(57)【要約】  本発明は、自然早産のプロテオミクスバイオマーカー、満期産のプロテオミクスバイオマーカー、およびそれらの使用方法に関する。特に、本発明は、妊娠している対象が早産のリスクが高いかどうかを決定するためのツール、ならびに妊娠している対象の早産のリスクを減少させるためのツールを提供する。
2019505815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠している対象の自然早産のリスクを評価する方法であって、
ａ．該妊娠している対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
ｂ．該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量的数値を決定する工程（ここで、該パネルは、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む）；および
ｃ．その測定値に基づいて自然早産のリスクを評価する工程
を含む、方法。
【請求項２】
パネルが、表４または表５のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パネルが、表７または表８のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
パネルが、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
パネルが、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
パネルが、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
パネルが、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
パネルが、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも４つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも５つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも６つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも７つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも８つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
パネルが、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥから選択されるタンパク質を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
パネルが、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３から選択されるタンパク質を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
パネルが、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１から選択されるタンパク質を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
パネルが、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥから選択される少なくとも５つのタンパク質を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
パネルが、少なくともＡ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
パネルが、表９に示す５〜８プレックスマルチマーカーパネルのうちのいずれか１つを含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
妊娠している対象が、初産婦である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルが、妊娠している対象から妊娠第１期および妊娠第２期に採取される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
サンプルが、妊娠している対象から妊娠１０〜１２週の間または妊娠１８〜２４週の間に採取される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該方法の工程が、妊娠している対象から妊娠第１期に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠している対象から妊娠第２期に採取された第二のサンプルに対して繰り返される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第一のサンプルが、妊娠している対象から妊娠８〜１２週の間に採取され、そして第二のサンプルが、妊娠している対象から妊娠１８週〜２４週の間に採取される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該第一および第二の両サンプルにおいて、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１から選択される少なくとも５つのマーカーが測定される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
血液サンプルが、血清または血漿サンプルである、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
マイクロ粒子に富む画分が、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて調製される、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
サイズ排除クロマトグラフィーが、水による溶出を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
サイズ排除クロマトグラフィーが、アガロース固相および水性液相を用いて行われる、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
調製工程が、限外ろ過または逆相クロマトグラフィーをさらに含む、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
調製工程が、サイズ排除クロマトグラフィーの前に、尿素を用いる変性、ジチオスレイトールを用いる還元、ヨードアセトアミンを用いるアルキル化、およびトリプシンを用いた消化をさらに含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
定量的数値の決定工程が質量分析を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
定量的数値の決定工程が、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
質量分析が、多重反応モニタリングを含み、液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルを含む溶媒を用いて行われ、および／または検出工程が、タンパク質に保持時間指標を割り当てる工程を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
質量分析が多重反応モニタリングを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
決定工程が、自然早産のリスクがある対象を分類する分類ルールを実行することを含み、ここで、該分類ルールの実行が、少なくとも０．０５未満のｐ値で早産または満期産の間の相関を生じる、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
決定工程が、自然早産のリスクがある対象を分類する分類ルールを実行することを含み、ここで、該分類ルールの実行が、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、該ＲＯＣ曲線が、少なくとも０．６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
分類ルールが対象を分類する値が、母体年齢、母体体重指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
分類ルールが、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の特異性を有するように構成されている、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される処置工程をさらに含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
妊娠している対象の自然早産のリスクを減少させる方法および／または自然早産の新生児合併症を軽減させる方法であって、
ａ．請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法により、妊娠している対象の自然早産のリスクを評価すること；および、
ｂ．自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項４２】
治療剤が、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
治療剤が、プロゲステロン膣用坐剤または１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸配合非経腸製剤を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
自然早産の増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルを有することを特徴とする妊娠している対象に、自然早産のリスクを減少させるように設計された有効量の処置剤を投与することを含み、ここで、該パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、方法。
【請求項４５】
処置剤が、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
処置剤が、プロゲステロン膣用坐剤または１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸配合非経腸製剤を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ａ．妊娠している対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製すること；および、
ｂ．該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量的数値を決定すること（ここで、該パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む）
を含む、方法。
【請求項４８】
マイクロ粒子関連タンパク質のパネルが、表４または表５のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
パネルが、表７または表８のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
パネルが、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
パネルが、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
パネルが、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
パネルが、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
パネルが、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
パネルが、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
パネルが、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
パネルが、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
パネルが、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
パネルが、少なくともＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥを含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
パネルが、少なくともＡ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２を含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
パネルが、少なくともＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥを含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
パネルが、少なくともＦ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
パネルが、少なくともＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
パネルが、少なくともＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳを含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
表１または表２の少なくとも４つのタンパク質を含む、請求項４４から６４のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項６６】
表１または表２の少なくとも５つのタンパク質を含む、請求項４４から６４のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項６７】
表１または表２の少なくとも６つのタンパク質を含む、請求項４４から６４のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項６８】
表１または表２の少なくとも７つのタンパク質を含む、請求項４４から６４のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項６９】
表１または表２の少なくとも８つのタンパク質を含む、請求項４４から６４のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項７０】
ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥから選択されるタンパク質を含む、請求項６５から６９のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項７１】
ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３から選択されるタンパク質を含む、請求項６５から６９のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項７２】
ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１から選択されるタンパク質を含む、請求項６５から６９のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項７３】
Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥから選択される少なくとも５つのタンパク質を含む、請求項６６に記載のパネル。
【請求項７４】
少なくともＡ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥを含む、請求項６７に記載のパネル。
【請求項７５】
表９に示す５〜８プレックスマルチマーカーパネルのうちのいずれか１つを含む、請求項６６から６９のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項７６】
妊娠している対象の自然早産のリスクを評価する方法であって、
（ａ）妊娠している対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
（ｂ）該画分中の１以上のタンパク質のレベルを検出する工程（ここで、該１以上のタンパク質が、ＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳの１以上を含む）；および
（ｃ）ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳからなる早産群の１以上のタンパク質レベルが閾値レベルを上回っているとき、および／またはＣＨＬＥからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高いと判定するか；または
ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳからなる早産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、および／またはＣＨＬＥからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高くないと判定する工程
を含む、方法。
【請求項７７】
妊娠している対象の自然早産のリスクを評価する方法であって、
（ａ）妊娠している対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
