(57)【要約】  本明細書において、哺乳動物対象における１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の処置のための組成物および方法を提供する。組成物は、ＩＬ−２遺伝子およびＴ１Ｄ特異的自己抗原（例えば、プロインスリン（ＰＩＮＳ））遺伝子を発現する乳酸発酵細菌（ＬＡＢ）を含む。例示的な方法は、哺乳動物対象に、組成物の治療有効量を経口投与することを含む。組成物は、対象に粘膜投与することができ、それによってＬＡＢが消化管に送達され、そこでＬＡＢが放出される。ＬＡＢによって発現される生物活性ポリペプチドは、このようにして粘膜送達を介して投与される。ＬＡＢは、対象にＩＬ−２の低用量を送達するように選択されうる。方法は、同時の全身性抗ＣＤ３抗体処置を必要としなくてもよい。方法は、残存ベータ細胞機能を有する対象、例えば最近発症したＴ１Ｄを有する対象にとって適しうる。
2019505524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドをコードする外因性核酸と、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）特異的抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸とを含むＬＡＢ；または
（ｂ）インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む第１のＬＡＢと、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）特異的抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む第２のＬＡＢとを含む組成物。
【請求項２】
前記ＬＡＢが、ラクトコッカス（Lactococcus）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種、ストレプトコッカス（Streptococcus）種、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＬＡＢが、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニアエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. Lactis）、ラクトコッカス・ピスシウム（Lactococcus piscium）、ラクトコッカス・プランタルム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）、ラクトバチルス・アセトトレランス（Lactobacillus acetotolerans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アギリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチルス・アルギダス（Lactobacillus algidus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・アミノリチクス（Lactobacillus amylolyticus）、ラクトバチルス・アミロフィルス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバチルス・アビアリウス（Lactobacillus aviarius）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アラフィノサス（Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス（Lactobacillus aviarius subsp. aviarius）、ラクトバチルス・ババリクス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カルニス（Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種アラクトサス（Lactobacillus casei subsp. alactosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種シュードプランタルム（Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum）、ラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種トレランス（Lactobacillus casei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・カテナフォルミス（Lactobacillus catenaformis）、ラクトバチルス・セロビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・コンフサス（Lactobacillus confusus）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルケンス（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・カルバタス亜種カルバタス（Lactobacillus curvatus subsp. curvatus）、ラクトバチルス・カルバタス亜種メリビオサス（Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・ダイバージェンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・フォルニカリス（Lactobacillus fornicalis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・フルクトサス（Lactobacillus fructosus）、ラクトバチルス・ガリナルム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・グラミニス（Lactobacillus graminis）、ラクトバチルス・ハロトレランス（Lactobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamsteri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ヘテロヒオキイ（Lactobacillus heterohiochii）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホモヒオキイ（Lactobacillus homohiochii）、ラクトバチルス・イネルス（Lactobacillus iners）、ラクトバチルス・インテスティナリス（Lactobacillus intestinalis）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）、ラクトバチルス・ケフィルグラナム（Lactobacillus kefirgranum）、ラクトバチルス・クンケーイ（Lactobacillus kunkeei）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）、ラクトバチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス・マルタロミクス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・マニホチボランス（Lactobacillus manihotivorans）、ラクトバチルス・マイナー（Lactobacillus minor）、ラクトバチルス・ミニタス（Lactobacillus minutus）、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・ムリナス（Lactobacillus murinus）、ラクトバチルス・ナゲリ（Lactobacillus nagelii）、ラクトバチルス・オリス（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラクトバチルス・パラブクネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種トレランス（Lactobacillus paracasei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Lactobacillus parakefiri）、ラクトバチルス・パラリメンタリウス（Lactobacillus paralimentarius）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ペロレンス（Lactobacillus perolens）、ラクトバチルス・ピスシコラ（Lactobacillus piscicola）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ポンチス（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・リマエ（Lactobacillus rimae）、ラクトバチルス・ロゴサエ（Lactobacillus rogosae）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバチルス・��ケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・サケイ亜種カモサス（Lactobacillus sakei subsp. camosus）、ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリシニウス（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）、ラクトバチルス・サンフランシセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチルス・シャーピー（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobacillus suebicus）、ラクトバチルス・トリコデス（Lactobacillus trichodes）、ラクトバチルス・ウリ（Lactobacillus uli）、ラクトバチルス・ワクシノステルカス（Lactobacillus vaccinostercus）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、ラクトバチルス・ビリデセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバチルス・ビツリナス（Lactobacillus vitulinus）、ラクトバチルス・キシロサス（Lactobacillus xylosus）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種マリ（Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis subsp. Yamanashiensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィズム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Bifidobacterium infantis）、エンテロコッカス・アルセジニス（Enterococcus alcedinis）、エンテロコッカス・アクイマリナス（Enterococcus aquimarinus）、エンテロコッカス・アシニ（Enterococcus asini）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium）、エンテロコッカス・カカエ（Enterococcus caccae）、エンテロコッカス・カメリアエ（Enterococcus camelliae）、エンテロコッカス・カニンテスチニ（Enterococcus canintestini）、エンテロコッカス・カニス（Enterococcus canis）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコラム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・コランバエ（Enterococcus columbae）、エンテロコッカス・デブリエセイ（Enterococcus devriesei）、エンテロコッカス・ジエストラメナエ（Enterococcus diestrammenae）、エンテロコッカス・ジスパー（Enterococcus dispar）、エンテロコッカス・デュランス（Enterococcus durans）、エンテロコッカス・エウレケンシス（Enterococcus eurekensis）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ギルブス（Enterococcus gilvus）、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス（Enterococcus haemoperoxidus）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Enterococcus hermanniensis）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・イタリクス（Enterococcus italicus）、エンテロコッカス・ラクチス（Enterococcus lactis）、エンテロコッカス・レ��ニイ（Enterococcus lemanii）、エンテロコッカス・マロドラツス（Enterococcus malodoratus）、エンテロコッカス・モラビエンシス（Enterococcus moraviensis）、エンテロコッカス・ムンディティ（Enterococcus mundtii）、エンテロコッカス・オリバ（Enterococcus olivae）、エンテロコッカス・パレンス（Enterococcus pallens）、エンテロコッカス・フェニクリコラ（Enterococcus phoeniculicola）、エンテロコッカス・プランタルム（Enterococcus plantarum）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Enterococcus pseudoavium）、エンテロコッカス・クエベセンシス（Enterococcus quebecensis）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Enterococcus raffinosus）、エンテロコッカス・ラッティ（Enterococcus ratti）、エンテロコッカス・リボルム（Enterococcus rivorum）、エンテロコッカス・ロタイ（En
