【手続補正書】
【提出日】平成19年5月14日(2007.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および少なくとも1の増幅可能領域を含む内部コントロール核酸分子であって、該フォワードプライマー結合部位、リバースプライマー結合部位および増幅可能領域が全て疑似乱数的に作製される、内部コントロール核酸分子。
【請求項２】
前記フォワードプライマー結合部位およびリバースプライマー結合部位がそれぞれ15から25核酸長である、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項３】
前記フォワードプライマー結合部位およびリバースプライマー結合部位がそれぞれ18から24核酸長である、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項４】
前記フォワードプライマー結合部位およびリバースプライマー結合部位がそれぞれ20から23核酸長である、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項５】
前記増幅可能領域が15から1000核酸長である、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項６】
前記少なくとも1のフォワードプライマー結合部位および少なくとも1のリバースプライマー結合部位が、いかなる既知、天然のヌクレオチド配列とも同一性を有さない、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項７】
前記増幅可能領域が、いかなる既知、天然の増幅可能領域の核酸配列とも同一性を有さない、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項８】
前記少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および増幅可能領域が、特定範囲のGC含量を有する、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項９】
前記少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および増幅可能領域の配列が、4塩基対より多い同一塩基対からなる配列を有さない、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１０】
前記少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および増幅可能領域の配列が、5塩基対より多い同一塩基対からなる配列を有さない、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１１】
プローブ結合部位をさらに含む、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１２】
前記プローブ結合部位がプローブに相補的である、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１３】
前記プローブが、5'ヌクレアーゼ型プローブ、TaqMan(登録商標)MGB(副溝結合物質)プローブ、スコーピオンプローブ、ライトサイクラー様式プローブセット、エクリプスプローブおよび分子ビーコンからなる群から選択される、請求項１２に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１４】
前記プローブが、蛍光色素およびクエンチャーの両方で標識されている、請求項１２に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１５】
前記蛍光色素が、TX-Red Fam、Tet、Vic、Rox、Cy3およびCy5からなる群から選択される、請求項１４に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１６】
前記クエンチャーが、Black Hole Quencher(商標)-2および非蛍光クエンチャーからなる群から選択される、請求項１５に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１７】
複数個のフォワードプライマー結合部位および複数個のリバースプライマー結合部位を有する、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１８】
前記複数個のフォワードプライマー結合部位および複数個のリバースプライマー結合部位が、複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーと相補的である、請求項１７に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項１９】
前記複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーが、個別の温度でアニーリングするように選択される、請求項１８に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項２０】
前記複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーが、前記内部コントロール核酸分子内に一連の個別の大きさの増幅可能領域が得られるように選択される、請求項１８に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項２１】
配列番号９の配列を有する、請求項１に記載の内部コントロール核酸分子。
【請求項２２】
少なくとも1の請求項１に記載の内部コントロール核酸分子、前記内部コントロール核酸分子の少なくとも1のフォワードプライマー結合部位に相補的に設計された少なくとも1のフォワードプライマー、および前記内部コントロール核酸分子の少なくとも1のリバースプライマー結合部位に相補的に設計された少なくとも1のリバースプライマーを含むキット。
【請求項２３】
複数個の請求項１に記載の内部コントロール核酸分子を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーを含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記少なくとも1のフォワードプライマーが、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列を有する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２６】
前記少なくとも1のリバースプライマーが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列を有する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２７】
前記少なくとも1の内部コントロール核酸分子がプローブ結合部位を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２８】
