(57)【要約】  ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に対する防御免疫を誘導するための合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、ベクターおよびその組成物ならびに方法が記載される。ＨＩＶに対する改善された防御免疫を提供するため、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするウイルス発現ベクターがワクチンにおいて使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、核酸。
【請求項２】
前記合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、シグナル配列、例えば、配列番号９〜配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むシグナル配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、膜貫通ドメイン、例えば、配列番号１３を含む膜貫通ドメインをさらに含み、好ましくは、前記合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、配列番号８のＣ末端および前記膜貫通ドメインのＮ末端に融合された配列番号３７をさらに含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、細胞質ドメインの断片、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列またはその残基１〜４を含む細胞質ドメインの断片をさらに含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
前記合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、（ａ）三量体形成ドメイン、例えば、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を有する三量体形成ドメインをさらに含む、または（ｂ）変異ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃ、の組み合わせを有する配列番号８を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項７】
前記合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、配列番号１９の残基１〜６８６のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸を含むベクターであって、前記核酸が、プロモーター配列に作動可能に連結されている、ベクター。
【請求項９】
ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）ベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のベクターの免疫原的有効量および担体を含む、組成物。
【請求項１３】
（ｉ）配列番号８、好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列を有する合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターの免疫原的有効量を含む第１の組成物、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくは第２のアデノウイルス２６ベクターの免疫原的有効量を含む第２の組成物、ならびに任意選択により、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのさらなる組成物であって、
（ｉｉｉａ）配列番号１〜４、２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするベクター、および
（ｉｉｉｂ）配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８、または配列番号３６の残基３０〜７２４を有する単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドの免疫原的有効量を含むポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１つの免疫原的有効量を含む、少なくとも１つのさらなる組成物
を含むワクチンの組み合わせであって、
前記第１の組成物、第２の組成物およびさらなる組成物は、同じ組成物中または１つ以上の異なる組成物中に存在する、ワクチンの組み合わせ。
【請求項１４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、前記方法が、請求項１２に記載の組成物または請求項１３に記載のワクチンの組み合わせを対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８のアミノ酸配列を含む、好ましくは、（ｉ）変異ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃ、の組み合わせを有する配列番号８、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸残基３０〜７０４、または（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸残基３０〜６８６を含む、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は世界中で何百万人もの人々を冒しており、効果的なワクチンによるＨＩＶの予防は、抗レトロウイルス処置が広く行き渡っている時代であっても依然として優先順位が非常に高い。ＨＩＶ−１は、ウイルスの最も一般的かつ病原性の株であり、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ症例の９０％以上がＨＩＶ−１グループＭの感染に由来する。Ｍグループは、さらにクレードまたはサブタイプに細分される。効果的なワクチンは、理想的には、強力な細胞応答と、異なるクレードのＨＩＶ−１株を中和し得る広域中和抗体の両方を誘起できよう。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１の高い遺伝的変異性により、ＨＩＶ−１ワクチンの開発は前例のない挑戦となる。潜在的なＴ細胞エピトープの適用範囲を改善し、細胞応答を改善するため、ＨＩＶグループ抗原（Ｇａｇ）、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、およびエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質に由来する「モザイク」ＨＩＶ−１Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ抗原は、潜在的なＴ細胞エピトープ（例えば、Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ２０１０、１６：３１９−３２３）の最大の適用範囲を提供する試みにおいて開発された。モザイク抗原は、野生型の天然に存在するＨＩＶ−１抗原と長さおよびドメイン構造が類似している。
【０００３】
例えば、ワクチンにおいて記載され使用されるモザイクＨＩＶ抗原には、Ｂａｒｏｕｃｈら、上記、および国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレットに記載される以下のようなものが含まれる：
（ａ）以下を含むＧａｇモザイク抗原：
（ａ）（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する第１のモザイクＧａｇ配列（「ｍｏｓ１Ｇａｇ」）、および
（ａ）（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する第２のモザイクＧａｇ配列（「ｍｏｓ２Ｇａｇ」）；
（ｂ）以下を含むＰｏｌモザイク抗原：
（ｂ）（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する第１のモザイクＰｏｌ配列（「ｍｏｓ１Ｐｏｌ」）、および
（ｂ）（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する第２のモザイクＰｏｌ配列（「ｍｏｓ２Ｐｏｌ」）；ならびに
（ｃ）以下を含むＥｎｖモザイク抗原：
（ｃ）（ｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する第１のモザイクＥｎｖ配列（「ｍｏｓ１Ｅｎｖ」）、および
（ｃ）（ｉｉ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する第２のモザイクＥｎｖ配列（「ｍｏｓ２Ｅｎｖ」）。
【０００４】
これらの抗原をコードする配列は、例えば組換えアデノウイルス血清型２６（ｒＡｄ２６）のような組換えアデノウイルスベクターなどのベクターにクローニングされており、これらの組換えベクターは、抗原に対する免疫応答を生成するためのワクチンとして以前に使用されている（例えば、Ｂａｒｏｕｃｈら、上記；および国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレット参照）。例えば、ｍｏｓ１Ｇａｇおよびｍｏｓ１Ｐｏｌモザイク抗原配列は、典型的にはＧａｇおよびＰｏｌの融合タンパク質（「ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ」）に結合され、そのコード配列は、第１のＡｄ２６ベクター（「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ」）にクローニングされる。ｍｏｓ２Ｇａｇおよびｍｏｓ２Ｐｏｌ抗原配列は、ＧａｇおよびＰｏｌの別の融合タンパク質（「ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ」）に結合され、そのコード配列は、第２のＡｄ２６ベクター（「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ」）にクローニングされる。ｍｏｓ１Ｅｎｖおよびｍｏｓ２Ｅｎｖをコードする構築物は、典型的には別々のＡｄ２６ベクター（それぞれ「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ」および「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖ」）にクローニングされる。
【０００５】
上記のようなモザイク抗原のセットは、グループＭ  ＨＩＶ−１単離体の良好な全体的適用範囲をもたらし、ここで、モザイク１抗原配列（例えば、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌおよびｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ）をコードするｒＡｄ２６ベクターにとってクレードＢおよびＣＲＦ０１  ＨＩＶ−１サブタイプが有利であり、モザイク２抗原配列（例えば、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌおよびｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖ）をコードするｒＡｄ２６ベクターにとってクレードＣ株が有利である。ｒＡｄ２６ベクターで発現されるモザイクＨＩＶ−１Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ抗原は、コンセンサスまたは天然配列ＨＩＶ−１抗原（Ｂａｒｏｕｃｈら、上記；および国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレット）と比較した場合、細胞性応答および体液性応答の両方の大きさを損なうことなく、アカゲザルにおける抗原特異的Ｔリンパ球応答の幅および深さの両方を改善するために使用され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記のワクチン成分に関するさらなる開発努力の結果、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖは、非ヒト霊長類において非最適な細胞表面発現および免疫応答を示したが、なお、これまでに報告されていない予想外かつ予測不可能な、他のｒＡｄ２６ベクター（例えば、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ）と比較した、製造プロセス中の非最適な遺伝的安定性を示した。したがって、ｍｏｓ２Ｅｎｖモザイク抗原がクレードＣ  ＨＩＶ−１株に有利であるため、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖを含むワクチンは、クレードＣ  ＨＩＶ−１サブタイプに対する非最適免疫応答をもたらし得る。したがって、ＨＩＶ−１クレードＣに対する改善された免疫応答を誘導するために使用され得る、ＨＩＶに対するワクチン中のｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原の代替物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、先に記載されたｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原と比較して改善された細胞表面発現および遺伝的安定性を有する新規合成ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質に関する。本発明はまた、好ましくは他のＨＩＶ抗原と組み合わせて使用される場合の、ＨＩＶ−１、特にＨＩＶ−１クレードＣに対する増加した免疫応答を誘導するためのそのような新規合成ＨＩＶエンベロープタンパク質および／またはそのコード配列の使用した組成物および方法に関する。
【０００８】
一般的な一態様では、配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ（すなわち、配列番号８の５２９位でのＩｌｅのＰｒｏへの置換）、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ（すなわち、配列番号８の４８０位でのＬｙｓのＧｌｕへの置換）、（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ（すなわち、配列番号８の４７９〜４８０位での、Ｇｌｕ−Ｌｙｓの、４つの連続するＡｒｇ残基による置換）、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１Ｃ（すなわち、配列番号８の４７１位でのＡｌａのＣｙｓへの置換）およびＴ５７５Ｃ（すなわち、配列番号８の５７５位でのＴｈｒのＣｙｓへの置換）の組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸に関する。一実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、シグナル配列、例えば、配列番号９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナル配列をさらに含む。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、膜貫通ドメイン、好ましくは配列番号１３のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインをさらに含む。
【００１０】
特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、細胞質ドメインの断片、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列またはそのアミノ酸１〜４（すなわちＮＲＶＲ）を含む細胞質ドメインの断片をさらに含む。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの断片、をさらに含む実施形態では、タンパク質はまた、配列番号８のカルボキシル末端（Ｃ末端）および膜貫通領域のアミノ末端（Ｎ末端）に融合された配列番号３７のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００１１】
別の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、三量体形成ドメイン、例えば、配列番号１５（ＧＣＮ４）または配列番号１６（フォールドン（ｆｏｌｄｏｎ）ドメイン）のアミノ酸配列を含む三量体形成ドメインを含む。好ましい一実施形態では、三量体形成ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。三量体形成ドメインを有するそのような実施形態は、配列番号８のアミノ酸配列を含むものなどの、本明細書で提供されるエクトドメイン配列に基づく可溶性（すなわち非膜結合性）合成ＨＩＶエンベロープタンパク質に有用であり、三量体形成ドメインは、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質のＣ末端に位置する。
【００１２】
さらに他の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、以下の変異：ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃを有する配列番号８を含む。６つの連続したアルギニン残基（配列番号８の天然配列中の４７８位および４８１位は既にＡｒｇ残基である）の導入は、さらに最適化されたフューリン切断部位をもたらし、改良されたプロセシング（すなわち切断）したエクトドメインが得られる。Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの３つの変異は、ＳＯＳＩＰ変異として知られており、最後の２つの変異により、新たに生成されたシステイン残基間に可能なジスルフィド架橋が導入される。全体として、これらの変異は、三量体形成ドメインの必要性なしに、可溶性の、三量体形成された、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質を生じる。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸１〜６８６、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸に関する。最も好ましくは、核酸によってコードされる合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００１４】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の一実施形態による合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含むベクターに関する。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。好ましい実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。好ましい一実施形態では、アデノウイルスベクターはアデノウイルス２６ベクターである。
【００１５】
本発明の別の一般的な態様は、本発明の一実施形態によるベクターの免疫原的有効量および担体を含む、組成物、好ましくはワクチン組成物に関し、ここで、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結される。一実施形態では、組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含む。
【００１６】
