(57)【要約】  本発明は、ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）タンパク質に対する、およびＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインに由来する免疫原ペプチドに対する、抗体またはその抗原結合断片に関する。本発明はさらに、免疫原性ペプチド、および該抗ＨＬＡ−Ｇ特異的抗体を産生するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列Ｘ１−ＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ−Ｘ２（配列番号４９）からなる単離されたペプチドであって、ここで、Ｘ１は、存在しないか、システイン、バリン、またはＫＴＨＶ（配列番号５０）もしくはＣＫＴＨＶ（配列番号５１）からなる群より選択される配列であり、Ｘ２は、存在しないか、またはシステインである、ペプチド。
【請求項２】
該ペプチドが、環状であって、かつ配列ＣＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５２）またはＣＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５３）からなり、ここで、Ｎ末端およびＣ末端のシステイン残基がジスルフィド結合で連結されている；
または、該ペプチドが、直鎖状であって、かつ以下：
ＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号５４）；
ＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５５）；
ＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５６）；
ＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号５７）；
ＣＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号５８）；
ＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号５９）；
ＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号６０）および
ＣＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号６１）
からなる群より選択される配列からなる、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を産生するための免疫原としての、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドを特異的に認識する、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体、好ましくはモノクローナル抗体。
【請求項５】
該抗体が、完全長抗体、その抗原結合断片、好ましくはｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、または二重特異的抗体である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
（ａ）配列番号８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号１０の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）および配列番号１２の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号２の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列ＫＶＳの軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および配列番号５の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項４または５に記載の抗体。
【請求項７】
（ａ）配列番号６４を含むか、または配列番号６４と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号６３を含むか、または配列番号６３と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含み、ここで、該抗体が、好ましくは、配列番号６４を含む可変領域（ＶＨ）を含む２つの重鎖；ならびに、配列番号６３を含む可変領域（ＶＬ）を含む２つの軽鎖を含む、完全長免疫グロブリンＧである、請求項４または５に記載の抗体。
【請求項８】
マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項４から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
請求項４から８のいずれか一項に記載の抗体の、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）または両方をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む、ベクター、好ましくは発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主細胞を、抗体の発現を可能にする条件下で培養することを含む、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体を産生する方法。
【請求項１３】
細胞傷害性薬物と結合された、請求項４から８のいずれか一項に記載の抗体を含む複合体。
【請求項１４】
癌またはウイルス感染の処置のための、請求項４から８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
生物学的サンプルにおいてＨＬＡ−Ｇを検出またはモニタリングするためのインビトロ診断法における、請求項４から８のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１６】
請求項４から８のいずれか一項に記載の抗体を含む、診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）タンパク質のα３ドメインに由来する免疫原性ペプチドに対する抗体またはその抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術的背景
癌において、１つの主要な免疫逃避機構は、Ｔ細胞シグナル伝達を損なう細胞表面上の阻害分子の発現である。これらの阻害分子の多くは、免疫チェックポイント（ＩＣＰ）とみなされ、自己免疫寛容(self-tolerance)を維持し、末梢組織内の生理学的免疫応答の持続時間および強度を調節して副次的な組織損傷を回避することが最初に示された多数の阻害経路を意味する。
【０００３】
ＨＬＡ−Ｇは、最近、その特定の受容体との相互作用により免疫細胞サブセットに浸潤するエフェクター機能を阻害し、腫瘍細胞においてしばしば上方制御される、ＩＣＰ分子として同定された（Carosella et al., 2015).
【０００４】
さらに、ＨＬＡ−Ｇはまた、ウイルス感染、自己免疫疾患および炎症性疾患のような病理学的状態または同種移植後において、新たに発現され得る、および／または上方制御され得る。
【０００５】
例えば、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、ＨＳＶ−１（ヘルペス単純ウイルス）、ＲＡＢＶ（狂犬病ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＩＡＶ（Ａ型インフルエンザウイルス）およびＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルスＩ型）などのウイルスは、ＨＬＡ−Ｇの発現を上方制御して、感染細胞がＣＴＬ細胞およびＮＫ細胞により認識され攻撃されるのを防ぐと考えられている。ＨＬＡ−Ｇはまた、ＣＤ８細胞をアポトーシスに誘導し、その細胞傷害性に影響を与えることにより、ＨＩＶ感染細胞に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を制御し得る（Tripathi and Agrawal, 2007）。
【０００６】
ＨＬＡ−Ｇは、絨毛癌細胞において最初に同定された非古典的ＭＨＣクラスＩ分子である。ＭＨＣクラスＩ抗原としては、β2−ミクログロブリン（β２Ｍ）に関連する３つの細胞外球状ドメイン（α１、α２およびα３）を示す古典的抗原ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ、ならびに非古典的抗原ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦおよびＨＬＡ−Ｇが挙げられる。
【０００７】
古典的なＭＨＣクラスＩ分子とは異なり、ＨＬＡ−Ｇは、（ｉ）限定された多型、（ｉｉ）組織特異的発現、および（ｉｉｉ）その機能による相違、によって特徴付けられる。
【０００８】
ＨＬＡ−Ｇ分子をコードする８つのエクソン遺伝子は、第６番染色体上の４．４ｋｂに及ぶ（Geraghty et al., 1987; Ellis et al., 1990）。エクソン２、３および４は、それぞれα１、α２およびα３細胞外ドメインをコードしている。一次ＲＮＡ転写物は、選択的にスプライシングされて７つのイソ型の発現をもたらし得て、そのうち４つは、膜結合型（ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３およびＨＬＡ−Ｇ４）であり、３つは、可溶性（ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびＨＬＡ−Ｇ７）である。ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５は、記載されている最も主要なイソ型であり、これはおそらく部分的には、抗体などの限られたＨＬＡ−Ｇ試薬のためである。それらの構造は、古典的なＨＬＡクラスＩ分子の典型である：重鎖が、β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）に非共有結合した３つの細胞外球状ドメインからなり、他のイソ型であるペプチドはより短く、重鎖の１つまたは２つの球状ドメインを欠失しており、β２Ｍとの会合はない。
【０００９】
ＨＬＡ−Ｇの免疫阻害活性は、３つの阻害受容体：白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ）、ＬＩＬＲＢ２（ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ）およびＫＩＲ２ＤＬ４（または、ＣＤ１５８ｄ）への特異的結合を介して生じる。
【００１０】
これらの受容体との相互作用を介して、古典的ＭＨＣクラスＩ分子とは異なり、ＨＬＡ−Ｇは、免疫系の主要な機能を下方制御するものとして作用し、刺激機能も同種ＨＬＡ−Ｇに対する応答も、今日まで報告されていない（Carosella et al., 2008a）。
【００１１】
他のＭＨＣクラスＩ分子と同様に、ＬＩＬＲＢ受容体は、ＨＬＡ−Ｇのα３ドメインと相互作用する。ＬＩＬＲＢ１受容体は、Ｂ細胞、ある種のＴ細胞、ある種のＮＫ細胞およびＡＰＣ（単球および樹状細胞）上で発現されるが、ＬＩＬＲＢ２発現は、骨髄系列に限定され、単球および樹状細胞でのみ発現される。
【００１２】
ＬＩＬＲＢ１およびＬＩＬＲＢ２受容体は、それぞれ、α３ドメイン／β２Ｍ複合体またはα３ドメインのみを介して、広範な古典的ＭＨＣ分子に結合する。実際に、ＬＩＬＲＢ１は、β２Ｍ結合ＨＬＡ−Ｇ複合体のみに結合し、一方で、ＬＩＬＲＢ２は、β２Ｍ結合ＨＬＡ−Ｇ分子および未β２Ｍ結合ＨＬＡ−Ｇ分子の両方、ならびに短縮型α１−α３ドメインイソ型を認識する。
【００１３】
ＨＬＡ−Ｇは、古典的ＭＨＣクラスＩ分子と比べて、ＬＩＬＲＢ２受容体に最も高い親和性を有するリガンドである。ＬＩＬＲＢ１およびＬＩＬＲＢ２受容体に対するＨＬＡ−Ｇの高親和性は、古典的なＭＨＣクラスＩ分子がその表面に発現されているとしても、腫瘍細胞の表面に提示されるＨＬＡ−ＧがＬＩＬＲＢ１および／またはＬＩＬＲＢ２受容体に結合し得るという事実によって特に示される。ＬＩＬＲＢ受容体に対するＨＬＡ−Ｇのこの優先的相互作用は、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性機能を阻害するのに十分である。
【００１４】
ＬＩＬＲＢ１および２受容体は、同じＨＬＡ−Ｇ型に結合せず、単量体構造よりもＨＬＡ−Ｇ多量体に対して高い親和性を示す（HoWangYin et al., 2012）。ＨＬＡ−Ｇに対するＬＩＲＢ受容体のこの高い親和性は、古典的ＭＨＣクラスＩ分子には存在しないＨＬＡ−Ｇのα３ドメイン内の芳香族アミノ酸であるＰｈｅ１９５およびＴｙｒ１９７の存在に関連することが示されている。
【００１５】
エフェクター細胞を阻害するために腫瘍細胞によって用いられる逃避機構としてのＨＬＡ−Ｇ発現の関連性は、広く実証されている（Loustau et al., 2013）。腫瘍細胞拒絶を媒介する目的を有するＨＬＡ−Ｇを標的とするいくつかのアプローチが開発されている（Carosella et al., 2008b; Yan, 2011）。わずかな抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が作製されており、たった１つのブロッキング抗体のみが利用可能である（８７Ｇ）（Blaschitz et al., 2000; Menier et al., 2003）。このモノクローナル抗体８７Ｇは、β２Ｍに結合するＨＬＡ−Ｇの重鎖のα１ドメインと相互作用する。ＨＬＡ−Ｇ中和することができ、それ故にインビトロおよびインビボでの腫瘍拒絶を回復することができると記載されているが（Agaugue et al., 2011）、その適用可能性は、ＨＬＡ−Ｇが未β２Ｍ結合完全長分子または短縮型イソ型として発現することが多いために、損なわれる。これらの種々のイソ型は、ＬＩＬＲＢ２阻害受容体に結合することもできる。
【００１６】
ＨＬＡ−Ｇ免疫化は著しく困難であり、特異的抗体はほとんど得られなかった。この中和抗体の生成の失敗の理由は明らかにされている。腎臓移植患者において、ＨＬＡ−Ｇの存在が抗体産生に有利に働かないことが実証された（Qiu et al., 2006）。最近のインビトロ研究により、ＨＬＡ−Ｇ／ＬＩＬＲＢ１相互作用が、ヒトにおけるＢ細胞成熟および抗体産生を損なうことが確認されている（Naji et al., 2014）。ＨＬＡ−Ｇはまた、モノクローナル抗体を産生するために一般的に用いられる種であるマウスにおいて免疫寛容機能（tolerogenic function）を発揮することも知られている（Favier et al., 2001）。ＨＬＡ−Ｇは、マウスＢ細胞において発現され、ヒトＬＩＬＲＢ１およびＬＩＬＲＢ２と機能的に相同である、ＰＩＲ−Ｂ受容体と相互作用する（Liang et al., 2002）。ＨＬＡ−Ｇ／ＰＩＲ−Ｂ相互作用は、Ｂ細胞の阻害をもたらして、マウスにおける抗体産生を阻止し得る。
【００１７】
見かけ上、ＴＰ２５．９９と称される古典的ＭＨＣクラスＩ分子のα３ドメインに対するモノクローナル抗体が開発されている（Tanabe et al., 1992）。しかしながら、他のものは、ＨＬＡ−Ｇのα３ドメインに結合しないことが示されている（Desai et al., 2000; Moy et al., 2000）。この相違は、抗体産生に好ましくないＨＬＡ−Ｇ α３ドメインの疎水性の特徴によって説明できる。
【００１８】
国際特許出願ＷＯ２０１４／０７２５３４は、ＨＬＡ−Ｇの完全α３ドメインを用いたＤＮＡ免疫化によって抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を産生および開発するための方法を提案しているが、全てのＨＬＡ−Ｇイソ型を認識し、ＨＬＡ−Ｇに関して改善された特異性を示す、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１９】
発明の概要
本発明者らは、今般、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインから免疫原性ペプチドを設計することにより、特異的抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を産生する困難性を回避することに成功した。
【００２０】
本発明の第一の目的は、配列 Ｘ１−ＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ−Ｘ２（配列番号４９）（ここで、Ｘ１は存在しない、システイン、バリン、またはＫＴＨＶ（配列番号５０）もしくはＣＫＴＨＶ（配列番号５１）からなる群より選択される配列であり、Ｘ２は、存在しない、またはシステインである。）からなる単離されたペプチドである。
【００２１】
かかるペプチドは、ＨＬＡ−Ｇタンパク質イソ型のα３ドメインに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を産生するための免疫原として有用である。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、本明細書で定義されるペプチドを特異的に認識する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２３】
抗体は、完全長抗体、その抗原結合断片、または二重特異性抗体であってもよい。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、そのような抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００２５】
本発明の別の目的は、本明細書で定義される抗体の、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）または両方をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。
【００２６】
該核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターもまた提供される。
該核酸またはベクターを含む宿主細胞がさらに記載される。
【００２７】
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を産生するための方法がさらに提供される。好ましい態様において、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体を産生する方法であって、該核酸または該ベクターを含む宿主細胞を、抗体の発現を可能にする条件下で培養することを含む方法が記載される。
【００２８】
抗体、該抗体を発現させる核酸またはベクターは、癌またはウイルス感染の処置に特に有用である。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、生体試料においてＨＬＡ−Ｇを検出またはモニタリングするためのインビトロ診断法における、本明細書に記載の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の使用である。
