(57)【要約】ＤＮＡ四重鎖結合および安定化活性、ならびに膵臓がんおよび他のヒトがんの処置における潜在性を有する式Ｉを含む化合物。本明細書に記載されるように、細胞を本発明の化合物によって処置した場合、比較的少数の遺伝子における遺伝子発現の変化を示し、この大多数はそれらのプロモーターにおいて推定四重鎖形成配列を有し、本発明の化合物がこれらの核遺伝子を選択的に標的化することが示された。これらの標的化された遺伝子のいくつかは患者生存の増加と関連し、ここで、ヒトにおけるそれらの発現は下方調節され、本発明の新規な化合物がヒトがんの処置において有用性を有し得ると考えられる。
2019505495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化９】
2019505495.tif 000018
を含む化合物、ならびにその塩、水和物および溶媒和物であって、ここで、
Ｒ２基は、同じであり、直鎖および分岐状のＣ１〜６−アルカンジイル（ａｌｋｙａｎｅｄｉｙｌ）からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、直鎖および分岐状のＣ１〜６−アルカンジイルおよびＣ７〜１２アラルカン−ジイルからなる群より選択され；
Ｘ基は、ハロ、ＯＲ１、ＮＲ５２、ＣＯＮＲ６２、ＣＯＯＲ７、ＨおよびＣＯＲ８からなる群より選択され、
Ｒ１は、Ｈ、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択により置換されているＣ５〜７シクロアルキル、Ｃ５〜７ヘテロシクロアルキルおよびアリールからなる群より選択され；
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリールおよびＣ７〜１２−アリールキルからなる群より選択されるか、またはＲ５基は、それらが付着するＮ原子と一緒になって、Ｎ含有飽和複素環式基を形成し；
Ｒ６基は、ＨおよびＣ１〜６アルキル基から各々選択されるか、またはＲ６基は、それらが付着するＮ原子と一緒になって、５〜１７員の複素環式環を形成し；
Ｒ７は、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ７〜１２アラルキルおよびアリールからなる群より選択され；
Ｒ８は、任意選択により置換されているＣ１〜６−アルキル、Ｃ７〜１２−アラルキルおよびアリールからなる群より選択され；
ただし、Ｘが
【化１０】
2019505495.tif 000019
である場合、Ｒ４はＲ２と異なることを条件とする、
化合物、ならびにその塩、水和物および溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ２が直鎖Ｃ２〜４アルカンジイルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３がＨである、請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ４が直鎖のＣ２〜４−アルカンジイルである、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
ＸがＮＲ５２である、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ５基が、それらが付着する窒素原子と一緒になって、４−メチルピペラジン−１−イル、モルホリン−４−イル、ピロリジン−１−イル、ピリジン−２−イルおよびピペリジン−１−イルから選択される複素環式基を形成する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
希釈剤と組み合わせた、前記請求項のいずれかに記載の化合物を含む組成物。
【請求項８】
前記組成物が医薬組成物であり、前記希釈剤が薬学的に許容される希釈剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
式ＩＩ：
【化１１】
2019505495.tif 000020
の化合物をさらに含む、請求項７または請求項８に記載の組成物であって、式中、
Ｒは、ＮＨ２またはＮ（Ｒ１３）Ｒ１４Ｘ１であり、ここで、
Ｒ１３は、Ｒ３と同じ基から選択され、
Ｒ１４は、Ｒ４と同じ基から選択され、
Ｘ１は、Ｘと同じ基から選択され、
ただし、式ＩＩの化合物は、式Ｉの化合物の５０重量％以下の量で存在することを条件とする、
組成物。
【請求項１０】
固形腫瘍の成長を阻害する、または固形腫瘍のサイズを低減するための動物の処置の方法における使用のための、請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、請求項１０に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
置換ナフタレンジイミド化合物の合成の方法であって、式ＩＩＩ：
【化１２】
2019505495.tif 000021
の化合物であって、式中、
Ｂｒは、ブロモであり；
Ｙは、ＨまたはＢｒであり；
Ｒ１２基は、同じであり、直鎖および分岐状のＣ１〜６アルケンジイルからなる群より選択される、化合物を、式ＩＶ：
Ｒ１３ＨＮＲ１４Ｘ２  ＩＶ
のアミンであって、式中、
Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１４は、直鎖および分岐状のＣ１〜６アルカンジイルおよびＣ７〜１２アラルカンジイルからなる群より選択され；
Ｘ２は、ハロ、Ｒ１１、ＮＲ１５２、ＣＯＮＲ１６２、ＣＯＯＲ１７、ＳＨおよびＣＯＲ１８からなる群より選択され；
Ｒ１１は、Ｈ、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択により置換されているＣ５〜７シクロアルキル、Ｃ５〜７ヘテロシクロアルキルおよびアリールからなる群より選択され；
各Ｒ１５は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリールおよびＣ７〜１２アラルキルからなる群より選択されるか、またはＲ１５基は、それらが付着するＮ原子と一緒になって、５〜７個の原子の飽和複素環式環を形成し；
各Ｒ１６は、ＨおよびＣ１〜６アルキル基からなる群より選択されるか、またはＲ１６基は、それらが付着するＮ原子と一緒になって、５〜７員の複素環式環を形成し；
Ｒ１７は、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ７〜１２アラルキルおよびアリールからなる群より選択され；
Ｒ１８は、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ７〜１２アラルキルおよびアリールからなる群より選択される、
アミンとの求核置換反応において反応させるステップを含み、
これによって、前記Ｂｒ原子、前記Ｂｒ原子の１つまたは各Ｂｒ原子が、前記アミン試薬の求核性アミン窒素によって置換されることで前記置換ＮＤＩ化合物を形成する、方法。
【請求項１３】
ＹがＢｒである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｂｒ原子の１つがアミン窒素によって置換されており、他方が反応しないまたはＨによって置換されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＹがＨである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ１３がＨである、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１４がＣ２〜４アルカンジイルからなる群より選択される、請求項１２から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
Ｘ２がＮＲ１５２である、請求項１２から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ１５基が、それらが付着するＮ原子と一緒になって、Ｎ−メチルピペラジン、ピロリドン、４−モルホリノおよびピペリジンから選択される複素環式環を形成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
式ＩＩＩの化合物が、式Ｖ：
【化１３】
2019505495.tif 000022
のブロモ置換テトラカルボン酸無水物を、式ＶＩ：
【化１４】
2019505495.tif 000023
のモルホリン出発材料と、イミド形成ステップにおいて反応させる予備的ステップにおいて生成される、請求項１２から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記イミド形成ステップが、マイクロ波中にて酢酸の存在下で実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記イミド形成ステップの生成物がカラムクロマトグラフィーによって精製される、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ブロモ置換テトラカルボン酸無水物Ｖが、式ＶＩＩ：
【化１５】
2019505495.tif 000024
のテトラカルボン酸無水物化合物の臭素化の予備的ステップにおいて形成される、請求項２０から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記臭素化が、５，５−ジメチル−１，３−ジブロモヒダントインを使用して、酸、好ましくは硫酸の存在下で、高い温度にて実施される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナフタレンジイミド、ＮＤＩ、およびそれらを合成する方法に関する。ＮＤＩは、ＤＮＡ四重鎖結合および安定化活性、ならびに膵臓がんおよび他のヒトがんの処置における潜在性を有する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＯ２００９／０６８９１６において、本発明者らは、トリおよびテトラ置換ナフタレンジイミド、ならびにそれらを生成するためのプロセスを記載した。トリ置換された例示生成物のいずれもが、コアリガンド上のエクアトリアル（ｅｑｕａｔｉｏｎａｌ）位置および極性位置に異なるアミノ官能性リガンドを有していなかった。トリ置換化合物を生成するのに適当であると言われている方法は、以下の模式図に基づいていた：−
【化１】
2019505495.tif 000003
［式中、Ｒ１は、任意選択により置換されているアルキルまたはアリールであり、ｎは、０または１である］。実際には、テトラ−（ｎ＝１）およびトリ置換（ｎ＝０）化合物の混合物が生成された。全ての置換基、即ちＲ１基は、同じである。
【０００３】
