(57)【要約】  本発明は、標的分子を検出するためのマイクロ流体装置に関し、マイクロ流体カートリッジを含み、マイクロ流体カートリッジは、ウェットカートリッジと、ドライカートリッジと、タンパク質マイクロアレイを有する。ドライカートリッジは、ウェットカートリッジと整列し、ウェットカートリッジ及びタンパク質マイクロアレイと流体的に連通する。ウェットカートリッジは、複数の試薬リザーバと、複数のバッファリザーバと、複数の廃液リザーバを含む。ドライカートリッジは、タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、複数のマイクロ流体チャネルを含む。
2019530884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体カートリッジを含む装置であって、
前記マイクロ流体カートリッジは、ウェットカートリッジと、ドライカートリッジと、タンパク質マイクロアレイを含み、
前記ウェットカートリッジは、ｉ）複数の試薬リザーバと、ｉｉ）複数のバッファリザーバと、ｉｉｉ）複数の廃液リザーバと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、複数のマイクロ流体チャネルと、を含み、前記開口は、前記タンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定め、
前記複数のマイクロ流体チャネルは、ｉ）複数の試薬チャネルと、ｉｉ）複数のバッファチャネルと、ｉｉｉ）前記アレイチャンバを前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記廃液リザーバに接続する複数のチャネルと、を含み、
前記複数のチャネルは、流体の滑らかな流れ及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され、
前記ドライカートリッジは、前記ウェットカートリッジと整列し、前記ウェットカートリッジ及び前記タンパク質マイクロアレイと流体的に連通する、装置。
【請求項２】
更なるマイクロ流体カートリッジを含み、前記更なるマイクロ流体カートリッジは、ウェットカートリッジと、ドライカートリッジと、タンパク質マイクロアレイを含み、
前記更なるマイクロ流体カートリッジにおいて、
前記ウェットカートリッジは、ｉ）複数の試薬リザーバと、ｉｉ）前記複数の試薬リザーバと同じ数の複数のバッファリザーバと、ｉｉｉ）第１及び第２の廃液リザーバと、ｉｖ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと、ｖｉ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、前記第１及び第２の廃液リザーバ、及び前記サンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、メインジャンクションの周囲に配置された複数のマイクロ流体チャネルと、を含み、前記開口は、前記タンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定め、
前記複数のマイクロ流体チャネルは、ｉ）複数の試薬チャネルを含み、前記複数の試薬チャネルの各々は、前記ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応し、ｉｉ）更に、複数のバッファチャネルを含み、前記複数のバッファチャネルの各々は、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、それぞれの対応する試薬チャネルに接続されて、バッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成し、ｉｉｉ）更に、前記メインジャンクションから前記バッファチャネルの各々に通じるチャネルと、ｉｖ）前記アレイチャンバを前記第１の廃液リザーバに接続するチャネルと、ｖ）前記アレイチャンバを前記メインジャンクションに接続するチャネルと、ｖｉ）前記メインジャンクションを前記第２の廃液リザーバに接続するチャネルと、を含み、上記ｉｉｉ）〜ｖｉ）のチャネルは、流体の滑らかな流れ及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され、ｖｉｉ）更に、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖｉｉｉ）前記複数のベントの各々に対応し且つ液体不透過性及び気体透過性である複数の気体透過性バリアと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記ウェットカートリッジと整列し、前記ウェットカートリッジ及び前記タンパク質マイクロアレイと流体的に連通することが可能であり、
前記複数のベントは、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
更なるマイクロ流体カートリッジを含み、前記更なるマイクロ流体カートリッジは、ウェットカートリッジと、ドライカートリッジと、タンパク質マイクロアレイを含み、
前記更なるマイクロ流体カートリッジにおいて、
前記ウェットカートリッジは、ｉ）複数の試薬リザーバと、ｉｉ）前記試薬リザーバと同じ数の複数のバッファリザーバと、ｉｉｉ）第１及び第２の廃液リザーバと、ｉｖ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと、ｖｉ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、前記第１及び第２の廃液リザーバ、及び前記サンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、複数のマイクロ流体チャネルを含み、前記開口は、前記タンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定め、
前記マイクロ流体チャネルは、ｉ）複数の試薬チャネルを含み、前記複数の試薬チャネルの各々は、前記ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応し、ｉｉ）更に、複数のバッファチャネルを含み、せせ複数のバッファチャネルの各々は、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、それぞれの対応する試薬チャネルに接続されて、バッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成し、メインチャネルに接続され、ｉｉｉ）更に、前記アレイチャンバを前記第１の廃液リザーバに接続するチャネルと、ｉｖ）前記アレイチャンバを前記メインチャネルに接続するチャネルと、ｖ）前記メインチャネルを前記第２の廃液リザーバに接続するチャネルと、を含み、上記ｉｉｉ）〜ｖ）のチャネルは、流体の滑らかな流れ及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され、ｖｉ）更に、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖｉｉ）前記複数のベントの各々に対応し且つ液体不透過性で気体透過性である複数のバリアと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記ウェットカートリッジと整列し、前記ウェットカートリッジ、及び前記タンパク質マイクロアレイと流体的に連通が可能であり、
前記複数のベントは、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記流体サンプルは、生物学的サンプルである、請求項２又は３に記載の装置。
【請求項５】
前記タンパク質マイクロアレイは、抗体マイクロアレイである、請求項１〜４の何れか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記機器は、一体化されたマイクロ制御装置、ポンプ、バルブ、及び光学センサを含む、請求項１〜５の何れか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記光学センサからの測定値は、定量化ソフトウェアを使用して解釈される、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記廃液リザーバは、予め定められた体積を可能にするように構成される、請求項１〜７の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
更に、ラミネート底部を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記ラミネート底部は、プリカットされた孔を含み、前記孔は、充填のために、前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記廃液リザーバの各々と整列する、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記ウェットカートリッジは再使用可能である、請求項１〜１０の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記ドライカートリッジは使い捨てである、請求項１〜１１の何れか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記マイクロ流体カートリッジは使い捨てである、請求項１〜１２の何れか１項に記載の装置。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載のマイクロ流体カートリッジを含む機器であって、前記機器は、更に、ポンプと、複数のバルブと、マイクロ制御装置と、光学系を含む、機器。
【請求項１５】
マイクロ流体カートリッジであって、
ウェットカートリッジと、ドライカートリッジと、タンパク質マイクロアレイを含み、
前記ウェットカートリッジは、ｉ）複数の試薬リザーバと、ｉｉ）複数のバッファリザーバと、ｉｉｉ）複数の廃液リザーバと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、複数のマイクロ流体チャネルと、を含み、前記開口は、前記タンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定め、
前記複数のマイクロ流体チャネルは、ｉ）複数の試薬チャネルと、ｉｉ）複数のバッファチャネルと、ｉｉｉ）前記アレイチャンバを前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記廃液リザーバに接続する複数のチャネルと、を含み、
前記複数のチャネルは、流体の滑らかな流れ及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され、
前記ドライカートリッジは、前記ウェットカートリッジと整列し、前記ウェットカートリッジ及び前記タンパク質マイクロアレイと流体的に連通する、マイクロ流体カートリッジ。
【請求項１６】
マイクロ流体カートリッジであって、
ウェットカートリッジと、ドライカートリッジと、タンパク質マイクロアレイを含み、
前記ウェットカートリッジは、ｉ）複数の試薬リザーバと、ｉｉ）前記複数の試薬リザーバと同じ数の複数のバッファリザーバと、ｉｉｉ）第１及び第２の廃液リザーバと、ｉｖ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと、ｖｉ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、前記第１及び第２の廃液リザーバ、及び前記サンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、メインジャンクションの周囲に配置された複数のマイクロ流体チャネルと、を含み、前記開口は、前記タンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定め、
前記複数のマイクロ流体チャネルは、ｉ）複数の試薬チャネルを含み、前記複数の試薬チャネルの各々は、前記ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応し、ｉｉ）更に、複数のバッファチャネルを含み、前記複数のバッファチャネルの各々は、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、それぞれの対応する試薬チャネルに接続されて、バッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成し、ｉｉｉ）更に、前記メインジャンクションから前記バッファチャネルの各々に通じるチャネルと、ｉｖ）前記アレイチャンバを前記第１の廃液リザーバに接続するチャネルと、ｖ）前記アレイチャンバを前記メインジャンクションに接続するチャネルと、ｖｉ）前記メインジャンクションを前記第２の廃液リザーバに接続するチャネルと、を含み、上記ｉｉｉ）〜ｖｉ）のチャネルは、流体の滑らかな流れ及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され、ｖｉｉ）更に、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖｉｉｉ）前記複数のベントの各々に対応し且つ液体不透過性及び気体透過性である複数の気体透過性バリアと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記ウェットカートリッジと整列し、前記ウェットカートリッジ及び前記タンパク質マイクロアレイと流体的に連通することが可能であり、
前記複数のベントは、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、マイクロ流体カートリッジ。
【請求項１７】
マイクロ流体カートリッジであって、
ウェットカートリッジと、ドライカートリッジと、タンパク質マイクロアレイを含み、
前記ウェットカートリッジは、ｉ）複数の試薬リザーバと、ｉｉ）前記複数の試薬リザーバと同じ数の複数のバッファリザーバと、ｉｉｉ）第１及び第２の廃液リザーバと、ｉｖ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと、ｖｉ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、前記第１及び第２の廃液リザーバ、及び前記サンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、複数のマイクロ流体チャネルを含み、前記開口は、前記タンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定め、
前記マイクロ流体チャネルは、ｉ）複数の試薬チャネルを含み、前記複数の試薬チャネルの各々は、前記ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応し、ｉｉ）更に、複数のバッファチャネルを含み、前記複数のバッファチャネルの各々は、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、それぞれの対応する試薬チャネルに接続されて、バッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成し、メインチャネルに接続され、ｉｉｉ）更に、前記アレイチャンバを前記第１の廃液リザーバに接続するチャネルと、ｉｖ）前記アレイチャンバを前記メインチャネルに接続するチャネルと、ｖ）前記メインチャネルを前記第２の廃液リザーバに接続するチャネルと、を含み、上記ｉｉｉ）〜ｖ）のチャネルは、流体の滑らかな流れ及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され、ｖｉ）更に、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖｉｉ）前記複数のベントの各々に対応し且つ液体不透過性で気体透過性である複数のバリアと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記ウェットカートリッジと整列し、前記ウェットカートリッジ、及び前記タンパク質マイクロアレイと流体的に連通が可能であり、
前記複数のベントは、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、マイクロ流体カートリッジ。
【請求項１８】
ウェットカートリッジであって、
ｉ）複数の試薬リザーバと、ｉｉ）前記複数の試薬リザーバと同じ数の複数のバッファリザーバと、ｉｉｉ）第１及び第２の廃液リザーバと、ｉｖ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと、ｖｉ）前記バッファリザーバ、前記試薬リザーバ、前記第１及び第２の廃液リザーバ、及び前記サンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、を含み、
ドライカートリッジ及びタンパク質マイクロアレイと整列することが可能である、ウェットカートリッジ。
【請求項１９】
ドライカートリッジであって、
タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、メインジャンクションの周囲に配置された複数のマイクロ流体チャネルを含み、前記開口は、前記タンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定め、
前記複数のマイクロ流体チャネルは、ｉ）複数の試薬チャネルを含み、前記複数の試薬チャネルの各々は、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応し、ｉｉ）更に、複数のバッファチャネルを含み、前記複数のバッファチャネルの各々は、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、それぞれの対応する試薬チャネルに接続されて、バッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成し、ｉｉｉ）更に、前記メインジャンクションから前記バッファチャネルの各々に通じるチャネルと、ｉｖ）前記アレイチャンバを前記第１の廃液リザーバに接続するチャネルと、ｖ）前記アレイチャンバを前記メインジャンクションに接続するチャネルと、ｖｉ）前記メインジャンクションを前記第２の廃液リザーバに接続するチャネルと、を含み、上記ｉｉｉ）〜ｖｉ）のチャネルは、流体の滑らかな流れ及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され、ｖｉｉ）更に、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバ、前記試薬リザーバ、及び前記第１及び第２の廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖｉｉｉ）前記複数のベントの各々に対応し且つ液体不透過性及び気体透過性である複数の気体透過性バリアと、を含み、
前記ドライカートリッジは、前記ウェットカートリッジ及び前記タンパク質マイクロアレイと整列することが可能であり、
前記複数のベントは、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、ドライカートリッジ。
【請求項２０】
ドライカートリッジであって、
タンパク質マイクロアレイを検出するための開口と、複数のマイクロ流体チャネルを含み、前記開口は、前記タンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定め、
前記複数のマイクロ流体チャネルは、ｉ）複数の試薬チャネルを含み、前記複数の試薬チャネルの各々は、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応し、ｉｉ）更に、複数のバッファチャネルを含み、前記複数のバッファチャネルの各々は、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、対応する試薬チャネルに接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成し、メインチャネルに接続され、ｉｉｉ）更に、前記アレイチャンバを第１の廃液リザーバに接続するチャネルと、ｉｖ）前記アレイチャンバを前記メインチャネルに接続するチャネルと、ｖ）前記メインチャネルを第２の廃液リザーバに接続するチャネルと、を含み、上記ｉｉｉ）〜ｖ）のチャネルは、流体の滑らかな流れ及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され、ｖｉ）更に、前記ウェットカートリッジのバッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと、ｖｉｉ）前記複数のベントの各々に対応し且つ液体不透過性で気体透過性である複数のバリアを含み、
前記ドライカートリッジは、前記ウェットカートリッジ及び前記タンパク質マイクロアレイと整列することが可能であり、
前記複数のベントは、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、ドライカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロ流体デバイスに関する。より具体的には、本発明は、標的分子を検出するための、タンパク質マイクロアレイが一体化されたマイクロ流体システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの診断手順又は他の手順は、収集点からサンプルが分析され得る施設へサンプルを長距離輸送する必要性に悩まされる。サンプル収集場所の近くで使用でき、例えば複雑なマトリックス内に微量で存在する標的分子について適時の様式で分析結果を生成できる、分析デバイスを提供することは有用であろう。
【０００３】
感度、定量、及びスループットの改善に関して、ＥＬＩＳＡは、吸着性の９６ウェルプレートの固相の上への抗体のコーティングに基づく、頻繁に使用されるフォーマットであり、ＥＬＩＳＡアッセイは単一検体へ限定されるものである。診断試験のうちの多くの割合は、依然として手動又は半自動のＥＬＩＳＡタイタープレートで遂行される。ＥＬＩＳＡは非常に大きな労働力を要し、ユーザーは合理化された代替技術を歓迎するだろう。現在、費用を考慮する以外にも、２つ以上のアッセイについて複数のマーカーの試験結果を得るために試験結果を発注することは、同じ試験室からリクエストされた場合でさえ、追加の遅延を招く傾向がある。同時に２つのアッセイを発注することはより多くのサンプルをしばしば異なる研究室へ送ることを意味し得る。これは、１つの試験を発注する標準的な実施よりも高い費用、及びさらなる試験が要求されるかどうかを査定するために結果の待機も招く。マルチプレックス化はパラダイムシフトであり、それは、より診断に役立つ情報を生ずる試験を使用して、より経済的な節約を可能にするものである。マルチプレックス化アッセイは、疾患マーカーの診断検出力も改善する。しばしば、単一マーカーは臨床的な感度及び／又は特異性を限定する。
【０００４】
ＥＬＩＳＡ表面のためのものに比較して、マイクロアレイ表面において使用されるより小さなスポットは、マイクロアレイアッセイのための試験サンプル中の検体が、アッセイにおいて枯渇又は変更される可能性の低減をもたらす（Ｅｋｉｎｓ，１９８９）。この差異は、マイクロアレイアッセイが、特に少ない検体のサンプルにおいてより良好な正確性、及び感度を有することも意味する。拡散制約が最小限にされるので、マイクロアレイアッセイはより速い反応速度とも関連する。したがって、本技術のプラットフォームは、従来のアプローチよりもバイオマーカーパネルのスループット、及び評価においてはるかに有効である。
【０００５】
最近、免疫アッセイはマイクロ流体システムに一体化されている。マイクロ流体システムは「ラボオンチップ（ＬＯＣ）」又は「バイオチップ」と通常称される。これらのＬＯＣマイクロ流体システムは、従来の研究室系と比較してアッセイを小型化する。免疫アッセイをＬＯＣへと一体化することには複数の利点があり、この利点としては、サンプル／試薬の低消費、感度の促進、混入リスクの低減、低単位費用、低電力消費、ならびにより高い信頼性、及び機能性が挙げられるがこれらに限定されない（Ｄｏｎｇ  ａｎｄ  Ｕｅｄｅ，２０１７；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。研究室において遂行される典型的な免疫アッセイは、試薬が非能率的に大量に輸送されて、溶液から免疫反応が生じる表面へ動くことに主として起因する長いインキュベーション時間に起因して、多くの時間をとる。マイクロ流体免疫アッセイの間の液輸送は、試薬の大量の輸送を支援し、免疫反応の効率を増加させることができる。免疫アッセイにおいて使用される試薬はかなり高価になり得る。マイクロ流体への免疫アッセイの一体化は、小型化に起因して試薬の消費を大幅に減少させることができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、部分的に、サンプルの小さな体積から複数の標的分子を並列して検出するためのマイクロ流体装置を提供する。標的分子としては、ポリペプチド、抗体、小分子、代謝物質、重金属などが挙げられる。マイクロ流体装置は、例えば標的分子のアレイの検出のための、タンパク質マイクロアレイが一体化されたマイクロ流体デバイスとすることができる。
【０００７】
一態様において、本発明は、タンパク質マイクロアレイを含むマイクロ流体カートリッジ、及び流体サンプルを受入れるレセプタクルを含む装置を提供し、流体サンプルはタンパク質マイクロアレイと流体的に連通されるように構成される。マイクロ流体カートリッジは、例えば流体の動きを制御するように、機器と空気圧で接続することができる。機器は、タンパク質マイクロアレイからのシグナルを検出することが可能である。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ウェットカートリッジ、ドライカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイを含むマイクロ流体カートリッジを含む装置であって、ウェットカートリッジが、複数の試薬リザーバと；複数のバッファリザーバと；複数の廃液リザーバとを含み；ドライカートリッジが、タンパク質マイクロアレイを検出するための開口（開口はタンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定める）、及び複数のマイクロ流体チャネルを含み、マイクロ流体チャネルが、複数の試薬チャネルと；複数のバッファチャネルと；アレイチャンバをバッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバに接続する複数のチャネルとを含み；チャネルが、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成され；ドライカートリッジが、ウェットカートリッジと整列し、ウェットカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイと流体的に連通される、装置を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ウェットカートリッジ、ドライカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイを含むマイクロ流体カートリッジであって、ウェットカートリッジが、
ｉ）例えばアッセイ特異的試薬を格納する複数の試薬リザーバと；
ｉｉ）複数のバッファリザーバ（バッファリザーバの数は、試薬リザーバの数と同じか又は異なり得る）と；
ｉｉｉ）複数の廃液リザーバと；
ｉｖ）バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと；
ｖｉ）バッファリザーバ、試薬リザーバ、廃液リザーバ、及びサンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、
を含み；
ドライカートリッジが、タンパク質マイクロアレイからのシグナルを検出するための開口（ウェットカートリッジと整列しる場合に、開口はアレイチャンバを定める）、及びメインジャンクションの周囲に配置された複数のマイクロ流体チャネルを含み、マイクロ流体チャネルが、
ｖｉｉ）複数の試薬チャネル（各々の試薬チャネルは、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応する）と；
ｖｉｉｉ）複数のバッファチャネル（各々のバッファチャネルは、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応する）と；
ｉｘ）メインジャンクションから各々のバッファチャネルへと通じるチャネルと；
ｘ）各々のバッファチャネルを各々の試薬チャネルと接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成するチャネルと；
ｘｉ）アレイチャンバを第１の廃液リザーバに接続するチャネルと；
ｘｉｉ）アレイチャンバをメインジャンクションに接続するチャネルと；
ｘｉｉｉ）メインジャンクションを第２の廃液リザーバに接続するチャネル（これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される）と；
ｘｉｖ）ウェットカートリッジのバッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ｘｖ）ベントの各々に対応する複数の流体不透過性で気体透過性のバリアに加えて、各々のペアの試薬チャネル／バッファチャネルをリザーバからメインチャネルに接続するチャネルと、
を含み；
ドライカートリッジが、ウェットカートリッジと整列し、ウェットカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイと流体的に連通され、ベントが、機器のマニホールドと相互接続する、
マイクロ流体カートリッジを提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、ウェットカートリッジ、ドライカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイを含むマイクロ流体カートリッジであって、ウェットカートリッジが、
ｉ）複数の試薬リザーバと；
ｉｉ）複数のバッファリザーバ（バッファリザーバの数は、試薬リザーバの数と同じである）と；
ｉｉｉ）第１の廃液リザーバ、及び第２の廃液リザーバと；
ｉｖ）バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと；
ｖｉ）バッファリザーバ、試薬リザーバ、廃液リザーバ、及びサンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、
を含み；
ドライカートリッジが、タンパク質マイクロアレイを検出するための開口（開口はタンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定める）、及びメインジャンクションの周囲に配置された複数のマイクロ流体チャネルを含み、マイクロ流体チャネルが、
複数の試薬チャネル（各々の試薬チャネルは、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応する）と；
複数のバッファチャネル（各々のバッファチャネルは、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、各々バッファチャネルは、各々の対応する試薬チャネルに接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成する）と；
メインジャンクションから各々のバッファチャネルへと通じるチャネルと；
アレイチャンバを第１の廃液リザーバに接続するチャネルと；
アレイチャンバをメインジャンクションに接続するチャネルと；
メインジャンクションを第２の廃液リザーバに接続するチャネル（これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される）と；
ウェットカートリッジのバッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ベントの各々に対応する液体不透過性で気体透過性である複数のバリアと、
を含み；
ドライカートリッジが、ウェットカートリッジと整列し、ウェットカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイと流体的に連通が可能であり、ベントが、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、
マイクロ流体カートリッジを提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ウェットカートリッジ、ドライカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイを含むマイクロ流体カートリッジであって、ウェットカートリッジが、
ｉ）複数の試薬リザーバと；
ｉｉ）複数のバッファリザーバ（バッファリザーバの数は、試薬リザーバの数と同じである）と；
ｉｉｉ）第１の廃液リザーバ、及び第２の廃液リザーバと；
ｉｖ）バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと；
ｖｉ）バッファリザーバ、試薬リザーバ、廃液リザーバ、及びサンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、
を含み；
ドライカートリッジが、タンパク質マイクロアレイを検出するための開口（開口はタンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定める）、及び複数のマイクロ流体チャネルを含み、マイクロ流体チャネルが、
複数の試薬チャネル（各々の試薬チャネルは、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応する）と；
複数のバッファチャネル（各々のバッファチャネルは、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、各々バッファチャネルは、各々の対応する試薬チャネルに接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成し、各々のバッファチャネルはメインチャネルに接続する）と；
アレイチャンバを第１の廃液リザーバに接続するチャネルと；
アレイチャンバをメインチャネルに接続するチャネルと；
メインチャネルを第２の廃液リザーバに接続するチャネル（これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される）と；
ウェットカートリッジのバッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ベントの各々に対応する液体不透過性で気体透過性である複数のバリアと、
を含み；
ドライカートリッジが、ウェットカートリッジと整列し、ウェットカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイと流体的に連通が可能であり、ベントが、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、
マイクロ流体カートリッジを提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、
ｉ）複数の試薬リザーバと；
ｉｉ）複数のバッファリザーバ（バッファリザーバの数は、試薬リザーバの数と同じである）と；
ｉｉｉ）第１の廃液リザーバ、及び第２の廃液リザーバと；
ｉｖ）バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ｖ）流体サンプルを受入れるサンプルウェルと；
ｖｉ）バッファリザーバ、試薬リザーバ、廃液リザーバ、及びサンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、
を含むウェットカートリッジであって；
ウェットカートリッジが、ドライカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイと整列することが可能である、
ウェットカートリッジを提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、タンパク質マイクロアレイを検出するための開口（開口はタンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定める）、及びメインジャンクションの周囲に配置された複数のマイクロ流体チャネルを含むドライカートリッジであって、
マイクロ流体チャネルが、
複数の試薬チャネル（各々の試薬チャネルは、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応する）と；
複数のバッファチャネル（各々のバッファチャネルは、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、各々バッファチャネルは、各々の対応する試薬チャネルに接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成する）と；
メインジャンクションから各々のバッファチャネルへと通じるチャネルと；
アレイチャンバを第１の廃液リザーバに接続するチャネルと；
アレイチャンバをメインジャンクションに接続するチャネルと；
メインジャンクションを第２の廃液リザーバに接続するチャネル（これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される）と；
ウェットカートリッジのバッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ベントの各々に対応する液体不透過性で気体透過性である複数のバリアと、
を含み；
ドライカートリッジが、ウェットカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイと整列することが可能であり、ベントが、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、
ドライカートリッジを提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、タンパク質マイクロアレイを検出するための開口（開口はタンパク質マイクロアレイと共同してアレイチャンバを定める）、及び複数のマイクロ流体チャネルを含むドライカートリッジであって、
マイクロ流体チャネルが、
複数の試薬チャネル（各々の試薬チャネルは、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応する）と；
複数のバッファチャネル（各々のバッファチャネルは、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応し、各々バッファチャネルは、各々の対応する試薬チャネルに接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成し、各々のバッファチャネルはメインチャネルに接続する）と；
アレイチャンバを第１の廃液リザーバに接続するチャネルと；
アレイチャンバをメインチャネルに接続するチャネルと；
メインチャネルを第２の廃液リザーバに接続するチャネル（これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される）と；
ウェットカートリッジのバッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
ベントの各々に対応する液体不透過性で気体透過性である複数のバリアと、
を含み；
ドライカートリッジが、ウェットカートリッジ、及びタンパク質マイクロアレイと整列することが可能であり、ベントが、機器のマニホールドと相互接続することが可能である、
ドライカートリッジを提供する。
【００１５】
タンパク質マイクロアレイは、抗体マイクロアレイ、タンパク質又はペプチドのマイクロアレイとすることができる。
【００１６】
流体サンプルは、生物学的サンプル、又は検出される標的分子を含有する任意の液体サンプルとすることができる。
【００１７】
機器は、ポンプ、バルブ、及び光学センサ、ならびに上記の構成要素を制御するための一体化マイクロ制御装置を含むことができる。
【００１８】
光学センサからの測定値は定量化ソフトウェアを使用して解釈することができる。ソフトウェアは、予め設定したスクリプトに従って、特定のバルブの開放又は閉鎖、及び流速を制御することができる。ソフトウェアは、画像捕捉、及び画像分析（シグナル定量化、及びバックグラウンドサブトラクション等）のための光学センサも制御することができる。
【００１９】
バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバは予め決定された体積を可能にするように構成され得る。
【００２０】
ウェットカートリッジは、リザーバの充填のために、バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの下でプリカットされた孔を含むラミネート底部を含むことができる。
【００２１】
ウェットカートリッジは必要に応じて再使用可能とすることができる。
【００２２】
ドライカートリッジは使い捨てとすることができる。
【００２３】
タンパク質マイクロアレイを含むアセンブルされたマイクロ流体カートリッジは、使い捨てとすることができる。
【００２４】
本発明のこの要約は必ずしも本発明のすべての特徴を記述するとは限らない。
【００２５】
本発明のこれら、及び他の特徴は、添付の図面を参照する以下の記載からより明らかになるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】抗原無しのＥＬＩＳＡからの、捕捉抗体と検出抗体との間の交差反応性スクリーニングの結果を示す。検出抗体はすべてビオチン化された。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＳＡ−ＨＲＰ）を使用してシグナルを検出し、組み込まれた表中で示される数は光学的密度測定値（Ｏ．Ｄ．）であった。
【図２】ＥＬＩＳＡからの、抗原と検出抗体との間の交差反応性スクリーニングの結果を示す。ウェル中の捕捉抗体に対応する抗原のインキュベーション後に、すべての検出抗体を、各々の抗原と他の３つの検出抗体との間の交差反応性の検出のために別個のウェルへ個別に適用した。
