【手続補正書】
【提出日】平成19年1月23日(2007.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明によれば、哺乳動物の身体においてアポトーシスを刺激する働きをする治療薬の有効性を評価するための方法が提供される。この方法は、
腫瘍細胞が見られる身体組織、または該治療薬で処置する哺乳類からの体液のサンプルを得ること、ここで、該組織または体液はカスパーゼ３の１７ｋＤａ断片を含み得、この断片はin vivoにおけるカスパーゼ３の特異的切断によって得られたものである；
該カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の存在量を測定すべく該サンプルをアッセイすること；
該治療薬を該哺乳類に投与すること；
該哺乳類から、該身体組織または体液の第二のサンプルを得ること；および
該切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の存在量を測定すべく該第二のサンプルをアッセイすること
を含み、該第一のサンプルで測定された量に対する、該第二のサンプルで測定された該１７ｋＤａ断片の量の増加が、該治療薬によるアポトーシス刺激および該治療薬の有効性に相関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
図面の簡単な説明
図１はＰ３０およびＰ６カラムで精製したマウス血漿由来の１７ｋＤａ切断カスパーゼ３サブユニットを示す。
図２はＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３の静注後のＰａｎｃ−１異種移植片における外因性ｗｔｐ５３の発現および１７ｋＤａカスパーゼ３サブユニットの発現を示す。
図３はＰａｎｃ−１異種移植片における、葉酸−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体静注後の経時的な１７ｋＤａカスパーゼ３サブユニットの発現を示す。図中、ＵＴ＝対照として用いた非処置動物；Ｆｐｐ５３＝葉酸−リポソームＡ−ｐ５３複合体；およびＦｐＶｅｃ＝エンプティーベクターを有する葉酸−リポソームＡ複合体。
図４はトランスフェリン−リポソームＡ−ｐ５３複合体およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）で処置した後のＤＵ１４５担癌マウスから抽出した血液細胞ペレットにおける１７ｋＤａタンパク質の存在を示す。
図５はトランスフェリン−リポソームＡ−ｐ５３を含む複合体とシスプラチンの組合せで処置した後の、ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍を持つ、または持たないマウス由来の血清における、カスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
図６はＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２の複合体で処置した後のＰＡＮＣ−１細胞におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の複合体で処置した、かかる細胞と比較して示す。
図７はＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２複合体とジェムザール(Gemzar)（登録商標）の組合せで処置した後の、ＰＡＮＣ−１細胞におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、非処置細胞と、また、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ＡＳＨＥＲ−２複合体単独、またはＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２複合体とジェムザール（登録商標）の組合せのいずれかで処置したものと比較して示す。
図８はＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２の複合体とジェムザール（登録商標）の組合せの静脈投与後のＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍担持マウス由来の血漿におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、非処置動物と、また、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体単独またはＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の複合体とジェムザール（登録商標）の組合せのいずれかで処置したものと比較して示す。
図９Ａおよび９Ｂは、各々、ＰＡＮＣ−１およびＣＯＬＯ３５７細胞のトランスフェクション８時間後の、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２単独による、またはジェムザール（登録商標）との組合せによるアポトーシス経路におけるタンパク質発現のin vitro抑制的調節を示す。両細胞種ともカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在の明瞭な結果を示した。これらの結果は、非処置細胞の結果およびジェムザール（登録商標）単独またはジェムザール（登録商標）とＴＦＲｓｖＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の組合せで処置した細胞の結果と対照的である。
