すと考えられる。より具体的には、オリゴヌクレオチドを隔離及び保護するように機能することができるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）などのトランスフェクション剤を用いずに、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子は、細胞のエンドソーム区画の酵素及び条件への直接的な曝露を受け得ることが考えられる。これは、例えば、実施例８に記載の脂質トランスフェクションと比較して、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆのメチル保護基のより効率的な除去をもたらし得る。これと一致して、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆは、自己送達トランスフェクションプロトコールに従って同等の活性（ＩＣ５０  １．２ｎＭ及びＩＣ５０  ３．４ｎＭ）を示した。図３Ａ〜Ｂ。
【０３０９】
実施例１０：カチオン性脂質トランスフェクション剤を使用せずに、ヒト肝細胞にトランスフェクトされた試験化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏポテンシー
凍結保存されたヒト肝細胞（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ノースカロライナ州ダーラム；ロット＃ＨＵＭ４１１１Ｂ）を、製造者の使用説明書に従って、コラーゲンＩでコーティングした９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の肝細胞プレーティング培地（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、解凍及びプレーティングした。４時間後、培地を、無血清維持培地（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ノースカロライナ州ダーラム）と交換した。試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆを、１μＭの濃度で開始して０．１３ｎＭまで連続希釈し；培地に添加し；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ，Ｉｎｃ．）などのカチオン性脂質トランスフェクション剤の非存在下で２４時間インキュベートした。次の日、培地を交換し、細胞をさらに２４時間成長させた。
【０３１０】
インキュベーション期間の後、細胞を溶解し、製造者のプロトコールに従って、ＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、ＲＮＡを調製した。大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して、ｃＤＮＡを調製した。次に、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１及びＩＰＯ８に対して正規化された遺伝子Ａ特異的プライマープローブを使用して、定量ＰＣＲを実施した。遺伝子ＡのｍＲＮＡ発現レベルを、ｍｏｃｋ処理された細胞に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、用量曲線をプロットした。３パラメータモデルを使用して、ＩＣ５０値を推定した。
【０３１１】
図４Ａ〜Ｂは、カチオン性脂質トランスフェクション剤を用いずにトランスフェクトした後の初代ヒト肝細胞における、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ及び試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆの活性を示す。上記のサル肝細胞自己送達実験と同様に、これらの条件は、実施例８のトランスフェクションプロトコールよりも、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子にみられるｉｎ  ｖｉｖｏの条件に、より酷似していると考えられる。実施例９の結果と一致して、両方の試験化合物は、同等の活性を示し（ＩＣ５０  ０．７ｎＭ及びＩＣ５０  ０．９ｎＭ）、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ中のメチル保護基が、これらの条件下でより効率的に除去されて、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆ中のホスホナート基のような完全に脱保護されたホスホナート基を生じ得ることを示唆した。図４Ａ〜Ｂ。
【０３１２】
実施例１１：試験化合物の安定性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４’−オキシメチルホスホナート化合物の安定性を評価するために、３μＭの対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ；対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅ：及び試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅを、１ｍｇ／ｍＬのラット肝臓トリトソーム（Ｓｅｋｉｓｕｉ  Ｘｅｎｏｔｅｃｈ、カンザス州カンザスシティ）中でインキュベートした。ラット肝臓トリトソームは、Ｔｒｉｔｏｎ  ＷＲ１３３９（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌとも呼ばれる）で処置されているラット肝臓細胞由来のリソソームである。続いて、製造者の使用説明書に従って、９６ウェル／１００ｍｇのＣＬＡＲＩＴＹ（登録商標）ＯＴＸ（商標）カートリッジＳＰＥプレート（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カルフォルニア州トーランス）及び９６ウェルプレート真空マニホールドを使用して、２つの対照化合物及び１つの試験化合物をリソソームマトリックスから抽出した。ＴＵＲＢＯＶＡＰ（登録商標）（Ｂｉｏｔａｇｅ、ノースカロライナ州シャーロット）溶媒蒸発ユニットを使用して、溶出液を蒸発させ、水中で再構成し、ＬＣ−ＭＳで分析した。
