(57)【要約】  本明細書中に記載の開示は、出生前およびＩＶＦケアにおける時間的制約のある異数性検出、ならびに現場または臨床における小さいＤＮＡ断片およびアンプリコンの配列決定のために使用され得る、短いＤＮＡ読み取りデータの非常に迅速なリアルタイム取得のために使用され得る。この能力により、臨床および研究用途のための、ナノポアに基づく配列決定方法の有用性が拡大され得る。
2019501641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．複数の核酸をナノポア配列決定装置に置くステップ、
ｂ．１つ以上のナノポアに前記核酸を通過させるステップ、
ｃ．標識化核酸残基を検出するステップ、および
ｄ．前記核酸の配列決定を行うステップ
を含み、前記複数の核酸が断片化核酸のプールを含む、方法。
【請求項２】
前記配列決定がリアルタイムで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列決定がオフィス環境で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記配列決定が現場環境で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記配列決定が臨床検査室で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記断片化核酸のプールが１０００塩基対長未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記断片化核酸のプールが５００塩基対長未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記断片化核酸のプールが１００塩基対長未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸が１０００ヌクレオチド長未満となるナノポアに基づく配列決定用の核酸ライブラリの調製のための方法であって、
ａ．核酸試料を断片化するステップ、
ｂ．産物のｄＡ尾部付加を行うステップ、
ｃ．核酸断片にアダプターを連結するステップ、および
ｄ．調製されたライブラリをナノポア配列決定装置に適用するステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
核酸ライブラリの調製が核酸低残留性プラスチックを使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アダプターが核酸断片に対して５：１モル比で温置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
共有結合タンパク質を含有するアダプターが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸ライブラリの調製が３時間未満で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
生体試料中の１つ以上のコピー数変動の存在を判定するための方法であって、
ａ．生体試料を受領すること、
ｂ．生体試料からＤＮＡを抽出すること、
ｃ．少なくとも１０００ｂｐ長の断片にＤＮＡを断片化すること、
ｄ．ナノポアに基づく配列決定のために断片を調製し、複数の生体試料の多重化が必要とされる場合、バーコード付き配列識別子を前記生体試料に付加すること、
ｅ．ナノポアに基づく配列決定装置を使用して複数の核酸分子の配列決定を行うこと、
ｆ．配列決定読み取りデータを蓄積すること、
ｇ．前記核酸分子が由来した染色体および染色体位置を同定するために、前記配列決定読み取りデータを参照ゲノムに対してアラインすることであって、試料にバーコードが付加されている場合に試料が最初に分離されるであろう、アラインすること、
ｈ．各染色体または染色体領域に対してアラインされた読み取りデータ数を数えること、
ｉ．参照と比較して、各染色体または染色体領域に対してアラインされた前記読み取りデータ数に基づき、コピー数変動が存在するか否かを判定すること、
ｊ．コピー数変動の欠如があることを判定するための満足のいくレベルの確実性を達成するために十分な数の配列決定読み取りデータが得られる場合、配列決定反応を終結させること
を含む方法。
【請求項１５】
前記配列読み取りデータが内部参照と比較され、前記内部参照が１番染色体またはその一部である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記配列読み取りデータが内部参照と比較され、前記内部参照が２番染色体またはその一部である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記配列読み取りデータが内部参照と比較され、前記内部参照が所定の染色体または遺伝領域である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料が妊娠産物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が羊水である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が絨毛膜絨毛生検である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料が母体血である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料が、卵割球または胚盤胞などの１個の細胞から抽出されるＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体試料が卵割球または胚盤胞などの複数の細胞から抽出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記生体試料が組織試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
核酸分子を含む生体試料中でのコピー数変動の判定を行うための操作を行うように計算システムを制御するための複数の命令でコードされるコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、前記操作が、
ａ．前記生体試料中に含有される複数の前記核酸分子のそれぞれの、ナノポアに基づく配列決定読み取りデータを受領すること、
ｂ．配列決定前に核酸試料にバーコードが付された場合、バーコード識別子に基づいて前記配列読み取りデータを分離すること、
ｃ．参照ゲノムに対して前記ナノポア配列決定読み取りデータをアラインすること、
ｄ．各染色体または染色体領域に対してアラインしている配列決定読み取りデータ（ＵＲ）の数を数えること、
ｅ．各染色体または染色体領域に対する配列決定読み取りデータの対応するパーセンテージを計算すること、
ｆ．参照ゲノムとの比較により、コピー数変動が存在するか否かを判定すること
