(57)【要約】本発明は、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさのための方法およびシステムに関する。特に、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさを判定するための方法であって、少なくとも１つのオブジェクトは、遺伝子情報を備える分子を受容するように構成され、本方法は、ｋサンプル点を備える面積Ａを生成するステップであって、ｋ点は、所定の分布に従って、面積Ａ内に分布される、ステップと、面積Ａの中心位置とデジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの中心位置を整列させるステップと、ｋサンプル点のそれぞれにおける強度値を抽出するステップと、個別のｋサンプル点における抽出される強度値の中心傾向を計算するステップとを含む。
2019505884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさを判定するための方法であって、前記少なくとも１つのオブジェクトは、遺伝子情報を備える分子を受容するように構成され、前記方法は、
ｋサンプル点を備える面積Ａを生成するステップであって、前記ｋ点は、所定の分布に従って、前記面積Ａ内に分布される、ステップと、
前記面積Ａの中心位置と前記デジタル画像内の前記少なくとも１つのオブジェクトの中心位置を整列させるステップと、
前記ｋサンプル点のそれぞれにおける強度値を抽出するステップと、
個別のｋサンプル点における前記抽出される強度値の中心傾向を計算するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記面積Ａは、前記デジタル画像内の前記少なくとも１つのオブジェクトの形状を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記面積Ａは、係数ｓ１で乗算される前記デジタル画像内の前記少なくとも１つのオブジェクトのサイズを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのオブジェクトは、好ましくは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを受容するように構成される、ビーズである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのオブジェクトは、直径ｄ１を有する、好ましくは、ｄ１＝２．８ピクセルを伴う、前記デジタル画像内の第１のディスクの形状を有する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記面積Ａは、直径ｄ２を有する、好ましくは、ｄ２＝３ピクセルを伴う、第２のディスクの形状を有する、請求項１から５に記載の方法。
【請求項７】
ｋ≦３０、好ましくは、ｋ＝２７を伴う、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記所定の分布は、青色雑音である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ｋサンプル点は、ポアソンディスクサンプリングを使用して生成される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ｋサンプル点のそれぞれにおける前記デジタル画像の強度値は、前記ｋサンプル点のそれぞれのサブピクセル位置における前記強度値のバイリニア補間を使用して抽出される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記個別のｋサンプル点の抽出された強度値の中心傾向は、前記個別のｋサンプル点の抽出された強度値の中央値を計算することによって計算される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記請求項のうちの１つに記載の方法のステップを行うためのコンピュータ実行可能命令を有する、１つまたはそれを上回るコンピュータ可読媒体を備える、コンピュータプログラム製品。
【請求項１３】
デジタル画像内のオブジェクトの全体的明るさを判定するためのシステムであって、前記少なくとも１つのオブジェクトは、遺伝子情報を備える分子を受容するように構成され、好ましくは、請求項１から１１に記載の方法のいずれかのステップを実施するように構成され、
ｋサンプル点を備える面積Ａを生成するように構成される、生成ユニットであって、前記ｋ点は、所定の分布に従って、前記面積Ａ内に分布される、生成ユニットと、
前記面積Ａの中心位置と前記デジタル画像内の前記少なくとも１つのオブジェクトの中心位置を整列させるように構成される、整列ユニットと、
前記ｋサンプル点のそれぞれにおける強度値を抽出するように構成される、抽出ユニットと、
個別のｋサンプル点における前記抽出される強度値の中心傾向を計算するように構成される、計算ユニットと
