(57)【要約】本開示は、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、リンカーとを含むコンストラクトであって、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質がそれぞれ、親和性試薬と反応性酵素とを含み、リンカーが、第１および第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害するのに特異的な第１および第２の官能基を含む、コンストラクトを提供する。本開示は、（ａ）親和性試薬と反応性酵素とを含む第１の融合タンパク質を、第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基を含むリンカーと接触させ、それによって第１の融合タンパク質とリンカーとをカップリングさせることと、（ｂ）親和性試薬と反応性酵素とを含む第２の融合タンパク質を、第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基を含むリンカーと接触させ、それによって第２の融合タンパク質とリンカーとをカップリングさせることと、を含む、方法をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンストラクトであって、
第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、リンカーと、を含み、
前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質がそれぞれ、親和性試薬および反応性酵素を含み、
前記リンカーが、第１の末端で前記第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な第１の官能基と、第２の末端で前記第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な第２の官能基と、を含む、コンストラクト。
【請求項２】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素および前記第２の融合タンパク質反応性酵素が異なる、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素および前記第２の融合タンパク質反応性酵素が同じである、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記第１の融合タンパク質親和性試薬および前記第２の融合タンパク質親和性試薬が異なる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記第１の融合タンパク質親和性試薬および前記第２の融合タンパク質親和性試薬が同じである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６】
各親和性試薬が、抗体またはそのフラグメント、小分子、モノボディ、タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項７】
前記親和性試薬が抗体またはそのフラグメントである、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項８】
前記抗体またはそのフラグメントが、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項９】
前記第１の融合タンパク質抗体またはそのフラグメントが、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体である、請求項７または８に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
前記抗体またはそのフラグメントが、トラスツズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記抗体またはそのフラグメントが、アダリムマブ、アレムツズマブ、アルシツモマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、イムシロマブ、カプロマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、ノフェツモマブ、オマリズマブ、ダクリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモマブ、エドレコロマブゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、セルトリズマブ、エクリズマブ、ウステキムマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、ベバシズマブ、ラキシバクマブ、トシリズマブ、ブレンツキシマブ、オファツムマブ、ベリムマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、オビヌツズマブ、ペンブロリズマブ、ラニビズマブ、ペンツズマブ、デノスマブ、カツマキソマブ、ゴリムマブ、シルツキシマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、およびデノスマブからなる群から選択される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
前記親和性試薬が小分子である、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
前記小分子が薬物である、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１４】
前記小分子が、アルデスロイキン、アレンドロン酸、アルファフェロン、アリトレチノイン、アロプリノール、アロプリム、アロキシ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、Ｌ型アスパラギナーゼ、アミホスチン、アムルビシン、アムサクリン、アナストロゾール、アンズメット、アラネスプ、アルグラビン、三酸化ヒ素、アロマシン、５−アザシチジン、アザチオプリン、ＢＣＧまたはタイスＢＣＧ、ベスタチン、ベタメタゾンアセタート、リン酸ベタメタゾンナトリウム、ベキサロテン、硫酸ブレオマイシン、ブロクスウリジン、ボルテゾミブ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルシトニン、キャンパス、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、カソデックス、セフェゾン、セルモロイキン、セルビジン、クロランブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、クラドリビン、クロドロン酸、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノキソーム、デカドロン、デカドロンホスファート、デレストロゲン、デニロイキンジフチトクス、デポメドロール、デスロレリン、デキサラゾキサン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、ジフルカン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロナビノール、ＤＷ−１６６ＨＣ、エリガード、エリテック、エレンス、エメンド、エピルビシン、エポエチン−アルファ、エポゲン、エプタプラチン、エルガミソール、エストラース、エストラジオール、リン酸エストラムスチンナトリウム、エチニルエストラジオール、エチオール、エチドロン酸、エトポホス、エトポシド、ファドロゾール、ファルストン、フィルグラスチム、フィナステリド、フリグラスチム、フロクスウリジン、フルコナゾール、フルダラビン、フルダラビンホスファート、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロデオキシウリジンモノホスファート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルオキシメステロン、フルタミド、ヘキサメチルメラミン、ホルメスタン、ホステアビン（ｆｏｓｔｅａｂｉｎｅ）、ホテムスチン、フルベストラント、ガンマガード、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、グリベック、グリアデル、ゴセレリン、塩酸グラニセトロン、ヒストレリン、ヒカムチン、ヒドロコルトン、エリスロ−ヒドロキソシノニルアデニン、ヒドロキシ尿素、ヒドロキシプロゲステロンカプロアート、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−アルファ２、インターフェロン−アルファ２α、インターフェロン−アルファ２β、インターフェロン−アルファｎ１、インターフェロン−アルファｎ３、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ１α、インターロイキン２、イントロンＡ、イレッサ、イリノテカン、キトリル、レンチナンスルファート、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、ロイプロリドアセタート、レバミソール、レボホル酸（ｌｅｖｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）カルシウム塩、レボトロイド、レボキシル、ロムスチン、ロニダミン、マリノール、メクロレタミン、メコバラミン、メドロキシプロゲステロンアセタート、メゲストロールアセタート、メルファラン、メネスト、６−メルカプトプリン���メスナ、メトトレキサート、メトビクス、ミルテホシン、ミノシクリン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、モドレナル、ミオセト、ネダプラチン、ニューラスタ、ニューメガ、ニューポゲン、ニルタミド、ノルバデックス、ＮＳＣ−６３１５７０、ＯＣＴ−４３、オクトレオチド、塩酸オンダンセトロン、オラプレッド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペディアプレド、ペガスパルガーゼ、ペガシス、ペントスタチン、Ｎ−ホスホノアセチルＬ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ピシバニル、ピロカルピンヒドロクロリド、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレマリン、プロカルバジン、プロクリット、ラルチトレキセド、レビフ、レニウム−１８６エチドロナート、リツキシマブ、ロフェロンＡ、ロムルチド、サラゲン、サンドスタチン、サルグラモスチム、セムスチン、シゾフラン、ソブゾキサン、ソルメドロール、ストレプトゾシン、ストロンチウム−８９クロリド、シンスロイド、タモキシフェン、タムスロシン、タソネルミン、タストラクトン、タキソテル、テセロイキン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロンプロピオナート、テストレッド、チオグアニン、チオテパ、チロトロピン、チルドロン酸、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、タスツズマブ、テオスルファン、トレイノイン、トレキサオール、トリメチルメラミン、トリメトレキサート、トリプトレリンアセタート、トリプトレリンパモアート、ＵＦＴ、ウリジン、バルルビシン、ベスナリノン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビルリジン、ジンカード、ジノスタチン−スチマラメル、ゾフラン、ＡＢＩ−００７、アコルビフェン、アクチムン、アフィニタク、アミノプテリン、アルゾキシフェン、アソプリスニル、アタメスタン、アトラセンタン、アバスチン、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）、ＣＣＩ−７７９、ＣＤＣ−５０１、セレブレクス、セツキシマブ、クリスナトール、シプロテロンアセタート、デシタビン、ＤＮ−１０１、ドキソルビシン−ＭＴＣ、ｄＳＬＩＭ、デュタステリド、エドテカリン、エフロルニチン、エキサテカン、フェンレチニド、ヒスタミンジヒドロクロリド、ヒストレリンヒドロゲルインプラント、ホルミウム１６６ＤＯＴＭＰ、イバンドロン酸、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ＰＥＧ、イキサベピロン、キーホールリンペットヘモシアニン、Ｌ−６５１５８２、ランレオチド、ラソホキシフェン、リブラ、ロナファルニブ、ミプロキシフェン、ミノドロン酸、ＭＳ−２０９、リポソームＭＴＰ−ＰＥ、ＭＸ−６、ナファレリン、ネモルビシン、ネオバスタット、ノラトレキセド、オブリメルセン、オンコ−ＴＣＳ、オシデム、パクリタキセルポリグルタミマート、パミドロン酸二ナトリウム、ＰＮ−４０１、ＱＳ−２１、クアゼパム、Ｒ−１５４９、ラロキシフェン、ランピルナス、１３−シス−レチン酸、サトラプラチン、セオカルシトール、Ｔ−１３８０６７、タルセバ、タキソプレキシン、チモシン−アルファ−１、チアゾフリン、チピファルニブ、チラパザミン、ＴＬＫ−２８６、トレミフェン、トランスＭＩＤ−１０７Ｒ、バルスポダー���、バプレオチド、バタラニブ、ベルテポルフィン、ビンフルニン、Ｚ−１００、ゾレドロン酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載のコンストラクト。
【請求項１５】
前記親和性試薬がモノボディである、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項１６】
前記親和性試薬がタンパク質である、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項１７】
前記タンパク質が少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項１８】
前記タンパク質がファージ中のタンパク質である、請求項１６または１７に記載のコンストラクト。
【請求項１９】
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１６または１７に記載のコンストラクト。
【請求項２０】
前記親和性試薬が合成抗体ドメインである、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項２１】
前記親和性試薬が、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ＨＥＬ４  Ｖｈドメイン（Ｐｒｅｄａｔｏｒ）、ブドウ球菌タンパク質Ａ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）のＺドメイン、古細菌「７ｋＤａ  ＤＮＡ結合剤」タンパク質ファミリー（Ａｆｆｉｔｉｎ）、炭水化物結合分子（ＣＢＤドメイン）、シスチンノットミニタンパク質（ｋｎｏｔｔｉｎ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（モノボディ、Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、γ−Ｂ−クリスタリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）、シスタチン（Ａｆｆｉｍｅｒ）、三重らせんコイルドコイルドメイン（Ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、リポカリンドメイン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、種々の膜受容体のＡドメイン（Ａｖｉｍｅｒ）、ＦｙｎのＳＨ３ドメイン（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２２】
前記リンカーが、ポリオキサゾリン、ポリアクリロモルホリン（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（「ＰＨＦ」）、ポリヒドロキシアルキルアクリラート、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスファート（「ＭＰＣ」）、または以下から選択される構造：
【化１】
2019530685.tif 000009
であり、
式中、
ｍは０〜１０であり、
ｎは１〜１００であり、
各ｐは独立して０、１、２、３または４であり、
ｑは０、１または２であり、
ｒは１または２であり、
ＥはＮＨまたはＣＨＲ１０であり、
ＧはＯ、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、ＣＨＮＨ２、ＣＨＣＯＯＨまたはＣＨＳＯ３Ｈであり、
Ｒ１０はＯＨ、ＮＨ２またはＣＯＯＨであり、
各Ｒ１１は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２またはＣＯＯＨである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２３】
各反応性酵素が、クチナーゼ、ＳｎａｐＴａｇ、ＨａｌｏＴａｇ、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメイン、β−ラクタマーゼ、グリコシダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメイン、アルカリホスファターゼ、タンパク質−チロシン−フソファターゼ（ｐｈｓｏｐｈａｔａｓｅ）、２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体、グルコシダーゼ、Ｎ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼ、Ｎ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、ストロメリシン、脂肪酸アミド加水分解酵素、エステラーゼ、シトクロムＰ４５０、メチオニンアミノペプチダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２４】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がクチナーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がｐ−ニトロフェニルホスホナートを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２５】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＳｎａｐＴａｇを含み、前記第１の末端の前記官能基がＯ６−ベンジルグアニンを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２６】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＨａｌｏＴａｇを含み、前記第１の末端の前記官能基がα−クロロアルカンを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２７】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がベータ−ラクタマーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がクラブラン酸またはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２８】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がグリコシダーゼを含み、第１の末端の前記官能基がアグリコンまたはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２９】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がヒドロキサム酸−ベンゾフェノンまたはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３０】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメインを含み、前記第１の末端の前記官能基が、同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３１】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメインを含み、前記第１の末端の前記官能基が、システイン反応性ＡＴＰ結合部位阻害剤を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３２】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がアルカリホスファターゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が、キノンメチド、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３３】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がタンパク質−チロシン−ホスファターゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が、ホルミルクロモン、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３４】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体を含み、前記第１の末端の前記官能基が同族ＲＮＡ配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３５】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がグルコシダーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がアグリコンまたはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３６】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＮ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がアデノシンまたはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３７】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＮ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がシトシンまたはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３８】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がシトシンまたはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項３９】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体を含み、前記第１の末端の前記官能基が、ハロアルカン、ハロ芳香族化合物、またはこれらの誘導体からなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４０】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＨＮＨエンドヌクレアーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が同族ＤＮＡニッキング部位を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４１】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がニッキングエンドヌクレアーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が同族ＤＮＡニッキング部位を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４２】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がゼラチナーゼＢを含み、前記第１の末端の前記官能基がチイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４３】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がゼラチナーゼＡを含み、前記第１の末端の前記官能基がチイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４４】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がストロメリシンを含み、前記第１の末端の前記官能基が、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４５】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が脂肪酸アミド加水分解酵素を含み、前記第１の末端の前記官能基がα−ケトキサゾール阻害剤またはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４６】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がエステラーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が、ホスホナート、カルバマート、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４７】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がシトクロムＰ４５０を含み、前記第１の末端の前記官能基が求電子ステロイド、芳香族アルキン、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４８】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がメチオニンアミノペプチダーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がベロラニブまたはその誘導体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４９】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がクチナーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がｐ−ニトロフェニルホスホナートを含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５０】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＳｎａｐＴａｇを含み、前記第２の末端の前記官能基がＯ６−ベンジルグアニンを含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５１】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＨａｌｏＴａｇを含み、前記第２の末端の前記官能基がα−クロロアルカンを含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５２】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がベータ−ラクタマーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がクラブラン酸またはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５３】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がグリコシダーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、アグリコンまたはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５４】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がヒドロキサム酸−ベンゾフェノンまたはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５５】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメインを含み、前記第２の末端の前記官能基が、同族ｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５６】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメインを含み、前記第２の末端の前記官能基が、システイン反応性ＡＴＰ結合部位阻害剤を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５７】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がアルカリホスファターゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、キノンメチド、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５８】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がタンパク質−チロシン−ホスファターゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、ホルミルクロモン、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５９】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体を含み、前記第２の末端の前記官能基が同族ＲＮＡ配列を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６０】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がグルコシダーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がアグリコンまたはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６１】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＮ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がアデノシンまたはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６２】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＮ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、第２の末端の前記官能基がシトシンまたはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６３】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がシトシンまたはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６４】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体を含み、前記第２の末端の前記官能基が、ハロアルカン、ハロ芳香族化合物、またはこれらの誘導体からなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６５】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＨＮＨエンドヌクレアーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が同族ＤＮＡニッキング部位を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６６】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、ニッキングエンドヌクレアーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、同族ＤＮＡニッキング部位を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６７】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がゼラチナーゼＢを含み、前記第２の末端の前記官能基がチイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６８】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がゼラチナーゼＡを含み、前記第２の末端の前記官能基がチイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６９】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がストロメリシンを含み、前記第２の末端の前記官能基が、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項７０】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、脂肪酸アミド加水分解酵素を含み、前記第２の末端の前記官能基が、α−ケトキサゾール阻害剤またはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項７１】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がエステラーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、ホスホナート、カルバマート、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項７２】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がシトクロムＰ４５０を含み、前記第２の末端の前記官能基が、求電子ステロイド、芳香族アルキン、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項７３】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がメチオニンアミノペプチダーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がベロラニブまたはその誘導体を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項７４】
方法であって、
（ａ）親和性試薬と反応性酵素とを含む第１の融合タンパク質を、第１の末端の第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基を含むリンカーと接触させ、それによって前記第１の末端に前記第１の融合タンパク質および前記リンカーをカップリングさせることと、
（ｂ）親和性試薬と反応性酵素とを含む第２の融合タンパク質を、前記リンカーの第２の末端と接触させ、前記リンカーの前記第２の末端が、前記第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基を含み、それによって前記第２の末端に前記第２の融合タンパク質および前記リンカーをカップリングさせることと、を含む、方法。
【請求項７５】
ステップ（ａ）および（ｂ）が順次実行される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ステップ（ａ）および（ｂ）が同時に事前形成される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素および前記第２の融合タンパク質反応性酵素が異なる、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素および前記第２の融合タンパク質反応性酵素が同じである、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１の融合タンパク質親和性試薬および前記第２の融合タンパク質親和性試薬が異なる、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１の融合タンパク質親和性試薬および前記第２の融合タンパク質親和性試薬が同じである、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
各親和性試薬が、抗体またはそのフラグメント、小分子、モノボディ、タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される、請求項７４〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記親和性試薬が抗体またはそのフラグメントである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗体またはそのフラグメントが、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１の融合タンパク質抗体またはそのフラグメントが、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体である、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記抗体またはそのフラグメントが、トラスツズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗体またはそのフラグメントが、アダリムマブ、アレムツズマブ、アルシツモマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、イムシロマブ、カプロマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、ノフェツモマブ、オマリズマブ、ダクリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモマブ、エドレコロマブゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、セルトリズマブ、エクリズマブ、ウステキムマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、ベバシズマブ、ラキシバクマブ、トシリズマブ、ブレンツキシマブ、オファツムマブ、ベリムマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、オビヌツズマブ、ペンブロリズマブ、ラニビズマブ、ペンツズマブ、デノスマブ、カツマキソマブ、ゴリムマブ、シルツキシマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、およびデノスマブからなる群から選択される、請求項８２〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記親和性試薬が小分子である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記小分子が、薬物からなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記小分子が、アルデスロイキン、アレンドロン酸、アルファフェロン、アリトレチノイン、アロプリノール、アロプリム、アロキシ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、Ｌ型アスパラギナーゼ、アミホスチン、アムルビシン、アムサクリン、アナストロゾール、アンズメット、アラネスプ、アルグラビン、三酸化ヒ素、アロマシン、５−アザシチジン、アザチオプリン、ＢＣＧまたはタイス−ＢＣＧ、ベスタチン、ベタメタゾンアセタート、リン酸ベタメタゾンナトリウム、ベキサロテン、硫酸ブレオマイシン、ブロクスウリジン、ボルテゾミブ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルシトニン、キャンパス、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、カソデクス、セフェゾン、セルモロイキン、セルビジン、クロランブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、クラドリビン、クロドロン酸、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノキソーム、デカドロン、デカドロンホスファート、デレストロゲン、デニロイキンジフチトクス、デポメドロール、デスロレリン、デキサラゾキサン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、ジフルカン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロナビノール、ＤＷ−１６６ＨＣ、エリガード、エリテック、エレンス、エメンド、エピルビシン、エポエチン−アルファ、エポゲン、エプタプラチン、エルガミソール、エストラース、エストラジオール、リン酸エストラムスチンナトリウム、エチニルエストラジオール、エチオール、エチドロン酸、エトポホス、エトポシド、ファドロゾール、ファルストン、フィルグラスチム、フィナステリド、フリグラスチム、フロクスウリジン、フルコナゾール、フルダラビン、フルダラビンホスファート、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロデオキシウリジンモノホスファート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルオキシメステロン、フルタミド、ヘキサメチルメラミン、ホルメスタン、ホステアビン（ｆｏｓｔｅａｂｉｎｅ）、ホテムスチン、フルベストラント、ガンマガード、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、グリベック、グリアデル、ゴセレリン、塩酸グラニセトロン、ヒストレリン、ヒカムチン、ヒドロコルトン、エリスロ−ヒドロキシノニルアデニン、ヒドロキシ尿素、ヒドロキシプロゲステロンカプロアート、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−アルファ２、インターフェロン−アルファ２α、インターフェロン−アルファ２β、インターフェロン−アルファｎ１、インターフェロン−アルファｎ３、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ１α、インターロイキン２、イントロンＡ、イレッサ、イリノテカン、キトリル、レンチナンスルファート、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、ロイプロリドアセタート、レバミソール、レボホル酸（ｌｅｖｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