(57)【要約】本明細書において報告するのは、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体の、第1の抗原および第2の抗原との結合を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程を含む：抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて固相に該抗体を捕捉する工程、捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第1の結合シグナルを決定する工程、(i)捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成し、第2の結合シグナルを決定する工程か、または(ii)表面を再生し、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて固相に該抗体を捕捉し、捕捉された抗体を、工程(b)で捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成し、第3の結合シグナルを決定する工程かのいずれか、ならびに、第1の結合シグナルおよび第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルから、第1の抗原および第2の抗原と抗体との全体の結合または個別の結合を決定する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体の、第1の抗原および第2の抗原との結合を決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
（a）抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉する工程、
（b）捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第1の結合シグナルを決定する工程、
（c）
捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成し、第2の結合シグナルを決定する工程か、または
表面を再生し、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉し、捕捉された抗体を、工程(b)で捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第3の結合シグナルを決定する工程か
のいずれか、ならびに
（d）第1の結合シグナルおよび第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルから、第1の抗原および第2の抗原と抗体との全体の結合または個別の結合を決定する工程。
【請求項２】
前記工程（d）が、
（d）（i）捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルが得られ、かつ（ii）捕捉された抗体-抗原-抗原複合体の形成または再生後の捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルよりも増加した第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルが得られる場合に、第1の抗原および第2の抗原と抗体との全体の結合または個別の結合を決定する工程
である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体の、第1の抗原および第2の抗原との全体の結合および個別の結合を決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
抗体の定常領域に特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉する工程、
捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、固定化された抗体-抗原複合体を形成する工程、
捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成する工程、ならびに
捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルが得られ、かつ捕捉された抗体-抗原-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルよりも増加した第2の結合シグナルが得られる場合に、第1の抗原および第2の抗原と抗体との個別の結合を決定し、それに基づいて全体の結合も決定する工程。
【請求項４】
前記固相が表面プラズモン共鳴チップであり、第1の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が二重特異性抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記二重特異性抗体が、CrossMabまたはDutaFabである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記捕捉試薬が、抗Fc領域抗体または抗Fab抗体である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記抗Fab抗体が、抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がDutaFabであり、前記固相が表面プラズモン共鳴チップであり、前記捕捉試薬が抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体であり、第1の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉が、前記抗体を45〜720秒間、流量2.5〜10 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することによる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉が、前記抗体を約60秒間、流量約5 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することによる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記インキュベートが、それぞれの抗原を濃度0.5〜5 μg/mLで、20〜90秒間注入することによる、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベートが、それぞれの抗原を濃度約2 μg/mLで、30秒間または60秒間注入することによる、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記インキュベートが、PBS-Tと300 mM  NaClとを含む緩衝液中である、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能アッセイの分野に関する。