【手続補正書】
【提出日】平成19年5月9日(2007.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、少なくとも１つの核酸を後で単離および精製するための生物学的サンプルを調製する方法:
a. 生物学的サンプルの細胞培地または細胞液をあらかじめ除去することなく、生物学的サンプルおよび抽出酵素溶液を混合し、可溶化液混合物を形成させる工程、ここで該抽出酵素溶液は、
1)リゾチーム、
2)リボヌクレアーゼ、
3)金属キレート剤、および、
4)非イオン性界面活性剤
を含む;
b.該可溶化液混合物をインキュベートする工程;および、
c.結合溶液を該可溶化液混合物に添加する工程、ここで該結合溶液は、
1)アルコールまたはポリエチレングリコール、
2)アルコールおよび塩の混合物、および、
3)アルコール、塩、および/またはカオトロープの混合物、
からなる群から選択される。
【請求項２】
生物学的サンプルが細胞培養物である請求項1の方法。
【請求項３】
細胞培養物における細胞が細菌、植物、酵母および哺乳類細胞からなる群から選択される請求項2の方法。
【請求項４】
可溶化液混合物を結合溶液の添加の前に少なくとも10秒間インキュベートする請求項1の方法。
【請求項５】
可溶化液混合物を結合溶液の添加の前に30分未満インキュベートする請求項4の方法。
【請求項６】
可溶化液混合物を結合溶液の添加の前に5分未満インキュベートする請求項5の方法。
【請求項７】
可溶化液混合物を結合溶液の添加の前に2分未満インキュベートする請求項6の方法。
【請求項８】
結合した核酸を洗浄溶液で洗浄する工程をさらに含む請求項1の方法。
【請求項９】
核酸を溶出する工程をさらに含む請求項1の方法。
【請求項１０】
金属キレート剤がEDTA、EGTA、CDTA およびそれらの組合せからなる群から選択される請求項1の方法。
【請求項１１】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン、アルキルグルコシド、アルキルチオグルコシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される請求項1の方法。
【請求項１２】
該アルキルチオグルコシドがオクチル-β-D-チオグルコピラノシドであるか、または、該ポリオキシエチレンがTriton X-100、Tween、またはIgepal CA-630である、請求項11の方法。
【請求項１３】
該アルコールがイソプロパノール、エタノールおよびそれらの組合せからなる群から選択される請求項1の方法。
【請求項１４】
塩が塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、および酢酸リチウムからなる群から選択される請求項1の方法。
【請求項１５】
該カオトロープがチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウムおよびそれらの組合せからなる群から選択される請求項1の方法。
【請求項１６】
細胞培養物における細胞が酵母細胞であり、かつ、抽出酵素溶液がさらにリチカーゼを含む請求項3の方法。
【請求項１７】
細胞培養物における細胞が哺乳類細胞であり、かつ、抽出酵素溶液がさらにプロテアーゼを含む請求項3の方法。
【請求項１８】
核酸がDNAである請求項1の方法。
【請求項１９】
d)核酸を固体支持体に結合させる工程、および、
e)結合した核酸を固体支持体から溶出する工程、
によって核酸を単離および精製することをさらに含む請求項1の方法。
【請求項２０】
抽出酵素溶液および結合溶液を同時に添加する請求項1の方法。
【請求項２１】
以下の工程を含む、生物学的サンプルから少なくとも１つの核酸を単離および精製する方法:
a) 生物学的サンプルの細胞培地または細胞液をあらかじめ除去することなく、生物学的サンプルを抽出酵素溶液および結合溶液と混合して可溶化液/結合溶液混合物を形成させる工程、ここで該抽出酵素溶液は、
1)リゾチーム、
2)リボヌクレアーゼ、
3)金属キレート剤、および、
4)非イオン性界面活性剤
を含み;
該結合溶液は、
1) ポリエチレングリコール、および