図１０はＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２単独による、またはＰＡＮＣ−１細胞のジェムザール（登録商標）１６時間後トランスフェクションの組合せによるアポトーシス経路におけるタンパク質発現のin vitro抑制的調節を示す。対照は図９Ａおよび９Ｂと同じである。
図１１は皮下ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍を担持するヌードマウスへの、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−アンチセンスＨＥＲ−２複合体単独またはジェムザール（登録商標）と組み合わせた静脈送達後の腫瘍細胞におけるアンチセンスＨＥＲ−２作用の局在を示す。１７ｋＤａサブユニットの存在を示す矢印は、肝細胞または肺細胞サンプルのいずれにも存在しない腫瘍における中央のバンドを指している。
図１２はＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍におけるＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せ処置のin vivo作用を、非処置腫瘍、またはジェムザール（登録商標）単独、複合体単独もしくはジェムザール（登録商標）とＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム  Ａ−スクランブルＨＥＲ−２ａ複合体の組合せで処置した腫瘍と比較して示すグラフである。
図１３はＲＢ９４腫瘍抑制遺伝子で全身処置した後のマウス血漿におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
図１４は化学療法後のヒト乳癌患者の血清におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
健康な細胞では、カスパーゼはミトコンドリアおよびサイトゾルに不活性型のプロ酵素として存在する(Mancini, M., et al., J. Cell Biol. 140: 1485-1495 (1998))。アポトーシスシグナルは２つの腫瘍経路：ミトコンドリアに付随する内因的経路と腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの細胞死受容体が介在する外因的経路に沿って伝達される。このカスケードはいくつかの異なる種類の刺激によって誘発される(Mathiasen and Jaeaettelae, Trends in Molecular Medicine 8:212-20 (2002))。放射線照射および化学療法薬など、ＤＮＡに傷害を起こす因子はｐ５３を活性化し、これは両アポトーシス経路を刺激し得る。重要なこととしては、両経路の遂行にはカスパーゼ３の活性化が必要であるということである。従って、カスパーゼ３により誘導されるタンパク質分解は実質上、全ての細胞アポトーシス経路において重要な事象であることが示されている。現在のデータは全て、アポトーシスの欠陥が癌の前提条件であることを示唆している(Jaeaettelae, M., Exp. Cell Research 248:30-43 (1999); Evans, G. and Vousden,K., Nature 411:342-348 (2001))。ＨＥＲ−２のような癌タンパク質の調節されない活性化、またはｐ５３のような腫瘍抑制タンパク質の不活性化によって誘導される細胞増殖シグナルはカスパーゼの活性化を誘導し、アポトーシスを増加させるはずである。しかし、ヒト腫瘍はアポトーシス遺伝子（例えば、ｐ５３）の突然変異（それらの不活性化を招く）を含み、かつ／または抗アポトーシスタンパク質(例えば、ＨＥＲ−２)の発現／活性化(Mathiason and Jaeaettelae TRENDS in Mol. Med. 8:212-220 (2002))が増強されており、その結果、腫瘍細胞の治療モダリティーに対する応答能の低下または不活性化に至っている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
典型的には、腫瘍サンプルまたは体液サンプル中の１７ｋＤａサブユニットの量の測定は、薬剤の性質にもよるが、投与から約３０分〜５日後、好ましくは投与から約８時間〜７２時間後に行うことができる。例えば、ＨＥＲ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療薬の投与の結果、比較的迅速にアポトーシスが起こるが、ｗｔｐ５３遺伝子を含む治療薬では効果が出るまでにもっと時間がかかる。処置が数日または数週間にわたる多数回処置である場合には、最初の処置から３０分〜５日後、各処置後、または最後の処置の後のサブユニットの量を測定することができる。処置が有効であれば、アポトーシスの量、従って、産生した１７ｋＤａサブユニットの量が経時的に上昇を続ける。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