本明細書において報告するのは、多重特異性抗体の相互作用を測定するための、新規の、SPRに基づく二重結合アッセイである。全体の結合は、決定された個別の読出し値に基づき算出することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
SPR（表面プラズモン共鳴）は、リアルタイムのタンパク質−タンパク質相互作用を測定するための、バイオセンサーに基づく技術である。SPR技術は、バイオ医薬の研究および開発における標準的なツールとなっており[1-5]、マクロ分子の相互作用の結合定数を決定するのに広く使われている。分子の相互作用の結合および解離の反応速度が決定できることで、複合体形成のメカニズムの詳細な識見が得られる[6]。こうした情報は、モノクローナル抗体および他のバイオ医薬品の選択および最適化のプロセスで不可欠な部分になりつつある[7-10]。加えて、SPR技術は、たとえば抗体が標的と結合する結合活性（結合能）の決定を可能にしている。
【０００３】
1回のアプローチで2種以上の相互作用の機能評価ができる技術は、数種しかない（たとえば、[12]で論じられているサスペンション・アレイ技術、時間分解蛍光アッセイ[13]）。これらの技術は、異なるフルオロフォアの並列検出をうまく利用している。加えて、光学バイオセンサーもあり、これらは複数の相互作用のオンラインの、したがって連続的な測定を、可能にしている[2-5]。
【０００４】
US 2010/256338（特許文献1）で開示されたのは、全長抗体および単鎖Fabフラグメントを含む多重特異性の、特に二重特異性の抗体、それらの製造方法、それら抗体を含有する薬学的組成物、およびそれらの用途である。
【０００５】
WO 2012/023053（特許文献2）で開示されたのは、免疫グロブリン分子の各結合部位に異なる特異性をもつ新規の二重特異性モノクローナル抗体と、免疫グロブリン分子の各結合部位に異なる特異性をもつ新規の二重特異性モノクローナル抗体を製造する方法とである。
【０００６】
WO 2015/172800（特許文献3）で開示されたのは、新規の多重特異性分子、およびそのような多重特異性分子に基づく新規の治療方法である。
【０００７】
Meschendoerfer, W. et al., が開示したのは、二重特異性分子の全機能分析を可能にする、SPRに基づくアッセイである(J. Pharm. Biomed. Anal. 132 (2016) 141-147（非特許文献1）)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】US 2010/256338
【特許文献２】WO 2012/023053
【特許文献３】WO 2015/172800
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Meschendoerfer, W. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 132 (2016) 141-147
【発明の概要】
【００１０】
本明細書において報告するのは、二重特異性抗体の両方の結合活性を測定するための、新規の、SPRに基づく二重結合アッセイである。全体の結合は、両方の測定された個別の読出し値に基づき算出することができる。標準的なSPRに基づく架橋アッセイと比較すると、良好な相関が示された。本明細書において報告するアッセイは、二重特異性抗体の全機能分析を可能にする。
【００１１】
本明細書において報告する一局面は、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む（モノクローナル）抗体の、第1の抗原および第2の抗原との個別の結合および全体の結合を決定するためのアッセイまたは方法であり、該方法は、以下の工程を含む：
(a)抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉する工程、
(b)捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第1の結合シグナルを決定する工程、
(c)
捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成し、第2の結合シグナルを決定する工程か、または
表面を再生し、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉し、捕捉された抗体を、工程(b)で捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、第2の捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第3の結合シグナルを決定する工程か
のいずれか、ならびに
(d) (i)捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルが得られ、かつ(ii)捕捉された抗体-抗原-抗原複合体の形成または再生後の(第2の)捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルとは異なる、または第1の結合シグナルよりも増加した第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルが得られた場合に、第1の抗原および第2の抗原との抗体の全体の結合または個別の結合を決定する工程。
【００１２】
一態様では、結合シグナルは、表面プラズモン共鳴により決定される。
【００１３】
