【手続補正書】
【提出日】平成19年1月10日(2007.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内小器官へ誘導するトラフィッキングシグナルを有する少なくとも１つのシグナルタンパク質及び１つのプロテアーゼに対する少なくとも１つのタンパク分解切断部位を含むキメラタンパク質であって、以下の（ａ）−（ｃ）のように構築される前記キメラタンパク質：
（ａ）前記全てのシグナルタンパク質の前記トラフィッキングシグナルが、前記シグナルタンパク質のＮ−又はＣ−末端に前記タンパク分解部位を、又はシグナル隠蔽タンパク質を前記タンパク分解部位を介して連結することによって不活化されており、従って前記キメラタンパク質が細胞質ゾルに存在し、
（ｂ）少なくとも１つのシグナルタンパク質の前記トラフィッキングシグナルが、前記タンパク分解切断部位が前記プロテアーゼによって切断されたときに活性化され、その結果、前記活性化されたシグナルタンパク質を含む少なくとも１つのフラグメントタンパク質が細胞内小器官に輸送され、更に
（ｃ）前記キメラタンパク質が少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列で標識され、前記検出可能なアミノ酸配列の細胞内の位置及び強度分布が前記プロテアーゼの前記切断に応じて変化する。
【請求項２】
細胞内小器官へ誘導するトラフィッキングシグナルを有する少なくとも２つのシグナルタンパク質及び１つのプロテアーゼに対する少なくとも１つのタンパク分解切断部位を含むキメラタンパク質であって、以下の（ａ）−（ｄ）のように構築される前記キメラタンパク質：
（ａ）１つのシグナルタンパク質の前記トラフィッキングシグナルが活性を維持し、前記シグナルタンパク質の残りのトラフィッキングシグナルは、前記シグナルタンパク質のＮ−又はＣ−末端に前記タンパク分解部位を、又はシグナル隠蔽タンパク質を前記タンパク分解部位を介して連結することによって不活化されており、従って前記キメラタンパク質は、前記活性なシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルによって誘導されて特定の細胞内小器官に輸送され、
（ｂ）前記キメラタンパク質が前記細胞内小器官に輸送された後、少なくとも１つのタンパク分解部位及び少なくとも１つの不活化されたシグナルタンパク質が細胞質ゾルに露出され、
（ｃ）前記タンパク分解切断部位がプロテアーゼによって切断されたときに、細胞質ゾルに露出された少なくとも１つの不活化されたシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが活性化され、その結果、前記活性化されたシグナルタンパク質を含むフラグメントタンク質が、前記キメラタンパク質が輸送された細胞内小器官とは異なる細胞内小器官に輸送され、更に
（ｄ）前記キメラタンパク質が少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列で標識され、前記検出可能なアミノ酸配列の細胞内の位置及び強度分布は前記プロテアーゼの切断に応じて変化する。
【請求項３】
前記タンパク分解切断によって生成されたフラグメントタンパク質の中で、異なる細胞内局在特性をもつ少なくとも２つのフラグメントタンパク質が、異なる検出可能なアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
その不活化されてあるトラフィッキングシグナルがタンパク分解切断によって活性化されるシグナルタンパク質を含むフラグメントタンパク質の中で、少なくとも１つのフラグメントタンパク質が検出可能なアミノ酸配列を含む請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
細胞内小器官へ誘導するトラフィッキングシグナルを有する１つのシグナルタンパク質及び１つのプロテアーゼのタンパク分解切断部位を介して前記シグナルタンパク質に連結された検出可能なアミノ酸配列を含むキメラタンパク質であって、以下の（ａ）−（ｃ）のように構築される前記キメラタンパク質：
（ａ）前記シグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが前記キメラタンパク質で活性を維持し、従って前記キメラタンパク質は細胞内小器官に輸送され、
（ｂ）前記キメラタンパク質が前記細胞内小器官に輸送された後、前記タンパク分解切断部位及び前記検出可能なアミノ酸配列が細胞質ゾルに露出され、更に
（ｃ）その結果、細胞質ゾルに露出された前記タンパク分解切断部位が前記プロテアーゼによって切断されるとき、細胞質ゾルに露出された前記検出可能なアミノ酸配列が細胞質ゾルに遊離される。
【請求項６】
前記活性を維持するシグナルタンパク質が、細胞質ゾルに露出された前記検出可能なアミノ酸配列の蛍光の波長と異なる蛍光波長を有する第２の検出可能なアミノ酸配列で更に標識され、前記タンパク分解切断が生じた後も前記第２の検出可能なアミノ酸配列が前記活性なシグナルタンパク質に付着したままである請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記不活化されてあるシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが、ミトコンドリア、葉緑体及びペルオキシソームから成る群から選択される細胞内小器官へ誘導するシグナルである請求項１及び２のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