を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項２６】
微生物について迅速に陽性または陰性と同定するための方法であって、
ａ．生体試料を受領すること、
ｂ．生体試料から核酸を抽出すること、
ｃ．前記微生物を同定し得るゲノム情報を含有する前記核酸の領域を増幅させること、
ｄ．ナノポアに基づく配列決定のために増幅核酸を調製すること、
ｅ．ナノポアに基づく配列決定装置を稼働させること、
ｆ．前記微生物について陽性または陰性と同定するために複数の配列が得られる場合、配列決定反応を終結させること
を含む、方法。
【請求項２７】
ＤＮＡの定められた領域において突然変異について迅速に陽性または陰性と同定するための方法であって、
ａ．生体試料を受領すること、
ｂ．生体試料から核酸を抽出すること、
ｃ．関心のあるゲノム情報を含有する前記核酸の領域を増幅させること、
ｄ．ナノポアに基づく配列決定のために増幅核酸を調製すること、
ｅ．ナノポアに基づく配列決定装置を稼働させること、
ｆ．関心のある前記突然変異について陽性または陰性と同定するために複数の配列が得られる場合、配列決定反応を終結させること
を含む、方法。
【請求項２８】
複数の生体試料を単回の配列決定反応へと多重化することを可能にするために、プライマーを使用して１つ以上の微生物が同定され得る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
関心のある前記ＤＮＡ領域に隣接する特異的プライマーを使用して、小さい（１０００ｎｔ）ＤＮＡ断片のＰＣＲに基づく増幅からなる予め定められたゲノム配列決定に対する存在もしくは欠如または変化を探すために、標的領域のナノポア配列決定のためのポリヌクレオチドライブラリを調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その開示がその全体において本明細書中に記載されるかのように参照により本明細書に組み込まれる２０１５年１１月１２日提出の米国仮特許出願第６２／２５４，５７９号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本開示の分野は、迅速な短ＤＮＡ配列決定を可能にするための、ライブラリ調製およびデータ分析方法に関する。特に、これは、実験室外の施設において異数性または遺伝子突然変異の有無の迅速診断を可能にするための、リアルタイムでのＤＮＡの短ＤＮＡ断片を配列決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナノポアに基づく配列決定は、メモリスティックサイズの装置上に取り付けられた約５００個のナノポアを通じて印加電界が１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を運ぶときにリアルタイムで電流の変化を記録する。ＤＮＡライブラリ調製およびデータ分析パイプラインは、１００ｋｂ長程度の長さの非常に長いＤＮＡ断片を並行して配列決定し、分析するように設計される。非常に長いＤＮＡ断片を集合させる目的は、デノボゲノムアセンブリおよびノンリファレンス（ｎｏｎ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）足場構築のためとされてきた。
【０００４】
標準的なナノポアに基づく配列決定プロトコールにおいて、平均で＞６ｋｂの長さにＤＮＡを断片化する。次いで、ＤＮＡ末端を修復し、ｄＡ尾部を付加し、長いＤＮＡ断片をキットアダプターミックスと連結させる。アダプターミックスは、２つのＤＮＡアダプター：Ｙ型アダプターおよびヘアピン型アダプターからなる。Ｙ型アダプターは、ＤＮＡをナノポアに先導するリーダー鎖および相補的ＤＮＡ鎖を分離し、ＤＮＡがポアを通過するのを促進する予め連結されたＥ５タンパク質を有する。ヘアピン型アダプターは、ヘアピンでの「Ｕターン」および２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の相補鎖の連続配列決定を可能にする。Ｙアダプター／鋳型／ヘアピン−アダプターの構造により、配列決定装置が鋳型読み取りデータ、相補的読み取りデータを生成させることができるようになり、これらの２つの読み取りデータ（すなわちｄｓＤＮＡに対する２Ｄ読み取りデータ）の較正が可能になる。２Ｄ読み取りデータは、１つのｄｓＤＮＡ分子からの配列決定の質を向上させる。Ｈｉｓ−タグ付加Ｅ３タンパク質は、ライゲーション工程中にヘアピン型アダプターに連結されるが、配列決定速度を鈍化させ、Ｈｉｓ−Ｔａｇビーズ精製を使用したヘアピンアダプターに連結されるＤＮＡ断片の精製のために使用される。ＭｉｎＩＯＮ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの平行配列決定能（約５００）は、いくつかの他の配列決定プラットフォームよりもはるかに低い（ＭｉＳｅｑ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ２５×１０６；Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，８０×１０６）。しかし、それぞれ、Ｉｏｎ  ＰｒｏｔｏｎおよびＭｉＳｅｑ（１ｎｔ／分および０．１７ｎｔ／分）と比較して、ＭｉｎＩＯＮプラットフォームは、大幅に高速で（１２００〜１８００ｎｔ／分）個々のヌクレオチドを配列決定する。
【０００５】
ナノポアに基づく配列決定は、１つのＤＮＡ断片の配列決定の完了後に別のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列決定が開始され、リアルタイムで読み取りデータが生成されるため、十分な読み取りデータが得られたときに配列決定を停止させ得るという明確な長所を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
現在のＭｉｎＩＯＮナノポアゲノムＤＮＡライブラリ調製および配列決定プロトコールは、短断片ライブラリ調製のために使用され得ない。本明細書中に記載の開示は、迅速な短ＤＮＡ配列決定を可能にするためのライブラリ調製およびデータ分析方法に関する。
【０００７】
ある実施形態において、本開示は、長断片の配列決定と比較してある時間において何倍もの読み取りデータを生成させるためのナノポアに基づく配列決定方法を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、本開示は、生体試料中の胎児由来の核酸の存在を検出することを含む、生体試料におけるナノポアに基づく配列決定方法を提供する。
【０００９】
また別の実施形態において、本開示は、出生前診断のためのナノポアに基づく配列決定方法を提供する。「出生前診断」という用語は、本明細書中で使用される場合、何らかの胎児状態または本明細書中に記載のナノポアに基づく配列決定方法により配列決定される胎児ＤＮＡに関する特徴の判定を包含する。
【００１０】
本開示の別の実施形態は、性別判定および、染色体の異数性または単純な突然変異が含まれ得るが限定されない胎児異常の検出のためのナノポアに基づく配列決定方法を含む。
