(57)【要約】【課題】  発毛・育毛作用を有する物質のスクリーニング方法ならびにそのために使用されるイン・ビボの評価方法を確立することである。【解決手段】  本発明による発毛・育毛作用のイン・ビボ評価方法は、毛周期を強制同調させたマウスを用いて毛包の形態変化を評価因子として測定し、発毛・育毛作用を評価する。極めて多数の生物抽出物または物質から、発毛剤・育毛剤の成分候補となり得るものを効率的にスクリーニングするには、繊維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ−５）作用の阻害の程度を測定することにより、該ＦＧＦ-５阻害作用を有する物質または生物抽出物を選び出すイン・ビトロ評価を行なう。次いで選び出された物質または生物抽出物を、発毛・育毛作用について前記イン・ビボ評価を行なうことが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発毛・育毛作用の有無を調べる試料を皮膚面に塗布し、毛周期の成長期後期から退行期への移行時に起きる毛包、毛、塗布された皮膚面の形態もしくは状態の変化を測定することにより、毛周期の成長期の延長または退行期への移行遅延を評価指標として、発毛・育毛効果の発現を評価することを特徴とする発毛・育毛のイン・ビボ評価方法。
【請求項２】
毛周期の休止期において抜毛することにより毛周期を強制同調させたマウスを使用して行われることを特徴とする請求項1に記載の発毛・育毛のイン・ビボ評価方法。
【請求項３】
毛周期の成長期において剃毛した、自然同調のマウスを使用して行われることを特徴とする請求項1に記載の発毛・育毛のイン・ビボ評価方法。
【請求項４】
前記の形態もしくは状態の変化について、毛包の長さ、毛包最深部（毛球部）の脂肪層への到達程度および到達毛包数、毛包の組織学的評価および試料塗布部分の皮膚色から選択される1つまたは複数の組合せを用いて評価することを特徴とする請求項1に記載の発毛・育毛のイン・ビボ評価方法。
【請求項５】
請求項1に記載の発毛・育毛効果のイン・ビボ評価試験に使用されるマウスであって、
マウスの毛周期を休止期において抜毛し、休止期から成長期への移行を強制的に誘導させることにより毛周期を同調させることを特徴とするマウスモデルの作製方法。
【請求項６】
発毛・育毛作用の評価に少なくとも請求項１〜４のいずれかの発毛・育毛のイン・ビボ評価方法による試験を実施し、成長期の延長または退行期への移行遅延の効果を有する新規育毛候補物質を見出すことを特徴とする発毛・育毛剤スクリーニング方法。
【請求項７】
前記イン・ビボ評価方法による試験に先立ち、
繊維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ−５）作用の阻害の程度を測定することにより、該ＦＧＦ-５阻害作用を有する物質または生物抽出物を選び出すイン・ビトロ（in vitro）評価を
行ない、
次いで選び出された物質または生物抽出物を試料として、前記イン・ビボ評価方法による試験を実施して、新規育毛候補物質を見出すことを特徴とする、請求項６に記載の発毛・育毛剤スクリーニング方法。
【請求項８】
前記イン・ビトロ評価が、ＦＧＦ−５およびインターロイキン−３（ＩＬ-３）に対し
て感受性のある培養細胞を有する培養液に、ＦＧＦ−５またはポジティブ・コントロール用のインターロイキン３、さらに試料である生物抽出物または物質、あるいはベヒクルを添加して培養した後、該細胞の増殖の程度を測定することにより該生物抽出物または該物質のＦＧＦ-５作用阻害を調べて生物抽出物または物質の発毛・育毛作用を評価すること
である、請求項７に記載の発毛・育毛剤スクリーニング方法。
【請求項９】
前記培養細胞が、FR-Ba/F3細胞またはBALB/3T3細胞であることを特徴とする請求項８に記載の発毛・育毛剤スクリーニング方法。
【請求項１０】
前記の阻害は、ＦＧＦ−５による培養細胞増殖の促進を阻止することである、請求項７〜９のいずれかに記載の発毛・育毛剤スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛周期を強制同調させたマウスモデルの作製方法、このマウスを用いた、毛包形態を評価指標にして発毛・育毛作用を評価するイン・ビボの方法、ならびにこれを利用した、発毛・育毛作用を有する物質のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで開発されてきた発毛・育毛剤の多くは、発毛を阻害する過剰皮脂分泌を抑制したり、頭皮などの血行不良を解消したり、あるいは男性ホルモンの作用を抑制することにより発毛を促すことを狙いとしている。他方、マツエキスに見られるように古来より植物由来の発毛・育毛剤が存在しており、その育毛作用の実体は詳らかでないが、民間療法において使用されてきた。このように多数の発毛・育毛剤が存在しているが、薄毛・脱毛の種類による効果の個人差も大きいこともあり、薄毛・脱毛に対して普遍的に効果を示すものは今のところ存在しない。
【０００３】
高齢化と多ストレスの社会を反映して薄毛・脱毛に対し、普遍的に効果を発揮する発毛・育毛剤のニーズは、依然として存在し、また今後とも高いと言える。新規の発毛・育毛剤成分として発毛・育毛効果を有する物質の探索が今も精力的になされてきているが、真に実効性のある新規物質は、容易には見出されない。その原因の１つとして、発毛・育毛剤成分の候補物質をスクリーニングする際の評価方法が必ずしも適切でないことが指摘されている。
【０００４】
毛は一定の速さで絶えず成長するのではなく、成長期と休止期を繰返しながら成長する。成長期から休止期までの毛の成長と脱毛のサイクル（毛周期）は、身体部位および人間の場合には毛1本ごとに相違する。現在の発毛・育毛剤のスクリーニング方法では、小川
らの開発した評価方法が使用されている。この方法は、８週齢程度の若いマウスでは、体表全体の毛の周期が概ね同調して休止期にあることを利用する。すなわち、マウス背部を剃毛後、試料を塗布し、休止期から成長期へ移行するタイミングを捉えて観察することにより、候補物質と対照物質との発毛・育毛効果の差異を比較する試験方法である。しかし、本法は、毛周期が休止期状態のマウスを使用し、しかも皮膚への刺激を一定に揃えることが困難である剃毛を採用しているために、用いるすべてのマウスの毛周期を同調させて試験を行うことが極めて困難であり、さらに剃毛から発毛・育毛効果の判定まで、通常４０日間ほどの長期間を必要とするなどの問題点があった。
【０００５】
他方、毛母細胞の毛周期に影響を与える物質の一つである変換成長因子（ＴＧＦ）βは、毛周期を成長期から退行期、休止期へ移行させる作用を示す。その作用を抑制するアンタゴニストが見出され、新規な育毛成分として提案されている。
【０００６】
鈴木らは、上記ＴＧＦβとは異なるサイトカイン、繊維芽細胞増殖因子５（以下、「ＦＧＦ−５」ともいう。）の生物活性にも毛周期の制御があることを見出した（非特許文献1〜4参照）。ＦＧＦ−５タンパク質は、多彩な生理作用を示す繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する。彼らの研究により、ＦＧＦ−５は、毛の成長を阻害し、毛周期を成長期から退行期へ移行させる作用を有していることが明らかとなった。成長期の毛胞に大量に発現するＦＧＦ−５Ｓ（ＦＧＦ−５の短鎖形分子）は、ＦＧＦ−５に対しアンタゴニスト活性を示すことにより、成長期から退行期への移行を遅らせて、毛成長を促進することも明らかとなった（非特許文献1〜4参照）。また、線維芽細胞成長因子５を動物に投与すると投与部位において毛周期異常が誘発されることが見出だされ、この発見に基づく脱毛症モデルが提案されている（特許文献１）。
