(57)【要約】      （修正有）【課題】ソマトスタチンアンタゴニストの提供。【解決手段】次式の化合物A1-cyclo[D-Cys-A2-D-Trp-A3-A4-Cys]-A5-Y1またはその医薬的に許容できる塩［式中：Ａ1は、置換されていてもよい芳香族α−アミノ酸であり；Ａ2は、置換されていてもよい芳香族α−アミノ酸であり；Ａ3は、Ｄａｂ、Ｄａｐ、ＬｙｓまたはＯｒｎであり；Ａ4は、β−ヒドロキシバリン、Ｓｅｒ、ＨｓｅｒまたはＴｈｒであり；Ａ5は、置換されていてもよいＤ−またはＬ−芳香族α−アミノ酸であり；Ｙ1は、ＯＨ、ＮＨ2またはＮＨＲ1であり、ここでＲ1は（Ｃ1-6）アルキルであり；式（Ｉ）の各アミドペプチド結合およびＡ1のアミノ基のアミン窒素はメチル基で置換されていてもよく、ただしそのようなメチル基が少なくとも１つある］、およびその使用について提供する。【選択図】図１
2006342171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
A1-cyclo{D-Cys-A2-D-Trp-A3-A4-Cys}-A5-Y1
(I)
またはその医薬的に許容できる塩
［式中：
Ａ１は、置換されていてもよい芳香族α−アミノ酸であり；
Ａ２は、置換されていてもよい芳香族α−アミノ酸であり；
Ａ３は、Ｄａｂ、Ｄａｐ、ＬｙｓまたはＯｒｎであり；
Ａ４は、β−ヒドロキシバリン、Ｓｅｒ、ＨｓｅｒまたはＴｈｒであり；
Ａ５は、置換されていてもよいＤ−またはＬ−芳香族α−アミノ酸であり；
Ｙ１は、ＯＨ、ＮＨ２またはＮＨＲ１であり、ここでＲ１は（Ｃ１−６）アルキルであり；
これらにおいて、置換されていてもよい芳香族α−アミノ酸は、それぞれ独立してハロゲン、ＮＯ２、ＯＨ、ＣＮ、（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ２−６）アルケニル、（Ｃ２−６）アルキニル、（Ｃ１−６）アルコキシ、Ｂｚｌ、Ｏ−ＢｚｌおよびＮＲ９Ｒ１０よりなる群から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立してＨ、Ｏまたは（Ｃ１−６）アルキルであり；
式（Ｉ）の各アミドペプチド結合およびＡ１のアミノ基のアミン窒素はメチル基で置換されていてもよく、ただしそのようなメチル基が少なくとも１つある］。
【請求項２】
Ａ１が、Cpa、1-Nal、2-Nal、2-Pal、3-Pal、4-Pal、Phe、Tfm、TyrまたはTyr(I)であり；
Ａ２が、2-Pal、3-Pal、4-Pal、Phe、TyrまたはTyr(I)であり；
Ａ５が、Dip、1-Nal、2-Nal、2-Pal、3-Pal、4-Pal、PheまたはD-Trpである、
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項３】
Ａ１がＣｐａである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａ３がＮＭｅＬｙｓである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
化合物が次式のものまたはその医薬的に許容できる塩である、請求項１に記載の化合物：
NmeCpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(NMeDCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NHMe;
Cpa-cyclo(DCys-NMe3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-NMeThr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-NMeCys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Nme2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(NMeDCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Dip-NHMe;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Tfm-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2;
Nal-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2;または
3-Pal-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2。
【請求項６】
化合物が次式のものまたはその医薬的に許容できる塩である、請求項４に記載の化合物：
NmeCpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2;
Nal-cyclo(DCys-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2;または
3-Pal-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2。
【請求項７】
化合物が次式のものまたはその医薬的に許容できる塩である、請求項５に記載の化合物：
NmeCpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;または
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2。
【請求項８】
化合物が次式のものまたはその医薬的に許容できる塩である、請求項６に記載の化合物：
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;または
Cpa-cyclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2。
【請求項９】
ソマトスタチンサブタイプ受容体−１、−２、−３、−４および−５のうち１種類以上を結合する方法であって、請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を１種類以上のソマトスタチンサブタイプ受容体と接触させる工程を含む方法。
【請求項１０】
有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を含む、ヒト対象または他の動物対象においてソマトスタチンサブタイプ受容体−１、−２、−３、−４および−５のうち１種類以上を結合するための医薬組成物。
【請求項１１】
細胞からアンタゴニスト作用を誘発する方法であって、細胞が１種類以上のソマトスタチン受容体を含み、細胞を有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩と接触させることを含む方法。
【請求項１２】
有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を含む、ヒトまたは動物対象においてソマトスタチンアンタゴニスト作用を誘発するための医薬組成物。
【請求項１３】
有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を含む、ヒトまたは動物対象において成長ホルモンの放出を促進するための医薬組成物。
【請求項１４】
有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を含む、その必要があるヒトまたは動物対象においてインスリンの放出を促進するための医薬組成物。
【請求項１５】
有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を含む、その必要があるヒトまたは動物対象において創傷の治癒を増進するための医薬組成物。
