(57)【要約】【課題】ＴＳＥ病関連の病原性プリオンタンパク質を単離し、濃縮し、モニターするための非侵襲的方法を提供する。【解決手段】いくつかの特定ペプチドにより、プリオン病に感染した動物およびヒトの脳ホモジネートからＰｒＰScを捕捉する。これらの８つのペプチドはプリオン病に罹っていない個体からの細胞プリオンタンパク質は捕捉しない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（配列ＩＤ番号１）ＷＱＰＰＲＡＲＩ；（配列ＩＤ番号２）ＮＷＣＫＲＧＲＫＱＣＫＴＨ；（配列ＩＤ番号３）ＮＹＫＫＰＫＬ；（配列ＩＤ番号５）ＹＲＧＹＲＧＹＲＧＹＲＧ；（配列ＩＤ番号６）ＹＲＧＲＹＧＹＫＧＫＹＧＹＲＧ；（配列ＩＤ番号７）ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＩＹＶ；（配列ＩＤ番号８）ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ；および（配列ＩＤ番号９）ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲ
からなる群から選ばれたペプチドを含むＰｒＰScを検出するための試薬。
【請求項２】
ＰｒＰScの検出方法であって、
最初に、サンプルを請求項１に記載のペプチドと接触させ、
ついで、ＰｒＰScを検出する、
ことを含む検出方法。
【請求項３】
ＰｒＰScを検出するための免疫学的検定法であって、
請求項１に記載のペプチドを結合させた固体担体を供給し、
当該固体担体をサンプルと接触させ、
当該担体を洗浄して結合していないサンプルを除去し、
当該固体担体をプリオンに対し特異性を有する抗体に接触させ、
ＰｒＰScが当該固体担体に結合しているかどうかを決定する検出ステップを実行する
ことを含む免疫学的検定法。
【請求項４】
ＰｒＰScの検出のためのキットであって、
請求項１に記載のペプチドを結合させた固体担体と、
ラベル付けされた、プリオンに対し特異性を有する抗体と
を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔背景〕
プリオン病または伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、これらが感染物質の性質についての従来の考えに異議を唱えるものであるのみならず、食物と血液の安全性に対しもたらす潜在的に重大な公衆衛生上の脅威ともなることから、科学界の関心をとらえてきた。さらに、近年、新しい変異型疾病であるｖＣＪＤの流行により、動物とヒトとの間における病気感染の可能性が劇的に強調されるようになってきた。本発明は、動物およびヒトにおける伝達性海綿状脳症｛Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ（ＴＳＥ）｝疾患の診断に対する合成ペプチドの使用に関するものである。
【０００２】
〔プリオン−ＴＳＥを生じさせる病原体〕
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）には、ヒトと動物との両方に感染する、一群の、急速に進行する、致命的な神経変性疾患が含まれる。ＴＳＥは、壊滅的な痴呆、筋間代性痙攣を伴う錐体路徴候および錐体外路系徴候、多病巣性の海綿状変化、アストログリオーシス、アミロイドプラーク、ニューロンの消失および炎症反応の不在等の臨床的および神経病理学的特徴を有し、通常、長い潜伏期間によって特徴づけられる。
【０００３】
ＴＳＥ疾患が、「スローウイルス」またはウイロイドに起因するかもしれないと示唆されたこともあった（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，１９７７年）。しかしながら、放射線、ヌクレアーゼおよび遺伝物質を傷つけるその他の試薬に対するスクレーピーの伝染力の極端に大きい抵抗力は、「ウイルス」説とは矛盾するものである。ＴＳＥ感染因子のこれら全ての「異常な」特徴に対し、１９８２年に、スタンリー・プルジナー（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｐｒｕｓｉｎｅｒ）博士が「プリオン」の概念を提唱した（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，１９８２年）。（核酸を含まない感染性タンパク質粒子を意味する）プリオン（ＰｒＰ）は、ヒトと動物とに存在する糖タンパク質である。このタンパク質の細胞型（ＰｒＰC）は、二つのＮ−結合糖鎖形成サイトとＣ末端のＧＰＩアンカーとを有する。これはニューロンで見つかるのが最も普通であり、その他の細胞（たとえば白血球、単核細胞および血小板）でも見つかっていたがその頻度はずっと小さかった（Ｈｏｌａｄａ，２０００年）。プリオンタンパク質の感染性スクレーピー疾患型（ＰｒＰSc）は、その細胞前駆体のプロテアーゼ抵抗性のイソ型であり、主に脳で見つかる。これは、ｖＣＪＤペイシェントの扁桃、脾臓およびリンパ節でもずっと低レベルで見つけだされている（Ｐａｒｉｚｅｋ，２００１年）。「プリオン」が、スクレーピー疾患の原因となる病原体であるというプルジナーの概念の結果およびその拡張により、全てのＴＳＥ疾患の病原体について、このタンパク質に関連すると思われる一群の病状を説明するために、一般的にプリオン病と呼ばれる概念が使用されるようになった。
【０００４】
ヒトのプリオン病は、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）として知られており、通常高齢者が罹患する。疾病の表現型に依存して、大部分のＣＪＤは、散発性（ｓＣＪＤ）であり、約１０％が家族性のＣＪＤ（ｆＣＪＤ）である。ごく最近になって、若年の成人で起こる新しい変異型のＣＪＤ（ｖＣＪＤ）が現れた。１９９５年以降、１００を超える症例が報告されている。プリオン病は、家畜および野生動物の多くの種が罹患する。このことは、たとえば、ヒツジとヤギのスクレーピー（ＭｃＧｏｗａｎ，１９２２年）、シカ類の慢性消耗性疾患（ＣＷＤ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９８０年）およびウシの牛海綿状脳症（ＢＳＥまたは「狂牛」病，Ｗｅｌｌｓ，１９８７年）といったユニークな名称がしばしば与えられていることに現れている。
【０００５】
〔ＰｒＰCとＰｒＰScの特徴〕
プルジナーの「タンパク質のみ」仮説によると、プリオン病を引き起こす感染性の病原体はタンパク質である。プリオンの主要成分は、ＰｒＰSc（疾病に特有の「スクレーピー」イソ型）と呼ばれる折返しの異常なＰｒＰであるようである。ＰｒＰScは、その正常な対応物（ＰｒＰC）から、立体構造の変化により発生するものと考えられている（Ｃｏｈｅｎ，１９９８年）。この変換のメカニズムに関して曖昧さがまだ残っているが、ＰｒＰScの存在下、基質として働く正常なＰｒＰCが、立体構造の変化を受け、自己触媒的プロセスによりＰｒＰScになり、その結果、ＰｒＰSc凝集体とアミロイドロッドとを形成し、これにより細胞死を引き起こすことが広く受け入れられている（Ｈｏｐｅ，１９８６年、Ｈｏｒｗｉｃｈ，１９９７年）。ＰｒＰCからＰｒＰScへの構造変化は、タンパク質のβ−シート構造の量の著しい増大と、おそらく、円二色法と赤外分光法によって示されるα−らせん量の僅かな減少が関与する、決定的な立体構造変化によって裏付けられることがほとんどである。（Ｐａｎ，１９９３年，Ｃａｕｇｈｅｙ，１９９１年）。ＰｒＰCからＰｒＰScへの変換の効率は、２つのＰｒＰ配座異性体間における配列相同性の程度に依存するようである。このユニークなメカニズムのため、プリオン病は、同一の種の間で容易に伝達でき、ＰｒＰの配列相同性が十分である場合には、種から種に伝達することができる（Ｒａｙｍｏｎｄ，２０００年）。したがって、提唱されたプリオン病の伝達機構が正しければ、動物とヒトとの間におけるこれらの脳障害の伝達によって、伝染病が引き起こされる可能性がある。
【０００６】
プロテアーゼ抵抗性は、ＰｒＰScとＰｒＰCとを区別するもう一つの特徴である。培養細胞と脳とにおいて、または、多くのＧＳＳペイシェントからのサンプルにおいて、ＰｒＰScはその細胞前駆体であるＰｒＰCより小さい。細胞プリオンとスクレーピープリオンとは、同じＰＲＮＰゲノム生成物の２つのイソ型であるが、ＰｒＰScがプロテイナーゼＫ処理で限定的に消化されるだけであるのに対し、ＰｒＰCは完全に分解される。この消化により、Ｎ末端が取り除かれた、ＰｒＰ２７−３０と称されるタンパク質の一種が得られる。ＰｒＰ２７−３０は、ＰｒＰCを宿主とするＰｒＰSc複製のために必要なＰｒＰScのコアであると仮定されてきた。プロテアーゼで処理されたプリオン分子、ＰｒＰ２７−３０すなわちＰｒＰresは、スクレーピーの伝染力と密接に関連しており（Ｇａｂｉｚｏｎ，１９８８年）、ＰｒＰScが伝染性のタンパク質であることの更なる証拠ともなっている。
【０００７】
おそらくβ−シート構造の著しい増加と、同時に生じるプロテアーゼ抵抗性に関連するさらなる特性は、ＰｒＰScとＰｒＰCとの間に観察される溶解度の相違である。ＰｒＰCは可溶タンパク質であるが、ＰｒＰScイソ型は高度に難溶性である。さらに、ＰｒＰCが、膜組織に固定されたＧＰＩのテールを介してニューロンの表面に付着する形態で見出される（Ｓｈｙｎｇ，１９９４年）のに対し、ＰｒＰresは、罹患細胞の細胞質中に見出され（Ｔａｒａｂｏｕｌｏｓ，１９９０年）、後期エンドソームおよびリソソーム区画に最も関連するようであり（Ａｒｎｏｌｄ，１９９５年）、ＰｒＰScは、感染した脳からの濃縮分中の非晶質の凝集物からも見つかっている（Ｍｅｙｅｒ，１９８６年）。
【０００８】
スクレーピーの伝染力とＰｒＰ２７−３０の間の密接な関連を示す証拠は増えつつある。もっとも純粋なサンプルにおいてさえ、ＰｒＰ分子と感染単位との推定比率は、〜１０4から１０5である（Ｈｏｒｗｉｃｈ，１９９７年、Ｂｏｌｔｏｎ，２００１年）。このような低い伝染力レベルでは、伝染に、他の構成要素、共因子または共有結合修飾が必要であることもあり得る。キメラのヒト−マウスＰｒＰCを発現するマウスの感染性についての遺伝子組換え研究では、ＰｒＰC以外の少なくとも１つの宿主因子（暫定的に第Ｘ因子と呼ばれており、ＰｒＰScの形成に分子シャペロンとして機能するかもしれない）の存在が示唆されている。（Ｔｅｌｌｉｎｇ，１９９５年）。
【０００９】
〔プリオン病の伝染力と伝達率〕
プリオン病は感染性を有する。動物のプリオン病の伝達率は、ヒツジからヒツジへのスクレーピー（Ｃｕｉｌｌｅ，１９３６年）およびヤギへの種を超えたスクレーピー（Ｐａｔｔｉｓｏｎ，１９５７年）ならびにヒトからチンパンジーへのクルおよびＣＪＤ（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，１９６６年、Ｇｉｂｂｓ，１９６８年）等の、感染した動物から健康な動物への脳ホモジネートの接種によって実験的に確立されてから久しい。スクレーピーのマウスへの感染の成功は、重要なブレークスルーであった（Ｃｈａｎｄｌｅｒ，１９６１年）。これにより、実験モデルが提供され、ＴＳＥ研究が大いに促進された。ウシにおける最近のＢＳＥおよびヒトの新しい変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）の原因は、ＢＳＥの場合には、動物への飼料として与えられたスクレーピーヒツジの死体の混合物を食べた結果であり（Ｂｒｏｗｎ，１９９７年）、ｖＣＪＤの場合は、ＢＳＥに感染したウシからの牛肉を食べた結果である（Ｂｒｕｃｅ，１９９７年）と考えられた。ｖＣＪＤとＢＳＥとの間の関係は、ＢＳＥ順応性を有するマカク（ヒトに最も近いモデル）およびＢＳＥおよびｖＣＪＤを引き起こす物質を接種した同系交配のマウスの研究から得られた神経病理的証拠によりさらに支持されている（Ｌａｓｍｅｚａｓ，１９９６年）。北米におけるミュールジカおよびヘラジカへのＣＷＤの流行への具体的懸念としては、ＣＷＤが、ＢＳＥのように、狩猟を通してこの病気に曝露されまたは、感染した肉を取り扱ったり食べたりする可能性のあるヒトに感染され得るかどうかということである。これまで、人食いの風習による死者の脳組織の摂取によるクルの流行ならびに、ホルモン、組織移植および汚染された医療器具の使用によるＣＪＤの医原性の感染等の、ヒトにおける悲劇的な偶然によるプリオン病の感染が報告されてきている。
