【手続補正書】
【提出日】平成18年12月20日(2006.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  サンプルを分析して、標的ポリヌクレオチド配列の存在または不存在を測定する方法であって、次の事項：
（ａ）サンプルをハイブリダイズ条件で次のもので処理し、
ｉ）光照射で第２担色部分との複合体を形成できる第１担色部分で標識された５’末端ヌクレオチドを有する第１ポリヌクレオチドプローブ、および
ii）該第２部分で３'末端ヌクレオチドが標識された第２ポリヌクレオチドプローブ、
該第１および第２プローブは該標的配列の相互に特有の領域に結合するのに用いられ、該両部分は両プローブの近接末端にあり、第１および第２部分と検出上相違する該複合体を形成し得るものである、
（ｂ）光刺激を与え複合体形成を引き起こし、
（ｃ）複合体の形成を検出すること
を含み、さらに次の事項：
（ｄ）該第１および第２部分は、互いに相違し、検出可能な複合体としてエクサイプレックスを形成し得ること、
（ｅ）該第１および第２部分は、分析されるサンプルのバルク相よりも大きい疎水性の局在性領域でエクサイプレックス形成関係となること
を特徴とする方法。
【請求項２】  第１および第２部分が下記：
（Ａ）二重鎖構造自体の内で、例えば実際の塩基対を有するか、または有さない代理塩基対パートナーの形態で、
（Ｂ）２本鎖核酸構造の１つの溝内、例えば大溝または小溝に少なくとも部分的に留まり、または、
（Ｃ）ポリホスフェート骨格に沿うかまたは越えて、
エクサイプレックス形成関係になる、請求項１の方法。
【請求項３】  サンプルを分析して、標的ポリヌクレオチド配列の存在または不存在を測定する方法であって、次の事項：
（ａ）サンプルをハイブリダイズ条件で次のもので処理し、
ｉ）光照射で第２担色部分との複合体を形成できる第１担色部分で標識された５’末端ヌクレオチドを有する第１ポリヌクレオチドプローブ、および
ii）該第２部分で３'末端ヌクレオチドが標識された標識された第２ポリヌクレオチドプローブ、
該第１および第２プローブは該標的配列の相互に特有の領域に結合するのに用いられ、該両部分は両プローブの近接末端にあり、第１および第２部分と検出上相違する該複合体を形成し得るものである、
（ｂ）光刺激を与え複合体形成を引き起こし、
（ｃ）複合体の形成を検出すること
を含み、さらに次の事項：
（ｄ）該第１および第２部分は、互いに相違し、検出可能な複合体としてエクサイプレックスを形成し得ること、
（ｅ）該第１および第２部分は下記：
（Ａ）二重鎖自体の内で、例えば実際の塩基対を有するか、または有さない代理塩基対パートナーの形態で、
（Ｂ）２本鎖核酸構造の１つの溝内、例えば大溝または小溝に少なくとも部分的に留まり、または、
（Ｃ）ポリホスフェート骨格に沿うかまたは越えて、
エクサイプレックス形成関係となること
を特徴とする方法。
【請求項４】  エクサイプレックスが、弱い吸引力、例えば、静電力、水素結合、ファンデルワールス力、双極子-双極子相互作用および／または疎水性相互作用により核酸分子に近接して保持される、請求項２または３の方法。
【請求項５】  第１および第２部分が次のように、
（Ｄ）２本鎖核酸の小溝内または近接内で、
（Ｅ）２本鎖核酸の大溝内または近接内で、
（Ｆ）核酸ヘリックスの中心領域の中で、
（Ｇ）ヌクレオチド塩基対の間で、
（Ｈ）ポリホスフェート・アニオン性結合（デオキシ）リボシル骨格に対して、
（Ｉ）オリゴヌクレオチド・プローブの隣接３’および５’末端で、またはその間で形成される窪み、膨らみまたは歪みの内で、
エクサイプレックス形成関係になる、請求項２−４いずれかの方法。
【請求項６】  第１または第２部分が、グアノシン、アデノシンもしくはシチジンのアミノ基、シチジン、ウリジンもしくは２'-デオキシウリジンのＣ５位、グアノシンもしくはアデノシンのＮ７位、またはシチジンもしくはアデノシンのＮ３位に結合している、請求項２−５いずれかの方法。
【請求項７】  増強された疎水性の局在領域を提供するために追加物をサンプル中に組込む、請求項１の方法。
【請求項８】  追加物がホスト-ゲスト複合体におけるホストとして作用し得る化合物であって、この複合体についてゲストがエクサイプレックス形成関係において第１および第２部分が形成される、請求項７の方法。
【請求項９】  ホストがシクロデキストリン、シクロファン、カリキサレン、クラウンエーテル、クリプタンドまたは類似構造物である、請求項８の方法。
【請求項１０】  追加物が表面活性剤、好ましくは４以上の炭素原子の少なくとも１つの鎖を有する４級アンモニウム塩である、請求項９の方法。
【請求項１１】  サンプルを分析して、標的ポリヌクレオチド配列の存在または不存在を測定する方法であって、次の事項：