他の一般的な態様では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するためのワクチンの組み合わせに関する。ワクチンの組み合わせは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくはアデノウイルス２６ベクターの免疫原的有効量を含む第１の組成物、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のベクター、好ましくは第２のアデノウイルスベクター、さらに好ましくは第２のアデノウイルス２６ベクターの免疫原的有効量をさらに含む第２の組成物、および任意選択により、配列番号１〜４、２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードするベクター、および配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を有するポリペプチド、または配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を有するポリペプチドを含むが、これに限定されない、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドの免疫原的有効量を含むポリペプチド、からなる群から選択される、少なくとも１つの免疫原的有効量を含む、少なくとも１つのさらなる組成物、を含み、第１の組成物、第２の組成物および任意選択によるさらなる組成物は、同じ組成物中または１つ以上の異なる組成物中に存在する。
【００１７】
本発明のさらに別の一般的な態様は、本発明の実施形態による組成物またはワクチンの組み合わせを対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法に関する。本発明はまた、本発明の一実施形態による組成物またはワクチンの組み合わせを用いた免疫応答のプライミングおよびブースティングを含む、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【００１８】
また、本発明のさらなる態様は、配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質に関する。一実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの変異を有する配列番号８を含む。別の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列の残基３０〜７０４または３０〜７１１を含む。さらに別の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列の残基３０〜６８６を含む。
【００１９】
本発明の別の態様は、本発明の実施形態によるベクターを含む細胞、好ましくは単離された細胞に関する。
【００２０】
本発明の上記の概要および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されるであろう。本発明は、図面に示した厳密な実施形態に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＨＩＶエンベロープタンパク質の構造の概略図である。全長ＨＩＶエンベロープタンパク質を示す。
【図１Ｂ】ＨＩＶエンベロープタンパク質の構造の概略図である。膜貫通ドメイン（ＴＭ）がＧＣＮ４三量体形成ドメインで置換され、フューリン切断部位が変異（ｓＣ４）した、本発明の実施形態による可溶性一本鎖ＨＩＶエンベロープタンパク質の構造を示す。
【図１Ｃ】ＨＩＶエンベロープタンパク質の構造の概略図である。本発明の実施形態による、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの断片（Ｃ４Ｄ７）を含む膜結合ＨＩＶエンベロープタンパク質の構造を示す。
【図２】本発明の実施形態による、さらなるＣ末端三量体形成ドメインを有するｍｏｓ２Ｅｎｖモザイク抗原配列および可溶性合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｓＣ４）に基づく可溶性ｓＣ１エンベロープタンパク質の発現レベルを示す。発現は、ｇｐ１２０に対するポリクローナル抗体を用いた定量的ウェスタンブロットによって測定した。ｓＣ１またはｓＣ４をコードするプラスミドを一過的に２回発現させ、各トランスフェクションをデンシトメトリーで２回定量した。ｓＣ１タンパク質は、比較的高い発現レベルを示したｓＣ４合成ＨＩＶエンベロープタンパク質と比較して、非常に低い発現レベルを示した。
【図３Ａ】ＥＬＩＳＡアッセイによって決定された可溶性ＣＤ４の存在下（薄灰色）および非存在下（暗灰色）におけるモノクローナル抗体１７ｂ（ｍＡｂ１７ｂ）との合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の結合を示す。ｓＣ１の結合を示す。
【図３Ｂ】ＥＬＩＳＡアッセイによって決定された可溶性ＣＤ４の存在下（薄灰色）および非存在下（暗灰色）におけるモノクローナル抗体１７ｂ（ｍＡｂ１７ｂ）との合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の結合を示す。ｓＣ４の結合を示す。
【図４】ｓＣ１タンパク質およびｓＣ４合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動からのウェスタンブロットの画像である。
【図５】膜結合Ｃ１、Ｃ１Ｄ７、Ｃ４およびＣ４Ｄ７合成ＨＩＶエンベロープタンパク質を発現する細胞の抗ｇｐ１２０ポリクローナル抗体（ＧＰ１２０）を用いたＦＡＣＳ分析により、および四次構造依存性であり、正しく折り畳まれたＥｎｖ三量体に優先的に結合する、広範に中和する抗体ＰＧ９（ＰＧ９）およびＰＧ１６（ＰＧ１６）に結合することにより、膜結合Ｃ１、Ｃ１Ｄ７、Ｃ４およびＣ４Ｄ７合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の相対的な細胞表面発現レベルを示す。
【図６】複数のウイルス継代後の全長Ｃ４（ＦＬＣ４）、Ｃ４Ｄ７およびｓＣ４を含む本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする配列を含むアデノウイルスベクターの安定性のグラフ表示である。組換えアデノウイルス２６ベクターは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞において生成された。トランスフェクションおよびプラーク精製のための最初の３継代の後、５つのプラークを選択し、Ｔ２５形式で、１０継代でアップスケールし、総ウイルス継代数（ｖｐｎ）１３となった。Ｅ１導入遺伝子カセットポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定されるｖｐｎ３，５，１０および１３の後の安定性が示される。例えば、３／５は、試験した５つのプラークのうち３つのプラークが安定であったことを意味し、５／５は、試験した５つのプラークのうち５つのプラークが安定であったことを意味する。
【図７Ａ】ウサギのＴＺＭ−ｂｌ細胞ベースの中和アッセイにおけるＨＩＶ−１エンベロープシュードタイプウイルス粒子（ＥＶＰ）に対するウイルス中和力価を示す。高アデノウイルスベクター投与群のｌｏｇ１０−形質転換ＩＣ５０値を、１，８，１４および２０週目にＥＶＰ  ＶＳＶ−Ｇ（陰性対照）およびＭＷ９６５．２６（ティア１ＡクレードＣ）に対して測定した。各ドットは個々のウサギのｌｏｇ１０−形質転換ＩＣ５０値を表し、グループ平均は水平線で示される。ＨＤ：試験した最高希釈液（上の実線）。ＬＤ：試験した最低希釈液（下の実線）。ＬＯＢ：バックグラウンド限界、コンパイルされた陰性試料の９５パーセンタイル値（点線）。ＬＤまたはＨＤ閾値を超えるＬｏｇ１０  ＩＣ５０値を対応する線に設定した。合わせた順位のためダン法を用いた対照との一方向ノンパラメトリック比較を、各時点について行った。統計的に有意な差異がグラフに示される：＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。ＶＳＶ−Ｇ（陰性対照）による結果を示す。
【図７Ｂ】ウサギのＴＺＭ−ｂｌ細胞ベースの中和アッセイにおけるＨＩＶ−１エンベロープシュードタイプウイルス粒子（ＥＶＰ）に対するウイルス中和力価を示す。高アデノウイルスベクター投与群のｌｏｇ１０−形質転換ＩＣ５０値を、１，８，１４および２０週目にＥＶＰ  ＶＳＶ−Ｇ（陰性対照）およびＭＷ９６５．２６（ティア１ＡクレードＣ）に対して測定した。各ドットは個々のウサギのｌｏｇ１０−形質転換ＩＣ５０値を表し、グループ平均は水平線で示される。ＨＤ：試験した最高希釈液（上の実線）。ＬＤ：試験した最低希釈液（下の実線）。ＬＯＢ：バックグラウンド限界、コンパイルされた陰性試料の９５パーセンタイル値（点線）。ＬＤまたはＨＤ閾値を超えるＬｏｇ１０  ＩＣ５０値を対応する線に設定した。合わせた順位のためダン法を用いた対照との一方向ノンパラメトリック比較を、各時点について行った。統計的に有意な差異がグラフに示される：＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。ＭＷ９６５．２６（ティア１ＡクレードＣ）による結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
様々な刊行物、論文および特許は、背景および本明細書を通して引用または記載されている。これらの参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれた文献、法令、物質、デバイス、論文などの議論は、本発明の状況を提供することを目的とするものである。そのような議論は、これらの事項のいずれかまたはすべてが、開示または特許請求された任意の発明に関する先行技術の一部を形成するということを認めるものではない。
【００２３】
他に定義されない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で用いる一部の特定の用語は、本明細書に示した意味を有する。本明細書において引用したすべての特許、公開特許出願および刊行物は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。本明細書で用いる場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明示していない限り、複数の言及を包含していることに注意されたい。
【００２４】
本明細書で用いる場合、「対象」は、本発明の実施形態によるベクター、組成物または組み合わせワクチンを投与されるか、または投与された任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。用語「哺乳動物」は、本明細書で用いる場合、任意の哺乳動物を包含している。哺乳動物の例としては、限定されないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。
【００２５】
本発明は、一般的に、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸およびベクター、ならびに合成ＨＩＶエンベロープタンパク質または合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターを、単独で、または１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるベクターと組み合わせて、および／または１つ以上のさらなる単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと組み合わせて用いて、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【００２６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科の一部であるレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）属のメンバーである。２つの種のＨＩＶ：ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２がヒトに感染する。ＨＩＶ−１は、最も一般的なＨＩＶウイルス株であり、ＨＩＶ−２よりも病原性であることが知られている。本明細書で用いる場合、用語「ヒト免疫不全ウイルス」および「ＨＩＶ」は、限定されないがＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２をいう。
【００２７】
ＨＩＶは、高度な遺伝的分岐を有する複数のクレードに分類される。本明細書で用いる場合、用語「ＨＩＶクレード」または「ＨＩＶサブタイプ」は、遺伝的類似性の度合に従って分類された関連するヒト免疫不全ウイルスを指す。現在、３つのグループのＨＩＶ−１分離株：Ｍ、ＮおよびＯが存在している。グループＭ（主系統）は、少なくとも１０個のクレードＡ〜Ｊからなる。グループＯ（分類外系統）は、同様の数のクレードからなり得る。グループＮは、グループＭまたはＯのいずれにも分類されていない新型のＨＩＶ−１分離株である。
【００２８】
本明細書で用いる場合、用語「ＨＩＶ抗原性ポリペプチド」、「ＨＩＶ抗原性タンパク質」、および「ＨＩＶ免疫原」は、ＨＩＶに対する免疫応答、例えば体液性および／または細胞性の媒介性応答を、対象において誘導し得るポリペプチドをいう。抗原性ポリペプチドは、ＨＩＶに対して、免疫応答を、対象において誘導し得るか、または免疫、例えば防御免疫を、それを必要とする対象において生じ得るＨＩＶのタンパク質、その断片もしくはエピトープ、または複数種のＨＩＶタンパク質もしくはその一部分の組み合わせであり得る。
【００２９】
好ましくは、抗原性ポリペプチドは、宿主において、対象をウイルス性疾患またはウイルス感染から防御する防御免疫応答を起こし得る、例えばウイルス性疾患もしくはウイルス感染に対する免疫応答を誘導し得る、および／または対象においてウイルス性疾患もしくはウイルス感染に対する免疫を生じさせ得る（すなわち、ワクチン接種される）ものである。例えば、抗原性ポリペプチドには、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはＨＩＶのタンパク質またはその断片、例えばＨＩＶまたはＳＩＶのエンベロープｇｐ１６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶのマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物が包含され得る。
【００３０】
ＨＩＶ抗原性ポリペプチドはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２抗原またはその断片であり得る。ＨＩＶ抗原の例としては、限定されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子産物（これらは、構造タンパク質および必須酵素をコードする）が挙げられる。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子産物はポリタンパク質として合成され、これはさらに、複数種の他のタンパク質産物にプロセシングされる。ｇａｇ遺伝子の一次タンパク質産物はウイルスの構造タンパク質ｇａｇポリタンパク質であり、これはさらに、ＭＡ、ＣＡ、ＳＰ１、ＮＣ、ＳＰ２およびＰ６タンパク質産物にプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスの酵素（Ｐｏｌ、ポリメラーゼ）をコードしており、一次タンパク質産物はさらに、ＲＴ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＩＮおよびＰＲタンパク質産物にプロセシングされる。ｅｎｖ遺伝子は、構造タンパク質、具体的にはビリオンエンベロープの糖タンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子の一次タンパク質産物はｇｐ１６０であり、これはさらにｇｐ１２０およびｇｐ４１にプロセシングされる。ＨＩＶ抗原の他の例としては、遺伝子調節タンパク質ＴａｔおよびＲｅｖ；アクセサリータンパク質Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＶｐｕ；カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、ならびにｐ２４ウイルスタンパク質が挙げられる。
【００３１】
特定の実施形態では、ＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、ＨＩＶのＧａｇ、ＥｎｖもしくはＰｏｌ抗原またはその任意の抗原性部分もしくはエピトープまたはその組み合わせ、好ましくは、ＨＩＶ−１のＧａｇ、ＥｎｖもしくはＰｏｌ抗原またはその任意の抗原性部分もしくはエピトープまたはその組み合わせを含む。
【００３２】
ＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、モザイクＨＩＶ抗原であってもよい。本明細書で用いる場合、「モザイク抗原」は、天然配列の断片からアセンブルされる組換えタンパク質を指す。モザイク抗原は、天然抗原と類似しているが、天然配列にみられる潜在的Ｔ細胞エピトープの適用範囲が最大限となり、それにより免疫応答の幅および適用範囲が改善されるように最適化されている。本発明で使用するためのモザイクＨＩＶ抗原は、好ましくはモザイクＧａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原、より好ましくはモザイクＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原である。本明細書で用いる場合、「モザイクＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原」は具体的には、ＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌおよび／またはＥｎｖポリタンパク質配列のうちの１つ以上に由来する複数種のエピトープを含むモザイク抗原を指す。
【００３３】
一実施形態では、本発明で使用するためのモザイクＨＩＶ抗原は、ｇａｇ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ抗原（例は配列番号１，２に提供される）；ｐｏｌ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原（例は配列番号３，４に提供される）；またはｅｎｖ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原（例は配列番号５，６に提供される；本発明の新規抗原、例えば、配列番号８，１７，１８，１９に提供されるものもまた、モザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原とみなし得る）である。特定の実施形態では、本発明で使用するためのモザイクＨＩＶ抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはｅｎｖ遺伝子産物の配列に由来するエピトープの組み合わせを含んでもよい。実例としての非限定的な例としては、ｅｎｖおよびｐｏｌの遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＥｎｖ−Ｐｏｌ抗原；ｇａｇおよびｐｏｌの遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＧａｇ−Ｐｏｌ抗原；ならびにｇａｇおよびｅｎｖの遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＧａｇ−Ｅｎｖ抗原が挙げられる。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子産物の配列は、１つ以上のクレード由来であり得る。
【００３４】