【００１０】
ＣＪＤ病が、種間のバリアがあるのかも知れない動物のＴＳＥと関連があることを示す確かな証拠はない。クルの流行は、ヒトの後天性プリオン病の最も大きな証拠を提供した。これまでヒト同士の間の感染による犠牲者としてのｖＣＪＤ患者の報告はないが、ＢＳＥとｖＣＪＤとの間の密接な関連はかなりの注意を惹いてきた。ヒトの感染についての心配は、ＰｒＰScがＢＳＥとｖＣＪＤのリンパ細網組織中で簡単に検出可能であるが、古典的なＣＪＤではそうではない（Ｈｉｌｌ，１９９７年）という観察と、ヒツジからウシへ継代したスクレーピーの病原体が宿主の範囲を変え、ヒトにより適応できるようになるかも知れないという推定とに基づいている。そのような挙動の実験的先例は周知である：スクレーピーのマウスに適応した株がハムスターを通過する継代により、マウスへの逆継代での伝達率が変化した（Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎ，１９８７年、Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎ，１９８９年）；ヒトのクルまたはＣＪＤの株は、霊長類または猫を介する継代まで、フェレットやヤギに感染しなかった（Ｇｉｂｂｓ，１９７９年）；また、ＢＳＥのウシ株は、マウスを介する継代までハムスターに感染しなかった（Ｆｏｓｔｅｒ，１９９４年）。あるいは、ＢＳＥがウシにおける自発的突然変異に起因したものである場合、この伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）の新しい株への種の感染性の実験的研究は、ヒトが感染されやすくないと予測する程には十分に進まなかった。
【００１１】
ヒトのＣＪＤ病とｖＣＪＤ病とに関する研究から、ゲノム感染性が、ヒトにおけるＴＳＥの広がりに影響する可能性のあるもう一つの要因であるかもしれないことが示された。散発性のＣＪＤ患者の大多数が、コドン１２９におけるＭｅｔ／ＭｅｔまたはＶａｌ／Ｖａｌに対し同型接合的である（Ｂｅｌａｙ，１９９９年）ことが見出された。しかしながら、既報告のｖＣＪＤの症例は、全て、Ｍｅｔ／Ｍｅｔに対し同型接合的であった。
【００１２】
ｖＣＪＤの流行の規模と期間はまだ明らかでない。なされた推定と採用されたモデル計算とに従って、種々異なる予測が提案された。ｖＣＪＤ全体についての１つの評価によれば、僅か２０５の症例が予測された（Ｖａｌｌｅｒｏｎ，２００１年）。他方、もう一つの予測によれば、もし感染がＢＳＥだけから来るものであるならば、次の８０年間におけるｖＣＪＤ死亡率は５０から５０，０００まで変動する。ＢＳＥがヒツジに感染するものであり、ついで、ヒトの食物連鎖に入り得るものであるならば、その数は１５０，０００にも達し得る（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，２００２年）。必要なパラメータが誤っているか入手不能である場合には、正確な予測をすることは不可能であるが、血液にｖＣＪＤの伝染力があるとすると、どのような予測も控えめなものになるという一事のみは確実である。さらに、ｖＣＪＤが新しい疾病であることが証明されたのは、単にヒトにおけるＣＪＤの調査が増加した結果ではない（Ｈｉｌｌｉｅｒ，２００２年）。
【００１３】
ＢＳＥ発生の広がりを除くために、政府による対抗策がとられた。米国および英国で反芻動物タンパク質の飼料が禁止された（１９８８年）。感染した恐れのある肉がヒトの食物連鎖に入るのを防止するために、一連の対策も講じられた。ヒトへの危険をさらに減らすために、ＦＤＡとＣＢＥＲは、２００１年８月に、１９８０〜１９９６年の間に累計６ヵ月以上英国に滞在したドナーを無期限に保留する新しい方針を打ち出した（ＦＤＡ，２００１年）。
【００１４】
〔プリオン病の診断検査法〕
プリオン検出の感度と信頼性の高い検査法の発展は、疾病の調査、リスクアセスメントならびに、将来の治療法と組み合わされた時には疾病の防止およびに根絶の絶対的必須条件である。現在、プリオン病の診断には、３つの基本的な評価フォーマットがある。（１）動物の伝染力のバイオアッセイ：これは、齧歯類の実験的なスクレーピーにおける、伝染性プリオンの測定に関する最も感度の高い方法であり、通常、患畜の脳ホモジネートのレシピアント動物への脳内注射によって達成される。しかしながら、種々異なる動物種におけるプリオン病の伝染力の定量的測定には、「種バリア」による限界があり、病理学、潜伏期間および、ＰｒＰScの分子的特徴が異なる、はっきりと区別できるプリオン「株」が存在する。したがって、この時間のかかる高価な死後診断法は、大部分は、齧歯類で種々異なるプリオン株を識別するための研究道具として使われており、伝染性の脳物質の較正のための参照としての役割を果たしている。（２）現在のＰｒＰ免疫学的検定法：これらは、全てのプリオン病中唯一知られた品質保証付き分子であるプロテアーゼ耐性ＰｒＰScの検出に基づく方法である。免疫化学的方法（免疫組織化学およびウェスタンブロッティング法）によるＰｒＰScの検出は、長年、動物およびヒトにおけるプリオン病の最も正確な診断を提供してきた（Ｓｃｈａｌｌｅｒ，１９９９年、Ｂｉｆｆｉｇｅｒ，２００２年）。これらは、死後診断のために広く使用されている。この目的のために、ＰｒＰの種々の領域に対して、米国特許第４８０６６２７号明細書および欧州特許第０８６１９００号明細書に記載され、広く使用されている３Ｆ４、６Ｈ４等多くのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が育てられてきた。しかしながら、ＰｒＰC（しばしば、ずっと大量に存在する）とＰｒＰScとを区別することができるとされる方法は非常に少なかった。１９９７年にコース（Ｋｏｒｔｈ）によって、そして、２００３年にパラミチオチス（Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓ）によって報告されたモノクローナル抗体は、両方共ＩｇＭであり、これらの抗体による診断評価法は開発されなかった。この結果、現在の免疫化学的方法は、ほとんどすべて、ＰｒＰScの検出の前に、通常、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化等の非特異性のプロテオリシスによって、ＰｒＰCを減少させるか除去するステップが必要である。このような前処理によって、ＰｒＰScの最初の６０〜７０残基から、ＰｒＰresと呼ばれる、ＰＫ耐性を有するＰｒＰ２７ｋＤａ−３０ｋＤａのコアが生じる。ついで、Ｎ−末端を切断したＰｒＰScすなわちＰｒＰres（病理学的サンプルだけに存在する）を検出するのに、このタンパク質の残りのＣ末端領域を認識する抗ＰｒＰ抗体を使用することができる。組織切片には、免疫組織化学的染色のために、通常、ＰｒＰC関連のバックグラウンドを減少するための酸加水分解による前処理も行われる。それゆえ、ＰｒＰresは、これらの免疫学的検定の前駆体ＰｒＰScの代用品である。種々の免疫学的検定フォーマットの間で、ウェスタンブロッティングは、ジ−、モノ−および非グリコシル化ＰｒＰバンドのマイグレーションに基づくＰｒＰの詳細な分子パターンを明らかにするという長所がある。この方法は、��トおよび動物のプリオン病における異なった脳ＰｒＰresのサブタイプを識別するためにも、広く使われてきた。現在では、より高いサンプル処理能力、より高い感度およびよりよい品質のために、ウエスタンブロット法以外の他の評価フォーマット｛従来のＥＬＩＳＡ、解離促進ランタニド−蛍光免疫検定法（ＤＥＬＦＩＡ，Ｂａｒｎａｒｄ，２０００年および米国特許公開第２００２０１３７１１４Ａ１号明細書に記載された方法）および、ＥＬＩＳＡと蛍光検出法と組み合わせた立体構造に依存する免疫学的検定法（ＣＤＩ）（Ｓａｆａｒ，１９９８年、米国特許公開第２００１０００１０６１Ａ１号明細書、米国特許公開第２００２０００１８１７Ａ１号明細書）等｝が開発されてきた。しかしながら、フォーマットに関係なく、ＰｒＰScは、必須の処理であるＰＫ消化後にのみＰｒＰCと選別し得るが、これでは、異種の生体サンプルについて最適化を図るのは困難であろうと思われる。（３）ヒツジのスクレーピーの臨床前診断のための第三眼瞼リンパ系組織の免疫組織化学処理を含むサンプル処理（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，２０００年、米国特許第６１６５７８４号明細書、米国特許第６２６１７９０号明細書）、脳および他の末しょう組織ホモジネートからのＰｒＰScを濃縮するタングストリン酸ナトリウムによる化学的処理（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，２００１年）および、患畜および患者の尿中のプリオンタンパク質の新しいイソ型の検出（Ｓｈａｋｅｄ，２００１ｂ年、国際公開第０２３３４２０Ａ２号パンフレット）のためのその他の方法も報告されている。キャピラリー電気泳動法およびフーリエ変換赤外分光法等の他の検出システムも報告されている。これらの方法は、まだその開発の初期段階にあり、技術的に複雑である。細胞プリオンを除去し、ついで、無差別に抗プリオン抗体認識を行うことによる、病原性プリオンの従来の識別法に加えて、ＰｒＰScをＰｒＰCから区別できる、プラスミノーゲンおよびフィブリノーゲン等の他の試薬が見出された。得られた証拠から、プリオン一次配列または個々のＰｒＰSc分子の特定の三次構造よりは、むしろ、種々の種のＰｒＰScに共通する性質が、プラスミノーゲンとの結合の原因であり得ることが示唆された（Ｆｉｓｃｈｅｒ，２０００年、Ｍａｉｓｓｅｎ，２００１年）。病原性プリオンタンパク質の捕捉と検出のためのプラスミノーゲンおよびその他の血清／血漿タンパクの使用への応用は、国際公開第０２００７１３号パンフレット特許および米国特許公開第２００１００５３５３３Ａ１号明細書に記載されている（Ａｇｕｚｚｉ，２００１年）。
【００１５】
現在製造されているプリオン診断評価装置は、すべて、サンプル源として脳組織を使用している。１９９９年の欧州委員会は、異なるメーカーからの４つのＢＳＥテストキットを評価した（Ｍｏｙｎａｇｈ，１９９９年）。それらの全てが別個のサンプル調製手順を必要としていた。キットの指示書に依存して、変性、ＰＫ消化またはＰｒＰSc濃縮等の脳組織ホモジネートの処理が必要であった。ＤＥＬＦＡ、免疫ブロットまたはプレートＥＬＩＳＡフォーマットで使用される評価検出システムでは、化学発光基質または比色基質が使用されていた。
【００１６】
〔プリオン病の生前診断への挑戦〕
