【手続補正書】
【提出日】平成19年5月7日(2007.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多細胞性代用組織集成体をイニシエート、培養、操作及び検定するための微小流体デバイスであって、
少なくとも１つの微小流体チャネル、前記チャネルに窪みを有する少なくとも１つのチャンバー、少なくとも１つが対照スフェロイドであり少なくとも１つが非対照スフェロイドである少なくとも２つのスフェロイド、液体培地、並びにデバイスのチャネル及びチャンバーの各々を通る培地の流れを提供する手段を含み、任意で、前記スフェロイドを所定の位置に保持すると同時に前記スフェロイドを通り過ぎた培地の流れを維持するための手段としての少なくとも１つの窪み又は障壁を含んでいてもよい、前記デバイス。
【請求項２】
非対照スフェロイドの導入及び抽出のための少なくとも１つのポートを含む、請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
多細胞性代用組織集成体をイニシエート、培養、操作及び検定するための微小流体デバイスであって、
少なくとも１つの微小流体チャネル、前記チャネルに窪みを有する少なくとも１つのチャンバー、少なくとも１つのスフェロイド、液体培地、デバイスのチャネル及びチャンバーの各々を通る培地の流れを提供する手段、並びに少なくとも１つのスフェロイドの移動を促し且つ栄養状態を助けることができる細胞の滋養になる試薬を含む、前記デバイス。
【請求項４】
多細胞性代用組織集成体をイニシエート、培養、操作及び検定するための微小流体デバイスであって、
少なくとも１つの微小流体チャネル、前記チャネルに窪みを有する少なくとも１つのチャンバー、少なくとも１つのスフェロイド、液体培地、並びにデバイスのチャネル及びチャンバーの各々を通る培地の流れを提供する手段を含み、前記液体培地が可逆的な、継続的な又はパルス状の流速を有する、前記デバイス。
【請求項５】
多細胞性代用組織集成体をイニシエート、培養、操作及び検定するための微小流体デバイスであって、
少なくとも１つの微小流体チャネル、前記チャネルに窪みを有する少なくとも１つのチャンバー、少なくとも１つのスフェロイド、液体培地、デバイスのチャネル及びチャンバーの各々を通る培地の流れを提供する手段、並びに前記スフェロイドを所定の位置に保持すると同時に前記スフェロイドを通り過ぎた培地の流れを維持するための手段としての少なくとも１つの障壁を含む、前記デバイス。
【請求項６】
スフェロイドを選別するためのスフェロイド選別障壁をさらに含み、選別がサイズによって行われる、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
多細胞性代用組織集成体をイニシエート、培養、操作及び検定するための微小流体デバイスであって、
少なくとも１つの微小流体チャネル、前記チャネルに窪みを有する少なくとも１つのチャンバー、少なくとも１つのスフェロイド、液体培地、並びにデバイスのチャネル及びチャンバーの各々を通る培地の流れを提供する手段を含み、少なくとも１つのチャネルが培地の多成分層流動流を確立するために用いられ、前記培地の少なくとも２成分が前記スフェロイドの別個の部分に接触できる、前記デバイス。
【請求項８】
少なくとも１つのチャンバー、少なくとも１つのチャネル又はそれらの組合せに、繊維芽細胞が播種される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
チャンバー及びチャネルに播種された繊維芽細胞が、スフェロイドを培養するのに用いることができる、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
スフェロイドが異型スフェロイドである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
スフェロイドが細胞からなっている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
細胞が、繊維芽細胞種、内皮細胞種、正常上皮細胞種及び新生物発生前上皮細胞種からなる群より選択される、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
細胞が上皮細胞、支質細胞、又は２つの異なる細胞の共培養物である、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１４】
細胞が乳房起源の細胞である、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