【０００７】
また、従来の毛乳頭細胞または毛包細胞を用いたイン・ビトロの測定は、動物からそうした細胞を注意深く採取してこれを培養する方式が大半であるため、極めて多数の候補物質の中から有効物質を迅速に検索する場合には到底対応できないことは明らかである。さらに発毛・育毛効果の検証は最終的にはイン・ビボの系で行なうことが望まれる。
【０００８】
従ってイン・ビトロの評価方法、イン・ビボの評価方法を問わず、さらに発毛・育毛効果の評価方法を改良し、効率的なスクリーニング方法を確立することが求められている。
【特許文献１】特開２００１−３４３３８３号公報
【非特許文献１】Ozawa K, Suzuki S, Asada Mら J.Biol.Chem. 273:29262-29271 (1998)
【非特許文献２】Suzuki S, Kato T, Takimoto Hら J. Invest. Dermatol．111：963-972（1998）
【非特許文献３】Suzuki S, Ota Y, Ozawa K, Imamura T  J.Invest. Dermatol. 114: 456-463 (2000)
【非特許文献４】Ota Y, Saitoh Y, Suzuki SらBiochem. Biophys. Res. Commun. 290: 169-176(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の方法は、上記の状況に鑑みて発毛・育毛作用を迅速かつ的確に測定し評価するための新しいイン・ビボの評価方法として開発されたものである。
本発明は、発毛・育毛作用を有する物質を含有する生体抽出物を探索するための発毛・育毛効果を測定・評価する方法を提案することを目的とする。すなわち優れた発毛・育毛作用を発揮する生物抽出物または物質を探索する目的のために、その発毛・育毛作用の効力を測定し、選別するイン・ビボの評価方法を提供することにある。さらにイン・ビトロの評価方法とを適切に組み合わせることにより、ハイスループットなスクリーニング・システムを創出することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決する本発明は、以下の構成を有する。
本発明の発毛・育毛のイン・ビボ評価方法は、発毛・育毛作用の有無を調べる試料を皮膚面に塗布し、毛周期の成長期後期から退行期への移行時に起きる毛包、毛、塗布された皮膚面の形態もしくは状態の変化を測定することにより、毛周期の成長期の延長または退行期への移行遅延を評価指標として、発毛・育毛効果の発現を評価することを特徴としている。
【００１１】
上記の方法では、毛周期の休止期において抜毛することにより毛周期を強制同調させたマウスを使用して行われることが望ましい。
あるいは毛周期の成長期において剃毛した、自然同調のマウスを使用して行ってもよい。
【００１２】
前記の形態もしくは状態の変化について、毛包の長さ、毛包最深部（毛球部）の脂肪層への到達程度および到達毛包数、毛包の組織学的評価および試料塗布部分の皮膚色から選択される1つまたは複数の組合せを用いて評価することを特徴としている。
【００１３】
また、前記の発毛・育毛効果のイン・ビボ評価試験に使用されるマウスであって、マウスの毛周期の休止期において抜毛し、休止期から成長期への移行を強制的に誘導させることにより毛周期を同調させることを特徴とするマウスモデルの作製方法も本発明に含まれる。
【００１４】
本発明の発毛・育毛剤スクリーニング方法は、発毛・育毛作用の評価に少なくとも上記のいずれかの発毛・育毛のイン・ビボ評価方法による試験を実施し、成長期の延長または退行期への移行遅延の効果を有する新規育毛候補物質を見出すことを特徴としている。
【００１５】
さらに、本発明の発毛・育毛剤スクリーニング方法は、前記イン・ビボ評価方法による試験に先立ち、
繊維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ−５）作用の阻害の程度を測定することにより、該ＦＧＦ-５阻害作用を有する物質または生物抽出物を選び出すイン・ビトロ（in vitro）評価を
行ない、
次いで選び出された物質または生物抽出物を試料として、前記イン・ビボ評価方法による試験を実施して、新規育毛候補物質を見出すことが望ましい。
【００１６】
前記イン・ビトロ評価は、ＦＧＦ−５およびインターロイキン−３（ＩＬ-３）に対し
て感受性のある培養細胞を有する培養液に、ＦＧＦ−５またはポジティブ・コントロール用のインターロイキン３、さらに試料である生物抽出物または物質、あるいはベヒクルを添加して培養した後、該細胞の増殖の程度を測定することにより該生物抽出物または該物質のＦＧＦ-５作用阻害を調べて生物抽出物または物質の発毛・育毛作用を評価すること
である。
【００１７】
前記培養細胞は、好ましくはFR-Ba/F3細胞またはBALB/3T3細胞である。
前記の阻害は、ＦＧＦ−５による培養細胞増殖の促進を阻止することである。
前記生物抽出物は、たとえば植物抽出物である。
さらに前記の発毛・育毛作用のイン・ビトロ評価の方法において、試薬類の中に細胞増殖刺激物質として少なくともＦＧＦ−５およびインターロイキン３を含むキットが、好ましく使用される。
〔発明の具体的説明〕
本発明の方法は、極めて多数の試料の中から、発毛剤・育毛剤の成分候補となり得る物質または生物抽出物を探索するための発毛・育毛作用の評価方法である。スクリーニングの対象となる物質または生物抽出物の中から、真に発毛・育毛作用を有するものを効率的に選別するためには、採用する評価方法の当否も重要である。なお本明細書において「毛周期」は、毛包における毛の産生についての一定のサイクルをいう。またその「同調」とは、個体内の体表各部位、及び個体間で、個体同士の毛周期が同一相に揃うことをいう。イン・ビボ評価方法
本発明である発毛・育毛作用のイン・ビボ（in vivo）評価方法は、発毛・育毛作用の
有無を調べる試料を皮膚面に塗布し、毛周期の成長期後期から退行期への移行時に起きる毛包、毛、塗布された皮膚面の形態もしくは状態の変化を測定することにより、毛周期の成長期の延長または退行期への移行遅延を評価指標として、発毛・育毛効果の発現を評価する方法である。かかる方法において、動物の毛を除去し、試験する物質を含む試料または試料の生物抽出物を塗布、経口、皮下注射などの方法で投与して、一定期間経過後に発毛の状態、毛包の形態変化などを調べ、対照群との比較によりその効果を判定する。この点では、これまで知られているイン・ビボ評価方法と共通している。しかしながら、本発明のイン・ビボ評価方法は、毛周期の成長期後期から退行期への移行時に生起する毛包の形態の急激な変化に着目し、これを評価用パラメータとして測定し、評価する試験であることを特徴としている。
【００１８】
イン・ビボ評価用の動物モデルを作製する場合、用いることのできる動物（ヒトを除く）としては、このような実験で使用されているものであれば、特段の制限なく使用できる。動物としてマウス、ラット、モルモット、ウサギなどの齧歯類やイヌ、ネコまたはサルなどが例示できる。これらのうちで好ましいものは、例数が多く取り扱える齧歯類であり
