(57)【要約】  本発明は、培養条件下でインビボに存在する細胞微小環境を再生することができる機能性酵素を含有するポリマーマトリックス又はゲルを含む組成物に関する。本発明はまた、そのような組成物、特にヒドロゲルを含む細胞培養のための装置、及び細胞培養の化学的微小環境を制御するための、又はインビボ細胞の生理学的若しくは病理学的条件を模倣するためのその使用に関する。本明細書に記載の組成物及び装置は、決定された細胞株又は初代細胞に対する化合物の治療効果を評価するためにインビトロでも使用され得る。 （図1）
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスを含むインビトロ細胞培養物中で使用するための組成物であって、前記マトリックスが前記細胞培養物中の酸素勾配が制御される酸素の還元を触媒することができる１種以上の酵素を含むことを特徴とする、上記組成物。
【請求項２】
前記マトリックスがポリマー又はタンパク質マトリックスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵素が、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、チトクロームオキシダーゼ又はラッカーゼから選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
カタラーゼ酵素をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記酵素が、架橋剤（クロスリンカー）によって前記マトリックスに共有結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記架橋剤が、グルタルアルデヒド（ＧＤＡ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド、ホルムアルデヒド、光反応剤から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記酵素が、機械的及び／又は静電的相互作用を介してポリマーマトリックス中に捕捉されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物がヒドロゲルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ヒドロゲルが、シリコーンヒドロゲル、ポリアクリルアミド、セルロース、セルロース誘導体、コラーゲン、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、キトサン、寒天、ポリマコン、ヒアルロン酸、ポリメチルメタクリレート、ヒドロゲルペプチド模倣物から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ヒドロゲルのマトリックスが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに含む、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヒドロゲルのポリマーマトリックスが、グルタルアルデヒドにより共有結合したグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、カタラーゼ及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む又はからなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞用の容器と請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物とを含む、インビトロ細胞を培養するための装置。
【請求項１３】
前記容器がペトリ皿である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記組成物が前記容器の底部に堆積されて１つ又は複数の層を形成する、請求項１２又は１３に記載の装置。
【請求項１５】
細胞培養物の化学的微小環境を制御し、及び／又はインビボ細胞の生理学的又は病理学的条件を模倣するためのインビトロ方法であって、細胞用容器中で細胞株又は初代細胞を培養する工程を特徴とし、請求項１から１１のいずれか一項の組成物が寄託されている、上記方法。
【請求項１６】
前記組成物によって生成された酸素勾配を測定するさらなるステップを含み、特に、前記測定が走査型電気化学顕微鏡によって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞培養物が癌細胞である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が上皮細胞である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物が堆積されている細胞用容器内で前記細胞株を培養する工程、及び前記細胞株に前記薬物又は化合物を添加する次の工程を含む、生理学的又は病理学的状態に対する薬物又は化合物の効果を評価するインビトロ方法。
【請求項２０】
前記組成物のマトリックスがミクロスフェアに封入されている、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記微小球が磁性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
以下の工程を含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載のヒドロゲルの形態の組成物の調製方法：
ａ）酸素の還元を触媒することができる１つ以上の酵素を含む溶液を調製する；
ｂ）架橋剤を添加する；
ｃ）溶液をゲル化する。
【請求項２３】