を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさを判定するための方法およびシステムに関する。特に、本発明は、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさを判定するための方法およびシステムに関し、少なくとも１つのオブジェクトは、遺伝子情報を備える分子を受容するように構成される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
バイオ技術、医学、および関連技術的分野は、分子の分析に基づく。電子デバイスは、高精度および特異性を伴って、分子を分析することができる。特に、近年、自動化された電子デバイスが、日常的方法によって大量のサンプルを分析するために開発されている。例えば、現代のＤＮＡシークエンシング装置は、大量のＤＮＡプローブの日常的分析のために使用される。タンパク質サンプルは、高スループットスクリーニングおよび関連方法によって分析されることができる。多くの場合、そのような電子デバイスは、サンプルプローブから放出される蛍光信号を検出する。これは、核酸またはタンパク質等の分子が染料等の蛍光化合物で標識されるときに可能である。
【０００３】
市販のシークエンシング装置は、蛍光染料で標識された大量のサンプルを並行してシークエンシング可能である。「次世代シークエンシング」（ＮＧＳ）と称される最近開発された方法は、シークエンシングに革命を起こしている。ＮＧＳは、フローセル内に空間的に分離される、または水中油型乳剤の生成によって、クローン的に拡大された、または単一のＤＮＡ分子の大量並行シークエンシングを可能にする。ＮＧＳは、数千またはさらに数百万から数十億のシークエンシング反応が同時に行われることを可能にする。
【０００４】
ＮＧＳでは、シークエンシングは、ポリメラーゼ媒介ヌクレオチド伸長の反復サイクルによって、または１つのフォーマットでは、ヌクレオチドライゲーションの反復サイクルによって行われる。大量並行プロセスとして、ＮＧＳは、プラットフォームに応じて、数百のメガ塩基対からギガ塩基対のヌクレオチドシーケンス出力を単一器具行程において生成する。大量のシーケンスデータの安価な生産は、従来の方法に優る主要な利点である。
【０００５】
ＮＧＳプラットフォームおよびＮＧＳ技術に関する一般的用途／分野は、例えば、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５：４６４１−６５８，２００９  ａｎｄ  Ｍｅｔｚｋｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１（２０１０年１月、３１−４６ページ）において論評されている。
【０００６】
ＮＧＳでは、種々の着目オリゴヌクレオチドが、支持体に共有結合される。続いて、蛍光染料で標識されたヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼを伴う成長中のオリゴヌクレオチド鎖に付着される。４つのヌクレオチドが、異なる蛍光染料で標識されると、プローブから放出される蛍光信号が、検出されることができ、オリゴヌクレオチドに付着されたヌクレオチドのタイプが、同定されることができる。検出後、蛍光染料は、切断され、次の合成サイクルが、実施され、新しい標識されるヌクレオチドが、成長中の鎖に付着される。複数のサイクルを実施することによって、成長中のオリゴヌクレオチド鎖のシーケンスが、段階的様式において判定されることができる。作業ステップは、自動化されたシークエンシング装置内で実施される。
【０００７】
第ＵＳ２０１０／０３２３３５０Ａ１号および第ＷＯ２００９／１１７１１９Ａ１号は、例えば、合成方法によるシークエンシングから得られたデータを使用して、ヌクレオチドシーケンス内の核酸の同定を判定するための方法および組成物に関する。
【０００８】
第ＷＯ２００８／０９７４５５Ａ１号は、蛍光材料、例えば、蛍光標識、染料、または顔料を備える、サンプル上もしくは内の蛍光を励起および測定し、特に、核酸上の蛍光標識を検出するための撮像システムに関する。さらに、複数の異なるＤＮＡテンプレート内の蛍光標識が同時に検出されるように構成される、デバイスが、開示される。
【０００９】
第ＷＯ２０１４／０２０１３７Ａ１号は、シークエンシングライブラリからの標的シーケンスを強化し、標的強化シークエンシングライブラリを提供するための方法に関し、シークエンシングライブラリは、大量の並行シークエンシングに好適であって、複数の二本鎖核酸分子を備える。
【００１０】
標識された分子を伴うサンプルプローブから放出される蛍光信号は、弱いが、信号は、高精度および特異性を伴って、検出される必要がある。したがって、精密な光学機器、特に、カメラおよび走査技術が、そのようなプロセスのために要求される。
【００１１】
加えて、シークエンシング装置の光学撮像システムによって捕捉されたデジタル画像の広範な評価が、例えば、ＦＡＳＴＱ内でシークエンシングの精密かつ信頼性のある結果を得るために必要である。
【００１２】