（ｂ）該画分中の１以上のタンパク質のレベルを検出する工程（ここで、該１以上のタンパク質が、Ａ２ＧＬ、ＡＡＣＴ、ＢＴＤ、Ｃ１ＱＡ、ＣＦＡＤ、ＣＦＡＩ、ＣＨＬＥ、ＣＬＵＳ、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１３Ａ、ＦＣＮ３、ＦＥＴＵＢ、ＧＰＸ３、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＥＰ２、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ３、ＫＡＩＮ、ＬＣＡＴ、ＭＡＳＰ１、ＭＢＬ２、ＰＧＲＰ２、ＰＬＦ４、ＰＯＮ１、ＰＲＧ４、ＰＲＯＳ、ＳＥＰＰ１、ＴＲＹ３およびＺＰＩの１以上を含む）；および
（ｃ）Ｃ１ＱＡ、ＣＦＡＤ、ＣＦＡＩ、Ｆ９、ＦＥＴＵＢ、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ３、ＰＬＦ４、ＰＲＧ４およびＰＲＯＳからなる早産群の１以上のタンパク質レベルが閾値レベルを上回っているとき、および／またはＡ２ＧＬ、ＡＡＣＴ、ＢＴＤ、ＣＨＬＥ、ＣＬＵＳ、Ｆ１０、Ｆ１３Ａ、ＦＣＮ３、ＧＰＸ３、ＨＥＰ２、ＫＡＩＮ、ＬＣＡＴ、ＭＡＳＰ１、ＭＢＬ２、ＰＧＲＰ２、ＰＯＮ１、ＳＥＰＰ１、ＴＲＹ３およびＺＰＩからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高いと判定するか；または
Ｃ１ＱＡ、ＣＦＡＤ、ＣＦＡＩ、Ｆ９、ＦＥＴＵＢ、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ３、ＰＬＦ４、ＰＲＧ４およびＰＲＯＳからなる早産群の１以上のタンパク質レベルが閾値レベルを下回っているとき、および／またはＡ２ＧＬ、ＡＡＣＴ、ＢＴＤ、ＣＨＬＥ、ＣＬＵＳ、Ｆ１０、Ｆ１３Ａ、ＦＣＮ３、ＧＰＸ３、ＨＥＰ２、ＫＡＩＮ、ＬＣＡＴ、ＭＡＳＰ１、ＭＢＬ２、ＰＧＲＰ２、ＰＯＮ１、ＳＥＰＰ１、ＴＲＹ３およびＺＰＩからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高くないと判定する工程
を含む、方法。
【請求項７８】
妊娠している対象の自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させる方法であって、
ａ．請求項７６または７７に記載の方法に従い、妊娠している対象の自然早産のリスクを評価すること；および
ｂ．自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項７９】
ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中の１以上のタンパク質の定量的数値を決定する工程（ここで、該タンパク質が、表１、２、４、５、７、８または９のタンパク質から選択される）；および
ｃ）定量的数値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類システムの分類ルールを実行する工程（ここで、該分類システムが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線において、少なくとも０．６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する）
を含む、方法。
【請求項８０】
ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中の１以上のタンパク質ペアの定量的数値を決定する工程（ここで、該ペアが、表６のタンパク質ペアから選択される）；および
ｃ）定量的数値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類システムの分類ルールを実行する工程（ここで、分類モデルが、０．０７、０．０１、０．００５または０．００１未満のｐ値で早産または満期産の間の相関関係を生じる）
を含む、方法。
【請求項８１】
ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中のタンパク質のパネルの定量的数値を決定する工程（ここで、該パネルが、表７のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む）；および
ｃ）定量的数値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類システムの分類ルールを実行する工程（ここで、分類システムが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線において、少なくとも０．８６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する）
を含む、方法。
【請求項８２】
ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；
ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中の１以上のタンパク質の定量的数値を決定する工程（ここで、該１以上のタンパク質が以下から選択される：
ｉ）Ｆ１３Ａ、Ｆ１３Ｂ、ＦＢＬＮ１、ＦＡ９、ＦＡ１０、ＰＲＯＳ、ＦＩＢＡ、ＦＩＢＧ、ＦＩＮＣ、ＨＡＢＰ２およびＰＬＦ４から選択される凝固／創傷治癒経路のタンパク質；
ｉｉ）ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、ＨＥＭＯ、ＴＲＦＥ、ＶＴＤＢ、ＰＧＲＰ２、ＣＤ５Ｌ、ＳＥＰＰ１、ＣＰＮ２、ＦＥＴＵＡ、ＦＥＴＵＢ、ＰＯＮ１、ＳＡＡ４、ＧＰＸ３から選択される炎症／酸化ストレス経路のタンパク質；
ｉｉｉ）ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＫＡＩＮ、ＨＥＰ２から選択されるキニン−カリクレイン−アンジオテンシン系経路のタンパク質；
ｉｖ）ＩＣ１、Ｃ９、ＣＢＰＮ、Ｃ６、Ｃ８Ａ、ＨＰＴ、ＭＢＬ２、Ａ２ＧＬ、Ａ１ＡＧ１、Ｃ７、ＡＴＲＮ、Ｃ１Ｒ、ＦＣＮ３、ＨＰＴＲ、ＩＧＪ、ＭＡＳＰ１、Ｃ８Ｇ、ＣＬＵＳ、Ａ１ＡＧ２、Ａ１ＢＧから選択される補体／獲得免疫経路のタンパク質；
ｖ）ＩＴＩＨ１、ＩＴＩＨ２、ＩＴＩＨ４、ＡＭＢＰ、ＴＲＹ３、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＭＧ、Ａ１ＡＴ、ＺＰＩから選択される繊維素溶解／抗凝固／網膜関連経路のタンパク質;
ｖｉ）ＡＰＯＭ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＡ１、ＬＣＡＴ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＤ、ＡＰＯＦから選択される脂質代謝経路のタンパク質;
ｖｉｉ）ＴＨＢＧ、ＴＴＨＹ、ＴＨＲＢから選択される甲状腺関連経路のタンパク質）；ならびに
ｃ）定量的数値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類システムの分類ルールを実行する工程
を含む、方法。
【請求項８３】
自然早産のリスクを減少させる、および／または新生児合併症を軽減させる方法であって、
ａ）請求項７６から８２のいずれか一項に記載の方法により、対象が自然早産のリスクにあることを決定する工程；および
ｂ）自然早産のリスクを減少させる、および／または新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与する工程
を含む、方法。
【請求項８４】
ａ）妊娠８〜１４週目の複数の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程（ここで、該複数の対象には、以前に早産を経験した複数の対象および以前に満期産を経験した複数の対象が含まれる）；
ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、画分中の複数のタンパク質の定量的数値を決定する工程（ここで、該タンパク質が、表１、２、４、５、７、８または９のタンパク質から選択される）；
ｃ）各サンプルについて、以下を示す値を示すトレーニングデータセットを準備する工程：
（ｉ）早産クラスまたは満期産クラスに属するとするサンプルの分類；および
（ｉｉ）複数のタンパク質バイオマーカーの定量的数値；ならびに、
ｄ）該トレーニングデータセットに機械学習アルゴリズムをトレーニングする工程（ここで、該トレーニングが、早産クラスまたは満期産クラスに属するとしてサンプルを分類する１つまたは複数の分類ルールを作成する）
を含む、方法。
【請求項８５】
（ａ）プロセッサ；および
（ｂ）該プロセッサに接続されたメモリであって、
（ｉ）画分中の複数のタンパク質バイオマーカーの定量的数値を示す値を含む、対象由来のサンプルの試験データ（ここで、該タンパク質が、表１、２、４、５、７、８または９のタンパク質から選択される）；
（ｉｉ）測定値を含む値に基づいて、対象を早産のリスクがあると分類する分類ルール（ここで、該分類ルールが、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９５％の感度を有するように作成される）；および
（ｉｉｉ）試験データに対して分類ルールを実行するためのコンピューター実行可能命令
を含むモジュールを装備している、メモリ
を含む、コンピューターシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的に関して、引用により本明細書中にその内容全体を包含させる２０１５年１２月４日出願の米国仮特許出願第６２/２６３，５４９号に基づく優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
早産は、新生児の罹病および５歳未満の小児の死亡の主な原因であり、在胎期間が短いほど、顕著にリスクが増すことが示されている（Liu et al., Lancer, 385:61698−61706, 2015; および、Katz et al., Lancet, 382:417−425, 2013）。在胎３８週後に生まれた乳児と比較して、複合新生児罹病率は、マーチ・オブ・ダイムズによると、在胎週数が１週短い毎に倍増する。自然早産（ＳＰＴＢ）のおよそ３分の２は自然発生的であり、このことは医学的介入と関連しないことを意味する（Goldenberg et al., Lancet, 371:75−84, 2008; および、McElrath et al., Am J Epidemiol, 168:980−989, 2008）。しかしながら、この状態の切実さにもかかわらず、ＳＰＴＢの原因についての我々の理解には進展がほとんどない。ＳＰＴＢは、単一の病態というよりむしろ症候群であるとするのが大多数の意見となってきているが、胎児−胎盤間インターフェイスの病態生理を研究することは、倫理面および物理的にも困難である（Romero et al., Science, 345:760−765, 2014)。循環マイクロ粒子（ＣＭＰ）生物学の分野の発展は、これらの粒子が胎児−胎盤環境のサンプリングを提示するために、これらの困難に対する解決策を提供し得る。さらに、これらの粒子の含有量を研究することにより、新規の血液ベースの、かつ臨床的に有用なバイオマーカーの同定を可能にすることが期待できる。
【０００３】
マイクロ粒子は、５０〜３００ｎｍの範囲のサイズであり、多くの種類の細胞によって放出される膜結合小胞である。マイクロ粒子の命名法は様々であるが、一般的には、５０〜１００ｎｍのマイクロ粒子はエキソソームと呼ばれ、１００ｎｍを超えるものは、微小小胞体（microvesicle）と呼ばれたり、微小凝集物（microaggregate）などの他の用語が文献でよく用いられる。特記しない限り、マイクロ粒子なる用語は、これらの種類の全てに対する一般的な言及である。マイクロ粒子は、ますます、生理的状況、病態生理的状況およびアポトーシスにおいて、細胞間のコミュニケーションの重要な手段として認識されている。異なるタイプのマイクロ粒子の含有量は、細胞タイプによって異なるが、それらは、核、細胞質ゾルおよび膜タンパク質、ならびに脂質およびメッセンジャーＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含み得る。細胞タイプの起源の状態に関する情報は、マイクロ粒子含有量の試験から得られ得る。従って、マイクロ粒子は、別の方法ではサンプリングすることが困難であり得る細胞、組織および臓器の活性をリアルタイムに固有のウィンドウに示す。
【０００４】
周産期合併症（adverse pregnancy outcome）の高い割合が、妊娠初期の胎児−胎盤間インターフェイスでそれらの病態生理学的起源を有する（Romero et al., supra, 2014; Gagnon, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 110:S99−S107, 2003; および、Masoura et al., J. Obstet Gynaecol, 32:609−616, 2012）。関連する組織および細胞集団の状態を評価するための能力は、切迫した合併症を予測することが予期される。満期産の妊娠と比較してかなり高い新生児罹病率が示される早産（３４週未満）の妊娠とを区別するための非侵襲的ツールは、タイムリーな治療薬の投与が早期分娩を阻止し、あるいは妊娠を延長できることを考慮すると、特に望ましい。
【０００５】
妊娠している対象が早産のリスクが高いかどうかを決定するためのツール、ならびに妊娠している対象の早産のリスクを低下させるためのツールが特に必要とされている。
【０００６】
本明細書中に引用される、特許、特許出願、特許出願公開公報、文献およびプロトコールは、引用により包含される。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、自然早産のプロテオミクスバイオマーカー、満期産のプロテオミクスバイオマーカー、およびそれらの使用方法に関する。特に、本発明は、妊娠している対象が早産のリスクが高いかどうかを決定するためのツール、ならびに妊娠している対象の早産のリスクを低下させるためのツールを提供する。
【０００８】
一側面において、本発明は、妊娠している対象の自然早産のリスクを評価する方法であって、（ａ）妊娠している対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；（ｂ）該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量的数値（quantitative measure）を決定する工程（ここで、該パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む）；および、（ｃ）その測定値に基づいて自然早産のリスクを評価する工程、を含む方法を提供する。いくつかの態様において、該パネルは、表４のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表５のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表７の複数のトリプレックス（triplex）から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表８の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＡ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２を含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＦ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳを含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも４つのタンパク質、表２の少なくとも４つのタンパク質、表４の少なくとも４つのタンパク質、または表５の少なくとも４つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも５つのタンパク質、表２の少なくとも５つのタンパク質、表４の少なくとも５つのタンパク質、または表５の少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも６つのタンパク質、表２の少なくとも６つのタンパク質、表４の少なくとも６つのタンパク質、または表５の少なくとも６つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも７つのタンパク質、表２の少なくとも７つのタンパク質、表４の少なくとも７つのタンパク質、または表５の少なくとも７つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも８つのタンパク質、表２の少なくとも８つのタンパク質、表４の少なくとも８つのタンパク質、または表５の少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥから選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥから選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは少なくとも７つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥから選択される少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥの少なくとも４つまたは少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表９に示す５〜８プレックスマルチマーカーパネルのうちのいずれか１つを含む。いくつかの態様において、該パネルは、妊娠第１期（first trimester）パネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、妊娠第２期（second trimester）パネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、８〜１４週のパネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、１８〜２４週のパネルを含む。