本発明において使用することができるモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ抗原の例としては、例えばＵＳ２０１２００７６８１２；Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１０，１６：３１９−３２３；およびＢａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５５：１−９，２０１３に記載のものが挙げられ、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好ましくは、本発明での使用のためのモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌおよび／またはＥｎｖ抗原としては、限定されないが、ｍｏｓ１Ｇａｇ（配列番号１）、ｍｏｓ２Ｇａｇ（配列番号２）、ｍｏｓ１Ｐｏｌ（配列番号３）、ｍｏｓ２Ｐｏｌ（配列番号４）、ｍｏｓ１Ｅｎｖ（配列番号５）、ｍｏｓ２Ｅｎｖ（配列番号６）、ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ（配列番号２８）、ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ（配列番号２９）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３５】
本明細書で用いる場合、用語「ＨＩＶエンベロープタンパク質」、「ｅｎｖタンパク質」および「Ｅｎｖ」の各々は、ＨＩＶビリオンのエンベロープ上に発現し、ＨＩＶがＨＩＶ感染細胞の原形質膜を標的としこれに付着することを可能にするタンパク質、またはＨＩＶに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導し得るか、もしくは免疫を、それを必要とする対象において生じさせ得るその断片または誘導体を指す。ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は、２つの成熟エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１へとタンパク質分解的に切断される前駆体タンパク質ｇｐ１６０をコードする。切断反応は、レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質前駆体において高度に保存された配列で、宿主細胞プロテアーゼ、フューリンによって媒介される。より具体的には、ｇｐ１６０は（ｇｐ１６０）３に三量体化し、次いで、２つの非共有結合的に会合したｇｐ１２０およびｇｐ４１への切断を受ける。続いて、ウイルスの侵入が、ｇｐ１２０／ｇｐ４１ヘテロ二量体の三量体によって媒介される。ｇｐ１２０は受容体結合断片であり、標的細胞上のＣＤ４受容体に結合する（標的細胞は、そのような受容体を有するもの、例えばＴ−ヘルパー細胞などである）。ｇｐ４１は、ｇｐ１２０に非共有結合しており、融合断片であり、ＨＩＶが細胞に侵入する第２工程を提供する。ｇｐ４１は、最初はウイルスエンベロープ内に埋もれているが、ｇｐ１２０がＣＤ４受容体に結合すると、ｇｐ１２０のコンフォメーションが変化してｇｐ４１が露出状態になることが引き起こされ、このとき、宿主細胞との融合が補助され得る。ｇｐ１４０は、天然状態の切断されたウイルススパイクのサロゲートとして使用されている三量体型ｇｐ１６０、すなわち（ｇｐ１６０）３の切断されていないエクトドメインである。
【００３６】
本発明の実施形態によれば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１タンパク質、それらの組み合わせ、融合物、トランケーションまたは誘導体であり得る。例えば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ４１タンパク質と非共有結合的に結合したｇｐ１２０タンパク質を含み得る。これはまた、ｇｐ１４０の三量体を安定化する三量体形成ドメインを有し得る、またはこれを含むように修飾され得る、安定化された三量体ｇｐ１４０タンパク質を含み得る。三量体化ドメインの例としては、限定されないが、Ｔ４−フィブリチン「フォールドン」三量体化ドメイン；ＧＣＮ４に由来するコイルドコイル三量体化ドメイン；および三量体タグとしての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼの触媒性サブユニットが挙げられる。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」はまた、エクトドメイン（すなわち、細胞外空間に伸びるドメイン）中のＣ末端トランケーション、ｇｐ４１の膜貫通ドメイン中のトランケーションなどのｇｐ４１中のトランケーション、またはｇｐ４１の細胞質ドメイン中のトランケーションを含む、エンベロープタンパク質を含むが、これに限定されない、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＨＩＶエンベロープタンパク質であり得る。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」はさらに、例えば、フューリン切断部位および／またはいわゆるＳＯＳＩＰ変異において、配列変異を有する天然に存在するＨＩＶエンベロープタンパク質の誘導体であり得る。
【００３７】
好ましくは、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、「合成ＨＩＶエンベロープタンパク質」である。本明細書中で用いる場合、用語「合成ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、免疫応答を誘導するか、またはそれを必要とする対象における１つ以上の天然に存在するＨＩＶ株に対する免疫を生じるように最適化された天然に存在しないＨＩＶエンベロープタンパク質を指す。モザイクＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質の例であり、本発明は、新規合成ＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原、例えば、配列番号８、１７、１８、または１９を含むものを提供する。
【００３８】
合成ＨＩＶエンベロープタンパク質およびそのコード配列
本発明の実施形態は、新規合成ＨＩＶエンベロープタンパク質およびこれらをコードする核酸分子に関する。
【００３９】
一実施形態では、配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質に関する。配列番号８は、膜貫通領域も細胞質ドメインも含まない合成成熟型ｇｐ１２０および合成切断型ｇｐ４１を含む。配列番号８は、ｍｏｓ２Ｅｎｖモザイク抗原（配列番号６）由来の配列のキメラおよび他のＨＩＶエンベロープタンパク質配列からなる天然に存在しない配列である。配列番号８を含む新規合成Ｅｎｖ抗原の配列は、（ｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原（配列番号６）と比較して）ＨＩＶクレードＣに対する幅広い適用範囲および増強されたＴ細胞応答を提供するように最適化される。特定の実施形態では、さらなるアミノ酸は、本明細書で定義される配列番号８またはその変異体の１つに付加され得る。
【００４０】
特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質はシグナル配列をさらに含む。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、小胞体（ＥＲ）の内腔への輸送中に新生ポリペプチド鎖から切断されるシグナル配列で合成される。原則として、任意の既知のシグナル配列を使用することができる。好ましくは、ＨＩＶ  Ｅｎｖシグナル配列またはその変異体が使用される。異なるシグナル配列が、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質について本技術分野で使用されている（国際公開２０１４／１０７７４４号パンフレットを参照）。特定の実施形態では、シグナル配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含む。好ましい一実施形態では、シグナル配列は配列番号９を含む。
【００４１】
特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は膜貫通ドメインをさらに含む。膜貫通ドメインは、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をＥＲ膜に固定し、ＨＩＶエンベロープの膜アセンブリおよび機能に寄与する。好ましくは、膜貫通ドメインは配列番号１３を含む。
【００４２】
別の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、切断型細胞質ドメインを有するｇｐ４１を含む。ｇｐ４１は、そのカルボキシル末端に、典型的には約１５０個のアミノ酸（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００２，７６：２６８３−２６９１）の著しく長い細胞質ドメインを有する。細胞質ドメインのトランケーションは、ＨＩＶ−１Ｅｎｖタンパク質のエクトドメインにおける保存領域の曝露を誘導することが報告された（同上）。本発明の合成ＨＩＶエンベロープ中の切断型細胞質ドメインは、全長細胞質ドメインの１〜約１４０アミノ酸、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０，１３０，または１４０アミノ酸などの範囲であり得る。特定の実施形態では、切断型細胞質ドメインは、Ｃ末端までの所与のアミノ酸の後のトランケーションによる、配列番号１７のアミノ酸７０４〜８６２（すなわち、本発明のＣ４分子の細胞質ドメイン）に由来する。好ましい実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＨＩＶｇｐ４１細胞質ドメインの１〜１０アミノ酸残基、より好ましくは４〜８アミノ酸残基、最も好ましくは７アミノ酸残基を有する、切断型細胞質ドメインを含む。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインまたはその断片は、Ｃ末端から細胞外ドメイン（エクトドメイン）に位置し、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が膜貫通ドメインも含む場合、細胞質ドメインまたはその断片は、Ｃ末端から膜貫通ドメインに位置する。例えば、図１Ａおよび図１Ｃを参照。特定の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列またはその断片、例えばその残基１〜４（すなわち、ＮＲＶＲ）など、を有する切断型細胞質ドメインを有するｇｐ４１を含む。他の切断型細胞質ドメインが記載され、使用され得る（例えば、Ｓｃｈｉｅｒｎｌｅら、ＰＮＡＳ１９９７；Ａｂｒａｈａｍｙａｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５）。
【００４３】
合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの断片をさらに含む実施形態では、タンパク質は配列番号３７のアミノ酸配列をも含むことが好ましく、これは配列番号１８の残基６５５〜６８２を含み、配列番号３７のアミノ酸配列は、配列番号８のＣ末端および膜貫通ドメインのＮ末端に融合される。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するものなどの膜貫通ドメイン、および配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４の残基１〜４（すなわち、ＮＲＶＲ）を有するものなどの、切断型細胞質ドメイン、または細胞質ドメインの断片をさらに含む。最も好ましくは、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、シグナル配列（すなわち、配列番号１８のアミノ酸残基１〜２９）を有するまたは有しない、配列番号１８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００４５】
別の実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、Ｅｎｖ膜貫通領域を置換する三量体形成ドメインを含む。三量体形成ドメインは、Ｅｎｖ三量体構造の安定性を増加させる。好ましくは、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ｇｐ１４０の三量体を安定化する三量体形成ドメインを含むように改変されたｇｐ１４０ポリペプチドを含む。三量体形成ドメインの例としては、限定されないが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むものなどの、Ｔ４−フィブリチン「フォールドン（ｆｏｌｄｏｎ）」三量体形成ドメイン；配列番号１５のアミノ酸配列を含むものなどの、ＧＣＮ４に由来するコイルドコイル三量体形成ドメイン；三量体タグとしての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼの触媒サブユニット；またはマトリリンベースの三量体形成モチーフが挙げられる。存在する場合、三量体形成ドメインは、典型的にはＣ末端から細胞外ドメインに位置する（図１Ｂ参照）。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が三量体形成ドメインを含む特定の好ましい実施形態では、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、シグナル配列（すなわち、配列番号１９のアミノ酸残基１〜２９）を有するまたは有しない、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。三量体形成ドメインを有するこれらの実施形態は、主に、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の可溶性エクトドメイン変異体に有用である。本発明のそのような可溶性変異体の特定の実施形態では、この切断部位を不活性化するためにフューリン切断部位を変異（例えば、配列番号８の４８０位でのＬｙｓからＧｌｕへの変異）させることが可能であり、その結果、タンパク質は一本鎖となり；これは三量体形成ドメイン、特に配列番号１９のＧＣＮ４三量体形成ドメインと良好に結合する。
【００４６】
三量体形成ドメインを使用しない合成ＨＩＶエンベロープタンパク質のそのような可溶性エクトドメイン変異体の代替的なバージョンもまた本発明の実施形態であり、フューリン切断部位を最適化する変異（４７９〜４８０位でのＧｌｙ−Ｌｙｓジペプチドの４つのＡｒｇ残基による置換）、およびいわゆるＳＯＳＩＰ変異（５２９位でのＩ＞Ｐ変異、および位置４７１〜５７５間の、配列番号８の位置における各ＡｌａおよびＴｈｒの、それぞれＣｙｓ残基での置換による、ジスルフィド架橋の導入）を組み合わせることにより、配列番号８から調製することができる。これにより、以下の変異の組み合わせ：ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃ、を有する配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質が得られる。
【００４７】
本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（配列番号８を含む）の三量体含有量をさらに増加させるための１つの可能な改変は、５２９位でのＩｌｅからＰｒｏへの改変である。これは可溶性および膜結合変異体の両方に有効であり得る。
【００４８】
ベクター
本発明の別の一般的な態様は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含むベクターに関する。本発明の実施形態によれば、ベクターは、本明細書に記載の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質のいずれかを含み得る。本発明の好ましい実施形態では、ベクターは、配列番号８、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９、より好ましくは配列番号１８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む。
【００４９】
本発明の実施形態によれば、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結され、これは核酸がプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、相同プロモーター（すなわち、ベクターと同じ遺伝子源に由来する）または異種プロモーター（すなわち、異なるベクターまたは遺伝子源に由来する）であり得る。好適なプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内の核酸の上流に位置する。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結され得る例示的なＣＭＶプロモーター配列は、配列番号２４に示される。
【００５０】
本発明の実施形態によれば、ベクターは発現ベクターであり得る。発現ベクターとしては、限定されないが、組換えタンパク質発現のためのベクター、およびウイルスベクターなどの対象の組織における発現のために核酸を対象に送達するためのベクターが挙げられるが、これに限定されない。本発明での使用に好適なウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ＭＶＡベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。ベクターは、非ウイルスベクターであってもよい。非ウイルスベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられる。
【００５１】
本発明の特定の実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。本発明によるアデノウイルスはアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属しており、好ましくは、マストアデノウイルス（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属に属するものである。これはヒトアデノウイルスであり得るが、また、他の種に感染するアデノウイルス、例えば限定されないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３もしくは５）またはサル（ｓｉｍｉａｎ）アデノウイルス（これには、サル（ｍｏｎｋｅｙ）アデノウイルスおよび類人猿アデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスもしくはゴリラアデノウイルスが包含される）であってもよい。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶもしくはＡｄＨｕ）またはチンパンジーもしくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈもしくはＳＡｄＶ）などのサル（ｓｉｍｉａｎ）アデノウイルスである。本発明において、種の表示なしでＡｄと称する場合はヒトアデノウイルスを意図しており、例えば短い表記「Ａｄ２６」は、ヒトアデノウイルス血清型２６であるＨａｄＶ２６と同じものを意味する。また、本明細書で用いる場合、表記「ｒＡｄ」は組換えアデノウイルスを意味し、例えば「ｒＡｄ２６」は組換えヒトアデノウイルス２６を指す。
【００５２】
ヒトアデノウイルスを用いて非常に高度な研究が実施されており、本発明の一部の特定の態様によればヒトアデノウイルスが好ましい。一部の特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスはヒトアデノウイルスをベースにしたものである。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９、５０、５２などをベースにしたものである。本発明の特に好ましい一実施形態によれば、アデノウイルスは、血清型２６のヒトアデノウイルスである。この血清型の利点の１つは、ヒト集団における低い血清有病率および／または低い先在中和抗体力価、ならびに臨床試験におけるヒト対象での使用経験である。
【００５３】