terococcus rotai）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Enterococcus saccharolyticus）、エンテロコッカス・シレシアクス（Enterococcus silesiacus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococcus solitarius）、エンテロコッカス・スルフレウス（Enterococcus sulfureus）、エンテロコッカス・テルミチス（Enterococcus termitis）、エンテロコッカス・タイランディクス（Enterococcus thailandicus）、エンテロコッカス・ウレアシチクス（Enterococcus ureasiticus）、エンテロコッカス・ウレイリチクス（Enterococcus ureilyticus）、エンテロコッカス・ビイキエンシス（Enterococcus viikkiensis）、エンテロコッカス・ビロルム（Enterococcus villorum）、エンテロコッカス・シャンファンゲンシス（Enterococcus xiangfangensis）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）、ストレプトコッカス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・ジスガラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・エキヌス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス・イニエ（Streptococcus iniae）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ミレリ（Streptococcus milleri）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサンギニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・ペロリス（Streptococcus peroris）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・シュードニューモニエ（Streptococcus pseudopneumoniae）、ストレプトコッカス・パイオジェンス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッティ（Streptococcus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・チグリヌス（Streptococcus tigurinus）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サンギニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Streptococcus vestibularis）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptococcus zooepidemicus）からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＬＡＢが、ラクトコッカス（Lactococcus）種である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＬＡＢが、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｔ１Ｄ特異的抗原が、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６Ｓ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、およびシトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｔ１Ｄ特異的抗原がＰＩＮＳである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ＬＡＢがＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸とＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸とを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
第１のＬＡＢがＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸を含み、第２のＬＡＢがＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸が前記ＬＡＢの染色体に組み込まれている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸が、前記ＬＡＢの染色体に組み込まれているか、または前記ＬＡＢに含有されるプラスミド上に存在する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸およびＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸が、両方とも前記ＬＡＢの染色体に組み込まれている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸およびＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸が、同じプロモーターによって駆動されるポリシストロン性発現単位の一部である、請求項９または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＩＬ−２が、ＩＬ−２の膜結合型またはＩＬ−２の可溶性型である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸がＩＬ−２変種ポリペプチドをコードする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＩＬ−２変種ポリペプチドが、対応する野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、減少したＩＬ−２活性を有するか、または増強されたＩＬ−２活性を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＩＬ−２変種ポリペプチドが、アルデスロイキン、テセロイキン、およびバイオロイキンからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＩＬ−２変種ポリペプチドが：
（ａ）成熟した、野生型ＩＬ−２と比較して、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋからなる群から選択される第１のアミノ酸置換；または
（ｂ）成熟した、野生型ＩＬ−２と比較して、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、およびＦ４２Ｋからなる群から選択される第２のアミノ酸置換；または
（ｃ）成熟した、野生型ＩＬ−２と比較して、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、およびＹ４５Ｋからなる群から選択される第３のアミノ酸置換；または
（ｄ）それらの組合せ
を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＬＡＢが、哺乳動物対象に投与した場合に低用量ＩＬ−２が粘膜送達されるように適合されている、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を含む組成物であって、前記ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）がＩＬ−２ポリペプチドをコードする外因性核酸と、ＰＩＮＳをコードする外因性核酸とを含み、前記ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）が、哺乳動物対象に投与した場合に低用量ＩＬ−２を粘膜送達するように適合されている、組成物。
【請求項２２】
それを必要とする哺乳動物対象におけるＴ１Ｄを処置するための請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を処置する方法。
【請求項２４】
抗ＣＤ３抗体が前記対象に投与されない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗ＣＤ３抗体を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗ＣＤ３抗体が、前記対象に前記組成物と同時に低用量で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ＣＤ３抗体が、前記対象に静脈内投与される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記低用量ＩＬ−２送達が、約０．０１Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約５．４Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲；約０．０２Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲；約０．１Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲；または約０．２Ｍ  ＩＵ／日／対象〜２．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲である、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が残存ベータ細胞機能を有する、請求項２３から２８のいずれか一項に記載に尾方法。
【請求項３０】
前記対象が最近発症したＴ１Ｄを有する、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が、残存ベータ細胞機能を示す血中または尿中Ｃ−ペプチド濃度を有する、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、約１ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるが少なくとも約０．２ｎｍｏｌ／Ｌの絶食時血中Ｃ−ペプチド濃度を有するか、または約４ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるが少なくとも約０．５ｎｍｏｌ／Ｌである刺激された血中Ｃ−ペプチド濃度を有するヒト患者である、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、前記組成物の投与前の過去１２カ月以内にＴ１Ｄと診断されている、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、前記対象に粘膜投与される、請求項２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が、液体形態で前記対象に投与される、請求項２３から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、食品、栄養補助食品、または坐剤製品の形態で前記対象に投与される、請求項２３から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、約１×１０４〜約１×１０１２、約１×１０６〜約１×１０１２、または約１×１０９〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む単位剤形で投与される、請求項２３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記単位剤形が、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、坐剤、および定用量エアロゾル剤からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、乾燥粉末形態またはその圧縮型である、請求項２３から３４および３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ＩＬ−２ポリペプチドをコードする外因性核酸と、Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸とを含む遺伝子改変微生物。
【請求項４１】
ＬＡＢである、請求項４０に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４２】
インターロイキン−２および／またはＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸が、前記微生物の染色体に安定に組み込まれている、請求項４０または４１に記載の遺伝子改変微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２７８，４９３号明細書および２０１６年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３５０，４７２号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表に関する言及
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含有する。２０１７年１月１０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、２０５３５０−００３０−００−ＷＯ−５４９９８７＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１８９，８５４バイトである。
【背景技術】
【０００３】
およそ１０００〜１５００万人の人が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に罹患しており、これは幼児および青年における最も一般的な代謝障害であり、ヨーロッパだけでも年齢１６歳未満の子供１１２，０００人に罹患している。Ｔ１Ｄは、遺伝的に感受性がある個体における膵臓のインスリン産生膵島ベータ細胞（「ベータ細胞」）の進行性の免疫媒介性の破壊に起因し、それによって慢性的な高血糖症が起こり、微小血管および大血管合併症を引き起こす。例えば、van Belle, T.L. et al., Physiol. Rev. 2011, 91(1): 79-118を参照されたい。一部の自己免疫疾患では治療の選択肢が利用可能であるが、Ｔ１Ｄに関して現在承認されている治療はない。Ｔ１Ｄを有する患者は、インスリンによる一生涯の処置を必要とする。その上、長期間の管理は、医師、看護師、栄養士、および他の専門家を含む多くの専門領域にわたるアプローチを必要とする。
