(57)【要約】本発明は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）を有する患者において下方調節された遺伝子転写産物の固有のパネルを開示する。転写産物の一部は、ＣＡＤ患者における調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の下方調節に関係する。患者血液サンプルにおいてＣＡＤを検出するための方法が提供される。【選択図】図３
2019528706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を判定するための方法であって、前記方法は、
対象から血液サンプルを獲得すること；
前記血液サンプルからＲＮＡを抽出すること；
前記抽出されたＲＮＡの少なくとも一部においてＲＮＡレベルを定量すること；
前記抽出されたＲＮＡにおいて複数種のＲＮＡ転写産物に対する発現レベルを算出すること；
前記複数種のＴＲＡＣ  ＲＮＡ転写産物に対する前記発現レベルと、同じＲＮＡ転写産物に対する対照発現レベルとを比較すること；及び
前記抽出されたＲＮＡにおける前記複数種のＴＲＡＣ  ＲＮＡ転写産物に対する前記発現レベルが、集合的に、前記同じＲＮＡ転写産物に対する前記対照発現レベルと有意に異なるかどうかを判定することであって、発現レベルの有意な差は、前記対象が冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有することを示す、前記判定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記血液サンプルは全血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出されたＲＮＡの少なくとも前記一部を定量する前に、前記抽出されたＲＮＡからリボソームＲＮＡを枯渇させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抽出されたＲＮＡからリボソームＲＮＡを枯渇させることは、リボソームＲＮＡに特異的であるプローブで前記抽出されたＲＮＡを処理することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数種のＲＮＡ転写産物は、ＦＯＸＰ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＥＴＳ１、及びＲＵＮＸ１を含み、発現レベルの有意な差がある場合、ＦＯＸＰ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＥＴＳ１、及びＲＵＮＸ１のそれぞれに対する発現レベルは下方調節されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
発現レベルの有意な差がある場合、ＦＯＸＰ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＥＴＳ１、及びＲＵＮＸ１のそれぞれに対する前記発現レベルは、１．５倍〜２倍下方調節されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数種のＲＮＡ転写産物は、ＤＧＫＡ、ＤＬＧ１、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＳＭＹＤ３、ＴＣＦ３、及びＴＲＩＭ２８を含み、発現レベルの有意な差がある場合、ＤＧＫ、ＤＬＧ１、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＳＭＹＤ３、ＴＣＦ３、及びＴＲＩＭ２８のそれぞれに対する発現レベルは下方調節されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
発現レベルの有意な差がある場合、ＤＧＫＡ、ＤＬＧ１、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＳＭＹＤ３、ＴＣＦ３、及びＴＲＩＭ２８のそれぞれに対する前記発現レベルは、１．５倍〜２倍下方調節されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象から前記血液サンプルを獲得する前に、冠動脈疾患の１つまたは複数のリスク要因を有すると同定されている対象を選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記リスク要因は、高血圧、加齢、上昇したコレステロール、及び冠動脈疾患の家族歴からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、８０％を上回る陽性予測値で冠動脈疾患を同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は、９０％を上回る陽性予測値で冠動脈疾患を同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有するという前記判定に基づき、前記対象を、スタチン、アスピリン、ＡＣＥ阻害剤、利尿剤、グルコース制御医薬、またはベータ遮断薬のうちの１種または複数種で治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有するという前記判定に基づき、前記対象を冠動脈造影に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記対照発現レベルは、冠動脈疾患を有しない個体からの経験的発現レベルデータに基づいて判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
冠動脈疾患を有しない前記個体は、冠動脈カテーテル造影によって冠動脈疾患を有しないと同定されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を判定するための方法であって、前記方法は、
対象の血液サンプルから抽出されたＲＮＡを獲得すること；前記抽出されたＲＮＡにおいて複数種のバイオマーカーに対する発現レベルを判定すること；前記抽出されたＲＮＡにおける前記複数種のバイオマーカーに対する前記発現レベルと、対照からの同じバイオマーカーの発現レベルとを比較すること；及び
前記抽出されたＲＮＡにおける前記複数種のバイオマーカーに対する前記発現レベルが、集合的に、前記対照における前記同じバイオマーカーに対する前記発現レベルと有意に異なるかどうかを判定すること
を含み、前記複数種のバイオマーカーの少なくとも２０％は、ＡＭＬ１、ＣＤ４、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＤＧＫＡ、ＤＬＧ１、ＥＴＳ１、ＦＯＸＰ３、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＳＭＹＤ３、ＲＵＮＸ１、ＴＣＦ３、ＴＲＩＭ２８、及びＺＡＰ７０からなる群より選択される、前記方法。
【請求項１９】
前記複数種のバイオマーカーに対する前記発現レベルが、前記対照における前記同じバイオマーカーに対する前記発現レベルと有意に異なる場合、冠動脈カテーテル造影を実施することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオマーカーの８０％を上回る割合が、個々に、１．５倍を上回って差異的に下方調節されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、９０％を上回る陽性予測値で冠動脈疾患を同定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有するという前記判定に基づき、前記対象を、スタチン、アスピリン、ＡＣＥ阻害剤、利尿剤、またはベータ遮断薬のうちの１種または複数種で治療することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象はヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
対象由来のＲＮＡサンプルを解析する方法であって、前記方法は、
前記ＲＮＡサンプルにおいて複数種のバイオマーカーに対する発現レベルを判定すること
を含み、前記複数種のバイオマーカーは、冠動脈疾患を有する個体におけるそれに対する発現レベルが、冠動脈疾患を有しない個体における発現レベルと異なるバイオマーカーを含み；