ＰｒＰScベースの生前評価に共通の課題は、ＰｒＰScが末しょう組織または体液中に存在するかということである。技術的な困難性のため、ＰｒＰScの存在または、体液中におけるそれに関連した伝染については、実験データがほとんどなく、この課題には議論の余地がある。スクレーピーのハムスターモデルでは、血液中に低レベルの伝染力を検出し得る。罹患したハムスターの血液に由来するリンパ球リッチな軟膜における伝染力は、血漿に由来するものよりも大きいが、全血液接種物と比べると、相対的に小さな割合を占めるだけである。血液中に存在しているこの感染因子の分子的定義は明白でない。散発性のＣＪＤペイシェントにおけるリスク因子と可能な感染源とを調査した結果、病気と、食物、輸血または他の血液産物の受容との間に有意の相関性は見出されなかった。初期のレポートでは、マウスへの脳内接種の後に、ＣＪＤペイシェントから得た血液における伝染力の存在の可能性が示されたが（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ，１９８５年、Ｔａｔｅｉｓｈｉ，１９８５年）、古典的なヒトのプリオン病では、ｖＣＪＤの場合を除いて、最も高い伝染力の量すなわちＰｒＰres量は、常に中枢神経系（ＣＮＳ）で見つかっており、末しょう組織での発見には一貫性がない。ｖＣＪＤペイシェントの、扁桃、脾臓およびリンパ節等の周辺リンパ細網組織で容易に検出できるＰｒＰScの存在により、リンパ細網組織に大量に存在するＰｒＰresが、循環系と相互作用し、その結果、ごく僅かのＰｒＰScがｖＣＪＤペイシェントの血液中に存在し、血液感染を引き起こすかも知れないと言う深刻な不安が生じた。血液中における他のＴＳＥの伝染力は、種々の実験動物でも証明されてきている。伝染力研究のための血液の大部分は、ＴＳＥに順応した齧歯類（たとえばマウスおよびハムスター）から得られていた。マウスに順応したＢＳＥ、マウスに順応したｖＣＪＤが、脳内感染および静脈内感染を通して確立されてきた。唯一の例外モデルはヒツジで行われた研究であった。この実験では、ＢＳＥ脳溶解物を接種した他のヒツジから取った全血液を輸血されたヒツジが、ＢＳＥの徴候を現した（Ｈｏｕｓｔｏｎ，２０００年、Ｈｕｎｔｅｒ，２００２年）。しかしながら、これらの実験結果は、まだ十分検討される必要がある。そのような血液中の感染因子の検出が、ＰｒＰScとＴＳＥ疾患との関係をよりよく理解することの助けになることが期待されている。
【００１７】
ＰｒＰCバックグラウンドを除去するためのサンプル処理の厳しさは、タンパク含有量の相違、この評価法を多数のサンプルに適用することの困難性または、プロテアーゼに敏感なＰｒＰSc折り畳み中間体または、わずかな量の本物のＰｒＰScについてさえ除去が不可避であることによる検出感度の低下のため、その他の末しょう組織試料や体液のためには適切でない場合があることは注意する必要がある。このことは、低レベルのＰｒＰScのみが存在し得る、末しょう組織および体液を使用する評価に特に該当する（堀内，１９９９年、Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９９年、Ｓｗｉｅｔｎｉｃｋｉ，２０００年）。これらの懸念のため、ＰｒＰScに高い親和性を示し、タンパク分解処理の不要な特定の検出を可能とする免疫学的な試薬の開発が必要とされている。
【００１８】
〔ＰｒＰSc検出のための新規な捕捉試薬の発見〕
「タンパク質のみ」または「プリオンのみ」説を受け入れるか受け入れないかに拘わらず、プリオン病の病因に貢献するかもしれないプリオン以外の剤または分子を探索するために継続的な努力が払われている。この探索は、答えを得ていない多くの疑問が推進力になっている。たとえば、合成された、いかなる汚染もないプリオンタンパク質は病気を引き起こさない。正常なＰｒＰCの病原性ＰｒＰScイソ型への変換を誘発するメカニズムは知られていない。もう一つの未解決の疑問は、動物とヒトとで観察される（病気の潜伏期間、糖鎖形成レベルおよび障害パターンによって定義される）種々のプリオン病の表現型に関連する。単一のＰＲＮＰ遺伝子型について同系交配のマウスの同型接合体の連続継代の後、全てのスクレーピー株が、その元の疾病プロフィールを保持していた。これらの観察により、研究者は、種々の表現型の株が同一の細胞プリオン前駆体の異なる立体構造のイソ型によって支配されたものであるのか、あるいは、遺伝し得る株の表現型を決定するもう一つの要因があるのかどうかについて疑問を持つようになった。実際、無細胞反応で造られた試験管内の変換モデルＰｒＰresは、動物中で新しいＴＳＥ伝染力を構成する様子を見せなかった（Ｃａｕｇｈｅｙ，２００３年）。これらの疑問のため、Ｐｒｕｓｉｎｅｒが提案した「Ｘタンパク質」と呼ばれる未知の要素があると多くの人々が考えるようになってきているが、いまだ発見には至っていない。
【００１９】
ＰＲＮＰ遺伝子について、動物の同型接合体における、異なった表現型を持つスクレーピー因子の異なる株の伝播を説明するために、プリオン粒子における強く結合したＲＮＡまたはＤＮＡ分子の存在が提案された（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，１９９１年）。リターンリフォーカシングゲル電気泳動法による高度に精製されたスクレーピープリオンの分析により、残留する核酸のサイズが小さいことが判明した（Ｋｅｌｌｉｎｇｓ，１９９２年）。しかしながら、最近のレポートで、Ｎａｒａｎｇが、スクレーピー−ハムスターの脳から精製したｓｓＤＮＡと非病原性プリオンとを混ぜ合わせたものを接種した動物が臨床的病状を示したと報告している（Ｎａｒａｎｇ，２００２年）。この発見に基づいて、彼は、ｓｓＤＮＡによってコードされた「アクセサリータンパク質」が、ＰｒＰCからＰｒＰScへの変換に関与しているかもしれないという仮説を立てている。これらの試験管内の立体構造と変換の研究に基づいて、ＤＮＡが、ＰｒＰSc立体構造の保護者としての働きと共に、ＰｒＰSc変換および凝集を促進する促進剤としても働くという仮説が提案された（Ｃｏｒｄｅｉｒｏ，２００１）。ごく最近では、試験管内でのＰｒＰCからＰｒＰresへの化学量論的変化には、特定のＲＮＡ分子を必要とするという報告がなされている（Ｄｅｌｅａｕｌｔ，２００３年）。ＰｒＰScを区別して捕捉できるがＰｒＰCは捕捉しない、Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社によって開発された抗核酸モノクローナル抗体（米国特許第６０／４３４，６２７号明細書、米国特許第６０／４４６，２１７号明細書）は、ＰｒＰScの核酸に対する関連性を示すもう一つの証拠である。
【００２０】
罹患した脳から分離されたＰｒＰScが、種々のグリカンとも関係していることが知られている。これらには、プリオンロッド中における１，４−結合のグルコース単位、スフィンゴ脂質、多糖類およびＰｒＰSc凝集体中のその他の膜組織構成成分（Ａｐｐｅｌ，１９９９年、Ｋｌｅｉｎ，１９９８年）ならびにプリオンアミロイドプラーク中の硫酸化プロテオグリカン（Ｓｎｏｗ，１９９０年）が含まれ、硫酸ヘパラン抗体（抗ＨＳ）および硫酸ヘパランプロテオグリカン抗体（抗ＨＳＰＧ）による結合が生じるという、免疫組織化学で開発されてきた特性が異常ＰｒＰに関連することが、感染後７０日という初期および疾病の間中ずっと示された（ＭｃＢｒｉｄｅ，１９９８年）。グリカンはまた、恐らく、ＰｒＰCからＰｒＰScへの変換に核酸が参与する場合とは異なるメカニズムを通して、細胞プリオンタンパク質をβ−シート立体構造に変える。ＰｒＰCからＰｒＰScへの生体外変換および、プリオン伝染力再構成実験において、硫酸化グリカンが、変換を促進するか、伝染力をエスカレートさせることが示された（Ｗｏｎｇ，２００１年、Ｓｈａｋｅｄ，２００１ａ年、Ｄｉａｚ−Ｎｉｄｏ，２００２年）。ワーナーは、最近、組換え型ＧＳＴ：：完全な長さのプリオンおよびＧＳＴ：：プリオン断片を用いて、組み換え型プリオンがヘパリンおよび硫酸ヘパランに直接結合することを証明した（Ｗａｒｎｅｒ，２００２年）。プリオン配列のペプチド領域２３〜５２が、全てのＨＳおよびＨＳＰＧ結合テストで陽性であった。ペプチドがヘパリンとの結合で完全な長さのプリオンと競合できなかったので、無傷のＰｒＰCにもう一つの主要なＧＡＧ結合サイトがあるかもしれないと著者は示唆している。もう一つの興味ある観察としては、プラスミノーゲンが、脳由来のＰｒＰScとは結合するが、ＰｒＰCとは結合しないという事実が報告されている。プラスミノーゲンがＰｒＰScと直接的相互作用を有することは証明されていないが、ヘパリンに対し親和性を有することが知られている領域である、プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ領域中に結合部があるのではないかと提案されている。もう一つの注目すべき観察は、種々異なる種（ウシおよびブタ）または、種々異なる器官（肺、腎臓および腸）からのＧＡＧが、プリオン結合に対し種々異なる親和性を示したという事実である。この親和性の相違は、プリオン配列自体に起因するものかもしれない。また、テストされたＧＡＧ中の特定の糖単位の存在に依存するものであるのかもしれない。
【００２１】
これらの観察に鑑み、ユニークなＰｒＰSc立体構造またはＰｒＰSc関連分子へのペプチドの親和性によって、ＰｒＰScを選択的に捕捉するがＰｒＰCは捕捉しないように設計された、いくつかのペプチドが提案された。これらは、プロテアーゼ前処理のない免疫沈降法によって、罹患した脳のホモジネートからＰｒＰScを識別し捕捉する能力によってスクリーニングされたものである。
【００２２】
〔（１）ヘパリン／硫酸ヘパリン結合領域ペプチド〕
ヘパリンや硫酸ヘパリン等のグリカン（ＧＡＧ）は、ＰｒＰScアミロイド凝集体と関連していた。この関連性に対する親和性は、ＧＡＧ：：ＰｒＰCよりＧＡＧ：：ＰｒＰScでずっと高いので、グリカン結合領域として特徴づけられるペプチドを使用して、選択的にＰｒＰScを捕捉しＰｒＰCを捕捉しないようにすることが可能である。この理由から、ヘパリンまたは硫酸ヘパリン結合領域と呼ばれるペプチド：（１）カルボキシ末端フィブロネクチンのＷＱＰＰＲＡＲＩ（Ｗｏｏｄｓ，１９９３年、Ｈｉｎｅｓ，１９９４年）、（２）アミロイド・タンパク質前駆体のＮＷＣＫＲＧＲＫＱＣＫＴＨ（Ｓｍａｌｌ，１９９４年）、（３）Ｎ−末端線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−１のＮＹＫＫＰＫＬ（Ｌｏｕ，１９９６年）および（４）ラミニンα１鎖のＣ−末端Ｇ−領域のＫＤＦＬＳＩＥＬＶＲＧＲＶＫ（吉田，１９９９年）が合成された。
【００２３】
〔（２）「濃縮された」Ｋｒｉｎｇｌｅペプチド〕
Ｋｒｉｎｇｌｅ領域は、プラスミノーゲンをＰｒＰScに選択的に結合させることに関与していた。Ｋｒｉｎｇｌｅ領域が、正に荷電したアミノ酸（たとえばＡｒｇおよびＬｙｓ）が関与するヘパリン／硫酸ヘパリン結合活性（水野，１９９４年）を有することが知られていた（Ｓｏｅｄａ，１９８９年）。別の出版物では、プリオン配列中に保存された二つのトリペプチド「ＹＹＲ」またはむしろ、提案された三つの非連続の「ＹＹＸ」が、ＰｒＰScと相互作用するが、ＰｒＰCとは相互に作用しないことが見出された（Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓ，２００３年、国際公開第００７８３４４Ａ１号パンフレット）。興味深いことに、ヒトのプラスミノーゲン配列中には、４つのＴｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ配列が、５つのＫｒｉｎｇｌｅ領域中４つ（Ｋｒｉｎｇｌｅ領域１中のＹ（９２）Ｒ（９３）Ｇ（９４），Ｋｒｉｎｇｌｅ領域３中のＹ（２６４）Ｒ（２６５）Ｇ（２６６），Ｋｒｉｎｇｌｅ領域４中のＹ（３６６）Ｒ（３６７）Ｇ（３６８）およびＫｒｉｎｇｌｅ領域５中のＹ（４７０）Ｒ（４７１）Ｇ（４７２））に存在していた。プラスミノーゲンには、Ｋ（１９）Ｋ（２０），  Ｒ（６１）Ｋ（６２），  Ｋ（７７）Ｋ（７８），  Ｒ（１５３）Ｙ（１５４），  Ｋ（２１１）Ｋ（２１２），  Ｋ（２３３）Ｒ（２３４），  Ｋ（３１１）Ｒ（３１２），  Ｋ（３７７）Ｋ（３７８），  Ｋ（４３３）Ｋ（４３４），  Ｋ（４７３）Ｒ（４７４），  Ｒ（５３０）Ｋ（５３１），  Ｋ（５５６）Ｋ（５５７），  Ｙ（６１４）Ｋ（６１５），  Ｒ（６４４）Ｋ（６４５），  Ｒ（７１２）Ｙ（７１３），  Ｋ（７５２）Ｙ（７５３）等の１６のＴｙｒ−ＬｙｓまたはＡｒｇ−ＴｙｒまたはＬｙｓ−ＴｙｒまたはＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇまたはＬｙｓ−Ｌｙｓ配列が存在していた。さらに、数個の離れたＴｙｒ、ＡｒｇまたはＬｙｓ残基が、Ｋｒｉｎｇｌｅループに形成されたジスルフィドブリッジによって、相互に近づけられていた（図１）。これらの観察に基づいて、恐らく、ＰｒＰSc複合体が関連するグリカンとの相互作用を介して、プラスミノーゲンＫｒｉｎｇｌｅ領域中とプリオン配列中のアミノ酸（Ｔｙｒ，ＡｒｇおよびＬｙｓ）が、ＰｒＰScへの選択的結合に寄与するものと考えられた。この理由から、２つの「濃縮されたＫｒｉｎｇｌｅ」ペプチド（ＹＲＧＹＲＧＹＲＧＹＲＧおよびＹＲＧＲＹＧＹＫＧＫＹＧＹＲＧ）が合成された。