細胞が、コラーゲン、合成若しくは天然のECM混合物、及びそれらの混合物からなる群より選択される細胞外基質（ECM）に埋め込まれている、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１６】
細胞の種類が、初代培養物又は樹立された細胞株、正常な又は悪性の細胞、及び疾患過程の種々の段階を表している細胞からなる群より選択される、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１７】
細胞の種類が乳房細胞である、請求項１３に記載のデバイス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
微小流体デバイスに通常の細胞培養法を適応させるのに重要な幾つかのキーパラメータとしては、例えば、播種材料の蒔かれる細胞の数、ECM層の体積/厚さ、及び培地交換の頻度が上げられる。微小流体チャンバーで繊維芽細胞単一層及び上皮オルガノイドを作成するのに必要な細胞の数は経験的に決定され、指針としては、24ウェルプレートに用いられる播種細胞密度からの縮尺が有用である(11)。顕微鏡実験に対しては最小限の厚さ（100 μMより薄い）が最も望ましく、ECM中に部分的に埋め込まれているだけの場合でも、充分な構造を有する上皮オルガノイドが形成されるであろう（3、12）。しかしながら、支質区画及び上皮区画を別々に扱える能力は、層が薄すぎる場合には損なわれ得る。また、微小流体デバイスにおける表面積対体積の比率は、通常の細胞培養の場合よりも大きく、よって、培地及び/又は酸素がより迅速に消費されて、より頻繁な交換か又は一定の流量を必要とする。
上述する本発明の好ましい実施態様は、具体的には、以下の通りである。
（実施態様１）
微小流体デバイスと少なくとも１つの三次元多細胞性代用組織集成体とを含む微小規模の流体ハンドリングシステムであって、
前記デバイスが、前記システムの組織集成体の各々をイニシエート、培養、操作及び検定するのに使用される、前記流体ハンドリングシステム。
（実施態様２）
デバイスが少なくとも１つの微小流体チャネルと少なくとも１つのチャンバーとを含み、前記チャンバーの壁は細胞層で裏打ちされており、前記デバイスのチャネル及びチャンバーの各々を通って液体培地が流れる、実施態様１のシステム。
（実施態様３）
少なくとも１つの多細胞性代用集成体がスフェロイドである、実施態様１のシステム。
（実施態様４）
デバイスが、液相光重合、電気マイクロモールディング、及びシリコン/ガラスミクロ機械加工からなる群より選択される方法を用いて組立てられている、実施態様１のシステム。
（実施態様５）
デバイスが、ポリジメチルシラン、イソボロニルアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ヒドロゲル、ガラス及びシリコンからなる群より選択される化合物を含む組立てデバイスである、実施態様４のシステム。
（実施態様６）
スフェロイドが、支質の上皮細胞浸潤、上皮-間葉移行、又は血管新生を介する腫瘍発生過程をモデリングするのに用いられる、実施態様１のシステム。
（実施態様７）
スフェロイドが、乳房の腫瘍発生におけるin situ腺癌腫から浸潤癌への移行をモデリングするのに用いられる、実施態様６のシステム。
（実施態様８）
スフェロイドが病状をモデリングするのに用いられる、実施態様６のシステム。
（実施態様９）
病状が癌である、実施態様６のシステム。
（実施態様１０）
癌が乳癌である、実施態様６のシステム。
（実施態様１１）
多細胞性代用組織集成体をイニシエート、培養、操作及び検定するための微小流体デバイスであって、
少なくとも１つの微小流体チャネル、少なくとも１つのチャンバー及び少なくとも１つのスフェロイドを含み、前記チャンバーの壁は細胞層で裏打ちされており、デバイスのチャネル及びチャンバーの各々を通って液体培地が流れる、前記デバイス。
（実施態様１２）
少なくとも１つのスフェロイドが非対照スフェロイド及び対照スフェロイドを含む、実施態様１１のデバイス。
（実施態様１３）
非対照スフェロイドの導入及び抽出のための少なくとも１つのポートを含む、実施態様１２のデバイス。
（実施態様１４）
スフェロイドの移動を促し且つ栄養状態を助けることができる細胞の滋養になる試薬を有する、実施態様１３のデバイス。
（実施態様１５）
液体培地が、可逆的な、継続的な又はパルス状の流速を有する、実施態様１４のデバイス。
（実施態様１６）
スフェロイドを所定の位置に保持するのと同時に前記スフェロイドを通り過ぎた培地の流れを維持するための、少なくとも１つの障壁を含む、実施態様１５のデバイス。