対照と比較した、前記複数種のバイオマーカーの発現の前記レベルは、前記対象が冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有することを示す、前記方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡサンプルは、全血から単離されたＲＮＡサンプルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対照は、冠動脈疾患を有しない個体における前記複数種のバイオマーカーの発現レベルを含むデータベースである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数種のバイオマーカーは表８に列挙される転写産物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数種のバイオマーカーは表７の転写産物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数種のバイオマーカーは表６の転写産物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数種のバイオマーカーは表５の転写産物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数種のバイオマーカーは表４の転写産物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数種のバイオマーカーは表３の転写産物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数種のバイオマーカーは表２の転写産物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数種のバイオマーカーは表６１の転写産物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数種のバイオマーカーは、表３〜１０に列挙されるバイオマーカーのいずれかの転写産物の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／または９５％を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有すると判定される場合、前記複数種のバイオマーカーの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／または９５％は少なくとも１．５倍下方調節されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数種のバイオマーカーの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／または９５％は、表３〜１０に列挙されるバイオマーカーのいずれかから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
冠動脈疾患の１つまたは複数のリスク要因を有すると同定されている対象を治療する方法であって、前記方法は、
請求項２４に記載の方法を用いてＲＮＡサンプルを解析すること；及び
前記対象が、冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有するという判定に基づいて、前記対象に医薬を投与することまたは医学的処置を行うこと
を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記リスク要因は、高血圧、加齢、上昇したコレステロール、及び冠動脈疾患の家族歴からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を判定するための方法であって、前記方法は、
対象から血液サンプルを獲得すること；
前記血液サンプルからタンパク質を抽出すること；
前記抽出されたタンパク質の少なくとも一部においてタンパク質レベルを定量すること；
前記抽出されたタンパク質において複数種のタンパク質の濃度を算出すること；
前記複数種のタンパク質に対する発現レベルと、同じタンパク質に対する対照レベルとを比較すること；及び
前記抽出されたタンパク質サンプルにおける前記複数種のタンパク質に対する前記レベルが、集合的に、前記同じタンパク質に対する前記対照レベルと有意に異なるかどうかを判定することであって、タンパク質レベルの有意な差は、前記対象が冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有することを示す、前記判定すること
を含む、前記方法。
【請求項４１】
前記複数種のタンパク質は、ＡＭＬ１、ＣＤ４、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＤＧＫＡ、ＤＬＧ１、ＥＴＳ１、ＦＯＸＰ３、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＳＭＹＤ３、ＲＵＮＸ１、ＴＣＦ３、ＴＲＩＭ２８、及びＺＡＰ７０を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象由来のタンパク質サンプルを解析する方法であって、前記方法は、
前記タンパク質サンプルにおいて複数種のバイオマーカーに対する発現レベルを判定すること
を含み、前記複数種のバイオマーカーは、冠動脈疾患を有する個体におけるそれに対する発現レベルが、冠動脈疾患を有しない個体における発現レベルと異なるバイオマーカーを含み；
対照と比較した、前記複数種のバイオマーカーの発現の前記レベルは、前記対象が冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有することを示す、前記方法。
【請求項４３】
前記複数種のバイオマーカーは、表３〜１０に列挙されるバイオマーカーのいずれかによってコードされるタンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／または９５％を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有すると判定される場合、前記複数種のバイオマーカーの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／または９５％は少なくとも１．５倍下方調節されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記複数種のバイオマーカーの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／または９５％は、表３〜１０に列挙されるバイオマーカーのいずれかから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
冠動脈疾患の１つまたは複数のリスク要因を有すると同定されている対象を治療する方法であって、前記方法は、
請求項４２に記載の方法を用いてタンパク質サンプルを解析すること；及び
前記対象が、冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有するという判定に基づいて、前記対象に医薬を投与することまたは医学的処置を行うこと
を含む、前記方法。
【請求項４７】
前記リスク要因は、高血圧、加齢、上昇したコレステロール、及び冠動脈疾患の家族歴からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月１日に出願された米国仮出願第６２／３８２，６６８号の利益を主張するものであり、その全開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、患者における冠動脈疾患（ＣＡＤ）を診断することに関し、方法は、患者から採取された血液サンプルを解析すること、及びＣＡＤを示すバイオマーカーのパネルのレベルを判定することを含む。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