【００１１】
本開示のさらに別の実施形態は、病原体の迅速検出および表現型決定のためのナノポアに基づく配列決定方法である。
【００１２】
本明細書中に記載の開示により、診察室および現場環境で行われ得る多岐にわたる新しい研究および臨床適用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】短断片配列決定ライブラリ調製の概略図。ｄｓＤＮＡを断片化し、サイズによって選択し、末端を修復し、濃縮した。上昇した濃度の、連結されたＥ５タンパク質を有するＹ型アダプターおよびヘアピンアダプターをｄｓＤＮＡに連結し、Ｅ３タンパク質（緑）はヘアピンアダプターに結合する。次いで、電流がナノポア（薄灰色）を通じてＤＮＡの１本鎖を運ぶ。
【図１Ｂ】短断片ライブラリ調製の最適化。レーン１、対照ＤＮＡ断片；レーン２、製造者のプロトコールを使用した対照断片およびアダプターのライゲーション；レーン３〜７、断片化およびｄＡ尾部付加鋳型ＤＮＡ（レーン３）の精製を使用したライゲーション効率の増加的な改善、反応体積の縮小（レーン４）、４℃で１〜２時間の温置の組み込み（レーン５、６）およびアダプターからのＥ５タンパク質放出を減少させるためにＲＴ温置時間を５分間に短縮（レーン７）。
【図２Ａ】Ｍｉｎｉｏｎを用いた短ＤＮＡ断片配列決定の使用したところ、正常男女、モノソミーＸ女性、１２トリソミー男性および２１トリソミー男性からのＤＮＡ試料中で正しく性別を判定し、異数性を検出することが可能であった（ｐ＜０．００１）。各染色体のコピー数は、ＵＡの補正された正規化パーセンテージ（Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡｉ）に反映された。黒い点は、顕著なコピー数変化がない染色体に相当し；赤い点は、正常な男性参照と比較して顕著なコピー数変化がある染色体に相当し；点線は９９．９％信頼区間に相当する。
【図２Ｂ】ポアソン分布下で異数性検出に必要とされる、理論的なより低いユニークアライメント（ｕｎｉｑｕｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（ＵＡ）。λ＝４１である場合、ｐ（ｘ＞１．５λ）＝０．０００８。ｐβ（ｘ’＜１．２５λ）＝０．１０。
【図２Ｃ】ポアソン分布下での１５Ｋ参照物を使用した理論的なより低い検出力。Ｙ染色体のＵＡは最も少なく、７９〜８０が割り当てられる。λ＝７９である場合、ｐ（ｘ＞１．５λ）＝１．０７×１０−５。ｐβ（ｘ’＜１．２５λ）＝０．０３４。
【図２Ｄ】生の読み取りデータ、２Ｄ読み取りデータおよびＨｇ１９参照ゲノムに対してユニークにアラインされた読み取りデータを示す時間と交差する短断片ライブラリの配列決定収率。
【図３】ＭｉｎＩＯＮライブラリ調製。
【図４】ソフトウェア比較。
【図５】ＭｉｎＩＯＮ稼働のまとめ。
【図６】１５Ｋ正常男性参照およびＧＲＣｈ３７ヒト参照ゲノムの比較。
【図７】ＵＬＣＳ細胞遺伝学的分析。
【図８】内部正規化。内部参照を使用する稼働１〜４は、本発明者ら自身のＤＮＡ配列決定データを使用するか、または他のグループから得たものを使用するかにかかわらず、変動係数が非常に低い。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
長い断片長と比較する短ＤＮＡ断片長ライブラリ調製のために等モル濃度を維持するため、インプットＤＮＡの総ｎｇを約１８倍低くすることおよびライゲーション効率を向上させることが必要であった（図１Ｂ）。本発明者らは、ライゲーション効率を向上させるためにプロトコールを体系的に改変した。ライゲーション反応を監視するために、４３４ｂｐ  ＰＣＲ産物およびＴ突出がある５７ｂｐ対照アダプター２本鎖を使用した（表１）。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
製造者のプロトコールの使用の結果、２つのアダプターが連結されているものは全ての最終産物の＜５％となった（図１Ｂ、レーン２）。ライゲーション前にｄＡ尾部付加ＤＮＡを精製することにより、２つのアダプターがライゲーションされる最終産物のパーセンテージが２５％まで増加した（図１Ｂ、レーン３）。１００μＬ〜２０μＬの反応体積の縮小により、２つのアダプターがライゲーションされた最終産物のパーセンテージが４８％までさらに増加した（図１Ｂ、レーン４）。１０分ＲＴおよび４℃で１〜２時間の温置を組み合わせることにより、本発明者らは、予め連結されたＥ５タンパク質を放出することなく、アダプターが両末端にライゲーションされた断片のパーセンテージを６１〜６３％まで増加させることができた（図１Ｂ、レーン５〜７）。したがって、ｄＡ尾部付加ＤＮＡを精製し、次いで濃縮して反応体積を縮小し、４℃で２時間という長いライゲーションを導入することにより、本発明者らは、両末端にアダプターがライゲーションされた最終産物のパーセンテージを＜５％から６３％まで増加させ（図１Ｂ、レーン２対７）、下流Ｈｉｓ−Ｔａｇビーズ精製のための十分な材料がもたらされた（図３）。
【００１７】
短ＤＮＡの配列決定で得られた多数の読み取りデータのデータ分析用の最適ツールを判定するために、本発明者らは、ＭｉｎＩＯＮ短ＤＮＡ配列決定稼働を通じて作製されたトレーニングライブラリを使用して、ＭＡＰにより推奨されるアライメントプログラムであるＬＡＳＴを２種類の類似のプログラム、Ｂｏｗｔｉｅ２およびＢｌａｔ（８〜１０）と比較した（図４）。Ｂｏｗｔｉｅ２およびＬＡＳＴ（それぞれ１分間および１４分間）がＢｌａｔ（６８分間）よりもアライメントを速く完了した一方で、Ｂｌａｔは、同じデータセットに対して、Ｂｏｗｔｉｅ２およびＬＡＳＴ（それぞれ５８％および６１％）と比較して、より良好なアライメント（６５％）を生じさせたが、これはおそらく、ＭｉｎＩＯＮ配列決定のエラーの結果、欠失が生じるという傾向に起因すると思われる（図３〜４）。Ｂｌａｔ（６２％）はまた、Ｂｏｗｔｉｅ２およびＬＡＳＴ（それぞれ４５％および５５％）と比較して、より多くのユニークアライメントを生成させた。ＭｉｎＩＯＮ短ＤＮＡ配列決定結果のアライメントのためにＢｌａｔを使用し、最も包括的なアライメント結果が提供された。高速サーバ上の十分な計算資源を考えると、パラレルスレート（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｔｈｒｅａｔｓ）の増加により、稼働時間がさらに短縮され得る。
【００１８】