【００３０】
該抗体を含む診断キットがさらに包含される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１．抗原の設計、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の免疫化および産生。Ａ．ヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質とＨＬＡ−Ｅ、Ａ２、Ｂ７、Ｂ４４およびＣＷ３とのアミノ酸配列アライメント。配列アライメントは、ＨＬＡ−Ｇの３つの免疫グロブリンドメイン：α１、α２およびα３について提供される。灰色で示された残基は、ＨＬＡ−Ｇとの相違を示す。ＬＩＬＲＢ１／２結合に関与するα３ドメイン中の領域は、黒色の両方向の矢印で示されている。ＨＬＡ−Ｇ特異的ＰＣ−１ペプチドのアミノ酸配列に下線を付し、太字で示す。Ｂ．免疫化したマウスにおける抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の産生。免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウス（黒色線／濃い灰色のヒストグラム）および免疫化していない対照マウス（薄い灰色線およびヒストグラム）由来の抗ＨＬＡ−Ｇ血清反応性の代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。破線は、それより高いシグナルは正であるとみなされる閾値を示す。血清を調製し、希釈し、そしてＨＬＡ−Ｇ５被覆ビーズと共にインキュベートして、その後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした。蛍光をフローサイトメトリーにより分析した。血清の４つの希釈物が示されている。Ｃ．ビオチン結合ＰＣ１ペプチドに対するＲ４Ｃ−Ｃ３（菱形記号／点線）およびＲ５Ｃ−Ｄ８（丸記号／破線）ｓｃＦｖ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＳｃＦｖ抗体を連続的に希釈し、ストレプトアビジンマイクロプレート上にコーティングしたビオチン−ＰＣ１を用いた直接ＥＬＩＳＡにより試験した。非ＨＬＡ−Ｇビオチニル化ペプチドを対照として用いた（四角および三角記号／太線）。
【図２】図２．Ａ．１５Ｅ７のκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。抗体の“相補性決定領域”（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の位置、ならびに“フレームワーク領域”（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）の位置を示す。Ｂ．１５Ｅ７のκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列と対応するマウス生殖細胞系アミノ酸配列との配列アライメント。生殖系列配列とは異なる１５Ｅ７ κ軽鎖の配列中のアミノ酸を太字で示す。ＣＤＲの位置が示されている。
【００３２】
【図３】図３．Ａ．１５Ｅ７の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の位置、ならびにＦＲの位置を示す。Ｂ．１５Ｅ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と対応するマウス生殖細胞系アミノ酸配列との配列アライメント。生殖系列配列とは異なる１５Ｅ７重鎖の配列中のアミノ酸を太字で示す。ＣＤＲの位置が示されている。
【図４】図４．Ａ．ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３のκ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。ｓｃＦｖのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の位置、ならびにＦＲの位置を示す。Ｂ．ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３のκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列と対応するマウス生殖細胞系アミノ酸配列との配列アライメント。生殖系列配列とは異なるｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３ κ軽鎖の配列中のアミノ酸を太字で示す。ＣＤＲの位置が示されている。
【図５】図５．Ａ．ｓｃＦｖ抗体Ｒ４Ｃ−Ｃ３の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。ｓｃＦｖ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の位置、ならびにＦＲの位置を示す。Ｂ．ｓｃＦｖ抗体Ｒ４Ｃ−Ｃ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と対応するマウス生殖細胞系アミノ酸配列との配列アライメント。生殖系列配列とは異なるｓｃＦｖ抗体Ｒ４Ｃ−Ｃ３重鎖の配列中のアミノ酸を太字で示す。ＣＤＲの位置が示されている。
【００３３】
【図６】図６．Ａ．１５Ｅ７モノクローナル抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１：分子量マーカー− 上から下へ順に、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、３７ｋＤａ、２５ｋＤａおよび２０ｋＤａ。レーン２：対照としてのマウスＩｇＧ。レーン３：１５Ｅ７モノクローナル抗体。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブリリアントブルーＢで染色した。Ｂｌｉｔｚバイオレイヤ干渉計システムを用いた、１５Ｅ７モノクローナル抗体のＰＣ−１ペプチドへの結合の反応速度分析。１５Ｅ７モノクローナル抗体をアミノカップリングによりＡＲ２Ｇチップに固定化した。種々の濃度のＰＣ−１ペプチド/ＢＳＡ（５〜６００ｎＭ）を、バイオセンサー表面に結合した１５Ｅ７と共にインキュベートした。分析を、１２０秒間（結合段階）の３０秒の時点で開始し、その後、緩衝液のみを１００秒間インキュベートして、１５Ｅ７からのＰＣ−１／ＢＳＡの解離を記録した。点線（１５０秒）の左側は会合速度を示し、右側は解離段階を示す。上の線は、１５Ｅ７の最高濃度のペプチド（６００ｎＭ）への結合に対応し、下の線は、最低濃度のペプチド（５ｎＭ）への結合に対応する。結合はペプチド濃度に比例した（中間線）。
【図７】図７．モノクローナル抗体１５Ｅ７のその標的への用量依存的結合：ｃＰＣ−１ペプチド（図７Ａ）；ＨＬＡ−Ｇ５組換えタンパク質（図７Ｂ）またはＨＬＡ−Ｇ６組換えタンパク質（両方とも、β２Ｍ結合のないタンパク質）（図７Ｃ）。種々の連続濃度の１５Ｅ７を用いて、用量依存的結合活性を判定した。ＰＥ結合ヤギ抗マウス抗体を用いたフローサイトメトリーにより、結合検出を行った。結合は、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ）での染色と比べて、１５Ｅ７での陽性標識ビーズの割合として表される。１５Ｅ７のＥＣ５０を、ｃＰＣ−１ペプチドでは２ｎｇ／ｍＬで、ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質では２８ｎｇ／ｍＬで、およびＨＬＡ−Ｇ６タンパク質では１２０ｎｇ／ｍＬで評価した。測定はトリプリケートで行った（ｎ＝３）；エラーバーはＳＤを示す。黒色線はリガンド被覆ビーズへの１５Ｅ７の結合を表し、灰色線は、対照ビーズ［変異ペプチド（図７Ａ）または非結合ビーズ（図７Ｂおよび７Ｃ）で被覆したビーズ］への１５Ｅ７の結合を表す
【００３４】
【図８】図８．Ｋ５６２細胞表面上に発現された未β２Ｍ結合ＨＬＡ−Ｇ１に対する抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体１５Ｅ７の用量依存的結合。種々の濃度（０−８０μｇ／ｍＬ）の１５Ｅ７を用いて、ＨＬＡ−Ｇ１陽性細胞（Ｋ５６２−Ｇ１） 対 ＨＬＡ−Ｇ陰性対照細胞（Ｋ５６２−ＰＶ）に対する１５Ｅ７の特異的用量依存的結合活性を判定した。１５Ｅ７の検出を、ＰＥ結合ヤギ抗マウス抗体を用いてフローサイトメトリーにより行った。１５Ｅ７は、標的Ｋ５６２−Ｇ１細胞に用量依存的結合を示すが（黒色線）、対照細胞株Ｋ５６２−ＰＶでは結合は検出されなかった（灰色線）。
【図９】図９．未処理のまたは酸処理したＫ５６２−Ｇ１およびＫ５６２−ＰＶ細胞（Ａ、Ｂ）ならびにＪＥＧ−３細胞（Ｃ）上の表面ＨＬＡ−Ｇ抗原のフローサイトメトリー分析。表面ＨＬＡ−Ｇ抗原を、以下のｍＡｂ：ＭＥＭ−Ｇ／９（天然ＨＬＡ−Ｇ複合体に特異的）、抗ｈβ２Ｍおよび１５Ｅ７によって分析した。ヒストグラム：明るい灰色：非染色；灰色：アイソタイプ対照（高β２ＭについてＩｇＭ、１５Ｅ７ ｍＡｂについてＩｇＧ２ａおよび４Ｈ８４についてＩｇＧ１）；暗灰色；示された抗体。
【図１０】図１０．１５Ｅ７モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−Ｇに特異的に結合し、古典的ＭＨＣクラスＩ分子に結合しない。１５Ｅ７の特異性を評価するこれらの結合アッセイを、ヒト古典的ＭＨＣクラスＩ分子をその表面に発現するが、ＨＬＡ−Ｇを発現しないリンパ腫細胞株（ＬＣＬ ＤＥＳ、ＬＣＬ ＢＲＯおよびＲＰＭＩ８８６６）を用いて行い、フローサイトメトリーにより分析した。１５Ｅ７を終濃度２０μｇ／ｍＬで用いた。結合は、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ）と比べて、１５Ｅ７での陽性染色細胞の割合として表される。Ｋ５６２−Ｇ１細胞およびＫ５６２−ＰＶ細胞をそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
ＨＬＡ−Ｇ治療用および診断用抗体は、Ｂ細胞の成熟および抗体分泌に対するＨＬＡ−Ｇ免疫寛容機能のために不十分である。本発明者らは、抗ＨＬＡ−Ｇ特異的抗体を誘導することができたＨＬＡ−Ｇ−α３ドメインに由来するペプチドを用いることにより、この阻害を回避することに成功した。
【００３６】
本発明は、ＨＬＡ−Ｇに特異的に結合し、多くの望ましい特性を示す、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体を提供する。実際に、生成された抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、古典的ＭＨＣクラスＩ分子との交差反応性がない場合、組換えまたは内生のいずれかのＨＬＡ−Ｇタンパク質に強く結合する。
【００３７】
本発明はまた、患者の細胞のいくつかの表面上でのＨＬＡ−Ｇの病理学的発現から生じる免疫系を回復させるためのかかる抗体の使用に関する。従って、抗体は、患者において診断された状態が、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の存在のために、患者において免疫系の下方制御の利点を有するとき、該患者の状態を処置または軽減するための使用に適している。本発明の抗体はまた、患者の状態の診断またはモニタリングのために使用され得る。
【００３８】
定義
抗体は、それが他の物質と結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、および／またはより長い持続時間で結合する場合、標的抗原に“特異的に結合する（specifically binds）”。“特異的結合（Specific binding）”または“優先的結合（preferential binding）”は、排他的結合を（それを含み得るが）必ずしも必要としない。一般的には、必ずしもそうではないが、結合への言及は優先的結合を意味する。結合の親和性は、結合速度定数および解離速度定数またはＫＤ（平衡解離）によって定義される。一般的に、抗体に関して用いられるとき、特異的結合とは、１０−８Ｍ未満、例えば１０−９Ｍ未満または１０−１０Ｍ未満の親和性（ＫＤ）値でその標的（複数可）に特異的に結合する（“認識する”）抗体を意味する。１０−９ＭのＫＤ値が１０−８ＭのＫＤ値より高い結合親和性を示すため、より低いＫＤ値は、より高い結合親和性（すなわち、より強い結合）を表す。
【００３９】
本発明において、本発明の抗体または抗原結合断片による“ＨＬＡ−Ｇタンパク質結合”は、本発明の抗体または抗原結合断片が、α３ドメインを提示するＨＬＡ−Ｇタンパク質イソ型を認識するか、またはα３ドメインと結合することが見いだされたが、β２−ミクログロブリンタンパク質もしくはその断片と結合するかまたは結合しないことがさらに見出されたことを意味する。
【００４０】
“結合する（associated）”とは、考慮されるドメイン間またはドメインおよびタンパク質間の密接な（非共有的な）相互作用を意味する。このような相互作用は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、またはイオン結合の形成によって達成され得る。
【００４１】
本発明の抗体またはその抗原結合断片の“特異的結合”特性とは、抗体またはその抗原結合断片が、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の他のドメインを除いて、または他のヒトタンパク質への結合を除いて、特に他のＨＬＡタンパク質への結合を除いて、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインに直接的に結合することを意味する。結合能は、本発明の技術分野において公知の従来の試験に従って、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインに対する結合親和性の判定によって測定することができ、特に結合親和性は、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析によりアッセイすることができる。特定の態様に従い、“特異的結合”は、本発明の抗体またはその抗原結合断片とＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインとの間のこのような特異的結合を介した相互作用が、本発明の抗体またはその抗原結合断片と他のヒトタンパク質、または他のＨＬＡ−Ｇドメインまたは他のＨＬＡタンパク質との間の相互作用よりも安定であることを意味する。安定性は、抗原−抗体複合体の、経時的または競合条件下での持続性を比較することによって、特に、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインを認識する抗体の解離定数を測定することによって、評価することができる。
【００４２】
“ブロッキング抗体”は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質と、その受容体のいずれかまたは全てとの、例えばＬＩＬＲＢ１受容体および／またはＬＩＬＲＢ２受容体との相互作用を阻害する抗体である。従って、“ブロッキング”とは、一般的に、α３ドメインまたはそれらの受容体を介するＨＬＡ−Ｇタンパク質間の結合によってもたらされる生物学的機能が、本発明の抗体または抗原結合断片の存在下でなくなる、または著しく減少することを意味する。本明細書に記載の生物学的機能とは、本明細書に記載され、文献で評価されている、α３ドメインを示すＨＬＡ−Ｇタンパク質の免疫阻害活性である。従って、抗体または抗原結合断片は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のアンタゴニスト物質、またはα３ドメインを有するＨＬＡ−Ｇタンパク質の作用のアンタゴニスト物質であると言える。なぜなら、かかるＨＬＡ−Ｇタンパク質の活性と干渉するおよび／またはその活性に少なくとも部分的にまたは完全に、直接的または間接的に反対（逆）だからである。好ましくは、ＨＬＡ−Ｇ受容体のいずれかまたは全てとの相互作用、すなわち結合の減少は、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％である。活性は、当技術分野で公知の結合アッセイによって測定することができる。
【００４３】
用語“Ｋａｂａｔの番号付け”、“Ｋａｂａｔの定義”および“Ｋａｂａｔのラベル付け”は、本明細書中、互換的に用いられる。当技術分野で認識されるこれらの用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基よりもより可変的(すなわち、超可変的)であるアミノ酸残基を番号付けるシステムを意味する（Kabat et al. 1971; Kabat, et al. 1991）。
【００４４】
本明細書で用いる用語“ＣＤＲ”は、抗体可変配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに３のＣＤＲが存在し、それらは、可変領域のそれぞれについて、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。本明細書で用いる用語“ＣＤＲセット”は、抗原に結合することができる単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲの一群を意味する。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔ（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) および (1991))に記載されるシステムは、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基の番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基の境界も提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者ら（Chothia et al, 1987 および Chothia et al., 1989）は、ＫａｂａｔのＣＤＲ内の特定のサブ部分が、アミノ酸配列レベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンフォメーションを有することを見出した。
【００４５】
本発明の抗体の“抗原結合断片”は、抗体の一部、すなわちＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインの抗原結合能を示す、本発明の抗体の構造の一部に対応する分子を意味する。特定の態様において、該断片は、完全な抗体構造を有する抗体の抗原結合能と実質的に同じ該ドメインに対する抗原結合能を示す。この抗原結合能は、標的抗原に対する抗体の親和性および考慮される抗原結合断片の親和性を測定することにより判定され得る。
【００４６】
