【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
(発明の開示)
この発明は、細胞受容体結合および無処置アデノウイルス粒子のＤＮＡ送達性を倍増する組換えアデノウイルス構築物を利用し、したがって遺伝子治療および細胞指向性ならびにアンチセンスに基づく抗ウイルス治療の改良された方法を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
しかしながら、当技術分野で示唆されてきたものとは対照的に、この発明は、ウイルス製品中で野生型アデノウイルスに汚染される危険性を削減する方法の一つとして；様々な診断および治療的応用のために、そのようなベクター中に外来ＤＮＡをパッケージすることを可能にする方法の一つとして；および特定の細胞型へのアデノウイルスベクターを指向させる方法の一つとして；Ａｄ構造タンパク質をコードする様々な遺伝子配列の全部または部分を欠失する組換えＡｄ由来ベクターの製造、増殖および使用を開示する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明はまたアデノウイルス三分節系リーダー(ＴＰＬ)ヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子も指向する。このＴＰＬヌクレオチド配列は(ａ)第一および第二の異なるＴＰＬエキソンまたは(ｂ)第一、第二および第三の同一または異なるＴＰＬエキソンを含み、該ＴＰＬエキソンは完全ＴＰＬエキソン１、部分ＴＰＬエキソン１、完全ＴＰＬエキソン２および完全ＴＰＬエキソン３からなる群から選択される。ここでは該分離核酸分子は部分ＴＰＬエキソン１、完全ＴＰＬエキソン２および完全ＴＰＬエキソン３から構成される核酸配列は含まなくてもよい。本発明の好ましい態様の一つは、さらにＴＰＬに作動可能に結合するイントロンを含み、そのイントロンはまたそのイントロンの除去のために必須なプロセッシングシグナルも含む。別な好ましい本発明の態様の一つは分離された核酸分子を指向する。このＴＰＬヌクレオチド配列は本質的に完全ＴＰＬエキソン３に作動可能に結合する完全ＴＰＬエキソン２に作動可能に結合する完全ＴＰＬエキソン１を含む。関連する態様の一つはさらにイントロンおよび適切なプロセッシングシグナルを含んでいてもよい。本発明の別の態様は：ｐＣＬＦ、ｐＤＶ６０、ｐＤＶ６７、ｐＤＶ６９、ｐＤＶ８０およびｐＤＶ９０からなる群から選択されたプラスミドに含まれる核酸分子を指向する。前記の核酸を含むパッケージング細胞系およびアデノウイルス粒子も本発明に包含される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明はまた前記のような安定に組込まれた核酸分子、作動可能に結合するプロモーターおよびアデノウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターパッケージング細胞系も指向する。そのＴＰＬ配列は本質的に完全第三ＴＰＬエキソンに作動可能に結合する完全第二ＴＰＬエキソンに作動可能に結合する第一ＴＰＬエキソンを含む。ここに該パッケージング細胞はアデノウイルスの三分節系リーダー(ＴＰＬ)ヌクレオチドを含む分離された核酸分子を含む。該ＴＰＬヌクレオチド配列は(ａ)第一および第二の異なるＴＰＬエキソン；または(ｂ)第一、第二および第三の異なるＴＰＬエキソン；を含むが、このＴＰＬエキソンは完全ＴＰＬエキソン１、部分ＴＰＬエキソン１、完全ＴＰＬエキソン２および完全ＴＰＬエキソン３、からなる群から選択される。ここに、該分離された核酸分子は部分ＴＰＬエキソン１、完全ＴＰＬエキソン２および完全ＴＰＬエキソン３から構成される核酸配列を含まなくてもよい。好ましくは、該細胞系は完全第一ＴＰＬエキソンを有していてもよい。本発明の別な態様の一つには、たとえばアデノウイルスファイバータンパク質のようなアデノウイルス構造タンパク質またはキメラプロテインを含むが、これにはアデノウイルスファイバータンパク質のテイルドメインが含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明はさらにヘルパー非依存性バイファー不含組換えアデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子の製法を指向する。該方法は該ゲノムのおよびファイバー含有粒子の集合を維持するための十分な機能的ファイバータンパク質発現を欠失したヘルパー非依存性ファイバー不含組換えアデノウイルスゲノムの複製およびパッケージングを補完するパッケージング細胞系を提供することを含む。そこでは該パッケージング細胞はアデノウイルス三分節系リーダー(ＴＰＬ)ヌクレオチドを有する分離された核酸分子を含む。該ＴＰＬヌクレオチド配列は(ａ)第一および第二の異なるＴＰＬエキソン；または(ｂ)第一、第二および第三の異なるＴＰＬエキソンを含む。このＴＰＬエキソンは完全ＴＰＬエキソン１、部分ＴＰＬエキソン１、完全ＴＰＬエキソン２および完全ＴＰＬエキソン３からなる群から選択される。ここに、該分離された核酸分子は部分ＴＰＬエキソン１、完全ＴＰＬエキソン２および完全ＴＰＬエキソンを含んでいなくてもよい。これに続いて該細胞系が産生した該アデノウイルス粒子を収集するものである。好ましい態様の一つでは、該アデノウイルス粒子はさらに外来性タンパク質または修正ファイバータンパク質を含む。この方法はまたアデノウイルスファイバータンパク質で粒子をコーティングする工程(すなわち、いずれにしてもファイバータンパク質を提供する)を含んでいてもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明はさらに、インビトロで外来性ファイバータンパク質をファイバー不含アデノウイルスに供給することを含む、修正アデノウイルスの産生方法を指向する。本発明の別の一態様は、本発明が修正アデノウイルスを産生する方法を指向するために、次の各工程の全組合せからいずれかを提供することもある。この工程には：ａ)ファイバー不含アデノウイルスベクターを産生するためのパッケージング細胞系を提供すること；ｂ)該細胞系にヘルパー非依存性ファイバー不含またはヘルパー依存性ファイバー不含の組換えアデノウイルスベクターゲノムを導入すること；ｃ)ファイバー不含アデノウイルスを増殖させ、収集すること；ｄ)ファイバー不含アデノウイルスを適切な緩衝液のいずれかに維持すること；およびｅ)馴化培地または可溶性ファイバー製剤またはウイルス製剤に適する緩衝液のいずれか内のファイバーとして加えて修正されたファイバーであってもよい外来性ファイバーを、該ファイバー不含アデノウイルスに提供すること；を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明はさらに治療用ベクターを調製するための組成物を指向する。該組成物はファイバータンパク質をコードする核酸配列を欠失したアデノウイルスゲノム、またはパッケージングを起こすために十分にはファイバーを発現できないゲノムを含むプラスミドを含有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明の別の一側面は異種遺伝子をヒトまたはいずれかの動物に送達する方法も指向する。該方法は、標的細胞をインビボまたは生体外で、該細胞を感染させるために十分な所定量の組換えアデノウイルス粒子と接触させることを含む、外来性遺伝子を該標的細胞に提供することを含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明の別の一側面は、該ファイバー遺伝子の相補性なしにファイバー含有アデノウイルス粒子のパッケージングを維持するために十分なアデノウイルスファイバータンパク質をコードしないか；または十分なアデノウイルスファイバータンパク質を発現しない；アデノウイルスベクターゲノムを含む、ヘルパーアデノウイルス粒子を指向する。該ゲノムはそのパッケージング配列内に該ゲノムのパッケージングを実質的に不可能にするような突然変異を有するものとする。パッケージング配列はウイルス粒子をパッケージングする際に関与する配列である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
