【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年2月5日(2007.2.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフィレグリンポリペプチドの抗アンフィレグリン抗体への結合を競合的に阻害するキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であって、該アンフィレグリンポリペプチドが、配列番号１を含み、該抗アンフィレグリン抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体。
【請求項２】
前記抗アンフィレグリン抗体が、配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号３、配列番号５および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗アンフィレグリン抗体が、配列番号２および配列番号３を含む抗体、配列番号４および配列番号５を含む抗体、ならびに配列番号１２および配列番号１４を含む抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号１２および配列番号１４を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｒＩｇＧ、二重特異性抗体、単鎖抗体および多重特異性抗体からなる群より選択される、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、エフェクター部分に結合される、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記アンフィレグリンポリペプチドが、癌細胞上に存在する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記アンフィレグリンポリペプチドが、皮膚細胞上に存在する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択される配列に対する同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号３、配列番号５および配列番号１４から選択される配列に対する同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体。
【請求項１１】
ポリペプチドに特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であって、該ポリペプチドは、配列番号１を含み、該抗体は、以下：配列番号２および配列番号３を含む抗体；配列番号４および配列番号５を含む抗体；ならびに配列番号１２および配列番号１４を含む抗体からなる群より選択される抗体により結合されるエピトープと同じアンフィレグリンエピトープに結合する、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、以下：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｒＩｇＧ、二重特異性抗体、単鎖抗体および多重特異性抗体からなる群より選択される抗体フラグメントである、請求項１０または１１に記載の抗体。
【請求項１３】
薬学的に受容可能な賦形剤および請求項１、１０または１１に記載の抗体を含有する、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記抗体がエフェクター部分に結合される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記抗体が配列番号１２および配列番号１４を含む、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記抗体が腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項１、１０または１１に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がアンフィレグリンを発現する腫瘍細胞のインビボ増殖を阻害する、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体がアンフィレグリンの少なくとも一つの生物学的活性を中和する、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１０または１１に記載の抗体を産生する宿主細胞であって、該宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、大腸菌、酵母細胞および昆虫細胞からなる群より選択される、宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１０または１１に記載される抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項２１】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号８、配列番号１０、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号８、配列番号１０、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択される核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２４】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２および配列番号１４から選択される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２５】
被験体における一種以上の癌細胞増殖を阻害する組成物であって、アンフィレグリンアンタゴニストの治療的有効量を含む、組成物。
【請求項２６】
前記癌細胞が表皮癌細胞または膵臓癌細胞である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
被験体における乾癬を処置する組成物であって、アンフィレグリンアンタゴニストの治療的有効量を含む、組成物。
【請求項２８】
前記アンフィレグリンアンタゴニストが抗アンフィレグリン抗体である、請求項２５または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗体が、エフェクター部分に結合される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗体が、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、（Ｆａｂ’）２抗体フラグメントもしくはＦｖ抗体フラグメントである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のエピトープと同じエピトープに結合する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２および配列番号１４から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】アンフィレグリン抗体ならびに癌および乾癬を処置するためのその使用
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は免疫学の分野に関する。具体的には、本発明は、アンフィレグリン（ＡＲ）のアンタゴニスト（好ましくは、抗ＡＲ抗体）、および、そのようなアンタゴニストを使用することによる癌または乾癬の検出または処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アンフィレグリンは、ホルボールエステルで処理されたＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞から最初に精製された約２０ｋＤａのヘパリン結合性の糖タンパク質である。この因子はＥＧＦファミリーの増殖因子に属し、（ケラチノサイトおよびいくつかの線維芽細胞細胞株を含む）数種の細胞タイプの増殖を刺激し、一方で、（多くの癌腫細胞株を含む）他の細胞の増殖を阻害する（Ｓｈｏｙａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、６５２８〜６５３２（１９８８）；Ｓｈｏｙａｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、１０７４〜１０７６（１９８９））。様々な研究により、ＡＲは主要なケラチノサイト自己分泌因子であることが解明されている（Ｃｏｏｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、２５４７〜２５５７（１９９１）；Ｃｏｏｋら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ、２１８〜２２２（１９９２）；Ｐｉｅｐｋｏｒｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５９、１１４〜１２０（１９９４））。ＡＲの特別な特徴は、その生物学的活性がヘパリン硫酸の存在下で完全に遮断されることである。ＡＲは、この性質を示す唯一の増殖因子であることが報告されている（Ｃｏｏｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１、２５４７〜２５５７（１９９１）；Ｃｏｏｋら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ、２１８〜２２２（１９９２）；Ｐｉｅｐｋｏｒｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５９、１１４〜１２０（１９９４））。単離されたＡＲが米国特許第５，１１５，０９６号に開示される（本明細書中に引用されるこの米国特許ならびにすべての他の米国特許および特許出願は本明細書によりそれらの全体が参考として援用される）。
【０００３】
ＡＲの多数の可溶性の活性なアイソフォームが、膜に固定されたＡＲ前駆体のタンパク質分解的切断によって産生する。これらの活性なアイソフォームには、ＡＲ７８、ＡＲ８１、ＡＲ８４、ＡＲ８７、ＡＲ９２およびＡＲ９８などがある（Ｓｈｏｙａｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、１０７４〜１０７６（１９８９）；Ｐｌｏｗｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０、１９６９〜１９８１（１９９０）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（３０）：１７９２７〜３１（１９９６））。可溶性の分泌型ＡＲは、そのチロシンリン酸化および分裂促進作用を、主に１７０ｋＤａのＥＧＦＲへの結合およびその活性化によって発揮する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：２９２４〜２９３１（１９９３））。
【０００４】
正常な成体表皮において、ＡＲは、低量であるかまたは検出不能であるが、表皮におけるいくつかの新生物過増殖性障害および非新生物過増殖性障害（付属器腫瘍、紫外線角化症、疣贅および扁平上皮癌を含む）では、ＡＲは、著しく過剰発現していることが免疫標識分析およびノーザン分析によって示されている（Ｐｉｅｐｋｏｒｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１８：１６５〜１７１（１９９６））。様々な研究により、ＡＲがヒト結腸癌において自己分泌増殖因子として作用することが明らかにされている。ＡＲに対する中和抗体の基底外側での投与は結腸癌細胞の基礎的ＤＮＡ複製を低下させる（Ｄａｍｓｔｒｕｐ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８０（７）：１０１２〜９（１９９９））。
【０００５】
ＡＲのｍＲＮＡ発現が乾癬皮膚において劇的に上昇することが報告されている（Ｃｏｏｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２：３２２４〜３２２７（１９９２））。強いＡＲ染色が、正常な皮膚におけるケラチノサイトの核に限定されたまばらで、限局的な標識化とは対照的に、乾癬表皮を伴うケラチノサイトの細胞質に存在する。ケラチノサイト特異的な遺伝子組換え発現により、ヒト乾癬に対する顕著な生物学的類似性を有する病変がもたらされている（Ｃｏｏｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２２８６〜２２９４（１９９７））。
【０００６】
公開された特許出願明細書ＥＰ１２４９２３７Ａ１には、ＡＲ発現阻害剤および老化皮膚に対する改善剤としてのその使用が開示される。
【０００７】
国際特許出願公開ＷＯ９０／１４０６９および米国特許第５，２６２，２９８号には、ＡＲの一致したアミノ酸配列を有するケラチノサイト自己分泌因子（ＫＡＦ）の単離が開示される。これら２つの参考文献では一般に、ＫＡＦ活性の阻害剤の投与が乾癬ならびに扁平上皮癌などの状態に有益であることが議論されている。
【０００８】
米国特許第５，８３０，９９５号および米国特許第６，２０４，３５９号には、ＡＲに対する抗体が開示される。
【０００９】
本発明は、開示されたアミノ酸配列または結合特徴（これらは上記の刊行物には開示されてない）を有する中和抗ＡＲ抗体に関する。乾癬および癌を処置するための様々なそのような抗ＡＲ抗体のインビボ効力が本発明において調べられている。これらの抗体は、被験体において、癌細胞の成長を阻害すること、創傷治癒、皮膚の性状を高めること、または／および、乾癬を処置することのための使用が見出される。本発明はまた、ＡＲの任意のアンタゴニスト（好ましくは抗ＡＲ抗体、より好ましくは、本明細書中において請求される抗体）を用いて乾癬または表皮癌および膵臓癌を処置する方法に従う。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、治療目的のために有用である抗ＡＲ抗体を提供する。例えば、本発明の抗体は、癌および／または他の増殖性状態（これには、良性の増殖性状態が含まれる）を有することが疑われる患者、あるいは、癌および／または他の増殖性状態（これには、良性の増殖性状態が含まれる）と診断されている患者を処置するために治療的に使用することができる。好ましい実施形態において、本発明の抗ＡＲ抗体は、乾癬と診断された患者を処置するために使用することができる。代わりの実施形態において、本発明の抗ＡＲ抗体は、細胞傷害性薬剤と結合し、ＡＲを発現する腫瘍細胞に対して使用することができる。１つの態様において、本発明の抗ＡＲ抗体は、ＡＲ発現細胞に関連する任意の増殖性障害を処置するために使用することができる。
【００１１】
本発明はＡＲタンパク質（例えば、配列番号１）について高親和性の抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明は、ＰＡＲ３４、ＰＡＲ８０およびＨｕＰＡＲ３４からなる群から選択されるＡＲ抗体に対するＡＲポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を提供する。この実施形態において有用であり得る他の選択された抗体が図２に開示される。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、エフェクター部分またはエフェクター成分に結合された抗体を提供する。エフェクター部分は標識（例えば、蛍光標識、エフェクタードメイン、例えば、ＭｉｃＡ）であってもよく、または細胞傷害性薬剤（例えば、放射性同位体または細胞傷害性の化学物質）が可能である。１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性薬剤オーリスタチン。他の実施形態において、抗体は、腫瘍細胞の成長を阻害するために単独で使用することができる。本発明の別の好ましい実施形態において、抗体は抗体依存的な細胞毒性を媒介する。
【００１３】
本発明によって提供される抗ＡＲ抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明は、霊長類患者を処置するための霊長類化抗ＡＲ抗体を提供する。本発明は、完全な抗体である抗ＡＲ抗体、ならびに抗ＡＲ抗体フラグメントを提供する。好ましい実施形態において、抗体フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｒＩｇＧ、二重特異性抗体、単鎖抗体および多重特異性抗体が含まれる。
【００１４】
本発明の抗ＡＲ抗体には、配列番号２〜５、配列番号８〜１２、配列番号１４〜１９として開示されるＶＨ領域およびＶＬ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対する相同性が９５％以上である抗体が含まれる。１つの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるＶＨ領域アミノ酸配列、ならびに／または、配列番号３、配列番号５および配列番号１４から選択されるＶＬ領域アミノ酸配列を含む抗ＡＲ抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明は、配列番号２および／または配列番号３（これらはＰＡＲ３４のＶＨ領域およびＶＬ領域にそれぞれ対応する）を含む抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号４および／または配列番号５（これらはＰＡＲ８０のＶＨ領域およびＶＬ領域にそれぞれ対応する）を含む抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１２および／または配列番号１４（これらはＨｕＰＡＲ３４のＶＨ領域およびＶＬ領域にそれぞれ対応する）を含む抗体を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または、配列番号３、配列番号５および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＡＲタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）に対して少なくとも８０％の相同性（好ましくは９８％の相同性）を有する配列を含むポリペプチドと結合するモノクローナル抗体（またはその抗体フラグメント）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＡＲモノクローナル抗体は、キメラ型、ヒト化型またはヒト型である。好ましくは、このモノクローナル抗体は、ＡＲ表面のリガンド結合部位について競合し、より好ましくは、表皮細胞または腫瘍細胞（これらの細胞は、ＡＲを発現する腫瘍細胞である）の増殖をインビボで阻害する。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、細胞傷害性薬剤（例えば、オーリスタチン）などのエフェクター部分に結合される。さらなる実施形態において、本発明は、抗体依存的な細胞の細胞傷害性を媒介するモノクローナル抗体を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、ＰＡＲ３４、ＰＡＲ８０およびＨｕＰＡＲ３４からなる群から選択される抗ＡＲ抗体が結合するエピトープと同じＡＲエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２〜５、配列番号１２および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、ＰＡＲ３４、ＰＡＲ８０およびＨｕＰＡＲ３４からなる群から選択される抗ＡＲ抗体を産生することができる宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞はハイブリドーマである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される核酸配列を含む。好ましい実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、大腸菌、酵母細胞および昆虫細胞からなる群から選択される。
【００２２】
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤と、ＡＲアンタゴニストとを含む薬学的組成物を提供する。１つの実施形態において、本発明は、抗ＡＲ抗体および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む組成物を提供する。１つの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または、配列番号３、配列番号５および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＡＲ抗体を含む。別の好ましい実施形態において、抗ＡＲ抗体は、ＰＡＲ３４、ＰＡＲ８０およびＨｕＰＡＲ３４からなる群から選択される。
【００２３】
薬学的組成物のいくつかの実施形態において、抗ＡＲ抗体はエフェクター部分またはエフェクター成分に結合される。エフェクター成分は標識（例えば、蛍光標識）であってもよく、または細胞傷害性薬剤（例えば、放射性同位体または細胞傷害性の化学物質部分）が可能である。本発明は、抗ＡＲ抗体に結合され得る様々な細胞傷害性薬剤を提供し、これらには、ジフテリアＡ鎖、エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、ネオマイシンおよびオーリスタチンが含まれる。薬学的組成物における抗ＡＲ抗体は完全な抗体であり得るか、または抗体フラグメントであり得る（これには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｒＩｇＧ、二重特異性抗体、単鎖抗体および多重特異性抗体が含まれる）。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、キメラ抗ＡＲ抗体、ヒト化抗ＡＲ抗体、またはヒト抗ＡＲ抗体を含む。
【００２４】
