(57)【要約】  本発明は、有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、チェックポイント阻害剤とを組み合わせてそれを必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法に関する。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、チェックポイント阻害剤とを組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象における癌を治療する方法。
【請求項２】
有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、チェックポイント阻害剤とを組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象における腫瘍の増殖を阻害する方法。
【請求項３】
投与される２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、前記チェックポイント阻害剤との前記組み合わせは、癌の治療においてまたは腫瘍細胞の増殖の阻害において、相加効果または相乗効果を提供する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
投与される２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、前記チェックポイント阻害剤との前記組み合わせは、癌の治療においてまたは腫瘍細胞の増殖の阻害において相乗効果を提供する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたは薬学的に許容可能なその塩が、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのプロドラッグまたは薬学的に許容可能なその塩が、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのカルボン酸エステルのプロドラッグまたは薬学的に許容可能なその塩が、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの酢酸エステルまたは薬学的に許容可能なその塩が、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記チェックポイント阻害剤は、生物学的治療薬または小分子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および融合タンパク質またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンドまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質のリガンドを阻害するまたは該リガンドと相互作用する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＰＤ−１阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＤ−１阻害剤である前記チェックポイント阻害剤は、ニボルマブまたはペンブロリズマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＤ−１阻害剤である前記チェックポイント阻害剤は、ニボルマブである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌は、泌尿生殖器、婦人科、肺、胃腸、頭頚部癌、悪性神経膠腫および脳転移を含む脳腫瘍、悪性中皮腫、非転移性または転移性乳癌、悪性黒色腫、メルケル細胞癌腫または骨および軟部組織肉腫、血液学的腫瘍、多発性髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病などのリンパ腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、転移性結腸直腸癌、ホルモン感受性またはホルモン不応性前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、頭頸部扁平上皮癌軟部組織肉腫、および小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、または結腸直腸癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩を含む組成物が、前記対象に投与される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物は、固体または液体製剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象は哺乳類である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳類はヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、チェックポイント阻害剤とを組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む、チェックポイント阻害剤の効果を開始、増強、または延長する、または、前記対象において、チェックポイント阻害剤に前記対象が応答することを可能にする方法。
【請求項２４】
投与される２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、前記チェックポイント阻害剤との前記組み合わせは、癌の治療においてまたは腫瘍細胞の増殖の阻害において、相加効果または相乗効果を提供する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
投与される２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、前記チェックポイント阻害剤との前記組み合わせは、癌の治療においてまたは腫瘍細胞の増殖の阻害において相乗効果を提供する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗腫瘍の反応は、腫瘍成長の阻害、腫瘍細胞死の誘発、腫瘍退行、腫瘍再発、腫瘍成長、腫瘍拡大の予防または遅延、および腫瘍排除から選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたは薬学的に許容可能なその塩が、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのプロドラッグまたは薬学的に許容可能なその塩が、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのカルボン酸エステルのプロドラッグまたは薬学的に許容可能なその塩が、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの酢酸エステルまたは薬学的に許容可能なその塩が、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記チェックポイント阻害剤は、生物学的治療薬または小分子である、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および融合タンパク質またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンドまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、チェックポイントタンパク質のリガンドを阻害するまたは該リガンドと相互作用する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＰＤ−１阻害剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＤ−１阻害剤である前記チェックポイント阻害剤は、ニボルマブまたはペンブロリズマブである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＤ−１阻害剤である前記チェックポイント阻害剤は、ニボルマブである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌は、泌尿生殖器、婦人科、肺、胃腸、頭頚部癌、悪性神経膠腫および脳転移を含む脳腫瘍、悪性中皮腫、非転移性または転移性乳癌、悪性黒色腫、メルケル細胞癌腫または骨および軟部組織肉腫、血液学的腫瘍、多発性髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病などのリンパ腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、転移性結腸直腸癌、ホルモン感受性またはホルモン不応性前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、頭頸部扁平上皮癌軟部組織肉腫、および小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、または結腸直腸癌である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩を含む組成物が、前記対象に投与される、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物は、固体または液体製剤である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象は哺乳類である、請求項２３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳類はヒトである、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互援用
本出願は、２０１５年１２月４日に出願された米国特許仮出願第６２／２６３，２２８号、２０１６年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／３０８，５８３号、２０１６年４月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／３２１，８５７号の利益を主張するものであり、その内容は、その全体においておよび全ての目的のために、本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
６−デオキシ−Ｌ−ガラクトースとも呼ばれるＬ−フコースは、動物のいくつかのＮ−およびＯ−結合グリカンおよび糖脂質の成分である単糖である。（Becker and Lowe, Glycobiology 13:41R-51R (2003)を参照されたい。）フコースは、典型的には、血液型抗原、セレクチンおよび抗体に結合したグリカンを含むグリカンの末端修飾として加えられる。フコースは、特定のフコシルトランスフェラーゼによってα（１，２）−、α（１，３）−、α（１，４）−およびα（１，６）−結合を介してグリカンに結合することができる。α（１，２）−フコース結合は、典型的には、Ｈ−血液型抗原と関連している。α（１，３）−およびα（１，４）−フコース結合は、ルイスＸ抗原の修飾に関連している。α（１，６）−フコース結合は、抗体上のものなどのＮ結合型ＧｌｃＮＡｃ分子と関連している。
【０００３】
タンパク質のフコシル化は、哺乳類の発達において役割を果たすと考えられている。ＦＸ遺伝子の標的突然変異のためのホモ接合マウスは、致命的な表現型を含む多面的異常を示す。ヘテロ接合性交配からのマウスの回復の減少も報告された。（Becker et al., Mammalian Genome 14:130-139 (2003)）。異常なタンパク質フコシル化は、癌におけるシアリルＬｅｗｉｓＸのアップレギュレーションを含む、ヒト疾患に関連することが提案されている。これらのグリカンは、Ｅ−およびＰ−セレクチン分子のリガンドである。癌細胞上のシアリルＬｅｗｉｓＸグリカンの増加は、内皮上のＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンとの相互作用を介して転移を増加させると推測されている。２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを含むフコース類似体のインビボ投与、タンパク質脱フコシル化に対するそれらの効果、および癌の治療の潜在的使用は、WO2012019165に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