図１はブロックセグメントで示すオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を、プロモーター配列および終止配列と共に有する、アデノウイルスＥ４転写ユニット全体の図解である。実施例１Ａにさらに記載してあるように、Ｅ４に特異的な部分を増幅するためのプライマーの位置もまた指摘してある。
図２は実施例１Ｂにさらに記載してあるように、プラスミドｐＥ４／Ｈｙｇｒｏの図式的マップである。
図３は実施例１Ｂにさらに記載してあるように、プラスミドｐＣＤＮＡ３／Ｆｉｂｅｒの図式的マップである。
図４は実施例１Ｂにさらに記載してあるように、プラスミドｐＣＬＦの図式的マップである。
図５は実施例１Ｃにさらに記載してあるように、２１１細胞系における、無処置アデノウイルスＥ４の３.１キロベース(ｋｂ)挿入物の存在を示すサザンブロットの写真である。
図６は実施例１Ｃにさらに記載してあるように、細胞から免疫沈殿させ、および在来型または変性型電気泳動条件下に電気泳動した、標識ファイバータンパク質を示すオートラジオグラムである。２９３細胞はファイバーを欠失する。しかし、サブライン２１１Ａ、２１１Ｂ、および２１１Ｒは、機能的な三量体型として、および変性した一量体型として、検出可能なファイバータンパク質を含有する。
図７は実施例１Ｄにさらに記載してあるように、プラスミドｐＤＥＸ／Ｅ１の図式的マップである。
図８は実施例１Ｆ１にさらに記載してあるように、プラスミドｐＥ１／Ｆｉｂｅｒの図式的マップである。
図９は実施例１Ｆ２にさらに記載してあるように、プラスミドｐＥ４／Ｆｉｂｅｒの図式的マップである。
図１０はアデノウイルス遺伝子多重欠失を有する組換えアデノウイルスベクターを形成するための共遺伝子移入および組換えに使用するためのリネアライズしたｐＤ・Ｅ１Ｂｂ・ｇａｌ・送達プラスミドを図解する。該プラスミドおよび組換えの操作法は、実施例２Ａにさらに詳記する。
図１１は、実施例２Ａにさらに記載してあるように、ｐＤＶ４４送達プラスミドの構築に使用されるプラスミドｐ１１.３の図である。
図１２はプラスミドｐ８.２の図である。
図１３は、組換えファイバーの三量体構造を示す。記載のように２３９、２１１Ａ、２１１Ｂ、または２１１Ｒ細胞を代謝的に［35Ｓ］メチオニンで標識し、可溶性タンパク質抽出物を調製し、およびファイバーを免疫沈殿させた。沈殿したタンパク質の一部を、半在来型または変性型の条件下に８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。三量体(Ｔ)および一量体(Ｍ)ファイバーの位置を示す。電気泳動条件の対照として、バキュロウイルス感染細胞で産生した組換えＡｄ２ファイバーを同一条件下に電気泳動させてクーマジーブルーで染色した。 
図１４は、ファイバー産生細胞によるファイバー突然変異体アデノウイルスの相補性を示す。該細胞系(試料当り２×１０6細胞)を温度感受性ファイバー突然変異体アデノウイルスＨ５ｔｓ１４２に１０ＰＦＵ／細胞で感染させ、許容温度(３２.５℃、点線)または制限的温度(３９.５℃、実線)でインキュベーションした。感染後４８時間後に凍結−解凍分解によってウイルスを分離し、ＳＷ４８０細胞上での螢光フォーカス検定法によって収率を測定した。各値は二重な試料の平均値を表し、記載のデータは多重な実験の代表値である。
図１５は、組換えＡｄ５ファイバーのＡｄ３粒子への取込みを示す。図１５Ａには、数種の異なるアデノウイルス抗原型から得たファイバータンパク質のＮ−末端(ペントン塩基結合)ドメインの整列を示す。上から下に、異なる抗原型５種を配列番号２１〜２５として表示する。図１５Ｂでは、３型アデノウイルスを指摘のように２９３、２１１Ｂまたは２１１Ｒ細胞内で増殖させ、次にＣｓＣｌ遠心分離を２回連続して精製した。次に精製ウイルス粒子１０μｇを変性条件下に電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。Ａｄ５ファイバーは、組換えＡｄ２ファイバーに対して免疫したウサギのポリクローナル抗体で検出した。検出のポジティブ対照としては、４００ｎｇの野生型Ａｄ２を「Ａｄ２」と記したレーンを移動させた。この条件下では、該Ａｄ２ファイバーおよびＡｄ５ファイバーの易動度は区別できず、該抗体は両タンパク質と反応した。
図１６は、ｐＤＶ４４における該ファイバーの欠失およびＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦベクターおよびＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔベクターのゲノム構造を示す。図１６Ａは、ｐＢＨＧ１０からファイバー遺伝子および残余Ｅ３配列(ＡＤ５のnt, 30819:32743)を除去することによって構築されたｐＤＶ４４を示す。図１６ＢはｐΔＥ１Ｂｇａｌを用いるｐＢＨＧ１０またはｐＤＶ４４のいずれかの共遺伝子移入によって構築したウイルスを示す。双方ともＥ１／Ｅ３欠失Ａｄ５ベクターであって、またＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦベクターは、ｐＤＶ４４における追加的なファイバー(Ｌ５)欠失を有する。
図１７はウイルス染色体の分析を示す。図１７Ａは、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦおよびＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔの予想されるＥｃｏＲＩ制限地図を示す。Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔゲノム右端の５.９ｋｂ断片はＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ内ファイバー配列の欠失によって、４.０ｋｂまで短縮される。図１７Ｂは、ＥｃｏＲＩ−消化ウイルスＤＮＡのエチジウムブロミド染色ゲルを示す。図１７Ｃは、実施例２に記載する、標識ファイバーまたはＥ４配列によって確認したゲルのサザンブロットを示す。
図１８は、ウイルス粒子内にある頂部タンパク質の分析を示す。２９３(ファイバー非発現)細胞または２１１Ｂ(ファイバー発現)細胞を、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔ(「ｗｔ」)またはＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ(「ΔＦ」)に感染させ、得られたウイルス粒子をＣｓＣｌ勾配上で精製した。精製ビリオン１０μｇを次に５〜１６％勾配ゲルで電気泳動させ、ウェスタンブロットした。タンパク質は、ポリクローナル抗ファイーバー抗体または抗ペントン塩基抗体で検出した。
