(57)【要約】【課題】    ヒトTh1/Th2バランスを正確かつ簡便に調べることができる検査方法並びに該検査方法に用いる検査用キットを提供すること。【解決手段】  検査方法は、ヒトから採取した被検試料について、ヒトTh1ヘルパーT細胞又はヒトTh2ヘルパーT細胞に発現した機能分子を利用したヒトTh1ヘルパーT細胞とヒトTh2ヘルパーT細胞のバランスを調べる。この方法を行なうための検査用キットは、ヒトTh1ヘルパーT細胞又はヒトTh2ヘルパーT細胞に発現する機能分子の遺伝子を増幅するプライマー若しくは該遺伝子の少なくとも１領域に相補性を有するプローブ又は前記機能分子と抗原抗体反応する抗体若しくはその抗原結合性断片を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取した被検試料について、ヒトTh1ヘルパーT細胞又はヒトTh2ヘルパーT細胞に発現した機能分子を利用したヒトTh1ヘルパーT細胞とヒトTh2ヘルパーT細胞のバランスを調べる検査方法。
【請求項２】
ヒトから採取した被検試料について、ヒトTh1ヘルパーT細胞及びヒトTh2ヘルパーT細胞に発現した機能分子を利用したヒトTh1ヘルパーT細胞とヒトTh2ヘルパーT細胞のバランスを調べる検査方法。
【請求項３】
前記ヒトTh1ヘルパーT細胞の機能分子が、ヒトのGalectin-3、CD97、DEC1、Onzin、CD49b、20α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ (20α-HSD)及びCX3CR1のうち少なくとも１つであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ヒトTh2ヘルパーT細胞の機能分子が、ヒトのC/EBPα、PCSK3、Notch4、CD6、TDAG51、CD53、Lamininα5、PPARγ、CCR2、CCR10、CCR11及びXCR1のうち少なくとも1つであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒトTh1ヘルパーT細胞又はヒトTh2ヘルパーT細胞に発現する機能分子の遺伝子若しくはそのmRNAを増幅するプライマー若しくは該遺伝子若しくはそのmRNAの少なくとも１領域に相補性を有するプローブ又は前記機能分子と抗原抗体反応する抗体若しくはその抗原結合性断片を含む、請求項１ないし４記載の方法を行なうための検査用キット。
【請求項６】
前記ヒトTh1ヘルパーT細胞の機能分子が、ヒトのGalactin-3、CD97、DEC1、Onzin、CD49b、20α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ (20α-HSD)、CX3CR1のうち少なくとも１つであることを特徴とする請求項５記載の検査用キット。
【請求項７】
前記ヒトTh2ヘルパーT細胞の機能分子が、ヒトのC/EBPα、PCSK3、Notch4、CD6、TDAG51、CD53、Lamininα5、PPARγ、CCR2、CCR10、CCR11及びXCR1のうち少なくとも1つであることを特徴とする請求項５又は６記載の検査用キット。
【請求項８】
DNAアレイの形態にある請求項５ないし７のいずれか１項に記載の検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトTh1/Th2リンパ球による免疫バランスの検査方法及び疾患の診断・治療、さらにはこれに基づく医薬品開発に関するものである。本発明は、特に癌や白血病などの悪性新生物による疾患、糖尿病、肝障害、宿主対移植片反応、多発性硬化症、気道炎症、皮膚炎、動脈硬化等のリンパ球機能分子遺伝子の発現あるいは遺伝子産物であるタンパク質の発現や機能を検査することにより、ヒトTh1/Th2リンパ球による免疫バランスの診断と治療、さらにはこれらリンパ球の発現分子を修飾したり、標的とした化合物により、免疫を制御する医薬品の開発に有用である。
【背景技術】
【０００２】
T細胞に関する最近の免疫学研究の進展から、ヘルパーT細胞がTh1とTh2という2つのサブタイプに分かれ、これらによって多くの免疫反応がコントロールされていることがマウスで明らかにされた（非特許文献１）。その後、同様のヘルパーT細胞サブセットはヒトでも存在することが明らかとなり、Th1とTh2のバランスが、癌、感染症、自己免疫疾患、糖尿病を含む数々の病気の発症や進展に重要な働きを持つと推測されている（非特許文献２、３）。それらによれば、Th1とTh2は相互に機能的なバランスをとっており、このバランスが保たれている場合には健康な状態であるが、バランスが崩れ、Th1に偏向すると、糖尿病、肝障害、気道炎症、宿主対移植片反応、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、動脈硬化、乾癬、腎炎等が、Th2に偏向すると癌、免疫不全、喘息、皮膚炎、アレルギー疾患、腎炎、感染症等が発症すると考えられている。
【０００３】
この理論によれば、Th1/Th2バランスを矯正することが治療につながるため、これらの疾患において、Th1とTh2のどちらにどの程度傾いているか（偏向）ということを知ることは、診断や治療に極めて重要である。
【０００４】
このTh1/Th2バランスの偏向を診断する方法は、現在、特異的なサイトカインの産生を調べることで行われている。すなわち、ヘルパーT細胞を集めてIL-2やIFN-γ等の産生が優位の場合にはTh1側へ、IL-4、IL-5などの産生が優位の場合にはTh2側への偏向しているとされる。しかし、この方法が診断法として確立されているという検証は行われていない（非特許文献４、５）。
【０００５】