また、サルアデノウイルスも一般的には、ヒト集団において低い血清有病率および／または低い先在中和抗体力価を有し、チンパンジーアデノウイルスベクターを用いた相当な量の研究が報告されている（例えば、米国特許６０８３７１６号明細書；国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット；国際公開第２０１０／０８６１８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０８５９８４号パンフレット；Ｆａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１１６０３−１３［１３］；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：１５１−５５［６９］；Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６：３９４−４０１［７０］；Ｔａｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５：６０８−１７［７１］；また、Ｂａｎｇａｒｉ  ａｎｄ  Ｍｉｔｔａｌ，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：８４９−６２［７２］による概説；およびＬａｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，２００９，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７：１３３３−３９［７３］による概説も参照のこと）。したがって、他の実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスをベースにしたものである。一部の特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス型１、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０またはＳＡ７Ｐをベースにしたものである。
【００５４】
好ましくは、アデノウイルスベクターは、複製欠損組換えウイルスベクター、例えばｒＡｄ２６、ｒＡｄ３５、ｒＡｄ４８、ｒＡｄ５ＨＶＲ４８などである。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２６を含む稀な血清型由来のカプシドタンパク質を含む。典型的な実施形態では、ベクターはｒＡｄ２６ウイルスである。「アデノウイルスカプシドタンパク質」は、具体的なアデノウイルスの血清型および／または指向性の決定に関与しているアデノウイルス（例えば、Ａｄ２６、Ａｄ３５、ｒＡｄ４８、ｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクター）のカプシドのタンパク質を指す。アデノウイルスのカプシドタンパク質としては典型的には、ファイバー、ペントンおよび／またはヘキソンタンパク質が挙げられる。本明細書で用いる場合、具体的なアデノウイルスの「カプシドタンパク質」、例えば「Ａｄ２６カプシドタンパク質」は、例えばＡｄ２６カプシドタンパク質の少なくとも一部分を含むキメラカプシドタンパク質であり得る。一部の特定の実施形態では、カプシドタンパク質はＡｄ２６のカプシドタンパク質全体である。特定の実施形態では、ヘキソン、ペントンおよびファイバーがＡｄ２６のものである。
【００５６】
当業者には、複数の血清型に由来する要素を合わせて単一の組換えアデノウイルスベクターにしてもよいことが認識されよう。したがって、異なる血清型の望ましい特性を兼ね備えたキメラアデノウイルスが産生され得る。したがって、一部の実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスは、第１の血清型の先在免疫の非存在と、例えば温度安定性、アセンブリ、アンカリング、調製歩留り、再指令または改善された感染、標的細胞内でのＤＮＡの安全性などの特性とを兼ね備えたものであり得る。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明に有用な組換えアデノウイルスベクターは主に、または完全にＡｄ２６に由来するものである（すなわち、ベクターはｒＡｄ２６である）。一部の実施形態では、アデノウイルスは、例えばゲノムのＥ１領域内に欠失を含有しているため複製欠損である。Ａｄ２６またはＡｄ３５などの非グループＣアデノウイルスに由来するアデノウイルスでは、アデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を、Ａｄ５などのヒトサブグループＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と置換することが典型的である。これにより、そのようなアデノウイルスの増殖が、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の相補性細胞株、例えば２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞などにおいて可能になる（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照のこと）。しかしながら、そのようなアデノウイルスは、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現しない非相補性細胞では複製され得ない。
【００５８】
組換えアデノウイルスベクターの調製は当該分野で公知である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよびＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ  ８１（９）：４６５４−６３に記載されている。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＥＦ  １５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１に見出される。本発明に有用なベクターの例としては、例えば、国際公開第２０１２／０８２９１８号パンフレット（その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
【００５９】
典型的には、本発明に有用なベクターは、組換えアデノウイルスゲノム全体を含む核酸（例えば、プラスミド、コスミド、またはバキュロウイルスベクター）を用いて調製される。したがって、本発明により、本発明のアデノウイルスベクターをコードする単離された核酸分子もまた提供する。本発明の核酸分子はＲＮＡの形態、またはクローニングによって得られるか、もしくは合成により産生されるＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
【００６０】
本発明に有用なアデノウイルスベクターは典型的には複製欠損である。このような実施形態では、ウイルスは、ウイルスの複製に極めて重要な領域、例えばＥ１領域の欠失または不活性化によって複製欠損にする。領域は、例えば、目的の遺伝子、例えば、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（通常、プロモーターに連結されている）をコードする遺伝子、またはＨＩＶ抗原性ポリペプチド（通常、プロモーターに連結されている）をコードする遺伝子を領域内に挿入することによって実質的に欠失または不活性化され得る。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、Ｅ２、Ｅ３もしくはＥ４領域などの他の領域内に欠失、またはこれらの領域内の１つ以上に、プロモーターに連結させた異種遺伝子の挿入を含み得る。Ｅ２−および／またはＥ４−変異型アデノウイルスでは、一般的には、Ｅ２−および／またはＥ４−相補性細胞株が組換えアデノウイルスを調製するために使用される。アデノウイルスのＥ３領域内の変異では、Ｅ３が複製に必要とされないため細胞株によって補完される必要はない。
【００６１】
本発明に用いるためのアデノウイルスベクターを充分な量で調製するため、パッケージング細胞株が典型的に使用される。パッケージング細胞は、複製欠損ベクター内に欠失または不活性化されているこれらの遺伝子を含んでいる細胞であり、したがって、細胞内でウイルスは複製できる。Ｅ１領域における欠失を有するアデノウイルスに好適なパッケージング細胞株としては、例えばＰＥＲ．Ｃ６、９１１、２９３およびＥ１  Ａ５４９が挙げられる。
【００６２】
本発明の実施形態によれば、上述のように、本明細書に記載の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質のいずれかを本発明のベクターで発現させることができる。遺伝コードの縮重に鑑みて、当業者は、本技術分野において完全に常用である方法に従って、同じタンパク質をコードするいくつかの核酸配列を設計できることを十分に承知している。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸は、任意選択により、処置する宿主（例えば、ヒト）における適正な発現が確実となるようコドン最適化することができる。コドン最適化は、当分野で広く応用されている技術である。本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする配列のいくつかの非限定的な例は、配列番号２５、２６および２７に提供される。典型的には、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸は、アデノウイルスゲノムのＥ１および／またはＥ３領域にクローニングされる。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクター、より好ましくはｒＡｄ２６ベクター、最も好ましくはアデノウイルスゲノムのＥ１領域に少なくとも１つの欠失を有するｒＡｄ２６ベクター、例えば、Ａｂｂｉｎｋ、ＪＶｉｒｏｌ、２００７，８１（９）：ｐ．４６５４−６３に記載されるものである。
【００６４】
本発明はまた、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む細胞、好ましくは単離された細胞を提供する。細胞は、組換えタンパク質産生のため、またはウイルス粒子の産生のために使用することができる。
【００６５】
したがって、本発明の実施形態は、合成ＨＩＶ抗原性ポリペプチドを作製する方法にも関する。本方法は、プロモーターに作動可能に連結された合成ＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすること、合成ＨＩＶ抗原性ポリペプチドの発現に好適な条件下でトランスフェクトされた細胞を増殖させること、合成ＨＩＶ抗原性ポリペプチドを細胞から単離することを含む。合成ＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーなどを含む当該分野で公知の任意の方法によって細胞から単離または回収することができる。組換えタンパク質発現のために使用される技術は、本開示に鑑みた当業者に周知である。
【００６６】
本発明はまた、本発明の合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするベクターを製造する方法を含み、本方法は、ベクターを含む細胞を培養して、前記培養中にベクターを増殖および増加させること、および本発明の合成ＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードするベクターを、細胞培養物、例えば細胞から、培養培地から、またはその両方から単離することを含む。ベクターは、当該分野で公知の方法に従ってさらに精製されてもよい。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明は、合成ＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む本発明の実施形態によるベクターを提供し、特定の例示的な実施形態では、核酸は、配列番号２５、２６および２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００６８】
組成物
別の一般的な態様において、本発明は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸および担体を含むベクターを含む組成物に関する。本発明の実施形態によれば、本明細書に記載のベクターのいずれかが組成物に含まれ得る。好ましくは、ベクターはウイルスベクター、より好ましくはアデノウイルスベクター、さらにより好ましくはアデノウイルス２６ベクターである。好ましい実施形態では、組成物は、配列番号８、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列を含む、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含む。
【００６９】
一態様では、本発明は、（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（例えば、配列番号１８または１９）および（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２のＨＩＶエンベロープタンパク質、をコードする核酸配列を共に含む１つ以上のベクターを含む組み合わせワクチンを提供する。ベクターは、それぞれ別個の組成物中に存在してもよく、または単一の組成物中に組み合わされてもよい。ベクター中の両方の核酸は、一対象に投与されることが意図され、これは、いずれかのベクター単独の投与で得られるであろう免疫応答よりも広いＨＩＶに対する免疫応答をもたらす。両方の核酸配列は、単一のベクター上に存在していてもよい。
【００７０】
本発明の実施形態によれば、組成物は、ウイルスベクターなどの、免疫原的有効量のベクターを含む。本明細書で用いる場合、「免疫原的有効量」または「免疫学的有効量」は、所望の免疫効果または免疫応答が、それを必要とする対象において誘導されるのに充分な組成物の量を意味する。一実施形態では、免疫原的有効量は、免疫応答が、それを必要とする対象において誘導されるのに充分な量を意味する。別の実施形態では、免疫原的有効量は、免疫が、それを必要とする対象において生じる、例えばウイルス感染などの疾患に対する防御効果がもたらされるのに充分な量を意味する。免疫原的有効量は、様々な要素、例えば対象の体調、年齢、体重、健康状態など；免疫応答を誘導するのか防御免疫をもたらすのかの具体的な用途；投与される具体的な組換えベクター；投与される組換えベクターにコードされた免疫原または抗原性ポリペプチド；投与される具体的な抗原性ポリペプチド；および免疫が所望される具体的な疾患（例えば、ウイルス感染）に応じて異なり得る。免疫原的有効量は、本開示に鑑みた当業者によって容易に決定され得る。
【００７１】
一般的な手引きとして、アデノウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターに関して用いる場合の免疫原的有効量は、約１０８ウイルス粒子〜約１０１２ウイルス粒子の範囲、例えば１０８、１０９、１０１０、１０１１または１０１２ウイルス粒子であり得る。免疫原的有効量は単一の組成物で投与してもよく、複数の組成物、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種類の組成物（例えば、錠剤、カプセル剤または注射剤）で投与してもよく、この場合、複数のカプセル剤または注射剤の投与が全体で対象に免疫原的有効量をもたらす。一般に、ポリペプチド、例えば単離された抗原性ポリペプチドに関して用いる場合、免疫原的有効量は、例えば約０．３〜約３０００マイクログラム（μｇ）、例えば１〜１０００μｇ、例えば１０〜５００μｇの範囲、例えば約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μｇであり得る。非限定的な例として、本発明の合成ＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原（配列番号８を有する）をコードするベクターの投与を、Ｅｎｖポリペプチド、例えば、配列番号７のアミノ酸３０〜７０８を有する２５０μｇのＨＩＶクレードＣ  Ｅｎｖ三量体タンパク質、の投与と組み合わせることが可能である。また、免疫原的有効量を対象に投与し、続いて別の用量の免疫原的有効量を同じ対象に、いわゆるプライム−ブーストレジメンで投与することも可能である。プライム−ブーストレジメンのこの一般的概念はワクチン分野の当業者には周知である。必要に応じて、さらなるブースター投与を任意選択によりレジメンに加えてもよい。
【００７２】
本発明の組成物は、担体をさらに含む。担体は、結合剤、崩壊剤、膨潤剤、懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香料、甘味料、保存料、染料、可溶化剤およびコーティングなどの１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。担体または他の物質の厳密な性質は、投与経路、例えば筋肉内、皮下、経口、静脈内、経皮、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内または腹腔内経路、に依存し得る。液体注射剤、例えば懸濁液および溶液について、好適な担体および添加剤としては、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、着色剤などが挙げられる。固体経口製剤、例えば散剤、カプセル剤、カプレット剤、ジェルキャップ剤および錠剤について、好適な担体および添加剤としては、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。経鼻スプレー／吸入混合物について、水溶液／懸濁液は、好適な担体および添加剤として、水、グリコール、油、皮膚軟化剤、安定化剤、湿潤剤、保存料、芳香剤、香料などを含み得る。
【００７３】
本発明の組成物は、投与を容易にし、有効性を改善するために対象への投与に好適な任意の物質で処方することができ、限定されないが、経口（経腸）投与および非経口注射が挙げられる。非経口注射としては、静脈内注射または注入、動脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、および関節内注射が挙げられる。本発明の組成物はまた、経粘膜、眼、直腸、長時間作用型移植、舌下投与（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、舌下（ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｔｏｎｇｕｅ）、門脈循環を迂回する口腔粘膜から、吸入、または鼻腔内を含む、他の投与経路のために処方することもできる。
【００７４】
本発明の特定の実施形態によれば、組成物は、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む、免疫原的有効量の、精製または部分的に精製された、アデノウイルス２６ベクターなどのアデノウイルスベクターを含む。前記組成物は、当該分野で公知の方法に従ってワクチン（「免疫原性組成物」とも称する）として処方され得る。
【００７５】
本発明の組成物は、任意選択により、免疫応答を増強するためのアジュバントをさらに含み得る。用語「アジュバント」および「免疫刺激剤」は、本明細書において互換的に用いており、免疫機構の刺激を引き起こす１つ以上の物質と定義する。この文脈において、アジュバントは、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターおよび／または本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターと組み合わせて使用されるＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするベクターに対する免疫応答を増強するために使用される。
【００７６】
本発明での使用に好適なアジュバントは、潜在的に安全であり、耐容性が良好であり、大衆に有効であるものがよく、例えば、ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６、ＧＳＫ−Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ  ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、アルミニウム塩（例えば、ＡｄｊｕＰｈｏｓ）、Ａｄｊｕｐｌｅｘ、およびＭＦ５９などが挙げられる。製剤中における各成分の最適な比率は、本開示に鑑みた当業者に周知の手法によって決定され得る。
