(57)【要約】  本開示は、Ａベータ中の立体配座エピトープ、それに対する抗体および免疫原およびそれに特異的な抗体を作製および使用する方法に関する。【選択図】図１
2019505166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＱＫと最大６個のＡベータのコンティグ残基とを含むＡベータペプチドと、リンカーとを含み、前記リンカーが、前記ＡベータペプチドのＮ末端残基および前記ＡベータのＣ末端残基に共有結合している、環状化合物。
【請求項２】
前記Ａベータペプチドが、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫ、ＨＨＱＫＬ（配列番号７）、ＶＨＨＱＫＬ（配列番号６）、ＶＨＨＱ（配列番号５）、およびＨＱＫＬ（配列番号２０）から必要に応じて選択される、配列番号１〜１６のいずれか１つの配列を有するペプチドから選択される、請求項１に記載の環状化合物。
【請求項３】
前記環状化合物が環状ペプチドである、請求項１または２に記載の環状化合物。
【請求項４】
ｉ）環状化合物中のＱおよび／またはＫの曲率が、対応する直鎖状化合物におけるＨ、Ｑおよび／またはＫと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％または少なくとも３０％異なる曲率を含み；ｉｉ）Ｈ、ＱおよびＫから選択される少なくとも１個の残基であって、前記残基の少なくとも１つの二面角が、対応する直鎖状化合物における前記対応する二面角と比較して、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、少なくとも１５０度、少なくとも１６０度、少なくとも１７０度、少なくとも１８０度、少なくとも１９０度、または少なくとも２００度異なる残基を含み；ｉｉｉ）エントロピーにより測定して、対応する直鎖状化合物と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％強く拘束されたＱおよび／またはＫの立体配座を有し；および／またはｉｖ）少なくともＨ、少なくともＱ、および／または少なくともＫが、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫ、および／またはＨＱＫＬ（配列番号２０）を含む前記直鎖状ペプチドで占められる立体配座より強く拘束された立体配座である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＨＱＫＬ（配列番号７）またはＨＱＫＬ（配列番号２０）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項６】
前記化合物が検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の環状化合物。
【請求項７】
前記リンカーが、１〜８個のアミノ酸および／またはこれと同等に機能的な分子および／または１つまたは複数の官能化可能な部分を含む、またはこれらよりなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記リンカーのアミノ酸がＡおよびＧから選択され、および／または前記官能化可能な部分がＣである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記リンカーが、アミノ酸ＧＣＧもしくはＣＧＣを含む、またはこれよりなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記リンカーがＰＥＧ分子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
以下の構造：
【化１】
2019505166.tif 000028
から選択される、請求項３に記載の環状化合物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の環状化合物を含む、免疫原。
【請求項１３】
前記化合物が、担体タンパク質または免疫原性増強物質と結合している、請求項１２に記載の免疫原。
【請求項１４】
前記担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、または前記免疫原性増強物質がキーホールキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））である、請求項１３に記載の免疫原。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の免疫原を含む、組成物。
【請求項１６】
アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントがリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の環状化合物、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の免疫原中に存在するＨＱＫの配列または関連エピトープ配列を有し、場合により、配列番号２、３、４または３２の配列を有する、Ａベータペプチドに特異的におよび／または選択的に結合する、単離された立体配座特異的および／または選択的抗体。 
【請求項１９】
Ａベータ上のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、前記抗体との結合に主に関与する、ＨＱＫの少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含むかまたはそれから構成され、前記少なくとも２個の連続するアミノ酸が、ＨＱＫ、場合によりＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫＬ（配列番号２０）またはＨＨＱＫＬＶ（配列番号８）内に組み込まれたＱＫであり、前記少なくとも２個の連続するアミノ酸が、ＨＱＫ、場合によりＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫＬ（配列番号２０）、ＨＨＱＫＬ（配列番号７）、ＨＨＱＫＬＶ（配列番号８）内に組み込まれたＨＱであり、または前記少なくとも２個の連続するアミノ酸が、ＨＨＱ、場合により、ＨＨＱＫ（配列番号１）またはＨＨＱＫＬＶ（配列番号８）内に組み込まれたＨＨである、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
前記Ａベータペプチドおよび／またはエピトープが、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＶＨＨＱＫＬ（配列番号６）、ＶＨＨＱ（配列番号５）、およびＨＱＫＬ（配列番号２０）を含むかまたはそれらから構成される、請求項１８または１９に記載の抗体。
【請求項２１】
対応する直鎖状ペプチドよりも優れて、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状化合物に選択的に結合し、場合により、対応する直鎖状化合物に比べて、前記環状化合物に対し、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維に比較して、Ａベータオリゴマーと選択的に結合する、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
前記選択性が、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維と比較して、Ａベータオリゴマーに対して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍高い、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
配列ＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープを含む直鎖状ペプチドと特異的および／または選択的に結合することがなく、場合により、前記直鎖状ペプチドの配列が、抗体を産生させるのに使用する環状化合物の直鎖型、場合により、配列番号２、３、４または３２で示される配列を有する直鎖状ペプチドである、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２５】
ｉｎ  ｓｉｔｕでＡベータモノマー斑および／またはＡベータ線維斑と結合しない、またはほとんど結合しない、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２７】
ヒト化抗体である、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２８】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される抗体結合フラグメントである、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２９】
場合により融合している軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下の配列を含む、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の抗体。
ＣＤＲ−Ｈ１  ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号２２）
ＣＤＲ−Ｈ２  ＶＨＰＧＲＧＶＳＴ（配列番号２３）
ＣＤＲ−Ｈ３  ＳＲＳＨＧＮＴＹＷＦＦＤＶ（配列番号２４）
ＣＤＲ−Ｌ１  ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号２５）
ＣＤＲ−Ｌ２  ＫＶＳ（配列番号２６）
ＣＤＲ−Ｌ３  ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号２７）
【請求項３０】
ｉ）配列番号２９で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記ＣＤＲの配列が、配列番号２２、２３および２４で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む重鎖可変領域を含む、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３１】
ｉ）配列番号３１で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号３１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記ＣＤＲの配列が配列番号２５、２６および２７で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２８で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によりコードされ；および／または、配列番号３０で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によりコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項１８〜３１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３３】
前記重鎖可変領域が、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含む、またはこれよりなり、および／または、前記軽鎖可変領域が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む、またはこれよりなる、請求項１８〜３２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３４】
ヒトＡベータに対する結合に関して、表１３に記載される前記ＣＤＲ配列を含む抗体と競合する、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３５】
請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質とを含む、イムノコンジュゲート。
【請求項３６】
前記検出可能な標識が、場合により、ＰＥＴ撮像などの対象の撮像に使用するための、陽電子放出放射性核種を含む、請求項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３７】
場合により、希釈剤と共に、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の抗体または請求項３５または３６に記載のイムノコンジュゲートを含む、組成物。
【請求項３８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の抗体または請求項３５および３６に記載のタンパク質性イムノコンジュゲートをコードする、核酸分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４０】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の抗体を発現し、場合により、請求項３９に記載のベクターを含むハイブリドーマである、細胞。
【請求項４１】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の免疫原、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の抗体、請求項３５もしくは３６に記載のイムノコンジュゲート、請求項３７に記載の組成物、請求項３８に記載の核酸分子、請求項３９に記載のベクターまたは請求項４０に記載の細胞を含む、キット。
【請求項４２】
請求項１８〜３５のいずれか１項に記載の抗体を作製する方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物もしくは免疫原または前記化合物もしくは免疫原を含む組成物を対象に投与すること、および投与する前記化合物もしくは免疫原および／またはＡベータオリゴマーに特異的または選択的であり、場合により、前記Ａベータペプチドを含む直鎖状ペプチドと結合しない、もしくはほとんど結合せず、および／または斑と結合しない、もしくはほとんど結合しない、抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することを含む、方法。
【請求項４３】
生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、ａ．前記生体試料と、請求項１８〜３５のいずれか１項に記載の抗体または請求項３６もしくは３７に記載のイムノコンジュゲートとを接触させること、およびｂ．何らかの抗体複合体の存在を検出することを含む、方法。
【請求項４４】
前記生体試料がＡベータオリゴマーを含むかどうかを判定する請求項４３に記載の方法であって、ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、前記試料と、Ａベータオリゴマーに特異的および／または選択的な請求項１８〜３５のいずれか１項に記載の抗体または請求項３６もしくは３７に記載のイムノコンジュゲートとを接触させること、およびｂ．何らかの複合体の存在を検出することを含み、検出可能な複合体の存在により、前記試料がＡベータオリゴマーを含み得ることが示される、方法。
【請求項４５】
複合体の量を測定する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が、脳組織もしくはその抽出物、全血、血漿、血清および／またはＣＳＦを含む、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料がヒト試料である、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料を対照、場合により以前の試料と比較する、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
ＳＰＲによりＡベータのレベルを検出する、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
対象のＡベータのレベルを測定する方法であって、ＡＤを有するリスクもしくは疑いがある、またはＡＤを有する対象に、請求項３５または３６に記載の抗体を含み、前記抗体が検出可能な標識とコンジュゲートされているイムノコンジュゲートを投与すること、および前記標識を検出すること、場合により前記標識を定量的に検出することを含む、方法。
【請求項５１】
前記標識が陽電子放出放射性核種である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
対象に免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物もしくは化合物の組合せ、場合により、ＨＱＫもしくはＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を前記対象に投与すること、および場合により、投与した前記化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む、方法。
【請求項５３】
Ａベータオリゴマーの伝播を抑制する方法であって、有効量の請求項１８〜３６のいずれか１項に記載のＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体またはイムノコンジュゲートを、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータ凝集および／またはＡベータオリゴマー伝播を抑制することを含む、方法。
【請求項５４】
ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の請求項１８〜３６のいずれか１項に記載の抗体またはイムノコンジュゲート、場合により、Ａベータオリゴマーに特異的もしくは選択的な抗体または前記抗体を含む医薬組成物；２）ＨＱＫ、ＨＨＱＫ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物または免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物、あるいは３）前記１の抗体または前記２の免疫原をコードする核酸または拡散を含むベクターを、必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項５５】
本明細書に記載の抗体を用いて、治療する前記対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
２つ以上の抗体または免疫原を投与する、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、組成物または核酸もしくはベクターを脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した前記化合物または免疫原を含む、医薬組成物である、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
本開示で示される配列、場合により表１５（１）で示される配列の内のいずれか１つの配列よりなるＡベータペプチドを含む、単離ペプチドを含む。
【請求項６０】
リンカーを含み、前記リンカーが前記ＡベータペプチドのＮ末端残基および／または前記ＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状ペプチドである、請求項５９に記載の単離ペプチド。
【請求項６１】
検出可能な標識を含む、請求項５９または６０に記載の単離ペプチド。
【請求項６２】
請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の単離ペプチドをコードする、核酸配列。
【請求項６３】
請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞または細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２０１５年１１月９日に出願された米国特許出願第６２／２５３０４４号、２０１６年７月１８日に出願された米国特許出願第６２／３６３，５６６号、２０１６年７月２２日に出願された米国特許出願第６２／３６５，６３４号および２０１６年９月１２日に出願された米国特許出願第６２／３９３，６１５号の優先権の利益を主張するＰＣＴ出願であり、上記の出願はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、アミロイドベータ（ＡベータまたはＡβ）エピトープおよびそれに対する抗体、より具体的には、Ａベータオリゴマー内で選択的に接触可能な立体配座Ａベータエピトープならびに関連する抗体組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
３６〜４３アミノ酸のペプチドとして存在するアミロイドベータ（Ａベータ）は、酵素であるβセクレターゼおよびγセクレターゼによってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から放出される産物である。ＡＤ患者では、Ａベータは可溶性モノマー、不溶性線維および可溶性オリゴマーの形で存在し得る。モノマー型のＡベータは、主として非構造化ポリペプチド鎖として存在する。線維型のＡベータは、よく株と呼ばれる様々な形態に凝集することができる。これらの構造のうちのいくつかは固体ＮＭＲにより決定されている。
【０００４】
例えば、原子分解三次元構造データの結晶学的データベースであるタンパク質データバンク（ＰＤＢ）では、３回対称性のＡβ構造（ＰＤＢエントリー２Ｍ４Ｊ）、Ａβ−４０モノマーの２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）およびＡβ−４２モノマーの一本鎖平行ｉｎ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）を含めたいくつかの線維の株の構造が入手可能である。
【０００５】
２Ｍ４Ｊの構造はＬｕら［８］に報告されており、２ＭＸＵの構造はＸｉａｏら［９］に報告されている。２ＬＭＮの構造はＰｅｔｋｏｖａら［１０］に報告されている。
【０００６】
Ａベータオリゴマーは、培養した細胞系およびニューロンを死滅させ、スライス培養物および動物生体において記憶を促進し長期増強（ＬＴＰ）と呼ばれる極めて重要なシナプス活性を遮断することが示されている。
【０００７】
これまでにオリゴマーの構造は決定されていない。さらに、ＮＭＲおよびその他の証拠から、オリゴマーが単一の明確に定められた構造ではなく、規則性に乏しく立体配座的に可塑性で順応性のある構造アンサンブルの形で存在することがわかっている。さらに、毒性オリゴマー種の濃度はモノマーまたは線維の濃度よりはるかに低い（推定値には幅があるが、約１０００分の１またはそれ以下である）ため、この標的は捉えどころのないものとなっている。
【０００８】
Ａベータと結合する抗体が記載されている。
【０００９】
「ＵＳＥ  ＯＦ  ＡＮＴＩ−ＡＭＹＬＯＩＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＩＮ  ＯＣＵＬＡＲ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ」と題する国際公開第２００９０４８５３８Ａ２号は、Ａベータ上に１つまたは複数の結合部位を認識し、眼疾患の治療に有用なキメラ抗体を開示している。
【００１０】
「ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＡＭＹＬＯＩＤ  ＯＲ  ＡＭＹＬＯＩＤ−ＬＩＫＥ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」と題する米国特許第９２２１８１２Ｂ２号は、アミロイド関連疾患の治療のために、アミノ酸残基１２〜２４の間のエピトープを含むＡベータに結合する医薬組成物および不連続抗体について記載している。
【００１１】
「ＡＮＴＩ−ＡＭＹＬＯＩＤ  ＢＥＴＡ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＴＨＥＩＲ  ＵＳＥ」と題する国際公開第２００３０７０７６０Ａ２号は、第一の領域がアミノ酸配列ＡＥＦＲＨＤＳＧＹ（配列番号３５）またはそのフラグメントを含み、第二の領域がアミノ酸配列ＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧ（配列番号３３）またはそのフラグメントを含む、Ａベータ不連続エピトープを認識する抗体を開示している。
【００１２】
「ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＡＭＹＬＯＩＤＯＳＥＳ」と題する米国特許出願公開第２０１１０１７１２４３Ａ１号は、ＨＱＫＬＶＦおよび／またはＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号１６）に結合する抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ形成を誘導することができるペプチドミモトープ、およびその使用を開示している。
【００１３】
国際公開第２００８０８８９８３Ａ１号および国際公開第２００１０６２８０１Ａ２号は、Ａベータアミノ酸１３〜２８（ＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ）（配列番号１９）に結合するペグ化抗体フラグメントおよびＡベータ関連疾患の治療におけるその使用を開示している。
【００１４】
「ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＳＹＭＰＴＯＭＳ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＰＡＲＫＩＮＳＯＮ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ」と題する国際公開第２００９１４９４８７Ａ２号は、ＥＶＨＨＱＫＬ（配列番号３４）、ＨＱＫＬＶＦ（配列番号１４）およびＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号１６）などの、Ａベータエピトープに特異的な抗体に対する結合能を有するペプチドを含む化合物を開示している。
【００１５】
ＨＨＱＫ（配列番号１）ドメインは、Ｇｉｕｌｉａｎ  Ｄら［１１］およびＷｉｎｋｌｅｒら［１２］により記載されているように、ヒトミクログリアにおける神経毒性の斑誘導に関与するとして説明されている。ＨＨＱＫ（配列番号１）に結合する非抗体治療薬は、タンパクフォールディング病の治療用として開示された（米国特許出願公開第２０１５０１０５３４４Ａ１号、国際公開第２００６１２５３２４Ａ１号）。
【００１６】
Ａベータのモノマーもしくは線維またはモノマーと線維の両方よりもＡベータオリゴマーと優先的または選択的に結合する抗体が望ましい。
【発明の概要】
【００１７】
本明細書では、残基ＨＨＱＫ（配列番号１）またはその一部を含むおよび／またはこれよりなるＡベータの立体配座エピトープ、およびそれに対する抗体が記載される。エピトープは、オリゴマー中のエピトープをモノマー中のエピトープから区別する立体配座により、Ａベータのオリゴマー種中で選択的に露出され得るエピトープとして特定される。
【００１８】
一態様は、ＨＱＫと最大６個のＡベータのコンティグ残基とを含むＡベータペプチドと、リンカーとを含み、リンカーが、ＡベータペプチドのＮ末端残基およびＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状化合物を含む。
【００１９】
一実施形態では、Ａベータペプチドは、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫ、ＨＨＱＫＬ（配列番号７）、ＶＨＨＱＫＬ（配列番号６）、ＶＨＨＱ（配列番号５）、およびＨＱＫＬ（配列番号２０）から任意に選択される、配列番号１〜１６のいずれか１つの配列を有するペプチドから選択される。
【００２０】
別の実施形態では、環状化合物は環状ペプチドである。
【００２１】
別の実施形態では、本明細書に記載される環状化合物は、ｉ）環状化合物中のＱおよび／またはＫの曲率は、対応する直鎖状化合物におけるＨ、Ｑおよび／またはＫと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％または少なくとも３０％と異なり；ｉｉ）Ｈ、ＱおよびＫから選択される少なくとも１個の残基であって、前記残基の少なくとも１つの二面角が、対応する直鎖状化合物における対応する二面角と比較して、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、少なくとも１５０度、少なくとも１６０度、少なくとも１７０度、少なくとも１８０度、少なくとも１９０度、または少なくとも２００度異なる残基を含み；ｉｉｉ）環状化合物は、エントロピーにより測定して、対応する直鎖状化合物と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％強く拘束されたＱおよび／またはＫの立体配座を含み；および／またはｉｖ）少なくともＨ、少なくともＱ、および／または少なくともＫが、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫ、および／またはＨＱＫＬ（配列番号２０）を含む直鎖状ペプチドで占められる立体配座より強く拘束された立体配座である。
【００２２】
別の実施形態では、ペプチドは、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＨＱＫＬ（配列番号７）またはＨＱＫＬ（配列番号２０）である。
【００２３】
別の実施形態では、化合物は、検出可能な標識をさらに含む。
【００２４】
別の実施形態では、リンカーは、１〜８個のアミノ酸および／またはこれと同等に機能する分子および／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む、あるいはこれよりなる。
【００２５】
別の実施形態では、リンカーのアミノ酸がＡおよびＧから選択され、かつ／または官能化可能な部分がＣである。
【００２６】
別の実施形態では、リンカーは、アミノ酸ＧＣＧもしくはＣＧＣを含む、またはこれよりなる。
【００２７】
別の実施形態では、リンカーはＰＥＧ分子を含む。
【００２８】
別の実施形態では、環状化合物は、図７Ｃの構造から選択される。
【００２９】
一態様は、環状化合物を含む、免疫原を含む。
【００３０】
一実施形態では、化合物は、担体タンパク質または免疫原性増強物質と結合している。
【００３１】
別の実施形態では、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、または免疫原性増強物質がキーホールキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））である。
【００３２】
一態様は、本明細書に記載される化合物または本明細書に記載される免疫原を含む、組成物を含む。
【００３３】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００３４】
別の実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである。
【００３５】
一態様は、任意選択で配列番号２、３または４の配列を有する、本明細書に記載の環状化合物で存在するＨＱＫの配列または関連エピトープ配列を有するＡベータペプチドに特異的および／または選択的に結合する、単離された立体配座特異的および／または選択的抗体を含む。
【００３６】
一実施形態では、抗体は、Ａベータ上のエピトープと特異的に結合し、エピトープは、抗体との結合に主として関与する、ＨＱＫの少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含むかまたはそれから構成され、少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＨＱＫ、場合によりＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫＬ（配列番号２０）またはＨＨＱＫＬＶ（配列番号８）内に組み込まれたＱＫであり、少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＨＱＫ、場合によりＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫＬ（配列番号２０）、ＨＨＱＫＬ（配列番号７），ＨＨＱＫＬＶ（配列番号８）内に組み込まれたＨＱであり、または少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＨＨＱ、場合により、ＨＨＱＫ（配列番号１）またはＨＨＱＫＬＶ（配列番号８）内に組み込まれたＨＨである。
【００３７】
別の実施形態では、Ａベータペプチドおよび／またはエピトープは、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＶＨＨＱＫＬ（配列番号６）、ＶＨＨＱ（配列番号５）、およびＨＱＫＬ（配列番号２０）を含むかまたはそれらから構成される。
【００３８】
別の実施形態では、抗体は、対応する直鎖状ペプチドよりも優れて、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状化合物に選択的に結合し、場合により、抗体は、対応する直鎖状化合物に比べて、環状化合物に対し、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
【００３９】
別の実施形態では、抗体は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりもＡベータオリゴマーと選択的に結合する。
【００４０】
別の実施形態では、Ａベータオリゴマーに対する選択性は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
【００４１】
別の実施形態では、抗体は、配列ＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープを含む直鎖状ペプチドと特異的かつおよび／または選択的に結合することがなく、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、抗体を生じさせるのに使用する環状化合物の直鎖型、場合により配列番号２、３または４で示される配列を有する直鎖状ペプチドである。
【００４２】
別の実施形態では、抗体は、ｉｎ  ｓｉｔｕでＡベータモノマー斑および／またはＡベータ線維斑に結合しない、またはほとんど結合しない。
【００４３】
別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００４４】
別の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【００４５】
別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される抗体結合フラグメントである。
【００４６】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体は、場合により融合している、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は以下の配列を含む：
ＣＤＲ−Ｈ１  ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号２２）
ＣＤＲ−Ｈ２  ＶＨＰＧＲＧＶＳＴ（配列番号２３）
ＣＤＲ−Ｈ３  ＳＲＳＨＧＮＴＹＷＦＦＤＶ（配列番号２４）
ＣＤＲ−Ｌ１  ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号２５）
ＣＤＲ−Ｌ２  ＫＶＳ（配列番号２６）
ＣＤＲ−Ｌ３  ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（配列番号２７）
【００４７】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号２９で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲの配列が配列番号２２、２３および２４で示される、アミノ酸配列；またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む重鎖可変領域を含む。
【００４８】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号３１で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号３１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲの配列が配列番号２５、２６および２７で示される、アミノ酸配列；またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【００４９】
別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２８で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは、抗体が、配列番号３０で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなり、かつ／または、軽鎖可変領域が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなる。
【００５１】
別の実施形態では、抗体は、ヒトＡベータとの結合に関して、表１３に記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する。
【００５２】
一態様は、本明細書に記載される抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質とを含む、イムノコンジュゲートを含む。
【００５３】
一実施形態では、検出可能な標識は、任意選択でＰＥＴ撮像などの対象の撮像に使用する、陽電子放出放射性核種を含む。
【００５４】
一態様は、場合により希釈剤とともに、本明細書に記載される抗体を含む組成物または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートを含む。
【００５５】
一態様は、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるタンパク質性イムノコンジュゲートをコードする、核酸分子を含む。
【００５６】
一態様は、本明細書に記載される核酸を含むベクターを含む。
【００５７】
一態様は、本明細書に記載される抗体を発現する細胞を含み、任意選択で、細胞は、本明細書に記載のベクターを含むハイブリドーマである。
【００５８】
一態様は、本明細書に記載される化合物を含むキット、本明細書に記載される免疫原、本明細書に記載される抗体、本明細書に記載されるイムノコンジュゲート、本明細書に記載される組成物、本明細書に記載される核酸分子、本明細書に記載されるベクターまたは本明細書に記載される細胞を含む。
【００５９】