本発明はまた、癌関連細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞を本発明の抗ＡＲ抗体と接触させることを含む。好ましい実施形態において、抗ＡＲ抗体は、ＡＲアミノ酸配列（例えば、配列番号１）に対する少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗ＡＲ抗体はエフェクター部分（例えば、細胞傷害性薬剤）と結合することができる。ほとんどの実施形態において、癌関連細胞は患者（代表的にはヒト）に存在する。いくつかの実施形態において、その患者は、転移癌と診断されて転移性癌を処置するための治療的療法を受けていても、また、単に、癌であると疑われていてもよい。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、そのような処置を必要としている被験体における癌を処置する方法で、配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または、配列番号３、配列番号５および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＡＲ抗体の薬学的有効量を前記被験体に投与することによる方法を提供する。
【００２６】
代わりの実施形態において、本発明の処置方法は、抗ＡＲ抗体および治療有効量の細胞傷害性薬剤を患者に投与することを含む。この場合、抗体および細胞傷害性薬剤は同時に投与することができ、またはいずれか一方を他方の前に投与することができる。別の代替形態において、細胞傷害性薬剤が抗体に結合され、それにより同時に投与される。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、そのような処置を必要としている被験体における乾癬を処置する方法で、ＡＲのアンタゴニストの治療有効量を上記被験体に投与することを含む方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、投与されるアンタゴニストは、ＡＲアミノ酸配列（例えば、配列番号１）に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列に結合することができる抗ＡＲ抗体である。より好ましくは、アンタゴニストは、配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または、配列番号３、配列番号５および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有する成熟型軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＡＲ抗体である。特に好ましい実施形態において、ＡＲアンタゴニストは、ＰＡＲ３４、ＰＡＲ８０およびＨｕＰＡＲ３４からなる群から選択される。
【００２８】
本発明はさらに、本明細書中に開示される様々な抗ＡＲ抗体を用いる診断試験および免疫アッセイを提供する。好ましい実施形態において、これらの方法では、生物学的サンプルを本発明の抗ＡＲ抗体と接触させることによって、患者由来の生物学的サンプルにおける乾癬または癌細胞を検出することを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、蛍光標識または放射性同位体などの標識に結合される。
【００２９】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物において乾癬または癌を診断する方法で、抗ＡＲ抗体を、哺乳動物から得られた試験サンプルと接触させること、および、抗体と試験サンプルのポリペプチドとの間での複合体の形成を検出することを含む方法を提供する。この場合、抗体は、ＡＲのアミノ酸配列（例えば、配列番号１）に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと結合する。この方法の好ましい実施形態において、試験サンプルは、新生物細胞の成長または増殖を有することが疑われる個体から、あるいは、癌または乾癬有することが疑われる個体から得られる。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
（定義：）
本明細書中で使用される「抗体」は、特定の抗原との免疫学的反応性を有する免疫グロブリン分子に対する参照を包含し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含する。この用語にはまた、遺伝子操作された形態、例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト化されたマウス抗体）、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などが含まれる。用語「抗体」にはまた、抗体の様々な抗原結合性形態が含まれ、これらには、抗原結合能力を有するフラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）が含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）もまた参照のこと。例えば、Ｋｕｂｙ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）もまた参照のこと。この用語はまた、組換え単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）も示す。この抗体との用語にはまた、二価分子または二重特異性分子、二重特異性抗体、トリアボディーおよびテトラボディーが含まれる。二価分子および二重特異性分子が、例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８：１５４７；Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：１５７９；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９９３、ｓｕｐｒａ；Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ：５３６８；Ｚｈｕら（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ、６：７８１；Ｈｕら（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６：３０５３；Ａｄａｍｓら（１９９３）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３：４０２６；およびＭａＣａｒｔｎｅｙら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８：３０１に記載される。
【００３１】
特定の抗原との免疫学的反応性を有する抗体は、ファージベクターまたは類似するベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択などの組換え方法（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６（１９８９）；およびＶａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９〜３１４（１９９６）を参照のこと）によって、あるいは、抗原で動物を免疫するか、または抗原をコードするＤＮＡで動物を免疫することによって作製することができる。
【００３２】
代表的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。それぞれの重鎖および軽鎖は定常領域および可変領域を含有する（これらの領域はまた「ドメイン」として知られている）。重鎖および軽鎖の可変領域は、３つの超可変領域（これらはまた「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる）によって中断される４つの「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの大きさが明らかにされている。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内では比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成的な軽鎖および重鎖の組み合わさったフレームワーク領域は、三次元空間においてＣＤＲを配置し、アラインメントするために役立つ。
【００３３】
ＣＤＲは、抗原のエピトープに対する結合に主に関係している。それぞれの鎖のＣＤＲは、代表的には、Ｎ末端から始まって順次番号が付けられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として示され、これらもまた、代表的には、特定のＣＤＲが存在する鎖によって特定される。従って、ＶＨのＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに存在し、これに対して、ＶＬのＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。
【００３４】
「ＶＨ」または「ＶＨ」との表示は、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を示し、これには、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂの重鎖が含まれる。「ＶＬ」または「ＶＬ」との表示は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を示し、これには、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂの軽鎖が含まれる。
【００３５】
表現「単鎖Ｆｖ」または表現「ｓｃＦｖ」は、従来の二鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが連結されて、１つの鎖を形成している抗体を示す。代表的には、リンカーペプチドが、その２つの鎖の間に挿入され、活性な結合部位の適切な折り畳みおよび生成を可能にする。
【００３６】
天然に存在するクラスのＩｇＧ抗体の定常領域と実質的に同一である定常領域を有する抗体は、存在する任意の定常領域が、天然に存在するクラスのＩｇＧ抗体の定常領域のアミノ酸配列と実質的に同一である抗体、すなわち、天然に存在するクラスのＩｇＧ抗体の定常領域のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８５％〜９０％（好ましくは少なくとも９５％）である抗体を示す。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、それが作製される方法ではなく、任意の真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を示す。本発明に関して有用であるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレー技術、またはそれらの組合せの使用を含むこの分野で知られている広範囲の様々な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、この分野で知られている技術、および、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）、ｐｐ．５６３〜６８１（これらはともにその全体が参考として本明細書中で援用される）に教示される技術を含むハイブリドーマ技術を使用して製造することができる。
【００３８】
用語「遺伝子改変された抗体」は、そのアミノ酸配列が本来の（ｎａｔｉｖｅ）抗体のアミノ酸配列から変化している抗体を意味する。本発明に対する組換えＤＮＡ技術の妥当性のために、抗体は、本来の抗体に見出されるアミノ酸の配列に限定される必要はない。すなわち、抗体を、所望の特徴を得るために再設計することができる。可能な変化は多数であり、ほんの１個または数個のアミノ酸を変化させることから、例えば、可変領域または定常領域の完全な再設計にまで及び得る。定常領域における変化は、一般に、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能などの特徴を改善するか、または変化させるために行われる。可変領域における変化は、抗原結合特徴を改善するために行われる。「遺伝子改変された抗体」の例には、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれる。
【００３９】
本発明の多くの好ましい使用において、これらには、癌または乾癬を処置するためのヒトにおける抗ＡＲ抗体のインビボ使用、またはインビトロ検出アッセイのための使用が含まれるが、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。
【００４０】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域もしくはその一部が変化させられ、もしくは置換され、もしくは交換され、その結果、抗原結合部位（可変領域）が、異なるかもしくは変化したクラス、エフェクター機能および／もしくは生物種の定常領域に、または、新しい性質をキメラ抗体に付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、トキシン、ホルモン、増殖因子、薬物など）に連結されている免疫グロブリン分子、あるいは（ｂ）可変領域もしくはその一部が、異なるかもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域を用いて変化させられ、または、そのような可変領域で置換され、またはそのような可変領域と交換されている免疫グロブリン分子である。キメラ抗体を作製するための様々な方法がこの分野では知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２〜１２０７（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４；２１４〜２２１（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１〜２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号および同第４，８１６，３９７号を参照のこと（これらはその全体が参考として本明細書中で援用される）。
【００４１】
用語「ヒト化抗体」または用語「ヒト化免疫グロブリン」は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体に由来する少なくとも１つ（好ましくはすべての）相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む免疫グロブリンを示し、この場合、存在するいずれかの定常領域はヒト免疫グロブリンの定常領域と実質的に同一であり、すなわち、少なくとも約８５％〜９０％（好ましくは少なくとも９５％）が同一である。従って、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分が、おそらくはＣＤＲを除いて、１つまたは複数の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的にはヒト可変ドメインの一部が、ヒト以外の生物種に由来する対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。多くの場合、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基が、抗原結合性を変化させるために、好ましくは抗原結合性を改善するために、ＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、この分野で広く知られている方法によって、例えば、抗原結合のために重要なフレームワーク残基を同定するためにＣＤＲ残基とフレームワーク残基との相互作用をモデル化すること、および、非通常的なフレームワーク残基を特定の位置において同定するための配列比較によって同定される。例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第６，１８０，３７０号（これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる）を参照のこと。抗体は、この分野で知られている様々な技術を使用してヒト化することができ、そのような技術には、例えば、ＣＤＲグラフト化（欧州特許ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、張り合わせまたは再表面化（欧州特許ＥＰ５９２，１０６、欧州特許ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９〜４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、７：８０５〜８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：９６９〜９７３（１９９４））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）が含まれる（これらのすべては本明細書によりその全体が参考として組み込まれる）。
【００４２】
完全な「ヒト」抗体はヒト患者の治療的処置のために望ましいと考えられる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレー法を含む、この分野で知られている様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびに、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９８／４６６４５、同ＷＯ９８／５０４３３、同ＷＯ９８／２４８９３、同ＷＯ９８／１６６５４、同ＷＯ９６／３４０９６、同ＷＯ９６／３３７３５および同ＷＯ９１／１０７４１を参照のこと（これらのそれぞれはその全体が参考として本明細書中で援用される）。ヒト抗体はまた、機能的な内因性の免疫グロブリンを発現することができず、しかし、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現することができる遺伝子組換えマウスを使用して作製することができる。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概略については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術の詳細な議論、ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコルについては、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９８／２４８９３、同ＷＯ９２／０１０４７、同ＷＯ９６／３４０９６、同ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９１６，７７１号および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が参考として本明細書中で援用される）。また、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）およびＭｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）などの企業は、上記に記載された技術に類似する技術を使用して、選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を提供するために契約することができる。
【００４３】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選抜（guided  selection）」として示される技術を使用して作製することができる。この方法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）が、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選抜を誘導するために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：８９９〜９０３（１９８８））。
【００４４】
用語「霊長類化抗体」は、サルの可変領域と、ヒトの定常領域とを含む抗体を示す。霊長類化抗体を作製するための様々な方法がこの分野では知られている。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６８１，７２２号および同第５，６９３，７８０号を参照のこと（これらはその全体が参考として本明細書中で援用される）。
【００４５】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原上の部位を示す。エピトープは、連続したアミノ酸、または、タンパク質の三次折り畳みによって並置される非連続のアミノ酸の両方から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、代表的には、変性溶媒に曝露されたときでも保持されており、これに対して、三次構造上の折り畳みによって形成されるエピトープは、代表的には、変性溶媒を用いた処理で失われる。エピトープは、代表的には、少なくとも３個のアミノ酸、より通常的には少なくとも５個または８個〜１０個のアミノ酸を特徴的な空間的配座で含む。エピトープの空間的配座を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学的方法および二次元核磁気共鳴法が含まれる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照のこと。２種の抗体があるタンパク質の同じエピトープに結合すると言及されるのは、そのタンパク質におけるアミノ酸を改変することで一方の抗体の結合を低減させるかまたは消失させると、もう一方の抗体の結合も低減するかまたは消失する場合、ならびに／または、上述の２種の抗体がそのタンパク質に対する結合に関して競合している場合（すなわち、一方の抗体がそのタンパク質に結合することで、他方の抗体の結合が低減するかまたは消失してしまう場合）である。
【００４６】