【図３】図３のＡ〜Ｌは、様々な捕捉抗体の濃度、及びマイクロアレイフォーマットにおける応答の試験のためのセットアップ、及び結果を示し、ここで、スライドはＧｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーによりスキャンした。Ａ〜Ｃ：４つのスポットをスポットした。左上から時計回りに、１３．２μｇ／ｍＬのＢＳＡ−ビオチン、１．２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、１２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、１２．５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。Ａ：３０００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及び１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂによりプロービングした。Ｂ：３００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及び１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂによりプロービングした。Ｃ：３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３、及び１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂによりプロービングした。Ｄ〜Ｆ：４つのスポットをスポットした。左上から時計回りに、１３．２μｇ／ｍＬのＢＳＡ−ビオチン、２０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、２０００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、２００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ  ｃＡｂ。Ｄ：５００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、及び１０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂによりプロービングした。Ｅ：５０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、及び１０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂによりプロービングした。Ｆ：５ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、及び１０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂによりプロービングした。Ｇ〜Ｉ：４つのスポットをスポットした。左上から時計回りに、１３．２μｇ／ｍＬのＢＳＡ−ビオチン、５μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、５００μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、５０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ。Ｇ：２００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、及び１０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂによりプロービングした。Ｈ：２０ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、及び１０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂによりプロービングした。Ｉ：２ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、及び１０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂによりプロービングした。Ｊ〜Ｌ：４つのスポットをスポットした。左上から時計回りに、１３．２μｇ／ｍＬのＢＳＡ−ビオチン、５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、５００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、５０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２。Ｊ：４μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂで１５００ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２によりプロービングした。Ｋ：４μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂで１５０ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２。Ｌ：４μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂで１５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２。
【図４】ＣＡ１５−３捕捉抗体の濃度を変動させた、シグナルに対する効果を例証するマイクロアレイのレイアウト、及び結果を示す。シグナルをＴＭＢ−ＭＸにより現像し、Ｇｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーによりスキャンした。スライド上にアイソレーターによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）；ＢＳＡ−ビオチン（８ｎＭ）、５００μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、２００μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。中央の列（左側から右側へ）；８０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、３２μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３、７５０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。下部の列（左側から右側へ）；３７５Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、１８７．５Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及び９３．７５Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及び１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂによりプロービングした。
【図５】図５のＡ〜Ｂは、ＥｒｂＢ２の固定化された抗原の力価測定（Ａ）、及びマイクロアレイアッセイからの対応する抗原の力価測定曲線（Ｂ）を示す。Ａ：スライド上にアイソレーターによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）；５００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、１２５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、６２．５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。第２の列（左側から右側へ）：上部の列と同じである。第３の列（左側から右側へ）：２８１２．５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、１８７５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、１４０６．２５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、９３７．５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。下部の列（左側から右側へ）；７０３．１３ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、４６８．７５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、３５１．５６ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、２３４．３８ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。
【図６】図６のＡ〜Ｄは、６の重複で捕捉抗体をロボットマイクロアレイプリンターを使用してプリントし、単一検出抗体によりプロービングした、マイクロアレイスライドについての結果を示す。明るい角のスポットは向きのためのＢＳＡ−ビオチンである。第１の列は５００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂである。第２列は５００μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂである。第３の列は５００μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂである。第４の列は２０００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ１である。第５の列は２０００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ２である。Ａ：２μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂによりプロービングした。Ｂ：４μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂによりプロービングした。Ｃ：２０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂによりプロービングした。Ｄ：１０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂによりプロービングした。
【図７】カスタムシリコーンアイソレーターにより手動でスポットしたマイクロアレイスライド上の捕捉抗体と検出抗体との間の交差反応性を示す。上部の列（左側から右側へ）、８ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。中央の列（左側から右側へ）、５０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、５００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、１５００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。下部の列（左側から右側へ）、７．５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、１００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、１５μｇ／ｍＬのＣＥＡ。次いで、それを、２μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、２０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂ、８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ、５μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂのｄＡｂ混合物によりプロービングした。
【図８】新しいＣＡ１５−３抗原（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ：３０Ｃ−ＣＰ９０６４Ｕ）中の可能性のある混入物を検査するマイクロアレイ実験を示し、そこで、マイクロアレイをＳＡ−ＨＲＰ、及びＥｎｚＭｅｔ銀現像剤によりプロービングし、現像されたシグナルをＧｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーによりスキャンした。マイクロアレイスライドをカスタムシリコーンアイソレートによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）、８ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、１５００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。中央の列（左側から右側へ）、５０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、６５０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。下部の列（左側から右側へ）、１００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、１５μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、７．５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。３０Ｕ／ｍＬの新しいＣＡ１５−３抗原、ならびに１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、２０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂ、８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ、及び５μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂのｄＡｂ混合物によりプロービングした。
【図９】図９のＡ〜Ｄは、抗原と検出抗体との間の交差反応性を検査するマイクロアレイ実験からの結果を示す。パネルＡ〜Ｂ：カスタムシリコーンアイソレーターによりプリントした。上部の列（左側から右側へ）、８ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。中央の列（左側から右側へ）、５０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、５００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、１５００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。下部の列（左側から右側へ）、７．５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、１００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、１５μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原。パネルＣ〜Ｄ：カスタムシリコーンアイソレーターによりプリントした。上部の列（左側から右側へ）、４ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、５０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、１５００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。中央の列（左側から右側へ）、２００μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、９７５μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、３９５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。下部の列（左側から右側へ）、１００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、１５μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、２．２５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。Ａ：３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及び２μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂによりプロービングした。Ｂ：８ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、及び５μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂによりプロービングした。Ｃ：２００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、及び２０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂによりプロービングした。Ｄ：１２０ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、及び８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂによりプロービングした。
【図１０】図１０のＡ〜Ｄは、抗原と捕捉抗体との間の交差反応性を検査するマイクロアレイ実験からの結果を示す。パネルＡ〜Ｃ：カスタムシリコーンアイソレーターによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）、８ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。中央の列（左側から右側へ）、５０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、５００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、１５００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。下部の列（左側から右側へ）、７．５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、１００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、１５μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原。パネルＤ：カスタムシリコンアイソレーターによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）、１０ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、２００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。中央の列（左側から右側へ）、２５０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、１２５μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原。下部の列（左側から右側へ）、５００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、１２５μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ。Ａ：３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及び２μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂによりプロービングした。Ｂ：５０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、及び２０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂによりプロービングした。Ｃ：８ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、及び５μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂによりプロービングした。Ｄ：３０ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、及び８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂによりプロービングした。
【図１１】図１１のＡ〜Ｎは、前混合したｄＡｂ、及びストレプトアビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）、又はＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰのいずれかによるシグナル増幅を示す。パネルＡ〜Ｇは、ＳＡ−ＨＲＰ、及びビオチン−ＨＲＰの様々な組み合わせによりプロービングし、プロービングしたスライドをＧｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーによりスキャンした、サンドイッチ抗体マイクロアレイアッセイの結果を示す。スライドをカスタムシリコーンアイソレーターによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）、４ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、１５００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。中央の列（左側から右側へ）、５０μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、６５０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。下部の列（左側から右側へ）、１００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、１５μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、７．５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２。Ａ〜Ｇをすべて、ＣＡ１５−３、ＣＥＡ、ＥｒｂＢ２、及びＣＹＦＲＡ  ２１−１からなる抗原混合物によりプロービングした。Ａ：５×モル量のＳＡ−ＨＲＰとｄＡｂの混合物により１５分間プロービングした。Ｂ：５×モル量のＳＡ−ＨＲＰとｄＡｂの混合物により１５分間、プラス４μｇ／ｍＬの追加のビオチン−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｃ：ｄＡｂ混合物により１５分間、プラス１μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰと前混合した４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｄ：ｄＡｂ混合物により１５分間、プラス２μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰと前混合した４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｅ：ｄＡｂ混合物により１５分間、プラス４μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰと前混合した４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｆ：ｄＡｂ混合物により１５分間、プラス５μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰと２０μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｇ：ｄＡｂ混合物により１５分間、プラス２５μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰと１００μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。パネルＨ〜Ｍ：マイクロアレイスライドを、４の重複で様々な濃度のＢＳＡビオチンによりプリントした。列１：１２０ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、及びプリンティングバッファ。列２：６０ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、及びプリンティングバッファ。列３：３０ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、及びプリンティングバッファ。列４：２０ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、及びプリンティングバッファ。列５：１５ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、及び１０ｎＭのＢＳＡ−ビオチン。列６：７．５ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、及び５ｎＭのＢＳＡ−ビオチン。列７：３．７５ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、及び２．５ｎＭのＢＳＡ−ビオチン。列８：１．８７５ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、及び１．２５ｎＭのＢＳＡ−ビオチン。次いでスライドを、ＳＡ−ＨＲＰ、及びビオチン−ＨＲＰの様々な濃度によりプロービングした。Ｈ：４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｉ：前混合した４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び２μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰにより１０��間プロービングした。Ｊ：前混合した４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び４μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｋ：前混合した４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び６μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｌ：前混合した４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び８μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。Ｍ：前混合した８μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び４μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。パネルＮ：Ｈ〜Ｍ中のデータのグラフでの表示。１：４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。２：４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び２μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。３：４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び４μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。４：８μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び４μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰにより１０分間プロービングした。
【図１２】図１２のＡ〜Ｂは、ＳＡ−ＨＲＰ、及びビオチン−ＨＲＰの前混合物についての異なるインキュベーション時間を示す。両方のパネルについて、スライドをカスタムシリコーンアイソレーターによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）、４ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、５０μｇμｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、１５００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。中央の列（左側から右側へ）、２００μｇμｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、９７５μｇμｇ／ｍＬのＣＥＡ、３９５μｇμｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。下部の列（左側、及び右側）、１００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、１５μｇμｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、２．２５μｇμｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。パネルＡは、ＳＡ−ＨＲＰ、及びビオチン−ＨＲＰ混合物の１０分間のインキュベーション時間での結果を示す。パネルＢは、ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ混合物の５分間のインキュベーション時間での結果を示す。スライドをＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍＤｏｃＴＭ  ＭＰ  Ｓｙｓｔｅｍによりスキャンした。
【図１３】図１３のＡ〜Ｃは、ＳＡ−ＨＲＰの希釈物をプリントし、ＴＭＢ−ＭＸによりプロービングしたスライドを示す。スライドをカスタムシリコーンアイソレーターによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）、０．５μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、１μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、２μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ。中央の列（左側から右側へ）、４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、バッファ、０．５μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ。下部の列（左側から右側へ）、１μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、２μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ。パネルＡは、Ｇｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーによりスキャンした、ＴＭＢ−ＭＸ（Ｍｏｓｓ基質）現像後のスライドの画像を示す。パネルＢは、機器により画像化したＴＭＢ−ＭＸ現像後のスライドの光学画像を示す。パネルＣは、パネルＢ中で図示されたＴＭＢ−ＭＸ応答の用量依存性のグラフ表示である。
【図１４】図１４のＡ〜Ｄは、異なるＴＭＢ−ＭＸインキュベーション時間を試験する、マイクロアレイスライドを示す。シグナルを機器により画像化した。スライドをカスタムシリコーンアイソレーターによりプリントした。上部の列（左側から右側へ）、２０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、８０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、７５０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。中央の列（左側から右側へ）、１００μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、４００μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、１２５ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原。下部の列（左側から右側へ）、１２５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、５００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、１８７５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。パネルＡは、２分間のＴＭＢ−ＭＸインキュベーション後のシグナルを示す。パネルＢは、４分間のＴＭＢ−ＭＸインキュベーション後のシグナルを示す。パネルＣは、６分間のＴＭＢ−ＭＸインキュベーション後のシグナルを示す。パネルＤは、８分間のＴＭＢ−ＭＸインキュベーション後のシグナルを示す。
【図１５】図１５のＡ〜Ｂは、スポッティングレイアウトに加えて、異なるプリントバッファを試験する２つの銀染色されたスポットについての画像を示す。２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂをカスタムシリコーンアイソレーターによりスポットした。Ａは１×ＰＢＳ中でスポットし、Ｂは１×ＰＢＳ＋２０％のグリセロール中でスポットする。ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍＤｏｃＴＭ  ＭＰ  Ｓｙｓｔｅｍにより画像化した。
【図１６】図１６のＡ〜Ｂは、銀現像したマイクロアレイスライドのＣＥＡ捕捉抗体のＧｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャンのシグナル強度に対するプリンティングバッファの効果を示す。スライドを、カスタムシリコーンアイソレーター上でスポットした。Ａ：１×ＰＢＳ、５％のグリセロール、及び０．０２％のサルコシルによりプリントされた抗体、及び抗原。上部の列（左側から右側へ）、４ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、５０μｇμｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、１５００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。中央の列（左側から右側へ）、２００μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、９７５μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、３９５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。下部の列（左側から右側へ）、１００ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、１５μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、２．２５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。Ｂ：１×  ＰＢＳによりプリントされた抗体、及び抗原。上部の列（左側から右側へ）、４ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、ＰＢＳ中の１０００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、ＰＢＳ中の１０００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ。中央の列（左側から右側へ）、３１２．５ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、６２５ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、１２５０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原。下部の列（左側から右側へ）、２５００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、５０００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、１００００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原。両方のウェルを、２００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原（Ｃ３１００−１４）、及び２０μｇ／ｍＬのＣ１２９９−８７Ｏ−Ｂ検出抗体によりプロービングした。９７５μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬのＣ１２９９−８７ＷのＣＥＡ捕捉抗体スポットを、比較のために白いボックス中でハイライト表示する。
【図１７】図１７のＡ〜Ｂは、異なるイオン強度のバッファをプロービングする結果を示す。捕捉抗体を、スライドの上へカスタムシリコーンアイソレーターによりスポットした。上部の列（左側から右側へ）、５０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。下部の列（左側から右側へ）、５００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、２５０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。結果を銀現像によって得て、ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍＤｏｃＴＭ  ＭＰ  Ｓｙｓｔｅｍにより画像化した。パネルＡは、１×ＰＢＳＴ＋５％のＢＳＡのプロービングバッファが使用された場合の結果を図示する。パネルＢは、より低いイオン強度（０．２５×ＰＢＳＴ＋５％のＢＳＡ）のプロービングバッファを使用する場合の結果を図示する。
【図１８】図１８のＡ〜Ｌは、抗原、及び検出抗体の混合物についての異なるインキュベーション時間を示す。スライドを、６の重複でマイクロアレイプリンターによりプリントし、第１の列は５００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、第２の列は５００μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂであった。マイクロアレイスキャナーは、銀現像した捕捉抗体スポットを画像化した。パネルＡ〜Ｆ：３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及び１５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原の抗原混合物によりプロービングし、ｄＡｂ混合物により１５分間プロービングした。Ａ：抗原混合物で１５分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｂ：抗原混合物で３０分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｃ：抗原混合物で６０分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｄ：抗原混合物で１５分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：４μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｅ：抗原混合物で３０分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：４μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｆ：抗原混合物で６０分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：４μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。パネルＧ〜Ｌ：３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及び１５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原の抗原混合物によりプロービングし、ｄＡｂ混合物により３０分間プロービングした。Ｇ：抗原混合物で１５分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｈ：抗原混合物で３０分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｉ：抗原混合物で６０分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｊ：抗原混合物で１５分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：４μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｋ：抗原混合物で３０分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：４μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。Ｌ：抗原混合物で６０分間プロービングした。ｄＡｂ混合物：４μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ、８μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。
