(57)【要約】  有効成分が、合成殺虫剤分子としてのネオニコチノイド殺虫剤、チアメトキサムと、ＤＥＥＴおよび／またはＩＲ３５３５（登録商標）などの昆虫忌避物質の中から選択される少なくとも１種の共力剤であって、チアメトキサムに対する前記共力剤のモル比が０．００１から０．２の間となって組成物中に存在する共力剤との組合せを含む殺虫剤組成物。共力作用は、低用量で観察される。前記組成物が、ヒトに対して、動物に対して、および／または作物に対して有害である昆虫に対する、特に、ピレスロイド、カーバメートおよび／または有機リン酸耐性蚊に対する闘いにおいて、網、織物、布またはテントなどの支持体に散布される、沈着される、または含浸される、殺虫剤組成物の使用。
2019501149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分が、
−合成殺虫性分子としてのチアメトキサムと
−Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メチルベンズアミド（ＤＥＥＴ）、３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸、エチルエステル（ＩＲ３５３５（登録商標））およびそれらの混合物の中から選択される少なくとも１種の共力剤であって、チアメトキサムに対する前記共力剤のモル比が０．００１から０．２の間となって組成物中に存在する共力剤との組合せを含む、殺虫剤組成物。
【請求項２】
組成物中のチアメトキサムに対する前記共力剤のモル比が、０．００５から０．１の間、好ましくは、０．０１から０．１の間、より好ましくは、０．０１から０．０５の間に含まれる、請求項１に記載の殺虫剤組成物。
【請求項３】
チアメトキサムが、組成物中に１０−７Ｍから３．１０−６Ｍの間に含まれる濃度で存在する、請求項１または２に記載の殺虫剤組成物。
【請求項４】
Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メチルベンズアミド（ＤＥＥＴ）が、組成物中に３．１０−８Ｍから３．１０−７Ｍの間に含まれる濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の殺虫剤組成物。
【請求項５】
３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸、エチルエステル（ＩＲ３５３５（登録商標））が、組成物中に３．１０−９Ｍから３．１０−８Ｍの間に含まれる濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の殺虫剤組成物。
【請求項６】
液体形態であり、有効成分が、有機相に可溶化される、および／またはナノ−もしくはマイクロ−カプセル中にカプセル封入される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の殺虫剤組成物。
【請求項７】
前記組成物が、網、織物、布またはテントなどの支持体に散布される、または沈着される、または含浸する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の殺虫剤組成物の使用。
【請求項８】
ヒトにとって、動物にとって、および／または作物にとって有害である昆虫、特に、群：双翅目、網翅目、鱗翅目、直翅目および半翅目から選択される昆虫に対する、請求項１から６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項９】
ピレスロイド耐性蚊に対する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
カーバメートおよび／または有機リン酸殺虫剤に対して耐性である蚊に対する、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）またはガンビアハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）に対する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
蚊媒介性疾患のコントロールにおける、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベクターコントロールにおける、特に、蚊媒介性疾患に対する新規殺虫剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