不活化されてある前記シグナルタンパク質が、シロイヌナズナ外皮膜タンパク質７（ＡｔＯＥＰ７）、ルビスコ小サブユニット（ＲｂｃＳ）、葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質（Ｃａｂ）、ルビスコアクチヴァーゼ（ＲＡ）、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ及びペルオキシソーム誘導モチーフ（ＳＫＬ）から成る群から選択される完全長タンパク質又はトラフィッキングシグナルを含むその部分である請求項１及び２のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記活性を維持するシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが、ミトコンドリア、葉緑体及び核の外膜、ペルオキシソーム膜並びに細胞質膜から成る群から選択されるものへ誘導するシグナルである請求項２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記活性を維持するシグナルタンパク質が特定のリン脂質と特異的に結合するタンパク質である請求項２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記活性を維持するシグナルタンパク質が、シロイヌナズナ外皮膜タンパク質７（ＡｔＯＥＰ７）、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ、プレックストリン相同ドメイン（ＰＨ）及びＦＡＰＰ（ファミリーＡ（ホスホイノシチド結合特異的）メンバー３）のプレックストリン相同ドメインから成る群から選択される完全長タンパク質又は前記トラフィッキングシグナルを含むその部分である請求項２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記シグナル隠蔽タンパク質がアミノ酸、ペプチド及びタンパク質から成る群から選択される請求項１及び２のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記検出可能なアミノ酸配列が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、その変異体及びその誘導体から成る群から選択される蛍光性タンパク質である請求項１、２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
細胞内で前記キメラタンパク質を発現させるために構築されてある、請求項１、２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列を含むリコンビナント遺伝子。
【請求項１５】
請求項１４に記載のリコンビナント遺伝子で形質転換された細胞。
【請求項１６】
前記細胞が真核細胞である請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記真核細胞が植物細胞である請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
in vivoでプロテアーゼの活性を分析する方法であって、以下の工程、
（ａ）細胞を請求項１４のリコンビナント遺伝子で形質転換する工程、
（ｂ）工程（ａ）の前、後又は工程（ａ）と同時に、前記細胞を形質転換して、前記プロテアーゼを発現させる工程、
（ｃ）前記形質転換細胞をインキュベートして前記タンパク質を発現させる工程、
（ｄ）前記インキュベート細胞の検出可能なアミノ酸配列の分布を観察する工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）で観察される前記検出可能なアミノ酸配列の分布を工程（ｂ）を実施されていないコントロール形質転換細胞の蛍光像と比較することによって前記プロテアーゼの活性を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
in vivoでプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程、
（ａ）細胞を請求項１４のリコンビナント遺伝子で形質転換する工程、
（ｂ）工程（ａ）の前、後又は工程（ａ）と同時に前記細胞を形質転換して、前記プロテアーゼを発現させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の前、後又は工程（ｂ）と同時に、前記形質転換細胞を薬剤候補物質で処理して、前記プロテアーゼを阻害する工程、
（ｄ）前記形質転換細胞をインキュベートして前記タンパク質を発現させる工程、
（ｅ）前記インキュベート細胞の検出可能なアミノ酸配列の分布を観察する工程、及び
（ｆ）工程（ｅ）で観察される前記検出可能なアミノ酸配列の分布を、工程（ｂ）を実施しないで調製したコントロール形質転換細胞、工程（ｃ）を実施しないで調製したコントロール形質転換細胞、及び工程（ｂ）及び（ｃ）を実施しないで調製したコントロール形質転換細胞の前記検出可能なアミノ酸配列の分布の少なくとも１つと比較することによって前記薬剤のプロテアーゼ阻害活性を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記プロテアーゼを発現させるために細胞を形質転換する工程が、前記プロテアーゼの発現のためにリコンビナント遺伝子を挿入する工程、又は前記プロテアーゼを発現することができるウイルスを感染させる工程である請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記形質転換されるべき細胞が真核細胞である請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記形質転換されるべき細胞が植物細胞である請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
