【手続補正書】
【提出日】平成19年8月3日(2007.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  外因的に添加された架橋剤を含まず、そして神経毒性活性を
示す、約３〜約24個のアミロイドβタンパク質を含んでなる単離された可溶性非
原線維性アミロイドβオリゴマー構造体。
【請求項２】  前記オリゴマー構造体が、アミロイドβ−タンパク質のトリ
マー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、12−マ
ー、16−マー、20−マー又は24−マー凝集体を含んで成る請求項１記載の単離さ
れたオリゴマー構造体。
【請求項３】  前記オリゴマー構造体が、非変性ゲル電気泳動により決定さ
れる場合、約36kD〜約108kDの分子量を有する請求項１記載の単離されたオリゴ
マー構造体。
【請求項４】  前記オリゴマー構造体が、非変性ゲル電気泳動により決定さ
れる場合、約26kD〜約28kDの分子量を有する請求項１記載の単離されたオリゴマ
ー構造体。
【請求項５】  前記オリゴマー構造体が、15％SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動により決定される場合、約22kD〜約24kDの分子量を有する請求
項１記載の単離されたオリゴマー構造体。
【請求項６】  前記オリゴマー構造体が、15％SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動により決定される場合、約18kD〜約19kDの分子量を有する請求
項１記載の単離されたオリゴマー構造体。
【請求項７】  前記オリゴマー構造体が、原子力顕微鏡により測定される場
合、約4.7nm〜約11.0nmの寸法の小球を含んで成る請求項１記載の単離されたオ
リゴマー構造体。
【請求項８】  前記オリゴマー構造体が、原子力顕微鏡により測定される場
合、約4.7nm〜約6.2nmの寸法の小球を含んで成る請求項１記載の単離されたオリ
ゴマー構造体。
【請求項９】  前記オリゴマー構造体が、原子力顕微鏡により測定される場
合、約4.9nm〜約5.4nmの寸法の小球を含んで成る請求項１記載の単離されたオリ
ゴマー構造体。
【請求項１０】  前記オリゴマー構造体が、原子力顕微鏡により測定される
場合、約5.7nm〜約6.2nmの寸法の小球を含んで成る請求項１記載の単離されたオ
リゴマー構造体。
【請求項１１】  前記オリゴマー構造体が、原子力顕微鏡により測定される
場合、約6.5nm〜約11.0nmの寸法の小球を含んで成る請求項１記載の単離された
オリゴマー構造体。
【請求項１２】  前記オリゴマー構造体の約40％〜約75％が、原子力顕微鏡
により測定される場合、約4.9nm〜約5.4nmの寸法、及び約5.7nm〜約6.2nmの寸法
の小球を含んで成る請求項１記載の単離されたオリゴマー構造体。
【請求項１３】  前記オリゴマー構造体が、16.5％のトリス−トリシンSDS
−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により決定される場合、約13kD〜約11
6kDの分子量を有する請求項１記載の単離されたオリゴマー構造体。
【請求項１４】  前記オリゴマー構造体が、16.5％のトリス−トリシンSDS
−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により決定される場合、約13kD〜約14
kD, 約17kD〜約19kD、約22kD〜約23kD、約26kD〜約28kD、約32kD〜約33kD、及び
約36kD〜約38kDから成る群から選択された分子量を有する請求項１記載の単離さ
れたオリゴマー構造体。
