(57)【要約】【課題】  過酸化水素による軟骨細胞の死滅（細胞死）を最小限に食い止め、その細胞の絶対数を高いレベルで維持し得る化合物（軟骨細胞破壊抑制剤）を提供すること。【解決手段】  ２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、及び２−エトキシ−４−メチルフェノールからなる群より選択された少なくとも１種の軟骨細胞破壊抑制剤。【効果】  体内で産生される過酸化水素によって誘導される軟骨細胞の細胞死（軟骨細胞数の減少）を最小限に食い止めることができるので、結果的に慢性関節リウマチや変形性関節症などの軟骨細胞破壊性（軟骨細胞分化障害性）疾患を予防あるいは治療することができ、また、別のメカニズムを持つ他の薬剤と併用することにより、より一層軟骨細胞の数を維持することができ、当該疾患を効果的に予防あるいは治療することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする軟骨細胞破壊抑制剤。
【化１】
2006001870.tif 000005
［但し、上記一般式（Ｉ）におけるＲ１はメチル基またはエチル基、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項２】
前記化合物が、２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、及び２−エトキシ−４−メチルフェノールからなる群より選択された少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞破壊抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨細胞破壊抑制剤に関し、詳しくは慢性関節リウマチや変形性関節症などの軟骨細胞破壊性（軟骨細胞分化障害性）の疾患の予防または治療に用いる軟骨細胞破壊抑制剤（以下、単に「抑制剤」ともいう）に関する。
【背景技術】
【０００２】
社会の高齢化に伴い、変形性関節症や慢性関節リウマチなどの軟骨障害疾患の患者は増加の一途をたどり、この領域における更なる技術開発が望まれている。
【０００３】
従来の技術としては、例えば、細胞成長因子とヒスタチンを組み合わせて軟骨細胞の増殖促進をねらった技術が開示されている（特許文献１）。しかしながら、安全性、安定性に鑑み、臨床的応用は確率されていない。
【特許文献１】特開平７−２５８１１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、軟骨細胞の分化の途中あるいは分化後においてその細胞数が、体内で産生された過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）により減少すると言われている。すなわち、体内で産生された過酸化水素に軟骨細胞が曝露されると、その細胞は障害を受け、細胞死の方向に誘導される。本発明者はこの軟骨細胞の細胞死に着目した。すなわち、過酸化水素による軟骨細胞の死滅（細胞死）を最小限に食い止め、その細胞の絶対数を高いレベルで維持することによって慢性関節リウマチや変形性関節症などの軟骨細胞破壊性（軟骨細胞分化障害性）疾患を予防あるいは治療することが効果的であろうと考え、そのような作用を持つ（過酸化水素に曝露されても軟骨細胞の細胞死を回避（予防）し得るような）化合物を種々試みた。いくつかの試行錯誤を重ねた結果、本発明者はついにある種の化合物が軟骨細胞の死滅を抑制することを突き止め、そして本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求項１に記載の抑制剤は、下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする。
【化２】
2006001870.tif 000002
【０００６】
［但し、上記一般式（Ｉ）におけるＲ１はメチル基またはエチル基、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよい。］
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）によって誘導される軟骨細胞の細胞死（軟骨細胞数の減少）を最小限に食い止めることができるので、全体的には軟骨細胞優勢となり、結果的に慢性関節リウマチや変形性関節症などの軟骨細胞破壊性（軟骨細胞分化障害性）疾患を予防あるいは治療することができる。また、別のメカニズムを持つ他の薬剤と併用することにより、より一層軟骨細胞の優勢が図られ、効果的に当該疾患を予防あるいは治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
軟骨細胞破壊抑制剤
前述したように、本発明の抑制剤は、下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなるものである。
【化３】
2006001870.tif 000003
【０００９】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ１はメチル基またはエチル基、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよい。なお、Ｒ１は炭素数１〜２であることが、軟骨細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で好ましく、メチル基であることがさらに好ましい。またＲ２は炭素数１〜３であることが、軟骨細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で好ましく、メチル基あるいはエチル基であることがさらに好ましい。また、Ｒ２は、３または４の位置に結合していることが、軟骨細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で好ましく、４の位置に結合していることがさらに好ましい。