(57)【要約】本発明は、対象における歯肉炎、歯周炎および/またはインプラント周囲炎からなる群から選択される口腔疾患の治療に使用するための、7.5未満のpHおよび、たとえば、P11-4、P11-8、P11-14、P11-13、P11-12、P11-28、P11-29、P11-2、P11-5、P11-17、P11-19、P11-20、P11-12、P11-16、P11-18、P11-26またはP11-31などの少なくとも生理的イオン強度で自己組織化することができる特定の自己組織化ペプチドを含む組成物を提供する。上記組成物は、適切な洗浄手順の後、上記疾患において歯に隣接して形成されたポケットを充填するために使用することができ、これは組織再生を増強する。組成物は、活性剤、たとえば、抗微生物剤または抗生剤の制御放出に適している可能性がある。本発明はまた、第一の組成物の上に第二の層を形成するのに適した自己組織化ペプチドをさらに含む、上記治療に適したキットを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における、歯周炎、インプラント周囲炎および／または歯肉炎からなる群から選択される口腔疾患の治療における使用のための配列番号：1の配列を含む自己組織化ペプチドを含む組成物であって、自己組織化ペプチドが、7.5未満のpHおよび少なくとも生理的イオン強度で自己組織化することができる、組成物。
【請求項２】
歯周炎の治療における使用のための、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
インプラント周囲炎の治療における使用のための、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
歯肉炎の治療における使用のための、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
疾患が、歯肉および/または骨が後退している、少なくとも1つの歯に隣接するポケットの形成を伴う、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項６】
自己組織化ペプチドが、配列番号：6-17のいずれかの少なくとも1つの配列を含み、自己組織化ペプチドが、Ac-N末端およびNH2-C末端を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項７】
自己組織化ペプチドが、配列番号：6、9、11、12、16または17のいずれかの配列、好ましくは、配列番号：6または9のいずれかを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項８】
治療が、
a)疾患に罹患した少なくとも1つの歯の洗浄または創面切除；および
b)口腔疾患によって引き起こされる歯肉および／または骨の後退によって引き起こされる前記歯に隣接するポケットへの組成物の挿入；および、
c)任意に、口腔からポケット内への細菌の侵入を減少させることができる層による組成物の被覆；
(ここで、該層は、自己組織化ペプチドを含むヒドロゲルによって形成されるのが好ましく、ここで、該ヒドロゲルは、ステップb)におけるポケットへの組成物の挿入後に形成されたヒドロゲルよりも高い剛性および密度を有する)
を含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項９】
自己組織化ペプチドの少なくとも70％が、モノマー状態で組成物中に存在する、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
組成物のpHが、ペプチドが自己組織化を開始するpHよりも高い、好ましくは、前記pHより0.1〜0.5pH単位高い、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
ポケットへの組成物の挿入後、ヒドロゲルが、ペプチドの自己組織化および得血液、歯肉溝滲出液、唾液およびそれらの混合物を含む群から選択される体液の包含によって形成される、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
組成物が、組織化した形態の自己組織化ペプチドおよび液体を含むヒドロゲルであり、液体が、緩衝液および対象の血液およびそれらの混合物を含む群から選択される、前記請求項１〜８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
組成物が、抗微生物剤、抗生剤、抗微生物剤または防腐剤を含み、該剤が、タウロリジン、クロルヘキシジン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、アジスロマイシンおよびミノサイクリンを含む群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
組成物が、口腔からポケットへの細菌の侵入を少なくとも3日間、好ましくは、少なくとも7日間減少させる、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
配列番号：2の配列を含む自己組織化ペプチドを含むエアロゲル組成物であって、自己組織化ペプチドが、7.5未満のpHおよび少なくとも本発明の生理的イオン強度で自己組織化することが可能であり、自己組織化ペプチドが、配列番号：6、9、11、12、16または17のいずれかの配列、好ましくは、配列番号：6の配列を含む、エアロゲル組成物。
【請求項１６】
(i)請求項１５に記載のエアロゲル組成物；および
(ii)エアロゲルとして同じ自己組織化ペプチドを含む少なくとも1つの組成物であって、
a)自己組織化ペプチドの少なくとも70％が、モノマー状態で組成物中に存在する、および/または
b)組成物が、組織化した形態の自己組織化ペプチドおよび液体を含むヒドロゲルである、組成物；
を含むキット。
【請求項１７】
対象における歯肉炎、歯周炎および/またはインプラント周囲炎の治療における使用のための請求項16に記載のキットであって、
任意に、キットが、インプラント周囲炎の治療に使用するためのものであり、組成物(i)および/または(ii)が、抗生物質製剤をさらに含む、キット。
【請求項１８】
組成物が、エアロゲル組成物、好ましくは、請求項１５に記載のエアロゲル組成物である、請求項１〜８、１１または１３−１４のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
対象における歯肉炎、歯周炎および／またはインプラント周囲炎の治療に使用するためのキットであって、
(i)前記組成物がインプラント周囲炎の治療に使用するためのものである場合、それがさらに抗生物質を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物である、第1の組成物；および
(ii)第2の組成物の自己組織化ペプチドが、第1の組成物のものよりも高い密度および高いゲル剛性を有するヒドロゲルを形成することができる、自己組織化ペプチドを含む第2の組成物であって、ここで、第2の組成物の自己組織化ペプチドは、ヒドロゲルを一緒に形成することができる2つの相補的ペプチドの混合物であることが好ましく、および、ここで、第2の組成物は、ポケット内の口腔からの細胞および/または細菌の侵入を減少させることができる層を形成するのに使用するためのものである、第2の組成物；
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における歯肉炎、歯周炎および/またはインプラント周囲炎からなる群から選択される口腔疾患の治療における使用のための、7.5未満のpHおよび、たとえば、P11-4、P11-8、P11-14、P11-13、P11-12、P11-28、P11-29、P11-2、P11-5、P11-17、P11-19、P11-20、P11-12、P11-16、P11-18、P11-26またはP11-31などの少なくとも生理的イオン強度で自己組織化することができる特定の自己組織化ペプチドを含む組成物を提供する。上記組成物は、適切な洗浄手順の後、上記疾患において歯に隣接して形成されたポケットを充填するために使用することができ、これは組織再生を増強する。組成物は、活性剤、たとえば、抗微生物剤または抗生剤の制御放出に適している可能性がある。本発明はまた、第一の組成物の上に第二の層を形成するのに適した自己組織化ペプチドをさらに含む、上記治療に適したキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
歯肉炎(歯肉組織の炎症)は、非破壊性歯周病である。歯肉炎の最も一般的な形態、そして歯周病の全体的な最も一般的な形態は、歯の表面に付着する細菌性バイオフィルム(プラークとも呼ばれる)に反応し、プラーク誘発性歯肉炎と呼ばれる。歯肉炎は、口腔衛生的に良好であり、可逆的である。
【０００３】
しかしながら、治療しない場合、または管理されない場合、歯肉炎は、歯周炎に進行する可能性がある。歯周炎、または歯周病は、歯周組織、すなわち、歯を取り囲みそして支持する組織に影響を及ぼす一連の炎症性疾患である。歯周炎は、歯の表面に付着して増殖する微生物に対する過度に攻撃的な免疫反応を伴って、これらの微生物によって引き起こされる。歯肉線維が破壊されると、歯肉組織が歯から分離し、歯周ポケットと呼ばれる溝が深くなる。歯肉縁下微生物、すなわち歯肉線から尖端的に存在する微生物は、歯周ポケットにコロニーを形成し、歯肉組織にさらなる炎症および進行性の骨減少を引き起こす。そのまま放置すると、歯垢が石灰化して、一般的に歯石と呼ばれる結石が形成される。たとえば、歯周靱帯の組織破壊、および歯槽骨吸収は、最終的には歯の動揺およびその後の関与する歯の喪失をもたらしうる。
【０００４】
初期段階では、歯周炎は、症状が非常に少なく、そして多くの個人では、治療を求める前に病気が著しく進行していた。歯周炎の診断は、プローブを用いて歯の周りの柔らかい歯肉組織を検査し(すなわち、臨床検査)、そして歯の周りの骨減少の量を決定するために患者のX線フィルムを評価する(すなわち、放射線写真検査)ことによって確立される。
【０００５】
歯周炎の現在の治療は、個々の歯科衛生の改善から開始する。歯肉炎および歯周炎を治療するには、歯肉線の上下の歯石が歯科衛生士または歯科医によって完全に除去されなければならない。歯肉線の下のこの非外科的洗浄は、創面切除術と呼ばれる。
【０００６】
疾患の進行の程度に応じて、治療は、バイオフィルムの単純な除去、スケーリングおよび根面平滑化から歯肉弁剥離および付着構造への直接アクセスを伴う外科的介入のような、より厳しい技術まで変化しうる。そのような療法の不利な点は、純粋に修復的な治癒が誘導されることである。表皮細胞のより高い増殖速度のために、長い接合部上皮がセメント質を含まない歯根表面を覆うことになる。さらに、歯肉瘢痕組織由来のコラーゲン線維は、いかなる機能的整列もなく、歯根表面に対して平行に配向していることが明らかにされた(Diedrich、Fritz ら、2003)。
【０００７】
歯周組織の修復の代わりに、組織の完全な再生を目的とする。このことは、理想的には、以下を含む：
【０００８】
・短い付着上皮の形成(上皮細胞増殖の抑制によって可能になる)
