(57)【要約】  結腸直腸がんリスクを決定するための方法は、対象の血液試料を得ることと、血液試料から血清またはＥＤＴＡ血漿を単離することと、血清またはＥＤＴＡ血漿を分析して、超長鎖ジカルボン酸（ＶＬＣＤＣＡ２８：４）の血漿レベルを決定することと、対象のＶＬＣＤＣＡ２８：４の決定された血漿レベルを、結腸直腸がんを有すると診断された対象のＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルの所定の範囲と比較することと、ＶＬＣＤＣＡ２８：４の決定された血漿レベルがＶＬＣＤＣＡの血漿レベルの所定の範囲内にある場合、結腸直腸がんリスクが存在すると決定することとを含む。
2019530883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、関節リウマチ、およびその組合せからなる群から選択される疾患状態に関して、対象における疾患状態リスクを決定する方法であって、
血液試料から血清またはＥＤＴＡ血漿を単離し、
前記単離された血清またはＥＤＴＡ血漿からＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルを決定し、
前記単離された血清又はＥＤＴＡ血漿から前記決定されたＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルを、前記疾患状態を有すると診断されていない複数の対象から予め決定された所定の範囲のＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルと比較し、
前記単離された血清またはＥＤＴＡ血漿からの前記決定されたＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルが、前記所定の範囲のＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルより少なくとも２５％低い場合、前記疾患状態リスクが存在すると決定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記単離された血清またはＥＤＴＡ血漿から前記決定されたＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルが、前記所定の範囲のＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルより少なくとも５０％低い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患状態が結腸直腸がんであり、前記単離された血清またはＥＤＴＡ血漿から前記決定されたＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルが、前記所定の範囲のＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルより少なくとも６２％低い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患状態が結腸直腸がんであり、前記単離された血清またはＥＤＴＡ血漿から前記決定されたＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルが、前記所定の範囲のＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルより少なくとも６８％低い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患状態が結腸直腸がんであり、前記単離された血清またはＥＤＴＡ血漿から前記決定されたＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルが、活動性疾患状態と診断された状態に相当する所定の範囲のＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベル内にある、請求項１、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患状態リスクが存在すると決定された場合、前記対象の血液中のＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルを増加させるのに十分な量の超長鎖ジカルボン酸を前記対象に投与すること
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記超長鎖ジカルボン酸が、２８〜３６個の炭素と、１〜４つの二重結合とを含む直鎖基を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記超長鎖ジカルボン酸が、式：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ
を有する化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記超長鎖ジカルボン酸が請求項８に記載の超長鎖ジカルボン酸のエステルである、請求項６〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記超長鎖ジカルボン酸が循環ＶＬＣＤＣＡ２８：４の少なくとも８％の増加が観察されるまで前記対象に投与される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記超長鎖ジカルボン酸が循環ＶＬＣＤＣＡ２８：４の少なくとも１５％の増加が観察されるまで前記対象に投与される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液試料が静脈穿刺を通して得られる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