本明細書は、上で使用されたジブロモ化合物のジクロロ置換類似体から出発するテトラ置換化合物を生成するための方法を記載している。プロセスは、同じＨ２ＮＲ１試薬が、両方の無水物基および両方の−塩素−置換炭素で反応することで、生成物上に４個の同一Ｒ１置換基を与える１つのステップで進行したか、または第１のステップにおいて、第１の試薬Ｈ２ＮＲ２が両方の無水物基で反応し、第２のステップにおいて、第２の試薬Ｈ２ＮＲ３が両方の塩素置換炭素原子で反応する２つのステップで進行した。イミド置換基上および／または芳香族環上に塩基性置換基を有する化合物は、強いＤＮＡ四重鎖結合特性を有する。
【０００４】
テトラ置換生成物は、Ｒ３基と異なるＲ２基を有する生成物を含めて、ＷＯ２００９／０６８９１６、ＵＳ２０１４−０２７５０６５Ａにおいて、およびＨａｍｐｅｌ  Ｓ．  Ｍ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．（２０１０年）２０巻、６４５９〜６４６３頁、Ｍｉｃｃｏ．  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．（２０１３年）５６巻、２９５９〜２９７４頁、Ｃｏｌｌｉｅ，  Ｇ．  Ｗ．ら、Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．（２０１２年）１３４巻、２７２３〜２７３１頁、Ｇｕｎａｒａｔｎａｍ，  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．（２００９年）５２巻、３７７４〜３７８３頁、Ｇｕｎａｒａｔｎａｍ，  Ｍ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．（２０１１年）１９巻、７１５１〜７１５７頁およびＭｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１３年）５２巻、１４２９〜１４３６頁において、テロメアの四重鎖、また一部の遺伝子のプロモーター領域に見出されたものに対するそれらの結合特性について試験されている。データは、いくつかのタンパク質の有効な下方調節を示し、これらの遺伝子のプロモーターはジイミドによって標的化され、それゆえに、がん細胞株パネルからのいくつかの細胞株の成長阻害をもたらす。本発明者らは、これらの公報において、カチオン性置換基における置換性基の性質および第３級アミン基の塩基度を変化させることの、結合特異性および強度に対する影響をさらに調査すること、ならびに膵臓がんを含めたがんのモデルを試験することによって、がん処置における化合物の潜在性を調査することを提案してきた。
【０００５】
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１５年）５巻：１１３８５頁において、Ｏｈｎｍａｃｈｔ，  Ｓ．Ａ．らは、ヒト膵臓がんのマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの、ＭＭ４１としても公知である４，９−ビス（（３−（４−メチルピペラジン−１−イル）−プロピル）アミノ）−２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオンの活性を開示している。
【０００６】
Ｎａｄａｉ，  Ｍ．らは、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．（２０１５年）４６巻、３６９〜３８０頁において、各イミド窒素原子で置換されている２−ジメチルアミノエチル基を有するとともにＮＤＩコア上の４位で置換されている２−（４−ヒドロキシ−３−ジメチルアミノメチルフェニル）エチルアミノ基を第３の置換基として有するトリ置換ナフタレンジイミド化合物を開示している。それは、テロメアのＧ四重鎖を安定化させる活性を有し、テロメア機能不全およびテロメラーゼ下方調節を引き起こす。細胞株パネル上の全般的遺伝子発現は、テロメア機能およびがんの機序に関わる遺伝子のモジュレーションを示した。しかしながら、著者らは、細胞の場面におけるＧ−４の生物学的関連性についての直接的証拠がまだ欠如していると結論づけている。
【０００７】
Ｎａｄａｉらによって報告されたトリ置換化合物の合成は、Ｄｏｒｉａら、Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ、（２０１２年）１０巻、２７９８〜２８０６頁に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／０６８９１６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４−０２７５０６５号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明において、式Ｉ：
【化２】
2019505495.tif 000004
［Ｒ２基は、同じであり、直鎖および分岐状のＣ１〜６−アルカンジイルからなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、直鎖および分岐状のＣ１〜６−アルカンジイルおよびＣ７〜１２アラルカン−ジイルからなる群より選択され；
Ｘ基は、ハロ、Ｒ１、ＮＲ５２、ＣＯＮＲ６２、ＣＯＯＲ７、ＨおよびＣＯＲ８からなる群より選択され、Ｒ１は、Ｈ、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択により置換されているＣ５〜７シクロアルキル、Ｃ５〜７ヘテロシクロアルキルおよびアリールからなる群より選択され；
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリールおよびＣ７〜１２−アリールキル（ａｒｙｌｋｙｌ）からなる群より選択されるか、またはＲ５基は、それらが付着するＮ原子と一緒になって、Ｎ含有の５〜７員の複素環式基を形成し；
Ｒ６基は、ＨおよびＣ１〜６アルキル基から各々選択されるか、またはＲ６基は、それらが付着するＮ原子と一緒になって、５〜７員の複素環式環を形成し；
Ｒ７は、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ７〜１２アラルキルおよびアリールからなる群より選択され；
Ｒ８は、任意選択により置換されているＣ１〜６−アルキル、Ｃ７〜１２−アラルキルおよびアリールからなる群より選択され；
ただし、Ｘは
【化３】
2019505495.tif 000005
であり、Ｒ４はＲ２と異なる］
の新たな化合物、ならびにその塩、水和物および溶媒和物が提供される。
【００１０】
可変基についての好ましい定義は、請求項１に従属する請求項から現れる。
【００１１】
Ｘがアミン基、即ちＮＲ５２基である化合物は、特に好ましい。こうした化合物のうち、２個のＲ５基が連結されて複素環を形成するものは、それらが、がん細胞株試験において有用な細胞毒性活性を有すると思われるので好ましい。
【００１２】
本発明者らは、化合物の水溶解性の制御を提供するために、Ｘが２−（ピロリジン−ｙ−イル）エチルである好ましい化合物の、ある範囲の酸付加塩を作り出した。好ましくは、塩は、カルボン酸塩、例えばジ−カルボン酸塩、トリカルボン酸塩、例えばギ酸塩または酢酸塩である。それは、例えばＨＣｌおよびカルボン酸塩の混合塩であってよい。
【００１３】
本発明は、固形腫瘍の成長を阻害する、または固形腫瘍、例えば膵臓腫瘍のサイズを低減するための動物の処置の方法における使用のための新たな化合物をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、新たな化合物および希釈剤または担体を含有する組成物も提供する。組成物は、好ましくは医薬組成物であり、次いで担体は薬学的に許容される。
【００１５】
本発明は、式ＩＩ：
【化４】
2019505495.tif 000006
［式中、Ｒは、ＮＨ２またはＮ（Ｒ１３）Ｒ１４Ｘ１であり、ここで、
Ｒ１３は、Ｒ３と同じ基から選択され、
Ｒ１４は、Ｒ４と同じ基から選択され、
Ｘ１は、Ｘと同じ基から選択される］
の化合物をさらに含み、
ただし、式ＩＩの化合物は、式Ｉの化合物の５０重量％以下の量で存在する、上述の組成物も提供する。
【００１６】
本発明の第２の態様において、置換ナフタレンジイミド化合物の合成のための方法であって、式ＩＩＩ：
【化５】
2019505495.tif 000007
［式中、Ｂｒは、ブロモであり；
Ｙは、ＨまたはＢｒであり；
Ｒ１２基は、同じであり、直鎖および分岐状のＣ１〜６アルカンジイルからなる群より選択される］
の化合物を、式ＩＶ：
Ｒ１３ＨＮＲ１４Ｘ２  ＩＶ
［式中、Ｒ１３は、ＨおよびＣ１〜６アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１４は、直鎖および分岐状のＣ１〜６アルカンジイルおよびＣ７〜１２アラルカンジイルからなる群より選択され；
Ｘ２は、ハロゲン、ＯＲ、ＮＲ１５２、ＣＯＮＲ１６２、ＣＯＯＲ１７、ＳＨおよびＣＯＲ１８からなる群より選択され；
Ｒ１１は、Ｈ、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、任意選択により置換されているＣ５〜７シクロアルキル、Ｃ５〜７ヘテロシクロアルキルおよびアリールからなる群より選択され；
各Ｒ１５は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリールおよびＣ７〜１２アラルキルからなる群より選択されるか、またはＲ１５基は、それらが付着するＮ原子と一緒になって、５〜７個の原子の飽和複素環式環を形成し；
各Ｒ１６は、ＨおよびＣ１〜６アルキル基からなる群より選択されるか、またはＲ１６基は、それらが付着するＮ原子と一緒になって、５〜７員の複素環式環を形成し；
Ｒ１７は、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ７〜１２アラルキルおよびアリールからなる群より選択され；
Ｒ１８は、任意選択により置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ７〜１２アラルキルおよびアリールからなる群より選択される］
のアミンとの求核置換反応において反応させるステップを含み、これによって、Ｂｒ原子、Ｂｒ原子の１つまたは各Ｂｒ原子がアミン試薬の求核性アミン窒素によって置換されることで置換ＮＤＩ化合物を形成する、方法が提供される。
【００１７】
方法の好ましい態様は、請求項１２に従属する請求項から現れる。
【００１８】
したがって本発明の方法は、芳香族求核置換反応において臭素化ナフタレンジイミドを式ＩＶのアミン試薬と反応させるステップを含み、これによって、臭素原子はアミノ基Ｎ（Ｒ１３）Ｒ１４Ｘ２によって置き換えられる。出発ジイミドは、モノ−ブロモ化合物もしくは（ＹはＨである）ジブロモ化合物（ＹはＢｒである）または両方の混合物であってよい。出発ジイミドがジブロモ化合物を含む場合、芳香族求核置換反応は、アミン基によって置き換えられている両方の臭素原子またはそれらのうちの一方のみをもたらし得る。第２の臭素原子はＨによって置き換えられていてよく、この事象において、生成物は、本発明の第１の態様によるトリ置換化合物である。これは高温でより容易に発生する。例えばカラムクロマトグラフィーを使用することによって、両方の混合物を分離することが好ましい。ジイミド出発材料が１個の臭素置換基を有する場合、生成物は、本発明の第１の態様の新たな化合物である。生成物は、置換ＮＤＩの混合物を含むことがあり、未反応ＮＤＩを含有することもある。生成物が、未反応ＮＤＩの有無に関わらず、置換ＮＤＩの混合物を含む場合、トリ置換ＮＤＩと比較して５０重量％以下のテトラ置換ＮＤＩが存在し得る。