共有結合で連結された成分として以下の１）−３）を含むキメラタンパク質を含む、細胞内のプロテアーゼを検出する系。
１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質
２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び
３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列。
【請求項２４】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記シグナルタンパク質、２）前記プロテアーゼ特異的切断部位、及び３）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２５】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）隠蔽配列、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）前記シグナルタンパク質、及び４）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２６】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記シグナルタンパク質、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）前記隠蔽配列、及び４）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２７】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一のシグナルタンパク質、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）第二のシグナルタンパク質、及び４）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２８】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記第一のシグナルタンパク質、２）第一のプロテアーゼ切断部位、３）前記隠蔽配列、４）前記第二のシグナルタンパク質、及び５）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２７に記載の系。
【請求項２９】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記隠蔽配列；２）第一のプロテアーゼ切断部位、３）第一のシグナルタンパク質、４）第二のプロテアーゼ切断部位、５）第二のシグナルタンパク質、及び６）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３０】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一のシグナルタンパク質、２）第一のプロテアーゼ切断部位、３）第二のシグナルタンパク質、４）第二のプロテアーゼ切断部位、５）隠蔽配列、及び６）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３１】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記プロテアーゼ特異的切断部位、２）前記シグナルタンパク質、及び３）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３２】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一のシグナルタンパク質、２）第一の検出可能な配列、３）前記プロテアーゼ切断部位、及び４）第二の検出可能な配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３３】
前記キメラタンパク質が更に、前記プロテアーゼ切断部位のＣ−末端と前記第二の検出可能な配列のＮ−末端との間に共有結合で連結された第二のシグナルタンパク質を含む請求項３２に記載の系。
【請求項３４】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一のシグナルタンパク質、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）第二のシグナルタンパク質、及び４）第二の検出可能な配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３５】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一の検出可能な配列、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）前記シグナルタンパク質、及び４）第二の検出可能な配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３６】
前記成分のいずれかが前記キメラタンパク質のＮ−末端を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３７】
