(57)【要約】  本発明は、２以上の質量標識のセットに関し、ここで各質量標識は下記式を含み：Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ、式中、Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、Ｍは質量修飾因子であり、ならびにＲｅはａ）質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはｂ）その分析物であり、そのセット中の各質量標識は整数質量を有し、そのセット中の各質量標識は同じ整数質量を有し、かつそのセットは質量標識の２以上のサブセットを含み、各サブセットは１つ、２つまたはそれより多くの質量標識を含み、かつそのサブセットが２以上の質量標識を含む場合、そのサブセット中の各質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量は同じサブセット中のおよび他の全てのサブセット中の質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量と異なり、かつ各質量標識は質量分析によって区別可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の質量標識のセットであって、各質量標識が下記式：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
を含み
式中：
Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、
Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、
Ｍは質量修飾因子であり、ならびに
Ｒｅはａ）前記質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはｂ）前記分析物であり、
前記セット中の各質量標識は整数質量を有し、
前記セット中の各質量標識は同じ整数質量を有し、
前記セットは質量標識の２以上のサブセットを含み、各サブセットは１つ、２つまたはそれより多くの質量標識を含み、
前記サブセットが２以上の質量標識を含む場合、前記サブセット中の各質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量は同じサブセット中のおよび他の全てのサブセット中の質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量と異なり、
各質量標識は質量分析によって区別可能であり、
各質量標識は下記一般式：
【化１】
2019501382.tif 000031
を含むレポーター部分Ｘを有し
式中、Ｒ１はＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である、２以上の質量標識のセット。
【請求項２】
２以上の質量標識のセットであって、各標識が下記式：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
を有し
式中、Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、Ｍは質量修飾因子であり、ならびにＲｅは前記質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基または前記分析物であり、およびＸは下記一般式：
【化２】
2019501382.tif 000032
を含み
式中、Ｒ１はＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である、２以上の質量標識のセット。
【請求項３】
Ｒ１はエチルである、請求項１または２のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項４】
Ｒ２はプロピルである、請求項１または２のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項５】
Ｒ１はイソプロピルである、請求項１または２のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項６】
Ｒ２はブチルである、請求項１または２のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項７】
Ｒ１はイソブチルである、請求項１または２のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項８】
前記質量修飾因子Ｍは下記構造：
【化３】
2019501382.tif 000033
を有し、
式中：  各Ｒ１０は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり、
ａは０−１０の整数であり、
ｂは少なくとも１であり、および
ｃは少なくとも１である
請求項１〜７のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項９】
各質量標識は少なくとも１つの質量系列修飾基をさらに含み、前記質量系列修飾基は前記レポーター部分Ｘの一部および／または前記質量修飾因子Ｍの一部である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの質量系列修飾基は前記レポーター部分Ｘおよび前記質量修飾因子Ｍの一部である、請求項９に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの質量系列修飾基は下記：
ｄ）重同位体２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏ；あるいは
ｅ）任意で１つ以上の重同位体置換を含む置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基；あるいは
ｆ）ａ）およびｂ）の組み合わせ
から選択される、請求項９または１０に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１２】
前記質量系列修飾基は−ＣＨ３、−１３ＣＨ３、−ＣＨＤ２、−１３ＣＨＤ２、−１３ＣＤ３または−ＣＤ３である、請求項１１に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの質量標識の各々は下記構造：
【化４】
2019501382.tif 000034
を有する質量系列修飾基を含み、
式中：
各Ｒ１１は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり；
ｄは１〜１０の整数であり；
ｅは１〜１０であり；および
ｆは１〜１０の整数である
請求項９〜１２のいずれかに記載の、セット。
【請求項１４】
Ｒｅが前記分析物であるとき、前記分析物はアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、リン脂質またはそれらの組み合わせの群から選択される１つ以上の分析物を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１５】
各質量標識は下記構造：
【化５】
2019501382.tif 000035
の１つを有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１６】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化６】
2019501382.tif 000036
2019501382.tif 000037
2019501382.tif 000038
2019501382.tif 000039
2019501382.tif 000040
を有するｎ＝１８の質量標識を含む、請求項１５に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１７】
各質量標識は下記構造：
【化７】
2019501382.tif 000041
を有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１４のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１８】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化８】
2019501382.tif 000042
2019501382.tif 000043
2019501382.tif 000044
2019501382.tif 000045
を有するｎ＝１６の質量標識を含む、請求項１７に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１９】
各質量標識は下記構造：
【化９】