「ＩｇＧクラス」の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の抗体を示す。重鎖および軽鎖におけるアミノ酸残基の番号付けはＥＵインデックスの番号付けである（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）；ＥＵ番号付けスキームが本明細書中では使用される）。
【００４７】
用語「ポリペプチド」、用語「ペプチド」および用語「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを示すために本明細書中では交換可能に使用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含有する天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーだけでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに対して適用される。
【００４８】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成されたアミノ酸、ならびに、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を示す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに、後で修飾されるそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造（例えば、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を示す。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有することができ、しかし、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を示す。アミノ酸は、それらの一般的に知られている三文字記号、または、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により勧告される一文字記号のいずれかによって本明細書中では示され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている一文字記号によって示され得る。
【００４９】
「保存的に改変された改変体」はアミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそのような核酸を示すか、あるいは、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一であるか、または関連した、例えば、天然では連続した配列を示す。遺伝暗号の縮重性のために、非常に多数の機能的に同一の核酸により、ほとんどのタンパク質がコードされる。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのコドンはすべてが、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、あるコドンによってアラニンが指定されるすべての位置において、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンの別のものに変えることができる。そのような核酸変化は「サイレントな変化」であり、これは、保存的に改変された変化の１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の核酸配列はどれもまた、核酸のサイレントな変化を記述する。当業者は、特定の状況では、核酸における各コドン（通常的にはメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および、通常的にはトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を生じさせるために改変され得ることを認識している。従って、多くの場合、ポリペプチドをコードする核酸の様々なサイレントな変化が、実際のプローブ配列に関してではなく、発現産物に関しては、記載された配列には含まれる。
【００５０】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列において１個のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変化または付加または欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、その変化が、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合、「保存的に改変された改変体」であることを認識する。機能的に類似するアミノ酸を提供する様々な保存的置換の様々な表がこの分野では広く知られている。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えてであり、また、それらを除外しない。代表的には、相互についての保存的置換は下記の通りである：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）：７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００５１】
用語「ＡＲ」は、アンフィレグリンの核酸およびポリペプチドの多型改変体、対立遺伝子、変異体ならびに種間ホモログを示し、これらには、（１）配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、好ましくは、少なくとも約２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチドまたはそれ以上の領域について、約６０％を越えるヌクレオチド配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、より好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するもの；（２）配列番号１のアミノ酸配列およびその保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起された抗体（例えば、ポリクローナル抗体）に結合するもの；（３）配列番号１のアミノ酸配列およびその保存的に改変された改変体をコードする核酸配列またはその相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで特異的にハイブリダイゼーションするもの；または（４）配列番号１のアミノ酸配列に対して、好ましくは、少なくとも約２５アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、２００アミノ酸またはそれ以上の領域について、約６０％を越えるアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものが含まれる。ＡＲポリヌクレオチド配列またはＡＲポリペプチド配列は、代表的には、霊長類（例えば、ヒト）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたは他の哺乳動物（これらに限定されない）を含む哺乳動物に由来する。「ＡＲポリペプチド」および「ＡＲポリヌクレオチド」には、天然に存在する形態または組換え形態の両方が含まれる。
【００５２】
「全長」のＡＲタンパク質またはＡＲ核酸は、１つまたは複数の天然に存在する野生型のＡＲポリヌクレオチド配列またはＡＲポリペプチド配列に通常の場合には含有される要素のすべてを含有する卵巣癌ポリペプチド配列または卵巣癌ポリヌクレオチド配列またはそれらの改変体を示す。例えば、全長のＡＲ核酸は、代表的には、全長の天然に存在するタンパク質をコードするエキソンのすべてを含む。「全長」は、翻訳後のプロセシングまたはスプライシング（選択的スプライシングを含む）の様々な段階の前またはその後であってもよい。
【００５３】
用語「ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）形態」は、細胞によって適切かつ自然に発現されたときに存在するようなポリペプチドの正しい三次元配座（すなわち、三次構造）を示す。
【００５４】
用語「同一の（同一である）」またはパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関連して、同じである２つ以上の配列または部分配列、あるいは、ＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０の配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメーターとともに使用して測定されたとき、または、手作業によるアライメントおよび目視検査によって、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定されたパーセント（すなわち、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアラインメントされたとき、指定された領域について約６０％の同一性、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列を示す（例えば、ＮＣＢＩウエブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／またはその他を参照のこと）。その場合、そのような配列は「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の補足部を示すか、または試験配列の補足部に対して適用され得る。この定義にはまた、置換を有する配列だけでなく、欠失および／または付加を有する配列、ならびに、天然に存在する、例えば、多型改変体または対立遺伝子改変体、および人工の改変体が含まれる。下記に記載されるように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを明らかにすることができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５個のアミノ酸またはヌクレオチドである領域について存在し、より好ましくは、長さが５０個〜１００個のアミノ酸またはヌクレオチドである領域について存在する。
【００５５】
「宿主細胞」は、天然に存在する細胞、あるいは、発現ベクターを含有し、発現ベクターの複製または発現を支持する形質転換された細胞である。宿主細胞は、培養細胞、外植片、およびインビボでの細胞などであり得る。宿主細胞は、大腸菌などの原核生物細胞、あるいは、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯおよびＨｅＬａなど）などの真核生物細胞であり得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログまたはウエブサイトｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇを参照のこと）。
【００５６】
用語「単離された」、用語「精製された」または用語「生物学的に純粋な」は、その天然の状態において見出されるような、通常の場合には伴う成分を実質的または本質的に含まない物質を示す。純度および均一度は、代表的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。調製物に存在する主要な化学種であるタンパク質または核酸は実質的に精製されている。具体的には、単離された核酸は、天然の状態では遺伝子に隣接し、かつ、遺伝子によってコードされるタンパク質ではないタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離されている。用語「精製された」は、いくつかの実施形態では、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせることを意味する。好ましくは、用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。「純度」または「精製」は、他の実施形態では、精製される組成物から少なくとも１つの混入物を除去することを意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均質であること、例えば、１００％純粋であることを要求しない。
【００５７】
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」は、例えば、ＡＲタンパク質、ＡＲポリヌクレオチドまたはＡＲ転写物の核酸またはポリペプチドを含有する生物学的な組織または流体のサンプルである。そのようなサンプルには、霊長類（例えば、ヒト）または齧歯類（例えば、マウス、およびラット）から単離された組織が含まれるが、これらに限定されない。生物学的サンプルにはまた、生検サンプルおよび検死解剖サンプルなどの組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、唾液、便、涙、粘液、体毛、皮膚などが含まれ得る。生物学的サンプルにはまた、患者の組織に由来する外植片ならびに初代細胞培養物および／または形質転換細胞培養物が含まれる。生物学的サンプルは、代表的には、真核生物から、最も好ましくは、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類（例えば、モルモット、ラット、マウス）、ウサギなど；または鳥類；ハ虫類；または魚類から得られる。
【００５８】
「生物学的サンプルを提供すること」は、本発明において記載された方法における使用のための生物学的サンプルを得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、細胞のサンプルを動物から取り出すことによって行われるが、しかし、以前に単離された細胞（例えば、別人によって、別の時間で、かつ／または別の目的のために単離された細胞）を使用することによって、または、本発明の方法をインビボで行うことによってもまた達成することができる。処置または結果の履歴を有する保存組織は特に有用である。
【００５９】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光分析的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるような酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド状金、発光性ナノ結晶（例えば、量子ドット）、ハプテンおよびタンパク質または他の実体が含まれ、これらは、例えば、放射性標識をペプチドに取り込むことによって検出可能にすることができ、または、ペプチドと特異的に反応し得る抗体を検出するために使用することができる。放射性同位体は、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉが可能である。場合により、本発明のタンパク質に対する抗体を特に使用することにより、放射性同位体は、下記において記載されるように、毒性成分として使用される。標識は、任意の位置において、ＧＰＲ６４核酸、タンパク質および抗体に取り込むことができる。抗体を標識に結合するためのこの分野で知られている方法はどれも用いることができ、これらには、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０：４０７（１９８２）によって記載されるそのような方法が含まれる。放射能標識されたペプチドまたは放射能標識された抗体組成物の寿命は、放射能標識されたペプチドまたは抗体を安定化させ、その分解から保護する物質の添加によって延ばすことができる。放射能標識されたペプチドまたは抗体を安定化させる任意の物質または物質の組合せを使用することができ、これらには、米国特許第５，９６１，９５５号に開示されるそのような物質が含まれる。
【００６０】
「エフェクター」または「エフェクター部分」または「エフェクター成分」は、抗体に対して、リンカーまたは化学結合によって共有結合的に、あるいは、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合または水素結合によって非共有結合的に結合する（または連結または結合される）分子である。「エフェクター」は様々な分子が可能であり、これらには、例えば、放射性化合物を含む検出成分、蛍光性化合物、酵素または基質、タグ（例えば、エピトープタグなど）、毒素、活性化可能な成分、化学療法剤または細胞傷害性薬剤、化学誘因剤、リパーゼ；抗生物質；または「強く（ｈａｒｄ）」放射する放射性同位体（例えば、ベータ線）が含まれる。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞の機能を阻害または防止し、かつ／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質を示す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤および毒素（例えば、細菌起源、菌類起源、植物起源または動物起源の酵素的に活性な毒素、あるいはそのフラグメントなど）を包含することが意図される。
【００６２】
「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、トキソイド、例えば、パクリタキセル（タキソール、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）およびドキセタキセル（タキソテレ、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｒｎａｃｅ）、トキソテレ、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エスペラマイシン類（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、５−ＦＵ、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、ＶＰ−１６、クロラムブチル、メルファランおよび他の関連するナイトロジェンマスタードが含まれる。この定義には、腫瘍に対するホルモン的作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤（例えば、タモキシフェンおよびオナプリストンなど）もまた含まれる。
【００６３】
本明細書中で使用される「キャリア」には、用いられた投薬量および濃度でさらされている細胞または哺乳動物に対して非毒性である薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤が含まれる。多くの場合、生理学的に許容され得るキャリアは水性のｐＨ緩衝化溶液である。生理学的に許容され得るキャリアの例には、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど；単糖、二糖および他の炭水化物、これには、グルコース、マンノースまたはデキストリンが含まれる；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡなど；糖アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールなど；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウムなど；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭが含まれる。
【００６４】
「薬学的有効」量または「治療有効」量は、腫瘍の処置に関連して、下記の効果の１つまたは複数を生じさせることができる量を示す：（１）鈍化および完全な成長停止を含む、腫瘍成長のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの減少；（４）末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、減少、鈍化または完全な停止）；（５）転移の阻害（すなわち、減少、鈍化または完全な停止）；（６）抗腫瘍免疫応答の強化、これは腫瘍の退行または拒絶を生じさせ得るが、しかし、腫瘍の退行または拒絶を生じさせる必要はない；および／または（７）障害に関連した１つまたは複数の症状のある程度の緩和。腫瘍を処置する目的のためのＡＲアンタゴニストまたは抗ＡＲ抗体の「治療有効量」は、経験的に、また、日常的な様式で決定することができる。
【００６５】
「処置」は、治療的処置および予防的または防止的な対策の両方を示す。処置を必要としているものには、障害を既に有するもの、ならびに、障害を防止しなければならないものが含まれる。
【００６６】
「被験体」は脊椎動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）を示す。
【００６７】
用語「癌」は、調節されない細胞成長によって代表的には特徴づけられる、哺乳動物において見出される任意のタイプの生理学的状態（例えば、新生物または悪性腫瘍）を示し、これには、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫または造血系新生物障害が含まれる。癌の例には、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、頭頸部癌、内皮の癌、骨の癌、筋肉の癌、膵臓癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺癌、胃癌、結腸癌、腎臓癌、悪性の膵臓インスリノーマ、悪性の類癌腫、膀胱癌、黒色腫、前悪性の皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、食道癌、尿生殖路癌、悪性の高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、表皮癌、副腎皮質癌、前立腺癌または子宮癌が含まれるが、これらに限定されない。癌細胞は任意のタイプの癌の癌性細胞であり、これは患者由来の癌組織の細胞であり得るか、または確立された癌細胞株の細胞であり得る。
【００６８】
本明細書中で使用される「腫瘍」は、悪性または良性であっても、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびに、すべての前癌性および癌性の細胞および組織を示す。