短ＤＮＡ断片のナノポアに基づく配列決定の臨床的有用性を明らかにするために、本発明者らは、このアプローチの異数性診断能を試験した。胎児異数性検査は、出生前検査（例えば羊水穿刺、絨毛採取（ＣＶＳ））、体外受精（ＩＶＦ）における胚の着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）および流産組織の評価の一部として日常的に行われる。迅速診断は、時宜を得た管理を可能にするために臨床的に必須である。羊水穿刺またはＣＶＳを通じて得られた出生前試料の場合、迅速な結果により、処置の選択肢がより限定されており、技術的に困難で、母体への危険がある、より進んだ妊娠期間へと妊娠が進行する前に処置を行うことが可能になる。ＰＧＳの場合、迅速試験により、胚凍結の必要なく、一定のＩＶＦ周期において胚を移植することが可能になる。しかし、核型分析およびマイクロアレイ分析など、異数性を診断するための標準的方法は完了まで７〜２１日を要する。異数性検出のための極低カバレッジ配列決定（ＵＬＣＳ）は、異数性を評価するための、参照ゲノムアセンブリに対する読み取りデータのアライメントを必要とする全ゲノム異数性検出のための新しいストラテジーであるが、依然として完了まで１５〜２１時間を要し、診察室で、または複雑度が低い環境で容易に使用できない、高価なおよび技術的に高度なライブラリ調製および配列決定プラットフォームを必要とする。異数性を判定するためのＵＬＣＳアプローチに必要であるのは、読み取りデータが、ゲノムに対するユニークアライメントを可能にするのに十分に長い必要があることのみである。したがって、リアルタイムで多数の短ＤＮＡ断片を迅速に配列決定する方法により、高度な実験設備外の環境における異数性の迅速診断が可能になる。
【００１９】
正常男女、１２トリソミー男性、２１トリソミー男性、モノソミーＸ女性からの精製ゲノムＤＮＡ試料を断片化し、サイズで選択し（３５０〜６００ｂｐ）、記載のように処理した（図３）。ＭｉｎＩＯＮを用いて本発明者らのプロトコールを使用して調製した短ＤＮＡ断片ライブラリの配列決定を行ったところ、配列決定の最初の３分後に約５００のユニークな読み取りデータが生成され、４３〜８７Ｋの生読み取りデータおよび２７〜５８Ｋの２Ｄ読み取りデータ（３２〜６７％）が配列決定の４時間後に得られた（図２、図５）。これは、好都合には、３６時間後の１２，０００個よりも少ない読み取りデータを配列決定した従来からのＭｉｎＩＯＮ配列決定プロトコールと匹敵する。本発明者らのプロトコールを使用して生成させた読み取りデータのうち、２Ｄ読み取りデータの４０〜７０％がある位置にユニークにマッピングされ得た（図５）。
【００２０】
短断片長ＤＮＡ配列決定ライブラリ調製および分析パイプラインを使用して、本発明者らは、全試料において２〜４時間以内に性別および異数性判定の成功に十分な数の読み取りデータを得た（ｐ＜０．００１）（図２Ａ）。ポアソン分布の正規化検定により、異数性（ｐβ−異数性）を検出することに対するＩＩ型エラーの確率は＜０．０５であった（図２Ｃ、図７）。ＭｉｎＩＯＮは容易に拡張可能であるため、並行して２つのＭｉｎＩＯＮ配列決定装置を稼働することによって１〜２時間以内に、かつ並行して４つのＭｉｎＩＯＮ配列決定装置を稼働することによって３０分〜１時間以内に細胞遺伝学的分析を行い得る。
【００２１】
まとめると、ＤＮＡの長い断片を配列決定するためのＭｉｎＩＯＮの意図される役割に加えて、本発明者らの結果から、現場または診療所での、出生前およびＩＶＦケアにおける時間的制約のある異数性検出のために使用され得る短ＤＮＡ読み取りデータの非常に迅速なリアルタイム取得ならびに小さいＤＮＡ断片およびアンプリコンの配列決定のためにもＭｉｎＩＯＮを使用し得るということが示される。この能力により、新しい臨床および研究適用へと、ＭｉｎＩＯＮの有用性が拡大され得る。
【００２２】
ここで本開示を次の実施例で説明するが、これは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例１
ライゲーション条件の開発
ライゲーション効率を評価するため、最初のライゲーション反応のために短ＤＮＡ対照断片を使用した。Ｑ５  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用してｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターから４３４ｂｐ断片を増幅させるために、Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いたＰＣＲを使用して断片を作製した。表１を参照のこと。
【００２４】
製造者のプロトコールに従い、５０ｍＬのＰＣＲ反応物を調製した。ＰＣＲ反応物を９８℃で３０秒の最初の変性と、９８℃で１０秒の変性、５７℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で２０秒の伸長の２５サイクルとに供した。完全な増幅を確実にするために、７２℃で２分間の最終伸長ステップを付加した。製造者のプロトコールに従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してＰＣＲ産物を精製した。ライゲーション効率を評価するために、Ｔ突出がある５７ｂｐの非対称アダプターを対照アダプターとして使用した。表１を参照のこと。アダプターミックス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ）中のＹ型およびヘアピンアダプターの０．２ｍＭ濃度を模倣するために、ＭｉｎＩＯＮアダプター緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中で０．４ｍＭまで対照アダプターを希釈した。
【００２５】
ＭｉｎＩＯＮゲノム配列決定キットプロトコール（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ、ＳＱＫ−ＭＡＰ００４）に従い、最初にライゲーション反応を行った。対照ＤＮＡ断片（０．２ｐｍｏｌ、５２ｎｇ）を３０μＬ  ＮＥＢ  Ｎｅｘｔ  ｄＡ−Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）反応［４ｍＬの対照断片、２１μＬのＱｉａｇｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＢ、３μＬの１０３  ＮＥＢ  Ｎｅｘｔ  ｄＡ尾部付加反応緩衝液および２μＬのＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’ｅｘｏ−）］に添加した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて３７℃で３０分間、反応を行った。ｄＡ尾部付加反応全てを１００μＬの総体積［３０μＬのｄＡ尾部付加反応、１０μＬの対照アダプター、１０μＬのヌクレアーゼ不含水、５０μＬのＮＥＢ  Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）］に添加し、室温（２３〜２５℃）で１０分間温置した。
【００２６】