一態様では、固相は表面プラズモン共鳴チップであり、第1の結合シグナルは表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルは表面プラズモン共鳴反応である。
【００１４】
一態様では、第1の抗原または／および第2の抗原は可溶性抗原である。
【００１５】
一態様では、抗体は二重特異性抗体である。一態様では、二重特異性抗体は、CrossMabまたはDutaFabである。
【００１６】
一態様では、捕捉試薬は抗Fc領域抗体または抗Fab抗体である。一態様では、この抗Fab抗体は、抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体である。
【００１７】
一態様では、抗体はDutaFabであり、固相は表面プラズモン共鳴チップであり、捕捉試薬は抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体であり、第1の結合シグナルは表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルは表面プラズモン共鳴反応である。
【００１８】
一態様では、捕捉は、抗体を、45〜720秒間、流量2.5〜10 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することによる。一態様では、捕捉は、抗体を、約60秒間、流量約5 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することによる。
【００１９】
一態様では、インキュベートは、それぞれの抗原を濃度0.5〜5 μg/mLで20〜90秒間注入することによる。一態様では、インキュベートは、それぞれの抗原を濃度約2 μg/mLで30秒間または60秒間注入することによる。
【００２０】
一態様では、抗体はDutaFabであり、固相は表面プラズモン共鳴チップであり、捕捉試薬は抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体であり、第1の結合シグナルは表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルは表面プラズモン共鳴反応であり、固定化は、抗体を約60秒間、流量約5 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することにより、インキュベートは、それぞれの抗原を濃度約2 μg/mLで30秒間または60秒間注入することによる。
【００２１】
一態様では、インキュベートは、PBS-Tと300 mM  NaClとを含む緩衝液中で実施される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
定義
「約」という用語は、その後ろの数値の+/- 20％の範囲を表す。一態様では、約という用語は、その後ろの数値の+/- 10％の範囲を表す。一態様では、約という用語は、その後ろの数値の+/- 5％の範囲を表す。
【００２３】
本明細書において、「抗体」という用語は最も広義に使用され、限定ではないがモノクローナル抗体、多重特異性抗体(たとえば二重特異性抗体、三重特異性抗体)、および所望の抗原結合活性を示すかぎり抗体フラグメントを含む、さまざまな抗体構造を包含する。
【００２４】
抗体は概して、2本のいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）と2本のいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）とを含んでいる。重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの各々が、可変ドメイン（可変領域）（通常はそのポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含んでおり、可変ドメインは抗原と相互作用することができる結合領域を含んでいる。重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの各々が、定常領域（通常はカルボキシル末端部分）を含んでいる。重鎖の定常領域は、（i）貪食細胞などのFcガンマ受容体(FcγR)をもつ細胞と、または（ii）Brambell受容体としても公知の新生児型Fc受容体(FcRn)をもつ細胞と、抗体との結合を仲介する。また、コンポーネント(Clq)などの古典的補体系の因子を含む一部の因子との結合も仲介する。抗体の重鎖の定常ドメインは、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むが、一方軽鎖は1つの定常ドメイン、CLだけを含み、これはカッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプであり得る。
【００２５】
一方、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、すなわち4つのフレームワーク領域(FR)と3つの超可変領域(HVR)とを含んでいる。
【００２６】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体にはIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの5つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられることがあり、たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、およびIgA2がある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００２７】
「（抗原との）結合」という用語は、インビトロのアッセイで抗体がその抗原と結合することを表し、一態様では、抗体が表面に結合される結合アッセイにおいて、抗原の抗体との結合が表面プラズモン共鳴(SPR)により測定される。結合とは、たとえば抗体の標的Aもしくは標的Bに対する、または捕捉分子に対する結合能、たとえば抗体の抗ヒトFab捕捉の測定を意味する。