前記成分のいずれかが前記キメラタンパク質のＣ−末端を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３８】
前記シグナルタンパク質が、前記キメラタンパク質又はその成分の少なくとも１つを植物細胞又は動物細胞小器官に局在させるために十分である請求項２３に記載の系。
【請求項３９】
前記シグナルタンパク質が、前記キメラタンパク質又はその成分の少なくとも１つを核、ゴルジ小体、溶解小胞、貯蔵小胞、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、小胞体、細胞質膜、又は植物細胞の葉緑体に局在させる請求項３８に記載の系。
【請求項４０】
前記シグナルタンパク質が、ＡｔＯＥｐ７、ＲｂｃＳ、Ｃａｂ、ＲＡ、ＳＫＬ、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ、ＰＨ、ＦＡＰＰ、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ、又はその機能的フラグメントの１つである請求項３９に記載の系。
【請求項４１】
前記シグナルタンパク質が、前記キメラタンパク質又はその成分の少なくとも１つを核、ゴルジ小体、貯蔵小胞、リソソーム、ペルオキシソーム、小胞体、細胞質膜、又は動物細胞のミトコンドリアに局在させる請求項３８に記載の系。
【請求項４２】
前記シグナルタンパク質が、ヒトのペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲＡ）、チトクロームｂ２、11−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β−ＨＳＤ）、Ｇ９−ＡＫＬ、ペルオキシソーム必須膜タンパク質47（ＰＭＰ47）；又はその機能的フラグメントの１つである請求項４１に記載の系。
【請求項４３】
前記切断部位が哺乳類又はウイルスのプロテアーゼで特異的に切断される請求項２３に記載の系。
【請求項４４】
前記切断部位がヒトの病原体に附随するプロテアーゼで特異的に切断される請求項４３に記載の系。
【請求項４５】
前記プロテアーゼが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、肝炎ウイルス、マラリア原虫、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、カポジ肉腫附随ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、黄熱病ウイルス、フラビウイルス、又はライノウイルスによって発現される請求項４４に記載の系。
【請求項４６】
前記プロテアーゼがセリン型プロテアーゼである請求項４３に記載の系。
【請求項４７】
前記マラリア原虫が熱帯熱マラリア原虫であり、前記プロテアーゼがプラスメプシンＩ及びプラスメプシンＩＩの１つである請求項４５に記載の系。
【請求項４８】
切断部位がＨＳＶの成熟のためのプロテアーゼによって特異的に切断される請求項４５に記載の系。
【請求項４９】
前記肝炎ウイルスがＣ型である請求項４５に記載の系。
【請求項５０】
前記ヒトの病原体が酵母菌、細菌、真菌、線虫、ウイルス又は原虫である請求項４４に記載の系。
【請求項５１】
前記切断部位が、血液凝固、アポトーシス又は細胞外マトリックスに附随する哺乳類のプロテアーゼによって特異的に切断される請求項４３に記載の系。
【請求項５２】
前記検出可能な配列の少なくとも１つが、蛍光性、リン光性又は化学発光性配列である請求項２３に記載の系。
【請求項５３】
前記検出可能な配列の１つの放出波長が、前記検出可能配列の他の少なくとも１つとは異なる請求項５２に記載の系。
【請求項５４】
前記検出可能な配列がクラゲの蛍光性タンパク質又はその誘導体である請求項５２に記載の系。
【請求項５５】
共有結合で連結された成分として以下を含む実質的に純粋なキメラタンパク質、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列。
【請求項５６】
細胞内のプロテアーゼ活性を検出するためのキメラタンパク質をコードする配列を含む核酸であって、前記キメラタンパク質が共有結合で連結された成分として以下を含む前記核酸、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列。
【請求項５７】
請求項５６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５８】
請求項５７に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項５９】
細胞内のプロテアーゼを検出するためのキットであって、
ａ）共有結合で連結された成分として、ｉ）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、ii）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及びiii）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列を含むキメラタンパク質、及び
ｂ）前記キメラタンパク質をコードする配列を含む核酸を含むベクター、
の少なくとも１つを含むことを特徴とするキット。
【請求項６０】
細胞内又は組織内のプロテアーゼを検出する方法であって、以下の工程、
ａ）対象の細胞又は組織に、共有結合で連結された成分として、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む第一のベクターを導入する工程、
ｂ）前記第一のベクターによってコードされたキメラタンパク質を発現させることができる条件下で前記細胞又は組織をインキュベートする工程、及び