【０００４】
短期間の治療または長期的なレジメンの状況のいずれにおいても、全身の免疫抑制を使用する自己反応性エフェクターＴ細胞の遮断が、自己免疫疾患における唯一の治療戦略である。制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の活性化または増大は、エフェクターＴ細胞とＴｒｅｇ細胞との間のバランスを回復することができ、免疫抑制に関連する毒性を生じることなく、同じ目的を達成しうると考えられている。
【０００５】
インターロイキン２（「ＩＬ−２」）は、主にＴ細胞に対するその直接の作用を介して免疫系において重要な機能を有する。Ｔ細胞が成熟する胸腺において、インターロイキン２は、ある特定の未成熟なＴ細胞の、体内の健康な細胞を攻撃するようにプライミングされる他のＴ細胞を抑制する制御性Ｔ細胞への分化を促進することによって、自己免疫疾患を防止する。より高濃度では、ＩＬ−２はまた、最初のＴ細胞が抗原によって同様に刺激される場合、Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞への分化も促進し、このように体が感染症と闘うのを助ける。
【０００６】
ネイティブＩＬ−２は、当初、リンパ球増殖因子として同定され、主にｉｎ  ｖｉｖｏでエフェクターＴ細胞応答を促進すると考えられ、エフェクターＴ細胞の強化が必要である状態、すなわちがんおよび感染疾患の処置のために組換えＩＬ−２が開発された。しかし、ＩＬ−２ノックアウトマウスがＴ細胞媒介自己免疫疾患を発症することから、ＩＬ−２は、エフェクターＴ細胞の分化、生存、および機能にとって必須であることが示された。ＩＬ−２は現在では、Ｔｒｅｇ細胞の発達、増大、生存、および末梢活性にとって重要なサイトカインであることが知られている。ＩＬ−２産生の欠損またはＩＬ−２応答性の欠如によって、Ｔｒｅｇ細胞機能の喪失および自己免疫の増加が起こる。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−２の三量体の高親和性受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞、ＮＫ細胞、ならびに好酸球より高レベルで構成的に発現する。ＳＴＡＴ５ａシグナリングの誘導は、Ｔｒｅｇ細胞においてエフェクターＴ細胞より低用量のＩＬ−２で起こる。従って、低用量のＩＬ−２は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴｒｅｇ細胞の優先的活性化を刺激し、生存を促進するように思われる。例えば、Yu, A., et al., Diabetes 2015, 64: 2172-2183を参照されたい。
【０００７】
臨床試験において、ＩＬ−２の投与は、免疫学的変化を誘導したが、グルコース代謝の変数を変化させなかった。例えば、Hartemann A. et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013; 1:295-305; およびRosenzwajg M. et al., J Autoimmun. 2015; 58:48-58を参照されたい。
【０００８】
ＩＬ−２医薬調製物は注射によって投与される。例えば投与しやすさの結果として経口送達は魅力的であるが、消化管での分解および低レベルの吸収により、一般的にこの経路は、ポリペプチドの送達に関して無効である。鼻、直腸、肺、および眼による経路などの代替経路が、ポリペプチドに基づく治療のために研究されている。
【０００９】
粘膜組織に治療分子を送達するために遺伝子改変細菌が使用されている。例えば、Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789; およびRobert S. and Steidler L., Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11を参照されたい。
【００１０】
遺伝的に変化させたラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を介してベータ細胞自己免疫に関係する抗原を腸に導入すると、Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞の誘導を介してＮＯＤマウスにおいてＴ１Ｄを停止させることが示されている。遺伝的に変化させたラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を経口投与すると、ヒトＩＬ−１０と共にヒトプロインスリン（ＰＩＮＳ）が消化管（ＧＩ）粘膜に送りこまれ、全身性の低用量抗ＣＤ３抗体と組み合わせると、新規発症（ｎｅｗ  ｏｎｓｅｔ）した糖尿病ＮＯＤマウスのほぼ６０％において長期寛容に向けて免疫系をリセットする。例えば、Robert, S. et al., Diabetes 2014, 63: 2876-2887; およびTakiishi, T. et al., J. Clin. Inv. 2012, 122(5): 1717-1725を参照されたい。しかし、抗ＣＤ３抗体などの追加の免疫調節剤を伴うそのような抗原特異的併用治療の臨床への移行は、例えばＦｃ改変抗ヒトＣＤ３抗体がＴ１Ｄの処置に関して規制当局によって承認されていないために、妨げられている。
【００１１】
オフターゲット活性および全身毒性を引き起こすことなく、Ｔ１Ｄの処置のために有効で、標的化され、制御された方法が当技術分野で必要である。そのような戦略は、投与を容易にし、安全性を増加させ、および理想的には有効性を改善して治療有効用量を低減させるはずである。本開示はこれらの必要性に取り組む。
【００１２】
参照による組み込み
本明細書における全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそのそれぞれの刊行物、特許、または特許出願が具体的に個々に参照により本明細書に組み込まれていることが示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に記載の用語と組み込まれた参考文献の用語との間に矛盾がある場合は、本明細書における用語が優先する。
【発明の概要】
【００１３】
従って、本明細書において、低用量ＩＬ−２を、例えばプロインスリン（ＰＩＮＳ）などのＴ１Ｄ特異的自己抗原と組み合わせて粘膜に送達するための送達媒体としての、生きた乳酸発酵細菌（ＬＡＢ）、例えば遺伝子改変ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ）株を含む組成物および方法を提供する。ＬＡＢは、生物学的応答を誘導し、次に膵臓ベータ細胞の自己免疫による破壊をさらに遮断する生物活性ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されている。そのような戦略は、例えば十分な残存ベータ細胞機能を有する対象において確立されたＴ１Ｄを好転させることができ、このため、自己免疫性糖尿病の「真の」治癒を表す。組成物は、例えば細菌を消化管、例えば下位消化管（例えば、結腸の遠位部分）に輸送して、そこで任意選択でＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）と組み合わせてＩＬ−２の適した低用量を分泌する、腸溶コーティングした医薬製剤の形態で経口投与されうる。
【００１４】
提供される組成物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドをコードする外因性核酸と、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）特異的抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸とを含む乳酸発酵細菌（ＬＡＢ）を含む。あるいは、提供される組成物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む第１のＬＡＢと、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）特異的抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む第２のＬＡＢとを含む。組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。前記ＬＡＢは、哺乳動物対象に投与した場合に、低用量ＩＬ−２を粘膜送達するように適合させてもよい。
【００１５】
一態様において、前記ＬＡＢは、ラクトコッカス（Lactococcus）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種、ストレプトコッカス（Streptococcus）種、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種からなる群から選択されうる。前記ＬＡＢは、ラクトコッカス（Lactococcus）種でありうる。例えば、前記ＬＡＢは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）であるうる。あるいは、前記ＬＡＢは、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニアエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. Lactis）、ラクトコッカス・ピスシウム（Lactococcus piscium）、ラクトコッカス・プランタルム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）、ラクトバチルス・アセトトレランス（Lactobacillus acetotolerans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アギリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチルス・アルギダス（Lactobacillus algidus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・アミノリチクス（Lactobacillus amylolyticus）、ラクトバチルス・アミロフィルス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバチルス・アビアリウス（Lactobacillus aviarius）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アラフィノサス（Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス（Lactobacillus aviarius subsp. aviarius）、ラクトバチルス・ババリクス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カルニス（Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種アラクトサス（Lactobacillus casei subsp. alactosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種シュードプランタルム（Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum）、ラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種トレランス（Lactobacillus casei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・カテナフォルミス（Lactobacillus catenaformis）、ラクトバチルス・セロビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・コンフサス（Lactobacillus confusus）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルケンス（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・カルバタス亜種カルバタス（Lactobacillus curvatus subsp. curvatus）、��クトバチルス・カルバタス亜種メリビオサス（Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・ダイバージェンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・フォルニカリス（Lactobacillus fornicalis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・フルクトサス（Lactobacillus fructosus）、ラクトバチルス・ガリナルム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・グラミニス（Lactobacillus graminis）、ラクトバチルス・ハロトレランス（Lactobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamsteri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ヘテロヒオキイ（Lactobacillus heterohiochii）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホモヒオキイ（Lactobacillus homohiochii）、ラクトバチルス・イネルス（Lactobacillus iners）、ラクトバチルス・インテスティナリス（Lactobacillus intestinalis）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）、ラクトバチルス・ケフィルグラナム（Lactobacillus kefirgranum）、ラクトバチルス・クンケーイ（Lactobacillus kunkeei）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）、ラクトバチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス・マルタロミクス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・マニホチボランス（Lactobacillus manihotivorans）、ラクトバチルス・マイナー（Lactobacillus minor）、ラクトバチルス・ミニタス（Lactobacillus