免疫システムのＴ細胞上のオフスイッチとして作用する免疫チェックポイントが、標的薬剤による免疫応答を回復させるために調査され、したがって身体の免疫系を活性化することによって癌を間接的に治療する。
【０００５】
国際出願のW02002086083、W02004004771、W02004056875、W02006121168、W02008156712、W02010077634、W02011066389、W02014055897および W02014100079は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１阻害抗体および／またはそのような抗体を同定する方法を報告する。さらに、US8735553およびUS8168757などの米国特許は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害抗体および／または融合タンパク質を報告している。W02002086083、W02004004771、W02004056875、W02006121168、W02008156712、W02010077634、W02011066389、W02014055897、およびW02014100079並びにUS8735553、およびUS8168757の開示は、それらの全体において、参照により、本願明細書に組み込まれる。
【０００６】
さらに、国際出願のW02011161699、W02012168944、W02013144704、W02013132317、およびWO2016044900は、プログラムされた細胞死１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路を抑制および／または阻害することができるペプチドまたはペプチド模倣化合物を報告している。W02011161699、W02012168944、W02013144704、W02013132317、およびWO 2016044900の開示は、それらの全体において、参照により、本願明細書に組み込まれる。
【０００７】
さらに、国際出願のWO2016142852、WO2016142894、WO2016142886、WO2016142835、およびWO2016142833は、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路を抑制および／または阻害することができる低分子化合物および／またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害することにより障害を治療することを報告している。WO2016142852、WO2016142894、WO2016142886、WO2016142835、およびWO2016142833の開示は、それらの全体において、参照により、本願明細書に組み込まれる。
【０００８】
最近、Ｔ細胞の表面のプログラム細胞死タンパク質１経路（ＰＤ−１）を標的とするモノクローナル抗体である細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）およびニボルマブ（Opdivo（登録商標））を標的とするモノクローナル抗体であるイピリムマブ（Yervoy（登録商標））が、進行性メラノーマ、進行性腎細胞癌および非小細胞肺癌の治療のために、米国食品医薬品局によって承認されている。しかしながら、現在のチェックポイント阻害剤療法は、部分的に既存の免疫活性化および阻害性受容体の存在に起因する比較的少数の癌対象集団における癌の治療に有効である。従って、非応答対象集団および応答対象集団の両方におけるチェックポイント阻害剤の有効性を開始または増強するための方法および併用療法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、対象における癌の治療または腫瘍細胞の増殖の阻害に有効なおよび／または腫瘍細胞に対する免疫応答を開始、増強または延長することができる、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース（本明細書では「２ＦＦ」とも呼ばれる）およびチェックポイント阻害剤を使用する組み合わせ治療を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＫＬＨ結合Ａ２０  Ｉｄ  Ｆａｂ（飲料水中２０ｍＭの２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース）によるワクチン接種ありまたはなしでの、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＶ移植Ａ２０マウスリンパ腫細胞の成長に対する２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのインビボ効果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＫＬＨ結合Ａ２０  Ｉｄ  Ｆａｂ（飲料水中２０ｍＭの２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース）によるワクチン接種と組み合わせた、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＶ移植Ａ２０マウスリンパ腫細胞の成長に対する２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのインビボ効果に対する免疫細胞サブセット枯渇の効果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、血清含有培地（対照共培養と比較される、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置共培養のＭＦＩ）中でＴ細胞と共培養されたＤＣ上の樹状細胞（「ＤＣ」とも呼ばれる））マーカーの測定を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、無血清培地（対照無血清共培養と比較される、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースで処理した無血清共培養のＭＦＩ）を、Ｔ細胞と共培養したＤＣ上のＤＣマーカーの測定を示す。
【図３】図３は、３つの異なる四量体（ＥＢＶ、Ｍ１、およびＣＭＶ）に対するＴ細胞への四量体結合（対照Ｔ細胞と比較した、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞への結合のＭＦＩ）の比較を示す。
【図４】図４は、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置ありまたはなし）におけるＺＡＰのＴＣＲ媒介性リン酸化を示す。
【図５】図５は、ＦＡＣＳによって評価された２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置ありまたはなしでのＴ細胞におけるガレクチン−３の発現を示す。
【図６】図６は、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置対ＴＧＦβで刺激した対照Ｔ細胞におけるＳＭＡＤ２のリン酸化の比較を示す。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、ＦＯＸｐ３発現および２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞対対照Ｔ細胞における調節性Ｔ細胞の割合の比較を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、ＦＯＸｐ３発現および２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞対対照Ｔ細胞における調節性Ｔ細胞の割合の比較を示す。
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、それぞれ（Ａ）ＩＮＦγ、（Ｂ）ＩＬ１２ｐ４０および（Ｃ）ＣＤ４０ＬにおけるＴ細胞／ＤＣ共培養サイトカインを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、それぞれ（Ａ）ＩＮＦγ、（Ｂ）ＩＬ１２ｐ４０および（Ｃ）ＣＤ４０ＬにおけるＴ細胞／ＤＣ共培養サイトカインを示す。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、それぞれ（Ａ）ＩＮＦγ、（Ｂ）ＩＬ１２ｐ４０および（Ｃ）ＣＤ４０ＬにおけるＴ細胞／ＤＣ共培養サイトカインを示す。
【図９】図９は、Ａ２０ワクチンモデルのサイトカイン評価、ＫＬＨ−イディオタイプ（対照）対２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース＋ＫＬＨ−イディオタイプ（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース）（ＢＡＬＢ／ｃマウス）を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれヒト共培養のＩＦＮγおよびＩＬ−１２ｐ７０のインビトロ産生を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれヒト共培養のＩＦＮγおよびＩＬ−１２ｐ７０のインビトロ産生を示す。
【図１１】２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース、抗−ＰＤ１抗体および２ＦＦと抗−ＰＤ１抗体との組合せの、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＶ移植Ａ２０マウスリンパ腫細胞の成長に対するインビボ効果を示す（飲料水中２０ｍＭ  ２ＦＦ、５ｍｇ／ｋｇ  抗ＰＤ１  ｑ３×３）。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｃは、腫瘍微小環境における活性免疫応答を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｃは、腫瘍微小環境における活性免疫応答を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｃは、腫瘍微小環境における活性免疫応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、適応免疫応答を活性化または増強することに基づく新規組み合わせ治療を記載する。適応免疫応答機構は、チェックポイント阻害剤が、既存の抗腫瘍免疫応答（すなわち、活性化Ｔ細胞）が存在する場合にのみ機能し、または、より効果的に機能することを意味する。例えば、既存の抗腫瘍応答をもたない患者では、チェックポイント阻害剤単独では効果がない可能性がある。したがって、抗腫瘍活性（例えば、抗腫瘍免疫応答）を活性化し、チェックポイント封鎖を阻害することができる組み合わせ治療は、チェックポイント阻害剤単独による治療に応答しない対象がこの併用治療の恩恵を受けることができるため、好ましい。
【００１２】