【図１９】ＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーによりスキャンした、ＴＭＢ−ＭＸ現像ウェルのマイクロアレイスキャンを示す。スライドをＯｍｎｉｇｒｉｄマイクロアレイプリンターによりプリントし、スポットを１２×１２グリッドで三重でプリントした。列１（左側から右側へ）：３０ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、４０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、３０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、２０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。列２（左側から右側へ）：１６００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、８００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、４００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、２００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。列３（左側から右側へ）：６００μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、０．２５μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、０．２μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、０．１６μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原。列４（左側から右側へ）：５８０μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、５．４μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、３．６μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、２．４μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原。列５（左側から右側へ）：１００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、１．３５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、０．９μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、０．６μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。列６（左側から右側へ）：１００μｇ／ｍＬのＭＭＰ−７  ｃＡｂ、９μｇ／ｍＬのＭＭＰ−７抗原、６μｇ／ｍＬのＭＭＰ−７抗原、３μｇ／ｍＬのＭＭＰ−７抗原。列７（左側から右側へ）：４０μｇ／ｍＬのフェリチンｃＡｂ、２０μｇ／ｍＬのフェリチンｃＡｂ、１０μｇ／ｍＬのフェリチンｃＡｂ、５μｇ／ｍＬのフェリチンｃＡｂ。列８（左側から右側へ）：２．７μｇ／ｍＬのフェリチン抗原、１．８μｇ／ｍＬのフェリチン抗原、１．２μｇ／ｍＬのフェリチン抗原、０．８μｇ／ｍＬのフェリチン抗原。列９（左側から右側へ）：４００μｇ／ｍＬのＣＡ１９−９  ｃＡｂ、２００μｇ／ｍＬのＣＡ１９−９  ｃＡｂ、１００μｇ／ｍＬのＣＡ１９−９  ｃＡｂ、２２．５ｋＵ／ｍＬのＣＡ１９−９抗原。列１０（左側から右側へ）：１５ｋＵ／ｍＬのＣＡ１９−９抗原、１０ｋＵ／ｍＬのＣａ１９−９抗原、５７０μｇ／ｍＬのＣＡ７２−４  ｃＡｂ、３００μｇ／ｍＬのＣＡ７２−４。列１１（左側から右側へ）：１５０μｇ／ｍＬのＣＡ７２−４、４０００Ｕ／ｍＬのＣＡ７２−４抗原、２０００Ｕ／ｍＬのＣＡ７２−４抗原、１０００Ｕ／ｍＬのＣＡ７２−４抗原。列１２（左側から右側へ）：２００μｇ／ｍＬのＤ−ダイマーｃＡｂ、１００μｇ／ｍＬのＤ−ダイマー抗原、２０μｇ／ｍＬのＤ−ダイマー抗原、４μｇ／ｍＬのＤ−ダイマー抗原。スライドを、ＣＡ１５−３（６０Ｕ／ｍＬ）、ＣＹＦＲＡ  ２１−１（８ｎｇ／ｍＬ）、ＣＥＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＣＡ７２−４（４０Ｕ／ｍＬ）、ＣＡ１９−９（１４８Ｕ／ｍＬ）、ＥｒｂＢ２（６０ｎｇ／ｍＬ）、フェリチン（２００ｎｇ／ｍＬ）、ＭＭＰ−７（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有する抗原混合物によりプロービングした。次いでスライドを、ｄＡｂ混合物（ＣＡ１５−３  ｄＡｂ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂ（８μｇ／ｍＬ）、ＣＥＡ  ｄＡｂ（２μｇ／ｍＬ）、ＣＡ７２−４  ｄＡｂ（５μｇ／ｍＬ）、ＣＡ１９−９  ｄＡｂ（１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＥｒｂＢ２  ｄＡｂ（０．４μｇ／ｍＬ）、フェリチンｄＡｂ（５μｇ／ｍＬ）、ＭＭＰ−７  ｄＡｂ（４００ｎｇ／ｍＬ））によりプロービングした。
【図２０】マイクロアレイスライド上にプリントした抗原についての平均化したＣＥＡ抗原曲線のグラフ図である。
【図２１】平均化した抗原曲線により正規化した捕捉抗体スポット上のＣＥＡについての抗原反応の標準曲線を図示する。
【図２２】本明細書において記載されるようで遂行したマイクロアレイアッセイ、及び商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｆｕｊｉｅｒｂｉｏ  Ｉｎｃ）を比較する、Ｂｒａｎｄ−Ａｌｔｍａｎプロットである。
【図２３】カートリッジ、及び機器によりプロービング、及び画像化したスライドの結果を示す。スライドをＯｍｎｉｇｒｉｄマイクロアレイプリンターによりプリントし、スポットを１２×１２グリッドで三重でプリントした。列１（左側から右側へ）：３０ｎＭのＢＳＡ−ビオチン、４０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、３０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、２０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。列２（左側から右側へ）：１６００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、８００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、４００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、２００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。列３（左側から右側へ）：６００μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｃＡｂ、０．２５μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、０．２μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原、０．１６μｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ  ２１−１抗原。列４（左側から右側へ）：１０００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、５．４μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、３．６μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原、２．４μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原。列５（左側から右側へ）：１００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、１．３５μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、０．９μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、０．６μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原。列６（左側から右側へ）：１００μｇ／ｍＬのＭＭＰ−７  ｃＡｂ、９μｇ／ｍＬのＭＭＰ−７抗原、６μｇ／ｍＬのＭＭＰ−７抗原、３μｇ／ｍＬのＭＭＰ−７抗原。列７（左側から右側へ）：４０μｇ／ｍＬのフェリチンｃＡｂ、２０μｇ／ｍＬのフェリチンｃＡｂ、１０μｇ／ｍＬのフェリチンｃＡｂ、５μｇ／ｍＬのフェリチンｃＡｂ。列８（左側から右側へ）：２．７μｇ／ｍＬのフェリチン抗原、１．８μｇ／ｍＬのフェリチン抗原、１．２μｇ／ｍＬのフェリチン抗原、０．８μｇ／ｍＬのフェリチン抗原。列９（左側から右側へ）：４００μｇ／ｍＬのＣＡ１９−９  ｃＡｂ、２００μｇ／ｍＬのＣＡ１９−９  ｃＡｂ、１００μｇ／ｍＬのＣＡ１９−９  ｃＡｂ、２２．５ｋＵ／ｍＬのＣＡ１９−９抗原。列１０（左側から右側へ）：１５ｋＵ／ｍＬのＣＡ１９−９抗原、１０ｋＵ／ｍＬのＣａ１９−９抗原、６００μｇ／ｍＬのＣＡ７２−４  ｃＡｂ、３００μｇ／ｍＬのＣＡ７２−４。列１１（左側から右側へ）：１５０μｇ／ｍＬのＣＡ７２−４、４０００Ｕ／ｍＬのＣＡ７２−４抗原、２０００Ｕ／ｍＬのＣＡ７２−４抗原、１０００Ｕ／ｍＬのＣａ７２−４抗原。列１２（左側から右側へ）：２００μｇ／ｍＬのＤ−ダイマーｃＡｂ、１００μｇ／ｍＬのＤ−ダイマー抗原、２０μｇ／ｍＬのＤ−ダイマー抗原、４μｇ／ｍＬのＤ−ダイマー抗原。スライドを、ＣＡ１５−３（６０Ｕ／ｍＬ）、ＣＹＦＲＡ  ２１−１（８ｎｇ／ｍＬ）、ＣＥＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＣＡ７２−４（４０Ｕ／ｍＬ）、ＣＡ１９−９（１４８Ｕ／ｍＬ）、ＥｒｂＢ２（６０ｎｇ／ｍＬ）、フェリチン（２００ｎｇ／ｍＬ）、ＭＭＰ−７（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有する抗原混合物によりプロービングした。次いでスライドを、ｄＡｂ混合物（ＣＡ１５−３  ｄＡｂ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＣＹＦＲＡ  ２１−１  ｄＡｂ（８μｇ／ｍＬ）、ＣＥＡ  ｄＡｂ（２μｇ／ｍＬ）、ＣＡ７２−４  ｄＡｂ（５μｇ／ｍＬ）、ＣＡ１９−９  ｄＡｂ（１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＥｒｂＢ２  ｄＡｂ（０．４μｇ／��Ｌ）、フェリチンｄＡｂ（５μｇ／ｍＬ）、ＭＭＰ−７  ｄＡｂ（４００ｎｇ／ｍＬ））によりプロービングした。
【図２４】図２４のＡ〜Ｂは、一実施形態に従う、分離したドライカートリッジ、及びウェットカートリッジの図解のイラスト、ならびに、それらが、どのように互いに、及び機器のマニホールドと相互接続することができるかを示す。パネルＡは上面図を示し、パネルＢは側面図を示す。
【図２５Ａ】ドライカートリッジの異なる実施形態の図解のイラストである。
【図２５Ｂ】ドライカートリッジの異なる実施形態の図解のイラストである。
【図２５Ｃ】ドライカートリッジの異なる実施形態の図解のイラストである。
【図２６】ウェットカートリッジの一実施形態の図解のイラストである。
【図２７】例示的なウェットカートリッジ、及びドライカートリッジの側面図の図解のイラストであり、これら２つの位置合わせを示す。
【図２８】機器、及びカートリッジのための、ポンプ、バルブ、リザーバ、及び流体経路の一実施形態の図解のイラストである。
【図２９】機器中で使用されるソレノイドバルブの一実施形態の図解のイラストである。
【図３０】機器、カートリッジ、及びコンピューター／ソフトウェア接続の一実施形態の図解のイラストである。
【図３１】ベンチトップ機器の一実施形態のイラストである。
【図３２】シリンジポンプの一実施形態のイラストである。
【図３３】マニホールドの一実施形態のイラストである。
【図３４Ａ】０．２μｇ／ＭＬの検出抗体濃度のＣＡ１５−３についての標準曲線を示す。
【図３４Ｂ】０．４μｇ／ＭＬの検出抗体濃度のＣＡ１５−３についての標準曲線を示す。
【図３５Ａ】１μｇ／ＭＬの検出抗体濃度のミオグロビンについての標準曲線を示す。
【図３５Ｂ】４μｇ／ｍＬの検出抗体濃度のミオグロビンについての標準曲線を示す。
【図３６】抗原無しのマイクロアレイからの、捕捉抗体と検出抗体との間の交差反応性スクリーニングの結果を示す。ＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーからの画像を使用してシグナルを検出し、ＩｍａｇｅＪにより定量化した。列Ａ：４００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。列Ｂ：８００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ。列Ｃ：１６０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。行１：４０ｎｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ。行２：２５μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂ。行３：４μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。
【図３７】マイクロアレイ上の乳癌パネルの抗原と検出抗体との間の交差反応性スクリーニングの結果を示す。ＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーからの画像を使用してシグナルを検出し、ＩｍａｇｅＪにより定量化した。列Ａ：４００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、及びＥｒｂＢ２抗原。列Ｂ：８００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ、及びＣＥＡ抗原。列Ｃ：１６０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ、及びＣＡ１５−３抗原。行１：４０ｎｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ。行２：２５μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂ。行３：４μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。
【図３８】マイクロアレイ上の乳癌パネルの抗原と捕捉抗体との間の交差反応性スクリーニングの結果を示す。ＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーからの画像を使用してシグナルを検出し、ＩｍａｇｅＪにより定量化した。列Ａ：４００μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｃＡｂ。列Ｂ：８００μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｃＡｂ。列Ｃ：１６０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。行１：ＣＡ１５−３抗原、及び４０ｎｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｄＡｂ。行２：ＣＥＡ抗原、及び２５μｇ／ｍＬのＣＥＡ  ｄＡｂ。行３：ＥｒｂＢ２抗原、及び４μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２  ｄＡｂ。
【図３９】バックグラウンドのサブトラクション後の様々なＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ条件のシグナルを示す。１：８ｕｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び４ｕｇ／ｍＬのビオチンＨＲＰによりプロービングしたＢＳＡ−ビオチンのカウント。２：１６ｕｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び８ｕｇ／ｍＬのビオチンＨＲＰによりプロービングしたＢＳＡ−ビオチンのカウント。３：３２ｕｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び１６ｕｇ／ｍＬのビオチンＨＲＰによりプロービングしたＢＳＡ−ビオチンのカウント。４：６４ｕｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び３２ｕｇ／ｍＬのビオチンＨＲＰによりプロービングしたＢＳＡ−ビオチンのカウント。
【図４０】図４０のＡ〜Ｃは、３つのスライドタイプ上の、プリントし、プロービングし、ＴＭＢにより現像したＥｒｂＢ２  ｃＡｂを示す。スライドをＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーにより画像化した。３０ｎＭのＢＳＡ−ビオチンをアレイの４つの隅に二重でプリントした。ＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、及び抗原の１つの列を二重でプリントし、最大濃度のＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、１／２最大濃度のＥＲｂＢ２  ｃＡｂ、１／４最大濃度のＥｒｂＢ２  ｃＡｂ、４μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、２μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、１μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原であった。パネルＡはアミノシランスライドの結果を示す。パネルＢはアルデヒドスライドの結果を示す。パネルＣはエポキシスライドの結果を示す。
【図４１】図４１のＡ〜Ｃは、０．０１％のサルコシル、及び０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むプリンティングバッファを使用する場合の、スポット形態の改善、及びＣＶの低減を示す。パネルＡは、４つの重複で１×ＰＢＳ中でプリントしたサンプルについての、ＴＭＢ現像、及びＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーによる画像化後に生じた画像を示す。上部の列：３０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。第２の列：４００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。第３の列：２００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。下部の列：１００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。パネルＢは、４つの重複で１×ＰＢＳ＋０．０１％のサルコシル＋０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中でプリントしたサンプルについての、ＴＭＢ現像、及びＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーによる画像化後に生じた画像を示す。上部の列：２０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３  ｃＡｂ。第２の列：１６００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。第３の列：８００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。第４の列：４００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。下部の列：２００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原。パネルＣは、パネルＡ、及びＢ中で示された結果のｃＡｂ、及び抗原の平均％変動係数（ＣＶ）を図示するグラフである。１：１×ＰＢＳによりプリントしたｃＡｂの％ＣＶ。２：１×ＰＢＳによりプリントした抗原の％ＣＶ。３：１×ＰＢＳ＋０．０１％のサルコシル＋０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡによりプリントしたｃＡｂの％ＣＶ。４：１×ＰＢＳ＋０．０１％のサルコシル＋０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡによりプリントした抗原の％ＣＶ。
【図４２】２２ｎｇ／ｍＬのミオグロビンによるプロービング後のミオグロビン捕捉抗体の結果を示す。１：２５ｕｇ／ｍＬのミオグロビンｃＡｂ、及び１ｕｇ／ｍＬのミオグロビンｄＡｂによる短いアッセイ時間（１０分間）で生じたシグナル。２：４０ｕｇ／ｍＬのミオグロビンｃＡｂ、及び５０ｎｇ／ｍＬのｄＡｂによる長いアッセイ時間（２７分間）で生じたシグナル。
【図４３】カートリッジを使用して、自動的な心臓パネル免疫アッセイの実行後にプロトタイプの機器から取得した画像を示す。角のスポットはＢＳＡ−ビオチンスポットである。ｃＡｂ、及び抗原を５の重複でプリントした。列１：後半、ミオグロビンｃＡｂ濃度１。列２：ミオグロビンｃＡｂ濃度２、ミオグロビンｃＡｂ濃度３。列３：ミオグロビン抗原濃度１、ミオグロビン抗原濃度２。列４：ＣＫ−ＭＢ抗原濃度１、ＣＫ−ＭＢ抗原濃度２。列５：ＣＫ−ＭＢ  ｃＡｂ濃度１、ＣＫ−ＭＢ  ｃＡｂ濃度２。列６：ＣＫ−ＭＢ  ｃＡｂ濃度３、ＮＴ−プロＢＮＰ  ｃＡｂ濃度１。列７：ＮＴ−プロＢＮＰ  ｃＡｂ濃度２、ＮＴ−プロＢＮＰ  ｃＡｂ濃度３。
【図４４】図４４のＡ〜Ｃは、ウェットカートリッジの代替実施形態のイラストである。パネルＡは、ウェットカートリッジの代替実施形態の上部のイラストである。パネルＢは、ウェットカートリッジの代替実施形態の底部のイラストである。パネルＣは、ウェットカートリッジの代替実施形態の図解のイラストである。
【図４５】図４５のＡ〜Ｃは、本明細書において記載されるような機器の一実施形態のイラストである。パネルＡは、機器の正面図を図示する。パネルＢは、機器の背面図を図示する。パネルＣは、機器の本体の分解を示す。
【図４６】図４６のＡ〜Ｂは、マニホールドの図解のイラストを示す。パネルＡは、マニホールドの背面図を図示する。パネルＢは、マニホールドの側面図を図示する。
【図４７】マニホールドラミネートの一実施形態の図解のイラストである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本開示は、部分的に、複数の標的ポリペプチド又は他の標的分子を並列して検出するためのマイクロ流体装置を提供する。マイクロ流体装置は、例えば疾患関連のタンパク質バイオマーカーのアレイの検出のための、タンパク質マイクロアレイが一体化されたマイクロ流体デバイスとすることができる。一般に、アッセイがマルチプレックスであり、アッセイサイズの著しい低減がある（それは試薬、及びサンプルの消費を減少させる）という点を除いて、本明細書において記載されるマイクロアレイ免疫アッセイは、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡと同じ基本プロトコルを利用する。
【００２８】
標的分子
標的分子としては、ヒト疾患、小分子、薬物代謝物質、乱用物質、水もしくは土壌のサンプル中の汚染物質、食品混入物、及び環境中のアレルゲンに関連するか、又はそれらと相関するバイオマーカーが、非限定的に挙げられる。いくつかの実施形態において、標的分子は、それらについての特異的な検出分子及び／又は認識分子（抗体等）が公的に利用可能な分子である。
【００２９】
バイオマーカー
バイオマーカーは、一般的に、生物学的な状態又は条件の測定可能な指標を指す。したがって、バイオマーカーは、本明細書において使用される場合、病的状態、疾患又は障害の存在；病的状態、疾患又は障害への素因；治療法的介入への応答などと相関し、したがってそれらの決定に使用することができる、生物学的なサンプル中で見出されるか、又は生物学的なサンプルから得られる、任意の検出可能な分子を指すことができる。
【００３０】
バイオマーカーの例としては、疾患又は障害（癌、心血管性疾患、糖尿病、炎症性疾患、又は神経学的病態等）についてのバイオマーカーが、非限定的に挙げられる。
【００３１】
「癌」という用語としては、癌腫（優勢癌であり、上皮細胞の癌、又は器官、腺もしくは他の体構成（例えば皮膚、子宮、肺、乳房、前立腺、胃、腸）の外部もしくは内部の表面を被覆する細胞の癌であり、転移する傾向がある）；肉腫（結合組織又は支持組織（例えば骨、軟骨、腱、靭帯、脂肪、筋肉）に由来する）；、及び血液系腫瘍（骨髄、及びリンパ組織に由来する）が挙げられる。癌腫は、腺癌（分泌が可能な器官又は腺（乳房、肺、大腸、前立腺又は膀胱等）で一般的に発症する）であり得るか、又は扁平上皮細胞癌（扁平上皮を起源とし、一般的に身体の大部分の領域で発症する）であり得る。肉腫は、骨肉腫もしくは骨原性肉腫（骨）、軟骨肉腫（軟骨）、平滑筋肉腫（平滑筋）、横紋筋肉腫（骨格筋）、中皮肉腫もしくは中皮腫（体腔の膜裏打ち）、線維肉腫（線維組織）、血管肉腫もしくは血管内皮腫（血管）、脂肪肉腫（脂肪組織）、神経膠腫もしくは星細胞腫（脳中で見出される神経原性結合組織）、粘液肉腫（原始胚結合組織）、又は間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏｕｓ）腫瘍もしくは混合性中胚葉腫瘍（混合性結合組織タイプ）であり得る。血液系腫瘍は、ミエローマ（それは骨髄の形質細胞を起源とする）；白血病（「体液の癌」であり、骨髄の癌であり、骨髄性白血病もしくは顆粒球性白血病（骨髄性白血球、及び顆粒性白血球）、リンパ性白血病、リンパ球性白血病もしくはリンパ芽球性白血病（リンパ性血液細胞、及びリンパ球性血液細胞）、又は真性赤血球増加症もしくは赤血病（様々な血液細胞産物であるが赤血球が優位）であり得る）；又はリンパ腫（固形腫瘍であり、リンパ系の腺又は結節で発症し、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫であり得る）であり得る。加えて、混合型癌（腺扁平上皮癌、混合性中胚葉腫瘍、癌肉腫又は奇形腫等）も存在する。
【００３２】
癌は、それらの起源の器官（すなわち「一次部位」）に基づいても命名され、例えば乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、大腸直腸癌、子宮頸癌、子宮癌などである。癌が一次部位から異なる身体の別の部分へ転移しても、この命名は存続する。一次部位に基づいて命名された癌は、組織分類と相関し得る。例えば、肺癌は、一般的に小細胞肺癌又は非小細胞肺癌（扁平上皮細胞癌、腺癌又は大細胞癌であり得る）であり；皮膚癌は、一般的に基底細胞癌、扁平上皮癌又はメラノーマである。リンパ腫は、頭部、頸部、及び胸部と関連するリンパ節に加えて、腹部リンパ節又は腋窩リンパ節もしくは鼠径リンパ節で生じ得る。
【００３３】
乳癌についてのバイオマーカーとしては、癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチン断片２１−１（ＣＹＦＲＡ  ２１−１）、及び可溶性のヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２）が、非限定的に挙げられる。
【００３４】
ＣＡ１５−３は、一般的に使用される乳癌についての腫瘍マーカー（バイオマーカー）である。それはＭＵＣ１遺伝子に由来し、したがってＣＡ１５−３はムチン１（ＭＵＣ１）としても公知である（Ｇｒｚｙｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。それは１２５５長のアミノ酸であり、１２２ｋＤａの分子量を有する（Ｂｅｇｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。それはムチンファミリーのメンバーであり、３つのメインドメイン（大きな細胞外領域、膜通過配列、及び細胞質ドメイン）からなる大きな膜貫通性の糖鎖付加された分子である（Ｒｉｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｇｒｚｙｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。健康な個体におけるＣＡ１５−３についての正常な範囲は、０〜２８Ｕ／ｍｌであることが見出されている（Ｂｅｇｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。癌腫が存在する場合に、ＣＡ１５−３の頂端側の向き、及びその糖鎖付加が変更され（Ｇｒｚｙｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、タンパク質は過剰発現され、細胞表面のすべてにわたって分布し、宿主免疫系から癌細胞を保護し転移活性を増進する環境を生成する（Ｄａｎｙｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。いくつかの実施形態において、ＣＡ１５−３は、例えば治療の前後での血液中のＣＡ１５−３のレベルの比較によって、乳癌再発の早期検出のために及び／又は乳癌についての治療の効率の評価のために使用することができる。
【００３５】
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【００３６】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は１８０ｋＤａの糖タンパク質であり、１９６５年にＧｏｌｄ、及びＦｒｅｅｄｍａｎによって最初に結腸癌から見出され抽出された（Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，１９６５）。その正常な機能は細胞接着、及びアポトーシスの阻害のためのものである。その結果、それは正常な粘膜細胞において発現され、腺癌中で過剰に発現される（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ  ａｎｄ  Ａｒａｂｚａｄｅｈ，２０１３）。体液の中へ放出される場合に、それは腫瘍細胞膜の周辺部に存在する。それは、乳癌、結腸直腸癌、及び他の上皮癌の患者においてしばしば過剰発現され、循環血流の中へ放出される（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。ＣＥＡのレベルは一般的に低く（例えば健康な成体において０〜２．５μｇ／Ｌ（１リットルあたりのマイクログラム）の間）、喫煙者においてわずかに高い（０〜５μｇ／Ｌの間の範囲）傾向がある（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６）。癌患者（例えば乳癌患者）において、ＣＥＡのレベルは１０μｇ／Ｌを超え得る（Ｒｏｍｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。いくつかの実施形態において、ＣＥＡは、マーカーとして、癌（乳癌、及び結腸直腸癌等）の診断、予後予測、又は治療への応答のモニタリングのために使用することができる。
【００３７】
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【００３８】
サイトケラチン断片２１−１（ＣＹＦＲＡ  ２１−１）は、４０ｋＤａの分子量を備えたサイトケラチン１９（酸性タイプ１のサイトケラチンのサブユニット）の可溶性断片であり（Ｊｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）アポトーシスの間に血流の中へ放出される（Ｏｌｏｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。健康な個体は、血清ＣＹＦＲＡ  ２１−１のレベルの上昇を示さない。いくつかの実施形態において、ＣＹＦＲＡ  ２１−１についての＞２．０ｎｇ／ｍｌのカットオフ値は、検出アッセイにおいて使用することができる（Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＣＹＦＲＡ  ２１−１のロッドドメインのヘリックス２Ｂ内のエピトープによるモノクローナル抗体が作製されている（Ｊｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。いくつかの実施形態において、ＣＹＦＲＡ  ２１−１は、癌再発及び／又は癌治療（乳癌治療等）の有効性の検出のために使用することができる。
【００３９】
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【００４０】
ヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のファミリー中の受容体のうちの１つである。ＨＥＲ２は、３つのドメイン（細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内キナーゼドメイン）からなる１８５ｋＤａの膜貫通タンパク質である（Ｓｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はマトリックスメタロプロテアーゼによって乳癌細胞表面から切断され、切断後に血清の中へＨＥＲ２−ＥＣＤを放出し得る（Ａｒｒｉｂａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。いくつかの実施形態において、＞１５ｎｇ／ｍｌのＨＥＲ２のレベルが、検出アッセイにおいて使用することができる（Ｈｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｆｏｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２は、マーカーとして、癌（乳癌等）の診断、予後予測、又は治療への応答のモニタリングのために使用することができる。
【００４１】
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【００４２】
バイオマーカーは、他の癌タイプの診断、再燃又はモニタリングが可能である。ＣＡ１９−９は、結腸直腸癌細胞株の培養培地からもともと単離されたシアル化されたルイス式血液型抗原である。それは、ＣＥＡの次に、消化管癌の診断のために最も一般的に使用される腫瘍マーカーである。ＣＡ１９−９のレベルは重度の膵臓癌の患者のうちの８０％において上昇する（３７Ｕ／ｍＬを超える）（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙは、疾患進行を決定するために、膵臓癌の治療の全体にわたるＣＡ１９−９のモニタリングの使用を推奨する（Ｌｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００４３】
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【００４４】
ＭＵＣ−１６としても公知のＣＡ−１２５は、糖タンパク質のムチンファミリーのうちの別の癌抗原である。それは３つの異なるドメイン（Ｎ末端、タンデム反復、及びＣ末端）からなり、細胞外領域は細胞からタンパク質分解性切断を介して放出される。ＣＡ−１２５は卵巣癌のための最も有用な臨床バイオマーカーである。ＣＡ−１２５レベルの上昇（３５Ｕ／ｍＬを超える）は卵巣癌の進行と相関し、卵巣癌のモニタリング、及び疾患再発の検出のためにＦＤＡに認可される（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００４５】
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【００４６】
腫瘍関連糖タンパク質又はＴＡＧ−７２としても公知のＣＡ７２−４は、消化管癌のためのバイオマーカーである。他の癌抗原に類似して、それは１０００ｋＤａを超えるムチン様の分子である。このバイオマーカーは胃癌のために最も有用である。高レベルのＣＡ７２−４（５Ｕ／ｍＬを超える）は、進行した胃癌又は腫瘍再発の予後を指摘する（Ｍａｔｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００４７】
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【００４８】
フェリチンは、主として細胞内鉄の貯蔵において役割を果たす細胞質タンパク質である。過剰発現された場合に、それは血清の中へ分泌され、多くの癌においてレベルの上昇が見出され得る。フェリチンのレベルの上昇は、ホジキンリンパ腫、肝細胞癌、非小細胞肺癌又は膵臓癌の患者について、より悪い予後の指標であり得る（Ｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｍｅｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｍａｘｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｋａｌｏｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかしながら、フェリチンについてのカットオフ値は癌タイプにより変動する（９２〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲）。フェリチンのレベルの上昇は乳癌再燃の指標でもあり得、より高いレベルのフェリチンの膵臓癌患者は、生存の機会が低減する。
【００４９】
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【００５０】
ＭＭＰ−７（マトリックスメタロプロテアーゼ−７）は、細胞間マトリックスのタンパク質を切断する亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。それは基底膜タンパク質のタンパク質分解性切断を介して癌浸潤を増進し得る。ＭＭＰ−７は多くの癌において過剰発現されることが見出され、卵巣癌、腎癌、及び急性骨髄白血病が挙げられる（Ｙｏｋｏｈｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。血清中のＭＭＰ−７のレベルの上昇は、癌予後において有用であり得る。卵巣癌患者は、７．４ｎｇ／ｍＬを超える血清ＭＭＰ−７レベルを示す（Ｓｈａｆｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。加えて、胃癌患者において、ＭＭＰ−７のレベルの上昇はより悪い予後、及び生存率の低減と相関した（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００５１】
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【００５２】
心血管性疾患は、心臓、及び血管を含む循環系の疾患である。心血管性疾患としては、冠動脈疾患（例えば狭心症又は心筋梗塞）、鬱血性心不全、卒中、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、不整脈、頻脈、狭窄症、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、静脈血栓症、アテローム性動脈硬化症などが、非限定的に挙げられる。心血管性疾患についてのバイオマーカーとしては、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、心筋トロポニン、ミオグロビン、及びＤ−ダイマーが、非限定的に挙げられる。
【００５３】
Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド又はＢＮＰは、ナトリウム利尿、利尿、及び血管拡張を誘導するホルモンとして機能する、心臓のマーカーである。それはプロＢＮＰプロホルモンとして最初に発現され、次いでそれは切断され、ＢＮＰ、及びＮＴ−プロＢＮＰ（Ｎ末端プロＢＮＰ）として分泌される。ＮＴ−プロＢＮＰはＢＮＰよりも長い半減期を有する（２時間対２０分間）。大部分の健康な人々はおよそ１０ｐｇ／ｍＬのＢＮＰを有する。平均的な心不全患者は、６７５ｐｇ／ｍＬのＢＮＰレベル、及び４６３９ｐｇ／ｍＬのＮＴ−プロＢＮＰレベルを有する。ＢＮＰ、及びＮＴ−プロＢＮＰの両方は、高齢者患者、女性、及び腎不全の患者において上昇する。反対に、ＢＮＰ、及びＮＴ−プロＢＮＰのレベルは肥満の人々において低減する。ＢＮＰ又はＮＴ−プロＢＮＰのいずれかのレベルの増加は、疾患の重症度、及び死亡率の増加と相関する。いくつかの実施形態において、ＢＮＰ又はＮＴ−プロＢＮＰレベルは、慢性心不全の患者等において心臓疾患リスクの増加もしくは減少を予測するために、又は予後、疾患の重症度、もしくはガイドされた治療法を確立、及び／もしくはモニターするために、使用することができる。いくつかの実施形態において、約８０ｐｇ／ｍＬのＢＮＰのレベルは検出アッセイのために使用することができる。
【００５４】
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【００５５】
心筋トロポニンは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、及びトロポニンＣからなる心臓特異的な複合体である。トロポニンＴ（３７ｋＤａ）、及びトロポニンＩ（２２ｋＤａ）は心臓のマーカーとしてルーチンに使用されてきたが、トロポニンＩはより一般的である。トロポニンＩは１００％心臓特異的であり、トロポニンＴとは異なり、腎臓疾患又は骨格の傷により上昇しない。トロポニンレベルの増加（１６０ｐｇ／ｍＬを超える）は病態の悪化を表す（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｏｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）。いくつかの実施形態において、トロポニンレベルは、心血管イベント（心筋梗塞（ＭＩ）又は心筋障害等）のリスク、治療法の最適化、予後、疾患の重症度、臨床転帰及び／又は死亡率を、予測、検出及び／又は決定することに使用することができる。トロポニンレベルの減少はより良好な予後と関連する。
【００５６】
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【００５７】
ミオグロビン（１７ｋＤａ）は、筋肉組織中に存在すること以外はヘモグロビンに類似するヘム結合タンパク質である。すべての筋肉組織中にあるので、それは心筋に特異的というわけではない。それは急性心筋梗塞の１〜４時間後に心臓組織から迅速に分泌されることが示されている。いくつかの実施形態において、８８ｎｇ／ｍＬを超えるミオグロビンレベルは、死亡率、心筋壊死又は心筋梗塞を予測及び／又は検出することに使用することができる。
【００５８】
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【００５９】
Ｄ−ダイマーはフィブリン分解のユニークな心臓マーカーである。それは、３つの酵素（トロンビン、因子ＸＩＩＩａ、及びプラスミン）の連続作用を介して形成される。商業的なＤ−ダイマーアッセイは、フィブリノーゲン分解産物又は非架橋フィブリン中に存在しないが、フィブリンの第ＸＩＩＩａ因子架橋断片のＤドメイン中に存在するエピトープを検出する（Ａｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。いくつかの実施形態において、Ｄ−ダイマー測定は、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、及び肺塞栓症（ＰＥ）を包含する）を除外するために、又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）における凝固活性化の診断もしくはモニタリングのために、臨床的に使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｄ−ダイマーレベルは、血管内フィブリン形成を開始するが必ずしも血栓症ではない疾患プロセス（非限定的に、血液凝固の活性化、老化、妊娠、癌又は癌関連ＶＴＥ等）を検出するために使用することができる（Ａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。いくつかの実施形態において、約５００ｎｇ／ｍＬのレベルが検出アッセイにおいて使用することができる。
【００６０】
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【００６１】
