(57)【要約】  本発明は、分泌体液、排泄体液及び脳脊髄液からなる群から選択される体液を含む診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出するインビトロ方法に関する。この方法は、ａ）前記試料中に存在する１種以上の阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することができる１種以上のリガンドが少なくとも一部に接合した固相に前記試料を接触させる工程；ｂ）前記１種以上の阻害成分を前記固相表面に存在する１種以上のリガンドに結合させ、それにより前記試料中の前記１種以上の阻害成分の量を低減する工程、及びその後に、ｃ）前記診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出する工程を含む。前記１種以上の阻害成分は、工程ｃ）において結合しかつ検出を妨害する可能性があることを特徴とする。【選択図】図１
2019530873.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌体液、排泄体液及び脳脊髄液からなる群から選択される体液を含む診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）前記試料中に存在する１種以上の阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することができる、１種以上のリガンドが少なくとも一部に接合した固相に前記試料を接触させる工程、
ｂ）前記１種以上の阻害成分を前記固相表面に存在する１種以上のリガンドに結合させ、それにより前記試料中の前記１種以上の阻害成分の量を低減する工程、及びその後に、
ｃ）前記診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出する工程を含み、
前記１種以上の阻害成分は、工程ｃ）において結合しかつ検出を妨害する可能性があることを特徴とする、インビトロ方法。
【請求項２】
前記１種以上の阻害成分は複数種のタンパク質と複数種の炭水化物の混合物を含む、請求項１に記載のインビトロ方法。
【請求項３】
前記１種以上の阻害成分は５〜１０００ｋＤａの分子量を持つ、請求項２に記載のインビトロ方法。
【請求項４】
前記１種以上の阻害成分は少なくとも１種の糖タンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項５】
前記１種以上の阻害成分は、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン、グリコホリン−Ｃ、亜鉛−α−２−糖タンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項６】
前記１種以上の阻害成分は、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン及び亜鉛−α−２−糖タンパク質からなる群から選択される、請求項４に記載のインビトロ方法。
【請求項７】
工程ｂ）は、ｂ１）前記１種以上の阻害成分が結合している前記固相から前記１種以上の疾患関連成分を含む前記試料を分離する工程を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項８】
前記固相は、１種以上の前記リガンドが少なくとも一部に接合した１つ以上の粒子の表面である、請求項１〜７に記載のインビトロ方法。
【請求項９】
ステップｂ）は、前記生体試料から前記１つ以上の粒子を除去するステップｂ１）を更に含む、請求項７及び８に記載のインビトロ方法。
【請求項１０】
前記粒子はナノ粒子又はミクロ粒子である、請求項６又は７に記載のインビトロ方法。
【請求項１１】
前記粒子は磁性粒子又はラテックス粒子である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項１２】
前記粒子は磁石の使用によって前記体液から除去される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項１３】
前記粒子は遠心分離の使用によって前記体液から除去される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項１４】
前記粒子は、濾過の使用によって前記体液から除去される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項１５】
前記固相は、膜又は固体表面である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項１６】
工程ｃ）は、前記試料を抗疾患関連成分抗体（検出抗体）と接触させ、その後に前記診断試料中の抗疾患関連成分の存在を検出することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項１７】
工程ｃ）は、表面の少なくとも一部を抗疾患関連成分抗体で被覆された粒子を前記診断試料に加え、その後に前記診断試料中の抗疾患関連成分の存在を検出することを含む、請求項１６に記載のインビトロ方法。
【請求項１８】
前記検出は、化学試薬を加えることによって行われる、請求項１６又は１７に記載のインビトロ方法。
【請求項１９】
前記体液は、尿、痰、唾液、及び脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項２０】
前記体液は、尿、痰及び唾液からなる群から選択される、請求項１９に記載のインビトロ方法。
【請求項２１】
前記体液は尿である、請求項２０に記載のインビトロ方法。
【請求項２２】
前記１種以上の疾患関連構成要素は、抗原を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項２３】
前記１種以上の疾患関連成分は、細菌全体、細胞、ウイルス又はそれらの断片を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項２４】
前記１種以上の疾患関連成分は、少なくとも１種の多糖を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項２５】
前記１種以上の疾患関連成分は、少なくとも１種の病原体由来成分を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１種の病原体由来成分は、多糖である、請求項２５に記載のインビトロ方法。
【請求項２７】
前記疾患関連成分は、ＬＡＭ等の結核菌抗原である、請求項２６に記載のインビトロ方法。
【請求項２８】
前記疾患関連成分は、ホスホイノシトールマンノシド、リポマンナン、Ｃ−多糖類肺炎連鎖球菌、及びＰＣ（ホスホコリン）−ヒト内因性抗原から選択される、請求項２５に記載のインビトロ方法。
【請求項２９】
前記１種以上のリガンドは、タンパク質に対する親和性を持つ、請求項１から２８のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項３０】
前記リガンドは、合成ペプチド等の生体分子である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項３１】
前記リガンドは、以下の成分：Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン、グリコホリン−Ｃ、亜鉛−α−２−糖タンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質、及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分のうちの１種以上に対する親和性を持つ生体分子である、請求項３０に記載のインビトロ方法。