前記架橋剤がグルタルアルデヒド（ＧＤＡ）である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＢＳＡが添加される追加の工程を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボに存在する細胞微小環境を培養条件下で再生することができる機能的酵素を含有するマトリックスを含む組成物に関する。本発明はまた、そのような組成物、特にヒドロゲル組成物を含む細胞培養のための装置、及び細胞培養の化学的微小環境を制御するための、又はインビボ細胞の生理学的若しくは病理学的条件を模倣するためのその使用に関する。組成物及び本明細書に記載の装置はまた、決定された細胞株又は初代細胞に対する化合物の治療効果を評価するためにインビトロで使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
酸素レベル及び機械的性質は、細胞増殖のための基本的なパラメータ、細胞に属するすべての機能及び決定を調節するパラメータである。そのような特性は、インビトロ細胞培養において完全に制御されなければならない。インビトロ細胞培養は一般に２０％酸素で行われるが、これは組織及び条件に応じて約５％に相当するインビボ組織に見られる酸素濃度ではない。グルコース、酸素及びｐＨ勾配は、細胞培養と幹細胞ニッチ、充実性腫瘍塊、老化組織などの重要な解剖学的領域の典型的な条件との間でかなり異なる。組織内及びインビボ細胞環境内に存在する主要な生理学的条件（基本的には酸素勾配、グルコース及びｐＨ）、すなわち複雑な方法及び高コストを伴う特定の器具類（例えば、低酸素フード）を使用しない限り一般的なインビトロ培養技術では得られない条件を、簡単で安価で制御可能な方法で再現する装置は最新技術に開示されていない。
【０００３】
酸素は、生理学的条件下で、関与する臓器又は組織に対して２４から１６０ｍｍＨｇの間で変動する分圧を有する。対照的に、病理学的条件下、特に腫瘍の条件下では、組織内の酸素レベルは劇的に減少するか、又は最も劇的な場合にはゼロであり、これら２つの状況はそれぞれ低酸素及び無酸素と定義され、これは酸素正常状態：生理学的の同義語から区別されるべきである。この強い減少の２つの主な原因は、組織への酸素の適切な投入を維持することができない血管の広範囲の混乱と、カルボキシヘモグロビン及びメトヘモグロビンのような臓器にとって危険なヘモグロビン中間体の頻繁な形成にある。この場合の分圧は、細胞内チトクローム周囲の０．０２ｍｍＨｇから、毛細血管内の酸素レベルに関連する４５ｍｍＨｇの範囲である。
【０００４】
生理学的及び病理学的条件下でのインビトロ培養条件とインビボ実条件との間の差異は、すべての前臨床実験、創薬過程、疾患の研究、再生医療、薬の実験、及びカスタマイズされた治療法において存在する問題を表している。
【０００５】
特許出願ＵＳ２０１５３６２４８３は、病理学的及び生理学的インビボ細胞状態の両方をインビトロで模倣するための方法を記載している。この方法は、高価で管理が難しい機械的要素を有する装置を必要とし、確かにこれは細胞増殖のために一般的に使用される培養プレートのレベルで増倍することができない。細胞外マトリックス中の代謝産物及び可溶性分子の濃度及び勾配の微量検査は、生理学的条件を再現するのに必要とされるようには達成されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、従来技術に記載されている解決策の不利な点を示さない生理学的又は病理学的細胞条件をインビトロで効果的に模倣するための新しい方法、組成物及び装置を提供することが問題とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、インビボに存在する細胞微小環境を培養条件下で再生することができる機能的酵素を含有するマトリックスを含む、特にヒドロゲルの形態の組成物の使用に基づく。
【０００８】
本発明者らは、細胞培養環境が本明細書に記載の組成物及びヒドロゲルによって制御できることだけでなく、作り出すことに成功する条件が、正常組織及び腫瘍組織の両方の組織に存在する条件と非常に類似することも示した。本発明の結果は、組成物及びヒドロゲルを含む装置の使用がインビトロで特定の生理学的条件を再現し、相対的な細胞代謝、例えば代謝、細胞シグナル伝達に対する環境の影響、健常細胞と腫瘍細胞の両方の遺伝子発現を研究することを可能にするので有利である。さらに、それは腫瘍成長因子を推定することを可能にし、それに基づいて、より有効な治療戦略を考案することを可能にする。本発明による装置は、インビボシステムと同じくらい信頼性があるがインビトロシステムの全ての利点を有する、前臨床試験のための独自のシステムを表す。新薬の可能性を評価するための新薬の実験から新しい治療戦略の開発まで、実際の腫瘍の微生理学的環境を研究するという利点を有する用途はいくつかあり得る。その上、計算方法を用いて、ヒト組織に天然に存在する濃度勾配を考慮に入れ、これらのバイオミメティックシステムにおいてそれらを試験することによって、薬物送達の新しい戦略を開発することが可能であろう。
【０００９】
第一に、本発明は、次に、前記細胞培養における酸素勾配が制御される酸素の還元を触媒することができる１つ又は複数の酵素を含有するマトリックス、特にポリマー又はタンパク質マトリックスを含むことを特徴とする、インビトロ細胞培養において使用される組成物に関する。
【００１０】
第二に、本発明は、細胞用の容器と、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物とを含む、インビトロ細胞を培養するための装置に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、細胞用容器中で細胞株（又は初代細胞）を培養する工程を特徴とするインビボ細胞の生理学的又は病理学的条件を模倣するためのインビトロ方法に関するもので、ここで本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物又はヒドロゲルは寄託されている。さらに、本発明は、細胞用容器中で細胞株（又は初代細胞）を培養する工程を特徴とする細胞培養物の化学的微小環境の制御方法に関するもので、ここで本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物は寄託されている。
