(57)【要約】本発明は、卵白から異種タンパク質を精製する方法に関する。いくつかの実施態様において、本開示は異種タンパク質を含む卵白から異種タンパク質を精製する方法に関し、該方法は以下を含む；（ａ）卵白のｐＨをｐＨ５．８〜６．５に調整し、ｐＨ調整された卵白を形成する工程；（ｂ）（ａ）のｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程；（ｃ）（ｂ）の第１の濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第１の溶出液を回収する工程；（ｄ）（ｃ）の第１の溶出液のｐＨをｐＨ５．０〜５．６に調整し、ｐＨ調整された溶出液を形成する工程；（ｅ）ｐＨ調整された溶出液を濾過し、第２の濾液を得る工程；（ｆ）第２の濾液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、ｐＨ調整された第２の濾液を形成する工程；（ｇ）（ｆ）のｐＨ調整された第２の濾液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、中和溶液を形成する工程；（ｈ）中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質を含む卵白から異種タンパク質を精製する方法、ここで該方法は以下を含む；
ａ．卵白のｐＨをｐＨ５．８〜６．５に調整し、ｐＨ調整された卵白を形成する工程；
ｂ．（ａ）のｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程；
ｃ．（ｂ）の第１の濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第１の溶出液を回収する工程；
ｄ．（ｃ）の第１の溶出液のｐＨをｐＨ５．０〜５．６に調整し、ｐＨ調整された溶出液を形成する工程；
ｅ．ｐＨ調整された溶出液を濾過し、第２の濾液を得る工程；
ｆ．第２の濾液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、ｐＨ調整された第２の濾液を形成する工程；
ｇ．（ｆ）のｐＨ調整された第２の濾液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、中和溶液を形成する工程；
ｈ．中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程。
【請求項２】
（ｉ）第２の溶出液をナノ濾過に掛け、第３の濾液を形成する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｊ）第３の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第３の溶出液を回収する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
（ｋ）第３の溶出液を第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第４の溶出液を回収する工程をさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
（ｌ）第４の溶出液を限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）に掛ける工程をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
異種タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
治療用タンパク質がセベリパーゼアルファである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
卵白が１リットルを超える容量のプールされた卵白である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
卵白が１０リットルを超える容量のプールされた卵白である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
卵白が５０リットルを超える容量のプールされた卵白である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）のｐＨが５．９〜６．２である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）のｐＨが酸性緩衝液を用いて調整される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）のｐＨが、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸およびバルビツール酸からなる群から選択される酸性剤を含む酸性緩衝液を用いて調整される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
酸性緩衝液が約５Ｍ〜約６Ｍの酢酸塩を含む、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
酸性緩衝液が約５Ｍ〜約６Ｍの酢酸ナトリウムを含む、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１６】
酸性緩衝液が卵白１キログラム当たり約０．５重量％〜約２重量％である、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
酸性緩衝液のｐＨが約４．０〜約６．５である、請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
酸性緩衝液が（ａ）の卵白に少なくとも毎分約１％（重量／重量）の速度で添加される、請求項１２〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
卵白が、ｐＨを調整している間、同時に撹拌されている、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）の卵白が約２℃〜約２５℃である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ｐＨ調整された卵白の導電率が約８ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍである、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ｐＨ調整された卵白が上層、中間層および下層に分離するように、ｐＨ調整された卵白を沈降させることをさらに含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ｐＨ調整された卵白を遠心分離し、セベリパーゼアルファを含む分画を回収し、次いでセベリパーゼアルファを含む分画を（ｂ）の濾過に掛けることをさらに含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
中間層を単離し、単離した中間層を（ｂ）の濾過に掛ける工程をさらに含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
（ｂ）の濾過が、ｐＨ調整された卵白を約０．１μｍ〜約１００μｍの範囲の平均孔径を有するフィルターに通すことを含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
（ｂ）の濾過がｐＨ調整された卵白を複数のフィルターに通すことを含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
フィルターが少なくとも約２ｍ２の面積を含む、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
フィルターが少なくとも約８ｍ２の面積を含む、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
卵白が約３０ｐｓｉ未満の差圧下でフィルターを通過する、請求項２５〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
卵白が約１５ｐｓｉ未満の差圧下でフィルターを通過する、請求項２５〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
第１の濾液が室温に加温される、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
（ｃ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスが、フェニル、オクチルまたはブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスである、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
（ｃ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスが、フェニル疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスである、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
異種タンパク質が、塩勾配を減少させることによって疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから溶出される、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
（ｄ）のｐＨの調整が、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸およびバルビツール酸からなる群から選択される酸性剤を含む酸性緩衝液を用いて調整される、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
（ｄ）のｐＨがｐＨ５．２〜５．５に調整される、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
（ｅ）の濾過が、溶出した異種タンパク質を約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲の平均孔径を有するフィルターに通すことを含む、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
（ｅ）の濾過が、溶出した異種タンパク質を約０．５μｍ〜約５μｍの範囲の平均孔径を有するフィルターに通すことを含む、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
第２の濾液のｐＨが、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸およびバルビツール酸からなる群から選択される酸性剤を含む酸性緩衝液を用いて調整される、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
第２の濾液のｐＨがｐＨ３．５〜３．９に調整される、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
ｐＨ調整された第２の濾液のｐＨが１０分間〜４０分間維持される、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ｐＨ調整された第２の濾液が、アミン、アンモニア、炭酸塩、炭酸水素塩、ホウ酸塩およびリン酸塩からなる群から選択される塩基性剤を含む塩基性緩衝液を用いて、（ｇ）に従って中和される、請求項１〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスが、スルホン酸メチル基、ジエチルアミノエチル基またはアンモニウム基を含むマトリックスから選択される、請求項１〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
異種タンパク質が塩勾配の増加を用いて溶出される、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
（ｉ）のナノ濾過が、第２の溶出液を約０．０５μｍ〜約０．２μｍの平均孔径を有するフィルターに通すことを含む、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
（ｉ）のナノ濾過が、第２の溶出液を複数のナノフィルターに通すことを含む、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスが、第４級アンモニウム、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基またはジエチルアミノエチル基を含むマトリックスから選択される、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスが（ｃ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスとは異なっている、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスがブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスである、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
限外濾過／透析濾過が、第３の溶出液を約０．０２μｍ〜約０．４μｍの平均孔径を有するフィルターに通すことを含む、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
