(57)【要約】  本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する処置又はワクチン接種のための改良された組換えワクチン接種用ベクター、並びに該組換えワクチン接種用ベクターを含む医薬組成物又はワクチンに関する。本発明はまた、ＨＢＶに対するワクチン接種法に使用するための組換えワクチン接種用ベクター、並びに、該組換えワクチン接種用ベクターを含むワクチンを含むキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の小型又は大型のエンベロープタンパク質であり、ここでの該小型又は大型のエンベロープタンパク質は好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）；及び
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）；並びに、以下：
（ｃ）配列番号１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＢ型肝炎ウイルス由来の免疫原性エンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）；及び／又は
（ｄ）配列番号２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＢ型肝炎ウイルス由来の免疫原性コアタンパク質（ＨＢｃ抗原）；及び／又は
（ｅ）配列番号３に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＢ型肝炎ウイルス由来のポリメラーゼの免疫原性ＲＴドメイン
の中の少なくとも１つ
を発現する組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項２】
（ｃ）におけるＨＢｓ抗原及び／又は（ｄ）におけるＨＢｃ抗原が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｃに由来する、請求項１記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項３】
（ｃ）における免疫原性ＨＢｓ抗原が配列番号４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は、（ｄ）における免疫原性ＨＢｃ抗原が配列番号５に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は、（ｅ）におけるポリメラーゼの免疫原性ＲＴドメインが配列番号６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１又は２記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項４】
（ｂ）におけるＢ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗ由来のＨＢｃ抗原のアミノ酸１〜１４９を含むか又はからなる、Ｃ末端の切断短縮されたコアタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項５】
（ｆ）ＣＤ７０
をさらに発現する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項６】
ＣＤ７０がヒトＣＤ７０である、請求項５記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項７】
ＣＤ７０が、配列番号２６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５又は６記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項８】
組換えワクチン接種用ベクターが、ウイルス、ウイルス様粒子、又は細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項９】
組換えワクチン接種用ベクターがＭＶＡウイルスである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項１０】
組換えベクターが、弱毒化サルモネラ株、ＣＭＶ系ベクター、ＶＳＶ系ベクター、アデノウイルスベクター、又は麻疹ベクターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えワクチン接種用ベクター。
【請求項１１】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び／又は（ｅ）をコードしている少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは５つの核酸配列（群）が１つの発現カセットに含まれている、請求項９記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１２】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び／又は（ｅ）をコードしている核酸の少なくとも１つがポックスウイルスプロモーターの制御下にあり、該ポックスウイルスプロモーターは好ましくはＰ７．５又はＰＨ５である、請求項９又は１１記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１３】
発現カセットが配列番号７に示されたアミノ酸配列をコードしている、請求項１１又は１２記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１４】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び／又は（ｅ）の少なくとも１つをコードしている核酸配列が、ＭＶＡゲノムの欠失Ｉ（ｄｅｌ Ｉ）、欠失ＩＩ（ｄｅｌ ＩＩ）、欠失ＩＩＩ（ｄｅｌ ＩＩＩ）、欠失ＩＶ（ｄｅｌ ＩＶ）、欠失Ｖ（ｄｅｌ Ｖ）、又は欠失ＶＩ（ｄｅｌ ＶＩ）、好ましくは欠失ＩＩＩ（ｄｅｌ ＩＩＩ）に挿入されている、請求項９及び１１〜１３のいずれか一項に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項１５】
Ｂ型肝炎に対するワクチン接種法に使用するための、
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の小型又は大型のエンベロープタンパク質であり、ここでの該小型又は大型のエンベロープタンパク質は好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）を発現するＭＶＡウイルス；及び
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）を発現するＭＶＡウイルス
であって、該方法は、
（ｉ）被験者に、
（ａ’）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の小型又は大型のエンベロープタンパク質であり、ここでの該小型又は大型のエンベロープタンパク質は好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）；及び／又は
（ｂ'）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）
を投与する工程；並びに
（ｉｉ）（ａ）を発現するＭＶＡウイルス及び（ｂ）を発現するＭＶＡウイルスを被験者に投与する工程
を含む、該ＭＶＡウイルス。
【請求項１６】
（ａ）を発現するＭＶＡウイルス及び／又は（ｂ）を発現するＭＶＡウイルスがさらにＣＤ７０を発現する、請求項１５記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項１７】
Ｂ型肝炎に対するワクチン接種法に使用するための、
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の小型又は大型のエンベロープタンパク質であり、ここでの該小型又は大型のエンベロープタンパク質は好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）；及び
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）
を発現するＭＶＡウイルスであって、該方法は、
（ｉ）被験者に、
（ａ’）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の小型又は大型のエンベロープタンパク質であり、ここでの該小型又は大型のエンベロープタンパク質は好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）；及び／又は
（ｂ'）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）
を投与する工程；並びに
（ｉｉ）該ＭＶＡウイルスを被験者に投与する工程
を含む、該ＭＶＡウイルス。
【請求項１８】
ＭＶＡウイルスがさらにＣＤ７０を発現する、請求項１７記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項１９】
治療法又はワクチン接種に使用するための請求項９及び１１〜１４のいずれか一項に記載のＭＶＡウイルス。
【請求項２０】
使用は、Ｂ型肝炎に対するワクチン接種法であり、該使用は、
（ｉ）被験者に
（ａ’）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の小型又は大型のエンベロープタンパク質であり、ここでの該小型又は大型のエンベロープタンパク質は好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）；及び／又は
（ｂ'）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）
を投与する工程；並びに
（ｉｉ）該ＭＶＡウイルスを被験者に投与する工程
を含む、請求項１９記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２１】
ワクチン接種法が好ましくは治療的ワクチン接種法である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２２】
ワクチン接種法の（ｉ）がプライミング工程であり、ワクチン接種法の（ｉｉ）がブースト工程である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２３】
（ｉ）におけるエンベロープタンパク質及び／又はコアタンパク質が少なくとも１つのアジュバントと一緒に共投与され、該アジュバントは好ましくは、ポリ［ジ（エチルフェノキシカルボン酸ナトリウム）］ホスファゼン（ＰＣＥＰ）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、サポニン又はその組合せからなる群より選択され、該ＴＬＲアゴニストは好ましくはＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストであり、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは好ましくはポリＩ／Ｃ、ＣｐＧ、ＲＩＧ−Ｉリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、サイクリックｄｉ−ＡＭＰ、サイクリックｄｉ−ＣＭＰ、サイクリックｄｉ−ＧＭＰ、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＣＴＡ１ＤＤ、又はｄｍＬＴである、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２４】
アジュバントが、ＰＣＥＰ及び／又はＣｐＧアジュバントである、請求項２３記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２５】
アジュバントがサイクリックｄｉ−ＡＭＰである、請求項２３記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２６】
（ｉ）が、（ｉｉ）を実施する少なくとも約１日前に、好ましくは少なくとも約５日前に、好ましくは少なくとも約１週間前に、好ましくは約１週間から約８週間前に、好ましくは約２週間から約５週間前に、好ましくは約３週間から約４週間前に実施される、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２７】
ワクチン接種法がさらに、（ｉ）の後及び（ｉｉ）の前に：
（ｉ’）被験者に
（ａ’）Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ由来のエンベロープタンパク質（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の小型又は大型のエンベロープタンパク質であり、ここでの該小型又は大型のエンベロープタンパク質は好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）；及び／又は
（ｂ'）Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）
を投与する工程
を含み、ここでの（ｉ’）は好ましくはブースト工程である、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２８】
（ｉ）が、（ｉ’）を実施する少なくとも約１日前に、好ましくは少なくとも約５日前に、好ましくは少なくとも約１週間前に、好ましくは約１週間から約８週間前に、好ましくは約２週間から約５週間前に、好ましくは約３週間から約４週間前に実施され、（ｉ’）が、（ｉｉ）を実施する少なくとも約１日前に、好ましくは少なくとも約５日前に、好ましくは少なくとも約１週間前に、好ましくは約１週間から約８週間前に、好ましくは約２週間から約５週間前に、好ましくは約３週間から約４週間前に実施される、請求項２７記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項２９】
投与が非経口経路又は粘膜経路による、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項３０】
投与が筋肉内であり、工程（ｉ）及び／又は工程（ｉ’）がアジュバントの投与を含み、ここでの該アジュバントはサイクリックｄｉ−ＡＭＰを含む、請求項２９記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項３１】
投与が皮下又は筋肉内であり、工程（ｉ）及び／又は（ｉ’）がアジュバントの投与を含み、ここでの該アジュバントはポリＩ／Ｃ又はＲＩＧ−Ｉリガンドを含む、請求項２９記載の使用のためのＭＶＡウイルス。
【請求項３２】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えワクチン接種用ベクター又はＭＶＡウイルスを含む、ワクチン又は医薬組成物。
【請求項３３】
組換えワクチン接種用ベクターが、請求項９及び１１〜１４のいずれか一項に記載のＭＶＡウイルス又は請求項１０記載のサルモネラ株である、請求項３２記載のワクチン。
【請求項３４】
ワクチンが非経口用又は粘膜用ワクチンである、請求項３２又は３３記載のワクチン。
【請求項３５】
（ｉ）
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ由来のエンベロープタンパク質（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の小型又は大型のエンベロープタンパク質であり、ここでの該小型又は大型のエンベロープタンパク質は好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）；及び／又は
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）
を含むタンパク質組成物；
（ｉｉ）請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のワクチン
を含むキット。
【請求項３６】
タンパク質組成物が非経口投与に適し、該組成物は好ましくはＰＣＥＰ及び／又はＣｐＧアジュバントである少なくとも１つのアジュバントを含む、請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
タンパク質組成物が粘膜投与に適し、ここでの該組成物は好ましくは、ＣＴＡ１ＤＤ、ｄｍＬＴ、ＰＣＥＰ、ポリＩ／Ｃ、ＲＩＧ−Ｉリガンド、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＣＭＰ、及びｃ−ｄｉＧＭＰ又はその組合せからなる群より選択されるアジュバントを含む、請求項３５記載のキット。
【請求項３８】
タンパク質組成物が筋肉内投与に適し、ここでの該組成物は好ましくは、サイクリックｄｉ−ＡＭＰである少なくとも１つのアジュバントを含む、請求項３５記載のキット。
【請求項３９】
タンパク質組成物が皮下又は筋肉内投与に適し、ここでの該組成物は好ましくはポリＩ／Ｃである少なくとも１つのアジュバントを含む、請求項３５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する処置又はワクチン接種のための改良された組換えワクチン接種用ベクター、並びに、該組換えを含む医薬組成物又はワクチンに関する。本発明はまた、ＨＢＶに対するワクチン接種法に使用するための組換えワクチン接種用ベクター、並びに、ＨＢＶに対するワクチン接種のためのキットに関する。
【０００２】
背景
２億４千万人以上の人々が、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に罹患している。認可された処置選択肢は、ヌクレオシ（チ）ド類似体及びインターフェロンαである。ヌクレオシ（チ）ド類似体は、Ｂ型肝炎を制御するが治癒せず、高額で長期の処置を必要とし、これには耐性ウイルスの出現を伴う可能性がある。インターフェロンα療法は副作用によって制限され、患者の１５〜２０％しか治癒されない。
【０００３】
ウイルスは、そのエンベロープタンパク質上に存在する抗原性エピトープに基づいた判別の目安になる抗体応答を誘導する４つの主要な血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）に、及び、ゲノムの全体的なヌクレオチド配列の変異に従って（少なくとも）８つの遺伝子型（Ａ〜Ｉ）に分類される。遺伝子型は明確に異なる地理的分布を示し、これはウイルスの進化及び伝播を追跡する際に使用される。遺伝子型間の差異は、疾患の重症度、経過、及び合併症の可能性、並びに処置及びおそらくワクチン接種に対する応答に影響を及ぼす。さらに、遺伝子亜型、例えばＡ１〜５が存在する。中央ヨーロッパ及び米国では、主な遺伝子型はＡ２である。しかしながら、感染したヒトの僅か１％だけがＡ２遺伝子亜型を有し、大半の患者は遺伝子型Ｂ、Ｃ又はＤのＨＢＶを有する。慣用的なＨＢＶワクチンは、ワクチンに含まれるＨＢＶ抗原と同じ遺伝子（亜）型のＨＢＶに対して、他の遺伝子（亜）型よりもより良好な防御を与えることが示されている。
【０００４】
宿主獲得免疫系は、効果的なＨＢＶの制御にとって不可欠であることが十分に確立されている。ＨＢＶの小型表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対して指向される中和抗体は、ウイルスが感染していない肝細胞に蔓延するのを防ぎ、ＨＢｓＡｇから抗ＨＢｓ抗体へのセロコンバージョンは、ＨＢＶ感染の臨床的エンドポイントを示す（Rehermann and Nascimben, Nat Rev Immunol 2005; 5:215-29）。ウイルスを排除している患者は強力なポリクローナルかつ多重特異的なＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を発生させるが、一方、慢性感染には、抗ウイルス性Ｔ細胞の枯渇及び進行的な機能不全を伴う（Rehermann et al., J Exp Med 1995; 181:1047-58）。慢性的なＨＢＶ感染が、ＨＢＶ免疫ドナーから骨髄を得た骨髄移植レシピエントにおいて消散したという臨床的観察は、感染の制御におけるＴ細胞の強力な役割を示唆する（Ilan et al., Gastroenterology 1993; 104:1818-21）。これらの観察に基づいて、内因的なＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を活性化させるための治療的ワクチン接種が設計された。しかしながら、慢性感染患者における数多くの臨床的試みは、抗ＨＢＶ免疫応答に対して一過性の効果しか及ぼさず、ＨＢＶを制御することができなかった（Kutscher et al,. Microb Biotechnol 2012; 5:270-82）。循環中の高いレベルのウイルス抗原への継続的な曝露が、免疫療法アプローチに対する主なハードルのようである。なぜなら、それらは寛容及びエフェクター細胞の機能不全を誘発するからである。
【０００５】
また、治療的ワクチン接種を、ウイルス血症を制御するが循環中の抗原レベルに対しては全く影響を及ぼさない抗ウイルス処置と組み合わせても、ワクチンの有効性及び臨床的転帰は改善しなかった（Michel et al., J Hepatol 2011; 54:1286-96）。
【０００６】
新規な免疫療法戦略の開発を促進するために、垂直感染した慢性ＨＢＶ感染モデルであるＨＢＶトランスジェニックマウス（ＨＢＶｔｇ）が開発された（Guidotti et al., J Virol 1995; 69:6158-69）。ＨＢＶｔｇマウスは、肝細胞においてＨＢＶを複製し、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、及びＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）を産生し、感染性ウイルスを血中に放出する（Guidotti et al., J Virol 1995; 69:6158-69）。ＨＢＶ抗原の発現は生誕時あたりに開始され、マウスはＨＢＶをコードするタンパク質に対して免疫学的に寛容であるが（Shimizu et al., J Immunol 1998; 161:4520-9）、この寛容は破壊され得る（Buchmann et al., Vaccine 2013; 31:1197-203）。
【０００７】
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は、ポックスウイルス科のオルソポックスウイルス属の一員である、ワクシニアウイルスに関連する。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞におけるワクシニアウイルスアンカラ株（ＣＶＡ）の５１６回の連続継代によって生成された（総説については、Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 (1975)参照）。これらの長期間の継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、そのゲノム配列の中の約３１キロ塩基が欠失し、それ故、複製については宿主細胞がトリ細胞に高度に限定されていると記載された（Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)）。多種多様な動物モデルにおいて、得られたＭＶＡはかなり弱病原性であるが（Mayr, A. & Danner, K., Dev. Biol. Stand. 41: 225-34 (1978)）、依然としてポックスウイルスに対して防御的免疫応答を生じたことが示された。それ故、このＭＶＡ株は、ヒト天然痘に対して免疫化するためのワクチンとして臨床試験において試験されている（Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987); Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974)）。これらの試験には、ハイリスクな患者を含む１２０，０００人を超えるヒトが関わり、そしてこれによりワクシニア系ワクチンと比較して、ＭＶＡは病原性を消失し、良好な耐容性を示し、一方、それは依然として良好で特異的な免疫応答を惹起することが判明した。
