【手続補正書】
【提出日】平成18年12月6日(2006.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）青年個体の集団中の１またはそれ以上の遺伝子あるいはその一部において見出される、１またはそれ以上の試料中の１またはそれ以上の遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定し、各遺伝子またはセグメントに対して同定される全ての点変異の頻度の合計を計算する工程、
ｂ）高齢個体の集団中の１またはそれ以上の遺伝子あるいはその一部において見出される、１またはそれ以上の試料中の１またはそれ以上の遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定し、各遺伝子またはセグメントに対して同定される全ての点変異の頻度の合計を計算する工程、
ｃ）ａ）で計算された青年集団の選択された遺伝子またはその一部において見出される点変異の頻度の合計をｂ）で計算された高齢集団の同じ遺伝子またはその一部において見出される点変異の頻度の合計と比較する工程であって、ここで、高齢集団における点変異の頻度の合計の有意な低下が、該選択された遺伝子が１またはそれ以上の危険(harmful)対立遺伝子を保持することを示す、工程、
ｄ）集団から単離されたＤＮＡ断片を供給する工程、
ｅ）検出可能な標識で標識された末端高温等融解（ｉｓｏｍｅｌｔｉｎｇ）ドメインを含む二本鎖ＤＮＡ産物を生産するのに適した条件下の高忠実度ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で該断片それぞれの標的領域を増幅する工程、ここで各ＰＣＲ誘導変異の変異率は約５×１０-5以下である、
ｆ）二本鎖ＤＮＡを形成するのに適した条件下で、ｂ）の産物を融解および再アニーリングし、それにより、野生型のホモ二本鎖と点変異を含むヘテロ二本鎖との混合物を生産する工程、
ｇ）該ヘテロ二本鎖と該ホモ二本鎖との融解温度の差に基づいて、ホモ二本鎖からヘテロ二本鎖を分離して、ヘテロ二本鎖を回収し、それにより、点変異を含む標的領域を富化したＤＮＡのプールを生産する工程、
ｈ）ホモ二本鎖の二本鎖ＤＮＡのみが生産される条件下で高忠実度ＰＣＲにて該プールを増幅し、それにより、野生型標的領域を含むホモ二本鎖ＤＮＡと、点変異を含む標的領域を含むホモ二本鎖との混合物を生産する工程、
ｉ）点変異を含む標的領域を含むホモ二本鎖ＤＮＡをＤＮＡの融解温度の差に基づいて分離し、点変異を含む標的領域を含む分離ＤＮＡを回収する工程、ならびに、
ｊ）回収されたＤＮＡの標的領域を配列決定し、標的領域内の点変異を同定する工程、
を含む、１またはそれ以上の危険(harmful)対立遺伝子を保持する遺伝子を同定する方法。
【請求項２】
工程（ｄ）の該集団が、少なくとも１０００の個体を含有するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｄ）の該集団が、少なくとも１０，０００の個体を含有するものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）の該集団が、約１０，０００〜約１，０００，０００の個体を含有するものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）の該集団が、ヒト集団である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該ヒト集団が、同じ人口統計学群の構成員からなるものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該ヒト集団が、ヨーロッパ人種またはその亜集団の個体からなるものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該ヒト集団が、アフリカ人種またはその亜集団の個体からなるものである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
該ヒト集団が、アジア人種またはその亜集団の個体からなるものである、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
該ヒト集団が、インド人種またはその亜集団の個体からなるものである、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
該プールが、該標的領域を含む断片を富化したものである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該高忠実度ＰＣＲが、高忠実度ポリメラーゼにより触媒され、ここでｂ）における各標的領域のコピー数が最高約６回、倍加される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ｇ）において、ホモ二本鎖からヘテロ二本鎖を分離し、かつｈ）において、定常（ｃｏｎｓｔａｎｔ）変性ゲルキャピラリー電気泳動、定常変性ゲル電気泳動、変性グラジェントゲル電気泳動、変性ゲルキャピラリー電気泳動または変性高速液体クロマトグラフィーによりホモ二本鎖ＤＮＡを分離する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ｇ）において、ホモ二本鎖からヘテロ二本鎖を分離し、かつｈ）において定常変性ゲルキャピラリー電気泳動または変性ゲルキャピラリー電気泳動によりホモ二本鎖ＤＮＡを分離する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該標的領域が、約８０〜約３，０００塩基対（ｂｐ）からなる等融解ドメインである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該標的領域が、約８０〜約１０００ｂｐである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