限外濾過／透析濾過が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの異種タンパク質濃度をもたらす、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
限外濾過／透析濾過がクエン酸緩衝液の使用を含む、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
異種タンパク質を含む卵白から異種タンパク質を精製する方法、ここで該方法は以下を含む；
ａ．卵白のｐＨをｐＨ５．８〜６．５に調整し、ｐＨ調整された卵白を形成する工程；
ｂ．（ａ）のｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程；
ｃ．（ｂ）の上清を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む溶出液を回収する工程；
ｄ．溶出液を濾過し、第２の濾液を得る工程；
ｅ．第２の濾液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、ｐＨ調整された第２の濾液を形成する工程；
ｆ．（ｅ）のｐＨ調整された第２の濾液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、中和溶液を形成する工程；
ｇ．（ｆ）の中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程；
ｈ．（ｇ）の第２の溶出液をナノ濾過に掛け、異種タンパク質を含む第３の濾液を形成する工程；
ｉ．第３の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第３の溶出液を回収する工程；
ｊ．第３の溶出液を第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第４の溶出液を回収する工程；
ｋ．第４の溶出液を限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）に掛ける工程。
【請求項５４】
異種タンパク質が治療用タンパク質である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
治療用タンパク質がセベリパーゼアルファである、請求項５３または５４記載の方法。
【請求項５６】
異種タンパク質を含む卵白から異種タンパク質を精製する方法、ここで該方法は以下を含む；
ａ．卵白のｐＨをｐＨ５．８〜６．５に調整し、ｐＨ調整された卵白を形成する工程；
ｂ．（ａ）のｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程；
ｃ．（ｂ）の第１の濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第１の溶出液を回収する工程；
ｄ．溶出液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、異種タンパク質を含むｐＨ調整された溶出液を形成する工程；
ｅ．（ｄ）のｐＨ調整された溶出液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、異種タンパク質を含む中和溶液を形成する工程；
ｆ．中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程。
【請求項５７】
（ｇ）第２の溶出液をナノ濾過に掛け、異種タンパク質を含む第３の濾液を形成する工程をさらに含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
（ｈ）第３の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、第３の溶出液を回収する工程をさらに含む、請求項５６または５７記載の方法。
【請求項５９】
（ｉ）溶出液を第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第４の溶出液を回収する工程をさらに含む、請求項５６〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
（ｊ）第４の溶出液を限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）に掛ける工程をさらに含む、請求項５６〜５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
請求項１〜６０のいずれかに記載の工程によって生成した生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年８月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは００５４−０００１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、３，６７１バイトのサイズである。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、卵白から異種タンパク質を精製する方法に関する。いくつかの実施態様において、本開示は異種タンパク質を含む卵白から異種タンパク質を精製する方法に関し、該方法は以下を含む：（ａ）卵白のｐＨをｐＨ５．８〜６．５に調整し、ｐＨ調整された卵白を形成する工程；（ｂ）（ａ）のｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程；（ｃ）（ｂ）の第１の濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第１の溶出液を回収する工程；（ｄ）（ｃ）の第１の溶出液のｐＨをｐＨ５．０〜５．６に調整し、ｐＨ調整された溶出液を形成する工程；（ｅ）ｐＨ調整された溶出液を濾過し、第２の濾液を得る工程；（ｆ）第２の濾液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、ｐＨ調整された第２の濾液を形成する工程；（ｇ）（ｆ）のｐＨ調整された第２の濾液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、中和溶液を形成する工程；（ｈ）中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子組み換え鳥類（例えば遺伝子組み換えニワトリ、ウズラまたはシチメンチョウ）は、大量のタンパク質供給を必要とする医薬品またはその他の商業的用途において使用される異種タンパク質を得るための望ましい発現系である。雌鳥は年間３３０個もの卵を産むことができ、それぞれが６．５グラムのタンパク質を含む。全タンパク質の約３．５グラムが卵白由来であり、その９０％は７種のタンパク質によって占められる；オボアルブミンは単独で卵白タンパク質の２グラム（卵白タンパク質の約５０％）を占める。現在、導入遺伝子の卵管特異的発現に由来し、卵白から回収される平均の異種タンパク質は、卵１個あたり約５〜１０ｍｇであることが知られている。ニワトリの卵における異種タンパク質産生の利点には、短い世代時間および人工授精を介する高い再生産率が含まれる。様々なタンパク質が遺伝子組み換えニワトリの卵において発現されている。例えば、米国特許第６，７３０，８２２号および米国特許出願公開第２００６／００１５９６０号を参照。
【０００４】
多くの治療用異種タンパク質（例えば、サイトカイン（例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣ−ＳＦ）、インターフェロン、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、抗体、ならびに様々なヒトリソソーム酵素などの組換えヒトタンパク質）が医薬品業界の興味の対象となっている。治療用タンパク質は、例えば遺伝子組み換えニワトリの卵白から容易に大量に取得できる。しかしながら、異種タンパク質を卵白から単離する従来の方法は多くの場合、免疫親和性の手法、または小規模産生のみに適した（例えば、最大で５Ｌの全卵白容量を含む）他の手法の使用に依存している。大規模なタンパク質産生のためには、そのような手法は費用、労力および時間に基づいて実用的でない。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書は、本明細書で開示される方法を用いて卵白から異種タンパク質を精製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本開示は異種タンパク質を含む卵白から異種タンパク質を精製する方法に関し、該方法は以下を含む：（ａ）卵白のｐＨをｐＨ５．８〜６．５に調整し、ｐＨ調整された卵白を形成する工程；（ｂ）（ａ）のｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程；（ｃ）（ｂ）の第１の濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第１の溶出液を回収する工程；（ｄ）（ｃ）の第１の溶出液のｐＨをｐＨ５．０〜５．６に調整し、ｐＨ調整された溶出液を形成する工程；（ｅ）ｐＨ調整された溶出液を濾過し、第２の濾液を得る工程；（ｆ）第２の濾液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、ｐＨ調整された第２の濾液を形成する工程；（ｇ）（ｆ）のｐＨ調整された第２の濾液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、中和溶液を形成する工程；（ｈ）中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程。
【０００６】
いくつかの実施態様において、本方法は、（ｉ）第２の溶出液をナノ濾過に掛け、第３の濾液を形成する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、（ｊ）第３の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第３の溶出液を回収する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、（ｋ）第３の溶出液を第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第４の溶出液を回収する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、（ｌ）第４の溶出液を限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）に掛ける工程をさらに含む。
【０００７】
様々なタンパク質が本開示に従って精製され得る。いくつかの実施態様において、異種タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施態様において、治療用タンパク質はセベリパーゼアルファである。
【０００８】
いくつかの実施態様において、本開示の卵白は１リットルを超える容量のプールされた卵白である。いくつかの実施態様において、卵白は１０リットルを超える容量のプールされた卵白である。いくつかの実施態様において、卵白は５０リットルを超える容量のプールされた卵白である。
【０００９】
（ａ）の工程の卵白のｐＨは調整され得る。いくつかの実施態様において、（ａ）のｐＨは５．９〜６．２である。いくつかの実施態様において、（ａ）のｐＨは酸性緩衝液を用いて調整される。いくつかの実施態様において、（ａ）のｐＨは、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸およびバルビツール酸からなる群から選択される酸性剤を含む酸性緩衝液を用いて調整される。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は約５Ｍ〜約６Ｍの酢酸塩を含む。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は約５Ｍ〜約６Ｍの酢酸ナトリウムを含む。
【００１０】
いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は卵白１キログラム当たり約０．５重量％〜約２重量％である。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液のｐＨは約４．０〜約６．５である。
【００１１】
緩衝液は様々な速度で卵白に添加され得る。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は（ａ）の卵白に少なくとも毎分約１％（重量／重量）の速度で添加される。いくつかの実施態様において、卵白はｐＨが調整されている間、同時に撹拌されている。
【００１２】
いくつかの実施態様において、卵白はｐＨが調整されている間、同時に撹拌されている。いくつかの実施態様において、（ａ）の卵白は約２℃〜約２５℃である。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白の導電率は約８ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍである。いくつかの実施態様において、本方法は、卵白が上層、中間層および下層に分離するように、ｐＨ調整された卵白を沈降させることを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、中間層を単離し、単離した中間層を（ｂ）の濾過に掛ける工程を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本方法はｐＨ調整された卵白を濾過することを含む。いくつかの実施態様において、（ｂ）の濾過は、ｐＨ調整された卵白を約０．１μｍ〜約１００μｍの範囲の平均孔径を有するフィルターに通すことを含む。いくつかの実施態様において、（ｂ）の濾過は、ｐＨ調整された卵白を複数のフィルターに通すことを含む。いくつかの実施態様において、フィルターは少なくとも約２ｍ２の面積を含む。いくつかの実施態様において、フィルターは少なくとも約８ｍ２の面積を含む。いくつかの実施態様において、卵白は約３０ｐｓｉ未満の差圧下でフィルターを通過する。いくつかの実施態様において、卵白は約１５ｐｓｉ未満の差圧下でフィルターを通過する。