毎年百万件を上回る数の心臓発作があり、３９秒ごとに約１人、毎日２，２００人のアメリカ人が心臓疾患で死亡する。冠動脈疾患（ＣＡＤ）の外的症状は、典型的に左腕に放散する胸痛、及び労作時の息切れ（呼吸困難）である。しかしながら、胸痛及び呼吸困難のみでは、特に特異的な前兆ではない。胸痛を呈する患者の前向き分析において、最終的にほとんどの症例は、骨格筋疾患（２０％）、消化管逆流症（ＧＥＲＤ）（１３％）であると判定され、一方でＣＡＤは症例の１１％において診断され、残りの症例は肺性、神経学的、または特発性のいずれかであった。加齢、男性という性別、上昇したコレステロール、喫煙、及び高血圧のフラミンガムリスク要因は、長期的リスクの非常に優れた予測因子である（３０歳リスク、Ｃ統計量＝０．８０３）が、それらは、人がＣＡＤを有するか否かを判定する際に実際の臨床現場において極めて精度が低い（Ｃ統計量＝０．６６７、０．５が偶然である）。ゆえに、ＣＡＤの診断の向上に対する多大な必要性がある。年間＞１百万件の心臓カテーテル術から、６２２，０００件はステント留置などの介入という結果になる。負荷心電図など、ＣＡＤを示唆する明らかな症状及び他の臨床検査にもかかわらず、血管造影図の２０〜４０％はいかなる閉塞動脈も検出しない。３９８，９７８人の患者を網羅する米国心臓病学会の登録は、２０％未満の狭窄を有する血管造影図の３９．２％を同定した。ゆえに、ＣＡＤの血液検査は、１年あたり４００，０００件もの不必要なカテーテル術を回避する潜在性を有するであろう。以前、本発明者らは、血液の発現プロファイリングを用いて、どの患者がベアメタルステントで再閉塞すると考えられ、ゆえに薬剤溶出性ステントから恩恵を受ける可能性があるかを診断し得ることを示した。ゆえに、ＲＮＡプロファイリングを冠動脈疾患自体の診断にまで広げることは実行可能でもあり重要でもある。
【０００４】
マイクロアレイを用いたいくつかの先行研究は、ＣＡＤと関連した、血中におけるＲＮＡシグネチャーが存在することを示唆した。しかしながら、正確にどの転写産物が変調されるかに関するこれらの研究の間での合意はかなり低い。そのような不一致は、いくつかの説明ができるであろうが、おそらく、マイクロアレイにおける真のシグナルを圧倒し得、ゆえに大きさの小さい真の変化を潜在的にマスクし得る、グロビンなどの非常に豊富なシグナルによって作り出されたノイズにより生じる。ゆえに、本発明者らは、診断用転写産物を同定するのを助ける、より進歩した単一分子ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）方法論を採用した。全血ＲＮＡのＲＮＡｓｅｑを用いて、本発明者らは、ＣＡＤの相関要因としての調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞機能障害の潜在的役割と一致する転写産物のサブセットを同定する。
【０００５】
発明の簡単な説明
本発明は、冠動脈カテーテル術を受ける患者の最高４０％までが、意味のある冠動脈遮断を実際には有しないという事実を利用する。ＣＡＤを有する患者対ＣＡＤを有しない者のｍＲＮＡ発現パターンを比較することによって、ＣＡＤと関連した転写産物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＡＤ）（ＴＲＡＣ）を同定した。このモデルの長所は、カテーテル術の前に血液が採られ得、血管造影の結果が数時間以内に分かることであり、それにより、トランスクリプトームに基づく検査を設計するための理想的な学習環境が提供される。冠動脈造影図が主治医によってデジタル的に解釈された後、患者を、≦２０％の狭窄（低ＣＡＤ）、任意の血管の＞２０％であるが＜７０％の狭窄（中ＣＡＤ）、及び任意の動脈の≧７０％の狭窄（ＣＡＤ）という３つの群に分けた。
【０００６】
臨床パラメーター：胸痛、労作性呼吸困難、またはＣＡＤを示唆する他の症状についての非緊急の非ＳＴ上昇型心筋梗塞（非ＳＴＥＭＩ）の訴えを呈する患者から、ＩＲＢ承認プロトコールの下での本研究への参加に対する同意を得た。本質的にすべての対象が、彼らの血液、ＤＮＡ／ＲＮＡ、及びＤＮＡ／ＲＮＡ配列データをバイオバンクに預けることをオプトインすることに同意した。心臓カテーテル術を許可された患者は、鎮静前に静脈穿刺によって３本のＴｅｍｐｕｓ血中ＲＮＡチューブ（各３ｍｌ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を収集された。さらなるチューブが、血漿（ＥＤＴＡ）及びバフィーコート（ＣＰＴ）のために収集された。静脈穿刺の後、これらの研究は純粋に観察的であり、決して臨床治療を変更しなかった。全血球算定（ＣＢＣ）を含めたすべての関連臨床データを、ゲノム研究との比較のために入手した。
【０００７】
心臓カテーテル術の前に、心臓の病歴を医療専門家によって実施して、認められているガイドラインによって規定されるＣＡＤリスク要因を判定した。高血圧を、≧１４０／９０ｍｍＨｇの血圧及び／または抗高血圧医薬による治療の病歴として規定した。糖尿病を、≧１２６ｍｇ／ｄｌの空腹時血糖及び／またはインスリンもしくは経口血糖降下剤の使用によって規定した。脂質異常症を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩガイドラインに従ってまたは脂質低下医薬による治療によって規定した。現在の喫煙状態を、呈示の３ヶ月以内の能動喫煙によって規定した。ＣＡＤの家族歴を、第一度近親者におけるＭＩまたは心臓死として規定した。
【０００８】
胸痛を、Ｍｉｎ，ｅｔ  ａｌ．［（Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ，１２８（８）：８７１（２０１５）］によって記載される狭心症の標準的基準に従って分類した。典型的狭心症は、労作時の胸骨下、顎、及び／または腕の痛みを含み、それは、安静及び／またはニトログリセリンの使用から１５分以内に解消する。非定型狭心症は、これらの特徴の２つを伴う。非狭心症胸痛を有する患者は、これらの症状の１つまたはそれ未満を経験する。胸痛を有しない呼吸困難患者は、典型的狭心症として分類される。
【０００９】
これらの臨床パラメーターから、年齢、性別、高血圧、糖尿病、症状タイプ（典型的／非定型胸痛）、家族歴、及び喫煙状態から累算されたポイントを順序（ｏｒｄｉｎａｌ）リスクモデルと比較してＣＡＤの可能性を予測するＭｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法に従って、リスクを採点した。
【００１０】
トランスクリプトームプロファイリング：Ｔｅｍｐｕｓ血液単離カラムを用いて、凍結されたＴｅｍｐｕｓ保存血液サンプルからＲＮＡを精製した。積極的な溶液中でのＤＮＡｓｅ処理（Ｔｕｒｂｏ（商標）ＤＮＡｓｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の後、２．５ｍｌの血液からの典型的なＲＮＡ収量は平均すると約５μｇになり、＞８のＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ完全性スコアを有した（１０が最大である）。ＤＮＡｓｅ処理された全ＲＮＡから、ＲｉｂｏＺｅｒｏ（Ａｍｂｉｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させ、約５００ｎｇのｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡを残した。ＲＮＡシーケンシング：ＲＮＡｓｅｑに関して、１００ｎｇのｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡをフラグメント化し、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅシーケンサー（ＳｅｑＬＬ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）で解析した。次いで、３８ｂｐの平均長で典型的に４千万個の生の読み取りを、Ｈｅｌｉｓｐｈｅｒｅソフトウェアを用いてトランスクリプトームまたはゲノムとコンピューターにより並べた。各転写産物と並ぶ読み取りの数をカウントし、約７７Ｋの公知の転写産物アイソフォームに関するデジタル遺伝子発現（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＤＧＥ）を作り出した（ＨＧ１９  ｂｕｉｌｄ）。次いで、生の読み取りカウントを、長い転写産物が短い転写産物よりも高発現したように見えないように転写産物のサイズによって、及びサンプルあたりの全読み取りの数によって調整して、「百万個のマッピングされた読み取りあたりの、１キロベースの転写産物あたりの読み取り（Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）」（ＲＰＫＭ）を生じさせる。ゆえに、ＲＰＫＭは、読み取りの種々の絶対数を有するサンプル間の発現レベルを補正する。本実施例は、ＲＮＡシーケンシングに関してＳｅｑＬＬ／Ｈｅｌｉｃｏｓ単一分子シーケンシング、及び定量に関してｄｄＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に基づくものの、限定されることなくダイレクトＲＮＡシーケンシング法、増幅に基づく方法、及びハイブリダイゼーション法を含む、ＲＮＡ転写産物の絶対及び相対レベルを判定するための他の方法が当業者に周知である。ＲＰＫＭレベルを、さらなる正規化なしでＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ１３（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に移行して、群間で異なる転写産物を同定した（ＴＲＡＣ）。
