【手続補正書】
【提出日】平成18年12月20日(2006.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
幸運なことに、多くの関係因子はライフスタイルを変えることによりコントロールできる。喫煙者の心臓血管障害の危険性は、非喫煙者の２倍以上である。人が禁煙したとき、彼または彼女が過去にどの程度喫煙していたかに関わらず、疾患を発症する危険性は急速に減少する。血清コレステロールレベルは、心臓血管障害の有病率と直接関係し、高血圧症または高い血圧は重要な危険因子である。身体的活動は、種々の機構を介して心臓血管障害の発症の危険性を減少させると仮定されている：心筋酸素供給を増加させ、酸素要求を減少し、かつ心筋収縮およびその電気刺激安定性を改善する。減少した酸素要求および心筋作業量は休息時の心拍数と血圧の低下に反映される。身体的活動はまた冠動脈の直径および拡張能力を増加させ、副行動脈形成を増加し、冠状動脈アテローム性動脈硬化症の進行の速度を低下させる。肥満および血清脂肪酸は、活動により減少する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
虚血性アテローム性動脈硬化症の処置のための手術的アプローチは、バイパス移植術、冠状動脈血管形成術、レーザー血管形成術、アテローム切除術、動脈内膜切除および経皮経管的血管形成術(ＰＣＴＡ)を含む。これらのアプローチ後の、閉塞が再発し、しばしばより悪くなる再狭窄が原因の失敗の割合は異常に高い(３０−５０％)。再狭窄のほとんどがさらなる炎症、平滑筋蓄積および血栓症が原因であるように見える。心臓血管疾患へのさらなる治療的アプローチは、虚血心臓および四肢疾患のような状態における血管形成および組織リモデリングの促進をする処置を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明は、正常なヒト血清には存在するが、心臓血管障害の個体由来の血漿では検出されない、分泌され、活性なポリペプチド種に関連する組成物に関する。これらのポリペプチド種は、本明細書で“心臓血管障害血漿ポリペプチド”またはＣＰＰと呼ぶ。特に、本発明の好ましいＣＰＰは、配列番号３−４として記載され、本発明でＣＰＰ６およびＣＰＰ７と名付けられているフラグメントである。組成物は、ＣＰＰ前駆体、モノクローナル抗体を含むＣＰＰに特異的な抗体および他のそれに由来する結合組成物を含む。さらに含まれるのは、これらの組成物の製造法および使用法である。本発明の前駆体は、非修飾前駆体、配列番号１−５のタンパク質分解的前駆体、および、配列番号１−５のアミノ酸配列における別のタンパク質分解部位に由来する中間体を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
他の局面において、本発明は、上記のポリペプチド、ペプチドフラグメントまたはペプチドのいずれかに特異的な単離抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。さらに好ましいのは、排他的にＣＰＰに結合する抗体、すなわち、他のポリペプチド、例えば、配列番号１−５からなる群から選択されるポリペプチドに由来しないポリペプチドを認識しない抗体である。抗ＣＰＰ抗体は、精製、診断および治療適用を有し、特に、ＣＰＰ−関連疾患の処置に適用を有する。精製および診断のための好ましい抗ＣＰＰ抗体は標識基に結合している。診断のための好ましいＣＰＰ−関連疾患は、冠状動脈疾患(ＣＡＤ)、冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)、末梢血管障害、脳虚血(卒中)、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧および他の心臓血管疾患を含む。処置および診断法は、ＣＰＰ抗原に特異的な抗体または抗体−由来組成物を用いるものであるが、これらに限定されない。特異的組織サンプルおよび体液(好ましくは血漿)中のＣＰＰを検出するための、および、組織中のＣＰＰの発現を検出するための診断法もまた本発明の一部である。薬学的に許容される担体と一緒の、上記の１個またはそれ以上の抗体を含む組成物も本発明の範囲内である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明は、さらに、個体における配列番号３−４のＣＰＰの異常な発現またはプロセシングに関連する疾患を処置するためのＣＰＰ組成物の使用法を含む。好ましいＣＰＰ−関連疾患は、冠状動脈疾患(ＣＡＤ)、冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)、末梢血管障害、脳虚血(卒中)、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧および他の心臓血管疾患を含む。さらに包含されるのは、ＣＰＰ遺伝子に相補的なプライマーおよび／またはメッセンジャーＲＮＡおよび抗ＣＰＰ抗体を含むＣＰＰ組成物の、組織および体液、好ましくは血漿におけるＣＰＰの量の検出および測定のための使用法である。本発明は、さらに、ＣＰＰの発現を増加させる化合物のスクリーニング法、ならびに、ＣＰＰと相互作用するおよび／または活性を増加させる化合物のスクリーニング法を含む。本発明はさらにＣＰＰの発現を阻害する化合物のスクリーニング法、ならびに、ＣＰＰと相互作用するおよび／または活性を阻害する化合物のスクリーニング法を含む。本発明はさらにこのようにして同定された化合物、ならびにそれらの組成物も包含する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本明細書で使用する、“とハイブリダイズする”なる用語は、中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション、好ましくは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、少なくとも互いに６０％相同のヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズしたままであることが可能な条件を記載することを意図する。好ましくは、条件は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％または９８％相同な配列が、典型的に互いにハイブリダイズしたまま残るようなものである。ストリンジェント条件は当業者に既知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見ることができる。好ましい、非限定的例において、核酸相互作用のためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件は下記の通りである：ハイブリダイゼーション段階は、６５℃で、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハルト溶液、０,５％ＳＤＳおよび１００μｇ／mlのサケ精子ＤＮＡの存在下と理解されている。ハイブリダイゼーションは４回の洗浄段階：
−５分、好ましくは６５℃で２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中の２回の洗浄；
−３０分、好ましくは６５℃で２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中の１回の洗浄、
−１０分、好ましくは６５℃で０.１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ緩衝液中の１回の洗浄
に続き、これらのハイブリダイゼーション条件は、約２０ヌクレオチド長の核酸分子に適している。上記のハイブリダイぜージョン条件は、当業者に既知の方法にしたがって、望む核酸の長さにしたがって変化させるべきであり、例えばHames B.D. and Higgins S.J. (1985)Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach. Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford; およびCurrent Protocols in Molecular Biology(前掲)にしたがって変化させる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
２つの配列間の配列の比較および％相同性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。配列の比較に使用する数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77のように改変された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68であり、その内容を出典明示により全体を本明細書に包含させる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)に包含されている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の配列と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、文字長＝１２で実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のポリペプチド配列と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、文字長＝３で実施できる。比較目的でギャップド・アラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., (1997)Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402に記載のように利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメーターを使用できる。その記載を出典明示により全体を本明細書に包含させるhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。配列の比較のために使用する数学的アルゴリズムの他の好ましい非限定的例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)であり、その記載を出典明示により全体を本明細書に包含させる。このようなアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２.０)に包含させ、それはＧＣＧ配列アラインメント・ソフトウエアパッケージの一部である。ＡＬＩＧＮプログラムをアミノ酸配列の比較に使用するとき、ＰＡＭ１２０ウェイト・残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用できる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