【００１４】
いくつかの実施態様において、第１の濾液は室温に加温される。いくつかの実施態様において、（ｃ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスは、フェニル、オクチルまたはブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスである。いくつかの実施態様において、（ｃ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスは、フェニル疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスである。
【００１５】
いくつかの実施態様において、異種タンパク質は、塩勾配を減少させることによって疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスから溶出される。
【００１６】
いくつかの実施態様において、（ｄ）のｐＨの調整は、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸およびバルビツール酸からなる群から選択される酸性剤を含む酸性緩衝液を用いて調整される。いくつかの実施態様において、（ｄ）のｐＨはｐＨ５．２〜５．５に調整される。
【００１７】
いくつかの実施態様において、（ｅ）の濾過は、溶出した異種タンパク質を約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲の平均孔径を有するフィルターに通すことを含む。いくつかの実施態様において、（ｅ）の濾過は、溶出した異種タンパク質を約０．５μｍ〜約５μｍの範囲の平均孔径を有するフィルターに通すことを含む。
【００１８】
いくつかの実施態様において、第２の濾液のｐＨは、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸およびバルビツール酸からなる群から選択される酸性剤を含む酸性緩衝液を用いて調整される。いくつかの実施態様において、第２の濾液のｐＨはｐＨ３．５〜３．９に調整される。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された第２の濾液のｐＨは１０分間〜４０分間維持される。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された第２の濾液は、アミン、アンモニア、炭酸塩、炭酸水素塩、ホウ酸塩およびリン酸塩からなる群から選択される塩基性剤を含む塩基性緩衝液を用いて、（ｇ）に従って中和される。
【００１９】
いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、スルホン酸メチル基、ジエチルアミノエチル基またはアンモニウム基を含むマトリックスから選択される。いくつかの実施態様において、異種タンパク質は塩勾配の増加を用いて溶出される。
【００２０】
いくつかの実施態様において、（ｉ）のナノ濾過は、第２の溶出液を約０．０５μｍ〜約０．２μｍの平均孔径を有するフィルターに通すことを含む。いくつかの実施態様において、（ｉ）のナノ濾過は、第２の溶出液を複数のナノフィルターに通すことを含む。
【００２１】
いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、第４級アンモニウム、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基およびジエチルアミノエチル基を含むマトリックスから選択される。
【００２２】
いくつかの実施態様において、第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスは、（ｃ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスとは異なる。いくつかの実施態様において、第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスはブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスである。
【００２３】
いくつかの実施態様において、限外濾過／透析濾過は、第３の溶出液を約０．０２μｍ〜約０．４μｍ、または約０．０５μｍ〜約０．４μｍの平均孔径を有するフィルターに通すことを含む。いくつかの実施態様において、限外濾過／透析濾過は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの異種タンパク質濃度をもたらす。いくつかの実施態様において、限外濾過／透析濾過はクエン酸緩衝液の使用を含む。
【００２４】
いくつかの実施態様において、本開示は異種タンパク質を含む卵白から異種タンパク質を精製する方法に関し、該方法は以下を含む；（ａ）卵白のｐＨをｐＨ５．８〜６．５に調整し、ｐＨ調整された卵白を形成する工程；（ｂ）（ａ）のｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程；（ｃ）（ｂ）の上清を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む溶出液を回収する工程；（ｄ）溶出液を濾過し、第２の濾液を得る工程；（ｅ）第２の濾液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、ｐＨ調整された第２の濾液を形成する工程；（ｆ）（ｅ）のｐＨ調整された第２の濾液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、中和溶液を形成する工程；（ｇ）（ｆ）の中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程；（ｈ）（ｇ）の第２の溶出液をナノ濾過に掛け、異種タンパク質を含む第３の濾液を形成する工程；（ｉ）第３の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第３の溶出液を回収する工程；（ｊ）第３の溶出液を第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第４の溶出液を回収する工程；および（ｋ）第４の溶出液を限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）に掛ける工程。いくつかの実施態様において、異種タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施態様において、治療用タンパク質はセベリパーゼアルファである。
【００２５】
いくつかの実施態様において、本開示は異種タンパク質を含む卵白から異種タンパク質を精製する方法に関し、該方法は以下を含む；（ａ）卵白のｐＨをｐＨ５．８〜６．５に調整し、ｐＨ調整された卵白を形成する工程；（ｂ）（ａ）のｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程；（ｃ）（ｂ）の第１の濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第１の溶出液を回収する工程；（ｄ）溶出液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、異種タンパク質を含むｐＨ調整された溶出液を形成する工程；（ｅ）（ｄ）のｐＨ調整された溶出液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、異種タンパク質を含む中和溶液を形成する工程；（ｆ）中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程。
【００２６】
いくつかの実施態様において、本方法は、（ｇ）第２の溶出液をナノ濾過に掛け、異種タンパク質を含む第３の濾液を形成する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、（ｈ）第３の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、第３の溶出液を回収する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、（ｉ）溶出液を第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第４の溶出液を回収する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、（ｊ）第４の溶出液を限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）に掛ける工程をさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施態様において、本方法は本明細書に記載されたプロセスによって生成した生成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本技術の上述および他の特徴および態様は、以下の実施例の記載から、および添付の図面で説明されるように、より良く理解され得る。添付の図面（これは本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する）はさらに、本技術の原理を説明するのに役立つ。
【００２９】
【図１】異種タンパク質であるセベリパーゼアルファの精製プロセスの概略図。
【００３０】
【図２】卵の収集および実施例１のセベリパーゼアルファを含む遺伝子組換え卵の卵白の回収の略図。
【００３１】
【図３】卵白溶液の粘度を減少させるために使用される、実施例１の清澄化プロセスの略図。
【００３２】
【図４】卵白タンパク質不純物のレベルを減少させるために使用される、実施例１のフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィープロセスの略図。
【００３３】
【図５】半加工卵白のための実施例１に概説される低ｐＨ沈殿／濾過および低ｐＨウイルス不活性化プロセスの略図。
【００３４】
【図６】タンパク質不純物を除去するための、およびウイルス排除の工程としての実施例１における陽イオン交換クロマトグラフィープロセスの略図。
【００３５】
【図７】ウイルス排除の工程として使用される、実施例１の陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスからの溶出液のナノ濾過プロセスの略図。
【００３６】
【図８】実施例１のナノ濾過からの生成物の陰イオン交換クロマトグラフィーの略図。
【００３７】
【図９】洗練の工程として使用される、実施例１の陰イオン交換クロマトグラフィープロセスからの生成物のブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーの略図。
【００３８】
【図１０】実施例１におけるセベリパーゼアルファを濃縮するために使用される、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィープロセスからの生成物の限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）の略図。
【００３９】
【図１１】実施例１において、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィープロセスによって生じた生成物からのセベリパーゼアルファを含む限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）生成物の濃度を調整するための、製剤化および原薬を充填する工程の略図。
【００４０】
【図１２】セベリパーゼアルファの完全長配列（配列番号１）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書に示され、記載されている特定の実施は例示であり、いかなる方法においても本願の範囲を限定することは意図されていないことが理解されるはずである。
【００４２】
本明細書で参照される公開された特許、特許出願、ウェブサイト、会社名および特定の文献は、それぞれが参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示されたのと同じ程度で、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で引用されるあらゆる参考文献と本明細書の具体的な教示との間のあらゆる矛盾は、後者を支持して解決されるべきである。同様に、当分野で理解される単語または語句の定義と本明細書において具体的に教示される単語または語句の定義との間のあらゆる矛盾は、後者を支持して解決されるべきである。
【００４３】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」はまた、その内容に明らかな他の指示がない限り、それらが指す用語の複数形を明確に包含する。用語「約」は本明細書において、おおよそ、ほぼ、大体、またはおよそを意味するように使用される。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用される場合、この用語は記載される数値の上限および下限を拡張することによって、その範囲を改変する。一般に、用語「約」は２０％の変動によって、記載される値よりも大きい数値および小さい数値に改変するように本明細書で使用される。
【００４４】