追加のバイオマーカーとしては、カルポニン−ｈ２、フコシルトランスフェラーゼＩＶ（ＦＵＴ  ４）、ＡＧＲ３（アンテリアグラジエント−３）、ＡＧＲ２（アンテリアグラジエント−２）、ＤＪ−１、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、αフェトプロテイン、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、プロ−ＧＲＰ（プロガストリン放出ペプチド）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＳＣＣ−Ａｇ（扁平上皮細胞癌抗原）／ＴＡ−４、ＣＡ−２４２、ＣＡ−５０、ＰｅｐＩ／ＩＩ（ペプシノーゲンＩ／ＩＩ比）、ＡＦＵ（αＬ−フコシダーゼ）、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＨＥ−４（ヒト精巣上体タンパク質／ＷＦＤＣ２  ４）、β２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）、ＶＭＡ（バニリルマンデル酸、３−メトキシ−４−ヒドロキシマンデル酸）、ＴＰＡ（組織ポリペプチド抗原）、ガレクチン−３、ミエロペルオキシダーゼ、及びｈｓ−ＣＲＰが挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００６２】
バイオマーカーは、様々な他の医学的病態の診断、及びモニタリングにも使用することができる。炎症は、病原体感染、及び組織損傷に関与する先天性免疫応答のホールマークである。加えて、人々は慢性的な炎症性疾患（関節リウマチ、喘息、及び刺激反応性腸障害等）を患い得る。炎症バイオマーカーは、炎症性病態における疾患活動性を査定し、感染を診断、及び管理する。ホールマークの炎症性バイオマーカーは、Ｃ反応性タンパク質又はＣＲＰである。ＣＲＰはタンパク質のペントラキシンファミリー（１１０〜１４４ｋｄａ）であり、サイトカインによって活性化された場合に肝細胞によって分泌される（Ａｌｇａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。次いでＣＲＰは、感染又は組織損傷の部位へ循環して、炎症部位への補体タンパク質の動員を支援する。健康な個体において、ＣＲＰの中央濃度は０．８μｇ／ｍＬである。炎症性の刺激に続いて、５００μｇ／ｍＬを超えて増加する。血清中濃度は最初の６時間で５μｇ／ｍＬを超えて上昇し、４８時間でピークに達する（Ｐｅｐｙｓ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈｆｉｅｌｄ，２００３）。炎症は心血管損傷の指標であり得るので、ＣＲＰは心臓病のリスクについてのバイオマーカーにも使用される。
【００６３】
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【００６４】
炎症の追加のバイオマーカーとしては、前記のフェリチン、及びＭＭＰ−７が挙げられる。血清フェリチンは、急性炎症、及び慢性炎症の急性期反応物、及びマーカーとして認識される。それは広範囲の炎症性病態において上昇することが見出される。フェリチンの上昇は鉄貯蔵の増加を反映し、その場合、鉄は病原体の使用から隔離されると考えられる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＭＭＰ−７は、癌についてのマーカーに加えて炎症のバイオマーカーとしても使用される。ＭＭＰ−７は、病原細菌の存在に加えて炎症性サイトカインによってもアップレギュレートされる（Ｂｕｒｋｅ，２００４）。フェリチン、及びＭＭＰ−７について、可能な抗体は、上述した段落で参照される。
【００６５】
多くの研究が神経系の病態（神経変性疾患、及び脳外傷等）のバイオマーカーを開発するために遂行されてきた。神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、及びプリオン病等）は、タンパク質凝集体又はプラークの形成によって特徴づけられる。血漿又は脳脊髄液（ＣＳＦ）中の特異的なバイオマーカーの同定は、これらの疾患を診断するのに比較的非侵襲性の手法を内科医へ提供するであろう。アルツハイマー病は認知機能を損なう進行性神経変性疾患であり、８０歳を超える年齢の集団のうちの２０％に影響する（Ｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。それは、アミロイドβペプチド４２、及びタンパク質タウから構成されるアミロイド斑の形成によって特徴づけられる。興味深いことには、アミロイドβ−４２レベルは、恐らく脳中での蓄積に起因してアルツハイマー病の患者のＣＳＦ中でより低いことが見出された。反対に、タウはＣＳＦ中で上昇する（Ｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。アルツハイマー病の患者の血漿中で見出されるバイオマーカーの利用は、診断において一層低侵襲性技法であろう。アルツハイマー病の患者の血液中で、タンパク質補体因子Ｈ（ＣＦＨ）の増加がある。ＣＦＨは補体活性化経路の負の調節因子であり、血液中のレベルの増加は疾患の後期ステージと相関する。ＣＦＨの上昇が他の神経変性疾患中で観察されず、したがってアルツハイマー病に特異的であるので、ＣＦＨも特に有用なバイオマーカーである（Ｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【表１５】
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【００６６】
パーキンソン病は、アルツハイマー病の次に最も一般的な神経変性疾患である。それは、脳幹、及び大脳における進行性の神経変性に起因する重症の運動不全によって特徴づけられる。ニューロンの多くは、最も顕著にはα−シヌクレインからなる封入体を示す。さらに、多くのタンパク質がパーキンソン病患者からのＣＳＦ中で見出され、これらのバイオマーカーの臨床有用性は決定されるべきである。しかしながら、補体関連タンパク質の増加が、パーキンソン病患者の血清中で見出されている。具体的には、前記のＣＦＨに加えて、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇ、及びＢ因子が増加する（Ｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００６７】
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【００６８】
伝達性海綿状脳症と称されるプリオン病は、ヒト、及び動物の両方に影響し得る疾患のユニークな群である。ヒトにおいて、伝達は典型的には遺伝学的であり、３３〜３５ｋＤａのプリオンタンパク質の異常な蓄積を生じる。その疾患状態において、プリオンタンパク質は典型的なα−ヘリックスの立体配座の代わりにβ−シート立体配座をとり、タンパク質蓄積、及び凝集を通じる（Ｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。現行の診断方法はプリオン病の同定に失敗しており、そのためこの疾患についてのバイオマーカーを有することは非常に有益であろう。ＣＳＦにおける少数のバイオマーカーがプリオン病罹患者において同定された。具体的には、１４−３−３、β−アミロイド、タウ、Ｓ１００ｂ、及び神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）である（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，２０１５）。１つの短所は、これらのマーカーがプリオン病に特異的ではなく、他の神経変性疾患でも存在し得るということである。したがって、ＣＳＦ又は血漿中の容易に入手可能なプリオン病特異的バイオマーカーを同定するために、多くの研究を行う必要がある。
【００６９】
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【００７０】
バイオマーカーの任意の組み合わせが使用され得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、例えば、ＣＹＦＲＡ  ２１−１は、再発及び／又は癌治療（乳癌治療等）の有効性を決定するために、他の乳癌バイオマーカー又は他の癌のバイオマーカー（ＣＡ１５−３等）と一緒に使用することができる；トロポニンは、心筋梗塞（ＭＩ）の早期検出のために、ミオグロビン又はクレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）と共に使用することができる；トロポニンは、急性冠症候群（ＡＣＳ）と一致する臨床的症候群を持つ患者におけるリスク査定のために、ＣＲＰ又はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと共に使用することができる；などである。
【００７１】
流体サンプル
「流体サンプル」は、標的分子を含有するか又は含有することが疑われる任意の流体（生物学的サンプル、環境サンプル、法廷サンプルなど等）であり得る。
【００７２】
「生物学的なサンプル」は、被験体から直接又は間接的に単離されるか又は得られる、任意の器官、組織、細胞又は細胞抽出物であり得る。例えば、生物学的なサンプルとしては、骨、脳、乳房、大腸、筋肉、神経、卵巣、前立腺、網膜、皮膚、骨格筋、腸、精巣、心臓、肝臓、肺、腎臓、胃、膵臓、子宮、副腎、扁桃腺、脾臓、軟組織からの細胞もしくは組織（例えば生検又は検死からの）、末梢血、全血液、赤血球濃縮物、血小板濃縮物、白血球濃縮物、血液細胞タンパク質、血漿、多血小板血漿、血漿濃縮物、血漿の任意の分画からの沈降物、血漿の任意の分画からの上清、血漿タンパク質画分、精製もしくは部分精製された血液タンパク質もしくは他の構成要素、血清、精液、哺乳動物初乳、乳汁、尿、便、唾液、胎盤抽出物、羊水、寒冷沈降物、寒冷上清、細胞溶解物、哺乳動物細胞培養物もしくは培養培地、発酵産物、腹水、血液細胞中に存在するタンパク質、固形腫瘍、又は、患者被験体（ヒト又は動物）、試験被験体もしくは実験動物被験体から得られる他の試料もしくはその任意の抽出物が、非限定的に挙げられ得る。いくつかの実施形態において、それは、サンプル中の非癌性細胞から癌細胞を分離することが所望され得る。サンプルとしては、正常細胞又は形質転換細胞（例えば組み換えＤＮＡ技術又はモノクローナル抗体技術経由の）によって細胞培養中で産生された産物も、非限定的に挙げられ得る。サンプルとしては、非哺乳類の被験体（昆虫又は蠕虫等）から単離された任意の器官、組織、細胞又は細胞抽出物も、非限定的に挙げられ得る。サンプルとしては、植物、細菌、カビ、胞子又はウイルスも、非限定的に挙げられ得る。「サンプル」は、被験体から直接単離されない実験条件下で作成された細胞又は細胞株でもあり得る。サンプルは、無細胞の、人工由来の、又は合成されたものでもあり得る。サンプルは、癌性であることが既知の、癌性の疑いのある、また癌性でないと考えられる（例えば正常又は対照）、細胞又は組織からであり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、サンプルは、本明細書において使用される場合、実質的に精製される（例えば細胞及び／又は細胞抽出物のない）。したがって、いくつかの実施形態において、サンプルとしては、細胞が実質的にない体液又は抽出物（血漿又は血清又は尿等）が挙げられ得る。かかるサンプルは、少量の細胞（５％以下等、すなわち０％〜５％の間の任意の値、例えば１％、２％、３％、４％、５％未満）を含有し得ることが理解されるべきである。あるいは、サンプルは細胞を含有し得る（全血液等）。
【００７４】
「対照」としては、ベースラインの発現又は活性の決定における使用のために得られるサンプルが挙げられる。したがって、対照サンプルは多くの手段によって得られ、非癌性の細胞又は組織から（例えば被験体の腫瘍もしくは癌細胞を囲む細胞から；癌がない被験体から；癌についてのリスクがある疑いをかけられない被験体から；又はかかる被験体に由来する細胞もしくは細胞株から）のものが包含される。対照としては、以前に確立された基準も挙げられる。したがって、本発明に従って遂行された任意の試験又はアッセイは、確立された基準と比較され、その都度、比較のために対照サンプルを得ることは必要ではないだろう。
【００７５】
サンプルを分析して、対象となる標的分子の存在又は量を検出することができる。
【００７６】
タンパク質マイクロアレイ
標的分子は、標的分子を特異的に結合する、好適な結合パートナー又はその断片を使用して検出することができる。例えば、いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、特異的にバイオマーカーを結合する、好適な抗体又はその断片を使用して検出することができる。代替の実施形態において、自己抗体は、例えばタンパク質又はペプチドを使用して検出することができる。任意の好適な検出方法は、本明細書において記載されるか又は当技術分野において公知であるように、使用することができる。
【００７７】
バイオマーカーを認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識、及び結合しない場合に、抗体はバイオマーカーを「特異的に結合する」。かかる抗体は、例えばサンプル中の別の参照分子についての抗体の親和性よりも少なくとも１０、１００、１０００又は１００００倍大きい、バイオマーカーについての親和性を有する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーを特異的に結合することができる抗体又はその断片は、マイクロアレイ（「抗体マイクロアレイ」）中で提示される。「抗体マイクロアレイ」によって、好適な基質（複数のバイオマーカーを結合することが可能である、化学的に官能化された又はポリマーコーティングされたガラス又は類似する材料等）上に提供される、複数の抗体又はその断片が意味される。
【００７９】
抗体は、マイクロアレイスポッティングロボット等による標準的な技法を使用して、基質へ付着又は基質上に沈着され得る。
【００８０】
一般に、抗体は、基質の領域中でバイオマーカーを検出できるように提供することができる。領域は、化学的に官能化された又はポリマーコーティングされた領域のサイズに加えて、使用される抗体の数、及びプリンティングの密度に依存する、任意の好適なサイズとすることができる。
【００８１】
一般に、抗体マイクロアレイは、複数のバイオマーカーを特異的に結合することが可能な複数の抗体を含むことになる。例えば、いくつかの実施形態において、抗体マイクロアレイにおける、各々の別個の抗体は別個のバイオマーカーを特異的に結合し得る。代替の実施形態において、抗体マイクロアレイは、特定のバイオマーカーを特異的に結合することが可能な複数の抗体を含み得る。したがって、抗体が異なるバイオマーカーを特異的に結合できるか、又は同じバイオマーカーの異なる領域を特異的に結合できるように、各々の抗体はマイクロアレイ中に存在する他の抗体とは異なり得る。
【００８２】
抗体マイクロアレイは、好適な数の抗体（約２〜約１０，０００の間の抗体、又はその間の任意の値（約１００、２００、３００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又は１００００等）の抗体等）を含み得る。いくつかの実施形態において、例えばマイクロアレイ基質のサイズ、デバイスによって検出可能な領域のサイズ、光学的検出システムによって得られる画像の分解能、及び抗体のスポットサイズに従って、より多くの数（１５０００、２００００の、及び３００００以上等）が使用することができる。
【００８３】
基質上にスポットすることができる抗体の数は、基質のサイズ、スポットの密度、交差反応性相互作用、スポットサイズなどに依存するであろうことが理解されるべきである。例えば、より多くの数抗体は、バイオマーカーを検出することが可能な領域のサイズを増加、又はスポット密度を増加、又はスポットサイズを減少させて、スポットすることができる。
【００８４】
抗体は、約５０ミクロン〜約５００ミクロンの直径、又はその間の任意の値（６０ミクロン、１００ミクロン、２００ミクロン又は２５０ミクロン等）とすることができるスポットとして基質上に提供することができる。いくつかの実施形態において、スポットは、例えばマイクロアレイ基質のサイズ、バイオマーカーによって検出可能な領域のサイズ、及び抗体の密度に従って、より大きくてもよい。スポットは、規則的又は不規則の任意の形状とすることができる。
【００８５】
抗体スポットは、一般的に、互いから空間的に不連続である。一般に、スポットは、互いから少なくとも１００ミクロン（互いから少なくとも１００、２００又は４００ミクロン等）分離される。
【００８６】
順序づけられているか又はランダムであるかにかかわらず、スポットは任意の好適な様式で配置することができる。一般に、スポットの分離が規則的で予め決定されるように、スポットは順序づけられた様式で配置される。スポットは、一次元、二次元又は三次元で配置することができる。例えば、スポットは、約１０〜約１，０００の数の列、及び行で配置することができる。
【００８７】
マイクロ流体カートリッジ
マイクロ流体回路、反応チャンバ又は「アレイチャンバ」、液体（試薬又はバッファ又はサンプル等）を収容するためのリザーバを含む、カートリッジ（「マイクロ流体カートリッジ」）が提供され得る。いくつかの実施形態において、マイクロ流体カートリッジは、複数の試薬リザーバ、及びチャネル、複数のバッファリザーバ、及びチャネル、複数の廃液リザーバ、及びチャネル、複数のベント、複数のポート、タンパク質マイクロアレイの検出のための開口に加えて、リザーバを接続するチャネル（例えばメインジャンクション又はメインチャネルからバッファチャネルへと通じるチャネル、バッファチャネルを試薬チャネルと接続するチャネル、アレイチャンバを廃液リザーバへと接続するチャネル、アレイチャンバをメインジャンクション又はメインチャネルへと接続するチャネル、メインジャンクション又はメインチャネルを廃液リザーバへと接続するチャネル）、ならびに／又は流体サンプルを受入れるサンプルレセプタクルもしくはサンプルウェルを、非限定的に含むことができる。いくつかの実施形態において、サンプルレセプタクル又はサンプルウェルは存在しなくてもよく、サンプルはリザーバのうちの１つの中へ充填することができる。いくつかの実施形態において、チャネルのうちのいくつかはメインジャンクションの周囲に配置することができる。いくつかの実施形態において、チャネルのうちのいくつかはメインチャネルに接続することができる。これらのチャネルは、例えば気泡の低減又は防止によって流体の滑らかな流れ、ならびに例えば試薬及び／又はバッファの流出の低減又は防止によってクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体カートリッジは、液体不透過性で気体透過性である複数のバリア（液体不透過性で気体透過性の膜）を含むことができる。いくつかの実施形態において、液体不透過性で気体透過性のバリアは水性液体不透過性とすることができる。いくつかの実施形態において、液体不透過性で気体透過性のバリアは、高表面張力液体不透過性とすることができる。
【００８９】
マイクロ流体カートリッジは、タンパク質マイクロアレイを受入れるレセプタクルを含むことができる。いくつかの実施形態において、マイクロ流体カートリッジは、タンパク質マイクロアレイを含むことができる。マイクロ流体カートリッジは、タンパク質マイクロアレイと流体的に連通され得る。
【００９０】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体カートリッジは、流体（試薬又はバッファ等）を収容するためのリザーバを含む「ウェット」部分（「ウェットカートリッジ」）、ならびにマイクロ流体回路、及び反応チャンバを含む「ドライ」部分（「ドライカートリッジ」）を含むことができる。ウェットカートリッジは、ドライカートリッジと整列しるように構成することができる。サンプルレセプタクルは、ウェットカートリッジ又はドライカートリッジ中に配置することができる。
【００９１】
マイクロ流体カートリッジは、例えば流体の動きを制御するように、機器と空気圧で接続することができる。機器は、タンパク質マイクロアレイを検出することができる。ベントは、機器のマニホールドと相互接続することができる。
【００９２】
ウェットカートリッジ
ウェットカートリッジは、複数の試薬リザーバ、及びチャネル、複数のバッファリザーバ、及びチャネル、複数の廃液リザーバ、複数のベント、複数のポート、ならびに随意に流体サンプルを受入れるサンプルレセプタクル又はサンプルウェルを含むことができる。いくつかの実施形態において、バッファリザーバの数は、試薬リザーバの数と同じとすることができる。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジは、２つの廃液リザーバ（第１の廃液リザーバ、及び第２の廃液リザーバと表記される）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ベントの数は、バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応することができる。いくつかの実施形態において、ポートの数は、バッファリザーバ、試薬リザーバ、廃液リザーバ、及び存在する場合はサンプルレセプタクル又はサンプルウェルの各々に対応することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジは、複数の試薬リザーバ（バッファリザーバの数は、試薬リザーバの数と同じとすることができる）と；複数の廃液リザーバと；バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；随意に流体サンプルを受入れるサンプルレセプタクル又はサンプルウェルと；バッファリザーバ、試薬リザーバ、廃液リザーバ、及び存在する場合はサンプルレセプタクル又はサンプルウェルの各々に対応する複数のポートと、を含むことができる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジは、
複数の試薬リザーバ（本明細書において「Ｒ＃」とデザインされる）と；
試薬リザーバと同じ数のバッファリザーバ（本明細書において「Ｂ＃」とデザインされる）と；
バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバが構成されて規定の体積を可能にするような、複数の廃液リザーバ（本明細書において「Ｗ＃」と表記される）と；
バッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；
流体サンプルを受入れるサンプルレセプタクル又はサンプルウェルと；
バッファリザーバ、試薬リザーバ、廃液リザーバ、及びサンプルレセプタクル又はサンプルウェルの各々に対応する複数のポートと；
随意にリザーバの充填のために、各々のリザーバ下でプリカットされた孔を含むことができるラミネート底部と、
を含むことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジ構成要素は以下の寸法を有することができる。
【００９６】
バッファリザーバＢ１及び／又は試薬リザーバＲ２は一般的に楕円形の形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。Ｂ１及び／又はＲ２は、長さ約３ｍｍ〜約４０ｍｍ（約９ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ（約３ｍｍ等）、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ（約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約１６０μｌ等）とすることができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、バッファリザーバＢ１は一般的に楕円形の形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。Ｂ１は、長さ約２ｍｍ〜約４０ｍｍ（約９ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ（約７ｍｍ等）、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ（約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約２００μｌ等）とすることができる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、試薬リザーバＲ２は一般的に楕円形の形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。Ｒ２は、長さ約２ｍｍ〜約４０ｍｍ（約９ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ（約４ｍｍ等）、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ（約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約１６０μｌ等）とすることができる。
【００９９】
試薬リザーバＲ３は一般的に楕円形の形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。Ｒ３は、長さ約３ｍｍ〜約４０ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約９ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ又はその間の任意の値（幅約４ｍｍ等）、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ又はその間の任意の値（深さ約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約２００μｌ等）とすることができる。
【０１００】
バッファリザーバＢ４は一般的に、例えば規定の体積、及び正確なポート位置合わせを可能にするように、約９０〜約１７９の角度（１５０度等）で湾曲させた形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。Ｂ４は、長さ約３ｍｍ〜約４０ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約１３ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ又はその間の任意の値（幅約８ｍｍ等）、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ又はその間の任意の値（深さ約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約４２０μｌ等）とすることができる。
【０１０１】
バッファリザーバＢ５は一般的に、余剰の体積を格納する、１つの側面での追加の領域を備えた、楕円形の形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。いくつかの実施形態において、Ｂ５は、余剰の体積を格納する、側面への余剰の三角形領域を含むことができる。Ｂ５は、長さ約３ｍｍ〜約４０ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約１３ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ又はその間の任意の値（幅約７ｍｍ又は約８ｍｍ等）、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ又はその間の任意の値（深さ約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約４２０μｌ等）とすることができる。
【０１０２】
試薬リザーバＲ６は一般的に楕円形の形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。Ｒ６は、長さ約３ｍｍ〜約４０ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約１１ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ又はその間の任意の値（幅約３ｍｍ等）、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ又はその間の任意の値（深さ約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約２２６μｌ等）とすることができる。
【０１０３】
試薬リザーバＲ７は一般的に、余剰の体積を格納する、１つの側面での追加の領域を備えた、楕円形の形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ７は、余剰の体積を格納する、底部中のわずかな膨らみを含むことができる。Ｒ７は、長さ約３ｍｍ〜約４０ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約１１ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ又はその間の任意の値（幅約４ｍｍ又は約５ｍｍ等）、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ又はその間の任意の値（深さ約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約２６０μｌ等）とすることができる。
【０１０４】
バッファリザーバＢ８は一般的に、ドライカートリッジと相互接続することを可能にするように、約９０〜約１７９度の角度（例えば１５０度）で湾曲させた形状とすることができるが、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）が企図され得る。いくつかの実施形態において、Ｂ８は、ドライカートリッジと相互接続するために、ウェットカートリッジの端部でのノッチ又はピンの周囲に彫るように構成された形状を含むことができる。Ｂ８は、長さ約３ｍｍ〜約４０ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約１５ｍｍ又は約１６ｍｍ等）；幅約２ｍｍ〜約５０ｍｍ又はその間の任意の値（幅約６ｍｍ又は約１０ｍｍ等）；、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ又はその間の任意の値（約７ｍｍ等）、体積約１０μｌ〜約２０００μｌ（約４２０μｌ等）とすることができる。
【０１０５】
廃液リザーバＷ１は一般的にＵ字の形状とすることができるが、侵入する液体の貯留を可能にする追加の面積を備えた、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。いくつかの実施形態において、Ｗ１は、右側のエッジに近いリザーバの底部の付近で正方形の膨らみを有することができる。Ｗ１は、体積約１００μｌ〜約２００００μｌ又はその間の任意の値（約３１３０μｌ又は約４０００μｌ等）を有することができる。Ｗ１において、入口ポートに侵入する流体は、通気ポート５４に到着するまで、カートリッジの右側のエッジに沿って、カートリッジの底部のエッジに沿って、次いでカートリッジの左側のエッジの上を、リザーバを介して進み得る。これは、シューティングからリザーバの端部へ侵入し通気ポートを詰まらせる流体を防止することができる。いくつかの実施形態において、Ｗ１は、例えば流体がリザーバの中へ容易に貯留されることを可能にするように、入口の付近で伸長して最初の大きなリザーバ領域を形成することができる。
【０１０６】
廃液リザーバＷ２は一般的にＵ字の形状とすることができるが、体積約１００μｌ〜約２００００μｌ又はその間の任意の値（約２１００μｌ又は約２５００μｌ等）を備えた、他の形状（円形、卵形、長方形、及び正方形等）も企図され得る。何らかの特定の理論に拘束されるものではないが、Ｗ２の形状は、通気ポートから可能な限り流体がＷ２リザーバに侵入することを可能にし、したがって通気ポートの不慮の閉塞を防止することができる。いくつかの実施形態において、Ｗ２は、例えば流体抵抗を減少させるように、入口の付近で拡張し最初の大きなリザーバ領域を形成することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、例えば、最初の大きなリザーバ領域（Ｗ１及び／又はＷ２のいずれか又は両方）を含むものは、Ｗ１又はＷ２に対応するポートに接続するように、狭くなり得る。Ｗ１、及びＷ２の中へ窪みを追加して、流体が、Ｗ１又はＷ２の狭い領域（それは抵抗、及び流れの停止を引き起こし得る）に直ちに到着することを低減又は防止することができる。
【０１０８】
存在する場合はサンプルレセプタクル又はサンプルウェルは、長さ約１ｍｍ〜約２０ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約１．２５ｍｍ、１．５ｍｍ又は約３ｍｍ等）；幅約１ｍｍ〜約１０ｍｍ又はその間の任意の値（幅約１．２５ｍｍ、２ｍｍ又は約５ｍｍ等）；、及び深さ２ｍｍ〜約７ｍｍ又はその間の任意の値（深さ約７ｍｍ等）、サンプルの容量約４μｌ〜約５００μｌ（約２５μｌ等）とすることができる。
【０１０９】
ウェットカートリッジの底部は任意の好適な材料で作製することができる。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジはラミネート底部を有することができる。ラミネート底部は、例えばリザーバローディングを支援するように、リザーバと整列しリザーバ下でプリカットされた孔を含むことができる。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジは、ウェットカートリッジの側面で試薬又はバッファリザーバのローディングポートを含むことができる。ローディング後に、側面ポート又はプリカットされた孔は、例えば透明なテープ又は他の好適なシーラントによりシールすることができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジはカートリッジの前方でハンドルを含むことができる。代替の実施形態において、ウェットカートリッジはウェットカートリッジの側面でグリップを含むことができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジは、ドライカートリッジとウェットカートリッジを位置合わせさせることを支援するように、位置合わせ特徴部（半円形切り欠き等）を含むことができる。
【０１１２】
ウェットカートリッジは、低タンパク質結合性特性を備えた任意の好適な材料（非限定的にポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、及びポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）等）で作製することができる。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジはポリカーボネートで作製することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジは再使用可能とすることができる。代替の実施形態において、ウェットカートリッジは使い捨てとすることができる。
【０１１４】
ドライカートリッジ
ドライカートリッジは、タンパク質マイクロアレイを検出するための開口、複数の試薬チャネルを含む複数のマイクロ流体チャネル、複数のバッファチャネルに加えて、接続チャネル（例えばメインジャンクション又はメインチャネルからバッファチャネルへと通じるチャネル、バッファチャネルを試薬チャネルと接続するチャネル、廃液リザーバ又はメインジャンクション又はメインチャネルへと通じるチャネルなど）；複数のベント、随意にベントに対応する液体不透過性で気体透過性である複数のバリア、及び随意に流体サンプルを受入れるサンプルレセプタクルを含むことができる。いくつかの実施形態において、チャネルは、メインジャンクション又はメインチャネルの周囲に配置することができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、ドライカートリッジは、タンパク質マイクロアレイを検出するための開口（そこで、ウェットカートリッジと整列しる場合に、開口は、アレイチャンバの底部を定めるドライカートリッジとウェットカートリッジとの間のタンパク質マイクロアレイを受入れるレセプタクルと一緒に、アレイチャンバを定める）、及びメインジャンクションの周囲に配置された複数のマイクロ流体チャネル又はメインチャネルを含み、マイクロ流体チャネルは、複数の試薬チャネル（各々の試薬チャネルは、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応する）と；複数のバッファチャネル（各々のバッファチャネルは、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応する）と；メインジャンクションから各々のバッファチャネルへと通じるチャネルと；各々のバッファチャネルを各々の試薬チャネルと接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成するチャネルと；アレイチャンバを第１の廃液リザーバに接続するチャネルと；アレイチャンバをメインジャンクションに接続するチャネルと；メインジャンクションを第２の廃液リザーバに接続するチャネル（これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される）と；ウェットカートリッジのバッファリザーバ、試薬リザーバ、及び廃液リザーバの各々に対応する複数のベントと；ベントの各々に対応する液体不透過性で気体透過性である複数のバリアと、を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ドライカートリッジはタンパク質マイクロアレイを受入れるレセプタクルを含むことができる。いくつかの実施形態において、ドライカートリッジはタンパク質マイクロアレイを含むことができる。いくつかの実施形態において、開口は、アレイチャンバの底部を定めるタンパク質マイクロアレイと一緒に、アレイチャンバを定めることができる。いくつかの実施形態において、開口は、ウェットカートリッジと整列しる場合に、アレイチャンバの底部を定めるドライカートリッジとウェットカートリッジとの間のタンパク質マイクロアレイを受入れるレセプタクルと一緒に、アレイチャンバを定める。いくつかの実施形態において、液体不透過性で気体透過性のバリアはベントの上に重ねられ得る。いくつかの実施形態において、これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成することができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ドライカートリッジは、複数のマイクロ流体チャネル（メインジャンクションの周囲に配置される）を含み、複数のマイクロ流体チャネルは、
各々の試薬チャネルが、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応するような、複数の試薬チャネル（本明細書において「Ｒ＃Ｃ」と表記される）と；
各々のバッファチャネルが、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応するような、複数のバッファチャネル（本明細書において「Ｂ＃Ｃ」と表記される）と；
ｉｉ）メインジャンクションから各々のバッファチャネルへと通じるチャネル（本明細書において「Ｃ＃／＃」と表記される）と；
各々のバッファチャネルを各々の試薬チャネルと接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成するチャネルと；
メインジャンクションを第２の廃液リザーバ（Ｗ２）に接続するチャネルと；
アレイチャンバをメインジャンクションに接続するチャネル（本明細書において「プレＣ」と表記される）と；
アレイチャンバを第１の廃液リザーバ（Ｗ１）に接続するチャネル（本明細書において「ポストＣ」と表記される）と、
を含み；
これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ドライカートリッジは、複数のマイクロ流体チャネル（メインチャネルの周囲に配置される）を含み、複数のマイクロ流体チャネルは、
各々の試薬チャネルが、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応するような、複数の試薬チャネル（本明細書において「Ｒ＃Ｃ」と表記される）と；
各々のバッファチャネルが、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応するような、複数のバッファチャネル（本明細書において「Ｂ＃Ｃ」と表記される）と；
バッファチャネルの上のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜（それは大気に曝露される）と；
各々のバッファチャネルを各々の試薬チャネルと接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成するチャネルと；
メインジャンクションを廃液リザーバに接続するチャネル（本明細書において「ＣＷ２」と表記される）と；
すべてのバッファチャネル、及びリザーバチャネルをメインチャネル（本明細書において「メインＣ」と表記される）に接続するチャネルと；
アレイチャンバをメインチャネルに接続するチャネル（本明細書において「プレＣ」と表記される）と；
アレイチャンバを廃液リザーバに接続するチャネル（本明細書において「ポストＣ」と表記される）と、
を含み；
これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ドライカートリッジは、複数のマイクロ流体チャネル（メインチャネルの周囲に配置される）を含み、複数のマイクロ流体チャネルは、
各々の試薬チャネルが、ウェットカートリッジの試薬リザーバのうちの１つに対応するような、複数の試薬チャネル（本明細書において「Ｒ＃Ｃ」と表記される）と；
各々のバッファチャネルが、ウェットカートリッジのバッファリザーバのうちの１つに対応するような、複数のバッファチャネル（本明細書において「Ｂ＃Ｃ」と表記される）と；
バッファチャネル、及び試薬ポートの下のポリプロピレン膜（本明細書において「シーリング膜」と表示される）と；
各々のバッファチャネルを各々の試薬チャネルと接続してバッファチャネル／試薬チャネルのペアを形成するチャネルと；
すべてのバッファチャネル、及びリザーバチャネルをメインチャネル（本明細書において「メインＣ」と表記される）に接続するチャネルと；
メインチャネル（本明細書において「メインＣ」と表記される）を第１の廃液リザーバに接続するチャネル（本明細書において「ＣＷ２」と表記される）と；
アレイチャンバをメインチャネルに接続するチャネル（本明細書において「プレＣ」と表記される）と；
アレイチャンバを第２の廃液リザーバに接続するチャネル（本明細書において「ポストＣ」と表記される）と、
を含み；
これらのチャネルは、流体の滑らかな流れ、及びクロスコンタミネーションの最小化を可能にするように構成される。
【０１２０】