（実施態様１７）
スフェロイドを選別するためのスフェロイド選別障壁をさらに含み、選別がサイズによって行われる、実施態様１６のデバイス。
（実施態様１８）
少なくとも１つのチャネルが培地の多成分層流動流を確立するために用いられ、培地の少なくとも２成分がスフェロイドの別個の部分に接触できる、実施態様１５のデバイス。
（実施態様１９）
スフェロイドが、脂質の上皮細胞浸潤、上皮-間葉移行、又は血管新生を介する腫瘍発生過程をモデリングするのに用いられる、実施態様１１のデバイス。
（実施態様２０）
スフェロイドが、乳房の腫瘍発生におけるin situ腺癌腫から浸潤癌への移行をモデリングするのに用いられる、実施態様１１のデバイス。
（実施態様２１）
スフェロイドが、病状をモデリングするのに用いられる、実施態様１１のデバイス。
（実施態様２２）
病状が癌である、実施態様２１のデバイス。
（実施態様２３）
癌が乳癌である、実施態様２２のデバイス。
（実施態様２４）
少なくとも１つのチャンバー、少なくとも１つのチャネル又はそれらの組合せが、スフェロイドの形成及び成長を惹起する、実施態様１１のデバイス。
（実施態様２５）
少なくとも１つのチャンバー、少なくとも１つのチャネル又はそれらの組合せに、繊維芽細胞が播種される、実施態様１１のデバイス。
（実施態様２６）
チャンバー及びチャネルに播種された繊維芽細胞が、スフェロイドを培養するのに用いることができる、実施態様２５のデバイス。
（実施態様２７）
スフェロイドが異型スフェロイドである、実施態様１１のデバイス。
（実施態様２８）
スフェロイドが細胞からなっている、実施態様１１のデバイス。
（実施態様２９）
細胞が、繊維芽細胞種、内皮細胞種、正常上皮細胞種及び新生物発生前上皮細胞種からなる群より選択される、実施態様２８のデバイス。
（実施態様３０）
多細胞性代用組織集成体をイニシエート、培養、操作及び検定するための微小流体デバイスであって、
細胞層で裏打ちされている２つの隣接するチャンバーを含み、各チャンバーは別個の組織を表すスフェロイドを含み、また各チャンバーは組織に特異的な液体培地を含む、前記微小流体デバイス。
（実施態様３１）
細胞が上皮細胞、支質細胞、又は２つの異なる細胞の共培養物である、実施態様２５のデバイス。
（実施態様３２）
細胞が乳房起源の細胞である、実施態様３１のデバイス。
（実施態様３３）
細胞が、コラーゲン、マトリゲルなどの合成若しくは天然のECM混合物、及びそれらの混合物からなる群より選択される細胞外基質（ECM）に埋め込まれている、実施態様３１のデバイス。
（実施態様３４）
細胞の種類が、初代培養物又は樹立された細胞株、正常な又は悪性の細胞、及び疾患過程の種々の段階を表している細胞からなる群より選択される、実施態様３１のデバイス。
（実施態様３５）
細胞の種類が乳房細胞である、実施態様３１のデバイス。
（実施態様３６）
腫瘍発生過程をモデリングするために実施態様１１のデバイスを使用する方法であって、
前記過程は、上皮細胞による支質区画の浸潤、上皮-間葉移行又は血管新生を含む前記方法。
（実施態様３７）
腫瘍発生過程が、乳癌でのin situ腺癌腫から浸潤癌への移行である、実施態様３６の方法。
（実施態様３８）
スフェロイドが、新生物プログレッションのモデルとしての機能を果たす、実施態様３６の方法。
（実施態様３９）
代用組織集成体を用いて被検作用物質のハイスループットスクリーニングを行う方法であって、
流体流動チャネル及びチャンバーを含む微小流体デバイスを作製する工程；
哺乳動物細胞の複数の細胞型の代用組織集成体を作製する工程；
デバイスのチャンバー内に代用組織集成体を配置する工程；
被検作用物質を、流体流動チャネルを通じて代用組織集成体まで導く工程；並びに、
代用組織集成体の応答を観察する工程；
を含む前記方法。
（実施態様４０）
応答が、スフェロイド成長の変化、遺伝子発現の変化、酵素活性の変化、細胞マーカーの変化、スフェロイドから分泌される産物の変化、観察される形態変化、組織浸潤及び転移における変化、又はそれらの組合せである、実施態様３９の方法。
（実施態様４１）
応答が、成長シグナルの自給率、成長阻害に対する非感受性、血管新生、アポトーシスの回避、組織浸潤及び転移、又はそれらの組合せを含む、実施態様３９の方法。
（実施態様４２）
被検作用物質に対する多細胞性組織の反応を模倣するためのハイスループットスクリーニングシステムであって、
複数の流体流動チャネルと複数個のチャンバーとを有する微小流体デバイス；及び
生きている哺乳動物細胞の生物学的特徴を備えている複数の代用組織集成体；
を含み、代用組織集成体の各々は前記チャンバーの１つに位置している、前記システム。