(57)【要約】  本開示は、例えば、癌の治療のための、新規な化合物、これらの化合物を含む組成物、及びそれらの使用に関する。特に、本開示は、式Iの化合物、並びにそれらの組成物及び使用を含む。2019501958.tif 000061
2019501958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの化合物:
【化１】
2019501958.tif 000056
[式中、
Aは、O又はSであり、
nは、0、1、2又は3であり、
nが1である場合、R1は、ハロ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル又は-X-C1〜6アルキルであり、
nが2又は3である場合、各R1は、独立に、ハロ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル若しくは-X-C1〜6アルキルであり、又は2つのR1が一緒になって、隣接する2個の環炭素原子に結合されるメチレンジオキシ基を形成し、
R2は、C1〜6アルキル又はC1〜6ハロアルキルであり、
R3は、存在しないか、又はハロ、-X-C1〜6アルキル若しくは-X-C1〜6ハロアルキルであり、
各Xは、独立に、O又はSである]
又は医薬的に許容されるその塩、溶媒和物及び/若しくはプロドラッグ。
【請求項２】
Aが、Oである、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R3が、存在しない、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
R2が、メチルである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
nが、0である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
nが、1であり、R1が、6-OCH3、7-OCH3、8-OCH3、6-OC2H5、6-SCH3、7-SCH3、6-CH3、6-C2H5、6-F、6-Cl、6-Br、7-F、7-Cl又は7-Brであり、場合によっては、R1が、6-CH3、6-OCH3又は7-OCH3である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
nが、2であり、R1が、6,7-ジCH3、6,7-ジOCH3又は6,7-O-CH2-O-である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
nが、3であり、R1が、5,6,7-トリOCH3である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
【化２】
2019501958.tif 000057
【化３】
2019501958.tif 000058
又は医薬的に許容されるその塩、溶媒和物及び/若しくはプロドラッグから選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１０】
【化４】
2019501958.tif 000059
である、請求項9に記載の化合物。
【請求項１１】
【化５】
2019501958.tif 000060
である、請求項9に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の1種又は複数の化合物及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の1種又は複数の化合物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法。
【請求項１４】
癌が、乳癌、白血病、子宮頚癌、脳腫瘍、肺癌、膀胱癌、腎癌、多発性骨髄腫若しくは他の血液がん、結腸直腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌又は前立腺癌である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
癌が、コルヒチン耐性、パクリタキセル耐性、ボルテゾミブ耐性、ビンブラスチン耐性及び/又は多剤耐性腫瘍細胞を含む、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の1種又は複数の化合物が、1種又は複数の他の抗癌剤と組み合わせて投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
他の抗癌剤が、有糸分裂阻害剤、場合によっては、パクリタキセル;bcl2阻害剤、場合によっては、ABT-737;プロテアソーム阻害剤、場合によっては、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブ;シグナル伝達阻害剤、場合によっては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、イマチニブ又はスニチニブ;DNA修復の阻害剤、場合によっては、イニパリブ、テモゾロミド又はドキソルビシン;及びアルキル化剤、場合によっては、シクロホスファミドからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
他の抗癌剤が、パクリタキセルである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の1種又は複数の化合物の投与量が、単独で投与される場合の請求項1〜11のいずれか一項に記載の1種又は複数の化合物の投与量よりも少ない、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の1種又は複数の化合物の投与量が、単独で投与される場合の請求項1〜11のいずれか一項に記載の1種又は複数の化合物の投与量の2分の1である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
他の抗癌剤の投与量が、単独で投与される場合の他の抗癌剤の投与量よりも少ない、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
他の抗癌剤の投与量が、単独で投与される場合の他の抗癌剤の投与量の2分の1である、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年11月20日出願の米国特許仮出願第62/258,033号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、例えば、癌の治療のための、新規なキノロンカルコン化合物、かかる新規なキノロンカルコン化合物を含む組成物、及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
連続的に分裂する癌細胞は、チューブリンの重合及び解重合の速やかで動的なプロセスに依存する。
【０００４】
微小管標的化剤、例えば、パクリタキセル及びビンブラスチン等は、診療機関で広く用いられている(Dumontet and Jordan、2010年;Kuppens、2006年;Singhら、2008年)。微小管標的化剤は、少なくとも4カ所の異なる結合部位/領域を介してチューブリンを結合することが公知である。パクリタキセルは、重合されたチューブリンのβ-サブユニットの内面に結合し、それにより、微小管構造が安定化し、したがって、解重合を防止する(Luら、2012年)。ラウリマライドは、異なる部位に結合するが、タキサン類に類似の微小管安定化をもたらす(Pryorら、2002年)。ビンカアルカロイド類は、ポリマーの末端で数個のチューブリンサブユニットに結合し、これらが、重合を起こすのを防止する。しかしながら、ビンブラスチンはまた、2つのαβ-チューブリンヘテロ二量体の界面で結合することも可能であり、したがって、自己会合を防止する(Gigantら、2005年)。微小管標的化剤の4番目の基は、コルヒチン結合部位によりチューブリンに結合する。化合物のこのクラスは、β-チューブリンサブユニットに結合し、それにより、微小管集合を阻害する(Ravelliら、2004年)。これは、微小管集合を阻害するが、コルヒチンの治療効果は、その治療係数が低い(すなわち、毒性が高い)ことにより制限される。
【０００５】
タキサン類及びビンカアルカロイド類と異なり、コルヒチン結合部位を標的化する薬剤は、多剤耐性問題を最小限にする。したがって、最小限の副作用で、コルヒチン結合部位に効率的に結合する薬物を開発する多くの努力が行われてきた(Borisy and Taylor、1967a;Borisy and Taylor、1967b;Luら、2012年;Weisenbergら、1968年;Zhou and Giannakakou、2005年)。しかしながら、現在まで、副作用が低い、コルヒチン結合部位を標的化する有効な薬物は、米国FDAによって、まだ承認されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】www.celllineauthentication.com
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書に開示される試験のキノロンカルコンは、化合物CTR-17[(E)-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン]及びCTR-20[(E)-6-メトキシ-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン]によって例示される通り、コルヒチン結合部位でチューブリンに結合し、癌特異的な方式で細胞を死滅させることが判明した。これらのCTR化合物の両方は、(パクリタキセル耐性、ビンブラスチン耐性及びコルヒチン耐性を含めた)多剤耐性癌細胞を効率的に死滅させることが観察された。更に、本試験で得られたデータによって、パクリタキセル及びCTR-17又はCTR-20の組合せが、多剤耐性細胞に対して強力な相乗効果があることも示された。動物試験から得られたデータによって、単独で又はパクリタキセルと併用して試験されたCTR化合物が、動物への著しい弊害が観察されない強力な抗腫瘍活性を有することが示された。更に、CTR-21((E)-8-メトキシ-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン)及びCTR-32((E)-3-(3-(2-エトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン)はまた、腫瘍細胞を死滅させることにおいて非常に強力である。CTR-17及びCTR-20と同じように、CTR-21及びCTR-32もまた、微小管の動力学を乱す。3つの同系細胞株から得られたデータによって、CTR-20、CTR-21及びCTR-32が、前悪性MCF10AT1及び非悪性MCF10A乳細胞に対して、完全な悪性MCF10CA1a乳癌細胞を優先的に死滅させることが示された。更に、これらの化合物のすべてが、多剤耐性癌細胞を効率的に死滅させる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本開示は、式Iの化合物:
【０００９】
【化１】
2019501958.tif 000003
【００１０】
、
[式中、
Aは、O又はSであり、
nは、0、1、2又は3であり、
nが1である場合、R1は、ハロ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル又は-X-C1〜6アルキルであり、
nが2又は3である場合、各R1は、独立に、ハロ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル若しくは-X-C1〜6アルキルであり、又は2つのR1が一緒になって、隣接する2個の環炭素原子に結合されるメチレンジオキシ基を形成し、
R2は、C1〜6アルキル又はC1〜6ハロアルキルであり、
R3は、存在しないか、又はハロ、-X-C1〜6アルキル若しくは-X-C1〜6ハロアルキルであり、
各Xは、独立に、O又はSである]
又は医薬的に許容される塩、溶媒和物及び/若しくはプロドラッグを含む。
【００１１】
一実施形態では、Aは、Oである。
【００１２】
一実施形態では、R3は、存在しない。
【００１３】
一実施形態では、R2は、メチルである。
【００１４】
一実施形態では、nは、1であり、R1は、6-OCH3、7-OCH3、8-OCH3、6-OC2H5、6-SCH3、7-SCH3、6-CH3、6-C2H5、6-F、6-Cl、6-Br、7-F、7-Cl又は7-Brである。他の実施形態では、nは、1であり、R1は、6-CH3、6-OCH3又は7-OCH3である。
【００１５】
一実施形態では、nは、2であり、R1は、6,7-ジCH3、6,7-ジOCH3又は6,7-O-CH2-O-である。他の実施形態では、nは、3であり、R1は、5,6,7-トリOCH3である。
【００１６】
一実施形態では、本化合物は、
【００１７】
【化２】
2019501958.tif 000004
【化３】
2019501958.tif 000005
【００１８】
又は医薬的に許容されるその塩、溶媒和物及び/若しくはプロドラッグから選択される。
【００１９】
他の実施形態では、本化合物は、
【００２０】
【化４】
2019501958.tif 000006
【００２１】
である。
【００２２】
更なる実施形態では、本化合物は、
【００２３】
【化５】
2019501958.tif 000007
【００２４】
である。
【００２５】
本開示はまた、本開示の1種又は複数の化合物及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物も含む。
【００２６】
本開示はまた、本開示の1種又は複数の化合物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法も含む。
【００２７】
一実施形態では、癌は、乳癌、白血病、子宮頚癌、脳腫瘍、肺癌、膀胱癌、腎癌、多発性骨髄腫又は他の血液がん、結腸直腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌及び前立腺癌である。他の実施形態では、癌は、コルヒチン耐性、パクリタキセル耐性、ボルテゾミブ耐性、ビンブラスチン耐性及び/又は多剤耐性腫瘍細胞を含む。
【００２８】
一実施形態では、本開示の1種又は複数の化合物は、1種又は複数の抗癌剤と組み合わせて投与される。他の実施形態では、他の抗癌剤は、有糸分裂阻害剤、場合によっては、パクリタキセル;bcl2ファミリー阻害剤、場合によっては、ABT-737及び抗-アポトーシス経路の他の阻害剤;プロテアソーム阻害剤、場合によっては、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブ(calfilzomib);シグナル伝達阻害剤、場合によっては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、イマチニブ又はスニチニブ;DNA修復の阻害剤、場合によっては、イニパリブ、テモゾロミド又はドキソルビシン;及びアルキル化剤、場合によっては、シクロホスファミドからなる群から選択される。更なる実施形態では、他の抗癌剤は、パクリタキセルである。
【００２９】
本開示の1種又は複数の化合物が、1種又は複数の抗癌剤と組み合わせて投与される実施形態では、本開示の1種又は複数の化合物の投与量は、単独で投与される場合の本開示の1種又は複数の化合物の投与量よりも場合によっては少ない。他の実施形態では、本開示の1種又は複数の化合物の投与量は、単独で投与される場合の本開示の1種又は複数の化合物の投与量の2分の1である。
【００３０】
本開示の1種又は複数の化合物が、1種又は複数の抗癌剤と組み合わせて投与される実施形態では、他の抗癌剤の投与量は、単独で投与される場合の他の抗癌剤の投与量よりも場合によっては少ない。他の実施形態では、他の抗癌剤の投与量は、単独で投与される場合の他の抗癌剤の投与量の2分の1である。
【００３１】
図面を参照して、本開示をこれからより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】化合物CTR-20((E)-6-メトキシ-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン)を、0、0.5、1.0、5.0及び10.0μMの濃度で、24又は72時間(h)処置した非同期的に増殖するHeLa S3細胞の細胞死百分率を示すプロットである。
【図２】(A)化合物CTR-17((E)-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン)の異なる濃度(0、0.75、1.0、3.0、5.0、7.5及び10.0μM)による処置の72時間(h)後のHeLa細胞のフローサイトメトリープロファイル;及び(B)非同期性のHeLa細胞が、偽薬（Sham）処置されたHeLa細胞(最上段)と比較して、3.0μM CTR-17で処置された(最下段)後、異なる時点(6、12、24、48及び72時間)での細胞周期プロファイルを示す図である。
【図３】2種の乳癌細胞株(MDA-MB-468及びMDA-MB-231;それぞれ最上段及び中段)及び1種の非癌乳房細胞株(MCF-10A)が、3.0μM CTR-17で処置した後(最下段)、異なる時間(0、6、12、24、48及び72時間)で得られたフローサイトメトリープロファイルを示す図である。
【図４】非同期性の乳癌細胞(MDA-MB-231及びMCF-7;それぞれ最上段及び中段)及びこれらのマッチング非癌乳細胞(184B5;最下段)が、未処置（Untreated）の細胞と比較して、CTR-20により0.5又は1μMで72時間(h)処置された後、得られたフローサイトメトリープロファイルを示す図である。
【図５】(A)MDA-MB-231細胞が、偽薬（Sham）対照と比較して、1μM CTR-20で4、8、24、28及び72時間処置した又は(B)HeLa S3細胞が、偽薬対照（Sham control）と比較して0.5、1.0、又は2.5μM CTR-20で、24、48及び72時間処置した後、得られたフローサイトメトリープロファイルを示す図である。
【図６】>60nM濃度のCTR-21によって、有糸分裂停止、最終的に、細胞死を引き起こしたフローサイトメトリープロファイルを示す図である。HeLa細胞は、フローサイトメトリーによるこれらの細胞周期プロファイルの分析の6、12、24、48及び72時間(h)前に、CTR-21の異なる濃度で処置した。Sham：偽薬。
【図７】>50nM濃度のCTR-32が、有糸分裂停止、最終的に、細胞死を引き起こしたフローサイトメトリープロファイルを示す図である。HeLa細胞は、フローサイトメトリーによるこれらの細胞周期プロファイルの分析の6、12、24、48及び72時間(h)前に、CTR-32の異なる濃度で処置した。Sham：偽薬。
【図８】CTR-21(30nM)及びCTR-32(50nM)が、12時間時点(左側から2番目の列)での一過性の有糸分裂停止を除く、MCF10A非癌細胞の細胞周期進行に対する、著しい効果をもたらさないフローサイトメトリープロファイルを示す図である。Sham：偽薬。
【図９】CTR-17、CTR-20、CTR-21及びCTR-32が、前悪性MCF10AT1及び非悪性MCF-10A乳細胞に対して、完全に悪性のMCF10A1a乳癌細胞を優先的に死滅させることを例示する図である。細胞は、(A)0.10、0.39、1.56又は6.25μMの用量におけるCTR-17、(B)0.10、0.39、1.56又は6.25μMの用量におけるCTR-20、(C)7.81、15.63、31.25、62.5、125又は250nMの用量におけるCTR-21、又は(D)7.81、15.63、31.25、62.5、125又は250nMの用量におけるCTR-32で72時間処置した。細胞生存率を、SRBアッセイを用いて決定した。
【図１０Ａ】(A)偽薬（Sham）処置し又は3μM CTR-17で処置し、γ-チューブリン（γ-Tubulin）に特異的な抗体で染色し(左端)、α-チューブリン（α-Tubulin）に特異的な抗体で染色し(左から2番目)、DNAをDAPIで対比染色し(右から2番目)、画像をマージ（Merge）した(右端)HeLa細胞の例示的な画像である。スケールバーは、10μmを示す。
【図１０Ｂ】(B)偽薬（Sham）処置した又は3μM CTR-17で処置したHeLa細胞のDAPI及びマージ（Merge）された画像のより高倍率を示す図である。
【図１０Ｃ】(C)3μM CTR-17で処置し、γ-チューブリン（γ-Tubulin）に特異的な抗体で染色し(左端)、α-チューブリン（α-Tubulin）に特異的な抗体で染色し(左から2番目)、DNAをDAPIで対比染色し(右から2番目)、画像をマージ（Merge）した(右端)HEK293T、MDA-MB-468及びMDA-MB-231細胞を示す図である。スケールバーは、最上段及び中段の画像では2μmを示し、最下段の画像では5μmを示す。(B)及び(C)中の白い矢印は、中央プレートにおける適切なアラインメントの失敗又は染色体の均等でない分離を意味する。
【図１１】偽薬（Sham）処置し又は3.0μM CTR-17で12時間(h)若しくは24時間処置し、その後、細胞周期進行、中心体異常、及び染色体アラインメント/分離を分析した、非癌細胞MCF-10A及び184B5並びに癌細胞MDA-MB-231、HeLa、MDA-MB-468及びHEK293Tについての有糸分裂細胞の百分率を示すプロットである。
【図１２Ａ】偽薬（Sham）(MCF-7のみ)又は1μM CTR-20で24時間(h)処置した、非同期的に増殖するMCF-7、MDA-MB-231及びHeLa S3細胞についての(A)ほぼ中期の例示的な画像を示す図である。次いで、細胞は、収集され、メタノールで固定され、α-チューブリン（α-Tubulin）に特異的な抗体でインキュベートし(図12Aの左端の列)、次いで、DNAをDRAQ5で対比染色し(図12Aの左の列から2番目)、画像をマージ（Merge）した(図12Aの右端の列)。すべての画像のスケールバーは、5μmを示す。
【図１２Ｂ】偽薬（Sham）(MCF-7のみ)又は1μM CTR-20で24時間(h)処置した、非同期的に増殖するMCF-7、MDA-MB-231及びHeLa S3細胞についての(B)ほぼ後期及び終期/細胞質分裂の例示的な画像を示す図である。次いで、細胞は、収集され、メタノールで固定され、α-チューブリン（α-Tubulin）に特異的な抗体でインキュベートし(図12Bの左端の列)、次いで、DNAをDRAQ5で対比染色し(図12Bの左の列から2番目)、画像をマージ（Merge）した(図12Bの右から2番目及び右端の列)。図12B中の終期/細胞質分裂MCF-7サンプルの内の囲みは、均等でない細胞分裂を示す。内の囲みを除くすべての画像のスケールバーは、5μmを示す。
【図１３】24時間偽薬（Sham）処置した又は1μM CTR-20で処置し、癌細胞MDA-MB-231、HeLa及びMCF-7と比較した、非癌細胞MCF-10A及び184B5の有糸分裂細胞の百分率を示すプロットである。
【図１４】二重のチミジン処置によって同期化され、次いで、7.5、8.5、9.5、10、10.5又は11.5時間の間、非存在下で(A;偽薬処置した)又は(B)1.0μM CTR-20の存在下で、新鮮な培地に放出した、カバーガラスにおいて増殖する、HeLa S3細胞についての様々な細胞期(図14A及び図14Bのそれぞれにおいて左から右:前中期、中期、後期/終期及び細胞質分裂)中の細胞の百分率のプロットを示す図である。
【図１５】HeLa細胞中の染色体が、CTR-21(中段)及びCTR-32(最下段)の存在下で不整列であることを示す図である。HeLa細胞は、メタノール中で固定化する12時間前に30nM CTR-21又は50nM CTR-32で処置し、γ-チューブリン（γ-Tubulin）に特異的な抗体(緑色,1列目)又はα-チューブリン（α-Tubulin）(赤色;2列目)で免疫染色し、次いで、Draq5で対比染色した(青色;3列目、5列目及び7列目)。マージ（Merge）された画像は、左から4列目、6列目及び8列目で示される。センタープレートでの適正な整列の失敗及び染色体の撹乱された分離を、白い矢印によって示す。Sham：偽薬。
【図１６】CTR-21及びCTR-32が、有糸分裂で停止した細胞中でBcl-XLを活性化することを示す図である。HeLa細胞は、CTR-21(15若しくは30nM)又はCTR-32(30若しくは50nM)で、6、12又は24時間(h)処置した。全細胞ライセートを、予定された時点で収集し、SDS PAGEタンパク質分離を行い、その後、パネル右側に列挙したタンパク質に特異的な抗体でウエスタンブロット法を行うために用いた。p-S62 Bcl-XLは、セリン62残留物(すなわち、Bcl-XLを活性化させる)においてリン酸化されたBcl-XLを示す。GAPDHを、ローディングコントロールとして用いた。サイクリンB（Cyclin B）のレベル及びCdc25Cの高分子量(すなわち、リン酸化された)が、化合物のいずれかの非存在下よりもCTR-21又はCTR-31の存在下で、より高いことを留意すべきである。Sham：偽薬。
【図１７Ａ】未処置（Untreated）(左端)及び偽薬（Sham）による処置(左から2番目)と比較して、CTR-17(3μM;右から2番目)又はCTR-20(1μM;右端)で12時間(放出後時間0として定義される)処置された後の、例示的なHeLa細胞周期ヒストグラムを示す図である。Controls：対照。
【図１７Ｂ】図17Aについて記載される通りCTR-17(最上部)及びCTR-20(最下部)で処置し、次いで、1×PBSで2回洗浄し、予め加温した、薬物なしの培地10ml中で、3、6、9又は12時間(左から右)の間再懸濁した細胞の例示的な細胞周期ヒストグラムを示す図である。
【図１８Ａ】CTR-21及びCTR-32の効果が可逆的であることを示す図である。CTR-21(30nM)又はCTR-32(50nM)で12時間(時間0hとして指定される)処置することにより、G2/M期で停止したHeLa細胞を、1×PBSで2回洗浄し、次いで、薬物なしの培地中で1、2、4、6及び8時間(h)培養することにより、細胞周期に放出した。次いで、細胞周期進行を、フローサイトメトリーにより分析した(下部のパネル)。Sham：偽薬。
【図１８Ｂ】CTR-21及びCTR-32の効果が可逆的であることを示す図である。図18Aに示す通り、CTR処置から放出して1、2、4、6及び8時間後のHeLa細胞の例示的な画像を示す図である。Tubulin：チューブリン。
【図１９】偽薬（Sham）又は3μM CTR-17(最上部の画像)で処置した非同期性のHeLa細胞(左側)及び184B5細胞(右側)から調製した全細胞抽出物を用いた、12、24及び48時間(時間、h)の時点での抗-PARP抗体で行ったウエスタンブロット法の結果を示す図である。GAPDHを、ローディングコントロールとして用いた(最下部の画像)。
【図２０Ａ】(A)偽薬（Sham）対照と比較して(最上段)、CTR-17(3.0μM)で24時間処置し、次いで、分析のために回収した直後の1時間EdU(10.0μM)を与えた(最下段)同期的なHeLa細胞の例示的な画像を示す図である。Merge：マージ、Bright field：明視野。