両末端にアダプターが連結されている対照断片は殆どなかったため（図１Ｂ、レーン２）、ｄＡ尾部付加のために代替的なＫｌｅｎｏｗ断片（３９／５９ｅｘｏ−）（ＮＥＢ）を使用し、ライゲーション反応に添加する前にｄＡ尾部付加反応物を精製した。対照ＤＮＡ断片（２５０ｎｇ）をｄＡ尾部付加反応［２．５μＬのＮＥＢｕｆｆｅｒ  ＩＩ、５ｍＬの１ｍＭデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、１ｍＬのＫｌｅｎｏｗ断片（３９／５９ｅｘｏ−）および総体積２５μＬになるまでヌクレアーゼ不含水］に供した。スプライセレクト（ＳＰＲＩ  ｓｅｌｅｃｔ）試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒに対する製造者のプロトコールに従い、１．８倍ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）での精製後、ｄＡ尾部付加対照断片を１２μＬの１／５  Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＢ（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８；Ｑｉａｇｅｎ）中で溶出し、０．０５ｍＭ（１３ｎｇ／ｍＬ）になるように希釈した。
【００２７】
１０：１アダプター−断片混合物（４ｐｍｏｌ対照アダプター、２μＬ  １０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中の０．２ｐｍｏｌ対照断片、１ｍＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよび２０μＬ最終体積になるまでＮＦ  Ｈ２Ｏ）に対してライゲーションを行うためにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して１６℃で一晩ライゲーション反応を行った結果、対照断片の約７５％が両端にアダプターを有したが、これは、下流ステップに対する十分な最終産物とはならない。したがって、２つ組で反応を行い、合わせた。次に、ＭｉｎＩＯＮキットで提供されるアダプターを保存するために、５：１の比率を使用した。
【００２８】
第２のライゲーション反応は、０．４ｐｍｏｌのＤＮＡ、２６μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ、１０μＬの対照アダプター、５０μＬのＢｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ）および１０μＬのヌクレアーゼ不含水（Ａｍｂｉｏｎ）による１００μＬのライゲーション反応を用いた、既に記載のような、精製ｄＡ尾部付加ＤＮＡを使用した、製造者のライゲーションプロトコールの反復であった（図１Ｂ、レーン３）。反応物を室温で１０分間温置し、１．８倍ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して精製し、ＳＱＫ−ＭＡＰ００３ＭｉｎＩＯＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ中の洗浄緩衝液（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ＰＥＧ  ８０００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ中で溶出させた。
【００２９】
第３のライゲーション反応は、既に記載のような精製ｄＡ尾部付加ＤＮＡを使用した低体積系であった（図１Ｂ、レーン４〜７）。０．２ｐｍｏｌのＤＮＡ（４ｍＬ）、２ｐｍｏｌの対照ＤＮＡアダプター（５μＬ）、１０μＬのＢｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘおよび１μＬのヌクレアーゼ不含水を含有する２０ｍＬライゲーション反応物を室温で１０分間温置し、ＳＱＫ−ＭＡＰ００３洗浄緩衝液とともに１倍ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して精製し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ中で溶出させた（図１Ｂ、レーン４）。室温で５〜１０分間、反応を行い、続いて４℃で１〜２時間温置した（図１Ｂ、レーン５〜７）。ＳＱＫ−ＭＡＰ００３洗浄緩衝液とともに１倍ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて反応物を精製し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ中で溶出させた。精製ライゲーション産物を２％アガロースゲル上で泳動させた。２つの技術的反復を用いてＩｍａｇｅＪデンシトメトリー分析を使用して、ライゲーション産物の分量を推定した。
【００３０】
実施例２
核酸操作
物質の最大限の回収を促進するために、別段の記載がない限り、１．５ｍＬの低残留性微小遠心チューブおよび低残留性チップを使用した。サーマルサイクラー中で行った全ての反応について、０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブを使用した（Ａｘｙｇｅｎ）。スプライセレクトのペレット化およびＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ関連精製のためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＳＰＲＩＳｔａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ６−チューブスタンド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用し；Ｈｉｓ−タグビーズ単離のためにＤｙｎａＭａｇ−２磁石（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。
【００３１】
実施例３
ゲノムＤＮＡ試料
ＭｉｎＩＯＮによる短ＤＮＡ断片ＵＬＣＳを使用した細胞遺伝学的分析のために、核型が正常な男女および１２トリソミー男性、２１トリソミー男性およびモノソミーＸ女性からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料を使用した。Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから核型が正常なヒト男女試料からのＢ型血液のリンパ球（ＧＭ１２８７７およびＧＭ１２８７８）を得て、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより提供されたプロトコールに従い培養した。製造者のマニュアルに従い、ＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、第２継代の細胞培養物からｇＤＮＡを抽出した。２１トリソミー男性からのｇＤＮＡは、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓにより提供された（ＮＧ０５３９７）。１２トリソミー男性およびモノソミーＸ女性からのＤＮＡ試料は、Ｇ−バンド核型分析を用いて細胞遺伝学的試験が行われた流産症例の妊娠産物から得た。ｇＤＮＡは、絨毛膜絨毛の絨毛初代細胞培養物から、Ａｌｌ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ｇＤＮＡの品質は、０．８％アガロースゲル上で調べ、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。ＤＮＡは必要になるまで−２０℃で保存した。
