【手続補正書】
【提出日】平成19年6月19日(2007.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  a)標的を含み得るサンプルを、該サンプルの添加前に、
i)少なくとも２つは実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、
ii)アンカーの少なくとも二つの異なる場所、それぞれの場所で各アンカーが結合するのが、
iii)アンカーに特異的な第１部分、および該標的に特異的なプローブを含む第２部分を有する二官能性リンカー、
を含む組合せと、該標的が該組合せに結合するのに有効な条件下で接触させ、
ここで領域の少なくとも一つの場所に位置する２個以上のアンカーが、異なる標的特異性を有する異なる二官能性リンカーと結合する、
を含む、少なくとも一つの標的を検出する方法。
【請求項２】更に
該組合せと任意の結合標的を、該結合標的の一つに特異的な第１部分、およびレポーター試薬に特異的な第２部分を含む少なくとも一つの検出リンカーと接触させる
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  更に
該組合せおよび任意の結合標的を、少なくとも一つの検出プローブと接触させる
ことを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】  第１検出プローブが、第１の場所で組合せに結合した第１標的に結合している、
第２検出プローブが同じ場所で組合せに結合した第２標的に結合している、そして
第１および第２検出プローブを同時にまたは連続して検出する、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】  該標的が目的の核酸に特異的なヌクレアーゼ保護フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】  該標的が目的の核酸に特異的なヌクレアーゼ保護フラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】  該標的が目的の核酸に特異的なヌクレアーゼ保護フラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】  各領域が少なくとも８個の異なるアンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】  １個以上の該検出リンカーを遮断した検出リンカーで希釈する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】  １個以上の該検出リンカーを遮断した検出リンカーで希釈する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】  １個以上の該検出リンカーを遮断した検出リンカーで希釈する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】  a)標的を含み得るサンプルを、該標的に特異的であり、結合するヌクレアーゼ保護フラグメントと接触させ、サンプルを残りの一本鎖核酸を消化させるのに有効なヌクレアーゼに曝し、次いで得られたサンプルを、
i)少なくとも２つは実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、
ii)アンカーの少なくとも二つの異なる場所、それぞれの場所で各アンカーが結合するのが、
iii)アンカーに特異的な第１部分、および該ヌクレアーゼ保護フラグメントに特異的なプローブを含む第２部分を有する二官能性リンカー、
を含む組合せと、該ヌクレアーゼ保護フラグメントが該組合せに結合するのに有効な条件下で接触させ、
ここで領域の第一の場所に位置する２個以上のアンカーが、異なる標的特異性を有する異なる二官能性リンカーと結合する、
b)該結合した保護フラグメントを検出する
ことを含む、少なくとも一つの核酸標的を検出する方法。
【請求項１３】  更に結合した保護フラグメントと特異的検出リンカーおよび／または検出プローブをハイブリダイズさせ、それにより該核酸の各々に対応するシグナルを発生させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】  該サンプル中に第一標的が第二の標的よりもはるかに多く存在し、
そして該第一および第二の場所での異なる二官能性リンカーの数が該第一および第二標的に対応するシグナルを調節できるように微調整され、そして／または該シグナルが遮断した検出リンカーを使用して微調整される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】  更に
a)該組合せと、該結合ヌクレアーゼ保護フラグメントの一つに特異的な第一部分およびレポーター試薬に特異的な第二部分を含む少なくとも１個の検出リンカーを含む任意の結合ヌクレアーゼ保護フラグメントをハイブリダイズし、
b)該検出リンカーと、シグナル伝達物体を含む該レポーター試薬を接触させ、そして
c)該シグナル伝達物体を検出する
ことを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】  第一検出リンカーが、該第一の場所で結合した第一ヌクレアーゼ保護フラグメントと結合し、
第二検出リンカーが、同じ場所で結合した第二ヌクレアーゼ保護フラグメントと結合し、
そして、第一および第二検出リンカーを同時にまたは連続して検出する、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】  該領域がチューブであり、該アンカーの場所が該チューブ内で直線状アレイで配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】  該領域がチューブであり、該アンカーの場所が該チューブ内で直線状アレイで配置される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】  該標的の少なくとも１個がＤＮＡ分子であり、該標的の少なくとも１個がＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】  該ヌクレアーゼ保護フラグメントの少なくとも１個がＤＮＡ分子に対して特異的であり、そして該ヌクレアーゼ保護フラグメントの少なくとも１個がＲＮＡ分子に対して特異的であるである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】  標的保護フラグメントが、該サンプルを該組合せと接触させる前にＰＣＲにより増幅される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】  該標的を、いずれかまたは両方がプライマーを固体表面に結合させる化学修飾を含む二つのＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲにより増幅させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】  該組合せおよび任意の結合標的を、アップコンバートされた蛍光団を含む標識プローブである標識検出プローブと接触させ、そして該検出プローブを測定することを含む、請求項１または１２に記載の方法。
【請求項２４】  該組合せおよび任意の結合保護フラグメントを、各々が該保護フラグメントの１個に特異的な部分および該標的に特異的ではない該保護フラグメント上の共通３'オーバーハンギング配列に特異的な部分を含む少なくとも二つの検出リンカーと接触させ、
該検出リンカーを、該共通配列に特異的であり、シグナル伝達物体を含むレポーター試薬と接触させ、そして
該シグナル伝達物体を検出する
ことを含む、請求項６または１３に記載の方法。
【請求項２５】  該組合せが大量の該領域を含み、本方法がハイスループットである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】  各領域が少なくとも８個の異なるアンカーを含む、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の要旨
本発明は、多種の生物学的または化学的アッセイを同時に行う組成物、装置および方法を提供し、多数のサンプルをハイスループット分析し得、そのサンプルには、例えば、診断アッセイにおいてスクリーニングされる多数の患者サンプル、または薬物探索の方法において試験される多数の可能性ある薬物もしくは治療薬がある。サンプル中の１つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せを提供する。この組合せには、多数の空間的に分離された領域を含む表面が含まれ、その領域は試験領域と名付けられ、少なくとも２つの実質的に同一のウェルであり得る。各表面は、実質的に同一な領域を、少なくとも２つ、好ましくは２０またはそれ以上、例えば、少なくとも約２５、５０、９６、８６４または１５３６含む。各試験領域は、１つまたはそれ以上の標的を含む(または部分的に含む)サンプルを導入する空間であると定義され、生物学的または化学的アレイを含む。(“標的を含むサンプル”または“サンプル中の標的を検出する”という語句は、標的を含まないかまたは検出されないサンプルまたは測定(検出の試み)を除外することを意味するものではない。通常の意味において、本発明は、標的がサンプル中に含まれるかどうかを、それが検出されるかされないかにかかわらず測定するアレイを含む。)このアレイは、包括的アンカーを含み、それぞれが、アンカーに特異的な第１の部分および少なくとも１つの標的に特異的なプローブを含む第２の部分を有する二官能性リンカー分子に結合する。本発明の組合せは、１つまたはそれ以上の標的を含むサンプルとの接触にあり、所望により、ディテクター分子と反応し、次いで、試験領域中における標的分子とプローブとの間の反応を検出する検出装置により応答指令信号が送られ、それによりアッセイの結果を得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の他の態様は、サンプル中の１つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、
a)少なくとも２つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、それら各領域に含まれるのが、
b)少なくとも８種のアンカー、それぞれが結合するのが、
c)アンカーに特異的な第１の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第２の部分を有する二官能性リンカー、