【図２０Ｂ】(B)偽薬（Sham）対照と比較して(最上段)、CTR-17で処置したHeLa細胞(最下段)の損傷したDNA(すなわち、損傷修復)を検出することによるγ-H2AXに特異的な抗体(左から2列目)による細胞免疫染色の例示的な画像を示す図である。エトポシド(50.0μM)を、陽性対照として用いた(中段)。スケールバーは、20μMを示す。Merge：マージ、Bright field：明視野。
【図２１】非同期的に増殖するHeLa細胞から調製した全細胞抽出物で行ったウエスタンブロットの画像を示す図である。同量のタンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、ブロット法を、ゲルの左で列挙したこれらのタンパク質に特異的な抗体(最上部から最下部まで:p-Cdk1、Y15;pCdk1、T161;Cdk1;サイクリンB（Cyclin B）;Wee1;Cdc25C;p-Cdc25C、S216;pCdc25C、T48)で行った。時間(h)における時点は、3.0μM CTR-17(右4列)又は偽薬（Sham）対照(左5列)で処置した後である。GAPDH(最下部の画像)を、ローディングコントロールとして用いた。「p-」は、リン酸化を示す。
【図２２】二重のチミジン(DT)ブロックによりG1/S期の境界で同期化され,次いで、対照と比較して、非存在下で(偽薬;最上段)又はCTR-17(3.0μM;最下段)の存在下で、3、6、9、12、16又は48時間(h)の間、細胞周期に放出したHeLa細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す図である。Control：対照、Sham：偽薬。
【図２３Ａ】二重のチミジン(DT)ブロックによるG1/S期の境界で同期化され、次いで、非存在下で(偽薬（Sham）;図23A)、1、3、6、9、12、14、16、18又は20時間(左から右)の間、時間0で完全培地に放出されたHeLa細胞の分析の結果を示す図である。同量のタンパク質は、SDS-PAGEによって分離され、その後、タンパク質に特異的な抗体、最上部から最下部まで:p-Cdk1、Y15;pCdk1、T161;Cdk1;p-Cdc25C、T48;Cdc25C;セキュリン（Securin）;サイクリンB（Cyclin B）;サイクリンE（Cyclin E）;サイクリンA（Cyclin A）;p-ヒストンH3（p-histone H3）;ヒストンH3（Histone H3）;GAPDH(ローディングコントロール);BubR1;及びGAPDH(ローディングコントロール)を用いて、ウエスタンブロット法を行った。
【図２３Ｂ】二重のチミジン(DT)ブロックによるG1/S期の境界で同期化され、次いで、3.0μM CTR-17の存在下で(図23B)、1、3、6、9、12、14、16、18又は20時間(左から右)の間、時間0で完全培地に放出されたHeLa細胞の分析の結果を示す図である。同量のタンパク質は、SDS-PAGEによって分離され、その後、タンパク質に特異的な抗体、最上部から最下部まで:p-Cdk1、Y15;pCdk1、T161;Cdk1;p-Cdc25C、T48;Cdc25C;セキュリン（Securin）;サイクリンB（Cyclin B）;サイクリンE（Cyclin E）;サイクリンA（Cyclin A）;p-ヒストンH3（p-histone H3）;ヒストンH3（Histone H3）;GAPDH(ローディングコントロール);BubR1;及びGAPDH(ローディングコントロール)を用いて、ウエスタンブロット法を行った。「p-」は、リンタンパク質を示す。
【図２４】6、9及び12時間(h)の間、二重のチミジン(DT)ブロックによるG1/S期の境界で同期化され、次いで、偽薬（Sham）処置され(左3列)、20ng/mlノコダゾール（Nocodazole）で処置され(中央3列)、又は3.0μM CTR-17で処置された(右3列)、HeLa細胞のウエスタンブロットの結果を示す図である。総蛋白抽出物を、抗-BubR1抗体を用いて免疫沈降にかけ、その後、抗-Cdc20抗体を用いてSDS-PAGE及びウエスタンブロット法によりタンパク質分離にかけて、BubR1とCdc20との間の相互作用を検査した。
【図２５】12時間、偽薬（Sham）処置し(最上部2列)又はCTR-17で処置し(3.0μM;最下部2列)、固定し、次いで、BubR1(左端の列)又はCenp-B(左から2番目の列)に特異的な抗体で免疫染色(セントロメア染色)された、非同期的に増殖するHeLa細胞の例示的な画像を示す図である。右から2列目は、マージ（Merge）された画像を示し、右端の列は、明視野（Bright field）の画像を示す。スケールバーは、最上段及び最下部から2列目では5μmを示し、他の画像では2μmを示す。
【図２６】精製されたブタのチューブリン及び1.0mM GTPを、10.0μMパクリタキセル（Paclitaxel）、3.0μM CTR-17、1.0μM CTR-20、又は5.0μMノコダゾール（Nocodazole）を含有する反応混合物に加え、次いで、チューブリンの重合を、分光光度法による340nm及び37℃で1時間毎分モニターした後、時間の関数(分)として340nmでの吸収度のプロットを示す図である。
【図２７】CTR-21及びCTR-32が、微小管重合を効率的に阻害することを示す図である。パクリタキセル（Paclitaxel）、CTR-20、CTR-21、CTR-32又はコルヒチン（Colchicine）を、高度に精製されたブタのチューブリン及び1.0mM GTPを含有する反応混合物に加えた。1分毎に蛍光発光をモニタリングしながら、反応を、37℃で1時間行った。蛍光励起は、350nmであり、発光を、430nmで記録した。
【図２８】(A)12時間、偽薬(Sham)処置し、50.0nMパクリタキセル(Tax)、50.0ng/mlノコダゾール(Noc)、3.0μM CTR-17、又は1.0μM CTR-20で処置し、次いで、細胞ライセートを、重合(Pol)及び可溶性(Sol)画分に分離し、同量のタンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、その後、α-チューブリンに特異的な抗体を用いた免疫ブロット法を行った(上部パネル)HeLa細胞の結果を示す図である。バンドは、デンシトメトリーで定量され、グラフの形態で表される(下部パネル)。(B)HeLa細胞を、CTR-17又はCTR-20の異なる濃度で処置し、図28Aについて記載される通り分画及び免疫ブロット法にかけた。
【図２９−１】CTR-17(A)及びCTR-20(B)が、用量依存的な方式でチューブリンの内部トリプトファン蛍光を消光したことを実証しているプロットを示す図である。25mM PIPES緩衝液に溶解した、精製されたチューブリンを、異なる濃度のCTR化合物の存在下又は非存在下で、37℃で30分間インキュベートした。
【図２９−２】蛍光を、295nmでの反応混合物の励起によりモニターし、発光スペクトルを、315から370nmまで記録し、解離定数を決定するためのCTR-17(C)及びCTR-20(D)の薬物濃度の関数としての蛍光強度の変化のプロットを示す図である。ΔFは、CTR化合物によって結合された場合、チューブリンの蛍光強度の変化である。データは、5つの独立した実験の平均である。
【図３０−１】(A)コルヒチン（Colchicine）に類似のCTR-17及びCTR-20が、チューブリンにおいてビンブラスチン（Vinblastine）結合部位に結合されなかったことが示唆されている結果を示す図である。コルヒチン、CTR-17、CTR-20、又はビンブラスチン各25μMを、1時間チューブリンでインキュベートして、チューブリンとこれらの各化合物との間の複合体の形成を促進した。得られた複合体を、蛍光性BODIPY FL-ビンブラスチン5μMで30分間インキュベートして、各化合物のチューブリンへの結合が、ビンブラスチンと競合するかどうか決定した。(B)CTR-17は、コルヒチン結合部位で又はその近傍で、チューブリンに結合する。チューブリン蛍光性コルヒチン複合体を、ビンブラスチン又はCTR-17の濃度を増加させながら、インキュベートした。CTR-17は、(蛍光性)コルヒチンと競合したが、ビンブラスチンは、(蛍光性)コルヒチンと競合しなかった。
【図３０−２】(CTR-17(C)及びCTR-20(D)は、用量依存的な方式で、コルヒチン（Colchicine）-チューブリン複合体の蛍光を抑制した。チューブリンを、コルヒチンの濃度が3.0、5.0及び8.0μM(CTR-17の場合)又は1.0、3.0及び5.0μM(CTR-20の場合)である3つの別々のセットで、異なる濃度のCTR-17又はCTR-20を用いて1時間インキュベートした。CTR-17(E)及びCTR-20(F)の阻害定数。最終のチューブリン複合体(図30C及び図30D)の蛍光強度を用いて、改変されたDixonプロットを利用した阻害濃度(Ki)を決定した。Fは、CTR-17(若しくはCTR-20)-コルヒチン-チューブリンの複合体又はビンブラスチン-コルヒチン-チューブリン複合体の蛍光であり、F0は、コルヒチン-チューブリン複合体の蛍光である。データは、少なくとも4つの独立した実験の平均である。
【図３１】(A)チューブリン(PDBコード:1SA0)の3D X線構造を用いて、コルヒチン（Colchicine）、CTR-17、CTR-20、ポドフィロトキシン（Podophyllotoxin）及びビンブラスチン（Vinblastine）のチューブリン-結合部位を予測する分子のドッキングの結果;及び(B)コルヒチン、CTR-17、CTR-20及びポドフィロトキシンの化学構造の画像を示す図である。
【図３２−１】3Dパターンでのチューブリンヘテロ二量体(PDBコード:1SA0)とコルヒチン(A)との間の予測された相互作用の画像を示す図である。2Dリガンド相互作用図は、4Åからコルヒチン(A')までの距離内のアミノ酸と化合物との間の潜在的な化学的相互作用を示す図である。
【図３２−２】3Dパターンでのチューブリンヘテロ二量体(PDBコード:1SA0)とCTR-20(B)との間の予測された相互作用の画像を示す図である。2Dリガンド相互作用図は、4ÅからCTR-20(B')までの距離内のアミノ酸と化合物との間の潜在的な化学的相互作用を示す図である。
【図３２−３】3Dパターンでのチューブリンヘテロ二量体(PDBコード:1SA0)とCTR-17(C)との間の予測された相互作用の画像を示す図である。2Dリガンド相互作用図は、4ÅからCTR-17(C')までの距離内のアミノ酸と化合物との間の潜在的な化学的相互作用を示す図である。
【図３３】(A)親KB-3-1及びMDR1過剰発現KB-C-2同系細胞株から調製した全細胞抽出物のウエスタンブロット法;及び(B)親H69及びMRP1過剰発現H69-AR同系細胞株から調製した全細胞抽出物のウエスタンブロット法の画像を示す図である。β-Actin：β-アクチン。
【図３４Ａ】グラフの形態でTable 8(表8)に示されたCTR-17データの部分を示す図である。CIは、組合せ指数を示す。CI<1.0、CI=1.0及びCI>1.0は、それぞれ相乗的、相加的及び拮抗的である(Chou、2006年)。示されたデータは、少なくとも4つの独立した実験の3回の平均±標準誤差値である。Paclitaxe：パクリタキセル。
【図３４Ｂ】グラフの形態でTable 8(表8)に示されたCTR-20データの部分を示す図である。CIは、組合せ指数を示す。CI<1.0、CI=1.0及びCI>1.0は、それぞれ相乗的、相加的及び拮抗的である(Chou、2006年)。示されたデータは、少なくとも4つの独立した実験の3回の平均±標準誤差値である。Paclitaxe：パクリタキセル。
【図３５Ａ】CTR化合物が、類似の効果で多剤耐性及び感受性細胞を死滅させることを示す図である。多剤耐性MDA-MB231TaxR細胞は、高レベルのP-糖タンパク質(P-gp;MDR1)を発現する。親MDA-MB231(WT)と共に、異なる濃度のパクリタキセル（Paclitaxe）(2.0、10.0、15.0、30.0及び100.0nM)で選択されるMDA-MB231細胞の全細胞抽出物を、抗-MDR1抗体を用いてSDS-PAGE及びウエスタンブロット法にかけた。GAPDHを、ローディングコントロールとして用いた。
【図３５Ｂ】CTR化合物が、類似の効果で多剤耐性及び感受性細胞を死滅させることを示す図である。MDR1過剰発現MDA-MB231TaxR(100nMパクリタキセル（Paclitaxe）で選択された)及びその親MDA-MB231細胞は、類似の効果によりCTR化合物によって死滅し、MDA-MB231TaxRは、MDA-MB231よりも、パクリタキセルに対して114倍を超える抵抗性があり、ビンブラスチン（Vinblastine）に対して少なくとも15倍抵抗性がある。Colchicine：コルヒチン。
【図３６】CTR-20、CTR-21及びCTR-32が、親RPMI-8226多発性骨髄腫細胞と類似の効力を有するボルテゾミブ（Bortezomib）耐性RPMI-8226細胞(RPMI-8226BTZR)を死滅させることを示す図である。
【図３７Ａ】パクリタキセルと組み合わせて用いた場合、CTR-20、CTR-21及びCTR-32が、多剤耐性MDA-MB231TaxR(100nMで選択される)細胞を死滅させる上で相乗的であることを示す図である。MDA-MB231TaxRに対するパクリタキセルと組み合わせたCTR-20の相乗効果。レーンは、300nMパクリタキセル(Tax)(レーン1)、312.5nM CTR-20(レーン2、5、8及び11)、312.5nM CTR-20プラス300nMパクリタキセル(レーン3)、150nMパクリタキセル(レーン4)、312.5nM CTR-20プラス150nMパクリタキセル(レーン6)、75nMパクリタキセル(レーン7)、312.5nM CTR-20プラス75nMパクリタキセル(レーン9)、37.5nMパクリタキセル(レーン10)、及び312.5nM CTR-20プラス37.5nMパクリタキセル(レーン12)を示す。「CI」は、組合せ指数を表し:CI<1.0、CI=1.0及びCI>1.0は、それぞれ相乗的、相加的及び拮抗的である。示されたデータは、少なくとも3つの独立した実験の3回の平均±標準誤差値である。Combination：組合せ。
【図３７Ｂ】パクリタキセルと組み合わせて用いた場合、CTR-20、CTR-21及びCTR-32が、多剤耐性MDA-MB231TaxR(100nMで選択される)細胞を死滅させる上で相乗的であることを示す図である。MDA-MB231TaxR(100nMで選択される)に対するパクリタキセル(Tax)と組み合わせたCTR-21の相乗効果。レーンは、300nMパクリタキセル(Tax)(レーン1)、23nM CTR-21(レーン2、5、8、11及び14)、23nM CTR-21プラス300nMパクリタキセル(レーン3)、150nMパクリタキセル(レーン4)、23nM CTR-21プラス150nMパクリタキセル(レーン6)、75nMパクリタキセル(レーン7)、23nM CTR-21プラス75nMパクリタキセル(レーン9)、37.5nMパクリタキセル(レーン10)、23nM CTR-21プラス37.5nMパクリタキセル(レーン12)及び18.75nMパクリタキセル(レーン13)、23nM CTR-21プラス18.75nMパクリタキセル(レーン15)を示す。「CI」は、組合せ指数を表し:CI<1.0、CI=1.0及びCI>1.0は、それぞれ相乗的、相加的及び拮抗的である。示されたデータは、少なくとも3つの独立した実験の3回の平均±標準誤差値である。Combination：組合せ。
【図３７Ｃ】パクリタキセルと組み合わせて用いた場合、CTR-20、CTR-21及びCTR-32が、多剤耐性MDA-MB231TaxR(100nMで選択される)細胞を死滅させる上で相乗的であることを示す図である。(100nMで選択される)DA-MB231TaxRに対するパクリタキセルと組み合わせたCTR-32の相乗効果。レーンは、300nMパクリタキセル(レーン1)、23nM CTR-32(レーン2、5、8、11及び14)、23nM CTR-32プラス300nMパクリタキセル(レーン3)、150nMパクリタキセル(レーン4)、23nM CTR-32プラス150nMパクリタキセル(レーン6)、75nMパクリタキセル(レーン7)、23nM CTR-32プラス75nMパクリタキセル(レーン9)、37.5nMパクリタキセル(レーン10)、23nM CTR-32プラス37.5nMパクリタキセル(レーン12)及び18.75nMパクリタキセル(レーン13)、23nM CTR-32プラス18.75nMパクリタキセル(レーン15)を示す。「CI」は、組合せ指数を表し:CI<1.0、CI=1.0及びCI>1.0は、それぞれ相乗的、相加的及び拮抗的である。示されたデータは、少なくとも3つの独立した実験の3回の平均±標準誤差値である。Combination：組合せ。
【図３８】MDA-MB231細胞に対するABT-737と組み合わせて用いた場合、CTR-20が、相乗的であることを示す図である。(A)レーンは、6.25μM ABT-737(レーン1、4及び7)、0.4μM CTR-20(レーン2)、0.4μM CTR-20プラス6.25μM ABT-737(レーン3)、0.2μM CTR-20(レーン5)、0.2μM CTR-20プラス6.25μM ABT-737(レーン6)、0.1μM CTR-20(レーン8)及び0.1μM CTR-20プラス6.25μM ABT-737(レーン9)を示す。(B)レーンは、3.125μM ABT-737(レーン1、4及び7)、0.4μM CTR-20(レーン2)、0.4μM CTR-20プラス3.125μM ABT-737(レーン3)、0.2μM CTR-20(レーン5)、0.2μM CTR-20プラス3.125μM ABT-737(レーン6)、0.1μM CTR-20(レーン8)及び0.1μM CTR-20プラス3.125μM ABT-737(レーン9)を示す。CIは、組合せ指数を示す。示されたデータは、少なくとも3つの独立した実験の3回の平均±標準誤差値である。Combination：組合せ。
【図３９】CTR-20、ABT-737及びMDA-MB231に対する2つの組合せのフローサイトメトリープロファイルを示す図である。MDA-MB231細胞は、6、12、24、48又は72時間(h)、偽薬(Sham)処置した又は6.25μM ABT-737、3.13μM ABT-737、0.4μM CTR-20(CTR)、0.4μM CTR-20プラス6.25μM ABT-737又は0.4μM CTR-20プラス3.13μM ABT-737で処置した。0.4μM CTR-20プラス6.25μM ABT-737の組合せが、処置の72時間までにMDA-MB231を完全に死滅させたことに留意されたい。
【図４０】ABT-737と組み合わせたCTR-20が、Bcl2アポトーシス経路によって細胞を死滅させうるということを示すウエスタンブロットデータを示す図である。CTR-20、ABT-737で又は2つの組合せで12時間処置したMDA-MB231細胞から調製した全細胞抽出物で行ったウエスタンブロット法。免疫染色を、ブロット法の右側に列挙したタンパク質に特異的な抗体を用いて行った。GAPDHを、ローディングコントロールとして用いた。「p-」は、リン酸化を示す。
【図４１】NCI-60癌パネルのスクリーニングから得られたデータの要約を示す図である。10μMのCTR-20を用いて、6種の白血病細胞株、9種の非小細胞肺癌細胞株、7種の結腸直腸癌細胞株、6種のCNS癌細胞株、9種の黒色腫細胞株、7種の卵巣癌細胞株、7種の腎癌細胞株、2種の前立腺癌細胞株及び6種の乳癌細胞株を含めた、NCI-60癌細胞株に対する薬物の効果を検査した。スクリーニング方法を、スルホロダミンB(SRB)比色アッセイにより行った。
【図４２Ａ】(A)単独の又はパクリタキセルと組み合わせた、薬物治療に応答した、処置後の日「D」の関数としての腫瘍サイズ(容積(mm3))のプロットを示す図である。括弧内の数字は、体重mg/kgである。Control：対照。
【図４２Ｂ】(B)ビヒクルのみで処置した(最上段)又は薬物パクリタキセル(Tax;最上部から2列目)、CTR-17(最上部から3列目);CTR-20(最下部から3列目)、パクリタキセル及びCTR-17(最下部から2列目)、並びにパクリタキセル及びCTR-20(最下段)で処置したMDA-MB-231ヒト転移性乳癌細胞を移植された代表的なATH490胸腺欠損マウスの例示的な画像を示す図である。括弧内の数字は、体重mg/kgである。Sham control：偽薬対照。
【図４３】薬物治療後の日(0、2、6、14、20、24、27又は30)の関数として、ビヒクル（Vihicle）、パクリタキセル(Tax)、CTR-17、CTR-20、パクリタキセル及びCTR-17又はパクリタキセル及びCTR-20で処置した6週齢のATH40胸腺欠損ヌードマウスの正規化された体重を示すプロットである。括弧内の数字は、体重1kg当たりmg単位での薬物濃度を示す。ATH490マウスの体重は、0日目の体重(100%)に基づき正規化された。
【図４４−１】処置の30日後に測定した、異なる処置から得られたATH490マウスの4つの異なる臓器(肝臓(A)及び脾臓(B))の質量のプロットを示す図である。すべての値は、平均±標準誤差として示される。各臓器質量(%)は、全体重により正規化された。Sham：偽薬。
【図４４−２】処置の30日後に測定した、異なる処置から得られたATH490マウスの4つの異なる臓器(腎臓(C)及び肺(D))の質量のプロットを示す図である。すべての値は、平均±標準誤差として示される。各臓器質量(%)は、全体重により正規化された。Sham：偽薬。
【図４５Ａ】(A)偽薬（Sham）(上図左)、10mg/kgパクリタキセル(上図右)、CTR-17 30mg/kg(中央左)、CTR-20 30mg/kg(中央右)、パクリタキセル5mg/kgプラスCTR-17 15mg/kg(下図左)及びパクリタキセル5mg/kgプラスCTR-20 15mg/kg(右下)で治療したATH490胸腺欠損マウスの肝臓の画像を示す図である。白い矢印は、有糸分裂細胞を示す。Vihicle：ビヒクル。
【図４５Ｂ】(B)(A)の治療レジメンの関数として、1mm2当たりの有糸分裂細胞の数を示すプロットである。Control：対照。
【図４６】偽薬（Sham）処置し(ビヒクルのみ;上図左)又はパクリタキセル10mg/kg(上図右)、CTR-17 30mg/kg(中央左)、CTR-20 30mg/kg(中央右)、パクリタキセル5mg/kgプラスCTR-17 15mg/kg(下図左)及びパクリタキセル5mg/kgプラスCTR-20 15mg/kg(右下)で30日間処置し、その後、脾臓組織が、H & E染色された後、毒性分析されたATH490胸腺欠損マウスの脾臓の画像を示す図である。矢印は、赤脾髄(RP)中のマクロファージの存在を示す。画像は、Zeiss EPI-蛍光顕微鏡(10×対物)を用いて撮られた。
【図４７】偽薬（Sham）(ビヒクルのみ;上図左)処置し又は10mg/kgパクリタキセル(上図右)、CTR-17 30mg/kg(中央左)、CTR-20 30mg/kg(中央右)、パクリタキセル5mg/kgプラスCTR-17 15mg/kg(下図左)及びパクリタキセル5mg/kgプラスCTR-20 15mg/kg(右下)で処置したATH490マウスの腎臓の画像を示す図である。30日目に、腎臓を回収し、H&Eで染色し、Zeiss EPI-蛍光顕微鏡(40×対物)下で観察した。上図右の画像に向けられている矢印は、硝子質（Hyaline）を示す。Glomerulus：糸球体。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
I.定義
別段の指示がない限り、本セクション及び他のセクションに記載されている定義及び実施形態は、本明細書で記載される本開示のすべての実施形態及び態様に適用可能であるということを意図しており、これらは、当業者によって理解されるものとして適している。
【００３４】
本開示の実施形態では、本明細書に記載した化合物は、少なくとも1つの不斉中心を有する。化合物が、1つ以上の不斉中心を有する場合、これらは、ジアステレオマーとして存在することができる。任意の割合におけるかかるすべての異性体及びそれらの混合物が、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。本化合物の立体化学が、本明細書に列挙された任意の所与の化合物において示された通りであり得、かかる化合物はまた、別の立体化学を有する対応する化合物のある量(例えば、20%未満、場合によっては、10%未満、場合によっては、5%未満、場合によっては、3%未満)を含むこともできるということが更に理解されるべきである。
【００３５】
本開示の実施形態では、本明細書に記載した化合物は、幾何異性を可能にする少なくとも1つの二重結合を有し、例えば、本化合物は、シス若しくはトランス異性体として存在することができる。任意の割合におけるかかるすべての異性体及びそれらの混合物は、本開示の範囲内において包含されることが理解されるべきである。本化合物の異性が、本明細書に列挙される任意の所与の化合物に示される通りであり得、かかる化合物はまた、別の異性を有する対応する化合物のある量(例えば、20%未満、場合によっては、10%未満、場合によっては、5%未満、場合によっては、3%未満)を含むこともできるということが更に理解されるべきである。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」とは、単独で用いられても別の基の一部として用いられても、直鎖又は分枝鎖、飽和のアルキル基を意味する。参照されるアルキル基において可能である炭素原子の数は、数値で示される接頭辞「Cn1-n2」によって示される。例えば、用語C1〜6アルキルとは、1、2、3、4、5又は6個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」とは、単独で用いられても別の基の一部として用いられても、直鎖又は分枝鎖、不飽和のアルケニル基を意味する。参照されるアルケニル基において可能である炭素原子の数は、数値で示される接頭辞「Cn1〜n2」によって示される。例えば、用語C2〜6アルケニルとは、2、3、4、5又は6個の炭素原子及び少なくとも1つの二重結合を有するアルケニル基を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「ハロ」とは、ハロゲン原子を指し、F、Cl及びBrが含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「ハロアルキル」とは、利用可能な水素原子のすべてを含めた、1個又は複数が、ハロゲン原子によって置き換えられるアルキル基を指す。参照されるハロアルキル基において可能である炭素原子の数は、数値で示される接頭辞「Cn1〜n2」によって示される。例えば、用語「C1〜6ハロアルキル」とは、1、2、3、4、5又は6個の炭素原子を有するハロアルキル基を意味する。一実施形態では、ハロゲンは、フッ素であり、この場合では、ハロアルキルは、「フルオロアルキル」基として、場合によっては本明細書で言及される。これは、水素原子のすべてが、フッ素原子によって置き換えられる一実施形態である。例えば、ハロアルキル基は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等となりうる。これは、ハロアルキル基がトリフルオロメチルである本開示の一実施形態である。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「対象」には、哺乳動物を含めた動物界のすべてのメンバーが含まれ、場合によっては、ヒトを指す。