【請求項１５】  請求項１記載のオリゴマー構造体の効果をアッセイするた
めの方法であって、
（ａ）動物の海馬に前記オリゴマー構造体を投与し；
（ｂ）電気刺激を適用し；そして
（ｃ）長期の相乗作用応答を決定するために細胞体スパイク振幅を経時的に測
定することを含んで成る方法。
【請求項１６】  前記動物の長期相乗作用応答が、前記電気刺激の適用の前
、オリゴマー構造体の代わりに投与される塩溶液を有することを除いて、同じ態
様で処理されるもう1つの動物の長期相乗作用応答に比較される請求項15記載の
方法。
【請求項１７】  請求項１記載のオリゴマー構造体を、試験材料において検
出するための方法であって、
（ａ）前記試験材料と6E10抗体とを接触せしめ；そして
（ｂ）前記抗体の前記オリゴマー構造体への結合を検出することを含んで成る
方法。
【請求項１８】  請求項１記載のオリゴマー構造体を、試験材料において検
出するための方法であって、
（ａ）前記材料と血清−欠失された神経芽腫細胞とを接触せしめ；そして
（ｂ）前記試験材料と接触させなかった神経芽腫細胞に対して前記細胞の形態
学を比較することによって、前記細胞における形態学的変化を測定することを含
んで成る方法。
【請求項１９】  請求項１記載のオリゴマー構造体を、試験材料において検
出するための方法であって、
（ａ）前記試験材料と脳スライス培養物とを接触せしめ；そして
（ｂ）前記試験材料と接触させなかった脳スライス培養物に対して比較して、
脳細胞の死を測定することを含んで成る方法。
【請求項２０】  請求項１記載のオリゴマー構造体を、試験材料において検
出するための方法であって、
（ａ）前記試験材料と神経芽腫細胞とを接触せしめ；そして
（ｂ）前記試験材料と接触させなかった神経芽腫細胞におけるFynキナーゼ活
性に対して前記細胞におけるFynキナーゼ活性を比較することによって、Fynキナ
ーゼ活性の上昇性を測定することを含んで成る方法。
【請求項２１】  請求項１記載のオリゴマー構造体を、試験材料において検
出するための方法であって、
（ａ）前記試験材料と一次星状細胞の培養物とを接触せしめ；そして
（ｂ）前記試験材料と接触させなかった一次星状細胞の培養物に比較して、前
記星状細胞の活性化を決定することを含んで成る方法。
【請求項２２】  請求項１記載のオリゴマー構造体を、試験材料において検
出するための方法であって、
（ａ）前記試験材料と一次星状細胞の培養物とを接触せしめ；そして
（ｂ）前記試験材料と接触させなかった一次星状細胞の培養物におけるmRNAレ
ベルに対して前記星状細胞における前記mRNAレベルを比較することによって、イ
ンターロイキン１、誘導性酸化窒素シンターゼ、ApoE, ApoJ及びα１−抗キモト
リプシンから成る群から選択されたタンパク質についてのmRNAの上昇性を前記星
状細胞において測定することを含んで成る方法。
【請求項２３】  請求項１記載のオリゴマー構造体の効果を調節する化合物
を同定するための方法であって、
（ａ）動物の海馬に塩溶液又は試験化合物のいずれかを投与し；
（ｂ）電気刺激を適用し；
（ｃ）長期相乗作用応答を決定するために細胞体スパイク振幅を経時的に測定
し；そして
（ｄ）試験化合物を投与された動物の長期相乗作用応答に対して、塩溶液を投
与されている動物の長期相乗作用応答を比較することを含んで成り、
但し、前記オリゴマー構造体の投与は治療のためには行われない方法。
【請求項２４】  前記塩溶液又は試験化合物を投与する前、投与と共に又は
投与の後、前記海馬にオリゴマー構造体を投与することをさらに含んで成る請求
項23記載の方法。
【請求項２５】  請求項１記載のオリゴマー構造体の神経毒性を阻止する化
合物を同定するための方法であって、
（ａ）前記試験化合物と接触させ又はさせないで前記オリゴマー構造体とニュ
