(57)【要約】  本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を用いてクローン病を治療する方法を目的とする。特に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を投与するための投与レジメンに関する。本発明はまた、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による治療のための患者を選択する方法に関する。
2019528285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローン病を有するヒト患者を治療する方法であって、前記方法が、前記ヒト患者に、安全かつ有効量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を投与することを含み、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、配列番号３、４及び５に示す配列をそれぞれ有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインと、配列番号６、７、及び８に示す配列をそれぞれ有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインとを含み、前記方法が、少なくとも１回の投与サイクルを含み、前記少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、（ａ）４００ｍｇの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を１用量、及び（ｂ）２００ｍｇの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を少なくとも１用量、として投与される、方法。
【請求項２】
前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、静脈内投与用又は皮下投与用に製剤される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療が、最大で６回のサイクルからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記２００ｍｇの用量が、１１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＫＧ２Ｄ抗体の用量（ｂ）の前記投与が、２２週間にわたって２週間ごとに１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、クローン病の症状の低減、臨床的応答の誘発、臨床的寛解の誘発又は維持、疾患進行の阻害、及び疾患合併症の阻害からなる群から選択される、前記ヒト患者における効果を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、クローン病活動指数スコアの低減、Ｃ反応性タンパク質発現レベルの低下、便中カルプロテクチン（calprotein）発現レベルの低下、及び開放排液瘻孔の数の低減からなる群から選択される、前記ヒト患者における効果を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト患者の前記クローン病活動指数スコアが、少なくとも１００ポイント低減される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト患者の前記クローン病活動指数スコアが、１５０ポイント未満に低減される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記クローン病の症状の低減が、前記ヒト患者における開放排液瘻孔の少なくとも５０％の減少である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト患者が、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の前記投与の前に、活動性の中程度〜重篤なクローン病を有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト患者が、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の前記投与の前に、２２０〜４５０のクローン病活動指数スコアを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト患者が、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の前記投与の前に、一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ２２５５３３６及び／又はｒｓ２２３９７０５を含む遺伝子型を有している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、配列番号１を含む重鎖可変領域と、配列番号２を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
クローン病を有するヒト患者を治療する方法であって、
（ａ）前記ヒト患者から生物学的サンプルを取得し、前記生物学的サンプルについて遺伝子型決定アッセイを実施することによって、前記ヒト患者がＮＫＧ２Ｄ受容体遺伝子又はＭＩＣＢ遺伝子にＳＮＰを有しているかどうかを判定する工程と、
（ｂ）前記患者がＳＮＰを有している場合、抗ＮＫＧ２Ｄ受容体抗体を投与する工程と、を含み、
前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、配列番号３、４及び５に示す配列をそれぞれ有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインと、配列番号６、７、及び８に示す配列をそれぞれ有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインとを含む、方法。
【請求項１６】
前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、（ａ）４００ｍｇの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を１用量、及び（ｂ）２００ｍｇの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を少なくとも１用量、の投与を含む少なくとも１回のサイクルで投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＮＰがｒｓ２２５５３３６又はｒｓ２２３９７０５である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１７年８月１７日に作成され、ファイル名はＪＢＩ５０９６ＷＯＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは５，９２２バイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を用いてクローン病を治療する方法を目的とする。特に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を投与するための投与レジメンに関する。本発明はまた、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による治療のための患者を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
クローン病（Crohn's disease、ＣＤ）は、制御されていない免疫反応によって特徴付けられる慢性過敏性腸疾患である（Ｂａｕｍｇａｒｔ  ＤＣ，Ｓａｎｄｂｏｒｎ  ＷＪ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１２；３８０：１５９０〜６０５；Ｍａｙｅｒ  Ｌ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２０１０；４５：９〜１６）。ＣＤに対する治療は、免疫抑制剤又は生物剤治療による炎症プロセスの阻害による免疫系の抑制に基づく。過去１０年間で治療は大幅に進歩した。これは主として抗腫瘍壊死因子（tumour necrosis factor、ＴＮＦ）モノクローナル抗体の開発と広範な使用によるものである。初期の効力にもかかわらず、長期的なメリットが観察されるのは、抗ＴＮＦ抗体を用いて治療したＣＤ患者の半分未満である。（Ａｌｌｅｚ  Ｍ，Ｖｅｒｍｅｉｒｅ  Ｓ，Ｍｏｚｚｉｃｏｎａｃｃｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ２０１０；３１：９２〜１０１）。新しい標的の生物剤が開発されており、これには免疫細胞の輸送を標的としたモノクローナル抗体が含まれるが、新たな作用機序による治療が依然として必要とされている。
【０００４】
ＣＤにおける腸内炎症性病変の持続性は、免疫細胞と非免疫細胞との間の能動的クロストークによって媒介され、Ｔ細胞は、この病理プロセスにおいて主要な役割を果たしている（Ａｌｌｅｚ  Ｍ，Ｍａｙｅｒ  Ｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：Ｐｅａｃｅ  ｋｅｅｐｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｔ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ  ２００４；１０：６６６〜７６）。炎症を起こした粘膜には、活性化したＴリンパ球が多量に浸潤しており、これにより炎症性サイトカインが生成され、これが細胞毒性を呈し、粘膜損傷に寄与する（Ｃｒｏｉｔｏｒｕ  Ｋ，Ｚｈｏｕ  Ｐ．Ｔ−ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００４；２０：５８１〜６．；Ｎｅｕｒａｔｈ  ＭＦ，Ｆｉｎｏｔｔｏ  Ｓ，Ｆｕｓｓ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；２２：２１〜６）。これらの免疫細胞の蓄積は、細胞のアポトーシスを行うために、血流からの能動的な補充、持続的な細胞周期、及び感受性の低減に依存する。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体による特定の抗原の識別と、共刺激シグナルの共送達とに依存する。興味深いことに、粘膜Ｔ細胞は、この共刺激シグナルを提供する自然免疫受容体を発現し得る。ナチュラルキラー群２メンバーＤ（Natural killer group 2 member D、ＮＫＧ２Ｄ）は、特定の条件下で、ナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞、一部のＮＫ  Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞、γδＴ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞の表面に存在する活性化受容体である。（Ｃｈａｍｐｓａｕｒ  Ｍ，Ｌａｎｉｅｒ  ＬＬ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ２０１０；２３５：２６７〜８５．；Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ＡＭ，Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ  Ａ，ＭｃＭａｈｏｎ  ＣＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２００２；１７：１９〜２９）。
【０００５】
ヒトＮＫＧ２Ｄに結合するリガンドは、主要な組織適合性複合体クラスＩ関連分子Ａ及びＢ、並びにＵＬ−１６結合タンパク質であり、これらは全て、細胞ストレスにより増加した発現を有する。（Ｇｒｏｈ  Ｖ，Ｂａｈｒａｍ  Ｓ，Ｂａｕｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１９９６；９３：１２４４５〜５０）。これらのＮＫＧ２Ｄリガンドの多数は、上皮細胞で発現し、ＩＢＤにおける炎症性粘膜において上方調節される（Ａｌｌｅｚ  Ｍ，Ｔｉｅｎｇ  Ｖ，Ｎａｋａｚａｗａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００７；１３２：２３４６〜５８；Ｌａ  Ｓｃａｌｅｉａ  Ｒ，Ｓｔｏｐｐａｃｃｉａｒｏ  Ａ，Ｏｌｉｖａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ  ２０１２；１８：１９１０〜２２；Ｔｉｅｎｇ  Ｖ，Ｌｅ  Ｂｏｕｇｕｅｎｅｃ  Ｃ，ｄｕ  Ｍｅｒｌｅ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２；９９：２９７７〜８２）。よって、腸内上皮は、ＮＫＧ２Ｄ経路を介した直接相互作用により様々なＴ細胞応答を調節し得る（Ａｌｌｅｚ  Ｍ，Ｍａｙｅｒ  Ｌ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ  ２００４；１０：６６６〜７６；ｈ  Ｖ，Ｂａｈｒａｍ  Ｓ，Ｂａｕｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６；９３：１２４４５〜５０）。
【０００６】
ＣＤにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの発現増加が観察されている（Ａｌｌｅｚ  Ｍ，Ｔｉｅｎｇ  Ｖ，Ｎａｋａｚａｗａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００７；１３２：２３４６〜５８）。ＣＤ４＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞は、特異的な細胞毒性活性を呈し、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する標的細胞を生体外で殺滅することができ、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、インターフェロン（interferon、ＩＦＮ）γ、及びインターロイキン−１７（interleukin-17、ＩＬ−１７））の重要な発生源でもある（Ａｌｌｅｚ  Ｍ，Ｔｉｅｎｇ  Ｖ，Ｎａｋａｚａｗａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００７；１３２：２３４６〜５８；Ｐａｒｉｅｎｔｅ  Ｂ，Ｍｏｃａｎ  Ｉ，Ｃａｍｕｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２０１１；１４１：２１７〜２６，２２６．ｅ１〜２．）。これらのサイトカインの産生は、Ｔ細胞受容体及びＮＫＧ２Ｄ受容体の共刺激により生体外で強力に増強される（Ａｌｌｅｚ  Ｍ，Ｔｉｅｎｇ  Ｖ，Ｎａｋａｚａｗａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００７；１３２：２３４６〜５８；Ｐａｒｉｅｎｔｅ  Ｂ，Ｍｏｃａｎ  Ｉ，Ｃａｍｕｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１１；１４１：２１７〜２６，２２６．ｅ１〜２）。興味深いことに、ＣＤ患者の炎症性粘膜中に見られるＴ細胞オリゴクローナル増殖の大部分は、ＮＫＧ２Ｄを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞に対応している（Ｃａｍｕｓ  Ｍ，Ｅｓｓｅｓ  Ｓ，Ｐａｒｉｅｎｔｅ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；７：３２５〜３４）。腸炎症におけるＣＤ４＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の意味は、移動誘導大腸炎のネズミモデルで更に詳しく示されている（Ｋｊｅｌｌｅｖ  Ｓ，Ｈａａｓｅ  Ｃ，Ｌｕｎｄｓｇａａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７；３７：１３９７〜４０６；Ｉｔｏ  Ｙ，Ｋａｎａｉ  Ｔ，Ｔｏｔｓｕｋａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００８；２９４：Ｇ１９９〜２０７）。特異的ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体の投与は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ発現を減少させ、大腸炎の発症を低減させた。ＮＫＧ２Ｄはまた、セリアック病において示されているように、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む他のＴ細胞サブセットの機能、特に細胞毒性を調節し得る（Ｈｕｅ  Ｓ，Ｍｅｎｔｉｏｎ  ＪＪ，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ  ＲＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００４；２１：３６７〜７７；Ｍｅｒｅｓｓｅ  Ｂ，Ｃｈｅｎ  Ｚ，Ｃｉｓｚｅｗｓｋｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００４；２１：３５７〜６６）。これらのデータは、ＣＤにおけるエフェクターＴ細胞の過剰活性におけるＮＫＧ２Ｄ経路の潜在的役割をサポートしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当該技術分野において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を用いてクローン病を有する対象を治療するための効果的な投与レジメンの必要性、並びに抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が臨床的効力を示す患者を選択する方法の必要性が存在する。本明細書において本発明はそのような方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願は、クローン病を患う対象の治療方法を提供し、この方法は、配列番号３、４及び５に示す配列をそれぞれ有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインと、配列番号６、７、及び８に示す配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインとを含む抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の安全かつ有効量を、ヒト患者に投与することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、この抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は少なくとも１回の投与サイクルで投与され、この少なくとも１回の投与サイクルのそれぞれについて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、（ａ）４００ｍｇの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を１用量、及び（ｂ）２００ｍｇの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を少なくとも１用量、として投与される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、この抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は静脈内投与用又は皮下投与用に製剤される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、この抗ＮＫＧ２Ｄ治療は最大で６サイクルからなる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、２００ｍｇの用量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が１１回投与される。
【００１３】
本明細書に記述されるいくつかの実施形態において、このＮＫＧ２Ｄ抗体の周期的投与は、最初の用量の投与後、２２週間にわたって２週間ごとに１回である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、この抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の量は、対象におけるクローン病の症状を低減させるか、臨床的応答を誘発するか、臨床的寛解を誘発若しくは維持するか、疾患の進行を阻害するか、又は対象における疾患の合併症を阻害するのに、有効である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、この抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の量は、対象のクローン病活動指数スコアを低減させるか、対象のＣ反応性タンパク質レベルを低下させるか、対象の便中カルプロテクチン（calprotein）レベルを低下させるか、又は対象の開放排液瘻孔の数を低減させるのに、有効である。
【００１６】
別の一実施形態において、この対象は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の投与の前に、一塩基多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）ｒｓ２２５５３３６及びｒｓ２２３９７０５について試験され陽性であった。
【００１７】
好ましい一実施形態において、この抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、配列番号１の重鎖可変領域と配列番号２の軽鎖可変領域とを含む。
【００１８】
本発明の別の一態様は、クローン病のヒト患者を治療する方法に関し、この方法は、
（ａ）このヒト患者から生物学的サンプルを取得し、その生物学的サンプルについて遺伝子型決定アッセイを実施することによって、このヒト患者がＮＫＧ２Ｄ受容体遺伝子又はＭＩＣＢ遺伝子にＳＮＰを有しているかどうかを判定する工程と、
（ｂ）この患者がＳＮＰを有している場合、抗ＮＫＧ２Ｄ受容体抗体を投与する工程と、を含み、
この抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、配列番号３、４及び５に示す配列をそれぞれ有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインと、配列番号６、７、及び８に示す配列をそれぞれ有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】抗ＮＫＧ２Ｄ臨床試験の概略図。
【図２】抗ＮＫＧ２Ｄ臨床試験のパートＩの概観図。（＊）はプライマリーエンドポイントの時点を示し、（＊＊）は最終的効力及び安全性のための来院を示す。（†）プラセボ非応答者は高用量（１２週に４００ｍｇ、１４〜２２週に２００ｍｇ）を受ける。
【図３】抗ＮＫＧ２Ｄ臨床試験のパートＩＩの概観図。（＊）はプライマリーエンドポイントの時点を示し、（＊＊）は最終的効力及び安全性のための来院を示す。（†）プラセボ非応答者は中程度の投与量（１２週に１５０ｍｇ、１４、１６、及び２０週に７５ｍｇ）を受ける。（‡）Ｂｉｏ−ＩＲ（不耐性／治療抵抗性）は１：１：１：１：１の比で無作為化された。
【図４】ＭＩＣＢ−ｒｓ２２３９７０５及びＮＫＧ２Ｄ−ｒｓ２２５５３３６ＳＮＰの遺伝子型に基づく、抗ＮＫＧ２Ｄ治療を受けた患者のＣＤＡＩスコアの変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
用語の定義：
本明細書で使用するとき、「ｈＮＫＧ２Ｄ」、並びに、特に断りがない限り又は文脈に反していない限り、用語「ＮＫＧ２Ｄ」、別名「ＮＫＧ２−Ｄ」、「ＣＤ３１４」、「Ｄ１２５２４８９Ｅ」、「ＫＬＲＫ１」、「キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１」、及び「ＫＬＲＫ１」は、ヒトキラー細胞活性化受容体遺伝子、そのｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００７３６０）、及びその遺伝子産物（配列番号９で示されるＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３１３８６）、又はその自然発生変種を意味する。ＮＫ及びＴ細胞において、ｈＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド結合形態はホモ二量体である（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；２：４４３〜４５１）。ｈＮＫＧ２Ｄ受容体は典型的にＤＡＰ１０と複合して表面に存在し（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０００；１９２：１０５９ｅｔ  ｓｅｑ．；ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＧ２９４２５、ＡＡＤ５０２９３）、より高次の複合体も形成することが示唆されている。本明細書においてｈＮＫＧ２Ｄに関して付随する任意のアクティビティ（例えば、細胞活性化、抗体認識など）は、ＤＡＰ１０及び／又はその他の構成要素との複合体又はより高次の複合体の形態でのｈＮＫＧ２Ｄによるものであり得る。
【００２１】
ヒトＮＫＧ２Ｄ（配列番号９）
ＭＧＷＩＲＧＲＲＳＲＨＳＷＥＭＳＥＦＨＮＹＮＬＤＬＫＫＳＤＦＳＴＲＷＱＫＱＲＣＰＶＶＫＳＫＣＲＥＮＡＳＰＦＦＦＣＣＦＩＡＶＡＭＧＩＲＦＩＩＭＶＴＩＷＳＡＶＦＬＮＳＬＦＮＱＥＶＱＩＰＬＴＥＳＹＣＧＰＣＰＫＮＷＩＣＹＫＮＮＣＹＱＦＦＤＥＳＫＮＷＹＥＳＱＡＳＣＭＳＱＮＡＳＬＬＫＶＹＳＫＥＤＱＤＬＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＨＩＰＴＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＩＬＳＰＮＬＬＴＩＩＥＭＱＫＧＤＣＡＬＹＡＳＳＦＫＧＹＩＥＮＣＳＴＰＮＴＹＩＣＭＱＲＴＶ
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は広義に使用され、具体的には全長のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び、特に断りがない限り又は文脈に反していない限り、所望の生物学的活性を呈する限り、抗原結合性フラグメント、抗体変異体、及びそれらの多重特異性分子を含む。一般に、全長抗体は、ジスルフィド結合により相互結合した少なくとも２つの重（heavy、Ｈ）鎖及び２つの軽（light、Ｌ）鎖、又はその抗原結合部分を含む糖たんぱくである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、より保護されたフレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と呼称される領域が散在している相補性決定領域（complementarily determining region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分けることができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で並ぶ、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体分子構造の一般的原理及び抗体の生成に関する様々な技法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に提供されている。
【００２３】
抗体の「抗原結合性フラグメント」は、抗原に検出可能な程度に結合することができる、全長抗体の一部分を含む分子であり、典型的に、少なくともＶＨ領域の１つ又は２つ以上の部分を含む。抗原結合性フラグメントは、抗体の１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の抗原結合部分と、単鎖構成体とを含む多価分子であり、ＶＬ及びＶＨ領域、又はその選択された部分が、合成リンカーによって又は遺伝子組換え法によって接合されて機能性の抗原結合分子を形成する。一部の抗体の抗原結合性フラグメントは、より大きな抗体分子の実際の切断（例えば、酵素的開裂）によって得ることができるが、多くの場合は典型的に遺伝子組換え技法により産生される。
【００２４】
用語「抗体誘導体」及び「免疫結合体」は本明細書において互換可能に使用され、全長抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む分子を示し、１つ又は２つ以上のアミノ酸は、例えば、抗体を第２の分子に結合させるために、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成などによって化学的に改変されている。例示的な改変としては、ＰＥＧ化（例えば、システインＰＥＧ化）、ビオチン化、放射性標識、第２の試薬（例えば細胞毒性剤）との結合が挙げられる。
【００２５】
「多重特異性分子」は、少なくとも１つの他の機能性分子（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンドなどの、別のペプチド又はタンパク質）に会合又は結合し、これによって少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する分子を形成する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。例示的な多重特異性分子には、二重特異性抗体、及び可溶性受容体フラグメント又はリガンドに結合する抗体が含まれる。
【００２６】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリンに由来する（すなわち、それと同一又は本質的に同一の）可変領域を有する抗体を含むことが意図される。更に、抗体が定常領域を含む場合、この定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリンに「由来する」。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により、又はインビボ（in viva）における体細胞突然変異により導入された突然変異）を含んでもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含むことは意図されていない。
【００２７】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含んだ、ヒト／非ヒトのキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長目）の超可変領域由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能を更に改良するために行われる。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなり、この可変ドメインにおいて、全て又は実質的に全ての超可変ループは、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基は、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃのうち少なくとも一部も含み得る。更なる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）、国際公開第９２／０２１９０号、米国特許出願第２００６／００７３１３７号、並びに米国特許第６，７５０，３２５号、同第６，６３２，９２７号、同第６，６３９，０５５号、同第６，５４８，６４０号、同第６，４０７，２１３号、同第６，１８０，３７０号、同第６，０５４，２９７号、同第５，９２９，２１２号、同第５，８９５，２０５号、同第５，８８６，１５２号、同第５，８７７，２９３号、同第５，８６９，６１９号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８２１，１２３号、同第５，７７０，１９６号、同第５，７７７，０８５号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、及び同第５，２２５，５３９号を参照のこと。
【００２８】
用語「超可変領域」は、本明細書で使用するとき、抗原結合を担当する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む（軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２）、並びに／又は「超可変ループ」に由来する残基（軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１〜９１７）。典型的に、この領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記述されている方法により実施される。本明細書における「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」及び「Ｋａｂａｔによる」などの表現は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対するこの番号付けシステムを指す。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いて、ペプチドの実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮化又はこれらへの挿入に対応する、より少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）と、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えばＫａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）とを含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、その抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列とを相同領域で位置合わせすることにより、決定することができる。
【００２９】
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるＣＤＲ以外のこれらのＶＨ又はＶＬ残基である。
【００３０】
「エピトープ」又は「結合部位」は、抗原結合ペプチド（例えば抗体）が特異的に結合する、抗原上の区域又は領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性コンポーネントとも呼ばれる）と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的に遮断されるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が、特異的に抗原に結合するペプチドの「溶媒除外表面」及び／又はフットプリント内にある）とを含んでもよい。本明細書における用語「エピトープ」は、特に断りがない限り（例えば、一部の文脈において、本発明は特定のアミノ酸残基に直接結合する抗体に関する）、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体に特異的に結合するｈＮＫＧ２Ｄ、又は本発明による別のｈＮＫＧ２Ｄ特異性試薬の、任意の特定の領域における、両タイプのアミノ酸結合部位を含む。ＮＫＧ２Ｄは、数多くの様々なエピトープを含み得、これには、（１）直鎖ペプチド抗原決定基、（２）成熟ＮＫＧ２Ｄコンフォメーションにおいて互いに近接位置にある１つ又は２つ以上の非連続アミノ酸からなるコンフォメーション抗原決定基、及び（３）全体で又は部分的にＮＫＧ２Ｄに共有結合する分子構造からなる翻訳後抗原決定基が含まれ得るが、これらに限定されない。特に断りがない限り又は文脈に反していない限り、コンフォメーション抗原決定基は、抗原結合ペプチドの原子から約４Å以内にＮＫＧ２Ｄアミノ酸残基を含む。
【００３１】
関心対象の抗体（例えば、ＭＳ又は２１Ｆ２）と「実質的に同じエピトープ又は決定基に結合する」という表現は、関心対象の抗体が特異的に結合するＮＫＧ２Ｄ分子に関してある抗体が関心対象の抗体と「競合する」ことを意味する。
【００３２】
「パラトープ」は、ある抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合部分の区域又は領域である。特に断りがない限り又は文脈に反していない限り、パラトープは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基（このいくつかは典型的にＣＤＲ内にある）と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に結合した抗原により効果的に遮断されるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が、特異的に結合した抗原の「溶媒除外表面」及び／又はフットプリント内にある）とを含んでもよい。
【００３３】
ＮＫＧ２Ｄ分子がナチュラルＮＫＧ２Ｄリガンド（例えばＭＩＣＡ）に結合するのを「遮断する」抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の能力とは、その抗体が、可溶性又は細胞表面に伴うＮＫＧ２Ｄ及びリガンド分子を用いたアッセイにおいて、用量依存的に、ＮＫＧ２Ｄ分子のリガンドに対する結合を検出可能な程度に低減することができ、このＮＫＧ２Ｄ分子はその抗体が存在しない状態でリガンドに検出可能な程度に結合することを意味する。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＭＩＣＡ結合を遮断することができるかどうかを判定するための例示的なアッセイは、実施例３に提供されている。この同じアッセイを、他のＮＫＧ２Ｄリガンドの抗体媒介性遮断を試験するのに使用することができる。
【００３４】
ポリペプチドの「変異体」とは、参照ポリペプチド（典型的には、天然又は「親」のポリペプチド）に実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このポリペプチド変異体は、天然のアミノ酸配列内の特定の位置に１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／若しくは挿入、並びに／又は一方若しくは両方の末端に付加を有し得る。
【００３５】
２つのアミノ酸配列の文脈において用語「実質的に同一」とは、その配列が、最適に位置合わせされたときに（例えば、デフォルトのギャップ加重を用いたＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムにより）、少なくとも約５０パーセントの配列同一性を共有することを意味する。典型的には、実質的に同一な配列は、少なくとも約６０パーセント、少なくとも約７０パーセント、少なくとも約８０パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも約９５パーセント、少なくとも約９８パーセント、又は少なくとも約９９パーセントの配列同一性を呈する。
【００３６】
２つの実質的に同一なアミノ酸配列における「対応する」アミノ酸位置とは、本明細書に参照される任意のタンパク質解析ソフトウェアにより位置合わせされたものである。
【００３７】
核酸配列（又はエレメント）は、別の核酸配列との機能的な関係に配置されるとき、その核酸配列（又はエレメント）「作動可能に連結」される。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している（すなわち、ポリペプチドの発現のコード）。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結している。リボソーム結合部位は、翻訳を促進するよう配置されている場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的かつ読み取りフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーなどの一部のエレメントは、作動可能に連結であるためにコーディング配列と連続的である必要はない。典型的に連結は、便利な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の技法に従って使用することができる。
【００３８】
「単離された」分子とは、それが属する分子分類に関して見出される組成物中の主な種である（すなわち、組成物中の分子の種類の少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子の種類、例えばペプチドの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又はそれ以上を構成する）分子である。一般に、抗体分子の組成物は、組成物中の全ペプチド種の文脈で、又は、少なくとも提案されている使用の文脈において実質的に活性のペプチド種に関して、抗体分子に関して９８％、９８％、又は９９％の均質性を呈する。
【００３９】
用語「治療する」又は「治療」及び同様の語は、本明細書において、望ましい薬理学的、生理学的、又は治療的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患、症状若しくは病状を予防若しくは部分的に予防することに関して予防的であってよく、並びに／又は、疾患、症状、病状、若しくはその疾患に起因する有害作用を部分的若しくは完全に治癒することに関して治療的であってもよい。用語「治療」は、本明細書で使用するとき、哺乳類（特にヒト）の疾患の何らかの治療を包含し、これには、（ａ）疾患の素因があり得るがまだ疾患を有していると診断はされていない対象において、疾患が発生するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害する、すなわち、進行を止めること、又は（ｃ）疾患を緩和する、すなわち、疾患及び／又はその症状若しくは病状を退縮させることが含まれる。本発明は、病的炎症に関連する疾患を患う患者の治療を目的とする。本発明は、長期間にわたって病的炎症に起因する、及び／又は、長期間にわたって生物学的系に存在する不適切な炎症に対する生理学的反応によって生じたものである、有害作用を予防、阻害、又は緩和することに関係する。
【００４０】
一態様において、本発明は対象を治療する方法を提供する。この方法は、例えば、対象の全般的な健康効果を有し得、例えば、対象の寿命を延ばすことができる。あるいは、この方法は例えば、疾患、疾病、病状、又は病気（「病状」）を治療、予防、治癒、緩和、又は寛解（「治療」）させることができる。一実施形態において、本発明は、特定の抗体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の病状を治療する方法を提供し、この病状は、対象におけるＮＫＧ２Ｄの活性を（部分的又は完全に）低減することにより治療可能である。治療は、治療的投与（すなわち、疾患又は病状の徴候及び症状が明らかな場合の投与）並びに予防的又は維持的療法（すなわち、疾患又は病状が静止時の投与）の両方、並びに寛解を誘導し、かつ／又は寛解を維持するための治療を包含する。これにより、疾患又は病状の重篤度を（部分的に、有意に、又は完全に）低減させることができるか、あるいは徴候及び症状を予防又は遅延させる（発症を遅延させる、長期的に寛解させる、又は静止状態にする）ことができる。
【００４１】