【００４１】
用語「医薬的に許容される」とは、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト等の治療に適合することを意味する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「医薬的に許容される塩」とは、対象の治療に適合する酸付加塩を意味する。
【００４３】
「対象の治療に適合する酸付加塩」は、任意の塩基性化合物の任意の非毒性有機若しくは無機塩である。酸付加塩を形成する塩基性化合物には、例えば、プロトン化に感受性であるアミン基を含む化合物が含まれる。適当な塩を形成する例示的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸、並びに金属塩、例えば、オルトリン酸一水素ナトリウム及び硫酸水素カリウムが含まれる。適当な塩を形成する例示的な有機酸には、モノ-、ジ-、及びトリカルボン酸、例えば、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸及びサリチル酸、並びにスルホン酸、例えば、p-トルエンスルホン酸及びメタンスルホン酸等が含まれる。かかる塩は、水和、溶媒和又は実質的に無水の形態で存在することができる。一般に、酸付加塩は、水及び様々な親水性有機溶媒により溶けやすく、これらの遊離塩基の形態と比べて、融点がより高いことが一般に実証されている。適当な塩の選択は、当業者によってなされうる。所望の酸付加塩の形成は、例えば、標準的な技法を用いて達成される。例えば、中性化合物は、適当な溶媒中の所望の酸で処置され、次いで、それによって形成される塩は、ろ過、抽出及び/又は任意の他の適当な方法によって単離される。
【００４４】
化合物に関して本明細書で使用される場合、用語「溶媒和物」とは、化合物と、化合物が沈殿される又は化合物が作製される溶媒との間で形成される複合体を指す。したがって、本明細書で使用される場合、用語「溶媒和物」とは、化合物、又は化合物の塩を意味し、適当な溶媒の分子は、結晶格子に取り込まれる。適当な溶媒の例は、エタノール、水等である。水が、溶媒であるとき、分子は、「水和物」と場合によっては称される。溶媒和物の形成は、化合物及び溶媒和物に応じて変わる。一般に、溶媒和物は、適切な溶媒に化合物を溶解し、冷却によって又は貧溶媒を用いて溶媒和物を単離することにより形成される。溶媒和物は、通常、周囲条件下で乾燥する又は共沸混合する。ある特定の溶媒和物を形成するために適当な条件の選択が、当業者によってなされる。
【００４５】
化合物に関して本明細書で使用される場合、用語「プロドラッグ」とは、生物学的条件下で反応して、化合物を生成する化合物の誘導体を指す。一実施形態では、プロドラッグは、利用可能なアミノ基で形成される従来のエステルを含む。例えば、利用可能なアミノ基は、塩基の存在下で、場合によっては、不活性な溶媒(例えば、ピリジン中の酸塩化物)中で、活性化された酸を用いてアシル化される。プロドラッグとして用いられているいくつかの一般的なエステルは、フェニルエステル、脂肪族(C1〜C24)エステル、アシルオキシメチルエステル、カルバメート及びアミノ酸エステルである。
【００４６】
本出願の1種又は複数の化合物は、例えば、対象に投与される又は「有効量」で用いられる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」等とは、所望の結果を達成するのに必要な投与量で及びその期間に、有効な量を意味する。例えば、癌の治療に関連して、本開示の1種又は複数の化合物の有効量は、例えば、本開示の1種又は複数の化合物を投与しない癌と比べて、癌を減少させる量である。有効量は、例えば、対象の疾患状態、年齢、性別、体重及び/又は種等の因子によって変わりうる。所与の化合物の量は、そのような量に対応し、所与の化合物、医薬製剤、投与経路、治療対象となる状態、疾患又は障害のタイプ、治療対象となる対象の同一性等の様々な因子に応じて変わるが、それでもやはり、当業者によりルーチン的に決定することができる。
【００４８】
II.化合物及びその調製の方法
微小管は、コルヒチン及びパクリタキセルを含めた、いくつかの異なる抗癌治療薬についての標的である。しかしながら、抗癌剤としてのコルヒチンの使用は、主に、その固有の毒性により、例えば、米国食品医薬品局(U.S.Food and Drug Administration)により承認されていない。したがって、本開示の試験の一目的は、微小管において最小限の毒性でコルヒチン結合部位を標的化する抗癌剤を開発することである。いくつかのカルコン誘導体を合成し、試験した。3つのヒト乳癌細胞株(MDA-MB-468、MDA-MB-231及びMCF-7)並びにマッチしている2つの非癌乳房細胞株(184B5及びMCF-10A)による試験から得られたデータから、CTR-17及びCTR-20が、有用な抗癌リードであることが示された。本試験はまた、K562(慢性骨髄性白血病[CML]細胞株)、HeLa(子宮頚癌)、U87MG(脳腫瘍)、T98G(テモゾロミド耐性脳腫瘍)、NCI-H1975(肺癌)、A549(肺癌)、RPMI-8226(多発性骨髄腫)、RPMI-8226-BR(化合物CTR-20のみの場合、ボルテゾミブ耐性RPMI-8226細胞株)、KB-3-1(子宮頚癌)、KB-C-2(コルヒチン耐性及びパクリタキセル耐性KB-3-1細胞株)、ANBL6-BR(化合物CTR-20のみの場合、ボルテゾミブ耐性多発性骨髄腫)、H69(小細胞肺癌)及びH69AR(多剤耐性小細胞肺上皮癌)を含めて、いくつかの他の癌細胞株に拡張された。(a)CTR-17及びCTR-20は、26回(MDA-MB-468対MCF-10AにおいてCTR-17)及び24回(HeLa対MCF-10AにおいてCTR-20)まで、非癌細胞に対して優先的に癌を死滅させ、(b)CTR-17及びCTR-20は、癌細胞-特異的な方式で紡錘体チェックポイント工程で長期の細胞周期の停止を誘導し、最終的に、アポトーシスにより癌細胞死をもたらし、(c)CTR-17及びCTR-20は、チューブリン重合を阻害し、(d)CTR-17及びCTR-20の解離定数は、それぞれ4.58±0.95μM及び5.09±0.49μMであり、(e)CTR-17及びCTR-20の微小管結合部位は、コルヒチンのそれとほぼ重複し、(f)コルヒチンと違って、CTR-17及びCTR-20化合物の効果は、可逆的であり、(g)コンピュータ内での分子のドッキング試験から得られたデータから、理論に拘泥するものではないが、強力なファンデルワールス相互作用を形成することに加えて、CTR-17、CTR-20及びコルヒチンはそれぞれ、チューブリンのアミノ酸残基と1つ、2つ及び3つの水素結合(H-結合)を形成することが示唆され、(h)CTR-17及びCTR-20は、(やはりパクリタキセル/コルヒチン耐性である)MDR1過剰発現及びMRP1過剰発現多剤耐性癌細胞を死滅させ、(i)CTR-20は、ボルテゾミブ耐性多発性骨髄腫細胞を死滅させ(RPMI-8226-BR及びANBL6-BRのIC50値は、それぞれ0.28±0.03及び0.76±0.28μMであった)、(j)パクリタキセル及びCTR-17又はCTR-20を用いたMDR1過剰発現KB-C-2細胞の組合せ治療では、相乗効果が示され、(k)in vitro及び動物試験から得られたデータでは、CTR-17及びCTR-20が、抗腫瘍薬として有用であることを示し、(l)移植されたマウスによる試験から得られたデータによって、CTR-20及びパクリタキセルの1/2量の組合せが、いかなる著しい弊害をも引き起こさず、化合物単独の総投与量よりも、より効率的であるということが示されたことが判明した。同時に、一実施形態では、CTR化合物、例えば、CTR-20は、例えば、コルヒチン/パクリタキセル耐性、ボルテゾミブ耐性、及び多剤耐性腫瘍細胞を含めて、多くの異なる癌細胞を死滅させることができる有用な抗癌剤であり、非癌細胞及び正常マウスの臓器に関する本試験で観察された著しい弊害がないことがデータによって示された。更に、(m)16���の化合物(CTR-21からCTR-40)で行った試験から、これらは、腫瘍細胞を死滅させ、IC50値が5.34nM(RPMI-8226に対するCTR-21)から2.69μM(MDA-MB231に対するCTR-27)に及ぶことが示され;(n)更なる試験では、CTR-21及びCTR-32は、これらのIC50値がナノモル(nonomolar)の範囲であるため、腫瘍細胞、MDA-MB231、MCF-7、HeLa及びRPMI-8226に対して強力であることが示され、(o)同系乳房及び乳癌細胞株による試験では、CTR-17、CTR-20、CTR-21及びCTR-32が、前癌又は非癌細胞に対して、完全に悪性の細胞を優先的に死滅させることが示され、(p)CTR-21及びCTR-32は、微小管重合阻害剤であり、(q)CTR-20と同様に、CTR-21及びCTR-32は、可逆的な有糸分裂阻害剤であり、(r)CTR-20及びABT-737の組合せ、Bcl2抗アポトーシスファミリータンパク質の阻害剤は、組合せ指数が0.07〜0.10であるため、MDA-MB231トリプルネガティブ転移性乳癌に対して相乗的であり、(s)CTR-20、CTR-21及びCTR-32ボルテゾミブ耐性RPMI-8226BTZR細胞、(t)CTR-20、CTR-21及びCTR-32は、多剤耐性及びパクリタキセル耐性MDA-MB231TaxR細胞を死滅させ、やはりパクリタキセル及びCTR-20で組み合わせた場合であり、(u)CTR-20は、6種の白血病細胞株、9種の非小細胞肺癌細胞株、7種の結腸直腸癌細胞株、6種のCNS癌細胞株、9種の黒色腫細胞株、7種の卵巣癌細胞株、7種の腎癌細胞株、2種の前立腺癌細胞株及び6種の乳癌細胞株を含めた、NCI-60癌細胞株を死滅させる。
【００４９】
したがって、本開示は、式Iの化合物:
【００５０】
【化６】
2019501958.tif 000008
【００５１】
、
[式中、
Aは、O又はSであり、
nは、0、1、2又は3であり、
nが1である場合、R1は、ハロ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル又は-X-C1〜6アルキルであり、
nが2又は3である場合、各R1は、独立に、ハロ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル若しくは-X-C1〜6アルキルであり、又は2つのR1が一緒になって、隣接する2個の環炭素原子に結合されるメチレンジオキシ基を形成し、
R2は、C1〜6アルキル又はC1〜6ハロアルキルであり、
R3は、存在しないか、又はハロ、-X-C1〜6アルキル若しくは-X-C1〜6ハロアルキルであり、
各Xは、独立に、O又はSである]
又は医薬的に許容されるその塩、溶媒和物及び/若しくはプロドラッグを含む。
【００５２】
一実施形態では、Aは、Oである。他の実施形態では、Xは、Sである。
【００５３】
一実施形態では、Xは、Oである。他の実施形態では、Xは、Sである。
【００５４】
一実施形態では、R3は、存在しない。他の実施形態では、R3は、F、-X-C1〜4アルキル又は-X-C1〜4ハロアルキルである。更なる実施形態では、R3は、F、-O-C1〜4アルキル又は-O-C1〜4ハロアルキルである。R3がF、-OCH3又は-OCF3である一実施形態である。他の実施形態では、R3は、4'-OCH3、5'-OCH3、6'-OCH3、4'-OCF3、4'-F又は5'-Fである。
【００５５】
一実施形態では、R2は、C1〜4アルキル又はC1〜4ハロアルキルである。他の実施形態では、R2は、CH3又はCF3である。更なる実施形態では、R2は、CH3である。R2がCF3である本開示の一実施形態である。
【００５６】
一実施形態では、nは、0、1又は2である。他の実施形態では、nは、0又は1である。更なる実施形態では、nは、0である。nが、1である一実施形態である。他の実施形態では、nは、2である。更なる実施形態では、nは、3である。
【００５７】
一実施形態では、nは、1であり、R1は、ハロ、C1〜4アルキル、C2〜4アルケニル又は-X-C1〜4アルキルである。他の実施形態では、nは、1であり、R1は、CH3又はOCH3である。更なる実施形態では、nは、1であり、R1は、6-OCH3、7-OCH3、8-OCH3、6-OC2H5、6-SCH3、7-SCH3、6-CH3、6-C2H5、6-F、6-Cl、6-Br、7-F、7-Cl又は7-Brである。nが、1であり、R1が、6-CH3、6-OCH3又は7-OCH3である一実施形態である。他の実施形態では、nは、1であり、R1は、6-OCH3である。
【００５８】
一実施形態では、nは、2であり、各R1は、独立に、ハロ、C1〜4アルキル、C2〜4アルケニル若しくは-X-C1〜4アルキルであり、又は2つのR1が一緒になって、隣接する2個の環炭素原子に結合するメチレンジオキシ基を形成する。他の実施形態では、各R1は、独立に、CH3若しくはOCH3であり、又は2つのR1が一緒になって、隣接する2個の環炭素原子に結合されるメチレンジオキシ基を形成する。更なる実施形態では、nは、2であり、R1は、6,7-ジCH3、6,7-ジOCH3又は6,7-O-CH2-O-である。nが、2であり、R1が、6,7-ジCH3又は6,7-ジOCH3である一実施形態である。
【００５９】
一実施形態では、nは、3であり、各R1は、独立に、ハロ、C1〜4アルキル、C2〜4アルケニル又は-X-C1〜4アルキルである。他の実施形態では、nは、3であり、各R1は、独立に、CH3又はOCH3である。更なる実施形態では、nは、3であり、R1は、5,6,7-トリOCH3である。
【００６０】
一実施形態では、本化合物は、
【００６１】
【化７】
2019501958.tif 000009
【化８】
2019501958.tif 000010
【００６２】
又は医薬的に許容されるその塩、溶媒和物及び/若しくはプロドラッグから選択される。
【００６３】
他の実施形態では、本化合物は、
【００６４】
【化９】
2019501958.tif 000011
【００６５】
である。
【００６６】
更なる実施形態では、本化合物は、
【００６７】
【化１０】
2019501958.tif 000012
である。
【００６８】
一実施形態では、Aは、Oであり、本開示の化合物は、例えば、一般合成スキーム1によって示される反応順序により調製される。当業者は、そのような合成を容易に適合して、AがSである対応する化合物を調製することができる。
【００６９】
スキーム1
【００７０】
【化１１】
2019501958.tif 000013
【００７１】
本開示の一実施形態では、式Iの化合物は、Vilsmeier Haack条件下で、式IIIのアセトアニリドを、DMF及びPOCl3で処置して、式IVの2-クロロキノリン3-カルボキシアルデヒドを得る工程と;塩基性条件下(例えば、ナトリウムメトキシド又はNaOHの触媒量)で、式IVの2-クロロキノリン3-カルボキシアルデヒドの、式Vの置換アセトフェノンとのクライゼン-シュミット縮合を行って、式VIの3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-フェニルプロパ-2-エン-1-オンを得る工程と、2-クロロ基(例えば、還流下で、氷酢酸水溶液で処置)でO-求核置換を経るような条件下で、式VIの3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-フェニルプロパ-2-エン-1-オンを反応させて、式Iのキノロンカルコンを生成する工程とを含む方法によって調製される。式IIIのアセトアニリドは、場合によっては、市販で入手可能である。或いは、式IIIのアセトアニリドは、標準的な手順に従って、対応するアニリンから調製される(Vogelら、1996年)。式IからVIの化合物では、R1、R2、R3及びnは、本明細書で定義する通りである。
【００７２】
III.組成物
本開示はまた、本開示の1種又は複数の化合物及び担体を含む組成物を含む。本開示の化合物は、対象への投与又は投与に適した生物学的に適合される形態における使用又はin vivoでの使用のための医薬組成物に、場合によっては配合される。したがって、本開示は、本開示の1種又は複数の化合物及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を更に含む。
【００７３】
本開示の化合物は、当業者によって理解される通り、対象に投与することもでき又は選択された投与経路又は使用に応じて、様々な形態で用いることができる。一実施形態では、本開示の1種又は複数の化合物は、(口腔を含めた)経口若しくは(静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経鼻、肺内、くも膜下腔内、直腸、局所、パッチ、ポンプ及び経皮を含めた)非経口投与又は使用及びそれに応じて配合された化合物により、対象に投与される又は用いられる。例えば、本開示の化合物は、注射で、スプレーで、錠剤/カプレットで、粉末で、局所的に、ゲルで、液滴で、パッチによって、インプラントによって、緩徐放出ポンプによって又は投与又は使用の任意の他の適当な方法によって投与され又は用いられ、その選択は、当業者によってなされうる。
【００７４】
一実施形態では、本開示の1種又は複数の化合物は、例えば、不活性な賦形剤で若しくは同化できる食用担体で、又は硬質又は軟質シェルゼラチンカプセルで密閉されて、又は錠剤に圧縮されて、又は食事の食物で直接取り込まれて経口投与又は経口使用される。一実施形態では、治療的経口投与又は使用の場合、本開示の1種又は複数の化合物は、添加剤と一緒に取り込まれ、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート等の形態で投与される又は用いられる。経口剤形にはまた、調節放出、例えば、即時放出及び時限放出配合物が含まれる。調節放出配合物の例には、例えば、コーティング錠、浸透圧送達デバイス、コーティングカプセル、マイクロカプセル化ミクロスフェア、凝集粒子、例えば、分子ふるいタイプ粒子として、又は繊維状の小束で凝集された又は保持された、微細中空浸透繊維束若しくは細断中空浸透糸の形態で使用した、例えば、持続放出(SR)、延長放出(ER、XR、若しくはXL)、時間放出又は時限放出、制御放出(CR)、又は連続放出 (CR又はContin)が含まれる。時限放出組成物は、例えば、リポソーム又は活性化合物が、マイクロカプセル化、複層コーティング等によって差次的に分解可能なコーティングで保護されるものを配合することができる。リポソーム送達システムには、例えば、小型単層小胞、大型単層小胞及び多層小胞が含まれる。一実施形態では、リポソームは、様々なリン脂質、例えば、コレステロール、ステアリルアミン及び/又はホスファチジルコリンから形成される。
【００７５】
本開示の他の実施形態では、本開示の1種又は複数の化合物は、非経口で投与される又は用いられる。本開示の1種又は複数の化合物の溶液は、例えば、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース等と場合によっては混合された、水で調製される。更なる例では、分散体は、アルコールと共に又はアルコール無しで、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、DMSO及びそれらの混合物中で、及び油中で調製される。注射の投与又は使用に適した医薬品形態には、無菌の注射剤又は分散体の用時溶解調製のための無菌水溶液又は分散体及び無菌粉末が含まれる。当業者は、適当な配合物を調製する方法を知っているはずである。
【００７６】
IV.治療の方法及び使用
本開示の化合物は新しく、したがって、本開示は、単独でも他の原薬と組み合わせても、治療方法、診断検査における、及び研究ツールとしての使用を含めた、本開示の化合物についてのすべての使用を含む。
【００７７】
同時に、本試験から得られたデータから、CTR化合物、例えば、CTR-20は、例えば、非癌細胞及び正常マウス臓器において観察される著しい弊害がなく、コルヒチン/パクリタキセル耐性、ボルテゾミブ耐性、及び多剤耐性腫瘍細胞を含めた、多くの異なる癌細胞を死滅させることができる有用な抗癌剤であることが示される。
【００７８】
したがって、一実施形態では、本開示の化合物は、医薬品として有用である。したがって、本開示は、医薬品として使用するための本開示の1種又は複数の化合物を含む。
【００７９】
本開示はまた、本開示の1種又は複数の化合物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法も含む。本開示はまた、対象において癌を治療するための本開示の1種又は複数の化合物の使用、対象において癌を治療するための医薬品の調製用の本開示の1種又は複数の化合物の使用、及び対象において癌を治療するために用いるための本開示の1種又は複数の化合物も含む。
【００８０】
一実施形態では、癌は、乳癌、白血病、子宮頚癌、脳腫瘍、肺癌、膀胱癌、腎癌、結腸直腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、多発性骨髄腫又は他の血液がんである。他の実施形態では、癌は、コルヒチン耐性、パクリタキセル耐性、ボルテゾミブ耐性、ビンブラスチン耐性及び/又は多剤耐性腫瘍細胞を含む。
【００８１】
治療方法又は使用は、場合によっては、単回投与又は使用からなる、或いは、一連の投与又は使用を含む、対象への投与又は有効量の本開示の1種又は複数の化合物の使用を含む。例えば、本開示の化合物は、少なくとも1週間に1回投与される又は使用される。しかしながら、他の実施形態では、本化合物は、所与の治療又は使用のために、3週間に1回から、又は1週間に1回から1日1回対象に投与される。他の実施形態では、本化合物は、1日2、3、4、5又は6回投与される又は用いられる。治療期間又は使用の長さは、様々な因子、例えば、癌の重症度、対象の年齢、配合物中の1種又は複数の化合物の濃度、本開示の化合物の活性、及び/又はその組合せに依存する。治療又は使用のために用いられる化合物の有効量が、ある特定の治療レジメン(regime)又は使用の経過に伴って増加しても減少してもよいということをやはり理解されたい。投与量の変化は、当技術分野で公知の標準的な診断検査によってもたらされ、明らかになりうる。いくつかの場合では、長期間の投与又は使用を要する。例えば、本開示の1種又は複数の化合物は、対象を治療するのに十分な量で及び期間中、投与される又は用いられる。
【００８２】
癌の程度及び/又は望ましくない臨床像は、癌を治療していない場合に比べて、場合によっては、少なくなり(軽減され)且つ/又は進行の時間経過を遅くする又は延長する。
【００８３】
本開示の1種又は複数の化合物は、単独で又は癌を治療するために有用な他の治療薬と組み合わせて、投与しても用いてもよい(場合によっては、「抗癌剤」として本明細書で言及される)。他の公知の治療薬と組み合わせて投与される又は用いられる場合、これは、本開示の1種又は複数の化合物が、これらの治療薬と同時に投与される又は用いられる一実施形態である。本明細書で使用される場合、2つの物質の対象への投与又は使用に関して、用語「同時の」とは、これらが、個体において同時に生物学的に活性があるように、2つの物質のそれぞれを提供することを意味する。投与又は使用の正確な詳細は、互いの存在下で2つの物質の薬物動態に依存し、互いに数時間以内に2つの物質を投与する又は用いる、更には、薬物動態が適している場合、一方の物質の投与又は使用の24時間以内に、もう一方の物質を投与する又は用いることを含むことができる。適当な投与レジメンの設計は、当業者にはルーチン的である。特定の実施形態では、2つの物質は、ほぼ同時に、すなわち、互いの数分以内に、又は両方の物質を含有する単一の組成物の形態で投与される又は用いられる。これは、2つの物質の組合せが、同時でないやり方で、対象に投与される又は用いられる更なる実施形態である。
【００８４】
一実施形態では、他の薬剤は、有糸分裂阻害剤(例えば、パクリタキセル);bcl2阻害剤(例えば、ABT-737);プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブ);シグナル伝達阻害剤(例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、イマチニブ又はスニチニブ);DNA修復の阻害剤(例えば、イニパリブ、テモゾロミド又はドキソルビシン);及びアルキル化剤(例えば、シクロホスファミド)からなる群から選択される。他の実施形態では、他の抗癌剤は、パクリタキセルである。
【００８５】
本開示の化合物の投与量は、多くの因子、例えば、化合物の薬理特性、投与又は使用のモード、対象の年齢、健康及び体重、癌の症状の性質及び程度、治療又は使用の頻度及びそれを使用する場合、併用治療又は使用のタイプ、及び対象における化合物のクリアランス率に応じて変わりうる。当業者は、上記の因子に基づき、適切な投与量を決定することができる。一実施形態では、本開示の化合物は、必要な場合、臨床での反応に応じて、場合によっては、調整される適当な投与量で、最初に投与される又は用いられる。代表的な例として、本開示の1種又は複数の化合物の経口投与量は、ヒト成人又は動物の場合1日1mg未満から1日1000mgに及ぶ。本開示の一実施形態では、医薬組成物は、経口投与又は使用のために配合され、化合物は、例えば、錠剤当たり有効成分0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、75.0、80.0、90.0、100.0、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950又は1000mgを含有する錠剤の形態である。一実施形態では、本開示の化合物は、単回の1日量で投与される又は用いられる又は総1日量は、1日量を2回、3回又は4回に分けることができる。
【００８６】
本開示の試験では、MDR1過剰発現KB-C-2又はMDA-MB231TaxR細胞の、パクリタキセル及びCTR-17、CTR-20、CTR-21又はCTR-32との組合せ治療は、相乗効果を示し、移植されたマウスを用いた試験から得られたデータによって、CTR-20及びパクリタキセルの1/2投与量の組合せが、いかなる著しい弊害をも引き起こさず、単独でいずれかの化合物の総投与量よりも効率的であることが示された。
【００８７】
したがって、本開示の1種又は複数の化合物が、1種又は複数の抗癌剤と組み合わせて投与される又は用いられる実施形態では、本開示の1種又は複数の化合物の投与量は、単独で投与される又は用いられる場合の本開示の1種又は複数の化合物の投与量よりも場合によっては少ない。他の実施形態では、本開示の1種又は複数の化合物の投与量は、単独で投与される又は用いられる場合の本開示の1種又は複数の化合物の投与量の2分の1である。
【００８８】
本開示の1種又は複数の化合物が、1種又は複数の抗癌剤と組み合わせて投与される又は用いられる実施形態では、他の抗癌剤の投与量は、単独で投与される又は用いられる場合の他の抗癌剤の投与量よりも場合によっては少ない。他の実施形態では、他の抗癌剤の投与量は、単独で投与される又は用いられる場合の他の抗癌剤の投与量の2分の1である。