【００２４】
〔（３）核酸結合ペプチド〕
核酸は、ＰｒＰSc凝集体と関連するもう一つの分子カテゴリーである。ＰｒＰScを捕捉するのに、抗ＤＮＡ抗体が有効に使用されてきた。ヒストンは、核ＤＮＡに結合することが知られている一群のタンパク質である。したがって、ＰｒＰScの捕捉能力を評価するために、（１）Ｈ２Ｂ（２１−４１）のＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＩＹＶ、（２）Ｈ３（１−２１）のＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡおよび、（３）Ｈ４（２−２４）のＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲの３つのペプチドが合成された。
〔発明の概要〕
【００２５】
本発明の目的は、ＴＳＥ病関連の病原性プリオンタンパク質を単離し、濃縮し、モニターする非侵襲的な方法を提供することである。本発明は、いくつかのペプチドと、プリオン病の患畜と患者との脳ホモジネートからＰｒＰScを捕捉するこれらのペプチドの能力に関する。これらの８つのペプチドは、プリオン病に罹患していない個体からの細胞プリオンタンパク質を捕捉しない。本発明をサポートする証拠により、ＰｒＰScが、研究対象の核酸やグリカン等の多くの他の分子に対する高い親和性と関連していることが証明された。この証拠により、上記の関連性が強く、ＰＫ消化処理に抵抗力を示すことおよび、そのような関連結合パートナーの認識を通して、ＰｒＰScがペプチドによって容易に単離され得ることも証明された。
【００２６】
本発明は、ＰｒＰScの検出のための、ＰｒＰScへの高い親和性と関連するグリカンまたは核酸を介してＰｒＰScを捕捉するための上記ペプチドと、プリオン配列に対し特異性を有する任意の抗体との組み合わせの使用に関するものである。
【００２７】
本発明のもう一つの態様は、好ましくは、病原性プリオンタンパク質と結合し、プリオンタンパク質の正常な細胞型とは結合しない上述のペプチドに関するものである。
【００２８】
本発明のもう一つの態様は、関連するグリカンまたは核酸の高い親和性認識を介したＰｒＰScの検出のための上記ペプチドと、プリオン配列に対し特異性を有する抗体との組合せに関するものである。
【００２９】
本発明のもう一つの態様は、生物学的薬剤の製造中におけるＰｒＰScの単離、精製、捕捉、除去および監視のための上記ペプチドに関するものである。
【００３０】
本発明のもう一つの態様は、評価手順中における捕捉または検出段階のための上記ペプチドを含む、ＰｒＰScの存在を決定するための組成物およびキットに関するものである。
【００３１】
本発明のもう一つの態様は、病原性プリオンタンパク質の結合パートナーとしての高い親和性に関連するグリカンまたは核酸に対応して生じた、ＰｒＰSc抗体の存在を決定するための組成物およびキットに関するものである。
【００３２】
本発明のさらにもう一つの態様は、抗ＰｒＰSc抗体、ＰｒＰScと相互作用しおよび／または関連することのできる上記グリカンまたは核酸を使用した抗ＰｒＰSc抗体の生産ならびに、グリカン：：ＰｒＰScまたは核酸：：ＰｒＰSc複合体およびプリオン病の感染の検出における抗ＰｒＰSc抗体の使用に関するものである。
【００３３】
本発明のもう一つの態様は、上記ペプチドの使用のための、グリカナーゼまたはヌクレアーゼ消化が関与する、厳しくないサンプル処理手順に関するものである。
【００３４】
〔脳ホモジネート調合物〕
正常およびスクレーピーのハムスターの脳溶解物を、全脳組織ホモジネートを１０％（ｗ／ｖ）含んだＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）として、ボルチモア研究および教育財団（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）から得た。さらに、この溶解物に、５％のナトリウムデオキシコレートと５％のＩｇｐａｌ  ＣＡ−６３０（ＮＰ−４０と同等）とをＰＢＳに含ませてなる１０Ｘの洗剤ホモジネート緩衝液（１／１０体積量）を加え、４℃で１時間培養し、ついで、１，０００ｇで１０分間で遠心沈降処理した。得られた上澄みを集め、評価に使用した。
【００３５】
正常およびＢＳＥのウシの脳組織は、英国のＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ（ＶＬＡ）から提供された。ヒトのｖＣＪＤとレービー小体型痴呆の脳組織は、英国のＮａｔｉｏｎａｌ  ＣＪＤ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ（ＮＣＪＤＳＵ）から提供された。脳組織は、ハムスター脳ホモジネート調合物と同一の（または類似の）方法で処理した。
【００３６】
〔合成ペプチド〕
９つのペプチドを、ＲｅｓＧｅｎ（現在は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）で合成し、あるいは、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｇｒｏｕｐ社から購入した。それぞれのペプチドのビオチンラベル付けを、アミノヘキサノイルスペーサー（Ｋ（Ｌｃ））を持つＣ末端リジンで、または、アミノヘキサノイルスペーサー（ＡＭＣＡＰ）を介してＮ末端で、行った。
ペプチドID  ペプチト配列                       配列の起源
供給元
配列ＩＤ番号1：WQPPRARI GK(Lc)-Biotin           フイブロネクチン
ResGen
配列ＩＤ番号2：Biotin-AMCAP-NWCKRGRKQCKTH  アミロイドタンパク質前駆体
ResGen
配列ＩＤ番号3：Biotin-AMCAP-NYKKPKL-G        線維芽細胞成長因子(FGF)-1
ResGen
配列ＩＤ番号4：Biotin-AMCAP-KDFLSIELVRGRVK  ラミニンA鎖
ResGen
配列ＩＤ番号5：YRGYRGYRGYRG-K(Lc)-Biotin      「濃縮」Kringle-A
ResGen
配列ＩＤ番号6：YRGRYGYKGKYGYRG-K(Lc)-Biotin  「濃縮」Kringle-B
ResGen
配列ＩＤ番号7：AQKKDGKKRKRSRKESYSIYV-GGK(Lc)-Biotin  ヒトヒストン 2B
Upstate
配列ＩＤ番号8：ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK(Lc)-Biotin  ヒトヒストン 3
Upstate
配列ＩＤ番号9：SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR-GSGSK(Lc)-Biotin  ヒトヒストン 4
Upstate
配列ＩＤ番号10：Biotin-AMCAP-TIADRYYRETAR        VP16タンパク質,HSV-2
ResGen
ビオチン化されたペプチドはＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬで溶解し、使用まで−２０℃で保存した。
【００３７】
〔ビオチン化されたペプチドのストレプトアビジン磁気ビーズへの接合〕
０．５ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）  Ｍ−２８０  ストレプトアビジン（米国，ニューヨーク，Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社，Ｃａｔ．＃１１２．０６）をＰＢＳで二回洗浄し、磁石（Ｄｙｎａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ社，ＭＰＣ）でこのビーズを緩衝液から単離した。１００μｇのペプチドと１ｍＬのＰＢＳとをこの洗浄ビーズに添加した。回転付きの培養を３７℃で１〜２時間行った。ＭＰＣで緩衝液からビーズを単離し、１ｍＬのＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ）で二回洗浄した。洗浄中、室温で５分間回転を行った。ついで、ペプチドを接合したビーズを、１ｍＭビオチンの、０．１％のＢＳＡを含む０．２Ｍのトリス−塩酸，ｐＨ８．０の液中で、３７℃で２時間、ブロックした。ついで、ビーズを１ｍＬのＰＢＳ（０．１％のＢＳＡ）により２回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳ（０．１％のＢＳＡ、１％のＴｗｅｅｎ  ２０）で一回洗浄し、毎回、室温で１０分間培養した。その後、ビーズを、１ｍＬのＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ）で一回洗浄し、ついで、１ｍＬのＰＢＳ（０．０５％のアジ化ナトリウム）中に４℃で保存した。
【００３８】
〔プロテイナーゼＫ消化〕
脳溶解物のＰＫ消化の条件：脳ホモジネートを、非イオン性洗剤を使用しまたは使用しないで、ＰＢＳ緩衝液中に懸濁した。全ホモジネートタンパク質の濃度は、僅か２．５ｍｇ／ｍＬであった。ＰＫ（米国，インディアナ州，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，Ｃａｔ．＃１３７３１９６）を添加して、５０μｇ／ｍＬの最終濃度にした。３７℃で０．５〜１時間掛けて培養を行った。Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ（米国，インディアナ州，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，Ｃａｔ．＃１５８５９１６）を添加して消化を停止し、４ｍＭの最終濃度にした。
【００３９】
〔ＰｒＰScの免疫沈降（ＩＰ）、非還元電気泳動および免疫ブロット検出〕