ドライカートリッジ、及びウェットカートリッジの接合部でのシーリング膜を含む実施形態において、何らかの特定の理論に拘束されるものではないが、シーリング膜は、バブルを低減もしく消失させ得る及び／又は試薬もしくはバッファのクロスコンタミネーションを低減もしくは防止することができる。いくつかの実施形態において、試薬又はバッファがドライカートリッジに早期に侵入することが防止され得る。シーリング膜は、ポリプロピレンで作製することができる。シーリング膜は、約１０μｍのポアサイズを有し、約５１μｍ厚みとすることができる。ポンプからの加圧に際して、試薬流体はシーリング膜を横切り、試薬チャネル（それは、ペアになったバッファチャネルと連結し、最終的には試薬をアレイチャンバへと通じるメインチャネルに連結する）を介してドライカートリッジに侵入することができる。シーリング膜はバルブ／ドライカートリッジの接合部に配置され、気体透過膜（ＧＰＭ）又は流体遮断膜と称され、カートリッジ内で流体を制限することによって流体入口から機器をこの場所で保護することができる。シーリング膜は、バッファチャネル、及びリザーバチャネル（例えばＢ１Ｃ又はＲ２Ｃ）への浸入口に同様に又は代替的に配置され、例えば流体がドライカートリッジを早期に侵入することを低減又は防止し、クロスコンタミネーション（例えば試薬クロスコンタミネーション）の低減又は防止を支援することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、バッファチャネル、及び試薬チャネルのペアリングは、試薬ステップ後にバッファによる試薬チャネルの洗浄を可能にし、それは、クロスコンタミネーション（例えば試薬クロスコンタミネーション）を低減又は防止することを支援することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、試薬チャネル／バッファチャネルのペアは、メインジャンクションではなくメインチャネルと連結され得る。かかる立体配置は、ドライカートリッジの構築においてより少数のラミネート層を可能にし、それは、何らかの特定の理論に拘束されるものではないが、バブルがジャンクション中でトラップされるようになり流れを低減又は防止することを低減又は防止することができる。いくつかの実施形態において、廃液リザーバ（例えばＷ２Ｃ）へのチャネルは、バブルを低減又は防止することができる。例えば、アレイチャンバへ流れる前に、試薬は、対応する廃液リザーバ（例えばＷ２）へ最初にプライミングされる。これは、試薬が侵入する前にチャネル中の存在し得る任意のバブル、及び空気を除去する。試薬がアレイチャンバに侵入する前に、これらのバブルを最初にＷ２へ押し出すことは、バブルがアレイチャンバ中に所在する抗体、及び抗原のスポットを妨害することを低減又は防止することができる。
【０１２３】
例えば、いくつかの実施形態において、リザーバ２のための試薬チャネル（Ｒ２Ｃ）は、リザーバ１のためのバッファチャネル（Ｂ１Ｃ）と接続され、リザーバ３のための試薬チャネル（Ｒ３Ｃ）は、リザーバ４のためのバッファチャネル（Ｂ４Ｃ）と接続され、リザーバ６のための試薬チャネル（Ｒ６Ｃ）は、リザーバ５のためのバッファチャネル（Ｂ５Ｃ）と接続され、リザーバ７のための試薬チャネル（Ｒ７Ｃ）は、リザーバ８のためのバッファチャネル（Ｂ８Ｃ）と接続され得る（例えば図２５Ａ）。いくつかの実施形態において、試薬チャネル／バッファチャネルのペアは、メインジャンクション又はメインチャネルへ直接接続され得る。
【０１２４】
ドライカートリッジは、抗体マイクロアレイ（本明細書において「アレイチャンバ」と表記される）からのシグナルの検出のための開口を含むことができる。開口の場所、及び寸法、ならびにしたがってアレイチャンバは、チャネル、及びリザーバの具体的な幾何学的構造に依存して変化し得ることが理解されるべきである。
【０１２５】
サンプルレセプタクルはドライカートリッジの中へ導入されて、このリザーバの中へのサンプルローディングを可能にすることができる。サンプルローディング後に、サンプルレセプタクルは、漏出を低減又は防止するために、例えば透明なテープによりシールすることができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ドライカートリッジ構成要素は以下の寸法を有することができる。
【０１２７】
バッファチャネルＢ１Ｃ、Ｂ４Ｃ、Ｂ５Ｃ及び／又はＢ８Ｃは、長さ約３ｍｍ〜約３６ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約１４ｍｍ、１６ｍｍ又は２５ｍｍ等）、及び幅約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ又はその間の任意の値（約２ｍｍ等）とすることができる。
【０１２８】
試薬チャネルＲ２Ｃ、Ｒ３Ｃ、Ｒ６Ｃ及び／又はＲ７Ｃは、長さ約３ｍｍ〜約２０ｍｍ又はその間の任意の値（長さ約１１ｍｍ等）、及び幅約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ又はその間の任意の値（約２ｍｍ等）とすることができる。
【０１２９】
何らかの特定の理論に拘束されるものではないが、バッファチャネル及び／又は試薬チャネルの幅、及び深さは、空気のポケットがリザーバとチャネルとの間で形成され、試薬がリザーバを誤って出ないようにチャネル中の十分な容量を提供することを可能にすることができる。
【０１３０】
Ｃ１／２及び／又はＣ５／６は、長さ約３ｍｍ〜約３５ｍｍ（約１６ｍｍ等）、及び幅約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ（約１ｍｍ等）とすることができる。
【０１３１】
Ｃ３／４は、長さ約３ｍｍ〜約３５ｍｍ（約８ｍｍ等）、及び幅約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ（約１ｍｍ等）とすることができる。
【０１３２】
Ｃ７／８は、長さ約３ｍｍ〜約５０ｍｍ（約３２ｍｍ等）、及び幅約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ（約１ｍｍ等）とすることができる。
【０１３３】
プレＣは、長さ約３ｍｍ〜約４４ｍｍ又はその間の任意の値（約１７ｍｍ、２２ｍｍ又は３０ｍｍ等）、及び幅約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ（約１ｍｍ等）とすることができる。
【０１３４】
ポストＣは、長さ約１２ｍｍ〜約３００ｍｍ又はその間の任意の値（約７０ｍｍ又は１２２ｍｍ等）、及び幅約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ又はその間の任意の値（約１ｍｍ〜約１．５ｍｍ等）とすることができる。
【０１３５】
メインＣは、存在する場合は、長さ約２０ｍｍ〜約８０ｍｍ又はその間の任意の値（約５３ｍｍ又は６５ｍｍ等）、及び幅約０．５ｍｍ〜約３ｍｍ又はその間の任意の値（約１ｍｍ等）とすることができる。
【０１３６】
ＰＴＦＥ膜は、存在する場合は、長さ約５ｍｍ〜約２７ｍｍ（約７ｍｍ等）、及び幅約２．５ｍｍ〜約６ｍｍ（約４ｍｍ等）とすることができる。
【０１３７】
アレイチャンバは、面積約４ｍｍ2〜約５００ｍｍ2又はその間の任意の値（面積約１００ｍｍ2等）、及び深さ約１００μｍ〜約３００μｍ又はその間の任意の値（深さ約２５０μｍ等）とすることができる。
【０１３８】
「シーリング膜」は、存在する場合は、長さ約５ｍｍ〜約８０ｍｍ（約３ｍｍ等）、及び幅約２．５ｍｍ〜約７ｍｍ（約３ｍｍ等）とすることができる。
【０１３９】
ドライカートリッジは、低タンパク質結合性特性を備えた任意の好適な材料（非限定的にポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、又は環状オレフィンポリマー等）で作製することができる。いくつかの実施形態において、ドライカートリッジはポリエチレンテレフタレートで作製することができる。
【０１４０】
ドライカートリッジ中のチャネルは、レーザー、又は任意の好適な手段（レプリカ成型又はインフェクション成型又はエンボシング等）を使用して形成することができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、ドライカートリッジは使い捨てとすることができる。
【０１４２】
ウェットカートリッジ中のベントは、ドライカートリッジ中のチャネルへのベントと整列しるように構成することができる。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジ中のベントは、空気が自由に流れることが可能なように、ドライカートリッジのベント、及び気体透過性膜又は流体遮断膜へ整列し得る（図２７）。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジ中のベントは、液体の通過を可能にせずに、機器中のポンプによって生成された圧力が自由に通過することができるように、ドライカートリッジの通気ポート、及び気体透過性膜又は流体遮断膜と整列し得る（図２７）。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジ中のリザーバ位置は、ドライカートリッジ中のチャネルへポートと整列しるように構成することができる（図２７）。
【０１４４】
ドライカートリッジの寸法は、タンパク質マイクロアレイ（抗体マイクロアレイ等）からのシグナルの検出のためのマイクロ流体チャネル、及び開口の幾何学的構造を格納するのに十分であることが理解されるべきである。ウェットカートリッジの寸法は、ドライカートリッジの寸法によって決定することができる。いくつかの実施形態において、アセンブルされたマイクロ流体カートリッジの寸法は、約８ｃｍ×５．５ｃｍ×１ｃｍとすることができる。
【０１４５】
「約」は、５％以下（例えば、０．５％、１％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％など）の、値又は範囲からの分散（プラス又はマイナス）を意味する。
【０１４６】
流体（試薬及び／又はバッファ等）は、ウェットカートリッジ又はマイクロ流体カートリッジの適切なリザーバの中へ充填することができる。いくつかの実施形態において、試薬及び／又はバッファはラミネート底部の孔を介して充填され、それはローディング後にシールすることができる。いくつかの実施形態において、試薬及び／又はバッファは、使用の前に、ウェットカートリッジ又はマイクロ流体カートリッジの適切なリザーバの中へ充填、及びシールされ、例えば４℃で保存することができる。代替の実施形態において、試薬及び／又はバッファは、使用の直前に、ウェットカートリッジ又はマイクロ流体カートリッジの適切なリザーバの中へ充填、及びシールすることができる。いくつかの実施形態において、試薬及び／又はバッファは、ウェットカートリッジ、及び／もしくはドライカートリッジ又はマイクロ流体カートリッジから別々に提供され得る。
【０１４７】
サンプルは、同時に又は試薬、及びバッファのローディングに続いて、サンプルレセプタクル又はサンプルウェルの中へ充填することができる。ウェットカートリッジ又はマイクロ流体カートリッジは、流体サンプルの精製のためのシステムを含むことができる。例えば、フィルター又は膜は、例えば血液サンプルのために使用することができる。精製度は、使用される流体サンプルのタイプに依存し、多くの事例において部分的精製で十分とすることができることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、サンプルは血液濾過要素の中へ充填することができる。これは、全血液からの血漿のフィルタリング、及び血液細胞の除去を可能にする血漿濾過フィルターを含むことができる。
【０１４８】
マイクロアレイ上のタンパク質又は抗体のスポットが、ドライカートリッジ（アレイチャンバ）の開口内に整列し、分析の開始に際してウェットカートリッジからの流体（サンプル、バッファ、試薬等）へ曝露され得るように、タンパク質マイクロアレイ（抗体マイクロアレイ等）スライドはドライカートリッジへ取り付け得る。
【０１４９】
タンパク質マイクロアレイ又は抗体マイクロアレイ中のタンパク質又は抗体が、アレイチャンバへ接近可能であり、ドライカートリッジ中のマイクロ流体チャネル、ポート及び／又はベントが、ウェットカートリッジ中の対応するリザーバ、ポート及び／又はベントと整列しるように、ドライカートリッジ、及びウェットカートリッジは整列し得る。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジ及び／又はドライカートリッジ中のノッチ又はガイドは簡単な位置合わせを可能にすることができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジが再び使用され得るように、ウェットカートリッジ、及びドライカートリッジは、可逆的に取り付けられて、アセンブルされたマイクロ流体カートリッジを形成する。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジ、及びドライカートリッジは別々に提供することができる。代替の実施形態において、ウェットカートリッジ、及びドライカートリッジは、恒久的に取り付けられて、アセンブルされたマイクロ流体カートリッジを形成し、それは使用後に処分することができる。いくつかの実施形態において、ウェットカートリッジ、及びドライカートリッジは、タンパク質マイクロアレイと一緒に提供することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質マイクロアレイは、ウェットカートリッジ、及び／もしくはドライカートリッジ又はマイクロ流体カートリッジから別々に提供することができる。
【０１５１】
機器、及び操作
マイクロ流体カートリッジは、マイクロ流体カートリッジを保持するようにデザインされた機器のカートリッジレセプタクルの中へ挿入することができる。機器は、マイクロ流体カートリッジのための位置合わせ機構／排出機構を含むことができる。例えば、機器は、マイクロ流体カートリッジ中の対応する特徴部の中へクランプすることができるクランピング特徴部（半円形の特徴部等）を含んで、カートリッジの正確な位置合わせを支援することができる。
【０１５２】
マイクロ流体カートリッジは、例えば流体の運動を制御するように、機器と空気圧で接続することができる。機器は、光学センサ又は他の検出システム（例えば測色システム）を使用して、タンパク質マイクロアレイを検出することが可能とすることができる。機器は、流体サンプルの精製のためのシステムを含むことができる。
【０１５３】
カートリッジレセプタクル、及び位置合わせ機構／排出機構に加えて、機器は、ポンプ、バルブシステム、マニホールド、ＬＥＤ励起光源、検出システム、ＣＰＵ、ブルートゥース(登録商標)接続、ＬＣＤタッチスクリーン、再充電式電池、及び回路基板、ＨＤＭＩ(登録商標)アダプター、ＵＳＢコネクター、イーサネット(登録商標)接続アダプター、シリアルポート、換気ファン、電源スイッチ、ならびに／又は保護エンクロージャのうちの１つ又は複数を、非限定的に含む。
【０１５４】
一旦挿入されると、ドライカートリッジ中のベントは機器のマニホールドと相互接続し、それはバルブをリザーバポートに接続することができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ポンプ、バルブ、及び検出システムは、ソフトウェアからの電気入力を様々な構成要素へ中継することができるプリント回路基板と一体化され得る。
【０１５６】
ポンプを使用して、圧力駆動の流体流れを生成することができる。好適なポンプは、例えば試薬、バッファ及び／又はサンプルの連続的な流体送達が可能である。いくつかの実施形態において、ポンプは真空ポンプとすることができる。機器のとの関連において所望通りに作動可能である限り、任意の好適なポンプが使用され得ることが理解されるべきである。機器は、ポンプが、流体が廃液リザーバに向かって流れるように試薬リザーバから押し出すことが可能なようにデザインされ得る。例示的なシリンジポンプは図３２中に図示される。ポンプは、一般的にその側面で曲げられたＵ字の形状とすることができる。底部上のポンプは、機器のマニホールドの中へ挿入することができる。Ｏリングをポンプの端部の周囲に嵌合させてマニホールド内のポンプをシールすることができ、流れを駆動するために使用される空気圧をシーリングする。ポンプの上部は歯を有することができる。モーターが動くとポンプがマニホールドの中に又は外へ動くように、相補的な歯を備えたリングは、ポンプをモーターへ結合することができる。ポンプはモーター（例えばＶｅｘ：ＲＢ−Ｉｎｎ−１１）によって作動することができる。
【０１５７】
カートリッジリーダーは、規定の体積の空気を押し出すか又は引き抜くことに使用される、容積式空気ポンプを含むことができる。空気は、例えばポンプ空洞の中へ軸方向で動くグラウンドステンレス鋼ピンによって移動され得る。ピンは固定された半径方向シールにより空洞の入口でシールすることができる。ピンは、ステッピングモーター駆動（例えばＨａｙｄｏｎ  Ｋｅｒｋ  ＬＣ１５７４Ｗ−０５）のリニアアクチュエーターによって直接動かされ得る。ポンプ位置は、近接センサにより光学的に測定することができる。スキップされたステップを検出、及び修正し、構造体中の変動を考慮するように、ポンプは自動的に較正され得る。バルブは、ポンプ、ベント、及びノズルの間の各接続に対する自動制御を可能にすることができる。バルブは、ネジ、及び表面シールを使用して、マニホールド組立体へ取り付け得る。マニホールド組立体は、複数のバルブに加えて、追加バルブのための空ソケットを含むことができる。ポンプの内部圧力を測定するために、圧力センサはシステム中に含まれ得る。圧力センサ、及びセンサ接続部内の空気の体積はシステム応答を改善するように最小限にされるべきである。
【０１５８】
バルブは、ソレノイドバルブ（例えばＰａｒｋｅｒ：Ｘ−７  ０５  Ｌ−Ｆ又はＬｅｅ：ＬＨＤＸ０５３２３００Ｂ）とすることができる。通気するための、又はカートリッジに接続することなくポンプの再度のゼロを可能にするための追加のバルブと共に、バルブはすべてのリザーバ（廃液リザーバを包含する）の上に置かれる（図２９）。特定のリザーバと関連するソレノイドバルブの開放は、そのリザーバ中の流体がリザーバから廃液リザーバに向かって移動することをもたらす。
【０１５９】
空気がポンプからバルブへマニホールドを介して進むことができるように、機器は、ポンプ、バルブ、及びカートリッジの間の空気の通過のためのチャネルを含むマニホールドに嵌合され得る。バルブが開放される場合、空気は、マニホールドの中へ戻って、及びカートリッジの対応するリザーバの中へ、特定のバルブを通って進むことができる。例示的なマニホールドは図３３、及び図４７中に図示され、それはポンプからバルブそしてカートリッジへ空気を接続するように機能する。空気はポート８８を通ってポンプを出て、バルブ入口８５へ進み、開放バルブを通る。次いで空気はポート８６を通ってバルブを出て、マニホールドに再度入り、ポート（そこで、マニホールドはカートリッジ８７と相互接続する）へ進む。ポンプを再度ゼロにするか、又はＷ１（１）もしくはＷ２（２）へ進む間に、空気はポートを通って大気６３へ出る。
【０１６０】
画像捕捉、アッセイ、及びシグナル定量化のスクリプティングを可能にし、公的に利用可能なカメラ通信ライブラリーを使用し、公的に利用可能な制御装置プロトコルを実装し、標準的なＪａｖａ(登録商標)グラフィカルユーザーインターフェース・ライブラリーを使用する、Ｊａｖａ(登録商標)アプリケーションが記載される。
【０１６１】
ソフトウェアを使用して、機器中のバルブの開放、及びしたがって流体の動きを制御することができ、例えば：
バッファを、バッファリザーバからメインジャンクションを介して、次いで第２の廃液リザーバ（Ｗ２）へ押し出して、チャネルの空気を実質的に低減又はパージすること；
サンプルを、サンプルウェルから例えば試薬リザーバＲ７を介して、メインジャンクションを横切って、プレＣ経由でアレイチャンバを介して、ポストＣ経由で第１の廃液リザーバ（Ｗ１）の上へ押し出すこと；
試薬を、試薬リザーバから、メインジャンクションを横切って、アレイチャンバを介して（プレＣ経由で）、ポストＣ経由で第１の廃液リザーバ（Ｗ１）の上へ押し出すこと；
である。
【０１６２】
光学センサを使用してサンプルアッセイ結果の測定値を取得することができ、定量化ソフトウェアを使用して測定値の結果を解釈することができる。
【０１６３】
光学センサを使用してサンプルアッセイ結果の測定値を取得することができ、定量化ソフトウェアを使用して測定値の結果を解釈することができる。
【０１６４】
任意の好適な光学的センシングシステムを使用することができる。いくつかの実施形態において、ソフトウェアがスポットの画像を得ることができるように、機器はカメラ（ＵＳＢカメラ（例えばＬｅｏｐａｒｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ：ＬＩ−ＯＶ７７２５）、及び照明システム等）を含む。次いでソフトウェアは、カメラによって撮られた画像に基づいて光学的密度を計算することができる。
【０１６５】
照明がスポットの画像をもたらすように、ＬＥＤアレイ光（例えばＬｉｆｅ−ｏｎ  Ｉｎｃ．）はスポットの視野の下に置くことができる。機器画像化システムは、光源（半透明のアクリルディフューザーを介して、次いでウェットカードの背面を介して光る、４つの白色ＬＥＤを含む）を含むことができる。ウェットカートリッジは半透明のポリカーボネートで作製され、それによって照明均一性を高めることができる。ＬＥＤの点滅は、好適なソフトウェアが生じた画像についてのゲイン、及びオフセットを計算することを可能にする。ＬＥＤは、三角形の時変信号によりスライドの背面を照明することができる。この変調はおよそ２．６Ｈｚで生じ得る。変調は、バルブ、及びポンプモーターの制御にも使用できる制御装置回路によって生成することができる。制御装置回路は、方形波信号（それは積分され、次いでＬＥＤへの電流の変調に使用される）を生成し、三角形の時変光出力を生じて、迷光ならびにピクセルのゲイン、及びオフセットの変動によって引き起こされる誤差を低減する。光路長は、機器のサイズを低減するために、可能な限り短くデザインすることができる。
【０１６６】
光学系は、ＴＡＤ系がアッセイによって生成されたアレイチャンバ中のスポットを画像化すること、挿入されたマイクロ流体カートリッジのタイプ、適合性、向き、及び挿入成功を決定すること、ならびにマイクロ流体カートリッジ中の流体の流れを画像化することを可能にし得る。カメラは、複数の機能を実行することができ、光学的密度を定量化するのに十分な解像度によるアッセイによって生成されたスポットを画像化すること；インプットとして機器からのブランク、及びスポット画像を撮ること；スポットアレイの選択されたカードタイプの構成された寸法に基づいて、スポットの２次元アレイの起点のスポット、及びアウトプットを見つけること；マイクロ流体カートリッジ上の特徴部を画像化すること（それはカートリッジのタイプ、適合性、及び向きが決定されることを可能にする）、及びＴＡＤが挿入成功を決定することを可能にすること；マイクロ流体カートリッジ内のマイクロ流体チャネルを画像化して、流体もしくは空気の位置を記録すること；診断を支援することもしくは試験の記録を提供すること；ならびに／又はバーコードスキャニングのためにカートリッジラベルを画像化することが、非限定的に挙げられる。
【０１６７】
ＬＥＤアレイは、マイクロ流体カートリッジの頂部表面を照明することができる。例えば上記のように、光入力は制御電子回路によって変調され、カメラ機能をサポートするようにソフトウェアによって制御することができる。これらの光は、トラブルシューティング、及び診断のためのアッセイの間の、バーコードスキャニング、及び可能性のあるビデオの記録のために使用することができる。画像化ＬＥＤは、アレイチャンバの底部への光を供給することができる。光入力は制御電子回路によって変調され、必要に応じてアレイチャンバ中のスポットの定量化のためにソフトウェアによって制御することができる。アレイチャンバ中のスポットの画像化のために、ＬＥＤからの光は、アレイチャンバの底部に侵入し、視界窓を介して通過し、他の表面に反射せずに又は他の表面を介して拡散せずに、カメラに侵入するべきである。画像化ＬＥＤからの光はＴＡＤデバイスの任意の要素に反射せずに又はそれらを介して拡散せずに、次いで上部からアレイチャンバを照明するべきである。拡散要素は、アレイ画像化ＬＥＤとマイクロ流体カートリッジアッセイチャンバとの間に含むことができ、ＬＥＤからの光はアッセイチャンバに入る前に均一に分布する。
【０１６８】
スポットの画像を得るために、ブランクの画像を最初に得ることができ、ソフトウェアが、スポットが現像される前に存在する任意のバックグラウンドを無視することによってスポットを検出することを可能にする。スポットの現像によって、スポット画像が得られる。画像捕捉の開始時に、２つの６４０×４８０ピクセルアレイをゼロ化（ｚｅｒｏｅｄ）し、一方は、各々の個別のピクセルの平均の黒色強度、及び白色強度を蓄積し、他方は、全体のピクセル平均を掛けた強度を蓄積することになる。空間的なピクセル平均も、フレームが捕捉された時間と一緒に記憶することができる。平均の空間的なピクセルは、以下の分析における代用物として変調信号のために使用することができる。これは、２．６Ｈｚの周波数の唯一の供給源が変調に起因するという仮定に基づく。
【０１６９】
一旦フレームの合計の所望の数が捕捉されると、平均のピクセル強度の時間記録は、正確な変調振動数、位相、及び振幅を同定するために、正弦波の範囲の振動数と関連づけることができる。この計算結果は変調の大きさに比例した値である。次に、最小二乗線形回帰を各々のピクセルについて計算して、抽出された変調信号に関する各々のピクセルのゲイン、及びオフセットを決定することができる。この時点で、個別のピクセルゲインがＬＥＤアウトプットに比例する比例定数を示すことを仮定することができる。ピクセルオフセットは、有用とは見なされず廃棄される。カード間の変動、チャンバ中の流体に起因する光学的密度変動、及び正確な振幅変調に起因する効果を阻止するために、画像は、最初に、その後にスポットが現像される直前に捕捉することができる。これらは「ブランク」画像、及び「スポット」画像と称される。最後の処理画像は、ブランクの画像のものと、スポット画像の各々のピクセルゲインの比の計算によって生成することができる。この画像は、ブランクの画像に対するスポット画像の計算された変調の大きさの比によってさらにスケール調整することができる。
【０１７０】
定量化のためのスポットは、ソフトウェアユーザーによって手動でマークすることができる。各々のスポットは中心スポット領域を含む。スポットのサイズは、ソフトウェアを使用して、ユーザーが変えることができる。スポットを定量化するために、新しい画像を計算することができ、そこで、各々のピクセルは、スポット画像、及びスポットのない画像の各々のピクセルの比に等しい。これはピクセルのゲイン、及びオフセットに加えて、バックライト、及び固有の空間的カード密度に起因する変動を除去する。中心スポット円内の平均ピクセル値が計算される。
【０１７１】
ポンプ、バルブ、及び光学カメラは機器の中へ一体化することができる。機器内で、これらの部分は、プリント回路基板（ソフトウェアから様々な構成要素への電気入力を中継することができる）と共に一体化することができる。機器は、マイクロ制御装置、ポンプ、バルブ、及び光学系を格納することができる。カートリッジ（ウェット、及びドライを一緒に）は機器の中へ挿入され、ばね機構を用いてマニホールド（バルブをリザーバポートに接続することができる）に相互接続することができる。ソフトウェアは機器に接続されたコンピューター上にロードすることができる。
【０１７２】
ＴＡＤ系は、カートリッジからの結果を制御、及び定量化できるリーダーを含むことができる。この機器は、プラスチック筺体、及び金属筺体で構成され、これらの筺体は、タッチスクリーンディスプレイ、メインＣＰＵ  ＰＣＢ、カートリッジインターフェース（ポンプ、多数のバルブ、定量化のためのカメラ、様々なＬＥＤ光源、及びＭＣＵを含む）、及びアッセイが正確に遂行されることを保証するＰＣＢ（バルブドライバー、モータードライバーならびにセンサを含む）を備える。リーダーの基本形態は、カートリッジ挿入のための引き出しと共に、ユーザーインタフェースのためのグラフィカルタッチスクリーンディスプレイを含むことができる。筺体はＯＴＳ防振脚を使用することができる。ＴＡＤソフトウェアはＡＲＭベースのＣＰＵ上で実行することができる。メインソフトウェア機能（すべてのＧＵＩを含む）はＪａｖａ(登録商標)で記述されたソフトウェアアプリケーション（ａｐｐ）の結果とすることができる。ａｐｐは、様々な他のソフトウェアライブラリー、及びパッケージ（開発過程が不明なソフトウェア（ＳＯＵＰ）のカテゴリーへと分類される）によるサポートに依存することができる。
【０１７３】
ＴＡＤは、公的に利用可能な電子サブ組立体を含むことができる。アプリケーションとユーザーの相互作用はタッチスクリーンを介して達成することができる。データエントリーはオンスクリーンキーパッドを介して達成することができる。いくつかの実施形態において、患者ＩＤエントリーのための外部バーコードスキャナーを追加することができる。
【０１７４】
本発明は以下の実施例でさらに示されることになる。
【０１７５】
１：バイオマーカーアッセイの開発、及び検証（ＥＬＩＳＡ）
１ａ：同族抗原に対する抗体反応性の検証（ＥＬＩＳＡ）
各々のバイオマーカーについてのサンドイッチ免疫アッセイ抗体ペアを、製造者の推奨に基づいて最初に選択した。これらは、４つのバイオマーカー（ＣＡ１５−３、ＣＥＡ、ＥｒｂＢ２、及びＣＹＦＲＡ２１．１）についてのペアを含んでいた。抗体ペアをサンドイッチ免疫アッセイにおいて試験して、ペアの品質を決定した（本明細書においてセクション１ｂ下で記載されるように）。
【０１７６】
より具体的には、ＣＥＡ抗原（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ：３０−ＡＣ２５Ｐ）、及びＣＹＦＲＡ２１．１抗原（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ：ＣＬＰＲＯ３５０）を、コーティングバッファ（０．２ＭのＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ９．４）中で希釈した。３つの濃度（２００ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ）での５０μＬのコーティングバッファ中の抗原を、室温で２時間インキュベーションすることによって、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のウェルの上へコーティングし、プレートを４℃で一晩保管した。翌日に、ＥＬＩＳＡプレートを、２００μＬのブロッキングバッファ（１×ＰＢＳＴ＋２％のＢＳＡ）により１時間ブロッキングした。次いでウェルを、５０μＬのそれぞれの一次抗体（１°抗体、表１）により１時間プロービングし、後続して、５０μＬの二次抗体（２°抗体）（ＨＲＰへコンジュゲートした様々な種からの抗ＩｇＧ）、又は５０μＬのＳＡ−ＨＲＰを３０分間ウェルへ適用した。続いて、ウェルを各洗浄について５分間で６回１×ＢＳＴにより洗浄した。５０μＬのＴＭＢ（ＶＷＲ）を３０分間使用してシグナルを現像し、次いで反応を５０μＬの２Ｍの硫酸により停止した。プレートを４５０ｎｍでＶｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してスキャンした。
【０１７７】
その抗原に対しての抗体反応性の試験についてのサンプルの結果を、表１中に図示する。間接的ＥＬＩＳＡ実験において、ｏｒｂ４８７８１（Ｂｉｏｒｂｙｔ）はＣＹＦＲＡ２１．１抗原を認識せず、すべての抗原濃度で低いＯ．Ｄ．値を与えた（表１）。しかしながら、ＣＹＦＲＡ２１．１についての他の２つの抗体（ＡＦ３５０６、及びＭＡＢ３５０６）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、用量依存的様式で抗原を認識することができた。ＣＥＡについての２つの抗体（１０−１１３４Ｂ、及び１０−１１３１）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）は、高い抗体濃度でさえサンドイッチアッセイにおいて低いシグナルを与えた。興味深いことには、それらはＣＥＡ抗原を認識することができた（表１）。ＣＥＡ抗原への結合において、２つの抗体が互いに妨害するかもしれない可能性が高い。追加のＣＥＡ抗体（１０−Ｃ１０Ｄ、１０−Ｃ１０Ｅ、及びＭＡＢ４１２８１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を包含する）は、用量依存的様式でＣＥＡ抗原を認識することができた。したがって、これらの抗体を、サンドイッチアッセイにおいてさらに試験した（セクション１ｂ）。
【０１７８】
2019530884.tif 000020
【０１７９】
１ｂ：サンドイッチアッセイのための抗体ペアの適合性（ＥＬＩＳＡ）
ＣＡ１５−３、及びＥｒｂＢ２について試験した第１のサンドイッチ抗体ペアは成功した。これらの抗体の最適化はセクション１ｃ中で見出すことができる。同族抗原を認識できる、ＣＥＡ、及びＣＹＦＲＡ２１．１についての抗体を同定した後に（セクション１ａ）、サンドイッチアッセイにおける適合性についての詳細な試験を、抗体に行った。
【０１８０】
ＣＥＡ抗体
ＣＥＡについて、異なる３つの抗体（１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度の１０−Ｃ１０Ｄ、１０−Ｃ１０Ｅ、及び１０−１１３４）を捕捉抗体（ｃＡｂ）として試験した。コーティングバッファ（０．２ＭのＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ９．４）中で希釈した５０μＬの抗体を、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のウェルの上へ個別にコーティングした。プレートを室温で２時間インキュベーションし、次いで４℃で一晩維持した。翌日に、ＥＬＩＳＡプレートを、２００μＬのブロッキングバッファ（１×ＰＢＳＴ＋２％のＢＳＡ）により１時間ブロッキングした。ウェルを２００μＬの１×ＰＢＳＴにより３回洗浄し、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、及び０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原により１時間インキュベーションし、後続して、１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μＬの異なるビオチン化検出抗体（表２）を１時間添加した。各々の捕捉抗体を、検出抗体（ｄＡｂ）としての他の２つの抗体により試験した。１×ＰＢＳＴの洗浄後に、ウェルを５０μＬのＳＡ−ＨＲＰにより３０分間プロービングし、次いで１×ＰＢＳＴにより各々５分間で６回洗浄した。５０μＬのＴＭＢ（ＶＷＲ）を３０分間使用してシグナルを現像し、反応を５０μＬの２Ｍの硫酸の添加によって停止した。プレートを４５０ｎｍでＶｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してスキャンした。サンプルの結果を表２中で示す。最も良好なシグナル対ノイズ比を有し、この研究においてＣＥＡ抗原への用量依存的応答を示した抗体ペアは、１０−Ｃ１０Ｄ捕捉抗体、及び１０−１１３４Ｂ検出抗体であった。抗体ＭＡＢ４１２８１は、これらの試験において高いバックグラウンドを示した。
【０１８１】
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【０１８２】
ＣＹＦＲＡ２１．１抗体
ＣＹＦＲＡ２１．１についての最初の抗体試験は、同族抗原を良好に認識した２つの抗体（ＭＡＢ３５０６、及びＡＦ３５０６）を同定した。これらの抗体を、２つの組み合わせ（１つは捕捉抗体としてＭＡＢ３５０６、及び検出抗体としてＡＦ３５０６で、ならびにその逆）のサンドイッチアッセイにおいて試験した。ＥＬＩＳＡアッセイを、様々な濃度でコーティングした捕捉抗体（表３）により以前に記載したように行い、次いで２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、及び０ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ２１．１抗原（表３）によりそれぞれプロービングした。次いでウェルを様々な濃度のビオチン化検出抗体（表３）、後続してＳＡ−ＨＲＰによりプロービングした。シグナルをＴＭＢにより現像した。次いでプレートを４５０ｎｍでＶｅｒｓａｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイクロプレートリーダーによりスキャンした。Ｏ．Ｄ．の結果を表３中で示す。捕捉抗体としてＭＡＢ３５０６、及び検出抗体としてＡＦ３５０６−Ｂを使用して実行されたサンドイッチアッセイは良好に動作し、用量依存的様式でＣＹＦＲＡ２１．１抗原を検出した。しかしながら、捕捉抗体としてＡＦ３５０６、及び検出抗体としてＭＡＢ３５０６による反対のサンドイッチアッセイは、これらの試験において、強いＣＹＦＲＡ２１．１シグナルをもたらさなかった。
【０１８３】
2019530884.tif 000022
【０１８４】
１ｃ：抗体の力価測定（ＥＬＩＳＡ）
捕捉抗体、及び検出抗体の両方について最適濃度を試験した。これらの実験は一般的には交差力価測定と称される。２倍の連続希釈を、各々のバイオマーカーについての捕捉抗体、及び検出抗体について調製した。２つの濃度の抗原（１つはその生理的カットオフ値の上、及び１つは下で）に加えて、ブランクの対照を調製した。各々の抗体ペアについての最適濃度を決定するために、シグナル対ノイズ比を、抗原のないウェルからのものによって抗原ウェルからの測定値を割ることによって計算した。捕捉抗体、及び検出抗体の最適濃度を、最も高いシグナル対ノイズ比、及び最も低いバックグラウンド測定値により決定した。
【０１８５】
バイオマーカー：ＥｒｂＢ２
ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを以前に記載されるように実行した。捕捉抗体（ＭＡＢ１１２９（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を、４つの異なる濃度（８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、及び１μｇ／ｍＬ）で試験した。同様に、検出抗体（ＢＡＦ１１２９（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を、１６０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、及び１６ｎｇ／ｍＬで試験した。ＥｒｂＢ２のカットオフが１５ｎｇ／ｍＬであるので、ＥｒｂＢ２抗原（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ：１１２９−ＥＲ−０５０）を、２５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、及び０ｎｇ／ｍＬで試験した。各々の組み合わせを二重で遂行した。結果、及び実験的なセットアップを表４中で示す。シグナル対ノイズ比を計算し、それぞれ４μｇ／ｍｌのｃＡｂ、及び８０ｎｇ／ｍｌのｄＡｂで、最も高いシグナル対ノイズ比が観察された。したがって、これらの２つの最適濃度を後の実験のために使用することにする。
【０１８６】
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【０１８７】
バイオマーカー：ＣＡ１５−３
ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイの実験を以前に記載されるように実行した。捕捉抗体（１０−ＣＡ１５３Ａ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ））を、４つの異なる濃度（５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、及び０．６２５μｇ／ｍＬ）で試験した。同様に、検出抗体（１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂ）を、２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び２５ｎｇ／ｍＬで試験した。ＣＡ１５−３２のカットオフが３０Ｕ／ｍＬであるので、ＣＡ１５−３抗原３０Ｃ−ＣＰ９０６４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を、１００Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、及び０Ｕ／ｍＬで試験した。各々の組み合わせを二重で遂行した。結果、及び実験的なセットアップを表５中で示す。シグナル対ノイズ比を計算し、ＣＡ１５−３についてのｃＡｂ、及びｄＡｂの最適濃度を、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、及び１００ｎｇ／ｍｌと決定した。
【０１８８】
2019530884.tif 000024
【０１８９】
バイオマーカー：ＣＹＦＲＡ２１．１
ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイの実験を以前に記載されるように実行した。捕捉抗体（ＭＡＢ３５０６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を、４つの異なる濃度（６．４μｇ／ｍＬ、３．２μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、及び０．８μｇ／ｍＬ）で試験した。同様に、検出抗体（ＡＦ３５０６−Ｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を、１０μｇ／ｍＬ、及び５μｇ／ｍＬで試験した。ＣＹＦＲＡ２１．１のカットオフが２ｎｇ／ｍＬであるので、ＣＹＦＲＡ２１．１抗原（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ：ＣＬＰＲＯ３５０）を、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、及び０ｎｇ／ｍＬで試験した。各々の組み合わせを二重で遂行した。結果、及び実験的なセットアップを表６中で示す。シグナル対ノイズ比を計算し、ＣＹＦＲＡ２１．１についてのｃＡｂ、及びｄＡｂの最適濃度を、それぞれ６．２５μｇ／ｍｌ、及び５μｇ／ｍｌと決定した。
【０１９０】
2019530884.tif 000025
【０１９１】
バイオマーカー：ＣＥＡ
ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイの実験を以前に記載されるように実行した。捕捉抗体（１０−Ｃ１０Ｄ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ））を、４つの異なる濃度（２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、及び２．５μｇ／ｍＬ）で試験した。他のバイオマーカーとは異なり、２つの検出抗体をＣＥＡ（１０−１１３４Ｂ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、及び１０−１１３４Ｂ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ））について試験した。これらの両方の検出抗体を、４つの異なる濃度（１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、及び１．２５μｇ／ｍＬ）で試験した。ＣＥＡのカットオフが５ｎｇ／ｍＬであるので、ＣＥＡ抗原（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ：３０−ＡＣ２５Ｐ）を、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、及び０ｎｇ／ｍＬで試験した。各々の組み合わせを二重で遂行した。結果、及び実験的なセットアップを表７中で示す。シグナル対ノイズ比を計算し、ＣＥＡについてのｃＡｂ、及びｄＡｂの最適濃度を、それぞれ１０μｇ／ｍｌ、及び１．２５μｇ／ｍｌと決定した。両方の検出抗体は、同様に良好に動作した。
【０１９２】
2019530884.tif 000026
【０１９３】
１ｄ：抗体の交差反応性（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡ試験を遂行して、交差反応が抗体とバイオマーカーとの間で生じたかどうかを決定した。