2019501382.tif 000046
を有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１４のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２０】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化１０】
2019501382.tif 000047
2019501382.tif 000048
2019501382.tif 000049
2019501382.tif 000050
2019501382.tif 000051
を有するｎ＝１８の質量標識を含む、請求項１９に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２１】
各質量標識は下記構造：
【化１１】
2019501382.tif 000052
を有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１４のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２２】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化１２】
2019501382.tif 000053
2019501382.tif 000054
2019501382.tif 000055
を有するｎ＝７の質量標識を含む、請求項２１に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに定義される質量標識の２以上のセットを含む、質量標識のアレイ。
【請求項２４】
前記アレイにおける任意の１つのセットの質量標識の各々の整数質量は前記アレイにおける全ての他のセットの質量標識の各々の整数質量とは異なる、請求項２３に記載の、質量標識のアレイ。
【請求項２５】
一セット中の各質量標識は下記：
ａ）前記セット中の全ての他の質量標識と同じ整数質量を有する質量系列修飾基、および
ｂ）前記アレイの全ての他のセットの質量標識と異なる整数質量
を含む、請求項２３または２４に記載の、質量標識のアレイ。
【請求項２６】
一セット中の各質量標識は同じ質量系列修飾基を含む、請求項２５に記載のアレイ。
【請求項２７】
一セット中の各質量標識は前記アレイの全ての他の質量標識の質量系列修飾基のアイソトポログである質量系列修飾基を含む、請求項２３〜２６のいずれかに記載の、アレイ。
【請求項２８】
分析物と関連付けることができる質量標識または質量標識の組合せを質量分析によって同定することにより分析物を検出することを含む、質量分析の方法であって、前記質量標識は請求項１〜２７のいずれかに定義される質量標識のセットまたはアレイ由来の質量標識である、質量分析の方法。
【請求項２９】
ａ）複数の試料を提供することであって、各試料は１つ以上の分析物を含み、各試料は１つの質量標識または質量標識の組み合わせで示差標識され、１つ以上の標識分析物を得；前記質量標識（複数可）は請求項１〜２７のいずれかに定義される質量標識のセットまたはアレイに由来する、こと；
ｂ）前記複数の示差標識された試料を混合して標識分析物を含む分析混合物を形成すること；
ｃ）任意で前記標識分析物を質量分析計で検出すること；
ｄ）前記標識分析物を質量分析計で解離して質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントを形成すること；
ｅ）前記質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントを検出すること；
ｆ）任意で前記質量標識を前記質量分析計で解離して前記レポーター部分を放出すること、および前記レポーター部分を検出すること；
ｇ）任意で工程ｆ）で形成された前記レポーター部分を解離してフラグメントを形成すること、および前記フラグメントを検出すること；
ｈ）前記標識分析物の質量スペクトル；および／または前記質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトル；および／または前記レポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて分析物を同定すること
を含む、請求項２８に記載の、質量分析の方法。
【請求項３０】
前記分析物は前記標識分析物の質量スペクトルに基づいて同定される、請求項２９に記載の、質量分析の方法。
【請求項３１】
前記分析物は前記質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトルに基づいて同定される、請求項２９に記載の、質量分析の方法。
【請求項３２】
無傷の質量標識を含む前記分析物フラグメントは無傷の質量標識を含むｂ系列イオン、好ましくはｂ１イオンである、請求項３１に記載の、質量分析の方法。
【請求項３３】
前記分析物は前記レポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて同定される、請求項２９に記載の、質量分析の方法。
【請求項３４】
ａ）複数の試料を提供することであって、各試料は１つ以上の分析物を含み、各試料は１つの質量標識または質量標識の組み合わせで示差標識され、１つ以上の標識分析物を得；前記質量標識（複数可）は請求項１〜３４のいずれかに定義される質量標識のセットまたはアレイに由来する、こと；
ｂ）前記複数の示差標識された試料を混合して標識分析物を含む分析混合物を形成すること；
ｃ）前記標識分析物を質量分析計で検出すること；
ｄ）前記標識分析物を質量分析計で解離して前記レポーター部分を放出すること、および前記分析物または前記分析物のフラグメントに付着した前記質量標識の残りを含む相補イオンを検出すること；
ｅ）任意で工程ｄで形成された前記相補イオンを解離してフラグメントを形成する、および前記フラグメントを検出する１つ以上のさらなる工程；
ｆ）前記標識分析物の質量スペクトルおよび／または前記相補イオンおよび／またはそのフラグメントの質量スペクトルに基づいて前記分析物を同定すること
を含む、請求項２８に記載の、質量分析の方法。
【請求項３５】
前記解離は質量分析計における衝突誘起解離である、請求項２９〜３４のいずれかに記載の、方法。
【請求項３６】
４００の質量対電荷比で６０，０００を超える分解能、好ましくは４００の質量対電荷比で１００，０００を超える、最も好ましくは４００の質量対電荷比で２５０，０００を超える分解能を有する質量分析計で実施される、請求項２９〜３５のいずれかに記載の、方法。
【請求項３７】
工程ｄ）において前記相補イオンは結合Ｌからの一酸化炭素のニュートラルロスによって形成される、請求項２９〜３６のいずれかに記載の、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
この発明は、ペプチド、特に複合タンパク質混合物に由来するペプチドを同定し、定量するために、ペプチドを標識するための有用な反応性標識およびこれらの反応性標識を使用するための方法に関する。これらの反応性標識は、高分解能および高質量精度の質量分析計、例えばオービトラップ、飛行時間型およびイオンサイクロトロン共鳴質量分析計によるペプチドの分析に特に価値がある。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
生物システムの研究、特にヒト疾患の理解は、疾患により、または疾患に応じて生物システムにおいて引き起こされる変化を検出する能力に依存する。そのような変化は、診断の手段を与え、ワクチンおよび医薬などの治療化合物の標的への洞察を提供する。核酸、タンパク質、ステロイド、糖および脂質を含む幅広い生体分子が疾患過程を理解するために定量的に測定される必要がある。この状況では、質量分析計を用いてそのような生体分子を定量的に検出する能力は、それらの研究ならびにヒトおよび動物疾患への適用においてかなりの進歩をもたらしてきた。同じ進歩が環境解析およびモニタリング、ならびに食品および飲料製造においても起きている。特に、合成の定量基準を提供するための安定な同位体の使用が、全てのクラスの生体分子のモニタリングのための同位体希釈質量分析において開発されてきた。しかしながら、これらの方法は従来、利用可能な合成標準を必要とし、これは常に可能とは限らない。
【０００３】
近年、質量分析による生体分子の定量分析をさらに改良するために、重同位体置換を有する様々な化学質量タグが開発されている。タグ設計に依存して、タグセットのメンバーは、同じ化学構造を有するが、異なる絶対質量を有する同位体か、または、同一の構造および絶対質量の両方を有するアイソバリックおよびアイソトポメリックのいずれかである。同位体タグはＭＳモードでの定量化のために典型的に使用され、一方、アイソバリックタグは、特有の質量を有するレポーター断片を放出するためにＭＳ／ＭＳモードでフラグメント化されなければならない。
【０００４】