本発明は、とりわけ、癌を治療する方法であって、有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたはそのプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能なその塩を、チェックポイント阻害剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。本発明はまた、とりわけ、それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害する方法であって、有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩を、チェックポイント阻害剤と組み合わせて対象に投与することを含む方法を提供する。さらに、本発明は、とりわけ、チェックポイント阻害剤の効果を増強または延長する方法、またはそれを必要とする対象において、チェックポイント阻害剤に対象が応答することを可能にする、有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩を、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの態様において、投与される２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩と、チェックポイント阻害剤との組合せは、癌の治療においてまたは腫瘍細胞の増殖の阻害において、相加効果または相乗効果を提供する。別の態様では、投与される２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩、およびチェックポイント阻害剤の組み合わせは、癌の治療においてまたは腫瘍細胞の増殖の阻害において、相乗効果を提供する。別の態様では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたは薬学的に許容可能なその塩は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのプロドラッグまたは薬学的に許容可能なその塩は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのカルボン酸エステルプロドラッグまたは薬学的に許容可能なその塩は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの酢酸エステルまたは薬学的に許容可能なその塩は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、生物学的治療薬または小分子である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および融合タンパク質またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７ファミリーリガンドまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質のリガンドを阻害するまたは該リガンドと相互作用する。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＰＤ−１阻害剤である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ−１阻害剤である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤であり、ニボルマブまたはペンブロリズマブである。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤はＰＤ−１阻害剤であり、ニボルマブである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は液体腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、泌尿生殖器、婦人科、肺、胃腸、頭頚部癌、悪性神経膠腫および脳転移を含む脳腫瘍、悪性中皮腫、非転移性または転移性乳癌、悪性黒色腫、メルケル細胞癌腫または骨および軟部組織肉腫、血液学的腫瘍、多発性髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病などのリンパ腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、転移性結腸直腸癌、ホルモン感受性またはホルモン不応性前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、頭頸部扁平上皮癌軟部組織肉腫、および小細胞肺癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、または結腸直腸癌である。いくつかの実施形態では、癌は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。いくつかの実施形態では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩を含む組成物を対象に投与する。いくつかの実施形態では、組成物は固体または液体製剤である。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤および２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、同時にまたはいずれかの順序で連続して投与される。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００１６】
定義
用語「阻害する」または「阻害」は、測定可能な量だけ減少させるか、または完全に防止することを意味する。本明細書で使用される阻害という用語は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の阻害または減少を意味することができる。
【００１７】
用語「処置」または「処置する」は、疾患または状態の臨床的または診断的症状の減少または排除によって証明されるように、患者における疾患または状態の進行を遅延、停止または逆転させることを指す。処置には、例えば、症状の重症度の低下、症状の数、または再発の頻度が含まれ得る。
【００１８】
「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦または州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方または動物、特にヒトにおける使用のために一般的に認められている薬局方に挙げられていることを意味する。「医薬適合性成分」という用語は、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースが投与される薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。
【００１９】
本明細書で使用する「プロドラッグ」という用語は、インビボ投与時に化合物の活性型に変換される化合物を指す。例えば、活性化合物のプロドラッグ形態は、アシル化（アセチル化または他の）およびエーテル誘導体、カルボン酸エステルまたはリン酸エステル、および活性化合物の様々な塩形態であり得るが、これらに限定されない。当業者は、本発明の化合物をプロドラッグ形態に容易に改変して、宿主生物または患者内の標的部位への活性化合物の送達を容易にする方法を認識するであろう。当業者は、癌の治療における化合物の意図された効果を最大限にするために、適用可能であれば、宿主生物または患者内の標的部位に所望の化合物を送達する際に、プロドラッグ形態の好ましい薬物動態パラメータを利用する。
【００２０】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩は、典型的には、望ましくない混入物から実質的に純粋である。これは、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容可能なその塩が、典型的には少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）または約８０％ｗ／ｗの純度であることを意味し、より好ましくは少なくとも約９０％または約９５％ｗ／ｗの純度で、不純物および他の汚染物質を実質的に含まないことを意味する。従来の精製技術を用いて、少なくとも９９％ｗ／ｗの均質な生成物を得ることができる。
【００２１】
治療の目的のための「対象」または「患者」という用語は、ヒト、家畜化されたおよび農場の動物、動物園、スポーツ、またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、牛などの任意の動物を含み、特に哺乳類に分類される動物を指す。好ましくは、対象はヒトである。
【００２２】
「治療上有効な量」または「有効な量」という用語は、対象における癌の進行を遅らせる、停止させる、または逆行させる、または患者の生存を増加させるのに十分な、本明細書に記載の１つまたは複数の薬剤または組成物の量を指す。治療有効量は、例えば、疾患の進行を遅らせることにおいて有効であることが示されている標的血清濃度を指してもよい。「治療上有効な量」という用語が併用療法を指すために使用される場合、併用効果が所望の生物学的または医学的応答を誘発するように、併用される薬剤の組み合わせの量を指す。有効性は、治療すべき状態に応じて、従来の方法で測定することができる。例えば、腫瘍性疾患において、効力は、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価することによって、または応答率（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「相乗作用」または「相乗効果」という用語は、作用物質の組み合わせの有効性の記載に関連して使用される場合、個々の薬剤の効果の合計から予想される効果よりも大きい組み合わせの任意の測定された効果を意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるように、薬剤の組合せの有効性の記載に関連して使用される場合、用語「相加」または「相加効果」は、個々の薬剤の効果の合計から予測される効果に類似する組み合わせの任意の測定された効果を意味する。
【００２５】
治療方法
固相での２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、以下の化学構造（Ｉ）：
【００２６】
【化１】
2019501145.tif 000003
を有し、これはアルファまたはベータのアノマーであり得る。
【００２７】
液体では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、対応するアルドース形態を介して、以下の化学構造（ＩＩ）：
【００２８】
【化２】
2019501145.tif 000004
を有する化合物に相互変換することができる。
【００２９】
したがって、本明細書中で使用される用語「２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース」は、式（Ｉ）、（ＩＩ）の化合物または対応するアルドース形態、またはそれらの混合物を指し、式（Ｉ）または（ＩＩ）のそれぞれは、独立して、アルファまたはベータアノマーであり得る。
【００３０】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、インビトロで宿主細胞によって産生される抗体または抗体誘導体の複合Ｎ−グリコシド結合糖鎖へのフコースの取り込みを低下させるWO 2009/135181に記載されている。２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース並びにその潜在的な抗腫瘍効果は、インビボで投与された場合にタンパク質フコシル化を阻害するWO 2012/019165に記載されている。WO 2009/135181およびWO 2012/019165の両開示は、それらの全体が本出願の開示に参照として組み込まれる。
【００３１】
驚くべきことに、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースが調節性Ｔ細胞を減少させることが見出されている。本明細書で提供される方法において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースで処置することによりフコシル化された場合に誘導されるＴ−細胞活性の変化に起因して癌を治療するための免疫調節剤として使用することができる。起こる変化としては、調節性Ｔ細胞集団の減少、抗原提示細胞のＴ細胞活性化の増加、ならびにＡＰＣの活性化の増加をもたらすＴ細胞受容体シグナル伝達の増加が挙げられる。Ｔ細胞活性のこの調節の結果は、Ｔ細胞およびＡＰＣ活性化を増加させるだけでなく、免疫抑制性腫瘍微小環境を減少させることであろう。したがって、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースでの処置は、宿主媒介抗腫瘍免疫応答の増加をもたらし、腫瘍進行の遅延または腫瘍発症の遅延をもたらす。抗腫瘍活性はまた、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞の直接養子移入によっても起こり得る。本明細書で提供される方法のための２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、それを必要とするヒトのような対象における癌を治療するのに有効な量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて安全に対象に投与することができる。本明細書で提供される方法では、チェックポイント阻害剤と組み合わせた２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、ＰＤ−１阻害剤とＣＴＬＡ−４阻害剤の組み合わせなどの既存のＰＤ−１併用療法よりも優れた安全性プロファイルを提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース（または２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの細胞内代謝物質または産物）は、癌ワクチンと共に投与された場合、液性および細胞性免疫応答を増加させる。