２８〜３６個の炭素超長鎖ジカルボン酸の構造を検証する方法であって、
血液試料から血清またはＥＤＴＡ血漿を単離し、
前記血清またはＥＤＴＡ血漿を低温環境で保存し、
１ナノモルの［２Ｈ２８］ジカルボン酸１６：０を含む約１ミリリットル（ｍＬ）のメタノールを前記単離された血清またはＥＤＴＡ血漿と混合し、
約１ｍＬの蒸留水および約２ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを前記単離された血清またはＥＤＴＡ血漿と混合し、
前記混合物から有機層を分離し、
前記有機層を乾燥し、
前記乾燥された有機層をイソプロパノール、メタノール、クロロホルム、および酢酸アンモニウムの組合せに溶解することと、
前記溶解された有機層について質量分析を行い、
陰イオンエレクトロスプレーイオン化を使用して、ジカルボン酸のアニオンを定量化して、ジカルボン酸２８：４構造を検証することと
を含む、方法。
【請求項１４】
イソプロパノール、メタノール、およびクロロホルムの組合せが４：２：１の比である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酢酸アンモニウムが約１５ミリモルの濃度で前記組合せ中に存在する、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「疾患診断、化学予防、および処置のための超長鎖ジカルボン酸の同定および使用」と題された２０１６年１０月３日に出願された米国非仮出願第１５／２８４，２１９号の一部継続出願であり、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられるが、本出願と矛盾する開示または定義がある場合は、本明細書における開示または定義が優先されるものとする。
【背景技術】
【０００２】
本発明の一般的発明概念は、疾患の検出に使用されるバイオマーカー化合物、より詳細には、超長鎖ジカルボン酸（以下、「ＶＬＣＤＣＡ」）、ならびに結腸直腸がんおよび腎臓がんを含む（これらに限定されない）様々な疾患の検出、化学予防、および処置のためのバイオマーカーとしてＶＬＣＤＣＡを使用する方法に関する。同定されたＶＬＣＤＡは、ヒトに特異的な内在性の抗炎症性かつ抗増殖性の脂質である。
【０００３】
がんは、異常細胞が制御されずに分裂し始め、潜在的に他の組織に侵入し得るある種の疾患である。がん細胞は、患者の血液および／またはリンパ系を通して、患者の身体の様々な部分に広がり得る。多くの種類のがんがあり、そのうち結腸直腸がんは、最も高い死亡率を有するがんの１つである。しかしながら、現在、結腸内視鏡検査などのいくつかの早期検出スクリーニングプログラムが存在し、結腸直腸がんを検出するのに有効であることが証明されているものの、多くの人は、コストおよび知覚される侵襲性のために、そのような検査を受けることに気が進まない。その結果、腎臓がんおよび結腸直腸がんを含めたあるタイプのがんを発症するリスクがより高い人を同定する、いくつかの低侵襲性血清ベース試験が開発された。
【０００４】
そのような試験の１つは、結腸直腸がんまたは膵臓がんと診断された患者からの血清の非標的化リピドミクス分析を伴う。血清内の脂質抽出物をモニターして、４４４〜５５５原子質量単位（ａｍｕ）の間にあるいくつかの質量がある期間にわたって減少するかどうかを測定する。しかしながら、脂質は、まだ分析標準として合成されていないので、これらの脂質は、以前はビタミンＥ代謝物として、その後に１つのカルボキシ官能基、２〜６つの二重結合、および２〜４つのヒドロキシ置換を有する超長鎖ヒドロキシル化多価不飽和脂肪酸として誤って割り当てられた。結果として、これらの推測される脂質候補のいずれも、構造的仮定を検証し、これらのバイオマーカーに関する臨床アッセイの信頼性を改善するための分析標準として合成されていない。
【０００５】
上記を考慮して、腎臓がんおよび結腸直腸がんを含む（これらに限定されない）がんのあるタイプを検出するための方法における早期リスク指標として使用され得る代謝マーカーの正確な割り当ておよび同定が望まれる。
【発明の概要】
【０００６】
ある長鎖炭化水素バイオマーカーの質量分布の減少は、しばしばがん診断の前兆であることが見出された。したがって、同定された特定の低レベルの長鎖炭化水素バイオマーカーに関するスクリーニングは、がんリスクの早期同定のための有用なツールとして、および追加のがん試験のための指標としての可能性を有する。特に、高まったがんリスクまたは初期がん（例えば、結腸直腸がんまたは膵臓がん）は、２８〜３０個の炭素原子、０〜１つのヒドロキシ基、および１〜４つの二重結合を有する、超長鎖ジカルボン酸（ＶＬＣＤＣＡ）、ならびに３２〜３６個の炭素原子、１または２つのヒドロキシ基、および１〜４つの二重結合を有するＶＬＣＤＣＡの存在の減衰と相関している。２８個の炭素および４つの二重結合を有する１つの特定の超長鎖ジカルボン酸（ＶＬＣＤＣＡ）は、診断マーカーとして、およびがん発生に対する保護を提供するためのサプリメントとしての可能性を有する。このＶＬＣＤＣＡ（以下、ＶＬＣＤＣＡ２８：４ｎ６として同定される）は、式（Ｉ）を有するが、二重結合の局在化に関して他の変異体を排除しない：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ
（Ｉ）。
【０００７】