【００１１】
血中ＲＮＡ保存／単離法の比較：ＴＲＡＣが、採用された血中ＲＮＡ保存法のタイプによって影響を受けるかどうかを判定するために、３本のＴｅｍｐｕｓ及び３本のＰａｘｇｅｎｅチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ  ＧｍｂＨ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を対象から同時に採取し、次いでメーカーのプロトコールに従ってＲＮＡを精製した。解析前に、Ｐａｘｇｅｎｅチューブを、メーカーによって指定されるようにカラム上でのＤＮＡｓｅ処理に供し、一方でＴｅｍｐｕｓ  ＲＮＡをＴｕｒｂｏＤＮＡｓｅで処理した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２６０／２８０によって定量化された等量のＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（ＲＮＡｓｅＨ＋）（ＢｉｏＲａｄ）を用いてランダムヘキサマーにより逆転写し、次いで、一連の「不変の」ＰＣＲ標的（１８Ｓリボソーム、ベータ−アクチン、ＧＡＰＤＨ）、主としてリンパ球に関係する標的（ＳｐｉＢ、ＣＤ８１、ＦｏｘＰ３）、または主として好中球に関係する選択された標的（ＡＬＰＬ、ＤＥＦＡ１、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ８、ＮＦｋＢ、ｃＭｙｃ）を用いて解析した。プールされた標準希釈物からのｃＤＮＡを包含し、ＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光色素を用いたＢｉｏＲａｄ  ＱＸ２００リアルタイムシステムでのドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって二つ組で解析した。各転写産物の存在量を、指定される、そのサンプルに対する１種または複数種の「不変の」転写産物と比べて表現した。
【００１２】
本バイオマーカーは、現在の医療業務においていくつかの有用な適用を有する。一部の実施形態には以下が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００１３】
１つの実施形態において、本明細書において開示される予測パネル及び方法は、冠動脈造影の必要性に取って代わり得るまたは必要性を低下させ得る。好ましい実施形態において、ＲＮＡバイオマーカーまたはそれらのタンパク質産物を査定して、ＣＡＤの１つまたは複数の症状を有する患者が冠動脈造影による介入検査を必要とし得る可能性を判定する。血管造影は、浅い鎮静、冠動脈床へのカテーテルの導入、及び造影剤の注射を要するため、合併症の有限かつ公知のリスク及び多額の費用が存在し、それは、本発明によって判定されるように、患者がＣＡＤのリスクが低い場合には回避され得る。
【００１４】
１つの実施形態において、本明細書において開示される予測パネル及び方法は、磁気共鳴（ＭＲ）血管造影またはコンピューター断層撮影（ＣＴ）血管造影などの冠動脈画像検査の必要性を示し得る。冠動脈イメージング機器が利用可能である状況において、本明細書に記載されるＴＲＡＣを用いて、ＭＲ血管造影またはＣＴ血管造影のような比較的非侵襲的な検査が正当化されるかどうか予測し得る。血管造影よりも侵襲性が低いものの、ＣＴは、患者へのいくらかの放射線曝露を伴う。ＭＲ及びＣＴ血管造影の両方とも、悪影響を有し得るトレーサー化合物の使用を伴い得る。さらには、機器の高いコストに起因して、ＭＲ及びＣＴは米国及び世界中の多くの非都市的地域において利用可能でない。
【００１５】
別の実施形態において、本明細書において開示される予測パネル及び方法は、医学的介入の必要性を示し得る。好ましい実施形態において、ＴＲＡＣバイオマーカーは、日常的な医療の下で対象に適用され、ＣＡＤの上昇したリスクがあると見なされ、ゆえに心臓発作、脳卒中、及び動脈瘤などの厄介な事象を起こしやすい。この実施形態において、高血圧、家族歴、加齢、及び／または上昇したコレステロールなど、ＣＡＤの１つまたは複数の公知のリスク要因を有する対象は、ＴＲＡＣ検査のために血液を採取され、結果を用いて医学的介入の必要性を判定する。早期ＣＡＤに対してよく用いられる薬物介入には、コレステロールを下げるスタチン、血管炎症及び血小板反応性を低下させる低用量アスピリン、ならびにＡＣＥ阻害剤、利尿剤、またはベータ遮断薬などの抗高血圧薬の使用が含まれる。ある場合には、食事または薬物による血糖レベルのより厳重な制御が重要であり得る。よく見られる生活様式の変化には、体重減少、禁煙、食事の変化、ストレスの低下、及び運動の増加が含まれる。
【００１６】
さらに別の実施形態において、ＴＲＡＣバイオマーカーのパネルは、患者の日常的な身体診察において用いられ、彼らのかかりつけ医に提示される。そのような実施形態において、ＴＲＡＣのパネルを用いて、早期ＣＡＤを有するが彼らの疾患進行に気づいていない患者を同定し得る。実際、ＣＡＤ関連事象による全死亡のほぼ半分は、彼らがＣＡＤを有することに一見したところ気づいていなかった人におけるものである。いったん同定されると、患者のリスクは、上で記載される薬物及び生活様式の介入によって軽減され得る。
【００１７】
１つの実施形態において、表１〜８に列挙されるものから選択される複数種の転写産物を含むＴＲＡＣバイオマーカーは、対象が、冠動脈疾患を有するまたは発症する増加した可能性を有することを示す。
【００１８】
好ましい実施形態において、ＴＲＡＣバイオマーカーは、ＡＭＬ１、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＤＧＫＡ、ＤＬＧ１、ＥＴＳ１、ＦＯＸＰ３、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＹＤ３、ＴＣＦ３、ＴＲＩＭ２８、及びＺＡＰ７０を含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】全血中のリンパ球数（Ｘ軸）との関連での、患者あたりのＲＮＡ収量（Ｙ軸）のプロットである。
【図２】全転写産物（ライトグレーの点）と比べた、表示される差異的に発現した転写産物（ダークグレーの点）とのＲＮＡｓｅｑ線形性のプロットである。
【図３】３つの群のそれぞれにおけるＣＡＤのレベル（Ｘ軸）との関連での、選択Ｔｒｅｇマーカーレベル（Ｙ軸）のプロットである。
【図４】ＣＡＤの臨床予測因子対ＲＮＡ予測因子の比較である。パネルＡ（上の左）は、年齢（数十年／１０）、性別（男性％）、症状タイプ（典型的／非定型）、糖尿病（％）、高血圧（ＨＴＮ、％）、ＣＡＤの家族歴（％）、及び現在の喫煙（％）を示した、各群に関してプロットされたＣＡＤの従来的臨床予測因子を示している。累積ＣＡＤリスクスコアは、Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法に基づいて各患者に対して算出され、グラフ目的のために１０で割られている。累積リスクスコアとＣＡＤの間の関係性を、受信者操作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）及び混同行列によって算出して、方法の精度を同定した（下の左）。パネルＢ（上の右）は、ＣＡＤ群によるＲＰＫＭとして表現された、それらの遺伝子記号としての７種のＲＮＡ転写産物（すなわち、ＤＧＫＡ、ＤＬＧ１等）の性能を示している。高発現した転写産物が過剰に表されるのを防ぐために、各転写産物を群全体におけるその発現の平均に対する比として表現して、累積スコアが計算された。グラフ目的のために、ＴＲＩＭ２８及び累積スコアは、／１０である。下の右のパネルにおいて、累積ＴＲＡＣスコア（陽性ＲＯＣを創出するための、一定のＴＲＡＣ）と血管造影により確認されたＣＡＤの間の関係性が、各群における４８人の患者に対する臨床モデルと同様に、ＲＯＣによって解析されている。