同位体質量タグの初期の例は同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）（Ｇｙｇｉ，  Ｓ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １７，  ９９４−９９９）であった。ＩＣＡＴ試薬は、１つの（重）タグに重同位体が取り込まれ、もう一方の（軽）タグでは置換がない、異なる取り込みを有する一対の質量タグである。２つの試料は重タグまたは軽タグのいずれかで標識され、次いで混合され、その後ＬＣ−ＭＳにより分析される。両方の試料中に存在するペプチドは、重同位体原子置換の数に比例して質量が異なるプリカーサーイオンの対を与える。
【０００５】
ＩＣＡＴ法はまた「サンプリング」法の例でもあり、これらは、生成される質量スペクトルの複雑性を低減させるために小さなペプチド集団を扱う一方で、元試料についての十分な情報を保持してその成分を同定する必要性を両立させる方法として有用である。ＩＣＡＴ手順で使用される「同位体コードアフィニティータグ」は、システインを含むペプチドを捕捉するための、チオールに対して反応性である一対のビオチンリンカー同位体を含む。プロテオームにおける典型的には９０〜９５％のタンパク質は少なくとも１つのシステイン含有ペプチドを有し、典型的にはシステイン含有ペプチドは全体で１０個に約１個のペプチドに相当し、そのため、システイン含有ペプチドの分析は、試料についての重大な情報を失うことなく、試料複雑性を大きく低減させる。よって、ＩＣＡＴ法では、１つの起源由来のタンパク質の試料が「軽」同位体ビオチンリンカーと反応させられ、一方、第２の起源由来のタンパク質の試料が、「重」同位体ビオチンリンカー（典型的には軽同位体よりも４〜８ダルトン重い）と反応させられる。２つの試料はその後、プールされ、エンドペプチダーゼで切断される。ビオチン化システイン含有ペプチドはその後、質量分析によるその後の分析のためにアビジン化ビーズ上で単離されてよい。２つの試料は定量的に比較でき：対応するペプチド対は相互標準として機能し、それらの比が定量され得る。ＩＣＡＴサンプリング手順は、依然として正確に起源試料を表すがＭｕｄＰＩＴよりも複雑性が低いペプチドの混合物を生成するが、多数のペプチドが依然として単離され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるそれらの分析は複雑なスペクトルを生成する。２つのＩＣＡＴタグを用いると、標識を含まない分析と比べ質量スペクトル中のペプチドイオンの数が倍加する。
【０００６】
同位体タグのさらなる例としては、４つまでの異なる試薬を提供するＩＣＰＬ試薬が挙げられ、ＩＣＰＬを用いると、質量スペクトルにおけるペプチドイオンの数は標識を含まない分析と比べ４倍になる。この理由のために、単純重同位体タグ設計で非常に高いレベルの多重化を開発することが実用的である可能性は低い。
【０００７】
同位体タグはプロテオミクス研究における定量を可能にし実験の再現性を助けるが、これは質量スペクトルの複雑性の増加という代償を払って達成される。この制限を克服するために、およびタンデム質量分析のより大きな特異性を利用するために、アイソバリック質量タグが開発された。２０００年（ＷＯ０１／６８６６４号）にそれらが導入されて以来、アイソバリック質量タグは、複数の試料の混合および同時分析前のタンパク質およびペプチド中のアミンおよび他の反応性官能基の普遍的標識によるプロテオミクス発現プロファイリングの改善された手段を提供してきた。タグはアイソバリックであり、同じ質量を有するので、それらは質量スペクトルの複雑性を増加させない。なぜなら同じペプチドの全てのプリカーサーはクロマトグラフ分離において全く同じ点で現れ同じ統合質量を有するからである。分子がタンデム質量分析の前にフラグメント化される場合にのみ、特有の質量レポーターが放出され、よって、元の試料の各々中に存在するペプチドの相対または絶対量が決定され得る。
【０００８】
ＷＯ０１／６８６６４号は、アイソバリック質量タグの根底にある原理を提示し、好適なタグの具体例を提供し、この場合、分子内の異なる特定原子が、それぞれ１３Ｃおよび１５Ｎを含む重同位体形態と置換される。ＷＯ０１／６８６６４号は、個々のタグのサイズを不当に増加させずに有効な全体の多重化率を増加させるための、複数のアイソバリックセットを作製するためのオフセット質量の使用をさらに記載する。
【０００９】
ＷＯ２００７／０１２８４９号は、３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＯＳｕ）を含むアイソバリック質量タグのセットをさらに記載する。
【００１０】
近年、高質量分解能質量分析計、例えばオービトラップ（Ｈｕ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ，  （２００５）  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，  ４０，  ４３０−４４３  ＆  Ｍａｋａｒｏｖ，  Ａ．  （２０００）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ７２，  １１５６−１１６２）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析計（Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９８）  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ，  １７，  １−３５）および高分解能飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｇ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，  （２０１１）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８３，  ５４４２−５４４６）により可能になった質量精度および質量分解能における劇的な改善により、イオン質量対電荷比間のミリダルトン差を分解できるようになった。この高分解能は、レポーター領域で１５Ｎに代わる１３Ｃの重核子置換を用いるアイソバリックタンデム質量タグの多重化を増加させるために開拓され、これはＭＳ／ＭＳによる分析で個々のレポーターフラグメント間の６．３２ミリダルトン差をもたらした（ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ，  Ｇ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８４，  ７４６９−７４７８  ＆  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８４，  ７１８８−７１９４）。同様に、ミリダルトン質量差を含むリジン同位体での代謝標識は高分解能質量分析によって分解でき、酵母で試料の多重化および相対定量を可能にすることが示されている（Ｈｅｂｅｒｔ，  Ａ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １０，  ３３２−３３４）。
【００１１】
前に開示されたアイソバリック質量タグの大きな利益に関わらず、今日まで多重化率は、市販の試薬において１０重に限定されている。加えて、ごくわずかな質量差を含むタグは有用である。なぜなら互いに関連する標識イオン、例えば異なる試料由来の対応するペプチドは、容易に認識できかつ他の異なるペプチドの同定を妨害する可能性がはるかに低い非常に特徴的かつ非天然の同位体パターンで、同じイオンエンベロープの中で密集するからである。
【００１２】
よって、各タグが他のものとミリダルトンの質量差だけ異なる、ペプチドおよび生体分子を標識するための、１０倍を優に超える多重化率を有するタグのセットが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
（発明の簡単な説明）
第１の態様では、本発明は、２以上の質量標識のセットに関し、ここで各質量標識は下記式を含み：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
式中：
−Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、
−Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、
−Ｍは質量修飾因子であり、ならびに
−Ｒｅはａ）質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはｂ）その分析物であり、