このヒトTh1／Th2バランスに基づく免疫制御法は、副作用が少なく、自然で新たな治療に結びつくと期待されており、最近、遺伝子治療、細胞療法などの形で臨床応用が始まってきているほか、細胞医薬としての応用も試みられだした。これらが実現するためには、簡便で有用なヒトTh1/Th2バランスの測定法が必要であるが、現在行われているサイトカイン産生を調べる方法は、一定期間の細胞培養とその後のサイトカインの定量という煩雑で専門的な作業と設備を必要とするため、簡便さと精密さでは問題がある。
【０００６】
これに代わる、よりヒトTh1/Th2バランスの指標となる適切な分子の発見とその分析方法が求められているが、未だ確立はしていない。その課題として、ヒトTh1/Th2バランスの偏向の指標となる標的分子が同定されること、さらに標的分子は１つと限られるわけではないため、どの標的分子に着目した治療法がその患者にとって最も有効かという検証が必要とされる。また、患者の病態に合わせた標的分子の特定とそれを修飾して免疫状態を修正する治療法の開発も求められる。これらの背景には次のような現行医療の問題点が挙げられる。
【０００７】
すなわち、従来の疾患治療の多くは、薬効が期待される薬剤で比較的画一的な治療が行われてきた。しかし、同じ疾患でも患者によりその発症機序や程度が異なったり、また同一の患者にあっても、病気の時期により病態像や機序が異なっているため、画一的な薬剤投与で十分な有効性が認められなかったり、逆に薬剤の副作用が問題となるなど、個人差や病態の違いを十分に考慮されていないために確実な治療方法としては不十分なところがある。
【０００８】
本願出願人は、先にマウスを用いた実験に基づき、Th1及び／又はTh2に発現した機能分子を利用したTh1/Th2バランスを調べる検査方法を出願した（特許文献１）。
【０００９】
【特許文献１】特開2004-147534号公報
【非特許文献１】Mosmann, T.R.: Ann. NY Acd. Sci. 664: 89, 1992
【非特許文献２】Springer Seminars in Immunopathology vol.21(3), 1999
【非特許文献３】最新医学「自己免疫疾患の臨床1998」,32, 1998
【非特許文献４】Wong, C.K. et al. Clin. Exp. Immunol. 125:177, 2001
【非特許文献５】Lassmann H. et al. Trends Mol. Med. 7:115, 2001
【非特許文献６】Christy,R.J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 2593, 1991
【非特許文献７】Mischoulon, D. et al. Mol. Cell. Biol. 12:2553, 1992
【非特許文献８】Metzger, S. et al. J. Biol. Chem. 265:9978, 1990
【非特許文献９】Smith, L.T. et al. Blood. 88:1234, 1996
【非特許文献１０】Artavanis-Tsakonas,S. et al. Science 284:770, 1999
【非特許文献１１】Uyttendaele,H. et al. Development 122:2251, 1996
【非特許文献１２】Imatani,A. et al. Oncogene 19:223, 2000
【非特許文献１３】Pal,A. et al. Immunol. Lett. 49:133, 1996
【非特許文献１４】Aruffo,A. et al. Immunol. Today  18:498, 1997
【非特許文献１５】Kasai,K. et al. J. Biochem. 119:1, 1996
【非特許文献１６】Puche,A.C. et al. Dev. Biol. 179:274, 1996
【非特許文献１７】Hughes,R.C. Glycobiology 4:5, 1994
【非特許文献１８】Pricci,F. Kidney Int. Suppl. 77:S31, 2000
【非特許文献１９】Hamann,J. et al. In: Leukocyte Typing VI. Editors: Kishimoto,T. et al. Garland Publishing,Inc. p527, 1997
【非特許文献２０】Qian,Y.M. et al. Immunology 98:303, 1999
【非特許文献２１】Boudjelal,M. et al. Genes Dev. 11:2052, 1997
【非特許文献２２】Shen,M. et al. Eur. J. Cell Biol. 80:329, 2001
【非特許文献２３】Wu,J.E. et al. Dev. Dyn. 199:292, 1994
【非特許文献２４】Edelman,J.M. et al. Cell Adhes.Commun. 2:131, 1994
【非特許文献２５】Miyake,S. et al. Eur. J. Immunol. 24:2000, 1994
【非特許文献２６】Creemers,J.J.W. et al. Mol.Biol. 11:127, 1992
【非特許文献２７】van Duijnhoven,H.H.L. et al. Hybridoma 11:71, 1992
【非特許文献２８】Park,C.G. et al. Immunity 4:583, 1996
【非特許文献２９】Rho, J. et al. Mol. Cell. Biol. 21:8365, 2001
【非特許文献３０】Wright,M.D. et al. Int. Immunol. 5:209, 1993
【非特許文献３１】Voehringer,D.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:2680, 2000