【００７７】
好ましい実施形態では、アジュバントは、ＡｄｊｕＰｈｏｓなどのアルミニウム塩である。
【００７８】
免疫原性組成物の調製および使用は当業者に周知である。液状の医薬組成物には、一般的には液状担体、例えば、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱物油または合成油が含められる。また、生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖類液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含めてもよい。
【００７９】
例えば、組換えアデノウイルスベクターは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎら、２００２、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ  １：４３−８）：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８，２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール、にも使用される緩衝剤中に保存してもよい。ヒトへの投与に好適な別の有用なアデノウイルス製剤緩衝剤は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ショ糖１０％ｗ／ｖ、ポリソルベート−８０  ０．０２％ｗ／ｖである。組換えアデノウイルスに好適な別の製剤緩衝剤は、１０〜２５ｍＭクエン酸緩衝剤ｐＨ５．９〜６．２，４〜６％（ｗ／ｗ）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、７０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート−８０、および任意選択により０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）エタノールを含む。明らかなことに、多くの他の緩衝剤を使用することができ、精製ベクターの保存および医薬投与のための好適な製剤のいくつかの例が知られている。
【００８０】
本発明の実施形態によれば、本発明の組成物は、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび／または１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるベクターと一緒に使用することができる。さらなるベクターおよび／またはＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、本発明の合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を含む同じ組成物中に存在し得る。それらはまた、ワクチンの組み合わせにおいて、本発明の合成ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を含む組成物と一緒に使用することができる１つ以上の異なる組成物中に存在することができる。好ましくは、１つ以上のさらなるベクターは、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであり、最も好ましくはアデノウイルス２６ベクターである。１つ以上のさらなるベクターは、本開示に鑑みた当業者に公知の任意のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードし得る。
【００８１】
一実施形態では、組成物またはワクチンの組み合わせは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む。そのような実施形態の利点は、免疫応答の幅が広がることである（クレードＢおよびＣからの株をカバーする）。
【００８２】
別の実施形態では、本発明の組成物またはワクチンの組み合わせは、配列番号２８（ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ）のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の組成物またはワクチンの組み合わせは、配列番号２９（ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ）のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む。
【００８４】
特定の実施形態では、本発明の組成物またはワクチンの組み合わせは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、および、配列番号２８または配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上のＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする、１つ以上のさらなるアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む。例えば、本発明の実施形態による組成物またはワクチンの組み合わせは、配列番号８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（例えば、配列番号１８）をコードする第１のベクター；配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のベクター；配列番号２８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする第３のベクター；および配列番号２９のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする第４のベクター、を有する４つのアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、組成物またはワクチンの組み合わせは、１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをさらに含む。本開示に鑑みた当業者に公知の任意のＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、ＨＩＶエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０またはｇｐ４１）、好ましくは安定化クレードＣまたはクレードＡ  ｇｐ１４０タンパク質などの安定化三量体ｇｐ１４０タンパク質を含むがこれらに限定されない、本発明の組成物またはワクチンの組み合わせにさらに含めることができる。好ましい実施形態では、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８（配列番号７の残基１〜２９はシグナル配列中に存在）を含むものなどの、安定化ＨＩＶクレードＣ三量体ｇｐ１４０タンパク質である。クレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質に加えて、または単独で使用することができる、代替的またはさらなるＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドは、例えば、配列番号３６のアミノ酸３０〜７２４（国際公開第２０１４／１０７７４４号パンフレットの配列番号２に対応し、配列番号３６の残基１〜２９はシグナル配列中に存在）に開示されるようなアミノ酸配列を有する、モザイクＥｎｖ三量体タンパク質である。
【００８６】
本発明の特定の実施形態によれば、ＨＩＶ抗原タンパク質は、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質であり得る。したがって、本発明の合成エンベロープタンパク質は、単離および／または精製された形態で使用して、免疫応答を誘発するか、またはそれを必要とする対象においてＨＩＶに対する防御免疫などを提供することができる。任意の配列番号８のアミノ酸配列を含む本明細書に記載の合成エンベロープタンパク質は、単離および／または精製された形態のＨＩＶ抗原性タンパク質として使用することができる。好ましい実施形態では、ＨＩＶ抗原タンパク質として単離された形態で使用される場合、合成エンベロープタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列の残基３０〜７１１または配列番号１９のアミノ酸配列の残基３０〜６８６、より好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列の残基３０〜７０４を含む。単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドはまた、以下の変異：ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃ、を有する配列番号８を含み得る。
【００８７】
本発明の実施形態はまた、配列番号８のアミノ酸配列を含む単離された合成ＨＩＶエンベロープタンパク質を含む組成物またはワクチンの組み合わせにも関する。本明細書に記載の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質のいずれかを使用することができる。本発明の特定の実施形態では、単離された合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列の残基３０〜７０４もしくは３０〜７１１、配列番号１９のアミノ酸配列の残基３０〜６８６、または以下の変異：ＥＫ４７９−４８０ＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃ、を有する配列番号８のアミノ酸配列、を含む。そのような組成物またはワクチンの組み合わせは、１つ以上の発現ベクター、例えば、アデノウイルス２６ベクターなどのアデノウイルスベクターをさらに含むことができ、これは、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質などの１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチド、または配列番号４，５，７，２８または２９に記載のものなどの他のＨＩＶ抗原性タンパク質、またはその断片をコードする。
【００８８】
本発明はまた、本発明の組成物またはワクチンの組み合わせを産生する方法にも関する。本発明の実施形態によれば、組成物または組み合わせを作製する方法は、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含むベクターを、担体、および任意選択により、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび／または１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと組み合わせることを含む。当業者は、そのような組成物を調製するために使用される従来技術に精通していよう。
【００８９】
ワクチンおよびワクチンの組み合わせ
本発明の実施形態によれば、組成物はワクチンであり得る。本明細書で用いる場合、用語「ワクチン」は、対象に防御免疫もしくは防御免疫応答を提供し得る、または対象にワクチン接種するための、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする発現ベクター、好ましくはウイルスベクターを含む組成物を指す。本発明の実施形態によれば、組成物を対象に投与すると、発現ベクターはコードされた合成ＨＩＶエンベロープタンパク質を発現し、発現された合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は対象の免疫系に提示され、それにより、免疫の産生または免疫応答の誘導に必要な応答を誘導する。
【００９０】
したがって、他の一般的な態様では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、対象において誘導するためのワクチンを提供する。本発明の実施形態によれば、ワクチンは、配列番号８のアミノ酸配列、好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列、を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする発現ベクターの免疫原的有効量を含む。好ましくは、発現ベクターはウイルスベクター、より好ましくはアデノウイルスベクター、最も好ましくはアデノウイルス２６ベクターである。
【００９１】
本発明の実施形態によれば、「免疫応答を誘導する」とは、本明細書に記載の方法および組成物に関して用いる場合、感染、例えばＨＩＶ感染に対して、予防目的で対象に防御免疫をもたらすこと、および／またはワクチン接種すること、ならびに感染、例えばＨＩＶ感染に対して、治療目的で所望の免疫応答または効果を、それを必要とする対象において引き起こすことを包含する。好ましくは、本発明の方法は予防目的のため、例えば防御免疫をもたらすためのものである。免疫応答は、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答であり得る。
【００９２】
本明細書で用いる場合、用語「防御免疫」または「防御免疫応答」は、ワクチン接種された対象が、このワクチン接種を行った対象の病原性因子による感染を制御できることを意味する。通常、「防御免疫応答」が発現されている対象は、軽度から中等度の臨床症状を発現するにすぎないか、または症状を全く発現しない。通常、ある特定の因子に対する「防御免疫応答」または「防御免疫」を有する対象は、前記因子による感染の結果として死亡することはない。
【００９３】
本発明の実施形態によれば、ワクチン組成物は、１つ以上のさらなるベクター、例えば、アデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターなどのウイルスベクターをさらに含むことができ、これは、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび／または１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、さらなるベクターおよび／または１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、同じ組成物またはワクチン中の１つ以上の異なる組成物中に処方され得る。
【００９４】
本発明はまた、１つ以上のＨＩＶクレードに対する免疫応答を、それを必要とする対象において、１つ以上のベクターを単離された抗原性ポリペプチドと組み合わせて用いてプライムおよびブーストするワクチンの組み合わせにも関する。したがって、別の一般的な態様において、本発明は、対象のＨＩＶに対する免疫応答を誘導するためのワクチンの組み合わせを提供する。本発明の実施形態によれば、ワクチンの組み合わせは、
（ｉ）配列番号８、または（ａ）Ｉ５２９Ｐ、（ｂ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｃ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、発現ベクターの免疫原的有効量を含む第１の組成物および担体；ならびに
（ｉｉ）免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含む第２の組成物および担体、を含み、
第１および第２の組成物の一方はプライミング免疫用であり、他の組成物はブースティング免疫用である。
【００９５】
本発明の実施形態によれば、ワクチンの組み合わせは、任意選択により、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする免疫原的有効量の１つ以上のさらなる発現ベクターをさらに含む。１つ以上のさらなる発現ベクターは第１の組成物または第２の組成物に含めることができ、または１つ以上のさらなる発現ベクターは第１および／または第２の組成物と一緒に投与される１つ以上のさらなる組成物に含めることができる。
【００９６】
本明細書で用いる場合、用語「共送達」、「共投与」または「〜と一緒に投与される」は、ウイルス発現ベクターと単離された抗原性ポリペプチド、または複数のウイルス発現ベクターなどの２つ以上の成分の同時投与を指す。「同時投与」は、２つ以上の成分の少なくとも同日内の投与であり得る。２つの成分が「〜と一緒に投与される」場合、これらは、別々の組成物で短期間、例えば２４、２０、１６、１２、８もしくは４時間内あるいは１時間以下以内に逐次投与され得るか、または単一の組成物で同時に投与され得る。
【００９７】
本発明のワクチンの組み合わせの特定の実施形態では、第１の組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み；単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８または配列番号３６の残基３０〜７２４を含む。特定の一実施形態では、第１の組成物は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む。別の特定の実施形態では、第１の組成物は、配列番号２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする、１つ以上のさらなるアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む。
【００９８】
本発明の別の一般的な態様は、本発明の一実施形態によるワクチンの組み合わせを含むキットに関する。
【００９９】
本発明のワクチンの組み合わせにおいて使用され得る、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、発現ベクター、さらなる発現ベクター、発現ベクターにコードされたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドなどの実施形態は、上記および実例としての以下の実施例で詳細に議論される。
【０１００】
ＨＩＶ感染に対する防御免疫を誘導するための方法
本発明はまた、それを必要とする対象における１つ以上のＨＩＶクレードに対する免疫応答を誘導する方法に関する。本明細書に記載の方法は、１つ以上の単離された抗原性ポリペプチドと組み合わせて１つ以上の発現ベクターを用いて免疫応答をプライミングおよびブースティングする方法を含む。
【０１０１】
一般的な一態様では、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法は、配列番号８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターの免疫原的有効量を含む組成物を、対象に投与することを含む。本明細書に記載の任意の組成物は、対象におけるＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法において使用することができる。好ましくは、組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含む。組成物はさらに、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび／または１つ以上のさらなる単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるベクターを含むことができる。
【０１０２】
別の一般的な態様において、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導する方法は、
（ｉ）配列番号８、または（ａ）Ｉ５２９Ｐ、（ｂ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｃ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、発現ベクターの免疫原的有効量を含む第１の組成物および担体を対象に投与する工程；
（ｉｉ）対象に、免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび担体を含む第２の組成物を投与する工程；ならびに