ここでそのセット中の各質量標識は整数質量を有し、ここでそのセット中の各質量標識は同じ整数質量を有し、ここでそのセットは質量標識の２以上のサブセットを含み、各サブセットは１つ、２つまたはそれより多くの質量標識を含み、ここでそのサブセットが２以上の質量標識を含む場合、そのサブセット中の各質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量は同じサブセット中のおよび他の全てのサブセット中の質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量と異なり、ここで各質量標識は質量分析によって区別可能であり、ここで各質量標識は下記一般式を含むレポーター部分Ｘを有し：
【化１】
2019501382.tif 000002
式中、Ｒ１はＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基；あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である。
【００１４】
別の態様では、本発明は２以上の質量標識のセットに関し、ここで各標識は下記式を含み：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
式中、Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、Ｍは質量修飾因子であり、ならびにＲｅは質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはその分析物であり、およびＸは下記一般式を含み：
【化２】
2019501382.tif 000003
式中、Ｒ１はＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明による質量標識の２以上のセットを含む、質量標識のアレイに関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は質量分析の方法に関し、その方法は分析物と関連付けることができる質量標識または質量標識の組合せを質量分析によって同定することにより分析物を検出することを含み、ここで質量標識は本発明による質量標識のセットまたはアレイ由来の質量標識である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
（図面の簡単な説明）
【図１】この発明の２−プロピル-ピロリジン-1-イル酢酸レポーターの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
（質量標識のセット）
本発明は、ペプチドおよび他の生体分子を標識するための、１０重を優に超える多重化率を有するアイソトポメリック反応性タグのセットを提供する。アイソトポメリック（ｉｓｏｔｏｍｏｐｅｒｉｃ）反応性タグの共選択可能なアイソトポログアレイは、いっそうより高いレベルの多重化を支持するミリダルトンの範囲で質量差を有する。
【００１９】
本発明はまた、特に生体試料のセット間の生物学的に有意な違いを発見するための標識ペプチド、タンパク質および他の生体分子の新規の分析形態を可能にするアイソトポメリック反応性タグの共選択可能なアイソトポログアレイの使用の方法を提供する。
【００２０】
第１の態様では、本発明は２以上の質量標識のセット（以下、「発明の質量標識の第１のセット」と呼ばれる）に関し、ここで各質量標識は下記式を含み：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
式中：
−Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、
−Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、
−Ｍは質量修飾因子であり、ならびに
−Ｒｅはａ）質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはｂ）その分析物であり、ここでそのセット中の各質量標識は整数質量を有し、ここでそのセット中の各質量標識は同じ整数質量を有し、ここでそのセットは質量標識の２以上のサブセットを含み、各サブセットは１つ、２つまたはそれより多くの質量標識を含み、ここでそのサブセットが２以上の質量標識を含む場合、そのサブセット中の各質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量は同じサブセット中のおよび他の全てのサブセット中の質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量と異なり、ここで各質量標識は質量分析によって区別可能であり、ここで各質量標識は下記一般式を含むレポーター部分Ｘを有し：
【化３】
2019501382.tif 000004
式中、Ｒ１はＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である。
【００２１】
「精密質量」という用語は、質量標識またはレポーター部分の理論上の質量を指し、質量標識全体またはレポーター部分の個々の同位体の精密質量の合計であり、例えば１２Ｃ＝１２．００００００、１３Ｃ＝１３．００３３５５、Ｈ１＝１．００７８２５、１６Ｏ＝１５．９９４９１５である。「精密質量」は質量欠損を考慮する。
【００２２】
「整数質量」という用語は、分子を構成する各核の各同位体の整数質量の合計であり、例えば１２Ｃ＝１２、１３Ｃ＝１３、１Ｈ＝１、１６Ｏ＝１６である。同位体の整数質量は、同位体の核を構成する陽子と中性子の合計であり、すなわち、１２Ｃは６個の陽子と６個の中性子を含み、一方、１３Ｃは６個の陽子と７個の中性子を含む。これは、同位体の公称の質量、または原子質量数もしくは核子数と呼ばれることも多い。
【００２３】
文献において、「アイソバリック」という用語は、同じ整数質量を有し、かつＭＳ／ＭＳ用に共選択可能である種を示すことが多いが、この発明との関連で我々は、同じ精密質量を有する種に関しては「アイソバリック」という用語を使用し、かつ我々は、同じ整数質量を有するがわずかに異なる精密質量を有し得る種に対しては、「シュードアイソバリック」という用語を使用する。
【００２４】
サブセット中の少なくとも２つの質量標識間の精密質量の差は通常、１００ミリダルトン未満、好ましくは５０ミリダルトン未満、最も好ましくは２０ミリダルトン（ｍＤａ）未満である。好ましくは、セット中の少なくとも２つの質量標識間の精密質量の差は、共通の同位体置換のため、２．５ｍＤａ、２．９ｍＤａ、６．３ｍＤａ、８．３ｍＤａ、９．３ｍＤａ、または１０．２ｍＤａである。例えば、第１の標識が１３Ｃ同位体を含み、第２の標識中で１３Ｃ同位体は１２Ｃに置き換えられるが１４Ｎ同位体が１５Ｎ同位体に置き換えられる場合、２つの標識間の精密質量の差は６．３ｍＤａとなる。
【００２５】
本明細書では、標識という用語はタグという用語と同義である。
【００２６】
「レポーター部分Ｘ」という用語は、典型的には開裂後に、質量分析により、独立して検出される質量標識の部分を示すために使用されるが、しかしながら、相補イオンとして分析物に付着された質量標識の残りの部分も本発明の方法で検出され得ることが理解されるであろう。質量修飾因子Ｘは、質量標識が確実に所望の整数質量を有するように質量標識に組み込まれる部分である。各質量標識のレポーター部分Ｘは、いくつかの実施形態では、重同位体を含まなくてもよい。
【００２７】
本発明によるレポーター部分の構成要素は好ましくは、レポーター部分のフラグメンテーションの部位が、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、表面誘起解離、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、または高速原子衝撃によって容易に破壊される開裂可能な結合Ｌの導入によって制御できるように、フラグメンテーション抵抗性である。最も好ましい実施形態では、結合はＣＩＤにより容易に破壊される。
【００２８】
所望の整数質量を達成するために、部分ＸとＭの一方もしくは両方、反応性官能基Ｒｅまたは分析物を重同位体で修飾できることが当業者により理解されるであろう。典型的には、重同位体は２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏから選択される。
【００２９】
好ましくは、サブセット中の各質量標識のレポーター部分は、サブセット中の他の全ての質量標識のレポーター部分のアイソトポログである。アイソトポログは、それらの分子の同位体組成のみが異なる化学種である。例えば、水は３つの水素関連アイソトポログ：ＨＯＨ、ＨＯＤおよびＤＯＤを有し、ここで、Ｄは重水素（２Ｈ）を表す。アイソトポログは、同じ数の各同位体を有するが異なる位置で有する同位体異性体であるアイソトポマー（同位体異性体）とは区別される。より好ましくは、２以上の質量標識のセットは、２以上の質量標識を含む少なくとも１つのサブセットを含む。
【００３０】
通常、精密質量の差は、異なる数またはタイプの重同位体置換（複数可）によってもたらされる。
