(57)【要約】  本発明は、細胞内受容体を標的とする脂質小胞の経口製剤における、任意で小分子と組み合わせられた、１つ以上の高分子、特にペプチド、タンパク質、核酸及びそれらの混合物に関する。本発明は、１つ以上のコレステリルエステルからなる中性の脂質小胞内にその高分子をカプセル化する。その小胞内にカプセル化された高分子の特異の特性には、本明細書で少なくとも５０％、すなわち非経口ＡＵＣに対する経口に基づいて多くは５０％を超えると定められる高い経口バイオアベイラビリティが含まれる。これまで哺乳動物の腸で非常に吸収されにくかったペプチド、タンパク質及び核酸などの巨大な親水性分子について、限定ではない例が提供される。先行技術において、それらの分子は、製剤で保護コーティング及び場合により吸収促進成分物質を用いても、一般的に２５％未満のバイオアベイラビリティである。本発明の更なる特徴は、経口使用後の高組織濃度であり、カイロミクロンによって体細胞に送達されたコレストソームの素早い取り込みの結果である。好ましい実施形態はインスリンについて開示され、そこではコレストソームでのカプセル化の経口バイオアベイラビリティが少なくとも６６％である。本発明以前には、インスリン並びに他のペプチド及びタンパク質の経口バイオアベイラビリティは、最大で２５％、通常は５〜１０％の間であった。癌の治療、特に癌免疫療法の実施における細胞内標的化に有用な１つ以上の高分子についての更なる好ましい例が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者又は対象への投与のための医薬剤形の組成物であって、該組成物は、無傷の積載済み小胞を提供するために、脂質小胞内にカプセル化された１つ以上の高分子を含み、前記積載済み小胞の外側表面コーティングは、コレステロールとＣ６〜Ｃ２６脂肪酸とから得られる少なくとも１つのコレステリルエステルを含み、前記高分子は、前記小胞を用いない場合に前記高分子によって得られる濃度の少なくとも１０倍の、前記患者又は対象の細胞中での細胞内濃度となる、組成物。
【請求項２】
前記積載済み小胞が前記患者又は対象の細胞の膜を通過する際に、前記積載済み小胞の前記外側表面コーティングがエンドソームを形成することなく無傷のままであり、前記小胞が、前記小胞に対するコレステリルエステル加水分解酵素の作用によって、前記細胞内で前記１つ以上の高分子を任意で放出する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記高分子が、タンパク質、ペプチド、核酸及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記高分子は、前記小胞を用いない場合に前記高分子によって得られる濃度の少なくとも２５０倍の細胞内濃度となる、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
無傷の前記小胞が、カイロミクロンについての表面受容体を発現する前記患者又は対象の細胞に結合し、無傷の前記小胞が、前記小胞に対する前記細胞内でのコレステリルエステル加水分解酵素の作用によって、１つ以上の前記高分子を前記細胞内で放出する、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
表面カイロミクロン受容体を発現する細胞中の前記高分子の前記細胞内濃度が、前記患者又は対象での表面カイロミクロン受容体を発現しない細胞中の前記高分子の前記細胞内濃度の少なくとも１０倍高い、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
表面カイロミクロン受容体を発現する細胞中の前記高分子の前記細胞内濃度が、積載済みカイロミクロンを形成しない小胞中の前記高分子の前記細胞内濃度よりも少なくとも１０倍高い、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
表面カイロミクロン受容体を発現する細胞中の前記高分子の前記細胞内濃度が、積載済みカイロミクロンを形成しない小胞中の前記高分子の前記細胞内濃度よりも少なくとも２５０倍高い、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項９】
無傷の前記積載済み小胞が前記患者又は対象の細胞に入り、前記細胞が前記小胞から前記高分子を放出するためにコレステリルエステル加水分解酵素を用い、前記細胞は、無傷の前記小胞の一部分を前記細胞から前記細胞を取り囲む細胞外液に任意で排出する、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
無傷の前記小胞が前記細胞内でコレステリルエステル加水分解酵素によって開かれ、前記高分子が前記細胞内の成分に作用する、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞が前記高分子を代謝し、更に／又は前記高分子を前記細胞から排出する、請求項１から1０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記高分子が、無傷の前記小胞中へのカプセル化の間に及びコレステリルエステル加水分解酵素による前記細胞中での放出時に変化せず、前記小胞中にカプセル化された前記高分子と同一であり、かつ同じ活性を有する、請求項１から1１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記高分子がインスリンである、請求項１から1２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
任意で腸溶コーティングが施された経口剤形であり、前記インスリンを皮下又は静脈内注射で前記患者又は対象に投与した場合の血中濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）の少なくとも５０％〜１００％の濃度で、前記高分子が前記患者又は対象の血流に到達する、請求項１から1３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記小胞の前記コア内に、前記高分子と組み合わせてプロテアーゼ阻害剤を更に組み込む、請求項１から1４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記プロテアーゼ阻害剤は、前記細胞が前記高分子を代謝するのを阻害し、前記細胞は、前記プロテアーゼ阻害剤がない時よりも多くの量の前記高分子を、周囲の細胞外液中に排出する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記小胞が、インスリン及び少なくとも１つの追加の高分子を含む、請求項１から1６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、前記インスリン及び／又は前記追加の高分子の細胞外代謝の阻害剤を更に含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
経口剤形であって、無傷の前記小胞が前記腸細胞を通って前記腸細胞のカイロミクロンへ入り、前記患者又は対象の細胞が前記カイロミクロンについての受容体を発現し、前記細胞は、前記カイロミクロンについての表面受容体を有しない細胞に比べて前記インスリン及び前記追加の高分子の高い細胞内濃度を実現し、更に前記カイロミクロンについての表面受容体を有しない細胞に比べてより多くの前記インスリン及び前記追加の高分子を放出する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記追加の高分子がバシトラシンである、請求項１７から1９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
ＩＤＥ阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤又はこれらの混合物を更に含む、請求項１３から２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
ＧＬＰ−１アンタゴニストを更に含む、請求項１３から２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記小胞のコア内に２つの高分子を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
第１の前記高分子がインスリンであり、第２の前記高分子がＧＬＰ−１アゴニストである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記小胞が、前記高分子の細胞内代謝の阻害剤を任意で含む、請求項１から２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記高分子がトラスツズマブであり、該トラスツズマブが、ｐＨ５．５〜６．５、好ましくはおよそｐＨ６．０で、積荷を積載した前記小胞の総重量の４０〜６０重量パーセントで前記小胞中に積載される、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記高分子がエキセナチドであり、前記小胞がＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を更に含む、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン又はこれらの混合物である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記高分子が、ＤＰＰ−ＩＶ酵素分解に対する安定性を改善するために修飾された又は血中での循環時間を延長するために修飾されたＧＬＰ−１分子である、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＧＬＰ−１分子が、リラグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド又はこれらの誘導体であり、前記組成物が、前記ＧＬＰ−１分子の細胞内代謝の阻害剤を任意で含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記高分子が、リラグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、又はこれらの誘導体からなる群から選択されたＧＬＰ−１分子であり、前記組成物が、組み換えインスリン、ＮＰＨインスリン、レンテインスリン、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、ノボログ、又はインスリンデグルデクからなる群から選択されたインスリンを更に含み、前記組成物が、前記ＧＬＰ−１分子及び前記インスリンのうちの一方又は両方の細胞内代謝の阻害剤を任意で含む、請求項２９又は３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ＧＬＰ−１分子がリキシセナチドであり、前記インスリンがグラルギンであり、細胞内代謝の任意の前記阻害剤がシタグリプチンである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記インスリンがインスリンリスプロであり、前記ＧＬＰ−１分子がデュラグルチドであり、任意の前記阻害剤がリナグリプチンである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記インスリンがデグルデクであり、前記ＧＬＰ−１分子がセマグルチドであり、任意の前記阻害剤がシタグリプチンである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記インスリンがノボログであり、前記ＧＬＰ−１分子がリラグルチドであり、任意の前記阻害剤がシタグリプチンである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記高分子の経口投与が、前記患者又は対象の体内における前記高分子の少なくとも５０％のバイオアベイラビリティをもたらす、請求項１３に記載の組成物。
【請求項３７】
前記バイオアベイラビリティが８５〜１００％である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記高分子の経口投与が、前記高分子の血漿中濃度よりも少なくとも１０倍高い組織中濃度をもたらす、請求項１３に記載の組成物。
【請求項３９】
前記高分子の経口投与が、前記高分子の血漿中濃度よりも少なくとも２０倍高い組織中濃度をもたらす、請求項１３に記載の組成物。
【請求項４０】
前記高分子の経口投与が、前記高分子の血漿中濃度の最大２５０倍である組織中濃度をもたらす、請求項１３に記載の組成物。
【請求項４１】
前記コレステリルエステルが、２つの異なるコレステリルエステルの混合物である、請求項１から４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
前記コレステリルエステルの成分が、長さの差が３炭素単位以上である複数の脂肪酸から得られる、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記コレステリルエステルの成分が、長さの差が２炭素単位以下である複数の脂肪酸から得られる、請求項４１又は４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記コレステリルエステルの成分が、長さの差が２炭素単位である複数の脂肪酸から得られる、請求項４１又は４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記小胞が、細胞をアポトーシスのための標的とするために、有効量のホスファチジルセリンを更に含む、請求項１から４４のいずれかに記載の組成物。
【請求項４６】
前記高分子が核酸である、請求項１から１２、１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項４７】
前記核酸がｐｇＷｉｚＧＦＰプラスミドである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記高分子がワクチンであり、前記小胞がアジュバントを更に含む、請求項１から１２、１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
前記小胞が、本発明は、経口剤形であって、前記小胞が、ｐＨ７．０〜７．８において前記小胞を放出するために腸溶コーティングをしたカプセルに入れられる、請求項１から４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５０】
前記小胞は、ｐＨ７．４において前記カプセルから放出される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記高分子がインスリンであり、前記追加の分子がプロテアーゼ阻害剤である、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項５２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、アプロチニン、大豆トリプシン（ＳＢＴＩ）及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５又は５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記インスリンが組み換えインスリンである、請求項５１又は５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記小胞がＮ−［１０−（２ヒドロキシベンゾイル）アミノ］デカン酸ナトリウム（ＳＮＡＤ）（ＳＮＡＣ）、Ｎ−［１０−（２ヒドロキシベンゾイル）アミノ］デカン酸ナトリウム（ＳＮＡＤ）、又はこれらの代替の塩である化合物を含み、前記塩が一ナトリウム塩、二ナトリウム塩及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項５５】
オメガ−３脂肪酸を更に含む、請求項１から５４のいずれかに記載の組成物。
【請求項５６】
ＥＤＴＡ又はその塩を更に含む、請求項１から５５のいずれかに記載の組成物。
【請求項５７】
経口剤形であって、対象の胃における前記組成物の消化を阻害するコーティングを備える、請求項１から５６のいずれかに記載の組成物。
【請求項５８】
前記コーティングが、腸溶コーティング又はゼラチンコーティングである、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記脂肪酸が、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライド酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、又はこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１から５８のいずれかに記載の組成物。
【請求項６０】
高分子を積載した複数の脂質小胞を製造する方法であって、前記小胞の外側表面コーティングは、コレステロールとＣ８〜Ｃ２６脂肪酸とから得られる少なくとも１つのコレステリルエステルを含み、前記方法は、
１．ａ）１つ以上の高分子と、任意で前記１つ以上の高分子の少なくとも１つの表面改質剤とを含有する極性溶媒混合物と、
ｂ）ミリスチン酸コレステリル及びラウリン酸コレステリルからなる群から選択される少なくとも１つの非イオン性コレステリル脂肪酸エステルを含む非極性溶媒混合物と
を超音波処理によって混合するステップと、ここで前記極性溶媒混合物ａ）及び前記非極性溶媒混合物ｂ）は、前記１つ以上の高分子と、前記１つ以上の表面改質剤と、前記少なくとも１つのコレステリル脂肪酸エステルと、前記非極性溶媒と、及び前記極性溶媒とが、前記混合するステップの後に小胞の均質分散物を形成するまで超音波処理され、
２．前記非極性溶媒を蒸発させて、前記極性溶媒中に前記小胞を残すステップと、ここで前記小胞のそれぞれは、複数の非イオン性コレステリル脂肪酸エステル分子と、前記１つ以上の高分子を内包する中空コンパートメントとを含む外層を備え、
とを含む方法。
【請求項６１】
ステップ１．ａ）における前記極性溶媒が、ｐＨ２．５〜３．５（好ましくは３）の緩衝液中にインスリンを含み、前記緩衝液中の前記インスリンの初期濃度が７．５〜８．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８ｍｇ／ｍｌであり、前記緩衝液の温度が３５〜３９℃（好ましくは３７℃）であり、前記緩衝液ａ）と前記非極性溶媒組成物ｂ）との混合物が２０分間超音波処理される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ステップ１又は前記ステップ２の間及び／又は後に、コアを積載した複数の前記小胞を、凝集を防止するための分散ステップに供することを含む、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記分散ステップがラウリル硫酸ナトリウムを用いて実施される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ステップ１、前記ステップ２若しくは前記分散ステップの間及び／又は後に、コアを積載した複数の前記小胞を、ゼラチン懸濁液を用いた安定化ステップに供することを含む、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
脂質小胞内にカプセル化された腫瘍溶解物又は該腫瘍溶解物からの１つ以上の高分子を含む組成物であって、前記小胞の外側表面コーティングは、コレステロールとＣ6〜Ｃ２６脂肪酸（好ましくはＣ６〜Ｃ２２脂肪酸又はＣ６〜Ｃ１４脂肪酸）とから得られる少なくとも１つのコレステリルエステルからなり、前記小胞の前記外側表面コーティングは、前記組成物が細胞膜を通過する間に無傷のままであり、これにより前記小胞及びそのコアがエンドソームを形成することなく樹状細胞を含むリンパ球系細胞に入り、細胞のコレステリルエステル加水分解酵素の作用により、カプセル化された前記溶解物又は抗原を前記細胞内で放出し、前記細胞中での前記溶解物又は抗原の細胞内濃度は、前記溶解物又は抗原を前記小胞内にカプセル化しない場合に同一濃度の腫瘍溶解物又は抗原を前記細胞に送達することによって得られる細胞内濃度よりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２５０倍高い、組成物。
【請求項６６】
前記腫瘍溶解物が、タンパク質、ペプチド、核酸又はこれらの混合物からなる群から選択される高分子を含み、前記組成物が抗原である、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
経口剤形であって、ｐＨ７．３〜７．６で前記腫瘍溶解物を放出するように定められたコーティングを備え、前記腫瘍溶解物又は抗原が、患者又は対象の回腸内の樹状細胞に向けられる、請求項６５又は６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記腫瘍溶解物が自己由来である、請求項６５から６７のいずれかに記載の組成物。
【請求項６９】
前記回腸で放出される組成物が、樹状細胞を活性化させることが実証された１つ以上の物質からなるコレストソームでカプセル化されたアジュバントを更に含有する、請求項６７又は６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記アジュバントはリポ多糖（ＬＰＳ）である、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
有効量の１つ以上のチェックポイント阻害剤モノクローナル抗体が任意で前記小胞内にカプセル化され、前記チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ又はこれらの混合物であり、前記組成物は、樹状細胞を活性化させることが実証された１つ以上の物質からなるアジュバントを任意で含む、請求項６５から７０のいずれかに記載の組成物。
【請求項７２】
前記アジュバントがリポ多糖（ＬＰＳ）である、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記回腸で放出される組成物が、樹状細胞に対するコレストソームでカプセル化された刺激物質、好ましくはＩＭＯ−２１２５を含有し、前記刺激物質による樹状細胞の活性化が、前記組成物に樹状細胞を曝露した後のインターフェロンガンマの濃度の上昇によって実証される、請求項６７から７２のいずれかに記載の組成物。
【請求項７４】
前記腫瘍溶解物の出所が同種異系である、即ち前記組成物が投与される患者以外の患者由来である、請求項６５から６７、６９から７４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７５】
前記小胞が腫瘍溶解物ではなく腫瘍抗原を含む、請求項６５、６７、６９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７６】
前記腫瘍抗原がｇｐ１００黒色腫抗原である、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記抗原が自己由来のポリ−ネオエピトープｍＲＮＡ癌免疫療法抗原構築物であり、前記抗原は治療対象の患者の癌細胞に由来する、請求項６５、６７、６９から７３、７５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７８】
前記ポリ−ネオエピトープｍＲＮＡ癌免疫療法抗原構築物が同種異系であり、前記抗原が、治療対象の患者から得られたものではないが、特定の種類の癌細胞に由来する、請求項６５、６７、６９から７３、７５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７９】
前記抗原の組成物構築物が自己由来であり、治療される前記患者の癌細胞から分泌されたエキソソームに由来し、前記エキソソームは前記患者の血液又は前記患者の腫瘍細胞から単離され、前記小胞は任意でアジュバントを含み、前記組成物は前記患者での癌細胞に対して細胞免疫応答を活性化する、請求項６５、６７、６９から７３、７５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８０】
少なくとも１つの追加の抗癌剤を更に含む、請求項６５から７８のいずれかに記載の組成物。
【請求項８１】
必要とする患者での癌を治療する方法であって、該方法は、請求項６５から７９のいずれかに記載の組成物を前記患者に経口投与することを含み、前記組成物は、前記患者の癌細胞に対して細胞免疫応答を活性化させる、方法。
【請求項８２】
前記組成物は少なくとも１つの追加の抗癌剤と同時投与される、請求項６５から７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
必要とする患者での癌を治療する方法であって、該方法は、請求項６５から７９のいずれかに記載の組成物の有効量を前記患者の腫瘍に直接注射することを含み、前記組成物が前記患者の癌細胞に対して細胞免疫応答を活性化させる、請求項６５から７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記組成物は少なくとも１つの追加の抗癌剤と同時投与される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞免疫応答は、前記組成物を前記患者のＴ細胞に曝露したときに前記組成物による刺激に応答したＩＬ−２又はＩＦＮガンマのインビトロ放出によって検出される、請求項８１から８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記小胞が、ミリスチン酸コレステリルと、ラウリン酸コレステリル又はパルミチン酸コレステリルのうちの１つ以上とからなる、請求項６５から８１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子、特に特定の生物活性ペプチド、タンパク質、核酸及びこれらの混合物をカプセル化する手段を対象とし、またこれは、これらの巨大分子に関して、経口吸収及び細胞内送達の両方を実現する第１の手段である。本明細書で開示される発明はコレストソーム（商標）であり、これは、親水性高分子についての高い積載容量をその中心に有する、中性電荷の脂質小胞である。高分子を含有し、１つ以上のコレステリルエステルからなるコレストソームは、従来の送達技術に勝る３つの特異な特性を示す。第１の特性は、高い経口バイオアベイラビリティであり、これは非経口ＡＵＣに対する経口に基づいて、少なくとも５０％、即ち多くの場合５０％超として本明細書では定義される。巨大親水性分子として、ペプチド、タンパク質、核酸及び蛍光プラスミドなどの限定でない例が挙げられ、これらはいずれも、これまで哺乳類の腸でほとんど吸収されないものであった。第２の態様は、無傷の小胞及びその高分子内容物をカイロミクロンに積載することであり、その小胞は腸細胞によって吸収された後、無傷の小胞がカイロミクロンに直接移送されるという特異な特徴である。第３の態様は、細胞と結合した体細胞による、無傷の小胞及びその高分子内容物の受容体を介した積載である。
【０００２】
本発明の更なる態様では、遠位腸での免疫活性化経路を標的とすることが可能となる。本発明は、遠位腸送達及び樹状細胞による吸収の両方を提供し、これらの要素を合わせると、上皮内癌に対する免疫系の経口活性化が可能となる。免疫系の樹状細胞内部で核酸、ペプチド及びタンパク質を送達する実用的な手段である本発明により、初めて自然免疫応答及び適応免疫応答の両方をプログラムするステップを生体外ではなく生体内で実施できることにより、以前の技術では決して可能とは考えられなかった方法で、その独自のプログラム手段を直ちに可能である。
【関連出願】
【０００３】
本出願は、２０１６年８月２３日出願の米国仮特許出願第６２／３７８，５９９号「Chylomicrons as Carriers for Cholesteryl Ester Vesicles Loaded with Peptides and Proteins for Oral Absorption and Intracellular Delivery」の優先権の利益を主張するものであり、その仮特許出願の内容はその全体が参照によって本出願に援用される。
【背景技術】
【０００４】
巨大ペプチド、タンパク質又は他の高分子が治療又は診断物質としての役割を果たす、多数の新規な治療製品がある。これらの大半は、細胞表面受容体に対する一次作用を有すると考えられ、その細胞表面受容体は、体内での分子の合成及び分解を制御するシグナリング経路の細胞内シーケンスに影響を及ぼす。これらの分子の大半は、無傷のまま消化管の細胞が吸収するには大き過ぎ、胃において複数の成分のアミノ酸に分解される。全般的に見ればこれらの分子は経口吸収さないため、実質的に全ての場合において、これらの分子はその治療作用を発揮するために体内に注射される。
【０００５】
慢性的な状態の治療に関して、患者の利便性及び服薬順守の向上のために、皮下（ＳＣ）注射などの非静脈（ＩＶ）経路を介した巨大分子の送達に大きな関心が寄せられている。一方で、一般的な投与経路である非経口投与は、さまざまな理由により、高分子の送達のための最善策にはなれない。経口投与に比べて非経口的送達は、より多くの費用が掛かり、機械設備及びより高度に熟練した人材を必要とする。皮下注射は、患者が自宅で実施できることを含む、ＩＶの使用に勝る利点を有する。しかしながら、ペプチド（モノクローナル抗体などのポリペプチドを含む）、タンパク質及びＤＮＡの経口投与は、経口送達が消化管を損傷させることなく又は送達物質自体による全身性副作用若しくは合併症をもたらす新規の物質無しで実現できるならば、はるかに便利であり、より高い安全性を有する。
【０００６】
当業者は一般に、哺乳類では巨大タンパク質分子の経口投与によって十分なバイオアベイラビリティ（皮下注射の血中濃度の曲線下面積の５０％超）を実現することはできないと考えている。経口経路による投与の場合、これらのタンパク質は腸細胞によって無傷のまま吸収されることはない。それどころか、これらのタンパク質は腸管腔内の酵素によって成分のアミノ酸構成要素へ分解され、これらの成分が腸細胞によって吸収される。このような保護されていない製剤では、経口製剤は、前消化管の胃及び十二指腸中での酸、プロテアーゼ又は胆汁による分解の結果として、生物利用可能ではなくなる。これらは不活性となる。これは特に、ペプチド、タンパク質、特定の小分子、及び核酸などの医薬組成物に当てはまる。バイオテクノロジー産業によって作られる実質的に全ての治療用タンパク質は、これらの消化管分解経路の影響を完全に受け、十分なバイオアベイラビリティを得る可能性はない。
【０００７】
この分解に関する問題に取り組んでいる当業者は、局所的な分解経路を回避して高分子の経口バイオアベイラビリティを改善するために、多様な保護戦略を試験している。酸がペプチダーゼを活性化させてタンパク質及びペプチドを分解することにより、成分のアミノ酸を迅速に吸収できるようにする胃の酸障壁を迂回するために、腸溶コーティングが１９６０年代から採用されている。腸溶コーティングは胃での酸分解に対する保護を提供するものの、その分子は十二指腸での酵素及び胆汁酸により迅速な分解を依然として受けやすい。腸溶コーティングは、腸細胞がペプチド又はタンパク質を吸収及び分解することを防止しない。よってペプチド又はタンパク質を腸溶コーティングすることによって実現される典型的なバイオアベイラビリティは、約５％、又は実質的に更に低くなる。
【０００８】
タンパク性コーティングは、典型的には吸収促進剤Ｎ−［８−（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）と共に、保護コーティングとして長年採用されてきた。この組成物の例は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅのウェブサイト（ｗｗｗ．ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ．ｃｏｍ）、及び２０１５年８月２６日のプレスリリースにおいて開示されており、そのプレスリリースには、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋによって開発中のＧＬＰ−１アゴニストであるセマグルチドに適用される、ＥｍｉｓｐｈｅｒｅのＥｌｉｇｅｎ（登録商標）技術（タンパク性コーティング及び吸収促進剤ＳＮＡＣ）の使用について記載されている。典型的な経口バイオアベイラビリティは、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋの開示によると最低１％かつ最高２．５％であり、週１回の１．０ｍｇのＳＣ用量は、１日１回経口投与される４０ｍｇ用量のＨｂＡ１ｃ（Ｃｌｉｎｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＮＣＴ  ０１９２３１８１）と同じであった。なお、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅの技術は２０１５年１０月現在、第３相試験でのセマグルチドを用いた経口使用に関して開示されている。
【０００９】
いくつかの事例で、Ｋｉｄｒｏｎ  ２０１３（１）などの当業者は、インスリン及びＧＬＰ−１などの重要なペプチドの腸溶コーティングに成功しており、更にプロテアーゼ阻害剤をその製剤と組み合わせることによって局所的な酵素分解を阻害しており、更に腸細胞自体を迂回する門脈血中に高分子を入れるために、細胞間の間隙を広げる手段としてＳＮＡＣ又はＮ−［１０−（２ヒドロキシベンゾイル）アミノ］デカン酸ナトリウム（ＳＮＡＤ）を組み合わせている。製剤のこれら３つの成分の全てが十分に活用されて局所的に作用可能であっても、実現される最高の経口バイオアベイラビリティは、これらの戦略では１０〜２０％である。残りの依然として解決されていない問題は、無傷のインスリン又はＧＬＰ−１が腸細胞に取り込まれず、無傷の活性形態で血中に移送されないことである。腸細胞が無傷のペプチドを内在化した場合でさえ、腸細胞自体が、腸細胞に取り込まれた保護されていないインスリン、ＧＬＰ−１、タンパク質又は核酸材料を更に分解してしまう可能性がある。従って、最悪の場合の分析では、ペプチドを腸細胞の周りに届ける吸収促進剤が、Ｋｉｄｒｏｎ又はＥｍｉｓｐｈｅｒｅが採用している戦略の最も有効な構成要素となる。
【００１０】
Ｋｉｄｒｏｎと同様の方法において、他の者が、典型的にはリン脂質又はリン脂質とポリエチレングリコールなどの高分子との混合物からなる、保護のための外側コーティング又はリポソームなどの粒子の作製を試みている。例えばＩｒｖｉｎｅ  ２０１１（２）を参照。Ｉｒｖｉｎｅによる米国特許出願第２０１１−０２２９５２９号（２）からの以下の抜粋において説明されているように、リポソームは上述の問題を解決しない。リポソームは、小型分子用の送達ビヒクルとして広範に利用されている。しかし、リポソーム内では多くの高分子薬物について高濃度のカプセル化を実現することは、これらの巨大分子は水溶性の傾向にあり、そのため典型的なリポソームの親油性の内核に適合できないため、依然として困難である。マイクロ及びナノ粒子による薬物送達が、タンパク質及び小型分子薬物をカプセル化できるが、これは依然として粒子質量当たりで非常に低いカプセル化薬物の総質量をもたらし、この事例ではタンパク質：リン脂質混合物で、典型的にはおおよそ１：１０００〜１：１０，０００の程度の質量比をもたらす（例えば、Ｂａｌｕ−Ｉｙｅｒの米国登録特許第７，６６２，４０５号（３）を参照）。
【００１１】
リポソームは、ドキソルビシンなどの親油性分子を使用した場合でさえ、１重量％まで積載することは稀である。本発明者らが開発したコレストソームは、少なくとも２０％、そして提示されたインスリンなどの限定でない例では６０％超を積載する（本明細書中では特段の記載がない限り％は重量％である）。
【００１２】
更に、多くの薬物製剤が、有用な薬物送達動態を維持するにはあまりに速くリポソームから漏出する。その上、重合体粒子合成で用いられる有機溶媒及びこれらの粒子内の疎水性／酸性環境が、治療剤の破壊をもたらし得る（Ｚｈｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  １８：５２−５７（４）参照）。
【００１３】
上述した少量の水溶性タンパク質又は小型分子のカプセル化以外にも、リポソームの使用には他の問題点がある。具体的には、大部分のリポソームの成分はリン脂質、通常はホスファチジルコリンであり、これらは両親媒性である。そのようなナノサイズの脂質粒子は、強い正の電荷を有する表面を有し、従って腸細胞の外膜により、そしてまた末梢細胞の細胞膜により反発される。
【００１４】
従って、リン脂質ベースのリポソームは経口的に吸収されず、また非経口的に投与されたときには、その中身を細胞に通過させることができない。従って、現在の組成物のリポソームは、タンパク質又はペプチド（モノクローナル抗体などのポリペプチドを含む）のカプセル化に不適である。十分なタンパク質又はペプチドをそれらの粒子に積載しても、いずれのリン脂質ベースのリポソームも、その分子積載物を損傷することなくカイロミクロンに取り込むことはできないので、経口的吸収の課題は解決できない。
【００１５】
Ｔｓｅｎｇ及びその同僚らは、そのような問題点を２００７年に更に分析し（５）、そこでコレステロールをホスファチジルリポソームに付加することが、そのような特性を変更して積載を改善するという仮説を試験した。彼らは、積載において僅かな改善しか見出せなかった。外側表面の正電荷を変更するのに十分なコレステロールはなかった。彼らにとってのより大きな意義は、リポソーム内のコレステロールを増加することは、積載された分子の脱出を防止するという観察事実であった。「リポソーム内のコレステロール含有量を増加した結果、非電解質及び電解質溶質についての膜透過性において劇的な増加をもたらす。リポソームによる最適化された薬物の送達は、最終的に透過性になり、標的化領域へカプセル化された薬物を放出するようにするリポソーム担体を必要とするが、それはまた血流での高い安定性を必要とする」。従って、コレステロール含有リポソームの分子放出特性における悪化を挙げて、本発明の特異なコレステリルエステル小胞とは完全に無関係な分野を更に教示しており、リポソーム分野全体においてリポソーム成分としてのコレステロールをほぼ断念している。
【００１６】
Ｉｒｖｉｎｅの特定のリポソームは、哺乳類に注射によって投与した場合、高分子の細胞内送達を増大させ、これは細胞内の核酸材料のトランスフェクションに良好に使用されている。しかしながら、リポソームでのリン脂質組成物は胃酸中では特に不安定であり、腸の胆汁酸によって分解され、これはペプチド及びタンパク質が分解されやすい腸内でのそれらの放出をもたらす。従って、リン脂質ベースのリポソーム中の高分子の使用では、経口バイオアベイラビリティはほとんど全く改善されない。そのリポソームは、注射によって投与される場合の徐放性製剤として、医薬に広く使用されている。リポソーム製造技術は一般にリン脂質組成物に依存しており、カチオン性粒子が最も一般的に製造され、本発明者による中性表面を有する小胞でのコレステリルエステルの使用からは離れた教示である。実際のところ、当該技術分野において開示されているリポソームのように小胞をリン脂質で作った場合、このような小胞が細胞によって取り込まれるとエンドソーム段階が生じるため、本発明の独自の有益な態様（５０％を超えるバイオアベイラビリティでの経口吸収、カイロミクロンへの無傷の取り込み、エンドソームに依存しない無傷の積載物の細胞内送達）のいずれもが失われる。
【００１７】
腸細胞による経口吸収のために高分子を送達しようとする先行技術の試みは、ナノサイズの粒子でのカプセル化によるものである。ほとんどの研究は、多様な組成のリポソームを用いて行われた。リポソームの欠点を認識した上で、タンパク質及びペプチドを消化管内での分解から保護するという同一の目標を有する、脂質又はポリマーベースの合成ナノ粒子が製造されている。例えばＧｅｈｏ  ２０１３（６）を参照。いくつかの製剤は、吸収されるペプチドの量を増大させるために、ペプチドと共にプロテアーゼ阻害剤を含んでいる。改善は僅かであり、経口バイオアベイラビリティを５％程度から１０％程度にするものの、依然としてバイオアベイラビリティを上昇させるための戦略として実行できない程度である。問題は、注射によって得られるものと同一の血中濃度を実現するために、どれほど多くの量を供給しなければならないかということである。
【００１８】
Ｇｅｈｏは、カプセル化された分子が上記細胞間の間隙に入ることによって消化管を通じて運ぶために、分子シャペロン技術を使用する。これらの技術は、細胞間に局所的な間隙を形成すること、及び分子を上記間隙に入れることに依存する。その方法は、経口バイオアベイラビリティを多少改善する（典型的には１５〜２０％まで）が、腸細胞及び他の重要な十二指腸の細胞に対する局所的な傷害のリスクも有する。Ｇｅｈｏの複数の態様、典型的にはプロテアーゼ阻害剤、及びＳＮＡＣ又はＳＮＡＤなどの化学的手段を用いて細胞間の間隙を広げる手段は、Ｋｉｄｒｏｎ及びその他によって利用されている。改善は僅かであり、経口バイオアベイラビリティが５％程度から１０％程度になるものの、依然としてバイオアベイラビリティを上昇させるための戦略として実行できない程度である。問題は、注射によって得られるものと同一の血中濃度を実現するために、どれほど多くの量を供給しなければならないかということである。
【００１９】
経口インスリンのバイオアベイラビリティの改善を試みる複合アプローチにおいて、Ｓｏｎａｊｅ及びその同僚らは、ラットにおいて約１７〜２０％のインスリンのバイオアベイラビリティを実現し、これは現時点でのアプローチの最良の組み合わせを示している（７−９）。彼らは、内因的に分泌されるインスリンの生理学的結果を模倣して、外因性インスリンの経口投与は、門脈循環を通して薬物を肝臓に直接送達するという前提から始めている。この特徴により、高インスリン血症及びこれに関連する長期の合併症を回避しながら、必要な肝臓の活性化を提供できる。Ｋｉｄｒｏｎ及びＧｅｈｏ、並びに本発明者らの知る限りインスリン及びＧＬＰ−１に取り組む他の全ての当業者はこの前提を受け入れており、従ってインスリンを、インスリンが分解されてしまう細胞内ではなく、細胞の周りに移動させてインスリンを保護することに焦点を当てている。よって経口バイオアベイラビリティを改善するための現在の標準は、分解からの保護、及び分子を門脈血中に取り込むことができる腸細胞の周りに分子を移動させる試みである（１、６）。Ｓｏｎａｊｅは、キトサンナノ粒子（ＮＰ）を使用し、この担体が有害な胃内環境に対する保護を提供することにより、酵素分解を回避すると主張している。Ｓｏｎａｊｅらによる最新の研究は、インスリンの経口送達のための、キトサン（ＳＣ）及びポリ（ガンマグルタミン酸）からなるｐＨ応答性ＮＰ系について記述している（７）。キトサンは無毒の軟組織適合性のカチオン性多糖類であり、粘膜表面に付着し、連続した上皮細胞の間の密着結合（ＴＪ）を一時的に開く。従って、ＣＳ  ＮＰを用いて作られた薬物は、従来の錠剤又は粉末製剤に勝る、送達に関する利点を有することになる。これらのＣＳ  ＮＰは、小腸の粘液層に付着して浸透できる。その後、浸透したＣＳ  ＮＰは、上皮細胞間のＴＪを一時的に開く。そのナノ粒子はｐＨ感受性であるため、安定性が低下して崩壊し、積載したインスリンを放出する。そしてインスリンは、開かれた傍細胞経路を通って侵入し、十二指腸細胞による吸収を迂回して、体循環へと移動する。このラットモデルにおけるアスパルトインスリンの算出されたバイオアベイラビリティは、１７％であった。
【００２０】
これらの当業者によるその後の研究は、ＣＳコーティングを保持し、しかし吸収促進剤を、ポリ（ガンマグルタミン酸）から、ガンマＰＧＡ−ＤＴＰＡとして知られるガンマポリグルタミン酸−ジエチレントリアミン五酢酸を形成するＤＴＰＡの添加に変更した。実験結果は、ＣＳ／ガンマＰＧＡ−ＤＴＰＡ  ＮＰが、ラットの小腸全体を通じてインスリン吸収を促進できることを示し、吸収されたインスリンは腎臓及び膀胱においてはっきりと確認された。血中グルコース濃度の長期的な低減をもたらすことに加えて、ＣＳ／ガンマＰＧＡ−ＤＴＰＡ  ＮＰを含有する腸溶コーティングカプセルの経口摂取は、処置の４時間後に最大インスリン濃度を示した。インスリンの相対的な経口バイオアベイラビリティはおよそ２０％であった（８）。これらの研究は、バイオアベイラビリティを、５〜１０％から理論的限界である２５％に近づける。プロテアーゼ阻害剤は明らかに重要であるが不十分であるため、更なる分子異化を防止しながらタンパク質を腸細胞に取り込む新規の手段を用いて、タンパク質の乏しいバイオアベイラビリティを更に改善することが依然として必要である。腸細胞に取り込まれた遊離インスリンがこれらの腸細胞内で分解されるという問題は残っている。腸内放出の正確な部位に依存して、腸細胞の周りのインスリンを門脈血中に移動させる戦略は、異化のない腸細胞による取り込みでないことに依然として苦悩しており、そのことは経口投与時のインスリンの分解の主要な手段である。
【００２１】
コーティングを用いて細胞膜を通過する戦略に関しては、細胞内に物質を移動させるナノ粒子がある。Ｈｏｎｇ  ２００４は、米国特許出願第２００４−００３７８７４Ａ１号（１０）において、ミセル様ナノ粒子送達手段について記載している。このカチオン性ナノ粒子は、主に細胞への遺伝物質のトランスフェクションに有用となり得るアニオン性核酸のカプセル化に使用された。これは、細胞膜の通過中にエンドソーム取り込みを受ける傾向を有し、これによってその内容物は分解された。更に、これは消化管の過酷な環境において不安定であり、腸細胞によって無傷のまま取り込まれにくいため、経口用途に好適ではなかった。
【００２２】
