【手続補正書】
【提出日】平成19年8月21日(2007.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  管疾患及び癌の危険性のある人を同定する方法であって、
当該人からの血清試料中の被検物ペプシノーゲンＩ（ＰＧＩ）の濃度を定量的に測定し、
該被検物に対する方法特異的なカットオフ値を選択し、
このように測定された被検物濃度を、該被検物に対する方法特異的なカットオフ値と比較し、そして
当該人からの血清試料中のホモシステイン濃度を測定し、ホモシステインに対する方法特異的な基準値と当該濃度とを比較し、ここで方法特異的なカットオフ値よりも低い血清ペプシノーゲンＩ濃度及び方法特異的な基準値よりも高い血清ホモシステイン濃度により該人を管疾患及び癌の危険性の高い人として同定する工程を含む、方法。
【請求項２】  血清ＰＧＩ濃度を測定し、そして更にホモシステイン濃度の測定をするために、血清ＰＧＩ濃度についてのカットオフ値よりも低い血清ＰＧＩ濃度を提示する人を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  更に試料中のビタミンＢ１２濃度を測定し、その濃度を方法特異的な基準値と比較する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】  請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって、
血清試料中のＰＧＩ濃度を測定する手段、及び
血清試料中のホモシステインの濃度を測定する手段、を含む、キット。
【請求項５】  該ペプシノーゲンＩ及びホモシステイン濃度を測定する手段が免疫学的手段を含む、請求項４に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、冠動脈疾患及び管疾患のみならず癌の危険性のある人を同定するための組み合わせ診断方法に関する。
本発明による方法は、高いホモシステイン値を示しているか又はそのような値になる傾向のある人であって、それゆえアテローム性動脈硬化や虚血性脳卒中を含む心血管疾患あるいは脳管疾患のようなホモシステイン値上昇の結果おこる病気のみならず癌の危険性のある人を同定するために、血液あるいは血清試料に関して実施される２つの測定の組み合わせに基づいている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
出願公開WO 96/15456は、血清試料中の被検物ペプシノーゲンＩ（ＰＧＩ）及びガストリン-１７（Ｇ-１７）の濃度を測定し、このようにして測定された濃度を個々の被検物に対する方法特異的なカットオフ値と比較することにより、幽門腺領域あるいは胃底腺領域のいずれかに、あるいは双方に係る粘膜における萎縮を決定する、胃癌の危険性をスクリーニングする方法を開示している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（MTHFR）は、ホモシステインのメチオニンへの再メチル化に必要な細胞内酵素である。この酵素の機能低下は、MTHFR遺伝子構造の欠陥、又はとりわけ葉酸、ビタミンＢ６及び／あるいはビタミンＢ１２の栄養素の不足により引き起こされる。MTHFR酵素の機能低下の結果、血清／血漿ホモシステイン値の上昇（高ホモシステイン血症）、及びホモシステイン尿症になる。上昇した血清／血漿ホモシステイン値は、種々の心臓疾患及び管疾患の危険性の増大と関連することが多くの文献において示されており、基準値よりも高い血清／血漿の高ホモシステイン値は、心臓疾患及び管疾患および虚血性脳卒中１−５の深刻な独立した危険因子となる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
萎縮性胃炎あるいは胃癌の結果としておこる内因子の欠乏、特に胃底腺領域におけるそれは、最終的には体内でのビタミンＢ１２の欠乏とそれためのホモシステイン濃度の上昇につながる。従って萎縮性胃炎のためにビタミンＢ１２が欠乏しているあるいは欠乏の危険性が高く、それ故血清又は血漿ホモシステイン値が上昇する可能性のある対象を同定することは非常に重要となるであろう。このような人において、早期にビタミンＢ１２補充を開始することが管疾患の阻止に有益となるであろう。細胞内酸素ラジカルの過剰生成のために癌の危険性があり、ビタミンＢ１２の補充又は他の処置が有益となり得る人が同定可能であるのもまた、重要であろう。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の１つの実施の態様に従って、また、当該人の血清についてビタミンＢ１２濃度が併せて測定され、ビタミンＢ１２の方法特異的な基準値と比較される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