ペプチド接合磁力ビーズを使用し、免疫沈降によって脳ホモジネートからＰｒＰScを捕捉した。このＩＰ手順は、次のプロトコルからなっていた：５０μＬのペプチド接合ビーズを、全部で１ｍＬのＩＰ緩衝液（３％のＴｗｅｅｎ  ２０と３％のＩｇｐａｌ  ＣＡ−６３０を含むＰＢＳ）中、ＰＫ処理したまたはＰＫ処理していない脳ホモジネートと混合し、２５℃下、２．５時間、回転付きで培養する。→ＭＰＣデバイスを使用してビーズを分離し、ＩＰ洗浄用緩衝液（２％のＴｗｅｅｎ  ２０と２％のＩｇｐａｌ  ＣＡ−６３０を含むＰＢＳ）でボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）することにより、３０秒間ずつ３回ビーズを洗浄する。→ビーズをＮｕＰＡＧＥサンプル緩衝液と共に、１０〜１５分間加熱して、捕捉されたＰｒＰScを溶出する。ＩＰ捕捉物からの溶出サンプルを、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（Ｒ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（米国，カリフォルニア州，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｔ．＃ＮＰ０３０２）にロードして、２００Ｖで、４５分間、非還元電気泳動に供した。免疫ブロット手順を以下のように実行した：ゲル中の分離タンパク質を、３０Ｖ、６０分間で、０．２μｍのＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃ＬＣ２００２）に移動させる。→この膜組織を、ＢｌｏｃｋｅｒTM  Ｃａｓｅｉｎ含有ＴＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）（米国，イリノイ州，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，Ｃａｔ．＃３７５３２）で、振盪付きで、２５℃下１時間かけるかまたは４℃で一昼夜かけてブロックする。→一次抗体として、１：３，０００希釈の３Ｆ４（米国，マサチューセッツ州，Ｓｉｇｎｅｔ社，Ｃａｔ．＃９６２０−０２）または、１：５，０００希釈の６Ｈ４（スイス，Ｐｒｉｏｎｉｃｓ社，Ｃａｔ．＃０１〜０１１）を使用してＰｒＰScを検出する。２５℃下、振盪付きで１時間かけて、１０％のブロッカーTMカゼイン含有ＴＢＳＴ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉ−Ｃｌ，０．２ＭのＮａＣｌ，０．２％のＴｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．０）に一次抗体を希釈した液で膜組織を培養する。→振盪付きで３回×５分間、ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄する。→５０％のブロッカーTMカゼイン含有ＴＢＳＴ緩衝液中１：１０，０００〜１：３０，０００に希釈した、ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（米国，ペンシルベニア州，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，Ｃａｔ．＃１１５−０３５−００３）で、膜組織を、２５℃下、振盪付きで１時間かけて培養する。→振盪付きで６回×５分間、ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄する。→ＥＣＬ化学ルミネセンス基質（米国、ニュージャージー州，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｃａｔ．＃ＲＰＮ２１０９）または、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ化学ルミネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ社）を膜組織に添加し、５分間現像する。→Ｂｉｏ  Ｍａｘ  ＭＲ−２フィルム（米国、ニューヨーク州，Ｋｏｄａｋ社）またはＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国，カリフォルニア州，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）へ曝露して像を得る。
〔利点〕
【００４０】
本発明では、グリカン、核酸等の、ＰｒＰSc複合体中の高い親和性に関連する分子を認識することにより、ＰｒＰScを捕捉するためにペプチドを使用する。これらの分子がＰｒＰScだけに関連し、ＰｒＰCには関連しないと言う厳密な関連性により、本発明は、ＰＫ消化やその他のタンパク質変性手順を必要としないで、ＰｒＰScを検出できる非侵襲的な手段を提供する。条件が穏やかになるため、病原性プリオンタンパク質の元々の構造と立体構造とが保存され、これによって、過酷なサンプル処理によるＰｒＰScの生成を最小限に抑え、真のＰｒＰScの存在を決定する機会が提供されるものと期待される。
【００４１】
合成ペプチドの使用は、その結合が特異的であり、固相への直接コーティングで容易に取り扱うこともでき、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の所与の試薬に、接合、リンクして、信号を発することができ、あるいは、その他の所望の診断評価フォーマットで採用することができる利益を与える。
〔引用文献〕
【００４２】
アグッチ・エー(Aguzzi A)，フィッシャー・エムビー（Fischer MB），「血清と血漿中のプリオン−結合活動(Prion-Binding Activity in Serum and Plasma)」, ２００１年，US 20010053533A1
【００４３】
アッペル・ティーアール(Appel TR)，ドゥムピタック・シー(Dumpitak C)，マッシーセン・ユー( Matthiesen U)，リーズナー・ディー(Riesner D)，「プリオンロッドは、不活性な多糖類スキャフォールドを含む (Prion rods contain an inert polysaccharide scaffold.)」，１９９９年，Biol Chem 380(11):1295-306
【００４４】
アーノルド・ジェイイー(Arnold, JE)，ティプラー・シー(Tipler C)，ラズロ・エル(Laszlo L)，ホープ・ジェイ(Hope J)，ランドン・エム(Landon M)，メイヤー・アールジェイ(Mayer RJ)，「スクレーピー感染マウスの脳中の後期エンドソーム様オルガネラにおけるプリオンタンパク質の異常なイソ型の蓄積(The abnormal isoform of the prion protein accumulates in late-endosome-like organelles in scrapie-infected mouse brain.)」，１９９５年， J. Pathol. 176:403-411
【００４５】
バーナード・ジー(Barnard G)，ヘルミック・ビー(Helmick B)，マッドン・エス(Madden S)，ギルボーン・シー(Gilbourne C)およびペイテル・アール(Patel R)，「ＢＳＥの診断テストとして、差分抽出とＤＥＬＦＩＡとを用いたウシの脳組織中のプリオンタンパク質の測定(The measurement of prion protein in bovine brain tissue using differential extraction and DELFIA as a diagnostic test for BSE)」，Luminescence，２０００年，15:357362
【００４６】
ビレイ・イーディー(Belay ED)，「人体における伝達性海綿状脳症(Transmissible spongiform encephalopathies in humans)」，１９９９年， Annu. Rev. Microbiol.  53:283-314.
【００４７】
ビフィンガー・ケイ(Biffiger K)，ツバルト・ディー(Zwald D)，カウフマン・エル(Kaufmann L)，ブリナー・エイ(Briner A)，ナイキ・アイ(Nayki I)，ピュッロ・エム(Purro M)，ボッチャー・エス(Bottcher S)，シュトゥルックマイヤー・ティー(Struckmeyer T)，シャラー・オー(Schaller O)，マイヤー・アール(Meyer R)，ファッツァー・アール(Fatzer R)，ツルブリッゲン・エイ(Zurbriggen A)，スタック・エム(Stack M)， モーゼル・エム(Moser M)，オッシュ・ビー(Oesch B)，クブラー・イー(Kubler E)，「脳ホモジネートのＰｒＰ（Ｓｃ）の検出のための発光イムノアッセイの検証(Validation of a luminescence immunoassay for the detection of PrP(Sc) in brain homogenate)」，２００２年， J Virol Methods 101(1-2):79-84.
【００４８】
ボルトン・ディーシー(Bolton DC)，「プリオンとタンパク質：立体構造間の区別(Prions and proteins: distinguishing between conformations)」，２００１年，The Lancet 358(9277):164-165
【００４９】
ブラウン・ピー(Brown P)，カタラ・エフ(Cathala F)，ラウベルタス・アールヘフ(Raubertas RF)，ガジュセク・ディーシー(Gajdusek DC)，カスターニュ・ピー(Castaigne P)，「クロイツフェルト−ヤコブ病の疫学：フランスにおける１５年間の研究の結論および世界文献のレビュー(The epidemiology of Creutzfeldt-Jakob disease: conclusion of a 15 year investigation in France and review of the world literature)」，１９８７年， Neurology 37:895-904.
【００５０】
ブラウン・ピー(Brown P)，「ヒトの健康に対するウシの海綿状脳症「狂牛病」）の危険性(The risk of bovine spongiform encephalopathy ("mad cow disease") to human health)」，JAMA 1997; 278: 1008-1011
【００５１】
ブルース・エムイー(Bruce ME)，ウィル・アールジー(Will RG)，アイアンサイド・ジェイダブリュー(Ironside JW)，マコーネル・アイ(McConnell I)，ドラモンド・ディー(Drummond D)，サティ・エイ(Suttie A)，マッカードル・エル(McCardle L)，クリー・エイ(Chree A)，ホープ・ジェイ(Hope J)，バーケット・シー(Birkett C)，カウセンス・エス(Cousens S)，フレーザー・エイチ(Fraser H)およびボストック・シージェイ(Bostock CJ)，「マウスへの伝達は、「新しい変異型」ＣＪＤが、ＢＳＥ物質によって引き起こされることを示している。(Transmissions to mice indicate that `new variant' CJD is caused by the BSE agent.)」，１９９７年，Nature 389:498-501
【００５２】
コーギー・ビーダブリュー(Caughey BW)，ドン・エイ(Dong A)，バート・ケイエス(Bhat KS)，エルンスト・ディー(Ernst D)，ヘイズ・エスエフ(Hayes SF)，コーギー・ダブリューエス(Caughey, W.S.)，「赤外分光分析による水中のスクレーピー関連タンパク質ＰｒＰ２７−３０の二次的構造分析(Secondary structure analysis of the scrapie-associated protein PrP2730 in water by infrared spectroscopy)」，１９９１年， Biochemistry 30:76727680.
