(57)【要約】  本発明は、光化学的内在化法を含むヒト患者における胆管癌を処置する方法における使用のためのＴＰＣＳ2a、ゲムシタビン、および場合によっては別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、を提供する。本発明を実施するための関連キットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者における胆管癌を処置する方法であって、
ｉ）前記患者へ０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量までＴＰＣＳ2aを全身投与することと、
ｉｉ）３〜５日後に、ゲムシタビンを５００〜１５００ｍｇ／ｍ2の用量まで全身投与し、かつ１０〜６０Ｊ／ｃｍの光線量を提供するために前記胆管癌の３ｃｍ以内に配置された光ファイバーを用いて６４０〜６６５ｎｍの波長の光を前記胆管癌に照射することと、場合によっては
ｉｉｉ）１〜４０日後に（好ましくは７〜２１日後に）ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチンを全身投与することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＴＰＣＳ2aは、０．０５〜０．３ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．２〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量まで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｉｉ）における前記ゲムシタビンは、９００〜１１００ｍｇ／ｍ2の用量まで投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記照射は、ゲムシタビン投与の開始の４時間以内に実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記光の波長は６５２ｎｍである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記光線量は１０〜４５Ｊ／ｃｍ、好ましくは２５〜３５Ｊ／ｃｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｉｉｉ）において、ゲムシタビン、および別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、はいずれも投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｉｉｉ）において、前記ゲムシタビンは、５００〜１５００ｍｇ／ｍ2、好ましくは９００〜１１００ｍｇ／ｍ2の用量まで投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｉｉｉ）において、前記細胞毒性薬は、１０〜５０ｍｇ／ｍ2、好ましくは２０〜３０ｍｇ／ｍ2の用量まで投与されるシスプラチンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｉｉｉ）において、前記ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、は、１回超投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、は、ステップｉ）およびｉｉ）の１〜４０日後に１４〜３０日周期で１回超（好ましくは２回）投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、は、１４〜３０日周期の少なくとも３周期、好ましくは少なくとも５周期において、１回以上（好ましくは２回）投与され、該第１の１４〜３０日周期はステップｉ）およびｉｉ）の１〜４０日後に続く、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は少なくとも２回実施され、好ましくはステップ（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｉｉ）の各回において、ステップ（ｉｉｉ）は少なくとも２回実施される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＰＣＳ2a、ゲムシタビンおよび別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、のうちの１つ以上の全身投与は、静脈内である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
シスプラチンは、前記処置において使用されていない、請求項１〜８または１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト患者における胆管癌の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、であって、
ｉ）前記ＴＰＣＳ2aが、前記患者へ０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量まで全身投与され、
ｉｉ）３〜５日後に、前記ゲムシタビンが、５００〜１５００ｍｇ／ｍ2の用量まで全身投与され、かつ前記胆管癌が、１０〜６０Ｊ／ｃｍの光線量を提供するために前記胆管癌の３ｃｍ以内に配置された光ファイバーを用いて６４０〜６６５ｎｍの波長の光を照射され、かつ場合によっては
ｉｉｉ）１〜４０日後に（好ましくは７〜２１日後に）ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、が、前記患者へ全身投与される、
ゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン。
【請求項１７】
前記ＴＰＣＳ2aは、０．０５〜０．３ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．２〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量まで投与される、請求項１６に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項１８】
ステップｉｉ）における前記ゲムシタビンは、９００〜１１００ｍｇ／ｍ2の用量まで投与される、請求項１６または１７に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項１９】
前記照射は、ゲムシタビン投与の開始の４時間以内に実施される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２０】
前記光の波長は６５２ｎｍである、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２１】
前記光線量は、１０〜４５Ｊ／ｃｍ、好ましくは２５〜３５Ｊ／ｃｍである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２２】
ステップｉｉｉ）において、ゲムシタビンおよび別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、はいずれも投与される、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２３】
ステップｉｉｉ）において、前記ゲムシタビンは、５００〜１５００ｍｇ／ｍ2、好ましくは９００〜１１００ｍｇ／ｍ2の用量まで投与される、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２４】
ステップｉｉｉ）において、前記細胞毒性薬は、１０〜５０ｍｇ／ｍ2、好ましくは２０〜３０ｍｇ／ｍ2の用量まで投与されるシスプラチンである、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２５】
ステップｉｉｉ）において、前記ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、は、１回超投与される、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２６】
前記ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、は、ステップｉ）およびｉｉ）の１〜４０日後に続く１４〜３０日周期において１回超（好ましくは２回）投与される、請求項２５に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２７】
前記ゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、は、１４〜３０日周期の少なくとも３周期、好ましくは５周期において、１回以上（好ましくは２回）投与され、該第１の１４〜３０日周期は、ステップｉ）およびｉｉ）の１〜４０日後に続く、請求項２４または２５に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２８】
ステップ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、少なくとも２回実施されることになっており、好ましくはステップ（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｉｉ）の各回において、ステップ（ｉｉｉ）が少なくとも２回実施される、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項２９】
ゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、のうちの１つ以上の全身投与は、静脈内である、請求項１６〜２８のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項３０】
シスプラチンは、前記処置において使用されない、請求項１６〜２３および２５〜２９のいずれか１項に記載の処置に使用するためのゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬。
【請求項３１】