【非特許文献３２】Hernandez-Torres,J. et al. J. Biol. Chem. 276:35405, 2001
【非特許文献３３】Miner,J.H. et al. J. Biol. Chem. 270:28523, 1995
【非特許文献３４】Sasaki,T. et al. FEBS Letter 509:181, 2001
【非特許文献３５】Zhu,Y. et al. J. Biol. Chem. 268:26817, 1993
【非特許文献３６】Tontonoz,P. et al. Genes & Dev. 8:1224, 1994
【非特許文献３７】Harris,S.G. et al. J. Immunol. 168:1372, 2002
【非特許文献３８】Kovalovsky D. et al. J. Neuroimmunol. 109:23, 2000
【非特許文献３９】Moro M.H. et al. J. Immunol. 166:7404, 2001
【非特許文献４０】Boring,L. et al. J. Biol. Chem. 271:7551, 1996
【非特許文献４１】Boring,L. et al. Nature 394:894, 1998
【非特許文献４２】Homey B. et al. Nat.Med. 8:157, 2002
【非特許文献４３】Schweickart,V.L. et al. J. Biol. Chem.. 275:9950, 2000
【非特許文献４４】Cairns C.M. et al. J.Immunol.. 167:57, 2001
【非特許文献４５】Muehlhoefer A. et al. J.Immunol. 164:3368, 2000
【非特許文献４６】Kasai K. et al. J. Biochem. 119:1, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
今後求められる治療としては、個々の患者の病態の詳細な診断が実施され、その診断結果に基づいて適切な治療法を施すというテーラーメード・セラピー（パーソナライズド・セラピー）が最も有用な治療法と考えられている。このような治療形態を考えると、多くの疾患がヒトTh1/Th2バランスの偏向によって発症すると考えられることから、ヒトTh1/Th2偏向に関する精密で簡便な診断法とそれに基づく治療法の開発が極めて重要である。
【００１１】
したがって、本発明の目的はヒトTh1/Th2バランスを正確かつ簡便に調べることができる検査方法並びに該検査方法に用いる検査用キットを提供することである。さらに、本発明の目的はヒトTh1/Th2バランスを変化させることが可能な、ヒトヘルパーT細胞を活性化又は制御するヒトヘルパーT細胞の加工方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ヒトTh1細胞及びヒトTh2細胞を用いて、ヒトTh1細胞あるいはヒトTh2細胞に選択的に機能分子が発現していることを見出し、この機能分子をヒトTh1/Th2バランスの診断法、治療法ならびに細胞医薬の開発に応用可能であることに想到し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、ヒトから採取した被検試料について、ヒトTh1ヘルパーT細胞又はヒトTh2ヘルパーT細胞に発現した機能分子を利用したヒトTh1ヘルパーT細胞とヒトTh2ヘルパーT細胞のバランスを調べる検査方法を提供する。また、本発明は、ヒトTh1ヘルパーT細胞又はヒトTh2ヘルパーT細胞に発現する機能分子の遺伝子を増幅するプライマー若しくは該遺伝子の少なくとも１領域に相補性を有するプローブ又は前記機能分子と抗原抗体反応する抗体若しくはその抗原結合性断片を含む、上記本発明の方法を行なうための検査用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によるヒトTh1/Th2バランスを測定する検査方法及びそのための検査用キットは、ヒトTh1細胞ならびにヒトTh2細胞に特徴的な機能分子を調べることにより、ヒトTh1/Th2の偏向を検査・診断できるほか、さらに機能分子を標的としたり修飾して免疫を制御する新たな治療法および医薬の開発に応用できる。上述してきたとおり、ヒトTh1/Th2バランスの偏向は種々の疾患の発病や病態に関与していることから、本発明によって疾患の要因、症状の推移を的確に把握することが可能となり、治療方法の選択や医薬品の開発に有用な情報を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上記の通り、本発明の検査方法は、ヒトTh1ヘルパーT細胞（本明細書において、単に「Th1」又は「Th1細胞」ということがある）及び/又はヒトTh2ヘルパーT細胞（本明細書において、単に「Th2」又は「Th2細胞」ということがある）に発現した機能分子を利用したTh1とTh2のバランスを調べることを含む。ここで、「機能分子」とは、Th1又はTh2のいずれか一方において、他方より有意に多く発現又は生産されている、Th1又はTh2のマーカーとして利用可能な分子を意味する。このような分子は、臨床検査分野において通常「マーカー」と呼ばれるものの範疇に入るものであるが、本発明で利用する分子の多くは、それ自体が免疫調節作用を有しているので、本明細書では、「機能分子」と命名した。本発明でいう「機能分子」には、マーカーとして利用可能なポリペプチドのみならず、核ポリペプチドをコードする核酸（例えば、mＲＮＡやそれを鋳型として得られるcＤＮＡ）、及びポリペプチドをコードしていない又はコードしているか否か不明であるが、マーカーとして利用可能な核酸も包含される。
【００１６】