【０１９４】
交差反応性：捕捉抗体と検出抗体との間（抗原の無い実験）
ＥＬＩＳＡ実験を以前に記載されるように実行した。抗原の代わりに、ウェルをブロッキングバッファ（１×ＰＢＳＴ＋２％のＢＳＡ）により１時間インキュベーションした。ＣＡ１５−３についてのビオチン化検出抗体（１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂ）は、１０−Ｃ１０Ｄ（ＣＥＡについての捕捉抗体）とのある程度の交差反応性を示し、０．２０６０５のＯ．Ｄ測定値であった（図１）。ＣＹＦＲＡ２１．１についてのビオチン化検出抗体（ＡＦ３５０６Ｂ）は、すべての捕捉抗体（そのペアの捕捉抗体（ＭＡＢ３５０６）を包含する）との交差反応性を示した。ＣＥＡ、及びＥｒｂＢ２についてのビオチン化検出抗体（１０−１１３１Ｂ、及びＢＡＦ１１２９）は、捕捉抗体のうちのどれとも交差反応性の有意水準を示さなかった。
【０１９５】
検出抗体と抗原との間の交差反応性
抗原と検出抗体との間の非特異的相互作用を決定するために、ＥＬＩＳＡ実験を以前に記載されるように実行した。各々のウェルを捕捉抗体によりコーティングし、ブロッキングし、その対応する抗原によりインキュベーションした。しかしながら、ペアの検出抗体によりプロービングする代わりに、抗原に関連しない検出抗体によりプロービングした。図２中で示されるように、抗原と他の検出抗体との間で交差反応性は見出されなかった。ＣＹＦＲＡ２１．１検出抗体が適用されたウェルによる比較的高い測定値は、この検出抗体とすべての捕捉抗体との間で以前に観察された交差反応性（図１）に由来するものかもしれない。
【０１９６】
捕捉抗体と抗原との間の交差反応性
すべての捕捉抗体を、ＣＡ１５−３濃度を減少させた抗原混合物（他の３つの抗原の濃度は一定のままであった）によりプロービングし、すべての検出抗体の混合物により検出した。予想されるようにＣＡ１５−３捕捉抗体（１０−ＣＡ１５−３Ａ）についてシグナルの減少が観察された。意外にも、ＣＥＡ捕捉抗体（１０−Ｃ１０Ｄ）、及びＣＹＦＲＡ２１．１捕捉抗体（ＭＡＢ３５０６）についてのシグナルの減少もあった（表８）。ＣＡ１５−３抗原（３０Ｃ−ＣＰ９０６４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ））は、ＣＥＡ、及びＣＹＦＲＡ２１．１の混入物を含有していたことが見出された。したがって、ＣＥＡ捕捉抗体、及びＣＹＦＲＡ２１．１捕捉抗体は、ＣＡ１５−３抗原ではなく、ＣＡ１５−３抗原溶液中に存在するそれらの同族抗原を非特異的に結合していた。ＭＡＢ１１２９（ＥｒｂＢ２捕捉抗体）とＣＡ１５−３抗原との相互作用はなかった。類似する実験を残りの３つのバイオマーカーについて遂行した。ＥｒｂＢ２について、用量依存的応答は、ＥｒｂＢ２捕捉抗体（ＭＡＢ１１２９）のみにより観察された（表８）。ＣＥＡ、及びＣＹＦＲＡ２１．１がＣＡ１５−３中の混入物として存在していたので、ＣＡ１５−３を、ＣＥＡ、及びＣＹＦＲＡ２１．１の試験についての抗原混合物から省いた。抗原混合物中にＣＡ１５−３無しで、ＣＥＡ捕捉抗体、及びＣＹＦＲＡ２１．１捕捉抗体はそれぞれの抗原のみを認識した（表８）。
【０１９７】
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【０１９８】
１ｅ：抗体親和性
捕捉抗体、及び検出抗体がどのくらい良好にそれぞれの抗原を認識したかを決定するために、ＥＬＩＳＡによる抗体親和性実験を遂行した。様々な量の時間で抗原、及び検出抗体をインキュベーションして、インキュベーション時間がどのようにシグナル測定値に影響するかを調べた。かかる実験の例を表９：左側中で示す。ウェルを、１．２５μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３についての捕捉抗体（１０−ＣＡ１５３Ａ）によりコーティングした。ブロッキング後に、ウェルを、３０Ｕ／ｍＬのカットオフレベルのＣＡ１５−３抗原により５分間〜６０分間で範囲のインキュベーション時間でインキュベーションした。抗原のない対照は各々のタイムポイントについて含まれていた。次いでウェルを、５分間〜６０分間の時間の量を変動させて、１００ｎｇ／ｍＬのＣＡ１５−３検出抗体（１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂ）によりプロービングした。結果を左側の下方で示す。予想されるように、抗原又は検出抗体によるより長いインキュベーション時間は、より強いシグナルを生成した。検出抗体インキュベーション時間の増加は、バックグラウンドシグナルに影響するとは思われなかった。６０分間の検出抗体インキュベーション時間について、シグナルは１５分間の抗原インキュベーション時間で飽和になり、より長い抗原インキュベーション時間はより高いシグナルをもたらさなかった。１０分間の抗原インキュベーション時間は、確実なシグナルのために十分であることが見出された。
【０１９９】
検出抗体インキュベーション時間を微調整し、検出抗体濃度の効果を観察して、類似する実験を遂行した。抗原をＣＡ１５−３について３０Ｕ／ｍＬのカットオフレベルでプロービングし、インキュベーション時間を１０分間で一定に保った（表９：右側）。検出抗体（１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂ）を、４つの異なる濃度（１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、及び８００ｎｇ／ｍＬ）で、５分間〜１時間でインキュベーション時間を変動させて試験した。１００ｎｇ／ｍＬ、及び２００ｎｇ／ｍＬの濃度について、予想されるように、インキュベーション時間によりシグナルは増加した。４００ｎｇ／ｍＬ、及び８００ｎｇ／ｍＬについて、シグナルは５又は１０分間のみの抗原インキュベーション時間後に飽和になり、さらなるインキュベーション時間はより強いシグナルをもたらさなかった。したがって、検出抗体について１００ｎｇ／ｍＬの濃度は、確実なシグナルのために十分であると思われた。抗原、及び検出抗体のインキュベーション時間に加えて検出抗体濃度を精密化するために、これらに類似する実験を残りのバイオマーカーについて遂行した。
【０２００】
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【０２０１】
２：抗体マイクロアレイアッセイの開発
２ａ：抗体の力価測定
各々の捕捉抗体についての様々な濃度を試験して、マイクロアレイについて最適濃度を決定した。４つのバイオマーカーすべてについての捕捉抗体を、１０倍の連続希釈でエポキシシランスライドにスポットした。個別の捕捉抗体について３つの濃度を１ウェルごとにスポットし、加えて、向きのために１３．２μｇ／ｍＬのＢＳＡビオチンをスポットした。３つのウェルに各々の捕捉抗体セットをスポットした（図３Ａ〜Ｌ）。次いで各々のウェルを、各々の抗原の３つの１０倍の濃度（３０Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、及び３０００Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３；５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び５００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ；２ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、及び２００ｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ２１．１、ならびに１５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、及び１５００ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２）によりプロービングした。各々のウェルを、その対応する検出抗体（１μｇ／ｍＬの１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂ、１０μｇ／ｍＬの１０−１１３１Ｂ、１０μｇ／ｍＬのＡＦ３５０６Ｂ、及び４μｇ／ｍＬのＢＡＦ１１２９）によりプロービングした。すべてのウェルをストレプトアビジン（ＳＡ）−Ａｌｅｘａ５４６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によりプロービングし、Ｇｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーにより５３２ｎｍでスキャンした。１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂについて、捕捉抗体濃度のどれも、３０Ｕ／ｍＬのカットオフレベルでＣＡ１５−３を検出することが可能でなかった（図３Ａ〜Ｌ）。１０−Ｃ１０Ｄについて、２０００μｇ／ｍＬは、５ｎｇ／ｍＬのカットオフレベルでＣＥＡを検出することができたが、シグナルは弱かった。ＭＡＢ３５０６、及びＭＡＢ１１２９の両方について、５００μｇ／ｍＬの捕捉抗体は、２ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ２１．１、及び１５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２の両方のカットオフレベルを検出することができた。
【０２０２】
ＣＡ１５−３捕捉抗体（１０−ＣＡ１５３Ａ）の複数の濃度、０．４μＬの４つの濃度（５００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、及び３２μｇ／ｍＬ）の捕捉抗体を、カスタムシリコーンアイソレーターを使用して、エポキシシランスライドの上へスポットした（セクション３、抗体マイクロアレイ構築を参照）。ＣＡ１５−３抗原スポットも、異なる実験における使用のためにスポットした。スライドをブロッキングし、３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原に加えて、１μｇ／ｍＬの検出抗体１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂによりプロービングした。結果をＴＭＢ−ＭＸ（Ｍｏｓｓ）により現像し、Ｇｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーによりスキャンした。プロービング条件について体積の限界を試験していたので、このプロービングを最小の体積で遂行した。図４中で示されるように、１０−ＣＡ１５３Ａが８０μｇ／ｍＬであった場合に、良好なシグナルが検出された。２００μｇ／ｍＬ、及び５００μｇ／ｍＬのより高い捕捉抗体濃度で、シグナルはより低かった。これは、これらのより高い濃度の捕捉抗体が抗原結合を妨害することができることを示唆する。シグナルは３２μｇ／ｍＬの捕捉抗体についても低かった。しかしながら、これは、この実験において使用される最小の体積、及びウェルの真中の場所（それはインキュベーションステップの間の抗原溶液の低い被覆をもたらした）に起因する可能性がある。類似する実験を他のバイオマーカーの捕捉抗体について遂行して、抗原捕捉について最も良好な密度を引き出す最適な捕捉抗体濃度を決定した。
【０２０３】
検出抗体濃度を経験的に決定した。化学的に修飾したマイクロアレイスライドに、マイクロアレイプリンター（Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｏｍｎｉｇｒｉｄ３００等）により、ＣＡ１５−３、及びＣＥＡについての捕捉抗体の希釈物をプリントした。ＣＡ１５−３、及びＣＥＡについての抗原の希釈物もデータ正規化の目的のためにプリントした。抗体、及び抗原を、１×ＰＢＳ＋０．０１％のサルコシル＋０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡのプリンティングバッファ中で希釈した。スライドのプリンティング、及び固定化後に、スライドをブロッキングバッファによりブロッキングした。１６のマイクロアレイグリッドを、変動する量のＣＡ１５−３抗原、及びＣＥＡ抗原、後続してＣＡ１５−３検出抗体、及びＣＥＡ検出抗体の希釈物によりプロービングした。ＣＡ１５−３検出抗体、及びＣＥＡ検出抗体の両方の異なる２つの希釈物で、７つの異なる抗原濃度をプロービングして、両方の検出抗体希釈についての標準曲線を生成した。ＣＡ１５−３については、検出抗体を０．２μｇ／ｍＬ、及び０．４μｇ／ｍＬで試験した。ＣＥＡ検出抗体は２０μｇ／ｍＬ、及び２５μｇ／ｍＬで試験した。ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチンＨＲＰ、及びＴＭＢによるシグナル現像後に、スライドをＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーにより画像化し、ＩｍａｇｅＪにより定量化した。バックグラウンド（ゼロの抗原でのｃＡｂカウント値）を捕捉抗体カウントから引いた。次いで捕捉抗体スポットを抗原スポットにより正規化した（ｃＡｂカウント／Ａｇカウント）。次いで正規化したカウントをプロービングされた抗原濃度に対してプロットして、標準曲線を生成した。０．２μｇ／ｍＬ、及び０．４μｇ／ｍＬの検出抗体の両方での８０μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３捕捉抗体についての標準曲線を、図３４Ａ〜Ｂ中で示す。０．２μｇ／ｍＬでの検出抗体の使用は直線状の標準曲線を生成し、その一方で０．４μｇ／ｍＬでの検出抗体は、より高い抗原濃度でカウントの飽和を引き起こした。これらの研究に基づいて、０．２μｇ／ｍＬをＣＡ１５−３についての検出抗体濃度として選択した。類似する実験もＣＥＡにより遂行し、検出抗体濃度として２０μｇ／ｍＬの選択がもたらされた。
【０２０４】
類似する実験を心血管バイオマーカーについて遂行した。検出抗体濃度を経験的に決定した。エポキシコーティングスライドを、ミオグロビンについての捕捉抗体の希釈物によりプリントした。ミオグロビンの希釈物もデータ正規化目的のためにプリントした。抗体、及び抗原を、１×ＰＢＳ＋０．０１％のサルコシル＋０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡのプリンティングバッファ中で希釈した。スライドのプリンティング、及び固定化後に、スライドをブロッキングバッファによりブロッキングした。１６のマイクロアレイグリッドを、変動する量のミオグロビン抗原、後続してミオグロビン検出抗体の希釈物によりプロービングした。ミオグロビンについて、検出抗体を、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、及び４μｇ／ｍＬで試験した。１μｇ／ｍＬ、及び４μｇ／ｍＬの検出抗体の両方での１００μｇ／ｍＬのミオグロビン捕捉抗体についての標準曲線を、図３５Ａ〜Ｂ中で示す。１μｇ／ｍＬでの検出抗体の使用は直線状の標準曲線を生成し、その一方で４μｇ／ｍＬでの検出抗体は、より高い抗原濃度でカウントの飽和を引き起こした。これらの研究に基づいて、１μｇ／ｍＬをミオグロビンについての検出抗体濃度として選択した。類似する実験も他の心血管バイオマーカー（ＣＫ−ＭＢ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、及びトロポニンＩ）により遂行し、これらのバイオマーカーについての検出抗体濃度としてそれぞれ５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬの選択がもたらされた。
【０２０５】
２ｂ：抗原力価測定
可能性のあるシグナル定量化目的のためにスポットされる最適の抗原濃度を決定するために、抗原標準曲線をマイクロアレイスライド上で遂行した。８つの異なる抗原濃度に加えて、４つの二重の捕捉抗体濃度をスライドの上へスポットした。ＥｒｂＢ２についてのこの実験の実施例を図５Ａ〜Ｂ中で示す。各々のウェルを異なる濃度のＥｒｂＢ２抗原によりプロービングして、異なる実験についての標準曲線を得た。次いでウェルを、２０μｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２検出抗体（ＢＡＦ１１２９）、後続してＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰによりプロービングし、シグナルをＴＭＢ−ＭＸにより現像した。スポットを機器のカメラにより定量化した。サンドイッチアッセイにおけるインキュベーションのために使用した抗原の量が、スポットした抗原に影響するべきでないので、各々のウェルは各々の抗原スポットについて重複と判断された。各々の抗原濃度について平均を得て、シグナル対濃度のグラフにおいてプロットして抗原力価測定についての標準曲線を得た（図５Ａ〜Ｂ）。類似する実験を他のバイオマーカーについて遂行して、抗原力価測定についての標準曲線を得た。
【０２０６】
２ｃ：抗体コンジュゲーション
検出抗体をビオチンにより修飾し、シグナル検出のためのストレプトアビジン（ＳＡ）を保有する一般的な二次検出試薬の使用を可能にした。ビオチンは非常に小さなサイズ（２４４Ｄａ）を有し、抗体、及びタンパク質へそれらの活性に影響せずにコンジュゲートすることができる。ビオチン分子は、ＨＲＰがその発色基質を触媒して目視可能なシグナルへと現像されるように、ＳＡを介してＳＡ−ＨＲＰへ強く結合するはずである。コンジュゲーションは、典型的には２つ以上のビオチン分子が抗体の上へコンジュゲートすることを可能にし、したがって１つの抗体へ結合できるＨＲＰ分子の数を増加させることによってシグナルを増幅する。検出抗体へビオチンをコンジュゲートするために、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル活性化ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。ＮＨＳエステルは抗体上の第一級アミンに加えてリジン残基の側鎖と反応して、アミド結合を形成する。ビオチン化反応のために、ＮＨＳエステル活性化ビオチンの１０ｍＭ溶液を調製した。２０μｇの検出抗体ごとに、０．５μＬの１０ｍＭのＮＨＳエステル活性化ビオチンを使用した。検出抗体−ビオチン溶液を、回転機上で室温で１時間インキュベーションした。インキュベーションに後続して、溶液を分子量１０，０００のカットオフの透析チューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中に置いた。溶液を含む透析チューブを冷１×ＰＢＳ中に置き、４℃で一晩放置した。これは、透析チューブ中で検出抗体を維持しながら任意のコンジュゲートされないビオチンの除去を可能にした。これは、コンジュゲーションバッファを１×ＰＢＳに交換することも可能にした。翌日に、溶液を透析チューブから取り出し、結果の検出抗体の最終濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ方法により定量化した。
【０２０７】
２ｄ：マイクロアレイ上での抗体の交差反応性
捕捉抗体と検出抗体との間の交差反応性
ＥＬＩＳＡにより遂行された交差反応性実験を、マイクロアレイフォーマットにおいてさらに検証した。マイクロアレイスライドをプリンティングロボットによりプリントした。これらのスライドは、６の複製でプリントしたすべての捕捉抗体を有する。すべての捕捉抗体を含有するウェルをブロッキングバッファによりブロッキングし、単一検出抗体によりプロービングして、交差反応性が捕捉抗体と検出抗体との間にあるかどうかを決定した。結果を図６Ａ〜Ｄ中で示す。ＣＡ１５−３についての検出抗体（１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂ）は、ＭＡＢ３５０６、ＭＡＢ１１２９、及び自身の捕捉抗体（１０−ＣＡ１５３Ａ）と軽度に交差反応することが見出された。ＣＹＦＲＡ２１．１、及びＥｒｂＢ２の両方についての検出抗体（ＡＦ３５０６、及びＢＡＦ１１２９）も、わずかにこれらの同じ捕捉抗体と交差反応した。
【０２０８】
捕捉抗体と検出抗体との間の交差反応性を、カスタムメイドのシリコンアイソレーター（Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によりスポットしたスライドでも検査した。スライドにすべての４つのバイオマーカーについての捕捉抗体、及び抗原の両方をスポットした。ウェルを、抗原の代わりにブロッキングバッファによりインキュベーションした。ウェルを、すべての４つのバイオマーカーについての検出抗体を含有する検出抗体混合物によりプロービングした（２μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３Ｂ−Ｂ、２０μｇ／ｍＬのＣ１２９９−８７Ｏ−Ｂ、８μｇ／ｍＬのＢＡＦ１１２９、及び５μｇ／ｍＬのＡＦ３５０６）。検出抗体を、プロービングの前にＳＡ−ＨＲＰと１時間前混合した（ｄＡｂ：５×ＳＡ−ＨＲＰ）。スポットをＮａｎｏｐｒｏｂｅｓからのＥｎｚＭｅｔ銀現像剤により現像し、Ｇｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーによりスキャンした。結果を図７中で示す。予想されるように、スポットした抗原は、ＥｒｂＢ２を例外して現像された。シグナルは、２５μｇ／ｍＬの捕捉抗体ＣＡ１５−３Ａ、２５０μｇ／ｍＬのＭＡＢ１１２９、及び５００μｇ／ｍＬのＣ１２９９−８７Ｗについて観察されなかった。低いレベルの交差反応性が、５０μｇ／ｍＬのＭＡＢ３５０６について観察された。
【０２０９】
交差反応性を、捕捉抗体と検出抗体との間で乳癌パネルについて検査した。ＣＡ１５−３、ＣＥＡ、及びＥｒｂＢ２についての捕捉抗体、及び抗原を、エポキシコーティングスライドの上へＧｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｏｍｎｉｇｒｉｄ３００によりプリントした。次いでスライドを抗原無しで検出抗体によりプロービングし、ＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーにより画像化した。交差反応性がなければ、抗原の非存在下において検出抗体によりプロービングした場合に、捕捉抗体シグナルはないに違いない。図３６はグラフによる実験結果を示す。各々のバーは異なる捕捉抗体／検出抗体の組み合わせを示す。試験された条件下で、乳癌パネルで捕捉抗体と検出抗体との間の交差反応性を示さない捕捉抗体／検出抗体の組み合わせのいずれかについて、バックグラウンドより上のシグナルはなかった。
【０２１０】
抗原と検出抗体との間の交差反応性
本発明者は、ＥＬＩＳＡによる交差反応性実験で、もとのＣＡ１５−３抗原はＣＥＡ、及びＣＹＦＲＡ２１．１抗原の不純物も同様に含有することを見出していた。新しいＣＡ１５−３抗原（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ：３０Ｃ−ＣＰ９０６４Ｕ）を取得し、マイクロアレイ上で試験して混入がもはやないことを保証した。捕捉抗体、及び抗原を、マイクロアレイスライドの上へシリコーンアイソレーターを使用してスポットした。ウェルを、３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原（新しい）によりプロービングし、すべてのバイオマーカーについての検出抗体混合物によりプロービングした。ウェルをＳＡ−ＨＲＰ、及びＥｎｚＭｅｔ銀現像剤によりプロービングした。生じたスライドを５３２ｎｍでＧｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーによりスキャンした。しかしながら、シグナルは、ＣＹＦＲＡ２１．１捕捉抗体、及びＣＥＡ捕捉抗体（ＭＡＢ３５０６、及びＣ１２９９−８７Ｗ）で見出されなかった（図８）。したがって、この新しいＣＡ１５−３抗原がこのマルチプレックス免疫アッセイを妨害する混入物を有していないと結論された。
【０２１１】
抗原と検出抗体との間の可能な交差反応を検査するために、抗原をマイクロアレイスライドの上へスポットした。スライドをブロッキングバッファ（１×ＰＢＳＴ＋５％のＢＳＡ）によりブロッキングし、抗原、及びそれらの対応する検出抗体によりプロービングした。スライドに別の実験のための捕捉抗体をスポットしたため、ウェルを抗原によりプロービングした。ウェルをＳＡ−ＨＲＰ、及びビオチン−ＨＲＰの前混合物（それぞれ４μｇ／ｍＬ、及び２μｇ／ｍＬ）によりプロービングし、ＥｎｚＭｅｔ現像剤により現像した。結果を図９Ａ〜Ｄ中で示す。すべての４つの抗原をスポットしたウェルを、２μｇ／ｍＬでＣＡ１５−３Ｂ−Ｂによりプロービングした。現像されたただ一つの抗原シグナルは、予想されるようにＣＡ１５−３のものであった。ＣＡ１５−３Ｂ−Ｂ検出抗体は、他の３つのバイオマーカーと交差反応しなかった。すべての４つの抗原スポットも、３つの分離したウェルにおいて、残りの３つの検出抗体（５μｇ／ｍＬのＡＦ３５０６Ｂ、２０μｇ／ｍＬのＣ１２９９−８７Ｏ−Ｂ、及び８μｇ／ｍＬのＢＡＦ１１２９）によりプロービングした。関連しない抗原による任意のシグナルはなかった。これは、検出抗体と非同族抗原との間に交差反応性相互作用がないことを確認した。
【０２１２】
可能性のある交差反応性を、乳癌パネルで抗原と検出抗体との間で検査した。ＣＡ１５−３捕捉抗体、ＣＥＡ捕捉抗体、及びＥｒｂＢ２捕捉抗体を、エポキシコーティングスライドの上へ、Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｏｍｎｉｇｒｉｄ  ３００により上記のようにスポットした。個別のマイクロアレイグリッドを、ＣＡ１５−３抗原、ＣＥＡ抗原、及びＥｒｂＢ２抗原のいずれかによりプロービングした。次いでウェルを他のバイオマーカーの検出抗体によりプロービングした（つまり、次いでＣＡ１５−３抗原によりプロービングしたウェルは、ＣＥＡ検出抗体、及びＥｒｂＢ２の検出抗体によりプロービングするだろう）。シグナル現像後に、スライドをＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーによりスキャンした。抗原はそれぞれの捕捉抗体を結合するが、抗原はその同族の検出抗体がないので、捕捉抗体スポットでシグナルはないに違いない。捕捉抗体／抗原スポットは、ウェルが対応する検出抗体によりプロービングされたというシグナルを示さなかった（図３７）。これは、交差反応性が乳癌パネルにおいて抗原と検出抗体との間になかったことを指摘する。
【０２１３】
抗原と捕捉抗体との間の交差反応性
抗原と捕捉抗体との間の相互作用を検査するために、マイクロアレイスライドに、カスタムシリコーンアイソレーターを使用して捕捉抗体、及び抗原をスポットした。スライドを一晩インキュベーションし、ブロッキングバッファ（１×ＰＢＳＴ＋５％のＢＳＡ）中で１時間ブロッキングした。次いでウェルを単一抗原、及びその対応する検出抗体によりプロービングした。結果を図１０Ａ〜Ｄ中で示す。３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３、及び２μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３Ｂ−Ｂ検出抗体によりプロービングしたウェルは、予想されるように、１０−ＣＡ１５−３Ａ捕捉抗体、及びＣＡ１５−３スポット抗原でのみシグナルを示した。５０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ、及びＣ１２９９−８７Ｏ−Ｂ検出抗体（２０μｇ／ｍＬ）によりプロービングしたウェルは、ＣＥＡ捕捉抗体（Ｃ１２９９−８７Ｗ）、及びＣＥＡスポット抗原でのみシグナルがあった。同様に、８ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ２１−１、及び５μｇ／ｍＬのその検出抗体（ＡＦ３５０６Ｂ）によりプロービングしたウェルは、ＣＹＦＲＡ２１−１捕捉抗体（ＭＡＢ３５０６）、及びＣＹＦＲＡ２１−１スポット抗原でのみシグナルを示した。３０ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２、及び８μｇ／ｍＬのその検出抗体（ＢＡＦ１１２９）によりプロービングしたウェルに、分離した実験において、捕捉抗体のみをスポットした。それは、ＥｒｂＢ２捕捉抗体（ＭＡＢ１１２９）でのみ、予想されるように、シグナルを示した。これらの結果は、このマルチプレックス免疫アッセイを妨害することができる、パネル内の抗原と他の捕捉抗体との間の強い交差反応性相互作用がないことを例証する。
【０２１４】
抗原と捕捉抗体との間の相互作用を検査するために、捕捉抗体を、Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｏｍｎｉｇｒｉｄ３００によりエポキシコーティングスライドの上へスポットした。次いでマイクロアレイグリッドを、ＣＡ１５−３、ＣＥＡ又はＥｒｂＢ２のいずれか、後続してそれらの同族の検出抗体によりプロービングした。シグナル現像後に、スライドをＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーによりスキャンした。もし抗原と捕捉抗体との間に相互作用があれば、その捕捉抗体でシグナルがあるだろう。交差反応性無しでは、抗原は、その対応する捕捉抗体でのみシグナルを示すべきである。試験された条件下で抗原と捕捉抗体との間の交差反応性を示さない任意の非特異的捕捉抗体で、シグナルは観察されなかった（図３８）。
【０２１５】
２ｄ：シグナル増幅
検出抗体ステップ、及びＳＡ−ＨＲＰステップを１つへと組み合わせて、異なる量のストレプトアビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）を試験した。検出抗体は、ＳＡ−ＨＲＰによってそれらを認識することができるようにビオチン化した。
【０２１６】
検出抗体とＳＡ−ＨＲＰの前混合物によるアッセイ時間の短縮
最初に、ビオチン化検出抗体、及びＳＡ−ＨＲＰインキュベーションを２つの構成要素の前混合によって１つへと組み合わせることによって、シグナルを増加させ、アッセイ時間を短縮しようと試みた。検出抗体を、プロービングの前に１時間回転させながら、いずれかの体積モル濃度で５倍のＳＡ−ＨＲＰと前混合した。ＣＡ１５−３（１０−ＣＡ１５−３Ａ）、ＣＹＦＲＡ  ２１−１（ＭＡＢ３５０６）、ＣＥＡ（Ｃ１２９９−８７Ｗ）、及びＥｒｂＢ２（ＭＡＢ１１２９）についての捕捉抗体を、マイクロアレイスライドの上へ手動でスポットした。すべての４つのバイオマーカーについての抗原を同様に手動でスポットした。次いでスポットを、１×カットオフのＣＡ１５−３、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡ、及びＥｒｂＢ２の抗原（それぞれ３０Ｕ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、及び１５ｎｇ／ｍＬ）により３０分間プロービングした。次いで異なるウェルを、ｄＡｂを混合した５×ＳＡ−ＨＲＰによりインキュベーションした（図１１Ａ〜Ｇ）。検出抗体混合物を１５分間、後続してＳＡ−ＨＲＰを１５分間であった。結果は、５倍のＳＡ−ＨＲＰと混合した検出抗体を１５分間プロービングすることが、良好なシグナルを得るのに十分であることを示唆した。いくつかのウェルを、検出抗体混合物、後続して様々な組み合わせでのＳＡ−ＨＲＰ、及びビオチン−ＨＲＰの混合物によっても１５分間プロービングした（図１１Ｈ〜Ｍ）。ＳＡ−ＨＲＰ、及びビオチン−ＨＲＰを前混合し、これを検出抗体混合物から分離してプロービングすることは、検出抗体、ＳＡ−ＨＲＰ前混合に比較して、シグナルを増加させることが見出された。
【０２１７】
組み合わせでのビオチン−ＨＲＰ、及びＳＡ−ＨＲＰの使用
ＳＡ−ＨＲＰと組み合わせたビオチンＨＲＰの使用を、マイクロアレイ上でのシグナル検出の感度を促進する目標で検討した。プロービングのために使用される前に３０分間前混合した、ＳＡ−ＨＲＰ対ビオチン−ＨＲＰの異なる比を最初に試みた。捕捉抗体、及び抗原を、図１１Ａ〜Ｇ中で参照されるように、マイクロアレイスライドの上へスポットした。異なるＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ組み合わせを図１１Ｈ〜Ｍ中で示す。ウェルをブロッキングし、次いで３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３、２ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ２１．１、１５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２、及び５０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡからなる抗原混合物によりプロービングした。ウェルを、１μｇ／ｍＬのＣＡ１５−３Ｂ−Ｂ、２０μｇ／ｍＬのＣ１２９９−８７Ｏ−Ｂ、８μｇ／ｍＬのＢＡＦ１１２９、及び５μｇ／ｍＬのＡＦ３５０６Ｂからなる検出抗体混合物によりプロービングした。検出混合物を、別々に又はプロービング前にＳＡ−ＨＲＰと前混合するかのいずれかでプロービングした。スライドを、２分間／２分間／８分間のＥｎｚＭｅｔ銀現像プロトコルを使用して現像した。結果は、ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ前混合物によりプロービングしたウェルが、ＳＡ−ＨＲＰ単独又はｄＡｂ混合物／５×ＳＡ−ＨＲＰ前混合物よりも高いシグナルを有していたことを例証する。加えて、ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ前混合物の最適濃度はそれぞれ４μｇ／ｍＬ、及び２μｇ／ｍＬであった。いずれかの試薬のより高い濃度により、より高いシグナルは達成されなかった。
【０２１８】
ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ前混合物の組み合わせた使用も、Ｏｍｉｎｇｒｉｄ  ３００マイクロアレイプリンターをプリントしＴＭＢ−ＭＸ検出方法を使用したスライドにより検討された。様々な濃度の、ビオチンへコンジュゲートしたＢＳＡを、図１１Ｎ中で参照されるように、マイクロアレイスライドの上へスポットした。ウェルをブロッキングし、次いで様々なＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ組み合わせにより１０分間プロービングした。スライドをＴＭＢ−ＭＸにより４分間現像した。スポットシグナルを定量化し、結果は、ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ前混合物によりプロービングしたウェルがＳＡ−ＨＲＰ単独よりも高いシグナルを有することを例証した。加えて、ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ前混合物の最適濃度はそれぞれ４μｇ／ｍＬ、及び４μｇ／ｍＬであった。８μｇ／ｍＬ、及び４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ／ビオチンＨＲＰ前混合物は、わずかに高いシグナルだが、より高いバックグラウンドも有していた。
【０２１９】
ＳＡ−ＨＲＰ、及びビオチン−ＨＲＰの適切な濃度が決定された状態で、図１２Ａ〜Ｂで示されたＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ混合物のためのインキュベーション時間を短縮できるかどうかを確かめることも試験した。スライドに、捕捉抗体、及びそれらの対応する抗原を並列してスポットした（図１２Ａ）。ウェルをブロッキングし、次いで６０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３、４ｎｇ／ｍＬのＣＹＦＲＡ２１．１、５０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ、及び３０ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２からなる抗原混合物により３０分間プロービングした。ウェルをＰＢＳＴにより洗浄し、次いで１μｇ／ｍＬの１０−ＣＡ１５−３Ｂ−Ｂ、５μｇ／ｍＬのＡＦ３５０６Ｂ、２０μｇ／ｍのＣ１２９９−８７Ｏ−Ｂ、及び８μｇ／ｍＬのＢＡＦ１１２９からなる検出抗体混合物により１５分間プロービングした。ＰＢＳＴ洗浄後に、ウェルを、１０分間又は５分間のいずれかで４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ／２μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰによりプロービングした。次に、スライドを、２分間／２分間／８分間のＥｎｚＭｅｔ銀現像プロトコルを使用して現像した。結果を図１２Ｂ中で示す。５分間のみでＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰによりプロービングした後のシグナルにおける低減が見出された。結果的に、１０分間のＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰインキュベーション時間を続いて行われる実験に使用した。
【０２２０】
ＳＡ−ＨＲＰ／ｂ−ＨＲＰのインキュベーション時間を低減するために、２つの試薬のより高い濃度を増加させた。濃度を変動させたＢＳＡ−ビオチンを図１１ＡＧ中で参照されるようにエポキシコーティングスライドの上へプリントした。スライドを、６４μｇ／ｍＬ／３２μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ／１６μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ／８μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ／４μｇ／ｍＬの濃度のＳＡ−ＨＲＰ／ｂ−ＨＲＰによりそれぞれ２分間プロービングした。スポットを２分間ＴＭＢにより現像し、ＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナー上で画像化した。結果を図３９中で見ることができる。バックグラウンドを平均カウントから引いた後に、６４μｇ／ｍＬ／３２μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ／ｂ−ＨＲＰが、ＢＳＡ−ビオチンのすべての濃度で最も高いシグナルを有していた。その結果、６４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び３２μｇ／ｍＬのｂ−ＨＲＰの混合物を、２分間のＳＡ−ＨＲＰ／ｂ−ＨＲＰのインキュベーション時間で、すべての続いて行われるアッセイのために使用した。
【０２２１】
２ｅ：シグナルの現像
測色検出
最初の研究を銀現像を使用して遂行し、これは測色的検出方法でありそこで、還元剤、及び過酸化水素の存在下においてＨＲＰは銀イオンの還元に触媒作用を及ぼす。この方法（ＥｎｚＭｅｔと称される）は、３つの溶液（硝酸銀、ヒドロキノン、及び過酸化水素）の連続的な添加、及び厳格なモル比を要求した。銀現像の実装は、機器プロトタイプを使用してマイクロ流体カートリッジにおいてアッセイを試験した場合に、難しいことが証明された。第一に、銀現像は、順番に、及び定義された体積でアッセイチャンバの中へ放出される必要がある３つの分離した試薬を要求する。加えて、試薬間の何らかの混入は、リザーバ、及びチャネル中での早発の銀沈着をもたらすことになる。イオンとの何らかの接触は早発の非特異的銀の沈着を導き得るので、試薬はイオンへも非常に敏感である。他のすべての試薬はイオンを含有することを考えると、これは潜在的な問題をもたらし得る。その結果、本発明者は、他の測色検出方法（ＴＭＢ−ＭＸ）を検討した。
【０２２２】
シグナル現像のためのＴＭＢ−ＭＸ
ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）はホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のための基質であり、ＥＬＩＳＡにおいて非常に一般的に使用される。ＴＭＢ−ＭＸ（ほとんど又はまったくバックグラウンド無しに、反応部位で不溶性の青い沈降物を産生するペルオキシダーゼ基質）（Ｍｏｓｓ基質）の使用によって、マイクロアレイにおける使用のためにこの基質を適合させた。
【０２２３】
ＴＭＢ−ＭＸの最初の試験は、様々な濃度（０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、及び４μｇ／ｍＬ）で、マイクロアレイスライドの上へＳＡ−ＨＲＰを二重でスポットしたマイクロアレイを包含していた（図１３Ａ）。ブロッキング、及び洗浄後に、アレイをＴＭＢ−ＭＸにより８分間インキュベーションし、後続して、蒸留水によりリンスして反応を停止した。スライドをＧｅｎｅｐｉｘマイクロアレイスキャナーでスキャンし、画像を定量化した。ＴＭＢ−ＭＸは、強い用量依存的なシグナルを生成した（図１３Ｂ、１３Ｃ）。この用量依存性は、図１３Ｃにグラフで示される。しかしながら、シグナルは、２μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰで飽和になるようと考えられる。
【０２２４】
ＴＭＢ−ＭＸ曝露の時間を低減できるかどうかを調べるために、捕捉抗体、及び抗原をマイクロアレイスライドの上へ手動でスポットした（図１４Ａ〜Ｄ）。すべての４つのウェルを、ＣＡ１５−３（３０Ｕ／ｍＬ）、ＣＹＦＲＡ２１．１（２ｎｇ／ｍＬ）、及びＥｒｂＢ２（１５ｎｇ／ｍＬ）からなる抗原混合物により３０分間プロービングした。ＰＢＳＴリンス後に、すべての４つのウェルを、１μｇ／ｍＬの１０−ＣＡ１５−３Ｂ−Ｂ、５μｇ／ｍＬのＡＦ３５０６Ｂ、及び８μｇ／ｍＬのＡＦ１１２９Ｂからなる検出抗体混合物により１５分間プロービングした。ＰＢＳＴリンス後に、すべての４つのウェルを、４μｇ／ｍＬ、及び２μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ混合物によりそれぞれ１０分間プロービングした。ＰＢＳＴリンス後に、次いでウェルを、２分間、４分間、６分間又は８分間のいずれかでＴＭＢ−ＭＸによりプロービングした。結果を図１４Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ中で示す。定性的に、２分間のＴＭＢ−ＭＸ曝露は高いシグナルのために十分ではなかったが、４分間、６分間又は８分間のＴＭＢ−ＭＸ曝露は、等価なシグナルを与えた。
【０２２５】
３：抗体マイクロアレイ構築
３ａ：マイクロアレイ基質
抗体マイクロアレイは表面の上への抗体固定化を要求する。これは、吸着又は共有結合性の固定化を介して生じ得る。これらの表面の機能は、抗体が固定化され得る支持を提供するだけではなく、最大の結合特性を示し、抗体のネイティブな立体配座、及び活性も維持するべきである。検出システムにおけるバックグラウンドノイズを最小限にするように、最小の非特異的結合を示す必要もある。
【０２２６】
分子吸着を介する固定化は、分子間力（主としてイオン結合ならびに疎水性相互作用、及び極性相互作用）によって生じる。各々の分子が、基質、及び以前に吸着されたタンパク質との反発的な相互作用を最小限にするために異なる配向で任意の接触を形成することができるので、これは不均一かつランダムに配向した抗体層をもたらす。したがって、吸着は固定化されたタンパク質の幾何学的サイズによって限定され、高密度のパッキングは立体的に抗体の活性部位をブロッキングし、それらの結合容量を妨害することができる。抗体、及びタンパク質は、ニトロセルロース又はゲルによりコーティングされたスライドの上へも吸着され得る。ハイドロゲルは三次元の支持体であり、捕捉分子はその中で多孔質構造の中へ拡散する。これは吸着容量の改善を通じるが、抗体は依然としてランダムに配向され、弱く付着される。さらに、大量輸送効果に関連する問題、及び非特異的相互作用からの高バックグラウンドシグナルは、アッセイの正確性、及び感度を妨害することができる（Ｎｉｍｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２２７】