図１９は、ＴＨＰ−１単球に対するＡｄ粒子の感染性を示す。図１９Ａは、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔまたはファイバー不含Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦに１０万粒子／細胞で感染したＴＨＰ−１細胞を示す。感染の４８時間後に細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌで染色し、および感染細胞の一部を光学顕微鏡で観測した。図１９Ｂは、細胞当り１０００粒子のＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔに、または細胞当り１０万粒子のＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦに、感染した細胞を示す。指摘したように、各細胞は組換えペントン塩基１００μｇ／ｍＬまたは組換えＡｄ２ファイバー２０μｇ／ｍＬで処理しておいた。
図２０は、実施例にさらに記載するような、改良されたファイバー相補的細胞系６３３および６４４の図式を示す。
図２１および図２２は、実施例にさらに記載するように、ファイバータンパク質を有するファイバー不含粒子のシュードタイピングおよび感染性に関するデータを示す。
図２３はＡｄ５のＣｌａＩからＢｇＩＩＩまでの断片を示す。
図２４はプラスミドｐＧＲＥ５−２／ＥＢＶを示す。
図２５はプラスミドｐＧＲＥ５−Ｅ１を示す。
図２６はプラスミドｐＳＥ２８０−Ｅ２・ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩを示す。
ファイバー欠失アデノウイルスベクターＡｄ.ｂｇａｌ.ＤＦをファイバー非発現細胞(２９３；「Ａｄ５.ｂｇａｌ.ＤＦ／０」)、Ａｄ５ファイバー発現細胞(６３３；「Ａｄ５.ｂｇａｌ.ＤＦ／５Ｆ」)、または本文記載の修正を加えたＡｄ３７ファイバー発現細胞(７０５；「Ａｄ５.ｂｇａｌ.ＤＦ／ ３７Ｆ」)内で増殖させ、ＣｓＣｌ精製を行った。精製粒子１０μｇを電気泳動し、ナイロン膜に転写した。対照としては、１０μｇの野生型Ａｄ３７、ファイバー遺伝子含有ベクターＡｄ５.ｂｇａｌ.ｗｔまたは精製組換えＡｄ３７ファイバーノブの試料を走らせた。各ブロットは組換えＡｄ３７ファイバータンパク質またはＡｄ２ファイバータンパク質に対するポリクローナル抗血清で確認した。負荷対照として、同じフィルターをＡｄ２ペントン塩基に対する抗体(非常に類似するＡｄ５ファイバーおよびＡｄ５ペントン塩基タンパク質を交差認識する抗Ａｄ２血清)を用いて再確認した。
図２８は、ファイバーの存在についてのＰＣＲ分析を示す。
図２９は、可溶性ファイバーを有するかまたは有しないファイバー不含ウイルスについての形質導入効率を示す。
図３０は、様々な量の６３３馴化培地を存在させたＨＤＦ細胞系上におけるＡＤ５ＢｇＦ−の形質導入効率を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
本発明の一態様では、ＴＰＬ核酸配列をコードするものと少なくとも９０％または９５％同一性のあるポリヌクレオチドを使用してもよい。本発明の別な態様では、ポリヌクレオチドにおける変化が単なる縮重変化以上の変化に基づく場合に、目的とするポリペプチドと少なくとも９５％の同一性のあるものをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
遺伝子：そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸。遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでもよい。遺伝子はコード領域の前または後にコード領域(リーダーおよびトレイラー)ならびに介在配列(イントロン)を各コードセグメント(エキソン)の間に有することがある。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
パッケージング細胞系
Ａ.アデノウイルス相補性の遺伝学
最近入手可能な組換えアデノウイルスベクターの第一世代は、典型的にはＥ１ａ領域およびＥ１ｂ領域を含む一般にＥ１領域と呼ばれる第一早期遺伝子領域に欠失を有している(これらの領域は遺伝子地図のユニット１.３０から９.２４までにわたる)。FieldsのVirology(Fields et al., 編, Lipincott-Raven, フィラデルフィア, 1996, p. 2116)、３ｄ版６７章の図３は２型アデノウイルス(Ａｄ２)の転写および翻訳地図を図示している。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
一態様は、ファイバーをコードするヌクレオチド配列を欠失するアデノウイルスゲノムを含む送達プラスミドを有し、組換えアデノウイルスのウイルスベクター産生に有用なパッケージング細胞を開示する。変化の一つでは、該送達プラスミドはさらに、外来ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。好適な送達プラスミドはｐＤＶ４４、ｐＥ１Ｂｇａｌ、またはｐＥ１ｓｐ１Ｂである。別の変化では、該細胞はさらにファイバーをコードするヌクレオチド配列を含む、細胞のゲノムに安定的に組込まれた相補性プラスミドを有する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
対象となるヌクレオチド配列は作動可能に連結する、異なるＤＮＡセグメントを少なくとも２種含む核酸分子を含む。このＤＮＡは本明細書に記載するＰＣＲによって、および、たとえばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Sambrook et al., 編, Cold Spring Harbor, ニューヨーク (1989) に記載されているような標準的技術を使用することによって操作し、増幅できる。典型的には本発明のヌクレオチド配列を製造するためには、選択したポリペプチドおよびプロモーターまたはエンハンサーをコードする配列をインビボまたはインビトロのいずれかの細胞内で自律的複製が可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結する。エンハンサーエレメントまたはプロモーターとヌクレオチド配列をベクターに作動可能に結合することによって、付着したセグメントがベクター配列とともに複製される。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
そこで、本発明はＴＰＬヌクレオチド配列を含む核酸分子を意図する。好ましくは、このＴＰＬヌクレオチド配列は、パッケージング細胞系内での発現に適するＲＮＡプロセッシングシグナル(例えば、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位)を含むイントロンに作動可能に結合していてもよい。最も好ましくは、このイントロンはスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む。あるいは、ＴＰＬヌクレオチド配列は、イントロンを含まなくてもよい。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