好ましくは、患者における胆管癌を処置するために、同時に、別個に、または連続して使用される、請求項１〜３、８、９、１６〜１８、２３または２４のいずれか１項で規定されるゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては別の細胞毒性薬を含む、キットであって、好ましくは、前記使用が請求項１６〜３０のいずれか１項で規定されるものである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者へＴＰＣＳ2aを全身投与することと、その後にゲムシタビンを全身投与することと、適切に配置された光ファイバーを介して胆管癌を照射することとを含む、患者における胆管癌を処置する方法に関する。この処置は、ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、のさらなる全身投与と併用されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
胆管癌（Bile duct cancer）（胆管癌（cholangiocarcinoma（ＣＣＡ））ともいわれる）は、稀有だが通常致命的な疾患である。ＣＣＡは、肝内ＣＣＡと肝外ＣＣＡとに区分され、後者は、肝門周囲ＣＣＡおよび遠位ＣＣＡへと細区分されることがある。ＣＣＡの９０％超は腺癌である。ＣＣＡは、人口においておよそ１．７／１００，０００の発症率を有する。より高い罹病率がアジアにおいて、特に中国において認められる。米国および欧州単独における新たな症例の数は、年間およそ１１，０００である。ＣＣＡの６０〜８０％は、肝外であり、これらの７０〜８０％は、治癒的切除のための候補ではない。５年生存率は５％未満であり、腫瘍が手術不能であるときは０％である。手術不能のＣＣＡについての平均生存率は１２か月である。
【０００３】
現に、ＣＣＡは、手術、ステント術および／または化学療法によって管理される。手術は、ＣＣＡのための唯一の潜在的な治癒的処置である。しかしながら、症状が呈された時点では、腫瘍の１／３未満しか摘出可能でない。内視鏡ステント術は、切除不能の疾患に罹患している患者における緩和的な胆管ドレナージのために選択する手順である。ＣＣＡ処置について承認された化学療法はない。推奨される化学療法処置は、ゲムシタビン（gemcitabine）およびシスプラチン(cisplatin)の組み合わせを含むが、治癒的ではない。Ｖａｌｌｅら，２０１０，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｄ．，３６２，ｐｐ  １２７３〜１２８１は、シスプラチンおよびゲムシタビンを、局所的に進行した胆管癌または転移した胆管癌に罹患している患者へ投与して、全生存率の中央値が１１．７か月に到達した実験を報告している。
【０００４】
ＣＣＡ、特に手術不能であり治癒的処置が存在しないＣＣＡのための処置についての大いなる必要性が残されている。
【０００５】
光化学的内在化（ＰＣＩ）は、サイトソルへの分子の送達を改善する公知の技術である。これを用いて細胞の機能に影響する分子（例えば、細胞を殺滅するための細胞毒性分子）を内在化したり、または細胞表面上に当該分子の提示を、例えば、ワクチン接種の方法において行わせたりすることができる。ＰＣＩとは、光増感剤を活性化するための照射ステップと組み合わせて当該薬剤を使用する技術であり、細胞へ同時投与される分子の、細胞のサイトソルへの放出を達成することが知られている。この技術は、細胞によってエンドソームなどの小器官へと取り込まれた分子を、照射後にこれらの小器官からサイトソルへと放出することを可能にする。ＰＣＩは、結果として広範な細胞崩壊または細胞死を生じない様式で、本来なら膜不透過性（または難透過性）である分子を細胞のサイトソルへと導入するための機序を提供する。
【０００６】
光化学的内在化（ＰＣＩ）の基本的な方法は、ＷＯ９６／０７４３２およびＷＯ００／５４８０２において説明されており、これらは参照により本明細書に援用される。このような方法においては、内在化される分子（本発明においては細胞毒性薬であろう）、および光増感剤を、細胞と接触させる。光増感剤および内在化される分子は、細胞内の細胞膜結合性サブコンパートメントに取り込まれ、すなわち、これらは、細胞内小胞（例えば、リソソームまたはエンドソーム）にエンドサイトーシスされる。適切な波長の光への細胞の曝露の際に、光増感剤は活性化されて、活性種を直接的にまたは間接的に発生させ、細胞内小胞の膜を破壊する。このことによって、内在化した分子をサイトソルへと放出することが可能となる。
【０００７】
このような方法において、大部分の細胞の機能性または生存度が悪影響を受けることはないことが認められた。したがって、治療薬を含む種々の異なる分子をサイトソル、すなわち細胞の内部へと輸送するために、「光化学的内在化」と名付けられるこのような方法の有用性が提唱された。
【０００８】
ＰＣＩは、幅広い種々の巨大分子、ならびにＩ型リボソーム不活性化タンパク質、免疫毒素、ブレオマイシン（ブレノキサン（Blenoxane）（登録商標））およびドキソルビシンのような化学療法薬、遺伝子をコードするプラスミドおよびオリゴヌクレオチドを含む、形質膜を容易に貫通することのない他の分子の生物活性を亢進することが示されてきた。対応する光力学的療法（ＰＤＴ）よりも深部の組織層において細胞毒性を誘導することが認められてきた。標的へ向かう治療薬と、固形腫瘍において優先的に蓄積する光増感剤によって誘導される光活性化サイトソル送達との組み合わせにより、ＰＣＩは、非常に特異的であることができ、このことは、抗腫瘍効果の亢進にも寄与する。
【発明の概要】
【０００９】
先に記載したように、ＣＣＡには、患者の平均余命を今のところ限定的に改善する既存の方法に対し、代替案を提供することができる医学的処置が必要である。本発明はこの必要性に対処する。
【００１０】
本件の発明者らは、驚くべきことに、本明細書で定義する用量での光増感剤ＴＰＣＳ2a、およびゲムシタビンの使用と、光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を用いた照射と、を包含する方法が、標準的な処置と比較して有意な改善をもたらすことを発見した。後述の実施例においてより詳細に説明するように、処置の６か月後で病変の８０％超が縮小し、病変の５０％超がもはや検出不可能であったことを実証した。このことは、ＣＣＡの処置についての新たな希望を提起する顕著かつ重要な結果である。ＰＣＩ法がエンドソーム中の分子のサイトソルへの放出に依存していること、ゲムシタビンが細胞内でエンドソームへと取り込まれ、この故にＰＣＩ処置から利益を受けることができることを示唆することは何もなかったことから、本結果は特に驚くべきものである。
【００１１】
したがって、第１の態様において、本発明は、ヒト患者における胆管癌を処置する方法であって、
ｉ）該患者へ０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（または０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）の用量までＴＰＣＳ2aを全身投与することと、
ｉｉ）３〜５日後に、ゲムシタビンを５００〜１５００ｍｇ／ｍ2の用量まで全身投与し、かつ１０〜６０Ｊ／ｃｍ（または１５〜６０Ｊ／ｃｍ）の光線量を提供するために該胆管癌の３ｃｍ以内に配置された光ファイバーを用いて６４０〜６６５ｎｍの波長の光を前記胆管癌に照射することと、場合によっては
ｉｉｉ）１〜４０日後に（好ましくは７〜２１日後に）ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、を全身投与することと、
を含む方法を提供する。
【００１２】
本明細書に定義するように、「処置する」とは、処置する前の症状と比較して、処置されているＣＣＡの１つ以上の症状を低減、軽減または除去することをいう。特に、該処置は、処置されているＣＣＡの大きさまたは体積の低減を含んでもよい。本処置は、光ファイバーに最も近いＣＣＡのみならず、より遠位にあって光源からの照射を直接受けないかもしれない他のＣＣＡにも及ぶ効果を含んでもよい。本発明の一態様において、本方法は、照射ステップ中に照射されない（このことは、直接的なまたは間接的な照射を含み、すなわち、照射ステップから結果として生じる光線量を受けない）１つ以上の胆管癌（またはそれゆえ細胞）を処置する。
【００１３】
「胆管癌（cholangiocarcinoma）」とは、肝内であってもよいし肝外（肝門周囲であってもよいし遠位であってもよい）であってもよい胆管癌（Bile duct cancer）である。ＣＣＡの９０％超は腺癌である。
【００１４】
「患者」はヒトである。
【００１５】
「全身投与」は、ＣＣＡに直接的に隣接する部位またはＣＣＡの近傍の部位以外の部位で、薬剤が身体へ投与され、投与された薬剤を結果的に全身が受ける、非局所的投与のいずれかの形態を含む。好都合には、全身投与は、腸管内送達（例えば、経口送達）または非経口送達（例えば、静脈内送達、筋肉内送達または皮下送達）を介するものであってもよい。静脈内送達が好ましい。
【００１６】
「ＴＰＣＳ2a」とは、以下の構造を有する光増感剤（テトラフェニルクロリンジスルホン酸）またはその異性体である。以下の構造は、７，８−ジヒドロ異性体を示す。１２，１３−ジヒドロ異性体および１７，１８−ジヒドロ異性体は、ＴＰＣＳ2aという語に包含される。その薬学的に許容され得る塩も包含される。このような分子は、ＷＯ０３／０２０３０９およびＷＯ２０１１／０１８６３５において説明されるとおりであり、これらは参照により本明細書に援用される。
【００１７】
【化１】
2019530718.tif 000002
【００１８】
ＴＰＣＳ2aは、ＢＯＣサイエンス（BOC Sciences）（ニューヨーク州、米国）から、またはＰＣＩバイオテックＡＳ（PCI Biotech AS）（ノルウェー）から入手されてもよい。あるいは、ＴＰＣＳ2aは、ＷＯ０３／０２０３０９およびＷＯ２０１１／０１８６３５において説明されているように調製されてもよい。薬学的に許容され得る塩は、生理学的に許容され得る有機酸または無機酸を伴う酸付加塩を含む。適切な酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸およびアスコルビン酸が挙げられる。好都合には、疎水性の塩もまた、例えば沈殿によって生成されてもよい。適切な塩としては、例えば、酢酸塩、臭化物塩、塩化物塩、クエン酸塩、塩酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、ステアリン酸塩、トシル酸塩、カルシウム塩、メグルミン塩、カリウム塩およびナトリウム塩が挙げられる。塩形成のための手順は、当該技術分野で従来からあるものである。
