【手続補正書】
【提出日】平成19年4月25日(2007.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  １つ以上の生物学的サンプルに存在する１つ以上の標的核酸の配列分析の方法であって、
（ａ）１つ以上の標的核酸を１つ以上の生物学的サンプルから得る工程、
（ｂ）工程（ａ）から得られた１つ以上の標的核酸を、別個の塩基特異的、配列特異的又は部位特異的相補的切断反応のセットに付す工程であって、各切断反応が、非整列断片のセットを生成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）から得られた非整列断片のセットを質量分析法によって分析する工程、及び、
（ｄ）工程（ｃ）から得られた質量分析スペクトルについて体系的コンピューター分析を行い、上記標的核酸の配列を分析する工程、
ここで、上記相補的切断反応は、種々の特異性を特徴とする標的核酸消化及び／又は標的配列の別の形態の消化をいう、
を含む方法。
【請求項２】  １つ以上の生物学的サンプルが、真核生物、原核生物及びウイルスからなる群より選択される生物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  1つ以上の標的核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドおよびＤＮＡ／ＲＮＡモザイク核酸からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】  １つ以上の標的核酸が、インビボでの、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写その後のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び転写に基づく方法からなる群より選択される１つ以上の連続的な増幅手段によって得られる、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】  １つ以上の増幅された標的核酸が、下記工程：
（ａ）１つ以上の標的核酸に転写制御配列を作用的に連結する工程、及び
（ｂ）１つ以上の標的核酸上の転写制御配列を認識する１つ以上のＲＮＡポリメラーゼを用いて、工程ａ）の１つ以上の標的核酸の一方または両方の鎖を転写させる工程
を含む方法によって１本鎖又は２本鎖標的核酸から生成された転写物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】  上記転写制御配列が、５′伸張部分のような転写制御配列を組み込むプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって１つ以上の標的核酸に作用的に連結される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】  転写制御配列が、真核生物の転写制御配列、原核生物の転写制御配列およびウイルスの転写制御配列からなる群より選択される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】  原核生物の転写制御配列が、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６プロモーターからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】  Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターを利用するＲＮＡポリメラーゼが、野生型または突然変異体のＲＮＡポリメラーゼであって、突然変異体ポリメラーゼが、２′デオキシ、２′−Ｏ−メチル、２′−フルオロ又は２′−アミノ置換基を有する非標準基質を転写物内に組込むことができる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  突然変異体ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７又はＳＰ６突然変異体ポリメラーゼのいずれかである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  得られた標的核酸が、塩基、糖及び／又はリン酸部分において修飾された１つ以上のヌクレオシドを組み入れる方法であって、修飾が、１つ以上の切断試薬による切断の特異性、及び／又は、切断産生物の質量及び／又は長さを改変する、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】  修飾が、修飾デオキシヌクレシド三リン酸、修飾リボヌクレオシド三リン酸、及び／又は修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸の酵素的組み込みによって導入されるか、修飾が、化学的に導入されるか、又は修飾が、両方法の組み合わせによって導入される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】  修飾が、ヌクレオチド三リン酸上の２′−デオキシ、２′−Ｏ−メチル、２′−フルオロ又は２′−アミノ置換基からなる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】  修飾が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合又はアルカリ化試薬とさらに反応したホスホロチオアートヌクレオシド間結合からなる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】  修飾が、ウリジン−５′−一リン酸サブユニットのＣ５上のメチル基からなる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１６】  