いくつかの態様において、該パネルは、１０〜１２週のパネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、２２〜２４週のパネルを含む。いくつかの態様において、妊娠している対象は、初産婦である。いくつかの態様において、サンプルは、妊娠第１期の妊娠している対象から採取される。いくつかの態様において、サンプルは、妊娠１０〜１２週の間の妊娠している対象から採取される。いくつかの態様において、サンプルは、妊娠第２期の妊娠している対象から採取される。いくつかの態様において、サンプルは、妊娠１８〜２４週の間の妊娠している対象から採取される。いくつかの態様において、該方法の工程は、妊娠している対象から妊娠第１期に採取された第一のサンプルに対して行われ、そして妊娠している対象から妊娠第２期に採取された第二のサンプルに対して繰り返される。いくつかの態様において、第一のサンプルは、妊娠８〜１２週の間の妊娠している対象から採取され、第二のサンプルは、妊娠１８週〜２４週の間の妊娠している対象から採取される。いくつかの態様において、少なくとも５つのマーカーは、該第一および第二のサンプルにおいて測定され、ここで、該少なくとも５つのマーカーが、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１から選択され、測定される。いくつかの態様において、血液サンプルは、血清または血漿サンプルである。いくつかの態様において、血液サンプルは血漿である。いくつかの態様において、血液サンプルは血清である。いくつかの態様において、マイクロ粒子に富む画分は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて調製される。いくつかの態様において、サイズ排除クロマトグラフィーは、水による溶出を含む。いくつかの態様において、サイズ排除クロマトグラフィーは、アガロース固相および水性液相を用いて行われる。いくつかの態様において、調製工程は、限外ろ過または逆相クロマトグラフィーをさらに含む。いくつかの態様において、調製工程は、サイズ排除クロマトグラフィーの前に、尿素を用いる変性、ジチオスレイトールを用いる還元、ヨードアセトアミンを用いるアルキル化、およびトリプシンを用いた消化をさらに含む。いくつかの態様において、定量的数値の決定工程は質量分析を含む。いくつかの態様において、定量的数値の決定工程は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を含む。いくつかの態様において、質量分析は、多重反応モニタリングを含み、液体クロマトグラフィーは、アセトニトリルを含む溶媒を用いて行われ、および／または検出工程は、タンパク質に保持時間指標（indexed retention time）を割り当てる工程を含む。いくつかの態様において、質量分析は、多重反応モニタリングを含む。いくつかの態様において、決定工程は、自然早産のリスクがある対象を分類する分類ルールを実行することを含み、ここで、該分類ルールの実行は、少なくとも０．０５未満のｐ値での早産または満期産の間の相関を生じる。いくつかの態様において、決定工程は、自然早産のリスクを有する対象を分類する��類ルールを実行することを含み、ここで、該分類ルールの実行は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、該ＲＯＣ曲線は、少なくとも０．６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する。いくつかの態様において、分類ルールが対象を分類する値は、母体年齢、母体体重指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの態様において、分類ルールは、カットオフ値、線形回帰（例えば、多変数線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定図（例えば、ＣＡＲＴ−分類および回帰ツリーのような再帰分割プロセス）、バックプロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、ベイジアン分類分析またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類、ならびにサポートベクター分類（例えば、サポートベクターマシン）を用いる。いくつかの態様において、分類ルールは、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の特異性を有するように構成される。いくつかの態様において、決定工程は、タンパク質が閾値レベルを上回るか下回るかを決定することを含む。いくつかの態様において、決定工程は、パネル中の各タンパク質の測定値を対照標準と比較することを含む。いくつかの態様において、該方法は、妊娠している対象の自然早産のリスクを医療従事者（health care provider）に伝える工程をさらに含み、ここで、該伝達は、妊娠している対象のその後の処置法の決定について情報を与える。いくつかの態様において、治療剤は、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。いくつかの態様において、治療剤は、プロゲステロン膣用坐剤または１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸配合非経腸製剤を含む。いくつかの態様において、該方法は、処置工程をさらに含む。いくつかの態様において、処置剤は、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。いくつかの態様において、処置剤は、プロゲステロン膣用坐剤または１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸配合非経腸製剤を含む。いくつかの態様において、本発明は、妊娠している対象の自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させる方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法に従い、妊娠している対象の自然早産のリスクを評価すること；および、（ｂ）自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与すること、を含む方法を提供する。いくつかの態様において、治療剤は、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。いくつかの態様において、治療剤は、プロゲステロン膣用坐剤または１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸配合非経腸製剤を含む。
【０００９】
他の側面において、本発明は、自然早産の増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルを有することを特徴とする、妊娠している対象に自然早産のリスクを減少させるように設計された有効量の処置剤を投与することを含み、ここで、パネルは、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、パネルは、表４のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表５のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表７の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表８の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ1、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において��パネルは、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＡ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２を含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＦ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳを含む。いくつかの態様において、パネルは、表１の少なくとも４つのタンパク質、表２の少なくとも４つのタンパク質、表４の少なくとも４つのタンパク質、または表５の少なくとも４つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表１の少なくとも５つのタンパク質、表２の少なくとも５つのタンパク質、表４の少なくとも５つのタンパク質、または表５の少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表１の少なくとも６つのタンパク質、表２の少なくとも６つのタンパク質、表４の少なくとも６つのタンパク質、または表５の少なくとも６つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表１の少なくとも７つのタンパク質、表２の少なくとも７つのタンパク質、表４の少なくとも７つのタンパク質、または表５の少なくとも７つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表１の少なくとも８つのタンパク質、表２の少なくとも８つのタンパク質、表４の少なくとも８つのタンパク質、または表５の少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥから選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、��ＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥから選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥから選択される、少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥから選択される、少なくとも４つまたは少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表９に示す５〜８プレックスマルチマーカーパネルのうちのいずれか１つを含む。いくつかの態様において、パネルは、妊娠第１期パネルを含む。いくつかの態様において、パネルは、妊娠第２期パネルを含む。いくつかの態様において、パネルは、８〜１４週のパネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、１８〜２４週のパネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、１０〜１２週のパネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、２２〜２４週のパネルを含む。いくつかの態様において、処置剤は、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。いくつかの態様において、処置剤は、プロゲステロン膣用坐剤または１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸配合非経腸製剤を含む。
【００１０】
別の側面において、本発明は、（ａ）妊娠している対象からの血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製すること；および、（ｂ）該画分中のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルの定量的数値を決定すること（ここで、該パネルが、表１または表２のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む）を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、該パネルは、表４のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表５のタンパク質から選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表７の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表８の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ1、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつか��態様において、該パネルは、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＡ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２を含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＦ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、該パネルは、少なくともＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳを含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも４つのタンパク質、表２の少なくとも４つのタンパク質、表４の少なくとも４つのタンパク質、または表５の少なくとも４つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも５つのタンパク質、表２の少なくとも５つのタンパク質、表４の少なくとも５つのタンパク質、または表５の少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも６つのタンパク質、表２の少なくとも６つのタンパク質、表４の少なくとも６つのタンパク質、または表５の少なくとも６つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも７つのタンパク質、表２の少なくとも７つのタンパク質、表４の少なくとも７つのタンパク質、または表５の少なくとも７つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表１の少なくとも８つのタンパク質、表２の少なくとも８つのタンパク質、表４の少なくとも８つのタンパク質、または表５の少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥから選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１��ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥから選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥから選択される少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥから選択される、少なくとも４つまたは少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、該パネルは、表９に示す５〜８プレックスマルチマーカーパネルのうちのいずれか１つを含む。いくつかの態様において、パネルは、妊娠第１期パネルを含む。いくつかの態様において、パネルは、妊娠第２期パネルを含む。いくつかの態様において、パネルは、８〜１４週のパネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、１８〜２４週のパネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、１０〜１２週のパネルを含む。いくつかの態様において、該パネルは、２２〜２４週のパネルを含む。
【００１１】
別の側面において、本発明は、妊娠している対象の自然早産リスクを評価するための方法であって、（ａ）妊娠している対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；（ｂ）該画分中の１以上のタンパク質のレベルを決定する工程（ここで、該１以上のタンパク質が、ＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳの１以上を含む）；および、（ｃ）ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳからなる早産群の１以上のタンパク質レベルが閾値レベルを上回っているとき、および／またはＣＨＬＥからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高いと判定するか；あるいは、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳからなる早産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、および／またはＣＨＬＥからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高くないと判定する工程、を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、（ｂ２）妊娠している対象からの画分において１以上のさらなるタンパク質のレベルを検出する工程（ここで、該１以上のさらなるタンパク質には、ＣＢＰＮ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１およびＴＲＦＥの１以上が含まれる）；および、（ｃ２）ＨＥＭＯおよびＴＲＦＥからなる早産群の１以上のさらなるタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、および／またはＣＢＰＮ、Ｃ９、Ｆ１３ＢおよびＩＣ１からなる満期産群の１以上のさらなるタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高いと判定するか；あるいは、ＨＥＭＯおよびＴＲＦＥからなる早産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、および／またはＣＢＰＮ、Ｃ９、Ｆ１３ＢおよびＩＣ１からなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高くないと判定する工程、をさらに含む。いくつかの態様において、検出工程は、該画分において、少なくとも４、５、６、７または８つのタンパク質レベルを検出することを含む。いくつかの態様において、妊娠している対象は初産婦である。いくつかの態様において、サンプルは、妊娠している対象から妊娠第１期に採取される。いくつかの態様において、サンプルは、妊娠１０〜１２週の妊娠している対象から採取される。いくつかの態様において、血液サンプルは、血清または血漿サンプルである。いくつかの態様において、マイクロ粒子に富む画分は、アガロース固相および水性液相を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて調製される。いくつかの態様において、調製工程は、限外ろ過または逆相クロマトグラフィーをさらに含む。いくつかの態様において、調製工程は、サイズ排除クロマトグラフィーの前に、尿素を用いる変性、ジチオスレイトールを用いる還元、ヨードアセトアミンを用いるアルキル化、およびトリプシンを用いた消化をさらに含む。いくつかの態様において、検出工程は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を含む。いくつかの態様において、質量分析は、多重反応モニタリングを含み、液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルを含む溶媒を用いて行われ、および／または検出工程が、タンパク質に保持時間指標を割り当てる工程を含む。いくつかの態様において、上記の方法は、妊娠している対象の自然早産のリスクを医療従事者に伝える工程をさらに含み、要すれば、ここで、該伝達は、妊娠している対象のその後の処置法の決定について情報を与える。