気候的および社会的変化は、蚊媒介性疾患の分布および動態に影響を及ぼし、ひいては、伝染病（マラリア、デング熱、チクングニア）の発生および再流行のリスクの一因となる。ほとんどの蚊媒介性疾患について、今日までワクチンがなく、根治的治療がない。ベクターコントロールおよび蚊に刺されることを防ぐことは、特に、化学物質の安全で効率的な使用に基づいている。蚊は耐性を持つようになるので、治療有効性を高め、耐性機序を回避するための昆虫に対する新規戦略を開発することが必要である。
【０００３】
今日まで古典的に使用されてきた化学物質は、その作用様式に従って２つの主なカテゴリーに分類される。第１のカテゴリーでは、蚊がその標的に接近するのを防ぐ昆虫忌避物質分子であり、第２のカテゴリーでは、蚊を「死滅させる」殺虫剤分子である。
【０００４】
忌避物質分子カテゴリーでは、世界中で広く使用される昆虫忌避物質として、ＤＥＥＴ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メチルベンズアミド、これまでは、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミドと名付けられていた）がある。その他の既知昆虫忌避物質として、イカリジン（ＫＢＲ）およびＩＲ３５３５（登録商標）（３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸エチルエステル）がある。ほとんどの蚊に対して有効であることは、それらが、通常、例えば、布または網に適用されるべき組成物中で比較的高濃度で使用されなければならないことを意味する。しかし、有効性と有害作用の間に妥協が見られなければならない。
【０００５】
蚊に対して広範に使用される殺虫剤合成分子として、分子は、ピレスロイド、カーバメートまたは有機リン酸ファミリー中で選択される。しかし、蚊は、これらの化学物質に対して、特に、例えば、マラリアコントロールのために家屋散布および蚊帳の含浸に広く使用されてきたピレスロイド殺虫剤に対してますます耐性になっている。したがって、新規殺虫剤候補が捜されている。
【０００６】
最近の研究（非特許文献１）に、主なデング熱ベクター蚊ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）に対する、非ピレスロイド殺虫剤（カーバメートファミリーに由来するプロポクスル）の忌避物質（ＤＥＥＴ）との組合せの効率が記載された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｏｎｎｅｔ  Ｊ．ら（２００９年）  Ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｘｉｄａｓｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｅｐｅｌｌｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ  ｉｎ  ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ．  Ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ＆  Ｖｅｃｔｏｒｓ第２巻：１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の第１の目的は、ピレスロイドカーバメートおよび／または有機リン酸耐性蚊のコントロールにおいて使用できる新規組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、マラリア、デング熱およびチクングニアなどの蚊媒介性疾患をコントロールするのに役立ち得る組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、用量が低減されながら最適化された殺虫剤治療有効性を有する殺虫剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らの探索が、蚊に対する、特に、デング熱、マラリアおよびチクングニア蚊ベクターに対するこれらの分子の作用機序を理解するように働くなかで、驚くべきことに、ここで、ネオニコチノイドファミリー（通常、作物における有害生物コントロールのために使用され、単独で蚊に対して非効率的である）に由来する特定の分子および極めて低濃度の昆虫忌避物質の組合せが、蚊に対する殺虫剤組成物として活性であり得ることがわかった。