【００８９】
次の限定しない例は、本開示の例示的なものである。
【実施例】
【００９０】
(実施例1)
化合物の合成及び特徴付け
I.材料及び方法
用いた化学薬品及び溶媒は、市販で入手可能であり、試薬グレードのものである、融点を、Veegoデジタル融点装置において、ガラス製開放型毛細管内で決定し、補正しなかった。これらの化合物の赤外(IR)スペクトルを、ATRアクセサリを用いてSchimadzu FT-IR 8400S赤外分光光度計において記録した。1H NMRスペクトルを、溶媒としてDMSO-d6及び内部標準としてTMSを用いて、Bruker Avance II 400分光計で記録した。質量スペクトル分析を、ESIモードでApplied Biosystem QTRAP 3200 MS/MS系を用いて行った。反応を、下塗りされたシリカゲルアルミニウムプレート(Kieselgel 60、254、E.Merck、Germany)を用いたTLCによってモニターし、区画を、紫外線照射下で視覚的に検出した。
【００９１】
II.一般的な合成手順
スキーム2:式Iのキノロンカルコンの一般的な合成
【００９２】
【化１２】
2019501958.tif 000014
【００９３】
式Iのキノロンカルコンの合成を、スキーム2に例示される反応順序に従って行った。式中、本明細書に記載した化合物について必要に応じて、nは、0、1又は2であり、R1は、6-OCH3、7-OCH3、8-OCH3、6,7-ジOCH3、6-CH3、6,7-ジCH3、6-Cl、6-Br又は7-Clであり、R2は、CH3、C2H5又はCF3であり、R3は、存在しないか又はOCH3、OCF3又はFであった。合成経路に利用したアセトアニリド(2a-2h)は、市販で入手可能な又は標準的な手順(Vogelら、1996年)に従って対応するアニリン(1a-1h)から合成した。次いで、アセトアニリド(2a-2h)を、Vilsmeier Haack条件下でDMF及びPOCl3で処置して、2-クロロキノリン3-カルボキシアルデヒド(3a-3h)(Meth-Cohnら、1981年)を得た。次いで、塩基性条件下で(ナトリウムメトキシド又はNaOHの触媒量)、2-クロロキノリン-3-カルバルデヒド(3a-3h)の、所望の置換アセトフェノン(4a-4i)とのクライゼン-シュミット縮合によって、高収率で3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-フェニルプロパ-2-エン-1-オン(QC-01-QC-25)を提供した(Dominguezら、2001年;Liら、1995年)。次いで、還流条件下で氷酢酸水溶液による処置後、3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-フェニルプロパ-2-エン-1-オンは、キノリン環の2-クロロ基におけるO-求核置換を受けて、対応する式Iのキノロンカルコン(CTR-17-CTR-40)を得た。合成された化合物の構造上の同一性を、これらの赤外(IR)分光分析、1H NMR及び質量スペクトルデータに基づき確立した。
【００９４】
(a)2クロロ-3-ホルミルキノリン(3a-3h)の合成のための一般手順(Meth-Cohnら、1981年)
アセトアニリド(2a)/置換アセトアニリド(2b-2h)(0.05mol)を、ジメチルホルムアミド9.6ml(0.125mol)に溶解し、本溶液に、オキシ塩化リン32ml(0.35mol)を、0℃で徐々に加えた。反応混合物を、乾燥管に取り付けた還流冷却器を装備した丸底フラスコ(RBF)に入れ、75〜80℃の油浴で4〜16時間加熱した。次いで、溶液を、室温まで冷却し、続いて、氷水100mlに注いだ。形成された沈殿物を、ろ過により収集し、酢酸エチルから再結晶化した。
【００９５】
(b)2-クロロキノリニルカルコン(QC-01-QC-25)の合成のための一般手順(Dominguezら、2001年;Liら、1995年)
メタノール(4ml)中の2-クロロ-3-ホルミルキノリン(3a-3h)(1mmol)、それぞれのアセトフェノン(4a-4i)(1mmol)及び塩基(ナトリウムメトキシド(触媒の)又は水酸化ナトリウム(1ペレット))の混合物を、室温で6〜24hr撹拌した。得られた沈殿物を、ろ過により収集し、水で洗浄し、DMF-H2O又はEtOH-H2Oから再結晶化した。
【００９６】
(c)式I(CTR-17からCTR-40)の3-(3-オキソ-3-フェニルプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オンの合成のための一般手順
3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-フェニルプロパ-2-エン-1-オン(QC-01-QC-25)(0.001mol)の70%酢酸(10ml)懸濁液を、還流下で4〜6時間加熱した。(TLCにおける単一スポットによって示される通り)反応の終了後、反応混合物を、室温まで冷却し、沈殿した固形生成物を、ろ過した。ろ過した生成物を、水で洗浄し、乾燥し、メタノール又はDMF/水中で再結晶化した。
【００９７】
III.本開示の代表的な化合物の合成
(a)(E)-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-17)の合成
【００９８】
2-クロロキノリン-3-カルバルデヒド(3a)
【００９９】
【化１３】
2019501958.tif 000015
【０１００】
標題化合物を、2クロロ-3-ホルミルキノリンの合成についての一般手順中のサブセクションII(a)下の前述のプロトコールに従って、アセトアニリド(2a)から調製した。
【０１０１】
収率72%;M.P.148〜150℃(Lit.149℃)(Srivastava and Singh、2005年);FT-IR(ATR)υ(cm-1):3044(芳香族C-H)、2870(アルデヒドC-H)、1684(C=O)、1574(C=N)、1045(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 10.57 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.90 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 8.0 Hz, 1H); MS-API: [M+H]+ 192 (計算値191.01).
【０１０２】
(E)-3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-(2-メトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-01)
【０１０３】
【化１４】
2019501958.tif 000016
【０１０４】
標題化合物を、2-クロロキノリニルカルコンの合成についての一般手順中のサブセクションII(b)下の前述のプロトコールに従って、2-クロロキノリン-3-カルバルデヒド(3a)の2-メトキシアセトフェノン(4a)とのクライゼン-シュミット縮合によって調製した。
【０１０５】
収率62%;M.P.113〜115℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3067(芳香族C-H)、1653(C=O)、1603(C=C)、1242(C-O-C)、1045(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 8.43 (s, 1H), 8.08-8.00 (m, 2H), 7.87 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.77 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 7.5, 1.8 Hz, 1H), 7.63-7.56 (m, 1H), 7.55-7.45 (m, 2H), 7.11-7.01 (m, 2H), 3.94 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 324.1 (計算値323.07).
【０１０６】
(E)-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-17)
【０１０７】
【化１５】
2019501958.tif 000017
【０１０８】
標題化合物を、3-(3-オキソ-3-フェニルプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オンの合成についての一般手順中のサブセクションII(c)下の前述のプロトコールに従って、酢酸水溶液(70%)中で3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-(2-メトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-01)を還流することにより調製した。
【０１０９】
収率81%;M.P.256〜258℃;FT-IR(KBr)υ(cm-1):3153(NH)、1656(C=O)、1586、1557(C=C)、1240、1020(C-O-C); 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ 12.05 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 7.86 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.60-7.44 (m, 4H), 7.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.26-7.19 (m, 2H), 7.08 (td, J = 7.4, 0.9 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 306.1 (計算値305.1).
【０１１０】
(b)(E)-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)-6-メチルキノリン-2(1H)-オン(CTR-18)の合成
【０１１１】
2-クロロ-6-メチルキノリン-3-カルバルデヒド(3b)
【０１１２】
【化１６】
2019501958.tif 000018
【０１１３】
標題化合物を、2クロロ-3-ホルミルキノリンの合成についての一般手順中のサブセクションII(a)下の前述のプロトコールに従って、N-p-トリルアセトアミド(2b)から調製した。
【０１１４】
収率75%;M.P.122〜123℃(Lit.123℃)(Srivastava and Singh、2005年);FT-IR(ATR)υ(cm-1):3051(芳香族C-H)、2873(アルデヒドC-H)、1686(C=O)、1576(C=N)、1055(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 10.55 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.79-7.63 (m, 2H), 2.57 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 206.02 (計算値205.03).
【０１１５】
(E)-3-(2-クロロ-6-メチルキノリン-3-イル)-1-(2-メトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-02)
【０１１６】
【化１７】
2019501958.tif 000019
【０１１７】
標題化合物を、2-クロロキノリニルカルコンの合成についての一般手順中のサブセクションII(b)下の前述のプロトコールに従って、2-クロロ-6-メチルキノリン-3-カルバルデヒド(3b)の2-メトキシアセトフェノン(4a)とのクライゼン-シュミット縮合によって調製した。
【０１１８】
収率67%;M.P.132〜135℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3071(芳香族C-H)、2833(脂肪族C-H)、1641(C=O)、1597(C=C)、1240、1026(C-O-C)、1047(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 8.34 (s, 1H), 8.02 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 7.6, 1.8 Hz, 1H), 7.65-7.55 (m, 2H), 7.54-7.41 (m, 2H), 7.18-6.90 (m, 2H), 3.93 (s, 3H), 2.55 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 338.1 (計算値337.09).
【０１１９】
(E)-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)-6-メチルキノリン-2(1H)-オン(CTR-18)
【０１２０】
【化１８】
2019501958.tif 000020
【０１２１】
標題化合物を、3-(3-オキソ-3-フェニルプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オンの合成についての一般手順中のサブセクションII(c)下の前述のプロトコールに従って、酢酸水溶液(70%)中で3-(2-クロロ-6-メチルキノリン-3-イル)-1-(2-メトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-02)を還流することにより調製した。
【０１２２】
収率86%;M.P.222〜224℃;FT-IR(KBr)υ(cm-1):3145(NH)、1654(C=O)、1584、1558(C=C)、1241、1019(C-O-C); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.88 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.89 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.44 (s, 1H), 7.32 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.04 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), MS-API: [M+H]+ 320.1 (計算値319.12).
【０１２３】
(c)(E)-7-メトキシ-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-19)の合成
【０１２４】
2-クロロ-7-メトキシキノリン-3-カルバルデヒド(3c)
【０１２５】
【化１９】
2019501958.tif 000021
【０１２６】
標題化合物を、2クロロ-3-ホルミルキノリンの合成についての一般手順中のサブセクションII(a)下の前述のプロトコールに従って、N-(3-メトキシフェニル)アセトアミド(2c)から調製した。
【０１２７】
収率78%;M.P.195〜196℃(Lit.196℃)(Srivastava and Singh、2005年);FT-IR(ATR)υ(cm-1):3053(芳香族C-H)、2879(アルデヒドC-H)、1688(C=O)、1583(C=N)、1240、1043(C-O-C)、1051(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 10.51 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.85 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.27 (dd, J = 9.0, 2.5 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 222.02 (計算値221.02).
【０１２８】
3-(2-クロロ-7-メトキシキノリン-3-イル)-1-(2-メトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-03)
【０１２９】
【化２０】
2019501958.tif 000022
【０１３０】
標題化合物を、2-クロロキノリニルカルコンの合成についての一般手順中のサブセクションII(b)下の前述のプロトコールに従って、2-クロロ-7-メトキシキノリン-3-カルバルデヒド(3c)の2-メトキシアセトフェノン(4a)とのクライゼン-シュミット縮合によって調製した。
【０１３１】
収率63%;M.P.178〜180℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3073(芳香族C-H)、2837(脂肪族C-H)、1666(C=O)、1595(C=C)、1227、1020(C-O-C)、1055(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 8.35 (s, 1H), 8.02 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.66 (dd, J = 7.6, 1.9 Hz, 1H), 7.51 (ddd, J = 8.9, 7.5, 1.9 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 9.0, 2.5 Hz, 1H), 7.13-6.98 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.93 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 354 (計算値353.08).
【０１３２】
(E)-7-メトキシ-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-19)
【０１３３】
【化２１】
2019501958.tif 000023
【０１３４】
標題化合物を、3-(3-オキソ-3-フェニルプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オンの合成についての一般手順中のサブセクションII(c)下の前述のプロトコールに従って、酢酸水溶液(70%)中で、3-(2-クロロ-7-メトキシキノリン-3-イル)-1-(2-メトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-03)を還流することにより調製した。
【０１３５】
収率83%;M.P.227-229℃;FT-IR(KBr)υ(cm-1):3144(NH)、1656(C=O)、1559(C=C)、1167、1021(C-O-C); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.96 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 7.85 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.60-7.42 (m, 3H), 7.32-7.18 (m, 4H), 7.08 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.81 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 336.1 (計算値335.12).
【０１３６】
(d)(E)-6-メトキシ-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-20)の合成
【０１３７】
2-クロロ-6-メトキシキノリン-3-カルバルデヒド(3d)
【０１３８】
【化２２】
2019501958.tif 000024
【０１３９】
標題化合物を、2クロロ-3-ホルミルキノリンの合成についての一般手順中のサブセクションII(a)下の前述のプロトコールに従って、N-(4-メトキシフェニル)アセトアミド(2d)から調製した。
【０１４０】
収率63%;M.P.145〜146℃(Lit.146℃)(Srivastava and Singh、2005年);FT-IR(ATR)υ(cm-1):3053(芳香族C-H)、2829(アルデヒドC-H)、1680(C=O)、1574(C=N)、1227、1026(C-O-C)、1051(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 10.53 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 7.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.50 (ddd, J = 9.3, 2.9, 1.0 Hz, 1H), 7.18 (s, 1H), 3.94 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 222 (計算値221.02).
【０１４１】
3-(2-クロロ-6-メトキシキノリン-3-イル)-1-(2-メトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-04)
【０１４２】
【化２３】
2019501958.tif 000025
【０１４３】
標題化合物を、2-クロロキノリニルカルコンの合成についての一般手順中のサブセクションII(b)下の前述のプロトコールに従って、2-クロロ-6-メトキシキノリン-3-カルバルデヒド(3d)の2-メトキシアセトフェノン(4a)とのクライゼン-シュミット縮合によって調製した。
【０１４４】
収率69%;M.P.226〜228℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3071(芳香族C-H)、2839(脂肪族C-H)、1666(C=O)、1620(C=C)、1234、1020(C-O-C)、1045(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 8.32 (s, 1H), 8.00 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.72 -7.63 (m, 1H), 7.51 (ddd, J = 8.9, 7.4, 1.9 Hz, 1H), 7.48-7.36 (m, 2H), 7.18-6.99 (m, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.93 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 354.1 (計算値353.08).
【０１４５】
(E)-6-メトキシ-3-(3-(2-メトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-20)
【０１４６】
【化２４】
2019501958.tif 000026
【０１４７】
標題化合物を、3-(3-オキソ-3-フェニルプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オンの合成についての一般手順中のサブセクションII(c)下の前述のプロトコールに従って、酢酸水溶液(70%)中で、3-(2-クロロ-6-メトキシキノリン-3-イル)-1-(2-メトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-04)を還流することにより調製した。
【０１４８】
収率83%;M.P.227〜229℃;FT-IR(KBr)υ(cm-1);3155(NH)、1652(C=O)、1597、1558(C=C)、1164、1022(C-O-C); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.91 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.78 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.57-7.49 (m, 2H), 7.48-7.40 (m, 1H), 7.20 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.07 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.89-6.81 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H); MS-API: [M+H]+ 336.1 (計算値335.12).
【０１４９】
(e)(E)-3-(3-(2,6-ジメトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-25)の合成
2-クロロキノリン-3-カルバルデヒド(3a)
【０１５０】
2クロロ-3-ホルミルキノリンの合成についての一般手順中のサブセクションII(a)下の前述のプロトコールに従って、化合物をアセトアニリド(2a)から調製した。標題化合物についてのスペクトルデータは、サブセクションIII(a)下で上記で得られる。
【０１５１】
(E)-3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-(2,6-ジメトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-09)
【０１５２】
【化２５】
2019501958.tif 000027
【０１５３】
標題化合物を、2-クロロキノリニルカルコンの合成についての一般手順中のサブセクションII(b)下の前述のプロトコールに従って、2-クロロキノリン-3-カルバルデヒド(3a)の、2,6-ジメトキシアセトフェノン(4b)とのクライゼン-シュミット縮合によって調製した。
【０１５４】
収率71%;M.P.199〜201℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3004(芳香族C-H)、2836(脂肪族C-H)、1650(C=O)、1581(C=C)、1223、1020(C-O-C)、1047(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ 8.42 (s, 1H), 7.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.71 - 7.79 (m, 2H), 7.52 - 7.62 (m, 1H), 7.35 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.80 (s, 6H); MS-API: [M+H]+ 354.2 (計算値353.08).