態様の一つではこの発明の対象となる核酸分子を単離、すなわち、成分の配列を得られる遺伝的環境から分離する。そこで、遺伝子断片の分子クローニングでも、同様に核酸分子を構築するためのオリゴヌクレオチドの化学合成でも、分離された核酸を与える。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
ＴＰＬヌクレオチド配列は、(ａ)第一および第二のＴＰＬエキソン、または(ｂ)第一、第二および第三のＴＰＬエキソン、のいずれかを含み、配列内の各ＴＰＬエキソンは、完全ＴＰＬエキソン１、部分ＴＰＬエキソン１、完全ＴＰＬエキソン２および完全ＴＰＬエキソン３、から構成される群から選択される。完全エキソンは野生型ウイルスゲノムに見出される配列に基づく完全な核酸配列を含むものである。好ましくは、このＴＰＬエキソンはＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ５、Ａｄ７、その他からのものであるが、しかしながら、それらは、本明細書に記載するようにいかなるＡｄ抗原型から由来するものでもよい。好適な部分ＴＰＬエキソン１は実施例に記載される。部分エキソン１を有するＴＰＬの使用はすでに報告されている(WO98/13499)。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
該イントロンおよびＴＰＬエキソンは様々な配置で作動可能に結合し、機能的なＴＰＬヌクレオチド配列を提供できるが、しかしながら、本発明の態様のいくつかでは、イントロンは構築物の一部でなくてもよい。たとえば、イントロンはＴＰＬエキソン１、２、または３のいずれかの間に位置していてもよく、該エキソンの順序は第一と第二または第一／第二／第三のいかなる順序でもよい。イントロンは第一のＴＰＬエキソンより前、または最後のＴＰＬエキソンより後、に位置することもできる。好適な一態様では、完全ＴＰＬエキソン１は完全ＴＰＬエキソン２に作動可能に連結しており、この完全ＴＰＬエキソン２は完全ＴＰＬエキソン３に作動可能に連結している。好適な変化の一つでは、アデノウイルスＴＰＬイントロン１は完全ＴＰＬエキソン１と完全ＴＰＬエキソン２との間に位置する。たとえばラビエスウイルスのような、他のウイルスシステムに由来する類似の翻訳制御配列を使用することも可能であろう。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
好適な「完全」ＴＰＬ核酸分子の一つであって、完全ＴＰＬエキソン１、２、および３を、エキソン１と２との間に挿入されたアデノウイルスイントロン１と共に有するものは、配列番号３２で示すヌクレオチド配列を持つ。好適な「部分」ＴＰＬ核酸分子の一つであって、部分ＴＰＬエキソン１および完全ＴＰＬエキソン２および３をこの順序で有するものは、配列番号２６で示すヌクレオチド配列を持つ。これら好適なＴＰＬヌクレオチド配列の構築は、実施例に記載する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
一態様では、相補性プラスミドは、アデノウイルス構造ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合する、プロモーターヌクレオチド配列を含む。該アデノウイルス構造ポリペプチドは：ヘキソン；ファイバー；ポリペプチドＩＩＩａ；ポリペプチドＶ；ポリペプチドＶＩ；ポリペプチドＶＩＩ；ポリペプチドＶＩＩＩ；およびそれらの生物学的活性のある断片から構成される群から選択される。他の変化では、相補性プラスミドはさらに、第一のアデノウイルス制御ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第二の制御ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第三の制御ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または前記の組合せのいずれか、をコードするヌクレオチド配列を含む。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
本発明によれば、好適な組換えアデノウイルスベクターゲノムは「ヘルパー非依存性」であって、これは、そのゲノムが第二の相補性ウイルスの助力なしに複製し、パッケージングされることができることを意味する。その代わりに、この相補性は本発明のパッケージング細胞系が提供する。本発明の追加的な態様は、「ヘルパー依存性」である、「無実質」と称されるベクターゲノムである。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
１.核酸遺伝子の発現カセット
様々な態様において、治療用遺伝子のペプチドをコードする配列は、発現ベクターに挿入して発現する；しかしながら、ある種の非コード配列を含む発現ベクターを構築することも同様に可能である。しかしながら、好ましくは非コード配列は排除される。あるいはポリペプチドの可溶型のためのヌクレオチド配列も利用しうる。他の好適な治療用ウイルスベクターの一つには、治療用ヌクレオチド配列内のコード配列の発現のための発現ベクターに作動可能に結合する治療用ヌクレオチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
例えば、今やＡｄ由来ウイルスベクターは、治療用ヌクレオチド配列を、その粒子の組織向性に基づいて特定の細胞または組織に送達し、通常の治療法では効果が限定されている無数の病状に採用できる、治療法の選択肢を拡大、強化できることが発見された。従って、遺伝子治療の方法であって、本明細書に記載するように予め選択した組織に指向する修飾されたファイバーまたはキメラファイバーを含む組換えアデノウイルス粒子を利用するものは、本発明の範囲内である。ベクター粒子は典型的には精製され、次に有効量を対象にインビボまたは生体外(インビトロ)で投与する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
インビトロまたは生体外遺伝子伝達のためには、投与は、最初に、たとえば肺上皮細胞、リンパ球、その他のような選択された細胞集団を患者から分離し、続いてこの発明の治療用組成物をインビトロまたは生体外で伝達し、次にこの細胞を、患者に戻すことによって達成されることが多い。たとえば様々な送達手段によるこの発明の治療用組成物の投与を経る方法などのインビボ治療も意図されている。例えば、エアロゾル投与および皮下注射、血管内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、眼内投与、その他なども本発明の範囲内である。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
この発明の組成物はインビボでＨＩＶ感染を崩壊させるために予防的または治療的に使用してもよい。その作用機構は、Ｔ細胞または単球にアンチセンスＨＩＶ配列またはリボチームを送達することによって遺伝子の発現または活性化を阻害するものである。本発明の方法を使用して、本明細書に記載する治療用ウイルスベクターを造血細胞を含む特定の細胞および組織に指向させる。この細胞の感染は様々なインテグリンが媒介すると思われ、これに向けて本発明のウイルスベクターを指向させるのは容易である。(たとえば、Huang et al., J. Virol., 70: 4502〜8, 1996参照)。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