2) 塩、
を含む、および、
b)可溶化液/結合溶液混合物を10秒〜30分インキュベートする工程。
【請求項２２】
生物学的サンプルが細胞培養物である請求項21の方法。
【請求項２３】
細胞培養物における細胞が細菌、植物、酵母および哺乳類細胞からなる群から選択される請求項22の方法。
【請求項２４】
c)核酸を固体支持体に結合させる工程、および、
d)該核酸を洗浄溶液で溶出する工程、
をさらに含む請求項21の方法。
【請求項２５】
核酸を溶出する工程をさらに含む請求項21の方法。
【請求項２６】
金属キレート剤がEDTA、EGTA、CDTA、およびそれらの組合せからなる群から選択される請求項21の方法。
【請求項２７】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン、アルキルグルコシド、アルキルチオグルコシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される請求項21の方法。
【請求項２８】
該アルキルチオグルコシドがオクチル-β-D-チオグルコピラノシドであるか、または、該ポリオキシエチレンがTriton X-100、Tween、またはIgepal CA-630である請求項27の方法。
【請求項２９】
可溶化液/結合溶液混合物を5分未満インキュベートする請求項21の方法。
【請求項３０】
該核酸がDNAである請求項21の方法。
【請求項３１】
工程のいずれかまたはすべてが自動化されている請求項21の方法。
【請求項３２】
細胞培養物における細胞が酵母細胞であり、かつ、抽出酵素溶液がさらにリチカーゼを含む請求項22の方法。
【請求項３３】
細胞培養物における細胞が哺乳類細胞であり、かつ、抽出酵素溶液がさらにプロテアーゼを含む請求項22の方法。
【請求項３４】
以下の工程を含む、生物学的サンプルの細胞培地または細胞液をあらかじめ除去することなく、少なくとも１つの核酸を後で単離および精製するための生物学的サンプルを調製する方法：
抽出酵素溶液を生物学的サンプルに添加して可溶化液混合物を形成させる工程、ここで該抽出酵素溶液は、
a)リゾチーム;
b)リボヌクレアーゼ;
c)金属キレート剤;および、
d)非イオン性界面活性剤、
を含む；および、
該可溶化液混合物を少なくとも10秒〜30分インキュベートする工程、ここで該抽出酵素溶液が該細胞を溶解し、それによって単離および精製のための該核酸が遊離する。
【請求項３５】
生物学的サンプルの細胞培地または細胞液をあらかじめ除去することなく、生物学的サンプルから核酸を迅速に単離および精製するための、または、少なくとも１つの核酸を後で単離および精製するための生物学的サンプルを調製するための、以下を含む抽出酵素溶液:
a)リゾチーム;
b)リボヌクレアーゼ;
c)金属キレート剤;および、
d)非イオン性界面活性剤。
【請求項３６】
生物学的サンプルが細胞培養物である請求項35の抽出酵素溶液。
【請求項３７】
細胞培養物における細胞が細菌、植物、酵母および哺乳類細胞からなる群から選択される請求項36の抽出酵素溶液。
【請求項３８】
金属キレート剤がEDTA、EGTA、CDTA、およびそれらの組合せからなる群から選択される請求項35の抽出酵素溶液。
【請求項３９】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン、アルキルグルコシド、アルキルチオグルコシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される請求項35の抽出酵素溶液。
【請求項４０】
該アルキルチオグルコシドがオクチル-β-D-チオグルコピラノシドであるか、または該ポリオキシエチレンがTriton X-l00、Tween、またはIgepal CA-630である請求項35の抽出酵素溶液。
【請求項４１】
該リゾチームが0.5〜40 mg/mlの濃度であり、該リボヌクレアーゼが0.1〜20 mg/mlの濃度であり、該金属キレート剤が10〜300 mMの濃度であり、該非イオン性界面活性剤が0.5 % 〜10%の濃度である、請求項35の抽出酵素溶液。
【請求項４２】
さらに安定剤およびバッファーを含む請求項35の抽出酵素溶液。