【００２８】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成している個々の抗体は、同一であり、および／または同じエピトープに結合する。とはいえ、存在し得る変異抗体、たとえば天然の変異を含むものまたはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じるものは別であるが、そのような変異体は通常は少量でしか存在しない。異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含むのが典型であるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に向けられたものである。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示すものであり、何らかの特定の方法で抗体を製造する必要があるとは解釈すべきでない。たとえば、本発明にしたがい使用されるモノクローナル抗体は、限定ではないが、ハイブリドーマ法、リコンビナントDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリンの遺伝子座を全部または一部を含有する遺伝子組換え動物を使う方法を含む、あらゆる技法によって作製することができ、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製する他の例示的方法は、本明細書において説明されている。
【００２９】
「超可変領域」または「HVR」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体の可変ドメインのうち、配列が超可変である領域（「相補性決定領域」または「CDR」）、および／または構造的に画定されるループ（「超可変ループ」）を形成する領域、および／または抗原と接触する残基を含む領域（「抗原接触部」）の各々を指す。概して、抗体は、VHに3つ(H1、H2、H3)とVLに3つ(L1、L2、L3)の6つのHVRを含む。本明細書における例示的なHVRとしては、次のものが挙げられる：
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に存在する超可変ループ(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))、
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)に存在するCDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))、
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、および93〜101(H3)に存在する抗原接触部(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))、ならびに
(d)HVRのアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、および94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組み合わせ。
【００３０】
特に断らないかぎり、HVRの残基および可変ドメインの他の残基（たとえばFRの残基）は、本明細書においてはKabatらにしたがい番号付けされる。
【００３１】
「価」という用語は、本願中に使用される場合、（抗体）分子中の特定数の結合部位の存在を表す。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、それぞれ、（抗体）分子中の2つの結合部位、4つの結合部位、および6つの結合部位の存在を表す。本明細書において報告する二重特異性抗体は、一つの好ましい態様では「二価」である。
【００３２】
多重特異性抗体
いくつかの特定の態様では、抗体は、多重特異性抗体であり、たとえば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性をもつモノクローナル抗体である。いくつかの特定の態様では、これらの結合特異性の一方は第1の抗原に対するものであり、他方は異なる第2の抗原に対するものである。いくつかの特定の態様では、多重特異性抗体は、同一抗原の2つの異なるエピトープに結合することができる。多重特異性抗体は、抗原を発現している細胞に細胞毒剤を局在化させるのに使われることもある。多重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体フラグメントとして調製することができる。
【００３３】
多重特異性抗体を作製するための技法としては、限定ではないが、異なる特異性をもつ2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対のリコンビナント共発現(Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, およびTraunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655- 3659参照)、および「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」操作法(たとえばUS 5,731,168参照)が挙げられる。多重特異性抗体はまた、抗体Fcヘテロダイマー分子を作製するための静電ステアリング効果を操作することによって(WO 2009/089004)；2つ以上の抗体またはフラグメントの架橋結合によって(たとえばUS 4,676,980, およびBrennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83参照)；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を製造することによって(たとえばKostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553参照)；二重特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディ（diabody）」技術を用いることによって(たとえば Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448参照)；および、単鎖Fv(scFv)ダイマーを用いることによって(たとえば Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374参照)；ならびに、たとえばTutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69で説明されているようにして三重特異性抗体を調製することによって、作製することもできる。