【００１２】
さらに、本発明は、細胞株を細胞用容器中で培養する工程、ここで本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物は寄託されている、及び前記細胞株上に前記薬物又は化合物を添加する工程を含む、決定された生理学的又は病理学的状態に対する薬物又は化合物の効果を評価するための方法に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、以下の工程を含む、ヒドロゲルの形態の組成物を調製するための方法に関する：
ａ）酸素の還元を触媒する傾向がある１以上の酵素を含む溶液を調製する；
ｂ）架橋剤を添加する；
ｃ）溶液をゲル化する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明による装置の動作を概略的に示す。
【図２】腫瘍の微小環境を再現するためにアクティブマトリックスのグリッドによって改変されたプロトタイプの培養プレートの写真。
【図３】対照プレート及び活性のない（酵素を含まない）タンパク質マトリックスで修飾したプレート上の細胞ＭＣＦ１０Ａ及びＭＣＦ７の増殖曲線。曲線は、使用されたマトリックスの生体適合性及び毒性の欠如を示す。
【図４】低酸素を発生させる活性ゲルから数十マイクロメートルに位置するＵＭＥ（Ｐｔ  １０μｍ）で記録されたアンペロメトリー、ＰＢＳ中のＡｇ／ＡｇＣｌに対してＥ＝−０．７Ｖ。約４秒で、１ｍＭの濃度のグルコースを添加した。
【図５】低酸素を生成するためのアクティブマトリックスのストリップ上のＵＭＥでの走査曲線。方向はアクティブストリップに垂直であり、電極はアクティブマトリックスが配置されているプレートから一定の高さに保たれている。ＰＢＳ中１ｍＭグルコース中のＡｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）に対してＥ＝−０．７Ｖ。
【図６】互いに１〜１．５ｍｍの距離に配置された活性マトリックスのストリップによって修飾されたプレート上のＵＭＥ（Ｐｔ  １０μｍ）の走査曲線。ＰＢＳ中１ｍＭグルコース溶液中のＡｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）に対してＥ＝−０．７Ｖ。
【図７】ＰＢＳに１  ｍＭグルコースが存在する状態で電位＝−０．６Ｖ、最大速度５０μｍ／ｓ、Ｐｔ  ＵＭＥ  １０μｍ、参照電極Ａｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）を用いて行ったゲル近傍のアプローチ曲線。
【図８】対照プレート及び非活性（ＢＳＡのみ）及び活性（Ｇｏｘ及びＣＡＴを含む）タンパク質マトリックスで修飾されたプレート上での細胞ＭＣＦ１０Ａの生存率についてエリスロシンＢを使用することによる増殖曲線。曲線は、使用したマトリックスの生体適合性と毒性の欠如を示している。さらに、活性プレート内に存在する化学的勾配の増殖への影響が強調されている。
【図９】対照プレート及び非活性（ｓｏｌｏ  ＢＳＡ）及び活性（Ｇｏｘ及びＣＡＴを含む）タンパク質マトリックスで修飾したプレート上での細胞ＭＣＦ１０Ａの生存率についてエリスロシンＢを使用することによる増殖曲線。曲線は、使用したマトリックスの生体適合性と毒性の欠如を示している。さらに、活性プレート内に存在する化学的勾配の増殖に対する影響が強調されている。
【図１０】酵素を含む活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ１０Ａの光学画像（左側）。
【図１１】非活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ１０Ａの光学画像（左側）。
【図１２】ヒドロゲルからの細胞ＭＣＦ１０Ａの距離に応じた細胞増殖密度、酵素の存在下でのゲルとの比較、及び対照ゲルとの比較。細胞密度の経過は、低密度領域が低酸素領域の近くに観察される勾配の存在下でのものとは対照的に、対照プレートにおいて均一である。
【図１３】非活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ１０Ａの光学画像（左側）。
【図１４】非活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ１０Ａの光学画像（左側）。
【図１５】酵素の存在下でのゲル及び対照ゲルとの密集度比較における、細胞ＭＣＦ１０Ａのヒドロゲルからの距離に応じた細胞増殖密度。細胞密度の経過は、低密度領域が低酸素領域の近くに観察される勾配の存在下でのものとは対照的に、対照プレートにおいて均一である。
【図１６】酵素を含む活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ７の光学画像（左側）。
【図１７】非活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養された細胞ＭＣＦ７の光学像（左側）。
【図１８】細胞ＭＣＦ７のヒドロゲルからの距離による細胞増殖密度、酵素の存在下でのゲルと対照ゲルとの比較。細胞密度の経過は、より高密度の領域が低酸素領域の近くに観察される勾配の存在下のものとは対照的に、対照プレートにおいて均一である。
【図１９】活性ゲルの格子（接着ストリップ間で２ｍｍ又は３ｍｍの距離で）又は対照格子で操作されたプレート中で培養された細胞ＭＣＦ１０及びＭＣＦ７によって発現された、いくつかの目的のタンパク質のＷＢ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、インビボに存在する細胞微小環境を培養条件下で再生することができる機能的酵素を含むマトリックスを含む組成物に関する。特に、本発明は、酸素勾配を制御するために細胞培養物の中で酸素の還元を触媒することができる１つ以上の酵素を含むことを特徴とする、インビトロ細胞培養物において使用されるポリマーマトリックス及びヒドロゲルに関する。