【請求項３２】
前記リガンドは、以下の成分：アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン及び亜鉛−α−２−糖タンパク質のうちの１種以上に対する親和性を有する生体分子である、請求項３１に記載のインビトロ方法。
【請求項３３】
前記リガンドは化学分子である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
【請求項３４】
前記リガンドは、４−メルカプトフェニルボロン酸、アミンベンゼンジアゾニウム化合物、及びポリミキシンからなる群から選択される、請求項３３に記載のインビトロ方法。
【請求項３５】
前記固相は、異なる阻害成分に対して親和性を有する異なるリガンドを含む、請求項１〜３４に記載のインビトロ方法。
【請求項３６】
前記固相は、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン、グリコホリン−Ｃ、亜鉛−α−２−糖タンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質、及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される異なる阻害成分に対して親和性を有する異なるリガンドを含む、請求項３５に記載のインビトロ方法。
【請求項３７】
分泌体液、排泄体液及び脳脊髄液からなる群から選択される体液を含む診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出するためのインビトロ方法であって、
ａ）前記体液中の、少なくとも１種のタンパク質を含む１種以上の阻害成分の量を低減して、浄化診断試料を提供する工程、及び
ｂ）工程ａ）の浄化診断試料中の前記１種以上の疾患関連成分の存在を検出する工程
を含むインビトロ方法。
【請求項３８】
前記１種以上の阻害成分は、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン、グリコホリン−Ｃ、亜鉛−α−２−糖タンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される、請求項３７に記載のインビトロ方法。
【請求項３９】
前記１種以上の阻害成分は、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン及び亜鉛−α−２−糖タンパク質からなる群から選択される少なくとも２種の阻害成分である、請求項３７又は３８に記載のインビトロ方法。
【請求項４０】
分泌体液、排泄体液及び脳脊髄液からなる群から選択される体液からなる群から選択される体液を含む診断試料から１種以上の阻害物質を除去するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）前記試料に、前記試料に存在する阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することのできる１種以上のリガンドが表面の少なくとも一部に接合した１つ以上の粒子を加える工程、
ｂ）前記１種以上の阻害成分を前記粒子に結合させる工程、及び
ｃ）前記試料から前記粒子を除去する工程を含み、
前記阻害成分は、それに続く免疫測定法に使用される際に前記診断試料を妨害することが可能な成分であることを特徴とするインビトロ方法。
【請求項４１】
免疫測定法におけるその後の診断試料の使用の前に前記診断試料から阻害成分を除去するのに使用する固相であって、
前記固相は、その少なくとも一部に接合した少なくとも２つの異なる種類のリガンドを有し、
前記リガンドは、異なる阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することができ、
前記阻害性成分は該診断用免疫測定法を妨害する可能性があることを特徴とする、固相。
【請求項４２】
前記リガンドは請求項２９〜３５のいずれか一項に定義した通りである、請求項４１に記載の固相。
【請求項４３】
前記固相は、その少なくとも一部に接合した異なるリガンドを持ち、前記リガンドは、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン、グリコホリン−Ｃ、亜鉛−α２−糖タンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質、及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも２種の阻害成分に対して親和性を持つ、請求項４１又は４２に記載の固相。
【請求項４４】
前記固相は少なくとも１つの粒子である、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の固相。
【請求項４５】
前記粒子はナノ粒子又はミクロ粒子である、請求項４４に記載の固相。
【請求項４６】
前記粒子は磁性粒子又はラテックス粒子である、請求項４４又は４５に記載の固相。
【請求項４７】
前記粒子が表面活性化磁性粒子である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の固相。
【請求項４８】
後続の免疫測定法で使用する診断試料を調製及び／又は浄化するための、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の固相の使用。
【請求項４９】
前記使用は、診断用免疫測定法が行われる前に前記診断試料から１種以上の阻害成分を除去又はその量を低減することを含む、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
ａ）免疫測定法において１種以上の疾患関連成分を捕捉及び検出する手段、及び
ｂ）体液中の少なくとも１種のタンパク質を含む１種以上の阻害成分の量を低減する手段を含む部品キット。
【請求項５１】
体液中の１種以上の阻害成分の量を低減する手段は、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の１種以上の固相を含む、請求項５０に記載の部品キット。
【請求項５２】
前記少なくとも１種のタンパク質は、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン、グリコホリン−Ｃ、亜鉛−α−２−糖タンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質、及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される、請求項５０又は５１に記載の部品キット。
【請求項５３】
前記１種以上の疾患関連成分は、ＬＡＭ等の結核菌抗原である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の部品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断用免疫測定法の分野に関し、さらに詳しくはその感度の改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法は、抗原と抗体との反応を通して溶液中の分子の濃度又は存在を決定する生化学的試験として広く用いられている。分析は、放射活性、蛍光活性、又は酵素活性等の標識活性を測定することで達成される。
【０００３】