“組み換えポリペプチド”なる用語は、本明細書で、人工的に設計され、最初の自然環境では連続しては見られない少なくとも２つのポリペプチド配列を含むポリペプチドを意味するか、組み換えポリヌクレオチドから発現されているポリペプチドを意味するために使用する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本明細書で使用する“ＣＰＰモジュレーター”または“ＣＰＰ６モジュレーター”または“ＣＰＰ７モジュレーター”なる用語は、本発明のＣＰＰの発現または生物学的活性のいずれかを調節(すなわち、増加または減少)できる分子(例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子または抗体)である。ＣＰＰ発現または活性を促進するＣＰＰモジュレーターは、ＣＰＰアクティベーターまたはアゴニストと呼ぶ。逆に、ＣＰＰ発現または活性を抑制するＣＰＰモジュレーターは、ＣＰＰ阻害剤またはアンタゴニストと呼ぶ。好ましくは、ＣＰＰモジュレーターは、発現または活性を少なくとも５、１０または２０％増加／減少させる。ＣＰＰ阻害剤は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより特徴付けられる、抗ＣＰＰ抗体、そのフラグメント、アンチセンスポリヌクレオチドおよび分子を含む。ＣＰＰアゴニストは、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより特徴付けられるポリヌクレオチド発現ベクターおよび分子を含む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明の他の局面は、抗ＣＰＰ抗体に関する。本明細書で使用する“抗体”なる用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＣＰＰのような抗原を特異的に結合する(免疫反応する)抗原結合部位を含む分子、またはその生物学的活性フラグメントまたはその相同物を意味する。好ましい抗体は、配列番号３−４からなる群から選択されるＣＰＰと排他的に結合し、他のポリペプチド配列と高親和性で結合しない。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分は、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより産生できるＦ(ａｂ)およびＦ(ａｂ')２フラグメントを含む。本発明は、ＣＰＰと結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体または、その生物学的活性フラグメントまたは相同物を提供する。本明細書で使用する“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”なる用語は、ＣＰＰの特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位のただ１つの種を含む、抗体分子の集団である。モノクローナル抗体組成物は、したがって、典型的にそれらが免疫反応する特定ＣＰＰの親和性に対して単独の結合親和性を示す。好ましいＣＰＰ抗体は標識基に結合している。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
本明細書で使用する、“ベクター”なる用語は、それが結合している他の核酸を輸送できる、核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは“プラスミド”であり、それは付加的ＤＮＡセグメントをその中にライゲートできる、環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターの他のタイプは、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内にライゲートできるウイルスベクターである。あるベクターは、それらが挿入された宿主細胞内で自己複製することが可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター)は、宿主細胞への挿入により宿主細胞のゲノム内に統合され、それにより宿主ゲノムと一緒に複製する。さらに、あるベクターは、それらが操作可能に結合している遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターを本明細書で“発現ベクター”と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形であるため、交換可能に使用できる。しかしながら、本発明は、同等な機能を提供する、このような他の発現ベクターの形、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含むことを意図する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
我々は、ここで、正常ヒト血漿を循環する本発明の“心臓血管障害血漿ポリペプチド”を記載する。本発明のポリペプチド種は、冠状動脈疾患(ＣＡＤ)、冠状動脈性心臓病(ＣＨＤ)、末梢血管障害、脳虚血(卒中)、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧および他の心臓血管疾患の危険性を測定するための、重要で正確な診断ツールを代表する。本発明のポリペプチドは、小、分泌性因子であり、それ自体、タンパク質を利用した治療の理想的な候補物である。臨床応用における投与量調節に関して、タンパク質治療は、精細に制御可能な発現を欠くことにより障害された遺伝子治療に好ましい。さらに、分泌性因子であるため、本発明のポリペプチド種、例えば、小分子またはタンパク質阻害剤の標的にしやすい。故に、本発明のポリペプチド種は、心臓血管疾患の予防および処置のための薬剤開発および治療戦略の設計に有用である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本発明の１つの局面は、抗ＣＰＰ抗体を産生するための免疫原としての使用に適した単離ＣＰＰ、およびその生物学的活性部分、ならびにポリペプチドフラグメントに関する。１つの態様において、天然ＣＰＰペプチドは血漿、細胞または組織供給源から、標準タンパク質精製技術を使用した適当な精製スキームにより単離できる。他の態様において、ＣＰＰは組み換えＤＮＡ技術により製造する。組み換え発現とは別に、ＣＰＰを、“ＣＰＰ組成物の化学的製造”なる表題の部分および実施例３に記載のようなペプチド合成技術を使用して化学的に合成できる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
表１に提供した情報は、ＣＡＤを有しない個体の血漿に存在するポリペプチド種の数を確認する。例えば、同じトリプシン消化ペプチドが、ＲＰ１分離における１つ以上のフラクションで発見される。これらのＲＰ１フラクションは広く離れているため、これは、トリプシン消化ペプチドが異なる循環ポリペプチド種に由来することを示唆する。したがって、表１において、同じペプチド配列が、ＲＰ１分離のフラクション１６およびフラクション２０に出現することは、トリプシン消化ペプチドが由来した２つのポリペプチド種が存在し、それらが異なる全体的疎水性を有することを示唆する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
配列番号５の観察されたトリプシン消化ペプチドは、実施例１に記載のように、配列番号３−４のポリペプチドのトリプシン消化に由来する。配列番号１のプロペプチド上での、予測されたシグナル配列の除去によりおよび二塩基性部位での連続的タンパク質分解により、配列番号３−４のポリペプチドに到着する。検出した種の分子量にしたがった分離を考慮すると(実施例１のステップ２に記載)、ＣＰＰ６および７(各々配列番号３および４)は、配列番号５のトリプシン消化ペプチドをもたらし、かつＲＰ１フラクション１６および２０に観察される(表１)、有望な血漿ポリペプチドを示す。それ自体、ＣＰＰ６および７は、心臓血管障害に関する診断および治療的戦略のためにとりわけ有効である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのセグメントを増幅するためのＰＣＲを行うための、プライマー対を含む。その対の各プライマーは、
ｉ)本対の一方のプライマーが、本発明のポリヌクレオチドの１つの鎖と完全に適合した対を形成し、対の他方のプライマーが同じポリヌクレオチドの相補鎖と完全に適合した二本鎖を形成し、そしてii)１０から２５００ヌクレオチドの間の距離で離れている、ポリヌクレオチド上の部位の、このような完全に適合した二本鎖由来の対になったプライマーのような、１５から３０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドである。好ましくは、対の各プライマーの、その各々の相補配列へのアニーリング温度は、実質的に同じである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