【００３４】
抗体またはフラグメントは、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、またはWO 2010/145793で説明されているような多重特異性抗体であってもよい。
【００３５】
抗体またはそのフラグメントは、WO 2012/163520で開示されているような多重特異性抗体（「DutaFab」とも呼ばれる）であってもよい。
【００３６】
二重特異性抗体は概して、同一抗原上の2つの異なる非重複エピトープ、または別々の抗原上の2つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
【００３７】
異なる二重特異性抗体フォーマットが公知である。
【００３８】
本明細書において報告する方法が使用できる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、以下のとおりである：
・ CrossMabフォーマット(=CrossMab)：第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとを含む多重特異性IgG抗体であって、
第1のFabフラグメントにおいて、
(a)CH1ドメインとCLドメインとが互換されているだけ（すなわち、第1のFabフラグメントの軽鎖はVLとCH1ドメインとを含み、第1のFabフラグメントの重鎖はVHとCLドメインとを含んでいる）、
(b)VHドメインとVLドメインとが互換されているだけ（すなわち、第1のFabフラグメントの軽鎖はVHとCLドメインとを含み、第1のFabフラグメントの重鎖はVLとCH1ドメインとを含んでいる）、または、
(c)CH1ドメインとCLドメインとが互換され、かつVHドメインとVLドメインとが互換されており（すなわち、第1のFabフラグメントの軽鎖はVHとCH1ドメインとを含み、第1のFabフラグメントの重鎖はVLとCLドメインとを含んでいる）、
第2のFabフラグメントは、VLとCLドメインとを含む軽鎖と、VHとCH1ドメインとを含む重鎖を含んでおり、
該CrossMabは、CH3ドメインを含む第1の重鎖と、CH3ドメインを含む第2の重鎖とを含むことができ、ここで両CH3ドメインは、それぞれアミノ酸置換により、相補的になるように操作されており、したがって第1の重鎖と修飾された第2の重鎖とのヘテロダイマー化が支持され、このことはたとえばWO 96/27011、 WO 98/050431、 EP 1870459、 WO 2007/110205、 WO 2007/147901、 WO 2009/089004、 WO 2010/129304、 WO 2011/90754、 WO 2011/143545、 WO 2012/058768、 WO 2013/157954、またはWO 2013/096291（参照により本明細書に組み入れられる）で開示されている；
・ 一アーム単鎖フォーマット（＝一アーム単鎖抗体）：第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であり、それによって個々の鎖は以下のとおりである：
・ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
・ 軽／重鎖の組合せ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋ノブ変異を有するCH3）
・ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋ホール変異を有するCH3）；
・ 二アーム単鎖フォーマット（＝二アーム単鎖抗体）：第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であり、それによって個々の鎖は以下のとおりで：
・ 軽／重鎖の組合せ1（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋ホール変異を有するCH3）
・ 軽／重鎖の組合せ2（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋ノブ変異を有するCH3）；
・ 一般的な軽鎖二重特異性フォーマット（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であり、それによって個々の鎖は以下のとおりである：
・ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
・ 重鎖1（可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋ホール変異を有するCH3）
・ 重鎖2（可変重鎖ドメイン＋CH1＋ヒンジ＋CH2＋ノブ変異を有するCH3）；
・ DutaFab：VHとVLドメインの相補対中に2つの(非重複)パラトープを含む抗体であって、第1のパラトープは、VLドメインのCDRlおよびCDR3ならびにVHドメインのCDR2に由来するアミノ酸残基を含み（からなり）、第2のパラトープは、VHドメインのCDR1およびCDR3ならびにVLドメインのCDR2に由来する残基を含む（からなる）。
この文脈では、「非重複」という用語は、DutaFabの第1のパラトープ内に含まれるアミノ酸残基は第2のパラトープには含まれず、DutaFabの第2のパラトープ内に含まれるアミノ酸残基は第1のパラトープには含まれないことを示す。
【００３９】
一態様では、二重特異性抗体はCrossMabである。
【００４０】
一態様では、二重特異性抗体は一アーム単鎖抗体である。
【００４１】
一態様では、二重特異性抗体は二アーム単鎖抗体である。
【００４２】
一態様では、二重特異性抗体は一般的な軽鎖二重特異性抗体である。
【００４３】
一態様では、二重特異性抗体はDutaFabである。
【００４４】
多価多重特異性抗体は異なる標的と特異的に結合するが、大抵は各標的に対し異なる親和性および複合体安定性を有する。十分な活性のある多価の多重特異性抗体だけが全標的に結合でき、対応するアッセイでも十分な生物学的活性を示す。
【００４５】
本明細書において報告する方法