）カルシウム塩、レボトロイド、レボキシル、ロムスチン、ロニダミン、マリノール、メクロレタミン、メコバラミン、メドロキシプロゲステロンアセタート、メゲストロールアセタート、メルファラン、メネスト、６−メルカプトプリン、���スナ、メトトレキサート、メトビクス、ミルテホシン、ミノシクリン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、モドレナル、ミオセト、ネダプラチン、ニューラスタ、ニューメガ、ニューポゲン、ニルタミド、ノルバデックス、ＮＳＣ−６３１５７０、ＯＣＴ−４３、オクトレオチド、塩酸オンダンセトロン、オラプレッド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペディアプレド、ペガスパルガーゼ、ペガシス、ペントスタチン、Ｎ−ホスホノアセチルＬ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ピシバニル、ピロカルピンヒドロクロリド、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレマリン、プロカルバジン、プロクリット、ラルチトレキセド、レビフ、レニウム−１８６エチドロナート、リツキシマブ、ロフェロンＡ、ロムルチド、サラゲン、サンドスタチン、サルグラモスチム、セムスチン、シゾフラン、ソブゾキサン、ソルメドロール、ストレプトゾシン、ストロンチウム−８９クロリド、シンスロイド、タモキシフェン、タムスロシン、タソネルミン、タストラクトン、タキソテル、テセロイキン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロンプロピオナート、テストレッド、チオグアニン、チオテパ、チロトロピン、チルドロン酸、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、タスツズマブ、テオスルファン、トレイノイン、トレキサオール、トリメチルメラミン、トリメトレキサート、トリプトレリンアセタート、トリプトレリンパモアート、ＵＦＩ、ウリジン、バルルビシン、ベスナリノン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビルリジン、ジンカード、ジノスタチン−スチマラメル、ゾフラン、ＡＢＩ−００７、アコルビフェン、アクチムン、アフィニタク、アミノプテリン、アルゾキシフェン、アソプリスニル、アタメスタン、アトラセンタン、アバスチン、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）、ＣＣＩ−７７９、ＣＤＣ−５０１、セレブレクス、セツキシマブ、クリスナトール、シプロテロンアセタート、デシタビン、ＤＮ−１０１、ドキソルビシン−ＭＴＣ、ｄＳＬＩＭ、デュタステリド、エドテカリン、エフロルニチン、エキサテカン、フェンレチニド、ヒスタミンジヒドロクロリド、ヒストレリンヒドロゲルインプラント、ホルミウム１６６ＤＯＴＭＰ、イバンドロン酸、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ＰＥＧ、イキサベピロン、キーホールリンペットヘモシアニン、Ｌ−６５１５８２、ランレオチド、ラソホキシフェン、リブラ、ロナファルニブ、ミプロキシフェン、ミノドロン酸、ＭＳ−２０９、リポソームＭＴＰ−ＰＥ、ＭＸ−６、ナファレリン、ネモルビシン、ネオバスタット、ノラトレキセド、オブリメルセン、オンコ−ＴＣＳ、オシデム、パクリタキセルポリグルタミマート、パミドロン酸二ナトリウム、ＰＮ−４０１、ＱＳ−２１、クアゼパム、Ｒ−１５４９、ラロキシフェン、ランピルナス、１３−シス−レチン酸、サトラプラチン、セオカルシトール、Ｔ−１３８０６７、タルセバ、タキソプレキシン、チモシン−アルファ−１、チアゾフリン、チピファルニブ、チラパザミン、ＴＬＫ−２８６、トレミフェン、トランスＭＩＤ−１０７Ｒ、バルスポダール���バプレオチド、バタラニブ、ベルテポルフィン、ビンフルニン、Ｚ−１００、ゾレドロン酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記親和性試薬がモノボディである、請求項８１に記載の方法。
【請求項９１】
前記親和性試薬がタンパク質である、請求項８１に記載の方法。
【請求項９２】
前記タンパク質が少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記タンパク質がファージ中のタンパク質である、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記タンパク質が治療剤である、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記親和性試薬が合成抗体ドメインである、請求項８１に記載の方法。
【請求項９６】
前記親和性試薬が、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ＨＥＬ４  Ｖｈドメイン（Ｐｒｅｄａｔｏｒ）、ブドウ球菌タンパク質Ａ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）のＺドメイン、古細菌「７ｋＤａ  ＤＮＡ結合剤」タンパク質ファミリー（Ａｆｆｉｔｉｎ）、炭水化物結合分子（ＣＢＤドメイン）、シスチンノットミニタンパク質（ｋｎｏｔｔｉｎ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（モノボディ、Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、γ−Ｂ−クリスタリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）、シスタチン（Ａｆｆｉｍｅｒ）、三重らせんコイルドコイルドメイン（Ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、リポカリンドメイン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、種々の膜受容体のＡドメイン（Ａｖｉｍｅｒ）、ＦｙｎのＳＨ３ドメイン（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７４〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記リンカーが、ポリオキサゾリン、ポリアクリロモルホリン（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（「ＰＨＦ」）、ポリヒドロキシアルキルアクリラート、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスファート（「ＭＰＣ」）、または以下から選択される構造：
【化２】
2019530685.tif 000010
であり、
式中、
ｍは０〜１０であり、
ｎは１〜１００であり、
各ｐは独立して０、１、２、３または４であり、
ｑは０、１または２であり、
ｒは１または２であり、
ＥはＮＨまたはＣＨＲ１０であり、
ＧはＯ、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、ＣＨＮＨ２、ＣＨＣＯＯＨまたはＣＨＳＯ３Ｈであり、
Ｒ１０はＯＨ、ＮＨ２またはＣＯＯＨであり。
各Ｒ１１は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２またはＣＯＯＨである、請求項７４〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
各反応性酵素が、クチナーゼ、ＳｎａｐＴａｇ、ＨａｌｏＴａｇ、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメイン、ベータ−ラクタマーゼ、グリコシダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメイン、アルカリホスファターゼ、タンパク質−チロシン−フソファターゼ（ｐｈｓｏｐｈａｔａｓｅ）、２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体、グルコシダーゼ、Ｎ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼ、Ｎ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、ストロメリシン、脂肪酸アミド加水分解酵素、エステラーゼ、シトクロムＰ４５０、メチオニンアミノペプチダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される、請求項７４〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がクチナーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がｐ−ニトロフェニルホスホナートを含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＳｎａｐＴａｇを含み、前記第１の末端の前記官能基がＯ６−ベンジルグアニンを含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＨａｌｏＴａｇを含み、前記第１の末端の前記官能基がα−クロロアルカンを含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がベータ−ラクタマーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がクラブラン酸またはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がグリコシダーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がアグリコンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がヒドロキサム酸−ベンゾフェノンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメインを含み、前記第１の末端の前記官能基が同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメインを含み、前記第１の末端の前記官能基が、システイン反応性ＡＴＰ結合部位阻害剤を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がアルカリホスファターゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が、キノンメチド、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がタンパク質−チロシン−ホスファターゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が、ホルミルクロモン、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、および上記の組み合わせを含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が２３Ｓ  ｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体を含み、前記第１の末端の前記官能基が同族ＲＮＡ配列を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がグルコシダーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がアグリコンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＮ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がアデノシンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＮ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がシトシンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がシトシンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体を含み、前記第１の末端の前記官能基が、ハロアルカン、ハロ芳香族化合物、またはこれらの誘導体からなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がＨＮＨエンドヌクレアーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が同族ＤＮＡのニッキング部位を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がニッキングエンドヌクレアーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が同族ＤＮＡニッキング部位を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がゼラチナーゼＢを含み、前記第１の末端の前記官能基がチイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がゼラチナーゼＡを含み、前記第１の末端の前記官能基がチイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がストロメリシンを含み、前記第１の末端の前記官能基が、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素が脂肪酸アミド加水分解酵素を含み、前記第１の末端の前記官能基がα−ケトキサゾール阻害剤またはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がエステラーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基が、ホスホナート、カルバマート、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がシトクロムＰ４５０を含み、前記第１の末端の前記官能基が、求電子ステロイド、芳香族アルキン、前記の誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記第１の融合タンパク質反応性酵素がメチオニンアミノペプチダーゼを含み、前記第１の末端の前記官能基がベロラニブまたはその誘導体を含む、請求項７４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がクチナーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がｐ−ニトロフェニルホスホネートを含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＳｎａｐＴａｇを含み、前記第２の末端の前記官能基がＯ６−ベンジルグアニンを含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＨａｌｏＴａｇを含み、前記第２の末端の前記官能基がα−クロロアルカンを含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がベータ−ラクタマーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がクラブラン酸またはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がグリコシダーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がアグリコンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がヒドロキサム酸−ベンゾフェノンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメインを含み、前記第２の末端の前記官能基が同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメインを含み、前記第２の末端の前記官能基が、システイン反応性ＡＴＰ結合部位阻害剤を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がアルカリホスファターゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、キノンメチド、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がタンパク質−チロシン−ホスファターゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、ホルミルクロモン、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせを含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体を含み、前記第２の末端の前記官能基が同族ＲＮＡ配列を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がグルコシダーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がアグリコンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＮ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がアデノシンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＮ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がシトシンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がシトシンまたはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体を含み、前記第２の末端の前記官能基が、ハロアルカン、ハロ芳香族化合物、またはこれらの誘導体からなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がＨＮＨエンドヌクレアーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が同族ＤＮＡニッキング部位を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が、ニッキングエンドヌクレアーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、同族のＤＮＡニッキング部位を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がゼラチナーゼＢを含み、前記第２の末端の前記官能基がチイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がゼラチナーゼＡを含み、前記第２の末端の前記官能基がチイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がストロメリシンを含み、前記第２の末端の前記官能基が、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素が脂肪酸アミド加水分解酵素を含み、前記第２の末端の前記官能基がα−ケトキサゾール阻害剤またはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がエステラーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基が、ホスホナート、カルバマート、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がシトクロムＰ４５０を含み、前記第２の末端の前記官能基が、求電子ステロイド、芳香族アルキン、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記第２の融合タンパク質反応性酵素がメチオニンアミノペプチダーゼを含み、前記第２の末端の前記官能基がベロラニブまたはその誘導体を含む、請求項７４〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
請求項７４〜１４８のいずれか１項に記載の方法によって調製されるコンストラクト。
【請求項１５０】
請求項１〜７３または１４９のいずれか１項に記載のコンストラクトを、前記コンストラクトを必要とする患者へ投与することを含む、方法。
【請求項１５１】
薬剤としての、請求項１〜７３または１４９のいずれか１項に記載のコンストラクトを必要とする患者のための、前記コンストラクトの使用。
【請求項１５２】
前記患者が乳癌に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、トラスツズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１５３】
前記患者が肺炭疽に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、ラキシバクマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１５４】
前記患者が関節リウマチまたは全身性若年性特発性関節炎に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントがトシリズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１５５】