重要な用途は疾患の診断であり、ここでは免疫測定法が体液中の低濃度の疾患関連分子を検出するために使用される。一例として、結核（ＴＢ）は、先進国でも途上国でも多面的な病気で、難しい公衆衛生上の課題であり、世界中で年間３００万人が死亡している。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、世界の人口の約３分の１が結核菌群の細菌に感染しており、結核は全成人の死亡の２６％を占め、最も一般的な致命的な感染症となっている。そのため、結核を効果的に制御するには感染経路の分断が必要であり、同様にそれには早期で正確な検出とそれに続く即時治療が必要である。
【０００４】
結核、マラリア、ＨＩＶ等の感染症が世界的に莫大な負担となっているにも拘わらず、活動性疾患の診断のための現在の試験は不適切であり、深刻な限界がある。したがって、診断試験の感度及び精度を改善する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
新規な方法、固相、及び固相に接合した体液から阻害剤を除去することができる１種以上のリガンドを含むキットを提供することで、上記の問題は克服又は少なくとも軽減された。
【０００６】
本発明の第１の態様として、分泌体液、排泄体液及び脳脊髄液からなる群から選択される体液を含む診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出するためのインビトロ方法であって、前記方法が、
ａ）前記試料中に存在する１種以上の阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することができる１種以上のリガンドが少なくとも一部に接合した固相に前記試料を接触させる工程；
ｂ）前記１種以上の阻害成分を前記固相表面に存在する１種以上のリガンドに結合させ、それにより前記試料中の前記１種以上の阻害成分の量を低減する工程、及びその後に、
ｃ）前記診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出する工程を含み、
前記１種以上の阻害成分は、工程ｃ）において結合しかつ検出を妨害する可能性があることを特徴とする、インビトロ方法を提供する。
【０００７】
本発明は、いくつかの体液が免疫測定法で検出可能な複合体の形成を阻止する阻害剤を含んでいるという洞察に基づいている。このように、本発明者らは、阻害成分の存在が免疫測定法の試験性能に悪影響を及ぼすことを見出した。それ故、阻害剤が存在すると、試料が標的抗原を含有している場合でも、目に見える又は記録された信号が生じず、従って、その試料は陰性であるとみなされてしまう。この問題を克服しそして失われた信号を元に戻すために、本発明者らは、そのような阻害剤の濃度を減少させ、その結果、それに続く免疫測定で高い感度が得られる方法を見出した。
【０００８】
本開示の文脈において、阻害成分は複数種のタンパク質と複数種の炭水化物の混合物を含んでもよい。例えば、阻害成分の分子量は、約５〜１０００ｋＤａであってもよい。本発明の全ての側面において、阻害成分は少なくとも１種のタンパク質、例えば少なくとも１種の糖タンパク質を含んでもよい。
【０００９】
本開示の全ての側面の文脈における阻害成分の好ましい群は群１：Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン、グリコホリン−Ｃ、亜鉛−α−２−糖タンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分である。
【００１０】
本開示の全ての側面の文脈における阻害成分のさらに好ましい群は群２：Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン、グリコホリン−Ｃ、亜鉛−α−２−糖タンパク質、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質、及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分である。
【００１１】
本開示の全ての側面の文脈における阻害成分のさらに好ましい群は群３：アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン及び亜鉛−α２−糖タンパク質である。本発明者らは、これら３つのタンパク質が非常に強力かつ豊富な阻害剤であることを見出した。
【００１２】
本発明の第１の側面の実施形態では、１種以上の阻害成分は群１、群２又は群３から選択される。一例として、阻害成分は、群３の阻害成分の全てであってもよい、又はそれを含んでもよい。
【００１３】
本発明の第１の態様の実施形態では、工程ｂ）は、前記１種以上の阻害成分が結合している前記固相から前記１種以上の疾患関連成分を含む前記試料を分離する工程ｂ１）を更に含む。従って、前記１種以上の阻害成分を前記固相表面に存在する１種以上のリガンドに結合させる工程の後に、試料と固相とを互いに分離する工程を続けて行ってもよい。これにより、試料中の疾患関連成分の今後の検出が容易になる可能性がある。
【００１４】
工程ａ）は、診断試料をリガンドが接合している固相と接触させることを含む。前記固相は、例えば、チップの表面又は試験管の表面の等の母体又は平坦な表面であってもよい。それ故、表面はプラスチック試験管の内表面であってもよい。従って、本発明の第１の側面の実施形態では、固相は膜又は固体表面である。このように、接触工程は、試料をチップに加えること、試料をチップが装着されている分析フローチャンバーに注入すること、試料を膜に通すこと、又は試料を試験管に加えることを含んでもよい。
【００１５】
しかしながら、固相は、１つ以上の粒子の表面であってもよい、即ち、接触工程は、粒子を試料に加えてもよい。従って、本発明の第１の側面の実施形態では、固相は、１種以上の前記リガンドが少なくとも一部に接合した１つ以上の粒子の表面である。従って、固相は、同種の、即ち、粒子に接合した同種のリガンドを持つ粒子を含んでよい。しかしながら、固相は、その表面に接合した第１の種類のリガンドを持つ第１の種類の粒子、その表面に接合した第２の種類のリガンドを持つ第２の種類の粒子、等々を含んでもよい。
【００１６】
従って、工程ａ）は、前記試料中に存在する阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することができる１種以上のリガンドが少なくとも表面の一部に接合した１つ以上の粒子を前記試料に加えることを含んでもよい。
【００１７】
更に、粒子が使用される場合、工程ｂ）は更に、前記生体試料から前記１つ以上の粒子を除去する工程ｂ１）を含んでもよい。これは、１種以上の阻害成分を粒子表面に存在する１種以上のリガンドに結合させた後に行われ、試料中の阻害成分の量をこのように低減することができる可能性がある。
【００１８】
粒子は、活性化され、リガンドが固定化されている表面を持つ粒子であってもよい。それ故、粒子は化学的に活性化された粒子といえる。
【００１９】
例えば、粒子は、ナノ粒子又はミクロ粒子であってもよい。それに加えて、又はその代わりに、粒子は磁性粒子又はラテックス粒子であってもよい。
【００２０】
例えば、磁石を用いて前記体液から粒子を除去してもよい。別の例として、遠心分離を用いて前記体液から粒子を除去してもよい。更なる例として、濾過を用いて体液から粒子を除去してもよい。
【００２１】
更に、工程ｃ）は、前記試料を抗疾患関連成分抗体（検出抗体）と接触させ、その後に前記診断試料中の抗疾患関連成分の存在を検出することを含んでもよい。検出抗体を、任意の適切な方法で標識してもよく、例えば電磁分光法で及び／又は光学密度（ＯＤ）測定で検出してもよい。検出は化学試薬を加えて行ってもよい。