本明細書で使用される技術的用語および科学的用語は他に定義されていない限り、本願に関連する分野の当業者に通常理解される意味を有する。本明細書において、参照は当業者に公知の様々な方法論および物質のためにもたらされる。本明細書において引用されるあらゆる文書の開示は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４５】
用語「精製する」は、異種タンパク質を卵白中に存在する１以上の他の不純物または成分から単離するために行われる方法または工程を意味する。分離される成分には、卵白中に存在する他のタンパク質、所望の異種タンパク質の凝集体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、エンドトキシンおよびウイルスが含まれる。
【００４６】
精製の工程は、（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー樹脂、または分子ふるいクロマトグラフィーの使用を介して）所望の異種タンパク質または混入物質のいずれかを結合する樹脂、膜または他のあらゆる固相担体を用いて実行され得る。異種タンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（本明細書に記載のいずれかのクロマトグラフィーカラムなど）を用いて、異種タンパク質を含む溶液から精製され得る。
【００４７】
本開示は、（例えば、遺伝子組換えニワトリが産んだ卵から得られる）卵白から異種タンパク質を精製する効率的な方法に関する。開示される本方法は、卵白から異種タンパク質（例えば組換えタンパク質）をクロマトグラフィーによって大量に単離するのに特に有用である。開示される本方法は、均一で低粘度の卵白溶液およびその後の所望の異種タンパク質を効率的に単離するプロセスを提供する。このプロセスは、卵白から治療用異種タンパク質を処理するのに特に適している。
【００４８】
精製中のｐＨ調整
当業者は、いくつかのｐＨ調整がタンパク質精製中に一般的に使用されることを知っているが、本開示は、特定のプロセス中の特定のｐＨ調整が卵白から異種タンパク質を精製する場合（特に大量の卵白が使用される場合）に特に有利であることを開示する。
【００４９】
いくつかの実施態様において、本発明の開示は、卵白の精製プロセスのあらゆる箇所における様々な特定のプロセス中にｐＨを調整することが、処理される卵白容量の増加および精製される異種タンパク質の量の増加を可能にし得ることを見出した。いくつかの実施態様において、本発明の開示は、様々な精製プロセス中にｐＨを調整することが、所望の異種タンパク質の精製効率の増大、費用の削減および／または時間の短縮を可能にし得ることを見出した。本明細書に記述されるｐＨ調整は、精製プロセスの１以上の有利な態様を達成し得る。例えば、いくつかの実施態様において、ｐＨは清澄化中にプールされた卵白の粘度をより低下させるために調整され得、第１の溶出液のｐＨは疎水性カラム後にタンパク質不純物を沈殿させるために調整され得、第２の濾液のｐＨは不純物を除去し、ウイルスを不活性化するために調整され得、およびｐＨ調整された第２の濾液のｐＨは濾液を調整し、クロマトグラフィーマトリックス（例えば陽イオン交換マトリックス）に掛けるために中和され得る。
【００５０】
いくつかの実施態様において、ｐＨは精製プロセスにおける４つのプロセス中に調整される：（１）卵白のｐＨを調整し、ｐＨ調整された卵白を形成するプロセス；（２）第１の溶出液のｐＨを調整し、ｐＨ調整された第１の溶出液を形成するプロセス；（３）第２の濾液のｐＨを調整し、ｐＨ調整された第２の濾液を形成するプロセス；および（４）第２の濾液のｐＨを中和し、中和溶液を形成するプロセス。
【００５１】
いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白のｐＨは、ｐＨ調整された卵白の粘度がより低くなるような値である。例えば、清澄化の工程における混合およびプールされた卵白は少なくとも約５（例えば、少なくとも約５．２、少なくとも約５．４、少なくとも約５．６、少なくとも約５．７、少なくとも約５．８、または少なくとも約５．９）および／または最大で約６．５（例えば、最大で約６．３、最大で約６．２、または最大で約６．１）のｐＨを有し得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は５．８〜６．５のｐＨを有し得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は５．９〜６．２のｐＨを有し得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は約６のｐＨを有し得る。理論に拘束されることを意図しないが、このようなｐＨ（例えば約６）は重力下で沈降する最大量の卵白由来沈殿物の形成を可能にし得ると考えられ、これにより濾過の必要性を低減し、均一で低粘度の卵白溶液の形成を促進する。いくつかの実施態様において、ｐＨは清澄化のプロセス全体にわたって維持される（すなわち、ｐＨは卵白が疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛けられるまで維持される）。いくつかの実施態様において、プールされた卵白のｐＨは卵白が濾過されるまで維持される。いくつかの実施態様において、プールされた卵白のｐＨは不純物の沈殿が十分に達成されるまで維持される。
【００５２】
いくつかの実施態様において、第１の溶出液のｐＨは、ウイルス不活性化プロセスの前にタンパク質不純物が沈殿するような値である。例えば、第１の溶出液のｐＨは、少なくとも約５〜約５．６（例えば、少なくとも約５．１、少なくとも約５．２、少なくとも約５．３、少なくとも約５．４、少なくとも約５．５、または少なくとも約５．６）および／または最大で約５．６のｐＨを有し得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は５．２〜５．５のｐＨを有し得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は約５．４のｐＨを有し得る。理論に拘束されることを意図しないが、このようなｐＨ（例えば約５．４）は細胞性不純物（例えばタンパク質）を沈殿させ得、ウイルス不活性化の工程の前にそれらは濾過によって除去され得ると考えられる。いくつかの実施態様において、このプロセス中の細胞性不純物の減少は、下流の処理のために物質の容量をより大きくすることを可能にする。いくつかの実施態様において、このプロセス中の細胞性不純物の減少は、下流の処理における効率をより高くすること（例えば、より速い精製、より安価な精製、より高純度の精製など）を可能にする。いくつかの実施態様において、第１の溶出液のｐＨは第１の溶出液が濾過されるまで維持される。いくつかの実施態様において、第１の溶出液のｐＨは、溶出液がウイルス不活性化プロセスを受けるまで維持される。
【００５３】
いくつかの実施態様において、第２の溶出液のｐＨは、ウイルス不活性化を生じるような値である。例えば、第２の溶出液のｐＨは、４．５未満、４．３未満または４．０未満のｐＨを有し得る。いくつかの実施態様において、第２の溶出液は、約２〜約４、約２．２〜約３．９、約２．５〜約３．９、約２．７〜約３．９、約３〜約３．９、約３．３〜約３．９、または約３．５〜約３．９のｐＨを有し得る。いくつかの実施態様において、第２の溶出液は約３．０〜約４．０のｐＨに調整され得る。理論に拘束されることを意図しないが、このようなｐＨ（例えば約３〜約４）は、ウイルスコートタンパク質を変性させることによって様々なウイルスおよびウイルス様粒子を不活性化できると考えられる。
【００５４】
一般に、酸性緩衝液に使用される酸性剤およびその塩の量は、酸性緩衝液の望ましいｐＨおよび精製プロセスに依存して様々であり得る。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は、約２．５〜約６．５、約３〜約６．５、約３．５〜約６．５、または約４．０〜約６．５（例えば、約４〜約５または約４〜約４．５）のｐＨを有し得る。例えば、酸性緩衝液は約４のｐＨまたは約４．５のｐＨを有し得る。
【００５５】
酸性緩衝液のｐＨ、濃度および同一性は、１以上の精製プロセスについて同一のままであってもよく、様々であってもよい。例えば、酸性緩衝液のｐＨ、濃度および同一性は、清澄化プロセス、タンパク質沈殿のプロセス、ウイルス不活性化プロセス、および中和プロセスの間で様々であってもよい。いくつかの実施態様において、同一の酸性緩衝液が各精製プロセスで使用される。いくつかの実施態様において、２以上の酸性緩衝液が単一の精製プロセス中に使用され得る。
【００５６】
一般に、酸性緩衝液中の酸性剤は適切なあらゆる酸（例えば有機酸または無機酸）であり得る。例示的な酸性剤には、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸およびバルビツール酸が含まれる。いくつかの実施態様において、２以上（例えば３つまたは４つ）の酸の組合せが酸性緩衝液中の酸性剤として使用され得る。
【００５７】
いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は１以上の塩（例えばアルカリ塩）を含み得る。このような塩の例は、酢酸ナトリウムであり得る。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液に使用される塩は、酸性緩衝液に使用される酸性剤の塩であり得る。他の実施態様において、酸性緩衝液に使用される塩は、酸性緩衝液に使用される酸性剤とは異なる酸の塩であり得る。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は約５Ｍ〜約６Ｍ（例えば約５．７Ｍ）の塩（例えば酢酸ナトリウム）を含み得る。理論に拘束されることを意図しないが、このような濃度を有する塩の使用は、適切な量の緩衝剤の含有量を有する酸性緩衝液をもたらし得ると考えられる。緩衝剤の含有量が高すぎると、酸性緩衝液は可燃性および／または腐食性となり得、これは緩衝液を維持、処理および／または保存するのに危険なものとし得る。緩衝剤の含有量が低すぎると、卵白のｐＨを目標値に調節するためにより大きな容量の酸性緩衝液が必要となり得、これにより卵白調製のプロセスおよび下流のタンパク質単離／精製プロセスの効率が減少し得る。
【００５８】
酸性緩衝液は、当分野で公知のあらゆる適切な方法によって形成され得る。例えば酸性緩衝液は、塩基を含む溶液に酸性剤を添加し、溶液のｐＨを所望の値に調節することによって形成され得る。例えば、氷酢酸溶液を適切な量のＮａＯＨに添加し、５．７Ｍ酢酸ナトリウムを含む酸性緩衝液を得てもよい。
【００５９】
一般に、酸性緩衝液の量は添加される精製産物（例えば、清澄化プロセスのプールされた卵白、第１の溶出液、第２の濾液またはｐＨ調整された第２の濾液など）の量と比較して少ない。例えば酸性緩衝液は、精製産物１キログラム当たり約０．５重量％〜約５重量％（例えば、約０．５重量％〜約２重量％、約０．７重量％〜１．５重量％、約０．９重量％〜約１．４重量％、約１重量％〜約１．４％、または約１．１重量％〜約１．３重量％）であり得る。従来、少量の酸性緩衝液の添加が卵白のｐＨを目標値に調整するのに有効であることは想定されていなかったため、プールされた卵白から大量のクロマトグラフィー処理を用いて異種タンパク質を精製する試みは、卵白容量の２〜５倍（すなわち２００％〜５００％）の容量の酸性緩衝液の添加を必要としていた。このようなプロセスは、卵白調製のプロセスで使用されるクロマトグラフィーカラムおよび他の製造装置のサイズ制限のため、大規模製造において経済的に実用的または現実的ではない。意外にも本発明者らは、大量のクロマトグラフィー処理が精製産物の量と比較して少量の酸性緩衝液（例えば、精製産物１キログラム当たり最大約５重量％）を添加することによって達成され得ることを発見し、これによりクロマトグラフィー単離プロセスで使用されるカラムの量、これらのプロセスで使用される他の装置のサイズ、ならびに異種タンパク質を卵白から単離する費用および時間が大幅に減少した。
【００６０】
理論に拘束されることを意図しないが、精製産物の量に対して比較的少量の酸性緩衝液を添加することのさらなる利点には、（１）精製産物のごくわずかな希釈、（２）導電率が本質的に変化しないこと（これはオボムチン−リゾチーム複合体の沈殿を可能にし、そしてより低いｐＨ範囲（例えば、ｐＨ５〜６．５）で卵白の粘度を減少させ、濾過およびクロマトグラフィーのプロセス中に望ましくない物質を卵白から分離するのを促進する）、および（３）異種タンパク質を損傷し、または精製産物の不均一なｐＨをもたらす可能性がある精製産物内の低ｐＨポケットの形成を最小化することが含まれると考えられる。
【００６１】