一態様は、本明細書に記載される抗体を作製する方法であって、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原または前記化合物もしくは免疫原を含む組成物を対象に投与することと、投与する化合物もしくは免疫原および／またはＡベータオリゴマーに特異的または選択的であり、任意選択で、Ａベータペプチドを含む直鎖状ペプチドと結合しない、もしくはほとんど結合せず、かつ／または斑と結合しない、もしくはほとんど結合しない、抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することとを含む、方法を含む。
【００６０】
一態様は、生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、
ａ．生体試料と、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの抗体複合体の存在を検出することを含む、方法を含む。
【００６１】
一実施形態では、生体試料がＡベータオリゴマーを含み、方法は、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、試料と、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出することを含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
【００６２】
別の実施形態では、複合体の量を測定する。
【００６３】
別の実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物、全血、血漿、血清および／またはＣＳＦを含む。
【００６４】
別の実施形態では、試料はヒト試料である。
【００６５】
別の実施形態では、試料を対照、任意選択で以前の試料と比較する。
【００６６】
別の実施形態では、ＳＰＲによりＡベータのレベルを検出する。
【００６７】
一態様は、対象のＡベータのレベルを測定する方法であって、ＡＤを有するリスクもしくは疑いがある、またはＡＤを有する対象に、本明細書に記載される抗体を含み、抗体が検出可能な標識とコンジュゲートされているイムノコンジュゲートを投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む、方法を含む。
【００６８】
一実施形態では、標識は陽電子放出放射性核種である。
【００６９】
一態様は、対象に免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載される化合物もしくは化合物の組合せ、任意選択で、ＨＱＫまたはＨＨＱＫ（配列番号１）もしくは関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を対象に投与すること；ならびに任意選択で、投与した化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む、方法を含む。
【００７０】
一態様は、Ａベータオリゴマー伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体またはイムノコンジュゲートを、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマー伝播を阻害することを含む、方法を含む。
【００７１】
一態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲート、任意選択で、Ａベータオリゴマーに特異的もしくは選択的な抗体または前記抗体を含む医薬組成物を投与すること；２）ＨＱＫ、ＨＨＱＫ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物または免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物あるいは３）１の抗体または２の免疫原をコードする核酸または核酸を含むベクターを、必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。
【００７２】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。
【００７３】
別の実施形態では、２つ以上の抗体または免疫原を投与する。
【００７４】
別の実施形態では、抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、組成物または核酸もしくはベクターを脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。
【００７５】
別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した化合物または免疫原を含む、医薬組成物である。
【００７６】
一態様は、本開示で示される配列、必要に応じ表１５（１）で示されるいずれか１つの配列よりなるＡベータペプチドを含む、単離ペプチドを含む。
【００７７】
一実施形態では、ペプチドは、リンカーを含み、リンカーがＡベータペプチドのＮ末端残基および／またはＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状ペプチドである。
【００７８】
別の実施形態では、本明細書に記載の単離ペプチドは、検出可能な標識を含む。
【００７９】
一態様は、本明細書に記載される単離ペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００８０】
以下の詳細な説明から本開示のその他の特徴と利点が明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明から本開示の趣旨および範囲内に含まれる様々な変更および改変が当業者に明らかになることから、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示すと同時に、単に説明を目的として記載されるものであることが理解されるべきである。
【００８１】
これより本開示の実施形態を図面と関連させて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】集団座標法（パネルＡ）およびＰｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏ法（パネルＢ、Ｃ、Ｄ）により求めた配列の関数としての露出の可能性を示す図である。
【図２】曲率を残基インデックスの関数として示す図である。直鎖状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の平衡アンサンブルの平均曲率（パネルＡ）が、環状ペプチドの曲率（パネルＢ）および線維の平衡アンサンブルおよび各種モノマーの両方に対する平均化曲率（パネルＣ）と共に示されている。それぞれのペプチド中の全ての残基の平均曲率値に対する収束チェックをパネルＦ〜Ｆに示す。
【図３】角度Ｃ−Ｃα−Ｃβ−Ｃγ（パネルＡ）、Ｃα−Ｃ−Ｎ−ＨＮ（パネルＢ）、ならびにＣα−Ｃβ−Ｃγ−Ｃδ２（パネルＣ）および残基１３Ｈの側鎖および主鎖原子を含むＯ−Ｃ−Ｃα−Ｃβ（パネルＤ）に対する二面角分布である。角度Ｃ−Ｃα−Ｃβ−Ｃγ（パネルＥ）、Ｃ−Ｃα−Ｎ−ＨＮ（パネルＦ）、ならびにＣα−Ｃβ−Ｃγ−Ｃδ２（パネルＧ）、およびＯ−Ｃ−Ｃα−Ｃβ（パネルＨ）に対する残基１４Ｈの二面角分布を示す。１５Ｑに対しては、角度Ｃα−Ｃβ−Ｃγ−Ｃ（パネルＩ）、Ｃ−Ｃα−Ｎ−ＮＨ（パネルＪ）、Ｎε２−Ｃγ−Ｃδ−Ｃβ（パネルＫ）およびＯ−Ｃ−Ｃα−Ｃβ（パネルＬ）に対する二面角分布を示す。１６Ｋに対しては、１５Ｑに対しては、角度Ｃα−Ｃβ−Ｃγ−Ｃ（パネルＭ）、Ｃ−Ｃα−Ｎ−ＮＨ（パネルＮ）、およびＯ−Ｃ−Ｃα−Ｃβ（パネルＯ）に対する二面角分布を示す。重なり合いパーセンテージ値は、表２に示されている。分布に対する二面角のピーク値は、表３に示されている。
【図４】それぞれの残基１３Ｈ（パネルＡ）、１４Ｈ（パネルＢ）、１５Ｑ（パネルＣ）、および１６Ｋ（パネルＤ）について、線維のエントロピーに対して、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの個々の二面角のエントロピーの変化のプロット。パネルＥ：個々の残基の非ラマチャンドランエントロピーの線維からの差異−すなわち、主鎖ラマチャンドランエントロピーは含まれない。パネルＦ：個々の残基の側鎖と主鎖の（合計）立体配座エントロピーから線維の対応する量を差し引いたもの。パネルＧは、環状ペプチドおよび線維両方の直鎖状ペプチドに対するそれぞれの残基のエントロピー損失を示す。
【図５】パネルＡにおいて、直鎖型（左パネル）および環状型（中間パネル）のペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑおよび１６Ｋの平衡主鎖ラマチャンドラン角を線維２Ｍ４Ｊにおける残基の主鎖ラマチャンドラン角とともに示す。ラマチャンドラン角度の重ね合わせ確率を表４に示す。対応する分布のピーク角度を表５に示す。パネルＢ〜Ｅは、それぞれのアミノ酸に対する個々の主鎖ラマチャンドラン角度
【数１】
2019505166.tif 000003
およびψの別の表現を示す。
【図６】残基ＨＨＱＫ（配列番号１）に対する溶解度および溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）のプロットである。パネルＡは、残基インデックスの関数としての溶解度を示す。ＨＨＱＫ（配列番号１）は垂直破線により示す。パネルＢは、残基ＨＨＱＫ（配列番号１）に対するＳＡＳＡを示し、環状ペプチド中のＨＨＱＫ（配列番号１）は点線で表され、直鎖状ペプチド中のＨＨＱＫ（配列番号１）は薄灰色実線で表され、線維２Ｍ４ＪにおけるＨＨＱＫ（配列番号１）は暗灰色実線で表される。パネルＣは、後述のように、それぞれの残基の溶解度で重みを付けたＳＡＳＡを示す。パネルＤは、重みを付けたΔＳＡＳＡを示し、線維２Ｍ４Ｊに対する環状および直鎖状ペプチドのＳＡＳＡの差異を示す。
【図７】ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の環状および直鎖状ペプチドアンサンブルの重心構造。黒色の立体配座は、環状ペプチドの最も大きいクラスターの重心であり、そのため、環状ペプチドの典型的な立体配座を最もよく表している。白色の立体配座は、最大ペプチドの最も大きいクラスターの重心であり、直鎖状ペプチドの典型的な立体配座を最もよく表し得る。直鎖状重心は、環状重心に整列されている。重ね合わせて整列させた構造は、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドに好ましい傾向のある様々な二面角および全体的なエピトープ立体配座を示す。パネルＡ：環状および直鎖状ペプチドの残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋ（ＨＨＱＫ  配列番号１）の整列された重心構造を２つの異なる視点からの重ね合わせ図により示す。パネルＢ：側鎖の配向が見えるようにリコリス表現（ｌｉｃｏｒｉｃｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）で描画した環状ペプチド構造ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）および直鎖状ペプチド構造ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の３つの図である。パネルＣ：環状のペプチド結合を有する環状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）、Ｃ残基とＨ残基の間にＰＥＧ２リンカーを有する環状ペプチドＣ−ＰＥＧ２−ＨＨＱＫＧ（配列番号３）、およびＫ残基とＣ残基の間にＰＥＧ２リンカーを有する環状ペプチドＣＧＨＨＱＫ−ＰＥＧ２（配列番号４）を含む、エピトープ残基ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状ペプチドの略図である。
【図８】エピトープＨＨＱＫ（配列番号１）の溶媒接触面積（ＳＡＳＡ）は、配列ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の直鎖状および環状ペプチド、ならびにＡベータ４０ポリペプチド２Ｍ４Ｊの対応する部分について示されている。パネルＡは、直鎖状（左）および環状（右）ペプチドのそれぞれのエピトープＨＨＱＫ（配列番号１）のＳＡＳＡを示す。パネルＢは、整列された環状および線維のＳＡＳＡ（左）、ならびに整列された環状および直鎖状ペプチドのＳＡＳＡを示す。両パネルは、環状ペプチドにより提示された抗原性表面は、直鎖状または線維ペプチドとは明確に異なることを示す。パネルＣは、Ａベータ４０線維２Ｍ４Ｊ内のエピトープＨＨＱＫ（配列番号１）配列を示し、溶媒に露出している原子のみを示す。表面積は、環状および直鎖状ペプチドでは異なった形で存在する。これは、抗体が環状ＨＨＱＫ（配列番号１）化合物に対し高親和性を、およびＡベータ４０ポリペプチドモノマーに対して低親和性を有するように選択され得ることを示す。
【図９】平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によるクラスタリングプロット；軸は、環状ペプチドアンサンブルの重心構造のＨＨＱＫ（配列番号１）に対するＨＨＱＫ（配列番号１）のＲＭＳＤ、直鎖状ペプチドアンサンブルの重心構造のＨＨＱＫ（配列番号１）に対するＨＨＱＫ（配列番号１）のＲＭＳＤ、およびＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｍ４Ｊの線維アンサンブルの重心構造のＨＨＱＫ（配列番号１）に対するＨＨＱＫ（配列番号１）のＲＭＳＤに対応する。各点は、環状ペプチド平衡アンサンブル（凡例に示したように円）、直鎖状ペプチド平衡アンサンブル（凡例に示したように＋記号）、またはＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｍ４Ｊから始まる線維平衡アンサンブル（凡例に示したように逆三角形）から取得した所定の立体配座に対応する。パネルＡ〜Ｃで、３つの異なる視点の結果が提示される。暗灰色の円で示される環状ペプチドアンサンブルは、直鎖状または線維アンサンブルとは立体配座の差異を示し、これは、パネルＤ〜Ｈに示す分布間の重なり合いパーセンテージを計算することにより定量し得る。パネルＤ〜Ｉは、環状、直鎖状および線維型のペプチドの間の重なり合いの収束チェックを示す。パネルＪは、単一残基欠失の直鎖状アンサンブルと９０％環状アンサンブルとの構造的重なり合いに与える影響を調査する。単一アミノ酸が立体配座選択性を与える場合には、構造的アライメントからそれを除くことにより、かなり高い重なり合いが生ずるであろう。この試験により、Ｋ１６は、環状ペプチドに対し、最高の立体配座選択性を与える可能性がある。
【図１０】その他の線維株立体配座に対するＲＭＳＤによるクラスタリングプロット；軸は、環状ペプチドアンサンブルの重心構造のＨＨＱＫ（配列番号１）に対するＨＨＱＫ（配列番号１）のＲＭＳＤ、直鎖状ペプチドアンサンブルの重心構造のＨＨＱＫ（配列番号１）に対するＨＨＱＫ（配列番号１）のＲＭＳＤ、およびＡベータのいくつかの線維モデルに対する平衡アンサンブルの重心構造のＨＨＱＫ（配列番号１）に対するＨＨＱＫ（配列番号１）のＲＭＳＤに対応する。各点は、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＭＸＵ（パネルＡ、２つの視野）、２ＬＭＰ（パネルＢ）、および２ＬＭＮ（パネルＣ、２つの視野）由来の環状ペプチドまたは線維平衡アンサンブルの様々な「株」から取得した所定の立体配座に対応する。
【図１１】組織培養上清クローンのパネルＡの環状ペプチドおよび直鎖状ペプチド、およびパネルＢのＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーに対する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合アッセイを示す図である。
【図１２】ＳＰＲ結合アッセイとＥＬＩＳＡとによる組織培養上清クローン結合の比較プロットを示す図である。
【図１３】選択したクローンの環状ペプチド（丸）、直鎖状ペプチド（四角）、Ａベータモノマー（上向きの三角形）およびＡベータオリゴマー（下向きの三角形）に対するＳＰＲ結合アッセイを示す図である。アスタリスクは、対照目的で非構造化直鎖状ペプチドに対して反応性のクローンを示している。
【図１４】６Ｅ１０陽性対照抗体（Ａ）およびシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）（Ｂ）に対して産生させた選択および精製されたモノクローナル抗体（３０１−１７、１２Ｇ１１）を用いた死体ＡＤ脳由来の斑の免疫組織化学染色を示す図である。
【図１５】選択し精製した抗体に関するＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いた二次スクリーニングを示す図である。捕捉抗体に対するＡベータオリゴマーのＳＰＲ結合応答から捕捉抗体に対するＡベータモノマーの結合応答を差し引いたもの（円）；ＡＤ患者からプールした可溶性脳抽出物の捕捉抗体に対するＳＰＲ結合応答から、非ＡＤ対照からプールした脳抽出物の捕捉抗体に対する結合応答を差し引いたもの（三角）；捕捉抗体に対するＡＤ患者由来のプール脳脊髄液（ＣＳＦ）のＳＰＲ結合応答から捕捉抗体に対する非ＡＤ由来のプールＣＳＦの結合応答を指し引いたもの（四角）。
【図１６】安定なＡベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して産生させたいくつかの抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。
【図１７】ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状ペプチドを用いて産生させた代表的な抗体の存在下または不在下におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡベータ凝集伝播のプロットである。
【図１８】異なるモル比の陰性アイソタイプ対照（Ａ）またはＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状ペプチドを用いて産生させた抗体の存在下または不在下における有毒性のＡベータオリゴマー（ＡβＯ）に対し曝露させたラット一次皮質ニューロンの生存率を示すプロットである。対照は、単独で培養したニューロン（ＣＴＲＬ）、オリゴマーなしで抗体と共にインキュベートしたニューロンおよびオリゴマーを含有または非含有の神経保護ヒューマニンペプチド（ＨＮＧ）を含む。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
表１は、直鎖状、環状および線維２Ｍ４Ｊ型の１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋの残基による曲率値を示す。
【００８４】
表２は、図３に示す二面角の分布の重なり合いパーセンテージを示す。
【００８５】
表３は、環状ペプチドと他の種との間に分布の差異が認められる二面角の二面角分布のピーク値を示す。列１は、検討した特定の二面角であり、列２は、環状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列３は、直鎖状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列４は、線維構造２Ｍ４ＪにおけるペプチドＨＨＱＫ（配列番号１）の二面角分布のピーク値であり、および列５は、直鎖状ペプチドと環状ペプチドとの間の二面角分布のピーク値の差異である。図３も参照されたい。
【００８６】
表４は、図５に示す残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋのラマチャンドラン角度の重ね合わせ確率を示す。特に、環状ペプチドと合致する立体配座をとる直鎖状アンサンブルの比率は、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｑ１５およびＫ１６に対し、それぞれ７６％、１０％、１０％、３２％である。これは、例えば、遊離ペプチド中のＨ１４およびＱ１５が、環状様の立体配座をとることは希であることを示す。
【００８７】
表５は、残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋのラマチャンドラン主鎖ファイ／プサイ角分布のピーク値を示す。第１列には、検討した残基であり、この残基は括弧内に示される２つの角ファイおよびプサイを示す。第２列には、直鎖状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）におけるそれぞれの残基のラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されており、第３列には、環状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）におけるそれぞれの残基のラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されており、最終列には、線維構造２Ｍ４Ｊにおけるそれぞれの残基のラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されている。図５を参照されたい。
【００８８】
表６は、図９に示す、直鎖状、環状および線維（２Ｍ４Ｊ）型のペプチドの間のＲＭＳＤクラスタリングの重なり合いパーセンテージを示す。
【００８９】
表７は、環状、直鎖状、および線維アンサンブルの重心立体配座における、残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋの主鎖および側鎖二面角の値である。
【００９０】
表８は、選択した組織培養上清クローンの結合特性を示す。
【００９１】
表９は、選択した抗体の結合特性のまとめを示す。
【００９２】
表１０は、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体のオリゴマー結合−モノマー結合を示す。
【００９３】
表１１は、ホルマリン固定組織で試験した抗体の特性を示す。
【００９４】
表１２は、例示的毒性試験である。
【００９５】
表１３は、ＣＤＲ配列を示す。
【００９６】
表１４は、重鎖および軽鎖の可変配列を示す。
【００９７】
表１５は、Ａベータ配列の表である。
【００９８】
表１６は、Ａベータ完全長配列を示す。
【００９９】
本開示の詳細な説明
本明細書では、アルツハイマー病に関連するオリゴマー種を含めたＡベータの毒性オリゴマー種内で優先的に接触可能なエピトープを標的とし得る抗体、免疫療法組成物および方法が提供される。Ａベータのオリゴマー種内での抗体結合に特異的かつ／または選択的に接触可能であり得るＡベータの領域が特定された。
【０１００】
本明細書で示されるように、モノマーおよび／または線維上に存在しない、またはわずかに存在するＡベータペプチド上の標的を特定することにより、オリゴマー特異的抗体またはオリゴマー選択的抗体の作製を達成した。オリゴマー特異的エピトープは、モノマーまたは線維の対応するセグメントと一次配列が異なっている必要はないが、オリゴマーにおいて立体配座的に際立ったものであり得る。つまり、これらは、オリゴマー内で、主鎖および／または側鎖の配向の点でモノマーおよび／または線維にはみられない（または好ましくない）と考えられる際立った立体配座を示す。
【０１０１】
直鎖状ペプチド領域に対して産生させた抗体は、オリゴマーに対して選択的ではない傾向があり、このため、モノマーとも結合する。
【０１０２】
本明細書に記載されるように、オリゴマー型のＡベータに選択的になり得る抗体を開発するため、本発明者らは、線維において破壊されやすく、加えて、オリゴマーの表面に露出し得るＡベータ配列の領域を特定することを目指した。
【０１０３】
実施例に記載されるように、本発明者らは、線維において破壊されやすいことが予測される領域を特定した。本発明者らは、その特定された標的を含む環状化合物が直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブルに対して別の立体配座の基準、例えば、異なる曲率プロファイル対残基インデックス、より大きい露出表面積、および／または平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によるアライメントが容易ではないことなどを満たすようこれを設計した。
【０１０４】
実施例で示すように、配列番号２の環状化合物を含む免疫原を使用して、モノクローナル抗体を産生した。実施例で示すように、標的領域を含む環状ペプチドを用いて、同じ配列の直鎖状ペプチド（例えば、対応する直鎖状配列）と比較して環状ペプチドと優先的に結合する抗体を産生させることができた。実験結果が記載されており、合成モノマーと比較して合成オリゴマーと選択的に結合し、対照ＣＳＦよりもＡＤ患者のＣＳＦと優先的に結合し、かつ／または対照の可溶性脳抽出物よりもＡＤ患者の可溶性脳抽出物と優先的に結合する、エピトープ特異的かつ立体配座選択的な抗体が特定される。さらに、ＡＤ脳組織の染色では、斑との結合を全くまたはほとんど示さない抗体が特定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、抗体がＡβオリゴマーの伝播および凝集を阻害することがわかった。
【０１０５】
Ｉ．定義
本明細書で使用される「Ａベータ（Ａ−ｂｅｔａ）」という用語は、代替的に「アミロイドベータ」、「アミロイドβ」、Ａベータ（Ａｂｅｔａ）、Ａベータ（Ａ−ｂｅｔａ）または「Ａβ」と呼ばれ得る。アミロイドベータは、３６〜４３個のアミノ酸よりなるペプチドであり、あらゆる種のあらゆる野生型および変異型、特にヒトＡベータを包含する。Ａベータ４０は４０アミノ酸型を指し、Ａベータ４２は４２アミノ酸型を指すなど。ヒト野生型Ａベータ４２のアミノ酸配列は配列番号３２で示される。
【０１０６】
本明細書で使用される「Ａベータモノマー」という用語は、Ａベータ（例えば、１〜４０、１〜４２、１〜４３）ペプチドの個々のサブユニット型のいずれかを指す。
【０１０７】
本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、本明細書では、複数（例えば、少なくとも２つ）のＡベータモノマーが非共有結合によって、約１００個未満またはより通常には約５０個未満のモノマーからなり、立体配座に柔軟性があり、部分的に規則的である三次元の小球に凝集したＡベータサブユニットのいずれか複数のものを指す。例えば、オリゴマーは、３個、４個、５個またはそれ以上のモノマーを含み得る。本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、合成Ａベータオリゴマーおよび／または天然Ａベータオリゴマーの両方を包含する。「天然Ａベータオリゴマー」は、ｉｎｖｉｖｏで、例えばＡＤを有する対象の脳およびＣＳＦ内で形成されるＡベータオリゴマーを指す。
【０１０８】
本明細書で使用される「Ａベータ線維」という用語は、電子顕微鏡下で原繊維構造を示す個々のＡベータペプチドが非共有結合により会合した集合体を含む分子構造を指す。原繊維構造は通常、「クロスベータ」構造であり、理論上、多量体の大きさに上限はなく、線維は数千個または何千個ものモノマーを含み得る。線維は数千個単位で凝集し、ＡＤに特徴的な主な病理学的形態の１つである老人斑を形成し得る。
【０１０９】
「ＨＨＱＫ」という用語は、配列番号１で示されるヒスチジン、ヒスチジン、グルタミンおよびリシンというアミノ酸配列を意味する。同様に、ＨＱＫ、ＨＨＱ、ＶＨＨＱ（配列番号５）、ＶＨＨＱＫＬ（配列番号６）、ＨＨＱＫＬ（配列番号７）、ＨＨＱＫＬＶ（配列番号８）、ＨＱＫＬ（配列番号２０）は、１文字アミノ酸コードによって識別されるアミノ酸配列を指す。文脈によっては、アミノ酸配列と記載される場合、それはＡベータまたは単離ペプチド内の配列、例えば環状化合物のアミノ酸配列などを指すことがある。
【０１１０】
本明細書で使用される「直鎖状化合物、モノマーおよび／または線維中の１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および／または１６Ｋによって占められるものとは別の立体配座」という用語は、溶媒露出度、エントロピー、曲率（例えば、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含むペプチドにおいて、例えば、実施例に記載の環状ペプチドで測定して）、ＲＭＳＤ構造アライメントおよび１つもしくは複数の主鎖二面角または側鎖二面角から選択される１つまたは複数の立体配座特性が、例えば、ＰＤＢ  ２Ｍ４Ｊに示される、および図１〜１０および／または表で示される、対応するＡベータ直鎖状ペプチド、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維構造中の１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑおよび／または１６Ｋの前記特性と比較して、異なることを意味する。さらに、本明細書で使用される「直鎖状ペプチド中の１５Ｑおよび／または１６Ｋによって占められるものとは別の立体配座」という用語は、溶媒露出度、エントロピー、曲率（例えば、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含むペプチドにおいて、例えば、実施例に記載の環状ペプチドで測定して）、ＲＭＳＤ構造アライメントおよび１つもしくは複数の主鎖二面角または側鎖二面角から選択される１つまたは複数の立体配座特性が、対応する直鎖状Ａベータペプチド中の１５Ｑおよび／または１６ＫまたはＨＨＱＫ（配列番号１）の前記特性と比較して、異なることを意味する。環状ペプチドアンサンブル中のエピトープの直鎖状または線維アンサンブルとは異なる曲率プロファイルは、図２により、環状ペプチド中で直鎖状ペプチドまたは線維とは実質的に異なる曲率を示す、特に残基Ｑ１５により立体配座選択性が付与され得ることを意味する。残基Ｋ１６はまた、直鎖状ペプチドとは実質的に異なる環状ペプチドの曲率を示し、線維により類似した曲率をとる。線維中の曲率は、それから明確に減少しており、また、環状または直鎖状ペプチド：ＨＨＱＫ（配列番号１）は線維中では、相対的に広がっている。図３によると、残基１３Ｈの場合、二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮおよびＯ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢにより、直鎖状および環状ペプチド両方のＨＨＱＫ（配列番号１）と、線維中の対応する二面角とが明確に区別される。残基１４Ｈの場合は、二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮおよびＯ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢにより、環状二面角分布が、直鎖状または線維アンサンブル中の対応する分布から明確に区別される。同様に、残基１５Ｑの場合は、二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮおよびＯ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢにより、環状二面角分布が、直鎖状または線維アンサンブル中の対応する分布から明確に区別される。残基１６Ｋ場合は、二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢにより、環状ペプチドが、直鎖状または線維アンサンブルから明確に区別され、二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮにより、環状および直鎖状ペプチドの両方が、線維から明確に区別される。図５Ｂによると、１３Ｈの主鎖ラマチャンドラン角度φおよびψにより、直鎖状および環状ペプチドが線維から明確に区別されるが、直鎖状および環状ペプチド相互には区別されない。１４Ｈの場合には、図５Ｃは、環状ペプチドのラマチャンドラン角度φおよびψは両方共、直鎖状または線維アンサンブルとは異なることを示す。同様に、１５Ｑおよび１６Ｋの場合は、図５Ｄおよび��は、環状ペプチドのラマチャンドラン角度φおよびψは、直鎖状または線維アンサンブル中の角度とは異なることを示す。図４Ｆ、Ｇは、環状ペプチドが直鎖状ペプチドより拘束されているが、線維より拘束が少ないことを示す。図４Ｆは、１５４Ｑおよび１６Ｋが、環状ペプチドアンサンブル中で、それらが直鎖状ペプチド中にある場合より拘束されていることを示し、上記の二面角と共に、モノマーが環状ペプチドと一致する立体配座をまれにしかとらないことを示唆する。環状アンサンブル中では直鎖状アンサンブル中より強く拘束されているにもかかわらず、環状ペプチドが直鎖状ペプチドより幾分多く溶媒曝露されており（図６Ｂ）、このことから、より抗原性の強い表面であることを示している。直接構造的アライメント（図７、８、９）により、環状ペプチドは、線維における直鎖状ペプチドまたはＨＨＱＫ（配列番号１）とは異なる構造的アンサンブルを示す。
【０１１１】
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および修飾されたＬ−アミノ酸をすべて包含する。アミノ酸の原子は様々な同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素に代わるジュウテリウム、窒素１４に代わる窒素１５および炭素１２に代わる炭素１３ならびにその他の同様の変化を含み得る。
【０１１２】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体ならびに例えば一本鎖Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメントまたは一本鎖Ｆｖフラグメントを含めた上記の抗体のフラグメントを包含するものとする。抗体は、組換え供給源由来のものおよび／またはウサギ、ラマ、サメなどの動物で産生されたものであり得る。また、トランスジェニック動物で産生され得る、もしくは生化学技術を用いて作製され得る、またはファージライブラリーなどのライブラリーから単離され得るヒト抗体も包含される。ヒト化抗体またはその他のキメラ抗体は、１種類または２種類以上のアイソタイプもしくはクラスまたは種由来の配列を含み得る。
【０１１３】
「単離された抗体」という語句は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生され、抗体を産生した供給源、例えば、動物、ハイブリドーマまたはその他の細胞系（抗体を産生する組換え昆虫、酵母または細菌細胞など）から取り出された抗体を指す。単離された抗体は任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度であることを意味する。
【０１１４】
本明細書で使用される「結合フラグメント」という用語は、抗体または抗体鎖の一部または一部分であって、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含み、抗原と結合する、またはインタクトの抗体と競合するものを指す。例示的結合フラグメントとしては、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体が挙げられる。フラグメントは、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖の化学処理または酵素処理によって得ることができる。フラグメントは、組換え手段によっても得ることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド架橋を還元する処理を実施して、Ｆａｂ’フラグメントを作製することができる。パパイン消化によりＦａｂフラグメントの形成を引き起こすことができる。また、組換え発現技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントならびにその他のフラグメントを構築することもできる。
【０１１５】
当該技術分野で認識されている「ＩＭＧＴ番号付け」または「ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース番号付け」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基より可変性のある（すなわち、超可変性の）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指す。
【０１１６】
ある抗体がＨＨＱＫ（配列番号１）などの特定残基内のエピトープに結合すると記載される場合、それは、その抗体が特定の残基またはその一部、例えば少なくとも１個または少なくとも２個の残基を含むペプチドまたはポリペプチドと最小限の親和性で特異的に結合し、例えばアイソタイプ対照抗体より大きい無関係な配列にも無関係な配列の空間的方位にも結合しないことを意味する。このような抗体は必ずしもＨＨＱＫ（配列番号１）（または関連エピトープ）の各残基と接触するわけではなく、前記エピトープ内の単一のアミノ酸置換またはアミノ酸欠失のどれもが、必ずしも結合親和性に大きな影響を及ぼすというわけではなく、および／または等しく影響を及ぼすというわけではない。
【０１１７】
ある抗体がエピトープ、例えばＨＨＱＫ（配列番号１）などの立体配座エピトープなどに選択的に結合すると記載される場合、それは、その抗体が特定の残基またはその一部を含む１つまたは複数の特定の立体配座に、別の立体配座の前記残基と結合する場合より大きい親和性で優先的に結合することを意味する。例えば、ある抗体が対応する直鎖状ペプチドよりもＨＨＱＫまたは関連エピトープを含むシクロペプチドと選択的に結合すると記載される場合、その抗体は、直鎖状ペプチドと結合する場合の少なくとも２倍の親和性でそのシクロペプチドと結合する。
【０１１８】
本明細書で使用される「立体配座エピトープ」という用語は、アミノ酸配列が特定の三次元構造を有し、対応する直鎖状ペプチド中に存在しない、または存在する可能性が低い三次元構造の少なくとも一面がコグネイト抗体によって特異的かつ／または選択的に認識される、エピトープを指す。エピトープ、例えばＨＨＱＫ（配列番号１）は、オリゴマーＡベータの分子表面に一部もしくは全部が露出しているもの、およびモノマー斑Ａベータもしくは線維斑Ａベータでは一部もしくは全部が抗体に認識されにくいものであり得る。立体配座特異的エピトープと特異的に結合する抗体は、その立体配座特異的エピトープの１個または複数のアミノ酸の空間的配置を認識する。例えば、ＨＨＱＫ（配列番号１）立体配座エピトープは、抗体によって選択的に、例えば直鎖状ＨＨＱＫ（配列番号１）を用いて産生された抗体と比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍もしくは１０００倍またはそれを超える大きな抗体選択性により認識される、ＨＨＱＫ（配列番号１）のエピトープを意味する。
【０１１９】
本明細書で使用される「関連エピトープ」という用語は、抗原性で、場合により、ＨＱＫを含む配列であるＨＨＱＫ（配列番号１）の少なくとも２個の残基、および／またはＡベータのＮ末端の１個、２個もしくは３個のアミノ酸残基、および／またはＨＨＱＫ（配列番号１）の少なくとも２個の残基のＣ末端の１個の残基を含む配列を意味する。例えば、本明細書では、小領域ＨＱＫを共有するＨＨＱＫ（配列番号１）およびＨＱＫＬ（配列番号２０）がＡベータ線維において不規則になりやすい領域として特定されたことが示される。したがって、ＨＱＫおよびＨＱＫＬは関連エピトープである。例示的関連エピトープとしては、表１５（１）に示される配列を挙げることができる。関連エピトープは、例えば、６個のＡベータ残基までである。
