(57)【要約】  本方法は、テロメラーゼ非依存性テロメア維持すなわち「ＡＬＴ」を採用する機能障害性細胞の複製を抑制するためのアプローチに関する。本方法論は、ＦＡＮＣＭの、並びにＢＲＣＡ１及びＢＬＭの１つ又は両方の、抑制に関する。これらの分子は、ＡＬＴによって引き起こされる複製ストレスの排除へのカギである。換言すれば、それらは、機能障害性細胞が増殖することを可能とする。これらの分子の抑制が、増殖を抑制する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＬＴ細胞の複製を抑制する方法であって、前記ＡＬＴ細胞を、（ｉ）ＦＡＮＣＭの抑制剤及び（ｉｉ）ＢＲＣＡ１又はＢＬＭの１つ又は両方の抑制剤と接触させることを含み、（ｉ）及び（ｉｉ）の各々が、ＦＡＮＣＭ、ＢＲＣＡ１及びＢＬＭを抑制するのに十分な量で投与される、方法。
【請求項２】
前記ＡＬＴ細胞が、がん細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抑制剤の各々が、ＤＮＡ発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抑制剤の各々が、ｓｉＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抑制剤の各々が、前記ＦＡＮＣＭ、ＢＲＣＡ１又はＢＬＭを抑制する結合性タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記結合性タンパク質が、抗体又は抗体の結合性断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡ分子が、１９〜２７ヌクレオチドからなる、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、機能障害性細胞によって特徴づけられる状態を軽減する方法に関し、ここで、機能障害それ自体は、それらのテロメアを維持する方法としてテロメラーゼ非依存性テロメア維持（alternative lengthening of telomers）又は「ＡＬＴ」を使用する細胞によって特徴づけられる。より具体的には、それは、それらの全てがＡＬＴ細胞における複製ストレス応答に関与するＦＡＮＣＭ並びにＢＲＣＡ１及びＢＬＭの１つ又は両方の発現を抑制することによる、前記細胞の抑制性複製ストレス応答又は破壊に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの正確な複製は、哺乳動物細胞にとって極めて重要である。細胞の「レプリソーム」（ＤＮＡ複製機構）は、しばしば、複製時に、障害に直面する。「複製ストレス」という用語は、複製フォークの一時的な又は一過性の停止を説明するために使用される（例えば、非特許文献１；非特許文献２を参照されたい。）。
【０００３】
レプリソームに対する課題を提起するＤＮＡの内在領域の１つが、テロメアである。この構造は、あらゆる直鎖クロモソームの終端に位置するＤＮＡ配列（ＴＴＡＧＧＧ）ｎのタンデムリピートからなる。テロメラーゼは、クロモソームの終端へのこの配列の付加を触媒する。テロメアは、ヒトにおいては１０〜１５Ｋｂ、及びマウスにおいては２５〜５０Ｋｂと、その長さが変化する。
【０００４】
ほぼ例外なく、体細胞は、テロメラーゼを発現せず、各細胞周期で進行性テロメア短縮を経験し、最終的には老化及び細胞死を引き起こす。例えば、非特許文献３を参照されたい。
【０００５】
細胞、例えばがん細胞の機能障害は、複製による不死化（replicative immortality）によって特徴づけられることがある。例えば、非特許文献４を参照されたい。この「複製による不死化」は、テロメア短縮を克服することによって達成される。或る割合のこれらの機能障害性細胞は、相同組換えに基づくテロメアの伸長を利用することによって、これを行う。非特許文献５；非特許文献６を参照されたい。この「テロメラーゼ非依存性テロメア維持」（以下、「ＡＬＴ」）を使用する細胞は、複製ストレスに対する感受性が高い傾向がある。それにも関わらず、ＡＬＴ細胞、すなわち上で言及される方法を介してそのテロメアの長さを維持する細胞は、例えばＡＬＴを獲得するがん細胞から明らかなように、複製を経験する。（或る細胞がＡＬＴ細胞であるかどうかを決定するための様々な方法論が周知であることが留意されるべきである。）。