【００６９】
（Ｉ．アンフィレグリン（ＡＲ）ポリペプチド）
用語「アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）」および用語「アンフィレグリンポリペプチド」は本明細書中では交換可能に使用され、これらは全長のＡＲタンパク質またはその機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体を示す。アンフィレグリンの様々な活性な形態が内膜タンパク質前駆体の内部切断産物から作製される。これらの活性な形態の例には、ＡＲ８４、ＡＲ８７またはＡＲ９８がある。ヒトＡＲの２５２アミノ酸の配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１６４８）は下記の通りである：
【００７０】
【化１】
2006517109.tif 000001
（配列番号１）
機能的に活性なＡＲフラグメントまたは誘導体は、全長の野生型ＡＲタンパク質に関連する１つまたは複数の機能的な活性（例えば、抗原性活性または免疫原性活性、天然の細胞基質と結合する能力など）を示す。ＡＲタンパク質、誘導体およびフラグメントの機能的活性は、当業者に知られている様々な方法によってアッセイすることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎら，ｅｄｓ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９８））。本明細書中における目的のために、機能的に活性なフラグメントにはまた、ＡＲポリペプチドの１つまたは複数の構造的ドメイン（例えば、結合ドメインなど）を含むそのようなフラグメントが含まれる。タンパク質ドメインは、ＰＦＡＭプログラム（Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７：２６０〜２（１９９９））を使用して同定することができる。
【００７１】
ＡＲポリペプチド誘導体は、代表的には、配列番号１またはそのフラグメントとのある程度の配列同一性または配列類似性を有する。ＡＲ誘導体は、制限酵素による切断または変異誘発などの、この分野で知られている様々な方法によって作製することができる。
【００７２】
（ＩＩ．ＡＲのアンタゴニスト）
ＡＲのアンタゴニストには、ＡＲの生物学的活性を直接的または間接的に妨害し、または低下させ、または阻害する任意の分子が含まれる。好ましい実施形態において、ＡＲのアンタゴニストは、ＥＧＦＲなどのそれらの受容体に対するＡＲの結合と競合するか、または、好ましくは、ＥＧＦＲなどのそれらの受容体に対するＡＲの結合を阻止する。アンタゴニストは、ＡＲの少なくとも１つの生物学的活性（例えば、受容体結合、チロシンリン酸化、下流側のシグナル伝達、分裂促進活性、乾癬病変における細胞の増殖）を妨害し、または低下させ、または阻害しなければならない。
【００７３】
好ましい態様において、アンタゴニストはＡＲと直接的に相互作用する。好ましくは、アンタゴニストはタンパク質である。より好ましくは、そのようなタンパク質はＡＲに結合する。さらにより好ましくは、アンタゴニストは、ＡＲに結合して、ＡＲの少なくとも１つの生物学的活性を中和する抗体フラグメントを含む抗体である。
【００７４】
別の態様において、アンタゴニストは、ＡＲの活性を阻害するが、ＡＲと直接的には相互作用しない任意のポリペプチドまたはペプチドである。１つの態様において、これらのアンタゴニストは、ＥＧＦＲなどのその受容体に対するＡＲの結合を阻止する。例えば、アンタゴニストは、変異したＡＲ分子、例えば、末端短縮化またはアミノ酸置換によって野生型ＡＲに由来するドミナントネガティブ型変異体などであり得る。好ましくは、そのような変異したＡＲはＡＲのシグナル伝達分子に対する結合能力を保持しているが、ＡＲの下流側のシグナル伝達を開始させる能力を失っている。その結果、変異したＡＲ分子は野生型ＡＲと競合することができ、従って、野生型ＡＲの活性を阻止することができる。標準的な変異誘発技術および分子クローニング技術により、末端短縮化およびアミノ酸置換を達成することができる。変異したＡＲ分子は、この分野で知られている標準的な送達手段によって、例えば、脂質トランスフェクションまたはウイルストランスフェクションなどによって標的細胞に投与することができる。さらなる例として、ＡＲの受容体の、ＡＲとのリガンド結合部位を阻止する抗体または他のペプチド遮断剤がある。例示的な抗体には、ＥＧＦＲに対する抗体である。
【００７５】
あるいは、アンタゴニストはＡＲシグナル伝達経路の上流側成分または下流側成分と相互作用し、それらを調節して、ＡＲの活性を間接的に低下させる。例えば、ＡＲの様々な活性が、ＥＧＦ受容体に対するＡＲの結合のときに受容体チロシンキナーゼ経路によって媒介されることが知られている。従って、この経路を調節することができる分子はどれも、ＥＧＦ受容体シグナル伝達経路の成分がこの分野で知られているならば、結合および活性を阻止する抗体または他のアンタゴニスト（これらに限定されない）を含めて、候補のアンタゴニストであり得る。酵母ツーハイブリッドスクリ−ニングおよび改変体スクリ−ニングは、ＡＲシグナル伝達経路の内因性のさらなる相互作用タンパク質を同定するための好ましい方法を提供する（Ｆｉｎｌｅｙ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ、ｅｄｓ．Ｇｌｏｖｅｒ  Ｄ．＆Ｈａｍｅｓ  Ｂ．Ｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、ｐｐ．１６９〜２０３（１９９０）；Ｆａｓｈｅｍａ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、２５０：１〜１４（２０００）；Ｄｒｅｅｓ  Ｂ．Ｌ．、ＣＵＫ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、３：６４〜７０（１９９９）；Ｖｉｄａｌ  Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｇｒａｉｎ  Ｐ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２７：９１９１〜２９（１９９９）；および米国特許第５，９２８，８６８号）。質量分析は、タンパク質複合体を解明するための代わりの方法である（例えば、Ｐａｎｄｌｅｙ  Ａ  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ、４０５：８３７〜８４６（２０００）；Ｙａｔｅｓ  ＪＲ  ３ｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、１６：５〜８（２０００）に総説される）。
【００７６】
さらに別の態様において、アンタゴニストはＡＲのタンパク質発現を阻害しなければならない。ＡＲ発現は、例えば、ＡＲの転写因子の調節因子などによって転写のレベルで、あるいはｍＲＮＡスプライシングまたは翻訳または翻訳後のレベルで調節することができる。
【００７７】
アンタゴニストはまた、ＡＲの一部またはすべてをコードするか、あるいはＡＲの実質的な配列類似性を有する核酸配列のアンチセンス核酸（これに限定されない）を含む核酸であり得る。ＡＲのＤＮＡ配列は、この分野では知られており、また、本明細書中に開示される。続いて、ＡＲ  ＤＮＡのアンチセンス核酸プローブ、およびアンチセンス阻止の最適な条件を、分子生物の分野における当業者に知られている関連した技術を使用することによって開発することができる。同様に、核酸試薬は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のクラスに属し得る（例えば、Ａｍｂｒｏｓ、Ｃｅｌｌ、１１３：６７３（２００３）；Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１３２：７０９（２００３）；およびＰａｌａｔｎｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４２５：２５７（２００３）を参照のこと）。
【００７８】
本発明のアンタゴニストにはまた、酵素機能を有するタンパク質の機能を多くの場合には調節し、かつ／またはタンパク質相互作用ドメインを含有する低分子が含まれる。化学的薬剤は、この分野では「低分子」化合物と呼ばれるが、代表的には、分子量が１０，０００未満（好ましくは５，０００未満、より好ましくは１，０００未満、最も好ましくは５００未満）である有機の非ペプチド分子である。このクラスのアンタゴニストには、化学合成された分子、例えば、コンビナトリアル化学ライブラリーに由来する化合物が含まれる。合成化合物は、ＡＲタンパク質の知られている性質または推測される性質に基づいて合理的に設計または同定することができ、あるいは、化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。このクラスの代わりの適切なアンタゴニストは天然産物（特に、植物または菌類などの生物に由来する二次代謝産物）であり、これらもまた、ＡＲ調節活性について化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。化合物を作製し、得るための様々な方法がこの分野では広く知られている（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ＳＬ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５１：１９６４〜１９６９（２０００）；Ｒａｄｍａｎｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ｊ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５１：１９４７〜１９４８（２０００））。
【００７９】
（ＩＩＩ．ＡＲに対する抗体）
本発明の、ＡＲに対する抗体（すなわち、抗ＡＲ抗体）は、ポリクローナル形態またはモノクローナル形態が可能であるが、ＡＲ（好ましくはヒトＡＲ、より好ましくは、ＡＲのヒトの生物学的に活性な形態の少なくとも１つ）の少なくとも１つのエピトープに結合しなければならない。抗体は、ａ）部分ＡＲタンパク質もしくは全長ＡＲタンパク質、またはｂ）その機能的に活性なフラグメントもしくは誘導体に結合しなければならない。抗体には、定常領域のすべてのタイプを有する抗体（これには、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥが含まれる）、および、任意のアイソフォーム（これには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる）が含まれる。軽鎖はκ軽鎖またはλ軽鎖であり得る。
【００８０】
好ましい態様において、抗ＡＲ抗体は好ましくは、少なくとも１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１の結合親和性でＡＲエピトープに結合する。
【００８１】
より好ましい態様において、本発明の抗体はＡＲの少なくとも１つの生物学的活性（例えば、受容体結合活性、シグナル伝達および細胞応答など）を中和する。これらの中和抗体はＡＲのその受容体に対する結合と競合することができ、または、ＡＲのその受容体に対する結合を完全に阻止する。これらの抗体は、シグナル伝達活性、および／または細胞応答の誘導（例えば、チロシンリン酸化）、および／またはＡＲ媒介による細胞増殖を阻害または完全に中和するはずである。１つの例において、中和抗体は、ＡＲが内因的に発現するタイプの細胞（例えば、マウス３Ｔ３細胞およびヒトＨＥＫｎ細胞など）の増殖を阻害することができる。好ましくは、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度の抗体により、特に、ＡＲもまたこれらの濃度の１つで使用されるとき、あるいは、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２５、０．５または１．０であるモル濃度の抗体の濃度において、ＥＧＦＲに対するＡＲの結合またはＡＲ媒介細胞増殖の少なくとも１０％、２５％、５０％、９０％、９５％、９９％または本質的には１００％が阻止される。
【００８２】
例示的な中和抗体には、これらもまた下記の実施例に記載され、また、図２に示される表に列挙されるが、下記のモノクローナル抗体が含まれる：ＰＡＲ２、ＰＡＲ５、ＰＡＲ１５、ＰＡＲ１９、ＰＡＲ２２、ＰＡＲ２３、ＰＡＲ２６、ＰＡＲ２９、ＰＡＲ３１、ＰＡＲ３４、ＰＡＲ４４、ＰＡＲ４６、ＰＡＲ５１、ＰＡＲ６７、ＰＡＲ７９、ＰＡＲ８０、ＰＡＲ８１およびＰＡＲ８４。これらの抗体は、細胞表面に発現しているＡＲに結合する。それらのほとんどすべてが、マウス３Ｔ３細胞またはヒトＨＥＫｎ細胞のＡＲ媒介による増殖を阻害するか、または完全に阻止さえする。ＰＡＲ３４およびＰＡＲ８０は最も強力な中和能力を有する。０．０７２μｇ／ｍｌもの少量のＰＡＲ３４およびＰＡＲ８０により、ＡＲ媒介の３Ｔ３細胞の増殖が約５０％阻害される。ＰＡＲ２、ＰＡＲ５、ＰＡＲ１５、ＰＡＲ２３、ＰＡＲ４６、ＰＡＲ８４もまた、非常に強力な中和抗体である。ＰＡＲ３４の成熟型重鎖可変領域および成熟型軽鎖可変領域のアミノ酸配列が本明細書では配列番号２および配列番号３にそれぞれに表される。ＰＡＲ８０の成熟型重鎖可変領域および成熟型軽鎖可変領域のアミノ酸配列が本明細書では配列番号４および配列番号５にそれぞれに表される。
【００８３】
本発明は、配列番号２、配列番号４および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型重鎖可変領域を含む抗ＡＲ抗体を提供する。これらの抗体はさらに、配列番号３、配列番号５および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型軽鎖可変領域を含むことができる。本発明には、これらの抗体の同じエピトープに結合する抗体が含まれる。エピトープタイプの決定は、この分野で知られている方法によって、例えば、競合アッセイ（これは、例えば、フローサイトメトリーによって測定されるような蛍光強度の変化によって検出され得る）などによって達成される。２つの抗体のエピトープが類似している場合、抗原結合部位が第１の抗体によって占められ、第２の抗体のコンジュゲートは細胞と結合することができない。これにより、このコンジュゲートのシグナルの喪失がもたらされ、その結果、蛍光強度が減少する。
【００８４】
本発明には、本明細書中に記載される抗体のアナログが含まれる。好ましいアナログには、配列番号２、配列番号４および配列番号１２の少なくとも６０％または８０％または９０％〜９５％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域、ならびに／あるいは、配列番号３、配列番号５および配列番号１４の少なくとも６０％または８０％または９０％〜９５％のアミノ酸配列同一性を有する成熟型軽鎖可変領域を含む抗体が含まれる。
【００８５】
同一性パーセントを決定する様々な方法がこの分野では知られている。指定された対象配列またはその指定された部分に関する「配列同一性パーセント（％）」は、デフォルト値に設定された検索パラメーターを用いてプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９７）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって実現されるような最大のパーセント配列同一性を達成するために必要であるならば、配列をアラインメントし、ギャップを導入した後での、対象配列（またはその指定された部分）におけるヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である候補派生配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率として定義することができる。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２のパラメーターは動的な値であり、目的とする配列が検索されている特定の配列の組成および特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自身によって確立される。任意の２つの抗体配列は、Ｋａｂａｔ（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、Ｋａｂａｔ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９８３））における番号付けスキームを使用することによって一方向でアラインメントされ得るだけである。従って、抗体の場合、同一性パーセントは一義的かつ十分に定義された意味を有する。「同一性％値」は、同一性パーセントが報告されている配列長さによって除された、一致する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数によって決定される。
【００８６】
例示された抗体のさらなる好ましいアナログは、例示された抗体とは保存的アミノ酸置換によって異なる。アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的のために、アミノ酸は下記のようにグループ分けすることができる：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の配向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換では、同じクラス内のアミノ酸同士の置換が伴う。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することである。
【００８７】
すべての生物種に由来するＡＲに対する抗体が本発明に含まれる。非限定的な例示の天然抗体には、ヒト、ニワトリ、ヤギ、および齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスターおよびウサギ）、ならびに、ヒト抗体を産生させるために遺伝子操作された遺伝子組換え齧歯類（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際特許出願公開ＷＯ９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、国際特許出願公開ＷＯ９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号を参照のこと、これらはその全体が参考として本明細書中で援用される）に由来する抗体が含まれる。天然抗体は、宿主動物によって産生される抗体である。好ましい実施形態において、抗体は、ＡＲに結合するか、またはＡＲを中和する単離されたモノクローナル抗体である。
【００８８】
モノクローナル抗体は、この分野で知られている従来のハイブリドーマ方法論によって作製される。Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜７（１９７５）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：５１１（１９７６）によって初めて記載されたハイブリドーマ技術が、多くの特定の抗原に対する高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞株を作製するために広く適用されている。
【００８９】
抗ＡＲ抗体のポリクローナル形態もまた本発明に含まれる。好ましくは、これらの抗体はＡＲの少なくとも１つの活性を中和するか、または本発明において、記載されたモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する。ポリクローナル抗体は、宿主動物をＡＲまたはそのフラグメントで免疫することによって作製することができる。ポリクローナル抗体は血流中に分泌され、知られている技術を使用して回収することができる。これらの抗体の精製された形態は、当然のことではあるが、好ましくは、プロテインＡまたは抗免疫グロブリンまたは抗原自体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを含む標準的な精製技術によって容易に調製することができる。どのような場合でも、免疫の成功をモニターするために、抗原に対する血清中の抗体レベルが、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡなどの標準的な技術を使用してモニターされる。
【００９０】
ＡＲに対する遺伝子改変された（すなわち、組換え）抗体もまた本発明に含まれる。これらの組換え抗体は、本発明においては、天然抗体と同じアミノ酸配列を有するか、または、天然抗体の変化したアミノ酸配列を有する。組換え抗体は、原核生物発現システムもしくは真核生物発現システムの両方を含む任意の発現システムにおいて、または、ファージディスプレー法を使用して作製することができる（例えば、Ｄｏｗｅｒら、国際特許出願公開ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際特許出願公開ＷＯ９２／０１０４７；米国特許第５，９６９，１０８号を参照のこと、これらはその全体が参考として本明細書中で援用される）。
【００９１】
遺伝子改変された抗ＡＲ抗体は上記の天然抗体および組換え抗体と機能的に等価でなければならない。改善された安定性および／または治療効力をもたらす改変された抗体が好ましい。改変された抗体の例には、アミノ酸残基の保存的置換を有するもの、および、抗原結合利用性を著しく有害に変化させないアミノ酸の１つまたは複数の欠失または付加を有するものが含まれる。置換は、治療的利用性が維持される限り、１つまたは複数のアミノ酸残基を変化または改変することから、領域の完全な再設計にまで及び得る。本発明の抗体は翻訳後に修飾され得る（例えば、アセチル化およびリン酸化）か、または、合成的に修飾され得る（例えば、細胞傷害性薬剤などの標識基の結合）。好ましい遺伝子改変された抗体はキメラ抗体およびヒト化抗体である。本発明には、マウスに由来する可変領域と、ヒトに由来する定常領域とを含み、その結果、ヒト被験体に投与されたとき、より長い半減期を有し、かつ免疫原性がより少ないキメラ抗体が含まれる。１つの実施形態において、マウスの可変領域は、下記の非限定的な例を含む本明細書中に記載されるモノクローナル抗体のいずれか１つに由来する：ａ）配列番号２および配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型重鎖可変領域、ならびに／または、配列番号３および配列番号５から選択されるアミノ酸配列を含む成熟型軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ｂ）ａ）の同じエピトープに結合する抗体；またはｃ）ａ）のアナログ。