二重特異性抗体または融合タンパク質などの新規のバイオ医薬はますます複雑になり、機能的特徴づけに関し新たな難題を提起している。標準的な抗体と比べて、二重特異性モノクローナル抗体では、2つの個別の相互作用を考慮する必要がある。
【００４６】
以前に、SPRに基づくアッセイセットアップが説明されている。これは、単一のセットアップで、二価二重特異性分子の（一方の個別の標的に加えて）両方の標的に対する結合能力を同時に評価することを可能にするものである。しかし、分析される分子に基づく架橋アッセイを用いる場合、たとえば固定化に伴う抗原活性の変化といった、いくつかの落とし穴が考えられる。
【００４７】
より詳しくは、二重特異性抗体の両方の標的に対する結合活性を並列で評価できる、SPRに基づくアッセイ原理が報告されている[11]。SPRに基づく架橋アッセイの開発によって、薬物の両方の標的との全体の結合を並列的に決定すること、および一方の抗原の個別の結合の寄与をリファレンス分子に対して相対的に評価することが可能になった。理論的には、全体の結合シグナルは、両方の個別の結合事象により乗法的に影響されるので、第2の個別の結合活性は、その他の2つの変数が既知であれば算出できる。
抗原2の結合（％）＝全体の結合（％）／抗原1の結合（％）  （式1）
【００４８】
本明細書において報告するのは、溶液中の両方の標的の個別の評価を可能にする、SPRに基づくアッセイである。このアッセイは、現在公知のアッセイセットアップの短所を克服するものである。アッセイ同士でデータを比較すると、全体の結合は、両方の測定された個別の読出し値に基づき算出できることが示された。このことは良好な相関により裏付けられている。したがって、このSPRに基づくアッセイ原理は、二重特異性CrossMabまたはDutaFabなどの二重特異性モノクローナル抗体の全機能分析をたった1回のアッセイで可能にする。
【００４９】
したがって、一態様では、本明細書において報告する方法は、溶液中の二重特異性抗体の両方の標的との結合を個別に評価するものである。
【００５０】
このアッセイは適格性ありと認めることができ、高効率の薬物開発を可能にする。
【００５１】
より詳しくは、本明細書において報告するのは、SPRに基づくアッセイセットアップであり、以後、二重結合アッセイと呼ばれる。このアッセイは、十分に確立された捕捉系を使用することによって、標的（抗原）の固定化および再生の必要性をなくし、かつ単一のアッセイセットアップで抗体の両方の機能性を直接決定することを可能にする。全体の結合は、以下のようにして算出することができる（図1Aも参照されたい）。
全体の結合（％）＝抗原2の結合（％）×抗原1の結合（％）  （式2）
【００５２】
したがって、一態様では、本明細書において報告する方法は、二重特異性抗体の両方の抗体機能性を、抗原を固相に捕捉することなく直接決定するものである。
【００５３】
したがって、一態様では、本明細書において報告する方法は、二重特異性抗体の全体の（すなわち抗原1および抗原2との）結合を決定するものであり、全体の結合は式2にしたがい算出される。
【００５４】
このSPRに基づくアッセイセットアップは、所与の二重特異性分子の測定可能な結合事象のすべてを並列的に得ることを可能にする。つまり、2つの結合事象を測定することができ、これらに基づいて第3のパラメーターを算出することができる。このアプローチは、本明細書において「二重特異性分子の全機能分析」と呼ばれる。
【００５５】
加えて、本明細書において報告するアッセイは適格性ありと認められており、精度および確度の決定により、その卓越した性能を示すことができた。このことは、このアッセイの妥当性が認められ得ること、したがって製品開発の後期で使用できることを保証している。
【００５６】
本明細書において報告するアッセイセットアップ全般は、二重特異性抗体の個別の抗原1結合活性および抗原2結合活性を決定することを可能にする。このことはSPRに基づく方法に基づき、該方法は、固定化された二重特異性抗体との両方の標的の結合事象の測定を可能にする。
【００５７】
したがって、一態様では、本明細書において報告する方法は、二重特異性抗体の個別の抗原1結合活性および抗原2結合活性を決定するものである。
【００５８】
捕捉系としては、抗ヒトFab捕捉系を選択した。この捕捉系がアッセイ開発に有利な点は、他にもあるがとりわけ、再生条件が確立していることであり、したがって、二重特異性抗体が各サイクルで捕捉され時間が経過するにつれて測定に一貫性が欠けるのを防げることである。この利点のおかげで、補充される抗体の結合特性は、測定の間中、終始一定している。
【００５９】
一般に、そのようなセットアップにおいて抗原2および抗原1のシグナルを取得する2つの基本的アプローチがある：
（A）1つのサイクル内で、まずは抗原2の結合(Ra)を決定し、それから、抗原2と結合した二重特異性抗体の抗原1との結合(Rv)を決定する。またはその逆。
（B）まずは抗原2の結合(Ra)を決定し、再生後、新たに固定化された二重特異性抗体(Rc)と第2の抗原1との相互作用(Rv)を決定する。
【００６０】
両方の相互作用が独立して生じる場合、この2つのアプローチの結果は等しくなる。アプローチ（B）は、追加の捕捉および再生の工程を要するので、測定時間が大幅に増加する。2つの異なるレポートポイントを読出し値として用いることができ、レポートポイントは、二重特異性抗体の捕捉レベル(Rc)および抗原の結合レベル(Ra、Rv)を含んでいるか、または抗原とその抗体との結合シグナル(Ra、Rv)だけを含んでいるかのいずれかである。生物学的に関係のないFcの相互作用(Rc)の寄与を防ぐために、結合シグナルRaおよびRvだけを用いた。
【００６１】
したがって、一態様では、本明細書において報告する方法は、結合を決定する読出し値として、二重特異性抗体の捕捉レベル(Rc)および抗原の結合レベル(Ra、Rv)か、または抗原と抗体との個別の結合シグナル(Ra、Rv)のみかの、いずれかを用いる。
【００６２】
標的との独立した抗原結合を明示するために、両方の機能性を個別に測定し、連続的添加から得られた機能性と比較した。
【００６３】
二重特異性抗体＝CrossMab:
2019532291.tif 000002
【００６４】
二重特異性抗体＝DutaFab:
2019532291.tif 000003
【００６５】
このように、連続的な抗原注入から誘導された結合シグナルは、個別の注入から取得されたシグナルと同等である。したがって、分析された標的結合事象は両方とも、独立して生じている。連続的アプローチのほうが好ましいが、それは測定時間がより短く、再生サイクルが削減されるためであり、このことはまた、捕捉系の能力にも影響し得る。