少なくとも1のプローブをさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記プローブが配列番号１０の配列を有する、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記プローブが標識化されている、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記内部コントロール核酸分子が線状プラスミドDNA分子である、請求項２２に記載のキット。
【請求項３２】
前記内部コントロール核酸分子が環状プラスミドDNA分子である、請求項２２に記載のキット。
【請求項３３】
前記内部コントロール核酸分子が二本鎖線状DNA分子である、請求項２２に記載のキット。
【請求項３４】
前記内部コントロール核酸分子がRT-PCRに用いる一本鎖RNA分子である、請求項２２に記載のキット。
【請求項３５】
リアルタイムPCRによる増幅における偽陰性検出を防ぐ方法であって、以下の工程を含む方法：
a.)  請求項１に記載の少なくとも1の内部コントロール核酸分子をリアルタイムPCR反応混合物に加える、
b.)  少なくとも1のフォワードプライマーおよび少なくとも1のリバースプライマーを加える、ここで該フォワードおよびリバースプライマーは、前記内部コントロール核酸分子のフォワードおよびリバースプライマー結合部位と相補的であり、且つ前記内部コントロール核酸分子の増幅可能領域の特異的な増幅に適している、
c.)  前記内部コントロール核酸分子の増幅可能領域を増幅し、該増幅可能領域の内部コントロールアンプリコンを作製する、および
d.)  前記内部コントロールアンプリコンの存在を検出する、ここで、該内部コントロールアンプリコンの検出によりリアルタイムPCRによる標的配列増幅の陰性検出を確認することができる。
【請求項３６】
少なくとも1のプローブを加える工程をさらに含み、該プローブが前記内部コントロール核酸分子のプローブ結合部位に相補的である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記プローブが、前記内部コントロールアンプリコンの存在を少なくとも部分的に検出する働きを持つ、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記内部コントロールアンプリコンの検出を蛍光検出で行う、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記内部コントロール核酸分子の増幅可能領域の増幅の阻害を利用し、リアルタイムPCR解析の定量結果を調整する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
内部陽性コントロールの別の例が、Rosenstraus M., et al., (1998) J. Clinical Microbiol 36(1):191-197で報告されている。そのグループは、トラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)およびヒトＣ型肝炎ウイルスに関するCOMAS AMPLICOR試験に用いる内部コントロール核酸を構築した。Rosenstrausらが構築した内部コントロール配列は、その標的配列のプライマーと同一のプライマー結合領域を有するが、増幅した標的核酸と内部コントロール配列とを区別する特有プローブ結合領域を含んでいる。各試験試料中に導入した内部コントロール配列は20コピーのみであったので、陽性内部コントロールシグナルにより、試験感度の限界濃度の標的から陽性シグナルを生ずるのに十分な増幅がなされていることが示された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
配列を作製する際に考えられる設計特性は数多くある。考慮することの例は、これらに限定されないが、配列のGC含量、既知、天然の配列またはPCR増幅可能領域と同一性を有さないこと、および同一塩基対の反復領域がないこと、などである。疑似乱数的に作製する配列は、これらの様々な特性のあらゆる組み合わせを考慮して設計する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
考慮に入れることができる別の設計特性は、内部コントロール配列が、あらゆる既知、天然のヌクレオチド配列に対して有意なヌクレオチド同一性を有さないことである。本明細書で用いられる、「あらゆる既知、天然のヌクレオチド配列に対して同一性を有さない」なる語句は、フォワードプライマー結合部位およびリバースプライマー結合部位の塩基対配列が、単一生物ゲノムのPCR増幅可能領域内の天然のヌクレオチド配列とハイブリダイズしないように設計されていることを意味する。従って、該無作為に作製されたプライマーを組み合わせても(フォワードおよびリバース)、リアルタイムPCRに通常用いられるハイブリダイゼーション温度およびポリメラーゼ伸長時間では、天然の配列を増幅させることは一般にできないはずである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
考慮できるさらなる別の設計特性は、増幅可能領域自体が、いかなる既知、天然の増幅可能領域のヌクレオチド配列に対しても有意な同一性を有さないことである。本明細書で用いられる、「いかなる既知、天然のPCR増幅可能領域のヌクレオチド配列に対しても有意な同一性を有さない」なる語句は、増幅可能領域が、ヌクレオチド増幅工程で増幅することができる、いかなる既知、天然の領域または既知の天然のヌクレオチド配列とも同じ塩基対配列を持たないことを意味する。一態様において、フォワードおよびリバースプライマーは、ある生物のゲノムのある小さな部分と同一の偶発的配列を、別個に持つ可能性がある。非常に短いプライマーを用いると、ある生物と同一の部位がいくつか発見される確率は非常に高いが、内部コントロールに特定化した長さ、つまり約15から約25塩基対のプライマーを用いると、その確率はかなり減少する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
相補的なフォワードプライマー結合部位の作製に利用し得るフォワードプライマー配列の例は、これらに限定するものではないが、以下の配列を含む：
gacatcgata tgggtgccg                    [配列番号１]
cgatatgggt gccgttcg                     [配列番号２]
atgggtgccg ttcgagc                      [配列番号３]。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
相補的なリバースプライマー結合部位の作製に利用し得るリバースプライマー配列の例は、これらに限定するものではないが、以下の配列を含む：
gagacgatgc agccattcg                    [配列番号４]
cgagacgatg cagccattc                    [配列番号５]
aatattcgcg agacgatgca g                 [配列番号６]
gagccaagtc agatgatggt acg               [配列番号７]