（ａ）サンプルをハイブリダイズ条件で次のもので処理し：
ｉ）光照射で第２担色部分との複合体を形成できる第１担色部分で標識された５’末端ヌクレオチドを有する第１ポリヌクレオチドプローブ、および
ii）該第２部分で３'末端ヌクレオチドが標識された第２ポリヌクレオチドプローブ、
該第１および第２プローブは該標的配列の相互に特有の領域に結合するのに用いられ、該両部分は両プローブの近接末端にあり、第１および第２部分と検出上相違する該複合体を形成し得るものである、
（ｂ）光刺激を与え複合体形成を引き起こし、
（ｃ）複合体の形成を検出すること
を含み、さらに次の事項：
（ｄ）該第１および第２部分は、互いに相違し、検出可能な複合体としてエクサイプレックスを形成し得ること、
（ｅ）該第１および第２部分がエクサイプレックス形成関係となるときに、エクサイプレックス蛍光信号を発し得る化合物を分析するサンプル中に含むこと、
を特徴とする方法。
【請求項１２】  追加物がホスト-ゲスト複合体におけるホストとして作用し得る化合物であって、この複合体についてゲストがエクサイプレックス形成関係において第１および第２部分から形成される、請求項１１の方法。
【請求項１３】  ホストがシクロデキストリン、シクロファン、カリキサレン、クラウンエーテル、クリプタンドまたは類似化合物である、請求項１２の方法。
【請求項１４】  追加物が表面活性剤である、請求項１１の方法。
【請求項１５】  表面活性剤が４級窒素原子に結合した４以上の炭素原子の少なくとも１つの鎖を有する４級アンモニウム塩である、請求項１４の方法。
【請求項１６】  追加物がポリアニオンを含む、請求項１１の方法。
【請求項１７】  追加物がポリ(ビニルスルフェート)などのポリスルフェート、硫酸コンドロイチンＡ、ＢもしくはＣ、ヘパリン、ポリホスフェート、核酸もしくはＰＮＡおよびペプチドの核酸を含む半合成核酸、ポリカルボキシレート、または少なくとも２つのカルボキシレート、ホスフェートおよびスルフェート基を含有するポリアニオン性ポリマーである、請求項１５の方法。
【請求項１８】  サンプルを分析して、標的ポリヌクレオチド配列の存在または不存在を測定する方法であって、次の事項：
（ａ）サンプルをハイブリダイズ条件で次のもので処理し、
ｉ）光照射で第２担色部分との複合体を形成できる第１担色部分で標識された５’末端ヌクレオチドを有する第１ポリヌクレオチドプローブおよび
ii）該第２部分で３'末端ヌクレオチドが標識された第２ポリヌクレオチドプローブ、
該第１および第２プローブは該標的配列の相互に特有の領域に結合するのに用いられ、該両部分は両プローブの近接末端にあり、第１および第２部分と検出上相違する該複合体を形成し得るものである、
（ｂ）光刺激を与え複合体形成を引き起こし、
（ｃ）複合体の形成を検出すること
を含み、さらに次の事項：
（ｄ）該第１および第２部分は、互いに相違し、検出可能な複合体としてエクサイプレックスを形成し得ること、
（ｅ）磁場を用いてエクサイプレックス放射を高めること
を特徴とする方法。
【請求項１９】  サンプルを分析して、標的ポリヌクレオチド配列の存在または不存在を測定するために、比較的極性の媒体を含むサンプルを分析する方法であって、次の事項：
（ａ）サンプルをハイブリダイズ条件で次のもので処理し、
ｉ）光照射で第２担色部分との複合体を形成できる第１担色部分で標識された５’末端ヌクレオチドを有する第１ポリヌクレオチドプローブおよび
ii）該第２部分で３'末端ヌクレオチドが標識された第２ポリヌクレオチドプローブ、
該第１および第２プローブは該標的配列の相互に特有の領域に結合するのに用いられ、該両部分は両プローブの近接末端にあり、第１および第２部分と検出上相違する該複合体を形成し得るものである、
（ｂ）光刺激を与え複合体形成を引き起こし、
（ｃ）該複合体の形成を検出すること、
を含み、さらに次の事項：
（ｄ）該第１および第２部分は、互いに相違し、検出可能複合体としてエクサイプレックスを形成し得、
（ｅ）この方法が(ｉ）比較的極性の媒体の少なくとも部分的な除去および（ii）低極性の媒体の付加の工程を少なくとも１つ、いずれの順序でも含み、もってエクサイプレックス放射を高めること
を特徴とする方法。
【請求項２０】  第１および第２部分がエクサイプレックス形成関係にあるときに互いに１ｎｍ以内にある、請求項１−１９いずれかの方法。
【請求項２１】  オリゴヌクレオチド・プローブが、核酸鎖に、核酸鎖の少なくとも１塩基により隔てられた隣接３’および５’末端で結合している、請求項１−２０いずれかの方法。
【請求項２２】  オリゴヌクレオチド・プローブの隣接３’および５’末端が核酸鎖の最大３塩基により隔てられている、請求項２１の方法。
【請求項２３】  オリゴヌクレオチド・プローブの各々が少なくとも６塩基を含む、請求項１−２２いずれかの方法。