特定の好ましい治療薬処置において、治療組成物はｐ５３、ＲＢもしくはＲＢ９４、またはアンチセンス（ＡＳ）ＨＥＲ−２オリゴヌクレオチドのいずれかをコードする核酸を含む。アポトーシス経路はｐ５３、ＲＢまたはＲＢ９４によって誘導されることが知られており、また、今般、これはＡＳ  ＨＥＲ−２処置によっても誘導されることが分かった。そのＰ１３Ｋ／Ａｋｔ経路との相互作用を通じ、ＨＥＲ−２はアポトーシスに作用することができ、かつ、アンチセンスＨＥＲ−２オリゴの投与後のＨＥＲ−２の抑制的調節は、カスパーゼ３の切断を誘導することが示された。リガンド−リポソーム−アンチセンスＨＥＲ−２複合体の一例としてＴｆＲｓｃＦｖ−ｌｉｐＡ−ＡＳＨＥＲ−２複合体があり、ここで、ＴｆＲｓｃＦｖは、トランスフェリン受容体と結合するモノクローナル抗体の単鎖Ｆｖフラグメントを表し、ＬｉｐＡは、１：１比のジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＤＯＴＡＰ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオンリポソームを表す。この複合体および類似の複合体が、出典明示により本明細書の一部とする米国特許出願出願番号０９／９１４，０４６に詳しく記載されている。リガンド−カチオンリポソーム−ｐ５３複合体の例は、出典明示により本明細書の一部とする米国特許出願出願番号０９／６０１，４４４に詳しく記載されており、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ：コレステロール、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）：ＤＯＰＥ、ＤＤＡＢ：コレステロールまたはＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ：コレステロールが挙げられる。以下の実施例で示すように、ｗｔｐ５３、ＲＢ９４またはＡＳＨＥＲ−２による処置とアポトーシスマーカーとしての１７ｋＤａサブユニットの存在との間には明らかな相関がある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
実施例１
細胞培養物および組織からタンパク質を単離する方法
Ａ．細胞培養物において１７ｋＤａ活性型カスパーゼ３断片の存在を検出するため、次の実施例で下記の手順を用いて、生細胞および浮遊している死細胞の双方から全タンパク質を単離した。細胞培養容器からの培地を除去し、保存した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
Ｂ．次の実施例の実験では、腫瘍または他のいずれかの動物器官／組織から全タンパク質を単離するために以下の手順を用いた。安楽死の後、組織を速やかに動物から切り出し、過剰量冷ＰＢＳで１〜３回すすぎ、清潔な無菌器具を用いて氷上に維持しながら、組織を刻んだ。刻んだ組織を１以上の、予め秤量した無菌のポリプロピレンチューブに入れ、すぐに液体窒素中に浸漬することで急速凍結させた。凍結組織は、タンパク質を単離するまで、−７０℃〜−８０℃に維持した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
サンプルの調製：
１０μｌのヒト血清（Ｐ−３０またはＰ−６精製後のもの）を４×サンプルバッファー(Invitrogen)および同溶液で１×サンプルバッファーとなるように希釈し、このカラム後サンプルを全量２４μｌ（１ｍｍコームの場合）および３６μｌ（１．５ｍｍコームの場合）とする。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤（安定化した液体形態中で０．５Ｍ  ＤＴＴ）を加えて最終サンプル量の１０％とした後すぐにこの溶液を５−１５分間、好ましくは１０分間、６５〜７５℃（好ましくは、７０℃）で加熱し、このサンプルをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上に載せる。ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動バッファーを用い、ゲル当たり１００〜２００の一定のボルト数および７０〜１２５ｍＡでゲルの泳動を行う。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
転写、免疫ブロット法および検出は上記のように行う。
サンプルバッファー
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー
（４×）１０ｍｌ
グリセロール                    ４．００ｇ
Ｔｒｉｓ塩基                    ０．６８２ｇ
ＴｒｉｓＨＣｌ                  ０．６６６ｇ
ＬＤＳ                          ０．８００ｇ
ＥＤＴＡ                        ０．００６ｇ
Ｓｅｒｖａ  Ｂｌｕｅ  Ｇ２５０  ０．７５ｍｌ（１％溶液）
フェノールレッド                ０．２５ｍｌ（１％溶液）