minutus）、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・ムリナス（Lactobacillus murinus）、ラクトバチルス・ナゲリ（Lactobacillus nagelii）、ラクトバチルス・オリス（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラクトバチルス・パラブクネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種トレランス（Lactobacillus paracasei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Lactobacillus parakefiri）、ラクトバチルス・パラリメンタリウス（Lactobacillus paralimentarius）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ペロレンス（Lactobacillus perolens）、ラクトバチル��・ピスシコラ（Lactobacillus piscicola）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ポンチス（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・リマエ（Lactobacillus rimae）、ラクトバチルス・ロゴサエ（Lactobacillus rogosae）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・サケイ亜種カモサス（Lactobacillus sakei subsp. camosus）、ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリシニウス（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）、ラクトバチルス・サンフランシセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチルス・シャーピー（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobacillus suebicus）、ラクトバチルス・トリコデス（Lactobacillus trichodes）、ラクトバチルス・ウリ（Lactobacillus uli）、ラクトバチルス・ワクシノステルカス（Lactobacillus vaccinostercus）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、ラクトバチルス・ビリデセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバチルス・ビツリナス（Lactobacillus vitulinus）、ラクトバチルス・キシロサス（Lactobacillus xylosus）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種マリ（Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis subsp. Yamanashiensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィズム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Bifidobacterium infantis）、エンテロコッカス・アルセジニス（Enterococcus alcedinis）、エンテロコッカス・アクイマリナス（Enterococcus aquimarinus）、エンテロコッカス・アシニ（Enterococcus asini）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium）、エンテロコッカス・カカエ（Enterococcus caccae）、エンテロコッカス・カメリアエ（Enterococcus camelliae）、エンテロコッカス・カニンテスチニ（Enterococcus canintestini）、エンテロコッカス・カニス（Enterococcus canis）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコラム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・コランバエ（Enterococcus columbae）、エンテロコッカス・デブリエセイ（Enterococcus devriesei）、エンテロコッカス・ジエストラメナエ（Enterococcus diestrammenae）、エンテロコッカス・ジスパー（Enterococcus dispar）、エンテロコッカス・デュランス（Enterococcus durans）、エンテロコッカス・エウレケンシス（Enterococcus eurekensis）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、��ンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ギルブス（Enterococcus gilvus）、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス（Enterococcus haemoperoxidus）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Enterococcus hermanniensis）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・イタリクス（Enterococcus italicus）、エンテロコッカス・ラクチス（Enterococcus lactis）、エンテロコッカス・レマニイ（Enterococcus lemanii）、エンテロコッカス・マロドラツス（Enterococcus malodoratus）、エンテロコッカス・モラビエンシス（Enterococcus moraviensis）、エンテロコッカス・ムンディティ（Enterococcus mundtii）、エンテロコッカス・オリバ（Enterococcus olivae）、エンテロコッカス・パレンス（Enterococcus pallens）、エンテロコッカス・フェニクリコラ（Enterococ
cus phoeniculicola）、エンテロコッカス・プランタルム（Enterococcus plantarum）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Enterococcus pseudoavium）、エンテロコッカス・クエベセンシス（Enterococcus quebecensis）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Enterococcus raffinosus）、エンテロコッカス・ラッティ（Enterococcus ratti）、エンテロコッカス・リボルム（Enterococcus rivorum）、エンテロコッカス・ロタイ（Enterococcus rotai）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Enterococcus saccharolyticus）、エンテロコッカス・シレシアクス（Enterococcus silesiacus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococcus solitarius）、エンテロコッカス・スルフレウス（Enterococcus sulfureus）、エンテロコッカス・テルミチス（Enterococcus termitis）、エンテロコッカス・タイランディクス（Enterococcus thailandicus）、エンテロコッカス・ウレアシチクス（Enterococcus ureasiticus）、エンテロコッカス・ウレイリチクス（Enterococcus ureilyticus）、エンテロコッカス・ビイキエンシス（Enterococcus viikkiensis）、エンテロコッカス・ビロルム（Enterococcus villorum）、エンテロコッカス・シャンファンゲンシス（Enterococcus xiangfangensis）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）、ストレプトコッカス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・ジスガラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・エキヌス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス・イニエ（Streptococcus iniae）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ミレリ（Streptococcus milleri）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサンギニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・ペロリス（Streptococcus peroris）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・シュードニューモニエ（Streptococcus pseudopneumoniae）、ストレプトコッカス・パイオジェンス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッティ（Streptococcus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・チグリヌス（Streptococcus tigurinus）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サンギニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Streptococcus vestibularis）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptococcus zooepidemicus）からなる群から選択されうる。
【００１６】
別の態様において、前記Ｔ１Ｄ特異的抗原は、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、およびシトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）からなる群から選択されうる。例えば、前記Ｔ１Ｄ特異的抗原はＰＩＮＳでありうる。
【００１７】
別の態様において、ＬＡＢは、ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸と、Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸とを含みうる。あるいは、第１のＬＡＢが、ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸を含み、第２のＬＡＢが、Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸を含みうる。ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸は、前記ＬＡＢの染色体に組み込まれてもよい。Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸は、前記ＬＡＢの染色体に組み込まれてもよく、または前記ＬＡＢに含まれるプラスミドに存在してもよい。ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸およびＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸の両方が、前記ＬＡＢの染色体に組み込まれてもよい。ＩＬ−２ポリペプチドをコードする前記外因性核酸およびＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする前記外因性核酸は、同じプロモーターによって駆動されるポリシストロン性発現単位の一部であってもよい。
【００１８】
なお別の態様において、前記ＩＬ−２は、ＩＬ−２の膜結合型またはＩＬ−２の可溶性型でありうる。前記ＩＬ−２ポリペプチドをコードする外因性核酸は、ＩＬ−２変種ポリペプチドをコードしうる。前記ＩＬ−２変種ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、減少したＩＬ−２活性または増強されたＩＬ−２活性を有しうる。前記ＩＬ−２変種ポリペプチドは、アルデスロイキン、テセロイキン、およびバイオロイキンからなる群から選択されうる。例えば、前記ＩＬ−２変種ポリペプチドは：
（ａ）成熟した、野生型ＩＬ−２と比較して、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋからなる群から選択される第１のアミノ酸置換；または
（ｂ）成熟した、野生型ＩＬ−２と比較して、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、およびＦ４２Ｋからなる群から選択される第２のアミノ酸置換；または
（ｃ）成熟した、野生型ＩＬ−２と比較して、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、およびＹ４５Ｋからなる群から選択される第３のアミノ酸置換；または
（ｄ）それらの組合せ
を含む。
【００１９】
提供される組成物は、ＩＬ−２ポリペプチドをコードする外因性核酸と、ＰＩＮＳをコードする外因性核酸とを含み、哺乳動物対象に投与した場合に、低用量ＩＬ−２を粘膜送達するように適合されている、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を含みうる。前記低用量ＩＬ−２送達は、約０．０１Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約５．４Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．０２Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３．０Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．１Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３．０Ｍ  ＩＵ／日／対象、または約０．２Ｍ  ＩＵ／日／対象〜２．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲内でありうる。