【請求項２４】  オリゴヌクレオチド・プローブが少なくとも９塩基を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】  検出が時間分解蛍光法による、請求項１−２４いずれかの方法。
【請求項２６】  検出が円偏光二色性分光法による、請求項１−２４いずれかの方法。
【請求項２７】  核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、混合ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリドまたはＰＮＡである、請求項１−２６いずれかの方法。
【請求項２８】  核酸が、タンパク質などの他の分子と組み合されている、請求項２７の方法。
【請求項２９】  核酸が、染色体、クロモチンまたは高度の細胞構造にある、請求項２８の方法。
【請求項３０】  核酸が１本鎖である、請求項１−２６いずれかの方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
核酸のアッセイについて別の提案が US-A-5 332 659 (Kidwell) に開示されている。この技術は、エクサイマー形成成分の十分高い局所的濃度をつくることにより、検出し得るエクサイマーが形成して、核酸をアッセイする。この技術の好ましい実施態様において、センス核酸鎖を、それに可変リンカーにより結合した複数のエクサイマー形成成分（例えば、ピレン）で標識する。このリンカーによって、該成分は互いにランダムに動き、相互作用し得て、エクサイマーの形成に関与する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
アッセイをなすためには、標的核酸を含有する可能性のあるサンプルをセンス鎖でプローブし、２つのエクサイマー形成成分が十分密接した距離にあるときに、エクサイマーの形成に作用し得る電磁気照射で系を刺激する（例えば、レーザーで)。ハイブリダイズされていないセンス鎖において、エクサイマー形成成分のランダム運動から得られるエクサイマー形成について比較的高い蓋然性がある。しかし、センス鎖が標的にハイブリダイズしていると、形成物（すなわち、センス鎖）は、エクサイマー形成成分の相互作用が標的不存在の対照に比べて信号をあまり低下しないような立体配置をとる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
US-A-5 332 659に開示されている別の実施態様において、センス鎖をさらに重く標識することが提案されている。この実施態様では、リンカーの長さを選択し、エクサイマー形成成分の運動自由度を下げ、溶液中の相互作用を少なくする（なくするものでない）。センス鎖は標的鎖に結合することができ、構造再編成を受けてエクサイマー形成のためにエクサイマー形成成分を互いに十分密接せしめる。しかし、もう１度、エクサイマー形成は、リンカーの存在により準備され相互作用し得る十分に高い有効濃度のエクサイマー形成成分に依存する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
エクサイプレックスの検出は、波長検出の手段によるが、さらに好ましくは、時間分解蛍光の使用やこれらの方法の組合せによる。エクサイプレックスは、円偏光二色性スペクトル効果を含む別の分光法でも検出できる。この方法はエクサイマー系について報告されている（参照、例えば、H. Mihara, Y. Tanaka, T. Fujimoto, N. Nishino, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2 (1995) p1133-1140)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
（標的ＤＮＡ）＋（ＯＮ１-Ｒ１）＋（Ｒ２-ＯＮ２）
式中、標的ＤＮＡ＝５'-ＣＧＡＡＴＴＧＴＡＴＧＣ、ＯＮ１＝５'-ＡＡＴＴＣＧ、ＯＮ２＝５'-ＧＣＡＴＧである。オリゴヌクレオチドＯＮ１およびＯＮ２を設計して、１つのヌクレオチド残基のギャップを有する標的ＤＮＡに隣接部位に相補的とする。
【表２】
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式中、Ｒ１は、ＯＮ１の末端５'リン酸基に-ＣＨ２-ＮＨ-リンカー基（Ｌ１）を介して共有結合したピレン基である。Ｒ２は、３'末端アデノシン・ヌクレオチ
ド残基のＣ６アミノ基に-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ２)２-ＮＨ-リンカー基（Ｌ２）を介して共有結合したジメチルアミノアニリン基である。