超純水                          １０ｍｌまで
１×バッファーはｐＨ８．５としなければならない。
ｐＨ調整には酸も塩基も用いてはならない。
ＬＤＳ＝ドデシル硫酸リチウム
還元条件：
以下のように、２０×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファー（ＭＥＳ）を希釈し、１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファーを調製する。
十分混合する。
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファー（ＭＥＳ）（２０×）  ５０ｍｌ
超純水                                                          ９５０ｍｌ
下層（外部）バッファーチャンバーで用いるための１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファー８００ｍｌをとっておく。約６００ｍｌの１×泳動バッファーで下層バッファーチャンバーに満たす。泳動直前に、２００ｍｌの１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ泳動バッファー当たり５００μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤を加えることで、上層（内部）バッファーチャンバー用の残りの２００ｍｌを調製する。十分混合する。
ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動バッファー：
（２０×）５００ｍｌ
ＭＥＳ                                                ９７．６ｇ（１．００Ｍ）
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸Ｔｒｉｓ塩基    ６０．６ｇ（１．００Ｍ）
ＳＤＳ                                                １０．０ｇ（６９．３ｍＭ）
ＥＤＴＡ                                                ３．０ｇ（２０．５ｍＭ）
超純水                                                ５００ｍｌまで
１×バッファーはｐＨ７．３でなければならない。ｐＨ調整には酸も塩基も用いてはならない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
この膜を一次抗体中でインキュベートする。使用する一次抗体はCell Signaling Technology (Beverly, MA)（カタログ番号９６６１１５）製の切断カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５）に対するウサギポリクローナル抗体を、好ましくは４℃で一晩、穏やかに揺動させた５〜５０ｍｌ溶液／５０ｃｍ２膜、好ましくは１０〜３０ｍｌ／５０ｃｍ２量のＴＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）の粉乳にて１：５００〜１：２０００、好ましくは１：１０００希釈したものである。あるいは、同じ希釈率のこの一次抗体を穏やかに揺動させながら室温（２０−２７℃）で２〜３時間インキュベートしてもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
実施例５
膵臓腫瘍および肝臓における切断カスパーゼ３  １７ｋＤａタンパク質の検出
１つの治療薬として、出典明示により本明細書の一部とする米国特許出願出願番号０９／９１４，０４６に詳細に記載されているＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体を用いた。ヒト膵臓癌（ＰＡＮＣ−１）皮下異種移植片腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスにＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３を２４時間で３回静注した。各注射で複合体は全量８００μｌ／マウス中に４０μｇのｐ５３プラスミドＤＮＡを含んだ。最後の注射から６０時間後、動物を安楽死させ、腫瘍および肝臓を摘出し、実施例１、３および４と同様にウエスタン分析用にタンパク質を単離した。非処置動物の腫瘍および肝臓からのタンパク質も対照として含めた。次に、この膜を負荷量が等しいかどうかを調べるため、アクチンに特異的な市販の抗体でプローブした。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