【請求項１６】
有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を含む、その必要があるヒトまたは動物対象において血管形成を促進するための医薬組成物。
【請求項１７】
ソマトスタチン受容体を有する細胞をイメージングする方法であって、Ｔｙｒ（Ｉ）を含む有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩と細胞を接触させることを含む方法。
【請求項１８】
有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を含む、その必要があるヒトまたは他の動物対象において、短身、悪液質、衰弱、ＩＩ型糖尿病および循環不良よりなる群から選択される疾病または症状を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
Ｂｒａｚｅａｕらが発見したテトラデカペプチドであるソマトスタチン（ＳＲＩＦ）は、下垂体、膵臓および消化管などの組織において種々の分泌プロセスに対する有効な抑制作用をもつことが示された。ＳＲＩＦは、中枢神経系において神経調節物質としても作用する。ＳＲＩＦがもつこれらの生物学的作用はすべて抑制性であり、一連のＧタンパク質結合した受容体により誘発される。受容体について５つの異なるサブタイプが解明されている（ｓｓｔｒ1〜ｓｓｔｒ5）。これら５つのサブタイプは内因性ＳＲＩＦリガンドに対して類似の親和性をもつが、種々の組織における分布が異なる。ソマトスタチンはこれら５つの異なる受容体（ＳＳＴＲ）サブタイプに比較的高い親和性で結合し、各サブタイプに対する親和性は等しい。種々の症状および／または疾病の治療には異なるタイプのソマトスタチンサブタイプへの結合が関連する。（”ｓｓｔｒ2”）（Raynor, et al., Molecular Pharmacol. 43: 838 (1993); Lloyd, et al., Am. J. Physiol. 268: G102 (1995))、一方、インスリンの抑制はソマトスタチンタイプ−５受容体（”ｓｓｔｒ5”）による
（Coy, et al. 197:366-371 (1993)）。成長ホルモンの抑制、より具体的にはＧＨ分泌性腺腫（肢端肥大症）およびＴＳＨ分泌性腺腫の抑制には、タイプ２と５の活性化が関連する。プロラクチン分泌性腺腫の治療には、タイプ５ではなくタイプ２の活性化が関連する。ソマトスタチン受容体サブタイプの活性化が関連する他の適応症は下記のものである：糖尿病、血管障害、増殖性網膜障害、暁現象および腎障害の治療のためのインスリンおよび／またはグルカゴンの抑制；胃酸分泌の抑制、より具体的には消化性潰瘍、腸皮および膵皮フィステル、過敏性腸症候群、ダンピング症候群、漿液性下痢症候群、エイズ関連下痢、化学療法誘発性下痢、急性または慢性膵炎、および消化管ホルモン分泌性腫瘍の抑制；癌、たとえば肝癌の治療；血管形成の抑制、炎症性障害、たとえば関節炎の治療；網膜障害の治療；慢性同種移植片拒絶反応の抑制；血管形成術；移植血管および消化管の出血防止。目的とする生物学的反応に関与する１種類以上の特定のソマトスタチン受容体サブタイプに対して選択的な類似体を入手することにより、不都合な副作用をもたらす可能性のある他の受容体サブタイプとの相互作用を減らすことが好ましい。
【０００２】
有効な低分子ＳＲＩＦアゴニストの開発により、異なるサブタイプに対する種々のトランケート形リガンドの親和性を識別する方法が見いだされた。Ｔｒｐ8−Ｌｙｓ9配列はこの受容体が認識するリガンド中にしばしば存在すると思われる。Ｔｒｐ8−Ｌｙｓ9配列はβ−折れ曲がりの部分を形成し、これは通常はＬ−ＴｒｐからＤ−Ｔｒｐへの置換、主鎖の環化、ジスルフィド橋、またはあらゆる拘束により安定化される。複数の受容体サブタイプが見いだされる前に行われたそのような構造単純化により生じた意図しない結果のひとつは、広域結合親和性の損失であった。その代表例は、オクトレオチド（OCTREOTIDE、登録商標）系列ペプチドにおいてタイプ２親和性は高いが、タイプ１、３、４および５親和性が低いことである。したがって、このタイプの類似体を用いた多くの基礎的な生物学的研究では、１つのタイプ以外のすべてのソマトスタチン受容体が仲介する作用を検出することができなかった。それ以来、一方では生物学的に安定な低分子ペプチドに広域結合性を再導入すること、そして特定の受容体に対する個別の特異性をもつペプチドおよびペプチド模倣体を開発することに向けて、多くの研究が行われた。
【０００３】
本発明者らは、各アミノ酸のＮ−アルキル化によりペプチド主鎖拘束を導入できることを見いだした。この修飾により、当該残基およびその前のアミノ酸が伸長コンホメーションをとるのが大幅に制限される。したがって、潜在的な分子内水素結合部位および同様にタンパク質分解酵素開裂部位がさらにブロックされ、これによりペプチドの薬物動態特性を向上させることができる。市販されているＮ−メチルアミノ酸はごくわずかであり、それらの合成は冗長である。しかし本発明の他の態様において本発明者らは、ＭｉｌｌｅｒおよびＳｃａｎｌａｎが報告した最近の文献から応用した固相法により、トランケート形ソマトスタチン類似体をあらゆるアミノ酸残基においてＮ−メチル化する方法を見いだした。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
１態様において本発明は、式（Ｉ）の化合物：
A1-cyclo[D-Cys-A2-D-Trp-A3-A4-Cys]-A5-Y1
(I)
またはその医薬的に許容できる塩に関する：
式中：
Ａ1は、置換されていてもよい芳香族α−アミノ酸であり；
Ａ2は、置換されていてもよい芳香族α−アミノ酸であり；
Ａ3は、Ｄａｂ、Ｄａｐ、ＬｙｓまたはＯｒｎであり；
Ａ4は、β−ヒドロキシバリン、Ｓｅｒ、ＨｓｅｒまたはＴｈｒであり；
Ａ5は、置換されていてもよいＤ−またはＬ−芳香族α−アミノ酸であり；
Ｙ1は、ＯＨ、ＮＨ2またはＮＨＲ1であり、ここでＲ1は（Ｃ1-6）アルキルであり；
これらにおいて、置換されていてもよい芳香族α−アミノ酸は、それぞれ独立してハロゲン、ＮＯ2、ＯＨ、ＣＮ、（Ｃ1-6）アルキル、（Ｃ2-6）アルケニル、（Ｃ2-6）アルキニル、（Ｃ1-6）アルコキシ、Ｂｚｌ、Ｏ−ＢｚｌおよびＮＲ9Ｒ10よりなる群から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく、Ｒ9およびＲ10はそれぞれ独立してＨ、Ｏまたは（Ｃ1-6）アルキルであり；
式（Ｉ）の各アミドペプチド結合およびＡ1のアミノ基のアミン窒素はメチル基で置換されていてもよく、ただしそのようなメチル基が少なくとも１つある。
【０００５】
１態様において本発明は、下記の式（Ｉ）のペプチドまたはその医薬的に許容できる塩である：
Ａ1が、Cpa、1-Nal、2-Nal、2-Pal、3-Pal、4-Pal、Phe、Tfm、TyrまたはTyr(I)であり；
Ａ2が、2-Pal、3-Pal、4-Pal、Phe、TyrまたはTyr(I)であり；
Ａ5が、Dip、1-Nal、2-Nal、2-Pal、3-Pal、4-Pal、PheまたはD-Trpである。
【０００６】
他の態様において本発明は、Ａ1がＣｐａである上記ペプチド群のペプチドである。
他の態様において本発明は、Ａ3がＮＭｅＬｙｓである上記ペプチド群のペプチドである。
【０００７】
さらに他の態様において本発明は、ペプチドが次式のものまたはその医薬的に許容できる塩である式（Ｉ）のペプチドである：
NmeCpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(NMeDCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NHMe;