本発明のポリヌクレオチド由来のハイブリダイゼーションプローブを、例えば、顕微鏡スライドまたは懸濁細胞上に調製した、固定または凍結組織切片のような、組織サンプル上のインサイチュハイブリダイゼーションを行うことにより、使用できる。簡単に言うと、標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、制御された条件下、調製した顕微鏡上の組織切片中のそのＤＮＡまたはＲＮＡ標的サンプルと結合させる。一般に、プラスミドまたはバクテリオファージＤＮＡベクターにクローン化された目的のＤＮＡから成るｄｓＤＮＡプローブをこの目的に使用できるが、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡプローブもまた使用できる。プローブは、一般に約１５から４０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。あるいは、本プローブは、ＰＣＲランダム・プライミング・プライマー伸長により産生されたまたはプラスミドからのＲＮＡのインビトロ転写により産生された(リボプローブ)ポリヌクレオチドプローブであってよい。これらの後者のプローブは、典型的に数百塩基対長である。本プローブを多数の標識基のいずれかで標識でき、具体的な検出法はプローブに利用する標識のタイプに対応する(例えば、それぞれに見合った、オートラジオグラフィー、Ｘ線検出、蛍光または可視顕微鏡分析)。本反応は、蛍光標識されたプローブ上に存在するフルオレッセイン部分に対する抗体のような、使用したディテクター分子の標識に対する免疫組織化学的技術を使用して、さらにインサイチュで増幅できる。具体的標識およびインサイチュ検出法は、例えば、出典明示により本明細書に包含させるHoward, G. C., Ed., Methods in Nonradioactive Detection, Appleton & Lange, Norwalk, Conn., (1993)に見ることができる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
本発明のポリヌクレオチドの全てを、所望により、当分野で既知の全ての標識基を取り込むことにより標識でき、分光、光化学、生化学、免疫化学または化学手段により検出できるようにする。さらなる例は、Urdea et al. (Nucreic Acids Research. 11:4937-4957, 1988)またはSanchez-Pescador et al. (J. Clin. Microbiol. 26(10):1934-1938, 1988)に記載のような、核酸フラグメントの非放射活性標識である。加えて、本発明のプローブはまたシグナル増幅を可能にするような構造特性を有し得、このような構造は、例えば、Urdea et al(Nucreic Acids Symp. Ser. 24:197-200, 1991)または欧州特許ＥＰ０２２５８０７(Chiron)により記載のような、分枝ＤＮＡプローブとして特徴付けられる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
標識はまた、プライマーまたは、増幅ＤＮＡのような、プライマー伸長産物の固体支持体への固定化を容易にするための、プライマーの捕獲に使用できる。捕獲標識はプライマーまたはプローブに結合し、固相試薬特異的結合メンバー(例えばビオチンおよびストレプトアビジン)と結合対を形成する、特異的結合メンバーであってよい。したがって、ポリヌクレオチドまたはプローブが担持する標識のタイプに依存して、それは、標的ＤＮＡの捕獲または検出に使用できる。さらに、本明細書に記載するポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、それ自体、捕獲標識として働くことがある。例えば、固相試薬結合メンバーが核酸配列である場合、それはプライマーまたはプローブの相補部分と結合するように選択され、それによりその固相にプライマーまたはプローブを固定化する。ポリヌクレオチドプローブそれ自体が結合メンバーとして働く場合、当業者は、プローブが標的と相補的ではない配列または“尾部”を含むことを認識するであろう。ポリヌクレオチドプライマーそれ自体が捕獲標識である場合、少なくともプライマーの一部は固相上の核酸と自由にハイブリダイズする。ＤＮＡ標識技術は、専門家には既知である。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
そのうえ、ＣＰＰの単離フラグメントをまた、このようなペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組み換え的に産生したペプチドのスクリーニングにより得ることができる。加えて、フラグメントを、慣用のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学反応のような当分野で既知の技術を使用して、化学的に合成できる。例えば、本発明のＣＰＰは、フラグメントの重複なしで所望の長さのフラグメントに適宜分割でき、または、好ましくは所望の長さの重複フラグメントに分割する。本フラグメントを製造し(組み換え的にまたは化学合成により)、試験して、ＣＰＰ生物学的活性を有するペプチジルフラグメントを、例えば、マイクロインジェクションアッセイまたはインビトロタンパク質結合アッセイにより、同定できる。説明のための態様において、ＣＰＰの異なるフラグメントを含むＣＰＰのペプチジル部分、例えばＣＰＰ標的結合領域を、チオレドキシン融合タンパク質として発現させることによりＣＰＰ活性に関して試験できる(例えば、米国特許５,２７０,１８１および５,２９２,６４６；およびＰＣＴ公開Ｗ０９４／０２５０２参照、これらの内容を、出典明示により本明細書に包含させる)。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
この方法の説明のための態様において、ＣＰＰ相同物または他の関連タンパク質の集団のためのアミノ酸配列を整列させ、好ましくは可能性のある最高の相同性を高める。このような変異体の集団は、例えば、１個またはそれ以上の種由来のＣＰＰ相同物、または同じ種由来であるが、変異のために異なるＣＰＰ相同物を含むことができる。整列した配列の各位置に出現するアミノ酸を、組み合わせ配列の縮重セットを創成するために選択する。可能性のあるＣＰＰ相同物のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から産生できる、多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置で行い、次いで、合成遺伝子を、発現のための適当な遺伝子とライゲートできる。遺伝子の縮重セットの目的は、１つの混合物中で、可能性のあるＣＰＰ配列の所望のセットをコードする配列の全てを提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当分野で既知である(例えば、Narang, SA(1983)Tetrahedron 393; Itakura et al. (1981)Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam:Elsevier pp. 273-289; Itakura et al. (1984)Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984)Science 198:1056; Ike et al. (1983)Nucleic Acid Res. 11:477参照)。このような技術は、他のタンパク質の定方向発生(directed evolution)に用いられている(例えば、Scott et al. (1990)Science 249:386-390; Roberts et al. (1992)PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990)Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990)PNAS 87:6378-6382；ならびに米国特許５,２２３,４０９、５,１９８,３４６および５,０９６,８１５参照)。上記文献の記載は、出典明示により本明細書に包含させる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
点変異により産生した組み合わせライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングならびにある特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための、広範囲の技術が、当分野で既知である。このような技術は、一般にＣＰＰの組み合わせ変異誘発により産生された遺伝子ライブラリーの急速スクリーニングに適用できる。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も広範に使用される技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングして、得られたベクターのライブラリーで適当な細胞をトランスフォーミングして、組み合わせ遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物を検出した遺伝子をコードするベクターの相対的に容易な単離を助けるような条件下で発現させることを含む。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
Ｃ−末端チオエステルを有するペプチドフラグメントを、出典明示により本明細書に包含させる下記の文献に記載の通りに製造できる：Kent et al, 米国特許６,１８４,３４４；Tam et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 92:12485-12489(1995); Blake, Int. J. Peptide Protein Res., 17:273(1981); Canne et al, Tetrahedron Letters, 36:1217-1220(1995); Hackeng et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:7845-7850(1997); またはHackeng et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 96:10068-10073(1999)。好ましくは、Hackeng et al(1999)に記載の方法を用いる。簡単に言うと、ペプチドフラグメントを固相支持体(下記)上で、典型的に０.２５mmolスケールで、出典明示により本明細書に包含させるSchnolzer et al, Int. J. Peptide Protein Res., 40:180-193(1992)に記載の、Ｂｏｃ化学のインサイチュ中和／ＨＢＴＵ活性化法を使用して合成する。(ＨＢＴＵは２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸であり、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである)。各合成サイクルは、希釈していないＴＦＡでの１から２分の処理によるＮα−Ｂｏｃの除去、１分のＤＭＦでの流水洗浄、１０から２０分の、１.０mmolの予め活性化したＢｏｃ−アミノ酸とのＤＩＥＡ存在下での結合時間、および２回目のＤＭＦでの流水洗浄から成る。(ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＤＭＦはＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、そしてＤＩＥＡはＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである)。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸(１.１mmol)を、３分、１.０mmolのＨＢＴＵ(ＤＭＦ中０.５Ｍ)で、過剰のＤＩＥＡ(３mmol)存在下予め活性化させる。各カップリング段階後、残った遊離アミンを、例えばSarin et al, Anal. Biochem., 117:147-157(1981)に記載のような慣用のニンヒドリンアッセイで測定することにより収率を測定する。Ｇｌｎ残基の結合後、ＤＣＭ流水洗浄を、ＴＦＡを用いた脱保護の前および後に使用し、可能性のある高温(ＴＦＡ／ＤＭＦ)−触媒ピロリドン形成を防止する。鎖構築が完了した後、本ペプチドフラグメントを脱保護し、無水ＨＦで１時間、０℃での処理により、４％ｐ−クレゾールをスカベンジャーとして使用して樹脂から開裂する。イミダゾール側鎖２,４−ジニトロフェニル(ｄｎｐ)保護基は、ｄｎｐ−除去法がＣ−末端チオエステル基と両立できないため、Ｈｉｓ残基上に残る。しかしながら、ｄｎｐをライゲーション反応中にチオールにより徐々に除去する。開裂後、ペプチドフラグメントを氷冷ジエチルエーテルで沈殿し、水性アセトニトリルに溶解し、凍結乾燥する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
上記のチオエステルペプチドフラグメントは、好ましくはHackeng et al(1999)に記載のように、または同等なプロトコールで製造したトリチル−結合メルカプトプロピオン酸−ロイシン(ＴＡＭＰＡＬ)樹脂上で合成する。簡単に言うと、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ(４mmol)を３.６mmolのＨＢＴＵで、６mmolのＤＩＥＡの存在下活性化し、１６分、２mmolのｐ−メチルベンズヒドリルアミン(ＭＢＨＡ)樹脂またはその等価物と結合させる。次に、３mmolのＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を２.７mmolのＨＢＴＵで、６mmolのＤＩＥＡの存在下活性化し、１６分、Ｌｅｕ−ＭＢＨＡ樹脂と結合させる。得られたＴＡＭＰＡＬ樹脂を、ＴＦＡ中２回、１分の３.５％トリイソプロピルシランおよび２.５％Ｈ２Ｏでトリチル保護基を除去した後、ポリペプチド−鎖構築のための出発樹脂として使用できる。チオエステル結合は、全ての所望のアミノ酸と、Schnolzer et al(上記)に記載のように、標準インサイチュウ−中和ペプチド結合プロトコールを１時間使用して形成できる。最終ペプチドフラグメントの無水ＨＦでの処置は、Ｃ−末端活性化メルカプトプロピオン酸−ロイシン(ＭＰＡＬ)チオエステルペプチドフラグメントを産生する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
宿主細胞株を、挿入配列の発現を調節する、または、発現タンパク質を所望の形態に加工する能力に関して選択できる。タンパク質のこのような修飾は、グリコシル、アセチル、リン酸、アミド、脂質、カルボキシル、アシルまたは炭水化物基を含むが、これらに限定されない。タンパク質の“プレプロ”形を開裂する翻訳後プロセシングはまた正しい挿入、折りたたみおよび／または機能に重要であり得る。例示の目的で、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８などの宿主細胞は、このような翻訳後活性に関する特異的細胞性機構および特徴的機構を有し、挿入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選択できる。特に興味深いのはキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)細胞、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)および他の酵母、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、ＳＦ９細胞、Ｃｌ２９細胞、２９３細胞、パンカビ属(Neurospora)、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＨｅＬａ細胞、線維芽細胞、シュワン腫細胞系、不死化哺乳類骨髄およびリンパ系細胞系、ジャーカット細胞、ヒト細胞および他の初代細胞である。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
細菌系での発現
細菌細胞の形質転換は、誘導性プロモーター例えば、“ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”ファージミド(Stratagene)または“ｐＳＰＯＲＴ１”(Gibco BRL)のハイブリッド１ａｃＺプロモーターを使用して達成できる。加えて、“ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”(ａ−ガラクトシダーゼ；Stratagene)またはｐＧＥＸ(グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；Promega, Madison, Wis.)を含むが、これらに限定されない、多くの発現ベクターを、容易に検出および／または精製できる開裂可能な融合タンパク質を製造するために、細菌細胞における使用のために選択できる。適当な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼの結合ができ、ＣＰＰ遺伝子のコード配列のｍＲＮＡへの下流(３')転写を開始できる、全ての核酸配列である。細菌プロモーターは、転写開始領域を有し、それは通常コード配列の５'末端に近位に配置する。この転写開始領域は典型的にＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例は、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーター配列および、トリプトファンのような生合成酵素由来の配列を含む。バクテリオファージ由来のプロモーターも使用でき、当分野で既知である。加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターも有用である；例えば、ｔａｔプロモーターは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。そのうえ、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合でき、転写を開始できる能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。有効なリボソーム−結合部位もまた望ましい。本発現ベクターはまた細菌におけるＣＰＰの分泌のために提供されるシグナルペプチド配列も含む。本シグナル配列は典型的に、当分野で既知のように、細胞からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。本タンパク質は増殖培地に(グラム陽性細菌)または、細胞の内膜と外膜の間に位置する細胞膜周辺腔(グラム陰性細菌)のいずれかに分泌される。本細菌発現ベクターはまた選択可能マーカー遺伝子も含み、形質転換された細菌株の選択を可能にする。適当な選択遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンを含む。選択可能マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるような生合成遺伝子を含む。例えば、抗体の誘導のために、大量のＣＰＰが必要であるとき、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいことがある。このようなベクターは、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、ＣＰＰコード配列を、ベクターに、ベータ−ガラクトシダーゼのアミノ−末端Ｍｅｔおよび続く７残基の配列と共にフレーム内にライゲートできる、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ(Stratagene)のような多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクター；ＰＩＮベクター(Van Heeke & Schuster JBiol Chem 264:5503-5509 1989))；ＰＥＴベクター(Novagen, Madison Wis.)；などである。細菌のための発現ベクターは上記に示す種々の構成要素を含み、当分野で既知である。例は、とりわけ���枯草菌、大腸菌、クレモリス菌(Streptococcus cremoris)およびストレプトコッカス・リビダンス(Streptococcus lividans)のベクターを含む。細菌発現ベクターを、カルシウムクロライド介在トランスフェクション、エレクトロポレーションなどの当分野で既知の技術を使用して、細菌宿主細胞に形質転換する。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
哺乳類系での発現