該方法は、好ましくは、ペプシノーゲンＩの測定のための免疫学的方法においてペプシノーゲンＩに対するポリ−あるいはモノクローナル抗体を使用する工程を包含する。本反応は、例えばプラスチック、ガラス、あるいはセルロースの支持体のような適切な支持体、例えばマイクロプレート上で実施するのが適切である。該免疫学的方法は、例えば試料中の該ペプシノーゲンＩ濃度の測定に吸光、発光、又は蛍光の技術を用いる既知の方法で実施され得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
もし、血清ペプシノーゲンＩ濃度が、その方法について認められている特異性及び感度に依存して、およそ４５０〜６９０pmol/lに相当する２０〜３０μg/lであるカットオフ値よりも低ければ、胃の胃底腺領域に萎縮がある。ＰＧＩに対する正常値、又は基準値は、２５〜１２０μg/lの範囲である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
２．ホモシステインの測定
血清中のホモシステイン値は、この目的で自体既知であり、また例えばキット形態として市販されている方法のいずれによっても測定され得る。血漿又は血清における総ホモシステインを定量するための確立された方法は、放射線検出、蛍光検出、あるいは電気化学的検出をともなう高速液体クロマトグラフィーによるものである。蛍光偏向イムノアッセイ（FPIA；Abbott Laboratories）のみならずエンザイムイムノアッセイ（EIA）（Bio-Rad Laboratories；Axis-Shield A/S）もまた開発されており、このイムノアッセイ法は、ジチオスレイトール及びアデノシンによる試料の前処置、次いで酵素的な工程によるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインの形成、そして、例えばモノクローナル抗Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン抗体を用いる総ホモシステインの測定を含むものである、例えば米国特許5,631,127号参照。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
３．ビタミンＢ１２の測定
本発明により、診断方法には、血清試料中のビタミンＢ１２濃度を随時測定する方法も含まれる。ビタミンＢ１２（コバラミン）濃度は、この目的で自体既知の方法のいずれによっても測定され得る。この既知の方法は、成長にコバラミンを必要とするEuglena gracilisあるいはLactobacillus leichmanniiのような生物体を用いる血清ビタミンＢ１２の微生物学的アッセイを包含する。ビタミンＢ１２の放射性同位体希釈アッセイもまた利用されており、このアッセイ技術は、例えば、Lau他、「Measurement of serum B12 levels using Radioisotope Dilution and Coated Charcoal」、Blood、26(1965)、202の文献中に詳細に記載されている。結合性タンパクが、生物学的に活性なコバラミンに特異的であれば、この放射性同位体希釈方法は、より迅速で、例えばEuglenaアッセイの結果と同等の結果を提示する。標準化された純粋な、あるいは精製された内因子調製物が、コバラミン類似物ではなくて真のコバラミンに特異的に結合するので、結合性タンパクとして最も満足できるものである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
このＢ１２の放射性同位体希釈アッセイは、一般的には、例えば選択されたｐＨで煮沸し、次いで一定量の放射性同位体５７Ｃｏ−Ｂ１２及び特定量の結合性タンパクを添加することにより、天然の結合性タンパクから内因性のＢ１２を遊離する工程を包含する。添加されたＢ１２の放射性同位体量は少量のタンパクが結合するには十分な量であるので、すべての結合タンパクは、いずれかの形態のＢ１２に結合される。天然のＢ１２と放射活性化Ｂ１２との双方が、競合して結合タンパクと結合するので、タンパクが結合したＢ１２の放射カウントが阻害された程度が、試料中のＢ１２の量を示すことになる。この方法は、上記Lauによって修正され、活性炭にコーティングしたタンパクによってタンパクが結合したＢ１２から結合していないＢ１２を分離し、結合している放射性Ｂ１２と結合している非放射活性Ｂ１２の混合物を含有する上清液の放射活性を、放射活性としてカウントする。血清Ｂ１２濃度は、このようにして得られたカウントを通常は標準チャートと比較して、算出されることになる。本方法を実施するためのラジオアッセイキットは、市販されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
我々の最近の未公表の研究によって、血清ビタミンＢ１２濃度が基準値の下限よりも低い（＜１７０ pmol/l）胃底腺萎縮を患っている対象（ＳＰＧＩ＜２５μg/l）の５０％は、著しく血清ホモシステイン濃度が上昇していることが判明した（平均３３.３μmol/l、１６〜１５７μmol/l）。更に血清ビタミンＢ１２濃度が１８０〜２３０ pmol/lの間（基準値は１７０〜７００ pmol/l）である対象の２２％はまた、ホモシステイン濃度が上昇していた（平均１８.９μmol/l、１６〜２５μmol/l）。