ーロン細胞の別々の培養物とを接触せしめ；
（ｂ）個々の培養物における生存細胞の割合を測定し；そして
（ｃ）個々の培養物における生存細胞の割合を比較し、そして前記オリゴマー
構造体の神経毒性を阻止する化合物が、前記試験化合物の不在下で前記オリゴマ
ー構造体と接触させた対応の培養物に比較して前記培養物における生存細胞割合
を高めるものとして同定されることを含んで成る方法。
【請求項２６】  請求項１記載のオリゴマー構造体の細胞表面タンパク質へ
の結合を阻止する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）前記試験化合物と接触させ又はさせないで前記オリゴマー構造体とニュ
ーロン細胞の別々の培養物とを接触せしめ；
（ｂ）前記オリゴマー構造体に結合する蛍光試験を添加し；
（ｃ）前記別々の細胞培養物を、蛍光活性化セルソーティングにより分析し；
そして
（ｄ）前記培養物の蛍光を比較し、そして前記オリゴマー構造物の細胞表面タ
ンパク質への結合を阻止する化合物が、前記試験化合物の不在下で前記構造体と
接触させた対応の培養物に比較して前記培養物の蛍光を低めるものとして同定さ
れることを含んで成る方法。
【請求項２７】  請求項１記載のオリゴマー構造体の細胞表面タンパク質へ
の結合を阻止する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）アミロイドβタンパク質から前記オリゴマー構造体を、それが蛍光試薬
と結合できる結合成分を含んで成るラベルされたオリゴマー構造体になるよう形
成し；
（ｂ）前記試験化合物と接触させ又はさせないで前記ラベルされたオリゴマー
構造体とニューロン細胞の別々の培養物とを接触せしめ；
（ｃ）前記オリゴマー構造体に結合する蛍光試薬を添加し；
（ｄ）前記別々の細胞培養物を、蛍光活性化セルソーティングにより分析し；
そして
（ｅ）前記培養物の蛍光を比較し、そして前記オリゴマー構造物の細胞表面タ
ンパク質への結合を阻止する化合物が、前記試験化合物の不在下で前記構造体と
接触させた対応の培養物に比較して前記培養物の蛍光を低めるものとして同定さ
れることを含んで成る方法。
【請求項２８】  請求項１記載のオリゴマー構造体の細胞表面タンパク質の
形成又はそれへの結合を阻止する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）前記試験化合物と混合されているか又は混合されていないアミロイドβ
タンパク質の別々のサンプルを調製し；
（ｂ）前記別々のサンプルにおいて前記オリゴマー構造体を形成し；
（ｃ）前記別々のサンプルとニューロンの細胞の別々の培養物とを接触せしめ
；
（ｄ）オリゴマー構造体に結合する蛍光試薬を添加し；
（ｅ）蛍光活性化セルソーティングにより前記別々の細胞培養物を分析；そし
て
（ｆ）前記培養物の蛍光を比較し、そして前記オリゴマー構造物の細胞表面タ
ンパク質の形成又はそれへの結合を阻止する化合物が、前記試験化合物の不在下
で前記構造体と接触させた対応の培養物に比較して前記培養物の蛍光を低めるも
のとして同定されることを含んで成る方法。
【請求項２９】  請求項１記載のオリゴマー構造体の細胞表面タンパク質の
形成又はそれへの結合を阻止する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）前記試験化合物と混合されているか又は混合されていないアミロイドβ
タンパク質の別々のサンプルを調製し；
（ｂ）前記別々のサンプルにおける前記オリゴマー構造体を、それが前記別々
のサンプルにおける蛍光試薬と結合できる結合成分を含んで成るラベルされたオ
リゴマー構造体になるよう形成し；
（ｃ）前記別々のサンプルとニューロン細胞の別々の培養物とを接触せしめ；