非経口投与後であっても、ほとんどの高分子は膜の通過での問題に直面し、またほとんどの送達システムは、無傷の高分子を細胞内に提供できない。その高分子は多くの標的細胞から排除され、その結果、除去又は分解されるまで血中で循環するものの、体細胞に良好に入り込むことはできない。エンドソーム取り込みは高分子を破壊する場合があり、高分子は細胞内標的に活性形態で到達できない。単独の又は送達手段中の高分子はいずれも、脳などの選択された器官及び組織を高分子の標的とすることを効果的に防止する脳血管障壁などの局所的障壁を通過できない。標的細胞への到達の失敗は、脳からアミロイドを除去するためのアミロイド経路内の標的に対するモノクローナル抗体の多くの臨床試験の失敗、及びアルツハイマー病を改善するために十分なモノクローナル抗体の活性の欠如の根本的な原因となり得る。一般に、これらのタンパク質はサイズが大きく、また脂質溶解度が低いため、他の新規の標的モノクローナル抗体の細胞内有効性も制限され得る。
【００２３】
Ｎａｇｙ（２０１４年）は、核酸にも適用される洗練された細胞内送達システムを実証しており、ここでは細胞内での放出は、粒子自体の酵素分解に依存した（１１）。しかしながらこの粒子も同様に、消化管内では不安定となるようであり、リンパ管及びそれに続く体細胞への送達のために無傷のままカイロミクロンに入らないようであった。Ｎａｇｙの粒子はまた、その粒子を取り込む細胞のエンドソームにおいて分解される可能性があった。
【００２４】
これらの技術は全て、腸細胞に無傷のまま取り込むこと、及び腸細胞を通した腸障壁の側底側の血液への通過中に無傷のままとすることが不可能であるという、上述の及び他の全ての脂質ベース粒子の主要な制限に直面している。
【００２５】
タンパク質、ペプチド及び遺伝物質などの経口投与された分子は、消化管内で消化されるか、若しくは無傷の形態で腸細胞の細胞膜を横断して拡散できないか、又はこれら両方であるため、当業者は、消化管を通した吸収が２５％以下である点に経口バイオアベイラビリティの障壁が存在し続けており、従ってタンパク質、ペプチド及び核酸に関しては、ＩＶ又はＳＣ投与が、上記活性医薬品の投与のための唯一の信頼できる方法であると広く信じている。
【００２６】
現在の技術を用いたペプチドの経口送達にとって厄介な根本的問題は、患者に所望の結果をもたらすために経口投与しなければならない薬剤の量である。例えば、セマグルチドの例のように分子が２．５％のバイオアベイラビリティを有する場合、経口用量は注射用量の４０倍であり、これは商品コストに影響を与え、分子自体の生産に関して問題となり得る。可溶性プロファイルの悪さ又は表面コーティングの分解によるバイオアベイラビリティの低さは、ある特定の薬剤が消化環境に耐えるとしても、その薬剤を意味のある方法で経口投与できないことを意味し得る。その薬剤は、例えば静脈内投与又は別の注射可能な投与経路を介した投与の場合に必要な用量よりも大幅に大きな用量で投与される必要があり得る。
【００２７】
ある大手企業が上述のようなセマグルチドの経口製剤を、経口用量が皮下用量の１０〜４０倍になるにもかかわらず第３相試験に供したことは、これらの絶望的な時代の兆しである。明らかな商品コストの上昇以外の更なる問題は、吸収のばらつきが大きくなる可能性があることであり、これは食品の影響などの未知の要因によってある特定の日に通常より多量に吸収された場合に、有害な副作用をもたらす。
【００２８】
本発明者らは、腸細胞、並びに経口投与されたタンパク質及びペプチドの腸細胞に関連する分解に対する、新規のアプローチを開示する。本発明は概念が簡単であり、非毒性製剤材料を使用し、そして予想外にマウス及びラットにおいてほぼ１００％のバイオアベイラビリティが得られた。得られる送達小胞は消化管内で安定しており、腸細胞によって完全に吸収される。しかしながら腸細胞はその粒子を分解せず、代わりにその粒子及びその内容物を、リンパ管を通した体細胞への送達のためにカイロミクロンに挿入する。よってその送達小胞は、その内容物を保護して消化管及び体細胞の細胞膜を通過し、初めて無傷の積載物を標的化された細胞内に送達する。小胞及びその内容物の細胞内送達を可能とする、カイロミクロンと結合する表面受容体を発現するいずれの細胞も、この新規の送達手段のために標的化される細胞である。本発明の特徴は、ＭｃＣｏｕｒｔ（１２）、並びにＳｃｈｅｎｔａｇ及びＭｃＣｏｕｒｔ（１３）によって開示されている。２５％のバイオアベイラビリティの障壁を克服できる予想外の能力が、本明細書で開示される本発明の主題である。
【００２９】
明らかに、タンパク質の経口投与による成功は、消化管内の酸及び／又は酵素分解を克服し、更に腸細胞膜に対する低い透過性を克服する、新規の製剤の創出に依存しており、また最終的に送達方法は、ペプチドを細胞内へと通過させ、かつ細胞膜の反対側においてペプチドを送達手段から無傷のまま放出する現在不可能であることを克服しなければならない。上述の制限及び欠点は全て、本明細書中で後に開示されるように、例えばインスリンに関して改善されている。
【００３０】
インスリンは、糖尿病に罹患した患者の治療に使用される薬剤であり、インスリン依存性糖尿病に対する唯一の治療法である。糖尿病は、絶対的又は相対的なインスリン欠乏（これは高血糖症につながる）という病理学的状態を特徴とし、２１世紀のヒトの健康に対する主な脅威の１つである。糖尿病患者の世界的負担は、２０１０年には２億２０００万人、そして２０２５年には３億３０００万人になる。Ｉ型糖尿病は主に、インスリンを産生する膵臓の機能不全に起因する。ＩＩ型糖尿病は、インスリンの作用に対する身体の応答性の欠如、インスリン抵抗性と呼ばれる状態を含む。インスリン抵抗性は、肥満、肝臓脂肪症、アテローム性心臓病、更には多くの形態の癌などの他の多数の代謝性疾患の前兆である。
【００３１】
全ての糖尿病のおよそ２０％〜３０％は、グルコース濃度を維持するために毎日インスリン注射をする。全ての糖尿病のうちの推定で１０％が、インスリン注射に完全に依存している。
【００３２】
現在、インスリン投与の唯一の経路は注射である。インスリンの毎日の注射は、患者にとって相当な苦痛を引き起こし、患者の服薬遵守に影響を及ぼし得る。最大の問題は低血糖症であり、これは重篤なものとなり得、場合によっては生命を脅かす場合がある。脂肪異栄養症、脂肪萎縮症及び脂肪肥大などの副作用は、注射部位において発生する。更にインスリンの皮下注射は、典型的には膵臓から門脈を介して肝臓に直接分泌されるインスリンが通常引き起こす、代謝の連続的な微調節を提供しない。
【００３３】
本発明は、インスリン及びインスリンなどのペプチドの投与のための代替的な解決策の必要性に対処する。最初に本発明は、インスリンの、注射可能な用量と同一の経口用量を提供する。これは、１００％の経口バイオアベイラビリティを実現する送達手段に関して予想される結果である。
【００３４】
インスリン及び他のペプチドの現在の経口製剤は、プロテアーゼ阻害剤及び吸収促進剤を必要とする（１）。実験データは、プロテアーゼ阻害剤が経口インスリン製剤による消化管での分解の問題を部分的に克服できることを示している（１）。しかしながら、経口吸収での改善があった場合であっても、全く吸収しないのをおそらく１０〜１５％の吸収に変換するのが最大の効果である。このような改善があったとしても、経口バイオアベイラビリティは低くかつ変動しやすいままであり、その結果、経口用量は注射で投与する場合の１０倍高くなることが多く、これは、いずれかの所与の日に投与された用量が全て実際に吸収された場合に致死量となり得るインスリンに患者を曝露することになる。
【００３５】
極めて重要なことには、本発明の送達手段は、小胞において実施される変形ステップである、脂質小胞の分子積載物に損傷がない状態でのカイロミクロンへの脂質小胞の取り込みによって、腸細胞代謝を伴わない腸細胞への細胞内送達という問題を解決する最初の手段である。カイロミクロンへの良好な取り込みは、本明細書で開示されるコレステリルエステルを用いて脂質小胞を構築することによってのみ可能となる。公知の他の生物学的カプセル化の方法はいずれも、消化管腸細胞による小胞の損傷のない取り込みを提供しない。
【００３６】
本発明においては、発明者らは、消化管腸細胞の膜を通過してカイロミクロンに入る分子を保護することによって、小胞全体をカイロミクロンに取り込む間に積載物を無傷のまま維持するという特定の目的のために、Ｃ８〜Ｃ１４コレステリルエステルの好ましい特定の混合物による高い積載性（即ち積荷が、７５０ｎｍ〜７，５００ｎｍ、より多くの場合には１，５００〜２，５００ｎｍ、より多くの場合には２０００ｎｍである好ましい小胞サイズにおいて、積荷を積載した小胞の総重量の２０重量％〜９６重量％、２５重量％〜９５重量％、多くの場合には２５〜９０重量％、３０重量％〜８０重量％、２５重量％〜７５重量％である）、及び遅い放出特性を選択したことに留意されたい。
【００３７】
そしてカイロミクロンは、コレステリルエステルなどの脂質のための完璧な脂質送達手段となり、従って通常は発生する細胞による取り込みへの抵抗は存在しない。コレステリルエステル及びその損傷していない積載物が細胞膜を通して細胞質に入る際に、エンドソーム段階は発生しない。コレステリルエステルのカプセル化タンパク質の開梱（ｕｎｐａｃｋｉｎｇ）は体細胞への送達後に体細胞内でのみ発生し、これは現在のいずれのシステムにも勝る大きな利点を本開示の送達方法に与える。従って本発明者らは、特許が存在する前に当然発明されていたもののこれまでペプチド送達手段の合成には使用されていなかった、トロイの木馬に類似したものを開示し、これは開梱が発生して通常細胞から排除される分子が内部に存在する際に、細胞内において驚くべき所望の結果をもたらす。
【００３８】
本開示のプロセスは、コレステリルエステルを用いた場合にのみ本開示のように作用することにも留意されたい。これは、脂質の中でもこれらの分子だけが、カイロミクロンによる細胞内送達及び細胞内での開梱の全ての過程において無傷のまま扱われるためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
既存の高分子による治療の限界を考慮すると、経口などの比較的便利な方法で、薬学的に活性を有する高分子を投与する製剤及び治療に対する需要が存在し続けており、そしてタンパク質及び他の分子を細胞に入れることができる製剤に対する需要が存在し続けている。これら両方の態様（経口吸収及び細胞内送達）を実現する１つの製剤手段の使用が、本発明に唯一の独自の態様である。
【００４０】
本発明においては、発明者らは好ましくは、消化管腸細胞の膜を通過してカイロミクロンに入る分子を保護することによって、小胞全体をカイロミクロンに取り込む間に積載物を無傷のまま維持するという特定の目的のために、Ｃ８〜Ｃ１４コレステリルエステルの好ましい特定の混合物による高い積載性及び遅い放出特性を選択したことに留意されたい。
【００４１】
そしてカイロミクロンは、コレステリルエステルなどの脂質のための完璧な脂質送達手段となり、従って通常は発生する細胞による取り込みへの抵抗は存在しない。コレステリルエステル及びその損傷していない積載物が細胞膜を通して細胞質に入る際に、エンドソーム段階は発生しない。コレステリルエステルのカプセル化タンパク質の開梱（ｕｎｐａｃｋｉｎｇ）は体細胞内でのみ発生し、これは現在のいずれのシステムにも勝る大きな利点を本開示の送達方法に与える。
【００４２】
本開示のプロセスは、コレステリルエステルを用いた場合にのみ本開示のように作用することにも留意されたい。これは、脂質の中でもこれらの分子だけが、カイロミクロンによる細胞内送達及び細胞内での開梱の全ての過程において無傷のまま扱われるためである。
【００４３】
既存の高分子による治療の限界を考慮すると、経口などの比較的便利な方法で、薬学的に活性を有する高分子を投与する製剤及び治療に対する需要が存在し続けており、そしてタンパク質及び他の分子を細胞に入れることができる製剤に対する需要が存在し続けている。これら両方の態様（経口吸収及び細胞内送達）を実現する１つの製剤手段の使用が、本発明に唯一の独自の態様である。本発明はまた、カイロミクロンの受容体を発現する細胞へのタンパク質又はペプチドの積載手段であって、脂質小胞内に前記分子を内包する積載手段も対象とする。この方法は経口用途に好適であり、経口送達手段として使用すると、ペプチド及びタンパク質に関するバイオアベイラビリティは、分子及びカプセル化の手段によってはほぼ１００％となる。本明細書で開示される方法を使用すると、細胞に無傷の分子が積載され、エンドソームを形成することなく細胞内への通過が生じる。本発明によれば、本発明による新規の積荷積載コレストソームは、患者又は対象の細胞内に活性分子を届けることができ、患者又は対象の治療又は診断をもたらす。この方法はまた、細胞内代謝の阻害剤の送達によって増強される。これは、非代謝分子が細胞から放出されて、別の方法で排出されるまで生物流体中を循環するためである。
【課題を解決するための手段】
【００４４】
本発明は、１つ以上のコレステリルエステルからなる脂質小胞内に親水性高分子を閉じ込め、そしてその小胞の好ましい表面特性により、これらの細胞がタンパク質又は小胞を分解することなくタンパク質又はペプチドを消化管腸細胞内に移動させる手段を対象とする。第２のステップとして、腸細胞は、無傷のその小胞を、血中へのリンパ移送のためにカイロミクロン中に移動させる。第３のステップとして、カイロミクロンは細胞（好ましくはカイロミクロン受容体を発現する）と結合し、これらの細胞にコレステリルエステル小胞及びその高分子積載物を積載する。この新規の発明の結果は、その高分子に関する高い経口バイオアベイラビリティ及び細胞内送達の両方である。本明細書中で開示される送達手段は、驚くべきことに経口取り込み及び細胞内送達の療法を実現し、これらはいずれも本発明より以前においては、高分子に関して良好に実現されたことはなかった。従来技術のアプローチは、これらの分子及び同様の巨大分子を腸細胞の周り及び腸細胞間に移動させることに焦点を当てていたが、腸細胞を通して、及び腸細胞から体細胞内へと分子を移動させる手段では、成功は得られなかった。
【００４５】
上述のように、本発明のある実施形態は、タンパク質又はペプチドを消化管腸細胞のゴルジ体内のカイロミクロン中に移動させ、続いて前記組成物がカイロミクロンの付着のための受容体を発現する細胞中に送達されるまでリンパ管及び血液中で循環させるために、積載済みカイロミクロンを腸細胞から放出する手段である。この方法は経口用途に好適であり、経口送達手段として使用すると、ペプチド及びタンパク質に関するバイオアベイラビリティは、分子及びカプセル化の手段によってはほぼ１００％となる。本明細書で開示される方法を使用すると、細胞に無傷の分子が積載され、驚くべきことに分解のエンドソームを形成することなく細胞内への通過が生じる。本発明によれば、本発明に従って調製される新規の積荷積載コレステリルエステル小胞は、患者又は対象の細胞内に活性分子を届けることができ、患者又は対象の治療又は診断をもたらす。実施形態では、この方法はまた、細胞内代謝の阻害剤の送達によって増強される。これは、非代謝分子が細胞から放出されて、別の方法で排出されるまで生物流体中を循環するためである。従来技術のアプローチは、カイロミクロンに取り込まれず、エンドソームを必要とせずに細胞膜を通過するのが容易ではないコーティングに焦点を当てていた。これらの従来技術の方法は、無傷の積載物の細胞内送達において効果が低い。
【００４６】
本発明は、十分に実現可能な例として、１つ以上のペプチドと、任意で細胞内ペプチド代謝の１つ以上の阻害剤とを含む、治療を必要とするヒト患者の治療における経口用途のための組成物を提供する。好ましい実施形態では、その組成物は、癌、感染症、糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及びメタボリックシンドロームの治療に有用である。
【００４７】
好ましい実施形態では、前記ペプチドは、任意でＧＬＰ−１アゴニストと組み合わされたインスリンであるが、これらの実施形態は限定的なものではなく、いかなる量のいずれのペプチド、タンパク質又は他の分子も明らかに本発明の範囲内である。積載済みの小胞は、１つ以上のペプチドを混合物として内包してもよく、そのペプチドの混合物はまた、細胞内で放出された時に前記分子の滞留時間を延長する目的で、ペプチド代謝の阻害剤を含有してもよい。
【００４８】
本発明の複数のステップは、Ｃ６〜Ｃ２６コレステリルエステル（即ちコレステリルエステルがコレステロールと、エステルを形成するＣ６〜Ｃ２６脂肪酸とから形成される）と、細胞への高分子の送達（特に、本明細書中の他の箇所で記載されているような経口経路の投与によるものを含むが、これに限定されない）の増強を提供する小胞の基本的な特徴に実質的に影響を及ぼすことのない他の成分とから本質的になる１つ以上のコーティング材料を必要とし、前記コレステリルエステルは、好ましくはＣ６〜Ｃ２２、Ｃ８〜Ｃ２２、Ｃ８〜Ｃ１８、好ましくはＣ８〜Ｃ１４コレステリルエステルであり、これは特異なことに、親水性中空中心と、小胞の内側表面及び外側表面の両方での中性電荷とを備えた小胞を形成する。その小胞は、ペプチド（好ましい実施形態ではインスリン）などの高分子を積載すると、特異なことに、腸細胞の頂端膜刷子縁に位置する腸細胞表面トランスポーターによって腸細胞に取り込まれる。高分子を内包する無傷の小胞は、その小胞の表面が腸細胞によって栄養素として認識される（脂肪酸及びコレステロールの両方の成分が、共にコレステリルエステルとして必要とされる）ため、取り込み後に細胞内で変化しない。腸細胞は、内部ペプチド積載物が損傷せずかつ認識されていない状態で、その小胞を新生カイロミクロンに入れる。このステップから、カイロミクロンは腸細胞によってリンパ管に送られ、これによりそのカイロミクロンについての表面受容体を発現する腸細胞でない体細胞内へ、これらの積荷積載コレステリルエステル（脂質）小胞のカイロミクロン送達が可能となる。
【００４９】
前記コレステリルエステル小胞の構築に使用されるコレステリルエステルは、コレステロール（本明細書中で定義されるような）と、本明細書の他の箇所で記載されるような１つ以上の飽和又は不飽和脂肪酸とから作られる。本発明において好ましい送達手段として開示される小胞は、Ｃ６〜Ｃ２６、Ｃ６〜Ｃ２２、Ｃ８〜Ｃ２２、Ｃ８〜Ｃ１８、好ましくはＣ８〜Ｃ１４の少なくとも１つの非イオン性コレステリルエステルを用いて構築され、小胞の組成の最適な実施形態は、ミリスチン酸とラウリン酸との質量比が４０：６０〜６０：４０、好ましくは５５：４５〜４５：５５又は５０：５０であり、これは腸細胞の頂端側トランスポーターによって最適に認識されて、無傷の小胞としてこれらの細胞に取り込まれる。
【００５０】
これらのコレステリルエステル小胞は、１つ以上のカプセル化された活性分子の周囲で環にされる。Ｃ６未満、特にＣ２〜Ｃ５（Ｃ４を含む）の脂肪酸から作られたコレステリルエステルは容易に環にならず、本発明による小胞でのカプセル化には不適となる。Ｃ１６より長いコレステリルエステルは、頂端側脂肪酸トランスポーターによる腸細胞内への内在化があまり最適でない。前記送達手段は、コレステリルエステルでのカプセル化がなく、前記コレステリルエステル小胞への積載でないといずれも腸細胞膜を適切に通過できない、様々なサイズの分子に好適である。前記小胞の特定の組成は、腸細胞による取り込みで搬送し、経口吸収される栄養素である脂肪酸及びコレステロールが細胞経路を用いてゴルジ体に到達する方法で、腸細胞内へと通過する能力を有する。本発明によると、本発明の新規の積荷を積載した小胞は、無傷のペプチド、タンパク質又は核酸分子を患者又は対象の細胞内に蓄えて、患者又は対象の治療を提供する。
【００５１】
本発明の範囲内である無傷のコレステリルエステル小胞は、驚くべきことに、特定の脂肪酸トランスポーターによって十二指腸細胞に取り込まれる。更に驚くべきことに、内在化された小胞は、外側の膜に損傷がないまま、その無傷の内容物と共にゴルジ体のカイロミクロン中へと迅速に移送される。コレステリルエステル小胞中のペプチドが積載されたカイロミクロンは、リンパ管に入り、次に胸管を介して血流に入った後で、腸細胞で積載されたカイロミクロンの一体的な部分であるアポリポタンパク質についての表面受容体を発現する体細胞内に、カプセル化されたペプチドを輸送する手段を提供する。その結果として、本明細書中で定義されるような、約５０％から１００％までの予想外に高いバイオアベイラビリティが得られる。
【００５２】
体細胞内に入ると、コレステリルエステル加水分解酵素が前記送達手段のコレステロールと脂肪酸との間の結合に作用し、その結果として、その細胞内で前記ペプチドの放出、及び任意でペプチド代謝の阻害剤の放出が起こる。体細胞は任意で、送達されたペプチドを細胞内に取り込み、そのペプチドを代謝し、更に／又はそのペプチドを遊離ペプチド又はコレステリルエステル小胞内のペプチドとして細胞から血中へと排出する。驚くべきことに、本発明者らは、細胞が任意で無傷のコレステリルエステル小胞を排出することにより、積載物に損傷がないまま前記コレステリルエステル小胞が体内を移動し続けることができることを発見した。そのコレステリルエステル小胞は、カイロミクロン（アポリポタンパク質）に対する表面受容体を発現しない細胞を含む他の細胞によって損傷がないまま取り込まれ得る。この普通でない再循環パターンは、驚くべきことにラットよりもマウスにおいて顕著であり、マウスにおいてより長い保持時間をもたらし、いくつかの例ではより好ましい薬物動態をもたらす。この再循環パターンはヒトでも発生すると予想される。
【００５３】
本発明のペプチド積載コレステリルエステル小胞の好ましい実施形態は、マウス及びラットでの研究において、高い血中インスリン濃度及びほぼ完全な経口バイオアベイラビリティを提供する。モル比１：１のＣ１２：Ｃ１４コレステリルエステルで選択され、特定のｐＨ及びインスリン濃度で調製されたコレステリルエステル小胞は、最大量のインスリンをカイロミクロン中へ送達し、これによって最大量のインスリンを体細胞中へ送達する。本明細書で開示される方法は、オリゴ及びポリペプチド（モノクローナル抗体などのポリペプチドを含む）及びタンパク質を含むいずれかのペプチド、並びにサイズ及び分子量が大きくばらつくＤＮＡ及びＲＮＡなどのポリヌクレオチドを含む他の高分子を、経口経路を介して細胞内に入れるために適合できる。開示される好ましい実施形態では、コレステリルエステル小胞を用いて細胞にＧＦＰプラスミドを積載し、続いてその細胞は特徴的な緑色蛍光を発し、これは本発明によるコレステリルエステル小胞が多数の核酸を容易にカプセル化でき、そして本明細書の他の箇所に記載されているようにこれらの高分子を細胞内に送達できることを証明する。
【００５４】
従っていくつかの実施形態では、本発明は経口剤形の医薬組成物を対象とする。一実施形態では、本発明は、特にヒトを含む哺乳類への投与のための経口剤形の医薬組成物を対象とし、これは高分子（例えばペプチド；タンパク質；核酸；抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤などを含む他の活性物質）、好ましくはインスリンである少なくとも１つの薬学的活性物質と、任意で１つ以上の追加の分子とを含むコアをカプセル化する小胞を含み、該小胞は、コレステロールとＣ６〜Ｃ２６脂肪酸（好ましくはＣ８〜Ｃ２２脂肪酸、又はＣ８〜Ｃ１４脂肪酸）とから得られる１つ以上のコレステリルエステルから本質的になる外側表面コーティングを有し、前記小胞の前記外側表面コーティングは、前記組成物が細胞膜を通過する間に無傷のままであり、これにより前記小胞及びその前記コアが、エンドソーム形成なしに前記哺乳類の体細胞に入り、前記高分子及び１つ以上の前記任意の追加の分子は、前記小胞の総重量の２０％〜９６％、多くの場合２５％〜９５％を構成する。好ましい態様では、前記高分子はインスリンであり、前記組成物は、ＧＬＰ−１アゴニストと、前記インスリン及び／又は前記ＧＬＰ−１アゴニストの分解の阻害剤とを更に含む。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は経口剤形の医薬組成物を対象とし、該医薬組成物は、インスリンである少なくとも１つの薬学的活性物質と、任意で１つ以上の追加の分子とを含み、これらは全て小胞のコア内にカプセル化され、前記小胞は、コレステロールと１つ以上のＣ６〜Ｃ２６、好ましくはＣ８〜Ｃ１４飽和又は不飽和脂肪酸とから得られる１つ以上のコレステリルエステルを含む外側表面を有し、前記薬学的活性物質は該活性物質及び前記小胞の約２０重量％〜約９６重量％、約２５重量％〜約９５重量％、好ましくは約２５重量％〜約８０重量％を構成し、前記組成物は、患者に前記組成物を経口投与した後、前記活性物質の少なくとも５０％のバイオアベイラビリティをもたらす。ある別の実施形態では、前記活性物質はインスリンであり、前記組成物は、ＧＬＰ−１分子と、任意で前記インスリン及び前記ＧＬＰ−１分子のうちの一方又は両方の細胞内代謝の阻害剤とを更に含む。別の実施形態では、前記組成物は、コレステロールとＣ８〜Ｃ１４脂肪酸とから得られるコレステリルエステルを含み、前記組成物は、患者への投与後に６０％〜１００％のバイオアベイラビリティをもたらす。更に他の実施形態では、本発明による前記組成物において、前記脂肪酸は、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライド酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、又はこれらの混合物からなる群から選択される。
【００５６】
更に他の実施形態では、本発明は、積荷を積載した小胞を作るために、小胞のコア内にカプセル化されたポリ−ネオエピトープｍＲＮＡ癌免疫療法抗原構築物と任意のアジュバントとを含む医薬組成物を対象とし、前記積荷を積載した小胞は、コレステロールと１つ以上のＣ６〜Ｃ２６、好ましくはＣ８〜Ｃ１４飽和又は不飽和脂肪酸とから得られる１つ以上のコレステリルエステルからなる外側表面を有し、前記抗原構築物及び前記任意のアジュバントは、前記積荷を積載した小胞の約１重量％〜約９６重量％、好ましくは前記積荷を積載した小胞の約重量１％〜約５０重量％、約２重量％〜約２５重量％を構成する。ある別の実施形態では、前記組成物は経口剤形であり、前記組成物は、前記ｍＲＮＡ癌免疫療法抗原構築物及び任意のアジュバントを患者又は対象の回腸及び／又は虫垂に送達するために適合される。更に他の実施形態では、前記アジュバントはリポ多糖（ＬＰＳ）アジュバントである。別の実施形態では、本発明によると、前記ポリ−ネオエピトープｍＲＮＡ癌免疫療法抗原構築物は自己由来である、即ち前記構築物は治療対象の患者の癌細胞に由来する。別の実施形態では、前記癌免疫療法構築物は同種異系である、即ち前記構築物は患者から得られたものではない適切な癌細胞に由来する。別の実施形態は、治療を必要とする患者の癌を治療する方法を対象とし、該方法は、前記患者に有効量の上述の組成物を、単独で又はアジュバントと組み合わせて、更に単独で又はチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与するステップを含む。本発明の更に他の実施形態では、前記脂質小胞を用いてプラスミド全体が細胞内に輸送される。この後者の発見は、経口剤形を用いた核酸による細胞のトランスフェクションの手段を提供する。ウイルスベクターが必要ないため、本開示のトランスフェクション手段は、核酸構築物を細胞に挿入する新規の潜在的に安全な手段を提示する。
【００５７】
したがって、一実施形態では、本発明は無傷の積載済み小胞を提供するために、脂質小胞内にカプセル化された１つ以上の高分子を含む、患者又は対象への投与のための医薬剤形の組成物を対象とし、前記積載済み小胞の外側表面コーティングは、コレステロールとＣ６〜Ｃ２６脂肪酸（好ましくはＣ６〜Ｃ２２、Ｃ８〜Ｃ２２、Ｃ８〜Ｃ１８、好ましくはＣ８〜Ｃ１４脂肪酸）とから得られる少なくとも１つのコレステリルエステルを含み、前記高分子は、前記小胞を用いない場合に前記高分子によって得られる濃度の少なくとも１０倍の、前記患者又は対象の細胞中での細胞内濃度となる。
【００５８】
本発明の好ましい態様では、前記組成物は、患者又は対象、好ましくはヒト患者への投与のために経口剤形で製剤される。
【００５９】
ある追加の実施形態では、本発明は、前記積載済み小胞が前記患者又は対象の細胞の膜を通過する際に、前記積載済み小胞の前記外側表面コーティングがエンドソームを形成することなく無傷のままであり、前記小胞が、前記小胞に対するコレステリルエステル加水分解酵素の作用によって、前記細胞内で前記１つ以上の高分子を任意で放出する上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６０】
更なる実施形態では、本発明は、前記高分子がタンパク質、ペプチド、核酸及びこれらの混合物からなる群から選択される、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６１】
更に別の実施形態では、本発明は、前記高分子が、前記小胞を用いない場合に前記高分子によって得られる濃度の少なくとも２５０倍の細胞内濃度となる、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６２】
また更に別の実施形態では、本発明は、無傷の前記小胞が、カイロミクロンについての表面受容体を発現する前記患者又は対象の細胞（標的化された細胞）に結合し、無傷の前記小胞が、前記小胞に対する前記細胞内でのコレステリルエステル加水分解酵素の作用によって、１つ以上の前記高分子を前記細胞内で放出する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６３】
また更なる実施形態では、本発明は、表面カイロミクロン受容体を発現する細胞中の前記高分子の前記細胞内濃度が、前記患者又は対象での表面カイロミクロン受容体を発現しない細胞中の前記高分子の前記細胞内濃度よりも少なくとも１０倍高い、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６４】
本発明の更に別の実施形態は、表面カイロミクロン受容体を発現する細胞中の前記高分子の前記細胞内濃度が、積載済みカイロミクロンを形成しない小胞中の前記高分子の細胞内濃度よりも少なくとも１０倍高い、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６５】
更に別の実施形態では、本発明は、表面カイロミクロン受容体を発現する細胞中の前記高分子の前記細胞内濃度が、積載済みカイロミクロンを形成しない小胞中の前記高分子の細胞内濃度よりも少なくとも２５０倍高い、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、無傷の前記積載済み小胞が前記患者又は対象の細胞に入り、前記細胞が前記小胞から前記高分子を放出するためにコレステリルエステル加水分解酵素を用い、前記細胞は、無傷の前記小胞の一部分を前記細胞から前記細胞を取り囲む細胞外液に任意で排出する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６７】
更なる実施形態では、本発明は、無傷の前記小胞が前記細胞内でコレステリルエステル加水分解酵素によって開かれ、前記高分子が前記細胞内の成分に作用する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６８】
また更なる実施形態では、本発明は、前記細胞が前記高分子を代謝し、更に／又は前記高分子を前記細胞から排出する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００６９】
更なる追加の実施形態では、本発明は、前記高分子が、無傷の前記小胞中へのカプセル化の間に及びコレステリルエステル加水分解酵素による前記細胞中での放出時に変化せず、前記小胞中にカプセル化された前記高分子と同一であり、かつ同じ活性を有する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７０】
ある更なる実施形態は、前記高分子がインスリンである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７１】
また更に別の実施形態では、本発明は、任意で腸溶コーティングが施された経口剤形であり、前記インスリンを皮下又は静脈内注射で前記患者又は対象に投与した場合の血中濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）の少なくとも５０％〜１００％の濃度で、前記高分子が前記患者又は対象の血流に到達する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７２】
また更なる追加の実施形態では、本発明は、前記小胞の前記コア内に、前記高分子と組み合わせてプロテアーゼ阻害剤を更に組み込む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７３】
別の実施形態は、前記プロテアーゼ阻害剤は、前記細胞が前記高分子を代謝するのを阻害し、前記細胞は、前記プロテアーゼ阻害剤がない時よりも多くの量の前記高分子を、周囲の細胞外液中に排出する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７４】
また更に別の実施形態では、本発明は、前記小胞がインスリン及び少なくとも１つの追加の高分子を含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７５】
また、ある実施形態では、本発明は、前記インスリン及び／又は前記追加の高分子の細胞外代謝の阻害剤を更に含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７６】
別の実施形態は、経口剤形であって、無傷の前記小胞が前記腸細胞を通って前記腸細胞のカイロミクロンへ入り、前記患者又は対象の細胞が前記カイロミクロンについての受容体を発現し、前記細胞は、前記カイロミクロンについての表面受容体を有しない細胞に比べて前記インスリン及び前記追加の高分子の高い細胞内濃度を実現し、更に前記カイロミクロンについての表面受容体を有しない細胞に比べてより多くの前記インスリン及び前記追加の高分子を放出する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７７】
別の実施形態は、前記追加の高分子がバシトラシンである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７８】
更なる追加の実施形態では、本発明は、ＩＤＥ阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤又はこれらの混合物を更に含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００７９】
本発明の追加の実施形態は、ＧＬＰ−１アンタゴニストを更に含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８０】
また更に追加の実施形態では、本発明は、前記小胞のコア内に２つの高分子を含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８１】
また更なる実施形態では、本発明は、第１の前記高分子がインスリンであり、第２の前記高分子がＧＬＰ−１アゴニストである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８２】
更に別の実施形態では、本発明は、前記小胞が前記高分子の細胞内代謝の阻害剤を任意で含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８３】
更なる追加の実施形態では、本発明は、前記高分子がトラスツズマブであり、該トラスツズマブが、ｐＨ５．５〜６．５、好ましくはおよそｐＨ６．０で、積荷を積載した前記小胞の総重量の４０〜６０重量パーセントで前記小胞中に積載される、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８４】
本発明はまた、前記高分子がエキセナチドであり、前記小胞がＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を更に含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８５】
本発明はまた、前記ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤がシタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン又はこれらの混合物である、上述の組成物を含む更に別の組成物を対象とする。
【００８６】
別の実施形態では、本発明は、前記高分子が、ＤＰＰ−ＩＶ酵素分解に対する安定性を改善するために修飾された又は血中での循環時間を延長するために修飾されたＧＬＰ−１分子である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８７】
更なる実施形態では、本発明は、前記ＧＬＰ−１分子がリラグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド又はこれらの誘導体であり、前記組成物が前記ＧＬＰ−１分子の細胞内代謝の阻害剤を任意で含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８８】
また更なる実施形態では、本発明は、前記高分子が、リラグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド及びこれらの誘導体からなる群から選択されたＧＬＰ−１分子であり、前記組成物が、組み換えインスリン、ＮＰＨインスリン、レンテインスリン、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、ノボログ、及びインスリンデグルデクからなる群から選択されたインスリンを更に含み、前記組成物が前記ＧＬＰ−１分子及び前記インスリンのうちの一方又は両方の細胞内代謝の阻害剤を任意で含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、前記ＧＬＰ−１分子がリキシセナチドであり、前記インスリンがグラルギンであり、細胞内代謝の任意の前記阻害剤がシタグリプチンである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９０】
更なる追加の実施形態では、本発明は、前記インスリンがインスリンリスプロであり、前記ＧＬＰ−１分子がデュラグルチドであり、任意の前記阻害剤がリナグリプチンである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９１】
本発明はまた、前記インスリンがデグルデクであり、前記ＧＬＰ−１分子がセマグルチドであり、任意の前記阻害剤がシタグリプチンである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９２】
更なる実施形態では、本発明は、前記インスリンがノボログであり、前記ＧＬＰ−１分子がリラグルチドであり、任意の前記阻害剤がシタグリプチンである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９３】
別の実施形態では、本発明は、前記高分子の経口投与が、前記患者又は対象の体内における前記高分子の少なくとも５０％のバイオアベイラビリティをもたらす、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９４】
更なる追加の実施形態では、本発明は、前記バイオアベイラビリティが８５〜１００％である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９５】
更に別の実施形態では、本発明は、前記高分子の経口投与が、前記高分子の血漿中濃度よりも少なくとも１０倍高い組織中濃度をもたらす、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９６】
ある別の実施形態では、本発明は、前記高分子の経口投与が、前記高分子の血漿中濃度よりも少なくとも２０倍高い組織中濃度をもたらす、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９７】
更に別の実施形態では、本発明は、前記高分子の経口投与が、前記高分子の血漿中濃度の最大２５０倍である組織中濃度をもたらす、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９８】
更なる実施形態では、本発明は、前記コレステリルエステルが２つの異なるコレステリルエステルの混合物である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【００９９】
また更に別の実施形態では、本発明は、前記コレステリルエステルの成分が、長さの差が３炭素単位以上である複数の脂肪酸から得られる、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１００】
追加の別の実施形態では、本発明は、前記コレステリルエステルの成分が、長さの差が２炭素単位以下である複数の脂肪酸から得られる、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０１】
更なる実施形態では、本発明は、前記コレステリルエステルの成分が、長さの差が２炭素単位である複数の脂肪酸から得られる、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０２】
また更に別の実施形態では、本発明は、前記小胞が、細胞をアポトーシスのための標的とするために、有効量のホスファチジルセリンを更に含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０３】
更なる別の実施形態では、本発明は、前記高分子が、好ましくはプラスミドを含む核酸である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０４】
また更なる追加の実施形態では、本発明は、前記核酸がｐｇＷｉｚＧＦＰプラスミドである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明は、前記高分子がワクチンであり、前記小胞がアジュバントを更に含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０６】
更なる実施形態では、本発明は、経口剤形であって、前記小胞が、ｐＨ７．０〜７．８において前記小胞を放出するために腸溶コーティングをしたカプセルに入れられる、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明は、前記小胞はｐＨ７．４において前記カプセルから放出される、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０８】
ある別の実施形態では、本発明は、前記高分子がインスリンであり、前記追加の分子がプロテアーゼ阻害剤である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１０９】
更に別の実施形態では、本発明は、前記プロテアーゼ阻害剤が、アプロチニン、大豆トリプシン（ＳＢＴＩ）及びこれらの混合物からなる群から選択される、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１１０】
更なる実施形態では、本発明は、前記インスリンが組み換えインスリンである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１１１】
更なる別の実施形態では、本発明は、前記小胞がＳＮＡＣ又はＳＮＡＤの塩である化合物を含み、前記塩が一ナトリウム塩、二ナトリウム塩及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１１２】
更に別の実施形態では、本発明は、オメガ−３脂肪酸を更に含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１１３】
ある追加の実施形態では、本発明は、ＥＤＴＡ又はその塩を更に含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１１４】
また更に別の実施形態では、本発明は、経口剤形であって、対象の胃における前記組成物の消化を阻害するコーティングを備える、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１１５】
また更なる実施形態では、本発明は、前記コーティングが腸溶コーティング又はゼラチンコーティングである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１１６】
更に別の実施形態では、本発明は、前記脂肪酸が、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライド酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、及びこれらの混合物からなる群から選択される、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１１７】
別の実施形態は、高分子を積載した複数の脂質小胞を製造する方法を対象とし、前記小胞の外側表面コーティングは、コレステロールとＣ８〜Ｃ２６脂肪酸（多くの場合Ｃ６〜Ｃ２２、Ｃ８〜Ｃ２２、Ｃ８〜Ｃ１８、更に多くの場合Ｃ８〜Ｃ１４脂肪酸）とから得られる少なくとも１つのコレステリルエステルを含み、前記方法は、
１．ａ）１つ以上の高分子と、任意で前記１つ以上の高分子の少なくとも１つの表面改質剤とを含有する極性溶媒混合物と、
ｂ）ミリスチン酸コレステリル及びラウリン酸コレステリルからなる群から選択される少なくとも１つの非イオン性コレステリル脂肪酸エステルから本質的になる非極性溶媒混合物と
を超音波処理によって混合するステップと、ここで前記極性溶媒混合物ａ）及び前記非極性溶媒混合物ｂ）は、前記１つ以上の高分子と、前記１つ以上の表面改質剤と、前記少なくとも１つのコレステリル脂肪酸エステルと、前記非極性溶媒と、及び前記極性溶媒とが、前記混合するステップの後に小胞の均質分散物を形成するまで超音波処理され、
