【手続補正書】
【提出日】平成19年6月1日(2007.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍のＫＲＥＤ活性でエチル４−クロロアセトアセテートをエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートへと変換可能であり、かつ、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの約１．５倍〜約２５倍のＫＲＥＤ活性でエチル４−クロロアセトアセテートをエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートへと変換可能であり、かつ該ＫＲＥＤポリペプチドは、Ａ２Ｖ；Ｋ３Ｅ；Ｆ５ＬまたはＦ５Ｃ；Ｎ７Ｋ；Ｅ９ＧまたはＥ９Ｋ；Ａ１２Ｖ；Ｐ１３Ｌ；Ｐ１４Ａ；Ａ１６ＧまたはＡ１６Ｖ；Ｔ１８Ａ；Ｋ１９Ｉ；Ｎ２０ＤまたはＮ２０Ｓ；Ｅ２１Ｋ；Ｓ２２ＮまたはＳ２２Ｔ；Ｑ２４ＨまたはＱ２４Ｒ；Ｖ２５Ａ；Ｎ３２ＳまたはＮ３２Ｄ；Ａ３６Ｔ；Ｓ４１Ｇ；Ｓ４２Ｎ；Ｉ４５Ｌ；Ａ４８Ｔ；Ｖ５６Ａ；Ｖ６０Ｉ；Ｙ６４Ｈ；Ｎ６５Ｋ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５ＹまたはＮ６５Ｓ；Ｓ６６ＧまたはＳ６６Ｒ；Ｈ６７ＬまたはＨ６７Ｑ；Ｄ６８ＧまたはＤ６８Ｎ；Ｇ７１Ｄ；Ｅ７４ＫまたはＥ７４Ｇ；Ｋ７８Ｒ；Ｋ７９Ｒ；Ｋ８５Ｒ；Ａ８６Ｖ；Ｎ９０Ｄ；Ｓ９３ＮまたはＳ９３Ｃ；Ｄ９５Ｎ、Ｄ９５Ｇ、Ｄ９５Ｖ、Ｄ９５ＹまたはＤ９５Ｅ；Ｋ９８Ｒ；Ｑ９９Ｌ、Ｑ９９Ｒ、またはＱ９９Ｈ；Ｔ１００Ａ；Ｉ１０１Ｖ；Ｑ１０３Ｒ；Ｉ１０５ＶまたはＩ１０５Ｔ；Ｋ１０６ＲまたはＫ１０６Ｑ；Ｈ１１０Ｙ、Ｈ１１０ＣまたはＨ１１０Ｒ；Ｖ１１４Ａ；Ａ１１６Ｇ；Ｉ１２０Ｖ；Ｋ１２４Ｒ；Ｄ１２９ＧまたはＤ１２９Ｎ；Ｄ１３１ＧまたはＤ１３１Ｖ；Ｄ１３２Ｎ；Ｋ１３４Ｍ、Ｋ１３４Ｖ、Ｋ１３４ＥまたはＫ１３４Ｒ；Ｄ１３７ＮまたはＤ１３７Ｇ；Ｑ１３８Ｌ；Ｖ１４０Ｉ；Ｄ１４３Ｎ；Ｌ１４４Ｆ；Ｋ１４５Ｒ；Ｖ１４７Ａ；Ｖ１５０Ａ；Ｈ１５３ＹまたはＨ１５３Ｑ；Ｈ１５７Ｙ；Ｆ１５８ＬまたはＦ１５８Ｙ；Ｒ１５９Ｋ；Ｅ１６０ＧまたはＥ１６０Ｖ；Ｆ１６２ＹまたはＦ１６２Ｓ；Ｅ１６３ＧまたはＥ１６３Ｋ；Ｅ１６５Ｄ、Ｅ１６５ＧまたはＥ１６５Ｋ；Ｋ１６７ＩまたはＫ１６７Ｒ；Ａ１７０Ｓ；Ｖ１７２Ｉ；Ｆ１７３Ｃ；Ｍ１７７ＶまたはＭ１７７Ｔ；Ｈ１８０Ｙ；Ｖ１８４Ｉ；Ｔ１９０Ａ；Ａ１９３Ｖ；Ａ１９４Ｖ；Ｆ２０１Ｌ；Ｋ２０３Ｒ；Ｆ２０９Ｙ；Ｖ２１８Ｉ；Ｎ２２４Ｓ；Ｅ２２６Ｋ、Ｅ２２６ＧまたはＥ２２６Ｄ；Ｓ２２８Ｔ；Ｄ２２９Ａ；Ｖ２３１ＩまたはＶ２３１Ａ；Ｑ２２３ＫまたはＱ２２３Ｒ；Ｅ２３４ＧまたはＥ２３４Ｄ；Ｔ２３５ＫまたはＴ２３５Ａ；Ｎ２３７Ｙ；Ｋ２３８ＲまたはＫ２３８Ｅ；Ｔ２５１Ａ；Ｖ２５５Ａ；Ｆ２６０Ｌ；Ａ２６２Ｖ；Ｔ２７２Ａ；Ｉ２７４Ｌ；Ｉ２７５ＬまたはＩ２７５Ｖ；およびＰ２８３Ｒからなる群より選択される１〜２０個のアミノ酸置換を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２からなる群より選択されるアミノ酸を有する、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
（ａ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一性を有するか；
（ｂ）（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるか；
（ｃ）１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のポリペプチド改変体であるか；
（ｄ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のポリペプチドからの少なくとも２２０アミノ酸残基フラグメントであるか；あるいは、