gacatgagcc aagtcagatg atg               [配列番号８]。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明の別の態様において、内部コントロール核酸分子はまた、少なくとも1のプローブ結合領域を含む。該プローブ結合領域は、リアルタイムPCRプローブに相補的に構築する。相補的なプローブ結合領域に対するプローブは、DNA検出および/または定量アッセイに一般に知られ利用されているいずれのプローブであってもよい。プローブのヌクレオチド配列は、前述の内部コントロール核酸分子のために設計したプライマーを用いたPCRで増幅できる、本発明の内部コントロール核酸分子領域に相補的になるように設計する。例えば、ATCTCGの塩基対配列を持つプローブAを利用する場合、プローブ結合領域は(例えば)CGAGATの配列を持つであろう。該プローブは、一般に(例えば)Primer Express(Applied Biosystems, Foster City, CA)のような専門のソフトウェアを用いて、各種のプローブに特有の規格(specifications)で設計する。内部コントロール核酸分子内の領域にハイブリダイズするよう設計されたプローブは、内部コントロールDNA配列にハイブリダイズする点で、プライマーと非常に似た行動をとるであろう。上記のプライマー結合領域の場合と同じ理由で、これらの領域が、任意の天然配列の増幅可能領域内部の領域とヌクレオチド同一性を有する可能性は低い。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
プローブを利用できるアッセイ例には、これに限定しないが、Taqman(登録商標)(Applied Biosystems)として知られる市販の5'ヌクレアーゼアッセイがある。Taqman(登録商標)アッセイでは、特定増幅可能領域を標的とするプライマーの内側のDNA配列に結合するよう設計したプローブを用いることができる。該プローブは一般に、5'末端を蛍光色素などのレポーター分子、および3'末端をクエンチャー(quencher)で標識化する。本発明の内部コントロール核酸分子のプローブ結合領域と組み合わせて用いることができる典型的なプローブの具体例は、これらに限定されないが、5'ヌクレアーゼ型プローブ、(Applied Biosystemsで製造可能な)TaqMan(登録商標)MGB(副溝結合物質(minor groove binder))プローブ、スコーピオン(Scorpion)プローブ、ライトサイクラー様式の「FRET」プローブセット、エクリプス(Eclipse)プローブ、分子ビーコンおよびその他多数を含む。プローブの標識が可能な各種フルオロフォアおよび各クエンチャーの例は、これらに限定されないが、TX-RedまたはROXおよびBlack Hole Quencher(商標)-2(Integrated DNA Technologiesで製造可能)、様々な非蛍光または蛍光クエンチャー色素と組み合わせたFam、Tet、Vic、Rox、Cy3、Cy5、TX-Redおよびその他多数の色素を含む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
試料中のVibrio parahaemolyticusの定量
Vibrio parahaemolyticus (Vp)は、米国における細菌性胃腸炎の貝類関連型症状の主な原因である河口性細菌であり、感染のほとんどは生または処理を誤った海産物の消費に起因する。Vpを検出するための以前の方法は、各種表現系アッセイにより個々の単離物を集中的に試験する人手と資金を必要とした (Myers, ML et al., Appl Environ Microbiol. 2003 69(4):2194-200; Hara-Kudo, Y. et al., Appl Environ Microbiol. 2001 Dec;67(12):5819-23.)。tl (易熱性溶血毒（thermolabile hemolysin）)遺伝子はVpの種特異的マーカーであり、一方tdh (耐熱性溶血毒（thermostable direct hemolysin）)およびtrh (耐熱性溶血毒類似毒（thermostable-related hemolysin）)遺伝子はVpの２つの病原性マーカーである。tdhには多くの変異体が存在し、それらは全て病気を引き起こすのに十分なTDHを産生できる可能性がある。プロモーター効率関連型のtdh1およびtdh2遺伝子変異体は、K+株と関係している。tdh2は、K+株において溶血活性を起こす。tdhはまた、V. hollisae、V. fluvialis、V. mimicus、 V. cholerae、および他の病原性微生物にも見られる。病原性に関係するtrhは、tdhと関連して病原性株に存在することが多い。trh1、trh2その他の幾つかのtrh変異体も存在し、それらは84%を超えるヌクレオチド同一性を有する。trhは、tdhと約70%のヌクレオチド同一性を有する。tdhとtrhは、tdh+trh+株において染色体上で近接している。tlはVp特異的マーカーであるが、その遺伝子の幾つかの領域においてtdhおよびtrhと顕著な類似性を有する。Smart Cycler（登録商標）システム (Cepheid, Sunnyvale, CA)を用いて、4-チャンネルリアルタイム多重PCRアッセイを開発した。このアッセイは本発明の内部コントロール核酸分子を含み、天然（非濃縮）試料中の全Vpおよび病原性Vpの同時計数のためのアッセイを最適化するよう設計された。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
内部コントロール核酸分子
本発明の外来内部コントロール核酸分子をこのアッセイに導入した。本アッセイに使用した例示的内部コントロール核酸分子の完全長配列を以下に示す：
cgcatgtggt  cacagccctg  acgaagctgt  catcaagttc  ataatgacat  cgatatgggt      60
gccgttcgag  cagtttagcc  ctaaatcacc  ctaccggcag  acgtatgtca  cattcaccag     120
ggagacgcat  gagattggat  gctgttgtgc  gccctcaaca  atgtaacgaa  tggctgcatc     180
gtctcgcgaa  tattgtcgta  ccatcatctg  acttggctca  tgtctgcaag  aggcttcgca     240
ctgggcttta  tg                                                             252
[配列番号９]。
この核酸分子にハイブリダイズするプローブを以下の配列番号１０に示す。
tctcatgcgt  ctccctggtg  aatgtg                                              26
[配列番号１０]。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
当業者は、過度の実験を行うことなく、いずれの天然配列にも同一性を有さない、フォワードおよびリバースプライマー結合部位並びにプローブ結合部位を含む内部陽性コントロールとして使用するための他の核酸分子を合成することができるであろう。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
内部コントロール核酸分子アンプリコンの他の例
内部コントロール核酸分子とともに利用される温度限定内部コントロール用に設計されたプライマーの例
【表２】
2007500517.tif 000001