本発明に従って治療される病状には、ＮＫＧ２Ｄが基礎疾患又は疾病への寄与に関係しているか若しくは役割を果たしているか、又は別様に有害な病状に寄与するような病状が含まれる。そのような病状に、クローン病が含まれる。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、一続きのＤＮＡにおける単一のヌクレオチド塩基に生じる一般的な変性である。例えば、ＳＮＰはＤＮＡの塩基１０００個につき１回起こり得る。ＳＮＰは疾患プロセスに関与していることがあるが、ただし、多くの場合は疾患に関係したものではない。そのようなＳＮＰの発生に基づいた遺伝子地図により、個々のゲノムにおけるＳＮＰの個々のパターンに基づいて遺伝子カテゴリーに群分けすることができる。そのような様相において、遺伝的に類似の個人に共通であり得る特性を考慮に入れて、そのような遺伝的に類似の個人の群に合わせた治療レジメンを作成することができる。本明細書で使用するとき、「ハプロタイプ」は、一緒に遺伝する傾向がある遺伝子群、ＤＮＡの変異、又はＳＮＰセットを意味する。また、同じ染色体上に見出される対立遺伝子の組み合わせ又はＳＮＰセットも意味し得る。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の安全かつ有効量」とは、対象に投与するとき、許容できない薬剤関連副作用を起こすことなしに、クローン病又はそれに伴う症状の治療に有効な抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の量を意味する。
【００４４】
用語「効力」とは、薬物投与レジメンの文脈において本明細書で使用するとき、特定の治療レジメンの有効性を意味する。効力は、本発明の薬剤に応答した、疾患の経過中の変化に基づいて測定され得る。一実施形態において、治療される障害の重篤度を反映する少なくとも１つの指標において改善、好ましくは持続的な改善を引き起こすのに十分な量及び時間で、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体）が対象に対して投与される。その治療の量及び時間が十分であるかどうかを判定するために、対象の病気、疾患又は病状を反映する様々な指標が評価され得る。そのような指標には例えば、疾患重篤度、症状、又は対象となっている障害の発現についての、臨床的に認識されている指標が含まれる。全体的な改善度は医師により判定され、医師はこの判定を、徴候、症状、生検、又は他の検査結果に基づいて行うことができ、また対象に対して行うアンケート（例えば所与の疾患に関して開発された生活の質に関するアンケートなど）を採用することもできる。
【００４５】
ＮＫＧ２Ｄ特異性抗体を投与して、対象の病状の改善を達成することができる。この改善は、疾患活性指標の低下、臨床症状の寛解、又は疾患活性の任意の他の測定によって示すことができる。そのような疾患指標の１つが、クローン病活動指数（Crohn's Disease Activity Index、ＣＤＡＩ）である。この指数は８つの要素からなり、それぞれ重み係数で調整した後に合計される。ＣＤＡＩ及び重み係数の構成要素は下記の通りである。
【００４６】
【表１】
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クローン病の臨床的寛解は、ＣＤＡＩスコアが１５０未満として定義される。
【００４７】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
本発明の抗体は、特定の機能及び／又は構造的特徴又は特性により特徴付けられる。抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的活性を評価するためのアッセイは、米国特許第７，８７９，９８５号（参照により本明細書に組み込まれる）に詳しく記述されており、また構造的特徴（例えば、アミノ酸配列）も、同第７，８７９，９８５号（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００４８】
機能特性
本発明の抗体はｈＮＫＧ２Ｄに結合する。一実施形態において、本発明の抗体は、高い親和性で、例えば、１０−７Ｍ以下のＫＤ、１０−８Ｍ以下のＫＤ、１ｎＭ以下のＫＤ、０．３ｎＭ以下のＫＤ、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は０．０１ｎＭ以下のＫＤでｈＮＫＧ２Ｄに結合に結合する。特定の一実施形態において、この抗体は０．１ｎＭ以下の親和性でｈＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００４９】
一態様において、本発明は、サル（例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ＮＣＢＩ受託番号ＡＪ４２６４２９）、及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ＮＣＢＩ受託番号ＡＪ５５４３０２））における１つ又は２つ以上のＮＫＧ２Ｄオルソログにも結合する抗体を提供し、及び／又は、ｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体、適正に折り畳まれたモノマー全長ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＮＫＧ２Ｄの細胞外部分を含むｈＮＫＧ２Ｄフラグメント、変性ｈＮＫＧ２Ｄ、又は上記ＮＫＧ２Ｄ形態の任意の組み合わせに結合する抗体を提供する。例えば、米国特許第７，９８７，９８５号の実施例５に示されているように、ヒト抗体２１Ｆ２及びＭＳの特定のカニクイザル細胞型に対する結合は、対応するＥＣ５０（すなわち、５０％効果濃度）値で、同じヒト細胞型への結合に比べて、それぞれ約６５％以上及び約７５％以上である。したがって、一実施形態において、本発明の抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合と同様の親和性又は効力をもって、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合する。例えば、抗体は、ＮＫＧ２Ｄ発現ヒトＮＫ細胞又はＴ細胞の対応する母集団について、対応するＥＣ５０の、約５０％以上、約６５％以上、又は約７５％以上のＥＣ５０で、ＮＫＧ２Ｄ発現のカニクイザル又はアカゲザルのＮＫ細胞又はＴ細胞に結合し得る。付加的に又は代替的に、抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄの親和性に対して、約３０％以上、約５０％以上、約６５％以上、又は約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、又は約９０％以上の親和性で、カニクイザル又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合し得る。そのような抗体は、ヒトに使用する前に、最も好適な動物モデル（複数可）において毒性試験を行うことができる利点を有する。
【００５０】
特定の一態様において、本発明の抗体はまた、ＯＮ７２などの既知のネズミ抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が結合しないＮＫＧ２Ｄの形態に結合する。具体的には、米国特許第７，９８７，９８５号の実施例３に記述されているように、ＯＮ７２とのプレインキュベーションは、その後に添加されたヒト１６Ｆ１６抗体のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を約８２％遮断したのみであった一方、１６Ｆ１６とのプレインキュベーションは、その後に添加されたＯＮ７２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を約９５％遮断した。
【００５１】
更に、本発明の抗体は、ＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を低減又は阻害することができ、すなわちｈＮＫＧ２Ｄ受容体をアンタゴナイズすることができる。これは例えば、本明細書に記述される又は当該技術分野で既知の１つ又は２つ以上の細胞毒性アッセイで試験され得る。例えば、抗体は、それが、一切の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の不在下での、又は非特異的な対照抗体の存在下での標的細胞の殺滅に比べて、ＮＫ細胞又はＴ細胞媒介性のＮＫＧ２Ｄ−リガンド発現標的細胞殺滅を少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、更により好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％阻害する場合、ＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を阻害する。
【００５２】
ｈＮＫＧ２Ｄアンタゴニストである本発明の抗体は、アゴニスト活性を有さないか又は低いアゴニスト活性を有し得る。好ましくは、そのような抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。アゴニスト活性は、本明細書に記述される又は当該技術分野で既知のアッセイの１つにおいて試験され得る。例えば、１つのタイプのアッセイは、共刺激アッセイであり、固定化した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下又は不在下で低レベルのＣＤ３を用いて刺激した末梢血リンパ球（peripheral blood lymphocyte、ＰＢＭＣ）の増殖を測定するものである（米国特許第７，９８７，９８５号の実施例１０を参照のこと）。そのようなアッセイにおいて、本発明の抗体の存在下における増殖は、抗体の不在下に比べ、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、又は有意に上回らない。好ましくは、本発明の抗体の存在下における増殖は、抗体の不在下に比べ、有意に上回らない。付加的又は代替的な一実施形態において、アゴニストアッセイにおける本発明の抗体のｈＮＫＧ２Ｄアゴニスト活性は、対照値に比べ、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、又は有意に上回らない。この対照は好ましくは陰性対照であり、例えば、抗体の不在下、細胞又は他の試薬の不在下、及び／又は関連のない抗体の存在下である。好ましくは、本発明の抗体のアゴニスト活性は、対照値に比べ、有意に上回らない。
【００５３】
別の一態様において、本発明は、リガンド誘発細胞毒性を遮断するためのＥＣ５０濃度が、ＮＫ細胞又はＴ細胞の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに結合する場合のＥＣ５０濃度よりも低い、好ましくは実質的に低い、抗体を提供する。例えば、ＯＮ７２について、ＢａＦ／３細胞上に発現している細胞表面ＮＫＧ２Ｄに結合するためのＥＣ５０濃度（０．０６２μｇ／ｍＬ）は、リガンド（ＵＬＢＰ３）発現標的細胞のＮＫ細胞媒介性殺滅を遮断するためのＥＣ５０濃度（０．０６５μｇ／ｍＬ）と同様であり、一方、２１Ｆ２では、細胞毒性を遮断するためのＥＣ５０濃度（２１Ｆ２：０．０２１μｇ／ｍＬ；ＭＳ：０．０１２μｇ／ｍＬ）が、細胞表面ＮＫＧ２Ｄに結合する場合（２１Ｆ２：０．０３３μｇ／ｍＬ；ＭＳ：０．０３２ｇ／ｍＬ）よりも低く、ＭＳは実質的に低い（米国特許第７，９８７，９８５号の実施例６及び９を参照のこと）。更に、ＭＳは、２１Ｆ２及び１６Ｆ１６の場合の濃度（飽和濃度以上に対応する濃度、米国特許第７，９８７，９８５号の図３）よりも低い濃度（細胞に伴うＮＫＧ２Ｄ−受容体の約８０％のみの飽和に対応する濃度、米国特許第７，９８７，９８５号の図３）で細胞毒性の最大遮断を達成した。よって、一実施形態において、本発明は、リガンド誘発細胞毒性を遮断するためのＥＣ５０濃度が、ＮＫ細胞又はＴ細胞の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに結合する場合のＥＣ５０濃度よりも低い、抗体、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体を提供する。細胞株又は他の好適な調製物のＮＫ細胞又はＴ細胞の細胞毒性を遮断するためのＥＣ５０は、例えば、同じ細胞株又は調製物の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに結合する場合のＥＣ５０に比べて、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７０％以下、約５０％以下、又は約４０％以下であり得る。試験のための例示的な細胞株には、ＮＫ−９２及びＮＫＬ細胞が含まれる。
【００５４】
別の一実施形態において、本発明は、利用可能なｈＮＫＧ２Ｄ受容体を飽和させるのに必要な濃度よりも低い濃度で、ＮＫ細胞の細胞毒性の最大遮断を達成する抗体を提供する。特定の一実施形態において、この抗体は更に、ｈＮＫＧ２Ｄとの結合においてＭＳと競合する。別の具体的な一実施形態において、そのような抗体は本質的にＭＳと同じｈＮＫＧ２Ｄエピトープに結合する。
【００５５】
この抗体は、例えば、１つ又は２つ以上の内因性ｈＮＫＧ２ＤリガンドのｈＮＫＧ２Ｄ結合に干渉することによって、ＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を低減又は阻害することができる。例えば、この抗体は、例えば、ＭＩＣＡとの、又はＭＩＣＡ及びＭＩＣＢとの、又はＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３との、又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及びＵＬＢＰ３との、又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、並びにＵＬＢＰ１、−２、−３、及び４の全てとの、又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、並びに１つ又は２つ以上のＲＡＥＴ１ファミリーメンバーとの、ｈＮＫＧ２Ｄ結合を低減又は阻害することによって、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ４、及び／又はＲＡＥＴ１ファミリーメンバーのｈＮＫＧ２Ｄ結合を低減又は阻害することができる。抗体が内因性ＮＫＧ２Ｄ−リガンドのｈＮＫＧ２Ｄ結合を阻害する能力は、本明細書に記述される結合アッセイ又は競合アッセイを使用して評価することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも３０％のリガンド結合、又は少なくとも５０％のリガンド結合、又は少なくとも７０％のリガンド結合、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のリガンド結合を阻害することができる。別の一実施形態において、本発明の抗体が１μｇ  ＭＩＣＡ−ｍＦｃのｈＮＫＧ２Ｄ結合を阻害する際のＩＣ５０は、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は０．０２ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５以下、又は０．００２以下である。別の一実施形態において、１μｇ  ＭＩＣＡ−ｍＦｃ結合の完全遮断は、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、又は０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は約０．０２ｎＭ以下の抗体濃度で達成される。一実施形態において、本発明は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のいずれよりも、リガンドのｈＮＫＧ２Ｄ結合（例えば、ＭＩＣＡのｈＮＫＧ２Ｄとの結合）を低減又は阻害するのに、同等以上に有効であるような抗体、特にヒト抗体を提供する。
【００５６】
付加的に又は代替的に、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、結合の際に（すなわち、結合の後の）細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄの量を減少させることができる。抗体の結合の際の細胞表面に伴うｈＮＫＧ２Ｄの低減は、リガンド結合とそれに続く活性化に利用可能なｈＮＫＧ２Ｄ受容体の数を減らすことになるため、有利な特性であり得る。理論に制限されるものではないが、これは、ＮＫＧ２Ｄの下方調節、内在化、又はその他の機序によって生じるものであり得る。米国特許第７，９８７，９８５号に記述されているように、ヒトＦｃ領域を有する抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体（例えばヒト抗体）は、細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄの量を効果的に減少させることができる。例えば、ヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体１６Ｆ１６、ＭＳ、及び２１Ｆ２は全て、血清の不在下で一晩インキュベーションした後、細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄの量を約７５％以上減少させ、中でもＭＳが最も効果的で、低濃度で７５〜９０％の下方調節を達成した（米国特許第７，９８７，９８５号の図１５〜１７）。更に、血清の存在下で、ｈＮＫＧ２Ｄ発現ＢａＦ／３細胞の飽和濃度未満に対応するＭＳ濃度が、最大の下方調節を達成した（米国特許第７，９８７，９８５号の図１６Ｂ）。したがって、一実施形態において、本発明は、飽和濃度未満でｈＮＫＧ２Ｄの最大下方調節を達成することができる、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を提供する。別の一実施形態において、そのような抗体はまた、ｈＮＫＧ２Ｄとの結合においてＭＳと競合する。別の一実施形態において、そのような抗体はまた、ＭＳと本質的に同じｈＮＫＧ２Ｄエピトープに結合する。本発明の抗体は、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の不在下、又は非特異的対照抗体の存在下での、細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄと比較して、細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄを、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも９０％減少させることができる。好ましくは、この抗体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体シグナリングの活性化がないか又は最小限である状態（すなわちアゴニスト活性がないか最小限である状態）を生じさせながら、細胞表面ＮＫＧ２Ｄの低減を達成する。細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄ及び抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体のアゴニスト活性を評価するための例示的なアッセイは、本明細書に記述される。一実施形態において、本発明は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０から選択される対照抗体よりも高い度合の下方調節が可能であるような、抗体（特にヒト抗体）を提供する。別の一実施形態において、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、飽和濃度よりも低い濃度で、細胞又は細胞株により表現される細胞表面ＮＫＧ２Ｄの最大下方調節を達成することができる。
【００５７】
別の一実施形態において、本発明は、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び／又は２１Ｆ２、より好ましくはＭＳ及び／又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄ上のエピトープと競合し、かつ／又はこれに結合するような、抗体を提供する。そのような抗体は、本明細書に記述される標準ｈＮＫＧ２Ｄ結合アッセイにおいて、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と交差競合する能力に基づいて特定することができる。１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のｈＮＫＧ２Ｄへの結合を阻害する試験抗体の能力は、その試験抗体がｈＮＫＧ２Ｄへの結合に関して１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と競合することができ、これによって１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄ上のエピトープに結合し得ることを示している。好ましい一実施形態において、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄ上のエピトープに結合するこの抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、実施例の記述に従って調製及び単離することができる。
【００５８】
別の好ましい一実施形態において、この抗体は、マウスモノクローナル抗体ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のいずれとも異なるエピトープに結合し、リストされているマウスモノクローナル抗体のいずれに比べても、より強く１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と交差競合する。
【００５９】
一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８から選択される１つ又は２つ以上の残基を含む。一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８から選択される５つ以上の残基を含む。一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄ（配列番号９）のＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８から選択される８個、１０個、１２個又はそれ以上の残基を含む。一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄ（配列番号９）の残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８を含む。一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄの残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８から本質的になる。一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８から選択される１つ又は２つ以上の残基からなる。一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄの残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８からなる。
【００６０】
一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄ（配列番号９）のＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７から選択される、水素結合に関与する１つ又は２つ以上の残基を含む。一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７から選択される、水素結合に関与する５つ以上の残基を含む。一実施形態において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７を含む。
【００６１】
好ましい本発明の抗体は、下記の特性のうち少なくとも１つ、より好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ以上を呈する：（ａ）任意選択で、細胞に結合するＥＣ５０よりも低い、リガンド誘発性細胞毒性を低減させるＥＣ５０で、ＮＫＧ２Ｄ発現のＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を妨げること、（ｂ）ＮＫＧ２Ｄとの結合において、少なくとも１つのＮＫＧ２Ｄリガンド、好ましくは少なくともＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３と、競合すること、（ｃ）ＮＫＧ２Ｄ発現のＮＫ細胞又はＴ細胞の表面にあるＮＫＧ２Ｄの量を、好ましくは少なくとも７５％減少させること、（ｄ）ｈＮＫＧ２Ｄとの結合の親和性に比べて、カニクイザル及び／又はアカゲザルＮＫＧ２Ｄに、好ましくは５０％以上の親和性で結合すること、（ｅ）ＮＫＧ２Ｄの２つ以上の形態又はコンフォメーションに結合すること、（ｆ）１ｎＭ以下、好ましくは０．１ｎＭ以下のＫｄでＮＫＧ２Ｄに結合すること、（ｇ）ｈＮＫＧ２Ｄとの結合において、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のうち１つ又は２つ以上と競合すること、（ｈ）ｈＮＫＧ２Ｄとの結合において、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のいずれに比べても、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２とより強く競合すること、（ｉ）細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄとの１６Ｆ１６、ＭＳ、又は２１Ｆ２の結合を９０％超を遮断すること、（ｊ）アゴニスト活性をわずかしか有さないこと、（ｋ）１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ及び／又は２１Ｆ２のいずれかと実質的に同じエピトープに結合し、好ましくはＭＳ及び／又は２１Ｆ２と実質的に同じエピトープに結合すること。上記の機能特性、及び／又は実施例に記述される機能特性の任意の組み合わせが、本発明の抗体により提示され得る。
【００６２】
構造特性
好ましい本発明の抗体は、米国特許第７，８７９，９８５号（参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるように作製され、単離され、かつ構造的及び機能的に特性付けられたヒトモノクローナル抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２である。
【００６３】
抗原結合フラグメント
本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、全長抗体又はその抗原結合フラグメントとして調製することができる。抗原結合性フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的に、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８；２４２：４２３〜４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １９８８；８５：５８７９〜５８８３を参照のこと）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的にＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的にＶＨドメイン）フラグメント；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；ＶＨ単鎖及びＶＬ単鎖を含む一価分子；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７；１０：９４９〜５７を参照のこと）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに１つ又は２つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能性パラトープが挙げられ、この単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基又はポリペプチドは、一緒に会合又は連結されてもよく、これにより機能性抗体フラグメントを形成することができる。様々なタイプの抗体フラグメントが、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５；２３：１１２６〜１１３６；国際公開第２００５／０４０２１９号、並びに公開された米国特許出願第２００５／０２３８６４６号及び同第２００２／０１６１２０１号に記述及び概説されている。
【００６４】
抗体フラグメントは、従来の組換え又はタンパク質工学的手法を用いて得ることができ、このフラグメントは、無傷の抗体と同様にして抗原結合又は他の機能に関してスクリーニングすることができる。
【００６５】
抗体フラグメントの作製のために様々な手法が開発されている。慣例的に、これらのフラグメントは全長抗体のタンパク分解消化により誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＢｉｏｃｈｅＭＩＣＡｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７〜１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは現在、組換え宿主細胞によって直接に作製され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収され、化学的に連結されて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３〜１６７（１９９２））。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。他の実施形態において、選ばれる抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（single-chain Fv fragment、ｓｃＦｖ）である。国際公開第１９９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、及び同第５，５８７，４５８号を参照のこと。抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号において記述されるように「直鎖抗体」であってもよい。このような直鎖抗体フラグメントは、単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００６６】
多重特異性分子
別の一態様において、本発明は、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原フラグメントを含む多重特異性分子を特徴とする。そのような多重特異性分子には、ｈＮＫＧ２Ｄに対する少なくとも１つの第１の結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを含む、二重特異性分子が含まれる。
【００６７】
二重特異性分子の１つのタイプは、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野で周知であり、全長二重特異性抗体の慣例的な作製は通常、２本の鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９（１９８３））。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができ、又は本明細書に記述される任意の他の抗原結合性フラグメントとして調製することができる。
【００６８】
本発明による二重特異性抗体において、少なくとも１つの結合エピトープがｈＮＫＧ２Ｄタンパク質上にある。この抗ＮＫＧ２Ｄ結合部分は、炎症誘発性白血球上の分子（例えば、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８））に結合する第２の部分と組み合わせることができ、これにより、細胞防衛メカニズムを炎症誘発性ｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対して集中させることができる。この実施形態において、二重特異性抗体を使用して、例えば、ＮＫＧ２Ｄを発現する炎症誘発性細胞に細胞毒性試薬を導くために、又はこれに対するＡＤＣＣ／ＣＤＣ攻撃を導くことができる。この細胞毒性試薬は例えば、サポリン、抗インターフェロンα試薬、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、又は放射性同位元素であり得る。
【００６９】
別の実施形態では、この第２の部分は、癌、ウイルス感染などのエフェクターリンパ球により通常調節される疾患状態に関連する細胞上に提示されるか、又はそれによって発現される細胞関連標的に結合する。よって、例えば、典型的な標的は、ＭＩＣ分子（例えば、ＭＩＣ−Ａ又はＭＩＣ−Ｂ）又はＵＬＢＰ（例えば、Ｒａｅ−１、Ｈ−６０、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＨＣＭＶ  ＵＬ１８、又はＲａｅ−１β）などの細胞ストレス関連分子、あるいは、ウイルス血球凝集素などの病原関連分子であり得る。
【００７０】
その他の多重特異性分子には、ｈＮＫＧ２Ｄ結合抗体部分が１つ又は２つ以上の他の非抗体タンパク質に融合して生成されるものが含まれる。このような多重特異性タンパク質と、それらをどのように構築するかについては、当該技術分野において記述されている。例えば、Ｄｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９（４）：４８２−４８９（１９９８））；米国特許第６，０４６，３１０号；米国特許公開第２００３／０１０３９８４号；欧州特許公開第１  ４１３  ３１６号；米国特許公開第２００４／００３８３３９号；ｖｏｎ  Ｓｔｒａｎｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００６；１０７：１９５５〜１９６２）、及び国際公開第２００４／０５６８７３号を参照のこと。本発明によれば、非抗体タンパク質は、例えば、前のセクションに記載された「第２の部分」のいずれかの抗原に対する適切なリガンド、例えば、Ｔ細胞又はＦｃ受容体に対するリガンド、あるいは細胞ストレス分子（例えばＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、ＵＬＢＰ）、あるいは病原関連分子（例えばウイルス血球凝集素）であり得る。
【００７１】
２価を超える多重特異性分子もまた、想到される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：６０（１９９１）。
【００７２】
本発明の多重特異性分子は、当該技術分野で既知の方法を用いて、構成成分の結合特異性を接合することによって調製することができる。例えば、多重特異性分子の各結合特異性を別々に生成し、次いで相互に接合させることができる。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合には、様々なカップリング剤又は架橋剤を共有接合に用いることができる。架橋剤の例としては、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，Ｍ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８を参照のこと）。他の方法には、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８、１１８〜１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１〜８３）、及びＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７〜２３７５）に記述されているものが含まれる。好ましい接合試薬はＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ  ＣｈｅＭＩＣＡｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から入手可能である。
【００７３】
結合特異性が抗体である場合、これらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル（sulthydryl）結合を介して接合され得る。特に好ましい一実施形態において、このヒンジ領域は奇数個（好ましくは１つ）のスルフヒドリル残基を含むよう、接合の前に改変される。
【００７４】
あるいは、両方の結合特異性は、同じベクター内でコードされ、同じ宿主細胞において発現及び組み立てることができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの単鎖抗体及び１つの結合決定基を含む単鎖分子であるか、又は２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は少なくとも２つの単鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；米国特許第５，４８２，８５８号；米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｉｎｉｃａ〜２６（１）：１〜９；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜１５５３；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：６４４４〜６４４８；及びＧｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８に記述及び概説されている。
【００７５】
抗体変異体
本発明の抗体は更に、本明細書に開示される１つ又は２つ以上のＶＨ及び／又はＶＬ配列を有する抗体を出発物質として用い、改変された抗体又は抗体「変異体」を遺伝子工学的に操作して調製することができ、この改変された抗体は、親抗体から改変された特性を有し得る。抗体は、一方又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）（例えば１つ又は２つ以上のＣＤＲ領域、及び／又は１つ又は２つ以上のフレームワーク領域）内にある１つ又は２つ以上の残基を改変することによって操作することができる。付加的に又は代替的に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能（複数可）を改変するために、定常領域（複数可）内の残基を改変することにより操作可能である。付加的に、抗体の抗原結合部分から、他の構成体（例えば抗原結合性フラグメント、抗体誘導体、免疫結合体、及び多重特異性分子）を調製することができる。標準の分子生物学技法を使用して、改変された抗体配列を調製し発現させることができる。
【００７６】
抗体変異体又は誘導体は典型的に、「親」抗体に比較して少なくとも１つの改変された特性を有するが、この抗体変異体又は誘導体は、本明細書に記述される抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体のうち１つ、一部、又は大半を保持することができ、この機能特性には、下記のものが含まれるがこれらに限定されない：（ａ）任意選択で、細胞に結合するＥＣ５０よりも低い、リガンド誘発の細胞毒性を低減させるＥＣ５０で、ＮＫＧ２Ｄ発現のＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を妨げること、（ｂ）ＮＫＧ２Ｄとの結合において、少なくとも１つのＮＫＧ２Ｄリガンド、好ましくは少なくともＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３と、競合すること、（ｃ）ＮＫＧ２Ｄ発現のＮＫ細胞又はＴ細胞の表面にあるＮＫＧ２Ｄの量を、好ましくは少なくとも７５％減少させること、（ｄ）カニクイザル及び／又はアカゲザルＮＫＧ２Ｄに、好ましくは実質的に同様の効力又は親和性で結合すること、（ｅ）ＮＫＧ２Ｄの２つ以上の形態又はコンフォメーションに結合すること、（ｆ）１ｎＭ以下、好ましくは０．１ｎＭ以下のＫｄでＮＫＧ２Ｄに結合すること、（ｇ）１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のうち１つ又は２つ以上と競合すること、（ｈ）ｈＮＫＧ２Ｄとの結合において、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のいずれに比べても、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２とより強く競合すること、（ｉ）細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄとの１６Ｆ１６、ＭＳ、又は２１Ｆ２の結合を９０％超を遮断すること、（ｊ）ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のいずれよりも低い、ｈＮＫＧ２Ｄに対するアゴニスト活性を有すること。上記の機能特性、及び／又は実施例に記述される機能特性の任意の組み合わせが、本発明の抗体により提示され得る。
【００７７】
抗体変異体及び誘導体の機能特性は、当該技術分野で利用可能な及び／又は本明細書に記載される標準アッセイを用いて評価することができる。例えば、抗体がｈＮＫＧ２Ｄに結合する能力は、例えば実施例に示されているような標準の結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、又はＥＬＩＳＡ）を用いて決定することができる。
【００７８】
核酸
本発明の別の一態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、細胞全体中、細胞溶解物中、又は部分的に精製された又は実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準技法（アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び他に当該技術分野で周知のもの）によって、他の細胞成分又は他の混入物（例えば他の細胞の核酸又はタンパク質）から精製分離されたときに、「単離された」又は「実質的に純粋にされた」状態となる。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、あるいは、イントロン配列を含んでいてもいなくてもよい。好ましい一実施形態において、この核酸は、ｃＤＮＡ分子である。以下の段落は、ＤＮＡ配列又はその使用を参照するが、一般に、ｍＲＮＡ配列にも同じ方法又は原理を適用することができる。
【００７９】
本発明の核酸は、標準の分子生物学的技法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、下記に更に詳述されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を擁する遺伝子組換えマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体については、ハイブリドーマにより生成される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準のＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技法によって取得することができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えばファージディスプレイ技法を用いて）得られる抗体については、抗体をコードする核酸はライブラリから回収することができる。
【００８０】
本発明の好ましい核酸分子は、米国特許第７，８７９，９８５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００８１】
一塩基多型（ＳＮＰ）
