【手続補正書】
【提出日】平成18年12月22日(2006.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
物質の組成に関する局面において、本発明は、受容体拮抗ドメインおよび正の免疫調節物質ドメインを含むタンパク質に実質的に関する。本発明はさらに、受容体拮抗ドメインはアポトーシス促進ドメインであってよく、正の免疫調節物質ドメインはインターロイキンであってよいことをさらに提供する。受容体拮抗ドメインはまた、配列番号：３４のアミノ酸配列またはその保存的変異体でありうる。
2004504272.tif 000001
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
一つの好ましい態様において、配列番号：３４に示すように、この構造的欠陥は、hPRLにおける129位に対応する位置の、グリシンのアルギニンへの置換である（hPRL-G129Rと呼ぶ）。実施例4、5、および6に示す細胞に基づくアッセイ法と共に、図3および4は、この変異したhPRLが真のhPRLR拮抗剤として作用することを証明する。したがって、hPRL-G129Rのような受容体拮抗ドメインは、特定の型の癌を治療するための治療的薬剤として役立ちうる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
以下の表は、hPRLA-IL2融合タンパク質の生物活性を調べるために、同系マウスおよび腫瘍細胞を用いる実験計画を示す。
2004504272.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の双機能分子の略図である。（A）ライスフェルドら（Reisfeld、1996）による先の研究において提唱されている、mAb-IL-2融合タンパク質、および（B）本発明に従うhPRLA-IL-2融合タンパク質。
【図２】  本発明の双機能融合タンパク質に関して提唱される作用機序の略図である。乳癌細胞によって産生されるPRLは、融合タンパク質（PRLA）が占有していることからPRLRに達することができない。同時に、融合タンパク質のIL-2部分が抗腫瘍T細胞反応を刺激する。
【図３】  共培養法を用いた、T-47Dヒト乳癌細胞におけるhPR1-G129Rの用量依存的な阻害作用、およびhPRLの刺激作用を示す。x軸は共培養したL細胞（対照）、L-PRLまたはL-hPRL-G129R細胞数を表す。各データポイントは、少なくとも3回の、3通のウェルでの独立した実験の平均値を表す。
【図４】  T-47Dヒト乳癌細胞増殖アッセイにおけるhPRL-G129Rの用量依存的な阻害作用、および4-OH-タモキシフェンとの相加作用を示す。x軸は、4-OH-タモキシフェンの非存在下（白いバー）または存在下の、いずれかでのhPRL-G129R濃度を表す。各データポイントは、少なくとも3回の、3通のウェルでの独立した実験の平均値を表す。
【図５】  pUCIG-MT-hPRL-IL-2融合タンパク質cDNAの、発現プラスミドのクローニングおよび構築の略図である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING                               
<110> GREENVILLE HOSPITAL SYSTEM
<120> BI-FUNCTIONAL CANCER TREATMENT AGENTS
<130> LF-A0215
<140> JP 2001-569368      
<141> 2001-03-23
<150> US 60/191,457
<151> 2000-03-23
<160> 35                            
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Asn Ile Lys Gly Ser Pro Trp Lys Gly Ser Leu Leu Leu Leu Leu  
1               5                  10                  15    
Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Ser Val Ala Pro Leu Pro Ile Cys  
20                  25                  30        
Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg Asp Leu Phe Asp  
35                  40                  45            
Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu Ser Ser Glu Met  
50                  55                  60                
Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg Gly Phe Ile Thr  
65                  70                  75                  80
Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala Thr Pro Glu Asp  
85                  90                  95    
Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe Leu Ser Leu Ile  
100                 105                 110        
Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr His Leu Val Thr  
115                 120                 125            
Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile Leu Ser Lys Ala  
130                 135                 140                
Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Leu  
145                 150                 155                 160
Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn Glu Ile Tyr Pro  
165                 170                 175    
Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp Glu Glu Ser Arg  
180                 185                 190        
Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg Arg Asp Ser His  
195                 200                 205            
Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg Ile Ile His Asn  
210                 215                 220                
Asn Asn Cys                                                      
225        
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Arg Gly Met Glu Leu Ile Val  
1               5                  10                  15    
Ser Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 3
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Ile Glu Lys Ile Ile  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Ala Tyr Pro                                              
20    
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 4
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Gln Leu Leu Glu Gly Val Glu Lys Ile Ile  
1               5                  10                  15    
Ser Gln Ala Tyr Pro                                              
20    
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> Cricetus sp.
<400> 5
Ile Gly Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Ile Glu Lys Ile Leu  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Ala Tyr Pro                                              
20    
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> Cetacea sp.