様々な例示的実施形態では、本発明の一般的発明概念の態様および利点は、ジカルボン酸としてのＶＬＣＤＣＡ２８：４の検証のための方法を提供することによって達成され得、これは、一部の実施形態では、［２Ｈ４］タウリンでの１つのカルボキシル基の逐次誘導体化およびトリメチルシリルジアゾメタンでの第２のカルボキシル基のメチル化を含み得る。反応はまた、内部標準［２Ｈ２８］ＶＬＣＤＣＡ２６：０を含めることによってモニターされ得る。一実施形態では、ＶＬＣＤＣＡ２８：４の２つのカルボキシル官能基の逐次誘導体化のために、１ミリリットルの乾燥血漿脂質抽出物に、５０μＬの２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド（１５．２ｍｇ／１０ミリリットルのアセトニトリルおよび１６．４μＬのトリメチルアミン）を添加する。試料を１５分間振盪しながら３０℃で加熱し、続いて５０μＬの［２Ｈ４］タウリン（９００μＬの蒸留水および１００μＬのアセトニトリル中５ｍｇ）を添加する。試料をさらに２時間振盪しながら３０℃で加熱した後、真空遠心分離によって乾燥させる。次に、１００μＬの２−プロパノールおよび２０μＬのトリメチルシリルジアゾメタン（ヘキサン中２Ｍ）を添加し、試料を３０分間振盪しながら３０℃で加熱する。次に、２０μＬの氷酢酸を添加して、残っているトリメチルシリルジアゾメタンを消費する。次いで、試料を真空遠心分離によって乾燥させ、１５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有するイソプロパノール、メタノール、およびクロロホルム（４：２：１）の混合物に溶解する。混合物をネガティブＥＳＩ（分解能１４０，０００）で分析して、誘導体化脂質のアニオンをモニターする。これは、１１１．０２９３１（［２Ｈ４］タウリン）および１４．０１５６５（トリメチルシリルジアゾメタン）ａｍｕの添加を伴い、５７１．３８４５（４４６．３３９６０＋１１１．０２９３１＋１４．０１５６５）の生成物および０．５３ｐｐｍの質量誤差でモニターされる５７０．３７７２のアニオンを生じる（図２Ｂ）。同様に、内部標準［２Ｈ２８］ＶＬＣＤＣＡ２６：０を［２Ｈ４］タウリンおよびトリメチルシリルジアゾメタンと順次反応させて、４３９．４３５１（３１４．３９０１６＋１１１．０２９３１＋１４．０１５６５）の生成物および０．４６ｐｐｍの質量誤差でモニターされる４３８．４２７８のアニオンを生じる。
【０００８】
様々な例示的実施形態例では、本一般的発明概念の態様および利点は、対象の血液試料を得ることと、血液試料から血清またはＥＤＴＡ血漿を単離することと、血清またはＥＤＴＡ血漿を分析して、超長鎖ジカルボン酸（ＶＬＣＤＣＡ２８：４）の血漿レベルを決定することと、対象のＶＬＣＤＣＡ２８：４の決定された血漿レベルを、結腸直腸がんを有すると診断された対象のＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルの所定の範囲と比較することと、血液試料内のＶＬＣＤＣＡ２８：４の決定された血漿レベルがＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルの所定の範囲内にある場合、結腸直腸がんを有する対象のリスクを決定することとを含む、結腸直腸がんを有する対象リスクを決定するための方法を提供することによって達成され得る。
【０００９】
一部の例示的実施形態例では、本一般的発明概念の先行するかつ／または他の態様および利点は、結腸直腸がんを有する対象リスクを決定するための方法であって、対象の血液試料を得ることと、血液試料から血清またはＥＤＴＡ血漿を単離することと、血清またはＥＤＴＡ血漿を分析して、ＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルを決定することと、対象のＶＬＣＤＣＡ２８：４の決定された血漿レベルを、結腸直腸がんを有すると診断された対象のＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルの所定の範囲と比較することと、血液試料内のＶＬＣＤＣＡ２８：４の決定された血漿レベルがＶＬＣＤＣＡ２８：４の血漿レベルの所定の範囲内にある場合、対象が結腸直腸がんを有すると決定することとを包含する、方法によって達成され得る。
【００１０】
一部の例示的実施形態例では、本一般的発明概念の先行するかつ／または他の態様および利点は、結腸直腸がんを有する対象を処置する方法であって、対象に結腸直腸がんを処置するのに十分な量の超長鎖ジカルボン酸を投与すること含む方法を提供することによって達成され得る。
【００１１】
一部の実施形態では、超長鎖ジカルボン酸は、Ｃ２８〜３６脂肪族基である直鎖基を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、超長鎖ジカルボン酸は、１〜４つの間の二重結合を有する直鎖基を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、超長鎖ジカルボン酸は、エポキシドまたはヒドロキシ官能基を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、超長鎖ジカルボン酸は、式（Ｉ）：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ
（Ｉ）
の化合物（ＶＬＣＦＡ２８：４）である。
【００１５】
一部の例示的実施形態では、本一般的発明概念の先行するかつ／または他の態様および利点は、ジカルボン酸２８：４構造を検証する方法であって、対象の血液試料を得ることと、血液試料から血清またはＥＤＴＡ血漿を単離することと、血清またはＥＤＴＡ血漿を低温環境で保存することと、１ナノモルの［２Ｈ２８］ジカルボン酸１６：０を含む約１ミリリットル（ｍＬ）のメタノールを１００マイクロリットルの血清またはＥＤＴＡ血漿を含有する試料に混合することと、約１ｍＬの蒸留水および約２ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを試料と混合することと、試料から有機層を分離することと、上部有機層を乾燥させることと、乾燥された上部有機層をイソプロパノール、メタノール、クロロホルム、および酢酸アンモニウムの混合物に溶解することと、溶解物について質量分析を行うことと、陰イオンエレクトロスプレーイオン化を使用して、ジカルボン酸のアニオンを定量化することとを包含する方法を提供することによって達成され得る。