Cpa-cyclo(DCys-NMe3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-NMeThr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-NMeCys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Nme2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(NMeDCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Dip-NHMe;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Tfm-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2;
Nal-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2;または
3-Pal-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2。
【０００８】
さらに他の態様において本発明は、ペプチドが次式のものまたはその医薬的に許容できる塩である式（Ｉ）のペプチドである：
NmeCpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2;
Nal-cyclo(DCys-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2;または
3-Pal-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2。
【０００９】
さらに他の態様において本発明は、ペプチドが次式のものまたはその医薬的に許容できる塩である式（Ｉ）のペプチドである：
NmeCpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;
Cpa-cyclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;または
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2。
【００１０】
さらに他の態様において本発明は、ペプチドが次式のものまたはその医薬的に許容できる塩である上記ペプチド群のペプチドである：
Cpa-cyclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2;または
Cpa-cyclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2。
【００１１】
他の形態において本発明は、ソマトスタチンサブタイプ受容体−１、−２、−３、−４および−５のうち１種類以上を結合する方法であって、請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を１種類以上のソマトスタチンサブタイプ受容体と接触させる工程を含む方法である。
【００１２】
前記形態の１態様において本発明は、ヒト対象または他の動物対象においてソマトスタチンサブタイプ受容体−１、−２、−３、−４および−５のうち１種類以上を結合する方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩をその必要がある対象に投与する工程を含む方法である。
【００１３】
他の態様において本発明は、細胞からソマトスタチンアンタゴニスト作用を誘発する方法であって、細胞が１種類以上のソマトスタチン受容体を含み、細胞を有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩と接触させることを含む方法である。
【００１４】
さらに他の態様において本発明は、ヒト対象または他の動物対象においてソマトスタチンアンタゴニスト作用を誘発する方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩をその必要がある対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１５】
他の態様において本発明は、ヒトまたは動物対象において成長ホルモンの放出を促進する方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を対象に投与することを含む方法である。
【００１６】
他の態様において本発明は、その必要があるヒトまたは動物対象においてインスリンの放出を促進する方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を対象に投与することを含む方法である。
【００１７】
他の態様において本発明は、その必要があるヒトまたは動物対象において創傷の治癒を増進する方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を対象に投与することを含む方法である。
【００１８】
さらに他の態様において本発明は、その必要があるヒトまたは動物対象において血管形成を促進する方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を対象に投与することを含む方法である。
【００１９】
他の態様において本発明は、その必要があるヒトまたは他の動物対象において疾病または症状を処置する方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩を対象に投与する工程を含み、その際、疾病または症状が短身（ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｅ）、悪液質、衰弱、ＩＩ型糖尿病、循環不良などよりなる群から選択されるものである方法である。
【００２０】
他の態様において本発明は、ソマトスタチン受容体を有する細胞をイメージングする方法であって、Ｔｙｒ（Ｉ）を含む有効量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容できる塩と細胞を接触させることを含む方法である。
【００２１】
詳細な説明
当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最大限に利用できる。したがって以下の具体的な態様は単なる本発明の説明と解釈すべきであり、本発明の全範囲を限定するためのものではない。
【００２２】
当業者に周知のように、ソマトスタチンの既知の用途および潜在的な用途は多種多様である。ソマトスタチンおよびその類似体は下記に挙げる疾病および／または症状の処置に有用であることが知られている。ソマトスタチンの多様な用途は下記のようにまとめることができる：クッシング症候群 (参照：Clark, R. V. et al, Clin. Res. 38, p. 943A, 1990)；ゴナドトロピン産生腫瘍 (参照：Ambrosi B., et al., Acta Endocr. (Copenh.) 122, 569-576, 1990)；副甲状腺機能亢進症(参照：Miller, D., et al., Canad. Med. Ass. J., Vol. 145, pp. 227-228, 1991)；ページェット病(参照：Palmieri, G. M. A., et