を含む組合せである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の他の実施態様は、少なくとも１つの標的を検出する方法であり、それには、当該標的が当該組合せと効率よく結合する条件下、上記のような当該組合せを、標的を含み得るサンプルと接触させることを含む。他の態様は、ＲＮＡ発現パターンを決定する方法であって、それには、上記の組合せと共に少なくとも２つのＲＮＡ分子を標的として含むサンプルをインキュベーションすることを含む(少なくとも１つの組合せのプローブが、ＲＮＡ標的によるプローブへの特異的なハイブリダイゼーションが効率的となる条件下、少なくとも１つのＲＮＡ標的に特異的(すなわち、選択的)となる核酸(例えばオリゴヌクレオチド)である。他の態様は、ＲＮＡ発現パターンを修飾する試薬(または条件)を同定する方法であって、それは、上記ＲＮＡ発現パターンを決定する方法であり、更に、当該試薬(または条件)の存在下作成するＲＮＡ発現パターンを多種の一群の条件下作成するＲＮＡ発現パターンに比較することを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また他の実施態様では、領域は、チューブまたは液体調節チャンネルとして定義され得、例えば、Ｂeattie et al (１９９５) Ｃlin. Ｃhem. ４, ７００-７０６に開示するようなフロースルーアッセイとして設計され得る。チューブは任意のサイズ、例えば、キャピラリーまたは広い内径のチューブであり得る；液体の流れを可能にし得る；または部分的にまたは完全にゲル、例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドで充たされ、それを通って化合物が、例えば、電気泳動により輸送(通過、流動、ポンプ輸送)され得る。好ましい態様では、チューブはゲルで充たされる；ゲルはアンカーの結合に関して活性化されており、異なるアンカーが連続して通過し、ゲル内のアンカーの直線的アレイの形成を可能にする；そしてリンカー、標的などが連続して通過する。表面内または表面上などの領域もまたそれ自身の表面の修飾により決まり得る。例えば、プラスチック表面はまた、修飾または誘導プラスチックで作成した部分を含み、それは、例えば、特定の型のポリマーを加える部位としての働きをし得る(例えば、ＰＥＧをポリスチレン表面に結合し得、次いで、カルボキシルまたはアミノ基で、二重結合、アルデヒドなどを誘導する。)。他に、プラスチック表面は突出(protrusion or bump)のようなモールドした構造を含み得、それは、アンカーの添加のためのプラットフォームとしての役割をし得る。他の実施態様において、領域はゲルパッド、例えばポリアクリルアミドゲルパッドまたはエアロパッドであり得、それらは、例えば、ガラスのような表面上に臨まれるパターンで配置され、または例えば、ガラスと石英プレートのような二つの表面の間にサンドイッチされ得る。アンカー、リンカー等はこのようなパッドの表面上に固定化でき、またはそれらの中に包埋され得る。ゲルパッドの種々の他の配置が、当業者には明らかであり、通常の、慣用法により製造できる。試験領域の相対的な方向付けは、任意の多様な型となり、それらには、四角または矩形または他の表面内の平行または垂直なアレイを含むがこれらに限らず、それらは、丸または他の表面、または直線状アレイなどのアレイに容易に拡張される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
領域はまた、領域内の幾つかまたはすべてのアンカーは、例えば、へこみ(indentation)および小さなくぼみ(dimple)によって、隣接するアンカーから物理的に分離されるように、更に再分割される。例えば、多くの領域内の再分割(小区域)は、約１０ないし約１００またはそれ以上もしくはそれ未満の範囲となり得る。ある実施態様では、１５３６-ウェルディッシュのウェルである領域を、より小さいウェルに更に再分割し、例えば、約４ないし約９００、好ましくは約１６ないし約３６ウェルとし、それにより、ウェル内のウェルのアレイに形成し得る。図４参照。そのくぼんだ表面により、各設計した空間(位置)に単一のアンカー(またはアンカーの群)を物理的に位置させるのに必要な強度が弱くなり、そして、アンカーを含む領域の大きさが、より均一となり、それにより、ブローブへ結合する標的の検出が促進される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
試験領域内または試験領域上のアンカーの物理的空間および相対的方向付けは限定されない。典型的に、アンカー同士の距離は、約０.００３ないし約５mmまたはそれ未満、好ましくは約０.０３と約１との間である。より長いおよびより短いアンカー空間(および面積)が含まれる。アンカーが、相互および領域の境界に相対的な任意の方向付けで配置され得る。例えば、それらは、四角、矩形、六辺形または他のアレイ、または放射線または同心円の中心から放射するアンカーを有する環状アレイのような二次元的方向付けで配置され得る。アンカーはまた、一次元の直線アレイで配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ配列に従って特異的位置にハイブリダイズし得、超分子アレイを形成し得るか、またはフロースルーゲルにおける直線配置である。他に、アンカーは“バーコード”様型となり得る(図６参照)。例えば、アンカーは相互に平行なロングラインとなり得る。各ロングラインの間またはその幅の距離は、調節された方法で変化し得、バーコードのような単なる認識パターンが生じ、例えば、１番目および３番目のラインは残りの広さの２倍となり得、ラインは取り除かれるなどされ得る。エクストラエンプティーラインは、１つの試験領域をはっきりと区別する最後のラインの後に位置され得、バーコードパターンは連続的な試験領域で繰り返され得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
アンカーのパターンは、分離したアッセイウェル(試験領域)または分離アッセイ小滴の位置を明確に登録する必要はない。“アッセイ位置”という語は、アッセイサンプルが適用されるアッセイ表面の位置の言及に使用される(これらは、アッセイサンプルの分離した小滴の位置により、または例えばマルチウェルプレート上の個々のアッセイウェルを決める壁または仕切りの位置により決められる)。アンカーパターン自体(例えばオリゴヌクレオチドアンカーの“バーコード”様パターン)を用い、各分離アンカーがパターン認識により正確に決められ、ちょうど各バーコードのラインが残りのラインに相対する位置により認識される。このため、第１のアンカーは、各アッセイ位置の１つの端または１つの角を必要としない。第１のアンカーは、アッセイ位置に相対する位置よりもむしろパターン認識により発見される。各アッセイ位置(例えば、小滴の面積またはウェルの面積)で使用される面積が、アンカーの繰り返しパターンの少なくとも１つの全体の単位を含むのに十分広い限り、次の各アッセイ点は、パターンがアッセイ位置の面積内にあるところはどこでも(バーコード)パターンにより特定されるすべての標的のアッセイ位置のサンプルを試験する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
アンカーは、各試験領域内の明確なまたは固定さえされているパターンで配置される必要はない。例えば、各アンカーは、粒子、ビーズなどに結合し得、それらは試験領域内のランダムな位置と仮定される。各アンカーの位置は、例えば検出可能なタグの使用により決定され得る。例えば、各型のアンカーに特異的なリンカー分子は、種々の蛍光、ルミネセンスなど、タグで標識され得、特定リンカー/アンカー対を含む粒子の位置は、リンカーから放射するシグナル、例えば、励起または放射スペクトルの性質により同定され得る。当業者ならば、種々の結合したタグであって、それぞれ認識し得るスペクトルを有する一群のリンカーを調製し得る。他に、アンカーは直接標識され得る。例えば、各型のアンカーをタグで標識し得、そのタグは様々なスペクトルを有する蛍光を他の型のアンカーにおいて発する。他に、粒子、ビーズなどは、大きさまたは形について相互に異なっている。本明細書中で記載する任意の標識および検出方法を用い得る。例えば、蛍光は、ＣＣＤを基にするイメージングシステムにより、スキャンニング蛍光顕微鏡またはＦluorescence Ａctivated Ｃell Ｓorter(ＦＡＣＳ)により測定され得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
例えば、核酸の場合、当業者ならば、他の物質または分子(例えば、他のオリゴヌクレオチドリンカー)への非特異的ハイブリダイゼーションを最小化する一方、選択したストリンジェンシー条件下、他の核酸にハイブリダイズさせ得る核酸(例えば、オリゴヌクレオチドアンカー)の特徴(長さ、塩基組成物および相補性の程度のような)を実験的に決定することができる。典型的に、アンカーのＤＮＡまたは他のアミノ酸配列、リンカーの部分、またはディテクターオリゴヌクレオチドは、その結合対と十分相補性があり、選択したストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズでき、Ｔmは室温よりも約１０から２０℃高くなり得る(例えば約３７℃)。通常、オリゴヌクレオチドアンカーは、長さ約８ないし約５０ヌクレオチド範囲となり得、好ましくは１５、２０、２５または３０ヌクレオチドとなり得る。本明細書中で使用するとき、“高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件”とは、核酸同士で少なくとも９５％、好ましくは約９７％から１００％のヌクレオチド相補性(同一性)があるときにハイブリダイゼーションが生じる任意の条件を意味する。しかし、望ましい目的に応じて、ハイブリダイゼーション条件は選択され得、低い相補性、例えば、約９０％、８５％、７５％、５０％などを必要とする。変わり得るハイブリダイゼーション反応パラメーターでは、塩濃度、緩衝液、pＨ、温度、インキュベーション時間、ホルムアミドのような変性剤の量および型などがある(例えば、Ｓambrook et al. (１９８９) Ｍolecular Ｃloning: Ａ Ｌaboratory Ｍanual (２d ed.) Ｖols. １-３, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress, Ｎew Ｙork; Ｈames et al.(１９８５). Ｎucleic Ａcids Ｈybridaization, ＩＬ Ｐress; Ｄavis et al. (１９８６), Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology, Ｅlsevir Ｓciences Ｐublishing, Ｉnc., Ｎew Ｙork)。例えば、核酸(例えば、リンカーオリゴヌクレオチド)を、試験領域(例えば、マルチウェルプレートのウェル-好ましい実施態様では、９６または３８４またはそれ以上のウェルプレート)に、体積約０.１ないし約１００またはそれ以上のμl(好ましい実施態様では、約１ないし約５０μl、最も好ましくは約４０μl)で、例えば６ＸＳＳＰＥ-Ｔ(０.９ Ｍ ＮaＣl、６０mＭ ＮaＨ２ＰＯ４、６mＭ ＥＤＴＡおよび０.０５% ＴritonＸ-１００)のような緩衝液中、濃度約０.０１ないし約５μＭ(好ましい実施態様では約０.１μＭ)で、加えることができ、約１０分ないし少なくとも３時間(好ましい実施態様では、少なくとも約１５分間)、温度約４℃ないし約３７℃(好ましい実施態様では、おおよそ室温)の範囲で結合対(例えば、表面上のオリゴヌクレオチドアンカー)にハイブリダイズすることができる。条件を選択し、ハイスループットとすることができる。本発明の１つの実施態様では、反応条件はおおよそ生理条件である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