【０１５５】
(E)-3-(3-(2,6-ジメトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-25)
【０１５６】
【化２６】
2019501958.tif 000028
【０１５７】
標題化合物を、3-(3-オキソ-3-フェニルプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オンの合成についての一般手順中のサブセクションII(c)下の前述のプロトコールに従って、酢酸水溶液(70%)中で3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-(2,6-ジメトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-09)を還流することにより調製した。
【０１５８】
収率65%;M.P.236〜238℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3149(NH)、1667(C=O)、1591、1558(C=C)、1252、1058(C-O-C); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.00 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.47 - 7.55 (m, 1H), 7.32 - 7.41 (m, 2H), 7.21 - 7.31 (m, 2H), 7.18 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.69 (s, 6H); MS-API: [M+H]+  336.2 (計算値335.12).
【０１５９】
(f)(E)-3-(3-(2-エトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-32)の合成
2-クロロキノリン-3-カルバルデヒド(3a)
標題化合物を、2クロロ-3-ホルミルキノリンの合成についての一般手順中のサブセクションII(a)下の前述のプロトコールに従って、アセトアニリド(2a)から調製した。本化合物についてのスペクトルデータは、サブセクションIII(a)下で上記で得られる。
【０１６０】
(E)-3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-(2-エトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-16)
【０１６１】
【化２７】
2019501958.tif 000029
【０１６２】
標題化合物を、2-クロロキノリニルカルコンの合成についての一般手順中のサブセクションII(b)下の前述のプロトコールに従って、2-クロロキノリン-3-カルバルデヒド(3a)の2-エトキシアセトフェノン(4i)とのクライゼン-シュミット縮合によって調製した。
【０１６３】
収率73%;M.P.128〜130℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3055(芳香族C-H)、2931(脂肪族C-H)、1669(C=O)、1596(C=C)、1238、1037(C-O-C)、1042(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) : δ 8.42 (s, 1H), 7.98 - 8.07 (m, 2H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.55 - 7.61 (m, 2H), 7.48 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.05 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.16 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.44 (t, J = 7.0 Hz, 3H); MS-API: [M+H]+ 338.2 (計算値337.09).
【０１６４】
(E)-3-(3-(2-エトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オン(CTR-32)
【０１６５】
【化２８】
2019501958.tif 000030
【０１６６】
標題化合物を、3-(3-オキソ-3-フェニルプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オンの合成についての一般手順中のサブセクションII(c)下の前述のプロトコールに従って、酢酸水溶液(70%)中で3-(2-クロロキノリン-3-イル)-1-(2-エトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-16)を還流することにより調製した。
【０１６７】
収率77%;M.P.199〜201℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3128(NH)、1651(C=O)、1597、1555(C=C)、1169、1023(C-O-C); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ 12.02 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.00 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.44 - 7.56 (m, 4H), 7.26 - 7.32 (m, 1H), 7.11 - 7.23 (m, 2H), 7.02 (td, J = 7.5, 1.0 Hz, 1H), 4.12 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.31 (t, J = 6.9 Hz, 3H). MS-API: [M+H]+ 320.2 (計算値319.12).
【０１６８】
(g)(E)-3-(3-(2-エトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)-6-メトキシキノリン-2(1H)-オン(CTR-40)の合成
2-クロロ-6-メトキシキノリン-3-カルバルデヒド(3d)
標題化合物を、2クロロ-3-ホルミルキノリンの合成についての一般手順中のサブセクションII(a)下の前述のプロトコールに従って、N-(4-メトキシフェニル)アセトアミド(2d)から調製した。本化合物についてのスペクトルデータは、サブセクションIII(d)下で上記で得られる。
【０１６９】
(E)-3-(2-クロロ-6-メトキシキノリン-3-イル)-1-(2-エトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-24)
【０１７０】
【化２９】
2019501958.tif 000031
【０１７１】
標題化合物を、2-クロロキノリニルカルコンの合成についての一般手順中のサブセクションII(b)下の前述のプロトコールに従って、2-クロロ-6-メトキシキノリン-3-カルバルデヒド(3d)の2-エトキシアセトフェノン(4i)とのクライゼン-シュミット縮合により調製した。
【０１７２】
収率74%;M.P.151〜153℃;FT-IR(ATR)υ(cm-1):3058(芳香族C-H)、2930(脂肪族C-H)、1655(C=O)、1622(C=C)、1233、1021(C-O-C)、1048(C-Cl); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) : δ 8.31 (s, 1H), 7.99 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 9.3, 2.8 Hz, 1H), 7.01 - 7.09 (m, 2H), 6.98 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.15 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 1.42 (t, J = 7.0 Hz, 3H);  MS-API: [M+H]+ 368.2 (計算値367.1).
【０１７３】
(E)-3-(3-(2-エトキシフェニル)-3-オキソプロパ-1-エニル)-6-メトキシキノリン-2(1H)-オン(CTR-40)
【０１７４】
【化３０】
2019501958.tif 000032
【０１７５】
標題化合物を、3-(3-オキソ-3-フェニルプロパ-1-エニル)キノリン-2(1H)-オンの合成についての一般手順中のサブセクションII(c)下の前述のプロトコールに従って、酢酸水溶液(70%)中で3-(2-クロロ-6-メトキシキノリン-3-イル)-1-(2-エトキシフェニル)プロパ-2-エン-1-オン(QC-24)を還流することにより調製した。
【０１７６】
収率86%;M.P.233〜235℃;FT-IR(KBr)υ(cm-1):3166(NH)、1652(C=O)、1598、1560(C=C)、1245、1023(C-O-C); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.94 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.00 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.43 - 7.53 (m, 3H), 7.17 - 7.26 (m, 3H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.12 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 1.31 (t, J = 7.0 Hz, 3H); MS-API: [M+H]+  350.2 (計算値349.13).
【０１７７】
以上の合成は、代表的な例である。Table 1(表1)は、本試験において合成され、特徴付けられた、24種の新規なキノロンカルコン化合物の化学構造及び化学名を示す。
【０１７８】
(実施例2)
CTR化合物のin vitro及びin vivo試験
I.材料及び方法
試薬
RPMI1640、DME/F12、ウシ胎児血清及び抗菌性抗真菌溶液(Pen/Strep/Fungiezone)を、Hyclone社(Logan、UT)から購入した。次のタンパク質に特異的な抗体を、Santa Cruz社(Santa Cruz、CA)から購入した。すなわち、PARP(分解産物)、cdc2、Tyr15又はThr161残留物におけるホスホ-cdc2、サイクリンA、サイクリンB、サイクリンE、wee1、cdc25C、ホスホ-ヒストンH3(Ser10)、α-チューブリン、γ-チューブリン及びGAPDHであった。次のタンパク質に特異的な抗体は、Abcam社(Cambridge、UK)製であった。すなわち、Thr48又はSer216におけるホスホ-cdc25C、セキュリン、BubR1、及びcdc20であった。Alexafluor488(抗マウス)及び568(抗ヤギ)結合IgG並びにDRAQ5/DAPIを、Molecular Probes/Invitrogen社から購入した。チューブリン重合キット(BK004P)及び精製されたブタのチューブリン(T240)は、Cytoskeleton Inc.(Denver、CO)から購入した。実験のために用いたすべての試験は、分析グレードであった。
【０１７９】
細胞株及び細胞培養
細胞株はすべて、ATCC社から購入し、別段の記載がない限り、10%ウシ胎児血清及び抗生物質(100単位ペニシリン/100μg/mlストレプトマイシン)を補充したRPMI-1640中で培養した。1845B5及びMCF-10A非癌乳房細胞株を、10%ウシ胎児血清、抗生物質及び成長因子を補充したDME/F12培地中で培養した。KB-3-1は、ヒト表皮癌細胞株であり、KB-C-2は、ABCB1/P-gpが過剰発現したその同系多剤耐性細胞株である。KB-C-2細胞株は、コルヒチンの濃度の増加の存在下で最初に確立された。ヒト小細胞肺癌H69細胞株及びその多剤耐性MRP1過剰発現同系H69AR細胞株は、ATCC社から購入した。H69AR細胞株は、アドリアマイシン(ドキソルビシン)の濃度の増加の存在下で確立された。H69細胞は、大型の多細胞凝集体として増殖し、細胞数を正確にカウントすることが難しい。したがって、H69AR細胞から得られた細胞毒性の結果を、多剤耐性表現型を有さない、小細胞肺癌細胞株SW1271と比較した。IL-6依存ボルテゾミブ耐性ANBL6-BR細胞株は、IL-6 1ng/mlを更に補充した。MCF10AT1及びMCF10CA1a細胞株は、MCF10A細胞株と同系であり、Center for Bioengineering and Tissue Regeneration、UCSF、CA、USAのDr.Valerie Weaverから取得した。MCF10AT1は、MCF10Aをc-Ha-Rasで形質転換することにより生成された前悪性細胞株であり;MCF10AT1細胞が、マウスに移植された後、MCF10CA1aは、悪性細胞を選択することにより単離された(Liu & Lin 2004年;Marellaら、2009年)。MCF10AT1及びMCF10CA1a細胞を、10% FBS(体積/体積)を補充したDMEM中で培養した。MDA-MB231TaxR細胞株を、1年間にわたってパクリタキセルの投与量を徐々に増加させMDA-MB231細胞を培養することにより、自家で生成し、最後に100nMパクリタキセルで維持した。薬物耐性細胞を、実験を実行する前に少なくとも1継代の間、薬物の非存在下で培養した。すべて細胞を、37℃(CO25%/空気95%)の加湿した培養器中で維持した。細胞株の確証を、短いタンデム反復(STR)プロファイリングを用いて行った。
【０１８０】
スルホロダミンB(SRB)系細胞毒性アッセイ
(抗)増殖アッセイについて、96穴のクラスター化された皿の4,000〜5,000細胞/ウェルを、前述の通り16時間インキュベートした(Huら、2008年;Skehanら、1990年)。16時間後、培養培地を、DMSOに溶解した試験化合物の異なる希釈を含有する新鮮な培地と置き換えた。いくつかのウェルを、陰性対照として10%トリクロロ酢酸(TCA)100μlで処置し、偽薬(ジメチルスルホキシドを含む培地;DMSO)処置した細胞を、陽性対照として用いた。インキュベーションの72時間後、培地を除去し、細胞を、4℃で1時間10%TCAで固定した。TCAを除去し、細胞を、冷たい水道水で洗浄し、プレートを風乾し、その後、0.4%SRB染色溶液50μlを各ウェルに加えた。インキュベーションの30分後、SRB染色溶液を除去した。細胞を1%酢酸溶液で洗浄し、次いで、水道水で洗浄して、非結合染色溶液を除去し、その後、風乾した。10mM(pH10.5)trizma塩基緩衝液200μlを、各ウェルに加えて、高分子を可溶化した。SRBによって染色された高分子を、自動化プレートリーダー(Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader、BioTek、Winooski、VT)を用いて540nm波長で決定した。細胞増殖(阻害)を、次式:
%細胞増殖=[(AT-CT)/(ST-CT)]×100
[式中、AT=処置された細胞の吸収度、CT=陰性対照細胞の吸収度、及びST=偽薬処置した細胞の吸収度]によって算出した。Graph Pad Prism v.5.04ソフトウェアを用いることによって、各セットを4回行った、2つの独立した生物学的複製によって生成されたS字形の用量反応曲線から、IC50値を算出した。KB-C-2、MDA-MB231又はMB231TaxR細胞に対する組合せ処置について、CTR化合物及びパクリタキセル又はABT-737を、単一の化合物のIC50値であった又はそれ以下であった異なる濃度で用いた。組合せ指数(CI)を、前述の通り算出した(Chou、2006年)。CI値が、1未満であった、1に等しかった又は1を超えた場合、それは、それぞれ相乗的、相加的又は拮抗的な効果を示す(Chou、2006年)。CI値を、4つの独立した実験から決定した。
【０１８１】
フローサイトメトリーによる細胞周期分析
プレート当たりおよそ1×106細胞を播種し、終夜増殖させた。次いで、細胞を、翌朝、試験化合物で処置し、予定された処置時間の後に回収した。細胞ペレットを、遠心により1,100rpmで収集し(AllegraTM X-12遠心機、Beckman Coulter社、Indianapolis、IN)、その後、細胞をPBSで2回洗浄し、75%エタノールで-20℃で12〜24時間固定化した。エタノールを、11,000rpmで遠心することにより除去し(AllegraTM X-12遠心機、Beckman Coulter社);細胞をPBSに懸濁し、同じローターにおいて11,000rpmで再度遠心した。次いで、PBSを除去し、細胞ペレットを懸濁し、ヨウ化プロピジウム(PI)染色溶液(0.3%nonidet P-40、RNase A100μg/ml及びPBS中のPI100μg/ml)で1時間染色した。細胞周期の異なるフェーズ中のDNA含有量を、Beckmann Coulter Cytomics FC500(Mississauga、ON、Canada)を用いたフローサイトメトリーにより分析した。薬物効果の可逆性を以下の通り決定した。CTR化合物で12時間処置したHeLa細胞を、1×PBSで2回洗浄し、次いで、予定された期間、予め加温した薬物を含まない完全培地にこれを放出した。次いで、細胞を、これらの形態について共焦点顕微鏡法により検査し、又は細胞(DNA)が、ヨウ化プロピジウムで染色された後、フローサイトメトリーにより細胞周期分析にかけた。
【０１８２】
細胞同期化
G1/S期の境界の同期化を、二重のチミジンブロック(DT)によって達成した。簡単にいうと、指数関数的に増殖する細胞を、2.0mMチミジンで18時間処置し、その後、薬物を含まない完全培地中で11時間インキュベートし、それにより、ほとんどの細胞は、中後期(mid-late)のG1期である。次いで、細胞を、2.0mMチミジン中で更に14時間インキュベートして、G1/S期の境界でこれらを停止した。前中期で細胞を停止させるため、細胞を、ノコダゾール(50ng/ml)を含有する完全培地中で18時間維持した。
【０１８３】
免疫蛍光染色
35mm組織培養プレート又は6穴のクラスター化された皿の底に入れたカバーガラス上の細胞を、試験しようとするCTR化合物を用いて12〜24時間処置した。続いて、細胞を、100%メタノールで15分間固定し、1×PBSで3回洗浄した。次いで、細胞を、3%BSA又は1%(v/v)FBSプラス1×PBST(0.1%(v/v)Triton X-100又は0.2%Tween 20を含有する1×PBS緩衝液)で「遮断」し、穏やかに撹拌しながら、一次抗体で4℃で終夜インキュベートした。非結合一次抗体を、PBSTで洗い落とし、二次抗体を暗所で1時間加えた。二次抗体を、Alexa 488又は568に結合させた。DNAを、DRAQ5又はDAPIで対比染色した。続いて、カバーガラスを、1×PBSTで3回各10分間洗浄し、その後、1×PBS中の90%グリセロールを含むスライドにこれらを取り付けた。各スライドを、Carl Zeiss 510 Metaレーザー走査顕微鏡又はAxioscopeで可視化した。画像分析を、顕微鏡を装備したLSM image examiner(Carl Zeiss社、Toronto、ON、Canada)で行った。
【０１８４】
ウエスタンブロット法
指数関数的に増殖する細胞を、処置後予定された時点で、1,100rpmで遠心することにより収集した(AllegraTM X-12遠心機、Beckman Coulter社)。細胞を、同じ条件下で遠心することによりPBSで3回洗浄し、その後、100μl細胞溶解緩衝液(150mM NaCl、5mM EDTA、1%Triton X-100、10mMトリス(pH7.4)、1mM PMSF、5mM EDTA及び5mMプロテアーゼ阻害剤)中の氷上で10〜15分間細胞溶解した。細胞抽出物を、11,000rpmで(AllegraTM X-12遠心機、Beckman Coulter社)4℃で10分間遠心した。上清を収集し、タンパク質濃度を、供給業者の仕様書(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)に従って、BCAアッセイキットを用いて測定した。次いで、細胞ライセートを、2×レムリーサンプル緩衝液で希釈し、95〜100℃で5分間沸騰した。タンパク質30〜40μgを、8%若しくは10%ポリアクリルアミドゲルに負荷し、電気泳動により分離した。次いで、タンパク質を、75分間24ボルトで、PVDF膜に電子的に移動させ、その後、5%脱脂乳で1時間「遮断した」。タンパク質を、5%脱脂乳を含有する0.1%TBST緩衝液中で一次抗体で終夜4℃でインキュベートした。この膜を、0.1%TBST緩衝液で3回洗浄し、5%脱脂乳を含有するTBST緩衝液中で二次抗体を用いて1時間インキュベートした。次いで、この膜を、TBST緩衝液で3回洗浄し、これらのシグナルを、ECL化学発光キット(Super Signal West pico、Thermo Fisher Scientific社)を用いたX線フィルムで可視化した。
【０１８５】
免疫沈降
細胞ライセートを、1×IP緩衝液(10mMフッ化ナトリウム、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤を補充した20mMトリス-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA及び1%(v/v)Triton X-100)中で調製し、穏やかに撹拌することにより4℃で3時間前もって除去した(pre-cleared)。続いて、免疫沈降を、終夜4℃で抗体を用いて行い、その後、タンパク質A/Gアガロースビーズで、更に5時間混合した。複合体を、細胞溶解緩衝液で5回洗浄し、5分間沸騰し、SDS-PAGEにより分離し、その後、適切な抗体で免疫染色した。
【０１８６】
微小管重合アッセイ
精製されたチューブリンの集合体に対する本開示の被験CTR化合物の効果を、製造業者の指示(Cytoskeleton Inc.、Denver、CO)に従って、チューブリン重合キットを用いて決定した。(同じキットで提供される)パクリタキセル、ノコダゾール、及びコルヒチン(Santa Cruz、CA)を、アッセイについての対照として用いた。吸収系アッセイキットは、波長340nmで37℃で測定した場合、微小管により散乱した光が、微小管のポリマー質量(polymer mass)に直接比例するという原理に基づいている。蛍光系アッセイキットは、重合プロセスが生じている間、蛍光性レポーター分子が、微小管に取り込まれるという原理に基づいている。蛍光の増強を、350nmの励起及び430nmの発光で、1分間隔で1時間測定した。吸収度又は蛍光を、自動化プレートリーダー(Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader、Bio-Tek)で測定した。
【０１８７】
差次的チューブリン抽出
2つの工程の抽出手順を用いて、偽薬処置したもの又は化合物で処置したものから、可溶性及びポリマー化チューブリン画分を別々に単離した(Tokesiら、2010年)。簡単にいうと、指数関数的に増殖する細胞を、パクリタキセル50nM、ノコダゾール50ng/ml、3.0μM CTR-17、又は1μM CTR-20で12時間処置した。次いで、細胞を回収し、予め加温した微小管安定化緩衝液(80mM PIPES(pH6.8)、1mM MgCl2、1mM EGTA、0.5%Triton X-100、10%グリセロール、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル)で溶解した。室温で2,500rpmで5分間の短時間の遠心後(AllegraTM X-12遠心機、Beckman Coulter社)、可溶性画分中のチューブリンヘテロ二量体を、上記の通り遠心により上清から分離した。可溶性チューブリンが完全に抽出されたことを保証するために、細胞ペレットを、微小管安定化緩衝液で再度洗浄し;上清画分をプールし;最後に、重合されたチューブリン複合体を、微小管不安定化緩衝液(20mMトリス(pH7.4)、150mM NaCl、1%Triton X-100、10mM CaCl2、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル)を用いて抽出した。抽出物を、遠心によって清澄にして、不溶性微小管画分を得た(AllegraTM X-12遠心機、Beckman Coulter社を用いて室温で5分間2,500rpm)。各サンプルについてのタンパク質の等量を、SDS-PAGEにより分離し、その後、ウエスタンブロット及びAlphaEaseFC 4.0ソフトウェアを用いたデンシトメトリー系分析を行った。