【０００８】
その後の数十年間において、ＭＶＡは、組換え遺伝子発現のためのウイルスベクターとして又は組換えワクチンとしての使用のために工学操作された（Sutter, G. et al., Vaccine 12: 1032-40 (1994)）。ワクチン又は医薬品の開発のためのＭＶＡ株が記載されている。米国特許第６，７６１，８９３号及び第６，１９３，７５２号を参照されたい。このような株は、特徴的な非ヒト細胞及び細胞株において、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において産生的複製を起こすことができるが、他の公知のワクシニア株の複製を可能とすることが知られるヒト細胞株において有意な産生的複製を起こすことができない。
【０００９】
上記に基づいて、当技術分野においては、ＨＢＶに対する治療的ワクチン接種に使用することのできる改良された手段及び方法が必要である。これらの手段及び方法は平行して、複数の亜型のＨＢＶに対して指向される中和抗体応答及び多重特異的Ｔ細胞応答を誘発するだろう。
【００１０】
詳細な説明
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する処置又はワクチン接種のための新規な組換えワクチン接種用ベクター、並びに、該ＭＶＡを含む医薬組成物又はワクチンに関する。本発明はまた、組換えＭＶＡを使用したＨＢＶに対するワクチン接種法にも関する。本発明の手段及び方法は、被験者においてＨＢＶに対する抗体応答並びにＴ細胞応答の両方を誘発すると考えられ、誘発された免疫応答は、多種多様なＨＢＶ遺伝子型及び血清型に対して有効であることがさらに考えられる。
【００１１】
本明細書において使用する「組換えワクチン接種用ベクター」は、弱毒化ウイルス又は細菌を指す。この脈絡において、「ベクター」は、担体として使用されるウイルス又は細菌を指す。典型的には、この弱毒化ウイルス又は細菌は、被験者の細胞に抗原をコードしている核酸を導入するために使用される。
【００１２】
本発明の組換えワクチン接種用ベクターは、弱毒化サルモネラ株であってもよい。しかしながら、代替的には大腸菌（Escherichia coli）、赤痢菌、エルシニア菌、乳酸菌、マイコバクテリア菌、リステリア菌、又はビブリオ菌の弱毒株などの他の原核微生物を使用してもよい。適切な微生物株の例としては、サルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・ダブリン（Salmonella dublin）、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteretidis）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexeneri）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnel）が挙げられる。弱毒化サルモネラ株は、最も良く特徴付けられた粘膜用ワクチン担体の１つである。弱毒化されているが依然として侵襲的である組換えサルモネラ株は、いくつかの病原体の防御性エピトープを粘膜に関連したリンパ組織に運び、それにより、担体及び外来抗原の両方に対する粘膜免疫応答、全身免疫応答、及びＣＴＬ免疫応答を誘発する、経口用ワクチンベクターとして使用されている。
【００１３】
さらに、本発明の組換えワクチン接種用ベクターは、弱毒化サルモネラ株、ＣＭＶ系ベクター、ＶＳＶ系ベクター、アデノウイルスベクター、又は麻疹ベクターであってもよい。
【００１４】
本発明の組換えワクチン接種用ベクターはウイルスベクターであり得、これは遺伝子を細胞に導入するための担体でもある、感染力を有するウイルス粒子であり得る。ワクチン接種用ウイルスベクターは、当業者には周知である。本発明においては特にポックスウイルスベクターが考えられる。組換えポックスウイルスは、標準的な遺伝子工学操作法によって作製されるポックスウイルスであり得る。好ましい実施態様では、本発明の組換えワクチン接種用ベクターはＭＶＡである。
【００１５】
ＭＶＡは、ベクター系として特に適している。例えば天然痘ウイルスに対してワクチン接種した後の短期間において、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を誘発する際に効果的であるその効力が実証されている。その安全性は確立されている。免疫不全被験者においてさえ免疫応答を誘導するその効力が知られている。
【００１６】
しかしながら、ＭＶＡがＨＢＶに対するワクチンとしての使用において有する利点とは別に、ＨＢＶワクチンの最大の課題は、体液性免疫応答並びに細胞性免疫応答の両方を誘導することができること、並びに、この免疫応答が好ましくは多数の遺伝子型及び／又は血清型のＨＢＶに指向されることである。ベクターの選択、ワクチン接種スキーム、及びＨＢＶ抗原は全て、ワクチン接種の有効性に寄与し得る。
【００１７】
本発明は、様々なＨＢＶ遺伝子型及び／又は血清型に由来するＨＢＶ抗原の組合せの使用を包含する。この組合せにより、多数のＨＢＶ株に対する幅広い免疫応答がもたらされただけでなく、単一のＨＢＶ遺伝子型に由来する抗原のみを含むワクチンと比較して、各ＨＢＶ遺伝子型に対するより強力な免疫応答がもたらされた。事実、本発明の手段及び方法を使用して、本発明者らは、低い、中間の、及びさらには高い抗原レベルを有する被験者において、免疫寛容を克服することさえできた。
【００１８】
ＭＶＡ系ワクチンは、いくつかの理由のために有益である。例えば、好ましいＭＶＡ株であるＭＶＡ−Ｆ６（Sutter and Staib, 2003. Curr. Drug Targets Infect. Disord. 3:263-271）は、初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞において良好に増殖し、ヒト細胞においては複製しない。ヒト細胞では、ウイルス遺伝子並びに工学操作された導入遺伝子は発現されるが、感染性ウイルスは全く産生されない。ＭＶＡの限定された宿主域は、ヒトをはじめとする多種多様な哺乳動物種においてインビボで観察された、非病原性表現型を説明し得る。ＭＶＡは、多くの毒性試験において安全であることが示されている。組換えＭＶＡの構築、作製、及び使用は、当技術分野において、例えば国際公開公報第９７／０２３５５号、Sutter and Staib, 2003（上記）及び国際公開公報第２００３／００８５３３号に記載されている。
【００１９】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の１つ以上の抗原を発現する、組換えワクチン接種用ベクター、好ましくは改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を考える。１つ以上の抗原は、ＨＢＶ由来のエンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）、ＨＢＶ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）、又はＨＢＶ由来のポリメラーゼのＲＴドメインから選択され得る。エンベロープタンパク質は、例えば、ＨＢＶ血清型ａｄｗのエンベロープタンパク質、例えばＨＢＶ遺伝子型Ａ血清型ａｄｗのエンベロープタンパク質、例えばＨＢＶ遺伝子型Ａ２血清型ａｄｗ２のエンベロープタンパク質であり得る。コアタンパク質は、例えば、ＨＢＶ血清型ａｙｗのコアタンパク質、例えばＨＢＶ遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗのコアタンパク質であり得る。
【００２０】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、１つを超えるエンベロープタンパク質を発現してもよく、ここでの１つを超えるエンベロープタンパク質は、異なる遺伝子型又は血清型のＨＢＶに由来し得る。例えば、本発明のＭＶＡは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質、並びに、遺伝子型Ｃのエンベロープタンパク質を発現し得る。同様に、本発明のＭＶＡは、１つを超えるコアタンパク質を発現してもよく、ここでの１つを超えるコアタンパク質は、異なる遺伝子型又は血清型のＨＢＶに由来し得る。例えば、本発明のＭＶＡは、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗのコアタンパク質、並びに、遺伝子型Ｃのコアタンパク質を発現し得る。
【００２１】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡはまた、ＨＢＶ由来のポリメラーゼ、又はＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインを発現し得る。このポリメラーゼは任意の遺伝子型又は血清型であり得る。該ポリメラーゼは好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｄ由来のポリメラーゼであり得る。
【００２２】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）（ここでの該エンベロープタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ由来の大型エンベロープタンパク質又は小型エンベロープタンパク質であり、好ましくは小型のエンベロープタンパク質である）；及び（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）（ここでの該コアタンパク質は好ましくはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ血清型ａｙｗに由来する）；並びに、以下：（ｃ）配列番号１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＢ型肝炎ウイルス由来のエンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）、（ｄ）配列番号２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＢ型肝炎ウイルス由来のコアタンパク質（ＨＢｃ抗原）、及び／又は（ｅ）配列番号３に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＢ型肝炎ウイルス由来のポリメラーゼのＲＴドメイン、の中の少なくとも１つを発現し得る。本発明のＭＶＡは、ＨＢＶの３つ、好ましくは４つ、又は最も好ましくは５つの抗原、例えば、抗原（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、抗原（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は抗原（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、抗原（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、抗原（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、抗原（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、又は抗原（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）を発現し得る。
【００２３】
本明細書において使用するＨＢＶの「エンベロープタンパク質」、「ＨＢｓ抗原」又は「ＨＢｓＡｇ」は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原を指す。「エンベロープタンパク質」、「ＨＢｓ抗原」又は「ＨＢｓＡｇ」は、別個なｍＲＮＡから翻訳される、小型、中型、及び大型のエンベロープタンパク質という３つの変種の中のいずれか１つに関し得る。３つ全ての変種に共通することは、Ｓ遺伝子の主要親水性領域（ＭＨＲ）内の１２４〜１４７のコドン位置に位置する「１つの」決定基エピトープである。この「１つの」決定基は、急性Ｂ型肝炎における初期免疫応答の経過中における抗ＨＢｓ抗体の主な標的の１つである。「エンベロープタンパク質」、「ＨＢｓ抗原」又は「ＨＢｓＡｇ」という用語は場合により、エンベロープタンパク質の免疫原性断片に関し得る。エンベロープタンパク質の免疫原性断片は、Ｎ末端及び／又はＣ末端が短縮されている、すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の少なくとも１つが欠失している、任意の完全長のエンベロープタンパク質に由来するタンパク質又はペプチドに関する。このような断片は、エンベロープタンパク質の一次配列の好ましくは少なくとも７０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも９０、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２５、最も好ましくは少なくとも１５０の連続したアミノ酸を含み、通常、免疫原性である。典型的には、このような免疫原性断片は、完全長のタンパク質と比較して、小型エンベロープタンパク質のアミノ酸位置に相当する少なくともアミノ酸９９〜１６８を含む。
【００２４】
本明細書において使用するＨＢＶの「コアタンパク質」又は「ＨＢｃ抗原」は、ヌクレオカプシドの構造タンパク質を指す。完全長のコアタンパク質は、１８３アミノ酸長であり、会合ドメイン（アミノ酸１〜１４９）と核酸結合ドメイン（アミノ酸１５０〜１８３）からなる。３４残基の核酸結合ドメインは極めて塩基性であり、１７個のアルギニンを有し、その機能と矛盾しない。コアタンパク質は溶液中で二量体であり；これらの二量体は自己会合して正二十面体のカプシドとなる。アミノ酸１〜１４９しか含まない切断短縮されたコアタンパク質も、カプシドを形成することができることが理解される。「コアタンパク質」又は「ＨＢｃ抗原」という用語は場合により、コアタンパク質の免疫原性断片に関し得る。コアタンパク質の免疫原性断片は、Ｎ末端及び／又はＣ末端が短縮されている、すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸の少なくとも１つが欠失している、任意の完全長のコアタンパク質に由来するタンパク質又はペプチドに関する。このような断片は、コアタンパク質の一次配列の好ましくは少なくとも１００、より好ましくは１２５、最も好ましくは１４９の以上連続したアミノ酸を含み、通常、免疫原性である。典型的には、このような免疫原性断片は、完全長のコアタンパク質と比較して、配列番号１１に示された配列の位置に相当する少なくともアミノ酸１８〜１４３を含む。典型例は、配列番号１１に示された完全長コアタンパク質のアミノ酸１〜１４９からなる、コアタンパク質断片である。
【００２５】
本明細書において使用する「免疫原性」は、特定の物質、例えば抗原又はエピトープが、ヒト又は動物の体内において免疫応答を惹起する能力を指す。換言すれば、免疫原性は、体液性及び／又は細胞媒介性免疫応答の誘発能である。抗原が免疫応答を惹起する能力は免疫原性と呼ばれ、これは体液性及び／又は細胞媒介性免疫応答であり得る。理論によって固めたくはないが、ＨＢＶに由来する任意の天然のＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、又はポリメラーゼが免疫原性であると推定される。また、天然配列と比較して、１つ以上のアミノ酸が交換、欠失、又は挿入されている、ＨＢＶに由来する天然のＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、又はポリメラーゼの多くの変異体が推定される。例示的な例として、天然ＨＢｓ抗原の免疫原性変異体は、「１つの」決定基エピトープが、別の血清型のＨＢｓ抗原の「１つの」決定基と交換されている、ＨＢｓ抗原である。典型的には、天然のＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、又はポリメラーゼの免疫原性変異体は、天然のＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、又はポリメラーゼのアミノ酸配列に対して９０％の配列同一性を有し得る。
【００２６】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質を含む。このようなエンベロープタンパク質は、小型、中型、及び大型のエンベロープタンパク質であり得、小型又は大型のエンベロープタンパク質が好ましく、小型エンベロープタンパク質が最も好ましい。該エンベロープタンパク質は好ましくは遺伝子型Ａ血清型ａｄｗ（Ａ／ａｄｗ）、好ましくはＨＢＶ Ａ２／ａｄｗ２である。しかしながら、ＨＢＶ ａｄｗの天然エンベロープタンパク質の免疫原性を有する任意の天然又は工学操作されたエンベロープタンパク質が、本発明に適している。好ましいエンベロープタンパク質は、配列番号０８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又は好ましくは配列番号０８に示されたアミノ酸配列を含むか若しくはからなる。該エンベロープタンパク質はまた、Ｎ末端又はＣ末端に追加のアミノ酸を有し得る。好ましくは、該エンベロープタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に３０以下、好ましくは２５以下、好ましくは２０以下、好ましくは１５以下、好ましくは１０以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、好ましくは３以下、好ましくは２以下、好ましくは１以下の追加のアミノ酸を有する。これらのアミノ酸は好ましくは、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａなどの自己切断部位の断片であり、これはKim et al. 2011, PLoS ONE, 6(4):e18556に記載されている。したがって、該エンベロープタンパク質は場合により、Ｎ末端に追加のプロリン及び／又はそのＣ末端に追加の配列GSGATNFSLLKQAGDVEENPG（配列番号０９）を含む。したがって、該エンベロープタンパク質は配列番号１０に示された配列を有し得る。
【００２７】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、Ｂ型肝炎ウイルス血清型ａｙｗ由来のコアタンパク質を含む。該コアタンパク質は好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ／ａｙｗである。ＨＢＶ ａｙｗの天然コアタンパク質の免疫原性を有する任意の天然又は工学操作されたコアタンパク質が本発明に適している。好ましい実施態様では、該コアタンパク質は、完全長タンパク質のアミノ酸１〜１４９からなる完全長コアタンパク質の断片である。好ましいコアタンパク質は、配列番号１１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有する配列を含むか、又は好ましくは配列番号１１に示されたアミノ酸配列を含むか若しくはからなる。該コアタンパク質はまた、Ｎ末端又はＣ末端に追加のアミノ酸を有し得る。好ましくは、該コアタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に３０以下、好ましくは２５以下、好ましくは２０以下、好ましくは１５以下、好ましくは１０以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、好ましくは３以下、好ましくは２以下、好ましくは１以下の追加のアミノ酸を有する。これらのアミノ酸は好ましくは、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａなどの自己切断部位の断片である。したがって、コアタンパク質は場合により、Ｎ末端に追加のプロリン及び／又はそのＣ末端に配列番号１２で示された追加の配列を含む。完全長の中のアミノ酸１〜１４９からなりかつ本明細書に記載のようなＣ末端配列を有する、コアタンパク質の断片は、カプシドに会合する能力を依然として有すると考えられ、追加のＣ末端配列はカプシドの形成を妨害しないと推定される。
【００２８】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、配列番号０１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有する、Ｂ型肝炎ウイルス由来の免疫原性エンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）を含み得る。配列番号０１は、世界中に分布するＨＢＶ株を代表する５００個のＨＢＶ配列のアラインメントに基づいて作製された、遺伝子型Ｃ株の大型エンベロープタンパク質の共通配列である。Ａ−決定基（抗ＨＢｓ抗体にとって最も重要な標的配列）が２つのアミノ酸を交換することによってａｙｗに改変された（血清型ａｙｗに指向される抗体の形成のために）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＶ０２７９７（２００７年９月１２日のバージョンＡＢＶ０２７９７．１ ＧＩ：１５７０５７６３５）を有する推定プレプレＳタンパク質に由来する示された配列に相当する、配列番号１に対して９９％の配列同一性を有する、配列番号０４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する免疫原性エンベロープタンパク質の例示的な例。配列番号０４と実質的に同じ配列を有するＨＢＶ株の存在は、不可欠なプロセス（フォールディング／プロセシング／提示）が、コードされたタンパク質において機能的であることを保証する。したがって、本発明によって、配列番号０１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する免疫原性エンベロープタンパク質は、配列番号０４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有するエンベロープタンパク質であると考えられる。さらに、遺伝子型Ｃ株のエンベロープタンパク質の共通配列は、遺伝子型Ｂ株のエンベロープタンパク質の共通配列と高度に類似している。免疫原性エンベロープタンパク質は、遺伝子型Ｃ株のエンベロープタンパク質の共通配列に基づき、これは同時に遺伝子型Ｂ株のエンベロープタンパク質の共通配列と非常に類似しているので、この免疫原性エンベロープタンパク質は、少なくとも遺伝子型Ｂ株及び遺伝子型Ｃ株という広域スペクトルに対して免疫応答を誘導することができる。配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する免疫原性エンベロープタンパク質は場合によりまた、配列番号１の対応する断片に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少��くとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有する、その免疫原性断片を指すと理解される。該エンベロープタンパク質はまた、Ｎ末端又はＣ末端に追加のアミノ酸を有し得る。好ましくは、該エンベロープタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に３０以下、好ましくは２５以下、好ましくは２０以下、好ましくは１５以下、好ましくは１０以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、好ましくは３以下、好ましくは２以下、好ましくは１以下の追加のアミノ酸を有する。これらのアミノ酸は好ましくは、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａなどの自己切断部位の断片である。したがって、該エンベロープタンパク質は場合により、Ｎ末端に追加のプロリン及び／又はそのＣ末端に追加の配列GSGEGRGSLLTCGDVEENPG（配列番号１３）を含む。したがって、該エンベロープタンパク質は、配列番号１４に示される配列を有し得る。