【０００６】
明らかに、ＡＬＴ細胞が経験する複製ストレスを克服するためのメカニズムが存在し、それは、欠損又はＡＬＴ細胞に関連する他の欠損にも関わらず、それらの継続的な複製を可能とする。
【０００７】
ＦＡＮＣＭは、ファンコニー貧血（「ＦＡ」）ファミリーの遺伝子の認められたメンバーである。このファミリーのメンバーは、とりわけ、鎖間架橋病変（interstrand cross linking lesions）の修復に関与すると認識される。例えば、その両方が参照によって組み込まれる、非特許文献７；及び非特許文献８を参照されたい。ＦＡＮＣＭ及びその３つの必須（obligatory）結合パートナー（ＦＡＡＰ２４、ＭＨＦＩ、及びＭＨＦ２）に係る情報は、例えば、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３； 非特許文献１４； 非特許文献１５； 非特許文献１６；及び非特許文献１７に見出すことができる。また、非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；及び非特許文献２１を参照されたい。
【０００８】
上記のCollisらは、非摂動（unperturbed）ヒトがん細胞におけるＦＡＮＣＭの急性の欠乏が、ＤＮＡ損傷の一般的なマーカーであるγ−Ｈ２ＡＸフォーカスの形成の増大を引き起こすことを観察した。上記のSchwabらは、ニワトリＤＴ４０細胞において同様にこれを観察した。
【０００９】
CollisもSchwabも、他の研究者も、これらの細胞におけるＤＮＡ損傷の原因又は性質を特定しなかった。
【００１０】
現在、ＦＡＮＣＭ又はその必須結合パートナーの１つの欠乏が、主としてテロメアで起こる、ＡＬＴ細胞における複製ストレスを誘発することが見出された。ＦＡＮＣＭの除去が、これらのＡＬＴテロメアでの複製効率を劇的に低減させることが示された。
【００１１】
さらに、その両方が相同組換えにとって極めて重要なタンパク質である、ＢＬＭ及びＢＲＣＡ１が、複製ストレスの部位へと動員され、ＤＮＡ終端切除を刺激すること及び相同組換えを促進することによってそれを解決する助けをすることが見出された。
【００１２】
ＦＡＮＣＭ及びＢＬＭ又はＢＲＣＡ１の１つの同時欠乏が、劇的に、微小核形成を増大させ、合成致死性を増大させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Berti, et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 23(2):103-109 (2016)
【非特許文献２】Zeman, et al., Nat. Cell Biol., 16(1):2-9 (2004)
【非特許文献３】Lopez-Ortin, et al., Cell, 153(6):1194-1217 (2013)
【非特許文献４】Hanahan, et al., Cell, 144(5):646-674 (2011)
【非特許文献５】Dilley, et al., Trends in Cancer, 1(2):145-156 (2015)
【非特許文献６】Cesare, et al., Nat. Rev. Genet., 11(5):319-330 (2010)
【非特許文献７】Caccaldi, et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 17(6):337-349 (2016)
【非特許文献８】Michl, et al., EMBO J., 35(9):909-923 (2016)
【非特許文献９】Meetei, et al., Nat. Genet., 37(9):958-963 (2005)