【図５】ＴＲＡＣ及び非関連転写産物の発現に対する、ＲＮＡ収集／安定剤溶液の影響を図解している。同じドナー（ｎ＝３）から、収集及び安定化の２つの異なる方法によって、全血ＲＮＡを調製した。主として陽イオン性界面活性剤ＣＰＣに基づくＰａｘＧｅｎｅ、または強力なグアニジン変性剤に基づくＴｅｍｐｕｓによって、ＲＮＡを調製した。同一分量のＤＮＡｓｅ処理されたＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いて逆転写し、次いでドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ、ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量的に増幅した。示された転写産物のレベル（Ｙ軸）は、＞２０Ｋのドロップレットのポアソン分布（＋ｓｅｍ）から算出された絶対分量に基づく、Ｔｅｍｐｕｓ対Ｐａｘｇｅｎｅにおける転写産物存在量の比（Ｘ軸）である。
【実施例】
【００２０】
発明の詳細な説明
実施例１．中間解析及びトランスクリプトームアライメントからのバイオマーカーの説明
臨床パラメーター：合計１１３人の患者が研究に参加し、１人の患者は、心不全についての検出されない除外基準により同意後に除外された。ゆえに、１１２人の患者が解析に利用可能であり、ＲＮＡｓｅｑは９６人の患者に対して上手く完了した。以下の実施例は、最初の４８人の患者のＲＮＡｓｅｑ結果、ならびにコホート全体の総合的臨床パラメーターを解析して、ＲＮＡｓｅｑの時間及び費用が残りの患者に対して正当化されるかどうかを判定した。
【００２１】
臨床予測モデル：累算された臨床リスク要因は、患者あたり５〜１２ポイントの範囲をもたらした。血管造影図での７０％の狭窄に基づくＣＡＤの真陽性と比較して、臨床リスク予測間で、ＪＲＯＣＦＩＴを用いて受信者操作曲線（ＲＯＣ）を計算した。フィットしたＲＯＣ曲線は、全１１２人の患者に対して６０．７％の精度、５７．７％の感度、及び６１．６％の特異度とともにＣ＝０．６６３、ならびに９６個のＲＮＡｓｅｑ＋ポイントに対してＸ、Ｙ、Ｚの同程度の値をもたらした。これらの値は、おそらく狭窄の閾値の差（そこでは５０％対本明細書では７０％）に起因して、このモデルに対する公開された値（Ｃ＝０．７１〜０．７７）よりもわずかに低く、Ｄｉａｍｏｎｄ−Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ予測モデル（Ｃ＝０．６４）と同等である。
【００２２】
解析パラメーター：患者あたり及び群あたりのＲＮＡの収量及び読み取りの数は、体系的に変動しなかった。ＲＮＡシーケンシングにおける様々な技術的品質管理ステップで１６人のさらなる患者が失敗し、ＲＮＡｓｅｑは９６人の患者に対して完了した。ほとんどの失敗は、３つの主要なステップ：ＲＮＡ精製もしくはリボソーム枯渇からの低収量、非効率なｃＤＮＡ合成、またはＲＮＡｓｅｑからの読み取りの低収量において生じた。リボ枯渇中の高損失（＞９０％）が理由で、ＲＮＡｓｅｑ過程を繰り返すのに必ずしも充分なＲＮＡが存在するわけではなかった。
【００２３】
ＲＮＡ収量の変動の源。ＰａｘｇｅｎｅまたはＴｅｍｐｕｓ  ＲＮＡ保存チューブのいずれかを用いて収集された患者血液サンプルは、ＲＮＡ収量の驚くほど大きな変動を示し、Ｔｅｍｐｕｓは概してより高い収量を生じさせた。本Ｔｅｍｐｕｓ保存サンプルにおいて、総核酸収量（ＤＮＡｓｅ処理前）は、（０．６〜３５μｇ／３ｍｌ全血、平均＝１０．６μｇ）に及んだ。ＲＮＡ収量と任意の単一血球数の間の相関はかなり弱く、絶対リンパ球数と最も強い相関があった（Ｎ＝１１２でｒ＝０．５５（Ｒ２＝０．３１））（図１）。１つの外れ値がこの相関を推進しているように見えるものの、それは、実際には相関に対して小さな影響しか有しない（ｒ＝０．４５  ｗ／ｏ）。これは、白血球数がＲＮＡ収量の変動性のほんの約３０％しか説明しないことを実証し、患者間でＲＮＡの回収に重要な差が存在し得ることを示唆する。
【００２４】
中間点におけるＴＲＡＣの初回同定：図２に示されるように、データのいかなる人為的な正規化もなしで、ＲＰＫＭにおいて、２５ｌｏｇ２の桁の大きさを上回る、ＲＮＡレベルの素晴らしい線形定量能がある。ＴＲＡＣを同定するために、患者を、低（＜２０％の狭窄）、中（２０〜６９％）、及び高ＣＡＤ（＞７０％）群に分けた。差異的に発現した転写産物を同定するために、本発明者らは、低対高ＣＡＤ群を比較し、＞１．４倍の変化及びｔ検定ｐ＜０．０５非補正を要し、図２においてダークグレーで強調された２３８種の転写産物がもたらされた。この組み合わせの倍率変化／ｔ検定ストラテジーは、真の差を同定する信頼性の高い手法として、スパイクされたサンプルを用いた大規模な多施設対照研究において確立されている。２３８種の転写産物リストが表１に提示されており、当技術分野においてよく見られるいくつかの異なる記述子、とりわけカリフォルニア大学サンタクルーズ校によって維持されるＵＣＳＣ  ＩＤ（すなわち、ｕｃ００２ｒｔｍ．２）、及びＵＳ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によって維持されるＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ（すなわち、ＮＭ＿００１１１３４９４）、ならびにコンセンサス遺伝子記号及び遺伝子説明を用いて、関連転写産物が同定されている。
【００２５】
分類アルゴリズム：ＡＮＯＶＡを用いて、本発明者らは、３つすべての群を再解析し、８４種の差異的に発現した転写産物を同定した（表２）。Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ１３ソフトウェアを用いて、１００％の感度及び特異度であるサポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを築いた。同じサンプルに適用された一個抜き交差検証（Ｌｅａｖｅ  Ｏｎｅ  Ｏｕｔ  Ｃｒｏｓｓ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）（ＬＯＯＣＶ）は、ＣＡＤを診断することにおいて、モデルが８７．５％の精度であることを見い出した（３３．３％がランダムである）。比較目的のために、同等のＳＶＭを築くＣａｒｄｉｏＤｘ転写産物（Ｅｌａｓｈｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用いることにより、ほんの３６．７％の精度（ＣＡＤ３７．５％、低４５．１％、中１０％、３３％＝ランダム）がもたらされた。しかしながら、ＣａｒｄｉｏＤｘ転写産物のこのＳＶＭは、それらが採用したアルゴリズムを含まない。参照のために、性別によって４８人の患者を分類することにより、主にＸ及びＹ染色体由来の３４種の転写産物が同定され、１００％の精度であるＳＶＭ予測モデルがもたらされた。
【００２６】
実施例２．９６人の患者からのＲＮＡｓｅｑデータのトランスクリプトームアライメントからのＲＮＡバイオマーカーの説明
１１２人の患者コホート全体を、Ｈｅｌｉｃｏｓ（今はＳｅｑＬＬ）プラットフォームを用いてＲＮＡシーケンシングに供した。ＲＮＡ精製、リボソームＲＮＡ枯渇、及びＲＮＡシーケンシングの後、９６個の患者サンプルがさらなる解析に適切であることが判定された。
【００２７】
発見及び検証セット。それら９６個のサンプルを、４５人の患者の「発見セット」及び５１人の患者の「検証セット」に無作為に分けた。
【００２８】
発見セット。４５人の患者を、ＲＮＡｓｅｑのために血液が採取されたのと同じ日に判定されるＣＡＤの程度に従った群に細分した。群は上で記載されており、低（０〜２０％の狭窄）、中（２１〜６９％）、及び高（≧７０％）から構成される。比較的高い信頼性を有する、比較的小さなセットのバイオマーカーを同定するために、低群を、組み合わせＴ検定（ｐ＜０．００１非補正、及び１．５の最小倍率変化）により中＋高群と比較し、５９種の転写産物がもたらされた（表３を参照されたい）。
【００２９】
倍率変化及び転写産物の科学的解析の両方に基づき、上位５位の変化した転写産物だけから、より小さなリストを構築した。ＤＩＳＣ群における５種の転写産物のみをもとに築かれたＰＬＳＤモデルは、８４％の精度であった（低に対して９１％、中＋に対して７７％）（表４を参照されたい）。
【００３０】
低群は、本質的に０％の狭窄を有する真の「正常」、及び少量のＣＡＤを有する一部の患者を含むため、本発明者らは、「正常」（０％）対「異常」（＞０％）によって患者を再編成する発見群に対して別の解析を行い、同様のＴ検定を行い、５００種の転写産物がもたらされた（表５を参照されたい）。
【００３１】