【００２９】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、配列番号２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有する、Ｂ型肝炎ウイルス由来の免疫原性コアタンパク質（ＨＢｃ抗原）を含み得る。配列番号２は、世界中に分布するＨＢＶ株を代表する５００個のＨＢＶ配列のアラインメントに基づいて作製された、遺伝子型Ｃ株のコアタンパク質の共通配列である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６４７６０７（２０１５年７月９日のバージョンＮＰ＿６４７６０７．１ ＧＩ：２１３２６５８８）を有するＨＢＶのカプシドタンパク質に由来する配列に対して実質的に同一である、配列番号２に対して１００％の配列同一性を有する、配列番号０５に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する免疫原性コアタンパク質の例示的な例。したがって、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する免疫原性コアタンパク質は、配列番号０５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有するエンベロープタンパク質であることが本発明によって考えられる。さらに、遺伝子型Ｃ株の共通配列は、遺伝子型Ｂ株の共通配列と同一である。免疫原性エンベロープタンパク質は、遺伝子型Ｂ株のエンベロープタンパク質の共通配列と同一である、遺伝子型Ｃ株のエンベロープタンパク質の共通配列に基づいているので、この免疫原性エンベロープタンパク質は、少なくとも遺伝子型Ｂ株及び遺伝子型Ｃ株という広域スペクトルに対して免疫応答を誘導することができる。配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する免疫原性コアタンパク質は場合によりまた、配列番号２の対応する断片に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有する、その免疫原性断片を指すと理解される。例示的な例として、このような免疫原性断片は、配列番号２のアミノ酸１〜１４９に対して９０％の配列同一性を有する断片であり得る。該コアタンパク質はまた、Ｎ末端又はＣ末端に追加のアミノ酸を有し得る。好ましくは、該コアタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に３０以下、好ましくは２５以��、好ましくは２０以下、好ましくは１５以下、好ましくは１０以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、好ましくは３以下、好ましくは２以下、好ましくは１以下の追加のアミノ酸を有する。これらのアミノ酸は好ましくは、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａなどの自己切断部位の断片である。したがって、該コアタンパク質は場合により、Ｎ末端に追加のプロリンを含む。該コアタンパク質はさらに場合により、そのＣ末端に配列番号０９又は１３に示される追加の配列を含み得る。したがって、該コアタンパク質は、配列番号１５に示される配列を有し得る。
【００３０】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有するＢ型肝炎ウイルス由来のポリメラーゼの免疫原性ＲＴドメインを含み得る。配列番号３は、世界中に分布するＨＢＶ株を代表する５００個のＨＢＶ配列のアラインメントに基づいて作製された、遺伝子型Ａ株、Ｂ株、Ｃ株及びＤ株のＲＴドメインの共通配列である。このようなポリメラーゼの免疫原性ＲＴドメインの例示的な例は、配列番号３に対して９７％の配列同一性を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。配列番号６は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦＹ０９２８０（２０１３年１月３１日のバージョンＡＦＹ０９２８０．１ ＧＩ：４２５８９１３３０）を有するＨＢＶの部分的ポリメラーゼに由来するポリメラーゼのＲＴドメインのアミノ酸配列に相当する。配列番号６は典型例である。なぜなら、それは、作製された遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの共通配列に対して最も高い類似性を有する天然のポリメラーゼのＲＴドメインであるからである。この配列を有するＨＢＶ株の存在は、不可欠なプロセス（フォールディング／プロセシング／提示）が、コードされたＲＴドメインにおいて機能的であることを保証する。したがって、また本発明によって、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する免疫原性ＲＴドメインは、配列番号０６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有するエンベロープタンパク質であることが考えられる。ポリメラーゼのＲＴドメインは、いくつかの高度に保存されたエピトープを含むので、また本発明のＭＶＡに含まれるポリメラーゼのＲＴドメインは、遺伝子型Ａ株、Ｂ株、Ｃ株及びＤ株のＲＴドメインの共通配列に基づくので、ポリメラーゼのこの免疫原性ＲＴドメインは、少なくとも遺伝子型Ａ株、Ｂ株、Ｃ株及びＤ株という広域スペクトルに対して免疫応答を誘導することができる。本発明はまた、ポリメラーゼのＲＴドメインが、完全長ポリメラーゼに含まれ得ることを想定する。したがって、免疫原性ＲＴドメインを含む完全長のポリメラーゼ又は完全長から切断短縮されたポリメラーゼも本発明の範囲内である。配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリメラーゼの免疫原性ＲＴドメインは場合によりまた、配列番号３の対応する断片に対して少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少��くとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有する、その免疫原性断片も指すと理解される。ポリメラーゼのＲＴドメインはまた、Ｎ末端又はＣ末端に追加のアミノ酸を有し得る。好ましくは、ＲＴドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に３０以下、好ましくは２５以下、好ましくは２０以下、好ましくは１５以下、好ましくは１０以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、好ましくは３以下、好ましくは２以下、好ましくは１以下の追加のアミノ酸を有する。これらのアミノ酸は好ましくは、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａなどの自己切断部位の断片である。したがって、ＲＴドメインは場合により、Ｎ末端に追加のプロリンを含む。該コアタンパク質はさらに場合により、そのＣ末端に配列番号１３に示される追加の配列を含み得る。したがって、ＲＴドメインは、配列番号１６に示される配列を有し得る。
【００３１】
本明細書に記載のような組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、ＣＤ７０分子も含み得るか又はさらに発現し得る。好ましくはＣＤ７０はヒトＣＤ７０である。
【００３２】
ＣＤ７０は、ＣＤ２７に対するリガンドであり、これはＣＤ２７Ｌとしても知られている。それはＩＩ型膜貫通タンパク質であり、高度に活性化されたリンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞リンパ腫におけるような）に発現されている。さらに、それは腎細胞癌上にも発現され、腫瘍標的として評価されている。ＣＤ７０リガンドの発現は通常、緊密に調節されているが、ＣＤ２７ＬがＢ細胞上に恒常的に発現されると、十分かつ効果的なメモリー様Ｔ細胞のプールが発生する（Arens, R. et al 2004 J Exp Med 199(11) 1595-605）。慢性的ウイルス感染では、ＣＤ７０シグナル伝達が転帰に関連している場合がある。
【００３３】
ＣＤ２７／ＣＤ７０は、それらのＴ細胞形成特性についてよく知られている、腫瘍壊死因子受容体／腫瘍壊死因子（「ＴＮＦＲ／ＴＮＦ」）スーパーファミリーの一員である。ＣＤ２７／ＣＤ７０の中で、このファミリーは、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ、及びＦａｓ／ＦａｓＬを含む。一次及び二次Ｔ細胞応答における、ＣＤ７０の役割、とりわけＯＸ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬなどの役割が、様々な感染症モデルにおいて研究されている［Hendrick et al., “CD27 is required for generation and long-term maintenance of T-cell immunity,” Nature Immunol. 1(5):433-440 (2000); Matter et al., “Virus-induced polyclonal B-cell activation improves protective CTL memory via retained CD27 expression on memory CTL,” Eur. J. Immunol. 35(11):3229-3239 (2005); A. Schildknecht et al., “Priming of CD8+ T-cell responses by pathogens typically depends on CD70-mediated interactions with dendritic cells,” Eur. J. Immunol. 37(3):716-728 (2007)］。興味深いことに、とりわけ樹状細胞（「ＤＣ」）上のＣＤ７０をはじめとする共刺激分子のアップレギュレーションは、ＴＬＲ／ＣＤ４０の刺激の組合せによって誘導され得る［Sanchez et al., “Combined TLR/CD40 stimulation mediates potent cellular immunity by regulating dendritic cell expression of CD70 in vivo,” J. Immunol. 178(3):1564-1572 (2007)］。
【００３４】
したがって、本発明によって、ＣＤ７０が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９１％、好ましくは少なくとも約９２％、好ましくは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも約９４％、好ましくは少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９６％、好ましくは少なくとも約９７％、好ましくは少なくとも約９８％、好ましくは少なくとも約９９％、好ましくは約１００％の配列同一性を有すると考えられる。
【００３５】
本発明の組換えワクチン接種用ベクター、好ましくはＭＶＡは、幅広いＨＢＶスペクトルに対する治療的ワクチン接種のために最適化され、かついくつかの出現頻度の高いＨＢＶ遺伝子型に由来する抗原性配列を含む。それ故、このＭＶＡは、様々な遺伝子型及び血清型のＨＢＶに対する免疫応答を誘導することができる。本発明の発明者らは、驚くべきことに、ＨＢＶ Ｄ／ａｙｗ抗原（群）しか含まないＭＶＡワクチンと比較して、ＨＢＶ Ａ／ａｄｗ由来のＨＢｓ抗原とＨＢＶ Ｄ／ａｙｗ由来のＨＢｃ抗原との組合せが、遺伝子型Ａ及びＤのＨＢＶに対する広範な免疫応答を誘導するだけでなく、ＨＢＶ Ｄ／ａｙｗに対するさらにより強力なＴ細胞応答を誘導することを発見した。さらに、本発明のＭＶＡはまた、遺伝子型ＣのＨＢＶ株の共通配列に基づいた、ＨＢｓ抗原又はＨＢｃ抗原も発現し得る。遺伝子型ＣのＨＢＶ株のこれらの共通配列はさらに、遺伝子型Ｂ株の共通配列に対して高度に類似しているか又はさらには同一であるかのいずれかである。このことは、これらの配列の一方又は両方を含む本発明のＭＶＡがさらに、少なくとも遺伝子型Ｂ株及び遺伝子型Ｃ株に対する広範な免疫応答を誘導するであろうことを意味する。さらに、本発明のＭＶＡは、遺伝子型Ａ株、Ｂ株、Ｃ株及びＤ株の共通配列に基づきかつ高度に保存された抗原を含有している、ポリメラーゼのＲＴドメインを発現し得る。したがって、このＲＴドメインをＭＶＡへと導入することによりさらに、少なくとも遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのＨＢＶに対する広範な免疫応答の誘導を促進するであろう。それ故、本発明のＭＶＡは、少なくとも遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのＭＢＶに対して有効なワクチンである。
【００３６】
「抗原」という用語は、細胞性の抗原特異的免疫応答又は体液性の抗体応答を発生するように宿主の免疫系を刺激する、１つ以上のエピトープを含有している分子を指す。抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片などが挙げられ得る。さらに、該抗原は、任意の公知のウイルス、細菌、寄生虫、プリオン、植物、原虫、又は真菌に由来し得、生命体全体であってもよい。該用語はまた腫瘍抗原も含む。合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ、及び他の組換えで又は合成により導かれた抗原も、本出願に含まれる。好ましい実施態様では、本発明における抗原は、ポリペプチド又はタンパク質である。
【００３７】
「エピトープ」という用語に関連して、「抗原」という用語は、（より長い）配列、特に（より長い）アミノ酸配列又はタンパク質配列を指し、一方、「抗原性エピトープ」又は「抗原のエピトープ」という語句は、より長い配列に由来するより短い配列の鎖を包含する。したがって、「抗原」という用語は、エピトープを包含する。「抗原」という用語はまた、本明細書に記載のようなタンパク質、ポリペプチド、及び抗原性タンパク質断片の変異体を含む。また、「抗原」という用語は、天然配列に対して同一である配列、並びに、天然配列に対する改変、例えば欠失、付加、挿入及び置換を包含する。好ましくは、抗原変異体は、基準抗原（すなわち、それが由来する抗原）に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％又は６５％、少なくとも約７０％又は７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、さらにより典型的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、最も典型的には少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有する。
【００３８】
本明細書において「抗原性エピトープ」とも呼ばれるエピトープは、宿主において依然として免疫応答を惹起する抗原の一部を形成する。しかしながら、エピトープは、それが由来する抗原の正確な配列に限定されない。したがって、「エピトープ」という用語は、天然配列に対して同一な配列、並びに、天然配列に対する改変、例えば欠失、付加、挿入、及び置換を包含する。好ましくは、エピトープ変異体は、基準エピトープ（すなわち、それが由来するエピトープ）に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％又は６５％、少なくとも約７０％又は７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、さらにより典型的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、最も典型的には少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有する。
【００３９】
２つの核酸間及びアミノ酸間の配列同一性を決定するための技術は、当技術分野において公知である。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、それらの「同一性百分率」を決定することによって比較され得る。２つの配列の同一性百分率（核酸配列であれアミノ酸配列であれ）は、２つのアラインされた配列間で正確に一致する数を、短い方の配列の長さで割り、これに１００を乗じたものである。
【００４０】
本明細書に記載の抗原又はエピトープに関する「アミノ酸配列同一性百分率（％）」は、配列をアラインさせ、最大の配列同一性百分率を達成するために必要であればギャップを導入した後に、配列が同一である部分として保存的置換を全く考慮することなく、基準配列（すなわち、それが由来する抗原又はエピトープ）におけるアミノ酸残基に対して同一である、候補配列内のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性百分率を決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野における技能範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公共的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して成し遂げることができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【００４１】
同じことが、必要な変更を加えて「ヌクレオチド配列同一性百分率（％）」にも適用可能である。
【００４２】
例えば、核酸配列のための適切なアラインメントは、Smith and Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics 2: 482-489の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムを、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発され、Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763によって正規化された、スコアリングマトリックスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列同一性百分率を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいてGenetics Computer Group（マジソン、ウィスコンシン州）によって提供される。この方法のデフォールトパラメーターは、ウィスコンシン配列解析パッケージプログラムマニュアル、バージョン８（１９９５）（Genetics Computer Group、マジソン、ウィスコンシン州から入手可能）に記載されている。本発明の脈絡における同一性百分率を確立する好ましい方法は、John F. Collins及びShane S. Sturrokによって開発され、IntelliGenetics社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）によって頒布された、エジンバラ大学が著作権を有するＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージの使用である。このパッケージ一式から、スミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用することができ、ここでのデフォールトパラメーターがスコアテーブルのために使用される（例えば、ギャップオープンペナルティは１２、ギャップエクステンションペナルティは１、ギャップは６）。作成されたデータから、「一致」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性百分率又は類似率を計算するための他の適切なプログラムは当技術分野において一般的に公知であり、例えば別のアラインメントプログラムは、デフォールトパラメーターと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォールトパラメーターを使用して使用することができる：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Descriptions＝５０個の配列；sort by＝ハイスコア；データベース＝non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスに見られ得る：http://wvw.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
【００４３】
本発明のＭＶＡにおいてＨＢＶ抗原をコードしている核酸は、個々の発現カセットに含まれても、又は好ましくは全て一緒に単一の発現カセットに含まれてもよい。本明細書において使用する「発現カセット」という用語は、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指令することのできるＤＮＡ配列並びにＲＮＡ配列を包含する。一般的に、それは、場合により終止シグナル及び／又は他の調節因子に作動可能に連結された、関心対象のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。発現カセットは、転写を調節するヌクレオチド配列を含み得る。発現カセットはまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要とされる配列も含み得る。発現カセットは、天然に存在しているが異種発現にとって有用な組換え形で得られているものであってもよい。コード領域は通常、関心対象のタンパク質をコードしている。関心対象のポリヌクレオチド配列を含む発現カセットはまたキメラであってもよく、このことは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。典型的には、本明細書の発現カセットは、ＭＶＡゲノム内に天然には存在せず（すなわち異種又は外因性又は外来性）、感染した細胞において転写を起こすことができる。
【００４４】
発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成プロモーター又は宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあり得る。本発明の発現カセットにおけるプロモーターは好ましくはポックスウイルスプロモーターである。このようなポックスウイルスプロモーターは、天然プロモーターでも、合成プロモーターでもよい。例示的な例として、ポックスウイルスプロモーターはＰｒ７．５プロモーター、ハイブリッド初期／後期プロモーター、ＰｒＳプロモーター、合成若しくは天然の初期又は後期プロモーター、例えば国際公開公報第２０１０／１０２８２２号若しくは国際公開公報第２００５／０５４４８４号に記載のプロモーターの１つ、又は牛痘ウイルスＡＴＩプロモーターである。例えば、ポックスウイルスプロモーターはＰ７．５（配列番号１７）（Endo et al. J Gen Virol. 1991 Mar;72 ( Pt 3):699-703）である。しかしながら、好ましいプロモーターは、Ｐ７．５より強力であるプロモーター、例えば配列番号１８に示された配列を有する米国特許出願公開第２０１１／００６４７６９号に記載のようなプロモーターＰＨ５である。
【００４５】