【００１６】
本明細書において「細胞培養物中で使用される」という用語は、細胞培養物、特に真核細胞培養物、さらに特にヒト細胞培養物と共に使用するのに適していることを意味する。この定義に属するとは、生体適合性組成物又はヒドロゲルを意味し、より詳細には細胞にとって有毒な生成物を形成しないことを意味する。
【００１７】
本明細書では、用語「マトリックス」及び「ポリマーマトリックス」の下では、活性酵素を取り込む又は吸収／吸着することができるヒドロゲル、マトリゲル、ポリマーを意味し、さらに「マトリックス（複数）」の下では、適切な基質（例えば培養プレートのプラスチック）の上にいったん堆積し、酵素をそれ自体に結合させることができ、その結果それらは勾配を生じさせる際にそれらの機能を果たすことができる物質を意味する。次いで、用語「マトリックス（複数）」の下では、酵素（複数）自体とともにこれらの物質に由来する組成物を意味する。「マトリックス」という用語は、ゲル（例えばタンパク質ベースのゲル）又は酵素を共有結合的に吸収／吸着／結合することができる物質が使用される場合に用いられ、「ポリマーマトリックス」は、前記マトリックスがポリマー構造からなる場合に用いられる。
【００１８】
本明細書に記載の組成物及びヒドロゲルのマトリックスに含まれる酵素は、細胞に対して毒性生成物を形成することなくＯ２を消費する酵素であり得、本明細書に記載のマトリックスは、第１の酵素によって産生される毒性生成物を除去／消費する第２の酵素さえ含み得る。さらに、酵素は、細胞を培養するのに十分な期間、例えば１２、２４、４８又は７２時間細胞培養物中で活性であるべきであり、言い換えれば、酵素はヒドロゲルの内部で変性形態であるべきではなく、触媒活性型であるべきである。
【００１９】
本発明の概要及び実施例及び実験データの欄に説明されているように、酵素による酸素消費の活性はインビトロ細胞培養物中の酸素勾配を制御することを可能にする。
【００２０】
マトリックスは、酵素とマトリックスとの間の相互作用の異なる原理、例えばグルタルアルデヒドとの架橋、ポリマーマトリックス中への捕捉、物理的又は静電的相互作用による吸着に基づいて調製することができる。最初の２つの方法は、酵素を固定化するために最もよく使われているものである。架橋は、２つ以上の分子間の共有結合の形成に基づくプロセスであり、一方、ポリマーマトリックス中の捕捉は、純粋に機械的原理及び静電的原理に基づく。架橋剤の例は、例えばグルタルアルデヒド（ＧＤＡ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートＢＳ３、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド、ホルムアルデヒド、ＵＶと組み合わせた光反応剤の使用である。
【００２１】
好ましい実施形態によれば、組成物はヒドロゲルの形態である。例えば酵素を捕捉するために、シリコーンヒドロゲル、ポリアクリルアミド、セルロース、セルロース誘導体、コラーゲン、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、キトサン、寒天、ポリマコン、ヒアルロン酸、ポリメチルメタクリレート、ヒドロゲルペプチド模倣物を用いることができる。この場合、酵素は架橋剤を用いてマトリックスに結合させるか、又はマトリックス架橋後に機械的に捕捉する。
【００２２】
酸素の還元を触媒する酵素の例は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、ラッカーゼ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、チトクロームオキシダーゼ、酸素を基質として用いるオキシダーゼ及びオキシドレダクターゼである。
【００２３】
好ましい実施形態によれば、好ましくはヒドロゲルの形態の組成物は、グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼ酵素を含むであろう。グルコースオキシダーゼ-ＧＯｘ‐は、以下の反応を触媒するオキシドレダクターゼファミリーの酵素である。
【化１】
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【００２４】
過酸化水素は細胞にとって有毒な非常に反応性の分子であり、このため上記の反応は、水中で産生されるＲＯＳ種を変換する、生物系における別の非常に重要な酸化還元酵素であるカタラーゼ‐ＣＡＴ‐のそれと結び付けられた。両方の反応の正味、２つの酸素分子が２つの水分子と１つの酸素分子に変換され、それがグルコースオキシダーゼのサイクルに戻る。ヒドロゲルはグルコースの存在下で酸素を消費し、グルコースは細胞代謝の基本的基質として細胞培養手段中に存在する。この好ましい実施形態はいくつかの利点を有する。溶液中のグルコースオキシダーゼは急速にゲル化する傾向がある。グルコースオキシダーゼは、例えば、真菌アスペルギルスニジェール又は他の供給源から精製されたものであり、一方、カタラーゼは、例えばウシ肝臓から精製され得る。グルコースオキシダーゼはグルコースを酸化するために酸素を使用し、そのような反応は、細胞培養手段中に天然及び生理学的に存在する「犠牲」基質の使用を提供することとは別に、局所グルコースの濃度及びその勾配さえも制御することを可能にする（図１に示すダイアグラム参照）。グルコース酸化の生成物が酸であるのと同様にｐＨさえ制御することができる。いくつかのオキシダーゼ及び酵素を同時に、同じ製剤中で使用して、制御された独立した方法でグルコース、酸素及びｐＨの局所濃度を変えることができる。
【００２５】