前記患者が、ホジキンリンパ腫または全身性未分化大細胞リンパ腫に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、ブレンツキシマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１５６】
前記患者が、慢性リンパ性白血病、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、関節リウマチ、および再発性弛張性多発性硬化症からなる群から選択される容態に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントがオファツムマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１５７】
前記患者が全身性エリテマトーデスに罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、ベリムマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１５８】
前記患者が、胃もしくは胃食道接合部の腺癌または転移性非小細胞肺癌に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、ラムシルマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１５９】
前記患者が潰瘍性大腸炎またはクローン病に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントがベドリズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６０】
前記患者が慢性リンパ性白血病または濾胞性リンパ腫に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、オビヌツズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６１】
前記患者が黒色腫または転移性非小細胞肺癌に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、ペンブロリズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６２】
前記患者が黄斑変性に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントがラニビズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６３】
前記患者が乳癌に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、ペルツズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６４】
前記患者が、骨粗鬆症、治療誘発性骨退縮、骨への転移、および骨巨細胞腫からなる群から選択される容態に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはフラグメントがデノスマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６５】
前記患者が悪性腹水に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、カツマキソマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６６】
前記患者が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される容態に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、ゴリムマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６７】
前記患者が、転移性腎細胞癌、前立腺癌、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、およびキャッスルマン病からなる群から選択される容態に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、シルツキシマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６８】
前記患者が多発性硬化症またはクローン病に罹患し、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、ナタリズマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１６９】
前記患者が大腸癌に罹患し、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントがパニツムマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１７０】
前記患者が、骨粗鬆症、治療誘発性骨退縮、骨への転移、および骨巨細胞腫からなる群から選択される容態に罹患しており、前記コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントが、デノスマブまたはそのフラグメントを含む、請求項１５０または１５１に記載の方法または使用。
【請求項１７１】
診断薬としての、請求項１〜７３または１４９のいずれか１項に記載のコンストラクトの、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、融合タンパク質コンストラクトおよびその調製方法および使用方法に関する。より詳細には、本開示は、モジュール式合成によって調製されたリンカーによってカップリングされた少なくとも第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを含む、正確に規定された融合タンパク質コンストラクトに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的薬物、具体的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および抗体フラグメントを組み込んだｍＡｂは、循環中または細胞表面上で疾患関連タンパク質を特異的に標的とする能力のため、製薬産業において関心対象である。抗体価を高め、細胞傷害性および半減期を増大させるエフェクター分子を結合させ、除去する標的へ免疫系を向かわせるフォーマットを使用することにより、次世代の抗体治療薬、すなわち治療能力の向上を示すものが創出された。しかしながら、これらの分子は、高収率で、および所望の機能を系統的に最適化することを可能にする合成可撓性で生成することがしばしば困難である。
【０００３】
例えば、拡張された機能性を有する現行の抗体フォーマットは、同時に発現されなければならない複数のドメインを特徴とするので、安定性または機能に関して巧妙に最適化されなければならない。現行の化学的方法は、抗体足場にペイロードを結合させるために、反応性アミノ酸の操作または既存の反応性アミノ酸側鎖の使用を必要とする。多くの場合、これらの反応の生成物は、生成物の異種性集団を生じる。このような直接的なアミノ酸修飾は、親分子の薬理学的特性に対して安定ではないか、または有害な影響を引き起こす（例えば、疎水性、凝集、免疫原性などの増大）こともあり得るので、ペイロードを結合させるための適切な場所を選択することに対して、多大なる努力を尽くさなければならない。
【０００４】
さらに、現行の抗体技術は、古典的なポリペプチド操作によって可能となるものの外に幾何学的形状（例えば、環状分子、ドメイン間の可変距離を有する分子など）、向き、化学量論、および抗体価を系統的に制御することができる足場の産物を可能にしない。この生産技術の制限は、現行のフォーマットが調査できる治療スペースに大きな制約を課す。現行のタンパク質工学的方法は、所望のコンストラクトを得るための天然のポリペプチド折りたたみ／ペプチドリンカーの固有のレパートリーに限定される。それゆえ、従来の工学的方法を用いて、より高い効能を呈し得る非天然型フォーマットを調製することはできない。さらに、発現宿主の毒性の制約または代謝特性のために、いくつかのエフェクター分子は、１つの培養系においてまとまって有効に産生することができない。加えて、分子の複雑性が増すにつれて、より大きな分子の正確な折り畳み、組み立て、および精製がより困難となり、それによって収率が低下し、コストがかさむ。
【０００５】
さらに、抗体分子の工業的産生は概して、原核生物宿主よりも堅牢性が低く、原核生物宿主と比較して産物収率が低下した抗体または抗体様フラグメントの発現を真核生物宿主において必要とし、結果的に原核生物宿主において発現することができる抗体または抗体様フラグメントに対する操作コストが結果的に高くなる。
【０００６】
したがって、単純に、比較的少数の構築ブロックの組み合わせによって、変化した抗体価、幾何学的形状、エフェクター機能および化学量論を有する抗体様薬物の多様なライブラリーの作製を可能にする、高分子量を有する次世代抗体治療薬を調製する費用対効果の高い方法について、当該技術分野における必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の１つの態様は、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、リンカーとを含むコンストラクトであって、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質がそれぞれ、親和性試薬と反応性酵素とを含み、リンカーが、第１の末端で第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害するのに特異的な第１の官能基と、第２の末端で第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害するのに特異的な第２の官能基とを含む、コンストラクトを提供する。
【０００８】
本開示の別の態様は、（ａ）親和性試薬と反応性酵素とを含む第１の融合タンパク質を、第１の末端で第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害するのに特異的な官能基を含むリンカーと接触させ、それにより第一の末端に第一の融合タンパク質およびリンカーをカップリングさせることと、（ｂ）親和性試薬と反応性酵素とを含む第２の融合タンパク質をリンカーの第２の末端と接触させることであって、リンカーの第２の末端が、第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害し、それによって第２の末端に第２の融合タンパク質およびリンカーをカップリングさせることに特異的な官能基を含む、接触させることと、を含む方法を提供する。
【０００９】
本開示の別の態様は、本開示の方法によって調製されるコンストラクトを提供する。
【００１０】
本開示の別の態様は、本開示のコンストラクトを投与することを必要とする患者へ、本開示のコンストラクトを投与することを含む方法を提供する。本開示の他の態様は、医薬としておよび／または診断薬としての本開示のコンストラクトの使用を提供する。
【００１１】
さらなる態様および利点は、図面と合わせて以下の詳細な説明の考察から当業者に明らかとなるであろう。本コンストラクトならびにその製造方法および使用方法は、種々の形態における実施形態を許容し得るが、本開示は例示的なものであり、本発明を本明細書に説明する具体的な実施形態に限定することを意図しないという理解の下で、以下の説明は具体的な実施形態が含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】トラスツズマブＦ（ａｂ）（ＴＦａｂ）融合遺伝子／タンパク質コンストラクトを示す。
【図２】精製ＴＦａｂ−クチナーゼおよびＴＦａｂ−ＳｎａｐＴａｇ融合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３】二価のコンストラクトのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図４】トラスツズマブおよび融合タンパク質コンストラクトＢ−１３の細胞生存率アッセイデータを示す。
【図５】マウスにおけるＢ−１３コンストラクトの血清濃度の経時的プロットである。
【図６】ＢＴ４７４腫瘍異種移植片を有するマウスに対するＢ−１３投与の効果の結果を示す。Ａ）ビヒクルで４週間にわたって、毎日２．５および５ｍｇ／ｋｇのＢ１３で、ならびに２．５ｍｇ／ｋｇで週２回のドキソルビシン（ｄｏｘ）で処置した動物の腫瘍体積の進行。２８日後に、ビヒクル対ドキソルビシン（ｐ＝．０００２）およびビヒクル対２つのＢ１３処置群（ｐ＝．０００１）の間に腫瘍体積の有意な差がある。Ｂ）４つの処置コホートにおける動物の全体重測定。ビヒクルとドキソルビシン（ｐ＝．０１１６）との間には全体重に有意差があったが、ビヒクルと２．５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝．２２３７）または５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝．４２９７）のＢ１３処置との間には有意差はなかった。Ｃ）４つの処置コホートにおける動物の器官重量。群間で器官の重量に有意差はない（ｐ＝０．９４９３）。Ｐ値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ７．０の２元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、コンストラクトならびにコンストラクトを作製する方法および使用する方法が提供される。コンストラクトは、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、リンカーとを含み、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質はそれぞれ、親和性試薬と反応性酵素とを含み、リンカーは、第１の末端で第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な第１の官能基と、第２の末端で前記第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な第２の官能基とを含む。複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素と第２の融合タンパク質反応性酵素とは異なる。複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は同じである。複数の実施形態において、第１の融合タンパク質親和性試薬と第２の融合タンパク質親和性試薬とは異なる。複数の実施形態において、第１の融合タンパク質親和性試薬および第２の融合タンパク質親和性試薬は同じである。場合によっては、複数の実施形態において、各親和性試薬は、抗体またはそのフラグメント、小分子、モノボディ、タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される。
【００１４】
親和性試薬と反応性酵素との融合タンパク質のコンストラクト
開示されたコンストラクトは、リンカーを介して連結された親和性試薬と反応性酵素との融合タンパク質を含む。
【００１５】
本明細書中で使用する場合および他に指定しない限り、「親和性試薬」は、所望の標的に対する親和性、例えば治療系における標的エピトープへ結合する能力、および／またはバイオセンサーシステムにおいて分析物を結合するもしくは認識する能力を呈する部分を指す。親和性試薬の例としては、抗体またはそのフラグメント、小分子、モノボディ、およびタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書中で使用する場合および他に指定しない限り、「反応性酵素」は、活性部位残基を不可逆的に阻害することに特異的な官能基へカップリングすることができる活性部位残基を含む酵素を指す。
【００１７】
本明細書中で使用する場合および他に指定しない限り、「タンパク質」は、天然ポリペプチド、天然および／または非天然アミノ酸を含むポリペプチド、ファージ中のタンパク質、治療用タンパク質、ならびに合成または天然由来のいずれかの抗体ドメインを指す。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸残基から構成されたポリマーを指す。ポリペプチドは、当該技術分野において理解されており、抗体、酵素、構造ポリペプチド、およびホルモンが含まれるが、これらに限定されない。本開示のポリペプチドは、天然または非天然のいずれかであり得る。
【００１９】
天然ポリペプチドには、自然界に存在するかまたは、例えば、化学合成もしくは組換え発現技術によって自然界において認められる形態で生成することができる、生物活性のあるポリペプチド（抗体を含む）が含まれるが、これに限定されない。天然ポリペプチドには、リポタンパク質および、例えば、限定されないが、グリコシル化タンパク質などの翻訳後修飾タンパク質も含まれる。
【００２０】
本開示の方法および組成物における使用が企図される抗体には、インビボまたはインビトロのいずれかで標的分子を認識しおよびこれと会合する抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【００２１】
本開示によって企図される構造ポリペプチドには、アクチン、チューブリン、コラーゲン、エラスチン、ミオシン、キネシンおよびダイニンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
本開示によって企図される非天然ポリペプチドには、合成ポリペプチド、ならびに本明細書で定義される天然または非天然ポリペプチドの断片、類似体および変異形が含まれるが、これらに限定されない。非天然ポリペプチドには、Ｄ型アミノ酸、修飾された、誘導体化された、または非天然のアミノ酸を構造の一部としてＤもしくはＬ立体配置および／またはペプチド模倣単位に有するタンパク質またはタンパク質物質も含まれる。「タンパク質」という用語は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、典型的には、短いポリペプチドを指す。
【００２３】
非天然ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を用いて、または、これに代わるものとして、所望のポリペプチドをコードする修飾されたポリヌクレオチドを使用する組換え発現技術を用いて調製される。
【００２４】
本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「フラグメント」は、全長のポリペプチドまたはタンパク質発現産物よりも小さなポリペプチドまたはタンパク質の何らかの部分を指すことを意味する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「類似体」は、分子全体またはそのフラグメントのいずれかに対して構造が実質的に類似し、同じ生物活性を有するが、種々の程度の活性を有することができる２種以上のポリペプチドのいずれかを指す。類似体は、そのアミノ酸配列の組成が、他のアミノ酸に対する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を包含する１つ以上の変異に基づいて異なる。置換は、置き換えられるアミノ酸およびこのアミノ酸と置き換わるアミノ酸の物理化学的または機能的関連性に基づいて、保存的または非保存的であり得る。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、「変異形」は、通常は分子の一部ではない追加の化学的部分を含むように修飾されたポリペプチド、タンパク質またはこれらの類似体を指す。このような部分は、例えば、以下に限定するものではないが、分子の溶解度、吸収および／または生物学的半減期を調節することができる。このような効果を仲介することができる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。このような部分を分子へカップリングするための手順は、当該技術分野で十分に既知である。
【００２７】
Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｃフラグメント、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、個々の重鎖、個々の軽鎖、二量体性重鎖および軽鎖（未処置の抗体において認められるヘテロ四量体性重鎖および軽鎖とは対照的）、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ヒト化抗体（およびヒト化抗体の様式で修飾された抗体だが、結果として得られる抗体は、非ヒト種の抗体のより非常に類似している）、キレート化組換え抗体（ＣＲＡＢ）、二重特異性抗体および多重特異性抗体、ならびに当該技術分野で既知の他の抗体誘導体またはフラグメントを含むがこれらに限定されない抗体ならびにそのフラグメントまたは誘導体が意図される。
【００２８】
先の態様の実施形態において、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、トラスツズマブまたはそのフラグメント、ラクシバカマブまたはそのフラグメント、トシリズマブまたはそのフラグメント、ブレンツキシマブまたはそのフラグメント、オファツムマブまたはそのフラグメント、ベリムマブまたはそのフラグメント、ラムシルマブまたはそのフラグメント、ベドリズマブまたはそのフラグメント、オビヌツズマブまたはそのフラグメント、ペンブロリズマブまたはそのフラグメント、ラニビズマブまたはそのフラグメント、ペルツズマブまたはそのフラグメント、デノスマブまたはそのフラグメント、カツマキソマブまたはそのフラグメント、ゴリムマブまたはそのフラグメント、シルツキシマブまたはそのフラグメント、ナタリズマブまたはそのフラグメント、パニツムマブまたはそのフラグメント、デノスマブまたはそのフラグメント、およびこれらの組み合わせを含む。
【００２９】