２．前記非極性溶媒を蒸発させて、前記極性溶媒中に前記小胞を残すステップと、ここで前記小胞のそれぞれは、複数の非イオン性コレステリル脂肪酸エステル分子と、前記１つ以上の高分子を内包する中空コンパートメントとから本質的になる外層を備え、
を含む。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明は、前記極性溶媒が、ｐＨ２．５〜３．５（好ましくは３）の緩衝液中にインスリンを含み、前記緩衝液中の前記インスリンの初期濃度が７．５〜８．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８ｍｇ／ｍｌであり、前記緩衝液の温度が３５〜３９℃（好ましくは３７℃）であり、前記緩衝液（ａ）と前記非極性溶媒組成物（ｂ）との混合物が２０分間超音波処理される、上述の方法を含む方法を対象とする。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明は、前記ステップ１（超音波処理によって混合するステップ）又は前記ステップ２（蒸発させるステップ）の間及び／又は後に、コアを積載した複数の前記小胞を、凝集を防止するための分散ステップに供することを含む、上述の方法を含む方法を対象とする。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明は、前記分散ステップがラウリル硫酸ナトリウムを用いて実施される、上述の方法を含む方法を対象とする。
【０１２１】
更なる追加の実施形態では、本発明は、前記ステップ１（超音波処理によって混合するステップ）、前記ステップ２（蒸発させるステップ）若しくは前記分散ステップの間及び／又は後に、コアを積載した複数の前記小胞を、ゼラチン懸濁液を用いた安定化ステップに供することを含む、上述の方法を含む方法を対象とする。
【０１２２】
追加の実施形態では、本発明は、癌を治療するための組成物を対象とする。
【０１２３】
ある実施形態では、本発明は、脂質小胞内にカプセル化された腫瘍溶解物又は腫瘍抗原を含む組成物を対象とし、前記小胞の外側表面コーティングは、コレステロールとＣ6〜Ｃ２６脂肪酸（好ましくは、例えばＣ６〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２２脂肪酸、又はＣ８〜Ｃ１４脂肪酸）とから得られる少なくとも１つのコレステリルエステルからなり、前記小胞の前記外側表面コーティングは、前記組成物が細胞膜を通過する間に無傷のままであり、これにより、前記小胞及びそのコアがエンドソームを形成することなく樹状細胞を含むリンパ球系細胞に入り、細胞のコレステリルエステル加水分解酵素の作用により、カプセル化された前記溶解物又は抗原を前記細胞内で放出し、前記細胞中での前記溶解物又は抗原の細胞内濃度は、前記溶解物又は抗原を前記小胞内にカプセル化しない場合に同一濃度の腫瘍溶解物又は抗原を前記細胞に送達することによって得られる細胞内濃度よりも少なくとも１０倍（多くの場合は少なくとも１００倍）、更に多くの場合は少なくとも２５０倍高い。
【０１２４】
ある追加の実施形態では、本発明は、前記腫瘍溶解物が、タンパク質、ペプチド、核酸及びこれらの混合物からなる群から選択される高分子を含み、前記抗原がペプチドである、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明は、経口剤形であって、ｐＨ７．３〜７．６で前記腫瘍溶解物又は抗原を放出するように定められたコーティングを備え、前記腫瘍溶解物又は抗原が、患者又は対象の回腸内の樹状細胞に向けられる、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１２６】
更なる実施形態では、本発明は、前記腫瘍溶解物又は抗原が自己由来である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１２７】
また更に別の実施形態では、本発明は、前記回腸で放出される組成物が、樹状細胞を活性化させることが実証された１つ以上の物質からなるコレストソームでカプセル化されたアジュバントを更に含有する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１２８】
ある追加の実施形態では、本発明は、前記アジュバントはリポ多糖（ＬＰＳ）である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１２９】
また更なる実施形態では、本発明は、有効量の１つ以上のチェックポイント阻害剤モノクローナル抗体が任意で前記小胞内にカプセル化され、前記チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ又はこれらの混合物であり、前記組成物は、樹状細胞を活性化させることが実証された１つ以上の物質からなるアジュバントを任意で含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１３０】
ある追加の実施形態では、本発明は、前記アジュバントがリポ多糖（ＬＰＳ）である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１３１】
ある別の実施形態では、本発明は、前記回腸で放出される組成物が、樹状細胞に対するコレストソームでカプセル化された刺激物質、好ましくはＩＭＯ−２１２５を含有し、前記刺激物質による樹状細胞の活性化が、前記組成物に対する樹状細胞の曝露後のインターフェロンガンマの濃度の上昇によって実証される、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１３２】
ある追加の実施形態では、本発明は、前記腫瘍溶解物の出所が同種異系である、即ち前記組成物が投与されることになる患者以外の患者由来である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１３３】
ある別の実施形態では、本発明は、前記小胞が腫瘍溶解物ではなく腫瘍抗原を含む、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１３４】
ある追加の実施形態では、本発明は、前記腫瘍抗原がｇｐ１００黒色腫抗原である、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１３５】
また更なる実施形態では、本発明は、前記抗原が自己由来のポリ−ネオエピトープｍＲＮＡ癌免疫療法抗原構築物であり、前記抗原は治療対象の患者の癌細胞に由来する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１３６】
また更に別の実施形態では、本発明は、前記ポリ−ネオエピトープｍＲＮＡ癌免疫療法抗原構築物が同種異系であり、前記抗原が、治療対象の患者から得られたものではないが、特定の種類の癌細胞に由来する、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明は、治療を必要とする患者の癌を治療する方法を対象とし、前記方法は、上述の組成物を前記患者に経口投与するステップを含み、前記組成物は、前記患者の癌細胞に対して細胞免疫応答を活性化させる。
【０１３８】
本発明の更なる実施形態は、有効量の上述の組成物を前記患者の腫瘍に直接注射することを含み、前記組成物が前記患者の癌細胞に対して細胞免疫応答を活性化させる、必要とする患者の癌を治療する上述の方法を含む方法を対象とする。
【０１３９】
ある別の実施形態では、本発明は、前記細胞免疫応答が、前記組成物を前記患者のＴ細胞に曝露したときの、前記組成物による刺激に応答したＩＬ−２又はＩＦＮガンマのインビトロ放出によって検出される、必要とする患者の癌を治療する上述の方法を含む方法を対象とする。
【０１４０】
また更なる実施形態では、本発明は、前記小胞が、ミリスチン酸コレステリルと、ラウリン酸コレステリル又はパルミチン酸コレステリルのうちの１つ以上とからなる、上述の組成物を含む組成物を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】脂質小胞と、中空コア内のミリスチン酸コレステリル、ラウリン酸コレステリル及びインスリンとのアセンブリを示す図である。軌道の形式には２つの格子モデルが存在する。尾部間の距離は約２０オングストローム（２ｎｍ）である。リポソームでは、尾部が嵌合せずに端から端まで横たわっているため、上記距離は更に長くなる。インスリンモノマーの最長距離は３７オングストローム（３．７ｎｍ）（マゼンタのボール）である。スクリーンを横断する距離は、３８６．８３６オングストローム、即ち３８．６ｎｍである。単一光子（ＲＲトラックモデル）では、いずれかの分子が動き回るための立体配座の柔軟性は実際には存在しない。
【図１Ａ】（表１）コレストソームと他の送達方法との間の特性比較を示す。複数の特性が、コレストソームが全てのカテゴリーにおいて優れるか、又は少なくとも同等であることを明らかにしている。この比較の１つの特に重要な側面は、ほぼどの分子も、その分子自体を変化させることなくコレストソームにカプセル化できることである。ほとんどの場合において、送達方法の必要性に合わせて分子を修飾する必要がある。設計の柔軟性は、薬物送達システムにとって有利な特性である。コレストソームは、従来技術における送達方法の制限のほとんどを受けない。
【図１Ｂ】（表３）公知の小胞直径のコレストソームに到達するために、様々な温度において２つの異なる溶媒中で様々なモル比を混合した後に得られる、コレステリルエステルの更なる調製品の概要を示す。
【図２】１：１のモル比で混合された、２ＣＨ２単位だけ異なる２つの短鎖コレステリルエステル、即ちカプリル酸コレステリル（Ｃ６）及びカプリン酸コレステリル（Ｃ８）を組み合わせることによって作られたコレストソームを示す。この組み合わせから得られたコレストソームは、平均サイズが３５０ｎｍであった。これらのコレストソームにＦＩＴＣを組み込み、ＭＣＦ−７細胞で試験すると、生存率の損失は全く発生せず、緑色蛍光により、これらのコレストソームが細胞内に濃縮されたことが示された。
【図３】１：１のモル比で混合された、４ＣＨ２単位だけ異なる２つの長鎖コレステリルエステル、即ちステアリン酸コレステリル（Ｃ１８）及びベヘン酸コレステリル（Ｃ２２）を組み合わせることによって作られたコレストソームを示す。この組み合わせから得られたコレストソームは、サイズが、クロロホルム中で６５℃において調製した場合の３９２ｎｍから、エーテル中で５５℃において調製した場合の３８９９ｎｍまでであった。これらのコレストソームにＦＩＴＣを組み込み、ＭＣＦ−７細胞で試験すると、生存率の損失は全く発生せず、緑色蛍光により、これらのコレストソームが細胞内に濃縮されたことが示された。
【図４】１：４のモル比で混合された、１０ＣＨ２単位だけ異なる２つのコレステリルエステル、即ちラウリン酸コレステリル（Ｃ１２）及びベヘン酸コレステリル（Ｃ２２）を組み合わせることによって作られたコレストソームを示す。この組み合わせから得られたコレストソームは、６５℃のクロロホルム中で調製した場合に、平均サイズが１５００ｎｍであった。これらのコレストソームにＦＩＴＣを組み込み、ＭＣＦ−７細胞で試験すると、生存率の損失は全く発生せず、緑色蛍光により、これらのコレストソームが細胞内に濃縮されたことが示された。
【図５】１：４のモル比で混合された、８ＣＨ２単位だけ異なる２つのコレステリルエステル、即ちミリスチン酸コレステリル（Ｃ１４）及びベヘン酸コレステリル（Ｃ２２）を組み合わせることによって作られたコレストソームを示す。この組み合わせから得られたコレストソームは、６５℃において調製した場合に、平均サイズが６９０ｎｍであった。これらのコレストソームにＦＩＴＣを組み込み、ＭＣＦ−７細胞で試験すると、生存率の損失は全く発生せず、緑色蛍光により、これらのコレストソームが細胞内に濃縮されたことが示された。
【図６】１：１のモル比で混合された、２ＣＨ２単位だけ異なる２つのコレステリルエステル、即ちミリスチン酸コレステリル（Ｃ１４）及びパルミチン酸コレステリル（Ｃ１６）を組み合わせることによって作られたコレストソームを示す。この組み合わせから得られたコレストソームは、６５℃のクロロホルム中で調製した場合に、平均サイズが１８９０ｎｍであった。これらのコレストソームにＦＩＴＣを組み込み、ＭＣＦ−７細胞で試験すると、生存率の損失は全く発生せず、緑色蛍光により、これらのコレストソームが細胞内に濃縮されたことが示された。
【図７】インスリンコレストソーム製剤１１１７の試験−６週目ｖｓ１８週目を示す。インスリンを含有するコレストソームの冷蔵庫内での安定性；ＥＬＩＳＡ法による全体、ペレット及び上清の逐次抽出を示す。
【図８】インスリン製剤１１１７を示す。小胞の２つの別個の集団間のＮＩＣＯＭＰ分布−小胞平均サイズは、小胞＃１（小胞の３３％）＝平均２０８ｎｍ、ＳＤ＝２９．２、小胞＃２（小胞の６７％）＝平均１１９１ｎｍ、ＳＤ＝１３３である。
【図９】示されたｐＨ及びイオン強度で作られたインスリン−コレストソーム中の平均脂質濃度（ｎ＝２）を示す。
【図１０】インスリンコレストソーム小胞中の平均インスリン濃度が、緩衝液のイオン強度がより低く、調製物のｐＨが３．０であるときに最高となることを示す。
【図１１】ｐＨ（６〜８）の製剤のカプセル化効率（Ｅ．Ｅ．）は、イオン強度がより高い場合に最大化される。ｐＨ（３及び５）のコレストソームのＥ．Ｅ．は、１×ＰＢＳのイオン強度を用いた場合に最大化される。
【図１２】インスリンの存在下でイオン強度の関数としてＤＬＳによって決定された、ｐＨ３のインスリン−コレストソーム小胞のサイズを示す。
【図１３】インスリンの存在下でイオン強度の関数としてＤＬＳによって決定された、ｐＨ３〜８のインスリン−コレストソーム小胞のサイズを示す。酸性条件及び塩基性条件におけるサイズの差に注目されたい。
【図１４】反応混合物：界面活性物質の添加前のインスリン−コレストソームを示す。
【図１５】反応混合物：界面活性物質の添加後のインスリン−コレストソームを示す。
【図１６】反応混合物：界面活性物質の添加後、かつカプセル化されなかったインスリンを除去するためのろ過後のインスリン−サイズ分布を示す。
【図１７】親水性ポケットと考えられる比較的大きな中心を示す、２０倍、８０倍及び１００倍におけるインスリンコレストソーム製剤の透過電子顕微鏡画像である。
【図１８】Ｃａｃｏ−２細胞の単層の頂端側の、コレストソームでカプセル化された分子に対する曝露に続く、側底流体の回収に使用される装置（Ｃａｃｏ−２細胞を用いたＢｉｏｃｏａｔ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）トランズウェルアッセイ）の図である。細胞にＦＩＴＣコレストソームインスリン又は非カプセル化ＦＩＴＣインスリンが与えられた。これらは分化したＣａｃｏ−２単層の頂端側の培地に添加された。「方法」において説明されるように、上記細胞を誘導してカイロミクロンを形成した。全てのサイズのコレストソームでカプセル化された分子がＣａｃｏ−２細胞に取り込まれ、その分子はそこからゴルジ体によってカイロミクロンに取り込まれる。腸細胞による取り込みプロセスは、Ｃａｃｏ−２細胞に関してここで示されているプロセスよりも迅速かつ効率的である。カイロミクロンの他の典型的な成分は、ＡＰＯ−Ｂ、他のアポリポタンパク質、及びトリグリセリドである。形成後、カイロミクロンはＣａｃｏ−２細胞によって、上記単層の側底側のリンパ液中へと分泌される。コレストソームが積載されたカイロミクロンは、Ｃａｃｏ−２の単層の側底側で上記流体中に捕捉される。
【図１９】Ｃａｃｏ−２試験を示す。コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣインスリン単独の２０００ｎｍ粒子であり、時間＝０がベースラインである。
【図２０】Ｃａｃｏ−２試験を示す。コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣインスリン単独の２０００ｎｍ粒子であり、時間＝２４時間である。
【図２１】Ｃａｃｏ−２試験を示す。コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣインスリン単独の２０００ｎｍ粒子であり、この場合には時間＝２４時間でのＣａｃｏ−２単層の頂端側及び側底側でのＦＩＴＣ読み取り値を示す。
【図２２】ＭＣＦ−７細胞内へのＦＩＴＣ−コレストソームインスリンのコレストソームを介した送達を示す。画像Ａは、２４時間後のＦＩＴＣ−コレストソームが積載されたＭＣＦ−７細胞の位相差顕微鏡画像である。画像Ｂは、２４時間後のＦＩＴＣ−コレストソームが積載されたＭＣＦ−７細胞の蛍光を示す。
【図２３】遊離ＦＩＴＣ−インスリン（行Ａ）、ＦＩＴＣ−コレストソームインスリン（行Ｂ）、及びＦＩＴＣ−コレストソームインスリン−カイロミクロン（行Ｃ）の、ＭＣＦ−７細胞内にＦＩＴＣ−インスリンを送達する能力を比較する。第１列は暗視野であり、第２列は蛍光であり、第３列はオーバレイである。積載量は、行Ｃに示されているようなＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロンからほぼ１０００倍となった。この実験では、ＭＣＦ−７細胞のＦＩＴＣインスリンコレストソーム積載は、ＦＩＴＣインスリンコレストソームを用いた本発明者らの過去のいくつかの実験より改善され、ここでは積載量はＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロンから更に多くなった。全ての場合において、Ｃａｃｏ−２細胞によるカイロミクロン中へのＦＩＴＣインスリンコレストソームの処理により、細胞内部のインスリンの量に関して確実な改善がもたらされる。この画像では、細胞膜がＦＩＴＣインスリンを劇的に更に濃縮するだけでなく、これらの細胞の細胞質にもＦＩＴＣが積載され、また２時間の時点で確認できる、エンドソームのない均一な分布が存在する。
【図２４】コレストソーム中のインスリン：全インスリンの平均バイオアベイラビリティ−マウスは６６％であった。インスリン−コレストソーム調製物１１１７。マウスでの用量は、２匹のマウスについてデータ点当たり１Ｕ／ｋｇであった。遅れているピークは、遊離インスリン及び全インスリンの両方が関与する細胞のエキソサイトーシスによって引き起こされる。
【図２５】コレストソーム中のインスリン：遊離インスリンのバイオアベイラビリティ−これはＩＶ調製物中の遊離インスリンに関する補正後のものである。ＩＶコレストソーム−インスリンは、３％の遊離インスリンで構成された（従ってＩＶ用量は３％高くなり、これに対応して経口用量に関しては３％低くなった。これは、消化管で遊離インスリンが吸収されないためである。）インスリン−コレストソーム調製物１１１７；マウスでの用量は、２匹のマウスについてデータ点当たり１Ｕ／ｋｇであった。
【図２６】投薬６時間後のマウスの血漿及び標的組織中のＦＩＴＣインスリン濃度を示す。コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣインスリンは、高い経口吸収率と、ＩＶで投与された同一用量よりも高い、経口投薬での組織分布とを示す。これらの試験は、血漿ＦＩＴＣ濃度が低い時点において細胞内のＦＩＴＣ濃度が高いことを示している。
【図２７】１単位／ｋｇのコレストソームインスリン１４１２製剤を経口投与されたラットにおける、時間に対するインスリン濃度を示す。この研究におけるＡＵＣは２９５．７であった。
【図２８】１．０ｕ／ｋｇのヒト組み換えインスリンを皮下投与されたラットに関する、時間に対するインスリン濃度を示す。ＡＵＣは３４４．４であった。
【図２９】インスリンコレストソームを１．０ｕ／ｋｇの用量で皮下投与されたラットにおける、時間に対するインスリン濃度を示す。ＡＵＣは３２２．５であった。
【図３０】投薬４時間後のラットの血漿及び標的組織中のＦＩＴＣインスリン濃度を示す。コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣインスリンは、高い経口吸収率と、ＳＣで投与された同一用量よりも高い、経口投薬での組織分布とを示す。これらの試験は、血漿ＦＩＴＣ濃度が低い時点において細胞内のＦＩＴＣ濃度が高いことを示している。
【図３１】ＪＥＮＷＡＹ分光光度計（希釈係数：７．５）を用いて、２８０ｎｍでの吸光度を分解検出波長（３５０ｎｍ）と比較した場合の、トラスツズマブ（ハーセプチン）に関する凝集及び分解制御データを示す。カプセル化、凍結乾燥及び透析による最小の凝集／分解に注目されたい。
【図３２】１．５ｍｌのポーションをタンパク質Ｇ−セファロースと混合することによって遊離抗体をコレストソームから分離する前に、トラスツズマブ−コレストソーム及びＩｇＧ−コレストソーム調製物を、脂質含有量、抗体含有量、及びサイズに関して分析した。脂質及び抗体濃度は、「方法」において説明されているようにして決定した。＊差分により決定、＊＊タンパク質Ｇ−セファロースからの溶出後の脂質として。
【図３３】トラスツズマブ−コレストソーム（１５１０）で処置、及びＩｇＧ−コレストソーム（１５１９）で処置された、１８４Ｂ５（青色のバー）及びＭＣＦ−７（灰色のバー）細胞の成長（Ａ）を示す。
【図３４】トラスツズマブ−コレストソーム（１５１０）で処置、及びＩｇＧ−コレストソーム（１５１９）で処置された、１８４Ｂ５（青色のバー）及びＭＣＦ−７（灰色のバー）細胞の細胞生存率（Ｂ）を示す。細胞を「方法」において説明されているようにして成長させ、更に「方法」において説明されているように処理した。
【図３５】凍結乾燥（中央のバー）による濃縮及びそれに続く透析（第３のバー）後のトラスツズマブの分析を示す。トラスツズマブ原液濃度を、説明されているように凍結乾燥及び透析後に測定した。バーの上の値は、（装入時、即ち未処理時のパーセンテージを１００％に設定した場合の）検出されたタンパク質の量を表す。タンパク質の量は、トラスツズマブ標準曲線との比較によって決定した。
【図３５Ａ】（表４）ｐｇＷｉｚＧＦＰの調製に使用される、カラム当たりのＱｉａｇｅｎ緩衝液成分を示す。
【図３６】１：１のモル比のミリスチン酸コレステリル及びパルミチン酸コレステリルから作られたコレストソームが、ヒト網膜上皮細胞にＦＩＴＣを積載する様子を示す。パネルＡは、ミリスチン酸／パルミチン酸から作られたＦＩＴＣ−コレストソームを用いて２時間処理されたＡＲＰＥ−１９細胞の画像を示す。左上のパネルは位相差画像であり、右上は２時間の時点における緑色蛍光チャネル画像であり、右下のパネルは合成画像である。
【図３７】ミリスチン酸コレステリル／パルミチン酸から作られたｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソーム（上側のパネル、３０時間の時点）、及びミリスチン酸コレステリル／ラウリン酸から作られたｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソーム（下側のパネル、２４時間の時点）で処理された、ＭＣＦ７細胞の画像を示す。各パネルにおいて、最も左側の画像は位相差画像であり、その次が緑色蛍光チャネル画像であり、その次が赤色蛍光チャネル画像であり、最も右側が合成画像である。これらの画像は、これらの製剤が両方共、ＭＣＦ７細胞にｐｇＷｉｚＧＦＰプラスミドを積載し、緑色の蛍光を発することを示している。培地対照パネル（図示せず）は、背景の自己蛍光に一致するごくわずかな蛍光しか示さなかった。
【図３８】ミリスチン酸コレステリル／パルミチン酸から作られたｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソーム（上側のパネル）、ミリスチン酸コレステリル／ラウリン酸から作られたｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソーム（中央のパネル）、及び培地のみ（下側のパネル）で２４時間処理された、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜細胞の画像を示す。各パネルにおいて、最も左側の画像は位相差画像であり、その次が緑色蛍光チャネル画像であり、その次が赤色蛍光チャネル画像であり、最も右側が合成画像である。これらの画像は、これらの製剤が両方共、ＡＲＰＥ−１９細胞にｐｇＷｉｚＧＦＰプラスミドを積載し、２４時間の時点において緑色蛍光の発生をもたらすことを示している。培地のみ、及びｐｇＷｉｚＧＦＰのみ（図示せず）は、２４時間の時点でわずかな蛍光しか示さず、これは背景の自己蛍光がほとんど無く、またカプセル化されていないプラスミドは細胞にごくわずかしか入らないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４２】
下記用語は、本発明を説明するために明細書の全般にわたって使用される。本願において特に定義されていない用語の場合、その用語には、当業者が理解するものと同じ意味が与えられる。本発明による１つ以上の脂質小胞カプセル化化合物を用いて治療し得る疾病又は疾患に与えられる定義は、当業者にとって一般的に知られているものである。
【０１４３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるような、単数形（「a」、「an」及び「the」）は、明白に、疑う余地も無く１つを言及するものでなければ、複数の対象まで含むものである。したがって、例えば、「化合物」（a compound）という言及は、２つ以上の異なる化合物を含む。本願において使用されるように、用語「含む」及びその文法的活用型は、非限定を意図しており、列記での事項の記述は、置換されることができる他の同様の事項、又は列記された事項に追加されることができる他の事項を排除するものではない。
【０１４４】
用語「患者」又は「対象」は、本発明による組成物が投与される動物、好ましくはヒトを記述するために、本明細書全体を通して使用される。家畜（獣医学用途における）などの特定の動物又はヒト患者に対する組成物の投与に関して、用語「患者」又は「対象」は、その特定の動物を指す。
【０１４５】
用語「化合物」は、本明細書で開示されるいずれかの特定の化学的な化合物を指すために本明細書中で使用される。文脈内での使用において、その用語は通常は、単一の化合物及び本明細書で開示されるようなその薬学的に許容可能な塩を指すが、特定の例では、開示されている化合物の立体異性体及び／又は光学異性体（ラセミ混合物を含む）を指す場合もある。
【０１４６】
用語「から本質的になる」は、組成物の成分又は組成物の要素の成分を記述するために使用され、その組成物は、これらの成分と、組成物又は要素の基本的かつ新規の特性を実質的に変化させないいずれかの追加の成分とを含有し、その組成物はそれらの成分を主に含有するが、場合によってはそれらの要素のみを含有する。
【０１４７】
本出願で使用される場合、「約」及び「およそ」は等しいものとして使用される。本出願で使用される、「約」／「およそ」を伴う又は伴わないいずれの数も、本発明の関連する態様において当業者によって理解されるいずれかの通常の変動を包含するものとする。
【０１４８】
およそ又は約：本明細書中で使用される場合、関心対象の１つ以上の値に適用される用語「およそ」又は「約」は、言明されている参照値に近い値を指す。特定の実施形態では、文脈に応じて、用語「およそ」又は「約」は、特段の記載がない限り、又は文脈からそうでないことが明らかでない限り、言明されている参照値から双方向（即ち大きい又は小さい）に１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満の範囲、より多くの場合には５％以下の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える、又は可能な値の０％未満となる場合を除く）。
【０１４９】
用語「治療」は、疾患を治すこと又は疾患に少なくとも良好な影響を及ぼすことを指す。文脈内の別の実施形態では、「治療」は、疾患及び／又は状態の可能性を防止／低減することを指す。別の実施実施では、「治療」は、疾患の発症を低減することを指す。別の実施形態では、「治療」は、疾患の症状を緩和することを指す。別の実施形態では、「治療」は、疾患又は症状の寛解をもたらすことを指す。別の実施形態では、「治療」は、疾患の進行を遅延させることを指す。
【０１５０】
本発明の実施における脂肪酸の選択の手段
本発明の実施での使用に適した脂肪酸が以下の表２に列挙されており、これらは構造、炭素数対二重結合の数の比であるＣ：Ｄの比、及び二重結合の位置によって更に特徴付けられる。
【０１５１】
表２．構造、炭素数対二重結合の数の比であるＣ：Ｄ及び二重結合の位置を特徴とする、コレステリルエステルの形成に潜在的に用いられる脂肪酸のリスト
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【０１５２】
上記表２において、脂肪酸分子のアルキル鎖におけるＣは炭素数であり、Ｄは二重結合の数であり、分子のＣ：Ｄ比率は提示された通りである。二重結合の位置は、鎖で位置１であるカルボニルの後の炭素の数で示す。そのような方式で、ミリストレイン酸に対するｎ−５は、二重結合が位置１４−５＝位置９で発見されるという意味である。
【０１５３】
本発明の実施におけるエステル化のためのコレステロール
用語「コレステロール」は、本発明によりコレストソームの形成に使用されることができるコレステリルエステルの調製において脂肪酸で縮合されることができる、いずれかのコレステロール化合物を記述するために本発明では使用される。用語「コレステロール」は、（限定でないが）例えば、７−ケトコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、７−ベータ−ヒドロキシコレステロール、コレステロール、５−アルファ、６−アルファエポキシド、４−ベータヒドロキシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、２４、２５−エポキシコレステロールのような追加の酸素添加部位を有したコレステロール分子（「コレステロールの酸素添加類似体」）、及びそれ自体でコレステロールと識別される化合物を含む。オキシステロールは、類型（ヒドロペルオキシ、ヒドロキシ、ケト、エポキシ）、導入する酸素添加された官能基の数及び位置並びにそれらの立体化学の性質によって変わり得る。このような様々なコレステロールが、中性表面及びコレステロールエステル分子に親水性を与えることができる基を有したコレストソームの提供においていくらかの柔軟性を提供するようにして、溶解度特性が変わるコレステロールエステルの提供に用いられてもよい。コレステロールタイプの分子はまた、ビタミンＤのようなエステル形成に必須的であるＯＨを含む任意のステロール構造ベースの化合物を含むことができる。
【０１５４】
コレストソームの有益な形成において要求されるモル比は、上記表２に挙げられたエステルの任意の対（一対のエステルが用いられる場合）での０．０５〜０．９５の範囲である。ほぼ同等なアルキル鎖長のコレステリルエステルの対及び活性分子の間での組成物の製品比は、約２：２：９６〜４８：４８：４、しばしば４５：４５：１０〜約２：２：９６、約４０：４０：２０〜約５：５：９０、約４０：４０：２０〜約２５：２５：５０の範囲である。多くのコレストソーム製剤において、２つ（以上の）コレステリルエステルが用いられる場合、その比率は、用いられるコレステリルエステルに対して１：１の比率の上下で変わる（例えば、６０：４０〜４０：６０、５５：４５〜４５：５５）ことに注目されたい。
【０１５５】
本発明の実施におけるコレステリルエステルの選択の手段
例えば、下記の原則が、カプセル化のためのエステル又はエステル対の選択手段である、コレストソームにおける構成成分のコレステリルエステルの選択のための基準を定め、表２で挙げられたコレステリルエステルの開示された物理化学的特性に依存する。
１）組合せのために選択されるエステルは、エステル対の間のエステル連結相互作用の最適化のために、それ自体で配列できるべきである。そのような静電気的相互作用は、小胞の必要な疎水性外部及び親水性中心を備える、配向のために重要である。
２）アルキル相互作用は、ファンデルワールス力を最適化することができる。
３）静電気的相互作用及びアルキル相互作用ファンデルワールス力の和は、小胞形態を維持して分子内部を維持する基本的な特性である。コレストソーム小胞の安定性のための重要な追加の要因は、エステルの二重疎水性末端と、カプセル化される１つ又は複数の分子を含む水性構成成分との間の反発力程度を含む。
４）小胞の全体的寸法は、アルキル鎖長の関数となる。選択されたエステルの長さが長くなると、小胞全体の全体的な疎水特性が増大する。
５）より小さな鎖長のエステルを用いると、小胞の全体的な親水性が実際に増加する（各エステルの全体構造に関して）。
６）小胞内のカプセル化を補助するためにより大きな疎水性領域を必要とする分子は、より長いアルキル鎖を有したエステルから恩恵を受けることができる。
７）より小さくて、カプセル化を補助するより親水性の構成成分を必要とする分子は、長さがより短いエステル対から恩恵を受けることができる。
８）更なる選択事項は、表２に挙げられたような不飽和アルキル鎖を用いることであり、ここでそのような脂肪酸は、コレステリルエステルの形成に用いるためのエステル側鎖の生成に用いられる。
９）不飽和脂肪酸の利用は、水性及び二重結合特性の間に追加の静電気的相互作用を組み込む小胞構造に、更なる構造的変更を提供する。
１０）小胞形成のためのエステルの選択プロセスにおいて、ＣＨ２鎖長の選択、例えば長さにおいて２個のＣＨ２〜２７個未満のＣＨ２の単位の範囲の選択は、小胞におけるエステルの相互作用を最大化するアルキル鎖を採用することが困難である結果として、あまり緻密でない構造を提供する。小胞壁のコレステロール成分は変化しない。ＣＨ２単位の内部でのファンデルワールス相互作用は、アルキル相互作用の柔軟性を支配する。しかし、有益な親水性小胞の中心に関し、そのような小胞での最適の構造配置はより長いアルキル鎖であり、これはより長いエステル分子が、製剤の安定性において水性環境に曝された小胞のより親水性の小胞中心を安定化させるために、より大きな有用性を有するということを意味する。
１１）対にされるコレステリルエステルの選択を、十二指腸細胞表面における対にされる脂肪酸トランスポーターに対する脂肪酸の相対的親和性に関して行う。Ｃａｃｏ−２細胞では、これらのトランスポーターは、長鎖脂肪酸に比べて短鎖脂肪酸をより積極的に取り込む。
【０１５６】
小胞の組成物に関して、コレステリルエステルは、十二指腸細胞の表面上のコレステロールトランスポーターとの反応性に基づいて選択され、上記組成物は、腸細胞への上記コレステリルエステルの迅速かつ完全な取り込みを促進する。本発明の実施のある重要なステップは、腸細胞表面に一意に発現する頂端表面トランスポーターによる取り込みである（１４）。更なる重要なステップは、Ｃａｃｏ−２細胞表面にも見られるこれらのトランスポーターによる、無傷の２つのエステルコレステリルエステル小胞の取り込みである（１５）。本発明者らは予想外にも、異なる複数のコレステリルエステルで作られた小胞がこれらのトランスポーターによって取り込まれることを発見した。この取り込みにはエンドソームが関与しないため、及びこれらのトランスポーターはコレステリルエステル小胞を破壊して開くことがないため、選択された材料は予想外にも、２つ以上のコレステリルエステルから生産された無傷の小胞をもたらした。従って、腸細胞に入る間に、小胞又はその内容物には変化がない。更に本発明の実施に関して、これらのトランスポーターの最適な機能性を利用するために、コレステリルエステルの特定の組み合わせを組み立てることができ、カプリン酸、カプリル酸、ミリスチン酸及びラウリン酸などの短鎖コレステリルエステルが、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸及びベヘン酸などの長鎖エステルよりも積極的かつ完全に取り込まれる。
【０１５７】
コレステリルエステル小胞は、内部に入ると、腸細胞内部でのカイロミクロン形成中の上記小胞の積載内容物の保護という更なる便益を提供する。これは、腸細胞は、コレステリルエステルをコレステロール成分及び脂肪酸成分に加水分解しないわずかな体細胞のうちの１つであるためである。この特徴及びカイロミクロン形成ステップは、腸細胞の特異な特性であり、従って本明細書で開示される本発明の実施における重要なステップである。これは、コレステリルエステルのペアが、分子の積載と、腸細胞の頂端側トランスポーターに対する相対的親和性との両方が最適化されるように、本発明者らによって選択されるためである。
【０１５８】
通常の細胞（腸細胞ではない、本明細書中で考慮されている細胞）もまた、本開示のコレステリルエステル小胞に対する表面トランスポーターを有し、また本発明者らが本明細書で示したように、腸細胞でない通常の細胞（限定でない例としてＭＣＦ−７細胞が使用される）もまた、細胞膜の通過中に本発明のコレステリルエステル小胞を（エンドソーム形成ステップなしに）取り込む。
【０１５９】
驚くべきことに、細胞取り込み後のコレステリルエステル小胞の処理は、通常の細胞と腸細胞とで異なっている。具体的には、受容体を介したエンドサイトーシスに続く、細胞内へのコレステリルエステル小胞の到達は、コレステリルエステル加水分解酵素の放出のためのシグナルであり、この酵素の特定の作用により小胞が破壊されて開き、その積載物が細胞質に放出される。これは腸細胞では発生しない。これは、これらの細胞内においてのみ、無傷の小胞が加水分解されず、無傷の形態のままカイロミクロンに取り込まれるためである。
【０１６０】
小胞のコレステリルエステルの成分の更なる好ましい特性は、以下の通りである。
１．上記成分の表面の中性電荷により、腸細胞が本発明のこれらの成分を選択的に認識できる。
２．脂質小胞コーティングの全組成物が、少量の安全な食物成分（コレステロールの脂肪酸エステル）からなり、従って安全な送達手段を提供する。
３．特に浸透性、及び特に互いを「パック」する能力及び小胞自体の中に組み込まれる医薬品の要件に関する特性。
【０１６１】
図２〜６は、表２で選択されるコレステリルエステルの異なる対によるコレストソーム小胞マトリックス形成の例による分子モデリングの略図を示す。図１１〜１３において、代表的なペプチド分子は、概ね水溶性であり、大きさが６ｋｄのペプチドであるインスリンである。図１４〜１５において、コレストソーム小胞構造は、大きさが約１５０ｋｄである代表的なモノクローナル抗体であるベバシズマブのカプセル化に適用された。図１６では、３つの代表的な分子のすべてを、コレステリルエステルミリステート及びラウレートで形成されたコレストソーム小胞に関して示す。
【０１６２】
長さにおける差が６個のＣＨ２単位より大きなエステル対（中間体として定義する）に関しては、エステル相互作用を維持すること、そして小胞内にパックされたアルキル鎖を依然として有するために複数の分子を反対方向に回転させることが可能である。この配列は、疎水性／親水性の交互の構造的領域を有する分子のパックに有用であり、小胞への組み込み時に、異なる分子タイプを分離するために利用される。
【０１６３】
エステル対の選択は、カプセル化される必要のある分子の構造及びその小胞と相互作用する能力に応じる。
【０１６４】
リポソームの正電荷と対比されるコレストソームの中性電荷
リポソームは、Ｃａｃｏ−２腸細胞障壁を通過することができず、実際に大部分が、それらの個別成分のリン脂質を取り入れる消化管で破壊されて開放される。したがって、リポソーム及びそれらの積載物は、おそらくそれらの表面電荷のために、腸細胞によって取り込まれない。コレストソームは、十二指腸細胞への吸収のための最終形態である（既にコレステロールエステラーゼによって吸収可能な部分に変換されている）コレステリルエステルから成る。これらは、コレステリルエステル由来のその組成により既に中性粒子であり、完全な吸収及びカイロミクロン形成での利用のために、十二指腸の腸細胞細胞にはそのような形態が好ましい。カプセル化された分子が完全に中空中心の内部に存在する限り、コレストソームは完全に取り込まれ、腸細胞のゴルジ体中のカイロミクロンに無傷のまま配置される。
【０１６５】
リポソームはタンパク質を積載せず、一方でコレストソームはそれを優先して積載する
リポソームは、タンパク質、遺伝子物質（ポリヌクレオチド、例えば、本願の他のところに記載されたようなＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、ペプチド（特にポリペプチド、例えば、モノクローナル抗体）及び利用可能な量の、高分子抗生剤を含めた多数の高分子（２％未満とは、ペプチド又はモノクローナル抗体に典型的である１００〜１０００ｍｇの投与量のカプセル化時に担体の量が非常に多いことを意味する）を積載しない。水溶性であり、正電荷である多数の分子が、リン脂質系リポソームのようなナノ粒子に有利に積載されない。対照的に、コレストソーム（コア）の内部は、カプセル化膜の寸法に比べて大きく、親水性である。電荷は中性であり、タンパク質、ペプチド、遺伝子だけでなく、帯電された親水性小型分子を積載することに適合するシステムである。これらの全てが全て消化管障壁を通過することができないため、コレストソーム小胞の利用は、初めて、腸細胞を迂回させるのではなく腸細胞を通過する、タンパク質及びペプチドが経口的に吸収される可能性を提供する。
【０１６６】
リポソーム及びそれによるその内容物がカイロミクロンに入り込まない
リポソームのリン脂質コーティングは消化管で分解され、したがって、リポソーム自体で分解され、その内容物が消化管で、そして、更には十二指腸の吸収部位に到着するも前に放出される。したがって、タンパク質がリポソームに積載され得るとしても、それが腸細胞により吸収できるようになる前に、リポソームとともに破壊される。リン脂質がカイロミクロンに取り込まれるリポソームを構成する可能性はない。
【０１６７】
リポソームは細胞膜を通過しない
リポソームは、その積載物と経口的に吸収されないばかりか、細胞に入り込むこともなく、おそらくそれらの表面でＡＰＯの欠乏時、脂質を必要とする細胞と結合する能力も備えていない。静脈内注射時、リポソームは肝により収穫され、そこでそれらの成分のリン脂質に破壊される。標的細胞が肝細胞である場合、肝における積載物分子の高い局地的濃度が大きな長所を提供できるにもかかわらず、これらは、普通、その内容物の細胞内送達を提供しない。
【０１６８】
組成物において有用なコレステリルエステル
コレステリルエステルは、コレステロール及び脂肪酸、好ましくはＣ４−Ｃ３６脂肪酸、多くはＣ８−Ｃ２６脂肪酸又はＣ８−Ｃ２２脂肪酸、更に多くはＣ８−Ｃ２０脂肪酸、より更に多くはＣ８−Ｃ１４脂肪酸で構成される。特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレライド酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、及びこれらの混合物からなる群から選択される脂肪酸が、本発明の実施での使用に適し得る。本発明者らは、Ｃ４−Ｃ６の脂肪酸がしばしば小胞を形成しないことを発見したので、Ｃ４−Ｃ６の脂肪酸はしばしば本発明にあまり適していない
【０１６９】
脂質粒子
Ｎｅｇｒｅｔｅ及びその同僚らによる米国特許出願第２０１１−０２６８６５３号（１６）において定義されたように、「脂質系粒子」とは、両親媒性脂質分子が水性相に配向されたそれらの極性基を有して整列している膜構造体を有する粒子を意味する。脂質膜構造体の例示は、リポソーム、多重層状小胞（ＭＬＶ）、及びミセル構造体のような構造配置を含む。
【０１７０】
「リポソーム」は、内側に位置した疎水性部分及び外側に位置した親水性部分を有するリン脂質分子の水中での二重層膜形成、及び二重層膜末端の閉鎖により形成される閉鎖されたナノ球体を意味する。リポソームの例示は、リン脂質二重層膜に形成される単一層を有したナノ球体、及び複数のリン脂質二重層に形成された多重層を有したナノ球体を含む。リポソームがそのような構造を有するため、水溶液がリポソームの内部及び外部のいずれにも存在し、脂質二重層は境界として提供される。
【０１７１】
「ミセル」は、両親媒性分子の凝集体を意味する。ミセルは、水性媒質でそれらの両親媒性分子の親脂質部分がミセルの中心に向けて位置しており、親水性部分がその外側に向けて位置している形態を有する。そのようなミセルにおいて球体の中心は親脂質性であり、周辺部は親水性である。ミセル構造の例示は、球体型、板状型、コラム型、楕円形、マイクロソーム型及び板状構造、並びに液晶を含む」。そのような構造体は、ペプチド及びタンパク質のような親水性分子をカプセル化するに当たって非常に劣悪であるが、ここで積載率は、１：１０００以下である点に注目されたい。親水性の中心（エステル官能基の配向から）及び疎水性の外部を有したコレストソームでは、それと対照的である。
【０１７２】
特定の実施形態では、内部及び外部は、擬似二重層類型の分子において交互嵌合しているエステル末端を有した内部空洞及び外側表面上のステロール核と同一であり得る。カイロミクロンがコレストソームを取る時、真の親水性である外部は変形して、積載されたカイロミクロンのアポリポタンパク質成分により再確立され、アポリポタンパク質がまた変形したカイロミクロンと細胞との結合を促進する。簡略に、カイロミクロンでのコレストソームの２ステップの形成は、先行技術の成果と比べて完全に新規なものであり、また予測不可のものである。
【０１７３】
有効量
用語「有効量」は、本明細書の全体にわたって本発明により意図される効果を提供するために、それらの使用の脈絡において所定量用いられる製剤又はその他の構成成分の濃度又は量を記述するために用いられる。製剤又は構成成分は、治療すべき疾患又は疾病において好ましい変化を提供するために用いることができるが、ここでその変化とは、治療すべき疾患又は疾病によって緩解、好ましい生理学的結果、治療すべき疾患又は疾病の逆転又は減衰、疾患又は疾病発生の予防又は兆しの減少である。製剤が組み合わせて用いられる場合、それぞれの製剤は有効量で用いられ、ここで有効量は、相乗作用的量を含むことができる。本発明に用いられる製剤の量は、製剤の性質、患者の年齢及び体重、並びに製剤の生物学的利用能及び薬物動態学に影響を及ぼす多数の様々な要因によって可変的であり、患者に投与される製剤の量は、一般的に、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ及びその他の本願に記載された範囲内である。疑う余地も無く、上記動物に提供される上記製剤のうち構成成分の投与量は、送達システムの追加される質量に対する補正後に、非経口手段によって提供されるものとほぼ同一である。当業者は、治療過程中に行われる投与スケジュール又は量での変化を容易に認識することができる。