シークエンシング装置では、シークエンシング装置のフローセルまたはシークエンシング装置のフローセルの一部のデジタル画像は、デジタル画像を捕捉するために使用される光学撮像システムの特性に大きく依存する。さらに、分子を受容するように構成される少なくとも１つのオブジェクトが、ＤＮＡまたはＲＮＡをその表面上に受容するように構成される、いわゆるビーズであるとき、デジタル画像および正方形ピクセル内の球状ビーズは、異なる形状を示し、ビーズの強度は、１つまたはそれを上回るピクセルの明るさの関数として公式化される必要がある。さらに、例えば、口径食影響によって生じる、光学撮像システム内の若干の歪曲影響は、特定のビーズを共同で表す、ピクセルセットの全体的明るさを判定する必要性をさらに強調する。さらに、球状ビーズおよび画像ピクセルが異なる形状を有し、考慮される必要があるという事実に加え、個別のピクセルの強度抽出もまた、画像整列プロセス、すなわち、サブピクセルの精密なビーズ位置および対応する蛍光画像の整列の若干の不正確性を補償する必要がある。
【００１３】
本発明の目的は、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさ、特に、少なくとも１つのオブジェクトが遺伝子情報を備える分子を受容するように構成される、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさを判定するための方法およびシステムを提供することである。本発明による方法は、コンピュータ実装である。しかしながら、また、本発明による方法を実装する他の方法も存在することが、当業者によって理解される。
【００１４】
本目的は、独立請求項に記載の方法およびシステムによって達成される。従属特許請求項は、好ましい実施形態に言及する。
【００１５】
本発明は、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさを判定するための方法に関する。少なくとも１つのオブジェクトは、遺伝子情報を備える分子を受容するように構成される。本方法は、ｋサンプル点を備える面積Ａを生成するステップであって、ｋ点は、所定の分布に従って、面積Ａ内に分布される、ステップを含む。本方法はさらに、面積Ａの中心位置とデジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの中心位置を整列させるステップを含む。本方法はさらに、ｋサンプル点のそれぞれにおける強度値を抽出するステップを含む。本方法はさらに、個別のｋサンプル点における抽出される強度値の中心傾向を計算するステップを含む。
【００１６】
好ましくは、本発明による方法の前述の議論されるステップは、上記に提示される順序で実行される。
【００１７】
好ましくは、面積Ａの中心位置とデジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの中心位置を整列させるステップは、アフィン変換によって、より好ましくは、線形変換、すなわち、平行移動によって行われる。
【００１８】
好ましくは、少なくとも１つのオブジェクトは、好ましくは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを受容するように構成される、ビーズである。
【００１９】
好ましくは、生成された面積Ａは、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの形状を有する。例えば、少なくとも１つのオブジェクトが、例えば、実際には、すなわち、３Ｄでは、立方体の形状を有する場合、デジタル画像内、すなわち、その２Ｄ表現では、長方形の形状を有する。したがって、生成された面積Ａも、好ましくはまた、長方形の形状を有する。
【００２０】
好ましくは、面積Ａは、係数ｓ１で乗算されるデジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトのサイズを有する。好ましくは、少なくとも１つのオブジェクトのサイズは、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの面積のサイズである。
【００２１】
好ましくは、少なくとも１つのオブジェクトは、直径ｄ１を有する、デジタル画像内の第１のディスクの形状を有する。好ましくは、ｄ１は、２．８ピクセルである。
【００２２】
好ましくは、生成された面積Ａは、直径ｄ２を有する、第２のディスクの形状を有する。好ましくは、ｄ２は、３ピクセルである。
【００２３】
好ましくは、少なくとも１つのオブジェクトが、直径ｄ１を有する、デジタル画像内の第１のディスクの形状を有する場合、生成された面積Ａは、第２のディスクの形状を有する。好ましくは、ｄ１＝ｄ２である。例えば、少なくとも１つのオブジェクトが、実際には、すなわち、３Ｄでは、球状形状を有する場合、デジタル画像内、すなわち、その２Ｄ表現では、第１のディスクの形状を有する。したがって、生成された面積Ａもまた、好ましくは、ディスク、すなわち、第２のディスクの形状を有する。
【００２４】
好ましくは、サンプル点の数ｋは、３０より小さいまたはそれと等しいｋ、好ましくは、ｋ≦３０、好ましくは、ｋ＝２７である。しかしながら、サンプル点の数ｋは、３０またはそれ未満に制限されないことが当業者によって理解される。