、なかでもマウスが特に望ましい。また動物の系統としては、個体差をある程度コントロールできることから純系のものを使用するのが好ましく、特に純系のマウスが好ましい。さらに、毛の成長を色差などでトレースすることができることから、有色動物であることが好ましく、有色マウスがさらに望ましい。このような有色の純系マウスとして、とりわけC3H/HeNマウスが好ましく例示できる。さらに動物群内の個体差を少なくするために、
個体間の毛周期を同調させて行うことが望ましい。本試験方法は、毛周期を同調させたマウスモデルを使用して行われる。
【００１９】
マウスの成長期、すなわち生後５０日以内では、基本的に毛周期が揃っており、マウスの日齢が同じであるマウスの群内では、同一の毛周期にある。本マウスモデルは、マウスの毛周期を休止期において抜毛し、休止期から成長期への移行を強制誘導させることにより、マウス個体間で毛周期をすべて同調させることを特徴としている。毛の除去方法は、好ましくは抜毛であり、剃毛のように皮膚への刺激が一定しないということはない。また休止期の抜毛であるために、毛除去が容易に実施できる。このような抜毛による毛周期の強制同調によれば、マウス群内の同調強度は常に高く一定であり、毛周期同調の信頼性は高く、従って試験の感度と精度を向上させることができる。
【００２０】
前記の発毛・育毛効果のイン・ビボ評価試験に使用されるマウスであって、マウスの毛周期の休止期において抜毛し、休止期から成長期への移行を強制的に誘導させることにより毛周期を強制同調させることを特徴とするマウスモデルの作製方法もまた本発明に含まれる。
【００２１】
発毛・育毛効果のイン・ビボ評価試験は、毛周期における成長期の延長または退行期への移行遅延をもたらすか否かを判定することによって行われる。発毛・育毛効果の観察時期の決定は、抜毛法による強制同調では、毛周期は強く同調しているために、適切な観察時期は容易に決定できる。すなわち成長期への移行日の判断は容易である。効果の観察時期として、成長期の初期、中期、後期、さらに退行期のいずれも好適である。効果判定を確実に行なうことができる限り、短い期間で済む方法が望ましい。本発明の方法では、試験期間を、抜毛をした日の翌日から２２日の間で任意に設定可能である。毛包などの形態を測定し、評価することは、抜毛後１日目〜２２日目に、好ましくは抜毛日より１７日目〜２１日目に、特に好ましくは１９日目、20日目に設定される。
【００２２】
抜毛に替えて剃毛による毛の除去方法もまた使用することができる。小川法における剃毛は休止期に実施される。この場合、毛周期の同調は自然同調であり、自然同調へ影響しない剃毛は難しいのが実情である。すなわち、剃毛は同調に関しては無作為的であり、さらに剃毛の影響が一様でないためにマウス群内の同調強度は、試験により一定しない。これに対し、本発明では、毛の除去方法として剃毛を採用する場合、成長期において毛を除去する。自然な同調を利用することについては、小川法と共通するが、成長期に剃毛することで休止期に剃毛するよりも毛周期への影響は小さく、自然同調であっても群内同調の強度はより高いと考えられる。また本発明の剃毛に基くイン・ビボ評価において発毛・育毛効果の観察時期は、成長期および退行期である。評価の対象は、成長期が延長した毛および退行期への移行が遅延した毛である。
【００２３】
さらに後述する実施例において、同一マウス個体における体表の異なる部位においても毛周期が同一の相にあるのか調べられた。その結果、同一マウス個体の背部左右は毛周期が一致しており、背部のそれぞれの側は独立して評価試験に用いることが可能であることが判明した。これより、マウス背面の全面を一範囲として用いる評価方法よりも少ない動物個体数で実施できる評価方法の確立、ならびに効率の良いスクリーニング方法の構築が可能となった。また、マウスの毛周期を構成する各相、すなわち成長期、退行期および休止期のうち、マウス群内の毛周期同調をより確実に行うことができる相は、休止期である
ことも本発明者らの研究により明らかとなった。通常７〜８週齢マウスでは、その毛周期は休止期にある。
【００２４】
発毛・育毛効果の判定に用いられる評価パラメータは多種多様である。従来は、休止期から成長期へ移行するタイミングを捉えて評価指標が観察されていた。毛周期の成長期後期から退行期への移行時に起きる毛包、毛、塗布された皮膚面の形態もしくは状態の変化もまた検出可能である、ダイナミックな変化であり、適宜選択して測定される。具体的には発毛本数の増加、毛密度の増加、毛の径の増大、毛包の成長、成長期の延長効果、毛包の長さ、毛包最深部（毛球部）の脂肪層への到達程度および到達毛包数、毛包の組織学的評価および試料塗布部分の皮膚色などが挙げられる。発毛・育毛効果の評価対象として、特に注目する対象は、成長期が延長した毛または退行期への移行が遅延した毛の増大である。それを窺わせる形態もしくは状態の変化は、本発明の方法では、毛包の長さ、毛包最深部（毛球部）の脂肪層への到達程度および到達毛包数、毛包の組織学的評価および試料塗布部分の皮膚色を採用し、これらから選択される1つまたは複数の組合せを用いて評価
する。
【００２５】
以上述べてきた本発明の抜毛法および剃毛法と、小川法とを比較のために表１にまとめた。
【００２６】
【表１】
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発毛・育毛作用を有する候補物質のスクリーニング方法
上記のイン・ビボ（in vivo）評価方法は、生物抽出物または候補物質（「試料」とも
いう）の発毛・育毛作用を、動物を用いて評価し、これに基づいて選別することを含むも
のであり、発毛・育毛作用を有する物質のスクリーニングに利用される。発毛・育毛作用の評価に際し、発毛・育毛作用が動物において実際に発現されるかを確認する意味においてイン・ビボの評価方法に基づくことが望ましいためである。本発明の上記評価方法は、退行期に移行する時期におけるダイナミックな毛包の形態変化を１つの指標、好ましくは複数の指標の組合せで評価する。そうした観点において休止期から成長期への移行のみに注目し、主として発毛効果を評価する従来のイン・ビボ評価方法とは区別される。本発明のイン・ビボ評価方法を、発毛・育毛作用を有する候補物質のスクリーニングに利用する場合は、マウスの毛周期の休止期における抜毛法と成長期おける剃毛法のいずれを用いてもよい。そうしたスクリーニングにおいて、本発明のイン・ビボ評価方法を単独で使用してもよい。
【００２７】
ところでイン・ビトロ（in vitro）の評価方法は、多数の試料を迅速に処理できるという利点を有する。好ましいイン・ビトロ評価方法であるためには、その他の要件として、分析に多段階の処理、たとえば分離精製の工程、煩雑な定量操作を要しないこと、評価の所要時間が短いこと、測定方法が簡便な分析によるものであって、装置および測定がシンプルであること、ならびに結果の誤差、バラツキが少なく、評価の信頼性、再現性が良好であることが挙げられる。同様にイン・ビボの評価方法も、動物を使用することから、動物の群間および群内の毛周期を同調させることにより個体差の変動をなるべく少なくするとともに、絞り込まれた候補対象の発毛・育毛作用剤としての有効性を的確に評価できるものが望ましい。そこで、本発明のスクリーニング方法では、発毛・育毛作用の確認はなるべくイン・ビボの系で行なうことを主眼とするものの、必要に応じてイン・ビトロ評価方法もまた組み入れることも可能である。好ましい態様として、一次スクリーニングとしてＦＧＦ−５阻害試験によるイン・ビトロの評価試験、その結果に基づいて候補対象を絞り、次いで動物を使用した二次スクリーングとして、動物塗布試験によるイン・ビボの評価試験を行なう構成が挙げられる。