【非特許文献１０】Mosedale, et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 12(9):763-771 (2005)
【非特許文献１１】Ceccia, et al., Mol. Cell, 25(3):331-343 (2007)
【非特許文献１２】Yam, et al., Mol. Cee, 37(6):854-878 (2010)
【非特許文献１３】Singh, et al., Mol. Cell, 37(6):879-886 (2010)
【非特許文献１４】Collis, eta l., Mol. Cell, 32(3):313-324 (2008)
【非特許文献１５】Huang, et al., Mol. Cell, 52(3):434-446 (2013)
【非特許文献１６】Huang, et al., Mol. Cell, 39(2)):259-268 (2010)
【非特許文献１７】Wang, et al., Mol. Cell, 49(5):997-1009 (2013)
【非特許文献１８】Schwab, et al., EMBO J., 29(4):806-818 (2010)
【非特許文献１９】Luke-Glaser, et al., EMBO J., 29(4):795-805 (2010)
【非特許文献２０】Singh, et al., Blood, 114(1):174-180 (2009)
【非特許文献２１】Blackford, et al., Hum. Mol. Genet., 21(9):2005-2016 (2012)
【非特許文献２２】Marichal, et al., Cold Spring Harb. Perspect Biol., 5(9) (2013)
【非特許文献２３】Ceccia, et al., Mol. Cell, 40(2):179-204 (2010)
【非特許文献２４】Drosopoulos, et al., J. Cell Biol., 197(2):253-266 (2012)
【非特許文献２５】Bizard, et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 6(7):a016477 (2014)
【非特許文献２６】Crouteau, et al., Annu. Rev. Biochem., 83:519-552 (2014)
【非特許文献２７】Gravel, et al., Genes Dev., 22(20:2767-2722 92008)
【非特許文献２８】Kibe, et al., Mol. Cell, 61(2):236-246 (2016)
【非特許文献２９】Acharya, et al., Phos One, 9(8):103819 (2014)
【発明の概要】
【００１４】
したがって、ＦＡＮＣＭ並びにＢＬＭ及びＢＲＣＡ１の１つ又は両方の発現を欠乏又は低減させることによって、対象における欠損ＡＬＴ細胞の数を低減させる方法を開発することが、本発明の目的である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のこの及び他の態様がどのようにして実現されるかが、以下の開示において示される。
【実施例】
【００１６】
実施例１
この第１の実験のセットは、ＦＡＮＣＭ欠損細胞において見られるＤＮＡ損傷が、実際上、二本鎖ＤＮＡ切断とは異なり、複製ストレスに起因することを確認するために設計された。
【００１７】
これらの各々が、異なる経路を活性化する、すなわち、複製ストレスは、ＡＴＲ−ＤＮＡ−ＰＫｃｓ−Ｃｈｋ１経路を活性化するのに対して、二本鎖切断は、ＡＴＭ−ＣｈＫ２経路を活性化する。例えば、非特許文献２２；及び非特許文献２３を参照されたい。
【００１８】
さらに、ＣｈＫ１のＳｅｒ３４５（「ＣｈＫｐＳ３４５」）及びＲＰＡのＳｅｒ３３（「ＲＰＡ３２−ｐＳ３３」）は、ＡＴＲによってリン酸化されるのに対して、ＲＰＡ３２のＳｅｒ４及びＳｅｒ８（「ＲＰＡ３２−ｐＳ４ｐＳ８又はｐＲＰＡ３２」）は、ＤＮＡ−ＰＫによってリン酸化される。