【００２０】
同様に、それを必要とする哺乳動物対象における、Ｔ１Ｄの処置のための組成物の使用も提供される。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を処置するための提供される方法は、組成物の治療有効量を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む。
【００２１】
一態様において、Ｔ１Ｄを処置する方法において、抗ＣＤ３抗体は前記対象に投与されない。あるいは、Ｔ１Ｄを処置する方法は、抗ＣＤ３抗体を前記対象に投与することをさらに含む。前記抗ＣＤ３抗体は、前記組成物と同時に低用量で前記対象に投与されうる。前記抗ＣＤ３抗体は、前記対象に静脈内投与されうる。
【００２２】
別の態様において、前記対象は、残存ベータ細胞機能を有しうる。前記対象は、最近発症（ｒｅｃｅｎｔ  ｏｎｓｅｔ）したＴ１Ｄを有しうる。前記対象は、残存ベータ細胞機能を示す血中または尿中Ｃ−ペプチド濃度を有しうる。前記対象は、絶食時血中Ｃ−ペプチド濃度が約１ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるが、少なくとも約０．２ｎｍｏｌ／Ｌであるか、または刺激時の血中Ｃ−ペプチド濃度が約４ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるが、少なくとも約０．５ｎｍｏｌ／Ｌであるヒト患者でありうる。前記対象は、前記組成物の投与前の過去１２カ月以内にＴ１Ｄと診断されていてもよい。
【００２３】
さらなる態様において、前記組成物は、前記対象に粘膜投与されうる。前記組成物は、液体の形態で前記対象に投与されうる。前記組成物は、食品、栄養補助食品、または坐剤製品の形態で前記対象に投与されうる。前記組成物は、約１×１０４〜約１×１０１２、約１×１０６〜約１×１０１２、または約１×１０９〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む単位剤形で投与されうる。前記単位剤形は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、坐剤、および定用量エアロゾル剤からなる群から選択されうる。前記組成物は、乾燥粉末形態またはその圧縮型でありうる。
【００２４】
さらに、ＩＬ−２ポリペプチドをコードする外因性核酸およびＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む遺伝子改変微生物が提供される。例えば、前記微生物はＬＡＢでありうる。前記インターロイキン−２および／またはＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸は、微生物の染色体に安定に組み入れられうる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）およびｈＩＬ−２遺伝子の融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を表す図であり、これはｅｎｏとＳＳｕｓｐ４５との間の高度発現Ｌ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子の前の遺伝子間領域（ｒｐｍＤ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７８７３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２３１６７３２．．２３１６９１１、相補体））を含む高度発現ホスホピルビン酸ヒドラターゼ遺伝子（ｅｎｏ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７４３２；位置：ＮＣ＿００９００４．１（６０６１８４．．６０７４８５））の下流に、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ６０５６８、アミノ酸２１〜１５３）をコードする。
【図２】遺伝子間領域と共に、ＬＬ−ＩＬ−２（ΔｔｈｙＡ、ｔｒｅＰＴＳ（ΔｔｒｅＰＰ）、ｏｔｓＢ、ΔｐｔｃＣ、およびｅｎｏ＞＞ｈＩＬ−２）の遺伝子座、およびＰＣＲ増幅産物サイズ（ｂｐ）を表す概略図である。
【図３】ＰｈｌｌＡ＞＞β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６１４９）発現モジュールを付加したｐＯＲＩ１９断片からなる骨格；ｅｎｏ＞＞ｈｉｌ−２の５’および３’に位置するクロスオーバー（ＸＯ）領域が隣接するｒｐｍＤ遺伝子間領域がカップリングするｇａｐＢの下流のｐｉｎｓを含むカーゴ領域；ならびにエリスロマイシン選択マーカーであるエリスロマイシン耐性２３Ｓ  ＲＮＡメチラーゼ遺伝子（ｅｒｍＣ）、を有する例示的な担体プラスミドを表す図である。
【図４】ＬＬ−ＩＬ−２から生成されたＰＣＲ断片の１．２％アガロースゲル分析を表す図である。
【図５】ＬＬ−ＩＬ−２培養上清中のｈＩＬ−２の存在を示すウェスタンブロットを表す図である。
【図６】ｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）とｐｉｎｓ遺伝子との融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号５７）を表す図であり、これはｇａｐＢとｐｉｎｓとの間の高度発現Ｌ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子の前の遺伝子間領域（ｒｐｍＤ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７８７３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２３１６７３２．．２３１６９１１、相補体）、例えばSteidler et al., Nat. Biotechnol. 2003; 21(7):785-789を参照されたい）を含む高度発現グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐＢ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７８７７；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２４９２５０９．．２４９３５１９、相補体））の下流に、ヒトプロインスリン（ＰＩＮＳ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１３０８、アミノ酸２５〜１１０）をコードする。
【図７】ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２：ΔｔｈｙＡ、ｔｒｅＰＴＳ（ΔｔｒｅＰＰ）、ｏｔｓＢ、ｐｔｃＣ−、ｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓおよびｅｎｏ＞＞ｈｉｌ−２の関連する遺伝子座を表す概略図であり、関連するオリゴヌクレオチド結合部位、ＥｃｏＲＩ制限部位、（／切断／）遺伝子特徴、遺伝子間領域（ＩＲ）、ＰＣＲ増幅産物サイズ（ｂｐ）を示す。
【図８】ＰｈｌｌＡ＞＞β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６１４９）発現モジュールを付加したｐＯＲＩ１９断片からなる骨格；遺伝子間領域ｒｐｍＤにカップリングし、ｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓの５’および３’に位置するクロスオーバー（ＸＯ）領域が隣接する、ｇａｐＢの下流のｐｉｎｓを含有するカーゴ領域；ならびにエリスロマイシン選択マーカーであるエリスロマイシン耐性２３Ｓ  ＲＮＡメチラーゼ遺伝子（ｅｒｍＣ）、を有する例示的な担体プラスミドを表す図である。
【図９】ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２から生成されたＰＣＲ断片の１．２％アガロースゲル分析を表す図である。
【図１０Ａ】（１）ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２培養上清中のＰＩＮＳの存在（黒色の矢印）（図１０Ａ）および（２）ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２培養上清中のｈＩＬ−２の存在（白抜きの矢印）（図１０Ｂ）を示すウェスタンブロットを表す図である。
【図１０Ｂ】上記と同様である。
【図１１】本開示に従う例示的な抗原特異的治療における新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスにおける高血糖症の安定な好転を表す図である。新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスを、本明細書に記載のように、例えば実施例３に記載のように処置し、血中グルコース濃度を処置開始後１４週間追跡した。粘膜送達ＬＬ−ＰＩＮＳまたは粘膜送達ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ−２による処置後に糖尿病のままであるマウスの割合を示す。
【図１２】初回血中グルコース濃度が３５０ｍｇ／ｄＬ超またはそれ未満である新規発症した糖尿病マウスにおける、本開示に従う例示的な抗原特異的治療の有効性を表す図である。本明細書において、例えば実施例３に記載の粘膜送達ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ  ＩＬ−２による処置時に糖尿病のままであるマウスの割合を示す。
【図１３】ＬＬ−ＩＬ−２と組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）との間の生物活性の比較を表す図である。
【図１４Ａ】ＬＬ−ＩＬ−２の単回用量（１０１０ＣＦＵ）を非肥満糖尿病マウスに投与後の様々な時点でのＧＩ管の異なる組織における生きた細菌の濃度を表す図である。（それぞれ、図１４Ａ：ＣＦＵ／組織；図１４Ｂ：ＣＦＵ／ｇ）。全てのバーは、マウス３匹の平均を表す（ｎ＝３）。ＳＩＰ＝近位小腸；ＳＩＤ＝遠位小腸；ＣＡＥ＝盲腸；ＣＯＰ＝近位結腸；ＣＯＤ＝遠位結腸。
【図１４Ｂ】上記と同様である。
【図１５】プラスミドｐＡＧＸ００５３の構造を表す図である。プラスミド骨格は、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５：：ｈｐｉｎｓ発現モジュールを付加したｐＴ１ＮＸ断片からなる。ＰｔｈｙＡ：チミジル酸シンターゼ遺伝子のプロモーター。ＥｍＲ：エリスロマイシン選択マーカー。ｒｅｐＤ、ｒｅｐＥ：複製遺伝子。
【図１６】ＬＬ−ＰＩＮＳ培養上清中の完全長のプラスミド由来ＰＩＮＳの存在を示すウェスタンブロットを表す図である。
【図１７】様々な組換え細菌によって処置した、新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスにおける糖尿病寛解率を表す図である。結果は、任意選択で本開示に従う例示的なＴ１Ｄ特異的抗原（すなわち、ＰＩＮＳ）と組み合わせた粘膜送達ＬＬ−ＩＬ−２（例えば、低用量ＩＬ−２を提供する）が、糖尿病の寛解を誘導し、新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスにおいて高血糖症を安定に好転させることを実証している。マウスを、本明細書に記載のように６週間処置し、処置開始後の１４週間を含む、血中グルコース濃度を測定した。処置後に糖尿病のままであるマウスの割合を示す（マンテルコックスログランク検定；＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１８】開始血中グルコース濃度に従う糖尿病寛解率を表す図である。結果は、開始血中グルコース濃度がマウスにおける治療成功を予測できることを示している。最近発症した糖尿病マウスを、初回（処置前）血中グルコースレベルが３５０ｍｇ／ｄｌ未満であるか、または３５０ｍｇ／ｄｌ超であるかに基づいて階層化した。結果は、任意選択で本開示に従う例示的な抗原特異的治療（例えば、ＰＩＮＳ）と組み合わせた粘膜送達ＬＬ−ＩＬ−２が、初回血中グルコース濃度が３５０ｍｇ／ｄＬ未満の最近発症した糖尿病マウスにおいて特に有効であることを実証する。本明細書に記載のＬＬ−ＩＬ−２またはＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ−２による処置後に糖尿病のままであるマウスの百分率を示す。ＬＬ−ＩＬ−２単独で処置し、３５０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコースを有する、「ＬＬ−ＩＬ２＜３５０（ｎ＝９）」として示すマウス６匹を６週間の処置後に屠殺し、マウス３匹を完全な１４週間の期間まで観察したことに注意されたい。ＬＬ−ＩＬ−２＞３５０（ｎ＝６）（黒三角）のデータ時点は、無処置＞３５０（ｎ＝１６）（黒四角）のデータ点の後ろに隠れている。グルコースが３５０ｍｇ／ｄＬ超である全てのＬＬ−ＩＬ−２処置マウスは６週間の処置後および１４週間の追跡期間後もなおも糖尿病のままであった（マンテルコックスログランク検定；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図１９】糖尿病ＮＯＤマウスにおける膵島ベータ細胞の膵島炎の採点を表す図である。結果は、任意選択で本開示に従う例示的な抗原特異的治療と組み合わせた粘膜送達ＬＬ−ＩＬ−２（例えば、低用量ＩＬ−２を提供する）（例えば、ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ−２）が、膵島炎の悪化（通常、無処置の場合の長期糖尿病への進行の際に認められる）を防止したのみならず、最近発症したおよび無処置の長期糖尿病マウスと比較して膵島ベータ細胞の膵島炎を低減させる（例えば、長期の「正常血糖」ＮＯＤマウスにおいて見出される膵島炎と同等の程度まで膵島炎を低減させる）ことを実証する。重度の膵島炎の程度は、無処置の長期糖尿病マウスと比較して処置によって改善した。膵島炎を示さない膵島ベータ細胞の割合は、最近発症したおよび無処置の長期マウスと比較すると劇的に増加した。軽度の膵島炎を有する膵島の有意な割合が、「膵島周囲炎」または「膵島炎なし」へと改善した。意外にも、膵島炎のこの有意な低減は、処置した全ての最近発症したマウス（「治癒」および「非治癒」として分類される、寛解を伴うおよび寛解を伴わない）において観察された。
【図２０】糖尿病ＮＯＤマウスの血漿中のランダムＣ−ペプチド濃度を表す図である。結果は、プロインスリンを伴うまたは伴わない低用量ＩＬ−２が、糖尿病ＮＯＤマウスにおいてベータ細胞機能を保存することを実証している。任意選択で本開示に従う例示的な抗原特異的治療と組み合わせたＬＬ−ＩＬ−２処置（例えば、ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ−２）の６週間後、寛解（「治癒」として分類される）を示す最近発症した糖尿病マウスにおける血漿中のＣ−ペプチド濃度は、最近発症したおよび無処置の長期糖尿病マウスと比較して増加した（マンホイトニーＴ検定；＊ｐ＜０．０５）。処置したが「非治癒」マウスの血漿中ではＣ−ペプチド濃度は検出されず（ＮＤ）、そのようなマウスでは活性なベータ細胞がほとんどまたは全く残存していないことがありうることを示している。分析した無処置の長期糖尿病マウス４匹中３匹に対して測定されたＣ−ペプチドレベルも同様に検出されなかった。