【００１２】
結果として、本発明は、有効成分が、
−ネオニコチノイドファミリー由来の合成殺虫剤分子としてのチアメトキサムと、
−Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メチルベンズアミド（ＤＥＥＴ）、３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸、エチルエステル（ＩＲ３５３５（登録商標））およびそれらの混合物の中から選択される少なくとも１種の共力剤であって、チアメトキサムに対する前記共力剤のモル比が、０．００１から０．２の間となって前記組成物中に存在する共力剤との組合せを含む殺虫剤組成物に関する。
【００１３】
より詳しくは、本発明の組成物では、チアメトキサム分子に対する前記共力剤のモル比は、好ましくは、０．００５から０．１の間、より好ましくは、０．０１から０．１の間に含まれる。
【００１４】
例えば、前記チアメトキサムは、組成物中に１０−７Ｍから１０−５Ｍの間の、好ましくは、１０−７Ｍから３．１０−６Ｍの間の極めて低い濃度で存在する。結果として、このような濃度は、ヒトおよび非標的動物に対する毒性を減らす。
【００１５】
ネオニコチノイドファミリーに由来する合成殺虫剤分子チアメトキサムは、蚊に対して単独で使用されることはなかったので、結果として、マラリア、デング熱およびチクングニアなどの蚊媒介性疾患のコントロールに使用されることがなかった。
【００１６】
有利なことに、ＤＥＥＴは、組成物中に３．１０−８Ｍから３．１０−７Ｍの間に含まれる濃度で存在し得る。ＩＲ３５３５（登録商標）は、組成物中で３．１０−９Ｍから３．１０−８Ｍの間に含まれるいっそう低濃度で存在し得る。これらの濃度で、ＤＥＥＴおよびＩＲ３５３５（登録商標）は両方とも、昆虫に対して忌避作用のある濃度より低い濃度である、すなわち、それらは、単独では、昆虫に対して、特に、蚊に対して忌避物質有効性を有さず、殺虫剤有効性を有さない。
【００１７】
本発明の殺虫剤組成物は、液体形態であり得、有効成分は、有機相に可溶化される、および／またはナノ−もしくはマイクロ−カプセル中にカプセル封入される。網、織物、布、テントまたは昆虫がその標的に到達するのを防ぐための任意のその他の材料などの支持体上に散布される、沈着される、またはその中に含浸されるように構成され得る。
【００１８】
本発明はまた、上記の殺虫剤組成物の使用に関し、前記組成物は、網（例えば、蚊帳）、織物、布またはテントなどの支持体上に散布され、沈着され、またはその中に含浸される。
【００１９】
したがって、本発明の殺虫剤組成物は、ヒトにとって、動物にとって、および／または作物にとって有害である昆虫に対して、特に、以下の群：双翅目、網翅目、鱗翅目、直翅目および半翅目に由来する昆虫に対して使用でき、ひいては、昆虫ベクター媒介性疾患をコントロールする方法を提供する。
【００２０】
より詳しくは、本発明の組成物は、ピレスロイド耐性蚊に対して、好ましくは、ガンビアハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）（マラリアの主なベクター）およびネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（デング熱、チクングニアおよび黄熱病ウイルスの主なベクター）に対して、ならびにカーバメートおよび／または有機リン酸殺虫剤に対して耐性である蚊に対して使用できる。
【００２１】
得られる主な利点は、低用量を用いた場合のより良好な保護、従って、ヒトおよび非標的動物の副作用の予測される低減である。さらに、本発明の組成物は、ピレスロイド殺虫剤に対して耐性である蚊に対して有効であり、この組成物をまた、作物保護の状況で使用できる。
【００２２】
本発明を、添付の図面を参照して、示される以下の実施形態においてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、実験に使用されたゴキブリワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）中枢神経系を例示する図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、ＤＵＭニューロン細胞内カルシウム濃度に対するＩＲ３５３５（登録商標）の複雑な用量依存効果を示す曲線である。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、種々の薬理学的物質の存在下での細胞内カルシウム濃度に対する１０−８Ｍ（Ａ）および１０−５Ｍ（Ｂ）で使用されたＩＲ３５３５（登録商標）の効果を例示する比較ヒストグラムである。