【００１６】
一部の実施形態では、対象の血液試料は、静脈穿刺によって得られる。
【００１７】
一部の実施形態では、低温環境は、冷蔵庫および冷凍庫を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、有機層は、約３０００倍の重力の遠心力を使用して試料から分離される。
【００１９】
一部の実施形態では、イソプロパノール、メタノール、およびクロロホルムの混合物は、４：２：１の比である。
【００２０】
一部の実施形態では、混合物は、約１５ミリモル（ｍＭ）の酢酸アンモニウムを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、質量分析は、直接注入を介して行われる。
【００２２】
一部の例示的実施形態では、本一般的発明概念の先行するかつ／または他の態様および利点は、化学予防剤を低循環レベルのＶＬＣＤＡを有する対象に提供する方法であって、対象に化学予防剤として働くのに十分な量の式（Ｉ）：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ
（Ｉ）
の化合物、（Ｉ）のプロドラッグ、または（Ｉ）の類似体を投与することを含む方法を供給することによって達成され得る。
【００２３】
本一般的発明概念の他の例示的実施形態では、本一般的発明概念の先行するかつ／または他の態様および利点は、対象の血液試料を得ることと、血液試料から血清またはＥＤＴＡ血漿を単離することと、血清またはＥＤＴＡ血漿を低温環境で保存することと、１ナノモルの［２Ｈ２８］ジカルボン酸１６：０を含む約１ミリリットル（ｍＬ）のメタノールを１００マイクロリットルの血清またはＥＤＴＡ血漿を含有する試料に混合することと、約１ｍＬの蒸留水および約２ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを試料と混合することと、試料から有機層を分離することと、上部有機層を乾燥させることと、乾燥された上部有機層をイソプロパノール、メタノール、クロロホルム、および酢酸アンモニウムの混合物に溶解することと、溶解物について質量分析を行うことと、陰イオンエレクトロスプレーイオン化を使用して、ジカルボン酸のアニオンを定量化することとを含むジカルボン酸２８：４構造を検証する方法を提供することによって達成され得る。
【００２４】
対象の血液試料は、静脈穿刺によって得られ得る。低温環境は、冷蔵庫および／または冷凍庫を含み得る。
【００２５】
有機層は、約３０００倍の重力の遠心力を使用することによって試料から分離され得る。
【００２６】
イソプロパノール、メタノール、およびクロロホルムの混合物は、４：２：１の比とすることができる。混合物は、約１５ミリモル（ｍＭ）の酢酸アンモニウムを含み得る。質量分析は、直接注入を介して行われ得る。
【００２７】
ＶＬＣＤＣＡ２８：４は、調査したすべてのヒト生体液（血漿、滑液、胸水、脳脊髄液、および臍帯血漿）に存在する。ＶＬＣＤＣＡ２８：４は、イヌ、ウシ、ウマ、または非ヒト霊長類カニクイザルもしくはアカゲザルの血漿中では検出可能ではなかった。対照的に、ＶＬＣＤＣＡ２８：４レベルは、非ヒト霊長類の最も近い生きているヒト近縁種であるチンパンジーの血漿中で検出された。
【００２８】
本一般的発明概念の追加の態様および利点は、以下の説明に部分的に記載されることになり、部分的には、その説明から明らかとなるか、または本一般的発明概念の実行によって習得され得る。
【００２９】
他の特徴および態様は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
添付の図面を参照しながら、以下の例示的実施形態の詳細な説明を通して、多種多様な追加の実施形態がより容易に理解され認識されるであろう。
【図１Ａ】ヒト血漿から抽出されたＶＬＣＤＣＡのリストを示す表である。
【図１Ｂ】ヒト血漿から抽出されたＶＬＣＤＣＡのリストを示す表である。親塊および誘導体化（カルボキシおよびヒドロキシル官能基）分子の質量が列挙されている。
【図２Ａ】対照血漿からの（１．９４ｐｐｍ質量誤差）４４５．３３２ａｍｕのスペクトル分子アニオンを有する親分子ＶＬＣＤＣＡ２８：４の分子アニオンを示す。
【図２Ｂ】対照血漿抽出物での［２Ｈ４］タウリンでの１つのカルボキシル基の逐次誘導体化およびトリメチルシリルジアゾメタンでの第２のカルボキシル基のメチル化によって５７０．３７７２ａｍｕ（０．５３ｐｐｍ質量誤差）の分子アニオンを有するＶＬＣＤＣＡ２８：４のジカルボキシル構造を検証するグラフである。
【図２Ｃ】［２Ｈ４］タウリンおよびトリメチルシリルジアゾメタンと順次反応させられて、０．４６ｐｐｍの質量誤差でモニターされる４３８．４２７８ａｍｕのアニオンを生じる安定同位体内部標準［２Ｈ２８］ＶＬＣＤＣＡ２６：０のジカルボキシル構造を検証するグラフである。
【図２Ｄ】は、ジヒドロキシＶＬＣＤＣＡ３６：２のジカルボキシル構造およびジヒドロキシ置換を検証するグラフである。対照血漿抽出物での［２Ｈ４］タウリンでの１つのカルボキシル基の逐次誘導体化およびトリメチルシリルジアゾメタンでの第２のカルボキシル基のメチル化は、ジカルボキシル構造を検証し、一方［２Ｈ６］無水酢酸での２つのヒドロキシ基のその後のアセチル化は、ジヒドロキシ置換を検証する。