９６人の患者で築かれた総合的予測モデル。最も強力なモデルを得るために、本発明者らは、全サンプルを包含し、発見／検証設計と同じようにそれらを低対中／高（中＋）に分けた。これにより、各群に４８人の患者がもたらされた。この設計を用いて、転写産物をまずフィルターにかけて、サンプルの７０％においてＲＰＫＭ＜０．０１を有する転写産物を除外し、次いで、０．００１の非補正ｐ値で低対中＋患者についての一元配置ＡＮＯＶによってＴＲＡＣを同定し、１９８種の転写産物がもたらされた（表６を参照されたい）。これら１９８種の転写産物は、本質的に同じＲＮＡ転写産物を網羅する一部の重複を含有し、１６９種の非冗長な固有のＲＮＡ転写産物がもたらされた。
【００３２】
これら１９８種の転写産物をもとに築かれたＰＬＳＤモデルは、識別が非常に精確であり、９８．９％の総合的精度（低に対して１００％、高に対して９７．９％）を示した。これは、Ｎ分割内部検証を用いてさえかなり堅牢なままであり、８０％の総合的精度（低に対して７７％、中＋に対して８３％）がもたらされた。
【００３３】
より高いレベルの発現に対するフィルタリング。１９８種の転写産物を、両群において＞２０ｔｈパーセンタイルレベルを有するものに対してフィルタリングすることによって、リストは、１９８種の転写産物よりも相対的に高い絶対発現を有する９６種の転写産物に絞られた。しかしながら、これは、それをもとに築かれたＰＬＳＤモデルの予測能を向上させず、９３％の総合的精度（低に対して９２％、中＋に対して９４％）を有したが、より少ない転写産物を有する依然としてかなり強力な検定を生じさせた（表７を参照されたい）。
【００３４】
小さなセットの予測転写産物の同定。さらにもっとリストを絞るために、コホート全体において予測的な１９８種の転写産物を、ＬｖＭ＋基準を用いて、ＤＩＳＣセットにおいて予測的な転写産物との重なりについて比較した（表３、５９種の転写産物）。両リストに共通しているものは１４種の転写産物であり、それを用いてコホート全体に対する新たなモデルを築いた。ＰＬＳＤモデルは、８６％の総合的精度（低に対して８７％、中＋に対して８５％）を有して強力なままであり、それはＬＯＯＣＶにおいて８０％の総合的精度まで下がった（表８を参照されたい）。
【００３５】
予測転写産物の最も包括的なリストの同定。診断的使用及び潜在的治療的使用の両方のために、採用され得る転写産物の最も包括的なリストを知ることに価値がある。ゆえに、ＡＮＯＶＡストリンジェンシーをｐ＜０．００５（先行実施例における０．００１に対して）まで緩和することによって、１１３２種の転写産物というより大きなセットが同定される（表９を参照されたい）。
【００３６】
ＴＲＡＣシグネチャーの解釈：中間及び完全解析の両方とも、典型的には増加した及び減少した転写産物の間に均衡が存在するＲＮＡ発現解析において滅多に生じないパターンである、差異的に発現した転写産物のほぼすべてがＣＡＤ患者において下方調節されていることを示した。さらには、本発明者らは、通常、ある範囲の大きさを予想するが、変化は本質的にすべて同じ大きさ（平均＝約１．７倍）である。ＴＲＡＣの広範な解析の後、最も可能性の高い説明は、ＴＲＡＣが特定の細胞タイプのマーカーであり、その細胞タイプは、発症中のまたは既存のＣＡＤを有する人において存在量が低下しているということである。広範な文献は、２種の比較的選択的な細胞タイプが、ＣＡＤを有する患者において存在量が変更され得ることを立証している。
【００３７】
循環細胞の改変集団のマーカーとしてのＴＲＡＣ。転写産物の一様の減少を得る１つの手段は、これらの転写産物が細胞のサブセットと優先的に関連しており、そのサブセットがＣＡＤ患者において減少しているかどうかである。ＣＣＬ２８、ＣＤ２ＢＰ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ５、ＣＤ８１、ＫＤＭ２Ｂ、ＬＥＦ１、及びＭＩＢ２など、中間解析において同定されたある特定の転写産物は、様々な幹細胞及び前駆細胞集団と以前に関連付けされている。ＣＤ８１は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及び造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるその十分に特徴付けされた役割が理由で興味深い。
【００３８】
安定したＣＡＤまたは前臨床アテローム性動脈硬化症を有する患者における、循環前駆細胞（ＣＰＣ）集団の低下を一貫して報告する実質的な文献がある。高コレステロール血症、喫煙、及び肥満は、循環前駆体のレベルの低下と関連している。反対に、循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、急性ＭＩ症例において増加している。しかしながら、希少である（＜１％）ＥＰＣ数の減少が、全血において検出されるＲＮＡレベルの実質的なシフトを引き起こし得ることはありそうにない。むしろ、ＥＰＣ減少及びＲＮＡプロファイルの両方が、アテローム性動脈硬化症における血液の細胞組成の何らかのより大きな変化の２つの態様であり得る。
【００３９】
Ｔｒｅｇの推定マーカーとしてのＴＲＡＣ：ＴＲＡＣに対する第二の潜在的な説明は、アテローム性動脈硬化症においてリンパ球の調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）サブセットの公知の低下が存在するということである。広範な文献は、ＣＡＤを有する患者におけるＴｒｅｇ存在量の低下、及びＴｒｅｇ対Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞の相対的不均衡を立証している。Ｔｒｅｇの潜在的な変化について検査するために、本発明者らは、３つのＣＡＤ群において公知のＴｒｅｇマーカーの調節を調べた。図３に示されるように、ＦｏｘＰ３、ならびにＣＤ４、ＣＤ２５、ＥＴＳ１、及びＲＵＮＸ１  ｍＲＮＡ発現レベルなどの他のマーカーは、低、中からＣＡＤへの発現の段階的な減少を示している。比較すると、プロスタグランジンＥ受容体３（ＰＴＧＥＲ３）などの無関係なマーカーの発現は、このＣＡＤに関連した傾向を示さない。
【００４０】
Ｔｒｅｇ不均衡は、観察されるＲＮＡ発現パターンを作り出すのに十分である。血中のＴｒｅｇ細胞数の低下が、ＲＮＡレベルの観察される変化を生じさせるのに大きさが十分であるかどうかを判定するために、不安定狭心症または急性冠症候群（ＡＣＳ）など、正常及びＣＡＤ患者におけるＴｒｅｇ％を報告している８本の刊行物を再検討し、Ｔｒｅｇ％の変化を計算した。フローサイトメトリーによってＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗとして典型的に規定されるＴｒｅｇの平均的低下は３０．２５％であり、それはＴｒｅｇ  ＲＮＡレベルの１．４３倍の差に翻訳され、これらのマーカーはＴｒｅｇに本質的に固有であることが想定された。ゆえに、コンセンサスＦｏｘＰ３マーカーに対するｍＲＮＡの１．４７倍の低下は、ＣＡＤにおけるＴｒｅｇ細胞数の報告された低下とかなり一致している。
【００４１】
実施例３：Ｔｒｅｇ様経路とのそれらの関係性によって同定されたバイオマーカー
Ｔｒｅｇ成熟及び分化の過程に特異的なあらかじめ指定された経路または遺伝子オントロジーは存在しない。Ｔｒｅｇシグナル伝達の機能的経路を作り出すように、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒｕｄｅｎｓｋｙ及び他者による近年の総説を適合させて、観察されたＲＮＡ変化のパターンと比較した。ＤＧＥ及び公知のＴｒｅｇシグナル伝達において顕著な重なりが観察された。
【００４２】
ＣＡＤのバイオマーカーは、Ｔｒｅｇ経路とのそれらの生物学的関係性によっても規定され得、ゆえに本発明者らは、Ｔｒｅｇ分化との公知の関係性を有しかつＣＡＤ状態により全身的に変動する一連のマーカーを同定した。これらには、ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、ＺＡＰ７０、及びその他が含まれる（表１０を参照されたい）。
【００４３】
Ｔｒｅｇ細胞に対する相対的特異性と関連しているが他のＴＲＡＣリストにおいて網羅されていない３種の転写産物（ＦｏｘＰ３、Ｒｕｎｘ１、ＩＬ２ＲＡ／ＣＤ２５）だけの遺伝子リストを用いて、９６人の患者コホートをもとに予測モデルを築き、それによって４８人の対象は低として、４８人は中または高（中＋）として分類される。これら３種の転写産物のみを用いて、ＰＬＳＤモデルは、６０％の総合的精度（低に対して６７％、中＋に対して５４％）を示した。しかしながら、Ｎ分割検証をすると、これは４６％の総合的精度（低に対して４７％、中＋に対して４４％）まで下がった。これにより、ＴＲＡＣはＴｒｅｇ数または機能に関係し得るものの、ＴＲＡＣは、Ｔｒｅｇ細胞の公知のマーカーよりもＣＡＤを予測することにおいてより優れた性能を果たすことが示唆される。