【図４】図４Ａは、ＤＵＭニューロン自発電気活性に対する１０−８Ｍで使用されたＩＲ３５３５（登録商標）の効果を例示する図であり、図４Ｂは、活動電位放電周波数に対する１０−８Ｍで使用されたＩＲ３５３５（登録商標）の効果の比較ヒストグラムを示す図である。
【図５】図５は、１０−８Ｍで使用されたＩＲ３５３５（登録商標）を用いる前処理前（Ａ）および前処理後（Ｂ）の電位固定条件下で記録された、チアメトキサム誘導性内向き電流（１０−６Ｍ）の効果を例示する図であり、（Ｃ）は、チアメトキサム誘導性内向き電流振幅に対するＩＲ３５３５（登録商標）（１０−８Ｍ）の効果の比較ヒストグラムを例示する図である。
【図６】図６は、アセチルコリン１０−３Ｍを用いる前処理後の昆虫ニューロンに対する種々の濃度のチアメトキサムの効果の比較ヒストグラムを示す図である。
【図７】図７は、アセチルコリン１０−３Ｍを用いる前処理後の昆虫ニューロンに対するＩＲ３５３５（登録商標）／チアメトキサム混合物の効果を例示するヒストグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２４】
材料および方法
昆虫ニューロンモデル
ゴキブリ背側不対正中（ＤＵＭ）ニューロンで実験を実施した。ゴキブリニューロン調製物は、脊椎動物および無脊椎動物の生物医学的モデルとしてよく使用され、ＤＵＭニューロンはさらに、その自発活動電位の根底にある、それを調節するイオン電流および受容体の生物物理学的および薬理学的特性のほとんどが、周知のパッチクランプ技術を使用することによって確立されているので、電気生理学的におよび薬理学的に十分に特性決定されている。
【００２５】
成体雄ゴキブリ、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）（図１参照のこと）は、標準条件（２９℃、１２時間明／１２時間暗の光周期）下で維持される本発明者らの実験コロニーから選び取った。動物を、解剖皿上に背側を上に固定した。背側角質、腸および一部の背縦走筋を、腹神経索にアクセスすることを可能にするために除去する。双眼顕微鏡下で注意深く解剖された腹部神経索およびその末端腹部神経節（ＴＡＧ）を、生理食塩水に入れる。動物の世話および取り扱い手順は、仏国制度的および国家的健康ガイドライン（Ｆｒｅｎｃｈ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）と一致している。
【００２６】
腹神経索およびその末端腹部神経節（ＴＡＧ）を、双眼顕微鏡下で注意深く解剖し、（ｍＭで）２００ＮａＣｌ、３．１ＫＣｌ、５ＣａＣｌ２、４ＭｇＣｌ２、５０スクロースおよび１０Ｎ−２−ヒドロキシメチルピペラジン−Ｎ９−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含有し、ｐＨがＮａＯＨを用いて７．４に調整された通常のゴキブリ生理食塩水中に入れる。成体ＤＵＭニューロン細胞体の単離は、Ｌａｐｉｅｄら（Ｉｏｎｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｄｕｌｔ  ａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｘｔｈ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｃｋｒｏａｃｈ  Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ第１４４巻：５３５〜４９頁、１９８９年）においてこれまでに記載されたように、ＴＡＧの中央部分の酵素的消化および機械的解離を使用して滅菌条件下で実施する。単離されたニューロン細胞体を、解離の２４時間後に記録のために使用する。
【００２７】
カルシウム画像処理
