【手続補正書】
【提出日】平成19年5月21日(2007.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  変異した抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有し、該ポリペプチドは、相補性決定領域（ＣＤＲ）において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって該親抗体と異なる配列を有し、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである、ポリペプチド。
【請求項２】  前記置換が、軽鎖可変領域のＣＤＲ３において生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】  前記置換が、重鎖可変領域のＣＤＲ３において生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】  前記置換が、軽鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２において生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】  前記置換が、重鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２において生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】  前記抗原が、メソセリンであり、前記親抗体が、抗メソセリン抗体ＳＳであり、そして前記ポリペプチドが、Ｓ９２、Ｇ９３およびＹ９４から選択される少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって抗体ＳＳと異なる配列を有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】  前記置換が、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（ＳＳ１）；Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ（Ｄ８）およびＳ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（Ｃ１０）から選択される、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】  前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】  前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖである、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１０】  前記ポリペプチドが、ｄｓＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】  前記ポリペプチドが、ｄｓＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１２】  治療的部分または検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】  前記治療的部分が、毒性部分である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】  前記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】  前記毒性部分が、細胞傷害性フラグメントであり、該細胞傷害性フラグメントが、ＰＥ３８である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】  前記毒性部分が、ジフテリア毒素またはその細胞傷害性フラグメント、サポリンまたはその細胞傷害性フラグメント、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性フラグメント、リシンまたはその細胞傷害性フラグメント、およびブリオジン１またはその細胞傷害性フラグメントからなる群より選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】  治療的部分または検出可能な標識をさらに含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】  前記治療的部分が、毒性部分である、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】  前記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】  前記毒性部分が、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される細胞傷害性フラグメントである、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】  バクテリオファージの表面タンパク質をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】  抗メソセリン抗体ＳＳのメソセリン結合親和性の少なくとも３倍のメソセリン結合親和性を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくともＬ９６Ｔ（Ｅ４）の軽鎖可変領域のＣＤＲ３において、アミノ酸が置換されている点で抗体ＳＳと異なる配列を有する、ポリペプチド。
【請求項２３】  治療的部分または検出可能な標識をさらに含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】  前記治療的部分が、毒性部分である、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】  前記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】  前記毒性部分が、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される細胞傷害性フラグメントである、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】  変異した抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、該ポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有し、該ポリペプチドは、相補性決定領域（ＣＤＲ）において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって親抗体と異なる配列を有し、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである、核酸分子。
【請求項２８】  前記抗原が、メソセリンであり、前記親抗体が、抗メソセリン抗体ＳＳであり、そして前記ポリペプチドが、Ｓ９２、Ｇ９３およびＹ９４から選択される少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって抗体ＳＳと異なる配列を有する、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】  前記置換が、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（ＳＳ１）；Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ（Ｄ８）およびＳ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（Ｃ１０）から選択される、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項３０】  抗メソセリン抗体ＳＳのメソセリン結合親和性の少なくとも３倍のメソセリン結合親和性を有するポリペプチドをコードする核酸分子であって、該ポリペプチドは、少なくともＬ９６Ｔ（Ｅ４）の軽鎖可変領域のＣＤＲ３において、アミノ酸が置換されている点で抗体ＳＳと異なる配列を有する、核酸分子。