（ｄ）オリゴマー構造体に結合する蛍光試薬を添加し；
（ｅ）蛍光活性化セルソーティングにより前記別々の細胞培養物を分析し；そ
して
（ｆ）前記培養物の蛍光を比較し、そして前記オリゴマー構造物の細胞表面タ
ンパク質の形成又はそれへの結合を阻止する化合物が、前記試験化合物の不在下
で前記構造体と接触させた対応の培養物に比較して前記培養物の蛍光を低めるも
のとして同定されることを含んで成る方法。
【請求項３０】  前記培養物の蛍光が、さらに、同じ態様で処理されている
培養物の蛍光と比較され、但し、オリゴマー構造体の形成の前、試験化合物の添
加する代わりに又は添加しない代わりに、前記試験化合物が、オリゴマー構造体
の形成の後、添加されるか又は添加されず、
そしてオリゴマー構造体の形成を阻止する化合物が、前記化合物がオリゴマー
構造体の前に添加される場合のみ、前記試験化合物の不在下で前記オリゴマー構
造体と接触させた対応の培養物に比較して前記培養物の蛍光を低めるものとして
同定され、そして
オリゴマー構造体の細胞表面タンパク質への結合を阻止する化合物が、前記化
合物がオリゴマー構造体の前又は後に添加される場合、前記試験化合物の不在下
で前記オリゴマー構造体と接触させた対応の培養物に比較して、前記培養物の蛍
光を低めるものとして同定される、請求項28記載の方法。
【請求項３１】  前記培養物の蛍光が、さらに、同じ態様で処理されている
培養物の蛍光と比較され、但し、オリゴマー構造体の形成の前、試験化合物の添
加する代わりに又は添加しない代わりに、前記試験化合物が、オリゴマー構造体
の形成の後、添加されるか又は添加されず、
そしてオリゴマー構造体の形成を阻止する化合物が、前記化合物がオリゴマー
構造体の前に添加される場合のみ、前記試験化合物の不在下で前記オリゴマー構
造体と接触させ対応の培養物に比較して前記培養物の蛍光を低めるものとして同
定され、そして
オリゴマー構造体の細胞表面タンパク質への結合を阻止する化合物が、前記化
合物がオリゴマー構造体の前又は後に添加される場合、前記試験化合物の不在下
で前記オリゴマー構造体と接触させた対応の培養物に比較して、前記培養物の蛍
光を低めるものとして同定される請求項28記載の方法。
【請求項３２】  請求項１記載のオリゴマー構造体の細胞表面タンパク質へ
の結合を検出するための方法であって、
（ａ）アミロイドβタンパク質から前記オリゴマー構造体を形成し；
（ｂ）前記オリゴマー構造体とニューロン細胞の培養物とを接触せしめ；
（ｃ）前記オリゴマー構造体に結合する、接合成分を包含する抗体を添加し；
（ｅ）結合されていない抗体を洗浄除去し；
（ｆ）前記オリゴマー構造体に結合される前記抗体に酵素を、前記接合成分に
より結合させ；
（ｇ）前記酵素により分解されて変色する無色の基質を添加し；そして
（ｈ）前記オリゴマー構造体の細胞表面のタンパク質への結合の規準として前
記変色を決定することを含んで成る方法。
【請求項３３】  請求項１記載のオリゴマー構造体の細胞表面タンパク質へ
の結合を阻害する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）前記試験化合物と混合されているか又は混合されていないアミロイドβ
タンパク質の別々のサンプルを調製し；
（ｂ）前記別々のサンプルにおいて前記オリゴマー構造体を形成し；
（ｃ）前記別々のサンプルとニューロン細胞の別々の培養物とを接触せしめ；
（ｄ）前記オリゴマー構造体を結合する、接合成分を包含する抗体を添加し；
（ｅ）結合されていない抗体を洗浄除去し；
（ｆ）前記オリゴマー構造体に結合される前記抗体に酵素を、前記接合成分に
より結合させ；
（ｇ）前記酵素により分解されて変色する無色の基質を添加し；そして
（ｈ）前記別々のサンプルの個々による変色を比較し、そして前記オリゴマー