【００１９】
ＹがＨである式ＩＩＩの化合物を反応させるプロセスステップが特に好ましい。ＹがＢｒである式ＩＩＩの出発化合物から新規なトリ置換化合物を形成することが所望されるならば、比較的高い温度の条件を使用することが望ましくあり得る。なぜなら、これはＨによる第２のＢｒ原子の置き換えを最適化し得るからである。しかしながら一般に、こうした高い温度の条件は、イミド環の開環を伴う望まれない副反応に至ることがある。そのため好ましくは、プロセスは還流下で実施される。
【００２０】
プロセスは、通常、生成混合物から所望の最終生成物を単離するための精製ステップを伴う。カラムクロマトグラフィーが手軽な精製ステップとして使用することができることは、本発明のプロセスの利点である。これは、このステップ、ならびにイミドおよびそれの前駆体臭素化テトラカルボン酸無水物およびそれのための前駆体無水物を合成する予備的ステップのための反応条件および試薬の選択によって可能になる。
【００２１】
本発明のプロセスは、好ましくは、添付の請求項２０および２３ならびにそれらに従属する請求項において定義され、実際に行われた実施例において例示されている通り、予備的ステップを伴う。
【００２２】
トリ置換されている本発明の新規な化合物は、テトラ置換されている本発明者らの前の公報ＵＳ２０１４−０２７５０６２に開示されている化合物よりも低い分子量を有する。同じモル濃度で、ＤＮＡ四重鎖安定化試験において、ＦＲＥＴ分析を使用してテトラ置換化合物と比較した場合、化合物は、腫瘍成長と潜在的に関連する一連のＤＮＡ四重鎖の安定化の減少を生み出すことが見出されている。さらに、ヒトがん細胞株パネルに対する細胞毒性について試験される場合、ＩＣ５０値は、本発明者らの前の化合物ＭＭ４１、テトラ置換化合物のそれに匹敵する。本発明者らは、驚くべきことに、ＭＩＡ−ＰａＣａ２膵臓腫瘍細胞株を使用して、膵臓がんについて異種移植片マウスモデルを、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験において試験した場合に、結果は、同じ濃度のテトラ置換化合物を使用するレジメンよりも良好であり、実際に、膵臓がんにおけるケアの現在の治療標準のゲムシタビンよりも良好であったことを見出した（図１）。動物は、処置でいかなる著しい体重損失も有していなかった。より低い濃度で試験される場合、腫瘍成長に対する結果は、本発明者らの前の試験において使用されたＭＭ４１化合物についての試験濃度と同等である。これらのデータは、化合物が固形腫瘍、例えば膵臓腫瘍の処置において治療的に有効であるという予想に至る。
【００２３】
驚くべきことに、ＭＩＡ−ＰａＣａ２膵臓がん細胞は、本発明の新規な化合物で処置される場合、比較的少数の遺伝子における遺伝子発現の変化を示し、この大多数はそれらのプロモーターにおいて推定四重鎖形成配列を有し、新規な化合物がこれらの核遺伝子を選択的に標的化するという概念と一致することが見出された。
【００２４】
その上、驚くべきことに、これらの標的化遺伝子のいくつかは患者生存の増加と関連し、ここで、ヒトにおけるそれらの発現は下方調節され、本発明の新規な化合物がヒトがんの処置において有用性を有し得るという概念を裏付ける。
【００２５】
本発明の化合物は、薬学的に許容される組成物の形態で提供することができる。組成物は任意の経路によって投与することができる。腫瘍の化学療法のため、組成物は、最も好都合には、静脈内に投与される。本発明の化合物、殊に酸付加塩の形態で提示される場合、例えば塩基性アミン基の一部または全てが塩形態に変換される場合、水溶性であり、およそ中性のｐＨを有する。そのままで、これらの塩は、静脈内投与に適切である水溶液の形態での投与に適当である。医薬水溶液は、好ましくは、化合物を１ｍｇ／ｌから５００ｍｇ／ｌ含む。
【００２６】
本発明の化合物は、医薬組成物に構成されるのに適当な形態で、例えば、乾燥させた再湿潤化可能な（ｒｅｈｙｄｒａｔａｂｌｅ）形態で、例えば担体または希釈剤とともに提供することができる。こうした乾燥された形態は、結晶化および／または蒸発によって生成することができる。代替として、化合物は、例えば、投与前の希釈のための水または薬学的に許容される有機溶媒中の濃縮物として提示され得る。
【００２７】
現存の腫瘍のための処置として使用される場合、本発明の化合物は、化学療法剤のために開発されたレジメンを使用して投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、添付の実施例においてさらに例証されている。
【実施例】
【００３０】
一連のトリ置換ナフタレンジイミドは、Ｇ−四重鎖リガンドとしておよび潜在的抗がん剤として合成および評価されている。下に詳述する通り、新たな合成手順が開発されている。模式図２における化合物４ｃは、現在のところリード化合物として同定されている：
【化６】
2019505495.tif 000008
【００３１】
化学
全ての化学物質、試薬および溶媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、およびＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍ（ＵＫ）から購入し、さらに精製することなく使用した。溶媒は、ＶＷＲおよびＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって供給された。ＢＤＨシリカゲル（ＢＤＨ  １５３３２５Ｐ）を使用して、カラムクロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィーは、中圧下にてガラスカラム中で、またはＢｉｏｔａｇｅ  ＳＰ４機器を使用してパック済みカラム（ＦＬＡＳＨシリカカラム（４０〜６３μｍ、６０Å））中で行った。ＨＰＬＣ分析は、３２２ポンプおよびＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ検出器を組み合わせるＧｉｌｓｏｎ器具を用いて、Ｃ１８  ５μｍ（１００ｍｍ×４．６ｍｍ）カラム（４１６２２２７１（Ｗ）、ＹＭＣ、日本）を使用して、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で実施した。分取ＨＰＬＣは、３２２ポンプおよび２８０ｎｍで検出するＵＶ／ｖｉｓ−１５５検出器を組み合わせるＧｉｌｓｏｎ器具を用いて、Ｃ１８  ５μｍ（１００ｍｍ×２０ｍｍ）カラム（２０１０２２２７２）（Ｗ）、ＹＭＣ、日本を使用して、２０ｍＬ／ｍｉｎの流速で実施した。水およびメタノールを０．１％ギ酸とともに、ＨＰＬＣのための溶媒として使用した。化合物４ａ〜４ｉの精製のため、以下の方法を使用した：注入後５分間１００％水溶液、次いで２５分かけて６０％水溶液に徐々に減少させた。
【００３２】
化合物３ａおよび３ｂについて、以下の方法を使用した：注入後２分間１００％水溶液、１７分かけて２０％溶液に徐々に減少させた。化合物４ａ〜４ｉのＨＰＬＣ純度分析のため、使用された方法は、注入後５分間は１００％水溶液、１８分かけて６０％ｗ／ｖ水溶液に、注入後５分間は１００％水溶液、４３分かけて６０％ｗ／ｖ水溶液であった。最終化合物についての純度は、９５％（ＨＰＬＣ、２８０ｎｍ）より大きかった。ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚで、Ｂｒｕｋｅｒ分光計上にて、ＣＤＣｌ３（０．０５％ＴＭＳ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡを用いる）中で記録した。ＮＭＲスペクトルは、ＴＭＳを標準（δ＝０ｐｐｍ）として使用する化学シフトを用いるＭｅｓｔＲｅＣ  ４．５．６．０で分析した。ＮＭＲ多重度略語は、ｓ（一重線）、ｂｓ（幅広の一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、５ｑ（五重線）、およびｍ（多重線）である。カップリング定数Ｊは、観察された通りにヘルツ（Ｈｚ）で報告されている。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）下で実行されるＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａグローバルタンデム質量分析計上で測定し、ＭａｓｓＬａｂ  ３．２ソフトウェアを使用して処理した。化合物２ａおよび２ｂについて、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲは、溶解性の問題により得られなかった。
参照方法１
【化７】
2019505495.tif 000009
【００３３】
スキーム１における手順を使用して、化合物４ａ〜４ｊを最初に合成した。
【００３４】
２−ブロモ−１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物（２ａ）および２，６−ジブロモ−１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物（２ｂ）：ナフタレン二無水物（１）（１ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）を濃硫酸（９６％）（３８ｍｌ）中に溶解した。濃硫酸（１８．５ｍｌ）中のジブロモイソシアヌル酸（１．０７ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）の溶液をその中に４時間の期間をかけて滴下により添加した。混合物をさらに１時間の間撹拌し、次いで氷（５００ｍｌ）上に注いだ。形成した黄色の固体を濾過し、水中０．５ＭのＨＣｌで洗浄し（２×１０ｍｌ）、真空下で乾燥させた。１、２ａおよび２ｂの混合物を含有する得られた黄色の固体をさらに精製することなく使用した。本発明者らは、２ａおよび２ｂを、それらの化合物の低い溶解性のために分離しなかった。その上、溶解性の問題によりＮＭＲデータが得られなかった。
【００３５】
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−（モルホリノ）プロピルアミノ）−２−ブロモ−１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸ジイミド（３ａ）およびＮ，Ｎ’−ビス（３−（モルホリノ）プロピルアミノ）−２，６−ジブロモ−１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸ジイミド（３ｂ）：化合物２（２ａおよび２ｂの混合物）（２５０ｍｇ、０．７２０ｍｍｏｌ）を超音波処理で氷酢酸（３ｍｌ）中にマイクロ波反応容器の中で懸濁させた。３−モルホリノプロピルアミン（３１１ｍｇ、３１６μＬ、２．１６ｍｍｏｌ）を撹拌混合物に滴下により添加した。反応チューブを密閉し、２５分間１３０℃でマイクロ波中にて処理した。溶媒除去後、分取ＨＰＬＣを介して残渣を精製し、誘導体３ａおよび３ｂを褐色の固体として得た。