【請求項３１】  請求項２７に記載の核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセット。
【請求項３２】  請求項２８に記載の核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現カセット。
【請求項３３】  抗原を保有する悪性細胞を殺傷するための組成物であって、該組成物は、毒性部分および標的化部分を含むイムノトキシンを含み、該標的化部分は、変異した抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、親抗体よりも少なくとも５倍高い抗原結合親和性を有し、該ポリペプチドは、相補性決定領域（ＣＤＲ）において、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸が置換されていることによって該親抗体と異なる配列を有し、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、そしてＷはＡまたはＴである、組成物。
【請求項３４】  前記抗原が、メソセリンである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】  前記標的化部分が、ＳＳ１、Ｄ８およびＣ１０からなる群より選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】  前記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】  前記毒性部分が、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される細胞傷害性フラグメントである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】  抗原を保有する悪性細胞を殺傷するための組成物であって、該組成物が、毒性部分および標的化部分を含むイムノトキシンを含み、ここで、該標的化部分が、抗体Ｅ４である、組成物。
【請求項３９】  前記毒性部分が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはその細胞傷害性フラグメントである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】  前記毒性部分が、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される細胞傷害性フラグメントである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】  親抗体よりも高い標的抗原親和性を有するポリペプチドを同定する方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）抗体と該標的抗原との間の特異的な結合に適切な条件下で、該標的抗原と請求項１に記載のポリペプチドを接触させる工程；
（ｂ）該親抗体またはそのフラグメントの親和性よりも高い親和性で該標的抗原に結合しない抗体またはそのフラグメントの全てを取り除く条件下で、該ポリペプチドを溶出する工程；ならびに
（ｃ）該ポリペプチドが該抗原に結合したか否かを決定する工程であって、これによって、結合することによって、該ポリペプチドが該親抗体よりも高い標的親和性を有することが確認される、工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】  変異した抗体の可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）親抗体のＶHドメインまたはＶLドメインのアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する工程であって、該核酸分子は、ホットスポットモチーフの内部に少なくとも１つのヌクレオチドを含む、少なくとも１つの親のホットスポットコドンを含む、工程；ならびに
（ｂ）該親のアミノ酸配列とは異なる変異したアミノ酸配列をコードする、複数の変異した核酸分子を生成する工程であって、ここで、各々の変異した核酸配列は、アミノ酸をコードする親のホットスポットコドンとは異なる少なくとも１つの変異したコドンを含み、該変異したコドンは、該親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする、工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】  請求項４２に記載の方法であって、ここで、前記複数の変異した核酸分子が、少なくとも１９のメンバーを含み、該１９のメンバーの各々は、前記親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸が、異なる天然のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードする、方法。
【請求項４４】  請求項４２に記載の方法であって、ここで、前記複数の変異した核酸分子が、アミノ酸をコードする少なくとも２つの親のホットスポットコドンとは異なる変異したコドンを含み、該変異したコドンの各々は、該親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする、方法。
【請求項４５】  請求項４２に記載の方法であって、ここで、前記複数の変異した核酸分子が、少なくとも３９９のメンバーを含み、該メンバーの各々が、前記親のホットスポットコドンによってコードされるアミノ酸が、異なる天然のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードする、方法。
【請求項４６】  請求項４２に記載の方法であって、さらにここで、前記親抗体が、コドンによってコードされる少なくとも１つの保存アミノ酸を有するあるクラスの抗体であり、ここで、該保存アミノ酸をコードするコドン（単数または複数）が変異していない、方法。
【請求項４７】  前記ホットスポットモチーフが、ＡＧＣＡ、ＡＧＴＴ、ＡＧＣＴ、ＡＧＴＡ、ＧＧＣＡ、ＧＧＴＴ、ＧＧＣＴ、ＧＧＴＡ、ＡＧＣおよびＡＧＴからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】  前記変異した核酸分子が、ＣＤＲを含む前記ＶHドメインまたはＣＤＲを含む前記ＶLドメインの一部分に、少なくとも１つの変異したコドンを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】  前記ＣＤＲが、前記ＶHドメインのＣＤＲ３である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】  前記ＣＤＲが、前記ＶLドメインのＣＤＲ３である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】  