いくつかの実施形態では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース（または２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの細胞内代謝物質または産物）は、ＣＤ４５ＲＯ１＋Ｔ細胞集団（記憶Ｔ細胞表現型）を増加させる。いくつかの実施形態では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース（または２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの細胞内代謝物質または産物）処理Ｔ細胞は、未処理（対照）Ｔ細胞よりも樹状細胞を活性化させる。いくつかの実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース（または２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの細胞内代謝物質または産物）は、抗原特異的（例えば、ＥＢＶ特異的）の四量体結合を増加させる。いくつかの実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース（または２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの細胞内代謝物質または産物）は、調節性Ｔ細胞集団ならびにＦＯＸｐ３＋細胞の数を減少させる。抗ＣＴＬＡ４チェックポイント阻害剤は、調節性Ｔ細胞集団を減少させることが示されており、抗ＰＤ１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体のような異なる機構的標的を有する他のチェックポイント阻害剤とうまく組み合わせられている。したがって、いくつかの実施形態では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース（または２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの細胞内代謝物質または産物）は、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの別のチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。
【００３３】
本明細書において提供される２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、対象における癌を治療するために有用である。それを必要とする動物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）への２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの投与は、腫瘍細胞または癌細胞の増殖を阻害し、または動物（例えば、ヒト患者）における癌の治療をもたらすことができる。従って、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、動物の癌の治療のための種々の状況において使用することができる。
【００３４】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースで治療できる特定のタイプの癌には、固形腫瘍および血液悪性腫瘍が含まれる。そのような癌には、限定されないが、（１）線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、骨癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻がん、咽喉がん、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原発癌、腎細胞癌、肝癌腫胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、小細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体細胞腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、皮膚癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない固形腫瘍、（２）急性リンパ芽球性白血病「ＡＬＬ」、急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病「ＡＭＬ」、急性前骨髄球性白血病「ＡＰＬ」、急性単芽球性白血病、急性赤白血病白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ性白血病、急性未分化白血病、慢性骨髄性白血病「ＣＭＬ」、慢性リンパ性白血病「ＣＬＬ」、毛状細胞白血病、多発性骨髄腫、急性および慢性の白血病、例えば、リンパ芽球性骨髄性白血病およびリンパ球性骨髄球性白血病を含むがこれらに限定されない血液媒介性の癌、並びに（３）ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、および真性赤血球増加症などのリンパ腫、が含まれる。
【００３５】
いくつかの態様では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、少なくとも１０ｍＭの濃度で製剤緩衝液（例えば、水性製剤緩衝液）に可溶である。いくつかの実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、少なくとも１００ｍＭの濃度で製剤緩衝液中に可溶性である。いくつかの態様では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも約３００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤緩衝液（例えば、水性製剤緩衝液）に可溶である。
【００３６】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容されるその塩は、治療上または予防上有効な量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースもしくはそのプロドラッグ、または薬学的に許容されるその塩、および１つまたは複数の薬学的に適合する（許容される）成分を含む医薬組成物として処方することができる。いくつかの態様では、哺乳類への投与に適している、有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースが賦形剤と混合されている２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースおよび薬学的賦形剤の医薬組成物が提供される。好ましい態様において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、ヒトへの投与のために処方される。したがって、本発明は、ヒトへの投与のために製剤化された２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを含む医薬組成物を提供する。処方された２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、一般に、１つ以上の薬学的に適合する（許容される）成分を含む。
【００３７】
例示的な医薬組成物または非医薬組成物は、典型的には、1つまたは複数の担体（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む水および油などの無菌液体など）を含む。医薬組成物が静脈内投与される場合、水はより典型的な担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射液用の液体担体として使用することができる。適切な賦形剤には、例えば、アミノ酸、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態を取ることができる。適切な薬学的担体の例は、E.W.Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。このような組成物は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、典型的には、治療に有効量なの２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを、典型的には精製形態で適切な量の担体とともに含む。処方物は、投与様式に対応する。
【００３８】
本明細書に記載の医薬組成物は、組成物を動物（例えば、哺乳類）に投与することを可能にする任意の形態であり得る。組成物は、固体または液体の形態であり得る。典型的な投与経路としては、経口、非経口、および舌下が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与には、皮下注射、腹腔内注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術が含まれる。好ましくは、組成物は経口投与される。これらの医薬組成物は、組成物の動物への投与時に２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースが生物学的に利用できるように処方することができる。組成物はまた、１つまたは複数の投与単位の形態を取ることもでき、例えば、錠剤は単一投与単位であり、固体形態の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの容器は、複数の投与単位を保持することができる。
【００３９】
医薬組成物を調製する際に使用される材料は、使用される量で非毒性であり得る。医薬組成物中の活性成分の最適な投与量は、様々な要因に依存することは、当業者には明らかであろう。関連する因子には、動物（例えば、ヒト）のタイプ、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの特定の形態、投与様式、使用される組成物、および治療される疾患または状態の重篤度が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
薬学的に許容可能な担体またはビヒクルは粒子状であり得、そのため、組成物は、例えば、錠剤または粉末の形態である。担体は液体であってもよく、組成物は、例えば、経口シロップ、香味水、または注射液である。
【００４１】
経口投与が意図される場合、組成物は、固体または液体の形態であることが好ましく、ここで半固体、半液体、懸濁液およびゲルの形態が本明細書で固体または液体のいずれかとみなされる。
【００４２】
経口投与のための固体組成物として、組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、丸薬、カプセル、チューインガム、ウェーハなどの形態に製剤化することができる。そのような固体組成物は、典型的には、１種以上の不活性希釈剤を含有する。さらに、以下の１つ以上が存在してもよい：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、またはゼラチンのような結合剤；デンプン、乳糖またはデキストリンのような賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル（Primogel）、コーンスターチ等のような崩壊剤; ステアリン酸マグネシウムまたはステロテックス（Sterotex）のような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；
スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味などの香味剤；および着色料。
【００４３】
組成物がカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態である場合、それは、上記タイプの材料に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリンまたは脂肪油のような液体担体を含有することができる。
【００４４】
組成物は、液体、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、溶液剤、エマルジョン剤または懸濁剤の形態であり得る。液体は、経口投与または注射による送達に有用であり得る。経口投与が意図される場合、組成物は、甘味剤、保存剤、色素／着色剤、および風味増強剤の１つ以上を含み得る。いくつかの態様では、組成物は粉末に調合され、最終使用者は経口投与のために水溶液中で粉末を混合する。注射による投与のための組成物（上記のように）には、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤および等張剤の１つまたは複数を含むこともできる。