【０１７４】
用語「同時投与」とは、２つ以上の活性化合物の投与を記述するために用いられるが、この場合、本発明による化合物を有効量の追加の薬剤又はその他の生物学的活性物質と併用する。用語の同時投与は、好ましくは患者に対する２つ以上の活性化合物の同時投与を含むが、化合物が実際に（好ましいであるとしても）必ずしも正確に同時又は同一組成物に投与されなければならないものではなく、単にここで有効な濃度が同時に血液、血清又は血漿中で発見されるようにする量で、化合物が患者又は対象に投与されるものである。
【０１７５】
用語「活性分子」、「活性物質」又は「活性化合物」は、生物学的系において活性であり、本願に記載されたようにコレストソームに取り込まれることができる任意の分子を意味する。本発明によるコレストソームは、それらの中性電荷の大きなコアに、小型分子及び巨大分子を含む、特に他に経口で効率的に送達することができない化合物を含む多数の活性分子を容易に収容することができる。これは、積荷積載コレストソームが送達において、活性化合物を腸細胞を通じてカイロミクロンに、その後、積荷積載コレストソームが投与される患者又は対象の細胞に提供する（本願に記載されたような）特異な機序のためである。これらの活性分子には、標準経口送達技術では不安定であって、一般に非経口的に投与される小型分子及び高分子、例えば、タンパク質（糖蛋白質を含む）及びポリペプチド（例えば、インスリン、インターフェロン、ｈＣＧ、Ｃ−反応性タンパク質、様々なインターロイキンを含むサイトカイン、成長因子）、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のような抗体（本願に別途で詳しく記載される抗体断片（単鎖可変断片又はｓｃＦｖ、抗体結合断片又はＦａｂ、３Ｇ抗体）を含むその他のポリペプチド、免疫原性ポリペプチド及びオリゴペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えば、裸のＤＮＡ、血漿ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、二官能性ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（他のものの中でも、特にｍｉＲ−１２２を含むもの）、並びにＤＮＡ及びＲＮＡの様々なオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが含まれる。限定ではないが本明細書に開示されるようなｐｇＷｉｚＧＦＰを含む、細胞に積載されて蛍光を発することができるプラスミドもまた、活性物質の範囲である。抗生物質（例えば、バンコマイシン及びペニシリン）及び抗ウイルス剤、及び特に高分子抗生剤を含むその他の活性分子を含め、本願に詳しく開示された多数の抗癌剤を含む多数の抗感染剤がまた、本発明により送達されることができる。
【０１７６】
本発明によるコレストソームが、非常に様々な寸法及び分子量の、事実上任意の活性分子の送達に用いることができることに注目されたい。本発明によるコレストソームはまた、患者又は対象の皮膚を通じて高い生物学的利用能を提供する、局所用抗生剤、局所用抗真菌剤、局所用血小板由来成長因子、その他成長因子、例えば、乾癬に対する局所用抗ＴＮＦ、及び局所用ワクチンを含む多数の活性分子の局所的送達、及び他のものの中でも特に化粧品剤の局所的送達に用いることができる。多数の化学治療剤、抗生剤及び抗ウイルス剤が、本発明によってコレストソームに取り込まれることができる。本発明によるコレストソームは、しかも小型分子であっても、そのような化合物に特に好適であるが、これは、本発明の組成物による活性分子送達の機序による化合物の細胞への送達が、バクテリア及びウイルスを含む様々な微生物に対抗する特に有効な治療を示すからである。
【０１７７】
本発明に用いるための他の化合物がまた、以下の実施例において記載される。
【０１７８】
用語「癌」は、無秩序な成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤、及び／又は転移をもたらす、正常な制御の喪失という特異な形質を有する腫瘍細胞の増殖を指すものとする。本明細書中で使用される場合、新生物としては、限定するものではないが、対象又は宿主の組織中の細胞の形態学的不規則性、及び同一のタイプの組織における正常な増殖と比較した場合の、対象の組織中の細胞の病理学的増殖が挙げられる。更に新生物としては、侵襲性又は非侵襲性の、良性腫瘍及び悪性腫瘍（例えば結腸腫瘍）が挙げられる。悪性新生物は、良性新生物より程度の高い形成異常、又は細胞の分化及び配向の喪失を示し、かつ浸潤及び転移の特性を有する点で、良性新生物と区別される。この文脈において、用語「癌」はまた、多重薬物耐性癌を含む薬物耐性癌も含む。本発明の腫瘍溶解物の由来となり得る新生物又は新形成物の例としては、限定するものではないが：癌腫（例えば扁平上皮癌、腺癌、肝細胞癌、及び腎細胞癌）、特に膀胱、骨、腸、乳房、子宮頸部、結腸（結腸直腸）、食道、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、甲状腺、卵巣、膵臓、前立腺及び胃の癌腫；急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、巨核球性白血病、微小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、好中球性白血病、及び幹細胞白血病などの白血病；良性及び悪性リンパ腫、特にバーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫；良性及び悪性黒色腫；骨髄増殖性疾患；肉腫、特にユーイング肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫、末梢神経上皮腫、及び滑膜肉腫；中枢神経系の腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、神経節腫、神経節膠腫、髄芽腫、松果体細胞腫瘍、髄膜腫、髄膜肉腫、神経線維腫、及び神経鞘腫）；生殖細胞系腫瘍（例えば腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌（例えば：小細胞肺癌；小細胞癌と非小細胞癌との混合；転移性胸膜中皮腫、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む胸膜中皮腫）、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、食道癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、及び黒色腫）；混合タイプの新形成物、特に癌腫及びホジキン病；並びにとりわけウィルムス腫瘍及び奇形癌腫のような混合起源の腫瘍が挙げられる。とりわけ卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、髄芽細胞腫及びＢ細胞リンパ腫を含む特定の上皮性腫瘍は、自食作用の亢進を示すことが示されており、本発明による化合物及び両方の主要な標的癌であることに留意されたい。
【０１７９】
用語「追加の抗癌剤」は、癌の治療において、本発明による小胞を含む１つ以上の組成物と同時投与できる追加の化合物を記述するために使用される。このような作用剤としては例えば、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ＰＩＫ−１変調因子、Ｂｃｌ−２阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｃｄｋ阻害剤、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤、ＩＧＦＲ−ＴＫ阻害剤、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、チェックポイント−１又は２阻害剤、フォーカルアドヒージョンキナーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）阻害剤、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、デカタニブ、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３１−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンジチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ１ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ニューラジアブ、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、イリノテカン、リポソーマルドキソルビシン、５’−ドデキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシシブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−、二ナトリウム塩、七水和物、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］（ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ２酢酸塩の酢酸塩［Ｃ５９Ｈ８４Ｎ１８Ｏｉ４−（Ｃ２Ｈ４Ｏ２）Ｘ、ただ��ｘ＝１〜２．４］、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロリド、パモ酸トリプトレリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマニチブ、リュープロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ビノレルビン、ベバシズマブ（モノクローナル抗体）及びアービタックス、クレモフォール非含有パクリタキセル、エポチロンＢ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２��５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００１、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ウォルトマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレドロン酸、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ペグ化インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ａ、ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドミド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランス型レチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メゲストロール、免疫グロブリン、窒素マスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、アンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、リポソーマルダウノルビシン、Ｅｄｗｉｎａ−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセトロン、トロピセトロン、ｓｓｐｅｇフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファ及びダルベポエチンアルファ、イピリムマブ、ベムラフェニブが特に挙げられる。組み合わせて使用できる他の抗癌剤としては、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブなどの免疫療法が挙げられる。これらの化合物は、本発明による組成物を内包する小胞とは別個に投与してもよく、又は場合によって、本発明による小胞に、1つ以上の高分子及び本明細書中の他の箇所に記載の任意の追加の化合物と共に含めてもよい。
【０１８０】
活性分子のコレストソームへの取り込み及び患者又は対象に対する投与が、同一の投与水準で、先行技術方法により送達される同一の活性分子よりもより大きな治療有効性を提供するという点に注目されたい。実際に、カイロミクロンに積荷積載コレストソームをパッケージする機序は、その実際の活性部位（細胞内）においてかなり多い量又は濃度の活性分子を提供するようになり、先行技術の方法よりもかなり大きな効能を提供する。多くの場合、本発明により細胞の内部に送達される活性物質濃縮物の量は、先行技術（同時代）手段による送達に比べて２倍以上、及びしばしば１０〜１００倍で活性濃度を提供する。
【０１８１】
コレストソーム中でのカプセル化に好適なペプチド
好ましい実施形態では、本発明は、インスリン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、ヒト成長ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、カルシトニン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、グレリン、エクステンジン−４、ＧＬＰ−１、いずれかのＧＬＰ−１アゴニスト、ＰＹＹ３６、オキシントモジュリン、ＧＬＰ−２及びグルカゴンを含むがこれらに限定されない親水性ペプチドからなる群から選択されることが多いペプチド又はタンパク質（これらはいずれも、本明細書の他の箇所に記載されているようにコレステリルエステルによってカプセル化される）を含む、経口用途又は細胞内用途のためのペプチド積載コレストソーム医薬組成物を提供する。別の実施形態では、上記タンパク質はインスリン分泌促進物質である。別の実施形態では、上記タンパク質はＧＬＰ−１である。別の実施形態では、上記タンパク質はＧＬＰ−１類似体である。別の実施形態では、上記タンパク質はＧＬＰ−１模倣体である。別の実施形態では、上記タンパク質はインクレチン模倣体である。別の実施形態では、上記タンパク質はＧＬＰ−１インクレチンを模倣する。別の実施形態では、上記タンパク質はＧＬＰ−２である。別の実施形態では、上記タンパク質はＧＬＰ−２類似体である。別の実施形態では、上記タンパク質はＧＬＰ−２模倣体である。この組成物を投与することにより、膵臓若しくは肝臓などの器官及び組織の構造若しくは機能の改善、哺乳類の成長の増進若しくは開始、又はインスリン治療が有益な個体におけるインスリンの投与が可能である。
【０１８２】
本発明の実施に使用するためのインスリン、ＧＬＰ−１及び組成物
一実施形態では、本発明の方法及び組成物のインスリンは、ヒトインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンは組み換えインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンは組み換えヒトインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンはウシインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンはブタインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンは、インスリンの金属錯体（例えばインスリンの亜鉛錯体、、プロタミン亜鉛インスリン、又はグロビン亜鉛インスリン）である。
【０１８３】
別の実施形態では、上記インスリンは六量体の形態で本発明に含有される。別の実施形態では、上記インスリンは速効型のものとして分類され、上記分類は例えば、インスリン類似体であるインスリンアスパルト、インスリンリスプロ及びインスリングルリシンを含む。
【０１８４】
別の実施形態では、上記インスリンは短時間作用型のものとして分類され、上記分類は通常のインスリンを含む。
【０１８５】
別の実施形態では、上記インスリンは長時間作用型のものとして分類され、上記分類は例えば、インスリングラルギン、インスリンデテミル及びインスリンデグルデクを含む。
【０１８６】
別の実施形態では、上記インスリンはレンテインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンはセミレンテインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンはウルトラレンテインスリンである。
【０１８７】
別の実施形態では、上記インスリンはＮＰＨインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンはグラルギンインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンはリスプロインスリンである。別の実施形態では、上記インスリンはアスパルトインスリンである。
【０１８８】
別の実施形態では、上記インスリンは、上述のタイプのインスリンのうちのいずれかの２つ以上の組み合わせである。別の実施形態では、上記インスリンは、当該技術分野において公知の、他のいずれかのタイプのインスリンである。これらの可能性はそれぞれ、本発明の別個の実施形態を示す。
【０１８９】
別の実施形態では、上述のタイプのインスリンのうちの１つ以上を、インスリンが送達手段から体細胞内に放出された場合のインスリンの細胞内代謝を防止できるインスリン代謝の阻害剤と任意で組み合わせてもよい。
【０１９０】
別の実施形態では、上述のタイプのインスリンのうちの１つ以上を、上述のペプチド、又は好ましい実施形態において既に列挙されたものではないペプチドのうちの１つ以上と組み合わせてもよい。当該技術分野において公知のいずれかのペプチドが本発明の範囲内である。
【０１９１】
メタボリックシンドロームでは、公知のように、栄養素の取り込みと、ミクロビオームの作用と、代謝バランスとの間のバランスを調整する、いわゆる回腸ホルモンが分泌される。従って回腸ホルモンとしては、限定するものではないが、ＧＬＰ−１、グリセンチン、Ｃ末端グリシン延長ＧＬＰ−１（７−３７）、（ＰＧ（７８−１０８））；仲介ペプチド−２（ＰＧ（１１１−１２２）アミド）；ＧＬＰ−２（ＰＧ（１２６−１５８）、ＧＲＰＰ（ＰＧ（１−３０））、オキシントモジュリン（ＰＧ（３３−６９）、及び単離されるその他のペプチド画分、ＰＹＹ（ＰＹＹ１−３６）及び（ＰＹＹ３−３６）、コルレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、エンテログルカゴン及びセクレチンが挙げられる。これらのペプチドのうちの２つ以上の、いずれかの１つ又はいずれかの組み合わせが、本発明のコレステリルエステル中でのカプセル化に好適である。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明のペプチド積載コレストソームは、１つ以上のインスリン及び１つ以上のＧＬＰ−１を、必要とする患者の治療に有効ないずれかのモル比で含有する。
【０１９３】
別の実施形態では、本発明のペプチド積載コレストソームは、１つ以上のインスリン及び１つ以上のグルカゴン分子を、必要とする患者の治療に有効ないずれかのモル比で含有する。
【０１９４】
別の実施形態では、本発明のペプチド積載コレストソームは、対象の糖尿病を治療するための方法を提供し、上記方法は、インスリン及び任意で他のペプチドと、任意で上記物質の細胞内代謝の１つ以上の阻害剤とを含む医薬組成物を、上記対象に経口投与することによって、糖尿病を治療するステップを含む。
【０１９５】
別の実施形態では、１つ以上のインスリン及び１つ以上のＧＬＰ−１を含有する上記ペプチド積載コレストソームは、細胞内インスリン代謝の阻害剤を任意で含有し、また細胞内ＧＬＰ−１代謝の阻害剤を任意で含有する。インスリン及びＧＬＰ−１と共に上記コレストソームのコア内に内包される、ＧＬＰ−１細胞内代謝のいずれかの阻害剤及びインスリン細胞内代謝のいずれかの阻害剤が、本発明の範囲内である。
【０１９６】
好ましい実施形態では、いずれかのＤＰＰ−４阻害剤が本発明の範囲内であることは当業者には明らかであるため、ＧＬＰ−１細胞内代謝の上記阻害剤は、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチンなどのＤＰＰ−４阻害剤となる。インスリン細胞内代謝のいずれかの阻害剤が、本発明の範囲内である。好ましい実施形態では、インスリン細胞内代謝の上記阻害剤は、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）の阻害剤となり、通常はＬｅｉｓｓｒｉｎｇ  ｉｎ  ２０１０  （１７）によって過去に開示されているように亜鉛メタロプロテアーゼの阻害剤である。
【０１９７】
Ｌｅｉｓｓｒｉｎｇは、ＩＤＥの新規のペプチドヒドロキサム酸阻害剤を開示している。得られる化合物は、既存の阻害剤よりおよそ１０（６）倍強力であり、非毒性であり、また驚くべきことに、従来の亜鉛メタロプロテアーゼと比較してＩＤＥに対して選択性である。これらのＩＤＥ阻害剤は、内在化されたインスリンの異化作用の低減に関与する機序によって、インスリンシグナリングを増強する。ＩＤＥの活性部位の特異な構造、及び本発明の阻害剤の作用様式は、従来の亜鉛メタロプロテアーゼとの交差反応が最小である阻害剤の開発が可能となり得ることを示唆している。この群によって開示される、本発明での使用に好適な、ＩＤＥ阻害剤の１つの特定の形態は、ＭＬ３４５である（１８）。
【０１９８】
別の実施形態では、上記ペプチド積載コレストソームは、インスリングラルギン及びリキシセナチドと、任意で体細胞内での代謝の１つ以上の阻害剤とを含有する。細胞内での酵素分解の一般的な阻害剤、即ち本製剤に含めるのに好適な一般的な阻害剤は、大豆トリプシン阻害剤である。
【０１９９】
別の実施形態では、上記ペプチド積載コレストソームはデュラグルチドを含有する。
【０２００】
別の実施形態では、上記ペプチド積載コレストソームはセマグルチドを含有する。
【０２０１】
別の実施形態では、上記ペプチド積載コレストソームはリラグルチドを含有する。
【０２０２】
一実施形態では、本発明の方法及び組成物に利用されるインスリンの量は、０．５〜３単位（ｕ）／ｋｇ（ヒト）である。一実施形態では、本発明の方法及び組成物におけるインスリンを測定するために使用される単位は、ＵＳＰインスリン単位である。一実施形態では、インスリンを測定するために使用される単位はミリグラムである。別の実施形態では、１ＵＳＰインスリン単位は３４．７ｍｇのインスリンに等しい。
【０２０３】
別の実施形態では、ヒト患者に関するインスリンの量は、０．１〜１．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は０．２〜１．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は０．３〜１．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は０．５〜１．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は０．１〜２．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は０．２〜２．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は０．３〜２．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は０．５〜２．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は０．７〜２．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は１．０〜２．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は１．２〜２．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は１．０〜１．２ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は１．０〜１．５ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は１．０〜２．５ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は１．０〜３．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は２．０〜３．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は１．０〜５．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は２．０〜５．０ｕ／ｋｇである。別の実施形態では、上記量は３．０〜５．０ｕ／ｋｇである。
【０２０４】
別の実施形態では、本発明は、対象の糖尿病を治療するための方法を提供し、上記方法は、インスリン及び任意で他のペプチドと、任意で上記物質の細胞内代謝の１つ以上の阻害剤とを含む医薬組成物を、上記対象に経口投与することによって、糖尿病を治療するステップを含む。
【０２０５】
特定の実施形態では、上記の積荷を積載した小胞はカプセル内に入れられ、上記カプセルの表面を更に腸溶コーティングすることにより、消化管の胃酸中での医薬組成物の分解を防止する。
【０２０６】
特定の実施形態では、上記ペプチド積載コレストソームの上記表面層は、約２〜約１４のｐＨ範囲において無傷のままとなる。
【０２０７】
他の実施形態では、上記積荷積載コレストソームは、材料を押出成形ステップに供するか、押出成形せずに使用するかに応じて、約２５０ｎｍから１０，０００ｎｍ（１０マイクロメートル）超まで、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、多くの場合約５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約１０００〜約２５００ｎｍ、約２００〜約３００ｎｍの直径を有する、単層小胞を有する。従って、活性分子が大きい場合には大きなコレストソームを用い、活性分子が小さい場合には小さなコレストソームを用いることに留意されたい。
【０２０８】
一実施形態では、上記タンパク質は組み換えタンパク質である。一実施形態では、上記タンパク質はインスリンである。別の実施形態では、上記タンパク質はグルカゴンである。別の実施形態では、上記タンパク質はインターフェロンガンマである。別の実施形態では、上記タンパク質はインターフェロンアルファである。別の実施形態では、上記タンパク質はインターフェロンベータである。別の実施形態では、上記タンパク質はエリスロポエチンである。別の実施形態では、上記タンパク質は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。上記タンパク質は当該技術分野で公知の他のいずれかのタンパク質である。
【０２０９】
別の実施形態では、上記タンパク質は成長ホルモンである。一実施形態では、上記成長ホルモンはソマトトロピンである。別の実施形態では、上記成長ホルモンはインスリン成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）である。別の実施形態では、上記成長ホルモンは当該技術分野で公知の他のいずれかの成長ホルモンである。
【０２１０】
別の実施形態では、上記タンパク質の分子量（ＭＷ）は１〜５０キロダルトン（ｋＤａ）である。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜４５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜４００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜３５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜３００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜２５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜２００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１０〜５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１５〜５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは２０〜５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは２５〜５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは３０〜５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは３５〜５０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜１００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜９０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜８０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜７０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１〜６０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１０〜１００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１５〜１００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは２０〜１００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは２５〜１００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは３０〜１００ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１０〜８０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは１５〜８０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは２０〜８０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは２５〜８０ｋＤａである。別の実施形態では、上記ＭＷは３０〜８０ｋＤａである。これらの可能性はそれぞれ、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２１１】
別の実施形態では、上記ＭＷは２０ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは２５ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは３０ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは３５ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは４０ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは４５ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは５０ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは５５ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは６０ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは６５ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは７０ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは７５ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは８０ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは８５ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは９０ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは９５ｋＤａ未満である。別の実施形態では、上記ＭＷは１００ｋＤａ未満である。
【０２１２】
上述のタンパク質のうちのいくつかの分子量は、以下の通りである：インスリン＝６キロダルトン（ｋＤａ）；グルカゴン＝３．５ｋＤａ；インターフェロン＝２８ｋＤａ、成長ホルモン＝２１．５〜４７ｋＤａ；ヒト血清アルブミン＝６９ｋＤａ；エリスロポエチン＝３４ｋＤａ；Ｇ−ＣＳＦ＝３０〜３４ｋＤａ；トラスツズマブ＝１５０ｋＤａ；カタラーゼ＝２８０ｋＤａ。よって、一実施形態では、これらのタンパク質の分子量は、本発明の方法による投与に好適である。
【０２１３】
別の実施形態では、本発明の方法及び組成物は、ヒト血清アルブミンの投与に使用される。一実施形態では、ヒト血清アルブミンは薬学的活性成分とはみなされないが、本発明の文脈において、アルブミンに優先的に結合できる活性成分のための、治療的に有効な担体として使用できる。
【０２１４】
タンパク質の各タイプは、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２１５】
本発明で使用される積載済みコレステリルエステル小胞のための経路
一実施形態では、本発明は、コレステロールと１つ以上の飽和又は不飽和脂肪酸とから作られる１つ以上のコレステリルエステルを含む中性電荷の表面層でカプセル化された、活性薬剤、好ましい実施形態では高分子である分子、更に多くの場合はペプチド（「ペプチド積載コレストソーム）、例えば薬学的活性物質（この用語は治療剤及び診断剤を含む）を含む、コレステリルエステル小胞組成物を提供する。本発明によるコレストソームは、幅広いサイズ及び重量を有する１つ以上の異なる活性薬剤分子、特にリポソーム、ペグ化、デンドリマー、カチオン性ナノ粒子などを含む従来技術の方法を用いて経口経路で送達するのが困難な薬学的活性分子を、カプセル化する。
【０２１６】
図１Ａ、表１コレステリルエステル小胞と代替的な送達技術との特性の比較分析を開示する
コレストソームを用いた経口吸収及び細胞内送達
本発明によると、上記ペプチド積載コレストソームは、哺乳類、患者又は対象への投与後の、上記コレストソーム小胞及びその無傷の積載物を内包するカイロミクロンを生成するためのカイロミクロン中への無傷の取り込み（このプロセスの具体的な複数のステップは、体内において腸細胞のみによって実施される）を可能とする、特定の組成のものである。続いて上記積荷積載カイロミクロンは消化管腸細胞によってリンパ管に放出され、その後、リンパ液が胸管に入ることによって血中に放出される。心臓を通過した後、小胞が積載された上記カイロミクロンは、この動脈血の供給を受ける全ての細胞にアクセス可能となるが、カイロミクロン結合受容体を有する細胞のみが上記内容物にアクセスすることになる。カイロミクロンとこれらの細胞との受容体を介した結合の後、コレストソーム及びその積載物は無傷のまま上記細胞内へと送達され、その一方で上記コレストソームは、コレステロールと脂肪酸との間の結合を破壊するコレステリル加水分解酵素の作用によって分解され、これにより、膜の内側にカプセル化された活性分子を上記細胞の細胞質内に放出する。本発明の影響は、経口投与された活性分子を細胞の内部に直接送達することによって、治療又は診断を実現することである。
【０２１７】
コレステリルエステルでカプセル化されると、本発明の医薬組成物及び経口の治療方法は、保護処理されていない状態では生体内での分解により効果のない、様々な活性成分のカイロミクロン−標的化された細胞内送達を可能とする。例えば、一部の特定の実施形態では、本願に定義される炎症関連代謝障害の治療に有用な高分子の有効な送達、ワクチンの身体特定部位への有効な送達、リボソーム及び核に作用する遺伝子物質の細胞内部への有効な送達、並びに皮膚バリア通過の潜在性を有した皮膚上での局所送達を可能にする。更に、本発明による組成物を用いた疾病及び／又は疾患のその他の治療方法が、本明細書に開示される。実際に、いずれの薬学的活性分子も、本発明の方法で患者又は対象の標的細胞へ有効に送達されることができ、その有効な治療結果に先行技術の送達方法は匹敵しない。治療が必要な患者への本発明の組成物の投与による疾病及び疾患の治療方法は、本発明の更なる実施形態を示す。本発明による治療方法の実施形態についての組成物の有効投与量は、１日当たり１マイクログラム以下の非常に小さな量から１ｇ以上までの範囲であり得る。その他の有効な投与量は、多くの要因の中でも特に、患者又は対象の大きさ及び年齢、患者の全体的な健康及びその分子の有効性に依存する。約０．００１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ未満〜約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の範囲の投与量が想定され、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ〜約２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲がより利用される。
【０２１８】
特定の実施形態では、医薬組成物は単層小胞であり、その小胞の全重量の約１０％〜約９８％、約２０％〜約９６％、しばしば約５０％〜約９６％、しばしば約９０％〜約９６％が、薬学的活性分子又は薬学的活性物質の重量である。
【０２１９】
本発明において、１種以上のコレステリルエステルに対する活性分子（好ましくは、薬学的活性物質を含む）の質量比は、約４：９６〜約９６：４、約１０：９０〜約９６：４、しばしば約１０：９０〜約９６：４、しばしば約２０：８０〜約９０：１０、約２０：８０〜約５０：５０、約５０：５０〜約９６：４、約９０：１０〜約９６：４である。
【０２２０】
本発明では、医薬組成物は、上記のコレストソーム小胞に組み込まれても変わらず、体細胞内でのコレステリルエステル加水分解酵素による放出で、その医薬組成物は同じ活性を有し、活性物質と同じである。
【０２２１】
別の実施形態では、コレステリルエステル交互嵌合の交互嵌合型の交互アルキル鎖モデル（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ａｌｋｙｌ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｄｅｌ）を用いて、薬学的活性物質−コレステリルエステル官能基相互作用に基づいて１種以上のコレステリルエステルを選択することにより、１種以上のコレステリルエステルに対する薬学的活性物質を含む活性分子の質量比を最大化する。下記実施例２は、最適の薬学的活性物質−コレステリルエステル官能基相互作用を確保する製剤の基準を記述する。
【０２２２】
更に別の実施形態では、医薬組成物は、１種以上のコレステリルエステルをジエチルエーテル中で反応させて、得られる有機相を真空下で除去し、カプセル化されるペプチドを高濃度で含む水相を導入することを含む方法によって作られるコレストソーム小胞である。
【０２２３】
更に別の実施形態では、コレステリルエステルは、それらの十二指腸腸細胞の表面上のコレステロール輸送体との反応性、及びカイロミクロンへの取り込み時まで腸細胞で無傷のまま残っている能力に基づいて選択される。
【０２２４】
本発明の実施形態では、コレステリルエステルは、コレステロールをＣ４−Ｃ３６の飽和又は不飽和脂肪酸、多くはＣ８−Ｃ２６脂肪酸、より多くはＣ８−Ｃ２２脂肪酸又はＣ８−Ｃ１４脂肪酸でエステル化して得られる。好ましい実施形態では、コレステリルエステルは、しばしば、コレステリルミリステート、コレステリルラウレート、コレステリルドデコネート、コレステリルパルミテート、コレステリルアラキドネート、コレステリルベヘネート、コレステリルリノレート、コレステリルリノレナート、コレステリルオレエート及びコレステリルステアレートからなる群から選択される。
【０２２５】
本発明によるコレストソームは、分子のための送達システムの中で特異である。初めて、本発明の発明者らは、タンパク質及びその他分子並びに化学的化合物を、食品分野において広く公知された食物中の脂肪である脂肪酸として偽装した。より具体的には、経口的吸収のために選択された物質が、食用コレステリルエステルであった。驚くべきことに、コレステリルエステルは、コレストソームのカプセル化された製品（特に、この方法以外では、患者に成功的に送達することができない高分子）をリポソーム又はいずれの他の小胞とも差別化する以下の特性を有した、特異なコレステリルエステル小胞を提供する。
１．送達手段及びシステムの全ての成分物質は、一般的な食用成分であり、ほとんどの適用において、これらの物質の１日当たりの総投与量が食品からよりも少ない。
２．コレストソームにカプセル化する作用温度は、多くの場合に３５〜４５℃であるが、これは、ペプチド及びタンパク質の身体循環形態での安定性のための最適温度である。
３．上記送達手段は、分子寸法、電荷、結合又は分解経路を考慮することもなく、全ての好ましい側面を提供する。
４．コレストソームのカプセル化されたタンパク質は、Ｃａｃｏ２腸細胞障壁の完全な通過を示し、カイロミクロンに無傷のまま取り込まれる。
５．肝及び関連の初回通過消去経路のバイパス
６．コレストソーム及びそれを含むカイロミクロンが、経口摂取から細胞内吸収までの全ての経路で細胞膜を通過するため、これらは、分子に対する保護を提供する。
７．細胞との結合、定量的な細胞内積載、細胞膜障壁の完全な通過
８．内在的な経路であるコレステリルエステルヒドロラーゼによる細胞質でのカプセル化された内容物の開梱
９．コレストソームは、エンドソーム吸収経路を用いないが、細胞内部位において積載物分子の堅固な細胞内濃度
１０．コレストソーム及びそのカプセル化された内容物は、本態形成カイロミクロンに取り込まれる時、全ての細胞に分配される。
【０２２６】
一部の送達システムが上記１０の特徴のうち１つ又は一部を実現するものの、特にこれまで、未吸収タンパク質の経口的利用を可能とした場合、このような好ましい特性を広範囲に実現しつつ、積載物分子を変更することなく、本質的に任意の分子又は化学的化合物に採用することができる送達システムはなかった。コレストソームは、任意の分子に適用することができる最初の細胞内送達システムである。実際に、コレストソームは、それが小型分子とともに存在すること以上に、他のものの中でも、特にタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド（他のものの中でも特に、ＲＮＡ及びＤＮＡ、例えば、裸のＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、干渉ＲＮＡ又は「ＲＮＡｉ」、例えば、小型干渉ＲＮＡ又は「ｓｉＲＮＡ」、小型ヘアピン型「ｓｈＲＮＡ」、二官能性ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ並びに、ＤＮＡ及びＲＮＡの様々なオリゴヌクレオチド）を含む高分子及び高分子抗生剤と効率的に存在する。
【０２２７】
活性分子を患者又は対象の細胞内標的に送達する特異な機序のため、本発明による積荷積載コレストソームは、積荷（すなわち、活性高分子）を、コレストソームがない場合に（すなわち、リポソーム内の送達を含めた従来の薬剤学物送達手段によって）提供される濃度よりも２倍以上の濃度で、本発明の組成物が投与される（好ましくは経口で）患者又は対象の細胞に送達することができる。大部分の実施形態では、本発明は、コレストソームがない場合に提供される（細胞に送達される）濃度よりも１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２５０倍以上、５００倍以上、及び１、０００倍以上の濃度で活性分子を細胞に送達する。
【０２２８】
コレストソームが、分子及び化学的化合物の送達のための先行技術に比べて新規であるため、本発明者は、先行技術が任意の類似したシステムを開示しない理由を指摘するために、詳細な比較情報を提供する。
【０２２９】
このような比較に次いで、限定でない実施例が提供される。
【０２３０】
コレステロールは、一般的に膜及び脂質の代謝において重大な構造的役割をする。これは、胆汁酸、ビタミンＤ及びステロイドホルモン（グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン及びアルドステロン）の生合成前駆体である。更に、これは、中枢神経系の発生及び作用に寄与し、信号送達及び精子発生にも重要な機能を行う。特定の膜タンパク質又はプロテオリピド（「ｈｅｄｇｅｈｏｇ」タンパク質）に対する共有結合からも発見されるが、これは、胎芽発生において重大な機能を行う。
【０２３１】