【００３１】
１つの実施形態では、質量標識はＷＯ０１／６８６６４号で定義されるようなタンデム質量タグのアイソトポログである。
【００３２】
好ましい実施形態では、質量標識の統合分子量は６００ダルトン以下、より好ましくは、５００ダルトン以下、さらにより好ましくは、４００ダルトン以下、最も好ましくは３００〜５００ダルトンである。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、レポーター部分の分子量は４００ダルトン以下、好ましくは２５０ダルトン以下、より好ましくは１００〜２５０ダルトン、最も好ましくは１００−２２０ダルトンである。サイズの小さいレポーター部分が特に有利である。なぜならそれは質量スペクトルのサイレント領域でピークを生じ、これが、質量スペクトルからレポーター部分を容易に同定することを可能にし、かつ感度の高い定量も可能にするからである。
【００３４】
本文脈で使用される質量スペクトルのサイレント領域という用語は、標識ペプチドのフラグメンテーションによって生成されるフラグメントの存在に関連するピークによって生じる低いバックグラウンド「ノイズ」を有する質量スペクトルの領域を指すと意図される。よって、サイレント領域という用語は、検出されるペプチドに関連するピークによって生じる低い「ノイズ」を有する質量スペクトルの領域を指すと意図される。ペプチドまたはタンパク質について、質量スペクトルのサイレント領域は２２０ダルトン未満、好ましくは２００ダルトン未満である。
【００３５】
本発明による質量標識は、タンパク質などの生体分子と反応して、標識生体分子、例えば標識タンパク質を形成するように設計される。
【００３６】
１つの実施形態では、Ｒ１はメチルである。別の実施形態では、Ｒ１はプロピルである。別の実施形態では、Ｒ１はイソプロピルである。別の実施形態では、Ｒ１はブチルである。別の実施形態では、Ｒ１はイソブチルである。
【００３７】
好ましい実施形態では、レポーター部分Ｘは、原子の少なくとも１つにおける同位体質量調整部分を含む。同位体質量調整部分は、１８Ｏ、１３Ｃ、１５Ｎまたは２Ｈであってよく、かつ１つ以上が存在してもよい。
【００３８】
別の実施形態では、開裂可能な結合Ｌは、限定はされないが、アミド結合、尿素結合、エステル結合またはエーテル結合を含む。好ましい実施形態では、開裂可能な結合Ｌはアミド結合を含む。別の好ましい実施形態では、開裂可能な結合Ｌは尿素結合を含む。別の好ましい実施形態では、開裂可能な結合Ｌはエステル結合を含む。別の好ましい実施形態では、開裂可能な結合Ｌはエーテル結合を含む。
【００３９】
「質量修飾因子Ｍ」という用語は、本明細書では、そのセット中の各質量標識が所望の整数質量を有することを確保する部分を指す。質量修飾因子Ｍは、質量分析によって必ずしも検出されるわけではない。しかしながら、質量修飾因子Ｍは相補イオンの一部として検出され得る（下記参照）。質量修飾因子Ｍは構造的に特に限定されず、単に質量標識の全体的な質量を変化させるように機能する。
【００４０】
別の実施形態では、質量修飾因子Ｍは下記構造を有し：
【化４】
2019501382.tif 000005
式中：
−各Ｒ１０は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり、
−ａは０−１０の整数であり、
−ｂは少なくとも１であり、および
−ｃは少なくとも１である。
【００４１】
好ましい実施形態では、質量修飾因子Ｍは下記から選択され：
【化５】
2019501382.tif 000006
式中、＊は同位体質量調整部分であり、かつ酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００４２】
別の実施形態では、各質量標識は少なくとも１つの質量系列修飾基をさらに含み、ここで質量系列修飾基はレポーター部分Ｘの一部および／または質量修飾因子Ｍの一部である。
【００４３】
好ましくは、各質量標識は質量系列修飾基を含み、ここで少なくとも１つの質量系列修飾基はレポーター部分Ｘまたは質量修飾因子Ｍの一部またはその両方である。より好ましくは、質量系列修飾基はレポーター部分Ｘの一部である。
【００４４】
好ましくは、質量系列修飾基は下記から選択されてよい：
ａ）重同位体２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏ；
ｂ）任意で１つ以上の重同位体置換を含む、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基；
ｃ）ａ）およびｂ）の組み合わせ。
【００４５】
１つの実施形態では、質量系列修飾基は−ＣＨ３、−１３ＣＨ３、−ＣＨＤ２、−１３ＣＨＤ２、−１３ＣＤ３または−ＣＤ３から選択される。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、各質量標識は下記構造を有する少なくとも１つの質量系列修飾基を含み：
【化６】
2019501382.tif 000007
式中：
−各Ｒ１１は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり；
−ｄは１〜１０の整数であり；
−ｅは１〜１０の整数であり；ならびに
−ｆは１〜１０の整数である。
【００４７】
本発明による質量標識では、Ｒｅは質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基または分析物のいずれかであってよい。
【００４８】
好ましくは、質量タグは、質量標識が分析物にコンジュゲートされるのを可能にする反応性官能基をさらに含む。質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基は特には限定されず、任意の適切な反応基を含み得る。
【００４９】
反応性官能基は、生体分子上のアミノ基、例えばリジン残基のε−アミノ基と反応し得る。最も単純な実施形態において、これはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり得る。他の反応性官能基、例えば、生体分子中のチオール基と反応するものが本明細書で企図される。特に、これらの反応性官能基は、システイン残基のチオール基と反応するように設計される。システイン残基と反応できる本発明の反応基の例はマレイミド、ハロアセチルおよび２−ジチオピリジン基である。システインのチオール基はマレイミド基の二重結合にまたがる求核付加を受け、かつハロアセチルまたは２−ジチオピリジン基との求核置換を受ける。
【００５０】
生体分子中のカルボニルまたはヒドロキシル基と反応できる反応性官能基もまた、本明細書で企図される。特に、これらの反応性官能基は、ステロイドホルモンのカルボニルまたはヒドロキシル基と反応するように設計される。生体分子中のカルボニルまたはヒドロキシル基と反応できる本発明の反応基は、ヒドラジドまたは−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２（式中、ｎは１〜６であり、好ましくは、ｎは３である、すなわち、アミノキシプロピルアミド）である。これらの基は、カルボニル基と反応して、それぞれ、ヒドラゾンまたはＯ−アルキルオキシムを形成する。反応性官能基の例は、ＷＯ２０１１／０３６０５９号（その引用が本明細書に組み込まれる）に示される。
【００５１】
好ましくは、反応性官能基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルまたはスルホジクロロフェニルエステルである。
【００５２】
Ｒｅが分析物であるとき、分析物は好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、リン脂質またはそれらの組み合わせを含む。
【００５３】
多重化を改善することは、アイソバリック質量標識の非常に求められている特徴である。なぜならそれは多数の試料の標識を可能にし、分析がたった１回の実験であり、したがって、分析の時間、費用を低減し、かつより多数の試料のための分析条件を標準化もするからである。本発明で開示される一般構造による質量標識中で１５Ｎおよび１３Ｃ置換のみを用いるアイソバリック質量標識用の質量標識を作製するために、２つの異なる元素を含む重同位体質量系列修飾基で置換可能な位置（Ｐ位置）と第１の元素に置換可能な位置（Ａ位置）と第１のものとは異なる第２の元素に置換可能な位置（Ｂ位置）とを考慮する必要がある。Ａ位置の数はＢ位置の数以上であるべきである。質量標識の（Ｐ＋１）個のサブセットが存在しかつ質量標識のｘ番目のサブセットがＣ個の質量標識を含むと仮定すると、Ｃは、（Ｂ＋１）以下であるべきである。各レポーター部分は、第１の元素または第２の元素のいずれかに由来する重同位体で置換された（ｘ−１）個の位置を含み、その場合、質量標識の各サブセットにおけるｗ番目の質量標識は、第１の重同位体元素のｙ個の原子および第１のものとは異なる第２の重同位体元素のｚ個の原子を含み、ｘは、１〜（Ｐ＋１）の値を有する。Ｐ＝（Ａ＋Ｂ）であり、質量標識の総数は、（Ａ＋１）に（Ｂ＋１）を乗じたものである。典型的には、重同位体は、２Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎから選択される。