可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含む単離された抗メソソリン抗体であって、該ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、各々、第一の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、第二の相補性決定領域および第三の相補性決定領域を有し、ここで該重鎖の該第一のＣＤＲ（「ＣＤＲ１」）、該第二のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）、および該第三のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）はそれぞれ、図１に示される重鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と示されるアミノ酸残基配列を有し、ここで該ＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ、図１に示される軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と示されるアミノ酸残基配列を有し、ただし、該ＶＬ鎖のＣＤＲ３におけるアミノ酸残基の配列は、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（抗体ＳＳ１）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４（抗体Ｄ８）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ１０）、Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ５）、Ｇ９３Ａ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｄ７）、Ｇ９３Ｑ−Ｙ９４Ｉ（抗体Ｂ７）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｔ−Ｙ９４Ｎ（抗体Ｄ９）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｄ−Ｙ９４Ｆ（抗体Ｃ３）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｄ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ４）、およびＬ９６Ｔ（抗体Ｅ４）から選択される置換によって、図１に示される配列とは異なり、該アミノ酸残基は図１において番号付けされている、単離された抗メソセリン抗体。
【請求項５２】  前記抗体はｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２である、請求項５１に記載の単離された抗メソセリン抗体。
【請求項５３】  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＨ  ＣＤＲ２からなる群より選択されるＣＤＲにおける少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換をさらに含み、該アミノ酸はＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされており、ここでＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、かつＷはＡまたはＴである、請求項５１に記載の単離された抗メソセリン抗体。
【請求項５４】  請求項５１に記載の単離された抗メソセリン抗体と、治療的部分または検出可能な標識とを含む、キメラ分子。
【請求項５５】  前記治療部分は、毒性部分である、請求項５４に記載のキメラ分子。
【請求項５６】  前記毒性部分はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（「ＰＥ」）である、請求項５５に記載のキメラ分子。
【請求項５７】  前記ＰＥは、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される、請求項５６に記載のキメラ分子。
【請求項５８】  前記抗体は、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＨ  ＣＤＲ２からなる群より選択されるＣＤＲにおける少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換をさらに含み、該アミノ酸はＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここでＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、かつＷはＡまたはＴである、請求項５４に記載のキメラ分子。
【請求項５９】  （ａ）請求項５４に記載のキメラ分子と、（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
【請求項６０】  メソセリン抗原を保有する悪性細胞を殺傷するための組成物であって、該組成物は、毒性部分および標的部分を含むキメラ分子を含み、該標的部分は可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を有し、該ＶＨ鎖およびＣＬ鎖は、各々、第一の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、第二のＣＤＲおよび第三のＣＤＲをそれぞれ有し、ここで該重鎖のそれぞれ該第一のＣＤＲ（「ＣＤＲ１」）、第二のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）および第三のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）は、図１に示される重鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と示されるアミノ酸残基配列を有し、該ＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ、図１に示される軽鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と示されるアミノ酸残基配列を有し、ただし、ＶＬ鎖のＣＤＲ３におけるアミノ酸残基の配列は、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（抗体ＳＳ１）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ（抗体Ｄ８）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ１０）、Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ５）、Ｇ９３Ａ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｄ７）、Ｇ９３Ｑ−Ｙ９４Ｉ（抗体Ｂ７）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｔ−Ｙ９４Ｎ（抗体Ｄ９）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｏ−Ｙ９４Ｆ（抗体Ｃ３）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｄ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ４）、およびＬ９６Ｔ（抗体Ｅ４）から選択される置換によって図１に示される配列とは異なり、該アミノ酸残基は図３において番号付けされている、組成物。