該標的領域が、約１００〜約５００ｂｐである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該標的領域が、タンパク質をコードする遺伝子のエキソンまたはその一部である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
該標的領域が、タンパク質をコードする遺伝子のイントロンとエキソンとの境界点にまたがる、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該標的領域が、タンパク質をコードする遺伝子の調節領域である、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
該標的領域が、タンパク質をコードする遺伝子のイントロンである請求項１記載の方法。
【請求項２２】
該標的領域が、ＲＮＡをコードする遺伝子内にある、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
ａ）青年個体の集団の１またはそれ以上の遺伝子あるいはその一部において見出される、１またはそれ以上の試料中の１またはそれ以上の遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定し、各遺伝子またはセグメントに対して同定される全ての点変異の頻度の合計を計算する工程、
ｂ）高齢個体の集団の１またはそれ以上の遺伝子あるいはその一部において見出される、１またはそれ以上の試料中の１またはそれ以上の遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定し、各遺伝子またはセグメントに対して同定される全ての点変異の頻度の合計を計算する工程、
ｃ）ａ）で計算された青年集団の選択された遺伝子またはその一部において見出される点変異の頻度の合計をｂ）で計算された高齢集団の同じ遺伝子またはその一部において見出される点変異の頻度の合計と比較する工程であって、ここで、高齢集団における点変異の頻度の合計の有意な低下が、該選択された遺伝子が１またはそれ以上の危険(harmful)対立遺伝子を保持することを示す、工程、
を含む、１またはそれ以上の危険(harmful)対立遺伝子を保持する遺伝子を同定する方法。
【請求項２４】
ａ）青年個体の集団の１またはそれ以上の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異のセットを同定し、ここで、該セットは、約または５×１０−５を超える頻度で生じる全ての遺伝性点変異を含み、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｂ）高齢個体の集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異のセットを同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｃ）ａ）で決定された青年集団の選択された遺伝子またはその一部において同定された各点変異の頻度をｂ）で決定された高齢集団の該選択された遺伝子において同定された同じ点変異の頻度と比較する工程であって、ここで、青年集団の該選択された遺伝子と比べての高齢集団の該選択された遺伝子における２またはそれ以上の点変異の頻度の有意な低下が、該選択された遺伝子が危険(harmful)対立遺伝子を保持することを示す、工程、
を含む、危険(harmful)対立遺伝子を保持する遺伝子を同定する方法。
【請求項２５】
ｄ）ｃ）において決定される高齢集団において低下する２またはそれ以上の点変異の頻度を、１またはそれ以上の中間年齢層特異的集団において決定する工程、
ｅ）該２またはそれ以上の点変異の頻度の年齢特異的低下を決定する工程、および
ｆ）頻度の該年齢特異的低下を特定の致死性疾病を引き起こす危険(harmful)対立遺伝子のセットの期待される頻度の年齢特異的低下と比較する工程であって、ここで、ｅ）で決定された頻度の年齢特異的低下は、危険(harmful)対立遺伝子の期待される頻度の年齢特異的低下と有意に異ならないという決定が、該選択された遺伝子は、有害な対立遺伝子を保持し、該致死性疾病を引き起こす可能性が高いことをさらに示す、工程、
をさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ｇ）高齢集団において低下する該２またはそれ以上の点変異の頻度を、１またはそれ以上の発端者集団の該選択された遺伝子において決定する工程、および