・露出した歯根表面上の新しい無細胞繊維セメント質
・機能性線維配向を有する新しい歯周靭帯の発達
・セメント-エナメル質接合部の2mm下まで伸びる新しい歯槽骨(Diedrichら、2003)
【０００９】
再生歯周靱帯組織を得るために、創傷治癒過程を治療的に操作することができる。最新技術で使用されている技術のいくつかを第1表にまとめる：
【００１０】
第1表：歯周再生を支える材料
【表１】
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【００１１】
さらに、この疾患は局所または全身投与された抗生物質で治療される。
【００１２】
歯周修復および再生には、4つの基本要素が必要である：適切な血液供給および創傷の安定性；骨および靭帯を形成する細胞の供給源；支持スキャフォールドまたはマトリックス；および細胞の移動、増殖とマトリックス合成、およびその部位の血管再生のための血管新生を調節する成長因子(Kaigler、Avila ら、2011)。
【００１３】
複数の合成ペプチド、その中でも、自己組織化ペプチドは、すでに組織再生をサポートする能力を示した。以下の第2表は、組織工学のために最も頻繁に使用されるペプチドのいくつかをまとめている。完全なリストは、Nuneらによって近年発行されている(Nune、Kumaraswamy ら、2013)。Ravichandranら、2014、J. Mater. Chem. B 2：8466-8478もまた、組織工学のための自己組織化ペプチドの適用を記載する。
【００１４】
第2表：組織再生用のSAP(すべてインビトロシステムでテスト済み)
【表２】
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【００１５】
この概観リストは、合成デザイナーペプチドが複数の組織上での再生のための適切な基質として役立つ効率を支持する。これまで、歯周靱帯の再生を支持するその能力に関して、たった１つのペプチドしか調査されていない(KumadaおよびZhang 2010)。ペプチドヒドロゲルへの細胞移動を可能にするために、純粋な自己組織化ペプチドスキャフォールドRADA16を、短い生物学的に活性なモチーフについて、直接カップリングによって官能化した。これらのモチーフは、2ユニットのRGD結合配列およびラミニン細胞接着モチーフであった。移動挙動は共焦点イメージングのみによって可視化された。2週間のインキュベーション後、ペプチドは組み込まれたRGD配列とともに、歯周の移動を有意に促進した。Takeuchiら、2016は、ラットの外科的歯周効果の治癒に対するRADA16の効果を記載する。
【００１６】
他のインビトロ研究では、細胞または組織を対象のペプチドと直接混合するか、またはヒドロゲルの上に置いた。両方のアプローチとも、活発な移動イベントが創傷治癒および最終的には組織恒常性に戻るための重要な問題である組織再生の生理学的過程を反映していない。歯周靭帯の場合、基底部の前駆細胞は、欠損領域に定着し、分化し、そして適切な細胞外マトリックスを構築するために動員されなければならない。別の研究では、以前にアメロゲニン内の、一組のヒドロキシアパタイト結合ペプチド(HABP)と共有する領域として同定されたアメロゲニン由来ペプチド5(ADP5)が、歯周靱帯を再生する可能性に関して調査された。セメント質の無細胞領域からのセメント質-歯根ストックブロックをペプチド溶液でコーティングし、そしてCa2+およびPO43-で浸漬した。このペプチドは、セメント質様ヒドロキシアパタイトミネラル層の無細胞形成を促進し、次に、インビトロで歯周靱帯細胞の付着を支持することが示された(Gungormus、Oren ら、2012)。このアプローチは、歯のセメント質の微細構造に対応しているが、歯周靭帯の必須の3D微小環境には寄与せず、最終的には歯周靭帯線維芽細胞がヒドロキシアパタイト表面に付着することができるという事実を証明する。
【００１７】
膜もまた、歯周炎の治療に使用される。一般的に、膜は動物由来のコラーゲンから作成され、線維組織の骨内欠損への内方成長を防ぐことを目的とする。
【００１８】
骨が罹患している場合は、代用骨材を使用して空隙充填剤として機能させることができる。誘導組織再生は、歯周病の欠損組織(硬組織と軟組織)を再生させる方法である。動物またはヒト由来のいずれか、あるいは合成ヒドロキシアパタイト/β-TCP製のものの3種類がある。
【００１９】
別の規格は、外科的に露出された歯根表面への局所適用のための歯周外科手術の補助として意図されているブタの幼若顎から得られる、エナメルマトリックスタンパク質、主にアメロゲニンからなる吸収性で、移植可能な材料である。
【００２０】
上記のすべてのテクニックや素材には、一般的な欠点が1つある。それらは、感染をより効果的に治療するために局所的抗生物質をデリバリーするのに使用することはできない(Tyagi、Vaish ら、2011、Ahuja、Baiju ら、2012)。現在、抗生物質の全身投与またはクロルヘキシジン溶液またはクロルヘキシジンチップの局所投与のみが代替法である。
【００２１】
組織の可逆的な炎症である粘膜炎は、インプラント周囲炎の発症を示すことができる。インプラント周囲炎は、歯科インプラントを囲む硬組織に影響を与える不可逆的な破壊的な炎症プロセス(混合嫌気性感染症)である(Mombelliら、2011)。それは、再生されるために歯科医の外科的介入を必要とする。
【００２２】
欠損のあるインプラント(インプラント周囲炎に罹患しているもの)の周りに見られる一連の歯周病原体は、さまざまな形態の歯周病に関連して見られるものと類似しているが、たとえば、ブドウ球菌属、腸内細菌およびカンジダ属などの他の細菌も含まれうる(Leonardtら、1999)。
【００２３】
粗いインプラント表面上では、滑らかな表面上よりもかなり多くのプラークが形成されることを示すことができた。インプラント周囲粘膜炎は、インプラント周囲の粘膜の可逆的炎症である。コントロール的に、インプラント周囲炎は、インプラント周囲の歯槽骨のさらなる進行性の炎症によって特徴付けられる。インプラント周囲炎は、インプラントの損失につながる可能性がある。
【００２４】
過去において、歯科用インプラントは、スイスの人口の約１％に導入されてきたが、成長する傾向が強い。インプラント周囲炎の罹患率は、インプラントを装着している全対象の約10〜29％、または20％と推定されている。
【００２５】
治療には、壊死組織や炎症組織の除去、破片の除去、抗生物質の使用、そして個々の歯科衛生の改善が含まれる。これには、抗感染性および／または抗微生物性の洗口剤の使用、たとえば、クロルヘキシジンベースの溶液による洗浄が含まれうる。
【００２６】
さらに、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテラ・インターメディア、タンネレラ・フォーサイシアおよびトレポネーマ・デンティコラなどの病原性細菌の減少または排除を目的として、局所または全身抗生物質療法、典型的には、メトロニダゾールとアモキシシリンの併用が推奨されることが多い。テトラサイクリン(たとえば、0.2％)、ドキシサイクリン(たとえば、5％)、アジスロマイシン(たとえば、0.5％)もまた使用されうる。
【００２７】
局所治療は、2.5mgのクロルヘキシジンを含むPerioChip(登録商標)(Dexcel Pharma GmbH)の適用を含むことができ、これは7日間にわたって連続的に放出される。同様に、Ligosan(登録商標)(Heraeus-Kulzer)は、ドキシサイクリンの徐放をもたらすゲルである。
【００２８】
細菌の除染だけでなく、新しい骨質の再生も治療の成功にとって決定的に重要である。新たな骨構造の形成がなければ、健康な新しい軟組織構造、たとえば、細菌の再導入を防ぐために重要である歯間乳頭または頬側歯肉縁を発達させることはできない。自家骨移植および異なる膜(たとえば、PTFE、コラーゲン)の使用などの現在の誘導組織再生は、外科的アプローチと組み合わされる。しかしながら、そのような膜の使用はまた、細菌の侵入および再感染を招きうる(Prathapachandranら、2012)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
最新技術を考慮すると、本発明者らは、上記疾患のより容易な適用および効果的な治療を可能にする、歯肉炎、歯周炎および/またはインプラント周囲炎の治療のための改良された製品を提供するという課題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
この問題は、本発明、特に請求項の主題によって解決される。本発明は、配列番号：1の配列を含む自己組織化ペプチド(SAP)を含む組成物を提供し、ここで、自己組織化ペプチドは、対象における、歯肉炎、歯周炎および／またはインプラント周囲炎からなる群から選択される口腔疾患の治療における使用のために、7.5未満のpHおよび少なくとも生理的イオン強度で自己組織化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】自己組織化ペプチドゲル(15mg/ml)からの抗生物質(150mg/ml)の放出後の細菌密度、およびそれがポルフィロモナス・ジンジバリス(A-C)およびストレプトコッカス・サングイニス(D-F)の増殖に与える影響。マル：メトロニダゾール、ホシ：テトラサイクリン、サンカク：シプロフロキサシン、シカク：ドキシサイクリ・ンハイクレート；コントロール：APIなしのゲル。  A/D P11-4ゲル。B/E P11-13/14ゲル。C/F P11-28/29ゲル。
【図２】ポリマーP11-4とインキュベートした後の脱灰された歯の断面。P11-4は、アレクサフルオロ(登録商標)647蛍光色素で共有結合標識されており、その結果、象牙質への繊維の容易な付着を可能にする象牙細管へのポリマーP11-4の浸透を示す白色ルミネセンスが得られる。
【図３】細胞または細菌の非存在下での7日間にわたるP11-ペプチドの安定性。100μl/ペプチド/ウェル、c=20mg/ml、PBS中、Qubit R Protein Assay Ref：Q33211で定量。P11-13/14およびP11-28/29などの相補的ペプチドは、P11-4またはP11-8よりも安定であるが、1ppm未満の、上清中へのペプチドの得られる放出は非常に低いと考えられ、したがって、非常に安定しているとみなされる。
【図４】細菌の存在下での3日間にわたるP11-4ペプチドの分解。100μlペプチド/ウェル、c=20mg/ml、PBS中、Qubit R Protein Assay Ref：Q33211で定量。このペプチドは3日以上にわたって安定であり、安定性は、細菌の存在下では大きな影響を受けず、これは図3のように上清へのSAPの放出に匹敵する。