修飾が、代替的同位元素を組み込むヌクレオチドからなる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１７】  工程（ａ）の１つ以上の標的核酸が、切断の前に精製されている、請求項１〜１６いずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】  上記精製が、固定化によってか又はクロマトグラフィーによって行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】  相補的切断反応が、酵素的切断、化学的切断および物理的切断からなる群より選択される、請求項１〜１８いずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】  相補的切断反応が、弛緩モノヌクレオチド特異性、モノヌクレオチド特異性、弛緩ジヌクレオチド特異性またはジヌクレオチド特異性を特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】  １つ以上の標的核酸が、アルカリ又はマクサム・ギルバート配列決定法において用いられる試薬を用いる処理からなる化学的消化反応に付される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】  １つ以上の標的核酸が、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素を用いる酵素的切断反応に付される、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】  １つ以上の標的核酸が、制限酵素、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ及び非特異的ホスホジエステラーゼからなる群より選択される１つ以上のエンドヌクレアーゼを用いる酵素的切断反応に付される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】  １つ以上のエンドヌクレアーゼが、Ｇ特異的Ｔ1リボヌクレアーゼ、Ａ特異的Ｕ2リボヌクレアーゼ、Ａ／Ｕ特異的ｐｈｙＭリボヌクレアーゼ、Ｕ／Ｃ特異的リボヌクレアーゼＡ、Ｃ特異的ニワトリ肝臓リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＣＬ３）、クサチビン、非特異的ＲＮアーゼＩ、及び大腸菌（E. coli）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）又は酵母（Saccharomyces cerevisiae）から単離されるピリミジン−アデノシンを好むＲＮアーゼからなる群より選択される、１つ以上の選択的か又は非選択的ＲＮＡエンドヌクレアーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】  １つ以上の標的核酸が、ホスホロチオアート修飾一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであり、そして核酸消化が、ヌクレアーゼＰ１を用いて行われる、請求項１〜８、１１〜１２及び１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】  １つ以上の標的核酸が、突然変異体ポリメラーゼを用いて調製されたモザイクのＲＮＡ／ＤＮＡ核酸又は修飾されたモザイクのＲＮＡ／ＤＮＡ核酸であって、切断試薬が、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はアルカリである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法
【請求項２７】  １つ以上の標的核酸が、野生型又は突然変異体ＲＮＡポリメラーゼを用いて調製された、転写物、修飾された転写物、モザイクのＲＮＡ／ＤＮＡ転写物又は修飾されたモザイクのＲＮＡ／ＤＮＡ転写物であり、切断試薬が、１つ以上の選択的か若しくは非選択的ＲＮＡエンドヌクレアーゼ又はアルカリである、請求項１〜２４及び２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】  １つ以上の標的核酸が、突然変異体Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼを用いて調製された、ｄＣＭＰ、ｄＵＭＰ又はｄＴＭＰのいずれかを取り込むモザイクのＲＮＡ／ＤＮＡ転写物であり、切断試薬が、ＲＮアーゼＡのようなピリミジン特異的ＲＮアーゼである、請求項１〜２４又は２６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】  工程（ｂ）の非整列断片のセットが、イオン交換ビーズを用いてさらに精製された、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】工程（ｂ）の非整列断片のセットが、固体支持体上にスポットされている、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】  上記固体支持体が、固体表面、プレート及び細片（チップ）からなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】  核酸断片の質量分析的分析が、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）からなる群より選択される質量分析的方法を用いて行われる、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】  基準核酸配列が公知である１つ以上の標的核酸の配列分析のための請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法であって、請求項１の工程（ｃ）において得られた非整列断片の１つ以上の質量スペクトルを基準核酸配列の質量スペクトルの公知又は予想質量スペクトルと比較し、そしてそこから体系的コンピューター分析によって１つ以上の標的核酸の全て又は一部のヌクレオチド配列を推定し、そして推定されたアミノ酸配列を基準核酸と比較し、１つ以上の標的核酸が、基準核酸と同一の配列又は異なる配列を有するかどうかを決定する付加的工程を含む方法。