別の例では、本発明のアデノウイルスベクターを使用して、インビボで遺伝子を中枢神経系(ＣＮＳ)の腫瘍に輸送することができる。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
ｐｃＤＮＡベクターによって提供される構成的ＣＭＶプロモーターによるファイバータンパク質の発現を強化するために、５型アデノウイルスの三分節系リーダー(ＴＰＬ)を含むＢｇｌＩＩ断片をｐＲＤ１１２ａ(Sheay et al., BioTechniques, 15: 856〜862 (1993))から切除して、ｐＣＤＮＡ３／ＦｉｂｅｒのＢａｍＨＩ部位に挿入して７４６９ｂｐを有するプラスミドｐＣＬＦを作成した。このプラスミド地図を図４に示す。主要後期アデノウイルスｍＲＮＡの全ての５’末端に存在するアデノウイルス三分節系リーダー配列は、Logan et al., Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 81: 3655〜3659 (1984)およびBerkner, BioTechniques, 6: 616〜629 (1988) に記載されており、部分的エキソン１を含むので「部分ＴＰＬ」と記載するが、これはヌクレオチド番号６０８１〜６０８９(第一リーダーセグメントの３’末端)、ヌクレオチド番号７１１１〜７１８２(第二リーダーセグメント全体)、およびヌクレオチド番号９６４４〜９８４５(第三リーダーセグメントおよびこのセグメントの下流にある配列)に対応する空間的に分離されたエキソン３個を有するＡｄ５リーダー配列と対応を示す。ｐＣＬＦに存在するこの部分三分節系リーダー配列の対応するｃＤＮＡ配列を配列番号８に示すが、各々ヌクレオチド番号９０７〜９１２から１２２８〜１２３３にあるＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ５’部位と３’部位とに接している。分離された本発明の部分ＴＰＬのヌクレオチド配列は、別に配列番号２６に示す。これには５’および３’制限部位を有し、また次の確認された各領域を有する：１〜６ｎｔのＢｇｌＩＩ部位；１〜１８ｎｔのポリリンカー；１９〜２７ｎｔの第一リーダーセグメント(エキソン１)の最後の９ｎｔ；２８〜９９ｎｔの第二リーダーセグメント(エキソン２)；１００〜１８７ｎｔの第三リーダーセグメント(エキソン３)；１８８〜３０１ｎｔは未知の機能を有するゲノムにある第三リーダー直後のｎｔ配列を含む；および３２２〜３２７ｎｔのＢｇｌＩＩ部位。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２６】
細胞系の製造および野生型Ａｄ５ファイバータンパク質またはキメラＡｄ５／Ａｄ３タンパク質の安定した核発現の立証は、図２０に示されている。図面では、細胞系の生成に使用される構築物の図式および細胞核で発現されたファイバータンパク質の存在を示す免疫蛍光結果が示されている。異なるＡｄファイバーを安定して発現するＡ５４９ベースの細胞系の間接的免疫蛍光検定法が示されている。６３３系は天然Ａｄ５ファイバータンパク質を発現し、６４４系は、Ａｄ５タンパク質の尾部およびシャフトドメインおよびＡｄ３ファイバーのノブドメインを伴うキメラファイバータンパク質を発現する。以前の研究(Stevensonら、１９９６)は、このタンパク質を含むウイルスがＡｄ３について予測される指向性を有することを示していた。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２８】
実施例７
改良ファイバー‐コンプレメンティング細胞系により製造された組換えアデノウイルスベクターのシュードタイピングおよび感染力
Ａ.Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦのシュードタイピング
製造されたアデノウイルスベクターが改変された指向性を有することを証明するため、ウイルス粒子を６３３(野生型Ａｄ５ファイバーを発現する)または６４４細胞(キメラＡｄ５／Ａｄ３ファイバーを発現する)から精製した。１０μgの精製粒子をウェスタンブロッティングにかけ、Ａｄ２ファイバーに対するポリクローナルウサギ抗体によりプローブした(Ａｄ５およびキメラ５Ｔ３Ｈファイバータンパク質の両方を検出する)。等量の精製Ａｄ.βｇａｌ.ｗｔまたはＡｖ９ＬａｃＺ(ウイルス染色体にキメラファイバー遺伝子を有する)を対照として使用した。結果は図２１に示されており、両ファイバータンパク質とも検出可能であり、シュードタイピングが確認された。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３７】
実施例９
一過性トランスコンプレメンテーション
ヒトアデノウイルス５型(Ａｄ５)は、遺伝子療法用ベクターとして開発されている。それが治療用遺伝子を細胞へ送達させる能力は、コクサッキーウイルス−アデノウイルス受容体(ＣＡＲ)とアデノウイルスファイバータンパク質の相互作用により伝達される。広範囲の細胞がＣＡＲを発現するため、アデノウイルスを用いて特異的細胞型へ遺伝子を送達させるのは困難であり得る。これに取り組む一方法は、ファイバーを遺伝学的に改変することによりウイルスを特定細胞型にターゲッティングすることである。しかしながら、改変されたファイバーをもつウイルスのクローニングおよび製造に関与する遺伝子工学的操作は、時間の浪費であり得る。すなわち、修飾ファイバー遺伝子のさらに能率化された試験システムを有することは、アデノウイルス遺伝子療法分野における顕著な前進となる。そのためファイバー欠失Ａｄによる組織培養細胞の感染およびファイバー発現を指令するプラスミドとの一過性共トランスフェクションを含むインビトロシステムが開発されている。このシステムにより、ウイルス粒子の状況における上記修飾ファイバーを容易かつ迅速に製造および評価することができる。さらにこのシステムは、修飾ファイバータンパク質をもつ治療量のアデノウイルスベクターを実際に製造するものと予測され得、上記ファイバーは目的とするリガンドをファイバー遺伝子に挿入することにより付加された新規指向性を有する。またこれらのファイバーでは、天然指向性(すなわちＣＡＲへの結合性)が除去され得る。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４２】
エピソームプラスミドのトランスコンプレメンテーションシステムは、ウイルス粒子の状況において修飾ファイバーの特徴を迅速に発現させ評価するのに好適である。エピソームプラスミドのトランスコンプレメンテーションはまた、新規指向性および天然指向性の排除を含む他の結合特性に関して修飾ファイバーのバンクを迅速に評価するのに非常に有用である。多数の修飾ファイバーを迅速に生成および試験するのに加えて、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦトランスコンプレメンテーションシステムには生産性および安全性に関する他の利点がある。エピソームプラスミドのトランスコンプレメンテーションは、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦをコンプレメントするのに要望されるあらゆる修飾ファイバーに対して安定した細胞系を作製することを必要としないという点で、トランスコンプレメンテーションを凌ぐ固有の利点を有する。Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦはＥ１、Ｅ３およびファイバーが欠失しているため、他の第一世代ベクターと比べると追加的な遺伝子欠失がある。これによって、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦはさらに複製欠陥性で恐らくは安全なものとなる。さらに、ファイバー遺伝子欠失の存在により、パッケージング細胞での組換えにより複製適格ウイルスを生成する機会が減少する。製造に関して言えば、単一Ａｄベクター製品は、単に細胞を適当なファイバー発現構築物でトランスフェクションすることによりあらゆる数の異なる細胞型に対して再ターゲッティングされ得る。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４３】