【００１９】
好ましい塩としては、ジエタノールアミン塩、エタノールアミン塩（好ましくは、ビス（モノエタノールアミン））、Ｎ−メチル−グルカミン塩、トリエタノールアミン塩、１−（２−ヒドロキシメチル）−ピロリジン塩および２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール塩が挙げられる。
【００２０】
本明細書でいわれる「薬学的に許容され得る」は、本発明の方法または使用において使用される他の成分と適合性があり、かつ受け手に対して生理学的に許容され得る成分をいう。
【００２１】
本明細書で使用する薬剤、例えば、ＴＰＣＳ2a、ゲムシタビンおよび／または他の細胞毒性薬は、本発明の方法における使用のための医薬組成物の形態で提供されてもよいし、薬学分野で公知の技術および手順によるいずれかの好都合な様式で、例えば、１つ以上の薬学的に許容され得る希釈剤、担体または賦形剤を用いて製剤化されてもよい。「薬学的に許容され得る」は、先に説明した意味を有する。組成物および担体または賦形剤材料の性質、薬用量などは、好みや所望の投与経路などに応じて所定の様式で選択されることができる。変更が可能な場合、薬用量は同様に、所定の様式で決定されることができ、分子の性質、処置の目的、患者の年齢、投与様式などに依拠してもよい。
【００２２】
実施例において明らかにされるように、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（または０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）（体重ｋｇあたりの薬剤ｍｇ）の用量（または濃度）でのＴＰＣＳ2aの使用は、特に有利な結果を提供することが認められてきた。好都合には、０．０５〜０．３ｍｇ／ｋｇ（または０．１〜０．３ｍｇ／ｋｇ）、好ましくは０．２〜０．３ｍｇ／ｋｇの用量が使用される。光増感剤は、患者へ迅速にまたはより緩徐に投与されてもよい。好都合には、ＴＰＣＳ2aは、３０秒間未満、例えば、１〜１５秒間にわたって投与されてもよいし、より長い時間枠、例えば、１分間〜１０分間にわたって投与されてもよい。
【００２３】
「ゲムシタビン（gemcitabine）」は、以下に示す構造を有するヌクレオシド類似体（４−アミノ−１−（２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン）であり、その薬学的に許容され得る塩を包含する。
【００２４】
【化２】
2019530718.tif 000003
【００２５】
ゲムシタビンは、ＤＮＡ合成を阻害し、かつ細胞の複製機械にも関与する酵素であるリボヌクレオチド還元酵素を阻害することによって、作用する。ゲムシタビンは、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌および膵癌のような適応症におけるいくつかの標準的な癌化学療法投与計画のために承認されている。この適応症について承認されていないが、胆管癌の緩和的処置にも通常使用される。
【００２６】
ゲムシタビンは、イーライリリー・アンド・カンパニー社（Eli Lilly & Co）（ジェムザール（Gemzar）（登録商標））またはシグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）（セントルイス、ミズーリ州、米国）などの製造業者から入手可能である。薬学的に許容され得る塩は好ましくは、先に定義したとおりであり、好ましくは塩酸塩である。
【００２７】
ゲムシタビンは、５００〜１５００ｍｇ／ｍ2（体表面積（ＢＳＡ）ｍ2あたりゲムシタビンｍｇをいう）の用量（または濃度）で患者へ投与される。ＢＳＡは、例えば、モステラー式（√（［身長（ｃｍ）×体重（ｋｇ）］／３６００））を用いて計算されてもよい。（必要な場合、これは、平均的成人用の変換因子、０．０２５ｍｇ／ｋｇ＝１ｍｇ／ｍ2を用いることによって、ｍｇ／ｋｇへと変換されてもよい）。好都合には、９００〜１１００ｍｇ／ｍ2の用量が使用される。好都合には、ゲムシタビンは、１時間未満、例えば、１５〜４５分間、例えば、約３０分間にわたって投与されてもよいし、より長い時間枠、例えば、１時間〜１２時間にわたって投与されてもよい。
【００２８】
胆管癌を「照射する」とは、光ファイバーを介して本明細書に定義する光を用いる腫瘍の照射をいう。照射は、本明細書で照明といわれることもある。これは、光増感剤を活性化するのに役立つ。腫瘍の細胞は、直接的に（光ファイバーと直接接触しているとき）または間接的に（光ファイバーから離れて、他の細胞による遮蔽を経ているとき）照明されてもよく、すなわち、光線量を受けてもよい。
【００２９】
患者の腫瘍または細胞の照明は、光増感剤の投与から３〜５日後に行われてもよい。好ましくは、照明は該投与のから４日後に行われる。
【００３０】
光増感剤の活性がゲムシタビンの放出に影響することを確実にするために、照射はゲムシタビン投与の直前、投与中および／または投与後に実施される。ゲムシタビンは、活性状態であるよう細胞内に取り込まれなければならず、たいていの細胞において、種々のヌクレオシド輸送体が、細胞内への取り込みに重要である。しかしながら、いくつかの癌細胞において、このような輸送体の発現は極めて低く、ゲムシタビンの取り込み、およびそれにより達成されることができる治療効果が厳しく制限されることがある。しかしながら、それにもかかわらず、このような細胞において、ゲムシタビンは、飲食作用によって取り込まれるかもしれず、（例えば、実施例において説明される試験管内癌細胞試験において）観察されてきたゲムシタビンの細胞毒性効果のＰＣＩ誘導性亢進は、飲食作用がこのような細胞における重要な輸送機序であるかもしれないことを示している。
【００３１】
理論によって束縛しようとするものではないが、ゲムシタビンは、患者の細胞における細胞内区画へと取り込まれ、光増感剤の活性化によって、ゲムシタビンが細胞内へと放出されるようである。結果として、照射が実施される前に、光増感剤は細胞内の関連区画になければならない。光増感剤の活性化時点に該区画の中にある分子、またはこのような活性化の直後にこのような細胞内へと取り込まれる分子は、サイトソルへと放出されることが認められてきた。（この点においては、いわゆる「光前（light before）」法に言及した、ＷＯ０２／４４３９６（これは、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。）
【００３２】
好都合には、該照射は、ゲムシタビン投与の開始１時間前からゲムシタビン投与の開始から４、５または６時間後までの時間範囲内で実施される。好ましくは、照射は、ゲムシタビン投与の開始から３時間または４時間以内に実施される（すなわち、ゲムシタビン投与の開始から、ゲムシタビン投与開始から３時間または４時間後までに、例えば、時間０がゲムシタビン投与の開始であるときの時間０、３０、６０、１２０、１８０または２４０分に）。したがって、例えば、ゲムシタビン投与が３０分間実施され、照射が１５分間実施されるとき、ゲムシタビン投与は、時間０で開始され、時間３０分で停止され、照明は時間１２０分で開始され、時間１３５分で終結されてもよい。しかしながら、ゲムシタビン投与から１、２、３または４日後までに実施される照射も、本発明の方法に包含される。
【００３３】
適宜、光照射ステップは、１回超（例えば、２、３または４回）実施されてもよい。このことは、特に大きな腫瘍または広範な領域にわたって広がる離散腫瘍に必要であることがある。この場合、同じ位置にあってもよいし異なる位置にあってもよい１本以上の光ファイバーを用いてもよい。１本以上の光ファイバーの位置は、各照射ステップで変更されてもよいし維持されてもよい（例えば、他の離散腫瘍または単一の腫瘍塊の領域に近い位置まで移動されてもよい）。
【００３４】
光増感剤を活性化する光照射ステップは、当該技術分野で周知の技術及び手順により行ってもよい。使用されるべき光の波長は６４０〜６６５ｎｍであり、好ましくは、６５２ｎｍである。適切な人工光源は当該技術分野で周知である。好都合には、照明（照射）は、ＰＣＩバイオテックＡＳ社の６５２ｎｍレーザーシステムダイオードレーザーによって提供されるが、任意の適切な赤色光源を使用してもよい。
【００３５】
光ファイバーは光を提供するために用いられ、ＣＣＡの３ｃｍ以内に配置される。本明細書で使用する場合、「光ファイバー」とは、遠位末端で光を送信することができる細く、可撓性のある、透明な繊維である。好ましくは、光は、表面にわたって均一に光を拡散するよう分散させられ、高強度の明るいスポットを最小限にするか、または除去する。光ファイバーの末端には、種々の先端を使用してもよく、例えば、前側分配装置またはマイクロレンズ製の先端または球状分散装置であってもよい。代替物において、光を散乱させるためにバルーンカテーテルを使用してもよい（例えば、メディライト社（Medlight）の分散用バルーンカテーテル）。別の代替物において、ファイバーは装飾されていなくてもよく、例えば、むき出しの先端を使用してもよい。好ましくは、光は、ファイバーの遠位端部が照明端である円筒状分散装置を通じて送信され、その分散装置が、その長さに沿って、送信された光を均一に分配する。
【００３６】
ファイバーは、ガラス製であってもよいしプラスチック製であってもよい。少なくともレーザー出力チャネルの直径であるそのコア直径は、好ましくは２００〜８００μｍ（例えば、４００〜６００μｍ、例えば、５００μｍ）またはいずれかのコーティングを含めて４００〜１２００μｍ（例えば、９００〜１０００μｍ）である。分散装置の長さが１０〜７０ｍｍ、好ましくは２０〜４０ｍｍであるファイバーを使用してもよい。１本を超える光ファイバーを、患者内部の大きな腫瘍または複数の離散腫瘍に使用してもよく、例えば、２本以上、例えば、３、４、５、６本またはそれより多数、例えば、１０本未満である。代替物において、複数回の照明（照射）のために、異なる位置へと移動されてもよいし同じ位置で維持されてもよい単一の光ファイバーを用いてもよい。
【００３７】
本発明にしたがって、ファイバー（すなわち、少なくとも１つのファイバーまたは各ファイバー）は、ＣＣＡの３ｃｍ以内に配置される。この寸法は、ファイバーの外面とＣＣＡの最も近い部分との間の距離をいう。好ましくは、ファイバーは、ＣＣＡに対してできるだけ近くに、例えば、ＣＣＡの１ｃｍもしくは２ｃｍ以内、またはＣＣＡの内部に配置される。好都合には、ファイバーは胆管の中に（例えば、カテーテルを介して）配置される。