【００２８】
本発明におけるイン・ビトロ評価のための測定方法として、迅速性、操作性や信頼性などを具えるために、動物を使用せず、替わりにＦＧＦ−５感受性の培養細胞、好ましくはＦＧＦ−５およびインターロイキン−３（ＩＬ‐3）両方に対して感受性を有する培養細
胞を用いるＦＧＦ−５作用の阻害試験がより好適であることがわかった。続いて行われるイン・ビボ評価においては、動物の毛周期を同調させ、生物抽出物を塗布する実験をなるべく短期間で実施できる方法の採用を最善の組合せとして採用する。イン・ビトロの評価、次いでイン・ビボの評価の順で構成される本評価方法は、発毛・育毛作用を多面的に検証するという方針のもとに構築されている。
【００２９】
従来のイン・ビトロ評価に基づくスクリーニング方法では、動物の毛周辺組織（たとえば毛包や毛乳頭を含む組織など）または毛関連細胞（たとえば毛乳頭細胞、毛包ケラチノサイトなど）を採取して、発毛・育毛効果を検証する方法が採られている。しかしながら、これらの評価方法では、イン・ビトロであっても動物を使用することに変わりがなく、動物から組織、細胞を適切に採取することも煩雑である。さらに個体差、採取の手技、条件などにも影響されやすい。本発明では、こうした動物から組織または細胞をその都度採取するのではなく、市販され、特性の明確となっている細胞株から作製されるFGF-５感受性の培養細胞、好ましくはＦＧＦ−５およびIL‐3両方に対して感受性がある培養細胞を
用いる。これにより、多数のサンプルを処理することが実現でき、ハイスループット・スクリーニングが達成できる。かかる評価方法を用いて生物抽出物または物質の発毛・育毛作用を評価し、選別することを含む発毛・育毛作用を有する物質のスクリーニング方法は、本発明に包含される。なお、発毛・育毛作用の探索対象となる前記生物抽出物は、好ましくは植物抽出物である。
【００３０】
従って本発明による発毛・育毛剤スクリーニング方法は、生物抽出物または物質の発毛
・育毛作用の評価に少なくとも上記のいずれかの発毛・育毛のイン・ビボ評価方法による試験を実施し、成長期の延長または退行期への移行遅延の効果を有する新規育毛候補物質を見出す方法である。発毛・育毛剤スクリーニング方法のより好ましい態様は、
前記イン・ビボ評価方法による試験に先立ち、
繊維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ−５）作用の阻害の程度を測定することにより、該ＦＧＦ-５阻害作用を有する物質または生物抽出物を選び出すイン・ビトロ（in vitro）評価を
行ない、
次いで選び出された物質または生物抽出物を、前記イン・ビボ評価方法による試験を実施して、新規育毛候補物質を見出すことを特徴としている。
【００３１】
なお、明らかにイン・ビトロ測定法の不要あるいは実施不可能なものについては直ちにイン・ビボ法を採用してもよい。次に、上記のイン・ビトロ評価法の生理的基盤をなす、ＦＧＦ−５作用の阻害と発毛・育毛作用について説明する。
繊維芽細胞増殖因子５（ＦＧＦ−５）作用の阻害
本発明者らの研究により、ＦＧＦ−５は、毛の成長を阻害し、毛周期を成長期から退行期へ移行させる作用を有していることが初めて明らかとなった。一方、毛包の根元にある毛乳頭は、毛母細胞の増殖や分化を調節することにより毛の成長を制御している。退行期になると毛母細胞は消失してしまうが、毛乳頭細胞は活動が低下するもののその数は減らない。次の成長期には、毛乳頭細胞が再び活性化され、その作用によって毛母細胞が新たに増殖・分化し始める。毛乳頭細胞そのものは変わっていないため、前の成長期と同じ太さの毛を作ることができる。従って、成長期から退行期・休止期に移る引き金の役割を担っているＦＧＦ−５の作用を何らかの方法で抑制すれば、成長期だけが延長される。よって、成長期をこのように長くする物質は、優れた発毛・育毛効果を発揮すると期待される。
【００３２】
実際、成長期の毛胞に大量に発現するＦＧＦ−５Ｓ（ＦＧＦ−５の短鎖形分子）は、ＦＧＦ−５に対しアンタゴニスト活性を示すことにより、成長期から退行期への移行を遅らせ、毛成長を促進することが、本発明者らにより報告されている。本発明者らは、さらに研究を進め、特定の植物または海藻類から得られる抽出物がＦＧＦ−５作用を阻害する活性を有することを見出した。そうした抽出物には、ＦＧＦ−５Ｓに似たアンタゴニスト活性を持つ1種または複数の物質が含まれるか、あるいはＦＧＦ−５に直接阻害作用を及ぼ
す阻害物質が存在するかもしれない。このような抽出物によるＦＧＦ−５阻害の機作および活性物質の実体は、今後の研究結果に待たねばならない。
【００３３】
ＦＧＦ−５は、動物、動物の毛周辺組織、動物の毛関連細胞に投与したとき、これらにおいて毛周期を調節し、毛周期異常を誘発することが可能であれば、特に限定されるものではない。従って、毛周期異常を誘発することが可能であれば、ＦＧＦ−５のフラグメント、ＦＧＦ−５の機能的領域を含む組み換えタンパク質、ＦＧＦ−５に化学修飾がされたタンパク質、ＦＧＦ−５と高い相同性を有するタンパク質、たとえばＦＧＦ−５のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を有するタンパク質等についても本発明のＦＧＦ−５として使用することができる。また、本発明で使用できるＦＧＦ−５は、シグマ（Sigma）社などから市販の試薬として購入できる
。さらに本発明で使用できるＦＧＦ−５は、遺伝子工学的方法により組換えタンパク質として発現させ、抽出することにより調製することもできる (Clementsら 1993)。
培養細胞を用いるイン・ビトロ評価
本発明のイン・ビトロ評価は、スクリーニングの対象である物質または生物抽出物が、培養細胞の増殖を促進するＦＧＦ−５作用を阻害するかどうかを測定することを骨子としている。そのイン・ビトロ評価は、測定方法が簡便な分析によるものであり、従って分析に多段階の処理、たとえば分離精製の工程、煩雑な定量操作などを要しない。評価の所要時間も短く、使用する道具、装置もシンプルであるという特徴を有する。具体的にはプラ
スチック製の試験用器具、たとえばプレート、チップ、ディスクといった固相支持体上で、培養細胞を用いるＦＧＦ−５阻害作用の検出テストにより発毛・育毛効果を確認する。このような一次スクリーニングのハイスループット化には、マルチウェルプレートを使用して、阻害の指標である細胞増殖の抑制程度をそのままマルチウェルプレート上で測定する方式が望ましい。
【００３４】
本発明のイン・ビトロ評価方法では、ＦＧＦ-５感受性の、すなわちＦＧＦ−５を添加
することにより増殖が促進される培養細胞、さらに好ましくはＦＧＦ−５ならびにＦＧＦ−５以外の増殖促進物質、たとえばサイトカイン、一例としてインターロイキン３（IL‐3）の両方に対して感受性がある培養細胞を使用する。それらは既に市販されているか、
あるいは作製容易な細胞である。中でも好ましいＦＧＦ−5感受性細胞系の例として、Ｆ
ＧＦ−５およびＩＬ-３両方に応答性のあるFR-Ba/F3細胞が挙げられる。FR-Ba/F3細胞は