抗原又はそのエピトープをコードしている核酸配列は好ましくはコドンが最適化されている。「コドンの最適化された」核酸配列は、望ましい宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞によって好まれるコドンによって置換されているコドンを含有している核酸配列を指す。核酸配列は、同一に翻訳されるポリペプチド配列を有するが、代替的なコドン使用を有する、特に標的生物の最も頻繁に出現するコドンを使用する、コドンの最適化された核酸配列へと変換される。抗原のコドンの最適化された核酸配列を作製する方法は一般的に、標的生物内の高度に発現している遺伝子と一般的に関連していない抗原の天然配列内のコドンを同定し、それらを、標的生物の遺伝子発現に広く使用されていることが知られているコドンで置き換えることを含む。コドンの最適化された核酸配列は、所望の宿主細胞において天然配列よりも改善された発現を示し得る。コドンの最適化された配列が、コドンの最適化されていない配列よりもタンパク質産生において改善を誘導するかどうかは、当業者によって調べられ得る。
【００４６】
コドンの最適化は、望ましい宿主にとって稀なコドンの使用を避ける。なぜなら、稀なコドンは、コードタンパク質の発現を遮断又は低下させる可能性があるからである。また、望ましい宿主のための核酸シグナルを導入し得る置換は、好ましくは回避される。このようなシグナルとしては、スプライスシグナル、終止シグナル、及び開始シグナルが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、以下の配列モチーフは、使用されるベクターの種類に応じて避けられる（例えば、ワクシニアウイルス初期転写終結シグナルは、多くの他のベクターでは避けられる必要はない）、内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、及びリボソーム進入部位；ＡＴリッチ及びＧＣリッチ配列鎖；ＡＲＥ、ＩＮＳ、及びＣＲＳ配列要素；反復配列及びＲＮＡ二次構造；（隠れた）スプライスドナー部位及びアクセプター部位、並びに分岐点；並びにワクシニア初期転写終結シグナル：（ＴＴＴＴＴＮＴ）。
【００４７】
コドン最適化のための技術は、当技術分野において公知である。ヌクレオチドの、異なるヌクレオチドを用いての置換は、他のヌクレオチドによるヌクレオチドの技術的又は人工的置換を指す。好ましくは、置換されたヌクレオチドは、コードされたアミノ酸配列を変化させない。置換は、同じアミノ酸をコードしている２つの相同なヌクレオチド配列におけるコドンを同定し、２つのうち１つの相同なヌクレオチド配列内のコドンを、コドンが依然として同じアミノ酸をコードするように変化させることによって実施され得る。変化は、相同ヌクレオチド配列の一方、両方すなわち全てにおいて行なわれ得る。
【００４８】
本発明は、全てのＨＢＶ抗原が好ましくは、いくつかの抗原を含む１本の単一のポリペプチド鎖として翻訳されることを考える。ポリペプチド鎖上で、抗原配列は好ましくは、自己切断部位配列によって隔離されている。したがって、いくつかの抗原を含むポリペプチド鎖は、翻訳後に切断されて複数のポリペプチド鎖となり、複数のポリペプチド鎖の各々は、単一のＨＢＶ抗原を含み得る。このアプローチは、全てのＨＢＶ抗原がほぼ等モルレベルで発現されるという利点を有する。いくつかの抗原を含むポリペプチド鎖の好ましい配置は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＨＢＶ Ａ／ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質、Ｐ２Ａ部位、ＨＢＶ Ｄ／ａｙｗ由来のコアタンパク質、Ｐ２Ａ部位、本明細書に記載のようなＢ型肝炎ウイルス由来のポリメラーゼの免疫原性ＲＴドメイン、Ｔ２Ａ部位、本明細書に記載のようなＢ型肝炎由来の免疫原性エンベロープタンパク質（ＨＢｓ抗原）、Ｔ２Ａ部位、本明細書に記載のようなＢ型肝炎由来の免疫原性コアタンパク質（ＨＢｓ抗原）である。好ましい実施態様では、いくつかの抗原を含むポリペプチド鎖は、配列番号０７に示される配列を含む。図１６Ｂに示されるように、２つの異なるエンベロープタンパク質は細胞膜に存在し、サブウイルス粒子として分泌され得る。これらのサブウイルス粒子は、異なるＨＢＶ遺伝子型に由来する両方のエンベロープタンパク質を含み得、抗原提示細胞によって取り込まれ得、これにより誘導された免疫応答は増加し得る。コア粒子は、空のカプシドを形成し得、ここでの空のカプシドは同じように、異なるＨＢＶ遺伝子型に由来するコアタンパク質を含み得る。このようなカプシドは、複数のＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答をトリガーするだろう。ポリメラーゼは、プロテアソーム内で分解され、ＨＬＡで提示されるだろう。本明細書に記載の配置はさらに、ほんの部分的にしかプロセシングされていないタンパク質の大半、すなわち、自己切断部位が切断されていないタンパク質が、分泌されたウイルス様粒子に取り込まれ、これにより免疫応答を増加すると推定され、特に獲得免疫応答を増強及び広域化するという利点を有する。
【００４９】
本発明は、ＭＶＡゲノム内の様々な挿入部位に取り込まれたＨＢＶ遺伝子を含む組換えＭＶＡを包含する。「様々な挿入部位」は、ＨＢＶ抗原をコードしているＨＢＶ遺伝子をそれぞれ、ＭＶＡゲノム内の同じ又は１つ以上の異なる挿入部位に挿入することができることを意味し、同じ挿入部位が好ましい。異なるは、例えば、第一の挿入部位が第二の挿入部位とは同じではないことを意味する。
【００５０】
例示的な例として、ＨＢＶ遺伝子は、ＭＶＡの遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入され得る。このようなＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、及びＩＧＲ１４８／１４９から選択され得る。しかしながら、ＨＢＶ遺伝子は、ＭＶＡの天然の欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、又はＶＩに挿入されることが好ましく、ここで少なくとも１つ又は好ましくは全てのＨＢＶ遺伝子（群）が天然の欠失部位ＩＩＩに挿入されることが好ましい。例示的な例として、全てのＨＢＶ遺伝子は、本明細書に記載のような単一のオープンリーディングフレーム上の単一の発現カセットに含まれ得、ここでの単一の発現カセットは天然の欠失部位ＩＩＩに挿入される。
【００５１】
組換えＭＶＡウイルスは、当技術分野において公知である慣用的な方法によって作製され得る。組換えポックスウイルスを得るための方法又は外因性コード配列をポックスウイルスゲノムに挿入するための方法は、当業者には周知である。例えば、方法は、以下の参考文献に記載されている：J. Sambrook, E. F. Fritsch及びT. ManiatisによるMolecular Cloning、A laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2003は、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡ及びＲＮＡの単離、ウェスタンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、及びＰＣＲ増幅技術などの、標準的な分子生物学技術のための技術を記載している。Brian W J Mahy及びHillar O Kangroによって編集されたVirology Methods Manual、Academic Press. 1996は、ウイルスの取扱い及び操作のための技術を記載している。AJ Davison及びRM Elliottによって編集されたMolecular Virology: A Practical Approach、The Practical Approach Series、オックスフォード大学出版のＩＲＬ出版、オックスフォード１９９３、第９章：Expression of genes by Vaccinia virus vectors、Current Protocols in Molecular Biology、発行者：John Wiley and Son Inc. 1998、第１６章、第ＩＶ節：Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vectorは、ＭＶＡの取扱い、操作、及び遺伝子工学操作のための技術及びノウハウを記載している。
【００５２】
本発明による組換えポックスウイルスの作製のために、様々な方法が適用可能であり得る。ウイルスに挿入する予定のＤＮＡ配列を、ポックスウイルスのＤＮＡ区画に対して相同なＤＮＡが挿入されているＥ．ｃｏｌｉプラスミド構築物に配置することができる。別々に、挿入する予定のＤＮＡ配列をプロモーターに連結させることができる。プロモーター−遺伝子の連結が、両末端上で必須ではない遺伝子座を含有しているポックスウイルスＤＮＡの領域にフランキングしているＤＮＡ配列に対して相同であるＤＮＡによってフランキングされるように、プロモーター−遺伝子の連結をプラスミド構築物内に配置することができる。結果として得られたプラスミド構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌内での増殖によって増幅させ、そして単離することができる。挿入する予定のＤＮＡ遺伝子配列を含有している単離されたプラスミドを、細胞培養液に、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に、ポックスウイルスによるこの培養液の感染と共に、トランスフェクトさせることができる。プラスミド及びウイルスゲノム内のそれぞれの相同なポックスウイルスＤＮＡ間の組換えにより、外来ＤＮＡ配列の存在によって改変されたポックスウイルスを作製することができる。
【００５３】
例えばＣＥＦ細胞などの適切な細胞培養液の細胞をポックスウイルスを用いて感染させることができる。感染した細胞は、続いて、外来遺伝子又は遺伝子群を含む第一のプラスミドベクターを用いて、好ましくはポックスウイルス発現制御配列の転写制御下でトランスフェクトすることができる。上記に説明されているように、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスゲノムの選択された部分への外因性配列の挿入を指令することのできる配列を含む。場合により、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスプロモーターに作動可能に連結されたマーカー及び／又は選択遺伝子を含むカセットも含有している。適切なマーカー又は選択遺伝子は、例えば、緑蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、又は他のマーカーをコードしている遺伝子である。選択カセット又はマーカーカセットの使用は、作製された組換えポックスウイルスの同定及び単離を簡素化する。しかしながら、組換えポックスウイルスはまた、ＰＣＲ技術によっても同定され得る。続いて、さらなる細胞を、上記のようにして得られた組換えポックスウイルスを用いて感染させ、第二の外来遺伝子又は遺伝子群を含む第二のベクターを用いてトランスフェクトすることができる。この遺伝子を、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入することができる場合には、第二のベクターではまた、ポックスウイルスゲノムへの第二の外来遺伝子又は遺伝子群の組み込みを指令するポックスウイルス相同配列が異なる。相同的組換えが起こった後、２つ以上の外来遺伝子を含む組換えウイルスを単離することができる。追加の外来遺伝子を組換えウイルスに導入するために、感染及びトランスフェクションの工程を、感染のためには事前の工程で単離された組換えウイルスを使用すること、及びトランスフェクションのためにはさらなる外来遺伝子又は遺伝子群を含むさらなるベクターを使用することによって繰り返すことができる。
【００５４】
あるいは、上記のような感染及びトランスフェクションの工程は相互に交換可能であり、すなわち、適切な細胞をまず、外来遺伝子を含むプラスミドベクターによってトランスフェクトし、次いでポックスウイルスを用いて感染させてもよい。さらなる代替法として、各々の外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、全ての得られた組換えウイルスを用いて細胞を共感染させ、全ての外来遺伝子を含む組換え体についてスクリーニングすることも可能である。３番目の代替法は、ＤＮＡゲノムと外来配列のインビトロでの連結、及びヘルパーウイルスを使用した組換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムの再構築である。４番目の代替法は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングされたワクシニアウイルスゲノムと、ワクシニアウイルスゲノム内の所望の組換え部位にフランキングしている配列に対して相同であるＤＮＡ配列にフランキングしている鎖状外来配列との間の、Ｅ．ｃｏｌｉ又は別の細菌種における相同的組換えである。
【００５５】
本発明による組換えＭＶＡウイルスは高度に複製が制限され、したがって高度に弱毒化されているので、それは、ヒト及びさらには免疫不全のヒトを含む多種多様な哺乳動物の処置のための理想的な候補である。さらに、ＭＶＡ系ワクチンの産生は、従来のワクチンの既存の産生能とは多かれ少なかれ独立している。なぜなら、ＭＶＡはＣＥＦ細胞において慣用的に培養することができるからである。したがって、本発明のＭＶＡ系ワクチンは、大量に短時間で生成することができる。さらに、本発明のＭＶＡベクターワクチンは複数のＨＢＶ抗原を送達することができ、したがって、高いレベルの体液性免疫及び細胞性免疫の同時誘導を可能とする。したがって、本発明はまた、ヒトを含む生存動物体内において免疫応答を誘導するための、医薬組成物及びまたワクチンを提供する。
【００５６】
ワクチンは好ましくは、ＭＶＡウイルスを、１０４〜１０９のＴＣＩＤ５０/mlの濃度範囲、好ましくは１０５〜５×１０８のＴＣＩＤ５０/mlの濃度範囲、より好ましくは１０６〜１０８のＴＣＩＤ５０/mlの濃度範囲、最も好ましくは１０７〜１０８のＴＣＩＤ５０/mlの濃度範囲で含む。
【００５７】
ヒトにおいて好ましいワクチン接種用量は、１０６〜１０９のＴＣＩＤ５０、最も好ましくは１０６ＴＣＩＤ５０又は１０７ＴＣＩＤ５０又は１０８ＴＣＩＤ５０を含む。
【００５８】
医薬組成物は一般的に、１つ以上の薬学的に許容される及び／又は認可された添加剤、例えば担体、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤、及び／又は安定化剤を含み得る。このような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであり得る。適切な担体は、典型的には、大型の緩徐に代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物などである。
【００５９】
「薬学的に許容される」という用語は、本発明によるＭＶＡの生物学的活性の有効性を妨害しない無毒性材料を意味する。担体の特徴は、投与経路に依存するだろう。医薬組成物はさらに、処置における活性又は使用のいずれかを増強する、他の物質も含有し得る。このような添加因子及び／又は物質は、本発明による免疫化法のために適用される予定の医薬組成物に含まれ得、これにより相乗作用を生じ得るか又は副作用が最小限となり得る。本発明によるＭＶＡの製剤化技術及び投与技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Muck Publishing Gompany、イーストン、ＰＡ州、最新版）に見られ得る。
【００６０】
ワクチンの調製のために、本発明による組換えＭＶＡは、生理学的に許容される剤形へと変換され得る。これは、天然痘に対するワクチン接種に使用されるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づいて実施され得る（Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392によって記載のように）。
【００６１】
例えば、精製されたウイルスは、約１０mMトリス、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で製剤化された５×１０８のＴＣＩＤ５０/mlの力価で−８０℃で保存することができる。ワクチン接種の調製のために、例えば１０２〜１０８個のウイルスの粒子を、アンプル中で、好ましくはガラス製のアンプル中で、２％のペプトン及び１％のヒトアルブミンの存在下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ml中で凍結乾燥させることができる。あるいは、ワクチン接種は、段階的な製剤中のウイルスの凍結乾燥によって作製され得る。この製剤は、インビボでの投与に適した、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、又はポリビニルピロリドン、又は他の補助剤、例えば抗酸化剤又は不活性ガス、安定化剤、又は組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの追加の添加剤を含有し得る。次いで、ガラス製アンプルを密封し、４℃から室温で数か月間保存することができる。しかしながら、必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で好ましくは保存される。
【００６２】
ワクチン接種又は治療のために、凍結乾燥液を、水溶液、好ましくは生理食塩水又はトリス緩衝液に溶解し、全身的に又は局所的のいずれかで、すなわち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、又は当業者には公知である任意の他の投与経路により投与し得る。投与様式、用量、及び投与回数は、公知の方法で当業者によって最適化され得る。
【００６３】
好ましいワクチン又は医薬組成物は、本明細書に記載のような本発明の組換えＭＶＡを含むことが理解される。また、本発明の組換えＭＶＡは、治療又はワクチン接種、好ましくは治療的ワクチン接種に、好ましくはＨＢＶに対する治療的ワクチン接種に使用され得ることが理解される。
【００６４】
本発明の組換えＭＶＡは有利には、感染症又はＢ型肝炎などの病的容態を治療及び／又は予防するのに有用である、医薬品又はワクチンを製造するために使用され得る。
【００６５】
本発明はさらに、Ｂ型肝炎に対するワクチン接種法を考える。ワクチン接種法は、治療的ワクチン接種法、すなわち、疾患の処置のためのワクチン接種法であり得る。本発明のワクチン接種法において、本明細書に記載のようなＨＢＶ ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質を発現するＭＶＡウイルス、及び本明細書に記載のようなＨＢＶ ａｙｗ由来のコアタンパク質を発現するＭＶＡウイルスが被験者に投与される。被験者は、本明細書に定義されているような任意の被験者、好ましくはヒト被験者であり得る。被験者は好ましくは、投与の必要性がある。本発明のワクチン接種法においては、ＨＢＶ ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質及びＨＢＶ ａｙｗ由来のコアタンパク質は、２つの異なるＭＶＡによって発現されてもよく、ここでの各々のＭＶＡは、エンベロープタンパク質又はコアタンパク質のいずれかを発現する。この場合、両方のＭＶＡが被験者に投与されなければならない。しかしながら、ＨＢＶ ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質及びＨＢＶ ａｙｗ由来のコアタンパク質はまた、同じＭＶＡによって発現されてもよい。この場合、たった１つのＭＶＡを被験者に投与しなければならない。後者の実施態様が好ましいことが理解される。
【００６６】
さらに、本発明は、被験者に投与される、ＣＤ７０分子をさらに発現する本明細書に記載のようなＨＢＶ ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質を発現するＭＶＡウイルス、及びＣＤ７０分子をさらに発現する本明細書に記載のようなＨＢＶ ａｙｗ由来のコアタンパク質を発現するＭＶＡウイルスを包含する。被験者は、本明細書に定義されているような任意の被験者、好ましくはヒト被験者であり得る。被験者は好ましくは、投与の必要性がある。さらに被験者は好ましくは、治癒的処置を必要とする慢性Ｂ型肝炎患者である。本発明のワクチン接種法においては、ＨＢＶ ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質とＣＤ７０分子、及びＨＢＶ ａｙｗ由来のコアタンパク質とＣＤ７０分子は、２つの異なるＭＶＡによって発現されてもよく、ここでの各々のＭＶＡは、エンベロープタンパク質とＣＤ７０、又はコアタンパク質とＣＤ７０のいずれかを発現する。この場合、両方のＭＶＡが被験者に投与されるべきである。しかしながら、ＨＢＶ ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質及びＨＢＶ ａｙｗ由来のコアタンパク質及びＣＤ７０分子はまた、同じＭＶＡによって発現されてもよい。この場合、たった１つのＭＶＡを被験者に投与しなければならない。後者の実施態様が好ましいことが理解される。
【００６７】
本発明のワクチン接種法は、被験者への本発明のＭＶＡの投与を含み、該ＭＶＡは好ましくは有効量であることがさらに理解される。
【００６８】
本発明のワクチン接種法は、少なくとも２回のワクチン接種工程を含み得る。ここで、免疫応答はプライム／ブースト処方計画によって誘導され、「遊離」タンパク質、例えばＨＢＶ ａ／ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質及び／又はＨＢＶ Ｄ／ａｙｗ由来のコアタンパク質が、プライムワクチン接種のために使用され、本発明の１つ以上の組換えＭＶＡが、少なくとも１回のブーストワクチン接種のために使用される。
【００６９】
したがって、第一の工程（プライム）で、「タンパク質ワクチン」を被験者に投与し得る。本明細書において使用する「タンパク質ワクチン」という用語は、ＨＢＶ Ａ／ａｄｗ由来のエンベロープタンパク質及び／又はＨＢＶ Ｄ／ａｙｗ由来のコアタンパク質、好ましくは該エンベロープタンパク質及び該コアタンパク質を含む組成物を指す。エンベロープタンパク質及びコアタンパク質の両方が好ましくは「遊離」タンパク質であり、このことはそれらが好ましくはウイルス粒子内に含まれていないことを意味する。エンベロープタンパク質及びコアタンパク質は２つの組成物で存在してもよく、これらは単独で投与されるか又は互いに組み合わせて投与される。エンベロープタンパク質及びコアタンパク質はまた、単一の組成物に含まれてもよい。「タンパク質ワクチン」に含まれるエンベロープタンパク質又はコアタンパク質は、微生物、例えば細菌細胞又は真菌細胞によって組換え産生されてもよい。
【００７０】
「タンパク質ワクチン」は好ましくは、ウイルス粒子を実質的に含まず、特にＭＶＡを実質的に含まないことが理解される。この脈絡における「実質的に含まない」は、タンパク質ワクチンが、１０３未満のＴＣＩＤ５０/ml、好ましくは１０２未満のＴＣＩＤ５０/ml、好ましくは１０１未満のＴＣＩＤ５０/ml、好ましくは１００未満のＴＣＩＤ５０/ml、好ましくは１０−１未満のＴＣＩＤ５０/ml、好ましくは１０−２未満のＴＣＩＤ５０/mlを含むことを意味する。タンパク質ワクチンはさらに、適切なアジュバントを含んでもよい。本明細書において使用する「アジュバント」は、抗原又はその断片に対する宿主の免疫応答（抗体及び／又は細胞媒介性）を増強、増大、又は強化する物質を指す。適切なアジュバントは当業者には公知である。好ましいアジュバントは、ポリ［ジ（エチルフェノキシカルボン酸ナトリウム）］ホスファゼン（ＰＣＥＰ）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、サポニン又はその組合せからなる群より選択され、該ＴＬＲアゴニストは好ましくはＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストであり、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは好ましくはポリＩ／Ｃ、ポリＩＣＬＣ（安定化形のポリＩ／Ｃ）ＣｐＧ、Ｒｉｇ−Ｉリガンド、ＳＴＩＮＧリガンド、サイクリックｄｉ−ＡＭＰ、サイクリックｄｉ−ＣＭＰ、サイクリックｄｉ−ＧＭＰ、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＣＴＡ１ＤＤ、若しくはｄｍＬＴ、又はその組合せである。しかしながら、本発明の発明者らは、タンパク質ワクチンが、例えばＣｐＧアジュバント又はＰＣＥＰなどのアルミニウム非含有アジュバントを含む場合、より強力なＴ細胞応答が、本発明のワクチン接種法によって誘導されるであろうことを発見した。この所見は驚くべきことである。なぜなら、Ｅｎｇｅｒｉｘ−ＢなどのＨＢＶ抗原を含む従来のワクチンは典型的には、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム含有アジュバントを含むからである。結果として、本明細書に記載のタンパク質ワクチンは好ましくは、ＣｐＧアジュバント又はＰＣＥＰ又はその両方を含む。本発明はさらに、ウイルスベクター、好ましくはＭＶＡウイルスベクターを提供し、ここでのアジュバントはサイクリックｄｉ−ＡＭＰである。