例えば、アンカーまたはリンカーの部分としての働きをし得る他の型の物質または分子(例えば、ポリペプチド、レクチンなど)の設計、および結合対との特異的相互作用に必要な反応条件は当分野には通常であり、一般的である(例えば、Ｎiemeyer et al (１９９４) Ｎucleic Ａcids Ｒes. ２２, ５５３０-５５３９; Ｆodor et al (１９９６)米国特許番号５,５１０,２７０; Ｐirrung et al (１９９２)、米国特許番号５,１４３,８５４に記載の通り)。インキュベーションパラメーターには、緩衝液、塩濃度、pＨ、温度、インキュベーション時間、担体および/または試薬の存在または非特異的相互作用を減少する条件がある。例えば、アンカーとして抗体を含む試験領域(例えば、マルチウェルプレートのウェル-好ましい実施態様では９６または３８４またはそれより多いウェルプレート)に、抗-抗体(例えば、抗原または抗体特異的二次抗体)を、体積約０.１ないし約１００またはそれよりも多いμl(好ましい実施態様では、約１ないし約５０μl、最も好ましくは約４０μl)で、例えば、６ＸＳＳＰＥ-Ｔ、ＰＢＳまたは生理食塩水のような緩衝液中、濃度約１０pＭないし約１０nＭ(好ましい実施態様では、約１nＭ)で加えることができ、表面上のアンカーと共に、約１０分ないし少なくとも約３時間(好ましい実施態様では、少なくとも１５分間)、温度約４℃ないし４５℃の範囲(好ましい実施態様では、約４℃)でインキュベーションし得る。ペプチドアンカーの場合、約５ないし約２０の長さのアミノ酸が好ましい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
試験領域内のアンカーは、“包括的な”群であり得、１つまたはそれ以上の様々なリンカーと相互作用し得る各アンカーであり、それぞれ、異なる“プローブ”部分以外のアンカーに特異的な部分がある；そのため、包括的アンカーの単一のアレイを用い、様々な一群のプローブをプログラムまたは決定する。アンカーのその包括的アッセイの順応性を図１および２に引用して示す。図２は１５の試験領域を含む表面を示し、それぞれ、６種のアンカーのアレイを含み、実施例中ではオリゴヌクレオチドである。図１は、これらアンカーの１つ(オリゴヌクレオチド)、アンカー１を概略し、それらは、アンカー１に特異的である１つの部分および標的mＲＮＡ１に特異的な第２の部分を含む、リンカー１と接触する。他に、あるものは、例えば、リンカー１のように、アンカー１に特異的な部分を含むが、標的mＲＮＡ１の代わりに標的mＲＮＡ２に特異的な第２の部分を含む、リンカー２と置換され得る。そのため、アンカー１を用い、２つまたはそれ以上の種々の標的mＲＮＡの何れか用のプローブを明記(またはプログラム、または定義、または決定)し得る。オリゴヌクレオチドまたはペプチドのハイレゾリューションパターン(アレイ)を作成し、結びつける方法は、高価であり、時間がかかり、および/または物理的に困難となり得る。アンカーの前形成アレイを用い、多種のプローブアレイをプログラムする能力は、本発明の１つの利点である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
リンカーのアンカー特異的部分の化学的性質は、もちろん、アンカーまたは相互作用するアンカーの機能である。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドならば、相互作用するリンカーの部分は、例えば、オリゴヌクレオチドに特異的に結合するペプチドであるか、または選択したストリンジェント条件下で効率的および特異的にハイブリダイズし得る核酸である。核酸は、例えば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＰＣＲ産物、または置換もしくは修飾核酸(例えば、イノシンのような天然には生じないヌクレオチド；スルファメート、スルファミド、ホスホチオネート、メチルホスホネート、カルバメートなどのような様々な既知連結を介する結合；またはＤＮＡストレプトアビジン結合のような半合成分子を含む)であり得る。一本鎖成分が好ましい。オリゴヌクレオチドアンカーに特異的なリンカー部分は、長さ約８ないし５０ヌクレオチドの範囲、好ましくは約１５、２０、２５または３０ヌクレオチドである。アンカーが抗体ならば、相互作用するリンカーの部分は、例えば、抗-抗体、抗原、またはアンカーと特異的に相互作用し得る分子の１つの小フラグメントであり得る。上記他のタイプのアンカーと特異的に相互作用し、そして、アンカー-特異的なリンカー部分としての働きをする物質または分子もまた、当分野に既知であり、通常の方法を用い設計し得る(例えば上記参照)。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
標的-特異的なリンカーの部分の化学的性質は、もちろん、プローブであり、相互作用する標的の機能である。例えば、標的が、特にmＲＮＡならば、標的-特異的なリンカーの部分は、例えば、標的に特異的に結合するオリゴヌクレオチドであるが、選択したハイブリダイゼーション条件下、ＲＮＡまたはＤＮＡを阻害する。当業者ならば、当分野に既知の方法を用い、標的に所望によりハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの特徴を実験的に決定し、非特異的な干渉ＤＮＡまたはＲＮＡへのハイブリダイズを最小とする(例えば、上記参照)。通常、非標的ＲＮＡの過剰のバックグラウンドに存在する標的mＲＮＡの識別に使用するオリゴヌクレオチドプローブの長さは、約８ないし約５０ヌクレオチドの範囲、好ましくは約１８、２０、２２または２５ヌクレオチドである。拮抗標的のあまりない生化学的アッセイで使用するオリゴヌクレオチドプローブはより短くなり得る。当分野に既知の方法(例えば、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ)を用い、オリゴヌクレオチドプローブの配列を、既知の遺伝的データベースにおいて可能性のある干渉配列と相互に関係せず、類似しないように、選択し得る。オリゴヌクレオチドプローブによるＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションが可能なハイブリダイゼーション条件の選択が、当分野に認識される方法を用い、決定することができる(例えば、上記参照)。例えば、標的ＲＮＡ[例えば、マルチウェルマイクロタイタープレート(例えば、９６または３８４またはそれ以上のウェル)のウェルのような任意の容器において、組織または増殖細胞から抽出した全ＲＮＡまたはmＲＮＡ(および所望により目的の試薬で処理した)]を、６ＸＳＳＰＥ-Ｔまたは他の緩衝液中、オリゴヌクレオチドプローブアレイを含む試験領域に添加し得(上記参照)、所望により、非特異的結合を減少させる試薬(例えば、破砕したニシンまたはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、約０.５mg/ml)を含み、約１０分ないし少なくとも１８時間(好ましい実施態様では、約３時間)の範囲の時間、経験的に決めた温度でインキュベーションする。ハイブリダイゼーションするストリンジェンシーは、アンカー-特異的なリンカー部分にアンカーを結合させるのに用いるストリンジェンシーと同一か、またはそれよりも弱い。他の型のプローブの設計および使用はまた、例えば、上記考察したように当分野に通常である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
以下に記載するアッセイまたは方法のそれぞれを、ハイスループット法で実施でき、それは、多数のサンプル(例えば、およそ約８６４、１０３６、１５３６、２０２５またはそれ以上であり、組合せの領域数に依存する)を各プレートまたは表面上で素早く同時にアッセイする。更に、多くのプレートまたは表面を同時に処理し得る。例えば、薬物探索の方法では、それぞれは薬物候補(例えば、様々な小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の物質のような多くのコンビナトリ化学ライブラリー)を含む多くのサンプルを添加し得、既述のように組合せの領域を分離するか、または生物学的または生化学的サンプルに加え、次いで、組合せの領域に分けて加え、そして、領域内に位置するプローブアレイと共にインキュベーションする；ならびにアッセイを各サンプルで行い得る。最近の高密度マイクロプレート、ＤＮＡスポッティングツールおよびデンサーマイクロプレート、ロボット、改善ディスペンサー、精巧な検出システムおよびデータ処理ソフトウェアから作成しデータを回収する、レーザー技術のような方法の出現と連続的な開発に伴い、本発明の方法を用い、１日あたり数千または数万またはそれ以上の化合物をスクリーニングまたは分析することができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
他の態様において、本発明の組合わせは、遺伝子発現のパターンを調節できる試薬のスクリーニングに使用できる。オリゴヌクレオチドのアレイは、例えば、その一連の遺伝子からの発現のパターンが特定の生理学的状態または発育段階、または疾病状態と相関しているmＲＮＡ種の同定に使用できる(“相関”遺伝子、ＲＮＡ、または発現パターン)。“相関的”または“相関”なる用語は、ＲＮＡの合成パターンが、細胞の生理学的状態に関連するが、所定のＲＮＡの発現が必ずしも特定の生理学的状態を担うか、それをもたらさないことを意味する。例えば、mＲＮＡの小サブセットは、特定の疾病状態のモデルとして働く細胞の発現、アップコンバートおよび／またはダウンコンバートにより同定され得る；病理学的表現型を示さない、この正常細胞と比較して変えられた発現のパターンは、これらの疾病状態の指標として働くことができる(“指標”遺伝子、ＲＮＡ、または発現パターン)。“相関的”および“指標”は交換可能に使用できる。例えば、ホルボールミリステートのような腫瘍促進剤で処理した細胞は、腫瘍生育の初期段階に見られるものを模倣した遺伝子発現のパターンを発現し得る。癌の他のモデルにおいて、マウスインスリノーマ細胞(例えば、細胞系ＴＧＰ６１)は、アデノウイルスに感染したとき、例えば、c-ＪunおよびＭＩＰ-２の発現の増加を示すが、一方ＧＡＰＤＨおよびＬ３２のようなハウスキーピング遺伝子の発現は実質的に影響されないままである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
一つの態様において、上記a)のような表面および該アンカーの少なくとも一部に特異的な第１部分および該標的の少なくとも一つに特異的なプローブを含む第２部分を有する２官能性リンカー分子を結合するための一連の指示書が提供される。指示書は、例えば(しかしこれに限定されない)、表面上の各々のアンカーの記載、いくつのアンカーがあるか、そしてそれらが表面のどこに位置するか、および特異的にリンカーをアンカーに結合(会合、結合等)させるプロトコールを含むことができる。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドである場合、指示書は各アンカーの配列を含むことができ、そこから、実施者がアンカーと特異的に相互作用(例えば、ハイブリダイズ)するリンカーの相補的アンカー特異的分子を設計できる；アンカーがペプチドである場合、指示書は、例えば、ペプチドと特異的に作用する抗体に関する情報を伝達できる。指示書は、アンカーおよびリンカーが会合するプロトコール、例えば、インキュベーション温度および時間、非会合分子の除去(例えば、洗浄)のための条件および試薬等のハイブリダイゼーション(または他のタイプの会合)の条件および試薬を含み得る。更に、指示書は、本明細書に記載の任意のタイプのコントロールリンカーの構築および使用における情報、および組合わせで行う定量、標準化、“微調整”または較正アッセイの方法における情報を含むことができる。指示書は、本明細書に記載のパラメーター、条件または態様を包含でき、その全て当業者により慣用的に、慣用法で行うことができる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