al., J. of Bone and Mineral Research, 7, (Suppl. 1), p. S240 (Abs. 591), 1992)；ＶＩＰ産生腫瘍 (参照：Koberstein, B., et al., Z. Gastroenterology, 28, 295-301, 1990 および Christensen, C., Acta Chir. Scand. 155, 541-543, 1989)；膵島細胞症およびインスリン過剰症(参照：Laron, Z., Israel J. Med. Sci., 26, No. 1, 1-2, 1990；Wilson, D. C., Irish J. Med. Sci., 158, No. 1, 31-32, 1989；および Micic, D., et al., Digestion, 16, Suppl. 1.70. Abs. 193, 1990)；ガストリン産生腫瘍 (参照：Bauer, F. E., et al., Europ. J. Pharmacol., 183, 55 1990)；ゾリンジャー-エリソン症候群 (参照：Mozell, E., et al., Surg. Gynec. Obstet., 170, 476-484, 1990)；エイズその他の症状に関連する分泌過多性下痢 (エイズによるもの：参照：Cello, J. P., et al., Gastroenterology, 98, No. 5, Part 2, Suppl., A163 1990；ガストリン放出ペプチド過多によるもの：参照：Alhindawi, R., et al., Can. J. Surg., 33, 139-142, 1990；腸移植片対宿主疾患に伴うもの：参照： Bianco J. A., et al., Transplantation, 49, 1194-1195, 1990；化学療法関連の下痢：参照：Petrelli, N., et al., Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol., Vol. 10, P 138, Abstr. No. 417 1991)；過敏性腸症候群 (参照：O'Donnell, L. J. D., et al., Aliment. Pharmacol. Therap., Vol. 4., 177-181, 1990)；膵炎 (参照：Tulassay, Z., et al., Gastroenterology, 98, No. 5, Part 2, Suppl., A238, 1990)；クローン病 (参照：Fedorak, R. N., et al., Can. J. Gastroenterology, 3, No. 2, 53-57, 1989)；全身性硬化症 (参照：Soudah, H., et al., Gastroenterology, 98, No. 5, Part 2, Suppl., A129, 1990)；甲状腺癌 (参照：Modigliani, E., et al., Ann., Endocr. (Paris), 50, 483-488, 1989)；乾癬 (参照：Camisa, C., et al., Cleveland Clinic J. Med., 57 No. 1, 71-76, 1990)；低血圧症 (参照：Hoeldtke, R. D., et al., Arch. Phys. Med. Rehabil., 69, 895-898, 1988 および Kooner, J. S., et al., Brit. J. Clin. Pharmacol., 28, 735P-736P, 1989); パニック発作 (参照：Abelson, J. L., et al., Clin. Psychopharmacol., 10, 128-132, 1990); 硬腫（sclerodoma）(参照：Soudah, H., et al., Clin. Res., Vol. 39, p. 303A, 1991); 小腸閉塞 (参照：Nott, D. M., et al., Brit. J. Surg., Vol. 77, p. A691, 1990); 胃食道逆流症 (参照：Branch, M. S., et al., Gastroenterology, Vol. 100, No. 5, Part 2 Suppl., p. A425, 1991); 十二指腸胃逆流症 (参照：Hasler, W., et al., Gastroenterology, Vol. 100, No. 5, Part 2, Suppl., p. A448, 1991); グレーブズ病 (参照：Chang, T. C., et al., Brit. Med. J., 304, p. 158, 1992); 多嚢胞性卵巣 (参照：Prelevic, G. M., et al., Metabolism Clinical and Experimental, 41, Suppl. 2, pp 76-79, 1992); 上部消化管出血 (参照：Jenkins, S. A., et al., Gut., 33, pp. 404-407, 1992 および Arrigoni, A., et al., American Journal of Gastroenterology, 87, p. 1311, (abs. 275), 1992); 膵仮性嚢胞および腹水 (参照：Hartley, J. E., et al., J. Roy. Soc. Med., 85, pp. 107-108, 1992); 白血病 (参照：Santini, et al., 78, (Suppl. 1), p. 429A (Abs. 1708), 1991); 髄膜腫 (参照：Koper, J. W., et al., J. Clin. Endocr. Metab., 74, pp. 543-547, 1992); ならびに癌悪液質 (参照：Bartlett, D. L., et al., Surg. Forum., 42, pp. 14-16, 1991)。以上の参考文献の内容を本明細書に援用する。
【００２３】
本発明のペプチドは、ソマトスタチンの１種類以上の活性に対するアンタゴニストとして有用である。たとえば、本発明のペプチドを用いて対象（たとえばヒト患者などの哺乳動物）における成長ホルモンまたはインスリンの放出を促進することができる。したがってこれらのペプチドは、成長ホルモンまたはインスリンの放出促進が有益となる生理学的状態の処置に有用である。本発明のペプチドは、創傷治癒の増進または血管形成の促進にも使用できる。さらにＴｙｒ（Ｉ）残基をもつ本発明ペプチドは、ソマトスタチン受容体を含む細胞のイメージングに使用できる。そのような本発明ペプチドは、インビボでソマトスタチン受容体をもつ細胞（たとえば癌細胞）の検出に、またはインビトロでソマトスタチン受容体結合アッセイにおける放射性リガンドとして使用できる。この本発明ペプチドは、放射性同位体で細胞をターゲティングするためのベクターとしても使用できる。
【００２４】
同様に本発明の範囲に含まれるのは、成長ホルモンまたはインスリンの放出を促進する必要を伴う疾病または障害を処置する際に使用するための、かつソマトスタチン受容体の検出、たとえば放射線イメージング法に使用するための、前記一般式に含まれるペプチドである。
【００２５】
式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容できる塩は、経口、非経口（たとえば筋肉内、腹腔内、静脈内もしくは皮下への注射、または埋込み）、鼻、膣、直腸、舌下または局所投与経路で投与でき、医薬的に許容できるキャリヤーと配合して各投与経路に適切な剤形を得ることができる。
【００２６】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形においては、有効化合物を少なくとも１種類の医薬的に許容できる不活性キャリヤー、たとえばショ糖、乳糖またはデンプンと混合する。そのような剤形は、常法によりこれらの不活性希釈剤以外の物質、たとえばステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含むこともできる。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、これらの剤形は緩衝剤を含むこともできる。錠剤および丸剤はさらに腸溶コーティングを備えたものとして製造できる。