【請求項６１】  前記毒性部分はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（「ＰＥ」）である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】  前記ＰＥは、ＰＥ３５、ＰＥ３８およびＰＥ４０からなる群より選択される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】  前記標的部分はさらに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＨ  ＣＤＲ２からなる群より選択されるＣＤＲにおける少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＥＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされており、ここでＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、かつＷはＡまたはＴである、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６４】  可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗メソセリン抗体をコードする単離された核酸分子であって、該ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、各々、第一の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、第二の相補性決定領域および第三の相補性決定領域を有し、該重鎖の第一のＣＤＲ（「ＣＤＲ１」）、第二のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）および第三のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）はそれぞれ、図１に示される重鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と示されるアミノ酸残基配列を有し、該ＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ、図１に示される軽鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と示されるアミノ酸残基配列を有し、ただし、ＶＬ鎖の第三のＣＤＲにおけるアミノ酸残基の配列は、Ｇ９３Ｋ−Ｙ９４Ｈ（抗体ＳＳ１）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｆ−Ｙ９４Ｎ（抗体Ｄ８）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｓ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ１０）、Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ５）、Ｇ９３Ａ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｄ７）、Ｇ９３Ｑ−Ｙ９４Ｉ（抗体Ｂ７）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｔ−Ｙ９４Ｎ（抗体Ｄ９）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｄ−Ｙ９４Ｆ（抗体Ｃ３）、Ｓ９２Ｇ−Ｇ９３Ｄ−Ｙ９４Ｈ（抗体Ｃ４）、およびＬ９６Ｔ（抗体Ｅ４）から選択される置換によって図１に示される配列とは異なり、該アミノ酸残基は、図３において番号付けされている、単離された核酸。
【請求項６５】  前記抗体はさらに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＨ  ＣＤＲ２からなる群より選択されるＣＤＲにおける少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここでＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、かつＷはＡまたはＴである、請求項６４に記載の核酸。
【請求項６６】  プロモーターに作動可能に連結された、請求項６４に記載の単離された核酸を含む、発現カセット。
【請求項６７】  さらに抗体が、ＶＬの第一のＣＤＲ、ＶＬの第二のＣＤＲ、ＶＨの第一のＣＤＲおよびＶＨの第二のＣＤＲからなる群より選択されるＣＤＲにおける少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷから選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされ、ここでＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、かつＷはＡまたはＴである、請求項６６に記載の発現カセット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
いくつかの抗体の実施形態のＶH領域およびＶL領域は直接一緒に連結され得るとはいえ、当業者は、これらの領域が、１以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって隔てられ得ることを認識する。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当該分野で周知である。例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：５８７９（１９８８）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３６（１９８８）；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１３６２（１９９０）；米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，１３２，４０５号およびＳｔｅｍｍｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２５６−２６５（１９９３）（全て、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般的に、ペプチドリンカーは、領域を連結すること、またはこれらの間のいくらかの最小の距離もしくは他の空間的関係を保つこと以外に特定の生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成要素であるアミノ酸は、分子のいくつかの特性（例えば、折り畳み、正味の電荷、または疎水性）に影響を与えるように選択され得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は必要に応じて、５０以下のアミノ酸の、一般的に４０以下のアミノ酸の、好ましくは３０以下のアミノ酸の、そしてより好ましくは２０以下のアミノ酸の長さのペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号５）のコンカテマー（好ましくは、２、３、４、５または６個のこのような配列）である。しかし、リンカー内のいくつかのアミノ酸置換が行われ得ることが認識されるべきである。例えば、バリンで、グリシンを置換し得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