【００３２】
実施例４
ライブラリ調製
ライブラリ調製のために、ｍｉｃｒｏ−ＴＵＢＥ（Ｃｏｖａｒｉｓ）において、製造者の５００ｂｐの設定でＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ２２０フォーカストウルトラソニケーター（ｆｏｃｕｓｅｄ  ｕｌｔｒａ−ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を使用してＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中の１２０μＬの２５ｎｇ／ｍＬ  ｇＤＮＡを断片化した。サイズ選択のために、１００μＬの断片化ｇＤＮＡを使用した。製造者のダブルサイズの選択プロトコールに従い、ライトサイド０．５５倍、レフトサイド０．７倍の条件（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、スプライセレクト試薬を使用して、１．５ｍＬのＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中でサイズ選択を行った。１．５ｍＬ  ＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブ中、４０〜５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ中でＤＮＡを溶出させた。次いで、断片サイズを確認するために、２％ゲル電気泳動に対して２μＬのＤＮＡを使用した。ＮａｎｏＤｒｏｐ定量のために精製ＤＮＡ（３μＬ）を保存した。サイズ選択したＤＮＡ断片は、約３５０〜６００ｂｐ長であった。
【００３３】
サイズ選択ＤＮＡにＢｕｆｆｅｒ  ＥＢを８０μＬの最終体積になるまで添加した。１．５ｍＬのＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブ中でＮＥＢ  Ｎｅｘｔ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）を使用して、末端修復反応を行った。次に、５μＬのＤＮＡ  ＣＳ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ，ＳＱＫ−ＭＡＰ００４）、１０μＬの１０×ＮＥＢ  Ｎｅｘｔ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒおよび５μＬのＮＥＢ  Ｎｅｘｔ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘをサイズ選択ＤＮＡ断片に添加し、穏やかにピペッティングすることにより混合した。反応物を室温で２５分間温置し、ＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブ中でスプライセレクト試薬プロトコールに従い、１．８倍ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して精製した。２２μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＥＢ中で末端修復ＤＮＡを溶出させ、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  ＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤＮＡを定量した。
【００３４】
滅菌ＰＣＲチューブ中、２５μＬの総体積で、Ｋｌｅｎｏｗ断片（３’→５’ｅｘｏ−）を使用して、末端修復ＤＮＡをｄＡ尾部付加反応に供した。この反応は、２．５μＬのＮＥＢｕｆｆｅｒ  ＩＩ、１μＬのＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’ｅｘｏ−）、１６．５μＬの末端修飾精製ＤＮＡおよび５μＬのｄＡＴＰ（１ｍＭ）を含有した。３７℃で４５分間、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ１０００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒａｔ中で反応物を温置し、１．８倍ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して精製し、次いで１２μＬの１／５Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＢ中で溶出させた。ＮａｎｏＤｒｏｐおよびＱｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳＡｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製産物を定量し、１／５Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＢを用いて約０．０５ｍＭ（約１８ｎｇ／ｍＬ）に希釈し、続く反応でｄＡ尾部付加ＤＮＡとして使用した。
【００３５】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁器スタンド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、製造者のプロトコールに従い、ＭｉｎＩＯＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔにおいて、１．５ｍＬ低残留性チューブ中でＨｉｓ−タグＤｙｎａｂｅａｄｓ（１０ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を洗浄した。洗浄したビーズを４０μＬの未希釈洗浄緩衝液（ＳＱＫ−ＭＡＰ００４）中で再懸濁し、氷上で保存した。１．５ｍＬ低残留性チューブ中でライゲーション反応を行った。２０μＬ反応は、４μＬのｄＡ尾部付加ＤＮＡ（０．２ｐｍｏｌ）、５μＬのアダプターミックス（１ｐｍｏｌ）（ＳＱＫ−ＭＡＰ００４）、１μＬのＨＰアダプター（１ｐｍｏｌ）（ＳＱＫ−ＭＡＰ００４）および１０μＬのＢｌｕｎｔ／ＴＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を含有する。各連続添加間に穏やかにピペッティングすることにより、この反応物を混合し、卓上遠心機で短時間スピンダウンした。室温で５分間、続いて４℃で２時間ライゲーション反応物を温置した。各試料に対して、個別のチューブ中で２×２０μＬ反応を行い、Ｈｉｓ−タグビーズ精製のために合わせた。
【００３６】