一般に、酸性緩衝液は約８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有し得る。例えば、酸性緩衝液は、少なくとも約８ｍＳ／ｃｍ（例えば、少なくとも約９ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１２ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１３ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１４ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１５ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１６ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１７ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１８ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１９ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約２０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約２１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約２２ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約２３ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約２４ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約２５ｍＳ／ｃｍ）および／または最大で約４０ｍＳ／ｃｍ（例えば、最大で約３９ｍＳ／ｃｍ、最大で約３８ｍＳ／ｃｍ、最大で約３７ｍＳ／ｃｍ、最大で約３６ｍＳ／ｃｍ、最大で約３５ｍＳ／ｃｍ、最大で約３４ｍＳ／ｃｍ、最大で約３３ｍＳ／ｃｍ、最大で約３２ｍＳ／ｃｍ、最大で約３１ｍＳ／ｃｍ、最大で約３０ｍＳ／ｃｍ、最大で約２９ｍＳ／ｃｍ、最大で約２８ｍＳ／ｃｍ、最大で約２７ｍＳ／ｃｍ、最大で約２６ｍＳ／ｃｍ、または最大で約２５ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有し得る。例えば、酸性緩衝液は約８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍの間の任意の値の導電率を有し得る。理論に拘束されることを意図しないが、約８ｍＳ／ｃｍ〜約４０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する酸性緩衝液の使用は、単離工程で使用されるカラムクロマトグラフィーの単離条件を変更することなく、およびさらなる沈殿または凝集を生ずることなく、そのプロセスが下流のタンパク質の単離工程と共に実施および合理化され得るように、精製産物（例えば卵白）の導電率の変化を最小限に抑えると考えられる。
【００６２】
いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は精製産物に単回ボーラス投与で添加され得る。いくつかの実施態様において、単回ボーラス投与は適切な注入速度（例えば少なくとも約１Ｌ／分）で行われ、酸性緩衝液の添加を適切な時間内（例えば、最大で約５分）に添加することを保証する。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は、少なくとも毎分約１％（重量／重量）、毎分２％（重量／重量）、毎分３％（重量／重量）、毎分４％（重量／重量）、毎分５％（重量／重量）、毎分１０％（重量／重量）、毎分２０％（重量／重量）、または毎分３０％（重量／重量）の速度で添加される。理論に拘束されることを意図しないが、単回ボーラス投与を使用する利点には、（１）清澄化中に重力下で容易に沈降する比較的大きな凝集を形成し、それにより大きなフィルターの必要性を減少させること、および（２）酸または塩基の繰り返しの添加を引き起こす誤ったｐＨの読み取りを生じ得、そして精製産物中の異種タンパク質を損傷する可能性がある、精製産物の連続滴定の必要性を回避することが含まれ得ると考えられる。
【００６３】
いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は精製産物中に一定期間滴定され得る。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液は、精製産物中の意図しない高濃度の酸性緩衝液を減少させるために、精製産物を混合しながら添加される。
【００６４】
いくつかの実施態様において、酸性緩衝液を精製産物に添加した後、精製産物は適切な温度（例えば２〜８℃、８〜１５℃、１５〜２０℃または２０〜３０℃）で混合される。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液を精製産物に添加した後、精製産物は２〜８℃で混合される。いくつかの実施態様において、酸性緩衝液の添加と卵白の混合は同時に行われる。
【００６５】
一般に、精製産物（例えばｐＨ調整された卵白）は（例えば、酸性緩衝液で処理されていない卵白の導電率に類似した）比較的低い導電率を有する。例えば、精製産物（例えばｐＨ調整された卵白）は、少なくとも約８ｍＳ／ｃｍ（例えば、少なくとも約８．２ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約８．４ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約８．６ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約８．８ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約９ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約９．２ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約９．４ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約９．６ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約９．８ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１２ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１３ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも約１４ｍＳ／ｃｍ）および／または最大で約２０ｍＳ／ｃｍ（例えば、最大で約１９ｍＳ／ｃｍ、最大で約１８ｍＳ／ｃｍ、最大で約１７ｍＳ／ｃｍ、最大で約１６ｍＳ／ｃｍ、最大で約１５ｍＳ／ｃｍ、最大で約１４ｍＳ／ｃｍ、最大で約１３ｍＳ／ｃｍ、最大で約１２ｍＳ／ｃｍ、最大で約１１．８ｍＳ／ｃｍ、最大で約１１．６ｍＳ／ｃｍ、最大で約１１．４ｍＳ／ｃｍ、最大で約１１．２ｍＳ／ｃｍ、最大で約１１ｍＳ／ｃｍ、最大で約１０．８ｍＳ／ｃｍ、最大で約１０．６ｍＳ／ｃｍ、最大で約１０．４ｍＳ／ｃｍ、最大で約１０．２ｍＳ／ｃｍ、または最大で約１０ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有し得る。例えば、精製産物（例えばｐＨ調整された卵白）は、約８ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍの間の任意の値の導電率を有し得る。理論に拘束されることを意図しないが、精製産物（例えばｐＨ調整された卵白）を約８ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍの導電率で保持することは、精製産物がこの工程で使用されるカラムクロマトグラフィーの単離条件を変化させることなく単離工程において一貫して使用され得るように、精製産物を下流のタンパク質の単離工程において使用される条件に適合させることを可能にすると考えられる。
【００６６】
いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は粘度が減少しており、濾過ケーキング(filter caking)の減少に役立つ。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は、速度制御されたレオメータ（例えば、Ｒｈｅｏｌｙｓｔ、ＡＲ−１０００−Ｎ型、TA Instruments、New Castle、DE）を用いて決定される、０．０１Ｐａ／ｓ未満、０．００５Ｐａ／ｓ未満、０．００２Ｐａ／ｓ未満、または０．００１Ｐａ／ｓ未満の粘度を有する。
【００６７】
精製プロセス
本発明の開示は精製プロセスの数に関し、これらは共に実行される場合、異種タンパク質の効率的な精製をもたらす。これらのプロセスは、必ずしも限定されないが、（１）清澄化プロセス、（２）疎水性相互作用クロマトグラフィープロセス、（３）ウイルス不活性化プロセス、および（４）陰イオン交換プロセスを含む。精製プロセスはさらに、ナノ濾過プロセス、陰イオン交換プロセス、第２の疎水性交換プロセス、および／または限外濾過／透析濾過プロセスを含み得る。本明細書に記述されるプロセスは様々な操作の順序（例えば、ウイルス不活性化プロセスは陰イオン交換プロセス前または後のいずれかにおいて実行され得る）で使用され得るが、一般的に清澄化プロセスは残りのあらゆるプロセスの前に存在する。いくつかの実施態様において、本開示は、（１）清澄化プロセス、（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）プロセス、（３）ウイルス不活性化プロセス、および（４）陰イオン交換プロセスを含む、操作の特定の順序を提供する。本開示を理解する当業者はまた、記載されている各精製プロセスの間に他のプロセスが含まれ得ることを理解する。例えば本明細書に開示されるように、さらなる濾過プロセスが清澄化プロセスとＨＩＣプロセスとの間、およびＨＩＣプロセスとウイルス不活性化プロセスとの間に存在し得る。
【００６８】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法の開始物質として使用される卵白は、卵白に対して外来性の組換えタンパク質（例えば異種タンパク質、例えば治療用組換えタンパク質）を含み得る。例示的な異種タンパク質には、サイトカイン（ＧＣ−ＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、エリスロポエチン、およびインターフェロンαまたはインターフェロンβなどのインターフェロンなど）；ヒトリソソーム酵素；免疫グロブリン（例えば抗体）；および構造タンパク質が含まれる。大量のクロマトグラフィー処理から単離され得る他の例示的な異種タンパク質は、例えば米国特許出願公開第２００９／０２９９０３７号および第２０１５／０３０７５４７号に記載されている。
【００６９】
いくつかの実施態様において、異種タンパク質はセベリパーゼアルファである。セベリパーゼアルファは、ｒｈＬＡＬ遺伝子を保有する遺伝子組換えセキショクヤケイの雌鳥からの卵の卵白から精製され得る。セベリパーゼアルファは６つのＮ結合型グリコシル化部位を含む単量体糖タンパク質であり、約５５，０００ダルトンの分子量を有する。セベリパーゼアルファのアミノ酸配列はヒトＬＡＬのアミノ酸配列と同一である。セベリパーゼアルファは、例えば米国特許第８，６６３，６３１号およびＷＯ２０１１／１３３９６０に記述されるようにカヌマ(Alexion, New Haven CT)という商品名で市販されている。
【００７０】
一般に、本明細書に記載される卵白から異種タンパク質を精製する方法は、（１）酸性剤を含む適切な量の酸性緩衝液（例えば、卵白１キログラム当たり約０．５重量％〜約５重量％）を（例えば少なくとも約１０リットルの容量を有する）卵白のプールに添加し、約５．８〜６．５の範囲のｐＨを有するｐＨ調整された卵白を形成するように混合する工程、（２）ｐＨ調整された卵白を濾過し、第１の濾液を回収する工程、（３）第１の濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第１の溶出液を回収する工程；（ｄ）（ｃ）の第１の溶出液のｐＨをｐＨ５．０〜５．６に調整し、ｐＨ調整された溶出液を形成する工程；（ｅ）ｐＨ調整された溶出液を濾過し、第２の濾液を得る工程；（ｆ）第２の濾液のｐＨをｐＨ３．０〜４．０に調整し、ｐＨ調整された第２の濾液を形成する工程；（ｇ）（ｆ）のｐＨ調整された第２の濾液をｐＨ５．０〜８．０に中和し、中和溶液を形成する工程；（ｈ）中和溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛け、異種タンパク質を含む第２の溶出液を回収する工程を含む。
【００７１】
本明細書のあらゆる箇所において、「第１」、「第２」、「第３」などの用語は、精製プロセスの特定の態様（例えば「第１の濾液」、「第２の濾液」など）を指す場合に使用される。明確性のために、「第１」、「第２」、「第３」などの指定は、種々のプロセスの存在を区別するために用語を補助するものであり、順序または数に関して限定するものではない。例えば本開示は、当業者が「第１の濾液」と「第２の濾液」との間に第３の濾過プロセスを実行し得、したがって第２の濾液の前に第３の濾液を形成し得ることを想定している。
【００７２】
本発明において使用される卵白プールには様々な容量が含まれ得るが、より大きな容量であることが特に有利であり得る。一般的に、本明細書に記載される方法において使用される卵白プールは工業規模であり、比較的大きな容量を有する。例えば、卵白プールは少なくとも約１リットル、少なくとも約１０リットル（例えば、少なくとも約５０リットル、少なくとも約１００リットル、少なくとも約２００リットル、少なくとも約３００リットル、少なくとも約４００リットル、少なくとも約５００リットル、少なくとも約６００リットル、少なくとも約７００リットル、少なくとも約８００リットル、少なくとも約９００リットル、少なくとも約１，０００リットル、少なくとも約１，５００リットル、少なくとも約２，０００リットル、少なくとも約３，０００リットル、少なくとも約４，０００リットル、少なくとも約５，０００リットル、少なくとも約１０，０００リットル、または少なくとも約２０，０００リットル）の容量を有し得る。本明細書に記載される方法において使用される開始物質としての卵白を調製する方法は、例えば米国特許出願公開第２００９／０２９９０３７号および第２０１５／０３０７５４７号に記載されている。
【００７３】
用語「清澄化」は最初の精製工程を指し、ここでプールされた卵白は酸性化され、粘度が減少し、いくつかの不溶性タンパク質がプールされた卵白から除去される。限定されないが、一般的な清澄化プロセスの概要が図３に見出され得る。いくつかの実施態様において、卵白が上層、中間層および下層に分離するように、プールされ、酸性化された卵白を適切な期間（例えば少なくとも約６時間）沈降させる。通常、上層は低密度の特定の不要物質（例えば変性タンパク質、ならびにリン脂質、トリグリセリドおよびコレステロールを含む泡沫状脂質）を含み、下層は卵白タンパク質から形成される沈殿物（例えばオボムチン−リゾチーム複合体）を含み、中間層は比較的清澄な卵白溶液を含む。一般に、清澄化は２〜８℃で行われる。