【０１８８】
CTR-チューブリン結合の解離定数の決定
精製されたチューブリン(0.4μM)を、25mM PIPES緩衝液(pH6.8)に溶解し、異なる濃度のCTR-17(若しくはCTR-20)の存在下又は非存在下で、37℃で30分間インキュベートした。チューブリンヘテロ二量体中のトリプトファン残基の固有の蛍光を、295nmにおける反応混合物の励起及び波長範囲315〜370nmにおける発光スペクトルによってモニターした。すべての測定を、式F補正値=F観測地×antilog[(Aex+Aem)/2]、[式中、Aex及びAemは、それぞれ励起及び発光波長における反応混合物の吸収度である]を用いて内部フィルターについて補正した。Graph Pad Prismソフトウェアを用いて、次の式
【０１８９】
【数１】
2019501958.tif 000033
【０１９０】
[式中、ΔFは、CTR化合物と結合した場合、チューブリンの蛍光強度の変化であり、ΔF最大は、チューブリンが化合物と結合される場合、蛍光強度の最大の変化であり、Cは、CTR化合物の濃度であり、Kdは、チューブリンに結合したCTR化合物の解離定数である]を用いて、チューブリンに結合しているCTR化合物の解離定数を決定した。
【０１９１】
競合結合測定
BODIPY FLビンブラスチン競合測定のために、CTR-17、CTR-20、コルヒチン、及びビンブラスチン各25μMを、精製されたチューブリンで37℃で1時間インキュベートした。続いて、BODIPY FLビンブラスチンを、最終濃度5.0μMまでチューブリン複合体に加え、その混合物を、37℃で30分間インキュベートした。コルヒチン競合測定のために、チューブリンを、異なる濃度の各化合物で37℃で1時間インキュベートした。続いて、コルヒチンを加えて、最終濃度1.0〜8.0μMに平衡のCTR-チューブリン又はビンブラスチン-チューブリンに加えた。蛍光を、自動化プレートリーダー(Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Micro plate Reader、Bio-Tek社)を用いてモニターした。ビンブラスチン競合測定のために、蛍光を、490nmにおける反応混合物の励起及び510〜550nmの範囲における発光スペクトルによりモニターした。コルヒチン競合測定のために、チューブリン複合体の蛍光を、励起波長360nm及び430nmにおける発光波長で決定した。改変されたDixonプロットを用いて、チューブリンに結合しているコルヒチンの競合阻害を分析し、CTR化合物の阻害濃度(Ki)を決定した。
【０１９２】
分子のモデリング
Molecular Operating Environment(MOE)(Chemical Computing Group Inc、Montreal、Quebec、Canada)を用いて、CTR化合物のβ-チューブリンサブユニットのコルヒチン結合ドメインへの相互作用モードを予測した。チューブリン-コルヒチン複合体(PDBコード:1SA0)の結晶構造を、標的構造として用い、同じソフトウェアを用いてエネルギー最小化及びプロトン化にかけた。ドッキングについてのプロトコールを、MOEウェブサイトから採用し、誘導適合プロトコールを用いた。最善のドッキングポーズを、結合についての自由エネルギーに基づき決定した。H-結合、疎水、イオン及びファンデルワールス相互作用の寄与を、自由エネルギー値を算出する場合考慮した。
【０１９３】
III.動物による作業
マウス、細胞及び試薬/プロトコール
5週齢の雌CD-1及びATH490(株コード490)胸腺欠損ヌードマウスを、Charles River社(Quebec、Canada)から購入した。MDA-MB-231ヒト転移性乳癌細胞を、American Tissue Culture Collection(ATCC、Manassas、VA、USA)から取得した。細胞を、加湿条件下で37℃及びCO25%で、10%ウシ胎児血清及び抗生物質を補充したDMEM高ブドウ糖培地(ATCC)中で維持した。
【０１９４】
パクリタキセル治療のために、パクリタキセル(Sigma社、MO)の40mg/ml原液を、DMSO中で調製した。マウスへの投与直前、パクリタキセル原液を、ビヒクルとして定義される10%DMSO、12.5%Cremophor、12.5%エタノール、及び65%食塩水系賦形剤(0.9%塩化ナトリウム、5%ポリエチレングリコール、及び0.5%tween-80)を含有する緩衝液中で10倍に希釈した(Huangら、2006年)。アラニントランスアミナーゼ(ALT、SUP6001-c)/アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST、SUP6002-c)カラーエンドポイントアッセイキットを、ID Labs Biotechnology(London、Ontario、Canada)から購入した。血清サンプル中のALT及びAST値の上昇を、肝臓損傷/傷害の指標として用いた。
【０１９５】
異種移植マウスにおけるCTR化合物の抗腫瘍活性
動物におけるCTR化合物の抗腫瘍活性を決定するために、胸腺欠損ヌードマウスにおけるヒト乳癌細胞の異種移植モデルを確立した。指数関数的に増殖するMDA-MB-231転移性乳癌細胞を回収し、マウスへの接種についてカウントした。各マウスを、0.2ml氷冷1×PBS中の10×106細胞で側腹部に皮下注射した。腫瘍サイズが直径4〜5mmに達した場合(1群当たりn=4〜5)、マウスを、本明細書に記載した通り、いくつかの群に無作為に割り付けた。
【０１９６】
動物を、食物及び水消費について毎日モニターし、動物の体重及び腫瘍体積を1週間に2回測定した。腫瘍体積を、デジタル式カリパスで測定し、次の式:長さ1/2×幅2を用いることによって決定した。血液サンプルを、心臓穿刺によって収集し、ALT及びAST測定について更に処置した。次いで、動物を、二酸化炭素によって直ちに安楽死させた。腫瘍及び生命維持を司る器官(脾臓、腎臓、肝臓及び肺)を収集し、パラフィン包埋のために処置する前に、10%緩衝ホルマリンに4℃で終夜固定した。次いで、パラフィン包埋したブロックを、4〜5μm厚さのセクションに切断した。腫瘍及び臓器の各切片を、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。
【０１９７】
動物における毒性試験
体重、ヘモグロビン(Hb)並びにアラニントランスアミナーゼ(ALT)/アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の量及び比の変化を用いて、毒性作用を測定した。更に、前述した通り、これらを回収し、固定し、処置し、パラフィン包埋し、区分し、染色した後、生命維持を司る器官(肝臓、脾臓、腎臓及び肺)を、蛍光顕微鏡法により分析した。
【０１９８】
統計解析
すべての値は、少なくとも3つの独立した実験の平均±標準誤差である。分析を、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software、Inc)を用いて行った。一元ANOVAを用いてp値を決定することにより、群間比較を行った。p値<0.05は、統計的に有意であると考えられた。
【０１９９】
IV.結果
Table 2(表2)は、SRBアッセイによって決定した乳癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7)及び非癌乳細胞(184B5)を用いて、4つのCTR化合物の初回のスクリーニングから得られた結果のまとめを含む。Table 2(表2)中の結果から見てわかるように、CTR-17、-18、-19、及び-20は、クロロキン又はシスプラチンよりも更に有効であり、本実験において用いられる2つの参照化合物、CTR-17及びCTR-20は、26回(MDA-MB-468/K562対MCF-10A)及び24回(HeLa対MCF-10A)まで、非癌細胞に対して癌細胞を優先的に死滅させることが観察された。それに対して、シスプラチンは、類似の効果で、癌及び非癌細胞を死滅させる。
【０２００】
Table 3(表3)は、CTR-17及びCTR-20の他の癌細胞株に対する抗増殖効果に関する結果のまとめを含む。すべての細胞株は、gDNAのSTRプロファイリングにより、2015年4月10日及び7月13日に認証された。Table 3(表3)中の結果から見てわかるように、CTR-17及びCTR-20は、脳腫瘍(U87MG)、テモゾロミド耐性グリア芽腫(T98G)、肺癌(NCI-H1975、A549)、多発性骨髄腫(RPMI-8229)、膀胱癌(UC3)、及び腎癌細胞株(HEK293T)を含めた、多くの異なる癌細胞を効率的に死滅させる。RPMI-8226-BR(ボルテゾミブ耐性)及びANBL6-BR(ボルテゾミブ耐性多発性骨髄腫)細胞株におけるCTR-20のIC50値はまた、別々の実験において決定され、それぞれ0.28±0.03μM及び0.76±0.28μMであることが判明した。
【０２０１】
Table 4(表4)は、16種の新規なCTR化合物(CTR-21からCTR-40)の抗増殖効果に関する結果のまとめを含む。これらのCTR化合物は、MDA-MB231、MCF-7、HeLa及びRPMI-8226癌細胞株を死滅させ、IC50値は、5.34nM(RPMI-8226に対するCTR-21)から2.69μM(MDA-MB231に対するCTR-27)に及ぶ。例えば、HeLa及びRPMI-8226細胞中のCTR-21のIC50は、それぞれ11.93±1.40及び5.34±0.89nMであった。同様に、CTR-32はまた、そのIC50値が、HeLa及びRPMI-8226細胞に対してそれぞれ12.88±0.35及び6.29±1.43nMであったため、有効であった。
【０２０２】
図1中の結果から見てわかるように、非同期的に増殖するHeLa S3細胞を、異なる濃度(0、0.5、1.0、5.0及び10.0μM)でのCTR-20で24又は72時間(h)処置した場合、CTR-20は、時間及び用量依存的な方式で細胞死を誘導した。細胞生存/死を、トリパンブルー除去アッセイにより決定した。1μM CTR-20によるHeLa細胞の処置によって、処置後72時間までにおよそ70%が死亡した。
【０２０３】
図2中の結果から見てわかるように、CTR-17は、G2/M期辺りで細胞周期を停止した。図2Aでは、CTR-17の異なる濃度(μM)による処置の72時間後のHeLa細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。図2Bでは、非同期性のHeLa細胞を、3.0μM CTR-17で処置した後、異なる時点における細胞周期プロファイルを示す。HeLa細胞の大部分は、3μM CTR-17による処置後12時間までにG2/M期辺りで停止した。
【０２０４】
理論に拘泥するものではないが、癌及び非癌細胞に対するCTR-17の差次的な効果は、一部で、本化合物に応答した細胞周期の停止のこれらの差によるものとなりうる。2つの乳癌細胞株(MDA-MB-468及びMDA-MB-231)並びに1つの非癌乳房細胞株(MCF-10A)を、3.0μM CTR-17で0〜72時間処置し、ヨウ化プロピジウムで染色し、これらの細胞周期プロファイルを、フローサイトメトリーにより分析した。これらの結果を図3に示す。MDA-MB-468転移性乳癌細胞は、3μM CTR-17で処置後6時間までにG2/M期辺りで蓄積し始め、その後、処置後48時間までに塊状に細胞死した。MDA-MB-231において、G2/M母集団は、同じ条件下でよりゆっくりと蓄積された。それにもかかわらず、MDA-MB-231細胞の大部分は、処置後48時間までにG2/M期辺りで停止した。G2/M母集団を強化したが、非癌MCF-10A細胞は、いずれの細胞周期コンパートメントにおいても完全に停止しなかった。
【０２０５】
図4中の結果から見てわかるように、CTR-20は、癌における細胞周期の停止及び細胞死を選択的にもたらしたが、非癌細胞における細胞死をもたらさなかった。非同期性の乳癌細胞(MDA-MB-231及びMCF-7)並びにこれらのマッチング非癌乳細胞(184B5)を、0.5又は1μMでのCTR-20で72時間処置した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーによる細胞周期分析用に収集し、固定し、ヨウ化プロピジウムで染色した。MDA-MB-231細胞の大部分は、1μM CTR-20の存在下で72時間以内に死滅した。理論に拘泥するものではないが、sub-G1 DNA量のプロファイルによって、細胞死が、アポトーシスによるものとなりうるということが示唆される。MCF-7乳癌細胞の大部分はまた、処置後72時間までに死滅しなかったが、G2/M期辺りで停止した。2つの癌細胞株とは対照的に、184B5非癌乳細胞は、同じ実験条件下で1μM CTR-20まで有意に影響を受けなかった。
【０２０６】
図5中の結果から見てわかるように、1μM CTR-20による癌細胞の処置によって、G2/M期辺りで24時間までに細胞周期を停止し、処置後72時間までに塊状に細胞死した。細胞を、4、8、24、48及び72時間(MDA-MB-231)又は24、48及び72時間(HeLa S3)、MDA-MB-231の場合1μM CTR-20で処置し(図5A)、HeLa S3の場合0.5、1.0又は2.5μMで処置した(図5B)。各時点で、細胞を、収集し、ホルムアルデヒドで固定し、次いで、ヨウ化プロピジウムで染色し、その後、フローサイトメトリーを行った。図5中で見てわかるように、1μMにおけるCTR-20は、処置後24時間までにG2/M期辺りでMDA-MB-231及びHeLa細胞を停止した。これらの細胞の大部分は、処置後72時間までにsub-G1 DNA量で死滅した。K562白血病細胞は、本発明者らが別々の実験で見出したものと類似のパターンの細胞周期の停止及び細胞死をやはり示した。
【０２０７】
図6及び図7中に示される通り、CTR-17及びCTR-20と同様に、CTR-21及びCTR-32は、G2/M期で細胞周期を停止させた。CTR-21又はCTR-32 30nMで処置したHeLa細胞は、G2/M期で一時的に停止した。しかしながら、細胞は、CTR-21及びCTR-32の濃度を、それぞれ60nM及び50nMまで増加した場合、正常なやり方でG1期に戻らなかった。更に、処置の48及び72時間後のフローサイトメトリープロファイルによって、60nM CTR-21又は50nM CTR-32が、均等でない細胞分裂及び細胞死を引き起こすことが示された。
【０２０８】
図8では、処置の12時間後でのG2/M期における一時的な停止を除いて、MCF10A非癌細胞のCTR-21(30nM)又はCTR-32(50nM)による処置が、著しい悪影響がなかったことが示される。
【０２０９】
4種のすべてのCTR化合物が検査され、(A)CTR-17、(B)CTR-20、(C)CTR-21及び(D)CTR-32は、前悪性MCF10AT1及び非癌MCF10A乳細胞に対して、完全に悪性のMCF10CA1a乳癌細胞を優先的に死滅させた。例えば、0.39μMのCTR-17/CTR-20における細胞生存率は、MCF10A1a、MCF10AT1及びMCF10Aでは、それぞれ39%/10%、60%/20%、及び95%/75%であった(図9A及び図9B)。同様に、31.25nMのCTR-21/CTR-32における細胞生存率は、MCF10A1a、MCF10AT1及びMCF10Aでは、それぞれ10%/40%、24%/70%、及び26%/87%であった(図9C及び図9D)。
【０２１０】
CTR-17によって、単極の中心体、染色体アラインメントの欠損、及び均等でない染色体の分離がもたらされる(図10)。細胞を、3.0μM CTR-17で12時間処置し、メタノールで固定し、γ-チューブリンに特異的な抗体(カラー画像で緑色)又はα-チューブリン(カラー画像で赤色)で染色し、次いで、DAPI(カラー画像で青色)でDNA対比染色した。図10A及び図10B(より高倍率)は、偽薬処置した又は3μM CTR-17で処置したHeLa細胞の例示的な画像を示す。図10Bの白い矢印は、均等でないアラインメント/分離を意味する。図10Cは、図10A及び図10B中と同じ方式で3μM CTR-17で処置したHEK293T、MDA-MB-468及びMDA-MB-231細胞の例示的な画像を示す。図10Cの白い矢印は、染色体の適切なアラインメント又は均等でない分離の失敗を意味する。図10に示した結果から見てわかるように、3.0μMのCTR-17で処置したほとんどの細胞は、単極の中心体、中央プレートにおける適切なアラインメントの失敗、及び均等でない染色体の分離を示した。これらの異常な現象は、HeLa、HEK293T、MDA-MB-468及びMDA-MB-231細胞株を含めた、これまで検査したすべての癌細胞株において観察された。
【０２１１】
CTR-17に応答した有糸分裂細胞の癌特異的増加は、単極の中心体及び異常な染色体アラインメント/分離による細胞の蓄積と関連があった(図11、Table 5(表5))。細胞を、12時間又は24時間偽薬処置し、又は3.0μM CTR-17で処置し、その後、細胞周期進行、中心体異常、及び染色体アラインメント/分離の分析を行った。図11は、CTR-17で癌細胞を処置すると、時間依存性方式で有糸分裂細胞が蓄積されたことを示すプロットである。分裂指数を、各細胞タイプについて少なくとも200個の細胞の蛍光顕微鏡分析によって決定し、データを、少なくとも2つの独立した実験の百分率平均±標準誤差として表した。図11中のプロットから得られた実数を、Table 5(表5)に示す。これらの群の有糸分裂細胞の総数が非常に小さいので、これらの細胞が有糸分裂で停止しないという意味ある統計的比較ができないため、Table 5(表5)は、偽薬対照及び非癌細胞(MCF-10A及び184B5)を含まない。3μMのCTR-17に応答したこのデータから見てわかるように、癌細胞は、単極の中心体又は異常な染色体アラインメント/分離による分裂期で蓄積されたが、非癌細胞(MCF-10A、184B5)は蓄積されなかった。
【０２１２】
CTR-20で処置した細胞は、単極の中心体又は異常な染色体アラインメント及び分離を示した(図12)。非同期的に増殖するMCF-7、MDA-MB-231及びHeLa S3細胞を、1μM CTR-20で24時間処置した。次いで、細胞を、収集し、メタノールで固定し、α-チューブリンに特異的な抗体(カラー画像中の緑色又は赤色)でインキュベートし、次いで、これを、DNAをDRAQ5で対比染色した(カラー画像中の赤色又は青色)。図12B中のMCF-7サンプルのうちの1つの内の囲みは、均等でない細胞分裂を示す。図12中の例示的な画像から見てわかるように、1μM CTR-20で処置した癌細胞はまた、多極中心体及び均等でない細胞分裂を示した。
【０２１３】
単極の中心体及びアラインメントが欠損し、分離が均等でない染色体を含む細胞の数は、CTR-20に応答して、劇的に増加した(図13、Table 6(表6))。図13に示す通り、CTR-20は、癌細胞-特異的な方式で、有糸分裂で細胞周期の停止を引き起こした。非同期的に増殖する細胞は、1μM CTR-20で24時間処置し、その後、有糸分裂中で停止した細胞を検査した。有糸分裂細胞の百分率を、少なくとも250〜400個の細胞の検査に基づき、算出した。カバーガラス上で1μM CTR-20で24時間処置した細胞を、氷冷メタノールで固定し、α-チューブリン抗体で免疫染色し、次いで、蛍光(florescent)顕微鏡法(Table 6(表6))によって観察する前にDNAをDRAQ5で対比染色した。Table 6(表6)は、これらの群の有糸分裂細胞の総数が非常に小さいので、これらの細胞が有糸分裂で停止しないという意味ある統計的比較ができないため、偽薬対照及び非癌細胞(MCF-10A及び184B5)を含まない。図13から見てわかるように、1μMにおけるCTR-20は、有糸分裂細胞の蓄積を癌においてもたらしたが、非癌細胞(MCF-10A、184B5)においてもたらさなかった。同様に、1μM CTR-20で処置した細胞は、単極の中心体を蓄積し、染色体アラインメントを欠損し、癌特異的な方式で分離した。
【０２１４】
CTR-20は、これらが最終的に停止した前中期/中期への細胞の移行を遅延させなかった(図14)。カバーガラス上で増殖しているHeLa S3細胞を、二重のチミジン処置によって同期化した(材料及び方法を参照のこと)。次いで、細胞を、7.5、8.5、9.5、10、10.5又は11.5時間の間、非存在下で(偽薬;図14A)又は1.0μM CTR-20(図14B)の存在下で、新鮮な培地に放出した。予定された時点で、細胞を、氷冷メタノールで固定し、α-チューブリンに特異的な抗体で免疫染色し、その後、DRAQ5でDNAを対比染色した。最後に、細胞を、対物40×の蛍光顕微鏡(Axio社)下で観察した。各サンプルについて少なくとも15カ所の領域を分析した。図14Bから見てわかるように、1μM CTR-20で処置した細胞は、前中期に達するまで、細胞周期によって正常に進行し;しかしながら、これらは、薬物の存在下で、G1/S期後、9.5〜10時間までに前中期において及び11.5時間までに中期において蓄積された。偽薬対照(図14A)と異なり、細胞は、1μM CTR-20(図14B)の存在下でG/S期後ちょうど11.5時間までに後期-細胞質分裂細胞周期コンパートメントにおいてほとんどなく、CTR-20によって引き起こされた中期の停止が、非常に有効であることを示している。それに対して、偽薬処置した細胞(図14A)は、後期/終期への進行及びG1/S期の停止から放出の7.5時間ほど早期に細胞質分裂を開始した。偽薬対照(図14A)中のほとんどの細胞は、11.5時間までに細胞質分裂又は間期の状態であった。本データは、細胞が、1μM CTR-20の存在下で前中期に停止し、最終的に、「永久に」停止される分裂期に進行したという概念と一致する。
【０２１５】
α-チューブリン又はγ-チューブリンに特異的な抗体で免疫染色された細胞から得られたデータによって、CTR-21及びCTR-32が、中期の染色体アラインメントにおける欠損をもたらすことが示された(図15)。非同期性のHeLa細胞を、CTR-21(30nM)又はCTR-32(50nM)で12時間処置し、その後、写真の最上部に示される通り、Draq5でDNAを染色し、又はγ-チューブリン又はα-チューブリンに特異的な抗体で免疫染色した。染色体は、センタープレートで適正に整列していない(白い矢印)。
【０２１６】
図16は、CTR-21又はCTR-32の存在下で、有糸分裂で停止したHeLa細胞が、Bcl-XL及びアポトーシスを活性化したことを示す。非同期性のHeLa細胞を、CTR-21(15若しくは30nM)又はCTR-32(30若しくは50nM)で6、12又は24時間処置した(図16)。各サンプルの細胞抽出物を、SDS-PAGEによるタンパク質分離にかけ、その後、ゲル写真の右に列挙されたものに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット法にかけた。偽薬対照と対照的にCTRによって処置されたサンプル中の高レベルのサイクリンBによって、細胞が、M期で停止したことが示された。処置の12時間後で高分子量Cdc25C(すなわち、リン酸化された)の強力な存在によって、Cdk1/サイクリンBが、その時まで非常に活性があり、したがって、細胞は、すでにM期に入ったことが示された。CTR-21又はCTR-32による細胞の処置は、処置後6時間までにBcl-XL抗アポトーシスタンパク質のリン酸化(すなわち、「活性化」)を引き起こした。これによって、その後に、PARPタンパク質の切断が続き、多くの細胞が、CTR-21(≧15nM)又はCTR-32(≧30nM)により処置後24時間までにアポトーシスを生じたことが示唆された。
【０２１７】
CTR-17及びCTR-20によって引き起こされる有糸分裂停止は、可逆的であった。図17Aは、CTR-17(3μM;右から2番目)又はCTR-20(1μM;右端)で12時間(放出後時間0として定義される)処置した後、典型的なHeLa細胞周期ヒストグラムを示す。放出後時間0で、細胞を、1×PBSで2回洗浄し、その後、予め加温した、薬物なしの培地10ml中で3、6、9又は12時間の間、細胞を再懸濁した(図17B)。図17Bから見てわかるように、CTR-17及びCTR-20が洗い落とされた後3時間以内に、細胞は、細胞周期に入った。これは、まだCTR-17及びCTR-20を含有する培養培地中の細胞と対照的である(図11及び図13)。したがって、本データによって、CTR-17及びCTR-20の効果が、可逆的であることが示される。
【０２１８】
CTR-17及びCTR-20(図17)の場合と同様に、CTR-21及びCTR-32の効果は、可逆的である(図18)。12時間CTR-21(30nM)又はCTR-32(50nM)の処置によりG2/M期で停止されたものが、PBSで洗浄され、次いで、薬物を含まない完全培地に放出された場合(図18A)、HeLa細胞は、2時間以内に次の細胞周期のG1期に入った。共焦点顕微鏡法から得られたデータ(図18B)は、フローサイトメトリーデータ(図18A)と一致する。同時に、本発明者らのデータは、CTR化合物が、持続的な副作用を有し得ないことが示唆されると思われる。