１．５ｍＬ低残留性チューブ中で、４０μＬの洗浄Ｈｉｓ−タグビーズをアダプター連結ＤＮＡに添加し、穏やかにピペッティングすることによって慎重に混合した。混合物を室温で５分間温置し、３０秒間氷上に置いた。ＭｉｎＩＯＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＳＱＫ−ＭＡＰ００４）のプロトコールに従い、Ｈｉｓタグビーズ精製を行った。穏やかに１０回ピペッティングすることにより、ペレット化したビーズを２８μＬのＥＬＢ溶出緩衝液（ＳＱＫ−ＭＡＰ００４）中で再懸濁した。懸濁液を室温で５分間温置し、３０秒間氷上に置き、懸濁液をペレット化のために磁器ラックに戻す前にもう一度これを繰り返した。溶出物を清潔な１．５ｍＬ低残留性チューブに移し、氷上で３０秒間温置し、次いで、残存ビーズ全てをペレット化するために、磁器ラックに２分間置いた。次いで、溶出物を１．５ｍＬ低残留性チューブに慎重に移した。このライブラリをプレ配列決定ミックスと呼んだ。次に、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔによる定量のために、４μＬのプレ配列決定ミックスを使用した。
【００３７】
実施例５
ＭｉｎＩＯＮ配列決定
次に、１５０ｍＬのプライミングミックス（１４７μＬのＥＰ緩衝液および３μＬの燃料ミックス（ｆｕｅｌ  ｍｉｘ））をＭｉｎＩＯＮ  Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ（Ｒ７．３）に載せ、１０分間温置した。プライミング工程を一度繰り返した。次に、１５０μＬのＭｉｎＩＯＮ配列決定ライブラリ（１２μＬのプレ配列決定ミックス、１３５ｍＬのＥＰ緩衝液および３ｍＬの燃料ミックス）を穏やかに混合し、ＭｉｎＩＯＮ  Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌに載せた。ＭＡＰ  ４８−ｈｒ  ｇＤＮＡ配列決定プロトコールを使用し、十分なデータが回収されたときに配列決定反応を停止させた。
【００３８】
実施例６
データ分析
ローカルｆａｓｔ５ファイルを移すためにＭｅｔｒｉｃｈｏｒ  Ａｇｅｎｔ  Ｖ２．２６を使用し、カレンシーをベースイベントに変換するために２Ｄ  Ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ  Ｒｅｖ１．１４を使用した（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｆａｓｔ５をｆａｓｔＱファイルに変換するために、Ｐｏｒｅ  ｔｏｏｌｓ  ｖ０．５．０を使用した。カットアダプト（ｃｕｔ  ａｄａｐｔ）ｖ１．７．１を使用して、最初および最後の５０塩基を各配列から除去し、除去後に少なくとも５０塩基長であった配列を維持した。ＢＬＡＴを使用して、１Ｄおよび２Ｄ読み取りデータの両方をＥｎｓｅｍｂｌ  ＧＲＣｈ３７ヒト参照ゲノムに対してアラインした（図３）。
【００３９】
スクリーニング基準を通過したのは１Ｄ配列の１％未満であり（≧４０％のクエリー、≧８０％アライメント同一性をカバー）、結果的にさらなる分析のために２Ｄ配列のみを使用した。さらなる分析のために、ゲノム位置に対するユニークなアライメントマッチ（ＵＡ）がある２Ｄ読み取りデータを保持した。ヒト参照ゲノムに対して２Ｄ配列をマッピングすることについて、Ｂｏｗｔｉｅ２も試験した。Ｂｏｗｔｉｅ２は、短い配列（５０〜２００ｂｐ）のハイスループットマッピングに対して設計されたため、＜５％全長２Ｄ読み取りデータがマッピングされ得る。４５４個のデータに対して作られたＢｏｗｔｉｅ２−−ｂｗａ−ｓｗ−のような設定も試験し、２Ｄ読み取りデータの３６％のみがＵＡであった。したがって、本発明者らは、２Ｄ読み取りデータの最初の２００ｂｐをアラインするためにＢｏｗｔｉｅ２を使用し、約１分で４５％ＵＡを生成させた（図４）。ＭｉｎＩＯＮの長い読み取りデータへのアライメントに対して最も包括的であると報告された推奨される設定を用いたＬＡＳＴを使用して、参照ゲノムに対して２Ｄ読み取りデータもマッピングしたが、これは、同じスクリーニング基準を使用したＢＬＡＴパイプラインと比較して、生じたＵＡはより少なかった（図３）。そのため、極低カバレッジ配列決定（ＵＬＣＳ）を使用する高速細胞遺伝学的分析に対して、ＢＬＡＴパイプラインからのＵＡのみを使用した。
【００４０】
実施例７
極低カバレッジ配列決定（ＵＬＣＳ）を使用したデジタル核型分析
極低カバレッジ配列決定（ＵＬＣＳ）は、細胞遺伝学的分析のための強力なツールである。概念実証として、本発明者らは、５つの試料において分析を行い、この実験に対して、改変したＵＬＣＳストラテジーを使用した。以前の試験から、ＵＬＣＳにおける変動係数（ＣＶ）（＜０．０１倍カバレッジ）が各常染色体において１５％よりも低く、ＭｉＳｅｑとＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームとの間で常染色体性ＣＶの有意な差がなかったことが示された。ＵＬＣＳ分析において、本発明者らは、各染色体におけるＵＡ（添字ｉ、ｉ＝１、２、…、２２、Ｘ、Ｙとして表示）がポアソン分布にフィットすると仮定した。
ＵＡｉ＝ｎｉφｉ
式中、ｎｉは、染色体ｉをカバーするために必要とされる読み取りデータ数であり、φｉは染色体ｉのカバレッジである。各染色体におけるＵＡのパーセンテージ（％ＵＡｉ）は、同じカバレッジ下での各染色体の長さおよびコピー数により決定される。
【００４１】
ＵＬＣＳに必要とされる配列決定読み取りデータの下限は、最初に染色体Ｙに割り当てられるＵＡにより決定したが、これは、ａ）これが最短の染色体の１つであり、したがってそこから配列決定されるＤＮＡ断片がより少なく、ｂ）染色体Ｙのうち、配列決定され、ヒト参照ゲノムにおいてアノテーションされているのは５０％未満であり、そのため、染色体Ｙ読み取りデータの半分を超えるものが、参照ゲノムに対してマッピング可能ではなく、カウントできず、ｃ）染色体ＸおよびＹの同一領域にマッピングされた読み取りデータが分析パイプラインによってＵＡとみなされないからである。さらに、染色体ＸとＹとの間の架橋および反復エレメントの存在により、ＸおよびＹ染色体からの読み取りデータのごく一部で置き違いが生じ、これによってさらに、Ｙ染色体に対してマッピングされ得る読み取りデータが減少する。
【００４２】
ＵＬＣＳ細胞遺伝学的分析に必要とされるＵＡｉの下限を推定するため、本発明者らは、異数性に対するＵＡの検出力を推定するために、Ｒ（ｑｐｏｉｓ関数）においてポアソン分布の正規化検定を使用した。ＵＡｉ＝４１である場合、ｐ（ｘ＞１．２５λ）＝０．０４、ｐ（ｘ＞１．５λ）＝０．０００８であり、異数性の検出力が９０％であると推定した。ＵＡｉが７９であった場合、異数性の検出力は９５．６％である。ＵＡＹ約７９に対する対応する総ＵＡは、正常男性試料において約１５，０００である。３０回の正常男性の配列決定結果から１５，０００ＵＡを無作為に選択し、正規化目的のために参照として各染色体に対する平均ＵＡを使用した（Ｒｅｆ＿ＵＡｉ）。ポアソン分布下で１５Ｋ参照物がヒトゲノムを代表しているか否かを調べるために、本発明者らは、各染色体のギャップなしの長さ（％ＵＬ）および％ＵＡのパーセンテージを比較した。常染色体におけるそれらの比率（Ｎｏｒｍ＿Ｒｅｆ＿％ＵＡ）は１．０４（ＳＤ＝０．０６８７、ＣＶ＝６．６％）（図６）であった。