【００１２】
別の側面において、本発明は、妊娠している対象の自然早産のリスクを評価するための方法であって、（ａ）妊娠している対象由来の血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；（ｂ）該画分中の１以上のタンパク質のレベルを決定する工程（ここで、該１以上のタンパク質が、Ａ２ＧＬ、ＡＡＣＴ、ＢＴＤ、Ｃ１ＱＡ、ＣＦＡＤ、ＣＦＡＩ、ＣＨＬＥ、ＣＬＵＳ、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１３Ａ、ＦＣＮ３、ＦＥＴＵＢ、ＧＰＸ３、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＥＰ２、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ３、ＫＡＩＮ、ＬＣＡＴ、ＭＡＳＰ１、ＭＢＬ２、ＰＧＲＰ２、ＰＬＦ４、ＰＯＮ１、ＰＲＧ４、ＰＲＯＳ、ＳＥＰＰ１、ＴＲＹ３およびＺＰＩの１以上を含む）；および、（ｃ）Ｃ１ＱＡ、ＣＦＡＤ、ＣＦＡＩ、Ｆ９、ＦＥＴＵＢ、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ３、ＰＬＦ４、ＰＲＧ４およびＰＲＯＳからなる早産群の１以上のタンパク質レベルが閾値レベルを上回っているとき、および／またはＡ２ＧＬ、ＡＡＣＴ、ＢＴＤ、ＣＨＬＥ、ＣＬＵＳ、Ｆ１０、Ｆ１３Ａ、ＦＣＮ３、ＧＰＸ３、ＨＥＰ２、ＫＡＩＮ、ＬＣＡＴ、ＭＡＳＰ１、ＭＢＬ２、ＰＧＲＰ２、ＰＯＮ１、ＳＥＰＰ１、ＴＲＹ３およびＺＰＩからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高いと判定するか；あるいは、Ｃ１ＱＡ、ＣＦＡＤ、ＣＦＡＩ、Ｆ９、ＦＥＴＵＢ、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ３、ＰＬＦ４、ＰＲＧ４およびＰＲＯＳからなる早産群の１以上のタンパク質レベルが閾値レベルを下回っているとき、および／またはＡ２ＧＬ、ＡＡＣＴ、ＢＴＤ、ＣＨＬＥ、ＣＬＵＳ、Ｆ１０、Ｆ１３Ａ、ＦＣＮ３、ＧＰＸ３、ＨＥＰ２、ＫＡＩＮ、ＬＣＡＴ、ＭＡＳＰ１、ＭＢＬ２、ＰＧＲＰ２、ＰＯＮ１、ＳＥＰＰ１、ＴＲＹ３およびＺＰＩからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高くないと判定する工程、を含む方法を提供する。ある態様において、該方法は、（ｂ２）妊娠している対象からの画分において１以上のさらなるタンパク質のレベルを検出する工程（ここで、該１以上のさらなるタンパク質には、ＡＮＧＴ、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＥ、Ｃ６、Ｃ８Ｇ、ＣＢＧ、Ｆ１３Ｂ、ＦＩＢＡ、ＨＡＢＰ２、ＰＬＭＮ、ＴＨＢＧおよびＴＨＲＢの１以上が含まれる）；および、（ｃ２）ＡＮＧＴ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＥ、ＣＢＧおよびＰＬＭＮからなる早産群の１以上のさらなるタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、および／またはＡＰＯＡ４、Ｃ６、Ｃ８Ｇ、Ｆ１３Ｂ、ＦＩＢＡ、ＨＡＢＰ２、ＴＨＢＧおよびＴＨＲＢからなる満期産群の１以上のさらなるタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高いと判定するか；あるいは、ＡＮＧＴ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＥ、ＣＢＧおよびＰＬＭＮからなる早産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、および／またはＡＰＯＡ４、Ｃ６、Ｃ８Ｇ、Ｆ１３Ｂ、ＦＩＢＡ、ＨＡＢＰ２、ＴＨＢＧおよびＴＨＲＢからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高くないと判定する工程、をさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、（ｂ３）妊娠している対象からの画分において１以上のさらなるタンパク質のレベルを検出する工程（ここで、該１以上のさらなるタンパク質には、Ａ１ＡＧ１、Ａ１ＡＧ２、Ａ１ＡＴ、Ａ１ＢＧ、Ａ２ＭＧ、ＡＭＢＰ、ＡＮＴ３、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＤ、ＡＰＯＨ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、ＡＴＲＮ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｓ、Ｃ４ＢＰＡ、Ｃ８Ａ、Ｃ９、ＣＤ５Ｌ、ＣＥＲＵ、ＣＦＡＢ、ＣＰＮ１、ＣＰＮ２、Ｆ１２、ＦＢＬＮ１、ＦＥＴＵＡ、ＦＩＮＣ、ＨＥＭＯ、ＨＰＴ、ＨＰＴＲ、ＩＣ１、ＩＧＨＡ２、ＩＧＪ、ＩＴＩＨ１、ＩＴＩＨ２、ＩＴＩＨ４、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＬＧ３ＢＰ、ＳＡＡ４、ＴＲＦＥ、ＴＳＰ１、ＴＴＨＹ、ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣおよびＺＡ２Ｇの１以上が含まれる）；および、（ｃ３）ＡＰＯＢ、ＡＰＯＨ、Ｃ１Ｓ、Ｃ４ＢＰＡ、ＣＥＲＵ、ＨＥＭＯ、ＩＧＨＡ２、ＬＧ３ＢＰ、ＳＡＡ４、ＴＲＦＥ、ＴＳＰ１およびＶＴＮＣからなる早産群の１以上のさらなるタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、および／または１ＡＧ１、Ａ１ＡＧ２、Ａ１ＡＴ、Ａ１ＢＧ、Ａ２ＭＧ、ＡＭＢＰ、ＡＮＴ３、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＤ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、ＡＴＲＮ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ１Ｒ、Ｃ８Ａ、Ｃ９、ＣＤ５Ｌ、ＣＦＡＢ、ＣＰＮ１、ＣＰＮ２、Ｆ１２、ＦＢＬＮ１、ＦＥＴＵＡ、ＦＩＮＣ、ＨＰＴ、ＨＰＴＲ、ＩＣ１、ＩＧＪ、ＩＴＩＨ１、ＩＴＩＨ２、ＩＴＩＨ４、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＴＴＨＹ、ＶＴＤＢおよびＺＡ２Ｇからなる満期産群の１以上のさらなるタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高いと判定するか；あるいは、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＨ、Ｃ１Ｓ、Ｃ４ＢＰＡ、ＣＥＲＵ、ＨＥＭＯ、ＩＧＨＡ２、ＬＧ３ＢＰ、ＳＡＡ４、ＴＲＦＥ、ＴＳＰ１およびＶＴＮＣからなる早産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを下回っているとき、および／またはＡ１ＡＧ１、Ａ１ＡＧ２、Ａ１ＡＴ、Ａ１ＢＧ、Ａ２ＭＧ、ＡＭＢＰ、ＡＮＴ３、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＤ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、ＡＴＲＮ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ１Ｒ、Ｃ８Ａ、Ｃ９、ＣＤ５Ｌ、ＣＦＡＢ、ＣＰＮ１、ＣＰＮ２、Ｆ１２、ＦＢＬＮ１、ＦＥＴＵＡ、ＦＩＮＣ、ＨＰＴ、ＨＰＴＲ、ＩＣ１、ＩＧＪ、ＩＴＩＨ１、ＩＴＩＨ２、ＩＴＩＨ４、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＴＴＨＹ、ＶＴＤＢおよびＺＡ２Ｇからなる満期産群の１以上のタンパク質のレベルが閾値レベルを上回っているとき、妊娠している対象を自然早産のリスクが高くないと判定する工程、をさらに含む。いくつかの態様において、検出工程は、妊娠している対象からの画分において３以上のタンパク質のレベルを検出すること（ここで、該３以上のタンパク質は、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣＩ、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される）を含む。いくつかの態様において、検出工程は、該画分において、少なくとも４、５、６、７または８つのタンパク質のレベルを検出することを含む。いくつかの態様において、妊娠している対象は初産婦である。いくつかの態様において、サンプルは、妊娠している対象から妊娠第１期に採取される。いくつかの態様において、サンプルは、妊娠１０〜１２週の間の妊娠している対象から採取される。いくつかの態様において、血液サンプルは、血清または血漿サンプルである。いくつかの態様において、マイクロ粒子に富む画分は、アガロース固相および水性液相を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて調製される。いくつかの態様において、調製工程は、限外ろ過または逆相クロマトグラフィーをさらに含む。いくつかの態様において、調製工程は、サイズ排除クロマトグラフィーの前に、尿素を用いる変性、ジチオスレイトールを用いる還元、ヨードアセトアミンを用いるアルキル化、およびトリプシンを用いた消化をさらに含む。いくつかの態様において、検出工程は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を含む。いくつかの態様において、質量分析は、多重反応モニタリングを含み、液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルを含む溶媒を用いて行われ、および／または検出工程が、タンパク質に保持時間指標を割り当てる工程を含む。いくつかの態様において、上記の方法は、妊娠している対象の自然早産のリスクを医療従事者に伝える工程をさらに含み、要すれば、ここで、該伝達は、妊娠している対象のその後の処置法の決定について情報を与える。
【００１３】
別の側面において、本発明は、妊娠している対象の自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させる方法であって、本明細書に記載の方法に従い、妊娠している対象の自然早産のリスクを評価すること、ならびに自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与すること、を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、治療剤は、ホルモンおよびコルチコステロイドからなる群より選択される。いくつかの態様において、治療剤は、プロゲステロン膣用坐剤または１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸配合非経腸製剤を含む。
【００１４】
別の側面において、本発明は、ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中の１以上のタンパク質の定量的数値を決定する工程（ここで、タンパク質が、表１、２、４、５、７、８または９のタンパク質から選択される）；および、ｃ）定量的数値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類システムの分類ルールを実行する工程（ここで、分類システムが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線において、少なくとも０．６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する）を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、対象は妊娠１０〜１２週である。いくつかの態様において、実行はコンピューターにより行う。いくつかの態様において、マイクロ粒子に富む画分は、サイズ排除クロマトグラフィーにより富化される。いくつかの態様において、サイズ排クロマトグラフィーは、水での溶出を含む。いくつかの態様において、質量分析は、ＬＣ−ＭＳを含む。いくつかの態様において、分類ルールが対象を分類する値が、母体年齢、母体体重指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの態様において、分類システムは、線形分類システムである。いくつかの態様において、分類システムは、カットオフ値、線形回帰（例えば、多変数線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定図（例えば、ＣＡＲＴ−分類および回帰ツリーのような再帰分割プロセス）、バックプロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、ベイジアン分類分析またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類、ならびにサポートベクター分類（例えば、サポートベクターマシン）を用いる。いくつかの態様において、分類ルールは、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の特異性を有するように構成される。
【００１５】
別の側面において、本発明は、ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中の１以上のタンパク質ペアの定量的数値を決定する工程（ここで、該ペアが、表６のタンパク質ペアから選択される）；および、ｃ）定量的数値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類ルールを実行する工程（ここで、分類モデルが、０．０７、０．０１、０．００５または０．００１未満のｐ値で早産または満期産との間の相関関係を形成する）を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、妊娠１０〜１２週である。いくつかの態様において、実行はコンピューターにより行う。いくつかの態様において、マイクロ粒子に富む画分は、サイズ排除クロマトグラフィーにより富化される。いくつかの態様において、サイズ排クロマトグラフィーは、水での溶出を含む。いくつかの態様において、質量分析は、ＬＣ−ＭＳを含む。いくつかの態様において、分類ルールが対象を分類する値が、母体年齢、母体体重指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの態様において、分類システムは、線形分類システムである。いくつかの態様において、分類システムは、カットオフ値、線形回帰（例えば、多変数線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定図（例えば、ＣＡＲＴ−分類および回帰ツリーのような再帰分割プロセス）、バックプロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、ベイジアン分類分析またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類、ならびにサポートベクター分類（例えば、サポートベクターマシン）を用いる。いくつかの態様において、分類ルールは、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の特異性を有するように構成される。
【００１６】