【００４４】
実施例４：先行ＣＡＤ予測モデル
公開された及び特許を取得した他の業績は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ技術及びＰａｘＧｅｎｅ血中ＲＮＡ保存チューブ（米国特許第９，１２２，７７７号及び第８，９１４，２４０号、その内容は参照により組み入れられる）に基づくＣＡＤに対する予測値で、転写産物を同定している。ＰａｘＧｅｎｅ保存血液のマイクロアレイプロファイリングを用いた先行研究は、１つの血中ＲＮＡに基づく診断（ＣａｒｄｉｏＤｘによるＣｏｒｕｓ  ＣＡＤ）につながっている。ＣａｒｄｉｏＤｘ検査（Ｃ＝０．７４５）は、純粋に臨床的なリスク査定（Ｃ＝０．７３２）をわずかに向上させるが、本ＲＮＡｓｅｑ検査は、有意により精確であることが判明した（Ｃ＝０．８７０）。さらに、ＣａｒｄｉｏＤｘによるＣｏｒｕｓＣＡＤ検査は、それらのリスクスコアを算出する際に対象の年齢及び性別を用いるが、一方で本ＴＲＡＣ法は、遺伝子発現レベルのみに基づく。
【００４５】
方法をより直接的に比較するために、本発明者らは、本データセットにおける発現レベルまたは予測値についての知識を持たずに、それらの特許及び刊行物から１７種の最もよく合致した転写産物を同定した。それら１７種のＣａｒｄｉｏＤｘマーカーの発現レベルは、本発明者らのＲＮＡｓｅｑデータセットにおいて低及び中＋患者の間で異ならなかった（表１１を参照されたい）。それにもかかわらず、本発明者らは、それらを用いて分類モデルを築くことを試み、ＰＬＳＤモデルにおいてこれら１７種の転写産物は、７３％の総合的精度（低に対して７５％、中＋に対して７１％）を有したが、Ｎ分割検証において精度は６３．５％まで落ち、５０％は偶然であると考えられた。ゆえに、それらは根本的に異なる方法であるため、精確に付き合わせて比較することは難しいが、本ＴＲＡＣバイオマーカーは、既存のＲＮＡバイオマーカーよりもＣＡＤを予測することにおいてより優れている。
【００４６】
実施例５：高い予測能を有する小さなセットの転写産物
中サイズのＴＲＡＣリスト、具体的には表６（１９８種の転写産物、１６９種が固有）に基づき、転写産物のより小さなパネルを、ヒト診断におけるそれらの適切性に対する具体的な基準に基づいて選択した。これらの基準は、転写産物とＴｒｅｇ細胞との推定関連性、高レベルの発現、及び近縁の遺伝子ファミリーメンバーからの相対的独立性に関係した。これらの基準を用いて、７種の転写産物：ＤＬＧ１、ＤＧＫＡ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＳＭＹＤ３、ＴＣＦ３、及びＴＲＩＭ２８を選択した。これらの転写産物のレベルをＲＮＡｓｅｑデータから抽出し、高発現した転写産物の過剰加重を最小限に抑えるためにコホート全体におけるその転写産物の平均発現のパーセンテージ（比）として表現し、次いで、図４（右のパネル）に示されるように、７種のＴＲＡＣの正規化レベルを加算して累積スコアを作成した。ＣＡＤまたは低ＣＡＤへの患者の分類は、このＴＲＡＣスコアのみに基づいて非常に精確であり（８０．２％）、０．８７３のＲＯＣ面積（ＡＵＣ、Ｃ統計量）を有した。比較すると、臨床予測因子のみを用いると（図４、左のパネル）、ほんの５４％の精度（偶然としての５０％）及び０．６３６のＣ統計量（偶然としての０．５００）が達成され得た。
【００４７】
実施例６：ＴＲＡＣの検出に対する血中ＲＮＡ安定剤の影響
記述されるように、他の発明は、本パネルとは完全に異なる、ＣＡＤに対する遺伝子パネルを記載している。それらの研究は、陽イオン性界面活性剤に基づくＰａｘＧｅｎｅと呼ばれる、血中ＲＮＡのための保存剤を採用したが、一方で本研究は、グアニジニウム様変性剤に基づくＴｅｍｐｕｓ保存剤を採用した。保存剤がＴＲＡＣの検出に影響を有するかどうかを判定するために、同じドナー由来の血液を、ＰａｘＧｅｎｅまたはＴｅｍｐｕｓチューブのいずれかに採取し、メーカーの指示によってＲＮＡを調製し、次いで、ｉＳｃｒｉｐｔ（ＢｉｏＲａｄ）での逆転写の後、等量のＲＮＡをドロップレットデジタルＰＣＲによって定量した。図５に示される結果は、測定されたＴＲＡＣのすべて（７種）が、１．５倍（ＴＲＩＭ２８）から＞７倍（ＩＣＯＳＬＧ）の範囲で、Ｐａｘｇｅｎｅ保存剤においてよりもＴｅｍｐｕｓ保存剤においてより良好に検出されたことをはっきりと示している。ゆえに、ＲＮＡ保存の方法は、これらＴＲＡＣの検出にとって重要であり、異なる保存剤の使用は、結果の間の一部の差を説明し得る。
【００４８】
血液に基づく検査を介したＣＡＤの精確な診断は、臨床医学においていくつかの主な利点を与える。第一に、それは、心臓カテーテル術などの侵襲的検査を回避し、ならびにＣＴ及びＭＲ血管造影などの画像供給源のより慎重な使用を可能にする。第二に、それは、進歩したイメージング法が利用できない世界中の農村地域におけるＣＡＤの診断を向上させ得る。最後に、バイオマーカーパネル内の個々のバイオマーカーは、治療用標的、及びスタチンなどの新たなまたは既存の療法の効能をモニターするマーカーの両方として働き得る。例えば、Ｔｒｅｇ数は、スタチン療法に応答性であることが示されており、そのため、ＴＲＡＣを使用して療法をモニターすることが可能であり得る。
【００４９】
免疫系とアテローム性動脈硬化症の間のつながりは周知である。血液構成要素、とりわけ単球／マクロファージ、好中球、リンパ球、及び血小板は、ＣＡＤの発症にメカニズム的に寄与する。本結果は、ＣＡＤが、アテローム性動脈硬化症の進行にメカニズム的に関係していると考えられるＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比の変化と関連しているという広範な証拠と一致している。
【００５０】
メカニズム的に、本結果は、免疫系における変化がＣＡＤの存在と相関し得ることを示唆し、それは、長年にわたって調査の実質的な路線であり、アテローム性動脈硬化症における脂質不均衡、炎症、微生物叢変化、及び自己免疫の間のつながりを徐々に築いている。ＣＡＤを有する患者におけるＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比の変化を実証した大きくかつ極めて一貫性のある文献があり、それらの観察される細胞変化は、ｍＲＮＡ発現の本変化と方向及び大きさの両方で一致している。スタチンの有益な効果についての１つの解釈は、ＬＤＬコレステロールを下げることに加えて、スタチンは、ＴＧＦ−βシグナル伝達の変調を介してＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞を誘導し得るということである。再現性のある臨床相関を超えて、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおけるＴｒｅｇレベルの実験的操作は、潜在的な因果関係に信用を与える。さらには、免疫調節手法は、アテローム性動脈硬化症の治療潜在性を付与し得ることが示唆されている。ＰＣＳＫ９阻害剤に関してまだ報告されていない効果である、Ｔｒｅｇ数に対するスタチンの刺激効果が、それらの抗アテローム生成効果に寄与し得ることは妥当と思われる。
【００５１】
様々な自己免疫疾患における、しかし全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の症例において最も著しい、アテローム性動脈硬化症の周知の発生を通じて、Ｔｒｅｇ機能障害とアテローム性動脈硬化症の間にさらなる関係性が見られ得る。ＴｒｅｇとＳＬＥの間の関係性は複雑であるものの、欠損したＴｒｅｇ数及び／または機能がＳＬＥの１つの要素であり、ゆえにＳＬＥ関連アテローム性動脈硬化症の構成要素でもあり得るという一般的コンセンサスがある。同様に、Ｔｒｅｇ不均衡と関連している乾癬及び乾癬性関節炎は、アテローム性動脈硬化症との十分に確立された関連性を有する。免疫−ＣＡＤのつながりは、免疫媒介性移植後動脈硬化における一見したところの因果関係によってさらに強化される。
【００５２】
潜在的に、免疫−ＣＡＤのつながりの最も有力な証拠は、再狭窄を阻止する抗生物質／免疫抑制剤であるラパマイシン及び関連化合物の証明された効能に由来する。ラパマイシンは、臨床的に関連するレベルでＴｒｅｇ数及び機能を増加させることが知られている。
【００５３】