【０１２０】
本明細書でアミノ酸配列内のアミノ酸もしくはその側鎖（例えば、ＨＨＱＫ（配列番号１）の１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑおよび／または１６Ｋ）またはより大きいポリペプチド内のアミノ酸配列に関して使用される「拘束された立体配座」という用語は、アミノ酸二面角の回転運動性が対応する直鎖状ペプチド配列またはより大きいポリペプチドにおける配列に比べて低下し、それにより、許容される立体配座の数が少なくなっていることを意味する。このことは、例えば、主鎖および側鎖二面角自由度のアンサンブルのエントロピー減少を見出すことによって定量化することが可能であり、それぞれのアミノ酸について、直鎖状アンサンブルに対して、環状アンサンブルおよび線維アンサンブルのエントロピー減少が図４Ｇでプロットされている。例えば、配列内の側鎖の立体配座自由度が直鎖状ペプチドより低ければ、エントロピーが減少することになる。直鎖状および環状ペプチドアンサンブル両方における、線維アンサンブルからのエントロピー増加が、それぞれのアミノ酸中の個々独立の二面角に対して、図４Ａ〜Ｄでプロットされている。直鎖状および環状ペプチドアンサンブル両方における、線維アンサンブルからのエントロピー増加が、ＨＨＱＫ（配列番号１）中のそれぞれのアミノ酸に対し、図４Ｆでプロットされている。直鎖状ペプチドからの立体配座の制約があれば、この抗原に対して特異的に産生された抗体の立体配座選択性が増大するものと思われる。アミノ酸配列ＨＨＱＫ（配列番号１）は、線維構造中で最も拘束されており、それは立体配座の自由度が環状ペプチドまたはモノマーより小さく、また、それは直鎖状ペプチドアンサンブル中の場合より、環状ペプチドアンサンブル中でより大きく拘束されている。図４Ｆは、Ｑ１５およびＫ１６（および程度は少ないがＨ１３も）環状ペプチドアンサンブル中では、平衡直鎖状ペプチドアンサンブル中のそれらより小さいエントロピーを有するが、環状ペプチドアンサンブル中では、それらは平衡線維アンサンブル中より大きいエントロピーを有することを示す。本明細書で使用される「より拘束された立体配座」という用語は、１つまたは複数の二面角の二面角分布（許容される二面角のアンサンブル）が、例えば、アミノ酸、例えばＨ、Ｑおよび／またはＫのエントロピーによる判定（例えば、立体配座の拘束が強いほどエントロピーが低くなる）で、比較立体配座より少なくとも１０％強く拘束されていることも意味する。具体的には、平均エントロピー変化により測定した、全体的により強く拘束された環状立体配座アンサンブル中の直鎖状および環状ペプチドのＨＨＱＫ（配列番号１）のより大きなエントロピーに対するエントロピーのパーセント減少率、［｜ΔＳ（環状）−ΔＳ（直鎖状）／（ｍａｘ（｜ΔＳ（環状）｜、｜ΔＳ（直鎖状）｜）］は、非拘束立体配座アンサンブルから平均で１０％超、２０％超、３０％超または４０％超減少している。上記式中のエントロピーΔＳは、線維に対するエントロピー、例えば、ΔＳ（環状）＝Ｓ（環状）−Ｓ（線維）として得られる。具体的には、図４Ｆにプロットしたデータによるエントロピーのパーセント減少率は、残基Ｈ、Ｈ、Ｑ、およびＫに対し、それぞれ８５％、６５％、５３％、および４３％である。直鎖状から環状ペプチドの全エントロピー差異（線維エントロピーに対する）は、平均［｜ΔＳ（環状）−ΔＳ（直鎖状）｜／）（ｍａｘ（｜ΔＳ（環状）｜、｜ΔＳ（直鎖状）｜）］＝６１％である。
【０１２１】
本明細書で抗体に関して使用される「斑との結合が全くまたはほとんどみられない」または「斑と結合しない、またはほとんど結合しない」という用語は、抗体が（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕの）免疫組織化学法で典型的な斑の染色形態を示さず、染色のレベルが、ＩｇＧ陰性の（例えば、無関係な）アイソタイプ対照でみられるレベルと同等である、またはその２倍以下であることを意味する。
【０１２２】
「単離ペプチド」という用語は、例えば組換え技術または合成技術によって作製され、ペプチドを作製した組換え細胞または残存ペプチド合成反応物などの供給源から取り出されたペプチドを指す。単離ペプチドは、任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度および任意選択で医薬品等級の純度であることを意味する。
【０１２３】
本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、本明細書に記載されるペプチドまたは化合物内に付加または導入することができるペプチド配列（ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグまたはＮＥタグなど）、蛍光タンパク質などの部分であって、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することが可能な部分を指す。例えば、標識は、（例えば、ＰＥＴ撮像に使用する）放射線不透性の陽電子放出放射性核種もしくは放射性同位元素、例えば３Ｈ、１３Ｎ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど；蛍光化合物（フルオロフォア）もしくは化学発光化合物（発色団）、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミンもしくはルシフェリンなど；酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなど；造影剤；または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば二次抗体を用いて間接的に検出可能なものであり得る。
【０１２４】
通常使用される「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に認識される抗原の抗体結合部位、通常、ポリペプチドセグメントを意味する。本明細書で使用される「エピトープ」はまた、記載される集団座標法を用いてＡベータ上で特定され得るアミノ酸配列またはその一部を指すこともある。例えば、特定された標的領域ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状化合物に対応する単離ペプチドに対して作製した抗体は、前記エピトープ配列の一部または全部を認識する。エピトープが抗体による結合に接触可能な場合、それは本明細書において「接触可能な」ものである。
【０１２５】
本明細書で使用される「より高い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚより強く（Ｋｏｎ）かつ／または小さい解離定数（Ｋｏｆｆ）で標的Ｙと結合する場合の相対的抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより高い親和性を有する。これと同様に、本明細書の「より低い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚより弱くかつ／または大きい解離定数で標的Ｙと結合する場合の相対的抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより低い親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性はＫＡ＝１／ＫＤで表すことができ、式中、ＫＤ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆである。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの値は、表面プラズモン共鳴技術を用いて、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ−１）（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて測定することができる。環状化合物、例えば任意選択の環状ペプチド中に提示される立体配座に選択的な抗体は、環状化合物（例えば、環状ペプチド）に対する親和性が直鎖状形態の対応する配列（例えば、非環化配列）より大きい。
【０１２６】
同じく本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、抗体の産生を誘発し、免疫原の免疫原性部分に対するＴ細胞およびその他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
【０１２７】
環状化合物に関する「対応する直鎖状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列もしくは化学的部分を含む、またはこれよりなるが、直鎖状（すなわち、非環状）形態であり、例えば溶液中でみられ得る直鎖状ペプチドの特性を有する、化合物、場合により、ペプチドを指す。例えば、対応する直鎖状化合物は、環化されていない合成ペプチドであり得る。
【０１２８】
ある抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」は、その抗体がエピトープ配列を認識し、最小限の親和性でその標的抗原と結合することを意味する。例えば、多価抗体は、その標的と少なくとも１ｅ−６、少なくとも１ｅ−７、少なくとも１ｅ−８、少なくとも１ｅ−９または少なくとも１ｅ−１０のＫＤで結合する。少なくとも１ｅ−８より高い親和性が好ましいものであり得る。可変ドメインを１つ含むＦａｂフラグメントなどの抗原結合フラグメントは、非フラグメント化抗体との多価相互作用の１０倍または１００倍低い親和性でその標的と結合する。
【０１２９】
ある形態のＡベータ（例えば、線維、モノマーまたはオリゴマー）または環状化合物と選択的に結合する抗体に関して本明細書で使用される「選択的に結合する」という用語は、その抗体が上記の形態と少なくとも２倍、少なくとも３倍または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍もしくは少なくとも１０００倍またはそれ以上の親和性で結合することを意味する。したがって、特定の立体配座（例えば、オリゴマー）に対してより選択的な抗体は、別の形態のペプチドおよび／または直鎖状ペプチドの少なくとも２倍などの親和性で特定の形態のＡベータと優先的に結合する。
【０１３０】
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、ＨＨＱＫ（配列番号１）エピトープペプチドを含むペプチドと共有結合して、任意選択でＨＨＱＫ（配列番号１）ペプチドのＮ末端およびＣ末端と結合して、環状化合物を生じさせることができる化学的部分を指す。リンカーは、スペーサーおよび／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含み得る。リンカーは、官能化可能な部分を介して担体タンパク質またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原強化物質と結合することができる。
【０１３１】
本明細書で使用される「スペーサー」という用語は、ペプチドのＮ末端およびＣ末端と直接的または間接的に共有結合して、長さがペプチド自体より長い環状化合物を生じさせることができる、好ましくは非免疫原性または低免疫原性の任意の化学的部分を意味し、例えば、スペーサーは、ＨＨＱＫ（配列番号１）よりなるペプチドのＮ末端およびＣ末端と結合して、主鎖の長さがＨＨＱＫ（配列番号１）配列自体より長い環状化合物を生じさせることができる。つまり、（例えば、３アミノ酸残基の）スペーサーを有するペプチドが環化されると、スペーサーのないペプチドより大きい閉環が生じる。スペーサーとしては、限定されないが、Ｇリピート、ＡリピートまたはＰＥＧリピートなどの非免疫原性部分、例えば、ペプチドと組み合わせた、ＧＨＨＱＫＧ（配列番号９）、ＨＨＱＫＧ（配列番号１０）、ＧＨＨＱＫ（配列番号１１）などが挙げられる。スペーサーは、１個もしくは複数のシステイン（Ｃ）残基などの１つもしくは複数の官能化部分を含む、またはこれと結合しているものであり得、官能化部分はスペーサー内に散在している、またはスペーサーの一端または両端と共有結合しているものであり得る。Ｃ残基などの官能化可能な部分がスペーサーの１つまたは複数の末端と共有結合している場合、スペーサーはペプチドと間接的に共有結合している。スペーサーはまた、ビオチン分子がアミノ酸残基内に導入されている場合のように、スペーサー残基内に官能化可能な部分を含み得る。
【０１３２】
本明細書で使用される「官能化可能な部分」という用語は、「官能基」を有する化学物質を指し、本明細書で使用される「官能基」は、別の原子団または単一原子（いわゆる「相補性官能基」）と反応して、２つの原子団または原子の間で化学的相互作用を形成する、原子団または単一原子を指す。システインの場合、官能基は、反応してジスルフィド結合を形成することができる−ＳＨであり得る。したがって、リンカーは、例えばＣＣＣであり得る。別の原子団との反応は、共有結合または例えば、Ｋｄが約１ｅ−１４になり得るビオチン−ストレプトアビジン結合の場合のような強い非共有結合であり得る。本明細書で使用される強い非共有結合は、Ｋｄが少なくとも１ｅ−９、少なくとも１ｅ−１０、少なくとも１ｅ−１１、少なくとも１ｅ−１２、少なくとも１ｅ−１３または少なくとも１ｅ−１４の相互作用を意味する。
【０１３３】
タンパク質および／またはその他の物質を免疫原性に役立つ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のプローブとして作用するよう環状化合物に機能化（例えば、結合）させ得る。この目的には、反応すること（例えば、共有結合または共有結合ではない強い結合を形成すること）が可能な任意の官能化可能な部分を使用し得る。ある特定の実施形態では、官能化可能な部分は、目的のタンパク質上にある対形成していないシステインと反応してジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり、目的のタンパク質は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫ブロットもしくは免疫組織化学アッセイに使用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質であり得る。
【０１３４】
本明細書で使用される「〜と反応する」という用語は一般に、電子の流れまたは静電荷の移動が起こることにより化学的相互作用が形成されることを意味する。
【０１３５】
本明細書で使用される「動物」または「対象」という用語は、任意選択でヒトを含む、または含まない哺乳動物を含めた動物界のあらゆるメンバーを包含する。
【０１３６】
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質の所望の特性を打ち消すことなく、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換わるアミノ酸置換のことである。適切な保存的アミノ酸置換は、疎水性、極性およびＲ鎖長が互いに類似したアミノ酸同士を置き換えることにより実施することができる。保存的アミノ酸置換の例としては以下のものが挙げられる。
【表１】
2019505166.tif 000004
【０１３７】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、配列を最適な比較目的で整列させる（例えば、第二のアミノ酸配列または核酸配列との最適アライメントのために第一のアミノ酸配列または核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列内のある位置が第二の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子は上記の位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、その配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重複位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて実施することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例には、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５８７７で改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムがある。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムにはそのようなアルゴリズムが組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターを例えばスコア＝１００、ワード長＝１２に設定してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施し、本願の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターを例えばスコア−５０、ワード長＝３に設定してＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されているＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（同文献）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメーターを用いることができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照されたい）。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例には、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムがある。ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いることができる。ギャップを許容するかしないかを問わず、上記のものと類似した技術を用いて２つの配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性を算出する際には通常、完全一致のみをカウントする。
【０１３８】
抗体に関しては、抗体配列をＩＭＧＴまたはその他のもの（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けの慣例）により最大限に整列させたとき、パーセンテージ配列同一性を決定することができる。アライメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較している場合、対象抗体領域と参照抗体領域の間のパーセンテージ配列同一性は、ギャップをカウントせず、対象抗体領域および参照抗体領域の両方で同じアミノ酸によって占められている位置の数を、整列させた２つの領域の位置の総数で除したものに１００を乗じてパーセンテージに変換したものとする。
【０１３９】
本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、天然の塩基、糖および糖間（主鎖）結合よりなるヌクレオシドモノマーまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、非天然のモノマーまたはその一部分を含む修飾または置換された配列を包含する。本願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含めた天然の塩基を包含し得る。配列はまた、修飾塩基を含み得る。このような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、ミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は二本鎖または一本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補的核酸配列およびコドン最適化等価物または同義コドン等価物を包含する。本明細書で使用される「単離核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術により作製された場合は実質的に細胞物質も培地も含まない核酸、あるいは化学的に合成された場合は化学的前駆体またはその他の化学物質を指す。単離核酸はまた、その核酸が由来する核酸に天然の状態で隣接する配列（すなわち、核酸の５’側および３’側に位置する配列）を実質的に含まない。
【０１４０】
「作動可能に連結されている」は、核酸の発現が可能なようにその核酸が制御配列を連結されていることを意味するものとする。適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。適切な制御配列の選択は、選択する宿主細胞によって決まり、当業者により容易に達成され得る。このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。
【０１４１】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、核酸分子を例えば、原核細胞および／または真核細胞内に導入し、かつ／あるいはゲノム内に組み込むことを可能にする前記核酸分子の任意の中間運搬体を含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルス系ベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどがこれに包含される。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は一般に、通常は環状ＤＮＡ二本鎖であり、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物を指す。
【０１４２】
「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、溶液中の２つの相補的核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件を選択することを意味する。ハイブリダイゼーションは核酸配列分子の全部または一部に起こり得る。ハイブリダイズする部分は通常、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチドの長さである。当業者には、核酸の二本鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝液中でのナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴｍ（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）またはこれと類似した方程式）によって決まることが認識されよう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメーターはナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子に類似しているが同一ではない分子を特定するには、１％のミスマッチによりＴｍが約１℃低下するものと考えられ、例えば、同一性が９５％を上回る核酸分子を探索するのであれば、最終洗浄温度は約５℃低下することになる。当業者は、これらの考慮事項に基づき、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することが可能であろう。好ましい実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を選択する。例として、以下の条件を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施し得る：上の方程式に基づき、Ｔｍを−５℃とし、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳで、ハイブリダイゼーションを実施し、次いで、６０℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４２℃、３×ＳＳＣでの洗浄段階が含まれる。ただし、上のものに代わる緩衝液、塩および温度を用いても同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１にみることができる。
【０１４３】
本明細書で使用され、当該技術分野でも十分に理解されている「治療すること」または「治療」という用語は、臨床結果を含めた有益な結果または所望の結果を得る方法を意味する。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、特に限定されないが、検出可能なものであるか検出不可能なものであるかを問わず、１つまたは複数の症状または病態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の拡散の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または緩和、疾患再発の減少および寛解（部分寛解または完全寛解を問わない）が挙げられる。「治療すること」および「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間が長くなることを意味し得る。本明細書で使用される「治療すること」および「治療」はまた、予防的治療を包含する。例えば、初期段階のＡＤを有する対象を本明細書に記載される化合物、抗体、免疫原、核酸または組成物で治療して進行を予防することができる。
【０１４４】
本明細書で使用される「投与される」という用語は、細胞または対象への治療有効量の開示の化合物または組成物の投与を意味する。
【０１４５】
本明細書で使用される「有効量」という語句は、所望の結果を得るのに必要な投与回数および期間で効果が得られる量を意味する。対象に投与する場合、有効量は対象の病状、年齢、性別、体重などの因子に応じて異なり得る。最適な治療反応を得るために投与レジメンを調整し得る。
【０１４６】
「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤または補形剤が、製剤の他の成分と適合性があり、その被投与者に対して実質的に有害でないことを意味する。
【０１４７】
１つまたは複数の記載される要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇまたはｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅまたはｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、抗体を単独で、または他の成分とともに含有し得る。
【０１４８】
本開示の範囲を理解するにあたっては、本明細書で使用される「〜よりなる」という用語またはその派生語は、記載される特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を明記し、また他の記載されていない特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を排除する、オープンエンドな用語であるものとする。
【０１４９】
本明細書で端点により数値範囲が記載されている場合、その範囲内に含まれる数および端数がいずれも含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５が含まれる）。また、数およびその端数はすべて「約」という用語によって修飾されるものと考えられることを理解するべきである。さらに、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容からそうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象を包含することを理解するべきである。「約」という用語は、言及されている数のプラスまたはマイナス０．１〜５０％、５〜５０％または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
【０１５０】
さらに、当業者であれば理解するように、特定のセクションに記載される定義および実施形態は、本明細書に記載される他の実施形態のうちそれらが適しているものに適用可能であるものとする。例えば、以下の節では、本発明の様々な態様がさらに詳細に定義される。そのように定義された各態様は、そうでないことが明記されない限り、１つまたは複数の他の任意の態様と組み合わせ得る。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴と、好ましいまたは有利であると示されている他の任意の特徴とを組み合わせ得る。
【０１５１】
冠詞の単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数の指示物を包含する。例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、複数の化合物をその混合物も含め包含し得る。
【０１５２】
ＩＩＩ．エピトープおよび結合タンパク質
本発明者らは、Ａベータ中にＨＱＫを含むエピトープ領域を特定した。これには、Ａベータペプチド上のアミノ酸１３〜１６の位置のＨＨＱＫ（配列番号１）およびＡベータペプチド上のアミノ酸１４〜１７の位置のＨＱＫＬ（配列番号２０）が含まれる。本発明者らはさらに、そのエピトープまたはその一部が立体配座エピトープであり得ること、およびＨＱＫ、ＨＨＱＫ（配列番号１）および／またはＨＱＫＬ（配列番号２０）またはその一部がＡベータのオリゴマー種中の抗体結合に選択的に接触可能であり得ることを明らかにした。
【０１５３】
理論に束縛されることを望むものではないが、線維は、オリゴマー化を触媒する傾向のある相互作用部位を示し得る。このことは、正常な個体には存在しない選択的な線維表面が露出され、Ａベータモノマーとの異常な相互作用を起こすことが可能である場合にのみ起こり得る。低ｐＨ、炎症時に存在するオスモライトまたは酸化的損傷などの環境変化が線維の破壊を誘発し、より安定性の低い領域の露出を引き起こし得ると考えられる。その結果、これらの低安定性領域を予測し、そのような予測を用いて、上記の領域を標的とする抗体を合理的に設計することに関心が持たれている。線維内で破壊される可能性のある領域はまた、オリゴマー種内で露出する領域の有力な候補となり得る。
【０１５４】
不規則になりやすい隣接するタンパク質領域を予測するためのコンピュータに基づくシステムおよび方法が、２０１５年１１月９日に出願された米国特許出願第６２／２５３０４４号「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｂｉａｓｉｎｇ」、および２００９年１０月６日に出願された米国特許出願第１２／５７４，６３７号、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ  ＭＩＳＦＯＬＤＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＰＩＴＯＰＥＳ」に記載されている。これらの出願特許のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施例に記載されるように、この方法をＡベータに適用し、本明細書で示されるように、Ａベータオリゴマーにおいて特異的および／または選択的により接触可能なエピトープを特定した。
【０１５５】
実施例に記載されるように、環状ペプチドであるシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）は、モノマー種および／または線維種と比較したオリゴマーのエピトープの立体配座の差を捕捉し得る。例えば、環状７マーのシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）中のアミノ酸に対する溶媒接触表面積、曲率、Ｒ立体配座エントロピー、ＲＭＳＤ構造アライメントならびにアミノ酸の二面角分布は、線維、または直鎖状型のペプチドと大きく異なることが明らかになり、これはＡベータモノマーのモデルになり得る。このことは、環状化合物は、直鎖状の対応するペプチド、または線維のエピトープとは異なる立体配座エピトープを提供し得ることを示唆している。（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を含む免疫原を用いて産生された抗体は、直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）に比べて、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に選択的に結合し、また、モノマーＡベータおよびＡベータ線維斑と比較して、合成および／または天然のオリゴマーＡベータ種に選択的に結合した。さらに、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体によりＡベータ凝集のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの伝播を阻害することができた。さらに、毒性アッセイで示したように、（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体は、Ａベータオリゴマー神経細胞毒性を抑制した。
【０１５６】
ＩＩ．ＨＨＱＫ（配列番号１）「エピトープ」化合物
したがって、本開示は、アミノ酸ＨＨＱＫ（配列番号１）またはＨＱＫＬ（配列番号２０）またはＨＱＫなどのその一部よりなるＡベータ中の立体配座エピトープを特定するものであり、ＨＨＱＫ（配列番号１）はＡベータのアミノ酸残基１３〜１６に対応し、ＨＱＫＬ（配列番号２０）は、アミノ酸１４〜１７に対応する。実施例で示すように、ＨＨＱＫ（配列番号１）およびＨＱＫＬ（配列番号２０）がＡベータ線維において不規則になりやすい領域として特定された。残基ＨＨＱＫ（配列番号１）およびＨＱＫＶ（配列番号２０）は、集団座標法を用いた予測で明らかになった。残基ＨＨＱＫ（配列番号１）はまた、Ｐｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏモデルアルゴリズムを用いて明らかになった。
【０１５７】
一態様は、ＨＨＱＫ（配列番号１）、前述のいずれかの一部を含む関連エピトープ配列を含むまたはそれからなるＡベータペプチドを含む化合物を含み、ペプチドがＨＨＱＫ（配列番号１）の場合、ペプチドは、直鎖状ＨＨＱＫ（配列番号１）とは少なくとも１つの特徴が異なる立体配座中に存在する。一実施形態では、Ａベータペプチドは、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＶＨＨＱＫ（配列番号１２）、ＨＱＫＬ（配列番号２０）またはＨＨＱＫＬ（配列番号７）から選択される。エピトープＨＨＱＫＬ（配列番号７）、ＨＱＫＬ（配列番号２０）およびＶＨＨＱＫ（配列番号１２）は、本明細書においては、ＨＨＱＫ（配列番号１）および関連エピトープとしてひとまとめにして称されるエピトープに含まれる（およびそれらの配列は、ひとまとめにして関連エピトープ配列と称される）。一実施形態では、関連エピトープは、ＨＱＫＬ（配列番号２０）、ＨＱＫおよびＡベータのＨＱＫおよびＮ末端の１個、２個または３個のアミノ酸および／またはＨＱＫのＣ末端の１アミノ酸を含むエピトープを含むまたはそれらからなる。一実施形態では、Ａベータペプチドは、表１５（１）のＡベータ配列を含むまたはそれからなる。
【０１５８】
一実施形態では、化合物はシクロペプチドなどの環状化合物である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、Ａベータペプチドは、場合により、例えば、環状化合物に対し提示される立体配座ペプチドで、ＨＱＫまたはＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープを含み、ＨＨＱＫ（配列番号１）のＡベータＮ末端および／または１アミノ酸Ｃ末端側の１個、２個または３個の追加の残基、例えば、ＨＨＱＫＬ（配列番号７）またはＶＨＨＱＫＬ（配列番号６）を含むことができる。例えば、ＡベータのＨＨＱＫ（配列番号１）のＮ末端の３アミノ酸はＹＥＷであり、ＨＨＱＫ（配列番号１）のＣ末端の３アミノ酸はＬＶＦである。一実施形態では、Ａベータペプチドは、最大６個のＡベータ残基である。一実施形態では、Ａベータペプチドは、最大５個のＡベータ残基である。さらに別の実施形態では、Ａベータペプチド（例えば、環状化合物などの化合物中の）は４個のＡベータ残基で、場合により、ＨＨＱＫ（配列番号１）である。
【０１６０】
一実施形態では、化合物はリンカーをさらに含む。リンカーは、スペーサーおよび／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む。リンカーは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個のアミノ酸および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの同等に機能する分子ならびに／あるいはその組合せを含み得る。一実施形態では、スペーサーアミノ酸は、非免疫原性または低免疫原性のアミノ酸残基、例えばＧおよびＡなどから選択され、例えば、スペーサーは、ＧＧＧ、ＧＡＧ、Ｇ（ＰＥＧ）Ｇ、ＰＥＧ−ＰＥＧ（ＰＥＧ２とも呼ばれる）−ＧＧなどであり得る。１つまたは複数の官能化可能な部分、例えば官能基を有するアミノ酸は、例えば、化合物と、作用物質もしくは検出可能なタグ、ＢＳＡなどの担体またはＫＬＨなどの免疫原性増強物質とを結合させるために含まれ得る。
【０１６１】
一実施形態では、リンカーは、ＧＣ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＧＣ、ＧＣＧまたはＰＥＧ２−ＣＧを含む。
【０１６２】
一実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７個または８個のアミノ酸を含む。
【０１６３】
特定の実施形態では、環状化合物は、最大１２、１１、１０、９、８、または７残基、場合により、アミノ酸および／または等価物ユニット、例えば、ＰＥＧユニットまたはその他の類似の寸法の化学部分を有する。
【０１６４】
ＨＱＫまたはＨＨＱＫ（配列番号１）を含むＡベータペプチドが、Ａベータ中に認められる、ＨＨＱＫ（配列番号１）のＮ末端側および／またはＣ末端側にある追加の残基を１つ、２つまたは３つ含む実施形態では、環化化合物中のリンカーは、Ａベータ残基のＮ末端および／またはＣ末端と共有結合している（例えば、ペプチドがＶＨＨＱＫ（配列番号１２）である場合、リンカーＶ残基およびＫ残基と共有結合している）。同様に、ＡベータペプチドがＨＨＱＫ（配列番号１）である場合、リンカーは残基ＨおよびＫと共有結合し、ＡベータペプチドがＨＨＱＫＬ（配列番号７）である場合、リンカーは残基ＨおよびＬと共有結合している。
【０１６５】
化合物（またはリンカーもタンパク質性である化合物）のタンパク質性部分は、タンパク質化学でよく知られている固相合成または均質溶液中での合成などの技術を用いる化学合成により調製し得る。
【０１６６】
一実施形態では、化合物は、環状化合物であり、例えば、ＨＱＫまたはＨＨＱＫ（配列番号１）を含むペプチドは、環状化合物中に含まれる。
【０１６７】