【００６６】
したがって、一態様では、連続的な抗原注入で決定された結合シグナルが、個別の注入から取得された結合シグナルと同等であれば、各抗原の二重特異性抗体との結合は独立していると決定される。
【００６７】
「同等」という用語は、一態様において本明細書において使用される場合、その後ろの数値の+/- 20％の範囲を表す。一態様では、同等という用語は、その後ろの数値の+/- 10％の範囲を表す。一態様では、同等という用語は、その後ろの数値の+/- 5％の範囲を表す。
【００６８】
この結果は、固定化された二重特異性抗体の量とは無関係である（図2参照）。
【００６９】
平行線分析のための最適な濃度範囲は、両方の抗原について決定される用量反応曲線を用いて決定することができる。たとえば、抗体の0〜1000 μg/mlの濃度範囲を両方の抗原について用いることができる。用量反応曲線は、二重特異性抗体の濃度を上昇させ、抗原2および抗原1の濃度を一定としたセンサーグラムから作成することができる。濃度範囲の抗原2に対する最終反応Raおよび抗原1に対する最終反応RvはそれぞれS字状の用量反応曲線を生じる。この用量反応曲線から、変曲点周辺の最適な直線範囲を求めることができる（図3）。
【００７０】
二重特異性抗体は通常、2つの抗原に対し異なる親和性をもつので、ある濃度の2つの異なる直線範囲が得られることになる。各抗原の異なる直線性範囲を原因とする全範囲を網羅するために、2つの範囲の最低濃度値から開始して2つの範囲の最高濃度値で終了する、5点の濃度範囲を確立することができる。こうすることで、1サイクル内で両方の抗原を用いて測定することが可能になる。最初の4濃度は抗原2の決定(Ra)に用い、最後の4濃度は抗原1の決定(Rv)用に考慮した。アッセイの適格性評価のため、50％から150％まで5つの異なる範囲を用い、各範囲について結合活性を三つ組で測定する。
【００７１】
CrossMabフォーマットの例示的な抗ANG2/VEGF二重特異性抗体について、ANG2は濃度3.93〜13.3 μg/ml(図3A)、VEGFA-121は濃度5.9〜20 μg/ml(図3B)の、2つの異なる直線範囲を得た。3.93 μg/ml〜20 μg/mlの5点濃度範囲を確立した。標準結合レベルで割った各サンプルの結合レベルから算出して決定した相対結合活性を測定値に対してプロットし、線形回帰を当てはめた（Ang2(Ra)は図3A、VEGFA-121(Rv)は図3B）。結果を以下の表に示す。
【００７２】
2019532291.tif 000004
これらのデータは、二重結合アッセイの高性能を反映している。
【００７３】
本明細書において報告するアッセイでは、抗体の捕捉は、5 μl/分のフローで60秒間、O.6 μg/mL〜10 μg/mLの範囲の抗体濃度で、最良に実施されることが見出されている。この範囲で、抗体の直線的な捕捉が実現可能である。
【００７４】
異なる緩衝液を試験した。PBS-Tと300 mM  NaClとを含む緩衝液が、5 μg/ml以下の濃度で、最も少ない非特異的結合を示すことが見出されている。
【００７５】
2019532291.tif 000005
【００７６】
本明細書において報告するアッセイは、特異的であり、機能喪失を示す。このことは、上記と同じ二重特異性CrossMab、アイソタイプ対照、および2種類の異なるストレスを与えたCrossMabのサンプルを用いて示された。アッセイの機能喪失特性を評価するために、CrossMabサンプルを中程度のストレスまたはより強いストレスに関しインキュベートした。本明細書において報告するアッセイにより、2つの異なるストレス条件で結合活性の喪失を決定することができた。さらに、異なる標的特異性を有するモノクローナルヒトIgG1がネガティブ対照の働きをした。したがって、本明細書において報告する方法は、薬物特異的であり、機能の喪失を示し、薬物開発の後期に適している。
【００７７】
2019532291.tif 000006
【００７８】
本明細書において報告するアッセイによって、二重結合アッセイの全体のシグナルの算出を可能にする式(2)に示すように、2つの分析された相互作用から、第3の直接測定されていない相互作用を導くことが可能になる。
【００７９】
本明細書において報告するアッセイは、すべての起こり得る標的相互作用（全体、抗原1、抗原2）について、良好な相関を示しており、したがって、たとえば二重特異性抗体の結合部位の独立した機能喪失を示すのに用いることができる。
【００８０】
以前説明された架橋アッセイでは、固定化された抗原と結合した抗体の複合体安定性は、第2の抗原が注入できるように十分高くなくてはならない。抗体が表面からあまりにも直ぐに解離してしまうと、架橋シグナルが生成できず、したがって両方の抗原の同時結合は実現できない。さらに、2つの抗原の一方を固定化する必要があるので、活性を大きく損なうことなく確実に完全に抗体を解離させるように、比較的緩い再生条件を特定しなくてはならない。スカウト実験用の多数の再生溶液が利用可能だとしても、強力な試薬を使用すれば、もっぱらタンパク質複合体の分裂を招きかねない。その結果、固定化されたタンパク質が傷つくことにもなり、表面能力が著しく低下することもある。
【００８１】
それに対し、本明細書において報告するアッセイ（二重結合アッセイ）を使用する場合、二重特異性分子とその抗原との複合体安定性は、結果に影響しない。したがって、複合体安定性が低い分子でも分析することができる。このアッセイの追加の利点は、用いられる捕捉系である。この利点のおかげで、表面に結合した二重特異性分子の結合特性は決定を行う間中変わらず、抗原結合能力は終始一定している。
【００８２】
架橋アッセイと二重結合アッセイは、分析される分子に関して、および決定の重点に関して、特定の特徴を有する。
【００８３】
架橋アッセイは、固定化された抗原と関連がある活性結合部位に選択的である。固定化された抗原と結合しない分子は、溶液中の第2の抗原と関連がある結合部位が十分活性であっても、失われる。架橋アッセイは、両方の結合事象を同時に取り扱い、その抗原の両方との結合を示す全分子の活性濃度を説明するものである。
【００８４】
本明細書において報告するSPRに基づく二重結合アッセイは、追加の相互作用を導入する捕捉工程を要する。したがって、捕捉され得る分子だけが分析される。このアッセイ原理の重点は、両方の抗原の二重特異性分子との独立した結合である。