【図２１】６週間の処置後にフローサイトメトリーによって測定した、糖尿病ＮＯＤマウスの局所（すなわち、腸間膜流入領域リンパ節；ＭＬＮ）、全身（すなわち、脾臓および血液）、および標的臓器（すなわち膵臓ＬＮ）での異なる免疫細胞サブセットにおけるＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋制御性Ｔ細胞の増大を表す図である。結果は、任意選択で本開示に従う例示的な抗原特異的治療と組み合わせた粘膜送達ＬＬ−ＩＬ−２（例えば、ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ−２）が、最近発症したマウスと比較して膵臓ＬＮにおけるｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋制御性Ｔ細胞数を増加させることを実証している。意外にも、膵臓ＬＮにおける増加は、寛解を示す（「治癒した」）マウスにおいて観察されたが、寛解を示さない（「非治癒」）マウスでは観察されなかった（マンホイトニーＴ検定；＊＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２２Ａ】ＬＬ−ＩＬ−２単独（図２２Ａ）で処置した、およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ（図２２Ｂ）で処置した、最近発症した糖尿病マウスにおける血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表す図である。
【図２２Ｂ】上記と同様である。
【図２３】試験登録時の３５０ｍｇ／ｄＬ未満の開始血中グルコース濃度に従う糖尿病寛解率を表す図である。マウスを、５つの実験処置群；無処置対照、ＬＬ−ＰＩＮＳ、ＬＬ−ＩＬ２、ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２の混合物、および実施例９に記載の全身性免疫調節抗ＣＤ３と組み合わせたＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２の混合物に割付した。処置後の様々な時点で糖尿病のままであったマウスの割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書において使用した省略語および頭字語には以下が含まれうる：
ＢＤ          Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ＢＳＡ        ウシ血清アルブミン
ＣＡＥ        盲腸
ＣＤＳ        コード配列
ＣＦＵ        コロニー形成単位
ＣＯＤまたはＤＣＯ    遠位結腸
ＣＯＰまたはＰＣＯ    近位結腸
ＤＣＯ        遠位結腸
ＥＤＴＡ      エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着法
ＦＡＣＳ      蛍光活性化セルソーティング
ＦＣＳ        ウシ胎仔血清
ＦＯＳ        フルクト−オリゴ糖
ＧＡＤ６５    グルタミン酸デカルボキシラーゼ
ＧＲＰ        シトルリン化グルコース調節タンパク質
ＧＵＳ        グルクロニダーゼ
ＨＲＰ        西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＡ−２      インスリノーマ関連タンパク質２
ＩＡＡ        インスリン自己抗体
ＩＣ          インスリン含有量決定
ＩＧＲＰ      膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質
ＩＬ−２      インターロイキン−２
ＩＮＳ        インスリン
ＩＵ          国際単位
ＬＡＢ        乳酸発酵細菌（複数可）
ＬＬ          ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）
ＬＬＯＱ      定量限界
ＭＣＴ  ｏｉｌ    中鎖トリグリセリド
ＭＬＮ        腸間膜リンパ節
ＭＭＴＴ      混合食負荷試験
ＭＴＴ        ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド
ＭＷＭ        分子量マーカー
ＮＣＢＩ      国立生物工学情報センター
ＮＩＢＳＣ    英国医薬品・医療製品規制庁
ＮＫ  ｃｅｌｌｓ    ナチュラルキラー細胞
ＮＯＤ  ｍｉｃｅ    非肥満糖尿病マウス
ＰＢＳ        リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ        ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＦＡ        パラホルムアルデヒド
ＰＩＮＳ      プロインスリン
ＰＬＮ        膵臓流入領域リンパ節
ｐｐＩＡＰＰ  （プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド
ＰＴＰＲＮ    タンパク質チロシンホスファターゼ、Ｎ型受容体
ＰＴＳ        ホスホトランスフェラーゼシステム
ＲＩＡ        ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
ＳＩＤ／ＤＳＩ    遠位小腸
ＳＩＰ／ＰＳＩ    近位小腸
ＳＰＬ        脾臓
Ｔ１Ｄ        １型糖尿病
ＴＳＬＰ      胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）
ＷＨＯ        世界保健機構
ＸＯ          クロスオーバー
ＺｎＴ８      亜鉛トランスポーター８
【００２７】
本明細書において、対象においてＴ１Ｄを処置するため、Ｔｒｅｇを誘導するため、および／またはＴ１Ｄ特異的抗原（すなわち、自己抗原）に対する寛容を回復するための組成物および方法を提供する。
【００２８】
本明細書において、（１）インターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子とＴ１Ｄ特異的抗原遺伝子とを含むＬＡＢ、または（２）インターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子を含む第１のＬＡＢと、Ｔ１Ｄ特異的抗原を含む第２のＬＡＢとを含む組成物を提供する。一部の例において、ＬＡＢは、ＩＬ−２遺伝子および／またはＴ１Ｄ特異的抗原遺伝子を発現して、ＩＬ−２およびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）を産生する。一部の実施形態において、組成物は、ＬＡＢと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。例示的な担体を本明細書に記載する。一部の例において、医薬組成物は、組成物を対象に粘膜送達するように適合されている。
【００２９】
それを必要とする哺乳動物対象におけるＴ１Ｄを処置する方法が提供される。方法は、本開示に従う組成物を対象に投与すること（例えば、粘膜経路を介して）を含む。例示的な方法は、ＩＬ−２およびＴ１Ｄ特異的抗原（例えば、ＰＩＮＳ）を発現することができるＬＡＢの治療有効量を対象に投与することを含む。
【００３０】
意外にも、有意な残存ベータ細胞機能を有する対象が、本明細書に記載の治療方法に特に良好に反応することが発見されている。このため、一部の実施形態において、本明細書に記載の方法における哺乳動物対象は、Ｔ１Ｄであると最近診断されているおよび／または最近発症したＴ１Ｄを有する。一部の例において、対象は、本明細書に記載のＬＡＢを含む組成物を投与する前に、過去１２カ月、過去２４カ月、または過去３６カ月以内にＴ１Ｄであると診断されていてもよい。
【００３１】
本明細書に記載の方法における一部の例において、ＩＬ−２および抗原ポリペプチドは粘膜に送達される。このアプローチによって、低用量の全身投与にとって必要な用量よりさらに低い低用量ＩＬ−２濃度の送達が起こりうる。このようにして、ＩＬ−２の全身送達に関連するオフターゲット毒性が回避されうる。
【００３２】
定義
本明細書において使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その」は、本文がそれ以外であることを明らかに示している場合を除き、複数形での言及を含む。例えば、用語「１つの細胞」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。同様に、本明細書に記載の医薬の処置または調製のための「１つの化合物」の使用は、本文がそれ以外であることを明らかに示していない限り、そのような処置または調製物のための１つまたは複数の化合物の使用を企図する。
【００３３】
本明細書において使用される用語「含む」は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他を除外しないことを意味すると意図される。組成物および方法を定義するために使用する場合の「本質的にからなる」は、組合せにとってあらゆる本質的に重要である他の要素を除外することを意味する。このため、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法による微量の夾雑物、ならびにリン酸緩衝食塩水、保存剤などの薬学的に許容される担体を除外しない。「からなる」は、本明細書に記載の組成物を投与するための他の成分の微量を超える要素および実質的な方法のステップにおける他の任意の成分を除外することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【００３４】
本明細書において使用される、遺伝子もしくはポリペプチドを「発現する」、またはポリペプチド（例えば、ＩＬ−２ポリペプチドまたはＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチド）を「産生する」という用語はそれぞれ、「発現することができる」、および「産生することができる」を含むことを意味する。例えば、外因性核酸を含有する微生物は、外因性核酸によってコードされるポリペプチドを産生するために十分な条件下（例えば、十分な水和および／または栄養物の存在下）に存在しうる。しかし、微生物は、コードされるポリペプチドを必ずしも能動的に産生しなくてもよい。ＬＡＢ（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））を乾燥（例えばフリーズドライ）させてもよく、そのような状態では休眠中（すなわち、ポリペプチドを能動的に産生していない）であると考えることができる。しかし、ＬＡＢを十分な条件に供すると、例えば対象に投与して放出させると（例えば、対象の消化管に）、ＬＡＢはポリペプチドを産生し始めることができる。このため、本開示の遺伝子もしくはポリペプチドを「発現する」、またはポリペプチドを「産生する」ＬＡＢは、その「休眠」状態のＬＡＢを含む。
【００３５】
参照数値に関連する用語「約」および本明細書において使用されるその文法的同等物は、参照数値そのものと、その参照数値からプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含みうる。例えば、用語「約１０」は、１０と、９〜１１の任意の量および９〜１１を含む任意の量を含む。一部の場合において、参照数値に関連する用語「約」はまた、その参照数値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％の値の範囲を含みうる。
【００３６】
「ＩＬ−２遺伝子」は、「ＩＬ−２ポリペプチド」をコードするインターロイキン２遺伝子を指す。用語「ＩＬ−２遺伝子」は、「ＩＬ−２変種ポリペプチド」をコードする「ＩＬ−２変種遺伝子」を含む。
【００３７】
用語「ＩＬ−２」または「ＩＬ−２ポリペプチド」は、膜結合型および可溶性型を含む、機能的な、例えば完全長のインターロイキン２ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−２ポリペプチド）、ならびに「ＩＬ−２変種ポリペプチド」を指す。
【００３８】
「ＩＬ−２変種」または「ＩＬ−２変種ポリペプチド」は、改変（例えば、切断または変異）されているが、機能的であるＩＬ−２ポリペプチド、例えばヒトＩＬ−２の切断型または変異型を指す。用語「ＩＬ−２変種ポリペプチド」は、対応する野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、活性が増強されたまたは活性が減少しているＩＬ−２ポリペプチドを含む。「ＩＬ−２変種ポリペプチド」は、少なくとも一部のＩＬ−２活性を保持している。
【００３９】
Ｔ１Ｄ特異的抗原
用語「Ｔ１Ｄ特異的自己抗原」、「Ｔ１Ｄ特異的抗原」、「疾患特異的抗原」、「自己（self）抗原」、「自己（auto）抗原」、または「抗原」は、本明細書において互換的に使用される。用語は、本明細書において自己抗原（self-antigen）または自己抗原（auto-antigen）の当技術分野で認識される意味に従って使用され、一般的に抗原が対象自身の免疫系によって認識され、典型的にそのような抗原に対する抗体を産生する、対象自身の体内を起源とする（対象自身の体によって産生される）ポリペプチド／タンパク質を指す。自己免疫疾患は一般的に、特定の疾患特異的自己抗原に関連する。Ｔ１Ｄにおいて、対象の免疫系は、ベータ細胞破壊プロセスに関連する少なくとも１つの抗原に対する抗体を産生しうる。そのような自己抗原には、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、および亜鉛トランスポーター（ＺｎＴ）８が含まれる。臨床的Ｔ１Ｄは、さらにクロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、およびシトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）などの、ベータ細胞によって発現される追加の候補標的分子に関連しうる。
【００４０】
用語「Ｔ１Ｄ特異的抗原遺伝子」は、上記の「Ｔ１Ｄ特異的抗原」をコードする遺伝子を指す。用語「Ｔ１Ｄ特異的抗原遺伝子」は、「Ｔ１Ｄ特異的抗原変種ポリペプチド」をコードする「Ｔ１Ｄ特異的抗原変種遺伝子」を含む。
【００４１】
用語「Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチド」は、対応する野生型ポリペプチドと比較した場合に増強された活性または減少した活性を有しうる、機能的、例えば完全長のポリペプチド、ならびに「Ｔ１Ｄ特異的抗原変種ポリペプチド」を指す。
【００４２】