【００９２】
キメラ抗体を作製するために、２つの異なる生物種に由来する部分（例えば、ヒトの定常領域、およびマウスの可変領域または結合領域）を従来の技術によって化学的に連結することができ、または、遺伝子操作技術を使用して１つの連続したタンパク質として調製することができる。キメラ抗体の軽鎖部分および重鎖部分の両方のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を連続したタンパク質として発現させることができる。キメラ抗体を作製する方法が、米国特許第５，６７７，４２７号、米国特許第６，１２０，７６７号および米国特許第６，３２９，５０８号に開示される（これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる）。
【００９３】
本発明の遺伝子改変された抗体にはまた、ＡＲに結合するか、またはＡＲを中和するヒト化抗体が含まれる。ヒト化抗体を作製する様々な方法が、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号に開示される（これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる）。本発明の１つの実施形態において、ヒト化抗体は、マウスのドナー免疫グロブリンのＣＤＲと、ヒトのアクセプター免疫グロブリンの重鎖フレームワークおよび軽鎖フレームワークとを含む。例えば、ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む成熟型重鎖可変領域、および／あるいは、配列番号３または配列番号５のアミノ酸配列を含む成熟型軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；ｂ）ａ）の同じエピトープに結合する抗体；またはｃ）ａ）のアナログのヒト化体。本明細書中に開示される実施例６では、配列番号１２および配列番号１４を含むアミノ酸配列を有するＨｕＰＡＲ３４を生じさせるためのモノクローナル抗体ＰＡＲ３４のヒト化が記載される。
【００９４】
抗ＡＲの霊長類化抗体または完全なヒト抗体もまた本発明に含まれる。本発明の好ましい実施形態において、前記の霊長類化抗体または完全なヒト抗体は、本明細書中に記載されるＡＲの活性を中和する。
【００９５】
ＡＲに対する完全ヒト抗体は様々な技術によって作製される。１つの例がトリオーマ方法論である。その基本的な方法、および、この方法において使用される例示的な細胞融合パートナーＳＰＡＺ−４が、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２：３６１〜３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３６，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号によって記載されている（これらのそれぞれはその全体が参考として援用される）。
【００９６】
ＡＲに対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントを少なくともコードする導入遺伝子を有する非ヒト遺伝子組換え動物から作製することができる。これらの性質を有する動物の作製および性質が、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際特許出願公開ＷＯ９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、国際特許出願公開ＷＯ９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号によって詳しく記載される（これらを参照のこと）（これらはその全体が参考として本明細書中で援用される）。
【００９７】
様々な組換え抗体ライブラリー技術もまた、完全なヒト抗体を作製するために利用することができる。例えば、１つの方法は、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）によって概略される一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞に由来するＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。ＡＲまたはそのフラグメントと結合する抗体が選択される。次いで、そのような抗体（または結合性フラグメントを含む）をコードする配列がクローン化および増幅される。Ｈｕｓｅによって記載されたプロトコルは、ファージディスプレー技術との組合せにおいてより効率的にされる。例えば、Ｄｏｗｅｒら、国際特許出願公開ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際特許出願公開ＷＯ９２／０１０４７；米国特許第５，９６９，１０８号を参照のこと（これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる）。これらの方法では、メンバーが異なる抗体をその外側表面に呈示するファージライブラリーが作製される。抗体は、通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして呈示される。所望する特異性を有する抗体を呈示するファージが、ＡＲまたはそのフラグメントに対するアフィニティー濃縮によって選択される。
【００９８】
真核生物のリボソームもまた、Ｃｏｉａ  Ｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．、１：２５４（１−２）：１９１〜７（２００１）；Ｈａｎｅｓ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８（１２）：１２８７〜９２（２０００）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５（２４）：１４１３０〜５（１９９８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４（１０）：４９３７〜４２（１９９７）（これらのそれぞれはその全体が参考として組み込まれる）に記載されるように、抗体のライブラリーを呈示し、かつ、標的抗原（例えば、ＡＲなど）に対するスクリーニングによって結合性のヒト抗体を単離するための手段として使用することができる。
【００９９】
酵母系もまた、哺乳動物の細胞表面タンパク質または分泌タンパク質（例えば、抗体など）をスクリーニングするために好適である。抗体ライブラリーを、標的抗原に対するヒト抗体を得る目的のために、酵母細胞の表面に呈示させることができる。この方法は、Ｙｅｕｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１８（２）：２１２〜２０（２００２）；Ｂｏｅｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５（６）：５５３〜７（１９９７）によって記載される（これらのそれぞれはその全体が参考として本明細書中で援用される）。あるいは、ヒト抗体ライブラリーを、酵母ツーハイブリッドシステム（国際特許出願公開ＷＯ０２００７２９Ａ２、これはその全体が参考として組み込まれる）によって細胞内で発現させ、スクリーニングすることができる。
【０１００】
抗ＡＲ抗体のフラグメントは、ＡＲに対する結合特異性を保持しており、これらもまた本発明に含まれる。例には、本明細書中に記載される任意の抗ＡＲ抗体の部分的もしくは完全な重鎖もしくは軽鎖、可変領域またはＣＤＲ領域が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態において、抗体フラグメントは、（カルボキシル端において短縮化された）短縮化鎖である。好ましくは、これらの短縮化された鎖は１つまたは複数の免疫グロブリン活性（例えば、補体結合活性）を有する。短縮化された鎖の例には、Ｆａｂフラグメント（これは、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）；Ｆｄフラグメント（これは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）；Ｆｖフラグメント（これは抗体の単一鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる）；ｄａｂフラグメント（これはＶＨドメインからなる）；単離されたＣＤＲ領域；（Ｆａｂ’）２フラグメント、二価フラグメント（これは、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む）が含まれるが、これらに限定されない。短縮化された鎖は、それぞれがこの分野では知られている従来の生化学的技術（例えば、酵素切断など）または組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。これらのポリペプチドフラグメントは、この分野で広く知られている様々な方法による無傷な抗体のタンパク質分解的切断によって、あるいは、停止コドンを、部位特異的変異誘発を使用してベクター内の所望の位置において、例えば、Ｆａｂフラグメントを作製するためにＣＨ１の後に、または、（Ｆａｂ’）２フラグメントを作製するためにヒンジ領域の後に挿入することによって作製することができる。単鎖抗体を、ＶＬコード領域およびＶＨコード領域を、ＶＬタンパク質フラグメントおよびＶＨタンパク質フラグメントをつなぐペプチドリンカーをコードするＤＮＡと連結することによって作製することができる。
【０１０２】
免疫グロブリン関連遺伝子は離れた機能的領域を含有し、それぞれが１つまたは複数の異なった生物学的活性を有するので、抗体フラグメントの遺伝子は、他の遺伝子に由来する機能的領域（例えば、酵素、米国特許第５，００４，６９２号、これはその全体が参考として組み込まれる）に融合して、融合タンパク質（例えば、免疫トキシン）、または新規な性質を有するコンジュゲートを作製することができる。
【０１０３】
本発明は、免疫トキシン（これに限定されない）を含む様々なエフェクター部分に結合された抗ＡＲ抗体の使用を含む。抗体を含む免疫トキシンである様々なコンジュゲート体がこの分野では広く記載されている。トキシンは、従来のカップリング技術によって抗体にカップリングすることができ、または、タンパク質のトキシン部分を含有する免疫トキシンを融合タンパク質として作製することができる。本発明のコンジュゲート体は、そのような免疫トキシンを得るための対応する方法で使用することができる。そのような免疫トキシンの例示として、Ｂｙｅｒｓ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２：５９〜７０（１９９１）によって、また、Ｆａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１２：５１〜５４（１９９１）によって記載される免疫トキシンがある。
【０１０４】
組換えＤＮＡ技術を、組換え抗ＡＲ抗体、ならびに、キメラ抗ＡＲ抗体またはヒト化抗ＡＲ抗体または任意の他の抗ＡＲ遺伝子改変抗体およびそのフラグメントもしくはコンジュゲート体を任意の発現システム（これには、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＮＳＯ細胞）などの原核生物発現システムおよび真核生物発現システムの両方が含まれる）において作製するために使用することができる。
【０１０５】
作製されると、本発明の完全な抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などを含むこの分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８２）を参照のこと）。医薬用途のためには、少なくとも約９０％〜９５％の均一性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８％〜９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。所望に応じて部分的または均一に精製されると、その後、ポリペプチドは、（体外を含めて）治療的に使用することができ、または、アッセイ手法および免疫蛍光染色などを開発および実施する際に使用することができる（一般的には、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９７９  ａｎｄ  １９８１）を参照のこと）。
【０１０６】
（ＩＶ．治療方法）
ＡＲアンタゴニスト（好ましくは、抗ＡＲ抗体）は癌の防止または処置において有用である。１つの好ましい態様において、本発明は、癌細胞を本明細書中に記載されるＡＲアンタゴニスト（好ましくは、本明細書中に記載される抗ＡＲ抗体）と接触させることを含む、癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。アンタゴニストは、癌細胞と、（例えば、被験体において、好ましくは哺乳動物において、より好ましくはヒトにおいて）インビトロ、エキソビボまたはインビボで接触する。好ましくは、本発明は、ＡＲアンタゴニスト（好ましくは、抗ＡＲ抗体）を薬学的有効量で被験体に投与することを含む、被験体における癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。１つの例において、癌細胞は膵臓癌細胞および／または表皮癌細胞である。抗ＡＲ抗体には、本発明の抗体、抗体フラグメントおよび抗体コンジュゲート体（好ましくは、強力な中和活性を有する抗体、例えば、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、およびそのキメラ体またはヒト化体など）が含まれる。そのような阻害は癌細胞の増殖を少なくとも１０％、３０％、５０％、７０％、８０％または９０％低下させる。
【０１０７】
癌細胞の増殖に対する抗体の阻害は、細胞に基づくアッセイによって、例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）取り込み（Ｈｏｓｈｉｎｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、３８、３６９（１９８６）；Ｃａｍｐａｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０７：７９（１９８８））；［３Ｈ］−チミジン取り込み（Ｃｈｅｎ，Ｊ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１３：１３９５〜４０３（１９９６）；Ｊｅｏｕｎｇ、Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：１８３６７〜７３（１９９５）；色素Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能である）（Ｖｏｙｔｉｋ−Ｈａｒｂｉｎ  ＳＬら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ、３４：２３９〜４６（１９９８））；軟寒天におけるコロニー形成アッセイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）などによって測定するすることができる。
【０１０８】
阻害はまた、腫瘍形成性アッセイによって評価される。１つの例において、異種移植片は、以前から存在する腫瘍に由来するヒト細胞、または腫瘍細胞株に由来するヒト細胞を含む。様々な腫瘍異種移植片アッセイがこの分野では知られている（例えば、Ｏｇａｗａ
Ｋら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９：６０４３〜６０５２（２０００）を参照のこと）。別の好ましい実施形態において、腫瘍形成性が、米国特許第５，６９８，４１３号（これはその全体が参考として組み込まれる）に記載される中空繊維アッセイを使用してモニターされる。
【０１０９】
本発明の上記の方法は、前記被験体において、癌細胞の増殖もしくは転移を阻害もしくは逆転させ、または癌のサイズを減少させる。
【０１１０】
本明細書中に開示される実施例３〜５および実施例７では、抗ＡＲ抗体によるＡＲ活性の阻害（細胞増殖および異種移植片腫瘍成長に対する影響を含む）を明らかにするアッセイが例示される。
【０１１１】
別の好ましい態様において、アンタゴニスト（好ましくは、本発明の抗体）は乾癬の処置のために使用することができる。乾癬は、最も一般的な皮膚疾患の１つであり、世界人口の２パーセントまでが罹患している。乾癬は、紅斑性の、境界が明確な丘疹、および、銀色の雲母様の鱗片によって覆われる円形プラークによって臨床的には特徴づけられる慢性的な炎症性皮膚疾患である。乾癬の皮膚病変部は一定しない掻痒性である。外傷を受けた領域は乾癬の病変を発達させることが多い（Ｋｏｅｂｎｅｒ現象または同型現象）。また、感染症、ストレスおよび薬物療法（例えば、リチウム、β遮断薬および抗マラリア薬物療法）を含む他の外的要因は感染を悪化させ得る（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．３００（１９９８））。乾癬の重篤度は乾癬領域重篤度指標（ＰＡＳＩ）（例えば、Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒら（１９９９）、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２６：２１０〜２１５、およびＴａｎｅｗら（１９９９）、Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１３５：５１９〜５２４を参照のこと）または様々な乾癬広域評価スコア（例えば、乾癬を処置する分野の当業者には広く知られているＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＰＧＡ）など）によって測定される。
【０１１２】
本発明は、そのような処置を必要としている被験体における乾癬を処置する方法で、薬学的有効量のＡＲアンタゴニストを前記被験体に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、前記アンタゴニストは抗ＡＲ抗体であり、より好ましくは、本明細書中に開示される抗体および抗体フラグメントおよびコンンジュゲート体である。
【０１１３】
本明細書中に開示される実施例８では、抗ＡＲ抗体（ＨｕＰＡＲ３４）が、ＳＣＩＤマウスにおける乾癬皮膚移植片を処置するために使用されるインビボ研究が例示される。
【０１１４】
本発明の別の態様において、アンタゴニスト、好ましくは、本明細書中に記載される抗体が、創傷治癒のために、または皮膚の性状を高めるために、または、ＡＲの異常な活性亢進によって引き起こされる何らかの他の障害に対して利益を提供するために使用することができる。
【０１１５】
治療的方法は、通常、ヒト患者に適用されるが、他の哺乳動物にも適用され得る。
【０１１６】
アンタゴニスト（例えば、本発明の抗体）を投与する様々な方法が存在する。非経口投与が好ましい。抗体は、患者に、ボーラス剤として静脈内投与によって、または、所定の期間にわたる連続注入によって、あるいは、筋肉内経路、皮下経路、腹腔内経路または脳脊髄内経路によって投与することができる。当業者に知られている経口経路、局所的経路、吸入経路または他の送達手段もまた本発明に含まれる。
【０１１７】
本発明の薬学的組成物は、一般に、アンタゴニスト（例えば、抗体）の溶液、または、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解されたそのカクテルを含む。すなわち、抗体は、患者を処置するための医薬品の製造において使用することができる。様々な水性キャリアを使用することができ、例えば、注射用水（ＷＦＩ）、あるいは、ｐＨを代表的には５．０〜８．０（ほとんどの場合には６．０〜７．０）に、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩などで緩衝化され、かつ／または、等張性にするために塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）を含有する水を使用することができる。キャリアはまた、活性なタンパク質を保護するために、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート８０、糖またはアミノ酸などの賦形剤を含有することができる。これらの配合におけるアンタゴニスト（例えば、抗体）の濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌまで広範囲に変化するが、多くの場合、１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲にある。配合されたモノクローナル抗体は非経口投与のために特に好適であり、静脈内注入物として、あるいは、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射によって投与することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の様々な方法が、当業者には知られており、または当業者には明らかであり、より詳しくは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０）（これは参考として本明細書中で援用される）に記載される。本発明は、ＡＲに結合する抗体（好ましくは、本明細書中に記載される抗体の１つ）を含む薬学的組成物を提供する。
【０１１８】