本発明の一態様において、対象のＮＫＧ２Ｄ受容体及び／又はＮＫＧ２Ｄリガンドのための遺伝子における遺伝的多型が、評価された。一実施形態において、このＮＫＧ２ＤリガンドはＭＩＣＢである。ＭＩＣＢ−ｒｓ２２３９７０５ＳＮＰは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する既知のリガンドであるＭＩＣＢタンパク質の発現レベルに関係する、ＭＩＣＢ遺伝子の変異体である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／及びＭＩＣＢ［ＮＫＧ２Ｄリガンド］ＳＮＰ  ｒｓ２２３９７０５（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ｄｂＳＮＰ））．Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｄｂＳＮＰ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：｛２２３９７０５｝，（ｄｂＳＮＰ  Ｂｕｉｌｄ  ＩＤ：｛１５０｝）から入手可能）。ｒｓ２２５５３３６ＳＮＰは、ＮＫＧ２Ｄタンパク質の発現レベルに関係する、ＮＫＧ２Ｄ受容体遺伝子の変異体である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／及びＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ｄｂＳＮＰ））．Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｄｂＳＮＰ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：｛２２５５３３６｝，（ｄｂＳＮＰ  Ｂｕｉｌｄ  ＩＤ：｛１５０｝）から入手可能）。クローン病のＮＫＧ２Ｄ抗体臨床試験から得た効力データの事後解析により、ｒｓ２２５５３３６ＳＮＰを有する対象サブ群においてＮＫＧ２Ｄ抗体の力がより高いことが示されている。
【００８２】
【表２】
2019528285.tif 000004
【００８３】
抗体作製
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来型のモノクローナル抗体手法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準体細胞ハイブリダイゼーション技法）を含む、様々な技法により作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原理的には、モノクローナル抗体を作製するための他の技法（例えば、Ｂリンパ球のウイルス性又は腫瘍性形質転換など）を用いることができる。
【００８４】
ハイブリドーマを調製するための１つの好ましい動物系は、ネズミ科系である。融合のための免疫化脾細胞の単離の免疫化プロトコル及び技法は、融合パートナー（例えば、ネズミ骨髄腫細胞）及び融合手順と同様、当該技術分野で周知である。本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体は更に、確立された技法を用いてネズミモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準の分子生物学技法を用いて、関心対象のネズミハイブリドーマから取得し、非ネズミ（例えばヒト）の免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を生成するために、当該技術分野で周知の方法を使用して、ネズミ可変領域をヒト定常領域に連結させることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと）。ヒト化抗体を生成するためには、当該技術分野で周知の方法を使用して、ネズミＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ）、及び米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、及び同第６，１８０，３７０号（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと）。
【００８５】
好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ｈＮＫＧ２Ｄに対応するよう導かれたそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の部分を擁する遺伝子組換え又は染色体改変マウスを用いて生成することができる。これらの遺伝子組換え及び染色体改変マウスには、それぞれＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと呼ばれるマウスが含まれ、これらは本明細書において「ヒトＩｇマウス」と総称される。ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、再配列されていないヒト重鎖（ｐ及びｙ）及びＫ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座と、内因性のｕ及びＫ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異とを含む（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ、ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９を参照のこと）。したがって、このマウスは、マウスＩｇＭ又はＫの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子には、クラススイッチ及び体細胞突然変異が起こり、高親和性ヒトＩｇＧＫモノクローナルを生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）（上記）；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９〜１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３、及びＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６〜５４６において概説）。ＨｕＭａｂマウスの調製及び使用と、そのようなマウスが擁する遺伝子改変については、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７〜６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７〜６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０〜３７２４；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７〜１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１〜８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２  ２９２０；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９〜５９１；及びＦｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１に更に記述されており、これらの内容は全て、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる。更に、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、及び同第５７７０４２９号（全てＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙ）；米国特許第５，５４５，８０７号（Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）；国際公開第��２／０３９１８号、同第９３／１２２２７号、同第９４／２５５８５号、同第９７／１３８５２号、同第９８／２４８８４号、及び同第９９／４５９６２号（全てＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙ）；及び国際公開第０１／１４４２４号（Ｋｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと。別の一実施形態において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子及び導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を擁するマウス（例えばヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を擁するマウス）を使用して育てることができる。そのようなマウスは、本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれ、国際公開第０２／４３４７８号（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．）に詳述されている。また更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の遺伝子組換え動物系が当該技術分野で利用可能であり、これを使用して本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を育てることができる。例えば、キセノマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｉｎｃ．）と呼ばれる代替の遺伝子組換え系を使用することができ、そのようなマウスは、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１５０，５８４号、及び同第６，１６２，９６３号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記述されている。更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の染色体改変動物系が当該技術分野で利用可能であり、これを使用して本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を育てることができる。例えば、ヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体の両方を擁するマウスは、「ＴＣマウス」と呼ばれ、これを使用することができる。そのようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２〜７２７に記述されている。更に、ｃｏｗｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ヒト重鎖及び軽鎖導入染色体を有するウシが当該技術分野において記述されており（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９〜８９４）、これを抗ｈＮＫＧ２Ｄ本発明の抗体を育てるのに使用することができる。
【００８６】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野にて確立されている。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、及び同第５，５７１，６９８号（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、同第５，４２７，９０８号及び同第５，５８０，７１７号（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、同第５，９６９，１０８号及び同第６，１７２，１９７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．）、並びに同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、及び同第６，５９３，０８１号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと。ヒトモノクローナル本発明の抗体は、ヒト免疫細胞を再構成したＳＣＩＤマウスを使用して調製することもでき、これによって免疫時にヒト抗体応答が生成され得る。そのようなマウスは例えば、米国特許第５，４７６，９９６号及び同第５，６９８，７６７号（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記述されている。
【００８７】
ヒトＩｇマウスを使用して本発明のヒト抗体を育てる場合、そのようなマウスは、ｈＮＫＧ２Ｄ抗原の精製又は濃縮調製物、及び／又はｈＮＫＧ２Ｄを発現している細胞で免疫化することができ、これについては、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６〜８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８４５〜８５１；並びに国際公開第９８／２４８８４号及び同第０１／１４４２４号に記述されている。好ましくは、このマウスは最初の注入時に６〜１６週齢である。例えば、ｈＮＫＧ２Ｄ抗原の精製又は濃縮調製物（５〜５０μｇ）を使用して、ヒトＩｇマウスを腹腔内で免疫化することができる。ｈＮＫＧ２Ｄ抗原の精製又は濃縮調製物を使用した免疫化によって抗体を生じない場合は、マウスは、ｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞（例えば、ヒトＮＫ細胞又はＴ細胞株、又は組換えｈＮＫＧ２Ｄを発現している哺乳類細胞（ＤＡＰ１０を含むもの又は含まないもの））で免疫化することができ、これにより免疫応答を促進することができる。
【００８８】
ｈＮＫＧ２Ｄに対する完全なヒトモノクローナル抗体を精製する詳細な手順は後述の実施例１に記述されている。投与される抗原の形態及び量（例えば、ｈＮＫＧ２Ｄポリペプチド、又はｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞）、並びに投与スケジュールと可能なアジュバントの使用（例えば、完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバント）は、典型的に、当該技術分野で確立されている方法により、各抗原−マウス系で最適化される。
【００８９】
この免疫応答は、眼窩後方出血により得られる血漿サンプルを用いた免疫化プロトコルの経過にわたってモニターすることができ、この血漿又は血清がＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ（後述）、抗ｈＮＫＧ２Ｄヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスが融合術に使用され得る。マウスは、殺処分の３日前に経静脈で抗原をブーストすることができ、殺処分後に脾臓を摘出する。各免疫化について２〜３回の融合を実施する必要があり得ることが想定される。
【００９０】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫化されたマウスの脾細胞及び／又はリンパ節細胞を単離し、これを適切な不死化細胞株（例えばマウス骨髄腫細胞株）に融合することができる。得られたハイブリドーマは、抗原特異的抗体の産生のためにスクリーニングすることができる。例えば、免疫化マウスから得た脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧと共に、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）の数の１／６に、融合させることができる。あるいは、この細胞は電気融合により融合させることができる。細胞は平底マイクロタイタープレートに約２×１０５接種し、次に、２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％Ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは融合から２４時間後に加える）を含む選択培地中で２週間インキュベーションする。約２週間後、細胞を、ＨＡＴをＨＴで置き換えた培地で培養することができる。次に個々のウェルをＥＬＩＳＡにより、ヒトモノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体に関してスクリーニングできる。大量のハイブリドーマの増殖が起これば、通常１０〜１４日後に培地が観察できる。この抗体分泌ハイブリドーマを再接種し、再びスクリーニングし、依然としてヒトＩｇＧに関して陽性であれば、そのモノクローナル抗体は限界希釈により少なくとも２回サブクローニングされ得る。この安定なサブクローンを次にインビトロで培養して、特性評価のために組織培地中で少量の抗体を生成させることができる。ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ中で成長させることができる（モノクローナル抗体精製のため）。上澄み液を濾過し、濃縮してから、タンパク質Ａ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）でアフィニティクロマトグラフィーを行う。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィーでチェックし、純度を確認できる。緩衝液をＰＢＳに交換することができ、分光法により濃度を決定することができる。モノクローナル抗体は部分標本に分け、−８０°で保存できる。
【００９１】
本発明の抗体は更に、宿主細胞トランスフェクトーマで産生させることができ、これは例えば、当該技術分野で周知のように、組換えＤＮＡ技法と遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを用いる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２）。
【００９２】
例えば、抗体を発現させるために、部分的又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、標準の分子生物学的技法（例えば、関心対象の抗体を発現するハイブリドーマを用いたＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、このＤＮＡは、発現ベクターに挿入することができ、これによってこの遺伝子は、転写及び翻訳制御配列に動作可能に連結され、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を提供することができる。
【００９３】
この発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合性であるように選ばれる。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ、より典型的には、両遺伝子が同一の発現ベクターに挿入される。この抗体遺伝子は、標準的方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補性制限部位のライゲーション、又は、制限部位がない場合は平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書に記述される抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を使用して、望ましいアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターにこれらを挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を生成することができ、これによって、ＶＨセグメントはそのベクター内でＣＨセグメント（複数可）に動作可能に連結され、ＶＬセグメントはそのベクター内でＣＬセグメントに動作可能に連結される。追加的に又は代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム内結合するように、ベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
【００９４】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内の抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を擁する。用語「制御配列」は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記述されている。
【００９５】
制御配列の選択を含む発現ベクター設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどの要素に依存し得ることが、当業者には理解されよう。哺乳類の宿主細胞発現の好ましい制御配列には、哺乳類細胞の高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（Simian Virus 40、ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（adenovirus major late promoter、ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマ）に由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが含まれる。あるいは、非ウイルスの制御配列、例えば、ユビキチンプロモーター又はｐ−グロビンプロモーターなどを使用することができる。また更に、制御要素は、例えばＳＲａプロモーター系（これは、ＳＶ４０早期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１の長い末端反復の配列を含む）などの様々な取得源から得た配列からなる（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６〜４７２）。
【００９６】
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞のベクター（例えば複製元）及び選択可能なマーカー遺伝子の複製を制御する配列などの追加の配列を擁し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号（全てＡｘｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと）。例えば、典型的に、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する抵抗性を付与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase、ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−宿主細胞で使用するため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
【００９７】
軽鎖及び重鎖の発現については、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準技法により宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、外来性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞内に導入するのに一般的に使用される幅広い技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。原核又は真核宿主細胞のいずれでも本発明の抗体を発現させることが理論的に可能ではあるが、真核細胞、特に哺乳類細胞は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築しかつ分泌する可能性が高いため、そのような真核細胞（最も好ましくは哺乳類宿主細胞）における抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核細胞発現は、活性抗体の高収量を産生するには非効率的であることが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２〜１３）。
【００９８】
本発明の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary、ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１〜６２１に記述されるようにＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６〜４２２０に記述されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞が含まれる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するための、他の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、同第８９／０１０３６号、及び欧州特許第ＥＰ３３８，８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入すると、抗体は、宿主細胞において抗体を発現させるのに十分な時間、あるいは、より好ましくは、宿主細胞が増殖する培地へ抗体を分泌させるのに十分な時間にわたって、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。
【００９９】
抗体の特徴評価
産生又は精製の後、又はスクリーニング若しくは選択手順の一環として、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の機能特徴評価を調査することができる。関心対象の機能特性には、例えば、ｈＮＫＧ２Ｄに対する抗体結合特異性、ｈＮＫＧ２Ｄ−リガンドとの抗体競合、参照抗体（例えば、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２）との抗体競合、抗体が結合するエピトープ、抗体−抗原相互作用の親和性、並びに抗体のアンタゴニスト／アゴニスト特性が含まれる。
【０１００】
下記は、抗体特徴評価のための例示的なアッセイの簡単な記述である。いくつかは後続のセクション及び／又は実施例において更に記述される。
（１）ｈＮＫＧ２Ｄの抗体特異性は、モノクローナル抗体（又は、動物スクリーニング手順の一環として、ポリクローナル抗体を含む血清）が、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合するが、ＮＫＧ２Ｄ陰性細胞には結合しないことを確認することにより、評価することができる。ＮＫＧ２Ｄを伴う又は伴わない細胞株を、抗体と共にインキュベートし、次に直接標識された二次抗体と共にインキュベーションし、例えば、フローサイトメトリーで可視化する。
（２）リガンド結合の遮断は、抗体又はハイブリドーマ上澄み液と共に又はなしで、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞のインキュベーションを行い、次にリガンド−ｍＦｃタンパク質及びそのリガンドに特異性の二次抗体と共にインキュベーションすることによって評価することができ、リガンド結合及びその遮断のレベルがフローサイトメトリーにより決定される。遮断は、プレインキュベーション時により低い結合が見られる場合、プレインキュベーションなしの場合に比べ、プレインキュベーションを伴う場合のリガンド結合％として計算することができる。
（３）１つ又は２つ以上の参照抗ＮＫＧ２Ｄ抗体により使用される結合部位の競合は、同様にして評価することができるが、ただし、プレインキュベーションは、本発明の抗体で実施するか、又は、参照抗体（例えば、ＯＮ７２又は１４９８１０）で実施することができ、次いで、後続で追加された抗体と共にインキュベーションし、検出を行う。
（４）抗体の親和性パラメータ（抗体のオンレートとオフレートを含む）は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置で決定することができる。例えば、ｈＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をチップ上に固定化することができ、抗体がこのチップの上を通過し、オンレートとオフレートを決定し、ＫＤが計算される。
（５）抗体によるＮＫＧ２Ｄ内在化の誘導は、抗体あり又はなしで一晩ｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞をインキュベートし、次に抗体を再び加え、フローサイトメーターでＮＫＧ２Ｄの結合レベル（すなわち結合している抗体のレベル）を検出する。
（６）抗体がｈＮＫＧ２Ｄ−リガンド媒介性殺滅を遮断する能力は、例えば、ＮＫ細胞株ＮＫ９２又はＮＫＬをエフェクター細胞として使用し、これがＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する５１Ｃｒ搭載標的細胞（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はＵＬＢＰ１〜４）を用いて評価することができる。
（７）ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヒトの）ではなくサルのＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞との、ヒト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の交差反応性は、サル及びヒトのＰＢＭＣをｈＮＫＧ２Ｄ抗体及び二次抗体と共に、ＰＢＭＣにおいて異なる細胞タイプのマーカーも一緒に、インキュベーションした後に、フローサイトメトリーにより示すことができ、様々なサブセットのＮＫＧ２Ｄ染色を解析することができる。
（８）抗体結合時のＮＫＧ２Ｄの活性化は、事前刺激あり又はなしで、（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ２８及びＩＬ−２又はＩＬ−１５を介して）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８及び／又はＮＫＧ２Ｄを介した刺激の際に、ＰＢＭＣ母集団において、ＣＤ８＋細胞の細胞増殖の誘導として測定することができる。
【０１０１】
結合アッセイ
本発明は、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する抗体、並びにその抗原結合性フラグメント及び免疫結合体を提供する。幅広い種類のアッセイの内任意のものを使用して、ｈＮＫＧ２Ｄに対する抗体の結合を評価することができる。とりわけ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、ＢＩＡＣＯＲＥ、及び他の競合アッセイが使用に好適であり、これらは当該技術分野で周知である。更に、競合アッセイを含むいくつかの結合アッセイが、米国特許第７，８７９，９８５号の実施例に記述されている。
【０１０２】
例えば、単純な結合アッセイを使用することができ、ここにおいて試験抗体は標的タンパク質又はエピトープ（例えば、ＮＫＧ２Ｄ又はその一部分）の存在下でインキュベートされ、未結合抗体を洗い流し、結合抗体の存在が、例えば、放射性同位体標識付け、質量分析などの物理的方法、あるいは、細胞蛍光分析（例えばＦＡＣＳｃａｎ）を用いて検出される直接的又は間接的な蛍光標識付けを使用して評価される。これらの方法は当業者には周知である。対照の非特異的抗体で見られる量を上回る結合量があれば、その抗体がその標的に特異的に結合していることを意味する。
【０１０３】
そのようなアッセイにおいて、試験抗体が標的の細胞又はヒトＮＫＧ２Ｄに結合する能力は、同じ標的に対する、（陰性）対照タンパク質（例えば、構造的に無関係の抗原に対して育てられた抗体、又は非Ｉｇペプチド又はタンパク質）と比較することができる。任意の好適なアッセイを用いて、対照タンパク質に比べて２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％、又はそれ以上高い親和性を備えているような、標的細胞又はＮＫＧ２Ｄに結合する抗体又はフラグメントは、その標的に「特異的に結合」又は「特異的に相互作用」すると表現され、これらは後述する治療法での使用に好ましい。更に、ＮＫＧ２Ｄに対する（陽性）対照抗体（例えば１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２）の結合に影響する、試験抗体の能力も、評価することができる。
【０１０４】
一態様において、本発明は、生物学的特性及び／又は実質的なＶＨ及び／又はＶＬ配列同定を、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と共有するような、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。１つの例示的な生物学的特性は、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２エピトープ（すなわち、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２抗体が結合するｈＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン内のそれぞれの領域）との結合である。１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、通常の交差遮断アッセイ（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記述されているもの）を使用することができる。
【０１０５】
例示的な交差遮断又は競合アッセイにおいて、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２（対照）抗体と試験抗体とを混合し（又は事前に吸着させ）、ＮＫＧ２Ｄを含むサンプルに適用することができる。特定の実施形態において、対照抗体を、様々な量の試験抗体（例えば、１：１０又は１：１００）と予め混合し、所定の時間が経過してから、ＮＫＧ２Ｄ含有サンプルに適用することができる。他の実施形態において、抗原／標的サンプルへの曝露中に、対照と、様々な量の試験抗体とを、単に混合することができる。結合抗体を遊離抗体から識別することができ（例えば、分離又は洗浄技法を用いて未結合抗体を除去することにより）、かつ、対照抗体を試験抗体から識別することができる（例えば、種特異性又はアイソタイプ特異性の二次抗体の使用、検出可能な標識で対照抗体を特異的に標識付けする、あるいは、質量分析などの物理的方法を用いて、異なる物質を識別するなどにより）限りにおいて、対照抗体の抗原に対する結合を試験抗体が減少させているかどうかを判定することができ、これにより、その試験抗体が、対照と同じエピトープを実質的に認識していることを示すことができる。このアッセイにおいて、完全に無関係な抗体の存在下での、（標識付けられた）対照抗体の結合は、高対照値となる。低対照値は、標識付けられた（陽性）対照抗体と、標識付けられていない対照抗体とをインキュベートすることによって得られ、このとき競合が発生し、標識抗体の結合が減少する。
【０１０６】
試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で、標識抗体の反応性が有意に減少するということは、試験抗体が、標識された対照抗体と同じエピトープを認識すること（すなわち「交差反応」）を示す。任意の対照：試験抗体比、又は約１：１０〜約１：１００の化合物で、標識対照の抗原／標的に対する結合を、少なくとも５０％、又はより好ましくは少なくとも７０％減少させる試験抗体又は化合物がある場合は、抗体又は化合物が、対照と実質的に同じエピトープ又は決定基に結合していると見なされる。好ましくは、そのような試験抗体又は化合物は、対照の抗原／標的との結合を少なくとも９０％減少させる。それにもかかわらず、対照抗体又は化合物の結合を測定可能な程度で低減させるような何らかの化合物又は抗体を、本発明において用いることができる。
【０１０７】
一実施形態において、競合はフローサイトメトリー試験によって評価することができる。ｈＮＫＧ２Ｄを有する細胞を最初に、受容体との特異的結合が知られている対照抗体（例えば、ｈＮＫＧ２Ｄを発現しているＴ細胞又はＮＫ細胞、又はｈＮＫＧ２Ｄを組換えにより発現しているＢａＦ／３細胞、及び１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２抗体）と共にインキュベートし、次に、蛍光色素又はビオチンで標識付けされ得る試験抗体と共にインキュベートする。試験抗体は、飽和量の対照抗体とのプレインキュベーションにより得られた結合が、対照とのプレインキュベーションなしでの抗体により得られた結合の８０％、好ましくは、５０％、４０％又はそれ以下（蛍光平均）であるとき、対照と競合すると言われる。あるいは、試験抗体は、飽和量の試験抗体と共にプレインキュベートされた細胞上の標識付けされた対照（蛍光色素又はビオチンによって）で得られる結合が、抗体とのプレインキュベーションなしで得られた結合の、８０％、好ましくは５０％、４０％又はそれ以下であるとき、対照と競合すると言われる。例示的な抗体競合アッセイについては実施例５を参照されたい。
【０１０８】
また同様の交差遮断アッセイを使用して、単に１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２をｈＮＫＧ２Ｄ−リガンドの好適な形態と交換することによって、試験（ヒト化）抗体が、ヒトＮＫＧ２Ｄの天然のリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、又はＲＡＥＴ１ファミリーメンバー）の結合に影響するかどうかを評価することができる。１つの好適な形態は、実施例に記述されており、リガンド（例えば、ＭＩＣＡ）と抗体のＦｃ部分との融合タンパク質である。リガンドがＦｃ領域に接合していることにより、そのＦｃ領域が由来する動物種に固有の抗体により融合タンパク質の検出が可能になる。例えば、ヤギの抗マウス抗体を用いて、ネズミＦｃ領域を検出することができる。
【０１０９】
一実施形態において、細胞アッセイが使用され、ここにおいてｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞（例えば、関節リウマチ患者から得たＣＤ４＋ＣＤ２８−細胞、又は、別の免疫疾患又は炎症性疾患から得た同等の細胞）を、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えばＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はＵＬＢＰタンパク質など）と共に、これらリガンドのいずれかを発現するＦｃ−融合タンパク質の形態で、又はこれらリガンドのいずれかを発現する細胞の形態で、インキュベートされ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又は他の分子がその細胞の活性を遮断する能力が評価される。別の一アッセイにおいて、ＮＫＧ２Ｄ受容体の活性のベースラインレベルは、リガンドが存在しない状態で得られ、抗体又は化合物がこのベースライン活性レベルにおいて減少を引き起こす能力が検出される。あるタイプの実施形態において、高スループットスクリーニングアプローチを使用して、受容体の活性化を遮断するか、又は下方制御することができる化合物を特定することができる。例示的なリガンド競合アッセイについては実施例３を参照されたい。
【０１１０】
好ましくは、ＮＫＧ２Ｄエピトープを認識するモノクローナル抗体は、関節リウマチなどの患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞（特にＣＤ４＋ＣＤ２８Ｔ細胞）にかなりの割合で存在するエピトープと反応するが、他の細胞（すなわち、ＮＫＧ２Ｄを発現しない免疫細胞又は非免疫細胞）とは顕著には反応しない。したがって、ＮＫ細胞又はＴ細胞上のｈＮＫＧ２Ｄを特異的に認識する抗体は、関節リウマチなどの自己免疫又は炎症性疾患の患者から採取したＴ細胞に結合する能力に関して試験することができる。本発明は、受容体を発現している細胞型（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）にかかわらず、ＮＫＧ２Ｄ活性が疾患の病理に関係しているような任意の疾患の治療に使用することができ、この抗体は、その特定の疾患に関連しているどの細胞型であれ、それに受容体が結合する能力について試験できることが、理解されよう。例えば、特定の疾患がＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ細胞の過剰活性又は増殖に関連していることが観察された場合、この抗体は、同じ受容体を発現するＮＫ細胞を使用して開発及び試験することができる。
【０１１１】
一実施形態において、この抗体は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（例えば関節リウマチ患者から採取したＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔ細胞）に結合する能力を試験するイムノアッセイにおいて検証される。例えば、末梢血リンパ球（peripheral blood lymphocyte、ＰＢＬ）は複数の患者から採取され、ＣＤ４＋、好ましくはＣＤ４＋ＣＤ２８−細胞は、例えば、関連する抗体を用いたフローサイトメトリーによって、そのＰＢＬから濃縮される。次に、所与の抗体が細胞に結合する能力が、当業者に周知の標準的方法を使用して評価される。かなりの割合の患者（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上）で、ＮＫＧ２Ｄを発現することが知られている細胞（例えばＲＡ患者から得たＮＫ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞など）のかなりの割合（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上）に結合することが見出されている抗体は、患者の細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を決定するための診断目的と、又は本明細書に記述される治療方法に使用するため（例えば、ヒトに好適な遮断抗体又は細胞毒性抗体として使用するため）との両方について、本発明における使用に好適であると見なすことができる。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体は直接的又は間接的に標識付けされ得る。間接的に標識付けられる場合、二次標識抗体が典型的に追加される。次に、抗体の細胞に対する結合が、例えば細胞蛍光分析（例えばＦＡＣＳ）を用いて検出され得る。このような方法は当該技術分野において周知である。
【０１１２】
本発明のいくつかの態様において、例えば、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞を殺滅することが望ましくない場合、本発明の抗体は好ましくは、Ｆｃ受容体に対する実質的な特異的結合を示さない。そのような抗体は、Ｆｃ受容体に結合しないことが知られている様々な重鎖の定常領域を含み得る。そのような例の１つが、ＩｇＧ４定常領域である。あるいは、定常領域を含まない抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメント）を、Ｆｃ受容体結合を回避するために使用することができる。Ｆｃ受容体結合は、当該技術分野で周知の方法に従って評価することができ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおいてＦｃ受容体タンパク質に対する抗体の結合を試験することができる。更に、任意の他の抗体タイプを使用することができ、ここにおいてＦｃ部分は、Ｆｃ受容体に対する結合を最小限にする又はなくすように改変される（例えば、国際公開第０３／１０１４８５号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。Ｆｃ受容体結合を評価するためのアッセイ（例えば細胞ベースのアッセイ）は、当該技術分野で周知であり、例えば、国際公開第０３／１０１４８５号に記述されている。
【０１１３】
機能性アッセイ