【００２７】
経口投与用の液体剤形には、当技術分野で慣用される不活性希釈剤、たとえば水を含有する、医薬的に許容できる乳剤、液剤、懸濁液剤、シロップ剤、エリキシル剤が含まれる。そのような不活性希釈剤のほかに、組成物は佐剤、たとえば湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、ならびに甘味剤、着香剤および香料を含有することもできる。
【００２８】
非経口投与用の本発明製剤には、無菌の水性または非水性の液剤、懸濁液剤または乳剤が含まれる。非水性の溶剤またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、たとえばオリーブ油およびトウモロコシ油、ゼラチン、ならびに注射用有機エステル、たとえばオレイン酸エチルである。そのような剤形は、佐剤、たとえば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含有してもよい。それらは、たとえば細菌捕獲フィルターによる濾過により、殺菌剤を組成物に含有させることにより、組成物の照射により、または組成物の加熱により殺菌できる。それらを無菌固体組成物の形で調製し、使用直前に無菌水または他のいずれかの無菌注射用媒質に溶解することもできる。
【００２９】
直腸または膣投与用組成物は好ましくは坐剤であり、これらは有効物質のほかに賦形剤、たとえばカカオ脂または坐剤用ろうを含有することができる。
鼻または舌下投与用組成物も、当技術分野で周知の標準的賦形剤を用いて製造される。
【００３０】
本発明組成物中の有効成分の用量は変更できるが、有効成分の用量は適切な剤形が得られるものでなければならない。選択する用量は、目的とする療法効果、投与経路および処置期間に依存する。目的とする療法効果を得るためには、一般に１日当たり２５μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）のレベルの量を、１回量として、または多数回に分けて、ヒトまたは他の動物、たとえば哺乳動物に投与する。
【００３１】
好ましい一般用量範囲は１日当たり２５０μｇ／ｋｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、これを１回量として、または多数回に分けて投与できる。
さらに、式（Ｉ）の化合物をたとえば下記の特許に記載される持効性組成物として投与できる。これらの配合物のうち、１４日または２８日徐放性配合物が好ましい。ＵＳＰ５，６７２，６５９には、ペプチドおよびポリエステルを含む持効性組成物が教示されている。ＵＳＰ５，５９５，７６０には、ゲル化可能な形のペプチドを含む持効性組成物が教示されている。ＵＳＰ５，８２１，２２１には、ペプチドおよびキトサンを含む持効性高分子組成物が教示されている。ＵＳＰ５，９１６，８８３には、ペプチドおよびシクロデキストリンを含む持効性組成物が教示されている。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１１８０（公開番号ＷＯ９９／３８５３６、１９９９年８月５日）には、吸収可能な持効性ペプチド組成物が教示されている。以上の特許および出願の内容を本明細書に援用する。
【００３２】
即効性または持効性組成物の使用は、目標とする適応症のタイプに依存する。適応症が急性または過急性障害からなる場合、持効性組成物による治療より即効性剤形による治療の方が好ましいであろう。これに対し、予防または長期治療のためには持効性組成物が一般に好ましいであろう。
【００３３】
略号
ソマトスタチン受容体サブタイプの命名法はIUPHARの推奨に従う。ｓｓｔｒ4は最初にBrunoらがクローニングした受容体を表わし、ｓｓｔｒ5は最初にO'Carrollらがクローニングした受容体を表わす。
【００３４】
一般アミノ酸の略号はIUPAC-IUBの推奨に従う。さらに本明細書中で用いる特定の略号の定義は下記のとおりである：
Abu     =  (-アミノ酪酸；
Aib     =  (-アミノイソ酪酸；
β-Ala  =  (-アラニン；
Amp     =  4-アミノフェニルアラニン；
Ava     =  5-アミノ吉草酸；
Cha     =  シクロヘキシルアラニン；
Cpa     =  3-(4-クロフェニル)アラニン；
Dab     =  2,4-ジアミノ酪酸；
Dap     =  2,3-ジアミノプロピオン酸；
Dip     =  3,3'-ジフェニルアラニン；
Gaba    =  (-アミノ酪酸；
HSer    =  ホモセリン；
1-Nal   =  3-(1-ナフチル)アラニン；
2-Nal   =  3-(2-ナフチル)アラニン；
Nle     =  ノルロイシン；
Nva     =  ノルバリン；
2-Pal   =  3-(2-ピリジル)アラニン；
3-Pal   =  3-(3-ピリジル)アラニン；
4-Pal   =  3-(4-ピリジル)アラニン；
Tfm     =  トリフルオロメチル；および
TfmA    =  4-トリフルオロメチルフェニルアラニン；
Tyr(I)  =  ヨウ素化チロシン残基(たとえば3-1-Tyr、5-I-Tyr、3,5-I-Tyr)ヨウ素は放射性同位体、たとえばI125、I127またはI131であってもよい。
【００３５】
下記の特定の試薬の略号も本明細書中に用いられる：
DBU    =  1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン；
DCM    =  ジクロロメタン；
DIC    =  ジイソプロピルカルボジイミド；
DIEA   =  ジイソプロピルエチルアミン；
DMF    =  ジメチルホルムアミド；
MTBD   =  1,3,4,6,7,8-ヘキサヒドロ-1-メチル-2H-ピリミド[1,2-a]ピリミジン；
o-NBS  =  2-ニトロベンゼンスルホニル；
TBTU   =  O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；および
TFA    =  トリフルオロ酢酸。
【００３６】
本明細書においてＮ−末端アミノ酸(たとえばＡ1についてのＣｐａ)以外のすべてのアミノ酸の略号が-NH-CH(R)-CO-の構造を表わし、ここでＲはアミノ酸の側鎖(たとえばＡｌａについてのＣＨ3)である。Ｎ−末端アミノ酸については、略号は(R1R2)-N-CH (R)-CO-の構造を表わし、ここでＲはアミノ酸の側鎖であり、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してＨまたは本明細書に定義した他のものである。
【００３７】
脂肪族アミノ酸は、１つまたは２つの側鎖をもつα−アミノ酸であり、側鎖は独立して炭化水素、たとえば炭素原子１〜６個の直鎖または分枝鎖である。脂肪族アミノ酸の例には、Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｌｅ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、ＮｖａまたはＡｂｕが含まれる。
【００３８】
”芳香族α−アミノ酸”が意味するものは、次式のアミノ酸残基である：
【００３９】
【化１】
2006342171.tif 000003
【００４０】
式中、Ｚ1は芳香環を含む部分であり、Ｚ2は水素または芳香環を含む部分である。そのような芳香環を含む部分には、ベンゼン環またはピリジン環および下記の構造が含まれるが、それらに限定されない。芳香環は１個以上の置換基Ｘを含むか、または含まない（Ｘはそれぞれの場合独立してハロゲン、ＮＯ2、ＣＨ3、ＯＣＨ3、ＣＦ3またはＯＨである）：
【００４１】
【化２】
2006342171.tif 000004
【００４２】