本明細書で「環状ペプチド」と記載される場合、それは（例えば、リンカーが１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸である）完全にタンパク質性の化合物を指す。実施例で決定され環状ペプチドについて記載される特性を、非アミノ酸リンカー分子を含む他の化合物（例えば、他の環状化合物）に組み込み得ることが理解される。
【０１６８】
したがって、一態様は、ペプチドＨＨＱＫ（配列番号１）（またはＨＱＫなどのその一部）を含む環状化合物およびリンカーを提供し、リンカーは、直接的にまたは間接的にＨＱＫまたはＨＨＱＫ（配列番号１）を含むペプチドに共有結合し、場合により、少なくとも１個のＨ、Ｑおよび／またはＫ残基が、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチド中のＨ、ＱおよびＫ残基とは別の、Ａベータモノマーで現れ得るような立体配座であり、場合により、少なくともＨ、Ｑおよび／またはＫは、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチド中で占められる立体配座より拘束された立体配座であるか、または例えば、Ａベータモノマー中で現れ得るような、それとは別の立体配座である。
【０１６９】
Ａベータ配列を含む直鎖状ペプチドは直鎖状化合物に含まれ得る。ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む直鎖状化合物または直鎖状ペプチドは、一実施形態では、対応する直鎖状ペプチドである。別の実施形態では、直鎖状ペプチドは、例えば、Ａベータ残基１〜３５またはそれより小さいＡベータ残基１０〜２０、１１〜２０、１２〜２０、１３〜２０、１０〜１９、１０〜１８などの部分を含む直鎖状ペプチドを含めた、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む任意の長さのＡベータペプチドである。直鎖状ペプチドはまた、いくつかの実施形態では完全長のＡベータペプチドであり得る。
【０１７０】
一実施形態では、環状化合物は、ＨＨＱＫ（配列番号１）と最大６個のＡベータ残基（例えば、ＨＨＱＫ（配列番号１）のＮ末端および／またはＣ末端の１個または２個のアミノ酸）とを含むＡベータペプチドと、リンカーとを含み、リンカーが、ＡベータペプチドのペプチドＮ末端残基およびＣ末端残基と直接的または間接的に共有結合し、場合により、少なくともＨ、ＱまたはＫは、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチド中のＨ、Ｑ、またはＫ、および／または線維中のＨＨＱＫ（配列番号１）のＨ、ＱまたはＫの立体配座とはとは別の立体配座であり、場合により、少なくともＨ、ＱまたはＫは、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチド中で占められる立体配座より拘束された立体配座である。
【０１７１】
環状化合物を環化前に、Ａベータペプチド、任意選択でＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープを含むペプチドのＮ末端またはＣ末端と共有結合したリンカーを有する、直鎖状分子として合成することができる。あるいは、環化前に、リンカーの一部をＮ末端と共有結合させ、一部をＣ末端と共有結合させる。いずれの場合も、直鎖状化合物を例えば頭−尾環化（例えば、アミド結合環化）で環化する。
【０１７２】
一実施形態では、環状化合物は、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む、またはこれよりなるＡベータペプチドと、リンカーとを含み、リンカーが、ペプチドのＮ末端およびＣ末端（例えば、ペプチドがＨＨＱＫ（配列番号１）よりなる場合、Ｈ残基およびＫ残基）と結合している。一実施形態では、環状化合物中のＨ、Ｑおよび／またはＫ残基の少なくとも１個が、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチド中でＨ、Ｑおよび／またはＫ残基の少なくとも１個によって占められる立体配座とは別の立体配座である。
【０１７３】
一実施形態では、環状化合物中のＨ、Ｑおよび／またはＫ残基の少なくとも１個が、モノマーおよび／または線維中で残基、場合により、Ｈおよび／またはＱおよび／またはＫ残基によって占められる立体配座とは別の立体配座である。
【０１７４】
一実施形態では、環状化合物中のＨ、Ｑおよび／またはＫ残基の少なくとも１個が、モノマーおよび／または線維中の残基によって占められる立体配座とは別の立体配座である。
【０１７５】
一実施形態では、別の立体配座は拘束された立体配座である。
【０１７６】
一実施形態では、少なくともＫ、場合により、単独の、またはＱと組み合わされたＫは、ＨＨＱＫ（配列番号１）またはＨＱＫＬ（配列番号２０）を含む直鎖状ペプチド中で占められる立体配座とは別の立体配座である。
【０１７７】
例えば、別の立体配座は、残基Ｋ１６、または残基Ｑ１５において、直鎖状ペプチドおよび／または線維におけるペプチドの二面角とは異なる、１つまたは複数の異なった二面角を含み得る。
【０１７８】
一実施形態では、環状化合物は、環状化合物と直鎖状化合物（例えば、直鎖状ペプチド）との間で最小の平均側鎖／主鎖二面角差を含む。
【０１７９】
一実施形態では、環状化合物は、Ｈ、ＱおよびＫから選択される残基を含み、環状化合物における１つまたは複数の側鎖または主鎖二面角が、直鎖状または線維化合物における対応する二面角よりも、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、少なくとも１５０度、少なくとも１６０度、少なくとも１７０度、少なくとも１８０度、少なくとも１９０度、または少なくとも２００度異なる。
【０１８０】
図３に示されるように、環状ペプチドのＱ１５およびＫ１６の二面角分布は、直鎖状ペプチドまたは線維２Ｍ４Ｊにおける残基と比較して、大幅に異なる。例えば、表３は、シミュレートした直鎖状ペプチド、環状ペプチドおよび線維では、Ｑ１５の二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮの差は、環状と直鎖状との間では、最可能値として、約−８０度であり、環状と線維との間では約３６度であることを示す。一実施形態では、環状化合物は、直鎖状ペプチドおよび／または線維における対応する二面角よりも、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度であるＣ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮ二面角を含む、Ｑ残基を含む。同様に、Ｑ１５の二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢに対する環状と直鎖状ペプチドとの間の二面角の差は、最可能値として約２００度であり、環状と線維ペプチドの間では、約３５度である。したがって、一実施形態では、環状化合物は、直鎖状化合物における対応する二面角よりも、少なくとも３０度異なる、少なくとも４０度異なる、少なくとも５０度異なる、少なくとも６０度異なる、少なくとも７０度異なる、少なくとも８０度異なる、少なくとも９０度異なる、少なくとも１００度異なる、等々最大少なくとも１８０度異なるＯ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢ二面角を含む、Ｑを含む。Ｋ１６二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢに対する環状ペプチドと直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドと線維との間の最可能二面角の対応する差は、それぞれ２０５および４０度である。したがって、一実施形態では、環状化合物は、直鎖状ペプチドまたは線維における対応する二面角よりも、少なくとも５０度異なる、少なくとも６０度異なる、少なくとも７０度異なる、少なくとも８０度異なる、少なくとも９０度異なる、少なくとも１００度異なる、等々最大少なくとも２００度異なる二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢを含む、Ｋを含む。
【０１８１】
表５に示すラマチャンドラン角度のピーク値によると、残基Ｈ１４、Ｑ１５、およびＫ１６に対する、最可能ラマチャンドランφおよびψ値は、環状および直鎖状ペプチドの間で異なる。Ｈ１４の場合、環状分布のピーク値は、（−６５、−４５）度であり、一方、直鎖状および線維分布のピーク値は、それぞれ（−１４５、２０）および（−１１５、１１５）、（−１１５、１５）である。φ値間の差異Δφは、８０度および５０度であり、ψ間の差異Δψは、６５度、１６０度および６０度である。φ、ψ値は、直鎖状と環状ペプチドとの間、および線維と環状ペプチドとの間で大きく異なる。表５はまた、Ｑ１５およびＫ１６のφ、ψの差異を記載している。Ｑ１５の環状と直鎖状との間の差異Δφは、９５度であり、Ｑ１５の環状と直鎖状との間の差異Δψは、２００度であり、環状と線維との間では、差異は最大４５度である。Ｋ１６の場合、環状と直鎖状との間の差異Δψは、約１９０度であり、環状と線維との間の差異Δφは、約５５度である。
【０１８２】
一実施形態では、環状化合物は、直鎖状および／または線維化合物における対応するラマチャンドラン角度よりも、少なくとも３０度、少なくとも４０度異なる、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、少なくとも１５０度、少なくとも１６０度、少なくとも１７０度、少なくとも１８０度、少なくとも１９０度、または少なくとも２００度異なるラマチャンドラン主鎖角度を含むＱを含む。
【０１８３】
角度の差は、例えば正または負、（＋）または（−）であり得る。
【０１８４】
別の立体配座は別の主鎖配向を含み得る。例えば、環状エピトープが抗体に対して露出する主鎖配向は、直鎖型または線維型と比較して異なるものである。
【０１８５】
別の立体配座はまた、直鎖状ペプチドおよび／またはＡベータ線維と比較して、アミノ酸を中心とする曲率またはＨＨＱＫ（配列番号１）もしくは関連エピトープを含む環状化合物の曲率の増大または減少を含み得る。
【０１８６】
一実施形態では、別の立体配座ＨＨＱＫ（配列番号１）は、直鎖状ＨＨＱＫ（配列番号１）、または線維構造２Ｍ４ＪにおけるＨＨＱＫ（配列番号１）と比較して変化した曲率を有する。変化した曲率プロファイルは図２Ｇで認めることができる。
【０１８７】
曲率の値は、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）、直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）、およびＨＨＱＫ（配列番号１）中のＮ末端からＣ末端にわたるＨ、Ｈ、ＱおよびＫに対し測定した。線維との関連は表１に示す。実施例２に示すように、これらは以下の通りであった（ラジアン単位、Ｎ末端からＣ末端までのＨ、Ｈ、Ｑ、およびＫの残基）：
環状ペプチド：１．４９；１．３７；０．７３；１．０４
直鎖状ペプチド：１．４６；１．４７；１．４１；１．３７
線維：１．１２；１．１２；０．９９；１．１５
【０１８８】
したがって、別の立体配座の、Ｑ、またはＫまたはＨに対する曲率は、直鎖状ペプチドまたは線維における曲率の値に比べて、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、または０．７またはそれを超えるラジアン変化する。
【０１８９】
一実施形態では、Ｑ、Ｋ、ＨＨ、ＨＱ、ＱＫ、ＨＨＱ、ＨＱＫ、および／またはＨＨＱＫ（配列番号１）は、例えば直鎖状ペプチドおよび／または線維などの非オリゴマー立体配座でこれら残基によって占められるものと比較して、別の立体配座にある。
【０１９０】
図２Ａは、異なる平衡シミュレーション時間から得られた直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の曲率をプロットした図である。凡例に示すように、いくつかの曲線が、１０ナノ秒から開始されて、７２ナノ秒、１３４ナノ秒、１９６ナノ秒、または２５８ナノ秒まで続く。シミュレーション時間が増えるに伴い、曲率値が上記および表１に示す値に収束する。類似の調査の、環状ペプチドの場合を図２Ｂに、線維の場合を図２Ｃに示す。パネルＤ、ＥおよびＦは、直鎖状、環状、および線維立体配座のそれぞれについて、シミュレーション時間の関数としての曲率値の収束を示す。収束度は、エラーバーが、環状ペプチドでは約０．００７ラジアン、直鎖状ペプチドでは０．０１１ラジアン、線維では０．００５ラジアンであることを示す。
【０１９１】
同様の変化を示す環状化合物も包含される。
【０１９２】
ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫまたはＨＱＫＬ（配列番号２０）を含むＡベータペプチドを含むいくつかの実施形態の環状化合物は、前述の１個の、例えば、ＨＨＱＫ（配列番号１）のＡベータの上流および／または下流に１個、または２個以上の残基を含み得る。このような場合、Ａベータ配列の対応する残基の末端のＮ末端およびＣ末端にスペーサーが共有結合している。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、ＡベータペプチドのＮ末端残基およびＣ末端残基と間接的に結合している。
【０１９４】
一実施形態では、環状化合物は図７Ｃの化合物である。
【０１９５】
環化ペプチドを作製する方法は当該技術分野で公知であり、ＳＳ環化またはアミド環化（頭−尾環化または主鎖環化）がこれに含まれる。実施例３に方法をさらに記載する。例えば、Ｎ末端およびＣ末端に「Ｃ」残基を有するペプチド、例えば、ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号１３）をＳＳ環化により反応させて、環状ペプチドを得ることができる。実施例２に記載されるように、図７Ｃの環状化合物について、特定された立体配座エピトープとの関連性を評価した。ＨＨＱＫ（配列番号１）ペプチドを含む環状化合物は、例えば、１つまたは複数の立体配座的特徴に選択的な抗体を生じさせるのに使用することができる。
【０１９６】
本明細書に記載されるエピトープＨＨＱＫ（配列番号１）および／またはその一部は、Ａベータ伝播病態に含まれるＡベータのミスフォールドされた伝播性の株における潜在的な標的となり得、その立体配座エピトープを認識する抗体は、例えば、そのような伝播性の株の検出に有用であり得る。
【０１９７】
別の態様では、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドを含めた本明細書に記載されるＡベータペプチド配列を含む、単離ペプチドも提供される。直鎖状ペプチドは、例えば、それと特異的または選択的結合をしない抗体の選択に使用することができる。単離ペプチドは、本明細書に記載されるリンカー配列を含み得る。リンカーは、ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）直鎖状ペプチドでは、Ｎ末端またはＣ末端と共有結合していても、あるいは一部がＮ末端と結合し、一部がＣ末端と結合していてもよい。環状ペプチドでは、リンカーはＣ末端およびＮ末端と直接的または間接的に結合している。
【０１９８】
別の態様は、本明細書に記載される化合物、任意選択で環状化合物を含む、免疫原を含む。免疫原は、例えば、環状化合物中に存在するＨＱＫまたはＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープ配列を含んでよい。Ａベータペプチドは、追加のＡベータ配列を含み得る。アミノ酸は、前記配列のすぐ上流および／または下流側部分にあってよい。このような免疫原に対して産生させた抗体を、例えば、ＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープを含むシクロペプチドとの結合に関して選択することができる。
【０１９９】
一実施形態では、免疫原は、ＡベータペプチドＨＨＱＫまたは関連エピトープ配列を含む環状ペプチドである。
【０２００】
一実施形態では、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質を含む。免疫原性増強物質は、アミド結合などを介して直接、または化学リンカーを介して間接的に、化合物と結合していてよい。
【０２０１】
免疫原は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬａｔｅｅｆら（２００７）に記載されている方法を用いて、拘束されたエピトープペプチドを含む環状化合物と、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体とをコンジュゲートすることにより作製することができる。一実施形態では、実施例３に記載される方法を用いる。
【０２０２】
免疫原を対象への投与のために適切に調製または製剤化され、例えば、免疫原は無菌のものまたは精製されたものであり得る。
【０２０３】
さらなる態様は、本明細書に記載される化合物または免疫原のタンパク質性部分をコードする単離核酸である。
【０２０４】
実施形態では、核酸分子は、本明細書で、場合により、配列番号１〜２１または表１５（１）で示されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードする。
【０２０５】
一実施形態では、核酸分子は、ＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープおよび任意選択で、本明細書に記載されるリンカーをコードする。
【０２０６】
さらなる態様は、前記核酸を含むベクターである。適切なベクターについては本明細書の他の箇所に記載する。
【０２０７】
ＩＩＩ．抗体、細胞および核酸
実施例６および７で示されるように、環状化合物ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）は、免疫原性であり、対応する直鎖状ペプチドに比べて、環状化合物に選択的に結合する多くの抗体を産生する。本明細書に記載のように、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を用いて産生された抗体には、環状化合物に選択的で、モノマーよりＡベータオリゴマーに選択的に結合し、ＡＤ組織において顕著な斑を欠く抗体が含まれた。本明細書に記載されるエピトープＨＨＱＫ（配列番号１）および／またはその一部は、ＡＤに含まれるＡベータのミスフォールドされた伝播性の株における潜在的な標的となり得、その立体配座エピトープを認識する抗体は、例えば、そのような伝播性の株の検出に有用であり得る。さらに環状化合物に対し産生された抗体は、Ａベータ凝集を阻害し、さらに、Ａベータオリゴマー誘導される神経細胞毒性を阻害し、それらの治療薬としての使用を示唆する。
【０２０８】
したがって、上記の化合物および特に環状化合物を用いて、Ａベータ中のＨＱ、ＨＱＫ、ＱＫ、および／またはＨＨＱＫ（配列番号１）に特異的に結合する抗体、および／または１つまたは本明細書に記載の複数の差次的特徴を含む、Ａベータにおける特定の立体配座のこれらの残基を認識する抗体を産生できる。同様に、例えば、ＨＫＬＶ（配列番号２０）、ＶＨＨＱＫ（配列番号１２）、ＨＨＱＫＬ（配列番号７）、ＶＨＨＱＫＬ（配列番号６）および／または本明細書に記載されるその他の関連エピトープ配列を含む環状化合物を用いて、ＨＱＫ、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫＬ（配列番号２０）などおよび／またはその特定の立体配座エピトープに特異的に結合する抗体を産生させることができる。
【０２０９】
したがって、一態様は、配列ＨＱＫ、ＨＨＱＫ（配列番号１）または本明細書に記載の関連エピトープ配列、場合により、表１５（１）のＡベータ配列を有するＡベータペプチドに特異的に結合する抗体（その結合フラグメントを含む）を含む。
【０２１０】
一実施形態では、Ａベータペプチドは環状化合物中、場合により、環状ペプチド中に含まれ、抗体は、環状化合物中に存在するＡベータに対して特異的または選択的である。
【０２１１】
一実施形態では、環状化合物は環状ペプチド、場合により、配列番号２、３または４で示されるものなどの本明細書に記載の環状化合物である。シクロペプチドおよび環状ペプチドという用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０２１２】
一実施形態では、抗体は、対応する直鎖状化合物に比べて、環状化合物中に存在するＡベータペプチドに特異的におよび／または選択的に結合する。一実施形態では、抗体は、Ａベータペプチドを含む対応する直鎖状化合物よりも環状化合物内で提示されるＡベータペプチドに対して選択的である。
【０２１３】
一実施形態では、抗体は、配列ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドとは結合せず、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、抗体を生じさせるために使用され任意選択で配列番号２、３、４または３２で示される環状配列の直鎖型である。
【０２１４】
一実施形態では、抗体はＡベータ上のエピトープと特異的に結合し、エピトープは、ＨＨＱＫ（配列番号１）、その関連エピトープまたはその一部または前述のいずれかの立体配座エピトープを含む、またはこれからなる。一実施形態では、エピトープがＨＨＱＫ（配列番号１）からなる場合、それは、立体配座エピトープである。
【０２１５】
実施例に記載されるように、実施例に記載されるアッセイを用いて、１つまたは複数の特性を有する抗体を選択することができる。
【０２１６】
一実施形態では、抗体は単離されている。一実施形態では、抗体は外来抗体である。
【０２１７】
一実施形態では、抗体は、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫまたはＨＱＫＬ（配列番号２０）からなるＡベータペプチドを含む環状化合物に比べて、直鎖状ＨＱＫＬＶＦ（配列番号１４）、直鎖状ＨＱＫＬＶＦＦ（配列番号１５）、直鎖状ＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号１６）、直鎖状ＥＶＨＨＱＫ（配列番号１８）、直鎖状ＶＨＨＱＫ（配列番号１２）、または直鎖状ＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号１９）に特異的に結合しない、および／またはそれらに選択的ではない。一実施形態では、抗体は、ＨＨＱＫ（配列番号１）からなる直鎖状ペプチドに特異的に結合しない、および／またはそれに選択的ではない。選択的結合は、本明細書に記載のように、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴法測定を使って測定できる。
【０２１８】
ＩＩＩ．抗体、細胞および核酸
実施例で示したように、（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を含む免疫原を用いて産生された抗体は、直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）に比べて、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に選択的に結合し、また、モノマーＡベータおよびＡベータ線維斑と比較して、合成および／または天然のオリゴマーＡベータ種に選択的に結合した。さらに、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体によりＡベータ凝集のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの伝播を阻害することができた。さらに、毒性アッセイで示したように、（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体は、Ａベータオリゴマー神経細胞毒性を抑制した。
【０２１９】
したがって、さらなる態様は、Ａベータ上のエピトープと特異的に結合する抗体であり、エピトープは、抗体に対する結合に主として関与する少なくとも１個のアミノ酸残基を含む、またはこれよりなり、その少なくとも１個のアミノ酸は、配列ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫまたはＨＱＫＬ（配列番号２０）内に組み込まれたＨ、ＱまたはＫであり、エピトープがＨＨＱＫ（配列番号１）からなる場合、エピトープは、立体配座エピトープである（例えば、対応する直鎖状ペプチドに比べて、例えば、エピトープの少なくとも１個のアミノ酸がより強く束縛されている場合、別の拘束された立体配座中のＡベータペプチドに選択的に結合する）。一実施形態では、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含む、またはこれよりなるものであり、その少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫまたはＨＱＫＬ（配列番号２０）内に組み込まれたＨＱ、またはＱＫである。
【０２２０】
別の実施形態では、認識されるペプチドは立体配座エピトープであり、ＨＨＱＫ（配列番号１）、ＨＱＫまたはＨＱＫＬ（配列番号２０）からなる。一実施形態では、抗体は、対応する直鎖状ペプチドに比べて、環状化合物中のＨＨＱＫ（配列番号１）に、場合により、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に選択的に結合する。
【０２２１】
一実施形態では、抗体は立体配座選択的抗体である。一実施形態では、抗体は、対応する直鎖状配列に比べて、本明細書に記載されるエピトープペプチド配列を含む環状化合物に特異的におよび／または選択的に結合する。例えば、特定のエピトープ立体配座と結合する抗体は、立体配座特異的抗体と呼ぶことができる。このような抗体は、本明細書に記載される方法を用いて選択することができる。立体配座選択的抗体は、特定のＡベータ種または関連種（例えば、二量体、三量体およびその他のオリゴマー種）のグループを区別して認識することが可能であり、ある種または種のグループに対して別の種（例えば、モノマー種または線維種）より高い親和性を有し得る。
【０２２２】
一実施形態では、抗体は単量体Ａベータと特異的に結合しない。一実施形態では、抗体は、例えばＡＤの脳組織においてｉｎ  ｓｉｔｕで、Ａベータ老人斑と特異的に結合しない。
【０２２３】
別の実施形態では、抗体は、天然または合成のオリゴマーＡベータより単量体Ａベータと選択的に結合することはない。
【０２２４】
一実施形態では、抗体は、本明細書に記載の少なくとも１つの別の立体配座の特徴（例えば、直鎖状化合物に比べて、環状化合物中のエピトープの特徴）を含む本明細書に記載のエピトープペプチド配列を含む環状化合物に特異的に結合する。
【０２２５】
例えば、一実施形態では、抗体は、Ｈ、ＱおよびＫから選択され、環状化合物における少なくとも１つの二面角が、直鎖状化合物において対応する二面角と少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度異なる、少なくとも１５０度異なる残基を含む、環状化合物に特異的に結合する。
【０２２６】
一実施形態では、抗体は、ＨＨＱＫ（配列番号１）、場合により直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）を含む直鎖状ペプチドに比べて、ＨＨＱＫ（配列番号１）またはその一部、場合によりシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）、を含む環状化合物に選択的に結合する。例えば、一実施形態では、抗体は、環状立体配座のＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープ配列と選択的に結合し、例えばＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴法、場合により本明細書に記載される方法を用いて測定される、環状立体配座のＨＨＱＫ（配列番号１）に対する選択性が、対応する直鎖状化合物などの直鎖状化合物内のＨＨＱＫ（配列番号１）に比べて、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍大きい。
【０２２７】
一実施形態では、抗体は、直鎖状ペプチドよりもエピトープ配列を含む環状化合物に、またはモノマーよりもＡベータオリゴマーなどのＡベータ種に、選択的に結合する一実施形態では、選択性は、環状化合物および／またはＡベータオリゴマーに比べて、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維から選択されるＡベータ種および／または直鎖状ＨＨＱＫ（配列番号１）、場合により直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
【０２２８】
一実施形態では、ＡベータオリゴマーはＡベータ１〜４２サブユニットを含む。
【０２２９】
一実施形態では、抗体はＡベータ線維斑（老人斑とも呼ばれる）染色を示さない。斑染色がみられないことは、Ａベータ特異的抗体である６Ｅ１０および４Ｇ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）または２Ｃ８（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ファーミングデール、ニューヨーク州）などの陽性対照ならびにアイソタイプ対照と比較することにより評価することができる。本明細書に記載される抗体は、その抗体が典型的な斑形態染色を示さず、染色のレベルがＩｇＧ陰性アイソタイプ対照でみられるレベルの２倍と同等またはそれ以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さない、またはほとんど示さないことになる。尺度は、例えば、アイソタイプ対照での染色レベルを１に設定し、６Ｅ１０での染色レベルを１０に設定することができる。抗体は、そのような尺度で染色レベルが２以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さないことになる。実施形態では、抗体は、例えば上記の尺度で、最小限のＡベータ線維斑染色を示し、そのレベルのスコアは少なくとも３程度または３未満である。
【０２３０】
一実施形態では、本明細書に記載される環状化合物または免疫原を用いて、場合により本明細書に記載の方法を用いて抗体を産生する。
【０２３１】
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【０２３２】
モノクローナル抗体を作製するには、本明細書に記載される免疫原で免疫感作した対象から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、標準的な体細胞融合法によりミエローマ細胞と融合し、それにより上記の細胞を不死化してハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当該技術分野で周知である（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））ならびにその他の技術、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：１４０−６７（１９８６））およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９）など）。目的のエピトープと特異的に反応する抗体の産生に関してハイブリドーマ細胞を免疫学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。
【０２３３】
特定の抗原または分子に対して反応性の特異的抗体または抗体フラグメントはまた、細胞表面成分とともに細菌内で発現する免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることにより作製し得る。例えば、ファージ発現ライブラリーを用いて、完全Ｆａｂフラグメント、ＶＨ領域およびＦＶ領域を細菌内で発現させることができる（例えば、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照されたい）。
【０２３４】
一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【０２３５】
非ヒト種からの抗体のヒト化については文献に十分に記載されている。例えば、欧州特許第号第０２３９４００号（Ｂ１）ならびにＣａｒｔｅｒおよびＭｅｒｃｈａｎｔ  １９９７（全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８，４４９−４５４，１９９７）を参照されたい。ヒト化抗体はまた、商業的に容易に入手できる（例えば、イギリス、ミドルセックス、トゥイッケナム、ホーリーロード２番のＳｃｏｔｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社）。
【０２３６】
ヒト化型のげっ歯類抗体は、ＣＤＲ移植（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８）によって容易に作製される。この方法では、げっ歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む６つのＣＤＲループと、対応するヒトフレームワーク領域とを結合させる。ＣＤＲ移植では、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原認識に影響を及ぼし得ることから、親和性が低下した抗体が得られることが多い（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２４：４８７−４９９，１９９２）。抗体の親和性を維持するには多くの場合、部位特異的変異誘発またはその他の組換え技術により特定のフレームワーク残基を置き換える必要があり、コンピュータによる抗原結合部位のモデル化を援用することもある（Ｃｏら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：２９６８−２９７６，１９９４）。
【０２３７】
ヒト化型の抗体は任意選択で、リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３５：９５９−９７３，１９９４）によって得られる。この方法ではげっ歯類抗体の表面残基のみをヒト化する。
【０２３８】
特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージディスプレイ戦略（Ｊｅｓｐｅｒｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９−９０３，１９９４）によって特定され得る。１つの方法では、特異的抗原に対するげっ歯類抗体の重鎖をクローン化し、ヒト軽鎖のレパートリーと対にして、繊維状ファージ上にＦａｂフラグメントとして提示させる。抗原との結合によりファージを選択する。次いで、選択されたヒト軽鎖をヒト重鎖のレパートリーと対にしてファージ上に提示させ、再び抗原との結合によりファージを選択する。その結果は、特定の抗原に特異的なヒト抗体Ｆａｂフラグメントとなる。別の方法では、メンバーがその外表面に様々なヒト抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦｖ）を提示するファージのライブラリーを作製する（Ｄｏｗｅｒら，国際公開第９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，国際公開第９２／０１０４７号）。特異的抗原に対するアフィニティー濃縮により所望の特異性を有する抗体を提示するファージを選択する。いずれかの方法で特定されたヒトＦａｂフラグメントまたはヒトＦｖフラグメントをクローン化して、哺乳動物細胞でヒト抗体として発現させ得る。
【０２３９】
ヒト抗体は任意選択で、トランスジェニック動物から得られる（米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；および同第５，７７０，４２９号）。この方法では、キメラマウスまたは生殖系列変異体マウスの重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子を欠失させる。次いで、そのような変異体マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する。次いで、得られたトランスジェニックマウスは抗原曝露時にヒト抗体の全レパートリーを作製することが可能になる。
【０２４０】
ヒト化抗体は通常、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖおよび単一ドメイン抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントまたは重鎖と軽鎖がスペーサーにより連結された一本鎖抗体として作製される。また、ヒト抗体またはヒト化抗体はモノマー型またはポリマー型で存在し得る。ヒト化抗体は任意選択で、１本の非ヒト鎖と１本のヒト化鎖（すなわち、１本のヒト化重鎖または軽鎖）とを含む。
【０２４１】
ヒト化抗体またはヒト抗体を含めた抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥを含めた任意のクラスの免疫グロブリン；ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めた任意のアイソタイプから選択される。ヒト化抗体またはヒト抗体は、１つまたは２つ以上のアイソタイプまたはクラスに由来する配列を含み得る。
【０２４２】
さらに、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより容易に単離される。例えば、本発明の疾患特異的エピトープを用いて、抗体ファージライブラリーが、必要に応じスクリーニングされ、疾患特異的エピトープに特異的な抗体フラグメントが特定される。場合により、特定された抗体フラグメントを用いて、本発明の様々な実施形態に有用な様々な組換え抗体を作製する。抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えばＸｏｍａ社（バークレー、カリフォルニア州）から市販されている。抗体ファージライブラリーをスクリーニングする方法は当該技術分野で周知である。
【０２４３】
さらなる態様は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下に記載する配列を含む、抗体および／またはその結合フラグメントである。
【表２】
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【０２４４】
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体はキメラ抗体、例えば表１０に記載されるＣＤＲ配列を含むヒト化抗体などである。
【０２４５】
別の実施形態では、任意選択で一本鎖抗体において、表１３のＣＤＲと軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、抗体も提供される。
【０２４６】