（ｅ）５０℃にてｐＨ７で６０分間インキュベーションした後に、最初のＫＲＥＤ活性の６０％より多くを保持する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドである；
ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項５】
請求項１、２、３、１６、１７、または１８のうちのいずれか１項に記載のＫＲＥＤポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、遺伝子発現を制御する一つ以上の異種調節配列に対して作動可能に連結されている、ヌクレオチド構築物。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによってコードされる前記ＫＲＥＤポリペプチドの発現の制御配列に対して作動可能に結合されており、該ベクターは、宿主細胞内で該ＫＲＥＤポリペプチドを発現するように該宿主細胞を形質転換し得る、ベクター。
【請求項８】
前記ＫＲＥＤポリペプチドをコードする請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドは、該宿主細胞内で該ＫＲＥＤポリペプチドの発現のための一つ以上の制御配列に対して作動可能に連結されている、宿主細胞。
【請求項９】
単離されかつ精製された、請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１０】
凍結乾燥形態の請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１１】
緩衝化媒体中に請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１２】
補因子としてＮＡＤＨを用いることについて増加した特異性を有する請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、該ポリペプチドは、アミノ酸残基Ｅ２２６における変異を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、Ｅ２２６における変異が、Ｅ２２６Ｇ、Ｅ２２６Ｄ、またはＥ２２６Ｋである、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１４】
増加した熱安定性を有する請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、該ポリペプチドは、アミノ酸残基Ｐ１４、Ｖ１４０、Ｖ１８４またはＡ１９４あるいはそれらの任意の組み合わせにおける変異を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、前記変異は、Ｐ１４Ａ、Ｖ１４０Ｉ、Ｖ１８４Ｉ、またはＡ１９４Ｖのうちの１つ以上である、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも９倍のＫＲＥＤ活性でエチル４−クロロアセトアセテートをエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートへと変換可能であり、かつ該ポリペプチドは、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３６、配列番号５３８、または配列番号５４０のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１３倍のＫＲＥＤ活性でエチル４−クロロアセトアセテートをエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートへと変換可能であり、かつ該ポリペプチドは、配列番号５３６または配列番号５３８のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は、９位においてグリシン、１４位においてアラニン、４２位においてアスパラギン、１９０位においてアラニン、１９４位においてバリンを含む、ポリペプチド。