【図５】機械的性質は、さまざまなイオンおよび緩衝液系の存在に依存する。トリス-NaCl(140 mol/L、pH 7.5±0.5)、人工唾液(トリス(120 mM)、Ca(NO3)(4 mM)、KH2PO4(2.4mM)、最終pH7.2、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地、pH 7.4、Gibco)およびトリスMgSO4(140mol/L、pH7.5±0.5)の存在下で形成されたP11-4(A)およびP11-8(B)ゲルのG’。DMEM培地は、主塩成分NaCl(110mol/L)を含む130mMの最終イオン強度からなる。したがって、存在する二価イオン(Mg2+、Ca2+、PO4 2-など)に変わって、より多くの一価イオン(Na+、Cl-など)があり、ストラッフォード・プロトコルで製造された人工唾液は、二価イオン(Ca2+ 、(NO3)-)対一価イオン(K+、HPO4-)の高い比率で、0.114Mイオン強度という最終イオン強度からなる。人工物の最終イオン強度は140mMと低いが、G’(NaClおよびMgSO4)の間の貯蔵係数に達したが、P11-8では最低の貯蔵係数が人工唾液で達成された。したがって、溶液は、より低いイオン強度を有したが、二価イオン(Ca+)は、P11-4自己組織化に対して好ましい効果を有する。NO3-は、一価イオンであり、溶液のイオン強度は130mM未満であったので、P11-8自己組織化は遅くなった。他方、DMEMおよびNaCl溶液を用いたP11-8の自己組織化動力学は非常に類似している。P11-4については、DMEMの添加は、主に一価イオンでのより低いイオン強度に起因して、NaClについてのように、より低い貯蔵係数を有するヒドロゲルをもたらした。
【図６】8日間のインキュベーション後の歯周靱帯モデル上での15mg/mlのP11-4ゲルの細胞移動。ヒト歯周靱帯細胞を細胞プール(A)に入れ、SAPゲル(C)をヒト象牙質(B)に置いた。次いで、細胞/SAP-ゲル/象牙質を8日間インキュベートし、視覚的に評価して5mmまでの移動がもたらされた。スケールバー：1mm
【図７】凍結乾燥P11-4エアロゲル。A：20mg/mL、B：40mg/mL、C：60mg/mL。A-C：2000xでのSEM。D：左から右へ：60mg/mL、40mg/mL、20mg/mL。20mg/mLおよび60mg/mLの凍結乾燥エアロゲルは、40mg/mLエアロゲルよりも密度が高いことが分かる。
【図８】歯周炎モデルにおけるブタP11-4の適用(ブタ、エクスビボ)。A：40mg/mLの組織化されたP11-4ゲルの歯周ポケットへの適用。B：40mg/mLの組織化されたP11-4ゲルから調製された凍結乾燥エアロゲルの歯周ポケット内への適用。C：インプラントをブタの顎に入れ、インプラント周囲炎の欠損を再現する欠損を設定した。D、E：20および40mg/mlの凍結乾燥P11-4ヒドロゲルのパッチを、分岐部およびインプラント周囲炎の欠損部位に配置した。F、G：それらを比と血液と混合した。
【図９】40mg/mLのP11-4エアロゲル中の細孔の光学顕微鏡(10倍)分析A：右下スケール：100μm；B：右下スケール：50μm。
【図１０】インビトロ歯周炎モデルにおけるSAP。図10Aは、SAP(15mg/ml)とともに3、7および14日間インキュベートした後のヒト頭蓋冠骨芽細胞(HCO)の細胞増殖を示す。試験系コントロールとしてコラーゲン(1.5mg/ml)を使用した。細胞増殖は、PrestoBlue生存試薬の代謝変換によって測定した。データを、1日目に測定した値に関して正規化した。白=第3日、斜線=第7日、黒=第14日。図10Bは、P11-4(15mg/ml)とともに7、14および21日間インキュベートした後のHCOのコラーゲン1型発現を示す。組織培養プレート(TCPS)上で増殖した細胞をコントロールとして使用した。細胞増殖は、PrestoBlue生存試薬の代謝変換によって測定した。データを、1日目に測定した値に関して正規化した。黒=第7日、白=第14日、斜線=第21日。図10Cは、異なる試験SAPで被覆された象牙質表面およびポジティブコントロールとしてのコラーゲンについての4(左列)および8(右列)日後のドナーコンパートメントからの歯周靱帯線維芽細胞(PDLF)の移動距離を示す。
【図１１】エアロゲルを調製するための例示的な凍結乾燥条件。A：パラメータ表；B：図。
【図１２】図12において、Aは、P11-4およびP11-8の異なる混合物の静的光散乱からのデータおよびそれらのヒドロゲルへの組織化時間を示す。興味深いことに、P11-8に対するP11-4の等しい比率(10mg*ml-1)は、純粋なペプチドよりも有意に速いゲル形成をもたらし、Bは、自己組織化ペプチドの異なる混合物の濃度勾配を評価した。
【図１３】ブタの顎へのP11-4ヒドロゲルのエクスビボ適用。Aは、エクスビボでのブタ顎における欠損の発生を示す。Bは、弁が開いた状態でMISTによって開かれた欠損を示す。Cは、曲がった針を用いたエムドゲイン(登録商標)の2壁欠損(Prep-Gelなし)への適用を示し、Dは、縫合糸で閉じられた前記欠損を示す。EおよびFは、トリパンブルー0.02％を添加しない場合(E)および補足する場合(F)の、P11-4ゲル(20mg/ml、pH 7-8、24時間前に組織化された))の適用を示す。Gは、縫合糸を2時間後に再び開いたときにヒドロゲルが依然として欠損部位で安定していたことを示す。Hは、トリパンブルーの補足をともなって欠損に適用されたP11-4ゲル(40mg/ml、pH X7-8)を示す。Iは、ずり流動化後のヒドロゲルの液滴を示し、Ｊは、短時間後のヒドロゲル安定性の回復を示す。
【図１４】エムドゲイン(登録商標)およびコラーゲンと比較した、自己組織化ペプチド上での細胞の増殖。Aは、異なるP11ヒドロゲルを用いた(P11-4、P11-8、P11-13およびP11-14、それぞれ、現在のゴールドスタンダードであるエムドゲイン(登録商標)と比較して)、24、48および96時間後のhPDLF細胞(ヒト歯周靭帯線維芽細胞)の細胞生存率、およびSAOS-2細胞(肉腫骨形成性)のB細胞生存率を示す。各SAPについては、左列15mg/ml SAP、中央列：20mg/ml SAP、右列：30mg/ml SAP、エムドゲイン(登録商標)については、濃度は30mg/mlで一定であり、3つの列は24、48および96時間投与を示す。Cは、異なるSAP(15mg/ml)とともに3、7および14日間インキュベートした後のヒト頭蓋冠骨芽細胞(HCO)の細胞増殖を示す。試験系コントロールとしてコラーゲン(1.5mg/ml)を使用した。細胞増殖を、PrestoBlue生存率試薬の代謝変換によって測定した。データを、1日目に測定した値に関して正規化した。
【図１５】純粋なウシ象牙質表面における24時間接着後のPDLF細胞。細胞は、純粋な象牙質表面に接着し、増殖した。細胞付着をSEMによって視覚化した。実施例Lで説明したような、B、C：象牙質表面および細胞ドナー区画を有する歯周モデル。ドナー区画からの細胞移動は、生存細胞のMTT染色によって決定された。Dは、24時間接触させた後に、蛍光標識されたSAP(P11-4)が歯根マトリックスと相互作用することを示す。EおよびFは、ファロイジンアクチン染色によるSAPヒドロゲル(P11-4)中のPDLFの移動を示す。Gは、象牙質表面に付着し、象牙質管内に移動した蛍光標識P11-4を示す。
【図１６】モデル歯周ポケットにおける、異なるSAP(P11-4について20mg/ml-1、すべての他のペプチドについて：10mg/mlにおける、4日(それぞれ左列)および8日(それぞれ右列)後)、およびコラーゲン(2mg/ml)のPDLF細胞の移動距離を示す。
【図１７】上清中のペプチド濃度手段によって測定された、24時間後の、2000 PDLF細胞/ウェルと接触している異なるSAPマトリックス(P11-4について20mg/ml、すべての他のペプチドについて：15mg/ml)(それぞれ左の濃い列)または培地(それぞれ右列)の安定性を示す。
【図１８】P11-4(15mg/ml)との、7(それぞれ左列)、14(それぞれ中央列)および21日(それぞれ右列)間のインキュベーションの後のHCO細胞による細胞外マトリックス、特にI型コラーゲンの発現の誘導を示す。組織培養プレート(TCPS)上で増殖した細胞をコントロールとして使用した。細胞増殖は、PrestoBlue生存試薬の代謝変換によって測定した。データを、1日目に測定した値に関して正規化した。毎日、コラーゲン発現は、P11-4とのインキュベーションにより有意に大きかった。
【図１９】I型コラーゲン(A、B)、III型コラーゲン(C、D)、III型コラーゲン、3D Zスタック78μm(E、F)、フィブリリンI(G、H)、フィブリリンII(I、J)について7日間P11-4(20mg/ml)とともにインキュベートしたヒト歯周靭帯線維芽細胞の染色を示す。10倍拡大、一次抗体抗フィブリリン1抗体、二次抗体：ヤギ抗マウスIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、アレクサフルオロ568。
【図２０】図20aは製造業者の推奨に従って、中性pH7にてDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)1部に、RADA16溶液(水中、1重量％のペプチド、Matrigel、Takeuchiら、2016)1部を加えた混合物を示す。自己組織化は見られない。図20bは、P11-4の自己組織化を示す。A1：pH>8でモノマーP11-4(6.3mM)、液体として出現；A2：pH7でP11-4(6.3mM)、高粘度のネマチックゲルとして出現(Kindら、2017より)。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
7.5未満のpHおよび少なくとも生理的イオン強度で自己組織化することができる自己集合ペプチドは、たとえば、そのようなpHで自己組織化を開始する可能性があるが、たとえば、好ましいペプチドであるP11-4の場合、必須ではない。それらはまた、より高いまたはより低いpHで自己組織化状態にありうる。
【００３３】
当業者は、溶液のイオン強度をどのように決定しそして測定するかを知っているであろう。イオン強度Iは一般に、式I=1/2Σ zi2biに従って計算され、ここでは、原子価因子(valence factor)であり、biは、i番目のイオン濃度の重量モル濃度[mol/kg{H2O}]である。総和であるΣは、溶液中のすべてのイオンに適用される。たとえば、150mMのNaCl溶液のイオン強度は、約0.15mol/Lである。これもまた、ほぼ血液のイオン強度である。口腔内に存在する唾液のイオン強度は、一般的にはるかに低く、たとえば、約0.04 mol/Lである。本発明の文脈において、生理学的範囲のイオン強度は、0.15 mol/Lのイオン強度に対応すると考えられる。
【００３４】
必要に応じて、機械的特性は、SAPの濃度、そしてさらに、組成物中に存在する分子およびイオンの種類によって影響されうる(図5および図5の説明文を参照)。本発明の組成物は、たとえば、NaClおよび、場合により、トリスなどの生物学的に適切な緩衝液を含みうる。組成物は、以下の実施例で使用される任意の緩衝液を含みうる。
【００３５】
本発明の自己組織化ペプチドは、三次元スキャフォールドを形成することができ、それによって組織再生を促進することができるペプチドである。本発明のこれらの、および関連する人工ペプチドは、一次元で組み立てられて、ベータシート、およびテープ様アセンブリなどの高次アセンブリを形成する。リン酸カルシウムに対して親和性を有する、自己組織化タンパク質の三次元超分子構造を形成することができる。