【請求項４３】
20 mg/mlのリゾチーム、10 mg/mlのリボヌクレアーゼ A、200 mMのEDTA、5%のTriton X-100、20%のグリセロールおよび50 mMのTris-HCl、pH 8.0を含む、請求項42の抽出酵素溶液。
【請求項４４】
以下の工程を含む、目的の核酸を単離および精製するための自動化方法:
a)細菌細胞を培養する工程、ここで該細菌細胞は目的の核酸を含む、
b) 培地を前もって除去することなく、抽出酵素溶液を培養した細菌細胞に添加し、可溶化液混合物を形成させる工程、ここで、該抽出酵素溶液は、
1.リゾチーム;
2.リボヌクレアーゼ;
3.金属キレート剤;および、
4.非イオン性界面活性剤、
を含む；
c)該可溶化液混合物をインキュベートする工程;
d)該可溶化液混合物と結合溶液とを混合する工程;
e)核酸をマトリックスに結合させる工程;および、
f)結合した核酸をマトリックスから溶出する工程。
【請求項４５】
生物学的サンプルの細胞培地または細胞液を除去することなく、生物学的サンプルから少なくとも１つの核酸を単離および精製するための、または、少なくとも１つの核酸を後で単離および精製するための生物学的サンプルを調製するための、以下を含む抽出酵素溶液を含むキット:
1)リゾチーム、
2)リボヌクレアーゼ、
3)金属キレート剤、および、
4)非イオン性界面活性剤。
【請求項４６】
さらに結合溶液を含む請求項45のキット。
【請求項４７】
該結合溶液が、
1)アルコールまたはポリエチレングリコール、
2)アルコールおよび塩の組合せ、および、
3)アルコール、塩、および/またはカオトロープの組合せ、
からなる群から選択される請求項46のキット。
【請求項４８】
該結合溶液が抽出酵素溶液と同時に、または抽出酵素溶液の後に利用され得る請求項46のキット。
【請求項４９】
以下の工程を含む、生物学的サンプルから少なくとも１つの核酸を単離および精製するため、または、少なくとも１つの核酸を後で単離および精製するための生物学的サンプルを調製するための方法、ここで該核酸はRNAまたはDNAのいずれかである：
(1) 生物学的サンプルの細胞培地または細胞液を前もって除去することなく、該サンプルに酵素溶液を添加して可溶化液混合物を形成させる工程、ここで該酵素溶液はリゾチームを含む、および、
(2)該可溶化液混合物を少なくとも10秒〜30分インキュベートする工程。
【請求項５０】
該酵素溶液が非イオン性界面活性剤、金属キレート剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む請求項49の方法。
【請求項５１】
さらに可溶化液混合物と結合溶液とを混合する工程、ここで該結合溶液は、
1) アルコールまたはポリエチレングリコール、
2)アルコールおよび塩の組合せ、および、
3)アルコール、塩、および/またはカオトロープの組合せ; 
からなる群から選択される、および、
核酸を固体支持体に結合させる工程、
を含む、請求項50の方法。
【請求項５２】
生物学的サンプルの細胞培地または細胞液を除去することなく、生物学的サンプルから核酸を迅速に抽出するための、リゾチームを含む酵素溶液。
【請求項５３】
非イオン性界面活性剤、金属キレート剤およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む請求項52の酵素溶液。
【請求項５４】
リボヌクレアーゼをさらに含む請求項53の酵素溶液。
【請求項５５】
生物学的サンプルの細胞培地または細胞液を除去することなく、生物学的サンプルからRNAまたはDNAを迅速に抽出するための、リゾチームを含むキット。
【請求項５６】
非イオン性界面活性剤、金属キレート剤およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む請求項55のキット。
【請求項５７】
結合溶液をさらに含む請求項56のキット。
【請求項５８】
該結合溶液が、
1) アルコールまたはポリエチレングリコール、
2) アルコールおよび塩の組合せ、および、
3)アルコール、塩、および/またはカオトロープの組合せ、
からなる群から選択される請求項57のキット。