組成物は予防的処置および／または治療的処置のために投与することができる。所望される効果を達成するために十分な量が「薬学的有効量」として定義される。アンタゴニスト（例えば、抗体など）は単回投与または反復投与によって患者に送達することができる。乾癬のための薬物の用量は、許容され得ない副作用を生じさせることなく疾患を緩和するために十分な量（「薬学的有効用量」）で、代表的には、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇのアンタゴニスト（例えば、抗体または融合タンパク質）を含有するが、ほとんどの場合には、体重１キログラムあたり、または単位用量物として、０．１ｍｇ〜１ｍｇ、または、１ｍｇ、２ｍｇもしくは５ｍｇ〜２０ｍｇを含有する。抗体薬物は、疾患の性質および重篤度に依存して、１回または複数回、例えば、１日あたり、１週間あたり、または１ヶ月あたり、１回、２回または３回で、１日〜数日、１週間〜数週間、１ヶ月〜数ヶ月間または１年〜数年間にわたって、あるいは長期間、投与することができる。
【０１１９】
疾患を治療する目的のために、アンタゴニスト（例えば、抗体）の適切な投薬量は、疾患の重篤度および経過、患者の臨床的履歴および臨床的応答、抗体の毒性、ならびに主治医の裁量に依存する。アンタゴニストは、好適には、一度に、または一連の処置の間中、患者に投与される。最初の候補投薬量が患者に投与されることがある。適正な投薬量および処置療法を、当業者に知られている従来の技術を使用して治療の進行をモニターすることによって確立することができる。
【０１２０】
また、アンタゴニスト（例えば、抗体など）は、当業者に知られているように、実質的に純粋な形態で単独で、または、様々な治療剤と一緒に利用することができる（例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｄｅｖｉｔａら、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９７を参照のこと）。抗体を用いた処置と一緒に使用され得る他の治療には、アンチセンス核酸分子または生物学的製剤（例えば、さらなる治療用抗体など）の投与が含まれる。従って、本発明の処置は、処置が、癌または乾癬の処置のために、連続的に、または別の薬剤との組合せで施されることを可能にする様式で定められる。乾癬を処置する場合、抗体は、多くの場合、１つまたは複数の他の免疫抑制薬物または他の治療（例えば、コルチコステロイド、シクロスポリン、メトトレキサート、光線療法（ＰＵＶＡを伴うか、またはＰＵＶＡを伴わない））の後で、あるいは、それらとの組合せで投与される。癌を処置する場合、癌治療のための従来の治療的方法（例えば、化学療法、放射線療法および手術など）をアンタゴニストと一緒に使用することができる。
【０１２１】
（Ｖ．診断方法）
本明細書中に開示される抗体は、疾患および障害（特に、ＡＲ発現に関連する癌または乾癬）の診断的評価および予後評価において有用である。疾患の各段階において、モノクローナル抗体を、診断の正確性を改善するために、また、処置の決定を容易にするために使用することができる。
【０１２２】
診断の様々な方法を、患者から得られた細胞サンプル（例えば、血液サンプル、リンパ節生検または組織）を使用してインビボで行うことができ、または、インビボ画像化によって行うことができる。
【０１２３】
特定の実施形態において、本発明は、本発明の抗体が診断画像化剤に結合されている抗体コンジュゲート体を提供する。本発明の抗体を含む組成物は、例えば、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどによってＡＲを検出するために使用することができる。１つまたは複数の標識化成分を抗体に結合することができる。例示的な標識化成分には、特に放射線画像化技術または磁気共鳴画像化技術における診断的価値を有する放射線不透過性色素、放射線造影剤、蛍光分子、スピン標識された分子、酵素、または他の標識化成分が含まれる。
【０１２４】
本発明は、癌または乾癬を検出する方法で、そのような検出を必要としている被験体において前記癌細胞または乾癬細胞におけるＡＲのｍＲＮＡまたはタンパク質の示差的な発現を検出することを含む方法を提供する。
【０１２５】
１つの例示的な実施形態において、癌を検出する方法は、ａ）患者からサンプルを単離すること；ｂ）前記サンプルの細胞を本発明の抗体と接触させること；ｃ）前記サンプル細胞の同じタイプの細胞の非癌性細胞を本発明の抗体と接触させること；およびｄ）非癌性細胞との前記サンプル細胞におけるＡＲの発現の差を検出し、比較することを含む。
【０１２６】
別の例示的な実施形態において、乾癬を検出する方法は、ａ）患者から皮膚サンプルを単離すること；ｂ）前記皮膚サンプルの細胞を本発明の抗体と接触させること；ｃ）正常な皮膚細胞を本発明の抗体と接触させること；およびｄ）前記正常な皮膚細胞との前記皮膚サンプル細胞におけるＡＲの発現の差を検出し、比較することを含む。
【０１２７】
癌または乾癬を前疾患状態または早期疾患状態において検出することに加えて、本発明の抗体はまた、乾癬を処置する方法などの治療的方法の処置効力を評価するために使用することができる。抗体は、特定の処置の前および後においてＡＲの発現レベルを検出するために利用される。ＡＲ発現レベルの低下はその処置の有効性の指標であり得る。
【０１２８】
本発明の抗体はまた、研究目的のためにインビトロアッセイのための検出剤として使用することができる。例えば、抗体は、この分野で知られている方法によって、例えば、タンパク質発現ライブラリーをスクリーニングすることなどによって、ＡＲに対する新規な受容体または他の結合性タンパク質を同定または単離するために使用することができる。
【０１２９】
本発明はまた、抗ＡＲ抗体を含む診断キットを提供する。そのような診断キットはさらに、所定量での試薬の包装された組合せを、診断アッセイを行うための説明書とともに含む。抗体が酵素で標識される場合、キットは、酵素によって要求される基質および補因子を含む。また、安定化剤および緩衝剤などの他の添加剤を含めることができる。これらの様々な試薬の相対的な量は、アッセイの感度を実質的に最適化するこれらの試薬の溶液中の濃度を規定するために広範囲に変化させることができる。特に、試薬は、適切な濃度を有する試薬溶液を溶解時に提供する、賦形剤を含む、通常の場合には凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。
【０１３０】
本発明の抗体は主にヒト被験体の処置に関係しているが、本発明の抗体はまた、獣医学的目的のために他の哺乳動物被験体（例えば、イヌおよびネコなど）の処置のためにも用いることができる。
【０１３１】
下記の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。本明細書におけるすべての引用物の開示はその全体が参考として本明細書中に特で援用される。
【実施例】
【０１３２】
（実施例１：可溶性ＡＲタンパク質の作製）
本実施例では、ＡＲの可溶性タンパク質の作製が記載される。様々な構築物がヒトＡＲの組換え発現のために作製された。野生型の全長ヒトＡＲポリペプチド（配列番号１）および他のクローン化されたＡＲ形態がＰＣＲによってクローン化された。
【０１３３】
３つの構築物を、抗ヒトアンフィレグリンモノクローナル抗体のさらなる特長づけを助けるために作製した。これらの構築物には、可溶性ＡＲ、可溶性ヒトＩｇＧ３Ｆｃ融合タンパク質、および細胞表面発現のための哺乳動物発現プラスミドが含まれた。細胞表面発現のために、ＡＲのＣ末端がＧＰ１膜アンカーと融合されるように、プラスミド構築物を作製した。
【０１３４】
ＰＣＲ反応を、ヒト特異的プライマー、テンプレートとしてのヒトｃＤＮＡ、およびクローン化されたｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の説明書に従って使用して行った。その後、ヒトＡＲをコードする得られたＰＣＲ  ＤＮＡフラグメントを発現ベクターのｐＤＬ１７４（可溶性）、ｐＤＬ１８２（ヒトＩｇＧ３Ｆｃ融合タンパク質）およびｐＤＬ３０１（細胞表面）（ＰＤＬ）と連結して、ｐＤＬ３８９、ｐＤＬ３９０およびｐＤＬ３９１をそれぞれ作製した。これらのプラスミドのそれぞれにおけるＡＲ部分のヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１３５】
２９３Ｈ細胞株およびＣｏｓ−７細胞株を供給者の説明書（ＡＴＣＣ）に従って培養させた。ＡＲ発現タンパク質のプラスミドＤＮＡを、分泌型タンパク質のために、ＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｆｉｓｈｅｒ）トランスフェクション試薬を製造者の説明書に従って使用して２９３Ｈ細胞にトランスフェクションした。培養培地を３日後〜５日後に集め、発現したＡＲ融合タンパク質をアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。細胞表面発現のためのプラスミドＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＣｏｓ−７細胞にトランスフェクションした。細胞を表面発現について分析し、クローン化した。
【０１３６】
可溶性ＡＲ融合タンパク質を、作製された抗ＡＲ抗体の１つ（ＰＡＲ５抗体）を使用するアフィニティーカラムによって、トランスフェクションされた細胞の上清から精製した。ヒトＩｇＧ３融合タンパク質を、プロテインＧカラムを使用して精製した。
【０１３７】
（実施例２：抗ＡＲモノクローナル抗体の作製）
本実施例では、抗ＡＲモノクローナル抗体の製造が記載される。
【０１３８】
（ＡＲのための免疫原）
組換えヒトＡＲをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、腹腔内経路または肉趾経路のいずれかによって免疫した。簡単に記載すると、マウスを、２０μｌの総最終体積において５μｇ〜２０μｇのタンパク質を等体積のＲｉｂｉアジュバントとともに使用して腹腔内または後足の肉趾において免疫した。肉趾免疫は４日または５日の間隔で４回行われた。腹腔内免疫は２週間間隔での４回の免疫を伴った。
【０１３９】
（ＥＬＩＳＡ：免疫前および免疫後）
血清力価を、標準的な抗体捕捉ＥＬＩＳＡアッセイおよびペルオキシダーゼ媒介検出を使用して、ヒト組換えＡＲに対するＥＬＩＳＡによって測定した。免疫前血清および免疫後血清の両方の連続希釈物を捕捉タンパク質とインキュベーションして、抗原−抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体および発色試薬を使用して検出した。タンパク質特異的な血清力価の量を分光光度法的に決定した（Ａ４１５）。
【０１４０】
また、免疫応答の特異性を明らかにするために、血清を、ＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する反応性についても調べた。
【０１４１】
（融合）
ＡＲ融合タンパク質に対する血清力価が非常に大きいマウス、ならびに、ＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦに対する検出可能な反応性を有しないマウスを屠殺した。膝窩、大腿部および仙骨のリンパ節が肉趾免疫マウスから取り出し、脾臓を腹腔内免疫マウスから取り出した。リンパ球をこれらの組織から単離し、ハイブリドーマを標準的な手順によって作製した。簡単に記載すると、ハイブリドーマを、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ細胞）とのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００媒介融合によって作製した。融合細胞を９６ウエルプレートにプレートあたり１０５細胞の密度で置床した。融合細胞の選択が、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地を使用して達成された。
【０１４２】
（ハイブリドーマのスクリーニング）
ハイブリドーマにより分泌された抗体の特異性を、上記に記載されるようなヒト組換えＡＲを使用するＥＬＩＳＡによって最初に明らかにした。ハイブリドーマウエルからの上清を、組換えヒトＡＲで被覆されたウエルにおいてインキュベーションした。抗原−抗体相互作用の検出および定量を、上記に記載されたのと同じ方法を使用して達成した。陽性ウエルの検出を、ヒトＡＲについて特異性を有する可能性のあるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマとして解釈した。
【０１４３】
ヒトＡＲに対する抗体の特異性を、ＡＲに対する結合について陽性であるすべての上清をＥＬＩＳＡによってＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦとの反応性について調べることによって確認した。どの上清も、ＡＲのようにＥＧＦファミリーのメンバーであるこれらのタンパク質との反応性を示さなかった。天然の立体配座で発現していると考えられるＡＲタンパク質との抗体の反応性が、ＰＭＡ刺激されたＭＣＦ−７細胞の上清（これは可溶性の天然のヒトＡＲを含有する）とインキュベーションされていた、ヤギ抗ヒトＡＲ抗体で被覆されたＥＬＩＳＡプレートでハイブリドーマ上清を試験することによってさらに明らかにされた。捕捉されたＭＣＦ−７由来ＡＲに対する結合により、天然の哺乳動物細胞由来のヒトＡＲとの反応性が明らかにされた。「ネイティブ」な細胞表面ＡＲについてＥＬＩＳＡ陽性上清の特異性を、全長の細胞表面ヒトＡＲでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞株に対する標準的なフローサイトメトリー方法を使用して評価した。
【０１４４】
フローサイトメトリーが、この分野で知られているプロトコルを使用することによって行われた。具体的には、表面ＡＲを発現するＣＨＯトランスフェクタント（２×１０５個）が、氷上で１時間、１０μＬ〜１００μＬのハイブリドーマ上清とともに５０μＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁された。徹底的な洗浄の後、細胞を、マウスＩｇＧについて特異的なフィコエリトリン結合ヤギ抗体と氷上で６０分間インキュベーションした。細胞を再び洗浄し、細胞表面の結合した抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎを使用するフローサイトメトリーによって検出した。標的抗原について陽性であると見なされたハイブリドーマは、バックグラウンド陰性コントロールを越える蛍光における少なくとも１の対数変化を生じさせるハイブリドーマとして解釈された。図３に示されるように、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３１、ＰＡＲ３４およびＰＡＲ８０などの抗体は、ＡＲのネイティブ形態に結合することができる。
【０１４５】
３つのハイブリドーマ融合体の様々なＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー分析を用いたさらなるスクリーニングを行い（肉趾免疫マウスについて２つ、腹腔内免疫マウスについて１つ）、ヒトＡＲについて８４個の陽性クローンを得た。図２に示される表には、陽性のモノクローナル抗体の一部、それらのアイソフォーム、結合特徴、および中和能力がまとめられる。
【０１４６】
（実施例３：抗ＡＲ抗体阻害アッセイ）
本実施例では、ＡＲとＥＧＦ受容体との結合の抗ＡＲ抗体阻害が記載される。
【０１４７】
ヒト組換えＡＲ（２μｇ／ｍｌ）を、ヒトＡＲに対する結合がＥＬＩＳＡによって以前に明らかにされたハイブリドーマ細胞の上清と氷上で３０分間インキュベーションした。その後、この混合物を１ｘ１０６個のＡ４３１細胞（これは高レベルのＥＧＦ−Ｒを発現する）に加え、氷上でさらに６０分間インキュベーションした。その後、細胞を洗浄し、ヒトＡＲについて特異的なビオチン標識のヤギ抗体と氷上で３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、フィコエリトリン結合アビジンとインキュベーションし、そして氷上でさらに３０分間インキュベーションした。細胞を再び洗浄し、細胞表面の結合した抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎを使用するフローサイトメトリーによって検出した。ＰＡＲ抗体ヒトＡＲ混合物とインキュベーションされた細胞の蛍光プロフィルを、ＡＲおよびコントロール抗体とインキュベーションされた細胞のプロフィルと比較した。ＡＲおよびＰＡＲ抗体と比較して、ＡＲおよびコントロール抗体とインキュベーションされた細胞の間での蛍光レベルの減少により、Ａ４３１細胞の表面でのＡＲおよびＥＧＦＲの相互作用の阻害が示された。図２に示される表において示されるように、１０を越える抗体が試験され、ＡＲ−ＥＧＦＲ相互作用の阻害を示した。また、図４に示されるように、多数のＰＡＲモノクローナル抗体がＡＲ媒介の活性を中和することができた。
【０１４８】
（実施例４：ＡＲ媒介細胞増殖のインビトロ阻害アッセイ）
本実施例では、アンフィレグリン誘導による細胞増殖の抗体中和が記載される。
【０１４９】
１つのタイプの実験において、Ｂａｌｂ／３Ｔ３線維芽細胞（これはＡＲ誘導の増殖を行うことができる）を１０４細胞／ウエルで９６ウエルプレートに０日目に置床した。１日目に、ウエルを無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において洗浄し、無血清培地において一晩インキュベーションした。２日目に、組換えヒトＡＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度でウエルに加えた。その後、ＰＡＲ抗体を様々な濃度（０．０３μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの最終濃度）で加えた。３日目に、ＢｒｄＵが６時間〜８時間にわたって加えられ、その後、増殖を、比色測定によるＥＬＩＳＡ型アッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＢｒｄＵ取り込みによって評価した。
【０１５０】
別の増殖アッセイでは、ＨＥＫｎ（ヒト表皮ケラチノサイト−新生児）細胞（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が利用された。この細胞は、内因的に合成されたＡＲに対して増殖する。ＨＥＫｎ細胞を３ｘ１０３細胞／ウエルで９６ウエルの黒色ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に０日目に置床した。１日目に、ウエルを増殖因子非含有培地（ＥｐｉＬｉｆｅ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で徹底的に洗浄した。その後、ＰＡＲ抗体を様々な濃度（０．０１μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌ）で加えた。４８時間後〜７２時間後、内因性アンフィレグリン誘導の増殖の阻害を、発光生存細胞アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用してＡＴＰを定量することによって評価した。
【０１５１】
抗ＡＲモノクローナル抗体とともにアンフィレグリンにより誘導される癌細胞の増殖のインビトロ阻害を試験するための研究も行った。様々な癌細胞株（ＡｓＰＣ−１、ＰＣ−３、Ａ５４９、ＨＣＴ−１１６）が５ｘ１０３細胞／ウエルで９６ウエルプレートに０日目に置床された。１日目に、ウエルを無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において洗浄し、無血清培地において８時間インキュベーションした。その後、ウエルを再び無血清培地で洗浄し、ＰＡＲ抗体を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。７２時間後、増殖の阻害を、ＢｒｄＵ取り込み（上記参照）を使用して評価した。
【０１５２】
図２に示されるように、列記されたＰＡＲ抗体はすべてが、細胞表面に発現しているＡＲに結合することができる。これらのＰＡＲ抗体はＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦに対する結合を示さなかった。ほとんどすべての列記されたＰＡＲ抗体は、３Ｔ３細胞およびＨＥＫｎ細胞におけるＡＲ媒介の細胞増殖を阻害することができる。ＰＡＲ３４およびＰＡＲ８０は最も強力な中和能力を有する。ＰＡＲ３４は、３Ｔ３細胞の増殖を０．０７２ｕｇ／ｍｌもの少ない量で５０％阻害することができ、ＨＥＫｎの細胞の増殖を０．０４１ｕｇ／ｍｌもの少ない量で阻害することができる。ＰＡＲ８０は、３Ｔ３細胞の増殖を０．０７２ｕｇ／ｍｌもの少ない量で５０％阻害することができ、ＨＥＫｎの細胞の増殖を０．２ｕｇ／ｍｌもの少ない量で阻害することができる。他の強力な抗体には、ＰＡＲ２、ＰＡＲ５、ＰＡＲ１５、ＰＡＲ２３、ＰＡＲ２９、ＰＡＲ３１、ＰＡＲ４６およびＰＡＲ８４が含まれる。これらのＰＡＲ抗体の細胞増殖に対する阻害のＩＣ５０％値およびＩＣ９０％値もまた、図２に示される表において列記した。
【０１５３】
（実施例５：ＡＲ中和ｍＡｂの２つのインビボ効力のアッセイ）
本実施例では、ＡｓＰＣ−１ヒト膵臓癌腫およびＡ４３１類表皮癌腫の異種移植片モデルにおける２つのＡＲ中和ｍＡｂ（ＰＡＲ８０（ＩｇＧ２ａ）およびＰＡＲ３４（ＩｇＧ２ｂ））のインビボでの試験効力が記載される。
【０１５４】
（ＡｓＰＣ−１ヒト膵臓癌腫における処置モデル）
１０×１０６個のＡｓＰＣ−１腫瘍細胞を５週齢のメスのヌードマウスに皮下（ｓ．ｃ．）接種した。マウスは、腫瘍の平均体積が１００ｍｍ３に達したとき、異なる処置群にランダムに分けられた。８匹のマウスからなる一群を、ＰＡＲ８０抗体を用いて、マウスあたり３ｍｇの総用量についてＩＶ注射によって、最初に１００μｌのＰＢＳにおける５００μｇの負荷用量で、次いで、１週間あたり３回での１０回の投薬について１００μｌのＰＢＳにおける２５０μｇで処置した。それぞれが８匹のマウスからなる２つのコントロール群には、ＩｇＧまたは生理的食塩水が同様に与えた。８匹のマウスからなる別の一群をゲムシタビンで処置した。このゲムシタビンは、膵臓癌のための標準的な化学療法処置であると考えられる用量で使用すると、陽性コントロールとしての役割を果たす。最後の投薬の２週間後に、効力が下記の基準に従って決定された：
この処置モデルのために使用された効力のエンドポイントは下記の通りであった：
・部分的退行：腫瘍重量が、処置開始重量の５０％まで減少する。
・抗腫瘍活性はコントロール群と比較されなければならない（統計学的に分析される）
・毒性：全身的毒性としての１０％の体重の喪失
図５に示されるように、ＰＡＲ８０を用いた処置は、規定食塩水またはＩｇＧコントロールを用いた処置と比較して、腫瘍体積の低下をもたらしたが、体重の喪失に基づく関連した全身的毒性を有さなかった（データは示されず）。