ＮＫＧ２Ｄ活性を反映する、任意の好適な生理学的変化を使用して、試験化合物又は抗体の利用性を評価することができる。例えば、細胞ベースのアッセイにおいて、様々な効果（例えば、遺伝子発現、サイトカイン産生、シグナリング分子リン酸化、細胞成長、細胞増殖、ｐＨ、細胞外二次情報伝達物質（例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、又はｃＡＭＰ）における変化、又は活性（例えば、細胞毒性活性、又は他のＴ細胞を活性化する能力）における変化）を、測定することができる。例えば、受容体の活性は、ＮＫＧ２Ｄ応答性遺伝子（例えば、ＣＤ２５、ＩＦＮ−γ、又はＴＮＦ−α）の発現を検出することによって評価され得る（例えば、Ｇｒｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ１００：９４５２〜９４５７；Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１〜１１を参照のこと）。あるいは、ＮＫＧ２Ｄ活性は、リガンドの存在下で、又は活性化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下で、並びに抗ＣＤ３抗体の存在下で、ＣＤ４＋ＣＤ２８−ＮＫＧ２Ｄ＋細胞をインキュベートすることにより、その化合物又は試験抗体がＴ細胞によるＴＮＦ−α又はＩＦＮ−γの放出を阻害する能力を評価することができる。あるいは、ＣＤ４＋ＣＤ２８−ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞は、リガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、ＵＬＢＰ−３など）の存在下で、又はリガンド産生細胞（例えば、自家ＭＩＣ＋ＲＡ滑膜細胞）の存在下で、インキュベートすることができ、その試験抗体又は化合物が、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α）、又はＴ細胞増殖を阻害する能力が、評価され得る。
【０１１４】
インビトロアッセイは、自己免疫又は炎症性疾患（例えばＲＡ）の患者から採取した細胞（例えば、ＲＡ患者から採取したＮＫＧ２Ｄを発現するＣＤ４＋ＣＤ２８−細胞（又はそれに由来する細胞株））を任意選択で使用することができるが、一般に任意のＮＫＧ２Ｄ発現細胞を使用することができる。例えば、受容体の発現が細胞の活性を検出可能な方法で変えるものである限り（例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドにより活性可能になるなど）、非ＲＡ免疫細胞株（例えばＴ細胞株）を、ＮＫＧ２Ｄをエンコーディングする導入遺伝子でトランスフェクトして本アッセイで使用することができる。細胞株は、例えば、ＲＡ患者のＣＤ４＋ＣＤ２８−ＮＫＧ２Ｄ＋細胞（例えば、滑液組織から単離されたＰＢＬ又はＴ細胞）を用いて確立することができる。そのような細胞は、ＮＫＧ２Ｄの継続的な発現を確実にするために、ＩＬ−１５の存在下で培養され得る（例えば、Ｇｒｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ１００：９４５２〜９４５７（この全開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１１５】
抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が１つ又は２つ以上のそのリガンドとのＮＫＧ２Ｄ相互作用を低減若しくは遮断する場合、又はｈＮＫＧ２Ｄリガンド相互作用を遮断することが知られている抗体と競合する場合、これは、ＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を低減させるのに有用であり得る。これは、典型的な細胞毒性アッセイによって評価することができる。実施例６は、例示的な細胞毒性アッセイ（標的細胞のＮＫＧ２Ｄ−リガンド媒介性殺滅）について記述している。ここで、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体がＭＩＣＡ−トランスフェクトされたＢａＦ／３のＮＫ細胞媒介性殺滅を低減又は阻害する能力は、５１Ｃｒの標的細胞放出を測定することにより評価される。
【０１１６】
他の態様において、本発明の抗体が実質的なアゴニスト活性を欠いていることを確実にすることが望ましい可能性がある。この目的のために、下記を含め、いくつかのアッセイを使用することができる。
【０１１７】
１つのアッセイは、可溶性又はプレート結合のいずれかで、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体との組み合わせで、健康なボランティア又はＩＢＤ患者から得たＰＢＭＣの、抗体活性化の後の増殖及びサイトカイン産生を評価することができる。この方法において、ＰＢＭＣは、健康な対象又は炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease、ＩＢＤ）患者から従来の方法で精製される。この細胞はＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｃ３４５５４）で染色される。１０７個の細胞（０．５ｍＬ  ＰＢＳ、２％ＦＣＳ中）に、１μＬ  ＣＦＳＥ（０．５ｍＭ）を加え、この細胞を３７℃で１０分間インキュベートする。次に、２ｍＬ  ＦＣＳを加え、この混合物を室温で１分間放置する。この細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１２ｍＬ）を用いて遠心分離で３回洗う。洗浄後、この細胞を、２％ＦＣＳの１ｍＬの培地（例えばＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁させる。
【０１１８】
９６ウェルプレートを、３０μＬの抗マウスＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１５−００６−００８）で２時間室温でコーティングし、次にＰＢＳで洗う。下記のスキームに従って抗体（抗ＣＤ３Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅカタログ番号１４−００３７−８２、抗ＣＤ２８カタログ番号３４８０４６  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｓｏｎ）を加え、ウェル内に残す：
細胞のみ
ＣＤ３  ０．１又は０．３ｎｇ／ｍＬ
ＣＤ３  ０．１又は０．３ｎｇ／ｍＬ＋ＣＤ２８  ０．２μｇ／ｍＬ
ＣＤ３  ０．１又は０．３ｎｇ／ｍＬ＋ＣＤ２８  ０．２μｇ／ｍＬ＋抗ＮＫＧ２Ｄ０．２μｇ／ｍＬ
ＣＤ３  ０．１又は０．３ｎｇ／ｍＬ＋抗ＮＫＧ２Ｄ０．２μｇ／ｍＬ
【０１１９】
次に、１００．０００ＣＦＳＥ標識付けられたＰＢＭＣを加え、３日間置く。次に上澄み液をサイトカイン分析のため回収し、ＰＢＭＣは、増殖のため抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及びＣＦＳＥ標識されたリンパ球のタイプに関して、フローサイトメトリーで分析される。
【０１２０】
別のアッセイにおいて、ＮＫＧ２Ｄリガンドを欠く標的細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性ポテンシャルの影響が、試験される。結合により細胞の細胞毒性ポテンシャルが上昇する場合は、アゴニスト活性が存在する。簡単に言うと、健康な対象から得たＩＬ−２刺激されたＰＢＭＣを、ＭＩＣＡを発現しているｐ８１５細胞と共にインキュベートし、又はトランスフェクトされていないｐ８１５細胞及び抗ＣＤ３抗体（これは、ｐ８１５細胞上のＦｃ受容体に結合することにより、再配向された殺滅をもたらす）、及びＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞と共にインキュベートする。次に、ｐ８１５細胞に結合しない抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（例えば、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの抗体）が、ＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ向け結合を遮断するかどうか、及び／又は、その抗体がＣＤ３−ｐ８１５再配向結合を増加させるかどうかについて、分析される。このようにして、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性は、抗ＣＤ３抗体及び追加の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体と共にｐ８１５細胞をインキュベートすることによって強化されるものではないことを示すことができ、一方、同じ抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、同じＰＢＭＣ母集団においてｐ８１５誘発の殺滅に対するＮＫ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断することを示すことによって、機能性であることを示すことができる。
【０１２１】
別のアッセイにおいて、ＮＫＧ２Ｄ−シグナリングの経路及び分子が、１つ又は２つ以上の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の追加によって活性化されるかどうかを見出すことができる。ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ細胞又はＮＫ−９２細胞）、又は末梢血から単離されたヒトＮＫ又はＣＤ８＋Ｔ細胞を、使用することができる。例えば、ＮＫＬ細胞は、例えばＦｃ−ＭＩＣＡ又は非照射ＭＩＣＡ発現細胞を対照として用いて、溶液中又はプレート結合状態のヒト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体と共にインキュベートすることができる。好適な時間（例えば、５、１０、３０分間）インキュベーションを行った後、この細胞を、氷上、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤の存在下で溶解させ、標準ウェスタンブロッティング技法により、ＮＫＧ２Ｄの刺激の下流であることが知られている１つ又は２つ以上のリン酸化されたシグナリング分子（例えば、Ｐｉ３Ｋ、Ａｋｔ、及びｖａｖ）のレベルに関して分析される。
【０１２２】
動物ベースのアッセイにおいて、動物体内の細胞におけるＮＫＧ２Ｄ活性化の何らかの生理学的又は病理学的結果を使用して、抗体又は試験化合物の活性を評価することができる。
【０１２３】
例えば、動物モデルの関節内に、リガンド産生細胞（例えばＭＩＣＡ産生滑膜細胞）の同時投与あり又はなしで、ＣＤ４＋ＣＤ２８−ＮＫＧ２Ｄ＋細胞を導入することができ、炎症又は組織損傷を評価する。次に試験化合物又は抗体を導入することができ、それらの、炎症又は組織損傷を阻害、遅延、反転、又は何らかの形で影響をもたらす能力が検出される。
【０１２４】
更に、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、ＲＡ）滑膜外植片の実験を行って、炎症誘発性サイトカインの自発的放出に対する遮断ＮＫＧ２Ｄの影響を調べることができる（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １９８９；２（８６５７）；２４４〜２４７を参照のこと）。そのようなアッセイにおいて、ヒト又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体がＲＡ滑膜培養物に対して試験され、ＮＫＧ２Ｄのリガンド結合及び機能を遮断するのに有用であることが示されている濃度で、例えばネズミ抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体と比較される。ＲＡ滑膜細胞は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はアイソタイプ対照抗体の不在下又は存在下で、４８時間培養される。既知の抗炎症性薬を陽性対照として使用することができる。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の効果は、６枚のＲＡ滑膜に対して、最初に最高３０μｇ／ｍＬの濃度で試験される。生きた細胞を染色するアッセイ（例えばＭＴＴアッセイ）により、細胞の生存性が分析され、加えた試薬が何らかの細胞毒性を有するかどうかを判定する。次にＥＬＩＳＡを使用して、培養上澄み液中のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６）のレベルを検出する。
【０１２５】
本発明の抗体は、例えば、乾癬又は潰瘍性大腸炎などの実験モデルで試験することができる。乾癬に罹った皮膚サンプルを、患者自身のＰＢＭＣと共にＳＣＩＤマウスに移植することができ、試験化合物の導入の影響と、それらの、炎症又は組織損傷を阻害、遅延、反転、又は何らかの形で影響をもたらす能力を検出することができる。Ｋｊｅｌｌｅｖら（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；３７：１３９７〜１４０６）及びＩｔｏら（Ａｍ  Ｊ  ｐＨｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００８；２９４：Ｇ１９９〜Ｇ２０７）は、抗ネズミＮＫＧ２Ｄ抗体を用いた、潰瘍性大腸炎の治療評価のための実験モデルについて記述している。
【０１２６】
医薬製剤
一実施形態において、本発明は、本明細書に記述される抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体と、１つ又は２つ以上の担体とを併せて含む、医薬組成物又は製剤を提供する。
【０１２７】
したがって、本発明の１つの例示的な態様は、１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するそのような抗体を含む医薬製剤であり、この製剤はｐＨ２．０〜１０．０を有する。この製剤は更に、緩衝系、防腐剤（複数可）、等張化剤（複数可）、キレート剤（複数可）、安定化剤、及び／又は界面活性剤を含み得る。一実施形態において、本発明の医薬製剤は、水性製剤、すなわち水を含む製剤である。そのような製剤は典型的には溶液又は懸濁液である。更なる一実施形態において、この医薬製剤は水溶液である。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に、用語「水溶液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
【０１２８】
別の一実施形態において、この医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、医師又は患者は投与前に溶媒及び／又は希釈剤をこれに添加することができる。
【０１２９】
別の一実施形態において、この医薬製剤は乾燥製剤（例えば凍結乾燥又はスプレー乾燥）であり、事前に溶解する必要なしにそのまま使用できる。
【０１３０】
更なる一態様において、この医薬製剤は、そのような抗体の水溶液と、緩衝剤とを含み、この抗体は１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で存在し、かつこの製剤は約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
【０１３１】
別の一実施形態において、この製剤のｐＨは、約２．０〜約１０．０、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．５、約５．０〜約８．０、及び約５．５〜約７．５からなるリストから選択される範囲にある。
【０１３２】
更なる一実施形態において、この製剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される緩衝剤を含む。これらの具体的な緩衝剤の各々は、本発明の代替の一実施形態を構成する。
【０１３３】
更なる一実施形態において、この製剤は更に、又は代替的に、製薬的に許容される防腐剤を含む。この防腐剤は、例えば、フェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、２−フェノキシエタノール、ブチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、２−フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロルヘキシジン、無水酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、エチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（３ｐ−クロロフェノキシプロパン−１，２−ジオール）、又はこれらの混合物からなる群から選択され得る。この防腐剤は、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、又は１０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な防腐剤の各々は、本発明の代替の一実施形態を構成する。医薬組成物中の防腐剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。
【０１３４】
更なる一実施形態において、この製剤は更に、又は代替的に、等張化剤を含む。この等張化剤は例えば、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖又は糖アルコール、アミノ酸（例えばＬ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール（グリセリン）、１、２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１、３−プロパンジオール、１、３−ブタンジオール）ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００）、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る。任意の糖（例えば単糖類、二糖類、又は多糖類）、又は水溶性グルカンで、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、ショ糖、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース−Ｎａを使用することができる。一実施形態において、この糖はショ糖である。糖アルコールは、少なくとも１つのーＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールが含まれる。一実施形態において、この糖アルコール添加剤はマンニトールである。上記の糖又は糖アルコールは、個別に又は組み合わせて使用することができる。糖又は糖アルコールが液体調製物に可溶性である限り、また、本発明の方法を使用する際に達成される安定化効果に悪影響を与えない限り、使用する量に固定的な限度はない。この糖又は糖アルコール濃度は、例えば、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬであり得る。この等張化剤は、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ〜７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ〜２４ｍｇ／ｍＬ、又は２５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的な等張化剤の各々は、本発明の代替の一実施形態を構成する。医薬組成物中の等張化剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。
【０１３５】
更なる一実施形態において、この製剤はまた、又は代替的に、キレート剤を含む。このキレート剤は例えば、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid、ＥＤＴＡ）、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びこれらの混合物から選択することができる。このキレート剤は、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬ、又は２ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。これらの具体的なキレート剤の各々は、本発明の代替の一実施形態を構成する。医薬組成物中のキレート剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。
【０１３６】
本発明の更なる一実施形態において、この製剤は更に、又は代替的に、安定化剤を含む。医薬組成物中の安定化剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。より具体的には、本発明の組成物は、安定化された液体医薬組成物であり得、この治療的活性成分には、液体医薬製剤の保管中に凝集体形成を呈する可能性があるポリペプチドが含まれる。「凝集体形成」は、オリゴマーの形成をもたらすポリペプチド分子間の物理的相互作用を意味し、これは可溶性のままであり得、又は、溶液中に沈殿する大きな目に見える凝集体である場合もある。「保管中」とは、いったん調製された液体医薬組成物又は製剤が、直ちに対象に投与されないことを意味する。むしろ、準備の後、保管のために液体形状、冷凍状態、又は乾燥形態のいずれかでパッケージされ、これを後に、対象へ投与するのに好適な液体形態又は他の形態に再構成する。「乾燥形態」は、液体の医薬組成物又は製剤が、フリーズドライ（すなわち凍結乾燥；例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ（１９８４）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４８〜５９を参照のこと）、スプレー乾燥（Ｍａｓｔｅｒｓ（１９９１）ｉｎ  Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（５ｔｈ  ｅｄ；Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ、Ｅｓｓｅｚ、Ｕ．Ｋ．）、ｐｐ．４９１〜６７６；Ｂｒｏａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．Ｉｎｄ．ｐｈａｒｍ．１８：１１６９〜１２０６；及びＭｕｍｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１２〜２０を参照のこと）、又は空気乾燥（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ（１９８８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：４５９〜４７０；及びＲｏｓｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４：４７〜５３）によって乾燥されるものを意味する。液体医薬組成物の保管中に起こるポリペプチドの凝集体形成は、ポリペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼす可能性があり、これにより医薬組成物の治療的効力の損失をもたらす可能性がある。更に、凝集体形成は、ポリペプチド含有医薬組成物を注入システムを使用して投与する際に、管、膜、又はポンプの閉塞といった他の問題を引き起こすことがある。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は、代替的に又は更に、組成物の保管中にポリペプチドによる凝集体形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」は、アミノ酸、又はアミノ酸の組み合わせであって、任意の所与のアミノ酸が、その遊離塩基形態又はその塩形態のいずれかで存在するものを意味する。アミノ酸の組み合わせが使用される場合、全てのアミノ酸がその遊離塩基形態で存在してもよく、全てがその塩形態で存在してもよく、あるいは、一部がその遊離塩基形態で存在し、残りがその塩形態で存在してもよい。一実施形態において、本発明の組成物を調製するために使用されるアミノ酸は、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸などの荷電側鎖を擁するものである。特定のアミノ酸がその遊離塩基形態又はその塩系体で存在している限りにおいて、特定のアミノ酸（例えばメチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン、及びこれらの混合物）の任意の立体異性体（Ｌ、Ｄ、又はその混合）、又はこれら立体異性体の組み合わせが、本発明の医薬組成物中に存在してもよい。一実施形態では、Ｌ−立体異性体が使用される。本発明の組成物は更に、これらのアミノ酸の類似体を用いて配合することができる。「アミノ酸類似体」は、本発明の液体医薬組成物の保管中にポリペプチドによる凝集体形成を減少させる望ましい効果をもたらすような、天然アミノ酸の誘導体を意味する。好適なアルギニン類似体には、例えば、アミノグアニジン、オルニチン及びＮ−モノエチルＬ−アルギニンが含まれ、好適なメチオニン類似体には、エチオニン及びブチオニンが含まれ、好適なシステイン類似体には、Ｓ−メチル−Ｌシステインが含まれる。他のアミノ酸と同様に、これらのアミノ酸類似体は、それらの遊離塩基形態又はそれらの塩形態のいずれかで、組成物中に組み込まれる。本発明の更なる一実施形態において、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、蛋白質の凝集を防止又は遅延するのに十分な濃度で使用される。
【０１３８】
本発明の更なる一実施形態において、治療薬として作用するポリペプチドが、このような酸化を受けやすい少なくとも１つのメチオニン残基を含むポリペプチドである場合、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために、メチオニン（又は他の含硫黄アミノ酸又は類似体）が添加されてもよい。この文脈において、用語「阻害」とは、経時的にメチオニン酸化種の蓄積が最小限になることを意味するよう意図される。メチオニン酸化を阻害することで、ポリペプチドを適切な分子形態に、より良く維持することができる。メチオニンのいずれかの立体異性体（Ｌ又はＤ）又はその組み合わせを、使用することができる。添加される量は、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量であるべきであり、これによりメチオニンスルホキシドの量が、規制機関により許容可能になる。典型的に、これは、本組成物が約１０％〜約３０％以下のメチオニンスルホキシドを含むことを意味する。一般にこれは、添加されるメチオニンとメチオニン残基との比が、約１：１〜約１０００：１（例えば１０：１〜約１００：１）となるように、メチオニンを添加することによって達成することができる。
【０１３９】
更なる一実施形態において、この製剤は更に又は代替的に、高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定化剤を含む。本発明の更なる一実施形態において、この安定化剤は、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロース又はそれらの誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−Ｌ及びＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、硫黄含有物質（モノチオグリセロール、チオグリコール酸、及び２−メチルチオエタノール）、並びに様々な塩（例えば塩化ナトリウム）から選択される。これらの具体的な安定化剤の各々は、本発明の代替の一実施形態を構成する。
【０１４０】
この医薬組成物は更に又は代替的に、その中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に高めるような、付加的な安定化剤を含んでもよい。本発明の具体的な目的の安定化剤には、メチオニン及びＥＤＴＡ（これらはポリペプチドのメチオニン酸化を防ぐ）、及び非イオン性界面活性剤（これは、冷凍−解凍又は機械的剪断に対してポリペプチドを保護する）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
更なる一実施形態において、この製剤は更に、又は代替的に、界面活性剤を含む。この界面活性剤は、例えば、洗剤、エトキシル化ひまし油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などのポロキサマー）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体（例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体（ｔｗｅｅｎｓ、例えばＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５））、モノグリセリド又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチン及びリン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン）、リン脂質の誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）及びリゾリン脂質（例えば、パルミトイルリゾホスファチジル−Ｌ−セリン、及びエタノールアミン、コリン、セリン又はトレオニンの１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートエステル）並びにリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体（例えば、リゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、並びに極性頭基（すなわちコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、トレオニン、グリセロール、イノシトール）の改変、並びに正に帯電したＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルトレオニン、並びにグリセロリン脂質（例えばセファリン）、グリセロ糖脂質（例えばガラクトピラノシド）、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロ−ジヒドロフシジン酸ナトリウムなど）、Ｃ６〜Ｃ１２の長鎖脂肪酸及びその塩（例えば、オレイン酸及びカプリル酸）、アシルカルニチン及び誘導体、リシン、アルギニン又はヒスチジンのＮα−アシル化誘導体、又はリシン若しくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リシン、アルギニン又はヒスチジン及び中性又は酸性アミノ酸の任意の組み合わせを含むジペプチドのＮα−アシル化誘導体、中性アミノ酸と２つの荷電アミノ酸の任意の組み合わせを含むトリペプチドのＮα−アシル化誘導体、ＤＳＳ（ドクサートナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７−１１−７］）、ドクサートカルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８−４９−４］）、ドクサートカリウム、ＣＡＳ登録番号［７４９１−０９−０］）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシン又はタウリン接合体、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリコ���ール酸ナトリウム、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミニオ−１−プロパンスルホネート、陰イオン性（アルキル−アリール−硫酸塩）一価界面活性剤、双性イオン性界面活性剤（例えばＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミニオ−１−プロパンスルホネート、３−コールアミド−１−プロピルジメチルアミニオ−１−プロパンスルホネート、陽イオン性界面活性剤（四級アンモニウム塩基）（例えば臭化セチル−トリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えばドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド）、ポロキサミン（例えばＴｅｔｒｏｎｉｃ製）（これは、プロピレンオキシドとエチレンオキシドのエチレンジアミンへの連続的付加により誘導される四官能基ブロックコポリマーである）、あるいは、イミダゾリン誘導体の群から選択される界面活性剤、又はこれらの混合物、から選択され得る。これらの具体的な界面活性剤の各々は、本発明の代替の一実施形態を構成する。
【０１４２】
医薬組成物中の界面活性剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。
【０１４３】
更なる一実施形態において、この製剤は、更に又は代替的に、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）及びベンズアミジン塩酸塩などのプロテアーゼ阻害剤を含むが、他の市販のプロテアーゼ阻害剤を使用してもよい。プロテアーゼ阻害剤は、自己触媒作用を阻害するために、プロテアーゼの酵素前駆体を含む医薬組成物において特に有用である。
【０１４４】
他の成分が、更に又は代替的に、本発明のペプチド医薬製剤中に存在し得ることが可能である。そのような付加的な成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、膨張性薬剤、張性調整剤、キレート剤、金属イオン、油性担体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、グリシン、リシン及びヒスチジンなどのアミノ酸）が挙げられ得る。そのような付加的な成分は、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を及ぼすべきではない。
【０１４５】
本発明による抗体を含む医薬組成物は、そのような治療を必要とする患者に、複数回にわたって、例えば、局所部位（例えば皮膚及び粘膜部位）、吸収をバイパスする部位（例えば、動脈内、静脈内、心臓内投与）、及び吸収を伴う部位（例えば、皮内、皮下、筋肉内又は腹腔内）に投与することができる。
【０１４６】
本発明による医薬組成物の投与は、例えば、経舌、舌下、頬、口腔内、経口、胃及び腸内、鼻、肺（例えば細気管支及び肺胞又はこれらの組み合わせ）、表皮、皮膚、経皮、膣、直腸、眼（例えば経結膜）、尿管及び非経口のいくつかの経路で、そのような治療を必要とする患者に投与することができる。
【０１４７】
本発明の組成物は、いくつかの投与形態で投与することができ、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、ミクロエマルジョン、多重エマルジョン、泡、膏薬、ペースト、貼付剤、軟膏、錠剤、被覆錠剤、リンス、カプセル（例えば、硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル）、座薬、直腸カプセル、ドロップ、ゲル、噴霧剤、粉末、エアロゾル、吸入剤、点眼剤、眼科用軟膏、眼科用リンス、膣ペッサリー、膣リング、膣軟膏、注射液、ｉｎ−ｓｉｔｕ形質転換溶液（例えばｉｎ−ｓｉｔｕゲル化、ｉｎ−ｓｉｔｕ固定、ｉｎ−ｓｉｔｕ沈殿、ｉｎ−ｓｉｔｕ結晶化）、輸液、及びインプラントとして投与することができる。
【０１４８】
本発明の組成物は更に、抗体の安定性を高め、生物学的利用度を高め、溶解度を高め、有害作用を低減し、当業者に周知の時間療法を達成し、患者のコンプライアンスを高め、又はこれらの組み合わせを目的として、例えば共有結合、疎水性及び静電的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤送達システム、及び高度薬剤送達システムに複合化又は取り付けることができる。担体、薬剤送達システム、及び高度薬剤送達システムの例としては、ポリマー（例えばセルロース及び誘導体）、多糖類（例えばデキストラン及び誘導体）、デンプン及び誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質（例えばアルブミン）、ゲル（例えば熱ゲル化系）、例えば当業者に周知のブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子、液晶及びその分散液、Ｌ２相及びその分散液（油−水系での相挙動が当業者に周知のもの）、ポリマーミセル、多重エマルジョン、自己乳化、自己ミクロ乳化、シクロデキストリン及びその誘導体、並びにデンドリマーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４９】
本発明の組成物は、抗体の肺投与のための、例えば、定量吸入器、乾燥粉末吸入器、及びネブライザーを使用した、固体、半固体、粉末及び溶液の製剤に有用であり、これらの装置は全て当業者に周知である。
【０１５０】
本発明の組成物は、制御性、持続性、遅延性、遷延性、及び徐放性の薬物送達システムの製剤に特に有用である。より具体的には、組成物は、非経口制御放出及び持続放出システム（両システムとも、当業者に周知のように、投与回数を何分の一にも減少させる）の製剤において有用であるが、これらに限定されない。更により好ましくは、皮下投与される制御放出及び持続放出システムである。本発明の範囲を制限することなく、有用な制御放出システム及び組成物の例としては、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、ミクロスフェア、ナノ粒子がある。
【０１５１】
本発明の組成物に有用な制御放出システムを作製する方法には、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧均質化、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフェアを生成するための溶媒蒸発、押出及び超臨界流体プロセスが含まれるがこれらに限定されない。一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  （Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｌ．，ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）、及びＤｒｕｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｖｏｌ．９９：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ＭａｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）を参照されたい。
【０１５２】
非経口投与は、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射により、シリンジ、任意選択でペン状シリンジを用いて行うことができる。あるいは、非経口投与は、輸液ポンプを用いて行うことができる。更なるオプションは、鼻腔又は肺スプレーの形態にするための、抗体化合物の投与のための溶液又は懸濁液であり得る組成物である。更なるオプションとしては、本発明の抗体を含む医薬組成物を、例えば、針なし注入による、若しくはパッチ、任意選択でイオン泳動パッチからの経皮投与、又は例えば、経粘膜、例えば口腔内投与に適合させることができる。
【０１５３】
抗体は、溶液、懸濁液又は乾燥粉末としてのビヒクルで、肺薬物送達に適した既知の種類の装置のいずれかを使用して、肺経路を介して投与することができる。これらの例としては、肺薬物送達のためのエアロゾル生成の３つの一般的なタイプがあり、これにはジェット又は超音波ネブライザー、定量吸入器、又は乾燥粉末吸入器が含まれ得るがこれらに限定されない（Ｙｕ  Ｊ、Ｃｈｉｅｎ  Ｙ  Ｗ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｐＨｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒ  Ｓｙｓ  １４（４）（１９９７）３９５〜４５３を参照のこと）。
【０１５４】
標準化試験方法に基づいて、粒子の空気動力学径（ｄａ）は、単位密度（１ｇ／ｃｍ３）の参照標準球形粒子の幾何学的同等直径として定義される。最も単純な例において、球形粒子の場合、ｄａは下記の式で記述されるように、密度比の平方根の関数として、参照直径（ｄ）に関係している：
ｄａ＝ρρａ  ｄ
【０１５５】
この関係は、非球形粒子に対して改変される（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄ  Ａ，Ｂｅｎ−Ｊｅｂｒｉａ  Ａ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌａｒｇｅ，ｐｏｒｏｕｓ  ｉｎｈａｌｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８４（２）（１９９８）３７９〜３８５を参照のこと）。用語「ＭＭＡＤ」及び「ＭＭＥＡＤ」は当該技術分野で記述され周知であり、空気動力学的粒径分布の中央値を表す（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄ  Ａ，Ｂｅｎ−Ｊｅｂｒｉａ  Ａ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌａｒｇｅ，ｐｏｒｏｕｓ  ｉｎｈａｌｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８４（２）（１９９８）３７９〜３８５を参照のこと）。空気動力学的中央粒子径（mass median aerodynamic diameter、ＭＭＡＤ）と空気動力学的有効中央粒子径（mass median effective aerodynamic diameter、ＭＭＥＡＤ）は互換可能に使用され、統計学的パラメータであり、実際の形状、大きさ、又は密度とは独立に、肺への付着能力に関係するエアロゾル粒子の粒径を経験的に記述するものである（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄ  Ａ，Ｂｅｎ−Ｊｅｂｒｉａ  Ａ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌａｒｇｅ，ｐｏｒｏｕｓ  ｉｎｈａｌｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８４（２）（１９９８）３７９〜３８５を参照のこと）。ＭＭＡＤは通常、インパクター（空気中の粒子の慣性挙動を測定する計器）を用いた測定から計算される。
【０１５６】
更なる一実施形態において、この製剤は任意の既知のエアロゾル化技術（例えば噴霧化）によりエアロゾル化することができ、１０μｍ、より好ましくは１〜５μｍ、最も好ましくは１〜３μｍのＭＭＡＤのエアロゾル粒子を達成することができる。好ましい粒径は、肺深部（ここでタンパク質が最適に吸収される）に薬物送達するための最も効果的な大きさに基づく（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄ  Ａ，Ｂｅｎ−Ｊｅｂｒｉａ  Ａ，Ｌａｎｇｅｒ  Ａ，Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌａｒｇｅ，ｐｏｒｏｕｓ  ｉｎｈａｌｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８４（２）（１９９８）３７９〜３８５を参照のこと）。
【０１５７】
この抗体を含む肺製剤の肺深部付着は、任意選択で、吸入技法の改変により更に最適化することができ、これには例えば、遅い吸入速度（例えば３０Ｌ／分）、息の保持、作動のタイミングが含まれるがこれらに限定されない。
【０１５８】
用語「安定化製剤」とは、物理的安定性が増大し、化学的安定性が増大し、あるいは物理的及び化学的安定性が増大した、製剤を意味する。
【０１５９】