本発明で用いられる、ヒトTh１の機能分子としては、Galactin-3、CD97、DEC1、Onzin、CD49b、20α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ (20α-HSD)、CX3CR1並びにこれらをコードする核酸である。またヒトTh2の機能分子は、 C/EBPα、PCSK3、Notch4、CD6、TDAG51、CD53、Lamininα5、PPARγ、CCR2、CCR10、CCR11、XCR1、並びにこれらをコードする核酸である。これらの分子機能は、単独でも組み合わせても本発明の検査用キットに利用することができる。
【００１７】
以下、これらの機能分子について、具体的に説明する。臨床上の検査・診断や治療法の開発、医薬組成物にあっては、ヒトの機能分子が対象となる。
【００１８】
C/EBPαは、C/EBP (CCAAT/enhancer-binding proteins)ファミリーの１つで、遺伝子の発現を制御する転写因子である。標的遺伝子配列は、T(T/C)NNGNAA(T/G)で、C端にB-Zip構造を持つことが知られている（非特許文献６）。この分子の機能は肝細胞の増殖、脂質代謝、好中球の分化などに重要であることが報告されている（非特許文献７、８、９）。しかしながら、この分子の医療応用上の有用性はまだ明確には見出されてはいない。なお、ヒトC/EBPα遺伝子の塩基配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_004364に記載されている（配列番号１及び２）。
【００１９】
Notchファミリーは、発生過程における細胞間相互作用にかかわる細胞膜レセプター型タンパク質であり、その機能は多岐にわたることが知られている（非特許文献１０）。その中でNotch4は、血管内皮細胞に発現するプロトオンコジーンとして見出されたが、その後いくつかの癌にもその発現が見出されている（非特許文献１１、１２）。しかしながら、Notch4の免疫学上の意義および医療応用上の意義は見出されてはいない。なお、ヒトNotch4遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_004557に記載されている（配列番号３及び４）。
【００２０】
CD6は、T細胞やB細胞の一部、神経細胞の一部などに発現している糖タンパク質である（非特許文献１３）。CD6は、T細胞における副刺激分子として知られ、T細胞の分化や活性化、細胞増殖に関与していることが知られている（非特許文献１４）。しかしながら、免疫疾患との関係や、臨床応用上の意義は定かではない。なお、ヒトCD6遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_006725に記載されている（配列番号５及び６）。
【００２１】
Galectin-3は、Galectinファミリーの１つであり、β-ガラクトース特異的レクチンであり、相補的糖タンパク質と結合することにより、細胞間相互作用など様々な生理作用に関与することが知られている（非特許文献１５）。機能としては、嗅細胞の形態形成やマクロファージなどの接着、糖化タンパク質のレセプターなどが知られてはいるが、必ずしも明確ではない（非特許文献１６、１７、１８、４６）。また、臨床応用上の意義も見出されていない。なお、ヒトGalectin-3遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_002306に記載されている（配列番号７及び８）。
【００２２】
CD97は、EGF様構造を持つ7回膜貫通型レセプターファミリーの１つであり、クラスII型Gタンパク質と共益していることが知られている。またCD97のリガンドは、CD55（Decay-accelerating factor）ということが知られている。CD97は、活性化リンパ球などに発現していることが知られているが、その詳細な機能や役割及び臨床応用上の意義は、明確ではない（非特許文献１９、２０）。なお、ヒトCD97遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_078481に記載されている（配列番号９及び１０）。
【００２３】
DEC1は、塩基性helix-loop-helixタンパク質の１つで、発見された経緯からStra13, Sharp2, BHLHB2 とも呼ばれている転写因子として知られている。DEC1は、神経細胞や線維芽細胞、軟骨細胞などいろいろな細胞に発現しており、細胞の増殖、分化、活性化に関与していることが報告されている（非特許文献２１、２２）。しかしながら、免疫疾患との関係や、臨床応用上の意義は見出されていない。なお、ヒトDEC1遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_003670に記載されている（配列番号１１及び１２）。
【００２４】
Onzinは、2000年にアメリカのNCBI（National Center for Biotechnology Infomation）のGenBankに、LIF（Leukemia Inhibitory Factor）により制御を受ける遺伝子として登録されている（GenBank Accession No.: AF263458）（配列番号１３及び１４）。現在のところ、Onzinに関する報告は、これ以外にはなく、免疫学的な知見や免疫疾患との関連、臨床応用上の意義は見出されていない。
【００２５】
CD49bは、別名インテグリンα2と呼ばれ、インテグリンβ1（CD29）とヘテロ２量体を形成し、VLA-2という接着分子を形成している。VLA-2は細胞外基質のコラーゲンやラミニンと結合し、細胞の分化、活性化、進展などに重要とされている（非特許文献２３、２４、２５）。Ｔ細胞でも発現しており、活性化や細胞浸潤への関与が報告されているが、Th1細胞やTh2細胞に関しては報告されていない。また、Th1/Th2免疫バランスに関する臨床応用上の意義も報告されていない。なお、ヒトCD49b遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_002203に記載されている（配列番号１５及び１６）。