本発明の好ましい実施形態では、毒素はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）である。用語「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素」は、本明細書中で使用される場合、全長のネイティブな（天然に存在する）ＰＥ、または改変されているＰＥをいう。このような改変としては、ドメインＩａの除去、ドメインＩｂ、ＩＩ、およびＩＩＩにおける種々のアミノ酸の欠失、単一のアミノ酸置換、およびカルボキシル末端での１以上の配列（例えば、ＫＤＥＬ（配列番号６）およびＲＥＤＬ（配列番号７））の付加が挙げられ得るが、これらに限定されない。Ｓｉｅｇａｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６−１４２６１（１９８９）を参照のこと。好ましい実施形態では、ＰＥの細胞障害性フラグメントは、ネイティブなＰＥの細胞傷害性の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは９５％を保持する。最も好ましい実施形態では、細胞傷害性フラグメントは、ネイティブなＰＥよりも毒性が高い。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
上述のように、いくつかまたはすべてのドメイン１ｂが欠失され得、そして残りの部分が、リンカーによってか、またはペプチド結合によって直接的に連結され得る。ドメインＩＩのいくつかのアミノ酸部分は、欠失され得る。そして、Ｃ末端は、残基６０９〜６１３のネイティブな配列（ＲＥＤＬＫ（配列番号８））を含み得るか、または構築物を細胞質ゾル内にトランスロケーションする能力を維持することが見出されているバリエーション（例えば、ＲＥＤＬ（配列番号７）またはＫＤＥＬ（配列番号６））、およびこれらの配列の反復を含み得る。例えば、米国特許第５，８５４，０４４号；同第５，８２１，２３８号；および同第５，６０２，０９５号、ならびにＷＯ９９／５１６４３を参照のこと。好ましい実施形態では、ＰＥは、ＰＥ４Ｅ、ＰＥ４０、またはＰＥ３８であるが、非標的細胞への顕著な毒性が生じないレベルまで、非特異的細胞傷害性が除去または減少されている任意の形態のＰＥが、標的化細胞においてトランスロケーションし得、そしてＥＦ−２をリボシル化し得るままである限り、本発明のイムノトキシンに使用され得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
【化１】
2003502030.tif 000001
（配列番号９）ライブラリーＬｉｂ  ８９／９３／９４を作製するために使用した。このオリゴは、ＶＬのコドン８９、９３および９４を、全てが２０個のアミノ酸が異なるＳＳ（ｓｃＦｖ）中の無作為化する。以下に記載される他の全てのライブラリーと同様に、このオリゴは、終止コドンを位置９４においてチロシンのオリゴと置換され、オケアー（ｏｃｈｅｒ）コドンおよびオパールコドンを作製しない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
【化２】
2003502030.tif 000002
（配列番号１０）（これは、残基９２−９４を無作為化する）を用いて作製した。残基９２−９４は、並んで配置される２つの異なるホットスポットによってコードされる。第３および第４のライブラリーをコントロールとして作製した。第３のライブラリーのＬｉｂ  ８９−９１は、オリゴＳＳ  ＶＬ  Ｍｕｔ  ８９−９１
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
【化３】
2003502030.tif 000003
（配列番号１１）（これは、残基８９−９１を無作為化する）を用いて作製した。残基９０は、ホットスポット中で保存された残基である。残基９１は、ホットスポットの外側にあたる。第４のライブラリーであるＬｉｂ  ９５−９７は、オリゴＳＳ  ＶＬ  Ｍｕｔ  ９５−９７
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
【化４】
2003502030.tif 000004
（配列番号１２）を用いて作製した。これは、残基９５−９７（これらの全ては、ホットスポットの外側にあたる）を無作為化する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
本明細書中に言及される全ての刊行物および特許は、本明細書中において、あたかも各個々の刊行物および特許が詳細かつ個々に本明細書中において参考として援用されて示されるのと同じ程度に、本明細書中へ参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、そのヌクレオチド配列から推定されるようなＳＳ  ｓｃＦｖ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖにおいて、ＶHは、リンカーペプチド（ＧＶＧＧＳＧ4ＳＧ4Ｓ）（配列番号２）によりＶLに結合される。フレームワーク領域、ＣＤＲおよびリンカーに印を付けている。Ｈは、重鎖を示し；Ｌは、軽鎖を示し；ＦＲは、フレームワーク領域を示し；ＣＤＲは、相補性決定領域を示す。
【図２】
４つのライブラリーの各々をパニングした後選択されるファージクローンのＥＬＩＳＡにより評価されるようなメソセリン結合。図２Ａ：この図は、別々の列において、ＳＳ  ｓｃＦｖの可変軽鎖のＣＤＲ３の、アミノ酸の番号付け、ヌクレオチド配列、およびアミノ酸配列を示す。一番上の列：親ｓｃＦｖ  ＳＳの可変軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸残基の番号。中央の列：ｓｃＦｖ  ＳＳ  ＣＤＲ３のＣＤＲ３におけるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）。長方形は、テトラヌクレオチドホットスポットモチーフを示し：長円形は、この配列中のセリンホットスポットモチーフを示す。一番下の列：１文字コードにおける、ｓｃＦｖ  ＳＳのＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号４）。
図２Ｂから２Ｅは、個々のライブラリー由来のクローンのＥＬＩＳＡの結果を示すパネルである。パネルにおける各文字記号は、単一クローンからのファージ粒子のＥＬＩＳＡシグナルを示す。各パネルにおいて塗りつぶされた四角（矢印により示される）は、内部標準の親ＳＳ（ｓｃＦｖ）ファージを示す。ライブラリーを、各パネルの１番上に示される。図２Ｂ：残基８９、９３、および９４で変異されたクローンのライブラリーからのＥＬＩＳＡの結果。図２Ｃ：残基８９、９０、および９１で変異されたクローンのライブラリーからのＥＬＩＳＡの結果。図２Ｄ：残基９２、９３、および９４で変異されたクローンのライブラリーからのＥＬＩＳＡの結果。図２Ｅ：残基９５、９６、および９７で変異されたクローンのライブラリーからのＥＬＩＳＡの結果。
【図３】
異なるライブラリーのパニングの後に得られたいくつかのＥＬＩＳＡ陽性のファージクローンのアミノ酸配列。クローン間で異なる領域の配列のみを示す。アステリスク（*）は、異なるヌクレオチド配列であるが、同じアミノ酸配列を有するいくつかのクローンが見出されたことを示す。ＶＬ  ＣＤＲ３ヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）が示される。
【図４】
固定化されたメソセリンへの野生型および変異されたｓｃＦｖイムノトキシンの結合について得られたＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラム（ＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）の比較。左から右へ、イムノトキシンの標的化部分は：親ＳＳ、ならびに変異された改変体ＳＳ１、Ｄ８、Ｃ１０およびＥ４である。Ｋoff、ＫonおよびＫDについての値を、図の下に表にする。「ＲＵ」は、「共鳴単位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）」を表す。Ｘ軸は、秒で時間を表す。