【００１９】
アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）から入手可能なＵ２−ＯＳ及びＳａＯＳ−２細胞は、ヒトＡＬＴ細胞である。以下で論じられるＨｅＬａ及びＭＧ６３細胞は、そうではない。全ての細胞が、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーターにおいて、３７℃で、１０％ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ中で培養された。
【００２０】
細胞から、ｓｉＲＮＡを使用してＦＡＮＣＭを欠乏させた。詳述すると、細胞に、陰性対照としてルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ、又はＦＡＮＣＭを標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクトした。これらのｓｉＲＮＡ分子は、商業的に入手可能であり、 Dharmaconから購入した。ヒト細胞は、ルシフェラーゼを発現しないため、添加されたｓｉＲＮＡは、いかなる遺伝子をも欠乏させないはずである。したがって、陰性対照は、以下の実験に係る通常の条件となる。標準的な培養条件については上記を参照されたい。その後、これらの細胞を、γＨ２ＡＸ、ＣｈＫ１−ｐＳ３４５、ＲＰＡ３２−ｐＳ４Ｓ８又はＢＬＭを認識する緑色色素で標識した抗体と接触させた。全ての細胞を、青色であるＤＡＰＩでも染色した。全ての抗体を、購入したか、又は他の研究者から提供を受けた。２００を超える細胞を、各試料において計測した。
【００２１】
結果は、ルシフェラーゼ対照細胞が、対照と比較して、１％未満のＣｈＫ１−ｐＳ３４５及びＲＰＡ３２−ｐＳ４ｐＳ８フォーカスを示すことを示した。
【００２２】
対照的に、細胞から、ｓｉＲＮＡを用いてＦＡＮＣＭを欠乏させたとき、細胞のおよそ１５％が、上で言及されたマーカーを含有する明るいフォーカスを示した。ＲＰＡ−ｐＳ４ｐＳ８フォーカスの増大に加えて、イムノブロッティング研究は、ＲＰＡ３２−ｐＳ３３及びＲＰＡ−ｐＳ４ｐＳ８の両方の劇的な増大を示し、細胞が複製ストレス下にあることを示した。
【００２３】
これらの結果は、ＦＡＮＣＭ欠損細胞におけるＤＮＡ損傷が、主に、ＤＮＡ複製ストレスに起因することを示唆する。
【００２４】
結果は、細胞の２０〜３０％が、ＢＬＭに関して陽性に染色されたことを実証する。ＢＬＭは、上で論じられる相同組換えの複数の重要な工程に関与するＤＮＡヘリカーゼである。
【００２５】
実施例２
これらの実験は、実施例１において観察された複製ストレスが、テロメアで起こっているかどうかを決定するために設計された。
【００２６】
上で論じられるようにＦＡＮＣＭを欠乏させた細胞を、これも上で説明されるように、対照細胞と同様に、３つのテロメア特異的マーカーを用いて探索した。ペプチド核酸プローブであるＴｅｌＣ、その両方がシェルタリン複合体の主要成分であるＴＲＦ１及びＴＲＦ２。
【００２７】
細胞を、ＤＮＡプローブ、又はＴＲＦ１に特異的な抗体、又はＴＲＦ２に特異的な抗体とともに、上で使用された同じＣｈＫ１−ｐＳ３４５抗体を用いて共染色した。
【００２８】
並列の実験において、ＣｈＫ１−ｐＳ３４５抗体を、ＢＬＭに特異的な抗体によって置換した。
【００２９】
結果は、染色によってもたらされるフォーカスの全てがテロメアのマーカーと共存し、それらは通常のテロメアの染色よりもより大きくより明るいことを示し、複製ストレスを経験したテロメアでのクラスター形成を示唆した。
【００３０】
これらの 実験をＡＬＴ細胞ＳａＯＳ−２において繰り返すと、同様の結果が得られた。対照的に、テロメラーゼ陽性細胞ＨｅＬａ及びＭＧ６３を試験すると、結果は相関しなかった。
【００３１】
これらのデータは、総合すると、ＦＡＮＣＭは、ＡＬＴ細胞のテロメアでの複製ストレスを軽減する機能を果たすことを示唆する。
【００３２】