本ＣＰＰは哺乳類細胞で発現できる。哺乳類発現系は当分野で既知であり、レトロウイルスベクター介在発現系を含む。哺乳類宿主細胞を、コード領域が後期プロモーターおよび三者間リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートできる、アデノウイルスのような多くの異なるウイルスベースの発現系で形質転換できる。本ウイルスゲノムの非必須ＥｌまたはＥ３領域への挿入は、感染宿主細胞における目的のポリペプチドの発現が可能である。好ましい発現ベクター系は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０１０４８に一般的に記載のようなレトロウイルスベクターである。適当な哺乳類発現ベクターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼと結合でき、ＣＰＰのコード配列の下流(３')のｍＲＮＡへの転写を開始できる、全てのＤＮＡ配列である、哺乳類プロモーターを含む。プロモーターは、通常コード配列の５'末端に近位である転写開始領域、および通常転写開始部位の２５−３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを含む。本ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼIIがＲＮＡ合成を正しい位置で開始するのを指示すると考えられている。哺乳類プロモーターはまた上流プロモーターエレメント(エンハンサーエレメント)を含み、これは、典型的にＴＡＴＡボックスの１００から２００塩基対上流に位置する。上流プロモーターエレメントは、転写が開始する速度を決定し、いずれの配向でも働くことができる。哺乳類プロモーターとしての特定の使用は、ウイルス遺伝子がしばしば非常に発現され、広い宿主範囲を有するため、哺乳類ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。例は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ２,２１１,５０４)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアン・ウイルス４０(ＳＶ４０)プロモーターのようなウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから得られるプロモーターを含む。ただし、このようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性である。高等真核生物によるＣＰＰをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列のベクターへの挿入により増加できる。エンハンサーは、プロモーター上でその転写を増加させるために働く、通常約１０から３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作動性エレメントである。多くのエンハンサー配列が現在哺乳類遺伝子から既知である(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトタンパク質およびインシュリン)。典型的に、しかしながら、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。例は、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。本エンハンサーは、好ましくはプロモーターから５'の位置に位置する。一般に、哺乳類細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３'に位置する制御領域に位置し、したがって、プロモーターエレメントと一緒になって、コード配���に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３'末端は、部位特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のものを含む。組み換えタンパク質の長期の高収率の産生は、適当な発現系において行うことができる。ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を含む、発現ベクターをこの目的で使用できる。哺乳類細胞で使用するための選択可能マーカーを含む適当なベクターは市販品から容易に入手でき、当業者に既知である。このような選択可能マーカーの例は、各々ｔｋ−またはｈｐｒｔ−細胞で使用するための、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。外因性核酸を哺乳類宿主に、および他の宿主に挿入する方法は当分野で既知であり、使用する宿主細胞により変化する。方法は、デキストラン−介在トランスフェクション、カルシウムリン酸沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチド(複数もある)のリポソームへの封入および、核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞を、非ヒトトランスジェニック動物の製造にも使用できる。例えば、１つの態様において、本発明の宿主細胞は、ＣＰＰ−コード配列がその中に挿入されている受精した卵母細胞または胚幹細胞である。このような宿主細胞を、外因性ＣＰＰ配列がそのゲノムに挿入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ＣＰＰ配列が変えられている相同組み換え動物の製造に使用できる。このような動物は、ＣＰＰまたはそのフラグメントの機能および／または活性の研究にならびにＣＰＰ生物学的活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書で使用する“トランスジェニック動物”なる用語は、１個またはそれ以上の動物の細胞が導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはラットまたはマウスのような齧歯類である。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。本導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそこから発育し、成熟動物のゲノムを残している細胞のゲノムに統合されており、それによりトランスジェニック動物の１種またはそれ以上の細胞形または組織においてコードした遺伝子産物の発現を指示する、外因性ＤＮＡである。本明細書で使用する“相同組み換え動物”は、動物の発育前に、内因性遺伝子が内因性遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞内に挿入された外因性ＤＮＡ分子の間の相同組み換えにより、変えられた、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウスである。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
本発明のトランスジェニック動物は、ＣＰＰ−コード核酸を、受精した卵母細胞の雄性前核に、例えば、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染により挿入し、そして本卵母細胞を、偽妊娠雌性養育動物中で発育させる。本ＣＰＰ  ｃＤＮＡ配列またはそのフラグメントを、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノムに挿入できる。別法として、マウスまたはラット由来のようなヒトＣＰＰ−コード遺伝子の非ヒト相同物を、導入遺伝子として使用できる。イントロンの配列およびポリアデニル化シグナルも導入遺伝子に包含でき、導入遺伝子の発現の効率を増加させる。組織−特異的制御配列(複数もある)は、ＣＰＰ導入遺伝子に操作可能に結合し、特定の細胞でのＣＰＰの発現を指示できる。トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を、胚操作およびマイクロインジェクションを介して産生する方法は当分野で一般的となっており、例えば、両方ともLeder et al.の米国特許４,７３６,８６６および４,８７０,００９、Wagner et al. の米国特許４,８７３,１９１ならびにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986、その記載を、出典明示により本明細書にその全体を包含させる)に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の製造に使用される。トランスジェニック創始動物を、そのゲノム内のＣＰＰ導入遺伝子の存在および／または本動物の組織または細胞におけるＣＰＰ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定できる。トランスジェニック創始動物を次いで導入遺伝子を担持するさらなる動物を繁殖するために使用できる。さらに、ＣＰＰをコードする導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物に繁殖できる。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
ＣＰＰ活性の評価
本発明がさらにＣＰＰおよびＣＰＰ配列の機能的フラグメントおよび変異体の活性を試験するまたは得る方法を提供することは認められよう。このような方法は、変異体または修飾ＣＰＰ−コード核酸を提供して、このコードしたポリペプチドがＣＰＰ生物学的活性を発現するか否かを評価することを含む。包含されるのは：(ａ)ＣＰＰまたは、その生物学的活性フラグメントまたは相同物を提供して；そして(ｂ)該ＣＰＰまたはその生物学的活性フラグメントもしくは相同物のＣＰＰ生物学的活性に関して試験することを含む、ＣＰＰの機能を評価する方法である。無細胞、細胞ベースのおよびインビボ形態を含む、適当な形態全てを使用できる。例えば、該アッセイは、宿主細胞でＣＰＰ核酸を発現し、そして該細胞内または他の影響される細胞内でＣＰＰ活性を観察することを含んでよい。他の例において、ＣＰＰまたはその生物学的活性フラグメントもしくは相同物を、細胞で構築し、ＣＰＰ生物学的活性を観察する。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
ＣＰＰ生物学的活性は、当分野で既知の任意の適当な方法でアッセイできる。抗原性および免疫原性は、例えば、本明細書で“抗ＣＰＰ抗体”および“ＣＰＰ抗体の使用”の章に記載する通りに検出できる。血漿中の循環は、“診断的および予後的使用”に記載のように検出できる。ＣＰＰ標的分子との相互作用は、本明細書に、例えば、“薬剤スクリーニングアッセイ”の章において記載の全ての方法にしたがい検出できる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を、ＥＬＩＳＡでスクリーニングできる。他の固相免疫アッセイと同様、本試験は、巨大分子がプラスチックに非特異的に吸着する傾向に基づく。この反応の可逆性から、免疫学的活性の損失なしに、抗原−抗体複合体の形成と、非結合物質からのこのような複合体の簡単な分離を可能にする。抗ペプチド血清を力価測定するために、免疫化に使用したのと異なる担体と結合しているペプチドを、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに吸着させる。吸着した本抗原を次いでウェル中で、抗ペプチド血清の希釈物と反応させる。非結合抗体を洗い流し、残った抗原−抗体複合体を、免疫動物のＩｇＧに特異的な抗体と反応させる。本二次抗体を、アルカリホスファターゼのような酵素と結合させる。酵素基質が添加された時に産生する可視的着色反応が、どのウェルが抗ペプチド抗体を含むかの指標である。分光光度計読み取りの使用が、ペプチド−特異的抗体結合の良好な定量を可能にする。高力価抗血清は、１０−３および１０−５希釈の間で直線力価曲線を産生する。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