【００３６】
収量３ａ（４８ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１１．１％）：1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  2.08-2.13  (m,  4H),  2.77-2.83  (m,  12H),  3.72-3.76  (m,  8H),  4.25-4.31  (q,  4H),  8.75  (d,  1H,  J=  8Hz),  8.80  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.92  (s,  1H).  13C  NMR  (100  MHz,  CDCl3,  TMS)  δ  23.31,  23.44,  38.81,  39.11,  52.50,  55.51,  55.45,  65.37,  65.41,  123.97,  125.75,  125.95,  126.01,  126.84,  128.68,  128.76,  130.73,  131.71,  138.44,  161.17,  161.87,  161.98,  162.56.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ２８Ｈ３１ＢｒＮ４Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値６００．１５４３。実測値：６００．１５３６。
【００３７】
収量３ｂ（４９ｍｇ、０．０７２２ｍｍｏｌ、１０．０％）：1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  2.00-1.92  (m,  4H),  2.45-2.37  (m,  8H),  2.53-2.50  (m,  4H),  3.54-3.52  (m,  8H),  4.33-4.28  (m,  4H),  8.99-8.76  (s,  2H).  13C  NMR  (100  MHz,  CDCl3,  TMS)  δ  21.7,  38.5,  51.8,  54.7,  63.7,  123.4,  124.5,  126.7,  128.2,  138.5,  161.4,  161.5.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ２８Ｈ３０Ｂｒ２Ｎ４Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値６７９．０６０３。実測値：６７９．０５９３。
【００３８】
４−（（３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロピル）アミノ）−２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ａ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、１−（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジン（７８ｍｇ、８５μｌ、０．５０ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（２ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、粗製混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ギ酸塩４ａを赤色の固体として得た。収量４ａ（５２ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ、２８．８％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.99-  2.09  (m,  6H),  2.62-  2.80  (m,  17H),  3.01  (m,  8H),  3.68-3.76  (m,  10H),  4.20-  4.26  (m,  4H),  8.23  (s,  1H),  8.31  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.61  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  10.16  (t,  1H,  exch  D20,  J=  5.8Hz).  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  23.7,  23.9,  38.2,  38.8,  41.1,  43.3,  50.2,  52.5,  52.7,  53.1,  54.6,  55.7,  65.5,  65.7,  99.9,  119.4,  119.8,  123.4,  124.6,  126.1,  127.9,  129.5,  131.4,  152.3,  163.0,  163.3,  166.0,  166.4.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３６Ｈ４９Ｎ７Ｏ６の計算値６７６．３８２３、実測値６７６．３８２５。
【００３９】
４−（（２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル）アミノ）−２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｂ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、１−（２−アミノエチル）−４−メチルピペラジン（７２ｍｇ、７５μｌ、０．５０ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（２ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、粗製混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ギ酸塩４ｂを赤色の固体として得た。収量４ｂ（９．４ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、５．３％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.96-2.02  (m,  4H),  2.53-2.68  (m,  21H),  3.03-3.05  (m,  4H),  3.62  (t,  4H,  J=  4.6Hz),  3.67-3.72  (m,  6H),  4.23-4.28  (m,  4H),  8.21  (s,  1H),  8.34  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.64  (d,  1H,  J=  8Hz),  10.28  (t,  1H,  exch  D20,  J=  4.8Hz);  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  24.0,  38.3,  39.1,  40.2,  43.7,  50.4,  52.9,  53.1,  53.6,  55.8,  56.0,  56.0,  66.0,  66.3,  100.3,  119.5,  120.0,  123.6,  124.6,  126.3,  128.0,  129.5,  131.4,  152.1,  163.0,  163.1,  163.3,  165.9.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３５Ｈ４７Ｎ７Ｏ６の計算値６６２．３６８０、実測値６６２．３６６６。
【００４０】
２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）−４−（（２−（ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｃ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、１−（２−アミノエチル）−ピロリジン（５７ｍｇ、６３μｌ、０．５０ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（２ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、粗製混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ギ酸塩４ｃを赤色の固体として得た。収量４ｃ（２５ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ、１４．８％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  2.02-2.04  (m,  8H),  2.68-2.78  (m,  12H),  3.19  (t,  4H,  J=  6.4Hz),  3.32  (t,  2H,  J=  6.6Hz),  3.71  (t,  4H,  J=  4.8Hz),  3.76  (t,  4H,  J=  4.6Hz),  4.01-4.02  (m,  2H),  4.22  (t,  4H,  J=  7Hz),  8.24  (s,  1H),  8.28  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.56  (d,  1H,  J=  8Hz),  10.17  (t,  1H,  exch  D20,  J=  4.2Hz).  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  23.3,  23.6,  23.7,  38.2,  38.9,  40.1,  52.6,  52.7,  53.9,  53.9,  55.8,  65.6,  65.8,  100.7,  119.1,  119.5,  123.5,  124.9,  126.1,  128.0,  129.2,  131.4,  151.8,  162.8,  163.2,  165.9,  166.5.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３４Ｈ４４Ｎ６Ｏ６の計算値６３３．３３８９、実測値６３３．３４０１。
【００４１】