【００５４】
好ましい実施形態では、Ｂは２以上である。
【００５５】
例えば、レポーター部分中および質量修飾因子中に８つのドープ可能な炭素と１つのドープ可能な窒素が存在する質量標識は、最大１８重の、すなわち（８＋１）に（１＋１）を乗じた、アイソバリックセットを支持する。１ダルトンの分解能で、これらのレポーターは、異なる整数レポーター質量を有する質量標識の１０重（Ｐ＝８＋１により、（９＋１）個）のサブセットを支持する。明らかに、レポーター部分基を異なるＲ−基で置換できるので、質量標識の異なる異性体が可能であり、異なるフラグメンテーション挙動の選択肢が提供される。
【００５６】
本発明による最も好ましい質量標識が、重同位体質量系列修飾基を含む２以上の質量標識のセットの例と共に、本明細書で、下の好ましい実施形態１〜４において詳細に記載される。質量標識はセット番号、元のセットサイズおよびレポーターイオン質量により識別され、例えば下記の実施形態またはセット１では、各質量標識はＴＭＴ−１−１８−「レポーター質量」と命名され、ここでＴＭＴは、タンデム質量タグ、すなわちタンデム質量分析用のタグを表し、数字の１はセット番号を指し、１８はセット中の質量標識の数を指し、レポーター質量は衝突誘起解離条件下での予想されるレポーターイオンの質量対電荷比である。様々なレポーターイオンが電子移動解離（ＥＴＤ）または電子捕獲解離（ＥＣＤ）により得られ得る。
【００５７】
（実施形態１：）
質量標識は、下記構造を有し：
【化７】
2019501382.tif 000008
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００５８】
この発明による質量タグのアイソバリックセットの特定の好ましい実施形態では、質量調整部分＊は１３Ｃまたは１５Ｎであり、セットは下記構造を有するｎ＝１８の質量標識を含む：
【化８】
2019501382.tif 000009
2019501382.tif 000010
2019501382.tif 000011
2019501382.tif 000012
2019501382.tif 000013
【００５９】
上で記載される好ましい実施形態で提示される専門用語を解釈すると、ｍ（上で規定される）は１８であり、ｎ＝９である。１５Ｎを置換できる窒素原子より１３Ｃを置換できる炭素原子が多いので、ａ＝８の置換可能な炭素核およびｂ＝１の置換可能な窒素核が存在する。よって、各タグに組み込まれる８つの原子の第１の重同位体質量調整因子（１３Ｃである）および１つの原子の第２の重同位体質量調整因子（１５Ｎである）が存在し、フルセットの質量タグは、フラグメンテーション可能な結合（上記構造中点線で示される）のどちらかの側で質量調整因子の全ての可能な組み合わせを作成することにより作製される。上記リストにおいて、レポーターイオンの整数質量に基づき、（ｎ＋１）＝１０のサブセットのタグが存在する、すなわち、サブセット２中のレポーターイオンは、サブセット１中のレポーターイオンよりおよそ１ダルトン重いことがわかる。同様に、サブセット３中のレポーターイオンは、サブセット２中のレポーターイオンよりおよそ１ダルトン重い、など。タグの各サブセット内で、計算した精密質量から、各タグは次のものと６．３２ミリダルトン異なることがわかる。サブセット１では、レポーターイオン中に重同位体質量調整因子が存在せず、このレポーターを構築できる方法は１つしかないため、サブセット１には１つのタグしか存在しない。サブセット２では、レポーターイオン中に重同位体質量調整因子が１つ存在し、レポーターの質量を、サブセット１と比べておよそ１ダルトンだけシフトさせる。質量調整因子を導入するには、１つの１５Ｎ核の導入によるかまたは１つの１３Ｃ核の導入によるかの２つの方法があり、それゆえ、サブセット２には、質量が互いに６．３ミリダルトン異なる２つのタグが存在する。サブセット３では、レポーターイオン中に２つの重同位体質量調整因子が存在し、レポーターの質量を、サブセット２と比べておよそ１ダルトンだけシフトさせる。２つの質量調整因子をサブセット３に導入するには、１つの１５Ｎ核と１つの１３Ｃ核の導入によるかまたは２つの１３Ｃ核の導入によるかの２つの方法があり、それゆえ、サブセット３には２つのタグが存在する。サブセット４では、レポーターイオン中に３つの重同位体質量調整因子が存在し、レポーターの質量をサブセット３と比べておよそ１ダルトンだけシフトさせる。この場合も、３つの質量調整因子をサブセット３に導入するには、１つの１５Ｎ核と２つの１３Ｃ核の導入によるかまたは３つの１３Ｃ核の導入によるかの２つの方法しかなく、それゆえ、サブセット４には、２つのタグが存在する。一般に、各サブセットにおけるタグの数は、質量調整因子核のうちどれがその構造中により少ない頻度で存在するかにより制限される。セット例１では、レポーターおよび質量正規化因子中に、１つの窒素核しか存在せず、そのため上で規定されるようにｂ＝１であり、タグの各サブセット中のタグの数は＜＝（ｂ＋１）であり、これは、最高２つのタグ／サブセットである。９番目のサブセットでは、８つの重同位体質量修飾因子が存在し、アイソバリックタグ構造全体を保持しながら８つの重同位体を有するレポーターイオンを構成するのに、２つの方法しか存在せず、そのため、９番目のサブセット中には２つのタグしか存在せず、同様に１０番目のサブセットでは、レポーター中に９つ全ての重同位体質量調整因子が存在し、質量修飾因子全てを有するレポーターを構成するのに１つの方法しか存在せず、そのため、サブセット１０には１つのタグしか存在しない。
【００６０】
質量正規化官能基（このタグ中で２つのβ−アラニン残基を含む）はかなり多様であり得ることは、当業者には明らかなはずである。明らかな置換としては、アラニン、バリン、ロイシンなどの他のアミノ酸とのまたはγ−アミノ酪酸、アミノペンタン酸またはアミノヘキサン酸などのより長いアミノ酸との置き換えが挙げられる。ポリエチレングリコールリンカーがアミノおよびカルボン酸末端で適切な場合もある。
【００６１】
（実施形態２：）
質量標識は、下記構造を有し：
【化９】
2019501382.tif 000014
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００６２】
質量系列修飾基２Ｈ（すなわちＤ）１３Ｃまたは１５Ｎを含むｎ＝１６の質量標識のセットの一例が下に示される：
【化１０】
2019501382.tif 000015
2019501382.tif 000016
2019501382.tif 000017
2019501382.tif 000018
2019501382.tif 000019
【００６３】
当業者であれば、２Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎの固定された置換は、上で示した実施例中の特定の場所に示されているが、これは説明のための便宜として行われており、実施形態セット２におけるこれらの固定された置換は、それらを別の場所に配置することがより好都合であるかまたは費用効率的である場合、レポーターイオン内の任意の好適な位置に配置できることを直ちに認識するであろう。
【００６４】
（実施形態３：）
質量標識は下記構造を有し：
【化１１】
2019501382.tif 000020
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００６５】
５つの重水素核の固定された置換がこのタグ構造中に存在することがすぐに分かる。
【００６６】
質量系列修飾基１３Ｃまたは１５Ｎを含むｎ＝１８の質量標識のセットの一例が下に示される：
【化１２】
2019501382.tif 000021
2019501382.tif 000022
2019501382.tif 000023
2019501382.tif 000024
2019501382.tif 000025
【００６７】
タグセット３中のタグは全て、タグセット１中のタグの同位体であり、各タグはタグセット１中の対応するタグよりもわずか５ダルトン強重いことは明らかであろう。その上、タグセット３中のレポーターは全て、タグセット１中のタグから一意的に分離可能である。よって、タグのこれらのセットは、３６重多重化を支持するために同時に使用できる。タグセット３由来のタグで標識されたペプチドは、タグセット１のタグとアイソバリックではなく；タグセット３中のタグはタグセット１中のタグから５ダルトンだけオフセットされることに注意されたい。
【００６８】
（実施形態４：）
質量標識は下記構造を有し：
【化１３】
2019501382.tif 000026
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００６９】