さらに、他のフォーカスと共存するテロメアのフォーカスは、通常のフォーカスよりもより大きくより明るい傾向があり、複製ストレスを示唆する。このパターンは、これもまたＡＴＣＣから購入される細胞株Ｓａｏｓ−２の細胞を用いる、第２の実験のセットにおいても繰り返された。
【００３３】
実施例３
上で注記されるように、ＦＡＮＣＭの様々な機能は、３つの必須結合パートナー：ＦＡＡＰ２４、ＭＨＦ１及びＭＨＦ２を必要とする。また、上で注記されるように、ＦＡＮＣＭは、ＦＡタンパク質のファミリーの一部である。
【００３４】
それらの機能をレビューすると、ＦＡＡＰ２４は、ＦＡＮＣＭのＣ末端に結合し、ＦＡコア複合体の一部として働き、ＦＡＮＣＤ２及びＦＡＮＣＩ（ＩＤ２）のモノユビキチン化（monoubiquination）を促進する。ＭＨＦ１及びＭＨＦ２は、両方ともヒストンフォールドタンパク質であり、「ＭＨＦ１／２」と称される安定な化学量論的（stochiometric）ヘテロ二量体を形成する。二量体は、ＦＡＮＣＭのＮ−末端に結合し、ＦＡＡＰ２４と同様に機能する。実験を、これらの分子又はＦＡファミリーの他のメンバーがＦＡＮＣＭと同様に作用するかどうかを決定するために実施した。
【００３５】
Ｕ２−ＯＳ細胞に、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを、又は２つのｓｉＲＮＡ「ＦＡＡＰ２４−１及び−２」をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、テロメアのＧリッチ鎖を認識するＰＮＡプローブ又はＴＲＦ１特異的抗体とともに、上で説明されるようにＣｈＫ１−ｐＳ３４５又はＢＬＭを認識する抗体で共染色した。細胞を、先の実施例と同様に計測した。
【００３６】
これらの２つのｓｉＲＮＡ分子は、同じ遺伝子を欠乏させるが、２つは、いわゆる「オフターゲット」効果を排除するために使用された。簡潔には、ｓｉＲＮＡ（概して、１９〜２７ヌクレオチドの長さ）が、１つの遺伝子にのみ特異的であるために選択されるけれども、当該ｓｉＲＮＡが、標的とされる当該１つの遺伝子に加えて、或る遺伝子を欠乏させる状況が存在する。２つの分子を使用することは、オフターゲット効果を最小化するのに役立つ。
【００３７】
結果は、ＦＡＡＰ２４の欠乏が、ＣｈＫ１−ｐＳ３４５及びＢＬＭフォーカスの劇的な増大を誘発したことを示す。さらに、ＭＨＦ１又はＭＨＦ２の１つ又は両方の除去が、同じ効果を有した。しかしながら、ＭＨＦ１／２の除去は、関連するフォーカスをほとんど誘発せず、ＦＡＡＰ２４が複製ストレスの緩和においてより重要な役割を有することを示唆した。ＦＡＮＣＭ、ＦＡＡＰ２４、ＭＨＦ１及びＭＨＦ２の全ての欠乏が、相加的効果を有した。すなわち、テロメアにおけるフォーカスの穏やかな増大が存在した。
【００３８】
ＦＡＮＣＭについて上で論じられたものと比較可能な、他のＦＡタンパク質（すなわち、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＧ及びＦＡＮＣＩ）に係る試験が、ＦＡＮＣＩの欠乏が、フォーカス形成に対する影響を有さず、ＦＡＮＣＢ及びＦＡＮＣＧの除去が、フォーカス形成において穏やかであるがはるかに低減した役割を有することを示した。ＦＡＮＣＭの除去によってもたらされる増大ほどには大きくはない、ＣｈＫ１−ｐＳ３４５フォーカス形成の穏やかな増大が存在した。しかしながら、ＢＬＭフォーカスの増大は、ＦＡＮＣＭと同等であり、ＦＡコア複合体が、ＢＬＭ動員の抑制において有効な役割を有することができるであろうことを示唆した。
【００３９】
実施例４
これらの実験は、テロメア複製におけるＦＡＮＣＭの役割を検証する。ＳＭＡＲＤアッセイを、ＦＡＮＣＭ欠乏細胞のサブテロメア領域において、参照によって組み込まれる非特許文献２４に従って、実施した。（「ＳＭＡＲＤ」は、「複製ＤＮＡの単一分子解析」（single molecule analysis of replicated DNA）のアクロニムである。）。詳述すると、細胞に、ＦＡＮＣＭを欠乏させるために、上で論じられるようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。その後、細胞を、ＩｄＵ及びＣｌｄＵで各々４時間順番に、パルス標識した。標識後、細胞のゲノムＤＮＡを、消化し、パルスフィールドゲル電気泳動に供してそれを分離し、サブテロメア及びテロメアが豊富ないずれかのゲノムＤＮＡを、テロメア特異的ＰＮＡプローブ及び古典的なサザンブロッティングを使用して同定した。