【００３８】
光ファイバーは、カテーテルを用いて、例えば、レーザー源と連結することができる、光ファイバーを基にしたカテーテルの形態（すなわち、光ファイバーが、処置の間はカテーテル内にあり、ファイバーからの光照射がカテーテル壁を通じて行われるように）で提供されてもよい。光ファイバーは光を装置の近位端から遠位端へと進める。遠位端は好ましくは、光ファイバーの長さに沿って光ファイバーによって送信される光を均一に分配することができる照明端（「拡散装置」）を有する。カテーテルは、光の内視鏡送達を可能にする。好ましくは、光拡散装置が使用される。好都合には、メディライトＳＡ社（Medlight SA）（スイス）の円筒状光拡散装置（Cylindrical Light Diffuser）、例えば、放射線不透過性マーカーを備えた円筒状光拡散装置のＲＤモデルが使用されてもよい。
【００３９】
本発明の方法において、患者の細胞を光へ曝露する時間は、必要とされる光線量を達成するために変更されてもよい。この時間は、光増感剤およびゲムシタビンの用量、使用される光のフルエンス率、ならびに腫瘍に対する光ファイバーの近接性を含む、種々の因子に応じて選択されてもよい。
【００４０】
腫瘍細胞に対する総光線量は、Ｊ／ファイバー（または腫瘍）ｃｍにおいて表してもよく、フルエンス率（Ｗ／ファイバーまたは腫瘍ｃｍ）×処置時間として計算される。
【００４１】
所望の光線量を達成するために、使用される光源のフルエンス率に応じて、照射時間が適宜選択されてもよい。例えば、１００ｍＷ／ｃｍのフルエンス率で１０または３０Ｊ／ｃｍ（または１５もしくは３０Ｊ／ｃｍ）の光線量を達成するために、２．５分または５分の照射時間がそれぞれ使用されてもよい。したがって、１００ｍＷ／ｃｍのフルエンスで１０〜６０Ｊ／ｃｍ（または１５〜６０Ｊ／ｃｍ）の光線量を達成するために、２．５〜１０分の照射時間が使用されてもよい。より高いまたはより低いフルエンス率で、使用される照射時間をそれぞれ、より短くまたはより長くすることができる。好ましくは、上述を考慮すると、照射時間は、光源のフルエンス率に応じて、１分〜２０分、例えば、２〜１０分である。これらのタイミングは、複数回の照明（照射）が使用される場合、各照射時間をいう。
【００４２】
当業者であれば、適切な光線量を選択することができ、これは、先に示した因子に依拠することになる。特に、光増感剤（ＴＰＣＳ2a）の用量または濃度がより高いと、使用する光線量をより低くすることができる。本発明において、光ファイバー（の拡散装置）または腫瘍ｃｍあたり１０〜６０Ｊ（またはｃｍあたり１５〜６０Ｊ）の光が特に有利であることは認められてきた。「ｃｍあたりのＪ」という単位において、ｃｍとは、光がファイバーの長さにわたって放射された場合（例えば、拡散装置が使用されるとき）は、光ファイバーの長さである。代替物において、これは、例えば、点光源が使用される場合は、腫瘍ｃｍであってもよい。いずれの場合においても、Ｊ／ｃｍは、局所環境に対してｃｍあたり提供される光線量をいう。好都合には、光線量は、フルエンスがファイバー（例えば、拡散装置）ｃｍあたり１００ｍＷの光拡散装置を用いる場合は、２．５〜１０分の照射時間で達成される。好ましくは、１０〜４５Ｊ／ｃｍ（または１５〜４５Ｊ／ｃｍ）、例えば、２０〜４０Ｊ／ｃｍまたは２５〜３５Ｊ／ｃｍの線量が使用される。
【００４３】
さらに、細胞生存度が維持されるべき場合、過剰レベルの毒性種の発生は回避されるべきであり、関連パラメータはそれに応じて調整されてもよい。
【００４４】
本発明の方法は、光化学的処置によって、すなわち、光増感剤が活性化した際の毒性種の発生による光力学的療法の効果によって、何らかの細胞損傷を必然的に生じることがある。本発明の方法の役割は、腫瘍細胞を破壊することであるので、この細胞死は重要ではなく、実際には有利であるかもしれない。しかしながら、いくつかの実施形態においては、細胞毒性分子が細胞内へ取り込まれて確実に局在的および特異的な細胞死を引き起こすということを確実にするために、細胞死は回避されるべきである。本発明の方法は、光増感剤の用量（濃度）に関連して光線量を選択することによって生残する細胞の割合または比率が調節されるように修正されてもよい。また、このような技術は当該技術分野で公知である。
【００４５】
好ましくは、実質的にすべての細胞、または有意な大部分（例えば、細胞の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０、８５、９０または９５％）は、光化学的内在化法のみによって（すなわち、細胞毒性薬なしで）殺滅されることはない。ＰＣＩ処置後の試験管内細胞生存度は、ＭＴＳ検査のような当該技術分野で公知の標準的な技術によって測定することができる。１つ以上の細胞型の生体内細胞死は、投与地点半径１ｃｍ以内で（またはある特定の組織深度で）、例えば、顕微鏡または他の適切な手段によって評価されてもよい。細胞死は、瞬間的には生じないかもしれないので、％細胞死は、照射数時間以内に（例えば、照射後４時間まで）生存したままである細胞の百分率を参照するが、好ましくは照射後４時間以上の％生存細胞を参照する。
【００４６】
本発明の任意の方法において、ステップ（ｉｉ）後、すなわちゲムシタビンを投与し、患者を照射へ供してから１〜４０日後、患者は、ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬を全身投与されてもよい。好ましくは、このような投与は、ステップ（ｉｉ）から５〜３０日後に行われ、特に好ましくは７〜２１日後に行われる。
【００４７】
ゲムシタビンが投与されるとき、ステップｉｉ）において投与されるゲムシタビンについて先に説明したように（すなわち、投与の用量、経路および持続時間に関して）投与されてもよい。
【００４８】
他の細胞毒性薬は、患者における副作用が許容され得るものである、癌、特に胆管癌を処置するのに適したいずれかの毒性薬であってもよい（例えば、通常使用される化学療法薬）。このような薬剤は、アルキル化薬、アントラサイクリンおよび他の細胞毒性抗生物質（例えば、ブレオマイシン）、タンパク質毒素（例えば、ゲロニン）、代謝拮抗薬（ゲムシタビンを含まない）、ビンカアルカロイドおよびエトポシド、チロシンキナーゼ阻害薬、ならびに白金化合物（例えば、シスプラチン）のような他の抗腫瘍薬を含む。
【００４９】
「シスプラチン(cisplatin)」は、以下に示される構造を有する白金含有抗癌薬である（（ＳＰ−４−２）−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ））。
【００５０】
【化３】
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【００５１】
シスプラチンは、ホスピラ（Hospira）のような製造業者から入手可能である（シスプラチン・ホスピラ（Cisplatin Hospira））。
【００５２】
他の細胞毒性薬についての適切な用量は、当該技術分野で公知である。シスプラチンを使用する場合、好都合には、１０〜５０ｍｇ／ｍ2、好ましくは２０〜３０ｍｇ／ｍ2の用量で使用される。投与の経路および持続時間は、ゲムシタビンについて先に説明したとおりであってもよい。
【００５３】
ステップｉｉｉ）においてゲムシタビンおよび少なくとも１つの他の細胞毒性薬を使用するとき、これらは同時に使用されてもよいし、別個に使用されてもよいし、連続して使用されてもよい。同時に使用するとき、これらは同じ時刻に投与されるが、単一の経路によって投与されてもよいし、別個の経路を介して投与されてもよい（例えば、混合物の静脈内の投与、または同じ時刻に異なる静脈進入地点を介した２つの（またはそれより多数の）調製物の投与）。別個に投与されるとき、これらは同じ時刻に投与されてもよいし、連続して投与されてもよいし、かつ／または投与のタイミングは重なっていてもよい。連続して使用するとき、異なる薬剤の投与を分離する時間は、２４時間以下である。好都合には、これらは、単一の混合物中でまとまって投与される。
【００５４】
本発明の好ましい特長において、ステップｉｉｉ）において使用されるゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬は、１回超、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回（例えば、最高２０回）投与される。単回（または各）周期においてこの投与が行われてもよいし、複数周期において合計としてこの投与が行われてもよい。
【００５５】
本明細書でいう場合、「周期」とは、特定の処置投与計画が適用される期間であり、たいていは反復されて周期的な処置を提供するものである。各周期における処置は、同じであってもよいし異なっていてもよい（例えば、異なる薬用量、タイミングなどを使用してもよい）。周期は、長さが１４〜３０日間であってもよく、例えば、２１日周期である。複数周期を使用してもよく、例えば、少なくとも２、３、４または５周期、例えば、６、７、８、９または１０（例えば、最多８、９、１０または２０）周期である。各周期内で、ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬は、先に説明したように、１回または複数回投与してもよい。好ましい特長において、ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬は、各周期において２回投与され、少なくとも３周期、好ましくは少なくとも５周期が行われる。
【００５６】
先のステップｉｉｉ）の好ましい特長において、ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬を用いた処置が実施されるが、本発明の別の態様において、このような処置は実施されず、特に当該処置は、シスプラチンのような別の細胞毒性薬の使用を含んでいない。
【００５７】
有効な処置のために、本明細書に説明する方法またはその一部を反復してもよい。したがって、例えば、ステップｉ）およびｉｉ）は、１回以上、例えば、２または３回、例えば、１〜６か月間またはそれより長い間隔の後、例えば、ステップｉｉ）またはｉｉｉ）の後、反復してもよい。好ましい態様において、全体的な方法は、少なくとも２回、例えば、３または４回反復される。
【００５８】