共有結合性固定化の間に、抗体又はタンパク質は、曝露されたアミノ酸の接近可能な官能基を介して固定化担体へ共有結合される。これは非可逆的結合をもたらし、高い表面被覆率を生ずる。アミノ酸の側鎖経由の化学的結合は、典型的には、タンパク質の外部に存在する残基に基づくので、アミノ酸の側鎖経由の化学的結合は多くの場合ランダムである。付着は多くの残基を介して同時に生じ、固定化されたタンパク質の集団中の不均一性を促進することができる。異なる官能基が標的とされ、アミン、チオール、カルボキシル、及びヒドロキシルが挙げられる。アミン基は、ＮＨＳ、アルデヒド又はエポキシをコーティングしたスライドを介して支持体へ共有結合で付着され得る。支持体は強いアミド結合を形成するＮＨ２基と反応する。典型的には、リジン側鎖は反応するが、反応がＮ−末端とも生じる場合がある。外部に曝露されるシステイン中に所在するチオール基は、マレイミドコーティングスライドと反応することができる。マレイミドの二重結合はチオール基と付加反応して、安定的なチオエーテル結合を形成する。しかしながら、このリンケージは還元試薬への曝露によって可逆的である。外部に曝露されるグルタミン酸、及びアスパラギン酸上に所在するカルボキシル基は、カルボジイミドの使用により、アミンコーティングスライドと反応することができる。セリン、及びスレオニンの側鎖上のヒドロキシルは、エポキシコーティングスライドと反応することができ、したがってエポキシコーティングスライドを、アミンとだけでなくヒドロキシルとも反応できるようにする（Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｓｎｙｄｅｒ，２００３）。
【０２２８】
どれが抗原スポッティングに最も良いスライド表面であるかを同定するために、異なる生理化学的特性の３つのタイプのマイクロアレイ表面を試験した。エポキシシランスライド（ＳｃｈｏｔｔからのＳｌｉｄｅ  Ｅ、及びＡｒｒａｙｉｔからのＳｕｐｅｒＥｐｏｘｙスライド等）、に加えて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルにより官能化されたポリマーの薄フィルム又は３Ｄポリマーのいずれかによりコーティングされたスライドを試験した。様々な量の４つの抗原（ＣＡ１５−３、ＣＹＦＲＡ２１．１、ＥｒｂＢ２、及びＣＥＡ）を、各々のタイプの表面の上へスポットした。３つのスライド中のシグナル強度、及びスポット形態の類似性にもかかわらず、評判がよいマイクロアレイ供給業者からのエポキシシランコーティングスライドを、ポリマーコーティングした表面と比較して室温での優れた安定性によって、アレイ基板として選択した。
【０２２９】
追加の試験を遂行して、エポキシコーティングスライドがこのマイクロアレイアッセイに好適であることを確認した。アミノシラン、及びアルデヒド中でコーティングした代替のスライドを試験した。アミノシランコーティングスライドは、抗体上のカルボキシル基へ共有結合するアミン基を提示する。アルデヒドコーティングスライドは、抗体上のアミン基へ共有結合で結合するアルデヒド基を提示する。ＥｒｂＢ２捕捉抗体、及び抗原を、すべての３つのスライドタイプの上へプリントした。ブロッキング後に、スライドを、１５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２抗原、及びＥｒｂＢ２検出抗体（４μｇ／ｍＬ）によりプロービングした。ＳＡ−ＨＲＰ／ｂ−ＨＲＰ、及びＴＭＢによるシグナル現像後に、スライドをＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーにより画像化した。プリンティングレイアウト、及び生じた画像を図４０Ａ〜Ｃ中で示す。エポキシコーティングスライド上にプリントした場合に、ＥｒｂＢ２  ｃＡｂは最も高いシグナルを示した。ＥｒｂＢ２  ｃＡｂはアミノシランスライド上でシグナルを有しておらず、アルデヒドコーティングスライド上でのみ弱いシグナルを有していた。ＥｒｂＢ２抗原スポットはすべてのスライドタイプ上でシグナルを有していたが、エポキシコーティングスライドは最も高いシグナルを有していた。エポキシコーティングスライドが高いアッセイシグナルのために好適であることが確認された。
【０２３０】
３ｂ：スポッティングバッファ
最初に、マイクロアレイスライドの上へのスポッティングを、１×リン酸バッファ食塩水（ＰＢＳ）中の抗体、及び抗原の希釈物によって遂行した。他のスポッティングバッファを試験して、スポットのより良好な均一性のための抗体、及び抗原の伸展を決定した。グリセロールは、スポットサイズ、及び形態の維持を支援することが以前に示されている（Ｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｒｉｃｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。１×ＰＢＳ又は１×ＰＢＳ＋２０％のグリセロールのいずれか中の２５μｇ／ｍＬの捕捉抗体１０−ＣＡ１５−３Ａをスポットし、次いでスポットしたアレイを、３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原により１時間、加えて２０μｇ／ｍＬのそのビオチン化検出抗体１０−ＣＡ１５−３Ｂ−Ｂにより３０分間プロービングした。シグナルをＳＡ−ＨＲＰにより３０分間検出し、ＥｎｚＭｅｔ銀現像剤（２分間／２分間／８分間）を使用して現像した。結果を図１５Ａ〜Ｂ中で示す。スポッティングバッファへの２０％のグリセロールの添加は、抗体のより一様な伸展を可能にした。それはより円形のスポット形状ももたらした。スポットバッファへの代替の添加物（界面活性剤、及び２’３’−ブタンジオール等）も検討した。１％のツイーン−２０又は３０％の２’３−ブタンジオールの添加は、シグナルの強度、抗体伸展又はスポット形態を改善した。
【０２３１】
１×ＰＢＳ、５％のグリセロール、及び０．０２％のサルコシルを含有するスポッティングバッファ（ＴＡＤプリンティングバッファ）を大部分の捕捉抗体のために使用し、ＣＥＡについての捕捉抗体（Ｃ１２９９−８７Ｗ）は例外とし、それは１×ＰＢＳ中でプリントされた場合に改善されたシグナルを与えた。図１６Ａ〜Ｂ中で示されるように、Ｃ１２９９−８７Ｗは、１×ＴＡＤプリンティングバッファ（図１６Ａ）又は１×ＰＢＳ（図１６Ｂ）のいずれか中でプリントした。両方の実験において、Ｃ１２９９−８７Ｗをおよそ１０００μｇ／ｍＬの濃度でプリントし、２００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原（Ｃ３１００−１４）によりプロービングし、２０μｇ／ｍＬのＣＥＡビオチン化検出抗体（Ｃ１２９９−８７Ｏ−Ｂ）、ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ（それぞれ４μｇ／ｍＬ、及び２μｇ／ｍＬ）、及びＥｎｚＭｅｔ銀検出（２分間／２分間／８分間）により検出した。Ｃ１２９９−８７Ｗスポットをハイライト表示する。左側のスポットに比較して（図１６Ａ）、１×ＰＢＳ中でスポッティングしたＣ１２９９−８７Ｗは、シグナルを有意に増加させた（図１６Ｂ）。
【０２３２】
いくつかの抗体が、ある条件下で（例えばＯｍｎｉｇｒｉｄ３００マイクロアレイにより使用する場合に）、グリセロール又はＴＡＤプリンティングバッファを使用して良好にプリントされないことが見出された。大多数の抗体、及び抗原は、ＰＢＳ中で良好にプリントされた。しかしながら、タンパク質の全濃度が非常に低かったので、低濃度のいくつかの抗体、及び抗原はＰＢＳ中でのプリントは成功しなかった。その結果、１×ＰＢＳ＋０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中で抗体、及び抗原をプリントした。これは、低濃度の抗体、及び抗原についてのタンパク質の全濃度を増加させ、プリンティングを改善した。したがって、１×ＰＢＳ＋０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを、プリンティングバッファとして、Ｏｍｎｉｇｒｉｄ３００によりプリントされたマイクロアレイ実験のために使用した。
【０２３３】
最初に、捕捉抗体、及び抗原を１×ＰＢＳ中でＧｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｏｍｎｉｇｒｉｄ３００によりスポットした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び／又はサルコシル（イオン性界面活性剤）を含む、追加のスポッティングバッファを試験した。結果を図４１Ａ〜Ｂ中で示す。ＣＡ１５−３捕捉抗体、及び抗原を、プリントバッファとして１×ＰＢＳ又は１×ＰＢＳ＋０．０１％のサルコシル＋０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡのいずれかを使用して、エポキシコーティングスライド上にプリントした。次いでスライドを、３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３抗原、及びＣＡ１５−３検出抗体によりプロービングした。シグナル現像後に、スライドをＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーにより画像化した。サルコシル、及びＢＳＡの添加は、捕捉抗体、及び抗原の両方のシグナル強度を改善した（図４１Ａ）。これらのプリントバッファ添加物は、それぞれ、スポット直径も増加させ、捕捉抗体、及び抗原の重複スポットの中で変動を低減させる（図４１Ｂ）。図４１Ｃは、パネルＡ、及びＢ中で示された結果のｃＡｂ、及び抗原の平均の％変動係数（ＣＶ）を示す。
【０２３４】
３ｃ：プリンティング方法
マイクロアレイプリンティングのために、複数の方策を、アッセイ開発の異なるステージに要求されるアレイの立体配置、及びサイズに依存して用いた。広範囲の条件が試験される場合に、又は高いスポット密度、及び一様な形態が要求されてプリンティングパラメーターが最終決定された場合に、ロボットシステム（ＡｒｒａｙＩｔ  ＳｐｏｔＢｏｔ３（Ａｒｒａｙｉｔ）、及びＭｉｃｒｏＧｒｉｄ  ＩＩ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）等）は、プリンティングマイクロアレイのために成功裡に使用された。アレイプリンティングの費用を低減し所要時間を短縮するために、予備的マイクロアレイ実験のために使用されるアレイに、各々の寸法でおよそ７ｍｍ×７ｍｍの１６（８×２）のウェルを特徴とするカスタムメイドのシリコーンアイソレーターにより手動でスポットした。それらは、表面張力によってアレイ基板の表面へ付着され、したがって容易に除去することができる。各々のウェルは９（３×３）又は１６（４×４）のいずれかのスポットを含む。９のスポットアイソレーターについてのスポット直径は１ｍｍであり、その一方で１６のスポットアイソレーターのものは０．７５ｍｍである。
【０２３５】
手動でスポットしたスライド上で生成された比較的より大きな液滴、及びプリンティングバッファ中のグリセロールの存在に起因して、スポットの完全乾燥は、エポキシ−アミン反応が生じるのに必要な室温の湿潤チャンバ中での一晩のインキュベーション後に生じず、したがって液滴中のいくらかのタンパク質は基質の表面と直接的に接触できず、シグナル損失をもたらす。その結果、室温の湿潤チャンバ中での一晩のインキュベーション後に、スライドを取り出し、４℃で２４時間乾燥し、後続して１×ＰＢＳＴ中で複数のリンスを行った。次いでスライドをブロッキングバッファ中で１時間ブロッキングした。
【０２３６】
シリコーンアイソレーターとマイクロアレイプリンターとの間でプリントしたスライドから生成されたシグナルを比較するために、スライドの複数のバッチのプリントのために、異なるサンプルを米国アリゾナ州のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｉｎｃ．、及びカナダ国モントリオールのＮＲＣ−ＢＲＩに設置されている異なるマイクロアレイプリンターへ送った。最終的に、Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｏｍｎｉ  Ｇｒｉｄ  ３００  ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙプリンターを社内で設定して、容易な実験デザインのために適切に制御されたＧＵＩソフトウェアにおいて、大容量（３０８枚までのスライド）、及び堅調な性能を提供した。ＡｒｒａｙＩｔから提供されたＳＭＰ３Ｂピンと一緒に、１４４のスポット（各々のスポットについての直径はおよそ２２０ミクロン）を単一ウェル中にプリントすることができた。１６ウェルフォーマットで、合計で２３０４のスポットを、単一スライド中にプリントした。複数のバッチのスライドに異なるバイオマーカーのサンプルをプリントした。プリントしたスライドから生成されたシグナルは満足のいくものであった。プリンティングパラメーター（ローディングパラメーター、洗浄手順、及び接触時間）のさらなる最適化は、必要であった。
【０２３７】
アイソレーターによる手動のスポッティングは予備実験のために有用であったが、それらは重複検体間であまりにも多くの変動を有していた。その結果、Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｏｍｎｉｇｒｉｄ３００（一度に３００枚のスライドまでプリンティングの可能なロボットマイクロアレイプリンター）を使用して、スライドをロボットによりプリントした。Ｏｍｎｉｇｒｉｄ３００は、ベンチトッププロセシングのための１枚のスライドあたりの８×２アレイ、又はマイクロ流体カートリッジにおける使用のための単一視野スライドのいずれかのプリンティングも可能にした。スライドをマイクロアレイクイルピン（ＳＭＢ３Ｂ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ））によりプリントし、およそ１５０〜４００ｕｍの直径のスポットをもたらした。およそ５０％の湿度で、スライドをＯｍｎｉｇｒｉｄ３００によりプリントした。プリンティング後に、スライドをプリンター中で７０％の湿度で一晩維持して、抗体／抗原固定化を可能にした。次いでスライドを翌日乾燥し、後続して１×ＰＢＳＴによる複数のリンスを行った。次いでスライドをブロッキングバッファ中で１時間ブロッキングした。
【０２３８】
３ｄ：ブロッキングバッファ、及びインキュベーションバッファ
予備的マイクロアレイを、１×ＰＢＳ＋０．０５％のツイーン（ＰＢＳＴ）＋２％のＢＳＡ（ＥＬＩＳＡアッセイ中で使用したものと同じバッファ）によりブロッキングした。振とうしながら室温で１時間ブロッキングした後に、高い非特異的バックグラウンドが観察された。２〜５％のＢＳＡの濃度の増加は、以前に試みられて示されるように、バックグラウンドノイズを改善した（Ｒｉｃｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２３９】
最初に、ブロッキングに続くインキュベーションステップを１×ＰＢＳＴ、及び５％のＢＳＡを含有するブロッキングバッファ中で実行した。抗原−抗体相互作用を促進するために、より低いイオン強度のインキュベーションバッファにおけるアッセイを試みた（Ｒｅｖｅｒｂｅｒｉ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｂｅｒｉ，２００７）。２つの捕捉抗体（５０μｇ／ｍＬ、及び２５μｇ／ｍＬの１０−ＣＡ１５−３Ａ、ならびに５００μｇ／ｍＬ、及び２５０μｇ／ｍＬのＭＡＢ１１２９）をスポットした。次いでウェルを、１×ＰＢＳＴ＋５％のＢＳＡ又は０．２５×ＰＢＳＴ  ５％のＢＳＡのいずれか中で希釈した３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３、及び１５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２により３０分間プロービングした。次いでウェルを、いずれかのプロービングバッファ中で希釈した検出抗体／５×ＳＡ−ＨＲＰ混合物により１５分間プロービングした。含まれていた検出抗体は、１μｇ／ｍＬの１０−ＣＡ１５−３Ｂ−Ｂ、及び４μｇ／ｍＬのＢＡＦ１１２９であった。次いでシグナルを、ＥｎｚＭｅｔ銀現像剤（２分間／２分間／８分間）により現像した。結果を図１７Ａ〜Ｂ中で見ることができる。より低いイオン強度バッファが使用された場合に、はるかに高いシグナルがＣＡ１５−３、及びＥｒｂＢ２の両方について得られた。したがって、イオン強度を低下させることが抗体抗原相互作用を支援することができ、したがって続いて行われる実験において使用すると結論した。
【０２４０】
３ｄ：マイクロアレイインキュベーション時間
ＥＬＩＳＡ実験において使用されるものに類似する時間（典型的には各々のインキュベーションステップについて１時間）で、試薬をインキュベーションするマイクロアレイ実験を最初に開始した。しかしながら、最終産物は可能な限り少ない時間で遂行されたアッセイであるので、より短いインキュベーション時間で実験を開始した。本明細書において示されたかかる実験の１つの例をロボットでプリントした捕捉抗体スライド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）上で遂行した。捕捉抗体の１０−ＣＡ１５−３Ａ、及びＭＡＢ１１２９を、５００μｇ／ｍＬでそれぞれスポットした。３０Ｕ／ｍＬのＣＡ１５−３、及び１５ｎｇ／ｍＬのＥｒｂＢ２の抗原混合物を、１５、３０又は６０分間のいずれかでインキュベーションした（図１８Ａ〜Ｆ）。続いて、１μｇ／ｍＬの１０−ＣＡ１５−３Ｂ−Ｂ、及び４μｇ／ｍＬのＢＡＦ１１２９の検出抗体混合物を、１５、３０又は６０分間のいずれかでスライドの上へ適用した（図１８Ｇ〜ｌ）。これらのステップに後続して、ウェルを４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰにより３０分間プロービングした。次いでスポットを、ＥｎｚＭｅｔ銀現像剤（２分間／２分間／８分間）により現像した。ＣＡ１５−３スポットによって示されるように、定量化のために適切なシグナルを産生する抗原混合物についての最も短いインキュベーション時間は、それぞれ３０分間であった（図１８Ａ〜Ｆ）。検出抗体について、１５分間のインキュベーションが検出可能なシグナルのために要求された（図１８Ｇ〜ｌ）。
【０２４１】
３ｅ：もたらされたマイクロアレイアッセイ
最適化されたマイクロアレイアッセイの例のウェルを、図１９中で示す。１４４の捕捉抗体、及び抗原をＯｍｎｉｇｒｉｄ  ３００を使用して、エポキシコーティングスライドの上へプリントし、固定化するために一晩放置した。翌日に、スライドを１×  ＰＢＳ＋５％のＢＳＡ中で１時間ブロッキングした。次いでウェルを、８つの癌バイオマーカー（ＣＡ１５−３（６０Ｕ／ｍＬ）、ＣＹＦＲＡ２１−１（８ｎｇ／ｍＬ）、ＣＥＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＣＡ７２−４（４０Ｕ／ｍＬ）、ＣＡ１９−９（１４８Ｕ／ｍＬ）、ＥｒｂＢ２（６０ｎｇ／ｍＬ）、フェリチン（２００ｎｇ／ｍＬ）、及びＭＭＰ７４（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有する抗原混合物により３０分間プロービングした。ＰＢＳＴによる短時間の洗浄後に、ウェルを検出抗体混合物により１５分間プロービングした。すべての検出抗体を、ＳＡ−ＨＲＰによる認識を可能にするようにビオチン化した。ウェルを再びＰＢＳＴにより短時間洗浄し、４μｇ／ｍＬのＳＡ−ＨＲＰ、及び４μｇ／ｍＬのビオチン−ＨＲＰの混合物により１０分間プロービングした。１×ＰＢＳＴによる５分間の洗浄後に、反応スポットをＴＭＢ−ＭＸにより４分間現像した。ＡｒｒａｙＩｔ測色スキャナーを使用してスライドをスキャンし、ＩｍａｇｅＪにより定量化した。
【０２４２】
捕捉抗体のプリンティングに加えて、検出抗体量の差を正規化するために抗原もプリントした。抗原を少なくとも３つの異なる濃度でプリントして抗原標準曲線を生成した。複数のウェルをプロービングした実験において、各々の抗原スポットの平均を使用して平均化された標準曲線を生成した（図２０）。検出抗体濃度、及びもたらされたシグナルにおけるこれらの正規化した小さな変動を使用して、次に捕捉抗体シグナルを正規化することができた。
【０２４３】
各々のバイオマーカーについての標準曲線を生成するために、ウェルは各々抗原の公知の濃度によりプロービングされた。もたらされた捕捉抗体のシグナル（図１９）を、所与のバイオマーカーについての平均化された抗原曲線により正規化した。平均化された抗原曲線の勾配の使用によって、シグナルを相対濃度に変換した（図２０）。次いでこの相対濃度を、図２１中で参照されるように抗原の既知の濃度に対してプロットした。これらの曲線をすべての８つのバイオマーカーについて生成した。
【０２４４】
同じ濃度の抗原によりプロービングした場合でさえ、ばらつきが２つのウェルの間に生じ得る。変動のレベルを変動係数（ＣＶ）により定量化することができる。変動係数を決定するために、捕捉抗体についての重複検体のシグナルの標準偏差を、捕捉抗体についての重複検体のシグナルの平均によって割り、１００を掛け、％ＣＶを得る。免疫アッセイについて、２０％未満の変動係数は許容可能なレベルの変動と考えられる。サンプル内変動（ｉｎｔｒａ−ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、同じスライド上の同じ濃度によりプロービングした複数のウェルについての平均％ＣＶである。サンプル間変動（ｉｎｔｅｒ−ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、可能性な異なる日の異なるスライド上の同じ濃度によりプロービングした複数のウェルについての平均％ＣＶである。サンプル内変動をすべてのバイオマーカーについて計算した。ＣＡ１５−３、及びＣＡ１９−９についてのサンプル内変動を表１２中で示す。ＣＡ１５−３、及びＣＡ１９−９についてのサンプル内変動は、両方とも許容変動の領域内で２０％未満である。
【０２４５】
2019530884.tif 000029
【０２４６】
サンプル間変動もバイオマーカーについて検討した。ウェルを、３つの分離した実験において分離した３日で、同じ濃度の抗原によりプロービングした。
【０２４７】
2019530884.tif 000030
【０２４８】
このアッセイを、各々のバイオマーカーについてＦＤＡ認可又はＣＥマーキングのＥＬＩＳＡキットとも比較して、このアッセイがＦＤＡ認可アッセイにどのくらい匹敵するのかを決定した。標準曲線を、ＥＬＩＳＡキット、及びこのマイクロアレイを使用して生成した。各々のバイオマーカーについての既知の３つの濃度も、ＥＬＩＳＡキット、及びマイクロアレイの両方によりアッセイした。これらの濃度は、低、中、及び高範囲の標準曲線に及んだ。各々のアッセイによって生成される標準曲線を使用して、これらの３つの「未知」の濃度を決定、及び比較した。ＣＹＦＲＡ２１−１を使用する実施例を、図２２中で示す。ＣＹＦＲＡ２−１について、Ｆｕｊｉｅｒｂｉｏ  Ｉｎｃ．からのＦＤＡ認可ＥＬＩＳＡキットにこのアッセイを比較した。２つの検出方法を対応のあるｔ検定を使用して比較し、Ｂｌａｎｄ−Ａｌｔｍａｎプロットにおいて視覚的に示した。このアッセイによって決定された濃度は、ＦｕｊｉｅｒｂｉｏのＥＬＩＳＡアッセイとの９５％の一致性を有していた。
【０２４９】
時間は心臓発作の診断における本質である。治療における任意の遅延は、患者の良好な転帰の機会を減少させる。その結果、本発明者は、特に心血管バイオマーカーパネルについての全アッセイ時間の減少を望んだ。最初に、心血管パネルについての全アッセイ時間は、２７分間（１０分間の抗原インキュベーション、１０分間の検出抗体インキュベーション、５分間のＳＡ−ＨＲＰ／ビオチンＨＲＰインキュベーション、及び２分間のＴＭＢインキュベーション）であった。本発明者は、全アッセイ時間を、１０分間（４分間のサンプルインキュベーション、２分間の検出抗体インキュベーション、２分間のＳＡ−ＨＲＰ／ビオチンＨＲＰ−インキュベーション、及び２分間のＴＭＢインキュベーション）に低減した。低減された全アッセイ時間でさえ、高いレベルのシグナル、及び感度を維持することができた。
【０２５０】
全アッセイ時間を低減するために、アッセイのいくつかの変数を変化させなければならなかった。具体的には、捕捉抗体、及び検出抗体の濃度を上昇させた。例えば、ミオグロビンの検出のために、より長いアッセイにおいて、捕捉抗体（ｃＡｂ）濃度は８０μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲であった。アッセイ時間を１０分間に低減した後に、ミオグロビン捕捉抗体濃度を、８００μｇ／ｍＬ〜１２．５μｇ／ｍＬのスパンに上昇させた。同様に、２７分間のより長いミオグロビンアッセイにおいて、５０ｎｇ／ｍＬの検出抗体（ｄＡｂ）濃度はミオグロビン抗原の検出のために十分であった。アッセイ時間の低減後に、ミオグロビン検出抗体濃度を１μｇ／ｍＬに上昇させた。しかしながら、これらの条件の変化にさせても、ミオグロビンシグナルは維持された。図４２は、２２ｎｇ／ｍＬのミオグロビン、及び異なる検出抗体濃度によりプロービングされた場合の、捕捉抗体について平均化されたシグナルを示す。たとえアッセイがより長いアッセイよりも実質的に短くても、より短いアッセイは変更された条件によりより高いシグナルを示す。したがって、１０分間のアッセイ時間が、試験された心血管バイオマーカーの検出のために十分であろうと結論された。
【０２５１】
３ｆ：マイクロ流体カートリッジ、及び機器により遂行された免疫アッセイ
マイクロ流体カートリッジ、及び機器の中へ抗体マイクロアレイアッセイを実装した。エポキシコーティングスライドを、マイクロ流体カートリッジによる正確な位置合わせのためにスライドの中心においてＯｍｎｉｇｒｉｄ３００によりプリントした。固定化後に、スライドをブロッキングし、マイクロ流体カートリッジに付着させた。ウェットカートリッジに、分離したリザーバ中の免疫アッセイのための試薬（ＣＡ１５−３キャリブレーター（４０Ｕ／ｍＬ）からなる抗原混合物、ＣＡ１５−３検出抗体（１０−ＣＡ１５３Ｂ−Ｂ：０．５μｇ／ｍＬ）、ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ（４μｇ／ｍＬ／４μｇ／ｍＬ）からなる検出抗体混合物）を充填した。ウェットカートリッジの中へ充填した他の試薬は、１×ＰＢＳ、蒸留水、及びＴＭＢ−ＭＸを含む。ドライカートリッジ、及びウェットカートリッジを組み立てて機器の中へ挿入した。スクリプトを実行してアッセイを自動的に遂行し、加えて図２３中で示される最終画像を撮影した。アッセイは、ＣＡ１５−３捕捉抗体スポット、及び抗原スポットについての結果を現像することができた。使用される検出抗体の高い濃度に起因して、追加の交差反応性スポットがあった。
【０２５２】
アッセイが研究室において最適化された状態で、マイクロ流体カートリッジの中へマイクロアレイアッセイを一体化した。試薬（抗原、検出抗体混合物、ＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ、ＴＭＢ、及びバッファ（ＰＢＳＴ、及びｄＨ2Ｏ等）等）を、ウェットカートリッジの中へ前充填した（図４４Ｃ）。心臓のマーカー捕捉抗体、及び抗原をスポットしたスライドを、ドライカートリッジに付着させた。ウェットカートリッジに、試薬を前充填した。Ｒ１にＴＭＢ、Ｒ２にｄＨ2Ｏ、Ｒ３にＳＡ−ＨＲＰ／ビオチン−ＨＲＰ、Ｒ４にＰＢＳＴ、Ｒ５にＰＢＳＴ、Ｒ６に抗原サンプル、Ｒ７に検出抗体混合物、及びＲ８にＰＢＳＴを充填した。次いでカートリッジを最初の機器プロトタイプのうちの１つの中へ置き、スクリプトを機器ソフトウェアを用いて実行した。機器は自動的にブランク、及びスポットの画像を取得した（図４３）。次いでこれらのスポットを、機器により光学的密度へと定量化することができる。結果は、機械がマイクロアレイアッセイを自動的に処理し、測色定量化可能な結果を現像することができることを示唆した。
【０２５３】
４：マイクロアレイアッセイのためのマイクロ流体カートリッジの開発
４ａ：分離したウェットカートリッジ、及びドライカートリッジのデザイン
ウェット構成要素、及びドライ構成要素は２つの別々のカートリッジに分けられる（図２４Ａ〜Ｂ）。図２４Ａは、２つのカートリッジの間にはさまれたスライドグラス１１を備えた、ドライカートリッジ１５、及びウェットカートリッジ１６の上面図を示す。図２４Ｂは、ドライカートリッジ１５、及びウェットカートリッジ１６の側面図スタックを示す。ドライカートリッジは、アレイチャンバ１２を定める開口に加えて、ウェットカートリッジ中のリザーバからの試薬及び／又はバッファをアレイチャンバ１２を介して廃液リザーバへ、さらにウェットカートリッジ中にも運ぶ、マイクロ流体チャネル１７、ならびに機器マニホールドポート１４を含む。流体遮断膜２２は、チャネルと機器マニホールドポートとの間に配置することができる。エラストマーシール２０は、感圧付着剤２１により、機器マニホールドポートの周囲のドライカートリッジの上部へ付着することができる。捕捉抗体を含むガラスマイクロアレイスライド１１は、感圧付着剤２１によりドライカートリッジへ付着され、感圧付着剤２１はドライカートリッジの底部へも付着されて、ウェットカートリッジへ付着させることができる。
【０２５４】
ウェットカートリッジ１６は、アレイチャンバを通過した後に使用済み試薬のためのリザーバ１８（試薬、及びバッファについての個別のリザーバ３〜１０、並びに廃液リザーバ１、及び２）、並びに取り扱いを容易にするタブ１３を含む。
【０２５５】
ドライカートリッジ１５、及びウェットカートリッジ１６は、同じ種類又は異なる種類の材料から作製することができる。いくつかの実施形態において、ドライカートリッジの一部は、ポリカーボネート１９部分と共にリエチレンテレフタレート２３からレーザー切断することができるが、ウェットカートリッジはポリカーボネート１９から作製することができる。
【０２５６】
ドライカートリッジ１５の分離は、組立体直前のマイクロアレイスライドグラスの挿入に加えて、特異的な生化学アッセイに従うカートリッジのカスタマイゼーション、及びアッセイのタイミングに関する柔軟性をもたらす。同様に、ウェットカートリッジ１６の分離は、試薬ローディングのための単純性、及び柔軟性をもたらす。
【０２５７】
ドライカートリッジについて、試薬チャネルを各々バッファチャネルと接続して、使用の間にチャネル中の残りの何らかの残存する試薬を洗浄した。ドライカートリッジの一実施形態を図２５Ａに示す。図２５Ａにおいて、番号付けした要素は、本明細書において以下の通り参照される。
ｉ）１１：ガラススライド；
ｉｉ）１２：アレイチャンバ；
ｉｉｉ）２２：気体透過膜
ｉｖ）２５：廃液リザーバ２（Ｗ２）からドライカートリッジ中のチャネル（ＣＷ２）へのポート
ｖ）２６：廃液リザーバ１（Ｗ１）のためのベント
ｖｉ）２７：廃液リザーバ２（Ｗ２）のためのベント
ｖｉｉ）２８：バッファリザーバ１のためのベント（Ｂ１Ｖ）
ｖｉｉｉ）２９：試薬リザーバ２のためのベント（Ｒ２Ｖ）
ｉｘ）３０：試薬リザーバ３のためのベント（Ｒ３Ｖ）
ｘ）３１：バッファリザーバ４のためのベント（Ｂ４Ｖ）
ｘｉ）３２：バッファリザーバ５のためのベント（Ｂ５Ｖ）
ｘｉｉ）３３：試薬リザーバ６のためのベント（Ｒ６Ｖ）
ｘｉｉｉ）３４：試薬リザーバ７のためのベント（Ｒ７Ｖ）
ｘｉｖ）３５：バッファリザーバ８のためのベント（Ｂ８Ｖ）
ｘｖ）３６：バッファリザーバ１のためのチャネル（Ｂ１Ｃ）
ｘｖｉ）３７：試薬リザーバ２のためのチャネル（Ｒ２Ｃ）
ｘｖｉｉ）３８：試薬リザーバ３のためのチャネル（Ｒ３Ｃ）
ｘｖｉｉｉ）３９：バッファリザーバ４のためのチャネル（Ｂ４Ｃ）
ｘｉｘ）４０：バッファリザーバ５のためのチャネル（Ｂ５Ｃ）
ｘｘ）４１：試薬リザーバ６のためのチャネル（Ｒ６Ｃ）
ｘｘｉ）４２；試薬リザーバ７のためのチャネル（Ｒ７Ｃ）
ｘｘｉｉ）４３：バッファリザーバ８のためのチャネル（Ｂ８Ｃ）
ｘｘｉｉｉ）４５：ドライカートリッジ中のＷ１からチャネル（ポストＣ）へのポート
ｘｘｉｖ）４６：廃液リザーバ２へのチャネル（ＣＷ２）
ｘｘｖ）４７：Ｂ１Ｃ、及びＲ２Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ１／２）
ｘｘｖｉ）４８：Ｂ４Ｃ、及びＲ３Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ３／４）
ｘｘｖｉｉ）４９：Ｂ５Ｃ、及びＲ６Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ５／６）
ｘｘｖｉｉｉ）５０：Ｂ８Ｃ、及びＲ７Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ７／８）
ｘｘｉｘ）５１：プレアレイチャンバチャネル（プレＣ）
ｘｘｘ）５２：ポストアレイチャンバチャネル（ポストＣ）
ｘｘｘｉ）５６：サンプルレセプタクル；
ｘｘｘｉｉ）１０４：開口
ｘｘｘｉｉｉ）１０６：メインジャンクション
ｘｘｘｉｖ）１０７：ウェットカートリッジとの位置合わせのためのノッチ；
ｘｘｘｖ）１０８：ウェットカートリッジとの位置合わせのためのポーク・ヨーク（ｐｏｋｅ  ｙｏｋｅ）
【０２５８】
図２５Ａ中で示されるドライカートリッジ中のチャネル、及び開口の位置、及びサイズは、以下の通りであった。
ｉ）Ｂ１Ｃ、Ｂ４Ｃ、Ｂ５Ｃ、Ｂ８Ｃ：長さ１４ｍｍ、幅２ｍｍ；
ｉｉ）Ｒ２Ｃ、Ｒ３Ｃ、Ｒ６Ｃ、Ｒ７Ｃ：長さ１１ｍｍ、幅２ｍｍ；
ｉｉｉ）Ｃ１／２：長さ１６ｍｍ、幅１ｍｍ；
ｉｖ）Ｃ３／４：長さ８ｍｍ、幅１ｍｍ；
ｖ）Ｃ５／６：長さ１６ｍｍ、幅１ｍｍ；
ｖｉ）Ｃ７／８：長さ３２ｍｍ、幅１ｍｍ；
ｖｉｉ）プレＣ：長さ１７ｍｍ、幅１ｍｍ；
ｖｉｉｉ）ポストＣ：長さ１２２ｍｍ、幅１〜１．５ｍｍ；
ｉｘ）開口：面積で１００ｍｍ2；
ｘ）スライドグラスを備えたアレイチャンバ：体積で２５ｍｍ2。
【０２５９】
作動時、リザーバ２のための試薬チャネルＲ２Ｃ（３７）は、リザーバ１のためのバッファチャネルＢ１Ｃ（３６）と接続し；リザーバ３のための試薬チャネルＲ３Ｃ（３８）は、リザーバ４のためのバッファチャネルＢ４Ｃ（３９）と接続し；リザーバ６のための試薬チャネルＲ６Ｃ（４１）は、リザーバ５のためのバッファチャネルＢ５Ｃ（４０）と接続し、リザーバ７のための試薬チャネルＲ７Ｃ（４２）は、リザーバ８のためのバッファチャネルＢ８Ｃ（４３）と接続する（図２５Ａ）。試薬が特定のリザーバから押し出されると、バッファリザーバペアからのバッファの押し出しは、チャネル中の残りの試薬が洗浄されることを可能にする（例えばＣ１／２（４７））。これらの構成は、試薬間のクロスコンタミネーションを低減又は防止することができる。また、すべての試薬チャネル／バッファチャネルのペアをメインジャンクションと接続して、試薬間のクロスコンタミネーションを低減又は防止した。試薬又はバッファが、リザーバから、チャネル（例えばＲ２Ｃ（３７）又はＢ１Ｃ（３６）、及びＣ１／２（４７）のいずれか）を通って押し出されると、流体はメインジャンクション１０６に到達する。ここから、流体は第１又は第２の廃液リザーバ（Ｗ２（２７）又はＷ１（２６））のいずれかへ押し出すことができる。すべての試薬をＷ２へ最初に押し出して、リザーバを「プライミング」し、Ｗ２（２６）の中へ任意の気泡を除去する。試薬が「プライミング」されると、リザーバからメインジャンクションへの全体のチャネルは特定の流体により充填される。次にＷ１（２７）へ押し出しが加えられ、流体は、特定の溶液を有するアレイチャンバを充填することができる。これは、スライド上にプリントされる試薬と抗体との間で何らかの相互作用が生じることを可能にするか、又はバッファの場合は、アレイチャンバからＷ１（２７）の中への何らかの非特異的相互作用が除去されることを可能にする。
【０２６０】
ドライカートリッジの代替実施形態を図２５Ｂに示す。図２５Ｂにおいて、番号付けした要素は、本明細書において以下の通り参照される。
ｉ）１１：スライドグラス；
ｉｉ）１２：アレイチャンバ；
ｉｉｉ）２５：廃液リザーバ２（Ｗ２）からドライカートリッジ中のチャネル（ＣＷ２）へのポート；
ｉｖ）３６：バッファリザーバ１のためのチャネル（Ｂ１Ｃ）
ｖ）３７：試薬リザーバ２のためのチャネル（Ｒ２Ｃ）
ｖｉ）３８：試薬リザーバ３のためのチャネル（Ｒ３Ｃ）
ｖｉｉ）３９：バッファリザーバ４のためのチャネル（Ｂ４Ｃ）
ｖｉｉｉ）４０：バッファリザーバ５のためのチャネル（Ｂ５Ｃ）
ｉｘ）４１：試薬リザーバ６のためのチャネル（Ｒ６Ｃ）
ｘ）４２；試薬リザーバ７のためのチャネル（Ｒ７Ｃ）
ｘｉ）４３：バッファリザーバ８のためのチャネル（Ｂ８Ｃ）
ｘｉｉ）４５：Ｗ１からポストＣへのポート
ｘｉｉｉ）４６：廃液リザーバ２へのチャネル（ＣＷ２）
ｘｉｖ）５１：プレアレイチャンバチャネル（プレＣ）
ｘｖ）５２：ポストアレイチャンバチャネル（ポストＣ）
ｘｖｉ）８０：メインチャネル（メインＣ）
ｘｖｉｉ）８１：ポリテトラフルオロエチレン膜Ｍ１／２
ｘｖｉｉｉ）８２：ポリテトラフルオロエチレン膜Ｍ３／４
ｘｉｘ）８３：ポリテトラフルオロエチレン膜Ｍ５／６
ｘｘ）８４：ポリテトラフルオロエチレン膜Ｍ７／８
ｘｘｉ）１０４：開口
ｘｘｉｉ）１０７：ウェットカートリッジとの位置合わせのためのノッチ
ｘｘｉｉｉ）１０８：ウェットカートリッジとの位置合わせのためのポーク・ヨーク（ｐｏｋｅ  ｙｏｋｅ）
【０２６１】
図２５Ｂに示されるドライカートリッジ中のチャネル、及び開口の位置、及びサイズは、以下の通りであった。
ｉ）２５：Ｗ２からのポート、０．７９ｍｍ2
ｉｉ）３６：Ｂ１Ｃ、１５ｍｍ
ｉｉｉ）３７：Ｒ２Ｃ、１１ｍｍ
ｉｖ）３８：Ｒ３Ｃ、２１ｍｍ
ｖ）３９：Ｂ４Ｃ、１５ｍｍ
ｖｉ）４０：Ｂ５Ｃ、１５ｍｍ
ｖｉｉ）４１：Ｒ６Ｃ、１２ｍｍ
ｖｉｉｉ）４２；Ｒ７Ｃ、１１ｍｍ
ｉｘ）４３：Ｂ８Ｃ、１５ｍｍ
ｘ）４５：ドライカートリッジ中のＷ１からポストＣチャネルへのポート、０．７９  ｍｍ2
ｘｉ）４６：ＣＷ２、１１ｍｍ
ｘｉｉ）５１：プレＣ、２０ｍｍ
ｘｉｉｉ）５２：ポストＣ、３７ｍｍ
ｘｉｖ）８０  メインＣ、５２ｍｍ
ｘｖ）８１：Ｍ１／２、２８ｍｍｍ2
ｘｖｉ）８２：Ｍ３／４、２８ｍｍ2
ｘｖｉｉ）８３：Ｍ５／６、２８ｍｍ2
ｘｖｉｉｉ）８４：Ｍ７／８、２８ｍｍ2
ｘｉｘ）１０４：開口、１００ｍｍ2
【０２６２】
作動時、試薬は、ウェットカートリッジ中の試薬リザーバ４、５、８又は９から、それぞれのチャネル３７、３８、４１又は４２を通ってメインチャネル８０へ押し出されることになる。試薬は、チャネルを通って通過する際に膜８１、８２、８３又は８４の下を通過することになる。膜は試薬を空気へ曝露し、試薬内の何らかの気泡が大気へ通過することを可能にする。メインチャネル８０中にあれば、試薬は、最初にＣＷ２（４６）を通ってＷ２のポート（２５）へ押し出されることになる。これは、廃液試薬がＷ２（２）へ入ることを可能にする。試薬は、チャネルを通って通過する際に膜８１、８２、８３又は８４の下を通過することになる。膜は試薬を空気へ曝露し、試薬内の何らかの気泡が大気へ通過することを可能にする。メインチャネル８０中にあれば、試薬は、最初にＣＷ２（４６）を介してＷ２（２）へ押し出されることになる。これにより、すべての空気が試薬から除去されたことを保証することになる。次いで試薬はプレＣ（５１）を通って開口（１０４）へ押し出され、この開口はスライドグラス（１１）と相互接続された場合に、アレイチャンバ（１２）を生成する。試薬はＷ１へのポストＣ（５２）中に継続することになる。これにより、すべての空気が試薬から除去されたことが保証されることになる。次いで試薬はプレＣ（５１）を通って開口（１０４）へ押し出され、この開口はスライドグラス（１１）と相互接続された場合に、アレイチャンバ（１２）を生成する。試薬はＷ１へのポストＣ（５２）中に継続することになる。アレイチャンバ中での試薬インキュベーション後に、残りの試薬は、そのペアになったバッファ試薬により洗浄される。バッファは、バッファリザーバ３、６、７、又は１０から、それぞれのチャネル３６、３９、４０又は４３を通って押し出されることになる。バッファは、チャネルを介して通過する際に膜８１、８２、８３又は８４の下を通過することになる。膜はバッファを空気へ曝露し、バッファ内の何らかの気泡が大気へ通過することを可能にする。メインチャネル８０中にあれば、バッファは、最初にＣＷ２（４６）を通ってＷ２（２５）のポートへ押し出され、Ｗ２（２）に入ることになる。これにより、すべての空気がバッファから除去されることが保証されることになる。次にバッファはプレＣ（５１）を通って開口（１０４）へ押し出され、この開口はスライドグラス（１１）と相互接続された場合に、アレイチャンバ（１２）を生成する。バッファはＷ１のポート（４５）へのポストＣ（５２）中で継続し、Ｗ１（１）に入ることになる。
【０２６３】
ドライカートリッジの代替実施形態を図２５Ｃに示す。図２５Ｃにおいて、番号付けした要素は、本明細書において以下の通り参照される。
ｉ）１１：スライドグラス；
ｉｉ）１２：アレイチャンバ；
ｉｉｉ）２５：廃液リザーバ２（Ｗ２）からドライカートリッジ中のＣＷ２チャネルへのポート；
ｉｖ）２６：廃液リザーバ１（Ｗ１）のためのベント
ｖ）２７：廃液リザーバ２（Ｗ２）のためのベント
ｖｉ）２８：バッファリザーバ１のためのベント（Ｂ１Ｖ）
ｖｉｉ）２９：試薬リザーバ２のためのベント（Ｒ２Ｖ）
ｖｉｉｉ）３０：試薬リザーバ３のためのベント（Ｒ３Ｖ）
ｉｘ）３１：バッファリザーバ４のためのベント（Ｂ４Ｖ）
ｘ）３２：バッファリザーバ５のためのベント（Ｂ５Ｖ）
ｘｉ）３３：試薬リザーバ６のためのベント（Ｒ６Ｖ）
ｘｉｉ）３４：試薬リザーバ７のためのベント（Ｒ７Ｖ）
ｘｉｉｉ）３５：バッファリザーバ８のためのベント（Ｂ８Ｖ）
ｘｉｖ）３６：バッファリザーバ１のためのチャネル（Ｂ１Ｃ）
ｘｖ）３７：試薬リザーバ２のためのチャネル（Ｒ２Ｃ）
ｘｖｉ）３８：試薬リザーバ３のためのチャネル（Ｒ３Ｃ）
ｘｖｉｉ）３９：バッファリザーバ４のためのチャネル（Ｂ４Ｃ）
ｘｖｉｉｉ）４０：バッファリザーバ５のためのチャネル（Ｂ５Ｃ）
ｘｉｘ）４１：試薬リザーバ６のためのチャネル（Ｒ６Ｃ）
ｘｘ）４２；試薬リザーバ７のためのチャネル（Ｒ７Ｃ）
ｘｘｉ）４３：バッファリザーバ８のためのチャネル（Ｂ８Ｃ）
ｘｘｉｉ）４５：ドライカートリッジ中のＷ１からポストＣチャネルへのポート；
ｘｘｉｉｉ）４６：廃液リザーバ２へのチャネル（ＣＷ２）
ｘｘｉｖ）４７：Ｂ１Ｃ、及びＲ２Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ１／２）
ｘｘｖ）４８：Ｂ４Ｃ、及びＲ３Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ３／４）
ｘｘｖｉ）４９：Ｂ５Ｃ、及びＲ６Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ５／６）
ｘｘｖｉｉ）５０：Ｂ８Ｃ、及びＲ７Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ７／８）
ｘｘｖｉｉｉ）５１：プレアレイチャンバチャネル（プレＣ）
ｘｘｉｘ）５２：ポストアレイチャンバチャネル（ポストＣ）
ｘｘｘ）５６：サンプルポート
ｘｘｘｉ）６６：シーリング膜
ｘｘｘｉｉ）８０：メインチャネル（メインＣ）
ｘｘｘｉｉｉ）１０４：開口、１００ｍｍ2
ｘｘｘｉｖ）１０７：ウェットカートリッジとの位置合わせのためのノッチ
【０２６４】
この実施形態において、図２５Ｃに示されるドライカートリッジ構成要素は以下の寸法を有することができる。
ｉ）２５：廃液リザーバ２（Ｗ２）からドライカートリッジ中のＣＷ２チャネルへのポート；０．７９  ｍｍ2
ｉｉ）２６：廃液リザーバ１（Ｗ１）のためのベント、１．１３  ｍｍ2
ｉｉｉ）２７：廃液リザーバ２（Ｗ２）のためのベント、１．１３  ｍｍ2
ｉｖ）２８：バッファリザーバ１のためのベント（Ｂ１Ｖ）、１．１３  ｍｍ2
ｖ）２９：試薬リザーバ２のためのベント（Ｒ２Ｖ）、１．１３  ｍｍ2
ｖｉ）３０：試薬リザーバ３のためのベント（Ｒ３Ｖ）、１．１３  ｍｍ2
ｖｉｉ）３１：バッファリザーバ４のためのベント（Ｂ４Ｖ）、１．１３  ｍｍ2
ｖｉｉｉ）３２：バッファリザーバ５のためのベント（Ｂ５Ｖ）、１．１３  ｍｍ2
ｉｘ）３３：試薬リザーバ６のためのベント（Ｒ６Ｖ）、１．１３  ｍｍ2
ｘ）３４：試薬リザーバ７のためのベント（Ｒ７Ｖ）、１．１３  ｍｍ2ｘｉ）３５：バッファリザーバ８のためのベント（Ｂ８Ｖ）、１．１３  ｍｍ2