別の側面において、本発明は、ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中のタンパク質のパネルの定量的数値を決定する工程（ここで、該パネルは、表７の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む）；および、ｃ）定量的数値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類システムの分類ルールを実行する工程（ここで、分類システムが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線において、少なくとも０．８６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する）を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、パネルは、表９のパネルである。いくつかの態様において、対象は、妊娠１０〜１２週である。いくつかの態様において、実行はコンピューターにより行う。いくつかの態様において、マイクロ粒子に富む画分は、サイズ排除クロマトグラフィーにより富化される。いくつかの態様において、サイズ排クロマトグラフィーは、水での溶出を含む。いくつかの態様において、質量分析は、ＬＣ−ＭＳを含む。いくつかの態様において、分類ルールが対象を分類する値が、母体年齢、母体体重指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの態様において、分類システムは、線形分類システムである。いくつかの態様において、分類システムは、カットオフ値、線形回帰（例えば、多変数線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定図（例えば、ＣＡＲＴ−分類および回帰ツリーのような再帰分割プロセス）、バックプロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、ベイジアン分類分析またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類、ならびにサポートベクター分類（例えば、サポートベクターマシン）を用いる。いくつかの態様において、分類ルールは、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の特異性を有するように構成される。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ａ）妊娠８〜１４週目の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、該画分中の１以上のタンパク質の定量的数値を決定する工程（ここで、該１以上のタンパク質が以下：ｉ）Ｆ１３Ａ、Ｆ１３Ｂ、ＦＢＬＮ１、ＦＡ９、ＦＡ１０、ＰＲＯＳ、ＦＩＢＡ、ＦＩＢＧ、ＦＩＮＣ、ＨＡＢＰ２およびＰＬＦ４から選択される凝固／創傷治癒経路のタンパク質；ｉｉ）ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、ＨＥＭＯ、ＴＲＦＥ、ＶＴＤＢ、ＰＧＲＰ２、ＣＤ５Ｌ、ＳＥＰＰ１、ＣＰＮ２、ＦＥＴＵＡ、ＦＥＴＵＢ、ＰＯＮ１、ＳＡＡ４、ＧＰＸ３から選択される炎症／酸化ストレス経路のタンパク質；ｉｉｉ）ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＫＡＩＮ、ＨＥＰ２から選択されるキニン−カリクレイン−アンジオテンシン系経路のタンパク質；ｉｖ）ＩＣ１、Ｃ９、ＣＢＰＮ、Ｃ６、Ｃ８Ａ、ＨＰＴ、ＭＢＬ２、Ａ２ＧＬ、Ａ１ＡＧ１、Ｃ７、ＡＴＲＮ、Ｃ１Ｒ、ＦＣＮ３、ＨＰＴＲ、ＩＧＪ、ＭＡＳＰ１、Ｃ８Ｇ、ＣＬＵＳ、Ａ１ＡＧ２、Ａ１ＢＧから選択される補体／獲得免疫経路のタンパク質；ｖ）ＩＴＩＨ１、ＩＴＩＨ２、ＩＴＩＨ４、ＡＭＢＰ、ＴＲＹ３、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＭＧ、Ａ１ＡＴ、ＺＰＩから選択される繊維素溶解／抗凝固／網膜関連経路のタンパク質;ｖｉ）ＡＰＯＭ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＡ１、ＬＣＡＴ、ＺＡ２Ｇ、ＡＰＯＤ、ＡＰＯＦから選択される脂質代謝経路のタンパク質;ｖｉｉ）ＴＨＢＧ、ＴＴＨＹ、ＴＨＲＢから選択される甲状腺関連経路のタンパク質、から選択される）；ならびに、ｃ）定量的数値を含む値に基づいて、対象を自然早産のリスクがあると分類する分類ルールを実行する工程、を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、妊娠１０〜１２週である。いくつかの態様において、実行はコンピューターにより行う。いくつかの態様において、マイクロ粒子に富む画分は、サイズ排除クロマトグラフィーにより富化される。いくつかの態様において、サイズ排クロマトグラフィーは、水での溶出を含む。いくつかの態様において、質量分析は、ＬＣ−ＭＳを含む。いくつかの態様において、分類ルールが対象を分類する値が、母体年齢、母体体重指数、初産婦および妊娠中の喫煙のうちの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの態様において、分類システムは、線形分類システムである。いくつかの態様において、分類システムは、カットオフ値、線形回帰（例えば、多変数線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定図（例えば、ＣＡＲＴ−分類および回帰ツリーのような再帰分割プロセス）、バックプロパゲーションネットワークのような人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、ベイジアン分類分析またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類、ならびにサポートベクター分類（例えば、サポートベクターマシン）を用いる。いくつかの態様において、分類ルールは、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の特異性を有するように構成される。
【００１８】
別の側面において、本発明は、自然早産のリスクを減少させる、および／または新生児合併症を軽減させる方法であって、ａ）本明細書に記載の方法により、対象が自然早産のリスクにあることを決定する工程；および、ｂ）自然早産のリスクを減少させる、および／または新生児合併症を軽減させるのに有効な量の治療剤を該対象に投与する工程、を含む、方法を提供する。
【００１９】
別の側面において、本発明は、ａ）妊娠８〜１４週目の複数の妊娠している対象の血漿または血清からマイクロ粒子に富む画分を調製する工程（ここで、該複数の対象には、以前に早産を経験した複数の対象および以前に満期産を経験した複数の対象が含まれる）；ｂ）選択された反応モニタリング質量分析を用いて、画分中の複数のタンパク質の定量的数値を決定する工程（ここで、該タンパク質が、表１、２、４、５、７、８または９のタンパク質から選択される）；ｃ）各サンプルについて、以下を示す値を示すトレーニングデータセットを準備する工程：（ｉ）早産クラスまたは満期産クラスに属するとするサンプルの分類；および（ｉｉ）複数のタンパク質バイオマーカーの定量的数値；ならびに、ｄ）トレーニングデータセットに機械学習アルゴリズムをトレーニングする工程（ここで、トレーニングが、早産クラスまたは満期産クラスに属するようにサンプルを分類する１つまたは複数の分類ルールを作成する）を含む、方法を提供する。ある態様において、トレーニングデータセットは、（ｉｉｉ）母体年齢、母体体重指数、初産婦および妊娠中の喫煙のような対象の状態、の少なくとも１つを示す値をさらに含む。いくつかの態様において、作成された複数のモデルから１つのモデルを選択することをさらに含む。いくつかの態様において、モデルは、感度および特異性を含む予め選択された基準に基づいて選択される。いくつかの態様において、分類ルールは、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９５％の感度を有するように構成される。
【００２０】
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の方法により作成された分類ルールを実行するためのコードを含む一時的でない有形のコンピューターにより読出し可能な媒体を提供する。
【００２１】
別の側面において、本発明は、（ａ）プロセッサ；および（ｂ）該プロセッサに接続されたメモリであって、（ｉ）画分中の複数のタンパク質バイオマーカーの定量的数値を示す値を含む、対象由来のサンプルの試験データ（ここで、該タンパク質が、表１、２、４、５、７、８または９のタンパク質から選択される）；（ｉｉ）測定値を含む値に基づいて、対象を早産のリスクがあると分類する分類ルール（ここで、該分類ルールが、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９５％の感度を有するように作成される）；および（ｉｉｉ）試験データに対して分類ルールを実行するためのコンピューター実行可能命令、を含むモジュールを装備しているメモリを含む、コンピューターシステムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＴＥＲＭ（満期産）症例からＳＰＴＢ症例を検出するためのタンパク質を選択するためのブートストラップＲＯＣ分析のグラフである。各タンパク質を、ブートストラップＲＯＣ分析からのＡＵＣの平均およびＳＤをそれぞれｘ軸値およびｙ軸値として、青色の点でプロットした。同じ分析からの結果でありながらサンプルラベル順列（permutation）を有する結果を、赤色の点としてプロットした。マゼンタ縦線（赤色点のｘ値の平均＋ＳＤ）およびグリーン横線（青色点のｙ値の平均＋ＳＤ）で区切られた右下の４分の１区画内の合計６２個のタンパク質（青色点）を、それらが比較的安定で、かつ顕著な識別能を有するために選択した。比較に際して、ラベル順列分析からのタンパク質のうちたった１２個のみ（赤色点）が、この４分の１区画に存在した。従って、推定偽陽性率は、２０％未満であった（１２／６２）。
【図２】図２は、ＳＴＰＢに関連する同時発現パターンを有すると同定された選択されたタンパク質の示差的依存性ネットワーク（ＤＤＮ）分析を示す。プロットでは、赤色線は、ＳＴＰＢ間でタンパク質ペア間の共発現が観察されたことを示し、一方、緑色線は、ＴＥＲＭケース間でタンパク質ペア間の共発現が観察されたことを示す。線の太さは、関連の統計的有意性に比例する。
【図３】図３は、表７（上）のＡＵＣまたは表８（下）の８０％の一定感度での特異性に基づく、上位２０の多変量モデルにおけるＤＤＮ選択タンパク質の頻度を示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、３つのタンパク質を組み合わせた例示的線形モデルのＲＯＣ曲線を示す。ブートストラップ再サンプリングによるＲＯＣ分析は、トレーニングデータの性能の推定範囲を提供した。図４Ｃは、５〜８個のマイクロ粒子関連タンパク質の上位１００個のパネルにおけるマーカー封入の頻度を示す。
【図５】図５は、ＳＰＴＢと対照との間の差異情報を含む、２つの時点（Ｄ１＝妊娠約１０から１２週；Ｄ２＝妊娠約２２から２４週）にわたるタンパク質発現における時間的パターンを示す。
【図６】図６は、ＳＰＴＢ検出のためのタンパク質の選択を示す。
【図７】図７は、統計的に一貫した性能を有するタンパク質を示す。
【図８】図８は、実施例２のサンプルからのＳＥＣデータの２つのプールが高い分析精度（変動係数が小さい）を示すことを示す。
【図９】図９は、実施例２で用いたサンプルから、対照からＳＰＴＢを検出する際に有益な複数のタンパク質に対するNeXosome（登録商標）サンプル調製工程（ＳＥＣ）を示す。
【図１０】図１０は、豊富なタンパク質ＡＬＢＵの濃度に対するＳＥＣの効果を示す。
【図１１】図１１は、妊娠２２〜２４週に採取したサンプル中のバイオマーカーＩＴＩＨ４を区別する際に、ＳＥＣがＳＰＴＢと対照との区別を改善したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、３８週より以前に自然早産となった女性のうち、妊娠１０〜１２週でそれらの発現プロフィールにおいて既にユニークである、妊娠に関連する生物学的プロセスに関連する統計学的に有意なＣＭＰ関連（循環マイクロ粒子−関連）タンパク質バイオマーカーおよびマルチプレックスパネルを提供する。これらのバイオマーカーは、臨床所見のかなり前にＳＰＴＢのリスクのある患者の臨床的に分類するのに有用である。このような同定は、観察の増加の必要性を示し、結果として、これらの患者の管理を顕著に改善しつつ、予防的療法の適用をもたらし得る。
【００２４】
タンパク質バイオマーカー
本発明は、自然早産のリスクを評価し低減させるためのツールを提供する。本明細書に記載の方法は、生物学的サンプルにおいて、少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００２５】
マイクロ粒子とは、約５０〜約５０００ｎｍの流体力学直径を有する細胞外微小胞または脂質ラフトタンパク質凝集を意味する。そのような用語マイクロ粒子としては、同一寸法の、エキソソーム（約５０〜約１００ｎｍ）、微小胞（約１００〜約３００ｎｍ）、エクトソーム（約５０〜約１０００ｎｍ）、アポトーシス小体（約５０〜約５０００ｎｍ）および脂質タンパク質凝集体が包含される。値に関して本明細書中で用いられる、用語“約”は、その値の９０〜１１０％を意味する。例えば、約１０００ｎｍの直径は、９００ｎｍ〜１１００ｎｍの範囲内の直径である。
【００２６】
マイクロ粒子関連タンパク質とは、哺乳動物（例えば、ヒト）対象からのマイクロ粒子に富むサンプル中で検出され得るタンパク質またはそのフラグメント（例えば、ポリペプチド）を意味する。そのようなマイクロ粒子関連タンパク質としては、検出時にマイクロ粒子と物理的に結合しているタンパク質またはそのフラグメントに限定されず、該タンパク質またはフラグメントは、マイクロ粒子間に取り込まれるか、または検出の前のある時期にマイクロ粒子と結合されていてよい。
【００２７】
特に断らない限り、タンパク質なる用語は、ポリペプチドおよびそのフラグメントを包含する。“フラグメント”には、目的の完全長タンパク質または成熟タンパク質よりも短いポリペプチドが含まれる。タンパク質の長さがｘアミノ酸であるとき、フラグメントは、そのタンパク質のｘ−１アミノ酸である。フラグメントは、これよりも短くてもよく（例えば、ｘ−２、ｘ−３、ｘ−４、…）、好ましくは１００アミノ酸以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０アミノ酸以下）である。フラグメントは、４アミノ酸程の短さであってもよいが、好ましくはより長くてもよい（例えば、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００アミノ酸）。
【００２８】
本発明は、少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質レベルを検出するためのツールを提供する。本明細書中で用いる、少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質の“レベルの検出”は、タンパク質の発現レベルの検出、タンパク質の絶対濃度の検出、対象標準との関係でのタンパク質レベルの増加または減少の検出、閾値レベルとの関係でのタンパク質レベルの増加または減少の検出、タンパク質濃度の測定、タンパク質濃度の定量、定量的数値の決定、妊娠している対象からのサンプル中の少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質の存在（例えば、閾値または検出可能なレベルを超えるレベル）の検出、あるいは、妊娠している対象からのサンプル中の少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質の不存在（例えば、閾値未満レベルまたは検出不可能なレベル）の検出を包含する。いくつかの態様において、定量的数値は、絶対値、比、平均、中央値、または範囲数であり得る。
【００２９】
本明細書で用いる、“タンパク質の検出”および“１以上のタンパク質の定量的数値の決定”タンパク質のフラグメントを検出するＭＳ法による検出を含む任意の手段を包含する。表および図面に開示されたデータは、検出のための親タンパク質のペプチドフラグメントを選択することによりタンパク質を検出する、ＭＲＭ−ＭＳによって得られた。
【００３０】
本発明の方法の開発中、多数のマイクロ粒子関連タンパク質が、（満期産であった対象からのサンプルと比較して）早産を経験した対象からのサンプルにおいて変化していると判定され、それ故に“早産バイオマーカー”と称される。さらに、本発明の方法の開発中、多数のマイクロ粒子関連タンパク質が、（満期産であった対象からのサンプルと比較して）早産を経験した対象からのサンプルにおいて変化していないと判定され、それ故に“満期産バイオマーカー”と称される。
【００３１】
いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおけるマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該マイクロ粒子関連タンパク質は表１のものである。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおける少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該少なくとも１つのタンパク質は表１から選択される。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおける少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該少なくとも１つのタンパク質は表１から選択される。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおける５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該タンパク質は表１から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて６つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該６つのタンパク質は表１から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて７つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該７つのタンパク質は表１から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて８つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該８つのタンパク質は表１から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて９つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該９つのタンパク質は表１から選択される。
【００３２】
いくつかの態様において、サンプルがおよそ妊娠１０〜１２週で得られるとき、マイクロ粒子関連タンパク質は、表１の最後のカラムに示される方向性（＋または−）を示し得る。表１の最後のカラムにおいて、（−）は、ＳＰＴＢ症例 対 ＴＥＲＭ対照において、バイオマーカーが下方制御されていることを示し、（＋）は、ＳＰＴＢ症例 対 ＴＥＲＭ対照において、バイオマーカーが上方制御されていることを示す。
【００３３】
【表１】
2019505815.tif 000003
【表２】
2019505815.tif 000004
【表３】
2019505815.tif 000005