好ましくは、ヒドロキシル基に連結された長鎖脂肪酸（しばしば、８個以上２６個以下の炭素原子を含む脂肪酸）を有したコレステロールエステルは、遊離されたコレステロールより極性ではなく、細胞質での輸送のための好ましい形態に、また生物学的不活性貯蔵（解毒）形態に現われる。これらは、生物学的膜には分布しないが、細胞内脂質粒子に充填される。
【０２３２】
動物においてコレステロールエステルヒドロラーゼは、膜及びリポタンパク質の形成に必要な時、コレステロール及び遊離された脂肪酸をエステル形態から遊離させる。これらは、また、副腎細胞においてホルモン合成のためにコレステロールを提供する。カルボキシルエステルヒドロラーゼ、リゾソーム酸コレステロールエステルリパーゼ、ホルモン敏感性リパーゼ及び肝細胞質コレステロールエステルヒドロラーゼを含む、多数のコレステロールエステルヒドロラーゼが同定されている。これらは、多数の異なる組織及び細胞機関に散在しており、様々な機能を有している。
【０２３３】
本発明者は、コレストソームと呼ばれるコレステリルエステル粒子内に分子をカプセル化する新規な送達技術を開示し、この粒子は、小腸の細胞により経口的に吸収された後に、リンパ輸送を通じて全ての身体細胞への送達のためにカイロミクロンに入れられる。この小胞がカイロミクロン輸送粒子から細胞に吸収された後、コレステロールエステルヒドロラーゼは粒子を開梱し、その分子を細胞内部位に遊離させる。
【０２３４】
本出願において、コレストソームの構造に関して関連のある背景情報は、発明の名称が「Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｍｅａｎｓ」である、２００７年３月２０日に出願された米国特許出願第２００７０２２５２６４号にある。
【０２３５】
本願に用いられた交互嵌合（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｏｎ）の原理は、当業者に知られている。例えば、Ｙｅａｇｌｅ、Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１０）を参照。
【０２３６】
「カイロミクロン」は、直径が約７５０〜４０、０００ｎｍの範囲である非常に大きな、非均質性の脂質リッチ粒子である。これらは、消化管の腸細胞で形成され、摂取した脂肪及び脂溶性ビタミンを、血流循環を介して細胞に輸送する機能を行う。コレストソーム及びその他脂質粒子由来のカイロミクロン形成の略図が、図１に示されている。分泌されたカイロミクロン粒子の寸法の非均一性は、脂肪吸収速度、吸収された脂肪の類型及び量に左右される。コレストソームが非常に大きな場合、その大きなコレストソームが取り込まれる、結果として得られるカイロミクロンがまた同様に大きくなり得る。
【０２３７】
「コレストソーム」は、消化管の不利な条件下で安定し、より大きな設計の柔軟性、大幅の様々な分子に対するより大きなカプセル化効率を保有し、更に容易な加工可能性の長所を有する。この好ましいコレストソームの特性は図１Ａ、表１に強調されており、ここで、送達システムを比較する。コレストソーム及びリポソームの間の構造的な差は、コレストソーム上に異なる物理的及び化学的特性を与え、したがって、コレステロールに所望の特性及び機能の面で卓越性を提供する。例えば、コレストソームは、２〜１３の広範囲なｐＨで安定するものと示された。対照的に、リポソームを記載した文献、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅの２００５年度概括論文によると、「胃液（ｐＨ１．９）、小腸（ｐＨ８）内の消化管酵素及び胆汁酸に対するリポソームの耐性が小さくて、それらの経口的適用は無駄である。」。コレストソームは、ｐＨ分解に抵抗し、したがって、特に本発明の新規な側面である分子の経口送達のための１次的手段として用いられる潜在性を有する。
【０２３８】
「積荷積載コレストソーム」は、薬学的活性物質、特に高分子をカプセル化したコレストソームを意味し、排他的な必要条件ではないが、コレストソーム小胞のコアに主にその薬剤を含んでいる。
【０２３９】
次に、コレステリルエステルの相互作用に基づく構造的特徴は、血中システムにおいて拡張される時間を与えるためにリポソームが用いるＰＥＧ表面と近似するように算出された静電気的表面特性である。これは、コレストソーム内に含まれる薬物又は分子により長い体内滞留時間を与え、一般的に薬物送達システムの長所であるが、分子が薬物送達小胞から放出されることができなければ、必須の長所になるものではない。
【０２４０】
これに対する証拠は、一剤形のコレストソームにおいて、中性表面を有したコレストソームが−１４の測定されたゼータ電位を有することを示す、ゼータ電位の測定値であるが、それらの積載されていない形態において単独コレストソームに対する中性電荷の典型である。ゼータ電位に対する中性電荷の境界値は、約−２０〜約＋２０、多くは約−２０〜約＋２０、多くは約−４０〜＋１０、−５〜＋５、又はほぼ０のゼータ電位を有していることを意味する。中性表面電荷に対する要求は、別の類型の製剤において用いられるＰＥＧの使用を誘導する。コレストソームは、様々な発明の中でも、特に実施形態の特定の比較においてＰＥＧの中性表面と近似する。
【０２４１】
コレストソームの構造的変更は、異なる内部及び外部の表面特性を結果として提供するエステルのモル比変更に基づいており、コレストソームにおいてそれらの特性が（リポソーム及び他の先行技術の送達手段でのように）親水性／疎水性隔離に基づく構成によって定められないので、より容易に定められて製造される。（超音波処理の結果としての寸法、しばしば温度、しばしばｐＨ（中性ｐＨの水溶液は、脂質小胞の寸法を定義するそれらの能力に影響を及ぼすことができるカプセル化のために、分子上に異なる電荷を有する）の証拠）。これらの全ての有益な特性は、下記の図１Ａ、表１にまとめており、他の送達システムのそれと比較した。
【０２４２】
下記の図１Ａ、表１に示されるように、コレストソーム及び他の送達方法の間の特性の比較は、コレストソームが、全てのカテゴリーにおいて優れるか又は少なくとも同等であることを証明する。このような比較のうち、特に重要な１つの側面は、ほぼ全ての分子がそれ自体の変化なしにコレストソームにカプセル化され得るという点である。そのような特徴は、その他送達システムと共有されないものであり、分子それ自体で特異的な傾向である。本発明において明白に立証される設計の柔軟性は、薬物送達システムのための有利な特性である。
【０２４３】
図１Ａ、表１
コレストソームと他の一般的な薬物送達手段との特性比較
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【０２４４】
上記図１Ａ、表１において、合成重合体は、一般的にＰＥＧ化のような技術を意味する。担体タンパク質は、ウイルスベクターのような付着される生物学的分子を意味する。ＰＥＧ化及び担体タンパク質の構築物は静脈内に提供され、本来消化管において分解されるため、リポソームと同様に、経口的に提供する時に吸収されない。
【０２４５】
ペプチドの経口吸収及び好ましい関連特性
理論によって束縛されるものではないが、本発明により、分子、好ましい実施形態では１つ以上のペプチド又はタンパク質を、コレステリルエステル小胞内にカプセル化する、製剤手段の経口送達が可能となり、上記コレステリルエステル小胞は、分子認識によって消化管の腸細胞に入り、消化され、カイロミクロンに取り込まれ、これにより、上記分子が消化管の腸細胞を通ってカイロミクロンに入る間に上記分子の完全性を十分に保護し、その後、リンパ系に入り、血中に入って体細胞の膜を横断する。本明細書で開示される本発明の製剤は安定しており、身体の細胞に取り込まれるまでは活性成分を放出しない。コレストソームと呼ばれる本発明の市販実施形態の特徴としては、以下が挙げられる：
１）エンドソームのない特定の脂肪酸トランスポーターが仲介する取り込みと、これに続くカイロミクロンへの無傷の小胞の挿入とによる、Ｃａｃｏ−２腸細胞障壁の完全な通過；
２）エンドソームを用いず、コレステリルエステル加水分解酵素による小胞からの放出を用いる、非腸細胞の細胞膜障壁の完全な通過；
３）送達方法がエンドソーム取り込みを概ね回避し、細胞質内で遊離する積載物が得られる、「トロイの木馬」に類似した細胞内送達の方法；
４）活性分子のサイズ、電荷、結合又は分解経路から比較的独立した、高い経口バイオアベイラビリティ並びに体細胞への送達及び取り込み（これにより、ペプチド積載コレストソームの表面はいくつかの用途において中性電荷を有する）；
５）活性成分は肝臓周辺のリンパ管内を循環する：いわゆる初回通過肝臓取り込みを回避するものの最終的には肝臓に達する経口送達方法；並びに
６）カイロミクロンの表面へのアポリポタンパク質の付着によって、細胞内へのペプチド送達が促進され、上記カイロミクロンは細胞との結合及び細胞内積載と、これに続く、コレステリルエステル加水分解酵素の作用による、細胞質内でのカプセル化された分子の開梱とが可能である。
【０２４６】
従って、本発明によるペプチド積載コレストソームは、１つ以上のペプチド（即ち好ましい実施形態における活性分子）を、患者又は対象の細胞内にある濃度まで送達する、唯一の実行可能な手段であり、上記患者又は対象には、コレストソーム中での投与を用いずに（即ちリポソーム中での送達を含む従来の薬学的送達手段によって）提供されるものの少なくとも２倍の本発明の組成物が（好ましくは経口）投与される。ほとんどの実施形態では、経口使用後の本発明は、コレストソームを用いずに提供されるものの少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍及び１０００倍以上の濃度まで、活性分子を細胞内に送達する。本発明による好ましい組成物のバイオアベイラビリティは、経口対非経口ＡＵＣ（曲線下面積）に基づいて算出した場合に、５０％〜約１００％（例えば９９．９＋％）、５５％〜９９．９％、６０％〜９９．５％、６５％〜９９％、７０％〜９８％、７５％〜９５％、５０％〜９５％などである。よって本発明の組成物は、特に経口組成物から、予想外に高いバイオアベイラビリティをもたらす。
【０２４７】
よって本発明は、これまでは収容できなかった（これ自体は予想外の結果である）様々なサイズ及び分子量の分子をカプセル化する手段を提供し、またサイズにかかわらず、本発明の組成物は、従来技術よりはるかに高いレベルの濃度で、細胞内の標的に活性分子を送達できる。従って、本発明に従って患者に投与できる活性化合物の投薬量は、従来の組成物を使用する場合より小さいことが多く、本発明がベースとするものではない標準的な経口投与組成物を用いる場合に必要とされる投薬量の、わずか１％〜５０％、多くの場合は５％〜５０％又は１０％〜２５％である。
【０２４８】
注射と比較した、経口投与後のバイオアベイラビリティ
薬物動態及び特に薬物動態比較において、バイオアベイラビリティは、（通常は経口の）吸収を定量化する手段である。バイオアベイラビリティは、薬物の重要な薬物動態特性の１つである全身循環に到達する変化していない薬物の、投与量に対する画分である。通常、薬物動態比較は、経口投薬後の曲線下面積（ＡＵＣ）、及び同一の静脈内（ＩＶ）投薬後のＡＵＣとして表される。定義によると、医薬を静脈内投与した場合、そのバイオアベイラビリティは１００％である。しかしながら、医薬を他の経路（例えば経口）で投与した場合、そのバイオアベイラビリティは一般に（不完全な吸収及び／若しくは初回通過時代謝によって）低下するか、又は患者間で変動し得る。バイオアベイラビリティは、薬物動態の基本的なツールの１つである。これは、バイオアベイラビリティは、非静脈内投与経路に関する投薬量の算出時に考慮しなければならないためである。
【０２４９】
本出願において、本発明者らは、経口のコレストソームでカプセル化されたインスリンが、いずれの経口送達システムによっても従来観察されたものより驚くほど高いバイオアベイラビリティを有することを示す。追加の実験において、器官及び組織の細胞は、ＦＩＴＣインスリンコレストソームを投与した場合に、何倍も高いＦＩＴＣ濃度を含有する。
【０２５０】
コレストソームは独力で細胞にゆっくりと入る
静脈内投与した場合、カイロミクロン中にないコレストソームは、カイロミクロンと脂質を必要とする細胞との結合に必要とされる表面アポリポタンパク質を有しないため、細胞と結合しない。しかしながら細胞膜は脂肪酸のためのトランスポーターを有しているようであり、これは明らかにコレストソームを取り込む（ＭＣＦ−７細胞のデータを参照）。従ってコレストソームの非経口投与は、トランスポーターに対する親和性を有する特定のコレステリルエステル小胞の、ある程度の細胞内取り込みを実現する。これらの同一のコレストソームを経口投与し、コレストソームがカイロミクロンで覆われた細胞に提示された場合、細胞内取り込みははるかに大きくなる。
【０２５１】
コレストソーム自体が、積載物に無傷のまま、体細胞内に入る
実施例３のＭＣＦ−７細胞の画像から理解できるように、ほとんどの体細胞表面に、小胞の成分として選択されるコレステリルエステルを認識する表面トランスポーターが存在するため、コレストソーム単独からの分子の明らかな細胞取り込みがほとんど常に存在する。
【０２５２】
カイロミクロン中へのＡＰＯ−Ｂ取り込みによる、体細胞との結合
コレストソーム内にカプセル化されてカイロミクロン内に取り込まれた高分子の細胞内送達は、活性分子積載物を含有する積荷積載コレストソームを含有するカイロミクロンが、コレステロール及びトリグリセリドを必要とする細胞と結合して、上記コレストソームを含む上記成分を、エンドソームでのいずれの二次カプセル化も必要とすることなく、細胞内へと移送すると、実現される。本発明者らの見解では、コレストソームでカプセル化された高分子によるエンドソーム形成は依然として発生し得るものの、コレステリルエステルコレストソームの摂取中に進行する通常のプロセスではないようである。
【０２５３】
カイロミクロンはコレストソーム単独よりも細胞取り込みを増幅する
コレストソームは、優先的にカイロミクロンに取り込まれるため、経口的吸収後、明らかにより多い量が細胞に吸収され得るようにする。次いで、カイロミクロンは、それらを必要とする細胞に脂質を選別的に送達する。必要とする細胞は、続いてカイロミクロンの表面上でＡＰＯ−Ｂに連結し得る結合部位タンパク質を発現して、カイロミクロンから細胞の細胞質への結合及び放出を行うようになる。その上、コレストソームから形成されたカイロミクロンは、全ての細胞に到逹する表面上のアポリポタンパク質認識特性を有する。カイロミクロンが細胞と接触する時、表面タンパク質を発現している細胞と結合し、これによりトリグリセリド及びコレステリルエステルを含む脂質の輸送を要請するようになる。リパーゼが細胞から排出された後、トリグリセリド及びコレストソームのような前記脂質が、それらのカプセル化された積載物を含む細胞に取り込まれる。
【０２５４】
対照的に、リポソームが血液に注射される場合、それらは、細胞探索脂質との結合のためのＡｐｏＥ内容物が欠乏しているため、細胞と結合すると予測されない。リポソームは、薬物送達において延長した血漿放出特性を創出するように提供される。更に、リポソーム内のカプセル化された薬物が放出システムを遅延させることが好ましい状況において、遅延放出システムは細胞に入り込むようになり、次いで、それが担持リポソームから遊離された後の薬物特性により積載物の細胞内送達があるものと予測される。
【０２５５】
細胞内でのコレストソームの開梱、細胞応答及びエキソサイトーシス経路
ここでは本発明者らは、コレステリルエステルが細胞膜を通過した後にコレステリルエステルに適用されるコレステロールエステル加水分解酵素について議論する。これは、この酵素の作用は、担体脂肪酸からコレステロール核を分離することであるためである。この酵素がコレステリルエステルに作用すると、高分子はコレストソームから遊離する。送達システムから遊離すると、次のステップは細胞内での薬学的作用である。
【０２５６】
細胞内の遊離ペプチドは代謝され得るため、エキソサイトーシス及び継続的な循環のためにいずれかのペプチドを残したい場合には、この代謝の阻害が必要となる。本発明の実施における、例えばインスリンなどの特定の分子に関して、当業者は、この物質の過剰な細胞内代謝を防止するために、コレストソーム小胞内に代謝の阻害剤を含める必要がある。
【０２５７】
例えば、細胞外作用の生成を目標とする場合、細胞内代謝を停止又は遅延させなければならず、従って細胞は遊離分子のエキソサイトーシスを選択する。これは特にインスリン及びその細胞内代謝に関連する。というのはこれが除去経路であり、細胞は代謝によってインスリンを迅速に除去するためである。
【０２５８】
本発明者らは、プロテアーゼ阻害剤がインスリンの細胞内代謝を停止させることができ、従って遊離インスリンのエキソサイトーシスを促進できることを示すために、実験を行った。
【０２５９】
積荷積載コレストソームの製剤
コレストソームは幾つかのステップで形成されるが、先に選択されたコレステリルエステルをエーテルのような有機溶媒に溶解させた後、有機溶媒を除去し、続いて超音波処理とともにカプセル化する分子を含んでいる水性の構成成分を添加して単層を形成し、水で分子周囲に親水性の比較的帯電されていない中空ポケットを生成する。
【０２６０】
いずれの形成ステップも、エステルの最低溶融温度に基づいた重要な特定の温度の水槽で行われる。選択されたエステル対の溶融温度が、カプセル化のために選択される分子を分解する温度と同一であるか、又はより低くなければならないので、作業温度は、コレステリルエステル対の選択のための１次的な条件である。温度の限界を念頭に置いて、コレステリルエステル対は、４５゜Ｃ未満の温度で二重層膜を形成するように選択しなければならず、これは、本発明の一部として開示される多くの実施例のためのコレステリルミリステート及びコレステリルラウレートの選択のための根拠である。
【０２６１】
図１は、コレステリルラウレート／コレステリルミリステート（１：１モル濃度）コレストソームの３次元モデルを表わす。コレストソームは、広範囲の寸法を有することができる。活性成分の積載は、好ましい実施例で示されるような算出を通じて決定されることができる。
【０２６２】
一旦、水性分子又は構築物が添加されると、濁った溶液が形成されるまで混合物を超音波処理し、単層小胞の形成のためのエネルギーを供給する超音波処理を用いて、未溶解エステルからの廃棄物を最小化する。水性の構成成分もまた、その添加前に標的温度で維持され、大部分のペプチド、タンパク質及び遺伝子について先に言及したように容認し得る最高の温度は、約４０〜５０℃のみである。特定の条件下で、本発明者らは、驚くべきことにインスリンが５５℃まで安定したままであることを見出した。
【０２６３】
次いで、溶液をろ過し、ろ過液を寸法一致（ｓｉｚｅ  ｃｏｎｆｏｒｍｉｔｙ）のための押出しのために残した。次いで、試料を冷蔵庫に保管し、そこで３０日以上安定したままである。
【０２６４】
新たにカプセル化された分子を単層コレステリルエステル小胞で取り囲み、中空ポケットの内部では、カプセル化された分子を消化管の苛酷な環境との接触から保護し、酵素及び免疫係細胞から遠く保持されるようにした。内部の分子は、帯電されないまま残っている。したがって、本発明による積荷積載コレストソームの提供は、容易であり、平坦な作業である。
【０２６５】
コレステリルエステル小胞構造（図１）
コレストソームの外膜は、一般的に複数のコレステリルエステルが同一であるか、又は類似した分子長を有した場合、コレステリルエステルベースの脂質小胞を形成するように配列されるコレステリルエステルからなり、前記コレストソームによりカプセル化される高分子の周囲に均一なカプセルを形成する。コレステリルエステルは、共に可溶性である限り、異なる長さで存在することができるが、これは、それらがともに凝集するように許容して、脂質小胞の全体寸法に比べて比較的大きな中空コアを有した小胞を形成するようになる。実際に、一部の構造配置は、全体小胞の８０％を超えてコア変位（ｃｏｒｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を有しており、インスリンのような水溶性分子の有益な高水準の積載を提供する。
【０２６６】
これは、小胞の形成が、コレステリルエステルの性質及びそれらの相対的モル分率によって決定される最小エネルギー配置で共存及び凝集することができる異なるエステルの差等モル分率の能力に基づいている。
【０２６７】
図１には分子、この場合はインスリン周囲の小胞のアセンブリの図が示されている。ここで、鎖は円形形式に配置されており、中性又は弱いマイナスの電荷を有した中空中心を形成する（ゼータ電位の測定は、各開示された製剤に対する実施例に示されたように、このような特性を定義するために行われた。コレストソーム単独では、−１４のゼータ電位読出値を有する）。
【０２６８】
コレストソーム内部のインスリンでは、それのゼータ電位が、更にマイナスとなる。コレストソームのカプセル化製剤は、リポソームと対照的に、高い正電荷を有しないが、ここでゼータ電位は、一部の実験で＋７６程度の範囲であり得る。
【０２６９】
本例示及びその他の例示において、コレステリルエステルは、共に可溶性である限り、異なる長さを有することができ、これは、それらが共に凝集するように許容して、単層小胞を形成するようになる。これは、小胞の中空コアが、コレステリルエステルの性質及びそれらの相対的モル分率によって決定される最小エネルギー配置で共存及び凝集することができる異なるエステルの差等モル分率の能力に基づいている。
【０２７０】
コレストソームのアセンブリを考慮し、図２と同様に３Ｄ略図を参照すると、ステロール核が空洞の内部と表面の外部の両方に向けてコレストソームマトリックスの内部及び外部が構造的に同一であるという過程が先ず考慮される。
【０２７１】
コレステリルエステルの選択により、技術者による変更の対象となる1つの特性は、エステル末端の長さである。より短い末端の長さを有するほど、ステロール核は互いにもっと近くなり、（鎖長によって）小胞の疎水性はより減少する。これは、コレストソームの親水性を強化する影響力を有することができる。これはモデルになり得、例示が図２〜６に示されている。
【０２７２】
更に、鎖長とは関係なく、脂質小胞の内部コアの同一の充填を仮定すると、より大きな分子周囲のより短い鎖は、分子対脂質の質量対質量の比率を増加させる。明らかに、より大きな分子はより大きな内部コアを必要とし、よって、エステル鎖長は、モノクローナル抗体のようなより大きな分子を収容するするためのより大きなコレストソームの構築に重要である。
【０２７３】
これらの考慮事項に対してバランスを取ることは、内部コアの相対的な親水性に対するエステル鎖長に影響される。より長いエステル鎖は疎水性を増加させ、より多い疎水性分子がコアに充填されるようにする。
【０２７４】
溶媒と相互作用するマトリックスコレステリルエステルの相互作用の論題もある。エチルアルコールを含む水性溶媒合剤は、カプセル化プロセスを全般的に補助し、固定された比率のコレステリルエステルでカプセル化される量を増やすものである。これは、構築物の電荷及びコレストソームの内部コアの電荷の影響である。
【０２７５】
例えば、オキシステロールの結晶構造において、エチルアルコールのようなアルコールを含むことによる溶媒比率の変化は、酸素分子が互いにより近づけられるように補助し、これは、コレストソームにおいてエステル配列を補助することができ、また分子がコレストソーム小胞のコアにより容易に入り込むように補助する。
【０２７６】
そのような相互作用のモデリングにおいて、本発明の発明者は、コレステリルエステルマトリックス構造体のモデルを試すことができ、どのエステルが特定の分子又は薬物のための最善の選択になるかを予測することができる。エステル、電荷、溶媒及び分子の間の相互作用を同時に考慮する時、システム的な接近が可能である。
【０２７７】
表２において、大部分のコレステリルエステルで作業の時、コレストソーム小胞の生成の間の温度範囲は、３５℃〜４５℃である。小胞を調製する間には、温度が一定に（＋／−５℃）維持される。温度は、任意の個別のエステルの溶融温度未満に維持される。例えば、ミリステート／ラウレートを用いたコレストソーム調製のためには、温度が最適には４０℃＋／−５℃に維持される。超音波処理前、混合成分への少量の界面活性物質又は帯電イオンの追加は、開示されるように、コレストソームの全体の収率を増加させ、そしてより均一な粒子の生成を促進する。
【０２７８】
超音波処理時間は、１０分〜３０分の範囲である。そのような時間は、一定の範囲で提示されるが、ここで遠心分離時間が可変的である。最適の超音波処理時間は、超音波処理器における最適の超音波処理地点を捜し出す能力によるものであり、最適の時間に溶液は濁る外観を形成し、固体物質の量が、その時点で目視による決定時、最小にならなければならない。
【０２７９】
請求されるろ過技術は、最初の寸法選別のための真空ろ過、及び引き続き、より精巧な寸法選別のための製剤の押出しを含む。
【０２８０】
標的に対する粒子寸法の影響力
コレストソーム成分の混合物は、高分子構成成分のイオン及び物理化学的特徴によって新規な方式で異なる。積荷積載コレストソームの寸法は、しばしば特定のコレステロールエステルでの標的に影響を与え、コレストソームに形成される時、特定の分子送達、したがってエステル鎖長の影響についてより良好に適合される。
【０２８１】
特定の実施形態では、医薬組成物は、約１００〜約７５０ｎｍ、好ましくは約２２５〜約２７５ｎｍ、より好ましくは２５０ｎｍ程度の直径を有した単層小胞である。ＤＬＬＳ測定値は、５０ｎｍ〜１、０００ｎｍ超の範囲の直径を有した小胞を示す。小胞のサイズは、特定の高分子内容物、製造のために選択されたコレステリルエステル、並びに製造中の温度及び超音波処理条件によって影響を受ける。最終寸法は、適切な細孔径及び超音波処理時間の制御とともに、その他の調製パラメータでの選択的押出しにより設定されることができる。
【０２８２】
電荷及び分子パターンがコレストソーム寸法にどのように影響を与えるか
より大きな正味の正電荷を有するより大きな分子は、最適のカプセル化にもっと長い鎖長を必要とするが、条件は、カプセル化プロセスの間に溶融温度がカプセル化される分子の安定性と両立できるという点である。より低い正味の正電荷を有するより小さな分子は、もっと短い鎖長のコレステロールエステルにカプセル化することができる。本発明によってコレステリルエステルに基づいた脂質小胞を提供するためのコレステリルエステル鎖長の調整は、十分にありふれた技術の範囲内である。
【０２８３】
上記コレストソームの表面は、構成成分のバランス及び混合物の特徴により滑らかであうか、或いは粗くてもよい。小胞表面の特徴は、エステル自体だけではなく、エステル間の相互作用によるものである。予測されることは、エステルが分子の相互作用を最適化し、それらの間のホール又は空間を最小化するように凝集することである。したがって、そのような配列は、多分粗い表面を提供する。
【０２８４】
本開示内容の図において、大部分のグラフィック例示が粗い構造配置を有するが、これは、エステルがそれ自体で配列されて、構造構成成分が小胞の表面上で交互嵌合され、平坦ではない（粗い）構造配置を提供するからである。一部の場合、エステルがそれ自体で配列され、一定の形態及び規模の（滑らかな）表面を提供したりもする。
【０２８５】
最終表面構造配置の性質は、用いられるエステルの組み合わせ及び製剤でのそれらの相対的濃度に左右される。要約すると、エステルの選択及び分子の選択のいずれも脂質小胞の最終配列に影響を与える。様々な構成成分が表面の構造配置に影響を与える一方、それ自体で腸細胞による吸収を可能とする新規な表面特性である中性表面は、最終の製剤において選択された分子の電荷の総体的影響であるはずである。表面はいつも中性でなければならない。
【０２８６】
形成されたコレストソームの特性及び提示される例示
驚くべきことに、より大きな正味の正電荷を有するより大きな分子が、最適のカプセル化のためにもっと長い鎖長のコレステリルエステルを必要とする。
【０２８７】
タンパク質及びペプチドのようなより大きな水溶性高分子と用いるのに好ましいコレステリルエステルは、Ｃ８−Ｃ１４の飽和又は不飽和脂肪酸、多くの場合にカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸からなる群から選択される脂肪酸のエステル化（又は対応するコレステリルエステルを提供する関連のプロセス）によって作られるものである。
【０２８８】
コレストソームを形成するための１つ以上（好ましくは２つ以上）のコレステリルエステルの混合は、様々な送達特性を有した異なる規模の活性分子を収容することができる。
【０２８９】
図１は、ラウリン酸コレステリル／ミリスチン酸コレステリル（１：１モル濃度）コレストソームの３次元モデルを示す。ここで複数の実施例において示される小胞は、２５０ｎｍ〜１０，０００ｎｍ（３５０ｎｍ〜１０，０００ｎｍ、５００ｎｍ〜１０，０００ｎｍ、７５０ｎｍ〜１０，０００ｎｍ、１，０００ｎｍ〜１０，０００ｎｍ、１，２５０ｎｍ〜７，５００ｎｍ、１，５００ｎｍ〜６，５００ｎｍ、７５０ｎｍ〜５，０００ｎｍ、１０００ｎｍ〜５，０００ｎｍ）のサイズとなり得るため、コレストソームは広範なサイズを有することができる。
【０２９０】
活性成分の積載量は、本開示の方法を用いて作られる小胞内の脂質重量に対する親水性重量の測定によって測定できる。成分の積載量は、実施例１及び２で開示されるもののような物理的測定及び算出によって決定してもよい。
【０２９１】
後続する実施例は、図２〜６の方式で細胞膜を通過するより多くのコレストソーム製剤を示すが、実際にコレストソームが腸細胞に吸収された後、損傷することなくカイロミクロンを通過する時、細胞内部への送達ははるかに大きくなる。より多くの細胞内浸透を説明するこのような実施例がまた提示される。
【０２９２】
コレストソームのカイロミクロンへの積載
ゴルジ体によるコレストソーム及びその分子積載物のカイロミクロンへの積載は、Ｃａｃｏ−２の頂端側再測定、及び側底側でカイロミクロンに回収される量から残存する量を差し引くことにより立証されるような、定量的なもの考えられる。従って、コレストソームに対するＣａｃｏ−２細胞の親和性は非常に高いものと思われる。実施例３において実証されるように、Ｃａｃｏ−２細胞は、頂端側に位置する利用可能なコレストソームの全てを側底側のカイロミクロン中へと除去する。従って、１つ以上の活性分子をカプセル化するために用いられるコレステリルエステルの早期の選択が、本発明の実施の重要なステップであり、本開示の技術を注意深く適用することにより、当業者は、腸細胞を通ってカイロミクロン中に、そして体細胞中にペプチドを積載できる。
【０２９３】
用語「薬学的に許容される」とは、投与される対象に許容不可能な毒性ではない本発明の化合物の塩形態、又はその他の誘導体（例えば、活性代謝物又はプロドラッグ形態）、又は担体、添加剤或いは賦形剤を意味する。
【０２９４】
本発明の製剤中の構成成分
本発明の製剤は、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又はアジュバントを含むことができる。許容可能な製剤は、好ましくは、採用される投与量及び濃度において受容者に無毒性である。薬学的製剤は、例えば、組成物のｐＨ、滲透性、粘度、透明度、色相、等張性、安定性、溶解又は放出速度、吸収又は浸透を変更、維持又は保存するための物質を含むことができる。適合した製剤材料には、限定でないが、以下のものが含まれる：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）；抗菌物質；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又はナトリウム亜硫酸水素塩）；バッファ（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又はその他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトール又はグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデクストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデクストリン）；フィラ；単糖類、二糖類、他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；着色剤、風味剤及び賦形剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量のポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトール又はソルビトール）；懸濁化剤；界面活性物質又は湿潤剤（プルロニック、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビタンエステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０及びとポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎは、本発明の実施例で用いられる；Ｔｗｅｅｎは、押出しステップの前にエマルジョンの収率を改善するために用いることができる；Ｔｗｅｅｎは、脂質への追加より前に、あるいは脂質に水性製剤に添加することができ、その後、水分を加える。可能な限りの最小量のＴｗｅｅｎを用い、これは、１００ｍｌの水分中で約１００マイクロリットル未満である。トリトン、トリメタミン、レシチン、コレステロール、又はチロキサポール）；安定性向上剤（例えば、蔗糖又はソルビトール）；等張性強化剤（例えば、アルカリ金属ハライド、好ましくは、ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール又はソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は製薬アジュバント。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ参照。
【０２９５】
最適の薬学的製剤は、例えば、意図する投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて、当業者が決定することができる。例えば、上記で言及したＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ参照。これらの製剤は、物理的状態、生体内放出速度、及び本発明の抗体の生体内除去速度に影響を与えることができる。
【０２９６】
薬学的製剤中の１次的なビヒクル又は担体には、限定でないが、非経口投与用組成物に通常用いられるその他の物質を補充することができる注射用水、生理学的食塩水溶液、又は人工脳脊髄液が含まれる。中性緩衝化食塩水又は血清アルブミンを混合した食塩水が、追加の例示のビヒクルである。薬学的製剤は、およそｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又はおよそｐＨ４．０−５．５のアセテート緩衝液を含むことができ、これは、更にソルビトール又は適切な代替物を含むことができる。本発明の薬学的製剤は、所望の純度を有した選択された組成物を、選択的剤形化剤（上記で言及したＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照）と混合して、凍結乾燥したケーキ又は水溶液の形態で保存用に調製されることができる。
【０２９７】
ひいては、製剤は、スクロースのような適切な賦形剤を用い、凍結乾燥物として剤形化することができる。
【０２９８】
製剤構成成分は、投与部位に許容可能な濃度で存在する。緩衝剤は、有利には、組成物を、通常約５〜約８のｐＨの範囲である生理学的ｐＨ、又はより低いｐＨに維持するために用いられる。
【０２９９】
本発明の薬学的製剤は、非経口的で送達することができる。非経口投与が考慮される場合、本発明に用いるための治療製剤は、発熱物質のない、非経口的に許容可能な水溶液の形態で存在することができる。製剤は、所望のイムノミセルの剤形を伴い、これは、その後蓄積注射を通じて送達することができる製品の制御又は徐放型放出を提供することができる。ヒアルロン酸のある製剤は、循環時、持続期間を強化する有効性を有する。
【０３００】
本発明による製剤は、吸入用に剤形化することができる。そのような実施形態では、不可視のコレストソーム−分子製剤が吸入用乾燥粉末として剤形化されるか、又は吸入溶液がまた、例えば、噴霧化によるエアゾル送達のための推進体を用いて剤形化することができる。肺への投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記述し、本願に参考文献として含まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５に追加に記載されている。
【０３０１】
製剤は、皮膚に対する局所適用のために剤形化することができる。そのような実施形態では、不可視のコレストソーム−分子製剤が軟膏又はクリームに剤形化され、皮膚表面に適用される。
【０３０２】
本発明の製剤は、消化管を通じて、例えば、経口的に送達することができ、これは、投与の好ましい経路を示す。そのような薬学的に許容される組成物の調製が本願に開示されており、当業界に属する。その様式で投与される、本願に開示された製剤は、錠剤及びカプセルのような固体投薬形態のコンパウンディングに通常用いられる担体の存在又は不在下で剤形化することができる。カプセルは、生物学的利用能が最大化され、予備全身分解が最小化された時、消化管内の地点で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。酸では安定であるが、十二指腸のｐＨ（約５．０〜約６．０又はそれより高い）では、分解可能な腸溶コーティングが好適であり得る。追加の薬剤が、吸収促進のために含まれていてもよい。希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物性オイル、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤がまた採用されてもよい。
【０３０３】
製剤は、錠剤の製造に適合した無毒性賦形剤との混合物で、有効量のコレストソーム、最も好ましくはコレストソーム製剤及び本願に開示された医薬組成物のうち分子を伴う。錠剤を滅菌水又は他の適切なビヒクルに溶解させることにより、溶液は、単位−投与量形態で調製され得る。好適な賦形剤には、限定でないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸塩、ラクトース又はリン酸カルシウム；又は結合剤、例えば、澱粉、ゼラチン又はアカシア；又は潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクが含まれる。
【０３０４】
生体内投与に用いる医薬組成物は、一般的に滅菌性である。特定の実施形態では、これは、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって実現することができる。特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される時、その方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再建の以前に、或いは以後に行うことができる。特定の実施形態では、非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態、又は溶液で保存することができる。特定の実施形態では、非経口組成物は、一般的に滅菌接近ポート、例えば、皮下注射針で貫通可能な栓のある静脈内溶液バック又はバイアルを有した容器に位置する。
【０３０５】
一旦、本発明の製剤が剤形化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体又は脱水又は凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに保存することができる。そのような製剤は、即時使用形態又は投与前に再建される形態（例えば、凍結乾燥された形態）で保存することができる。
【０３０６】
本発明の製剤の投与経路は、経口、静脈内、腹膜内、大脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路による注射；徐放型放出システム又は移植装置によるものを含む。薬学的製剤は、大量注射によって又は注入によって、連続的に又は移植装置によって投与することができる。医薬組成物はまた、所望の分子が吸収又はカプセル化される膜、スポンジ又は他の適切な物質の移植によって局所的に投与することができる。移植装置が用いられる場合、装置は、任意の適合した組織又は臓器に移植又は局所的に適用することができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性巨丸剤又は連続的投与を通じたものであり得る。
【０３０７】
消化管における酸及び／又は酵素分解からの分子積載物の保護
コレストソームエステル小胞自体が２〜１４の範囲のｐＨ値で損なわれずに存在することとは対照的に、リポソームは同一条件で迅速に分解されて、本発明による組成物に比べて相対的に不安定である。不安定な積載物を備えて調製されたコレストソームは、その積載物の内容物が消化管における分解から保護されなければならない場合に、腸を標的にした外側の層でコーティングされることがあり、積荷積載コレストソームが十二指腸（コレストソームを取り込んだカイロミクロンを提供する腸細胞の消化管部位）に到逹するようになる。
【０３０８】
インスリン及びその他タンパク質／ポリペプチドのような積載物は、酸に不安定であり、酸又は酵素分解に対する潜在性のある生体内システム又は動物に使用する前に適用されなければならない、コレストソーム内のインスリン保護用の腸溶コーティングの追加ステップを必要とする。当分野の実施における一般的な状況において、コレストソームの内容物が酸に不安定なペプチド及びタンパク質である場合、更に、そのような製品が経口摂取用製剤にカプセル化されるコレストソームである場合、胃腸内の酸からコレストソームの内容物を保護する腸溶コーティングを有した最終の投与製品が存在しなければならない。ほとんどの場合、十二指腸でのコレストソームの放出後、十二指腸において酵素分解又は胆汁塩を介したサポニン化の可能性があって、胆汁塩、膵臓リパーゼ及び膵臓エステラーゼとの接触時、個別のコレストソームの安定性の研究が行われる必要がある。したがって、タンパク質又はペプチドが酸分解から自由なものと明確に立証されるまで、或いは立証されない限り、剤形は、コレストソーム構築物で充填された後、ｐＨ５．５〜６．０で内容物を放出する腸溶コーティングでコーティングされている小型カプセルとなる。そのような目的に適合したコーティングは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（６４、６５）又は酸に安定であるが、Ｅｕｄｒａｇｉｔ重合体と類似した分解特性を有する他の腸溶コーティングになるものであり、コレストソームがそれ自体で低いｐＨで安定であっても、酸分解からコレストソームの内容物を保護するために、当業界において公知された腸溶コーティングを採用する必要がある。
【０３０９】
本願で用いられたように、「腸溶コーティング」は、約５．０から７．０〜約７．６（上記範囲において、好ましくは約５．０〜約６．０又はそれより多く）の範囲未満のｐＨで実質的に不溶性であり、限定でないが、ポリ（ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）で安定化されたｄｌ−ラクチド−コ−グリコリド、キトサン（Ｃｈｉ））、脂質、アルギン酸塩、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、酢酸セルローストリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸塩（ＨＰＭＣＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、カラーコン（ｃｏｌｏｒ  ｃｏｎ）、フードグレーズ及びヒドロキシプロピルメチルセルロース及びエチルセルロースの混合物、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、シェラック、メタクリル酸とエチルアクリル酸塩の共重合体、及びメチルアクリル酸塩モノマーが重合される間に添加されるメタクリル酸とエチルアクリル酸塩の共重合体からなる群から選択される１つ以上の組成物である様々な物質を含むことができる。
【０３１０】
高分子がコレストソームに取り込まれると、この産物はカプセル内に配置されることになる。このカプセルは、コレストソーム組成物の意図した放出部位に応じて、腸溶コーティングを施されていてもいなくてもよい。例えば、胃の酸に対してコレストソーム組成物を保護し、ｐＨ５．５付近において放出するために、上記カプセルに腸溶コーティングを施してもよい。コレストソームの癌免疫療法における使用に関する、ここで適用される第２の例としては、施された腸溶コーティングは、ｐＨ値７．３〜７．６の回腸内でコレストソームを放出する。
【０３１１】
腸溶コーティングは、水若しくは好適な有機溶媒中でのポリマーの溶液を用いて、又は水性ポリマー分散液を用いて、パンコーティング又は流動層コーティングなどの従来のコーティング技法によって上記カプセルに適用できる。別の実施形態として、それぞれ別個の組成物を内包し、順次放出するように設計された、カプセル内の複数のカプセルに対して、放出制御型腸溶コーティングを適用できる。上記放出の好ましい実施形態は、ｐＨ５．５の十二指腸での外側カプセル標的放出、及びｐＨ７．３〜７．６の回腸での内側カプセル放出である。例えば、放出制御型層のための好適な材料としては、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとの共重合体）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ（アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとの共重合体）、セルロース誘導体、例えばエチルセルロース水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）、ＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）などが挙げられる。