実施例１０
Ａｄ３７ファイバータンパク質を含むアデノウイルス遺伝子デリバリーベクター
アデノウイルス３７型(サブグループＤ)は、目および生殖系の感染に関与しており、これらの組織または他の粘膜、並びに他の細胞型をターゲッティングするのに有用であり得る。Ａｄ３７の指向性は、そのファイバータンパク質の結合優先性に起因するもので、チャング(Chang)Ｃ、結膜上皮細胞系を含む細胞表面に位置する未同定の受容体に結合する(Huangら、J.Virology ７３(４)：２７９８−２８０２(１９９９))。このファイバーは、Ａｄ５が感染するものとは異なる細胞型へのウイルス感染を指令するため、遺伝子デリバリーターゲッティング方法が提供されると思われる。この実施例は、Ａｄ３７ファイバータンパク質を発現するパッケージング細胞系の構築、およびこのファイバータンパク質を含むファイバー欠失Ａｄベクター(例えばＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ)の粒子生成におけるそれらの用途について記載している。Ｎ−末端を介してペントンベースタンパク質へ結合することにより、ファイバータンパク質はウイルスカプシドに結合され、Ａｄ３７ファイバーを修飾することによりそのＮ−末端配列をＡｄ５タンパク質のそれとより密接に適合させると、それがこれらのベクターにおいてＡｄ５ペントンベースと有効に結合することが確実になる。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６２】
これらの粒子はアデノウイルスのカプシド構造を有し、Ａｄにより使用される有効なファイバー−およびペントンベース伝達経路を用いて細胞に感染する。感染後、ハイブリッドゲノムは、そのＡＡＶ配列により細胞の染色体に組込まれ得る。この実施例において、ＡＡＶベクターゲノムは、ファイバー欠失ベクターのｐＥ１領域に挿入され、生成したベクターはＡｄ５またはＡｄ３７ファイバータンパク質を発現するパッケージング系で発達する。従って、回収された粒子は、それらのＡＡＶゲノムを標的細胞へ取り込ませる能力と合わせて各ファイバータンパク質から予測される指向性を有する。かかるシュードタイピングは、我々が既に報告したファイバー欠失ベクターの場合と同様、当然若干の修飾ファイバータンパク質のいずれかにより可能である。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６３】
Ａｄベクターは、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦに関して記載した方法と同様にして、ｐＡｄ.ＡＡＶ１(Lieberら、J.Virol. ７３：９３１４−９３２４、１９９９)およびｐＤＶ４４(本明細書で前述されている)間の組換えにより構築される。ｐＡｄ.ＡＡＶ１が、リポーターとしてＭＬＶプロモーター駆動分泌アルカリ性ホスファターゼ遺伝子(ＳＥＡＰ)、およびＳＶ４０−駆動ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ｎｅｏ)遺伝子を担うことにより、ＡＡＶカセットにより安定して形質導入される細胞が選択され得る。生成したベクター(Ａｄ.ＡＡＶ１.○Ｆ)は、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦのファイバー欠失を伴うゲノムのＥ１領域に挿入されたＡｄ.ＡＡＶ１のＡＡＶベクターカセットを有する。６３３細胞におけるＡｄ.ＡＡＶ１.ΔＦの発達により、ＡＡＶゲノムおよびＡｄ５ファイバーをもつ粒子が生成し、それらはＡｄ５に伴う指向性を有している。７０５細胞におけるＡｄ.ＡＡＶ１.○Ｆの発達により、Ａｄ３７ファイバーをもつためそれに伴う異なる指向性を有する粒子が生成する。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６４】
チャングＣ細胞(Ａｄ３７受容体を発現する)およびこのタンパク質は発現しないがＡｄ５受容体を発現するＡ５４９細胞(ＣＡＲ)を感染させることにより、指向性を評価する。アルカリ性ホスファターゼ発現を検定することにより、感染範囲をモニターし、安定して形質導入された細胞のフラクションをネオマイシン選別により検定する。感染中における競争相手として精製組換えＡｄ５またはＡｄ３７ファイバータンパク質を用いることにより、シュードタイプ粒子により予測される受容体の使用を評価する。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７０】
この実施例は、いかにファイバー発現性パッケージング系を用いて、指向性が改変されたヘルパー依存的または「ガットレス」ベクターのシュードタイプ粒子を生成させ得るかを示している。ガットレスベクターは多くまたは全部のＡｄ遺伝子を欠くため、それらは欠けている機能を提供し得るヘルパーウイルスの存在下で混合培養物として培養されなければならない。現在までのところ、かかるヘルパーウイルスはＥ１以外のＡｄ機能を全て提供しており、Ｅ１は２９３細胞または均等内容細胞での培養によりコンプレメントされる。生成したウイルス粒子を採取し、ヘルパーウイルスを典型的にはＣｓＣｌ勾配遠心分離により除去する(ベクター染色体は一般にヘルパー染色体よりも短いため、２粒子間の浮遊密度に差異が生じる)。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７３】
チャングＣ細胞(Ａｄ３７受容体を発現する)およびこのタンパク質を発現しないが天然Ａｄ５受容体(ＣＡＲ)を発現するＡ５４９細胞を感染させることにより、指向性を評価する。抗ジストロフィン抗体による感染細胞の免疫蛍光染色により感染範囲を評価する。感染中の競争相手として精製組換えＡｄ５およびＡｄ３７ファイバータンパク質を使用することにより、シュードタイプ粒子による予測された受容体の使用が評価される。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８１】
Ｂリンパ様細胞系の改変されたインビトロ指向性および感染
遺伝子操作による修飾が加えられたウイルスによる実験は、若干の異なる細胞型が、Ａｄ５(Stevensonら、J.Virol.７１：４７８２−４７９０(１９９７))により使用されるＣＡＲ依存的経路による場合よりもＡｄ３受容体との相互作用を通じて感染され易いことを示した。シュードタイピング系をさらに評価するため、Ａｄ５またはキメラ５Ｔ３ＨファイバーをもつＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦが幾つかの細胞系に感染する能力を検定した。ＦａＤｕ(頭部および頚部腫瘍系)、ＴＨＰ−１単核細胞、およびＭＲＣ−５線維芽細胞を検定した。以前の研究結果(Stevensonら、J.Virol.７１：４７８２−４７９０(１９９７))と一致して、キメラＡｄ５／Ａｄ３ファイバータンパク質の使用により、等しい粒子／細胞比でこれらの系全ての感染が増加した。反対に、ラット平滑筋細胞系Ａ−１０は、Ａｄ３シュードタイプ粒子によるよりもＡｄ５により幾分容易に感染された。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８２】