ガラスカバースリップを備えたファルコン１００６ペトリ皿を、ポリ−Ｄ−リジンヒドロブロミド（分子量７０，０００〜１５０，０００）を用いてコーティングし、単離したＤＵＭニューロン細胞体をプレーティングする。外部記録溶液は、（ｍＭで）：２００ＮａＣｌ、３．１ＫＣｌ、５ＣａＣｌ２、４ＭｇＣｌ２および１０ＨＥＰＥＳバッファーを含有し、ｐＨは、ＮａＯＨを用いて７．４に調整する。細胞を、暗所で、１０μＭのフラ−２ペンタキス（ｐｅｎｔａｋｉｓ）（アセトキシ−メチル）エステルとともに、３７℃で６０分間インキュベートする。ローディング後、細胞を生理食塩水中で３回洗浄する。次いで、ガラスカバースリップを、薬物適用を可能にする重力灌流システムに接続された記録チャンバー（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｈａｍｄｅｎ，  ＣＴ）中にマウントする。落射蛍光を備えた倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて画像処理実験を実施する。励起光は、７５−Ｗ一体キセノンランプによって提供される。励起波長（３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ）は、デジタル電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  Ｒ２）を備えたコンピュータによって駆動されるモノクロメーター（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｌａｍｂｄａ  ＤＧ４）を使用して適用し、それらは、カルシウム画像処理ソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ６，  ｌｎｄｅｃ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ）を用いてコンピュータに記録される。３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの曝露時間は、通常、１５０ｍｓであり、画像を種々の周波数で集める。データは、発光蛍光の比（３４０ｎｍ／３８０ｎｍ）として表される。１０−９Ｍ〜１０−５Ｍの範囲の種々の濃度の昆虫忌避物質ＩＲ３５３５（登録商標）を試験した。
【００２８】
電気生理学および全細胞パッチクランプ記録
電気活性およびネオニコチノイド誘導性内向き電流を、それぞれ、電流固定および電位固定様式下で全細胞記録配置でパッチクランプ技術を使用して記録する。パッチクランプ電極を、Ｐ−９７モデルプラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（ＧＣ１５０Ｔ−１０）から引く。パッチピペットは、内部ピペット溶液で充填された場合に１〜１．２ＭΩの範囲の抵抗を有する。細胞外および細胞内溶液間の液体接合部電位は、ギガオームシール（＞３ＧΩ）の形成前に常に補正する。シグナルをＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ増幅器を用いて記録する。チアメトキサムによって誘導されるイオン電流は、ｄｉｇｉｄａｔａ獲得システム（ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２０Ａ）に接続されたソフトウェア制御ｐＣｌａｍｐを用いてコンピュータ上にディスプレイされる。単独で、およびＩＲ３５３５（登録商標）（１０−８Ｍ）を用いる前処理後に適用されたチアメトキサムの効果を測定するために、電位固定条件下で、ＤＵＭニューロン細胞体を、−５０ｍＶの電位を保持する定常状態で電位固定する。実験は室温で実施する。
【００２９】
実施例１
１．１−昆虫ニューロンに対する昆虫忌避物質ＩＲ３５３５（登録商標）の用量依存効果
カルシウム画像処理を使用して、ＤＵＭニューロンにおける細胞内カルシウム濃度に対する昆虫忌避物質ＩＲ３５３５（登録商標）の効果を研究することが可能であった。ＩＲ３５３５（登録商標）のバス適用は、細胞内カルシウム濃度に対して複雑な多相用量依存効果を誘導する（図２を参照のこと）。
図２Ａは、試験される種々の濃度のＩＲ３５３５（登録商標）に左右される細胞内カルシウム濃度の変化を例示する用量反応曲線を示す。細胞内カルシウム濃度変動（３４０／３８０の比として提示される）は、試験された各ＩＲ３５３５（登録商標）濃度について得られた平均値から算出されている（ｎ＝５）。図２Ｂ〜Ｄは、それぞれ、１０−８Ｍ、３．１０−６Ｍおよび１０−５Ｍで試験されたＩＲ３５３５（登録商標）によって誘導される細胞内カルシウム濃度上昇のスペクトラムを表す。