抗体の抗原結合断片は、免疫原性ペプチドの認識部位を包含するＣＤＲまたはその一部（複数可）と称される超可変ドメインを含む断片を包含する。４鎖免疫グロブリンの各軽鎖および重鎖（それぞれＶＬおよびＶＨ）は、それぞれＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３およびＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを有する。従って、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３ならびにＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のうち全てのまたは選択されたＣＤＲまたはその機能的部分、すなわち、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインに対して、所望の結合能を示す、好ましくは高い親和性を有する部分を含むかまたはそれからなる本発明の抗体の断片（抗原結合断片）に関する。
【００４７】
用語“モノクローナル抗体”は、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を意味し、それが産生される方法によらない。従って、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。
【００４８】
“ポリクローナル血清”とは、特異的抗原に対して産生された多数の異なる抗体またはそのフラグメントの異種集団を含む血清を意味し、即ち、それらは、該特異的抗原に見出される多数の異なる抗原決定基に特異的である。
【００４９】
本明細書で用いる“キメラ抗体”は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において対応する配列と同一かまたは相同であるが、残りの鎖（複数可）が、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体の断片において対応する配列と同一化または相同である抗体であって、それらが所望の生物学的活性を示す限り、かかる抗体を意味する。本明細書で用いる“ヒト化抗体”は、“キメラ抗体”のサブセットである。
【００５０】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一態様において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および／またはその標的に対する能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト哺乳動物などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある例において、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域の残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている場合もある。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、またはドナー抗体中にも見られない残基を含み得る。これらの改変は、結合親和性などの抗体の性能をさらに精緻化するために行われる。一般的には、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性、異性化、免疫原性などの抗体の性能を改善する、１つ以上の個々のＦＲ残基置換を含んでいてよい、少なくとも１つ、および一般的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、一般的にＨ鎖では６以下であり、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の、一般的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含む。
【００５１】
“ヒト抗体”は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものであり、および／またはファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で公知のヒト抗体の作製技術のいずれかを用いて作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
【００５２】
２つのアミノ酸配列の“同一性パーセント”は、Karlin and Altschul, 1993で修正された、Karlin and Altschul, 1990に記載のアルゴリズムを用いて決定することができる。このようなアルゴリズムは、Altschulら（1990）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（1997）に記載のギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータを用いることができる。
【００５３】
“保存的置換”は、そのような修飾がなされた元の分子と同様の機能的および化学的特性を有する分子を産生し得る。例えば、“保存的アミノ酸置換”は、あるアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響を及ぼさないように、その位置の該アミノ酸残基を別の残基で置換することを含み得る。所望のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）は、当業者により決定され得る。例えば、アミノ酸置換を用いて、分子配列の重要な残基を同定するか、または本明細書に記載の分子の親和性を増減させることができる。１以上の保存的アミノ酸置換を含む変異体は、当業者に知られているポリペプチド配列を改変する方法、例えば係る方法を記載する参考文献、例えば、Molecular Cloning： A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley ＆ Sons, Inc., New Yorkに見出される方法に従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換には、以下の群中のアミノ酸間でなされる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および、（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００５４】
用語“対象”、“個体”および“患者”は、本明細書中互換的に用いられ、処置について評価されるべき、および／または処置されるべき哺乳動物を意味する。対象は、ヒトであってもよいが、他の哺乳動物、特にヒト疾患の実験モデルとして有用な哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌなども包含される。
【００５５】
用語“処置”または“処置する”とは、ヒトを含む対象が、該対象の状態（病状）を直接的または間接的に改善する目的で医療援助を受ける、動作、適用または治療を意味する。特に、この用語は、いくつかの態様において、発症率の低下、症状の緩和、再発をなくす、再発を少なくする、発症の予防、症状の改善、予後の改善またはそれらの組合せを意味する。当業者は、処置が必ずしも症状の完全な撤廃または除去をもたらすとは限らないことを理解し得る。例えば、癌に関して、“処置”または“処置する”とは、腫瘍性または悪性の細胞増殖（cell growth）、増殖（proliferation）または転移を遅らせること、腫瘍性または悪性の細胞増殖、増殖または転移の発生を予防または遅延させること、あるいはそれらのいくつかの組合せを意味し得る。
【００５６】
免疫原性ペプチド
本発明者らは、古典的ＭＨＣクラスＩ分子に対して交差反応性のない、ＨＬＡ−Ｇに特異的な抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を開発するための免疫原性ペプチドを設計した。
ＨＬＡ−Ｇアミノ酸配列は、図１Ａに示すように、他のＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ｅ、Ａ２、Ｂ７、Ｂ４４およびＣＷ３）とは異なる。ＨＬＡ−Ｇの配列と比べてＭＨＣクラスＩ配列のアミノ酸における変異を灰色で強調し、異なるドメイン内に多くのホットスポットが示されている。特に、ＨＬＡ−Ｇの高度に特異的な配列が、位置１９４−１９７のα３ドメイン内で同定された。ＨＬＡ−Ｇ α３ドメインのこの部分は、ＨＬＡ−Ｇとその受容体との間の相互作用に必須のアミノ酸を包含する（図１Ａ）。
【００５７】
これに基づいて、本発明者らは、配列Ｘ１−ＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ−Ｘ２（配列番号４９）からなる免疫原性ペプチドを設計した（ここで、Ｘ１は存在しないか、システイン、バリンであるか、またはＫＴＨＶ（配列番号５０）もしくはＣＫＴＨＶ（配列番号５１）からなる群より選択される配列であり、Ｘ２は存在しないか、またはシステインである）。
【００５８】
好ましい態様において、ペプチドは環状であり、以下の配列からなる：
ａ．ＣＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５２）、
ｂ．ＣＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５３）、
ここで、ジスルフィド結合はＮ末端およびＣ末端のシステイン残基を連結する。
【００５９】
別の好ましい態様において、ペプチドは直線状であり、以下からなる群より選択される配列からなる：
ＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号５４）；
ＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５５）；
ＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５６）；
ＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号５７）；
ＣＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号５８）；
ＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号５９）；
ＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号６０）および
ＣＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ（配列番号６１）。
【００６０】
ペプチドは、当技術分野で公知の任意の技術、例えば化学合成または組換えにより製造され得る。
該ペプチドをコードする核酸も提供される。
【００６１】
本発明はまた、核酸のクローニングおよび／または発現のためのベクター、とりわけ宿主細胞におけるクローニングおよび／または発現に適するプラスミドに関する。
特定の態様により、転写および発現の調節配列を加えることができる。
【００６２】
組換え発現ベクターは、一般的に、構成的または誘導可能のいずれかで、プロモーターに作動可能に連結された発現するための配列をコードする核酸を含む。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製および組込みに適し得る。一般的なベクターは、転写および翻訳ターミネーター配列、開始配列、および前記免疫原性ペプチドをコードする核酸の発現調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは、場合により、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物および原核生物の両方においてカセットの複製を可能にする配列、すなわちシャトルベクター、ならびに原核システムおよび真核システムの両方のための選択マーカーを含む、一般的な発現カセットを含む。
【００６３】
以下にさらに詳細に記載するように、免疫原性ペプチドは、免疫化によって抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を産生するために有用である。
【００６４】
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体
本発明は、上記に定義の免疫原性ペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００６５】
本発明の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体はすべて、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインを認識する。
【００６６】
特定の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ＨＬＡ−Ｇを発現する細胞において天然に見出される立体構造を有するＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインに特異的に結合する。換言すれば、本発明のかかる抗体またはその抗原結合断片は、ＨＬＡ−Ｇを発現する細胞において天然に見出されるＨＬＡ−Ｇのα３ドメインの特異的エピトープを認識する。
【００６７】
本発明の目的は、α３ドメインを包含するＨＬＡ−Ｇイソ型に対する、またはα３ドメインに関連するＨＬＡ−Ｇイソ型を認識する、特異的抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を産生することである。従って、ＨＬＡ−Ｇタンパク質への結合を言及するとき、本発明は、とりわけ、α３ドメインを表すＨＬＡ−Ｇイソ型への結合に関する。
【００６８】
特定の態様において、ＨＬＡ−Ｇの可溶性形態を認識する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６９】
別の態様において、ＨＬＡ−Ｇの膜アンカー型を認識する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００７０】
最も好ましい態様において、本発明の抗体は、直線状または環状のいずれかの免疫原性ペプチド、ならびに可溶性形態のＨＬＡ−Ｇタンパク質および細胞表面の（すなわち、天然立体構造の）ＨＬＡ−Ｇプロテインを認識する。
【００７１】
上記のように、ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、一般にイソ型と呼ばれる、いくつかの構造的形態（または三次元形態）で見いだされ得る。ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５は、それぞれ、β２−ミクログロブリンタンパク質と関連してまたは関係なく見出される膜結合または分泌型ＨＬＡ−Ｇタンパク質である。対照的に、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３およびＨＬＡ−Ｇ４は、同時にα２およびα３ドメインの全てを示さない膜結合型ＨＬＡ−Ｇタンパク質イソ型である。ＨＬＡ−Ｇ１イソ型はまた、細胞表面で二量体形態として見出され得る。ＨＬＡ−Ｇ６およびＨＬＡ−Ｇ７は、同時に全てのα２およびα３ドメインを示さない分泌型ＨＬＡ−Ｇタンパク質イソ型である。
【００７２】
有利には、本発明の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、α３ドメインをを示すＨＬＡ−Ｇのすべてのイソ型を認識する。
【００７３】
好ましい態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５およびＨＬＡ−Ｇ６（単量体および二量体イソ型）から選択されるＨＬＡ−Ｇタンパク質イソ型の少なくとも１つまたは幾つかに結合する。
【００７４】
特定の態様において、本発明の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、β２−ミクログロブリンタンパク質と結合している、または結合していないにかかわらず、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を認識する。
【００７５】
しかしながら、ある場合に、ＨＬＡ−Ｇタンパク質に結合して見いだされ得るβ２−ミクログロブリンタンパク質は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の全てのイソ型に体系的に存在するわけではない。上記に詳述したように、結合したβ２−ミクログロブリンタンパク質の存在も、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のＬＩＬＲＢ２阻害受容体への結合を可能にするために必ずしも必要ではない。
【００７６】
従って、本発明において、“β２−ミクログロブリン未結合ＨＬＡ−Ｇタンパク質”は、β２−ミクログロブリンタンパク質に結合していないＨＬＡ−Ｇタンパク質に関する。“β２−ミクログロブリン未結合短縮型ＨＬＡ−Ｇタンパク質イソ型”または“α３ドメイン提示するβ２−ミクログロブリン未結合短縮型ＨＬＡ−Ｇタンパク質イソ型”とは、ＨＬＡ−Ｇタンパク質に見出され得る全てのドメインを提示せず、かつβ２−ミクログロブリンタンパク質と結合しない、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を意味する。
【００７７】
本発明の特定の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ＨＬＡ−Ｇ、特にβ２−ミクログロブリン未結合ＨＬＡ−Ｇ、すなわち、α３ドメインを示すβ２−ミクログロブリン未結合ＨＬＡ−Ｇまたはα３ドメインを示すβ２−ミクログロブリン未結合短縮型ＨＬＡ−Ｇに存在するとき、α３ドメインに特異的に結合する
【００７８】
特定の態様において、ＨＬＡ−Ｇタンパク質が単量体または二量体の形態であるとき、このタンパク質のα３ドメインに結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００７９】
特定の態様により、本発明の抗体またはその抗原結合断片は両方とも、ＨＬＡ−Ｇタンパク質が単量体および／または二量体の形態であるとき、該タンパク質のα３ドメインに結合し、およびβ２−ミクログロブリンタンパク質が結合しているか否かに関わらず、ＨＬＡ−Ｇタンパク質に存在するとき、α３ドメインに結合する。
【００８０】
本発明の特定の態様を説明する目的で、該抗体のＣＤＲを含む可変ドメインを含む抗体の抗原結合断片は、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２を包含し、それらは、ＫａｂａｔおよびまたＲｏｉｔｔ Iら（Fundamental and Applied Immunology MEDSI/McGraw-Hill）を参照して明確に定義されている。Ｆｖ断片は、疎水性相互作用によって互いに結合した抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる；ｄｓＦｖ断片において、ＶＨ：ＶＬヘテロ二量体は、ジスルフィド結合によって安定化されている；ｓｃＦｖ断片において、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、フレキシブルなペプチドリンカーを介して互いに連結され、従って一本鎖タンパク質を形成している。Ｆａｂ断片は、抗体のパパイン消化によって得られる単量体断片である；それらは、ジスルフィド結合を介して互いに結合したＬ鎖全体、およびＨ鎖のＶＨ−ＣＨ１断片を含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域のジスルフィド結合部の抗体のペプシン消化によって産生され得る；それは、２つのＦａｂ’断片を含み、さらに免疫グロブリン分子のヒンジ領域の一部を含む。Ｆａｂ’断片は、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによってＦ（ａｂ’）２断片から得られ得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は二価であり、すなわち、それらは、天然の免疫グロブリン分子のように２つの抗原結合部位を含む；一方、Ｆｖ（Ｆａｂの可変部分を構成するＶＨ−ＶＬ二量体）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＦａｂ’ 断片は、一価であり、すなわち、それらは、１つの抗原結合部位を含む。