複数の実施形態において、リンカーは、ポリオキサゾリン、ポリアクリロモルホリン（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（「ＰＨＦ」）、ポリヒドロキシアルキルアクリラート、２−メチルアクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスファート（「ＭＰＣ」）、または以下から選択される構造である：
【化１】
2019530685.tif 000002
であって、
式中ｍは０〜１０であり、ｎは１〜１００であり、各ｐは独立して、０、１、２、３または４であり、ｑは０、１または２であり、ｒは１または２であり、ＥはＮＨまたはＣＨＲ１０であり、ＧはＯ、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、ＣＨＮＨ２、ＣＨＣＯＯＨまたはＣＨＳＯ３Ｈであり、Ｒ１０はＯＨ、ＮＨ２またはＣＯＯＨであり、各Ｒ１１は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２またはＣＯＯＨである。
【００３０】
各反応性酵素は、クチナーゼ、ＳｎａｐＴａｇ、ＨａｌｏＴａｇ、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメイン、ベータ−ラクタマーゼ、グリコシダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメイン、アルカリホスファターゼ、タンパク質−チロシン−フソファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体、グルコシダーゼ、Ｎ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼ、Ｎ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、ストロメリシン、脂肪酸アミド加水分解酵素、エステラーゼ、シトクロムＰ４５０、メチオニンアミノペプチダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される。複数の実施形態において、各反応性酵素は、クチナーゼ、ハロアルカン脱水素酵素ＨａｌｏＴａｇ、Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ変異体、ＳｎａｐＴａｇ、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメイン、ベータラクタマーゼ、グリコシダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される。複数の実施形態において、各反応性酵素は、クチナーゼ、ハロアルカン脱水素酵素ＨａｌｏＴａｇ、Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ変異体、ＳｎａｐＴａｇ、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される。
【００３１】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素と第２の融合タンパク質反応性酵素とは異なる。複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は同じである。複数の実施形態において、第１の融合タンパク質親和性試薬と第２の融合タンパク質親和性試薬とは異なる。複数の実施形態において、第１の融合タンパク質親和性試薬および第２の融合タンパク質親和性試薬は同じである。場合によっては、複数の実施形態において、各親和性試薬は、抗体またはそのフラグメント、小分子、モノボディ、タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される。
【００３２】
複数の実施形態において、親和性試薬と反応性酵素との融合タンパク質は、反応性酵素を親和性試薬へ結合させるための従来の合成化学技術によって形成される。いくつかの場合において、親和性試薬がタンパク質または抗体を含む場合、融合タンパク質は、親和性試薬および反応性酵素をコードするポリヌクレオチド配列を発現させることによって生成される。いくつかの態様において、本開示は、プロモーターへ作用可能に連結されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらなる態様において、本開示は、ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞である。関連する実施形態において、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。なおさらなる実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。さらなる態様において、本明細書に開示される融合タンパク質を生成する方法が提供され、この方法は、ポリペプチドの発現を誘導するのに適切な条件下で本開示の宿主細胞を培養するステップを含む。関連する実施形態において、ポリペプチドが単離される。
【００３３】
親和性試薬
本開示のコンストラクトは、融合タンパク質へ官能性を提供する親和性試薬を含む融合タンパク質を含む。したがって、正確に規定された構造および機能を有する第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを含むコンストラクトを組み立てることができる。親和性試薬を介して融合タンパク質に付与される官能性の例としては、循環中もしくは細胞表面上にある疾患関連タンパク質の標的化の強化、細胞傷害性の亢進、免疫調節、薬物送達、造影剤としての使用、診断薬としての使用、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
第１の親和性試薬および第２の親和性試薬は同じであっても異なっていてもよい。各親和性試薬は、抗体またはそのフラグメント、小分子、モノボディ、タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択することができる。
【００３５】
複数の実施形態において、親和性試薬は、抗体またはそのフラグメントを含む。抗体またはそのフラグメントは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。抗体またはそのフラグメントは、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体であり得る。抗体またはそのフラグメントの例としては、トラスツズマブまたはそのフラグメント、ラクシバカマブまたはそのフラグメント、トシリズマブまたはそのフラグメント、ブレンツキシマブまたはそのフラグメント、オファツムマブまたはそのフラグメント、ベリムマブまたはそのフラグメント、ラムシルマブまたはそのフラグメント、ベドリズマブまたはそのフラグメント、オビヌツズマブまたはそのフラグメント、ペンブロリズマブまたはそのフラグメント、ラニビズマブまたはそのフラグメント、ペルツズマブまたはそのフラグメント、デノスマブまたはそのフラグメント、カツマキソマブまたはそのフラグメント、ゴリムマブまたはそのフラグメント、シルツキシマブまたはそのフラグメント、ナタリズマブまたはそのフラグメント、パニツムマブまたはそのフラグメント、およびデノスマブまたはそのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
複数の実施形態において、親和性試薬は小分子を含む。小分子は薬物であり得る。小分子薬物の例としては、アルデスロイキン、アレンドロン酸、アルファフェロン、アリトレチノイン、アロプリノール、アロプリム、アロキシ、アルトレタミン、アミノグルテチミド、Ｌ型アスパラギナーゼ、アミホスチン、アムルビシン、アムサクリン、アナストロゾール、アンズメット、アラネスプ、アルグラビン、三酸化ヒ素、アロマシン、５−アザシチジン、アザチオプリン、ＢＣＧまたはタイスＢＣＧ、ベスタチン、ベタメタゾンアセタート、リン酸ベタメタゾンナトリウム、ベキサロテン、硫酸ブレオマイシン、ブロクスウリジン、ボルテゾミブ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルシトニン、キャンパス、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、カソデックス、セフェゾン、セルモロイキン、セルビジン、クロランブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、クラドリビン、クロドロン酸、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノキソーム、デカドロン、デカドロンホスファート、デレストロゲン、デニロイキンジフチトクス、デポメドロール、デスロレリン、デキサラゾキサン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、ジフルカン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロナビノール、ＤＷ−１６６ＨＣ、エリガード、エリテック、エレンス、エメンド、エピルビシン、エポエチン−アルファ、エポゲン、エプタプラチン、エルガミソール、エストラース、エストラジオール、リン酸エストラムスチンナトリウム、エチニルエストラジオール、エチオール、エチドロン酸、エトポホス、エトポシド、ファドロゾール、ファルストン、フィルグラスチム、フィナステリド、フリグラスチム、フロクスウリジン、フルコナゾール、フルダラビン、フルダラビンホスファート、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロデオキシウリジンモノホスファート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルオキシメステロン、フルタミド、ヘキサメチルメラミン、ホルメスタン、ホステアビン（ｆｏｓｔｅａｂｉｎｅ）、ホテムスチン、フルベストラント、ガンマガード、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、グリベック、グリアデル、ゴセレリン、グラニセトロン、塩酸、ヒストレリン、ヒカムチン、ヒドロコルトン、エリスロ−ヒドロキシノニルアデニン、ヒドロキシ尿素、ヒドロキシプロゲステロンカプロアート、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−アルファ２、インターフェロン−アルファ２α、インターフェロン−アルファ２β、インターフェロン−アルファｎ１、インターフェロン−アルファｎ３、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ１α、インターロイキン２、イントロンＡ、イレッサ、イリノテカン、キトリル、レンチナンスルファート、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、ロイプロリドアセタート、レバミソール、レボホル酸（ｌｅｖｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）カルシウム塩、レボトロイド、レボキシル、ロムスチン、ロニダミン、マリノール、メクロレタミン、メコバラミン、メドロキシプロゲステロ���アセタート、メゲストロールアセタート、メルファラン、メネスト、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトビクス、ミルテホシン、ミノシクリン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、モドレナル、ミオセト、ネダプラチン、ニューラスタ、ニューメガ、ニューポゲン、ニルタミド、ノルバデックス、ＮＳＣ−６３１５７０、ＯＣＴ−４３、オクトレオチド、塩酸オンダンセトロン、オラプレッド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペディアプレド、ペガスパルガーゼ、ペガシス、ペントスタチン、Ｎ−ホスホノアセチルＬ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ピシバニル、ピロカルピンヒドロクロリド、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレマリン、プロカルバジン、プロクリット、ラルチトレキセド、レビフ、レニウム−１８６エチドロナート、リツキシマブ、ロフェロンＡ、ロムルチド、サラゲン、サンドスタチン、サルグラモスチム、セムスチン、シゾフラン、ソブゾキサン、ソルメドロール、ストレプトゾシン、ストロンチウム−８９クロリド、シンスロイド、タモキシフェン、タムスロシン、タソネルミン、タストラクトン、タキソテル、テセロイキン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロンプロピオナート、テストレッド、チオグアニン、チオテパ、チロトロピン、チルドロン酸、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、タスツズマブ、テオスルファン、トレイノイン、トレキサオール、トリメチルメラミン、トリメトレキサート、トリプトレリンアセタート、トリプトレリンパモアート、ＵＦＴ、ウリジン、バルルビシン、ベスナリノン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビルリジン、ジンカード、ジノスタチン−スチマラメル、ゾフラン、ＡＢＩ−００７、アコルビフェン、アクチムン、アフィニタク、アミノプテリン、アルゾキシフェン、アソプリスニル、アタメスタン、アトラセンタン、アバスチン、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）、ＣＣＩ−７７９、ＣＤＣ−５０１、セレブレクス、セツキシマブ、クリスナトール、シプロテロンアセタート、デシタビン、ＤＮ−１０１、ドキソルビシン−ＭＴＣ、ｄＳＬＩＭ、デュタステリド、エドテカリン、エフロルニチン、エキサテカン、フェンレチニド、ヒスタミンジヒドロクロリド、ヒストレリンヒドロゲルインプラント、ホルミウム１６６ＤＯＴＭＰ、イバンドロン酸、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−ＰＥＧ、イキサベピロン、キーホールリンペットヘモシアニン、Ｌ−６５１５８２、ランレオチド、ラソホキシフェン、リブラ、ロナファルニブ、ミプロキシフェン、ミノドロン酸、ＭＳ−２０９、リポソームＭＴＰ−ＰＥ、ＭＸ−６、ナファレリン、ネモルビシン、ネオバスタット、ノラトレキセド、オブリメルセン、オンコ−ＴＣＳ、オシデム、パクリタキセルポリグルタミマート、パミドロン酸二ナトリウム、ＰＮ−４０１、ＱＳ−２１、クアゼパム、Ｒ−１５４９、ラロキシフェン、ランピルナス、１３−シス−レチン酸、サトラプラチン、セオカルシトール、Ｔ−１３８０６７、タルセバ、タキソプレキシン、チモシン−アルファ−１、チアゾフリン、チピファルニブ���チラパザミン、ＴＬＫ−２８６、トレミフェン、トランスＭＩＤ−１０７Ｒ、バルスポダール、バプレオチド、バタラニブ、ベルテポルフィン、ビンフルニン、Ｚ−１００、ゾレドロン酸およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３７】
複数の実施形態において、親和性試薬はタンパク質を含む。複数の実施形態において、タンパク質は、天然タンパク質、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ファージ中のタンパク質、治療用タンパク質、合成抗体ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。複数の実施形態において、タンパク質は、非天然アミノ酸、ファージ中のタンパク質、治療用タンパク質、合成抗体ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３８】
複数の実施形態において、親和性試薬は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ＨＥＬ４  Ｖｈドメイン（Ｐｒｅｄａｔｏｒ）、ブドウ球菌タンパク質Ａ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）のＺドメイン、古細菌「７ｋＤａ  ＤＮＡ結合剤」タンパク質ファミリー（Ａｆｆｉｔｉｎ）、炭水化物結合分子（ＣＢＤドメイン）、シスチンノットミニタンパク質（ｋｎｏｔｔｉｎ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（モノボディ、Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、γ−Ｂ−クリスタリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）、シスタチン（Ａｆｆｉｍｅｒ）、三重らせんコイルドコイルドメイン（Ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、リポカリンドメイン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、種々の膜受容体のＡドメイン（Ａｖｉｍｅｒ）、ＦｙｎのＳＨ３ドメイン（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３９】
反応性酵素
本開示の融合タンパク質は、リンカー上に存在する反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基へカップリングすることができる反応性酵素を含む。したがって、正確に規定された構造を有する第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを含むコンストラクトは、融合タンパク質反応性酵素の活性部位残基に選択的にカップリングする合成リンカーを使用するモジュール式アプローチを用いて組み立てることができる。
【００４０】
第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は、同じであっても異なっていてもよい。各反応性酵素は、クチナーゼ、ＳｎａｐＴａｇ、ＨａｌｏＴａｇ、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメイン、ベータ−ラクタマーゼ、グリコシダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメイン、アルカリホスファターゼ、タンパク質−チロシン−フソファターゼ（ｐｈｓｏｐｈａｔａｓｅ）、２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体、グルコシダーゼ、Ｎ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼ、Ｎ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、ゼラチナーゼＢ、ゼラチナーゼＡ、ストロメリシン、脂肪酸アミド加水分解酵素、エステラーゼ、シトクロムＰ４５０、メチオニンアミノペプチダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択することができる。
【００４１】
複数の実施形態において、各反応性酵素は、クチナーゼ、ＨａｌｏＴａｇ、ＳｎａｐＴａｇ、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメイン、ベータラクタマーゼ、グリコシダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される。複数の実施形態において、各反応性酵素は、クチナーゼ、ＨａｌｏＴａｇ、ＳｎａｐＴａｇ、およびこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される。
【００４２】
複数の実施形態において、反応性酵素は、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのモビリティクラス（ＭＯＢ）リラクサーゼドメインである。Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのＭＯＢリラクサーゼドメインは、リラクサーゼタンパク質もコードする移動性プラスミド内に位置する小さな同族のトランスファー起点（ｏｒｉＴ）ＤＮＡ配列に共有結合する酵素である。このような酵素は、特定のヌクレオチド残基でｏｒｉＴ  ＤＮＡ配列を切断し、切断点でｏｒｉＴ  ＤＮＡ配列に共有結合する。Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのＭＯＢリラクサーゼドメインは、ファミリーによって特徴づけることができ、各ファミリーメンバーは類似の構造および機序を有する。Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼファミリーの既知のＭＯＢリラクサーゼドメインの例としては、ＭＯＢＦ、ＭＯＢＨ、ＭＯＢＱ、ＭＯＢＣ、ＭＯＢＰ、およびＭＯＢＶが挙げられる。各リラクサーゼファミリーのメンバーについてのＯｒｉＴ配列は、各リラクサーゼタンパク質配列が由来する移動性プラスミドに特異的である。リラクサーゼファミリーおよびその関連プラスミドの既知の例としては、ＭＯＢＦファミリー：ｐＦ、ｐＲ１００、ｐＲ３８８、ｐＷＷＯ、ｐＭＦＬＶ０２、ｐＲＥＢ５、ｐＲＥＣ１、およびｐＮＡＣ３；ＭＯＢＨファミリー：ｐＲ２７、ｐＣＡＲ１、ｐＳＸＴ、ｐＩＰ１２０２、ｐＭＯＬ２８、およびｐＰＮＡＰ０１；ＭＯＢＣファミリー：ｐＣｌｏＤＦ１３、ｐ２３０２３、ｐＣＲＹ、ｐＡＤ１、ｐＳＫＵ１４６．２、ｐＬＭ７、およびｐＳｔ０；ＭＯＢＱファミリー：ｐＲＳＦ１０１０、ｐＰＲＯ２、ｐＴｉ、ｐＡｔ、ｐＧＯＸ３、ｐＷＣＦＳ１０３、ｐＢＭ３００、ｐＣＡＵＬ０１、ｐＴＢ３、ｐＫＪ５０、およびｐＲＦ；ＭＯＢＰファミリー：ｐＲＰ４、ｐＥＳＴ４０１１、ｐＢＩ１０６３、ｐＲ６４、ｐＥＴ４６、ｐＡＣＲＹ０４、ｐＲＡＳ３、ｐＶｉｒＤ２ｐＴｉ、ｐＣｏｌＥ１、ｐＲＡ３、ｐＶＴ７４５、ｐＣＰ１３、ｐＦＭＣ、ｐＲＰ４、ｐＲ６４、ｐＫ、ｐＲＡＹ、ｐＣＨ４、ｐＥＴ３５、ｐＮＰ４０、ｐＣＦ１０、ｐＶｉｒ、ｐＢＯＴ３５０２、ｐＭＤ１３６、ｐＣＩＺ２、ｐＳ１９４、ｐＳＫ６３９、およびｐＲＪ９；ならびにＭＯＢＶファミリー：ｐＭＶ１５８、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＢＢＲ１、ｐＴｎ５５２０、ｐＴｎ４５５５、ｐＩｎｃＵ、およびｐＩｎｃＸが挙げられ、ここで下付き文字「ｐ」はプラスミドを表す。