【００２２】
検出抗体は表面に接合させることができる。従って、工程ｃ）は、例えば、その表面の少なくとも一部に抗疾患関連成分抗体が被覆されている粒子を加えること、及びその後に前記診断試料中の抗疾患関連成分の存在を検出することを含んでもよい。工程ａ）が、試料を、少なくとも一部に１種以上のリガンドが接合した粒子と接触させることを含む場合には、工程ｃ）は、その表面の少なくとも一部を抗疾患関連成分抗体で被覆した粒子を前記診断試料に加え、前記粒子は、その後に前記診断試料中の抗疾患関連成分の存在を検出することを含む。
【００２３】
従って、工程ａ）が、表面の少なくとも一部に１種以上のリガンドが接合した１つ以上の粒子を前記試料に加えることを含む場合は、工程ｃ）は、前記診断試料に第２の粒子を加えることを含んでもよく、前記粒子はその表面の少なくとも一部を抗疾患関連成分抗体で被覆し、その後に前記診断試料中の抗疾患関連成分の存在を検出してもよい。
【００２４】
本開示の文脈において、体液を、尿、痰、唾液、及び脳脊髄液からなる群から選択してもよい。これらは、検出法としてＯＤ測定値を用いる今後の分析に非常に適している体液である。更に、体液は、尿、痰、及び唾液からなる群から選択されてもよい。これらは、採取が容易であり、大量に入手することができ、そして血液とは対照的に、比較的無菌かつ不透過性である体液である。そのため、そのような体液は、患者から試料を採取できる可能性が限られている環境での使用に適している。一例として、体液は尿であってもよい。
【００２５】
疾患関連成分は、抗原、即ち、生物において免疫応答を誘導することができる分子、又はその代謝産物を含んでもよい。例えば、疾患関連成分には、外因性抗原、即ち、注射や吸入等によって体外から体内に侵入した抗原が含まれても良い。一方、抗原は内因性抗原又は腫瘍抗原であってもよい。
【００２６】
本発明の第１の側面の実施形態では、１種以上の疾患関連成分は少なくとも１種の多糖を含む。
【００２７】
１種以上の疾患関連成分は、ヒト起源又は病原体起源のものであってもよい。１種以上の疾患関連成分は、細菌全体、細胞、ウイルスを含んでもよく、又はそれらの断片、例えば細胞壁成分等であってもよい。更に、１種以上の疾患関連成分は、タンパク質、炭水化物を含んでもよく、又はタンパク質若しくは炭水化物起因の分解生成物であってもよい。
【００２８】
第１の側面の実施形態では、１種以上の疾患関連成分は少なくとも１種の病原体由来成分を含む。病原体由来成分は多糖であってもよい。
【００２９】
病原体は、宿主生物に侵入する可能性があるウイルス、細菌、原虫、プリオン、真菌又は他の微生物等の感染因子である。病原体由来成分は、従って、そのような病原体に由来する分子である。病原体由来成分は更に、血液を含む全ての種類の生体試料において検出される可能性がある。従って、本発明の別の態様では、体液を含む診断試料中の１種以上の病原体由来成分の存在を検出するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）前記試料中に存在する阻害成分に対して親和性を有しかつ結合することができる１種以上のリガンドが少なくとも一部に接合した固相に前記試料を接触させる工程、
ｂ）前記１種以上の阻害成分を前記固相表面に存在する１種以上のリガンドに結合させ、それにより前記試料中の前記１種以上の阻害成分の量を減少させる工程、及びその後に、
ｃ）前記診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出する工程を含み、
前記１種以上の阻害成分は、工程ｃ）において結合しかつ検出を妨害する可能性があることを特徴とする、インビトロ方法が提供される。体液は、血液、尿、痰、唾液及び脳脊髄液からなる群から選択されてもよい。
【００３０】
一例として、疾患関連成分は、ＬＡＭ等の結核菌抗原、又はその代謝産物であってもよい。ＬＡＭは、主要な結核菌の表面抗原リポアラビノマンナンである。ＬＡＭの代謝産物は、脱脂ＬＡＭ等のＬＡＭ分解断片であってもよい。
【００３１】
疾患関連成分の更なる例には、ホスホイノシトールマンノシド、リポマンナン、Ｃ−多糖類肺炎連鎖球菌、及びＰＣ（ホスホコリン）−ヒト内因性抗原、ホスファチジルコリン合成での中間体が含まれる。
【００３２】
上記のように、本発明の全ての側面において、使用されるリガンドは、糖タンパク質等のタンパク質に対する親和性を有してもよい。タンパク質は、上記の群１、群２又は群３に列挙されている阻害成分のいずれか１種であってもよい。
【００３３】
従って、リガンドは、群１、群２又は群３中の少なくとも１種の阻害成分に対して親和性を有してもよい。従って、固相に接合したリガンドは、群１、群２又は群３中の任意の数の種類の阻害成分に対して親和性を有し、それと結合することができる。一例として、固相に接合したリガンドは、群１、群２又は群３中の全ての阻害成分に対して親和性を有し、それと結合することができる。
【００３４】
本発明の第１の側面の実施形態では、固相に接合したリガンドは、群１又は群２の少なくとも２種の阻害成分に対する親和性を有し、例えば、少なくとも３種、更に例えば、少なくとも５種の群１又は群２の阻害成分に対する親和性を持つ。
【００３５】
本発明の第１の側面の実施形態では、固相に接合したリガンドは、群３の少なくとも１種の阻害成分に対する親和性を有し、例えば少なくとも２種、更に例えば全ての阻害成分に対する親和性を持つ。
【００３６】
本発明の第１の側面の実施形態では、固相に接合したリガンドは、群３の少なくとも１種の、例えば少なくとも２種、更に例えば全ての阻害成分に対する親和性を有し、かつ、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、グリコホリン−Ｃ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも１種の、例えば少なくとも２種の、更に例えば少なくとも３種の、更に例えば少なくとも４種、更に例えば少なくとも５種の阻害成分に対する親和性を持つ。
【００３７】
本発明の第１の側面の実施形態では、固相に接合したリガンドは、群３の全ての阻害成分に対する親和性を有し、かつ、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、グリコホリン−Ｃ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも１種の、例えば少なくとも２種の、更に例えば少なくとも３種の、更に例えば少なくとも４種、更に例えば少なくとも５種の阻害成分に対する親和性を持つ。
【００３８】
本発明の第１の側面の実施形態では、固相に接合したリガンドは、群３の少なくとも１種の、例えば少なくとも２種、更に例えば全ての阻害成分に対する親和性を有し、かつ、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、グリコホリン−Ｃ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも１種の、例えば少なくとも２種の、更に例えば少なくとも３種の、更に例えば少なくとも４種、更に例えば少なくとも５種の阻害成分に対する親和性を持つ。
【００３９】
本発明の第１の側面の実施形態では、固相に接合したリガンドは、群３の全ての阻害成分に対する親和性を有し、かつ、Ｉｇα−１鎖Ｃ領域、グリコホリン−Ｃ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも１種の、例えば少なくとも２種の、更に例えば少なくとも３種の、更に例えば少なくとも４種の、更に例えば少なくとも５種の阻害成分に対する親和性を持つ。
【００４０】