【図３Ａ】異なる動物種の血漿中および異なるヒト生体液中のＶＬＣＤＣＡレベルの表である。
【図３Ｂ】腎臓がんおよび結腸直腸がんと診断された患者の血漿中の減少したＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルを図示するチャートである。
【図４】ＶＬＣＤＣＡ２８：６のヒト生体液レベルおよび他の種の血漿中のレベルの評価を列挙する表である。
【図５】ジカルボン酸のカルボンキシルエステルプロドラッグおよび相当する構造のリストを図示する表である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
ヒトの血液中のある長鎖炭化水素バイオマーカー塊の普及の減少は、しばしばがんの前兆である。したがって、低レベルの特異的な同定された長鎖炭化水素バイオマーカーに関するスクリーニングは、がんリスクの早期同定のための有用なツールとして、および追加のがん試験のための指標としての可能性を有する。特に、高まったがんリスクまたは初期がん（例えば、結腸直腸がんまたは膵臓がん）は、２８〜３０個の炭素原子、０〜１つのヒドロキシ基、および１〜４つの二重結合を有する超長鎖ジカルボン酸（ＶＬＣＤＣＡ）、ならびに３２〜３６個の炭素原子、１または２つのヒドロキシ基、および１〜４つの二重結合を有するＶＬＣＤＣＡの非疾患対照に対する減少と相関している。
【００３２】
２８個の炭素および４つの二重結合を有する１つの特定の超長鎖ジカルボン酸（ＶＬＣＤＣＡ）は、診断マーカーとして、およびがん発生に対する保護を提供するためのサプリメントとしての可能性を有する。このＶＬＣＤＣＡ（以下、ＶＬＣＤＣＡ２８：４として同定される）は、式（Ｉ）：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ
（Ｉ）
を有する。
【００３３】
膵臓がんまたは結腸直腸がんと診断された患者における４４４〜５５５ａｍｕの間の原子質量を有するいくつかの分子の減少がモニターされたヒト血漿または血清内の脂質抽出物は、ＶＬＣＤＣＡとして同定される。４４５．３３２３ａｍｕの原子質量を有する分子アニオンに関して、この脂質は、初めて、ＶＬＣＤＣＡ２８：４として同定された。ジカルボン酸へのＶＬＣＦＡの変換は、最初にミクロソームＣＹＰ４Ｆによる脂肪酸のω酸化、それに続くアルコールデヒドロゲナーゼを介したアルデヒドへの変換、およびＣＹＰ４Ｆによるまたは脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼによるＶＬＣＤＣＡへの最終変換を伴う。本発明の概念は、最大３６個の炭素長のＶＬＣＤＣＡの特徴付けを含む。
【００３４】
最大３６個の炭素長までのＶＬＣＤＣＡは、例えば、結腸直腸がん、卵巣がん、前立腺がん、および膵臓がんなどの様々ながんの脂質バイオマーカーとして使用され得る。本一般的発明概念は、結腸直腸がんおよび膵臓がんと診断された患者からのヒト血漿または血清の脂質抽出物内の数が減少することをモニターされている、４４４〜５５５ａｍｕのＶＬＣＤＣＡバイオマーカー塊の正確な同定を提供する。本発明の概念に従って、これらの脂質バイオマーカーは、１〜４つの二重結合および０、１、または２つのヒドロキシ置換を有するＶＬＣＤＣＡとして同定される。
【００３５】
図１Ａおよび図１Ｂは、ヒト血漿から抽出されたＶＬＣＤＣＡのリストを示す表である。図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、連続脂肪酸伸長は、脳、脾臓、膵臓、腎臓、回腸、およびリンパ節において中程度のレベルで、および霊長類の網膜、胸腺、表皮、生殖細胞において高レベルで見出される酵素である超長鎖脂肪酸−４（ＥＬＯＶＬ４）の伸長を伴う。これらの超長鎖脂肪酸は、スフィンゴミエリンおよびフォトファチジルコリンの脂肪酸成分としての構造的機能を遂行し、シグナル伝達の役割を果たし、ジカルボン酸の潜在的な前駆体である。
【００３６】
図２Ａは、［２Ｈ４］タウリンでの１つのカルボキシル基の逐次誘導体化およびトリメチルシリルジアゾメタンでの第２のカルボキシル基のメチル化の前の、４４５．３３２ａｍｕ（１．９４ｐｐｍ質量誤差）のスペクトル分子アニオンを有するＶＬＣＤＣＡ２８：４のグラフである。図２Ｂは、対照血漿の有機抽出物を［２Ｈ４］タウリンおよびトリメチルシリルジアゾメタンと順次反応させることによって、５７０．３７７２ａｍｕ（０．５３ｐｐｍ質量誤差）の分子アニオンを有するジカルボキシル構造（ＶＬＣＤＣＡ２８：４）を検証するグラフである。図２Ａおよび２Ｂを参照すると、１０００μＬの対照血漿の脂質抽出物と［２Ｈ４］タウリンおよびトリメチルシリルジアゾメタンとの反応は、両方のカルボン酸基を誘導体化する。分子アニオン４４５．３３２３ａｍｕは、４つの二重結合を有しかつヒドロキシ置換を有さないＶＬＣＤＣＡとして同定される。この脂質は、５つの二重結合および２つのヒドロキシ置換を有する脂肪酸としての以前の割当てではなく、正しく同定され、ジカルボン酸２８：４として割り当てられている（ＧＴＡ−４４６）。
【００３７】
ジカルボン酸２８：４構造を検証する方法も開示されている。この方法は、［２Ｈ４］タウリンおよびトリメチルシリルジアゾメタンを使用することによるＶＬＣＦＡ２８：４における２つのカルボキシル基の誘導体化を含む。この検証方法は、静脈穿刺によって収集された血液試料を得ること、次いで、血液試料から血清またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）血漿のいずれかの試料を単離することを含む。血清および／またはＥＤＴＡ血漿の試料は、ある実施形態では、分析の前に試料が分解することを制限するために低温環境（例えば、冷蔵庫）中で保存され得るまたは凍結され得る。