特に好ましい態様において、本方法は、本方法の２回（すなわち、ステップｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）の実施）またはそれより多数の実施を含み、好ましくはこの中で、ステップｉ）〜ｉｉｉ）の第１回および／または第２回（またはそれより後の回）において、ステップｉｉｉ）が少なくとも２回実施される。したがって、例として、本方法は、次のように実施されてもよい。
ｉ）ＴＰＣＳ2aを該患者へ、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（または０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）の用量まで全身投与して、
ｉｉ）３〜５日後、ゲムシタビンを５００〜１５００ｍｇ／ｍ2の用量まで全身投与し、ゲムシタビン投与の完了から２〜４時間後、６４０〜６６５ｎｍの波長の光を、該胆管癌の３ｃｍ以内に配置された光ファイバーを用いて胆管癌に照射して、１０〜６０Ｊ／ｃｍ（または１５〜６０Ｊ／ｃｍ）の光線量を提供し、
ｉｉｉ）１〜４０日後（好ましくは７〜２１日後）、ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、を全身投与し、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）を少なくとも１回反復し、
ｖ）ステップｉ）〜ｉｖ）を少なくとも１回反復する。
【００５９】
特に好ましい態様において、ステップｉｉｉ）は、先に説明したような周期で実施され、特にステップｉｉｉ）の複数回周期が（ステップｉｖ）を開始する前に）実施され、これらの周期の各々において、ゲムシタビンおよび／またはシスプラチンのような別の細胞毒性薬は２回以上投与される。
【００６０】
例として、第１回および第２回におけるステップｉｉｉ）に、ゲムシタビンおよび／またはシスプラチンを１回または、例えば、１日後および８日後に２回投与する周期が２、３または４周期含まれる方法が、実施されてもよい。ステップｉ）およびｉｉ）が第１回のステップｉｉｉ）の後および第２回のステップｉｉｉ）の前に実施されるとき、第２回のステップｉｉｉ）において第１の周期に影響してもよく、例えば、ゲムシタビン投与および照射は、第１の周期におけるゲムシタビンおよびシスプラチンの第１の投与と置き換えてもよい。１つの選択肢において、患者は、第２回が開始する前に（ステップｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）の）第１回の後１〜４週間の期間、いかなる処置へも供されない。その場合、処置は次に、先に示したようにステップｉ）およびｉｉ）、次いでステップｉｉｉ）で再度始まる。好ましい処置のタイミングおよび／または使用される好ましい用量は、実施例において説明するとおりである。
【００６１】
処置に先立って、処置される患者は、胆道ステント術へ供され、適切な胆管ドレナージを確実にしてもよい。ステントは、プラスチックであっても金属であってもよく、当該技術分野で公知の手順を用いて胆管の中へと配置される。後者は、照明の間適所に維持されてもよいのに対し、前者は照明の間取り外され、その手順の後に新たなステントが挿入される。
【００６２】
先の方法およびその好ましい特長は、先に説明した薬剤の使用へも適用される。したがって、代替的な態様において、本発明は、ゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに、場合によっては別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、を、ヒト患者における胆管癌を処置する上での使用のために提供し、この中で、
ｉ）前記ＴＰＣＳ2aは、前記患者へ０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ（または０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）の用量まで全身投与され、
ｉｉ）３〜５日後、前記ゲムシタビンは、前記患者へ５００〜１５００ｍｇ／ｍ2の用量まで全身投与され、前記胆管癌は、１０〜６０Ｊ／（例えば、光ファイバーまたは腫瘍）ｃｍ（または１５〜６０Ｊ／ｃｍ）の光線量を提供するために前記胆管癌の３ｃｍ以内に配置されるファイバーを用いて、６４０〜６６５ｎｍの波長の光を照射され、および場合によっては、
ｉｉｉ）１〜４０日後（好ましくは７〜２１日後）、ゲムシタビンおよび／または別の細胞毒性薬、好ましくはシスプラチン、を、該患者に全身投与する。
先に説明した定義および好ましい特長は、同様に適用可能である。
【００６３】
本発明は、好ましくは、患者における胆管癌を処置するために、同時に、別個に、または連続して使用されるゲムシタビンおよびＴＰＣＳ2a、ならびに場合によっては先に定義したような別の細胞毒性薬を含む、キットも提供し、この中で、好ましくは、該使用は先に定義したとおりである。
【００６４】
本発明による好ましい態様は、実施例において明らかにされるとおりであり、実施例において使用されるパラメータまたは構成要素のうちの１つ以上が、先に説明した方法の好ましい特長として使用されてもよい。
【００６５】
次に、以下の非限定的な実施例において、以下の図面を参照しつつ、本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、７２時間のゲムシタビン曝露後の細胞毒性を示す。細胞株ＴＦＫ−１（Ａ）およびＥＧＩ−１（Ｂ）の生存度を、実施例１における材料および方法の下に説明したような７２時間のゲムシタビンインキュベーション後のＭＴＴアッセイによって分析した。各データ点は、３回の実験からの平均（±標準偏差）を表す。
【図２】図２は、ＴＦＫ−１細胞株における１００ｎＭゲムシタビンを用いたＰＣＩを示す。本実験は、実施例１における材料および方法の下に説明したような１００ｎＭのゲムシタビン用量を用いて実施した。データ点は、３つの並行測定の平均値（±標準偏差）であり、３回の独立した実験を代表する１つを表す。図中のＰＤＴは、「ＰＣＩ単独」を意味する。
【図３】図３は、ＥＧＩ−１細胞株における１００ｎＭゲムシタビンを用いたＰＣＩを示す。本実験は、実施例１における材料および方法の下に説明したような１００ｎＭのゲムシタビン用量を用いて実施した。データ点は、３つの並行測定の平均値（±標準偏差）であり、３回の独立した実験を代表する１つを表す。図中のＰＤＴは、「ＰＤＩ単独」を意味する。
【図４】図４は、異なる用量のゲムシタビンを用いたＰＣＩ処置後のＴＦＫ−１細胞のコロニー形成能を示す。本実験は、異なる用量のゲムシタビン（図上に示す）および１４０秒間の照明時間を用いて、実施例１における材料および方法の下に説明したように実施した。３回の独立した実験を実施して、本質的に同様の結果を得た。
【図５】図５は、２００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを用いたＰＣＩの効果に関する動物試験の結果を示す。皮下的に成長するＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト肺癌腫瘍細胞を有する動物に５ｍｇ／ｋｇのアンフィネックス（Amphinex）（登録商標）（ＴＰＣＳ2a）を静脈内注射によって投与した。３日後、動物に２００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを投与し、腫瘍を４時間後に照明した。腫瘍の大きさを週あたり２〜３回測定した。結果は、光化学的処置単独（ＰＣＩ単独）もゲムシタビン単独も、未処置の腫瘍（未処置）を有する対照群と比較して、腫瘍成長に及ぼす有意な効果を有していなかったことを示す。対照的に、ＰＣＩおよびゲムシタビンの組み合わせは、腫瘍の成長を実質的に低減させ、ＰＣＩがゲムシタビンの効果を有意に亢進することができることを示した。
【図６】図６は、４００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを用いたＰＣＩの効果に関する動物試験の結果を示す。本方法は、４００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを使用したこと以外は、図５について先に説明したように実施した。本結果は、光化学的処置（ＰＣＩ単独）もゲムシタビン単独（ゲムシタビン４００ｍｇ／ｋｇ）も、未処置の腫瘍（未処置）を有する対照群と比較して、腫瘍成長に及ぼす有意な効果を有していなかったことを示す。対照的に、ＰＣＩおよびゲムシタビンの組み合わせは、腫瘍成長を実質的に低減させ、ＰＣＩがゲムシタビンの効果を有意に亢進することができることを示した。
【図７】図７は、６か月における処置に対して陽性応答を呈した患者、すなわち、部分奏功（ＰＲ）または完全奏功（ＣＲ）の患者の百分率を示す。ＰＣＩ処置へ供した患者（ＰＣＩ第１相：コホート３および４）を、標準的な非ＰＣＩ化学療法処置を用いて処置された患者（ＡＢＣ０２）と比較した。
【図８】図８は、コホート３および４の胆管癌患者の応答について、標的（測定可能な）病変全部のＰＣＩ処置後の状態を示す。
【図９】図９は、コホート３および４の胆管癌患者の応答について、期待される処置済標的（測定可能な）病変のＰＣＩ処置後の状態を示す。
【図１０】図１０は、コホート全部に由来する放射線学的に査定可能な胆管癌患者全員における全体的な標的腫瘍の大きさの低減を示す。
【実施例】
【００６７】
実施例１：胆管癌細胞におけるゲムシタビンを用いたＰＣＩの試験管内査定
材料および方法
細胞株および成長培地
使用した細胞株はＴＦＫ−１およびＥＧＩ−１であり、いずれもノルウェー・ラジウム病院（The Norwegian Radium Hospital）（オスロ、ノルウェー）のがん予防部門から入手した。ＴＦＫ−１はヒト乳頭状胆管腺癌細胞株であり、ＥＧＩ−１はあまり分化していないヒト胆管腺癌細胞株である。いずれの細胞株も肝外腫瘍を起源とする（Ｓａｉｊｙｏら，１９９５，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，１７７：６１−７１；ＥＧＩ−１  −  Ｃｅｌｌ  ＬＩＮＣＳ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ  ｎｅｔｗｏｒｋ−ｂａｓｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ。ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｃｓ．ｈｍｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｄｂ／ｃｅｌｌｓ／５０１８１／から入手可能。）が、形態学的にも生理学的にも極めて異なっている（Ｘｕら，２０１３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊａｎ  １；１９（１）：１１８〜１２７、Ｐｉｇｎｏｃｈｉｎｏら，２０１０，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，１０：６３１）。