【００７４】
いくつかの実施態様において、清澄化の間に、ｐＨ調整された卵白のｐＨが所望の値（例えば、５．７±０．１、６．０±０．１、または６．３±０．１）の範囲外になった場合、このｐＨは、酸（例えば上述の酸性緩衝液）または塩基（例えば、５．７Ｍ酢酸ナトリウムまたは１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液）を用いて所望の値に達するように調整され得る。そのような実施態様において、ｐＨ調整の後に、さらなる混合（例えば少なくとも約１時間）および沈降（例えば少なくとも約３時間）が室温で行われ得る。一般的に、清澄化中の混合および沈降の合計時間は、卵白中の異種タンパク質が処理環境に曝露される時間を最小限にするために２４時間を超えず、これによりこれらのタンパク質の生理活性が維持される。
【００７５】
いくつかの実施態様において、清澄化は、沈降の工程の後にｐＨ調整された卵白から中間層を単離する工程を含み得る。一般的に、中間層は、当分野で公知の方法を用いて単離され得る。例えば、中間層は、中間層の内容物が上層および下層を乱すことなく受入容器に送り込まれ得るように、チューブ（例えば、金属チューブまたはポリカーボネートチューブ）を中間層（好ましくは中間層の中央）に挿入することによってｐＨ調整された卵白を含む容器から吸引され得る。
【００７６】
一般に、清澄化の間、ｐＨ調整された卵白は、中間層に懸濁したあらゆる粒子を除去するために濾過され得、均質で低粘度の清澄な卵白溶液が取得され得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は、最大で約１００μｍ（例えば、最大で約９０μｍ、最大で約８０μｍ、最大で約７０μｍ、最大で約６０μｍ、最大で約５０μｍ、最大で約４０μｍ、最大で約３０μｍ、最大で約２０μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約９μｍ、最大で約８μｍ、最大で約７μｍ、最大で約６μｍ、最大で約５μｍ、最大で約４μｍ、最大で約３μｍ、最大で約２μｍ、または最大で約１μｍ）および／または少なくとも約０．１μｍ（例えば、少なくとも約０．２μｍ、少なくとも約０．３μｍ、少なくとも約０．４μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約０．６μｍ、少なくとも約０．７μｍ、少なくとも約０．８μｍ、少なくとも約０．９μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約２μｍ、または少なくとも約３μｍ）の平均孔径を有する１以上のフィルターに通して濾過され得る。例えば、フィルターは約０．１μｍ〜約１００μｍ（例えば、約０．１μｍ〜約４０μｍ、約４０μｍ〜約１００μｍ、約３μｍ〜約６μｍ、または約０．１μｍ〜約０．３μｍ）の範囲の平均孔径を有し得る。
【００７７】
いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白の濾過は互いに直列に連結した複数のフィルターに通して行われ得、ここでフィルターの平均孔径は順次減少している。例えば、ｐＨ調整された卵白は直列に連結した３つのフィルターを含む濾過システムに通して濾過され得、ここで第１のフィルターは約４０μｍの平均孔径を有し得、第２のフィルターは約３μｍ〜約６μｍの平均孔径を有し得、第３のフィルターは約０．１μｍ〜約０．３μｍの平均孔径を有し得る。このような濾過システムの例は、Pall Corporationから市販されている連続的なデプスフィルターを含むシステム（例えば、Ｔ２６００、Ｋ２００ＰおよびＢｉｏ１０デプスフィルターを含む）である。場合により、濾過システムはさらに、（例えば約０．２μｍの平均孔径を有する）第４のフィルターを第３のフィルターの下流に含んでもよい。第４のフィルターの例は、Sartorius Corporationから入手可能なＳａｒｔｏｂｒａｎ Ｐフィルターである。
【００７８】
いくつかの実施態様において、清澄化に使用されるフィルターは、大きな濾過媒体面積を有し得る。例えばフィルターは、少なくとも約１ｍ２（例えば、少なくとも約２ｍ２、少なくとも約４ｍ２、少なくとも約６ｍ２、または少なくとも約８ｍ２）の濾過媒体面積を有し得る。
【００７９】
いくつかの実施態様において、酸性緩衝液および卵白を混合し、ｐＨ調整された卵白を形成した後、ｐＨ調整された卵白は、ｐＨ調整された卵白中の沈殿物を沈降させる必要なく濾過され得る。そのような実施態様において、ｐＨ調整された卵白（添加／混合の工程の間に形成される沈殿物および残りの卵白溶液を含む）は、沈殿物をｐＨ調整された卵白から事前にいかなる分離もせずに濾過され得る。例えば、酸性緩衝液および卵白を混合した後、ｐＨ調整された卵白は、本明細書に記載される１以上のフィルター（例えば、孔径が減少していく３つの直列に連結したフィルターを含む濾過システム）を用いて沈降させることなく濾過され得る。理論に拘束されることを意図しないが、このような方法は、沈降の工程を除くことによって大量のクロマトグラフィー処理のために卵白を調製する時間と費用、および卵白から異種タンパク質を単離する時間と費用を大幅に削減できると考えられる。
【００８０】
いくつかの実施態様において、酸性緩衝液および卵白を混合し、ｐＨ調整された卵白を形成した後、ｐＨ調整された卵白は上清から沈澱物（例えばオボムチン−リゾチーム複合体）を分離するために遠心分離され得る。したがって、得られた上清は次に、本明細書に記載される１以上のフィルターを用いて濾過され得る。
【００８１】
一般的に、濾過された卵白溶液は、カラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用に基づくクロマトグラフィーなど）を用いて異種タンパク質を単離するために用いられ得る。このようなクロマトグラフィー法の例は、例えば米国特許出願公開第２００９／０２９９０３７号に記載されている。
【００８２】
いくつかの実施態様において、フィルターは濾過の前に緩衝液で前処理される。前処理緩衝液は、卵白（例えばｐＨ調整された卵白）を通す前にフィルターを濡らすために使用され得る。前処理緩衝液は１以上の塩（例えばアルカリ塩）を含み得る。例示的な塩にはリン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムが含まれる。いくつかの実施態様において、前処理緩衝液はリン酸ナトリウムと塩化ナトリウムとの組合せを含み得る。一般的に、前処理緩衝液は酸を含み得る。例示的な酸には、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸およびバルビツール酸が含まれる。いくつかの実施態様において、２以上（例えば３つまたは４つ）の酸の組み合わせが前処理緩衝液に使用され得る。
【００８３】
いくつかの実施態様において、前処理緩衝液は卵白のｐＨと実質的に同一のｐＨを有し得る。例えば、前処理緩衝液は少なくとも約５．８〜６．５のｐＨを有し得る。いくつかの実施態様において、前処理緩衝液は約６のｐＨを有し得る。理論に拘束されることを意図しないが、卵白のｐＨと実質的に同一のｐＨを有する前処理緩衝液を用いてフィルターを処理することは、フィルター表面のｐＨを卵白のｐＨに類似するように調整でき、それにより濾過中の卵白の沈殿（これはフィルターに目詰まりを生じさせ得、またはフィルターにせん断応力を生じさせる試料の流れを妨げ得、それによりフィルターの使用寿命を著しく短縮し得る）を最小限に抑えると考えられる。
【００８４】
いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された卵白は、清澄化中に比較的小さな差圧下（例えば、約３０ｐｓｉ未満、約２５ｐｓｉ未満、約２０ｐｓｉ未満、約１５ｐｓｉ未満、約１２ｐｓｉ未満、約１０ｐｓｉ未満または約５ｐｓｉ未満）でフィルターを通過し得る。理論に拘束されることを意図しないが、卵白を比較的小さな差圧下でフィルターに通すことは、フィルターの損傷および／または目詰まりを最小限に抑え得、フィルターは非常に高価であり得るため、それにより製品費用が削減されると考えられる。
【００８５】
本明細書において、用語「第１の濾液」は、ｐＨ調整された卵白が遠心分離または他の手法のいずれを用いて単離されたかに依存せず、ｐＨ調整された卵白の濾過により清澄化された卵白産物を指す。いくつかの実施態様において、本開示の方法は、ｐＨ調整された卵白を遠心分離し、セベリパーゼアルファを含む分画を回収し、次いでセベリパーゼアルファを含む分画を（ｂ）の濾過に掛けることを含む。第１の濾液は回収され得、さらなる精製プロセスに使用され得る（例えば、第１の濾液は疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスに掛けられ得る）。いくつかの実施態様において、第１の濾液は２０〜３０℃（例えば室温）に調整され、またはあるいは２〜８℃に調整される。
【００８６】
本発明のある実施態様は、１以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）マトリックスを含む方法を提供する。例えば図４参照。適切なＨＩＣカラムは、その固定相が疎水性基を含むＨＩＣカラムである。いくつかの実施態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスは、フェニル、オクチルまたはブチル疎水性相互作用マトリックスである。そのようなＨＩＣマトリックスの限定されない例は、フェニルＨＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムである。１以上のＨＩＣプロセスの包含は、１以上の細胞性タンパク質不純物の減少または排除を促進し得る。ある実施態様において、ＨＩＣプロセスは高塩濃度緩衝液を利用し、異種タンパク質（またはその凝集）と疎水性カラムとの相互作用を促進する。ＨＩＣプロセスは、精製産物をロードする前に平衡化緩衝液で平衡化され得る。いくつかの実施態様において、ＨＩＣプロセスは清澄化プロセスの後に行われる。いくつかの実施態様において、清澄化プロセス後のＨＩＣプロセスはフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスである。当業者は、ＨＩＣプロセスがＨＩＣプロセス中に適切な洗浄緩衝液を用いた１以上の洗浄を用い得ることを理解している。ＨＩＣプロセスの産物（溶出された産物）は、本明細書において「第１の溶出液」と呼ばれる。
【００８７】
いくつかの実施態様において、異種タンパク質を精製する方法は、精製産物をｐＨ５．０〜５．６に調整することによる不純物の沈殿を含む。例えば図５参照。いくつかの実施態様において、ｐＨの低下によるタンパク質不純物の沈殿はＨＩＣプロセスの後に行われ得る（すなわち、これは第１の溶出液に対して行われ得る）。ｐＨの低下によるタンパク質不純物の沈殿は、２０分間よりも長く、１時間よりも長く、２時間よりも長く、４時間よりも長く、８時間よりも長く、１２時間よりも長く、１８時間よりも長く、２４時間よりも長く、または４８時間よりも長く行われ得るが、７２時間を超えるべきではない。いくつかの実施態様において、ｐＨの低下によるタンパク質不純物の沈殿は１５〜３０℃、または１８〜２５℃の温度で行われ得る。ｐＨの低下によるタンパク質不純物の沈殿による産物は「ｐＨ調整された溶出液」と呼ばれる。
【００８８】
いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された溶出液は、不純物をさらに除去するために濾過される。いくつかの実施態様において、フィルターはデプスフィルターである。用語「デプスフィルター」は技術用語であり、表面上だけではなく、その３次元構造内に混入物および／または不純物（本明細書に記述されるあらゆる混入物および／または不純物など）を捕獲する多孔性濾過媒体を含むフィルターを意味する。デプスフィルターは、それらがフィルター内に混入物または不純物を保持し、詰まる前に相対的に大きな量を保持できることを特徴とする。デプスフィルターの構成は、複数の層、複数の膜、単層または樹脂材料を含み得る。デプスフィルターの限定されない例には、ＣＵＮＯ（登録商標） Ｚｅｔａ ＰＬＵＳ（登録商標） Ｄｅｌｉｐｉｄフィルター(3M, St. Paul, Minn.)、ＣＵＮＯ（登録商標） Ｅｍｐｈａｚｅ ＡＥＸフィルター(3M, St. Paul, Minn.)、ＣＵＮＯ（登録商標） ９０ＺＡ０８Ａフィルター(3M, St. Paul, Minn.)、ＣＵＮＯ（登録商標） ＤＥＬＩ０８Ａ Ｄｅｌｉｐｉｄフィルター(3M, St. Paul, Minn.)、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｘ０ＨＣフィルター(EMD Millipore, Billerica, Mass.)、ＭＩＬＬＩＳＴＡＫ（登録商標）パッド(EMD Millipore, Billerica, Mass.)が含まれる。ｐＨ調整された溶出液に対して使用されるフィルターは様々な孔径であり得、これは精製される異種タンパク質に依存する。いくつかの実施態様において、フィルターは０．１μｍ、０．２μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、１μｍまたは２μｍのフィルターである。ｐＨ調整された溶出液の濾過による産物は「第２の濾液」と呼ばれる。
【００８９】