このように、固相は、上記の群１、群２又は群３に列挙された阻害成分等の異なる阻害成分に対して親和性を持つ異なるリガンドを含んでもよい。例として、少なくとも２種の、例えば少なくとも３種の、更に例えば少なくとも５種の異なる種類のリガンドを固相に接合させてもよく、各種類は異なる阻害成分に対して親和性を持つ。
【００４１】
リガンドは、合成ペプチド等の生体分子であってもよい。一例として、リガンドは、上記の群１、群２又は群３に列挙されている阻害成分の１種以上に対して親和性を持つ生体分子であってもよい。
【００４２】
さらに、生体分子は、群４から選択されるアミノ配列を含むペプチドであってもよい：
ＣＰＲＬＳＬＨ  ＲＰＡＬＥＤＬＬ（配列番号１）
ＣＳＩＰＶＣＧＱＤＱ  ＶＴＶ（配列番号２）
ＣＬＡＧＬＦＧＡＡＥＧ  ＱＡＦ（配列番号３）
ＣＷＦＭＰＳＡＰＹＷＩ  ＬＡ（配列番号４）
ＣＬＴＣＶＤＬＤＥＣＡ  ＩＰＧ（配列番号５）
ＣＹＹＶＹＮＬＴＡＰＰ  ＥＣＨ（配列番号６）
ＣＡＬＦＱＴＰＳＹＴＱ  ＰＹＱ（配列番号７）
ＣＬＲＹＭＹＲＨＫＧＴ  ＹＨ（配列番号８）
ＣＥＰＶＹＶＱＲＡＫＡ  ＹＬＥ（配列番号９）
Ｃ  ＲＮＰＤＥＤＰＲＧＰ  Ｗ（配列番号１０）
Ｃ  ＡＫＱＣＰＡＬＥＶＴＷＰ（配列番号１１）
Ｃ  ＶＬＶＤＰＥＱＶＶＱＲＨ（配列番号１２）
【００４３】
群４から選択されるアミノ配列を含むペプチドは、群１又は群２の少なくとも１種の、例えば全ての、阻害成分に対して親和性を有してもよい。
【００４４】
１種又は数種の、例えば少なくとも２種、更に例えば少なくとも３種、更に例えば少なくとも５種の、上記ペプチドを固相に接合させることができる。一例として、上記の全ての異なる種類のペプチドを、表面又は単一粒子等の固相に接合してもよい。一例として、固相は、粒子に無作為に接合された２種以上から全てのペプチドを持つ粒子を含み、粒子間でほぼ均一にペプチドを分布させるようにしてもよい。代替として、固相は、表面に接合したペプチドを１種だけから数種持つ第１の種類の粒子、並びに表面に接合した他の種類のペプチドを持つ第２の種類の粒子等々を含んでも良い。一例として、固相は多数の異なる種類の粒子を含み、各種類の粒子は粒子表面に接合した、他の種類と異なる種類のリガンドを持つ。
【００４５】
更に、リガンドは化学分子であってもよい。一例として、リガンドは、４−メルカプトフェニルボロン酸、アミンベンゼンジアゾニウム化合物、及びポリミキシンからなる群から選択することができる。上記群のいくつかの化学分子を同時にリガンドとして使用することができる。
【００４６】
本発明の第１の側面の構成として、体液を含む診断試料から１種以上の阻害成分を除去するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）前記試料に、前記試料に存在する阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することのできる１種以上のリガンドが表面の少なくとも一部に接合した１つ以上の粒子を加える工程、
ｂ）前記１種以上の阻害成分を前記粒子に結合させる工程、及び
ｃ）前記試料から前記粒子を除去する工程を含み、
前記阻害成分は、それに続く免疫測定法に使用される際に前記診断試料を妨害することが可能な成分であることを特徴とする方法が提供される。
体液は、本明細書において上記で考察したように、分泌体液、排泄体液及び脳脊髄液からなる群から選択してもよい。
【００４７】
本発明の第１の側面の更なる構成として、その後の免疫測定法のために体液を含む診断試料を調製及び／又は洗浄するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）前記試料に、前記試料に存在する阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することのできる１種以上のリガンドが表面の少なくとも一部に接合した１つ以上の粒子を加える工程、
ｂ）前記試料中に存在する前記１種以上の阻害成分が前記粒子表面に存在する前記１種以上のリガンドに結合することを可能にする工程、及び、その後に
ｃ）免疫測定法用に調製された診断試料を得る工程を含み、前記阻害成分は、アッセイ成分に結合し、診断用免疫測定法を妨害する可能性があることを特徴とする方法を提供する。
体液は、本明細書において上に考察したように、分泌体液、排泄体液及び腦脊髄液からなる群から選択してもよい。
【００４８】
本発明の第２の側面として、分泌体液、排泄体液及び脳脊髄液からなる群から選択される体液を含む診断試料中の１種以上の疾患関連成分の存在を検出するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）前記体液中の、少なくとも１種のタンパク質を含む１種以上の阻害成分の量を低減して、浄化診断試料を提供する工程、及び
ｂ）工程ａ）の浄化診断試料中の前記１種以上の疾患関連成分の存在を検出する工程を含む方法が提供される。
【００４９】
第２の側面に関して使用される用語及び定義は、上記の第１の側面に関して考察した通りである。
【００５０】
阻害成分は、少なくとも１種の糖タンパク質等の少なくとも１種のタンパク質を含んでもよい。本発明の第２の側面の実施形態では、１種以上の阻害成分は、本明細書の上記に開示した阻害成分の群１、群２又は群３から選択される。
【００５１】
従って、工程ａ）は、群１、群２又は群３における全ての阻害成分を低減する等、群１、群２又は群３における任意の数の種類の阻害成分の量を低減することを含んでもよい。
【００５２】
本発明の第２の側面の実施形態では、ステップａ）は、群１、群２又は群３の少なくとも２種の阻害成分の量を低減することを含み、例えば、群１又は群２の少なくとも３種の、更に例えば少なくとも５種の阻害成分の量を低減することを含む。
【００５３】
本発明の第２の側面の実施形態では、ステップａ）は、群３の少なくとも１種の、例えば少なくとも２種の、更に例えば全ての種類の、阻害成分の量を低減する工程、及びＩｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、グリコホリン−Ｃ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも１種の、例えば少なくとも２種の、更に例えば少なくとも３種の、更に例えば少なくとも４種の、更に例えば少なくとも５種の阻害成分の量を低減する工程を含む。
【００５４】
本発明の第２の側面の実施形態では、ステップａ）は、群３の少なくとも１種の、例えば少なくとも２種の、更に例えば全ての種類の阻害成分の量を低減する工程、及びＩｇα−１鎖Ｃ領域、グリコホリン−Ｃ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも１種の、例えば少なくとも２種の、更に例えば少なくとも３種に、更に例えば少なくとも４種の、更に例えば少なくとも５種の阻害成分の量を低減する工程を含む。
【００５５】
本発明の第３の側面として、免疫測定法における前記診断試料のその後の使用の前に診断試料から阻害成分を除去するのに使用する固相であって、前記固相はその少なくとも一部に接合した、阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することができる１種以上のリガンドを持ち、前記阻害成分は、前記診断用免疫測定法を妨害する可能性があることを特徴とする、固相が提供される。
【００５６】