【００２６】
PCSK3（proprotein convertase subtilisin/kexin type 3）は、セリンプロテアーゼの一種である（非特許文献２６、２７）。その機能として、種々の前駆タンパク質からタンパク質を生成することが知られているが、まだその詳細は解明されておらず、またその臨床応用上の意義も見出されていない。なお、ヒトPCSK3遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_002569に記載されている（配列番号１７及び１８）。
【００２７】
TDAG51は、T cell death associated gene 51の略であり、T細胞は活性化を受けた後アポトーシスを起こすが、その際に誘導されるタンパク質である。最近の報告では必ずしも細胞の死と関係あるわけではないとの報告もあり、まだ機能は十分に解明されているわけではない（非特許文献２８、２９）。また免疫疾患への応用が期待されているが、まだその意義は見出されていない。なお、ヒトTDAG51遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_007350に記載されている（配列番号１９及び２０）。
【００２８】
CD53は、白血球に発現している抗原として知られている。細胞の活性化あるいは細胞の死との関係を示唆する報告もあるが、その機能はまだ定かではない（非特許文献３０、３１、３２）。また臨床応用上の意義も見出されてはいない。なお、ヒトCD53遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_000560に記載されている（配列番号２１及び２２）。
【００２９】
Lamininα5は、ラミニンという基底膜を構成する高分子糖タンパク質を構成する分子の１つである。ラミニンの生理活性は、細胞の接着、進展、増殖、分化、細胞間シグナル伝達など多岐に関与していることが知られている（非特許文献３３、３４）。Ｔ細胞が発現するラミニンの意義や生物学的役割などは報告がなく、また臨床応用上の意義も見出されてはいない。なお、ヒトLamininα5遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_005560に記載されている（配列番号２３及び２４）。
【００３０】
PPARγは、脂質代謝系酵素発現の制御に関与しているタンパク質の１つとして見出された。機能としては、脂肪細胞の増殖や分化やプロスタグランディンＪ２のレセプターであることが知られている。プロスタグランディンＪ２のレセプターはＴ細胞にも発現していることが報告され、サイトカイン等の産生に関与していることも報告されている（非特許文献３５、３６、３７）。臨床応用上の意義は、糖尿病、肥満、高脂血症などへの関与や抗炎症作用におけるマーカーとして期待されているが、Th1/Th2免疫バランスに関する報告はなく、その応用が期待される。なお、ヒトPPARγ遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_005037に記載されている（配列番号２５及び２６）。
【００３１】
20α-ヒドロキシステロイドデキドロゲナーゼ（20α-HSD）は、プロゲステロンを代謝し20α-ヒドロキシプロゲステロンを生成する酵素である。20α-HSDにより、プロゲステロンが代謝されることにより、プロゲステロンの作用が失われることも知られている。またプロゲステロンは、他の酵素により代謝され、種々のステロイドホルモンが生成されることが知られている（「細胞機能と代謝マップ  Ｉ．細胞の代謝・物質の動態」（株）東京化学同人，1997）。プロゲステロンは、妊娠中に増加するホルモンであり、妊娠の維持に深く関わっているホルモンである。また、ステロイドホルモンにはその抗炎症作用や免疫抑制作用も知られ、医薬品としても用いられている。プロゲステロンも、抗炎症作用や免疫抑制作用があることも報告されているが（非特許文献３８、３９）、プロゲステロンの代謝におけるT細胞の関与については報告されていない。なお、ヒト20α-HSD遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_001353に記載されている（配列番号２７及び２８）。
【００３２】
CCR2は、Gタンパク質共役型7回膜貫通型のケモカインレセプターである。発現はマクロファージや平滑筋細胞、繊維芽細胞、一部のＴ細胞などに認められることが報告されている。そのリガンドであるケモカインは、MCP-1,MCP-2,MCP-3,MCP-4,MCP-5が知られている（非特許文献４０）。医学的には動脈硬化に関与しているという報告があるが（非特許文献４１）、Ｔ細胞における役割は解明されておらず、臨床応用上の意義も見出されていない。なお、ヒトCCR2遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_000648に記載されている（配列番号２９及び３０）。
【００３３】
CCR10は、Gタンパク質共役型7回膜貫通型のケモカインレセプターである。発現はマクロファージやケラチノサイト、一部のＴ細胞などに認められることが報告されている。そのリガンドであるケモカインは、CCL27、CCL28が知られている。医学的には皮膚の炎症に関与しているという報告があるが（非特許文献４２）、ヒトＴh1細胞やヒトTh2細胞における役割は解明されていない。なお、ヒトCCR10遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. AF215981に記載されている（配列番号３１及び３２）。