合成ペプチドを担体と結合させる一般的技術は、数種の文献、例えばWalter and Doolittle, “Antibodies Against Synthetic Peptides”, in Setlow et al., eds., Genetic Engineering, Vol. 5, pgs. 61-91 (Plenum Press, N.Y., 1983); Green et al. Cell, Vol. 28, pgs. 477-487 (1982); Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 78, pgs. 3403-3407 (1981); Shimizu et al., 米国特許４,４７４,７５４；およびGanfield et al.、米国特許４,３１１,６３９に記載されている。したがって、これらの文献を出典明示により本明細書に包含させる。また、ハプテンを担体と結合させるために用いる技術は、本質的に上記文献の技術と同じである、例えばchapter 20 in Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immuno Assay(Elsevier, New York, 1985)。ペプチドを担体に結合するための４つの最も一般的に使用されるスキームは(１)例えばKagan and Glick, in Jaffe and Behrman, eds. Methods of Hormone Radioimmunoassay, pgs. 328-329(Academic Press, N.Y., 1979)およびWalter et al. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 77, pgs. 5197-5200(1980)に記載のような、アミノ結合のためのグルタールアルデヒド；(２)例えばHoare et al., J. Biol. Chem., Vol. 242, pgs. 2447-2453(1967)により記載のような、カルボキシルのアミノへの結合のための水溶性カルボジイミド；(３)例えば、Bassiri et al., pgs. 46-47, in Jaffe and Behrman, eds. (上記)およびWalter et al. (上記)に記載のような、チロシンのチロシン側鎖への結合のためのビスジアゾベンジジン(ＢＤＢ)；および(４)例えばKitagawa et al., J. Biochem. (Tokyo), Vol. 79, pgs. 233-239(1976)およびLerner et al. (上記)により記載のような、アミノ基へのシステイン(または他のスルフヒドリル)の結合のためのマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)である。あるペプチドをタンパク質担体に結合するための適当な方法を選択する一般的な規則は下記のように述べることができる：結合に関与する基は、配列に１回だけ、好ましくは、セグメントの適当な末端に出現すべきである。例えば、ＢＤＢは、チロシン残基が、その可能性のある抗原性特性のために選択した配列の重要な部分に出現するとき、使用すべきではない。同様に、中心に位置するリシンは、グルタールアルデヒド法を除外し、そしてアスパラギン酸およびグルタミン酸の出現は、しばしばカルボジイミド法を除外する。他方、適当な残基を、それらが“天然”タンパク質配列に存在するかしないかに関わらず、選択した配列セグメントのいずれかの末端に、結合部位として配置できる。内部セグメントは、アミノおよびカルボキシ末端と異なり、ポリペプチド主鎖が続いている天然タンパク質において発見されるのと同じ配列と、“非結合末端”で有意に異なる。α−アミノ基をアセチル化し、続いてペプチドをそのカルボキシ末端の方向で結合することにより、問題がある程度解決できる。担体タンパク質への結合効率は、簡便には、放射活性アミノ酸を一段階合成のために使用して、または、完成したペプチドのチロシン残基のヨウ素化により標識して製造した、放射活性標識ペプチドを使用して、測定する。本ペプチドにおけるチロシンの存在がまた、望ましいとき、感受性放射免疫アッセイを可能にする。したがって、チロシンを、それが天然ポリペプチドにより定義されるペプチド配列の一部でないとき、末端残基として挿入できる。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
本発明の抗体を用いるアッセイの１つの態様は、本発明のモノクローナル抗体が結合している表面の使用を含む。表面の基本構造は、異なる形を取ってよく、異なる組成を有し、組成物もしくは積層の混合物、またはそれらの組み合わせであり得る。本表面は、使用および測定の方法に依存して、種々の形状および形を取ることができ、種々の寸法を有し得る。表面の実例は、パッド、ビーズ、ディスクまたはストリップであり、平ら、凹状または凸状であってよい。厚さは厳密ではなく、一般に約０.１から２mmの厚さであり、任意の簡便な直径または他の寸法である。本表面は、典型的に棒、管、毛管、繊維、ストリップ、ディスク、プレート、キュベットで支えられ、典型的に、多孔性であり、抗体の共有結合を可能にし、検出可能なシグナルを発生させるための手段の一部を形成する他の化合物の結合を可能にするために、多機能性であるか、多機能性になることができる。天然および合成の両方の、広範囲の有機および無機ポリマーおよび、これらの組み合わせを、固体表面用物質として用いることができる。ポリマーの実例は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(４−メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、レイヨン、ナイロン、ポリ(ビニルブチレート)、シリコン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロースおよびラテックスを含む。他の表面は、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド(metaloid)、半導体製品、セメント、ケイ酸塩などを含む。また包含されるのは、ゲル、ゼラチン、リポポリサッカライド、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドを形成する物質、またはデキストラン、ポリアルキレングリコール(２から３炭素原子のアルキレン)またはリン脂質のような界面活性剤のような、数個の水性相を形成するポリマーである。抗体の表面への結合は、文献から一般的に入手可能である、既知の技術により達成できる(例えば、“Immobilized Enzymes,” Ichiro Chibata, Press, New York (1978)およびCuatrecasas, J. Bio. Chem., 245:3059 (1970))。本発明のこの局面のアッセイの実施に際して、サンプルを水性媒体と混合し、本媒体を、それに結合した抗体を有する表面と接触させる。標識を、表面と結合した検出可能なシグナルを提供するために、水性媒体に、同時にまたは連続的に添加してよい。検出可能なシグナルを発生させる方法は、標識分析物の取り込みを含んでよく、または、それに標識結合体を有する二次モノクローナル抗体の使用を含んでよい。必要に応じて、分離および洗浄段階を行う。検出された本シグナルは、サンプル中のＣＰＰの存在と比例する。同じ支持体上の目盛り決めを含むのは、本発明の範囲内である。本発明のアッセイの特定の態様は、説明の目的で、限定の目的ではなく、スライドまたはペトリ皿のウェルのような支持体の使用を含む。本技術は、分析すべきサンプルを、適当な固定物質と共に支持体上に固定し、スライド上のサンプルをモノクローナル抗体とインキュベートすることを含む。例えば、リン酸緩衝化食塩水のような適当な緩衝液での洗浄後、支持体を、抗体の標識した特異的結合パートナーと接触させる。必要に応じてインキュベートした後、スライドを２回水性緩衝液で洗浄し、抗原���対する標識モノクローナル抗体の結合について測定を行う。標識が蛍光であるとき、スライドを、カバーガラス上の蛍光抗体マウンティング流体で覆い、次いで、蛍光顕微鏡で試験して、結合の程度を決定する。他方、標識が、モノクローナル抗体に結合した酵素であってよく、結合の程度を酵素活性の存在に関するスライドの試験により決定でき、これは、沈殿、色素などの形成により支持され得る。本発明の抗体を用いる特定の例は、二重決定要素ＥＬＩＳＡアッセイである。例えば、ガラスまたはビニールプレートのような支持体をＣＰＰに特異的な抗体で、慣用の技術によりコートする。本支持体を、ＣＰＰの含有が疑われるサンプルと、通常、水性媒体中で接触させる。３０秒から１２時間のインキュベーション時間の後、本支持体を媒体から除去し、非結合ＣＰＰを除去するために、例えば、水または水性緩衝化媒体で洗浄し、ＣＰＰに特異的な抗体と、また通常水性媒体中で接触させる。本抗体を、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素で直接または間接的に標識する。インキュベーション後、本支持体を本媒体から除去し、上記のように洗浄する。本支持体または本水性媒体の酵素活性を測定する。この酵素活性は、サンプル中のＣＰＰの量と比例する。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