【００４５】
上記のように、本明細書に記載の方法において有効な２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、インビトロアッセイまたはインビボアッセイを、最適な投与量範囲を同定するのを助けるために任意に用いることができる。組成物に使用される正確な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重篤度に依存し、施術者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
【００４６】
組成物は、適切な投与量が得られるように、有効量の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを含む。典型的には、この量は、組成物の重量で少なくとも約０．０１％の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースである。いくつかの態様では、経口投与が意図される場合、この量は、組成物の約０．１重量％〜約１００重量％の範囲に変化させることができる。好ましい経口組成物は、組成物の重量に対して、例えば約４％〜１００％、４％〜７５％または４％〜約５０％の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを含むことができる。
【００４７】
いくつかの態様において、静脈内投与のために、投与される量は、約１〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースであろう。
【００４８】
一般に、動物に投与される２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの経口投与量は、動物の体重の約１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、より典型的には、動物の体重の約５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇまたは３００ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、動物に投与される投薬量は、約１ｇ、約５ｇ、または約１０ｇ〜約１５０ｇ／日、または約１ｇ〜、約５ｇ〜、約１０ｇ〜、約１５ｇもしくは約２０ｇ〜約６０ｇ／日である。
【００４９】
一般に、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたはその医薬組成物は、所望の効果に従って、毎日、毎週、隔週または毎月のスケジュールで投与することができる。いくつかの態様において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたはその医薬組成物は、約１〜５回、約１〜約１０回、約１〜約１５回またはそれ以上のサイクルで投与することができ、各サイクルは１ヶ月の期間である。各サイクル内の用量は、毎日（１日１回、１日２回、または１日２回以上を含む）、隔日、週２回、週２回、週３回または月ごとに１回投与することができる。サイクルは、休止期間を任意に含むことができる。あるいは、休止期間をサイクル間に含めることができる。いくつかの態様において、投与は、疾患の持続期間であろう。
【００５０】
２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたはその医薬組成物の好ましい投与様式は、医師の裁量に委ねられ、医学的状態の部位に部分的に依存する。一実施形態では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたは組成物は、非経口的に投与される。別の実施形態では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたは組成物を経口投与する。
【００５１】
別の実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、小胞、特にリポソーム中に送達され得る（Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER参照、Lopez-Berestein および Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 同書、pp. 317-327;一般的に同書を参照されたい。）。
【００５２】
さらに別の実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたは複数の組成物は、制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)を参照されたい。）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983) を参照されたい; Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)についても参照されたい。）。Langerによるレビュー（Science 249：1527-1533（1990））で議論された他の制御放出系を使用することができる。
【００５３】
用語「担体」は、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースが投与される希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を指す。そのような医薬担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む水および油などの液体であってもよい。担体は、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することができる。一実施形態では、動物に投与する場合、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたは組成物および薬学的に許容される担体は無菌である。水は、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを静脈内投与する場合に好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射液用の液体担体として使用することができる。適切な薬学的担体はまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤を含む。本組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。
【００５４】
免疫チェックポイントは、自己耐性を維持するおよび末梢組織損傷を最小限に抑えるために免疫系応答の程度を調節することに寄与する免疫系における阻害経路を指す。しかしながら、腫瘍細胞はまた、免疫系チェックポイントを活性化して、腫瘍組織に対する免疫応答の有効性を低下させる（免疫応答を「ブロックする」）ことができる。大部分の抗癌剤とは対照的に、チェックポイント阻害剤は、免疫系の内因性抗腫瘍活性を増強するために、腫瘍細胞を直接的に標的化せず、むしろリンパ球受容体またはそれらのリガンドを標的とする。（Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264）ＣＴＬＡ４、ＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１などの免疫系チェックポイントに対する拮抗的なチェックポイントブロッキング抗体による治療は、癌および他の疾患に対する免疫療法の最も有望な新しい手段の１つである。ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、様々なＢ−７リガンド、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、ＢＴＬＡ、Ａ２ａＲなどの追加のチェックポイント標的も調査中である。現在、ＣＴＬＡ−４阻害剤であるイピリムマブ（Yervoy（登録商標））、ともにPD-1の阻害剤であるペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））およびニボルマブ（Opdivo（登録商標））を含む、３つのチェックポイント阻害剤が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から癌治療についての早期の承認を受けている。さらに、いくつかのチェックポイント阻害剤が臨床試験中である。
【００５５】
最近のデータは、腫瘍自体内で起こりうる抗ＣＴＬＡ−４抗体の二次的メカニズムを示唆している。ＣＴＬＡ−４は、腫瘍内エフェクターＴ細胞（本明細書では「Ｔｅｆｆ細胞」とも呼ばれる）と比較して、調節性Ｔ細胞（本明細書では「Ｔｒｅｇ細胞」とも呼ばれる）上のより高いレベルで腫瘍において発現することが見出され、Ｔｒｅｇ細胞に優先的に影響を与える抗ＣＴＬＡ−４の仮説が得られた。“Therapeutic use of anti-CTLA-4 antibodies”, Christian U. Blank and Alexander Enk, International Immunology, Vol. 27, No. 1, pp. 3-10。ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の組み合わせに関する最近の研究は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１経路の併用遮断が協力して、調節性Ｔ細胞およびＭＤＳＣの両方に対するＴｅｆｆ細胞の比率を増加させ、これにより、腫瘍微小環境における抑制を低減し、炎症を促進することを示す。“Combination of CTLA-4 and PD-1 blockade expands infiltrating T-cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors”, Curran et al., PNAS | March 2, 2010 | vol. 107 | no. 9 | 4275-4280。チェックポイント阻害剤と別の治療剤との組み合わせは、チェックポイント阻害剤の抗腫瘍応答および/または治療剤の効果を増強または延長し得る。これに関して、WO2015/069770は、癌の治療のための適応免疫応答、特にＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１阻害剤の組合せの活性化に基づく併用処置を開示する。WO 2015/069770の開示内容は、本出願の開示内容全体が参考として援用される。
【００５６】
チェックポイント遮断抗ＣＴＬＡ−４抗体が抗腫瘍効果を媒介する１つのメカニズムは、調節性Ｔ細胞を減少させることによるものである。抗ＣＴＬＡ−４抗体の作用機序が異なるため、エフェクターＴ細胞に付与された抑制シグナル伝達を解除する抗ＰＤ１チェックポイント遮断抗体とうまく組み合わせることができる。これらの抗体を用いた二重封鎖は、前臨床的に（Proc Natl Acad Sci USA 2010, 107, 4275-4280）およびクリニックで（N Engl J Med 2013, 369, 122-133; N Engl J Med 2015, 372, 2006-2017）、ともに、抗腫瘍応答も改善する。
【００５７】
一般に、癌の治療に有効な２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースおよびチェックポイント阻害剤の最適量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な投与量範囲を同定するのを助けるために、インビトロアッセイを任意に用いることができる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路および悪性疾患の段階にも依存し、施術者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から外挿することができる。
【００５８】