【００８１】
最も好ましい態様において、ｓｃＦｖ断片が提供される。
【００８２】
ＶＨ−ＣＤＲ３および／またはＶＬ−ＣＤＲ３もしくはそれらの機能的部分を含むか、またはそれからなる断片は、ＣＤＲ３領域が抗原認識特異性の決定因子であると思われるとき、特に好ましい。特定の抗原結合断片は、抗体のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。
【００８３】
本発明のこれらの抗原結合断片は、二重特異性抗体、トリボディー（tribodies）またはテトラボディー（tetrabodies）などの多価抗原結合断片を得るために共に組み合わされ得る。これらの多価抗原結合断片も本発明の一部である。
【００８４】
同一または異なる抗原上の２つの異なるエピトープに同時に結合することができる、二重特異性抗体または多重特異性抗体もまた、包含される。二重特異性抗体または多重特異性抗体は、２つの抗体の化学結合、２つの抗体を産生する細胞株の融合、または組換え二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体分子が得られる遺伝的アプローチなどの種々の生化学的方法によって得ることができる。
【００８５】
本発明の特定の態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。従って、本発明はモノクローナル抗体にも関し、これらの抗体の組成物は、抗原結合特異性に関して、従って、可変領域組成に関して、同一である抗体を含むことを意味する。
【００８６】
本発明のさらなる態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ポリクローナル血清として提供されるか、またはポリクローナル血清から精製される。
【００８７】
本発明において、抗体は、非ヒト哺乳動物抗体、例えばマウス抗体、またはキメラ抗体であってよい。好ましい態様において、抗体は、ヒト化されていてよい。特定の態様において、ヒト抗体が包含される。
【００８８】
別の態様において、本発明はまた、本明細書に記載の定義のいずれかによる抗体またはその抗原結合断片を含む構築物であって、ここで、該抗体またはその抗原結合断片が、機能的に異なる分子と複合体を形成している、構築物に関する。
【００８９】
本発明の構築物は、共有結合、移植（grafting）、化学的もしくは生物学的基もしくは分子との化学結合、例えば保護基もしくはインビボでのプロテアーゼ切断からの保護に適する分子、抗体または抗原結合断片の安定性および／もしくは半減期の改善のための分子など、生物学的に活性な分子、とりわけ治療的に有効な成分、例えば毒素もしくは細胞傷害性薬物、ヒト身体の特定の細胞もしくは組織に対して抗体または抗原結合断片を標的化するのに適するベクター（とりわけタンパク質ベクターを含む）との化学結合、または標識、例えば放射性元素との化学結合、または、とりわけ抗体の断片がも用いられるとき、リンカーとの化学結合を含む、任意の好適な結合形態から生じる融合タンパク質または複合体のいずれかであり得る。
【００９０】
好ましい抗体またはその抗原結合断片の例を以下に記載する。
【００９１】
特定の態様において、
（ａ）配列番号８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、および／または配列番号１０の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および／または配列番号１２の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号２の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、および／または配列ＫＶＳの軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および／または配列番号５の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が提供される。
【００９２】
好ましくは、かかる抗体は、
（ａ）配列番号８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号１０の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１２の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号２の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列ＫＶＳの軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および配列番号５の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。
【００９３】
さらに好ましくは、かかる抗体は、
（ａ）配列番号６４を含むか、または配列番号６４と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号６３を含むか、または配列番号６３と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含み得る。
【００９４】
特定の態様において、該相同配列は、アミノ酸の保存的置換によってのみ異なる。
別の態様において、該相同配列は、ヒト化配列である。
【００９５】
特定の側面において、抗体は、配列番号６４を含む可変領域（ＶＨ）を含む２つの重鎖；ならびに、配列番号６３を含む可変領域（ＶＬ）を含む２つの軽鎖を含む、完全長免疫グロブリンＧである。かかる抗体は、１５Ｅ７と称され、実施例部分に、より詳細に記載されている。
【００９６】
別の特定の態様において、
（ａ）配列番号２３の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、および／または配列番号２５の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および／または配列番号２７の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号１５の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、および／または配列ＫＶＳの軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および／または配列番号１８の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む抗体を提供する。
【００９７】
好ましくは、かかる抗体は、
（ａ）配列番号２３の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号２５の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号２７の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号１５の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、の配列ＫＶＳ軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１８の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。
【００９８】
さらに好ましくは、かかる抗体は、
（ａ）配列番号６７を含むか、または配列番号６７と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号６５を含むか、または配列番号６５と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含み得る。
【００９９】
特定の態様において、該相同配列は、アミノ酸の保存的置換によってのみ異なる。
別の態様において、該相同配列は、ヒト化配列である。
【０１００】
好ましい側面において、配列番号６７を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号６５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むｓｃＦｖを提供する。かかるｓｃＦｖ断片は、Ｒ４Ｃ−Ｃ３と称され、実施例部分により詳細に記載されている。
【０１０１】
別の特定の態様において、
（ａ）配列番号２３の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、および／または配列番号２５の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および／または配列番号２７の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号１５の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、および／または配列ＫＶＳの軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および／または配列番号２０の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む抗体を提供する。
【０１０２】
好ましくは、かかる抗体は、
（ａ）配列番号２３の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号２５の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号２７の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号１５の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列ＫＶＳの軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）および配列番号２０の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。
【０１０３】
さらに好ましくは、かかる抗体は、
（ａ）配列番号６７を含むか、または配列番号６７と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または
（ｂ）配列番号６６を含むか、または配列番号６６と８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含み得る。
【０１０４】
特定の態様において、該相同配列は、アミノ酸の保存的置換によってのみ異なる。
別の態様において、該相同配列は、ヒト化配列である。
【０１０５】
別の側面において、配列番号６７を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号６６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むｓｃＦｖを提供する。かかるｓｃＦｖ断片は、Ｒ５Ｃ−Ｄ８と称される。
【０１０６】
抗体の可変領域の配列は配列表に列記され、以下に記載される。
抗体１５Ｅ７のＶＬ κ鎖：
FR1: DVLMTQIPFSLPVSLGDQASISCRSS (配列番号１)
CDR1: QSIVHRSGNTY (配列番号２)
FR2: LEWYLQKPGQSPKLLIY (配列番号３)
CDR2: KVS
FR3: NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC (配列番号４)
CDR3: FQGSHLPPT (配列番号５)
FR4: FGGTTLEIK (配列番号６)
抗体１５Ｅ７のＶＨ鎖：
FR1: QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKAS (配列番号７)
CDR1: GYTFTDYW (配列番号８)
FR2: MDWVKQRPGQGLEWIGT (配列番号９)
CDR2: IYPSDSST (配列番号１０)
FR3: HYNQEFKGKATMTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYC (配列番号１１)
CDR3: AREGLAGVFYFDY (配列番号１２)
FR4: WGQGTTLTVSS (配列番号１３)
ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３のＶＬ κ鎖：
FR1: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS (配列番号１４)
CDR1: QSLVHSNGNTY (配列番号１５)
FR2: LHWYLQKPGQSPKLLIY (配列番号１６)
CDR2: KVS
FR3: NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC (配列番号１７)
CDR3: SQSTHFPPT (配列番号１８)
FR4: FGGGTKLEII (配列番号１９)
ｓｃＦｖ Ｒ５Ｃ−Ｄ８のＶＬ κ鎖：
FR1: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS (配列番号１４)
CDR1:QSLVHSNGNTY (配列番号１５)
FR2:LHWYLQKPGQSPKLLIY (配列番号１６)
CDR2: KVS
FR3: NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC (配列番号１７)
CDR3: SQSTHVPPT (配列番号２０)
FR4: FGAGTKLELK (配列番号２１)
ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３およびＲ５Ｃ−Ｄ８のＶＨ鎖：
FR1: QVQLKQSGPQLVRPGASVKIPCKAS (配列番号２２)
CDR1:GYSFTNYW (配列番号２３)
FR2:MHWVKQRPGQGLEWIGM (配列番号２４)
CDR2: IAPSDSDS(配列番号２５)
FR3: RLNQNFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYC (配列番号２６)
CDR3: AREGVTMITTGLDY (配列番号２７)
FR4: WGQGTTLTVSS (配列番号２８)
【０１０７】
さらなる抗体（Ｎ２７Ｆ１２およびＮ３８Ｆ４と称される）ならびにｓｃＦｖ（３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｃ１０、３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｇ３および３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｈ１０と称される）が産生されている。該さらなる抗体およびｓｃＦｖの可変領域の配列は配列表に列記され、以下に記載される。
抗体Ｎ２７Ｆ１２のＶＬ κ鎖：
FR1: ENVLTQSPAIMAASLGEKVTMTCSAS (配列番号６８)
CDR1: SSVSSNF (配列番号６９)
FR2: LHWYQQKSGTSPKLWIY (配列番号７０)
CDR2: GTS
FR3: NLASGVPARFSGSGTGISYSLTVSNMEAENDAAYYC (配列番号７１)
CDR3: QQWNAYPFT (配列番号７２)
FR4: FGAGTKLELK (配列番号２１)
抗体Ｎ２７Ｆ１２のＶＨ鎖：
FR1: EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVAS (配列番号７３)
CDR1: GFTFSSYW (配列番号７４)
FR2: LSWVRQSPEKGLEWVAE (配列番号７５)
CDR2: VRLKSDNYAT (配列番号７６)
FR3: SYAESVKGKFTISRDDANSRLYLQMNSLRPEDTGIYYC (配列番号７７)
CDR3: TTGDY (配列番号７８)
FR4: WGQGTTLTVSS (配列番号１３)
抗体Ｎ３８Ｆ４のＶＬ κ鎖：
FR1: DVVMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSS (配列番号７９)
CDR1: QSLVNSNGNTL (配列番号８０)
FR2: LHWYLQKPGQSPKLLIY (配列番号１６)
CDR2: KVS
FR3: NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC (配列番号１７)
CDR3: SQSTHVPWT (配列番号８１)
FR4: FGGGTKLEIK (配列番号８２)
抗体Ｎ３８Ｆ４のＶＨ鎖：
FR1: EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVAS (配列番号７３)
CDR1: GLTFSSYW (配列番号８３)
FR2: MSWVRQSPEKGLEWVAE (配列番号８４)
CDR2: IRLRSDNYVK (配列番号８５)
FR3: QYADSVKGRFTISRDDSKGRLYLQMNRLRGDDTGIYFC (配列番号８６)
CDR3: TTGDY (配列番号７８)
FR4: WGQGTTLTVSS (配列番号１３)
ｓｃＦｖ ３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｃ１０および３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｇ３のＶＬ κ鎖：
FR1: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS (配列番号１４)
CDR1: QTIVHSNGNTY (配列番号８７)
FR2: LEWYLQKPGQSPKLLIY (配列番号３)
CDR2: KVS
FR3: NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC (配列番号４)
CDR3: FQGSHVPPT (配列番号８８)
FR4: FGGGTKLEIK (配列番号８２)
ｓｃＦｖ ３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｃ１０のＶＨ鎖：
FR1: EVQLQQSGAELVKPGTSVKLSCKAS (配列番号８９)
CDR1: GYTFTRNW (配列番号９０)