本明細書で使用するとき、タンパク質製剤の「物理的安定性」という用語は、抗体が熱機械的ストレスに曝された結果、及び／又は疎水性表面及び界面などの不安定化界面及び表面との相互作用の結果として、その抗体が、生物学的に不活性及び／又は不溶性の凝集体を形成する傾向を意味する。水性抗体製剤の物理的安定性は、好適な容器（例えばカートリッジ又はバイアル）に充填された製剤を、様々な温度で様々な時間にわたって機械的／物理的ストレス（例えば振盪）に曝露させた後、外観検査及び／又は濁度測定の手段を用いて評価される。製剤の外観検査は、暗い背景で鋭い集束光を用いて行われる。製剤の濁度は、例えば０〜３の尺度で、濁度の度合をランク付けする視覚的スコアにより特性評価される（濁りが見られない製剤は視覚的スコア０に対応し、日光下で視覚的に濁りが見られる製剤は視覚的スコア３に対応する）。製剤は、日光下で視覚的に濁りが見られる場合、抗体凝集体に関して物理的に不安定であるとして分類される。あるいは、製剤の濁りは、当業者に周知の単純な濁度測定により評価することができる。水性抗体製剤の物理的安定性は、抗体の立体配座状態の分光学的試薬又はプローブを用いて評価することもできる。このプローブは好ましくは、抗体の非天然立体配座に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の分光学的小分子プローブの一例が、チオフラビンＴである。チオフラビンＴは、アミロイド原線維の検出に広く使用されている蛍光染料である。原線維の存在下、及びおそらくは他のタンパク質構造の存在下において、チオフラビンＴは、原線維タンパク質形態に結合すると、約４５０ｎｍで新たな励起極大を生じ、約４８２ｎｍで発光増強が生じる。非結合のチオフラビンＴは本質的にそれらの波長で非蛍光である。
【０１６０】
他の小分子を、天然状態から非天然状態へのタンパク質構造の変化のプローブとして、使用することができる。例えば、タンパク質の露出した疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブがある。疎水性パッチは一般に、天然状態のタンパク質の三次構造内に埋設されるが、タンパク質が展開又は変性し始めると露出する。これらの分光学的小分子プローブの例としては、例えば、アントラセン、アクリジン、フェナントロリン等の芳香族の疎水性染料が挙げられる。他の分光学的プローブは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン等の疎水性アミノ酸のコバルト金属錯体などの金属アミノ酸錯体である。
【０１６１】
本明細書で使用するとき、タンパク質製剤の「化学的安定性」という用語は、天然抗体構造に比べて、生物学的潜在能の低下及び／又は潜在的に増強された免疫原性を伴う、化学分解生成物の形成につながる、抗体構造における化学共有結合変化を意味する。様々な化学分解生成物は、天然抗体の種類と性質、及び、その抗体が曝される環境に応じて形成され得る。化学分解の除去は、完全に回避することはおそらく不可能であり、当業者に周知のように、抗体製剤の保管中及び使用時に、化学分解生成物の量の増加がしばしば見られる。多くのタンパク質は脱アミド化しやすい。脱アミド化とは、グルタミニル残基又はアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解して遊離カルボン酸を形成するプロセスである。他の分解経路には、高分子量転換生成物の形成が含まれ、これは、２つ以上のタンパク質分子がアミド基転移及び／又はジスルフィド相互作用により互いに共有結合して、共有結合二量体、オリゴマー及びポリマー分解生成物の形成をもたらすものである（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｈｅｒｎ．Ｔ．Ｊ．＆  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｍ．Ｃ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２）。化学分解の他の変種としては、酸化（例えば、メチオニン残基の酸化）を挙げることができる。様々な環境条件に暴露した後、様々な時点での化学分解生成物の量を測定することにより、抗体製剤の化学的安定性を評価することができる（分解生成物の形成はしばしば、例えば温度上昇により、加速され得る）。個々の分解生成物の量はしばしば、種々のクロマトグラフィー技法（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて、分子の大きさ及び／又は電荷に依存する分解生成物の分離によって決定される。
【０１６２】
よって、上述のように、用語「安定化製剤」とは、物理的安定性が増大し、化学的安定性が増大し、あるいは物理的及び化学的安定性が増大した、製剤を意味する。一般に、製剤は、有効期限に到達するまで、（推奨される使用及び保管条件に従い）使用中及び保管中に安定でなければならない。
【０１６３】
本発明の一実施形態において、抗体を含む医薬製剤は、６週間を超える使用期間、及び３年を超える保管期間にわたって安定である。
【０１６４】
本発明の別の一実施形態において、抗体を含む医薬製剤は、４週間を超える使用期間、及び３年を超える保管期間にわたって安定である。
【０１６５】
本発明の更なる一実施形態において、抗体を含む医薬製剤は、４週間を超える使用期間、及び２年を超える保管期間にわたって安定である。
【０１６６】
本発明のまた更なる一実施形態において、抗体を含む医薬製剤は、２週間を超える使用期間、及び２年を超える保管期間にわたって安定である。
【０１６７】
好適な抗体製剤は更に、他の既に開発された治療用モノクローナル抗体と共に結果を調べることにより、決定することもできる。例えばＲｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｏｎｃｏｌｙｍ、Ｈｕｍｉｒａ、及び類似の製剤など、いくつかのモノクローナル抗体が臨床状況において効率的であることが示されており、これらを本発明の抗体と共に使用することができる。例えば、モノクローナル抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）のいずれかの単回使用バイアルに濃度１０ｍｇ／ｍＬで供給され得、これはＩＶ投与用に、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び注入のために滅菌水が配合されている。ｐＨは６．５に調整される。代替的に、抗体は、ヒスチジン、ショ糖、及びポリソルベート８０を含む溶液に配合され得る。
【０１６８】
診断適用
本発明のｈＮＫＧ２Ｄ抗体は更に、非治療的用途を有する。例えば、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄタンパク質の、例えば特定の細胞、組織、又は血清における発現を検出する、診断アッセイに有用であり得る。例えば、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、抗ｈＮＫＧ２Ｄ治療の患者を選択するアッセイに使用することができる。そのような目的のために、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、血清又は組織検体中のｈＮＫＧ２Ｄの存在を分析する、ＮＫＧ２Ｄを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を検査する、又は、ＮＫＧ２Ｄを発現する疾患促進細胞（例えば、ＮＫ又はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞）の存在を検査するのに使用することができる。そのような分析は、例えば、血中の可溶性ＭＩＣＡレベルを調べる分析検査と組み合わせることができる（例えば、国際公開第２００３／０８９６１６号（Ｓｐｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと）。
【０１６９】
診断用途のために、抗体は典型的には、検出可能な部分を用いて標識される。数多くの標識が利用でき、これは以下のカテゴリーに概ね群分けすることができる。
（ａ）放射性同位元素、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ。抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１  ａｎｄ  ２，Ｃｏｌｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記述されている技法を用いて、放射性同位元素で標識付けることができ、放射能をシンチレーション計数を用いて測定することができる。
（ｂ）蛍光標識（稀土元素キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン、及びテキサスレッドなど）が利用可能である。蛍光標識は、例えば上記のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに開示されている技法を用いて、抗体に接合させることができる。蛍光は、蛍光光度計を用いて定量化することができる。
（ｃ）様々な酵素−基質標識が利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号はこの一部の概説を提供している。酵素は一般に、種々の技法を用いて測定され得る色素基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質の色変化を触媒することができ、これは、分光光学的に測定することができる。代替的に、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量する技法は、上記に記述されている。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起され、これにより発光することができ、これを測定することができる（例えばケミルミノメーターを用いて）。あるいは化学発光基質は、蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ、米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素を接合させる技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｅｄ．，Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ＆Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３：１４７〜１６６（１９８１）におけるＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」に記述されている。
【０１７０】
酵素−基質組み合わせの例としては、例えば次のものが挙げられる：
（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と、基質として過酸化水素を用い、過酸化水素は染料前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する、
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、色素基質としてパラ−ニトロフェニルホスフェートを用いる、
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と、色素基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）又は発蛍光性基質４−メチルウンベリフェリル−ｐ−β−ガラクトシドを用いる。
【０１７１】
多数の他の酵素−基質の組み合わせが、当業者に利用可能である。これらの一般的な概説については、米国特許第４，２７５，１４９号及び同第４，３１８，９８０号を参照のこと。
【０１７２】
時に、標識は、抗体と間接的に接合される。当業者には、これを達成するための様々な技法がわかるであろう。例えば、抗体はビオチンと接合させることができ、上述の３つの広い標識カテゴリーのうち任意のものをアビジンと接合させることができ、又はその逆も可能である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、これにより、標識が抗体にこのように間接的に接合することができる。あるいは、標識と抗体との間接的な接合を達成するために、抗体は小さなハプテン（例えばジゴキシン）と接合され、上述の様々なタイプの標識のうちの１つを、抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）と接合させる。これにより、標識と抗体との間接的な接合を達成することができる。
【０１７３】
本発明の別の一実施形態において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は必ずしも標識付ける必要はなく、その存在は、ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合する標識付けられた二次抗体を用いて検出することができる。
【０１７４】
本発明の抗体は、任意の既知のアッセイ方法（例えば競合結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ）に適用することができる。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７〜１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。
【０１７５】
免疫化学的に、組織サンプルは新鮮なもの又は冷凍であってよく、あるいは例えば、パラフィンに埋め込まれて、ホルマリンなどの防腐剤で固定されてもよい。
【０１７６】
抗体は更に、インビボ診断アッセイに使用することができる。一般的に、抗体は放射性核種で標識され、又は例えば核磁気共鳴によって検出可能な非放射性指標で標識され、又は他の当該技術分野で周知の手段で標識される。好ましくは、この標識は放射性同位体標識であり、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、又は１１１Ｉｎである。標識された抗体は、好ましくは血流経由で宿主に投与され、宿主における標識抗体の存在及び位置が測定される。撮像技術は、新生物の検出、ステージング及び治療に好適に使用される。放射性同位元素は、任意の手段でタンパク質によって結合され、この手段には、金属キレート化合物若しくはラクトペルオキシダーゼ、又はヨウ素標識化のためのヨードゲン技法が含まれる。
【０１７７】
利便性のため、本発明の抗体は、キット（すなわち、診断アッセイを行うための説明と共に、所定の量の試薬の組み合わせパッケージ）として提供することができる。抗体が酵素で標識される場合、このキットは、基質と、酵素が必要とする補因子（例えば、検出可能な発色団又は発蛍光団を提供する基質前駆体）を含む。加えて、安定化剤、緩衝剤（例えば、遮断バッファ又は溶解バッファなど）といった他の添加剤が含まれ得る。アッセイの感度を実質的に最適化するような試薬の溶液中濃度を提供するために、様々な試薬の相対量は大きく変化し得る。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供するような、賦形剤を含む乾燥粉末（通常、凍結乾燥）として提供されてもよい。
【０１７８】
治療適用
本発明は、本明細書に記述されるヒト又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を使用して患者を治療する方法も提供する。一実施形態において、本発明は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製における、本明細書に記述されるヒト又はヒト化抗体の使用を提供する。典型的には、この患者は自己免疫又は炎症性の疾患又は障害を患っているか、又はリスクがある。
【０１７９】
例えば、一態様において、本発明は、治療を必要としている患者において、ＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を低減又は阻害する方法を提供し、これには、患者にヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を投与する工程が含まれ、この抗体が、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド媒介性活性化を低減又は防止する。一実施形態において、この方法は、ＮＫ細胞又はＴ細胞活性の増大が有害となっている疾患を有する患者において、そのようなリンパ球の活性を低下させることを目的とし、この疾患は、ＮＫ細胞又はＴ細胞が関与する、ＮＫ細胞又はＴ細胞に影響を与える、又はＮＫ細胞又はＴ細胞による溶解を被りやすい細胞により生じるものであり、あるいは、この疾患は、ＮＫ及び／又はＴ細胞活性の増大により生じる又は特徴付けられるものであり、例えば自己免疫疾患若しくは障害又は炎症性状態である。一態様において、本発明は患者における慢性炎症を低減する方法を提供する。
【０１８０】
本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物で治療される例示的な状態又は障害としては、全身性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節炎、乾癬性関節炎、骨関節症、脊椎関節症（強直性脊椎炎）、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性ミオパチー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、血管炎、全身性血管炎、側頭動脈炎、アテローム性動脈硬化症、サルコイドーシス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、悪性貧血、自己免疫血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本病、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介在性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、自己免疫性卵巣炎）、自己免疫性精巣炎、自己免疫性ブドウ膜炎、抗リン脂質症候群、中枢神経系及び末梢神経系の脱髄疾患（例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発性ニューロパチー、又はギランバレー症候群）、及び慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー、肝胆汁性疾患（例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及びその他の非肝臓指向性ウイルス）、慢性自己免疫活性肝炎、ウイルス性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、ウェゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、及び原発性硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎又はクローン病、セリアック病、グルテン感受性腸疾患）、及びウィップル病、自己免疫又は免疫介在性の皮膚疾患（水疱性皮膚症、多形性紅斑、及び接触皮膚炎）、ヘルペス状皮膚炎、乾癬、尋常性天疱瘡、白斑（白皮症）、アレルギー性疾患（例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品過敏症及び蕁麻疹）、免疫学的肺疾患（例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症、及び過敏性肺炎）、慢性閉塞性肺疾患、及び移植関連疾患（移植片拒絶反応及び移植片対宿主病を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
例えば、一態様において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、１つ又は２つ以上の他の抗炎症剤と共に使用され、これには、鎮痛薬、免疫抑制剤（例えば、Ｂ細胞低下剤及びＴ細胞阻害剤などのＢ細胞又はＴ細胞アンタゴニスト；補体阻害剤）、コルチコステロイド、及び抗ＴＮＦα剤、又はその他の抗サイトカイン若しくは抗サイトカイン受容体剤、及び抗血管新生薬が含まれるがこれらに限定されない。具体的な例としては、メトトレキサート、ＴＳＧ−６、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）又はその他のＢ細胞治療薬、抗ＩＬ１２（ｐ４０）抗体、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質、ＩＬ−１−受容体アンタゴニスト、ＩＬ−１抗体、ＩＬ−１５抗体、ＩＬ−１８抗体、及び抗ＩＬ６Ｒ抗体が挙げられる。組み合わせ治療の更なる実施例が、以下に提供される。
【０１８２】
１つ又は２つ以上の他の薬剤又はアプローチが、本発明の治療と組み合わせて使用される場合、各治療が別々に実施されるときに観察される効果に付加的となる組み合わせ結果に関して、要件はない。少なくとも付加的効果は一般的に望ましいが、ＮＫＧ２Ｄ活性の何らかの低下、又は上記の単独治療の１つを上回る他の有益効果が、有益となり得る。また、相乗効果を呈する組み合わせ治療に関して、特に要件はないが、相乗効果はもちろん可能であり、有利となる。ＮＫＧ２Ｄに基づく治療は、例えば、数分から数週間及び数か月にわたる間隔をおいて、他の治療の前又は後に行うことができる。また、抗ＮＫＧ２Ｄ組成物又は他の薬剤のいずれかの２回以上投与が利用されることも想到される。この薬剤は、交換可能に投与してもよく、交互の日又は週に投与してもよく、又は、抗ＮＫＧ２Ｄ治療サイクルを行ってから、他の薬剤治療サイクルを行うこともできる。いずれにしても、必要なのは、投与の回数にかかわらず、治療上有益な効果を発揮するために有効な組み合わせ量で、両薬剤を投与することである。
【０１８３】
投与量
この抗体の投与について、投与量は宿主の体重に対して約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。例えば、投与量は、体重に対して約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの版比内であり得る。例示的な治療レジメンは、週２回、週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回、又は３〜６か月ごとに１回の投与を必要とする。本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の好ましい投与レジメンは、経静脈投与又は皮下注射により、体重に対して約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇであり、抗体は、以下の投与スケジュールのいずれか１つを用いて投与される：（ｉ）負荷投与として１〜３週間ごとに２〜４用量、次いで２か月ごと、（ｉｉ）４週間ごと、（ｉｉｉ）毎週、又は任意の他の最適な投与。いくつかの方法において、結合特異性の異なる２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、このとき、投与される各抗体の投与量は、指示された範囲内にある。抗体は通常、複数回にわたって投与される。投与ごとの間隔は、例えば、毎週、毎月、３か月ごと、又は１年ごとであり得る。間隔は、不規則にすることもでき、これは患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示される。いくつかの方法において、投与量は、血漿抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍＬになるように、またいくつかの方法において約２５〜３００μｇ／ｍＬになるように、調節される。代替的に、抗体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合、必要な投与の頻度が少なくなる。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、続いてヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体の順である。投与量及び投与頻度は、その治療が予防的であるか又は非予防的（例えば、緩和的又は治癒的）であるかによって変化し得る。予防適用においては、比較的低用量の投与が、比較的低頻度の間隔で、長期間にわたって投与される。一部の患者は、生涯にわたって治療を受け続ける。緩和的又は治癒的適用においては、疾患の進行が減少又は停止するまで、そして好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量の投与が時に必要となる。その後、この患者には予防的レジメンで投与することができる。
【０１８４】
抗炎症剤の適切な投与量は、その抗炎症剤が単独で又は他の薬剤と組み合わせて投与される場合について、既に臨床療法において採用されている投与量に近似される。治療中の状態に応じて投与量の変動が発生する可能性が高い。治療担当医師は、個々の対象の適切な投与量を決定することができる。
【０１８５】
製造物品
本発明の別の一実施形態において、上述の障害の治療に有用な物質を含む製造物品が提供される。例えば、この製造物品は、本明細書に記述されるヒト又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体と、障害（例えば、ヒトにおける自己免疫又は炎症性疾患）を有効量のその抗体で治療するための使用者向け説明書とを共に含む容器を含み得る。製造物品は、典型的には、容器と、この容器に付着又は添付されるラベル又はパッケージ添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル瓶、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成してよい。容器は、病状を治療するための有効量である組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下用注射針で突き刺し可能な栓を有する静注用溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書のヒト又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体であり、あるいは、そのような抗体を含む抗原結合性フラグメント又は抗体誘導体（例えば、免疫結合体）である。ラベル又は添付文書は、組成物が、関節リウマチなどの選択病状を治療するために用いられることを示す。
【０１８６】
更に、この製造物品は、（ａ）中に組成物を収容する第１の容器であって、この組成物は本明細書のヒト又はヒト化抗体を含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物を収容する第２の容器であって、この組成物はヒト又はヒト化抗体以外の治療薬を含む、第２の容器と、を含み得る。本発明のこの実施形態の製造物品は更に、自己免疫又は炎症性の疾患又は障害を治療するために、第１及び第２の組成物を組み合わせて使用することができることを示すパッケージ添付文書を含み得る。そのような治療薬は、前述セクションに記述された補助療法のいずれであってもよい。代替的に、又は追加的に、この製造物品は、製薬的に許容される緩衝剤を含む第２（又は第３）の容器を更に含んでよく、この緩衝剤には、注射用静菌水（bacteriostatic water for injection、ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液が含まれる。この製造物品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含むことができる。
【実施例】
【０１８７】
更に、本発明の詳細は、以下の非限定例によって例示される。
【０１８８】
実施例１：ｈＮＫＧ２Ｄに対するヒトモノクローナル抗体の生成及び初期スクリーニング
材料及び方法
抗原。
可溶性ＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：１２９９−ＮＫ）又は細胞表面に発現したＮＫＧ２Ｄ（ＮＫ、ＢＡＦ、又はＣＨＯ）を、免疫の抗原として使用した。ＢＡＦ細胞は全長ＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０と共にコトランスフェクトされた。ＣＨＯ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ点突然変異体でトランスフェクトされ、これはＤＡＰ１０なしで細胞表面に移送される（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；３８５：７３０〜２）。ＮＫ細胞は、天然にＮＫＧ２Ｄを発現する一次性ＮＫ細胞であった。
【０１８９】
マウス。
ＮＫＧ２Ｄに対する完全なヒトモノクローナル抗体を、ヒト抗体遺伝子を発現する遺伝子組換えマウスのＫＭマウス（商標）株で生成した（国際公開第０２／４３４７８号（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．））。このマウス株において、内因性κ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１〜８２０に記述されているように、ホモ接合型的に破壊されており、内因性マウス重鎖は、ＨｕＭａｂマウスについて国際公開第０１／０９１８７号の実施例１に記述されているように、ホモ接合型的に破壊されている。このマウス株は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１に記述されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子（ＫＣ０５）を擁する。このマウス株は更に、国際公開第０２／４３４７８号に記述されているように、ヒト重鎖導入染色体（ＳＣ２０）を擁する。
【０１９０】
免疫化。
第１シリーズの免疫化において、動物は、ＮＫＧ２ＤトランスフェクトされたＢＡＦ細胞及びＮＫＧ２ＤトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を交互に腹腔内注射することにより、又はアジュバントあり若しくはなしで一次性ヒトＮＫ細胞を腹腔内注射することにより、免疫化された。各マウスは、５×１０６個の細胞を毎週又は隔週腹腔内投与により免疫化した（合計６回）。このマウスは、５×１０６個のＮＫＧ２ＤトランスフェクトされたＢＡＦ細胞で経静脈投与によりブーストしてから、３日後及び２日後に殺処分し、脾臓を摘出した。動物実験は、Ｄａｎｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌガイドラインに従って実施された。
【０１９１】
第２シリーズの免疫化において、動物は、様々なアジュバントと共にＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃで、腹腔内及び脚経路経由で免疫化された。各マウスは、７×２５μｇ  ＮＫＧ２Ｆ−ｈＦｃ／Ｒｉｂｉ／ｉｐ／ｓｃ、１×２５μｇ  ＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃ／ＣＦＡ／ｉｐ／ｓｃ、１×２５μｇ  ＮＫＧ２ＤｈＦｃ／ＩＦＡ／ｉｐ／ｓｃ、１×３０μｇ  抗ＣＴＬＡ４＋４０μｇ  ＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃ／ＩＦＡ／ｉｐ／ｓｃ、１×２５μｇ  ＮＫＧ２ＤｈＦｃ／Ｒｉｂｉ／ｉｐ／ｓｃで免疫化され、２×３０μｇ／ＰＢＳ／ｉｐ／ｉｖでブーストし、３日後及び２日後に殺処分し、脾臓を摘出した。動物実験は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌガイドラインに従って実施された。
【０１９２】
マウス血清のスクリーニング。
免疫化マウスから得た血清を、ＮＫＧ２Ｄ特異性に関してフローサイトメトリー分析によりスクリーニングし、選択した血清を更に、実施例３に記述されているように、ＭＩＣＡリガンドの結合を中和する能力に関して試験した。ＮＫＧ２Ｄに特異的に結合しかつＭＩＣＡ結合を中和する抗体の、高い力価を生成したマウスが、ハイブリドーマ産生に選択された。
【０１９３】
ハイブリドーマの産生。
選択された各免疫化マウスの脾臓を均質化し、脾細胞の単細胞懸濁液を、Ｘ６１Ａｇ８６５３骨髄腫細胞との融合に使用した（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）。この融合は、前述のようにポリエチレングリコール（polyethyleneglycol、ＰＥＧ）１５００を使用して実施され（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８））、Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ（商標）ＣＥＥＦ−５０Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて電気融合された。
【０１９４】
融合細胞は最初に、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％ＦＢＳ及び５％細胞源（ハイブリドーマクローニング因子、ＢｉｏＶｅｒｉｓ）を補った選択的ＤＭＥＭ  ＨＡＴ培地に播種した。このプレートをそれぞれ、５％ＦＢＳ及び０．７％細胞源を補ったＤＭＥＭ  ＨＴ培地に１〜２回培地交換しながら１０〜１４日間インキュベートし、上澄み液を採取してスクリーニングを行った。試験結果陽性のクローンを増殖させ、限界希釈によりサブクローニングして、安定なクローンを生成した。選択されたクローンは、抗ＮＫＧ２Ｄ特異性抗体の存在について、またＭＩＣＡ結合を中和する能力について、ＦＡＣＳ分析により継続的にスクリーニングした。
【０１９５】
ハイブリドーマ上澄み液のスクリーニング。
第１の一連の免疫化から得たハイブリドーマ上澄み液の一次スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリー分析（flow cytometry analysis、ＦＡＣＳ）を用いて、抗ＮＫＧ２Ｄ特異性抗体の存在について試験を行った。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡは次のように実施された。マキシソーププレートを５０μＬ０．４μｇ／ｍＬ  ｍＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ（ネズミＦｃに融合しＣＨＯ細胞に発現したＮＫＧ２Ｄの細胞外部分を含む）でコーティングし、ＰＢＳ中４℃で一晩置き、次いでＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて室温で１５分間置いて遮断した。このプレートを次に、５０μＬハイブリドーマ上澄み液でインキュベートし、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγフラグメント特異性（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３６−０９８）を用いてＮＫＧ２Ｄ−特異性抗体を検出した。これらのインキュベーションは室温で１時間実施され、各ステップの間にプレートはＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗った。結合抗体は、１００μＬ  ＴＭＢ基質（Ｋｅｍ−ＥＮ−Ｔｅｃ）を用いて可視化し、４Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を用いて止めた。このプレートを４５０ｎｍ及び６２０ｎｍで読み取った。ＦＡＣＳについては、ＮＫＧ２Ｄ発現ＢａＦ／３細胞への結合と、ＮＫＧ２Ｄを発現していない対照ＢａＦ／３細胞を分析した。１０μＬ中５００００個の細胞を、９０μＬハイブリドーマ上澄み液と共に３０分間４℃でインキュベーションし、次に、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで洗い、次に二次ヤギ−抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγフラグメント特異性（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３６−０９８）と共にインキュベートした。この細胞を次にＢ＆Ｄ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。ＮＫＧ２Ｄ発現ＢａＦ／３細胞を染色するが対照細胞は染色しない抗体が、ＮＫＧ２Ｄ特異性であると見なされた。
【０１９６】
第２シリーズの免疫化の一次スクリーニングは直接ＥＬＩＳＡで、抗ＮＫＧ２Ｄ特異性抗体の存在を試験した。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡは次のように実施された。マキシソーププレートを１〜２ｍｇ／ｍＬ  ｈＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、ＰＢＳ中４℃で一晩置き、次いで、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５％ニワトリ血清を用いて室温で３０〜６０分間置いて遮断した。このプレートを次に、５０μＬハイブリドーマ上澄み液及び５０μＬ遮断緩衝液と共にインキュベートし、ＮＫＧ２Ｄ−特異性抗体を、遮断緩衝液中の抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ８０−１１５Ｐ）を用いて検出した。これらのインキュベーションは室温で１時間実施され、各ステップの間にプレートはＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗った。結合抗体は、ＡＢＴＳ基質（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、製品：ＡＢＴＳ−１０００）を用いて可視化した。このプレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて４１５ｎｍで読み取った。
【０１９７】
ＥＬＩＳＡ一次スクリーニングで選択されたハイブリドーマを、上述のように、ＦＡＣＳを使用して二次スクリーニングを行った。市販のネズミ抗体（１４９８１０及びＯＮ７２）を対照として使用した。
【０１９８】
結果
免疫化マウスから得た高選択性血清は、ＮＫＧ２Ｄ結合及びリガンド遮断特性によって同定され（例示的な結果を図１Ａ及び１Ｂに示す）、選択されたマウスを、融合及びハイブリドーマ産生に使用した。約２５００のハイブリドーマがＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによりスクリーニングされ、ＮＫＧ２Ｄ特異性クローンが同定された。図２は、市販の抗体（１４９８１０）と比較した、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合しているがＮＫＧ２Ｄ陰性細胞には結合していない、ハイブリドーマ上澄み液中のヒト抗体を示す。第１シリーズの免疫化の３つのハイブリドーマ（１６Ｆ１６、１６Ｆ３１及び２１Ｆ２）から得た抗体と、第２シリーズの免疫化から得たいくつかの抗体（ＭＳを含む）が、組換え生成と更なる試験のために選択された。
【０１９９】
実施例２：組換え生成及び配列決定
ヒト抗体を発現している融合マウス脾臓から得た数百のハイブリドーマの第２のバッチを、別個のラウンドの免疫化（複数可）から得た。これらは実施例１の記述と同様にして、ＦＡＣＳを用いて、ＮＫＧ２Ｄ特異性についてスクリーニングされた。１つのハイブリドーマ（ＭＳ）からの抗体を、組換え生成及び更なる試験のために選択した。
【０２００】
抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をＰＣＲにより同定し、次に、ハイブリドーマからのｍＲＮＡの単離された生成物の配列決定を行った。
【０２０１】
材料及び方法
ＲＮＡの精製。
全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ製ＲＮｅａｓｙを用い、メーカーの説明書に従って精製されたが、ただし、β−メルカプトエタノールは手順から除外された。ＲＮＡの品質は、分光光度計（２６０／２８０ｎｍ、１．８＜比＜２．０）でチェックし、時々、ＲＮＡ分解をバイオアナライザーを用いて評価した。
【０２０２】
ＲＴ−ＰＣＲ。
ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製キット）により全長ｃＤＮＡを合成した。
【０２０３】
ＰＣＲ。
ＣｌｏｎｅｔｅｃｈのＨＦＩＩポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施した。ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ中に導入された保存配列に、５’プライマー（ＥｃｏＲＩあり）をアニーリングした。２つの３’プライマーは、それぞれＩｇＧ（ＶＨ）とκ鎖（ＶＬ）の保存領域にアニーリングするよう設計した。制限部位も、３’プライマー（ＢｓｉＷＩ（ＶＬ）及びＮｈｅＩ（ＶＨ））内に存在していた。ＰＣＲは、全てのＶＨ及びＶＬ増幅について、二重複製で実施した（ＰＣＲ導入の突然変異をチェックするため）。ＰＣＲ反応が不成功であった場合、ＶＬ及びＶＨはＮｏｖａｇｅｎ製の変性５’プライマーミックスを用いて増幅した。
【０２０４】
ＰＣＲ生成物の精製。
ＰＣＲ生成物（約５５０ｂｐ）を、１％アガロースゲル上で分離し、切除し、ＧＦＸカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）で精製し、ＤＮａｓｅフリーウォーター中で溶出させた。
【０２０５】
ライゲーション。
ＰＣＲ生成物及びその発現ベクター（アンピシリン耐性）を、適切な制限酵素で切断した（ＶＨ、ＥｃｏＲＩ＋ＮｈｅＩ及びＶＬ、ＥｃｏＲＩ＋ＢｓｉＷＩ）。可変ドメインの、アイソタイプ記述ベクター（ＮＫＧ２Ｄに対するＩｇＧ４）へのライゲーションは、Ｔ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）により触媒された。使用するプラスミドはｐＴＴ５であった（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００２；３０（２）：ｅ９；Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２００３；８４（３）：３３２〜４２）。
【０２０６】
発現ベクターにおける挿入のチェック（コロニーＰＣＲ）。
免疫能をもつ大腸菌（上位１０個）をライゲーションミックスで形質転換し、アンピシリン耐性クローンを一晩選択した。ＶＨ及びＶＬの両方について合計で８つの陽性コロニーを選んだ。コロニーＰＣＲ及びゲル電気泳動（１％アガロース）により、全てのコロニーについて、期待される大きさに合致する挿入部についてチェックした。
【０２０７】
配列決定／ミニプレップ。
全ての陽性コロニーＰＣＲの部分標本を、配列決定のために調製した（ＥｘｏＳＡＰｉｔを使用）。合計で３２個のＰＣＲ生成物が、各クローンについて配列決定された（（８＊ＶＨ＋８＊ＶＬ）＊２（ＰＣＲ複製））。この配列が解析され（ベクターＮＴＩを使用）、クローンのＶＨ及びＶＬに対応する陽性細菌クローンがアップスケールされ（ミニ／マキシプレップ）、このＤＮＡがＨＥＫ２９３／６Ｅトランスフェクションン（ＧＦＸカラム）のために精製された。２つ以上のＶＨ及びＶＬ配列が同定された場合、全ての可能なＶＬ及びＶＨの組み合わせがＨＥＫ２９３／６Ｅ細胞に発現された。
【０２０８】
組換え生成物。
重鎖及び軽鎖の同定された可変領域が、それぞれ重鎖及び軽鎖のヒトＩｇＧ４フレームワークに挿入去れ、高レベルでＨＥＫ２９３細胞の２つのベクターから発現された。抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムで精製された。
【０２０９】
ＨＥＫ２９３／６Ｅ細胞における抗体発現。
ＨＥＫ２９３細胞は、Ｇｉｂｃｏ製のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で継代培養された。トランスフェクションの当日、細胞は１００万個／ｍＬの濃度に希釈された。３０ｍＬトランスフェクションを行うため、１５μｇの重鎖ベクター及び１５μｇの軽鎖ベクターを、２ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ及び４０μＬ２９３ｆｅｃｔｉｎと混合した（次いでＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を加え、合計体積を３０ｍＬとした）。６日間インキュベーションした後、細胞を遠心分離して（１０００ｒｐｍ、１０分間）ペレットにし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ精製用にその上澄み液を採取した。