細胞を単層培養物として、７５ｃｍ2の組織培養フラスコ（ヌンク（NUNC）、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、ロスキレ、デンマーク）中で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ2を用いて成長させた。ＴＦＫ−１細胞株は、Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＰＡＡラボラトリー、（PAA Laboratories）、パシング、オーストリア）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ・アルドリッチ社）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）中で成長させた。ＥＧＩ−１細胞株は、Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地（シグマ・アルドリッチ社）中で成長させた。
【００６８】
ＴＰＣＳ2a光増感剤
ジ（モノエタノールアンモニウム）メソ−テトラフェニルクロリンジスルホナート（ＴＰＣＳ2a／アンフィネックス（登録商標））はＰＣＩバイオテックＡＳ社（リサケル、ノルウェー）によって提供された。アンフィネックスのバッチ番号はＦＡＭＰ  １００２であった。ＴＰＣＳ2a（３％ポリソルベート８０、２．８％マンニトール、５０ｍＭトリスｐＨ８．５中）ストック溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を一定分量において４℃で遮光して保存した。光増感剤を用いた作業はすべて、抑止した光の下で実施した。
【００６９】
光源
細胞の照明を、ルミソース（Lumisource）（ＰＣＩバイオテック社、オスロ）を用いて実施した。このランプは、およそ４３５ｎｍに主要ピークを有する青色光を放射する４つの標準的な光チューブ（１８Ｗ／チューブ、オスラム（Osram）Ｌ  １８／６７）からなるので、ＴＰＣＳ2aの励起に使用した。青色光源から放射される放射照度は、１２ｍＷ／ｃｍ2であり、照明面積（７６５ｃｍ2）にわたって変化は１０％未満であった。光源は、放射照度を安定に維持して細胞を高熱から防止するために、露光の間空冷した。
【００７０】
ＰＣＩを用いないゲムシタビンの細胞毒性
細胞を異なる濃度のゲムシタビン（１〜１０００ｎＭ）とともに７２時間インキュベートし、細胞生存度を、これらの細胞株について先に説明したようなＭＴＴアッセイ（後述を参照されたい）によって評価した（Ｐｉｇｎｏｃｈｉｎｏら，２０１０，上述；Ｌｉｅｋｅら，２０１２，ＢｉｏＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ，１２：１４７１〜２４０７）。
【００７１】
ゲムシタビンを用いたＰＣＩ
細胞を９６ウェルまたは６ウェルのプレート（ヌンクロン（Nunclon）、ヌンク、ロスキレ、デンマーク）中に播種し、３７℃で一晩接着させておいた。ゲムシタビンを細胞へ添加し、５４時間インキュベートした後、０．４μｇ／ｍｌのＴＰＣＳ2aを添加した。１８時間のさらなるインキュベーション後、細胞をＴＰＣＳ2a非含有培地中で洗浄し、ゲムシタビン含有のＴＰＣＳ2a非含有培地中に再懸濁し、４時間インキュベートした。細胞を照明し、洗浄し、薬物非含有培地中に再懸濁し、細胞生存度を照明４８時間後にＭＴＴアッセイによって、または照明６日後のコロニー形成アッセイによって評価した（後述を参照されたい）。
【００７２】
ＭＴＴ細胞生存度アッセイ
ＭＴＴ法（テトラゾリウム色素還元）は、ルミソースを用いた露光の４８時間後に実施した。培養培地を除去し、細胞を、０．２５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社（Sigma））を含有する培地中でおよそ３時間インキュベートした後、１００μｌの９９％ジメチルスルホキシド（シグマ社）と置き換えた。９６ウェルプレートを振盪器上に５分間セットした後、パワー・ウェーブ（power wave）ＸＳ２（バイオテック社（Biotek）、バーモント州、米国）を用いて吸光度５７０ｎｍで測定した。ＭＴＴ培地のみをインキュベートした、細胞を含有していないウェルをブランク減算に使用した。
【００７３】
コロニー形成アッセイ
細胞（２５０００個／ウェル）を６ウェルプレート（ヌンク）中に播種し、一晩接着させておき、先に説明した光化学的処置へ供した。細胞をインキュベーターの中に入れ、３日間のインキュベーション後に細胞培地を新鮮培養培地と置き換えた。コロニーを０．９％ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌで１回洗浄し、９６％エタノール中で１０分間固定し、メチレンブルー（シグマ社）の飽和溶液で１０分間染色した。その後、細胞をＨ2Ｏ中で洗浄し、次に乾燥させた後、目視検査によって査定した。
【００７４】
結果および考察
ＴＦＫ−１およびＥＧＩ−１細胞株におけるゲムシタビンの細胞毒性
初期の実験において、細胞毒性は、４時間のゲムシタビンインキュベーション時間を用いて調査されたが、その理由は、いくつかの他の薬剤の場合に、これが、ＰＣＩ実験における適切なインキュベーション時間であるからである。しかしながら、本結果は、４時間の曝露を非常に高い用量（最高１ｍＭを検査した）でさえ用いても、ゲムシタビンがこれらの細胞株に及ぼす非常にわずかな細胞毒性効果しか有さないことを示した（データ非表示）。それゆえ、ゲムシタビン曝露時間を、これらの細胞株について早期に使用されてきた（Ｐｉｇｎｏｃｈｉｎｏら，２０１０，上述；Ｌｉｅｋｅら，２０１２，上述）７２時間まで延長することに決定した。
７２時間曝露を用いた３μＭまでの濃度におけるゲムシタビンの細胞毒性を図１に示す。７２時間のインキュベーションを用いてでさえ、ゲムシタビンの細胞毒性はむしろわずかであり、ＴＦＫ−１細胞株について３μＭのゲムシタビンで約５０％の細胞毒性に到達するのに対し、ＥＧＩ−１細胞株は、本実験において採用される最高用量でさえゲムシタビンに対して非感受性であったことがわかる。ＰＣＩ実験において１００ｎＭのゲムシタビン濃度を使用することに決め、その理由はこの用量でゲムシタビン単独の細胞毒性がせいぜいささやかであり、ＰＣＩ処置の効果を不明瞭にしないであろうからであった。
【００７５】
ＭＴＴ細胞毒性アッセイを用いてのゲムシタビンを用いたＰＣＩ
本実験は、材料および方法の下に説明したような１００ｎＭのゲムシタビン用量を用いて実施した。図２から、ＴＦＫ−１細胞株においてＰＣＩがゲムシタビンの細胞毒性効果を有意に増大させたことがわかる。したがって、ゲムシタビン単独が（図１に示す結果に良好に従って）約５０％の細胞毒性効果を与えたのに対し、ＰＣＩとの組み合わせは、光線量依存的様式で細胞毒性を強く増大させた。光化学的処置単独（図２におけるＰＤＴ）は、細胞生残に及ぼすささやかな効果しか有しておらず、ＰＣＩがゲムシタビンの細胞毒性を相乗的に増大させることを示した。
同じ結論は、ＥＧＩ−１細胞株を用いた実験から描くことができた（図３）。おこの細胞株において、ゲムシタビン単独は、（また図１における結果に従って）細胞生残に及ぼすいかなる効果もなかった。しかしながら、ＰＣＩを用いて、非常に強い細胞毒性効果を達成した（９９％の細胞の殺滅）のに対し、最も高い光線量の光化学的処置単独（ＰＣＩ単独）は、細胞の約５０％しか殺滅させなかった。この細胞株において、ＰＣＩを用いると、非常に良好な細胞毒性効果が、ゲムシタビン単独およびＰＣＩ単独（図におけるＰＤＴ）がいかなる細胞毒性効果も有さない（例えば、図３における１２０秒間の照明）条件下でも達成され、ゲムシタビンを用いたＰＣＩの相乗効果を明確に示した。ＰＣＩを用いて、９０％を超える細胞殺滅が１００ｎＭのゲムシタビン用量を用いて達成することができたのに対し、ＰＣＩなしでは、このレベルの細胞殺滅は、３０倍高い用量（図１Ｂにおける３０００ｎＭ用量）を用いても得られなかったことも特筆すべきである。
【００７６】
ＴＦＫ−１細胞株のコロニー形成能に及ぼすＰＣＩの効果
ＴＦＫ−１細胞をＰＣＩで処理し、細胞生存度を、材料および方法の下で説明したようなコロニー形成アッセイによって評価した。初期の実験は、ゲムシタビン単独が、ＭＴＴアッセイによって評価されるような生存度よりも、コロニー形成能に及ぼす効果が実質的に高いことを示した（図４も参照されたい）。本実験において、より低用量のゲムシタビンも用いることがそれゆえ必要であった。図４から、３３０および１００ｎＭのゲムシタビン用量を用いた処理後にＴＦＫ−１がコロニーを形成することができず、３３ｎＭではいくらかのコロニー形成が観察されることができたのに対し、未処置の試料に置いて観察されたものよりもなおも低いにもかかわらず、１０ｎＭでは実質的なコロニー形成を観察したことがわかる。１０ｎＭゲムシタビン＋ＰＣＩを用いてコロニー形成を観察することはなかったが、ＰＣＩ単独を用いて処理した試料においては、細胞はコロニーを形成する能力をなおも有していた。このことは、ＰＣＩが細胞のコロニー形成能にも及ぼすゲムシタビンの効果を亢進することを示し、いくぶんそのことは、もちろん癌の処置における使用に非常に重要であり、その理由はこれが、処置後に成長し続ける細胞の能力の尺度であるからである。
【００７７】
結論
本結果は、光化学的内在化が、ＰＣＩなしで使用されるときにゲムシタビンの効果に対して極めて耐性のある２つの異なる胆管癌細胞株に及ぼすゲムシタビンの効果を有意に亢進することができることを示している。
【００７８】
実施例２：抗癌作用を提供するためのゲムシタビンを用いたＰＣＩの生体内（マウス）での査定
本試験は、細胞毒性薬ゲムシタビンと併用される光増感剤ＴＰＣＳ2aを用いた光化学的内在化（ＰＣＩ）の生体内での抗癌有効性を評価するために用いた。
【００７９】
材料
検査物質１：アンフィネックス（ＴＰＣＳ2a）（バッチ番号ＦＡＭＰ１００２，ＰＣＩバイオテックＡＳ社）
検査物質２：ゲムシタビン（シグマ・アルドリッチ社）