【００３８】
約１００マイクロリットルの血清および／またはＥＤＴＡ血漿の試料を、例えば、ＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ、８８  Ａｖｅ．Ｌｅａｃｏｔａ、ＰｏｉｎｔｅＣｌａｉｒｅ、ＱＣ、Ｈ９Ｒ  １Ｈ１によって供給されるタイプの１ナノモルの［２Ｈ２８］ジカルボン酸１６：０を含有する１ミリリットル（ｍＬ）のメタノールと混合して、試料混合物を形成することができる。次いで、１ミリリットルの蒸留水および２ミリリットルのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを試料混合物に添加する。次いで、試料混合物を有機溶媒中で撹拌して、脂質画分を抽出する。例えば、試料混合物は、室温で約３０分間高速（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｍｕｌｔｉｔｕｂｅ  Ｖｏｒｔｅｘの設定値９）で振盪することによって、撹拌することができる。次いで、試料混合物を沈降させて、有機上層を試料の残部から分離する。次いで、試料混合物を試験管に移し、室温で約１０分間、約３０００倍の重力で遠心分離する。
【００３９】
一実施形態では、試料混合物の上記沈降時に、約１ミリリットルの上部有機層を１．５ミリリットルのマイクロチューブに移し、例えば、遠心真空蒸発によって乾燥させ、その後、乾燥した上部有機層部分を、約１５ミリモル（ｍＭ）の酢酸アンモニウムを含有する、それぞれ４：２：１の比でイソプロパノール、メタノール、およびクロロホルムの混合物に溶解する。次いで、サブミリのマス精度での高分解能（例えば、２００原子質量単位で１４０，０００）データ取得を、例えば、商標「Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＴＭ」の下でＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって製造販売されているタイプのオービトラップ質量分析計での直接注入を介して試料に行う。しかしながら、他のタイプまたはモデルの質量分析計が使用され得る。複数の試料が方法に従って同時にプロセシングされる実施形態では、ある試料から次の試料へのゴースト効果を最小化するために、オービトラップ質量分析計への投入ラインを試料間にメタノールならびにそれぞれ３：２の比でヘキサンおよび酢酸エチルの混合物を使用して洗浄してもよい。次いで、陰イオンエレクトロスプレーイオン化では、ジカルボン酸のアニオンを定量化し、獲得された高分解能データセットから、図１に図示するように、データを減少させて、ＶＬＣＤＣＡのリストを提供することができる。
【００４０】
ＶＬＣＦＡ２８：４中の２つのカルボキシル基の検証を［２Ｈ４］タウリンでの１つのカルボキシル基の逐次誘導体化、およびトリメチルシリルジアゾメタンでの第２のカルボキシル基のメチル化によって得た。検証方法は、約１ミリリットルの乾燥脂質抽出物を５０μＬの２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド（１５．２ｍｇ／１０ミリリットルのアセトニトリルおよび１６．４μＬのトリメチルアミン）に添加することを含む。試料を１５分間振盪しながら３０℃で加熱し、続いて５０μＬの［２Ｈ４］タウリン（９００μＬの蒸留水および１００μＬのアセトニトリル中５ｍｇ）を添加する。試料をさらに２時間振盪しながら３０℃で加熱した後、真空遠心分離によって乾燥させる。次に、１００μＬの２−プロパノールおよび２０μＬのトリメチルシリルジアゾメタン（ヘキサン中２Ｍ）を添加し、試料を３０分間振盪しながら３０℃で加熱する。次に、２０μＬの氷酢酸を添加して、残っているトリメチルシリルジアゾメタンを消費する。次いで、試料を真空遠心分離によって乾燥させる。次いで、混合物を、約１５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有するそれぞれ４：２：１の比のイソプロパノール、メタノール、およびクロロホルムの混合物に溶解させる。
【００４１】
混合物をネガティブＥＳＩ（分解能１４０，０００）で分析して、誘導体化脂質のアニオンをモニターする。これは、１１１．０２９３１（［２Ｈ４］タウリン）および１４．０１５６５（トリメチルシリルジアゾメタン）ａｍｕの添加を伴い、５７１．３８４５（４４６．３３９６０＋１１１．０２９３１＋１４．０１５６５）の生成物および０．５３ｐｐｍの質量誤差でモニターされる５７０．３７７２のアニオンを生じる（図２Ｂ）。同様に、内部標準［２Ｈ２８］ＶＬＣＤＣＡ２６：０を［２Ｈ４］タウリンおよびトリメチルシリルジアゾメタンと順次反応させて、４３９．４３５１（３１４．３９０１６＋１１１．０２９３１＋１４．０１５６５）の生成物および０．４６ｐｐｍの質量誤差でモニターされる４３８．４２７８のアニオンを生じる。本発明の方法の上述の実施形態で使用される様々な量の材料は、方法が上述の実施形態による材料のおおよその比率を使用して行われるように変化し得ることが認識されるであろう。本一般的発明概念によるそのような代替の実施形態が本明細書で企図されており、本一般的発明概念から逸脱すると理解されるべきではない。さらに、本発明の方法は、一度に複数の試料を同時に検証するために使用することができ、例えば、本一般的発明概念の精神および範囲から逸脱することなく、複数の試料が上述のようにプロセシングされ得ることが企図される。
【００４２】
