【手続補正書】
【提出日】平成19年8月17日(2007.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
a）それぞれドナー抗体の重鎖相補性決定領域（CDR）CDR1、CDR2、CDR3をコードする核酸配列と重鎖フレームワーク領域（FR）FR1、FR2、FR3及びFR4とをin frameに一緒に融合することによって作製された、可変重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーを合成すること、ただし少なくとも1つのFRは複数のヒト重鎖フレームワーク領域を含む1以上のサブバンクに由来するものであること；
b）可変重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列及び軽鎖可変領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーを細胞に導入すること；
c）可変重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列及び軽鎖可変領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーを発現させること；
d）抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニングすること；並びに
e）抗原と結合するヒト化抗体を単離すること
を含むヒト化抗体を作製する方法。
【請求項２】
以下の工程：
a）それぞれドナー抗体の軽鎖CDR1、CDR2、CDR3をコードする核酸配列と軽鎖FR1、FR2、FR3及びFR4とをin frameに一緒に融合することによって作製された、可変軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーを合成すること、ただし少なくとも1つのFRは複数のヒト軽鎖フレームワーク領域を含む1以上のサブバンクに由来するものであること；
b）可変軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列及び重鎖可変領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーを細胞に導入すること；
c）軽鎖可変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列及び重鎖可変領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーを発現させること；
d）抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニングすること；並びに
e）抗原と結合するヒト化抗体を単離すること
を含むヒト化抗体を作製する方法。
【請求項３】
以下の工程：
a）それぞれドナー抗体の重鎖CDR1、CDR2、CDR3をコードする核酸配列と重鎖FR1、FR2、FR3及びFR4とをin frameに一緒に融合することによって作製された、可変重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーを合成すること、ただし少なくとも1つのFRは複数のヒト重鎖フレームワーク領域を含む1以上のサブバンクに由来するものであること；
b）それぞれドナー抗体の軽鎖CDR1、CDR2、CDR3をコードする核酸配列と軽鎖FR1、FR2、FR3及びFR4とをin frameに一緒に融合することによって作製された、可変軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーを合成すること、ただし少なくとも1つのFRは複数のヒト軽鎖フレームワーク領域を含む1以上のサブバンクに由来するものであること；
c）可変重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーと、軽鎖可変領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーとを細胞に導入すること；
d）重鎖可変ポリペプチド及び軽鎖可変領域のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコンビナトリアルライブラリーを発現させること；
e）抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体をスクリーニングすること；並びに
f）抗原と結合するヒト化抗体を単離すること、
を含むヒト化抗体を作製する方法。
【請求項４】
複数のヒトフレームワーク領域が複数のヒト生殖系列配列又は複数のヒト抗体由来の配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
複数のヒトフレームワーク領域が複数のヒト生殖系列配列及び複数のヒト抗体由来の配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸配列がオーバーラップPCR又はライゲーションによってin frameに一緒に融合される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
工程(a)の前に、複数のフレームワーク領域を含む少なくとも1つのサブバンクを作製する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
各FRが1以上のサブバンクに由来する、請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により作製されたヒト化抗体。
【請求項１０】
請求項９に記載のヒト化抗体および担体、希釈剤または賦形剤を含有する組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
AL1〜AL13をAL1'〜AL10'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク１、又は表１に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー１が作製される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
BL1〜BL10をBL1'〜BL16'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク２、又は表２に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー２が作製される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
CL1〜CL11をCL1'〜CL12'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク３、又は表３に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー３が作製される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
DL1〜DL4をDL1'〜DL14'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク４、又は表４に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー4が作製される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
AH1〜AH10をAHK1'〜AHK18'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク５、又は表5に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー5が作製される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
BHK1〜BHK17をBHK1'〜BHK17'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク６、又は表6に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー6が作製される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
CHK1〜CHK15をCHK1'〜CHK13'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク７、又は表7に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー7が作製される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
AH1〜AH10をAHC1'〜AHC13'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク８、又は表8に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー8が作製される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