ＴＯＦ質量分析法におけるイオン検出は、典型的に電子放出性(electro-emissive)検出器、例えば、電子増倍管(ＥＭＰ)またはマイクロチャンネル・プレート(ＭＣＰ)の使用により達成できる。これらの装置の両方とも、一次投射荷電粒子を、二次的、三次的、四次的などの電子にのカスケードに変換することにより機能する。一個の投射荷電粒子の衝撃により産生される二次電気の可能性を、本荷電粒子のイオン−対−電子変換効率と取ることができる(または、より単純に、変換効率)。入射荷電粒子の合計数と比較したときのカスケーディング事象に関する総電子収量を、典型的に検出器増幅率と記載する。一般にＭＣＰの全体的反応時間が、ＥＭＰより優れているため、ＭＣＰが、質量／荷電分解力の増強のために好ましい電子放出性検出器である。しかしながら、ＥＭＰは、速い反応時間と広い周波数バンド幅が必要ではない、消費動態エネルギーのイオン集団の検出に十分機能する。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
質量分析計から計算した分子質量と、ゲノムまたは発現遺伝子データベースのようなデータベースから予測される分子質量の一致において、翻訳後プロセシングが行われていてよい。タンパク質分解プロセシング、Ｎ−末端メチオニンの除去、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化などを含む、タンパク質構造を修飾する、種々のプロセシング事象が存在する。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
本発明の単離核酸分子は、例えば、下記に詳述するような、ＣＰＰ  ｍＲＮＡ(例えば、生物学的サンプル中)またはＣＰＰ−コード遺伝子における変化の検出に、および、ＣＰＰ活性の調節に使用できる。本ＣＰＰは、ＣＰＰの不十分な産生により、または、ＣＰＰ標的分子の過剰な産生により特徴付けられる疾患の処置に使用できる。加えて、本ＣＰＰは、天然に存在するＣＰＰ標的分子のスクリーニング、ＣＰＰ活性を調節する、好ましくは活性化する薬剤または化合物のスクリーニングに、ならびに、ＣＰＰの不十分な産生もしくは野生型ＣＰＰと比較して減少したまたは異常な活性を有するＣＰＰ形の産生により特徴付けられる疾患の処置に使用できる。さらに、本発明の抗ＣＰＰ抗体はＣＰＰを検出および単離し、ＣＰＰのバイオアベイラビリティーを調節し、そしてＣＰＰ活性を調節するために使用できる。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
さらに別の態様において、ＣＰＰが細胞表面または細胞外タンパク質と結合する能力を検出する、診断的アッセイを提供する。例えば、それは、細胞中で検出可能なレベルで発現されている間はＣＰＰ標的タンパク質(標的に対して減少したまたは増加したいずれかの結合親和性を有する)の結合が欠失している、ＣＰＰ変異体の検出に望ましいであろう。このような変異体は、上記の診断的ＤＮＡ配列決定技術または免疫アッセイにより検出するために実際的でなくてもよい、例えば、変異、例えば、点変異体から産生できる。本発明は、したがって、サンプル組織由来の１個またはそれ以上のＣＰＰ−コード遺伝子をクローニングし、そして、クローン化遺伝子を組み換え遺伝子産物と標的タンパク質の間の相互作用の検出が可能な条件下で発現させることを一般的に含む、診断的スクリーニングアッセイを意図する。本明細書の、“薬剤スクリーニングアッセイ”の章の下に記載した種々のアッセイの記載から、他の分子に結合するＣＰＰの能力の決定に、広範囲の方法が使用できることは明らかであろう。これらの技術は、野生型ＣＰＰと比較してＣＰＰ標的タンパク質に対する高いまたは低い結合親和性を有するタンパク質の変異体を発生させる、ＣＰＰ−コード遺伝子の変異の検出に使用できる。逆に、ＣＰＰ標的タンパク質およびＣＰＰが“餌”であるものと、患者サンプル由来であるものを交換することにより、主題のアッセイはまたＣＰＰ標的タンパク質の野生型形と比較して、ＣＰＰに対して高いまたは低い結合親和性を有するＣＰＰ標的タンパク質変異体の検出に使用できる。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
上記アッセイ法の１個以上の態様において、一方または両方のタンパク質の非結合形からの分離を容易にするため、およびアッセイの自動化に適用させるために、ＣＰＰまたはその標的分子のいずれかを固定化することが望ましいことがある。候補化合物の存在下および非存在下での、試験化合物のＣＰＰへの結合、またはＣＰＰと標的分子の相互作用は、反応体を含有するのに適した全ての容器中で、かつ、本明細書に記載の全ての固定化プロトコールにより達成できる。あるいは、本複合体をマトリックスから解離し、ＣＰＰ結合または活性のレベルを、標準技術を使用して決定できる。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２５】
他の態様において、ＣＰＰ発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中のＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する、方法において同定する。候補化合物存在下のＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、候補化合物非存在下のＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較する。本候補化合物を次いでこの比較に基づいて、ＣＰＰ発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、候補化合物の存在下でＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がその非存在下より大きい(統計的に有意に大きい)とき、本候補化合物はＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤として同定される。あるいは、候補化合物の存在下でＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がその非存在下より小さい(統計的に有意に小さい)とき、本候補化合物は、ＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定される。細胞中のＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、本明細書でＣＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して記載の方法により決定できる。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
本発明のさらに別の局面において、本ＣＰＰを２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおいて、“餌タンパク質”として使用でき(例えば、米国特許５,２８３,３１７；Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; およびBrent ＷＯ９４／１０３００参照、これらの内容を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる)、ＣＰＰに結合するまたはそれと相互作用し(“ＣＰＰ−結合タンパク質”または“ＣＰＰ−ｂｐ”)、ＣＰＰ活性に関与する他のタンパク質を同定する。このようなＣＰＰ−結合タンパク質はまた、例えば、ＣＰＰ−介在シグナル伝達経路の下流エレメントとして、ＣＰＰまたはＣＰＰ標的によるシグナルの伝達に関与しているようである。あるいは、このようなＣＰＰ−結合タンパク質はＣＰＰ阻害剤であるようである。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
本発明はまた本明細書に記載のような診断、予後、予防および処置のための、上記スクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤の使用に関する。したがって、このような薬剤を、本明細書に記載のような診断、予後または処置に使用するための薬剤または医薬組成物の設計、製剤、合成、製造および／または製品において使用することも本発明の範囲内である。例えば、１つの態様において、本発明は、上記スクリーニングアッセイの一つにより得ることができる化合物の構造および／または特性を参照した、薬剤または医薬組成物の合成または製造の方法を含む。例えば、薬剤または医薬組成物を、ＣＰＰ標的分子を発現する細胞と試験化合物を接触させ、本試験化合物が本ＣＰＰ標的分子と結合するまたは活性を調節する能力を決定する、方法により得られた化合物の構造および／または特性に基づいて合成できる。他の例示的態様において、本発明は、ＣＰＰまたはその生物学的活性部分を試験化合物と接触させ、本試験化合物がＣＰＰまたはその生物学的活性部分と結合する、または活性を調節する(例えば、刺激または阻害する)能力を決定する方法により得られた化合物の構造および／または特性に基づいて合成または製造する方法を含む。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
先行文献に示されるように(Ferns, G. A. A. et al. (1991)Science, 253:1129-1132)、再狭窄のラット頸動脈傷害モデルは、可能性のある治療作用の指標に有用であり得る。本方法の例は、米国特許６５００８５９に記載され、その記載を出典明示により本明細書に包含させる。簡単に言うと、国立加齢動物取扱および使用協議会(National Institute on Aging Animal Care and use Committee)により承認されたプロトコールを使用し、ＧＲＣコロニー由来の６ヶ月齢Wistarラットを、腹腔内２０mg／体重kgペントバルビタール、２mg／体重kgケタミンおよび４mg／体重kgキシラジン(xylazine)で麻酔する。左外頸動脈を２−Ｆｒｅｎｃｈ  Ｆｏｇａｒｔｙ塞栓摘出カテーテルでカニューレ挿入し、食塩水で膨張させ、総頸動脈を３回上下させて通し、拡張した脱内皮的傷害(deendothelializing injury)を作る。本動物を、適当な用量の試験物質またはビヒクル単独(例えば、一日あたりの体重に基づいて、１：２：２：１６５  ＤＭＳＯ：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：脱水エタノール：リン酸緩衝化食塩水のような適当な溶液)を、傷害２時間後に開始する腹腔内注射により処置した。試験物質またはビヒクル単独を、腹腔内注射として、１日１回、次の４日間投与した。１１日後、本動物(８匹処置および１０匹ビヒクル−処置)を上記のように麻酔し、頸動脈を単離し、１０％緩衝化ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。頸動脈の横断面を顕微鏡スライドにマウントし、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色する。本頸動脈の画像をデジタルボードに投影し、内膜と中膜の横断面領域を測定した。新生内膜領域(厚さ)の減少は、本試験物質が有効な抗再狭窄剤であることを示す。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