５つの重水素核の固定された置換がこのタグ構造中に存在することがすぐに分かる。
【００７０】
この発明による質量タグのアイソバリックセットの特定の好ましい実施形態では、質量調整部分＊は１３Ｃまたは１５Ｎであり、セットは下記構造を有するｎ＝７の質量標識を含む：
【化１４】
2019501382.tif 000027
2019501382.tif 000028
2019501382.tif 000029
【００７１】
タグセット４中の７つのタグは全て、タグセット１中のタグの同位体であり、各タグはタグセット１中のタグとおよそアイソバリックであることは明らかである。その上、タグセット４中のレポーターは全て、タグセット１中のタグから一意的に分離可能である。よって、タグのこれらのセットは、２５重多重化を支持するために同時に使用できる。タグセット４由来のタグで標識されたペプチドは、タグセット１のタグで標識された対応するペプチドとアイソバリックであり、かつ共選択可能であり、よってタグセット４中のタグおよびタグセット１中のタグは一緒に、タグのより大きなシュード−アイソバリックアレイを形成する。
【００７２】
別の態様では、本発明は、以下で「発明の質量標識の第２のセット」と呼ばれる、２以上の質量標識のセットに関し、ここで各標識は下記式を有し：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
式中、Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、Ｍは質量修飾因子であり、ならびにＲｅは質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはその分析物であり、およびＸは下記一般式を含み：
【化１５】
2019501382.tif 000030
式中、Ｒ１はＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である。
【００７３】
発明の質量標識の第１のセットの定義ならびに特定のおよび好ましい実施形態は、等しく発明の質量標識の第２のセットに適用可能である。
【００７４】
発明の第１および第２の質量標識のセットとの関連で前に記載される個々の質量標識は、本発明の追加の態様を構成する。
【００７５】
（質量標識のアレイ）
本発明はまた、以下「発明の質量標識のアレイ」と呼ばれる、発明の第１および第２の質量標識のセットによる質量標識の２以上のセットを含む、質量標識のアレイを提供する。
【００７６】
発明の質量標識の第１のセットとの関連で詳細に記載される定義ならびに特定のおよび好ましい実施形態は、等しく、発明の質量標識のアレイに適用される。
【００７７】
一実施形態では、アレイにおける任意の１つのセットの質量標識の各々の整数質量は、アレイにおける他の全てのセットの質量標識の各々の整数質量とは異なる。
【００７８】
好ましい実施形態では、一セット中の各質量標識は下記を含む：
ａ）そのセット中の他の全ての質量標識と同じ整数質量を有する質量系列修飾基、および
ｂ）アレイの他のセット全ての質量標識と異なる整数質量。
【００７９】
特に好ましい実施形態では、レポーター部分Ｘは質量系列修飾基を含む。
【００８０】
１つの実施形態では、一セット中の各質量標識は同じ質量系列修飾基を含む。
【００８１】
別の実施形態では、一セット中の各質量標識は
ａ）同じである；または
ｂ）アレイの他の質量標識全ての質量系列修飾基のアイソトポログである、
質量系列修飾基を含む。
【００８２】
好ましい実施形態では、一セット中の各質量標識は、アレイの他の質量標識全ての質量系列修飾基のアイソトポログである質量系列修飾基を含む。
【００８３】
（質量分析の方法）
本発明はまた、以下「発明の質量分析の方法」と呼ばれる、質量分析の方法を提供し、この方法は、分析物と関連付けることができる質量標識または質量標識の組合せを質量分析によって同定することにより分析物を検出することを含み、ここで質量標識は、本発明の前の態様に定義されるような、発明の質量標識の第１のまたは第２のセット、あるいは発明の質量標識のアレイ由来の質量標識である。
【００８４】
１つの実施形態では、発明の質量分析の方法は下記を含む：
ａ）複数の試料を提供することであって、各試料は１つの質量標識または質量標識の組み合わせで示差標識され、質量標識（複数可）は発明の質量標識の第１のまたは第２のセット、あるいは発明の質量標識のアレイに由来する、こと；
ｂ）複数の標識された試料を混合して標識分析物を含む分析混合物を形成すること；
ｃ）任意で標識分析物を質量分析計で検出すること；
ｄ）標識分析物を質量分析計で解離して質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントを形成すること；
ｅ）質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントを検出すること；ｆ）任意で質量標識を質量分析計で解離してレポーター部分を放出すること、およびレポーター部分を検出すること；
ｇ）任意で工程ｆ）で形成されたレポーター部分を解離してフラグメントを形成すること、およびフラグメントを検出すること；
ｈ）標識分析物の質量スペクトル；および／または質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトル；および／またはレポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて分析物を同定すること。
【００８５】
特定の実施形態では、解離は、好ましくは、質量分析計での衝突誘起解離である。
【００８６】
別の特定の実施形態では、相補イオンは、リンカーＬからの一酸化炭素のニュートラルロスによって工程ｄ）で形成される。
【００８７】
好ましくは、本明細書で記載される方法は、４００の質量対電荷比で６０，０００を超える分解能、好ましくは４００の質量対電荷比で１００，０００を超える、最も好ましくは４００の質量対電荷比で２５０，０００を超える分解能を有する質量分析計で実施され得る。
【００８８】
分析物は、ｉ）標識分析物の質量スペクトル；またはｉｉ）質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトル；またはｉｉｉレポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて同定され得る。ｉｉ）による同定が行われるとき、無傷の質量標識を好ましくは含む分析物フラグメントは無傷の質量標識を含むｂ系列イオン、好ましくはｂ１イオンである。分析物はレポーター部分Ｘまたはレポーター部分Ｘのフラグメントの質量スペクトルに基づいて同定されてよい。
【００８９】
よって、１つの実施形態では、分析物は標識分析物の質量スペクトルに基づいて同定されてよい。
【００９０】
別の実施形態では、分析物は質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトルに基づいて同定されてよい。好ましい実施形態では、無傷の質量標識を含む分析物フラグメントは無傷の質量標識を含むｂ系列イオン、好ましくはｂ１イオンである。
【００９１】
別の実施形態では、発明の質量分析の方法は下記を含む：
ａ）複数の試料を提供することであって、各試料は１つの質量標識または質量標識の組み合わせで示差標識され、質量標識（複数可）は発明の質量標識の第１のまたは第２のセット、あるいは発明の質量標識のアレイに由来する、こと；
ｂ）複数の標識された試料を混合して標識分析物を含む分析混合物を形成すること；
ｃ）標識分析物を質量分析計で検出すること；
ｄ）標識分析物を質量分析計で解離してレポーター部分を放出すること、および分析物または分析物のフラグメントに付着した質量標識の残りを含む相補イオンを検出すること；
ｅ）任意で工程ｄで形成された相補イオンを解離してフラグメントを形成する、およびフラグメントを検出する１つ以上のさらなる工程；
ｆ）標識分析物の質量スペクトルおよび／または相補イオンおよび／またはそのフラグメントの質量スペクトルに基づいて分析物を同定すること。
【００９２】
特定の実施形態では、解離は、好ましくは、質量分析計での衝突誘起解離である。
【００９３】
別の特定の実施形態では、相補イオンは、リンカーＬからの一酸化炭素のニュートラルロスによって工程ｄ）で形成される。
【００９４】
好ましくは、本明細書で記載される方法は、４００の質量対電荷比で６０，０００を超える分解能、好ましくは４００の質量対電荷比で１００，０００を超える、最も好ましくは４００の質量対電荷比で２５０，０００を超える分解能を有する質量分析計で実施され得る。
【００９５】