２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）−４−（（２−（ピリジン−２−イル）エチル）アミノ）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｄ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、２−（２−アミノエチル）ピリジン（６１ｍｇ、５９μｌ、０．５０ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（２ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、粗製混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ギ酸塩４ｄを赤色の固体として得た。収量４ｄ（１２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、７％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.90-1.96  (m,  4H),  2.49-2.58  (m,  12H),  3.22  (t,  2H,  J=7Hz),  3.57  (t,  4H,  J=4.6Hz),  3.62  (t,  4H,  J=4.6Hz),  3.97-4.02  (m,  2H),  4.16-4.20  (m,  4H),  7.11-7.15  (m,  1H),  7.29-7.27  (m,  1H),  7.57-7.61  (d,  1H,  J=7.8Hz),  8.20  (s,  1H),  8.26  (d,  1H,  J=8Hz),  8.56  (d,  2H,  J=8Hz),  10.21  (t,  1H,  exch  D20,  J=5.6Hz);  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  24.2,  37.7,  38.6,  39.2,  42.8,  53.1,  53.3,  56.2,  66.5,  66.5,  100.1,  119.8,  121.9,  123.5,  123.6,  124.5,  126.2,  127.9,  129.5,  131.3,  136.8,  149.7,  151.9,  152.2,  157.8,  163.0,  163.1,  163.4,  166.1.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３５Ｈ４０Ｎ６Ｏ６の計算値６４１．３０９０、実測値６４１．３０８８。
【００４２】
２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）−４−（（４−（ピロリジン−１−イル）ブチル）アミノ）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｅ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、４−（１−ピロリジニル）−１−ブチルアミン（４８ｍｇ、５１μｌ、０．３３ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（１．５ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、粗製混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ギ酸塩４ｅを赤色の固体として得た。収量４ｅ（１７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、１４％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.94-2.11  (m,  12H),  2.59-2.77  (m,  12H),  3.14  (t,  2H,  J=  7.8Hz),  3.28-3.29  (m,  4H),  3.63-3.70  (m,  6H),  3.76  (t,  4H,  J=  4.6Hz),  4.23-4.27  (m,  4H),  8.17  (s,  1H),  8.34  (d,  1H,  J=  8Hz),  8.64  (d,  1H,  J=  8Hz),  10.10  (t,  1H,  exch  D20,  J=  5.4Hz);  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  23.2,  23.4,  23.7,  23.8,  26.7,  38.3,  38.9,  42.4,  52.7,  52.8,  53.3,  54.7,  55.8,  55.9,  65.7,  65.9,  100.2,  119.5,  119.5,  123.6,  124.7,  126.3,  128.1,  129.5,  131.4,  152.3,  162.9,  163.1,  163.4,  166.2.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３６Ｈ４８Ｎ６Ｏ６の計算値６６１．３７１３、実測値６６１．３７１３。
【００４３】
２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）−４−（（２−（ピペリジン−１−イル）エチル）アミノ）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｆ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、１−（２−アミノエチル）ピペリジン（４２ｍｇ、４７μｌ、０．３３ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（１．５ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、粗製混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ギ酸塩４ｆを赤色の固体として得た。収量４ｆ（１３ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、１１％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.57-1.60  (m,  2H),  1.69-1.75  (m,  4H),  1.95-2.00  (m,  4H),  2.51-2.68  (m,  16H),  2.87  (t,  2H,  J=  6.4Hz),  3.61  (t,  4H,  J=  4.6Hz),  3.67  (t,  4H,  J=  4.6Hz),  3.76-3.80  (m,  2H),  4.22-4.28  (m,  4H),  8.18  (s,  1H),  8.31  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.61  (d,  1H,  J=  8Hz),  10.24  (t,  1H,  exch  D20,  J=  5Hz);  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ23.8,  24.2,  25.2,  38.5,  39.2,  39.9,  53.1,  53.2,  54.3,  56.2,  56.8,  66.4,  66.5,  100.3,  199.5,  119.9,  123.6,  124.5,  126.2,  127.9,  129.5,  131.2,  152.0,  162.9,  163.1,  163.4,  165.9.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３５Ｈ４６Ｎ６Ｏ６の計算値６４７．３５６６、実測値６４７．３５５７。
【００４４】
４−（（２−モルホリノエチル）アミノ）−２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｇ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（６０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、４−（２−アミノエチル）モルホリン（２６ｍｇ、３０μｌ、０．２ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（１ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、粗製混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ギ酸塩４ｇを赤色の固体として得た。収量４ｇ（１５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、２２％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.92-1.96  (m,  4H),  2.42-45  (m,  8H),  2.49-2.54  (m,  4H),  2.59  (t,  4H,  J=4.4Hz),  2.80  (t,  2H,  J=  6Hz),  3.56  (m,  4H,  J=  4.4Hz),  3.62  (t,  4H,  J=  4.4Hz),  3.66-3.70  (m,  2H),  3.78  (t,  4H,  J=  4.4Hz),  4.23-4.30  (m,  4H),  8.21  (s,  1H),  8.33  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.64  (d,  1H,  J=  8Hz),  10.34  (t,  1H,  exch  D20,  J=  4.8Hz);  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  24.4,  24.6,  38.7,  39.4,  40.1,  53.5,  53.6,  56.4,  56.5,  56.8,  66.93,  66.96,  66.99,  100.3,  119.5,  120.0,  123.7,  124.5,  126.2,  127.9,  129.5,  131.2,  152.1,  163.1,  163.5,  165.9.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３４Ｈ４４Ｎ６Ｏ７の計算値６４９．３３７６、実測値６４９．３３５０。