簡単に言うと、雄Wistarラット(２００−３００ｇ)を、イナクチン(１００mg／kg)で麻酔する。胆管を１０インチ長のＰＥ１０管系でカニューレ挿入する。小腸を暴露し、ガーゼパッド上に広げる。カニューレ(１／８”luer lock, tapered female adapter)を、小腸と盲腸の分岐点から１２cmに挿入する。スリットを同分岐点から４cm離して切断する(回腸の８cm長を利用)。温ダルベッコリン酸緩衝化食塩水、ｐＨ６.５(ＰＢＳ)の２０mlを、この腸セグメントの洗い流しに使用する。本遠位開口部を２０cm長のシリコン管系でカニューレ挿入する(０.０２”Ｉ.Ｄ..×.０.０３７”Ｏ.Ｄ.)。本近位カニューレを蠕動ポンプに接続し、この腸を２０分、温ＰＢＳで０.２５ml／分で洗浄する。本腸セグメントの温度を連続的にモニターすべきである。実験の開始時に、２.０mlのコントロールサンプル(０.０５ｍＣｉ／mLの１４Ｃ−タウロコレートと５mM非放射標識タウロコレート)を本腸セグメントに３mlシリンジで充填し、胆汁サンプル回収を開始する。コントロールサンプルを０.２５ml／分の速度で２１分注入する。胆汁サンプルフラクションを３分毎に、工程の最初の２７分回収する。２１分のサンプル注入後、本回腸ループを、２０mlの温ＰＢＳ(３０mlシリンジを使用して)で洗い流し、次いで、本ループを２１分、温ＰＢＳで０.２５ml／分で洗い流す。２回目の潅流を上記のように、しかし、試験化合物をさらに添加して行い(２１分投与、その後の２１分洗い流し)、胆汁を最初の２７分、３分毎にサンプリングする。必要に応じて、３回目の潅流を上記のように行い、これは典型的にコントロールサンプルを含む。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
血清脂質測定を同様に測定する。血液を、絶食させたイヌの橈側皮静脈から、血清分離管に採血する(Vacutainer SST, Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, N.J.)。本血液を２０００rpmで２０分遠心し、血清を傾捨する。総コレステロールを、９６ウェル形で、Ｗａｋｏ酵素診断キット(Cholesterol CII)(Wako Chemicals, Richmond, Va.)を使用して、コレステロールオキシダーゼ反応を利用して、過酸化水素を産生させ、それを比色分析で測定することにより測定する。０.５から１０μｇコレステロールから標準曲線をプレートの最初の２カラムに調製する。本血清サンプル(２０−４０μｌ、予測される脂質濃度に依存する)または既知血清コントロールサンプルを、別のウェルにデュプリケートで添加する。水を添加して、各ウェルの容量を１００μｌとする。着色試薬の１００μｌアリコートを各ウェルに添加し、プレートを１５分、３７℃でインキュベートした後５００nmで読む。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４９】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤する。投与経路の例は、非経腸、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜的、および直腸投与を含む。非経腸、皮内または皮下投与に使用する溶液または懸濁液は下記のものを含んでいてよい：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および張性を調節するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節できる。非経腸製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数回用量バイアルに入れてよい。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６０】
多くの薬剤が、心臓血管障害の処置および予防に有用である。このような薬剤は、有利には、ＣＰＰと組み合わせて使用できる。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】
低分子量タンパク質(＜２０kDa)は、直列逆相捕捉カラム：５０ml  ＰＬＲＰＳ  １００オングストローム(Polymer labs, UK)に適応させた。ＰＬＲＰＳカラム上の３方向バルブを、３３ｍＡＵ(２８０nm)のカットオフで切り替え、ゲル濾過溶出液を逆相捕捉カラムに送った。このカットオフ値は、最初にＯＤ値の概算範囲を提供するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用により、続く、３つのカットオフ値(ＯＤ範囲の高、中および低値)の評価により確立した。最終カットオフ値は、少なくとも８５％の低分子タンパク質比率で得られる低分子量タンパク質を最大となるように選択した。低分子量タンパク質およびペプチドを逆相捕捉ＰＬＲＰＳカラムから、０.１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮの水溶液の１カラム容量勾配により溶出した。
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７８】
Ｃ４カラムを溶液Ａで平衡化および洗浄し、タンパク質およびペプチドを、逆相ＨＰＬＣ分別１におけるサンプルの溶出位置に適合させた２相性勾配で溶出した。完全な質量データを、エレクトロスプレー・イオン・トラップ質量分析を使用して獲得した。１６の異なる勾配を使用し、ＣＨ３ＣＮ濃度範囲が、溶媒濃度に対応するＲＰ１フラクションのＣＨ３ＣＮの５％マイナスおよびプラスの範囲であった。３０％ＣＨ３ＣＮ以上の溶媒濃度でＲＰ１中に溶出したタンパク質に関して、ＲＰ２勾配の出発溶出条件を、ＣＨ３ＣＮパーセントで、ＲＰ１溶出濃度マイナス３０％と設定した。２４の溶出フラクションを深いウェルプレートに回収し、最適ＳｐｅｅｄＶａｃ濃度およびさらなる自動装置処置のために設計した最適化した異なる収集構成を採用した。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
９６−ウェルプレート(ＤＷＰ)を回収し、２連続濃度段階に付した。容量を０.８mlから約５０μｌ／ウェルに、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥することにより濃縮し、次いで約２００μｌに再溶解し、約５０μｌ／ウェルに再濃縮し、＋４Ｃで貯蔵した。次いでタンパク質を再緩衝し、トリプシンを本ウェルに添加し、密封し、本プレートを３７Ｃで１２時間インキュベートし、続いてクエンチ(ｐＨを２.０より低くするためのギ酸の添加)することにより消化させた。ウェルに添加すべきトリプシンの濃度は、各特定のフラクションに関して２８０nmで記録したＯＤに基づいて調節した。これはトリプシンの最適使用およびほとんどの濃縮フラクションの完全な消化を確実にする。自動スポット装置(Bruker MALDI sample prep. Robots)を使用して、ＭＡＬＤＩプレート上に、感受性および質量目盛り標準と共にＨＣＣＡマトリックスと予め混合した、各ウェルからの容量の付着に使用した。ＭＡＬＤＩプレートを、Bruker Reflex III MALDI MS装置を使用して分析した。９６ウェルプレートの各ウェルの内容物を、LC-ESI-MS-MS Bruker Esquire ESI Ion-Trap MS装置で分析した。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
トリプシン消化ペプチドの存在は、２０kDより少ない分子量であり、アミノ酸配列ＦＴＴＬＶＱＤＬＡＮＡＦＱＱＥＡＱＴＳＧＫを含むポリペプチドが、開始ヒト血漿サンプルに存在したことを示唆する。このようなポリペプチドは、配列番号３−４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものを含む。
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
天然化学ライゲーション
下記により完全に記載するように、非保護フラグメントのライゲーションは下記のように行う：本乾燥ペプチドを、ほぼＰＨ７付近で１−８mMの最終ペプチド濃度を得るために、当モル量で６Ｍグアニジンヒドロクロライド(ＧｕＨＣｌ)、０.２Ｍリン酸、ｐＨ７.５に溶解し、１％ベンジルメルカプタン、１％チオフェノールを添加する。通常、本反応を一晩行い、ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレー質量分析法で追跡する。本ライゲーション産物を続いてまだ存在する保護基を除去するために処置する。Ｎ−末端チアゾリジン環の開環は、ｐＨ３.５で最終濃度０.５Ｍの固体メトキサミンの添加および２時間、３７℃でのさらなるインキュベーションを必要とする。１０倍過剰のＴｒｉｓ(２−カルボキシエチル)ホスフィンを添加し、その後ＨＰＬＣ精製する。本ポリペプチド鎖を含むフラクションをＥＳＭＳにより同定し、集め、凍結乾燥する。
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９２】
フラグメント４および５のライゲーションは、ｐＨ７.０で６Ｍ  ＧｕＨＣｌ中、行う。各反応物の濃度は８mMであり、１％ベンジルメルカプタンおよび１％チオフェノールを、還元環境を作るためおよびライゲーション反応を促進するために添加した。ほとんど定量的なライゲーション反応が、３７℃で一晩撹拌後に観察される。反応のこの時点で、ＣＨ３−Ｏ−ＮＨ２・ＨＣｌを本溶液に添加して０.５Ｍ最終濃度とし、Ｎ−末端チアゾリジン環を開環するためにｐＨを３.５に調節する。２時間、３７℃でインキュベーション後、ＥＳＭＳを使用して反応の完了を確認する。本反応混合物を続いて本ペプチドフラグメントの１０倍過剰のＴｒｉｓ(２−カルボキシエチルホスフィン）で１５分処理し、本ライゲーション産物を分取ＨＰＬＣ(例えば、Ｃ４、２０−６０％ＣＨ３ＣＮ、０.５％／分)で精製し、凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵する。
同様の方法を、残りのライゲーションに関してわずかに改変して繰り返す。