【００３４】
CCR11は、Gタンパク質共役型7回膜貫通型のケモカインレセプターである。発現はマクロファージや心臓などに認められることが報告されている（非特許文献４３）。そのリガンドであるケモカインは、MCP-1、MCP-2、MCP-4が知られている。医学的には炎症に関与しているという報告があるが、ヒトＴh1細胞やヒトTh2細胞における役割は解明されていない。なお、ヒトCCR11遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. AF193507に記載されている（配列番号３３及び３４）。
【００３５】
XCR1は、Gタンパク質共役型7回膜貫通型のケモカインレセプターである。発現は胸腺細胞やNK細胞、一部のＴ細胞などに認められることが報告されている。そのリガンドであるケモカインは、lymphotactinが知られている。医学的にはリウマチなどの炎症や免疫反応に関与しているという報告があるが（非特許文献４４）、ヒトＴh1細胞やヒトTh2細胞における役割は解明されていない。なお、ヒトXCR1遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_005283に記載されている（配列番号３５及び３６）。
【００３６】
CX3CR1は、Gタンパク質共役型7回膜貫通型のケモカインレセプターである。発現はマクロファージやＴ細胞などに認められることが報告されている。そのリガンドであるケモカインは、fractalkineが知られている。医学的にはクローン病などの免疫疾患に関与しているという報告があるが（非特許文献４５）、ヒトＴh1細胞やヒトTh2細胞における役割は解明されていない。なお、ヒトCX3CR1遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. NM_001337に記載されている（配列番号３７及び３８）。
【００３７】
本発明では、これらの機能分子を利用することにより、ヒトTh1/Th2バランスの偏向を検査・診断できるほか、これらの機能分子を標的としたり、あるいは修飾化し、免疫を制御する新たな治療法ならびに医薬の開発を提供することができる。
【００３８】
本発明の検査方法は、ヒトから採取したヒトヘルパーT細胞のおける、上記した機能分子の発現量を測定することにより、ヒトTh1/Th2バランスがTh1偏向かTh2偏向かを検査する方法である。好ましい例として、患者のリンパ球から、公知の方法にてRNAを抽出し、メッセンジャーRNA（mＲＮＡ）を精製後、例えばＲＴ−ＰＣＲ法などにより機能分子のｍＲＮＡ発現量を調べることにより、患者のTh1/Th2バランスがTh1偏向かTh2偏向かを検査する方法を挙げることができる。たとえば10個以上のリンパ球、好ましくは106個以上のリンパ球から、たとえばISOGEN（ニッポンジーン社製）などを用いて、トータルＲＮＡを抽出し、オリゴdtプライマーを用いて0.1μｇ以上の、好ましくは1.0μｇ以上のトータルＲＮＡ逆転写して得られたｃＤＮＡを用いて、サーマルサイクラー（たとえばアプライドバイオシステムズジャパン（株）社製GeneAmp9700）にてＰＣＲを行う。増幅したＤＮＡ断片は電気泳動（たとえばコスモバイオ社製i-Mupid J）を行い、特異的に増幅されたバンドをデンシトグラフ（たとえばアトー社製AE-6920）にて測定することもできる。あるいは、各遺伝子に対するDNAプローブ断面を用いたDNAアレイにより遺伝子発現を調べることもできる。Th1とTh2の比は、好ましくは1.5倍以上、さらに好ましくは5倍以上のものとする。検査する方法はこれに限らず、あるいは好ましくは患者のリンパ球のタンパク質を、機能分子に対する抗体又はその抗原結合性断片（例えばFabフラグメント、F(ab')2フラグメント等）を用いて、酵素免疫学的測定法やウェスターンブロット法、フローサイトメトリー法などにて機能分子タンパク質発現量や細胞数を調べることにより、患者のTh1/Th2バランスがTh1偏向かTh2偏向かを検査する方法である。さらには、好ましくは、患者もしくは疾患モデルのリンパ球からタンパク質を抽出し、その機能を各機能分子に適切な方法たとえばゲルシフトアッセイやタンパク質のリン酸化などでしらべることにより、患者のTh1/Th2バランスがTh1偏向かTh2偏向かを検査する方法である。また、好ましくは、患者のリンパ球からTh1やTh2の細胞を誘導するときに、あるいは誘導したTh1やTh2の細胞を例えばCD3抗体などで刺激したときに、発現誘導される機能分子のRNA量やタンパク質量を指標としてTh1/Th2バランスを検査する方法である。上記したRT-PCR等の方法は、上記した通り、各機能分子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列がわかっているので当業者が常法に基づき容易に実施することができるし、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００３９】
また、ヒトヘルパーT細胞の機能分子の遺伝子産物が、細胞活性に影響をもつ場合、これを利用した細胞医薬品の加工に応用する方法も可能である。すなわち、ヒトのGalactin-3、CD97、DEC1、Onzin、CD49b、20α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ (20α-HSD)、CCR2、CX3CR1、C/EBPα、PCSK3、Notch4、CD6、TDAG51、CD53、Lamininα5、PPARγ、CCR10、CCR11及びXCR1のうち少なくとも1つのT細胞の機能分子を標的として、ヒトヘルパーT細胞を活性化又は制御する、ヘルパーＴ細胞を活性化又は抑制する、ヘルパーＴ細胞の加工方法も可能である。具体例としては、ヒトヘルパーT細胞群をプロゲステロン処理することにより、ヒトTh1ヘルパー細胞を制御し、ヒトTh2ヘルパーT細胞群を選択的に回収することができる方法が挙げられる。さらに、機能分子に作用するような医薬品であるプロゲステロンを、たとえばTh1細胞側に偏向した生体に投与することにより、生体Th1/Th2バランスを整えたり偏向させる治療に応用することができる。このような、細胞処理と加工や生体のTh1/Th2バランス調整を行うためには、機能分子の遺伝子産物として作用し得る適切なステロイド剤、抗炎症剤、酸素阻害剤、代謝阻害剤等が用いられる。