用語「Ｔ１Ｄ特異的抗原変種」または「Ｔ１Ｄ特異的抗原変種ポリペプチド」は、改変（例えば、切断または変異）されているが機能的であるポリペプチド、例えばヒトＰＩＮＳの切断または変異型を指す。用語「変種ポリペプチド」は、対応する野生型ポリペプチドと比較した場合に増強された活性または減少した活性を有するポリペプチドを含む。「変種ポリペプチド」は、少なくとも一部の生物活性を保持している（機能的ポリペプチド）。ＧＡＤ６５およびＩＡ−２の例示的な変種は、抗原性特性を保持しているＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０００８０９．１（配列番号７）およびＮＰ＿００２８３７．１（配列番号９）と比較してそのトリミング型（例えばそれぞれ、ＧＡＤ６５３７０−５７５およびＩＡ−２６３５−９７９）を含み、このため本開示の組成物および方法において、例えばＴｒｅｇの刺激および対象における寛容の誘導において有用である。一般的に、Ｔ１Ｄ特異的抗原のトリミング型または切断型は、ＬＡＢ（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現され、分泌される。
【００４３】
用語「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図される様式で機能することができる関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合性である条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートされる。
【００４４】
対象
「対象」は、例えば本開示の方法に従って本開示の組成物の投与によって恩典が得られうる生物である。対象は、哺乳動物（「哺乳動物対象」）でありうる。例示的な哺乳動物対象には、ヒト、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ）、ペット（例えば、イヌ、ネコ、およびウサギ）、ならびに他の動物、例えばマウス、ラット、および霊長類が含まれる。一部の例において、哺乳動物対象はヒト患者である。
【００４５】
低用量ＩＬ−２
用語「低用量ＩＬ−２」は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞集団のコンピテンスおよび安定性を促進する、ならびに／またはそれぞれの対象においてナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への発達を促進することができるが、対象におけるナイーブＴ細胞のエフェクターＴ細胞および／もしくはメモリーＴ細胞への分化を刺激する閾値用量／濃度よりは低い、ＩＬ−２ポリペプチドの用量または濃度を指す。Ｔｒｅｇ細胞は、例えばＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）に関して測定した場合に、エフェクターＴ細胞よりＩＬ−２に関して１０〜２０倍低い活性化閾値を有することが示されている。ｐＳＴＡＴ５の下流で、細胞機能にとって重要な多数の遺伝子の活性化には、Ｔｒｅｇ細胞の場合、エフェクターＴ細胞より１００倍低いＩＬ−２用量を必要とする（例えば、Yu, A., et al., Diabetes 2015, 64: 2172-2183を参照されたい）。しかし、ヒトにおける公知の処置レジメンに関連して、Ｔｒｅｇ細胞を刺激するために必要なＩＬ−２の最小用量は確立されていない。
【００４６】
一部の実施形態において、例えばヒトの処置の状況において、低用量ＩＬ−２は、典型的に約０．０１Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約５．４Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲でありうるＩＬ−２ポリペプチドまたはＩＬ−２変種ポリペプチドの用量を指す。低用量は、約０．０１Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲でありうる。低用量は、約０．０２Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．０３Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．０４Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．０５Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．０６Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．０７Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．０８Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．０９Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．１Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．２Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．３Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．４Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．５Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．６Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．７Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．８Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、約０．９Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象、または約１．０Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約３Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲でありうる。低用量は、約０．０２Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約２．５Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲でありうる。低用量はまた、約０．０５Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約２．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲でありうる。低用量は、約０．１Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約１．５Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲でありうる。さらに他の実施形態において、低用量は、約０．３ＭＩＵ／日／対象〜約１．０Ｍ  ＩＵ／日／対象でありうる。低用量は、０．５Ｍ  ＩＵ／日／対象〜約１．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の範囲でありうる。
【００４７】
用語「国際単位」（ＩＵ）は、本明細書において、当技術分野で認識された意味に従って使用され、物質（例えば、ポリペプチド）の量を表す。１つの国際単位を構成する質量または容量は、どの物質が測定されるかに基づいて変化する。世界保健機構（ＷＨＯ）は、生物活性ポリペプチドに関する単位の特徴づけを提供する。例えば、ヒトＩＬ−２の１ＩＵは、生物活性ポリペプチド（ＷＨＯ国際標準物質；ＮＩＢＳＣ８６／５００）の約７３ｐｇと同等である。
【００４８】
低用量抗ＣＤ３
用語「低用量抗ＣＤ３」は、抗ＣＤ３抗体の標準用量未満の抗ＣＤ３抗体の累積用量もしくは濃度、またはＴ１Ｄもしくはがんなどの疾患を処置するためにヒトにおいて規制当局が承認した抗ＣＤ３抗体の用量を指す。例えば、ヒトにおいて、低用量抗ＣＤ３処置は、ヒトにおける抗ＣＤ３抗体の５０ｍｇ未満（累積）の用量を含みうる。例えば、低用量抗ＣＤ３は、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ；約５ｍｇ〜約４０ｍｇ；約１０ｍｇ〜約３０ｍｇ；約１５ｍｇ〜約２５ｍｇ；約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ；約１５ｍｇ〜約２０ｍｇ；または約３０ｍｇ〜約３５ｍｇの累積抗ＣＤ抗体処置を含みうる。低用量（ｌｏｓｅ−ｄｏｓｅ）抗ＣＤ３は、約５０ｍｇ；約４５ｍｇ；約４０ｍｇ；約３５ｍｇ；約３０ｍｇ；約２５ｍｇ；約２０ｍｇ；約１５ｍｇ；約１０ｍｇ；または約５ｍｇの累積抗ＣＤ抗体処置を含みうる。
【００４９】
例えば、一部の場合において、ヒトに投与される抗ＣＤ３抗体の累積投薬量は、特定の期間、例えば１４日の期間で投与される約３４ｍｇまたは約１７ｍｇでありうる。このことは、抗ＣＤ３抗体の約２．４３ｍｇまたは１．２１ｍｇが１４日間の間に投与されることを意味する。
【００５０】
低用量抗ＣＤ３処置はまた、Ｔ１Ｄまたはがんを処置するために規制当局により承認された抗ＣＤ３抗体用量の約８０％；約７０％；約６０％；約５０％；約４０％；約３０％；約２０％；約１０％；約５％；約２％；約１％；約８０％〜約７０％；約７０％〜６０％；約６０％〜５０％；約５０％〜２５％；約４０％〜１５％；または約３０％〜５％の用量を含みうる。
【００５１】
マウスなどの他の哺乳動物において、低用量抗ＣＤ３は、約５μｇ、２．５μｇ、または１μｇより低い投薬量を指しうる。例えば、マウスの処置のために約５μｇを使用することができる。一部の場合において、約２．５μｇをマウスの処置のために使用することができる。他の例において、１μｇをマウスの処置のために使用することができる。マウスに関する総投薬量は、１２．５μｇまたは６μｇの抗ＣＤ３でありうる。
【００５２】
抗ＣＤ３は、少なくとも１日１回から１日５回まで投与することができる。例えば、累積投薬量を満たす限り、１日１回、１日２回、または１日３回。例えば、投与される用量が２．４３ｍｇ／日で、投与を１日２回行う場合、１．２１５ｍｇ／用量を投与することができる。
【００５３】
低用量抗ＣＤ３レジメンを達成するために、投薬量は、累積投薬量を満たす限り、少なくとも３日間；４日間；５日間；６日間；７日間；８日間；９日間；１０日間；１１日間；１２日間；１３日間；１４日間；１５日間；１６日間；１７日間；１８日間；１９日間；２０日間；３０日間；または４０日間連続して、少なくとも１日１回投与することができる。例えば、３４ｍｇ抗ＣＤ３投薬量レジメン（低用量抗ＣＤ３）を１４日間投与する場合、およそ２．４３ｍｇ／日を対象に投与することができる。一部の場合において、低用量抗ＣＤ３は、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１年間、またはそれ超の間連続して、少なくとも１日１回投与することができる。
【００５４】
低用量抗ＣＤ３は、本明細書に記載の組成物の投与と同時に静脈内投与することができる。任意選択で、低用量抗ＣＤ３は、本明細書に記載の組成物の初回投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間、３週間、または１カ月後に投与することができる。さらに、一部の場合において、低用量抗ＣＤ３は、本明細書に記載の組成物の初回投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間、３週間、または１カ月前に投与することができる。
【００５５】
一部の場合において、Ｔ１Ｄおよびがんなどの疾患を処置するために、ヒトにおける抗ＣＤ３抗体の標準用量または規制当局により承認された抗ＣＤ３抗体の用量を、本明細書に記載の組成物の投与の前または後に患者に投与することができる。
【００５６】
ある特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体はテプリズマブでありうる。
【００５７】
患者の亜集団
本明細書に記載の方法を使用して処置される対象は、有意な（例えば、測定可能な）残存ベータ細胞機能を有しうる。そのような状況下では、対象は、処置を中断後または完全に中止後であっても、疾患の寛解を維持しうる。新たに診断された患者は、ある特定の少数の膵島ベータ細胞（ベータ細胞）が診断時に残存していることが多く、そのような患者は、ある特定の少量の内因性のインスリンを産生することができる。そのような患者集団は、本開示の組成物および方法（例えば、低用量ＩＬ−２およびＰＩＮＳ治療）によって処置した場合に、特に良好に恩典を得ることができる。本明細書に記載の処置は、ベータ細胞のさらなる破壊を防止することができ、このため疾患の寛解を誘導しうる。最初のベータ細胞量が処置の有効性に影響を及ぼしうることが見出された。例えば、本開示の組成物によって処置した、処置開始時の血中グルコース濃度が約３５０ｍｇ／ｄＬ以下である最近発症したＮＯＤマウスの５７％において、糖尿病を好転させることができた。疾患の好転は、初回グルコース濃度が３５０ｍｇ／ｄＬ超であるマウスの２２％でしか達成されなかった。さらに、最近発症したマウスにおいて、疾患の好転は、処置を中止した後も安定なままであり、本開示の方法（生物活性ポリペプチドの粘膜送達を伴う）が高血糖症を有効に治し、ベータ細胞に対して長期寛容を回復することができることを示している。しかし、対象のベータ細胞が一度破壊されると、そのような対象はもはや記載の処置から同じように恩典を受けることはできない。
【００５８】
処置
本明細書において使用される用語「処置」、「処置すること」などは、疾患または状態、例えばＴ１Ｄの特徴的な症状または兆候を改善または軽減することを意味する。例えば、Ｔ１Ｄの処置によって、対象において抗原特異的免疫寛容の回復または誘導が起こりうる。他の例において、処置は、自己免疫性糖尿病を停止させるか、または自己免疫性糖尿病を好転させることを意味する。例えば、処置によって残存ベータ細胞量の維持が起こりうる。別の例において、Ｔ１Ｄの処置は、Ｔｒｅｇ細胞の頻度または活性化を増加させることを伴う。他の例において、処置は、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞（例えば、胸腺における）を増大させうる、および／またはＴｒｅｇ細胞の末梢血への遊走を誘導しうる。なお他の例において、処置は、対象（ヒト患者）の臨床マーカーの少なくとも１つの改善を伴う。例えば、処置は、血中および／または尿中Ｃ−ペプチドレベルを上昇させうる。他の例において、処置は、対象（例えば、ヒト患者）の血中グルコースレベル（例えば、食物摂取に応答して、または絶食時グルコースレベル）を低下させうる；対象における適切な血中グルコースレベルを維持するために必要なインスリンの注射量を低減させうる；対象における糖尿病関連自己抗体レベルを低減させうる、および／またはＣ−ペプチドレベルを増加／保存させうる（例えば、経口グルコース耐糖能試験後の）。処置は、連続的／長期的処置、または対象が疾患もしくは状態の臨床症状を、処置の中止後有意な期間（例えば、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、または少なくとも５年）有しない処置を意味しうる。