本明細書の他の箇所で述べたように、アンカーの所定のアレイを含む本発明の表面に広範な型のリンカーを付着せしめて、広範なプローブアレイのいずれかをプログラミングできる。さらに、本発明の表面から所定の組のリンカーを離脱せしめ、表面に他の組のリンカーを付着せしめて（第一の組と同じかまたは異なる）、所定の表面を何回も再利用することが可能となる。この柔軟性および再利用性は本発明の別の利点である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
他の態様において、本発明の組合わせを用いて、ＥＳＴ(発現配列タグ)を位置付けできる。すなわち、ＭＡＰＳアッセイを用いて、ＥＳＴ群のどれが同じ遺伝子の異なる(または部分的に重なる)部分からつくられたか、およびどれが非反復かを(これらが存在すれば)決定できる。図１８、１９、２０、２１は、このようなアッセイを示す。この例において、アッセイで１６のＥＳＴのどれが共通遺伝子に“結合”しているかを(これが存在すれば)決定する。アッセイの第１工程(参照、図１８)ではアレイが集合され、位置付けしようとする各ＥＳＴが、その対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブにより提示される。位置付けしようとするＥＳＴの数に等しい(または多い)数のアレイが表面の単離領域(例えば、ウェル)に分散している。表示例において、組合わせの表面は１６のウェルを含み、各ウェルが１６種のＥＳＴ特異的オリゴヌクレオチド、番号１-１６、を含有する。ＥＳＴに“対応する”(ＥＳＴ“特異的”な)オリゴヌクレオチドとは、１つのＥＳＴに十分に相補的であって、選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、そのＥＳＴに特異的にハイブリダイズし、他の非関連ＥＳＴとはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドである。この型のＥＳＴ対応オリゴヌクレオチドが特異的に(最適の条件下で)結合できるのは、ＥＳＴを本来生成した遺伝子から合成されたcＤＮＡのコード鎖または非コード鎖、またはＥＳＴを本来生成した遺伝子から合成されたmＲＮＡである。オリゴヌクレオチドの設計で考慮されるべき要因および特異的ハイブリダイゼーションをなすための最適化ハイブリダイゼーションパラメーターについては、本明細書の別の箇所で述べる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
別の態様において、本発明は、複数のどのＥＳＴが所定の核酸に相補的かを決定する方法に関し、下記の事項を含む。
a)２官能的オリゴヌクレオチドリンカー分子の集合体(その各々が、少なくとも１つの該ＥＳＴに対応するプローブである第１部分、およびアンカーオリゴヌクレオチドに特異的な第２部分を含む)を、該所定の核酸を含有し得る試験サンプルとインキュベートして、該オリゴヌクレオチドと該核酸との第１ハイブリダイゼーション産物を得、
b)該第１ハイブリダイゼーション産物をアンカーオリゴヌクレオチド(各アンカーオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの該リンカー分子のアンカー特異的部分に対応している)の固定化アレイとインキュベートして、該アンカー、該オリゴヌクレオチドプローブおよび該核酸を含む第２ハイブリダイゼーション産物を形成し、
c)該第１または該第２のいずれかのハイブリダイゼーション産物をディテクターオリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドの１つが対応するＥＳＴに対応するが、ＥＳＴの異なる部分に対して該オリゴヌクレオチドプローブよりも特異的である)とインキュベートし、
d)該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレオチドにより標識されたかを検出する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
なお、アンカーオリゴヌクレオチドの該アレイは組合わせの領域上に固定化されている。該組合わせは下記を含む。
１)調べようとするＥＳＴの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、
２)調べようとするＥＳＴの数に等しい数の、異なるアンカーを含む。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
勿論、ＥＳＴを位置付けするための上記方法は、試験配列(例えば、ポリヌクレオチド)を目的の任意の核酸中へ位置付けするのに使用できる。例えば、２以上のクローン化ＤＮＡフラグメントまたはcＤＮＡが同じゲノムＤＮＡに位置付けされるかを調べることができる。このような方法が役立ち得るのは、例えば、長い複雑な遺伝子の構造的解明おいてである。同様に、１以上の継ぎ合わせた配列またはコード配列が同じゲノムＤＮＡに位置付けされるかを調べることができる。このような決定をなし得るのは、例えば、診断試験においてであって、分化スプライシングパターンを特徴とする正常状態と疾患状態とを識別する。位置付け方法の他の多くの適用については、当業者に明かであろう。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
ＰＣＲの柔軟性は、本発明の方法における多くの変法を可能にする。一つの実施態様において、標的の増幅に使用する１個または両方のＰＣＲプライマーは、得られるＰＣＲ産物が、特異的または非特異的に、固体支持体に結合するのを可能にする。このような化学修飾は、例えば、コースターＤＮＡ結合プレート(例えば、Ｎ−オキシスクシンイミドエステルで修飾された、またはＰierce, Ｒockford, ＩＬのＰeacti-Ｂindプレートのようなマレイン酸無水物被覆プレート)のような表面に結合をさせる５'アミド化を含む。そのような化学修飾を含むオリゴヌクレオチドを産生させる方法は、当分野で通常であり、慣用である。このような修飾プライマーを含むＰＣＲ生産物は、固体支持体、例えば、マイクロタイターウェルの内壁、ビーズ(例えば、非磁気または磁気ビーズ)を含む任意の支持体、または本明細書に記載の任意のタイプの表面に結合できる。もちろん、ＰＣＲプライマーはまたＰＣＲ反応を開始する前に支持体に結合できる。ＰＣＲの数回のサイクルを、洗浄無しで、しかし過剰の結合プライマーででき、得られたＰＣＲ産物は支持体に結合したままである。増幅標的配列の支持体への結合は、アンカーおよび／またはリンカーを含む表面に接触(例えば、ハイブリダイズ)する前、または接触した後の標的の洗浄を容易にでき、次いでそのような表面から遊離される。
他の実施態様において、標的の増幅に使用した１個または両方のＰＣＲプライマーは、１個以上の制限酵素部位を含み得、目的の標的配列の末端またはフランキングの隣に制限部位を挿入することを可能にする。制限部位はＰＣＲにより、それがアンカーおよび／またはリンカーを含む表面に接触(例えば、ハイブリダイズ)する前または後に増幅した標的に添加できる。この方法で挿入した制限部位は、例えば、標的配列にフランキングなクローニング部位を提供することにより、増幅した標的のクローニングを促進する。例えば、１個以上の制限部位を、ＰＣＲプライマーにおいて標的特異的配列と支持体への結合をさせる化学修飾の間に置くことがでる。標的を、修飾ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅させ、そして化学修飾を介して支持体に結合させた後、洗浄し、次いで標的配列に隣接した制限部位を開裂させ、それにより洗浄標的を遊離できる。例えば、図２３参照。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
ＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイにおいて、目的の標的は、すべての核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ、cＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、rＲＮＡ、tＲＮＡ、mＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、修飾核酸、合成核酸などであり得る。本発明の好ましい具体的態様において、このアッセイが用いられるのは、組織または細胞のＲＮＡ抽出物中に存在する１以上のmＲＮＡ標的である。目的の標的を含有するサンプルは、選択されたストリンジェント条件(特異的ハイブリダイゼーションを達成するのに適当な反応条件については上記参照)で１以上の特異的保護フラグメントと最初にハイブリダイズせしめる。保護フラグメントは、ポリヌクレオチドであって、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ(ＰＣＲ産物を含む)、ＰＮＡ、修飾または置換の核酸であり得て、目的の核酸標的部分に特異的である。“特異的”保護フラグメントとは、その意図する結合相手と十分に相補的であり、選択されたストリンジェント条件でそれと結合するが、他の意図していない核酸とは結合しないポリヌクレオチドを意味する。保護フラグメントは、長さが少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは５０から約１００、または完全長のcＤＮＡと同じであり得る。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
好ましい具体的態様において、ポリヌクレオチド保護フラグメントをＭＡＰＳプレート上よりも質量分析計で測定する。最も好ましい具体的態様において、ポリヌクレオチドのいずれもハイブリダイゼーションまたはヌクレアーゼ消化工程中に固相表面に結合(付着)される。ハイブリダイゼーション後、保護フラグメントを残してハイブリダイズ標的をヌクレアーゼまたは化学処理などにより分解し、直接比率で、どれほどのフラグメントが標的にハイブリダイズしていたかがわかる。あるいは、標的の(１本鎖)ハイブリダイズ部分、またはハイブリダイズ標的および保護標的から形成された表面を残すように処理し、さらに分析する。分析すべきサンプルをハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ混合物の残りから分離し(例えば、エタノール沈降、または吸収またはアフィニティクロマトグラフィ-など)、溶出または固定化し、高い情報量のためにループ注入により質量分析計に入れる。好ましい具体的態様において、分析しようとするサンプル(例えば、タンパク質フラグメント)を、よく知られた既知技術で、表面に吸着し、レーザー照射により解析する。最も高感度のためには、フーリエ変換質量分析法(ＦＴＭＳ)(または他の類似の高度な技法)用いることができ、フェムトモル以下の各保護フラグメントを検出できる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