【００７１】
さらなる工程（ブースト）では、本明細書に記載のような１つ以上の組換えＭＶＡが被験者に投与される。１つ以上の組換えＭＶＡが、本明細書に記載のような医薬組成物又はワクチンに含まれ得る。
【００７２】
典型的には、組換えＭＶＡは、プライムワクチン接種から少なくとも約１日後に、好ましくは少なくとも約５日後に、好ましくは少なくとも約１週間後に、好ましくは約１週間から約８週間後に、好ましくは約２週間から約５週間後に、好ましくは約３週間から約４週間後に投与される。
【００７３】
また、ワクチン処方計画は、プライムワクチン接種後に２回以上のブーストワクチン接種を含むことが本発明によって包含される。好ましい実施態様では、タンパク質ワクチンは、プライムワクチン接種及び１回目のブーストワクチン接種のために使用される。また、本発明によって、タンパク質ワクチンを使用した２回目、３回目、又はさらなるブーストワクチン接種工程も実施され得ることが考えられる。タンパク質ワクチンを用いてのブーストワクチン接種後、ブーストワクチン接種は、本明細書に記載のような１つ以上の組換えＭＶＡを投与することによって実施される。また、本発明によって、１回目の組換えＭＶＡの投与の後に、２回目の投与、３回目の投与、又はさらなる投与（さらなるブーストワクチン接種）が続き得ることが包含される。
【００７４】
このような場合、タンパク質ワクチンを用いての１回目のブーストワクチン接種は、事前のワクチン接種工程から少なくとも約１日後に、好ましくは少なくとも約５日後に、好ましくは少なくとも約１週間後に、好ましくは約１週間から約８週間後に、好ましくは約２週間から約５週間後に、好ましくは約３週間から約４週間後に実施される。次いで、組換えＭＶＡ又はタンパク質ワクチンのいずれかを用いてのその後のブーストワクチン接種は、事前のワクチン接種から少なくとも約１日後に、好ましくは少なくとも約５日後に、好ましくは少なくとも約１週間後に、好ましくは約１週間から約８週間後に、好ましくは約２週間から約５週間後に、好ましくは約３週間から約４週間後に実施される。
【００７５】
本発明のワクチン接種法はさらに、プライム−ブーストワクチン接種の前に、ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを用いての被験者の処置を含み得る。このようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ＨＢＶに感染した被験者におけるＨＢＶ遺伝子を標的化し、これにより、標的化ＨＢＶ遺伝子の発現を減少させると考えられる。好ましくは、ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡは、標的化ＨＢＶ遺伝子をコードしているＲＮＡの３’領域を標的化する。好ましい実施態様では、標的化ＨＢＶ遺伝子をコードしているＲＮＡの標的化３’領域は、ＲＮＡのポリＡテイルの上流に位置する（すなわち、標的化領域は、ポリＡテイルに対して５’に、すなわち換言すれば５'から３’の方向に向かって標的化領域が最初に来て、続いてポリＡテイルが来る）。ｓｉＲＮＡが使用される場合、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子が標的化されると考えられる。しかしながら、好ましい実施態様では、全てのＨＢＶ遺伝子が標的化される。１つのｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して、ＨＢＶ遺伝子を標的化してもよい。しかしながら、１つを超えるｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを使用して、ＨＢＶ遺伝子を標的化してもよい。ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを用いてのこのような処置は、標的化遺伝子の発現（すなわち翻訳）を、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、又は８５％、好ましくは少なくとも約９０％減少させると考えられる。ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを用いての被験者のこのような処置は、プライム−ブーストワクチン接種を開始する１日前から２０週間前、１週間前から１９週間前、２週間前から１８週間前、３週間前から１７週間前、４週間前から１６週間前、５週間前から１５週間前、６週間前から１４週間前、７週間前から１３週間前、好ましくは約８週間前に実施され得る。本発明者らは驚くべきことに、プライム−ブーストワクチン接種を開始する前のｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを用いてのこのような処置は、プライム−ブーストワクチン接種後に発生したＴ細胞応答を増加させることを発見した。
【００７６】
本発明による免疫化法は、治療有効量のタンパク質ワクチン又は組換えＭＶＡを利用するだろう。治療有効量はさらに、症状の寛解、例えばこのような容態の治療、治癒、予防、又は寛解をもたらすのに十分な化合物／成分の量を指す。好ましい実施態様では、免疫化は、予防的及び／又は治療的の両方であり得る。免疫応答を奏功するための本発明の有効量は、抗原又はワクチンの種類、投与手段、標的部位、ヒト被験者であるか動物であるか、及び処置が予防的であるか又は治療的であるかをはじめとする、多くの異なる要因に応じて変更される。組換えＭＶＡの好ましい用量は本明細書に開示されている。
【００７７】
本発明は、トリをはじめとする、被験体動物を免疫化するための方法を提供する。好ましくは、動物は、ラット、ウサギ、ブタ、マウス、及びヒトをはじめとする哺乳動物であり、ＭＶＡの用量を被験者に投与する工程を含む。最も好ましくは、被験者はヒトである。１つの実施態様では、被験者は成人である。
【００７８】
投与は、当業者によってよって決定されるような任意の投与経路によって実施され得る。好ましくは、投与は、非経口、腸管粘膜、好ましくは筋肉内、静脈内、皮下（例えば掻爬又は注射）、鼻腔内（例えば吸入による）又は経口である。好ましい投与様式は非経口又は粘膜である。
【００７９】
さらに、本発明は、筋肉内である投与を提供し、ここでの投与は、アジュバントの投与を含む。好ましくは、アジュバントは、サイクリックｄｉ−ＡＭＰを含む。
【００８０】
さらに、本発明はまた、皮下又は筋肉内である投与を包含し、ここでの投与は、アジュバントの投与を含む。好ましくは、該アジュバントはポリＩ／Ｃ又はＲｉｇ−Ｉリガンドを含む。
【００８１】
本発明はまた、上記のようなワクチン接種法を考え、ここでのワクチン接種用ベクターは、ＭＶＡではなく、ＭＶＡと同じ抗原（群）を発現する１つ以上のサルモネラ株（群）である。したがって、本明細書に記載のワクチン接種法は、必要な変更を加えて、サルモネラ株を使用したワクチン接種法に応用される。このようなワクチン接種法は好ましくは、粘膜ワクチン接種法であり、タンパク質ワクチンは好ましくはＣＴＡ１ＤＤ又はｄｍＬＴを用いて免疫賦活される。
【００８２】
本発明はまた、これらの方法に使用するための本明細書の方法に開示された任意の化合物を包含する。例えば、本発明は、本明細書に開示されているようなワクチン接種法に使用するための組換えＭＶＡを包含する。
【００８３】
本発明はまた、本発明の１つ以上の組換えワクチン接種用ベクターを含む、医薬組成物又はワクチンを考える。すでに記載されているように、「ワクチン」は、被験者における病的容態を予防又は治療するために使用され得る。該用語は、サブユニットワクチン、すなわち、抗原が天然状態において関連している生物から分別されかつ分離されている抗原を含有しているワクチン組成物、並びに、とりわけ抗原及び／又はそのエピトープを有する本発明の組換えポックスウイルスを含有している組成物の両方を包含する。ワクチンは、活性成分の免疫学的活性を増強する１つ以上の追加の成分を含んでも含まなくてもよい。ワクチンは追加的にさらに、医薬組成物に対して典型的なさらなる成分を含んでもよい。本発明のワクチンは好ましくはヒト及び／又は獣への使用のためである。
【００８４】
本発明のワクチン又は組成物、例えばＭＶＡウイルスを含むワクチンは一般的に、１つ以上の薬学的に許容される担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤、及び／又は安定化剤を含み得る。このような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであり得る。適切な担体は、典型的には、大型の緩徐に代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物などである。米国特許出願公開第２０１１／００５２６２７号第７欄に記載のような他の担体も組成物に添加してもよい。
【００８５】
本発明はまた、プライム／ブースト免疫化のための少なくとも２つのバイアル／容器を含むキットも包含し、ここでの少なくとも１つのバイアル／容器は、１回目の接種（プライム接種）のための本明細書に記載のようなタンパク質ワクチン、及び場合によりさらなる接種（ブースト接種）のためのさらなるバイアルを含み、ここでのさらなるバイアルは好ましくは本発明の組換えワクチン接種用ベクターを含む。キットはまた、少なくともさらなる接種（「ブースト接種」）のための本明細書に記載のような組換えワクチン接種用ベクターを含む少なくとも１つのさらなるバイアル／容器を含む。キットはさらに、被験者への組換えワクチン接種用ベクターの投与のための説明書を含み得る。
【００８６】
本発明は、好ましい被験者がヒトであると考える。説明書は、本明細書に定義されているようなタンパク質ワクチン及び又は組換えワクチン接種用ベクターが被験者に複数（すなわち２、３、４、５、６など）の用量で特定の時点（例えば前回の投与から少なくとも４週間後、少なくとも６週間後、少なくとも８週間後）に投与されることを示し得る。好ましくは、説明書は、タンパク質ワクチン及び／又は組換えワクチン接種用ベクターが少なくとも３又は少なくとも４用量で投与される予定であることを示す。
【００８７】
本発明によって、本明細書に記載のキットが考えられ、ここでのキットに含まれるワクチン（群）は、非経口投与に適している。このようなキットでは、タンパク質ワクチンは好ましくは、ＰＣＥＰ及び／又はＣｐＧワクチンを用いて免疫賦活され得、組換えワクチン接種用ベクターは好ましくは本発明のＭＶＡであり得る。
【００８８】
本発明によってまた、本明細書に記載のキットも考えられ、ここでのキットに含まれるワクチン（群）は、粘膜投与に適している。このようなキットでは、タンパク質ワクチンは好ましくは、ＣＴＡ１ＤＤ、ｄｍＬＴ、ＰＣＥＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＣＭＰ、又はその組合せを用いて免疫賦活され得、組換えワクチン接種用ベクターは好ましくは、サルモネラ株、ＣＭＶ系ベクター、ＶＳＶ系ベクター、アデノウイルスベクター、又は麻疹ベクター、好ましくは本発明のサルモネラ株であり得る。
【００８９】
さらに、本発明によってまた、本明細書に記載のキットも考えられ、ここでのキットに含まれるワクチン（群）は、粘膜投与に適している。このようなキットでは、タンパク質ワクチンは好ましくは、ＣＴＡ１ＤＤ、ｄｍＬＴ、ＰＣＥＰ、ポリＩ／Ｃ、Ｒｉｇ−Ｉリガンド、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＣＭＰ、ｃ−ｄｉＧＭＰ、又はその組合せを用いて免疫賦活され得、組換えワクチン接種用ベクターは好ましくは、本発明のサルモネラ株、又は好ましくはサルモネラ株、ＣＭＶ系ベクター、ＶＳＶ系ベクター、アデノウイルスベクター、又は麻疹ベクターであり得る。
【００９０】
本発明はさらに、タンパク質組成物が筋肉内投与に適しているキットを提供する。好ましくは、該組成物は、サイクリック−ｄｉ−ＡＭＰである少なくとも１つのアジュバントを含む。
【００９１】
本発明によって、タンパク質組成物が皮下又は筋肉内投与に適しているキットも考えられる。好ましくは、該組成物は、ポリＩ／Ｃである少なくとも１つのアジュバントを含む。
【００９２】
本発明はまた、本明細書に記載の組換えＭＶＡを含む（宿主）細胞を提供する。ポックスウイルスに許容される細胞の例としては、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＴＭ４細胞、ＣＶＩ細胞、ＶＥＲＯ−７６細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ＭＶＡのための好ましい細胞はＣＥＦ細胞及びＢＨＫ細胞である。追加の細胞株は、当業者には公知である。細胞へのポックスウイルス構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔法、感染、及び当技術分野において公知であり標準的な実験マニュアル、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc. New Yorkに記載の他の方法によって行なわれ得る。
【００９３】
本発明はまた、組換えポックスウイルスを用いて感染させた（宿主）細胞も提供する。したがって、（宿主）細胞をＭＶＡウイルスベクターに感染させ、挿入しようとする遺伝子を含むさらなるベクター、例えばプラスミドベクターを用いて、好ましくはＭＶＡ又はポックスウイルス発現制御配列又はプロモーター、例えば合成ＰｒＳプロモーターの転写制御下でトランスフェクトすることができる。上記に説明されているように、プラスミドベクターは、ポックスウイルスゲノムの選択された部分への、例えば天然に存在する欠失部位又は遺伝子間領域の１つにフランキングする部分への、異種配列の挿入を指令することのできる配列を含む。
【００９４】
本明細書において使用する「約」又は「およそ」という用語は、所与の数値又は範囲からの２０％以内の逸脱、例えば１０％以内又は５％以内の逸脱を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】タンパク質によるプライム／ＭＶＡによるブーストのワクチン接種は高度に免疫原性である。（Ａ）ＨＢＶ亜型ａｙｗのＳ及びコアのオープンリーディングフレームを、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩ（ｄｅｌ ＩＩＩ）に、それぞれポックスウイルスプロモーターＰ７．５及びＰＨ５の制御下で挿入した。（Ｂ）野生型マウス（ｎ＝３）にＭＶＡ−Ｓ（１×１０８i.u.）、ＭＶＡ−コア（１×１０８i.u.）、又はＭＶＡｗｔ（１×１０８i.u.）を用いて１回（０日目；塗りつぶされた棒グラフ）又は２回（０日目及び２１日目；縞の棒グラフ）ワクチン接種した。（プライム後）８日目に又は（ブースト後）２７日目に、脾臓細胞を、ＨＢｓＡｇ（Ｓ１９０及びＳ２０８）由来ペプチド又はＨＢｃＡｇ（Ｃ９３）由来ペプチドを用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγについて分析した。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１２μgの組換えＨＢｓＡｇ又はＨＢｃＡｇを用いてワクチン接種した。ＣｐＧがアジュバントとして使用された。８日目に、脾臓細胞をＨＢｓＡｇ由来ペプチド又はＨＢｃＡｇ由来ペプチドを用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγの発現について分析した。（Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１２μgの組み換えられＣｐＧにより免疫賦活されたＨＢｃＡｇ又はＨＢｓＡｇを用いてプライムワクチン接種し、２１日目に、ＭＶＡ−コア（１×１０８i.u.）又はＭＶＡ−Ｓ（１×１０８i.u.）を用いてブーストした。２７日目に、脾臓細胞をＨＢｓＡｇ由来ペプチド又はＨＢｃＡｇ由来ペプチドを用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγの発現について分析した。血清を、イムノアッセイによって抗ＨＢｓ抗体について（中央のパネル）又は競合的ＥＬＩＳＡによって抗ＨＢｃ抗体について（右のパネル）分析した。示されるＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現頻度はバックグラウンドが差し引かれている。Ｓ／ＣＯ、シグナル値対カットオフ値；i.u.、感染単位。
【図２】ワクチン接種により誘発されたＨＢＶ特異的抗体応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、抗原血症と逆相関する。（Ａ〜Ｄ）低度の、中程度の、及び高度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウス（ｎ＝４）に、ＣｐＧにより免疫賦活されたＨＢｓＡｇ又はＨＢｃＡｇを用いて免疫化した。２１日目に、マウスに、それぞれＭＶＡ−Ｓ（１×１０８i.u.）又はＭＶＡ−コア（１×１０８i.u.）を用いてブーストした。２７日目に（ブーストから６日後）、血清を、（Ａ）抗ＨＢｓ抗体及び（Ｂ）抗ＨＢｃ抗体について分析した。低度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスの（Ｃ）脾臓細胞及び（Ｄ）肝臓に関連したリンパ球をＨＢｓＡｇを用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞について分析した。示されたＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現頻度はバックグラウンドが差し引かれている。Ｓ／ＣＯ、シグナル値対カットオフ値；neg＝陰性；i.u.、感染単位。
【図３】ワクチン接種により誘発されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度は、抗原血症と逆相関する。低度の、中程度の、及び高度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウス（ｎ＝４）に、１２μgのＣｐＧにより免疫賦活されたＨＢｓＡｇ又はＨＢｃＡｇを用いて免疫化した。２１日目に、マウスに、ＭＶＡ−Ｓ（１×１０８i.u.）又はＭＶＡ−コア（１×１０８i.u.）を用いてブーストした。ブーストから２７日後に、脾臓細胞（Ａ）及び肝臓に関連したリンパ球（Ｂ）を、ＨＢｓＡｇ（Ｓ１９０及びＳ２０８）特異的ペプチド又はＨＢｃＡｇ（Ｃ９３）特異的ペプチドを用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγの発現について分析した。上のパネル及び中央のパネルは例示的な動物を示し、下のパネルは、バックグラウンドを差し引いた後のＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現頻度を示す。i.u.、感染単位。
【図４】ワクチン接種により誘発されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能。野生型マウス並びに低度及び中程度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスに、ＣｐＧにより免疫賦活されたＨＢｓＡｇを用いて免疫化した。２１日目に、マウスをＭＶＡ−Ｓ（１×１０８i.u.）を用いてブーストした。ブーストから６日後に、Ｓ特異的な脾臓由来ＣＤ８＋Ｔ細胞を（Ａ）ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγの発現について分析した。（Ｂ）Ｓ特異的な脾臓又は肝臓由来ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ペプチドＳ１９０を用いての刺激後にＩＦＮγ発現、ＩＬ−２発現及びＴＮＦα発現について分析した。（Ｃ）Ｓ１９０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の多量体の染色、並びにＣＤ１２７及びＫＬＲＧ−１の表面発現の共染色。i.u.、感染単位。
【図５】異種のワクチン接種は、高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスにおけるＴ細胞寛容を破壊する。（Ａ）Ｓ亜型ａｙｗ及びａｄｗのオープンリーディングフレームを、強力なポックスウイルスプロモーターＰＨ５の制御下で、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩ（ｄｅｌ ＩＩＩ）に配置した。（Ｂ）〜（Ｄ）高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウス（ｎ＞４）に、１６μgのＨＢｓＡｇ（亜型ａｙｗ又はａｄｗ）及び１６μgのＨＢｃＡｇ（亜型ａｙｗ）を、示されたアジュバントと一緒に用いて０日目及び１４日目にワクチン接種した。２８日目に、マウスを、ＭＶＡ−ＰＨ５−Ｓ（５×１０７i.u.；亜型ａｙｗ又はａｄｗ）及びＭＶＡ−コア（５×１０７i.u.）を用いてブーストした。ブーストから６日後に、（Ｂ）脾臓細胞（左パネル）及び肝臓に関連したリンパ球（ＬＡＬ、右パネル）を単離し、ペプチドＳ１０９及びＳ２０８（示されている場合は亜型ａｄｗ）又はＣ９３を用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγの発現について分析した。（Ｃ）脾臓細胞及びＬＡＬを、Ｃ末端のＨＢｓＡｇ特異的１５−ｍｅｒペプチドのプール（アミノ酸１４５から２２６を網羅、亜型ａｙｗ）を用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞について分析した。（Ｄ）ＩＦＮγを発現するＳ２０８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを、ＴＮＦα及びＩＬ−２の発現について分析した。ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現頻度の平均値±標準誤差はバックグラウンドが差し引かれて示されている。ｎｓ：有意ではない。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１スチューデントｔ検定；i.u.、感染単位。
【図６】異種のワクチン接種は、高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスにおいてセロコンバージョンを誘導する。（Ａ）〜（Ｄ）高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウス（ｎ＞４）に、０日目及び１４日目に、ＣｐＧ及びＰＣＥＰを用いて免疫賦活された１６μgのＨＢｃＡｇ（亜型ａｙｗ）及び１６μgのＨＢｓＡｇ（示されているような亜型ａｙｗ又はａｄｗ）を用いてワクチン接種した。２８日目に、マウスを、ＭＶＡ−ＰＨ５−Ｓ（５×１０７i.u.；亜型ａｙｗ又はａｄｗ）及びＭＶＡ−コア（５×１０７i.u.）を用いてブーストした。対照として、５匹の高度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウスに、０日目及び１４日目にアジュバントＣｐＧ及びＰＣＥＰを用いてワクチン接種し、続いて、１×１０８のＭＶＡ−ｗｔを用いてブーストした。ブーストから６日後に、血清を（Ａ）抗ＨＢｓ抗体又は（Ｂ）抗ＨＢｃ抗体の存在について分析した。（Ｃ）ＨＢＶｔｇマウス由来の抗ＨＢｓ抗体陽性血清を、亜型ａｙｗＨＢｓＡｇの中和能について分析した。（Ｄ）は、ワクチン接種前後の血清中ＨＢｓＡｇレベルを示す。平均値±標準誤差が示されている。ｎｓ：有意ではない。Ｓ／ＣＯ、シグナル値対カットオフ値。＊＊ｐ＜０．０１スチューデントｔ検定。