【００５３】
コーギー・ビー(Caughey B)およびコシスコ・ディーエイ(Kocisko DA.)，「核酸は共犯者？(A nucleic-acid accomplice?)」，２００３年， Nature Oct 16;425(6959):673-4
【００５４】
チャンドラー・アール(Chandler R)，「スクレーピーの脳物質で生み出されたマウスの脳症(Encephalopathy in mice produced with scrapie brain material)」，１９６１年， Lancet 1:1378-1379
【００５５】
コーエン・エフイー(Cohen FE)，プルジナー・エスビー(Prusiner SB.)，「プリオンタンパク質の病理学的立体構造(Pathologic conformations of prion proteins)」，１９９８年，Annu Rev Biocem 67:793-819
【００５６】
コルデイロ・ワイ(Cordeiro Y)，マチャド・エフ(Machado F)，ジュリアーノ・エル(Juliano L)，ジュリアーノ・エムエー(Juliano MA)，ブレンタニ・アールアール(Brentani RR)，フォグエル・ディー(Foguel D)，シルヴァ・ジェイエル(Silva JL)，「ＤＮＡが細胞プリオンタンパク質をβ−シート立体構造に変え、プリオンペプチドの凝集を禁止する(DNA converts cellular prion protein into the beta-sheet conformation and inhibits prion peptide aggregation)」，２００１年，J Biol Chem. 276(52):49400-9.
【００５７】
クイエ・ジェイ(Cuille J)，シェレ・ピーエル(Chelle PL)，「La maladie dite tremblante du mouton est-elle inocuable? 」，１９３６年，C. R. Acad. Sci. 203, 1552-1554
【００５８】
デロールト・エヌディー(Deleault ND)，ルカッセン・アールダブリュー(Lucassen RW)およびスパッタポーン・エス(Supattapone S)，「ＲＮＡ分子がプリオンタンパク質の変換を刺激する(RNA molecules stimulate prion protein conversion.)」，２００３年， Nature Oct 16;425(6959):717-20
【００５９】
ディアズ−ニド・ジェイ(Diaz-Nido J.)，ワンドセル・エフ(Wandosell F.)およびアビラ・ジェイ(Avila J)，「神経変性病における、グリコサミノグリカンとβ−アミロイド、プリオンならびにτペプチド(Glycosaminoglycans and beta-amyloid, prion and tau peptides in neurodegenerative diseases.)」，２００２年，J Biol Chem Jul;23(7):1323-32
【００６０】
ＦＤＡおよびＣＢＥＲ，米国保健社会福祉省（２００１）(U.S. Department of Health and Human Services  (2001))ＩＶ，「産業ガイダンスにおけるドナー保留についての勧告：血液および血液産物による、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）と変異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）の感染危険の可能性を減少させるための改訂防止策(RECOMMENDATIONS FOR DONOR DEFERRAL in Guidance for Industry: Revised Preventive Measures to Reduce the Possible Risk of Transmission of Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD) and Variant Creutzfeldt-Jakob Disease (vCJD) by Blood and Blood Products)」
【００６１】
ファーガソン・エヌエム(Ferguson NM)，ガーニー・エイシー(Ghani AC)，ドネリィ・シーエイ(Donnelly CA)，ハゲナース・ティージェイ(Hagenaars TJ)，アンダーソン・アールエム(Anderson RM)，「英国のヒツジ群のＢＳＥ感染の可能性によるヒトの健康に対するリスクの推定(Estimating the human health risk from possible BSE infection of the British sheep flock.)」，２００２年， Nature 415(6870):420-4
【００６２】
フィッシャー・エムビー(Fischer MB)，ロッケル・シー(Roeckl C)，パリチェク・ピー(Parizek P)，シュヴァルツ・エイチピー(Schwarz HP)，アグッチ・エイ(Aguzzi A)，「病気関連プリオンタンパク質のプラスミノーゲンへの結合(Binding of disease-associated prion protein to plasminogen.)」，２０００年， Nature 408:479-83.
【００６３】
フォスター・ジェイディー(Foster JD)，ホープ・ジェイ(Hope J)，マコーネル・アイ(McConnell I)，ブルース・エム(Bruce M)，フレーザー・エイチ(Fraser H)，「ウシの海綿状脳症の、ヒツジ、ヤギおよびマウスへの感染(Transmission of bovine spongiform encephalopathy to sheep, goats, and mice.)」，１９９４年， Ann N Y Acad Sci 724:300-3.
【００６４】
ガビゾン・アール(Gabizon R)，マッキンレー・エムピー(McKinley MP)，グロス・ディー(Groth D)，プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，「スクレーピープリオン伝染性の免疫親和性、精製および無効化(Immunoaffinity purification and neutralization of scrapie prion infectivity. )」，１９８８年，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 66176621.
【００６５】
ガジュセク・ディーシー(Gajdusek DC)，ギブズ・シージェイジェイ(Gibbs CJJ)，アルパース・エムピー(Alpers MP)，「チンパンジーに対するクル様症候群の実験的感染)(Experimental transmission of a kuru-like syndrome to chimpanzees.)」，１９６６年， Nature 209:794-796
【００６６】
ガジュセク・ディーシー(Gajdusek DC)，「非従来型ウイルス、その起源およびクルの消滅(Unconventional viruses and the origin and disappearance of kuru.)」，１９７７年， Science 197:94360
【００６７】
ギブズ・シージェイジェイ(Gibbs CJJ)，ガジュセク・ディーシー(Gajdusek DC)，アッシャー・ディーエム(Asher DM)，アルパース・エムピー(Alpers MP)，ベック・イー(Beck E)、ダニエル・ピーエム(Daniel PM)，マシューズ・ダブリュービー(Matthews WB)，「クロイツフェルト−ヤコブ病（海綿状脳症）：チンパンジーへの感染(Creutzfeldt-Jakob disease (spongiform encephalopathy): transmission to the chimpanzee.)」，１９６８年， Science 161, 388-389
【００６８】
プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，ハドロウ・ダブリュージェイ(Hadlow WJ)（編者），「神経系の遅い伝達性の疾患(Slow transmissible diseases of the nervous system.)」，Volume 2. New York: Academic Press;  p. 87-110.における、ギブズ・シージェイジュニア(Gibbs CJ Jr)，ガジュセク・ディーシー(Gajdusek DC)，アミックス・エイチ(Amyx H)，「クロイツフェルト−ヤコブ病およびクルのウイルスにおける種の変異(Strain variation in the viruses of Creutzfeldt-Jakob disease and kuru.)」，１９７９年
【００６９】
ヒル・エイエフ(Hill AF)，ザイドラー・エム(Zeidler M)，アイアンサイド・ジェイ(Ironside J)，コリンジ・ジェイ (Collinge J)，「扁桃の生検による新しい変異型クロイツフェルトヤコブ病の診断(Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy.)」，１９９７年， Lancet 349(9045):99-100
【００７０】
ヒリアー・シーイー(Hillier CE)，サーモン・アールエル(Salmon RL)，ニール・ジェイダブリュー(Neal JW)，ヒルトン・ディーエイ(Hilton DA)，「変異型クロイツフェルトヤコブ病の過小確認の可能性：組織的研究(Possible underascertainment of variant Creutzfeldt-Jakob disease: a systematic study.)」，２００２年， J Neurol Neurosurg Psychiatry 72(3):304-9
【００７１】
ハインズ・ケイエル(Hines KL)，クルカルニ・エイビー(Kulkarni AB)，マッカーシー・ジェイビー(McCarthy JB)，チアン・エイチ(Tian H)，ワード・ジェイエム(Ward JM)，クリスト・エム(Christ M)、マッカートニー−フランシス・エヌエル(McCartney-Francis NL)，フルフト・エルティー(Furcht LT)，カールソン・エス(Karlsson S)，ワール・エスエム(Wahl SM)，「合成フィブロネクチン・ペプチドは、トランスフォーミング成長因子β１ノックアウト・マウス中の炎症性細胞浸潤を妨害する( Synthetic fibronectin peptides interrupt inflammatory cell infiltration in transforming growth factor beta 1 knockout mice.)」，１９９４年， Proc Natl Acad Sci U S A May 24;91(11):5187-91.
【００７２】
ホラダ・ケイ(Holada K)，シマック・ジェイ(Simak J)，フォスタル・ジェイジー(Vostal JG)，「輸血によるＢＳＥの感染(Transmission of BSE by blood transfusion.)」，２０００年，Lancent 356(9243):1772
【００７３】
ホープ・ジェイ(Hope J)，モートン・エルジェイディー(Morton LJD)，ファーカー・シーエフ(Farquhar CF)，マルソープ・ジー(Multhaup G)，ベイルーサー・ケイ(Beyreuther K)，キンバーリン・アールエイチ(Kimberlin RH)，「スクレーピー関連のフィブリル（ＳＡＦ）の主要なポリペプチドのサイズ、電荷分布およびＮ末端タンパク質配列は、正常な脳タンパク質（ＰｒＰ）について予測されるサイズ、電荷分布およびＮ末端タンパク質配列と同一である(The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP))」，１９８６年，EMBO J. 5, 25912597.
【００７４】
ホリウチ・エム(Horiuchi M)，コーギー・ビー(Caughey B)，「プロテアーゼ耐性状態への変換は、正常なプリオンタンパク質の、局所的領域を経由する、スクレーピー型への特異的結合により開始される(Specific binding of normal prion protein to the scrapie form via a localized domain initiates its conversion to the protease-resistant state.)」，１９９９年， EMBO J  18(12):3193-203.
【００７５】
ホーウィッチ・エイエル(Horwich AL)，ワイスマン・ジェイエス(Weissman JS)，「致命的な立体構造−プリオン病におけるタンパク質の折り畳みの間違い(Deadly ConformationsProtein Misfolding in Prion Disease.)」，１９９７年， Cell, 89:499510
【００７６】
ヒューストン・エフ(Houston F)，「ヒツジの輸血によるＢＳＥの感染(Transmission of BSE by blood transfusion in sheep.)」，２０００年， Lancet 356(9234):999-1000
【００７７】
ハンター・エヌ(Hunter N)，フォスター・ジェイ(Foster J)，チョン・エイ(Chong A)，マカッチャン・エス(McCutcheon S)，パーナム・ディー(Parnham D)，イートン・エス(Eaton S)，マッケンジー・シー(MacKenzie C)，ヒューストン・エフ( Houston F)，「輸血によるプリオン病の感染(Transmission of prion diseases by blood transfusion.)」，２００２年，J Gen Virol  Nov;83(Pt 11):2897-905
【００７８】
ジャクソン・ジーエス(Jackson GS)，ホッツ・エルエル(Hosszu LL)，パワー・エイ(Power A)，ヒル・エイエフ(Hill AF)，ケニー・ジェイ(Kenney J)，サイビル・エイチ(Saibil H)，クレーヴン・シージェイ(Craven CJ)，ワルト・ジェイピー(Waltho JP)，クラーク・エイアール(Clarke AR)，コリンジ・ジェイ(Collinge J)，「天然の立体構造とフィブリロジェニックな立体構造との間における単量体型のヒトプリオンタンパク質の可逆性な変換(Reversible conversion of monomeric human prion protein between native and fibrilogenic conformations.)」，１９９９年， Science 283(5409):1935-7.