【０３１２】
本発明のこれらの態様及び他の態様を、以下の限定でない実施例において更に説明する。
【０３１３】
本出願の限定でない実施例
実施例１．段階的：コレステリルエステル小胞の調製及び試験
コレステリルエステル小胞の調製
この実施例は、本明細書において開示されるようにインスリンである分子の最終的な経口使用のためのコレステリルエステル小胞の調製における複数のステップを示す。当業者であれば、わずかな実験で、これらの条件がＧＬＰ−１アゴニストペプチドと共に使用するのに好適であることを理解するだろう。最終的に得られる、経口薬物分子、経口タンパク質、経口ペプチド、経口遺伝子又は遺伝物質の核酸構築物（本実施例においてこれ以降、用語「分子」は、これらのうちの１つ又は全てを定義するために使用される）のカプセル化のための小胞は、以下のようにして調製できる：
１．精製コレステリルエステル、及びカプセル化のための組成物要素を得る；
２．カプセル化の標的分子を得て、純度及び３７℃〜５５℃での安定性に関して予備試験する；
３．エステルと分子との間の相互作用のコンピュータモデルを用いて、小胞混合物中のコレステリルエステルの成分を最適化することにより、上記分子の最大小胞積載量を実現する；
４．任意で、小胞カプセル化分子を調製し、顕微鏡検査を含む生物学的研究の実施のためにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識を含める（上記ＦＩＴＣ標識は、ヒトの試験又は治療用途を目的とした製品の成分ではない）。
【０３１４】
小胞の形成での使用が考えられるコレステリルエステル及び分子の研究
この実施例は一般に、ペプチド、タンパク質及び遺伝子のカプセル化のためのコレステリルエステルの調製に適用され、上記ペプチド、タンパク質及び遺伝子の大半は、５５℃未満の温度で小胞に積載する必要がある。カプセル化分子が安定でなくなるため、この温度を超えることはできず、従って本発明の実施において使用するためのコレステリルエステルの選択は、製剤中での液体形態のコレステリルエステルの使用に大きく依存している。候補コレステリルエステルの選択における複数のステップは、以下の通りである。
【０３１５】
各エステルの融点を決定する。例えば、コレステリルミリステートは、６５℃の溶融転移温度を有しており、その温度を超えると、固体構成成分が溶融する。
【０３１６】
製剤目的は、多くのタンパク質及びペプチドが約４０℃以上の温度で変性し始めることを考慮した、リポソーム調製物と一致する、融点未満の温度におけるコレステリルエステルの使用であった。
【０３１７】
選択されたミリスチン酸及びラウリン酸エステルに対して更なる温度試験を実施した。ロータリーエバポレーター内で有機溶媒を脂質から完全に除去した後、ＤＳＣを実施したところ、２つの融点が示され、第１のものはおよそ６０℃であり、第２の融点はより高い温度であり、典型的には８０℃であった。このステップは、個々の成分の溶融物には反映されず、有機溶媒を除去した後の、１；１のモル比の脂質の組織の安定性の試験を反映している。
【０３１８】
これらの知見に基づき、例えばインスリンを含む、製剤化されるタンパク質及びペプチドの安定性を考慮して、カプセル化手順の作業温度は４０〜５５℃に維持された。インスリンは、この範囲の温度にわたって安定していることが示された。例えば最適なインスリン調製物は、３７〜５５℃であった。
【０３１９】
分子のカプセル化のための、Ｃ６〜Ｃ２２のコレステリルエステルの対と、組成物との選択
カプセル化小胞の適切な形成のための特定のコレステリルエステルの選択は、新規接近法及び電算化された分子モデリングを伴う。コレステリルエステルの特性及びカプセル化のための標的分子と、分子周囲のエステルから形成された小胞の中空コア内部との間の相互作用が、体積対体積基準又は重量対重量基準の積載のような好ましいコレストソーム−分子特性の定義に用いられる。
【０３２０】
カプセル化に利用できる小胞の関連容積は、エステルの鎖長に応じる。小胞全体の直径は、実験条件、例えば超音波処理で供給されるエネルギに応じて修正される。しかしながら上記関連容積は内半径によって決定される。内半径は、対を成している成分のうちの一方の成分のステロール核に対する、対の他方のメンバーのステロール核の長さによって決定される。内半径は、小胞の外半径と、選択されて対をなすエステル対の長さとの間の差である。内半径の長さは、鎖長が増大するに従って減少する。鎖長の増大により、エステル壁の疎水性が高まる。外側のステロール核と内側の露出したステロール核とは、鎖長が増大するに従って互いから離れる。
【０３２１】
最適なカプセル化のためにエステル対を選択する際、カプセル化される分子の電荷／双極子及びサイズを含む複数の要素を考慮する必要がある。次にこれを、鎖長の関数としての、壁内でのエステルの静電分布と比較する。そして、水性環境での分子との静電的適合性に基づいてエステル対を選択する。
【０３２２】
コレストソームの製剤
ａ）コレストソームは、短鎖〜長鎖のコレステリルエステルを用いて形成できる。本発明者らは本明細書において、Ｃ６〜Ｃ２２の範囲の具体例を有している。
ｂ）コレストソームは、２ＣＨ２単位を超える差を有するコレステリルエステル対を用いて形成できる。
ｃ）クロロホルム及びエーテルを含む選択された上記エステル対の可溶性の関数として選択される有機溶媒による、脂質成分中でのエステル対の可溶化を使用できる。
ｄ）これらのエステル対は、異なるサイズの小胞を形成でき、薬物／分子を細胞内へと搬送できる。
ｅ）エステルの分子画分は変化し得る。
ｆ）有機溶媒が除去される温度は、これもまたエステルのモル比に応じて、及び大半の用途において極めて重要な形成剤である溶媒に応じて、４０〜６５℃とすることができる。
ｇ）エステルの可溶化は、異なる量の有機溶媒を使用できる。
ｈ）製剤プロセス：
１）（様々なサイズの）丸底（ＲＢ）フラスコに所望の質量の各エステルを加え、適当な量の有機溶媒を加える。
２）ＲＢフラスコをロータリーエバポレーターに取り付け、所望の温度の水浴中に配置し、２０分間回転させる。
３）真空を印加して有機溶媒を除去する。
４）有機溶媒が除去されたら、所望の温度の水浴中にあった水性成分を加える。
５）２０分にわたって超音波処理する。
６）ろ過を行い、脂質及びろ液（調製物）を回収する。
７）透析、ろ過などの方法で、カプセル化されていない薬物を除去する。
【０３２３】
図１Ｂ、表３は、短鎖、中鎖及び長鎖脂肪酸コレステリルエステルの混合物の試験の結果をまとめたものであり、後続の図は、ＭＣＦ−７細胞に対するこれらのコレステリルエステル小胞の影響を示す。
【０３２４】
２ＣＨ２単位だけ異なる２つの短鎖（Ｃ６／Ｃ８）の混合物
図２では、コレストソームは、１：１のモル比で混合された、２ＣＨ２単位だけ異なる２つの短鎖コレステリルエステル、即ちカプリル酸コレステリル（Ｃ６）及びカプリン酸コレステリル（Ｃ８）を組み合わせることによって、作られた。この組み合わせから得られたコレストソームは、エーテル中で調製した場合に３５０ｎｍの平均サイズを有し、またＦＩＴＣをこれらのコレストソームに組み込むと、緑色蛍光により、これらが細胞に入ったことが示された。
【０３２５】
４ＣＨ２単位だけ異なる２つの長鎖（Ｃ１８／Ｃ２２）の混合物
図３では、コレストソームは、１：１のモル比で混合された、４ＣＨ２単位だけ異なる２つの長鎖コレステリルエステル、即ちステアリン酸コレステリル（Ｃ１８）及びベヘン酸コレステリル（Ｃ２２）を組み合わせることによって、作られた。この組み合わせから得られたコレストソームは、クロロホルム中で６５℃において調製した場合の３９２ｎｍから、エーテル中で５５℃において調製した場合の３８９９ｎｍまでのサイズを有し、またＦＩＴＣをこれらのコレストソームに組み込むと、緑色蛍光により、これらが細胞に入ったことが示された。
【０３２６】
１０ＣＨ２単位だけ異なる混合物（Ｃ１２／Ｃ２２）
図４では、コレストソームは、１：４のモル比で混合された、１０ＣＨ２単位だけ異なる２つのコレステリルエステル、即ちラウリン酸コレステリル（Ｃ１２）及びベヘン酸コレステリル（Ｃ２２）を組み合わせることによって、作られた。この組み合わせから得られたコレストソームは、クロロホルム中で６５℃において調製した場合に１５００ｎｍの平均サイズを有していた。ＦＩＴＣをこれらのコレストソームに組み込むと、緑色蛍光により、これらが細胞に入ったことが示された。
【０３２７】
８ＣＨ２単位だけ異なる混合物（Ｃ１４／Ｃ２２）
図５では、コレストソームは、４：１のモル比で混合された、８ＣＨ２単位だけ異なる２つのコレステリルエステル、即ちミリスチン酸コレステリル（Ｃ１４）及びベヘン酸コレステリル（Ｃ２２）を組み合わせることによって、作られた。この組み合わせから得られたコレストソームは、クロロホルム中で６５℃において調製した場合に６９０ｎｍの平均サイズを有していた。ＦＩＴＣをこれらのコレストソームに組み込むと、緑色蛍光により、これらが細胞に入ったことが示された。
【０３２８】
２ＣＨ２単位だけ異なる混合物（Ｃ１４／Ｃ１６）
図６では、コレストソームは、１：１のモル比で混合された、２ＣＨ２単位だけ異なる２つの中鎖コレステリルエステル、即ちミリスチン酸コレステリル（Ｃ１４）及びパルミチン酸コレステリル（Ｃ１６）を組み合わせることによって、作られた。この組み合わせから得られたコレストソームは、クロロホルム中で調製した場合に１８９０ｎｍの平均サイズを有し、またＦＩＴＣをこれらのコレストソームに組み込むと、緑色蛍光により、これらが細胞に入ったことが示された。
【０３２９】
１２Ｃ：１４Ｃコレストソーム対照の調製：
５ｍＬのＰＢＳ緩衝液を１５ｍＬ遠心分離チューブに加え、水浴中で５５℃まで加熱した。８０．０ｍｇのミリスチン酸コレステリル及び７５．０ｍｇのラウリン酸コレステリルを１００ｍＬの丸底フラスコ（ＲＢＦ）に加え、５ｍＬのジエチルエーテル（ＤＳＣ及び相図構成によって決定された１：１のモル比）で可溶化した。続いて、１５５．０ｍｇのコレステリルエステル及びジエチルエーテルを内包するＲＢＦを、５５℃に予熱したＢｕｃｈｉ  Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−３システム内に保持した。エステルを、速度設定４の低真空に２０分間曝露し、溶媒を除去した。次に、真空封止を解放した後でＲＢＦを取り出した。予熱した５ｍｌのＰＢＳをＲＢＦ中のエステルに加え、５５℃に予熱したＳ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｏｎｉｃｏｒ又はＥｌｍａｓｏｎｉｃ  Ｐ内で２０分にわたって超音波処理した。コレストソーム溶液を、４０ｕｍＦａｌｃｏｎセルストレーナーを通して、遠心分離チューブ内へとろ過し、４℃で保管した。
【０３３０】
コレストソームの積載量算出のための仮定及び手順
小胞内の分子の積載量は、ＨＰＬＣで決定される最終製剤中の脂質の質量、顕微鏡検査及びＤＬＬＳによって決定される小胞の平均サイズ、並びに調製物の水性成分の開始濃度を含む複数のパラメータの分析後に、決定される。
【０３３１】
本発明の典型的な実施において、二重層モデル中のエステル体積は、全体積に対してわずかなパーセンテージとなる。
全体の直径（ｎｍ）は、複数の実験条件に応じて可変である。
エステル二重層の幅は２．５ｎｍであるため、総体積から内部体積を引いたものが、脂質が占める体積と等しいものとする。
よって外層の半径−２．５ｎｍが内層の半径である。
カプセル化される体積の算出のステップは、以下の通りである：
ａ）ＤＬＳ又は顕微鏡検査を用いて粒子の直径を測定する。
ｂ）直径を２で割ることにより、外半径を算出する。
ｃ）該半径をＲｏｕｔとする。
ｄ）Ｒｉｎ＝Ｒｏｕｔ−２．５ｎｍである。
ｅ）エステル（球形粒子と仮定する）が占有する体積を算出する。
４／３＊ｐｉ＊［（Ｒｏｕｔ）３−（Ｒｉｎ）３］＝エステルが占有する体積。
ｆ）ＳＹＢＹＬを用いて算出された個々のエステルの体積は６４０．４５オングストローム３であり、立方ナノメートルに換算すると．６４０ｎｍ３である。
ｇ）ステップｅ）から得られた、エステルが占有する体積を、個々のエステルの体積で割って、コレストソーム中のエステルの総数を算出する。
ｈ）１つのエステルの質量を算出する：まず、ミリスチン酸分子及びラウリン酸分子の平均質量を得る。ミリスチン酸コレステリルに関して、ＭＷ＝５９７．００９２であり、ラウリン酸コレステリルに関して、ＭＷ＝５６８．９５６０であるため、平均＝５８２．９８ｇ／モルである。次に、１つのエステルの質量＝５８２．９８ｇ／モル÷６．０２２Ｅ＋２３エステル／モル＝９．６８０８８０１０６２７６９８４ｅ−２２ｇ／エステルを得る。これに、ステップｇ）のエステル数／コレストソームを掛けて、１つのコレストソームの質量を得る。
ｉ）コレストソームの大半は、活性薬剤を内包した内側コアである。
ＨＰＬＣ法に基づいて、調製物中の脂質の質量を決定する。脂質の合計質量を得て、これをステップｈ）から得られた１つのコレストソームの質量で割って、コレストソームの数を決定する。
ｊ）カプセル化される分子が占有する体積である、内側コアの体積を決定する。Ｖｉｎｎｅｒ ｓｐｈｅｒｅ＝４／３＊ｐｉ＊（Ｒｉｎ）３
ｋ）ｎｍ３で表されたコレストソームの体積をｍｌに変換する。
１ｍｌ＝１ｃｍ３
１０６ｃｍ３＝１ｍ３
１０２７ｎｍ３＝１ｍ３
ｌ）ステップｋ）から得られた体積に、ステップｉ）から算出されたコレストソームの数を掛ける。
ｍ）これが、調製物の体積当たりの、カプセル化体積である。
ｎ）ステップｍ）から得られたカプセル化体積に、製剤中の水性分子の開始濃度を掛ける。これにより、脂質の質量当たりの調製物の体積に対する、物質のカプセル化される質量が与えられる。
【０３３２】
実施例２．インスリンのためのコレステリルエステル組成物
コレストソーム中のインスリンの薄膜調製物に関するステップ及び方法
この実施例は、最終的な経口用途のためにコレステリルエステル小胞内にカプセル化されたインスリンの調製における複数のステップを示す。具体例として、微生物中で作られたヒト組み換えインスリン（Ｐｒｏｓｐｅｃ  ｌａｂｓ（イスラエル））コレストソームが、実施例１において好ましいものとして開示したエステルからのコレステリルエステルの選択により、実施例１に記載されているような本発明の方法で調製された。当業者であれば、わずかな実験で、また異なる複数の分子の特性をわずかに調整するだけで、これらの条件がＧＬＰ−１アゴニストペプチドと共に使用するのに好適であることを理解するだろう。最終的に得られる、経口薬物分子、経口タンパク質、経口ペプチド、経口遺伝子又は遺伝物質の核酸構築物（本実施例においてこれ以降、用語「分子」は、これらのうちの１つ又は全てを定義するために使用される）をカプセルする小胞は、ここで開示されるようにして調製できる。
【０３３３】
インスリンを内包するコレストソームの複数のバッチを、モル比１：１の２つのコレステリルエステル、即ちミリスチン酸コレステリル及びラウリン酸コレステリルの最適化された混合物を用いて調製した。組成に関するコレステリルエステルの選択は、積載量の算出によってインスリンに関して最適化された、実施例１で開示された化合物から行われる。
【０３３４】
これは限定を意味するものではないが、合理的な実験を行うと、インスリン又は同様の分子を用いた製剤のためのコレステリルエステルの好適な対は他にも存在し、これらは本発明の実施において許容される。
【０３３５】
インスリンを含む最適なコレストソーム製剤の特定の調製において、任意のコレステロールエステルをコレストソームの成分として選択してもよく、これらは、コレストソーム製品の最終ゼータ電位がその中性の又はわずかに負の表面電荷を保持している限り、本発明の範囲内とすることができる。実施例１で開示されている原理を用いてインスリンに対して選択された２つのエステルは、ミリスチン酸コレステリル及びラウリン酸コレステリルであり、これらはエステル鎖長が２ＣＨ２単位だけ異なり、また本開示のように組み合わせた場合に、本方法で調製されたコレストソーム小胞に対して大きな内部親水性中心を提供する。この対は、脂肪酸の鎖長の中央にある。鎖長が短い小胞ほど疎水性が低いこと、及び２ＣＨ２単位より大きいコレステリルエステルからのコレストソーム形成の顕著な特性を考慮すると、他の鎖長も同様に機能し得る。
【０３３６】
特定のコレステリルエステルの量を最適化することは、生体内使用のためのインスリン含有コレストソームの最適な積載及び放出プロファイルを提供する目的のために、完全に本発明の範囲内である。
【０３３７】
初期の開始条件は、ラウリン酸／ミリスチンの１：１モル比に基づくが、多様なインスリン分子の製剤における最終比率はこれに限定されない。各インスリン分子は、それ自体の構造、及び最適な積載のためのコレステリルエステルの最終的な選択の手段として推定されるコレステリルエステルとの分子相互作用に関して、検査する必要がある。最適な最終製剤が、疎水性がより高い領域を必要とする場合には、より長鎖の脂肪酸エステルが使用される。これは、疎水性空間の全体の比率はアルキル鎖の長さに基づいて変化するためである。特定のインスリン分子に関して、更に中央に集中した親水性構造が必要な場合、その目的は、脂肪酸とのエステルにされた、２５ヒドロキシ、７−ケト又は他のヒドロキシコレステロールなどのオキシステロールのうちの１つを使用することである。
【０３３８】
カプセル化分子はインスリンであり、これは、レギュラーインスリン、ＮＰＮインスリン、インスリングラルギン、インスリンデグルデク、又はインスリンの効果の試験において生物活性を有するように調製され、かつそれが示された、インスリンのいずれかの製剤を含むが、これらに限定されない。コレストソーム製剤の調製における複数のステップは、以下を含んでいた。
【０３３９】
適切な温度（３７〜５５℃）の水浴を調製する；ＰＢＳ中の水性インスリン調製物（８ｍｇ／ｍｌ）を水浴に入れ、温度を平衡させる；等モル量のラウリン酸コレステリル及びミリスチン酸コレステリル（それぞれ７５ｍｇ）を計量し、丸底フラスコに入れる；有機溶媒（ジエチルエーテル）を加えてエステルを溶解させる；手で振り混ぜて溶解させる；丸底フラスコをロータリーエバポレーターに入れ、５分間回転させる；ロータリーエバポレーターに取り付けられたフラスコを水浴に入れる；真空を印加し、１０分間回転させる；ロータリーエバポレーターをオフにし、丸底フラスコに水を加える；任意でＴｗｅｅｎを加える；水浴中において、ロータリーエバポレーター（真空なし）で２０分間回転させる；濁った調製物が形成され、最小量の固体脂質だけが丸底フラスコ内に残るまで、１０〜３０分にわたって超音波処理する；超音波処理から取り外し、真空ろ過を用いてろ過する；濁ったろ液を保存する；任意でろ液を押し出す；使用まで調製物を冷蔵庫に保管する。
【０３４０】
冷蔵庫内では、製剤１１１７は図７に示すように少なくとも１８週間にわたって安定していた。
【０３４１】
粒径のＤＬＳ分析を、ＮＩＣＯＭＰ  ３８０  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅｒ  （Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）を用いて実施した。製剤１１１７に関する上記ＮＩＣＯＭＰの出力のサンプルを図８に示す。２つの粒径分布が存在し、一方は平均２０８ｎｍ、もう一方は平均１１９１ｎｍであった。
【０３４２】
インスリン−コレストソームの代替的な調製
インスリン−コレストソームはまた、丸底フラスコ内での脂質層の形成を行わずに調製された。この調製は、８．０ｍｇ／ｍｌのインスリン溶液を内包する１５ｍｌ反応容器を用いて、本発明者らによって行われた。５ｍｌのインスリン溶液を、脂質のエーテル溶液をゆっくりと注入しながら、３７℃の水浴超音波処理機内に保持し、連続的な真空を印加してエーテルを除去した。１０〜２０分間の超音波処理後、ここでは非常に濁った反応混合物を、真空から取り出して、粒径を画定するため及び凝集物を除去するために処理した。Ｔｗｅｅｎ２０をこの混合物に加えることにより、凝集物を減少させ、また遠心分離によるカプセル化されていないインスリンの分離を促進した。この調製により、凝集物が少ない多量のカプセル化インスリンが得られ、また薄膜ステップを必要とすることなく、１時間以内に３００Ｕを超えるインスリンがカプセル化された。
【０３４３】
薄膜法を用いたコレステリルエステル小胞の調製における、ｐＨ及びインスリン可溶性
コレストソームインスリンの多数の調製を行った。これらのデータを検討すると、ｐＨは、調製に使用したインスリンの積載量及び潜在的な可溶性に影響を及ぼすようであった。従って、インスリンの可溶性限界を、ｐＨ３、５、６、７及び８において経験的に試験した。図９では、各製剤の脂質含有量に関するデータを、ＰＢＳ緩衝液の２つの異なるイオン強度において、インスリン溶液のｐＨによってプロットした。
【０３４４】
試験した各ｐＨにおける最大濃度を以下に適用した：
各ｐＨ及びイオン強度の組み合わせに関して、原材料溶液を調製した。経験的に決定された最大濃度のヒト組み換えインスリン（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＰｒｏＳｐｅｃ）を、上記原材料溶液に加えた。次にこれらの原材料溶液を、必要に応じて１Ｍ  ＨＣｌ又は１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、所望のｐＨに再調整した。５．０ｍｌの原材料溶液を５５℃に加熱し、調製物の水性成分として用いた。
【０３４５】
インスリン−コレストソームを、薄膜脂質層を用いて調製した。
１５．０ｍＬのＣｒｙｓｔａｌｇｅｎ遠心分離チューブ内の、予熱した５．０ｍＬの１×ＰＢＳを、エステル溶液に加えた。水性混合物の超音波処理を、Ｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｓｏｎｉｃｏｒ（ニューヨーク州ウエストバビロン）で実施した。超音波処理は２０分間行われ、丸底フラスコを５分毎に９０°回転させた。
【０３４６】
２０分後、事前に計量したＦａｌｃｏｎセルストレーナーを用いて、コレストソームを元の１５．０ｍＬのＣｒｙｓｔａｌｇｅｎ遠心分離チューブに戻し、これを標準的な冷蔵庫で保管する。事前に計量した丸底フラスコを、３７℃に設定されたＶＷＲ乾燥ユニットに入れる。１５．０ｍＬのＣｒｙｓｔａｌｇｅｎ遠心分離チューブ、及びＦａｌｃｏｎセルストレーナーの最終的な重量を、使用の２４時間後に記録して、脂質の量に関するおおよその％収率を算出する。脂質コレストソームの特性決定及び分析は、動的レーザ光散乱（ＤＬＬＳ；ＮａｎｏＢｒｏｏｋ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ホルツビル））及び高速液体クロマトグラフィ、即ちＨＰＬＣ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ２０２０  ＬＣ−ＭＳ、島津製作所（日本、東京））を利用して行う。
【０３４７】
コレストソームのサイズ：
酸性ｐＨ（３、５及び６）では、サイズはイオン強度の上昇と共に増大する。反対に、塩基性ｐＨ（８）におけるコレストソームのサイズは、イオン強度の低下と共に減少する。ｐＨ（７）のコレストソームのサイズは、図９及び１０に示すように、イオン強度に影響されない。
【０３４８】
カプセル化効率（Ｅ．Ｅ．）
ｐＨ（６〜８）の製剤のＥ．Ｅ．は、より高いイオン強度において最大化される。ｐＨ（３及び５）のコレストソームのＥ．Ｅ．は、図１１に示すように、１×ＰＢＳのイオン強度を用いて最大化される。
【０３４９】
ｐＨ（８）のコレストソーム：
インスリンの可溶性はｐＨ８．０において高く、コレストソーム内にカプセル化される濃度は、塩基性ｐＨ（８）において、イオン強度が上昇するほど高くなる。残念なことに、ＨＰＬＣ分析により、図１３に示すように、ｐＨ（８）環境はインスリンＡ／Ｂ二量体を破壊し、これらの製剤が好ましくないものとなることが示された。
【０３５０】
ｐＨ（３〜４）のコレストソーム：
カプセル化されるインスリン濃度は、高い及び低いイオン強度において最大化される。反対に、脂質濃度は、図１１〜１３に示すように、中央イオン強度において最大化される。
【０３５１】
結論：
カプセル化されるインスリンは、試験したイオン強度範囲にわたって最大であり、またｐＨ８．０におけるインスリンの不安定性により、ｐＨの範囲にわたって比較的一定の脂質取り込み及びサイズパラメータが存在したため、ｐＨ３〜４での製剤の生産が好ましい実施形態である。
この研究で使用したｐＨ３のインスリン製剤（１１１７）は、実施例４で実証されるように、マウスにおいて経口バイオアベイラビリティを示した。
【０３５２】
凝集物を除去するための反応混合物の処理
１０〜２０分にわたる反応混合物の超音波処理後、反応混合物を界面活性物質（インスリンに関する好ましい実施形態では任意でＴｗｅｅｎ２０）で処理し、混合して遠心分離した。添加された界面活性物質は、遠心分離及び第１の上清（カプセル化されなかったインスリン）の除去後に反応混合物が均質に分散したままとなるように反応混合物を調整するために使用された。反応混合物が均質に分散されたことが観察され、また顕微鏡検査により、粒子が均一に分散しておりかつ凝集物が少ないことが示されると、混合物は、インスリン−コレストソーム含有反応混合物から未カプセル化インスリンをろ過分離するための準備ができた状態となった。
【０３５３】
インスリン−コレストソーム混合物からの未カプセル化インスリンの除去
界面活性物質を使用する場合、インスリンコレストソームを遠心分離によって界面活性物質から分離してもよい。この時点でインスリンコレストソームは凝集物を含まず、一般に、ＰＢＳ中に均一に分散させて、使用まで冷蔵庫で保管できる。しかしながら、混合物中の遊離インスリンを、ろ過又は透析によって更に除去してもよい。
【０３５４】
ろ過は、０．４５ｕ親水性ＰＶＤＦ滅菌フィルタを用いて、カプセル化されなかった過剰なインスリンを除去した。この混合物をフィルタ上で洗浄したあと、フィルタから分離して、洗浄済み製品インスリン−コレストソームとして使用するために保管した。フィルタ分離により、インスリン原材料溶液の更なる使用が可能となった。一部の調製物は、中性ｐＨの１×ＰＢＳに対して３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析チューブを用いて透析して、未カプセル化インスリンを除去した。ｐＨ３の１×ＰＢＳ中で得られた調製物も透析したが、０．５×及び２．０×ＰＢＳ中のｐＨ３の調製物は、０．４５ｕ親水性ＰＶＤＦ滅菌シリンジフィルタを用いてろ過した。ろ過された材料を逆流によって回収した。
【０３５５】
凝集物及び粒径の顕微鏡検査
反応混合物の初期サイズ決定を、粒径５００ｎｍ〜５０００ｎｍの粒子を効果的に可視化する暗視野顕微鏡検査によって実施した。図１４のような、凝集物が光学顕微鏡下で視認可能であるインスリン製剤の画像を提供する。更に多量の界面活性物質を使用するための試料の更なる処理は、図１４に示すように、粒子のサイズを変化させずに凝集物を減少させる。図１５には、平均サイズおよそ１．７マイクロメートル（１．６〜１．８の範囲）の界面活性物質分散インスリン−コレストソーム粒子分布を示す。図１６に示すような、更に高倍率の粒子の画像が存在し、ここでは、粒子が外半径及び内半径で構成されることを理解できる。以下の「積載量算出」において詳述するように、内側コア及び外側膜の内容量を算出して、粒子積載量を定義するために使用できる。これらの粒子の更なる分析により、図１７に示すように、これらの粒子は走査電子顕微鏡検査に供された。ここでは、中心に大きな親水性コアを有するコレステリルエステル粒子の性質が、はるかに容易に可視化される。以下の計算の通り、この粒子のコアは粒子の内容量の５０％超であり、以下のインスリンに関して提示される実施例では、コアは全小胞の内容量の６９％を示す。
【０３５６】
インスリン−コレストソーム：２０００ｎｍ小胞の積載量を定義する計算
これらの計算は、実施例２のように調製されたコレストソームインスリンに関するものである。インスリンの調製物水溶液は、８ｍｇ／ｍｌの開始インスリン濃度を有すると仮定する。
ＨＰＬＣは、調製物（ラウリン酸コレステリル及びミリスチン酸コレステリルの合計質量）中の１ｍｇ／ｍｌの脂質を測定すると仮定する。
測定された小胞の直径は２０００ｎｍである。
外半径＝Ｒｏｕｔ＝１０００ｎｍ
内半径＝Ｒｉｎ＝１０００ｎｍ−２．５ｎｍ＝９９７．５ｎｍ
Ｒｏｕｔ３＝１，０００，０００，０００ｎｍ３
Ｒｉｎ３＝９９２５１８７３４．４ｎｍ３
エステルの体積＝４／３＊ｐｉ＊（１，０００，０００，０００−９９２５１８７３４．４）＝３１３２１５６５ｎｍ３
エステルの数＝３１３２１５６５／０．６４０＝４８９３９９４５．８
１つのコレストソーム中のエステルの質量＝（４８９３９９４５．８）＊（９．６８００×１０−２２）＝４．７３７×１０−１４グラム＊１０００ｍｇ／１グラム）＝１つのコレストソーム中に４．７４７×１０−１１ｍｇのコレステリルエステル
脂質含有量のＨＰＬＣ測定から１ｍｇ／ｍｌの脂質を仮定する。
１ｍｇ／（４．７４７×１０−１１）＝２．１×１０１０、１ｍｌ中のコレストソームの数。
【０３５７】
内容積の算出
４／３＊ｐｉ＊（Ｒｉｎ）３＝４／３＊ｐｉ＊（９９２５１８７３４．４ｎｍ３）＝４１５５３４５１０１ｎｍ３
ｍｌに変換
（４１５５３４５１０１ｎｍ３）＊（１ｍ３／１０２７ｎｍ３）＊（１０６ｃｍ３／１ｍ３）＊（１ｍｌ／１ｃｍ３）＝コレストソーム当たり４．１５５×１０−１２ｍｌ
（２．１×１０１０）＊（４．１５５ｘ１０−１２）＝調製物１ｍｌ当たり、カプセル化体積．０８７ｍｌ
８ｍｇ／ｍｌ＊（．０８７）＝．６９８ｍｇインスリン／調製物（ｍｌ）
調製物１ｍｌ当たり脂質１ｍｇ；従ってこの例での質量は、６９．８％のカプセル化に関して、調製物１ｍｌ当たり．６９８ｍｇインスリン／１ｍｇ脂質である。
【０３５８】
この技術の実際の応用において、全粒径に対してインスリン２５重量％〜約９６重量％、ほとんどの場合２５重量％〜８０重量％という積載範囲が、本発明の範囲内である。
【０３５９】
最終収率：直径１５００ｎｍ〜３０００ｎｍの小胞からなる調製物１ｍｌ当たりインスリンおよそ２０単位の濃度
カプセル化インスリンを含むコレストソームの構造の例
図１にモデル化して示されており、かつ図１６に透過ＥＭで示されているのは、一例としての、カプセル化インスリン（製剤１１１７）を含む積載済みコレストソーム構造モデルである。これらの理想的な脂質粒子は凝集して脂質の塊となり、この塊のそのままの状態での生成サイズは約１０００〜５０００ｎｍであることが想定される。本発明者らは、１０００ｎｍ〜３０００ｎｍの粒径が細胞内への巨大分子（例えばインスリン）の積載のために良好に機能し、また哺乳類において経口バイオアベイラビリティを有することを発見したが、これらの大型粒子を均一なサイズの２５０ｎｍの粒子に押出成形することも、好ましい実施形態である。これは、当該技術分野において公知の標準的な高圧押出成形デバイスを用いて実施できる。
【０３６０】
実施例３．コレストソームでカプセル化されたペプチド、タンパク質及び遺伝物質に関する生体内細胞試験方法
細胞試験方法の概要
腸細胞による取り込み及びカイロミクロン中への取り込みは、この目的のために発明された上記小胞が示す高い経口バイオアベイラビリティの主要な構成要素である。この実施例は、コレステリルエステルの選択によって伝えられる細胞取り込み及びカイロミクロン取り込み特性を試験する生体内手段に対する、（実施例２からの）インスリンコレストソームの調製及び投与のステップを詳述する。この試験システムは、腸細胞モデルシステムで開始され、この目的のためには、上記腸細胞モデルシステムはここではＣａｃｏ−２細胞単層であり、これにより、カプセル化分子を有するコレステリルエステル小胞は、Ｃａｃｏ−２細胞膜を通過するために使用された後、カイロミクロンに取り込まれ、これは、ＭＣＦ−７細胞を用いてＣａｃｏ−２細胞から回収された側底流体中で測定できる。
【０３６１】
上記分子（例えばインスリン）のコレステリルエステル小胞カプセル化の後、及び上記ＦＩＴＣ標識分子（例えばインスリン）のコレステリルエステル小胞カプセル化の後に行われるステップは、以下の通りである：
１．Ｃａｃｏ−２細胞単層中のＦＩＴＣ標識分子を試験し、２４時間後に、側底流体中のカイロミクロンカプセル化ＦＩＴＣ−コレストソーム分子を回収し、コレストソーム積載済みカイロミクロンに取り込まれたものと定義する；
２．試験細胞（例えばＭＣＦ−７細胞）をカイロミクロン含有ＦＩＴＣコレストソーム分子に曝露し、これらの試験細胞によるＦＩＴＣ分子の取り込みを決定する。使用の容易さ及び癌との関連性のためにＭＣＦ−７細胞が選択されることが多いが、作業を行う者は、多くの生物活性分子の細胞内取り込みが新規のものであり、薬物送達の分野の従来技術から予期されていないものであるため、細胞を標的とすることが科学的研究の対象である場合には、多くの異なる細胞株を取り込みに関して試験を行うことを認識するであろう；
３．顕微鏡を用いて、細胞内ＦＩＴＣ分子がエンドソームに内包されるか、又は細胞質中で遊離しているかを決定する。早期の時点（２時間、４時間）では、細胞全体にわたるＦＩＴＣの均一な分布が示され、これはエンドソームステップがないことを示す。エンドソームの撮像に関して典型的な、比較的遅い時点は、初期曝露のおよそ２４時間後であり、エンドソームは４８時間時点、及び更には７２時間時点において可視化できるが、これらの遅い時点までには、エキソサイトーシスによって、大半の細胞がエンドソームＦＩＴＣ標識内容物を除去している；
４．ＧＬＵＴトランスポーターのウエスタンブロット発現を用いて、分子の細胞内作用が、細胞内分子の作用によって制御される追加の物質又は分子の細胞表面を介した取り込みとして発現されるかどうかを決定する。
【０３６２】
Ｃａｃｏ−２細胞培養
Ｃａｃｏ−２腸管上皮細胞を、（熱で不活性化した）２０％のウシ胎児血清、１ｎＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２９２μｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、及び１×ＭＥＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１１４０）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞を７５ｃｍ２のフラスコ内で培養し、３７℃及び５％ＣＯ２環境で、８０〜９０％コンフルエントになるまでインキュベートした。Ｂｉｏｃｏａｔ  ＨＴＳ  Ｃａｃｏ−２アッセイシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ、＃３５４８０２）を輸送研究に使用した。細胞を３×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、製造元のプロトコルを用いて、腸細胞様細胞に分化させた。このシステムは、このプロセスに通常必要な２１日ではなく３日で分化した単層を確立するために、特別な原線維コラーゲンインサートと、酪酸、ホルモン、成長因子及び代謝産物で強化された血清非含有分化培地とを使用した。これは、成長段階を確立するための播種後に、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ系培地を用いた、３７℃、５％ＣＯ２での４８時間の細胞のインキュベーションを伴っていた。次に培地を、規定の分化培地と交換して、更に４８時間インキュベートした。この時点で、Ｃａｃｏ−２細胞は更なる研究の準備ができた状態となる。
【０３６３】
Ｃａｃｏ−２細胞によるカイロミクロン生産
分化Ｃａｃｏ−２細胞を、Ｌｕｃｈｏｏｍｕｎ及びＨｕｓｓａｉｎ−１９９９（２１）による方法を用いたカイロミクロンの生産に使用した。この方法は、カイロミクロン生産を実現するために、１．６：１．０ｍＭの比のオレイン酸（ＯＡ）及びタウロコール酸（ＴＣ）の補充を用いる。ＯＡ：ＴＣ溶液は、ＯＡを１０ｍＭのＴＣ溶液に加え、３７℃で透明になるまでインキュベートすることによって、ＢＩＯＣＯＡＴ分化プロトコルで使用されるＤＭＥＭ系細胞成長培地中で調製された。次にこれを０．２ｕでろ過し、すぐに輸送研究に使用した。処理及びＯＡ：ＴＣを、ウェルの頂端側に４５０ｕｌの体積で添加し、輸送研究及びカイロミクロン生産のために２４時間インキュベートした。ＰＢＳ及び１ｍｇ／ｍｌのグルコースを、側底側に１ｍｌの体積で添加した。Ｃａｃｏ−２単層の緊密な結合の完全性の評価を、１００ｍＭのＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。上記細胞単層を、１００ｕｌ／ウェルの溶解緩衝液で溶解させ、３７℃で１０分間インキュベートした。全ての試料を測定まで４℃で保管した。頂端、側底及び細胞ＦＩＴＣ−インスリンの蛍光レベルを、ＬＳ４５ルミネッセンス分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて決定した。
【０３６４】
カイロミクロンレベルを、ヒトＡｐｏＢ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、＃ＳＴＡ−３６８）を用いて評価した［１６］。ヒトＡｐｏＢ−１００標準液を等分して−２０℃で保管し、他の全ての成分は４℃で保管した。１０×洗浄緩衝液濃縮物を脱イオン水で１×まで希釈し、均質になるまで撹拌することによって、１×洗浄緩衝液を調製した。抗ＡｐｏＢ抗体１：１０００及び二次抗体１：１０００を使用直前に試験希釈液で希釈することによって、抗ＡｐｏＢ抗体及び二次抗体を調製した。希釈された一連のヒトＡｐｏＢ−１００標準液を、試験希釈液中において０〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で調製した。第１の標準試験管は、２ｕＬの５０ｕＬ／ｍＬヒトＡｐｏＢ−１００標準液及び１９９８ｕＬの試験希釈液を内包していた。残りの７個の標準試験管は、上述の標準液５００ｕＬに５００ｕＬの試験希釈液を加えることによって調製した。側底側血清を採取し、４℃において１０００ｇで１０分間遠心分離した。上記血清は、ＥＬＩＳＡの実行直前に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２０，０００倍に希釈する必要があった。１００ｕＬのＡｐｏＢの未知サンプラー標準液を、抗ＡｐｏＢ抗体コーティングプレートに添加し、各ＡｐｏＢ未知試料、標準液及びブランクを２回複製した。次に上記プレートを２時間にわたって３７℃でインキュベートした。マイクロウェルストリップを、１ウェル当たり２５０ｕＬの１×洗浄緩衝液で３回洗浄した。そしてこれらのウェルを空にし、マイクロウェルストリップをペーパータオル上で軽く叩いて、過剰な洗浄緩衝液を除去した。続いて１００ｕＬの希釈済み抗ＡｐｏＢ抗体を各ウェルに加え、オービタルシェーカー上で１時間にわたって室温でインキュベートした。次にウェルを、上述のように３回洗浄した。そして、１００ｕＬの希釈済み二次抗体を各ウェルに加え、再びオービタルシェーカー上で１時間にわたって室温でインキュベートした。ウェルを再び３回洗浄した。基質溶液を室温に加熱し、１００ｕＬの基質溶液を、ブランクを含む各ウェルに加えた。プレートを再び、オービタルシェーカー上で、反応が完了するまで室温でインキュベートした。１００ｕＬの停止溶液を、ブランクウェルを含む各ウェルに加えることによって、反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、一次波長として４５０ｎｍを用いて、分光光度計を用いて読み取った。
【０３６５】
トランズウェルでのＣａｃｏ−２研究、及びカイロミクロンの形成
図１８は、トランズウェルプレートの基本的な設定を示すものであり、上記トランズウェルプレートは、Ｃａｃｏ−２細胞の単層を横断する物質の通過を示すために設計されている。コレストソームインスリン及び他のコレステリルエステル調製物の場合、本発明者らは、Ｃａｃｏ−２細胞による取り込みと、これに続く、Ｃａｃｏ−２細胞のカイロミクロンへの、無傷のコレステリルエステルの挿入とを試験する。これは当該技術分野において新規のＣａｃｏ−２細胞単層の使用である。これは、Ｃａｃｏ−２細胞は上述の条件下でカイロミクロンを生成することが公知であるためである。
【０３６６】
この技術の実施において、本発明者らは、細孔サイズ０．４μｍの１２ウェルフォーマットのＣｏｒｎｉｎｇトランズウェル透過性支持体を採用する。本発明者らは、Ｃａｃｏ−２細胞が７５ｃｍ２フラスコ内で８０〜９０％コンフルエントとなった後で、各トランズウェル実験を開始する。細胞を通例に従ってトリプシン処理し、血球計数器を用いて計数した。細胞の濃度は、培養培地で２×１０５細胞／ｍＬに調整した。トランズウェルプレートのウェルに０．５ｍＬの細胞希釈物を播種した。体積１．５ｍｌの培地を側底側に添加した。細胞を上述のようにインキュベートし、１９〜２０日間にわたって、培地を１日おきに交換した。この時点でＣａｃｏ−２細胞は分化し、処理の準備ができた状態となる。トランズウェルプレートの上側及び下側チャンバからの全ての培地を除去し、両チャンバを、１ｍｇ／ｍＬのグルコースを含有するＰＢＳ（ＰＢＳＧ）で３回洗浄する。ＰＢＳＧをプレートの上側及び下側チャンバに添加し、１時間インキュベートする。全てのＰＢＳＧを両チャンバから除去し、グルコースを添加したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＧ）１．５ｍＬを下側チャンバに添加した。
【０３６７】
Ｃａｃｏ−２細胞単層の頂端側である上側チャンバは、０．５ｍＬの適切な処理（ＰＢＳＧ単独、ＰＢＳＧ中のＦＩＴＣコレストソーム、又はＰＢＳＧ中のＦＩＴＣ−インスリンコレストソーム）を受ける。全てのウェルは、グルコース１．０ｍｇ／ｍＬという最終濃度を有する。次にプレートを２時間インキュベートする。全ての溶液を除去し、Ｚｅｉｓｓ共焦点ＬＳＭ５１０顕微鏡で観察する。
【０３６８】
２時間にわたって頂端側にＦＩＴＣインスリンコレストソームを適用した後の、側底流体の撮像により、側底流体試料中において、ＦＩＴＣ−インスリンを含有する全体的に比較的大型のカイロミクロンが優勢であることが示される。この流体は側底流体の回収後に撮像されており、調製物全体にわたる顕微鏡検査を反映したものではないことに留意することが重要である。従ってこれらのＦＩＴＣインスリン含有カイロミクロンは明らかに、Ｃａｃｏ−２細胞によって形成された。
【０３６９】
Ｃａｃｏ−２細胞を横断するＦＩＴＣ−インスリンｖｓＦＩＴＣ−コレストソームインスリン
頂端膜を横断して側底側表面においてカイロミクロンとして排出されるプロセスを追跡するために、Ｃａｃｏ−２細胞装置の頂端側に配置した２４時間後に、ＦＩＴＣ−インスリン及びＦＩＴＣ−コレストソームインスリンのＦＩＴＣシグナルを比較した。図１９に示すように、トランズウェルの頂端側に配置された未カプセル化ＦＩＴＣ−インスリンのほぼ１００％が、２４時間後にそこに残っていた。これは、ＦＩＴＣ−インスリンに関するＦＩＴＣシグナルの約１％のみがＣａｃｏ−２細胞で見出され、ＦＩＴＣ−インスリンに関するＦＩＴＣシグナルの１％未満が側底層で記録されたことが図１９で確認できるため、結論付けられる。またこの発見は、遊離インスリンがＣａｃｏ−２細胞を効率的に通過できないことを裏付けている。
【０３７０】
図２０は、ＦＩＴＣ−インスリン−コレストソーム混合物が遊離インスリンを依然として含有している場合に発生するように、コレストソーム中のＦＩＴＣ−インスリンの５０％が頂端側にあるままである場合の計数を示す。本発明者らはこれを、Ｃａｃｏ−２単層を横断する側底流体への通過に関する、最悪の場合のシナリオと呼ぶ。
【０３７１】
図２１は最良の場合を示しており、ここでは、頂端側のＦＩＴＣ−インスリン−コレストソームの全てがコレストソーム内にカプセル化され、その全てが側底流体へと通過する。本発明の実施及び製品の試験において、凝集物の問題により、本発明者らのＦＩＴＣ−インスリンコレストソーム調製物の大半にある程度の遊離ＦＩＴＣインスリンが生成される。よって実際のケースはおそらく、最悪の場合におけるＣａｃｏ−２の５０％の通過と、最良の場合における１００％の通過との間となる。これは、マウス及びラットの両方においてこれ以降で示されるバイオアベイラビリティに非常によく似ている。遊離インスリンの存在により、測定が複雑になる。最終的な分析は、側底層の流体から、ＦＩＴＣ−インスリンからのほとんど追跡できないＦＩＴＣシグナルを示し、これは、ＦＩＴＣ−コレストソームインスリンが細胞を通って輸送される能力を有する一方で、遊離インスリンがＣａｃｏ−２細胞を迂回できないことのエビデンスを更に支持する。
【０３７２】
全般的に見れば、頂端側に配置されたＦＩＴＣ−インスリンコレストソームの少なくとも約５０％は、２４時間後には側底側にあった。ＦＩＴＣ−インスリン−コレストソーム調製物の一部、約８１％は、実際には遊離ＦＩＴＣ−インスリンであり、カプセル化されていなかったため、これは控えめな推定であると考えられる。Ｃａｃｏ−２細胞を通って移動する間に、ＦＩＴＣ−コレストソームインスリンがカイロミクロンに組み込まれるようになることは明らかである。
【０３７３】
このデータは、遊離インスリンが、Ｃａｃｏ−２細胞を通って輸送される能力を有しないことを裏付けており、これは哺乳類種における遊離インスリンの極めて低いバイオアベイラビリティと一致する。
【０３７４】
しかしながら、インスリンをコレストソーム中にカプセル化すると、インスリンをＣａｃｏ−２層を横断して輸送できた。これは、コレステリルエステル小胞にカプセル化されたインスリンが、消化系から出て血流中へと輸送される潜在的な能力を有し、この血流中でインスリンが抹消細胞へと輸送され得ることを示しているため、重要である。
【０３７５】
ＭＣＦ−７細胞の培養
ＦＩＴＣを含む及び含まないインスリンコレストソーム調製物は、定期的な試験のために細胞株を必要とした。本発明者らはこの目的のためにＭＣＦ−７細胞を選択した。これは、これらは容易に成長し、また標準的な細胞株の多くの特徴を有するためである。
【０３７６】
ＭＣＦ−７上皮乳癌細胞を、ＡＴＣＣから得た。１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、１ｎＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕのペニシリン、１００Ｕのストレプトマイシン、２９２ｕｇ／ｍｌのグルタミン、及び１０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、細胞を成長させた。細胞単層を７５ｃｍ２フラスコ中で、加湿された３７℃、５％ＣＯ２環境に維持した。最適な成長条件を提供するために、培地を４８〜７２時間毎に交換した。その後、ＥＶＯＳ  ＦＬ細胞撮像システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を分析した。