ヒドロキシ官能基を含有するジカルボン酸の場合、様々な実施形態では、脂質は、［２Ｈ４］タウリンでの１つのカルボキシル基の逐次誘導体化、およびトリメチルシリルジアゾメタンでの第２のカルボキシル基のメチル化を最初に受ける。次に、ヒドロキシ基を［２Ｈ６］無水酢酸で誘導体化する。具体的には、２つのカルボン酸官能基を上記のように誘導体化する。次いで、試料を乾燥させ、７５μＬのピリジンおよび７５μＬの［２Ｈ６］無水酢酸を添加する。試料を振盪ながら６０℃で１時間加熱し、真空遠心分離によって乾燥させ、１５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有するイソプロパノール、メタノール、およびクロロホルム（４：２：１）の混合物に溶解する。ジヒドロキシＶＬＣＤＣＡ３６：２（図１Ｂ、ＧＴＡ５９４、ＰＣ５９４を参照されたい）の場合、これは、３．６８ｐｐｍの質量誤差でモニターされる８０８．５８２４のアニオンを作製する（図２Ｃ）８０９．５８９６（５９４．４８５９４＋１１１．０２９３１＋１４．０１５６５＋２＊４５．０２９３９）の生成物を生じる。内在性ＶＬＣＤＣＡおよびそれらの誘導体に関する塊の完全なリストは、図１Ａおよび図１Ｂに示されている。
【００４３】
代替の例示的実施形態では、データは、安定同位体内部標準のピーク面積対内在性脂質のピーク面積の比として単純に減少され得る。しかしながら、本一般的発明概念は、そこに限定されない。すなわち、代替の例示的実施形態では、分析標準が利用可能である場合、検量線が絶対定量化のために構築され得る。さらなる例示的実施形態では、ＶＬＣＦＡは、タンデム質量分析（ＭＳ２）、または三重四重極機器でのユニット分解能質量分析を含むがこれらに限定されない他の様々な質量分析技術によって定量化され得る。しかしながら、本一般的発明概念は、そこに限定されない。さらなる例示的実施形態では、液体クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、および超臨界流体クロマトグラフィーなどの様々な従来のクロマトグラフィー方法が直接注入の代替として使用され得る。しかしながら、本一般的発明概念は、そこに限定されない。
【００４４】
図３Ａは、異なる動物種の血漿中および異なるヒト生体液中のＶＬＣＤＣＡレベルの表である。これらのデータは、ＶＬＣＤＣＡが高等霊長類の血液中にのみ存在することを示し、この脂質が後期進化的発達を表すことを示している。ヒトでは、ＶＬＣＤＣＡは、血漿に加えて多種多様な生体液中に存在する。
【００４５】
図３Ｂは、疾患状態を有すると診断されていない対照群のＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルに対する腎臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、および関節リウマチの疾患状態を有する患者の血漿中のＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルの減少を図示するチャートである。ＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルの減少は、乳がん、多形性膠芽腫、潰瘍性大腸炎、および乾癬に対しては注目されず、したがって、ＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルの減少が疾患状態リスク情報を提供する能力を示している。対照群は、疾患状態を有すると診断されていない複数の対象から決定されたＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルの範囲を提供する。同様に、各個々の疾患状態に関して複数の対象において観察されたＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルは、特定の診断された疾患状態に相当するＶＬＣＤＣＡ２８：４血漿レベルの範囲を提供する。
【００４６】
対照に対する約２５％のＶＬＣＤＣＡ２８：４の減少は、腎臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、および関節リウマチの１つまたは複数の状態に対する活動性または感受性を示している。対照に対する約５０％のＶＬＣＤＣＡ２８：４の減少は、腎臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、および関節リウマチの１つまたは複数の状態に対する活動性または感受性のより強力な指標である。対照に対する約６２％のＶＬＣＤＣＡ２８：４の減少は、活動性結腸直腸がんまたは結腸直腸がんに対する感受性の指標である。対照に対する約６８％以上のＶＬＣＤＣＡ２８：４の減少は、活動性結腸直腸がんまたは結腸直腸がんに対する感受性のより強力な指標である。
【００４７】
臨床的には、４４４〜５５５の間のバイオマーカー塊の減衰ががん発症前に検出されてきた。加えて、これらのバイオマーカー塊は、同定されたがん性組織を除去するための手術後に回復されず、これは、これらのバイオマーカー塊ががん性組織に由来せず、内因性の化学的保護因子を表し得ることを示唆している。
【００４８】
ＶＬＣＤＣＡ２８：４などの２８〜３６個の炭素原子を有するＶＬＣＤＣＡを含めたこれらの因子のサプリメントは、がんまたは炎症性疾患発症に対する保護を提供するために、あるタイプのがんまたは炎症性障害を発症する疾患状態リスクを有すると同定された人々に対して提供され得る。ある例では、ヒト血漿からのこれらの同定された脂質の精製画分は、抗炎症性および抗増殖性の両方の特性を有することが観察された。ＶＬＣＤＡは、循環ＶＬＣＤＣＡ２８：４の少なくとも８％の増加が観察されるまで、対象に投与され得る。好ましくは、ＶＬＣＤＡは、循環ＶＬＣＤＣＡ２８：４の少なくとも１５％の増加が観察されるまで、対象に投与され得る。
【００４９】