【００７９】
ケリングス・ケイ(Kellings K)，マイヤー・エヌ(Meyer N)，ミレンダ・シー(Mirenda C)，プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，リーズナー・ディー(Riesner D)，「改良リターンリフォーカシングゲル電気泳動による、精製スクレーピープリオン調合物中の核酸のさらなる解析(Further analysis of nucleic acids in purified scrapie prion preparations by improved return refocusing gel electrophoresis.)」，１９９２年， J. Gen. Virol. 73, 10251029.
【００８０】
キンバーリン・アールエイチ(Kimberlin RH)，コール・エス(Cole S)，ウォーカー・シーエイ(Walker CA)，「ラットおよびハムスターへの感染における、マウス・スクレーピーの単一株への一時的および永久的変化(Temporary and permanent modifications to a single strain of mouse scrapie on transmission to rats and hamsters.)」，１９８７年， J Gen Virol 68:1875-81.
【００８１】
キンバーリン・アールエイチ(Kimberlin RH)，ウォーカー・シーエイ(Walker CA)，フレーザー・エイチ(Fraser H)，「マウススクレーピーの種々異なる株のゲノムの同一性が、ハムスター中で発現され、マウス中の再分離で保存される(The genomic identity of different strains of mouse scrapie is expressed in hamsters and preserved on reisolation in mice.)」，１９８９年， J Gen Virol 70:2017-25.
【００８２】
クライン・ティーアール(Klein TR,)，キルシュ・ディー(Kirsch D)，カウフマン・アール(Kaufmann R)およびリーズナー・ディー(Riesner D)， １９９８年， Biol. Chem. 379:655-666
【００８３】
コース・シー(Korth C)，スチーリ・ビー(Stierli B)，シュトライト・ピー(Streit P)，モーゼル・エム(Moser M)，シャラー・オー(Schaller O)，フィッシャー・アール(Fischer R)，シュルツ−シェーファー・ダブリュー(Schulz-Schaeffer W)，クレッチュマー・エイチ(Kretzschmar H)，レーバー・エイ(Raeber A)，ブラウン・ユー(Braun U)，エーレンスペルガー・エフ(Ehrensperger F)，ホーネマン・エス(Hornemann S)，グロックスヒューバー・アール(Glockshuber R)，リーク・アール(Riek R)，ビレター・エム(Billeter M)，ブュートリッヒ・ケイ(Wuthrich K)，オッシュ・ビー(Oesch B)，「モノクローナル抗体によって定義される、プリオン（ＰｒＰSc）に対し特異性を有するエピトープ(Prion (PrPSc)-specific epitope defined by a monoclonal antibody.)」，１９９７年， Nature 390(6655):74-7 
【００８４】
ラスメザス・シーエル(Lasmezas CI)，デズリー・ジェイピー(Deslys JP)，デマイメイ・アール(Demaimay R)，アジュー・ケイティー(Adjou KT)，ラムーリー・エフ(Lamoury F)等，「マカクへのＢＳＥの感染(BSE transmission to macaques.)」，１９９６年， Nature 381:74344
【００８５】
ルオ・ワイ（Luo Y），ガブリエル・ジェイエル(Gabriel JL)，ワング・エフ(Wang F)，ジャン・エックス(Zhan X)，マシアグ・ティー(Maciag T)，カン・エム(Kan M)，マッキーハン・ダブリューエル(McKeehan WL)，「分子モデリングと欠失突然変異生成が、線維芽細胞成長因子−１の構造的統合性における核転移配列を複雑にする(Molecular modeling and deletion mutagenesis implicate the nuclear translocation sequence in structural integrity of fibroblast growth factor-1.)」，１９９６年， J Biol Chem. Oct 25;271(43):26876-83.
【００８６】
マイセン・エム(Maissen M)，ロッケル・シー(Roeckl C)，マーカス・ジー(Markus G)，ゴールドマン・ダブリュー(Goldman W)，アグッチ・エイ(Aguzzi A)，「プラスミノーゲンは、複数の種の病気関連プリオンタンパク質に結合する(Plasminogen binds to disease-associated prion protein of multiple species.)」，２００１年， Lancet 357:2026-8.
【００８７】
マヌエリディス・イーイー(Manuelidis EE)，キム・ジェイエイチ(Kim JH)，メリカンガス・ジェイアール(Mericangas JR)，マヌエリディス・エル(Manuelidis L)，「人血から動物へのクロイツフェルト−ヤコブ病の感染(Transmission to animals of Creutzfeldt-Jakob disease from human blood.)」，１９８５年， Lancet 2:89697 
【００８８】
マクブライド・ピーエイ(McBride PA)，ウィルソン・エムアイ(Wilson MI)、エイケレンブーム・ピー(Eikelenboom P)，タンストール・エイ(Tunstall A)，ブルース・エムイー(Bruce ME)「スクレーピーに感染したマウスの培養期間中ずっと、硫酸ヘパランプロテオグルカンが、アミロイドプラークと神経解剖学的な目標ＰｒＰの病状に関連する(Heparan Sulfate Proteoglycan is Associated with Amyloid Plaques and Neuroanatomically Targeted PrP Pathology throughout the Incubation Period of Scrapie-Infected Mice.)」，１９９８年， Experimental Neurol. 149:447-454 
【００８９】
マックゴウアン・ジェイピー(McGowan JP)，「ヒツジのスクレーピー( Scrapie in sheep.)」，１９２２年， Scott. J. Agric. 5:36575
【００９０】
マイヤー・アールケイ(Meyer RK)，マッキンレー・エムピー(McKinley MP)，ボウマン・ケイエイ(Bowman KA)，ブラウンフェルト・エムビー(Braunfeld MB)，バリー・アールエイ(Barry RA)，プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，「細胞プリオンタンパク質およびスクレーピープリオンタンパク質の分離と特性(Separation and properties of cellular and scrapie prion proteins.)」，１９８６年， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:23102314. 
【００９１】
ミズノ・ケイ(Mizuno K)，イノウエ・エイチ(Inoue H)，ハギヤ・エム(Hagiya M)，シミズ・エス(Shimizu S)，ノセ・ティー(Nose T)，シモヒガシ・ワイ(Shimohigashi Y)，ナカムラ・ティー(Nakamura T)，「ヘアピンループとと２次Ｋｒｉｎｇｌｅ領域が、肝細胞成長因子のヘパリン結合と生物学的活性の必須のサイトである(Hairpin loop and second kringle domain are essential sites for heparin binding and biological activity of hepatocyte growth factor.)」，１９９４年，J Biol Chem. Jan 14;269(2):1131-6. Plasminogen
【００９２】
モイナー・ジェイ(Moynagh J)，シンメル・エイチ(Schimmel H)，「ウシの伝達性海綿状脳症の診察のための諸テストの評価(The evaluation of tests for the diagnosis of Transmissible Spongiform Encephalopathy in Bovines (8 July 1999))」，１９９９年７月８日， http://europa.eu.int/comm/food/fs/bse/bse12en.html. 
【００９３】
ナラング・エイチケイ(Narang HK)，「海綿状脳症物質の性質の批評的総説：プリオン説対ウイルス説(A critical review of the nature of the spongiform encephalopathy agent: prion theory versus virus theory.)」，２００２年， Exp Biol. Med. (Maywood) 227(1):4-19 
【００９４】
オローク・ケイアイ(O'Rourke KI)，バズラー・ティーヴィー(Baszler TV)，ベッサー・ティーイー(Besser TE)，ミラー・ジェイエム(Miller JM)，カトリップ・アールシー(Cutlip RC)，ウェルズ・ジーエイ(Wells GA)等，「第三眼瞼リンパ系組織の免疫組織化学によるスクレーピーの臨床前診断(Preclinical diagnosis of scrapie by immunohistochemistry of third eyelid lymphoid tissue.)」，２０００年、 J Clin Microbiol 38:3254-9. 
【００９５】
パン・ケイエム(Pan KM)，ボールドウィン・エム(Baldwin M)，グエン・ジェイ(Nguyen J)，ガセット・エム(Gasset M)，セルバン・エイ(Serban A)，グロス・ディー(Groth D,)，メールホーン・アイ(Mehlhorn I)，フワン・ゼット(Huang Z)，フレッタリック・アールジェイ(Fletterick RJ)，コーエン・エフイー(Cohen FE)，プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，「スクレーピープリオンタンパク質の形成における、螺旋形状からシート形状への変換(Conversion of -helices into -sheets features in the formation of the scrapie prion proteins.)」，１９９３年， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10962-10966 
【００９６】
パラミシオチス・イー(Paramithiotis E)等，「病的に誤って折り畳まれた立体構造に選択的なプリオンタンパク質エピトープ(A prion protein epitope selective for the pathologically misfolded conformation)」，２００３年， Nat Med Jul;9(7):893-9
【００９７】
パリチェク・ピー(Parizek P)，ロックル・シー(Roeckl C)，ウェーバー・ジェイ(Weber J)，フレッシッヒ・イー(Flechsig E)，アグッチ・エイ(Aguzzi A)，レーバー・エイジェイ(Raeber AJ)，「一次リンパ細胞と神経細胞とにおける細胞プリオンタンパク質の生成率と脱落の類似性(Similar turnover and shedding of the cellular prion protein in primary lymphoid and neuronal cells.)」，２００１年 
【００９８】
パティソン・アイ，「ヤギへのスクレーピーの感染(Transmission of scrapie to the goat.)」，１９５７年， Lancet 272:104-105.
【００９９】
プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，「新規な伝染性のタンパク性粒子がスクレーピーを引き起こす(Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.)」，１９８２年， Science (1982) 216:13644 
【０１００】
レイモンド・ジージェイ(Raymond GJ)等，「慢性消耗性疾患に対するヒト、ウシおよびヒツジの感染性を制限する分子バリアの証拠(Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.)」，２０００年， EMBO J Sept 1; 19(17): 4425-30
【０１０１】
サファール・ジェイ(Safar J)，ウィル・エイチ(Wille H)，イトリ・ヴィー(Itri V)，グロス・ディー(Groth D)，セルバン・エイチ(Serban H)，トルチャ・エム(Torchia M)，コーエン・エフイー(Cohen FE)，プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，「異なる立体構造を有するＰｒＰ（Ｓｃ）分子を持つ８つのプリオン株(Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations.)」，１９９８年， Nat. Med. 4(10):1157-65 
【０１０２】
シャラー・オー(Schaller O)，ファッツァー・アール(Fatzer R)，スタック・エム(Stack M)，クラーク・ジェイ(Clark J)，クーリー・ダブリュー(Cooley W)，ビフィガー・ケイ(Biffiger K)，エグリ・エス(Egli S)，ドーヘル・エム(Doherr M)，ヴァンデヴェルデ・エム(Vandevelde M)，ハイム・ディー(Heim D)，オッシュ・ビー(Oesch B)，モーゼル・ピー(Moser M)，「ウシのＰｒＰ（Ｓｃ）の検出のウエスタン免疫ブロット手順の検証と牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の診断のための急速調査方法としてのその使用(Validation of a western immunoblotting procedure for bovine PrP(Sc) detection and its use as a rapid surveillance method for the diagnosis of bovine spongiform encephalopathy (BSE).)」，１９９９年，Acta Neuropathol (Berl) 98(5):437-43.