【図７】ＭＶＡベクターによるＨＢＶ抗原の発現。（Ａ）及び（Ｂ）マウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ＭＶＡ−Ｓ、ＭＶＡ−コア、又はＭＶＡｗｔを用いて感染させた（ＭＯＩは１０）。感染から１６時間後、（Ａ）全細胞溶解液を、ウェスタンブロットによってＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇの発現について分析した。（Ｂ）上清中に分泌されたＨＢｓＡｇを、ＨＢｓＡｇ特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。Ｓ／ＣＯ、シグナル値対カットオフ値。
【図８】ＣｐＧにより免疫賦活されたＨＢｓＡｇを用いてのワクチン接種。高度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウスに、アジュバントとしてＣｐＧを含有している１２μgのＨＢｓＡｇを用いて免疫化した。２１日目に、マウスを、ＭＶＡ−Ｓを用いてブーストした。プライム免疫化から０、２７、３５、４２、４９及び５６日後に、血清を、ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｓ抗体のレベルについて分析した。Ｓ／ＣＯ、シグナル値対カットオフ値。
【図９】タンパク質によるプライムワクチン接種のためのアジュバントの比較。（Ａ）〜（Ｃ）野生型マウスに、０日目に、示されたアジュバント（群）と一緒に１６μgのＨＢｓＡｇ（亜型ａｙｗ）及び１６μgのＨＢｃＡｇ（亜型ａｙｗ）を用いてワクチン接種した。２８日目に、マウスを、ＭＶＡ−ＰＨ５−Ｓ（５×１０７i.u.；亜型ａｙｗ）及びＭＶＡ−コア（５×１０７i.u.）を用いてブーストした。ブーストから６日後に血清を、（Ａ）抗ＨＢｓ抗体及び（Ｂ）抗ＨＢｃ抗体の存在について分析した。（Ｃ）ブーストから６日後に、脾臓細胞を、ＨＢｓＡｇ（Ｓ１９０及びＳ２０８ａｄｗ）特異的ペプチド又はＨＢｃＡｇ（Ｃ９３）特異的ペプチドを用いた刺激後に細胞内サイトカイン染色によって分析した。棒グラフは、バックグラウンドを差し引いた後にＩＦＮγについて陽性に染色されたＣＤ８＋細胞の比率（平均値±標準誤差）を示す。i.u.、感染単位。
【図１０】ＨＢＶｔｇマウスの分類。マウスを、ＨＢＶｔｇマウスの場合、血清中で決定されたウイルス力価に密接に相関するそれらの抗原レベルに従って分類した。
【図１１】Ｔ細胞の刺激に使用されたペプチド。表は、マウスＫｂ／ＫｄＭＨＳ−Ｉ対立遺伝子によって拘束されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を決定するために使用されたペプチド配列を示す。Ｓプールを使用して、マウス及びヒトのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を幅広く決定した。
【図１２】実施例４のワクチン接種スキームのグラフによる概観。高度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウス（≧４）に、０日目及び１４日目に、示されたアジュバントと一緒に１６μgのＨＢｓＡｇ（亜型ａｙｗ又はａｄｗ）及び１６μgのＨＢｃＡｇ（亜型ａｙｗ）を用いてワクチン接種した。２８日目に、マウスをＭＶＡ−ＰＨ５−Ｓ（５×１０７i.u.；亜型ａｙｗ又はａｄｗ）及びＭＶＡ−コア（５×１０７i.u.）を用いてブーストした。ブーストから６日後に、（Ｂ）脾臓細胞（左パネル）及び肝臓に関連したリンパ球（ＬＡＬ、右パネル）を単離し、ペプチドＳ１０９及びＳ２０８（示されている場合には亜型ａｄｗ）又はＣ９３を用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によってＩＦＮγの発現について分析した。
【図１３】多量体の染色とＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色の相関。ＨＢＶｔｇマウスに、アジュバントとしてＣｐＧを含有している１２μgのＨＢｓＡｇを用いて免疫化した。２１日目に、マウスを、ＭＶＡ−Ｓを用いてブーストした。ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答は、ペプチドＳ１９０を用いてエクスビボで再刺激した後に、Ｓ１９０多量体の染色又は細胞内サイトカイン染色のいずれかによって２８日目に検出された。
【図１４】血清中の免疫複合体の検出。ＨＢＶｔｇマウスを、ＣｐＧを用いて免疫賦活されたＨＢｓＡｇを用いて免疫化した。２１日目に、マウスをＭＶＡ−Ｓを用いてブーストした（１×１０８i.u.）。ブーストから６日後に、血清を、抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｓＡｇ、及び沈降した免疫複合体中のＨＢｓＡｇについて分析した。i.u.、感染単位；ｎｄ；検出不可能。
【図１５】様々なワクチンアジュバントの比較。野生型ＣＨ５７Ｂｌ／６マウスを、様々なアジュバント製剤中で複合体が形成されているＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇを用いて免疫化した。１：ＣｐＧと水酸化アルミニウム；２：ポリホスファゼンＰＣＥＰとアルミニウム；３：ＰＣＥＰとＣｐＧとアルミニウム；４：ＣｐＧのみ；５：ＰＣＥＰのみ；６：ＣｐＧとＰＣＥＰ。２８日目に、全ての動物を、亜型ａｄｗのコア及びＳを発現するＭＶＡを用いてブーストした。図１５Ａ〜Ｂは、２８日後（タンパク質によるプライムのみ）及び３４日後（タンパク質によるプライムとＭＶＡによるブースト）の抗ＨＢｓ抗体（図１５Ａ）及び抗ＨＢｃ抗体（図１５Ｂ）を示す。図１５Ｃ〜Ｄは、プライム後（図１５Ｃ）及びＭＶＡによるブースト後（図１５Ｄ）のＳ及びコアのエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。図１５Ｅは、ＨＢＶ亜型ａｙｗを、感染前に示された血清希釈液と共にインキュベートし、感染細胞によるＨＢｓＡｇの分泌を４日後、７日後及び１０日後に測定した、中和アッセイを示す。
【図１６】多重抗原のオープンリーディングフレーム。図１６Ａは、配列番号０７によって示される多重抗原性ポリペプチド鎖の構造を示す。図１６Ｂは、Ａ／ａｄｗ及びＣ／ａｙｗのＨＢｓ抗原を含むサブウイルス粒子の形成を図示する。図１６Ｃは、Ｄ／ａｙｗ及びＣ／ａｙｗのＨＢｃ抗原を含む空のカプシドの形成を図示する。
【図１７】配列番号０７によって示される多重抗原性ポリペプチド鎖に由来する完全にプロセシングされたタンパク質及びそれらの運命の図解。
【図１８】配列番号０７によって示される多重抗原性ポリペプチド鎖に由来する部分的にプロセシングされていないタンパク質及びそれらの予想される運命の図解。部分的にプロセシングされていないものの殆どは、分泌されたウイルス様粒子／線維への取り込みに因り、免疫応答を増加させる（特に獲得免疫応答を増強及び広域化する）と推定される。
【図１９】Ｃ末端のオーバーハングを含むＨＢＶ Ａ２／ａｄｗ２の小型エンベロープタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）。下線の配列は、Ｃ末端のオーバーハングを有さないＨＢＶ Ａ２／ａｄｗ２の小型エンベロープタンパク質のアミノ酸配列（配列番号０８）に相当する。Ｃ末端のオーバーハングは、配列番号０９に相当するＰ２Ａ切断断片である。
【図２０】Ｎ末端及びＣ末端のオーバーハングを含むＨＢＶ Ｄ／ａｙｗのコアタンパク質断片１〜１４９のアミノ酸配列（配列番号１２）。下線の配列は、Ｎ末端及びＣ末端のオーバーハングを有さないＨＢＶ Ｄ／ａｙｗのコアタンパク質断片１〜１４９のアミノ酸配列（配列番号１１）に相当する。Ｃ末端のオーバーハングは、配列番号０９に相当するＰ２Ａ切断断片である。
【図２１】Ｎ末端及びＣ末端のオーバーハングを含むＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインのアミノ酸配列（配列番号１６）。下線の配列は、Ｎ末端及びＣ末端のオーバーハングを有さないＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインのアミノ酸配列（配列番号０６）に相当する。Ｃ末端のオーバーハングは、配列番号１３に相当するＴ２Ａ切断断片である。
【図２２】Ｎ末端及びＣ末端のオーバーハングを含むＨＢＶ Ｃ／ａｙｗの大型エンベロープタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）。下線の配列は、Ｎ末端及びＣ末端のオーバーハングを有さないＨＢＶ Ｃ／ａｙｗの大型エンベロープタンパク質のアミノ酸配列（配列番号０４）に相当する。Ｃ末端のオーバーハングは、配列番号１３に相当するＴ２Ａ切断断片である。
【図２３】Ｎ末端オーバーハングを含むＨＢＶ Ｃ／ａｙｗのコアタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５）。下線の配列は、Ｎ末端のオーバーハングを有さないＨＢＶ Ｃ／ａｙｗのコアタンパク質のアミノ酸配列（配列番号０５）に相当する。
【図２４】ＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインの共通配列のアミノ酸配列（配列番号０３）。
【図２５】遺伝子型Ｃ ＨＢＶ株の大型エンベロープタンパク質の共通配列のアミノ酸配列（配列番号０１）。
【図２６】遺伝子型Ｃ ＨＢＶ株のコアタンパク質の共通配列のアミノ酸配列（配列番号０２）。
【図２７】ＲＮＡｉの組合せ及び治療的ワクチン接種。（Ａ）実験の設定。ＨＢＶｘｆｓトランスジェニックマウスは、ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＢＶ）、関連性のないｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＥＧ）の投与を受けたか、又は未処置のまま放置された。８週間後、全てのマウスは、ＨＢＶコア及び表面抗原（ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇ）を用いての、タンパク質によるプライム・ＭＶＡによるブーストの治療的免疫化を受けた。（Ｂ）ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ設計の図解。
【図２８】ＨＢＶ抗原レベル及び抗体応答及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答。（Ａ）血清中ＨＢｅＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルの動態。（Ｂ）屠殺の時点（９１日目、１３週目（Ｗ））におけるマウスの血清中の抗ＨＢｓ抗体。（Ｃ）プライム−ブーストのワクチン接種後の肝臓及び脾臓において測定されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【図２９】最適なＭＶＡ用量の推定。低度及び中程度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウスを、血清中のＨＢｅＡｇレベルに従って分類した。（Ａ）ＨＢＶｔｇマウスのグループ（ｎ＝３〜４）を、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰを用いて免疫賦活された１５μgの粒子状ＨＢｃＡｇを用いて２週間間隔で２回免疫化した。２８日目に、マウスを、４回の異なる用量のＭＶＡ−コア（それぞれ、３×１０６、１×１０７、３×１０７、１×１０８ＰＦＵ）を用いてブーストした。０日目から３５日目（ブーストから７日後）までのマウス血清を、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｓ抗体、及び抗ＨＢｃ抗体（Ｂ）、並びにＡＬＴレベル（Ｃ）について分析した。（Ｄ）３５日目に、ＨＢＶｔｇマウスの脾臓細胞及び肝臓に関連したリンパ球を単離し、ＭＶＡ由来ペプチドＢ８Ｒ又はＨＢｃＡｇ由来ペプチドｃ９３を用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。示されたＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現頻度はバックグラウンドが差し引かれている。i.m.−筋肉内免疫化；Ｓ／ＣＯ−シグナル値対カットオフ値；ＰＦＵ−プラーク形成単位；Ｕ−単位；ＩＵ−国際単位。
【図３０】タンパク質によるプライミングのためのアジュバントとしてのｃ−ｄｉ−ＡＭＰの評価。中程度及び高度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウスを、血清中のＨＢｅＡｇレベルに従って分類した。（Ａ）ＨＢＶｔｇマウスのグループ（ｎ＝７）を、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ又はＣｐＧ／ＰＣＥＰの組合せを用いて免疫賦活された１５μgの粒子状ＨＢｓＡｇと１５μgのＨＢｃＡｇとの混合物を用いて２週間間隔で免疫化した。２８日目に、マウスを１０８ＭＶＡ−Ｓ／コアを用いてブーストした。ｃ−ｄｉ−ＡＭＰを２回注射され「空の」ＭＶＡ（ＭＶＡｗｔ）を用いてブーストされたＨＢＶｔｇマウス（ｎ＝４）を対照として使用した。０日目から３４日目（ブーストから６日後）のマウスの血清を、ＡＬＴレベル（Ｂ）、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｓ抗体、及び抗ＨＢｃ抗体（Ｃ〜Ｄ）について分析した。（Ｅ）３４日目にＨＢＶｔｇマウス（ｎ＝４）の脾臓細胞及び肝臓に関連したリンパ球を単離し、ＨＢｃＡｇ由来ペプチドｃ９３又はＨＢｓＡｇ由来ペプチドｓ２０８を用いて刺激し、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。示されたＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現頻度はバックグランドが差し引かれている。i.m.−筋肉内免疫化；Ｓ／ＣＯ−シグナル値対カットオフ値；ＰＦＵ−プラーク形成単位；ＩＵ−国際単位。
【図３１】様々なアジュバントのための最適な送達経路の推定：ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ポリＩＣ、及びＲＩＧ−Ｉリガンド。低度及び中程度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウスを、血清中ＨＢｅＡｇレベルに従って分類した。（Ａ）ＨＢＶｔｇマウスのグループ（ｎ＝５）を、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ポリＩＣ、又はＲＩＧ−Ｉリガンドを用いて免疫賦活された１５μgの粒子状ＨＢｓＡｇと１５μgのＨＢｃＡｇの混合物を用いて２週間間隔で免疫化した。２８日目に、マウスを、６×１０７のＭＶＡ−Ｓ／コアを用いてブーストした。免疫化は専ら筋肉内経路によって実施されたか、又は、タンパク質によるプライミングが皮下投与され、続いて腹腔内にブーストが投与された。０日目から３４日目（ブーストから６日後）のマウスの血清を、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｓ抗体、及び抗ＨＢｃ抗体（Ａ）について分析した。ＨＢＶｔｇマウスの体重を実験を通じて１週間に１回モニタリングした（Ｂ）。（Ｃ）３４日目に、ＨＢＶｔｇマウスの脾臓細胞及び肝臓に関連したリンパ球を単離し、ＭＶＡ由来ペプチドＢ８Ｒ、ＨＢｓＡｇ由来ペプチドｓ２０８、又はＨＢｃＡｇ由来ペプチドｃ９３を用いて刺激した。次いで、細胞を、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。示されるＩＦＮγ産生Ｔ細胞の出現頻度はバックグラウンドが差し引かれている。i.m.、s.c.、i.p.−それぞれ、筋肉内、皮下、腹腔内による免疫化；Ｓ／ＣＯ−シグナル値対カットオフ値；ＰＦＵ−プラーク形成単位；ＩＵ−国際単位。
【図３２】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける新規ＭＶＡ構築物（ＭＶＡ ＨＢＶｖａｃ）の評価。（Ａ）ＭＶＡ−Ｓ／コア及びＭＶＡ−ＨＢＶＶａｃの図示。（Ｂ）示されたＭＶＡクローンを産生している細胞の溶解液のウェスタンブロット分析。ポリクローナル抗体を使用したグリコシル化されていないＳ及びグリコシル化されたＳについての染色。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグループ（ｎ＝５）を、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰを用いて免疫賦活された２０μgの粒子状ＨＢｓＡｇと２０μgのＨＢｃＡｇの混合物を用いて１回プライムした。２週間後、マウスを、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、及びＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインを発現する、６×１０７のＭＶＡ−Ｓ／コア又は６×１０７のＭＶＡ−ＨＢＶｖａｃのいずれかを用いてブーストした。（Ｄ）から２１日目（ブーストから７日後）までのマウスの血清を、抗ＨＢｓ抗体及び抗ＨＢｃ抗体について分析した。（Ｅ）２１日目に、脾臓細胞を単離し、ＭＶＡ由来ペプチドＢ８Ｒ、ＨＢｓＡｇ特異的ペプチド、ＨＢｃＡｇ特異的ペプチド、及びＨＢＶ ＲＴ特異的ペプチド、並びにペプチドプールを用いて刺激した。オボアルブミン由来ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬは陰性対照としての役目を果たした。次いで、細胞を、細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。赤色の矢印は、陽性ＲＴ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。i.m.−それぞれ、筋肉内免疫化；Ｓ／ＣＯ−シグナル値対カットオフ値；ＰＦＵ−プラーク形成単位；ＩＵ−国際単位。
【図３３】ＣＤ７０をさらに発現する組換えワクチン接種用ベクターの構築物（ｒＭＶＡ）のヌクレオチド配列（配列番号２７）。該構築物の様々なドメインが以下のように示されている：Ｄｅｌ ＩＩＩフランキング配列１（下線で示される）、ｍＨ５プロモーター（二重下線で示される）、ＨＢコアタンパク質（太下線で示される）、Ｐ２Ａ（破線で示される）、ヒトＣＤ７０分子（波線で示される）、ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）（太字で示される）、ｅＧＦＰ（二点鎖線で示される）、Ｄｅｌ ＩＩＩフランキング配列２（太字かつ太下線で示される）。
【図３４】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＣＤ７０を発現するＭＶＡの評価。（Ａ）ＭＶＡコア及びＭＶＡコア−ＣＤ７０の図示。どちらのベクターも、ＨＢＶコア遺伝子型Ｄ配列及びより容易な精製を可能とするＧＦＰを発現する。ＭＶＡコア−ＣＤ７０は、さらにＣＤ７０遺伝子を発現する。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグループ（ｎ＝６〜７）を、ＰＣＥＰ及びＣｐＧを用いて免疫賦活された２０μgの粒子状ＨＢｃＡｇを用いて１回筋肉内にプライムした。３週間後、マウスを、腹腔内に注射された１０８i.u.のＭＶＡコア又は１０８i.u.のＭＶＡコア−ＣＤ７０又は１０８i.u.のＭＶＡ野生型（ＭＶＡｗｔ）のいずれかを用いてブーストした。（Ｃ）３５日目に、脾臓細胞を単離し、ＭＶＡ由来ペプチドＢ８Ｒ又はコアペプチドＣ９３を用いて刺激した。オボアルブミン由来ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬは陰性対照としての役目を果たした。次いで、細胞を細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。データは、１グループあたり平均値±標準誤差として示される。点は、個々のマウスにおいて決定された数値を示す。i.u.−感染単位。
【図３５】ＨＢＶトランスジェニックマウスにおいてＣＤ７０を発現するＭＶＡの評価。（Ａ）ＭＶＡコア及びＭＶＡコア−ＣＤ７０の図示。どちらのベクターも、ＨＢＶコア遺伝子型Ｄ配列及びより容易な精製を可能とするＧＦＰを発現する。ＭＶＡコア−ＣＤ７０は、さらにＣＤ７０遺伝子を発現する。（Ｂ）１．３倍の過剰長ゲノムを有するトランスジェニックマウスのグループ（ｎ＝５〜６）を、ＰＣＥＰ及びＣｐＧを用いて免疫賦活された２０μgの粒子状ＨＢｃＡｇを用いて１回筋肉内にプライムし、３週間後、腹腔内に注射された１０８i.u.のＭＶＡコア又は１０８i.u.のＭＶＡコア−ＣＤ７０のいずれかを用いてブーストした。１０８のＭＶＡ野生型（ＭＶＡｗｔ）を用いてそれにより処置された２匹のマウスは対照としての役目を果たした。（Ｃ）３５日目に、肝臓に関連したリンパ球（ＬＡＬ）を単離し、ＭＶＡ由来ペプチドＢ８Ｒ又はコアペプチドＣ９３を用いて刺激した。未刺激細胞は陰性対照としての役目を果たした。細胞を、ＩＦＮγ（赤色）及びＩＬ−２（青色）について細胞内サイトカイン染色した後にフローサイトメトリーによって分析した。３匹の代表的な動物についてのＦＡＣＳプロットが示されている。
【００９６】
実施例
マウス及びワクチン接種
Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｗｔ）及びＨＢＶトランスジェニックマウス（F. Chisari、The Scripps Institute、ラホヤ、ＣＡ州、米国によって親切にも提供された、ＨＢＶ１．３．３２株（Guidotti et al., J Virol 1995; 69:6158-69）（ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、亜型ａｙｗ））は、施設の指針に従って特殊な病原体フリーの条件下、社内の飼育から得られた。タンパク質によるワクチン接種のために、マウスに、５０μlのＰＢＳ中に３１．９１μgの合成ホスホロチオエート化ＣｐＧ ＯＤＮ １６６８及び／又は２５若しくは５０μgのポリ［ジ（エチルフェノキシカルボン酸ナトリウム）］ホスファゼン］（ＰＣＥＰ）と混合された、組換え酵母ＨＢｓＡｇ又はＥ．ｃｏｌｉ ＨＢｃＡｇ（APP Latvijas BiomedicT nas、リガ、ラトビア）を用いて皮下に免疫化した。ＭＶＡによるワクチン接種のために、マウスに、５００μlのＰＢＳ中１×１０８感染単位のそれぞれの組換えＭＶＡを用いて腹腔内にワクチン接種した。
【００９７】
細胞内サイトカイン染色、多量体の染色、及び脱顆粒アッセイ
脾臓細胞及び肝臓に関連したリンパ球（ＬＡＬ）を以前に記載（Stross et al., Hepatology 2012; 56:873-83）されているように単離し、Ｈ２−ｋｂ拘束性ペプチド又はＨ−２Ｄｂ拘束性ペプチド（図１０）（jpt Peptide Technologies、ベルリン、ドイツ）又は組換えＨＢｓＡｇ（親切にもRheinbiotech-Dynavax、デュッセルドルフ、ドイツによって提供された）を用いて１mg/mlのブレフェルジンＡ（シグマアルドリッチ社、タウフキルヘン、ドイツ）の存在下で５時間刺激した。細胞を、臭化エチジウム・モノアジド（インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ）を用いて生死について染色し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２−Ｆｃブロック（ＢＤバイオサイエンシーズ社、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて遮断した。表面マーカーを、ＰＢにコンジュゲートさせた抗ＣＤ８ａ抗体及びＰＥにコンジュゲートさせた抗ＣＤ４抗体（eBiosciences社、エヒング、ドイツ）を用いて染色した。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を、ＦＩＴＣ抗ＩＦＮγ抗体（ＸＭＧ１．２）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ＴＮＦα抗体、及びＡＰＣ抗ＩＬ２抗体（eBiosciences社、エヒング、ドイツ）を用いてCytofix/Cytopermキット（ＢＤバイオサイエンシーズ社、ハイデルベルク、ドイツ）を製造業者の推奨に従って使用して実施した。