同様に、酸素還元反応で生成した過酸化水素を触媒的に除去するために他の酵素ペルオキシダーゼを使用することができる、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用することができる。
【００２６】
調製物に使用される酵素の濃度は、マスター方程式を使用するシミュレーションによって、又は細胞培養環境における特定の局所濃度及び勾配を得るために有限要素シミュレーションによって提供することができる。一実施形態によれば、ヒドロゲルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに含み得る。ゲル形成において、保護マトリックスとしてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液の使用は、ゲル化の間の酵素の変性を回避するために有利であることをもたらした。さらに、非常に高濃度で存在するＢＳＡはヒドロゲルネットワークに入り、それを構成し、ＢＳＡ分子間及びＢＳＡ分子と酵素分子との間に多くの架橋を形成する：このようにして酵素の濃度を、酵素が非常に低い濃度で存在する場合に酵素がゲル中に固定されないというリスクなしに装置によって必要とされる量まで減少又は増加させることができる。さらにＢＳＡの存在はそれらの活性を阻害することによってそれらを変性し得る酵素中の分子間架橋の確率を減少させる。
【００２７】
本発明はまた、特に本明細書に記載の実施形態のいずれかによる活性酵素を含有するポリマーマトリックスを用いて、細胞用容器並びに上記の組成物及びヒドロゲルを含むインビトロ細胞を培養するのに適した装置に関する。装置を用いて、例えばペトリ皿又は市場で入手可能な他の容器のような細胞系の培養に適した任意の容器を使用することができる。装置は、ヒドロゲルが細胞のための容器の底部上の単一の又は複数の層として堆積されることを提供し得る。
【００２８】
装置の一実施形態によれば、酵素活性成分を有するポリマーマトリックスが使用され、（磁性又は非磁性の）ミクロスフェアに封入される。
【００２９】
一実施形態によれば、ヒドロゲルは、以下の工程を含む方法で調製することができる：
ａ）酸素の還元を触媒することができる１つ以上の酵素を含む溶液を調製する；
ｂ）架橋剤を添加する；
ｃ）溶液をゲル化する。
【００３０】
好ましくは、この方法はＢＳＡを添加し、続いて例えばグルタルアルデヒド（ＧＤＡ）のような架橋剤を添加することを含む。酵素及びＢＳＡは、好ましくは、例えばＰＢＳのような細胞培養物に適合する緩衝液中で混合されるであろう。例えば、まず最初に、グルソースオキシダーゼとカタラーゼを含む混合物を調製し、それに最初にＢＳＡ、次に架橋剤、例えばＧＤＡを添加する。
【００３１】
本発明はまた、細胞培養物の化学的微小環境を制御するためのインビトロ方法及び／又はインビボ細胞の生理学的又は病理学的条件を模倣するための方法に関する。そのような方法は、少なくとも、細胞株又は初代細胞が、例えば組成物、好ましくは本明細書に記載されているようなヒドロゲルが沈着されているペトリ皿のような装置中で平板培養及び培養される工程を含む。一実施形態によれば、腫瘍細胞又は上皮細胞が使用される。使用され得る特定の細胞株の例は、実験の部にさらに詳細に示されるように、ＭＣＦ７及びＭＣＦ１０Ａである。
【００３２】
先に示したように、本明細書に記載したポリマーマトリックス、ヒドロゲル及び装置を含む組成物は、候補化合物をスクリーニングするためのインビトロ法において、例えば決定された細胞株に対する化合物の効果を評価するための薬物として有利に使用できる。
【００３３】
以下の実施例は、本発明の理解を容易にするために提供されるものであり、それらは決して特許請求の範囲に記載される発明を限定するものとして意味されるものではなく、またそのように解釈されてはならない。
【００３４】
本特許出願に示される実験で使用される全ての細胞株は、購入することができ、市場で入手可能な株である。
【実施例】
【００３５】
１．１  ＧＯｘとＣＡＴを含むヒドロゲル
グルコースオキシダーゼ‐ＧＯｘ‐は、以下の反応を触媒するオキシドレダクターゼファミリーの酵素である。
【化２】
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【００３６】
過酸化水素は細胞にとって有毒な非常に反応性の分子であり、このため上記の反応は、水中で産生されるＲＯＳ種を変換する、生物系における別の非常に重要な酸化還元酵素であるカタラーゼ‐ＣＡＴ‐のそれと結び付けられた。両方の反応の正味、２つの酸素分子が２つの水分子と１つの酸素分子に変換され、それがグルコースオキシダーゼのサイクルに戻る。ヒドロゲルはグルコースの存在下で酸素を消費し、グルコースは細胞代謝の基本的基質として細胞培養手段中に存在する。酵素はタンパク質であるため、グルタルアルデヒドなどの適切な薬剤に容易に共有結合することができるアミノ酸基（−ＮＨ２）やカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）など、さまざまな反応性官能基を持っている（図１）。グルタルアルデヒドは、無色の小さな分子で、室温で液体で、水とアルコールの両方に任意の割合で溶解する。構造的にそれは５個の炭素原子を持つ直鎖ジアルデヒドであり、正確にアルデヒド基はそれにこれらの高い反応性の特徴を与える。分子内反応（低濃度の酵素）に関して酵素とＧＤＡとの間の相互作用を促進し、酵素がゲルから逃げること（低濃度のＧＤＡ）及び酵素が架橋の数が多い（高濃度のＧＤＡ）ために不溶性になることの両方を回避するように最適濃度を評価した。多数の架橋が酵素の活性立体配座を歪めるので、酵素活性は使用されるＧＤＡの濃度に反比例する。グルタルアルデヒドは有毒物質であるが、以前の研究でも我々の実験でも、使用濃度では細胞培養に問題を引き起こさないことが観察された。その上、それは固定剤であるが、細胞運動を評価するために行われた経時的なビデオで観察されたように、この機能はこれらの濃度では行われず、細胞は留まることなくゲル自体の上を自由に動くということができる。ゲル形成において、保護及びゲル化マトリックスとしてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液の使用は、ゲル化中の酵素の変性を避けるために基本的なことである。さらに、高濃度で存在するＢＳＡはヒドロゲルネットワークに入り、ＧＤＡはＢＳＡ分子間及びＢＳＡ分子と酵素分子間にいくつかの架橋を形成する。このようにして、非常に低い濃度で存在する場合に酵素がゲル中に固定されないというリスクなしに、酵素の濃度を装置に必要な量まで減少又は増加させることができる。さらにＢＳＡの存在はそれらの活性を阻害することによってそれらを変性させることができる酵素中の分子間架橋の可能性を減少させる。