【０１５５】
（ＡｓＰＣ−１ヒト膵臓癌腫およびＡ４３１類表皮癌腫を使用する防止モデル）
マウス（ｎ＝１２）を、体重に基づいて、異なる処置群にランダムに分けた（群あたり１２匹のマウス）。５×１０６個のＡｓＰＣ−１腫瘍細胞またはＡ４３１腫瘍細胞を５週齢のメスのヌードマウスに０日目に皮下接種し、抗体の投薬を、マウスあたり３ｍｇの総用量についてＩＶ注射によって、５００μｇ／１００μｌのＰＢＳの最初の負荷用量で１日目に開始し、次いで、１週間あたり３回での、２５０μｇ／１００μｌのＰＢＳの１０回の他の投薬を用いて続けた。最後の投薬の２週間後、効力が決定された。効力エンドポイント：１０％の体重の喪失によって定義されるような関連した全身的毒性を伴うことなく、コントロールマウスに対して処置マウスの腫瘍のサイズが低下したことによって抗腫瘍活性が明らかにされた。
【０１５６】
図６に示されるように、ＡｓＰＣ−１防止モデルでは、ＰＡＲ３４およびＰＡＲ８０の両方が、腫瘍体積の減少における効力を実証しており、ここで、体重の喪失に基づく関連した全身的毒性は伴わなかった（データを示さず）。
【０１５７】
図７に示されるように、Ａ４３１防止モデルでは、ＰＡＲ８０が、腫瘍体積の実質的な減少を、体重の喪失に基づく関連した全身的毒性を有することなく明らかにした（データは示されず）。
【０１５８】
（実施例６：抗ＡＲ抗体のヒト化）
本実施例では、マウス抗アンフィレグリンモノクローナル抗体ＰＡＲ３４のヒト化が記載される。
【０１５９】
ＰＡＲ３４のヒト化が、本質的にはＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９〜１００３３（１９８９））の手順に従って行われた。最初に、ＰＡＲ３４のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列に対する大きい相同性をそれぞれ有するヒトＶＨセグメントおよびヒトＶＬセグメントを同定した。次いで、ＣＤＲの構造を維持するために重要であるフレームワークアミノ酸とともにＣＤＲ配列を、選択されたヒトフレームワーク配列の中につないだ。また、対応するＶ領域亜群において希であることが見出されたヒトフレームワークアミノ酸を、潜在的な免疫原性に低下させるために、コンセンサスなアミノ酸配列で置換した。得られたヒト化モノクローナル抗体（ＨｕＰＡＲ３４）をマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０において発現させた。精製されたＰＡＲ３４抗体およびＨｕＰＡＲ３４抗体を用いた競合的結合アッセイを使用して、ヒトアンフィレグリンに対するＨｕＰＡＲ３４の親和性がＰＡＲ３４の親和性の約１．８分の１であることが示された。
【０１６０】
（ＰＡＲ３４可変領域ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定）
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、ＰＡＲ３４を発現する約１０７個のハイブリドーマ細胞から抽出し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ  ｍＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を供給者の説明書に従って用いて単離した。二本鎖ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を供給者の説明書に従って使用して合成した。重鎖および軽鎖に対する可変領域ｃＤＮＡを、マウスのγ鎖およびκ鎖のＣ領域にそれぞれアニーリングする３’プライマーと、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キットにおいて提供される５’ユニバーサルプライマーとを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＶＨのＰＣＲについては、３’プライマーは下記の配列を有する：５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ−３’（配列番号６）。ＶＬのＰＣＲについては、３’プライマーは下記の配列を有する：５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号７）。ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを配列決定のためにｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にサブクローン化した。ＤＮＡ配列決定は、蛍光ジデオキシ鎖停止剤（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って用いたＰＣＲサイクル配列決定反応によって行われた。
【０１６１】
数個の重鎖クローンおよび軽鎖クローンを２つの独立したＰＣＲ反応から配列決定した。マウスの代表的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対して相同的な特有の配列が同定された。ＰＡＲ３４の重鎖および軽鎖のＶ領域のｃＤＮＡ配列、ならびに推定されるアミノ酸配列が図８および図９にそれぞれ示されている。
【０１６２】
（ＨｕＰＡＲ３４の可変領域の設計）
抗体可変領域（すなわち、「Ｖ」領域）のヒト化が、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９〜１００３３（１９８９））によって概略されるように行われた。最初に、ＰＡＲ３４の可変領域の分子モデルを、コンピュータープログラムのＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６８：５９５〜６２０（１９８３））を利用して構築した。次に、ヒトのＶセグメント配列およびＪセグメント配列に対する相同性検索に基づいて、ゲノムのＶＨセグメントＤＰ−３（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７８９（１９９２））およびＪセグメントＪＨ−４（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、２７：５８３〜５９１（１９８１））を、ＨｕＰＡＲ３４の重鎖可変領域のためのフレームワークを提供するために選択した。ＨｕＰＡＲ３４の軽鎖可変領域については、ゲノムのＶＬセグメントＬ１（Ｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７〜８３６（１９９４））およびＪセグメントＪＫ４（Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：１５１６〜１５２２（１９８２））を使用した。ＰＡＲ３４のＶＨと、アクセプターのヒトＤＰ−３セグメントおよびヒトＪＨ４セグメントとの間でのフレームワークアミノ酸の同一性は６８％であり、一方、ＰＡＲ３４のＶＬと、アクセプターのヒトＬ１セグメントおよびヒトＪＫ４セグメントとの間での同一性は８０％であった。
【０１６３】
このコンピューターモデルにより、ＣＤＲとの著しい接触が示唆されたフレームワーク位置において、ＰＡＲ３４のＶ領域に由来するアミノ酸を元のヒトフレームワークアミノ酸の代わりに使用した。これは、重鎖の残基２８、残基４８、残基６７、残基６８、残基７０、残基７２、残基７４および残基９８において行われた（図１０）。軽鎖については、置換が、残基４６、残基６９および残基７１において行われた（図１１）。対応するヒトＶ領域亜群におけるそれらのそれぞれの位置において希にしか存在しないフレームワーク残基を、それらの位置においてヒトのコンセンサスアミノ酸で置換した。これは、重鎖の残基１７、残基３８および残基７７において行われた（図１０）。ＰＡＲ３４、設計されたＨｕＰＡＲ３４、およびヒトアクセプターアミノ酸配列の、ＶＨおよびＶＬについてのアラインメントが図１０および図１１にそれぞれ示されている。
【０１６４】
（ＨｕＰＡＲ３４のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の構築）
ＨｕＰＡＲ３４のＶＨおよびＶＬのそれぞれをコードする遺伝子を、シグナルペプチドと、スプライスドナーシグナルと、哺乳動物発現ベクターへのその後のクローニングのための適切な制限酵素部位とを含むミニエキソンとして構築した。ＶＨミニエキソンおよびＶＬミニエキソンにおけるスプライスドナーシグナルは、対応するヒト生殖系列のＪＨ配列およびＪＫ配列にそれぞれ由来した。ＨｕＰＡＲ３４のＶＨミニエキソンおよびＶＬミニエキソンにおけるシグナルペプチド配列は、対応するＰＡＲ３４のＶＨ配列およびＶＬ配列にそれぞれ由来した。ＨｕＰＡＲ３４のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列、ならびに推定されるアミノ酸配列が図１２および図１３にそれぞれ示される。
【０１６５】
ＨｕＰＡＲ３４のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、図１４に例示されるように、長さが約６０塩基から８０塩基に及ぶ８個の重なる合成オリゴヌクレオチドプライマーの伸張、およびＰＣＲ増幅によって構築した（Ｈｅ，Ｘ．−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．、１６０：１０２９〜１０３５（１９９８））。オリゴヌクレオチドプライマーの１および２、３および４、５および６、ならびに７および８を別個にアニリーニングし、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて伸長させた。得られた二本鎖ＤＮＡセグメントのＡおよびＢ、ならびにＣおよびＤを別個に混合し、変性し、アニリーニングし、伸長させて、ＤＮＡフラグメントのＥおよびＦをそれぞれ得て、その後、これらを混合して、３回目のアニーリングおよび伸長の工程で完全なミニエキソン（Ｇ）を作製した。ミニエキソンを、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｒｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用する、プライマー９およびプライマー１０を用いたＰＣＲによって増幅した。ＨｕＰＡＲ３４のＶＨ遺伝子の合成のために使用されたプライマー１〜１０（配列番号２０〜２９）、およびＶＬ遺伝子の合成のために使用されたプライマー１〜１０（配列番号３０〜３９）が表１５および表１６にそれぞれ示されている。
【０１６６】
ＰＣＲ増幅フラグメントをゲル精製して、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化した。ＨｕＰＡＲ３４のＶＨ遺伝子を、ヒトγ１遺伝子がヒトγ２遺伝子の代わりの使用されるｐＶｇ１．Ｄ．Ｔｔ（重鎖発現ベクターｐＶｇ２．Ｄ．Ｔｔ（Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５９：３６１３〜３６２１（１９９７））の誘導体）にサブクローン化した。ＨｕＰＡＲ３４のＶＬ遺伝子を、ｐＨｕＣｋａｐｐａ．ｒｇｐｔ．ｄＥ（κ軽鎖発現ベクターｐＯＫＴ３．Ｖｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５９：３６１３〜３６２１（１９９７））の誘導体）にサブクローン化した。配列確認の後、完全な重鎖転写ユニットを含有するＥｃｏＲＩフラグメントを、Ｋｏｓｔｅｎｌｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９３：５５６〜５６５（２００１））に記載されるような軽鎖発現ベクター内の特徴的なＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化して、重鎖および軽鎖を発現させるための１個のベクターを構築した。ＨｕＰＡＲ３４をＩｇＧ１形態で発現させるための得られたベクターは、ｐＨｕ１Ｄ１０．ＩｇＧ１．ｒｇｐｔ．ｄＥ（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９３：５５６〜５６５（２００１））の構造と類似した構造を有しており、ｐＨｕＰＡＲ３４−ＩｇＧ１と名付けられた。ｐＨｕＰＡＲ３４−ＩｇＧ１の概略的な構造が図１７に示される。
【０１６７】
（ＨｕＰＡＲ３４の発現）
ＨｕＰＡＲ３４を安定的に産生する細胞株を得るために、発現ベクターｐＨｕＰＡＲ３４−ＩｇＧ１をマウス骨髄腫細胞株の染色体にエレクトロポレーションによって導入した。
【０１６８】
マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）が、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）および０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が補充されたＤＭＥ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）において、３７℃で、７．５％ＣＯ２インキュベーターにおいて維持された。ＮＳ０への安定的なトランスフェクションが、本質的にはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９〜１７５（１９９２）に記載されるようにエレクトロポレーションによって行われた。トランスフェクションの前に、ｐＨｕＰＡＲ３４−ＩｇＧ１を、ＦｓｐＩを使用して線状化した。約１０７個の細胞が２０μｇの線状化プラスミドでトランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞を、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）および０．１ｍＭの非必須アミノ酸を含有するＤＭＥ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）に懸濁して、数枚の９６ウエルプレートに置床した。４８時間後、選択培地（１０％のＦＢＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、ＨＴ培地補充物、０．２５ｍｇ／ｍｌのキサンチンおよび１μｇ／ｍｌのミコフェノール酸を含有するＤＭＥ）を加えた。選択を開始した約１０日後、培養上清を抗体の産生についてアッセイした。
【０１６９】
ＨｕＰＡＲ３４の発現をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｎａｌｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を０．２Ｍの炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）における１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−γ鎖特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の１００μｌ／ウエルを用いて４℃で一晩被覆し、洗浄緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、２００μｌ／ウエルのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液／ＴＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて室温で１５分間ブロッキング処理した。洗浄緩衝液による洗浄の後、ＨｕＰＡＲ３４を含有するサンプルをＥＬＩＳＡ緩衝液（１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）に適切に希釈して、１００μｌ／ウエルをＥＬＩＳＡプレートに加えた。標準として、ヒト化抗ＣＤ３３ＩｇＧ１／κモノクローナル抗体ＨｕＭ１９５（Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１１４９〜１１５４（１９９２））を使用した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、結合した抗体を、１００μｌ／ウエルの１：１０００希釈物のＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を使用して検出した。室温で０．５時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、発色を、１００μｌ／ウエルのＡＢＴＳ基質（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を加えることによって行った。発色を、５０μｌ／ウエルの２％シュウ酸を加えることによって停止させた。吸光度を、ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して４１５ｎｍにおいて読み取った。
【０１７０】
高レベルのＨｕＰＡＲ３４を産生するＮＳ０の安定なトランスフェクタントの１つ（クローンｖ１＃２）をタンパク質非含有基礎培地−１（ＰＦＢＭ−１）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に適合化し、タンパク質非含有基礎培地−１（ＰＦＢＭ−１）において拡大培養し、タンパク質非含有供給培地−２（ＰＦＦＭ−２）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）が補充されたＰＦＢＭ−１において拡大培養して、なくなるまで成長させた。遠心分離およびろ過の後、培養上清をプロテインＡセファロースカラムに負荷した。カラムをＰＢＳで洗浄して、抗体を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．８）／０．１Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出した。１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、溶出されたタンパク質はＰＢＳに対して透析され、０．２μｍでろ過されて、４℃で保存された。抗体濃度が、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定された（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４Ａ２８０）。精製された抗体は、標準的な手順に従ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特徴づけられた。非還元条件下での分析では、ＨｕＰＡＲ３４は約１５０ｋＤ〜１６０ｋＤの分子量を有することが示された。還元条件下での分析では、ＨｕＰＡＲ３４は、約５０ｋＤの分子量を有する重鎖と、約２５ｋＤの分子量を有する軽鎖とから構成されることが示された。抗体の純度は９５％を越えるようであった。
【０１７１】
（ＨｕＰＡＲ３４の結合特性）
ヒトアンフィレグリンに対するＨｕＰＡＲ３４の親和性を競合ＥＬＩＳＡによって分析した。ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を０．２Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）における０．５μｇ／ｍｌの組換え可溶性ヒトアンフィレグリンの１００μｌ／ウエルを用いて４℃で一晩被覆し、洗浄緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、２００μｌ／ウエルのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液／ＴＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて室温で１５分間ブロッキング処理した。洗浄緩衝液による洗浄の後、１００μｌ／ウエルのＥＬＩＳＡ緩衝液におけるビオチン化ＰＡＲ３４（０．１２５μｇ／ｍｌの最終濃度）および競合剤抗体（７５μｇ／ｍｌの最終濃度から始まり、３倍づつ連続希釈されたＰＡＲ３４またはＨｕＰＡＲ３４）の混合物を三連で加えた。コントロールとして、ＥＬＩＳＡ緩衝液における７５μｇ／ｍｌのヒト化抗ＣＤ３３ＩｇＧ１／κモノクローナル抗体ＨｕＭ１９５（Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１１４９〜１１５４（１９９２））の１００μｌ／ウエルを使用した。競合剤非含有コントロールとして、１００μｌ／ウエルのＥＬＩＳＡ緩衝液を使用した。プレートを１時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、結合した抗体を、ＥＬＩＳＡ緩衝液における１μｇ／ｍｌのＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の１００μｌ／ウエルを使用して検出した。室温で０．５時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で洗浄した後、発色を、１００μｌ／ウエルのＡＢＴＳ基質（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）を加えることによって行った。発色を、１００μｌ／ウエルの２％シュウ酸を加えることによって停止させた。吸光度を４１５ｎｍにおいて読み取った。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡ競合実験の代表的な結果が図１８に示される。ＰＡＲ３４およびＨｕＰＡＲ３４はともに、濃度依存的な様式でビオチン化ＰＡＲ３４と競合した。表１（下記）に示されるように、ＰＡＲ３４およびＨｕＰＡＲ３４の平均ＩＣ５０値（これは、コンピューターソフトウエアのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた）は、それぞれ１．０７μｇ／ｍｌおよび１．９０μｇ／ｍｌであった。ヒトアンフィレグリンに対するＨｕＰＡＲ３４の結合はＰＡＲ３４の結合よりも約１．８倍低かった。これらの結果は、マウス抗アンフィレグリンモノクローナル抗体ＰＡＲ３４のヒト化が成功していたことを示している。ＨｕＰＡＲ３４はヒトアンフィレグリンに対する結合親和性を保持していた。
【０１７３】
（表１  ＥＬＩＳＡ競合実験の要旨）
【０１７４】
【表１−１】
2006517109.tif 000002
【０１７５】
【表１−２】