【０２１９】
CTR-17は、癌細胞-特異的な方式でアポトーシスを誘導する(図19)。ウエスタンブロット分析を、非同期性のHeLa細胞から調製された全細胞抽出物を用いて、処置の12、24又は48時間後の時点で抗-PARP抗体で行った。図19から見てわかるように、3.0μMにおけるCTR-17は、処置後48時間まで、HeLa細胞中でアポトーシスを誘導したが、184B5非癌細胞中では誘導しなかった。本データは、Table 2(表2)に示されるデータと一致する。
【０２２０】
CTR-17は、DNA複製の障害もDNA損傷も引き起こさなかった。図20Aは、CTR-17(3.0μM)で24時間処置し、次いで、分析のためにそれらを回収する直前に1時間EdU(10.0μM)を与えた非同期性のHeLa細胞を示す。DNAに取り込まれたEdUの検出を、蛍光顕微鏡法により行った。図20Bは、損傷したDNA(すなわち、損傷修復)を検出するために行ったγ-H2AXに特異的な抗体による細胞免疫染色を示す。エトポシド(50.0μM)を、陽性対照として用いた。図20中の例示的な画像から見てわかるように、用いた実験条件下で、EdU陽性細胞は、偽薬対照及びCTR-17(3.0μM)によって処置された細胞の場合、それぞれ、25.4%及び22.0%であった。したがって、本データによって、CTR-17が、DNA複製においていかなる障害をも引き起こさないことが示される。本データは、図14に示されるデータと一致する。図20Bに示されたデータによって、CTR-17が、いかなる著しいDNA損傷をも引き起こさないことが実証される。
【０２２１】
CTR-17で処置した細胞は、有糸分裂で停止し、G2期で停止しなかった(図21)。ウエスタンブロット分析を、非同期的に増殖するHeLa細胞から調製された全細胞抽出物を用いて行った。同量のタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ブロット法を、図21に示すゲルの左側に列挙したこれらのタンパク質に特異的な抗体で行った。時間(h)における時点は、3.0μM CTR-17による処置後である。GAPDHを、ローディングコントロールとして用いた。「p-」は、リン酸化を示す。図21に示したウエスタンブロットデータによって、CTR-17が、M期初期に細胞周期の停止を引き起こすことが実証された。この結論は、Tyr15におけるそのリン酸化から判断して、Cdk1活性が、処置のおよそ12時間後に増加し始め、検査した最終時点の48時間まで、十分に活性があったという事実に由来した。本結論との一致において、Cdc25C活性は、同時点辺りに達し、理論に拘泥するものではないが、Cdk1活性化回路の増幅は、少なくとも処置後24時間まで全速力であったことが示唆される。しかしながら、Cdc25Cは、処置後48時間までに、完全に不活性化され(Thr48におけるタンパク質及びリン酸化のレベルを参照のこと)、理論に拘泥するものではないが、Cdc25Cが、Cdk1活性を更に増幅する必要はもはやないことを示唆している。CTR-17及びCTR-20によるG2/M期辺りの細胞周期の停止の初期の結論は、フローサイトメトリーから得られたデータが、細胞がG2期又はM期の状態であったか否か、明確な結論を出すのに十分なほど詳述されていなかったためであったことに留意されたい。
【０２２２】
細胞は、CTR-17の存在下で、有糸分裂を終了しなかった。CTR-17の細胞周期進行に対する効果を正確に評価するために、二重のチミジン(DT)ブロックによりG1/S期の境界で同期化したHeLa細胞を、図22に示した時間(h)の間、CTR-17(3.0μM)の非存在下で(偽薬)又はCTR-17(3.0μM)の存在下で、細胞周期に放出した。二重のチミジン処置によるG1/S停止から放出後9時間まで、偽薬処置した対照による類似のやり方で、CTR-17で処置した細胞は、細胞周期を通して進行した。しかしながら、偽薬対照と異なって、処置された細胞は、M期を終了しなかった。代わりに、図22中で見てわかるように、CTR-17で処置した細胞のほとんどは、次の細胞周期のG1期(DTの48時間後)に入らずに、アポトーシスにより最終的に死滅した。
【０２２３】
同期化した細胞を用いた細胞周期試験から得られたデータによって、CTR-17が、有糸分裂早期において細胞を停止させることが実証された。二重のチミジン(DT)ブロックによるG1/S期の境界で同期化したHeLa細胞を、示された期間(時間)、3.0μM CTR-17の非存在下で(偽薬;図23A)又は存在下(図23B)で、時間0で、完全培地に放出した。同量のタンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、その後、列挙したタンパク質に特異的な抗体によるウエスタンブロット法を行った。「p-」は、リンタンパク質を示す。GAPDHを、ローディングコントロールとして用いた。非同期性の細胞から得られたデータ(例えば、図21)と一致して、G1/S期の境界におけるHeLa細胞が、3μM CTR-17を含有する完全培地に放出された場合、CTR-17は、M期初期において細胞を停止した。Cdk1及びCdc25Cは、CTR-17の存在下で活性し続け、これは、二重のチミジンブロックからの放出後少なくとも20時間まで、Cdk1のTyr15に対する脱リン酸化及びCdc25CのThr48に対するリン酸化によって明らかにされる。これは、高レベルのセキュリン、サイクリンB及びヒストンH3リン酸化と同時に起こり、サイクリンE及びサイクリンAの無視できるレベルが観察されたにすぎない。更に、BubR1は、放出後12時間までに高度にリン酸化された。同時に、理論に拘泥するものではないが、本データによって、細胞周期は、センタープレートにおける染色体の適切なアラインメントの欠点により、推定上、紡錘体チェックポイント工程で(APCに媒介されるセキュリン分解前に)、CTRの存在下で停止したことが強く示唆される。本結論は、図2、図3、図4、図5、図11、図13、図14、図21、図22、及び図25を含めた、他の示されたデータにより裏付けられている。
【０２２４】
免疫共沈降によって、CTR-17が、紡錘体チェックポイント活性化工程で細胞周期の停止を引き起こすことが確認された。二重のチミジン(DT)ブロックによるG1/S期の境界で同期化したHeLa細胞を、図24に示した期間の間(hは、時間を示す)、処置しなかった(偽薬)、ノコダゾール20ng/mlで処置した、又は3.0μM CTR-17で処置した。総蛋白抽出物を、抗-BubR1抗体を用いて免疫沈降にかけ、その後、抗-Cdc20抗体を用いたSDS-PAGE及びウエスタンブロット法によりタンパク質分離にかけて、BubR1とCdc20との間の相互作用を検査した。フローサイトメトリー及びウエスタンブロット法から得られたデータと一致して、免疫共沈降から得られたデータ(図24)では、BubR1及びCdc20として紡錘体チェックポイント工程で細胞を停止させたCTR-17は、CTR-17の存在下で会合したことが実証された。しかしながら、APCは、いまだ活性がなかった。CTR-17による細胞周期の停止点は、ノコダゾールによるものと類似する。
【０２２５】
BubR1は、CTR-17の存在下で動原体で蓄積された。非同期的に増殖するHeLa細胞を、12時間、偽薬処置し又はCTR-17(3.0μM)で処置し、固定し、次いで、BubR1又はCenp-Bに特異的な抗体で免疫染色した(セントロメア染色)。図25から見てわかるように、動原体におけるBubR1の蓄積によって、動原体と有糸分裂のスピンドル/中心体との間の固有の張力が欠如し、したがって、スピンドル集合体チェックポイントの活性を永続的に延長することが示される。
【０２２６】
CTR-17及びCTR-20は、チューブリン重合を阻害した。精製されたブタのチューブリン及び1.0mM GTPを、10.0μMパクリタキセル、3.0μM CTR-17、1.0μM CTR-20、又は5.0μMノコダゾールを含有する反応混合物に加えた。チューブリンの重合を、分光光度法により340nm及び37℃で1時間毎分モニターした(図26)。CTR-17及びCTR-20は、増殖期を延長させ、微小管重合反応における定常状態の平衡に達するのに長い時間がかかった。このパターンは、ノコダゾールのそれと類似するが、微小管安定化剤パクリタキセルのそれと異なる。したがって、理論に拘泥するものではないが、本データによって、CTR-17及びCTR-20が、チューブリン重合の阻害剤であることが示される。
【０２２７】
CTR-21及びCTR-32は、微小管重合阻害剤である。図27に示したデータは、CTR-21及びCTR-32が、CTR-17及びCTR-20と同様に微小管阻害剤であったかどうか検査するために、in vitro微小管集合アッセイから得られる。微小管重合を、蛍光性レポーター分子の微小管への取り込みに関してモニターした。アッセイを、37℃で1時間行い、分光光度法により1分間隔で読み取った。2つの異なる濃度100nM及び1.0μMで、CTR-21及びCTR-32を用いた。10nMで、そのどちらとも、1.0μMでCTR-20の類似の程度まで微小管重合を阻害し、CTR-21及びCTR-32は、CTR-20よりも強力な微小管阻害剤であることが示された。2つの中でもとりわけ、CTR-21は、微小管重合を阻害する上で、CTR-32よりも有効であると思われる。
【０２２８】
CTR-17及びCTR-20は、チューブリンの重合されたプールを減少した(図28)。HeLa、MDA-MB-231及びMDA-MB-468細胞を、偽薬処置した、50.0nMパクリタキセル(Tax)、ノコダゾール(Noc)50.0ng/ml、3.0μM CTR-17、又は1.0μM CTR-20で、12時間処置した。細胞ライセートを、重合(Pol)及び可溶性(Sol)画分に分離し、同量のタンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、その後、α-チューブリンに特異的な抗体を用いた免疫ブロット法を行った。バンド(図28Aの上部パネル)を、デンシトメトリーで定量化し、グラフの形態で表した(図28Aの下部パネル)。可溶性及び重合された画分の合計は、1.0である。異なる濃度のCTR-17又はCTR-20で処置したHeLa細胞を、図28Aに記載した通り分画及び免疫ブロット法にかけた。CTR-17及びCTR-20は、ノコダゾールと同様にチューブリンポリマー画分を減少させた。この分画パターンは、パクリタキセルと明確に対照的であり、チューブリンポリマー画分を増加させる。CTR-17によるチューブリン重合の減少は、3〜6μMの濃度の範囲内で用量依存的であった(図28B)。しかしながら、CTR-20の効果は、1.0μMの濃度ですでに飽和であり、CTR-20が、チューブリン重合のより強力な阻害剤であることが示されている(図28B)。
【０２２９】
CTR-17及びCTR-20は、チューブリンに結合した。それぞれ図29A及び図29Bから見てわかるように、CTR-17及びCTR-20は、用量依存的な方式で、チューブリンの内部トリプトファン蛍光を消失させた。25mM PIPES緩衝液に溶解した精製されたチューブリンを、異なる濃度のCTR-17又はCTR-20の存在下又は非存在下で37℃で30分間インキュベートした。蛍光を、295nMにおける反応混合物の励起によりモニターし、発光スペクトルを、315から370nmから記録した。図29C及び図29Dはそれぞれ、解離定数を決定するための、CTR-17及びCTR-20の薬物濃度に対してプロットした蛍光強度の変化を示す。ΔF(y-軸)は、CTR化合物によって結合した場合、チューブリンの蛍光強度の変化である。データは、5つの独立した実験の平均である。CTR-17及びCTR-20は、用量依存的な方式でチューブリンに結合した。
【０２３０】
CTR-17及びCTR-20の両方は、コルヒチンのチューブリンへの結合を阻害した(図30)。コルヒチンに類似の、試験されたCTR化合物は、チューブリンにおいてビンブラスチン結合部位に結合しなかった。コルヒチン、CTR-17、CTR-20、又はビンブラスチン各25μMを、チューブリンで1時間インキュベートして、チューブリンとこれらの化合物のそれぞれとの間の複合体の形成を促進した。得られた複合体を、蛍光性BODIPY FL-ビンブラスチン5μMで30分間インキュベートして、各化合物のチューブリンへの結合が、ビンブラスチンと競合したかどうか決定した。CTR-17は、コルヒチン結合部位で又はその近傍でチューブリンに結合する。ビンブラスチン又はCTR-17の濃度を増加させながら、チューブリン蛍光性コルヒチン複合体を、インキュベートした。CTR-17は、(蛍光性の)コルヒチンと競合したが、ビンブラスチンは、(蛍光性の)コルヒチンと競合しなかった。CTR化合物は、用量依存的な方式で、コルヒチン-チューブリン複合体の蛍光を抑制した。図30に示される通り、異なる濃度のコルヒチンの3つの異なるセットで、チューブリンを、異なる濃度のCTR-17又はCTR-20で1時間インキュベートした。CTR-17及びCTR-20の阻害定数を決定した。最終のチューブリン複合体の蛍光強度(図30C及び図30D)を用いて、改変されたDixonプロット(図30E及び図30F)を利用した阻害濃度(Ki)を決定した。図30では、Fは、CTR-17(若しくはCTR-20)-コルヒチン-チューブリンの複合体又はビンブラスチン-コルヒチン-チューブリン複合体の蛍光であり、F0は、コルヒチン-チューブリン複合体の蛍光である。データは、少なくとも4つの独立した実験の平均である。図30のデータによって、理論に拘泥するものではないが、チューブリンにおけるCTR-17及びCTR-20の結合部位は、コルヒチンの結合部位と重複し得るが、ビンブラスチンの結合部位と重複し得ないことが示唆される。
【０２３１】
図31Aは、コルヒチン(カラー画像中の青色;図31A中の中間の灰色)、CTR-17(カラー画像中の緑色;図31A中のより明るめの灰色)、CTR-20(カラー画像中のマゼンタ;図31A中のより暗めの灰色)及びポドフィロトキシン(カラー画像中の黄色;図31A中の明るめの灰色)のチューブリン-結合部位が、非常に近いが、ビンブラスチン(カラー画像中の赤色;図31A中の最も暗い灰色)の結合部位と近くないことを予測する分子のドッキングの結果を示す。チューブリン(PDBコード:1SA0)の3D X線構造を本試験に用いた。図31Bは、コルヒチン(カラー画像中の青色;図30B中の最も暗い灰色)、CTR-17(カラー画像中の緑色;図31B中の明るめの灰色)、CTR-20(カラー画像中のマゼンタ;図31B中の暗めの灰色)及びポドフィロトキシン(カラー画像中の明るめの赤色;図31B中の最も明るい灰色)の化学構造を、チューブリンにおけるそれらのそれぞれの結合部位に結合した場合、近接した重複の可視化を助けることを示すことが示される。要約すると、理論に拘泥するものではないが、分子のモデリングから得られたデータによって、CTR-17及びCTR-20によって結合されたチューブリン部位が、コルヒチン及びポドフィロトキシンの部位と本質的に重複するが、ビンブラスチンの部位と完全に異なることが示された。
【０２３２】
チューブリンヘテロ二量体(PDBコード:1SA0)とコルヒチン(A)、CTR-20(B)、及びCTR-17(C)との間の予測された相互作用を、図32中の3Dパターンで示す。図32中の2Dリガンド相互作用の図では、4Åのコルヒチン(A')、CTR-20(B')、又はCTR-17(C')への距離内のアミノ酸と化合物との間の潜在的な化学的相互作用を示す。チューブリンとコルヒチンとの間で3つのH-結合があり、チューブリン-CTR-17とチューブリン-CTR-20との間に、それぞれ1つ及び2つのH-結合がある。矢印の方向は、水素結合における電子供与体を示す。H-結合は、それぞれ側鎖及びアミノ酸主鎖によって形成される。疎水性及び極性残基の数は、チューブリンへの結合において、コルヒチンとCTR化合物との間で重複する。色コードは、次の通りである。暗めの灰色(カラー画像で赤色)の正方形の囲みは、コルヒチン及びCTR-20への結合に共通するチューブリンアミノ酸であり;最も明るい灰色(カラー画像中の黄色)の囲みは、コルヒチン及びCTR-17への結合に共通のものであり;明るめの灰色(カラー画像中の青色)の囲みは、CTR-17及びCTR-20への結合に共通のものである。非共有結合性及びファンデルワールス相互作用によって、チューブリンとこれらの化合物との間の結合が安定化する。要約すると、分子のモデリングから得られたデータによって、コルヒチン、CTR-17及びCTR-20のチューブリンへの結合モードは、チューブリンにおいて同じアミノ酸残基にしばしば結合するのと非常に類似することが示された。しかしながら、これらはまた、結合モードの差を示す。例えば、コルヒチンは、3つのH-結合を形成し、CTR-17及びCTR-20は、それぞれ、1つのみ及び2つのH-結合を形成する。理論に拘泥するものではないが、これらの差は、例えば、本化合物の効果、毒性及び可逆性に直接関連することが可能である。
【０２３３】
CTR-17及びCTR-20は、多剤耐性癌細胞に対して有効である。親KB-3-1及びMDR1過剰発現KB-C-2同系細胞株から調製された全細胞抽出物のウエスタンブロット法を、図33Aに示す。親H69及びMRP1過剰発現H69AR同系細胞株から調製された全細胞抽出物のウエスタンブロット法を、図33Bに示す。Table 7(表7)中のデータによって、CTR-17及びCTR-20が、類似の効力によって、親(KB-3-1)及びMDR1過剰発現多剤耐性細胞(KB-C-2)を死滅させ、これらのCTR化合物が、マッチしている小細胞肺癌細胞(SW-1271)に対して、MRP1過剰発現多剤耐性細胞(H69AR)を優先的に死滅させることが示される。SRBアッセイを用いて、抗増殖効果を決定した。コルヒチン、パクリタキセル及びビンブラスチンは、多剤耐性細胞を死滅させることにおいて主として効果がない。図33及びTable 7(表7)に示されるデータによって、CTR-17及びCTR-20が、類似の効力でKB-3-1(子宮頚癌)及びそのMDR1過剰発現多剤耐性同系細胞(KB-C-2)を死滅させ、コルヒチン、パクリタキセル、及びビンブラスチンが、非抵抗性細胞よりも少なくとも10倍有効性が低い薬物耐性細胞を死滅させることが実証されている。更に、両CTR化合物とも、マッチしている非癌小細胞肺癌細胞株(SW-1271)に対して、MRP1過剰発現、多剤耐性H69AR細胞を優先的に死滅させた。
【０２３４】
図34から見てわかるように、CTR-17及びCTR-20は、パクリタキセルと合わせた場合、相乗効果を示す。KB-C-2多剤耐性細胞を、異なる投与量のCTR化合物及びパクリタキセルの組合せで、抗増殖試験にかけた。SRBアッセイから得られたデータを用いて、S字形の用量反応曲線を作成し、それから、中央効果量(Dm)、影響された画分(Fa)及び曲線のスロープ(m)を決定した。次いで、これらの値を用いて、方法論セクションで概説した通り、CTR-17/-20間のパクリタキセルとの組合せ効果を決定した。Table 8(表8)に示されたCTR-17データの一部を、図34A中でグラフの形態で示す。レーンは、0.65μM CTR-17(レーン1&4)、23nMパクリタキセル(レーン2)、0.65μM CTR-17プラス23nMパクリタキセル(レーン3)、5.75nMパクリタキセル(レーン5)、及び0.65μM CTR-17プラス5.75nMパクリタキセルを示す。Table 8(表8)に示されたCTR-20データの一部を、図34Bにグラフの形態で示す。レーンは、0.25μMのCTR-20(レーン1&4)、23nMパクリタキセル(レーン2)、0.25μM CTR-20プラス23nMパクリタキセル(レーン3)、11.5nMパクリタキセル(レーン5)、及び0.25μM CTR-20プラス11.5nMパクリタキセル(レーン6)を示す。CIは、組合せ指数を示す。CI<1.0、CI=1.0及びCI>1.0は、それぞれ、相乗的、相加的及び拮抗的である(Chou、2006年)。更に詳細について、Table 8(表8)を参照のこと。示されたデータは、少なくとも4つの独立した実験の3回の平均±標準誤差値である。図34及びTable 8(表8)中のデータから示される通り、KB-C-2多剤耐性細胞においてパクリタキセルと組み合わせて用いた場合、CTR-17及びCTR-20は、相乗的な細胞死滅効果を示した。0.65μM CTR-17及び23.0nMパクリタキセルの組合せ指数(CI)が、0.71±0.08であり、0.25μM CTR-20及び11.5〜23.0nMパクリタキセルの組合せ指数(CI)が、0.69であったことに留意されたい。したがって、CTR化合物及びパクリタキセルの組合せは、MDR1過剰発現多剤耐性KB-C-2(及び、理論に拘泥するものではないが、他の)細胞においてほぼ相乗的となりうる。
【０２３５】
図35中のデータによって、MDR1過剰発現パクリタキセル耐性MDA-MB231TaxRが、CTR-17、CTR-20、CTR-21及びCTR-32に感受性があることが示される。パクリタキセル耐性MDA-MB231TaxR細胞株を、細胞が、100nMのパクリタキセルを含有する培地中で成長する及び増殖するまで、1年間にわたってパクリタキセルの濃度を追加的に増加することにおいて、トリプルネガティブのMDA-MB231転移性乳癌細胞株を培養することにより自家で生成した。続いて、細胞に、毎月1回100nMパクリタキセルを投与し、細胞を、実験用に用いられる前に、少なくとも1継代の間薬物から除去した。図35Aは、P-糖タンパク質(MDR1)の発現についてのMDA-MB231親細胞(WT)と並んだ、パクリタキセル抵抗性の異なるレベル:2.0、10.0、15.0、30.0及び100.0nMでのMDA-MB231TaxR細胞のウエスタンブロット法が、それぞれ2.0、10.0、15.0、30.0及び100.0μMでのパクリタキセルの濃度で選択された細胞であることを示す。親MDA-MB231細胞(WT)は、P-糖タンパク質を発現せず;しかしながら、TaxR細胞中で抵抗性のレベルが増加するにつれて、P-糖タンパク質発現のレベルは、増加する(図35A)。図35B中のデータによって、コルヒチン、CTR-17、CTR-20、CTR-21、及びCTR-32が、親MDA-MB231細胞と同じ程度まで、(100.0nMパクリタキセルにおいて選択される)MDA-MB231TaxR細胞を死滅させることが示される。しかしながら、MDA-MB231TaxR細胞は、それぞれおよそ114及び15倍までパクリタキセル及びビンブラスチンに抵抗性があり、MDA-MB231TaxR細胞が、性質上多剤耐性であることが示唆された。
【０２３６】
図36中のデータによって、ボルテゾミブ耐性RPMI-8226BTZR多発性骨髄腫細胞が、CTR-20、CTR-21及びCTR-32に感受性があることが示される。ボルテゾミブ耐性RPMI-8226BTZR細胞株を、20S触媒サブユニットのβ5ペプチドを標的化するプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブの濃度を徐々に増加させることにおいて、RPMI-8226多発性骨髄腫細胞株を培養することにより自家で開発した。RPMI-8226BTZRは、20Sサブユニットのβ1、β2及びβ5ペプチドを過剰発現する。図36によって、RPMI-8226BTZRが、RPMI-8226親細胞と比較して、ボルテゾミブに対しておよそ28倍抵抗性があることが示される。しかしながら、RPMI-8226BTZRは、CTR-20、CTR-21及びCTR-32に感受性がある(図36)。
【０２３７】
パクリタキセルと組み合わせた場合、CTR-20、CTR-21及びCTR-32によって、パクリタキセル/多剤耐性MDA-MB231TaxR細胞を死滅させることにおいて相乗作用を示した(図37及びTable 9(表9))。CTR-17及びCTR-20が、MDR1過剰発現KB-C-2細胞を死滅させる上でパクリタキセルと相乗的であることが前もって見出された(図34及びTable 8(表8))。図37及びTable 9(表9)中のデータは、MDA-MB231TaxR細胞に対するパクリタキセル並びにCTR-20(A)、CTR-21(B)及びCTR-32(C)の組合せ効果を示す。実験のこのセットの場合、本発明者らは、パクリタキセルの4〜5種の異なる投与量を、CTR-20、CTR-21又はCTR-32の単回投与と組み合わせた。細胞生存率は、これらの薬物がそれぞれ、用いた投与量で単独に用いた場合、常に50%を超えた。しかしながら、パクリタキセル及びCTR-20、CTR-21又はCTR-32と組み合わせた場合、細胞生存率は、同じ投与量で減少した。例えば、0.3μMのCTR-20及び37.5nMパクリタキセルの組合せでは、MDA-MB231TaxR細胞のおよそ56%が死滅した(Table 9(表9))。CTR-21 23.4nM及び18.75nMパクリタキセルの組合せでは、MDA-MB231Tax細胞58%が死滅した(Table 9(表9))。最後に、23.4nMのCTR-32及び18.75nMパクリタキセルの組合せでは、MDA-MB231TaxR細胞の52%が死滅した(Table 9(表9))。これらのデータを、それぞれ、組合せ指数(CI)0.59、0.35及び0.27に置き換え(Table 9(表9)及び図37)、これらの組合せが相乗的であることが示される。パクリタキセルが一般に毒性があるため、多剤耐性癌細胞に対する低い薬物濃度でのパクリタキセル-CTRの組合せの相乗効果は、副作用が少ない薬物耐性癌を制御する新たな機会を示す。