（ｉｉｉ）任意選択により、対象に、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする免疫原的有効量の１つ以上のさらなる発現ベクターを投与する工程、を含み、工程（ｉ）および（ｉｉ）がいずれかの順序で実施され、一方の工程がプライミング免疫のためのものであり、他方の工程がブースティング免疫のためのものである。本発明の実施形態によれば、任意選択による、１つ以上のさらなる発現ベクターの有効量が、第１の組成物または第２の組成物と一緒に投与される。好ましい実施形態では、任意選択による１つ以上のさらなる発現ベクターの有効量が、第１の組成物と一緒に投与される。
【０１０３】
免疫応答を誘導する方法の特定の実施形態において、第１の組成物は、配列番号８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み；第２の組成物は、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８または配列番号３６の残基３０〜７２４を有する単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含み；ならびに１つ以上のさらなる発現ベクターは、配列番号２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターであり；第１の組成物は、プライミング免疫のために１回以上、１つ以上のさらなる発現ベクターと一緒に対象に投与され、第２の組成物は、ブースティング免疫のために１回以上対象に投与される。
【０１０４】
発現ベクターおよび／または抗原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物の投与は、典型的には筋肉内、皮内または皮下である。しかしながら、静脈内、直腸、経皮、経口、経鼻などの他の投与様式も同様に想定され得る。免疫原性組成物の筋肉内投与は、発現ベクター、例えばアデノウイルスベクター、および／または抗原性ポリペプチドの懸濁剤を注射するためのニードルを使用することにより行われ得る。代替手段は、組成物を投与するための無針注射デバイス（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）の使用）またはワクチンを含有している凍結乾燥粉末剤の使用である。
【０１０５】
筋肉内、静脈内、皮膚もしくは皮下注射または罹病部位での注射のためには、ベクターは、パイロジェンフリーであり適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口に許容され得る水性液剤の形態である。同様に、単離された抗原性ポリペプチドは、適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口に許容され得る液剤の形態である。当業者は、適当な液剤を例えば等張性ビヒクルを用いて、例えば塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、乳酸加リンゲル注射剤を用いて調製することが充分にできよう。必要に応じて、保存料、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤を含めてもよい。また、徐放製剤を使用してもよい。
【０１０６】
典型的には、本発明の実施形態によるワクチン組成物の投与は、感染または症状の発現前にＨＩＶ抗原に対する免疫応答を生成させるための予防目的を有するものである。他の実施形態では、発現ベクター、例えばアデノウイルスベクター、および／またはＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、曝露後の予防のために投与され得る。
【０１０７】
発現ベクター、例えばアデノウイルスベクターおよび／または抗原性ポリペプチドを含有している免疫原性組成物を対象に投与すると、抗ＨＩＶ免疫応答が対象において生じる。検出可能な免疫応答が誘導されるのに充分な組成物の量を「免疫原的有効用量」または「免疫原的有効量」と定義する。本発明の典型的な一実施形態では、免疫応答は防御免疫応答である。
【０１０８】
投与される実際の量ならびに投与の速度および時間推移は、処置されるものの性質および重症度に依存する。処置の処方、例えば投薬量の決定などは、一般開業医および他の医師または獣医の状況では獣医の責任の範囲内であり、典型的には、処置される障害、個々の患者の体調、送達部位、投与方法および実行者に公知の他の要素が考慮される。上記の手法およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編，１９８０において知得され得る。
【０１０９】
アデノウイルスベクターの調製およびそのような粒子の組成物への任意選択による製剤化後、ベクターは、個体、特にヒトまたは他の霊長類に投与され得る。非ヒト哺乳動物への送達は治療目的である必要はなく、実験の状況、例えば、本発明のアデノウイルスベクターによって発現された合成ＨＩＶエンベロープタンパク質に対する免疫応答の機構の究明に使用するためであってもよい。
【０１１０】
本開示の方法の一実施形態では、１つ以上のＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のアデノウイルスベクターが、免疫応答をプライムするために使用される。１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドが、プライミング免疫のための１つ以上のアデノウイルスベクターと一緒に使用され得る。プライム免疫処置は１回のみ投与してもよいが、任意選択により複数回投与、例えば、時間０で初期プライム投与、その後、初期プライム投与後約４〜１４週間、例えば、４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３もしくは１４週間、またはその間の任意の時間に、別のプライム投与により投与することもできる。１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、任意選択により、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるアデノウイルスベクターまたは他のベクターと一緒に免疫応答をブーストするために使用され得る。ブースト免疫処置も、１回または複数回で、例えば、最初に、初期プライム投与後約１８〜３６、例えば、１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５もしくは３６週間、またはその間の任意の時間に、その後、初期プライム投与後約３６〜５２、例えば、３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９もしくは６０週間、またはその間の任意の時間に、別のブースト投与により投与することができる。免疫処置によって誘導される免疫応答はモニタリングされる。
【０１１１】
また、本開示の方法の実施形態では、最終ブースト免疫処置が初期プライム投与の約２２〜２６週間後に投与されることを意味する短期プライム−ブーストレジメンも想定される。プライム免疫処置は０週目に投与され得る。ブースト免疫処置は、複数回で、例えば、最初に、初期プライム投与後約７〜９週間もしくは１１〜１３週間、または、４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，もしくは１４週間、またはその間の任意の時間に、その後、初期プライム投与後約２２〜２６週間、または、１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，もしくは２８週間、またはその間の任意の時間に、別のブースト投与により投与することができる。特定の実施形態では、１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドが、プライミングおよび／またはブースティング免疫のための１つ以上のアデノウイルスベクターと一緒に投与される。
【０１１２】
プライム投与およびブースト投与のためのレジメンは、投与後に測定された免疫応答に基づいて調整され得ることは当業者によって容易に認識されよう。例えば、ブースト組成物は一般的には、プライム組成物の投与の数週間または数ヶ月後、例えば、プライム組成物の投与の約２〜３週間もしくは４週間、または８週間、または１６週間、または２０週間、または２４週間、または２８週間、または３０週間もしくは３２週間または１〜２年後に投与される。
【０１１３】
本発明の実施形態によれば、アジュバントは、プライミングおよび／またはブースティング免疫の一部として、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと一緒に投与され得る。任意のアジュバントは、本開示に鑑みて使用することができ、特定の実施形態では、アジュバントは、ＡｄｊｕＰｈｏｓのようなアルミニウム塩である。  
【０１１４】
本発明の好ましい一実施形態において、本明細書に開示の方法に使用されるアデノウイルスベクターとしてはｒＡｄ２６ベクターが挙げられる。好ましくは、配列番号１８または配列番号１９、最も好ましくは配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクターは、単独でまたは配列番号５のアミノ酸配列を有するｍｏｓ１Ｅｎｖなどの１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるｒＡｄ２６ベクターと組み合わせて、免疫応答をプライムするために使用され、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８または配列番号３６の残基３０〜７２４を含むものなどの単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、免疫応答をブーストするために使用され、またはその逆である。
【０１１５】
例示的な一実施形態では、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクターは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするｒＡｄ２６ベクターと組み合わせて、免疫応答をプライムするために使用される。配列番号１〜４，２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるｒＡｄ２６ベクターも、免疫応答をプライムするために他のｒＡｄ２６ベクターと一緒に投与され得る。特定の実施形態におけるプライミング投与は、任意のブースティング免疫が投与される前に２回投与される。配列番号７（好ましくは）のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含むか、または配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を含む単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、またはそのような単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドの少なくとも２つの組み合わせは、免疫応答をブーストするために投与され、好ましくは２回以上投与される。好ましくは、アジュバントは、ブースティング免疫において単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドと一緒にさらに投与される。
【０１１６】
特定の実施形態では、免疫応答は、アデノウイルスベクター、好ましくはｒＡｄ２６ベクターにコードされた４つのＨＩＶ抗原の投与によってプライムされ、コードされた４つの抗原は、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらの４つの抗原の各々は、約１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）、例えば約５×１０１０ｖｐ（すべてのベクターを合わせて）の総用量で投与される別個のアデノウイルスベクター、好ましくはｒＡｄ２６ベクター上にコードされ得る。ベクターは、例えば、１：１：１：１の比率で、予め混合されていてもよい。プライミング投与は、最初のプライミング投与後に、例えば、最初のプライミング投与後、８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５または１６週間で、繰り返してもよい。この実施形態において、免疫応答は、プライミング投与に使用されるものと同じアデノウイルスベクターワクチンを単離されたＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０タンパク質と一緒に投与することによってブーストされる。ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４０タンパク質は、例えば、クレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質（配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８を含む）、またはモザイクｇｐ１４０タンパク質（配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を含む）、またはクレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質およびモザイクｇｐ１４０タンパク質であり、約５０〜３００μｇタンパク質の総用量で、例えば、クレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質を、例えば、５０，１００，１５０，２００，２５０，または３００マイクログラム、またはその間の任意の量で、または、モザイクｇｐ１４０タンパク質を、例えば、５０，１００，１５０，２００，２５０，または３００マイクログラム、またはその間の任意の量で、またはクレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質とモザイクｇｐ１４０タンパク質との組み合わせ（例えば、１：１の比で、一緒に混合するかまたは別々に投与する）を、５０，１００，１５０，２００，２５０，または３００マイクログラム、またはその間の任意の量で含む。好ましくは、ｇｐ１４０タンパク質は、アジュバント、例えば、リン酸アルミニウムと一緒に投与される。免疫応答をブーストするアデノウイルス＋ｇｐ１４０タンパク質投与は、最初のプライミング投与後、約１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９または３０週間、またはその間の任意の時間に投与してもよい。ブースト投与は、例えば、最初のプライミング投与後、約４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３または５４週間、またはその間の任意の時間に繰り返してもよい。この実施形態によるすべての投与は、好ましくは、筋肉内経路を介して行われる。
【０１１７】
実施形態
実施形態１は、配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする。
【０１１８】
実施形態２は、実施形態１による核酸であって、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、シグナル配列、例えば、配列番号９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号９、を含むシグナル配列をさらに含む。
【０１１９】
実施形態３は、実施形態１または２による核酸であって、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、膜貫通ドメイン、例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメイン、をさらに含み、好ましくは、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、配列番号８のＣ末端および膜貫通ドメインのＮ末端に融合された配列番号３７をさらに含む。
【０１２０】
実施形態４は、実施形態３による核酸であって、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、細胞質ドメインの断片、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１〜４（すなわち、ＮＲＶＲ）を含む細胞質ドメインの断片をさらに含む。
【０１２１】
実施形態５は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が配列番号１８のアミノ酸配列を含む、前記実施形態１〜４のいずれか１つの核酸である。
【０１２２】
実施形態６は、実施形態１または２による核酸であって、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、（ａ）ＧＣＮ４、フィブリチン（フォールドンドメイン）からなる群から選択される三量体形成ドメイン、例えば、配列番号１５または配列番号１６、好ましくは配列番号１５のアミノ酸配列を有する三量体形成ドメインをさらに含む、または（ｂ）以下の変異：ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃ、の組み合わせを有する配列番号８を含む。
【０１２３】
実施形態７は、実施形態６による核酸であって、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
実施形態８は、実施形態５による核酸であって、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列からなる。
【０１２５】
実施形態９は、実施形態７による核酸であって、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列からなる。
【０１２６】
実施形態１０は、実施形態１〜９のいずれかの核酸を含むベクターであって、核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結されている。
【０１２７】
実施形態１１は、ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、より好ましくはアデノウイルス２６ベクターである、実施形態１０によるベクターである。
【０１２８】
実施形態１２は、実施形態１０または実施形態１１のベクターを含む単離された細胞である。
【０１２９】
実施形態１３は、実施形態１０または１１のベクターの免疫原的有効量、および担体を含む組成物である。
【０１３０】
実施形態１４は、ワクチンの組み合わせであって、配列番号１８のアミノ酸配列を有する合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターの免疫原的有効量を含む第１の組成物、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくは第２のアデノウイルス２６ベクターの免疫原的有効量をさらに含む第２の組成物、ならびに任意選択により、配列番号１〜４，２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードするベクター、および配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８、または配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を有する単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドからなる群から選択される、少なくとも１つの免疫原的有効量を含む、少なくとも１つのさらなる組成物、を含み、第１の組成物、第２の組成物およびさらなる組成物は、同じ組成物中または１つ以上の異なる組成物中に存在する。
【０１３１】
実施形態１５は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、方法は、実施形態１３の組成物または実施形態１４のワクチンの組み合わせを対象に投与することを含む。
【０１３２】