図２はＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体を静注したマウスのＰＡＮＣ−１腫瘍に主要な外因性ｗｔｐ５３の発現を示す。また、同じウエスタンブロットを、１７ｋＤａ断片の存在に関してプローブする目的でも用いた。図３の一番下のレーンに示されているように、腫瘍ではこの１７ｋＤａマーカータンパク質の存在下で実質的増強が見られるが、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体で処置した後の肝臓では低レベルの痕跡しか見られず、このことはｗｔｐ５３機能の回復が特に腫瘍においてアポトーシスの誘導をもたらすことを示している。外因性の野生型（ｗｔ）ｐ５３の発現と１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の発現との間には明らかな相関があった。このパネルの上のバンドは１７ｋＤａサブユニットの１９ｋＤａ前駆体を示している。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
実施例７
切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の発現が治療に対する腫瘍応答に関連していることの証明
実施例６の結果は、Ｔｆ−ＬｉｐＡ−ｐ５３およびＣＤＤＰでの全身処置から６０時間後のＤＵ１４５腫瘍担持マウスから抽出した血液細胞ペレットにおける１７ｋＤａタンパク質の存在を示す。正常なリンパ球はｐ５３により誘導されるアポトーシスに感受性がある。従って、血中における１７ｋＤａ断片の出現が本当に腫瘍と関連しているかどうかを調べるために評価を行った。実施例６で記載したＤＵ１４５腫瘍担持マウスに施したものと同じ処置を、ＰＡＮＣ−１皮下異種移植片腫瘍存在を有する、または有さないマウスに繰り返した。さらに、この試験では、血液細胞の存在による複雑化を避けるために血清の使用を試してみた。血清を用いるので、負荷量が等しいかどうかを評価するためにハウスキーピング遺伝子を用いることはできないが、各レーンに等量を負荷した。実施例２に記載したようにヘパリンを用いずに全血１ｍｌから血清を単離し、実施例３および４に記載したようにウエスタン分析を行った。図５に示すように、１７ｋＤａ断片は担癌動物で、さらには担癌動物のみに強く発現した。よって、このバンドの存在はｗｔｐ５３／ＣＤＤＰ治療に対する腫瘍応答と明らかに関連している。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
実施例８
アポトーシス指標としてのカスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の検出：in vitroでのＡＳ−ＨＥＲ−２  ＯＤＮ処置後
本発明のさらなる特定の実施形態では、切断１７ｋＤａサブユニットがアンチセンス（ＡＳ）ＨＥＲ−２による治療の有効性を証明する手段として腫瘍および／または血液で検出できること、すなわち、アポトーシス経路がＡＳＨＥＲ−２処置によって誘導されることが証明された。（用いたアンチセンスＨＥＲ−２オリゴヌクレオチドは、出典明示によりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第６，０２７，８９号および米国出願出願番号０９，７１６，３２０に記載されているものである）。そのＰ１３Ｋ／Ａｋｔ経路ＨＥＲ−２との相互作用によりアポトーシスに影響を及ぼし得ることが示されている。従って、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳＨＥＲ−２複合体を介したＨＥＲ−２の抑制的調節はカスパーゼ３の切断を誘導するものと思われた。１７ｋＤａ断片に対する市販(Cell Signaling Technology)の抗体を用い、実施例３および４のようにウエスタン分析によりその発現を検出した。タンパク質溶解物は実施例１で記載した手順を用いて得た。トランスフェクション２４時間後、ＡＳＨＥＲ−２またはスクランブル（ＳＣ）ＨＥＲ−２  ＯＤＮのいずれかを有するＴｆＲｓｃＦｖ−ｌｉｐＡ複合体で処置した細胞からのタンパク質は実施例１で記載したように単離した。スクランブルＨＥＲ−２  ＯＤＮは、順序は無作為であるが、アンチセンス分子と同様のヌクレオチド組成を有する。ある実施形態では、ＡＳ−ＨＥＲ−２  ＯＤＮは、ヒトＨＥＲ−２遺伝子をコードする遺伝子センス鎖と開始コドンが相同な、ヌクレオチド１５個のＤＮＡ片である。Ｔ７５フラスコに１．２×１０６のＰＡＮＣ−１細胞を播種し、２４時間後、０．５μＭのＡＳ  ＨＥＲ−２またはスクランブル（ＳＣ）ＯＤＮを含有するＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ複合体でトランスフェクトした。実施例１で記載したようにウエスタン分析用にタンパク質を単離した。４〜２０％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルの各レーン当たりの負荷量は４０μｇであった。ニトロセルロース膜に転写した後、ブロットを、実施例３および４のように、カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片に特異的な市販のＡｂおよび負荷量が等しいかどうかを調べるためのアクチンでプローブした。１７ｋＤａより上のバンドは１７ｋＤａサブユニットの１９ｋＤａ前駆体を示す。図６に示すように、カスパーゼ３  １７ｋＤａ断片の誘導は明白であり、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２処置後にアポトーシス経路が刺激されることを示している。非処置またはＳＣ  ＨＥＲ−２  ＯＤＮ処置細胞ではいずれもこのバンドは明でなく、このことは明らかなＡＳ  ＨＥＲ−２特異的作用であることを示している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