さらに別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号２９で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号２２、２３および２４で示される、アミノ酸配列またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号３１で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号３１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号２５、２６および２７で示される、アミノ酸配列またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域アミノ酸配列が、配列番号２８で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重最適化型によってコードされている。別の実施形態では、抗体は、配列番号３０で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む。
【０２４７】
別の態様は、表１３に記載されるＣＤＲ配列を有する抗体と同じエピトープと特異的に結合する抗体である。
【０２４８】
別の態様は、ヒトＡベータとの結合に関して、表１３に記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する、抗体を含む。
【０２４９】
抗体間の競合は、例えば、被験抗体が参照抗体と共通の抗原との特異的結合を阻害する能力を評価するアッセイを用いて判定することができる。競合結合アッセイで測定したとき、過剰の被験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍または２０倍）が参照抗体の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％阻害する場合、被験抗体は参照抗体と競合することになる。
【０２５０】
さらなる態様は、治療剤、検出可能な標識または細胞毒性物質とコンジュゲートした抗体である。一実施形態では、検出可能な標識は陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えばＰＥＴ撮像で使用され得る。
【０２５１】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体および／またはその結合フラグメントとオリゴマーＡベータとを含む、抗体複合体に関する。
【０２５２】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体またはその一部をコードする、単離核酸である。
【０２５３】
また、重鎖または軽鎖をコードする、例えば、本明細書に記載されるＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域および／またはＣＤＲ−Ｈ３領域を含む重鎖をコードする、あるいは本明細書に記載されるＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域および／またはＣＤＲ−Ｌ３領域を含む軽鎖をコードする、核酸も提供される。
【０２５４】
本開示はまた、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列のバリアントを提供する。例えば、バリアントとしては、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列と少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列またはコドン縮重配列もしくはコドン最適化配列が挙げられる。別の実施形態では、バリアント核酸配列は、配列番号２９および３１をコードする核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０２５５】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体をコードする、単離核酸である。
【０２５６】
別の態様は、本明細書に開示される核酸を含む発現カセットまたはベクターである。一実施形態では、ベクターは単離ベクターである。
【０２５７】
ベクターは、抗体および／またはその結合フラグメントの作製あるいは本明細書に記載されるペプチド配列の発現に適したベクターを含めた任意のベクターであり得る。
【０２５８】
既知の方法で、タンパク質を確実に発現させる適切な発現ベクター内に核酸分子を組み込み得る。考え得る発現ベクターとしては、特に限定されないが、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。ベクターは使用する宿主細胞と適合性のあるものであるべきである。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に適した」ものであり、これは、その発現ベクターが、本明細書に記載されるエピトープまたは抗体に対応するペプチドをコードする核酸分子を含んでいることを意味する。
【０２５９】
一実施形態では、ベクターは、遺伝子治療により例えば一本鎖抗体を発現させるのに適したものである。ベクターは、例えば神経特異的プロモーターなどを用いて、神経組織での特異的発現に適合させることができる。一実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳを含み、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の発現を可能にする。このようなベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体を送達するのに用いることができる。
【０２６０】
適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。
【０２６１】
このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。
【０２６２】
一実施形態では、制御配列は、神経組織および／または細胞での発現を指令する、または増大させる。
【０２６３】
一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【０２６４】
組換え発現ベクターはまた、本明細書に記載される抗体またはエピトープペプチドを発現させるためにベクターにより形質転換、感染または形質移入した宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含み得る。
【０２６５】
組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドの発現または安定性を増大させる；組換えペプチドの溶解度を増大させる；ならびに例えば本明細書に記載されるタグおよび標識を含めたアフィニティー精製のリガンドとして作用することにより標的組換えペプチドの精製を補助する融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする、発現カセットを含み得る。さらに、標的組換えタンパク質にタンパク質分解切断部位を付加して、融合タンパク質精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離させ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ社、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、マサチューセッツ州）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられ、これらは組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを融合させるものである。
【０２６６】
例えばニューロンおよび神経組織内にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で遺伝子を導入するシステムとしては、ウイルス、中でもとりわけ単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスを含めたレトロウイルスに基づくベクターが挙げられる。これに代わる遺伝子送達の方法としては、裸のプラスミドＤＮＡおよびリポソーム−ＤＮＡ複合体の使用が挙げられる。別の方法には、ＤＮＡをポリカチオン濃縮して脂質に封入し、脳内遺伝子送達により脳内に導入する、ＡＡＶプラスミドの使用（Ｌｅｏｎｅら，米国特許出願公開第２００２０７６３９４号）がある。
【０２６７】
したがって、別の態様では、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターおよび抗体をリポソーム、ナノ粒子およびウイルスタンパク質粒子などの小胞で製剤化し、例えば、本明細書に記載される抗体、化合物、免疫原および核酸を送達し得る。特に、ポリマーソームを含めた合成ポリマー小胞を用いて抗体を投与することができる。
【０２６８】
別の態様では、本明細書に記載される抗体を発現する、または本明細書に開示されるベクターを含む細胞、任意選択で単離細胞および／または組換え細胞も提供される。
【０２６９】
組換え細胞は、ポリペプチドの産生に適した、例えば抗体および／またはその結合フラグメントの産生に適した任意の細胞を用いて作製することができる。例えば、核酸（例えば、ベクター）を細胞内に導入するには、用いるベクターに応じて、細胞に形質移入し得る、細胞を形質転換し得る、または細胞に感染させ得る。
【０２７０】
適切な宿主細胞としては、多種多様な原核宿主細胞および真核宿主細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載されるタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現させ得る。
【０２７１】
一実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞、蠕虫細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および哺乳動物細胞から選択される真核細胞である。
【０２７２】
別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ミエローマ細胞、脾臓細胞またはハイブリドーマ細胞である。
【０２７３】
一実施形態では、細胞は神経細胞である。
【０２７４】
抗体またはペプチドを発現させるのに適した酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、特に限定されないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属またはクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の様々な種が挙げられる。酵母（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）で発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）が挙げられる。酵母および真菌を形質転換させるプロトコルは当業者に周知である。
【０２７５】
適切であり得る哺乳動物細胞としては、特にＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）およびＮＳ−１細胞が挙げられる。哺乳動物細胞での発現を指令するのに適した発現ベクターは一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０などのウイルス材料由来のもの）ならびにその他の転写制御配列および翻訳制御配列を含む。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。
【０２７６】
一実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ細胞などの縮合細胞であり、ハイブリドーマ細胞は、エピトープまたは本明細書に記載のエピトープ配列に特異的および／または対し、選択的な、例えば、モノマーよりもＡベータオリゴマーに選択的に結合する抗体、直鎖状化合物よりも環状化合物中のエピトープ配列に選択的に結合する抗体または斑との結合を全くまたはほとんど示さない抗体などの、抗体を産生する。
【０２７７】
さらなる態様は、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。
【０２７８】
ＩＶ．組成物
さらなる態様は、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターまたは抗体を含む組成物である。
【０２７９】
一実施形態では、組成物は希釈剤を含む。
【０２８０】
核酸に適した希釈剤としては、特に限定されないが、水、生理食塩水およびエタノールが挙げられる。
【０２８１】
抗体もしくはそのフラグメントを含めたポリペプチドおよび／または細胞に適した希釈剤としては、特に限定されないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝溶液およびグリセロール溶液あるいはポリペプチドおよび／または細胞を凍結させるのに適した他の溶液が挙げられる。
【０２８２】
一実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるペプチド、免疫原、抗体、核酸またはベクターのいずれかを含み、任意選択で薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。
【０２８３】
本明細書に記載される組成物は、対象に投与することができる薬学的に許容される組成物を調製する既知の方法それ自体により、任意選択でワクチンとして、有効量の活性物質が薬学的に許容される溶媒との混合物の形で組み合わさるように調製することができる。
【０２８４】
医薬組成物としては、特に限定されないが、凍結乾燥粉末剤または水性もしくは非水性の無菌注射用液剤もしくは無菌注射用懸濁剤が挙げられ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および組成物を目的とする被投与者の組織または血液に実質的に適合させる溶質をさらに含有し得る。このような組成物中に記載の存在し得るその他の成分としては、例えば水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎなど）、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。無菌粉末剤、顆粒剤、錠剤または濃縮した液剤もしくは懸濁剤から即時注射液剤および即時注射懸濁剤を調製し得る。組成物は、例えば、特に限定されないが、患者に投与する前に滅菌水または生理食塩水で再構築する凍結乾燥粉末として供給され得る。
【０２８５】
医薬組成物は薬学的に許容される担体を含み得る。適切な薬学的に許容される担体としては、実質的に化学的に不活性で無毒性であり医薬組成物の生物活性の効果に干渉しない組成物を含む。適切な医薬担体の例としては、特に限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスファチジル−エタノールアミン（ｄｉｏｌｅｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）およびリポソームが挙げられる。このような組成物は、患者に直接投与する形態になるように、治療有効量の化合物を適量の担体とともに含有するべきである。
【０２８６】
組成物は薬学的に許容される塩の形態であり得、このような塩としては、特に限定されないが、遊離アミノ基を用いて形成される塩、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するなどおよび遊離カルボキシル基を用いて形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアルニノエタノール（２−ｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｏ  ｅｔｈａｎｏｌ）、ヒスチジン、プロカインなどに由来するなどが挙げられる。
【０２８７】
本明細書に記載される化合物または免疫原を含む実施形態では、組成物はアジュバントを含む。
【０２８８】
使用し得るアジュバントとしては例えば、通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒菌の成分である、内因性アジュバント（リポ多糖など）が挙げられる。外因性アジュバントには、通常、抗原と非共有結合し、宿主免疫応答を増強するよう製剤化される、免疫調節物質がある。水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（一般にミョウバンと総称される）はアジュバントとして日常的に使用される。様々な外因性アジュバントが免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こし得る。このようなものとしては、サポニン、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ社、ウスター、マサチューセッツ州）またはそれから生成されるＩＳＣＯＭおよび（免疫刺激複合体）および膜タンパク質抗原と複合体を形成したＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（免疫刺激複合体）などの粒子など、プルロニックポリマーと鉱油、死滅マイコバクテリアと鉱油、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖などの細菌生成物ならびにリピドＡおよびリポソームが挙げられる。
【０２８９】
一実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。水中油型乳剤としては、スクアレン；ラッカセイ油；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４３８７号）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型乳剤は、免疫刺激物質、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ  ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＴＰ−ＤＰＰ）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））またはその他の細菌細胞壁成分とともに使用され得る。
【０２９０】
アジュバントを単一組成物として免疫原とともに投与し得る。あるいは、アジュバントを免疫原投与の前に、免疫原投与と同時に、かつ／または免疫原投与の後に投与し得る。
【０２９１】
アジュバントは一般に、リン酸緩衝生理食塩水に溶かした０．０５〜１．０パーセント溶液として使用される。アジュバントは免疫原の免疫原性を増強するが、アジュバント自体は必ずしも免疫原性であるわけではない。アジュバントは、投与部位付近に免疫原を局所的に保持することよって作用し、免疫系細胞への免疫原の緩徐で持続的な放出を促進するデポとしての効果をもたらし得る。アジュバントはまた、免疫原デポに免疫系細胞を誘引し、そのような細胞を刺激して免疫応答を誘発し得る。したがって、諸実施形態は、アジュバントをさらに含む組成物を包含し得る。
【０２９２】
非経口免疫感作のためのアジュバントとしては、アルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびヒドロキシリン酸アルミニウム）が挙げられる。標準的プロトコルに従って、抗原をアルミニウム化合物とともに沈殿させる、またはアルミニウム化合物上に吸着させることができる。ＲＩＢＩ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）などのその他のアジュバントも非経口投与に使用することができる。
【０２９３】
粘膜免疫感作のためのアジュバントとしては、細菌毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび百日咳毒素（ＰＴ）またはその組合せ、サブユニット、トキソイドもしくは変異体）が挙げられる。例えば、天然のコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）の精製調製物が有用であり得る。上記のいずれかの毒素のフラグメント、ホモログ、誘導体および融合物も、アジュバント活性を保持している限り適切なものである。好ましくは、毒性が低下した変異体を使用する。適切な変異体については、（例えば、国際公開第９５／１７２１１号（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ  ＣＴ変異体）、国際公開第９６／６６２７号（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ  ＬＴ変異体）および国際公開第９５／３４３２３号（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ  ＰＴ変異体）に）既に記載されている。方法および組成物に使用し得る追加のＬＴ変異体としては、例えば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ変異体、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙ変異体、Ｇｌｕ−１１０−Ａｓｐ変異体およびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐ変異体が挙げられる。その他のアジュバント（様々な供給源（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍもしくはシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ））の細菌モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、サポニンまたはポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアなど）も粘膜投与に使用することができる。
【０２９４】
その他のアジュバントとしては、インターロイキンなどのサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１２、ケモカイン、例えばＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５、マクロファージ刺激因子ならびに／あるいは腫瘍壊死因子が挙げられる。使用し得るその他のアジュバントとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｄａｖｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４７：１７１−１８３，２０００）が挙げられる。
【０２９５】
水中油型乳剤としては、スクアレン；ラッカセイ油；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４３８７号）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型乳剤は、免疫刺激物質、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ  ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＴＰ−ＤＰＰ）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））またはその他の細菌細胞壁成分とともに使用され得る。
【０２９６】
粘膜免疫感作および非経口免疫感作の両方に有用なアジュバントとしては、ポリホスファゼン（例えば、国際公開第９５／２４１５号）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３ｂ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール（例えば、米国特許第５，２８３，１８５号および国際公開第９６／１４８３１）号およびＱＳ−２１（例えば、国際公開第８８／９３３６号）が挙げられる。
【０２９７】
アジュバントを免疫原と結合させて投与し得る。例えば、免疫原を含むペプチドの立体配座の変化が免疫原に対する免疫応答の性質に影響を及ぼさないように、パルミチン酸などの脂質を１つまたは複数のペプチドと直接結合させ得る。
【０２９８】
一実施形態では、組成物は本明細書に記載される抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載される抗体と希釈剤とを含む。一実施形態では、組成物は無菌組成物である。
【０２９９】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体およびＡベータ、場合によりＡベータオリゴマーを含む、抗体複合体を含む。複合体は、溶液中に存在しても、または組織中に、場合によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで含まれてもよい。
【０３００】
Ｖ．キット
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルあるいはその他の筐体に入った本明細書に記載されるｉ）抗体および／またはその結合フラグメント、ｉｉ）核酸、ｉｉｉ）ペプチドまたは免疫原、ｉｖ）組成物あるいはｖ）組換え細胞と、任意選択で参照物質および／またはキットの使用のための説明書とを含む、キットに関する。
【０３０１】
一実施形態では、キットは、収集バイアル、標準緩衝液および検出試薬のうちの１つまたは複数のものをさらに含む。
【０３０２】
ＩＶ．方法
本明細書に記載される化合物、免疫原および抗体を作製する方法が含まれる。
【０３０３】
特に、ＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープの立体配座エピトープに選択的な抗体を作製する方法であって、対象、任意選択で非ヒト対象に本明細書に記載されるエピトープ配列を含み立体配座的に制約のある化合物、任意選択でＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープを含む環状化合物を投与することと、環状化合物と特異的または選択的に結合し、任意選択で、ｉ）合成および／または天然のオリゴマーと特異的または選択的に結合し、かつ／あるいはｉｎ  ｓｉｔｕ組織試料で老人斑との結合が全くもしくはほとんどみられない、または対応する直鎖状ペプチドとの結合が全くもしくはほとんどない、抗体産生細胞あるいは抗体を単離することとを含む、方法が提供される。環状化合物は、例えば、本明細書に記載される環状化合物を含む、本明細書に記載されるいずれかの「エピトープ」を含み得る。
【０３０４】
一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、モノクローナル抗体を作製するためのものである。
【０３０５】
一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、ヒト化抗体を作製するためのものである。
【０３０６】
環状化合物を用いて作製する抗体は、本明細書および前述の実施例に記載される通りに選択される。一実施形態では、この方法は、任意選択で本明細書に記載される方法を用いて、直鎖状ペプチドよりも環状ペプチドに特異的または選択的に結合し、エピトープ配列に特異的であり、オリゴマーと特異的に結合し、かつ／あるいはｉｎ  ｓｉｔｕの斑および／または対応する直鎖状ペプチドと結合しない、またはほとんど結合しない抗体を単離することを含む。
【０３０７】
さらなる態様では、生体試料がＡベータを含むかどうかを検出する方法であって、生体試料と本明細書に記載される抗体とを接触させること、および／または何らかの抗体複合体の存在を検出することを含む、方法が提供される。一実施形態では、この方法は、生体試料が、残基Ｈ、ＱまたはＫの少なくとも１つが非オリゴマー立体配座のＨ、Ｑおよび／またはＫによって占められるものとは別の立体配座にあるＡベータを含むかどうかを検出するためのものである。一実施形態では、この方法は、生体試料がオリゴマーＡベータを含むかどうかを検出するためのものである。
【０３０８】
一実施形態では、この方法は、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、生体試料と、本明細書のＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体とを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出することを含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
【０３０９】
一実施形態では、形成された複合体のレベルを、適切なＩｇ対照または無関係な抗体などの被験抗体と比較する。
【０３１０】
一実施形態では、検出を定量化し、生成した複合体の量を測定する。測定は、例えば標準物質に対して相対的なものであり得る。
【０３１１】
一実施形態では、測定された量を対照と比較する。
【０３１２】
別の実施形態では、この方法は、
（ａ）抗体−抗原複合体の生成が可能な条件下で、前記対象の試験試料と本明細書に記載される抗体とを接触させること；
（ｂ）被験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定すること；および
（ｃ）被験試料中の抗体−抗原複合体の量と対照とを比較することを含み、
対照と比較して試験試料中に抗体−抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータを含むことが示される。
【０３１３】
対照は、試料対照（例えば、ＡＤを有さない対象または軽度、中等度もしくは進行型といった特定の型のＡＤを有する対象に由来するもの）または対象のＡベータオリゴマーレベルの変化をモニターするための同じ対象由来の以前の試料であり得る。
【０３１４】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を使用する。
【０３１５】
一実施形態では、抗体は、ＨＱＫまたはＨＨＱＫ（配列番号１）または関連立体配座エピトープを含むＡベータの立体配座を特異的および／または選択的に認識し、抗原：抗体複合体の存在が検出されることにより、試料がＡベータオリゴマーを含むことが示される。
【０３１６】
一実施形態では、試料は生体試料である。一実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物および／またはＣＳＦを含む。一実施形態では、試料は、全血、血漿または血清を含む。一実施形態では、試料はヒト対象から採取されるものである。一実施形態では、対象は、ＡＤが疑われる、ＡＤのリスクがある、またはＡＤを有する。
【０３１７】
多くの方法を用いてＡベータ：抗体複合体を検出でき、それにより生体試料中にＨＨＱＫ（配列番号１）または関連立体配座エピトープを含むＡベータおよび／またはＡベータオリゴマーが試料中に存在することを、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫細胞化学などのイムノアッセイを含めて、本明細書に記載の抗体を使って判定する。
【０３１８】
実施例に記載されるように、表面プラズモン共鳴技術を用いて立体配座特異的結合を評価することができる。抗体を標識する、または複合体の抗体に特異的な検出可能に標識した二次抗体を用いる場合、その標識を検出することができる。一般に用いられる試薬としては、蛍光発光抗体およびＨＲＰ標識抗体が挙げられる。定量的方法では、発生したシグナルの量を標準物質または対照との比較により測定することができる。測定はまた、相対的なものであり得る。
【０３１９】
さらなる態様は、対象または組織中のＡベータのレベルを測定する、またはそのようなＡベータを撮像する方法であって、任意選択で、測定または撮像するＡベータがオリゴマーＡベータである、方法を含む。一実施形態では、この方法は、ＡＤを有するリスクがある、ＡＤを有することが疑われる、またはＡＤを有する対象に検出可能な標識とコンジュゲートした抗体を投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む。標識は、一実施形態では、例えばＰＥＴ撮像に使用することができる陽電子放出放射性核種である。
【０３２０】
さらなる態様は、対象の免疫応答を誘導する方法を含み、該方法は、本明細書に記載される化合物、免疫原および／またはＨＨＱＫ（配列番号１）または関連エピトープを含む環状化合物などの本明細書に記載の化合物を含む組成物を対象に投与すること；および場合により、投与した化合物または免疫原に特異的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む。
【０３２１】
一実施形態では、投与する免疫原は、図７Ｃの化合物を含む。
【０３２２】
一実施形態では、対象はげっ歯類などの非ヒト対象である。作製された抗体産生細胞は、一実施形態ではハイブリドーマ細胞系を作製するために使用する。
【０３２３】
本明細書では、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体が、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的に結合し、Ａベータ斑染色がないことが示される。オリゴマーＡベータ種は、ＡＤにおいて毒性のある伝播性の種であると考えられる。さらに、図１９に示すように、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を用いて産生させ、オリゴマーに特異的な抗体は、Ａベータの凝集およびＡベータオリゴマーの伝播を阻害した。したがって、Ａベータオリゴマーの伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体を、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマーの伝播を阻害することを含む、方法も提供される。実施例に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイをモニターすることができる。
【０３２４】
抗体はまた、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患の治療に有用であり得る。例えば、レビー小体型認知症のバリアントおよび封入体筋炎（筋肉疾患）では、ＡＤと類似した斑がみられ、Ａベータはまた、脳アミロイド血管症に関与する凝集体も形成することがある。上記のように、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体は、ＡＤの毒素原性のＡベータ種であると考えられるオリゴマーＡベータと結合し、毒素原性Ａベータオリゴマーの形成を阻害する。
【０３２５】
したがって、さらなる態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の本明細書に記載される抗体、任意選択で、前記抗体を含むＡベータオリゴマー特異的もしくはＡベータオリゴマー選択的組成物または医薬組成物を投与すること；あるいは２）必要とする対象にＨＨＱＫ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物、免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法である。他の実施形態では、本明細書に記載の抗体または免疫原をコードする核酸も、必要に応じ、対象への核酸の送達に好適するベクターを用いて、対象に投与できる。
【０３２６】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。一実施形態では、検出可能なＡベータレベル（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される、または撮像により測定されるＡベータ抗体複合体）を有する対象を抗体で治療する。
【０３２７】
抗体および免疫原を例えば、本明細書に記載される医薬組成物に含ませ、例えば小胞に製剤化して送達を改善することができる。
【０３２８】
ＨＨＱＫ（配列番号１）を標的とする１つまたは複数の抗体および／または関連抗体を組み合わせて投与することができる。さらに、本明細書に開示される抗体をベータセクレターゼ阻害剤またはコリンエステラーゼ阻害剤などの１つまたは複数の他の治療剤とともに投与することができる。
【０３２９】
一実施形態では、抗体は、任意選択でＡベータオリゴマーと特異的または選択的に結合する、立体配座特異的／選択的抗体である。
【０３３０】
また、ＡＤを治療するための組成物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸の使用が提供される。
【０３３１】
本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸、ベクターなどを、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、眼窩内、点眼、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾール投与または経口投与により投与することができる。
【０３３２】
ある特定の実施形態では、医薬組成物を全身投与する。
【０３３３】
他の実施形態では、医薬組成物を脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。例えば、このような方法は、埋込み型カテーテルおよびポンプの使用を含み、これらはカテーテルを通して注入部位に所定用量を放出するものである。当業者であればさらに、理解されよう。カテーテルは、それを可視化して脳内の所望の投与部位または注入部位に隣接する位置に配置することが可能な外科技術により埋め込まれ得る。このような技術は、参照により本明細書に組み込まれるＥｌｓｂｅｒｒｙらの米国特許第５，８１４，０１４号「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｂｙ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ」に記載されている。また、米国特許出願公開第２００６０１２９１２６号（ＫａｐｌｉｔｔおよびＤｕｒｉｎｇ，「Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｆｕｓｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ」）に記載されているもの方法などの方法が企図される。脳およびＣＮＳの他の部分に薬物を送達する装置が市販されている（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標）ＥＬ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社、ミネアポリス、ミネソタ州）。
【０３３４】
別の実施形態では、血液脳関門を通過する受容体介在型輸送が可能になるよう投与する化合物を修飾するなどの方法を用いて、医薬組成物を脳に投与する。
【０３３５】
他の実施形態では、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸と、血液脳関門を通過する輸送を促進することが知られている生物学的に活性な分子との共投与が企図される。