第３の側面に関して使用される用語及び定義は、上記の第１の側面に関して考察した通りである。一例として、固相は、その少なくとも一部に接合した少なくとも２種のリガンドを持っていてもよい。従って、第３の側面は、免疫測定法における診断試料のその後の使用の前に診断試料から阻害成分を除去するのに使用するための固相を提供することができ、前記固相は、その少なくとも一部に接合した少なくとも２つの異なる種類のリガンドを有し、前記リガンドは、異なる阻害成分に対して親和性を持ちかつ結合することができ、ここで前記阻害成分は、前記診断用免疫測定法を妨害する可能性があることを特徴とする。
【００５７】
例えば、一種又は複数種のリガンドは、上記の第１の側面の任意の実施形態において定義されたとおりであり得る。
【００５８】
本発明の第３の側面の実施形態では、固相は少なくともその一部に接合した異なるリガンドを持ち、従って前記リガンドは上記の群１、群２又は群３から選択される少なくとも２種の阻害成分に対して親和性を持つ。
【００５９】
一例として、固相は少なくとも１つの粒子であってもよい。更に、粒子はナノ粒子又はミクロ粒子であってもよい。更なる例として、粒子は磁性粒子又はラテックス粒子でもよい。
【００６０】
粒子の表面はまた、リガンドを表面に結合させるために活性化されていてもよい。従って、粒子は表面活性化磁性粒子であってもよい。
【００６１】
本発明の第４の側面として、その後の免疫測定法に使用する診断試料を調製及び／又は浄化するための本発明の第３の側面による固相の使用が提供される。第４の側面に関して使用される用語及び定義は、上記の他の側面に関して考察した通りである。その使用は、診断用免疫測定が行われる前に、前記診断試料から１種以上の阻害成分を除去又は低減することを含んでもよい。阻害成分は、本明細書の上記の群１、群２又は群３から選択することができる。従って、この使用は、群１、群２、又は群３の任意の数の種類の阻害成分の量を低減すること、例えば群１、群２、又は群３の全ての阻害成分を低減することを含んでも良い。
【００６２】
更に、この使用は、群１、群２又は群３の少なくとも２種の阻害成分の量を低減することを含んでもよく、例えば、群１、群２又は群３の少なくとも３種、更に例えば少なくとも５種の阻害成分の量を低減することを含んでも良い。
【００６３】
本発明の第４の側面の実施形態では、この使用は、群３の少なくとも１種の阻害成分の量を低減すること、例えば少なくとも２種の、更に例えば全ての阻害成分の量を低減すること、及びＩｇα−１鎖Ｃ領域、プロトロンビン、グリコホリン−Ｃ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも１種の量を低減すること、例えば少なくとも２種の、更に例えば少なくとも３種の、更に例えば少なくとも４種の、更に例えば少なくとも５種の量を低減することを含む。
【００６４】
本発明の第４の側面の実施形態では、この使用は、群３の少なくとも１種の阻害成分の量を低減すること、例えば少なくとも２種の、更に例えば全ての阻害成分の量を低減すること、及びＩｇα−１鎖Ｃ領域、グリコホリン−Ｃ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質及びインターロイキン１８結合タンパク質阻害成分からなる群から選択される少なくとも１種の量を低減すること、例えば少なくとも２種の、更に例えば少なくとも３種の、更に例えば少なくとも４種の、更に例えば少なくとも５種の量を低減することを含む。
本発明の第５の側面として、
ａ）免疫測定法において１種以上の疾患関連成分を捕捉及び検出する手段、及び
ｂ）体液中の、少なくとも１種のタンパク質を含む１種以上の阻害成分の量を低減する手段を含む部品キットが提供される。
【００６５】
本発明の第５の側面の実施形態では、体液中の１種以上の阻害成分の量を低減する手段は、上記の第３の側面による１種以上の固相を含む。従って、キットは、本明細書に開示される阻害成分に対するリガンドが接合されている粒子を含んでもよい。しかしながら、体液中の１種以上の阻害成分の量を低減する手段は、膜、母体、チップ表面又は試験管の内面等の１種以上の阻害成分に対するリガンドがその上に固定化されている固相を含んでもよい。
【００６６】
少なくとも１種以上の阻害成分は、少なくとも１種のタンパク質、例えば、少なくとも１種の糖タンパク質を含む。阻害成分は、上記の群１、群２又は群３に記載の阻害成分から選択してもよい。
【００６７】
更に、１種以上の阻害成分の量を低減する手段は、少なくとも２種の異なる阻害成分、例えば、上記の群１、群２又は群３から選択される少なくとも２種の阻害成分を低減する手段を含んでもよい。
【００６８】
免疫測定法において１種以上の疾患関連成分を捕捉及び検出する手段は、抗疾患関連成分抗体（検出抗体）、例えば、阻害成分に対するリガンドが接合している粒子以外の粒子に接合した抗疾患関連成分抗体等を含んでもよい。
【００６９】
更に、本発明の第５の側面の実施形態では、１種以上の疾患関連成分は、ＬＡＭ等の結核菌抗原である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、免疫測定法の前に試料を浄化するための本開示の一般的な方法を示す。（Ａ）リガンドを使用：粒子（Ｂ）表面、固体表面（Ｃ）、フィルター母体（Ｄ）に。
【００７１】
【図２】図２は、様々な体液（１００ｐｇ／ｍｌ）での、ＬＡＭ−ＴｂアッセイのＳｐｅＣｌｅａｎ（試料浄化剤）による改善を示している。
【００７２】
【図３】図３は、種々の抗原（１００ｐｇ／ｍｌ）を加えた尿試料での、アッセイ感度の改善に対するＳｐｅＣｌｅａｎの効果を示している。
【００７３】
【図４】図４は、尿試料をＳｐｅＣｌｅａｎで前処理した場合の免疫アッセイ（尿中のＬＡＭの検出）の臨床的感度の違いを示している。未処理感度＝４７．６％、ＳｐｅＣｌｅａｎ処理＝８０．９％、ｎ＝２１、ＬＯＤ：０．４、ＯＤ：６２０ｎｍ。
【発明の詳細な説明】
【００７４】
本発明者らは、その後の免疫測定法における感度が増大するように生体試料中の阻害化合物の量を低減する方法を見出した。
【００７５】
例えば、主要な結核菌表面抗原リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）を健康な個人又は結核（ＴＢ）患者からの尿に加えた場合、ＰＢＳ又は合成尿中の同量のＬＡＭと比較した場合、ＬＡＭ信号は、高い頻度で減少又は完全に消光される。この阻害効果は個体間で異なり、また同じ個体からでも様々な時点で採取した試料間でも異なる。
【００７６】
以前のプロテオミクス研究では、健康な個人から採取した２８００以上の尿中タンパク質が同定されているが、免疫測定法におけるそれらタンパク質の影響はまだ調査されていない。質量分析と組み合わせた様々なクロマトグラフィーを使用して、本発明者らは、例えば、健康な尿から、ＬＡＭ免疫測定法に対して阻害効果を持つ可能性のある数種の豊富なタンパク質を単離、精製し、特徴付けすることができた。
【００７７】
これらのタンパク質は、添加リン酸緩衝生理食塩水又は合成尿模倣液中で再構成されると、単独又は組み合わせで、ＬＡＭ抗原をマスキングすることによって、又は検出抗体と相互作用させることによって、試験に対する阻害効果を発揮する。患者の尿の阻害効果を低減すると、明らかにＬＡＭに基づく尿検査の診断感度と正確さが増すと考えられる。
【００７８】
本明細書では、免疫測定法に対するこれらのタンパク質の阻害効果、作用機序の理解、また体液からそれらを除去する方法を見出し、それによるアッセイ感度の回復を提示する。これは免疫測定法の感度に大きな利点を提供する。本明細書では、ＬＡＭアッセイは診断試料の前浄化から恩恵を得ることができる免疫測定法の例として使用されるが、この工程は他の免疫測定法にも適用可能である。
【００７９】
尿は無菌であるため様々な疾患の診断に使用するのに適した母体であり、血液又は他の液体と比較してより大量に得ることができ、そして最も重要なことは血液の場合のように針が不要であり、従って、例えば、肝炎やＨＩＶ等の更なる内感染症を回避できる。