【００２５】
好ましくは、所定の分布は、青色雑音である。青色雑音の実施例は、例えば、参考文献［１］、［２］、または［３］に与えられる。
【００２６】
好ましくは、ｋサンプル点は、ポアソンディスクサンプリングを使用して生成される。ポアソンディスクサンプリングの実施例は、参考文献［１］に示される。
【００２７】
好ましくは、ｋサンプル点のそれぞれにおけるデジタル画像の強度値は、ｋサンプル点のそれぞれのサブピクセル位置における強度値のバイリニア補間を使用して抽出される。
【００２８】
好ましくは、個別のｋサンプル点の抽出された強度値の中心傾向は、個別のｋサンプル点の抽出された強度値の中央値を計算することによって計算される。
【００２９】
好ましくは、少なくとも１つのオブジェクトは、蛍光化合物を運ぶように構成される。好ましくは、デジタル画像は、蛍光化合物による電磁放射の放出の間、光学撮像システムによって得られる。
【００３０】
代替として、デジタル画像はまた、反射照明の間、好ましくは、反射白色光照明の間、光学撮像システムによって得られてもよい。
【００３１】
本発明はまた、請求項のうちの１つの方法のステップを行うためのコンピュータ実行可能命令を有する、１つまたはそれを上回るコンピュータ可読媒体を備える、コンピュータプログラム製品に関する。
【００３２】
本発明はまた、デジタル画像内のオブジェクトの全体的明るさを判定するためのシステムに関する。
【００３３】
好ましくは、少なくとも１つのオブジェクトは、遺伝子情報を備える分子を受容するように構成される。
【００３４】
好ましくは、本システムは、請求項のいずれかに記載の方法のいずれかのステップを実施するように構成される。
【００３５】
本発明によるシステムは、ｋサンプル点を備える面積Ａを生成するように構成された生成ユニットを備え、ｋ点は、所定の分布に従って、面積Ａ内に分布される。
【００３６】
本発明によるシステムはさらに、面積Ａの中心位置とデジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの中心位置を整列させるように構成される、整列ユニットを備える。
【００３７】
本発明によるシステムはさらに、ｋサンプル点のそれぞれにおける強度値を抽出するように構成される、抽出ユニットを備える。
【００３８】
本発明によるシステムはさらに、個別のｋサンプル点における抽出される強度値の中心傾向を計算するように構成される、計算ユニットを備える。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明は、好ましい例示的実施形態を参照して、かつ添付の図面を参照して、以下により詳細に説明されるであろう。
【図１】図１は、例示的蛍光画像ならびにその拡大されたセクションを示す。
【図２】図２は、本発明の好ましい実施形態による、ビーズ位置と整列されたポアソンディスクＰを伴う、図１に示されるような蛍光画像の拡大されたセクションを示す。
【図３】図３は、本発明の好ましい実施形態による、ポアソンディスクＰのサンプル点ｋにおける強度値を抽出するための例示的バイリニア補間を示す。
【図４】図４は、本発明の好ましい実施形態による、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさを判定するためのシステムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
図１は、左側に、いわゆる蛍光画像、すなわち、いくつかのビーズによって運ばれる蛍光化合物の放出の間、光学撮像システムを使用して得られるデジタル画像を表す、例示的デジタル画像を示す。ビーズは、ＤＮＡまたはＲＮＡを受容するように構成される、オブジェクトである。そのようなビーズは、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓという商標名で、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．から市販されている（参考文献［４］参照）。図１の右側は、図１の左側の例示的蛍光画像の例示的な拡大されたセクションを示す。拡大されたセクションの囲まれた部分は、当技術分野において公知の方法によって判定されたビーズの位置を示す。本実施形態では、ビーズのサイズは、約２．８ピクセルである。
【００４１】
図２は、本発明の好ましい実施形態による、ビーズ位置と整列されたポアソンディスクＰを伴う、図１の右側に示されるような蛍光画像の拡大されたセクションを示す。
【００４２】
ポアソンディスクＰは、ビーズの直径より若干大きい直径、すなわち、本好ましい実施形態では、３ピクセルを有する。
【００４３】