本発明の芳香族α−アミノ酸の他の例は、置換されたＨｉｓ、たとえばＭｅＨｉｓ、Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）またはＨｉｓ（π−Ｍｅ）である。
本明細書中で用いる”アルキル”は、表示した長さをもつ直鎖または分枝鎖構造いずれのアルキル基も含むものとする。そのようなアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどである。用語Ｃ0アルキルが定義に含まれる場合、これは共有単結合を表わすものとする。
【００４３】
”低級アルキル”という用語は、炭素原子１〜６個の分枝鎖および直鎖アルキル基の両方を含むものとする。
本明細書中で用いる”アリール”は、各環が最高７員の安定な単環式、二環式または三環式炭素環を含むものとし、その際少なくとも１つの環は芳香環である。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ビフェニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、フェナントレニルなどが含まれる。
【００４４】
本明細書中で用いる”ヘテロサイクリル（複素環）”は、安定な５〜７員単環式複素環、または安定な８〜１１員二環式複素環、または安定な１１〜１５員三環式複素環を表わす。これらは飽和または不飽和であり、炭素原子、ならびにＮ、ＯおよびＳよりなる群から選択される１〜４個の異種原子からなる。前記複素環のいずれかがベンゼン環に縮合した二環式基も含まれる。複素環式環は、安定な構造を形成するいかなる異種原子または炭素原子においても結合できる。そのような複素環式要素には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アゼピニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、クロマニル、シンノリニル、ジヒドロベンゾフリル、ジヒドロベンゾチエニル、ジヒドロベンゾチオピラニル、ジヒドロベンゾチオピラニルスルホン、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、イソクロマニル、イソインドリニル、イソキノリニル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オキサジ
アゾリル、２−オキソアゼピニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、ピリジル、ピリジルＮ−オキシド、キノキサリニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロ−キノリニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアゾリル、チアゾリニル、チエノフリル、チエノチエニル、チエニルなど。
【００４５】
”置換された”という用語は、１個以上の当該置換基（たとえばハロ、ヒドロキシ、低級アルキルなど）で置換された当該基（たとえば低級アルキル、アリール、シクロアルキルなど）を含むものとする。置換基はその基のいずれの原子に結合していてもよい。
【００４６】
略号”ＮＭｅ”は”Ｎ−メチル−”を表わす。本明細書中で用いるＮＭｅは、関連アミノ酸のアミド窒素がメチル化されていることを示す。たとえば”ＮｍｅＣｐａ”は-N(CH3)-CH(R)-CO-（Ｒは４−クロロフェニル）、”Ｎｍｅ２−Ｎａｌ”は-N(CH3)-CH(R)-CO-（Ｒは２−ナフチル）などを表わす。
【００４７】
アルコキシという用語は、表示した長さの直鎖または分枝鎖構造のアルコキシ基を含むものとする。そのようなアルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ヘキソキシ、イソヘキソキシなどである。
【００４８】
ハロゲンまたはハロという用語は、ハロゲン原子であるフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含むものとする。
アミノ酸残基が光学活性である場合、Ｄ−形と特に表示しない限りＬ−形であるものとする。
【００４９】
材料
４−メチルベンゾヒドリルアミン塩酸塩樹脂（０．２５または０．５ミリ当量／ｇ）をAdvanced ChemTech Inc.（ケンタッキー州ルイビル）から入手した。Ｎαｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護されたアミノ酸をBachem Inc.（カリフォルニア州トランス）、Advanced ChemTech Inc.およびSynthetech Inc.（オレゴン州アルバニー）から購入した。アミノ酸の反応性側鎖を下記の１以上の基で遮断した：Ｃｙｓ，４−メチルベンジルオキシカルボニル；Ｌｙｓ，２−クロロベンジルオキシカルボニル；Ｔｈｒ，Ｏ−ベンジル；Ｔｙｒ，Ｏ−２，６−ジクロロベンジル。試薬および溶媒はすべてＡＣＳ等級以上であり、それ以上精製せずに用いられた。
【００５０】
ペプチド合成
ペプチド合成は下記の反応経路により概説できる：
【００５１】
【化３】
2006342171.tif 000005
【００５２】
式（Ｉ）の化合物は、４−メチルベンゾヒドリルアミン官能化１％架橋ポリスチレン樹脂（０．２５または０．５ミリ当量／ｇ）上、０．２５ｍｍｏｌ規模で、Advanced ChemTech（２００型）合成装置により、下記のプロトコルを用いて合成でき、この方法で合成された：脱ブロック、４０％ＴＦＡ（２分、２０分）；ＤＣＭ洗浄サイクル（３回洗浄）；中和、１０％ＤＩＥＡ（１分、５分）；ＤＭＦ洗浄サイクル；ＤＣＭ洗浄サイクル（２回洗浄）；２回の結合；１回目は１，３−ジイソプロピルカルボジイミドエステル（３当量）を用いてＤＣＭ中で３０分間；ＤＣＭ洗浄（３回洗浄）；２回目の結合は予備調製ＴＢＴＵエステル（３当量）を用いてＤＭＦ中で９０分間、触媒量のＤＩＥＡを使用；ＤＭＦ洗浄（１回洗浄）；ＤＣＭ洗浄（３回洗浄）。結合反応を定性的にモニターする。
【００５３】
Ｎα−保護
目的とするメチル化部位のアミノ基を脱ブロックした後、樹脂をＤＣＭ（２０ｍＬ）に懸濁した。この懸濁液にコリジン（３当量）およびｏ−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（３当量）を添加し、混合物をAdvanced ChemTech（２００型）合成装置で２時間振とうした。次いで樹脂をＤＣＭ洗浄（２回洗浄）およびＤＭＦ洗浄（３回洗浄）した。保護をニンヒドリン試験により定性的にモニターする。
【００５４】
Ｎα−メチル化
ｏ−ニトロベンゼンスルホンアミド保護した樹脂をＤＭＦ（２０ｍＬ）に懸濁し、これにＭＴＢＤ（３当量）および４−ニトロベンゼンスルホン酸メチルまたはジメチル硫酸（Ｃｙｓ11について）を添加した。混合物をAdvanced ChemTech（２００型）合成装置で０．５時間振とうし、樹脂をＤＭＦ洗浄（４回洗浄）した。
【００５５】
Ｎα−Ｍｅ脱保護
目的残基をメチル化した後、樹脂を再びＤＭＦ（２０ｍＬ）に懸濁した。この懸濁液にＤＢＵ（３当量）および２−メルカプトエタノール（３当量）を添加し、混合物をAdvanced ChemTech（２００型）合成装置中で０．５時間撹拌した。次いで樹脂をＤＭＦ（５回
洗浄）で十分に洗浄した。
【００５６】
以上のメチル化法は、ジメチル化誘導体になったＤ−Ｃｙｓ6（たとえば化合物２および１０参照）以外のすべての残基について良好に行われた。しかしＤ−Ｃｙｓ6をＣｙｓ6に代えるとモノメチル化ペプチドが得られた。
【００５７】
ペプチドの開裂
捕そく剤アニソール（約３０％ｖ／ｖ）を含有する無水フッ化水素を用いて０℃で４５分間の酸加水分解により、ペプチドを樹脂支持体から開裂させ、同時に側鎖を脱保護した。ペプチドを９０％酢酸（約６００ｍＬ）中でわずかに過剰のＩ2により環化した（１５分間）。次いでアスコルビン酸の添加により過剰のＩ2を除去した。
【００５８】
精製