【００４０】
本発明で用いる患者の材料は、好ましくはリンパ球であるが、リンパ球を含む組織あるいはリンパ系組織など、本発明で規定される機能分子が含まれる材料であればいずれであってもかまわない。また、採取した材料はそのまま検査しても良いが、試験管や培養プレートなどを用いてインビトロで培養を行った後でもよい。また、培養の際に、プロテインキナーゼ活性化剤、カルシウムオノフェア、ヌクレオチド、サイトカイン誘導物質、マイトージェン、抗体、抗原、癌特異的ペプチドや腫瘍細胞などの適当な刺激物質で刺激してもかまわない。
【００４１】
ここで用いる機能分子の発現量の測定方法は、上記に限らず他の方法でもかまわない。また、測定するものも上記に限らず、DNAであっても良い。また測定対象が発現量ではなく、DNAやRNAの遺伝子配列、タンパク質のアミノ酸配列であってもよい。さらには測定が発現量や構成（核酸やアミノ酸の量や配列）ではなく、機能分子を発現した細胞自体や機能分子を発現した組織さらには生物活性や生理機能などの機能分子の表現機能であってもかまわない。
【００４２】
本発明によって提供される機能分子と病態との関連を調べることにより、診断への対応のみならず、核機能分子を標的としたり、あるいは核機能分子の機能を修飾する物質を医薬として開発することができる。その場合、機能分子自体を発現する細胞や組織、動物、さらには機能分子の遺伝子を導入した細胞あるいは遺伝子を導入した動物を研究材料に用いてもよい。また、機能分子の遺伝子やタンパク質を欠失させたり、遺伝子の突然変異体を導入したり、人工的に合成した遺伝子を付加したり、遺伝子配列の一部を改変したものを導入した形質転換した細胞もしくは動物を用いてもかまわない。このようにして得られるTh1/Th2バランスを制御しうる医薬用途の物質は、患者の病態に合わせたテーラーメイド・セラピー（パーソナライズ・セラピー）として利用することができる。
【００４３】
具体的には、ヒトヘルパーＴ細胞の機能分子の遺伝子、遺伝子発現、遺伝子産物、遺伝子産物の生理活性、遺伝子を導入した細胞の少なくとも１つを指標として、検出手段が、電気泳動、抗体、可視光、蛍光、光の偏向や屈折や散乱、電気伝導度の変化等を検出手段とし、核酸やタンパク質を結合したフィルターやメンブラン、粒子、アレイや固体素子等の不要化物のうち、少なくとも１つを用いることができる。これにより、免疫バランスの偏向した患者の診断が可能となり、それに基づいて、治療のための医薬や治療法の開発が可能となる。医薬は治療法の開発には少なくとも1種類以上の遺伝子の発現あるいは遺伝子産物を指標として、その機能を修飾する方法が用いられる。
【００４４】
機能を修飾する有効成分としては、遺伝子自体、アンチセンス、アプタマー、デコイ型核酸、遺伝子発現調節物質、遺伝子産物、遺伝子産物抗体あるいは遺伝子産物合成阻害物等が挙げられる。
【００４５】
本発明はまた、ヒトTh1ヘルパーT細胞又はヒトTh2ヘルパーT細胞に発現する機能分子の遺伝子若しくはそのmRNAを増幅するプライマー若しくは該遺伝子若しくはそのmRNAの少なくとも１領域に相補性を有するプローブ又は前記機能分子と抗原抗体反応する抗体若しくはその抗原結合性断片を含む、上記本発明の検査方法を行なうための検査用キットをも提供する。プライマーは、上記したRT-PCR等において、機能分子のmRNAやDNAの部分領域にハイブリダイズし、該mRNAやDNAを増幅するものである。ＰＣＲ法やNASBA法のような核酸増幅法自体はこの分野において周知であり、プライマーの塩基配列さえ設定すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。核酸増幅法により検査を行う場合、鋳型となるのは、通常、ｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを鋳型として生成されるｃＤＮＡである。また、核酸プローブを用いた検査方法としては、ノーザンブロット法やサザンブロット法を挙げることができる。核酸プローブとしては、蛍光標識、ビオチン標識、放射標識、酵素標識などで標識した標識プローブを用いることもできるし、固相に不動化して、標的核酸をハイブリダイゼーションにより固相にトラップするための固相プローブとして用いることもできる。複数の固相プローブを１枚の基板の上に整列させたアレイを用いることもできる。核酸の標識化や、固相への不動化は周知の方法により行うことができる。プライマーとして用いる場合、核酸のサイズは、１５塩基以上５０塩基以下が好ましく、２０塩基以上４０塩基以下程度が好ましい。また、プローブとして用いる場合には、サイズは１５塩基以上、鋳型核酸の全長以下である。プライマー又はプローブとして用いる核酸は、ハイブリダイズすべき核酸領域と相補的な塩基配列を有することが好ましいが、１０％以下程度のヌクレオチドが置換していても通常プライマー又はプローブとして用いることができる。また、キットは、上記のとおり、各機能分子に対する抗体又はその抗原結合性断片を含んでいてもよく、複数の機能分子に対する抗体又はその抗原結合性断片を１枚の基板上に整列させたペプチドアレイを含んでいても良い。検査用キットは、任意的に、キットに常用的に含まれている、例えば、各種緩衝液や標識用の試薬等を含んでいてもよい。