以下に具体例を挙げるが、この例示でいう「ブチル」は、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルを総称したものであり、また「プロピル」は、ｎ−プロピル、イソプロピルを総称したものである。すなわち、２−メトキシフェノール（２ＭＰ、グアヤコール）、２−メトキシ−３−メチルフェノール、２−メトキシ−３−エチルフェノール、２−メトキシ−３−プロピルフェノール、２−メトキシ−３−ブチルフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、２−メトキシ−４−プロピルフェノール、２−メトキシ−４−ブチルフェノール、２−メトキシ−５−メチルフェノール、２−メトキシ−５−エチルフェノール、２−メトキシ−５−プロピルフェノール、２−メトキシ−５−ブチルフェノール、２−エトキシフェノール、２−エトキシ−３−メチルフェノール、２−エトキシ−３−エチルフェノール、２−エトキシ−３−プロピルフェノール、２−エトキシ−３−ブチルフェノール、２−エトキシ−４−メチルフェノール、２−エトキシ−４−エチルフェノール、２−エトキシ−４−プロピルフェノール、２−エトキシ−４−ブチルフェノール、２−エトキシ−５−メチルフェノール、２−エトキシ−５−エチルフェノール、２−エトキシ−５−プロピルフェノール、２−エトキシ−５−ブチルフェノールなどが挙げられる。中でも、軟骨細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で、２−メトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＭＰ」ともいう）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＥＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＭＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＥＰ」ともいう）が好ましく、その中でも２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰ、及び２Ｅ４ＭＰが最も好ましい。なお、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は１種類を単独で使用しても良いし、２種以上を併用することもできる。
【００１０】
これら２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰはいずれも、木クレオソートの構成成分である（Ogata N., Baba T.Analysis of beechwood creosote by gas chromatographymass spectrometry and high-performance liquid chromatography. Res Commun Chem Pathol Pharmacol ６６，４１１−４２３（１９８９）,ブナ木クレオソートのガスクロマトグラフィー・質量分析法および高速液体クロマトグラフィー法による分析）。緒方規男（N. Ogata）他著ファーマコロジー（Pharmacology）、４６巻、（１９９３）、第１７３頁には、クレオソートが腸管運動抑制に基づく止瀉作用を有する旨記載されている。また、医薬品製造指針（日本公定書協会編）１９８８年版第２４０頁の胃腸薬製造承認基準において、Ｖ欄の止瀉薬の区分中１項の殺菌剤として収載されている。また、伊藤宏著「薬理学」（（株）蛍光堂、１９８３年１月５日改訂第６版発行）第４１６頁にも、クレオソートは腸内防腐に用いるほか、吸入適応により去痰作用を示す旨記載され、日本薬局方でも、去痰、腸内異常醗酵、食中毒などに用いる旨記載されている。ザ・ユナイテッド・ステーツ・ディスペンサトリー（The United States Dispensatory）、２７th ed.（１９７３）、第３５５頁にも、クレオソートは、外用として殺菌剤、内用として去痰剤として使用される旨記載されている。
【００１１】
塩の形態 
また、本発明の抑制剤は、塩基を用いた塩の形態とすることも可能である。用いる塩としては、薬学的に（薬剤学的に）許容し得る塩であれば特に限定するものではなく、例えば、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リチウムなどの金属塩、アミン類（モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）との塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
【００１２】
軟骨細胞破壊性（軟骨細胞分化障害性）の疾患
本発明の抑制剤を用いる対象疾患名としては、例えば、変形性関節症、慢性または急性の関節リウマチなどが挙げられる。
【００１３】
使用量
本発明の抑制剤の投与量（使用量）については、対象となる動物の種類あるいは性別、年齢、症状の程度によって変わるので一概にはいえないが、ヒトにおける経口投与あるいは直腸内投与（坐剤）の場合は、およそのところ１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇであり、０．５〜５ｍｇであることが好ましく、また注射剤としての投与の場合には、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇであり、０．２５〜２．５ｍｇであることが好ましい。これらの１日量を１回でまたは分２〜分４、あるいはそれ以上の回数に分けて投与することができる。
【００１４】
剤型