ｃ）前記キメラタンパク質の細胞内局在の変化を、前記細胞内プロテアーゼの存在の指標として検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６１】
前記方法が、更に、前記対象の細胞又は組織に前記プロテアーゼをコードする核酸配列を含む第二のベクターを導入し、更に前記細胞又は組織内の前記第二のベクターを発現させてその中の前記プロテアーゼを生成する工程を含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
プロテアーゼ阻害剤をin vivoで検出する方法であって、以下の工程、
ａ）対象の細胞又は組織に、共有結合で連結された成分として、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む第一のベクターを導入する工程、
ｂ）前記細胞又は組織に対象のプロテアーゼをコードするベクターを導入する工程、
ｃ）前記細胞又は組織を候補化合物と接触させる工程、
ｄ）前記第一のベクターによってコードされたキメラタンパク質及び前記第二のベクターによってコードされた前記プロテアーゼを発現させることができる条件下で前記細胞又は組織をインキュベートする工程、及び
ｅ）前記キメラタンパク質の細胞内局在の変化を、前記プロテアーゼ阻害剤の存在の指標として検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
前記方法が、更に、前記キメラタンパク質の細胞内局在の変化を検出するために自動化又は半自動化装置を使用することを含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記自動化又は半自動化装置が、前記細胞又は組織内で前記検出可能な配列を検出するために適合させた光学系を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
プロテアーゼ阻害剤をin vivoで検出する方法であって、以下の工程、
ａ）対象の細胞又は組織に、共有結合で連結された成分として、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む第一のベクターを導入する工程、
ｂ）前記細胞又は組織を候補化合物と接触させる工程、
ｃ）前記第一のベクターによってコードされたキメラタンパク質及び対象のプロテアーゼを発現させることができる条件下で前記細胞又は組織をインキュベートする工程、及び
ｄ）前記キメラタンパク質の細胞内局在の変化を、前記プロテアーゼ阻害剤の存在の指標として検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６６】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記検出可能なアミノ酸配列、２）前記プロテアーゼ特異的切断部位、及び３）非隠蔽シグナルタンパク質としてのプレックストリン相同ドメイン（ＰＨ）を含む請求項２３に記載の系。
【請求項６７】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）隠蔽配列、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）隠蔽シグナルタンパク質としてのミトコンドリアへ誘導する配列、及び４）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項６８】
前記ミトコンドリアへの誘導配列が、ヒトのペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲＡ）又はその機能的フラグメントである請求項６７に記載の系。
【請求項６９】
前記隠蔽配列が、シグナルタンパク質、蛍光タンパク質、又はその機能的の１つである請求項６７に記載の系。
【請求項７０】
前記キメラタンパク質が、共有結合で連結された成分として以下の１）−３）を含む請求項６７に記載の系。
１）非隠蔽シグナルタンパク質としてのプレックストリン相同ドメイン（ＰＨ）、
２）前記プロテアーゼ特異的切断部位、
３）隠蔽シグナルタンパク質としてのミトコンドリアへの誘導配列、及び
４）前記検出することができるアミノ酸配列。
【請求項７１】
前記ミトコンドリアへの誘導配列が、ヒトのペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲＡ）又はその機能的フラグメントである請求項７０に記載の系。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
考察されるように、本発明の実施は、動物細胞で機能するシグナルタンパク質の使用と適合する。典型的な例には下記の表Ｉに示されている動物のシグナルが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
表Ｉ
2004538006.tif 000001
1タイプＡ：シグナルタンパク質は隠蔽シグナルタンパク質として用いることができる。
タイプＢ：シグナルタンパク質は非隠蔽シグナルタンパク質として用いることができる。