【０３１３】
ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）オリゴヌクレオチドＢＥＨ  Ｃ１８カラム  １．７μｍ粒径  逆相超高性能液体クロマトグラフィー（２．１×５０ｍｍ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して達成されるクロマトグラフィー分離を備えるＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して、０．４ｍＬ／分で緩衝添加剤を含有する移動相を供給した。カラム温度を７０℃に維持し、使用される試料注入量は、１０または１５μＬであった。負イオンモード及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）条件下で機能するＳＹＮＡＰＴ（登録商標）Ｇ２Ｓ高解像度飛行時間質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して、対照及び試験化合物ならびにそれらの代謝産物を検出した。ＰＲＯＭＡＳＳ  ＤＥＣＯＮＶＯＬＵＴＩＯＮ（商標）ソフトウェア（Ｎｏｖａｔｉａ、ペンシルベニア州ニュータウン）を使用した電荷状態デコンボリューションにより、ゼロ電荷状態分子イオン質量を得た。実験的に決定された質量を、予想される理論上の分子量と比較することにより、対照及び試験化合物ならびにそれらの代謝産物を同定した。
【０３１４】
図５Ａは、ラット肝臓トリトソームにインキュベートした後の対照及び試験化合物のガイド鎖の安定性を示す。トリトソームにおけるホスファターゼは、対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅの５’−ＰＯ４を除去し得る。トリトソームと共にインキュベートした２時間以内に、対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅのガイド鎖を、検出することができず、５’−ＰＯ４の代わりに５’−ＯＨを有する対照化合物のガイド鎖の代謝産物（「Ｍ１」）で置換した。図５Ａ。代謝産物の５’末端ヌクレオチドの化学構造は、対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅのガイド鎖の５’末端ヌクレオチドの化学構造と同じであった。２４時間のインキュベーション期間中、試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅからのホスホナート切断は観察されなかった。試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅは、対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅと比較した場合に、改善された代謝安定性も示した。図５Ａ。これらのデータにより、ガイド鎖の５’末端ヌクレオチドに位置する完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートがホスファターゼ媒介性切断に対して耐性を示すことが示唆される。対照化合物５’−ＰＯ４、２’−ＯＭｅ及び試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅの５’末端ヌクレオチドの対照比較が以下に示される。
【化２８】
2019530656.tif 000029
【０３１５】
関連実験では、１．７μＭの試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆを、１．２Ｕ／ｍＬ（酸ホスファターゼ活性）のラット肝臓トリトソーム（Ｓｅｋｉｓｕｉ  Ｘｅｎｏｔｅｃｈ、カンザス州カンザスシティ）中でインキュベートした。試料を、リソソームマトリックスから抽出し、上記のようなＵＰＬＣにより、試験化合物及び関連代謝産物の存在について分析した。経時的に、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆのガイド鎖のレベルは、徐々に減少し、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆと同じ構造を有する優勢な種を含む代謝産物の混合物により、試料中で交換されて、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆのガイド鎖が、これらの条件下で、試験化合物完全脱保護、２’−Ｆのガイド鎖に変換されたことを示唆した。図５Ｂ。４８時間後、代謝産物の混合物は、試験化合物完全モノメチル保護、２’−Ｆの元の量の約８０％で存在し、ガイド鎖の５’末端ヌクレオチドに位置する完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートが、ホスファターゼ媒介性切断に対して耐性を示すことを示した。図５Ｂ。
【０３１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏで４’−オキシメチルホスホナート化合物の安定性を評価するために、２匹の雄ＣＤ−１マウスに、３ｍｐｋで試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅを投与し、各時点で、肝臓を処理し、逆相イオン対形成超性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＩＰ−ＵＰＬＣ）及び高解像度質量分析（ＨＲＭＳ）で分析した。凍結組織を、Ｃｏｖａｒｉｓ  ＴｉｓｓｕｅＴｕｂｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｔｈｉｃｋ粉砕バッグ（Ｃｏｖａｒｉｓ、マサチューセッツ州ウォーバーン）に移し、液体窒素中で急速凍結し、Ｃｒｙｏｐｒｅｐ粉砕機（Ｃｏｖａｒｉｓ、マサチューセッツ州ウォーバーン）を用いて粉砕した。