、「Ba/F3細胞」へ発現カセット付の「ＦＧＦ−Receptor 1c」cDNAを遺伝子導入することにより、安定的に「ＦＧＦ−Receptor 1c」を発現させた細胞株である。ここでＦＧＦ−Receptor 1c（以下「ＦＲ」と略す）とは、ＦＧＦ−５のレセプター（ＦＧＦ−Receptor）を意味する。 FR-Ba/F3細胞の親細胞株「Ba/F3細胞株（マウスのＩＬ−３依存性proＢ細
胞）」は、理研セルバンクを始め、様々なところから入手できる。当業者にとり、従来の遺伝子工学技術を用いて、「ＦＧＦ−Receptor 1c」を発現するcDNAを得て、上記親細胞
株に遺伝子導入することは、通常の遺伝子工学操作の範囲内である。FR-Ba/F3細胞は、その親株「Ba/F3細胞」と同様にＩＬ-３依存性（ＦＧＦ-５と同様に幅広い細胞の増殖を刺
激し促進する別種のサイトカインであるＩＬ−３が存在しないと、生存・増殖できない性質）である。加えて、FR-Ba/F3細胞は、ＦＲを発現させることによりＦＧＦ-５（ＦＧＦ-１，２にも）に対する応答性を獲得し、ＩＬ−３が存在しなくとも、ＦＧＦ-５およびヘ
パリン（ＦＧＦがＦＲに結合し、そのシグナルを細胞内へ入力する際にはヘパリンの結合も併せて必要とされる）が存在すれば、生存・増殖が可能であるという特徴を有する。このようにFR-Ba/F3細胞は、両サイトカインに応答するため、ポジティブ・コントロールとして、ＩＬ−３に対する応答を併せて調べることにより、用いた細胞の増殖能または生物抽出物または物質自体の培養細胞への影響をチェックすることができるという利点もある。従ってFR-Ba/F3細胞は、イン・ビトロ評価方法の結果に対する信頼性からも特に望ましい培養細胞である。
【００３５】
好ましい他のFGF-５感受性細胞の例として、BALB/c3T3またはNIH/３T3繊維芽細胞が挙
げられ、これらの細胞も市販されている。これらの培養細胞は、培養および取り扱いに便利である利点に加えて、定量的なイン・ビトロ評価を行なう場合には好適である。しかしながら、動物の毛関連細胞（たとえば毛乳頭細胞や毛包ケラチノサイト）が、容易に入手でき、かつ、安定的に長期の継代培養が可能であれば、本発明のイン・ビトロ評価において、そうした細胞の使用を排除するものではなく、むしろ発毛の生理に関わる細胞であるために好適であるかも知れない。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様における具体的な手順として、ＦＧＦ−５およびＩＬ-３に
対して感受性のある培養細胞を、10％ウシ胎児血清を含む培養液中で培養する。たとえば96穴培養用プレートに播き換え、培養液にＦＧＦ−５またはインターロイキン３、さらに適当に希釈した試料（生物抽出物または物質）またはベヒクルを添加して培養する。あるいは、上記細胞が培養されているＦＧＦ-５含有培養液に、対象の生物抽出物または物質
を添加することによってもよい。ここで添加する用量としては、使用する細胞、培養条件等により異なるが、培養液中の濃度として１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、生物抽出物または物質の用量は希釈倍率を変えて少なくとも数点設定するのが好ましい。これは添加効果を的確に判定するためには用量依存性（dose-dependence）を検討することが好ま
しいからである。
【００３７】
一定期間培養した後、該細胞の増殖の程度を測定する。各ウェルに市販のセルカウンティングキットを添加し、一定時間、たとえば1〜24時間、好ましくは２〜８時間、具体的
には３時間培養した後、ＩＬ-３依存的な増殖に比べて、ＦＧＦ-５依存的なFR-Ba/F3細胞増殖をいずれの濃度で阻害するかどうかを調べてもよい。阻害の程度は、最大阻害の50%
阻害濃度で比較できる。たとえば、マイクロプレートリーダーを用いて細胞数を数えることにより細胞増殖を調べることができる。あるいはそれぞれの細胞に細胞増殖の指標となる物質（チミジンなど）を加え、その取り込みを見ることによって効果を判定してもよい。チミジンなどの取り込みを指標とする場合には、あらかじめ3H、14Cなどの放射性同位
元素で標識しておくことが望ましい。増殖の程度の比較には、被検物質の代わりにベヒクルを含むものを対照とする。既に有効性が知られている他の物質、たとえばミノキシジルを基準として使用し、それと比較してもよい。発毛・育毛効果の強弱に関して、数量的な比較ができる。
【００３８】
上記培養細胞のＦＧＦ-５依存的な増殖が抑制されれば、添加した試料の生物抽出物ま
たは物質が、ＦＧＦ−５による細胞増殖の刺激作用を阻害したこととなる。生物抽出物または物質のそうしたＦＧＦ-５作用を阻害する活性は、ベヒクルを投与した対照群に対す
る細胞増殖の相対割合として、たとえば％で示される。このことは、そうした生物抽出物などがＦＧＦ-５の毛周期異常を誘発する作用を抑制すること、すなわち発毛・育毛効果
を有することにつながる。イン・ビトロ評価は、数値化された発毛・育毛効果に関していくつかの段階に分けた評価基準を設けて、その基準に従って判断するか、次のイン・ビボ評価を行なうための要件とする最低基準値を設けてもよい。
【００３９】
上記のイン・ビトロ評価方法を用いて生物抽出物または物質の発毛・育毛作用を評価し、選別することを含む発毛・育毛作用を有する物質のスクリーニング方法は、本発明に包含される。なお、効率化のためには、使用する試薬、器材、機器装置のほか、培養条件、測定条件も一定にしておくことも望ましい。かかる観点から、発毛・育毛作用のイン・ビトロ評価方法のために使用されるキットであって、添付される試薬類の中に少なくともＦＧＦ−５およびインターロイキン３を細胞増殖刺激物質として含むキットの使用も推奨される。そうしたキットには、必要に応じてマイクロプレート、緩衝液、細胞増殖アッセイの試薬類、培養基なども含められる。
動物モデルを用いるイン・ビボ評価
本発明のスクリーニング方法におけるイン・ビボ評価は、動物、好ましくは毛周期を強制同調させたマウスモデルに試料である物質または生体抽出物を塗布投与することを特徴としている。次いで適切な観察時期に毛包の形態などを測定して、発毛剤または育毛剤成分の候補となり得る物質または該抽出物について、その発毛・育毛効果を評価するステップが含まれる。
【００４０】
候補物質または生物抽出物が発毛・育毛効果を有すると判定されるためには、毛周期の成長期を実際に延長するか、あるいは退行期への移行を遅らせることが必要であり、これらは、具体的に次のようにして確認される。毛周期が休止期にあるマウス背部を抜毛し、成長期を誘導する。抜毛直後から候補物質または生物抽出物（たとえば50％エタノール溶液）を、通常は、１日1回塗布する。最終塗布の翌日、マウスの皮膚を採取して薄切切片
を作成し、毛包の形態、大きさを比較する。対照群であるベヒクル（たとえば50%エタノ
ール）塗布群では、毛包が短く既に退行期に移行しているのに対し、当該生物抽出物の塗布群では、毛包が長く成長期が持続していることを確認する。
【００４１】
対照群には、ベヒクルが塗布投与されるが、使用するベヒクルとしては、通常動物試験で使用できる水性ベヒクルを使用することができ、たとえば50%エタノール水溶液、リン
酸緩衝生理食塩水などが好ましく例示できる。さらに、動物における塗布する部位は、毛周期の同調が維持される限り特に限定されるものではない。本発明の評価方法における操