【００８０】
そのために、体液から阻害剤を除去する試料浄化剤（ＳｐｅＣｌｅａｎ）を構築するための２つの手法を使用した：
Ａ）尿中阻害剤に対する結合親和性を持つペプチドのファージディスプレイ技術による同定。磁石を用い体液から阻害剤を容易に除去するために、阻害タンパク質に対するリガンドとして作用する以下に列挙される１２個のペプチドを同定し、磁性粒子（ＭＰ）に接合させた。
Ｂ）標的糖脂質抗原（ＬＡＭ）と阻害タンパク質（主にＮ−アセチルグルコサミンからなる）の炭水化物部分との間の構造的相違についての我々の理解は、阻害剤に対する結合能力を持ついくつかのリガンドを同定するのに役立った。次にこれらのリガンドを用いて、体液から阻害剤を簡単に除去するための多くのリガンド−ＭＰ接合体を構築した。
【００８１】
従って、前記生体試料が免疫測定法等のその後の診断アッセイに使用される前に、尿又は血漿、痰、唾液等の他の体液を含む生体試料（体液）から阻害剤を除去する方法が初めて本明細書で提供される。前記阻害剤を除去するために、ナノ粒子又はミクロ粒子等の粒子を本明細書で使用してもよい。前記粒子は、例えば、ラテックス又は磁性粒子である。一般的な方法を図１に示す。Ａ）は、リガンドが固定化された磁性粒子をインキュベーション後、即ち阻害成分を結合させた後に、磁性を用いて試料からどのように除去できるかを示し、Ｂ）は、磁性粒子（ＭＮＰ）表面に、及び結合阻害剤と共に固定化されたリガンド（ＳｐｅＣｌｅａｎリガンド）を示し、Ｃ）は、固体表面に結合したリガンドを示し、Ｄ）は、フィルター母体に結合したリガンドを示す。
【００８２】
現在の文脈で使用できる多様な表面、大きさ及び機能性を持つ磁性粒子を含む、様々な種類の粒子を提供する多くの製造業者がある。
【００８３】
試料浄化剤（例えば、本明細書で定義されるようにその表面の少なくとも一部に接合したリガンド（化学的又は生物学的）を含む粒子）は、任意の体液から阻害剤を除去するために使用することができる技術である。この手法は、様々な診断方法と組み合わせて使用することができ、従って、ＬＡＭアッセイに限定されない。粒子へのリガンドの接合は従来の手段によって実施することができる。
阻害タンパク質及びリガンドの例
【００８４】
下記は単離タンパク質（診断アッセイを妨害する阻害タンパク質）のリストであり、これは免疫測定法でのその後の使用のための診断試料の浄化及び／又は調製でのリガンドとしての使用のためのそれに結合する生物学的分子の同定の基礎を形成する。本明細書に開示される方法においてリガンドとして使用する例を提示する、化学リガンドのリストも提供される。
＜免疫測定法で阻害効果を示すタンパク質の例（グループ１）＞
Ｉｇα−１鎖Ｃ領域
プロトロンビン
アポリポタンパク質Ｄ
ウロモジュリン
グリコホリン−Ｃ
亜鉛−α２−糖タンパク質
ヘパリン硫酸プロテオグリカン
ホスホイノシチド−３−キナーゼ相互作用タンパク質
インターロイキン１８結合タンパク質
＜ペプチドリガンド（グループ４）＞
ＣＰＲＬＳＬＨ  ＲＰＡＬＥＤＬＬ（配列番号１）
ＣＳＩＰＶＣＧＱＤＱ  ＶＴＶ（配列番号２）
ＣＬＡＧＬＦＧＡＡＥＧ  ＱＡＦ（配列番号３）
ＣＷＦＭＰＳＡＰＹＷＩ  ＬＡ（配列番号４）
ＣＬＴＣＶＤＬＤＥＣＡ  ＩＰＧ（配列番号５）
ＣＹＹＶＹＮＬＴＡＰＰ  ＥＣＨ（配列番号６）
ＣＡＬＦＱＴＰＳＹＴＱ  ＰＹＱ（配列番号７）
ＣＬＲＹＭＹＲＨＫＧＴ  ＹＨ（配列番号８）
ＣＥＰＶＹＶＱＲＡＫＡ  ＹＬＥ（配列番号９）
Ｃ  ＲＮＰＤＥＤＰＲＧＰ  Ｗ（配列番号１０）
Ｃ  ＡＫＱＣＰＡＬＥＶＴＷＰ（配列番号１１）
Ｃ  ＶＬＶＤＰＥＱＶＶＱＲＨ（配列番号１２）
化学リガンド（例）
４−メルカプトフェニルボロン酸
アミンベンゼンジアゾニウム化合物
ポリミキシン
＜実験の部＞
【００８５】
実験の部は、抗原に対する診断試料から阻害剤を除去する浄化工程、例えば（ＬＡＭ）検出を用いることの好ましい効果を説明する。
＜試料浄化剤（ＳｐｅＣｌｅａｎ）の準備＞
ペプチド（抗阻害剤）の各種母体への接合
【００８６】
アミノ基で官能化された、磁性微粒子、ニトロセルロース膜、ラテックスビーズ及びフリットをペプチドリガンドの固定化／接合に使用した。グループ４の等量の全ペプチドを固相に接合した。アミノ基を、最初にブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのブロモアルキル化反応により臭素に変換した。次に、システイン化ペプチドを、ｐＨを維持しながら活性化母体に滴下した。接合収率を最大にするために、１０ｍＭのトリブチルホスフィンを反応混合物に加えチオール基が酸化しないようにし、母体表面で臭素との反応を可能にした。
【００８７】
得られた試料浄化剤をＳｐｅＣｌｅａｎ１と命名した。阻害化合物の量を低減するために、これを試料に加え、インキュベーション後に除去することができる。例えば、磁性粒子は磁石によって除去することができる。
母体表面への化学リガンドの接合
【００８８】
母体表面への４−メルカプトフェニルボロン酸の接合は、上記のようにして行った。ベンゼンジアゾニウム化合物及びポリミキシンの固定化のために、カルボキシル（ＣＯＯＨ）官能化母体を使用した。簡単に説明すると、母体を最初にｐＨ６．０の２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸で平衡化し、続いてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）で１時間活性化した。洗浄後、アミン含有リガンドを加え、室温で２時間かけ接合させた。
【００８９】
得られた試料洗浄剤をＳｐｅＣｌｅａｎ２と命名した。
一般的なアッセイの説明（ＬＡＭアッセイ、ＬＡＭ抗原の検出）
・捕捉抗ＬＡＭ抗体で被覆された磁性粒子を尿／他の体液に加えてインキュベートする。
・洗浄後、ビオチン化検出抗体を加えてインキュベートする。
・洗浄後、アビジン−ＨＲＰ酵素接合体を加えてインキュベートする。
・テトラメチルベンジジンを洗浄した後、ＴＭＢ基質を加え、発色強度（４５０ｎｍで記録された光学濃度）で検出。
【００９０】
体液はあらゆる色の形成を阻止する阻害剤を含んでいる可能性があるので、信号がより低いもの或いはないものとして視認又は記録され、それ故、標的抗原を含んでいても陰性と見なされる。この問題を克服しそして失われた信号を元に戻すには、阻害剤を除去し体液を浄化する必要がある。そのために、捕捉粒子を加える前の阻害剤の洗浄のためにＳｐｅＣｌｅａｎ１又はＳｐｅＣｌｅａｎ２を使用した本開示の試料洗浄工程を用いる。それ故、上記のアッセイ又は方法を行う前に洗浄工程を導入する。
結果
実施例１
【００９１】
以下において、実施例１はＬＡＭ（抗原）アッセイであり、実施例２〜４は、抗原（ＬＡＭ）アッセイが行われる前に行われる追加の試料洗浄工程を含む。このデータから、試料中に存在し抗原に結合する阻害分子は、抗原に結合する捕捉粒子（ＬＡＭ）を生体試料に加える前に除去されるので、抗原検出試験（この文脈ではＬＡＭ）の前に洗浄工程を実施することでアッセイの感度が改善することが分かる。
４５０ｎｍの信号
合成尿                                            ０．２５１
合成尿＋１００ｐｇ／ｍｌ  ＬＡＭ                  ４．４４０
尿                                                ０．２８
尿＋１００ｐｇ／ｍｌ  ＬＡＭ                      ０．３１
【００９２】
ＬＡＭを加えた合成尿では、その中に阻害分子が存在しないため、ＬＡＭの信号が高い。しかしながら、ＬＡＭを加えた尿中ではＬＡＭの信号は低いかほとんど存在しない。