【０２３８】
図38及びTable 10(表10)中のデータによって、CTR-20及びABT-737の組合せが、MDA-MB231トリプルネガティブ転移性乳癌細胞に対して相乗的であることが示される。本発明者らは、CTR-20及び抗アポトーシスBcl2ファミリータンパク質の阻害剤の組合せ効果を検査した。CTR-20の3種の異なる投与量及びABT-737の2種の異なる投与量による異なる組合せのすべてから得られたデータによって、MDA-MB231細胞において相乗効果が示された。特に、0.2μMのCTR-20及びABT-737 6.25μMの組合せでは、CI値が0.07であり、高度の相乗作用を示した。同様に、0.4μMのCTR-20及び6.25μMのABT-737の組合せのCIは、0.10であった。これらの組合せで、MDA-MB231細胞母集団を完全に除外した(Table 10(表10)及び図38)。
【０２３９】
図39中のデータによって、0.4μM CTR-20(CTR)及び6.25μM ABT-737(ABT)の組合せが、処置後72時間までにMDA-MB231母集団を完全に全滅させることが示される。単一のレジメンとして、6.25μMまでのABT-737は、いかなる実質的なやり方においても細胞周期進行を変更しなかった。しかしながら、MDA-MB231細胞は、0.4μM CTR-20プラス6.25μM ABT-737の存在下で、G2/M期で、「永久に」停止し、組合せ治療後72時間までに、(競合するsub-G1 DNAの存在により現れた)アポトーシス細胞死をもたらした。
【０２４０】
CTR-20及びABT-737の組合せは、M期で細胞周期の停止によってアポトーシスを誘導し、抗アポトーシスBcl-XL及びMcl-1を抑制する。図40中のデータによって、(1)セリン62残留物におけるサイクリンB及びBcl-XLリン酸化のレベルが、0.4μM CTR-20の存在下で実質的に増加し、細胞周期が、G2/M期で停止し、抗-アポトーシス経路が抑制された(黒い矢印)こと;(2)0.2〜0.4μM CTR-20及び6.25μM ABT-737の組合せが、Mcl-1をダウンレギュレートする(白い矢印)ことにより抗-アポトーシス経路を更に抑制したこと;並びに(3)CTR-20(0.2〜0.4μM)及びABT-737(3.13〜6.25μM)の組合せが、PARP及びカスパーゼ3の切断によって現れたように、アポトーシスを効率的に誘導したことが示される。
【０２４１】
図41中のデータによって、CTR-20が、NCI60癌パネル中に含まれるすべての細胞株の細胞増殖を効率的に死滅させた又は抑制したことが示される。米国国立癌研究所(US national Cancer Institute)によって行われた、SRBによって媒介される細胞生存アッセイから得られたデータによって、10μM CTR-20で48時間処置した細胞が、NCI-60パネルにおいて:6種の白血病細胞株(-2.46から+10.88%までの範囲)、9種の非小細胞肺癌細胞株(-11.97から38.93%まで)、7種の結腸直腸癌細胞株(+4.37から+23.11まで)、6種のCNS癌(-+11.48から+17.04%まで)、9種の黒色腫(-10.05から+50.45%まで)、7種の卵巣癌細胞株(+1.18から+50.80%まで)、7種の腎癌細胞株(-7.90から+42.01%まで)、2種の前立腺癌細胞株(+10.76から+22.06まで)、及び6種の乳癌細胞株(-2.02から+18.91%まで)を含めた、60種の癌細胞株すべての増殖を効率的に死滅させた/抑制したことが示される。
【０２４２】
図42から見てわかるように、CTR-17及びCTR-20では、異種移植モデルにおける有効な抗腫瘍活性を示した。図42Aは、単独で又はパクリタキセルと組み合わせた、薬物治療に応答した、腫瘍サイズ(体積(mm3))の変化を示す。実験プロトコール及びデータを、Table 11(表11)及び12(表12)にそれぞれ示す。CTR-18及びCTR-19の抗腫瘍活性を、Table 13(表13)に示す。値は、平均±標準誤差である。「D」は、処置後の日数を示す。図42Bは、ビヒクルのみであった又は示される薬物で処置されたMDA-MB-231ヒト転移性乳癌細胞で移植された代表的なATH490胸腺欠損マウスの例示的な画像を示す。括弧内の数字は、体重mg/kgである。図42及びTable 11(表11)及び12(表12)から見てわかるように、CTR-17及びCTR-20によって、マウス異種移植モデルにおけるMDA-MB-231転移性乳癌に対する強力な抗腫瘍活性が示された。CTR-17(又はCTR-20)1/2用量のパクリタキセル1/2用量との組合せは、CTR-17、CTR-20、又はパクリタキセル単独の総投与量よりもかなり有効であった。4つのすべてのCTR化合物(CTR-17、-18、-19及び-20)は抗腫瘍活性を示したが、CTR-20は、MDA-MB-231転移性乳癌細胞で移植されたマウスによる最大の抗腫瘍活性を示す。この結果は、in vitro試験の結果と一致する。
【０２４３】
体重分析から得られたデータから、CTR化合物は、マウスに対して毒性がないことが示されている(図43)。6週齢のATH40胸腺欠損ヌードマウスを、説明文に示される通り治療した。「Tax」は、パクリタキセルが、Table 11(表11)に記載されている通りi.v.により注射されたことを示す。D0〜D30は、薬物治療の0日後から30日後を示す。括弧内の数字は、体重mg/kgにおける薬物濃度を示す。ATH490マウスの体重は、0日目(100%)に全体重に基づき正規化した。CTR-17もCTR-20も、体重の変化によって決定される通り、ATH490胸腺欠損マウスへのいかなる著しい毒性副作用も引き起こさなかった。
【０２４４】
CTR-17もCTR-20も、マウスの生命維持を司る器官へのいかなる著しい弊害をも引き起こさないことが観察された。(Table 11(表11)に記載されている通り)異なる治療群から得られたATH490マウスの異なる4つの臓器(肝臓、脾臓、腎臓及び肺)の質量を、治療の30日後に測定した。GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software社)を用いて、分析を行った。すべての値は、平均±標準誤差として示される。各群間の比較を、一元ANOVAを用いて決定したp値によって行った。p値<0.05は、統計的に有意であると考えられる。このデータによって、ビヒクルのみの群と薬物によって治療された群の間の脾臓、腎臓、及び肺の質量に有意差がなかった(脾臓、腎臓及び肺についてのp値は、それぞれ0.99、0.74、及び0.36であった)ことが示される。しかしながら、パクリタキセル及びCTR化合物と組み合わせて治療したサンプルの肝臓サイズは、ビヒクルのみの対照のそれよりもいくぶん小さかった。(p=0.0003)。各臓器質量(%)を、全体重(BW)で正規化した。本データによって、理論に拘泥するものではないが、CTR-17 30mg/kg又はCTR-20 30mg/kgによるATH490マウスの治療は、図44に示される4つの生命維持を司る器官(肝臓、脾臓、腎臓及び肺)の質量の変化によって決定される通り、動物においていかなる著しい弊害をも引き起こさない。
【０２４５】
図45では、肝臓に対するCTR-17及びCTR-20の効果の例示的な画像を示す。ATH490胸腺欠損マウスを、30日間、列挙した濃度に示される通り治療し(図45A)、次いで、肝臓細胞増殖を、有糸分裂細胞の数を検査することにより分析した(図45A中の白い矢印)。「Tax」は、パクリタキセルを示す。(図45B)中の括弧内の数字は、体重mg/kgである。図45及びTable 14(表14)から見てわかるように、パクリタキセル10mg、CTR-17 30mg、又はCTR-20 30mgで治療した動物の肝臓は、分裂指数の増加が小さいことを示した。しかしながら、この小さい増加は、AST/ALT比が<3であるため正常であると考えられる(Table 14(表14))。肝臓組織中の有糸分裂細胞における小さい増加は、パクリタキセル1/2用量(5mg)及びCTR-17 1/2用量(15mg)又はCTR-20 1/2用量(15mg)を組み合わせて用いた場合、完全に防止された(p<0.0001)。
【０２４６】
CTR-17もCTR-20も、脾臓へのいかなる著しい毒性を引き起こさないことが観察された。ATH490胸腺欠損マウスを、30日間、偽薬処置した(ビヒクルのみ)又は指示された投与量の化合物で治療し、その後、脾臓組織をH & E染色した後、毒性分析を行った。括弧内の数字は、体重kg当たりmgである。矢印は、赤脾髄(RP)中のマクロファージの存在を示している。画像を、Zeiss EPI-蛍光顕微鏡(10×対物)を用いて撮影した。脾臓における毒性を、Table 15(表15)にまとめて示す。薬物投与を、Table 11(表11)に記載されている通り行った。図46及びTable 15(表15)から見てわかるように、ミエロイド及びリンパ球の細胞充実性、過形成の増加を含めた、脾臓の考慮すべき副作用を示したパクリタキセル(10mg/kg)で治療した動物と違って、CTR-17 30mg/kg又はCTR-20 30mg/kgで治療した動物は、赤脾髄中のミエロイド要素のわずかな増加を除いて、脾臓組織へのいかなる著しい弊害をも示さなかった。CTR-20 1/2用量(15mg)及びパクリタキセル1/2用量(5mg)で治療した動物は、脾臓へのいかなる弊害をも示さなかった。
【０２４７】
図47は、腎臓に対するCTR-17及びCTR-20の効果の例示的な画像を示す。ATH490マウスを、Table 11(表11)に記載されている通り治療した。30日目に、腎臓を回収し、H&Eで染色し、Zeiss EPI-蛍光顕微鏡(40×対物)下で観察した。CTR-17(30mg/kg)、CTR-20(30mg/kg)又はCTR-17(15mg/kg)若しくはCTR-20(15mg/kg)と組み合わせたパクリタキセル(5mg/kg)による動物の治療は、一般に、腎臓へのいかなる著しい弊害をも引き起こさなかった。しかしながら、マウスを、パクリタキセル(10mg/kg)で処置した場合、5匹のうちおよそ1匹のマウスは、糸球体の空間が拡張されるガラス状の及び無細胞の硝子質及び低細胞性の外観を有する腎異常を示した。
【０２４８】
V.考察
芳香族ケトン及びエノン基、カルコン系化合物(スキーム3)から構成される中心コアによって、強力な抗チューブリン活性を示すことが報告されている(Luら、2012年)。
【０２４９】
【化３１】
2019501958.tif 000034
【０２５０】
スキーム3:(a)カルコン及び(b)本試験のキノロンカルコンのコアの化学構造
【０２５１】
カルコンのチューブリンへの結合は、コルヒチン及びポドフィロトキシンによって阻害されることが報告され、いくつかのカルコン系化合物は、コルヒチン結合部位によって又はそれに非常に近接してβ-チューブリンに効率的に結合することができるということが示唆されている(Duckiら、2005年;Duckiら、2009年;Hadfieldら、2003年;Lawrenceら、2000年;Peyrotら、1992年)。他の試験によって、カルコン系化合物は、可逆的に及び速やかにチューブリンに結合し、したがって、微小管集合を阻害することも示された(Stantonら、2011年)。
【０２５２】
カルコン骨格に基づき微小管を標的化する有効且つ安全な抗癌剤の開発は、医学的に重要である。
【０２５３】
ある範囲の置換基、例えば、アリール環A中のニトロ基、メトキシ及びメチル基等及びハロゲン原子(F、Cl及びBr)を有する10種のキノロンカルコンを合成し、次いで、3種の乳癌細胞株及び1種又は2種の非癌乳房細胞株に対する抗癌活性についてスクリーニングした。これらの結果から、試験済みの異なる置換の中でもとりわけ、アリール環A中の2-メトキシ置換は、乳癌細胞に対する選択性及び増殖抑制効力を強化し、MDA-MB-231、MDA-MB-468、及びMCF-7細胞に対してIC50値がそれぞれ0.41、0.15及び0.52μMであることが示された。そのため、次いで、フェニル環A中で2-アルコキシ置換を有した(Table 1(表1))24種の新規なキノロンカルコンを合成し、次いで、これらの化合物のうちのいくつかの抗癌活性を検査した(Table 2〜4(表2〜4))。
【０２５４】
化合物CTR-17及びCTR-20は、非癌細胞に対して、24〜26倍まで、癌を優先的に死滅させることを示した。更に、CTR-17及びCTR-20による様々な異なる癌細胞株の死滅におけるIC50値によって、サブ-μM範囲中で、その両方が有望なリードを作製することが見出された。更なる試験によって、24種の新規なキノロンカルコン化合物のすべてが、癌細胞を効率的に死滅させ、その多くが、非癌細胞に対して癌を優先的に死滅させることが示された。同系細胞株による試験では、CTR-20、CTR-21及びCTR-32が、前悪性MCF10AT1及び非癌MCF10A乳細胞に対して、完全に悪性のMCF10CA1a乳癌細胞を優先的に死滅させることが示された。前もって、本発明者らは、CTR-17及びCTR-20が、非抵抗性細胞とほぼ有効な(又は場合によってはより優れた)多剤耐性細胞の2つの異なる系統(過剰発現MDR1又はMRP)を死滅させたことを同定した。それに対して、コルヒチン、パクリタキセル及びビンブラスチンは、多剤耐性細胞を死滅させることにおいて、非抵抗性対照細胞よりも少なくとも10倍有効性が低い。CTR-21及びCTR-32は、効力が高い多剤耐性及びパクリタキセル耐性MDA-MB231TaxR乳癌細胞を死滅させることが判明した。CTR-20はまた、2つのボルテゾミブ耐性多発性骨髄腫細胞株(RPMI-8226-BR及びANBL6-BR)を効率的に死滅させ、本データによって、CTR化合物が、現在、化学療法の失敗の主要な原因である薬物耐性問題を効率的に克服することが示される。
【０２５５】
本データによって、CTR-17及びCTR-20の両方が、チューブリンに結合し、その結果、微小管重合を阻害させることが示された。本発明者らはまた、CTR-17及びCTR-20のチューブリン結合部位が、コルヒチン結合部位と密接に重複するが、ビンブラスチン結合部位から離れることも示されている。コンピュータ内での分子のモデリングから得られたデータによって、強力なファンデルワールス相互作用に加えて、CTR-17、CTR-20及びコルヒチンがそれぞれ、チューブリンにおけるアミノ酸残基との1つ、2つ及び3つのH-結合を形成することが示唆される。
【０２５６】
コルヒチン結合部位への結合によって微小管の動力学を乱す薬剤は、ヒトに対してかなり毒性がある傾向があるが、薬物耐性問題を最小限にすることは周知である。CTR-20、CTR-21及びCTR-32等の化合物が、薬剤耐性を克服することができるという知見は、少なくともCTR-17及びCTR-20が、コルヒチン結合部位に結合するというこの以前の知見と一致する。
【０２５７】
ヒトに非常に毒性があることが公知である(Luら  2012年)、コルヒチンと対照的に、CTR-17及びCTR-20等の化合物は、動物に対してほとんど毒性を示さず(図43〜図47)、これは、in vitroデータと一致する(Table 2(表2))。CTR-20と同様に、CTR-21及びCTR-32等の化合物は、悪性-依存方式で細胞を死滅させる。この概念は、CTR-17、CTR-20、CTR-21及びCTR-32による微小管の動力学の阻害が、化合物を洗い落とした後(細胞周期進行を回復することにより現れる)、可逆的であるため、補強される。
【０２５８】
理論に拘泥するものではないが、化合物(例えば、CTR-17、CTR-20及びコルヒチン)とチューブリンのアミノ酸残基との間のH-結合の数は、効果、可逆性及び毒性の差と関連しうる。上記を受けて、2つのH-結合を示すCTR-20は、多くの異なる癌においてかなり有効であり(Tables 2及び3(表2及び3))、依然として可逆的である(図17)。更に、CTR-20は、非癌細胞に対して、優先的に癌細胞を死滅させることを示す(Table 2(表2))。CTR-17及びCTR-20では、DNA損傷を引き起こすこともDNA複製を妨害することも観察されなかった。
【０２５９】
MDA-MB-231転移性乳癌を移植されたマウスによる実験から得られたデータによって、CTR-20の効果が、パクリタキセルの効果とほぼ匹敵することが示される(CTR-20及びパクリタキセルが、それぞれ30mg/kg及び10mg/kgの用量で用いられたが、前者を、i.p.によって投与し、後者を、i.v.によって投与した)。しかしながら、CTR-20は、毒性が低い(図46)。更に、CTR-20及びパクリタキセル1/2用量の組合せは、CTR-20又はパクリタキセル単独の総投与量よりも更に有効であった。
【０２６０】
同時に、in vitroデータによって、新規なチューブリン-標的化化合物、例えば、CTR-17、CTR-20、CTR-21及びCTR-32等が、NCI-60癌パネル並びにMDR1-及びMRP1過剰発現多剤耐性癌細胞(パクリタキセル、ビンブラスチン及びコルヒチンにも抵抗性がある)に含有される細胞株のすべてを含めた、多くの異なる癌細胞を優先的に死滅させることが示される。転移性乳房腫瘍細胞を移植されたマウスから得られたデータによって、単独で又はパクリタキセルと組み合わせて用いた場合、これらのCTR化合物の両方が、強力な抗腫瘍活性を有することが示された。
【０２６１】
本開示は、好ましい例であると現在考えられるものに関して記載されており、本開示が、開示された例に限定されないということが理解されるべきである。それとは反対に、本開示は、添付した特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる様々な修正及び相当する処置を包含することを目的としている。
【０２６２】
各個別の刊行物、特許又は特許出願が、その全体を参照により組み込まれることが具体的に及び個別に示された場合と同じ程度で、すべての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示における用語が、参照により本明細書に組み込まれる文献において別々に定義されることが見出されている場合、本明細書で提供される定義は、用語についての定義として働くものである。
【０２６３】
【表Ａ−１】
2019501958.tif 000035
【表Ａ−２】
2019501958.tif 000036
【表Ａ−３】
2019501958.tif 000037
【０２６４】
【表１−１】
2019501958.tif 000038
【表１−２】
2019501958.tif 000039
【表１−３】
2019501958.tif 000040
【表１−４】
2019501958.tif 000041
【０２６５】
【表２】
2019501958.tif 000042
【０２６６】
【表３】
2019501958.tif 000043
【０２６７】
【表４】
2019501958.tif 000044
【０２６８】
【表５】
2019501958.tif 000045
【０２６９】
【表６】
2019501958.tif 000046
【０２７０】
【表７】
2019501958.tif 000047
【０２７１】
【表８】
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【０２７２】
【表９】
2019501958.tif 000049
【０２７３】
【表１０】
2019501958.tif 000050
【０２７４】
【表１１】
2019501958.tif 000051
【０２７５】
【表１２】
2019501958.tif 000052
【０２７６】
【表１３】
2019501958.tif 000053
【０２７７】
【表１４】
2019501958.tif 000054
【０２７８】
【表１５】
2019501958.tif 000055
【図１】
2019501958.tif 000062
【図２Ａ】
2019501958.tif 000063
【図２Ｂ】
2019501958.tif 000064
【図３】
2019501958.tif 000065
【図４】
2019501958.tif 000066
【図５Ａ】
2019501958.tif 000067
【図５Ｂ】
2019501958.tif 000068
【図６】
2019501958.tif 000069
【図７】
2019501958.tif 000070
【図８】
2019501958.tif 000071
【図９】
2019501958.tif 000072
【図１０Ａ】
2019501958.tif 000073
【図１０Ｂ】
2019501958.tif 000074
【図１０Ｃ】
2019501958.tif 000075
【図１１】
2019501958.tif 000076
【図１２Ａ】
2019501958.tif 000077
【図１２Ｂ】
2019501958.tif 000078
【図１３】
2019501958.tif 000079
【図１４】
2019501958.tif 000080
【図１５】
2019501958.tif 000081
【図１６】
2019501958.tif 000082
【図１７Ａ】
2019501958.tif 000083
【図１７Ｂ】
2019501958.tif 000084
【図１８Ａ】
2019501958.tif 000085
【図１８Ｂ】
2019501958.tif 000086
【図１９】
2019501958.tif 000087
【図２０Ａ】
2019501958.tif 000088
【図２０Ｂ】
2019501958.tif 000089
【図２１】
2019501958.tif 000090
【図２２】
2019501958.tif 000091
【図２３Ａ】
2019501958.tif 000092
【図２３Ｂ】
2019501958.tif 000093
【図２４】
2019501958.tif 000094
【図２５】
2019501958.tif 000095
【図２６】
2019501958.tif 000096
【図２７】
2019501958.tif 000097
【図２８】
2019501958.tif 000098
【図２９−１】
2019501958.tif 000099
【図２９−２】
2019501958.tif 000100
【図３０−１】
2019501958.tif 000101
【図３０−２】
2019501958.tif 000102
【図３１Ａ】
2019501958.tif 000103
【図３１Ｂ】
2019501958.tif 000104
【図３２−１】
2019501958.tif 000105
【図３２−２】
2019501958.tif 000106
【図３２−３】
2019501958.tif 000107
【図３３Ａ】
2019501958.tif 000108
【図３３Ｂ】
2019501958.tif 000109
【図３４Ａ】
2019501958.tif 000110
【図３４Ｂ】
2019501958.tif 000111
【図３５Ａ】
2019501958.tif 000112
【図３５Ｂ】
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【図３６】
2019501958.tif 000114
【図３７Ａ】
2019501958.tif 000115
【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
2019501958.tif 000117
【図３８】
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【図３９】
2019501958.tif 000119
【図４０】
2019501958.tif 000120
【図４１】
2019501958.tif 000121
【図４２Ａ】
2019501958.tif 000122
【図４２Ｂ】
2019501958.tif 000123
【図４３】
2019501958.tif 000124
【図４４−１】
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【図４４−２】
2019501958.tif 000126
【図４５Ａ】
2019501958.tif 000127
【図４５Ｂ】
2019501958.tif 000128
【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
2019501958.tif 000131
2019501958.tif 000132
2019501958.tif 000133