【０３３６】
また、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸を血液脳関門を通過させて投与する方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７０１２０６１号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ」に記載されている、血液脳関門の透過性を一時的に増大させることを目的とする方法などが企図される。
【０３３７】
上の開示は本願を全体的に説明するものである。以下の具体例を参照することにより、さらに十全な理解することができる。これらの例は単に説明を目的として記載されるものであって、本願の範囲を限定することを意図するものではない。状況によって好都合であることが示唆される、または好都合である場合、形態の変更および均等物による置換が企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は説明的な意味を意図するものであって、限定を目的とするものではない。
【０３３８】
以下の非限定的な例は本開示を例示するものである。
【０３３９】
実施例
実施例１
集団座標予測
ミスフォールドされたエピトープを予測する方法は、２０１５年１１月９日に出願され参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／２５３０４４号、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｂｉａｓｉｎｇ」に記載されている「集団座標バイアス」によって得られる。そこに記載されているように、この方法は、あるタンパク質（またはペプチド凝集体）にグローバル座標のバイアスをかけて、そのタンパク質（またはペプチド凝集体）をミスフォールドさせた後、部分的に構造化されていないタンパク質（またはペプチド凝集体）のフォールドされない可能性が最も高いアンフォールド領域を予測する、分子動力学に基づくシミュレーションを用いるものである。バイアスシミュレーションを実施し、各残基インデックスに対応する溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）（検討するタンパク質の初期構造のものと比較した）。ＳＡＳＡはＨ２Ｏが接触可能な表面積を表す。ＳＡＳＡの（検討するタンパク質の初期構造のものと比較した）正の変化は、関連する残基インデックスの領域におけるアンフォールドを示すと考え得る。この方法をそれぞれが独自の形態を有する単鎖、および３種類のＡベータ株、すなわち、３回対称性構造（またはモノマー）（ＰＤＢエントリー２Ｍ４Ｊ）のＡβ−４０ペプチド、２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）のＡβ−４０モノマーおよび一本鎖平行ｉｎ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ（例えば、一本の鎖の残基が近接する鎖の同じ残基と相互作用するベータシートが反復したもの）構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）のＡβ−４２モノマーに適用した。
【０３４０】
米国特許出願第６２／２５３０４４号、ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ  ＭＩＳＦＯＬＤＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＰＩＴＯＰＥＳ  ＢＹ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＶＥ  ＣＯＯＲＤＩＮＡＴＥ  ＢＩＡＳＩＮＧに記載されている集団座標法ならびにＫ．Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｅ．Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｄａｒｉａｎ，Ｏ．Ｇｕｖｅｎｃｈ，Ｐ．Ｌｏｐｅｓ，Ｉ．ＶｏｒｏｂｙｏｖおよびＡ．Ｄ．Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ．Ｃｈａｒｍｍ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ：Ａ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｈａｒｍｍ  ａｌｌ−ａｔｏｍ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４）：６７１−６９０，２０１０；ならびにＰ．Ｂｊｅｌｋｍａｒ，Ｐ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｅｎｄｅｔ，Ｂ．ＨｅｓｓおよびＥ．Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＨＡＲＭＭ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎ  ＧＲＯＭＡＣＳ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｆｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｍａｐｓ，ｖｉｒｔｕａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ  ｗａｔｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏ．Ｃｏｍｐ．，６：４５９−４６６，２０１０に記載されているＣＨＡＲＭＭ力場パラメーター（ともに参照により本明細書に組み込まれる）をＴＩＰ３Ｐ水とともに用いて、各初期構造に対するシミュレーションを実施した。
【０３４１】
この方法を用いて予測されたエピトープを実施例２に記載する。
【０３４２】
Ａベータオリゴマー特異的エピトープを予測するためのＧ−ｏモデル法
第２のエピトープ予測モデルは、天然の状態からの部分的なタンパク質アンフォールドの自由エネルギーランドスケープに基づいている。天然の状態は、実験的に誘導された線維構造と見なされる。タンパク質が天然の状態から一次配列の所定の量だけ部分的にアンフォールドしている場合、エピトープ候補は、不規則に最小自由エネルギーを費やさせるコンティグ配列セグメントである。与えられたタンパク質立体配座の自由エネルギーは、立体配座エントロピーおよびアンフォールド状態に適する極性官能基の溶媒和、ならびに静電気的およびファンデルワールス的、エントロピー的に天然の状態を安定化するタンパク質内相互作用を含むいくつかの寄与要因から生じる。
【０３４３】
部分的アンフォールドタンパク質ランドスケープのＧ−ｏモデル
アンフォールド中に起こる自由エネルギー変化を説明する近似モデルは、固定エネルギーを天然の状態の全ての接点に割り付け、接点は、固定カットオフ距離ｒｃｕｔｏｆｆ内の１対の重（非水素）原子として定義される。Ｇ−ｏ様モデルは、タンパク質フォールディングの前に記載の調査では、うまく実施された。Ｇ−ｏ様モデルは、天然タンパク質相互作用形態から生じる効果を単離し、実際には、アンフォールド自由エネルギーランドスケープは、単一の天然状態構造から容易に計算できる。
【０３４４】
アンフォールドセグメントの合計エネルギーコストは、アンフォールド領域の立体配座エントロピー項と共に、破壊される相互作用の数に依存する。
【０３４５】
次の式では、小文字の変数は、原子を意味し、大文字の変数は、残基を意味する。Ｔをタンパク質中の全残基のセット、Ｕをタンパク質中のアンフォールド残基のセット、Ｆをタンパク質中のフォールド残基のサブセットとする（したがって、Ｔ＝Ｕ∪Ｆ）。高い天然度のアンフォールド機序は、複数の不規則残基のコンティグ鎖からなる。ここで、単一のアンフォールドコンティグ鎖の近似を採用し、このコンティグ鎖を不規則化するための自由エネルギーコストを計算した。
【０３４６】
アンフォールド残基セットＵに対する合計自由エネルギー変化ΔＦＧ−ｏ（Ｕ）は、次の通り。
ΔＦＧ−ｏ（Ｕ）＝ΔＥＧ−ｏ（Ｕ）−ＴΔＳＧ−ｏ（Ｕ）      （１）
【０３４７】
アンフォールドエンタルピー関数ΔＥＧ−ｏ（Ｕ）は、Ｕ残基セットのアンフォールドにより破壊された多くの相互作用により与えられる。
【数２】
2019505166.tif 000006
【０３４８】
式２では、ｉ、ｊの合計は、アンフォールド領域中に対の１つまたは両方の原子を有する全ての重原子のユニーク対を対象にしており、ｒｉおよびｒｊは原子ｉおよびｊの座標であり、ｒｃｕｔｏｆｆ（４．８Åとする）は相互作用距離カットオフである。Θ（ｘ）は、ヘビサイド関数で、ｘが正の場合、Θ（ｘ）＝１で、それ以外は０として定義される。接点当たりのエネルギーは、室温でタンパク質を完全にアンフォールドしたときに全体の実験の安定性ΔＦＥｘｐ（Ｕ）｜Ｕ＝Ｔを繰り返すように選択され得る。
【数３】
2019505166.tif 000007
【０３４９】
結果は、この値に依存しない。これは、この問題全体のグローバルエネルギースケールを設定するに過ぎない。このモデルでは、この自由エネルギーは、４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌの一定の数値を採用した。この値は、大きな関心事ではない。理由は、エピトープ予測の方法において、不規則化しようとしているのは、同じタンパク質の異なる領域の相対的自由エネルギーコストであるためである。
【０３５０】
アンフォールドエントロピー項ΔＳＧ−ｏ（Ｕ）の計算は、下記のＢで考察される。
【０３５１】
Ｂ．エントロピー計算
【０３５２】
アンフォールド状態におけるタンパク質に接触可能な微視的な状態の数は、天然状態での接触可能な数より遥かに多く、そのため、アンフォールド時に、立体配座エントロピーの好ましい増加がある。アンフォールド領域中の全残基Ｋを合計することによるアンフォールドセグメントＵの合計エントロピーが計算される。
【数４】
2019505166.tif 000008
式中、ΔＳｂｂ，Ｋ、ΔＳｂｕ→ｅｘ，Ｋ、ΔＳｅｘ→ｓｏｌ，Ｋは、文献［３］に記載の残基Ｋの３つの立体配座エントロピー成分であり、ΔＳｂｂ，Ｋは、天然状態からアンフォールド状態への主鎖エントロピー変化であり、ΔＳｂｕ→ｅｘ，Ｋは、埋め込まれた内側タンパク質からタンパク質の表面への側鎖のエントロピー変化であり、ΔＳｅｘ→ｓｏｌ，Ｋは、表面からのから溶液への変化に対し側鎖で得られるエントロピーである。
【０３５３】
１つの補正がアンフォールド状態立体配座エントロピーに適用される。理由は、単一配列近似では、部分的アンフォールド鎖の末端が天然の構造中のそれらの位置に固定されるためである。これは、部分的アンフォールド構造において両端を拘束するために支払われるべきループエントロピーペナルティーが存在することを意味し、これは、完全アンフォールド状態には存在しない。
【数５】
2019505166.tif 000009
【０３５４】
ここで、ｆｗ（Ｒ｜Ｎ）Δτは、理想的ランダムウォークが、Ｎステップ後に、ウォーク中にタンパク質中へ侵入逆行することなく、位置Ｒを中心とする体積τに戻る確率を計算することにより求められる。約ｎ≒２０残基より短い鎖長に対しては、融解鎖のサイズは、タンパク質直径よりも遥かに小さく、タンパク質の立体的に排除された量は不透過性面として十分に取り扱える。融解鎖のポリマー状態の数は、タンパク質の表面上の起点から、不透過性面に接触するまたはそれを通過することなく、融解ポリマーがタンパク質中に再入する部位まで移動するランダムウォークの比率を乗ずる必要がある。上記状態の比率は、次の形式で書くことができる。
【数６】
2019505166.tif 000010
式中、Ｒは、出口および入口部位間の末端間の距離であり、Ｎは、融解領域の残基の数であり、ａ、ｌ、Ｖｃは、アンフォールドポリペプチドシミュレーションに当てはめることにより決定されたパラメーターである。パラメーターｌは、２つのＣα原子間の有効弧長であり、Ｖｃは、それぞれの残基の平均排除量である。式６をシミュレーション結果にあてはめることにより、パラメーターの値、ａ＝０．０２１７、ｌ＝４．８６７、Ｖｃ＝３．２９１が得られる。このエントロピーペナルティーは一般的なものであり、配列と無関係である。
【０３５５】
ジスルフィド結合は、アンフォールドセグメントの運動をさらに制限するため、ループエントロピー項に関し追加の検討が必要である。ジスルフィド結合が存在する場合には、ループが通過する必要のある追加のノードとして取り扱われ、事実上、全ループを２つのより小さいループに分割し、両方が、上述の境界条件に晒される。
【０３５６】
Ｃ．自由エネルギーランドスケープからのエピトープ予測
部分的アンフォールタンパク質の自由エネルギーランドスケープが得られると、可変エネルギー閾値Ｅｔｈが適用され、３個以上のアミノ酸を含み、閾値未満のエネルギーコストを有するセグメントがエピトープ候補として予測される。予測は、変化する閾値Ｅｔｈに対し安定である。
この方法を用いて予測されたエピトープを実施例２に記載する。
【０３５７】
実施例２
Ｉ．立体配座特異的エピトープ
本開示は、オリゴマーＡベータペプチド、特に、ミスフォールドタンパク質種である毒性のオリゴマーのＡβペプチドに選択的であり得る抗体に関する。このＡβペプチドのプリオン様伝播およびシナプス小胞との干渉は、アルツハイマー病（ＡＤ）で生じるシナプス機能障害および認知機能低下が原因であると考えられている。Ａβは、ガンマセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断により生じる長さ３６〜４３アミノ酸のペプチドである。ＡＤ患者では、Ａβは、モノマー、線維中、および可溶性オリゴマー中に存在する。ＡβはＡＤ患者の脳にみられるアミロイド斑の主成分である。
【０３５８】
モノマー型では、Ａβは非構造化ポリペプチド鎖として存在する。線維型では、Ａβは異なる形態に凝集することができ、これらは多くの場合、株と呼ばれる。上記の構造のうちいくつかのものは固体ＮＭＲにより決定されたものであり、一部の線維構造はｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で得られたものであり、それ以外は、ＡＤ患者から採取したアミロイド斑を用いて線維を播種することにより得られたものである。
【０３５９】
オリゴマーは、毒性のある伝播性のペプチド種であり、モノマーＡβを局在化させ、オリゴマーに変換し、最終的に線維に変換することが示唆されている。
【０３６０】
オリゴマー特異的抗体を作製するための必要条件の１つが、モノマーまたは線維上には存在しないＡβペプチド上の標的の特定である。これらのオリゴマー特異的エピトープは、モノマーまたは線維の対応するセグメントと一次配列が異なるわけではないが、オリゴマーにおいて立体配座が異なるものとなる。つまり、これらは、モノマーにも線維にも存在しない独特の立体配座でオリゴマー中に存在することになる。
【０３６１】
これまでにオリゴマーの構造は決定されておらず、さらに、ＮＭＲの証拠から、オリゴマーが単一の明確に定められた構造ではなく、規則性に乏しく立体配座的に可塑性で順応性のある構造アンサンブルの形で存在することが示されている。さらに、オリゴマー種の濃度はモノマーまたは線維のものよりもはるかに低い（推定値には幅があるが、約１０００分の１またはそれ以下である）ため、この標的は捉えどころのないものとなっている。
【０３６２】
一次配列（例えば、直鎖状配列）のコンティグ鎖または線維構造に対する抗体は、その効果を制限する問題点をいくつか抱え得る。直鎖状ペプチド領域に対して産生させた抗体は、オリゴマーに対して選択的ではない傾向があり、このため、モノマーとも結合する。モノマーの濃度は実質的にオリゴマーの濃度より高いため、そのような抗体治療剤は「標的に対する注意散漫」という問題を抱えることがあり、オリゴマー種を選択的に標的とし除去するのではなく、むしろ主としてモノマーと結合し、機能的Ａβの除去を促進する。アミロイド封入体に対して産生させた抗体は主として線維と結合し、その結果、血管原性浮腫および／または微小出血を表すと考えられるシグナル変化を含めたアミロイド関連画像異常（ＡＲＩＡ）が生じた。
【０３６３】
オリゴマー型のＡβに選択的な抗体を開発するため、線維内で破壊され得る領域を特定した。理論に拘束されるのを望むわけではないが、線維における破壊が同様にオリゴマーの表面にも露出するのではないかという仮説を立てた。しかし、オリゴマー上では、これらの配列領域は、モノマーおよび／または線維のものとは異なる立体配座で露出し得る。例えば、表面にあるとき、それらは線維またはモノマーにみられる対応する量より曲率が高く、露出表面積が大きく、それとは異なる二面角分布を示すターン領域の形で、および／または線維またはモノマー（例えば、直鎖状ペプチド）中で示される対応する量と比較して、構造的アライメントにより決定して全体的に異なる立体配座形状で露出し得る。
【０３６４】
ＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状化合物を本明細書に記載し、図７パネルＣに示す。この環状化合物は、上記の基準を１つまたは複数満たすよう設計したものである。
【０３６５】
線維内の破壊されやすい領域を特定することの潜在的有益性の１つは、それにより線維がモノマーからオリゴマーの核を形成する触媒基質としての役割を果たし得る二次的な核形成過程に関与する領域が特定され得ることである［３］。側鎖が露出した線維の領域の方が付近のモノマーとの異常な相互作用に関与してモノマーの付着を促進する可能性が高いと思われ、次いで、このように付着したモノマーは、線維の表面またはその付近で効率的に増大する濃度という環境に曝され、それによりオリゴマーを含めた多量体凝集体を形成する可能性が高くなるものと思われる。Ａβの露出領域を有する加齢線維または損傷線維は毒性オリゴマーの産生を増大させ得るものであり、線維上のこれらの不規則な領域に対する抗体は、このような伝播機序を阻止するのに効果的であるものと思われる。
【０３６６】
ＩＩ．集団座標およびＰｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏ予測
エピトープＨＨＱＫ（配列番号１）は、実施例１に記載し、図１に示すように、集団座標法から予測される２ＭＸＵ株、およびＰｒｏｍｉｓ  Ｇ−ｏ法 から予測される２Ｍ４Ｊ株由来のエピトープとして出てきたものである。
【０３６７】
パネルＡでは、グラフは、部分的に不規則化した線維から得られたエピトープ予測を示す。ＨＨＱＫ（配列番号１）エピトープは、ＰＤＢ構造２ＭＸＵ（図１（パネルＡ、左））に対する予測として出てきたものであり、一方、ＨＱＫＬ（配列番号２０）は、ＰＤＢ構造２Ｍ４Ｊ（パネルＡ、右）に対する予測として出てきたものである。（図１、パネルＢ）、ＨＨＱＫ（配列番号１）は、構造２Ｍ４Ｊの鎖Ｃに対するＰｒｏＭｉｓアルゴリズムのエピトープ予測として出てきたものである。（パネルＣ）、ＨＨＱＫ（配列番号１）は、構造２Ｍ４Ｊの鎖Ｇ、Ｈ、Ｉに対するエピトープとして出てきたものである。アンフォールドランドスケープは、３つ全ての鎖に対し類似に見え、これは、構造の３回対称に起因する。（パネルＤ）、ＨＨＱＫ（配列番号１）は、構造２ＭＸＵの鎖Ｌに対するエピトープとして出てきたものである。重なり合っているエピトープＨＱＫＬ（配列番号２０）はまた、集団座標法を用いて、株２Ｍ４Ｊ（図１）から予測されたエピトープとして出てきたものである。
【０３６８】
ＩＩＩ．環状ペプチドの曲率
残基インデックスに関数としての環状ペプチドの曲率を、直鎖状ペプチドおよび線維の曲率と比較した。
【０３６９】
ペプチド中の全ての残基に対する曲率値は、それぞれの平衡アンサンブルを平均化後得られる。図２のパネルＡ、Ｂ、またはＣの直鎖状、環状、または線維−２Ｍ４Ｊプロット中の点（ｘ、ｙ）は、天然の残基１３〜１６、ＨＨＱＫ（配列番号１）の曲率に対応する。パネルＡおよびＢのこの範囲の外側の残基、すなわち、パネルＡの１２、およびパネルＢの１１、１２、および１７は、それぞれ直鎖状および環状構築物中に存在する非天然残基に対応する。収束は、アンサンブルを１０ナノ秒から、経過時間７２ナノ秒、１３４ナノ秒、１９６ナノ秒、および２５８ナノ秒まで平均化することにより示す。パネルＧは、線維の曲率と共に、直鎖状および環状ペプチドに対する曲率の収束値を示す。興味深いことに、環状ペプチド中のＱ１５の曲率は、直鎖状ペプチドまたは線維中の値よりも実質的に小さい。Ｋ１６はまた、環状ペプチド中で、直鎖状ペプチドよりも顕著に小さい曲率を有し、線維中の曲率と同等であるがそれでもまだそれより小さい。
【０３７０】
環状および直鎖状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の曲率プロファイルを、線維２Ｍ４Ｊの曲率プロファイルと共に、図２Ｇに示す。図中に示すように、残基１６Ｋは、直鎖状ペプチドとは異なる曲率を有するが、線維に比べてまだ小さいとはいえ、類似である。以外かもしれないが、環状ペプチド中のグルタミン残基１５Ｑは、直鎖状ペプチドまたは線維中の１５Ｑの曲率に比べて、顕著に小さい曲率を有する。曲率の差異は、環状ペプチドとその他の立体配座型との間の抗原性プロファイルの差異の尺度である。
【０３７１】
図２Ａは、異なる平衡シミュレーション時間から得られた直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の曲率をプロットした図である。凡例に示すように、いくつかの曲線が、１０ナノ秒から開始されて、７２ナノ秒、１３４ナノ秒、１９６ナノ秒、または２５８ナノ秒まで続く。シミュレーション時間が増えるに伴い、曲率値が上記および表１に示す値に収束する。類似の調査の、環状ペプチドの場合を図２Ｂに、線維の場合を図２Ｃに示す。パネルＤ、ＥおよびＦは、直鎖状、環状、および線維立体配座のそれぞれについて、シミュレーション時間の関数としての曲率値の収束を示す。収束度は、エラーバーが、環状ペプチドでは約０．００７ラジアン、直鎖状ペプチドでは０．０１１ラジアン、線維では０．００５ラジアンであることを示す。曲率値は、直鎖状アンサンブルでは約２００ナノ秒後に、環状アンサンブルでは約１５０ナノ秒後に、線維アンサンブルでは約２０ナノ秒後に完全に収束した。ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）に対する残基インデックスの関数としての平均曲率を、パネルＧに示す。この図では、直鎖状ペプチドは、灰色実線で、環状ペプチドは薄灰色実線で、線維は点線で示される。残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋの曲率の数値を表１に記載する。環状ペプチド中のＨ１３の曲率は、直鎖状ペプチドに類似であり、また、線維より大きい。環状ペプチド中のＨ１４の曲率は、直鎖状ペプチド中の値よりわずかに小さいが、それでも線維の値より大きい。Ｑ１５の曲率は、直鎖状ペプチドまたは線維中の曲率より実質的に小さい。Ｋ１６の曲率はまた、直鎖状ペプチド中の曲率より実質的に小さいが、それでも線維中の曲率よりまだ小さい。
【０３７２】
本明細書で考察した図１〜１０のプロットでは、データは、Ｃｈａｒｍｍ２７力場を用いる陽溶媒（ＴＩＰ３Ｐ）中での平衡シミュレーションから得ている。各アンサンブルのシミュレーション時間および立体配置数は以下の通りである。環状ペプチドアンサンブル：シミュレーション時間３００ナノ秒、１００００のフレームを含む；直鎖状ペプチドアンサンブル：シミュレーション時間２００ナノ秒、１００００のフレームを含む；２Ｍ４Ｊアンサンブル：６０ナノ秒、１００００フレームを含む。
【０３７３】
環状エピトープの曲率は直鎖状ペプチドまたは線維とプロファイルが異なるため、これらの残基を含むオリゴマー上のアミノ酸の対応する伸縮振動は線維またはモノマーのものとは異なる主鎖配向を有するのでなないかと予想される。しかし、曲率の大きさは非物理学的なものであると思われ、環状ペプチドを特徴付ける曲率の数値は非拘束直鎖状ペプチドに対するいくつかの残基で得られる。
【０３７４】
表２に基づいて、直鎖状、環状および線維（２Ｍ４Ｊ）ペプチドに対する１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋの曲率値を表１に示す。
表１．残基による曲率値
【表３】
2019505166.tif 000011
【０３７５】
ＩＶ．二面角分布
オリゴマー選択的エピトープを特定するためのさらなるコンピュータ支援が、オリゴマー内の露出エピトープの代わりである環状ペプチドの側鎖二面角分布ならびに主鎖二面角のラマチャンドランφおよびψ分布の両方によって得られる。いくつかの角度は、線維またはモノマー中の対応する分布とは実質的に異なる。
【０３７６】
側鎖および主鎖二面角分布を４個の残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋに対し調査した。分布、例えば、「環状」分布中の「直鎖状」の重なり合いパーセントは、角度を５°の要素に分割し、その後、確率振幅中のカットオフを無限大から、環状分布の９０％がカットオフを越え、１０％がカットオフ未満に残るようになるまで、カットオフを小さくしていくことにより得られる。これにより、許容可能な角度中の１つまたは複数の領域が画定される。この領域内の直鎖状分布のパーセントを次に求めた。この方法は、非相互的であり、通常、数対の分布間で異なる数を与える。
【０３７７】
図３に示されるように、残基１３Ｈの場合、二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮおよびＯ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢにより、直鎖状および環状ペプチド両方のＨＨＱＫ（配列番号１）と、線維中の対応する二面角とが明確に区別される。残基１４Ｈの場合は、二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮおよびＯ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢにより、環状二面角分布が、直鎖状または線維アンサンブル中の対応する分布から明確に区別される。同様に、残基１５Ｑの場合は、二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮおよびＯ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢにより、環状二面角分布が、直鎖状または線維アンサンブル中の対応する分布から明確に区別される。残基１６Ｋの場合は、二面角Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢにより、環状ペプチドが、直鎖状または線維アンサンブルから明確に区別され、二面角Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮにより、環状および直鎖状ペプチドの両方が、線維から明確に区別される。図５Ｂによると、１３Ｈの主鎖ラマチャンドラン角度φおよびψにより、直鎖状および環状ペプチドが線維から明確に区別されるが、直鎖状および環状ペプチド相互には区別されない。１４Ｈの場合には、図５Ｃは、環状ペプチドのラマチャンドラン角度φおよびψは両方共、直鎖状または線維アンサンブルとは異なることを示す。同様に、１５Ｑおよび１６Ｋの場合は、図５ＤおよびＥは、環状ペプチドのラマチャンドラン角度φおよびψは、直鎖状または線維アンサンブル中の角度とは異なることを示す。
【０３７８】
図３に示す二面角分布から、直鎖状ペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は、それぞれの二面角について以下の通りである：１４Ｈ：Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮ、１４％；１５Ｑ：Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢ、１１％；１６Ｋ：Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢ、２８％。全ての重ね合わせ確率を表２に示す。個々の二面角における比較的小さい差異の蓄積が、ペプチドの全体的立体配座の大きく、重要な差異をもたらし、それにより、下記実施例ＶＩＩＩでさらに記載するように、構造的アライメントの大きな片寄りをもたらすことに留意することは重要である。
【０３７９】
線維におけるペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は、それぞれの二面角について、以下の通りである：１３Ｈ：Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢ、０％；１４Ｈ：Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢ、３０％；１５Ｑ：Ｏ−Ｃ−ＣＡ−ＣＢ、４５％；１６Ｋ：Ｃ−ＣＡ−Ｎ−ＨＮ、６％。全ての重ね合わせ確率は、表２を参照されたい。再度、個々の二面角における比較的小さい差異の蓄積が、ペプチドの全体的立体配座の大きく、重要な差異をもたらし、それにより、下記実施例ＶＩＩＩでさらに記載するように、構造的アライメントの大きな片寄りをもたらすことに留意されたい。
【０３８０】
図３に基づいて、表２は、直鎖状、環状および線維（２Ｍ４Ｊ）型中の残基Ｈ１３、Ｈ１４、Ｑ１５、およびＫ１６の主鎖および側鎖角度に対する二面角分布の重なり合いパーセントを、相互と比較して、示す。例えば、列２は、直鎖状ペプチド中の所定の二面角と、環状型の同じ角度との間の重なり合いパーセンテージを示す。
【表４】
2019505166.tif 000012
【０３８１】
上記の側鎖および主鎖二面角分布の解析によると、残基Ｑ１５およびＫ１６は、直鎖状ペプチドおよび線維アンサンブルとの大きい相違を示す。これらの尺度により、Ｑ１５およびＫ１６は、立体配座選択性を付与するエピトープに対する重要な残基であり得る。残基Ｈ１４は、より小さい相違を示すが、立体配座選択性を付与するのを支援し得る。
【０３８２】
図３に示されるデータに基づいて、表３には、環状ペプチド種とそれ以外の種との間に分布の有意差がみられる二面角について二面角分布のピーク値を記載する。表３の列１は、検討した特定の二面角であり、列２は、環状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列３は、直鎖状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列４は、線維構造２Ｍ４ＪにおけるペプチドＨＨＱＫ（配列番号１）の二面角分布のピーク値であり、および列５は、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドに対する二面角分布のピーク値の差異である。
【表５】
2019505166.tif 000013
【０３８３】
Ｖ．側鎖のエントロピー
残基の側鎖のエントロピーは、
【数７】
2019505166.tif 000014
から概算され得る。式中、合計は特定の残基の側鎖の全二面角であり、ｐ（φｉ）は上記で解析した二面角分布である。
【０３８４】
残基側鎖部分のエントロピーの詳細な分析
１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋのそれぞれの二面角のエントロピーを調査した。それぞれの残基の二面角のエントロピーを図４のパネルのＡ〜Ｄにプロットしている。１５Ｑおよび１６Ｋのいくつかの二面角のエントロピーが直鎖状型と比較して減少しており、このことは、直鎖状型およびおそらくモノマーとは異なる傾向がある立体配座においてこれらの角度の形が制約されることを示している。パネルＥは、線維のエントロピー比べた残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋの合計側鎖エントロピー（ラマチャンドラン主鎖角度は含まない）のプロットで、例えば、環状ペプチドのΔＳはＳ（環状）−Ｓ（線維）である。これは、環状ペプチドでは、エントロピーは、線維に比較して増大し、直鎖状ペプチドの１３Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋでは増大するが、１４Ｈでは線維に比較して減少する。加えて、環状ペプチドは直鎖状ペプチドよりも小さいエントロピーを有するように見える。パネルＦは、線維のエントロピーに比べた残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋに対する合計側鎖エントロピー＋ラマチャンドラン主鎖エントロピーのプロットである。これは再度、１５Ｑおよび１６Ｋでは、エントロピーが、線維に比較して増大するが、環状ペプチドは、これらの残基で、直鎖状ペプチドより小さいエントロピーを有し、したがって、より強く拘束されていることを示す。他方では、Ｈ１４は、環状および直鎖状型において、線維より小さいエントロピーを示し、直鎖状型では、全ての内で最小エントロピーを示す。これは、線維は、ペプチドの他の部分を拘束し、実際にＨ１４のエントロピーを増大させることを意味する。再度、パネルＧは、今度は直鎖状モノマーのエントロピーに比べた残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋに対する合計立体配座エントロピーのプロットである。これは、残基Ｈ１３、Ｑ１５、およびＫ１６に対する環状ペプチド中の、直鎖状ペプチドに比べて、減少した立体配座エントロピーを示す。しかし、合計エントロピー減少は、約１ｋＢにすぎない。しかし、このわずかに制限されたセットの立体配座になる確率は、ｅｘｐ（−ΔＳ）≒０．３７未満である。理由は環状立体配座がかなりのエントロピーを有するにしても、二面角の重なり合いにおいて上記し、および下記実施例ＶＩＩＩの構造的重なり合いで記載のように、それらは別々の重なり合わない立体配座分布に対応しているためである。
【０３８５】
環状ペプチドは、残基１５Ｑおよび１６Ｋに関し、直鎖状ペプチドより強固である。エントロピーはＨ１３に関し、全て同等であり、環状ペプチドのエントロピーは、Ｈ１４では、直鎖状から増大し、環状および直鎖状の両エントロピーは、線維のエントロピーより小さく、これは、興味深いことに、線維中のエネルギーの制約がＨ１４のエントロピーの増大をもたらすことを示している。環状ペプチドのエントロピーは、直鎖状ペプチドのエントロピーから約１ｋＢだけ小さくなる。環状ペプチドの側鎖立体配座のエントロピーがより低いことから、選択性を付与するのに役立つ可能性のあるより明確に定められた立体配座の形が裏付けられる。
【０３８６】
ＶＩ．ラマチャンドラン角
エピトープが抗体に対して露出する主鎖配向は、ペプチドが直鎖状型であるか、環状型であるか、または繊維型であるかによって異なる。この相違は、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの両方の各残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋについて、主鎖に沿ってラマチャンドラン角ファイおよびプサイ（またはφおよびψ）をプロットすることにより定量化することができる。配列ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）からなる直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの両方ならびに線維構造２Ｍ４ＪにおけるＨＨＱＫ（配列番号１）の残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋについて平衡シミュレーションでサンプリングしたファイ角およびプサイ角を図５にプロットする。図５、パネルＢから、環状ペプチドの１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋに対する主鎖二面角分布は、直鎖状ペプチドまたは線維に対しサンプリングした二面角の分布とは異なることがわかる。
【０３８７】
環状型の９０％のラマチャンドラン角で重なり合いのある直鎖状型における残基１４Ｈのラマチャンドラン角の確率は１０％であり、線維の環状との対応する重なり合いは、２３％である。環状型と重なり合いのある直鎖状型の残基１３Ｈのラマチャンドラン角の確率は遥かに大きく、７６％である。しかし、環状型（０％）の９０％のラマチャンドラン角で重なり合いのある線維型の確率は無視できる。１５Ｑに対する対応する確率は、それぞれ１０％および２８％である。１６Ｋに対する対応する確率は、それぞれ３２％および１％である。表４を参照されたい。
【表６】
2019505166.tif 000015
【０３８８】
表５は、図５でプロットした、残基１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋに対するラマチャンドラン角のピーク値（最可能値）を示す。残基Ｈ１４、Ｑ１５、およびＫ１６に対する最可能ラマチャンドランφおよびψ値は、環状および直鎖状ペプチドの間で異なる。Ｈ１４の場合、環状分布のピーク値は、（−６５、−４５）度であり、一方、直鎖状および線維分布のピーク値は、それぞれ（−１４５、２０）および（−１１５、１１５）、（−１１５、１５）である。これらのファイおよびプサイ値の環状−直鎖状間の差異は、８０および６５度であり、ファイおよびプサイ値の環状−線維間の差異は、５０、１６０および６０度である。ラマチャンドラン値は、直鎖状と環状ペプチドとの間、および線維と環状ペプチドとの間で大きく異なる。
【０３８９】
表５はまた、Ｑ１５およびＫ１６のファイ、プサイ角度の差異を記載している。Ｑ１５の環状と直鎖状との間の差異デルタ（ファイ）は、９５度であり、Ｑ１５の環状と直鎖状との間の差異、デルタ（プサイ）は、２００度であり、環状と線維との間では、差異は最大４５度である。Ｋ１６の場合、環状と直鎖状との間の差異デルタ（ファイ）は、約１９０度であり、環状と線維との間の差異デルタ（プサイ）は、約５５度である。多くのこれらのピーク二面角値の差異は、環状エピトープ立体配座に対して選択した抗体が直鎖状エピトープおよび線維エピトープに対して低い親和性を有する可能性があることを示している。
【０３９０】
１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋに対するラマチャンドラン主鎖φ、ψ分布のピーク値（最も可能性が高い値）を表５に示す。表５の第１列には、検討した残基が記載されており、この残基は括弧内に示される２つの角ファイおよびプサイを示す。第２列には、直鎖状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）におけるラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されており、第３列には、環状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）におけるラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されており、最終列には、線維構造２Ｍ４Ｊにおけるラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されている。
【表７】
2019505166.tif 000016
【０３９１】
ＶＩＩ．エピトープの溶解度および抗原性
図６、パネルＡは、Ａベータペプチドの天然配列による各アミノ酸の固有溶解度のプロットである。図６、パネルＢは、環状ペプチド、直鎖状ペプチド、および線維の平衡アンサンブル中の各残基の平均溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）のプロットである。これは、環状ペプチド中の残基ＨＨＱＫ（配列番号１）のＳＡＳＡが線維より増大し、加えて、ＳＡＳＡが直鎖状ペプチドより中程度に増大することを示し、より多くの表面が露出され、したがって、抗体結合に接触可能となると可能性があることを示す。露出の増大は、残基Ｋ１６にとって最も重要であり、これは、直鎖状ペプチドに比べてＳＡＳＡの最大の増大を示す。