実施例２
【００９３】
＋／−１００ｐｇ／ｍｌのＬＡＭを加えた１人の健康なドナーの尿に対するＳｐｅＣｌｅａｎの効果
試料 ＳｐｅＣｌｅａｎ 外径４５０ｎｍ
尿                              −                ０．１４
尿＋１００ｐｇＬＡＭ／ｍｌ      −                ０．１７
尿＋２５０ｐｇＬＡＭ／ｍｌ      −                ０．５１
尿＋５００ｐｇＬＡＭ／ｍｌ      −                ０．９３
尿                              ＋                ０．２２
尿＋１００ｐｇＬＡＭ／ｍｌ      ＋                ３．１１
尿＋２５０ｐｇＬＡＭ／ｍｌ      ＋                ４．１２
尿＋５００ｐｇＬＡＭ／ｍｌ      ＋                ７．７４
【００９４】
これは、アッセイを実施する前のＳｐｅＣｌｅａｎ工程（即ち、試料中の阻害剤の除去）が抗原（ＬＡＭ）検出試験の感度を高めることを示している。浄化工程が行われない場合、抗原についての低い信号（ＬＡＭ）しか得られないか、或いは信号（ＬＡＭ）が全く得られない。
実施例３
【００９５】
５人の健康なドナーの様々な程度の阻害を持つ尿に対するＳｐｅＣｌｅａｎの効果。この実験では、尿試料に１００ｐｇ／ｍｌのＬＡＭを加えた。
試料        ＳｐｅＣｌｅａｎ        ４５０ｎｍ
Ｄ１        −                      ０．４００
Ｄ１        ＋                      ４．１４９
Ｄ２        −                      ３．８８
Ｄ２        ＋                      ４．３０
Ｄ３        −                      １．３４
Ｄ３        ＋                      ４，１９
Ｄ４        −                      ３．６５
Ｄ４        ＋                      ４．４０
Ｄ５        −                      ０．３１
Ｄ５        ＋                      ２．８８
合成尿（ＬＡＭ無）                  ０．２５１
合成尿＋１００ｐｇ／ｍｌＬＡＭ      ４．４４０
【００９６】
この実験は、試料洗浄剤で処理した後に正常信号（ＬＡＭ添加合成尿）に戻る個々の尿中に、低濃度（Ｄ２、Ｄ４）、中濃度（Ｄ３）及び高濃度（Ｄ１、Ｄ５）の範囲の様々な量の阻害剤が存在することを明確に示している。
実施例４
【００９７】
ＬＡＭを加えた健康な尿に対する２種類の異なるＳｐｅＣｌｅａｎ組成物（ＳｐｅＣｌｅａｎ１とＳｐｅＣｌｅａｎ２（上記参照））の効果。
試料 ＳｐｅＣｌｅａｎ ４５０ｎｍ
１−  尿                      −                  ０．２２
２−  尿＋１００ｐｇ／ｍｌ    −                  ０．２４
３−  尿                      １                  ０．１８
４−  尿＋１００ｐｇ／ｍｌ    １                  ４．２２
５−  尿＋５０ｐｇ／ｍｌ      １                  ２．８８
６−  尿＋２０ｐｇ／ｍｌ      １                  ２．１１
７−  尿                      ２                  ０．２８
８−  尿＋１００ｐｇ／ｍｌ    ２                  ４．７８
９−  尿＋５０ｐｇ／ｍｌ      ２                  ３．１１
１０−尿＋２０ｐｇ／ｍｌ      ２                  ２．２５
【００９８】
この実験は、生物学的リガンドに基づく試料洗浄剤（ＳｐｅＣｌｅａｎ１）が化学に基づく試料洗浄剤（ＳｐｅＣｌｅａｎ２）と同じくらい良好に機能することを示している。
実施例５
【００９９】
様々な体液におけるＬＡＭ−ＴＢアッセイのＳｐｅＣｌｅａｎによる改善の効果を調べるために実験を行った。ＳｐｅＣｌｅａｎ１を加えた又は加えていない尿、痰、唾液及び脳脊髄液を、上記の実施例１〜４に記載のアッセイで試験した。結果を図２に示し、これは、ＳｐｅＣｌｅａｎ１組成物を加えることで、全ての生体試料のアッセイにおけるＯＤを明らかに増強することを明確に示している。
実施例６
【０１００】
様々な抗原（ホスホイノシトールマンノシド、リポマンナン及びＣ−多糖Ｓ．ニューモニエ）を加えた尿試料中でアッセイを実施する場合のＳｐｅＣｌｅａｎによる改善の効果を見るために実験を行った。結果を図３に示すが、ＳｐｅＣｌｅａｎ１で処理した全ての試料で未処理試料と比較して６２０ｎｍでのＯＤが明らかに改善した、即ちアッセイ感度が試験した全ての抗原で増加した。
実施例７
【０１０１】
アッセイ感度のＳｐｅＣｌｅａｎによる改善の効果を、肺結核が確認されている２１人の様々なＴＢ患者から収集された尿試料にて試験した。
【０１０２】
図４は、尿試料をＳｐｅＣｌｅａｎ１組成物で前処理した場合の免疫アッセイ（尿中のＬＡＭの検出）の臨床的感度の差を示す。ＳｐｅＣｌｅａｎ１による前処理の結果、大部分の試料において陽性信号が増加し、感染個体の３１．８％を正確に同定することから８０．９％感染患者に対してアッセイの臨床感度の全体的な改善がもたらされた。
実施例８
【０１０３】
アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン及び亜鉛−α２−糖タンパク質に対するペプチドリガンドを、本明細書の上記に開示した接合方式に従って磁性微粒子に接合させ、ＳｐｅＣｌｅａｎ３と表示される試料洗浄剤を得る。
【０１０４】
ＳｐｅＣｌｅａｎ３を尿試料に加え、またインキュベーション後には除去し、その後、抗原（ＬＡＭ）アッセイを上記の一般的なアッセイの記載に従って実施する。
実施例９
【０１０５】
アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン及び亜鉛−α２−糖タンパク質に対するペプチドリガンドを、本明細書の上記に開示した接合方式に従って固体表面に接合させて、ＳｐｅＣｌｅａｎ４と表示される試料洗浄剤を得る。
【０１０６】
尿試料をＳｐｅＣｌｅａｎ４表面と接触させ、インキュベートのために放置する。次いで、試料を表面から分離し、その後、抗原（ＬＡＭ）アッセイを上記の一般的なアッセイの記載に従って実施する。
実施例１０
【０１０７】
アポリポタンパク質Ｄ、ウロモジュリン及び亜鉛−α−２−糖タンパク質に対するペプチドリガンドを、上記に開示した接合方式に従って試験管の内面に接合させて、ＳｐｅＣｌｅａｎ５と表示された試料洗浄剤を得る。
【０１０８】
尿試料を試験管に加え、インキュベートのために放置後に試験管から取り出す。次いで、試料の抗原（ＬＡＭ）アッセイを上記の一般的なアッセイの説明に従って実施する。
【図１】
2019530873.tif 000003
【図２】
2019530873.tif 000004
【図３】
2019530873.tif 000005
【図４】
2019530873.tif 000006
【配列表】
2019530873000001.app
【国際調査報告】
2019530873.tif 000007
2019530873.tif 000008
2019530873.tif 000009