実施例１０
シグナル変換経路のin vitro抑制的調節におけるＡＳ  ＨＥＲ−２に関する切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の発現
腫瘍を標的とするＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体での膵臓癌（ＰａｎＣａ）の処置はＨＥＲ−２の発現（過剰発現でない場合でも）をダウンレギュレーションすることができ、従って、細胞の増殖／生存に負の作用をし、腫瘍細胞の死滅の増強に導くアポトーシス経路を積極的に促進する。ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム複合体を介したＨＥＲ−２のダウンレギュレーションが下流のシグナル伝達経路に影響を及ぼし得ることを証明するため、ＰａｎＣａ細胞系統ＰＡＮＣ−１およびＣＯＬＯ３５７においてこの複合体の、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路およびアポトーシスの成分に作用する能力をウエスタン分析により評価した。これら２つの細胞系統はＨＥＲ−２発現のレベルが異なり、ＣＯＬＯ３５７はＰＡＮＣ−１より有意に高いＨＥＲ−２レベルを発現することから選択した。開始コドン領域（５’−ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＡＣＴ−３’）に相補的なホスホロチオエート配列特異的ＡＳ  ＨＥＲ−２と、対照としての非配列特異的ＳＣ（５’−ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ−３’）ＯＤＮを合成し、Ransom Hill Biosciences (Ramona, CA)による逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対してＡＳおよびＳＣ配列をスクリーニングしたところ、ＡＳ  ＯＤＮはＨＥＲ−２に対してのみ相同性を有していたが、ＳＣ  ＯＤＮとデータベース中の配列には相同性はなかったことが示された。ＰＡＮＣ−１またはＣＯＬＯ  ３５７細胞を６穴プレートに播種し、２４時間後に、１μＭ（ＰＡＮＣ−１の場合）または０．５μＭ（ＣＯＬＯ  ３５７の場合）のＡＳ  ＨＥＲ−２またはＳＣＨＥＲ−２ＯＤＮ（陰性対照）を有するＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ複合体でトランスフェクトした。オリゴ単独、または相乗作用を見出すために、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））との組合せで細胞をトランスフェクトした。示された時間に細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファー中で溶解させ、タンパク質を測定し、４〜２０％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で泳動させ（全タンパク質６０μｇ／レーン）、実施例１、３および４で記載したようにウエスタン分析のためにするニトロセルロースに転写した。ＨＥＲ−タンパク質の発現を検出するため、膜を抗ヒトＨＥＲ−２／Ｎｅｕ（Ｃ−１８）ウサギポリクローナルＡｂ(Santa Cruz Biotechnolog)でプローブし、ＥＣＬ(Amersham)によりシグナルを検出した。非処置細胞に比べた場合のタンパク質発現の変化を、全および／またはリン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ  ４７３）、ＰＩ３Ｋ経路における中枢的成分（抗ヒトポリクローナルＡｂ， Cell Signaling Technologyを使用）、リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ  １３６）、アポトーシスの調節に重要な因子（抗ヒトウサギポリクローナル抗体，Cell Signaling Technologyを使用）、ならびに切断カスパーゼ３（Ａｓｐ  １７５）（１７ｋＤａサブユニットに特異的なウサギポリクローナル抗体，Cell Signaling Technologyを使用）およびＰＡＲＰ／切断ＰＡＲＰ（ポリＡＤＰリボポリメラーゼ、アポトーシスのもう１つのマーカー）（抗ヒトウサギポリクローナル抗体，Cell Signaling Technology使用）（両者ともアポトーシスの下流指標）に関しても確認した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
実施例１２
ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ−ＨＥＲ−２によるＰａｎＣａ異種移植片腫瘍のin vivo化学増感