以下の文献を参照されたい：A. Hansel et al., FASEB J, 16:911-31(2002)（ヒトのペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲＡ））；U. Bomer et al., J. Biol. Chem. 272:30439-30446(1997)（チトクロームｂ12）；A. Naray-Fejes-Toth and G. Fejes-Toth, J. Biol. Chem. 15436-15444(1996)（11β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β−ＨＳＤ））；J.A. McNew and J.M. Godman, J. Cell Biol. 127:1245-1257(1994)（Ｇ９−ＡＫＬ）；Dyer et al., J. Cell Biol. 133:269-280(1996)（ＰＭＰ47（ペルオキシソーム必須膜タンパク質７））。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
２．Ｎｉａプロテアーゼの例証的使用
上記に記載したように構築されたキメラ基質タンパク質を用いてプロテアーゼ活性を測定するために、タバコ葉脈萎縮ウイルス（Tobacco Vein Mottling Virus;ＴＶＭＶ）のＮＩａプロテアーゼを本発明の実施例でモデル系として用いた。ＮＩａプロテアーゼはもっとも性状が明らかにされたウイルスプロテアーゼの１つであり、前記はＴＶＭＶによって産生されるポリプロテインで７つの特異的部位を切断することが知られている。最適なプロテアーゼ活性を達成するために、Ｎ末端の６つのアミノ酸残基（Ｐ６−Ｐ１）及びＣ末端の４つのアミノ酸残基（Ｐ１'−Ｐ４'）が要求され、更に４つの保存アミノ酸残基（Ｖ−Ｒ−Ｆ−Ｑ）が基質タンパク質のＰ４−Ｐ１に含まれていなければならない。前記４つの保存アミノ酸残基のいずれかがグリシン（Gly）に変異した場合、前記基質タンパク質のタンパク分解切断は生じない（H.Y. Yoon et al., 2000）。
ＮＩａプロテアーゼのタンパク分解部位（ＰＳ（ＮＩａ））を含むキメラ基質タンパク質発現のためのリコンビナント遺伝子、ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰをポリエチレングリコール仲介形質転換法によってプロトプラストに導入したとき、ＧＦＰ及びＲＦＰが大きな集合物として細胞質ゾルに蓄積した（図４）。この結果は、前記プロテアーゼが機能しない場合に一致する。この場合には、集合物の細胞質ゾルでの蓄積は、ＡｔＯＰＥ７タンパク質の疎水性領域間の疎水性相互作用により生じたと考えられる。キメラ基質タンパク質の赤色蛍光シグナルを葉緑体の自家蛍光と容易に識別することができない場合には（図４（ｂ））、２つの異なる蛍光標識を用い、緑色蛍光がオーバーラップ蛍光画像として赤色蛍光と同時に発生するか否かを観察することによって前記基質の反応を明瞭に識別することができる（図４（ｃ））。ＮＩａプロテアーゼをコードするプラスミド及びＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰをコードするプラスミドが形質転換により一緒に導入されたとき、緑色及び赤色蛍光シグナルは葉緑体の外皮膜（envelope membrane）及び細胞質ゾルにそれぞれ分離した（図５）。この結果は、ＮＩａプロテアーゼはキメラ基質タンパクをそのタンパク分解部位で切断し、２つのタンパク質、ＲＦＰ及びＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰを生成することができたことを示している。前記プロテアーゼの反応は、緑色蛍光シグナルがシグナルタンパク質の作用によって葉緑体外皮膜に移動し（図５（ａ））、赤色蛍光シグナルは細胞質ゾルに分散し（図５（ｂ））、更に両蛍光シグナルのオーバーラップ画像（図５（ｃ））を観察することによって確認することができる。
酵素反応の結果を特定する本発明の有効性は、コントロール実験と比較することによって更に明瞭に観察することができる。図４（ａ）及び図５（ａ）を比較することによって、タンパク分解切断により前記シグナルタンパク質の隠蔽トラフィッキングシグナルが活性化されることが、蛍光の分布における変化とともに観察することができる。図４（ｂ）及び５（ｂ）を比較することにより、シグナル隠蔽タンパク質として用いられた赤色蛍光タンパク質は、トラフィッキングシグナルの隠蔽の他に蛍光シグナルの分布の変化において役割を果たすことが観察される。
従って、シグナルタンパク質及び蛍光タンパク質を含むキメラタンパク質、並びにタンパク分解部位を含むシグナル隠蔽タンパク質を含むキメラ基質タンパク質を基質として用いて、プロテアーゼの活性を測定し、更にその阻害剤をin vivoでスクリーニングすることができることが提唱される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
以下は本発明で使用される核酸及びタンパク質の配列情報の実例である。プロテアーゼ及びそれらの切断部位の例は配列番号：45−50、55−74及び77−120で提供される。前記の例には以下が含まれる：ＮＩａプロテアーゼ（配列番号：45及び46）及びその切断部位（配列番号：47−50）、ＨＩＶ−１プロテアーゼ（配列番号：55及び56）及びその切断部位（配列番号：57−74）、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ（配列番号：77及び78）及びその切断部位（配列番号：79−84）、ＨＳＶ−１プロテアーゼ（配列番号：85及び86）及びその切断部位（配列番号：87−90）、ＨＴＬＶ−１プロテアーゼ（配列番号：91及び92）及びその切断部位（配列番号：93−96）、ＨＣＭＶプロテアーゼ（配列番号：97及び98）及びその切断部位（配列番号：99−102）、ＡＰＰβ−セクレターゼ（配列番号：103及び104）及びその切断部位（配列番号：105−106）、カスパーゼ３（配列番号：107及び108）及びその切断部位（配列番号：113−114）、カスパーゼ３の大サブユニット（配列番号：109及び110）、カスパーゼ３の小サブユニット（配列番号：111及び112）、ヒト血液凝固第II因子（配列番号：115及び116）及びその切断部位（配列番号：117−118）、並びにヒト血液凝固第XI因子（配列番号119及び120）。