2006517109.tif 000003
ヒトアンフィレグリン（ＡＲ）とＰＡＲ３４またはＨｕＰＡＲ３４との間での親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して分析した。
【０１７６】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析は下記のプロトコルに従って行うことができる。ＰＡＲ３４またはＨｕＰＡＲ３４が、標準的なアミンカップリングキット（ＢＩＡｃｏｒｅ）を使用してＰｉｏｎｅｅｒ  Ｆ１チップに固定化される。表面プラズモン共鳴が２４℃において５０μｌ／分の流速で測定される。ＡＲ（会合相）の注入が１８０秒間行われる。続いて、解離が３時間にわたってモニターされる。結合の速度論（ｋａおよびｋｄ）が、ＢＩＡ評価プログラムを使用して、分析物の５つの異なる濃度（３２０ｎＭ、１６０ｎＭ、８０ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ）で得られたデータから計算される。２回の参照が、参照表面および緩衝液のみのコントロールからの応答を除くために適用される。結合親和性ＫＤが、分析物の濃度系列から得られるセンサーグラムの会合相および解離相を同時に近似することによって得られる。
【０１７７】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して決定された結合パラメーターが下記の表２に示される。ＢＩＡｃｏｒｅの結果から、ＨｕＰＡＲ３４がＰＡＲ３４の２倍以内のＡＲに対する親和性を有することが示される。
【０１７８】
（表２：抗体結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析）
【０１７９】
【表２】
2006517109.tif 000004
（実施例７：ＡＲ媒介の細胞増殖のＨｕＰＡＲ３４阻害のインビトロアッセイ）
３Ｔ３細胞におけるＡＲ媒介増殖のＨｕＰＡＲ３４阻害およびＰＡＲ３４阻害のインビトロアッセイを、実施例４において一般的に記載されたように行った。ヒト化ＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ２ｂはまたコントロールとして使用された。図１９に示される結果によって示されるように、ＨｕＰＡＲ３４（ＩＣ５０＝０．０５５μｇ／ｍｌ）はＰＡＲ３４（ＩＣ５０＝０．０２５μｇ／ｍｌ）の２倍以内の抗増殖能を有する。
【０１８０】
（実施例８：ＳＣＩＤマウス移植片モデルでのＨｕＰＡＲ３４効力のインビボアッセイ）
本実施例では、ヒト乾癬皮膚−ＳＣＩＤマウス移植片モデル（Ｚｅｉｇｌｅｒら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、８１（９）：１２５３〜６１（２００１））における抗ＡＲ抗体（ＨｕＰＡＲ３４）の効力を明らかにするインビボ研究が記載される。
【０１８１】
免疫抑制マウス（ヌードマウスまたは重症複合型免疫不全［ＳＣＩＤ］マウスのいずれか）へのヒト皮膚の移植は乾癬の研究に対する方法を提供する（Ｋｒｕｅｇｅｒ、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、６４：３０７〜３１２（１９７５）；Ｋｒｅｕｇｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、６８：１５４８〜１５５７（１９８１）；Ｂａｋｅｒら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１２６：１０５〜１１０（１９９２）；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４６：５８０〜５８８（１９９５）；Ｗｒｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９８：１８７８〜１８８７（１９９６）；Ｅｌｌｉｓら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１３６：６０９〜６１６（１９９９））。この方法を使用して、この疾患の表現型特徴（すなわち、表皮肥厚、広範囲の突起網形成、および炎症性細胞の存在）が移植皮膚において長期間にわたって維持される（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４６：５８０〜５８８（１９９５））。
【０１８２】
乾癬皮膚の２名のヒト提供者および正常な皮膚の２名の提供者が研究のために募集された。組織が８匹のＳＣＩＤマウス（ＣＢ−１７系統；Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）に移植された：４匹が正常な皮膚の移植片を受け、４匹が乾癬皮膚の移植片を受けた。正常なヒト皮膚および乾癬病変プラーク皮膚が被移植ＳＣＩＤマウスの背側表面に移植され、マウスは一般には、Ｚｅｉｇｌｅｒら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、８１（９）：１２５３〜６１（２００１）に記載される手順に従って処置された。簡単に記載すると、１つのパンチ生検組織サンプルを下記のようにマウスに移植した。マウスをナトリウムペントバルビタール（Ｂｕｔｌｅｒ  Ｃｏ．、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ、２５ｇｍマウスあたり０．２ｍｌにおいて１．８ｍｇの用量で）の腹腔内注射によって麻酔した後、各マウスの背側領域の毛を剃った。マウスの皮膚を所定のサイズに手術により除去し、ヒト組織で置き換えた。この組織は吸収性縫合糸（４−０Ｄｅｘｏｎ“Ｓ”、Ｄａｖｉｓ−Ｇｅｃｋ、Ｍａｎａｔｉ、Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ）でマウスの背中に固定された。その後、移植片を、５日間、Ｘｅｒｏｆｏｒｍワセリン包帯（Ｋｅｎｄａｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）で処置した。動物は、準備段階および処置段階を通して無菌環境において維持された。皮膚移植片は、１週間〜２週間、癒合させられ、その後、処置が開始された。移植を受けたマウスは２つの処置群のいずれかにランダムに割り当てられた。
【０１８３】
組織を癒合させた後、ＨｕＰＡＲ３４およびＩｇＧ２ｂコントロール抗体がＳＣＩＤマウスに対する処置について試験された。抗体の正体は、研究の継続期間中は隠されたままであった。処置プロトコルは、合計で８回の投薬について２４日間にわたって３日毎に動物あたり抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液の２００μｌの腹腔内注射からなった（２１日の処置期間）。マウスは、体重が抗体投与の初日および最終日に測定された。処置期間が終了したとき、マウスを屠殺し、移植されたヒト組織（および少量の周囲のマウス皮膚）を手術により取り出して、１０％緩衝化ホルマリンにおいて固定処理した。
【０１８４】
組織をパラフィンに包埋した後、多数の５ミクロン切片をそれぞれの組織片から切断し、顕微鏡用スライドガラスに載せ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。表皮領域を、ＮＩＨ画像分析ソフトウエアを使用して単位長さあたりの表皮厚さの変化の関数として測定した。具体的には、組織切片を１０Ｘの倍率での光学顕微鏡観察によって視覚化した。このレベルの倍率で、それぞれの皮膚切片の表皮領域全体が、等しいセグメント（通常的には、代表的な組織切片にわたって３セグメント〜４セグメント）において「捕捉」され、各セグメントの領域が、ＮＩＨ画像分析ソフトウエアを使用して定量された。それぞれの移植片からの多数の領域が、大きなｎ値を提供するためにこのように定量された。これらの値から平均表皮領域を求めた。移植前に、それぞれの提供者からの小さい組織片が１０％緩衝化ホルマリンにおいて固定処理され、表皮厚さのゼロ時間での評価のために使用された。
【０１８５】
定量的評価に加えて、皮膚移植片はまた組織学的に評価された。皮膚肥厚、増大した突起網形成、ならびに、リンパ球、マクロファージおよび好中球による皮膚浸潤および／または表皮内浸潤を含む乾癬の特徴が得られた。
【０１８６】
（結果）
表３には、本研究から得られたデータが示される。
【０１８７】
（表３：ＳＣＩＤマウスでの移植および処置の前および後における正常なヒト皮膚および乾癬ヒト皮膚の表皮厚さ）
【０１８８】
【表３−１】
2006517109.tif 000005
【０１８９】
【表３−２】
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１示された値は、４名の正常な提供者および４名の乾癬の提供者から得られた皮膚サンプルが移植されたマウスあたり多数の組織学的切片における多数の領域に基づく平均値および標準偏差である。
【０１９０】
正常な皮膚は生検直後において乾癬プラーク皮膚よりもはるかに薄かった。以前の皮膚移植片研究（例えば、Ｅｌｌｉｓら、２０００；Ｚｅｉｇｌｅｒら、２００１を参照のこと）と一致していたが、正常な皮膚は、移植後、過増殖応答を受けていた。
【０１９１】
乾癬皮膚は、移植後の期間を通して、また処置期間中、過増殖表現型を維持した。
【０１９２】
最も顕著なことには、Ｉｇ２ｂコントロール（試薬Ａ）ではなく、ＨｕＰＡＲ３４（試薬Ｂ）が、移植された正常な皮膚および移植された乾癬プラーク皮膚の両方において過増殖状態を劇的に抑制した。図２０Ｃおよび図２０Ｄは、Ｉｇ２ｂ（図２０Ｃ）またはＨｕＰＡＲ３４（図２０Ｄ）による処置の後での移植された正常な皮膚の組織切片の光学顕微鏡観察像を示す。図２１Ａおよび図２１Ｂは、Ｉｇ２ｂ（図２１Ａ）またはＨｕＰＡＲ３４（図２１Ｂ）による処置の後での移植された乾癬皮膚の組織切片の光学顕微鏡観察像を示す。
【０１９３】
図２０および図２１における像によって明らかにされるように、ＨｕＰＡＲ３４は、コントロール抗体を用いた処置と比較したとき、正常な皮膚の移植片および乾癬皮膚の移植片の両方におけるケラチノサイトの増殖を劇的に抑制している。
【０１９４】
（実施例９：単層培養におけるヒト表皮ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞に対するＨｕＰＡＲ３４の影響のインビトロアッセイ）
Ｉｇ２ｂコントロールではなく、ＨｕＰＡＲ３４を用いた処置により、表皮の厚さが著しく低下した上記の実施例８の結果に基づいて、単層培養におけるケラチノサイトの増殖に対するこれらの同じ２つの試薬の影響を評価することが提案された。
【０１９５】
正常なヒト表皮ケラチノサイトおよびヒト皮膚線維芽細胞を、以前の記載（Ｖａｒａｎｉら、Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏ  Ｒｅｓ、２８６：４４３〜７（１９９４））のようにヒト皮膚から単離した。標準的なインビトロアッセイ手法を使用して、本発明者らは、両方の細胞タイプの増殖および皮膚線維芽細胞集団におけるＩ型プロコラーゲンの合成に対する試薬Ａ（Ｉｇ２ｂ）および試薬Ｂ（ＨｕＰＡＲ３４）の影響を評価した。インビトロアッセイが、以前の報告（Ｂｈａｇａｖａｔｈｕｌａら、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１２２：１３０〜１３９（２００４））に記載されるように行われた。
【０１９６】
（結果）
図２２に示されるグラフによって示されるように、ＨｕＰＡＲ３４（“Ａｂ  Ｂ”）については、ケラチノサイトの増殖が著しく減少し、一方、ＩｇＧ２ｂコントロール抗体（“Ａｂ  Ａ”）については、減少は観測されなかった。
【０１９７】
パラレル研究において、同じ２つの抗体（ＨｕＰＡＲ３４およびＩｇ２ｂ）が、ヒト皮膚線維芽細胞の増殖に対するそれらの影響についてアッセイされた。図２３に示される上段のグラフによって示されるように、Ｉｇ２ｂ（“Ａｂ  Ａ”）またはＨｕＰＡＲ３４（“Ａｂ  Ｂ”）のいずれも皮膚線維芽細胞の増殖に影響しなかった。同様に、図２３に示される下段のグラフに示されるように、Ｉｇ２ｂまたはＨｕＰＡＲ３４のいずれも、ヒト皮膚線維芽細胞によるＩ型プロコラーゲンの同化に影響しなかった。
【０１９８】
まとめると、実施例８および実施例９に記載される結果は、ヒト皮膚移植片を有するＳＣＩＤマウスへのＨｕＰＡＲ３４の腹腔内注射は、ヒト皮膚における表皮過形成を抑制することにおいて効果的であったことを明らかにしている。このことは、ＳＣＩＤマウスにおける移植および維持の関数として過形成になる正常な皮膚においてだけでなく、移植前に過形成であった乾癬プラーク皮膚において観測された。Ｉｇ２ｂが表皮ケラチノサイトの増殖を抑制しなかったという事実は、ＨｕＰＡＲ３４に対する応答に関連する特異性を示唆している。
【０１９９】
ＨｕＰＡＲ３４とは対照的に、Ｔリンパ球の機能に影響を及ぼすと考えられる２つの異なる薬剤、すなわち、シクロスポリンＡ、およびＣＤ１１ｂに対する抗体は、乾癬に関連する過形成応答を低下させるが、移植された正常な皮膚の過形成を阻害しなかった。
【０２００】
他方で、特異性がより広い薬剤（例えば、合成コルチコステロイドおよびＰＰＡＲ−γリガンド）は、乾癬皮膚の増殖を阻害するようであるが、移植された正常な皮膚における表皮増殖を付随的に抑制する（Ｅｌｌｉｓら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１３６：６０９〜６１６（２０００）；Ｚｅｉｇｌｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１：１２５３〜１２６１（２００１））。これらの知見の１つの解釈は、乾癬皮膚のみを標的とする薬剤は、おそらくは、疾患の免疫基盤に対して作用することによってそのように抑制し、一方、コルチコステロイドおよびトログリタゾン（ＰＰＡＲ−γリガンド）などの広特異性薬剤はケラチノサイトの自己分泌増殖経路において下流側の事象に影響を及ぼすと考えられるということである。
【０２０１】
移植された正常な皮膚における表皮過形成応答を抑制するその能力、および、単層培養における自己分泌ケラチノサイト成長を抑制するその能力にもかかわらず、ＨｕＰＡＲ３４は、表皮の増殖を抑制する用量で使用されたとき、線維芽細胞の機能に影響を及ぼさないようである。この点において、ＨｕＰＡＲ３４の作用機構はコルチコステロイドと著しく異なるようである。なぜなら、強力なステロイドは表皮および真皮の両方の機能を抑制するからである。皮膚線維芽細胞の機能に対する有害な影響を伴うことなく表皮の過形成を効果的に抑制するＨｕＰＡＲ３４の能力のために、ＨｕＰＡＲ３４は、乾癬を含む様々な過増殖状態を処置するための有用な薬剤となる。
【０２０２】
本発明が好ましい実施形態を参照して記載されているが、様々な改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることを理解しなければならない。
【０２０３】
すべての刊行物、特許、特許出願およびウエブサイトは、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願またはウエブサイトが、その全体が参考として組み込まれるように具体的かつ個々に示されているかのようにそれと同じ程度に、その全体が参考として本明細書中で援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、抗ＡＲ抗体ＰＡＲ３４の成熟型重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号２）および成熟型軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号３）、ならびに、抗ＡＲ抗体ＰＡＲ８０の成熟型重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号４）および成熟型軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図２】図２は、ヒトＡＲに対して作製された陽性のモノクローナル抗体の集団を示す。示されたデータには、抗体のアイソフォーム、結合特徴および中和能力が含まれる。
【図３】図３は、アンフィレグリンを発現する細胞の表面におけるＰＡＲ抗体結合のＦＡＣＳアッセイを示す。
【図４】図４はアンフィレグリンのインビトロＰＡＲ抗体中和のプロットを示す。
【図５】図５はＡｓＰＣ−１インビボ処置モデル研究における結果のプロットを示す。
【図６】図６はＡｓＰＣ−１インビボ防止モデル研究における結果のプロットを示す。
【図７】図７はＡ４３１インビボ防止モデル研究における結果のプロットを示す。
【図８】図８はＰＡＲ３４抗体の重鎖可変領域に対するｃＤＮＡ配列（配列番号８）を示す。推定されるアミノ酸配列（配列番号９）がヌクレオチド配列の下に示される。シグナルペプチド配列が斜体字で示される。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））の定義に基づくＣＤＲには下線が付される。成熟型重鎖はグルタミン酸（Ｅ）残基（太字および二重下線）から始まる。
【図９】図９はＰＡＲ３４抗体の軽鎖可変領域に対するｃＤＮＡ配列（配列番号１０）を示す。推定されるアミノ酸配列（配列番号１１）がヌクレオチド配列の下に示される。シグナルペプチド配列が斜体字で示される。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））の定義に基づくＣＤＲには下線が付される。成熟型軽鎖はアスパラギン酸（Ｄ）残基（太字および二重下線）から始まる。
【図１０】図１０は、ＰＡＲ３４（配列番号２）およびＨｕＰＡＲ３４（配列番号１２）ならびにヒト生殖系列のＤＰ−３セグメントおよびＪＨ４セグメント（配列番号１３）の、一文字記号で示されるＶＨ領域アミノ酸配列のアラインメントを示す。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））の定義に基づくＣＤＲ配列は、ＰＡＲ３４のＶＨ配列において下線が付される。ヒトＶＨセグメントにおけるＣＤＲ配列はこの図では省略されている。ＨｕＰＡＲ３４のＶＨ配列における一重下線のアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触することが予測され、従って、対応するマウス残基で置換された。二重下線のアミノ酸は、潜在的な免疫原性を低下させるために、コンセンサスなヒト残基で置換された。
【図１１】図１１は、ＰＡＲ３４（配列番号３）、ＨｕＰＡＲ３４（配列番号１４）、ならびにヒト生殖系列のＬ１セグメントおよびＪＫ４セグメント（配列番号１５）の、一文字記号で示されるＶＬ領域アミノ酸配列のアラインメントを示す。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））の定義に基づくＣＤＲ配列は、ＰＡＲ３４のＶＬ配列において下線が付される。ヒトＶＬセグメントにおけるＣＤＲ配列はこの図では省略されている。ＨｕＰＡＲ３４のＶＬ配列における一重下線のアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触することが予測され、従って、対応するマウス残基で置換された。
【図１２】図１２は、ミニエキソンにおけるＨｕＰＡＲ３４の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１６）および推定されるアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。シグナルペプチド配列が斜体字で示される。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））の定義に基づくＣＤＲには下線が付される。成熟型重鎖はグルタミン酸（Ｅ）残基（太字および二重下線）から始まる。示される配列は特徴的なＭｌｕＩ部位（ＡＣＧＣＧＴ）およびＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）が隣接する。
【図１３】図１３は、ミニエキソンにおけるＨｕＰＡＲ３４の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１８）および推定されるアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。シグナルペプチド配列が斜体字で示される。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））の定義に基づくＣＤＲには下線が付される。成熟型軽鎖はアスパラギン酸（Ｄ）残基（太字および二重下線）から始まる。配列は特徴的なＭｌｕＩ部位（ＡＣＧＣＧＴ）およびＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）が隣接する。
【図１４】図１４は、ヒト化ＰＡＲ３４Ｖ遺伝子を合成するために使用されたスキームを示す。
【図１５】図１５は、ＨｕＰＡＲ３４のＶＨ遺伝子を合成するために使用されたオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２０〜２９）を示す。
【図１６】図１６は、ＨｕＰＡＲ３４のＶＬ遺伝子を合成するために使用されたオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３０〜３９）を示す。
【図１７】図１７は、ＨｕＰＡＲ３４  ＩｇＧ１／κを発現させるためのベクターの構造を示す。
【図１８】図１８は、ヒトアンフィレグリンに対するＨｕＰＡＲ３４およびＰＡＲ３４の結合親和性を測定する競合ＥＬＩＳＡからの結果のプロットを示す。可溶性アンフィレグリンに対するビオチン化ＰＡＲ３４の結合が種々の量の競合剤（ＰＡＲ３４またはＨｕＰＡＲ３４）の存在下で分析された。ＨｕＭ１９５がＨｕＰＡＲ３４に対する非競合アイソフォームコントロールとして使用された。
【図１９】図１９は、ＡＲにより媒介される細胞増殖のＨｕＰＡＲ３４阻害のインビトロアッセイの結果を示す。
【図２０】図２０は、（Ｃ）Ｉｇ２ｂまたは（Ｄ）ＨｕＰＡＲ３４による処置の後における移植された正常な皮膚の組織断面の光学顕微鏡観察画像を示す。
【図２１】図２１は、（Ａ）Ｉｇ２ｂまたは（Ｂ）ＨｕＰＡＲ３４による処置の後における移植された乾癬皮膚の組織断面の光学顕微鏡観察画像である。
【図２２】図２２は、ヒト表皮ケラチノサイトに対するＨｕＰＡＲ３４またはＩｇ２ｂの影響のインビトロ成長アッセイの結果を示す。
【図２３】図２３は、単層培養における皮膚線維芽細胞に対するＨｕＰＡＲ３４またはＩｇ２ｂの影響のインビトロアッセイの結果を示す。