<400> 6
Glu Glu Glu Glu Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> Mustela sp.
<400> 7
Ile Glu Glu Glu Asn Arg Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 8
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Ile Glu Gly Met Glu Met Ile Phe  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val Ile Pro                                              
20    
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> Ovis sp.
<400> 9
Glu Glu Glu Glu Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Asn Ile Phe  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val Ile Pro                                              
20    
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> Porcine sp.
<400> 10
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> Camelus sp.
<400> 11
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 12
Glu Ile Glu Gln Asn Arg Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val Gln Pro                                              
20    
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> Elephantus sp.
<400> 13
Val Lys Glu Glu Asn Gln Arg Leu Leu Glu Gly Ile Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Asp Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> Unknown Organism
<220> 
<223> Description of Unknown Organism: Ancestral mammal
<400> 14
Ile Glu Glu Glu Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> Gallus sp.
<400> 15
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Arg Val His Ser                                              
20    
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> Meleagris gallopavo
<400> 16
Ile Glu Glu Gln Asp Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Arg Ile His Ser                                              
20    
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> Chelonia sp.
<400> 17
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> Crocodilus sp.
<400> 18
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Ile  
1               5                  10                  15    
Gly Arg Val Gln Pro                                              
20    
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> Lacerta sp.
<400> 19
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Val Ile  
1               5                  10                  15    
Gly Arg Val Gln Pro                                              
20    
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> Unknown Organism
<220> 
<223> Description of Unknown Organism: Ancestral amniote
<400> 20
Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Gln Val His Pro                                              
20    
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> Xenopus sp.
<400> 21
Val Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Lys Ile Val  
1               5                  10                  15    
Gly Arg Ile His Pro                                              
20    
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> Rana catesbeiana
<400> 22
Val Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu Gly Met Glu Arg Ile Ile  
1               5                  10                  15    
Gly Arg Ile Gln Pro                                              
20    
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> Dipnoi sp.
<400> 23
Val Glu Asp Gln Thr Lys Gln Leu Ile Glu Gly Met Glu Lys Ile Leu  
1               5                  10                  15    
Ser Arg Met His Pro                                              
20    
<210> 24
<211> 21
<212> PRT
<213> Unknown Organism
<220> 
<223> Description of Unknown Organism: Tilapia sp. 
<400> 24
Met Gln Gln Tyr Ser Lys Ser Leu Lys Asp Gly Leu Asp Val Leu Ser  
1               5                  10                  15    
Ser Lys Met Gly Ser                                              
20    
<210> 25
<211> 21
<212> PRT
<213> Unknown Organism
<220> 
<223> Description of Unknown Organism: Tilapia sp. 
<400> 25
Met Gln Glu His Ser Lys Asp Leu Lys Asp Gly Leu Asp Ile Leu Ser  
1               5                  10                  15    
Ser Lys Met Gly Pro                                              
20    
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> Cyprinus carpio
<400> 26
Leu Gln Glu Asn Ile Asn Ser Leu Gly Ala Gly Leu Glu His Val Phe  
1               5                  10                  15    
Asn Lys Met Asp Ser                                              
20    
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> Cyprinus carpio
<400> 27
Leu Gln Asp Asn Ile Asn Ser Leu Gly Ala Gly Leu Glu Arg Val Val  
1               5                  10                  15    
His Lys Met Gly Ser                                              
20    
<210> 28
<211> 21
<212> PRT
<213> Cyprinus carpio
<400> 28
Leu Gln Asp Asn Ile Asn Ser Leu Val Pro Gly Leu Glu His Val Val  
1               5                  10                  15    
His Lys Met Gly Ser                                              
20    
<210> 29
<211> 21
<212> PRT
<213> Salmonis sp.
<400> 29
Leu Gln Asp Tyr Ser Lys Ser Leu Gly Asp Gly Leu Asp Ile Met Val  
1               5                  10                  15    
Asn Lys Met Gly Pro                                              
20    
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> Oncorhynchus tshawytscha
<400> 30
Leu Gln Asp Tyr Ser Lys Ser Leu Gly Asp Gly Leu Asp Ile Met Val  
1               5                  10                  15    
Asn Lys Met Gly Pro                                              
20    
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> Oncorhynchus sp.
<400> 31
Leu Gln Asp Tyr Ser Lys Ser Leu Gly Asp Gly Leu Asp Ile Met Val  
1               5                  10                  15    
Asn Lys Met Gly Pro                                              
20    
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met  
1               5                  10                  15    
Arg Glu Leu Glu Asp Gly                                          
20        
<210> 33
<211> 22
<212> PRT
<213> Bovine sp.