【００９８】
脱顆粒アッセイのために、脾臓細胞を、モネンシン、ブレフェルディンＡ、ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた抗ＣＤ１０７ａ抗体、及びＡＰＣにコンジュゲートさせた抗ＣＤ１０７ｂ抗体の存在下でペプチドを用いて５時間刺激し、その後、パシフィックブルーによるＣＤ８ａの表面染色、及びＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ ＩＦＮγ（eBiosciences社、エヒング、ドイツ）を用いてCytofix/Cytopermキット（ＢＤバイオサイエンシーズ社、ハイデルベルク、ドイツ）を製造業者の推奨に従って使用しての細胞内サイトカイン染色を行なった。
【００９９】
多量体の染色のために、脾臓細胞及びＬＡＬを、ＰＥにコンジュゲートさせたＳ１９０（VWLSVIWM、配列番号１９）又はＭＶＡ Ｂ８Ｒ（TSYKFESV、配列番号２０）多量体を用いて２０分間染色し、その後、パシフィックブルーを用いてのＣＤ８ａ、ＦＩＴＣ ＫＬＲＧ１及びＡＰＣ ＣＤ１２７（eBiosciences社、エヒング、ドイツ）による染色を、抗Ｆｃ受容体抗体（クローン２．４Ｇ２）の存在下で２０分間実施した。データを、ａＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシーズ社、ハイデルベルク、ドイツ）でのＦＡＣＳ分析によって取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター社、アシュランド、米国）を使用して分析した。
【０１００】
血清学的分析
ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｓ抗体、及び抗ＨＢｃ抗体の血清中レベルを、１：２０の希釈率でＡＸＳＹＭ（商標）アッセイ（アボットラボラトリーズ社、アボットパーク、ＩＬ州、米国）を使用して決定した。リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応による血清中ＨＢＶ力価の定量は、以前に記載（Untergasser et al., Hepatology 2006; 43:539-47）の通りに実施された。
【０１０１】
中和アッセイ
記載（Lucifora et al., J Hepatol 2011; 55:996-1003）のように分化及び培養したＨｅｐａＲＧ細胞を、ワクチン接種を受けたマウスの血清の連続希釈液（１：３３、１：１００、１：３３３、及び１：１０００）の存在下、２００個のＤＮＡを含有しエンベロープを有するＨＢＶ粒子／細胞（亜型ａｙｗ）に２回感染させた。陽性対照として、０．８の国際単位のＨｅｐａｔｅｃｔ（商標）ＣＰ抗体（バイオテストファーマＧｍｂＨ社、ドライアイヒ、ドイツ）を使用した。感染から２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、分化培地 １mlを加えた。血清を感染から４日後、７日後、及び１０日後に回収し、ＨＢｓＡｇを１：２０の希釈率でイムノアッセイによって検出した。
【０１０２】
統計分析
統計分析は、プリズム５ソフトウェア（グラフパッド社、サンディエゴ、米国）を使用して実施された。結果は、平均値±平均の標準誤差として表現される。グループ間の差異が、両側スチューデントｔ検定を使用して統計学的有意性について分析された。
【０１０３】
ＭＶＡワクチンの作製
組換えＭＶＡを、以前に記載（Staib et al., Biotechniques 2003; 34:694-6, 698, 700）のように相同的組換え及び宿主範囲の選択によって作製した。完全ＨＢｃＡｇ（遺伝子型Ｄ、亜型ａｙｗ）及びＨＢｓＡｇのオープンリーディングフレーム（遺伝子型Ｄ、亜型ａｙｗ又はａｄｗ）を、ＭＶＡ導入用プラスミドｐＩＩＩΔＨＲ−ＰＨ５又はｐＩＩＩΔＨＲ−Ｐ７．５にクローニングし、これによりＨＢＶタンパク質を初期／後期ワクシニアウイルス特異的プロモーターＰＨ５（ＨＢｃＡｇ ａｙｗ／ＨＢｓＡｇ ａｙｗ／ＨＢｓＡｇ ａｄｗ）又はＰ７．５（ＨＢｓＡｇ ａｙｗ）の制御下に配置した。各ウイルスの構築後、遺伝子の発現、挿入されたＤＮＡの配列、及びウイルス純度を確認した。ワクチン製剤の作製のために、ＭＶＡをＣＥＦ中で慣用的に増殖させ、ショ糖を介した超遠心分離によって精製し、１mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて再構成し、標準的な方法（Staib et al., Methods Mol Biol 2004; 269:77-100）に従って滴定した。
【０１０４】
イムノブロット
ＮＩＨ−３Ｔ３マウス線維芽細胞（ＣＲＬ−１６５８）を、１０％ＦＣＳ、１００U/mlのペニシリン及び１００μg/mlのストレプトマイシンの補充された、ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。細胞を、感染から１６時間後に溶解緩衝液（５０mMのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０mM ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０、０．０２％のＮａＮ３、及び１００μg/mlのフェニルメチルスルホニルフルオライド）中に収集し、１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分離し、ニトロセルロース膜（０．４５μM；バイオラッド社、ミュンヘン、ドイツ）上にブロットした。膜を抗ＨＢｃ抗体（抗血清Ｈ８００；親切にもH. Schallerによって提供された）、抗ＨＢｓ抗体（Ｍｕｒｅｘ ＨＢｓＡｇバージョン３；アボット社、アボットパーク、ＩＬ州、米国）又は抗アクチン抗体（シグマ社、ミュンヘン、ドイツ）をそれぞれ１：１００００、１：５０、及び１：１００００希釈率で用いて４℃でインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼにより標識された二次マウス抗体及びウサギ抗体（ディアノバ社、ハンブルク、ドイツ）を１：５０００の希釈率で２１℃で１時間使用した。抗体を、５％脱脂粉乳を含有しているリン酸緩衝食塩水で希釈した。増強化学発光を指示されている通りに（ロシュ社、マンハイム、ドイツ）使用した。
【０１０５】
培養細胞上清中に分泌されたＨＢｓＡｇを、アボット社ＡｘＳＹＭ ＨＢｓＡｇアッセイ（アボットラボラトリーズ社、アボットパーク、ＩＬ州、米国）を使用して決定した。
【０１０６】
実施例１：タンパク質によるプライム／ＭＶＡによるブーストのワクチン接種は、強力な抗ＨＢＶ免疫を誘導する
【０１０７】
ＨＢｓ（ＭＶＡ−Ｓ）又はＨＢｃ（ＭＶＡ−コア）のいずれかを発現する２つのＭＶＡワクチンを、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ亜型ａｙｗから作製した（図１Ａ）。ウェスタンブロット及びＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡにより、いずれのＭＶＡからも正しいタンパク質の発現が確認された（図７Ａ、Ｂ）。
【０１０８】
免疫原性を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６（ｗｔ）マウスを、ＭＶＡ−Ｓ、ＭＶＡ−コア、又はＭＶＡｗｔ（１０８感染単位）を用いて腹腔内に免疫化し、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度を、免疫化から８日後に細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって決定した。腹腔内経路を使用した。なぜなら、ＭＶＡの全身分布を目的としたからであった。ＭＶＡ−Ｓ、ＭＶＡ−コア及びＭＶＡｗｔによる免疫化は、ＭＶＡ由来免疫優性Ｂ８Ｒペプチドと同等なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、これは二回目の免疫化後にブーストされた（図１Ｂ）。これとは対照的に、ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は全く検出されなかった（図１Ｂ）。
【０１０９】
ＨＢＶ特異的免疫を誘導するために、本発明者らは、異種のプライム−ブーストワクチン接種を実施した。マウスは、アジュバントとしてＣｐＧを有する１２μgの組み換えられた粒子状のＨＢｓＡｇ又はＨＢｃＡｇ（亜型ａｙｗ）の投与を受けた。ＨＢｓＡｇによるワクチン接種から８日後、Ｓ１９０及びＳ２０８ペプチドを用いての刺激に応答したＩＦＮγを分泌している脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度は約０．６％であり、一方、ＨＢｃＡｇによる免疫化後にＣ９３に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は殆ど検出できなかった（図１Ｃ）。ＭＶＡ−Ｓ又はＭＶＡ−コアのいずれかを用いての２１日目のブーストワクチン接種は、ＨＢｓＡｇ特異的又はＨＢｃＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の高い出現頻度、並びに、高い抗ＨＢｓ抗体又は抗ＨＢｃ抗体の力価をそれぞれ誘導することができた（図１Ｄ）。要するに、そうしたデータは、異種のプライム−ブーストワクチン接種がＨＢＶ特異的Ｔ細胞を誘導するのに必要とされたことを示す。
【０１１０】
実施例２：高度の抗原血症は、抗ＨＢＶ免疫の誘導を妨げる
ＨＢＶ特異的免疫応答の誘導に対するＨＢＶ抗原負荷の影響を調べるために、ＨＢＶ１．３．３２トランスジェニック（ＨＢＶｔｇ）マウスを、ワクチン接種前にそれらの血清中ＨＢｅＡｇレベルに従って低度の抗原血症、中程度の抗原血症、及び高度の抗原血症のグループに分類した（図１０）。ブーストから６日後、ＨＢｓＡｇ／ＭＶＡ−Ｓの投与を受けたマウスにおける抗ＨＢｓ抗体力価は、中程度の抗原血症グループのマウスと比較して、低度の抗原血症グループにおいてより高く、高度の抗原血症マウスにおいては依然として検出不可能であった（図２Ａ）。ＭＶＡ−Ｓによるブースト後から３５日間モニタリングした場合でさえも、高度の抗原血症マウスは、検出可能な抗ＨＢｓ抗体力価を発生せず、ＨＢｓＡｇは低いレベルで持続した（図１１）。抗ＨＢｓ抗体が過剰量のＨＢｓＡｇと複合体を形成し、よって検出を回避し得るかどうかを研究するために、本発明者らは、沈殿した１３１個のタンパク質複合体を尿素を用いて溶かし、イムノアッセイを繰り返した。これにより、本発明者らは、ワクチン接種を受けた高度の及び中程度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスにおいてＨＢｓＡｇ−抗ＨＢｓ抗体の免疫複合体を見い出したが、低度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウスにおいては見出さなかった（図１４）。しかしながら、ＨＢｃＡｇ特異的抗体は、ＨＢｃＡｇ／ＭＶＡ−コアのワクチン接種を受けた全てのグループのマウスの血清中に検出されたが、力価は再び、抗原血症とは逆相関する傾向を示した（図２Ｂ）。ワクチン接種により誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答を分析するために、本発明者らはＨＢｓＡｇを用いて脾臓細胞及び肝臓に関連したリンパ球（ＬＡＬ）を刺激した。本発明者らは、ｗｔマウスにおいてＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の高い出現頻度を見い出したが、本発明者らはどのグループのＨＢＶｔｇマウスにおいてもＨＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出しなかった（図２Ｃ、Ｄ）。
【０１１１】
抗体力価と同じように、本発明者らは、抗原血症とＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の間の逆相関を観察した。高度の抗原血症マウスでは、ＨＢｓＡｇ／ＭＶＡ−Ｓ並びにＨＢｃＡｇ／ＭＶＡ−コアによる免疫化により、末梢（脾臓）においてもＨＢＶの複製場所である肝臓においても、検出可能なＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＨＢｃＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができなかった（図３Ａ、Ｂ）。中程度又は低度のＨＢｅＡｇ負荷を有するマウスは、ＨＢｓＡｇ／ＭＶＡ−Ｓに対するＳ１９０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答及びＳ２０８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、並びにＨＢｃＡｇ／ＭＶＡ−Ｃによるワクチン接種に対するＣ９３特異的Ｔ細胞応答を発生した。低度の抗原血症マウスに検出されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度は、中程度の抗原血症マウスにおいて見られたものより高かった。重要なことには、ＭＶＡ Ｂ８Ｒ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度は抗原血症とは独立し、全てのグループ間で同等であり、このことは、等価なワクチン効力を示す（図３Ａ、Ｂ）。
【０１１２】
慢性感染及び抗原の持続中に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、疲弊した機能不全な表現型を発達させ得る。このような状態では、抗原特異的Ｔ細胞の数は、ＩＦＮγ産生などの機能的検査を通して大きく過小評価される。それ故、Ｓ１９０特異的、Ｃ９３特異的、及びＢ８Ｒ特異的な多量体の染色が実施され、これにより免疫化された高度の抗原血症マウスの脾臓又は肝臓においてＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は検出されなかったが、Ｂ８Ｒ多量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞は容易に検出可能であった。このことは、ワクチンが実際に、このグループにおいてＨＢＶ特異的Ｔ細胞を誘導することができなかったことを示唆した。低度及び中程度の抗原血症グループにおいて、ＨＢＶ−Ｓ１９０特異的応答及びＭＶＡ−Ｂ８Ｒ特異的応答は、同じような比の多量体陽性かつＩＦＮγ陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞を示した（図１３）。要するに、ＨＢＶ抗原レベルは、どれだけ効率的にＨＢＶ特異的抗体並びにＴ細胞応答が、異種のプライム−ブーストワクチン接種によって誘導され得るかに影響を及ぼす。
【０１１３】
実施例３：抗原血症は、ワクチン接種により誘導された応答の質に影響を及ぼす
ＣＤ８＋Ｔ細胞の重要なエフェクター機能は、ＩＦＮγに加えてＩＬ−２及びＴＮＦαの産生、並びに、ペプチド刺激に応答して脱顆粒する能力（これはＣＤ１０７ａの表面発現によって分析され得る）を含む。Ｓ１９０ペプチドによる刺激時に、ＨＢｓＡｇ／ＭＶＡ−Ｓを用いての免疫化によりｗｔマウス及び低度の抗原血症のＨＢＶｔｇマウスにおいて誘導された、ＩＦＮγ＋Ｓ１９０特異的脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞は、同じような比で脱顆粒し（それぞれ７２．３％及び７３．４％）（図４Ａ）、中程度の抗原血症マウスに由来する脾臓及び肝臓のＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ−２及びＴＮＦαの同等な発現を示し、これは、ペプチドによる刺激時に程度は低いが脱顆粒することもでき（６２％）、しかしＩＬ−２の発現は欠失していた（図４Ｂ）。
【０１１４】
多量体結合性細胞が増殖する分化段階を決定するために、本発明者らはＣＤ１２７及びＫＬＲＧ−１を染色した。ｗｔ及び低度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスのワクチン接種は、肝臓及び脾臓において高い比率のＳ１９０特異的ＣＤ１２７＋ＫＬＲＧ−１−多量体結合性細胞を誘導したが、増殖能及び新たなエフェクター細胞前駆体を発生する能力を有する長寿命細胞の一過性前駆体であると考えられている（図４Ｃ）。しかしながら、中程度の抗原血症マウスでは、これらの細胞は、殆ど検出できなかった（図４Ｃ）。これらのデータは、ＨＢＶ抗原発現が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能性、特にエフェクター細胞のＩＬ−２分泌及び増殖能を消失させることを示す。
【０１１５】
実施例４：タンパク質によるプライムワクチン接種のためのアジュバントの比較
ポリホスファゼンアジュバントＰＣＥＰが、ＣｐＧの免疫刺激作用を増強するであろうことを調べるために、ＰＣＥＰをＣｐＧの代わりに使用したか、又はタンパク質ワクチン製剤及び組み合わせたＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇのためにＣｐＧに加えた。
【０１１６】
野生型マウスに、０日目に、それぞれのアジュバント（群）と一緒に１６μgのＨＢｓＡｇ（亜型ａｙｗ）及び１６μgのＨＢｃＡｇ（亜型ａｙｗ）を用いてワクチン接種した。２８日目に、マウスを、ＭＶＡ−ＰＨ５−Ｓ（５×１０７i.u.；亜型ａｙｗ）及びＭＶＡ−コア（５×１０７i.u.）を用いてブーストした。ブーストから６日後に、血清を、抗ＨＢｓ抗体（図９Ａ）及び抗ＨＢｃ抗体（図９Ｂ）の存在について分析した。ブーストから６日後、脾臓細胞を、ＨＢｓＡｇ（Ｓ１９０及びＳ２０８ａｄｗ）特異的ペプチド又はＨＢｃＡｇ（Ｃ９３）特異的ペプチドを用いての刺激後にＩＣＳによって分析した（図９Ｃ）。棒グラフは、バックグラウンドを差し引いた後、ＩＦＮγについて陽性と染色されたＣＤ８＋細胞の比率（平均値±標準誤差）を示す。i.u.感染単位。
【０１１７】
ＰＣＥＰの（単独で又はＣｐＧと組み合わせての）使用は、ｗｔマウスにおいてタンパク質によるプライム／ＭＶＡによるブーストのワクチン接種後に抗ＨＢｓ抗体応答及び抗ＨＢｃ抗体応答を誘導するのに単独でのＣｐＧより優れていたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は同等であった（図９Ａ〜Ｃ）。
【０１１８】
実施例５：アジュバントの組合せの比較
次に、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答に対する様々なアジュバントの効果を決定することを目的とした。それ故、野生型ＣＨ５７Ｂｌ／６マウスを、様々なアジュバント製剤中で複合体を形成した粒子状のＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇを用いてプライムした。グループ１〜３において（ｎ＝３）、ＨＢｓＡｇを水酸化アルミニウムと複合体を形成させ、ＨＢｃＡｇ、ＣｐＧ又はポリホスファゼンアジュバント又はその両方と合わせた。グループ４〜６（ｎ＝３）を、ＣｐＧ若しくはポリホスファゼンのいずれか又はその両方を用いるがアルミニウムは全く用いずに免疫賦活された粒子状ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇを使用してワクチン接種した。２８日目に、全ての動物を、亜型ａｄｗのコア及びＳを発現するＭＶＡを用いてブーストした。
【０１１９】
ＨＢｓ及びＨＢｃに対する抗体応答は２８日後（タンパク質によるプライムのみ）及び３４日後（タンパク質によるプライムとＭＶＡによるブースト）に決定された。図１５Ａ及び図１５Ｂは、特にＨＢｓに対する抗体応答が、アルミニウムが回避された場合に意外にもはるかにより顕著であったことを示す。図１５Ｃ〜Ｄは、プライム後（図１５Ｃ）及びＭＶＡによるブースト後（図１５Ｄ）におけるＳ及びコアのエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。
【０１２０】
ワクチン製剤が全くアルミニウムを含有していない場合、Ｔ細胞応答は、プライム後にすでに検出可能であった。興味深いことに、全てのグループにおいて等価な効力でＭＶＡによりブーストした後に（Ｂ８Ｒ特異的応答によって示される）、全てのマウスがコア特異的Ｔ細胞応答を発生させたが、アルミニウムを伴わないワクチン接種を受けた動物は再び、はるかにより顕著なＳ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を発生させた。
【０１２１】
実施例６：異種ＨＢｓＡｇ亜型を用いてのワクチン接種は、高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスにおいてＴ細胞寛容を破壊し、強力な抗体産生を誘導する
マウス血清を、ワクチン接種後にその中和能について分析した。ＨＢｓＡｇ亜型ａｄｗを用いてワクチン接種されたマウスは、最大１：１０００という高い希釈率でさえもＨＢＶ亜型ａｙｗを交差中和することができた（図１５Ｅ）。
【０１２２】
次に、より高いＨＢＶ抗原負荷の存在下において寛容を破壊するために、異種のタンパク質によるプライム／ＭＶＡによるブーストのワクチン接種の免疫原性を増強させることを目指した。
【０１２３】
より強力な抗原によるトリガーがワクチン接種の効力を向上させるかどうかを試験するために、ＨＢｓＡｇを発現する新規ＭＶＡも、より強力なプロモーターＰＨ５の制御下において工学操作し（図５Ａ）、１４日目に２回目のタンパク質によるワクチン接種を実施した（図１２）。さらに、亜型ａｙｗ（ＨＢＶｔｇマウスと同一）とａｄｗのＨＢｓＡｇを比較した。さらに、ＰＣＥＰを、プライム及びブースト中に、タンパク質ワクチン製剤及び組み合わせたＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇのためにＣｐＧに加え、これにより、複数のＨＢＶ抗原に対する免疫応答が達成される。この改変されたワクチン接種処方計画（０日目及び１４日目におけるＣｐＧ及びＰＣＥＰを用いて免疫賦活された組み合わせられたＨＢｓＡｇ／ＨＢｃＡｇによるプライム、続いて、より強力なＰＨ５プロモーターの下で抗原を発現するＭＶＡ−Ｓ／ＭＶＡ−コアを使用した２８日目におけるブースト）が適用されると、高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスにおいて寛容を破壊する能力が存在し、ＨＢｓＡｇ特異的及びＨＢｃＡｇ特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導された（図５Ｂ、Ｃ）。
【０１２４】
次に、ワクチンと標的抗原との間の部分的な不一致がワクチンの有効性を向上させるかどうかが研究された（Schirmbeck et al., Eur J Immunol 2003; 33:3342-52）。亜型特異的ペプチドＳ２０８を用いて決定したところ（図１１）、ワクチン抗原Ｓａｙｗ又はＳａｄｗのいずれかが、両方の亜型に対してＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した（図５Ｂ）。しかしながら、異種のＳａｄｗ含有ワクチンは、より強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答及び検出可能なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導した（図５Ｂ、Ｃ）。中程度の抗原発症マウスに由来するＳ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞で本発明者らが観察したものと同じように（図４Ｂ）、脾臓Ｓ２０８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγ及びある程度までＴＮＦαを分泌することが判明したが、ほんの僅かなＩＬ−２の発現しか示さなかった（図５Ｄ）。