次に、試料をセーフロックチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ニューヨーク州ホーポージ）に戻し、１ｍＬのＣＬＡＲＩＴＹ（登録商標）ＯＴＸ（商標）溶解ローディングバッファー（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア州トーランス）を添加した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、メリーランド州フレデリック）を使用して、組織を３０Ｈｚで３分間均質化した。次に、試料を、４℃、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。製造者のプロトコールに従って、１００ｍｇの９６ウェルＣｌａｒｉｔｙ（登録商標）ＯＴＸ（商標）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カルフォルニア州トーランス）固相抽出プレートを使用して、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ及びその代謝産物を上清から抽出した。最終溶出液を凍結し、凍結乾燥し、８０μＬの水に再懸濁して、ＲＰ−ＩＰ−ＵＰＬＣ−ＨＲＭＳで分析した。
【０３１７】
ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）オリゴヌクレオチドＢＥＨ  Ｃ１８カラム１．７μｍ粒径  逆相超高性能液体クロマトグラフィー（２．１×５０ｍｍ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して達成されるクロマトグラフィー分離を備えるＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して、０．４ｍＬ／分で緩衝添加剤を含有する移動相を供給した。カラム温度を７０℃に維持し、使用される試料注入量は、４０μＬであった。負イオンモード及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）条件下で作動するＳＹＮＡＰＴ（登録商標）Ｇ２Ｓ高解像度飛行時間質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆ及びその代謝産物のガイド鎖を検出した。ＰＲＯＭＡＳＳ  ＤＥＣＯＮＶＯＬＵＴＩＯＮ（商標）ソフトウェア（Ｎｏｖａｔｉａ、ペンシルベニア州ニュータウン）を使用した電荷状態デコンボリューションにより、ゼロ電荷状態分子イオン質量を得た。実験的に決定された質量を、予想される理論的分子量と比較することにより、試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅ及びそれらの代謝産物のガイド鎖を同定した。試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅのガイド鎖及び関連代謝産物に対するシグナル強度を、ＰＲＯＭＡＳＳ  ＤＥＣＯＮＶＯＬＵＴＩＯＮ（商標）ソフトウェアで算出し、電荷状態デコンボリューションされたシグナル強度から誘導する。
【０３１８】
４８時間までに、試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅのガイド鎖の量は、徐々に約３０％に減少していた。図５Ｃ。試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅのガイド鎖の量が減少するにつれて、試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅと同じ構造を有する代謝物（Ｍ２）は、徐々に増加して、５０時間で約２０％及び１７５時間で３０％超に達し、４’−オキシメチルホスホナートのメチル基が、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒドロキシル基に変換されたことを示唆する。図５Ｃ。
【０３１９】
実施例１２：マウスにおける試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
ＣＤ−１雌マウスに、下記の投薬量レベル及び二本鎖核酸阻害剤分子を使用して、１０μＬ／ｇの容量で皮下投与した。対照群に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。動物を、処置の７２または２４０時間後に死亡させた。肝臓の左中葉を取り出し、１〜４ｍｍのパンチを取り出し、ドライアイス上の９６ウェルプレートに入れた。ＣＦＸ３８４  ＴＯＵＣＨ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ヘラクレス）を使用するｑＰＣＲで、標的ｍＲＮＡの低減を測定した。全ての試料を、ＰＢＳで処置された対照動物で正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州ラホヤ）を使用してプロットした。
【０３２０】
最初の実験では、マウスに、対照化合物５’−ＯＨ、２’−Ｆ；試験化合物５’−ＰＯ４、２’−Ｆ、及び対照化合物完全脱保護、２’−Ｆを１ｍｐｋで皮下投与した。これらの３つの化合物は、図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、ガイド鎖の１位のヌクレオチドを除いて同一であり、対照化合物は、５’−ＯＨまたは５’−ＰＯ４基を有し、試験化合物は、完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートを有する。投与後３日目に、標的遺伝子ＡのｍＲＮＡ発現の阻害を測定した。試験化合物完全脱保護、２’−Ｆは、同じ用量の２つの対照化合物と比較した場合、有意に改善された遺伝子サイレンシング活性を示した。図６Ａ。これらのデータにより、代謝的に安定な４’−オキシメチルホスホナートがＲＮＡｉ阻害剤分子のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を改善することが実証される。
【０３２１】