同定された脂質バイオマーカーＶＬＣＤＣＡ２８：４は、ＶＬＣＦＡの変換によって産出される。この変換は、最初にミクロソームＣＹＰ４ＦによるＶＬＣＦＡ２８：４（ＶＬＣＦＡ２８：４ｎ６）のω酸化、それに続くアルコールデヒドロゲナーゼを介したアルデヒドへの変換、およびＣＹＰ４Ｆによるまたは脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼによるＶＬＣＤＣＡ２８：４ｎ６への最終変換を伴う。最大２６個の炭素のＶＬＣＤＣＡが以前に報告されているが、本方法は、最大３６個の炭素長のＶＬＣＤＣＡの特徴付けを提供する。
【００５０】
対象内の同定された脂質バイオマーカーＶＬＣＤＣＡ２８：４の血清または血漿レベルを定量化する方法は、結腸直腸、腎臓、前立腺、および膵臓がんを含むがこれらに限定されない複数のがんを発症するリスク因子としてこれらの脂質をモニターするために使用され得る。例えば、一実施形態では、ＶＬＣＦＡは、三連四重極機器でのユニット分解能質量分析を含めた様々な他の質量分析計でＭＳ２によって定量化され得る。さらに、クロマトグラフィー法も直接注入法の代替として使用され得、これは、液体クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン、電気泳動、および超臨界流体クロマトグラフィーを含み得る。しかしながら、本一般的発明概念は、そこに限定されない。
【００５１】
図４は、ジカルボン酸のカルボキシルエステルプロドラッグおよび相当する構造のリストを図示する表である。さらに、同定された脂質バイオマーカーＶＬＣＤＣＡ２８：４またはＶＬＣＤＣＡ２８：４の潜在的なエステルは、がん治療薬としてまたはがん化学予防薬として使用され得るこれらの脂質の様々な医薬類似体またはプロドラッグの開発に使用され得る。
【００５２】
図５は、プロドラッグの開発に使用され得る同定された脂質バイオマーカーＶＬＣＤＣＡ２８：４のモノ−およびジ−エステルを表す。同定された脂質バイオマーカーＶＬＣＤＣＡ２８：４は、担体を含む医薬組成物で、または様々な他の薬剤もしくは薬物と組み合わせて提供され得る。同定された脂質バイオマーカーＶＬＣＤＣＡ２８：４は、サプリメント、栄養補助食品で提供され得る、かつ／または他の様々な食品と組み合わせて提供され得る。同定された脂質バイオマーカーＶＬＣＤＣＡ２８：４は、がんを処置する、予防する、かつ／または軽減するのに十分な量で、結腸直腸がん、腎臓がん、前立腺がん、および膵臓がんを含むがこれらに限定されない複数のがんの少なくとも１つと診断された対象に投与され得る。
【００５３】
結腸直腸がんを処置する方法
例示的実施形態では、本一般的発明概念は、結腸直腸がんを有する対象を処置する方法を提供する。代替の例示的実施形態では、本一般的発明概念は、化学予防剤および化学予防剤で低循環レベルのＶＬＣＤＣＡを有する対象を処置する方法も提供する。処置方法は、結腸直腸がんまたは低循環レベルのＶＬＣＤＣＡを有する対象に、血中を循環するＶＬＣＤＣＡのレベルを増加させるのに十分な量のＶＬＣＤＣＡ、式（Ｉ）の化合物、（Ｉ）のプロドラッグ、または（Ｉ）の類似体：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ
（Ｉ）
を投与することを含む。
【００５４】
しかしながら、本一般的発明概念は、そこに限定されない。すなわち、他の例示的実施形態では、化合物（Ｉ）の構造類似体および／または化合物（Ｉ）のプロドラッグエステルも、優れたかつ／または改善されたバイオアベイラビリティ（ＢＡ）を提供するために、開発され得る。
【００５５】
膵臓がんを処置する方法
他の例示的実施形態では、本一般的発明概念は、膵臓がんを有する対象を処置する方法および低循環レベルのＶＬＣＤＣＡを有する個人における化学予防剤として提供する。処置方法は、膵臓がんまたは低循環レベルのＶＬＣＤＣＡを有する対象に、血中を循環するＶＬＣＤＣＡのレベルを増加させるのに十分な量のＶＬＣＤＣＡ、式（Ｉ）の化合物、（Ｉ）のプロドラッグ、または（Ｉ）の類似体：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ
（Ｉ）
を投与することを含む。
【００５６】
しかしながら、本一般的発明概念は、そこに限定されない。すなわち、他の例示的実施形態では、化合物（Ｉ）の構造類似体および／または化合物（Ｉ）のプロドラッグエステルも、優れたかつ／または改善されたバイオアベイラビリティ（ＢＡ）を提供するために、開発され得る。
【００５７】
前立腺がんを処置する方法
代替の例示的実施形態では、本一般的発明概念は、前立腺がんを有する対象を処置する方法および低循環レベルのＶＬＣＤＣＡを有する個人における化学予防剤として提供する。処置方法は、前立腺がんまたは低循環レベルのＶＬＣＤＣＡを有する対象に、血中を循環するＶＬＣＤＣＡのレベルを増加させるのに十分な量のＶＬＣＤＣＡ、式（Ｉ）の化合物、（Ｉ）のプロドラッグ、または（Ｉ）の類似体：
ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ
（Ｉ）
を投与することを含む。
【００５８】
しかしながら、本一般的発明概念は、そこに限定されない。すなわち、他の例示的実施形態では、化合物（Ｉ）の構造類似体および／または化合物（Ｉ）のプロドラッグエステルも、優れたかつ／または改善されたバイオアベイラビリティ（ＢＡ）を提供するために、開発され得る。
【００５９】
他のＶＬＣＤＣＡ（図１Ａに列挙されている）、およびこれらのＶＬＣＤＣＡの構造類似体またはプロドラッグエステルも、血中を循環するＶＬＣＤＣＡのレベルを増加させ、結腸直腸がんを処置するための潜在的な治療候補である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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