ＥＢＶ感染Ｂ細胞への遺伝子送達により、様々なリンパ増殖性疾患の治療法が開発され得る。例えば、ドナー骨髄のエクスビボパージングにより感染細胞を排除すると、ＥＢＶ関連リンパ増殖性疾患の危険性が低減化され得、ＥＢＶ誘導悪性腫瘍、例えばＡＩＤＳ関連リンパ腫はまた潜在的標的である。しかしながら、Ｂ細胞もＥＢＶ形質転換リンパ芽球状細胞系(ＬＣＬ)もＡｄ５に基くベクターにより有効に感染されることはない。Ａｄ３シュードタイプ粒子の指向性は幾分広いと思われるため、ＥＢＶ感染ＬＣＬがこのシステムを用いて感染され得るか否かという疑問が発せられた。Ａｄ３シュードタイプ粒子が３名の異なる正常ヒトドナーからのリンパ球のＥＢＶ感染により生成されたＬＣＬに感染する能力を試験した。以前の報告と一致して、Ａｄ５ファイバーを担う粒子によるこれらの感染はほとんどまたは全く無かった。反対に、キメラファイバータンパク質を備えたウイルス粒子は、これらの系全てに有効に感染し得た。等しい粒子／細胞比で、検査されたＬＣＬは全てＡｄ３受容体を用いると少なくとも１０倍感染性が高かった。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８４】
実施例１６
外来性ファイバーの付加によるアデノウイルスベクターの製造
コンプレメンティング細胞系での成長によるファイバーレスウイルスの製造の結果、同じくコンプレメンティング細胞系での組換えから生じる汚染性ファイバーゲノムを含む製品が生成され得る。ファイバーレスアデノウイルスベクターへ外来性ファイバーを加えることによりこの不利点は排除される。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８９】
上記とは対照的に、外来性ファイバーの付加によるファイバーレスウイルスの製造は１段階プロトコルだけでよい。ファイバーレスウイルスは、外来性ファイバーを感染培地に加えることによりＳ.８細胞系を用いて増幅される。製造に必要な外来性ファイバーの量は非常に低く、１ローラー瓶につき要求される精製ファイバーは７５ngを越えない。所望ならば、このプロセスの後ＣｓＣｌ精製を行い得る。上述したところによると、このプロトコルに対する一つの利点は、当然それが製造中にアデノベクター組換えの機会を全く提供しないことである。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９０】
ファイバーレスウイルスの１０ローラー瓶(ＲＢ)製品は、上記２段階方法を用いて製造された。アデノベクターの収量は６.６×１０１２粒子‐総Ａｄ／βｇａｌＦ―であった。また、ファイバーレスアデノベクターの１ＲＢ製品も外来性ファイバーによる一段階方法を用いて同じ出発物質から製造した。全収量は２.５×１０１１粒子‐Ａｄ５βｇａｌＦ―であった(一段階方法)。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９１】
ＤＮＡを両製品から単離し、ファイバー汚染に関するＰＣＲ検定を遂行した(図２８)。１０g‐18程度の非常に低量のファイバー汚染を検出するためのＰＣＲ検定を開発した。ＰＣＲ検定は、外来性ファイバーを加えることにより為される製品汚染がかなり低いことを示した(１０−15g一段階方法)対１０−８二段階方法)。従って、より単純な一段階方法により汚染低下が達成された。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９４】
この実験はまた、細胞侵入プロセスにおける可溶性ファイバーの役割を示した。結論は、いかなるファイバー(野生型、突然変異、リガンド融合を伴う)を加えても、野生型シャフト(またはペントン結合に必要な領域)を有していれば、ファイバーが特異的な存在であるいかなる細胞型に対しても内側にゲノムをもつ(ガットレス、腫瘍細胞崩壊性、導入遺伝子発現性など)ファイバーレスベクターを再ターゲッティングし得るということである。この方法の利点は、各新規リガンドを伴うベクターを製作する必要が無いことである。ファイバーレスベクターを一つ製造するだけで、いつでも入手できる外来性「ターゲッティング可能」ファイバーを加えることにより異なるバックボーンを製作するのにそれが使用され得る。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はブロックセグメントで示すオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を、プロモーター配列および終止配列と共に有する、アデノウイルスＥ４転写ユニット全体の図解である。実施例１Ａにさらに記載してあるように、Ｅ４に特異的な部分を増幅するためのプライマーの位置もまた指摘してある。
【図２】  図２は実施例１Ｂにさらに記載してあるように、プラスミドｐＥ４／Ｈｙｇｒｏの図式的マップである。
【図３】  図３は実施例１Ｂにさらに記載してあるように、プラスミドｐＣＤＮＡ３／Ｆｉｂｅｒの図式的マップである。
【図４】  図４は実施例１Ｂにさらに記載してあるように、プラスミドｐＣＬＦの図式的マップである。
【図５】  図５は実施例１Ｃにさらに記載してあるように、２１１細胞系における、無処置アデノウイルスＥ４の３.１キロベース(ｋｂ)挿入物の存在を示すサザンブロットの写真である。
【図６】  図６は実施例１Ｃにさらに記載してあるように、細胞から免疫沈殿させ、および在来型または変性型電気泳動条件下に電気泳動した、標識ファイバータンパク質を示すオートラジオグラムである。２９３細胞はファイバーを欠失する。しかし、サブライン２１１Ａ、２１１Ｂ、および２１１Ｒは、機能的な三量体型として、および変性した一量体型として、検出可能なファイバータンパク質を含有する。
【図７】  図７は実施例１Ｄにさらに記載してあるように、プラスミドｐＤＥＸ／Ｅ１の図式的マップである。
【図８】  図８は実施例１Ｆ１にさらに記載してあるように、プラスミドｐＥ１／Ｆｉｂｅｒの図式的マップである。
【図９】  図９は実施例１Ｆ２にさらに記載してあるように、プラスミドｐＥ４／Ｆｉｂｅｒの図式的マップである。
【図１０】  図１０はアデノウイルス遺伝子多重欠失を有する組換えアデノウイルスベクターを形成するための共遺伝子移入および組換えに使用するためのリネアライズしたｐＤ・Ｅ１Ｂｂ・ｇａｌ・送達プラスミドを図解する。該プラスミドおよび組換えの操作法は、実施例２Ａにさらに詳記する。
【図１１】  図１１は、実施例２Ａにさらに記載してあるように、ｐＤＶ４４送達プラスミドの構築に使用されるプラスミドｐ１１.３の図である。
【図１２】  図１２はプラスミドｐ８.２の図である。
【図１３】  図１３は、組換えファイバーの三量体構造を示す。記載のように２３９、２１１Ａ、２１１Ｂ、または２１１Ｒ細胞を代謝的に［35Ｓ］メチオニンで標識し、可溶性タンパク質抽出物を調製し、およびファイバーを免疫沈殿させた。沈殿したタンパク質の一部を、半在来型または変性型の条件下に８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。三量体(Ｔ)および一量体(Ｍ)ファイバーの位置を示す。電気泳動条件の対照として、バキュロウイルス感染細胞で産生した組換えＡｄ２ファイバーを同一条件下に電気泳動させてクーマジーブルーで染色した。 