【００３４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいてマイクロ粒子関連タンパク質のパネルのレベルを検出する工程を含み、ここで、該マイクロ粒子関連タンパク質は表２のものである。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて少なくとも１つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該少なくとも１つのタンパク質は、表２から選択される。表２に列記されたタンパク質は、満期産対照からＳＰＴＢを差異付ける統計的に一貫した性能を有するタンパク質に対応する。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該少なくとも１つのタンパク質は、表２から選択される。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該タンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて５つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該５つのタンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて６つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該６つのタンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて７つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで、該７つのタンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて８つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該８つのタンパク質は表２から選択される。例示的態様において、本発明の方法は、妊娠対象からの生物学的サンプルにおいて９つのマイクロ粒子関連タンパク質のレベルを検出する工程を含み、ここで該９つのタンパク質は表２から選択される。
【００３５】
【表４】
2019505815.tif 000006
【表５】
2019505815.tif 000007
【表６】
2019505815.tif 000008
【００３６】
別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４、表５、表７または表８のタンパク質から選択される３つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥが含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＡ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２が含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥが含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧから選択される少なくとも３つのタンパク質が含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧが含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、少なくともＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳが含まれる。いくつかの態様において、該少なくとも３つのタンパク質には、表７または表８に示される複数のトリプレックスのいずれか１つが含まれる。
【００３７】
別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される４つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される５つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。別の態様において、本発明の方法は、タンパク質s of 表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される６つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される７つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。別の態様において、本発明の方法は、表１、表２、表４または表５のタンパク質から選択される８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００３８】
別の態様において、本発明の方法は、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００３９】
別の態様において、本発明の方法は、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００４０】
別の態様において、本発明の方法は、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。いくつかの態様において、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質は、妊娠している対象の自然早産リスクを長期的にモニタリングするのに使用される。いくつかの態様において、第１のサンプルは、妊娠８〜１４週（例えば、１０〜１２週）に採取され、第２のサンプルは、妊娠１８〜２４週（例えば、２２〜２４週）に採取される。評価時に、対象がもはや自然早産のリスクを有しないことが２回目の測定後に判明した場合、残りの妊娠期間の管理は、医療従事者によって適宜調整され得る。同様に、評価時に、対象が自然早産のリスクを有し続けているか、または以前に判定されたよりも自然早産のリスクが高いと判定された場合、残りの妊娠の管理は、医療従事者によって適宜調整され得る。
【００４１】
別の態様において、本発明の方法は、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００４２】
別の態様において、本発明の方法は、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００４３】
別の態様において、本発明の方法は、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００４４】
別の態様において、本発明の方法は、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧおよびＴＲＹ３からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００４５】
別の態様において、本発明の方法は、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質のレベルを検出する工程を含む。
【００４６】
本明細書において、自然早産のリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルを提供する。いくつかの態様において、自然早産の増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、表１または表２のタンパク質から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、マイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、表４のタンパク質から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、マイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、表５のタンパク質から選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、表７の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、表８の複数のトリプレックスから選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＦＥＴＵＢ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ｆ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧからなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳ、ＴＲＦＥ、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、ＴＲＹ３、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥからなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、Ａ２ＡＰ、Ａ２ＧＬ、ＡＰＯＬ１、ＡＰＯＭ、Ｃ６、ＣＰＮ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ４、ＫＡＩＮ、ＫＮＧ１、ＭＢＬ２、ＳＥＰＰ１、ＴＨＢＧ、およびＴＲＹ３からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、ＡＭＢＰ、ＡＰＯＡ１、ＣＤ５Ｌ、Ｃ８Ａ、Ｆ１３Ａ、ＨＰＴ、ＩＴＩＨ１およびＩＴＩＨ２からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＡ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２を含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＦ１３Ａ、ＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＩＣ１、ＰＧＲＰ２およびＴＨＢＧを含む。いくつかの態様において、パネルは、少なくともＣＨＬＥ、ＦＥＴＵＢおよびＰＲＯＳを含む。
【００４７】
いくつかの態様において、自然早産のリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質の第１のパネル（例えば、妊娠第１期のパネル、妊娠８〜１２週のパネル、または妊娠１０〜１２週のパネル）を提供する。いくつかの態様において、自然早産のリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質の第２のパネル（例え、妊娠第２期のパネル、妊娠１８〜２４週のパネル、または妊娠２２〜２４週のパネル）を提供する。いくつかの態様において、妊娠している対象は、妊娠第１期の間、妊娠８〜１２週の間、または妊娠１０〜１２週の間、およびその後の妊娠第２期の間、妊娠１８〜２４週の間、または妊娠２２〜２４週の間のリスクを評価される。かかる態様において、有用なパネルは、ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１からなる群より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つのタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、妊娠第１期のパネルは、
【００４８】
本明細書中に提示されるパネルのいくつかの態様において、自然早産のリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、または５以下のマイクロ粒子関連タンパク質を含む。例示的な態様において、自然早産のリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、５個以下のタンパク質を含む。別の例示的態様において、自然早産のリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、６個以下のタンパク質を含む。別の例示的態様において、自然早産のリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、７個以下のタンパク質を含む。別の例示的態様において、自然早産のリスクが高いことを示すマイクロ粒子関連タンパク質のパネルは、８個以下のタンパク質を含む。
【００４９】
いくつかの態様において、本発明は、妊娠している対象からの血液サンプルからマイクロ粒子に富む画分を調製する工程；および、本明細書に記載のマイクロ粒子関連タンパク質のパネルのいずれか１つの定量的数値を決定する工程、を含む方法を提供する。
【００５０】
妊娠している対象
本明細書に記載のツールおよび方法は、妊娠している対象におけるＳＰＴＢのリスクを評価するために使用することができ、ここで、該対象は、任意の種の哺乳動物であり得る。本明細書に記載のいくつかの態様において、妊娠している対象は、ヒトの女性である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠第１期（例えば、妊娠第１〜１２週）、妊娠第２期（例えば、妊娠第１３〜２８週）または妊娠第３期（例えば、妊娠第２９〜３７週）である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠初期（例えば、妊娠８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０週から、妊娠２１週より前まで；妊娠８週以降、妊娠２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９週まで）である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠中期（例えば、妊娠２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０週から、妊娠３１週より前まで；妊娠２０週以降だが、妊娠３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２または２１週まで）である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠後期（例えば、妊娠３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７週から、妊娠３８週より前まで；妊娠３０週以降だが、妊娠３７、３６、３５、３４、３３、３２または３１週まで）である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠１７週未満、妊娠１６週未満、妊娠１５週未満、妊娠１４週未満または妊娠１３週未満であり；妊娠８週以降であるが、妊娠２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０または９週までである。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、およそ妊娠８〜１２週である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、およそ妊娠１８〜２４週である。例示的態様において、妊娠しているヒト対象は、妊娠１０〜１２週である。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、およそ妊娠２２〜２４週である。妊娠ステージは、妊娠している対象の最後の正常な月経の最初の日から計算することができる。
【００５１】
いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、初妊婦である。他の態様において、妊娠している対象は経産婦である。いくつかの態様において、妊娠している対象は、少なくとも１回の以前の自然早産（例えば、妊娠３８週より前の出産）を経験していてよい。いくつかの態様において、妊娠しているヒト対象は、無症候性である。いくつかの態様において、対象は、妊娠前高血圧、真性糖尿病、腎疾患、既知の血栓症および／または他の顕著な既存の医学的状態（例えば、子宮頚管が短い）の病歴などのＰＴＢのリスク因子を有し得る。
【００５２】
サンプル
本発明の方法で使用するためのサンプルは、妊娠している対象から得られた生物学的サンプルである。好ましい態様において、該サンプルは、上記のセクションに記載した妊娠ステージの間に採取される。いくつかの態様において、サンプルは、血液、唾液、涙、汗、鼻分泌物、尿、羊水または子宮膣液サンプルである。いくつかの態様において、サンプルは、血液サンプルであり、好ましい態様においては、血清または血漿である。いくつかの態様において、サンプルは、冷凍（例えば、−２０℃または−８０℃）で貯蔵されている。
【００５３】
自然早産のリスクを評価する方法
本明細書で用いる語句“自然早産の増加したリスク”とは、妊娠している対象が、１以上の早産マーカーが検出されるとき、自然早産の増加したリスクを示すマイクロ粒子関連タンパク質の特定のパネルが検出されるとき、および／または１以上の満期産マーカーが検出されないとき、自然早産（妊娠３８週以前）を有する可能性がより高いことを示す。いくつかの態様において、自然早産のリスクを評価することは、早産のリスクに確率を割り当てることを伴う。いくつかの態様において、自然早産のリスクを評価することは、妊娠している対象を、自然早産のリスクが高い、中程度または低いと層別化することを伴う。いくつかの態様において、自然早産のリスクを評価することは、集団全体、または特定の特性（年齢、体重、病歴、地域性（geography）、および／または他の因子）における集団と比較して、妊娠している対象のリスクが増加しているか、または減少しているかを判定することを伴う。いくつかの態様において、自然早産のリスクを評価することは、自然早産のリスク割合を割り当てることを伴う。
【００５４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠している対象が、妊娠３７〜３８週の間の自然早産を有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠している対象が、妊娠３７週以前に自然早産を有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠している対象が、妊娠３６週以前に自然早産を有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠している対象が、妊娠３５週以前に自然早産を有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠している対象が、妊娠３４週以前に自然早産を有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠している対象が、妊娠３３週以前に自然早産を有する可能性が高いことを示す。いくつかの態様において、本発明の方法は、妊娠している対象が、妊娠３２週以前に自然早産を有する可能性が高いことを示す。
【００５５】
数値的に増加したリスクは、早産について、１．０を超えるハザード比、好ましくは１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３．０を超えるハザード比に関連する。
【００５６】