本発明の抑制剤は、医療用薬剤における一般的な形態で以て使用される。一般的な形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤や、注射剤（血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与など）、あるいは坐剤などが挙げられる。錠剤、顆粒剤、散剤の形態に調製する際には、従来公知の担体を広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース等の賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ゼラチン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の結合剤、例えば、澱粉、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等の崩壊剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸などの滑沢剤が使用できる。錠剤には、必要に応じて、通常の剤皮を施すこともでき、例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠等とすることができ、さらに二層錠、多層錠としてもよい。また、顆粒剤や散剤も通常の剤皮を施すことができる。
【００１５】
医薬品としてのみならず、本発明の抑制剤は一般の飲食物として摂取することもできる。すなわち、菓子類（クッキー、ビスケット、ケーキ、饅頭、スナック菓子、ガム、キャンデーなど）や飲料水（栄養ドリンク、炭酸飲料水、乳酸飲料水、清涼飲料水など）、インスタント食品（即席麺、即席カレーやシチューなど）、練り食品（ハム、ソーセージ、かまぼこなど）、油脂加工品（バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシングなど）、調味料（ソース、しょう油、塩、コショウなど）、乳製品（ヨーグルト、加工乳など）に含ませて本発明の抑制剤の摂取を図ることもできる。
【実施例】
【００１６】
本発明の一実施例を以下に説明するが、本発明はこれによって限定されない。
【００１７】
実施例１〜３および比較例１
種々の条件下での軟骨細胞の生存率を検討した。なお、軟骨細胞として、マウス胚細胞由来の軟骨細胞様に分化するＡＴＤＣ５（ＲＩＫＥＮ  ＢＡＮＫ，ＲＢＣ０５６５）培養細胞株を用いた。
【００１８】
ＡＴＤＣ５を９６ウエルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、５％ＦＢＳ（牛胎子血清）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変ＭＥＭ）培地を用いて、インキュベーター内で５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で２日間培養した。培養後、ＤＭＥＭで２回洗浄し、細胞を過酸化水素に曝露すべく、９０μｌの５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（インスリン含有）、及び１０μｌの過酸化水素（最終濃度として１ｍＭとなるように調製）、並びに試験液（グアヤコール（２ＭＰ）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ））を各ウエルに入れ、４日間３７℃で培養した。なお、試験液は、ＤＭＥＭに溶解した後、フイルターで除菌した。各実験系の構成を下記［表１］にまとめる。
【表１】
2006001870.tif 000004
【００１９】
その後、培地を同量交換し、細胞増殖／細胞毒性測定用試薬の１つである、Cell Counting Kit-8（同仁化学社製、特許公報第２７５７３４８号公報参照）の溶液（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt (WST-8)5mmol/リットル、1-methoxy phenazine methosulfate（1-methoxy PMS）0.2mmol/リットル、NaClが150mmol/リットル）を各ウエルに１０μｌずつ添加した。そして、炭酸ガスインキュベーター内で３０分呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（参照波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００２０】
結果を図１および図２に示す。図２にあっては、過酸化水素無添加群の吸光度を１００％とした場合の添加群の吸光度を％値（活性％）として算出した。
【００２１】
図から明らかなように、軟骨細胞の細胞死が過酸化水素によってもたらされているが（比較例１）、過酸化水素と２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰを併用した系（実施例１〜３）では、軟骨細胞の生存率が上がっていることから過酸化水素の細胞死誘導を２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰが阻止したと考えられ、これら化合物には過酸化水素による軟骨細胞の細胞死を防ぐ効果があることがこれにより明かである。特に２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰは著効である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（ａ）は過酸化水素無添加群（コントロール）、（ｂ）は過酸化水素添加群（比較例１）、（ｃ）は過酸化水素および２ＭＰ添加群（実施例１）、（ｄ）は過酸化水素および２Ｍ４ＭＰ添加群（実施例２）、（ｅ）は過酸化水素および２Ｍ４ＥＰ添加群（実施例３）の軟骨細胞の状態をそれぞれ示した顕微鏡写真の図である。
【図２】コントロール、比較例１、実施例１、実施例２、及び実施例３の、軟骨細胞の生存率（％）を示すグラフ図である。
【図１】
2006001870.tif 000006
【図２】
2006001870.tif 000007