【００３７】
１．２  酸素濃度の勾配を評価するための電気化学プローブ顕微鏡
我々の装置でゲルによって生成された酸素の濃度勾配を評価するために、我々は走査型電気化学顕微鏡、すなわちマイクロメートルスケールで化学プロセスを評価するための、次いで細胞培養の微小環境を特徴付けるのに有用である、強力な装置を使用した。超微小電極（ＵＭＥ）を使用することによって、レドックスプロセスなどの電気化学的プロセスを検出することが可能である。プローブ（ＵＭＥ）は、３つのエンジンと３つの圧電素子とを有するシステムに接続され、次いで３つの直交軸Ｘ、Ｙ及びＺに移動して位置決めすることができる。このようなシステムはＵＭＥで測定されたプロセスを空間的に解くことを可能にし、次いでトポグラフィーを表示し、基板の局所的な化学反応性を調べることを可能にする。まず、アプローチにより、一つが基板に近づくと、負のフィードバックモード、本発明者らの分析の場合では電流は、近づくにつれて徐々に減少し、ｄ→０のようにそれは→０となる。ここで、ｄはプローブと特定の場合にはプラスチック又はガラスで作られた基板との間の距離である。このようにして、その機能性を測定するためにゲルに非常に近いが、機械的損傷を回避するために多すぎることなく、我々の電極にとって理想的な位置を選択することが可能である。この時点で、基板に対して平行に走査することによって、基板生成‐先端収集（ＳＧ‐ＴＣ）モードで、電極を表面近くに移動させ、溶液に浸し、ＵＭＥに流れる電流を基板上の各位置について記録する。それが観察されるのは、ＵＭＥで測定しているスピーシーズの濃度変化を反映する電流の変化である。プローブ位置に応じて、電流の曲線と二次元画像の両方を得ることができる。この酸素勾配を評価することに成功するという事実は、模倣したい腫瘍モデル又は生理学的／病理学的組織又はニッチ（例えば、幹細胞ニッチ）のモデルと同様のインビトロモデルを作成するためにパラメータを確立することによって、酵素濃度を再現された勾配と相関させることができ、デバイス基板の特定の位置にある細胞がどの酸素濃度にさらされているかを評価できること（すなわち各単一細胞の微小環境が測定されること）が基本となる。
【００３８】
２．１  ＧＯｘとＣＡＴを用いたヒドロゲルの調製
試薬表
【表１】
2019528795.tif 000005
【００３９】
カタラーゼ及びグルコースオキシダーゼの溶液を調製した後、それらをＢＳＡを含有する溶液中に１：１の比率で混合し、総最終容量の１．３８％に等しい量のグルタルアルデヒド（２５％水）を添加する。白色を調製するために、ＢＳＡのみを同じ割合のグルタルアルデヒドと共に使用する。溶液は急速にゲル化する傾向があるので、グルタルアルデヒドはゲルの使用直前にのみ添加されるべきである。グルコースオキシダーゼ（Ｘ型）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｎｉｇｅｒ真菌のものであるのに対し、カタラーゼはウシ肝臓のものである。使用した化合物はすべてＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００４０】
２．２  測定に使用したＳＥＣＭ装置
酸素勾配を測定するために使用される機器は、プローブ走査型電気化学顕微鏡「ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｔｅｘａｓ」モデルＣＨＩ  Ｂ９１０である。
【００４１】
２．３  ＧＯｘ及びＣＡＴを用いた基質中の細胞増殖の分析
本発明者らのヒドロゲルが細胞増殖にどのように影響したかを評価するために、ＭＣＦ７及びＭＣＦ１０Ａの両方を以下のように培養した：
ｉ）酵素を含むヒドロゲルの存在下、
ｉｉ）酵素を含まないヒドロゲルの存在下、白色、
ｉｉｉ）ヒドロゲルが存在しない場合
細胞の生存率の比色マーカーを用いて２４、４８及び７２時間に細胞計数を行った。ｉ）とｉｉ）との間の比較は、細胞が酵素によって生成された勾配に罹患しているかどうかを評価するための基本であり、ｉｉ）とｉｉｉ）との間の比較は、ゲルの塩基組成が細胞に対していくらか毒性であるかどうかを評価するために行われた。
【００４２】
各チャンバーに細胞をプレーティングし培養する。２４時間、４８時間及び７２時間（１日当たりマルチウェル）の期間における細胞生存率の比色分析を行い、それから細胞増殖曲線を得る。実験はＭＣＦ１０ＡとＭＣＦ７の両方について繰り返される。プレーティングは以下のいくつかのステップで行われる。
−分割（皿１０センチ）
−ファルコン１５に培地１ｍｌを入れる
−培地を除去し、５ｍｌのＰＢＳで洗浄する
−１ｍｌのトリプシン＊と５分間のインキュベーター内
−トリプシンで細胞を再開し、それらをファルコン１５に入れる
−２ｍｌの培地を用いて細胞を皿に残したままにする
−培地３ｍｌを加えて遠心する
−上清を除去し、数ｍｌの培地に「ペレット」を再懸濁する（利用可能な細胞数に応じて）
−細胞計数
−６４室で１：２細胞：ＰＢＳに希釈する（この手順のために約２０μＬの細胞懸濁液を使用する）
−ＰＢＳ：ＥＲＹＴＨＲＯＳＩＮＥＢで１：２溶液を希釈
−Ｂｕｒｋｅｒチャンバー内のそのように調製した溶液に１０μｌを入れ、光学顕微鏡でカウントを進める。