マルチプローブアッセイを使用する利点は、各プローブアレイにおいて、実際の実験プローブと同じ反応条件下に付す、多くの“コントロール”プローブを包含できる能力である。例えば、アレイの各領域は、ポジティブおよび／またはネガティブコントロールを含むことができる。“ポジティブコントロールプローブ”なる用語は、本明細書で、例えば、実質的に標的と相互作用するか、または定量的にもしくは定性的に既知の方法で相互作用し、それにより、プローブ／標的相互作用の(内部)標準として働くことが既知のコントロールプローブを意味するために使用する。“ネガティブコントロールプローブ”なる用語は、本明細書で、実質的に標的と相互作用しないことが既知のコントロールプローブを意味するために使用する。このようなプローブは、例えば、ハイブリダイゼージョン特異性を統制できる。用いることができるこのタイプのコントロールの例として、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを、疾病の一連の相関遺伝子の発現を調節する薬剤のスクリーニングに使用するアッセイが考慮される。各サンプルの溶解細胞の数、mＲＮＡの回収、またはハイブリダイゼージョン効率の可変性の内部標準化コントロールとして、プローブアレイは、１個またはそれ以上の基底レベルまたは、その発現が試験する薬剤により調節されることが予期されない構造遺伝子(例えば、アクチン、チューブリンその他)またはＤＮＡ結合タンパク質(例えば、転写調節因子その他)のような構成的ハウスキーピング遺伝子に特異的なプローブを含むことができる。更に、その試験した薬剤が、細胞死または毒性のような望ましくない副作用をもたらすかを測定するために、プローブアレイはアポトーシス(計画細胞死)プロセスの一部として誘導されることが既知の遺伝子に特異的な、または細胞外傷(例えば、ヒートショックタンパク質)または細胞毒性(例えば、p４５０遺伝子)の条件下に誘導されるプローブを含むことができる。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
活性要素を不活性要素で希釈することによる、特定の標的のアッセイの“微調整”は、またアッセイの別の段階で行うことができる。例えば、標識、標的特異的レポーターを、“不活性”標的特異的レポーター、例えば、同じ標的特異的部分(例えば、オリゴヌクレオチド配列)であるが、シグナル伝達物体なし、またはシグナル伝達物体の不活性化または不活性形のもので希釈することにより検出のレベルで行うことができる。本明細書で使用する“シグナル伝達物体(signaling entity)”なる用語は、標識、タグ分子または検出可能なシグナルを放出する、またはそのようなシグナルを産生できる物質、例えば、蛍光分子、発光酵素、または本明細書に記載の種々のシグナル伝達物質である。特に好ましい実施態様において、“微調整”は、標的含有複合体を検出リンカー(検出リンカーは、下記、例えば、複合体サンドイッチタイプ検出法に関するセクション、実施例２３および図２４において記載)に接触させる段階を含む。検出リンカーのセットは、例えば、アッセイにおける各個々の標的の感受性の微調整のために設計できる。例えば、特定の標的がサンプル中に非常に高レベルで存在することが知られている場合、標的のための検出リンカーを経験的に測定可能な量の、標的特異的部分(例えば、オリゴヌクレオチド配列)を含むが、レポーター試薬に特異的な部分はないか、または標的特異的部分と、不活性レポーター試薬に予め結合したレポーター試薬特異的部分を含む、“遮断検出リンカー”で希釈することができる。即ち、レポーター試薬に特異的な部分を含む変わりに、その部分は無くてもよく、またはレポーター試薬との相互作用(例えば、ハイブリダイズ)が防止(例えば、遮断)されている。このような微調整は、ある場合、本明細書で、シグナル“弱化”と呼ぶ。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
標的ＲＮＡ、例えば、mＲＮＡ、rＲＮＡ、tＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは全ＲＮＡを含むサンプルを種々の方法で調製できる。例えば、mＲＮＡを抽出するインビトロ細胞培養をマイクロタイタープレートの個々のウェル中のような表面の領域に置く。所望により、これらの細胞は、所望の細胞密度が達成された後に、刺激剤または治療剤の可能性のある薬剤のような目的の薬剤で処理でき、それは種々の手段で、例えば、複製ピンツール(Ｂeckmanから入手可能な９６または３８４ピンツールのような)で、ピペット輸送により、またはインクジェット分散により細胞に添加でき、細胞と適当な時間、例えば、アッセイに依存して１５分から４８時間の間インキュベートする。インビトロまたはインビボ源由来の組織または細胞から抽出された全ＲＮＡ、mＲＮＡ等を慣用の、当分野で既知の方法(例えば、商品として入手可能なキット)を使用して調製できる。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
本発明の方法に関して、標的を当分野で既知の種々の方法でおよび／または本明細書に記載の方法(例えば、ヌクレアーゼ保護フラグメント検出に関して)で標識(タグ付け)できる。例えば、化学ルミネッセント分子、または化学ルミネッセント分子の産生を触媒する酵素、またはフルオレセインまたはcy５のような蛍光分子、またはキレート化ランタニド金属の一つのような時間分解蛍光分子、または放射活性化合物のような、検出用シグナルを提供する化学基と、標的分子を直接的または間接的に結合できる。あるいは、標的をそれらがプローブと反応した後に、１個またはそれ以上の標的特異的レポーターで標識できる(例えば、図１に示す抗体、オリゴヌクレオチドまたはプローブおよび標的に関連して上記の一般的タイプの分子)。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
二つのタイプのラベルを個々に検出する能力は、ＭＡＰＳアッセイにおける更なるタイプのコントロールを可能にする。特定のアンカー位置(図７は３つの典型的なアンカー位置を示し、各々多くの実質的に同一のアンカー(Ａ、ＢまたはＣ)を有する)のために設計したリンカーのいくつか(例えば、約１０から約１００％)は、一端に結合した標識(例えば、蛍光物質（fluor）)を有し得る。例えば、ローダミンまたはＣy５蛍石はリンカーの５'末端に結合できる。このような修飾リンカーは“コントロールリンカー”と名付ける。リンカーおよびコントロールリンカーの混合物がアンカーと会合し、標的を含むサンプルを得られるプローブアレイとインキュベートした後、異なる蛍光物質(例えば、フルオレセインまたは化学ルミネッセントのような他の検出標識)を担持する標的特異的レポーターを使用できる(または標的を直接蛍光物質または他の検出標識で標識できる)；そして二つのシグナルの比率を決定できる。コントロールリンカーの存在は、試験領域内および間の官能的(例えば、リンカーと相互作用できる)アンカーの数の計測を可能にし(即ち、シグナル標準化の目的で、標的に結合するアレイの各位置の能力を試験する)、結合標的の量の定量の基本として働き、アンカー位置の局在化を助けおよび／または例えば、サンプルが、標的の不存在下によりシグナルがない場合、ポジティブコントロールを提供する。本発明の一つの態様において、二つの異なる標識(例えば、フルオロフォア)をまた使用して、標的分子の二つの異なる集団を検出する；しかし、シグナルの空間的分離による標的の存在の認識の能力は、異なる標的分子の標識の一つのタイプの使用を可能にする。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
標識を独立して検出する能力(例えば、フルオレセインとローダミンのような、例えば、識別可能な波長で放出される蛍光標識、または異なるアップコンバートした蛍光団)は、本発明の方法の付加的な柔軟性を可能にする。例えば、２個以上の標的の各々を、直接または間接的に、それ自体の独自の検出可能な標識で標識できる。これは、例えば、表面上に局在する標的の位置の同定、または局在するビーズのサイズによる標的の同定に加えて(またはその代わりに)、標識(例えば、放出の色)に特異的な性質に基づいた標的の検出を可能にする。本発明の他の態様において、標的の多様性は、独立して領域内の一つの場所で検出できる。例えば、２個以上(例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上)の標的を、アンカーの一つの(実質的に同一の)グループにより定義される場所で検出できる。即ち、一連のリンカーを使用でき、その各々は、同じアンカーに特異的なアンカー特異的部分と異なる標的に関する標的特異的レポーター部分を有する。例えば、４つのこのようなリンカーのセットを使用した場合、全４つは一つの場所でアンカーのグループのメンバーに結合でき、４つの異なる標的がその場所に結合することを可能にする。これらの各々の標的を異なる、識別可能な標識で標識(直接または間接的)した場合、研究者は、４つの標的の各々の独立した位置での存在の決定ができる。したがって、例えば、１領域内の５つのアンカー(アンカーのグループ)のアレイを、２０個ほど多い異なる標的の検出のために、上記のシナリオにおいて使用できる。このようなアッセイは、実施例２４および図２５に説明する。同様に、例えば、８０個ほど多い複数の標的を、一つのタイプのアンカーが、任意の定義した形態で、例えば、ビーズまたはフロースルー装置のような固体表面に、一つの場所ではないが、均等に分布しているとき、独立して検出できる；そしてビーズサイズまたは散乱のような他の態様を使用し、標的同一性または標的のグループに関する情報を提供できる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