【００４３】
リンカー
リンカーは、少なくとも第１の末端と第２の末端とを含む。リンカーはさらに、第１の末端に、融合タンパク質を不可逆的に阻害することに特異的な第１の官能基を含む。リンカーはさらに、第２の末端に、融合タンパク質を不可逆的に阻害することに特異的な第２の官能基を含む。
【００４４】
複数の実施形態において、リンカーは、含窒素Ｃ３〜７複素環、ポリオキサゾリン、ポリアクリロモルホリン（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（「ＰＨＦ」）、ポリヒドロキシアルキルアクリラート（例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、２−メチアクリロイルオキシ（ｍｅｔｈｙａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスファート（「ＭＰＣ」）、またはこれらの組み合わせをさらに含む。例えば、リンカーは、ポリオキサゾリン、ポリアクリロモルホリン（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ＰＨＦ、ポリヒドロキシアルキルアクリラート、またはＭＰＣを含むことができる。
【００４５】
複数の実施形態において、リンカーは、
【化２】
2019530685.tif 000003
から選択される基を含む。
式中、
ｍは０〜１０であり、
ｎは１〜１００であり、
各ｐは独立して０、１、２、３、または４であり、
ｑは０、１、または２であり、
ｒは１または２であり、
ＥはＯ、ＮＨまたはＣＨＲ１０であり、
ＧはＯ、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、ＣＨＮＨ２、ＣＨＣＯＯＨ、またはＣＨＳＯ３Ｈであり、
Ｒ１０はＯＨ、ＮＨ２またはＣＯＯＨであり、かつ
各Ｒ１１は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２またはＣＯＯＨである。
【００４６】
複数の実施形態において、リンカーは
【化３】
2019530685.tif 000004
を含む。いくつかの実施形態において、ＥはＯである。種々の実施形態において、ＥはＮＨである。いくつかの実施形態では、ＥはＣＨＲ１０である。例えば、ＥはＣＨＯＨ、ＣＨＮＨ２、ＣＨＣＯＯＨ、またはＣＨＳＯ３Ｈを含むことができる。これらの実施形態において、ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であることができる。例えば、ｍは１、２、３、４、または５であることができる。いくつかの実施形態において、ｍは１、２、または３である。種々の実施形態において、ｎは、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。
【００４７】
複数の実施形態において、リンカーは
【化４】
2019530685.tif 000005
を含む。いくつかの場合において、ｐは１、２、または３である（例えば、１または２）。例えば、リンカーは、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはガンマ−グルタミン酸を含むことができる。種々の実施形態において、ｎは、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。
【００４８】
複数の実施形態では、リンカーは
【化５】
2019530685.tif 000006
を含む。いくつかの場合において、ｐは０、１、２、または３である（例えば、１または２）。種々の実施形態において、ｎは、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。
【００４９】
複数の実施形態において、リンカーは
【化６】
2019530685.tif 000007
を含む。複数の実施形態において、ＧはＯである。ＧがＯである複数の実施形態において、各Ｒ１１は独立して、ＨまたはＯＨであることができる。複数の実施形態において、ＧはＣＨ２である。ＧがＣＨ２である複数の実施形態において、各Ｒ１１は独立して、ＨまたはＯＨであることができ、ただし、少なくとも１つのＲ１１がＯＨであることを条件とする。複数の実施形態において、各Ｒ１１はＯＨである。ＧがＣＨ２である種々の実施形態において、各Ｒ１１は独立してＨまたはＮＨ２であることができ、ただし、少なくとも１つのＲ１１がＮＨ２であることを条件とする。ＧがＣＨ２である種々の実施形態において、各Ｒ１１は独立してＨまたはＣＯＯＨであることができ、ただし、少なくとも１つのＲ１１がＣＯＯＨであることを条件とする。複数の実施形態において、ＧはＣＨＯＨである。ＧがＣＨＯＨである複数の実施形態において、各Ｒ１１は独立してＨまたはＯＨであることができる。複数の実施形態において、各Ｒ１１はＯＨである。複数の実施形態において、ＧはＣＨＮＨ２である。ＧがＣＨＮＨ２である複数の実施形態において、各Ｒ１１は独立してＨまたはＮＨ２であることができる。複数の実施形態において、ＧはＣＨＣＯＯＨである。ＧがＣＨＣＯＯＨである複数の実施形態において、各Ｒ１１は独立してＨまたはＣＯＯＨであることができ、ただし、少なくとも１つのＲ１１がＣＯＯＨであることを条件とする。これらの実施形態において、ｎは、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。
【００５０】
複数の実施形態において、リンカーは、含窒素Ｃ３〜７複素環（例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン）、ポリアルキレンジアミン（例えば、ポリエチレンジアミン、ポリプロピレンジアミン、ポリブチレンジアミン）、負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、ガンマ−グルタミン酸）、または糖（例えば、単糖、多糖、イノシトール、またはポリシアル酸）を含む。
【００５１】
複数の実施形態において、リンカーは、ポリアルキレンオキシドを含む。ポリアルキレンオキシドは、直鎖状であっても分枝状であってもよい。例えば、リンカーは、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４０、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ１５０、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ２０００）、ポリプロピレングリコール、またはポリブチレングリコールを含むことができる。ポリアルキレンオキシドは、約３０〜約５０００（例えば、約３０〜４５００、約３０〜４０００、約３０〜３５００、約３０〜３０００、約３０〜２５００、約３０〜２０００、約３０〜１５００、約３０〜１０００、約４６〜１０００、約４６〜７５０、約４６〜５００、約４６〜２５０、または約４６〜１００）の分子量を有することができる。ポリエチレンオキシドスペーサーは、その末端の片方または両方に反応性官能基を有するおよび有さないものが、当該技術分野において十分に既知であり、例えば、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、ＰｉｅｒｃｅＮｅｔ、およびＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈを通じて市販されている。
【００５２】
第１および第２の末端の官能基を通して、リンカーは、少なくとも２価の抗体コンストラクトを提供するために、穏和な条件下で部位特異的に、高い収率で、急速な動態で、融合タンパク質反応性酵素と反応する。リンカー末端の官能基は、反応性酵素を不可逆的に阻害する何らかの官能基であり得る。
【００５３】
官能基の例としては、ｐ−ニトロフェニルホスホナート、Ｏ６−ベンジルグアニン、α−ハロアルカンまたはその誘導体、ハロ芳香族化合物またはその誘導体、クラブラン酸またはその誘導体などのベータ−ラクタムまたはその誘導体、アグリコンまたはその誘導体、ヒドロキサム酸−ベンゾフェノンまたはその誘導体、同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列、システイン反応性ＡＴＰ結合部位阻害剤、キノンメチドまたはその誘導体、α−ハロホスホン酸またはその前駆体もしくは誘導体、ホルミルクロモンまたはその誘導体、同族のＲＮＡ配列、アデノシンまたはその誘導体、シトシンまたはその誘導体、同族のＤＮＡのニッキング部位、チイランまたはその誘導体、ヒドロキサム酸またはその誘導体、α−ケトキサゾール阻害剤またはその誘導体、求電子ステロイド、ホスホナート、カルバマート、芳香族アルキン、ベロラニブまたはその誘導体、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５４】
複数の実施形態において、官能基は、ｐ−ニトロフェニルホスホナート、Ｏ６−ベンジルグアニン、α−ハロアルカンまたはその誘導体、ハロ芳香族化合物またはその誘導体、クラブラン酸またはその誘導体などのベータ−ラクタムまたはその誘導体、ヒドロキサム酸−ベンゾフェノンまたはその誘導体、同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。複数の実施形態において、官能基は、ｐ−ニトロフェニルホスホナート、Ｏ６−ベンジルグアニン、α−ハロアルカンまたはその誘導体、ハロ芳香族化合物またはその誘導体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５５】
複数の実施形態において、官能基は、同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列である。この実施形態の改良において、同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１）、５’−ＴＴＴＧＣＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴ−３’（配列番号２）、５’−ＴＴＴＧＣＧＴＡＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴ−３’（配列番号３）、５’−ＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＣＧＴＡＴＴＧＴＣＴＡＴＡＧＣＣＣＡＧＡＴＴＴＡＡＧＧＡ−３’（配列番号４）、５’−ＣＣＡＴＴＴＣＴＣＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＡＴＧＣＧＣＣＣＴ−３’（配列番号５）、５’−ＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＡＧＴＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＡ−３’（配列番号６）、５’ＡＣＧＴＴＴＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＧＴＣＴＡＡＧＴＧＣＧＣＣＣＴ−３’（配列番号７）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５６】
複数の実施形態において、融合タンパク質反応性酵素はＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメインであり、官能基は同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列である。複数の実施形態において、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメイン（各リラクサーゼタンパク質配列について移動性プラスミドによって特定される）／同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列対は、ｐＲ１００／５’−ＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１）、ｐＦ／５’−ＴＴＴＧＣＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴ−３’（配列番号２）、ＴｒａＩＰ３０７／５’−ＴＴＴＧＣＧＴＡＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴ−３’（配列番号３）、ｐＲ３８８／５’−ＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＣＧＴＡＴＴＧＴＣＴＡＴＡＧＣＣＣＡＧＡＴＴＴＡＡＧＧＡ−３’（配列番号４）、ｐＲ１１６２／５’−ＣＣＡＴＴＴＣＴＣＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＡＴＧＣＧＣＣＣＴ−３’（配列番号５）、ｐＭｏｂＭＮ１９９／５’−ＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＡＧＴＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＡ−３’（配列番号６）、ｐＳＣ１０１／５’ＡＣＧＴＴＴＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＧＴＣＴＡＡＧＴＧＣＧＣＣＣＴ−３’（配列番号７）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５７】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はクチナーゼを含み、第１の末端の官能基はｐ−ニトロフェニルホスホナートを含む。
【００５８】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はＳｎａｐＴａｇを含み、第１の末端の官能基はＯ６−ベンジルグアニンを含む。
【００５９】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はＨａｌｏＴａｇを含み、第１の末端の官能基はα−クロロアルカンを含む。
【００６０】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はベータ−ラクタマーゼを含み、第１の末端の官能基はベータ−ラクタムまたはその誘導体を含む。
【００６１】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はグリコシダーゼを含み、第１の末端の官能基はアグリコンまたはその誘導体を含む。
【００６２】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はマトリックスメタロプロテイナーゼを含み、第１の末端の官能基はヒドロキサム酸−ベンゾフェノンまたはその誘導体を含む。
【００６３】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメインを含み、第１の末端の官能基は、同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメインを含み、第１の末端の官能基は、システイン反応性ＡＴＰ結合部位阻害剤を含む。
【００６５】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は、アルカリホスファターゼを含み、第１の末端の官能基は、キノンメチド、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、それらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００６６】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は、タンパク質−チロシン−ホスファターゼを含み、第１の末端の官能基は、ホルミルクロモン、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００６７】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体を含み、第１の末端の官能基は同族のＲＮＡ配列を含む。
【００６８】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はグルコシダーゼを含み、第１の末端の官能基はアグリコンまたはその誘導体を含む。
【００６９】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はＮ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、第１の末端の官能基はアデノシンまたはその誘導体を含む。
【００７０】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はＮ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、第１の末端の官能基はシトシンまたはその誘導体を含む。
【００７１】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼを含み、第１の末端の官能基はシトシンまたはその誘導体を含む。
【００７２】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体を含み、第１の末端の官能基は、ハロアルカン、ハロ芳香族化合物、またはその誘導体からなる群から選択される官能基を含む。
【００７３】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はＨＮＨエンドヌクレアーゼを含み、第１の末端の官能基は同族のＤＮＡニッキング部位を含む。
【００７４】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は、ニッキングエンドヌクレアーゼを含み、第１の末端の官能基は、同族のＤＮＡニッキング部位を含む。
【００７５】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はゼラチナーゼＢを含み、第１の末端の官能基は、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００７６】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はゼラチナーゼＡを含み、第１の末端の官能基は、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００７７】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は、ストロメリシンを含み、第１の末端の官能基は、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００７８】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素は、脂肪酸アミド加水分解酵素を含み、第１の末端の官能基は、α−ケトキサゾール阻害剤またはその誘導体を含む。
【００７９】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はエステラーゼを含み、第１の末端の官能基は、ホスホナート、カルバマート、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００８０】
複数の態様において、第１の融合タンパク質反応性酵素はシトクロムＰ４５０を含み、第１の末端の官能基は、求電子ステロイド、芳香族アルキン、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００８１】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素はメチオニンアミノペプチダーゼを含み、第１の末端の官能基はベロラニブまたはその誘導体を含む。
【００８２】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はクチナーゼを含み、第２の末端の官能基はｐ−ニトロフェニルホスホナートを含む。
【００８３】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はＳｎａｐＴａｇを含み、第２の末端の官能基はＯ６−ベンジルグアニンを含む。
【００８４】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はＨａｌｏＴａｇを含み、第２の末端の官能基はα−クロロアルカンを含む。
【００８５】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はベータ−ラクタマーゼを含み、第２の末端の官能基はベータ−ラクタムまたはその誘導体を含む。
【００８６】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はグリコシダーゼを含み、第２の末端の官能基はアグリコンまたはその誘導体を含む。
【００８７】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、マトリックスメタロプロテイナーゼを含み、第２の末端の官能基は、ヒドロキサム酸−ベンゾフェノンまたはその誘導体を含む。
【００８８】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素がＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼのリラクサーゼドメインを含み、第２の末端の官能基が同族のｏｒｉＴオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００８９】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメインを含み、第２の末端の官能基は、システイン反応性ＡＴＰ結合部位阻害剤を含む。