ＴＲＡＣの多くは、Ｔｒｅｇ機能との公知の関係性を有する。何よりも、フォークヘッドボックス転写因子ＦｏｘＰ３は、Ｔｒｅｇサブセットに対する決定的マーカーと見なされ、Ｔｒｅｇ機能に関与する一連の転写産物を転写的に調節すると考えられる。ＦｏｘＰ３は、プロモーター脱メチル化によってそれ自体がエピジェネティックに制御されて、Ｔｒｅｇにおける安定な発現が可能となり、今度は公知のプロモーター結合部位を介してＴｒｅｇ特異的転写を調節する。他の研究は、ジアシルグリセロールキナーゼの２つのアイソフォーム（ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ）がＴ細胞アネルギーに関わっており、ＤＧＫＺは、ｃ−ｒｅｌを通じたＮＦｋＢシグナル伝達の変調を介して内在性（ｎａｔｕｒａｌ）Ｔｒｅｇの生成に関わっていることを示している。ＦｏｘＰ３転写因子は、Ｅｔｓ転写因子と相互作用することが知られており、大動脈瘤転写産物プロファイリングに関する先行研究は、このアテローム性動脈硬化病状が、大動脈組織におけるＥｔｓ転写因子依存的シグナル伝達の協調的変化と関連していることを実証した。ゼータ鎖関連タンパク質であるＺａｐ７０は、ＴＣＲ関与の間、Ｔｒｅｇ細胞において優先的にリン酸化される。
【００５４】
Ｔｒｅｇ不均衡の根底にある原因は現在不明であるものの、微生物叢の変化が、循環中に放出される短鎖脂肪酸のタイプを変更し得、それによって、ＧＩ及び循環Ｔｒｅｇ分化の両方を変調するという増加し続ける証拠がある。
【００５５】
診断用検査を構成することに加えて、ＴＲＡＣは、特にＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比を変調することによって、ＣＡＤの根底にある構成要素の一部、及びもしかすると治療法の新たな標的を解明するのを助け得る可能性がある。ハイスループットスクリーニングにより、Ｔｒｅｇ生成を刺激する数十種のＦＤＡ化合物が迅速に査定され得る。
【００５６】
本明細書で同定される転写産物プロファイルを適合させて、無症状の個体におけるＣＡＤに対するスクリーニング検査を作り出し得、早期検出によりリスク修正及び薬物療法が可能になると考えられる。マイクロアレイを用いて、本発明者らは、同様の血中ＲＮＡ手法を用いて、アドリアマイシン心毒性及びアスピリン抵抗性（ＡＲ）など、他の心血管疾患の起源についての新たな洞察を生み出し、ＡＲが自己免疫性抗血小板症候群に潜在的に起因するという革新的観察を行った。
【００５７】
本研究にはある特定の制限がある：１）交絡変数：ＴＲＡＣシグネチャーは、群間で異なるリスク要因または薬物処理に関係し得る。しかしながら、収集された臨床的変数に基づき、本発明者らは、この影響を創出するほど十分に異なる併存病状または処方薬使用を同定し得ず、それを完全に排除するのは難しい。２）特異性：ＴＲＡＣは任意の動脈における疾患を検出することが可能であり、たとえ検査が他の動脈におけるアテローム性動脈硬化症を検出している場合でさえ、それは依然として多大な診断価値を有するであろう。胸痛及び血中における陽性ＴＲＡＣプロファイルの組み合わせは、カテーテル術または他の追跡診断が必要とされるという有力な証拠であろう。同様に、陽性ＴＲＡＣ検査と組み合わせた手足のしびれは、末梢血管超音波検査を正当化するのに十分であろう。心電図群は、ＣＡＤに対するそれらの予測因子が大動脈アテローム硬化症も予測することを観察し、血液マーカーがアテローム性動脈硬化症の一般的予測因子である可能性があることを示唆した。先行研究により、アテローム性動脈硬化症の位置は、特定の血管床に広がっている特定の自己抗原に関係し得る、推測され得る、所定の患者における特異的リスク要因と関連した有効なエンドフェノタイプであることが示唆されている。
【００５８】
【表１】
2019528706.tif 000003
2019528706.tif 000004
2019528706.tif 000005
2019528706.tif 000006
2019528706.tif 000007
2019528706.tif 000008
2019528706.tif 000009
【表２】
2019528706.tif 000010
2019528706.tif 000011
2019528706.tif 000012
2019528706.tif 000013
【表３】
2019528706.tif 000014
2019528706.tif 000015
2019528706.tif 000016
【表４】
2019528706.tif 000017
【表５】
2019528706.tif 000018
2019528706.tif 000019
2019528706.tif 000020
2019528706.tif 000021
2019528706.tif 000022
2019528706.tif 000023
2019528706.tif 000024
2019528706.tif 000025
2019528706.tif 000026
2019528706.tif 000027
2019528706.tif 000028
2019528706.tif 000029
2019528706.tif 000030
2019528706.tif 000031
2019528706.tif 000032
2019528706.tif 000033
2019528706.tif 000034
2019528706.tif 000035
2019528706.tif 000036
2019528706.tif 000037
2019528706.tif 000038
2019528706.tif 000039
2019528706.tif 000040
【表６】
2019528706.tif 000041
2019528706.tif 000042
2019528706.tif 000043
2019528706.tif 000044
2019528706.tif 000045
2019528706.tif 000046
2019528706.tif 000047
2019528706.tif 000048
2019528706.tif 000049
2019528706.tif 000050
【表７】
2019528706.tif 000051
2019528706.tif 000052
2019528706.tif 000053
2019528706.tif 000054
【表８】
2019528706.tif 000055
【表９】
2019528706.tif 000056
2019528706.tif 000057
2019528706.tif 000058
2019528706.tif 000059
2019528706.tif 000060
2019528706.tif 000061
2019528706.tif 000062
2019528706.tif 000063
2019528706.tif 000064
2019528706.tif 000065
2019528706.tif 000066
2019528706.tif 000067
2019528706.tif 000068
2019528706.tif 000069
2019528706.tif 000070
2019528706.tif 000071
2019528706.tif 000072
2019528706.tif 000073
2019528706.tif 000074
2019528706.tif 000075
2019528706.tif 000076
2019528706.tif 000077
2019528706.tif 000078
2019528706.tif 000079
2019528706.tif 000080
2019528706.tif 000081
2019528706.tif 000082
2019528706.tif 000083
2019528706.tif 000084
2019528706.tif 000085
2019528706.tif 000086
【表１０】
2019528706.tif 000087
【表１１】
2019528706.tif 000088
2019528706.tif 000089
【図１】
2019528706.tif 000090
【図２】
2019528706.tif 000091
【図３】
2019528706.tif 000092
【図４】
2019528706.tif 000093
【図５】
2019528706.tif 000094
【国際調査報告】
2019528706.tif 000095
2019528706.tif 000096
2019528706.tif 000097
2019528706.tif 000098
2019528706.tif 000099
2019528706.tif 000100
2019528706.tif 000101
2019528706.tif 000102
2019528706.tif 000103