【０３７７】
ＭＣＦ−７細胞に積載されたコレストソームＦＩＴＣインスリン
ＦＩＴＣインスリンコレストソームをＭＣＦ−７細胞の細胞培養培地に積載し、インキュベートして、細胞内に輸送できたインスリンの量を決定し、またその取り込みの時間経過を追跡することによって、初期ＭＣＦ−７細胞研究を実施した。
【０３７８】
図２２は、ＦＩＴＣ−コレストソームインスリンの積載の２４時間後の、ＭＣＦ−７細胞の位相差及び蛍光画像を示す。フレームＡは暗視野画像を示し、フレームＢは蛍光を示す。ＦＩＴＣインスリンコレストソームは細胞全体に顕著に拡散しているが、フレームＢ全体にわたって多くの小球状エキソサイトーシス小胞も確認できる。これらの少なくとも一部は、ＦＩＴＣインスリンを依然として無傷のまま含有する。これは、ＦＩＴＣインスリンコレストソームの経口投与後、長期間にわたって、マウス血漿中でＦＩＴＣインスリンが検出されるためである。
【０３７９】
均一な緑色の光であるＭＣＦ−７細胞の蛍光は、十分な数のＦＩＴＣ−コレストソームインスリン小胞が細胞内に輸送され、コレステリル小胞のための膜トランスポーターを支持することを示す。これは重要な発見であった。これは、これは、コレストソームインスリン自体が２４時間にわたってインスリンを細胞へと十分に送達すること、及びコレストソーム内でのＦＩＴＣインスリンの取り込みが、カイロミクロンステップを伴わずに発生することを示すためである。更に、この時間経過の早期の時点は、エンドサイトーシス小胞を全く示さない。よって、ＦＩＴＣインスリンコレストソームの細胞取り込みが、エンドサイトーシスのエビデンスを全く伴うことなく、細胞質内で遊離したＦＩＴＣインスリンの放出につながることのエビデンスが存在する。実際には、ＦＩＴＣ標識の分布は、細胞エキソサイトーシスが始まる約時間まで、均一のままである。
【０３８０】
時間経過研究により、ＭＣＦ−７細胞の蛍光のピークが約１８時間の時点で見られることが示された。しかしながら、経口送達時、コレストソームインスリンはまず、インスリンを送達するために、ＭＣＦ−７細胞によって模倣される末梢細胞に到達する前に腸壁を迂回する必要がある。従ってこの実験の次のステップは、コレストソームインスリンをＣａｃｏ−２細胞表面に配置することであった。これは、カイロミクロン中へのコレステリルエステル小胞の吸収及び配置の腸細胞プロセスを模倣するものである。次に、カイロミクロンの積載物を含む側底流体を、カイロミクロンからコレステリルエステルを受け取る際のＭＣＦ−７細胞中への予想される流入（コレストソームの経口使用の効果の模倣）に関して試験してもよい。
【０３８１】
ＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロン積載ＭＣＦ−７細胞
カプセル化ＦＩＴＣ−インスリンを含有するコレストソームを、市販のＦＩＴＣ標識レギュラーインスリンを用いて、本明細書中に開示されているように調製した。Ｃａｃｏ−２細胞を用いて、コレストソームが腸細胞を通して無傷のインスリン（即ちインスリンはコレストソーム内にあるままである）を移送してカイロミクロンに入ることを保証し、その後カイロミクロンはＣａｃｏ−２膜の側底側で検出された。ＥＬＩＳＡを用いて、酸保護インスリンが頂端Ｃａｃｏ−２障壁を通過しない（＜５％）こと、及び側底側の全てのインスリンがカイロミクロン内にあることを実証した。インスリン単独では腸細胞障壁を通過しないこと、及びそれにもかかわらずコレストソーム中のＦＩＴＣインスリンはＣａｃｏ−２腸細胞障壁を通過することを確認するために、ＦＩＴＣ−インスリンを頂端側で使用した。これらの実験から、吸収効率を、インスリンの側底側含有量と頂端側含有量との間の差として決定した。更なる実験により、コレストソームでカプセル化されたインスリンに対するｐＨの変更及び胆汁塩の効果を比較した。更に、コレストソームに積載されたインスリンを含有する場合のカイロミクロンの安定性を定量し、積載済みコレストソームからインスリンを生体内で放出するために必要な条件を研究した。
【０３８２】
図２３では、ＦＩＴＣインスリン調製物を、ＭＣＦ−７細胞に隣接する培地内に配置して、細胞への取り込みを実証した。この画像は上記構築物を培地に添加した２時間後に撮影された。図２２は、未カプセル化ＦＩＴＣ−インスリン（列Ａ）、ＦＩＴＣ−コレストソームインスリン（列Ｂ）、及びカイロミクロン中のＦＩＴＣ−コレストソームインスリン（列Ｃ）の、ＦＩＴＣ−インスリンをＭＣＦ−７細胞中に送達する能力を比較する。全ての列は、最初に暗視野画像、中央に蛍光画像を有し、最後の画像は暗視野画像に対する蛍光画像のオーバレイである。
【０３８３】
この実験では、ＭＣＦ−７細胞のＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロン積載量は、ＦＩＴＣ−インスリン単独による積載量（列Ａ）と比較してほぼ１０００倍大きかった（列Ｃ）。カイロミクロンステップを用いずに与えられるＦＩＴＣインスリンコレストソームによる列Ｂでは、中程度であるものの検出可能である積載量が存在した。図２３全体を通して、２時間の時点では、視認可能なエンドソーム、及び細胞全体へのＦＩＴＣインスリンの均一な分布は存在しないことを理解できる。
【０３８４】
全ての場合において、Ｃａｃｏ−２細胞によるＦＩＴＣコレストソームのカイロミクロンへの生体内処理は、細胞内のインスリン量の確実な改善をもたらす。これは、ＦＩＴＣインスリンコレストソーム単独による積載量（列Ｂ）より大きい。
【０３８５】
この画像の列Ｃにおいて細胞膜がＦＩＴＣインスリンを劇的に多量に濃縮するだけでなく、これらの細胞の細胞質にもＦＩＴＣインスリンが積載される。これはわずか２時間の曝露後に起こり、カイロミクロンがコレストソーム単独に比べて多量に積載を行うだけでなく、コレストソーム単独に比べて迅速に積載を行うことを裏付けている。
【０３８６】
次に、Ｃａｃｏ−２モデルの高い経口バイオアベイラビリティの予想を裏付けるために、この特定の製剤をマウスに投与する。本発明のこの態様を実施例４に開示する。
【０３８７】
実施例４．コレストソーム−インスリンの生体内マウス研究
実施例４で開示される実験は、コレストソーム中のインスリンの使用による、予想される高い経口バイオアベイラビリティを裏付けるために設計された。
【０３８８】
インスリンのＥＬＩＳＡ分析
ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（＃ＥＺＨＩ−１４Ｋ及び＃ＥＺＨＩ−１４ＢＫ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ドイツ、ダルムシュタット））を用いて、ＥＬＩＳＡ分析を製造元の説明書に従って実施した。１０×濃縮ＨＲＰ洗浄緩衝液を、その全量と４５０ｍＬの脱イオン水とを混合することによって希釈した。ストリップをマイクロタイタープレートから取り外し、ウェルに３００ｕＬの希釈ＨＲＰ洗浄緩衝液を充填した。上記プレートを室温で５分間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、２０ｕＬの試験緩衝液をＮＳＢ（非特異的結合）ウェル及び各試料ウェルに加えた。２０ｕＬのマトリクス溶液を、ＮＳＢ、標準及び対照ウェルに加えた。２０ｕＬのヒトインスリンの標準液を二重に加えた。２０ｕＬのＱＣ１及び２０ｕＬのＱＣ２を適切なウェルに加えた。２０ｕＬの未知の試料を残りのウェルに二重に加えた。２０ｕＬの検出抗体を全てのウェルに加えた後、全てのウェルをプレートシーラーで覆い、オービタルプレートシェーカー上において室温で１時間インキュベートした。プレートシーラー及びデカント溶液をプレートから取り除き、１回の洗浄につき１ウェル当たり３００ｕＬの希釈したＨＲＰ洗浄緩衝液で、ウェルを３回洗浄した。１００ｕＬの酵素溶液を各ウェルに加え、プレートを再びシーラーで覆って、オービタルシェーカー上において室温で３０分間インキュベートした。シーラー及びデカント溶液を取り除き、ウェルを同一の方法で５回洗浄した。１００ｕＬの基質溶液を各ウェルに加え、ウェルを再び封止して、オービタルシェーカーに５〜２０分間入れた。反応が完了したことを示す青色が現れた後、１００ｕＬの停止溶液をウェルに加えた。各ウェルの吸光度を、波長として４５０ｎｍを用いて、分光光度計を用いて読み取った。測定値を、マイクロ単位／ｍｌで記録した。
【０３８９】
マウスへのコレストソームインスリンの経口送達
この実施例は、マウスに経口又はＩＶコレストソームインスリンを投与した後に収集されたデータを提示する。
【０３９０】
インスリンを、遊離（未カプセル化）ヒト組み換えインスリンとして、又はコレストソームでカプセル化されたヒト組み換えインスリンとして投与した。相対バイオアベイラビリティ（パーセントＡＵＣとして表される、ＩＶバイオアベイラビリティに対する経口バイオアベイラビリティ）の測定のためにマウスに投与されるインスリン−コレストソームのうち、半分を経口投薬し、残りの半分を、陰茎静脈に入れた３１ゲージの針を用いてＩＶ投薬した。
【０３９１】
使用したマウスの投薬及び犠死は、厳格な人道的手順に従った。用量１．０Ｕ／ｋｇのヒト組み換えインスリンを、０．０５〜０．１ｍｌの食塩水中で、ＮＤ４スイスウェブスターマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（インディアナ州インディアナポリス）に投与した。マウスを投与前３時間にわたって絶食させ、１時間後に食餌にアクセスできるようにした。水は常にマウスに供給されていた。マウスは、陰茎静脈注射前にイソフルランを吸入することによって、麻酔を受けた。採血の誘導のために３％ｍｇ／Ｋｇ体重を吸入させ、また維持のために２％ｍｇ／Ｋｇを吸入させた。インスリン投与後、マウスを、最初の６時間は３０〜６０分毎に、その後は１２時間毎に監視し、挙動及び排尿を厳密に記録した。１時点につき２匹のマウスを、Ｃｏ２室での吸入によって犠死させた。
【０３９２】
マウスを犠死させる時点は、０（投与前）、及び投与後３０分、１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間であった。犠死したマウスにおいて、大動脈穿刺、採血によって血液試料を回収した。
【０３９３】
図２４及び２５は、バイオアベイラビリティの比較を目的としてマウスに１．０Ｕ／ｋｇのコレストソームインスリンを経口投与及びＩＶ投与した結果を示す。図２４はコレストソームインスリン（総量、抽出が完了したものと仮定）をプロットしており、図２５は、細胞内での放出及びエキソサイトーシスの後の、コレストソームを含まないインスリンをプロットしている。ＩＶバイオアベイラビリティに対する経口バイオアベイラビリティの尺度として相対ＡＵＣを用いると、経口遊離インスリンは１１０％のバイオアベイラビリティを示し、また製剤中の３％の遊離インスリンに関して補正した場合には更に高いバイオアベイラビリティを示した。
【０３９４】
インスリンの、エキソサイトーシスに関連する大きなピークは、経口及びＩＶ投薬後４〜６時間において記録され、これは、細胞に入った無傷のコレストソームの一部が、開かれてその内容物を細胞内で放出することなく、無傷のまま再び外側へ輸送されることを示している。
【０３９５】
図２５のようなコレストソームでカプセル化されたインスリンのプロットを考慮すると、全体でのコレストソームでカプセル化されたＡＵＣ関連バイオアベイラビリティは平均６６％であり、これはまた、経口及びＩＶ投薬両方の４時間後の時点における依然としてカプセル化されているインスリンコレストソームの極めて大きなエキソサイトーシスピークに関連する。コレストソームは全て、細胞内遊離インスリンを放出すると予測されていたが、上記データは、細胞が、カイロミクロン結合後に細胞に入るコレストソームの少なくとも一部分を排出しているだけであると主張している。
【０３９６】
このようなコレストソーム輸送に関する初期の理解を考えると、送達の最適化のために更なる研究が必要である。また、マウス毎に有意なばらつきが存在した。しかしながら、図２４、２５に記録されている情報はそれにもかかわらず重要である。これは、この情報は、本発明者らのモデル及び本発明者らの試験管内データを検証し、またコレストソームインスリンが、極めて高いバイオアベイラビリティ、実際のところこれまでに得ることができた最良の値である通常の５〜２５％より大幅に高いバイオアベイラビリティで、哺乳類に経口送達できる能力を有することを示すためである。
【０３９７】
細胞に対する経口及びＩＶコレストソームの出入りの機序に関する更なる注意として、インスリン濃度（ｕＵ／ｍＬ）は、マウスから血漿を回収して、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅキットを用いてインスリンＥＬＩＳＡを実施することによって決定した。ＡｐｏＢ  ＥＬＩＳＡキットはヒト組み換えインスリン専用のものであるため、ＡｐｏＢ  ＥＬＩＳＡで測定されるいずれのインスリンも、遊離インスリン又はコレストソームインスリンとして送達されるインスリンであったことに留意することが重要である。これが重要なのは、本研究で使用したマウスが糖尿病に罹患していなかった、即ち自身で自然に産生されたインスリンも有していたが、ヒトインスリン試験用のＭｉｌｌｉｐｏｒｅキットは、上記キットがマウスインスリンと交差しないことを発表しているためである。インスリンの読み取り値がマウスからのものであるかコレストソームインスリンからのものであるか決定できない場合、結果は決定的なものとならなくなる。ヒト組み換えインスリンは、これに付着したＡｐｏＢ  タンパク質を有するものの、体内で産生された通常のインスリンはこれを有しないため、ＡｐｏＢ  ＥＬＩＳＡキットは、細胞結合機序の一部としてＡｐｏＢも含有するカイロミクロン中のコレストソームインスリンから特異的に送達されるインスリンを判定できた。
【０３９８】
組織対血漿比のマウス研究
図２６に示すように、コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣインスリンは経口使用後に組織への高い吸収率を示し、実際に、脳、肝臓、腎臓及び心臓などの標的組織中の濃度は、同一用量をＩＶ投与した後よりも、経口投薬後の方が高い。これは、経口使用によりＦＩＴＣ−インスリンがカイロミクロン中に入れられ、カイロミクロンはおそらく、注射されたコレストソームよりも良好に細胞への積載を行うため、予想されることである。
【０３９９】
ここでの試験は、組織に適用されるＦＩＴＣ較正標準に従ってＦＩＴＣを検出することであった。組織の試料は、投薬の６時間後、即ちインスリンの血漿中濃度が図２４のデータによると低くなっている時に、採取された。従ってＦＩＴＣの試験は細胞内ＦＩＴＣを反映する。これは、問題となっている組織の血液汚染及びおそらく間質液汚染が存在しないためである。組織中濃度は特に脳において高く、血漿ＦＩＴＣと組織ＦＩＴＣとの比は１００超：１であった。腎臓及び心臓は、組織対血漿の比が更に高く、２００：１を超えた。肝臓では比較的低かったが、それでも５０超：１であった。要約すると、ＦＩＴＣ及び組み換えヒトインスリンが血漿中でほとんど検出できない時点において、血漿に対する組織の比は極めて高いままであった。インスリンは細胞によって迅速に代謝されるため、これらの比は細胞内ＦＩＴＣの保持を反映しており、またこれは、培地中のＦＩＴＣコレストソームインスリンに対する曝露の２４時間後でも濃度を依然として高くすることができる本発明者らの細胞の実験におけるＦＩＴＣの長期保持と完全に一致している。
【０４００】
実施例５．コレストソーム−インスリンの生体内−ラット研究
経口バイオアベイラビリティ研究
これらの実験は、経口栄養法によって投与されたコレステロールカプセル化インスリン製剤（コレストソーム−インスリン）と皮下注射によって投与されたコレステロールカプセル化インスリン製剤（コレストソーム−インスリン）と（これらはいずれも、健康なメスのＷｉｓｔａｒラットに皮下（ｓ．ｃ．）投与された同一のインスリンと比較した）の間の、相対的な血漿及び組織と血漿とのインスリンの比を評価するために実施された。
【０４０１】
この研究は、投与された製剤からのインスリンのバイオアベイラビリティの比較のために設計され、これは、製剤の投与後２４時間にわたる経口投与とＩＶ投与との比として算出された曲線下面積（ＡＵＣ）によって定義される。
【０４０２】
体重２４６．５〜２９２．８ｇの１６匹の健康なメスＷｉｓｔａｒラットを、３つの研究グループに分配した。６匹のラットからなる２つのコホートにコレストソームインスリンを経口投与及びＳＣ注射し、残りの４匹のラットには、対照として、レギュラーインスリンを皮下投与した。各ラットには、１．０ｍｌ／動物の、スポンサーによってケージ番号及びラット番号のみで識別された溶液が投薬された。メスのＷｉｓｔａｒラットの２つのグループは、投薬の３時間前から１時間後までの期間にわたって絶食させた。ラットは水には常にアクセスできた。投薬から１時間後に、食餌へのアクセスの自由をラットに与え始めた。死亡率と、低血糖の兆候を含む罹患率とについて、ラットを毎日監視した。投薬の３０分前にベースライン血液を採取した後、血漿の調製のために、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間及び２４時間の時点で５００ｕｌの血液試料を採取した。全てのラットを、ＣＯ２過剰摂取によって、投薬の２４時間後に安楽死させた。安楽死直後に、心臓穿刺によって、血漿調製のために最後の血液試料を採取した。全ての血漿試料を、ＥＬＩＳＡを用いた試験まで、−８０℃で凍結した。
【０４０３】
動物には、市販のげっ歯類用飼料（５％  ７０１２  Ｔｅｋｌａｄ  ＬＭ−４８５  Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｂｌｅ  Ｄｉｅｔ、Ｈａｒｌａｎ）と、滅菌飲用水とが与えられた。全ての動物は、全研究期間を通して、環境制御飼育条件を備えた立ち入り制限設備に閉じ込められた。この設備は、１８〜２６℃、湿度３０〜７０％に維持され、明暗サイクルは１２時間であった（６：００に照明オン、１８：００に照明オフ）。実験開始前の少なくとも３〜５日にわたって、動物を上記飼育条件に慣れさせた。
【０４０４】
研究経過全体を通して、全ての動物は正常な行動を示し、コレストソームでカプセル化されたインスリンの経口及びＳＣ投与、並びにレギュラーインスリンのＳＣ投与はいずれも十分に許容された。薬物毒性又は重篤な低血糖の兆候は全く観察されなかった。
【０４０５】
結果。血漿インスリンを、各試験日に完全標準曲線及び対照試料を用いて、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）で３重に試験した。インスリン濃度を複数の時点の平均としてプロットし、得られた血中濃度及びＡＵＣ値を、図２７（経口コレストソーム、平均ＡＵＣ２９５）、図２８（Ｓ．Ｃ．レギュラーインスリン、平均ＡＵＣ３４４）及び図２９（Ｓ．Ｃ．コレストソームインスリン、平均ＡＵＣ３２２）に示す。全てのＡＵＣ値を、実際に投与された用量（残留した戻り値を差し引く）に関して補正し、０．２５単位（これはおよそ１単位／ｋｇ体重である）に対するＡＵＣとして表した。経口コレストソームインスリンからのＡＵＣとＳ．Ｃ．インスリンからのＡＵＣとの比較を、相対経口バイオアベイラビリティの正確な推定値とみなした。この実験では、コレストソームインスリンの経口バイオアベイラビリティは、ＳＣ注射に対して８６％であり、コレストソームインスリンｖｓＳＣコレストソームインスリンに対する経口コレストソームインスリンの相対バイオアベイラビリティは９２％であった。
【０４０６】
組織対血漿比−ラット研究
図３０に示すように、コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣインスリンは経口使用後にラット組織への高い吸収率を示し、実際に、脳、肝臓、腎臓及び心臓と行った標的組織中の濃度は、同一用量をＳＣ投与した後よりも、経口投薬後の方が高い。これは、経口使用によりＦＩＴＣ−インスリンがカイロミクロン中に入れられ、カイロミクロンはおそらく、注射されたコレストソームよりも良好に細胞への積載を行うため、予想されることである。
【０４０７】
ここでの試験は、組織に適用されるＦＩＴＣ較正標準に従ってＦＩＴＣを検出することであった。組織の試料は、投薬の６時間後、即ちインスリンの血漿中濃度が図２６〜２８のデータによると低くなっている時に、採取された。従ってＦＩＴＣの試験は細胞内ＦＩＴＣを反映する。これは、これらの低い値では、組織の血液汚染及びおそらく間質液汚染が因子となりにくいためである。
【０４０８】
ラットにおけるＦＩＴＣの器官濃度は、マウスにおける器官濃度と同様であった。腎臓はこれらの種の間で異なっており、また肝臓はマウスよりもラットの方が高かった。しかしながら、全体的な組織対血漿比は、マウスよりもラットの方が低かった。これは、特にＳＣ投薬を受けたラットにおいて、血漿中濃度がより高いことを反映している。ラットに関しては、肝臓が最も高く、腎臓が最も低かった。脳での分布は、ラットよりもマウスの方が良好であった。要約すると、ＦＩＴＣ及び組み換えヒトインスリンが血漿中でほとんど検出できない時点において、血漿に対する組織の比は極めて高いままであった。インスリンは細胞によって迅速に代謝されるため、これらの比は細胞内ＦＩＴＣの保持を反映しており、またこれは、培地中のＦＩＴＣコレストソームインスリンに対する曝露の２４時間後でも濃度を依然として高くすることができる本発明者らの細胞の実験におけるＦＩＴＣの長期保持と完全に一致している。
【０４０９】
実施例６．コレストソーム製剤に添加されるプロテアーゼ阻害剤
この実施例は、細胞内での代謝によってコレストソーム積載物が放出した細胞膜内のペプチド及びタンパク質を保護する手段を開示する。細胞内代謝の上記遅延は、これらの作用を延長させることによって効力を増大させる役割を果たす。任意で、ペプチド代謝の臓器阻害剤は、細胞がそれ自体のエキソサイトーシス経路を用いてより多量の積載物を除去するのを促進し得る。
【０４１０】
パイロット研究を実施し、ここではＭＧ−１３２を、１１１７インスリン−コレストソームにも曝露されたＭＣＦ−７細胞に添加した。ＭＧ−１３２は、損傷がより少ないインスリン−コレストソームのエキソサイトーシスを引き起こす可能性があることが分かった。これは、コレストソームからインスリンを放出させるように作用する酵素であるコレステリルエステル加水分解酵素に対する作用を示している。
【０４１１】
本発明のこの実施形態では、本発明で作られる、１つ以上のペプチドをカプセル化する上記コレステリルエステル小胞は、更に、及び任意で、上記哺乳類又は患者若しくは対象の細胞内での上記ペプチドの代謝若しくは異化の速度を遅延させる、又は上記代謝若しくは異化を完全に防止する、プロテアーゼ阻害剤物質のうちの１つ以上を組み込む。
【０４１２】
別の実施形態では、上記プロテアーゼ阻害剤は、限定するものではないがリマ豆トリプシン阻害剤、アプロチニン、大豆トリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）又はオボムコイドなどのトリプシン阻害剤である。
【０４１３】
別の実施形態では、上記プロテアーゼ阻害剤はシステインプロテアーゼ阻害剤であり、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は：シスタチン；１型シスタチン（若しくはステフィン）；２型シスタチン；ヒトシスタチンＣ、Ｄ、Ｓ、ＳＮ及びＳＡ；シスタチンＥ／Ｍ；シスタチンＦ；３型シスタチン；又はキニノーゲンを含む。
【０４１４】
別の実施形態では、上記阻害剤は抗生物質バシトラシンであり、上記物質の有効量は、コレストソーム送達後に細胞に対して毒性傷害を引き起こす量未満である。
【０４１５】
別の実施形態では、上記阻害剤はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、例えば限定するものではないが、シタグリプチン、サキサグリプチン又はリナグリプチンであり、これらはそれぞれ、ＧＬＰ−１アゴニストの作用の延長を目的として市販されている。
【０４１６】
別の実施形態では、上記阻害剤は、ＭＬ−３４５及び過去に開示されている他のもの（１８）を含むがこれらに限定されない、インスリン分解酵素阻害剤（ＩＤＥ阻害剤）である。
【０４１７】
別の実施形態では、上記プロテアーゼ阻害剤はトレオニンプロテアーゼ阻害剤であり、本発明のトレオニンプロテアーゼ阻害剤は：ＭＬＮ−５１９、ＥＲ−８０７４４６、ＴＭＣ−９５Ａを含む。
【０４１８】
別の実施形態では、ボルテゾミブ又はイキサゾミブなどのプロテアソーム阻害剤を、本発明を使用して細胞中に送達されたペプチドの作用を延長する目的で使用してもよい。正常な細胞では、プロテアソームは、ユビキチン化タンパク質の分解によって、タンパク質発現及び機能を調節し、また異常な又はミスフォールドしたタンパク質について細胞を洗浄する。
【０４１９】
別の実施形態では、上記プロテアーゼ阻害剤はアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤であり、本発明のアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤は：ペプスタチンＡ、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤１１、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤１、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤２、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤３、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤４、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤５、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤６、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤７、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤８、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤９、ペプシン阻害剤Ｄｉｔ３３、アスパルチルプロテアーゼ阻害剤、又はプロテアーゼＡ阻害剤３を含む。
【０４２０】
別の実施形態では、上記プロテアーゼ阻害剤はメタロプロテアーゼ阻害剤であり、本発明のメタロプロテアーゼ阻害剤は：アンジオテンシン−１変換酵素阻害性ペプチド、抗出血因子ＢＪ４６ａ、ベータカゼイン、プロテイナーゼ阻害剤ＣｅＫＩ、毒メタロプロテイナーゼ阻害剤ＤＭ４３、カルボキシペプチダーゼＡ阻害剤、ｓｍｐＩ、ＩＭＰＩ、アルカリプロテイナーゼ、ＩＮＨ、ラテキシン、カルボキシペプチダーゼ阻害剤、抗出血因子ＨＳＦ、テスチカン−３、ＳＰＯＣＫ３、ＴＩＭＰ１、メタロプロテイナーゼ阻害剤１、メタロプロテイナーゼ阻害剤２、ＴＩＭＰ２、メタロプロテイナーゼ阻害剤３、ＴＩＭＰ３、メタロプロテイナーゼ阻害剤４、ＴＩＭＰ４、推定メタロプロテイナーゼ阻害剤ｔａｇ−２２５、メタロプロテアーゼの組織阻害剤、ＷＡＰ、ｋａｚａｌ、免疫グロブリン、又はｋｕｎｉｔｚ及びＮＴＲドメイン含有タンパク質１を含む。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、上記プロテアーゼ阻害剤は、自殺阻害剤、遷移状態阻害剤又はキレート剤である。いくつかの実施形態では、本発明の上記プロテアーゼ阻害剤は：ＡＥＢＳＦ−ＨＣｌ、（イプシロン）−アミノカプロン酸、（アルファ）１−アンチキモトリプシン、アンチパイン、アンチトロンビンＩＩＩ、（アルファ）１−アンチトリプシン（［アルファ］１−プロテイナーゼ阻害剤）、ＡＰＭＳＦ−ＨＣｌ（４−アミジノフェニル−メタンスルホニル−フルオリド）、アプロチニン、ベンズアミジン−ＨＣｌ、キモスタチン、ＤＦＰ（ジイソピルフルオロリン酸塩）、ロイペプチン、ＰＥＦＡＢＬＯＣ．ＲＴＭ．ＳＣ（４−（２−アミノエチル）−塩酸ベンゼンスルホニルフルオリド）、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、ＴＬＣＫ（１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノンＨＣｌ）、ＴＰＣＫ（１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン）、イセチオン酸ペンタミジン、ペプスタチン、グアニジウム、アルファ２−マクログロブリン、亜鉛のキレート剤、又はヨード酢酸、亜鉛である。いくつかの実施形態では、上記キレート剤はＥＤＴＡである。
【０４２２】
ある有効量で本明細書中において開示される各プロテアーゼ阻害剤物質は、上記コレストソームが放出したタンパク質又はペプチドの代謝が上記プロテアーゼ阻害剤によって遅延されるという条件で、本発明の別個の実施形態を表す。細胞内での上記ペプチドの代謝を遅延させる又は防止するいずれかのプロテアーゼ阻害剤が、プロテアーゼ阻害剤の選択の分野において好ましいことは、当業者には明らかであろう。
【０４２３】
細胞質に到達するコレストソームから上記プロテアーゼ阻害剤を放出する細胞に傷害をもたらさないプロテアーゼ阻害剤を採用することが、本発明の好ましい実施形態である。
【０４２４】
第１及び第２のプロテアーゼ阻害剤の各量は、本発明の別個の実施形態を表し、また上記量の選択されたプロテアーゼ阻害剤が、上記ペプチド又はタンパク質の代謝を遅延させる又は防止することは、当業者には明らかであろう。
【０４２５】
実施例７：経口トラスツズマブコレストソーム及びＩｇＧ対照
導入。乳癌は、乳腺（小葉癌）又は乳管（乳管癌）として発生し、制御不能な乳房細胞分裂が原因である。ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）遺伝子は、ＨＥＲ２タンパク質の産生を担う。これらのタンパク質は、正常で健康な乳房細胞表面で受容体として作用し、これらの細胞の成長、分裂及び修復を補助する。トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））は、ＨＥＲ２陽性乳癌患者に対して治療効果があることが分かっているＩｇＧ１モノクローナル抗体である。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）及びホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路に作用するトラスツズマブは、ＨＥＲ２受容体の細胞内シグナリングを妨害する。
【０４２６】
癌などの疾患に対する高い治療効果を有する多くのモノクローナル抗体は、カプセル化のせん断応力に曝露された場合に、変性する、又は凝集物を形成する傾向を有する。トラスツズマブは、これらのせん断応力に対する耐性を有することが分かっており、従ってそのカプセル化は、典型的にはトラスツズマブ耐性ＨＥＲ２陽性乳癌患者の将来の治療にとって有望である。
【０４２７】
ＨＥＲ２陰性ＭＣＦ−７ヒト細胞へのトラスツズマブの送達方法としてのコレストソームの使用は、毒性効果の評価のために実施される。トラスツズマブに対する応答性を有すると思われ、かつ将来の研究で評価できる、ＨＥＲ２陽性癌細胞株のいくつかの試験管内モデルは、ＳＫＢＲ３及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３である。
【０４２８】
試験管内カプセル化の後、トラスツズマブの生体内経口及び細胞内送達が最終的な目標である。現在、トラスツズマブに関して、安全で効果的な経口製剤が必要とされている。コレストソーム技術は、この需要を満たす可能性を示している。新規の薬物送達システムとして、コレストソームは、消化管の酸性環境に耐えて、腸内吸収によって循環系に入ることができる能力を示す。この研究では、トラスツズマブはコレストソーム内に良好にカプセル化された。
【０４２９】
トラスツズマブ原材料溶液の調製
注射用のトラスツズマブの研究用製剤（これ以降、トラスツズマブ；〜１ｍｇ／ｍＬトラスツズマブ、〜５ｍＭヒスチジン、〜５０ｍＭα−トレハロース、〜０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、及び〜１％ｗ／ｖベンジルアルコール、ｐＨ６．０；Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ケンタッキー州オーウェンズボーロ）から贈与）を、開始材料として使用した。後で分析するためにアリコートを確保した。トラスツズマブは、カプセル化の前かつ洗剤の除去後に濃縮する必要があった。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を、ＤｅｔｅｒｇｅｎｔＯＵＴ（商標）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）Ｍｅｄｉ（ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ミズーリ州セントルイス））を用いて、およそ２５０ｍＬのトラスツズマブから除去した。得られた溶液をグリセロール中で２％とし、凍結乾燥によって濃縮し、４Ｌの０．５×ＰＢＳに対して２時間透析した（１００ｋＤ  ＭＷＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＣＥ膜；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（カリフォルニア州ランチョドミンゲス）。
【０４３０】
トラスツズマブポストカラム溶液を、５０ｍｌの円錐形チューブに採取した。８０％グリセロールを上記トラスツズマブポストカラム溶液に加え、グリセロールの最終濃度を、トラスツズマブポストカラム溶液中で２％とし、続いてこれを凍結乾燥した。凍結乾燥プロセス後のトラスツズマブの吸光度を、ＪＥＮＷＡＹ分光光度計を用いて、２つの波長：２８０ｎｍ及び３５０ｎｍにおいて取得した。吸光度の測定値は、図３１にプロットされている。次に、２０％グリセロールトラスツズマブ溶液の透析プロセスを、分子量カットオフ１００，０００、公称平坦幅３１ｍｍのＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈセルロースエステル（ＣＥ）透析膜を用いて、４リットルの０．５×ＰＢＳに対して２時間実施した。トラスツズマブ透析後溶液の吸光度の測定値は、図３２に記録されている。カプセル化のための最終的なトラスツズマブ原材料溶液は、およそ１２．５２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブ、０．１８％のベンジルアルコール（ｐＨ６．０）、０．４２８ｍＭのヒスチジンＨＣｌ、０．３４６ｍＭのヒスチジン、及び８．７４１ｍＭのトレハロース二水和物を含有する。
【０４３１】
トラスツズマブ−コレストソームの調製：
５ｍＬのトラスツズマブ原材料溶液を１５ｍｌの円錐形チューブに加え、４０℃で平衡させた。８０ｍｇのミリスチン酸コレステリル及び７５ｍｇのラウリン酸コレステリル（ＮＵ  Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ（ミネソタ州エリジアン）を１００ｍｌの丸底フラスコ（ＲＢＦ）に加え、５ｍｌのジエチルエーテルで可溶化した。次にこの溶液を、Ｂｕｃｈｉ  Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−３に入れ、速度設定４で１０分間、非真空下で回転させた後、４０℃で１０分間、低真空に曝露した。続いてＲＢＦを取り外し、４０℃の５ｍｌのトラスツズマブ原材料溶液をＲＢＦに加え、４０℃で２０分にわたって超音波処理した。超音波処理中、ＲＢＦを５分毎に回転させた。続いてトラスツズマブコレストソームを、滅菌セルストレーナー４０μｍメッシュバスケット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州ウォルサム））を通してろ過し、過剰な脂質材料を除去して、４℃で保管した。
【０４３２】
未カプセル化トラスツズマブの分離
タンパク質Ｇ−セファロース（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ミルピタス））を製造元の説明書に従って使用して、未カプセル化トラスツズマブを分離した。簡潔に述べると、タンパク質Ｇマトリクスを、結合緩衝液で５回洗浄し、トラスツズマブ−コレストソームを積載し、室温で９０分間インキュベートした。続いて試料を５０００×ｇで３０分間回転させた。マイクロピペットを用いて上清を除去し、更なる分析のために保存した。次に溶出緩衝液をマトリクスに加え、上述のように試料を遠心分離した。上清を回収し、更なる分析のために保存した。予想外にも、未カプセル化トラスツズマブを除去するために使用したタンパク質Ｇ−セファロースからトラスツズマブ−コレストソームを回収するのは困難であった。経験的なエビデンス（図３３及び図示せず）により、これは、製剤中の脂質の量に関連している可能性があると示唆されている。分離プロセス中のコレストソームの回収を最大化するための方法を発見するために努力が続けられている。
【０４３３】
ＩｇＧ−コレストソームの調製：
５ｍＬの１８．８ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧ原材料（０．０２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ミシガン州ノバイ））を用いて、上述の方法を使用してＩｇＧ−コレストソームを調製した。トラスツズマブ−コレストソームに関して上述したように、タンパク質Ｇ−セファロースを用いて、未カプセル化ＩｇＧをＩｇＧ−コレストソームから分離した。
【０４３４】
トラスツズマブコレストソーム及びＩｇＧコレストソームの分析：
コレストソーム（商標）の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を、Ｎａｎｏｂｒｏｏｋｓ−９０Ｐｌｕｓ  ＰＡＬＳを用いて実施した。脂質濃度の分析は、上述のようにコレストソーム（商標）溶液に対して実施したＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ２０２０）分光光度法を用いて得た。
【０４３５】
細胞処理：ＭＣＦ−７細胞を７５ｃｍ２のフラスコ中で培養し、３７℃及び５％ＣＯ２環境で、８０〜９０％コンフルエントとなるまでインキュベートした。様々な処理及び製剤を用いたＭＣＦ−７細胞のインキュベーションを、２４ウェルフォーマットで実施した。細胞を１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、処理前に２４時間インキュベートした。続いて細胞を２４時間インキュベートした後、洗浄し、トリプシン化し、血球計数器で計数した。生存率をトリパンブルー排除法で決定した。
【０４３６】
まず、粗コレストソームを乳房上皮細胞（１８４Ｂ５及びＭＣＦ−７）上に置き、細胞の成長（図３３）及び生存率（図３４）に対する影響を試験した。可溶性抗体又はコレストソーム製剤化抗体のいずれも、細胞の生存率には全く影響を及ぼさなかった。コレストソーム製剤化トラスツズマブ、及びはるかに程度は低いもののＩｇＧは、１８４Ｂ５細胞の成長に影響を及ぼしたが、ＭＣＦ−７細胞には影響を及ぼさなかった。
【０４３７】
結果及び議論
タンパク質生物製剤の典型的な臨床製剤は、溶液中の量が比較的少ないため、コレストソームでのカプセル化を実施する前にタンパク質を濃縮する必要がある。場合によっては、凍結乾燥などの濃縮プロセス中に、凝集による大きな損失が存在した。図３５は、トラスツズマブに関して、トラスツズマブが凍結乾燥又はカプセル化の応力下において分解又は凝集を全く示さなかったため、このような態様の損失が最小であることを示唆している。図３５は、コレストソーム中のＩｇＧ及びトラスツズマブが、いずれも１０００倍希釈において脂質の干渉なく良好に測定できるため、これらに関して損失が最小であることを示している。
【０４３８】
ＩｇＧ及びトラスツズマブをカプセル化したコレストソーム製剤は、脂質の取り込み及びサイズが異なっていたが、カプセル化されると推定される量、及び抗体対脂質の質量比については同様であった。トラスツズマブは、およそ５０％の積載重量比で、コレストソーム内に良好にカプセル化された。カプセル化トラスツズマブ又はＩｇＧのいずれも、ＭＣＦ−７細胞又は１８４Ｂ５細胞に対する毒性は全く示さなかった。これはこれらの製剤を動物モデルで試験してもよいことを示している。
【０４３９】
実施例８．ＭＣＦ−７及びＡＲＰＥ−１９網膜細胞のコレストソーム−ＦＩＴＣ積載
ＦＩＴＣコレストソームを、ミリスチン酸コレステリル（Ｃ１４）及びパルミチン酸コレステリル（Ｃ１６）のモル比１：１の混合物からも調製した。驚くべきことに、このコレストソーム調製物から、ＭＣＦ−７細胞へのＦＩＴＣの迅速な取り込みが観察された。
【０４４０】
ＦＩＴＣ原材料の調製：１．０ｍｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ溶液の溶液を、１×ＰＢＳ中で中性ｐＨにおいて作った。
【０４４１】
ミリスチン酸コレステリル／パルミチン酸を用いたコレストソームの調製：
ミリスチン酸コレステリル（７５ｍｇ）及びパルミチン酸コレステリル（８４ｍｇ）のモル比１：１の溶液を、５ｍｌのクロロホルム中で作った。このクロロホルム溶液を、Ｂｕｃｈｉ  Ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｏｒに取り付けられた丸底フラスコに加えた。上記フラスコを、６５℃に設定された水浴に入れ、１０分間回転させた。この時点において真空を印加して、有機溶媒を除去した。溶媒が除去された後、５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ水性ＦＩＴＣ溶液を加えた。上記溶液を、５７℃という高温に達した超音波処理器の浴に移した。超音波処理を２０分間実施した。次に製剤をろ過して、使用されなかった脂質から製剤を分離した。
【０４４２】
未カプセル化ＦＩＴＣの分離。製剤を、０．２２ｕフィルタを通して重力ろ過し、除去された体積が規則的な間隔で流体によって置き換えられることを保証した。
【０４４３】
細胞研究−ＭＣＦ−７
この実験では、２２ｕｇのＦＩＴＣ製剤をＭＣＦ−７細胞表面に配置した。蛍光撮像を経時的に実施し、画像を２、４、８及び２４時間時点で撮影した。このデータにより、図３６に示すように、ミリスチン酸及びラウリン酸から調製されたＦＩＴＣコレストソームに比べて、ミリスチン酸及びパルミチン酸から調製されたＦＩＴＣコレストソームに関して更に迅速な取り込みが明らかになった。取り込みの速度の差は予想外のものであり、本明細書において、コレストソーム構築物の特別な特性として開示した。この特定の実験において、ＦＩＴＣ自体のＭＣＦ−７細胞への取り込みも存在したが、ＦＩＴＣ単独に比べて、コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣから、はるかに大きな蛍光が得られたことは明らかであった。
【０４４４】
細胞研究−網膜細胞ＡＲＰＥ−１９
１：１のモル比のミリスチン酸コレステリル及びパルミチン酸コレステリルから作られたコレストソームをＦＩＴＣと共に積載したヒト網膜上皮細胞を図３６に示す。この実験では、２２ｕｇのＦＩＴＣ製剤をＡＲＰＥ−１９細胞表面に配置した蛍光撮像を経時的に実施し、画像を２、４、８及び２４時間時点で撮影した。パネルＡは、ミリスチン酸／パルミチン酸から作られたＦＩＴＣ−コレストソームで２時間処理されたＡＲＰＥ−１９細胞の画像を示す。左上のパネルは２時間の時点における緑色蛍光チャネル画像であり；左下のパネルは赤色蛍光チャネル画像であり；右下のパネルは合成画像である。このデータにより、ミリスチン酸及びラウリン酸から調製されたＦＩＴＣコレストソームに比べて、ミリスチン酸及びパルミチン酸から調製されたＦＩＴＣコレストソームに関して更に迅速な取り込みが存在することが示唆された。取り込みの速度の差は予想外のものであり、本明細書において、コレストソーム構築物の特別な特性として開示した。
【０４４５】
実施例９．核酸コレストソーム：ＧＦＰプラスミド
蛍光タンパク質は、生命科学者によって広く使用されている、遺伝的にコード化されたツールである。元の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は１９９２年にクローン化され、それ以来、科学者達は、多様な色のセットをもたらす多数のＧＦＰ変異体及び非ＧＦＰタンパク質を設計してきた。緑色蛍光プラスミド（ＧＦＰ）の良好なトランスフェクション、及びトランスフェクトされた細胞による緑色蛍光の発現は、良好な細胞内送達機序の決定的なエビデンスであると広く考えられている。従ってこれらの実験を、コレストソームでのカプセル化を用いた核酸材料の細胞内送達を実証するために実施した。
【０４４６】
Ｈｉｍｏｕｄｉ−２００２（２２）に記載されているような、ｐｇＷｉｚＧＦＰプラスミドの原材料を用いて開始されるＧＦＰの成長及び精製における複数のステップは、以下の通りであった。
【０４４７】
ＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒ培地の調製
１．８００ｍＬのＨ２Ｏを２Ｌ三角フラスコに加えた。
２．２０ｇのＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒ培地（Ｓｉｇｍａ  Ｌ３５２２）を、液体が澄んだ黄色になり、全ての粉末の塊が溶解するまで、振り混ぜて溶解させた。ステップ１及び２を更に２回繰り返して、それぞれ８００ｍＬのＬＢ  Ｍｉｌｌｅｒ培地を内包した３つのフラスコを得た。
３．これらのフラスコを液体培地設定でオートクレーブ処理した。