作を容易にする観点からは、動物の背部周辺が好ましい。特にマウスの毛周期休止期に背部左右を抜毛して強制同調した場合、その背部両側の独立した２つの範囲の一方を対照用に使用できるため、動物の使用数を減らすことができて好都合である。
【００４２】
また動物にＦＧＦ−５を投与して毛周期異常を誘発させた脱毛症モデルを作製し、これに試料を投与し、発毛・育毛効果について同様のインビボ評価を行なってもよい。たとえば毛周期に関して成長期が誘導された後のマウスにＦＧＦ-５を毎回同じ部位に皮下注射
し、さらにその注射部位周辺に、生物抽出物を１日所定の回数、塗布し、これを5〜10日
間繰り返す。この脱毛症モデルでは、発毛・育毛作用として、塗布によりＦＧＦ−５作用を阻害する活性が示されるか、またはその程度を、毛包の形態、長さなどの測定を通じて評価される。
【００４３】
生物抽出物をマウスモデルに投与する方法として、投与後の発毛・育毛効果を判定することができる限り、特に限定されるものではない。通常は実使用に準じたものが好ましく、特に経皮投与が好ましい。具体的な例としては、毛周期同調が誘発された部位に、該生物抽出物を塗布する方法が挙げられる。その用量は１ｎｇ〜１０ｍｇ乾燥重量／個体／１回程度が好ましい。この作業は１回のみでも、数回繰り返してもよい。
【００４４】
上記マウスモデルにおける発毛・育毛効果を判定する方法としては、特に限定されるものではなく、このような効果を判定する方法として通常知られている方法でもよい。たとえば上記抽出物の投与群と非投与群との比較をすることにより、効果を判定する方法が挙げられる。あるいは上記指標について、既に有効性が知られている他の物質、たとえばミノキシジルを用いて同時に測定し、その結果を基準として比較してもよい。発毛・育毛効果の強弱に関し、数量的な比較ができる。
【００４５】
ここで比較する際の指標としては、毛の生育または毛包の形態を測定するのがよい。毛の生育とは、毛、毛周辺組織、毛関連細胞の生育に関係する様々な生理現象を含むものである。具体的には、毛の量、毛の長さ、毛の直径、毛の成長率、毛の発毛率、発毛本数の増加、毛密度、脱毛本数、毛包の形態および大きさ、毛包の組織学的評価、成長期の延長効果、毛球部の脂肪層への到達程度および到達本数、試料塗布部分の皮膚色などを比較する。その比較には、目視、写真、または組織分析等による観察、毛周期等を指標として数値化することによって効果を判定することができる。塗布部位の皮膚切片を調製し、毛包の形態および大きさを比較してもよい。あるいは毛周期を指標として比較し、効果を判定する方法として次の方法が例示される。毛周期の成長期に入ると、毛包メラノサイトにおいてメラニン生産が開始され、成長期の進行に伴ってメラニン産生量が増加し、皮膚の暗色化が進行する。従ってかかる皮膚の明度を測定することによって成長期の進行程度を比較して、効果を判定することができる。
【００４６】
具体的には、光学顕微鏡下にて観察した皮膚切片像は、写真撮影およびコンピュータへの画像データの取り込みを行なって、切片中の毛包の形態および大きさを比較する。候補物質を塗布したマウス実験群の毛包が、ベヒクル塗布対照群よりも毛成長が促進されていれば、発毛・育毛効果があると判断できる。また同じ実験を成長期の後半から開始することにより、毛周期が成長期から退行期へ移行するのを遅延させるのであれば、育毛活性を有することが推測される。その際の評価は、数値化された発毛・育毛効果に関して数段階、たとえば５段階に分けた評価基準を設けて、その基準に従って判断してもよい。
生物抽出物およびその調製
上記の発毛・育毛作用の評価において、実際に測定および評価の対象となる試料は、各種生物から調製された生物抽出物あるいは発毛・育毛作用の有無または強度を調べる化合物もしくは物質である。発毛・育毛作用の有無または強度を調べる化合物もしくは物質は、水または適当な溶媒などに溶解しまたは分散させて使用する。なお、本明細書における
「生物抽出物」とは、生物からの一般的な抽出物に必ずしも限定されるものではなく、任意に一定方式の調製方法を設定して調製されたものであってもよい。動植物、微生物など、どんな生物起源の材料にも適用できる。なお、後述の実施例では、植物抽出物に絞って検索した例を示すが、このことでその他の生物起源の抽出物を上記スクリーニングの対象から排除するものではない。
【００４７】
試料としての生物抽出物を調製する工程は、夾雑物もしくは共存物を除去し、あるいは精選するためのもので、当業界で通常用いられている技術、たとえば、洗浄、粉砕、剥皮、研磨、圧搾、篩別などの方法を使用することができる。生物体から抽出液を作製する工程は、水、塩類を含有する溶液、あるいは適当な抽出溶剤を用いて行なうことができる。このようにして得られた粗抽出物は、そのままでも上記評価システムの試料として使用できる。あるいは、さらに分画処理を行なうことにより得られ、発毛・育毛作用の有効物質を有する画分形態としてスクリーニング評価に供してもよい。その分画処理の程度は任意であり、必要に応じて行われる。すなわち、濃縮、乾燥、または水もしくは極性溶媒への再溶解といった操作、あるいは生理作用を損なわない範囲で、公知の方法により脱色、脱臭、脱塩などの精製処理、カラムクロマトグラフィーなどによる分画処理による精製をさらに行なってもよい。
【００４８】
本発明を実施するための最良の形態として用いられる植物抽出物は、植物から水または水以外の溶媒で抽出することにより得ることができる。ここで「植物抽出物」とは、植物体、たとえば葉、茎、樹皮、花、実、根、雄シベなどの植物体の一部、全草または樹液などを生のまま、または乾燥して、必要ならさらに粉砕、加熱処理などの必要な加工処理した後に、水または適当な溶媒にて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液、またはその乾燥末を意味する。
【００４９】
植物抽出物を調製する場合、植物は生のまま抽出工程に供してもよい。しかし、抽出効率を考慮すると、細切、乾燥、粉砕などの処理を行なった後に抽出を行なうことが望ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬して行なう。効率を上げるために、連続的または間歇的な撹拌をするか、あるいは抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度は、通常５℃から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出原体の性状、抽出溶媒の種類、抽出温度などによっても異なるが、一般に１〜14日程度とするのが適当である。抽出操作は、ソックスレー抽出器などの抽出器具を使用して連続抽出してもよい。その抽出方法は、特に限定されず、通常の方法、たとえば加熱抽出したものであってもよいし、常温抽出であってもよい。さらに常圧下の他に、加圧下で抽出を行なってもよい。
【００５０】