【０２１０】
精製。
ヒト抗体の組換え発現ＩｇＧ４変異体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａカラムで精製された。抗体をカラムに通した後、このカラムを、カラム体積の１０倍量のＰＢＳ緩衝液で洗い、抗体を１００ｍＭグリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させ、次いで、ＨｉｇｈＴｒａｐ（商標）脱塩カラムを使用してＰＢＳ緩衝液に交換した。全ての操作は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ製のＡｋｔａｘｐｒｅｓｓシステムにより制御された。精製された抗体の典型的な濃度範囲は、１０〜１３０ｍｇ／ｌ（０．３〜３．３ｍｇ／３０ｍＬ）であった。
【０２１１】
結果
１６Ｆ１６（ＩｇＧ４）Ｈ鎖、１６Ｆ１６Ｌ鎖、１６Ｆ３１（ＩｇＧ４）Ｈ鎖、及び１６Ｆ３１Ｌ鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、米国特許第７，８７９，９８５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、また１６Ｆ１６（ＩｇＧ４）、１６Ｆ３１（ＩｇＧ４）、ＭＳ（ＩｇＧ４）及び２１Ｆ２（ＩｇＧ４）の全長、可変、及びＣＤＲアミノ酸配列のそれぞれの配列識別子は、米国特許第７，８７９，９８５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０２１２】
これらの手順を用いて生成され、かつ本明細書に記述される臨床プロトコルに使用される、例示的な抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、下記に示す配列を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を含む：
抗ＮＫＧ２Ｄ  ＶＨ（配列番号１）
ＱＶＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＤＤＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＳＹＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＮＷＤＤＡＦＮＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
抗ＮＫＧ２Ｄ  ＶＬ（配列番号２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０２１３】
これらの手順を用いて生成され、かつ本明細書に記述される臨床プロトコルに使用される、例示的な抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、並びに、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。
配列番号３
ＳＹＹＷＳ
配列番号４
ＨＩＳＹＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳ
配列番号５
ＷＤＤＡＦＮＩ
配列番号６
ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号７
ＧＡＳＳＲＡＴ
配列番号８
ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ
【０２１４】
実施例３：中程度〜重篤な活動性クローン病を治療するための抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
緒言
この主試験の臨床的実証は、中程度〜重篤な活動性クローン病を有する参加者における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の安全性及び効力に関する情報を提供するものである。
【０２１５】
この試験に使用される抗ＮＫＧ２Ｄの特徴
配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示すＶＨ及びＶＬ領域を含む、ナチュラルキラー群２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体に特異的に結合するヒト免疫グロブリンＧ４アイソタイプモノクローナル抗体が、これらの試験に使用される。この抗体はＮＫＧ２Ｄリガンド結合を遮断し、これにより、下流シグナル伝達減少を妨げる。この下流シグナル伝達減少は、妨げられない場合、細胞増殖と炎症促進性サイトカイン及び細胞毒性メディエーターの放出をもたらす。クローン病患者から得られたいくつかのエビデンスは、ＮＫＧ２Ｄ受容体活性化が、局所サイトカインの生成、免疫応答の活性化、及び標腸細胞の直接的細胞毒性を媒介することにより、疾患の病因において一定の役割を果たしている、という仮説をサポートしている。集合的に、標的組織におけるＮＫＧ２Ｄリガンド又は炎症促進性サイトカインの発現、並びに、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の異常な発現及び活性化に関する前臨床データ及び臨床データは、ＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害剤の臨床的開発に対する理論的根拠を提供している。
【０２１６】
臨床試験
２０１５年１１月１１日時点において、合計１０５人の対象が３つの臨床試験において抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の投与を受けている（２つの関節リウマチ（ＲＡ）試験で６５人の対象、クローン病の第ＩＩａ相試験で４０人の対象）。
【０２１７】
関節リウマチ
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を用いた２つの試験が、活動性ＲＡの患者において実施された。単回投与量（０．０００２〜７．５ｍｇ／ｋｇ）及び複数回投与量（０．０２〜４ｍｇ／ｋｇ）部分を含むヒト初回投与（first-in-humans、ＦＩＨ）の第Ｉ相単回増加用量／複数回増加用量試験で、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に曝露された２４人の対象において、１３の用量レベルが評価された。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の皮下投与は、研究対象の用量範囲で十分に忍容され、単回投与又は複数回投与レジメンのいずれにも、安全性に関する徴候は伴わなかった。第ＩＩａ相の無作為化単回用量二重盲検プラセボ対照付き並行群試験において、臨床的効力は、メトトレキサート（methotrexate、ＭＴＸ）で併用治療されている活動性ＲＡ対象において評価された。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に曝露した４１人の対象において、４ｍｇ／ｋｇの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の単回ＳＣ注射は、プラセボに比べて、治療後６週、１２週、又は２４週での疾患活性において、統計学的に有意な低下は生じなかった。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は十分に忍容され、試験中に安全に関する懸念は生じなかった。
【０２１８】
クローン病
第ＩＩａ相多施設無作為化二重盲検プラセボ対照付き並行群単回投与試験で、対象は、中程度〜重篤な活動性クローン病で、従来の治療（コルチコステロイド又は免疫調節薬）に不成功又は不耐性であった者、又は、１ＴＮＦαアンタゴニスト治療に不耐性又は治療抵抗性であった者であり、クローン病活動指数（ＣＤＡＩ）スコアが≧２２０であるが≦４５０でなければならず、かつ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）≧１０ｍｇ／ｄＬ又は内視鏡検査（スクリーニング中に実施され、盲検化された中央の画像診断者により読み取りが行われた、活動性潰瘍の内視鏡的確認）により炎症が確認された対象のみが、この試験に包含された。この試験は、北米、ヨーロッパ、及びイスラエルの３２の研究機関で７８人の対象が参加し、無作為化された。全対象は、０週時点でプラセボＳＣ（ｎ＝３８）又は２ｍｇ／ｋｇ抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＳＣ（ｎ＝４０）に無作為に１：１の比で割り当てられた。７８人の無作為化対象の中で、平均ベースラインＣＤＡＩスコアは３３０．５であり、２９．５％が最大の１ＴＮＦαアンタゴニスト治療に対して不耐性又は治療抵抗性であった（Ｍａｔｔｈｉｅｗ  Ａら２０１６Ｇｕｔ０：１〜８．ｄｏｉ：１０．１１３６）。
【０２１９】
４週時点のベースラインＣＤＡＩスコアから、変化のプライマリーエンドポイントについて対象が評価された。２４週まで、安全性と効力評価が行われた。４週時点で、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群のＣＤＡＩに、プラセボ群に比べて１６ポイント上回る低減が観察されたが、これは有意ではなかった（ｐ＝０．４０３）。しかしながら、所定の有意レベル０．１０に基づけば、ＣＤＡＩスコアは１２週時点で、プラセボ群に比べて抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群が有意に高かった（プラセボに比べ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体で、５５ポイント上回るＣＤＡＩ低減が観察された。ｐ＝０．０５６）。同じ所定の有意レベル０．１０に基づいて、ＣＤＡＩスコアの低減は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群のうち所定のサブ群「生物剤の事前の不成功なし」（試験母集団の７１％）が、プラセボに比べ、１２週までの全てのベースライン後来院において、有意に高かった（１週、ｐ＝０．０６８；２週、ｐ＝０．０４８；４週、ｐ＝０．０９５；８週、ｐ＝０．０１５、１２週、ｐ＝０．０２５）。
【０２２０】
本試験の一環として、対象のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＮＫＧ２Ｄリガンドのための遺伝子における遺伝的多型が、評価された。効力データの事後解析では、ＮＫＧ２Ｄ受容体及び／又はＭＩＣＢリガンド（ＳＮＰ陽性コホート）における特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を有する対象サブ群において、より高い効力が示された。ＳＮＰ陽性状態とより高い臨床的効力との間の関係が、この第ＩＩｂ相試験において前向き試験された。
【０２２１】
試験参加の平均持続期間は、２つの治療群間で同等であった。特別な関心対象の死亡又は医学的事象は報告されなかった。２４週までに、１つ又は２つ以上の有害事象（ＡＥ）があった対象の割合は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群とプラセボ群とで同様であった。両群において、胃腸事象が最も多く報告されたＡＥであった（抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群で１７人、プラセボ群で１４人の対象）。重篤なＡＥ（ＳＡＥ）は多くはなく、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群で５人（４人はクローン病、１人はクロストリジウム−ディフィシレ菌感染症）であったのに比べ、無作為化対象７８人中７人（９％）で、それぞれ１件のＳＡＥ、プラセボ群において２人（１人はクローン病、１人は腎石症）であった。全てのＳＡＥは、試験薬治療に関連している可能性は低いと評価された。
【０２２２】
全体的に、これらのデータは、中程度〜重篤な活動性クローン病を患う対象において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の更なる開発をサポートしている。
【０２２３】
このプロトコルは、中程度〜重篤な活動性クローン病を患う対象において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の安全性及び効力を評価するようデザインされた、３つの個別の無作為化二重盲検プラセボ対照付き並行群多施設試験から構成されており、この対象は、１つ又は２つ以上の承認された生物剤に対して前に不成功又は不耐性であった者（Ｂｉｏ−ＩＲ）、あるいは、コルチコステロイド又は免疫調節薬に対して不適切な応答を示したか又は忍容できなかった者（Ｂｉｏ−ＮＦ）であった。プロトコルは２部に分けられる。
【０２２４】
パートＩでは、次の２つの試験が実施される：
・試験１：生物剤不耐性又は治療抵抗性（Ｂｉｏ−ＩＲ）の対象における試験；
・試験２：生物剤治療に前に不成功になっていない対象における試験（生物剤非不成功［Ｂｉｏ−ＮＦ］）。
【０２２５】
パートＩＩでは、次の試験が実施される：
・試験３：生物剤不耐性又は治療抵抗性（Ｂｉｏ−ＩＲ）の対象における用量範囲決め試験。
【０２２６】
パートＩの２つの試験は、Ｂｉｏ−ＩＲ（生物剤不耐性又は治療抵抗性）とＢｉｏ−ＮＦ（前に生物剤治療に不成功になっていない者）の両方の対象の専有の母集団を採用することにより、元の第ＩＩａ相試験の結果に基づくよう行われる。パートＩのＢｉｏ−ＩＲ母集団において許容可能な効力が確立された場合、プロトコルの第３試験（生物剤不耐性又は治療抵抗性の対象における用量範囲決め試験からなる）が開始される（パートＩＩ）。
【０２２７】
目的及びエンドポイント
目的及びエンドポイント
目的
３つの試験の各々において、目的は同じである。
【０２２８】
主目的
・ＣＤＡＩスコアをベースラインから低減させることについての、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の効力を評価すること。
・抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の安全性を評価すること。
【０２２９】
副次的目的
・臨床的寛解、臨床的応答、及び粘膜の内視鏡的治癒を引き起こすこと、並びに、寛解を維持することについての、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の効力を評価すること。
・効力と、ＮＫＧ２Ｄ及び／又はＭＩＣＢ  ＳＮＰバイオマーカーの存在との間の関係を評価すること。
・一般的及び疾患特異性の健康関連の生活の質を改善すること、並びに、クローン病関連の入院及び手術を低減させることについての、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の効力を評価すること。
・抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療の薬物動態、免疫原性、薬力学、及びバイオマーカー（例えば、ＣＲＰの低減、便中カルプロテクチン、及び便中ラクトフェリン）を評価すること。
【０２３０】
エンドポイント
３つの試験それぞれのプライマリーエンドポイントは、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化である。
【０２３１】
以下のエンドポイントは、試験３（この試験の用量範囲決め部分）のみにおける主要なセカンダリーエンドポイントとして評価される。これらのエンドポイントは、試験１及び試験２において評価されるが、主要なセカンダリーエンドポイントとしては特定されない。
・ＣＤＡＩで測定される、８週時点の臨床的寛解（ＣＤＡＩ＜１５０）。
・ＣＤＡＩで測定される、８週時点の臨床的応答（ＣＤＡＩのベースラインからの低減が≧１００ポイント、又は、ＣＤＡＩ＜１５０）。
・８週時点のＰＲＯ−２のベースラインからの変化（ＣＤＡＩスコアの腹痛及び排便頻度サブスコアの合計）。
・ＰＲＯ−２で測定される、８週時点の臨床的寛解（ＰＲＯ−２＜７５）。
・ＰＲＯ−２で測定される、８週時点の臨床的応答（ＰＲＯ−２のベースラインからの低減が≧５０ポイント、又はＰＲＯ−２＜７５）。
・１２週時点でのクローン病単純内視鏡スコア（Simple Endoscopic Score for Crohn's Disease、ＳＥＳ−ＣＤ）のベースラインからの変化。
【０２３２】
下記の効力エンドポイントは、３つの試験それぞれで評価される：
・全てのベースライン後来院での、ＣＤＡＩのベースラインからの変化。
・全てのベースライン後来院での、ＣＤＡＩに基づく臨床的寛解。
・全てのベースライン後来院での、ＣＤＡＩに基づく臨床的応答。
・全てのベースライン後来院での、ＰＲＯ−２のベースラインからの変化。
・全てのベースライン後来院での、腹痛スコア（ＣＤＡＩ評価に基づく毎日の平均値の平均）のベースラインからの変化。
・全てのベースライン後来院での、排便頻度スコア（ＣＤＡＩ評価に基づく毎日の平均値の平均）のベースラインからの変化。
・全てのベースライン後来院での、ＰＲＯ−２に基づく臨床的寛解。
・全てのベースライン後来院での、ＰＲＯ−２に基づく臨床的応答。
・全てのベースライン後来院での、ＰＲＯ−３（ＣＤＡＩスコアの腹痛、排便頻度、及び全般的な健康状態サブスコアの合計）のベースラインからの変化。
・８週時点で臨床的応答があった対象の中で、２４週時点のＣＤＡＩに基づく臨床的寛解。
・８週時点で臨床的寛解があった対象の中で、２４週時点のＣＤＡＩに基づく臨床的寛解。
・１２週及び２４週時点での、ＳＥＳ−ＣＤスコアのベースラインからの変化。
・１２週及び２４週時点での、ＳＥＳ−ＣＤスコア≧３のベースラインからの低減に基づく、内視鏡的改善。
・１２週及び２４週時点での、ＳＥＳ−ＣＤにおけるベースラインからの少なくとも５０％の改善。
・１２週及び２４週時点での内視鏡的治癒（粘膜潰瘍の不在として定義される）。
・全てのベースライン後来院での瘻孔応答（排液瘻孔の数がベースラインから≧５０％低減として定義される）。
・ブリストル便性状スケールに基づくエンドポイント（複数可）（詳細は統計解析計画［Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｌａｎ、ＳＡＰ］に記載）。
・全てのベースライン後来院での、０〜１０の数値的評価スケール（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ、ＮＲＳ）に基づく、腹痛のベースラインからの変化。
・８週、１２週、及び２４週時点での、炎症性腸疾患アンケート（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ、ＩＢＤＱ）スコアのベースラインからの変化。
・８週、１２週、及び２４週時点での、ＩＢＤＱ（≧１７０）に基づく臨床的寛解。
・８週、１２週、及び２４週時点での、ＩＢＤＱのベースラインからの≧１６ポイントの改善。
・８週、１２週、及び２４週時点での、３６項目ショートフォーム健康調査（ＳＦ−３６）の身体的サマリー（ＰＣＳ）及び精神的サマリー（ＭＣＳ）スコアにおける、ベースラインからの変化。
・８週、１２週、及び２４週時点での、ＳＦ−３６のＰＣＳ又はＭＣＳスコアにおける、≧５ポイントの改善。
・８週、１２週、及び２４週時点での、バイオマーカー（ＣＲＰ、便中カルプロテクチン、便中ラクトフェリン）のベースラインからの変化。
・ＳＮＰステータスによる８週時点のＣＤＡＩに基づく臨床的寛解。２つのＳＮＰ（ＮＫＧ２Ｄ又はＭＩＣＢ）のうち少なくとも１つが陽性である対象は、ＳＮＰ陽性であると見なされる。
【０２３３】
他の効力エンドポイントが、ＳＮＰステータスにより検討され得る（詳細はＳＡＰに記載）。
【０２３４】
エンドポイントに関する評価については、セクション０の試験評価の項を参照のこと。
【０２３５】
実施例４：試験デザイン及び理論的根拠
試験デザインの概要
本発明のプロトコルは、２つのパートで実施される３つの別個の試験からなり（図１）、これらは、中程度〜重篤な活動性クローン病を患う対象において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の安全性及び効力を評価するようにデザインされる。
【０２３６】
パートＩでは、次の２つの試験が実施される：
・試験１：生物剤不耐性又は治療抵抗性（Ｂｉｏ−ＩＲ）の対象における試験；
・試験２：生物剤治療に前に不成功になっていない対象における試験（生物剤非不成功［Ｂｉｏ−ＮＦ］）。
【０２３７】
パートＩＩでは、次の試験が実施される：
・試験３：生物剤不耐性又は治療抵抗性（Ｂｉｏ−ＩＲ）の対象における用量範囲決め試験。
【０２３８】
パートＩの２つの試験は、Ｂｉｏ−ＩＲ（生物剤不耐性又は治療抵抗性）とＢｉｏ−ＮＦ（前に生物剤治療に不成功になっていない者）の両方の対象の専有の母集団を採用することにより、元の第ＩＩａ相試験の結果に基づくよう行われる。Ｂｉｏ−ＩＲ母集団において許容可能な効力が確立された場合、プロトコルの第３試験（生物剤不耐性又は治療抵抗性の対象における用量範囲決め試験からなる）が開始される（パートＩＩ）（図１を参照のこと）。
【０２３９】
実施例５：参加者
各試験の標的母集団は、中程度〜重篤な活動性クローン病（少なくとも３か月の持続期間）を患う≧１８歳の男性又は女性からなり、これは、０週時点でＣＤＡＩスコアが≧２２０ただし≦４５０であり、スクリーニング時点で高ＣＲＰ＞０．３ｍｇ／ｄＬ（＞３．０ｍｇ／Ｌ）及び／又はカルプロテクチン＞２５０ｍｇ／ｋｇとして定義される。対象は、放射線撮影、組織学、及び／又は内視鏡検査により、過去の任意の時点で事前に確認されている大腸炎、回腸炎又は回結腸炎を有する必要がある。
【０２４０】
加えて、これらの試験の対象は、１つ又は２つ以上の承認された生物剤に対して前に不成功又は不耐性であった者（すなわち、ＴＮＦα−アンタゴニスト又はベドリズマブ、以下本明細書において生物剤不耐性又は治療抵抗性対象と呼ばれる）、あるいは、コルチコステロイド又は免疫調節薬（すなわち、６−メルカプトプリン［６−ＭＰ］、アザチオプリン［ＡＺＡ］、及びＭＴＸ）に対して不適切な応答を示したか又は忍容できなかったが、生物剤に対してはそうでなかった者（以下、本明細書において生物剤非不成功対象）でなければならない。これら２つの母集団は、以下に記載される。
・生物剤不耐性又は治療抵抗性（Ｂｉｏ−ＩＲ）対象（試験１及び試験３）は、インフリキシマブ（又はインフリキシマブのバイオシミラー）、アダリムマブ（又はアダリムマブのバイオシミラー）、セルトリズマブペゴル、又はベドリズマブを、クローン病の治療用に承認された用量で投与されたが、初期に応答しなかったか、初期には応答したが後に失われたか、又はその薬剤に不耐性であった者として定義される。Ｂｉｏ−ＩＲ対象は、前のＴＮＦαアンタゴニスト使用に対して≧８週間のウォッシュアウト期間、及び前のベドリズマブ使用に対して１６週間のウォッシュアウト期間を設けなければならない。
・生物剤非不成功（Ｂｉｏ−ＮＦ）対象（試験２）は、コルチコステロイド又は免疫調節薬６−ＭＰ、ＡＺＡ、又はＭＴＸに対して不適切な応答を示したか又は忍容できなかった者として定義される。コルチコステロイド依存性を呈している（すなわち、クローン病の症状が戻ることなしに、コルチコステロイドの低減に成功できない）対象も適格である。Ｂｉｏ−ＮＦ対象はまた、生物剤治療を受けていてよいが、効力の欠落又は不耐性以外の理由で（例えば、休薬日）中断された場合に限る。
【０２４１】
３つの試験全体で約４５０人の対象が包含されることが想定される。
・パートＩは、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の高用量レジメンの安全性及び効力をプラセボと比べる試験であり、約２００人の対象が包含される（Ｂｉｏ−ＩＲが１００人、及びＢｉｏ−ＮＦが１００人）。
・パートＩＩは、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の複数用量レジメンの安全性及び効力をプラセボと比べる試験であり、ウステキヌマブ（ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標））が参照群として使用される。パートＩＩは追加で約２５０人対象を包含する。パートＩＩに包含される対象は全て、Ｂｉｏ−ＩＲ対象である。
【０２４２】
図２及び図３には、パートＩとパートＩＩの模式図がそれぞれ示されている。
【０２４３】
両パートの試験にわたって、効力、ＰＫ、ＰＤ、免疫原性、バイオマーカー、及び安全性が、適切な時間及びイベントのスケジュールに示される時点において評価される。
【０２４４】
薬理遺伝学的分析のための血液サンプルは、プロトコルのこの構成要素とは別に同意する対象から採取される（地域規制により許可される場合）。薬理遺伝学的研究への対象の参加は任意である。
【０２４５】
３つの試験のそれぞれが、別個に分析される。各試験のプライマリーエンドポイントは、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化である。
【０２４６】
外部のデータ監視委員会（Data Monitoring Committee、ＤＭＣ）が３つの試験の非盲検の安全性データを定期的にレビューし、対象の安全性を監視する。ＤＭＣは、少なくとも１人の該当する治療分野の医療専門家と、少なくとも１人の統計学者を含む。ＤＭＣの責任、権限、及び手順は、その許可証に文書化される。
【０２４７】
実施例６：パートＩ
パートＩにおいて、１００人のＢｉｏ−ＩＲ対象及び１００人のＢｉｏ−ＮＦ対象が、プラセボ又は抗ＮＫＧ２Ｄ抗体高用量の投与を受けるよう、１：１の比で無作為に割り当てられる。これは、順序変更されたブロック無作為化を用い、ベースラインＣＤＡＩスコア（≦３００又は＞３００）及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）で階層化される。Ｂｉｏ−ＩＲ及びＢｉｏ−ＮＦ母集団には別々の無作為化が用いられる。各母集団に十分な数のＳＮＰ陽性対象を確保するために、試験１又は試験２のＳＮＰ陽性対象の比率が７５％（想定される罹患率）未満である場合、各群で５０人超の対象が無作為化され得る。
【０２４８】
パートＩの各試験の治療群は、以下の通りである：
・０週、２週、４週、６週、８週、及び１０週時点でのプラセボＳＣ；１２週からは、これらの対象は以下のように追加用量が投与される：
−１２週時点で臨床的応答している（ＣＤＡＩのベースラインからの低減が≧１００ポイント、又はＣＤＡＩ＜１５０）プラセボ治療対象は、引き続き、１２週から２２週までプラセボＳＣ注射ｑ２ｗが投与される。
−１２週時点で臨床的応答していないプラセボ治療対象は、１２週時点で抗ＮＫＧ２Ｄ抗体４００ｍｇ  ＳＣが投与され、次いで１４週から２２週まで抗ＮＫＧ２Ｄ抗体２００ｍｇ  ＳＣ  ｑ２ｗが投与される。
・０週時点で抗ＮＫＧ２Ｄ抗体４００ｍｇ  ＳＣ、次いで２２週まで２００ｍｇ  ＳＣ  ｑ２ｗ。
【０２４９】
試験１において無作為化Ｂｉｏ−ＩＲ対象の最初の８０％（治療群当たり、少なくとも４０人のＢｉｏ−ＩＲ対象及び少なくとも３０人のＢｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ陽性対象）が８週来院を終えたとき、あるいは、８週より前に試験参加を中止した場合、パートＩの暫定分析が計画される。
【０２５０】
この暫定分析により、パートＩＩを早期に開始することが可能になる。パートＩＩが早期に開始されるかどうかにかかわらず、１００人のＢｉｏ−ＩＲ対象が包含されるまで、パートＩのＢｉｏ−ＩＲ対象の試験参加は継続される。暫定分析に基づいてパートＩＩを開始する決定が行われた場合、１００人のＢｉｏ−ＮＦ対象が包含されるまで、パートＩのＢｉｏ−ＮＦ対象の試験参加は継続される。暫定分析に基づいてパートＩＩが開始されない場合は、全てのＢｉｏ−ＩＲ対象が１２週来院を終えたしたとき（又は、１２週より前に試験参加を中止した場合）、データが分析され、パートＩＩに進むべきか否かが判断される。
【０２５１】
実施例７：パートＩＩ
パートＩＩにおいて、２５０人の追加のＢｉｏ−ＩＲ対象が、プラセボ、あるいは抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の３つの用量レベル、あるいはウステキヌマブのうち１つの投与を受けるよう、１：１：１：１：１の比で無作為に割り当てられる。これは、順序変更されたブロック無作為化を用い、ベースラインＣＤＡＩスコア（≦３００又は＞３００）及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）で階層化される。十分な数のＳＮＰ陽性対象を確保するために、試験３のＳＮＰ陽性対象の比率が７５％（想定される罹患率）未満である場合、各群で５０人超の対象が無作為化され得る。
【０２５２】
パートＩＩの治療群は、以下の通りである：
・０週、２週、４週、及び８週時点でのプラセボＳＣ；１２週からは、これらの対象は以下のように追加用量が投与される：
−１２週時点で臨床的応答している（ＣＤＡＩのベースラインからの低減が≧１００ポイント、又はＣＤＡＩ＜１５０）プラセボ治療対象は、引き続き、１２週、１４週、１６週、及び２０週にプラセボが投与される。
−１２週時点で臨床的応答していないプラセボ治療対象は、１２週時点で抗ＮＫＧ２Ｄ抗体１５０ｍｇ  ＳＣが投与され、次いで１４週、１６週、及び２０週に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体７５ｍｇ  ＳＣが投与される。
・高用量：０週に抗ＮＫＧ２Ｄ抗体４００ｍｇ  ＳＣ、そして２週及び４週に２００ｍｇ  ＳＣ、次いで２０週まで４週間ごとに（ｑ４ｗ）２００ｍｇ  ＳＣ。
・中用量：０週に抗ＮＫＧ２Ｄ抗体１５０ｍｇ  ＳＣ、そして２週及び４週に７５ｍｇ  ＳＣ、次いで２０週まで７５ｍｇ  ＳＣ  ｑ４ｗ。
・低用量：０週に抗ＮＫＧ２Ｄ抗体５０ｍｇ  ＳＣ、そして２週及び４週に２５ｍｇ  ＳＣ、次いで２０週まで２５ｍｇ  ＳＣ  ｑ４ｗ。
・０週にウステキヌマブ（約６ｍｇ／ｋｇ  ＩＶになるよう階層用量）（下記の箇条書きに示す）、次いで８週及び１６週に９０ｍｇ  ＳＣ。
−ウステキヌマブ２６０ｍｇ（体重≦５５ｋｇ）。
−ウステキヌマブ３９０ｍｇ（体重＞５５ｋｇかつ≦８５ｋｇ）。
−ウステキヌマブ５２０ｍｇ（体重＞８５ｋｇ）。
【０２５３】
図２に示すように、対象は必要に応じてプラセボ投与を受け、パートＩＩの盲検を維持する。
【０２５４】
実施例８：暫定分析
試験１において無作為化Ｂｉｏ−ＩＲ対象の最初の８０％（治療群当たり、少なくとも４０人のＢｉｏ−ＩＲ対象及び少なくとも３０人のＢｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ陽性対象）が８週来院を終えたとき、あるいは、８週より前に試験参加を中止した場合、パートＩの暫定分析が計画される。
【０２５５】
この暫定分析は、効果を示す目的のために十分な数の対象が評価されたことをその分析結果が示唆する場合、パートＩＩ（すなわち、試験３の用量範囲決め）を早期に開始することが可能になる。この暫定分析は、試験１の実施又は完了に影響を与えないため、管理的なものと見なされ、最終的な試験１分析の多重性調整を必要としない。
【０２５６】
試験チームとは独立の治験依頼者委員会が設立されて、この暫定データをレビューし、所定の判断ルール（暫定分析計画に定義される）に従って、推奨される決定／対処を構築する。
【０２５７】
暫定分析は、試験２又は試験３については計画されない。
【０２５８】
実施例９：試験デザインの理論的根拠
本発明のプロトコルは、２つのパートで実施される３つの別個の試験からなり、これらは、中程度〜重篤な活動性クローン病を患う対象において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の安全性及び効力を評価するようにデザインされる。試験１と試験２は、プロトコルのパートＩを構成する。このパートにおいて、中程度〜重篤な活動性クローン病のＢｉｏ−ＩＲ及びＢｉｏ−ＮＦ対象における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の単回投与レジメンの安全性及び効力が評価される。許容可能な効力が（Ｂｉｏ−ＩＲ対象について）パートＩで確立されたら、パートＩＩ（Ｂｉｏ−ＩＲ対象における用量範囲決め試験）が開始される。
【０２５９】
試験母集団
３つの試験それぞれの標的母集団は、中程度〜重篤な活動性クローン病（少なくとも３か月の持続期間）を患う、インフォームドコンセント時点で≧１８歳の男性又は女性からなり、これは、ＣＤＡＩスコアが≧２２０かつ≦４５０であり、高ＣＲＰ＞０．３ｍｇ／ｄＬ（＞３．０ｍｇ／Ｌ）及び／又はカルプロテクチン＞２５０ｍｇ／ｋｇとして定義される。
【０２６０】
Ｂｉｏ−ＩＲ母集団は、１つ又は２つ以上の生物剤治療に対して、応答しないか、応答を失ったか、又は不耐性である対象を含み、この母集団は、現在の治療で満たされていない最も高いニーズを有するため、このプロトコルで主たる関心対象母集団である。Ｂｉｏ−ＩＲ母集団において、治療に対する応答は、一般にＢｉｏ−ＮＦ母集団よりも低い。
【０２６１】
Ｂｉｏ−ＮＦ対象群は、開発プログラムの早期にこの母集団における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の影響について追加情報を得るために、パートＩ（試験２）に含まれる。
【０２６２】
プラセボ非応答者に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体用量の選択
パート１においては、プラセボ非応答者には高用量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（４００ｍｇ／２００ｍｇ）が選択された。これは、このパートで試験される用量レジメンがこれのみだからである。
【０２６３】
パート２においては、プラセボ非応答者には中用量が選択された。この用量は、前の第ＩＩａ相試験で試験された用量（効力が示された）よりも高いため、この用量が効果的だと考えられるためである。中用量は更に、高用量に比べて必要な注射回数が少ない。
【０２６４】
実施例１０：評価
効力評価
両パートの試験に選択される効力評価（例えば、ＣＤＡＩ、ＣＲＰ、便バイオマーカー）は、クローン病研究における疾患活動性の臨床的に関連する効果の主要又は補助的手段として、規制機関により承認されている十分に確立された手段である。
【０２６５】
ＣＤＡＩは、効力及び安全性の最後の来院時に計算され、試験薬の長期中止後の効力レベルが評価される。
【０２６６】
ＣＤＡＩの変化は、寛解よりも感度が高いため（すなわち、ＣＤＡＩの変化は、同じサンプルサイズに対して、寛解よりも大きな値を提供する）、３つの試験それぞれでプライマリーエンドポイントとして使用される。ゆえに、この試験はＣＤＡＩの変化を使用した第ＩＩ相について、より効果的であり得る。ただし、臨床的寛解のエンドポイントは、より厳しいエンドポイントとなり、パートＩＩを早期に開始するかどうかを判定するより保守的な判断ルールを提供するため、暫定分析に使用される。
【０２６７】
内視鏡的改善は臨床的症状（例えばＣＤＡＩの変化）よりも遅れて起こると考えられるため、内視鏡的改善の初期評価は（８週ではなく）１２週に行われる。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体とプラセボとを適切に比較するために、プラセボ対照付き期間は１２週まで継続される。
【０２６８】
薬物動態評価
薬物動態評価は、クローン病を患う対象における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の体内動態をより良く理解するために用いられる。
【０２６９】
免疫原性評価
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に対する抗体検出のための血清サンプルが採取され、クローン病を患う対象における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の免疫原性が更に評価される。
【０２７０】
薬力学的評価
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による治療に対する、クローン病を患う対象の応答をより良く理解するため、ＰＤ分析のための血清サンプルが採取される。
【０２７１】
実施例１１：ＤＮＡ及びバイオマーカーの採取
遺伝的変異は、薬物分布及び応答における個人差に寄与する重要な要素であり得ることが知られており、疾患感受性及び予後を知るマーカーの役割を果たし得る。薬理遺伝学的研究は、臨床的結果における個人差を説明するのに役立つ可能性があり、また、薬物に対して異なる応答をする母集団サブ群を特定するのに役立つ可能性がある。
【０２７２】
ＮＫＧ２Ｄ第ＩＩａ相臨床試験から得たデータの事後解析が実施され、患者サンプルの遺伝子型決定を行うことによって、ｒｓ２２５５３３６又はｒｓ２２３９７０５ＳＮＰを有する患者を特定した。この２つのＳＮＰの遺伝子型に基づいて、４つの患者群が試験された。４つの潜在的ハプロタイプ全てについて、これらを有する対象が検討された。このデータは図４にまとめられている。治療から１５日目のＣＤＡＩを、治療前のＣＤＡＩスコアと比較した変化を示す。これらのデータは、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の投与後にＣＤＡＩ表現型が減少した度合が、ハプロタイプと相関関係があることを示している。許容的対立遺伝子に関して複合ホモ接合体である人は（すなわち、ｒｓ２２５５３３６及びｒｓ２２３９７０５ＳＮＰの両方を擁する人は）、ＭＩＣＢ及びＮＫＧ２Ｄの発現が少なく、よって、ＣＤＡＩの低減が大きくなる。逆に、ＭＩＣＢ及びＮＫＧ２Ｄの発現が高い対立遺伝子を有する人は、ＣＤＡＩの変化が小さく、疾患レベルの改善度が低いことが観察された。これらのデータは、これらのＳＮＰに関する対象の遺伝子型と、ＮＫＧ２Ｄ抗体の臨床的効力との間に、潜在的な相関関係があることを示す。
【０２７３】
これらのＳＮＰと抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に対する応答との関係を理解するために、ＳＮＰ分析（ＮＫＧ２Ｄ  ＳＮＰ  ｒｓ２２５５３３６及びＭＩＣＢ［ＮＫＧ２Ｄリガンド］ＳＮＰ  ｒｓ２２３９７０５）のため、全対象から全血サンプルが採取された（詳しくは、ＩＢの最新版を参照のこと）。更に、任意の薬理遺伝学同意書に署名した対象は、完全ゲノム検査を受ける。
【０２７４】
この薬理遺伝学的構成要素の目標は、ＤＮＡを採取して、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＰＫ、ＰＤ、効力、安全性、又は忍容性に影響を与え得る遺伝因子を特定し、また、クローン病に関係する遺伝因子を特定することである。
【０２７５】
バイオマーカー評価は、治療に対する生体応答を検討し、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療及び／又はクローン病に関連するバイオマーカーを特定するために行われる。血清ベースのバイオマーカー分析用の血液サンプルは、全ての対象から採取して、ＮＫＧ２Ｄ経路に関するタンパク質やクローン病の病因を評価する。全血サンプルは、ＲＮＡ発現及びＴ細胞受容体（T-cell receptor、ＴＣＲ）レパートリーの分析のため、全ての対象から採取される。粘膜生検サンプルは、遺伝子及び／又はタンパク質発現の分析と、疾患及び／又は治癒の組織学的評価のために、回結腸内視鏡検査中に採取される。
【０２７６】
ＮＫＧ２Ｄの受容体占有（receptor occupancy、ＲＯ）評価と、免疫表現型評価（ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）も実施される。免疫表現型は、フローサイトメトリーを用いて実施され、用量投与の前後のＣＤ４、ＣＤ８、及びＮＫ細胞の数を評価する。
【０２７７】
実施例１２：対照、無作為化、及び盲検
試験の両パートにおいて、積極的治療がないときに起こり得る臨床的エンドポイントにおける変化の頻度及び大きさを確立するために、プラセボ対照が使用される。プラセボ対照に加えて、ウステキヌマブ参照群をパートＩＩで使用して、この試験の臨床的エンドポイントの感度を判定する。
【０２７８】
ウステキヌマブは、その効力及び安全性プロファイルが十分に記述されていることから、参照群として使用するよう選択された。また、他の治療薬（例えば、ＴＮＦαアンタゴニスト）の使用は、Ｂｉｏ−ＩＲ対象の母集団を潜在的に混同させる可能性があり、盲検を維持するのにかなりの患者の負担をもたらすことが認識されている。
【０２７９】
無作為化は、治療群に対する対象の評価における偏りを最小限に抑え、既知及び未知の対象属性（例えば人口統計学的及びベースライン特性）が治療群全体に均等にバランスがとれるようにする可能性を高め、治療群にわたる統計的比較の妥当性を高めるために、使用される。盲検処置は、データ収集中及び臨床的エンドポイントの評価中の潜在的な偏りを低減するために使用される。
【０２８０】
実施例１３：用量選択
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
ＲＡ及びクローン病の対象における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の以前の臨床試験で得られたＰＫ、ＰＤ及び効力分析の結果並びに安全性データを利用して、このプロトコルにおける３つの試験の用量選択が特徴付けられた。試験ＮＮ８５５５−３６１８は、ＲＡの対象で実施された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の最初のヒト臨床試験であり、ＲＡ対象に対し、調査された最大単回ＳＣ用量は７．５ｍｇ／ｋｇ、調査された最大複数ＳＣ用量レジメンは、２週間ごとに（ｑ２ｗ）４ｍｇ／ｋｇ、合計４回投与であった。ＲＡ対象の滑液中により多くの薬物が入ることが必要であると考えられているため、より高い用量が部分的に投与された。しかしながら、より高い用量であっても、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体はこれらの対象に有効であるとは見られなかった。前のクローン病臨床試験で得られた受容体占有データでは、受容体占有が８週間で約８０％だったものが、１２週時点で約＜２０％に下がっていることが示された（Ａｌｌｅｚ  Ｍ，Ｓｋｏｌｎｉｃｋ  ＢＥ，Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋａ−Ｊａｒｏｓｉｎｓｋａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ  Ａｎｔｉ−ＮＫＧ２Ｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＮＮＣ０１４２−０００２）ｉｎ  ａｃｔｉｖｅ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  Ｇｕｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｆｉｒｓｔ：０３  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１６．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｇｕｔｊｎｌ−２０１６−３１１８２４）。
【０２８１】
前の臨床試験で、ＲＡ又はクローン病の対象において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は十分に忍容され、安全性に関する懸念は特定されなかった。加えて、５２週間反復投与毒性試験では、カニクイザルにおいて最大無有害量（no-observed-adverse-effect level、ＮＯＡＥＬ）は週１回１００ｍｇ／ｋｇ  ＳＣであることが示されている。これらの安全性及び毒性結果に基づいて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の提案されている用量レジメンは、許容可能な安全性プロファイルを有し得ることが期待される。
【０２８２】
前の臨床試験から得た抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＰＫ及びＮＫＧ２Ｄ  ＲＯデータを用いて、母集団ＰＫ／ＰＤモデリング及びシミュレーションが実施された。この試験のための用量レジメンの選択をガイドするのに役立てるため、モデル予測抗ＮＫＧ２Ｄ抗体濃度及び腸におけるＮＫＧ２Ｄ  ＲＯが使用された。腸におけるＮＫＧ２Ｄ  ＲＯは、腸内の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の濃度が、末梢循環血における濃度の約１０％であると仮定することにより予測された。これは、全身循環と腸との間の抗体分布係数が５％〜１５％であることが報告されているためである。