BHC1〜BHC30をBHC1'〜BHC24'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク９、又は表9に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー9が作製される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
CHC1〜CHC27をCHC1'〜CHC13'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク10、又は表10に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー10が作製される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
DH1〜DHC3をDH1'〜DH3'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブバンク11、又は表11に記載する配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルサブライブラリー11が作製される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
いくつかの実施形態において、コンビナトリアルサブライブラリー5'および6'は、非ヒトCDR H1およびH2（一本鎖または二本鎖の形態であり、Kabatの定義に従うもの）をサブバンク５および６とそれぞれ直接ライゲーションさせることにより、別々に構築される。あるいはまた、サブライブラリー5'および6'は、非ヒトCDR H1およびH2（Kabatの定義に従うものであり、一本鎖（＋）形態のもの）を表５に示す核酸144〜187および表６に示す188〜231とそれぞれ直接ライゲーションさせることにより得てもよい。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
いくつかの実施形態において、コンビナトリアルサブライブラリー8'および9'は、非ヒトCDR H1およびH2（一本鎖形態であり、Chothiaの定義に従うもの）をサブバンク８および９とそれぞれ直接ライゲーションさせることにより、別々に構築される。あるいはまた、サブライブラリー8'および9'は、非ヒトCDR H1およびH2（Chothiaの定義に従い、一本鎖形態（＋）であるもの）を表８に示す核酸276〜319および表９に示す320〜363とそれぞれ直接ライゲーションさせることにより得てもよい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
コンビナトリアルサブライブラリー11'および12'は、非ヒトCDR H3（一本鎖または二本鎖の形態）をサブバンク７（Kabatの定義）および10（Chothiaの定義）にそれぞれ直接ライゲーションさせることにより、別々に得られる。あるいはまた、サブライブラリー11'および12'は、非ヒトCDR H3（一本鎖（＋）形態）を表７に示す核酸232〜275および表10に示す364〜407とそれぞれ直接ライゲーションさせることにより得てもよい。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
AL1〜AL13をDL1'〜DL4'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブライブラリー１、２、３および４を合わせて、または表35〜40のオリゴヌクレオチドならびに表１、２、３および４に記載される配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、コンビナトリアルライブラリー１が作製される。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
AH1〜AH10をDH1'〜DH3'と組み合わせて用い、テンプレートとしてサブライブラリー５、６、７、11を合わせて、または表43〜47、54に記載のオリゴヌクレオチドならびに表５、６、７、11に記載される配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いて、あるいはサブライブラリー８、９、10、11、または表49〜54に記載のオリゴヌクレオチドならびに表８、９、10および11に示す配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行う。これにより、それぞれコンビナトリアルライブラリー２または３が作製される。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
別の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、直接ライゲーションにより構築される。例えば、ヒトκ軽鎖生殖系列フレームワークのコンビナトリアルライブラリー（コンビネーションライブラリー1'）は、サブライブラリー1'、2'、3'およびサブバンク４（または核酸139〜143、表４を参照）を一緒に直接連続ライゲーションさせることにより構築される。これに続いて、表60および表61に記載されるオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応ステップを行う。ヒト重鎖生殖系列フレームワーク領域の２つのコンビナトリアルライブラリー（１つはCDRのKabat定義についてのもの、コンビネーションライブラリー2'；１つはCDRのChothia定義についてのもの、コンビネーションライブラリー3'）は、サブライブラリー5'、6'、11'およびサブバンク11（Kabat定義）またはサブライブラリー8'、9'、12'およびサブバンク11（Chothia定義）を一緒に、直接連続ライゲーションさせることにより構築される。あるいはまた、サブバンク11は、そのライゲーション反応において核酸408〜413（表11を参照）と置き換えてもよい。これに続いて、表62および表63に記載されるオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応ステップを行う。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
AH1〜AH10をDH1'〜DH3'と組み合わせて用い、予め一緒にライゲーションさせておいたサブライブラリー5'、6'、11'およびサブバンク11（または核酸408〜413、表11を参照）または予め一緒にライゲーションさせておいたサブライブラリー8'、9'、12'およびサブバンク11（または核酸408〜413、表11を参照）をテンプレートとして用いてPCRを行う。これにより、それぞれコンビナトリアルライブラリー2'または3'が作製される。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５７】
フレームワークシャフル型VHおよびVLサブライブラリーの構築は、表１〜７および11に示したオリゴヌクレオチドを用いて行った。より詳細には、表１〜７および11に記載したオリゴヌクレオチドは、Kabat定義による軽鎖（κ）および重鎖のあらゆる公知のヒトフレームワーク生殖系列遺伝子の完全な配列をコードしている。表64および65に記載したオリゴヌクレオチドは、mAb B233のCDRの部分をコードしており、対応するヒト生殖系列フレームワークと重複している。表64に関しては、AL1〜13とDL1U〜4Uを除いて、各オリゴヌクレオチドは、mAb B233の１つのCDRの部分（下線）と１つのヒト生殖系列軽鎖フレームワークの部分（Kabat定義; Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, DC, 1991）をコードしている。CDRL1、L2およびL3はそれぞれAL1U〜10U/BL1〜10、BL1U〜16U/CL1〜11およびCL1U〜12U/DL1〜4によってコードされる。オリゴヌクレオチドAL1〜13はM13遺伝子3リーダー重複配列（太字）を含み、オリゴヌクレオチドDL1U〜4UはCκ重複配列（太字）を含む。表65に関しては、AH1〜10およびDH1U〜3Uを除いて、各オリゴヌクレオチドは、mAb B233の１つのCDRの部分（下線）と１つのヒト生殖系列重鎖フレームワークの部分（Kabat定義）をコードしている。CDRH1、H2およびH3はそれぞれAH1U〜17U/BH1〜17、BH1U〜16U/CH1〜15およびCH1U〜13U/DH1〜3によってコードされる。オリゴヌクレオチドAH1〜10はM13遺伝子3リーダー重複配列（太字）を含み、一方オリゴヌクレオチドDH1U〜3UはCκ1重複配列（太字）を含む。（K=GまたはT、M=AまたはC、R=AまたはG、S=CまたはG、W=AまたはT、およびY=CまたはT）。
【表６４】
2007502622.tif 000001
2007502622.tif 000002
【表６５】
2007502622.tif 000003
2007502622.tif 000004