２つのＮＩａプロテアーゼ基質タンパク質の核酸及びタンパク質配列は配列番号：51−54で提供され、HIV-1プロテアーゼ基質タンパク質の核酸及びタンパク質配列は配列番号：75−76で提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
韓国特許出願第10-2001-00481213号で考察されたように、本発明は更に、本明細書に記載した前記キメラ基質タンパク質を用いてin vivoでプロテアーゼ活性を測定する方法を提供する。更にまた提供されるものは、前記プロテアーゼ活性を測定する方法を用いたプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする方法である。
韓国特許出願第10-2001-00481213号で更に開示されているように、in vivoでプロテアーゼ活性を測定するために、プロテアーゼ及び前記プロテアーゼに特異的なキメラ基質タンパク質は細胞内で同時に存在する必要がある。
更にまた、本発明の特徴の１つであるキメラ基質タンパク質のためのリコンビナント遺伝子が細胞内に導入され、細胞内で前記キメラタンパク質が発現される。プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする標的プロテアーゼは前記細胞内に存在する内因性プロテアーゼであっても、リコンビナント遺伝子による形質転換又はウイルスによる感染で発現される外因性プロテアーゼでもよい。しかしながら、内因性プロテアーゼが標的である場合は、例えば前記プロテアーゼの発現の調節及び低レベルのプロテアーゼ発現の検出の難しさのために、スクリーニングの正確さ及び効率は低下するであろう。従って本発明は、in vivoでプロテアーゼ活性をより効率的に決定する系を提供する。前記の系では、細胞をリコンビナント遺伝子で形質転換するか、又はウイルスで細胞を感染させることによって特定のプロテアーゼを過剰に発現させるか、又は調節された態様で発現させることができる。ウイルスプロテアーゼの場合にはウイルス感染を用いることができる。しかしながら、ウイルスプロテアーゼ発現の調節は完全には理解されていないので、プロテアーゼをコードするリコンビナント遺伝子で細胞を形質転換させることによって発現されたプロテアーゼを用いることがより好ましい。前記発現されたプロテアーゼは細胞質ゾルに局在するので、キメラ基質タンパク質も同様に細胞質ゾルに局在させることが必要である。従って、in vivoで効率的にプロテアーゼ活性を測定する系は、本発明の第一の特徴のキメラ基質タンパク質を用いることによって構築することができる（この場合、キメラタンパク質に包含されるシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルは隠蔽されている）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
タンパク分解切断部位配列がＶＲＦＱ（配列番号：48）及びＲＱＡＮＦＬＧ（配列番号：64）を有するＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ：ＰＳ：ＲＦＰをコードする２つのリコンビナントプラスミド（図１０（ｂ））を以下のように構築した。
終止コドンをもたないＧＦＰを調製するために、プライマー５'−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴ−３'及び５'−ＧＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴ−３'を用いてＰＣＲ増幅を実施した。XhoI及びSacI部位を含むＰＣＲ生成物をpBluescript-Tベクターでサブクローニングし、続いてXhoI及びSacIで制限消化を実施した。このXhoI／SacIフラグメントをXhoI及びSacIで消化したｐＨ+ＡＴＰアーゼ−Ｇベクター（図7（ｉ））でサブクローニングした。
ＲＦＰの上流にタンパク分解切断部位を配置するために、順方向プライマー５'−ＧＡＧＣＴＣＰＳＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧ−３'（ＰＳはＮＩａ切断部位ＶＲＦＱのためのＧＴＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧ、又はＨＩＶ−１切断部位ＲＱＡＮＦＬＧのためのＡＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧである）及び逆方向プライマー５'−ＧＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧ−３'を326RFPベクターのＰＣＲ増幅に用いた。ＰＳ：ＲＦＰを含む構築物（これもまたSacI部位を含む）をSacIで制限消化し、これらSacIフラグメントを上記のように調製したＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ（終止コドンをもたない）サブクローンのSacI部位でサブクローニングし、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ：ＰＳ：ＲＦＰのためのリコンビナントプラスミドを作製した。