【００３０】
領域Ｉでは（図２Ａおよび２Ｂ）、１０−８Ｍで、すなわち、極めて低い濃度で使用したＩＲ３５３５（登録商標）で最大に到達する細胞内カルシウム濃度の３．１０−９Ｍから３．１０−８Ｍの間の一時的な増大を観察することが可能である。
【００３１】
領域ＩＩは、１０−７Ｍ〜３．１０−６Ｍの濃度範囲において使用されたＩＲ３５３５（登録商標）について得られた細胞内カルシウム濃度のさらなる上昇に対応する（図２Ａおよび２Ｃ）。最後に、領域ＩＩＩは、極めて高濃度（３．１０−５Ｍ）で使用されたＩＲ３５３５（登録商標）によって生じた最大効果に対応する（図２Ａおよび２Ｄ）。これらの結果は、昆虫忌避物質ＩＲ３５３５（登録商標）が、昆虫ニューロンにおいて細胞内カルシウム濃度の上昇によってその効果を発揮することを実証する。
【００３２】
１．２−細胞内カルシウム上昇の起点
細胞内カルシウム濃度上昇の起点（すなわち、細胞内および／または細胞外起点）を調べるために、カルシウムチャネルおよび膜受容体の種々の特異的遮断薬および／またはアンタゴニストを試験した。図３のヒストグラムは、カフェイン、ωコノトキシン（ω−ｃｔｘ）およびピレンゼピン（ＰＺＰ）などの種々の薬理学的物質の存在下での細胞内カルシウム濃度に対する、１０−８Ｍ（図３Ａ）および１０−５Ｍ（図３Ｂ）で使用されたＩＲ３５３５（登録商標）の比較効果を示す。
【００３３】
これらの結果から、本発明者らは、１０−８Ｍで使用されたＩＲ３５３５（登録商標）の効果は、Ｍ１／Ｍ３  ｍＡＣｈＲ亜型調節を介した細胞膜電圧依存性カルシウムチャネルによる細胞外カルシウムに起因すると決定した。高濃度のＩＲ３５３５（登録商標）については、細胞外カルシウムおよび内部貯蔵から放出されたカルシウムの両方が、昆虫ニューロンにおける忌避物質の効果に関与している。
【００３４】
１．３−ＤＵＭニューロン自発活動電位に対する昆虫忌避物質ＩＲ３５３５（登録商標）の効果
直前に提示されたデータから、１０−８Ｍは、ＤＵＭニューロンにおける細胞内カルシウム濃度の有意な上昇をもたらすＩＲ３５３５（登録商標）のより低い濃度であると思われる。結果として、１０−８Ｍ  ＩＲ３５３５（登録商標）を使用して以下の実験を実施した。全細胞記録配置においてパッチクランプ技術を使用して、ＩＲ３５３５（登録商標）（１０−８Ｍ）が、自発活動電位放電周波数の増大と関連する有意な膜脱分極を誘導することを示すことが可能であった（図４Ａ）。対応する図４Ｂは、自発活動電位放電周波数に対するＩＲ３５３５（登録商標）（１０−８Ｍ）の効果の比較ヒストグラムを例示する。
【００３５】
上記で提示される結果によれば、種々の薬理学的物質、カルシウム画像処理および電気生理学的技術を使用して、同一ニューロン調製物に関して得られたこれまでの結果に基づいて、ＤＵＭニューロンにおける細胞内カルシウム濃度に対する、極めて低濃度で使用されたＩＲ３５３５（登録商標）の効果を要約することが可能である。ＩＲ３５３５（登録商標）は、Ｍ１／Ｍ３  ｍＡＣｈＲ亜型に作用することによって、バックグラウンドカルシウム活性化型カリウムチャネルを阻害し、観察される小さい脱分極をもたらす。この膜脱分極は、膜によるカルシウム流入に関与するＮ型高電圧活性化型カルシウムチャネルを刺激するのに十分である。
【００３６】
実施例２
昆虫ニューロンに対する昆虫忌避物質ＤＥＥＴの用量依存効果
種々の濃度のＤＥＥＴを用いて、実施例１と同様の実験を行った。
【００３７】
昆虫ニューロンに対する昆虫忌避物質ＤＥＥＴの適用は、細胞内カルシウム濃度変化に対する二相性効果をもたらす。ＤＥＥＴは、低濃度範囲（１０−９Ｍ〜１０−７Ｍ）では、細胞内カルシウム濃度の上昇を誘導し、１０−７Ｍ  ＤＥＥＴで最大に到達する（０．４〜０．６の範囲の、０．７の最大値を有する、発光蛍光の比（３４０ｎｍ／３８０ｎｍ））。
【００３８】
ＤＥＥＴは、１０−７Ｍよりも高い濃度については、反対の効果（すなわち、細胞内カルシウム濃度の重大な低減）をもたらす。
【００３９】
したがって、共力剤としてのＤＥＥＴの好ましい濃度は、発光蛍光の比（３４０ｎｍ／３８０ｎｍ）が、０．６を上回る、３．１０−８Ｍから３．１０−７Ｍの間から選択されなければならない。
【００４０】
実施例３
ＩＲ３５３５（登録商標）／チアメトキサム間に生じる共力作用
ネオニコチノイド殺虫剤チアメトキサムを、電位固定条件下で、パッチクランプ技術を使用して、ＤＵＭニューロンに対して、単独で、およびＩＲ３５３５（登録商標）（１０−８Ｍ）を用いる前処理後に試験した（図５）。