上記のin vitro研究では、ＰａｎＣａ細胞のＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体での処置はそれらのジェムザール（登録商標）応答を高めることが示されている。この遺伝子療法送達系がヒト癌、例えばＰａｎＣａにとって臨床上信頼できるものとなるためには、in vitroで見られた増感の上昇をin  vivoモデルへと翻訳しなければならない。in vivoＰａｎＣａの処置におけるＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２の有効性は、皮下ＰＡＮＣ−１異種移植片マウスモデルを用いて評価した。約５０ｍｍ３の皮下異種移植片腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウス（５〜９個体／１個体当たり２つの腫瘍を有する群）を、ＯＤＮを含有するＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体９ｍｇ／ｋｇ／注射で１週間に３回処置した。対照としてある動物群には、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２単独、またはジェムザール（登録商標）と、ＳＣ  ＯＤＮを有する複合体との組合せを施した。ジェムザール（登録商標）は、６０ｍｇ／ｋｇを１週間に２回腹腔内投与した。動物には全部で、複合体の静注１８回とジェムザール（登録商標）１２回を施した。図１２に示されるように、ジェムザール（登録商標）単独は腫瘍の増殖に最小の作用だけを示したが、ＡＳ  ＨＥＲ−２単独では効果はなかった。ジェムザール（登録商標）単独または対照ＳＣ  ＯＤＮおよびジェムザール（登録商標）を施した群は統計学的に差がなく、このことはＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＳＣ  ＯＤＮおよびジェムザール（登録商標）による増殖阻害が厳密に薬物の作用であることを示している。しかしながら、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せを施したマウスにおいて腫瘍増殖は実質的に阻害された。併用療法およびジェムザール（登録商標）単独またはＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２単独を施した群の間の差は統計学的に極めて有意である（スチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１）。よって、ＡＳ  ＨＥＲ−２を有する複合体の、ジェムザール（登録商標）と組み合わせた静脈投与はＰａｎＣａに対して有効である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
また、動物の体重も毒性の指標としてモニタリングした。体重の低下は見られず、いずれの処置群の間にも有意差はなかった。よって、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２は著しい非特異的細胞傷害性を持たないことが明らかである。従って、この研究は、全身送達された、腫瘍を標的とするリポソームＡＳ  ＨＥＲ−２複合体は、１７ｋＤａ切断カスパーゼ３断片の発現によって実証されるようなアポトーシスの誘導により、ＰａｎＣａ腫瘍を化学療法薬に対して増感させ得ることを明らかに示し、より有効な処置法をもたらす。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
多種のヒト癌において野生型ＲＢを用いた遺伝子置換療法がin vitroおよびin vivoでそれらの腫瘍形成性を抑制または軽減することができた。ＲＢ９４は末端切断型のＲＢであり、全長タンパク質のＮＨ２末端において１１２のアミノ酸残基を欠いており、腫瘍増殖の抑制において全長ＲＢよりもいっそう高い効力がある。ＲＢ９４タンパク質は全長ＲＢよりも長期低リン酸化状態に留まることが分かっている。それは細胞増殖の抑制を担う非リン酸化型または低リン酸化型であることから、これによりＰＢ９４の高い効力を見込める可能性がある。また、このＮ末端切断型ＲＢタンパク質はまた、アポトーシス／生存の細胞制御にも寄与することができることも示唆されている(Tomei, L.D. in Apoptosis: the Molcular Basis of Cell Death, pp 279-316, 1991)。よって、in vivoにおけるＲＢ９４の腫瘍細胞への送達および発現の結果、アポトーシスが誘導できる。ＲＢ９４で処置した担癌マウスの血漿における切断カスパーゼ３の１７ｋＤａ断片の検出は進行中のアポトーシスの指標となる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
【図１】Ｐ３０およびＰ６カラムで精製したマウス血漿由来の１７ｋＤａ切断カスパーゼ３サブユニットを示す。
【図２】ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−ｐ５３の静注後のＰａｎｃ−１異種移植片における外因性ｗｔｐ５３の発現および１７ｋＤａカスパーゼ３サブユニットの発現を示す。
【図３】Ｐａｎｃ−１異種移植片における、葉酸−ＬｉｐＡ−ｐ５３複合体静注後の経時的な１７ｋＤａカスパーゼ３サブユニットの発現を示す。図中、ＵＴ＝対照として用いた非処置動物；Ｆｐｐ５３＝葉酸−リポソームＡ−ｐ５３複合体；およびＦｐＶｅｃ＝エンプティーベクターを有する葉酸−リポソームＡ複合体。