【０１０３】
シェークト・ジーエム(Shaked GM)，マイナー・ゼット(Meiner Z)、アブラハム・アイ(Avraham I)，タラブロス・アール(Taraboulos A)，ガビゾン・アール(Gabizon R)，「可溶化されたプロテアーゼ耐性ＰｒＰとプリオンロッドの非タンパク質構成要素からのプリオン伝染力の再構築(Reconstitution of Prion Infectivity from Solubilized Protease-resistant PrP and Nonprotein Components of Prion Rods.)」，２００１ａ年，  J. Biol. Chem. 276(17):14324-14328 
【０１０４】
シェークト・ジーエム(Shaked GM)，シェークト・ワイ(Shaked Y)，カリブ−インバル・ゼット(Kariv-Inbal Z)，ハリミ・エム(Halimi M)，アブラハム・アイ(Avraham I)，ガビゾン・アール(Gabizon R)，「プリオン病に感染した動物とヒトの尿中に、プロテアーゼ耐性プリオンタンパク質イソ型が存在する(A Protease-resistant Prion Protein Isoform Is Present in Urine of Animals and Humans Affected with Prion Diseases)」，２００１ｂ年，J. Biol. Chem., 276(34):31479-82  
【０１０５】
シング・エスエル(Shyng SL)，ホイザー・ジェイイー(Heuser JE)，ハリス・ディーエイ(Harris DA)，「アグリコ脂質で固定されたプリオンタンパク質は、クラスリンで被覆されたピットにより取り込まれる(Aglycolipid-anchored prion protein is endocytosed via clathrin-coated pits.)」，１９９４年， J. Cell Biol. 125:123950 
【０１０６】
スモール・ディーエイチ(Small DH)，ヌルコム・ヴィー(Nurcombe V)，リード・ジー(Reed G)，クラリス・エイチ(Clarris H)，モイア・アール(Moir R)，ベイルーサー・ケイ(, Beyreuther K)，マスターズ・シーエル(Masters CL)，「アルツハイマー病のアミロイドタンパク質前駆体のヘパリン結合領域が、神経突起の伸張の規制に関与している(A heparin-binding domain in the amyloid protein precursor of Alzheimer's disease is involved in the regulation of neurite outgrowth.)」，１９９４年，J Neurosci. Apr;14(4):2117-27
【０１０７】
スノー・エイディー(Snow AD)，「ゲルストマン−シュトロイスラー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病およびスクレーピーのプリオンタンパク質アミロイドプラークに対する硫酸ヘパランプロテオグリカンの免疫学的局在決定(Immunolocalization of heparan sulfate proteoglycans to the prion protein amyloid plaques of Gerstmann-Straussler syndrome, Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie.)」，１９９０年， Lab Invest. 63(5):601-1 
【０１０８】
ソエダ・エス(Soeda S)，オオキ・エイチ(Ohki H)，シメノ・エイチ(Shimeno H)，ナガマツ・エイ(Nagamatsu A)、「プラスミノーゲンのヘパリンへの結合のさらなる特徴付け：リジン残基の関与の証拠(Further characterization of the binding of plasminogen to heparin: evidence for the involvement of lysine residues.)」，１９８９年，Biochim Biophys Acta. Nov 9;999(1):29-35. Plasminogen
【０１０９】
スイートニッキ・ダブリュー(Swietnicki W)，モリラス・エム(Morillas M)，チェン・エスジー(Chen SG)，ガンベッチ・ピー(Gambetti P)，スレビッチ・ダブリューケイ(Surewicz WK)，「組み換え型ヒトプリオンタンパク質ｈｕＰｒＰ９０−２３１の凝集とフィブリル化(Aggregation and fibrillization of the recombinant human prion protein huPrP90-231)」，２０００年，Biochemistry 39(2):424-31. 
【０１１０】
タラブロス・エイ(Taraboulos A)，セルバン・ディー(Serban D)，プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，「スクレーピープリオンタンパク質は、持続的に感染させられた培養細胞の細胞質に蓄積する(Scrapie prion proteins accumulate in the cytoplasm of persistently infected cultured cells.)」，１９９０年，J. Cell. Biol. 110:211732 
【０１１１】
タテイシ・ジエイ，「ヒトの血液および尿からマウスへのクロイツフェルト−ヤコブ病の感染(Transmission of Creutzfeldt-Jakob disease from human blood and urine into mice.)」，１９８５年，Lancet 2:1074 
【０１１２】
テリング・ジーシー(Telling GC)，スコット・エム(Scott M)，マストリアンニ・ジェイ(Mastrianni J)，ガビゾン・アール(Gabizon R.)，トルチャ・エム(Torchia M)，コーエン・エフイー(Cohen FE)，デアーモンド・エスジェイ(DeArmond SJ)，プルジナー・エスビー(Prusiner SB)，「ヒトおよびキメラのＰｒＰ導入遺伝子を発現するマウス中のプリオンの伝播には、細胞ＰｒＰと他のタンパク質との相互作用が関与する(Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein.)」，１９９５年，Cell 83:7990. 
【０１１３】
ヴァレロン・エイジェイ(Valleron AJ)，ボエレ・ピーワイ(Boelle PY)，ウイル・アール(Will R)，セスブロン・ジェイワイ(Cesbron JY)，「英国のｖＣＪＤの年齢特徴に基づく、流行規模と潜伏期間との推定(Estimation of epidemic size and incubation time based on age characteristics of vCJD in the United Kingdom.)」，２００１年，Science 294(5547):1726-8 
【０１１４】
ウォズワース・ジェイディー(Wadsworth JD)，ジョイナー・エス(Joiner S)等，「高感度免疫ブロット分析法を使用した、変異型クロイツフェルトヤコブ病におけるプロテアーゼ抵抗性プリオンタンパク質の組織分布(Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay.)」，２００１年，Lancet 358(9277):171-80 
【０１１５】
ワーナー・アールジー(Warner RG)，ハント・シー(Hundt C)，ワイス・エス(Weiss S)，ターンブル・ジェイイー(Turnbull JE)，「細胞プリオンタンパク質中の硫酸ヘパラン結合サイトの識別(Identification of the heparan sulfate binding sites in the cellular prion protein.)」，２００２年，J Biol Chem. May 24;277(21):18421-30
【０１１６】
ウェルズ・ジーエイエイチ(Wells GAH)，スコット・エイシー(Scott AC)，ジョンソン・シーティー(Johnson CT)，ガニング・アールエフ(Gunning RF)，ハンコック・アールディー(Hancock RD)等，「ウシにおける新規な進行性海綿状脳症(A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle.)」，１９８７年，Vet. Rec. 31:41920
【０１１７】
ウィリアムズ・イーエス(Williams ES)，ヤング・エス(Young S)，「捕獲されたミュールジカの慢性消耗性疾患：海綿状脳症(Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy.)」，１９８０年，J. Wildl. Dis.  16:8998
【０１１８】
ウォン・シー(Wong C)，ジオン・エルダブリュー(Xiong LW)，ホリウチ・エム(Horiuchi M)，レイモンド・エル(Raymond L)，ウエーリー・ケイ(Wehrly K)，チェセブロ・ビー(Chesebro B)，コーギー・ビー(Caughey B)，「硫酸化グリカンと昇温とにより、プロテアーゼ耐性プリオンタンパク質のＰｒＰＳｃに依存する無細胞形成が促進される(Sulfated glycans and elevated temperature stimulate PrPSc-dependent cell-free formation of protease-resistant prion protein)」，２００１年，EMBO J，20(3):377-386 
【０１１９】
ウッズ・エイ(Woods A)，マッカーシー・ジェイビー(McCarthy JB)，フルフト・エルティー(Furcht LT)，カウチマン・ジェイアール(Couchman JR)，「フィブロネクチンのＣＯＯＨ末端ヘパリン結合領域からの合成ペプチドは、焦点癒着形成を促進する(A synthetic peptide from the COOH-terminal heparin-binding domain of fibronectin promotes focal adhesion formation.)」，１９９３年，Mol Biol Cell. Jun;4(6):605-13 
【０１２０】
ヨシダ・アイ(Yoshida I)，タシロ・ケイ(Tashiro K)，モンジ・エイ(Monji A)，ナガタ・アイ(Nagata I)、ハヤシ・ワイ(Hayashi Y)，ミツヤマ・ワイ(Mitsuyama Y)，タシロ・エヌ(Tashiro N)，「ラミニンα１鎖カルボキシ末端球状領域のヘパリン結合サイトおよび生物学的活性の確認(Identification of a heparin binding site and the biological activities of the laminin alpha1 chain carboxy-terminal globular domain.)」，１９９９年，J Cell Physiol. Apr;179(1):18-28.
【０１２１】
本発明の具体的な実施態様は以下の通りである。
【０１２２】
（１）（配列ＩＤ番号１）ＷＱＰＰＲＡＲＩ；（配列ＩＤ番号２）ＮＷＣＫＲＧＲＫＱＣＫＴＨ；（配列ＩＤ番号３）ＮＹＫＫＰＫＬ；（配列ＩＤ番号５）ＹＲＧＹＲＧＹＲＧＹＲＧ；（配列ＩＤ番号６）ＹＲＧＲＹＧＹＫＧＫＹＧＹＲＧ；（配列ＩＤ番号７）ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＩＹＶ；（配列ＩＤ番号８）ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ；および（配列ＩＤ番号９）ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲ
からなる群から選ばれたペプチドを含むＰｒＰScを検出するための試薬。
（２）  ＰｒＰScの検出方法であって、
最初に、サンプルを実施態様１に記載のペプチドと接触させ、
ついで、ＰｒＰScを検出する、
ことを含む検出方法。
（３）  ＰｒＰScを検出するための免疫学的検定法であって、
実施態様１に記載のペプチドを結合させた固体担体を供給し、
当該固体担体をサンプルと接触させ、
当該担体を洗浄して結合していないサンプルを除去し、
当該固体担体をプリオンに対し特異性を有する抗体に接触させ、
ＰｒＰScが当該固体担体に結合しているかどうかを決定する検出ステップを実行する
ことを含む免疫学的検定法。
（４）  ＰｒＰScの検出のためのキットであって、
実施態様１に記載のペプチドを結合させた固体担体と、
ラベル付けされた、プリオンに対し特異性を有する抗体と
を含んでなるキット。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】ＩＰ捕捉物とハムスターＰＲＰScの免疫ブロットを示す。
【図２】ＩＰ捕捉物とＢＳＥ  ＰＲＰScの免疫ブロットを示す。
【図３】ペプチドによるｖＣＪＤの脳からのＰＲＰScの免疫捕捉を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2006105988000001.pdf