FR2: ITWVRLRPGQGLEWIGD (配列番号９１)
CDR2: IYPGDAST (配列番号９２)
FR3: HYNGKFKNKATLTVDTSSSTAYLQVSSLTSEDSAVYYC (配列番号９３)
CDR3: AREQVQFAMFFDV (配列番号９４)
FR4: WGTGATVTVSS (配列番号９５)
ｓｃＦｖ ３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｇ３のＶＨ鎖：
FR1: QVQLQQPRAELVKPGASVKMSCKAS (配列番号９６)
CDR1: GYTFARYW (配列番号９７)
FR2: ISWLKLRPGQGLEWIGD (配列番号９８)
CDR2: IYPGDDST (配列番号９９)
FR3: HYNGKFKNKATLTVDTSTSTAYIQLSSLTSEDSAVYYC (配列番号１００)
CDR3: AREQVQFAMFFDV (配列番号９４)
FR4: WGTGATVTVSS (配列番号９５)
ｓｃＦｖ ３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｈ１０のＶＬ κ鎖：
FR1: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS (配列番号１４)
CDR1: QSIVHSNGNTY (配列番号１０１)
FR2: LEWYLQKPGQSPKLLIY (配列番号３)
CDR2: KVS
FR3: NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC (配列番号４)
CDR3: FQGSHVPPT (配列番号８８)
FR4: FGGGTKLEIK (配列番号８２)
ｓｃＦｖ ３１５７−Ｃ５７−Ｒ６Ｂ−Ｈ１０のＶＨ鎖：
FR1: QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKAS (配列番号７)
CDR1: GYTFTDYW (配列番号８)
FR2: MDWVKQRPGQGLEWIGT (配列番号９)
CDR2: IYPSDSST (配列番号１０)
FR3: HYNQEFKGKATMTVDKSSSTAYMHLGSLTSEDSAVYYC (配列番号１０２)
CDR3: AREGLAGVFYFDY (配列番号１２)
FR4: WGQGTTLTVSS (配列番号１３)
【０１０８】
本発明はまた、より高い結合親和性などの抗体の改善された生物学的特性を有する、上記の好ましい抗体の抗体変異体も提供する。該抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入すること、またはペプチド合成により、調製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入および／または置換が含まれる。欠失、挿入および置換の任意の組合せを行って最終構築物とされ、ただし、該最終構築物は所望の特性を有する。抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製することができる。これらの方法には、オリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異導入、ＰＣＲ突然変異誘発、および先に調製した変異抗体または変異していない（天然の）抗体のカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。一態様において、本発明の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）値は、１０−８ Ｍ未満、特に１０−９ Ｍ未満または１０−１０ Ｍ未満である。結合親和性は、ＥＬＩＳＡまたは生物特異的相互作用分析（biospecific interaction analysis）などの当技術分野で公知の技術、または当技術分野で公知の他の技術を用いて決定され得る。
【０１０９】
本明細書に記載の抗体は、常套法に従って、抗原結合活性、抗原結合特異性、および生物学的機能などのそれらの特性を決定するために試験され得る。
【０１１０】
本明細書に記載の抗体は、例えばペグ化、グリコシル化などによって、当技術分野において公知であり、容易に利用可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するように修飾することができる。血清半減期を延長し得る修飾が有用である。
【０１１１】
免疫化による抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の産生
本発明の一側面において、上記の免疫原性ペプチドは、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインに特異的な抗体を産生するための免疫原として有用であり得る。
【０１１２】
従って、説明を目的として、本発明の抗体またはそのフラグメントは、哺乳動物、特に齧歯動物、とりわけマウスまたはラットに、上記の免疫原性ペプチドを免疫化することで得られ得る。種々の哺乳動物の遺伝子型が、哺乳動物の免疫化を介して本発明を実施するのに適していると結論付けることができる。
【０１１３】
免疫化プロトコールは、プライミング（priming）工程およびブースティング（boosting）工程を包含してよく、より詳細には後述する。
【０１１４】
従って、本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合断片の製造法であって、
ａ．非ヒト動物への、上記の免疫原性ペプチドの投与、
ｂ．該動物から得られた血清または血漿サンプルからの誘発された抗体の回収、およびＨＬＡ−Ｇタンパク質のα３ドメインに対する特異性の検査、
ｃ．要すれば、回収された抗体のクローニング、ならびに
ｄ．要すれば、該回収された抗体からの抗原結合断片の調製
を含む方法に関する。
【０１１５】
生成された抗体または抗原結合断片の投与、回収、およびその後のクローニングは、当技術分野における常套法によって達成することができる。例えば、高度な配列決定法を用いたクローニングの前の特性化方法もまた当技術分野で周知である。
【０１１６】
回収された抗体からの抗原結合断片の調製はまた、当技術分野における常套方法、特にハイスループット合成技術によって達成することもできる。
【０１１７】
抗体または抗原結合断片の産生のための宿主動物は、ヒトを除く哺乳動物、とりわけ齧歯動物、特にマウスであり得る。
【０１１８】
特定の態様により、本明細書に記載の製造方法はまた、本発明の抗体の製造のために用いられる宿主動物を屠殺する工程を含む。
【０１１９】
特定の態様により、本発明の抗体またはその抗原結合断片の製造方法は、工程ａにおいて、任意の成分、特に化合物として定義される、投与される抗原（複数可）または免疫原性抗原断片（複数可）と組み合わせて用いられるとき、抗原特異的免疫応答を補助、促進、延長または増強するように作用するアジュバントの同時投与を包含する。アジュバントは、免疫化（またはワクチン接種）および免疫療法の分野において周知である。
【０１２０】
特定の態様により、上記の方法の工程ａによる投与は、活性免疫原性物質の第１の投与（プライム（prime）免疫化または投与）、その後の免疫化プロトコールの過程で第１の投与から時間を置いて、少なくとも１回のさらなる投与（ブースト(boost)免疫化またはブースト投与）を意味するプライムブースト免疫化プロトコールを用いて行われる。ブースト免疫化には、１回、２回、３回またはそれ以上の投与が含まれる。
【０１２１】
特定の態様において、用いるプライムブースト免疫化プロトコールは、同種（homologous）または異種（heterologous）の免疫化プロトコールのいずれかであり、投与された活性な免疫原性成分（例えば、抗体または断片）が、プライム投与およびブースト投与においてそれぞれ同じであるか、または異なることを意味する。
【０１２２】
特定の態様において、プライム投与が行われるとき、および／またはブースト免疫化が行われるときを含む、上記の方法の工程ａにおける活性な免疫原性成分の投与は、アジュバント、例えばＦｒｅｕｎｄのアジュバントと共に同時に行われる。アジュバントは、当技術分野で周知の物質である。
【０１２３】
特定の態様において、アジュバント投与は、特にポリペプチドまたはその免疫原性断片が免疫化に用いられるとき、プライム免疫化およびブースト免疫化の両方で実行される。
【０１２４】
免疫化を使用して抗体またはその抗原結合断片を産生することを目的とした免疫プロトコールを設計するためのベースであるか、またはベースとして用いることができる免疫プロトコールの詳細は、後記の実施例セクションに記載されている。
【０１２５】
別の態様において、哺乳動物は、該免疫原性ペプチドをコードする核酸またはベクターを用いて、例えばＤＮＡ免疫化の手段によって、免疫化される。
【０１２６】
ＤＮＡ免疫化のための幾つかの送達方法、例えば、ＤＮＡを細胞外空間へ送達する、生理食塩溶液中の核酸またはベクターの筋肉内または皮内注射などが一般的に利用可能である。この方法は、生物学的組織の電気刺激を用いて一時的に細胞膜を透過させる“エレクトロポレーション”によって補助され得る。あるいは、細胞の細胞質にＤＮＡを直接送達させ得る噴射式（Ballistic）装置を用いることにより、プラスミド被覆金粒子を用いて皮膚に衝突させることを含む、“遺伝子銃送達”を用いることができる。あるいは、プラスミドＤＮＡを表皮および真皮の細胞に導入する力を圧力に依存する“ニードルフリー（無針）装置”を用いることができる。
【０１２７】
ポリクローナル抗体調製のために、免疫化された非ヒト動物から血清を得て、その中に存在する抗体を周知技術により単離する。血清は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を得るために固体支持体に結合させた上記の免疫原性ペプチドを用いてアフィニティー精製されてもよい。
【０１２８】
別の態様において、免疫化していない非ヒト哺乳動物由来のリンパ球を単離し、インビトロで増殖させ、その後、細胞培養において免疫原に曝露させる。その後、リンパ球を回収し、以下に記載の融合工程を実行する。
【０１２９】
モノクローナル抗体について、次の工程は、免疫化された非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離、およびその後の、抗体産生ハイブリドーマを形成するための、これらの脾細胞と不死化細胞との融合である（Harlow et al., 1988; Hammerling, et al, 1981に記載）。
【０１３０】
あるいは、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、組換え技術およびファージ提示技術またはそれらの組み合わせの使用を含む、任意の他の公知の技術を用いて調製することができる。
【０１３１】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントの組換え産生には、以下に記載の、適当な宿主細胞中で抗体またはそのフラグメントをコードする核酸を発現させることが含まれる。
【０１３２】
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の組換え産生
本発明はまた、本明細書に記載の本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子に関する。
【０１３３】
特に、上記の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）またはその両方をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【０１３４】
本明細書に記載のＣＤＲのヌクレオチド配列は、容易に設計することができるか、または配列決定することができる。
【０１３５】
例示の目的で、モノクローナル抗体１５Ｅ７の軽鎖および重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、それぞれ、図２Ａおよび３Ａに示す、配列番号３５および配列番号３８である。
【０１３６】
ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、図４Ａに示す配列番号４１であり、Ｒ４Ｃ−Ｃ３重鎖ヌクレオチド配列、すなわち配列番号４６は、図５Ａに示される。
【０１３７】
さらに、組換え抗体またはそのフラグメントを産生するための方法も記載される。
【０１３８】
本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸は、発現ベクターに挿入される。軽鎖および重鎖は、同じか、または異なる発現ベクター中にクローニングされる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現べクター（複数可）内の調節配列に作動可能に連結されている。かかる調節配列には、シグナル配列、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結配列が含まれる。発現ベクターは、一般的に、宿主生物において、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えばテトラサイクリンまたはネオマイシンを含み得る。
【０１３９】
一例において、重鎖および軽鎖の両方のコード配列は、１つの発現ベクターに含まれる。別の例において、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれは、個々のベクター内にクローニングされる。後者の場合、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、インビボまたはインビトロのいずれかで無傷の（インタクトな）抗体を組み立てることを可能にする、両方の鎖の発現のために１つの宿主細胞に同時にトランスフェクトすることができる。あるいは、重鎖をコードする発現ベクターおよび軽鎖をコードする発現ベクターは、重鎖および軽鎖のそれぞれを発現させるために異なる宿主細胞に導入され得て、その後、それらを精製および組み立ててインビトロでインタクトな抗体を形成することができる。
【０１４０】
本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、細菌細胞、酵母細胞、糸状菌細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞などの原核および真核発現系において産生され得る。本発明の組換え抗体はグリコシル化されるか、または真核細胞において発現される必要はない；しかしながら、哺乳動物細胞における発現が一般的に好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト胚性腎臓細胞株（２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−または＋ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、Ｆｌｐ−ｉｎ ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ細胞）、およびヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
無傷の（インタクトな）免疫グロブリンを分泌することができる多数の好適な宿主細胞株が当技術分野で開発されているため、哺乳動物組織細胞培養は、ポリペプチドを発現し、産生するのに好ましく、それらには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株、または形質転換されたＢ細胞もしくはハイブリドーマが含まれる。
【０１４２】
これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーなどの発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。
【０１４３】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖をコードする配列ならびに発現制御配列）を含むベクターは、宿主細胞タイプによって変わる、周知の方法によって宿主細胞内に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを、他の宿主細胞に使用することができる（一般的に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press、2nd ed., 1989)を参照のこと）。重鎖および軽鎖が別個の発現ベクター上にクローニングされるとき、該ベクターを同時トランスフェクトして、発現させ、そして無傷の免疫グロブリンを得る。
【０１４４】
宿主細胞を、ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトし（例えば、化学的トランスフェクション法またはエレクトロポレーション法によって）、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、常套の（または適宜修飾された）栄養培地中で培養する。
【０１４５】
一旦発現されると、本発明の抗体またはそのフラグメントは、さらなるアッセイおよび適用のために実質的に均一な調製物を得るためにさらに単離または精製され得る。当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製法を用いることができる。例えば、好適な精製手順は、免疫親和性またはイオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、硫酸アンモニウム沈殿、およびゲル濾過を含み得る（一般的に、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照のこと）。少なくとも約９０から９５％の均質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、医薬用途のためには９８から９９％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。
【０１４６】
ファージディスプレイ法
所望の結合特性を有する抗体は、ファージディスプレイライブラリーおよびスクリーニングを用いて産生させることもできる。
【０１４７】
特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別個にクローニングし、ファージライブラリーに無作為に組み換え、その後、それをWinter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載の通りに、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、一般的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントとして、抗体フラグメントを提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。あるいは、天然レパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、免疫化工程なしに広範囲の非自己および自己抗原に対する抗体の単一供給源を提供することができる。最後に、天然ライブラリーを、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードするランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて、インビトロで再編成することによって、合成的に作製することもできる。