抽出用の溶媒として、水の他に、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの低級アルコール系溶媒、ポリエチレングリコール、1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール系溶媒、エチルエーテル、プロピルエーテルなどのエーテル系溶媒、アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒などの極性有機溶媒を用いることができる。特に、物質の溶解性に優れ、かつ凝固点および沸点が比較的低い溶媒が好ましく用いられる。上記の溶媒から1種または2種以上を選択して抽出に用いられる。抽出する植物の種類、部位、性状などに応じて、抽出溶剤を適宜選択すればよい。たとえば皮膚炎を起こすシュウ酸カルシウムなどが多く含まれる植物の場合には、水と上記有機溶媒とを組み合わせた複数の溶剤を交互に使用することによる抽出操作により、あるいは混合溶媒を用いる分配による抽出を行うことにより、不適切な成分を選択的に除去した抽出物を得ることもできる。あるいは、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などを用いることもできる。必要ならば、たとえば特開昭62-172096号公報
に開示されている超臨界状態の二酸化炭素といった流体による方法を採用してもよい。
有効と判定された生物抽出物
本発明のスクリーニング方法の評価システムにより、発毛・育毛効果があると判定された生物抽出物には、発毛・育毛の有効物質が1種（または複数）含有され、そのまま育毛
剤または化粧料などに有効成分として含有させることができ、あるいは他の育毛成分と一緒に配合して利用することもできる。保存、育毛剤の形態など、製剤化の条件を考慮すると、さらに減圧濃縮、希釈、ろ過などの処理を適宜行なって用いてもよい。生物抽出物の溶液を、濃縮、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を行なって乾燥物としてもよい。上記生物抽出物から、さらに分画を進めることにより発毛・育毛作用を有する物質を有効成分として含む活性の高い画分を得てもよい。分画は通常利用されている分画方法、たとえば、遠心分離、限外ろ過、塩析、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種方法、あるいはそうした分離方法の組み合わせにより行なうことができる。当該画分から、発毛・育毛作用を生理作用として発揮する物質を単離し同定するには、従来用いられている天然物化学または生化学的手法を利用して行なうことができる。
〔発明の効果〕
本発明による発毛・育毛作用のイン・ビボ評価方法は、毛周期を強制同調させたマウスを使用し、毛包の形態変化を評価の指標として測定する。このため個体間差、測定結果の誤差、バラツキが少なくなり、また短期間に候補対象について発毛・育毛作用を的確に評価できる。
【００５１】
さらに本方法は、成長期の延長作用または退行期への移行遅延の作用の評価に有効であり、かかる特異な発毛・育毛性質を有する新規育毛物質の探索を可能とする。
本方法は、従来知られている方法に比較し、試験の感度と精度が高く、より短期間に育毛判定を行ない得る、育毛剤候補物質スクリーニングに有用なイン・ビボ評価方法である。培養細胞を使用してＦＧＦ-５作用を阻害する活性を調べるイン・ビトロ評価と、引き
続き実施するイン・ビボ評価とから構成されるスクリーニング方法は、多数の試料を効率よく処理でき、ハイスループット化が可能となる。
〔実施例〕
以下、本発明について実施例を挙げてさらに説明を加えるが、本発明がこのような実施例にのみに限定されるものではない。なお特にことわらない限り、％は、重量％である。
【実施例１】
【００５２】
植物抽出物の調製
エイジツ（ノイバラRosa multiflora Thunb.の偽果および果実）、 ビワ（Eriobotrya japonica Lindley）の葉、ワレモコウ（Sanguisorba officinalis）の根茎、ウワウルシ
（Arctostaphylos uva-urusi(Linne) Sprengel(Ericaceae)）の葉、マテ（学名Ilex  Paraguariensis）、キャッツクロー（学名Uncaria tomentosa）、ヨモギ（学名Artemisia princes）の葉および茎、褐藻類（Brown algae 褐藻網 Class Phaeophyceae）の全藻について、いずれも乾燥重量200ｇに対し、50％エタノール水溶液、1リットルの割合で、室温にて１〜10日間浸漬して、可溶性成分を抽出した。抽出液と抽出残渣との分離は、遠心分離またはろ過によった。得られた上清を試料とした。
【実施例２】
【００５３】
マウスの自然毛周期  
37日齢、38日齢、39日齢、40日齢、41日齢および42日齢のC3H/HeNマウス（日本SLC社より購入）を頸椎脱臼により屠殺し、背部を剃毛した後に皮膚を採取した。採取した皮膚は、10％ホルマリン水溶液で固定した後、エタノール脱水系列による処理、キシレンによる透徹を行ない、パラフィン包埋した。ミクロトーム（ヤマト社製）を用いて、毛包が皮膚開口部から毛球部まで完全に観察できる、体軸に平行に切り取った厚さ４μmの薄切切片
を作成し、シランコートしたスライドグラス（マツナミ社製）上で伸展させた。キシレンによる脱パラフィン処理、エタノール親水系列による処理後、ヘマトキシリンおよびエオシンにより、上記切片を染色し、エタノール脱水系列による処理、キシレンによる透徹を
行なった後、カナダバルサムを用いて封入した。
【００５４】
光学顕微鏡下にて観察した皮膚切片像は、写真撮影を行ない、さらにコンピュータに画像データを取り込んで、切片中の毛包の形態および大きさを比較した。その結果、各日齢のマウスは、各日齢内ですべて毛包長の違いに有意差はなく、毛周期が揃っていることが確認された。また、40日齢マウスでは、39日齢マウスに比較して毛包長が急激に短縮していた（図１および図２）。
【００５５】
また、39日齢のC3H/HeNマウス（日本SLC社より購入）を頸椎脱臼により屠殺し、マウス背部で左右両側の等面積である独立した２つの範囲をそれぞれ剃毛した後に、各部位の皮膚を採取した。上記と同様にすることにより採取皮膚の薄切切片が得られ、光学顕微鏡下で写真撮影し、切片中の毛包の形態および大きさを観察して比較した。その結果、マウス背部の左右部位における毛包の形態および大きさに違いは見られなかった。
【００５６】
これらの結果から、同日齢マウスでは毛周期は同調しており、さらに背部の左右間でも毛周期は同調していることが分かった（図３）。
【実施例３】
【００５７】
抜毛による成長期への強制同調
49日齢（毛周期は休止期）のC3H/HeNマウス（日本SLC社より購入）を一週間予備飼育し、マウスの背部を抜毛して強制的に成長期への移行を誘導した。
【００５８】
抜毛日翌日から、抜毛部位に50％エタノールを１日1回、0.05mL/cm2ずつ塗布した。抜
毛後17日目、18日目、19日目および20日目におけるマウスの皮膚の色を観察した。皮膚の色が変化した20日目のマウスを頸椎脱臼により屠殺して、塗布部位の皮膚を採取した。採取した皮膚は実施例２と同様に処理し、得られた皮膚薄片切片の光学顕微鏡写真を撮影し、毛包の形態および大きさを観察した（図４）。
【００５９】
抜毛後17日目、18日目、19日目および20日目のマウスの皮膚色は、同日齢のマウス群内では同色であり、20日目のマウスにおける毛包の形態（長さも含む）が、群内で揃っていることから、休止期のマウスを抜毛することにより試験に供するマウス全数の毛周期を強制的に同調させ得ることが明らかとなった。
【実施例４】
【００６０】
実施例３と同様にC3H/HeNマウスの背部を抜毛し、強制的に成長期を誘導した。抜毛日