【０２８３】
パートＩ
パートＩの選択された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体用量レジメンには、０週で負荷投与４００ｍｇ  ＳＣ、次いで２２週まで２００ｍｇ  ＳＣ  ｑ２ｗが含まれた。０週での負荷投与４００ｍｇは、臨床的応答の迅速な開始を生じさせるためのものである。パートＩの用量レジメンは、前の臨床試験で十分に忍容された最大全身曝露量と同様の全身曝露量を達成することが予測された。ヒトに対して最初の試験において、最大の複数用量レジメン４ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ  ｑ２ｗ（４回投与）は、血清中の中央値（範囲）Ｃｍａｘが７９．３（５２．８〜９１．２）μｇ／ｍＬをもたらした。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の血清中Ｃｍａｘの予測された中央値は、６４．６４μｇ／ｍＬであり、８週時点の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体濃度中央値は３８．９４μｇ／ｍＬ、クローン病を患う対象における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体血清濃度の定常状態トラフ中央値は３８．３１μｇ／ｍＬである（表２）。
【０２８４】
【表３】
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【０２８５】
腸内の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体濃度を、血清中抗ＮＫＧ２Ｄ抗体濃度の約１０％だと仮定すると、腸内の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の予測される中央値ピーク及びトラフ濃度は、それぞれ６．４６μｇ／ｍＬ及び３．８３μｇ／ｍＬである。ＮＫＧ２Ｄ  ＲＯと抗ＮＫＧ２Ｄ抗体血清濃度との間の生体外での関係分析の結果、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体血清濃度が≧３μｇ／ｍＬであるとき、≧９０％のＲＯが達成されることが示唆されている。その結果、パートＩの用量レジメンは、腸内で約９９％のＮＫＧ２Ｄ  ＲＯをもたらすことが期待される（Ｅｒｒｏｒ！  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ｎｏｔ  ｆｏｕｎｄ．）。このように、パートＩの用量レジメンは、クローン病を患う対象における許容可能な安全マージン内に留まりながら、最大の臨床的応答を達成する確率を増大させることが期待される。
【０２８６】
パートＩＩ
パートＩＩでは、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の３つの用量レジメン（高、中及び低）が選択され、これらは、クローン病を患う対象における曝露量−応答の関係を評価するために、幅広い範囲の全身薬物曝露量を提供することが見込まれる。０週、２週、及び４週での負荷投与は、臨床的応答の迅速な開始を生じさせるためのものである。提案の用量レジメンでの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の見かけの週末相半減期は約２〜３週間であるため、４週〜２０週にわたって４週間ごとに抗ＮＫＧ２Ｄ抗体をＳＣ投与することで、クローン病対象における臨床的応答を維持する可能性が高い抗ＮＫＧ２Ｄ抗体濃度の定常状態トラフ血清中央値を生成することが期待される。加えて、下記に記載されるＰＫ／ＰＤモデリングの結果は、パートＩＩにおける４週間投与間隔の使用を支持している。
【０２８７】
パートＩＩの高用量レジメンは、０週に４００ｍｇ、２週及び４週に２００ｍｇ、次いで２０週まで２００ｍｇ  ｑ４ｗである。この用量レジメンは、クローン病を患う対象において、血清中の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体中央値Ｃｍａｘが５３．９９μｇ／ｍＬ、８週時点の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体血清濃度中央値が１８．９５μｇ／ｍＬ、定常状態での血清抗ＮＫＧ２Ｄ抗体濃度トラフ中央値が１２．００μｇ／ｍＬとなることが予測される。シミュレーション結果は、この高用量レジメンで対象の８９％が、定常状態でトラフ血清抗ＮＫＧ２Ｄ抗体濃度＞３μｇ／ｍＬを維持することが見込まれ、予測される中央値の腸ＮＫＧ２Ｄ  ＲＯは＞９６％（１）となることを示唆している。
【０２８８】
パートＩＩの中用量レジメンは、０週に１５０ｍｇ  ＳＣ、２週及び４週に７５ｍｇ、次いで２０週まで７５ｍｇ  ｑ４ｗである。この中用量レジメンは、高用量レジメンで達成された全身曝露量の約３８％をもたらすことが見込まれる。定常状態での予測される中央値の腸ＮＫＧ２Ｄ  ＲＯは８７％である。
【０２８９】
パートＩＩの低用量レジメンは、０週に５０ｍｇ  ＳＣ、２週及び４週に２５ｍｇ、次いで２０週まで２５ｍｇ  ｑ４ｗである。この低用量レジメンは、クローン病を患う対象において抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の最低有効投与量を見出すために選択されている。定常状態での抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の予測される中央値の血清トラフ濃度は０．７４μｇ／ｍＬであり、これは腸内の中央値ＮＫＧ２Ｄ  ＲＯの６４％をもたらすことが見込まれる。更に、ＲＡ対象のＦＩＨ試験において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の投与量が≧０．３ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗになるまで、ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｄ発現の減少は観察されなかった。また、投与量が≧１ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗになるまで、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方におけるＮＫＧ２Ｄ発現の減少は観察されなかった。これらの観察結果は、薬理学的効果を生成するために少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗの用量レジメンが必要であること、及び、選択された２５ｍｇ  ｑ４ｗ低用量メンテナンスレジメンは、曝露−応答曲線の低い部分で治療効果を生成する可能性が高いことを示唆している。
【０２９０】
パートＩ及びパートＩＩ
パートＩ及びパートＩＩで、選択された４つの異なる抗ＮＫＧ２Ｄ抗体投与レジメンは、前の臨床試験及び５２週間反復用量毒性試験から得た利用可能な全てのＰＫ、効力及び安全性データに基づくものであった。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体について現在利用可能な情報は、ＮＫＧ２Ｄ  ＲＯと薬剤の臨床的効果との間の関係が確立されていないことに留意すべきである。また、現在報告されている腸組織の抗体分布係数は、限定的である可能性があり、腸内の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体濃度は正確に予測されない可能性がある。それにもかかわらず、パートＩ及びパートＩＩで、４つの異なる抗ＮＫＧ２Ｄ抗体投与レジメンの使用は、幅広い範囲の薬剤曝露を提供するものとなり、クローン病治療における抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の曝露−応答関係の堅牢な特性評価を提供することが見込まれる。
【０２９１】
ウステキヌマブ
静脈内（intravenous、ＩＶ）ウステキヌマブを用いた第ＩＩ相の３つの誘導試験、及びＳＣウステキヌマブを用いた第Ｉ相の３つの維持試験から得られた結果を使用して、クローン病治療のためのウステキヌマブの適切な用量レジメンが判定された。その結果、０週で、単回ＩＶ誘導用量６ｍｇ／ｋｇのウステキヌマブ（体重に基づく階層固定用量として投与）、次いで、８週間ごとに９０ｍｇのＳＣ維持療法を行い、一連のエンドポイント（患者報告の結果、炎症の客観的測定、及び健康関連の生活の質測定）にわたって確実な効力を提供し、併せて望ましい安全性プロファイルを提供したことが示されている。
【０２９２】
実施例１４：対象母集団
適格名対象のためのスクリーニングは、試験薬の投与前５週間以内に実施される。
【０２９３】
３つの試験に対象を包含するための組み入れ基準及び除外基準は、以下の２つのサブセクションに記述される。組み入れ基準又は除外基準について疑問がある場合、治験責任医師は、適切な治験依頼者担当者に相談し、試験に対象を包含する前に問題を解決しなければならない。逸脱事例は許可されない。
【０２９４】
下記の組み入れ基準及び除外基準は、このプロトコルの３つの試験全てに適用される。
【０２９５】
組み入れ基準
可能性のある対象はそれぞれ、この試験に包含されるために、下記の基準全てを満たす必要がある：
１．≧１８歳の男性又は女性であること。
２．過去の任意の時点でＸ線撮影、組織学、及び／又は内視鏡検査により確認された、大腸炎、回腸炎又は回結腸炎を伴う、少なくとも３か月の持続期間のクローン病又は瘻孔を伴うクローン病を有すること。
３．ベースラインＣＤＡＩスコアが≧２２０かつ≦４５０であるものとして定義される、活動性クローン病を有すること。
４．スクリーニング時に以下のうち少なくとも１つを有すること：
ａ．異常なＣＲＰ（＞０．３ｍｇ／ｄＬ［＞３．０ｍｇ／Ｌ］）
又は
ｂ．カルプロテクチン＞２５０ｍｇ／ｋｇ。
５．パートＩにおいて、クローン病の以前又は現在の投薬について以下の要件を満たしていること：
ａ．１つ又は２つ以上の承認された生物剤治療（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はベドリズマブ）に対して、不適切な応答、応答の喪失、又は不耐性を示したことがある。
又は
ｂ．従来療法が不成功であったことがある：
１）コルチコステロイド及び／又は免疫調節薬（すなわち、ＡＺＡ、６−ＭＰ、又はＭＴＸ）を現在、適切な治療用量で投与されている。
又は
２）コルチコステロイド及び／又は免疫調節薬（すなわち、ＡＺＡ、６−ＭＰ、又はＭＴＸ）の適当なコースに対し、応答しない、又は不耐性であった履歴を有する。
又は
３）コルチコステロイド依存性を有しているか、コルチコステロイド依存性の履歴があること。
６．パートＩＩにおいて、クローン病の従前又は現在の投薬に関して、以下の要件を満たしていること：１つ又は２つ以上の承認された生物剤治療（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はベドリズマブ）に対して、前に、不適切な応答を示したか、応答を喪失したか、又は不耐性となったことがある。
７．クローン病の治療のための併用投与について、以下の要件に準拠していること。これらの要件は、他に記載のない限り、これらの要件に適合している用量が、ベースライン時（０週）前の少なくとも３週間にわたって、安定しているか又は中断されている場合に、許可される：
ａ．経口５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）化合物。
ｂ．経口コルチコステロイド（プレドニゾン当量用量４０ｍｇ／日以下、又は９ｍｇ／日のブデソニド、又は５ｍｇ／日のジプロピオン酸ベクロメタゾン。
ｃ．クローン病の主治療として使用される抗生物質。
ｄ．従来型の免疫調節薬（すなわち、ＡＺＡ、６−ＭＰ、又はＭＴＸ）：対象は、少なくとも１２週間にわたって投与されており、かつ、ベースライン前の少なくとも４週間にわたって安定用量でなければならない。
８．大腸直腸癌の家族歴、高い大腸直腸癌リスクの個人履歴、年齢＞５０歳、又は他の既知のリスク因子を有する対象は、大腸直腸癌の監視を最新状態にする必要がある（スクリーニング中に行ってもよい）。腺腫様ポリープは、試験薬の初回投与の前に除去しておかなければならない。
９．８年以上にわたり広範な大腸炎を有するか、又は１２年以上にわたり大腸の左側に限定された疾患を有する対象は、最初の試験薬投与前の１年以内に形成異常の存在について評価するための内視鏡検査を受けるか、又は、スクリーニング来院時に悪性度の有無を評価するための内視鏡検査を受けて、悪性のエビデンスがない状態でなければならない。
１０．以下のパラメータ内のスクリーニング検査結果を有すること：
ａ．ヘモグロビン≧８．０ｇ／ｄＬ。
ｂ．白血球数（ＷＢＣ）≧３．０×１０３／μＬ。
ｃ．好中球≧１．５×１０３／μＬ。
ｄ．血小。≧１００×１０３／μＬ。
ｅ．血清クレアチニン＜１．７ｍｇ／ｄＬ。
ｆ．アラニンアミノトランスフェラーゼ（alanine aminotransferase、ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase、ＡＳＴ）の濃度が、試験実施の検査機関で正常範囲上限（upper limit of the normal range、ＵＬＮ）の２倍以内でなければならない。
ｇ．直接（抱合型）ビリルビン＜１．０ｍｇ／ｄＬ。
１１．以下の結核（tuberculosis、ＴＢ）スクリーニング基準に従って適格であると考えられること：
ａ．スクリーニング前に、潜在性又は活動性ＴＢの履歴がないこと。活動性ＴＢのエビデンスがない場合、潜在性ＴＢの治療を現在受けている対象、あるいは、潜在性ＴＢの履歴がありかつ試験薬の初回投与の前３年以内に潜在性ＴＢに対する適切な治療を完了していることを示す文書がある対象については、例外となる。以前のＴＢ治療の妥当性を検証し、適切な文書を提供することは、治験責任医師の責任である。
注：上記に概説されている例外は、多剤抵抗性ＴＢ負荷が高い国（例えば、ブラジル、中国、インド、ロシア連邦、及び南アフリカ）の対象は、多剤耐性ＴＢの潜在的懸念があることから、除外される。
ｂ．医療履歴及び／又は身体的検査の際に活動性ＴＢを示唆する徴候又は症状を有しないこと。
ｃ．最近、活動性ＴＢを有する人と最近密接な接触がないこと。そのような接触があった場合は、ＴＢ専門医師に紹介して追加評価を行い、保証された場合は、試験薬の初回投与の前又は同時に、潜在性ＴＢに対する適切な治療を受けること。
ｄ．修正項１により改変された基準。
ｄ．１試験薬の初回投与前２か月以内に、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ検査で陰性であるか、活動性ＴＢが除外されるＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ検査で新たに陽性と特定され、この場合、潜在性ＴＢの適切な治療が、試験薬の初回投与の前又はこれと同時に開始されていること（ただし、多剤抵抗性ＴＢ負荷が高い国［例えば、ブラジル、中国、インド、ロシア連邦、及び南アフリカ］は除き、これらの国で新たに特定されたＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ検査陽性結果の対象は除外される）。不確定結果は、指示に従って取り扱うべきである。ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ検査がその国で認可／登録されていない場合は、ツベルクリン皮膚検査陰性であることが追加で必要となる。ツベルクリン皮膚検査は推奨されるが、ツベルクリンが利用できない国にある試験期間については不要である。ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ  ＩＮ−Ｔｕｂｅ検査は、上述の組み入れ基準に記述されているように潜在性ＴＢ及び適切な治療の履歴がある対象については、スクリーニング時には不要である。
ｅ．試験薬の初回投与の前３か月以内に行った胸部Ｘ線撮影（後−前像及び側方像）があり、適格な放射線医の読み取りを受け、現在活動性のＴＢ又は古い不活動性ＴＢのエビデンスがないこと。
１２．妊娠可能性のある女性は、スクリーニング時に高感度血清（β−ヒト線毛性性腺刺激ホルモン［β−ｈＣＧ］）妊娠検査結果が陰性であり、かつ０週時点で妊娠尿検査結果が陰性でなければならない。
１３．無作為化の前に、女性対象は以下のいずれかでなければならない：
ａ．下記で定義されるように、妊娠能力がないこと：
１）初潮前：初潮前状態とは、初潮がまだ起こっていない状態である。
２）閉経後：閉経後状態とは、別の医学的原因なしに、１２か月間にわたる無月経として定義される。閉経後範囲において高レベルの卵胞刺激ホルモン（follicle-stimulating hormone、ＦＳＨ）（＞４０ＩＵ／Ｌ又はｍＩＵ／ｍＬ）を使用して、女性がホルモン避妊薬又はホルモン置換療法を使用していない閉経後状態であることを確認することができる。ただし、１２か月間の無月経がない場合、単回のＦＳＨ測定では不十分である。
３）永久不妊：永久不妊方法には、子宮摘出、両側卵管切除、両側卵管閉塞／結紮手術、及び両側卵巣摘出が含まれる。
又は
ｂ．妊娠能力を有する場合：
１）臨床試験に参加する対象の避妊方法の使用に関する地域の規制に準拠して、避妊効果の高い方法（一貫して適正に使用した場合に失敗率が年間＜１％）を実施すること。避妊効果の高い方法の例としては、使用者に依存しない方法、例えば、排卵阻害に関係する移植可能なプロゲストゲン単独のホルモン避妊薬、子宮内デバイス（intrauterine device、ＩＵＤ）、子宮内ホルモン放出システム（intrauterine hormone-releasing system、ＩＵＳ）、精管切除のパートナー、又は性交禁止（治験薬に関係する全リスク期間中に異性間性交を控えることとして定義され、かつ、対象の希望及び通常のライフスタイルに適合している場合にのみ、効果の高い方法と見なされる）、又は、使用者に依存する方法、例えば、排卵阻害に関係する組み合わせ（エストロゲン及びプロゲストゲンを含む）ホルモン避妊薬、又は、排卵阻害に関係するプロゲステロン単独の避妊薬（経口、注射可能）。
２）試験期間中、及び、試験薬の最後の投与後少なくとも１２週間（２０週以前に試験薬を中断したパートＩＩの対象については１６週間）にわたって、効果の高い避妊方法を続けることに合意すること。
注：試験開始後に、対象の妊娠能力が変化した場合（例えば、初潮前の女性に初潮が起こった場合）、又は妊娠リスクが変化した場合（例えば、異性間性交活動性でなかった女性が活動性になるなど）、女性は、組み入れ基準全体に記述されているように、効果の高い避妊方法を開始しなければならない。
１４．女性は、試験期間中、及び、試験薬の最後の投与後少なくとも１２週間（２０週以前に試験薬を中断したパートＩＩの対象については１６週間）にわたって、生殖補助医療の目的のため、卵（卵子、卵母細胞）を提供しないことに合意しなければならない。
１５．試験期間中、及び、試験薬の最後の投与後少なくとも１２週間（２０週以前に試験薬を中断したパートＩＩの対象については１６週間）にわたって、男性は、
ａ．妊娠可能性のある女性と性的に活動性である場合、障壁避妊方法（例えば、殺精子フォーム／ゲル／フィルム／クリーム／座薬と共にコンドーム使用）を使用することに合意しなければならない。
ｂ．妊娠した女性と性的に活動性である場合、コンドームを使用しなければならない。
ｃ．精子を提供しないことに合意しなければならない。
１６．このプロトコルに指定された禁止事項及び制限事項を守る意思があり、それが可能でなければならない。
１７．各自が研究の目的とそれに必要な手順を理解し、研究に参加する意思があることを示す、インフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）に署名しなければならない。
１８．修正項１により改変された基準。
１８．１この試験の全対象について、ＳＮＰ検査のためのＤＮＡサンプル採取が必要である。各対象は、陽性又は陰性のいずれかのＳＮＰステータスを有していなければならない。各対象は、地域の規制により認められている場合、追加の任意のＤＮＡ研究の許諾に合意する場合、別個のＩＣＦに署名しなければならない。任意のＤＮＡ研究に対して許諾を拒否しても、この試験への参加から対象を除外することはない。
【０２９６】
除外基準
可能性のある対象で、以下の基準のいずれかに該当する者は、この試験の参加から除外される：
１．症候性狭窄又は狭窄症、短腸症候群、又は手術の必要が予測され得る任意の他の症状発現などの、クローン病の合併症を有している場合は、治療に対する応答を評価するＣＤＡＩの使用から除外され得る。さもないと、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブでの治療効果を評価するための能力を混乱させる可能性がある。
２．現在膿瘍があるか、又は膿瘍の疑いがある。最近の皮膚及び肛門膿瘍は、更なる手術の必要性が予想されない限りにおいて、ベースラインの少なくとも３週間前、又は腹腔内膿瘍に関してはベースラインの８週間前に、排膿され適切に治療されている場合は、除外とはならない。活動性の瘻孔がある対象は、手術の必要性が予想されない場合、かつ現在特定されている膿瘍がない場合には、組み入れることができる。
３．ベースライン前の６か月以内に何らかの腸切除を行ったか、又は３か月以内に何らかの他の腹内手術を行った場合。
４．排液中の（すなわち、機能中の）ストーマ又はオストミーを有する場合。
５．所定期間内に、以下の処方薬又は治療のいずれかを受けている場合：
ａ．ＩＶコルチコステロイドの投与を、ベースライン前の３週間以内に受けている場合。
ｂ．他の経口免疫調節薬（例えば、６−チオグアニン［６−ＴＧ］、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、又はミコフェノール酸モフェチル、トファシチニブ及び他のヤーヌスキナーゼ［ＪＡＫ］阻害剤）の投与を、ベースライン前の６週間以内、又は薬剤の半減期の５倍以内のうちいずれか長い方の期間のうちに受けている場合。
ｃ．非生物学的試験薬又は治験薬を、ベースライン前の４週間以内、又は薬剤の半減期の５倍以内のうちいずれか長い方の期間のうちに受けている場合。
ｄ．非自家幹細胞治療（例えばＰｒｏｃｈｙｍａｌ）、ナタリズマブ、エファリズマブ、又はＢ細胞若しくはＴ細胞を消耗させる生物剤（例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、又はビジリズマブ）の投与を、ベースライン前の１２か月以内に受けている場合。
ｅ．ＴＮＦα−アンタゴニスト生物剤（例えば、ｍＡｂ治療）、又は、ＴＮＦαを抑制若しくは排除することを目的とした他の薬剤の投与を、ベースライン前の８週間以内に受けている場合。
ｆ．ベドリズマブの投与を、ベースライン前の１６週間以内に受けている場合。
ｇ．他の免疫調節生物剤を、ベースライン前の１２週間以内、又は薬剤の半減期の５倍以内のうちいずれか長い方の期間のうちに受けている場合。
ｈ．クローン病の治療として、アフェレーシス治療（例えば、アダカラムアフェレーシス）又は完全非経口栄養法を、ベースライン前の３週間以内に受けている場合。
６．過去４か月以内に、腸内病原菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素を含む）に関して便培養又はその他の検査で陽性となっている場合。ただし、再検査結果が陰性であり、かつその病原の感染継続の徴候がない場合は除く。
７．ＩＬ−１２又はＩＬ−２３を標的とする生物剤（ウステキヌマブ又はブリアキヌマブ（ＡＢＴ−８７４）を含むがこれらに限定されない）をこれまでに投与されたことがある場合。
８．抗ＮＫＧ２Ｄ抗体をこれまでに投与されたことがある場合。
９．ベースライン前の１２か月以内にカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette-Guerin、ＢＣＧ）ワクチン接種を受けたか、又は、ベースライン前の１２週間以内に他の生菌又は生ウイルスワクチン接種を受けた場合。
１０．慢性又は再発性の感染症の病歴があるか又は進行中である場合。これには、慢性腎感染症、慢性胸部感染症、再発性尿路感染症（例えば、再発性腎盂腎炎又は慢性継続性膀胱炎）、又は開放、排膿、若しくは感染した皮膚創傷若しくは潰瘍が含まれるがこれらに限定されない。
１１．現在、感染の徴候又は症状を有する場合。明確な非重篤感染症（例えば、急性上気道感染症、単純尿路感染症）の場合は、治験責任医師の裁量により、必ずしも除外とは見なされない。
１２．ベースライン前の８週間に、重篤な感染症（例えば、敗血症、肺炎、又は腎盂腎炎）の履歴を有し、これには入院又はＩＶ抗生物質投与を必要とする何らかの感染症が含まれる。
１３．ベースライン前の８週間以内に、眼部帯状疱疹感染のエビデンスがある場合。
１４．スクリーニング前に、潜伏性又は急性肉芽腫性感染症の履歴がある場合。これにはヒストプラスマ症又はコクチジオイデス真菌症が含まれる。潜在的ＴＢの履歴の適格性に関する情報は、組み入れ基準１１ａを参照のこと。
１５．現在急性感染症（ＴＢを含む）のエビデンスがあるか、又は、スクリーニング時若しくは他の利用可能な胸部Ｘ線撮像で肺の悪性疾患が疑われる小節がある場合。ただし、外科的又は追加の撮像により、及び情報源文書の確認により、最終的に解消された場合を除く。
１６．非結核性抗酸菌感染症又は重篤な日和見感染症（例えば、サイトメガロウイルス大腸炎、ニューモシスチス・カリニ肺炎、アスペルギルス症）を有しているか、又は有したことがある場合。
１７．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体陽性であるか、スクリーニング時にＨＩＶ検査結果が陽性である場合。
１８．治療成功の履歴（抗ウイルス治療から少なくとも２４週間後に、ＨＣＶ  ＲＮＡが陰性となることとして定義される）なしに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の抗体が血清陽性である場合。
１９．対象は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のスクリーニングを受けなければならない。少なくとも、これには、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶ表面抗体（抗ＨＢｓ）、及びＨＢＶコア抗体（抗ＨＢｃ）合計の検査が含まれる：
ａ．全てのＨＢＶスクリーニング検査（すなわち、ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｃ、及び抗ＨＢｓ）に関して陰性である対象が、この試験に適格である。
ｂ．表面抗原検査が陽性（ＨＢｓＡｇ＋）である対象は、他のＢ型肝炎検査の結果にかかわらず、この試験には不適格である。
ｃ．表面抗原検査が陰性（ＨＢｓＡｇ−）で、かつコア抗体検査陽性（抗ＨＢｃ＋）で表面抗体検査陽性（抗ＨＢｓ＋）である対象は、この試験に適格である。
ｄ．表面抗体検査のみが陽性（抗ＨＢｓ＋）の対象は、この試験に適格である。
ｅ．コア抗体検査のみが陽性（抗ＨＢｃ＋）の対象は、更にＢ型肝炎ＤＮＡ酸の検査（ＨＢＶ  ＤＮＡ検査）を受けなければならない。ＨＢＶ  ＤＮＡの検査が陽性であれば、その対象はこの試験に適格ではない。ＨＢＶ  ＤＮＡの検査が陰性であれば、その対象はこの試験に適格である。ＨＢＶ  ＤＮＡの検査ができない場合には、その対象はこの試験に適格ではない。
注：ＨＩＶ、ＨＣＶ、及びＨＢＶの検査結果によりこの試験に不適格となった対象については、これらの感染の治療に関して専門家と医師とが相談することが推奨される。
２０．重篤、進行性、又は制御されていない、腎臓、肝臓、血液学的、内分泌、肺、心臓、神経、脳、又は精神疾患、又はその徴候と症状を有する場合。
２１．移植臓器を受けている場合（スクリーニングの１２週間以上前に行われた角膜移植は除く）。
２２．リンパ増殖性疾患の既知の履歴がある場合。これには、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（monoclonal gammopathy of unknown significance、ＭＧＵＳ）、リンパ腫、あるいは、リンパ増殖性疾患の可能性が疑われる徴候と症状（リンパ節疾患及び／又は巨脾症など）が含まれる。
２３．既知の悪性疾患を有するか、悪性疾患の履歴を有する場合（ただし、例外として、基底細胞癌、皮膚の正常所在扁平上皮癌正常所在子宮頸癌（再発のエビデンスなしに治療済みのもの）、又は、スクリーニング前の５年以内に再発のエビデンスなしに治療済みの皮膚の扁平上皮癌が含まれる）。
２４．不良な忍容性、又は静脈へのアクセスが困難であるために、複数の静脈穿刺を受けることができない場合、又は受ける意思がない場合。
２５．ベースライン前の１２か月間に、薬物乱用（薬物又はアルコール）の問題があったことが知られている場合。
２６．抗ＮＫＧ２Ｄ抗体若しくはウステキヌマブ又はそれらの賦形剤のいずれかに対して、既知のアレルギー、過敏症、又は不耐症がある場合（ＩＢを参照のこと）。
２７．この試験の参加中に、治験薬又は手順を用いた何らかの他の試験に参加しているか、又は参加しようとしている場合。
２８．本試験に包含されている間に、又は試験薬の最後の投与から１２週間（２０週以前に試験薬を中断したパートＩＩの対象については１６週間）以内に、妊娠中、母乳栄養中、又は妊娠しようとしている女性、あるいは、子供の父親となる計画である男性。
２９．治験責任医師の見解において、参加が対象の最善の利益とはならないような（例えば健康状態を低下させるような）、あるいは、プロトコル固有の評価を妨げる、制限する、又は混乱させ得るような、何らかの状況を有する場合。
３０．治験責任者又は試験実施機関の被雇用者であり、治験責任者又は試験実施機関の指示に基づいて提示試験又は他の試験に直接的に関与している者、あるいはそのような被雇用者又は治験責任者の家族。
【０２９７】
実施例１５：治療割り当てと盲検
治療割り当て
この研究では中央無作為化を実施する。対象は、治験依頼者により又は治験依頼者の監督下で試験前に準備された、コンピューター生成無作為化スケジュールに基づいて、パートＩにおいて２つの治療群のうち１つに無作為に割り当てられ（１：１比）、パートＩＩにおいて５つの治療群のうち１つに無作為に割り当てられる（１：１：１：１：１比）。３つの試験はそれぞれ、別個の無作為化を有する。各無作為化は、無作為に順序変更されたブロックを用いてバランス化され、ベースラインＣＤＡＩスコア（≦３００又は＞３００）及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）により階層化される。対話型ウェブ応答システム（interactive web response system、ＩＷＲＳ）は、対象の治療割り当て及び合致する試験薬キットを決定する、固有の治療コードを割り当てる。リクエスト者はＩＷＲＳにコンタクトする際に、自分の使用者識別及び個人番号を使用しなければならず、その対象を一意に識別するために、該当する対象の詳細情報を与える。
【０２９８】
盲検
試験盲検を維持するために、試験薬容器は、試験名及び薬剤番号又はシリンジ番号を含むラベルを有する。このラベルは、容器内の試験薬を特定しない。薬剤番号又はシリンジ番号は、その薬が分与される際に、症例報告フォーム（case report form、ＣＲＦ）に入力される。試験薬は外観及びパッケージが同一である。
【０２９９】
計画された効力及び安全性評価は、下記の計画されたＤＢＬの後に実施される（追加のＤＢＬが生じる場合があり、これは統計解析計画に記述される）：
・暫定分析ロック（試験１：Ｂｉｏ−ＩＲ対象）：パートＩ  Ｂｉｏ−ＩＲ対象の約８０％（治療群当たり、少なくとも４０人のＢｉｏ−ＩＲ対象及び少なくとも３０人のＢｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ陽性対象）が８週来院を終えたとき、あるいは、８週より前に試験参加を中止した場合、行われる。
・パートＩ  Ｂｉｏ−ＩＲの１２週ＤＢＬ（試験１）：全てのパートＩ  Ｂｉｏ−ＩＲ対象が１２週来院を終えたとき、又は１２週より前に試験参加を中止した場合、行われる。
・パートＩ  Ｂｉｏ−ＮＦの１２週ＤＢＬ（試験２；任意）：このＤＢＬは、パートＩ  Ｂｉｏ−ＩＲ対象の１２週ＤＢＬに基づいて、パートＩＩを開始しないという決定がなされた場合に行われる。専用ＤＢＬは、全てのＢｉｏ−ＮＦ対象が１２週来院を終えたとき、又は１２週より前に試験参加を中止した場合、行われる。
・パートＩ（試験２）及びパートＩＩ（試験３）Ｂｉｏ−ＮＦの１２週ＤＢＬ：全てのパートＩ  Ｂｉｏ−ＮＦ及びパートＩＩ対象が１２週来院を終えたとき、又は１２週より前に試験参加を中止した場合、行われる。
・２４週ＤＢＬ（試験１、２、及び３）：全てのパートＩ及びパートＩＩ対象が２４週来院を終えたとき、又は２４週より前に試験参加を中止した場合、行われる。
・最終ＤＢＬ（試験１、２、及び３）：全てのパートＩ及びパートＩＩ対象が最後の効力及び安全性来院を終えたとき、又は最後の効力及び安全性来院より前に試験参加を中止した場合、行われる。
【０３００】
パートＩ  Ｂｉｏ−ＮＦ及びパートＩＩの１２週ＤＢＬより前に行われるＤＢＬの時点で、限られた数の治験依頼者側の者に対して、治療割り当ての盲検が解除される。パートＩ  Ｂｉｏ−ＮＦ及びパートＩＩの１２週ＤＢＬの時点で、治験実施施設モニター（治験実施施設とのやりとりがある）を除く治験依頼者に対して、治療割り当ての盲検が解除される。パートＩ  Ｂｉｏ−ＮＦ及びパートＩＩの１２週ＤＢＬの前に、対象レベルのデータにアクセスする治験依頼者人員の識別情報は、盲検解除の前に文書化される。試験盲検は、試験の全ての対象について最終的な分析が完了するまで、治験責任医師、治験実施施設人員、対象、及び治験依頼者側の治験実施施設モニターに対して維持される。この対処は、残りの治験責任医師及び対象評価における潜在的な偏りを軽減する。
【０３０１】
治療割り当てを潜在的に盲検解除し得るデータ（すなわち、試験薬の血清濃度、抗薬物抗体、治療割り当て、及び試験薬調製／アカウンタビリティデータ）は、特別に注意して取り扱われ、盲検の完全性を維持し、偏りの可能性を最小限に抑えるように保証される。特に、盲検解除の前に、この情報が、データクリーニングの目的のため、限られた数のデータ管理スタッフにのみ利用可能となる。また該当する場合は、独立の薬剤感作を実施する目的で品質保証担当者に利用可能となる。
【０３０２】
ＳＮＰステータスと、ベースライン後のＣＲＰ、便中ラクトフェリン、及び便中カルプロテクチン検査の結果は、治験実施施設に対して盲検化される。治験実施施設がこれらのデータを要求する場合は、最終的な分析が完了した後に提供される。
【０３０３】
指定された薬剤師又は他の適切なライセンス及び権限を有する人員及び独立の薬剤モニターは、試験薬に関して盲検解除される。プラセボ輸液／注射は、ウステキヌマブ輸液／抗ＮＫＧ２Ｄ抗体注射と同じ外観を有する。いかなる場合でも、盲検解除された人員は、対象に対する治療割り当てを明らかにしてはならない。
【０３０４】
生物分析目的のため、ＰＫ、抗薬物抗体、及びＰＤ生物分析を開始する前に、盲検解除されたデータ管理チームは治験依頼者側のバイオアナリストに対し、対象が受けた治療（抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ウステキヌマブ、又はプラセボ）についての情報を提供するが、対象に対して無作為化されている用量レベルについての情報は提供しない。ＰＫ、免疫原性、及びＰＤ生物分析を行う目的のため、ＪａｎｓｓｅｎのＢｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙのバイオアナリストには、薬剤濃度の決定、試験薬に対する抗体の検出、又はＰＤ評価のために血清サンプルを分析する時点で、治療レベルデータ（抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ウステキヌマブ、又はプラセボ）が盲検解除される。サンプルは、投与された治療に基づいて分けられる。対象の識別及び投与用量は開示されない。
【０３０５】
加えて、所与の対象の治療割り当ては、予期せぬ重篤な副作用の疑い（suspected unexpected serious adverse reaction、ＳＵＳＡＲ）に関して、規制による報告要件を充足するために、治験依頼者、治験審査委員会／独立倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ／Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＲＢ／ＩＥＣ）、及び治験実施施設人員に対して盲検解除される場合がある。
【０３０６】
治験責任医師には無作為化コードは提供されない。このコードは、ＩＷＲＳ内に維持される。このコードは、治験責任医師が個々の対象に対する盲検を破ることを可能にする機能を有する。
【０３０７】
通常の状況下では、全ての対象について最終的分析が完了するまで、盲検は解除されるべきではない。そうでない場合には、対象の治療ステータスを知ることによって特定の緊急治療／一連の対処が示され得る場合に限り、盲検は解除されるべきである。そのような場合、治験責任医師は緊急時にＩＷＲＳに連絡することにより治療の内容を判断することができる。治験責任医師は、盲検を解除する前に、可能であれば治験依頼者又は被指名人に連絡して、具体的な状況について検討することが推奨される。治験依頼者又はその被指名人との電話連絡は、毎日２４時間、週７日間可能である。盲検が解除された場合、治験依頼者には可及的速やかに通知しなければならない。盲検解除の日付、時間、及び理由をＩＷＲＳによりＣＲＦの適切なセクションに文書化し、情報源文書としなければならない。ＩＷＲＳから受け取ったコード解除を示す文書は、セキュリティが確実な方法で対象の情報源文書と共に保持され、これによって、治験実施施設モニターを盲検解除しないようにする。治験責任医師は、治験実施施設モニター又は治験依頼者人員に対して、試験治療の割り当てを明らかにしないようにアドバイスされる。
【０３０８】
別個のコード破棄手順はＪａｎｓｓｅｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙグループが使用するために利用可能であり、これにより規制及び健康管轄機関の具体的な陽性に準拠するために個々の対象の盲検解除が可能になる。
【０３０９】
治療割り当てが盲検解除された対象は、更なる試験薬投与は中止されるが、予定された評価のために引き続き再訪するべきである（セクションＥｒｒｏｒ！  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ｎｏｔ  ｆｏｕｎｄ．）。
【０３１０】
実施例１６：用量及び投与
パートＩ
試験のパートＩにおいて（図２）、全ての対象が０週にプラセボＳＣ又は抗ＮＫＧ２Ｄ抗体４００ｍｇ  ＳＣの投与を受け、１２週時点でのプラセボ非応答者を除き、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２週に、プラセボＳＣ又は抗ＮＫＧ２Ｄ抗体２００ｍｇ  ＳＣの投与を受ける。プラセボ非応答者は１２週に抗ＮＫＧ２Ｄ抗体４００ｍｇ  ＳＣの投与を受け、１４、１６、１８、２０、及び２２週に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体２００ｍｇ  ＳＣの投与を受ける。パートＩの試験薬濃度は１００ｍｇ／ｍＬである。
【０３１１】
パートＩの盲検を維持するために、全ての対象が０週及び１２週に４回のＳＣ注射を受け、２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、２０、及び２２週に２回のＳＣ注射を受ける。
【０３１２】
パートＩＩ
試験のパートＩＩにおいて（図３）、対象は下記の通り、プラセボ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の３つの用量レジメンのうちの１つ、又はウステキヌマブの投与を受けるよう、等しい割合で無作為に割り当てられる。
・プラセボ：０、２、４、８、１２、１６、及び２０週にプラセボＳＣ。１２週時点でのプラセボ非応答者は、１２週に抗ＮＫＧ２Ｄ抗体１５０ｍｇ  ＳＣの投与を受け、１４、１６、及び２０週に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体７５ｍｇ  ＳＣの投与を受ける。
・抗ＮＫＧ２Ｄ抗体高用量：０週に４００ｍｇ  ＳＣ、及び２、４、８、１２、１６、及び２０週に２００ｍｇ  ＳＣ。（試験薬濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ）
・抗ＮＫＧ２Ｄ抗体中用量：０週に１５０ｍｇ  ＳＣ、及び２、４、８、１２、１６、及び２０週に７５ｍｇ  ＳＣ。（試験薬濃度＝０週は１００ｍｇ／ｍＬ及び５０ｍｇ／ｍＬ、その後の用量は７５ｍｇ／ｍＬ）
・抗ＮＫＧ２Ｄ抗体低用量：０週に５０ｍｇ  ＳＣ、及び２、４、８、１２、１６、及び２０週に２５ｍｇ  ＳＣ。（試験薬濃度＝０週は５０ｍｇ／ｍＬ、その後の用量は２５ｍｇ／ｍＬ）
・ウステキヌマブ：０週に約６ｍｇ／ｋｇ  ＩＶの階層用量（セクション０）、及び８及び１６週に９０ｍｇ  ＳＣ。
【０３１３】
０週の試験約ＩＶ投与は、１時間未満の時間にわたって行うべきである。この輸液は、調製から５時間以内に完了させるべきである。
【０３１４】
パートＩＩの盲検を維持するために、全ての対象は０週に４回のＳＣ注射及びＩＶ輸液の投与を受け、２、４、１２、及び２０週に２回のＳＣ注射を受け、８及び１６週に３回のＳＣ注射を受け、１４週に１回のＳＣ注射を受ける。
【０３１５】
治療コンプライアンス
試験薬は、有資格スタッフによるＩＶ輸液又はＳＣ注射として投与される。各投与の詳細は、ＣＲＦに記録される。ＩＶ輸液については、これには、ＩＶ輸液の日付、開始時刻と停止時刻、輸液量が含まれる。ＳＣ注射については、ＳＣ注射の日付及び時刻が含まれる。
【０３１６】
実施例１７：効力評価
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に対する疾患活動性応答を評価するには、ＣＤＡＩが主なツールになり、他に、ＰＲＯ−２、ＰＲＯ−３、ブリストル便性状スケール、及ＮＲＳ０〜１０スケールに基づく腹痛が用いられる。炎症の程度は、血清ＣＲＰ濃度の測定により評価される。便サンプルが採取及び分析されて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブ治療を反映し得るマーカーの変化が評価される。対象の健康状態は、ＩＢＤＱ及びＳＦ−３６を用いて測定される。粘膜治癒は、回結腸内視鏡により評価される。瘻孔疾患を伴う対象は、瘻孔の閉鎖も評価される。
【０３１７】
クローン病活動性指数
ＣＤＡＩは、８つの異なるクローン病関連変数（腸外症状発現、腹部の塊、体重、ヘマトクリット、液状便の合計回数、腹痛／痙攣、下痢止め薬（複数可）及び／又はあへん剤の使用、並びに全般的な健康状態）に関する情報を集めることによって評価される。最後の４変数は、対象が７日間にわたって日誌カードにスコア付けを行う。ＰＲＯ−２スコアは、液状便の合計回数と腹痛／痙攣のＣＤＡＩ構成要素に基づく。ＰＲＯ−３スコアもＣＤＡＩに基づくものであり、ＰＲＯ−２構成要素に加え、全般的な健康状態も含む。対象は、日誌入力を行い、来院のたびに日誌を持参することになっている。
【０３１８】
ブリストル便性状スケール
ブリストル便性状スケールは、ヒトの便の形状（性状）を７つのカテゴリーに分類するための医療用補助である。腸の様々な疾患（例えば過敏性腸症候群）に対する治療の有効性を評価するのに、研究用ツールとして使用されている。対象はブリストル便性状スケールを日誌入力として記入し、１２週間まで来院のたびに日誌を持参する。
【０３１９】
腹痛数値的評価スケール
痛みのＮＲＳは、成人における痛みの強度の一次元測定である。１１ポイント（０〜１０）のＮＲＳを使用して、腹痛を評価する。スコア０は、「無痛」を表し、スコア１０は、「考えられる限り最悪の痛み」を表す。スコアが大きいほど、痛みの重篤度と強度が大きいことを示す。対象は、過去２４時間で最もひどかった痛みを最もよく反映する数字を１つだけ選ぶ。腹痛ＮＲＳは毎日評価する。対象は、日誌入力を行い、来院のたびに日誌を持参することになっている。
【０３２０】
Ｃ反応性タンパク質
Ｃ反応性タンパク質は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者における炎症のマーカーとして有用であることが示されている。クローン病において、高いＣＲＰ濃度は、重度の臨床的活動性、高い沈降率、及び大腸内視鏡検査で検出される活動性疾患に関連している。エラー！  参照先が見つかりません。，エラー  参照先が見つかりません。ＣＲＰ測定のための血液サンプルは、時間及びイベントのスケジュールに示された来院時に、全ての対象から採取される。ＣＲＰは、検証済みの高感度ＣＲＰアッセイを使用して検定される。ベースライン後ＣＲＰ測定の結果は、中央検査機関により治験責任医師に開示されることはない。