【０１２５】
特に、ＳａｙｗではなくＳａｄｗを含有しているワクチン製剤のみが、高度の抗原血症マウスにおいて検出可能な抗ＨＢｓ抗体応答を誘導することができ（図６Ａ）、一方、抗ＨＢｃ抗体は、両方の製剤によって誘導された（図６Ｂ）。重要なことには、Ｓａｄｗによって産生された抗ＨＢｓ抗体は、亜型ａｙｗのＨＢＶ粒子を中和することができた（図６Ｃ）。Ｓａｄｗワクチン接種グループにおける抗ＨＢｓ中和抗体の誘導と同時に、ＨＢｓＡｇのレベルは低いレベルまで有意に下降した（図６Ｄ）。要するに、このことは、改変ワクチン接種処方計画は実際に、ＨＢＶｔｇマウスにおけるＢ細胞及びＴ細胞の寛容の破壊を可能としたことを示した。
【０１２６】
実施例７：多重抗原性ＭＶＡによって誘導された広範な免疫応答
次に、多重抗原性ＭＶＡを使用して１つ、２つ、及びいくつかのＨＢＶ抗原に対する免疫応答の誘導の比較を目指した。意外なことに、Ｓ又はＳとＰｏｌのいずれかに対する体液性免疫応答並びに細胞性免疫応答は、コアがＭＶＡワクチンベクターによって共発現された場合に改善された。
【０１２７】
実施例８：ＲＮＡｉの組合せ及び治療的ワクチン接種
高い力価のＨＢＶ抗原を発現するＨＢＶトランスジェニックマウスのＨＢＶｘｆｓ株を、全てのＨＢＶ ＲＮＡの３'領域を標的化しているＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡを用いて処置した。ｓｉＲＮＡによる処置により、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇのレベルは９０％減少した。８週間後、動物を、タンパク質によるプライム−ＭＶＡ-ＨＢＶによるブーストのワクチンを用いてワクチン接種することにより、抗ＨＢｓ抗体及びＨＢＶ特異的Ｔ細胞を誘導した（図２７）。タンパク質ワクチンとして、粒子状ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇを、ＣｐＧ及びＰＣＥＰを用いて免疫賦活した。ＭＶＡワクチンベクターは、ＨＢＶ Ｓ及びコアタンパク質の完全なオープンリーディングフレームを発現した。対照は、ｓｉＲＮＡなし、ワクチン接種なし、及びその組合せであった。
【０１２８】
ブーストワクチン接種から６日後、マウスを屠殺し、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇのレベル並びに抗ＨＢｓ抗体の力価を決定した（図２８Ａ、Ｂ）。肝臓及び脾臓から、Ｔ細胞を単離し、ＨＢＶ特異的ペプチドを用いてエクスビボで刺激し、細胞内サイトカイン染色によってインターフェロンγの発現について染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図２８Ｃ）。
【０１２９】
実施例９：最適なＭＶＡ用量の推定
最初のセットの実験において、本発明者らは、ＨＢＶｔｇマウスにおいて満足できる免疫原性を示しかつ免疫寛容を破壊することができるであろう、異種のタンパク質によるプライム／ＭＶＡによるブーストのワクチン接種のための最低のＭＶＡ用量を評価することを目指した。それ故、低度及び中程度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスのグループを、ビス−（３’，５’）−サイクリック二量体アデノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ）を用いて免疫賦活された１５μgの粒子状ＨＢｃＡｇを用いて２週間間隔で２回免疫化した。２８日目に、マウスを、４回の異なる用量のＭＶＡ−コア（それぞれ、３×１０６、１×１０７、３×１０７、１×１０８ＰＦＵ）を用いてブーストした（図２９Ａ）。様々なＭＶＡ用量を用いた免疫化処方計画によって惹起された体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を、ブースト免疫化から７日後（３５日目）に評価した。
【０１３０】
０日目及び３５日目（ブーストから７日後）のマウスの血清を、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｓ抗体、及び抗ＨＢｃ抗体について分析した（図２９Ｂ）。全ての免疫化処方計画が、３５日目にＨＢＶｔｇマウスの血清中で検出されたのと同じようなレベルの抗ＨＢｃ抗体を誘起した。さらに、マウスの全てのグループが、血中のＨＢｓＡｇの有意な減少を示した。この効果は、抗ＨＢｓ抗体によって媒介されなかった。なぜなら、免疫化処方計画は、ＨＢＶｔｇモデルにおけるＨＢｓＡｇのセロコンバージョンに必須であるＨＢｓＡｇを含まなかったからである。興味深いことに、ブーストとしてより高い用量のＭＶＡ−コア（３×１０７及び１×１０８ＰＦＵ）の投与を受けたグループのＨＢＶｔｇマウスは、血清中ＨＢｅＡｇレベルのかなりの減少を示した（図２９Ｂ）。さらに、肝アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の僅かな上昇もまた、より高い用量のＭＶＡ−コア（３×１０７及び１×１０８ＰＦＵ）の投与を受けたマウスのグループに観察された（図２９Ｃ）。これらのデータは、これらの２つのマウスのグループにおける免疫化プロトコールにより、おそらくＨＢｃＡｇ特異的Ｔ細胞の増強された活性に因り、肝臓においてＨＢＶの複製が抑制されたことを示唆する。実際に、肝臓に関連したリンパ球（ＬＡＬ）及び脾臓細胞の細胞内ＩＦＮγ染色は、より高い用量のＭＶＡ−コアを用いて免疫化されたＨＢＶｔｇマウスが、より効果的なＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、特に肝臓において開始することができたことを示した（図２９Ｄ）。同時に、ＭＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、免疫化のために使用されたより高いＭＶＡ用量と共に有意に増加しなかった。
【０１３１】
これらの結果から、異種のタンパク質によるプライム／ＭＶＡによるブーストのワクチン接種のための３×１０７ＰＦＵというＭＶＡ−コアの用量が、低度及び中程度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスにおいて免疫寛容を破壊するのに十分であると結論付けることができる。
【０１３２】
実施例１０：タンパク質によるプライミングのためのアジュバントとしてのｃ−ｄｉ−ＡＭＰの評価
平衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導する安全かつ効果的なアジュバントがないことは、臨床試験を開始する際の障害であり得る。さらに、新規に同定された細胞質内のパターン認識受容体ＳＴＩＮＧのトリガーは、治療的ワクチン接種のための興味深い代替選択肢である。それ故、本発明者らは、治療的Ｂ型肝炎ワクチンのための新規アジュバント候補としてのｃ−ｄｉ−ＡＭＰの有効性を研究することを目指した。この目的のために、中程度及び高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスのグループ（ｎ＝７）のマウスは、２回のタンパク質によるプライム及びＭＶＡによるブースト免疫化を受けた。タンパク質によるプライミングのための粒子状ＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇを合わせ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ又は以前に確立されたＣｐＧとポリホスファゼン（ＰＣＥＰ）の組合せを用いて免疫賦活した。２８日目に、マウスを、ＭＶＡ−Ｓ／コアの混合物を用いてブーストした（図３０Ａ）。ｃ−ｄｉ−ＡＭＰの注射及び「空の」ＭＶＡ（ＭＶＡｗｔ）の投与を受けたＨＢＶｔｇマウス（ｎ＝４）を対照として使用した。体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を誘導するワクチン製剤の有効性を３４日目（ブーストから６日後）に比較した。
【０１３３】
ｃ−ｄｉ−ＡＭＰによる免疫化プロトコールもＣｐＧ／ＰＣＥＰによる免疫化プロトコールも、高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスにおける血清中ＨＢｅＡｇレベルには影響を及ぼさなかった（図３０Ｃ）。どちらの試験されたワクチン製剤も、有意な抗ＨＢｃ抗体応答を誘導した。しかしながら、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰを用いての免疫化は、ＣｐＧ／ＰＣＥＰ処方計画と比較して、有意により高い力価の抗ＨＢｃ抗体を誘導した（ｐ＜０．０５）（図３０Ｃ）。興味深いことに、どちらの免疫化プロトコールによっても、全ての調べられたＨＢＶｔｇマウスにおいてＨＢｓＡｇから抗ＨＢｓ抗体へのセロコンバージョンが起こった（図３０Ｄ）。ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ又はＣｐＧ／ＰＣＥＰにより免疫賦活されたワクチンによって誘起された高いレベルの抗ＨＢｓ抗体は、循環中のＨＢｓＡｇと複合体を形成し、該ＨＢｓＡｇをマウスの血清から除去した。これに対し、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰのみの投与を受けその後ＭＶＡｗｔによるブーストを受けたＨＢＶｔｇマウスは、抗ＨＢｓ抗体を全く発生せず、これらのマウスの血清中のＨＢｓＡｇのレベルは未変化のままであった。重要なことには、どちらのワクチン製剤もＨＢＶｔｇマウスの脾臓（ｐ＜０．０５）及び特に肝臓に関連したリンパ球（ｐ＜０．０５）において検出可能な有意なＨＢｓＡｇ特異的（ｓ２０８）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答及びＨＢｃＡｇ特異的（ｃ９３）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し（図３０Ｅ）、これにはＡＬＴの増加に起因する軽度なＴ細胞により誘導される肝障害が伴った（図３０Ｂ）。ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ又はＣｐＧ／ＰＣＥＰ処方計画によって誘起されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大きさには統計学的有意差はなかった。
【０１３４】
これらのデータを鑑みて、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰは、高度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスにおいてさえも治療的なタンパク質によるプライム−ＭＶＡによるブーストのワクチン接種のためのアジュバント候補であると考えられる。
【０１３５】
実施例１１：様々なアジュバント（ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ポリ−ＬＣＩＣ及びＲＩＧ−Ｉリガンド）のための最適な送達経路の推定
治療的な異種のタンパク質によるプライム／ＭＶＡによるブーストのワクチン接種におけるタンパク質によるプライミングのための適切なアジュバントのために、スクリーニングを拡大した。本発明者らの目的は、治療用Ｂ型肝炎ワクチンのための２つの新規アジュバント候補（ポリ−ＬＣＩＣ及びＲＩＧ−Ｉリガンド）の有効性とｃ−ｄｉ−ＡＭＰの有効性を比較することであった。さらに、本発明者らは、最も効果的な適用経路を発見するために様々な免疫化プロトコールを研究した。この目的のために、低度及び中程度の抗原血症ＨＢＶｔｇマウスのグループ（ｎ＝５）が、２回のタンパク質によるプライム及びＭＶＡによるブーストの免疫化を受けた（図３０Ａ）。タンパク質によるプライミングのための粒子状ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇを組合せ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ポリ−ＬＣＩＣ又はＲＩＧ−Ｉリガンドを用いて免疫賦活した。２８日目に、マウスを、ＭＶＡ−ｓＡｇとＭＶＡ−コアの混合物を用いてブーストした。免疫化は、専ら筋肉内（i.m.）経路によって実施されたか、又はタンパク質によるプライミングは皮下（s.c.）に投与され、その後、腹腔内（i.p.）ブーストが投与された。様々なワクチン製剤の有効性及び適用経路を、３４日目（ブーストから６日後）における体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の誘導に関して比較した。
【０１３６】
全てのワクチン接種プロトコールが、ＨＢＶｔｇマウスの血清中のＨＢｓＡｇレベルを強力に減少させた。これは、調べた全てのアジュバント及び送達経路が、マウスの血中でＨＢｓＡｇと複合体を形成した高い力価の抗ＨＢｓ抗体を誘起できたという事実に起因していた。同様に、誘導された抗ＨＢｃ抗体のレベルは、マウスのグループ間で同等であり、筋肉内免疫化経路が、抗ＨＢｃ抗体の誘導においてより強力であるという傾向が僅かにあった。それにも関わらず、ＨＢｅＡｇレベルによって間接的に検出されたより低いＨＢＶの複製は、筋肉内若しくは皮下／腹腔内経路を介してｃ−ｄｉ−ＡＭＰの投与を受けたか、又は筋肉内経路を介してポリ−ＬＣＩＣの投与を受けたＨＢＶｔｇマウスのグループにおいてのみ観察された（図３１Ａ）。残念なことに、ポリ−ＬＣＩＣを用いての筋肉内への免疫化は、ＨＢＶｔｇマウスにおいてかなりの体重減少をもたらした、調べられた唯一のプロトコールであった（図３１Ｂ）。ｃ−ｄｉ−ＡＭＰは、どの投与経路を使用したかに関係なく、免疫化ＨＢＶｔｇマウスの脾臓及び特に肝臓においてＨＢｃＡｇ特異的（ｃ９３）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答及びＨＢｓＡｇ特異的（ｓ２０８）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を誘導する際にもより優れていると考えることができる（図３１Ｃ）。興味深いことに、ポリ−ＬＣＩＣが筋肉内に送達された場合、活発な肝内ＨＢｃＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答がもたらされ、一方、皮下／腹腔内経路で送達された場合、主にＨＢｓＡｇ特異的（ｓ２０８）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘起された。ＲＩＧ−Ｉリガンドは、ＨＢＶ特異的体液性応答を誘導することができたが、初期ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することはできなかった。対照として使用されたＭＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、全ての免疫化グループにおいて脾臓及び肝臓において同等であり、このことは、同等なワクチン接種効力を示す。
【０１３７】
これらのデータは、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰが非常に強力なアジュバントであり、ポリ−ＬＣＩＣは中程度の効力を示し、ＲＩＧ−Ｉリガンドは、治療的なタンパク質によるプライム−ＭＶＡによるブーストのワクチン接種には十分に効果的ではないことを実証する。ｃ−ｄｉ−ＡＭＰは、筋肉内及び皮下／腹腔内適用経路の両方において同等に効果的であった。
【０１３８】
実施例１２：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける新規ＭＶＡ構築物（ＭＶＡ−ＨＢＶｖａｃ）の評価
さらに、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ（主なＨＢＶの遺伝子型であるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを網羅する配列）、及びＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインを発現する新規に構築されたポリシストロン性ＭＶＡ（ＭＶＡ−ＨＢＶｖａｃ）のインビボでの免疫原性を評価した。２つのポリシストロン性ワクチン接種用構築物の図解が作成された：全ての主要なＨＢＶ遺伝子型のＨＢＶのコア及びＳ並びにＨＢＶポリメラーゼのＲＴドメインを網羅しているＨＢＶＶａｃ、並びに、ＨＢＶのコア及びＳを発現するＣ／Ｓ（Ｃ／Ｓ）（図３２Ａ）。タンパク質の発現はウェスタンブロットによって確認された。図３２Ｂは、ＨＢＶＶＡｃ又はＳ／Ｃのいずれかを発現する様々な組換えＭＶＡクローンによるＳの発現を示す。
【０１３９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグループ（ｎ＝５）を、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰを用いて免疫賦活された粒子状ＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇの混合物を用いて１回プライムした。２週間後、マウスを、ＭＶＡ−ＳとＭＶＡ−コアの混合物、又は等量の新規ＭＶＡ−ＨＢＶｖａｃのいずれかを用いてブーストした。マウスを２１日目に屠殺し、ＨＢＶ特異的体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を評価した（図３２Ｃ）。
【０１４０】
新規なポリシストロン性ＭＶＡは、ＭＶＡ−Ｓ構築物とＭＶＡ−コア構築物の組合せの混合物と同等な、有意な抗ＨＢｓ抗体応答及び抗ＨＢｃ抗体応答を誘起しなかった（図３２Ｄ）。さらに、ＭＶＡ−ＨＢＶｖａｃを用いての免疫化は、ＭＶＡ−ＳとＭＶＡ−コアの混合物によって誘発された大きさと同じような、活発なＨＢｓＡｇ特異的（ｓ１９０、ｓ２０８、及びＳプール）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答及びＨＢｃＡｇ特異的（ｃ９３、Ｃプール）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘起した（図３２Ｅ）。さらに、ＭＶＡ−ＨＢＶｖａｃを用いての免疫化により、プライミングのためにＲＴタンパク質が全く使用されなかったとしても、ペプチドＲＴ６１、ＲＴ３３３、及びＲＴペプチドプール２（矢印で印が付けられている）に対するＲＴ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が低いレベルで検出された。
【０１４１】
これらのデータは、ポリシストロン性ＭＶＡ（ＭＶＡ−ＨＢＶｖａｃ）が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて予想された全てのタンパク質を発現し、インビボで優れた免疫原性を示したことを示した。
【０１４２】
実施例１３：ＣＤ７０の共発現によるＭＶＡ構築物の免疫原性の増加
ＭＶＡ系ワクチンベクターのインビボでの免疫原性を向上させるために、ＣＤ７０を二シストロン様に発現するＭＶＡベクターを構築した（図３４Ａ）。
【０１４３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグループ（ｎ＝６〜７）を、ＣｐＧ及びＰＣＥＰを用いて免疫賦活された粒子状ＨＢｃＡｇを用いて１回プライムした。２週間後、マウスを、ＭＶＡ−コア又はさらにＣＤ７０を発現する等量のＭＶＡコア−ＣＤ７０のいずれかを用いて、又は対照としての野生型ＭＶＡを用いてブーストした（図３４Ｂ）。マウスを３５日目に屠殺し、ＨＢＶ特異的体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を評価した。体液性免疫応答は、ＭＶＡコア及びＭＶＡコア−ＣＤ７０によるブーストの後に同一であったが、ＭＶＡコア−ＣＤ７０を用いてブーストされたマウスにおいて、ＭＶＡ（Ｂ８Ｒ）特異的サイトカインに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は僅かに増加し、ＨＢＶ（Ｃ９３）特異的サイトカインに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は有意に増加した（図３４Ｃ）。反復実験により同一の結果が得られた。
【０１４４】
３回目の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで繁殖させたＨＢＶトランスジェニックマウスのグループ（ｎ＝５〜６）にワクチン接種した。これらの動物では、免疫寛容は、治療的ワクチン接種時に破壊され得る。ＣｐＧ及びＰＣＥＰを用いて免疫賦活された粒子状ＨＢｃＡｇを用いて１回プライミングした後、マウスを、ＭＶＡ−コア又は等量のＣＤ７０を発現するＭＶＡコア−ＣＤ７０のいずれかを用いてブーストした（図３５Ａ及びＢ）。野生型ＭＶＡをワクチン接種されたマウスは、対照としての役目を果たした。マウスを３５日目に屠殺し、ＭＶＡ特異的Ｔ細胞応答及びＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を評価した。肝臓に関連したリンパ球にゲーティングしたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＶＡコアを用いてワクチン接種されたマウスと比較して、マウスがＭＶＡコア−ＣＤ７０を用いてワクチン接種を受けた場合、それぞれＭＶＡ特異的ペプチド及びＨＢＶコア特異的ペプチドを用いて再刺激するとＩＦＮｇ及びＩＬ２のより顕著な分泌を示した。ＭＶＡｗｔを用いてブーストされたマウスでは、ＭＶＡ特異的Ｔ細胞応答は検出されたが、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答は検出されなかった（図３５Ｃ）。
【０１４５】
上記の結果に関して、ＣＤ７０とＨＢＶ特異的抗原の共発現がインビボで、ＭＶＡ特異的Ｔ細胞応答及びＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を有意に増加させたと結論付けることができる。
【０１４６】
本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていなくとも、任意の要素又は要素群、制限又は制限群の非存在下において適切に実施され得る。したがって、例えば、「含んでいる（comprising）」、「含んでいる（including）」「含有している」などの用語は、拡大してかつ制限なく解釈されるべきである。さらに、本明細書に使用される用語及び表現は、制限のためではなく説明のために使用され、このような用語及び表現の使用において、示されかつ記載された特色のあらゆる均等物又はその一部を排除する意図はなく、しかし、様々な改変が特許請求された本発明の範囲内において可能であることが認められる。したがって、本発明は例示的な実施態様によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されそこに具現化された本発明の任意選択の特色、改変、及び変法が、当業者によって用いられ得、このような改変及び変法は本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０１４７】
本発明は、本明細書において幅広くかつ包括的に記載されている。包括的な開示に該当する各々のより狭義の種及び副属のグループも本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が具体的に本明細書に列挙されているか否かに関わらず、属から任意の対象が除去されるという但し書き又は消極的な限定を有する、本発明の包括的な記載を含む。
【０１４８】
他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内である。さらに、本発明の特色又は態様は、Markushグループの見地から記載されているが、当業者は、本発明がまた、Markushグループのいずれかの個々のメンバー又はメンバーのサブグループの見地からそれに関して記載されていることを認識しているだろう。
【０１４９】
本明細書に引用された全ての文書及び特許文書の内容は、その全体が参照により組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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