ｘｉｉ）３６：バッファリザーバ１のためのチャネル（Ｂ１Ｃ）、５ｍｍ
ｘｉｉｉ）３７：試薬リザーバ２のためのチャネル（Ｒ２Ｃ）、１０ｍｍ
ｘｉｖ）３８：試薬リザーバ３のためのチャネル（Ｒ３Ｃ）、１８ｍｍ
ｘｖ）３９：バッファリザーバ４のためのチャネル（Ｂ４Ｃ）、５ｍｍ
ｘｖｉ）４０：バッファリザーバ５のためのチャネル（Ｂ５Ｃ）、５ｍｍ
ｘｖｉｉ）４１：試薬リザーバ６のためのチャネル（Ｒ６Ｃ）、１０ｍｍ
ｘｖｉｉｉ）４２；試薬リザーバ７のためのチャネル（Ｒ７Ｃ）、９ｍｍ
ｘｉｘ）４３：バッファリザーバ８のためのチャネル（Ｂ８Ｃ）、５ｍｍ
ｘｘ）４５：ドライカートリッジ中のＷ１からポストＣチャネルへのポート；０．７９ｍｍ2
ｘｘｉ）４６：廃液リザーバ２へのチャネル（ＣＷ２）、１５ｍｍ
ｘｘｉｉ）４７：Ｂ１Ｃ、及びＲ２Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ１／２）、１０ｍｍ
ｘｘｉｉｉ）４８：Ｂ４Ｃ、及びＲ３Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ３／４）、１０ｍｍ
ｘｘｉｖ）４９：Ｂ５Ｃ、及びＲ６Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ５／６）、１０ｍｍ
ｘｘｖ）５０：Ｂ８Ｃ、及びＲ７Ｃからメインジャンクションへのチャネル（Ｃ７／８）、１０ｍｍ
ｘｘｖｉ）５１：プレアレイチャンバチャネル（プレＣ）、１８ｍｍ
ｘｘｖｉｉ）５２：ポストアレイチャンバチャネル（ポストＣ）、２７ｍｍ
ｘｘｖｉｉｉ）５６：サンプルポート、０．７９ｍｍ2
ｘｘｉｘ）６６：シーリング膜、９．６２ｍｍ2
ｘｘｘ）８０：メインチャネル（メインＣ）、５１ｍｍ
ｘｘｘｉ）１０４：開口、１００ｍｍ2
【０２６５】
作動時、サンプルは最初にサンプルポート（５６）を通って試薬リザーバの中に装填されることになる。試薬は、ウェットカートリッジ中の試薬リザーバ４、５、８又は９から、それぞれのシーリング膜（６６）を通って、それぞれのチャネル３７、３８、４１又は４２の中へ押し出されることになる。試薬は、メインチャネル８０へのそれぞれのバッファチャネル／試薬チャネル４７、４８、４９又は５０の中へ入ることになる。インチャネル８０中にあれば、試薬は、最初にＣＷ２（４６）を通ってＷ２のポート（２５）へ押し出されることになる。これは、廃液試薬がＷ２（２）へ入ることを可能にする。これにより、すべての空気が試薬から除去されたことを保証することになる。次いで試薬はプレＣ（５１）を通って開口（１０４）へ押し出され、この開口はスライドグラス（１１）と相互接続された場合に、アレイチャンバ（１２）を生成する。試薬はＷ１へのポストＣ（５２）中に継続することになる。アレイチャンバ中での試薬インキュベーション後に、残りの試薬は、そのペアになったバッファ試薬により洗浄される。バッファは、バッファリザーバ３、６、７又は１０から、それぞれのシーリング膜（６６）を通って、それぞれのチャネル３６、３９、４０又は４３へ押し出されることになる。試薬は、メインチャネル８０へのそれぞれのバッファチャネル／試薬チャネル４７、４８、４９又は５０の中に入ることになる。メインチャネル８０中にあれば、バッファは、最初にＣＷ２（４６）を通ってＷ２（２５）のポートへ押し出され、Ｗ２（２）に入ることになる。これにより、すべての空気がバッファから除去されることが保証される。次に、バッファはプレＣ（５１）を通って開口（１０４）へ押し出され、それはスライドグラス（１１）と相互接続された場合に、アレイチャンバ（１２）を生成する。バッファはＷ１のポート（４５）へのポストＣ（５２）中で継続し、Ｗ１（１）に入ることになる。
【０２６６】
ウェットカートリッジ中のリザーバの位置、及びサイズは、それらが所定の体積を可能にするように最適化される。ウェットカートリッジの実施形態を図示する図２６、及び４８Ｃ中で、番号付けした要素は、存在する場合、本明細書において以下の通り参照される。
ｉ）１：廃液リザーバ１（Ｗ１）
ｉｉ）２：廃液リザーバ２（Ｗ２）
ｉｉｉ）３：バッファリザーバ１（Ｂ１）
ｉｖ）４：試薬リザーバ２（Ｒ２）
ｖ）５：試薬リザーバ３（Ｒ３）
ｖｉ）６：バッファリザーバ４（Ｂ４）
ｖｉｉ）７：バッファリザーバ５（Ｂ５）
ｖｉｉｉ）８：試薬リザーバ６（Ｒ６）
ｉｘ）９：試薬リザーバ７（Ｒ７）
ｘ）１０：バッファリザーバ８（Ｂ８）
ｘｉ）１３：取り扱いタブ
ｘｉｉ）２４：ドライカートリッジ１０７との位置合わせのためのノッチ
ｘｉｉｉ）２４：ドライカートリッジ１０８との位置合わせのためのポーク・ヨーク（ｐｏｋｅ  ｙｏｋｅ）特徴部
ｘｉｖ）２５：Ｗ２からドライカートリッジへのポート
ｘｖ）４４：サンプルウェル
ｘｖｉ）４５：Ｗ１からドライカートリッジへのポート
ｘｖｉｉ）５４：バルブへのポート
ｘｖｉｉｉ）５５：ドライカートリッジへのポート
【０２６７】
図２６中で、リザーバの寸法は以下の通りである。
【０２６８】
Ｂ８（１０）：体積４２０μｌのリザーバ。Ｂ８は、ドライカートリッジと相互接続するために、ウェットカートリッジの端部でノッチの周囲に彫った湾曲した形状である。このリザーバは、長さ１５ｍｍ、幅１０ｍｍ、及び深さ７ｍｍの領域を被覆する。
【０２６９】
Ｒ７（９）：体積２６０μｌのリザーバ。Ｒ７は、余剰の体積を可能にするように底部におけるわずかな膨らみを備えた、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ１１ｍｍ、幅４ｍｍ、及び深さ７ｍｍの領域を被覆する。
【０２７０】
サンプルレセプタクル（４４）：幅５ｍｍ、長さ１．５ｍｍ、及び深さ７ｍｍ。これはおよそ２５μｌのサンプルを保持する。
【０２７１】
Ｒ６（８）：体積２２６μｌのリザーバ。Ｒ６は一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ１１ｍｍ、幅３ｍｍ、及び深さ７ｍｍの領域を被覆する。
【０２７２】
Ｂ５（７）：体積４２０μｌのリザーバ。このリザーバは、余剰の体積を格納する側面の余剰の三角形の領域を備えた、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、およそ長さ１３ｍｍ、幅７ｍｍ、及び深さ７ｍｍの領域を被覆する。
【０２７３】
Ｂ４（６）：体積４２０μｌのリザーバ。このリザーバは、所定の体積を可能にし、正確にポートを整列するように、一般的に湾曲させた形状である。このリザーバは、およそ長さ１３ｍｍ、幅８ｍｍ、及び深さ７ｍｍの領域を被覆する。
【０２７４】
Ｒ３（５）：体積２００μｌのリザーバ。このリザーバは、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ９ｍｍ、幅４ｍｍ、及び深さ７ｍｍの領域を被覆する。
【０２７５】
Ｒ２（４）：体積１６０μｌのリザーバ。このリザーバは、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ９ｍｍ、幅３ｍｍ、及び深さ７ｍｍの領域を被覆する。
【０２７６】
Ｂ１（３）：体積１６０μｌのリザーバ。このリザーバは、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ９ｍｍ、幅３ｍｍ、及び深さ７ｍｍの領域を被覆する。
【０２７７】
Ｗ２（２）：体積およそ２１００μｌのリザーバ。このリザーバはＵ字の形状を有する。このデザインは、通気ポートから可能な限り流体がＷ２リザーバに侵入することを可能にする。これは通気ポートの任意の不慮の閉塞を防止する。
【０２７８】
Ｗ１（１）：体積およそ３１２９μｌの廃液リザーバ。このリザーバはＵ字の形状を有する。入口ポートに入る流体は、通気ポートに到着するまで、カートリッジの右側のエッジに沿って、カートリッジの底部のエッジ（ハンドルの付近で）に沿って、次いでカートリッジの左側のエッジの上を、リザーバを介して進む。加えて、正方形の膨らみは、右側のエッジに近いリザーバの底部の付近に加えられた。これは流入する流体のプールを可能にするために加えられた。これは、シューティングからリザーバの端部へ入り通気ポートを詰まらせる流体を防止する。
【０２７９】
図４８Ｃ中で、リザーバの寸法は以下の通りである。
【０２８０】
Ｂ８（１０）：体積４７５μｌのリザーバ。Ｂ８は、ドライカートリッジと相互接続するために、ウェットカートリッジの端部でノッチの周囲に彫った湾曲した形状である。このリザーバは、長さ約１９ｍｍ、幅約６ｍｍ、及び深さ約９ｍｍの領域を被覆する。
【０２８１】
Ｒ７（９）：体積３００μｌのリザーバ。Ｒ７は、余剰の体積を可能にするように底部におけるわずかな膨らみを備えた、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ約１１ｍｍ、幅約６ｍｍ、及び深さ約９ｍｍの領域を被覆する。
【０２８２】
Ｒ６（８）：体積２７５μｌのリザーバ。Ｒ６は一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ約１１ｍｍ、幅約３ｍｍ、及び深さ約９ｍｍの領域を被覆する。
【０２８３】
Ｂ５（７）：体積４５０μｌのリザーバ。このリザーバは、余剰の体積を格納する側面の余剰の三角形の領域を備えた、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ約１３ｍｍ、幅約６ｍｍ、及び深さ約９ｍｍの領域を被覆する。
【０２８４】
Ｂ４（６）：体積４５０μｌのリザーバ。このリザーバは、所定の体積を可能にし、ポートを正確に整列するように、一般的に湾曲させた形状である。このリザーバは、長さ約１５ｍｍ、幅約４．５ｍｍ、及び深さ約９ｍｍの領域を被覆する。
【０２８５】
Ｒ３（５）：体積２５０μｌのリザーバ。このリザーバは、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ約９ｍｍ、幅約３ｍｍ、及び深さ約９ｍｍの領域を被覆する。
【０２８６】
Ｒ２（４）：体積３００μｌのリザーバ。このリザーバは、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ約１０ｍｍ、幅約４ｍｍ、及び深さ約９ｍｍの領域を被覆する。
【０２８７】
Ｂ１（３）：体積１７５μｌのリザーバ。このリザーバは、一般的に楕円形の形状である。このリザーバは、長さ約９ｍｍ、幅約３ｍｍ、及び深さ約９ｍｍの領域を被覆する。
【０２８８】
Ｗ２（２）：体積およそ２０００μｌのリザーバ。このリザーバはＵ字の形状を有する。このデザインは、通気ポートから可能な限り流体がＷ２リザーバ流入することを可能にする。これは通気ポートの任意の不慮の閉塞を低減又は防止する。
【０２８９】
Ｗ１（１）：体積およそ２０００μｌの廃液リザーバ。このリザーバはＵ字の形状を有する。入口ポートに入る流体は、通気ポートに到着するまで、カートリッジの右側のエッジに沿って、カートリッジの底部のエッジ（ハンドルの付近で）に沿って、次いでカートリッジの左側のエッジの上を、リザーバを介して進む。加えて、正方形の膨らみは、右側のエッジに近いリザーバの底部の付近に加えられた。これは流入する流体のプールを可能にするために加えられた。これは、シューティングからリザーバの端部へ侵入し通気ポートを詰まらせる流体を低減又は防止する。
【０２９０】
底部ラミネート：図２６、及び４８Ｃ中で図示されるウェットカートリッジはラミネート底部を有する。ラミネートは、リザーバローディングのために使用される、リザーバ下でプリカットされた孔を含有する。
【０２９１】
マイクロアレイ抗体スライド
抗体を、スライドグラスの上へプリントしたスポットがアレイチャンバと整列しるようにプリントした。それらが互いと整列する限り、アレイチャンバ、及びプリントしたスポットの場所は変更することができる。抗体は、５０μｍ〜３００μｍの範囲のスポットサイズでプリントすることができる。
【０２９２】
５：機器デザイン
５ａ：ポンプ、及びソレノイドバルブシステム
圧力駆動の流れは、ポンプ（６８）によって生成される。ポンプは、選択されたリザーバ中の流体が大気に向かって押し出されて連続的な試薬送達を可能にするように、選択されたリザーバ（それからの流体移動は所望される）の上のバルブの開放によって、大気への廃液リザーバの開放によって、所望される方向で動く。この機器は、ポンプが試薬リザーバから押し出すようにデザインされた。移動させたい試薬のリザーバ（例えば３）のソレノイドバルブ（６５）を開放することによって、流体は廃液１又は廃液２のいずれかに向かってリザーバから移動することになる（図２８）。流体トラップ（６４）は、リザーバからの液体がマニホールド又はバルブに流入できないことを保証する。シーリング膜（６６）は、液体がアレイチャンバ又はドライカートリッジチャネルの中へとリザーバを早期に出ることを防止する。しかしながら、ポンプ（６８）からの圧力、及び特定のバルブ（６５）の開放に際して、液体は、Ｗ１（１）又はＷ２（２）に向かってシーリング膜を横切ることができる。リザーバをプライミングしたい場合、溶液を廃液リザーバ２（２）へ移動させる。これはリザーバ中に存在する何らかの気泡を低減又は消失させ、試薬をメインジャンクションへ通じることになる。これに後続して、廃液離ぁ＾バー１（１）に向けて押し出され、これは、試薬をアレイチャンバ（１２）を横切って、廃液１リザーバ（１）の中へ通じることになる。ポンプはモーター（Ｖｅｘ：ＲＢ−Ｉｎｎ−１１）によって作動される。廃液リザーバ１（１）、及び廃液リザーバ（２）のための両方のバルブを大気（６３）へ開放し、空気がカートリッジから逃げることを可能にする。あるいは、ルアーポート（６７）は、空気がマニホールド、及びカートリッジ内でのみ進むように、マニホールドをシールする。モーターの回転はポンプを内外に動かし、流体の移動をもたらす。
【０２９３】
カートリッジリーダーは、空気の特定の体積を押し出すか又は引き抜くことに使用される、容積式空気ポンプを含む。空気は、ポンプ空洞の中へ軸方向に動くグラウンドステンレス鋼ピンによって排出される。ピンは固定された半径方向のシールにより空洞の入口でシールされる。ピンは、ステッピングモーター駆動（Ｈａｙｄｏｎ  Ｋｅｒｋ  ＬＣ１５７４Ｗ−０５）のリニアアクチュエーターによって直接動かされる。ポンプ位置は、近接センサにより光学的に測定される。スキップされたステップについて検出、及び修正し、構造体中の変動を考慮するように、ポンプは自動的に較正される。バルブは、ポンプ、ベント、及びノズルの間の各接続に対する自動制御を可能にする。バルブは、ネジ、及び表面シールを使用して、マニホールド組立体へ取り付けられる。マニホールド組立体は１１のバルブを含み、将来のカートリッジ反復を促進するために２つの追加のバルブのための空ソケットを含むことになる。ポンプの内部の圧力を測定するために、圧力センサはシステムに含まれる。圧力センサ、及びセンサ接続部内の空気の体積はシステム応答を改善するように最小限にされるべきである。
【０２９４】
どのリザーバが所定の時間に開放されるかを制御するために、ソレノイドバルブ（Ｐａｒｋｅｒ：Ｘ−７  ０５  Ｌ−Ｆ）を用いた。ソフトウェアによって開放するように、ソレノイドバルブを電気機械的に作動させる。何らかの作動無しでは、バルブは閉鎖される。ポンプが、試薬リザーバから廃液リザーバ開放部に向かって大気圧へ流体を押し出す場合、バルブの開放は空気がリザーバの中へ流入することを可能にする。バルブの概略を図２９中で図示し、ブロックされたポート６９、共通ポート７０、及び通常は閉鎖されたポート７１を示す。バルブが作動される場合に、ポート７０、及び７１の開放はバルブを介する空気の通過を可能にする。バルブがもはや作動されないか又はオフされた場合に、これらのポートは閉鎖する。バルブを、すべてのリザーバ（廃液リザーバを包含する）の上に置いた（図２８）。また、通気すること、又はカートリッジの中に接続せずにポンプの再度のゼロを可能にするために追加のバルブを置いた。
【０２９５】
５ｂ：光学的センシング
任意の好適な光学的センシングシステムを使用することができる。いくつかの実施形態において、ソフトウェアがスポットの画像を得ることができるように、機器はカメラ（ＵＳＢカメラ（例えばＬｅｏｐａｒｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ：ＬＩ−ＯＶ７７２５）、及び照明システム等）を含む。次に、ソフトウェアは、カメラによって撮られた画像に基づいて光学的密度を計算することができる。
【０２９６】
照明がスポットの画像を可能にするように、ＬＥＤアレイ光はスポットの視野の下に置くことができる（例えばＬｉｆｅ−ｏｎ  Ｉｎｃ．）。機器画像化システムは、光源（半透明のアクリルディフューザーを介して、次いでウェットカードの背面を介して光る、４つの白色ＬＥＤからなる）からなる。ウェットカートリッジは半透明のポリカーボネートで作製され、それによって照明均一性を高める。ＬＥＤの点滅は、好適なソフトウェアが生じた画像についてのゲイン、及びオフセットを計算することを可能にする。ＬＥＤは、三角形の時変信号によりスライドの背面を照明する。この変調はおよそ２．６Ｈｚで生じる。変調は、バルブ、及びポンプモーターの制御にも使用される制御装置回路によって生成される。制御装置回路は、方形波信号（それは積分され、次いでＬＥＤへの電流の変調に使用される）を生成し、三角形の時変光出力を生じる。光路長は、機器のサイズを低減するために、可能な限り短くデザインすることができる。
【０２９７】
光学系は、ＴＡＤ系がアッセイによって生成されたアレイチャンバ中のスポットを画像化すること、挿入されたマイクロ流体カートリッジのタイプ、適合性、向き、及び挿入成功を決定すること、ならびにマイクロ流体カートリッジ中の流体の流れを画像化することを可能にする。カメラは複数の機能を実行する。それは、光学的密度を定量化する十分な解像度によるアッセイによって生成されたスポットを画像化する。それは、インプットとして機器からのブランクと、及びスポット画像を撮ることになる。それは、さらに、スポットアレイの選択されたカードタイプの構成された寸法に基づいて、スポットの２次元アレイの起点のスポット、及びアウトプットを見つけることになる。それは、マイクロ流体カートリッジ上の特徴部を画像化すること（それはカートリッジのタイプ、適合性、及び向きが決定されることを可能にする）、及びＴＡＤが成功挿入を決定することを可能にすることになる。それは、マイクロ流体カートリッジ内のすべてのマイクロ流体チャネルを画像化して、流体又は空気の位置を記録し、診断を支援するか又は試験の記録を提供することになる。カメラは、バーコードスキャニングのためにカートリッジラベルを画像化することもできる。
【０２９８】
ＬＥＤアレイは、マイクロ流体カートリッジの頂部表面を照明する。光入力は制御電子回路によって変調され、上記のカメラ機能をサポートするようにソフトウェアによって制御することができる。これらの光は、トラブルシューティング、及び診断のためのアッセイの間の、バーコードスキャニング、及び可能性のあるビデオの記録のために使用される。画像化ＬＥＤは、アレイチャンバの底部への光を提供する。光入力は制御電子回路によって変調され、必要に応じてアレイチャンバ中のスポットの定量化のためにソフトウェアによって制御される。アレイチャンバ中のスポットの画像化のために、ＬＥＤからの光は、アレイチャンバの底部に侵入し、視界窓を介して通過し、他の表面に反射せずに又は他の表面を介して拡散せずに、カメラに侵入する必要がある。画像化ＬＥＤからの光はＴＡＤデバイスの任意の要素に反射せずに又はそれらを介して拡散せずに、次いで上部からアレイチャンバを照明する必要がある。拡散要素は、アレイ画像化ＬＥＤとマイクロ流体カートリッジアッセイチャンバとの間に含まれ、ＬＥＤからの光がアッセイチャンバに侵入する前に、均一に分布させる。
【０２９９】
スポットの画像を得るために、ブランクの画像は最初に得ることができ、ソフトウェアが、スポットが現像される前に存在する任意のバックグラウンドを無視することによってスポットを検出することを可能にする。スポットの現像によって、スポット画像を得ることができる。画像捕捉の開始時に、２つの６４０×４８０ピクセルアレイをゼロ化し、一方は、各々の個別のピクセルの平均の黒色強度、及び白色強度を蓄積し、他方は、全体のピクセル平均を掛けた強度を蓄積することになる。空間的なピクセル平均も、フレームが捕捉された時間と一緒に記憶される。平均の空間的なピクセルは、以下の分析における代用物として変調信号のために使用される。これは、２．６Ｈｚの周波数の唯一の供給源が変調に起因するという仮定に基づく。
【０３００】
一旦フレームの合計の所望の数が捕捉されると、平均のピクセル強度の時間記録は、正確な変調振動数、位相、及び振幅を同定するために、正弦波の範囲の振動数と関連づけられる。この計算結果は変調の大きさに比例した値である。次に、最小二乗線形回帰を各々のピクセルについて計算して、抽出された変調信号に関する各々のピクセルのゲイン、及びオフセットを決定する。この時点で、個別のピクセルゲインがＬＥＤアウトプットに比例する比例定数を示すことが仮定される。ピクセルオフセットは、有用とは見なされ廃棄される。カード間の変動、チャンバ中の流体に起因する光学的密度変動、及び正確な振幅変調に起因する効果を阻止するために、画像は、最初に、その後にスポットが現像される直前に捕捉される。これらは「ブランク」画像、及び「スポット」画像と称される。最後の処理画像は、ブランクの画像のものと、スポット画像の各々のピクセルゲインの比の計算によって生成される。この画像は、ブランクの画像に対するスポット画像の計算された変調大きさの比によってさらにスケール調整させられる。
【０３０１】
定量化のためのスポットは、ソフトウェアユーザーによって手動でマークすることができる。各々のスポットは中心スポット領域を含む。スポットのサイズは、ソフトウェアを使用して、ユーザーが変えることができる。スポットを定量化するために、新しい画像を計算することができ、そこで、各々のピクセルは、スポット画像、及びスポットのない画像の各々のピクセルの比に等しい。これはピクセルのゲイン、及びオフセットに加えて、バックライト、及び固有の空間的カード密度に起因する変動を除去する。中心スポット円内の平均ピクセル値が計算される。機器は、ソフトウェアがＴＭＢ−ＭＸから現像されたスポットの画像を撮ることができるように、カメラ、及び照明システムを含んでデザインされた。次いでソフトウェアは、カメラによって撮られた画像に基づいて光学的密度を計算することができる。カメラはＵＳＢカメラ（Ｌｅｏｐａｒｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ：ＬＩ−ＯＶ７７２５）である。ＬＥＤ光のアレイはスポットの視野の下であり、照明はスポットの画像を可能にする（Ｌｉｆｅ−ｏｎ  Ｉｎｃ．）。ＬＥＤ光の点滅は、ソフトウェアが生じた画像についてのゲイン、及びオフセットを計算することを可能にする。光路長は、ユニットを可能な限りコンパクトにするために、可能な限り短くデザインすることができる。
【０３０２】
５ｃ：機器の一体化
ポンプ、バルブ、及び光学カメラはすべて機器の中へ一体化されることになる。機器内で、これらの部分はプリント回路基板と共に一体化されることになる。この回路基板はソフトウェアから様々な構成要素への電気入力のすべてを中継することになる。
【０３０３】
機器は、マイクロ制御装置、ポンプ、バルブ、及び光学系を格納することになる。カートリッジ（ウェット、及びドライと一緒に）は機器の中へ挿入され、ばね機構を用いてマニホールドと相互接続することになる。マニホールドはバルブをリザーバポートに接続するものである。ＰＣラップトップ上に現在ロードされたソフトウェアは、２つのＵＳＢケーブル（一方は機器を制御し、他方はカメラを制御する）を介して機器に接続する。機器、カートリッジ、及びソフトウェアがどのように一緒になるのかを示す概略図を、図３０に図示する。
【０３０４】
ＴＡＤ系は、カートリッジからの結果を制御、及び定量化するリーダーを含む。この機器は、プラスチック筺体、及び金属筺体で構成され、これらの筺体は、タッチスクリーンディスプレイ、メインＣＰＵ  ＰＣＢ、カートリッジインターフェース（ポンプ、多数のバルブ、定量化のためのカメラ、様々なＬＥＤ光源、及びＭＣＵを含む）、及びアッセイが正確に遂行されることを保証するＰＣＢ（バルブドライバー、モータードライバーならびにセンサを含む）を備える。リーダーの基本形態は、カートリッジ挿入のための引き出しと共に、ユーザーインタフェースのためのグラフィカルタッチスクリーンディスプレイから構成される。筺体はＯＴＳ防振脚を使用することができる。リーダーは、調整の必要性がない十分に水平な表面上で使用されることが想定される。リーダーは、十分に水平でない場合ユーザーへ指示することができる。ＴＡＤソフトウェアはＡＲＭベースのＣＰＵ上で実行されることになる。メインソフトウェア機能（すべてのＧＵＩを含む）はＪａｖａ(登録商標)で記述されたソフトウェアアプリケーション（ａｐｐ）の結果とすることができる。ａｐｐは、様々な他のソフトウェアライブラリー、及びパッケージ（開発過程が不明なソフトウェア（ＳＯＵＰ）のカテゴリーへと分類される）によるサポートに依存することになる。ＴＡＤにおいてマイクロ制御装置で動くソフトウェアは、ＴＡＤファームウェアと称されることになる。これは、ランタイム時にこのソフトウェアは著しく再構成できず、それがパワーアップ時に実行を開始するであろうことを暗示することが意図される。ＴＡＤのファームウェアは、カートリッジインターフェース中のマイクロ制御装置上で動くことになる。このファームウェアは、２つのスレッド（連続的無限のメインループ、及び一定のインターバルタイマー割り込み）からなるリアルタイム構成を使用して実装されることになる。割り込みは高速符号と称され、メインループは低速符号と称されることになる。経験則として、ＭＣＵは、高速符号、及び低速符号の実施しそれぞれ半分の時間を費やすと予想される。
【０３０５】
ＴＡＤは、多くのカスタム、及び既製の電気的サブ組立体から構成することができる。ＴＡＤのためのメインＵＩは、７インチのタッチスクリーンＬＣＤに基づくことができる。これは、ＦＴ５ｘ０６制御装置に基づくパラレルインターフェース、及びＩ２Ｃタッチスクリーン制御装置によるＯＴＳ構成要素とすることができる。アプリケーションとユーザーの相互作用はすべてタッチスクリーンを介して達成されることになる。何らかのデータエントリーは、オンスクリーンキーパッドを介して達成されることになる。いくつかの実施形態において、患者ＩＤエントリーのための外部バーコードスキャナーの追加を含むことができる。ＧＵＩはホームスクリーンからなって、ユーザー許可レベルに依存して、ユーザーが、アッセイの実行、及び機器設定へのアクセスのための、ウィザードスタイルでガイドされるプロセスを開始することを可能にする。ＴＡＤは、バッテリーバックアップの目的のためのＮｉＭＨバッテリーを含むことができる。約４Ａ＊ｈの４つのＭｉＭＨ電池は、約２時間の間、８Ｗでデバイスを実行するのに十分なエネルギーを供給することができる。リーダーは４〜６の電池を使用することができる。ＣＰＵ  ＰＣＢは、ＴＡＤのＧＵＩ、及び通信のすべてを収容する。マニホールドＰＣＢは、上部のＬＥＤＳ、バルブ、及びポンプモーターのための駆動の構成要素を含む。それは、圧力センサのためのＡＤＣも含む。カートリッジインターフェースＰＣＶは、カートリッジインターフェースのすべての機能性を管理する。このボードは、アレイチャンバをアップライト照明するための照明ＬＥＤの取り付けを可能にする。それは、すべてのインプットパワーの変換（バッテリーの充電、及びモニタリングを含む）も含む。バッテリーＰＣＢは、バッテリー、バッテリーサーミスター、及びバッテリーモニター回路を機械的に取り付ける。
【０３０６】
マニホールド組立体（図４６Ａ〜Ｂ、概念図）は、カートリッジインターフェースＰＣＢ；光学的検出システム中で記載される、カメラ（１０９）、及びＬＥＤ画像化カートリッジ；マイクロ流体カートリッジインターフェース中で記載される、マニホールドポート（１４）、光学窓、及び位置合わせ特徴部；ならびにポンプ（６８）、バルブ（６５）、圧力センサ、及び積層スタック（１１０）を含むことができる。ポンプ（６８）、バルブ（６５）、及び組み立てられたカートリッジ（７９）はすべて、マニホールドの積層スタック（１１０）と相互接続する必要がある。加えて、カメラ（１０９）はアレイチャンバ（１２）の結果を正確に画像化するように配置する必要がある。図３３、及び４７は、２つの例示的な詳細なマニホールドの積層スタック（それはポンプからバルブへそしてカートリッジへ空気を接続するように機能する）を示す。空気はポート８８を介してポンプを出て、バルブ入口８５へ進み、開放バルブを通る。次いで空気はポート８６を介してバルブを出て、マニホールドに再流入し、ポート（そこで、マニホールドはカートリッジ８７と相互接続する）へ進む。ポンプを再度ゼロにするか、又はＷ１（１）もしくはＷ２（２）へ進む間に、空気はポートを通って大気６３へ出る。
【０３０７】
カートリッジ接続部は、機器がカートリッジを正確に連結することが期待される接続特徴部を含む。この接続部は、機器から独立して、カートリッジデザインを反復して適用できるようにカートリッジのデザイン、及び構造に十分な柔軟性を提供することが意図される。カートリッジリーダーは１０のノズルを含み、各々は高さ０．９ｍｍ、内径３ｍｍ、外径３．５ｍｍ、斜角面６０°である。３ｍｍの内径は、ノズルガスケット中の柔軟性を許容するために深さ０．９ｍｍであり、次いでそれは内部の空気の体積を最小限にするために０．５ｍｍの直径孔へ移行する。ノズルは５．８ｍｍ間隔で配置される。リーダーは、将来のカートリッジ反復を支持するように、最小の変更による２つの追加のノズルを追加する空間を含む。
【０３０８】
ノズル、及びカートリッジ位置合わせ特徴部は、単一アルミビレットから機械加工され、マニホールド組立体へねじ留めされる。ノズルは、マイクロ流体カートリッジ上の１０のポートと相互接続する。ポートは、５．８ｍｍ間隔で、カートリッジ正中線を中心とし、カートリッジの先端から２．７２ｍｍで配置される。各々のノズル／ポートのペアは、カートリッジリーダーとマイクロ流体カートリッジとの間に独立した空気接続を提供する。厚さ０．０３インチのシリコーンエラストマーガスケットは空気ポートの上に結合される。ガスケットは、各々の空気ポートと位置合わせさせた１．５ｍｍの孔を含む。クランプされた場合に、ガスケットは、空気ポートとノズルとの間にシールを提供する。マイクロ流体カートリッジインターフェースのノズル、及びノズルガスケットは、ばね又はアクチュエーター駆動機構と一緒にクランプされる。クランピングはユーザーから入力される力なしで達成されることになる。機構は、３０±５Ｎの全クランピング力ですべてのノズルへ均一なクランピング力を提供する。機構は、高さ１２ｍｍ〜１７ｍｍのカートリッジのための許容可能なクランピング力を維持することができる。これは、大きすぎる圧力（ガスケットを歪め、シーリングを妨害する場合がある）を加えることなく、カートリッジのエラストマー表面とリーダーのノズルとの間に十分な局所的圧力を加え、適切なシールを提供することを保証することになる。カートリッジリーダー上の位置合わせ特徴部は、ノズルの側面（ウェットカートリッジの上部の側面上の特徴部と係合する）にある。これらは正確なカートリッジ位置合わせのために使用される。それらは、端部の３つの縁上に面を備えた矩形の突部から構成することができる。特徴部は、水平面における１〜２ｍｍのミスアラインメントに対処することになる。
【０３０９】
積層スタックはマイクロ流体空気チャネルを提供して、ベント／取入口、ポンプ、バルブ、及びノズルを接続する。機器を改造するか又はマイクロ流体接続を再構成するために、スタックは、容易に取り外すこと、及び置き換えることができる。スタックは、スタックの上部又は底部を出る円形のチャネルを介して、他の構成要素と相互接続し、各々のチャネル付近の２〜４ｍｍのシールを提供する付着剤が露出するアイランドにより、他の構成要素へシールする。スタックは、マニホールド組立体上で特徴部（ピンなど）によって整列し、さらに正確な向きでのみ取り付けることができるような特徴部を含む。システムは、湿潤している可能性のある空気がマイクロ流体カートリッジを通って移動して、環境へ安全に廃棄される経路を含む。この経路は、ポンプのための空気取入口を兼ねる。ベントポート開放部は下に向けら、塵がポート中で集まることを防止する。ベントをＧＰＭにより覆って、塵が空気系に侵入することを防止する。ベントはカートリッジリーダーのボディの中へ吐出する。カートリッジリーダーの内部で構築される圧力／真空を防止するように、小体積の空気を、カートリッジリーダーの中へ、及びから外へ自由に流れることを可能にする必要がある。
【０３１０】
カートリッジは、カートリッジリーダー（８９）から伸長する引き出しの中へ置くことができる（図４５Ａ）。挿入の間にカートリッジを水平に保持することは容易であろう。引き出しは、カートリッジを適切に挿入しないと（例えばカートリッジがリーダーと衝突する）閉鎖されないことが所望される。引き出し閉鎖機構は、カートリッジが適切に挿入されず引き出しが閉鎖される場合にカートリッジへの損傷を防止するために、力が制限される。引き出しデザインは、ユーザーの損傷を防ぐように、ピンチポイントを最小限にしかつフォースラミネート（force laminating）を含むことができる。カートリッジリーダーに収容された場合に、マイクロ流体カートリッジは、マイクロ流体カートリッジ内で保持される流体の全体の体積を保持する容量を有することができる取り外し可能なドリップトレー内で保持される。移動する引き出し要素はトレーとすることができる。トレーは洗浄のために取り外し可能である。トレーは、幅８０ｍｍまで、及び長さ７０ｍｍまでのカートリッジを許容し、幅９５ｍｍまで、及び長さ８５ｍｍのカートリッジを許容するトレーと置き換えて、将来のカートリッジ反復を可能にすることができる。２つの追加の空気ポートのための空間を含むことが意図される。トレーは、マイクロ流体カートリッジの容易な設置、及び取り外しを可能にするために、フィンガークリアランスポケットを含むことができる。トレーは、上下逆さまで又は正しくない向きでカートリッジを挿入することができないようにする特徴部を含むことができる。最終機器の図を図４５Ａ〜Ｃに示し、内部要素（ポンプ、ＣＰＵ、モーター、及びマニホールド組立体を含む）は、プラスチック筺体（９６）、及び金属構成要素（９４）によって囲まれる。機器の前面は、７インチの液晶ディスプレー画面（９０）、及び挿入されたカートリッジの格納のための排出可能トレー（８９））からなる。放熱用金属板は機器（９５）の冷却を支援するために機器の背面に配置される。様々なＵＳＢ、及び電気的接続部は、機器（９１、９３）の正面、及び背面上に置かれる。機器は、機器９２の背面にあるＯＮボタンによって電源が入る。
【０３１１】
５ｄ：作動スクリプト
ソフトウェアにおけるスクリプトは、機器がどのリザーバから、及びどのリザーバへ押し出すかを命令するのに使用される。スクリプトはテキストファイルに書き込んで、機器の中へロードすることができ、ユーザーフレンドリーなＪａｖａ(登録商標)ベースのスクリプトはこのシステムでの使用のために特に開発された。いくつかの単純なコマンドは、カートリッジ（ベントオール（ｖｅｎｔ  ａｌｌ））、及びポンプ（ベントイン（ｖｅｎｔ  ｉｎ）、ベントアウト（ｖｅｎｔ  ｏｕｔ）、ベントミッド（ｖｅｎｔ  ｍｉｄ））における圧力を再度ゼロにするために使用される。スクリプト制御のための別の単純なコマンドは「ブレイク（ｂｒｅａｋ）」であり、それは、ユーザーが継続を希望するまで、単純にスクリプトを休止する。最終的に、画像制御「取得ブランク（ｇｒａｂ  ｂｌａｎｋ）」は、バックグラウンドのために使用されるブランクの画像を取得し、「取得スポット（ｇｒａｂ  ｓｐｏｔｓ）」は、スポットが現像され終えた時に画像を取得する。機械の流体装置を制御するために、１つのコマンド行は、流体を所望される場所へ移動させるのに必要な情報をすべて含む。例示的なポンプコマンドとしては、「ベントオール」（すべてのバルブを開放、及び閉鎖して、カートリッジ中の圧力を再度ゼロにする）、「ベントイン」（ポンプをすべて外へ向けて動かし、したがって押し出すことができる）、「ベントイン」（ポンプをすべて中へ向けて動かし、したがって引くことができる）、「ベントミッド」（ポンプを中間へ動かす）が挙げられ；例示的な流体コマンドとしては、「ドロー（ｄｒａｗ）」（ポンプが試薬リザーバに向かって流体を引く）、「プッシュ（ｐｕｓｈ）」（ポンプが試薬リザーバから流体を押し出す）が挙げられ；例示的な画像化コマンドとしては、「取得ブランク」（ブランクの画像を取得する）、「取得スポット」（スポット画像を取得する）が挙げられ；例示的な他のスクリプトコマンドとしては、「ブレイク」（スクリプト、及び機器を休止する）、及び「／／」（その後に、コマンドではなく任意のテキストをコメントする）が挙げられる。ポンプコマンドは、スクリプト行の開始であり、「プッシュ」（リザーバから廃液へ流体を押し出す）又は「ドロー」（それは反対方向で流体を押し出す）のいずれかである。ドロー又はプッシュに後続するものは、押し出されることが望まれる体積（例えば１００μＬ）である。コマンドの次のパートは、そこから流体が押し出されることが望まれるリザーバ（例えば「Ｒ１」）である（バッファリザーバ又は試薬リザーバのうちの任意のものから選択することができる）。これに後続するものは、流体を押し出すことが望まれるリザーバ（例えば「Ｗ１」）である（Ｗ１又はＷ２のいずれかを選び出す）。コマンドの最後のパートは、流体を押し出すのに使用されるであろう時間の量（すなわち１００秒）である。体積の量、及び時間の量は流速（すなわち流体がどのくらい速く移動するか）を決定する。
【０３１２】
スクリプトは、．ｔｘｔファイル拡張によりプレーンテキストファイルで保存される。ファイルコンテンツのどれもケースセンシティブではない。スクリプトの各々の行は、コメント、単一コマンド又は両方を含むと想定される。行がコマンドを含む場合、コマンド名は行の最初の非空白文字で始まることになる。行の始まり空白文字（スペース、及びタブ）は無視されることになる。コメントはスクリプトパーサによって処理されないテキストである。これらを使用して、スクリプトの人間の理解を支援する対人可読情報を伝達することができる。コメントは／／で始まる。コメントデリミタ後の何らかのテキストは、スクリプトパーサによって無視されることになる。行の最初の非空白文字がコメントデリミタであれば、行全体が無視されることになる。パラメーターは、ユニットにより明確に指示されない限り、コマンド定義中で規定された順序で存在する必要がある。パラメーターは、コマンドから、及び互いにスペースにより分離される。多くのコマンドが、１又は２以上のバルブの規格を要求する。有効なバルブディスクリプタは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｗ１、Ｗ２、ＡＬＬ、ＶＥＮＴ、ＮＯＮＥである。すべての数値パラメーターは科学的記数法（例えば１．４ｅ−９）で規定することができ、負の記号により規定されない限り、正であることが想定される。数値パラメーターは、便宜上、単位（秒、μｌ、ｇ／ｍｌ等）が後続し得る。存在する場合、さらに要求される無単位パラメーターがない限り、規定の単位は、そのコマンドについて定義されたパラメーターの順序を無効にすることになる。時刻の値は秒であると想定される。体積の値はマイクロリットルであると想定される。濃度の値は１ミリリットルあたりのグラムであると想定される。いくつかのコマンドは、例えばパラメーターが特異的なタンパク質を参照することを表示するために、名称が規定されることを要求する。その名称へのすべての参照は、同じものと分類される必要がある。名称は、二重引用符により開始、及び終了するスクリプトで記述される。
【０３１３】
カートリッジ、及び機器の作動
ドライカートリッジの組み立て
ウェットカートリッジ、及びドライカートリッジは別々に供給されるが、これは必須ではない。抗体をプリントしたスライドは、ドライカートリッジの中の付着剤の層の上へ表を下にして置かれる。スライドは一緒にクランプされて、スライドに対するチャネルの良好なシーリングを保証する。
【０３１４】
ウェットカートリッジの組み立て
試薬は、底部ラミネート中のプリカットされた孔を介してリザーバの中へ充填することができる。試薬がポート又はベントポートからあふれ出ないことを保証するために、テープ片をウェットカートリッジの上部を横切って置き、これらのポートをシーする。一旦試薬が充填されると、テープ片をラミネートのプリカットされた孔を横切って置いて、リザーバをシールする。最終製品において、試薬は製造の間に充填され、より適切な機構によってシーリングが生じることになる。サンプルは、この時点で、ウェットカートリッジの上部を介してサンプルポートへ付加することができる。あるいは、サンプル機構は、全体のカートリッジがアセンブルされた後にサンプルを付加できるように、設置することができる。
【０３１５】
ウェットカートリッジ、及びドライカートリッジの組み立て
付着性カバーは、付着剤を露出するドライカートリッジの背面から除去される。ドライカートリッジ、及びウェットカートリッジは、ポーク・ヨーク（ｐｏｋｅ  ｙｏｋｅ）、及びノッチを使用して整列しる。ドライカートリッジはウェットカートリッジの上へプレスされる。ドライカートリッジ、及びウェットカートリッジは、クランプによりシールされる。
【０３１６】
カートリッジ／機器相互接続
組み立てられたカートリッジは、カートリッジ入口ポートの中へスライドされる。カートリッジプラットフォーム上のばね機構を無効にするためにある程度の力が適用される。一旦カートリッジが機器の中へ完全に挿入されると、プラットフォーム上の圧力の解放によって、カートリッジの通気ポートが出現し、マニホールドポートと正確に相互接続することを可能にする。
【０３１７】
ソフトウェア、及びアッセイプロトコル
ベンチトップ機器の実施形態（図３１）は２つのＵＳＢケーブルを介してパーソナルコンピューターに接続される。最終製品は、すべて１つの製品の中へ一体化された、ソフトウェア、機器、及び画像化スクリーンを有することができる。ベンチトップ機器のために、ソフトウェアはパーソナルコンピューター上にロードされる。アッセイのプロトコルを含むスクリプトは、ａｐｐの中へロードされる。スクリプトは、スクリプトの最初の行へ進むこと、及びプレイを押すことによって、開始することができる。組み立てられたマイクロ流体カートリッジ（７９）は、機器の前面へ装填される。スクリプトにより、クランピングモーター（７２）が係合され、カートリッジクランピングＣＡＭ（７６）を介してカートリッジはクランプされて、マニホールド（７３）と相互接続することができる。機器は、機器中のバルブＰＣＢ（７４）によるバルブ（６５）の開放を（スクリプトを介して）自動的に制御することができる。同時に、スクリプトは、ポンプ（６８）を動かすポンプモーター（７５）を作動させる。これは、所定の試薬リザーバ又はバッファリザーバから所定の廃液リザーバへと移動する流体をもたらす。全体のアッセイが完了するまで、試薬はアレイチャンバを横切って順次押し出される。ＴＭＢによるスポット現像の前に、ソフトウェアは、下部のＰＣＢ（７８）を通るＬＥＤ、及びカメラ覆い（７７）中に配置されるカメラを作動させることができる。これは、アッセイのためのブランクの画像を生成する。ＴＭＢ後に、カメラはスポット画像を撮る。カメラ取得もスクリプトによって制御される。スポットは特定の設定ファイルのロードによって定量化することができる。スポットは自動的に定量化され、結果ファイルをセーブすることができる。最終製品は、ユーザー・フレンドリーなフォーマットで結果を図示し、結果がカットオフよりも高いバイオマーカーレベルを示すかどうかを示すことができる。
【０３１８】
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【０３５９】
すべての引用は、参照により本明細書に援用される。
【０３６０】
本発明は１又は２以上の実施形態に関して記載されている。しかしながら、当業者には、特許請求の範囲に定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更、及び修正を行い得ることが明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１８Ｋ】
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【図１８Ｌ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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