【図４】トランスフェリン−リポソームＡ−ｐ５３複合体およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）で処置した後のＤＵ１４５担癌マウスから抽出した血液細胞ペレットにおける１７ｋＤａタンパク質の存在を示す。
【図５】トランスフェリン−リポソームＡ−ｐ５３を含む複合体とシスプラチンの組合せで処置した後の、ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍を持つ、または持たないマウス由来の血清における、カスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
【図６】ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２の複合体で処置した後のＰＡＮＣ−１細胞におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の複合体で処置した、かかる細胞と比較して示す。
【図７】ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２複合体とジェムザール(Gemzar)（登録商標）の組合せで処置した後の、ＰＡＮＣ−１細胞におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、非処置細胞と、また、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ＡＳＨＥＲ−２複合体単独、またはＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２複合体とジェムザール（登録商標）の組合せのいずれかで処置したものと比較して示す。
【図８】ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２の複合体とジェムザール（登録商標）の組合せの静脈投与後のＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍担持マウス由来の血漿におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を、非処置動物と、また、ジェムザール（登録商標）単独、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−ＡＳ  ＨＥＲ−２複合体単独またはＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の複合体とジェムザール（登録商標）の組合せのいずれかで処置したものと比較して示す。
【図９】各々、ＰＡＮＣ−１およびＣＯＬＯ３５７細胞のトランスフェクション８時間後の、ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２単独による、またはジェムザール（登録商標）との組合せによるアポトーシス経路におけるタンパク質発現のin vitro抑制的調節を示す。両細胞種ともカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在の明瞭な結果を示した。これらの結果は、非処置細胞の結果およびジェムザール（登録商標）単独またはジェムザール（登録商標）とＴＦＲｓｖＦｖ−リポソームＡ−スクランブルＨＥＲ−２の組合せで処置した細胞の結果と対照的である。
【図１０】ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２単独による、またはＰＡＮＣ−１細胞のジェムザール（登録商標）１６時間後トランスフェクションの組合せによるアポトーシス経路におけるタンパク質発現のin vitro抑制的調節を示す。対照は図９Ａおよび９Ｂと同じである。
【図１１】皮下ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍を担持するヌードマウスへの、ＴｆＲｓｃＦｖ−ＬｉｐＡ−アンチセンスＨＥＲ−２複合体単独またはジェムザール（登録商標）と組み合わせた静脈送達後の腫瘍細胞におけるアンチセンスＨＥＲ−２作用の局在を示す。１７ｋＤａサブユニットの存在を示す矢印は、肝細胞または肺細胞サンプルのいずれにも存在しない腫瘍における中央のバンドを指している。
【図１２】ＰＡＮＣ−１異種移植片腫瘍におけるＴｆＲｓｃＦｖ−リポソームＡ−アンチセンスＨＥＲ−２とジェムザール（登録商標）の組合せ処置のin vivo作用を、非処置腫瘍、またはジェムザール（登録商標）単独、複合体単独もしくはジェムザール（登録商標）とＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム  Ａ−スクランブルＨＥＲ−２ａ複合体の組合せで処置した腫瘍と比較して示すグラフである。
【図１３】ＲＢ９４腫瘍抑制遺伝子で全身処置した後のマウス血漿におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。
【図１４】化学療法後のヒト乳癌患者の血清におけるカスパーゼ３の１７ｋＤａサブユニットの存在を示す。