【０１４８】
治療用途
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体またはその抗原結合断片、かかる抗体またはフラグメントをコードする核酸、あるいはそれらを発現するベクターは、癌または癌性疾患ならびに関連または併発疾患または状態などの病状の処置に、これらの病理がＨＬＡ−Ｇに関与する腫瘍の免疫回避機構と関連しているとき、有用である。より一般的には、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体またはその抗原結合断片は、宿主におけるＨＬＡ−Ｇタンパク質の不適切な発現を含む病状の治療に有用である。
【０１４９】
より具体的には、本明細書中、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体またはその抗原結合断片、かかる抗体またはフラグメントをコードする核酸、あるいはそれらを発現するベクターを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌またはウイルス感染を処置するための方法が記載される。
【０１５０】
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体またはその抗原結合断片は、単一の有効成分として、または化学療法、放射線療法もしくは治療的ワクチン接種を含む別の免疫療法などの別の処置法と組み合わせて用いられ得る。
【０１５１】
本明細書に記載される抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、ＨＬＡ−Ｇに関連する免疫回避機構に対抗するのに有用であり、全体的な抗腫瘍効果を高め、癌患者に有益である。
【０１５２】
特定の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、抗体をブロッキングし得る。“ブロッキング抗体”、または“中和抗体”は、少なくとも白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ）またはＬＩＬＲＢ２（ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ）に対するＨＬＡ−Ｇ結合を阻害する抗体を意味する。
【０１５３】
特定の態様により、以下のＨＬＡ−Ｇタンパク質イソ型：ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５またはＨＬＡ−Ｇ６の少なくとも１つまたは複数と、α３ドメインによって認識されるそれらの受容体との間の結合が阻止される。
【０１５４】
特定の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、α3ドメインを提示するＨＬＡ−Ｇタンパク質の、ＬＩＬＲＢ１またはＬＩＬＲＢ２受容体の少なくとも一方への結合をブロックし、特に該ＨＬＡ−Ｇタンパク質のＬＩＬＲＢ１受容体およびＬＩＬＲＢ２受容体の両方への結合をブロックする。
【０１５５】
別の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、細胞傷害性薬物と複合体化され得る。ある側面において、このような構築物（抗体−薬物複合体またはＡＤＣとも称される）は、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーであり得る、少なくとも１つのスペーサーまたはリンカーをさらに含む。かかるリンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。抗体を細胞傷害性薬物に連結させる幾つかの方法が当業者に公知である。ＡＤＣは、一般的に、表面に露出したリシンまたは鎖間ジスルフィド結合の還元により生成された遊離システインのいずれかの側鎖を介して抗体に該細胞傷害性薬物を結合させることによって生成される。
【０１５６】
細胞傷害性薬物または細胞毒素は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、および／または細胞の破壊（細胞死）を引き起こし、および／または抗腫瘍／抗増殖効果を発揮する、当技術分野で公知の任意の分子であり得る。細胞傷害性薬物の多くのクラスが、ＡＤＣ分子に有用性を有する可能性があることが知られている。これらには、限定されないが、アマニチン、オーリスタチン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、エンジイン、レキシトロプシン、タキサン類、ピューロマイシン、メイタンシノイド、ビンカアルカロイド、チューブリジンおよびピロロベンゾジアゼピンが含まれる。植物毒素および細菌毒素を含む毒素、例えば破傷風またはジフテリア毒素、リシン、サポニン、エンドトキシンＡなどは、細胞傷害性薬物として用いることができる。
【０１５７】
特定の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、放射性核種に複合体化され得る。
【０１５８】
さらに別の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、それらが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進するＦｃ領域を含むように、改変（例えば、修飾またはキメラ化）され得る。多くのＦｃ変異体が、その目的のために既報である（例えば、Lazar et al, 2006; Moore et al, 2010）。
【０１５９】
かかる抗体または複合体は、癌の処置に有用である。
【０１６０】
癌は任意のタイプの癌を意味し、好ましくは膀胱癌、腎癌、泌尿生殖器癌および黒色腫から選択され得る。癌疾患または腫瘍性状態の他の限定されない例は、白血病、基底細胞癌、乳癌、悪性中皮腫、光線性角化症、淡明細胞型腎細胞癌、網膜芽細胞腫、棘状細胞癌、上皮内癌（in situ carcinoma）、結腸直腸癌、卵巣癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、類内膜腺癌、古典的ホジキンリンパ腫、肺癌、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、胃癌、大腸癌、胆道癌、膵管腺癌、食道扁平上皮癌、胞状奇胎である。
【０１６１】
ウイルス感染の間、ＨＬＡ−Ｇ発現の上方制御は、免疫系による破壊を免れるために幾つかのウイルスによって用いられる戦略の一部を形成する。
本発明に従って処置され得るウイルス感染の限定されない例は、ＨＩＶ感染、狂犬病ウイルス感染またはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染、ならびにＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、ＨＳＶ−1（ヘルペス単純ウイルス）またはＩＡＶ（Ａ型インフルエンザウイルス）による感染である。
【０１６２】
別の側面において、本発明は、組成物、例えば、薬学的担体と共に製剤された、本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載の“薬学的担体”には、生理的に適合性の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与（例えば、注射または点滴による）に適する。
【０１６３】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。投与の経路および／または様式は、所望の結果によって変わってよい。
【０１６４】
選択された投与量レベルは、投与経路、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および過去の病歴などを含む種々の要因によって変わってよい。例えば、本発明の抗体は、３回／週から１回／月の範囲で０．２〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され得る。
【０１６５】
別の側面において、医薬またはワクチンは、該抗体もしくはフラグメントをコードする核酸、または該核酸を含むベクターを含む組成物である。
【０１６６】
ベクターは、有利には、ウイルスベクターであってよく、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクターおよびアデノウイルス関連ベクターからなる群より選択されるウイルスベクターであり得る。
【０１６７】
核酸、ベクターまたは組成物は、直接投与することができるか、または投与前にリポソームにパッケージされ、または金コロイド粒子上にコーティングされ得る。特定の態様において、本発明の抗体をコードする核酸は、裸（naked）の形態で投与され得る。
【０１６８】
遺伝子による免疫化のために、ワクチン組成物は、好ましくは、注射またはガス圧駆動式パーティクルボンバードメント（gas driven particle bombardment）により腫瘍内または全てのタイプのリンパ系組織に、皮内、皮下、筋肉内に投与され、宿主における免疫応答を刺激するのに有効な量で送達される。本発明の好ましい態様において、投与は、注射工程に加えて、本明細書中“エレクトロトランスファー”という用語によっても記載されるエレクトロポレーション工程を含む。
【０１６９】
核酸はまた、リポソームトランスフェクション、パーティクルボンバードメントまたはウイルス形質導入（同時培養技術を含む）を用いて、エクスビボでリンパ系細胞または骨髄細胞に投与され得る。次いで、処置された細胞を免疫される対象に再導入する。
【０１７０】
さらに別の側面において、免疫原性ペプチド、該ペプチドをコードする核酸、または該ペプチドを発現するベクターは、患者における抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のインビボ産生のために使用される。
【０１７１】
診断方法およびキット
本発明はまた、ＨＬＡ−Ｇタンパク質をインビトロで検出する、あるいは健康状態もしくは病状をモニタリングまたは診断するのに適する手段、ならびに健康状態もしくは病状をモニタリングまたは診断するための手段であって、そのような状態もしくは病状になりやすい患者に行う手段を提供する。
【０１７２】
特定の態様において、この病状は癌またはウイルス感染である。
【０１７３】
特に、本発明は、サンプル中のＨＬＡ−Ｇタンパク質を検出する、および／または特定の健康状態を示しやすい、もしくは病状を有しやすい患者から以前に得られたサンプルの分析により健康状態もしくは病状をモニタリングもしくは診断するためのインビトロ方法に関し、該方法は、以下の操作：
ａ．免疫複合体の形成を可能にする条件下で、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片をサンプルと接触させること、および
ｂ．該抗体またはその抗原結合断片とＨＬＡ−Ｇタンパク質との間で形成される免疫複合体をインビトロで検出すること
を含む。
【０１７４】
特定の態様により、本発明は、サンプル、例えば妊娠しやすい患者から以前に得られたサンプルまたは臓器もしくは組織もしくは細胞移植（複数可）を受けた患者から得られたサンプル中の、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のインビトロ検出を可能にする。結果として、健康状態、すなわち病的状態の存在を必ずしも必要としない生理的状態のモニタリングを行うことができる。従って、その後の病的状態の存在または不存在の診断も行うことができる。
【０１７５】
サンプルが病的状態を呈する可能性のある患者から以前に得られたとき、そのような病的状態のその後のモニタリングまたは診断も行うことができる。特定の態様において、病的状態とは、上記に記載の状態を意味する。
【０１７６】
本発明はまた、上記のインビトロアッセイ法または診断方法のためのキットに関し、該キットは、以下のもの：
ａ．本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片、
ｂ．（ａ）の抗体またはその抗原結合断片とアッセイするためのサンプルとの免疫複合体（複数可）の形成に適する試薬（複数可）；
ｃ．場合により、工程（ｂ）の免疫複合体（複数可）の形成を検出するのに適する試薬（複数可）
を含む。
【０１７７】
ＨＬＡ−Ｇタンパク質の検出は、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡアッセイなどの液相での検出のような、当技術分野で公知の任意の技術によって達成され得る。特定の態様により、（ａ）それに結合された固定化された抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を有する支持体（ここで、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は本発明の抗体である）；および、（ｂ）それに結合されたレポーター分子を有する可動性（mobile）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体（ＨＬＡ Ｇタンパク質の別のエピトープに結合する）を含むキットが提供される。レポーター分子は、定量的またはほぼ定量的に検出可能な任意の分子であり得る。例えば、レポーター分子は、比色分析試薬、蛍光測定試薬、放射性同位体試薬、または検出可能なエンドポイントを有する酵素剤であってもよい。
【０１７８】
本発明の方法は、要すれば、生物学的サンプル中で検出された標識の量をＨＬＡ−Ｇ標準と比較することによりＨＬＡ−Ｇを測定する工程を含み得る。
【０１７９】
本発明の方法は、生物学的サンプルを含む。そのようなサンプルは、組織サンプル、例えば腫瘍組織サンプル、血液サンプル、組織サンプルと接触する培地、および例えば単離された細胞を用いるとき、該細胞と接触する培地、羊水、胚と接触する培地から選択されてよいが、これらに限定されない。本発明の方法は、ＨＬＡ−Ｇ発現を示す状態を診断または検出するために用いられ得る。この態様において、ＨＬＡ−Ｇ発現を示す状態の対照値は、サンプル中に見出されるＨＬＡ−Ｇの量と比較され得る。ＨＬＡ−Ｇが低いかまたは存在しない場合、特定の状態が示され得て、他の状態は、増加したＨＬＡ−Ｇレベルによって示され得る。当業者は、状態の診断に有用な指標レベルを容易に決定することができる。そのようなＨＬＡ−Ｇ指標状態は、子癇前症、子癇前症の危険性の増加、胎児の有害転帰（adverse fetal outcome）、胎児の有害転帰のリスクの増加、癌、または癌発症のリスクの増加を含み得るが、これらに限定されない。
【０１８０】
可溶性ＨＬＡ−Ｇ（ｓＨＬＡ−Ｇ）はまた、ヒトの体外受精（ＩＶＦ）における胚品質のバイオマーカーとして報告されている。従って、特定の態様において、本発明の抗体は、ＩＶＦでの移植の成功の可能性を評価するために、胚培養上清（ＥＳ）におけるＨＬＡ−Ｇタンパク質の存在をモニターするために有用である。
【０１８１】
従って、一般的に上記の本発明は、例示として提供され、本発明を限定するものではない、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【０１８２】
略語
ＡＰＣ：抗原提示細胞
ＡＴＣＣ：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
β２Ｍ：ベータ−２−ミクログロブリン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＣＦＡ：完全フロイントアジュバント
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球
ＣＴＬＡ−４：細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４
ＤＣ：樹状細胞
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＤＭＥＭ：ダルベッコの修飾イーグル培地
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着検定法
ＥＣ：有効濃度
ＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーター
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＦＲ：フレームワーク領域
ｈ：時間
ＨＡＴ：ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン
ＨＥＳ：ヒドロキシエチルデンプン
ＨＬＡ：ヒト白血球抗原
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＰ：西洋わさびペルオキシダーゼ
ＩＣＰ：免疫チェックポイント
ＩＤ：識別子（IDentity）
ＩＦＡ：不完全フロイントアジュバント
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＩＬＴ−２：免疫グロブリン様転写産物２
ＩＬＴ−４：免疫グロブリン様転写産物４
ＩＭＤＭ：イスコフ改変ダルベッコ培地
ＩＰ：腹腔内
ＩＰＴＧ：イソプロピル β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド
ＩＶ：静脈内
ＩＶＦ：体外受精
ＫＤａ：キロダルトン
ＫＩＲ２ＤＬ４：キラー細胞免疫グロブリン様受容体２Ｉｇドメインおよび長い細胞質テイル４
ＫＬＨ：キーホールリンペットヘモシアニン
ＬＩＬＲＢ１：白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１
ＬＩＬＲＢ２：白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２
Ｍ：モル
ＭＥＭ：最小必須培地
ＭＨＣ：主要組織適合遺伝子複合体
ｍＬ：ミリリットル
ＮＫ：ナチュラルキラー細胞
ｎＭ：ナノモル
ＯＤ：光学密度
ＯＮ：一晩
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣ−１：拘束性（Constrained）ペプチド−１
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤ―１：プログラムされた細胞死タンパク質１
ＰＤ−Ｌ１：プログラムされた細胞死リガンド１
ＰＥ：フィコエリスリン
ＰＩＲ−Ｂ：抑制型（Paired）免疫グロブリン様受容体Ｂ
ＰＳ：ペニシリン／ストレプトマイシン
ＲＮＡ：リボ核酸
ＲＰＭ：毎分回転数
ＲＴ：室温
ＳＢ：スーパーブロス
ｓｃＦｖ：一本鎖可変フラグメント
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｓｅｃ：秒
ＳＥＱ：配列
ｓＨＬＡ−Ｇ：可溶性ＨＬＡ−Ｇ
ＴＢＳ：トリス緩衝生理食塩水
ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
ＵＶ：紫外線
Ｖ：容量
ＶＨ：可変重鎖
ＶＬ：可変軽鎖
μＬ：マイクロリットル
【実施例】
【０１８３】
実施例
材料および方法
ペプチド合成