【００４０】
次に、そのようにして同定されたＤＮＡを、伸長させ、抗ＩｄＵ及び抗ＣｌｄＵ抗体で染色し、赤色及び緑色に標識し、古典的なＦＩＳＨ方法論に供した。画像を、可視化し、ハロゲン化ヌクレオチドを含有する繊維を、標準的な方法を使用して計測した。
【００４１】
結果は、ＦＡＮＣＭ欠乏細胞において、複製効率の３倍の減少を示した。当該減少は、全ＤＮＡ複製の減少との相関性を有しないと考えられる。なぜなら、ＦＡＮＣＭ欠乏細胞の細胞周期プロファイルの比較は、対照と同程度であったからである。
【００４２】
しかしながら、これらの結果は、ＦＡＮＣＭが存在しないか又はこれが低減すると、複製フォークが、ＡＬＴテロメアで休止及び／又は停止する傾向があり、複製ストレスの増大を引き起こすという結論を支持する。
【００４３】
実施例５
「ＢＬＭ」は、複製、複製ストレス応答及びテロメア生物学を含む多数のＤＮＡ代謝経路に関与することが知られている。非特許文献２５；及び非特許文献２６を参照されたい。それは、テロメアにおける相同組換え時のＤＮＡ終端切除において重要な役割を果たすことが知られている。例えば、非特許文献２７；及び非特許文献２８を参照されたい。
【００４４】
ＢＬＭの機能を研究するために、細胞から、上で論じられたｓｉＲＮＡ方法論を使用して、ＦＡＮＣＭ及びＢＬＭを同時欠乏させ、ＤＮＡ終端切除を、ＲＰＡ３２−ｐＳ４ｐＳ８及びＲＰＡ３２−ｐＳ３３を認識する抗体を使用するイムノブロッティングを介して監視した。
【００４５】
ＢＬＭの欠乏は、ＦＡＮＣＭも欠乏させた細胞において、ＤＮＡ終端切除を劇的に減弱化し、ＢＬＭが、ＡＬＴテロメアでの複製応答時のＤＮＡ終端切除に必要とされることを証明した。例えば非特許文献６が、ＡＬＴ細胞が、相同組換えに依存して、テロメアの長さを維持し、停止した複製フォークを修復することを示すことが指摘されるべきである。ＤＮＡ終端切除の低減は、相同組換えを損ない、ＤＮＡ修復プロセスを妨害する。この実験の結果は、２つの対象分子を欠乏させたときの、微小核を有する細胞の劇的な増大という観察結果と一致する。さらに、標準的なクリスタルバイオレットアッセイが、２つの分子の欠乏によってもたらされる、強い致死的な相互作用を示した。
【００４６】
実施例６
これらの実験は、ＤＮＡ代謝における別の「プレイヤー」であるＢＲＣＡ１が、ＡＬＴテロメア複製ストレス系に関与するかどうかを決定するために設計された。この分子は、チェックポイント活性化及び相同組換えを含むＤＮＡ代謝の複数の面に非常に関与するとして、周知である。非特許文献２９は、それがＡＬＴテロメアで見出さされること、及び、それがＢＬＭのヘリカーゼ活性を刺激することを示した。
【００４７】
ＢＲＣＡ１の役割を研究するために、上で説明されるようなＦＡＮＣＭ欠乏細胞を、ＢＲＣＡ１特異的抗体、及びこれも上で説明されるようなテロメア特異的プローブで共染色した。Ｕ２−ＯＳ及びＳａＯＳ−２細胞の両方を、標準的な方法を使用して試験した。
【００４８】
結果は、ごく一部の対照細胞がＢＲＣＡ１フォーカスを示すが、これらはテロメアとほとんど共存しないことを示した。
【００４９】
一方、ＦＡＮＣＭ欠乏細胞におけるＢＲＣＡ１特異的フォーカスの９０％超が、テロメアと共存する。
【００５０】
特に関心が持たれることは、ストレスを付加されたＡＬＴテロメアへのＢＬＭ及びＢＲＣＡ１の動員が、相互に依存することである。
【００５１】
実施例７
さらなる実験が、検討中の修復プロセスにおけるＢＲＣＡ１の機能を解明するために実施された。二本鎖切断（「ＤＳＢ」）の修復時において、ＢＲＣＡ１の最も重要な機能は、「高忠実性」修復経路として認識される、相同組換えを介してＤＳＢを修復することができるように、５３ＢＰ１に対抗し、ＤＮＡ終端切除を刺激することであることが知られている。細胞を、複製ストレス誘発因子である紫外光に供すると、ＢＲＣＡ１が、ＤＮＡ終端切除を促進することも示されている。