【００４３】
１５Ｋ参照物は性染色体の％ＵＬの約半分に相当する％ＵＡを表し、これは性染色体の均一な領域におけるユニークではないアライメントの減少の結果であり得る。ミトコンドリアの染色体（ＭＴ）は多コピーの小さい染色体であり、これはＵＬＣＳ細胞遺伝学的分析には含まれなかった。ポアソン分布に従い、正常男性参照の各染色体の９９．９％信頼区間は、同じカバレッジで
【数１】
2019501641.tif 000004
として推定され得る。
【００４４】
１５，０００ＵＡ読み取りデータを使用してクエリー試料の各染色体のコピー数を入手するために（図７）、本発明者らは、各染色体におけるユニークにアラインされた読み取りデータ（ＵＡｉ）の数が前に記載のようにポアソン分布にフィットすると仮定した。
【００４５】
１５，０００ＵＡ読み取りデータを使用して、染色体のコピー数により、クエリー試料と参照との間の正規化された比（Ｎｏｒｍ＿％ＵＡｉ）を決定した：
【数２】
2019501641.tif 000005
染色体の増減に起因するカバレッジφの変化に対処するために、補正された正規化％ＵＡｉは、
【数３】
2019501641.tif 000006
に等しく、ここで、
【数４】
2019501641.tif 000007
は、Ｚ−スコアにより決定される場合、正常な常染色体の平均Ｎｏｒｍ＿％ＵＡｉである。未知の試料に対して、この試験において、既知の正常な常染色体により、正常な常染色体のＮｏｒｍ＿％ＵＡｉの標準偏差（ＳＤ）（ＳＤ正常）を推定した（
【数５】
2019501641.tif 000008
内）（ｎ＝１０５、ＳＤ正常＝０．０４８９）。各染色体に対してＺ−スコアを計算した：
【数６】
2019501641.tif 000009
【００４６】
＞３．２９の｜Ｚ−スコア｜を有する染色体をｐ＜０．００１で異常な染色体とみなした。Ｚ−スコアが＞３．２９であった場合、本発明者らは、染色体の増加があるものとみなし、Ｚ−スコアが＜−３．２９であった場合、本発明者らは、染色体の減少があるとみなす。改変Ｚ−スコア法が、小さい常染色体における異常の検出において、各染色体の調査に基づくＺ−スコア法よりも特異性が低い一方で、これは異数性検出に対して十分な検出力（＞９５％）を提供した（図２Ｃ）。正常な常染色体の理論値Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡ正常＝１、常染色体のフルトリソミーＮｏｒｍ’＿％ＵＡトリソミー＝１．５、常染色体のモノソミー  Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡモノソミー＝０．５、正常女性のＸ染色体Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡＸ＿女性＞１．５、正常女性のＹ染色体またはＹ染色体欠損Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡｙ＿女性＜０．５。
【００４７】
本発明者らは、補正した正規化％ＵＡｉ（Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡｉ）は染色体のコピー数を反映すると仮定した。調整Ｚ−スコア（Ｚ’−スコア）を計算するために、Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡｉを使用した。｜Ｚ−スコア｜＜３．２９である正常な常染色体のＮｏｒｍ’＿％ＵＡｉをまとめた（平均＿Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡ＝０．９９９９、ＳＤ＿Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡ＝０．０４８１）。各染色体に対するＺ’−スコアは、
【数７】
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に等しい。
【００４８】
簡潔に述べると、１５，０００ＵＡを正常男性試料から無作為に選択し、−これを全部で３０回繰り返し−、正規化目的のために平均を算出した（Ｒｅｆ＿ＵＡ）。各試料に対して、性別判定および異数性検出のために最初の１５，０００ＵＡ（クエリー＿ＵＡ）を選択した。ＵＡをまとめ、各染色体（ＵＡｉ、ｉ＝１、２、…Ｘ、Ｙ）についてカウントし、ＵＡｉ／１５，０００×１００により、各染色体について対応するパーセンテージ（％ＵＡｉ）を計算した。クエリー試料の染色体のそれぞれに対する％ＵＡｉ（クエリー＿％ＵＡｉ）を正常男性参照（Ｒｅｆ＿％ＵＡｉ）に対して正規化し、各染色体のコピー数を検出するために補正した（Ｎｏｒｍ’＿％ＵＡｉ）（図７、図２Ａ）。
【００４９】
実施例８
内部正規化
ＤＮＡ配列決定またはマイクロアレイを使用したコピー数変動および／または異数性の判定のために、参照試料中のシグナル存在度と試験試料中のシグナル存在度を比較する。例えば、試験試料ＡからのＤＮＡの「Ｘ」ｎｇを配列決定する場合、１００ｋのユニークな読み取りデータは２１番染色体にマッピングする。同じ配列決定の実行において試験試料Ｂからの「Ｘ」ｎｇのＤＮＡを配列決定する場合、１５０ｋのユニークな読み取りデータは２１番染色体にマッピングする。しかし、同じ配列決定の実行において「Ｘ」ｎｇの参照、正常、ＤＮＡ試料を配列決定する場合、１００ｋのユニークな読み取りデータは２１番染色体にマッピングされる。したがって、試料Ａは参照試料と同じ２１番染色体の存在度を有し、一方で試料Ｂでは５０％多く、すなわち２１トリソミーである。
【００５０】
別の実施形態において、２１番染色体にマッピングする読み取りデータの相対的存在度を内部参照、例えば１番染色体などと比較する。参照試料を使用して正常な比率を決定し得る。将来的な実行において、２１番染色体からの読み取りデータ数に対する１番染色体からの読み取りデータの比率を決定する。この比率の低下は、参照染色体と比較して２１番染色体の存在度が相対的に上昇していることを示唆する。
【００５１】
この分析は、試験の感度および特異性を向上させるために（例えば低カバレッジの配列決定またはマイクロアレイ）参照試料を用いて従来からの分析と合わせて行い得るか、または参照試料も実行する必要を回避するために単独で実行し得る。
【００５２】
図８で示される場合、内部参照を使用した稼働１〜４は、本発明者ら自身のＤＮＡ配列決定データを使用するか、または他のグループから得るかにかかわらず、変動係数が非常に低い。
【図１Ａ】
2019501641.tif 000011
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【配列表】
2019501641000001.app
【国際調査報告】
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2019501641.tif 000028