本発明の他の実施態様において、目的の標的に特異的な“アンカー”は、リンカーと結合していないがむしろ、直接標的と結合している；標的は、次ぎに、所望により標的特異的レポーターと相互作用できる。標識されていても非標識でも、標的は当分野で日常的であり慣用的である種々の方法で検出できる(例えば、Ｆodor et al (１９９６) Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,５１０,２７０; Ｐirrung et al (１９９２) Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,１４３,８５４; Ｋoster (１９９７) Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,６０５,７９８; Ｈollis et al (１９９７) Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,６５３,９３９; Ｈeller (１９９６) Ｕ.Ｓ. Ｐat, Ｎo. ５,５６５,３２２; Ｅggers et al. (１９９７) Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,６７０,３２２; Ｌipshutz et al (１９９５), ＢioＴechniques １９, ４４２-４４７; Ｓouthern (１９９６) Ｔrends in Ｇenetics １２, １１０-１１５参照)。検出法は、酵素ベースの検出、比色法、ＳＰＡ、オートラジオグラフィー、マススペクトロメトリー、電気的方法、吸光度または発光の検出(化学ルミネッセンスまたは電気ルミネッセンスを含む)、および、例えば、タグとして使用した微小粒子由来の光分散形の検出を含む。また、蛍光標識は、例えば、電荷結合素子(ＣＣＤ)または蛍光顕微鏡(例えば、走査または共焦点蛍光顕微鏡)での結像により、または走査システムとＣＣＤアレイまたは光電子増倍管の結合により、またはアレイベースの検出法(例えば、各１０ミクロン部の試験領域の表面電位を検出でき、または解像が十分高いとき、表面プラスモン共鳴を使用できる)の使用により検出できる。あるいは、アレイはリンカー、標的またはレポーター上の標識へのエネルギー移動(またはそれによる修飾)により検出できる標識(例えば、フルオレセインおよびローダミンのような、エネルギー移動プローブの一つの対)を含むことができる。とりわけ、蛍光ベースの検出システムのホストは、蛍光強度、蛍光偏光法(ＦＰ)、時間分割蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動および均質徐放性蛍光(ＨＴＲＦ)である。反復バーコード様パターンの分析は、パターン認識により達成できる(各特異的標識標的の、他のスポットまたは線に対するその位置による適当なスポットまたは線の発見)、標識の強度の定量に従う。１または２次元アレイのバーコード認識装置および分析のソフトウェアは、慣用的に製造されおよび／または商品として入手可能である(例えば、Ｒava et al. (１９９６) Ｕ.Ｓ. Ｐatent Ｎo. ５,５４５,５３１参照)。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
図１９はマップＥＳＴの続く段階を図説する：ＭＡＰＳプレートへのディテクターオリゴヌクレオチドの添加。プレートの各ウェルに、マップするＥＳＴの一つに対応するディテクターオリゴヌクレオチドを入れる。各ディテクターオリゴヌクレオチドは検出に使用する分子、例えば、検出の方法が蛍光イメージングである場合、フルオレセインに結合したオリゴヌクレオチドである。各ディテクターオリゴヌクレオチドはＥＳＴの一つに相補的であるが、ＥＳＴ特異的プローブが異なり、一つのＥＳＴに相補的なプローブおよびディテクターオリゴヌクレオチドが同時に両方結合できる。
洗浄後、単一ディテクターオリゴヌクレオチドを、図に番号付けするように各ウェルに添加する。即ち、第１ＥＳＴに相補的な配列を有するディテクターオリゴヌクレオチドを第１ウェルになどである。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
図２１は図１８-２０に示すプローブ、ディテクターオリゴヌクレオチドおよびＥＳＴ番号１、２および６の関係を図説する。
図２２はハイスループットアッセイを図説する。
図２３は増幅標的の製造法を説明する。
図２４は、検出リンカーとレポーター試薬でのアッセイを説明する。
図２５は、複数の蛍光物質（flour）の使用を説明する。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
実施例２  結合動態(図１１参照)
Ｃy５誘導体化リンカー番号１のその相補的結合アンカーへのハイブリダイゼーションの速度を、異なる濃度のリンカーに関して示す。一般的ＭＡＰＳプレートを、アンカー１がウェル当り４スポットで結合している以外、図１のように調製する。インキュベーションを、室温で０.１％Ｔween-２０含有５×ＳＳＰ中、室温で行い、ウェルを３回５×ＳＳＰで洗浄し、結合蛍光を測定した。プレートの蛍光画像をＴundraで撮り、背景を引いて各ウェル内の各スポットでの結合強度をＴundraソフトウェアで計算した。プロットしたのは、二つのデュプリケートウェルの４点の結合強度の平均と標準分散である。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
実施例４  結合曲線
実施例３のように調製したプレートに、異なる濃度の標的オリゴヌクレオチドを添加する。会合しているリンカーは標的の部分に相補的な２５量体配列を含む。標的を、全量３０または１００マイクロリットルの０.０５％ＳＤＳ含有５×ＳＳＣ中に添加し、プレートを覆い、５０℃で一晩インキュベートする。標的の結合リンカーへのハイブリダイゼーションに続き、標的を化学ルミネッセンスを使用した好ましいプロトコールにより可視化する。標的の別々の部分に相補的な(リンカーに相補的な部分と同じではない)２５量体配列を含むビオチニル化ディテクターオリゴヌクレオチドを３０nＭで添加する。ビオチニル化ディテクターは、過剰の非結合標的を洗い流した後３０分間添加できるか、または一晩のハイブリダイゼージョン中に標的と一緒に添加できる。ディテクターの添加に続いて、表面を２回５×ＳＳＣ、１回０.１％Ｔween-２０および１％ＰＥＧ含有１×ＳＳＰ(ＳＳＰＴＰ)で洗浄し、２５０μg／mlのストレプトアビジンに接合したホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ：ＳＡ、Ｐierce, Ｒockford, ＩＩlから)の１：５０,０００希釈を、ＳＳＰＴＰ中５時間室温で添加する。ウェルを４回ＳＳＰＴＰで洗浄し、１回洗浄し、次いでＳuper Ｓignal Ｕltra試薬(Ｐierce)とインキュベートする。数分後、蛍光の画像をＴundraイメージャーで集め、例えば、画像を５分ＣＣＤアレイ内に蓄積できる。低レベルの標的を、標的の濃度が〜５×１０-１３Ｍほど少なくてもいくつかのウェルでは可視化できる；シグナルの量は、一般に〜１０-１０Ｍの濃度の標的で飽和される。反復スポットで検出されるシグナルの量は、非常に再現性である。
実施例５  二つのオリゴヌクレオチドのアッセイ(図１２参照)
上記の好ましいプロトコールを使用した二つの異なる標的オリゴヌクレオチドのＭＡＰＳハイブリダイゼーションアッセイを証明する結合曲線を示す。一般的ＭＡＰＳプレートを、各々４回各ウェル内にスポットされた４つの異なる固定オリゴヌクレオチドで調製する。第２および第４のアンカーに関して、相補的リンカーオリゴヌクレオチドは、記載のように自己凝集した。二つの標的を４０マイクロリットル中に示す濃度で、記載のように各ウェルに添加し、５０℃で一晩インキュベートする。各標的の結合量は、記載のように、ＨＲＰ：ＳＡおよび化学ルミネッセンス結像後に、各標的に特異的なビオチニル化検出オリゴヌクレオチドの結合により可視化された。下部パネルにおいて、イメージの強度を定量する。Ｔundra Ｉmagaerパッケージの一部であるソフトウェアを使用して上部パネルに示す矢印の間の線に沿って画像の強度をスキャンした。標的の最低濃度である１.１pＭで、スキャンしたイメージは十分に定義されたガウスピークを各スポットで示し、一方、標的の０濃度では、最も左のサンプルで検出可能な背景ピークはなかった。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
二つの検出法を直接比較する。各々ウェル当り４スポットで、４つのオリゴヌクレオチドアンカーが結合したＭＡＰＳプレートに、二つのオリゴヌクレオチドを各ウェルに添加し、両方とも共有結合したcy５部分を含むか、両方ともビオチン基を含む。落射蛍光測定を、記載のように可視化および蛍光リンカーの測定に関して行う。化学ルミネッセンス測定をＭＡＳＰアッセイに記載のように、ＨＲＰ：ＳＡの続く連続添加および化学ルミネッセンス基質を使用して行う。産生したシグナルは大まかに同じ強度である。しかし、各ウェルを離す壁があるマイクロプレートの外形、および液体の泡または流体のミニスカス(miniscus)のために、落射蛍光画像の反射がデータ解析に影響し得る。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
実施例１１  試験ヌクレアーゼ保護プロトコール
ヌクレアーゼ保護プロトコールのハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の最適条件の試験のアッセイにおいて、Ａmbion(Ａustin, Ｔexas)のＮuclease Ｐrotection Ａssay Ｋitを使用して条件、緩衝液および酵素を提供する。８個のサンプルを３つの緩衝液の一つに調製する。Ｈyb Ｂuff １は１００％Ｈybridization Ｂuffer(Ａmbion)；Ｈyb Ｂuff ２は７５％Ｈybridization Ｂufferおよび２５％Ｈybridization Ｄilution Ｂuffer(Ａmbion)およびＨyb Ｂuff ３は各々５０％である。試験mＲＮＡに相補的な６０残基を含む７０量体オリゴヌクレオチドを合成し(Ｂiosource Ｉnternational, Ｃamarillo, ＣＡ)、Ａmbionによりソラレン-ビオチンの標識について示されるプロトコールにしたがって、ソラレン-フルオレセイン(Ｓchleicher and Ｓchuell, Ｋeene, ＮＨ)で標識する。簡単に、保護フラグメントを２０μlのＴＥ緩衝液(１０mＭ Ｔris、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８)中５０μg／mlに希釈し、１０分間沸騰させ、急速に氷水で冷やす。ＤＭＦ中の４μlの１３０μg／mlソラレン-フルオレセインを添加し、サンプルを４５分、４０℃で手持ちの長波長ＵＶ源で照射する。遊離ソラレンフルオレセインを飽和ブタノールでの抽出により除去する。使用したmＲＮＡは、アンチセンスプラスミド(ＡmbionのpＴＲＩ-ＧＡＰＤＦ-ＭouseアンチセンスＣontrol Ｔemplate)から、Ｔ７プロモーターおよびＭaxiＳcriptキット(Ａmbion)を使用して製造したＧＡＰＤＨアンチセンスmＲＮＡである。短保護フラグメントは、別々に合成し、同様に標識した６０量体相補的部分である。保護フラグメントの配列は下記の通りである：
【表２】
2003504011.tif 000001
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
実施例１２  ＮＰＡ-ＭＡＰＳによるmＲＮＡアッセイ(図１５参照)