いくつかの態様において、自然早産バイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方のレベルを検出すること（例えば、存在を検出することを含む）は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に基づくプロテオーム分析を用いて行われる。例示的態様において、この方法は、サンプルに対してサイズ排除クロマトグラフィーを行い、高分子量画分を集めて、マイクロ粒子に富むサンプルを得ることを含む。その後、該マイクロ粒子に富むサンプルを、トリプシンなどのタンパク質分解酵素による消化前に抽出して、複数のペプチドを含む消化されたサンプルを得る。次いで、消化されたサンプルを、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の前に、ペプチド精製／濃縮工程を行い、サンプルのプロテオームプロフィールを得る。いくつかの態様において、精製／濃縮工程は、逆相クロマトグラフィー（例えば、０．２μＬ Ｃ１８ 樹脂を含むＺＩＰＴＩＰペプチドチップ、Millipore Corporation製、Billerica、MA）を含む。
【００５７】
いくつかの態様において、自然早産バイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方のレベルを検出すること（例えば、存在を検出することを含む）は、抗体ベースの方法を用いて行われる。好適な抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ウェスタンブロット、および抗体マイクロアレイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
自然早産のリスクを評価する方法は、本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーの少なくとも１つの定量的数値を含む情報に基づいて、自然早産のリスクが高い対象を分類することを含み得る。分類には、分類アルゴリズムまたはモデルを用いることができる。線形および非線形モデル（例えば、ＣＡＲＴ分類および回帰木などのプロセス）、バックプロパゲーションネットワークなどの人工ニューラルネットワーク、判別分析（例えば、Bayesian分類器またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類器およびサポートベクター分類器（例えば、サポートベクター機器）などの多くのタイプの分類アルゴリズムが、この目的に好適である。カットオフなどの特定の分類値（classifier）は、ヒトの検査によって実行することができる。多変量分類などの他の分類値は、コンピューターに分類アルゴリズムを実行させる必要がある。
【００５９】
分類アルゴリズムは、１つまたは別のグループに分類された対象から導出されたバイオマーカー測定のデータセットの分析を実行する機械学習アルゴリズムを含む、数学的分析によって作成され得る。上記の分類アルゴリズムのタイプを作成するものを含む、多くの機械学習アルゴリズムが当技術分野で公知である。
【００６０】
診断検査は、感度（真の陽性である、陽性と分類された割合）および特異性（真の陰性である、陰性と分類された割合）により特徴付けられる。診断検査の相対的な感度と特異性には、トレードオフが関係している可能性があり、感度が高いほど特異性が低くなり、特異性が高いほど、感度が低くなることを意味する。これらの相対値は、受信機動作特性（ＲＯＣ）曲線上に表示することができる。バイオマーカーなどの一連の変数の診断力は、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）によって反映される。
【００６１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の分類は、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９８%、または少なくとも９９%の感度を有する。本明細書に記載の分類値は、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９または少なくとも０．９５のＡＵＣを有する。
【００６２】
自然早産のリスクを低減する方法
一態様において、妊娠している対象が、自然早産のリスクが高いと判定されたとき、適切な処置プランが用いられ得る。例として、頚管縫縮術のような外科的介入およびプロゲステロン補充は、早産を予防するのに有効であることが示されている（Committee on Practice Bulletins, Obstetrics ＆ Gynecology, 120:964−973, 2012)。いくつかの態様において、ヘルスケアの専門家によって、外来回数の増加のような有リスク・プロトコールへの切り替え、および／または高リスク患者に対処するために特別に訓練された医師への患者の紹介などの他の手段が取られる。いくつかの態様において、妊娠している対象が、自然早産のリスクが高いと判定されたとき、妊娠している対象が、ＮＩＣＵ施設にアクセスし、地方の患者のためのそのような施設へのアクセス計画を立てることのようなステップが取られ得る。さらに、妊娠している対象および家族は、胎児フィブロネクチン検査（診断）およびコルチコステロイド（例えば、乳児の肺発達）および硫酸マグネシウム（例えば、乳児の神経保護の目的）などの急性期症候性介入のより詳しい知識を得ることができる。さらに、妊娠している対象は、食事療法、禁煙および医師からの他の助言に従うようにモニターされ得る。
【００６３】
ある態様において、妊娠している対象は、プロゲステロン補充療法を受ける。現在、再発性自然早産の予防のためのプロゲステロン補充は、単胎妊娠かつ自然早産の既往を有する女性；および自然早産の既往がなく、偶発的に検出された顕著に短い子宮頸管長（１５ｍｍ未満）の女性に適用される。本発明は、プロゲステロン補充が有益であり得る、さらなる妊婦を同定するためのツールを提供する。これらの対象には、リスクの既往がなく、偶発的に検出された顕著に短い子宮頸管長の妊婦；および、経産婦であるが、以前は自然早産ではなかった妊婦が含まれる。
【００６４】
早産のリスクが高いと判定された妊婦は、妊娠３６週まで（例えば、同定時、または妊娠１６週までの間、０日から２０週までの間、６日から妊娠３６週まで)、プロゲステロンを受容するよう勧められるか、またはプロゲステロンを投与される。いくつかの態様において、プロゲステロン補充は、毎週２５０ｍｇの筋肉内注射を含む。例示的態様において、毎週のプロゲステロン補充は、ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステルの注射による投与を含む。他の態様において、プロゲステロン補充は、毎日５０〜３００ｍｇ、７５〜２００ｍｇまたは９０〜１１０ｍｇの用量で、プロゲステロンを経膣投与することを含む。
【００６５】
別の態様において、早産のリスクが高いと判定された単胎妊娠女性で、妊娠３４週未満での自然早産の既往、かつ妊娠２４週より前に短い子宮頸管長（２５ｍｍ未満）が報告されている女性では、頚管縫縮術（頚椎縫合または子宮頸部縫合としても公知）を受けるか、または行われることが推奨される。いくつかの態様において、頚部の外科手術は、マクドナルド外科手術であり、他の態様では、Shirodkarの外科手術または腹部外科手術である。
【００６６】
従って、本発明は、妊娠している対象の自然早産のリスクを低減する、および／または自然早産の新生児合併症を軽減する１つの方法であって、本発明の方法に従い妊娠している対象の自然早産のリスクを評価し、自然早産のリスクを減少させる、および／または自然早産の新生児合併症を軽減するために、治療剤を投与すること、改善されたケア管理プロトコールを処方すること、胎児フィブロネクチン検査を実施すること、コルチコステロイドを投与すること、硫酸マンガンを投与すること、あるいは対象のモニタリングおよび監視を有効な回数に増加させること、を含む方法を提供する。いくつかの態様において、治療剤は、ホルモン剤およびコルチコステロイドからなる群より選択される。いくつかの態様において、治療剤は、経膣プロゲステロンまたは１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸配合非経腸製剤を含む。
【００６７】
キット
別の態様において、サンプル中の、自然早産バイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方を検出可能とする試薬のキットを提供する。タンパク質バイオマーカーを検出することができる試薬には、抗体が含まれるが、これに限定されない。タンパク質バイオマーカーを検出することができる抗体はまた、一般的に、フルオロフォアまたは酵素などの分子に直接的または間接的に結合されて、それは検出可能な反応を触媒することができ、試薬のそれぞれの標的への結合を示す。
【００６８】
いくつかの態様において、キットはさらに、血漿からのマイクロ粒子に富むサンプルの迅速な調製のために、低容量（例えば、１ｍｌ）の垂直カラム中の高分子量ゲル濾過組成物を含むサンプル処理材（例えば、セファロースのようなアガロース）を含む。例えば、マイクロ粒子に富むサンプルは、凍結およびさらなる処理のための分析施設への輸送の前の準備段階で、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより、調製され得る。
【００６９】
いくつかの態様において、キットは、自然早産のリスクを評価するための指示書をさらに含む。本明細書で用いる用語“指示書”とは、対象からのサンプル中の目的のタンパク質（複数可）の存在を検出するための（発現レベルを判定することを含む）キットに含まれる試薬の使用に関する指示を意味する。目的のタンパク質は、自然早産バイオマーカーおよび満期産バイオマーカーの一方または両方を含み得る。いくつかの態様において、指示書は、インビトロでの診断製品を標識する際に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって要求される目的用途に関する記述をさらに含む。ＦＤＡは、インビトロ診断を医療機器として分類し、５１０（ｋ）申請で承認されることを要求している。５１０（ｋ）申請に必要な情報には、以下のものが含まれる：１）機器の商品名または商標名、一般名または通常名、および分類名を含む、インビトロ診断製品名；２）製品の使用目的；３）該当する場合、５１０（ｋ）申請書を提出した所有者または事業者の施設登録番号；ＦＤ＆Ｃ法のセクション５１３に該当する場合にはインビトロ診断製品のクラス、既知の場合は適切なパネル、または所有者もしくは事業者が、その機器がかかるセクションに分類されていないと判断した場合は、その決定状況およびインビトロ診断製品がそのように分類されていないと判断するための根拠；４）適用可能な場所に、写真または製品図面を含む、インビトロ診断製品を記述するのに十分な要求される添付文書および製品広告、その使用用途、ならびに使用説明書；５）その機器が、米国における商品流通において同等なタイプの他のインビトロ診断製品と類似している、および／または異なることを示す文書、該文書を支持するデータを添付；６）実質的等価性判定の基礎となる安全性および有効性データの５１０（ｋ）概要；または、a statement that実質的同等性に関するＦＤＡの承認を支持する該５１０（ｋ）安全性および有効性情報が、書面による請求から３０日以内に利用可能となる旨の書面；７）提出者が、彼らが知る限り、上市前報告書で提出された全てのデータおよび情報が真実かつ正確であり、重大な事実が省略されていないと、宣誓する書面；ならびに、８）ＦＤＡが実質的同等の判断を下すのに必要なインビトロ診断製品に関するさらなる情報。
【００７０】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに完全に理解され得る。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例および態様は、例示の目的のみであることが理解される。
【実施例】
【００７１】
実施例
略語：ＡＵＣ（曲線下面積）；ＣＩ（信頼区間）；ＣＭＰ（循環マイクロ粒子）；ＤＤＮ（Differential Dependency Network）；ＦＤＲ（偽発見率）；ＬＣ（液体クロマトグラフィー）；ＬＭＰ（最後の月経期間）；ＭＲＭ（多重反応モニタリング）；ＭＳ（質量分析）；ＲＯＣ（受信機動作特性）；ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）；ＳＰＴＢ（自然早産）；およびＴＥＲＭ（満期産）。
【００７２】
実施例１：妊娠１０〜１２週の間に得られたサンプル中のＳＰＴＢバイオマーカーの同定
この実施例は、前向き研究で集められた出産コホートの一部として妊娠１０〜１２週の間に得られた血漿サンプルを利用する研究を記載している。３４週以前のＳＰＴＢの単胎ケースを、３７週以降の合併症のない出産と、サンプリング時の母体年齢、人種および妊娠期間を合わせた。妊娠第１期サンプルからの循環マイクロ粒子（ＣＭＰ）を単離し、その後、タンパク質バイオマーカーを同定するために多重反応モニタリング質量分析法（ＭＲＭ−ＭＳ）により分析した。３４週より前のＳＰＴＢを、その妊娠期間中における新生児罹患率の増加を考慮して評価した。
【００７３】
材料および方法
臨床データおよび試料片採取。臨床データおよび母体のＫ２−ＥＤＴＡ血漿サンプル（妊娠１０〜１２週）が、前向き研究で集められたLIFECODES出産コホートの一部として、２００９−２０１４年にBrigham and Women's Hospital（BWH）（Boston、MA）で採取され、−８０℃で貯蔵された。適格基準には、妊娠１５週未満で妊婦管理を開始し、ＢＷＨでの出産を計画している、１８歳以上の患者が含まれる。除外基準には、既存の医学的障害および胎児の異常が含まれた。妊娠期間は、妊娠１２週以前の超音波スキャンで確認された。最後の月経周期（ＬＭＰ）と一致するとき、ＬＭＰを用いて妊娠期間を決定した。一致しないとき、妊娠期間は最も早く利用可能な超音波検査によって設定された。満期産は妊娠３７週より後と定義され、この調査の目的のための早産は、３４週以前のＳＰＴＢと定義された。全ての症例は独立して検討され、２人の母体胎児認定専門医によって検証された。妊娠結果または特徴の不一致が生じたとき、その症例は再検討され、最終的な特徴付けを決定するためのコンセンサス会議が開かれた。３４週以前のＳＰＴＢの２５例の単胎症例は、サンプリングの母体の年齢、人種および妊娠期間（±２週間）による２つの対照出産と一致させた。
【００７４】
ＣＭＰ富化。血漿サンプルを、David H マードック研究所（DHMRI, Kannapolis, NC）にドライアイスで冷却しながら輸送し、サンプル処理および症例／対照状態を試験する実験者も盲検化するために無作為化した。ＣＭＰを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって富化し、水（ＲＮＡｓｅ不含有、ＤＮＡｓｅ不含有、蒸留水）を用いて均一濃度（isocratically）で溶出した。要するに、ＰＤ−１０カラム（GE Healthcare Life Sciences）に、ＡＢＴ（Miamim, FL）の２％アガロースビーズ標準（孔径５０−１５０ｕｍ）１０ｍＬを充填し、洗浄し、最短で２４時間４℃にて貯蔵し、３日以内に使用した。使用する日に、カラムを再度洗浄し、１ｍＬの解凍されたそのまま（neat）の血漿サンプルをカラムに適用した。すなわち、血漿サンプルは、ＳＥＣの前に濾過、希釈または処理されなかった。
【００７５】
循環マイクロ粒子はカラムのボイドボリューム中に捕捉され、高濃度のタンパク質ピークから一部分分離された（Ezrin et al., Am J Perinatol, 32:605−614, 2015）。サンプルは、個々のサンプル処理間の変動性を最小にするために４日間に亘って１５〜２０バッチで処理された。２００μｇの総タンパク質（ＢＣＡによって決定される）を含む各臨床標本からの集められたＣＭＰカラム画分の１つのアリコートを２ｍＬの微量遠心管（ＶＷＲ）に移し、プロテオーム分析のためにドライアイスで冷却しながらBiognosys（Zurich、Switzerland）に輸送した。
【００７６】
液体クロマトグラフィー−質量分析。定量的プロテオーム液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を、Biognosys AGによって行った。要するに、各サンプルについて、２０μｇの全タンパク質を凍結乾燥させ、次いで８Ｍ 尿素で変性させ、ジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシン（Promega）で一晩消化した。得られたサンプルペプチドを、SpeedVacシステムを用いて乾燥させて、４５μＬのBiognosys ＬＣ溶媒中に再溶解し、Biognosys iRTキットを含むBiognosys PlasmaDive （拡張バージョン２．０）安定同位体標識対照ペプチド混合物と混合した。
【００７７】
その後、全タンパク質１μｇを、インハウスパックＣ１８カラム（内径７５μｍ、カラム長１０ｃｍ、New Objective)に注入した；カラム材料は、Thermo Scientific Easy nLC ナノ液体クロマトグラフィーシステム上のMagic AQ（Michromの、３μｍ粒径、２００Å孔サイズ）であった。ＬＣ−ＭＲＭアッセイを、標準ナノエレクトロスプレー供給源を備えたThermo Scientific TSQ Vantage トリプル四重極質量分光計で測定した。ＬＣ−ＭＲＭのＬＣ勾配は、５−３５％溶媒Ｂ（０．１％ ＦＡ含有、９７％アセトニトリル水溶液）で３０分、その後３５−１００％溶媒Ｂで２分、および１００％溶媒Ｂで８分であった（全勾配の長さは４０分であった）。サンプル間のペプチドの定量化のために、ＴＳＱ Vantageを、３．２５分の捕捉ウィンドウ長を含むスケジュールされたＭＲＭモードで実行した。ＬＣ溶離剤を、１．９ｋＶでエレクトロスプレーし、Ｑ１を単位分解能（０．７Ｄａ）で実行した。シグナル処理およびデータ分析を、mProphet （Reiter et al., Nature Methods, 8:430−435, 2011）に基づく多重化ＭＲＭデータ分析のためのSpectroDive（商標） Biognosyのソフトウェアを用いて行った。１％のＱ値フィルターを適用した。タンパク質濃度を、ＬＣ／ＭＳに注入された標準化タンパク質１μgに基づいて決定した。
【００７８】