さらなる態様において、チェックポイント阻害剤および２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、同時にまたはいずれかの順序で連続的に投与される。特定の態様において、チェックポイント阻害剤はＰＤ−１阻害剤またはＣＴＬＡ−４阻害剤である。別の特定の態様において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースおよびチェックポイント阻害剤は、最大耐容量（ＭＴＤ）または最適生物学的用量（ＯＢＤ）で対象に投与される。ＭＴＤとＯＢＤを測定することは当該技術分野の範囲内である。いくつか態様において、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースはそのＭＴＤまたはＯＢＤに提供され、チェックポイント阻害剤はＭＴＤまたはＯＢＤの５０％〜１００％、好ましくは５０％〜９０％で投与される。あるいは、チェックポイント阻害剤は、そのＭＴＤまたはＯＢＤに投与され、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースは、ＭＴＤまたはＯＢＤの５０％〜１００％、好ましくは５０％〜９０％で投与される。いくつかの態様では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースおよびチェックポイント阻害剤の両方が、ＭＴＤまたはＯＢＤの６０％〜９０％で投与される。
【００６０】
本発明で使用されるように、組み合わせレジメンは、同時に与えられてもよく、またはチェックポイント阻害剤が、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースとは治療の間の異なる時間に与えられて、互い違いのレジメンで与えられてもよい。この時間差は、２つの薬剤の投与の間に数分、数時間、数日、数週間またはそれ以上の範囲であり得る。したがって、組み合わせという用語は、必ずしも同時に投与されることを意味するものではなく、単一投与量として投与されることを意味するのではなく、各成分が所望の治療期間中に投与されることを意味する。薬剤は、異なる経路によって投与することもできる。
【００６１】
本明細書では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのプロドラッグまたは２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたはそのプロドラッグの薬学的に許容可能な塩も提供する。したがって、本明細書で提供される様々な実施形態のいずれかにおいて、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースのプロドラッグまたは２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースまたはそのプロドラッグの薬学的に許容可能な塩を使用することができる。
【００６２】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明、特定の実施形態の非限定的な実施例、および添付の図面を参照することによって、より完全に理解され得る。
【実施例】
【００６３】
実施例は、本発明のさらなる理解を助けるために提供される。使用される特定の材料、プロトコルおよび条件は、本発明をさらに説明することを意図しており、その合理的な範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００６４】
実施例１．免疫サブセット枯渇を伴うＡ２０マウスリンパ腫研究
ＫＬＨ−Ａ２０  Ｉｄ  Ｆａｂは、ＯｋｅｌｅｙらＰＮＡＳ  ２０１２に記載されているように作製した。Ａ２０細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ２−メルカプトエタノールおよびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（ＰＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。免疫化群（ＢＡＬＢ／ｃ、Ｈａｒｌａｎ）に、ＫＬＨ−Ｆａｂ結合体（５０μｇ）をＴｉｔｅｒＭａｘアジュバント（１：１）と共に、２１日目に皮下注射し、−７日目に追加免疫した。２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置群は、−１４日目に開始する２０ｍＭ  ２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを含有する飲料水を受けた。２回目のワクチン接種の１週間後（０日目）、全てのマウスに２．５×１０６個のＡ２０腫瘍細胞（ｉ．ｖ．）を投与した。２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置を２１日目まで続け、続いて通常の飲料水を続けた。免疫細胞の枯渇は、−６、−５、−４、０および＋７日目（２００μｇ／マウス腹腔内）に投与された枯渇抗体で達成された。抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）または−ＣＤ８（５３−６．７２）抗体によるＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞枯渇が、−１、７、１４、２１、２９日目の血液中で確認された（ＦＡＣＳ分析）。同様の結果が、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの０日目および２９日目の脾臓においても見られた。図１Ａおよび１Ｂは、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇が、Ａ２０イディオタイプワクチン＋２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの組み合わせの活性を低下させることを示す。したがって、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、組合せ活性において役割を果たす。
【００６５】
実施例２．全血からのＴ細胞および樹状細胞の単離
Ｔ細胞を１０ｍＬの全血から単離し、１２００ｒｐｍ（３００×ｇ）で１０分間遠心分離した（ブレーキなし）。血小板を含む最上層を、白血球層を破壊することなく注意深く除去した。その後、残りの血液（５００μＬ／１０ｍＬ血液）にRosetteSep（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（StemCell technologies、Vancouver、BCのPanT細胞）を加えた。これを２０分間インキュベートし、次いで、１０ｍＬのＰＢＳと共に１ｍＬのＦＢＳを添加した。調製した血液／ＰＢＳ溶液を５０ｍＬのファルコンに入れたヒストパーク（２０〜２５ｍＬ）を非常にゆっくりと重ねた。これをブレーキなしで遠心分離した（２５℃、１５００ｒｐｍ、２５分間）。上層を除去し、軟膜層中のＴ細胞を新しい５０ｍＬチューブに移した。Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁し、２５ｍＬまで補充し、５分間インキュベートし、ＰＢＳで５０ｍＬにし、ペレット化した。この赤血球溶解工程を２回繰り返した。次いで、Ｔ細胞をＴ細胞培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％ＰＳを補充したＲＰＭＩ培地）に再懸濁し、２つのＴ２５フラスコに入れた（１００〜２００μＭの２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースありまたはなし）。ＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆ビーズ（２０μＬ／フラスコ、Miltenyi Biotec）を添加してT細胞を活性化した。２４時間後、ＩＬ２を添加した（100ng/μL、R＆D Systems）。細胞を継代するたびに、新たなＩＬ２および２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを添加した。
【００６６】
９０ｍＬの血液を使用し、血小板の除去後、RosetteSep（商標）ＴＭヒトＴ細胞濃縮カクテルを添加しなかった以外は、ＰＢＭＣをＴ細胞と同様に単離し、ヒストパークにオーバーレイする前に、代わりに等量のＰＢＳ（９０ｍＬ）を前もって添加した上記のようにヒストパークを遠心分離すると、ＰＢＭＣ含有バフィコートが得られる。赤血球溶解後、ＰＢＭＣを樹状細胞（ＤＣ）培地（３０％ＤＭＥＭ  ７０％Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５＋２ｍＭグルタマックス＋１０％ＡＴＢ血清＋１％ＰＳ）に再懸濁し、６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、上清を吸引して捨て、付着細胞を培地で洗浄し、ＩＬ４（１００ｎｇ／μＬ、R＆D Systems）およびＧＭ−ＣＳＦ（２００ｎｇ／μＬ、R＆D Systems）を補充した２ｍＬの培地で各ウェルを補充しながら、接着している単球を分化させて増殖させてＤＣにする。プレートを４〜５日間インキュベートし、次いで細胞をＴ２５フラスコに移した。細胞が継代されるたびに（２〜３日ごと）、新しいサイトカインが与えられた。
【００６７】
Ｔ細胞とＤＣとの共培養
共培養実験を、４８ウェルプレート中、１０：１（Ｔ細胞：ＤＣ）の比でＤＣ培地中で行った。ＤＣ培地（２００００〜３００００／ウェル）および１０倍のＴ細胞を、各ウェルに合計２００μＬ／ウェルのＤＣ培地で播種した。共培養物を２４時間インキュベートした後、後述するように細胞がＤＣ成熟マーカーについて評価した。
【００６８】
トランスウェル共培養
トランスウェルアッセイを、２４ウェルプレートで行った。共培養は、ウェルあたり５００μＬの最終容量で上記のようにして培養した。トランスウェルサンプルについては、ＤＣをウェルに播種し、Ｔ細胞をインサートに入れた。次いで、細胞を２４時間インキュベートし、トランスウェルを含まない共培養と同じ方法で調べた。
【００６９】
無血清共培養
ＤＣは、２つのフラスコに分けられた１つは正常培地で、もう１つは無血清培地で分割された８日目まで説明したように増殖させた。血清は存在しないが、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地は、培養物の健康を維持するのに役立つ成長因子を含む。４８ウェルプレート中で上記のように共培養実験を行った。
【００７０】
共培養におけるＤＣマーカーの分析
共培養物をＦＡＣＳ分析を用いて試験した。インキュベーション後、細胞をヒトＦｃブロック（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＢＤ染色緩衝液（ＢＳＡ）中で洗浄し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、蛍光標識した抗ＭＨＣＩＩ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８３、および抗ＣＤ４０一次抗体（ＢＤ、ＢＤ染色緩衝液（ＢＳＡ）中の１：１００または１：５０）または適切なアイソタイプ対照（氷、暗所、４０分）。次いで、細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＳＡ）で２回洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。ＤＣを前方散乱および側方散乱によって同定し、各マーカーのＭＦＩを２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置培養物で対照培養物のものと比較した。図２Ａおよび２Ｂは、血清含有および無血清アッセイ条件の両方について、これらのマーカー間の倍数差異を示す。
【００７１】
図２Ｂは、Ｔ細胞と自己ＤＣとの共培養実験が、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞が対照Ｔ細胞よりもＤＣを活性化することを明らかにした。これは、ＤＣ活性化および成熟マーカーＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＣＤ４０の増加によって示される。これらの増加は、Ｔ細胞とＤＣを分離するためにトランスウェルインサートを使用した場合に起こらないため、可溶性因子が単独で原因ではない可能性が高いことを示唆しているため、接触依存性である。ＤＣ単独では、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置の有無にかかわらず、これらのマーカーの変化を示さない。この相互作用はまた、無血清培地が同じ増加をもたらさないので、これらの細胞表面活性化マーカーの増加のために抗原が存在することを必要とする。
【００７２】
実施例３．Ｔ細胞の四量体染色