本発明のプロセスはウイルス不活性化プロセスを含み、これにより精製産物のｐＨはｐＨ３．０〜４．０に調整される。例えば図５参照。いくつかの実施態様において、ウイルス不活性化プロセスは、精製産物のｐＨをｐＨ３．２〜３．６に調整することを含む。ｐＨ調整された精製産物（すなわち「ｐＨ調整された第２の濾液」）は、１０分間よりも長く、２０分間よりも長く、３０分間よりも長く、４０分間よりも長く、６０分間よりも長く、または６０分間よりも長く、低ｐＨ（ｐＨ３．０〜４．０）で維持され得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された第２の濾液は、１０分間〜１２０分間、１０分間〜９０分間、２０分間〜９０分間、３０分間〜９０分間、４０分間〜９０分間、５０分間〜９０分間、または６０分間〜９０分間、低ｐＨ（ｐＨ３．０〜４．０）で維持され得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された第２の濾液は、１０分間〜６０分間、１０分間〜５０分間、１０分間〜４０分間、または１０分間〜３０分間、低ｐＨ（ｐＨ３．０〜４．０）で維持され得る。いくつかの実施態様において、ｐＨ調整された第２の濾液はウイルス不活性化プロセスの間、１０℃〜３０℃、または１８℃〜２５℃の温度において、低ｐＨ（ｐＨ３．０〜４．０）で維持され得る。
【００９０】
ウイルス不活性化プロセスの後、精製産物のｐＨは次の精製プロセスのための精製産物を調製するために調整され得る。いくつかの実施態様において、ｐＨはｐＨ５．０〜８．０に調整され得、中和溶液を形成し得る。ｐＨは、当分野で公知のあらゆる塩基性緩衝液（限定されないが、アミン、アンモニア、炭酸塩、炭酸水素塩、ホウ酸塩およびリン酸塩を含む）を用いて調整され得る。いくつかの実施態様において、中和溶液に対してさらなる処理工程を行う。いくつかの実施態様において、中和溶液は陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛けられる。例えば図６参照。本発明で利用される陽イオン交換クロマトグラフィープロセスは、当分野で公知のあらゆる陽イオン交換クロマトグラフィープロセス（例えば、スルホン酸メチル基、ジエチルアミノエチル基またはアンモニウム基を含むマトリックス）を使用し得る。ある実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーの工程は、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ樹脂(Life Technologies)またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｓマトリックス(Tosoh Bioscience LLC, Yamaguchi 746-8501, Japan)を充填したカラムを用いることによって達成され得る。特定の実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーの工程は結合−溶出(bind-elute)モードで操作され得る。いくつかの実施態様において、対象の異種タンパク質は、塩勾配の増加を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスから溶出される。異種タンパク質を含む陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスによる産物は「第２の溶出液」と呼ばれる。
【００９１】
いくつかの実施態様において、精製産物に対してナノ濾過を行う。例えば図７参照。あらゆる適切なナノ濾過デバイスが使用され得る。ある実施態様において、ナノ濾過デバイスは約１５ｎｍ〜約２００ｎｍの平均孔径を有する。この使用に適したナノフィルターの例には、限定されないが、ＤＶＤ、ＤＶ５０、ＤＶ２０(Pall)、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＲ(Millipore)、Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎおよび７５Ｎ(Planova)が含まれる。具体的な実施態様において、ナノフィルターは、約１５ｎｍ〜約７２ｎｍ、もしくは約１９ｎｍ〜約３５ｎｍ、または約１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍまたは７２ｎｍの平均孔径を有し得る。好ましい実施態様において、ナノフィルターは約３５ｎｍの平均孔径を有する（Ａｓａｈｉ ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎフィルターまたはその等価物など）。ナノフィルターの表面積は、精製産物の濃度および容量に依存して様々であり得る。いくつかの実施態様において、ナノフィルターは、０．１ｍ２、０．２ｍ２、０．５ｍ２、１ｍ２、１．５ｍ２、２ｍ２、２．５ｍ２または３ｍ２よりも大きな表面積を有する。いくつかの実施態様において、ナノフィルターは２．１ｍ２の表面積を有する。ナノ濾過による産物は「第３の濾液」と呼ばれる。
【００９２】
いくつかの実施態様において、異種タンパク質を精製する方法は、精製産物を陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに掛けることを含む。例えば図８参照。陰イオン交換クロマトグラフィーの原理は当分野で周知であるが、簡潔に述べると、単離される粒子と使用される樹脂上の電荷間の電荷−電荷相互作用に依存している。カラムは通常、固定された正に荷電した部分を含む。一般に、これらは第４級アミノ基（Ｑ樹脂）またはジエチルアミノエタン基（ＤＥＡＥ樹脂）である。本開示の実施に有用な市販されている陰イオン交換樹脂の例には、限定されないが、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標） Ｑ(Pall Life Sciences)およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ(Merck)樹脂が含まれる。従来の陰イオン交換樹脂には、ビーズ形式で使用される陰イオン交換樹脂（例えばGE Healthcare Bio-Sciences ABから入手可能なＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））が含まれる。したがって、ある実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィーはビーズに基づくクロマトグラフィー樹脂を含む。しかしながら、ビーズに基づくシステムのスループットの制限は、不純物を効率的に捕獲するために大容量のカラムを必要とする。ビーズに基づくクロマトグラフィーにおいて、吸着に利用可能な表面積の大部分はビーズの内部である。結果的に物質の輸送速度は通常、細孔拡散によって制御されるため、分離処理は本質的に緩慢である。
【００９３】
別の実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、膜に基づくクロマトグラフィー樹脂（Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標） Ｑ樹脂など）を含む。膜に基づくクロマトグラフィーシステムは、対流している膜細孔に直接結合するリガンドを有し、これにより物質輸送に対する内部細孔拡散の影響を減少させる。
【００９４】
いくつかの実施態様において、異種タンパク質を精製する方法は第２のＨＩＣ精製プロセスを含む。第２のＨＩＣ精製プロセスは、第１のＨＩＣマトリックスにおいて使用されたマトリックスと同一または異なるマトリックスであり得る。いくつかの実施態様において、第２の疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスは、フェニル、オクチルまたはブチル疎水性相互作用マトリックスである。いくつかの実施態様において、第２のＨＩＣマトリックスはブチルＨＩＣである。例えば図９参照。ある実施態様において、第２のＨＩＣプロセスは高塩濃度緩衝液を利用し、異種タンパク質（またはその凝集）と疎水性カラムとの相互作用を促進する。第２のＨＩＣプロセスは、精製産物をロードする前に平衡化緩衝液で平衡化され得る。当業者は、第２のＨＩＣプロセスが第２のＨＩＣプロセス中に適切な洗浄緩衝液を用いた１以上の洗浄を使用し得ることを理解している。ＨＩＣプロセスの産物（溶出された産物）は、本明細書において「第４の溶出液」と呼ばれる。
【００９５】
本発明は様々なフィルターを含む処理を提供する。当業者は、デッドエンド濾過、デプス濾過、およびタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）（クロスフロー濾過（ＣＦＦ）とも呼ばれる）が、記述された各フィルターのために本開示によって想定されることを認識し得る。いくつかの実施態様において、ＴＦＦが精製プロセスで（特により大量でより高濃度の精製産物を処理する場合に）使用される。ＴＦＦは当業者に周知であり、広範な状況での実施のための装置およびプロトコルが様々な製造者（限定されないが、Pall Corporation, Port Washington, N.Y.およびSpectrum Labs, Rancho Dominguez, Califを含む）から市販されている。一般に、ＴＦＦは膜表面を横切る残余分の再循環を含む。この穏やかなクロスフローの供給は膜の目詰まりを最小限に抑え、高い濾過速度を維持し、生成物の高い回収率を与える。ある実施態様において、ＴＦＦの工程はフラットシートシステムを用いて実施され得る。フラットシートシステムは、そのようなシステムがエンベロープウイルス粒子に対する過剰なずり応力を妨げるための手段（例えば、オープンフローチャネル）と共に提供される、大規模産生において使用され得る。あるいは、ＴＦＦの工程は中空糸システムを用いて実施され得る。
【００９６】
いくつかの実施態様において、限外濾過／透析濾過は精製産物をさらに濃縮するために実行され得る。例えば図１０参照。いくつかの実施態様において、限外濾過／透析濾過は陰イオン交換クロマトグラフィープロセスの後に実行され得る（すなわち、限外濾過／透析濾過はナノ濾過の濾液または第４の溶出液に対して実行され得る）。ある実施態様において、第４の溶出液は限外濾過によって、約２％〜約１０％（重量／体積）のタンパク質濃度に濃縮され得る。ある実施態様において、限外濾過はオープンチャネルスクリーンを有するカセットにおいて実行され、限外濾過膜は約１００ｋＤａ未満または約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０ｋＤａまたはそれ未満の公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）有する。いくつかの実施態様において、限外濾過膜はわずか５０ｋＤａのＮＭＷＣＯを有する。
【００９７】
限外濾過の終了に際し、濃縮物は透析濾過を介してさらに濃縮され得る。ある実施態様において、透析濾過溶液は安定化剤および／または緩衝剤を含み得る。好ましい実施態様において、安定化剤および緩衝剤は適切な濃度のグリシンである。
【００９８】
通常、最小の交換体積は、元の濃縮物の体積の少なくとも約３倍、または元の濃縮物の体積の少なくとも約４、５、６、７、８、９倍またはそれ以上である。通常、濃縮プロセスの終了時に、溶液のｐＨは約６．０〜７．５である。
【００９９】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は薬学的に許容され得る異種タンパク質を含む生成物をもたらす。本明細書において、用語「薬学的に許容され得る」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに適している、妥当な利益／リスク比に見合った、異種タンパク質を含むそれらの組成物および／または剤形を指す。いくつかの実施態様において、精製された異種タンパク質は静脈内投与に適している。
【０１００】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される精製された異種タンパク質は疾患または症状の処置のために使用され得る。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法で産生した精製された異種タンパク質は、当分野で従来公知の方法によって産生した異種タンパク質と比較して、より高いタンパク質純度、より高い活性、より高い安定性、またはより低い製造費用を有する。例えば、本発明の方法がセベリパーゼアルファを精製するのに使用される場合、精製されたセベリパーゼアルファは、当分野で従来公知の方法によって産生したセベリパーゼアルファと比較して、より高いタンパク質純度、より高い活性、より高い安定性、またはより低い製造費用を有し得る。いくつかの実施態様において、本開示は本明細書に記載される方法によって生成した生成物（例えば、セベリパーゼアルファ）に関する。いくつかの実施態様において、精製された異種タンパク質（例えば、セベリパーゼアルファ）は疾患または症状の処置（例えば、ライソゾーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症と診断された患者の処置）のために使用される。用語「処置する」、「処置している」または「処置」は、状態、疾患または障害の少なくとも１つの症状を減少または排除するのに十分な治療有効量の化合物を投与することを含む。
【０１０１】
本明細書で引用される全ての出版物（例えば、特許、特許出願公開および論文）の内容は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１０２】
実施例１：セベリパーゼアルファの精製
製造プロセスおよびプロセスの制御の説明
遺伝子組換えセキショクヤケイを用いた、組換えヒトライソゾーム酸性リパーゼ（ｒｈＬＡＬ）であるセベリパーゼアルファの産生のプロセスは、卵白（ＥＷ）中にセベリパーゼアルファを発現するように開発された。セベリパーゼアルファを従来のクロマトグラフィー法を用いて特定の順番および特定のｐＨレベルでＥＷから精製した。精製プロセスはまた、ウイルス減少のための特定の追加の工程を包含していた。図１はセベリパーゼアルファ産生プロセスにおける工程の概要を示す。
【０１０３】