【００４５】
４−（（テトラヒドロフリルメチル）アミノ）−２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｈ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（６０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフルフリルアミン（２１ｍｇ、２１μｌ、０．２ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（１ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、粗製混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ギ酸塩４ｈを赤色の固体として得た。収量４ｈ（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１５％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.26-1.28  (m,  4H),  1.71-1.78  (m,  6H),  1.94-2.05  (m,  2H),  2.12-2.51  (m,  10H),  3.56-3.57  (m,  4H),  3.62-3.64  (m,  4H),  3.74-3.78  (m,  1H),  3.84-3.87  (m,  1H),  3.97-4.00  (m,  1H),  4.24-4.28  (m,  4H),  8.27  (s,  1H),  8.34  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.65  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  10.34  (t,  1H,  exch  D20,  J=  4.8Hz);  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  24.4,  24.6,  25.9,  38.8,  39.4,  47.3,  53.6,  56.4,  56.5,  66.94,  66.97,  68.6,  100.2,  119.5,  120.0,  123.7,  124.5,  126.2,  127.9,  129.5,  131.2,  152.5,  163.1,  163.4,  166.2.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３３Ｈ４１Ｎ５Ｏ７の計算値６２０．３０９６、実測値６２０．３０８４。
【００４６】
４−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｉ）：化合物３ａ（２４ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン（９ｍｇ、１１μｌ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ（０．８ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ３３７％  ９．５／０．５／０．０３の混合物を溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーを介して粗製混合物を精製し、化合物４ｉを赤色の固体として得た。収量４ｉ（１５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、５９％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.11  (t,  6H,  J=  7Hz),  1.46-1.47  (m,  4H),  1.90-2.53  (m,  12H),  2.64-2.69  (m,  4H),  2.86  (t,  2H,  J=  6.2Hz),  3.56-3.57  (m,  4H),  3.61-3.65  (m,  6H),  4.23-4.30  (m,  4H),  8.21  (s,  1H),  8.31  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.62  (d,  1H,  J=  8Hz),  10.27  (t,  1H,  exch  D20,  J=  5Hz);  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  11.8,  24.4,  24.5,  38.6,  39.3,  47.1,  51.6,  53.5,  53.6,  56.5,  66.9,  100.1,  119.4,  120.2,  123.7,  124.3,  126.1,  127.8,  129.6,  131.2,  152.1,  163.12,  163.16,  163.5,  165.9.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３４Ｈ４６Ｎ６Ｏ６の計算値６３５．３５５２、実測値６３５．３５５７。
【００４７】
４−（（４−ヒドロキシフェネチル）アミノ）−２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｊ）：化合物３ａおよび３ｂの混合物（１３９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、塩酸チラミン（８０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４７ｍｇ、６５μｌ、０．４６ｍｍｏｌ）ならびにＮＭＰ（２ｍｌ）をマイクロ波容器の中で懸濁させた。チューブをゴムカップで密閉し、１２５℃に３０分間マイクロ波照射下で加熱した。溶媒除去後、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９．５／０．５の混合物を溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーを介して粗製混合物を精製し、化合物４ｊを赤色の固体として得た。収量４ｊ（１１ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、７％）。1H  NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  1.75-1.82  (m,  4H),  2.31-2.43  (m,  12H),  2.91  (t,  2H,  J=  6.6Hz),  3.41-3.44  (m,  8H),  3.9-3.71  (m,  2H),  4.02  (m,  4H),  6.72  (d,  2H,  J=  8.4Hz),  7.15  (d,  2H,  J=  8Hz),  7.84  (s,  1H),  8.02  (d,  1H,  J=  8Hz),  8.30  (d,  1H,  J=  8Hz),  9.86  (brs,  1H,  exch  D20).  13C  NMR  (100MHz,  CDCl3),  δ  29.9,  30.9,  38.4,  38.9,  44.5,  53.4,  53.5,  56.2,  56.4,  66.5,  66.7,  94.4,  100.1,  116.1,  119.4,  120.2,  123.5,  124.5,  126.2,  129.0,  130.2,  131.3,  155.4,  162.9,  163.1,  163.5,  165.8.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３６Ｈ４１Ｎ５Ｏ７の計算値６５６．３０７４、実測値６５６．３０８４。
参照方法２
【化８】
2019505495.tif 000010
【００４８】
スキーム２に従って４ｃの合成を最適化した。プロセスは、ステップｉｉの生成混合物の精製で３ａおよび３ｂならびにＢｒのない副生成物を分離することを伴う。これは、カラムクロマトグラフィーによる生成物４のより簡便な精製を可能にした。これは、方法１で使用されている通りの分取ＨＰＬＣでは不可能なスケールアップも可能にした。異なる反応条件を使用して化合物３ａを得た。使用された全ての条件ならびに化合物３ａおよび３ｂについての相対的収率は、表１に報告されている。
【表１】
2019505495.tif 000011
【００４９】
２−ブロモ−１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物（２ａ）および２，６−ジブロモ−１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物（２ｂ）：
ナフタレン二無水物（１）（１５０ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を硫酸（１．５ｍｌ）中にスラリー化し、得られた懸濁物を５分間室温で撹拌することで、完全な溶解を可能にした。５，５−ジメチル−１，３−ジブロモヒダントイン（８８ｍｇ、０．３０８ｍｍｏｌ）を１時間の期間をかけてゆっくり添加し、丸底フラスコを密に塞ぐことで、反応混合物からの臭素の漏れを回避した。溶液を８０℃で７２時間の間撹拌し、次いで氷（３０ｍｌ）上に注いだ。形成された黄色の固体を濾過し、水（２×１０ｍｌ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、混合物２ａおよび２ｂが得られた。溶解性の問題によりＮＭＲデータが得られなかった。結果として得られた混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。
【００５０】