アンフィネックスのためのビヒクル  ３％トゥイーン８０、２．８％マンニトール、５０ｍＭトリスｐＨ８．５
ゲムシタビンのためのビヒクル  ０．９％ＮａＣｌ
【００８０】
マウス、投与経路および用量レベル
ヒト腫瘍異種移植片を作製するのに広く使用され、依然としてヒトにおける投与に先立って新たな化合物の抗腫瘍効果を検査するための実験的な選択方法であるヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（雌、ＣＤ−１ｎｕ／ｎｕ系、少なくとも６週齢）を用いた。検査物質の投与経路は静脈内とした。アンフィネックス（登録商標）の用量は、ＰＣＩバイオテックＡＳ社および共同研究者によって実施された早期のマウスの試験に基づいて、５ｍｇ／ｋｇとした。
【００８１】
方法
アンフィネックス（登録商標）は、３％トゥイーン８０、２．８％マンニトール、５０ｍＭトリスｐＨ８．５中に希釈することによって投薬のために製剤化し、１．２５ｍｇ／ｍＬの投薬溶液とした。
ゲムシタビンは、０．９％ＮａＣｌ中に溶解することによって投薬のために製剤化し、２０および４０ｍｇ／ｍＬの投薬溶液とした。
溶液を投薬当日に新鮮に調製し、遮光した。
１群あたり１０匹のマウスを用いて６群の処置群とした。マウスに７×１０7個／ｍＬのＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍細胞を皮下注射して、本試験に含めるための最適な腫瘍の選択を可能にした。適切な大きさの腫瘍を種々の処置群へと割り当てた。
各群に番号（１〜６）を付与した。処置群は次の通りであった。
第１群  ゲムシタビン、２００ｍｇ／ｋｇ
第２群  アンフィネックス（登録商標）＋ゲムシタビン＋レーザー処置、５ｍｇ／ｋｇ＋２００ｍｇ／ｋｇ
第３群  ビヒクル群＋アンフィネックス（登録商標）＋レーザー処置、５ｍｇ／ｋｇ
第４群  ビヒクル群＋レーザー無処置、
第５群  ゲムシタビン、ｎ＝１０、４００ｍｇ／ｋｇ
第６群  アンフィネックス（登録商標）＋ゲムシタビン＋レーザー処置、５ｍｇ／ｋｇ＋４００ｍｇ／ｋｇ
アンフィネックス（登録商標）を、尾静脈を介して、４ｍＬ／ｋｇの用量容積を用いて静脈内投与した。
ゲムシタビンの投与経路は、１０ｍＬ／ｋｇの用量容積での静脈内投与とした。
ビヒクル群は０．９％ＮａＣｌとし、これを１０ｍＬ／ｋｇの用量容積で静脈内注射によって投薬した。
ゲムシタビンまたはビヒクル投与のおよそ４時間後、第２、３、および６群における動物は、６５０ｎｍダイオードレーザーを用いて腫瘍を照明された（後述を参照されたい）。
【００８２】
手順
ヒトＮＣＩ−Ｈ４６０非小細胞肺癌細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）、メリーランド、米国、またはヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー（European Collection of Cell Cultures）（ＥＣＡＣＣ）、ポートン・ダウン、英国）を、試験管内で成長しているコンフルエント未満の培養物から収集し、生細胞数を決定した。次に、細胞をおよそ７×１０7個／ｍＬの濃度で滅菌済みリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁した。ヌード（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウスへおよそ７×１０6個のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を０．１ｍＬの容積で右脇腹に皮下注射した。動物を腫瘍の様相について規則的に検討した。測定可能な腫瘍が大部分のマウスにおいて確立されたとき、１群あたり最多１０匹を目標に、動物を６つの処置群へと割り当てた。マウスは、腫瘍体積が７２時間後におよそ１００〜１５０ｍｍ3の範囲にあるような大きさに腫瘍が到達したとき、アンフィネックスの静脈内注射を受けた。この時点で動物にゲムシタビンを投与し、腫瘍をおよそ４時間後に照明した。
腫瘍照明のために、各動物を一度に１回、下腹領域のみ、すなわち、腫瘍面積＋直径２ｍｍの周辺領域を曝露することができる金属製の拘束具の中に拘束した。次に、６５０ｎｍダイオードレーザー（ＴＷＩダイオードレーザー、クウォンタ・システム社（Quanta System）、イタリア）を用いて、腫瘍組織を１５Ｊ／ｃｍ2の光線量まで、９０ｍＷ／ｃｍ2のフルエンス率で曝露した。各動物の腫瘍をレーザーへおよそ１６７秒間曝露して、１５Ｊ／ｃｍ2の所要線量を付与した。
腫瘍の大きさが多量に変化する場合、動物の表面におけるフルエンス率を９０ｍＷ／ｃｍ2まで調整して、各動物について正確な線量および照明時間を付与した。例えば、１５Ｊ／ｃｍ2の光線量については、１２０ｍＷのファイバー出力は、１．３ｃｍの照明径（およそ平均腫瘍径）を網羅するのに必要とされ、ファイバーから腫瘍までの距離は２．１ｃｍとすべきである。
腫瘍の大きさは、デジタルカリパスを用いて毎週少なくとも２回、照明後の４週間まで、または（英国内務省のライセンスにおいて指定されるような）腫瘍の大きさもしくは他の臨床兆候が当該マウスを本試験から除去することを必要とするまで測定した。腫瘍の寸法を記録し（長さおよび幅）、腫瘍体積を式（Ｗ2×Ｌ）／２（式中、Ｗは、最も幅の広い腫瘍寸法であり、Ｌは最長とする）を用いて計算した。腫瘍の大きさが過剰になったまたはいずれかの有害作用が確認された場合、動物を屠殺した。
【００８３】
データ解析
本試験の期間にわたって測定された腫瘍の寸法、すなわちｍｍ単位の長さ（Ｌ、長い）および幅（Ｗ、短い）を記録し、生データとして保存した。処置の初日の平均腫瘍体積を各群について報告した。相対的な腫瘍体積の計算および平均腫瘍成長曲線のプロットを実施した。体重データも得た。
【００８４】
結果および考察
本試験の結果は、ＰＣＩ技法が、生体内でのゲムシタビン作用を有意に亢進することができることを示した（図５）。純粋なゲムシタビン処置は、未処置の対照群と比較して、腫瘍成長にまったく効果がなかったか（図５、２００ｍｇ／ｋｇゲムシタビン）または非常にささやかな効果（図６、４００ｍｇ／ｋｇゲムシタビン）しかなかったことがわかる。光化学的処置単独（ＰＣＩ単独、すなわち、ゲムシタビンを用いないアンフィネックス（登録商標）およびレーザー光の適用）も事実上、まったく効果がなかったこともわかる。しかしながら、ゲムシタビンおよびＰＣＩの組み合わせは、ゲムシタビンのいずれの用量を用いても、腫瘍成長において実質的な遅延をもたらし、明らかな相乗効果を誘発した。
本試験における動物の体重は表１に示す。実験群はすべて、本試験開始時に１０匹の動物を含めていたが、本試験の間、数匹の動物は、主として実験的腫瘍の過剰な成長により、屠殺しなければならなかった。屠殺することになった個体数は、対照群（すなわち、「未処置」群および「ＰＣＩ単独」群）よりも多く、ゲムシタビンを用いてＰＣＩを受けた群において最少であり、その理由は、後者の処置が腫瘍成長における有意な遅延を誘発したからである。すべての実験群において、動物は平均して、本試験の終了時に体重が増えたことがわかる。明らかに、体重増加は、本試験の開始時には最小平均体重であった「ＰＣＩ単独」対照群において最大であった。他の群の間では、体重増加は極めて同様であった。これらの群のうちのいくつかにおいて、体重のわずかな減少（最大７％）が照明時点後の第１の期間においてみられた。この減少は、ゲムシタビンを用いたＰＣＩ処置を受けている群において最も顕著であったが、起こり得るつかの間の体重減少もその他の群のうちのいくつかにおいて観察された。これらのデータは、アンフィネックスまたはＰＣＩのいずれかの処置によるゲムシタビンの全身レベルの毒性の明白なまたは非可逆的な悪化がないことを示唆している。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
結論
本結果は、アンフィネックス光増感剤を用いたＰＣＩが、ヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ４６０肺癌モデルにおいてゲムシタビンの抗腫瘍効果を有意に亢進することができることを示す。
【００８７】
実施例３：胆管癌の処置におけるゲムシタビンを用いたＰＣＩの生体内（ヒト）での査定
本試験は、ゲムシタビンのアンフィネックス（登録商標）誘導性光化学的内在化（ＰＣＩ）に続くゲムシタビン／シスプラチン化学療法の安全性、耐用性および有効性を、進行性の手術不能な胆管癌に罹患している患者において評価するための第Ｉ相／第ＩＩ相用量漸増試験とした。
【００８８】
試験集団：
組織学的にまたは細胞学的に、手術不能な局所進行性または転移性の胆管癌と診断された、化学的に未処置の男女の患者。
【００８９】
薬物：
アンフィネックス３０ｍｇ／ｍｌ：３０ｍｇ／ｍｌの活性物質ＴＰＣＳ2a．２ＭＥＡ（ＴＰＣＳ2a．２（モノエタノールアミン））（２６ｍｇ／ｍｌの活性部分ＴＰＣＳ2a）
賦形剤：ＴＰＣＳ2a．２ＭＥＡを３．０％トゥイーン８０、５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．５および２．８％マンニトール中に製剤化する。
【００９０】
処置：
ステント術：
患者は全員、ＰＣＩ処置に先立って胆道ステント術を受け、適切な胆管ドレナージを確保した。
これを反映する鍵となる除外パラメータは、「血清（総）ビリルビン」であり、最大１．５×病院用正常上限（ＵＬＮ）とすることができた。
ステントは、プラスチックまたは金属のいずれかであることができた。プラスチックステント術の場合、レーザー照明に先立ってＥＲＣＰ手順の間にこの／これらのステントを除去し（４日後）、新たなステント（複数可）を照明手順直後に適所に置いた。金属ステントを使用する場合、これらのステントは、レーザー照明の間でも胆管の中の適所に維持した。
【００９１】
ＰＣＩ処置
０日後：単回用量のアンフィネックス（登録商標）（フィマポルフィン）を静脈内注射（用量漸増−後述を参照されたい）によって、１ｍｌ未満の容積で全身投与し、これを０．９％ＮａＣｌで流し入れた。
４日後：単回用量のゲムシタビン１０００ｍｇ／ｍ2をＳｍＰＣ／処方情報にしたがって０．９％塩化ナトリウムで再構成および希釈し、３０分にわたる静脈内点滴により投与した。
４日後−レーザー光適用：ゲムシタビンの投与開始後３時間（±１時間）の時間枠内で実施した。レーザー光適用は、ＣＥ標識ＰＣＩ６５２ｎｍ赤色光レーザー、放射照度１００ｍＷ／ｃｍ（すなわち、光ファイバーの拡散装置の長さ１ｃｍあたり１００ｍＷ）を用いて実施して、示される光線量を達成した（例えば、コホート１において、患者を１５０秒間の照明に供して、１５Ｊ／ｃｍの線量を達成し、コホート２〜４の患者を３００秒間の照明に供して、３０Ｊ／ｃｍの線量を達成したが、より大きなまたはより多数の腫瘍に罹患している数名の患者は、追加の照明を必要とした）。（用量漸増−後述を参照されたい）