ＥＷを回収し、プールし、保存のために凍結した。精製を開始するための解凍の際に、プールされたＥＷをｐＨ調整し、デッドエンド濾過で清澄化した。次に、清澄化されたＥＷ中のセベリパーゼアルファを疎水性相互作用クロマトグラフィー（フェニルＨＩＣ、ＰＨＩＣ）で捕獲し、次いで以下で記載されるように、ｐＨ５．４での沈降、低ｐＨでのウイルス不活性化の工程、ＤＴＴ処理、ならびに陽イオン交換クロマトグラフィー、ナノ濾過、陰イオン交換膜クロマトグラフィー（第４級アミン）、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ブチルＨＩＣ、ＢＨＩＣ）を用いた精製を行った。ブチルＨＩＣ溶出液をｐＨ調整し、製剤化されていない原薬を得た。製剤化されていない原薬を濃縮、透析濾過、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加と共に製剤化し、最終原薬を得る。
【０１０４】
処理全体を通して、シングルユースディスポーザブルシステムまたはシングルユースミキサー（ＳＵＭ）を使用した。全てのフィルターは使い捨てであった。ガンマ線照射したシングルユースディスポーザブルバッグおよびコネクタを緩衝液および中間生成物のために用いた。生成物に接触する全ての材料をＵＳＰクラスＶＩの要求に関して評価した。
【０１０５】
下流のプロセス全体を通して、次の単位操作のための処理が１日未満の特定の時間間隔内で連続している場合、中間体を室温（１８℃〜２５℃）で保持した。出願人は、プロセスの中間体が、化学的安定性が示されている工程において微生物増殖の可能性を最小限に抑えるために２〜８℃で保持され得ることを記述する。保持の時間が２４時間を超える場合、バイオバーデンのための試料を保持時間の終了時に取り出し、微生物制御を確認した。
【０１０６】
プロセスの中間体を回収し、プロセス容器に含まれるバッグに保存した（これは必要に応じて処理一式の間または処理一式内において移動された）。調整した緩衝液および溶液を、より大きな体積のための緩衝液移行トートを含む保存バッグに保持した。生成物が保持のために冷却された場合、プロセス容器にカバーを付け、温度を維持するために冷却システムに接続した。出願人は、生成物が同一のシステムを用いて処理温度に加温され得ることを記述する。
【０１０７】
精製プロセスは、プロセスの発展およびプロセスを特徴付けるデータに基づいて規定された各工程の標的設定値を有していた。これらの設定値は以下に説明されるプロセスに含まれる。検証中に評価された各プロセス工程の制御限界および操作範囲は特定のシステムハードウェアおよび装置の能力を反映し、したがって開発範囲よりも狭くなる場合があった。通常の処理の間、操作範囲外の偏位は逸脱の開始および生成物の影響の可能性の評価を促した。生成物の質に影響を及ぼす可能性があることが特定されているイベントを調査し、材料をそれに応じて配置した。
【０１０８】
以下の節は、図１において同定されたセベリパーゼアルファ製造プロセスの各単位操作に対する情報を提供する。
【０１０９】
プロセスの説明の要約
卵の収集およびＥＷの回収
ｒｈＬＡＬ遺伝子を保有する遺伝子組換えセキショクヤケイの雌鳥由来のＥＷが製造プロセスの開始物質であった。プールされたＥＷを２〜８℃で保持した。保持時間の最大値は５日以下であった。図２は卵の収集およびＥＷの回収の図示を提供する。
【０１１０】
清澄化
清澄化の工程の目的は、プールされたＥＷを酸性化し、溶液の粘度を減少させることであった。酸性化はまた、いくつかのタンパク質の沈殿をもたらした。
【０１１１】
解凍した卵白を、無菌培地ライナー(sterile media liner) (Thermo Scientific/Hyclone P/N 343050-0005)を含む適切なサイズのポリプロピレンタンク（２５Ｌ）にプールした。プールされた卵白を、オーバーヘッドミキサー（３３０ｒｐｍ）を用いて２〜８℃で均一になるまで混合した。次に、プールされた卵白を、ｐＨ４．０の５．７Ｍ酢酸ナトリウムの添加によって標的ｐＨに調整した。表６に、標的ｐＨを達成するために各清澄化の実行(run)に添加された５．７Ｍ酢酸ナトリウムの容量を記載する。標的ｐＨが達成されたことを保証するため、ｐＨを２時間よりも長い間モニターした。
【０１１２】
酸性化ＥＷ溶液の濾過は微粒子の減少をもたらし、第１のクロマトグラフィーの工程による処理を可能とした。保持時間の最大値は２４時間以下であった。図３は清澄化の工程の図示を与える。
【０１１３】
フェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー
フェニルＨＩＣの工程の目的は、清澄化されたＥＷからセベリパーゼアルファを捕獲し、ＥＷタンパク質不純物のレベルを減少させることであった。濾過の前に、フィルターに濾過したＲＯ／ＤＩ水を個別に８０Ｌ／ｍ２流した。水を流している間、各フィルターのホールドアップ体積が実験的に決定された。水を流すのが完了すると、フィルターを連続的な列に配管し、１６Ｌ／ｍ２のＰＨＩＣ平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）を流した。流出液のｐＨおよび導電率が流している緩衝液の仕様に合っていた場合に（例えば、ｐＨ６．０±０．１、導電率１６．０±２．０）、緩衝液を流すのを終了した。プールされた卵白を、３／８”ディップチューブ(I/P 73 tubing Cole)を用いて連続的に混合（オーバーヘッドミキサー、３００ｒｐｍ）しながら１．０Ｌ／分でフィルター列上にロードした。測定された、累積的なホールドアップ体積（約１３．２Ｌ）の８０％が回収され、廃棄された。次に濾液を、凝固した低密度の沈殿物がディップチューブに侵入するまで適切なサイズの別々の容器に回収した。次に、濾過の列に平衡化緩衝液を１．５ホールドアップ体積（約２５Ｌ）で流した。最終的な濾液をクリーンタンクパドル(clean tank paddle)を用いてよく混合し、試料採取の前に均一性を保証した。濾液をＰＨＩＣ分離の前に一晩２〜８℃で保存した。
【０１１４】
ＰＨＩＣ分離の前に、２〜８℃で保存された濾液を室温の水浴を用いて加温した。濾液をＳａｒｔｏｂｒａｎ１５０カートリッジ（０．４５ｕｍ／０．２２ｕｍ、Ｐ／Ｎ５２３１３０７Ｈ４−００）に通して二次的に濾過し、最終的なＰＨＩＣロードを生成した。表１に使用した緩衝液およびプロセス内のパラメータを記載する。
表１
ＰＨＩＣクロマトグラフィー単位操作
【表１】
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この単位操作の図示について、図４参照。
【０１１５】
ｐＨ５．４での沈降およびウイルス不活性化のための低ｐＨインキュベーション
フェニルＨＩＣの後、溶出液を回収し、溶出液を混合しながらｐＨをｐＨ５．４に減少させた。次に、ｐＨ調整された溶出液を深層濾過および０．２μｍのフィルター列に掛けた。温度を１８〜２５℃に維持した。ｐＨ５．４での沈降の工程の目的はＥＷタンパク質不純物の減少である。
【０１１６】
（濾過後の）沈降プールのｐＨを、混合しながらｐＨ３．７にさらに低下させた。ｐＨを６０〜９０分間保持した。低ｐＨインキュベーションの工程の目的はウイルス不活性化である。この単位操作の図示について、図５参照。
【０１１７】
陽イオン交換クロマトグラフィー
ウイルス不活性化後、沈降プールをＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｓマトリックスを用いて陽イオン交換クロマトグラフィーに掛けた。沈降プールのｐＨをＴｒｉｓを用いて５．７〜５．９に上げ、次いでジチオトレイトールを添加した。ＧｉｇａＣａｐ Ｓ陽イオン交換カラム（スルホン酸メチル；Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA）を用いてクロマトグラフィーを進行させた。陽イオン交換クロマトグラフィーの単位操作はＥＷタンパク質不純物を減少させ、ウイルス排除の工程として役立つ。陽イオン交換クロマトグラフィーの工程の図示について、図６参照。
【０１１８】
ナノ濾過
陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出液をナノ濾過に掛け、潜在的な外来性ウイルスをプロセスの流れから除去した。溶出液を室温に加温し、ｐＨおよび塩のモル濃度を調整した。次に溶出液をまず０．２μｍのフィルターに掛け、次いで０．１μｍのフィルターに掛けた。洗浄後、濾液を回収した。ナノ濾過の工程の概要について、図７参照。
【０１１９】
陰イオン交換膜クロマトグラフィー
ナノ濾過後、濾液をＭｕｓｔａｎｇ Ｑ陰イオン性膜を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーに掛けた。膜をまずｐＨ６．７〜６．９に平衡化した。陰イオン交換膜クロマトグラフィーの工程は潜在的な外来性物質をプロセスの流れから除外する。陰イオン交換膜クロマトグラフィーの工程の概要について、図８参照。
【０１２０】
ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー
次に、陰イオン交換膜クロマトグラフィーからのプールを、最後の洗練の工程としてブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーに掛けた。プールのｐＨを２〜８℃の温度で６．０（ｐＨ５．９未満のｐＨは宿主タンパク質の不十分な排除をもたらした）に調整した。ブチルＨＩＣカラムを平衡化し、次にプールをカラム上にロードした。カラムを３回洗浄し、次いでセベリパーゼアルファ産物を溶出し、溶出液を回収した。図９はブチルＨＩＣの工程の概要である。
【０１２１】
限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）
ブチルＨＩＣカラムからの溶出液を限外濾過／透析濾過に掛けた。ＵＦ／ＤＦを平衡化し、次いでセベリパーゼアルファ産物をロードし、濃縮した。ＵＦＤＦ工程の間、セベリパーゼアルファはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）存在下で濃縮され、ＵＤＳマトリックスはＤＳ製剤化緩衝液(formulation buffer)（５４ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．９）に交換される。図１０はＵＦ／ＤＦ工程の概要である。
【０１２２】
製剤化および原薬の充填
製剤化および原薬の充填の工程の目的は、ＵＦＤＦプールを適切な濃度のセベリパーゼアルファおよびＨＳＡに調整し、次いでＤＳを保存容器中に濾過することである。図１１は製剤化およびＤＳ濾過の工程の略図である。
【０１２３】
セベリパーゼアルファの精製のいくつかの好ましい制御を表２に記載する。
表２：セベリパーゼアルファの精製プロセスにおける制御
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１２４】
セベリパーゼアルファのプロセスは、操作に柔軟性を持たせるため（例えば、スケジュールまたは装置の準備のための遅延に適応させるため）、またはプロセス内の制御テストの結果を待つために、プロセスのホールドポイントを伴って設計された。プロセスのホールドポイントの適合性は、種々の緩衝液環境においてセベリパーゼアルファの安定性を評価するプロセスの特徴付けの研究の間に確立された。ホールドポイントおよび保持時間は、プロセス中間体の安定性および保持の間の微生物学的制御を示すことによって、フルスケールで検証された。
【０１２５】
表３に、プロセス中間体の保持時間の限界および検証の間に示された保持期間の最大値を反映する保存条件を記載する。２４時間未満の保存期間を伴うプロセス中間体は、プロセスにおける中間のホールドポイントとはみなされない。プロセス中間体の保持時間を表３に記載する。
表３：プロセス中間体の保持時間
【表３】
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【０１２６】
本明細書に記載された方法および適用のための他の適切な修飾および適応が、あらゆる実施態様の範囲を逸脱することなくなされ得ることは、関連する分野の当業者には容易に明らかである。以下の実施例は説明の目的のみのために本明細書に包含され、限定することを意図しない。
【０１２７】
特定の実施態様が本明細書において示され、記述されているが、特許請求の範囲は記載され、示された部分の特定の形式または配置に限定されないことが理解されるはずである。本明細書において、説明のための実施態様が開示されており、特定の用語が用いられているが、それらは一般的な意味および説明的な意味でのみ使用され、限定の目的で使用されない。上記の教示を考慮して、本実施態様の修飾および変形がなされ得る。したがって本実施態様は、具体的に記述された実施態様とは異なるように実施され得ることが理解されるはずである。
【０１２８】
様々な実施態様が上述されているが、それらは本教示の説明および例としてのみ提示され、限定の目的ではないことが理解されるはずである。本技術の精神および範囲を逸脱することなく、形式上および細部の様々な変更が本明細書においてなされ得ることは、関連する分野の当業者には明らかである。したがって、本技術の幅および範囲は、上述のいかなる実施態様によっても限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲およびその等価物のみによって規定されるべきである。本明細書で議論された各実施態様の各特徴および本明細書で引用された各参考文献の各特徴は、他のあらゆる実施態様の特徴と組み合わせて使用され得る。本明細書で議論された全ての特許および出版物は参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019528238.tif 000015
【図１１】
2019528238.tif 000016
【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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