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−（モルホリノ）プロピルアミノ）−２−ブロモ−１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸ジイミド（３ａ）。化合物２ａおよび２ｂ（１９４ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を超音波処理で氷酢酸（１．５ｍｌ）中にマイクロ波反応容器の中で懸濁させた。３−モルホリノプロピルアミン（２４２ｍｇ、２４５μＬ、１．６８ｍｍｏｌ）を撹拌混合物に滴下により添加した。反応チューブを密閉し、３０分間１２５℃でマイクロ波中にて処理した。溶液を次いで炭酸カリウムで塩基性化し、クロロホルム（３×５ｍｌ）で抽出した。有機相を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９６／４０の混合物を溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーを介して、得られた残渣を精製した。収量３ａ（１０７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、３５％）1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  1.95-1.97  (m,  4H),  2.40-2.43  (m,  8H),  2.52-2.53  (m,  4H),  3.51-3.54  (m,  8H),  4.28-4.33  (q,  4H),  8.77  (d,  1H,  J=  8Hz),  8.82  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.935  (s,  1H).  13C  NMR  (100  MHz,  CDCl3,  TMS)  δ  29.3,  29.7,  31.2,  38.1,  53.5,  56.4,  56.5,  59.5,  66.9,  126.0,  126.1,  126.7,  126.9,  128.6,  130.6,  130.8,  131.6,  138.4,  161.1,  161.8,  161.9,  162.5.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ２８Ｈ３１ＢｒＮ４Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値６００．１５４３。実測値：６００．１５３６。
【００５１】
２，７−ビス（３−モルホリノプロピル）−４−（（２−（ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ）ベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトラオン（４ｃ）：化合物３ａ（０．１５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、１−（２−アミノエチル）ピロリジン（pirrolidine）（０．０６ｍＬ、０．５１ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ（１ｍＬ）をマイクロ波反応容器の中で懸濁させた。反応チューブを密閉し、２５分間１３０℃でマイクロ波中にて処理した。室温に冷却した後、溶媒を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ３  ９５／５／０．４の混合物を溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーによって粗製混合物を精製した。化合物４ｃを赤色の油状物として得た（１１８ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ、７５％の収率）。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3,  TMS)  δ  2.019-2.040  (m,  8H),  2.683-2.782  (m,  12H),  3.195  (t,  4H,  J=  6.4Hz),  3.32  (t,  2H,  J=  6.6Hz),  3.708  (t,  4H,  J=  4.8Hz),  3.764  (t,  4H,  J=  4.6Hz),  4.009-4.024  (m,  2H),  4.22  (t,  4H,  J=  7Hz),  8.237  (s,  1H),  8.28  (d,  1H,  J=  7.6Hz),  8.56  (d,  1H,  J=  8Hz),  10.174  (t,  1H,  exch  D20,  J=  4.2Hz).  13CNMR  (100MHz,  CDCl3)  δ  23.3,  23.6,  23.7,  38.2,  38.9,  40.1,  52.6,  52.8,  53.9,  53.9,  55.8,  65.6,  65.8,  100.7,  119.1,  119.5,  123.5,  124.9,  126.1,  128.0,  129.2,  131.4,  151.8,  162.8,  163.2,  165.9,  166.5.ＨＲＭＳ（ＥＳ＋）：（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ３４Ｈ４４Ｎ６Ｏ６の計算値６３３．３３８９、実測値６３３．３４０１。
【００５２】
塩形成
次いで４ｃを塩に変換することで、その水溶解性を増強した。異なる塩を得、５ｍｇ／ｍｌでのそれらの溶解性および結果として得られた水溶液のｐＨを評価した。結果は表２に報告されている。
【表２】
2019505495.tif 000012
【００５３】
生物物理学的および細胞生物学データ
ＦＲＥＴアッセイ。９６ウェルフォーマットにおける高スループットスクリーンとして使用されるように修飾された蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを使用して、四重鎖ＤＮＡ配列を安定化するためのナフタレンジイミド化合物の能力を調査した。いくつかの四重鎖配列を研究した（ヒトテロメアＧ−四重鎖ＤＮＡ配列５’−ＦＡＭ−ｄ（ＧＧＧ［ＴＴＡＧＧＧ］３）−ＴＡＭＲＡ−３’および二重鎖配列５’−ＦＡＭ−ｄＴＡＴＡＧＣＴＡＴＡ−ＨＥＧ−ＴＡＴＡＧＣＴＡＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（ＨＥＧリンカー：［（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）６］）を含む）。
【００５４】
標識化オリゴヌクレオチドは、ドナーフルオロフォアＦＡＭ：６−カルボキシフルオレセインおよびアクセプターフルオロフォアＴＡＭＲＡ：６−カルボキシテトラメチルローダミンをそれらに付着している。ＦＲＥＴプローブ配列をストックから妥当な濃度（４００ｎＭ）へ、６０ｍＭカコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に希釈し、次いで８５℃に１０分間加熱することによってアニールし、続いて加熱ブロックにおいて室温に冷却した。化合物をＤＭＳＯ中の１０ｍＭストック溶液として貯蔵し；最初の１：１０希釈において、１０ｍＭのＨＣｌを使用して最終溶液（２×濃度で）を調製し、この後、６０ｍＭのカコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を全ての後続ステップにおいて使用した。（２０μＭのリガンド濃度での）反応体積における最大ＨＣｌ濃度は、したがって２００μＭであり、十分に使用される緩衝液の範囲内である。関連対照も、アッセイへの干渉について調べるために行った。９６ウェルプレート（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、各ウェル中に５０μｌのアニールしたＤＮＡ、続いて５０μｌの化合物溶液をアリコートにすることによって調製した。ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上にて４５０〜４９５ｎｍでの励起および５１５〜５４５ｎｍでの検出で、測定を行った。安定な値を確保するために各読取りの前に３０秒間一定温度を維持しながら、蛍光読取りを３０〜１００℃の範囲において０．５℃の間隔で行った。プログラムＯｒｉｇｉｎ  ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）に書かれているスクリプトを使用して、データの最終分析を実施した。ΔＴｍ値の算出のために、Ｏｒｉｇｉｎ７．０における高度な曲線フィッティング機能を使用した。全ての決定を三連でまたはそれ以上で行った。ΔＴｍにおけるＥｓｄは±０．１℃である。
【表３】
2019505495.tif 000013
【００５５】
細胞培養および細胞毒性試験。ヒトがん細胞株およびヒト体細胞株ＷＩ−３８（肺線維芽細胞）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、および供給元によって特定されている通りの他の構成成分が補充された適切な培地中で、細胞株を維持した。細胞株を３７℃、５％ＣＯ２で維持し、慣用的に継代した。薬物をＤＭＳＯ中に溶解させ、０．２２μｍ細孔サイズフィルターユニットを介して濾過した後に、細胞株に適切な培地に添加した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを使用して９６ウェルプレート中で、細胞成長阻害を測定した。未処理対照ウェルの吸光度の百分率として表される各薬物濃度について５４０ｎｍで平均吸光度を求めることによって、５０パーセント阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。
【００５６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のため、Ｍｉａ−ＰａＣａ２細胞を、Ｔ７５培養フラスコ中でＩＣ５０決定のために使用される密度と同等の密度に播種し、２４時間の間１０ｍｌのＤＭＥＭ中で成長させることで付着を可能にした後に、化合物３ｄを培養培地に添加した。化合物曝露に続いて、細胞をＰＢＳ中にて２回洗浄し、トリプシン処理によって収集し、遠心分離（３００ｇ、５分、４℃）によって回収し、ＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中に再懸濁した。ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを使用して試料をホモジナイズし、−８０℃で貯蔵した後に、ＲＮＡ抽出した。３つの生物学的反復を別々の日に行った。
【表４】
2019505495.tif 000014
【００５７】
抗腫瘍活性
プロトコール
マトリゲルで成長させた膵臓腫瘍細胞株ＭｉａＰａＣａ−２（右側腹部中の５×１０６個の細胞）の皮下異種移植片を有するＣＤ１ヌードマウスにおける、ＭＭ４１およびゲムシタビンと比較した化合物４ｃ（ＭＭ４１−ｔｒｉ）の治療効果を研究する。
【００５８】
実験概要
１  右側腹部にＳＣ  ５×１０６個のＭｉａｐａｃａ−２細胞を接種する（未補充ＲＰＭＩ＋マトリゲル）。
２  腫瘍が皮下に確立するのを待つ（およそ１１日）。
３  腫瘍が０．１ｃｍ３の平均サイズに達するまで毎週、腫瘍のサイズを測定する。腫瘍の発達のこの段階で、マウスは治療研究を開始する準備ができている。
４  各々８匹のマウスで構成される５つの治療群を形成し、１群当たりおよそ０．１ｃｍ３平均の腫瘍サイズを有するように、マウスを再度群に分ける。
５  対応する用量のＭＭ４１または化合物４ｃまたはゲムシタビンをＩＶにより投与する。
群１：週２回用量のゲムシタビン  １５ｍｇ／Ｋｇで処置された８匹のマウス。