ｈ）青年集団における該選択された遺伝子またはその一部中の該２またはそれ以上の点変異の頻度を、発端者集団における該選択された遺伝子またはその一部中の該２またはそれ以上の点変異の頻度と比較する工程であって、ここで、青年集団に対する発端者集団における該１またはそれ以上の点変異の頻度の有意な増加は、該遺伝子が該疾病の原因となる役割を果たす危険(harmful)対立遺伝子を保持することを示す、工程、
をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ｇ）高齢集団において低下する該２またはそれ以上の点変異の頻度を、早期発症疾患を有する個体からなる１またはそれ以上の発端者集団の該選択された遺伝子において決定する工程、および
ｈ）青年集団における該選択された遺伝子またはその一部中の該２またはそれ以上の点変異の頻度を、発端者集団における該選択された遺伝子またはその一部中の該２またはそれ以上の点変異の頻度と比較する工程であって、ここで、青年集団に対する発端者集団における該１またはそれ以上の点変異の頻度の有意な増加は、該遺伝子が二次危険因子である危険(harmful)対立遺伝子を保持することを示す、工程、
をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
該遺伝性点変異が：
ａ）遺伝子またはその一部を含むＤＮＡ断片の第１のプールを提供する工程であって、ここで、該プールは、集団から単離される、工程、
ｂ）検出可能な標識で標識された末端高温等融解ドメインを含む二本鎖ＤＮＡ産物を産生するのに適した条件下で、高忠実度ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で該断片の各々から該遺伝子または一部の標的領域を増幅する工程であって、ここで、各ＰＣＲ誘導変異の変異率が、約５×１０−５以下である、工程、
ｃ）二本鎖ＤＮＡを形成するのに適した条件下でｂ）の産物を融解および再アニーリングし、それによって、野生型ホモ二本鎖と点変異を含むヘテロ二本鎖との混合物を生産する工程、
ｄ）該へテロ二本鎖および該ホモ二本鎖の融解温度の差に基づいてヘテロ二本鎖をホモ二本鎖から分離し、ヘテロ二本鎖を回収し、それにより、点変異を含む標的領域を富化したＤＮＡの第２のプールを生産する工程、
ｅ）ホモ二本鎖の二本鎖ＤＮＡのみが生産される条件下で高忠実度ＰＣＲにて該第２プールを増幅し、それにより、野生型標的領域を含むホモ二本鎖ＤＮＡと点変異を含む標的領域を含むホモ二本鎖ＤＮＡとの混合物を生産する工程、
ｆ）点変異を含む標的領域を含むホモ二本鎖ＤＮＡをＤＮＡの融解温度の差に基づいて分離し、点変異を含む標的領域を含む分離ＤＮＡを回収する工程、ならびに
ｇ）回収されたＤＮＡの標的領域を配列決定し、標的領域内の点変異を同定する工程、
を含む方法を使用して同定される請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
該青年個体の集団が、致死性の疾病に対する危険(harmful)対立遺伝子を最も高い頻度で保持すると期待される発端者集団であり、該高齢集団が、致死性の疾病に対する危険(harmful)対立遺伝子を最も低い頻度で保持すると期待される、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
ａ）早期発症発端者集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｂ）後期発症発端者集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｃ）早期発症発端者集団中の選択された遺伝子またはその一部において見出される点変異の頻度を後期発症発端者集団中の該選択された遺伝子またはその一部における同じ点変異の頻度と比較する工程であって、ここで、後期発症発端者集団と比べての早期発症発端者集団中の１またはそれ以上の点変異の頻度の有意な増加は、該遺伝子が、疾病の出現を促進する二次危険因子である危険(harmful)対立遺伝子を保持する、工程、
を含む、疾病の出現を促進する二次危険因子である危険(harmful)対立遺伝子を保持する遺伝子を同定する方法。
【請求項３１】
ａ）早期発症発端者集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｂ）後期発症発端者集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｃ）ａ）において計算される早期発症発端者集団の選択された遺伝子またはその一部において見出される点変異の頻度をｂ）において計算される後期発症発端者集団の同じ遺伝子またはその一部において見出される点変異の頻度と比較する工程であって、ここで、後期発症発端者集団における点変異の頻度の有意な低下は、選択された遺伝子が、疾病の出現を促進する二次危険因子である危険(harmful)対立遺伝子を保持することを示す、工程、
を含む、疾病の出現を促進する二次危険因子である危険(harmful)対立遺伝子を保持する遺伝子を同定する方法。
【請求項３２】