【０３２１】
便中ラクトフェリン及びカルプロテクチン
便中ラクトフェリン及び便中カルプロテクチンは、ＩＢＤ患者の腸内炎症と治療に対する応答とを特定する敏感かつ特異的なマーカーであることが示されている。便中ラクトフェリン及びカルプロテクチン濃度のための便サンプルは、時間及びイベントのスケジュールに示された来院時に、全ての対象から採取される。便中ラクトフェリン及びカルプロテクチン濃度のアッセイは、検証された方法を用いて実施される。腸内炎症及び治療応答に関連する別のマーカー（例えば細菌叢）のために、追加の試験も便サンプルに対して行うことができる。ベースライン後便中ラクトフェリン及びカルプロテクチン検査の結果は、中央検査機関により治験責任医師に開示されることはない。
【０３２２】
炎症性腸疾患アンケート
ＩＢＤＱは、ＩＢＤを有する対象のための３２項目からなる自己報告アンケートであり、腸症状（軟便、腹痛）、全身症状（疲労、睡眠パターンの変化）、社会的機能（勤怠、社交的イベントをキャンセルする必要性）、及び感情的機能（怒り、抑うつ、苛立ち）の４次元にわたるＰＲＯを評価する。スコア範囲は３２〜２２４であり、スコアが高いほど良い結果を示す。
【０３２３】
３６項目ショートフォーム健康調査
ＳＦ−３６は、８つの機能分野スケールで全般的な健康状態を測定するために開発された。
・健康問題による身体的機能の制限。
・身体的な健康問題による日常的役割の活動の制限。
・身体の痛み。
・全般的な精神的健康状態（心理的窮迫及び健康な状態）。
・個人的又は感情的な問題による日常的役割の活動の制限。
・身体的又は精神的健康問題による社会的機能の制限。
・活力（エネルギー及び疲労）。
・全般的な健康状態の認識。
【０３２４】
８つのスケールスコアに基づいて、身体的サマリー（ＰＣＳ、Physical Component Summary）及び精神的サマリー（ＭＣＳ、Mental Component Summary）を導出することができる。スケールスコア及びサマリースコアを、ノルムベースシステムを用いて０〜１００のスコアに変換し、このとき、一般の米国母集団の基準に基づいて、線形変換を実施して、スコアを平均５０及び標準偏差１０に変換する。ＳＦ−３６によって測定される概念は、年齢、疾患又は治療群に対して特異的ではなく、様々な疾患の相対的な負荷、及び様々な治療の相対的な利益を比較することが可能になる。
【０３２５】
瘻孔評価
全ての対象が瘻孔に関して評価される。瘻孔疾患を伴う対象は、瘻孔の閉鎖が評価される。腸管皮膚瘻（例えば肛囲及び腹部）は、軽い圧迫にもかかわらず排液がない場合に、もはや排液性ではない（すなわち、閉鎖している）と見なされる。直腸腟瘻は、身体的検査又は関連症状（例えば、直腸内容物の通過、膣からの放屁など）がないことのいずれかに基づいて、閉鎖していると見なされる。
【０３２６】
内視鏡エンドポイント
粘膜治癒は、内視鏡（回結腸内視鏡）検査中に評価される。各治験実施施設に提供される試験参照マニュアルに従い、ビデオ回結腸内視鏡検査を実施して、スクリーニング時、１２週、及び２４週に、粘膜炎症及び潰瘍化の存在の有無を判定する。ビデオ回結腸内視鏡検査を来院日に行わない場合は、０週来院の少なくとも８日前と、１２週来院前８日間以内に実施しなければならない。２４週のビデオ回結腸内視鏡は提唱されるが必須ではない。実施する場合は、２４週来院前８日間以内に行わなければならない。ビデオ内視鏡は中央施設によって評価され、治療群及び治療来院に対して盲検化される。完全なビデオ内視鏡検査は、回腸末端部が視覚化できない場合、回腸末端部の評価を必要としない。
【０３２７】
ＳＥＳ−ＣＤスコアは、５つの回結腸セグメントにわたって、４つの内視鏡要素の評価（潰瘍の存在／大きさ、潰瘍に覆われた粘膜表面の割合、他の病変の影響を受けた粘膜表面の割合、及び狭細／狭窄の存在／タイプ）に基づく。各内視鏡要素は、セグメントごとに０〜３にスコア付けされ、全コンポーネントスコアの和（範囲０〜５６）から合計スコアが導出される。ＳＥＳ−ＣＤスコアは、中央の読み取り担当者が評価する。
【０３２８】
ＳＥＳ−ＣＤスコアの評価に加えて、内視鏡治癒（これは従来、治療的介入に応答した粘膜潰瘍の解消（不在）として定義されている）も、中央の読み取り担当者が評価する。
【０３２９】
実施例１８：薬物動態及び免疫原性評価。
評価
血清サンプルを用いて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びウステキヌマブのＰＫ及び免疫原性を評価する（抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に対する抗体及びウステキヌマブに対する抗体）。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びウステキヌマブの血清濃度と、ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する抗体の分析のために採取されたサンプルを更に用いて、免疫原性の更なる特徴評価、又は関連バイオマーカーの評価のために、試験期間中又は期間後に生じる懸念に対処する安全性又は効力の側面を評価することができる。これらの血清サンプルについては遺伝子解析は行われない。対象の秘密が保持される。
【０３３０】
試験薬の血清濃度のみを評価する（すなわち、試験薬に対する抗体を評価しない）来院時には、十分な量の静脈血サンプル１本を採取し、各血清サンプルを２つのアリコートに分ける（試験薬の血清濃度用に１つ、バックアップ用に１つ）。試験薬の血清濃度と試験薬に対する抗体を評価する来院時には、十分な量の静脈血サンプル１本を採取する。各血清サンプルは３つのアリコートに分ける（試験薬の血清濃度、試験薬に対する抗体、及びバックアップに１つずつ）。
【０３３１】
血清濃度
血清サンプルを分析して、治験依頼者により又は治験依頼者の監督下で、検証済みの特異的かつ感受性の高い方法を用いて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びウステキヌマブの濃度を決定する。
【０３３２】
免疫原性評価（試験薬に対する抗体）
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びウステキヌマブに対する抗体の検出及び特徴評価は、治験依頼者により又は治験依頼者の監督下で、検証済みのアッセイ法を用いて実施することができる。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する抗体の検出のために採取された全てのサンプルは、更に、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブ血清濃度について評価され、抗体データの解釈を可能にする。
【０３３３】
血清サンプルは、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに結合する抗体についてスクリーニングされ、確認された陽性サンプルの力価が報告される。他の分析を行って、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する抗体の安定性を検証することができ、及び／又は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はステキヌマブの免疫原性を更に特徴評価することができる。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する抗体は、時間及びイベントのスケジュールに従って、全ての対象から採取された血液について評価される。また、サンプルは、試験を中止した対象の最終来院時にも採取すべきである。これらのサンプルは、治験依頼者又は治験依頼者の被指名人により試験される。
【０３３４】
実施例１９：バイオマーカー及び他の薬力学的評価
バイオマーカー評価を行って、治療に対する生物学的応答を検討し、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療及び／又はクローン病に関連するバイオマーカーを特定する。評価には、時間及びイベントのスケジュールに従って採取された、血清、全血、便、及び粘膜生検サンプル中の、関連バイオマーカーの評価が含まれる。
【０３３５】
血清系バイオマーカー
血清系バイオマーカー分析のための血液サンプルを、全ての対象から採取する。実施されるアッセイは、以下のものを含み得る：ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＢＰ１〜６を含むがこれらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ経路に関係するタンパク質の測定、並びにクローン病に関係するタンパク質、例えばＳＡＡ（血清アミロイドＡ）、ＩＦＮγ、又はマトリックスメタロプロテイナーゼの測定。
【０３３６】
全血系バイオマーカー
ＲＮＡ発現について試験薬の効果を調べるために、全血サンプルが全ての対象から採取される。全血分析はまた、クローン病の病因に関連するＲＮＡ発現を調べることができる。ＴＣＲレパートリーの分析のために、追加の血液サンプルが取得される。
【０３３７】
生検系バイオマーカー
粘膜生検サンプルは、遺伝子及びタンパク質発現に対する試験薬の効果を調べ、疾患及び治癒の組織学的評価を行うために、ビデオ回結腸内視鏡検査中に採取される（更なる詳細について、治験参照マニュアルを参照のこと）。粘膜生検分析はまた、クローン病の病因に関連する遺伝子及びタンパク質発現を調べることができる。
【０３３８】
ＮＫＧ２Ｄ受容体占有率
ＮＫＧ２Ｄ  ＲＯ評価は、時間及びイベントのスケジュールに指定されている時点で実施される。ＮＫＧ２Ｄ  ＲＯは、検証されたフローサイトメトリーアッセイを用いて決定される。
【０３３９】
免疫表現型
免疫表現型評価（ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞）は、時間及びイベントのスケジュールに指定されている時点で実施される。免疫表現型は、フローサイトメトリーを用いて行われる。
【０３４０】
薬理遺伝学的（ＤＮＡ）評価
全ての対象は、スクリーニング時に、ＮＫＧ２Ｄ  ＳＮＰ  ｒｓ２２５５３３６及びＭＩＣＢ（ＮＫＧ２Ｄリガンド）ＳＮＰ  ｒｓ２２３９７０５に関して検査される。別個のＩＣＦに署名した対象については、完全ゲノム検査が行われ、疾患又は薬剤に対する反応と、特定の遺伝子とのリンクに関する研究が行われる。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに関連するＤＮＡ研究のみ、又は、この薬物が開発された疾患に関連するＤＮＡ研究のみが、行われる。この検査のため、１０ｍＬの血液サンプルを全ての対象から採取する。ＤＮＡ抽出に失敗した場合、代替の薬理遺伝学的血液サンプルが、対象から要求される。
【０３４１】
更に対象は、試験の他の側面への参加や、試験への今後の参加に影響を与えることなしに、随時、完全ゲノム検査のための任意のＤＮＡ同意を撤回することができる。
【０３４２】
実施例２０：統計方法
統計解析は、治験依頼者によって、又は治験依頼者の権限のもとで行われる。効力及び安全性データを分析するために使用される統計的方法の一般的な記述が、下記に示される。統計解析計画には、具体的な詳細が提供される。
【０３４３】
記述的統計（例えば、平均、中央値、標準偏差、四分位範囲、最小、及び最大）を用いて、連続変数が要約される。計数及び割合を使用して、分類変数が要約される。グラフィックデータディスプレイ（例えば、線プロット）を使用して、データを要約することもできる。
【０３４４】
分類データに対する好適な解析（例えば、適当な場合にはカイ二乗検定、又はコクラン・マンテル・ヘンツェルカイ二乗検定）を使用して、選択されたエンドポイント（例えば、臨床的寛解）を達成する対象の割合を比較する。稀に、治療比較のためにフィッシャーの正確確率検定を使用する。連続応答パラメータは、ファン・デル・ヴェルデン正規スコアに基づく分散分析（analysis of variance、ＡＮＯＶＡ）又は共分散（analysis of covariance、ＡＮＣＯＶＡ）モデルの解析を使用して比較される。
【０３４５】
全ての統計的検定は、特に指定のない限り、有意水準０．０５（両側）で実施される。全ての治療比較について、名目上のｐ値が表示される。
【０３４６】
実施例２１：サンプルサイズ決定
３つの試験（試験１［パートＩ  Ｂｉｏ−ＩＲ対象］、試験２［パートＩ  Ｂｉｏ−ＮＦ対象］、及び試験３［パートＩＩ  Ｂｉｏ−ＩＲ対象］）の全てに対するサンプルサイズの計算は、２サンプルｔ検定を用いて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体とプラセボの間の、８週時点の（各試験におけるプライマリーエンドポイント）、ＣＤＡＩスコアのベースラインの変化における有意な差を検出するための検出力により決定された。
【０３４７】
パートＩにおけるサンプルサイズ
Ｂｉｏ−ＩＲ対象（試験１）
全てのＢｉｏ−ＩＲ対象
【０３４８】
Ｂｉｏ−ＩＲ対象におけるサンプルサイズ計算のための仮定は、ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００２（ＴＮＦ−アンタゴニスト治療に不成功又は不耐性であったクローン病を患う対象について、治験依頼者が実施した試験）から得たデータに基づいて行われた。この試験において、８週時点のベースラインからの平均ＣＤＡＩ変化は、プラセボ及びウステキヌマブ６ｍｇ／ｋｇ群についてそれぞれ、−２５．１（ＳＤ＝９１．４１）及び−７８．７（ＳＤ＝９１．７９）であり、８週時点で臨床的寛解にある対象の割合はそれぞれ、７％及び２１％であった。これらの仮説は、非完了者となった６％の対象の影響を組み込んでいる。
【０３４９】
現在の試験において、８週時点のベースラインからの平均ＣＤＡＩ変化は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群において−７９、プラセボ群において−２５であり、共通ＳＤは９２であると仮定すると、治療群当たり５０人の対象が、全体のタイプ１誤差０．０５（両側；表）で、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体とプラセボとの間の治療の差を検出するのに、約８０％の検出力を提供する。
【０３５０】
臨床的寛解の検出力計算は、ウステキヌマブについて以前観察されたよりも、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の方が効力が１０％上回ることを示す潜在能力に基づく。試験１において治療群当たり５０人のＢｉｏ−ＩＲ対象が、全体のタイプ１誤差０．０５（両側；表）で、８週時点に臨床的寛解にある対象の割合について、プラセボとの差を検出するのに、９０％の検出力を提供する。この際、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は寛解率が３１％であることを想定し、これは、前の試験でのウステキヌマブ寛解率を１０％上回る。
【０３５１】
実施例２２：ＳＮＰ陽性であるＢｉｏ−ＩＲ対象（Ｂｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ＋）。
前述のように、前の第ＩＩａ相試験における効力データの事後解析は、ＳＮＰ陽性である対象のサブ群において、より大きな効力を示した。ゆえに、ＳＮＰ陽性ステータスとより高い臨床的効力との間の関係が、この試験において前向きに調べられた。クローン病母集団の７５％がＳＮＰ陽性であるという仮定に基づくと、５０人のＢｉｏ−ＩＲ対象は約３８人のＢｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ＋対象をもたらす。群当たり３８人のＢｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ＋対象は、全体のタイプ１誤差０．０５（両側；表３）で、８週時点に臨床的寛解にある対象の割合について、プラセボとの差を検出するのに、８０％の検出力を提供する。この際、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は寛解率が３１％であることを想定し、これは、その試験でのウステキヌマブ寛解率を１０％上回る。
【０３５２】
【表４】
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【０３５３】
実施例２３：Ｂｉｏ−ＮＦ対象（試験２）。
全てのＢｉｏ−ＮＦ対象
Ｂｉｏ−ＮＦ対象におけるサンプルサイズ計算のための仮定は、ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００２（コルチコステロイド又は免疫調節薬に不成功又は不耐性であったが、ＴＮＦ−アンタゴニスト治療には不成功ではなかった、クローン病を患う対象について、治験依頼者が実施した試験）から得たデータに基づいて行われた。ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００２において、８週時点のベースラインからの平均ＣＤＡＩ変化は、プラセボ及びウステキヌマブ６ｍｇ／ｋｇ群についてそれぞれ、−６６．３（ＳＤ＝９７．８１）及び−１１６．３（ＳＤ＝１０２．８８）であり、８週時点で臨床的寛解にある対象の割合はそれぞれ、２０％及び４０％であった。これらの仮説は、非完了者となった４％の対象の影響を組み込んでいる（ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００２において）。
【０３５４】
Ｂｉｏ−ＮＦ母集団における治療オプションの利用可能性を反映して、試験２について、サンプルサイズの推定は、予め評価された治療薬（例えばウステキヌマブ）によって示されるより大きい所望の効果に基づいていた。よって、８週時点のベースラインからの平均ＣＤＡＩ変化は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群において−１５２（寛解率５０％に基づき、これは、ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００２でのウステキヌマブ寛解率よりも１０％大きい）、プラセボ群において−６６であり、共通ＳＤは１００であると仮定すると、治療群当たり５０人の対象が、全体のタイプ１誤差０．０５（両側；表）で、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体とプラセボとの間の治療の差を検出するのに、約９９％の検出力を提供する。
【０３５５】
治療群当たり５０人のＢｉｏ−ＮＦ対象は更に、全体のタイプ１誤差０．０５（両側；表）で、８週時点に臨床的寛解にある対象の割合について、プラセボとの差を検出するのに、８９％の検出力を提供する。この際、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は寛解率が５０％であることを想定し、これは、ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００２でのウステキヌマブ寛解率を１０％上回る。
【０３５６】
ＳＮＰ陽性であるＢｉｏ−ＮＦ対象（Ｂｉｏ−ＮＦ／ＳＮＰ＋）
クローン病母集団の７５％がＳＮＰ陽性であるという仮定に基づくと、５０人のＢｉｏ−ＮＦ対象は約３８人のＢｉｏ−ＮＦ／ＳＮＰ＋対象をもたらす。群当たり３８人のＢｉｏ−ＮＦ／ＳＮＰ＋対象は、全体のタイプ１誤差０．０５（両側；表）で、８週時点に臨床的寛解にある対象の割合について、プラセボとの差を検出するのに、８０％の検出力を提供する。この際、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は寛解率が５０％であることを想定し、これは、ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００２でのウステキヌマブ寛解率を１０％上回る。
【０３５７】
実施例２４：パートＩＩのサンプルサイズ（試験３）
全てのＢｉｏ−ＩＲ対象
試験１のＢｉｏ−ＩＲ母集団に使用したのと同じ仮定を使用して、治療群当たり５０人の対象が、８週時点のＣＤＡＩのベースラインからの変化に関する用量応答シグナルを検出するのに、８５％の平均検出力を提供する。これは、全体のタイプ１誤差０．０５（両側）で、７つの候補用量応答モデル（詳細はＳＡＰに記載）に基づく。治療群当たり５０人の対象は更に、タイプＩ誤差０．０５（両側；表）で、８週時点のＣＤＡＩのベースラインからの変化に関する、最高用量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群とプラセボ治療群との間の治療の差を検出するのに、約８０％の検出力を提供する。これにより、パートＩＩでは合計サンプルサイズが対象２５０人となる（ウステキヌマブ治療群のために追加の対象５０人を組み入れる）。
【０３５８】
パートＩＩの治療群当たり５０人のＢｉｏ−ＩＲ対象は更に、全体のタイプ１誤差０．０５（両側；表）で、８週時点に臨床的寛解にある対象の割合について（最初の主要なセカンダリーエンドポイント）、最高用量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群とプラセボ治療群との間の差を検出するのに、９０％の検出力を提供する。この際、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は寛解率が３１％であることを想定し、これは、ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００１でのウステキヌマブ寛解率を１０％上回る。
【０３５９】
ＳＮＰ陽性であるＢｉｏ−ＩＲ対象（Ｂｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ＋）
クローン病母集団の７５％がＳＮＰ陽性であるという仮定に基づくと、５０人のＢｉｏ−ＩＲ対象は約３８人のＢｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ＋対象をもたらす。治療群当たり３８人のＢｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ＋対象は、全体のタイプ１誤差０．０５（両側；表）で、８週時点に臨床的寛解にある対象の割合について、最高用量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群とプラセボ治療群との間の差を検出するのに、８０％の検出力を提供する。この際、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は寛解率が３１％であることを想定し、これは、ＣＮＴＯ１２７５ＣＲＤ３００１でのウステキヌマブ寛解率を１０％上回る。
【０３６０】
効力分析
このプロトコルは３つの別々の試験からなる。各試験は、プライマリーエンドポイント（有意水準０．０５）に対する別個のタイプＩ誤差対照で別々に分析される。各試験内の他のエンドポイントは、多重性に関して対照付きにはならない。
【０３６１】
このプロトコルで計画された分析に、試験ごとに１つずつ、３つの分析セットが使用される。各試験に関して、この分析対象集合は、試験薬投与を受けた全ての無作為化された対象である。効力分析は、改変された治療企図原理に基づく。このため、試験薬の投与を受けた各対象についての効力データが、実際に受けた治療にかかわらず、割り当てられた治療に従って分析される。
【０３６２】
実施例２５：試験１（パートＩ  Ｂｉｏ−ＩＲ対象）プライマリーエンドポイント分析
パートＩのＢｉｏ−ＩＲ対象のプライマリーエンドポイントは、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化である。
【０３６３】
ＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群とプラセボ治療群との間で比較される。この比較のため、ファン・デル・ヴェルデン正規スコアに基づくＡＮＣＯＶＡモデルが、治療を固定係数として、またベースラインＣＤＡＩスコア及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）を共変量として、使用される。この分析には、セクション０に記載されている治療不成功ルール及び欠落データルールが適用される。
【０３６４】
試験１では、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群とプラセボ群とを比べて、有意水準０．０５で有意な改善が検出された場合に、試験が陽性と見なされる。
【０３６５】
他の効力エンドポイント分析
下記のエンドポイントが、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群とプラセボ治療群との間で比較される。
・全てのベースライン後来院での、ＣＤＡＩのベースラインからの変化。
・全てのベースライン後来院での、ＣＤＡＩに基づく臨床的寛解。
・全てのベースライン後来院での、ＣＤＡＩに基づく臨床的応答。
・全てのベースライン後来院での、ＰＲＯ−２のベースラインからの変化。
・全てのベースライン後来院での、腹痛スコア（ＣＤＡＩ評価に基づく毎日の平均値の平均）のベースラインからの変化。
・全てのベースライン後来院での、排便頻度スコア（ＣＤＡＩ評価に基づく毎日の平均値の平均）のベースラインからの変化。
・全てのベースライン後来院での、ＰＲＯ−２に基づく臨床的寛解。
・全てのベースライン後来院での、ＰＲＯ−２に基づく臨床的応答。
・全てのベースライン後来院での、ＰＲＯ−３のベースラインからの変化。
・８週時点で臨床的応答があった対象の中で、２４週時点のＣＤＡＩに基づく臨床的寛解。
・８週時点で臨床的寛解があった対象の中で、２４週時点のＣＤＡＩに基づく臨床的寛解。
・１２週及び２４週時点での、ＳＥＳ−ＣＤスコアのベースラインからの変化。
・１２週及び２４週時点での、ＳＥＳ−ＣＤスコア≧３のベースラインからの低減に基づく、内視鏡的改善。
・１２週及び２４週時点での、ＳＥＳ−ＣＤにおけるベースラインからの少なくとも５０％の改善。
・１２週及び２４週時点での内視鏡的治癒（粘膜潰瘍の不在として定義される）。
・全てのベースライン後来院での瘻孔応答（排液瘻孔の数がベースラインから≧５０％低減として定義される）。
・ブリストル便性状スケールに基づくエンドポイント（複数可）（詳細はＳＡＰに記載）。
・全てのベースライン後来院での、０〜１０のＮＲＳに基づく、腹痛のベースラインからの変化。
・８週、１２週、及び２４週時点での、ＩＢＤＱスコアのベースラインからの変化。
・８週、１２週、及び２４週時点での、ＩＢＤＱ（≧１７０）に基づく臨床的寛解。
・８週、１２週、及び２４週時点での、ＩＢＤＱのベースラインからの≧１６ポイントの改善。
・８週、１２週、及び２４週時点での、ＳＦ−３６のＰＣＳ及びＭＣＳスコアにおける、ベースラインからの変化。
・８週、１２週、及び２４週時点での、ＳＦ−３６のＰＣＳ又はＭＣＳスコアにおける、≧５ポイントの改善。
・８週、１２週、及び２４週時点での、バイオマーカー（ＣＲＰ、便中カルプロテクチン、便中ラクトフェリン）のベースラインからの変化。
・ＳＮＰステータスによる８週時点のＣＤＡＩに基づく臨床的寛解。２つのＳＮＰ（ＮＫＧ２Ｄ又はＭＩＣＢ）のうち少なくとも１つが陽性である対象は、ＳＮＰ陽性であると見なされる。
【０３６６】
他の効力エンドポイントが、ＳＮＰステータスにより検討され得る（詳細はＳＡＰに記載）。
【０３６７】
実施例２６：試験２（パートＩ  Ｂｉｏ−ＮＦ対象）プライマリーエンドポイント分析
パートＩのＢｉｏ−ＮＦ対象のプライマリーエンドポイントは、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化である。
【０３６８】
ＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群とプラセボ治療群との間で比較される。この比較のため、ファン・デル・ヴェルデン正規スコアに基づくＡＮＣＯＶＡモデルが、治療を固定係数として、またベースラインＣＤＡＩスコア及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）を共変量として、使用される。この分析には、治療不成功ルール及び欠落データルールが適用される。
【０３６９】
試験２では、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体群とプラセボ群とを比べて、有意水準０．０５で有意な改善が検出された場合に、試験が陽性と見なされる。
【０３７０】
他の効力エンドポイント分析
記載されているエンドポイントそれぞれについて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群とプラセボ治療群の間で比較が行われる。
【０３７１】
実施例２７：研究３（パートＩＩ）プライマリーエンドポイント分析
プライマリーエンドポイントは、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化である。
【０３７２】
多重比較手順とモデリング技法、ＭＣＰ−Ｍｏｄを組み合わせた統合ストラテジーを使用して、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体用量に関する用量−応答関係を分析する（用量−応答分析の効力測定は、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化である）。このアプローチは、２つの主要ステップからなる。第１のステップは、全体のタイプ１誤差を制御しながら、多重対比検定により、用量−応答シグナルを検定することからなる。用量−応答シグナルが検出された場合、第２のステップは、観察データを最もよく表すモデルを選択し、それを用いて、関連する精度で適切な用量を推定することである。用量−応答分析の詳細は、ＳＡＰに記述される。
【０３７３】
試験３は、プライマリーエンドポイントの用量−応答シグナルが検出された場合、陽性とみなされる。用量−応答分析に加え、８週時点でのＣＤＡＩスコアのベースラインからの変化に関して、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群対プラセボ群の対としての比較が行われる。これらの比較は、多重度に関して調整されない。これらの比較のため、ファン・デル・ヴェルデン正規スコアに基づくＡＮＣＯＶＡモデルが、治療を固定係数として、またベースラインＣＤＡＩスコア及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）を共変量として、使用される。ウステキヌマブ治療群と、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群又はプラセボとの対比比較は、計画されていない。ただし、ウステキヌマブ治療群についてはサマリー統計が提供される。
【０３７４】
上記の分析には、８週以前に１つ又は２つ以上の治療不成功ルールに適合した対象は、ＣＤＡＩスコアのベースライン値が８週に持ち越される。８週以前に、下記の事象のいずれかが生じた対象は、実際のＣＤＡＩスコアに関係なく、プライマリーエンドポイント分析に関して治療不成功と見なされる：
・併用するクローン病薬における特定の変更（詳細はＳＡＰに記載）。
・クローン病関連の手術（膿瘍ドレナージ又は串線配置を除く）。
・効力の欠如による、又はクローン病を悪化させるＡＥによる、試験薬の中止。
【０３７５】
加えて、評価のために戻って来なかった対象、又は８週時点のＣＤＡＩスコアを計算するためのデータが不十分な対象（すなわち、ＣＤＡＩの構成要素で利用可能なのが４つ未満）は、利用可能な最後のＣＤＡＩが８週に持ち越される。
【０３７６】
プライマリーエンドポイント分析の堅牢さを調べるために、プライマリーエンドポイントの感度分析が、様々な欠落データアプローチを用いて実施される。これらの分析はＳＡＰに記述される。更に、プライマリーエンドポイントについては、試験組み入れ時に排便頻度及び腹痛の所定の閾値に適合しない対象を除外した感度分析が行われる。この閾値及び分析も、ＳＡＰに記述される。
【０３７７】
主要セカンダリーエンドポイント（複数可）分析
主要なセカンダリーエンドポイントは以下の通りである：
・ＣＤＡＩで測定される、８週時点の臨床的寛解（ＣＤＡＩ＜１５０）。
・ＣＤＡＩで測定される、８週時点の臨床的応答（ＣＤＡＩのベースラインからの低減が≧１００ポイント、又は、ＣＤＡＩ＜１５０）。
・８週時点のＰＲＯ−２のベースラインからの変化。
・ＰＲＯ−２で測定される、８週時点の臨床的寛解（ＰＲＯ−２＜７５）。
・ＰＲＯ−２で測定される、８週時点の臨床的応答（ＰＲＯ−２のベースラインからの低減が≧５０ポイント、又はＰＲＯ−２＜７５）。
・１２週時点のＳＥＳ−ＣＤのベースラインからの変化。
【０３７８】
８週時点の臨床的寛解及び臨床的応答（ＣＤＡＩ又はＰＲＯ−２により定義される）の主要セカンダリーエンドポイントは、ベースラインＣＤＡＩスコア（≦３００又は＞３００）及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）で階層化したコクラン・マンテル・ヘンツェル（ＣＭＨ）カイ二乗検定（両側）により、各抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群とプラセボ群との間で比較される。加えて、ＣＤＡＩで測定される８週時点の臨床的寛解のエンドポイントについては、ＭＣＰ−ＭＯＤストラテジーを用いて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体用量に関する用量応答関係が調べられる。
【０３７９】
８週以前に１つ又は２つ以上の治療不成功ルール（プライマリーエンドポイントに記載）に適合した対象は、臨床的寛解又は臨床的応答ではないと見なされる。８週時点でＣＤＡＩスコアが欠落している（すなわち、ＣＤＡＩの構成要素＜４）対象は、ＣＤＡＩスコアにより測定されるものとして、臨床的寛解又は臨床的応答ではないと見なされる。８週時点でＰＲＯ−２スコアが欠落している（すなわち、ＰＲＯ−２の少なくとも１つの構成要素スコアが欠落している）対象は、ＰＲＯ−２スコアにより測定されるものとして、臨床的寛解又は臨床的応答ではないと見なされる。
【０３８０】
８週時点のベースラインからのＰＲＯ−２の変化は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群それぞれとプラセボ群との間で比較される。これには、ファン・デル・ヴェルデン正規スコアに基づくＡＮＣＯＶＡモデルが、治療を固定係数として、またベースラインＰＲＯ−２スコア及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）を共変量として、使用される。
【０３８１】
８週以前に１つ又は２つ以上の治療不成功ルールに適合した対象は、ベースラインのＰＲＯ−２スコアが８週に持ち越される。評価のために戻って来なかった対象、又は８週時点のＰＲＯ−２スコアが欠落している対象は、利用可能な最後のＰＲＯ−２スコアが８週に持ち越される。
【０３８２】
１２週時点のベースラインからのＳＥＳ−ＣＤの変化は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群それぞれとプラセボ群との間で比較される。これには、ファン・デル・ヴェルデン正規スコアに基づくＡＮＣＯＶＡモデルが、治療を固定係数として、またベースラインＳＥＳ−ＣＤスコア及びＳＮＰ陽性ステータス（あり又はなし）を共変量として、使用される。ＳＥＳ−ＣＤスコアのデータ取扱いルールはＳＡＰに記載される。
【０３８３】
主要セカンダリーエンドポイントとして、ウステキヌマブ治療群と、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群又はプラセボとの対比比較は、計画されていない。ただし、ウステキヌマブ治療群についてはサマリー統計が提供される。
【０３８４】
主要セカンダリーエンドポイントについては、試験組み入れ時に排便頻度及び腹痛の所定の閾値に適合しない対象を除外した感度分析が行われる。この閾値及び分析は、ＳＡＰに記述される。
【０３８５】
主要セカンダリーエンドポイントに関して、多重度に関しての調整は行われない。
【０３８６】
他の効力エンドポイント分析
記載されているエンドポイントそれぞれについて、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群のそれぞれとプラセボ治療群との間で比較が行われる。これらのエンドポイントについて、ウステキヌマブ治療群と、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体治療群又はプラセボとの対比比較は、計画されていない。ただし、ウステキヌマブ群についてはサマリー統計が提供される。
【０３８７】
薬物動態分析
各サンプリング時点で、血清抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びウステキヌマブ濃度の記述的統計が計算される。血清抗ＮＫＧ２Ｄ抗体及びウステキヌマブ濃度は、経時的に、治療群ごとに集約される。
【０３８８】
定量可能な最低濃度を下回る濃度は、要約統計においてゼロとして扱われる。
【０３８９】
非線形混合効果モデリング（ＮＯＮＭＥＭ、nonlinear mixed-effects modeling）を用いた抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の母集団ＰＫ分析アプローチを用いて、ＰＫパラメータを評価する。母集団ＰＫパラメータ推定値に対する重要な共変量の影響が評価され得る。詳細は、母集団ＰＫ分析計画に提供され、母集団ＰＫ分析の結果は別の技術報告に提示される。
【０３９０】
免疫原性分析
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に対する抗体の、及びウステキヌマブに対する抗体の、出現率及び力価は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブの投与を受けた全ての対象について要約され、また、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に対する抗体、又はウステキヌマブに対する抗体の検出のために適切なサンプルを有する（抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブの初回投与後に取得された少なくとも１つのサンプルがある対象）。
【０３９１】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する抗体が陽性である対象のリストが提供される。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する抗体の最大力価は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する抗体が陽性である対象に関して提供される。
【０３９２】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する中和抗体（ＮＡｂ）の出現率は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対する抗体が陽性である対象に関して提供され、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブに対するＮＡｂに関して評価可能なサンプルを有する。
【０３９３】
バイオマーカー分析
バイオマーカー分析は、測定されたバイオマーカーに対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の影響を特性評価するものである。これにより、治療に関連するバイオマーカーを特定し、更にこれらのバイオマーカーが抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に対する応答を予測できるかどうかを判定する。ウステキヌマブのバイオマーカー分析は、比較として行われるが、ウステキヌマブのための新しいバイオマーカーを特定するものではない。
【０３９４】
血清、全血分析、便、及び粘膜生検分析（組織学的検査を含む）の結果は、別の技術報告に報告される。
【０３９５】
薬物動態学的／薬力学的分析
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の血清濃度とＰＤ及び／又は臨床エンドポイントとの間の関係が検討される。
【０３９６】
経時的なＮＫＧ２Ｄ  ＲＯ（％）は、治療群ごとに集約される。
【０３９７】
経時的な末梢血ＮＫ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋を含む）の絶対数及び割合は、治療群ごとに集約される。
【０３９８】
薬理遺伝学的分析
任意のＤＮＡ同意に署名した対象のＤＮＡ採取についての試験的遺伝子分析は、別の技術報告に提示される。
【０３９９】
暫定分析
無作為化パートＩ  Ｂｉｏ−ＩＲ対象の最初の８０％（治療群当たり、少なくとも４０人のＢｉｏ−ＩＲ対象及び少なくとも３０人のＢｉｏ−ＩＲ／ＳＮＰ陽性対象）が８週来院を終えたとき、あるいは、８週より前に試験参加を中止した場合、試験１の暫定分析が計画される。この暫定分析は、効果を示す目的のために十分な数の対象が評価されたことをその分析結果が示唆する場合、パートＩＩ（すなわち、試験３の用量範囲決め）を早期に開始することが可能になる。この暫定分析は、試験１の実施又は完了に影響を与えないため、管理的なものと見なされ、最終的な試験１分析の多重性調整を必要としない。
【０４００】
一次効力評価は、（Ｂｉｏ−ＩＲ対象における）８週時点の臨床的寛解に関する、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体とプラセボとの間の比較である。寛解は、ＣＤＡＩの変化（この試験のプライマリーエンドポイント）よりも厳しいエンドポイントであり、パートＩＩを早期に開始するかどうかを判定するより保守的な判断を提供する。他の選択された効力分析（例えば、ＣＤＡＩ及びＰＲＯ−２の変化、臨床応答）も実施される。詳細は暫定分析計画に提供される。
【０４０１】
試験チームとは独立の治験依頼者委員会が設立されて、この暫定データをレビューし、所定の判断ルール（これは暫定分析計画に定義される）に従って、推奨される決定／対処を構築する。
【０４０２】
実施例２８：試験薬情報
試験薬の物理的記述
パートＩ及びパートＩＩにおいて、この試験のために供給される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は凍結乾燥薬製品であり、注射のために１．１ｍＬの水で再構成したとき、１０ｍＬガラス製バイアル中に、１００ｍｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、３４ｍＭのＬ−ヒスチジン、８．６％（ｗ／ｖ）のショ糖、及び０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ｐＨ６．０である。これは、治験依頼者の責任の下に製造及び提供される。
【０４０３】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のプラセボは、１０ｍＬガラス製バイアル中に、９ｍＬの３４ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン溶液、８．６％（ｗ／ｖ）のショ糖、及び０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ｐＨ６．０である。
【０４０４】
パートＩＩにおいて、ＩＶ輸液用のウステキヌマブ５ｍｇ／ｍＬ最終バイアル入り製品と、それに合致するプラセボが、３０ｍＬバイアルに、１用量強度単回使用の滅菌溶液として供給される（すなわち、公称容量２６ｍＬ中に１３０ｍｇ）。
【０４０５】
ウステキヌマブＳＣは、単回使用の充填済みシリンジ（prefilled syringe、ＰＦＳ）に、容量１ｍＬ（用量９０ｍｇ）の滅菌溶液として供給され、公称容量１．０ｍＬ中に、ウステキヌマブ９０ｍｇ、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン一塩酸一水和物、ショ糖、及びポリソルベート８０を含み、ｐＨ６．０である。防腐剤は存在しない。ＰＦＳの針カバーは乾燥天然ゴム（ラテックスの誘導体）を含み、これはラテックス感受性の人にアレルギー反応を引き起こす可能性がある。液体プラセボは、１ｍＬ  ＰＦＳ入りで供給される。
【０４０６】
プラセボ投与は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はウステキヌマブ投与のそれぞれと同様の外観を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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