この発明の質量標識の多くは、時にはたった１ミリダルトン程度の、ごくわずかな質量差によって互いに区別される。現在のオービトラップ計測手段が６．３ミリダルトンの質量差を有するレポーターイオンを分解できることは既に立証されている（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８、上記で引用）。しかしながら、最小の質量差により互いに区別される質量標識では、より高い分解能が必要となる場合があり、これは、現在のところ、市販のフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計でルーチン的に達成できる。
【００９６】
飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計は、飛行管の長さに応じて高分解能、高質量精度データが取得され得るタイプの質量分析計のさらなる例である。市販の、マルチターン（Ｏｋｕｍｕｒａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｅｎｇ），  １１，  ２６１−２６６）およびスパイラルＴＯＦ（Ｓｈｉｍｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ７，  ｅ３７１０７）配置は、オービトラップと同様の質量分解能を既に達成できる。
【００９７】
オービトラップ質量分析計は、クアドロ対数（ｑｕａｄｒｏ−ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ）ポテンシャル分布を有する静電場を形成する外側バレル様電極および同軸内側スピンドル様電極から構成される（Ｈｕ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ，  （２００５）  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，  ４０，  ４３０−４４３  ＆  Ｍａｋａｒｏｖ，  Ａ．  （２０００）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ７２，  １１５６−１１６２）。動的にトラップされたイオンからのイメージ電流が検出され、デジタル化され、フーリエ変換を用いて周波数領域データに変換され、その後質量スペクトルに変換される。イオンはオービトラップ中に注入され、そこでイオンは内側電極周囲の軌道経路に落ち着く。内側電極周囲の軌道振動の周波数がイメージ電流として記録され、それに対してフーリエ変換アルゴリズムが適用されて超高分解能を有する質量スペクトルに周波数領域信号を変換できる。
【００９８】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）質量分析では、イオンの試料がキャビティのようなイオントラップ内に保持されるが、ＦＴＩＣＲ  ＭＳでは、イオンは交差電磁場によって高真空チャンバー中にトラップされる（Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９８）  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ，  １７，  １−３５  ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ａ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｃ．Ｌ．  （２００８）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  （Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  Ｃａｌｉｆ），  １，  ５７９−５９９）。電場は、箱の２つの側面を形成する１対のプレート電極によって形成される。この箱は、超伝導磁石の磁場に収容され、この超伝導磁石は、２枚のプレート、トラッピングプレートとともに、印加された磁場に直交する、トラッピングプレート間の円形軌道に注入されたイオンを拘束する。箱の２つのさらなる対向側面を形成する２枚の「送信プレート」に高周波パルスを印加することにより、イオンはより大きな軌道に励起される。イオンのサイクロイド運動は、「受信プレート」を含む箱の残り２つの対向側面で対応する電場を発生する。励起パルスはより大きな軌道にイオンを励起し、この軌道は、イオンのコヒーレントな運動が衝突によって失われるときに崩壊する。受信プレートによって検出される対応する信号は、フーリエ変換（ＦＴ）分析によって質量スペクトルに変換される。ＦＴＩＣＲ機器の質量分解能は、印加される磁場の強度とともに増加し、超高分解能（＞１、０００，０００）分析を達成できる（Ｓｃｈａｕｂ，  Ｔ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  （２００８）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８０，  ３９８５−３９９０）。
【００９９】
誘起フラグメンテーション実験では、ＦＴＩＣＲ機器は、イオントラップと同様の様式で作動でき−対象の単一種を除く全てのイオンをＦＴＩＣＲキャビティから放出できる。衝突ガスをＦＴＩＣＲキャビティ中に導入し、フラグメンテーションを誘起できる。フラグメントイオンをその後分析できる。一般に、「受信プレート」により検出される信号のＦＴ分析によって分析される場合フラグメンテーション生成物と浴ガスが組み合わさり低い分解能を与えるが、しかしながら、フラグメントイオンをキャビティから放出し、例えば、四重極型または飛行時間型装置とのタンデム構成で分析できる。
【０１００】
飛行時間型質量分析計では、狭い運動エネルギー分布を有するイオンのパルスをフィールドフリードリフト領域に進入させる。機器のドリフト領域で、各パルスにおける異なる質量対電荷比を有するイオンは異なる速度で移動し、したがって異なる時間でドリフト領域の末端に位置するイオン検出器に到達する。ドリフト領域の長さはＴＯＦ機器の質量分解能を決定し、これは容易に増大させることができる。到達イオンに応答して検出器によって生成されるアナログ信号は、時間−デジタル変換器によってすぐにデジタル化される。イオン飛行時間の測定は、各到達イオンの質量対電荷比を決定する。飛行時間型機器には多くの異なる設計がある。設計は、イオン源の性質によってある程度決定される。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ）質量分析では、イオンのパルスが、金属ターゲット上に結晶化した試料材料のレーザー励起によって生成される。これらのパルスは、それらがそこから加速される飛行管の一端で形成する。
【０１０１】
エレクトロスプレーイオン源から質量スペクトルを取得するために、直交軸ＴＯＦ（ｏａＴＯＦ）配置が使用される。エレクトロスプレーイオン源で生成されるイオンのパルスは、「プッシャー」プレートによって連続流からサンプリングされる。プッシャープレートは、起源から直交配置される飛行管中にイオンを加速する一時的な電位差を用いて、飛行時間型質量分析計中にイオンを注入する。質量対電荷比に対するイオン到達数のヒストグラムを作成するために、プッシャープレート〜検出器の飛行時間が記録される。このデータは、時間−デジタル変換器を用いてデジタル記録される。
【０１０２】
この発明の全ての可能なタグを分解するために、高分解能を有する質量分析計が必要とされるが、機器の性質は、本発明の実施にとって特に重要ではない。加えて、本出願に記載されているタグの多くは、１ダルトンの質量差で分離される可能なタグのサブセットが使用される限り、１ダルトンの分解能しか有しない機器ででも分解され得る。
【０１０３】
発明について下記実施例により、下で詳細に記載するが、実施例は例示にすぎず、発明の範囲を決して制限するものではない。
【実施例】
【０１０４】
（実施例）
（質量標識の合成）
（実施例１：２−プロピル−ピロリジン−１−イル酢酸の合成）
図１はこの発明の２−プロピル-ピロリジン-1-イル酢酸レポーターの模式図を示す。ブロモエタンをエトキシエタン中のマグネシウムとの反応によりＧｒｉｇｎａｒｄ試薬に変換して生成物１を得る。並行して、プロリンをアミノ基でＣＢｚ保護基により保護して生成物２を得る。プロリンカルボン酸をその後、ワインレブアミンと反応させて対応するアミド（３）を得る。これを生成物１と反応させて、ケトン生成物４を得ることができる。ＣＢｚ基を、メタノール中でパラジウム／木炭触媒を用いる水素による還元により除去して生成物５を得る。ケトンをその後、水素化アルミニウムリチウムで還元して２−プロピル−ピロリジン（生成物６）を得る。２−プロピル−ピロリジンをその後、ブロモ酢酸ベンジルエステルと反応させて生成物７を得る。ベンジル保護基を、メタノール中でパラジウム／木炭触媒を用いる水素による還元により除去して、所望の２−プロピル−ピロリジン−１−イル酢酸レポーターである、生成物８を得る。
【図１】
2019501382.tif 000056
【国際調査報告】
2019501382.tif 000057
2019501382.tif 000058
2019501382.tif 000059