ａ）青年個体の集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定し、各遺伝子または断片について同定された全ての点変異の頻度の合計を計算する工程、
ｂ）高齢個体の集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定し、各遺伝子または断片について同定された全ての点変異の頻度の合計を計算する工程、
ｃ）ａ）において計算される青年集団の選択された遺伝子またはその一部において見出される点変異の合計頻度をｂ）において計算される高齢集団の同じ遺伝子またはその一部において見出される点変異の合計頻度と比較する工程であって、ここで、高齢集団における点変異の合計頻度の有意な増加は、該選択された遺伝子が、寿命を延ばす単一または複数の対立遺伝子を保持することを示す、工程、
を含む、寿命を延ばす対立遺伝子を保持する遺伝子を同定する方法。
【請求項３３】
ａ）青年個体の集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｂ）高齢個体の集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｃ）ａ）において決定される青年集団の選択された遺伝子またはその一部において同定される各点変異の頻度をｂ）において決定される高齢集団の該選択された遺伝子において同定される同じ点変異の頻度と比較する工程であって、ここで、青年集団の該選択された遺伝子に比べて高齢集団の該選択された遺伝子における２またはそれ以上の点変異の頻度の有意な増加は、該選択された遺伝子が、寿命を延ばす単一または複数の対立遺伝子を保持することを示す、工程、
を含む、寿命を延ばす対立遺伝子を保持する遺伝子を同定する方法。
【請求項３４】
ａ）青年個体の集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｂ）高齢個体の集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定する工程、
ｃ）ａ）において決定される青年集団の選択された遺伝子またはその一部において同定される各点変異の頻度をｂ）において決定される高齢集団の該選択された遺伝子において同定される同じ点変異の頻度と比較する工程であって、ここで、青年集団の該選択された遺伝子に比べて高齢集団の該選択された遺伝子における点変異の頻度の有意な増加は、該選択された遺伝子が、寿命を延ばすかまたは寿命を延ばす遺伝子に連鎖している対立遺伝子を保持することを示す、工程、
を含む、寿命を延ばすかまたは寿命を延ばす遺伝子に連鎖している対立遺伝子を保持する遺伝子を同定する方法。
【請求項３５】
ａ）該疾病に罹患していない青年個体の集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定し、各遺伝子またはその断片において同定される全ての点変異の頻度を合計する工程、
ｂ）該疾病を有する発端者集団の遺伝子またはその一部において見出される遺伝性点変異を同定し、各点変異が生じる頻度を決定し、各遺伝子またはその断片において同定される全ての点変異の頻度を合計する工程、
ｃ）青年集団中の選択された遺伝子またはその一部における点変異の合計頻度を発端者集団中の該選択された遺伝子またはその一部における点変異の合計頻度と比較する工程であって、ここで、発端者集団における点変異の合計頻度の有意な増加は、該遺伝子が、該疾病において原因的役割を果たすことを示す工程、
を含む、疾病の発生率に影響する遺伝子を同定する方法。
【請求項３６】
ａ）５×１０−５以上の頻度で生じる全ての遺伝性点変異のセットを、青年亜集団、高齢亜集団、中間年齢層亜集団、疾病罹患亜集団、早期発症疾病罹患亜集団および後期発症疾病罹患亜集団からなる群から選択される亜集団を含む同じ集団の構成員において別々に決定する工程、ならびに
ｂ）亜集団内の各遺伝性点変異の頻度を決定する工程であって、ここで、青年集団に比べて高齢集団における頻度の低下が、致死性疾病を引き起こすかまたは促進する対立遺伝子を示し、青年集団に比べて中間年齢層集団または高齢集団における頻度の増加が、致死性疾病の発現を抑制または遅延する対立遺伝子を示す工程、
を含む、集団のゲノムの任意の標的領域における１またはそれ以上の有害(deleterious)、危険(harmful)または有益な遺伝性点変異を同定する方法。
【請求項３７】
ａ）５×１０−５以上の頻度で生じる全ての遺伝性点変異のセットを、青年亜集団、高齢亜集団、中間年齢層亜集団、疾病罹患亜集団、早期発症疾病罹患亜集団および後期発症疾病罹患亜集団からなる群から選択される亜集団を含む同じ集団の構成員において別々に決定する工程、
ｂ）亜集団の間内で各遺伝性の点変異の頻度を決定する工程、
ｃ）絶対ノックアウト点変異である点変異を決定する工程であって、約０．０２％〜約２％の全ての絶対ノックアウト点変異の合計頻度は、遺伝子が、生殖を妨害する劣性対立遺伝子を保持することを示し、約０．０２％未満の全ての絶対ノックアウト点変異の合計頻度は、該遺伝子が、生殖を妨害する優性対立遺伝子を保持することを示す工程、
を含む、劣性有害(deleterious)遺伝性点変異または優性有害(deleterious)遺伝性点変異を保持する単一または複数の遺伝子を同定する方法。