第２の実験では、ＣＤ−１雌マウスに、対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ及び試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅを１ｍｐｋで皮下投与した。これらの化合物は、図１Ｃ及び１Ｄに示されるように、ガイド鎖の１位のヌクレオチドを除いて同一であり、対照化合物は、５’−ＯＨを有し、試験化合物は、完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートを有する。投与後４日目に、標的遺伝子ＢのｍＲＮＡ発現の阻害を測定した。同じ用量の対照化合物と比較した場合に、試験化合物が有意に改善された遺伝子サイレンシング活性を示す同じ傾向が観察され、４’−オキシメチルホスホナートがｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を改善することが実証された。図６Ｂ。
【０３２２】
第３の実験では、ＣＤ−１雌マウスに、試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆを、０．３、１、及び３ｍｐｋの体重で皮下投与した。投与後１０日目に、標的遺伝子ＡのｍＲＮＡ発現の阻害を測定した。試験化合物モノメチル保護、２’−Ｆは、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現の用量依存的なノックダウンを示した。図７。
【０３２３】
第４の実験では、ＣＤ−１雌マウスに、試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅを、０．３または１ｍｐｋで皮下投与した。これら２つの試験化合物は、ガイド鎖の１位のヌクレオチド上の４’−オキシメチルホスホナートを除いて同一であり；図１Ｄに示されるように、４’−オキシメチルホスホナートの一方は、完全に脱保護され、他方は、単一のメチル基で保護される（すなわち、モノメチル保護される）。投与後３及び１０日目に、標的遺伝子ＢのｍＲＮＡ発現の阻害を測定した。２つの化合物は、用量及び時点の両方で用量依存的なノックダウン及び類似のポテンシーを示した。図８。いかなる理論にも束縛されるものではないが、４’−オキシメチルホスホナートのモノメチルエステルは、ｉｎ  ｖｉｖｏで完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートになり得ると考えられる。
【０３２４】
実施例１３：非ヒト霊長類における試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
第１の実験では、雄及び雌のカニクイザルに、対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅ及び試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅを、体重１キログラム当たり３ミリグラムで投与した。これらの化合物は、図１Ｃ及び１Ｄに示されるように、ガイド鎖の１位のヌクレオチドを除いて同一であり、対照化合物は、５’−ＯＨ基を有し、試験化合物は、完全に脱保護された４’−オキシメチルホスホナートを有する。第２の実験では、雄及び雌のカニクイザルに、試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅ及び試験化合物モノメチル保護、２’−ＯＭｅを、体重１キログラム当たり３ミリグラムで投与した。これら２つの試験化合物は、ガイド鎖の１位のヌクレオチド上の４’−オキシメチルホスホナートを除いて同一であり；図１Ｄに示されるように、４’−オキシメチルホスホナートの一方は、完全に脱保護され、他方は、単一のメチル基で保護される（すなわち、モノメチル保護される）。二本鎖核酸阻害剤分子を、１０ｍｌ／ｋｇの容量で皮下投与した。対照群に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。
【０３２５】
全ての試料収集前に、動物を一晩絶食させた。研究の−７、１４、２８、及び５６日目に、動物に鎮静剤を与え、約２０ｍｇの経皮肝臓生検試料を収集した。組織試料を、秤量して、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）で保存するために半分に分割するか、または−７０℃で保存した。ＣＦＸ３８４  ＴＯＵＣＨ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ヘラクレス）を使用するｑＰＣＲで、標的ｍＲＮＡの低減を測定した。全ての動物の試料を、最初に、それ自体の投与前の対照試料に対し、次に、ＰＢＳで処置された対照動物に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホヤ）を使用してプロットした。
【０３２６】
第１の実験では、試験化合物完全脱保護、２’−ＯＭｅは、１４日目及び２８日目に、対照化合物５’−ＯＨ、２’−ＯＭｅと比較して、より良好なｍＲＮＡ還元活性を示し、４’−オキシメチルホスホナートの存在がカニクイザルにおけるＲＮＡｉ阻害剤分子のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を改善することが実証された。図９Ａ。第２の実験では、試験化合物（完全脱保護及びモノメチル保護）の両方は、全ての時点で同様の活性を示した。図９Ｂ。
【図１Ａ】
2019530656.tif 000040
【図１Ａ−２】
2019530656.tif 000041
【図１Ｂ】
2019530656.tif 000042
【図１Ｂ−２】
2019530656.tif 000043
【図１Ｃ】
2019530656.tif 000044
【図１Ｃ−２】
2019530656.tif 000045
【図１Ｄ】
2019530656.tif 000046
【図１Ｄ−２】
2019530656.tif 000047
【図２−１】
2019530656.tif 000048
【図２−２】
2019530656.tif 000049
【図３】
2019530656.tif 000050
【図４】
2019530656.tif 000051
【図５】
2019530656.tif 000052
【図６】
2019530656.tif 000053
【図７】
2019530656.tif 000054
【図８】
2019530656.tif 000055
【図９】
2019530656.tif 000056
【国際調査報告】
2019530656.tif 000057
2019530656.tif 000058