【００４３】
合計細胞数は次の式で計算される。
Ｍ×Ｖ×１０−４×Ｆ．Ｄ．ＰＢＳ×Ｆ．Ｄ．ＥＢ
ここで、ＭはＢｕｒｃｋｅｒチャンバーの細胞の細胞数の平均、Ｖは細胞のペレットが再懸濁された体積、Ｆ．Ｄ．は希釈係数である。
−プレーティング
【００４４】
一旦計数を行ったら、何個の細胞をプレーティングするかを決める。
−適切な量の細胞溶液を拾い上げ、それを適切な培地１ｍｌに懸濁する。
−マルチウェル又は使用されている３．５ｃｍ幅のペトリ皿のすべてのチャンバーに再分配する。
＊トリプシンはペプチド結合の破裂を促進し、細胞のペトリ皿への接着を可能にする。
【００４５】
プレーティングのあと、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に細胞計数をいつもの手法で、マルチウェルの６つのチャンバーのそれぞれについて項目「分裂」及び「細胞計数」として実施する。幅が３．５ｃｍで１０ｃｍではない皿であり、量が適切に比較されるので、唯一の変動は使用するＰＢＳとトリプシンの量だけである。他のマルチウェルでは、細胞をヒドロゲル及び白色の存在下で平板培養し、細胞移動をゲルに関して評価するために、１８／２４時間の時間経過でマイクロインキュベーターを備えた光学顕微鏡でモニターした。
【００４６】
２．４  酸素勾配に対する細胞増殖密度
細胞ＭＣＦ１０Ａ及びＭＣＦ７をその後プレートすることができる、いくつかのプレート（皿）を調製した。２日間の培養後、コンフルエントに達する前に細胞を固定し、全ての点でその相対的計数を行い、そしてゲルからの異なる距離での増殖を評価した。
【００４７】
結果の分析
図３：対照プレート及び活性のない（酵素を含まない）タンパク質マトリックスで修飾したプレート上の細胞ＭＣＦ１０Ａ及びＭＣＦ７の増殖曲線。曲線は、使用されたマトリックスの生体適合性及び毒性の非存在を示す。
【００４８】
勾配を生成する酵素を組み込むために使用されるタンパク質ヒドロゲルの生体適合性及び毒性の非存在を、細胞培養及びエリスロシンＢを用いた細胞生存率試験によって試験した。培養２４時間、４８時間及び７２時間の細胞数を測定した。細胞増殖は、培養プレートの表面上のマトリックスの存在によって影響されない。
【００４９】
酸素勾配は、走査型電気化学顕微鏡法によるマイクロメートル分解能で特徴付けられた。
【００５０】
図４の曲線は、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）に対して−０．７Ｖに等しい酸素還元電位で記録された電流測定を示し、作用電極はペトリ皿上の活性ゲルから数十マイクロメートル離れたＳＥＣＭによるＵＭＥである。記録された電流は酸素濃度に正比例する。曲線の開始から約４秒後に、１ｍＭの濃度のグルコースをＰＢＳ（分析溶液）に添加した。活性マトリックスのレベルでのそのような添加の後、グルコース酸化プロセスが始まり、それは酸素の過酸化水素への還元（カタラーゼによって水と酸素に変換される）に関連している。全体として酸素が消費され、曲線から観察されるように、酸素濃度の急激な減少のためにグルコースを添加した後に電流が急激に減少する（２０秒後に記録された電流はゼロに等しい局所酸素濃度に対応する）。微小電極によって分析された特定の局在化において、電流、次いで酸素濃度は時間的に安定したままであることに留意されたい。
【００５１】
図４。低酸素を発生させる活性ゲルから数十マイクロメートルの位置にあるＵＭＥ（Ｐｔ  １０μｍ）で記録された電流測定、ＰＢＳ中Ａｇ／ＡｇＣｌに対してＥ＝−０．７Ｖ。約４秒で、１ｍＭの濃度のグルコースを添加した。
【００５２】
図５は、ＵＭＥがゲル表面から約２５μｍの高さに保たれ、ゲルストリップの方向に垂直で、アクティブマトリックスが配置されているプレート平面に平行な線に沿って数百マイクロメートルの厚さを有するゲルストリップ上で走査される走査曲線を示す。図から、低酸素は活性マトリックスの細片の近くでマークされ、それによって生じる濃度の勾配は、インビボで見られ、異なる毛細血管と血管の間に存在する距離によって引き起こされる勾配構造に従って数百マイクロメートルの長さを有することが分かる。
【００５３】
図５。低酸素を発生させるための活性マトリックスのストリップ上のＵＭＥの走査曲線により検出された酸素濃度、方向は活性ストリップに対して垂直であり、電極はその上の、活性マトリックスが置かれているプレートから一定の高さに保たれる。ＰＢＳ中１ｍＭグルコース中のＡｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）に対してＥ＝−０．７Ｖ。
【００５４】
図６は、互いに１〜１．５ｍｍの距離に配置された４つのアクティブマトリックスのストリップに垂直な方向に培養プレートの表面に平行なＵＭＥによる走査曲線を示す。表面改質は、低酸素領域及び関連する酸素勾配を、インビボで見られるものと同様の構造で、かつ毛細血管の分布に起因して再生成する。
【００５５】
図６。互いに１〜１．５ｍｍの距離に配置された活性マトリックスのストリップによって修飾されたプレート上のＵＭＥ（Ｐｔ  １０μｍ）の走査曲線。ＰＢＳ中１ｍＭグルコース溶液中のＡｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）に対してＥ＝−０．７Ｖ。
【００５６】
図７は、ＵＭＥを他のゲルからそれに垂直な方向に活性ゲルに近づけることによって記録されたアプローチ曲線（電流を酸素濃度に変換した）を示す。プレート表面に垂直な方向でさえも酸素濃度の勾配が中央で広がることに注目することができ、そのような特徴は勾配の３Ｄ構造概念を実証する。アプローチの終わりに、ゲルから数十ミクロンで、ゼロ濃度のＯ２が得られることに留意されたい。
【００５７】
図７  Ｐｔ  ＵＭＥ  １０μｍ及び参照電極Ａｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）を用いて、ＰＢＳ中１ｍＭのグルコース、電位＝−０．６Ｖ及び最大速度５０μｍ／ｓの存在下で行ったゲル近傍のアプローチ曲線。