粗製ペプチドを、Ｃ−１８結合シリカゲル上、軸圧縮カラム（Dynamax-300Å、５または８μｍ、２１．４×２５０ｍｍ）を用いる調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。直線勾配溶離系を２０ｍＬ／分の流速で用いた：Ａ；０．１％ＴＦＡ、Ｂ；８０％ＭｅＣＮ中の０．１％ＴＦＡ、２０％Ｂ〜５０％Ｂ、１％／分。分離を分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより２１５ｎｍでモニターした。生成物含有画分をプールし、真空濃縮し、凍結乾燥した。各ペプチドが酢酸水溶液からの凍結乾燥により一定重量の綿毛状白色粉末として得られた。最終ペプチドの純度を分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより２１５ｎｍで評価した。Vydac  Ｃ−１８支持体（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、孔径300Å、Liquid Separations Group）を用いて分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを記録した。直線勾配溶離系を１．５ｍＬ／分の流速で用いた：ＨＰＬＣ−１、Ａ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ、８０％ＭｅＣＮ中の０．１％ＴＦＡ；２０％Ｂ〜５０％Ｂ、１％／分；ＨＰＬＣ−２、Ｃ、ＴＥＡＰ（０．１Ｍ、ｐＨ３）中の５％ＭｅＣＮ；Ｄ、ＭｅＣＮ中の２０％Ｃ、１０％Ｄ〜７０％Ｄ、１％／分。カラム溶出液を２１５ｎｍでモニターした。各ペプチドの保持時間および純度をRainin Dynamax HPLC Method Managerにより評価した。各ペプチドは純度＞９８％をもつことが認められた。ＨＰＬＣ保持時間の結果を表１に示す。
【００５９】
【表１−１】
2006342171.tif 000006
【００６０】
【表１−２】
2006342171.tif 000007
【００６１】
アミノ酸分析
ペプチドを真空下に（１１０℃；２０時間）、０．２％の３−（２−アミノエチル）インドール（Pierce）を含有する４Ｍメタンスルホン酸中で加水分解した。加水分解物について、ｏ−フタリドアルデヒド試薬（Sigma Chemical Co.）で誘導体化した後、一体式ガードカラム付き１００×４．６ｍｍ、３μｍのＣ１８軸圧縮カラム（Microsorb AAAnalysis（商標）Ｏ型；Rainin Instrument Co.）を取り付けた自動ＨＰＬＣシステム（Rainin Instrument Co.）によりアミノ酸分析を行った。誘導体化した第一級アミノ酸を二元勾配により溶離した：緩衝液Ａ；４．５％ｖ／ｖのメタノールおよび０．５％ｖ／ｖのテトラヒドロフランを含有する０．１０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．２）および緩衝液Ｂ；メタノール。勾配シーケンス；０分で０％Ａ；１６．５分で３５％Ａ；３０分で９０％Ａ；３３分で９０％Ａを、流速１．０ｍＬ／分で周囲温度において使用。溶出液を３４０ｎｍでモニターし、Dynamax HPLC Method Manager（Rainin）により積分する。標準保持時間は下記のとおりであった：Ａｓｐ、６．６分；Ａｒｇ、１９．９分；Ｔｒｐ、２５．４分およびＬｙｓ、２９．５分。表１の各ペプチドが第一級アミノ酸について予想した分析結果を示した。システインは定量されない。
【００６２】
質量分析
LaserMat 2000 質量分析計（Thermal Bioanalysis、カリフォルニア州サンホゼ）を使用し、マトリックスとしてのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸および内標準としてのサブスタンスＰ（1348.7 Da）を用いて、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析によりペプチドを分析した。それぞれの場合、スペクトルは内標準に関する主Ｍ−Ｈ+イオンピーク、予想した被分析体Ｍ−Ｈ+イオンピーク、およびマトリックス（< 500 Da）に伴う数ピークからなっていた。結果を表１に示す。
【００６３】
ＳＲＩＦによるＧＨ放出抑制の拮抗
雄ラット成体から下垂体前葉を採集し、これまでに文献記載されているトリプシン／ＤＮａｓｅ法により分散させた（Murphy, W. A.; Taylor, J.; Moreau, J.-P. および Coy, D. H., Peptide Res. 1989, 2, 128-132）。分散した細胞を、無菌濾過したダルベッコ改変イーグル培地で希釈し（ＭＥＭ、Gibco Laboratories、ニューヨーク州グランド・アイランド）、これに２．５％のウシ胎仔血清（Gibco）、３％のウマ血清（Gibco）、１０％の新鮮ラット血清（氷上に保存、１時間を超えない）（下垂体ドナー由来）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibco）、ゲンタマイシン（10 ng mL-1；Sigma）およびナイスタチン（10,000 U mL-1；Gibco）を補充した。細胞をランダムに約２００，０００個／ウェルの密度で接種した（Costar cluster 24；Rochester Scientific Co.；ニューヨーク州ロチェスター）。接種した細胞を前記ダルベッコ培地中に、９５％空気／５％ＣＯ2、３７℃の加湿雰囲気で４〜６日間維持した。ホルモン攻撃用に調製する際には、細胞を培地１９９（Gibco、１ｍＬ、３回洗浄）で洗浄した。各用量の本発明化合物（プレート当たり６種類の用量）を、３ウェル内で１ｎＭ  ＳＲＩＦの存在下に、１％のＢＳＡ（フラクションＶ；Sigma Chemical Co.）を含有する全体積１ｍＬの培地１９９中で試験した。すべてのウェルにＧＨＲＨ（１−２９）ＮＨ2（１ｎＭ）を装入した。ＧＨＲＨ（１−２９）ＮＨ2（１ｎＭ）で刺激した対照群、およびＳＲＩＦ（１ｎＭ）とＧＨＲＨ（１−２９）ＮＨ2（１ｎＭ）で阻害した対照群を、それぞれの細胞培養プレートに含めた。空気／二酸化炭素雰囲気（９５／５％、３７℃で３時間）で３時間インキュベートした後、培地を除去し、ホルモン含量をアッセイするまで−２０℃に保存した。National Hormone and Pituitary Program (NHHP)（カリフォルニア州トランス）のDr. A. F. Parlowから好意的に提供された成分を用いて、培地中の成長ホルモンを標準二重抗体ＲＩＡにより測定した。
【００６４】
ＳＲＩＦ（１ｎＭ）に対するアンタゴニストのＩＣ50をSigmaplot（Jandel Scientific、カリフォルニア州サン・ラファエル）により計算した。数値を平均ＩＣ50（ｎＭ）±ＳＥＭとして表わし、表２に示す。
【００６５】
【表２−１】
2006342171.tif 000008
【００６６】
【表２−２】
2006342171.tif 000009
【００６７】
クローン化ヒトソマトスタチン受容体の機能性発現