【図１４】  図１４は、ファイバー産生細胞によるファイバー突然変異体アデノウイルスの相補性を示す。該細胞系(試料当り２×１０6細胞)を温度感受性ファイバー突然変異体アデノウイルスＨ５ｔｓ１４２に１０ＰＦＵ／細胞で感染させ、許容温度(３２.５℃、点線)または制限的温度(３９.５℃、実線)でインキュベーションした。感染後４８時間後に凍結−解凍分解によってウイルスを分離し、ＳＷ４８０細胞上での螢光フォーカス検定法によって収率を測定した。各値は二重な試料の平均値を表し、記載のデータは多重な実験の代表値である。
【図１５】  図１５は、組換えＡｄ５ファイバーのＡｄ３粒子への取込みを示す。図１５Ａには、数種の異なるアデノウイルス抗原型から得たファイバータンパク質のＮ−末端(ペントン塩基結合)ドメインの整列を示す。上から下に、異なる抗原型５種を配列番号２１〜２５として表示する。図１５Ｂでは、３型アデノウイルスを指摘のように２９３、２１１Ｂまたは２１１Ｒ細胞内で増殖させ、次にＣｓＣｌ遠心分離を２回連続して精製した。次に精製ウイルス粒子１０μｇを変性条件下に電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。Ａｄ５ファイバーは、組換えＡｄ２ファイバーに対して免疫したウサギのポリクローナル抗体で検出した。検出のポジティブ対照としては、４００ｎｇの野生型Ａｄ２を「Ａｄ２」と記したレーンを移動させた。この条件下では、該Ａｄ２ファイバーおよびＡｄ５ファイバーの易動度は区別できず、該抗体は両タンパク質と反応した。
【図１６】  図１６は、ｐＤＶ４４における該ファイバーの欠失およびＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦベクターおよびＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔベクターのゲノム構造を示す。図１６Ａは、ｐＢＨＧ１０からファイバー遺伝子および残余Ｅ３配列(ＡＤ５のnt, 30819:32743)を除去することによって構築されたｐＤＶ４４を示す。図１６ＢはｐΔＥ１Ｂｇａｌを用いるｐＢＨＧ１０またはｐＤＶ４４のいずれかの共遺伝子移入によって構築したウイルスを示す。双方ともＥ１／Ｅ３欠失Ａｄ５ベクターであって、またＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦベクターは、ｐＤＶ４４における追加的なファイバー(Ｌ５)欠失を有する。
【図１７】  図１７はウイルス染色体の分析を示す。図１７Ａは、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦおよびＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔの予想されるＥｃｏＲＩ制限地図を示す。Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔゲノム右端の５.９ｋｂ断片はＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ内ファイバー配列の欠失によって、４.０ｋｂまで短縮される。図１７Ｂは、ＥｃｏＲＩ−消化ウイルスＤＮＡのエチジウムブロミド染色ゲルを示す。図１７Ｃは、実施例２に記載する、標識ファイバーまたはＥ４配列によって確認したゲルのサザンブロットを示す。
【図１８】  図１８は、ウイルス粒子内にある頂部タンパク質の分析を示す。２９３(ファイバー非発現)細胞または２１１Ｂ(ファイバー発現)細胞を、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔ(「ｗｔ」)またはＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ(「ΔＦ」)に感染させ、得られたウイルス粒子をＣｓＣｌ勾配上で精製した。精製ビリオン１０μｇを次に５〜１６％勾配ゲルで電気泳動させ、ウェスタンブロットした。タンパク質は、ポリクローナル抗ファイーバー抗体または抗ペントン塩基抗体で検出した。
【図１９】  図１９は、ＴＨＰ−１単球に対するＡｄ粒子の感染性を示す。図１９Ａは、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔまたはファイバー不含Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦに１０万粒子／細胞で感染したＴＨＰ−１細胞を示す。感染の４８時間後に細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌで染色し、および感染細胞の一部を光学顕微鏡で観測した。図１９Ｂは、細胞当り１０００粒子のＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔに、または細胞当り１０万粒子のＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦに、感染した細胞を示す。指摘したように、各細胞は組換えペントン塩基１００μｇ／ｍＬまたは組換えＡｄ２ファイバー２０μｇ／ｍＬで処理しておいた。
【図２０】  図２０は、実施例にさらに記載するような、改良されたファイバー相補的細胞系６３３および６４４の図式を示す。
【図２１】  図２１は、実施例にさらに記載するように、ファイバータンパク質を有するファイバー不含粒子のシュードタイピングおよび感染性に関するデータを示す。
【図２２】  図２２は、実施例にさらに記載するように、ファイバータンパク質を有するファイバー不含粒子のシュードタイピングおよび感染性に関するデータを示す。
【図２３】  図２３はＡｄ５のＣｌａＩからＢｇＩＩＩまでの断片を示す。
【図２４】  図２４はプラスミドｐＧＲＥ５−２／ＥＢＶを示す。
【図２５】  図２５はプラスミドｐＧＲＥ５−Ｅ１を示す。
【図２６】  図２６はプラスミドｐＳＥ２８０−Ｅ２・ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩを示す。
【図２７】  ファイバー欠失アデノウイルスベクターＡｄ.ｂｇａｌ.ＤＦをファイバー非発現細胞(２９３；「Ａｄ５.ｂｇａｌ.ＤＦ／０」)、Ａｄ５ファイバー発現細胞(６３３；「Ａｄ５.ｂｇａｌ.ＤＦ／５Ｆ」)、または本文記載の修正を加えたＡｄ３７ファイバー発現細胞(７０５；「Ａｄ５.ｂｇａｌ.ＤＦ／ ３７Ｆ」)内で増殖させ、ＣｓＣｌ精製を行った。精製粒子１０μｇを電気泳動し、ナイロン膜に転写した。対照としては、１０μｇの野生型Ａｄ３７、ファイバー遺伝子含有ベクターＡｄ５.ｂｇａｌ.ｗｔまたは精製組換えＡｄ３７ファイバーノブの試料を走らせた。各ブロットは組換えＡｄ３７ファイバータンパク質またはＡｄ２ファイバータンパク質に対するポリクローナル抗血清で確認した。負荷対照として、同じフィルターをＡｄ２ペントン塩基に対する抗体(非常に類似するＡｄ５ファイバーおよびＡｄ５ペントン塩基タンパク質を交差認識する抗Ａｄ２血清)を用いて再確認した。
【図２８】  図２８は、ファイバーの存在についてのＰＣＲ分析を示す。
【図２９】  図２９は、可溶性ファイバーを有するかまたは有しないファイバー不含ウイルスについての形質導入効率を示す。
【図３０】  図３０は、様々な量の６３３馴化培地を存在させたＨＤＦ細胞系上におけるＡＤ５ＢｇＦの形質導入効率を示す。