完全ＮＰＡ-ＭＡＰＳプロトコールを、実施例１１に記載のものと同じハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の条件で使用した。１０個のサンプルをアッセイで流した。全て、同じ量の７０量体オリゴヌクレオチド保護フラグメントおよび異なる量のＧＡＰＤＡ mＲＮＡを含んだ。０.０８mg／ml Ｙeast ＲＮＡ(Ａmbion)含有５０％Ｈybridization Ｂufferおよび５０％Ｄilution Ｂufferの１０μlの中のハイブリダイゼーションサンプルを９０℃で６分加熱し、７０℃で５分加熱して短く遠心し、１９℃に冷やして１９時間インキュベーションした。次いで、２００μlのヌクレアーゼ混合物を各サンプルに３０分、１９℃で添加した。各サンプルを、ＭＡＰＳアッセイのために６０μlに等分した。２μlの１０Ｎ ＮaＯＨおよび２μlの０.５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、サンプルを９０℃に１５分、３７℃に１５分加熱し、２０分室温で放置した。次いで、サンプルを２μlの１０Ｍ ＨＣlで中和し、２Ｍ ＨＥＰＥＳ pＨ７.５および保護フラグメントに特異的な２００nＭのビオチニル化ディテクターオリゴヌクレオチドを含む１２μlの２０×ＳＳＣを、１μlの１０％ＳＤＳと共に添加した。サンプルを混合し、８０℃で５分加熱し、各サンプルの２個の３５μl量をＭＡＰＳプレートの二つのウェルにピペット輸送した(各サンプルを二つにわけ、ＭＡＰＳプレートでデュプリケートで流す)。プレートは標準ＭＡＰＳプロトコールのために調製されており、保護フラグメントに特異的な自己凝集ＣＹ５誘導体化リンカーが既に結合している。ＭＡＰＳプレートを覆い、５０℃で一晩インキュベートし、発光の検出を記載のように行った。最後のサンプルにおいて、保護フラグメント単独ではＭＡＰＳでどのように検出されるかの可視化のコントロールとして、ヌクレアーゼをアッセイ中に添加しない。図の下部において、ウェルの上の列の強度スキャン(イメージャーの分析として)を示す。サンプルに存在するＧＡＰＤＨ mＲＮＡの量(即ち、ＭＡＰＳプレートに等分した後の各デュプリケートにおける量)を図に列記する。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
実施例１４  全マウス肝臓ＲＮＡ抽出物におけるＧＡＰＤＨ mＲＮＡのＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイ
全マウスＲＮＡ抽出物を、ＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイでＧＡＰＤＨ mＲＮＡについてアッセイし、希釈曲線を作る。マウス肝臓由来の全ＲＮＡは、Ｑuiagenキットを使用して調製する。ＲＮＡを０.５Ｍ Ｍg-アセテート含有７０％ＥtＯＨに沈殿させ、１０μlの０.８nＭ保護フラグメント含有０.０５％ＳＤＳ含有５×ＳＳＣ中に再懸濁した。添加した保護フラグメントはオリゴヌクレオチド７０塩基長であり、その６０塩基がマウスＧＡＰＤＨに相補的である。マウスＧＡＰＤＨ mＲＮＡに相補的なフラグメントを使用する(“保護フラグメント”)か、これらの配列の相補物をネガティブコントロールとして使用する(“アンチセンスフラグメント”)。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
実施例１５  コントロールを含むヌクレアーゼ保護ＭＡＰＳアッセイ
mＲＮＡはマウス肝臓から抽出され、ヌクレアーゼ保護は、ＧＡＤＰＨ特異的保護フラグメントがマウスＧＡＰＤＨに相補的な６０ヌクレオチドを含み、標的に相補的ではないフラグメントの３'で１５“オーバーハンギング”ヌクレオチドが続く以外、本質的に実施例１４に記載のように行う。ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ消化後、残りの保護フラグメントを、二つの異なるオリゴヌクレオチド検出フラグメントを固定化保護フラグメントの検出に使用する以外、本質的に実施例１４に示すようにＭＡＰＳプレートとハイブリダイズさせる。一つの検出フラグメントは保護フラグメントのＧＡＰＤＨ特異的部分に相補的であり、他方、コントロールは保護フラグメントの１５塩基オーバーハング部分に相補的である。各検出フラグメントは異なる複製サンプル(即ち、異なるウェル)で使用し、両方の検出フラグメントが同じ検出分子で標識できるようにする。本実施例においては、両フラグメントをＨＲＰで標識する。ヌクレアーゼの添加なしに、両方の検出フラグメントのからのシグナルが見られる；一方、ヌクレアーゼ消化が行われたときは、ＧＡＰＤＨ配列に対応するシグナルのみが検出できる。ＧＡＰＤＨ特異的シグナルの量は、保護フラグメントを存在するＧＡＰＤＨ mＲＮＡの量に対し対して過剰に添加したため、ヌクレアーゼ消化の不存在下で見られるものに相対して減少する。これは、ＧＡＰＤＨ mＲＮＡの量が保護ハイブリダイゼーションを限定し、形成された二本鎖の量(したがって、ヌクレアーゼから保護された保護フラグメントの量)がmＲＮＡを反映するようにする。mＲＮＡが反応混合物に含まれないとき、ヌクレアーゼを添加したときシグナルは検出できない。上記の発見は、アッセイのハイブリダイゼーションおよび消化段階が所望により起こっていることを証明する。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
実施例１６  疾病状態と相関する遺伝子の発現を変え得る化合物のスクリーニングの転写アッセイ
ヒト腫瘍由来の細胞系を使用する。正常細胞よりも高いレベルで３０遺伝子が発現されることが判明している。(即ち、これらの３０遺伝子は正常細胞でよりも使用されおり、mＲＮＡを造り、続いて遺伝子が指示するタンパク質を製造する。転写アッセイは、各遺伝子のmＲＮＡがどの程度存在するかにより、どの程度遺伝子が使用されているかを測定する。)ＭＡＰＳプレートでのヌクレアーゼ保護アッセイ(ＮＰＡ-ＭＡＰＳ)を使用して、８８００個の化学化合物を試験して、化合物存在下での細胞の成長が、６個の正常(構造的、“ハウスキーピング”)遺伝子の発現に影響することなく３０個の相関的遺伝子のいくつかの発現を減少できるかを見るために試験する。効果を有する化合物は、この種の腫瘍の処置の医薬の開発に将来的に有用であるかも知れない。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
実施例２２  増幅した標的の調製
ＰＣＲプライマー(Ｐrimer Ｏne)を、プライマーオリゴヌクレオチドの５'末端に導入された化学修飾を介して、固体支持体(例えば、ビーズまたは反応容器)に結合せる。プライマーは、５'から３'で、化学修飾、プロテアーゼにより開裂できるペプチド配列、および目的の標的に相補的な配列(例えば、目的のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー)を含む。ペプチドの代わりに、特異的に開裂できる他の要素も使用できる。例えば、実施例２１に記載のようなＰＣＲ増幅に続いて、まだ固体支持体に結合しているＰＣＲ産物を変性し、(所望により)洗浄し、支持体に結合した一本鎖分子を残す。洗浄し、結合した分子を、次いで、(例えば、適当なプロテアーゼでの処理により)放出させ、アンカーおよび／またはリンカーを含む表面と接触させる。あるいは、変性に続いて放出された増幅標的の鎖を、アンカーおよび／またはリンカーを含む表面と接触できる。いずれの場合も、増幅した標的の一つの鎖のみ、リンカーと接触(例えばハイブリダイズ)し、増幅した標的の逆の鎖からのハイブリダイゼーションとの競合が排除され、バックグラウンドが減少する。リンカーは、増幅した標的配列のいずれか、または両方に特異的に設計できる。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
実施例２３  検出リンカーとレポーター試薬でのアッセイ(図２４参照)
目的のｍＲＮＡを含むサンプルを、ｍＲＮＡに相補的ではない、標的特異的部分およびコントロールオーバーハング部分を含むオリゴヌクレオチドを保護フラグメントとして使用したヌクレアーゼ保護法に付す。ヌクレアーゼ消化に続き、コントロールオーバーハング部分を、図の左部分に説明にように、望ましいように、開裂できる；またはオーバーハングは、図の右部分に説明するように、消化されないようにできる。得られるヌクレアーゼ保護フラグメントを、標的特異的部分およびコントロールオーバーハング部分を含む検出リンカーとハイブリダイズさせる。図の左部分に示すアッセイにおいて、検出リンカーのコントロールオーバーハング部分は、ハイブリダイズしないままである；対照的に、図の右部分に示すアッセイにおいて、検出リンカーのオーバーハング部分は、保護フラグメントの残りのコントロールオーバーハング配列とハイブリダイズする。アッセイの次段階において、検出と相互作用できる部分を含むレポーター試薬を複合体と相互作用させる。図の左部分に示すアッセイにおいて、レポーター試薬は検出リンカーのハイブリダイゼーションに利用可能なままであるコントロールオーバーハング特異的部分とハイブリダイズし、複合体がレポーター試薬のシグナル伝達物質のために検出できる。対照的に、図の右部分に示すアッセイにおいて、レポーター試薬は相補的配列がハイブリダイズエーションのために利用可能でないため、複合体と結合できず、シグナルは複合体に結合しない。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
本発明の多くのアッセイにおいて、レポーター試薬は検出リンカーに存在する任意の配列と相互作用でき、コントロールオーバーハングに特異的な配列に限定されない。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
実施例２４  多重蛍光物質(fluor)(図２５参照)
５つの場所、Ａ−Ｅを含む領域を図２５に示す。各場所は異なるグループの実質的に同一のアンカー、アンカーＡ−Ｅを含む。場所Ａのアンカーに、４つの異なるタイプのリンカーをハイブリダイズし、その各々はアンカーＡに特異的な部分を含む。しかし、アンカーの各々は：標的１、２、３および４に対する異なる標的特異的部分を含む。したがって、標的のアンカー／リンカー複合体へのハイブリダイゼーション後、標的１、２、３または４は全て場所Ａで局在化するようにできる。同様に、４つの異なるタイプのリンカーが場所Ｂにハイブリダイズできる。各リンカーは、アンカーＢに特異的な部分を含むが、標的特異的部分は標的５、６、７または８に特異的である。同様の形態で、標的９−１２は場所Ｃと、標的１３−１６は場所Ｄとおよび標的１７−２０は場所Ｅと関連する。これらの標的のいずれかを直接的または間接的に、例えば、アップコンタート可能な蛍光団のような異なる、独立した検出可能な蛍光物質で標的する場合、５つの独立した場所での全２０個の標的を独立して検出できる。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
ＴＨＰ−１ヒト単球を９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートで、５０,０００または１５０,０００細胞／ウェルで生育させる。細胞は未処理であるか、フォルボール１２−ミリステート１３−アセテート(ＰＭＡ)で４８時間分化させ。続いてリポポリサッカライド(ＬＰＳ)で４時間活性化する。処理に続き、細胞をグアニジウムイソチオシアネート(guanidium isothyocyanate)で処理し、必要になるまで凍結させる。ｍＲＮＡを、ビオチン−ポリｄＴが結合したストレプトアビジン常磁性粒子を使用して得る。あるいは、全ＲＮＡをtri試薬(Ｓigma Ｃhemical Ｃo., Ｓt. Ｌouis, ＭＯ)での抽出により得る。ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡのいずれかを含むサンプルを、ＤＮＡ保護フラグメントとして、各々が５'から３'で、目的の１３個の標的の一つの特異的な２５量体(ＧＡＰＤＨ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、カテプシンＧ、cox-２、シクリン−２、ビメンチン、ＬＤ７８-β、ＨＭＧ−１７、オステオポンチン、β−トロンボグロビン、アンギオテンシンまたはアクチン)；１０量体スペーサー；共通オリゴヌクレオチドディテクタープローブに特異的な２５量体；および１５量体共通オーバーハング配列を含むオリゴヌクレオチドの１３個の６０量体一本鎖の混合物を使用したヌクレアーゼ保護法に付す。ｍＲＮＡはそれにより、アッセイにおいて標的として働く化学量論量の“対応するＤＮＡ保護フラグメント”に変換する。これらの対応するＤＮＡ保護フラグメントをコントロールオーバーハング配列とインキュベートするコントロール実験は、ヌクレアーゼ消化が望まれるように行われた場合に予測されるように、実質的に目的のｍＲＮＡ標的に特異的な配列のみが対応する保護フラグメントに存在することを示す。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