【０３９２】
図６Ｃは、図６Ａに示す溶解度により重みを付けたＳＡＳＡを示す。重み付け因子は、所定の残基の溶解度からＡベータ線維中の最小溶解度を差し引き、線維中の溶解度の標準偏差で除算することにより得られる。重み付けした溶解度を、環状、直鎖状および線維アンサンブル中の各残基に対しプロットした。図６Ｄは、環状および直鎖状ペプチドの、線維に対する変化および重み付け溶解度を示す。合わせて、これらのプロットは、残基Ｋ１６が顕著に溶媒曝露され、結合に対し接触可能であり、残基Ｈ１３およびＨ１４はまた、結合に対し溶媒曝露されやすいと思われることを示す。
【０３９３】
線維構造中のＨＨＱＫ（配列番号１）の立体配座中の残基に比べて、残基が差次的曝露および抗体結合の利用の最大の可能性を有するということに関し決定的な証拠はないが、図６のプロットは、ヒスチジンＨ１３およびＨ１４を含む全ての残基が抗体結合に対し利用可能でなければならないことを示す。
【０３９４】
ＶＩＩＩ．環状ペプチド立体配座のアンサンブルは直鎖状立体配座または線維立体配座アンサンブルとは異なる方法でクラスター化する
立体配座間に標準的な構造的アライメントの測定基準を用い、次いでクラスタリング解析を実施することにより、配列ＨＨＱＫ（配列番号１）が環状ペプチドにおいて直鎖状ペプチドとは異なる立体配座を提示するという決定的証拠を確認することができる。直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドのＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）ならびにＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｍ４Ｊに対応する構造の完全長線維について立体配座の平衡アンサンブルを得る。これらのアンサンブルから残基ＨＨＱＫ（配列番号１）に関する立体配座のスナップショットを収集し、次いで環状ペプチドアンサンブルの最も大きいクラスター、直鎖状ペプチドアンサンブルの最も大きいクラスター、および線維アンサンブル中のＨＨＱＫ（配列番号１）の最も大きいクラスターの重心を構造的に整列させ、その後、３つの平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の値を記録し、プロットする。ここでは、最大クラスターアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｍａｘｃｌｕｓｔｅｒ）によりクラスタリングを実施する。図９に、直鎖状アンサンブル、環状アンサンブルおよび線維アンサンブルの３つの対応するＲＭＳＤ値を三次元散布図としてプロットする。図９、パネルＡ、Ｂ、Ｃは、３次元散布図の３つの異なる図を示す。
【０３９５】
表６は、直鎖状、環状および線維（２Ｍ４Ｊ）ペプチド立体配座のＲＭＳＤ散布図の重なり合いパーセンテージを示す。列１は、直鎖状型から環状型への重なり合いパーセンテージが極めて小さく、７％にすぎないことを示す。
【表８】
2019505166.tif 000017
【０３９６】
図９および表６から、３つのアンサンブルが互いに異なる方法でクラスター化することは明らかである。特に、環状ペプチド構造のアンサンブルは直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブルとは異なっており、このことは、環状ペプチドエピトープに特異的な抗体が直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブル内で提示される立体配座に対して低い親和性を有する可能性があることを示している。環状ペプチドに対し産生させた抗体は、立体配座選択的であり得、直鎖状または線維立体配座のＡベータよりもオリゴマー型に結合するのが好ましい。アンサンブル間の区別は、いくつかの側鎖と主鎖との間の二面角分布の重なり合いに関係なく行われ、上記の多数の小さい差次的特徴が全体的に異なる立体配座分布に繋がることも多い。
【０３９７】
アンサンブル間の重なり合いを、以下のように計算した。環状アンサンブルと重なり合う直鎖状アンサンブルの比率（パーセント）は、最初にこの３次元ＲＭＳＤ空間の量を長さ０．１Åの立方体要素に分割することにより得られる。その後、カットオフ密度以上の環状分布密度を有する立方体が環状分布の９０％を含むような、環状分布中の点の「カットオフ密度」が得られる。これは、環状分布を含み、外れ値による全てのアーチファクトを取り除く特徴的体積を与える体積（これは不連続であってよい）を決定する。その後、この領域内にある直鎖状分布由来の点の比率が得られる。この方法を用いることにより、直鎖状中の線維、直鎖状中の環状、などに関する重なり合いパーセンテージを得ることが可能である。
【０３９８】
上記方法で得られた数値的重なり合いパーセンテージを表６に示す。特に、環状ペプチドおよび線維ペプチド２Ｍ４Ｊは、０％の重なり合いである。上記方法によると、環状分布内の直鎖状分布の重なり合いは７％であり、直鎖状ペプチドは、約９３％の確率で環状立体配座とは異なるサンプリング状態であることを意味する。
【０３９９】
図９、パネルＤは、本文で記載のように、直鎖状アンサンブルの９０％の線維アンサンブルとの重なり合いパーセントを示し、パネルＥは、直鎖状アンサンブルの９０％の環状アンサンブルとの重なり合いパーセントを示す。この数字は、特に重要である。理由は、これは直鎖状ペプチドが環状ペプチドと一致する立体配座をとる可能性を示すためである。パネルＦは、環状アンサンブルの９０％の直鎖状アンサンブルとの重なり合いパーセントを示す。図９のパネルＧは、線維アンサンブルの９０％の直鎖状アンサンブルとの重なり合いパーセントを示す。数値的重なり合いパーセンテージを表６に示す。さらに、パネルＨは、環状ペプチドアンサンブルの、そのパーセンテージを０％〜１００％変えた場合の、特定のパーセント内の直鎖状ペプチドアンサンブルの重なり合いパーセントを示す。パーセンテージが９０％の場合、重なり合いパーセンテージは、パネルＥおよび表６の収束数値（７％）に等しいことに留意されたい。再度、これは、直鎖状ペプチドが環状様立体配座をとる可能性を決定する。パネルＩは、最初に、カットオフ値、すなわち、合計分布の与えられたパーセンテージが包含されるような、例えば、環状および直鎖状分布に対する合計分布の６０％になる密度カットオフ値、より大きい密度を有する分布の部分を得ることにより決定される、直鎖状と環状との分布の間の相関係数を示す。その後、これらの部分分布に対し、相関係数が下記の通り定義される。
【数８】
2019505166.tif 000018
このように定義された、直鎖状と環状との分布間の相関係数は、１００％のそれぞれの分布が含まれる場合、約７％に収束する。
【０４００】
例えば、図９のパネルＤ〜Ｇは、アンサンブル重なり合い値の収束を示す。図９Ｄは、直鎖状および線維アンサンブルが、０．０４％未満に収束した重なり合いを有することを示す。図９Ｅは、直鎖状アンサンブルが環状アンサンブルと約７％の収束値により重なり合うことを示す。図９Ｆは、環状アンサンブルが直鎖状アンサンブルと３２％の収束値により重なり合うことを示す。図９Ｇは、線維アンサンブルが直鎖状アンサンブルと約０．６％の収束値により重なり合うことを示す。
【０４０１】
図９、パネルＨは、環状ペプチドアンサンブルの、そのパーセンテージを０％〜１００％変えた場合の、特定のパーセント内の直鎖状ペプチドアンサンブルの重なり合いパーセントを示す。パーセンテージが９０％の場合、重なり合いパーセンテージは、パネルＥおよび表６の収束数値（７％）に等しいことに留意されたい。再度、これは、直鎖状ペプチドが環状様立体配座をとる可能性を決定する。
【０４０２】
図９、パネルＩは、最初に、カットオフ値、すなわち、合計分布の与えられたパーセンテージが包含されるような、例えば、環状および直鎖状分布に対する合計分布の６０％になる密度カットオフ値、より大きい密度を有する分布の部分を得ることにより決定される、直鎖状と環状との分布の間の相関係数を示す。その後、これらの部分分布に対し、相関係数が下記の通り定義される。
【数９】
2019505166.tif 000019
このように定義された、直鎖状と環状との分布間の相関係数は、１００％のそれぞれの分布が含まれる場合、約７％に収束する。
【０４０３】
図９、パネルＪは、単一残基欠失の直鎖状アンサンブルと９０％環状アンサンブルとの構造的重なり合いに与える影響を調査する。単一アミノ酸が立体配座選択性を与える場合には、構造的アライメントからそれを除くことにより、分布間でかなり高い重なり合いが生ずるであろう。この試験により、Ｋ１６は、環状ペプチドに対し、最高の立体配座選択性を与え得ものとして優れている。
【０４０４】
図７のパネルＡに、環状ペプチドアンサンブル構造由来の最大クラスターの重心を構成する、環状ペプチドからのＨＨＱＫ（配列番号１）の最も典型的な立体配座の２つの図が黒色で示されている。加えて、最大クラスターの重心を構成する直鎖状ペプチドアンサンブルの最も典型的な立体配座が図７に白色で示され、黒色で示された環状ペプチド上に、ＲＭＳＤを用いてそれらを整列させることにより、最も適切なように重なり合わされ、それらの異なる配向性が明確にされている。図７、パネルＢは、この場合も、ＲＭＳＤを基準にしてそれらを整列させることにより最も適切なように重なり合わされた、完全配列ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）の、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドに対する対応する重心立体配座を示す。
【０４０５】
表７は、環状ペプチドアンサンブルの重心構造、直鎖状ペプチドアンサンブルの重心構造、および線維アンサンブルの重心構造中の１３Ｈ、１４Ｈ、１５Ｑ、および１６Ｋにより占められるラマチャンドラン主鎖および側鎖二面角の値を記載している。図７には、環状および直鎖状重心立体配座がプロットされている。重心構造は、環状立体配座と直鎖状または線維立体配座との間でかなり異なるいくつかの二面角を示す。表７の列１は目的の残基および二面角を示し、列２は環状アンサンブルの重心構造中の二面角の値を示し、列３は直鎖状アンサンブル重心における二面角値を示し、列４は線維アンサンブル重心における二面角の値を示す。多くの環状二面角は、直鎖状または線維重心における対応する二面角とは大きく異なることが明らかである。例えば、残基１６Ｋ中の二面角Ｃ−ＣＡ−ＣＢ−ＣＧは、環状と直鎖状との間で１１０度の差異を示し、環状と線維との間では１１１度の差異を示す。重心構造の二面角は、二面角分布のピーク値と同じである必要はないことに留意されたい。
【表９】
2019505166.tif 000020
【０４０６】
図８は、環状、直鎖状、および２Ｍ４Ｊ線維アンサンブルに対する重心構造を、ここでは、残基ＨＨＱＫ（配列番号１）の表面積表現を用いて、再度示す。抗体に対し提示され得る表面積プロファイルは、重心立体配座間で異なる。図８Ｂは、整列された環状および線維のＨＨＱＫ（配列番号１）のＳＡＳＡ表面（左）、ならびに整列された環状および直鎖状ペプチドのＨＨＱＫ（配列番号１）のＳＡＳＡ表面（右）を示す。パネル８Ｃは、ＨＨＱＫ（配列番号１）の線維単独でのＳＡＳＡ表面を示し、これは、対応する残基の埋没の程度を示している。したがって、Ａベータの直鎖状ペプチド中のこの領域に対し産生された抗体は、環状ＨＨＱＫ（配列番号１）に結合しそうもなく（例えば、等しいまたは類似の選択性を有する）、逆に、環状ＨＨＱＫ（配列番号１）に対し産生された抗体は、Ａベータ中のこの領域に結合しそうもない（例えば、等しいまたは類似の選択性を有する）。
【０４０７】
図１０は、環状アンサンブルがＡベータ線維のその他のいずれかの株と大きくは重なり合わないことを示す。特に、環状ペプチドアンサンブル分布と線維分布との間の重なり合いはゼロである。図１０ＡはＰＤＢ  ２ＭＸＵ（２つの別の図）の結果、図１０ＢはＰＤＢ  ２ＬＭＰの結果、および図１０ＣはＰＤＢ  ２ＬＭＮ（２つの別の図）の結果を示す。
【０４０８】
実施例３
立体配座拘束エピトープを含む環状化合物構築
シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）などのＨＨＱＫ（配列番号１）を含むペプチドは頭−尾環化することができる。
【０４０９】
Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成などの既知の方法を単独で、または他の方法と組み合わせて用い、ＨＨＱＫ（配列番号１）と、好ましくは２個、３個もしくは４個のアミノ酸および／またはＰＥＧ単位を含むリンカーとを含む、直鎖状ペプチドを合成することができる。例えばＨａｍｌｅｙ（２０１４）［６］およびＲｏｂｅｒｔｓら（２０１２）［７］（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているカップリング化学を用いて、ＰＥＧ分子をＮ末端のアミン基に結合させることができる。直鎖状ペプチド化合物は、１）ペプチド＋リンカーのアミノ末端とカルボキシ末端を共有結合させてペプチド結合を形成させること（例えば、主鎖の環化）、２）ペプチド＋リンカー内のアミノ末端もしくはカルボキシ末端と側鎖を共有結合させること、または３）ペプチド＋リンカー内の２つの側鎖を共有結合させることにより環化され得る。
【０４１０】
環状化合物内の結合は、すべて通常のペプチド結合であっても（ホモデティック環状ペプチド）、あるいはエステル結合、エーテル結合、アミド結合もしくはジスルフィド結合などの他のタイプの結合を含んでも（ヘテロデティック環状ペプチド）よい。
【０４１１】
ペプチドをＮ末端もしくはＣ末端またはペプチドの内側にある、例えばシステインおよびホモシステインを含めたチオール含有残基またはメルカプタン含有残基の酸化により環化させ得る。例えば、ペプチドに隣接する２個のシステイン残基を酸化させてジスルフィド結合を形成させ得る。用い得る酸化試薬としては、例えば、酸素（空気）、ジメチルスルホキシド、酸化グルタチオン、シスチン、塩化銅（ＩＩ）、フェリシアン化カリウム、トリフルオロ酢酸タリウム（ＩＩＩ）またはその他の酸化試薬、例えば当業者に公知であり当業者に公知の方法とともに使用し得る酸化試薬などが挙げられる。
【０４１２】
米国特許出願公開第２００９／０２１５１７２号、米国特許出願公開第２０１０／０２４０８６５号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７５５９号には環状ペプチド合成に関連する方法および組成物が記載されており、米国特許第７，５６９，５４１には環化の様々な方法が記載されている。国際公開第０１／９２４６６号およびＡｎｄｒｅｕら，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：９１−１６９にはその他の例が記載されている。
【０４１３】
より具体的には、システイン残基が隣接し、かつ／または挿入されているスペーサーを含むリンカーを付加することにより、ＨＨＱＫ（配列番号１）エピトープを含む環状ペプチドを構築することができる。ペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加した非天然システイン残基の間でジスルフィド結合を形成させることにより、ペプチドを環状立体配座に構築することができる。また、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸の間でペプチド結合を形成させること（例えば、頭−尾環化）により、それを環状化合物に合成することができる。
【０４１４】
ペプチド合成を標準的な製造方法に従いＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（サニーベール、カリフォルニア州、米国）で実施する。
【０４１５】
例えば、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含むペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加したシステイン残基間のジスルフィド結合を用いて、拘束された環状立体配座の立体配座エピトープＨＨＱＫ（配列番号１）を含むシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧＣ）（配列番号１３）環状ペプチドを構築することができる。２つの非天然システイン残基にうち１つをＧＨＨＱＫ（配列番号１１）のＣ末端に、１つをＮ末端に付加した。この２つのシステインを制御された条件下で酸化してジスルフィド架橋を形成させる、または頭部と尾部を反応させてペプチド結合を生じさせる。
【０４１６】
上記の通り、ＡベータオリゴマーのＨＨＱＫ（配列番号１）のアミノ酸主鎖および側鎖の立体配座および配向を模倣するように環状ペプチドの構造を設計した。
シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）
【０４１７】
以下の方法（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）を用いてシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を合成した。標準的な従来のＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成により、保護された直鎖状ペプチドを２−クロロトリチルクロリド樹脂上で合成し、次いで、３０％ＨＦＩＰ／ＤＣＭを用いて樹脂から切断した。低濃度のＥＤＣ．ＨＣｌ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液を用いることにより、保護された直鎖状ペプチドを対応する保護された環状ペプチドに環化した。保護された環状ペプチドをＴＦＡにより脱保護して粗環状ペプチドを得、粗ペプチドをＲＰ  ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後、純粋な環状ペプチドを得た。
【０４１８】
直鎖状ペプチドＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）のアミド縮合によりシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を調製することができる。
【０４１９】
直鎖状化合物Ｃ−ＰＥＧ２−ＨＨＱＫＧ（配列番号３）のアミド縮合によりシクロ（Ｃ−ＰＥＧ２−ＨＨＱＫＧ）（配列番号３）を調製することができる。
【０４２０】
直鎖状化合物ＣＧＨＨＱＫ−ＰＥＧ２（配列番号４）のアミド縮合によりシクロ（ＣＧＨＨＱＫ−ＰＥＧ２）（配列番号４）を調製することができる。
【０４２１】
直鎖状（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を調製した（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）。標準的な従来のＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成により、保護された直鎖状ペプチドをＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂上で合成し、次いで、保護されたペプチドをＴＦＡにより切断して粗ペプチドを得、粗ペプチドをＲＰ  ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後、純粋なペプチドを得、これを用いてＢＳＡをコンジュゲートした。
【０４２２】
免疫原構築
環状化合物シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を上記の通りに合成し、次いでＢＳＡおよび／またはＫＬＨとコンジュゲートした（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）。ＰＢＳ緩衝液に溶かしたＳＭＣＣによりＢＳＡまたはＫＬＨを再活性化し、次いで、純粋なペプチドをＰＢＳ緩衝液に溶かした溶液をコンジュゲーション混合物に加え、コンジュゲーション混合物を室温で２時間攪拌した。次いで、コンジュゲーション混合物を透析後に凍結乾燥させて、コンジュゲーション産物を得た。
【０４２３】
実施例４
抗体の生成および選択
立体配座拘束化合物、任意選択で環状化合物、例えばシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）ペプチドなどのＨＨＱＫ（配列番号１）を含む環状ペプチドなどとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とを結合させる。シクロペプチドシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を記載のように作製し、カナダ動物管理協会により承認されたプロトコルに従ったマウスモノクローナル抗体作製のために（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＬＴＤ（ビクトリア、ブリティッシュコロンビア州、カナダ））に送付した。マウス血清を、抗体の産生に使用した立体配座ペプチドを用いてスクリーニングしたが、しかし、ＢＳＡと結合した関連ペプチド、例えば、シクロ（ＣＧＨＨＱＫ−ＰＥＧ２）−ペプチド（配列番号４）を用いても同様にスクリーニングできる。
【０４２４】
実施例６にさらに記載するように、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を含む免疫原を用いてハイブリドーマを作製した。ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲにより、本明細書に記載される直鎖状（非構造化）ペプチドよりもシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）ペプチドと優先的に結合するハイブリドーマ上清をスクリーニングした。陽性ＩｇＧ分泌クローンを大規模生産およびプロテインＧを用いるさらなる精製に供する。
【０４２５】
実施例５
斑／線維との結合の有無の評価
免疫染色には、本明細書に記載される抗体、陽性対照の６Ｅ１０（１μｇ／ｍｌ）およびアイソタイプ対照の、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ（１μｇ／ｍｌ、Ａｂｃａｍ社）を一次抗体として用いる。切片を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３×５分間洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００、ＥＣＬ社）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ−Ｔで３×５分間洗浄する。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスする。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を５０倍、２００倍および４００倍の倍率で記録する。
【０４２６】
実施例６
方法および材料
免疫原
米国カリフォルニア州サニーベールのＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社でペプチドを作製した（環状および直鎖状両方）。トリフルオロ酢酸対イオンプロトコルを用いてペプチドをＫＬＨ（免疫感作用）およびＢＳＡ（スクリーニング用）とコンジュゲートした。ペプチドを脱塩し、ＭＳおよびＨＰＬＣにより確認し、純度９５％であると判断された。ペプチドをＩＰＡ社に発送し、マウスを用いたモノクローナル抗体の作製に使用した。
【０４２７】
抗体
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体をいくつか作製した。
【０４２８】
５０日齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ケベック州）を免疫感作した。抗原を含有するがアジュバントは含有しない一連の皮下水性注射剤を１９日間にわたって投与した。環状ペプチド−ＫＬＨの０．５ｍｇ／ｍＬ無菌生理食塩水溶液の注射によりマウスを１匹当たり１００μｇのペプチドで免疫感作した。マウスをＬａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社の換気ラックシステムで飼育した。第１９日、マウス全４匹を安楽死させ、ハイブリドーマ細胞系の作製用にリンパ球を回収した。
【０４２９】
融合／ハイブリドーマの発育
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）の存在下でマウスＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。融合した細胞をＨＡＴ選択を用いて培養した。この方法では、半固形メチルセルロース系ＨＡＴ選択培地を用いてハイブリドーマ選択とクローン化とを１つの段階に組み合わせる。半固形培地上で単一細胞由来のハイブリドーマが増殖してモノクローナルコロニーを形成した。融合事象から１０日後、得られたハイブリドーマクローンを９６ウェル組織培養プレートに移し、中期対数増殖期に達するまで（５日）ＨＴ含有培地で増殖させた。
【０４３０】
ハイブリドーマの解析（スクリーニング）
ハイブリドーマの組織培養上清を間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニング抗原（環状ペプチド−ＢＳＡ）（一次スクリーニング）で試験し、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ二次抗体を用いてＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の両方について探索し、ＴＭＢ基質で発色させた。このアッセイで０．２ＯＤ超であったクローンを次の試験ラウンドに進めた。陽性培養物をスクリーニング抗原で再試験して分泌を確認し、無関係の抗原（ヒトトランスフェリン）で再試験して非特異的ｍＡｂを除去し、偽陽性を除外した。抗体捕捉ＥＬＩＳＡにより目的とする全クローンにアイソタイピングを実施して、それらがＩｇＧアイソタイプであるのか、またはＩｇＭアイソタイプであるのかを判定した。また、目的とする全クローンを間接ＥＬＩＳＡにより他の環状ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートおよび直鎖状ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートで試験して、交差反応性を評価した。
【０４３１】
ＢＳＡとコンジュゲートしたシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）を用いた間接ＥＬＩＳＡにより、マウスハイブリドーマ抗体をスクリーニングした。
【０４３２】
ＥＬＩＳＡ抗体スクリーニング
簡潔に述べれば、ＥＬＩＳＡプレートを４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）コンジュゲートＢＳＡ  １００ｕＬ／ウェルでコートし、脱脂粉乳の３％ＰＢＳ溶液を用いて室温で１時間ブロックした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質３，３’，５，５’，−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０４３３】
さらなる試験のため陽性クローンを選択した。マウスＨＨＱＫ（配列番号１）ハイブリドーマの陽性クローンを間接ＥＬＩＳＡにより、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）コンジュゲートＢＳＡおよびヒトトランスフェリン（ＨＴ）に対する反応性について試験した。プレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；または２）３７℃のｄＨ２Ｏ  Ｏ／Ｎ中０．２５ｕｇ／ウェルのＨＴ抗原５０ｕＬ／ウェルでコートした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質３，３’，５，５’，−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０４３４】
ＥＬＩＳＡによるシクロと直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）化合物の選択性
ＥＬＩＳＡプレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；２））４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧコンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；または３）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの陰性ペプチド１００ｕＬ／ウェルでコートした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０４３５】
アイソタイピング
抗体捕捉実験を用いてハイブリドーマ抗体にアイソタイピングを実施した。捕捉プレートをｐＨ９．６の炭酸塩コーティング緩衝液中、４℃で一晩、１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）抗体でコートした。ブロッキング段階は用いなかった。一次抗体（ハイブリドーマ上清）を加えた（１００ｕｇ／ｍＬ）。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：５，０００ヤギ抗マウスＩｇＧγ−ＨＲＰまたは１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ−ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０４３６】
ＳＰＲ結合アッセイ−一次および二次スクリーニング
抗体とＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーとの結合に関するＳＰＲ解析
Ａベータモノマーおよびオリゴマー調製
氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）にＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーの調製組換えＡベータ４０およびＡベータ４２ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国）を溶かした。一晩蒸発させることによりＨＦＩＰを除去し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心機で乾燥させた。モノマーの調製には、ペプチド薄膜をＤＭＳＯで戻して５ｍＭとし、ｄＨ２Ｏでさらに１００μＭに希釈し、直ちに使用した。５ｍＭのＤＭＳＯペプチド溶液を無フェノールレッドＦ１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）で希釈して最終濃度１００μＭとすることによりオリゴマーを調製し、４℃で２４時間〜７日間インキュベートした。
【０４３７】
ＳＰＲ解析
ＳＰＲ解析高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ−１）（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて、全ＳＰＲ測定を実施した。ＳＰＲ直接結合アッセイを用いて組織培養上清の一次スクリーニングを実施し、このアッセイでは、Ｈｉｇｈ  Ａｍｉｎｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＡＣ）センサーチップ（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）の個々のフローセル上にＢＳＡコンジュゲートペプチド、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、表面に抗体を流した。二次スクリーニングでは、プロテインＧで精製したｍＡｂをＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いて解析し、このアッセイでは、プロテインＡ誘導体化センサーチップ（ＸａｎＴｅｃ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ社、デュッセルドルフ、ドイツデュッセルドルフ、ドイツ）上に抗体を捕捉し、表面にＡベータ４０モノマー、Ａベータ４２オリゴマー、可溶性脳抽出物および脳脊髄液を流した。ＳＰＲ直接結合アッセイで、ＨＡＣセンサーチップの個々のフローセル上にＡベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、精製ｍＡｂを流すことにより抗体の特異性を検証した。
可溶性脳抽出物およびＣＳＦ試料のＳＰＲ解析
【０４３８】
可溶性脳抽出物およびＣＳＦ調製物
可溶性脳抽出物およびＣＳＦの調製
ＵＢＣ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｃｌｉｎｉｃで評価した患者からヒトの脳組織およびＣＳＦを採取した。推定ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準［５］に基づくものである。腰椎穿刺後１時間以内にＣＳＦをポリプロピレンチューブに収集し、処理し、１００μＬポリプロピレンバイアルに等分し、−８０℃で保管する。
【０４３９】
ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳ（カナダケベック州ラヴァルのＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社の無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルを添加したもの）に浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）する。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかける（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、−８０℃で保管する。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求める。
【０４４０】
ＳＰＲ解析
ＳＰＲ解析ＡＤ患者４例および同年齢の対照４例の脳抽出物ならびにＡＤ患者９例および同年齢の対照９例のＣＳＦ試料をプールし解析した。プロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に精製ｍＡｂを捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
【０４４１】
Ａベータモノマーとの結合の有無の評価
組織培養上清の一次スクリーニングでは、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを直接結合アッセイに用いた。二次スクリーニングでは、Ａベータ４０モノマーおよびＡベータ４２オリゴマー、可溶性脳抽出物およびＣＳＦ試料を間接（捕捉）結合アッセイに用いた。
一次スクリーニング
【０４４２】
コグネイト環状ペプチドに対する抗体の結合の有無について組織培養上清をスクリーニングした。各試料を希釈し、固定化したペプチドおよびＢＳＡ参照の表面に１２０秒間、二重反復で注入し、次いで、３００秒間の解離相にのみランニング緩衝液を注入した。解析サイクル毎に、センサーチップ表面を再生した。ＢＳＡ参照表面およびブランクランニング緩衝液注入から結合を減算することによりセンサグラムを二重参照し、解離相の結合応答報告点を収集した。
【０４４３】
オリゴマー結合アッセイ
次の合成Ａベータ４２オリゴマーを上記の通りに作製および固定化し、抗体結合応答を解析した。Ａベータ４２オリゴマーに対する抗体結合応答を環状に対する結合応答と比較した。
【０４４４】
Ａベータオリゴマーとの結合の検証。
Ａベータ４２オリゴマー結合をさらに検証および確認するため、抗体を共有結合で固定化し、次いで、市販の調製済みの安定なＡベータ４２オリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー、フランス）を表面に注入した。
【０４４５】
結果
ＥＬＩＳＡ試験では、ハイブリドーマクローンの大部分がシクロペプチドと結合することがわかった。
次のクローンをシクロおよび直鎖状ＨＨＱＫ（配列番号１）化合物に対する結合選択性についてＥＬＩＳＡにより試験した。複数のクローンがＣＧＨＨＱＫＧコンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）よりも優先的にシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）と結合した。
【０４４６】
アイソタイピングでは、クローンの大部分がＩｇＧ１クローン、ＩｇＧ２ａクローンおよびＩｇＧ３クローンを含めたＩｇＧであることがわかった。ＩｇＭクローンおよびＩｇＡクローンも複数同定されたが、それ以上追究しなかった。
【０４４７】
表面プラズモン共鳴を用いた直接結合解析を実施して、配列番号２の環状ペプチドと結合する組織培養上清中の抗体についてスクリーニングした。結果を図１１および表８に示す。
【０４４８】
図１２は、ＳＰＲ直接結合アッセイ結果とＥＬＩＳＡ結果の間の相関をプロットしたものであり、直接結合の結果とＥＬＩＳＡの結果との間に相関があることを示している。
【０４４９】
上記の通りに調製した環状ペプチド、直鎖状ペプチド、Ａベータ１〜４２モノマーおよびＡベータ１〜４２オリゴマーとの結合能についてクローンを再試験した。上記のＳＰＲを用いて結合アッセイを実施した（直接結合アッセイ）。表８に示すように、実施した結合アッセイに基づきクローンをいくつか選択した。
【０４５０】
選択したクローンはＩｇＧ  ｍＡｂであった。一次スクリーニングの負の数は結合がみられなかった（例えば、アイソタイプ対照未満であった）ことを示している。
【表１０】
2019505166.tif 000021
【０４５１】
ＥＬＩＳＡプレスクリーニング
ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡプレスクリーニングにより、直鎖状ペプチドと比較して環状ペプチドとの結合の増大を示すクローンを特定した。そのクローンの一部はＫＬＨ−エピトープリンカーペプチドに対して反応性であった。これらはさらなる検討から除外した。本明細書に記載されるアイソタイピング法を用いて、クローンの大部分がＩｇＧアイソタイプであることが明らかになった。
【０４５２】
表面プラズモン共鳴により測定する直接結合−一次スクリーニング
表面プラズモン共鳴を用いて、抗体クローンを含有する組織培養上清を環状ペプチド、直鎖状ペプチド、ＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーとの直接結合について試験した。
【０４５３】