【００３６】
本発明の文脈において、自己組織化ペプチドは、たとえば、後述のペプチドP11-4、P11-8、P11-2、P11-5の場合のように、それ自身で自己組織化することができるかもしれないが、たとえば、後述のP11-13/P11-14およびP11-28/P11-29、P11-30/P11-31の場合のように、それらは2つの自己組織化ペプチドを組み合わせて代替的に自己集合することができる。
【００３７】
本発明の自己組織化ペプチドは、コンセンサス配列である配列番号：1、X1-X2-X1-X2-X1を含み、ここで、X1は独立して、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、オルニチンからなる群から選択され、X2は独立して、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびグルタミンからなる群から選択される。独立して選択されるとは、たとえば、上記の配列の1、3または5位のX１が互いに異なり得ることを意味する。もちろん、それらは同じものであることも可能である。
【００３８】
好ましくは、本発明の自己組織化ペプチドは、配列番号：2、X1-X2-X1-X2-X1を含んでもよく、ここで、X1は独立して、グルタミン酸およびオルニチンからなる群から選択され、X2は独立して、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される。
【００３９】
本発明の自己組織化ペプチドは、さらに、配列番号：3、X3-F-X1-W-X1-F-X1を含んでもよく、ここで、X1は独立して、グルタミン酸およびオルニチンからなる群から選択され、X3は、アルギニン、グルタミン酸およびオルニチンからなる群から選択され、ここで、X3はアルギニンであるのが好ましい。
【００４０】
本発明の自己組織化ペプチドは、配列番号：4、X4-X4-X3-F-X1-W-X1-F-X1-X4-X4を含むか、またはそれからなるのが好ましく、ここで、X1は独立して、グルタミン酸およびオルニチンからなる群から選択され、X3は、アルギニン、グルタミン酸およびオルニチンからなる群から選択され、X4は独立して、グルタミン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、オルニチンからなる群から選択される。X3はアルギニンであるのが好ましい。独立して、X4はグルタミンであるのが好ましい。
【００４１】
本発明の自己組織化ペプチドは、配列番号：5、Q-Q-R-F-X1-W-X1-F-X1-Q-Qを含むか、またはそれからなるのが好ましく、ここで、X1は独立して、グルタミン酸およびオルニチンからなる群から選択される。
【００４２】
本発明の文脈において、自己組織化ペプチドは、WO 2004/007532 A1、US10/521,628、US12/729,046、US13/551,878、US 14/062,768、またはWO2014/027012 A1に教示され、それらは、全体を参照することにより本願に組み込まれる。上記ペプチドが、第4表に列挙される特定のペプチドを含むか、またはそれらからなるのが最も好ましい。もちろん、たとえば、上に開示されるように、他の自己組織化ペプチドと組み合わせて組織化される自己組織化ペプチドは、1つのキットまたは1つの組成物中に製剤されうる。
【００４３】
配列番号：6、9、11、12、16または17のペプチドは、たとえば、それらは比較的低濃度で使用することができるので、細胞と非常に相溶性があり、有益な電荷分布を有するため、特に有利である。
【００４４】
好ましくは、自己組織化ペプチドは、配列番号：6の配列を含むかまたはそれからなる。配列番号：6の配列からなるペプチドは、P11-4と命名され、そして本発明を通して好ましい。別の好ましい実施態様では、自己組織化ペプチドは、配列番号9の配列を含むかまたはそれからなる(P11-8)。
【００４５】
本発明の組成物はまた、配列番号：6からなるペプチドに対して少なくとも45％の配列同一性を有する少なくとも1つの自己組織化ペプチドを含みうる。ペプチドが、配列番号：6からなるペプチドに対して少なくとも54％、少なくとも63％、少なくとも72％、少なくとも81％または少なくとも90％の配列同一性を有するか、または前記ペプチドであるのが好ましい。本発明のペプチドは、11アミノ酸長でありうる。
【００４６】
自己組織化ペプチドは、Ac-N末端および/またはNH2-C末端、好ましくは両方を含む修飾ペプチドであるか、または非修飾ペプチドでありうる。非ブロック形態は、脱アミノ化反応を開始する傾向があるので、安定性を高めるために、配列番号：1のすべての自己組織化ペプチドの末端をブロックするのが好ましい。特に、6、9、11、12、16および17のペプチドは、Ac-N末端およびNH2-C末端を含んでもよい。配列番号：18-29は、本発明の修飾ペプチドに対応する。
【００４７】
第3表：好ましい自己組織化ペプチドのコンセンサス配列
【表３】
2019528274.tif 000005
【００４８】
第4表：好ましい自己組織化ペプチド。位置X1を下線で示す。
【表４】
2019528274.tif 000006
【００４９】
自己組織化ペプチドが、対象のエンドペプチダーゼに対する制限部位を有さないのが好ましい。それらは、細胞のための特別な認識モチーフを含む必要もない。
【００５０】
驚くべきことに、本発明者らは、自己組織化ペプチドが、歯周病治療またはインプラント周囲炎治療後の歯周ギャップまたはインプラントギャップの軟組織および硬(骨)組織の両方の再生に寄与することを明らかにすることができたが、ここで、自己組織化ペプチドは、組織成長のためのガイドマトリックスとして作用する。それらはまた、上皮細胞による成熟前の過剰増殖を防ぐ。
【００５１】
本発明はまた、配列番号：1を有する配列を含む自己組織化ペプチドの有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における歯肉炎、歯周炎および／またはインプラント周囲炎の治療方法を提供し、ここで、下記にさらに説明されるように、自己組織化ペプチドは、上記対象に対して、7.5未満のpHおよび少なくとも生理的イオン強度で自己組織化することができる。
【００５２】
組成物は、歯肉炎の治療に使用するためのものであり得、ここで、歯肉炎によって影響を受ける軟組織の再生は、溝ポケットへの本発明の組成物の投与によって改善される。
【００５３】
組成物は、歯周炎の治療に使用するためのものでありうる。これに関連して、組成物は、抗生物質を含むかまたは抗生物質と同時投与されるのが好ましい。抗生物質はペプチドでありうる。いくつかの実施態様では、組成物は、非ペプチド抗生物質を含まない。
【００５４】
組成物は、インプラント周囲炎の治療に使用するためのものでありうる。これに関連して、組成物は、好ましくは抗生物質またはたとえばタウロリジンなどの抗菌剤を含むか、またはそのような薬剤と同時投与される。抗生物質はペプチドでありうる。いくつかの実施態様では、組成物は、非ペプチド抗生物質を含まない。
【００５５】
治療されるべき疾患は、少なくとも1つの歯またはインプラントに隣接するポケットの形成を伴うのが好ましく、ここで、歯肉および/または骨、特に骨が後退している。歯肉と骨の両方が後退した段階において治療は特に有利である。
【００５６】
本発明の1つの実施態様では、組成物中で、自己組織化ペプチドの少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％がモノマー状態で存在する。この目的のために、組成物のpHは、ペプチドが自己組織化を開始するpH(たとえば、P11-4についてはpH7.5)より高い、好ましくは前記pHより0.1〜0.5pH単位高い、または前記pHより0.5pH単位高くありうる。
【００５７】
迅速な凝集を回避するために、pHをそのpHに緩衝することができる。それは、凝集、およびヒドロゲルの形成が、ポケットへの適用後すぐに開始される場合に有益でありうる。したがって、pHは、緩衝なしで、ペプチドが自己組織化を開始するpHよりも0.1〜0.5pH単位高くてもよい。1つの実施態様では、組成物は、たとえば、WO 2014/027012に従って調製された凍結乾燥ペプチドを含みうる。
【００５８】
組成物中の自己組織化ペプチドが本明細書中に記載されるようにモノマー性または本質的にモノマー性である場合、ポケットへの組成物の挿入後、ヒドロゲルが、ペプチドの自己組織化および好ましくは体液の包含によって形成される。これは、たとえば、細胞の誘導のための栄養素および/またはシグナル伝達分子を用いた、組織再生に有利な環境に寄与する。そのような体液は、たとえば、血液、歯肉溝滲出液(溝滲出液とも呼ばれる)、またはそれらの混合物でありうる。唾液もまた、典型的には少量で組み込まれてもよい。注目すべきことに、インプラント周囲炎には歯肉溝滲出液はない。
【００５９】
あるいは、SAPと同時投与される液体は、ヒドロゲル、たとえば、対象由来の血液に組み込まれてもよい。
【００６０】
モノマー自己組織化ペプチド組成物の適用のために、異なる適用形態が使用されうる。たとえば、二成分注射器が使用されてもよい。
【００６１】
モノマーSAPを含む組成物を二成分注射器に充填し、一方の区画にはSAPを、そして第2の区画にはインサイチュで組織化を誘発する溶液を充填する。SAPを含む組成物または充填された注射器は、凍結乾燥されてもよい。歯科医師は、注射器の内容物を直接ポケットに適用してもよい。
【００６２】
適用中、溶媒および凍結乾燥SAPは、主に歯周ポケット内で混合されてもよく、使用される溶媒または歯周ポケット内で優勢な酸性条件のいずれかに起因して、インサイチュで組織化する(たとえば、Artocorp社(日本)製の二成分注射器にて)。
【００６３】
あるいは、適用中、溶媒および凍結乾燥SAPは、二成分注射器の混合チャンバー内で混合され、使用される溶媒または主に歯周ポケット内の条件のいずれかに起因してインサイリュで組織化する(たとえば、Sulzer製の二成分注射器、Mixpacカートリッジシステムにて)。
【００６４】
自己組織化ペプチドが2つのペプチドの組み合わせ、たとえば、それぞれP11-13とP11-14またはP11-28とP11-29として組み立てられる場合、単一のペプチドの溶液は別々に包装され、それぞれの組み合わせは、たとえば、手動または2区画注射器で投与前に混合されうる。適用可能であれば、API(活性医薬成分、特に、抗生物質製剤などの抗菌剤)を、使用前に組成物中の2つの成分のいずれか(または両方)とともに含めることができる。
【００６５】
迅速な組織化を得るために、２つの成分を混合した後に得られるSAPの濃度は、たとえば、10mg/mL以上、任意に、20mg/mL以上、40mg/ml以上、または60mg/ml以上、特に20-60mg/mlでありうる。
【００６６】
構造安定性を増加させるために、好ましくは、動物由来でないもの、たとえば、セルロースまたはヒドロキシメチルセルロースなどのその誘導体である追加のゲル形成剤を組成物中に含ませることができる。
【００６７】