ポアソンディスクＰは、参考文献［１］に提示されるようなアルゴリズムを使用して生成される。ポアソンディスクＰは、それぞれが相互から最小距離Ｒを有するｋサンプル点を備え、パラメータＲは、参考文献［１］に説明されるようなアルゴリズムにおいてユーザ定義された密度パラメータである。本アルゴリズムを使用して、青色雑音分布が、ポアソンディスクＰ内に作成される。言い換えると、ｋ点は、青色雑音分布を伴うポアソンディスクＰ内に分布される。ポアソンディスクＰは、本ビーズのためだけに作成されず、デジタル画像全体内の全てのビーズ間位置の明るさを判定するために使用されることができる。さらに、そのように生成されたポアソンディスクＰはまた、他のデジタル画像内の１つまたはそれを上回るビーズ位置の明るさを判定するためにも使用されることができることが可能性として考えられ、当業者によって理解される。言い換えると、ポアソンディスクＰは、１回、生成されることができ、次いで、種々の画像内の種々のビーズ位置のために使用されることができる。
【００４４】
次のステップでは、ポアソンディスクは、ビーズ位置と整列される。言い換えると、ポアソンディスクの中心は、ビーズ位置の中心と整列される。
【００４５】
次のステップでは、各サンプル点において、強度値が、抽出される。サンプル点の位置における強度値の抽出は、バイリニア補間を使用して抽出され、したがって、バイリニア強度抽出をもたらす。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態による、ポアソンディスクＰのサンプル点ｋにおける強度値を抽出するためのバイリニア補間は、図３を参照して例示的に示される。図３では、「Ｓ」として示されるサンプル点が、サブピクセルの精密位置Ｓ（ｘ０，ｙ０）におけるピクセル内にある。
図３では、
Ｓ＝（ｘ０，ｙ０）は、サンプル点Ｓの２次元サブピクセルの精密位置を示し、
Ｒ１１＝（ｘ１，ｙ１）は、左下近隣ピクセルを示し、
Ｒ２１＝（ｘ２，ｙ１）は、右下近隣ピクセルを示し、
Ｒ１２＝（ｘ１，ｙ２）は、左上近隣ピクセルを示し、
Ｒ２２＝（ｘ２，ｙ２）は、右上近隣ピクセルを示す。
さらに、以下の定義が、適用される。
【化１】
2019505884.tif 000003
これを背景として、以下の方程式が、定義される必要がある。
【化２−１】
2019505884.tif 000004
【化２−２】
2019505884.tif 000005
ピクセルの全長が２であることを考慮して、前述の述べられた方程式は、以下のように簡略化されることができる。
【化３】
2019505884.tif 000006
故に、強度は、バイリニア補間として導出されることができる
【化４】
2019505884.tif 000007
式中、
Ｉ（ｘ，ｙ）：＝画像内の（ｘ，ｙ）に位置するピクセルの明るさ
ｉｉｄ：＝サンプル点Ｓの強度値
【００４７】
そのような様式では、ｋサンプル点のサンプル点Ｓ毎の強度値が、判定される。
【００４８】
次のステップでは、ｋサンプル点にわたる中央値フィルタリングが、適用され、したがって、それぞれ、ポアソンディスク全体およびビーズ全体の強度値をもたらす。言い換えると、ビーズの全体的明るさは、その方法において判定されることができる。
【００４９】
図４は、本発明の好ましい実施形態による、デジタル画像内の少なくとも１つのオブジェクトの全体的明るさを判定するためのシステム１００を示す。
【００５０】
一般に、システム１００は、前述のように方法ステップを実施するように構成される。
【００５１】
システム１００は、ｋサンプル点を備える面積Ａを生成し、ｋ点は、青色雑音分布に従って面積Ａ内に分布される、生成ユニット１０１を備える。言い換えると、生成ユニット１０１は、ｋサンプル点を備える、ポアソンディスクＰを生成するように構成される。
【００５２】
ポアソンディスクＰの生成後、システム１００の整列ユニット１０２は、ポアソンディスクＰの中心位置とデジタル画像内のビーズの中心位置を整列させる。
【００５３】
その後、抽出ユニット１０３は、ｋサンプル点のそれぞれの強度値を抽出する。
【００５４】
ｋサンプル点の強度値を抽出後、システム１００の計算ユニット１０４は、個別のｋサンプル点における抽出された強度値の中央値を計算し、したがって、ビーズの全体的明るさをもたらす。
【００５５】
本発明は、図面および前述の説明において詳細に図示および説明されたが、そのような例証および説明は、例証的または例示的かつ非制限的と見なされるべきである。本発明は、したがって、開示される実施形態に限定されない。開示される実施形態の変形例は、図面、本開示、および添付の請求項の研究から、当業者ならびに請求される発明の実践者によって理解され、もたらされることができる。請求項では、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を備える）」は、他の要素またはステップを除外せず、不定冠詞「ａ」もしくは「ａｎ」は、複数形を除外せず、「少なくとも１つ」を意味し得る。
[参考文献]
【００５６】
【化５−１】
2019505884.tif 000008
【化５−２】
2019505884.tif 000009
【図１】
2019505884.tif 000010
【図２】
2019505884.tif 000011
【図３】
2019505884.tif 000012
【図４】
2019505884.tif 000013
【国際調査報告】
2019505884.tif 000014
2019505884.tif 000015
2019505884.tif 000016