【００４１】
チアメトキサム（１０−６Ｍ）単独の適用は、小さな振幅を有する内向き電流を誘導する（図５Ａおよび５Ｃを参照のこと：−５０ｍＶの保持電位で電位固定条件下で記録された、平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊、ｐ＜０，０１；ｎ＝３〜４）。
【００４２】
一方、１０−８Ｍで使用された忌避物質ＩＲ３５３５（登録商標）を用いるＤＵＭニューロンの前処理後に、チアメトキサム誘導性内向き電流振幅の重大な増大が観察される。この場合には、平均電流振幅は、単独で適用されたチアメトキサムを用いた場合に得られる電流振幅よりも約６倍重大である（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【００４３】
結論として、カルシウム画像処理および電気生理学などの補完的アプローチは、ネオニコチノイド殺虫剤チアメトキサムが、小さい振幅を有する内向き電流を誘導することが可能なアゴニストのように作用することを示す。ＤＵＭニューロンが低濃度のＩＲ３５３５（登録商標）を用いて前処理される場合には、チアメトキサムによる内向き電流振幅生成（ｐｒｏｄｕｃｅｓ）は、より重大である。これによって、細胞内カルシウム濃度の増大によってチアメトキサムの効果を増大できる、共力剤としてのＩＲ３５３５（登録商標）の役割が確認される。これらの結果によって、忌避物質ＩＲ３５３５（登録商標）を、分子チアメトキサムと組み合わせることは、１）蚊媒介性疾患によって発達した耐性機序を回避し、２）用量を低減しながら殺虫剤有効性を増大するための、興味深い代替法であり得るということが確認される。
【００４４】
実施例４
アセチルコリンを用いる前処理
１０−３Ｍの濃度のアセチルコリンを１秒間ＤＵＭニューロンに適用し、３分後、実施例３と同一プロトコール下でＤＵＭニューロンに対して１０−７Ｍ、１０−６Ｍおよび１０−５Ｍのチアメトキサムを試験した。
【００４５】
チアメトキサム単独を用いた場合には電流は記録されなかったが、アセチルコリンを用いる前処理後のチアメトキサムは、電流振幅を誘導し、その振幅は、図６のヒストグラムにおいて報告される。これは、ニューロンのコリンネルジック（ｃｈｏｌｉｎｅｎｅｒｇｉｃ）受容体に対して作用するアセチルコリンが、細胞内カルシウムの増大につながり、これが、観察された電流によって示されるチアメトキサムの効果を誘導することを示唆する。
【００４６】
図６は、電流振幅は、チアメトキサム１０−７Ｍについて最高値であり、およびチアメトキサム１０−６Ｍについて最低値であることを示す。
【００４７】
しかし、この濃度のチアメトキサム１０−６Ｍで、１０−８ＭのＩＲ３５３５（登録商標）と組み合わせた場合に（アセチルコリン１０−３Ｍを用いる前処理後に）、共力効果が観察される（図７のヒストグラムを参照のこと）。
【００４８】
上記の結果から、周知の昆虫忌避物質ＩＲ３５３５（登録商標）は、ネオニコチノイドチアメトキサムの神経毒性効果を増強可能であると結論付けることができる。実施例４は、ニューロンが内因性神経伝達物質アセチルコリンを用いて前処理される場合に、増強がより有効であることを明確に示す。実際、アセチルコリンは、細胞内カルシウム濃度を増大するとわかっている。アセチルコリンおよびＩＲ３５３５（登録商標）の両方を用いる前処理は、細胞内カルシウム上昇によって共力効果を強化する。これらの結果は、内因性アセチルコリンレベルおよび／またはチアメトキサムによって影響を受ける標的の密度は、蚊ガンビアハマダラカ（Ａ．ｇａｍｂｉａｅ）（Ｋｉｓと名付けられた）の野生集団と、有機リン酸および／またはカーバメートなどの殺虫剤に対して耐性の蚊（ＡｃｅｒＫｉｓと名付けられた）の間で異なっていると思われるので、極めて興味深い。この場合には、耐性蚊ＡｃｅｒＫｉｓに対するこのようなＩＲ３５３５／チアメトキサム混合物の適用は、これらの蚊の死亡率を増大するために、および耐性機序に打ち勝つために極めて有効となる。
【００４９】
言い換えれば、上記の結果は、本発明の忌避物質／殺虫剤組成物が、「野生の」蚊よりも耐性蚊に対してより有効であろうということを示し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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