別の実施態様では、組成物は、たとえば、組織化した形態または本質的に組織化した形態で、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％の自己組織化ペプチド、ならびに緩衝液(組織化形態を安定化するpHで)および対象の血液およびそれらの混合物からなる群から選択される液体を含む。前記組成物は典型的にはヒドロゲルを形成する。
【００６８】
歯科開業医は、カニューレを備えた注射器からゲルを直接1つのポケットまたは複数のポケットの中、あるいは歯科インプラントの周囲に適用することができる。
【００６９】
このような組成物は、たとえば、優先的にモノマーであるSAPを緩衝液Aに溶解させ、緩衝液Bを添加し、次いで、混合することによって製造することができ、SAPの組織化が起こる。組成物は、歯周ポケット内への適用を可能にし、形成されたヒドロゲルが安定するまでの待ち時間を短縮する注射器に包含されてもよい。任意に、ゲルの保存安定性を増加させるために、1つ以上の保存剤を添加してもよく、および/または濃色注射器を使用してもよい。任意に、組成物は、歯根清掃および歯周外科手術の計画の後に適用することができる。
【００７０】
そのような組成物は、たとえば、20mg/mL以上の自己組織化ペプチドを含みうる。実験的歯周欠損に対する安定性およびヒドロゲル投与を試験した。20mg/mLのP11-4を含む組成物は、たとえば、HClの添加によってpHを下げることによって十分に安定にすることができた。40mg/mLまたは60mg/mLを含む組成物は、適用がより容易であり、ポケット内でより安定であった(図8A)。したがって、約30mg/mL-70mg/mL、好ましくは、約40mg/mL-60mg/mLのSAP(たとえば、P11-4)を含む組成物を使用することが好ましい。
【００７１】
1つの実施態様では、モノマーSAPおよび組織化したSAPは、歯周ポケットに投与される。たとえば、二成分注射器などの二成分適用システムを使用することができ、一方のチャンバーはモノマーペプチドを含み、他方のチャンバーは組織化ペプチドを含む。組織化ペプチドの濃度は、たとえば、5-20mg/ml、好ましくは10-15mg/mLでありうる。モノマーペプチドの濃度は、同じかそれ以上、たとえば、10-60mg/mL、好ましくは、20-50mg/mLでありうる。たとえば、小繊維形態の組織化SAPおよびモノマーペプチドの混合物をインサイチュで混合する。この適用形態は、粘度の増加、欠損内に形成されたゲルの安定性の増加、および隣接表面への結合の増加をもたらす。
【００７２】
異なる自己組織化ペプチドの組み合わせもまた使用されうる。たとえば、優れた細胞適合性を提供するP11-4は、以下のようにP11-8と組み合わせることができる(%は、wt/wt%に関連する)。
【００７３】
第5表：
【表５】
2019528274.tif 000007
【００７４】
たとえば、P11-4とP11-8の相補的自己組織化ペプチドの組み合わせは、それらの互いに対する引き付ける力のためにより速い適用をもたらす、著しく速い組織化時間を提供する。このことは、図12にも示される。
【００７５】
たとえば、50mMのTRIS、pH8中の2mlの10mg*ml-1のP11-8(モノマー)と混合された、50mMのトリス緩衝液、0.192M NaCl、pH6中の2mlの10mg*ml-1のP11-4(モノマー)の混合物は、純粋なペプチド組織化時間と比較して、5分という有意に速い組織化時間をもたらす。
【００７６】
チップの調製のためにセルロース誘導体を自己組織化ペプチドに添加することが可能である。このために、組成物は規定のキャビティに充填され、空気乾燥され、硬くて硬いチップがもたらされ、それが直接ポケットに適用されてもよい。
【００７７】
組織化した自己組織化ペプチドと、任意に、1種以上の増量剤(たとえば、トレハロースまたはマンニトール)とから形成されたヒドロゲルを、乾燥、たとえば、凍結乾燥させることによって、たとえば、組織化した自己組織化ペプチドと増量剤によって形成されたヒドロゲルを凍結乾燥させることによって、本発明のスポンジ組成物を調製することも可能である。条件に応じて、小さな孔または大きな孔のいずれかを達成することができ、そして閉じた多孔質の外面を設計することができ、その結果、異なる放出および吸収特性がもたらされる。歯科医は、歯根のスケーリング/プレーニングの後に、スポンジを骨構造上に直接適用することができる。次いで、たとえば、当該分野で公知のように、保護膜を使用するか、または好ましくは自己組織化ペプチドの第2の層を用いて組織を閉じてもよい。縫合糸もまた、あるいは代替的に適用されうる。
【００７８】
組織化した自己組織化ペプチドによって形成されたヒドロゲルを乾燥することによって得られる乾燥(たとえば、凍結乾燥)スポンジはまた、エアロゲルまたはエアロゲル組成物とも呼ばれる。
【００７９】
本発明者らは、SAPを含む乾燥(たとえば、凍結乾燥によって乾燥された(すなわち、凍結乾燥された)、または臨界点乾燥による乾燥された)エアロゲルまたはスポンジが、約20-60mg/mL、好ましくは、30-60mg/mLまたは40-60mg/mLの濃度のSAP(たとえば、P11-4)を有する溶液から有利に形成されうることを見出した。対応するエアロゲルの調製は、実験セクションに記載される。欠損部への40mg/mlのP11-4エアロゲルの適用を図8Bに示す。Scanlonら、2007に開示されているように、すなわち、2分間液体窒素中に急速浸漬し、続いて室温で一晩凍結乾燥機(たとえば、Heto、Drywinner)中で凍結乾燥することによって、凍結乾燥エアロゲルを調製することもできる。
【００８０】
したがって、本発明は、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4および/または配列番号：5に従うコンセンサス配列を含む自己組織化ペプチドなどの本発明のSAPを含むエアロゲルを提供し、ここで、自己組織化ペプチド、たとえば、P11-4またはP11-8、好ましくは、P11-4は、7.5未満のpHおよび少なくとも本発明の生理的イオン強度で自己組織化することができ、これは、本明細書に開示されるように、医薬適用に有用である。このようなエアロゲルは、本明細書に開示されるように、任意に、活性剤を含む。
【００８１】
固体SAP組成物、たとえば、上記のようなチップ、または、好ましくはスポンジは、身体に由来する液体、たとえば、血液または滲出液によって再水和されうる。安定なゲルが形成されるのを待つ時間は必要ではないので、欠損(歯周ポケット)を、たとえば、縫合糸によって、保護膜および/または第2のSAP層を用いて適用直後に閉じることができる。
【００８２】
あるいは、1つの実施態様では、再水和およびポケットの最適充填のために、SAPを含む溶液を固体SAP組成物に添加することができる。SAPを含む前記溶液は、たとえば、5-20mg/mLまたは8-10mg/mlの濃度の組織化したSAP、および/またはたとえば、10-50mg/mLの濃度のモノマーSAPを含む溶液であってもよい。乾燥(たとえば、凍結乾燥された)スポンジ(エアロゲルとも呼ばれる)などの固体SAP組成物、および組織化したモノマーSAPを含む溶液をそれぞれ、たとえば、デュアルチャンバー注射器の別々の区画に含むキットが提供される。別のキットは、乾燥エアロゲルなどの固体SAP組成物、および、たとえば、乾燥形態のモノマーの自己組織化ペプチドおよび自己組織化ペプチドの組織化をもたらすことができる緩衝液を別々の区画に含むデュアルチャンバー注射器を含みうる。2つの成分を混合した後、歯周ポケットの充填を促進する追加のSAP小繊維および繊維が形成される。キットは、
(i)配列番号：2の配列を含む自己組織化ペプチドを含むエアロゲル組成物であって、
自己組織化ペプチドが、7.5未満のpHおよび少なくとも生理的イオン強度で自己組織化することが可能である、エアロゲル組成物；および
(ii)エアロゲルとして同じ自己組織化ペプチドを含む少なくとも1つの組成物であって、
a)自己組織化ペプチドの少なくとも70％が、モノマー状態で組成物中に存在する、および/または
b)組成物は、組織化した形態の自己組織化ペプチドおよび液体を含むヒドロゲルである、組成物；
を含みうる。
【００８３】
このようなキットは、対象における歯肉炎、歯周炎および/またはインプラント周囲炎、好ましくは、歯周炎またはインプラント周囲炎の治療に使用するためのものでありうる。キットが、インプラント周囲炎の治療に使用するためのものである場合、組成物は抗生物質製剤をさらに含む。
【００８４】
固体SAP組成物、たとえば、上記のエアロゲルまたはスポンジは、厚さ2-5mmで、約6-10mm x 6-10mm、たとえば、7-8mm x 7-8mmまたは8mm x 8mmの標準サイズを有しうる。それは、歯周ポケットに容易に適用されることができ、その表面に付着する。
【００８５】
有利には、本発明のSAP組成物、特に本発明の固体SAP組成物、たとえば、乾燥(たとえば、凍結乾燥された)スポンジは、薬学的に許容される着色剤(たとえば、カーマイン、キャラメル、アナット抽出物などの薬物着色剤)および/または放射線不透過性をもたらす薬剤(硫酸バリウムなど)を含みうる。色は歯科開業医のための適用を単純化する。放射線不透過性という特徴は、SAP組成物の治癒および吸収のモニタリングを単純化する。
【００８６】
組成物(たとえば、乾燥粉末またはゲル)は、滅菌されてもよく、電子線またはガンマ線照射によって滅菌されてもよく、あるいは成分が使用前に無菌濾過されてもよい。
【００８７】
自己組織化ペプチドの総濃度は、0.05-100％(ペプチド重量/バルク製品重量)、たとえば、0.1-80％、0.2-40％、0.5-20％、または1-10％でありうる。
【００８８】
好ましくは、0.1-1mlの本発明の組成物、例えば0.2-0.5mlを、1つの歯もしくはインプラントに隣接するポケット内または欠損部位内に投与することができ、組成物は、上記のような自己組織化ペプチドの濃度、たとえば、約10％(または10mg/ml)を有する。
【００８９】
任意に、本発明の組成物は、トランスグルタミナーゼなどの架橋剤；Sulfo-DSS、DTSSP、Sulfo-EGS、DSG、DSP、DSS、EGSなどのホモ二官能性、アミン反応性、NHS-エステル架橋剤；Sulfo-SDA、Sulfo-LC、SDA、Sulfo-SDAD、SDA、LC-SDA、SDADなどのヘテロ二官能性、NHS-エステル/ジアジリン架橋剤化合物；リボフラビン、またはグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドなどの光反応性架橋剤、または還元糖を含みうる。組成物はまた、ポケットまたは欠損部位内に適用した後に、UV照射によって活性化されうる上記の架橋剤のうちの1つと組み合わせて、またはそのような架橋剤なしで、UV照射によって架橋されうる。架橋は、モノマー形態で塗布された組成物でも、組織化された状態で塗布された組成物でも可能である。
【００９０】
表面での活性が増大した架橋剤、たとえば、紫外線照射によって活性化された感光性架橋剤は、組成物の表面に、保護的な、より緻密なまたは堅い構造の形成をもたらし、したがって、ポケットや欠損のある場所への口腔からの細胞および/または細菌の侵入を減少させる。
【００９１】
