【手続補正書】
【提出日】平成19年5月1日(2007.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を発酵可能な炭素源の存在下で生育させ、これにより１種もしくはそれ以上のω−３またはω−６脂肪酸を生成せしめ、
ｃ）場合により、ω−３またはω−６脂肪酸を回収する
ことを含んでなるω−３またはω−６脂肪酸の製造方法。
【請求項２】
機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子が、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発酵可能な炭素源が、単糖類、少糖類、多糖類、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、メタノールおよび炭素含有アミンよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
油性酵母菌が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
油性酵母菌がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞が、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ）（ｉ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸の内在性供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を発現させそしてオレイン酸をエイコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサペンタエン酸の製造方法。
【請求項８】
ａ）（ｉ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸の内在性供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を発現させそしてオレイン酸をドコサヘキサエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のドコサヘキサエン酸を回収する
ことを含んでなるドコサヘキサエン酸の製造方法。
【請求項９】
ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の酵素をコードする遺伝子を含んでなる形質転換された油性酵母菌。
【請求項１０】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項９に記載の油性酵母菌。
【請求項１１】
酵母菌がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項１０に記載の油性酵母菌。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって製造される微生物油。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４９】
ＧＣ分析（一般方法で述べられる方法に従った）は、４個のキメラ遺伝子（図１６）を含有する形質転換体中のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の存在を示したが、野生型ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株中には示されなかった。これらのデータはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が遺伝子操作されて、ω−３脂肪酸であるＥＰＡを生成したことを確証した。
なお、本発明の特徴および態様を要約すれば以下のとおりである。
１．  ａ）機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を発酵可能な炭素源の存在下で生育させ、これにより１種もしくはそれ以上のω−３またはω−６脂肪酸を生成せしめ、
ｃ）場合により、ω−３またはω−６脂肪酸を回収する
ことを含んでなるω−３またはω−６脂肪酸の製造方法。
２．  機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子が、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼよりなる群から選択される上記１に記載の方法。
３．  発酵可能な炭素源が、単糖類、少糖類、多糖類、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、メタノールおよび炭素含有アミンよりなる群から選択される上記１に記載の方法。
４．  油性酵母菌が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される上記１に記載の方法。
５．  油性酵母菌がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である上記４に記載の方法。
６．  ａ）（ｉ）Δ１２デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な炭素源の存在下で生育させ、Δ１２デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてオレイン酸をリノール酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のリノール酸を回収する
ことを含んでなるリノール酸の生成方法。
７．  ａ）（ｉ）Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な炭素源の存在下で生育させて、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてリノール酸をγ−リノレン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のγ−リノレン酸を回収する
ことを含んでなるγ−リノレン酸の製造方法。
８．  ａ）（ｉ）Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）α−リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素基質の存在下で生育させて、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてα−リノール酸がステアリドン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のステアリドン酸を回収する
ことを含んでなるステアリドン酸の製造方法。
９．  ａ）（ｉ）Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ１５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてリノール酸をα−リノール酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のα−リノール酸を回収する
ことを含んでなるα−リノール酸の製造方法。
１０．  ａ）（ｉ）Ｃ18/20エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）γ−リノレン酸からなるエロンガーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてγ−リノレン酸をジホモ−γ−リノール酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のジホモ−γ−リノール酸を回収する
ことを含んでなるジホモ−γ−リノール酸の製造方法。
１１．  ａ）（ｉ）Ｃ18/20エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）ステアリドン酸からなるエロンガーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてステアリドン酸をエイコサテトラエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサテトラエン酸の製造方法。
１２．  ａ）（ｉ）Ｃ20/22エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）エイコサペンタエン酸からなるエロンガーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてエイコサペンタエン酸をドコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のドコサペンタエン酸を回収する
ことを含んでなるドコサペンタエン酸の製造方法。
１３．  ａ）（ｉ）Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）ジホモ−γ−リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてジホモ−γ−リノール酸をアラキドン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のアラキドン酸を回収する
ことを含んでなるアラキドン酸の製造方法。
１４．  ａ）（ｉ）Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）エイコサテトラエン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてエイコサテトラエン酸をエイコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサペンタエン酸の生成方法。
１５．  ａ）（ｉ）Δ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）ドコサペンタエン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてドコサペンタエン酸をドコサヘキサエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のドコサヘキサエン酸を回収する
ことを含んでなるドコサヘキサエン酸の製造方法。
１６．  ａ）（ｉ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）ジホモ−γ−リノール酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてジホモ−γ−リノール酸をエイコサテトラエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサテトラエン酸の製造方法。
１７．  ａ）（ｉ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）アラキドン酸からなるデサチュラーゼ基質の供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現させそしてアラキドン酸をエイコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサペンタエン酸の製造方法。
１８．  デサチュラーゼまたはエロンガーゼ基質の供給源が、油性酵母菌に内在性である上記６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
１９  デサチュラーゼまたはエロンガーゼ基質の供給源が、油性酵母菌に外来性である上記６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
２０．油性酵母菌が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される上記６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
２１．  油性酵母菌がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である上記２０に記載の方法。
２２．  Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、および
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子
よりなる群から選択される上記７または８のいずれかに記載の方法。
２３．  エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、および
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子
よりなる群から選択される上記１０、１１および１２のいずれかに記載の方法。
２４．  Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号４、配列番号１１５、配列番号１１９、および配列番号１２３よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子
よりなる群から選択される上記１３または１４のいずれかに記載の方法。
２５．  Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、および
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子
よりなる群から選択される上記１６または１７のいずれかに記載の方法。
２６．  宿主細胞が、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される上記５または２１のいずれかに記載の方法。
２７．  ａ）（ｉ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸の内在性供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を発現させそしてオレイン酸をエイコサペンタエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサペンタエン酸の製造方法。
２８．  ａ）（ｉ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）オレイン酸の内在性供給源
を含んでなる油性酵母菌を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母菌を適切な発酵可能な炭素源の存在下で生育させて、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を発現させそしてオレイン酸をドコサヘキサエン酸に変換させ、
ｃ）場合により、ステップ（ｂ）のドコサヘキサエン酸を回収すること
を含んでなるドコサヘキサエン酸の製造方法。
２９．  ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の酵素をコードする遺伝子を含んでなる形質転換された油性酵母菌。
３０．  ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される上記２９に記載の油性酵母菌。
３１．  酵母菌がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である上記３０に記載の油性酵母菌。
３２．  上記１〜２８のいずれか一項に記載の方法によって製造される微生物油。