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【実施例１】
【００４７】
ヒトTh1細胞およびヒトTh2細胞の誘導
ヒト末梢血よりTh1細胞およびTh2細胞を誘導した。すなわち、ヒト末梢血単核球より、CD4陽性CD45RA陽性ナイーブＴ細胞をFACS VantageTM (BD社)を用いて単離した。このCD4陽性CD45RA陽性ナイーブＴ細胞（5x104 cells/mL）を10%ウシ胎児血清（GIBCO-BRL社）を含んだAIM-V培地（GIBCO社）に顕濁し、あらかじめ抗CD3抗体を固相化した12穴プレートに播種し、培養を行った。Th1細胞の誘導の際にはこの培養系に、IL-12(20U/mL), IFN-γ(15ng/mL), IL-2(20U/mL), 抗IL-4抗体(50μg/mL) を加えた。一方Th2細胞の誘導には、IL-4(30ng/mL), IL-2(20U/mL), 抗IFN-γ抗体(50μg/mL),を加えた。48時間ごとに、上記と同様のサイトカイン、抗体を加えて10日間培養した。細胞が増加するに従い、培養器具はスケールアップし、25cm2のフラスコ、75cm2のフラスコに変えて培養を行った。得られたTh1細胞およびTh2細胞を、ガラスピペットを用い、撹拌しながら遠心管に集め、遠心することにより回収した。
【実施例２】
【００４８】
固相化抗CD3抗体によるヒトTh1細胞およびヒトTh2細胞の刺激
回収したTh1細胞およびTh2細胞を、予め10cmシャーレに固相化した抗CD3抗体（2μg/mL）にて２時間刺激し、上記と同様に回収した。
【実施例３】
【００４９】
RT-PCR法によるGalactin-3、CD97、DEC1、Onzin、CD49b、20α-HSD、CX3CR1のmRNAの測定
未刺激のヒトTh1細胞、ヒトTh2細胞および抗CD3抗体で刺激したヒトTh1細胞、ヒトTh2細胞より、公知の手法により、RT-PCR法にて各遺伝子の mRNA発現量を比較した（"PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications"  Innis, M. A. et al.  ed., Academic Press, San Diego, 1990）。すなわち、ISOGEN（ニッポンジーン社）を用いて、各細胞よりtotal RNAを抽出し、oligo dT プライマーを用いて1μgのtotal RNAから逆転写して得られたcDNAでPCRを行った。PCRの条件は、94℃で2分30秒加熱後、94℃30秒・60℃30秒・72℃1分のサイクルを25回から28回行い、さらに伸長反応を72℃7分間行った。用いたプライマーの配列を表１に示す。増幅したDNA断片は1.2%アガロースゲルで電気泳動を行い、特異的に増幅されたバンドを検出した。検出されたバンドのデンシトメトリーによる解析の結果を表２に示す。
【００５０】
【表１】
2006105843.tif 000002
【００５１】
【表２】
2006105843.tif 000003
【００５２】
表２に示す通り、ヒトTh1細胞にGalactin-3、CD97、DEC1、Onzin、CD49b、20α-Hydroxysteroid dehydrogenase (20α-HSD)、CX3CR1の発現が、ヒトTh2細胞よりも明らかに強く認められた。なお、表２中、「Th1-」は未刺激ヒトＴｈ１細胞、「Th2-」は未刺激ヒトＴｈ２細胞、「Th1+」は抗ＣＤ３抗体刺激ヒトＴｈ１細胞、「Th2+」は抗ＣＤ３抗体刺激ヒトＴｈ２細胞を表す（下記表４においても同じ）。
【００５３】
このように、上記の機能分子活性が活性化したヒトTh1細胞に発現していることが判明し、ヒトTh1/Th2バランスのTh1への偏向を検出できることが明らかとなった。
【実施例４】
【００５４】
RT-PCR法によるC/EBPα、PCSK3、Notch4、CD6、TDAG51、CD53、Lamininα5、PPARγ、CCR2、CCR10、CCR11、XCR1、 のmRNAの測定
未刺激のヒトTh1細胞、ヒトTh2細胞および抗CD3抗体で刺激したヒトTh1細胞、ヒトTh2細胞より、公知の手法により、RT-PCR法にて 各遺伝子の mRNA発現量を比較した（"PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications"  Innis, M. A. et al. ed., Academic Press, San Diego, 1990）。すなわち、ISOGEN（ニッポンジーン社）を用いて、各細胞よりtotal RNAを抽出し、oligo dT プライマーを用いて1μgのtotal RNAから逆転写して得られたcDNAでPCRを行った。PCRの条件は、94℃で2分30秒加熱後、94℃30秒・60℃30秒・72℃1分のサイクルを25回から28回行い、さらに伸長反応を72℃7分間行った。用いたプライマーの配列を表３に示す。増幅したDNA断片は1.2%アガロースゲルで電気泳動を行い、特異的に増幅されたバンドを検出した。検出されたバンドのデンシトメトリーによる解析の結果を表４に示す。
【００５５】
【表３】
2006105843.tif 000004
【００５６】
【表４】
2006105843.tif 000005
【００５７】
表４に示す通り、Th2細胞に C/EBPα、PCSK3、Notch4、CD6、TDAG51、CD53、Lamininα5、PPARγ、CCR2、CCR10、CCR11 XCR1、の発現が強く認められた。
【００５８】
このように、上記の機能分子が活性化したTh2細胞に発現していることが判明し、ヒトTh1/Th2バランスのTh2への偏向が検出できることが明らかとなった。
【配列表】
2006105843000001.app