【００９０】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、アルカリホスファターゼを含み、第２の末端の官能基は、キノンメチド、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００９１】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、タンパク質−チロシン−ホスファターゼを含み、第２の末端の官能基は、ホルミルクロモン、α−ハロホスホン酸、これらの前駆体、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【００９２】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は２３ＳｒＲＮＡ（アデニン（２５０３）−Ｃ（２））−メチルトランスフェラーゼの変異体を含み、第２の末端の官能基は同族のＲＮＡ配列を含む。
【００９３】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はグルコシダーゼを含み、第２の末端の官能基はアグリコンまたはその誘導体を含む。
【００９４】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はＮ−６アデニン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、第２の末端の官能基はアデノシンまたはその誘導体を含む。
【００９５】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はＮ（４）−シトシン特異的ＤＮＡメチラーゼを含み、第２の末端の官能基はシトシンまたはその誘導体を含む。
【００９６】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼを含み、第２の末端の官能基はシトシンまたはその誘導体を含む。
【００９７】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、ハロアルカンデハロゲナーゼの変異体を含み、第２の末端の官能基は、ハロアルカン、ハロ芳香族化合物、またはその誘導体からなる群から選択される官能基を含む。
【００９８】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はＨＮＨエンドヌクレアーゼを含み、第２の末端の官能基は同族のＤＮＡニッキング部位を含む。
【００９９】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、ニッキングエンドヌクレアーゼを含み、第２の末端の官能基は、同族のＤＮＡニッキング部位を含む。
【０１００】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、ゼラチナーゼＢを含み、第２の末端の官能基は、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【０１０１】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、ゼラチナーゼＡを含み、第２の末端の官能基は、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【０１０２】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、ストロメリシンを含み、第２の末端の官能基は、チイラン、ヒドロキサム酸、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【０１０３】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素は、脂肪酸アミド加水分解酵素を含み、第２の末端の官能基は、α−ケトキサゾール阻害剤またはその誘導体を含む。
【０１０４】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はエステラーゼを含み、第２の末端の官能基は、ホスホナート、カルバマート、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【０１０５】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はシトクロムＰ４５０を含み、第２の末端の官能基は、求電子ステロイド、芳香族アルキン、これらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。
【０１０６】
複数の実施形態において、第２の融合タンパク質反応性酵素はメチオニンアミノペプチダーゼを含み、第２の末端の官能基はベロラニブまたはその誘導体を含む。
【０１０７】
コンストラクトを調製する方法
本開示の別の態様は、（ａ）親和性試薬と反応性酵素とを含む第１の融合タンパク質を、第１の末端で第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基を含むリンカーと接触させ、それによって第１の融合タンパク質とリンカーとを第１の末端でカップリングさせることと、（ｂ）親和性試薬と反応性酵素とを含む第２の融合タンパク質をリンカーの第２の末端と接触させることと、を含む方法であって、リンカーの第２の末端が、第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害し、それによって第２の融合タンパク質とリンカーとを第２の末端でカップリングさせることに特異的な官能基を含む、方法を提供する。
【０１０８】
本明細書で使用する場合および他に指定しない限り、「カップリングした」、「カップリングする」または「カップリングすること」は、共有結合形成を包含し、例えば、共有結合形成を介して融合タンパク質はリンカー末端で官能基と不可逆的に会合する。
【０１０９】
本明細書に開示する方法は、部位特異的に反応性酵素と反応する、末端に官能基を有する小分子リンカーを用いるモジュール様式で、親和性試薬と反応性酵素とを含む融合タンパク質を、穏和な反応条件下で迅速な動態を用いて特異的に反応性酵素と結合する。
【０１１０】
本明細書に開示する方法は、例えば、治療用コンストラクトの非常に多様な集団がモジュール様式で生成されることのできる手段を提供する、１つ以上の利点を提供する。加えて、反応性アミノ酸を抗体足場上で直接操作／官能化する必要がないため、拡張された官能性を有する抗体フォーマットの調製は、本開示のコンストラクトを用いた場合、簡単である。さらに、融合タンパク質とリンカーとのカップリングの穏和な、迅速な、かつ部位特異的な性質により、多様なエフェクター分子を抗体フラグメントへ高収率で正確な化学量論で抗体様フラグメントから離れて結合させることができる。さらになお、毒素またはグリコシル化タンパク質などの抗体フラグメントを有する相同な宿主中で発現することができない分子は、種々の生物中で発現することができ、モジュール様式でコンストラクトへ結合することができる。モジュール式合成は、標準的なタンパク質工学／発現を使用して調製するには大き過ぎるまたは複雑過ぎる分子の作製を可能にするが、このような方法はポリペプチドを培養中の１つ以上の鎖として発現させる必要がある。
【０１１１】
化学結合モジュール式アプローチによって、可変性の化学量論、配向、および幾何学的構造の正確に定義されたタンパク質コンストラクトを生成する効率的な方法が可能となる。これらの属性は、リンカーに多様性をコードすることによって、および／またはリンカーへの融合タンパク質の結合の順序を変えることによって、系統的に変化させることができる。現行のタンパク質工学的方法は、所望のコンストラクトに達するための天然のポリペプチド折りたたみ／ペプチドリンカーの固有のレパートリーに限定される。それゆえ、従来の工学的方法を用いてより大きな効能を呈し得る非天然型フォーマットを調製することはできない。
【０１１２】
最後に、より小さな抗体様フラグメントの発現によって、抗体分子の工業的生産において典型的に使用される真核生物宿主に加えて、原核生物宿主における発現が可能となる。原核生物の堅牢性は、しばしば真核生物発現系の５倍である産物収率に加えて、より低コストの製造プラットフォームを可能にすることが十分に既知である。
【０１１３】
本開示の別の態様は、本開示の方法によって調製されるコンストラクトを提供する。
【０１１４】
複数の実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は順次（すなわち段階的に）実行される。複数の実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は同時に実施される（すなわち、ワンポット反応）。各親和性試薬および反応性酵素は、本明細書に開示される親和性試薬および反応性酵素のいずれかから選択することができる。第１の末端の官能基と第２の末端の官能基とを含むリンカーは、本明細書に開示されるリンカーおよび官能基のいずれかから選択することができる。
【０１１５】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は同じであり、リンカーの第１の末端で第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基は、リンカーの第２の末端で第２の融合タンパク質反応酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基と同じであり、ステップ（ａ）および（ｂ）を同時に実行する。
【０１１６】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は同じであり、リンカーの第１の末端で第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基は、リンカーの第２の末端における第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基とは異なっており、ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時に実行される。
【０１１７】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は異なり、リンカーの第１の末端で第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基は、リンカーの第２の末端の第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基と同じであり、ステップ（ａ）および（ｂ）は順次実行される。
【０１１８】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は異なり、リンカーの第１の末端で第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基は、リンカーの第２の末端の第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基とは異なっており、ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時に実行される。
【０１１９】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は異なり、リンカーの第１の末端の第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基は、リンカーの第２の末端の第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基とは異なり、ステップ（ａ）および（ｂ）は同時に実行される。
【０１２０】
複数の実施形態において、第１の融合タンパク質反応性酵素および第２の融合タンパク質反応性酵素は異なり、リンカーの第１の末端の第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基は、リンカーの第２の末端の第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基とは異なり、ステップ（ａ）および（ｂ）は順次実行される。
【０１２１】
本明細書に開示される方法は、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａおよび／または約３００ｋＤａより大きな分子量を有する分子の規模変更可能な調製を可能にする、および／または単に比較的少数の構築ブロックの組み合わせによって、変化した原子価、幾何学的配置、エフェクター機能、および化学量論を有する抗体様薬物の多様なライブラリーの作製など、１つ以上の利点を提供する。
【０１２２】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、生理学的ｐＨに緩衝された何らかの水溶液、例えばｐＨ７．４のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中で行うことができる。第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、およびリンカーの濃度は、概して、何らかの濃度であり得る。濃度は、第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、およびリンカーが、飽和溶液を形成することなく、選択された溶媒に完全に溶解するように典型的に選択される。リンカーが、第１の末端および第２の末端で酵素を不可逆的に阻害することに特異的な官能基のみを含む場合、第１の融合タンパク質とリンカーと第２の融合タンパク質との相対濃度は、少なくとも約１：１：１であり、１つの融合タンパク質あたり酵素リンカー末端を不可逆的に阻害することに特異的な１つの官能基を提供する。
【０１２３】
実施形態において、工程（ａ）および（ｂ）は周囲温度で実施される。温度は、融合タンパク質中に存在する任意のタンパク質を変性させるほど高くすべきではない。
【０１２４】
複数の実施形態において、コンストラクトは、固体支持体上に調製することができる。複数の実施形態において、ステップ（ａ）および／または（ｂ）の１つ以上の成分を固体支持体上に提供することができる。適切な固体支持体は当該技術分野において十分に既知である。
【０１２５】
コンストラクトを使用する方法
本開示の別の態様は、本開示のコンストラクトを必要とする患者へ、このコンストラクトを投与することを含む方法を提供する。本開示のさらに別の態様は、本開示のコンストラクトを必要とする患者のための薬剤としての使用を提供する。本開示の別の態様は、診断薬としての本開示のコンストラクトの使用を提供する。
【０１２６】
複数の実施形態において、患者は、乳癌、肺炭疽、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、再発性弛張性多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、胃もしくは胃食道接合部の腺癌、転移性非小細胞肺癌、潰瘍性大腸炎、クローン病、黒色腫、黄斑変性、骨粗鬆症、治療誘発性骨退縮、骨への転移、骨巨細胞腫、悪性腹水、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、転移性腎細胞癌、前立腺癌、卵巣癌、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、大腸癌およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１２７】
本明細書中で使用する場合および他に指定されない限り、「疾患」および「障害」は相互交換可能に用いられる。
【０１２８】
複数の実施形態では、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、トラスツズマブまたはそのフラグメント、ラクシバカマブまたはそのフラグメント、トシリズマブまたはそのフラグメント、ブレンツキシマブまたはそのフラグメント、オファツムマブまたはそのフラグメント、ベリムマブまたはそのフラグメント、ラムシルマブまたはそのフラグメント、ベドリズマブまたはそのフラグメント、オビヌツズマブまたはそのフラグメント、ペンブロリズマブまたはそのフラグメント、ラニビズマブまたはそのフラグメント、ペルツズマブまたはそのフラグメント、デノスマブまたはそのフラグメントカツマキソマブまたはそのフラグメント、ゴリムマブまたはそのフラグメント、シルツキシマブまたはそのフラグメント、ナタリズマブまたはそのフラグメント、パニツムマブまたはそのフラグメント、デノスマブまたはそのフラグメント、およびこれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【０１２９】
複数の実施形態において、患者は乳癌に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、トラスツズマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３０】
複数の実施形態において、患者は肺炭疽に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ラクシバカマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３１】
複数の実施形態において、患者は、関節リウマチまたは全身性若年性特発性関節炎に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、トシリズマブまたはその断片を含む。
【０１３２】
複数の実施形態において、患者は、ホジキンリンパ腫または全身性未分化大細胞リンパ腫に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ブレンツキシマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３３】
複数の実施形態において、患者は、慢性リンパ性白血病、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、関節リウマチ、および再発性弛張性多発性硬化症からなる群から選択される容態に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、オファツムマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３４】
複数の実施形態において、患者は、全身性エリテマトーデスに罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ベリムマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３５】
複数の実施形態において、患者は、胃もしくは胃食道接合部の腺癌または転移性非小細胞肺癌に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ラムシルマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３６】
複数の実施形態において、患者は、潰瘍性大腸炎またはクローン病に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ベドリズマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３７】
複数の実施形態において、患者は、慢性リンパ性白血病または濾胞性リンパ腫に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、オビヌツズマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３８】
複数の実施形態において、患者は、黒色腫または転移性非小細胞肺癌に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ペンブロリズマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１３９】
複数の実施形態において、患者は黄斑変性に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ラニビズマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４０】
複数の実施形態において、患者は乳癌に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ペルツズマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４１】
複数の実施形態において、患者は骨粗鬆症、治療誘発性骨退縮、骨への転移、および骨巨細胞腫からなる群から選択される容態に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントはデノスマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４２】
複数の実施形態において、患者は悪性腹水に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、カツマキソマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４３】
複数の実施形態において、患者は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される容態に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ゴリムマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４４】