本発明の全ての実施態様において、組成物は、活性剤、特にタウロリジンなどの抗菌剤もしくは抗生物質、または防腐剤、たとえば、クロルヘキシジンを含んでもよい。歯周炎やインプラント周囲炎の治療に有用な抗生物質は、たとえば、ドキシサイクリン(たとえば、20mg/ポケットの用量で)である。この場合、特に抗生物質が使用される場合、抗生物質治療は典型的には歯肉炎に必要とされないので、疾患は、好ましくは歯周炎またはインプラント周囲炎である。インプラント周囲炎に対しては、抗生物質治療が常に必要とされるが、それは局所的または全身的でありうる。好ましくは、抗生物質は、本発明の組成物、または本発明のキットの一部であり、自己組織化ペプチドによって形成されたヒドロゲルに組み込まれる。
【００９２】
活性剤は、テトラサイクリン(たとえば、約0.2％)、ドキシサイクリン(たとえば、約5％)、アジスロマイシン(たとえば、約0.5％)、ミノサイクリンなどの抗生物質；および/またはクロルヘキシジンなどの防腐剤を含む。
【００９３】
組成物はまた、あるいは代替的に、抗炎症剤、特に、サリチル酸塩(たとえば、アセチルサリチル酸)、プロピオン酸誘導体(たとえば、イブプロフェン、ナプロキセン)、酢酸誘導体、エノール酸誘導体、アントラニル酸誘導体またはスルホンアニリド、あるいは選択的COX-2阻害剤、および/または薬草抽出物(たとえば、カモミール抽出物および／またはクローブ抽出物)などの非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)を含みうる。
【００９４】
本発明の文脈において、他に明示的に示されていない限り、「ａ」は「1つまたはそれ以上」を意味し、すなわち、「1つの抗生物質(an antibiotic)」は、2つ(またはそれ以上)の抗生物質の組み合わせを含む。
【００９５】
自己組織化ペプチドによって形成されたヒドロゲルへの組み込みに起因して、抗生物質または他の活性剤の遅い送達が達成される。好ましくは、投与量および送達は、ポケット内の細菌増殖を抑制するためおよび/または細菌を殺すために適切な濃度の薬剤が達成されるように調整される。活性剤は、ヒドロゲルが形成されるときにそれに直接組み込まれるか、ヒドロゲルの形成後にそれに拡散されるか(ここで、ヒドロゲルの機械的および拡散抵抗は疾患を遅延化させる)、または、より制御された送達のためにカプセル化される(ここで、カプセル化された活性剤はヒドロゲルに組み込まれる)。適切なカプセル化材料は、たとえば、ゼラチン、アルギン酸塩または脂質でありうる。活性剤が、自己組織化ペプチドに化学的に結合していないのが好ましいが、そのような実施態様は可能である。
【００９６】
好ましくは、本発明の組成物は、口腔からポケットへの細菌の侵入を少なくとも3日間減少させる。好ましくは、少なくとも5日間または少なくとも7日間、活性抗生物質剤の濃度は、少なくとも該日数に対して治療的レベルである。驚くべきことに、本発明の組成物は、少なくとも3日間の期間にわたって、ほぼ一定の速度(1日当たり+/-20％)での、活性剤、たとえば、抗菌剤の制御放出を媒介しうることが見出された。
【００９７】
本発明はまた、対象における歯肉炎、歯周炎および／またはインプラント周囲炎の治療に使用するためのキットを含み、ここで、キットは、以下を含む：
(i)前記組成物がインプラント周囲炎の治療に使用するためのものである場合、それがさらに抗生物質を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物である、第1の組成物；および
(ii)第2の組成物の自己組織化ペプチドが、第1の組成物のものよりも高いゲル密度および高いゲル剛性を有するヒドロゲルを形成することができる、自己組織化ペプチドを含む第2の組成物であって、ここで、第2の組成物の自己組織化ペプチドは、ヒドロゲルを一緒に形成することができる2つの相補的ペプチドの混合物であることが好ましく、および、ここで、第2の組成物は、ポケット内の口腔からの細胞および/または細菌の侵入を減少させることができる層を形成するのに使用するためのものである。
【００９８】
第1および／または第2の組成物は、注射器、たとえば、本明細書に記載の二成分注射器に含まれていてもよい。
【００９９】
ゲル密度およびゲル剛性は、たとえば、最新技術において知られている方法に従って測定することができ、たとえば、剛性は、Cameron、2001、In vitro Cellular & Developmental Biology -Plant 37：419)により記載されるように測定することができる。好ましくは、密度および/または剛性、最も好ましくは、両方が、第1の組成物によって形成されたヒドロゲルのそれぞれのパラメータよりも10%を超えて、20%を超えて、30%を超えてまたは50%を超えて高い。
【０１００】
本発明の組成物が使用される治療は、以下を含み得る：
a)疾患に罹患した少なくとも1つの歯またはインプラントの洗浄または創面切除；および
b)口腔疾患によって引き起こされる歯肉および／または骨の後退によって引き起こされる前記歯またはインプラントに隣接するポケットへの組成物の挿入。
【０１０１】
の前に、特に、深いポケットの外科的開口後に、ステップa)を行うことができる。その場合、治療の最後のステップとして、外科的開口部は閉じられる。あるいは、ポケットを開けることを回避するが、洗浄およびその後の本発明の組成物の適用を可能にする、微小侵襲的技術を使用してもよい。
【０１０２】
ステップa)は、たとえば、当技術分野で知られている方法、たとえば、歯根のスケーリング、歯根プレーニングまたは空気研磨によって実施することができる。
【０１０３】
ステップb)では、細菌の発生の余地を残さないように、ポケットはできるだけ完全に埋められてもよい。好ましくは、罹患した歯またはインプラントの複数のポケット、またはすべてのポケットが治療される。
【０１０４】
任意に、ステップc)において、ポケット内の組成物は、口腔からポケット内への細菌の侵入を減少させることができる層によって覆われる。そのような層は、たとえば、当技術分野で公知のPDFEまたはコラーゲン膜などの膜であり得る。あるいは、層は、本明細書のキットの第2の成分について記載したように、第1の組成物よりも高い剛性および密度を有するヒドロゲルを形成する、自己組織化ペプチドの層、または2つの自己組織化ペプチドの組み合わせでありうる。
【０１０５】
例えば、第1のペプチドがP11-4である場合、第2のペプチドは、P11-8、またはP11-13とP11-14の組み合わせ、またはP11-28とP11-29の組み合わせでありうる。第1のペプチドがP11-8である場合、第2のペプチドは、P11-13とP11-14の組み合わせ、またはP11-28とP11-29の組み合わせでありうる。あるいは、より高い濃度およびゲル剛性のゲル組成物は、より高濃度の自己組織化ペプチドを使用することによって形成することができ、その結果、たとえば、第1の組成物は、P11-8を含み、第2の組成物は第一組成物中の濃度の150-250％、たとえば、180-200％でP11-8を含みうる。たとえば、ステップb)は、10mg/mlのP11-8を用いて、そして、ステップc)は、20mg/mlのP11-8を用いて実施することができる。
【０１０６】
第2の層は、それが相補的SAPを含む場合、二成分注射器によって投与することができ、ここで、第1の区画は2つのSAPのうちの一方を含み、第2の区画は第2のSAPを含む。注射器内のSAPは凍結乾燥されていても非凍結乾燥であってもよい。
【０１０７】
使用される注射器システムに応じて、上記で説明したように、混合は、混合室内または主にポケット内で起こってもよい。第2の層はまた、活性剤、たとえば、本明細書に記載の抗生物質を組み込んでもよい。
【０１０８】
ポケットの中に、SAPは再生に必要な組織の成長と発達のためのマトリックスを提供する。組織再成長中のその遅い吸収に起因して、それは、特に、歯槽骨の再生および靭帯の形成のために、より速く成長する(望まれない)歯肉軟部組織以外の他の組織の再成長を可能にする。
【０１０９】
さらに、再生のためのマトリックスを提供することによって、ポケット内の組成物によって形成されるヒドロゲル中に含まれ得る活性剤はゆっくりと拡散し、そして局所的な細菌性炎症を効果的に治療する。
【０１１０】
歯周靭帯は、歯のセメント質と歯槽骨の間の複雑な組織構造を表す。マトリックスは、主にコラーゲンからなるそれらのECMを生成する歯周靭帯線維芽細胞(PDLF)によって形成される。歯周炎の間、この構造は深刻な影響を受ける。P11-4またはP11-8などの自己組織化ペプチドが組織再生を可能にするかどうかを試験するために、歯周間隙のインビトロのヒト組織モデルが開発された。それは組織再生の重要な製造ステップの評価を可能にする。インビトロでの研究は、歯周組織再生に対する自己組織化ペプチドの好ましい効果を明らかにし、特に、それらは、関連細胞の増殖をもたらし、それらは、細胞の移動を促進し、そして、それらは、細胞による細胞外マトリックス産生を増加させる。
【０１１１】
次に続く図および実施例は、本発明を例示しさらに説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。本明細書に引用されたいずれの参考文献も本明細書に完全に組み込まれる。
【実施例】
【０１１２】
実施例A
モノマー適用形態
100mlのビーカーガラスを用意し、50mlの水を加える。水酸化ナトリウムでpHを8または8.5に変える。攪拌しながらゆっくりと添加することにより、1gの自己組織化ペプチドP11-4を加える。材料が完全に溶解するまで5分間待つ。
【０１１３】
溶液のpHを確認し、pHを8±0.4に保ち、必要であれば、NaOHまたはクエン酸でそれを修正する。
【０１１４】
溶液をフィルター滅菌して2チャンバー滅菌注射器に入れる。バルクをチャンバー1に充填し、注射器を凍結乾燥し、純粋な滅菌水または滅菌生理食塩水をチャンバー2に加える。
【０１１５】
プランジャーを押すことによって、2つの成分が混ざり合って、より低いpHと高いイオン強度に起因してポケットの中で組織化する基本的な押出製品ができる。適切な洗浄、たとえば、スケーリングおよび創面切除の後、歯科医師は混合物をポケットに注入することができる。
【０１１６】
あるいは、最終製品は、滅菌ろ過の代わりに電子ビームで滅菌されうる。
【０１１７】
実施例B
ポリマー適用形態
100mlのビーカーガラスを用意し、50mlの水を加える。水酸化ナトリウムでpHを8または8.5に変える。攪拌しながらゆっくりと添加することにより、1gの自己組織化ペプチドP11-4を塩基性溶液に添加する。材料が完全に溶解するまで5分間待つ。
【０１１８】
滅菌フィルター溶液。
【０１１９】
pHが7.0に設定されるまで、常に撹拌しながら、滅菌濾過クエン酸、0.1Mを滅菌環境で溶液に添加する。
【０１２０】
溶液を2チャンバー滅菌注射器に入れる。バルクをチャンバー1に充填し、注射器を凍結乾燥し、純粋な滅菌水または滅菌生理食塩水をチャンバー2に加える。
【０１２１】
プランジャーを押すことによって、2つの成分が混ざり合って、より低いpHと高いイオン強度に起因してポケットの中で組織化する基本的な押出製品ができる。適切な洗浄、たとえば、スケーリングおよび創面切除の後、歯科医師は混合物をポケットに注入することができる。