群２：週２回用量のＭＭ４１（テトラ置換ＮＤ化合物）１５ｍｇ／Ｋｇで処置された８匹のマウス。
群３：週２回用量の化合物４ｃ  １５ｍｇ／Ｋｇで処置された８匹のマウス。
群４：週２回用量の化合物４ｃ  １０ｍｇ／Ｋｇで処置された８匹のマウス。
群５：生理食塩水だけで毎週２回処置された８匹の対照マウス。
【００５９】
腫瘍成長曲線は、図１に示されている。１５ｍｇ／ｋｇでの化合物４ｃ（ＭＭ４１−ｔｒｉと記されている）は、高度に有意な抗腫瘍応答を示している。ＭＭ４１は、Ｍｉｃｃｏら  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２０１３年において強調されたジ−モルホリノ−ジ−Ｎ−メチル−ピペラジンナフタレンジイミド誘導体である。動物は、処置でいかなる著しい体重損失も有していなかった。
【００６０】
遺伝子発現
方法
細胞培養
細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、液体窒素下で貯蔵した。細胞を単層培養Ｔ７５（７５ｃｍ２のフラスコ）中で、加湿された５％ＣＯ２雰囲気にて３７℃で維持した。Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号２５０３００２４）、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液Ｈｙｂｒｉｄ−Ｍａｘ（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｐ７５３９）およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号１０２７０１０６）を含む必要な補充物とともに、（ＡＴＣＣ）に従った適切な培地中で、細胞を維持した。細胞を、８０〜９０％コンフルエンスで継代した。
【００６１】
ＲＮＡ抽出
ＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞を、インキュベーションの４８時間前に、ＭａｔＴｅｋの３５ｍｍガラス底ディッシュ中に播種した。化合物４ｃについて３つのインキュベーション時間：０時間、６時間および２４時間を検査した。ＲＮＡ抽出のため、１×ＰＢＳ（塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし、Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｄ１４０８）中で細胞を２回濯いだ後のトリプシン処理によって、細胞（最大１×１０７個の細胞）を収集した。トリプシンと等体積の培地で培地を中和させた後、細胞を滅菌遠心チューブに移し、４分間４００ｒｐｍにて室温で遠心分離することで、細胞をペレット化した。遠心分離に続いて培地およびトリプシンを除去した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用してＱＩＡＧＥＮ（カタログ番号７４１０４）によって、ＲＮＡを細胞のペレットから抽出した。ＲＮＡ品質をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒの使用によって調べ、１反復当たり＞２５ｎｇ／μｌ濃度でＲＮＡ約５００ｎｇの最小分量を検証した。
【００６２】
ＵＣＬ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００機器、および０時間曝露での対照細胞に対する分析された細胞のゲノムにおける全ての個々の遺伝子のＲＮＡ発現レベルで得られたデータによって、ＲＮＡ−Ｓｅｑ配列決定研究を行った。４つの反復を各時点について使用し、したがって、合計１２の個々のゲノムを分析し、統計量を各時点について得た。
【００６３】
遺伝子発現分析−化合物４ｃを用いる処置に続く遺伝子発現の変化
データは、処置されたＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞からのＲＮＡ−ｓｅｑデータから取り、ＲＮＡレベルによって測定された発現の最も有意な下方調節を示す遺伝子から選択された遺伝子についてｌｏｇ倍数（ｌｏｇ−ｆｏｌｄ）発現変化を示す。
【表５】
2019505495.tif 000015
【表６】
2019505495.tif 000016
【表７】
2019505495.tif 000017
【００６４】
遺伝子発現の変化の分析は、２つの時点で変化の一貫したパターンを示し、下方調節された遺伝子（上記の表５）は、一般に、ＤＮＡ傷害応答を含めて、転写活性化、ＧＴＰアーゼ活性およびがん経路に関与するタンパク質をコードしている。特筆すべきは、最も強く下方調節された遺伝子が、それらのプロモーター領域内に推定ＤＮＡ四重鎖配列を有する傾向があることである。対照的に、上方調節された遺伝子（上記の表７）は、膜および細胞外マトリクスの構造および機能に関与するタンパク質をコードし、それらのプロモーターにおける推定四重鎖配列の著しい過少表示を有する傾向がある。各遺伝子プロモーターにおける推定四重鎖配列の数は、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（バージョン８６、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して一次配列から概算されている。
【００６５】
上記の分析において最も下方調節された遺伝子のいくつか（例えば、ＰＲＤＭ１６、ＣＢＦＡ２Ｔ３およびＳＨＡＮＫ２）は、メチル化されていると見出された場合に膵臓がんにおける患者生存の改善に関連すると前に報告されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＭＪ、Ｒｕｂｂｉ  Ｌ、Ｄａｗｓｏｎ  ＤＷ、Ｄｏｎａｈｕｅ  ＴＲ、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  Ｍ（２０１５年）Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｅｎｅｓ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０巻（６号）：ｅ０１２８８１４）。ＴＲＥＸ１およびＴＰ７３遺伝子の遺伝子産物はＤＮＡ修復に関与し：これらの遺伝子における多型は、膵臓がんにおける患者生存にも相関することが報告されている（Ｄｏｎｇ  Ｘ、Ｌｉ  Ｙ、Ｈｅｓｓ  ＫＲ、Ａｂｂｒｕｚｚｅｓｅ  ＪＬ，  Ｌｉ  Ｄ．（２０１１年）ＤＮＡ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｇｅｎｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  Ａｆｆｅｃｔ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １６巻（１号）、６１〜７０頁）。
【００６６】
以前のバイオインフォマティクス研究は、ヒトゲノムが３００，０００から７００，０００の間の潜在的な四重鎖形成配列を含有することを示唆している（Ｔｏｄｄ  ＡＫ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｍ、Ｎｅｉｄｌｅ  Ｓ．（２００５年）Ｈｉｇｈｌｙ  ｐｒｅｖａｌｅｎｔ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３巻（９号）、２９０１〜２９０７頁；Ｈｕｐｐｅｒｔ  ＪＬ、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｓ．（２００５年）Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３巻（９号）、２９０８〜２９１６頁；Ｋｗｏｋ  ＣＫ、Ｍａｒｓｉｃｏ  Ｇ、Ｓａｈａｋｙａｎ  ＡＢ、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＶＳ、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｓ．（２０１６年）ｒＧ４−ｓｅｑ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３巻（１０号）、８４１〜８４４頁）。しかしながら、細胞中の活性クロマチンにおける四重鎖形成のつい最近の研究（Ｈａｅｎｓｅｌ−Ｈｅｒｔｓｃｈ  Ｒ、Ｂｅｒａｌｄｉ  Ｄ、Ｌｅｎｓｉｎｇ  ＳＶ、Ｍａｒｓｉｃｏ  Ｇ、Ｚｙｎｅｒ  Ｋ、Ｐａｒｒｙ  Ａ、Ｄｉ  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｍ、Ｐｉｋｅ  Ｊ、Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ、Ｎａｒｉｔａ  Ｍ、Ｔａｎｎａｈｉｌｌ  Ｄ、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｓ．（２０１６年）Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｍａｒｋ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８巻（１０号）、１２６７〜１２７２頁）は、ほんの約１０，０００個の四重鎖がヒトクロマチンにおいて存在し、主にヒトがんに関与する遺伝子のプロモーター領域に濃縮されていることを示している。このこと、および真核細胞において少数の折り畳まれたＲＮＡ四重鎖しか存在しないという所見（Ｇｕｏ  ＪＵ、Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ．（２０１６年）ＲＮＡ  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ  ａｒｅ  ｇｌｏｂａｌｌｙ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３巻（６３０６号）．  ｐｉｉ：  ａａｆ５３７１）は、四重鎖選択的標的化がヒトがんの処置において実現可能であるという仮説を裏付ける。
【００６７】
驚くべきことに、化合物４ｃで処置された場合のＭＩＡ−ＰａＣａ２膵臓がん細胞は、比較的少数の遺伝子における遺伝子発現の変化を示し、このうちの大多数は、それらのプロモーターにおいて推定四重鎖形成配列を有しており、化合物がこれらの核遺伝子を選択的に標的化しているという概念と一致することが見出された。
【００６８】
驚くべきことに、これらの標的化遺伝子のいくつかは、ヒトにおけるそれらの発現が下方調節された場合に患者生存の増加と関連し、化合物４ｃなど、この開示における化合物がヒトがんの処置において有用性を有し得るという概念を裏付けている。
【図１】
2019505495.tif 000025
【国際調査報告】
2019505495.tif 000026
2019505495.tif 000027
2019505495.tif 000028