<400> 33
Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Leu Ala Leu Met  
1               5                  10                  15    
Arg Glu Leu Glu Asp Gly                                          
20        
<210> 34
<211> 199
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
amino acid sequence
<400>  34
Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg 
1               5                   10                  15      
Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu 
20                  25                  30          
Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg 
35                  40                  45              
Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala 
50                  55                  60                  
Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe 
65                  70                  75                  80  
Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr 
85                  90                  95      
His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile 
100                 105                 110         
Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu 
115                 120                 125             
Arg Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn 
130                 135                 140                 
Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp 
145                 150                 155                 160 
Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg 
165                 170                 175     
Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg 
180                 185                 190         
Ile Ile His Asn Asn Asn Cys 
195                 
<210> 35
<211> 199
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>  35
Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg 
1               5                   10                  15      
Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu 
20                  25                  30          
Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg 
35                  40                  45              
Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala 
50                  55                  60                  
Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe 
65                  70                  75                  80  
Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr 
85                  90                  95      
His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile 
100                 105                 110         
Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu 
115                 120                 125             
Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn 
130                 135                 140                 
Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp 
145                 150                 155                 160 
Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg 
165                 170                 175     
Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg 
180                 185                 190         
Ile Ile His Asn Asn Asn Cys 
195                 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の双機能分子の略図である。（A）ライスフェルドら（Reisfeld、1996）による先の研究において提唱されている、mAb-IL-2融合タンパク質、および（B）本発明に従うhPRLA-IL-2融合タンパク質。
【図２】  本発明の双機能融合タンパク質に関して提唱される作用機序の略図である。乳癌細胞によって産生されるPRLは、融合タンパク質（PRLA）が占有していることからPRLRに達することができない。同時に、融合タンパク質のIL-2部分が抗腫瘍T細胞反応を刺激する。
【図３】  共培養法を用いた、T-47Dヒト乳癌細胞におけるhPR1-G129Rの用量依存的な阻害作用、およびhPRLの刺激作用を示す。x軸は共培養したL細胞（対照）、L-PRLまたはL-hPRL-G129R細胞数を表す。各データポイントは、少なくとも3回の、3通のウェルでの独立した実験の平均値を表す。
【図４】  T-47Dヒト乳癌細胞増殖アッセイにおけるhPRL-G129Rの用量依存的な阻害作用、および4-OH-タモキシフェンとの相加作用を示す。x軸は、4-OH-タモキシフェンの非存在下（白いバー）または存在下の、いずれかでのhPRL-G129R濃度を表す。各データポイントは、少なくとも3回の、3通のウェルでの独立した実験の平均値を表す。
【図５】  pUCIG-MT-hPRLA-IL-2融合タンパク質cDNAの、発現プラスミドのクローニングおよび構築の略図である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004504272.tif 000003
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療剤を製造するための、配列番号：35を含むが129位でのアミノ酸置換を有する受容体拮抗ドメインならびにIL-2、IL-12、およびIFNγからなる群より選択されるサイトカインである正の免疫調節物質ドメインを含むタンパク質の使用。
【請求項２】
受容体拮抗ドメインが配列番号：34を含む、請求項1記載の使用。
【請求項３】
129位のアミノ酸がかさ高い側鎖アミノ酸である、請求項1記載の使用。
【請求項４】
129位のアミノ酸がアルギニンである、請求項1記載の使用。
【請求項５】
癌性細胞を有する個体において免疫応答を誘導する薬剤を製造するための、
（i）配列番号：35を含むが129位でのアミノ酸置換を有するプロラクチン拮抗剤ドメイン；ならびに
（ii）IL-2、IL-12、およびIFNγからなる群より選択されるサイトカインである免疫調節物質ドメイン
を含むタンパク質の使用。
【請求項６】
プロラクチン拮抗剤ドメインが実質的に配列番号：34のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、請求項5記載の使用。
【請求項７】
癌の治療剤を製造するための、hGHにおいて120位でのアミノ酸置換を含む成長ホルモン拮抗剤ドメインである受容体拮抗ドメインならびにIL-2、IL-12、およびIFNγからなる群より選択されるサイトカインである正の免疫調節物質ドメインを含むタンパク質の使用。
【請求項８】
120位のアミノ酸がかさ高い側鎖アミノ酸である、請求項7記載の使用。
【請求項９】
120位のアミノ酸がアルギニンである、請求項7記載の使用。