構造体の細胞表面タンパク質の形成又はそれへの結合を阻止する化合物が前記試
験化合物の不在下で前記オリゴマー構造体と接触させた対応の培養物に比較して
前記培養物により生成される変色を低めるものとして同定されることを含んで成
る方法。
【請求項３４】  前記培養物により生成される変色が、さらに、同じ態様で
処理されている培養物により生成される変色と比較され、但し、オリゴマー構造
体の形成の前、試験化合物の添加する代わりに又は添加しない代わりに、前記試
験化合物が、オリゴマー構造体の形成の後、添加されるか又は添加されず、
そしてオリゴマー構造体の形成を阻止する化合物が、前記化合物がオリゴマー
構造体の前に添加される場合のみ、前記試験化合物の不在下で前記オリゴマー構
造体と接触させ対応の培養物に比較して前記培養物により生成される変色を低め
るものとして同定され、そして
オリゴマー構造体の受容体結合を阻止する化合物が、前記化合物がオリゴマー
構造体の前又は後に添加される場合、前記試験化合物の不在下で前記オリゴマー
構造体と接触させた対応の培養物に比較して、前記培養物により生成される変色
を低めるものとして同定される請求項33記載の方法。
【請求項３５】  請求項１記載のオリゴマー構造体の形成を阻止する化合物
を同定するための方法であって、
（ａ）前記試験化合物と混合されているか又は混合されていないアミロイドβ
タンパク質の別々のサンプルを調製し；
（ｂ）前記別々のサンプルにおいて前記オリゴマー構造体を形成し；
（ｃ）タンパク質アセンブリーが、電気泳動、免疫認識及び原子力顕微鏡から
成る群から選択された方法を用いて、別々のサンプルに形成されているかどうか
を評価し；そして
（ｄ）前記別々のサンプルにおける前記タンパク質アセンブリーの形成を比較
し、そして前記オリゴマー構造体の形成を阻止する化合物が、前記オリゴマー構
造体が前記試験化合物の不在下で形成されるサンプルと比較して前記サンプルに
おける前記オリゴマー構造体の低形成を低めるものとして同定されることを含ん
で成る方法。
【請求項３６】  請求項１記載の単離された球状の可溶性、非原線維性アミ
ロイドβオリゴマー構造体の調製方法であって、
（ａ）前記オリゴマー構造体を形成できるモノマーアミロイドβタンパク質の
溶液を得；
（ｂ）前記タンパク質溶液を、約5nM〜約500μMの最終濃度まで適切な培地に
希釈し；
（ｃ）段階（ｂ）から得られる培地を、約４℃で、約２〜約48時間インキュベ
ートし；
（ｄ）前記溶液を、約14,000gで約４℃で遠心分離し；そして
（ｅ）前記アミロイドβオリゴマー構造体を含むものとして前記遠心分離に起
因する上清液を回収することを含んで成る方法。
【請求項３７】  前記段階（ｂ）に起因する培地を、クラステリンの存在下
で約４℃でインキュベートすることを含んで成る請求項36記載の方法。
【請求項３８】  請求項１記載の単離された球状の可溶性、非原線維性アミ
ロイドβオリゴマー構造体の調製方法であって、
（ａ）前記オリゴマー構造体を形成できるモノマーアミロイドβタンパク質の
溶液を得；
（ｂ）前記アミロイドβモノマーをヘキサフルオロイソプロアノールに溶解し
；
（ｃ）固体ペプチドを得るために急速真空蒸発によりヘキサフルオロイソプロ
アノールを除去し；
（ｄ）前記固体ペプチドを、DMSO原液を得るためにDMSOに溶解し；
（ｅ）前記原液を適切な培地中に希釈し；
（ｆ）ボルテックスにかけ；そして
（ｇ）約４℃で約24時間インキュベートすることを含んで成る方法。
【請求項３９】  請求項１記載のオリゴマー構造体を試験サンプルにおいて
検出するための方法であって、
（ａ）前記試験化合物と神経細胞とを接触せしめ；そして前記細胞がADDL−誘
導性異常ニューロンシグナルを示すかどうかを決定することを含んで成る方法。