翌日から抜毛部位に50％エタノールまたはキャッツクローエキスを１日1回、0.05mL/cm2
ずつ塗布した。抜毛後17日目、18日目、19日目および20日目におけるマウスの皮膚の色を観察した。皮膚の色が変化した20日目のマウスを頸椎脱臼により屠殺して、塗布部位の皮膚を採取した。採取した皮膚は実施例２と同様に処理し、得られた皮膚薄片切片の光学顕微鏡写真を撮影し、20日目におけるマウス皮膚薄片切片中の毛包の形態および大きさを観察した（図５）。
【００６１】
抜毛後20日目のマウスでの毛包の脂肪層への到達数は、キャッツクローエキス塗布群が50％エタノール塗布群よりも多く、組織学的には明らかにキャッツクローエキス塗布群で成長期の延長または退行期への移行遅延が観察された（表２および表３）。また、毛包長に関しても抜毛後20日目においてキャッツクロー群が有意に長いことが明らかとなった（図６）。
【００６２】
【表２】
2006105812.tif 000003
【００６３】
【表３】
2006105812.tif 000004
【実施例５】
【００６４】
49日齢（毛周期は休止期）のC3H/HeNマウス（日本SLC社より購入）を一週間予備飼育し、マウスの背部で左右両側の等面積である独立した２つの範囲をそれぞれ抜毛して強制的に成長期への移行を誘導した。
【００６５】
抜毛日から、抜毛部位に50％エタノールを１日1回、0.05mL/cm2ずつ塗布した。抜毛後19日目および20日目のマウスを頸椎脱臼により屠殺して、塗布部位の皮膚を採取した。採
取した皮膚は実施例２と同様に処理し、得られた皮膚薄切切片の光学顕微鏡写真を撮影し、毛包の形態および大きさを観察した（図７）。
【００６６】
その結果、毛包の形態（長さなど）について、背部左右による違いは見られなかった。このことより、休止期にあるマウス背部の左右両側の独立した２つの範囲を抜毛することにより試験に用いるマウス全数の毛周期を強制的に同調させ得ることが明らかとなった。
【実施例６】
【００６７】
実施例５と同様にC3H/HeNマウスの背部で左右両側の等面積である独立した２つの範囲
をそれぞれ抜毛して強制的に成長期への移行を誘導した。抜毛日から背部片側の抜毛部位に50％エタノール、もう一方の側の抜毛部位にはキャッツクローエキスを１日1回、0.05mL/cm2ずつ塗布した。抜毛後19日目および20日目のマウスを頸椎脱臼により屠殺して、塗
布部位の皮膚を採取した。採取した皮膚は実施例２と同様に処理し、得られた皮膚薄片切片の光学顕微鏡写真を撮影し、毛包の形態および大きさを観察した（図８）。
【００６８】
毛包の脂肪層への到達数は、キャッツクローエキス塗布部位が50％エタノール塗布部位よりも多く、組織学的には明らかにキャッツクローエキス塗布部位で成長期の延長または退行期への移行遅延が観察された。また、毛包長に関しても抜毛後19日目、20日目ともにキャッツクロー塗布部位が有意に長いことが明らかとなった（図９、図１０）。
【実施例７】
【００６９】
培養細胞を用いるＦＧＦ−５阻害物質の検出（イン・ビトロ評価）
ＦＧＦ−５およびインターロイキン−３（ＩＬ-３）に応答性のあるFR-Ba/F3細胞を、10％ウシ胎児血清を含む培養液中で培養した。96穴培養用プレート（ファルコン社製）に
、10,000細胞／ウェルで播き換え、培養液に1μg/mlのＦＧＦ−５または10ng/mlのＩＬ−３、さらに適当に希釈した試料（実施例１の植物抽出液）およびベヒクルである50％エタノールを添加して３日間培養した。その後、各ウェルにセルカウンティングキット（和光純薬製）を添加し、３時間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いて細胞増殖を調べた。その結果を図１１に示す。エイジツ、ビワ、ワレモコウ、ウワウルシ、マテ、キャッツクロー、ヨモギ、褐藻からのいずれの抽出物は、ＩＬ-３依存的な増殖に比べて、Ｆ
ＧＦ-５依存的なFR-Ba/F3細胞増殖をいずれも低濃度で阻害した。これらの結果から上記
の植物抽出物は、選択的にＦＧＦ−５阻害活性を持つことが示された。
【実施例８】
【００７０】
成長期後半のマウス塗布実験（成長期の剃毛法）
毛周期が休止期にある８週齢のC3H/HeNマウス（日本SLC社より購入）の背部を抜毛し、成長期を誘導した。誘導17日後、抜毛部位に生えた毛をバリカンで除毛し、剃刀で剃毛した直後から３日間ないしは４日間、実施例１に記載した植物抽出物（50％エタノール溶液）を、１日１回、0.05mL/cm2ずつ塗布した。対照群のマウスには、50%エタノールを1日1
回、同様に塗布した。
【００７１】
最終塗布の翌日、上記マウスを頸椎脱臼により屠殺して、塗布部位の皮膚を採取した。実施例２と同様に処理し、得られた薄切切片の光学顕微鏡写真を撮影し、切片中の毛包の形態および大きさを比較した。その像を図１２に示す。対照群であるエタノール（ベヒクル）塗布群では、毛包が短く既に退行期に移行しているのに対し、上記植物抽出物の塗布群では、毛包は長く成長期が持続していた。従ってこれらの植物抽出物が、毛周期の成長期を延長しており、明らかに育毛活性を有することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、39日齢マウスの毛包の顕微鏡写真を示す。毛胞は真皮にある嚢状の毛球部から表皮へ向かって伸びる構造物であり、その中に成長中の毛が包まれている。
【図２】図２は、40日齢マウスの毛包の顕微鏡写真を示す。像の下部には、皮下（脂肪）組織が見られる。
【図３】図３は、39日齢マウスの左右背部における毛包の顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、抜毛後20日目の50%エタノール塗布マウスの毛包顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、抜毛後20日目のキャッツクローエキス塗布マウスの毛包顕微鏡写真を示す。
【図６】図６は、抜毛後20日目のマウスの毛包長（μｍ）を示す。
【図７】図７は、背部左右を抜毛した後19日目、20日目の50%エタノール塗布マウスの毛包顕微鏡写真を示す。
【図８】図８は、背部左右を抜毛した後19日目、20日目のキャッツクローエキス塗布マウスの毛包顕微鏡写真を示す。
【図９】図９は、マウス背部左右を抜毛した後19日目の毛包長を示す。
【図１０】図１０は、マウス背部左右を抜毛した後20日目の毛包長を示す。
【図１１】図１１は、FR-Ba/F3培養細胞のＦＧＦ-５依存的、ならびにＩＬ-３依存的な増殖に及ぼす、各種の植物または海藻からの抽出物の阻害作用を示す。横軸は、培地中の抽出物の濃度（単位：％（V/V））である。
【図１２】図１２は、毛周期が成長期の末期にあるマウスの皮膚切片像を示す写真である。切片中の毛包の形態および大きさから、ベヒクルである５０％エタノールを塗布した群（写真中のスケールは0.1ｍｍを示す。他の写真も同様の倍率である。）では、退行期に移行していたが、植物抽出物塗布群、すなわちウワウルシ、褐藻類、ワレモコウまたはエイジツの抽出液を塗布した群ではそれぞれ成長期が持続し、毛包は長く維持されていた。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図１１】
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