【００８５】
まとめると、本明細書において報告する、新規の、SPRに基づく二重結合アッセイは、所与の二重特異性抗体が招く技術的落とし穴を回避することができる。このアッセイ原理は、両方の個別の標的の相互作用を測定するが、以前説明されたSPRに基づく架橋アッセイ原理は、両方の標的との全体の結合、そしてそれに加えて、一方の個別の相互作用を扱う[11]。
【００８６】
参照文献リスト
2019532291.tif 000007
2019532291.tif 000008
【００８７】
以下の実施例および図は、本発明の理解を助けるために提供するものであり、本発明の真の範囲は、添付の請求項に記載されている。なお、記載の諸手順には、本発明の精神から逸脱することなく変更を加えることができることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】CrossMabにより例示される二重特異性抗体の捕捉および2種の抗原との相互作用。(A)まず、CrossMabがFab捕捉抗体によって捕捉される(捕捉シグナルRc)。次に、捕捉されたCrossMabへと、溶液中の抗原2(Ra)および／または抗原1(Rv)が集まることができる。(B)個別の相互作用を表示するセンサーグラム。Rc:捕捉シグナルに対応する結合反応。Ra:抗原2の結合に対応する結合反応。Rv:抗原1の結合に対応する結合反応。
【図２】抗原2と抗原1を同時にまたは連続的に注入することによる、1.5 μg/mL（下方のグラフ）と5 μg/mL（上方のグラフ）で捕捉されたDutaFabを用いて決定された、抗原2と抗原1の独立した結合。グラフは三つ組であり、一番上は抗原2と抗原1の同時注入により得られたもの、真ん中は抗原1を注入してから抗原2を注入して得られたもの、一番下は抗原2を注入してから抗原1を注入して得られたものである。
【図３】異なる二重特異性抗体(CrossMab)濃度による全部の用量反応曲線の直線状の用量反応曲線。最終的な読出し値については、(A)対数尺の二重特異性抗体濃度に対する抗原2の抗原結合シグナル、および(B)対数尺の二重特異性抗体濃度に対する抗原1の抗原結合シグナルをプロットして平行線モデルを用いた。
【実施例】
【００８９】
装置および試薬
SPR実験はすべて、BIAcore（著作権）T200測定器(GE Healthcare)で、25℃で実施した。VEGFA-121、Ang2、各種CrossMab、および使用したすべての対照抗体は、Roche Diagnostics GmbH製であった。
【００９０】
実施例1
アッセイ手順−二重結合アッセイ
捕捉用抗ヒトFab抗体(Human Fab Capture Kit, GE Healthcare)を、GE Healthcareが提供するアミンカップリング化学を用いてCM5バイオセンサーチップの表面に固定化した。0.4 M  1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)と0.1 M  N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)の1:1混合物を流量5 μL/分で用いて、フローセルを活性化した。酢酸ナトリウム（pH 5.0）中の抗ヒトFab抗体を15 μg/mlで420秒間注入することによって、およそ6000 RUの表面密度を得た。標的の結合が固定化により制限されることがないように、少なくとも5000 RUの薬物を固定化すべきである。リファレンス対照フローセルを、先述したのと同様に処理した。最後に、両方の表面に1 M  エタノールアミン/HCl（pH 8.5）を注入してブロックした。固定化緩衝液としては、HBS-N(10 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4、GE Healthcare)を使用した。二重特異性抗体をPBS-T(1 mM KH2PO4、10 mM Na2HP04、137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、pH 7.4、0.05％ Tween-20；Roche Diagnostics GmbH、ドイツ国マンハイム)で希釈し、第2のフローセルに、さまざまな濃度で90秒間、流量10 μL/分で注入した。両方のフローセルに、Ang2を60秒間、濃度1.1 μg/mlで注入してから、1.4 μg/mlのVEGFA-121を60秒間注入した。解離時間(ランニング緩衝液で洗浄)は、流量10 μL/分で、30秒だった。すべての相互作用は25℃で実施された。各結合サイクル後にグリシン再生溶液(pH 2.1)を60秒間、流量30 μL/分で注入して、共有結合しなかったタンパク質をすべて除去した。シグナルは、毎秒1シグナルの割合で検出した。サンプルは三つ組で測定し、活性は標準サンプルに対して測定した。
【００９１】
実施例2
アッセイ手順−標的ベースの架橋アッセイ
標的ベースの架橋アッセイは、本質的にはGassnerら[11]で説明されているアッセイに基づくが、用量反応曲線をたとえば1.92〜5 μg/mlに調節する変更を加えた。このアッセイは、50％から150％の範囲で適格性ありと認めることができ、直線性は0.9987、確度は97％、精度は2.9％であった。このアッセイは薬物特異的であり、機能喪失を示し、後期の妥当性評価に適している。
【００９２】
実施例3
曲線当てはめおよび統計分析
これらのアッセイについて、相対結合活性を算出するために、USP 1034による平行線モデル[14]を用いた。この平行線モデルは、以下の式により説明することができる：
Ys = αs + βlog(x) + e  （式3）
YT = αT + βlog(x) + e  （式4）
式中、Ysは、濃度xの標準サンプルに対する反応であり、YTは、同じ濃度xの試験サンプルに対する反応である。標準サンプルに対する試験サンプルの効力は、
2019532291.tif 000009
である。このモデルの基本類似性仮定は、勾配βが等しいことである。
【図１】
2019532291.tif 000010
【図２】
2019532291.tif 000011
【図３】
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【国際調査報告】
2019532291.tif 000013
2019532291.tif 000014