上記のように調製した対応する保護フラグメントの混合物を含むサンプルを、アンカー／リンカーアレイにハイブリダイズする。未処理または誘導したクラスターのいずれか由来のサンプルを使用する。次いでハイブリダイズした保護フラグメントの各場所での存在および量を、標識ディテクターオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより検出する。各場所でのシグナルの量を標準化するために、本明細書に記載のように、ディテクターオリゴヌクレオチドを適当な量の遮断されたオリゴマーで希釈する。各場所でのシグナルの量を処理し、コントロールＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化する。得られたデータは、違う日に行った８回繰り返したサンプルで、ならびに３つの異なる実験で調製したサンプルで再現性がある。一つの実験における１３個の転写物の相対的な発生量を下記の表に示す。
【表５】
2003504011.tif 000002
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
各ピクセル位置の関数は、ピクセルと各スポットの間の距離を計算し、各スポットを一定の距離に関するインパルス反応関数によりスポット振幅を増幅することにより、そのピクセルで観察される強度とする寄与と合う。インパルス反応関数に使用する画像は、適当な(一定)半径のＧaussian およびＬorentzianの合計により定義する。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
５  −  現在のウェルに関して適合させたｘ、ｙオフセットを使用して、グリッドがマイクロプレートの次ぎのウェルに関してである改善された精度で概算する。９ミリメートルオフセットが次ぎの隣接ウェルに関して比例すると予測される(ピクセルの数における距離を、イメージングシステムの倍率計数により変換して)。ウェルの間の距離はプレートのサイズに対して小さいため、位置の局所概算の使用が最も正確である。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  リンカー１がアンカー１に特異的な部分および標的mＲＮＡ１に特異的な他の部分(プローブ)を含み、標的検出プローブ１が、リンカーの標的特異的部分の配列と異なる標的mＲＮＡ１の配列に特異的である、オリゴヌクレオチドの設計スキームを図解する。
【図２】  １５個の試験領域を含み、各々６アンカーオリゴヌクレオチドのアレイを含む、表面を図解する。
【図３】  リンカーのアンカー特異的部分がプローブ部分(レセプタータンパク質)にビオチンおよびストレプトアビジン分子を介して結合し、レセプターに特異的なリガンドが蛍光標識分子で標識されている、レセプター結合アッセイのリンカーの設計を図解する。Ｂ：ビオチン。ＳＡ：ストレプトアビジン。Ｒec：レセプタータンパク質。リガンド：レセプターのための天然または合成リガンド。＊：リガンドに結合する蛍光標識分子。
【図４】  ２１個の試験領域を含み、その各々が更に１６個の小領域に分割(へこみ、くぼみ)されている表面を図解する。
【図５a】  ウェルセパレーターを示す。
【図５b】  サブディバイダーを示す。
【図５c】  基盤を示す。
【図６】  各々“バーコード”様形であるプローブ(またはアンカー)の直線アレイを含む、二つの試験領域を示す。
【図７】  各々で多コピー(“グループ”)で存在する３アンカー(Ａ、ＢおよびＣ)を含む試験領域を模式的に示す。アンカーの各グループの位置は、“位置”と名付ける。
【図８】  特異的逆転写酵素により産生されるcＤＮＡがＭＡＰＳプレート上でアッセイさせるアッセイを図説する。
【図９】  ヌクレアーゼ保護法を使用するアッセイを図説する(ＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイ)。サンプルＲＮＡを細胞または組織から調製し、薄波状線として示す。ＲＮＡサンプルにポリヌクレオチド保護フラグメントのグループを添加し、太い、濃いそして薄い線で描く。保護フラグメントの濃い部分は特異的ＲＮＡ標的に相補的であり、これらの標的にハイブリダイズするセグメントを示す。薄い部分はオーバーハンギング部分を示す；配列は相補的配列と接触するが、標的と相補的ではない。保護フラグメントを過剰に添加する。全ての利用可能な標的の保護フラグメントへのハイブリダイズに続いて、サンプルをヌクレアーゼの適当なカクテルおよび化学処理で処理し、望ましくない非ハイブリダイズＲＮＡおよび非ハイブリダイズポリヌクレオチドを破壊する。例えば、Ｓ１ヌクレアーゼは、存在する一本鎖ＤＮＡを破壊できる。これ故、過剰の保護フラグメントを結合保護フラグメントのオーバーハンギング非ハイブリダイズ部分として加水分解する。ＲＮＡはリボヌクレアーゼＨを含むリボヌクレアーゼの添加によりまたは塩基中でサンプルを加熱することにより破壊できる。残りは、各ＲＮＡ標的がサンプルにどの程度存在するかを反映する開裂保護フラグメントの収集物である。残りの保護フラグメントwＭＡＰＳハイブリダイゼーションアッセイで測定する。
【図１０】  ＭＡＰＳアッセイにおけるハイブリダイゼーション特異性を図説する。
【図１１】  アンカーのリンカーへの結合動態を図説する。
【図１２】  二つのオリゴヌクレオチド標的のＭＡＰＳアッセイを図説する。
【図１３】  感受性シフトの定量を図説する。
【図１４】  ４つのリンカー／アンカー組合わせの融点温度決定を図説する。
【図１５】  ＮＰＡ-ＭＡＰＳによるmＲＮＡアッセイを図説する。
【図１６】  ＮＰＡ-ＭＡＰでの希釈曲線を図説する。
【図１７】  ホスホチロシン残基を含むペプチドの検出のためのアッセイを図説する。
【図１８】  マップＥＳＴのアッセイの第１段階を図説する：ＭＡＰＳプレートの一般的アンカーのアレイにマップするＥＳＴの各々に対応する凝集リンカーの凝集。１６ウェルのマイクロプレートの各表面に１６個の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含むリンカーが結合し、４×４マトリックスに配置する。第１位置はオリゴ１を有し、これは第１ＥＳＴ配列の部分に相補的であり、試験する１６ＥＳＴのためにこのようにする。
ＥＳＴを得た遺伝子から産生されたcＤＮＡまたはmＲＮＡを全１６ウェルに添加し、適当な条件下でハイブリダイズさせた。それ故、１６ＥＳＴ配列の一つを含むcＤＮＡまたはmＲＮＡが、相補的プローブが置かれる位置に凝集する。
【図１９】  マップＥＳＴの続く段階を図説する：ＭＡＰＳプレートへのディテクターオリゴヌクレオチドの添加。プレートの各ウェルに、マップするＥＳＴの一つに対応するディテクターオリゴヌクレオチドを入れる。各ディテクターオリゴヌクレオチドは検出に使用する分子、例えば、検出の方法が蛍光イメージングである場合、フルオレセインに結合したオリゴヌクレオチドである。各ディテクターオリゴヌクレオチドはＥＳＴの一つに相補的であるが、ＥＳＴ特異的プローブが異なり、一つのＥＳＴに相補的なプローブおよびディテクターオリゴヌクレオチドが同時に両方結合できる。
洗浄後、単一ディテクターオリゴヌクレオチドを、図に番号付けするように各ウェルに添加する。即ち、第１ＥＳＴに相補的な配列を有するディテクターオリゴヌクレオチドを第１ウェルになどである。
【図２０a】  図１８および１９に示すマップＥＳＴのアッセイの結果を示す。ディテクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび適当なストリンジェンシーの条件下のでの洗浄後、例えば、マイクロプレートの１６ウェルをＣＣＤベースの蛍光イメージャーで結像する。図２０aは様式化した結果を示す。各ＥＳＴ特異的ディテクターオリゴヌクレオチドは、対応するＥＳＴ特異的プローブにより抑制されたmＲＮＡまたはcＤＮＡを標識すべきであることは予期される。例えば、プローブ５はその位置で第５ＥＳＴ配列を含むcＤＮＡまたはmＲＮＡを凝集し、第５ディテクターヌクレオチドがまた同じ位置でcＤＮＡまたはmＲＮＡをハイブリダイズしなければならない。これは、各検出オリゴヌクレオチドが適合プローブを標識する、これらの様式化データで当て嵌まる。加えて、最初の３つのディテクターオリゴヌクレオチドは、各々最初の３個により固定されたcＤＮＡまたはmＲＮＡを標識を標識し、これらの配列が同じ遺伝子に並んでいることを示す。同様に、最後の５個のＥＳＴは結合しているように見える。これらのデータからの結合を図２０bにグラフ的に示す。
【図２０b】  図１８および１９に示すマップＥＳＴのアッセイの結果を示す。ディテクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび適当なストリンジェンシーの条件下のでの洗浄後、例えば、マイクロプレートの１６ウェルをＣＣＤベースの蛍光イメージャーで結像する。図２０aは様式化した結果を示す。各ＥＳＴ特異的ディテクターオリゴヌクレオチドは、対応するＥＳＴ特異的プローブにより抑制されたmＲＮＡまたはcＤＮＡを標識すべきであることは予期される。例えば、プローブ５はその位置で第５ＥＳＴ配列を含むcＤＮＡまたはmＲＮＡを凝集し、第５ディテクターヌクレオチドがまた同じ位置でcＤＮＡまたはmＲＮＡをハイブリダイズしなければならない。これは、各検出オリゴヌクレオチドが適合プローブを標識する、これらの様式化データで当て嵌まる。加えて、最初の３つのディテクターオリゴヌクレオチドは、各々最初の３個により固定されたcＤＮＡまたはmＲＮＡを標識を標識し、これらの配列が同じ遺伝子に並んでいることを示す。同様に、最後の５個のＥＳＴは結合しているように見える。これらのデータからの結合を図２０bにグラフ的に示す。
【図２１】  図１８-２０に示すプローブ、ディテクターオリゴヌクレオチドおよびＥＳＴ番号１、２および６の関係を図説する。
【図２２】  ハイスループットアッセイを図説する。
【図２３】  増幅標的の製造法を説明する。
【図２４】  検出リンカーとレポーター試薬でのアッセイを説明する。
【図２５】  複数の蛍光物質（flour）の使用を説明する。
【手続補正５２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】
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