【０１２２】
あるいは、最終製品は、滅菌ろ過の代わりに電子ビームで滅菌されうる。
【０１２３】
実施例C
ポリマー適用形態
100mlのビーカーガラスを用意し、50mlの水を加える。水酸化ナトリウムでpHを8または8.5に変える。攪拌しながらゆっくりと添加することにより、1gの自己組織化ペプチドP11-4を塩基性溶液に添加する。材料が完全に溶解するまで5分間待つ。
【０１２４】
pHが7.0に設定されるまで、常に撹拌しながら、クエン酸、0.1Mを溶液に添加する。
【０１２５】
ゲルを1チャンバー注射器に充填する。注射器を20kGyの電子ビームで照射する。
【０１２６】
プランジャーを押すことによって、注射器は滅菌ゲルを治療部位に放出する。適切なスケーリングおよび創面切除の後、歯科医師は混合物を歯周ポケットに注入することができる。
【０１２７】
あるいは、最終製品は、滅菌ろ過の代わりに電子ビームで滅菌されうる。
【０１２８】
実施例D
カプセル化された材料を含むポリマー塗布形態
100mlのビーカーガラスを用意し、50mlの水を加える。水酸化ナトリウムでpHを8または8.5に変える。攪拌しながらゆっくりと添加することにより、1gの自己組織化ペプチドP11-4を塩基性溶液に添加する。材料が完全に溶解するまで5分間待つ。
【０１２９】
所望の抗生物質、たとえば、2％アガロースゲル溶液中、500mg/lにて、ドキシサイクリン(コア物質)を調製する。コア材料を5g/lの塩化カルシウム溶液に滴下して、カプセル封入ドキシサイクリンを形成した。
【０１３０】
pHが7.0に設定されるまで、常に撹拌しながら、クエン酸、0.1Mを溶液に添加する。カプセル封入された抗生物質を、ゲル形成の前、形成中、または形成後に加える。
【０１３１】
ゲルを1チャンバー注射器に充填する。注射器を20kGyの電子ビームで照射する。
【０１３２】
プランジャーを押すことによって、注射器は滅菌ゲルを治療部位に放出する。適切なスケーリングおよび創面切除の後、歯科医師は混合物を、たとえば、歯周病によって影響を及ぼされたインプラントまたは歯に隣接して形成された歯周ポケットに注入することができる。
【０１３３】
実施例E
活性剤を含むポリマー適用形態
100mlのビーカーガラスを用意し、50mlの水を加える。水酸化ナトリウムでpHを8または8.5に変える。攪拌しながらゆっくりと添加することにより、1gの自己組織化ペプチドP11-4を塩基性溶液に添加する。材料が完全に溶解するまで5分間待つ。
【０１３４】
所望の抗生物質、たとえば、ドキシサイクリンを500mg/lにて、透明な溶液に加える。
【０１３５】
pHが7.0に設定されるまで、常に撹拌しながら、クエン酸、0.1Mを溶液に添加する。抗生物質を、ゲル形成の前、形成中、または形成後に加える。
【０１３６】
ゲルを1チャンバー注射器に充填する。注射器を20kGyの電子ビームで照射する。
【０１３７】
プランジャーを押すことによって、注射器は滅菌ゲルを治療部位に放出する。適切な洗浄、たとえば、スケーリングおよび創面切除の後、歯科医師は混合物を、たとえば、歯周病によって影響を及ぼされたインプラントまたは歯に隣接して形成された歯周ポケットに注入することができる。
【０１３８】
実施例F
自己組織化ペプチドにより形成された異なるゲルからの抗生物質の放出
抗生物質を含む(150mg/ml)か、または含まない自己組織化ペプチドを含むヒドロゲルは、それぞれのペプチドを15mg/mlの濃度で、または組み合わせSAPについて等モル濃度を〜10mg*ml-1の濃度で以下のように溶解することによって形成された：
P11-4： A：0.055M トリス；pH8.0  B：0.055M トリス；0.192M NaCl；pH7.0
P11-8： A：H20                   B：0.055M トリス；0.236M NaCl；pH9.0
P11-13/P11-29：     0.1M トリス；0.052M NaCl；pH8.0
P11-14/P11-28：     0.055M トリス；0.096M NaCl；pH7.2
【０１３９】
異なる緩衝剤への抗生物質の添加が抗生物質効果に影響を与えるかどうかを試験した(図1A/B参照)。
【０１４０】
ペプチドP11-13およびP11-14によって形成されたゲルについて、またはP11-28およびP11-29について、等モル濃度のペプチド溶液をウェルプレート中で調製し、そして生理学的条件にpH補正してゲルを得た。
【０１４１】
さらに、100μL/ウェルの明確な嫌気性ポルフィロモナス・ジンジバリスまたは好気性Ｓ.アングイネス(S. anguines)細菌培養物(107 CFU/ml、たとえば、990μlのBHI培地、10μlの108 CFU/ml細菌懸濁液)をゲル上に加えた。増殖への影響は、OD600nmで濁度を測定することによって評価した。抗生物質を用いて得られたデータをコントロール(ゲル＋細菌＋抗生物質を含まない培地)に対して正規化し、相対細菌密度を分析した。50μl/ウェルの培地を２日毎に添加した。
【０１４２】
この濃度ではほとんどの系で有効性が低かったメトロニダゾールを除いて、すべての抗生物質は、自己組織化ペプチドによって形成されたゲルから120時間にわたる細菌増殖を抑制するのに十分な濃度で安定に放出された。
【０１４３】
一般に、抗生物質を添加する緩衝液の選択によっては、影響に大きな違いはないと思われる。
【０１４４】
細菌の成長を抑えるためには、より高濃度のメトロニダゾールを使用すべきであり、この抗生物質は、P11-28とP11-29ゲルからの放出速度が最も良いようである。したがって、メトロニダゾールを150mg/mlより高い濃度で、好ましくは、少なくとも500mg/ml、少なくとも1000mg/mlまたは少なくとも2000mg/ml、そして、好ましくは自己組織化ペプチドP11-28およびP11-29と組み合わせて使用することが好ましい。
【０１４５】
実施例G
凍結乾燥自己組織化ペプチドを含むエアロゲル
自己組織化ペプチドを含むヒドロゲルは、モノマー形態が維持されている緩衝液A中に2倍の標的濃度でそれぞれのペプチドを溶解することによって形成された。同量の自己組織化をもたらす緩衝液Bを添加した。組織化は、少なくとも24時間(4℃にて)行われた。
【０１４６】
以下の標的濃度を有する異なる組成物を試験した：
・20mg/mL P11-4
・40mg/mL P11-4
緩衝液A：0.055M トリス；pH8.0   緩衝液B：0.055M トリス；0.192M NaCl；pH7.0 
【０１４７】
-80℃にて凍結乾燥し、加熱領域で94時間凍結乾燥して、凍結乾燥を行った。
最終温度は15℃であった。150μl/ウェルを凍結乾燥した。
例示的な条件を図11および第6表に示す。
【０１４８】
第6表
【表６】
2019528274.tif 000008
【０１４９】
エアロゲルは、試験したすべての組成物で形成された。特に、40mg/mLおよび60mg/mLの溶液を凍結乾燥することによって形成されたエアロゲルは、取り扱いが容易であり、実験的な歯周ポケットに適用された。
【０１５０】
形成された材料を図7に示す。
【０１５１】
実施例H
歯周炎モデルにおけるSAP組成物の実験的投与
本発明による組成物を新鮮なエクスビボ豚顎で試験した。臼歯に隣接して、歯槽を粘膜の切開によって露出し、実験的な歯周ポケットを形成した。
【０１５２】
40mg/mlの凍結乾燥エアロゲルをポケットに入れ、露出した骨にわずかに押し付けた。エアロゲルは骨に付着した。皮膚弁を閉じて再び開いた。エアロゲルの部分が皮膚弁に付着し、組織への優れた接着を示した(図8B)。皮膚弁は適所に留まる。4分後、動きは見られない。4分後、皮膚弁を再度開き、エアゲルの維持を確認した。エアロゲルの一部は溶解またはゲル化しているが、ポケットの中にとどまる。
【０１５３】
別の実験では、エアロゲルも露出した歯根象牙質に付着することが確認できた。血液または血清含有培地を添加すると、エアロゲルは相互作用するが形態を維持する。
【０１５４】
さらなる実験のために、インプラントをブタの顎に配置し、インプラント周囲炎の欠損を再現する欠損を設定した(図8C)。実施例Gに従って作製された20および40mg/mlの凍結乾燥P11-4ヒドロゲルのパッチ(またはエアロゲル)を分岐部およびインプラント周囲炎欠損部位に配置し(図8D、E)、次いで、ヒト血液を重ねた(8F、G)。
【０１５５】
パッチは、歯肉組織ならびに歯根表面に非常に効率的に付着する。それらは、欠損スペースを埋めるために容易に変形されうる。血液はパッチに染み込んでいるが、パッチは安定しており、溶解しない。臨床専門家によれば、パッチは、インプラント周囲炎の欠損、特に、欠損の完全な提示がすでに存在する場合、ならびに分岐部の欠損において、非常に適している。
【０１５６】
実施例I
インビトロ歯周炎モデルにおけるSAP組成物の実験的投与
歯周ポケットのインビトロモデル(Meyerら、2016)を用いて、ドナー区画からの歯根膜線維芽細胞(PDLF)の移動距離を評価した。手短に言えば、組織治癒の初期過程を決定するために、3つの評価項目が調査された：ヒト一次性歯周靭帯線維芽細胞(PDLF、ScienCell)の接着、増殖および移動。可能な限り近いインビボ条件を模倣するために、純粋なウシ象牙質表面が基礎構造として役立った。ATP生存率キット(Promega)を使用して、PDLFの接着および増殖を時間依存的に評価した。マトリックス上の細胞の可視化は、SEMによって実現された。細胞接着および増殖の評価のために、インビボで歯周組織再生を促進するためのその有効性を既に証明されているので、エムドゲイン(登録商標)(Straumann)をポジティブコントロールとして使用した。移動速度および距離を評価するために、コラーゲンＩベースの細胞ドナー区画を、特別に設計されたチャンバー内の象牙質上に配置し、歯周ポケットをシミュレートした。
【０１５７】
図10Aは、SAP(15mg/ml)とともに3、7および14日間のインキュベートした後のヒト頭蓋冠骨芽細胞(HCO)の細胞増殖を示す。試験系コントロールとしてコラーゲン(1.5mg/ml)を使用した。細胞増殖を、PrestoBlue生存試薬の代謝変換によって測定した。データを、1日目に測定した値に関して正規化した。
【０１５８】
図10Bは、P11-4(15mg/ml)とともに7、14および21日間インキュベートした後のHCOの1型コラーゲン発現を示す。組織培養プレート(TCPS)上で増殖した細胞をコントロールとして使用した。細胞増殖を、PrestoBlue生存試薬の代謝変換によって測定した。データを、１日目に測定した値に関して正規化した。
【０１５９】
図10Cは、異なる試験SAPおよびポジティブコントロールとしてコラーゲンで被覆した象牙質表面についての4(左列)および8(右列)日後のドナー区画からの歯周靱帯線維芽細胞(PDLF)の移動距離を示す。
【０１６０】
さらに、PDLFがP11-4ヒドロゲル上で最もよく増殖することを示すことができた。それらは、マトリックスの内側にも広がるが、組織化されたSAPマトリックスを分解しない。
【０１６１】
実施例J
ブタの顎への生体外適用
a)欠損発生