統計分析。ＳＰＴＢと満期産対照（term delivery）とを区別する有益な分析物を選択するために、処理されたタンパク質定量データを、初めに、単変量受容体作動特性（ＲＯＣ）曲線分析にかけた（Fawcett, Pattern Recognition Letters, 27:861−874, 2006；および、Robin et al., BMC Bioinformatics, 19:12:77, 2011)。サンプルラベルパーミュテーション（Sample Label Permutation）により得られた０（null）に対するブートストラップ再サンプリングを、偽発見率（ＦＤＲ）を管理するために用いた（Carpenter and Bithell, Statistics in Medicine, 19:1141−1164, 2000；および、Xie et al., Bioinformatics, 21:4280−4288, 2005）。要するに、各タンパク質について、元データからのブートストラップサンプルについてＲＯＣ分析を繰り返し、面積下曲線（ＡＵＣ）の平均および標準偏差（ＳＤ）を推定した。その後、ブートストラップ手順を、同じデータに再度適用したが、サンプルＳＰＴＢステータスラベルは無作為に並べ替えられて適用した。permutation分析は、ＦＤＲを制御し、候補タンパク質バイオマーカーの選択中に複数の比較を調整するために０結果を提供した。次いで、タンパク質間でＳＰＴＢ表現型依存性高次同時発現パターンを抽出するために、Differential Dependency Network （ＤＤＮ） バイオインフォマティクスツールを適用した（Tian et al., Bioinformatics, 32:287−289, 2015）。さらなるバイオインフォマティクスツールであるBiNGOを用いて、観察されたプロテオーム脱調節とＳＰＴＢとの間の機能的関連を探索するために、ＤＤＮサブネットワークにおいて過剰に提示された遺伝子オントロジーカテゴリーを同定した（Maere et al., Bioinformatics, 21:3448−3449, 2005）。選択されたタンパク質間の相補的な値および潜在的な臨床的に関連する性能の範囲を評価するために、多変量線形モデルを導出し、ブートストラップ再サンプリングを用いて評価した。
【００７９】
結果
サンプルセットの特性および臨床的特徴を表３に示す。妊婦の年齢、人種、ボディマス指数（ＢＭＩ）、公的保険の使用、妊娠中の喫煙、入院時の妊娠週数は両群で同等であった。母親の教育レベルは対照群で高く、ＳＰＴＢ症例の大部分は初産である傾向があった。
【００８０】
【表７】
2019505815.tif 000009
【００８１】
標的とされたＭＲＭを介して評価された１３２個のタンパク質を、ＳＰＴＢと満期産とを区別する能力について個別に評価した。各候補タンパク質の平均ブートストラップＡＵＣが、０より顕著に大きく（ラベルパーミュテーションで推定される平均ブートストラップＡＵＣの平均＋ＳＤ以上であり）、ブートストラップＡＵＣの分散が大きいタンパク質を排除することを必要とすることにより、１３２個のタンパク質のうち６２個は、ＳＰＴＢの検出に対するロバスト性を実証した（図１の右下部分)。対照的に、サンプルラベルパーミュテーションと同じ基準を用いて、たった１２個のタンパク質が選択された。従って、タンパク質選択の推定ＦＤＲは、２０％未満であった（１２／６２）。これらの６２個のタンパク質を、さらなる多変量分析の候補として考慮した。表４は、ＳＰＴＢ症例 対 ＴＥＲＭ対照において下方制御（−）されたタンパク質、またはＳＰＴＢ症例 対 ＴＥＲＭ対照において上方制御（＋）されたタンパク質の性能値を提供する。ｐ値、ＡＵＣおよび感度が６５％に固定されたときの特異性は、ＡＵＣでランク付けされたバイオマーカーについて最高から最低まで示される。
【００８２】
【表８】
2019505815.tif 000010
【表９】
2019505815.tif 000011
【００８３】
個別に、６２個中２５個のタンパク質が、ＳＰＴＢと満期産対照とを区別するために、最も低いｐ値（≦０．１０）および最も高いＡＵＣ（≧０．６１８）を有していた（表５）。
【００８４】
【表１０】
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【００８５】
６２個の選択されたタンパク質間のDifferential Dependency Network（ＤＤＮ）分析は、多くのＳＰＴＢ表現型関連共発現パターンを同定した（図２）。炎症、創傷治癒、凝固カスケード、およびステロイド代謝のような多くの遺伝子オントロジーカテゴリーが、ＤＤＮ分析共発現サブネットワーク間で過剰に提示された。表６は、識別可能なペアワイズ相関の上位のリストを提供する（ｐ値＜０．００１−０．０６９）。ＤＤＮサブネットワークを形成する合計２０個のユニークなタンパク質が存在した。ペアワイズ相関のいくつか（CBPN−TRFE、CPN2−TRFE、A1AG1−MBL2）は、ＳＰＴＢ症例よりむしろＴＥＲＭ対照に包含されるマーカーであり、ＳＰＴＢに対する防御を示唆していた。
【００８６】
【表１１】
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【００８７】
利用可能なサンプルサイズに基づいて、かつオーバートレーニングを避けるために、臨床的に関連する性能を評価するために線形モデルのみを評価し、変数は、表６の２０個のタンパク質のうち２個または３個のタンパク質の全ての可能な組合せに限定された（１３３０モデル）。各モデルは、８０％の固定された感度でＲＯＣ ＡＵＣの中央値（９０％ＣＩ）および特異性を推定するために、２００ブートストラップ再サンプリングデータを用いて導き出され、評価された。ＡＵＣおよび特異性の９０％ ＣＩの下限に関して、上位２０のモデルをそれぞれ表７および表８に示す。サンプルサイズによって制限が与えられた場合、モデルは、独立したサンプルセットで試験できなかった。これを補うために、トレーニングデータセットにおけるパネルの性能に関するＣＩを、反復ブートストラップ分析によって推定した。表７は、感度を８０％に設定したときに、最良の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する複数のトリプレックスを示す。表８は、感度を８０％に設定したときに、最良の特異性を有する試験Ｄの複数のトリプレックスを示す。
【００８８】
【表１２】
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【００８９】
【表１３】
2019505815.tif 000015
【００９０】
上位２０モデルのパネルに含まれるＤＤＮ分析からの個々のタンパク質の頻度を評価した。最も頻出したタンパク質バイオマーカーは、ＨＥＭＯ、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥであった（図３）。２つの３タンパク質パネルを用いた例示的な線形モデルについての感度および特異性をプロットすることにより、ＲＯＣ曲線およびＡＵＣを決定した（図４Ａおよび図４Ｂ）：Ａ２ＭＧ、ＨＥＭＯおよびＭＢＬ２（図４Ａ）ならびにＫＬＫＢ１、ＩＣ１およびＴＲＦＥ（図４Ｂ）。
【００９１】
明らかな単一分析物ＡＵＣを有するタンパク質バイオマーカー（複数）を、多重化候補として評価するためにも選択した：ＣＢＰＮ、ＣＨＬＥ、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＨＥＭＯ、ＩＣ１、ＰＲＯＳおよびＴＲＦＥ。上位２０の５〜８個のマーカーパネルは、線形モデルおよびブートストラップ再サンプリングを用いて推定された７５％感度でのＡＵＣおよび特異性に基づいた。
【００９２】
【表１４】
2019505815.tif 000016
【００９３】
パフォーマンス基準には、ｐ値、７５％感度での特異性およびＲＯＣ分析からのＡＵＣが含まれる。各基準について、ブートストラップ推定９５％信頼区間（５％ＣＩ、９５％ＣＩ）および中央値（５０％ＣＩ）に対応する３つの数がある。
【００９４】
図４Ｃは、２０ＤＤＮマーカー（＝２５７７５４パネル）の５〜８バイオマーカーパネル（５〜８タンパク質のマルチプレックス)×２００ブートストラップ試行からの上位１０００パネル（８０％感度での、特異性の５％に基づく）における、マーカーインクルージョン頻度を示す。Ａ１ＡＧ１、Ａ２ＭＧ、ＣＨＬＥ、ＩＣ１、ＫＬＫＢ１およびＴＲＦＥの、６つのマーカーは、最高の頻度を示す。
【００９５】
結論
ＳＰＴＢ症例において妊娠１０〜１２週までに特徴的な発現プロフィールを示す、いくつかの臨床的に関連する生物学的プロセスに関与する多数のタンパク質バイオマーカーが同定された。同定されたタンパク質バイオマーカーは、凝固、線維素溶解、免疫調節および補体系に関連する相互関連生物学的ネットワークに主に関与している（表１０）。これらのシステムは、順々に、獲得免疫との相互作用および成功裏の妊娠を継続するのに必要な炎症プロセスの介在を有すると考えられている。
【００９６】
【表１５】
2019505815.tif 000017
【００９７】
免疫調節不全、異常凝固および子宮内炎症が多くのＳＰＴＢ症例分に共通することがますます理解されている（Romero et al., Science、345:760−765, 2014)。妊娠の有害転帰の高い割合は、妊娠初期において病態生理的原因を有すると考えられている。早期の胎盤形成および栄養芽細胞機能の異常は、高血圧を伴う妊娠だけでなく、ＳＰＴＢを経験した妊婦の約３０％にも観察されている（Kim et al., Am J Obstet Gynecol, 189:1063−1069, 2003）。この重要な時期に母体と胎児との間の障壁にある細胞の状態、条件および機能は、既に、妊娠の有害転帰をもたらしやすい性質がある。他には、胎盤特異的マイクロ粒子の濃度が、妊娠経過に伴って有意に増加することが観察された（Sarker et al., J Transl Med, 12:204, 2014）。マイクロ粒子介在シグナル伝達における初期の撹乱（perturbation）は、妊娠が進行するにつれて徐々に拡大する可能性がある。結局、妊婦と胎児のクロストークにおける異常は、忍容を促進していたシステムのネットワーククラッシュを引き起こし、自然早産に至る可能性がある。
【００９８】
ＳＰＴＢの根本原因をより深く理解することの従来の障害の１つは、母体と胎児との間の障壁自体およびヒト胎盤のユニークな性質を調べることの難しさである。子宮内スペースは、物理的にも、倫理的にも、遠く隔絶されている。このように、おそらく超音波による子宮頸管長の測定を除いて、ＳＰＴＢのリスクに応じて患者を層別化するための有用なバイオマーカーの開発にはほとんど進歩が見られていない（Conde−Agudelo et al., BJOG, 118:1042−1054, 2011）。マイクロ粒子中のタンパク質含有量の違いは、母体と胎児との障壁の生物学に関する未利用であった情報を表す。本発明の開発中に決定されるとおり、改善された特異性（ＡＵＣの増加によって示されるような）は、ＣＭＰ濃縮血漿画分に関連する複数のタンパク質バイオマーカーの同時の考察により得られ得る。
【００９９】
実施例２：妊娠２２週〜２４週の間に得られたサンプル中のＳＰＴＢバイオマーカーの同定
この実施例は、妊娠２２〜２４週の間に、実施例１の同じ妊娠対象から得られた血漿サンプルを利用する試験を記載している。サンプル調製、分析および統計方法は、実施例１に記載のものと同じである。
【０１００】
例として、実施例１で分析した３つのバイオマーカー（ＩＴＩＨ４、ＡＡＣＴおよびＦ１３Ａ）の測定値（時間点Ｄ１）を、この実施例の後の時間点（時間点Ｄ２）での該タンパク質の対応する測定値に対してプロットした。これを図５に示す。ＳＰＴＢと対照との区別を改善するために用いることができる個々のバイオマーカーについて、Ｄ１とＤ２の測定値の間には異なっているが明確なパターンがある。破線は、２つの時間点測定を用いた、ＳＰＴＢと対照との間の可能な分類境界を示す。
【０１０１】
以下のタンパク質は、１０〜１２週（時間点Ｄ１、実施例１）および２２〜２４週（時間点Ｄ２、本実施例）のＳＰＴＢを予測する安定した性能を示した：ＡＡＣＴ、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、Ｆ１３Ｂ、ＡＰＯＬ１、ＬＣＡＴ、ＰＧＲＰ２、ＦＢＬＮ１、ＩＴＩＨ２、ＣＤ５Ｌ、ＣＢＰＮ、ＶＴＤＢ、ＡＭＢＰ、Ｃ８Ａ、ＩＴＩＨ１、ＴＴＨＹおよびＡＰＯＡ１。
【０１０２】
実施例３：妊娠１０〜１２週の間に得られたサンプル中のＳＰＴＢバイオマーカーのサブセットの同定
本実施例は、妊娠１０−１２週の間に得られた血漿サンプルを利用する試験を記載する。実施例１のものとは独立したコホートを用いて、１０〜１２週の間に得られたとき、３５週未満のＳＰＴＢを予測するマーカーセットを検証した。
【０１０３】
方法：
１０〜１２週の間に得られた、前向き研究で集められた血漿サンプルを有する７５名の単胎妊婦における産科学的結果を、３５週未満のＳＰＴＢについての医師である評価者（reviewer）によって検証した。これらは、１５０例の合併症のない単胎満期産と一致した。対象群は、サンプリング時の妊娠週数（±２週間）、母体年齢（±２歳）、人種および出産回数（parity）で一致した。これらの標本からのＣＭＰを分離し、３５週未満の出産リスクを予測する能力について、以前の試験から選択された既知のタンパク質バイオマーカーの多重反応モニタリング質量分析により分析した。組み合わせた機能的プロファイリング／経路分析によるこれらの分析物の生物学的関連性もまた調べた。
【０１０４】
データ分析および結果：
症例群および対照群は、ＢＭＩ（２６ 対 ２５ ｋｇ／ｍ２；Ｐ＝０．３７）または体外受精（１７％ 対 １０％；Ｐ＝０.１０）の状態のそれぞれで異ならなかった。出産時の平均妊娠週数は３３対３９週であった（Ｐ＜１０−５）。以前の試験で同定されたＣＭＰマーカーは、再びＳＰＴＢについて異なるKaplan-Meier曲線を示したことが観察された。
【０１０５】
図６に示すように、ＳＰＴＢ患者および対照サンプルを、置換（ブートストラップサンプリング）を５０回行って無作為にサンプリングした。毎回、レシーバー−オペレーティング特性（ＲＯＣ）曲線をコンピューター計算し、対応する曲線下面積（ＡＵＣ）を推定した。５０回のブートストラップサンプリングの実行から推定されたＡＵＣの平均（垂直軸）および標準偏差（水平軸）を、各候補タンパク質バイオマーカー（黒丸）でプロットした。同じ手順を、サンプルの患者／対照ラベルが無作為にスクランブルされている（ラベルパーミュテーション：label permutation）間に繰りかえし、タンパク質バイオマーカーが識別能を有さないとき、結果がどのように現れるかをシミュレートして、該結果を白抜きの四角でプロットした。水平線は、両方ともラベルパーミュテーションの結果から推定される、平均値より１標準偏差上の値を示す。垂直線は、両方とも正しく標識された結果から推定される、平均値より１標準偏差上の値に相当する。左上の四分の一区分中の黒丸は、比較的高い、かつ統計的に安定した識別能を有するタンパク質である。ブートストラップサンプリングおよびラベルパーミュテーション分析を用いて、上記の表２に列記したタンパク質のセットは、ＳＰＴＢを対照群から区別する統計的に一貫した識別能（ＲＯＣ分析によって証明される）を示した。黒丸は、ブートストラップＲＯＣ分析においてＳＰＴＢを対照群から区別するためのタンパク質のＡＵＣの平均（ｙ軸）およびＳＤ（ｘ軸）を表す。白抜きの四角は、同じブートストラップＲＯＣ分析であるが、無作為に再配置されている（パーミュテーションされた：permutated）サンプルのＳＰＴＢ／対照ラベルからのタンパク質のＡＵＣの平均およびＳＤを表す。図７に示すとおり、統計的に一貫した性能を有するタンパク質は、プロットの左上の四分の一区分中の黒丸として示される。
【０１０６】
以下のタンパク質は、実施例１のサンプルセットと実施例３のサンプルセットとの間で一貫した性能を示したことを特記する。これらのタンパク質は、ＫＬＫＢ１、ＡＰＯＭ、ＩＴＩＨ４、ＩＣ１、ＫＮＧ１、Ｃ９、ＡＰＯＬ１、ＰＧＲＰ２、ＴＨＢＧ、ＦＢＬＮ１、  ＩＴＩＨ２、ＶＴＤＢ、Ｃ８Ａ、ＡＰＯＡ１、ＨＰＴおよびＴＲＹ３である。
【０１０７】
実施例４：サンプル調製法
サンプル調製法をさらに検討した。
【０１０８】
図８は、実施例２のサンプルからのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）データにおける２ＱＣプールが、高い分析精度（変動係数が小さい）を示すことを示す。２つの集められたサンプルを、実施例２のデータ作成のために用いられたサンプルセット（２２〜２４週のサンプル）において用た。分析精度の数値である変動係数（ＣＶ）は、ＱＣデータを技術的複製物として用いて、全てのタンパク質について推定された。全てのタンパク質に亘るＣＶの分布を、ヒストグラムとしてプロットした。プールＡ：影付き棒グラフ、プールＢ：白抜き棒グラフ。分析精度は、バイオマーカー発見研究にとって適切であった。
【０１０９】
図９は、実施例２で用いた２２〜２４週のサンプルから、対照群からＳＰＴＢを検出するのに有益な多数のタンパク質に関するNeXosome（登録商標）サンプル調製工程（ＳＥＣ）を示す。サンプルブートストラップバイオマーカー選択手順を用いて、同じ患者から得られたNeXosomeサンプル調製工程での試料片および血漿試料片から直接、データ作成を行った。結果は、多数の有益なタンパク質が、ＳＥＣでの試料片のデータから同定されたことを示す。NeXosome サンプル調製工程（ＳＥＣ）により、高価値のマイクロ粒子が富化され、その結果、ＳＰＴＢのための臨床的に有益かつ生物学的に関連するバイオマーカーの同定が改善された。
【０１１０】
図１０は、豊富なタンパク質アルブミン（ＡＬＢＵ）の濃度に対するＳＥＣの効果を示す。ボックスプロットは、ＳＥＣ調製によるサンプル中および血漿サンプル中のアルブミン定量の分布を直接示す。NeXosome サンプル調製工程（ＳＥＣ）は、血漿を直接使用するのと比較して、顕著にアルブミン濃度を減少させた。
【０１１１】
図１１は、ＳＥＣが、Ｄ２ ＩＴＩＨ４における、ＳＰＴＢと対照群との区別を改善したことを示す。ボックスプロットは、NeXosome サンプル調製工程（ＳＥＣ）を用いるとき、および用いないときのサンプル中のＳＰＴＢと対照群との間のバイオマーカー ＩＴＩＨ４の分布の差異を比較する。ＳＥＣは、ＳＰＴＢと対照群の間のバイオマーカーＩＴＩＨ４についての区別を顕著に改善した（ＳＥＣ調製サンプルからのデータではＰ＜０．０００４に対して、Mann−Whitney−Wilcoxon検定での血漿からの直接のデータではＰ＝０．３１４５であった）。
【０１１２】
上記の発明は、その特定の態様を参照して記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更が行われ、均等物が置換され得ることは、当業者に理解されるべきである。上記の種々の態様は、さらなる態様を提供するために組み合わせることができる。加えて、記載された発明の目的の精神および範囲に対して、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの１または複数工程を適用するために、多くの改変が行われてよい。このような改変は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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