モノクローナル抗体を作製するために用いたＰＣ−１ペプチド［ＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５６）］を、MultiSynTechのＳｙｒｏ上でＤＩＣをアクティベーターとして用いてＦｍｏｃ標準化学によって合成し、次いで逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。
【０１８４】
ＰＣ１ペプチドを液体クロマトグラフィー − 質量分析（ＬＣＭＳ）により分析した。
【０１８５】
免疫原の製造
ＰＣ１ペプチドを、以下のように側鎖Ｃ末端システインを介してＫＬＨにカップリングさせた：５ｍｇのペプチドを結合に用いた。ＰＢＳに溶解したＫＬＨタンパク質（７７６００、ThermoFisher、Paris、France）を、ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳリンカー（２２３１２、ThermoFisher、Paris、France）を用いて活性化した。遊離リンカーを透析により除いた。ＰＢＳに溶解したペプチドを活性化ＫＬＨと共にインキュベートした。遊離ペプチドを透析により除去した。ＰＣ−１−ＫＬＨ複合体をＰＢＳ １Ｘ（ｐＨ７．２）に溶解させ、−２０℃で貯蔵した。
【０１８６】
マウス免疫化
Janvier laboratories（Le Genest-St-Isle、France）から購入し、Pasteur Institute animal facility（Paris、France）で飼育した、２種のマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪ）を免疫化に用いた。マウスは、最初の免疫原注射のとき７週齢であった。マウスを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ Ｆ５８８１； Sigma、Lyon、France）（ｖ／ｖ）と混合したＫＬＨに結合させたＰＣ−１ペプチド５０μｇのエマルジョンを用いて腹腔内（ＩＰ）免疫し、次いで、１０日後に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；Ｆ５５０６； Sigma、Lyon、France）と混合したＰＣ−１−ＫＬＨ５０μｇをＩＰ注射し、その後、最初の注射の２０日後、３０日後および１８５日後に、ＰＣ−１−ＫＬＨ／ＩＦＡ２５μｇを３回注射した。
【０１８７】
ＰＣ１−ＫＬＨ／ＣＦＡまたはＩＦＡエマルジョンを、暗所でＲＴにて３０分間ボルテックスして調製した。
【０１８８】
免疫化マウスの眼窩後方出血（retro-orbital bleeding）により得られた血液から、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）およびＥＬＩＳＡ分析（以下に記載）により、抗体応答をモニターした。
【０１８９】
ハイブリドーマの作製
マウスに、安楽死処置の３日前に免疫原を静脈内（ＩＶ）に追加免疫した。脾臓を取り出し、脾細胞を、抗体産生ハイブリドーマを得るために、不死化ミエローマ細胞株ｓｐ２／０−Ａｇ１４とのその後の融合のために精製した。融合は、ポリエチレングリコールベースの標準プロトコールを用いて行った（Koehler, G., C. Milstein. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975. 256(5517): p.495-7）。その後、得られたハイブリドーマを、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、熱不活性化ＦＣＳ（２０％）、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン、１Ｘ）、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン１３０、２％）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１％）を添加した選択ＤＭＥＭ培地中で培養した。ハイブリドーマを、コロニー形成および抗体産生のために選択培地中で７〜１４日間増殖させた。直鎖状および環状ＰＣ−１ペプチドを特異的に認識する抗体の産生を、それぞれＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー分析により評価した。陽性ハイブリドーマをクローニングし、目的のモノクローナル抗体を分泌する単一細胞由来のクローンを同定するために増殖させた。
【０１９０】
ファージディスプレイ技術
抗ＨＬＡ−Ｇ 一本鎖抗体遺伝子ライブラリーの構築
各動物の脾臓から、業者指示書に従ってＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ キット（Molecular Research Center Inc., Cincinnati、USA）を用いてＲＮＡを単離するために、最後のブースト免疫後にサンプル採取した。ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡを、マウスＶＨ、ＶＬκおよびＶＬλをコードするＤＮＡの増幅を目的とするプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物を、初めに、業者指示書に従ってｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ ｅａｓｙ ベクター（Promega、Madison、Wisconsin）中にクローニングして、重鎖（ＶＨ）または軽（ＶＬκ＋ＶＬλ）鎖のいずれかをコードする２つの抗体遺伝子サブライブラリーを得た。
【０１９１】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリーの構築を以下のように行った：まず、ＶＬ（ＶＬκおよびＶＬλ）ＰＣＲ産物を、ファージミドベクターｐＴＨ中にクローニングした；第２に、ＶＨ ＰＣＲ産物を、ＶＬκまたはＶＬλレパートリーを含むｐＴＨ中にクローニングした。クローニング部位は、ＶＨおよびＶＬクローニングのための制限酵素部位に隣接する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー配列と、それに続くヘキサヒスチジンタグおよびｃ−ｍｙｃタグを含む。プラスミドおよびファージミドを、大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ 細菌株（Stratagene、Amsterdam、Netherlands）内で増殖させた。ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを含む形質転換された細菌を採取し、Nucleobond Plasmid Midi キット（Macherey‐Nagel; Dueren、Germany）を業者指示書に従って用いて、該ライブラリーからプラスミド／ファージミドを単離し、その後アリコートに分けて−８０℃で貯蔵した。
【０１９２】
最終的なｓｃＦｖライブラリーのサイズは、ＰＣＲによって決定された約９３％のフルサイズの挿入物を含む、１．２ｘ１０７のクローンから構成された。次いで、細菌ライブラリーを、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を用いてファージ／ｓｃＦｖライブラリーとしてパッケージした。ファージ／ｓｃＦｖを３０℃にて２５０ｒｐｍで１６時間かけて生成させた。細胞を遠心分離によってペレット化し、ファージを含む上清をポリエチレングリコール法を用いて沈殿させた。沈殿したファージを再懸濁させ、０．４５μＭフィルターで濾過し、ファージ滴定まで４℃で貯蔵した。
【０１９３】
ライブラリーのスクリーニング
ファージ／ｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングを、ストレプトアビジンＥＬＩＳＡ高容量プレート（15501、Piece）上にコーティングした１μｇ／ｍＬのビオチニル化−ＰＣ１ペプチドを用いて行った。ストリンジェンシーを増強させながら５回のパンニング（パンニングの各ラウンド毎に２、４、８および１５回の洗浄）を適用した。未結合ＨＬＡ−Ｇ ＰＣ１ペプチド（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％中、１０μｇ／ｍＬ）を、ファージ／ｓｃＦｖ溶出の競合体（competitor）として用いた。選択されたファージの回収および増幅のために、指数関数的に増殖する大腸菌培養物を、各回のパンニング後に溶出したファージ懸濁液に感染させた。
【０１９４】
選択されたファージの反応性を評価するために、各回のパンニング後にビオチニル化ＨＬＡ−Ｇ ＰＣ１ペプチドを抗原として用いてファージ−ＥＬＩＳＡを行った。１回目と２回目のパンニング後、シグナルはバックグラウンドと同じレベルにあった。シグナルは、第４ラウンドのパンニングの後にバックグラウンドの３倍に増加した。ファージディスプレイ技術によれば、そのようなシグナル増加は、特異的結合体の濃縮に対応する。第５ラウンドのパンニングの後に、ファージミドＤＮＡを該ライブラリーから抽出した。９６個のクローンを単離し、ディープウェルマイクロタイタープレート（Maxisorp、Nunc、Danemark）上で作製した。ファージ粒子を含む上清をファージ−ＥＬＩＳＡ法によって試験し、６種のＰＣ１特異的結合体（Ｒ４Ｃ−Ｃ３、Ｒ４Ｃ−Ｂ１、Ｒ４Ｃ−Ｆ２、Ｒ４Ｃ−Ｆ１、Ｒ４Ｃ−Ｆ１２およびＲ５Ｃ−Ｄ８）を同定して、配列決定した。
【０１９５】
ｓｃＦｖ産生
タンパク質発現のために、同定された陽性結合体から単離されたファージミドＤＮＡを、非サプレッサー大腸菌株ＨＢ２１５１に形質転換させた。選択されたプレートから無作為に選択された単一コロニーを、カルベニシリンおよびグルコース（１％）を添加したＳＢ培地（Super Broth）５ｍＬ中に接種した。培養物を、３７℃にて一晩、撹拌しながらインキュベートし、その後、より大量のＳＢ培養物に移した（５００μＬの培養物を５００ｍＬの新鮮なＳＢ培地に移した）。培養物のＯＤ６００が１に達したときに、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を添加して標的タンパク質の発現を誘導した。細胞を１６℃にて一晩（ＯＮ）増殖させて、その後遠心分離により回収した。ｓｃＦｖを抽出し、業者指示書に従ってニッケルカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ スピンカラム、Qiagen、Valencia、CA）を用いて精製した。
【０１９６】
フローサイトメトリー分析
細胞株
Ｋ５６２細胞は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection CCL-243）から購入したヒト白血病細胞である。Ｋ５６２−Ｇ１およびＫ５６２−ＰＶは、ＨＬＡ−Ｇ１をコード化するベクターまたは対応する空（mock）ベクターをそれぞれ用いるＫ５６２野生型細胞のヌクレオフェクションによって得られた。これらの細胞株を、１０％熱不活性化ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ培地中で培養した。
【０１９７】
古典的ＭＨＣクラスＩ分子を発現するが、ＨＬＡ−Ｇは発現しない、リンパ芽球様細胞株ＬＣＬ−ＤＥＳ、ＬＣＬ−ＢＲＯおよびＲＰＭＩ８８６６は、Ｄ．Ｗｉｅｌｓ（Institut Gustave Roussy、Villejuif、France）の好意によって贈呈された。これらの細胞を、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、１％のペニシリン/ストレプトマイシン、１０ｍＭ ナトリウムピルビンおよび２００ｇ／ＬＤーグルコースを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
【０１９８】
バイオプレックスビーズ、受容体およびモノクローナル抗体
バイオプレックスビーズ（ＭＣ１００２８−０１およびＭＣ１００６２−０１）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Marnes-la-Coquette、France）から購入し、ＰＥ結合マウスＩｇＧ１（クローンＰ.３．６．８．２．１．１２−４７１４）をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Paris; France）から購入し、およびＦＩＴＣ結合ラットＩｇＧ２ａをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（クローン：Ｒ３５−９５ ５５３９２９、Le Pont de Claix; France）から購入した。
【０１９９】
ＨＬＡ−Ｇ６およびＨＬＡ−Ｇ５タンパク質産生
ＨＬＡ−Ｇ６遺伝子のα１α３ドメインおよびＨＬＡ−Ｇ５遺伝子のα１α２α３ドメインのコード配列を、ｐＡｃＧＰ６７バキュロウイルストランスファーベクターにクローニングした。異なる挿入物を含むｐＡｃＧＰ６７バキュロウイルスベクターの遺伝子構築物およびプラスミド増幅物を、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ（Luxembourg）により作製した。プラスミドを、パスツール研究所（Institut Pasteur）のProteople施設（Paris、France）においてＤＨ５細菌宿主中で増幅させた。トランスファーベクターおよびＡｃＭＮＰＶ直鎖状ＤＮＡ（ＢＤのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標））をヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）細胞に同時トランスフェクトして、相同部位間の組み換えを可能にし、該トランスファーベクターからＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡに挿入物を移した。各タンパク質をコードする組換えウイルスを作製し、Ｓｆ９細胞を感染させて、その後組換えタンパク質を産生するために用いた。
【０２００】
一旦、組換えタンパク質が発現したら、細胞を溶解し、溶解物を固定化ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ親和性樹脂カラムに添加した。非特異的に結合したタンパク質を除去するために数回洗浄後、結合したＳｔｒｅｐＴａｇタンパク質を２．５ｍＭのデスチオビオチンで溶出させた。精製した溶出タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してＨＬＡ−Ｇ５の存在を確認し、その後アリコートに分けて、−２０℃で貯蔵した。
【０２０１】
Ｂｉｏｐｌｅｘビーズのカップリング
Ｂｉｏｐｌｅｘビーズを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Marnes-la-Coquette; France）から提供されるキットを供給者指示書に従って用いて、標準的なアミノカップリング法によって、組換えＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６タンパク質で、または合成環状ｃＰＣ−１ペプチド（ＣＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ、配列番号５２）でコーティングした。特異性の（陰性）対照として、カップリングしていないビーズまたは変異ペプチドＣＴＨＨＰＶＡＤＡＥＡＴＬＲＣ（配列番号６２）でコーティングしたビーズをそれぞれ用いた。
【０２０２】
環状ｃＰＣ−１ペプチドは、先の結晶学的研究（Clements et al., 2005）によって決定されたＨＬＡ−Ｇのα３ドメイン内の位置１８９−２０３のＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５６）アミノ酸領域の立体配座を模倣するように設計された。立体配座の模倣は、ＰＣ−１ペプチドのＮ末端バリン残基をシステイン残基で置換することによって得られ、その結果、Ｎ末端およびＣ末端のシステイン残基間にジスルフィド結合が形成された。
【０２０３】
抗ＨＬＡ−Ｇ血清およびモノクローナル抗体の分析
免疫化マウスの血清中またはクローン化ハイブリドーマ細胞培養上清中の特異的抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の検出を、フローサイトメトリーにより評価した。フローサイトメトリーを、最初に、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびｃＰＣ−１ペプチドでコーティングされたビーズを用いて行った。
【０２０４】
ビーズを、ＲＴにて１時間、モノクローナル抗体を含む血清または細胞培養上清の種々の希釈液と共にインキュベートし、その後、２回洗浄し、ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（405307、Biolegend、USA）と共にＲＴにて３０分間インキュベートした。フローサイトメトリー分析をＬＳＲ ＦＯＲＴＥＳＳＡ（Beckton Dickinson、Le Pont-de-Claix、France）を用いて行った。データをＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Tree star、Ashland、USA）を用いて分析した。陽性染色ビーズの割合を決定するために、アイソタイプ・コントロールを用いて蛍光ビーズの９９％を除去するように電子ゲートを設定した。従って、陽性染色ビーズは、アイソタイプ・コントロールの９９％が示す染色強度より高い染色強度を有するものとして定義された。
【０２０５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
９６ウェルマイクロプレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル)のＰＣ−１ペプチドでコーティングし、ＲＴにて一晩インキュベートし、その後１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ−乾燥スキムミルクで、ＲＴにて１時間ブロッキングした。ＰＢＳ ｔｗｅｅｎ ０．０５％で１回洗浄後、血清またはモノクローナル抗体の希釈液を、ＲＴにて２時間添加した（５０μＬ／ウェル）。プレートを３回洗浄し、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧを、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ ０．０５％、１％ ＢＳＡ（５０μＬ／ウェル）中１／１００００で、ＲＴにて１時間添加した。３回洗浄後、プレートをＴＭＢ基質（KPL、Gaithersburg、USA）で染色し、ＯＤ４５０で読み取った。
【０２０６】
ファージディスプレイのために、ＨＬＡ−Ｇ ＰＣ１の遊離ペプチドまたはＢＳＡに結合したペプチドを、９６ウェルマイクロタイタープレート（Maxisorp、Nunc、Danemark）上にコーティングした。抗ヒスチジンタグ抗体（Qiagen、Courtaboeuf、France）を用いて検出を評価した。
【０２０７】
モノクローナル抗体１５Ｅ７のさらなる特徴付け
アイソタイプ特定