【００５２】
以下の実験は、ＢＲＣＡ１が、ＦＡＮＣＭ欠損ＡＬＴ細胞におけるテロメアでのＤＮＡ終端切除において或る役割を有することを示した。
【００５３】
本書で示される他の実施例と同様に、ＵＳ−ＯＳ細胞に、ルシフェラーゼ（対照）、ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＭ、又はＢＲＣＡ１及びＦＡＮＣＭの両方を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。細胞を溶解し、溶解物を、標準的な方法に従って、抗体を用いてブロッティングした。
【００５４】
結果は、ＢＲＣＡ１及びＦＡＮＣＭの同時欠乏が、Ｓｅｒ４／８及び３３でのＲＰＡ３２のリン酸化を著しく妨げることを示し、ＢＲＣＡ１が、ＡＬＴテロメアでのＤＮＡ終端切除に必要とされることを示す。
【００５５】
ＲＰＡは、損傷したＤＮＡの修復に関与することが知られている。ＲＰＡがＳｅｒ４及びＳｅｒ８でリン酸化されると、そのようにしてリン酸化されたＲＰＡ分子は、損傷の部位へと動員され、一本鎖ＤＮＡに結合する。
【００５６】
したがって、ＲＰＡのリン酸化の測定値は、ＲＰＡ活性化の、及びＤＮＡ終端切除の指標であり、それはすなわち、どの程度の量の一本鎖ＤＮＡが産生されているかの指標である。したがって、ＦＡＮＣＭ欠乏ＡＬＴ細胞において進行中である修復の量が決定された。より簡単に表現すると、リン酸化ＲＰＡレベルの減少は、ＤＮＡ終端切除の低減及びＤＮＡ修復の低減を示唆する。
【００５７】
さらに、ＢＬＭと同様に、同時欠乏細胞における微小核の非常に劇的な増大、及び試験したＡＬＴ細胞における強い合成致死性が存在したが、これは、ＡＬＴの特徴を示さないテロメラーゼ陽性細胞ＨｅＬａ及びＭＧ６３においては見られない現象であった。ＢＲＣＡ１及びＢＬＭ１を同時欠乏させ、ＦＡＮＣＭを欠乏させなかったときには合成致死性は見られなかった。 
【００５８】
前述の開示は、ＦＡＮＣＭ並びにＢＲＣＡ１及びＢＬＭの１つ又は両方を抑制することによって機能障害性ＡＬＴ細胞を排除する方法に関する、本発明の特徴を示す。これらの３つの分子（ＦＡＮＣＭ、ＢＲＣＡ１及びＢＬＭ）は、ＡＬＴ細胞における複製ストレスの軽減に関与することが示される。それらを抑制することによって、これらの機能障害性細胞の生存度が、劇的に低減する。
【００５９】
抑制は、例えばｓｉＲＮＡ又は他のタンパク質発現の抑制剤を使用して、ヌクレオチドレベルのものであってもよく、また、タンパク質抑制剤、例えば小分子、すなわち、非ペプチド系、ヘテロ環分子、抑制性抗体、抑制性を有する抗体断片、等を使用することによって、タンパク質レベルで起こるものであってもよい。
【００６０】
方法論は、機能障害性細胞を抑制及び／又は排除するための他の方法論と組み合わせて使用され得る。例えば、複数種のがん細胞が、ＡＬＴによって特徴づけられる。ＡＬＴを軽減するメカニズムを抑制することによって、標準的な薬剤療法を修正して、例えば、激しい治療法によって引き起こされる正常な細胞に対する負担を低減させることができる。当該修復メカニズムが抑制されると、かかる激しい治療法の形態は、もはや必要とされない。
【００６１】
本発明の他の態様は、当業者には明確であり、ここでは示されない。
【００６２】
利用された用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定の用語として使用されるものではなく、かかる用語及び表現その使用において、示され説明された特徴又はその一部のいかなる均等物を排除する意図も存在せず、本発明の範囲内において様々な修正形態が考え得ることが認識される。
【国際調査報告】
2019505562.tif 000002
2019505562.tif 000003
2019505562.tif 000004
2019505562.tif 000005
2019505562.tif 000006