【００５８】
このように操作されたプレート細胞ＭＣＦ１０Ａ及びＭＣＦ７中で培養した装置により再現された酸素勾配を一旦特徴付けた。図８及び図９は、それぞれ細胞ＭＣＦ１０Ａ及びＭＣＦ７の増殖曲線を示しており、プレート表面の中心に活性材料のストリップが存在すると細胞の増殖が変化することが観察される。
【００５９】
図８：対照プレート及び非活性（ＢＳＡのみ）及び活性（Ｇｏｘ及びＣＡＴを含む）タンパク質マトリックスで修飾されたプレート上の細胞ＭＣＦ１０Ａの生存率についてエリスロシンＢを使用することによる増殖曲線。曲線は、使用したマトリックスの生体適合性と毒性の非存在を示している。さらに、アクティブプレート内に存在する化学的勾配の成長に対する影響が強調されている。
【００６０】
図９：対照プレート上及び非活性（ＢＳＡのみ）及び活性（Ｇｏｘ及びＣＡＴを含む）タンパク質マトリックスで修飾したプレート上の細胞ＭＣＦ７の生存率についてエリスロシンＢを使用することによる増殖曲線。曲線は、使用したマトリックスの生体適合性と毒性の非存在を示している。さらに、アクティブプレート内に存在する化学的勾配の成長に対する影響が強調されている。
【００６１】
図１０は、活性ヒドロゲルで操作されたプレートにおける細胞ＭＣＦ１０Ａの４８時間の培養後に撮影された光学画像を示す（画像の左側に見える）。細胞はゲルの近くの培地中に存在する酸素勾配に応答して勾配密度で増殖することが観察される。そのような勾配は、非活性対照ゲルで修飾されたプレートには存在しない（図１１）。
【００６２】
図１０。酵素を含む活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ１０Ａの光学像（左側）
【００６３】
非活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ１０Ａの光学画像（左側）。
【００６４】
図１２は、活性ゲル及び対照ゲルからの距離（図１０及び図１１）に依存し、次いで図５に示す酸素勾配又は勾配がない場合の細胞密度を示す。
【００６５】
図１２。細胞ＭＣＦ１０Ａのヒドロゲルからの距離に応じた細胞増殖密度、酵素の存在下でのゲルとの比較及び対照ゲルとの比較。細胞密度の経過は、低密度領域が低酸素領域の近くに観察される勾配の存在下でのものとは対照的に、対照プレートにおいて均一である。
【００６６】
図１３は、活性ヒドロゲル（画像の左側に見える）で操作されたプレートにおけるＭＣＦ１０Ａのコンフルエントまでの培養物の撮影された光学画像を示す。細胞はゲルの近くの培地中に存在する酸素勾配に応答して勾配密度で増殖することが観察される。そのような勾配は、非活性対照ゲルで修飾されたプレートには存在しない（図１４）。
【００６７】
図１３。非活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ１０Ａの光学画像（左側）。
【００６８】
図１４。非活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養した細胞ＭＣＦ１０Ａの光学画像（左側）。
【００６９】
図１５。細胞ＭＣＦ１０Ａのヒドロゲルからの距離に依存する細胞増殖密度、酵素の存在下でのゲルと対照ゲルとのコンフルエンス比較。細胞密度の経過は、低密度領域が低酸素領域の近くに観察される勾配の存在下でのものとは対照的に、対照プレートにおいて均一である。
【００７０】
図１６は、活性ヒドロゲルで操作されたプレートにおける細胞ＭＣＦ７の４８時間の培養後に撮影された光学画像を示す（画像の左側に見える）。細胞はゲルの近くの培地中に存在する酸素勾配に応答して勾配密度で増殖することが観察される。そのような勾配は、非活性対照ゲルで修飾されたプレートには存在しない（図１７）。ＭＣＦ７、腫瘍細胞の場合、細胞密度は酸素の近くで、したがって低酸素領域で増加する（そのような状況は腫瘍組織の細胞が露出される状況と同様である）ことに留意されたい。
【００７１】
図１６。酵素を含む活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養したＭＣＦ７細胞の光学画像（左側）
【００７２】
図１７。非活性ヒドロゲルの存在下で２４時間培養された細胞ＭＣＦ７の光学画像（左側）。
【００７３】
図１８は、活性ゲルと対照ゲル（図１６と１７）からの距離に依存し、次に図５に示す酸素勾配における又は勾配の非存在における細胞密度を示す。
【００７４】
図１８。細胞ＭＣＦ７のヒドロゲルからの距離による細胞増殖密度、酵素の存在下でのゲルと対照ゲルとの比較。細胞密度の経過は、より高密度の領域が低酸素領域の近くに観察される勾配の存在下のものとは対照的に、対照プレートにおいて均一である。コントロールプレート及び操作されたものにおいて培養された正常細胞及び腫瘍細胞のいくつかの目的のタンパク質の発現をウエスタンブロットによって調査し（図１９）、その結果は細胞微小環境及び細胞表現型におけるそのような条件の結果の制御における我々の装置の有効性を実証する。特に低酸素条件下で活性であるタンパク質ＨＩＦ−１αに対する効果（ＨＩＦ‐１αは腫瘍組織の多くの細胞に見られる）に注目すべきである。細胞は、互いに２ｍｍ又は３ｍｍの距離でストリップを有する活性ゲル又は対照ゲルの格子のパターンで修飾されたプレート中で培養された。
【００７５】
図１９。活性ゲルの格子（隣接するストリップ間で２ｍｍ又は３ｍｍの距離のストリップ）又は対照グリッドで操作されたプレート中で培養された細胞ＭＣＦ１０及びＭＣＦ７によって発現された、いくつかの目的のタンパク質のＷＢ。
【図１】
2019528795.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2019528795.tif 000024
【国際調査報告】
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