実施形態１６は、実施形態１３の組成物または実施形態１４のワクチンの組み合わせであり、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、配列番号１〜４、２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上のさらなる抗原性ポリペプチドをコードする、１つ以上のさらなるアデノウイルスベクター、ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導するのに使用される、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８または配列番号３６の残基３０〜７２４を含む、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド、を含む。
【０１３３】
実施形態１７は、配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質である。
【０１３４】
実施形態１８は、実施形態１７の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質であって、変異ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃ、の組み合わせを有する配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号１８の残基３０〜７０４もしくは配列番号１９の残基３０〜６８６を含む。
【０１３５】
実施形態１９は、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび／または１つ以上のさらなる単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなる発現ベクターをさらに含む、実施形態１３の組成物である。
【０１３６】
実施形態２０は、配列番号１８のアミノ酸配列からなる合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含む、実施形態１３の組成物である。
【０１３７】
実施形態２１は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、および任意選択により、配列番号１〜４，２８および２９のアミノ酸配列を含む１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターをさらに含む、実施形態２０による組成物である。
【０１３８】
実施形態２２は、実施形態１９，２０または２１のいずれか１つによる組成物を対象に投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において産生する方法である。
【０１３９】
実施形態２３は、組成物またはワクチンの組み合わせを作製する方法であって、実施形態１０または実施形態１１のベクターを担体と組み合わせること、および任意選択により、担体と一緒に、１つ以上の組成物中の１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび／または１つ以上の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードするベクターを組み合わせることを含む。
【０１４０】
実施形態２４は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、対象において誘導するためのワクチンの組み合わせであって、
（ｉ）配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、発現ベクターの免疫原的有効量を含む第１の組成物および担体；ならびに
（ｉｉ）免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含む第２の組成物および担体、を含み、
第１および第２の組成物の一方はプライミング免疫用であり、他の組成物はブースティング免疫用であり、
ワクチンの組み合わせは、任意選択により、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする免疫原的有効量の１つ以上のさらなる発現ベクターをさらに含み、１つ以上のさらなる発現ベクターは、第１もしくは第２の組成物、または第１または第２の組成物と一緒に使用される１つ以上のさらなる組成物に含まれる。
【０１４１】
実施形態２５は、実施形態２４によるワクチンの組み合わせであって、第１の組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み；単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８または配列番号３６の残基３０〜７２４を含み；ならびに１つ以上のさらなる発現ベクターは、配列番号１〜５、２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターである。
【０１４２】
実施形態２６は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、
（ｉ）配列番号８、または（ｉ）Ｉ５２９Ｐ、（ｉｉ）Ｋ４８０Ｅ、および（ｉｉｉ）ＥＫ４７９−４８０ＲＲＲＲ、Ｉ５２９Ｐ、Ａ４７１ＣおよびＴ５７５Ｃの組み合わせ、からなる群から選択される１つ以上の変異を有する配列番号８、のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする、発現ベクターの免疫原的有効量を含む第１の組成物および担体を対象に投与する工程； 
（ｉｉ）対象に、免疫原的有効量の単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドおよび担体を含む第２の組成物を投与する工程；ならびに
（ｉｉｉ）任意選択により、対象に、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする免疫原的有効量の１つ以上のさらなる発現ベクターを投与する工程、を含み、
工程（ｉ）および（ｉｉ）がいずれかの順序で実施され、一方の工程がプライミング免疫のためのものであり、他方の工程がブースティング免疫のためのものであり、好ましくは、任意選択による、１つ以上のさらなる発現ベクターの有効量が、第１の組成物と一緒に投与される。
【０１４３】
実施形態２７は、実施形態２６による方法であって、第１の組成物は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクター、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターを含み；第２の組成物は、配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８または配列番号３６の残基３０〜７２４を有する単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチドを含み；ならびに任意選択による１つ以上のさらなる発現ベクターは、配列番号２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原性ポリペプチドをコードするアデノウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス２６ベクターであり；第１の組成物は、プライミング免疫のために１回以上、任意選択により１つ以上のさらなる発現ベクターと一緒に対象に投与され、第２の組成物は、ブースティング免疫のために１回以上対象に投与される。
【０１４４】
実施形態２８は、シグナル配列を有するまたは有しない、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列からなる合成ＨＩＶエンベロープタンパク質である。
【０１４５】
実施形態２９は、（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第１の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、および（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２のＨＩＶエンベロープタンパク質、をコードする核酸配列を共に含む１つ以上のベクターを含むワクチンの組み合わせである。
【０１４６】
実施形態３０は、実施形態２９によるワクチンの組み合わせであって、第１の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
実施形態３１は、以下の成分を含むワクチンの組み合わせである：
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列からなる合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするＡｄ２６ベクター；および
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするＡｄ２６ベクター。
【０１４８】
実施形態３２は、以下の成分をさらに含む、実施形態３１によるワクチンの組み合わせである：
（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるＨＩＶ抗原をコードするＡｄ２６ベクター。
【０１４９】
実施形態３３は、以下の成分をさらに含む、実施形態３１または３２によるワクチンの組み合わせである：
（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列からなるＨＩＶ抗原をコードするＡｄ２６ベクター。
【０１５０】
実施形態３４は、以下の成分をさらに含む、実施形態３１〜３３のいずれか１つによるワクチンの組み合わせである：
（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列の残基３０〜７０８、または配列番号３６のアミノ酸配列の残基３０〜７２４を有し、任意選択によりアジュバントをさらに含む、単離されたＨＩＶ抗原性ポリペプチド。
【０１５１】
実施形態３５は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とするヒト対象において誘導する方法であって、
（ａ）対象に、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；および（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、を投与する工程であって；好ましくは、ｒＡｄ２６ベクターは、約１：１：１：１の比で、約１〜１０×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）の総用量、例えば５×１０１０ｖｐで投与する工程；
（ｂ）工程（ａ）を約１０〜１４週間で、例えば工程（ａ）の後１２週間で繰り返す工程；
（ｃ）対象に、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｖ）配列番号７のアミノ酸３０〜７０８の配列を有する単離されたＨＩＶｇｐ１４０タンパク質；および（ｖｉ）リン酸アルミニウムアジュバント、を投与する工程であって、好ましくは、ｒＡｄ２６ベクターは、約１：１：１：１の比で、約１〜１０×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）の総用量、例えば５×１０１０ｖｐで投与し、および単離されたＨＩＶｇｐ１４０タンパク質は、約５０〜３００マイクログラム、例えば２５０マイクログラムの用量で；２０〜２８週間、例えば工程（ａ）の後２４週間で投与する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）を約４２〜５４週間で、例えば工程（ａ）の後４８週間で繰り返す工程、を含む方法である。
【０１５２】
実施形態３６は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とするヒト対象において誘導する方法であって、
（ａ）対象に、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；および（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター、を投与する工程であって；好ましくは、ｒＡｄ２６ベクターは、約１：１：１：１の比で、約１〜１０×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）の総用量、例えば５×１０１０ｖｐで投与する工程；
（ｂ）工程（ａ）を約１０〜１４週間で、例えば工程（ａ）の後１２週間で繰り返す工程；
（ｃ）対象に、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む抗原をコードするｒＡｄ２６ベクター；（ｖ）配列番号７のアミノ酸３０〜７０８の配列を有する単離されたＨＩＶｇｐ１４０タンパク質；（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸３０〜７２４の配列を有する単離されたＨＩＶｇｐ１４０タンパク質；および（ｖｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバント、を投与する工程であって、好ましくは、ｒＡｄ２６ベクターは、約１：１：１：１の比で、約１〜１０×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）の総用量、例えば５×１０１０ｖｐで投与し、および単離されたＨＩＶｇｐ１４０タンパク質は、約５０〜３００マイクログラム、例えば２５０マイクログラムの用量で；２０〜２８週間、例えば工程（ａ）の後２４週間で投与する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）を約４２〜５４週間で、例えば工程（ａ）の後４８週間で繰り返す工程、を含む方法である。
【実施例】
【０１５３】
実施例１：ＨＩＶエンベロープ抗原配列の設計
いくつかのＨＩＶエンベロープ抗原配列は、モザイクＨＩＶ抗原ｍｏｓ２Ｅｎｖ（配列番号６；以前にも国際公開第２０１０／０５９７３２号パンフレットに記載される）と配列類似性を有するように設計された。新しく設計された膜結合の配列は、ＨＩＶエンベロープタンパク質からの完全に天然の野生型配列、またはｍｏｓ２Ｅｎｖ配列および野生型ＨＩＶエンベロープタンパク質配列のキメラに基づくもの（組み合わせ）であった。全長エンベロープタンパク質配列（図１Ａ参照）に加えて、細胞質ドメインのＣ末端切断を有する配列も設計された（例えば、図１Ｃ参照）。例えば、Ｓｃｈｉｅｒｎｌｅら、ＰＮＡＳ１９９７；Ａｂｒａｈａｍｙａｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５）；Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００２，７６：２６８３−２６９１も参照されたい。可溶性変異体はまた、膜貫通（ＴＭ）領域の前のＣ末端トランケーションによって調製され、これはＧＣＮ４三量体形成ドメインなどの三量体形成ドメインによって置換された（例えば、図１Ｂ参照）。これらの可溶性変異体は、フューリン切断部位の変異によって一本鎖変異体にさらに変換され、したがって、ｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニットへのエンベロープタンパク質の細胞外ドメインのプロセシングを阻害する。
【０１５４】
生成および試験されたすべての構築物のうち、Ｃ４に基づく構築物は、最適な特性、例えば、良好な製造可能性、折り畳み、免疫原性などを有し、これらはさらなる研究のために選択された。膜貫通ドメイン（ｓＣ４、図１Ｂ）の代わりにＧＣＮ４三量体形成ドメインを有するＣ４構築物の可溶性変異体、および細胞質ドメインの７アミノ酸断片を含む変異体（Ｃ４Ｄ７、図１Ｃ）も生成し、さらなる研究において試験した。Ｃ４、ｓＣ４、およびＣ４Ｄ７のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７、１９、および１８に示す。これらをコードする配列をそれぞれ配列番号２５、２７および２６に示す。構築物Ｃ１は、ｍｏｓ２Ｅｎｖ配列（配列番号６）に基づく細胞外ドメイン配列を有する。それぞれ図１Ｂおよび図１Ｃに示すｓＣ４およびＣ４Ｄ７と同様である、膜貫通ドメイン（ｓＣ１）の代わりにＧＣＮ４三量体形成ドメインを有する構築物Ｃ１の可溶性変異体、および細胞質ドメインの７アミノ酸断片（Ｃ１Ｄ７）を含む変異体もまた生成された。構築物Ｃ１およびその変異体は、本質的に先行技術のｍｏｓ２Ｅｎｖ配列に基づいているため、比較目的のためのさらなる研究に用いられた。Ｃ１、ｓＣ１およびＣ１Ｄ７のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３１、３０および３２に示す。これらをコードする核酸配列をそれぞれ配列番号３４、３３および３５に示す。試験された他の構築物は、構築物Ｃ４に基づくものよりも最適性が低く、さらなる開発に取り入れられなかった。
【０１５５】
実施例２：合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の発現および折り畳み
合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の発現レベル、折り畳み、および細胞表面発現を測定した。
【０１５６】
発現レベル
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、実施例１に記載したように、可溶性合成ＨＩＶエンベロープタンパク質ｓＣ１およびｓＣ４をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした。可溶性タンパク質の発現レベルを、定量的ウェスタンブロット（ＱＷＢ）を用いて上清中で測定した。結果を図２に示す。ｓＣ１（これは本質的に膜貫通ドメインが付加されたｍｏｓ２Ｅｎｖに対応する）の低発現レベルは、最近のｍｏｓ２Ｅｎｖの知見と一致する。結果によって示されるように、本発明のｓＣ４変異体は、ｓＣ１変異体（対照）より有意に高い発現レベルを示した。
【０１５７】
タンパク質の折り畳み
タンパク質折り畳みは、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、ＣＤ４の結合後にのみ露出する、ＨＩＶエンベロープタンパク質の共受容体結合部位に結合することが知られている抗体（ＭＡｂ１７ｂ）への可溶性合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の結合を測定することにより試験された。特に、ＣＤ４へのｓＣ４の前の結合を有する、およびＣＤ４へのｓＣ４の前の結合を有しない、ＭＡｂ１７ｂへの結合について、精製されたｓＣ４の結合を試験した。精製したｓＣ１を対照として使用した。前のエンベロープタンパク質へのＣＤ４結合を有しないｓＣ４へのＭＡｂ１７ｂの結合は、部分的に折り畳まれていないか、またはプレトリガーされたエンベロープタンパク質（すなわち、ＣＤ４結合の非存在下で「オープン」コンフォメーションをとる不安定なＥｎｖ）を示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。
【０１５８】
図３Ｂに示すように、ｓＣ４は、ＣＤ４への前の結合があるとＭＡｂ１７ｂへの強い結合を示すが、ＣＤ４への前の結合がないとＭＡｂ１７ｂへの検出可能な結合を示さない。これに対し、図３Ａに示すように、ｓＣ１は、ＣＤ４への前の結合の有る場合および無い場合の両方で、ＭＡｂ１７に対する結合がはるかに低いことを示した。この結果は、ｓＣ４が正しい折り畳みパターンを有し、ＣＤ４結合前に共受容体結合部位の曝露がないことを示唆する。
【０１５９】
可溶性タンパク質変異体の四次構造およびプロトマー間の誤ったジスルフィド架橋形成を評価するために、ｓＣ１およびｓＣ４の未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってタンパク質の折り畳みを分析した。未変性ゲル上での電気泳動後、ゲル中のタンパク質をウェスタンブロット分析によって検出した。図４の結果に示すように、ｓＣ４の大部分は三量体状態で存在し、これは正しい四次構造である。
【０１６０】