【請求項３４】  決定された核酸配列差が、欠失、置換、挿入又はそれらの組み合わせである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】  核酸配列差が、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】  １つ以上の生物学的サンプルに存在する１つ以上の標的核酸の公知及び未知のヌクレオチド配列変異をスコアするための請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項３７】  上記の公知及び未知のヌクレオチド配列変異の決定が、所定の領域／遺伝子の種々の対立遺伝子配列の同定、疾患関連突然変異のスコア、体細胞変異の検出又は分子進化の領域における研究を可能にする、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】  １つ以上の標的核酸について得られたスペクトルを、複数の参照核酸について予測された質量スペクトルと比較し、それによって、１つ以上の生物学的サンプルにおける１つ以上の標的核酸を同定する／検出する、請求項３３に記載の方法の使用。
【請求項３９】  １つ以上の生物学的サンプルにおける１つ以上の標的核酸の発現プロフィールを測定するための、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】  １つ以上の生物学的サンプルに存在する１つ以上の標的核酸の未知配列の配列分析のための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法であって、上記方法が、下記工程：
（ａ）１つ以上の生物学的サンプルから１つ以上の標的核酸を一本鎖形態で引き出す工程、
（ｂ）工程（ａ）から得られた１つ以上の標的核酸を、４つの別々の塩基特異的相補的切断反応のセットに付す工程であって、各切断反応が、非整列断片のセットを生成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）から得られた非整列断片のセットを質量分析法によって分析する工程、
（ｄ）工程（ｃ）から得られた質量スペクトルについて体系的コンピューター分析を行い、上記標的核酸の配列をアセンブルする工程、及び
（ｅ）もし配列が工程（ｄ）の後で一義的に決められないなら、場合により、工程（ａ）〜（ｄ）を反復し、それによって、上記標的核酸及び／又は上記標的核酸の異なる部分の改変された形態を生成し、結合データが一義的配列の解に収束するまで追加的モノヌクレオチド及び／又はジヌクレオチド特異的切断反応を行い、非整列断片の追加的セットを提供する工程、
ここで、上記相補的切断反応とは、さまざまな特異性を特徴とする標的核酸消化及び／又は標的配列の別の形態の消化をいう、
を含む方法。
【請求項４１】  １つ以上の生物学的サンプルに存在する１つ以上の未知配列の標的核酸の配列分析のための、請求項４０に記載の方法の使用。
【請求項４２】  １つ以上の生物学的サンプルにおける１つ以上の未知配列の標的核酸の配列決定のための、請求項４０に記載の方法の使用。
【請求項４３】  １つ以上の生物学的サンプルのゲノム全体の遺伝子型分類のための、請求項３３〜３５及び４０のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項４４】  １つ以上の生物学的サンプルにおける基準核酸が公知である、１つ以上の標的核酸の、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法による、質量分析法を用いる配列分析のためのキットであって、キットが、
（ａ）１つ以上のヌクレオチド三リン酸、
（ｂ）１つ以上のポリメラーゼ、
（ｃ）１つ以上の核酸切断剤、及び
（ｄ）核酸配列が公知である、１つ以上の基準核酸のセット
（ｅ）場合により、標的核酸を精製するための試薬、
（ｆ）場合により、非整列断片のセットを精製するためのイオン交換ビーズ、
（ｇ）場合により、その上に非整列断片のセットをスポットすることができる固体支持体、及び
（ｈ）場合により、１つ以上の標的核酸の質量スペクトルを基準核酸の質量スペクトルと比較し、それから標的核酸の核酸配列を推定するためのコンピューターソフトウェア
を含むキット。
【請求項４５】  １つ以上の生物学的サンプルに存在する、基準核酸配列が公知である１つ以上の標的核酸
の配列を分析するための、
における配列差を決定するための、
同標的核酸における公知及び未知ヌクレオチド配列変異をスコアするための、
同標的核酸を検出及び／又は同定するための、又は
同標的核酸を用いてゲノム全体の遺伝子型分類を行うための、
請求項４４に記載のキットの使用。
【請求項４６】  質量分析法を用いる、１つ以上の生物学的サンプルにおける１つ以上の未知の標的核酸の、請求項１〜３２及び４０のいずれか１項に記載の方法による配列分析のためのキットであって、キットが、下記：
（ａ）１つ以上のヌクレオチド三リン酸、
（ｂ）１つ以上のポリメラーゼ、及び
（ｃ）１つ以上の核酸切断剤、
（ｄ）場合により、標的核酸を精製するための試薬、
（ｅ）場合により、非整列断片のセットを精製するためのイオン交換ビーズ、
（ｆ）場合により、その上に非整列断片のセットをスポットすることができる固体支持体、及び
（ｇ）場合により、該標的核酸の配列を分析し、１つ以上の一義的配列をもたらすためのコンピューターソフトウェア
を含むキット。
【請求項４７】  １つ以上の生物学的サンプルに存在する未知配列を有する１つ以上の標的核酸の配列を分析するための、配列を決定するための、又は、この１つ以上の標的核酸を用いるゲノム全体の遺伝子型決定を行うための、請求項４６に記載のキットの使用。