１５Ｅ７アイソタイプを、Clonotyping Southern キット（Clinisciences、Nanterre、France）を業者指示書に従って用いて、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。簡単に説明すると、プレートを、４℃にて一晩、捕捉抗体（各アイソタイプに特異的）でコーティングし、その後ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した。次いで、プレートをＲＴまで温め、１５Ｅ７モノクローナル抗体を含むハイブリドーマ上清を、ＲＴにて１時間、添加した。キットに含まれるＨＲＰ結合抗アイソタイプ二次抗体を、１／２０００で用いた。プレートをＴＭＢ基質（Eurobio/KPL、Gaithersburg、USA）で染色し、ＯＤ４５０で読み取った。
【０２０８】
１５Ｅ７モノクローナル抗体の作製
１５Ｅ７ハイブリドーマを、マウスにおいて腹水としてインビボで増殖させた。所望のモノクローナル抗体を産生するのに十分増殖させた後、該モノクローナル抗体を含む腹水を精製した。精製は、標準的なプロテインＡ−セファロースカラムを用いてクロマトグラフィーにより達成した。１５Ｅ７を含む溶出画分を集め、透析し、必要に応じて濃縮した。ＵＶスキャンを用いてＯＤ２８０で濃度を決定し、２ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２０９】
結合親和性の決定（ＢＬＩＴＺ技術）
結合親和性および結合速度を、ＢＬＩＴＺ技術により決定した。１５Ｅ７モノクローナル抗体を、標準的なアミンカップリング法を用いて第１級アミンを介してバイオセンサーチップＡＲ２Ｇ（Pall ForteBio）に共有結合させた。結合を、１５Ｅ７に結合したチップを種々の濃度のＢＳＡに結合したＰＣ−１ペプチドと共にインキュベートすることにより測定した。抗原−抗体結合速度を１２０秒間追跡し、解離速度を１００秒間追跡した。結合曲線および解離曲線は１：１に適合する。
【０２１０】
実施例１：マウスにおける抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の産生
免疫原の設計
本発明者らは、“拘束ペプチド（Peptide Constrained）：ＰＣ−１”（図１Ａ；太字および下線で示す）と称されるＨＬＡ−Ｇのα３アミノ酸領域１８９−２０３に対応する高度にＨＬＡ−Ｇ特異的なペプチドを設計し、マウスを免疫化するためにそれを用いた。
ＰＣ−１配列：ＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣ（配列番号５６）
ＰＣ−１免疫原は、β２Ｍ結合とは無関係に、ＨＬＡ−Ｇ α３含有イソ型に特異的な治療に適する抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体を作製することが期待される。
【０２１１】
免疫化、ハイブリドーマ作製およびｓｃＦｖ産生
ＫＬＨに結合したＰＣ−１ペプチドを用いた免疫化プロトコールは、材料および方法のセクションに記載されている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスをペプチド免疫化に用いた。
【０２１２】
マウスを、ＣＦＡ中のＰＣ−１−ＫＬＨ複合体を用いて腹腔内免疫し（primed）、ＩＦＡ中の免疫原を４回ＩＰ追加（ブースト）免疫した。免疫化したマウス空の血清を、免疫化法の種々の時点で採取し、Ｂｉｏｐｌｅｘ−ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびｃＰＣ−１結合ビーズを用いて試験した。各実験について、陽性対照および陰性対照を、得られたポリクローナル抗体の特異的親和性を決定するために設定した。免疫化していないマウスからの血清を用いて標識されたものと比較して、ＨＬＡ−Ｇ−ペプチドビーズがＦＡＣＳにおいてピークシフトを示したとき、血清を陽性と見なした。
【０２１３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＣ−１−ＫＬＨペプチドで免疫化したとき、各ＩＰ追加免疫後に、有意なレベルの抗ＨＬＡ−Ｇ ＩｇＧ抗体が血清中に検出された。図１Ｂは、免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスおよびワクチン接種していない対照マウスから採取した血清の存在下で得られたＨＬＡ−Ｇ５でコートしたビーズの染色を示す。抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、最低用量の血清（１／１０００希釈）であっても用量依存的に有意に検出された。カップリングしていない対照ビーズを用いて、特異的結合は検出されなかった（データ示さず）。
【０２１４】
最高の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体力価を有するマウスを、ハイブリドーマ作製またはファージディスプレイのために用いた。
【０２１５】
材料および方法セクションに記載のように融合を行った。その後、ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマをクローニングし、再度、ＥＬＩＳＡによって確認して、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体を産生する目的のクローンを検出した。
【０２１６】
ファージディスプレイ法は、材料および方法部分に記載の通りに行った。ｓｃＦｖクローンであるＲ４Ｃ−Ｃ３、Ｒ４Ｃ−Ｂ１、Ｒ４Ｃ−Ｆ２、Ｒ４Ｃ−Ｆ１およびＲ５Ｃ−Ｄ８のＨＬＡ−Ｇペプチドに対する反応性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。Ｒ４Ｃ−Ｃ３およびＲ５Ｃ−Ｄ８クローンは、ビオチン結合ＰＣ１ペプチドに対して高い反応性を示した（図１Ｃ）。Ｒ４Ｃ−Ｃ３は、ＨＬＡＧタンパク質イソ型と反応した。
【０２１７】
ハイブリドーマクローン１５Ｅ７およびｓｃＦｖクローンＲ４Ｃ−Ｃ３を、さらなる分析のために選択した。
【０２１８】
実施例２：マウスモノクローナル抗体１５Ｅ７およびｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３の遺伝学的特徴付け
モノクローナル抗体１５Ｅ７の軽鎖および重鎖可変領域ならびにＲ４Ｃ−Ｃ３ ｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡ配列を、標準的なＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定法を用いて得た。
【０２１９】
モノクローナル抗体１５Ｅ７
１５Ｅ７の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図２Ａに示す。
１５Ｅ７の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図３Ａに示す。
【０２２０】
軽鎖および重鎖における最も高度な可変性は、主に、抗体の特異性を定義する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域内に位置する。１５Ｅ７ ＶＬおよびＶＨ配列の分析により、軽鎖および重鎖のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の描写を図２Ａおよび３Ａに示す。
【０２２１】
１５Ｅ７κ軽鎖の配列を、既知のマウス生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列と比較した（図２Ｂ）。１５Ｅ７軽鎖は、マウス生殖系列ＩＧＫＶ１−１１７由来のＶＬセグメントおよびマウス生殖系列ＩＧＫＪ１由来のＪＫセグメントを利用する。
【０２２２】
１５Ｅ７重鎖（γ）配列と既知のマウス生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較は、１５Ｅ７重鎖が、マウス生殖系列ＩＧＨＶ１−６１由来のＶＨセグメント、マウス生殖系列ＩＧＨＪ２由来のＪＨセグメントおよびのマウス生殖系列ＩＧＨＤ４−１由来のＤＨセグメントを利用することを実証した（図３Ｂ）。
【０２２３】
これらのアミノ酸配列の比較は、１５Ｅ７の重鎖（９３．１％）および軽鎖（９４．６％）配列の対応するマウス生殖細胞系との高い相同性を明示する。軽鎖の配列における変異は、ＦＲ１およびＦＲ４、ならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域に分布しているが（図２Ｂ）、重鎖配列における変異は、主にＣＤＲ領域およびＦＲ３に限定されている（図３Ｂ）。従って、これらの結果は、１５Ｅ７モノクローナル抗体が、親和性成熟プロセスを受け、特定のＨＬＡ−Ｇエピトープに対して強い特異性／親和性を獲得したマウスＩｇＧであることを実証している。
【０２２４】
ｓｃＦｖクローンＲ４Ｃ−Ｃ３
ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図４Ａに示す。
Ｒ４Ｃ−Ｃ３重鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図６Ａに示す。ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３のＶＬおよびＶＨ配列を分析し、軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域を図４Ａおよび５Ａに示すように描写した。
【０２２５】
ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３ κ軽鎖の配列を、既知のマウス生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列と比較した。このアライメントは、ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３軽鎖が、マウス生殖系列ＩＧＫＶ１−１１０由来のＶＬセグメントおよびマウス生殖系列ＩＧＫＪ１由来のＪＫセグメントを利用することを実証した。ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３とその対応するマウス生殖系列セグメントとの間の配列アライメントを図４Ｂおよび５Ｂに示す。
【０２２６】
ｓｃＦｖ重鎖（γ）配列と既知のマウス生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較は、この鎖が、マウス生殖系列ＩＧＨＶ１Ｓ１２６由来のＶＨセグメント、マウス生殖系列ＩＧＨＪ２由来のＪＨセグメントおよびのマウス生殖系列ＩＧＨＤ２−１２由来のＤＨセグメントを利用することを実証した。ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３ ＶＨと対応するマウス生殖系列との間の配列アライメントを図６Ｂに示す。これらのアミノ酸アライメントにより、ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３の軽鎖および重鎖の配列が、該生殖系列配列に対して９６．４％および８２．８％相同であることが明らかとなった。軽鎖配列における変異は、主に、ＣＤＲ３領域に位置するが（図４Ｂおよび５Ｂ）、一方、重鎖配列における変異は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および全てのＣＤＲに分布している（図６Ｂ）。重鎖配列における高い突然変異率は、ｓｃＦｖ Ｒ４Ｃ−Ｃ３が、親和性成熟プロセスを受け、ＨＬＡ−Ｇ由来ペプチドに対する強い親和性を獲得したことを証明する。
【０２２７】
実施例３：抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体１５Ｅ７の特徴付け
タンパク質分析
１５Ｅ７モノクローナル抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した（図７Ａ）。重鎖の分子量は、約５０ｋＤａであり、軽鎖の分子量は約２５ｋＤａである。各２個のコピーを有するため、１５Ｅ７の分子量は１５０ｋＤａと推定され、モノクローナル抗体１５Ｅ７がマウスＩｇＧ ２ａクラスに属することが確認される。
【０２２８】
アイソタイプ特定および親和性決定
１５Ｅ７のアイソタイプをＥＬＩＳＡにより評価した。１５Ｅ７アイソタイプはＩｇＧ２ａであると判定された。
１５Ｅ７の親和性を、材料および方法セクションに記載のＢＬＩＴＺ技術により評価した。代表的なデータを図７Ｂに示す。５〜６００ｎＭの範囲のＢＳＡに結合したＰＣ−１を種々の濃度で、バイオセンサーチップに結合した１５Ｅ７と共にインキュベートした。各濃度について、結合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）を測定し、親和性定数ＫＤ（ｋａ／ｋｄ）を計算するために用いた。親和性定数は１．５７ｎＭと評価された。
【０２２９】
ＨＬＡ−Ｇタンパク質およびペプチドに対する特異性
ＨＬＡ−Ｇ５およびＧ６タンパク質ならびにｃＰＣ−１ペプチドとの１５Ｅ７の反応性を決定するために、フローサイトメトリーに基づく滴定を実施した。
【０２３０】
１５Ｅ７抗体を、ｈβ２Ｍを含まないＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびｃＰＣ−１ペプチドでコートしたビーズ、ならびにそれらの陰性対応物（カップリングしていないビーズまたは変異ペプチドでコーティングしたビーズ）に対して連続希釈して滴定した。図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに示される結果は、１５Ｅ７がそれぞれ、２ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値でｃＰＣ−１ペプチドに、２８ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値で組換えＨＬＡ−Ｇ５タンパク質に、および１２０ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値で組換えタンパク質ＨＬＡ−Ｇ６に強力に結合することを示す。この分析は、特異的に異なるβ２Ｍを含まないＨＬＡ−Ｇイソ型に結合する１５Ｅ７の能力を実証した。
【０２３１】
細胞表面上に発現されたβ２Ｍを含まないＨＬＡ−Ｇ１イソ型に結合する１５Ｅ７の能力もまた評価した。実際に、ＨＬＡ−Ｇ１不含有イソ型を発現するＫ５６２−Ｇ１細胞およびＫ５６２−ＰＶ細胞を１５Ｅ７抗体の連続希釈物と共にインキュベートし、特異的結合を、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ）と比較してフローサイトメトリーにより分析した。図８に示す結果は、１５Ｅ７が、５．０μｇ／ｍＬのＥＣ５０値でＫ５６２−Ｇ１細胞に特異的に結合するが、Ｋ５６２−ＰＶ細胞には結合しないことを示す。
【０２３２】
マイルドな酸処置により、細胞表面に結合したＨＬＡクラスＩ不含有重鎖を残して、細胞表面β２Ｍ分子を放出する（Polakova et al., 1993; Storkus et al., 1993）。未処置およびｐＨ３．０処置されたＫ５６２−Ｇ１細胞上のＨＬＡ−Ｇ抗原の発現を、天然ＨＬＡ−Ｇ／β２Ｍ複合体に対するＭＥＭ−Ｇ／９ ｍＡｂを用いてフローサイトメトリーにより分析した。さらに、ヒトβ２ｍに対するｍＡｂを実験の対象として用いて、その放出を確認した。ＭＥＭ−Ｇ／９ ｍＡｂならびに抗β２Ｍ ｍＡｂは、未処置のＫ５６２−Ｇ１細胞に結合するが、酸処置は、それらの結合を減少させた。対照的に、１５Ｅ７ ｍＡｂによる検出（marking）では結合が増え、このことは、それが未β２Ｍ結合ＨＬＡ−Ｇ重鎖を認識することを証明している（図１０Ａ）。Ｋ５６２−ＰＶ細胞を陰性対照として用いた（図１０Ｂ）。
【０２３３】
同じ実験を、内生ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ複合体を発現するＪＥＧ−３細胞について行った。１５Ｅ７ ｍＡｂは、未処置のＪＥＧ−３細胞に結合しなかったが、酸処置後に染色が増加し、一方で、ＭＥＭ−Ｇ／９および抗β２Ｍ ｍＡｂの染色は、バックグラウンド値近くまで低下した（図１０）。
これらの結果は、１５Ｅ７ Ｍａｂが免疫原性ｃＰＣ−１ペプチドおよびβ２Ｍ不存在下で細胞表面ＨＬＡ−Ｇ上に発現されるエピトープを認識することを確認する。
【０２３４】
古典的ＭＨＣクラスＩ分子に対する交差反応はない
上記のように、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体の開発における主な懸案の１つは、古典的ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）分子に対して交差反応性のないＨＬＡ−Ｇに対する高度に特異的な抗体を得ることであった。ＨＬＡ−Ｇに対する１５Ｅ７の特異性およびその古典的ＭＨＣ−Ｉ分子との交差反応性の不存在を、ＨＬＡ−Ｇを発現しない異なるヒトＭＨＣ−Ｉ陽性細胞株を用いたフローサイトメトリーによって評価した。
【０２３５】
実際に、その表面上にヒト古典的ＭＨＣ−Ｉ分子を発現するが、ＨＬＡ−Ｇを発現しない、ヒトリンパ腫細胞株（ＬＣＬ−ＤＥＳ、ＬＣＬ−ＢＲＯおよびＲＰＭＩ８８６６）を、一定濃度の１５Ｅ７（２０μｇ／ｍＬ；１３３ｎＭ）で染色した。この濃度は、Ｋ５６２−Ｇ１細胞の８０％が染色され、アイソタイプ対照との非特異的結合がこの投与量で検出されなかったために、用いた。Ｋ５６２−Ｇ１およびＫ５６２−ＰＶ細胞をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。図１１は、１５Ｅ７が、ＨＬＡ−Ｇ１発現細胞（Ｋ５６２−Ｇ１）に強く結合するのに対して、古典的ＭＨＣ−Ｉ分子を発現するＨＬＡ−Ｇ陰性細胞は染色されなかったことを示す。これは、１５Ｅ７モノクローナル抗体がＨＬＡ−Ｇタンパク質に特異的であり、古典的ＭＨＣクラスＩ分子に対して交差反応性を示さないことを実証する。
【０２３６】
結論
本発明は、ＨＬＡ−Ｇペプチド免疫化アプローチに基づいて抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を産生する方法を示す。免疫化に用いたペプチド（ＰＣ−１）は、古典的ＭＨＣクラスＩ分子と比較してＨＬＡ−Ｇに高度に特異的に設計され、全長ＨＬＡ−Ｇとその受容体ＬＩＬＲＢ１およびＬＩＬＲＢ２との相互作用に関与するアミノ酸を含む。
【０２３７】
本発明者らは、このＨＬＡ−Ｇ α３領域の疎水性特性にもかかわらず、異なる技術、融合（ハイブリドーマの作製）およびファージディスプレイを用いて抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体を開発することが可能であることを示した。
上記の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、ＨＬＡ−Ｇのいくつかのイソ型を認識することができる。これらの抗体は、内因性細胞表面β２Ｍを含まないＨＬＡ−Ｇ１に結合する。それらは、古典的ＭＨＣクラスＩ分子と交差反応しないため、これらのＨＬＡ−Ｇ特異的抗体は、診断および治療目的のために用いられ得る。
【０２３８】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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