ヒトソマトスタチン受容体（ｈｓｓｔｒ1-5）を含むゲノムクローン（Yamada, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89, 251-255；Yasuda, K., et al., J. Biol. Chem. 1992, 267, 20422-20428；Yamada, Y., et al., Mol. Pharmacol. 1992, 42, 2136-2142；Rohrer, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993, 90, 4196-4200）は、Dr. Graeme I. Bell（シカゴ大学）から好意的に提供された。ｈｓｓｔｒ1、ｈｓｓｔｒ2、ｈｓｓｔｒ3、ｈｓｓｔｒ4およびｈｓｓｔｒ5  ｃＤＮＡを、それぞれ１．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＸｍｎＩフラグメント、１．７−ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、２．０−ｋｂのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、１．４−ｋｂのＮｈｅＩ−ＮｄｅＩフラグメント、および１．２−ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして単離した。これらはそれぞれ全長受容体の全コード領域を含む。これらのフラグメントを個別に、哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ５の対応する制限エンドヌクレアーゼ部位において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流にサブクローニングし、発現プラスミドｐＣＭＶ５／ｈｓｓｔｒ1、ｐＣＭＶ５／ｈｓｓｔｒ2、ｐＣＭＶ５／ｈｓｓｔｒ3、ｐＣＭＶ５／ｈｓｓｔｒ4およびｐＣＭＶ５／ｈｓｓｔｒ5を作製した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞中へのトランスフェクションのために、哺乳動物細胞ネオマイシン選択マーカーを保有するプラスミドｐＲＳＶ−ｎｅｏ（American Type Culture Collection、マリーランド州ロックビル）を付加した。
【００６８】
受容体発現およびトランスフェクション
リン酸カルシウム法によりトランスフェクションを実施した。１０％のウシ胎仔血清を補充したα−最少必須培地（α−ＭＥＭ；Gibco）にＣＨＯ−Ｋ１細胞を維持し、リン酸カルシウム沈殿法によりそれぞれの発現プラスミドでトランスフェクションした。発現プラスミドが挿入されたクローンを、５００μｇ ｍＬ-1のゲネチシン（G418；Gibco）を補充したα−ＭＥＭ中で選択した。独立したＣＨＯ−Ｋ１クローンをガラス環クローニングにより採取し、選択培地での培養により増殖させた。単離クローンから膜を調製し、まず［125Ｉ］Ｔｙｒ11−ＳＲＩＦおよび［125Ｉ］ＭＫ−６７８（ｓｓｔｒ2について）との結合についてｈｓｓｔｒ発現を評価した。
【００６９】
放射性リガンド結合アッセイ
５タイプの受容体について、対応するＣＨＯ−Ｋ１細胞のホモジェネート（Polytron設定６、１５秒）から氷冷トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ）中で細胞膜を採取し、遠心した（３９０００ｇ、１０分、２回）；中間で新たな緩衝液に再懸濁した。最終ペレットをアッセイのためにトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ）に再懸濁する。アリコートの膜を０．０５ｎＭの［125Ｉ］Ｔｙｒ11−ＳＲＩＦ（タイプ１、３、４、５）または［125Ｉ］ＭＫ−６７８（タイプ２）と共に、ＢＳＡ（10 mg mL-1）、ＭｇＣｌ2（5 mM）、Trasylol（200 kIU mL-1）、バシトラシン（0.02 mg mL-1）およびフッ化フェニルメタンスルホニル（0.02 mg mL-1）を含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中でインキュベートする（３７℃、３０分間）。最終アッセイ体積は０．３ｍＬであり、０．３％ポリ（エチレンイミン）に予め浸漬したＧＦ／ＣフィルターでBrandel迅速濾過モジュールを用いて迅速濾過することによりインキュベーションを終了する。次いでそれぞれの試験管およびフィルターをアリコートの冷緩衝液（５ｍＬ、３回）で洗浄する。
【００７０】
結合した全放射性リガンドから１．０μＭ  ＳＲＩＦの存在下で結合したリガンドを差し引いたものとして比結合を定義する。これらのアッセイ系により下記の全放射性リガンド結合値および非特異的結合（ｎｓｂ）値が一般に得られる：ｈｓｓｔｒ1、７０００ｃｐｍの全結合−対３５００ｃｐｍのｎｓｂ；ｈｓｓｔｒ2、９０００ｃｐｍの全結合−対１０００ｃｐｍのｎｓｂ；ｈｓｓｔｒ3、８０００ｃｐｍの全結合−対１０００ｃｐｍのｎｓｂ；ｈｓｓｔｒ4、６０００ｃｐｍの全結合−対３５００ｃｐｍのｎｓｂ；およびｈｓｓｔｒ5、７５００ｃｐｍの全結合−対３５００ｃｐｍのｎｓｂ。結合親和性を５種類の受容体サブタイプそれぞれについてＫi値±ＳＥＭ（ｎＭ）として表わし、表２に示す。
【００７１】
タイプ５仲介による細胞内Ｃａ2+移動
ヒトｓｓｔ５受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を０．３％ＥＤＴＡ／リン酸緩衝化塩類溶液（２５℃）中でのインキュベーションにより収穫し、遠心により２回洗浄した。洗浄した細胞を、蛍光Ｃａ2+指示薬Fura-2AM添加のためにハンクス緩衝化塩類溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した。約１０6個／ｍｌの細胞懸濁液を、２μＭのFura-2AMと共に約２５℃で３０分間インキュベートした。結合しなかったFura-2AMをＨＢＳＳ中で２回の遠心により除去し、磁気撹拌機構および温度調節式キュベットホルダーを備えた蛍光分光計（日立F-2000）に最終懸濁液を移した。３７℃で平衡化した後、細胞内Ｃａ2+移動の測定のためにソマトスタチンペプチドを添加した。励起および発光波長はそれぞれ３４０および５１０ｎｍであった。
【００７２】
例示データを図１に示す。これは上記アッセイ法で被験化合物として類似体５を用いて得た結果を表わす。
分子モデリング
Silicon Graphics Indigo2 High Impact 10000 コンピューターにより、SYBYL分子モデリングソフトウェア、バージョン6.6（Tripos Associates Inc.、米国ミズーリ州セントルイス）を用い、Kollman全原子力場法（Weiner, S. J., et al., J. Comp. Chem. 1986, 7, 230-252）で分子モデリングを行った。始化合物Sandostatin/オクトレオチド（Octreotide）の３溶液ＮＭＲ構造；D-Phe5-c[Cys6-Phe7-D-Trp8-Lys9-Thr10-Cys11]-Thr12-ol（1SOCおよび2SOC）に関するＰＤＢファイルをＰＤＢデータベースから入手した。これらの構造をSYBYL 6.6に輸入し、変更して、類似体９を基礎とするＮ−メチル化化合物を形成した。Kollman部分原子電荷をモノマー辞書から負荷した。変更残基をアニーリングし、次いで共役勾配アルゴリズムを用いて≦0.01 Kcal molA-1の終ｒｍｓ（final root mean square）勾配に完全エネルギー最小化することにより、構造を最適化した。他のすべての最小化オプションについて、距離依存誘電関数（McCammon, J. A., et al., Biochem. 1979, 18, 927-942）をデフォルト設定と共に用いた。結果を表３に詳述する。
【００７３】
【表３】
2006342171.tif 000010
【００７４】
他の態様
本発明をその詳細な記述に関して記載したが、以上の記述は本発明を説明するためのものであり、特許請求の範囲により定められる本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点および変更も本発明に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ｈｓｓｔｒ−５仲介による細胞内Ｃａ2+移動のインビトロ抑制を示すグラフである。
【図１】
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