４．滅菌済みのＬＢ培地を５０ｕｇ／ｍＬ硫酸カナマイシン（ＧＩＢＣＯ、１００×、１５１６００−０５４）に触れさせ、ｐｇＷｉｚＧＦＰプラスミドのグリセロール原材料（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ、ＮＤ；５７５７ｂｐ）を接種した。
５．フラスコを３７℃で一晩、振盪（２００ｒｐｍ）させながらインキュベートした。
【０４４８】
ｐｇＷｉｚＧＦＰのカラム精製
１．緩衝液Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３（プラスミドＧｉｇａ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（メリーランド州ジャーマンタウン））を、製造元の仕様書に従って調製した（緩衝液組成物の仕様は表４に提供されている）。
２．インキュベーションのおよそ２２〜２４時間後、培養物の成長を、適切にブランク設定された分光光度計を用いて、培養物が１．５Ｅ＋９〜３〜４Ｅ＋９の微生物を有するまで、６００ｎｍでの光密度（ＯＤ）を測定することによって監視した。
３．微生物を６，０００×ｇ、１５分間、４℃（ＪＬＡ  ９．１０００ローター；Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｊ−Ｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ａｖａｎｔｉ、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（カリフォルニア州ブレア））でペレット化した。上清を廃棄した。
４．微生物をペレット化している間に、３つのＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ  １００００カラムをそれぞれ７５ｍＬの緩衝液ＱＢＴで平衡させた。
５．微生物ペレットを１２５ｍＬの緩衝液Ｐ１中で再懸濁し、全てのペレットを組み合わせた。
６．１２５ｍＬの緩衝液Ｐ２を、発泡を回避するためにゆっくりと加えた後、６回激しく反転させることによって完全に混合し、最後にベンチトップ上で５分間、ＲＴでインキュベートした。
７．１２５ｍＬの冷却した緩衝液Ｐ３を、再懸濁したペレット混合物に加え、６回反転させることによって激しく混合し、氷上で３０分間インキュベートした。
８．処理したペレットを、ステップ３と同一の遠心分離器内のＪＬＡ１６．２５０ローターで、４０℃で３０分間、瓶内で２０，０００×ｇで回転させた。
９．上清を清浄な２５０ｍＬ遠心分離瓶に注意深く移した。
１０．ＪＬＡ１６．２５０ローターを用いて、上清を、４℃で１５分間、２０，０００×ｇで回転させて、カラムを目詰まりさせるいずれの追加の粒子も取り除いた。
１１．ステップ１０から得られた上清をカラムに適用した。通過した平衡流を廃棄した。
１２．カラムを６００ｍＬの緩衝液ＱＣで洗浄した。
１３．プラスミドを、１００ｍＬの緩衝液ＱＦを用いて、清浄な２５０ｍＬ遠心分離瓶に溶出させた。
１４．溶出したプラスミドを内包する２５０ｍＬ遠心分離瓶に７０ｍＬのＲＴイソプロパノールを加えて十分に混合することにより、プラスミドを沈殿させた。
１５．ＪＬＡ１６．２５０ローターを用いて、この混合物を４℃で３０分間、１５，０００×ｇで遠心分離した。上清を廃棄した。
１６．ペレットを１０ｍＬのＲＴ７０％エタノールですすぎ、ＪＬＡ１６．２５０ローターを用いて４℃で１０分間、１５，０００×ｇで再び回転させた。上清を廃棄した。注記：ペレットの外見は純白となるはずである。
１７．遠心分離瓶をペーパータオル上に〜４５°の角度で倒すことによって、ペレットを〜２０分間風乾した。２ｍＬのヌクレアーゼ非含有水をペレットに加えた。４℃で一晩のインキュベーションの後、ペレットを再懸濁し、１５ｍＬ円錐形チューブに移した後、４℃で保管した。収率は、それぞれ２．４Ｌの合計培養体積に対して、１０ｍｇ〜１５ｍｇとなるはずである。
１８．これらの方法を用いて、およそ１００ｍｇのｐｇＷｉｚＧＦＰを調製し、ｐｇＷｉｚＧＦＰ−コレストソーム（商標）の調製において使用した。
【０４４９】
ミリスチン酸コレステリル／ラウリン酸コレステリルからのｐｇＷｉｚＧＦＰ−コレストソーム（商標）の調製
５ｍＬの４ｍｇ／ｍＬ精製ｐｇＷｉｚＧＦＰ原材料溶液を、１５ｍｌ円錐形チューブに加え、５５℃で平衡させた。同時に、８０ｍｇのミリスチン酸コレステリル及び７５ｍｇのラウリン酸コレステリル（ＮＵ  Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ（ミネソタ州エリジアン））を１００ｍｌ丸底フラスコ（ＲＢＦ）に入れ、５ｍｌのジエチルエーテルで可溶化した。次に、可溶化されたエステルを含むフラスコを、Ｒｏｔｏｖａｐｏｒ  Ｒ−３（Ｂｕｃｈｉ（デラウェア州ニューキャッスル））上に置き、速度設定４で、真空を印加せずに５５℃で１０分間回転させた後、更に１０分間、低真空に曝露した。続いてＲＢＦを取り外し、事前に平衡させた４ｍｇ／ｍＬのｐｇＷｉｚＧＦＰ原材料溶液をＲＢＦに加え、これをＥｌｍａｓｏｎｉｃ  Ｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｔｏｖａｔｅｃｈ（ニュージャージー州メープルウッド））で、５０℃で２０分にわたって超音波処理（９０％出力、３５ｋＨｚ）した。超音波処理中、ＲＢＦを５分毎に回転させた。次に、得られたｐｇＷｉｚＧＦＰ−コレストソーム（商標）を、滅菌４０μｍナイロンメッシュストレーナー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州ウォルサム））を通してろ過した。未カプセル化ＦＩＴＣを分離するために、製剤を、０．２２ｕフィルタを通して重力ろ過し、除去された体積が規則的な間隔で流体によって置き換えられることを保証した。製剤を、細胞研究での分析及び使用まで、４℃で保管した。
【０４５０】
ミリスチン酸コレステリル／パルミチン酸コレステリルからのｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソームの調製
５ｍｌの３．６ｍｇ／ｍｌ精製ｐｇＷｉｚＧＦＰ原材料溶液を、１５ｍｌ円錐形チューブに加え、５５℃で平衡させた。同時に、７５．５ｍｇのミリスチン酸コレステリル及び８３．５ｍｇのパルミチン酸コレステリル（ＮＵ  Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ（ミネソタ州エリジアン））を１００ｍｌ丸底フラスコ（ＲＢＦ）に入れ、５ｍｌのクロロホルムで可溶化した。次に、可溶化されたエステルを含むフラスコを、Ｒｏｔｏｖａｐｏｒ  Ｒ−３（Ｂｕｃｈｉ（デラウェア州ニューキャッスル））上に置き、速度設定４で、真空を印加せずに６５℃で１０分間回転させた後、更に１０分間、低真空に曝露した。続いてＲＢＦを取り外し、事前に平衡させた３．６ｍｇ／ｍＬのｐｇＷｉｚＧＦＰ原材料溶液をＲＢＦに加え、これをＥｌｍａｓｏｎｉｃ  Ｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｔｏｖａｔｅｃｈ（ニュージャージー州メープルウッド））で、５７℃で２０分にわたって超音波処理（９０％出力、３５ｋＨｚ）した。超音波処理中、ＲＢＦを５分毎に回転させた。次に、得られたｐｇＷｉｚＧＦＰ−コレストソーム（商標）を、滅菌４０μｍナイロンメッシュストレーナー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州ウォルサム））を通してろ過した。未カプセル化ＦＩＴＣを分離するために、製剤を、０．２２ｕフィルタを通して重力ろ過し、除去された体積が規則的な間隔で流体によって置き換えられることを保証した。製剤を、細胞研究での分析及び使用まで、４℃で保管した。
【０４５１】
ｐｇＷｉｚＧＦＰ−コレストソーム（商標）の分析：
コレストソーム（商標）の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を、Ｎａｎｏｂｒｏｏｋ  ９０Ｐｌｕｓ  ＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ、Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて実施した。脂質濃度は、ＨＰＬＣと、適切な標準曲線との比較とを用いて決定した（ＬＣＭＳ  ２０２０、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（メリーランド州コロンビア））。ＤＮＡ濃度はＢｉｏＳｐｅｃ−ｎａｎｏ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ（メリーランド州コロンビア））を用いた２６０ｎｍでの吸光度の測定によって決定した。
【０４５２】
細胞内送達研究及び撮像
ｐｇＷｉｚＧＦＰ−コレストソーム（商標）の細胞内送達特性を試験するために、２００ｕｌのコレストソームでカプセル化されたｐｇＷｉｚＧＦＰ調製物をＭＣＦ−７細胞の培地に加え、上記細胞を、Ｃｈｅｎｇ  １９９６（２３）の方法で哺乳類細胞における遺伝子導入及び発現を経時的に監視する手段としての緑色蛍光タンパク質変異体の存在に関して試験した。
【０４５３】
図３７は、ミリスチン酸コレステリル／パルミチン酸から作られたｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソーム（上側のパネル、３０時間の時点）、及びミリスチン酸コレステリル／ラウリン酸から作られたｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソーム（下側のパネル、２４時間の時点）で処理された、ＭＣＦ７細胞の画像を示す。各パネルにおいて、最も左側の画像は位相差画像であり、その次が緑色蛍光チャネル画像であり、その次が赤色蛍光チャネル画像であり、最も右側が合成画像である。これらの画像は、これらの製剤が両方共、ＭＣＦ７細胞にｐｇＷｉｚＧＦＰプラスミドを積載し、緑色の蛍光を発することを示している。培地対照パネル（図示せず）は、背景の自己蛍光に一致するごくわずかな蛍光しか示さなかった。全般的に見れば、これらの画像は、ｐｇＷｉｚＧＦＰ−コレストソーム（商標）の驚くほど確実な細胞取り込みを実証し、これらの細胞内でのＧＦＰプラスミドの明らかな複製挙動がこれに続いた。細胞は生存したままであり、これらのＧＦＰ発現実験中に完全性の喪失は一切示されなかった。
【０４５４】
図３８のミリスチン酸コレステリル／パルミチン酸コレステリルＧＦＰコレストソームの読み取り値は、培地への添加の２４時間後に得られた。ミリスチン酸コレステリル／パルミチン酸から作られたｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソーム（上側のパネル）、及びミリスチン酸コレステリル／ラウリン酸から作られたｐｇＷｉｚＧＦＰコレストソーム（中央のパネル）、及び培地に添加されたｐｇＷｉｚＧＦＰのみ（下側のパネル）で２４時間処理された、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜細胞の画像が示されている。各パネルにおいて、最も左側の画像は位相差画像であり、その次が緑色蛍光チャネル画像であり、その次が赤色蛍光チャネル画像であり、最も右側が合成画像である。これらの画像は、これらの製剤が両方共、ＡＲＰＥ−１９細胞にｐｇＷｉｚＧＦＰプラスミドを積載し、２４時間の時点において緑色蛍光の発生をもたらすことを示している。ｐｇＷｉｚＧＦＰのみは、２４時間の時点でわずかな蛍光しか示さず、これは、背景の自己蛍光がほとんど無く、またプラスミドが細胞にごくわずかしか自発的に入らないことを示す（図示せず）。全般的に見れば、これらの画像は、ｐｇＷｉｚＧＦＰ−コレストソーム（商標）の驚くほど確実な細胞取り込みを実証し、これらの細胞内でのＧＦＰプラスミドの明らかな複製挙動がこれに続いた。細胞は生存したままであり、これらのＧＦＰ発現実験中に完全性の喪失は一切示されなかった。
【０４５５】
実施例１０．癌免疫療法におけるコレストソームの使用
この実施例は、固形腫瘍を患った患者に対する完全に個別化された免疫療法アプローチについて説明する。本発明の全範囲は、腫瘍を切除して組織を自己免疫療法組成物に加工するために得ることができる場合に実施でき、上記自己免疫療法組成物は精製後、任意でアジュバントと共に、コレストソーム内にカプセル化される。上記構築物は、本発明の一態様において、上記患者の腫瘍に直接注射することによって投与してもよい。別の好ましい態様では、上記組成物をカプセル中に積載してもよく、その後このカプセルに、経口投与後にｐＨ７．３〜７．６で上記組成物を放出するよう、腸溶コーティングを施してもよい。本発明をこのようにして実施すると、上記組成物は、回腸及び場合によっては虫垂のみにおいて送達される。回腸に適用されたコレストソームでカプセル化された免疫療法組成物は、パイエル板において回腸の内側を覆う樹状細胞によって取り込まれ、これらの樹状細胞は、それらの体内位置において標的化された癌抗原を発現する上記癌細胞を攻撃するように、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞をプログラムする。例としては、黒色腫、全ての種類の肺癌、結腸癌、肝細胞癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、前立腺癌、乳癌、及び神経膠芽腫などの脳腫瘍が挙げられる。
【０４５６】
抗原及びアジュバントに対する樹状細胞の曝露
樹状細胞（ＤＣ）は、最も効果的な抗原提示細胞である。この１０年間、癌患者の免疫療法のためのＤＣの使用は大きく増加した。高いエンドサイトーシス能力と、一次Ｔ細胞応答を開始させる特異な能力とにより、ＤＣは、この目的のための最も強力な候補となった。注射によって与えられるＤＣワクチン接種は、腫瘍の退縮をもたらす場合があるが、このアプローチに対する応答は穏やかなものである。本発明は、第１の態様において、この活性腫瘍組成物をコレストソームにカプセル化して、上記活性腫瘍組成物が確実に樹状細胞に入るようにすることによって、これらの制限を克服する。第２の態様では、標的化される樹状細胞は、遠位腸管の回腸のパイエル板のリンパ系応答組織のものである。
【０４５７】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を細胞アジュバントとしての樹状細胞（ＤＣ）と併せて送達するために、多様なアプローチが使用されてきた。単球前駆体由来のＤＣは、多様な戦略を用いて全腫瘍抗原によってパルス化され、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋抗腫瘍応答を誘発することが実証されている。本研究では、単球由来ＤＣは、同種異系黒色腫細胞株Ａ−３７５からの溶解物によってパルス化され、Ｔ細胞を繰り返し刺激するために使用された。得られたＴ細胞を、Ａ−３７５標的及びＨＬＡ  Ａ２−陽性黒色腫細胞株ＤＦＷに対する細胞傷害活性に関して調査した。ＦＩＴＣ標識化黒色腫溶解物のＤＣによる取り込みにより、黒色腫細胞の溶解物が効率的にエンドサイトーシスを受けることが証明された。溶解物パルス化ＤＣによる刺激は、Ｔ細胞による強い増殖応答をもたらし、これは、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ両方に対する抗体によって阻害できた。
【０４５８】
溶解物パルス化ＤＣによって試験管内で刺激されたＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩに対する抗体によって遮断される黒色腫標的に対する強力な細胞傷害性を示した。溶解物パルス化ＤＣはまた、ＥＬＩＳＰＯＴ法で測定される、Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマ分泌を誘発した。本発明者らは、溶解物パルス化ＤＣの、黒色腫関連抗原をＴ細胞に対して提示する能力も調査した。ｇｐ１００、ｍａｇｅ１、ＮＹ−ＥＳＯ及びＭＡＲＴ−１などの黒色腫関連抗原の合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＰＯＴ法は、溶解物パルス化ＤＣがＴ細胞を抗原特異的に刺激できることを明らかにした。この結果は、同種異系腫瘍細胞からの溶解物を抗原の出所として使用して、黒色腫の腫瘍特異的Ｔ細胞を刺激できることを実証した（２４）。
【０４５９】
自己腫瘍の取得及び加工
患者腫瘍標本（自己試料）をコレストソーム中への加工のために提出する各場合において、腫瘍加工の第１のステップは、「溶解物」の形成となる。
【０４６０】
本明細書中で使用される用語「溶解物」は、固化した腫瘍材料が、水、生理食塩水及び緩衝液などの水性媒体中に、裸眼ではいずれの固形状の塊も観察できない程度に、かつ抗原提示細胞が分散質を貪食できる程度に、分散された状態を意味する。しかしながらこの用語は全く限定的に解釈してはならない。固定化された腫瘍材料の調製、微粒子の調製、及び溶解物の調製の詳細は、本明細書の実施例に具体的に記載されている。従って当業者は、実施例における上述の概説及び具体的説明を参照し、これらの方法を必要に応じて修正又は改変することによって、所望の微粒子又は溶解物を調製できる。
【０４６１】
腫瘍溶解物、及び上記溶解物中の抗原性構築物の加工は、遠心分離を用いた複数の画分の分離に進む。回収された各画分は、患者のＴ細胞に対する抗原として試験される。好適なアジュバントは、限定でない例ではリポ多糖（ＬＰＳ）である。末梢血中でのＴ細胞応答の分析のために、密度勾配遠心法によってＰＢＭＣを単離し、計数し、ペプチド及び同系のＢＭＤＣを添加することによって再刺激する。応答性の検出手段としてのＩＬ−２及びＩＦＮガンマの増加が発生するはずである。Ｔ細胞応答の細分類は、ＭＨＣクラスＩＩ遮断抗体（２０ｍｇ／ｍｌクローンＭ５／１１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を用いて実施される。全ての試料を二重又は三重に試験する。
【０４６２】
Ｔ細胞応答性を示す上記患者の腫瘍溶解物の画分を、コレストソーム中にカプセル化することによって加工する。コレストソーム中に加工されたこれらの活性画分をＬＰＳアジュバントと組み合わせ、上記腫瘍の出所であった患者に経口送達するために調製する。
【０４６３】
全ての場合において、ＰＢＭＣの単離に好適な血液試料は、腫瘍の切除と同時に採取される。上記血液試料は、無傷の腫瘍及び抗原として研究室で加工されたその成分に対する試験管内応答を試験するために使用される。
【０４６４】
同種異系腫瘍の取得及び加工
本明細書に記載されているような調製のためにアクセスできる腫瘍を有しない患者に関して、血液標本から採取した患者のＴ細胞を用いて手順を実施し、また同一のタイプの同種異系腫瘍を抗原として加工する（自己腫瘍に関して実施したように、腫瘍溶解物として開始する）か、又は患者Ｔ細胞を、黒色腫に対するｇｐ１００、卵巣癌若しくは肝細胞癌に対するＮＹ−ＥＳＯ−１、又は当該技術分野において開示されている他のものからなってもよい、上記腫瘍タイプに対する既知の「一般的な抗原」に対して試験する。
【０４６５】
溶解物パルス化ＤＣによって試験管内で刺激されたＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩに対する抗体によって遮断される黒色腫標的に対する強力な細胞傷害性を示した。溶解物パルス化ＤＣはまた、ＥＬＩＳＰＯＴ法で測定される、Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマ分泌を誘発した。本発明者らは、溶解物パルス化ＤＣの、黒色腫関連抗原をＴ細胞に対して提示する能力も調査した。ｇｐ１００、ｍａｇｅ１、ＮＹ−ＥＳＯ及びＭＡＲＴ−１などの黒色腫関連抗原の合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＰＯＴ法は、溶解物パルス化ＤＣがＴ細胞を抗原特異的に刺激できることを明らかにした。この結果は、同種異系腫瘍細胞からの溶解物を抗原の出所として使用して、黒色腫の腫瘍特異的Ｔ細胞を刺激できることを実証した（２４）。
【０４６６】
本発明の目的のために、この試験手順において患者自身のＴ細胞に対する応答性を有すると考えられるいずれかの抗原が、コレストソームの調製に好適となり得るが、これは、これらのコレストソームがコレストソーム中で調製された患者のＴ細胞から免疫応答を誘発する限りにおいてである。ＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて、患者のＴ細胞による抗原認識によってもたらされるサイトカインを識別してもよい。
【０４６７】
ＥＬＩＳＰＯＴ法の例：ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴキット（Ｄａｋｅｗｅｉ（中国））を用いて、ペプチドで一晩活性化した後のサイトカイン発現Ｔ細胞の頻度を決定した。簡潔に述べると、Ｔ細胞（１ウェル当たり１０５個）及びペプチド（５０μｇ／ｍｌ）を２個１組のウェルに加え、ＤＣを１：５〜１：１０の比（ＤＣ：Ｔ）で１８〜２０時間にわたって加えた。プレートを洗浄した後、希釈した検出抗体（１：１００希釈）を加えて、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ストレプトアビジン−ＡＰ（１：１００希釈）を加え、３７℃で更に１時間インキュベートした。次にＡＥＣ溶液混合物を各ウェルに加え、プレートを室温で約１５〜２０分間暗所に放置した後、脱イオン水を加えて進行を停止させた。プレートを、Ｅｌｉｓｐｏｔ  ＣＴＬリーダー（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ（メリーランド州コロンビア））で走査し、結果をＥｌｉｓｐｏｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡＩＤ（ドイツ、シュトラースベルグ）で分析した（２５）。
【０４６８】
本発明での使用のための組織組成物を取得するための追加の手段
本明細書に記載されているような調製のためにアクセスできる腫瘍を有しない患者に関して、血液標本から採取した患者のＴ細胞を用いて手順を実施し、更に上記患者の血液から採取されたエキソソームに対して試験する。これらの癌エキソソームの出所は、試験管内で成長させた後で上清の採取及びエキソソームの単離を行った患者の腫瘍であってもよい。任意で、エキソソームを、Ａｅｔｈｌｏｎ  Ｈｅｍｏｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ａｅｔｈｌｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ（カリフォルニア州サンディエゴ））（２６）などの血液濃度技法を用いて、患者の血液から直接回収してもよい。
【０４６９】
アクセス可能な腫瘍を有する患者に関して、全ゲノム配列に迅速にアクセスできる場合、上記手順を用いて、コレストソーム送達小胞での使用のためのポリネオエピトープｍＲＮＡ癌免疫療法抗原構築物を誘導するために、手順を使用する。抗原特異的突然変異は、健康な組織では発現されず、また成熟Ｔ細胞レパートリーによって新抗原として潜在的に認識され得るため、癌免疫療法の理想的な標的である。全ての患者の腫瘍は、全ゲノム配列決定によって最初に同定しなければならない固有の突然変異のセット（「ミュータノーム」）を有する。新抗原は、マウスにおいて良好に機能する注射用ワクチン構築物へと加工される。このアプローチは、パイロットフェーズ１ヒト試験を受けており、単一の患者のワクチン／免疫療法の「即時」生産に基づく治療の進歩であると考えられている。このアプローチの新規の態様は、上記構築物をコレストソーム中にカプセル化し、アジュバントを加えた後、この構築物を回腸に送達して、上記患者のパイエル板の樹状細胞を直接プログラムすることである。このアプローチは革命的なものであり、全てのタイプのコレストソームでカプセル化された抗原を、抗原性物質を求めて遠位腸を監視する樹状細胞に直接取り込ませるという、特異な特性によるものである。
【０４７０】
ここで提案されているアプローチは、理想的には、切除された自己腫瘍を用いて開始され、次世代配列決定、計算免疫学及び合成ゲノミクスの分野の利点を統合して、該腫瘍に対して特異的な、広範なネオエピトープ標的レパートリーを定義する。一度に複数の突然変異を標的化することにより、理論的には、クローンの不均一性及び抗原の逃避といった現在の癌治療薬の開発における重要な問題を解決する道が開かれる可能性がある（２７）。
【０４７１】
この構築物は現在、第１相試験に供されている。従って本発明者らは、回腸への経口送達による、樹状細胞へのコレストソーム送達が、樹状細胞の良好な活性化の可能性を大幅に拡大することにより、安全性の改善において完全に新規のものとなり、かつ極めて重要なものとなると信じている。
【０４７２】
過去にＴ細胞活性化因子としての溶解物によってわずかな成功しか得られていないにもかかわらず、本発明は依然として、ワクチン抗原としての自己腫瘍溶解物の使用に依存している。上記戦略は、腫瘍の再発に対して有効であると期待される。これは、腫瘍溶解物は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（適応免疫応答）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（先天的免疫応答）を刺激できる全ての関連するエピトープを含有するはずであるためである。問題は、樹状細胞の無効なプログラミング、又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原に対するＴ細胞の無効な活性化であると思われる。本発明はこれらの制限を、パイエル板の樹状細胞に対して抗原提示ステップを標的化することによって克服する。本発明は更に、アジュバントによって、並びにパイエル板の樹状細胞が抗原及びアジュバントを更に容易に捕えるよう、抗原及びアジュバントをコレストソーム中にカプセル化することによって、上記樹状細胞の活性化を確実なものとする。本発明は、過去における腫瘍溶解物の末梢注射による樹状細胞の無効な活性化を克服する。
【０４７３】
自己腫瘍を用いて開始されるプロセスとしてのそれ自体の性質により、パイエル板に対して標的化されたコレストソーム中のこれらの抗原の使用は、宿主の非癌性組織及び器官に対するＴ細胞の自己免疫活性化をトリガする可能性が低くなる。同様に、新規に活性化されたＴ細胞に対する患者の免疫系からの攻撃は存在しないはずであるため、ＣＡＲ−Ｔ手順におけるような免疫抑制剤の使用もまた、議論の対象となるはずである。現在のＴ細胞活性化方法のこれらの問題は両方共、本発明では回避される。
【０４７４】
過去における癌の免疫活性化因子としての抗原の皮下注射の使用とは異なり、本発明は経口投与に依存する。しかしながら、回腸内の免疫系プログラミングの部位に到達するために、前部消化管での分解を回避する必要がある。従って抗原を本発明の外側カプセル内で製剤することにより、無傷のままの抗原及び任意でアジュバントの回腸への送達、並びにパイエル板での活性化が得られる。この経口使用の進歩性により、樹状細胞の生体外抗原プログラミングの必要が回避され、また、生体外で適切な量の活性化Ｔ細胞を生成する必要も当然回避される。本質的には、本発明者らははじめて、上記患者の腫瘍自体からの組成物を用いて、該腫瘍に対してＴ細胞をプログラミングし、また全ての活性化及び増殖ステップを、試験管内でサイトカイン発現によって活性であることが確認された後に、生体内で実施する。
【０４７５】
必要な腫瘍の取得量は、少なくとも１グラム、及び好ましくは５グラム以上とする。本発明者らの研究室に到着したら、新鮮な腫瘍を細断し、ＰＢＳで洗浄して血液を除去した後、コラゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｃａｔ＃Ｃ５１３８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて３７℃で少なくとも１時間消化する。続いて小片を１００ｍｍセルストレーナーに通して、単一細胞懸濁液を得る。
【０４７６】
凍結融解サイクルを用いて上記細胞懸濁液から腫瘍溶解物を調製する。抗原性混合物中に生きた細胞が残らないことを確実にするために、最適なサイクル数は５回である。溶解物を調製するための凍結融解方法は、当該技術分野において公知である（２８）。＞１０マイクロメートルの大型粒子を除去するための遠心分離によって、抗原性組成物を更に分離する。この時点で反応混合物にアジュバントを加えてもよい。
【０４７７】
腫瘍溶解物の粗濾過及び膜濃縮画分を、体積およそ１．０ｍｌのＰＢＳ中に懸濁させ、この混合物を、本発明者らによって過去に開示されているように（１３、２９）、コレストソーム中にカプセル化する。
【０４７８】
次にこれらのコレストソームでカプセル化された画分を凍結乾燥し、凍結乾燥済みの材料を、回腸標的化のためのカプセル送達に供する。これらのカプセルは、腫瘍を切除した患者に経口投与で戻され、回腸及び／又は虫垂付近の上行結腸への上記組成物の送達を標的とする。
【０４７９】
消化管中での抗原の分解を克服するために、本発明は、上記腫瘍溶解物抗原を脂質小胞中にカプセル化する。製剤が上記抗原性組成物を回腸で放出し、カプセル化小胞がパイエル板に到達すると、この抗原積載小胞は優先的に樹状細胞に入る。これは、この特性はコレストソーム中でのカプセル化によって伝えられるためである。樹状細胞に入るコレストソーム組成物の周りではエンドソームが形成されないため、コレストソームの外側表面が細胞質中のコレステリル加水分解酵素によって除去されると、抗原及びアジュバントが細胞質中に遊離して、樹状細胞認識及びパッケージングがＴ細胞の活性化中にＴ細胞に提示される。
【０４８０】
この手順によって初めて、樹状細胞を活性化するか又は場合によって腸を吸収されないまま無害に通過する組成物を用いた、回腸での樹状細胞の活性化が可能となる。腫瘍溶解物組成物の経口投与の安全性という利点に加えて、小胞中での上記組成物のカプセル化により、患者の腫瘍に対して活性化Ｔ細胞をプログラミングする役割を負った樹状細胞のみによる、抗原及びアジュバントの取り込みが保証される。
【０４８１】
更に、経口剤形の製造は、現在の注射剤形の製造よりも要求が少なく、患者にとっても当然喜ばしいものとなる。経口使用に対する応答が上記患者の腫瘍の根絶には充分でない場合には、コレストソームでカプセル化された構築物の代替的な送達、例えば腫瘍への直接注射も適用できる。
【０４８２】
腫瘍抗原粒子の調製方法は特に限定されず、適用可能な方法としては例えば：固化した腫瘍組織を粉砕して微小な断片の微粒子を調製する方法；腫瘍組織又は腫瘍細胞の粉砕済み断片を溶解して、溶解物を固体微粒子に固定する方法；抗原ペプチド及び抗原タンパク質などの可溶性腫瘍抗原を固体微粒子に固定する方法などが挙げられる。上記固体微粒子としては例えば、直径約０．０５〜１０００ｍｕ．ｍの鋼鉄粉末、炭素粉末、ポリスチレンビーズなどを使用できる。使用可能な微粒子としては、食作用を可能とするために抗原提示細胞によって微粒子として認識されるようにリポソームなどの脂質粒子に結合した、粉砕した組織断片、腫瘍細胞若しくは可溶性腫瘍抗原、又は結合剤若しくは架橋剤を用いて可溶性腫瘍抗原自体を互いに結合させることによって得られた微粒子が挙げられる。
【０４８３】
腫瘍成分の混合物を含有するコレストソーム小胞のサイズは特に制限されないが、生体内での受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞内に容易に通過できるサイズが望ましい。元々小型の単一細胞の状態である固定された腫瘍細胞を粉砕する必要はない。しかしながら、細胞が固定作業中に凝集した場合は、粉砕又は分散処理を適用することが望ましい。粉砕又は分散処理のためには、ホモジナイザーによる処理、超音波処理、消化酵素による部分的消化などを用いることができる。１０００マイクロメートル以下、好ましくは３８０マイクロメートル以下の孔径を有するスクリーンを通過させることによって、微粒子を調製することもできる。これらの微粒子の調製は当業者には公知であり、当業者は、単一の適切な方法又は複数の方法の組み合わせによって、微粒子を調製できる。
【０４８４】
固化した腫瘍材料から溶解物を調製するための方法として、例えばタンパク質分解酵素を使用する方法を適用できる。タンパク質分解酵素の例としては、プロテイナーゼＫが挙げられる。タンパク質分解酵素以外の酵素、酸、アルカリなどの適切な組み合わせを使用する方法を利用してもよい。固化した腫瘍材料の溶解を実現できるいずれの方法を採用してもよく、当業者は適切な方法を選択できる。溶解物は、上述のように固体微粒子に固定してもよい。
【０４８５】
コレストソームでカプセル化された免疫療法剤の経口回腸送達
回腸を標的にしたコレストソームでカプセル化された免疫療法構築物、及びコレストソームでカプセル化されたＬＰＳなどのアジュバントの、上記経口送達は、本発明者らによって癌ワクチンの送達手段として過去に開示されている、腸溶コーティング済み回腸標的化カプセルを用いて実現される。開示されているこの経口送達カプセルは、その外側内容物を回腸で放出し、その内側内容物を虫垂の部位の右結腸で放出するように、特別にコーティングされている（３０）。コレストソームでカプセル化された構築物に対するこの送達の適用は過去に試みられていないため、上記開示はその全体が参照によって本出願に援用される。
【０４８６】
本発明の特定の実施において、コレストソームでカプセル化された画分及びＬＰＳ又は他のアジュバントを内包する経口送達カプセルは、監視及び粘膜表面免疫防御を担う多くの樹状細胞を有する濃縮リンパ組織であるパイエル板の部位である回腸において、これらの画分を放出することを標的とする。回腸は、樹状細胞によって仲介されるＴ細胞免疫の部位である。任意で、内側カプセルは、Ｂ細胞免疫の刺激のために、右結腸の虫垂において放出される。
【０４８７】
チェックポイント阻害剤との併用治療
これらの経口コレストソーム画分治療（又は充填剤のみを含むカプセルからなる同一のプラセボ）を投与される患者は、任意で、ＰＤ−１モノクローナル抗体（例えばニボルマブ、ペンブロリズマブ）、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（例えばアテゾリズマブ）、及び任意でＣＴＬＡ−４抗体（例えばイピリムマブ）を投与される。患者はまた任意で、ＩＬ−２、又はインターフェロンなどの一般的な免疫系活性化因子による、サイトカイン刺激を受けてもよい。これら後者の治療のうちの１つ以上は、それぞれの製造元の指示に従って非経口投与される。インターロイキン２（ＩＬ−２）及びイピリムマブによる非特異的免疫刺激は、持続的な癌の退縮につながり得るものの、各作用剤に関する全体としての腫瘍応答率は低く（高用量ＩＬ−２に関して１６％、及びイピリムマブに関して１１％）；完全応答（ＣＲ）率は１０％未満である。イピリムマブと高用量ＩＬ−２との併用治療を受けた黒色腫患者３６人の予備試験では、全応答（ＯＲ）率が２５％であり、１７％は８年超にわたって持続するＣＲを達成したが、このＩＬ−２＋イピリムマブの組み合わせは、これらの結果と確認するための更なる試験が行われていない。抗ＰＤ１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体は現在のところ、黒色腫患者においてそれぞれ最高３８％及び１７％のＯＲ率を有し、イピリムマブと組み合わせた場合に最高４０％のＯＲ率を有することが報告されているが、応答の長期持続性はまだ分かっていない。
【０４８８】
腫瘍溶解物積載樹状細胞（ＤＣ）による免疫療法は、抗腫瘍免疫応答を誘導するための最も有望な戦略の１つであるが、細胞傷害性Ｔ細胞の抗腫瘍活性は、チェックポイント阻害剤経路である阻害性Ｔ細胞共受容体細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）の発現によって抑制され得る。この抑制の緩和によってＣＴＬＡ−４遮断抗体は腫瘍拒絶を促進するが、上記抗体の最も好適な用途の全範囲は、また完全には決定されていない。
【０４８９】
チェックポイント阻害剤を腫瘍溶解物と併せて研究した者もいる。Ｃ３Ｈマウス骨肉腫（ＬＭ８）モデルにおける前臨床概念は、ＣＴＬＡ−４遮断が原発腫瘍において、低温処理済み腫瘍溶解物パルス化ＤＣと協働することにより、肺転移の増殖を防止するというものである。免疫応答活性化を評価するために、筆者らは、Ｃ３Ｈマウス（合計６０匹）の以下の４つのグループを確立した：ｉ）対照免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）処置マウス；ｉｉ）腫瘍溶解物パルス化ＤＣ処置マウス；ｉｉｉ）抗ＣＴＬＡ−４抗体処置マウス；並びにｉｖ）腫瘍溶解物パルス化ＤＣ及び抗ＣＴＬＡ−４抗体処置マウス。腫瘍溶解物パルス化ＤＣ及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与されたマウスは、転移性腫瘍内での制御性Ｔリンパ球の数の減少及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の数の増加、転移成長の阻害、寿命の延長、脾臓内での制御性Ｔリンパ球の数の減少、並びに高い血清インターフェロン−ガンマレベルを示した。抗ＣＴＬＡ−４抗体と腫瘍溶解物パルス化ＤＣとの組み合わせは、全身性免疫応答を増強させた。これらの知見は、腫瘍溶解物パルス化ＤＣとＣＴＬＡ−４遮断抗体との組み合わせの骨肉腫における効果を初めて文書化したものである。著者らは、低温処理済み腫瘍溶解物パルス化ＤＣが、それだけでは不十分であるものの、臨床現場の患者の骨肉腫において、ＣＴＬＡ−４遮断と組み合わせると、転移性病変の拒絶を仲介でき、かつ疾患の再発を防止できることを示唆している（３１）。
【０４９０】
腫瘍溶解物によるこれらの有望な結果に鑑みて、チェックポイント阻害剤を別個の治療として溶解物と組み合わせてもよく、あるいはチェックポイント阻害剤を、樹状細胞、Ｔ細胞又は癌細胞表面の受容体に直接到達する手段としてコレストソームに加えてもよい。これらの化合物は通常モノクローナル抗体であり、本明細書で提示されているコレストソームでのカプセル化に供されるモノクローナル抗体の例は、同様のサイズの分子の良好なカプセル化、及び細胞モデルにおける細胞内送達を示す。
【０４９１】
従って本発明の好ましい態様は、腫瘍抗原及びチェックポイント阻害剤の両方を、アジュバントと共に、本発明の経口送達カプセルに含めることである。
【０４９２】
腫瘍による高レベルのＰＤ−１発現を克服するために設計された更なる実施形態では、コレストソーム中にカプセル化された抗原性混合物は、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に対して特異的なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する。ヒトＴ細胞表面のＰＤの−１リガンドのｓｉＲＮＡを介したノックダウンは、ＩＦＮ−γ産生及びＣＴＬ活性を含むこれらの細胞の機能を増強する。従って本発明者らは、ｓｉＲＮＡのコレストソームでカプセル化された抗ＰＤ−１オリゴを、パイエル板に送達される組成物に組み込むことによって、活性化Ｔ細胞の表面における標的ＰＤ−１発現タンパク質の細胞表面及びｍＲＮＡ発現を低減する。ｓｉＲＮＡオリゴによるＰＤ−１リガンドの低減は、リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲによって確認される。上記ｓｉＲＮＡを組成物に加えると、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在、及びＴ細胞クローンによるＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２発現のｓｉＲＮＡ関連ノックダウンに関して検査された上清により、ＩＦＮ−γ産生の増大が明らかになる。更にｓｉＲＮＡトランスフェクトＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、試験管内溶解物抗原に対する溶解活性の上昇を示す。
【０４９３】
ＰＤ−１遮断因子に加えて、腫瘍抗原に対して樹状細胞を更に活性化するために、コレストソームでカプセル化された混合物中にＴ細胞励起性サイトカインを組み込むことが、別の実施形態である。ＩＬ−２及びＩＬ−１２は、両方のサイトカインが日常的使用において腫瘍に対してＴ細胞を励起することが分かっているため、この目的に好適である。腫瘍溶解物、ＰＤ−１抗体及びＩＬ−１２などのサイトカインを含めるためのコレストソームでカプセル化された組成物の回腸送達は、本発明の範囲内である。
【０４９４】
更なる実施形態は、樹状細胞などの抗原提示細胞を活性化してＴ細胞プライミングを改善する刺激物質を含めることである。このような物質は、ＴＬＲ９アゴニスト、最近開示されたＩＭＯ−２１２５などである。現在、ＩＭＯ−２１２５は腫瘍微小環境に注射されており、従ってイピリムマブ又はペンブロリズマブなどのチェックポイント阻害剤との併用療法で投与される。予備臨床試験では、腫瘍内に注射されたＩＭＯ−２１２５は、形質細胞様樹状細胞を刺激して、多量のインターフェロンアルファ及びヘルパーＴ細胞−１サイトカインを誘発し、これは腫瘍微小環境における免疫細胞浸潤の増加をもたらした。更に、腫瘍内ＩＭＯ−２１２５と抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１抗体との組み合わせは、各作用剤単独の場合と比較して、全身的な腫瘍制御の改善をもたらした。コレストソームでカプセル化されたＩＭＯ−２１２５の使用は、樹状細胞を強く刺激することによって、この物質が腫瘍に注射された場合に活性化ステップを改善すると期待される。回腸の樹状細胞に送達されるものとしてコレストソームでカプセル化されたＩＭＯ−２１２５を使用することは、本発明の範囲内である。コレストソームでカプセル化されたＩＭＯ−２１２５は、全身に注射される有効量のチェックポイント阻害剤と組み合わせて、あるいはチェックポイント阻害剤に対する腫瘍の応答性を増強するために、経口投与されるコレストソームでカプセル化されたチェックポイント阻害剤と組み合わせて、投与される。
【０４９５】
上記免疫療法を受ける全ての患者は、生体内腫瘍応答性に関して、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に関して、フローサイトメトリー法を用いて監視される。腫瘍の溶解／退縮は、ＲＥＣＩＳＴによって、並びに腫瘍のＴ細胞浸潤並びに溶解及び退縮を示すための反復生検によってその機序が、文書化される。
【０４９６】
フローサイトメトリー法
ＭＣＦ−７細胞を、処理の１日前に、１２ウェルプレート上に、１ウェル当たり７５０，０００細胞の量で配置した。翌日、培地を除去し、温かい（３７℃）リンガー緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。細胞を、補充された血清非含有ＤＭＥＭ中で１時間血清飢餓状態にし、続いて２．３ｕｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−コレストソームを、血清非含有ＤＭＥＭを内包したウェルに三重に加えた。３つのウェルは、未染色対照として利用するために、処理を行わなかった。プレートを、図１に示されている時間にわたって３７℃でインキュベートした。処理後、ウェルを氷冷リンガー緩衝液で４回洗浄した。細胞を上述のようにフローサイトメトリー用に調製した。これらの研究ではＤＲＡＱ５（核染色）は使用されなかった。これは、本発明者らが定義した単一細胞ゲートにおける事象の＞９０％がＤＲＡＱ５に関して陽性に染色されることを、本発明者らは以前に発見していたためである。
【０４９７】
４．５時間＋ＦＢＳに関して、細胞を上述のように処置した：ウェルを洗浄し、細胞を処理の１時間前に飢餓状態とした。細胞をＦＩＴＣ−コレストソームで４．５時間インキュベートした後、ＦＢＳを、最終濃度が１０体積％となるように、ウェルに添加した。これらのウェル内の総体積は５０ｕＬ増加し、初期ＦＩＴＣ−コレストソーム濃度であったものが２．１ｕｇ／ｍＬまで希釈された。細胞をＦＩＴＣ−コレストソームで合計２４時間インキュベートした後、フローサイトメトリーのために調製した。
【０４９８】
ＦＩＴＣ−コレストソームは、ＭＣＦ−７細胞内での時間依存性蓄積を示し、測定可能な取り込みが処理の３０分前に検出された。本発明者らは定常状態の動態を達成できなかったが、これはこれらの研究に使用した濃度が原因であり得る。特に、ＦＩＴＣ−コレストソームを加えた４．５時間後にＦＢＳの添加を受けた細胞は、有意な小胞取り込みを示した。平均蛍光強度は血清飢餓細胞より有意に低く、これは（１）（ＦＢＳの添加による）試料の希釈、及び（２）細胞成長によるシグナルの薄弱化（血清飢餓細胞は成長が停止している）によるものであり得る。本発明者らは、最初のフローサイトメトリーデータを提供することにより、ＦＩＴＣ濃度２．３ｕｇ／ｍＬでのＭＣＦ−７細胞中のＦＩＴＣ−コレストソームの時間依存性取り込みを支持する。これらの結果は、蛍光顕微鏡検査を用いて、及び／又は細胞溶解後に蛍光光度計で細胞内ＦＩＴＣ濃度を測定することにより、確認される。
【産業上の利用可能性】
【０４９９】
上述のように、本明細書に記載の組成物及び方法により、特定の患者における特定の腫瘍の殺滅を増強するための、優れた、及び十分に特性決定された、抗原性の、任意でアジュバントを含む組成物を提供できる。一般に適用可能な抗原の一部は、腫瘍自体の試料採取を行わずに本発明の実施を可能とし得るが、これらは応用であり、必ずしも本明細書の好ましい実施形態ではない。本開示の個別化された経口免疫療法は、患者に対して使用する準備ができたものであるが、市販前に規制当局による承認を必要とする。
【０５００】
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【図１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３５Ａ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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