抗原特異的四量体および陰性対照四量体は、ＭＢＬ（Woburn、MA）から購入した。２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース（１００μＭ）の有無にかかわらず上記のように増殖させたＴ細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、遠心分離し、ヒトＦｃブロック（EMD Millipore）とともにＢＤ染色緩衝液（ＢＳＡ）に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を所望の四量体１０μＬ／ウェルまたは陰性対照で染色し、暗所で３０分間室温でインキュベートした。細胞を遠心分離し、ＢＤ染色緩衝液（ＢＳＡ）中で洗浄し、次いで、冷やしたＢＤ  ＢＳＡ染色緩衝液中で再懸濁して、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。図３は、３つの異なる四量体（ＥＢＶ、Ｍ１、およびＣＭＶ；ＭＢＬ  Ｂｉｏ）の対照Ｔ細胞と比較した、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞への結合のＭＦＩ倍数変化（fold change）を示す。
【００７３】
実施例４：ＴＣＲシグナリング
精製したＴ細胞を６ウェルプレート（２．５×１０６細胞／ウェル、２．５ｍＬのＴ細胞培地）に播種し、０〜４時間、３７℃でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（２０μＬビーズ／ウェル、Miltenyi Biotec、San Diego、CA）で活性化した。示された時間に試料を採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（Thermo Scientific、DNAseおよびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含む）で溶解し、ドライアイス上で急速凍結した後、−８０℃で保存した。細胞溶解物（ＢＣＡアッセイによって決定された約３μｇ／サンプル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流し、抗ｐＺＡＰ７０抗体（Cell Signaling Technologies）を用いたニトロセルロース膜のウエスタンブロットによって調べた。簡単に述べると、ブロットを５％ミルク入りＴＢＳＴ（Cell Signaling TechnologiesからのTBST）中で室温で１時間ブロックし、ＴＢＳＴでリンスし、次いで、一次抗体（ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中の抗ｐＺＡＰ７０  １：１０００）とともに４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体でＲＴで１時間（ＴＢＳＴ中５％脱脂乳で１：２０００）、続いて洗浄（３×ＴＢＳＴ）し、メーカーの指示にしたがって、Cell Signaling Elite ECLを用いて検出した。ブロットをAmersham（商標）６００イメージャ（GE Healthcare）を用いてスキャンした。画像化されると、ブロットを除去し、他の一次抗体を用いてさらなるマーカーについて再プローブすることができた。この方法のために、膜を、最初にＰＢＳで洗浄した後、Thermo ScientificのRestore（商標）ＰＬＵＳウエスタンブロットストリッピングバッファーを使用して室温で３０分間ストリッピングした。これに続いて、膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、５％ミルク入りＴＢＳＴ中で室温で１時間ブロッキングした。次いで、全ＺＡＰ７０を染色するために、上記のブロットプロトコルを続けた。図４は、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞を有する対照Ｔ細胞と比較して、ＺＡＰ７０強度に対して正規化されたｐＺＡＰ７０タンパク質レベルを示す。
【００７４】
実施例５．ガレクチン−３の活性化Ｔ細胞発現
精製したＴ細胞を１２ウェルプレート（１０６細胞／ウェル、１〜２ｍＬのＴ細胞培地）に播種し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（４μＬビーズ／２ｍＬ培地、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、次いで、固定および透過処理後のＦＡＣＳ分析後のガレクチン−３発現について分析した。要するに、細胞をペレット化し（２×１０５個）、ＢＤ染色緩衝液（ＦＢＳ）で２回洗浄した後、冷やしたBD Cytofix（商標）固定バッファー（３０分、ＲＴ）で再懸濁した。細胞をペレット化し、ＢＤ染色緩衝液（ＦＢＳ）で２回洗浄し、BD Perm/Wash（商標）バッファー（３０分、室温）に再懸濁した。細胞を新鮮なBD Perm/Wash（商標）バッファーで洗浄し、抗ガレクチン−３抗体（Life Technologies、または適切なアイソタイプ対照）でＲＴ（４０分、暗所）で染色した。細胞を室温でBD Perm/Wash（商標）で２回洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析するためにＢＤ染色緩衝液（ＦＢＳ）に再懸濁した。図５は、対照Ｔ細胞の細胞と比較した、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞におけるガレクチン−３ＭＦＩの倍数変化を示す。
【００７５】
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、抗原提示細胞上のペプチドＭＨＣと直接相互作用し、フコシル化分子であることが示唆されている（Garcia et al. 1996, Science, 274）。我々は、対照細胞と比較して、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞におけるフローサイトメトリーによるＥＢＶ特異的四量体結合の増加を観察した（他の抗原；ｆｌｕ、ＣＭＶでも若干の増加が観察された）。これは、ｐ−ＭＨＣに対するＴＣＲの親和性の増加を示す。さらに、ＤＣとのＴ細胞の共培養から抗原（血清タンパク質の形態のペプチド抗原）を除去すると、ＤＣ上に活性化マーカーがほとんどまたは全く増加しなかった。これらの結果を総合すると、ＴＣＲ／ｐＭＨＣ相互作用が２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置によって調節されていることが示唆される。ＴＣＲが関与し、Ｔ細胞シグナル伝達が起こるためには、ＴＣＲ／ペプチド−ＭＨＣ相互作用は、ＴＣＲの基礎的シグナル伝達および活性化を調節するガレクチン−糖タンパク質格子相互作用を克服するのに十分強くなければならない。本発明者らは、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置により、ガレクチン−３糖タンパク質相互作用を低下させ、より容易なＴＣＲ／ｐＭＨＣ媒介シグナル伝達を可能にする、Ｔ細胞におけるガレクチン−３レベルの減少があることを観察した。ＴＣＲシグナル伝達を調べたところ、ＴＣＲシグナル伝達カスケードの中心にあることが知られているタンパク質である、Ｚａｐ７０が有意にリン酸化され、ナイーブ細胞と比較して２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞においてより長期間リン酸化されたままであることを観察した（同様の結果が他のシグナル伝達タンパク質で観察された）。
【００７６】
実施例６．ＴＧＦβシグナル伝達および調節性Ｔ細胞分析
血清を含まないＲＰＭＩ培地（１％ＰＳ、２．５ｍＬ）を含む６ウェル皿（２．５ｘ１０６細胞／ウェル）に細胞を播種し、血清飢餓の６時間後に、細胞をＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍＬ）で１０分間刺激した。細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、ドライアイス上で急速凍結し、続いて−８０℃で保存した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液（ＤＮＡｓｅおよびプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含む）で溶解した。以前に記載したように、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流し、抗ｐＳＭＡＤ２抗体および抗アクチン抗体を用いたニトロセルロース膜のウエスタンブロットによって調べた。図６は、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞についての同じ比率と比較した対照Ｔ細胞についてのアクチン強度に対するｐＳＭＡＤ２の比を示す。
【００７７】
ヒト調節性Ｔ細胞カクテル（BD Pharmingen（商標））を用いて培養物中の調節性Ｔ細胞を同定し、ＦＡＣＳを用いて分析した。簡潔には、細胞をヒトFcブロック（EMD Millipore）を有するＢＤ染色緩衝液（ＢＳＡ）中に洗浄し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を蛍光標識したヒト調節Ｔ細胞カクテル（BD Pharmingen（商標）、ＢＤ染色緩衝液（ＢＳＡ）中１：１００）または適切なアイソタイプ対照（氷、暗所、４０分）で染色した。次いで、細胞をＢＤ染色緩衝液（ＢＳＡ）で２回洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。調節性Ｔ細胞はＣＤ４＋、ＣＤ２５＋及びＣＤ１２７ＬＯＷと同定された。図７Ａおよび７Ｂは、この三重ゲート集団における細胞の割合を示す。
【００７８】
上記の細胞内染色の場合と同様にしてＴ細胞を調製し、固定して透過性にし、抗ＦＯＸｐ３抗体（BD Biosciences）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。要約すると、前述のように３０分間氷上でヒトＦｃブロック（Miltenyi Biotec）を用いてＢＤ染色緩衝液（ＦＢＳ）中でインキュベートした後、細胞を暗所（ＲＴ）で２０分間抗ＣＤ４抗体で染色した。等容積のＢＤ染色緩衝液（ＦＢＳ）を加え、サンプルを回転させてＢＤ染色緩衝液（ＦＢＳ）で１回洗浄した後、冷却したBD Cytofix（商標）固定バッファー中でＲＴで３０分間再懸濁した。細胞をペレット化し、ＢＤ染色緩衝液（ＦＢＳ）で２回洗浄し、再懸濁し、BD Perm/Wash（商標）バッファー中で室温で３０分間インキュベートした。細胞を新鮮なBD Perm/Wash（商標）バッファーで洗浄し、抗ＦＯＸｐ３抗体（または適切なアイソタイプ対照）でＲＴ（４５分、暗所）で染色した。細胞を室温でBD Perm/Wash（商標）で２回洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析するためにＢＤ染色緩衝液（ＦＢＳ）に再懸濁した。細胞をＣＤ４＋でゲートし、このゲートからＦＯＸｐ３＋細胞を同定した。図７Ａおよび７Ｂは、対照Ｔ細胞培養と比較した２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置培養物中のＦＯＸｐ３＋Ｔ細胞の総数の倍数変化を示す。
【００７９】
０、１２５、５００または２０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、連続して４２日間連続経口胃管栄養法により、Sprague-Dawleyラット（ＣＤ（登録商標）［Ｃｒ１：ＣＤ（登録商標）（ＳＤ）］に２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを投与した。予備試験並びに試験の２日目、７日目、２２日目、４３日目、４９日目、５６日目、および７１日目にヘパリンナトリウムで血液試料（０．４ｍＬ／時間点）を採取した。サンプルは採集から２４時間以内に処理した。試料のアリコートを、各マーカーに特異的な予め試験し、滴定した所定量のモノクローナル抗体で染色した。各管の赤血球を溶解し、染色後、細胞をVersalyse Lysis Buffer溶液（Beckman Coulter）で固定した。調製した標本をBeckman-Coulter FC 500 MPLフローサイトメーターで分析した。
【００８０】