一次スクリーニングの結果を図１１に示す。パネルＡは環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドとの結合を示している（非構造化）。パネルＢはＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーとの結合を示している。環状ペプチドに対しては、いくつかのクローンが反応性の増大を示し、直鎖状ペプチドに対しては、いずれのクローンも反応性が最小限であるか、または反応性を全く示さない。全体的にＡベータオリゴマー結合に対する選択性がみられる。モノマー反応性は、大部分のクローンがほぼ０または０未満である。
【０４５４】
図１３に、選択したクローンの結合プロファイルを比較して示す。表面プラズモン共鳴を用いて、環状ペプチド（構造化）、直鎖状ペプチド（非構造化）、ＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーにおける特定のエピトープに対する直接結合について各クローンを評価する。アスタリスクで示される対照には、非構造化エピトープ（例えば、直線状エピトープ）に対して優先的に反応性を示すクローンを選択した。
【０４５５】
図１２は、クローン組織培養上清のＳＰＲ直接結合アッセイ結果およびＥＬＩＳＡ結果の結果をプロットしたものであり、直接結合の結果とＥＬＩＳＡの結果との間に相関があることを示している。
【０４５６】
実施例７
二次スクリーニング
免疫組織化学
固定も抗原回復も実施していない凍結ヒト脳切片に免疫組織化学を実施した。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ  Ｃａｎａｄａ社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）と１時間インキュベートすることにより非特異的結合をブロックした。免疫染色には以下の一次抗体を使用した：マウスモノクローナルアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂならびに抗アミロイドβ６Ｅ１０（以上、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入）ならびにシクロペプチドに対して反応性を示す選択した精製クローン。いずれの抗体も１μｇ／ｍＬで使用した。切片を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３×５分間洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００、ＥＣＬ社）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ−Ｔで３×５分間洗浄した。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスした。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を２０倍および４０倍の倍率で記録した。Ａｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏｓｈｏｐでＬｅｖｅｌｓ  Ａｕｔｏ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いて画像を最適化した。
【０４５７】
ＣＳＦおよび脳抽出物
ＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ（Ｃ０４−０５９５）から承認を受け、メリーランド大学のＢｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋからヒト脳組織を入手した。ＵＢＣ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌｉｎｉｃ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓで評価した患者からＣＳＦを採取した。この試験はＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄにより承認を受けたものであり、ＣＳＦ試料を収集する前に参加者または法律上の近親者から書面による同意を得た。推定ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準に基づくものとした。腰椎穿刺後１時間以内にＣＳＦをポリプロピレンチューブに収集し、処理し、１００μＬポリプロピレンバイアルに等分し、−８０で保管した。
【０４５８】
ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳおよびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（ラヴェル、ケベック州、カナダ）の無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルに浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）した。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかけた（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、−８０℃で保管した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求めた。
【０４５９】
ＣＳＦ：ＡＤを有するドナー９例およびＡＤを有さないドナー９例からＣＳＦをプールした。精製ＩｇＧを全抗体とも３０マイクログラム／ｍｌの濃度で用いて、試料をＳＰＲにより解析した。マウスＩｇＧを抗体対照として使用し、いずれの実験も少なくとも２回反復した。
【０４６０】
抗体６Ｅ１０を用いてＣＳＦおよび脳抽出物での陽性結合を確認した。
ＳＰＲ解析：ＡＤ患者の脳抽出物４例および同年齢の対照の脳抽出物４例をプールし解析した。ＴＢＳ中でホモジナイズした脳試料には前頭皮質のブロードマン第９野が含まれていた。いずれの実験も、高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーである、実施例６に記載のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ−１）（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて実施した。本明細書に記載されるシクロペプチドに対して作製した精製抗体をプロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
【０４６１】
結果
ＣＳＦ脳抽出物および免疫組織化学
いくつかのクローンをＣＳＦ、可溶性脳抽出物中でのＡベータとの結合能について試験し、死体ＡＤ脳の組織試料を表９に示す。表９では陽性度がプラス印の数により示されている。
【０４６２】
表９および表１０は、選択したクローンが本明細書に記載されるＳＰＲによる測定でモノマーよりもオリゴマーに対して結合選択性を有することのデータとなる。
【０４６３】
表９にはＩＨＣの結果もまとめてあり、ここでは、「＋／−」は、アイソタイプ対照と類似した染色またはアイソタイプ対照と異なる染色であるが明確な斑形態はみられないことを表す。
【０４６４】
６Ｅ１０抗体でみられる陽性斑染色と比較して、クローン３０１−１７（１２Ｇ１１）では新鮮な凍結切片上に斑染色がみられない例を図１４に示す。
【０４６５】
ＨＨＱＫ（配列番号１）を含むシクロペプチドに対して産生させた抗体が、モノマーよりもＡベータオリゴマーと優先的に結合し、ＡＤ患者の脳抽出物および／またはＣＳＦ中のＡベータとも優先的に結合することを図１５に示す。
【０４６６】
表９、１０ならびに図１４および１５に示されるように、ＨＨＱＫ（配列番号１）を含むシクロペプチドに対して産生させた多くの抗体は、脳抽出物および／またはＣＳＦ中のＡベータと結合したが、ＳＰＲではモノマーとあまり結合せず、ＩＨＣによる斑線維とあまり結合しなかった。
【表１１】
2019505166.tif 000022
＊スコアリングは同じ試料カテゴリーで他のクローンに対して相対的なものである。
【表１２】
2019505166.tif 000023
【０４６７】
実施例８
合成オリゴマー結合
共有結合で固定化した抗体との結合について市販の調製済み合成アミロイドベータオリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー）の連続２倍希釈物（７．８ｎＭ〜２０００ｎＭ）を試験した。対照抗体ｍＡｂ６Ｅ１０の結果を図１６Ａに示し、マウス対照ＩｇＧの結果を図１６Ｂに示す。シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）に対して産生させた抗体を用いた結果を図１６Ｃに示す。
【０４６８】
実施例９
ホルマリン固定組織での免疫組織化学
ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）に対して産生させた抗体を用いてヒト脳組織を評価した。患者はそれまでに、（ｉ）老人斑および神経原線維濃縮体を示すビルショウスキー銀法、（ｉｉ）アミロイドを示すコンゴーレッドならびに（ｉｉｉ）濃縮体を示し老人斑が「神経突起性」であることを確認するタウ免疫組織化学法の３部よりなる方法でアルツハイマー病であることが特徴付けられ診断されていた。この組織を用いて、選択したモノクローナル抗体クローンの斑反応性を試験した。脳組織を１０％緩衝ホルマリンで数日間固定し、Ｓａｋｕｒａ  ＶＩＰ組織処理装置でパラフィン処理した。組織切片にマイクロ波による抗原回復（ＡＲ）を実施するか、または実施せずに、１μｇ／ｍｌの抗体で探索した。陽性対照として、汎アミロイドベータ反応性抗体６Ｅ１０を選択した抗体クローンと同時にインキュベートした。抗体を抗体希釈剤（Ｖｅｎｔａｎａ社）で希釈し、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ（Ｖｅｎｔａｎａ社）で発色させた。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ  ＩＨＣ染色装置で染色を実施した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４５顕微鏡で画像を取得した。画像は神経病理学の専門知識を有する専門の病理学者が盲検的に解析した。
【０４６９】
下の表１１に示されるように、固定組織を用いると、被験抗体は抗原回復の有無を問わず、老人斑アミロイドの特異的染色が陰性であった。陽性対照には６Ｅ１０を用いた。
【表１３】
2019505166.tif 000024
【０４７０】
実施例１０
オリゴマー伝播の阻害
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイを用いてアミロイドベータ（Ａβ）凝集に対する抗体の効果を検討することにより、その生物学的機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。Ａβ凝集は、予め形成された小さいＡβオリゴマーの核によって誘導され、この核を介して伝播し、単量体Ａβから可溶性オリゴマー、次いで不溶性線維への全過程には同時に、ベータシート形成の増大が伴う。このことはベンゾチアゾール塩のＴｈＴによってモニターすることができ、ＴｈＴがベータシートに富む構造に結合すると、その励起および発光の最大値がそれぞれ３８５ｎｍから４５０ｎｍおよび４４５ｎｍから４８２ｎｍに遷移し、それにより蛍光が増大する。簡潔に述べれば、Ａβ１〜４２（Ｂａｃｈｅｍ  Ａｍｅｒｉｃａｓ社、トーランス、カリフォルニア州）を可溶化し、超音波処理し、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、黒色の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社、モンロー、ノースカロライナ州）のウェルに加え、これに等体積のシクロペプチドに対する抗体または無関係のマウスＩｇＧ抗体アイソタイプ対照を加え、Ａβ１〜４２ペプチドと抗体のモル比を１：５とした。ＴｈＴを加え、プレートを室温で２４時間インキュベートし、１時間毎にＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてＴｈＴ蛍光測定値（４４０ｎｍ励起、４８６ｎｍ発光）を記録した。全ウェルからバックグラウンド緩衝液の蛍光読取り値を減算し、さらに、対応するウェルから抗体単独のウェルの読取り値を減算した。
【０４７１】
図１７に示されるように、ＴｈＴ蛍光によりモニターしたＡβ４２凝集は、蛍光が最小である最初の遅滞期、蛍光が急激に増大する対数期および最後にＡβ分子種が平衡状態にあり蛍光の増大がみられないプラトー期を特徴とするＳ字形を示した。Ａβ４２と無関係のマウス抗体との共インキュベーションでは、凝集過程に対する有意な効果が全くみられなかった。これに対し、Ａβ４２と被験抗体との共インキュベーションでは、凝集過程のいずれの期も阻害された。図１７には抗体クローン１７（１２Ｇ１１；ＩｇＧ３アイソタイプ）で得られた結果を示す。ＴｈＴ凝集アッセイは、ＡＤの病理発生に極めて重要なＡβ伝播およびモノマー、オリゴマー、前原線維および線維からのＡβ凝集のｉｎ  ｖｉｖｏの生物物理学的／生化学的段階を模倣するものであることから、シクロＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号２）に対して産生させた抗体はこの過程を完全に打ち消す可能性を秘めている。マウスＩｇＧ対照抗体を用いて実施したアイソタイプ対照では阻害はみられなかった。
【０４７２】
実施例１１
アルツハイマー病の免疫療法に最適なプロファイルの達成：毒性Ａベータオリゴマーに特異的な抗体の合理的作製
【０４７３】
目的：毒性アミロイドβオリゴマー（ＡβＯ）に特異的な抗体を作製すること
【０４７４】
背景：現時点での証拠から、ＡβＯの伝播性プリオン様株は、モノマーおよび線維とは対照的に、ニューロンに対して優先的に毒性を示し、アルツハイマー病（ＡＤ）のタウ病態を誘発することが示唆される。さらに、臨床試験では、用量制限有害作用がＡβ線維認識と関係があることがわかっている。これらの観察結果から、安全性および有効性のためには毒性ＡβＯの特異的中和が望ましいものであり得ることが示唆される。
【０４７５】
設計／方法：本明細書に記載されるように、標準力場による分子動力学を用いてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅに蓄積されているＡβ線維の原子レベルの構造を攪乱するコンピュータシミュレーションを用いた。新生前原線維またはオリゴマーではわずかに安定な領域が露出する可能性が高いという仮説を立てた。オリゴマーにおいて提示される場合とモノマーまたは線維において提示される場合の抗原性プロファイルの差を定量化するクラスタリング解析、曲率、溶媒への露出、溶解度、二面角分布およびラマチャンドラン角分布をすべて用いて予測エピトープの立体配座特性を特徴付けた。局所的なＡβＯ立体配座を模倣し得る環状フォーマットで候補ペプチドエピトープを合成し、担体タンパク質とコンジュゲートし、マウスでのモノクローナル抗体作製に用いた。精製した抗体をＳＰＲおよび免疫組織化学によりスクリーニングした。
【０４７６】
結果：
コグネイト構造化ペプチドおよび合成ＡβＯを認識することが可能であり、非構造化ペプチド、リンカーペプチドまたはＡβモノマーとはほとんどまたは全く結合しないことに基づき、５種類の予測エピトープに対するＩｇＧクローンを６６種類選択し精製した。
さらなるスクリーニングにより、対照と比較してＡＤ患者のＣＳＦおよび脳抽出物中の天然の可溶性ＡβＯと優先的に結合する抗体を特定した。ＡＤ脳の免疫組織化学的解析により、斑と反応しない抗体クローンを選択することができた。
【０４７７】
結論：コンピュータにより特定したＡβＯエピトープにより、天然のＡＤ  ＡβＯと選択的に結合しモノマーにも線維にも有意な交差反応性を示さないという所望の標的プロファイルを有する抗体を作製することができた。
【０４７８】
実施例１２
毒性阻害アッセイ
シクロペプチドに対して産生させた抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性の阻害をラット一次皮質ニューロンアッセイで試験することができる。
【０４７９】
抗体および対照ＩｇＧをそれぞれ２ｍｇ／ｍＬなどの濃度に調節する。様々なモル比のＡベータオリゴマーと抗体を溶媒対照、Ａベータオリゴマー単独および神経保護ペプチドのヒューマニンＨＮＧなどの陽性対照とともに試験する。
【０４８０】
例示的設定を表１２に示す。
【０４８１】
室温で１０分間プレインキュベートした後、体積を培地で８４０マイクロリットルに調節する。この溶液を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、溶液を一次皮質ニューロンに直接添加し、細胞を２４時間インキュベートする。ＭＴＴ試験を用いて細胞生存率を求めることができる。
【表１４】
2019505166.tif 000025
【０４８２】
この試験は、３０１抗体クローン１７を用いて実施した。抗体単独は、最高の濃度（１／２  オリゴマー／抗体比率）で若干の毒性を示し、抗体調製物のエンドトキシン混入によると思われるが、より低い濃度（１／１および５／１  オリゴマー／抗体比率）で添加した場合は、Ａベータオリゴマー毒性の抑制が示された（図１８）。
【０４８３】
実施例１３
ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性阻害アッセイ
シクロペプチドに対して産生させた抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性の阻害をマウス行動試験でｉｎ  ｖｉｖｏで試験することができる。
【０４８４】
マウスの脳室内（ＩＣＶ）に注射する前に、抗体およびアイソタイプ対照をそれぞれＡベータ４２オリゴマーと２以上の様々なモル比で予め混合する。対照群には、溶媒単独を注射するマウス、オリゴマー単独を注射するマウス、抗体単独を注射するマウスおよび神経保護ペプチドのヒューマニンなどの陽性対照を注射するマウスを含める。あるいは、抗体をオリゴマーのＩＣＶ注射前、注射時および／または注射後に全身投与してもよい。オリゴマーのＩＣＶ注射から約４〜７日後に開始して、マウス空間認識試験（ＳＲＴ）、Ｙ迷路試験、モーリス水迷路モデルおよび新奇物体認識モデル（ＮＯＲ）などの学習および記憶に関する行動試験で認知を評価する。
【０４８５】
マウス空間認識試験（ＳＲＴ）は、海馬機能の尺度である地理的記憶を評価するものである（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。このモデルでは２チャンバの装置を使用し、この装置のチャンバは形状、模様および色が異なっている（すなわち、地理的差）。チャンバは透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ製の廊下で繋がっている。最初に個々のマウスを探索期の５分間、一方のチャンバにのみアクセスできる装置の中に入れておく。次いで、マウスをホームケージに３０分間戻し、「選択」期の５分間、再び装置の中に入れ、その間、マウスは両方のチャンバにアクセスできる。正常な認知機能を有するマウスは前回探索したチャンバを記憶しており、新規なチャンバで費やす時間の方が長い。ＤＩ＝（ＴＮ−ＴＦ）／（ＴＮ＋ＴＦ）で識別指数（ＤＩ）を算出し、式中、ＴＮは新規なチャンバで費やした時間の量であり、ＴＦは馴染みのあるチャンバで費やす時間の量である。毒性ＡベータオリゴマーによりＤＩの低下が起こるが、ヒューマニン陽性対照により一部レスキューされ得る。ＩＣＶ注射後の様々な時間におけるこの試験の成績を用いて、シクロペプチドに対して産生させた抗体がＡベータオリゴマー毒性をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する可能性を評価することができる。
【０４８６】
Ｙ迷路試験（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）は、主として前頭前皮質（作業記憶）および海馬（空間構成要素）が仲介する空間作業記憶の試験である。マウスが２本の腕を探索することができるＹ字形の迷路の中にマウスを置く。短期記憶が無傷なマウスは連続試行で交互に２本の腕に行く。毒性ＡベータオリゴマーをＩＣＶ注射したマウスは認知に障害がみられ、ランダム値５０％（これに対し正常個体は約７０％）付近の交互のランダム行動を示す。この障害は、コリンエステラーゼ阻害剤ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）またはヒューマニンによりそれぞれ部分的または全面的に正常に戻る。この試験により、被験抗体のＡベータオリゴマー毒性に対する防御活性に関してまた別のｉｎ  ｖｉｖｏ評価ができる。
【０４８７】
モーリス水迷路はまた別の広く認められている認知モデルであり、主として海馬機能に依存する空間学習および長期地理的記憶を検討するものである（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。マウスを複数回の試行で、不透明な水面の下に隠したプラットフォームを見つけるよう訓練する。プラットフォームの位置の想起に関するマウスの学習成績は、視覚的な手掛かりおよび記録したビデオに基づく。マウスを水に放ってからプラットフォームを見つけるまでの時間は着実に短縮され、これをマウスの学習速度とし、複数日にわたって測定する。認知が正常なマウスでは、プラットフォームを見つけるのに必要な時間が連日短縮される（学習）。長期記憶の解析には、訓練後に試験を複数日反復する。つまり、プラットフォームを取り去り、以前のプラットフォームの位置の上を横切る回数または最初に横切るまでの時間を長期記憶を評価する尺度として用いる。毒性ＡベータオリゴマーをＩＣＶ注射したマウスは、学習および長期記憶の両方に欠陥がみられ、被験抗体の防御活性を評価するためのモデルとなる。
【０４８８】
新奇物体認識（ＮＯＲ）モデルは、新奇な物体を既知の物体より有意に長い時間をかけて調べるというげっ歯類の正常な行動を利用するものであり、この行動は主として嗅周皮質機能に依存する（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。習得試行でマウスまたはラットに２つの同一の物体を探索させる。短時間の試行間間隔の後、一方の物体を新奇な物体に置き換える。動物を活動領域に戻し、各物体を能動的に探索して費やした時間を記録する。正常なげっ歯類は馴染みのある物体を思い出し、新奇な物体の方の探索に有意に長い時間を費やす。これに対し、Ａベータオリゴマー処置したげっ歯類は明確な認知障害を示し、「馴染みのある」物体と「新奇な」物体の両方の探索に同程度の時間を費やす。これは、既知の臨床認知機能改善薬（例えば、ドネペジル）により一時的に正常に戻すことができる。ＮＯＲ試験を縦断研究で複数回実施して、被験抗体の認知に対する潜在的な有益性を評価することができる。
【０４８９】
行動試験に加え、脳組織を収集し、シナプスマーカー（ＰＳＤ９５、ＳＮＡＰ２５、シナプトフィジン）および炎症マーカー（ＩＬ−１ベータ）のレベルを解析することができる。オリゴマーのＩＣＶ注射から約１４日後にマウスを屠殺し、生理食塩水を灌流する。海馬を収集し、急速凍結し、解析まで−８０℃で保管する。ホモジナイズした試料のタンパク質濃度をＢＣＡにより求める。ＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ社、米国）を用いてシナプスマーカーの濃度を求める。シナプスマーカーは通常、Ａベータオリゴマーを注射したマウスで２５〜３０％減少し、ヒューマニン陽性対照により９０〜１００％に回復する。ＩＬ−１ベータ炎症性マーカーの濃度は、Ａベータオリゴマーを注射したマウスで約３倍になり、この増大はヒューマニンによって大幅に抑えられる。これらのアッセイは、被験抗体の防御活性に関する分子レベルでのまた別の尺度となる。
【０４９０】
実施例１４
ｉｎ  ｖｉｖｏ伝播阻害アッセイ
Ａベータ毒性オリゴマーのｉｎ  ｖｉｖｏの伝播およびそれに関連する病態を様々なアルツハイマー病（ＡＤ）げっ歯類モデルで研究することができる。例えば、ヒトＡＰＰのトランスジェニックマウス（例えば、ＡＰＰ２３マウス）またはヒトＡＰＰとＰＳＥＮ１のトランスジェニックマウス（ＡＰＰＰＳ１マウス）は高レベルのＡベータを発現し、加齢とともに炎症および神経損傷を伴うアミロイド沈着が徐々にみられるようになる。オリゴマー含有脳抽出物の脳内接種によりこの過程を大幅に加速させることができる（１３、１４）。これらのモデルは、脳内または全身に投与した被験抗体によるＡベータオリゴマー伝播の阻害を研究するためのシステムとなる。
【０４９１】
実施例１５
ＣＤＲシーケンシング
ＩｇＧ３重鎖とカッパ軽鎖とを有することが明らかになった３０１−１２Ｇ１１を重鎖および軽鎖のＣＤＲおよび可変領域として選択した。
【０４９２】
５’ＲＡＣＥならびに適切なマウス免疫グロブリンの重鎖（ＩｇＧ１／ＩｇＧ３／ＩｇＧ２Ａ）および軽鎖（カッパ）の可変領域配列を増幅する遺伝子特異的逆方向プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０４９３】
シーケンシング用に特異的バンドを切り取ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。
【０４９４】
各鎖について少なくとも８種類のクローンを選定し、シーケンシングの前に増幅領域の有無についてＰＣＲでスクリーニングした。選択したＰＣＲ陽性クローンにシーケンシングを実施した。
【０４９５】
ＣＤＲ配列を表１３に記載する。重鎖および軽鎖の可変部分のコンセンサスＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表１４に記載する。
【表１５】
2019505166.tif 000026
【表１６】
2019505166.tif 000027
表１５．Ａベータ配列
１）
ＨＨＱＫ（配列番号１）
ＣＧＨＨＱＫＧ、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号２）
ＣＨＨＱＫＧ、Ｃ−ＰＥＧ２−ＨＨＱＫＧ、シクロＣ−ＰＥＧ２−ＨＨＱＫＧ（配列番号３）
ＣＧＨＨＱＫ、ＣＧＨＨＱＫ−ＰＥＧ２、シクロ（ＣＧＨＨＱＫ）−ＰＥＧ２（配列番号４）
ＶＨＨＱ（配列番号５）
ＶＨＨＱＫＬ（配列番号６）
ＨＨＱＫＬ（配列番号７）
ＧＨＨＱＫＧ（配列番号９）
ＨＨＱＫＧ（配列番号１０）
ＧＨＨＱＫ（配列番号１１）
ＶＨＨＱＫ（配列番号１２）
ＣＧＨＨＱＫＧＣ（配列番号１３）
ＥＶＨＨＱＫ（配列番号１８）
ＨＱＫＬ（配列番号２０）
ＣＧＨＨＱＫＣ、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＣ）（配列番号１７）
２）
ＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号１６）
ＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号１９）
ＨＱＫＬＶ（配列番号２１）
ＨＨＱＫＬＶ（配列番号８）
ＨＱＫＬＶＦ（配列番号１４）
ＨＱＫＬＶＦＦ（配列番号１５）
表１６
ヒトＡベータ１〜４２
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号３２）
【０４９６】
ここまで、現時点で好ましい例であると考えるものに関して本願を記載してきたが、本願は本開示の例に限定されないことを理解するべきである。これとは逆に、本願は、添付の請求項の趣旨および範囲に含まれる様々な改変および同等の構成を包含するものとする。
【０４９７】
刊行物、特許および特許出願はいずれも、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照により組み込まれることが明記された場合と同じように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、例えば表またはその他の箇所に記載されるアクセッション番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含めた本明細書に記載される各アクセッション番号に関連する配列は、その全体が参照により組み込まれる。
【０４９８】
請求項の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、記載全体と一致する最も広い解釈がなされるべきである。
【０４９９】
本明細書で参照される参考文献の引用
［１］Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ａ．Ｎ．Ｃｒｅｓｐｉ，Ｓｔｅｆａｎ  Ｊ．Ｈｅｒｍａｎｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｐａｒｋｅｒ，ａｎｄ  Ｌｕｋｅ  Ａ．Ｍｉｌｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｍｉｄ−ｒｅｇｉｏｎ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｂｙ  ｌｅａｄｉｎｇ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ｜５：９６４９，２０１５｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０９６４９．
［２］Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｊ．Ｈｉｌｓｅｒ  ａｎｄ  Ｅｒｎｅｓｔｏ  Ｆｒｅｉｒｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７５６−７７２，１９９６．Ｔｈｅ  ＣＯＲＥＸ  ａｐｐｒｏａｃｈ．
［３］Ｓａｍｕｅｌ  Ｉ．Ａ．Ｃｏｈｅｎ，Ｓａｒａ  Ｌｉｎｓｅ，Ｌｅｉｌａ  Ｍ．Ｌｕｈｅｓｈｉ，Ｅｒｉｋ  Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ，Ｄｕｎｃａｎ  Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｌｕｋｅ  Ｒａｊａｈ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｅ．Ｏｔｚｅｎ，Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｍ．Ｄｏｂｓｏｎ，ａｎｄ  Ｔｕｏｍａｓ  Ｐ．Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ−β４２  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｏｃｃｕｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１０（２４）：９７５８−９７６３，２０１３．
［４］Ｐｉｅｔｒｏ  Ｓｏｒｍａｎｎｉ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ａ．Ａｐｒｉｌｅ，ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ．Ｔｈｅ  ｃａｍｓｏｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２７（２）：４７８−４９０，２０１５．
［５］Ｄｅｂｏｒａｈ  Ｂｌａｃｋｅｒ，ＭＤ，ＳｃＤ；Ｍａｒｉｌｙｎ  Ｓ．Ａｌｂｅｒｔ，ＰｈＤ；Ｓｕｓａｎ  Ｓ．Ｂａｓｓｅｔｔ，ＰｈＤ；Ｒｏｄｎｅｙ  Ｃ．Ｐ．Ｇｏ，ＰｈＤ；Ｌｉｎｄｙ  Ｅ．Ｈａｒｒｅｌｌ，ＭＤ，ＰｈＤ；Ｍａｒｓｈａｉ  Ｆ．Ｆｏｌｓｔｅｉｎ，ＭＤ  Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ．Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９４；５１（１２）：１１９８−１２０４．ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｎｅｕｒ．１９９４．００５４０２４００４２０１４．
［６］Ｈａｍｌｅｙ，Ｉ．Ｗ．ＰＥＧ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ２０１４；１５，１５４３−１５５９；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ５００２４６ｗ．
［７］Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＭＪ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ６４：１１６−１２７．
［８］Ｊ．Ｘ．Ｌｕ，Ｗ．Ｑｉａｎｇ，Ｗ．Ｍ．Ｙａｕ，Ｃ．Ｄ．Ｓｃｈｗｉｅｔｅｒｓ，Ｓ．Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｒ．Ｔｙｃｋｏ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＯＦ  ＢＥＴＡ−ＡＭＹＬＯＩＤ  ＦＩＢＲＩＬＳ  ＩＮ  ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ＢＲＡＩＮ  ＴＩＳＳＵＥ．ＣＥＬＬ  Ｖｏｌ．１５４  ｐ．１２５７（２０１３）．
［９］Ｙ．Ｘｉａｏ，Ｂ．ＭＡ，Ｄ．ＭｃＥｌｈｅｎｙ，Ｓ．Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｆ．Ｌｏｎｇ，Ｍ．Ｈｏｓｈｉ，Ｒ．Ｎｕｓｓｉｎｏｖ，Ｙ．Ｉｓｈｉｉ，Ａ  ＢＥＴＡ（１−４２）ＦＩＢＲＩＬ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＩＬＬＵＭＩＮＡＴＥＳ  ＳＥＬＦ−ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＭＹＬＯＩＤ  ＩＮ  ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ．ＮＡＴ．ＳＴＲＵＣＴ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．Ｖｏｌ．２２ｐ．４９９（２０１５）．
［１０］Ａ．Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｗ．Ｙａｕ，Ｒ．Ｔｙｃｋｏ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＣＯＮＳＴＲＡＩＮＴＳ  ＯＮ  ＱＵＡＴＥＲＮＡＲＹ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＩＮ  ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＢＥＴＡ−ＡＭＹＬＯＩＤ  ＦＩＢＲＩＬＳ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ｖ．４５４９８  ２００６．
［１１］  Ｇｉｕｌｉａｎ  Ｄ，Ｈａｖｅｒｋａｍｐ  ＬＪ，Ｙｕ  Ｊ，Ｋａｒｓｈｉｎ  Ｗ，Ｔｏｍ  Ｄ，Ｌｉ  Ｊ，Ｋａｚａｎｓｋａｉａ  Ａ，Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  Ｊ，Ｒｏｈｅｒ  ＡＥ．Ｔｈｅ  ＨＨＱＫ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３（４５），２９７１９−２６．
［１２］  Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｋ，Ｓｃｈａｒｎａｇｌ  Ｈ，Ｔｉｓｌｊａｒ  Ｕ，Ｈｏｓｃｈｖｋｙ  Ｈ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｉ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ＭＭ，Ｈｕｔｉｎｇｅｒ  Ｍ，Ｗｉｅｌａｎｄ  Ｈ，Ｍａｒｚ  Ｗ．Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａβ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１９９９，４０（３），４４７−５５．
【図１−１】
2019505166.tif 000029
【図１−２】
2019505166.tif 000030
【図２−１】
2019505166.tif 000031
【図２−２】
2019505166.tif 000032
【図２−３】
2019505166.tif 000033
【図２−４】
2019505166.tif 000034
【図３−１】
2019505166.tif 000035
【図３−２】
2019505166.tif 000036
【図３−３】
2019505166.tif 000037
【図３−４】
2019505166.tif 000038
【図４−１】
2019505166.tif 000039
【図４−２】
2019505166.tif 000040
【図４−３】
2019505166.tif 000041
【図４−４】
2019505166.tif 000042
【図５−１】
2019505166.tif 000043
【図５−２】
2019505166.tif 000044
【図５−３】
2019505166.tif 000045
【図５−４】
2019505166.tif 000046
【図６−１】
2019505166.tif 000047
【図６−２】
2019505166.tif 000048
【図７−１】
2019505166.tif 000049
【図７−２】
2019505166.tif 000050
【図８】
2019505166.tif 000051
【図９−１】
2019505166.tif 000052
【図９−２】
2019505166.tif 000053
【図９−３】
2019505166.tif 000054
【図９−４】
2019505166.tif 000055
【図９−５】
2019505166.tif 000056
【図１０−１】
2019505166.tif 000057
【図１０−２】
2019505166.tif 000058
【図１０−３】
2019505166.tif 000059
【図１１】
2019505166.tif 000060
【図１２】
2019505166.tif 000061
【図１３】
2019505166.tif 000062
【図１４】
2019505166.tif 000063
【図１５】
2019505166.tif 000064
【図１６−１】
2019505166.tif 000065
【図１６−２】
2019505166.tif 000066
【図１６−３】
2019505166.tif 000067
【図１６−４】
2019505166.tif 000068
【図１７】
2019505166.tif 000069
【図１８−１】
2019505166.tif 000070
【図１８−２】
2019505166.tif 000071
【配列表】
2019505166000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月18日(2018.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019505166000001.app
【国際調査報告】
2019505166.tif 000072
2019505166.tif 000073
2019505166.tif 000074
2019505166.tif 000075