【手続補正書】
【提出日】平成18年11月28日(2006.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本出願は、インスリンシグナル伝達経路に関与するタンパク質を同定するために、トランスジェニックショウジョウバエを使用する方法について開示する。本方法により同定されるショウジョウバエ遺伝子のヒト相同体は、インスリンシグナル伝達経路の調節異常に関係する病的症状を処置、予防または改善する治療薬開発のための適当な標的である。従って、一局面において、本発明は、II型糖尿病およびＡ型インスリン抵抗性症候群などの当該症状を処置または改善するために有用なモジュレーターを同定する方法であって、ａ）表４または表５に開示のタンパク質からなる群より選択されるタンパク質の生化学的機能を調整するか、および／または当該タンパク質の遺伝子発現を調整する、候補モジュレーターの能力を分析することを含む方法に関し、そしてさらにｂ）インスリンシグナル伝達経路の調節異常に関係する病的症状の動物モデルにおいて、および／または当該症状を有する対象の臨床研究において、観察される病理学的影響を改善させる特定のモジュレーターの能力について分析することもまた含み得る方法に関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明のさらに別の局面においては、生体サンプル中、表４または表５に開示のタンパク質からなる群より選択されるいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを検出するために必要な成分を含んでなる分析方法および診断キットが提供され、ここで当該キットは、例えば、表４または表５に開示のタンパク質からなる群より選択されるいずれか１種以上のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド；当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補性のヌクレオチド配列；当該タンパク質のいずれか１種以上またはそのフラグメントの抗体（当該タンパク質のいずれか１種以上またはそのフラグメントに結合する）；を含んでなる。好適な態様において、かかるキットはキット成分の使用法につき詳述する説明書をも含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明を実施するに際しては、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡにおける多くの常套技術を使用する。これらの技法は文献上周知であり、例えば、以下に説明がある：Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, IIおよびIII, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes IおよびII, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); and Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (それぞれ、WuとGrossman、およびWu, eds)。よく知られたショウジョウバエの分子遺伝学的技術については、文献：Robert, D.B., Drosophila, A Practical Approach (IRL Press, Washington D.C. 1986)に記載がある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本明細書にて一般的に言及する場合、表４または表５に開示されたものからなる群より選択されるタンパク質または遺伝子は、ヒトの遺伝子型を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
使用したその他の遺伝的方法は、ＥＰ因子突然変異誘発である（Rorth, P., et al. 1998 Development 125, 1049−57）。ＥＰ因子は、一端にＵＡＳ配列と基礎プロモーターを含む合成修飾Ｐ因子である。ＥＰ因子は、しばしば遺伝子の５’端でショウジョウバエゲノムに任意に挿入され得る。ＥＰ因子はＵＡＳ配列と基礎プロモーターを含む唯一の末端をもち非対称であるため、近傍遺伝子上のＥＰ挿入の効果が挿入されたＥＰ因子の配向の影響を受ける。該挿入部位でＥＰ因子のＵＳＡと基礎プロモーターを含む末端に隣接して位置する遺伝子は、しばしばＧＡＬ４依存的に発現することが示されている。しかし、ＥＰ挿入はまた近傍遺伝子のシス−エレメントを破壊し、Ｇal４非依存性様式でその発現に影響する。ＥＰ挿入株の大型コレクションが公的に入手し得る（参照：www.fruitfly.org)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
ショウジョウバエゲノムは約１４,０００個の予測遺伝子を含む（Adams et al., 2000 Science 287 2185−95）。これらの遺伝子は予測転写産物によって規定される（場合により転写単位または「セレラ転写産物」（ＣＴまたはＣＧ）という；参照：www,Celera.com）。既知機能および予測される機能にもとづき、これらの遺伝子または転写単位は、異なる機能カテゴリーまたは「ビン（bin）」に分類される。公的に利用可能なＥＰ株を解析すると、該株が４８３遺伝子（ＣＴ）の開始コドン（ＡＴＧ）から上流に１０Ｋｂの距離内に挿入されたＥＰ因子をもつ１５３６ＥＰ株であることが分かる。これらの遺伝子は、プロテインキナーゼ／ホスファターゼ、シグナル伝達分子、トランスポーター、リガンド結合タンパク質、転写因子、酵素およびその他のタイプの分子の機能的ビンに属する。機能的ビンカテゴリーは、セレラ・ショウジョウバエ・ジャンボリー・リリース１（Celera Drosophila Jamboree Release 1）にもとづく。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
ＥＰ(Ｘ)０３８２／ＳＨＰ−２
統計的解析では、ＥＰ(Ｘ)０３８２がＤp１１０Ｄ９５４Ａ過剰発現により誘発される小眼表現型を有意に抑制することも確認する。ＥＰ(Ｘ)０３８２／Ｘ；ey−Ｇal４, ＵＡＳ−Ｄp１１０Ｄ９５４Ａ／＋ハエの眼の平均サイズ（１.０４×１０−１ｍｍ２）は、ＸＸ；ey−Ｇal４,ＵＡＳ−Ｄp１１０Ｄ９５４Ａ／＋ハエの平均サイズ（９.０５×１０−２ｍｍ２；ｐ＜０.０００１）よりも有意に大きく、ＥＰ(Ｘ)０３８２がＤp１１０Ｄ９５４Ａの機能を抑制することを示している。下記表２参照。
【表３】
2006509795.tif 000001
ａ）行１および２は、ストックｗ／Ｙ；ey−Ｇal４,ＵＡＳ−Ｄp１１０Ｄ９５４Ａ／ＣyＯの略記表現型を示す。行３〜４は、交配ＥＰ(Ｘ)０３８２／Ｙ；＋／＋×ｗ／ｗ；ey−Ｇal４,ＵＡＳ−Ｄp１１０Ｄ９５４Ａ／ＣyＯの略記子孫表現型を示す。ＣyＯは平均体染色体である（上記方法の項参照）。
ｂ）行１〜２のハエは同胞である。行３〜４のハエは同胞である。しかし、行１〜２のハエは行３〜４の同胞ではない。従って、彼らは眼の大きさを含め、身体の大きさに影響する幾分異なる成長条件を経験しているはずである。従って、それらの間で意味のある眼のサイズの比較のために、行３〜４の測定した眼のサイズは、共通の表現型ＸＹ；ey−Ｇal４,ＵＡＳ−Ｄp１１０Ｄ９５４Ａ／＋（行２、欄１；行４、欄１）のハエは同じ平均眼サイズをもつべきであるという仮定にもとづき補正する。行３〜４で測定した２０個の眼のそれぞれを、ファクター０.９８１により補正する（７.２４×１０−２／７.３８×１０−２、欄２参照）。この欄は補正した眼サイズの平均を示す。ステューデントのｔ−検定は行１と行３の平均がｐ＜０.００１の有意レベルで異なることを示す。
ｃ）標準偏差は補正した眼サイズにもとづく。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2006509795.tif 000002
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2006509795.tif 000003