ＴＧＦβＲはフコシル化されており、文献はこのフコシル化が腫瘍細胞におけるＴＧＦβ結合に影響し得ることを示唆している（British Journal of Cancer（2014）110,156-163）。ＳＭＡＤ媒介転写は、ＴＧＦβＩ受容体へのＴＧＦβ結合後のリン酸化を必要とする。図６は、Ｔ細胞の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置がＴＧＦβ刺激後の対照Ｔ細胞と比較してＳＭＡＤ２リン酸化を減少させ、ＴＧＦβ結合の変化およびフコシル化Ｔ細胞上のシグナル伝達を支持することを示す。ＦＯＸｐ３発現は、ＴＧＦβシグナル伝達の下流にあるＳＭＡＤ転写因子によって駆動される。２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞は、調節性Ｔ細胞集団（全細胞のパーセント、図７Ｂ）の減少に関連するＦＯＸｐ３＋の発現低下を示した（図７Ａ）。表１は、ラットを２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースで処理した場合、この結果がインビボで翻訳されたことを示している。２日目の収集から、プレテスト値（表１）と比較して、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースを投与された全ての群において、調節性Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸｐ３＋）の相対的割合が減少する傾向があった。ＳＭＡＤ２転写因子のリン酸化を介したＴＧＦβシグナル伝達は、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置によって減少し、Ｔ細胞培養におけるＦＯＸｐ３発現の低下およびＴ−調節細胞数の減少をもたらす。調節性Ｔ細胞の減少は、免疫抑制性腫瘍微小環境を低下させることが知られている。抗ＣＴＬＡ４抗体によって付与される活性の一部は、調節性Ｔ細胞の枯渇に向けられている（Simpson et al. (2013) JEM, 210）。前臨床的に、そして最近では臨床で、抗ＣＴＬＡ４抗体が抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１チェックポイント抗体とうまく組み合わせられている（Larkin et al. (2015) NEJM 373）。調節性Ｔ細胞を減少させることに対する２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースの効果は、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコースに影響を受けたＴ細胞をＰＤ１またはＰＤＬ１標的化剤と組み合わせることにより、さらに増強された抗腫瘍免疫を付与するであろう。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
実施例７．Ｔ細胞／ＤＣ共培養における分泌されたサイトカインの分析およびインビボでの観察
先に記載したＴ細胞／ＤＣ共培養由来の組織培養上清を回収し、Luminexアッセイによってサイトカイン変化について評価した。同様に、Ａ２０ワクチンモデル研究からの血液サンプルを凝固させ、サイトカイン（MCYTOMAG01L1X-13マウスサイトカイン磁気ビーズパネル、Millipore）の分析のために血清を回収した。図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＤＣおよび２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置Ｔ細胞の共培養において、抗原特異的Ｔ細胞活性化に重要なサイトカイン、例えばＩＮＦｙ、ＩＬ１２ｐ４０およびＣＤ４０Ｌが、対照Ｔ細胞を含有する培養物と比較した場合、組織培養上清中で増加したことを示す。図９は、組織培養共培養系で観察されたサイトカインの変化に加えて、免疫応答に重要なサイトカインの特異的増加が、Ａ２０腫瘍ワクチンモデルで観察されたことを示している（上記、枯渇なし、−２１日目、−１４日目、０日目、および１日目で採取したサンプル；ＩＬ１５）。これらのデータは、２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース処置が、インビトロおよびインビボで最適な免疫応答の鍵となるサイトカインのアップレギュレーションをもたらし得ることを示している。
【００８３】
実施例８．ヒトＰＢＭＣにおけるインビトロ２ＦＦおよび抗ＰＤ１抗体の組合せ
ＣＭＶ陽性ドナー（Astarte（商標）Biologics）からのＣＭＶ反応性ヒトＰＭＢＣを解凍し、６ウェルプレートに播種し、ＤＣ培地（３０％ＤＭＥＭ  ７０％Ｘ−ビボ＋２ｍＭグルタマックス＋１０％ＡＴＢ血清＋１％ＰＳ）中で一晩培養した。翌日、上清を回収してＴ細胞を単離し、接着細胞を培地で洗浄し、次いで１ウェルあたりＩＬ４（１００ｎｇ／μＬ）およびＧＭＣＳＦ（２００ｎｇ／μＬ）を補充した培地２ｍＬを補充、付着している単球をＤＣへと分化および増殖させた。プレートを４〜５日間インキュベートし、次いで細胞をＴ２５フラスコに移した。細胞が継代されるたびに（２〜３日ごと）、新しいサイトカインが与えられた。上清中のＴ細胞を、ＳｔｅｍＳｅｐヒトＴ細胞濃縮キット（Stemcell technologies）を用いて単離した。次いで、Ｔ細胞をＴ細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清、１％ＰＳ）に再懸濁し、２つのＴ２５フラスコに入れた（１００〜２００μＭ  ２ＦＦありまたはなし）。Ｔ細胞を活性化するために、ＣＤ３ＣＤ２８抗体被覆ビーズ（Miltenyi Biotec）（２０μＬ／フラスコ）を添加した。２４時間後にＩＬ２を添加した（１００ｎｇ／μＬ）。細胞を継代するたびに、新しいＩＬ２および２ＦＦを添加した。細胞を１０〜１２日間培養し、５μｇ／ｍＬのＣＭＶ抗原刺激（Astarte Biologics）を伴うまたは伴わない、および、１μｇ／ｍＬの抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ、Keytruda）を伴うまたは伴わない４８ウェルプレート中の１０：１（Ｔ細胞：ＤＣ）比のＤＣ培地中で共培養実験を行った。共培養物を２４時間インキュベートした後、ヒトＴ細胞高感度ルミネックスアッセイ（Millipore）を用いて製造業者の指示に従って上清をＩＦＮγおよびＩＬ１２ｐ７０についてアッセイした。
【００８４】
５日間の共培養からの上清中のＩＦＮγおよびＩＬ１２ｐ７０を、ルメニクスアッセイを用いて測定し、各サイトカインの濃度を内部標準曲線を用いて計算した。図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、ＣＭＶ抗原に曝露された２ＦＦ成熟Ｔ細胞は、対照細胞と比較して上昇した抗原特異的Ｔ細胞応答を有し、この組合せへの抗ＰＤ１の添加は、２ＦＦ成熟Ｔ細胞の抗原特異的応答をさらに増強する。
【００８５】
実施例９．Ａ２０マウスリンパ腫研究
Ａ２０細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ２−メルカプトエタノールおよびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（ＰＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。すべてのマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎ＝６／群）に１×１０５個のＡ２０腫瘍細胞（ｉ．ｖ．）を移植し、４つの群：未処置；２ＦＦのみで処置；抗ＰＤ１抗体のみで処置；抗ＰＤ１抗体との２ＦＦの組み合わせで処置、に分けた。２ＦＦ処置群は、腫瘍移植の日から開始して２０ｍＭ  ２ＦＦを含む飲料水を受け、研究の全体を通して継続した。２ＦＦを受けていないマウスには通常の飲料水が与えられた。抗ＰＤ１抗体（Ebiosciences、クローンJ43）処置群は、腫瘍移植後５日目から開始して３日ごとに５ｍｇ／ｋｇの３回の投与を受けた。図１１に示されるように、２ＦＦ単独処置群は、未処置群と比較して生存率が増加させたが、抗ＰＤ１抗体単独処置群は、未処置群と比較して生存率を改善しなかった。２ＦＦと抗ＰＤ１抗体との組み合わせで処置したマウスの群は、腫瘍移植後約５４日の５０％の耐性生存率を示し、腫瘍移植後約９０日で実験終了まで持続した。このことは、実験の最後まで続く約４０日間の処置後の抗ＰＤ１単独処置群および未処置群におけるわずか１７％の生存率であることと比較され、また、約９０日での実験の終了まで続く処置の７０日後の２ＦＦ単独処置群におけるわずか１７％の生存率と比較される。これらのデータは、２ＦＦおよび抗ＰＤ１の組み合わせが、未処置および２ＦＦまたは抗ＰＤ１単剤処置と比較して、腫瘍移植マウスの生存期間を延長させることを示す。
【００８６】
ディスカッション
実施例に示すように、２ＦＦは、抗ＣＴＬＡ４抗体で観察されるものと同様に、調節性Ｔ細胞集団を減少させる能力を実証している。調節性Ｔ細胞集団の減少は、調節性Ｔ細胞発生に重要なＴＧＦ−βシグナル伝達およびＦＯＸｐ３誘導の減弱と関連する。したがって、抗ＰＤ１遮断抗体の存在下での２ＦＦのコンビナトリアル活性をインビトロおよびインビボの両方で評価した。実施例は、インビトロで２ＦＦが抗ＰＤ１抗体と協力して抗原特異的Ｔ細胞活性化を増加させることを実証した；インビボでは、２ＦＦは、未処置または単剤処置群と比較して、リンパ腫の同系マウスモデルにおいて、抗ＰＤ１抗体に対する抗腫瘍応答および全生存期間を延長させることを示した。
【００８７】
実施例１０．４Ｔ１マウス腫瘍研究
腫瘍浸潤免疫細胞に対する２ＦＦ処置の効果を評価するために、ｂａｌｂ／ｃマウスに４Ｔ１細胞（２×１０４皮下注射）を移植し、同日に２０ｍＭ  ２ＦＦの飲料水で開始した。１９日目（腫瘍が約２５０〜３００ｍｍ３のとき）または２８日目（腫瘍が約８００〜１０００ｍｍ３のとき）に腫瘍を除去し、カミソリの刃で細かく刻んだ後、５ｍＬの冷却した解離緩衝液（ＤＭＥＭ（高グルコース）培地、５％ＦＢＳ、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ（Roche）、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ（５０ｍｇ／ｍＬ  ２０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐｈ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０％グリセロールでストック）に溶解し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｃ−チューブに移した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳを各チューブ上で泳動し、チューブを３７℃で４０分間連続回転させてインキュベートした。次いで、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳを２回泳動させ、チューブを急速に回転させて、チューブの底に腫瘍を集めた。次いで、管の内容物を、シリンジのゴム栓を用いて７０μｍのメッシュフィルターに通して５０ｍＬのファルコンチューブに通し、組織を穏やかに解離させた。フィルターを５ｍＬの冷却した酵素阻害剤緩衝液（ＤＭＥＭ（高グルコース）、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、チューブを遠心分離し、上清を捨て、サンプルをＰＢＳに再懸濁させた。次いで、細胞を、製造者の指示に従ってeFluor（登録商標）506バイアビリティ色素（eBioscience）で染色した。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液（０．５％ＦＢＳ、０．０５％ＮａＮ３）中で２回洗浄し、免疫細胞を同定するためにＣＤ４５に対する抗体をそれぞれ含む３つの異なるパネルの抗体で免疫表現型を調べた。樹状細胞抗原について表現型を調べた細胞を、暗所で氷上で３０分間所望の抗体で染色し、染色緩衝液で２回洗浄し、１：４のＰＢＳ：固定緩衝液（Biolgend）に再懸濁し、４℃で一晩保存した。翌日、細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。Ｔ調節性細胞について表現型を調べた細胞を、氷上で暗所で３０分間、細胞表面抗原に対する所望の抗体で最初に染色した。次いで、細胞を洗浄し、固定し、透過処理し、製造指示（カタログ番号77-5775）に従ってeBioscience染色セットを用いてＦＯＸｐ３で染色した。
【００８８】
図１２Ａ〜Ｃに示すように、２ＦＦ処置動物は、Ｔ調節性細胞が有意に減少し、移植後１９日目により活性化された樹状細胞が増加した。この結果はまた、移植後２８日目に、２ＦＦ処置動物由来の腫瘍がメモリーおよびエフェクターＴ細胞を増加させたことを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【国際調査報告】
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