まとめると、タンパク質の折り畳み実験の結果は、ｓＣ４可溶性合成ＨＩＶエンベロープタンパク質が、所望の折り畳みプロファイルを有し、既存のｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原（ｓＣ１によって表される）の折り畳みプロファイルと比較して改善されることを実証する。
【０１６１】
細胞表面発現
ＨＩＶエンベロープタンパク質Ｃ１（全長）、Ｃ４（全長、図１Ａ参照）、Ｃ１Ｄ７、およびＣ４Ｄ７の膜結合変異体の細胞表面発現もまた研究された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｅＧＦＰコードプラスミドのみ（陰性対照、ＮＣ）、またはｅＧＦＰコードプラスミドとともにＨＩＶエンベロープタンパク質変異体をコードする発現構築物を一緒に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、ｇｐ１２０および二次抗体に対するいくつかのポリおよびモノクローナル抗体への曝露により細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析にかけ、次いでエンベロープタンパク質の細胞表面発現レベルを調べた。エンベロープ変異体の品質は、抗ｇｐ１２０ポリクローナル抗体を用いて全体の発現レベルを決定すること、および四次構造依存性であり、正しく折り畳まれたエンベロープ三量体に優先的に結合する、広範に中和する抗体ＰＧ９およびＰＧ１６の相対的結合を評価することによって評価した。
【０１６２】
細胞表面発現実験の結果を図５に示す。抗ｇｐ１２０抗体を用いて測定された短縮型変異体Ｃ１Ｄ７およびＣ４Ｄ７の表面発現レベルは、その全長対応物であるＣ１およびＣ４の表面発現レベルよりもはるかに高い。これは、Ｅｎｖのカルボキシ末端からの１４４残基の欠失がエンベロープ表面発現レベルを増加させることを確認する。本発明の全長Ｃ４構築物はまた、全長Ｃ１と比較して改善されたＰＧ９およびＰＧ１６結合を示し、これはＣ４エンベロープ配列が細胞表面上で適切に折り畳まれている（すなわち三量体）ことを示唆する。
【０１６３】
この結果はまた、細胞膜ドメインの膜貫通ドメインおよび７個のアミノ酸が付加された本質的にＭｏｓ２ＥｎｖであるＣ１Ｄ７変異体が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上に表面発現され得ることを実証する。これは、Ａｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖにおける可溶性構築物と対照的に、Ａ５４９細胞にトランスフェクトされた場合、表面上で検出可能なレベルで発現することができない。しかしながら、ＰＧ９およびＰＧ１６への相対的な結合は、バックグラウンドを上回ってほとんど検出されず、これは、Ｃ１Ｄ７エンベロープ配列が折り畳まれておらず、おそらく細胞表面上に完全な三量体として存在しないことを示唆している。
【０１６４】
全体的に、Ｃ４Ｄ７エンベロープ変異体は、最適な抗体結合プロファイルを有し、全長対応物Ｃ４より高いｇｐ１２０発現を有し、およびＣ１およびＣ１Ｄ７と比較して１５倍を超えるＰＧ９およびＰＧ１６結合を有する（図５）。
【０１６５】
実施例３：ＨＩＶエンベロープ配列をコードするベクターの安定性
我々の研究室における以前の研究（未発表）は、ｍｏｓ２Ｅｎｖ抗原配列をコードするアデノウイルス２６（Ａｄ２６）ベクターが比較的高いＶＰ／ＩＵ比（アデノウイルス産生物バッチの品質が低いことを示す）を示し、さらにそのようなベクターは安定性の問題を示した。したがって、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質構築物のアデノウイルスバックグラウンドにおける安定性を試験することが重要であった。
【０１６６】
上記の実施例１に記載のＣ４、Ｃ４Ｄ７およびｓＣ４のＨＩＶ抗原配列をコードする組換えＡｄ２６（ｒＡｄ２６）ベクターを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞中で生成した（それぞれ、「ｒＡｄ２６．Ｃ４」、「ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７」、および「ｒＡｄ２６．ｓＣ４」と称する）。ベクタークローン（プラーク）を採取し、研究バッチの生成のためにスケールアップした。最大５つのウイルスクローン（プラーク）をＴ２５フォーマットにスケールアップし、Ｔ２５フォーマットで１０継代、連続的に継代培養した（トランスフェクションおよびプラーク精製工程である１〜３継代、続いてＴ２５フォーマットで１０継代、合計１３継代となった）。遺伝的安定性は、Ｅ１導入遺伝子カセットＰＣＲアッセイ、続いてｖｐｎ１３で配列決定することにより、ウイルス継代数（ｖｐｎ）３，５，１０および１３で評価した。結果を図６に示す。
【０１６７】
全長Ｃ４をコードするｒＡｄ２６ベクター（ｒＡｄ２６．Ｃ４）は、２〜３日で完全な細胞病原性効果（ＣＰＥ）がないことによって決定されるような、不十分な増殖特性；Ｅ１導入遺伝子カセット領域の欠失によって決定されるような、遺伝的不安定性；またはその組み合わせを示した（図６）。不十分な増殖特性および観察された遺伝的不安定性のために、全長Ｃ４をコードするこのベクターはさらに追求されなかった。
【０１６８】
対照的に、Ｃ４Ｄ７をコードするｒＡｄ２６ベクター（ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７）およびｓＣ４をコードするｒＡｄ２６ベクター（ｒＡｄ２６．ｓＣ４）では、すべての増殖したプラークは、実験の過程で遺伝的に安定したままであった（図６）。したがって、新規のｓＣ４およびＣ４Ｄ７構築物は、アデノウイルスベクターのバックグラウンドにおける安定性に関して元のｍｏｓ２Ｅｎｖ構築物より優れている。ｖｐｎ１３までの遺伝的安定性試験は、ベクターの工業的規模の調製に使用されたものを超えるいくつかの継代の増殖を表す。
【０１６９】
実施例４：アデノウイルスベクターにおけるＨＩＶエンベロープ配列の発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ抗原性
ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７およびｒＡｄ２６．ｓＣ４の発現および抗原性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでベクター形質導入Ａ５４９細胞（ヒト細胞株）中のｍｏｓ１Ｅｎｖ（配列番号５）をコードする組換えＡｄ２６ベクター（以下「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ」）と別々にまたは組み合わせて評価した。フローサイトメトリー分析は、すべての抗原が、対照としての単一エンベロープ抗原の２ｘ１０４ウイルス粒子（ｖｐ）またはアデノウイルス形質導入による２つの組み合わされたＥｎｖ抗原の１×１０４ｖｐのいずれかで形質導入された細胞培養物において発現したことを実証した。すべての形質導入は、ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌをコードするアデノウイルスベクター（「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ」）およびｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌをコードするアデノウイルスベクター（「ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ」）（Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１０、１６：３１９−３２３）の単回用量（１×１０４ｖｐ）をさらに含み、その結果、評価されたベクターの組み合わせは、前臨床および臨床使用のために意図されるような異なるアデノウイルスベクターの相対比を示した。好ましくは、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターは、臨床用途のためにｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌおよびｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ抗原をコードするベクターと組み合わせられる。
【０１７０】
ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＥｎｖおよびｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７の組み合わせは、モノクローナル抗体結合によって決定される、評価されたエピトープの最大の適用範囲を生じた。特に、Ａｄ２６．Ｃ４Ｄ７による形質転換によって寄与されたＰＧ１６エピトープの曝露は、ＰＧ１６がＨＩＶ−１  ＥｎｖのＶ１／Ｖ２ループ領域を認識する広範に中和するモノクローナル抗体を表すことから、ワクチンの使用に有望である（Ｗａｌｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９）。したがって、Ｃ４配列に由来する本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ｍｏｓ１Ｅｎｖのみによって生成される免疫応答と比較して、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対する免疫応答の幅を増加させる。エンベロープタンパク質領域に向けられたワクチン誘導抗体応答は、ＲＶ１４４の研究（Ｈａｙｎｅｓら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１２）におけるＨＩＶ−１感染からの保護と相関することが示されており、したがって、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質ＨＩＶワクチンレジメンに含める有望な候補である。
【０１７１】
実施例５：合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターの免疫原性
Ａｄ２６ベクターバックグラウンドにおける本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質配列をウサギで試験して、これらの構築物がｒＡｄ２６．ｍｏｓ２Ｅｎｖ構築物に対する免疫原性の代替物であるかどうかを決定した。
【０１７２】
ｍｏｓ１Ｅｎｖ（ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ；配列番号５）をコードするアデノウイルスベクターの免疫原性を、単独で、および本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするアデノウイルスベクター（ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７およびｒＡｄ２６．ｓＣ４；それぞれ配列番号８、特に配列番号１８および１９を含む）と組み合わせて試験した。すべての場合において、ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ抗原およびｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ抗原（ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ［配列番号２８］およびｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ［配列番号２９］）をコードするアデノウイルス２６ベクターも投与した。より具体的には、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ（３価ワクチン：ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌおよびｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ）単独の免疫原性を、ｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７またはｒＡｄ２６．ｓＣ４の１つと組み合わせたｒＡｄ２６．ｍｏｓ１Ｅｎｖ（４価ワクチン：ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＥｎｖおよびｒＡｄ２６．Ｃ４Ｄ７；またはｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ、ｒＡｄ２６．ｍｏｓ１ＥｎｖおよびｒＡｄ２６．ｓＣ４の投与）の免疫原性と比較した。本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターを欠く３価ワクチンと、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターを含む４価ワクチンとの比較により、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質が保護の幅に寄与しているかどうかを決定することができる。
【０１７３】
これらのＡｄ２６ベクターを第０週および第６週に二重プライムとして投与し、クレードＣ  ｇｐ１４０タンパク質（残基１〜２９のシグナルペプチド配列を有しない、配列番号７を有する３価Ｅｎｖ  ｇｐ１４０タンパク質、国際公開第２０１０／０４２９４２号パンフレット参照）を第１２週および第１８週に二重ブーストとして投与した（例えば、Ｂａｒｏｕｃｈら、２０１５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４９：３２０−３２４参照）。表１は、現在の研究に使用されたワクチンレジメンを記載する。ｒＡｄ２６．エンプティは、ＨＩＶ抗原タンパク質の配列をコードする遺伝子を欠く対照ベクターを指す。各グループは６匹のウサギを含んでいた。
【０１７４】
【表１】
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【０１７５】
３価Ａｄ２６ワクチン（本発明の新規Ｅｎｖ抗原を欠く）と４価Ａｄ２６ワクチン（新規ｓＣ４またはＣ４Ｄ７Ｅｎｖ抗原を含む）との比較は、新規抗原が保護の幅に寄与するかどうかを試験することを可能にする。確立されたＴＺＭ−ｂｌ細胞ベースの中和アッセイ［Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ  ＤＣ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９，４８５：３９５−４０５；Ｓａｒｚｏｔｔｉ−Ｋｅｌｓｏｅ  Ｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４，４０９：１３１−１４６］を使用して、ワクチン候補の中和活性を測定した。
【０１７６】
結果を図７に示し、３価ワクチン（表１のグループ１）を対照群として用い、新規４価ワクチン（表１のグループ２および３）のそれぞれと比較することによって、統計的に分析した。
【０１７７】
全体的に、新規のＣ４由来（すなわち、配列番号８を含むＥｎｖタンパク質をコードする、ｍｏｓ２Ｅｎｖの代替物である）アデノ構築物は、ウサギにおける２つの相同な筋肉内免疫後に免疫原性であった。
【０１７８】
ティア１Ｂシュードウイルスに対するウサギ免疫血清の中和能力は非存在であったが（データは示さず）、このようなウイルスは中和することがより困難であることが知られていたため、これは予想外ではない。
【０１７９】
クレードＢティア１Ａウイルスに対するウサギ免疫血清のシュードウイルス中和能力は、新規成分の添加によって影響を受けなかった（データは示さず）。これは、新規抗原がワクチン中に存在する既存のクレードＢ抗原の免疫原性を否定的に妨げないことを実証している（新規成分はクレードＣに向けられていたが、そのような望ましくない干渉を試験前に先験的に除外できなかった）。
【０１８０】
クレードＣティア１Ａウイルスに対するウサギ免疫血清のシュードウイルス中和能力は、３価（ｍｏｓ１Ｅｎｖのみを有する）免疫のみ（グループ１）と比較して、アデノを含有する４価の新規Ｃ４Ｄ７（４価、グループ２）において、有意に増強された（図７パネルＢ）。さらに、８週目でのクレードＣティア１Ａウイルスに対するウサギ免疫血清のシュードウイルス中和能力は、３価（ｍｏｓ１Ｅｎｖのみを有する）免疫のみ（グループ１）と比較して、アデノを含有する４価の新規ｓＣ４（４価、グループ３）において、有意に増強された（図７パネルＢ）。
【０１８１】
結論として、Ａｄ２６にコードされるＣ４Ｄ７およびｓＣ４構築物は免疫原性であり、その追加は、ｍｏｓ１Ｅｎｖ（主にクレードＢ）を唯一のＡｄ２６−コードＥｎｖ成分として有するワクチンのクレードＣ株に対する結合および中和能力を拡大した（図７Ｂ）。
【０１８２】
実施例６：本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードするベクターを含むワクチンレジメンの免疫原性
１つのさらなるウサギの研究は、４価ベクターの組み合わせＡｄ２６．Ｍｏｓ４．ＨＩＶ（４つのアデノウイルスベクターからなる：Ａｄ２６．Ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ［配列番号２８をコードする］、ｄ２６．Ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ［配列番号２９をコードする］、Ａｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ［配列番号５をコードする］、およびＡｄ２６．Ｍｏｓ２ＳＥｎｖ［上記の「Ｃ４Ｄ７」という名前は「Ｍｏｓ２Ｓ」とも称される；このベクターは、本発明による新規配列番号１８をコードする］、１：１：１：１の混合物中、５×１０９ｖｐの総用量で）を、第０週および第６週に二重プライム免疫として筋肉内に適用し、クレードＣ  ｇｐ１４０［配列番号７のアミノ酸残基３０〜７０８の配列を有する］、モザイクｇｐ１４０［配列番号３６のアミノ酸残基３０〜７２４の配列を有する］、またはクレードＣ  ｇｐ１４０およびモザイクｇｐ１４０を組み合わせて、第１３週および第１９週に適用して、評価した。これらのタンパク質ブーストを、免疫化の日に処方された２５０ｍｃｇのリン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせた１０または５０マイクログラムのタンパク質総量で筋肉内に適用した。
【０１８３】
結果は、すべての試験レジメンがすべての動物において免疫原性であり、高い抗体力価およびティア１Ｅｎｖシュードタイプウイルスに対する中和活性を誘導することを示す。モザイクｇｐ１４０をワクチン抗原として単独でまたはクレードＣ  ｇｐ１４０と組み合わせて使用した場合、モザイクｇｐ１４０特異的ＥＬＩＳＡ力価およびクレードＢシュードウイルスの認識は、クレードＣ  ｇｐ１４０単独でブーストした対照群と比較して第１５週で有意に増加した。全体的な改善の効果の大きさは中程度であり、モザイクｇｐ１４０単独と比較して、２価クレードＣ  ｇｐ１４０−モザイクｇｐ１４０の組み合わせでブーストされたグループについては、より大きかった。研究の２１週目で、これらの差異は失われ、２価クレードＣ  ｇｐ１４０−モザイクｇｐ１４０ブーストまたは１価クレードＣ  ｇｐ１４０ブーストを受けたコホートについて測定された免疫応答は、統計的に区別できなかった。
【０１８４】
２価タンパク質レジメンは、クレードＣ  ｇｐ１４０単独でブーストしたレジメンと同等のクレードＣのＥＬＩＳＡ力価の誘導およびシュードウイルス認識を示し、これは、クレードＢ関連免疫原モザイクｇｐ１４０の包含が、クレードＣ抗原の適用範囲に陰性影響を与えなかった一方で、研究の１５週目にクレードＢの適用範囲を優位に増強したことを示唆する。
【０１８５】
データにより、本発明による合成Ｅｎｖ抗原をコードするＡｄ２６．Ｍｏｓ２ＳＥｎｖベクターが、ワクチンレジメンで首尾よく使用できることが確認される。
【０１８６】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2019505188.tif 000004
【図１Ｃ】
2019505188.tif 000005
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019505188.tif 000015
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