複数の実施形態において、患者は、転移性腎細胞癌、前立腺癌、卵巣癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、およびキャッスルマン病からなる群から選択される容態に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、シルツキシマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４５】
複数の実施形態において、患者は多発性硬化症またはクローン病に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、ナタリズマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４６】
複数の実施形態において、患者は大腸癌に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、パニツムマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４７】
複数の実施形態において、患者は骨粗鬆症、治療誘発性骨退縮、骨への転移、および骨巨細胞腫からなる群から選択される容態に罹患しており、コンストラクトの少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントはデノスマブまたはそのフラグメントを含む。
【０１４８】
本開示に従ったコンストラクト、方法、および使用は、以下の実施例の観点においてより良好に理解することができ、これらの実施例は、単にコンストラクトを例示することが意図されており、これらの範囲を何らかの方法で限定することを決して意味していない。
【実施例】
【０１４９】
実施例１：トラスツズマブ由来のＦ（ａｂ）ドメインの遺伝子／タンパク質発現ベクター構築
モノクローナル抗体トラスツズマブ（以後「ＴＦａｂ（ｓ）」と呼ぶ）由来のＦ（ａｂ）ドメイン（軽鎖可変ＶＬ−軽鎖定常カッパ鎖Ｃκ、および重鎖可変ドメインＶＨ−重鎖定常ドメインＣＨ１）をコードする遺伝子を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてのコドンの最適化を用いて合成した。以下の８つの２シストロン性融合タンパク質を、制限酵素非含有ＰＣＲを用いて、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３２（ＩＢＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に基づくテトラサイクリン誘導性発現ベクター中に組み立てた：
１．「Ｎ末端クチナーゼ−ＶＬ融合体」−５’−ＲＢＳ１−ＡＴＧ−クチナーゼ−（ＥＡＡＡＫ）２−ＶＬＣＫ−＊＊−ＲＢＳ２−ＡＴＧ−ＶＨＣＨ１−ＬＶＰＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−＊＊−３’（配列番号８および９）
２．「Ｎ末端ＳｎａｐＴａｇ−ＶＬ融合体」−５’−ＲＢＳ１−ＡＴＧ−ＳｎａｐＴａｇ−（ＥＡＡＡＫ）２−ＶＬＣＫ−＊＊−ＲＢＳ２−ＡＴＧ−ＶＨＣＨ１−ＬＶＰＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−＊＊−３’（配列番号１０および１１）
３．「Ｃ末端クチナーゼ−ＣＫ融合体」−５’−ＲＢＳ１−ＡＴＧ−ＶＬＣＫ−（ＥＡＡＡＫ）２−クチナーゼ−＊＊−ＲＢＳ２−ＡＴＧ−ＶＨＣＨ１−ＬＶＰＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−＊＊−３’（配列番号１２および１３）
４．「Ｃ末端ＳｎａｐＴａｇ−ＣＫ融合体」−５’−ＲＢＳ１−ＡＴＧ−ＶＬＣＫ−（ＥＡＡＡＫ）２−ＳｎａｐＴａｇ−＊＊−ＲＢＳ２−ＡＴＧ−ＶＨＣＨ１−ＬＶＰＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−＊＊−３’（配列番号１４および１５）
５．「Ｎ末端クチナーゼ−ＶＨ融合体」−５’−ＲＢＳ１−ＡＴＧ−ＶＬＣＫ−＊＊−ＲＢＳ２−ＡＴＧ−クチナーゼ−（ＥＡＡＡＫ）２−ＶＨＣＨ１−ＬＶＰＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−＊＊−３’（配列番号１６および１７）
６．「Ｎ末端ＳｎａｐＴａｇ−ＶＨ融合体」−５’−ＲＢＳ１−ＡＴＧ−ＶＬＣＫ−＊＊−ＲＢＳ２−ＡＴＧ−ＳｎａｐＴａｇ−（ＥＡＡＡＫ）２−ＶＨＣＨ１−ＬＶＰＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−＊＊−３’（配列番号１８および１９）
７．「Ｃ末端クチナーゼ−ＣＨ１融合体」−５’−ＲＢＳ１−ＡＴＧ−ＶＬＣＫ−＊＊−ＲＢＳ２−ＡＴＧ−ＶＨＣＨ１−（ＥＡＡＡＫ）２−クチナーゼ−ＬＶＰＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−＊＊−３’（配列番号２０および２１）
８．「Ｃ末端ＳｎａｐＴａｇ−ＣＨ１融合体」−５’−ＲＢＳ１−ＡＴＧ−ＶＬＣＫ−＊＊−ＲＢＳ２−ＡＴＧ−ＶＨＣＨ１−（ＥＡＡＡＫ）２−ＳｎａｐＴａｇ−ＬＶＰＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−＊＊−３’（配列番号２２および２３）
【０１５０】
図１は、トラスツズマブＦ（ａｂ）（ＴＦａｂ）融合遺伝子／タンパク質コンストラクトを示す。Ａ）Ｃ末端重鎖融合体。Ｂ）Ｎ末端重鎖融合体。Ｃ）Ｃ末端軽鎖融合体。Ｄ）Ｎ末端軽鎖融合体。
【０１５１】
実施例２：タンパク質発現／精製
実施例１の８つのＴＦａｂ融合タンパク質をコードするベクターをＳｈｕｆｆｌｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。成長培地（５００ｍＬ×２×ＹＴ）、カルベニシリン（２００μｇ／ｍＬ）およびスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する発現培養物に、適切な発現カセットを有する細胞ストックの一晩培養液（５ｍＬ）を接種した。培養物を約０．８の光学分散（ＯＤ）に達するまで２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で生育させた。この時点で、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を２００ｎｇ／ｍＬの終濃度で培養物へ添加して、タンパク質発現を誘導した。発現相の間に２５０ｒｐｍで１４時間振盪しながら培養物を２４℃で維持した。
【０１５２】
発現後、遠心分離を介して細胞を収集し、ＤＮアーゼＩを含有するＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）３５ｍＬおよびＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を用いる化学的破壊を介して溶解した。細胞溶解物を遠心分離により破砕片を除去し、コバルトＩＭＡＣ樹脂（ベッド容積３ｍＬ）を含有するカラムへ添加した。溶解物を４℃で撹拌しながらビーズ上で１時間インキュベートした。この期間の後、ビーズをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で入念に洗浄し、次いで生成物をイミダゾール含有緩衝液（２０ｍＬ）で溶出した。次いで、タンパク質溶離液をタンパク質Ｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でまず精製した後、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）機器を介して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製した。ＦＰＬＣを介したカラム精製はすべて、製造元の示唆するプロトコルにより行った。純粋なタンパク質生成物を含有する画分をプールし、遠心濃縮器で濃縮した後、連結反応を行った。
【０１５３】
図２は、精製ＴＦａｂ−クチナーゼおよびＴＦａｂ−ＳｎａｐＴａｇ融合体のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。レーン１および２は、それぞれクチナーゼ（７２ｋＤａ）およびＳｎａｐＴａｇ（６９ｋＤａ）のＮ末端ＶＨ融合体の計算された分子量に近いバンドを示す。レーン３および４は、Ｃ末端ＶＨ融合体に由来するバンドを示す。レーン５および６ならびに７および８はそれぞれ、Ｃ末端ＣＫおよびＣＨ１融合体に由来するバンドを示す。
【０１５４】
したがって、実施例１および２は、親和性試薬（ＴＦａｂ）と反応性酵素（クチナーゼおよび／またはＳｎａｐＴａｇ）とを含む本開示の融合タンパク質の調製物を示す。
【０１５５】
実施例３：ＳｎａｐＴａｇ−ＴＦａｂ融合タンパク質を有するクチナーゼ−ＴＦａｂ融合タンパク質を接合するためのリンカーの調製
【化７】
2019530685.tif 000008
第１の末端のｐ−ニトロフェニルホスホナートと、第２の末端のＯ６−ベンジルグアニンと、エチレングリコールと、アミド単位とを含む、本開示によるリンカーを、以下に示す合成スキームにより調製した。
【０１５６】
１−アミノ−Ｎ−（４−（（（２−アミノ−９Ｈ−プリン−６−イル）オキシ）メチル）ベンジル）−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサヘニコサン−２１−アミド（１）。Ｆｍｏｃ−２１−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサヘネイコサン酸（ｈｅｘａｏｘａｈｅｎｅｉｃｏｓａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（５６７ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＴＨＦに溶解した。この溶液に、ＤＩＣ（１４９ｍｇ、１８３μＬ、１．１８ｍｍｏｌ）、続いてＮＨＳ（１３６ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩撹拌しておいた。回転式蒸発器で溶媒を除去し、得られた黄色の油状物を５ｍＬのＤＭＦに再懸濁した。この溶液に（４−アミノメチル）−Ｏ６−ベンジルグアニン（２６６ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２日間撹拌しておいた。この期間の後、ＤＭＦをＮ２気流下で一晩、反応物から除去した。次いで、得られた橙色の油状物を５ｍＬのＭｅＯＨ中２０％ピペリジンで処理し、室温で１時間撹拌しておいた。回転式蒸発器を用いて溶媒を除去し、得られた橙色油状物を１０ｍＬのＨ２Ｏに再懸濁させた。次いで、この溶液を遠心分離して不溶性材料をペレットにし、清澄化上清をＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  ４００  ＨＰＬＣを介して逆相Ｃ１８カラムへと５つの個別の部分で適用する。溶出は、脱イオン限外濾過水（ＤＩＵＦ）＋０．０１％ＴＦＡ中の７５％ＡＣＮの線形勾配を用いて、ＤＩＵＦ＋０．０１％ＴＦＡを移動相として、流量１０ｍＬ／分で６０分間かけて行った。次いで２０〜３５分の画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥して琥珀色の油状物（４２４ｍｇ、７１％）を得た。
【０１５７】
１−（４−４−（（（２−アミノ−９Ｈ−プリン−６−イル）オキシ）メチル）フェニル）−３，２５−ジオキソ−６，９，１２，１５，１８，２１−ヘキサオキサ−２，２４−ジアザオクタコサン−２８−酸（２）。化合物１（５０ｍｇ、８３μｍｏｌ）を２．５ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、この溶液に無水コハク酸（８．３ｍｇ、８３μｍｏｌ）を添加した。反応が完了した際（ＭＡＬＤＩ−ＭＳによってモニターして約３０分）、回転式蒸発器で溶媒を除去した。次いで、得られた琥珀色の油状物を、まず１０：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨを用いるシリカゲルクロマトグラフィーを介して精製して不純物を除去し、次いでＭｅＯＨで溶出してゴム状の琥珀色の固体（４２ｍｇ、７２％）を得た
【０１５８】
中間体（３）である１７−（エトキシ（４−ニトロフェノキシ）ホスホリル）−３，６，９，１２，１５−ペンタオキシヘプタデカン−１−アミニウムクロリドの調製は、その全体が参照により本明細書により援用されるＭｏｄｉｃａ，Ｊ．Ａ．ｅｔ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２  Ｎｏｖ  ５；１３（１６）：２３３１−４を参照されたい。
【０１５９】
エチル（４−ニトロフェニル）（１−（４−（（（２−アミノ−９Ｈ−プリン−６−イル）オキシ）メチル）フェニル）−３，２５，２８−トリオキソ−６，９，１２，１５，１８，２１，３２，３５，３８，４１，４４−ウンデカオキサ−２，２，２４，２９−トリアザヘキサテトラコンタン−４６−イル）ホスホナート（４）。化合物２（３９ｍｇ、５５μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した。この溶液に、ＰｙＢＯＰ（３４ｍｇ、５８μｍｏｌ）、続いてＮ−メチルモルホリン（５．６ｍｇ、６．１μＬ、５５μｍｏｌ）を加え、反応物を室温で３０分間撹拌しておいた。この期間の後、この混合物に２５０μＬのＤＭＦに溶解した化合物３（２９．３ｍｇ、５５μｍｏｌ）を添加し、続いてＮ−メチルモルホリン（１１．２ｍｇ、１２．２μＬ、１１０μｍｏｌ）を添加し、反応物を一晩（約１６時間）撹拌しておいた。この期間の後、混合物を、ＤＩＵＦを用いて５ｍＬに希釈し、この混合物を遠心分離して不溶性材料を除去した。次いで、清澄化した上清をＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  ４０００  ＨＰＬＣを介したＣ１８セミプレップスケールカラムに注入し、７５％ＡＣＮ水溶液＋０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いてＤＩＵＦ＋０．１％ＴＦＡを移動相として７０分間かけて流量１０ｍＬ／分で精製した。画分を１／分の速度で収集した。次いで、２５〜４０分の画分をＭＡＬＤＩにより分析した。純粋な生成物を含有するものをプールし、−８０℃で凍結し、凍結乾燥して黄色の油状物を得た。次いで、この油状物を、上述の手順を使用してさらに１回のＨＰＬＣ精製に付した。この試行からの純粋な画分をプールし、凍結し、および凍結乾燥して、淡黄色の油状物（１１ｍｇ、１７％）を得た。
【０１６０】
したがって、実施例３は、第１の末端の第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な第１の官能基と第２の末端の第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な第２の官能基とを含む本開示のリンカーの調製を示す。
【０１６１】
実施例４：ジ−ＴＦａｂコンストラクトの組み立て
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の実施例２由来の等量のクチナーゼ−ＴＦａｂ融合体（５μＭ）およびＳｎａｐＴａｇ−ＴＦａｂ融合体（５μＭ）ならびに実施例３由来のクチナーゼ−ＳｎａｐＴａｇリンカー（５μＭ）を混合し、４時間反応させておいた。反応後、生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【０１６２】
図５は、調製されたコンストラクトのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。８つのＴＦａｂと１つのリンカーとのプールから、１６個の二価類似体コンストラクトを作製することができる。
【０１６３】
したがって、実施例４は、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、リンカーと、を含む、本開示のコンストラクトのライブラリーの調製を示し、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質はそれぞれ、親和性試薬と反応性酵素とを含み、リンカーは、第１の末端の第１の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な第１の官能基と、第２の末端の第２の融合タンパク質反応性酵素を不可逆的に阻害することに特異的な第２の官能基とを含む。
【０１６４】
実施例５：細胞成長阻害アッセイ
トラスツズマブは、ＨＥＲ２＋乳癌の治療に採用される。２つのＨＥＲ２（＋＋＋）細胞株（ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３）、１つのＨＥＲ２（＋＋）細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−ＶＩＩ−１３５）および１つの対照細胞株ＡＴ−４３１（ＨＥＲ２−）を、確立されたプロトコルにより培養し、実施例４において調製したトラスツズマブまたは２価のトラスツズマブ類似体の１つを４ｐＭ〜４μＭの範囲の濃度で複数回投与して９６時間処理した。この期間後の生存率はＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。生存率は、未処置の対照に対する百分率値として計算した。
【０１６５】
これらの実験から、Ｂ−１３と命名された１つのコンストラクトが、トラスツズマブに対して最も好ましい細胞成長阻害およびＥＣ５０値を示した。細胞生存率実験をＢ−１３対トラスツズマブで再度行った。図４は、種々の細胞株におけるトラスツズマブおよびＢ−１３によるかなりの細胞成長阻害を示す細胞生存率アッセイデータを示す。Ａ）ＢＴ４７４細胞の成長阻害。Ｂ）ＳＫＢＲ３細胞の成長阻害。Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−１３５−ＶＩＩ細胞の成長阻害。Ｄ）トラスツズマブまたはＢ−１３に対する成長阻害を示さないＨＥＲ２（−）ＡＴ−４３１細胞を用いた対照実験。
【０１６６】
したがって、実施例５は、本開示のコンストラクトのライブラリーが生物学的使用、例えば細胞成長阻害についてどのようにアッセイされることができるかを示す。さらに、実施例５は、インビトロでの癌細胞生存率アッセイにおけるこのコンストラクトの細胞傷害性を示す。実施例３の融合タンパク質コンストラクトの組み立て方法は、多機能性抗体様治療用分子の調製をワンポット様式において可能にする。
【０１６７】
実施例６：Ｄｉ−ＴＦａｂコンストラクトのインビボでの薬物動態
Ｂ−１３コンストラクト（２ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＣＩＤベージュマウスに静脈内ボーラスとして、総用量１０ｍｇ／ｋｇで投与した。血液試料（約２００μＬ）を、投与後の種々の時点で尾静脈から採取した。合計３匹のマウス（ｎ＝３）を処置し、各時点について試料採取した。ＥＬＩＳＡ法を用いて、標準曲線比較を介して血清中のＢ１３の濃度を測定した。図５に示すように、これらのデータをプロットし、２区画（２指数関数的）薬物動態モデルに適合させて、０．２２時−１の排出速度定数および３．１時間の半減期を得た。
【０１６８】
したがって、実施例６は、本開示の融合タンパク質コンストラクトのインビボでの使用、および本開示のコンストラクトの薬物動態データを示す。
【０１６９】
実施例７−ＢＴ４７４腫瘍異種移植片を有するマウスに対するＢ−１３投与の効果
８週齢の雌ＳＣＩＤベージュマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、０．０２５ｍｇ、９０日間放出の１７βエストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。２日間後、２×１０６個のＢＴ４７４細胞を１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌとの１：１混合物を乳腺脂肪パッドに同所的に接種した。腫瘍が約１５０ｍｍ３の体積に達したら、等しい平均腫瘍体積を有する４つの処置コホート（ｎ＝５）へ２０匹の動物を無作為に割り当てた。１つのコホートにおいて、Ｂ１３を、週５回（月曜日〜金曜日）、４週間にわたって腹腔内（ＩＰ）注射により、合計２０回の５ｍｇ  ｋｇ−１用量で投与し、第２のコホートにおいては、Ｂ１３は２．５ｍｇ／ｋｇの用量で同じ経路および頻度を介して投与した。第３のコホートにおいては、ドキソルビシン（ｄｏｘ）を週２回、２．５ｍｇ／ｋｇで４週間にわたり合計８回の用量でＩＰ注射により投与した。対照コホートにビヒクル（ＰＢＳ＋０．００４％（ｗ／ｗ）ポリソルベート２０）を週に５回注射した。Ｂ１３およびｄｏｘ溶液は、両方とも同じビヒクル中に製剤された。Ｂ１３試料は、リムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）アッセイによって決定されるように、１．０未満のエンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬを含有していた。腫瘍寸法を２日ごとに順次測定し、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて体積を計算し、式中、Ｖ＝体積、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅であった。結果を図６に示す。
【０１７０】
Ｂ１３は、ＢＴ４７４マウス異種移植片モデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示す。さらに、Ｂ１３は、本研究において使用した２用量では、毒性の外部徴候を示さない。これは、処置コホートが有意な体重減少を示したｄｏｘとは対照的である。
【０１７１】
前述の説明は、理解の明瞭性のみのために与えられるものであり、本発明の範囲内の修正は当業者に明らかであり得るため、いかなる不要な限定もそこから理解されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2019530685000001.app
【国際調査報告】
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2019530685.tif 000018
2019530685.tif 000019