ドリルを使用して、ブタの顎の異なる部位に2つおよび3つの壁欠陥ならびに分岐部欠陥を発生させた(図13A、矢印)。それらは、低侵襲性歯周治療(MIST)によって開かれ、そして、弁が開かれた(図13B)。
【０１６２】
エムドゲイン
b)エムドゲイン(登録商標)の適用
エムドゲイン(登録商標)は、欠損の充填を改善するために、曲がった針を用いて(Prep-Gelなしで)2壁欠損(2-wall defect)に適用された(図13C)。材料の粘度が高いため、針と注射器をルアーロックで結合した。材料は、周囲の表面をすべて十分に覆った。欠損を縫合糸で閉じた(図13D)。閉鎖および手動の圧縮の後、わずかな材料のみが押し出された。
【０１６３】
c)P11-4ヒドロゲルの適用
P11-4ゲル(20mg/ml、pH7)を、ヒドロゲルの視認性を改善するためのトリパンブルー(TB、0.02%wt/wt)を添加しないで(図13E)、および添加して(図13F)、2壁欠損に適用した。曲がった針を用いた適用は、欠損の充填を改善した。材料の粘度が低いため、純粋なP11-4ゲルは、最適な方法では欠損部位に留まらなかった。ヒドロゲルを含むTBの安定性は、純粋なペプチドと比較してより高く、そしてそれは改善された様式で欠損部位に留まった。欠損を縫合糸で閉じた。閉鎖および手動の圧迫の後、縫合糸からの材料の漏出は観察されなかった。２時間後、縫合糸を再び開いた。その場合にも、材料は、適用部位ではっきりと見ることができた(図13G)。
【０１６４】
P11-4ゲル(40mg/ml、pH7)を、ヒドロゲルの視認性を改善するためのトリパンブルー(TB、0.02％wt/wt)を添加しないで、および添加して(図13H)、2壁欠損に適用したが、20mg/mlの場合と同様の結果が得られた。しかしながら、ここでは、TB補足は目に見えるほどは粘度を増加させなかった。この濃度では、ヒドロゲルは、加圧下で粘度が変化するので(ずり流動化)、それが非ニュートン流体であることは明らかである。液滴を図13Iに示す。ヒドロゲル安定性は、針を離れた後の一定時間後に回復する(図13J)。これは、欠損部位に適用されたときにヒドロゲルが、より液体であり、したがって、組織および歯根の表面によく分布し、そしてその場で安定化するという利点を有する。
【０１６５】
60mg/mlのP11-4の適用は、強いゲル形成のために困難であった。
【０１６６】
実験は、P11-4ゲルが、15-50mg/ml、20-40mg/mlまたは、好ましくは、30-40mg/mlの濃度での適用に非常に適しているという結論を導く。たとえば、0.01-0.04％、たとえば、0.02-0.03％の濃度でのTBの補足は、生体内試験での視認性の向上に役立ち、また、低濃度、たとえば、15-25mg/mlのP11-4において粘度を上げるためにも推奨される。これは他の自己組織化ペプチドにも適合し、特に、SAPヒドロゲル自体の粘度が低すぎる場合に適合する。SAPは、エムドゲイン(登録商標)と同じルーチン内で使用できる。
【０１６７】
実施例K
エムドゲイン(登録商標)およびコラーゲンと比較した、自己組織化ペプチド上の細胞の増殖
自己組織化ペプチド(P11-4、P11-8、P11-13およびP11-14、それぞれ、15mg/ml SAP、20mg/ml SAP、30mg/ml SAP)上のhPDLF(歯周靱帯線維芽細胞)およびSAOS-2(骨肉腫)細胞の増殖を、24、48および96時間後に現在のゴールドスタンダードであるのエムドゲイン(登録商標)および/またはコラーゲンと比較した。エムドゲイン(登録商標)の場合、濃度は、30mg/mlで一定である。生存率はPrestoBlue(登録商標)細胞生存率試薬A13261によって測定された。
【０１６８】
試験したすべての濃度で、P11-4およびP11-8は、エムドゲイン(登録商標)と比較してhPDLF細胞の細胞生存率の増加をもたらす。SAOS-2細胞では、試験したすべての濃度で、P11-4は、エムドゲイン(登録商標)と比較して細胞の細胞生存率の増加をもたらし、P11-8では、生存率は、30mg/mlで大きく増加し、他の濃度でわずかに増加するかまたは同程度であった(図14AおよびB)。
【０１６９】
ヒト頭蓋冠骨芽細胞(HCO)の細胞増殖を、異なるSAP(15mg/ml)とともに、3、7および１４日間インキュベートした後に分析した。試験系コントロールとしてコラーゲン(1.5mg/ml)を使用した。細胞増殖は、PrestoBlue生存試薬の代謝変換によって測定した。データを、1日目に測定した値に関して正規化した。測定した濃度では、P11-4は、コラーゲンと同様の増殖をもたらした(図14C)。
【０１７０】
実施例L
自己組織化ペプチド上の細胞の付着
PDLF細胞を、純粋なウシ象牙質表面上(すなわち、SAPなし)で24時間培養した。細胞付着をSEMにより可視化した(図15A)。
【０１７１】
象牙質表面および細胞ドナー区画を有する歯周モデルを設定した。5mmのモデル歯周ポケットを、ヒドロゲル(ピンク)を含むPDLFおよびアガロースに囲まれた象牙質表面(中央スラブ)を用いて作製する(図15B)。細胞移動距離の分析は、MTT染色後に可能であり(図15C)(Meyerら、2017)、異なるSAPヒドロゲルを用いた移動を図16に示す。
【０１７２】
P11-4とウシの歯の歯根マトリックスの象牙質との相互作用を蛍光標識P11-4で分析した。100μl(20mg/ml)の標識P11-4ヒドロゲルを歯根マトリックスと接触させた。インキュベーションの開始後24時間写真を撮ったものであり、SAPが象牙質管に移動することを示す。写真については、EDTAでサンプルを72時間脱灰し、クライオトームを用いて切断した(図15D、G)。したがって、再石灰化は、歯の表面上のSAPによってだけでなく、象牙質管内でも促進されうる。
【０１７３】
PDLF細胞をヒドロゲルブロックとともに72時間インキュベートした後、SAPヒドロゲル(P11-4、20mg/ml)中の細胞の移動を、ファロイジンアクチン染色によって分析した(図15EおよびF)。
【０１７４】
実施例M
SAP中のPDLF細胞の移動距離
実施例Lで説明したように、PDLF細胞を異なるSAPまたはコラーゲンヒドロゲル(P11-4：20mg/ml；すべての他のもの：15mg/ml)中で移動させた。移動距離は4日後と8日後に分析した。P11-4中の移動距離は、4日後と8日後の両方におけるコラーゲン中の移動距離に一致した。P11-8では、移動は、4日後にはコラーゲンと比較してわずかに増加したが、8日後には増加しなかった。細胞は、P11-13/14およびP11-28/29中でも移動したが、コラーゲンと比較して距離は減少した(図16)。視覚的には、PDLF細胞の均一な移動は、P11-8で最も明らかである。
【０１７５】
実施例N
さまざまなSAPマトリックスの安定性
異なるSAPヒドロゲルまたはマトリックス(P11-4について20mg/ml；P11-8について15mg/ml)を2000個のPDLF細胞/ウェルまたは培地と接触させた。UV分光法による上清中のペプチド濃度の検出により、24時間後に分解を測定した。細胞の有意な影響は見られなかった。P11-4およびP11-8は、他のSAPよりもわずかに多く分解した(図17)。結論として、細胞がSAPヒドロゲル中で増殖し、移動するにもかかわらず、他の実験に示されるように、該ヒドロゲルは安定である。
【０１７６】
実施例O
SAPによって誘発される細胞外マトリックスの発現
HCO細胞(5000細胞)を、P11-4(15mg/ml(ヒドロゲル)とともにインキュベートした。組織培養プレート上で増殖させた細胞をコントロールとして用いた。7、14および21日後に、I型C末端コラーゲンプロペプチドを測定するMicroVue CICPアッセイによってI型コラーゲンの発現を検出し、PrestoBlue生存試薬の代謝変換によって測定した増殖速度に対して正規化した。データを、1日目に測定した値に関して正規化した。
【０１７７】
それぞれの日において、コラーゲンの発現は、P11-4とのインキュベーションにより有意に大きかった(図18)。
【０１７８】
P11-4(20mg/ml)との7日間のインキュベーション後の2000細胞中のI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブリリンI、およびフィブリリンIIの発現を抗体染色によって検出した(倍率10倍、一次抗体抗：フィブリリン1抗体、二次抗体：ヤギ抗マウスIgG(H+L)高交差吸収二次抗体、アレクサフルオロ568)。
【０１７９】
実施例P
生体内試験
イヌ下顎骨における、臨界サイズ、急性離開、スプリットマウス、ゴールドスタンダード対照前臨床試験では、P11-4の330mg*ml-1ヒドロゲルが埋め込まれている。空の欠損およびゴールドスタンダードであるストローマン(登録商標)エムドゲインで満たされた欠損と比較して、P11-4ヒドロゲルは、予想される治癒の徴候を示し、そしてデバイス関連イベントは記録されなかった。離開は、たとえば、www.pocketdentistry.comで定義されるように、局在化した歯肉の後退であり、これは、炎症性口腔疾患、たとえば、歯周炎またはインプラント周囲炎のモデルとして使用することができる。
【０１８０】
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【図１Ａ−Ｃ】
2019528274.tif 000009
【図１Ｄ−Ｆ】
2019528274.tif 000010
【図２】
2019528274.tif 000011
【図３】
2019528274.tif 000012
【図４】
2019528274.tif 000013
【図５ａ−５ｂ】
2019528274.tif 000014
【図６】
2019528274.tif 000015
【図７Ａ−Ｄ】
2019528274.tif 000016
【図８Ａ−Ｇ】
2019528274.tif 000017
【図９Ａ−Ｂ】
2019528274.tif 000018
【図１０Ａ−Ｂ】
2019528274.tif 000019
【図１０Ｃ】
2019528274.tif 000020
【図１１】
2019528274.tif 000021
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2019528274.tif 000022
【図１３Ａ−Ｊ】
2019528274.tif 000023
【図１４Ａ−Ｂ】
2019528274.tif 000024
【図１４Ｃ】
2019528274.tif 000025
【図１５Ａ−Ｃ】
2019528274.tif 000026
【図１５Ｄ−Ｇ】
2019528274.tif 000027
【図１６】
2019528274.tif 000028
【図１７】
2019528274.tif 000029
【図１８】
2019528274.tif 000030
【図１９Ａ−Ｆ】
2019528274.tif 000031
【図１９Ｇ−Ｊ】
2019528274.tif 000032
【図２０ａ−２０ｂ】
2019528274.tif 000033
【配列表】
2019528274000001.app
【国際調査報告】
2019528274.tif 000034
2019528274.tif 000035
2019528274.tif 000036