光ファイバー：活動状態での拡散装置長が２、３または４ｃｍである円筒状光拡散装置ＲＤ。供給元：メディライトＳＡ社（Medlight SA）、スイス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｌｉｇｈｔ．ｃｏｍ／）。１つ超の腫瘍があった場合、または腫瘍がファイバーの活動状態での拡散装置チップよりも大きな場合、全体的な／すべての腫瘍（複数可）を網羅するために、追加の照明を行うことができた。
光ファイバーの位置取りのためのカテーテル（光ファイバーをこのカテーテルの中へと押し入れ、それによりファイバーの活動状態での遠位拡散装置チップは腫瘍部位（複数可）に配置することができた：蛍光顕微鏡下での誘導の下で、半透明ＥＲＣＰカテーテルを胆管内へと進行させた。使用したＥＲＣＰカテーテル：ＭＴＷ  ＥＲＣＰカテーテル、金属チップ付き、長さ２１５ｃｍ、直径＝２．３＞１．８ｍｍ、文献番号９９  ０１  ３０  ３１  ２またはＭＴＷ  ＥＲＣＰカテーテル０３５円錐形金属チップカニューレ、長さ２１５ｃｍ、直径＝１．８ｍｍ。文献番号０１  ３０  ６１  １。ＭＴＷエンドスコピー社（MTW Endoskopie）、ドイツ（ｈｔｔｐ：／／ｎｍｇ．ｋｉｅｖ．ｕａ／ｆｉｌｅｓ／Ｋａｔａｌｏｇ％２０ＭＴＷ．ｐｄｆ）により供給。
コホート１における１名の患者（患者２）において、第２のＰＣＩ処置を、同じ用量パラメータ（アンフィネックス０．０６ｍｇ／ｋｇおよび１５Ｊ／ｃｍの光線量）を用いた初回のＰＣＩ処置のおよそ９か月後に行った。コホート２における患者６も、０．２５ｍｇ／ｋｇのアンフィネックスおよび３０Ｊ／ｃｍの光線量を用いた初回ＰＣＩ処置のおよそ１７か月後に第２のＰＣＩ処置を受けた。
【００９２】
背景処置（標準的な処置）
レーザー光適用７〜２１日後に開始し、４名の患者を除く全員が、８周期の標準的な全身化学療法を受けた：シスプラチン（２５ｍｇ／ｍ2）およびゲムシタビン（１０００ｍｇ／ｍ2）、各２１日周期の１日後および８日後に付与。
特に、患者コホートは、次の背景処置を受けた。
コホート１：３名の患者−２名が８周期を受け、１名が周期１および２ならびに周期３の初回化学療法投与（１日後）を受けた
コホート２：３名の患者−３名が全員、８周期を受けた。
コホート３：４名の患者−３名の患者が８周期を受け、１名が周期１の初回化学療法投与（１日後）を受けた。
コホート４：６名の患者−４名の患者が８周期を受け、１名が６周期を受け、１名はいずれの周期も受けなかった
【００９３】
用量漸増−第Ｉ相
次の用量のアンフィネックスおよび光を合計１６名の患者において検討した。コホートは、最低３名の患者からなった（背景化学療法の少なくとも周期１を完了−次の用量レベルへの漸増について必要とされる安全性査定のため）。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
結果−安全性：
用量制限毒性（ＤＬＴ）は観察されず、用量を増加させるとともに用量有害反応において明らかな上昇はなかった。最も共通した有害事象とは、軽度光感受性反応、腹痛、および胆管炎であった。
【００９６】
結果−有効性：
患者をＣＴまたはＭＲによって基線で、ならびに標準的な化学療法処置の周期１の開始からおよそ３および６か月後に検討した。画像はすべて、２名のＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答査定基準）および胆管癌の専門家によって個別に査定された。査定は、コホート１〜４については患者を処置する病院の専門家（地方での読取り）によって、またはコホート３および４については２名の中央の独立した放射線学の専門家（中央での読取り）によって、地方レベルで行った。中央での読取りについては、読み手間の論議の場合、調整者が査定に用いられた。
コホート１〜３において適用される用量レベルは後述のとおりであり、有効であると期待された（Ｓｕｌｔａｎら，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １７：１２１７〜１２２９）。
コホート３および４からの６か月間の結果（９名の患者のうち７名が査定可能）：進行性疾患（ＰＤ）（２０％超の成長）２名、安定した疾患（ＳＤ）１名、部分奏功（ＰＲ）（３０％超の縮小）２名、完全奏功（ＣＲ）（見えない腫瘍）２名（中央での読取りを介した）。客観的応答速度（ＰＲ＋ＣＲ）は、５０％超であった（７名のうちの４名の患者が肝門癌であり、未処置）が、標準的な処置（ゲムシタビンおよびシスプラチンの組み合わせ（Ｖａｌｌｅら，２０１０，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６２：１２７３〜１２８１）、肝門癌、未処置の患者１３名）で期待されるものをはるかに上回っている。
コホート３および４（中央での読取り）からの患者レベルにおける応答の査定を、標準的な化学療法処置（ＡＢＳ０２）と比較して、図７に示す。２名の中央での独立した放射線学専門家によって同定されるすべての標的（＝測定可能な）病変の合計（中央での読取り）を評価する、コホート３および４からの標的病変レベルにおける応答の査定は、図８に示す。２名の中央での独立した放射線学の専門家によって同定される期待される処置済標的（＝測定可能な）病変を評価する、コホート３および４からの標的病変レベルでの応答の査定は、図９に示す。
本結果は、（０．１２または０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＰＳＣ2aで処置され、３０Ｊ／ファイバーｃｍの光線量へ曝露された）コホート３および４における患者の５０％超が６か月での処置に対して部分奏功または完全奏功を呈したのに対し、標準的な化学療法を用いた処置では、患者の１０％未満（１３名中１名）が部分的な処置となったことを示す（図７）。さらに、選択された標的病変のほぼ９０％が縮小し、その６０％超が６か月で検出不可能となった（図８）。同様の結果は、期待される処置済標的病変を検討したときに観察された（図９）。図９から、１４の腫瘍のみが（すなわち、照明領域において）処置されることが期待されたということは特筆されるであろう。しかしながら、照射領域にはない腫瘍を含む、すべての腫瘍を考慮した場合を示す図８に示されるように、１９の腫瘍のうちの１７が応答を示した。このことは、照明領域の外側にある腫瘍の少なくとも３つが処置に応答したことを示しており、効果が照明領域を越えて広がっていることを示唆している。照射部位の外側にある腫瘍を標的とする局所免疫応答を刺激するかもしれない照射された腫瘍からの分子の放出から、このことが結果的に生じるのかもしれないという可能性が考えられる。これらの結果は、すでに有効な処置が利用可能ではなかった患者に対する胆管癌の処置を提起するという点で非常に重要である。
すべてのコホートからの放射線学的に査定可能な各患者についての標的腫瘍の全体的な大きさに及ぼす影響を、図１０に示す。コホート１および２については、地方での読取りの結果を示す。コホート３および４については中央での読取りの結果を示す。患者４および１１は、放射線学によって査定可能ではなかった、すなわち、彼らの病変が、腫瘍減少計算を許容するよう測定することはできなかったので、除外した。図１０は、患者全員のおよそ９０％が腫瘍の大きさの減少を示したことを示す。
検討した患者の概観、彼らのＲＥＣＩＳＴ結果および彼らの全生存率（ＯＳ）を、以下の表２に示す。６か月でのＲＥＣＩＳＴについての２つの列は、地方での読取り（左側の列）および中央での読取り（右側の列）を示す。４名の患者は生存したままである（患者６、１２、１４および１６）。今日までの平均生残は１６か月であり（最終列を参照されたい）、生残中央値は１４．４か月である（データ非表示）。生存したままである４名の患者に鑑みて、平均生残は、本試験における患者についての１６か月を超えて増加するであろうと期待される。
【００９７】
【表３】
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【００９８】
実施例４：胆管癌の処置におけるゲムシタビンを用いたＰＣＩの生体内（ヒト）査定（代替的な処置プロトコル）
本試験は、進行性の手術不能の胆管癌に罹患している、第２回の光化学的内在化（ＰＣＩ）処置を用いた患者におけるゲムシタビンのアンフィネックス（登録商標）誘導性ＰＣＩに続くゲムシタビン／シスプラチン化学療法の有効性を評価することとする。
【００９９】
試験集団：
組織学的にまたは細胞学的に手術不能と診断され、局所的に進行したまたは転移した胆管癌の処置癌に罹患している、化学的に未処置の男女の患者。
【０１００】
薬物：
実施例３にあるとおり、アンフィネックス  ３０ｍｇ／ｍｌ
【０１０１】
処置：
処置は、実施例３にあるとおり行うが、次のタイミングを用いる。
ａ）第１のＰＣＩ処置
０および４日後：アンフィネックス（登録商標）（フィマポルフィン）およびゲムシタビン、次いで３０Ｊ／ｃｍの線量を達成するために実施例３に説明したような照射（ゲムシタビン投与完了２〜４時間後）。
ｂ）標準的な全身化学療法
レーザー光適用の７または２１日後に開始して、患者は、４周期の標準的な全身化学療法を受ける：シスプラチン（２５ｍｇ／ｍ2）およびゲムシタビン（１０００ｍｇ／ｍ2）、各２１日周期の１日後および８日後に実施例３に説明したとおり付与。
ｃ）第２のＰＣＩ処置
標準的な全身化学療法の第４の周期の１８日後および第５の周期の１日後に、ＰＣＩ処置を、上記で０および４日後に行ったように反復する。第２のＰＣＩ処置の開始（＝周期４の１８日後）、およびその後の全身化学療法の開始は、患者の健康状態に応じて最長４週間まで延期してもよい。
ｄ）標準的な全身化学療法
周期５は、周期４の２１日後の翌日に開始する（先にとおり、患者の健康により遅延することがない限り）。全身化学療法は、ｂ）に明らかにしたように行うが、周期５においてのみ８日後に行う。３つの追加の周期は、ｂ）に明らかにしたように行う（すなわち、８日後および２１日後の処置）。
安全性および有効性は、実施例３において説明したとおり評価する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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