【００５９】
本明細書において使用されるように、これらの用語は、前記疾患または状態に罹患する前に、疾患もしくは状態またはそれに関連する症状の重症度を低減することを含めて、疾患もしくは状態または疾患もしくは状態に関連する症状の発症を予防または遅らせることも包含する。罹患前のそのような予防または低減とは、投与時に疾患または状態に罹患していない患者への本明細書に記載の化合物または組成物の投与を指す。「予防」はまた、例えば改善期間後の、疾患もしくは状態、またはそれに関連する症状の再発の予防もしくは再燃−予防も包含する。
【００６０】
治療有効量
本明細書において使用される用語「治療有効量」は、所望の処置レジメンに従って投与した場合に、所望の治療効果または応答を誘発する本開示の非病原性微生物または組成物の量を指す。化合物または組成物は典型的に、１日１回、または１日に複数回投与した場合に、治療有効量と同等の活性成分の量を含有する、単位剤形、例えば錠剤またはカプセル剤で提供される。
【００６１】
当業者は、所望の治療効果（例えば、Ｔ１Ｄの有効な処置のため）を達成するために必要である組換え微生物の治療有効量が、例えば微生物によって発現されるＩＬ−２ポリペプチドの性質、ＬＡＢによって発現される抗原ポリペプチドの性質、投与経路、ならびにレシピエントの年齢、体重、および他の特徴に応じて変化することを認識するであろう。
【００６２】
最近発症したＴ１Ｄ
一部の実施形態において、対象は最近発症したＴ１Ｄを有する。用語「最近発症したＴ１Ｄ」、「新規発症したＴ１Ｄ」、または「最近発症した疾患」は、最近（例えば、約３カ月以内、約６カ月以内、約９カ月以内、約１２カ月以内、約１５カ月以内、約１８カ月以内、約２４カ月以内、約３０カ月以内、約３６カ月以内、約４２カ月以内、約４８カ月以内、約５４カ月以内、または約６０カ月以内）、Ｔ１Ｄと診断されている対象（例えばヒト患者）の状態を指す。
【００６３】
ヒトにおいて、Ｔ１Ｄの診断前および後に起こるベータ細胞機能の低下は、診断マーカー化合物を使用して測定することができる。例えば、Ｃ−ペプチドは、インスリンと等量で産生され（プロインスリンの酵素的切断時）、従って内因性のインスリン分泌の測定として使用することができる（インスリンによって処置されている患者を含む）。Ｃ−ペプチドは、糖尿病患者の臨床での管理に使用されており、Ｃ−ペプチドを測定するアッセイ系は当業者に公知である。例えば、Jones A.G. and Hattersley A.T., Diabetic Medicine 2013, 30: 803-817; Little RR et al., Clin. Chem. 2008, 54: 1023-1026; Wiedmeyer et al., Clin. Chem. 2007, 53: 784-787を参照されたい。
【００６４】
Ｃ−ペプチド値は、ｎｍｏｌ／Ｌ（１ｎｍｏｌ／Ｌは１０００ｐｍｏｌ／Ｌであり、約３ｎｇ／ｍＬに等しい）で測定することができる。Ｃ−ペプチドは、対象の血液中または尿中で測定することができる。血中Ｃ−ペプチドレベルは、非絶食時対象（ランダムＣ−ペプチド）、絶食時対象（絶食時Ｃ−ペプチド）、または混合液体食もしくはグルカゴン（刺激Ｃ−ペプチド）などの食事刺激剤によって刺激した対象において測定することができる。尿中のＣ−ペプチドは、２４時間の期間にわたって対象によって分泌されるＣ−ペプチドの全量として測定することができる。尿に含有されるＣ−ペプチドはしばしば、Ｃ−ペプチドとクレアチニンとの間の比率として測定される。
【００６５】
一部の実施形態において、本開示の組成物を投与する前の対象（例えば、ヒト）（例えば、最近発症したＴ１Ｄを有する対象）は、約１ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるが、少なくとも約０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約０．４ｎｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約０．３ｎｍｏｌ／Ｌ、または少なくとも約０．２ｎｍｏｌ／Ｌの絶食時Ｃ−ペプチド濃度を有する。他の実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、約４ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるが、少なくとも約１ｎｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約０．８ｎｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約０．７ｎｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約０．６ｎｍｏｌ／Ｌ、または少なくとも約０．５ｎｍｏｌ／Ｌの刺激された血中Ｃ−ペプチド濃度を有する。なお他の実施形態において、最近発症したＴ１Ｄを有する対象（例えば、ヒト）は、約４未満であるが、少なくとも約１、少なくとも約０．９、少なくとも約０．８、少なくとも約０．７、少なくとも約０．６、少なくとも約０．５、少なくとも約０．４、または少なくとも約０．３の食後尿中Ｃ−ペプチド：クレアチニン比（ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌ）を有する。
【００６６】
他の実施形態において、最近発症したＴ１Ｄ対象（例えば、ヒト患者）は、対象の血清または血液中のインスリン自己抗体（ＩＡＡ）を測定することによって同定することができる。一部の例において、対象は、ＩＡＡ試験陽性である。血清中ＩＡＡ濃度はまた、疾患の進行または処置の進行を測定するために使用されうる。インスリン自己抗体を測定する方法が記述されている。例えば、Demeester et al., Diabetes Care 2015, 38(4): 644-651を参照されたい。
【００６７】
粘膜
用語「粘膜（mucosa）」または「粘膜（mucous membrane）」は、本明細書においてその当技術分野で認識される意味に従って使用される。「粘膜」は、口腔粘膜、直腸粘膜、胃粘膜、腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、頬粘膜、気管支または肺粘膜、および鼻または嗅覚粘膜などの、体に見出される任意の粘膜でありうる。
【００６８】
本明細書において使用される用語「粘膜送達」は、当技術分野で認識される意味に従って使用され、すなわち、例えば本開示の組成物を粘膜に接触させることを介しての粘膜への送達を意味する。口腔粘膜送達には、頬側、舌下、および歯肉送達経路が含まれる。従って、一部の実施形態において、「粘膜送達」は、胃送達、腸送達、直腸送達、頬側送達、肺送達、眼送達、鼻送達、膣送達、および経口送達を含む。
【００６９】
用語「粘膜寛容」は、対象が、粘膜経路を介して抗原に曝露された後の、哺乳動物対象（例えば、ヒト患者）における抗原に対する特異的免疫応答の阻害を指す。典型的に、前記粘膜寛容は全身性の寛容である。低用量の経口寛容は、低用量の抗原によって誘導される経口寛容であり、ナイーブ宿主に寛容を伝達することができるシクロホスファミド感受性制御性Ｔ細胞によって媒介される能動免疫抑制によって特徴づけられる。高用量の経口寛容は、高用量の抗原によって誘導される経口寛容であり、シクロホスファミド処置に対して非感受性であり、アネルギーおよび／または抗原特異的Ｔ細胞の欠如を介してＴ細胞の反応性低下の誘導へと進行する。シクロスファミドに対する感受性の差を使用して、低用量と高用量の寛容を識別することができる。Strobel et al., Immunology 1983, 49:451-456。例示的な経口寛容は、Mayer and Shao, Nature Rev. Immunol. 2004, 4:407-419に記載される低用量の経口寛容である。
【００７０】
免疫調節化合物
一部の実施形態において、本開示は、対象が追加の（すなわち、ＩＬ−２に加えて）免疫調節化合物によって同時に処置されていない、Ｔ１Ｄの処置のための方法を提供する。このため、対象はＴ１Ｄ特異的抗原およびＩＬ−２単独によって処置される。
【００７１】
一部の実施形態において、本開示は、対象が追加の免疫調節化合物によって同時に処置されている、Ｔ１Ｄの処置のための方法を提供する。このため、対象は、Ｔ１Ｄ特異的抗原、ＩＬ−２、および追加の免疫調節化合物によって処置される。
【００７２】
用語「免疫調節化合物」または「免疫調節剤」は、本明細書においてその当技術分野で認識される意味に従って使用される。免疫調節化合物は、当業者に公知の任意の免疫調節化合物でありうる。当業者は、本明細書に記載の処置に免疫調節化合物を含めるまたは含めない選択を有しうる。処置レジメンに免疫調節化合物を含める決定は、中でも、本明細書に記載の処置の成績、対象の遺伝的形質、および／または生理状態によって左右されうる。
【００７３】
一部の実施形態において、免疫調節化合物は、寛容誘導化合物である。寛容誘導は、例えば制御性Ｔ細胞を誘導することによって、または間接的には、例えば未成熟樹状細胞を活性化して寛容の樹状細胞を作製することによって、および／または成熟樹状細胞における「共刺激」因子の発現を誘導するＴｈ２免疫応答を阻害することによって、得ることができる。免疫調節化合物および免疫抑制化合物は、当業者に公知であり、これにはスペルグアリンなどの細菌代謝物、タクロリムスまたはシクロスポリンなどの真菌および放線菌代謝物、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＴＧＦβ（制御性Ｔ細胞の選択的アジュバントとして）、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＳＬＰ、およびＲａｎｋ−Ｌ（選択的寛容誘発性ＤＣ誘導剤として）などの免疫抑制性サイトカイン、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ３などの抗体および／またはアンタゴニスト、ならびにＣＴＬ−４１  ｇまたはＣＴＬＡ−４アゴニスト融合タンパク質などのタンパク質、ペプチド、または融合タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、免疫調節化合物は、免疫抑制化合物である。免疫抑制化合物は、免疫抑制サイトカインまたは抗体でありうる。他の実施形態において、免疫抑制サイトカインは、寛容増強サイトカインまたは抗体である。用語「免疫調節化合物」がまた、その機能的相同体も含むことは、当業者によって認識されるであろう。機能的相同体は、意図される目的に関して本質的に同じまたは類似の機能を有するが、構造が異なりうる分子である。一部の例において、免疫調節化合物は、抗ＣＤ３、またはその機能的相同体である。
【００７４】
ＬＡＢ
本開示は、遺伝子改変乳酸発酵細菌（ＬＡＢ）の使用に関する。ＬＡＢ株は、ラクトコッカス（Lactococcus）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種、ストレプトコッカス（Streptococcus）種、またはエンテロコッカス（Enterococcus）種でありうる。
【００７５】
本明細書において使用される、ラクトコッカス（Lactococcus）またはラクトバチルス（Lactobacillus）は、特定の種または亜種に限定されないが、ラクトコッカス（Lactococcus）もしくはラクトバチルス（Lactobacillus）種または亜種のいずれかを含むことを意味する。例示的なラクトコッカス（Lactococcus）種には、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ピスシウム（Lactococcus piscium）、ラクトコッカス・プランタルム（Lactococcus plantarum）、およびラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）が含まれる。一部の例において、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）は、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニアエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、またはラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. Lactis）である。
【００７６】
例示的なラクトバチルス（Lactobacillus）種には、ラクトバチルス・アセトトレランス（Lactobacillus acetotolerans）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アギリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチルス・アルギダス（Lactobacillus algidus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・アミノリチクス（Lactobacillus amylolyticus）、ラクトバチルス・アミロフィルス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバチルス・アビアリウス（Lactobacillus aviarius）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アラフィノサス（Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus）、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス（Lactobacillus aviarius subsp. aviarius）、ラクトバチルス・ババリクス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチルス・ビフェルメンタンス（Lactobacillus bifermentans）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カルニス（Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種アラクトサス（Lactobacillus casei subsp. alactosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、ラクトバチルス・カゼイ亜種シュードプランタルム（Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum）、ラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ亜種トレランス（Lactobacillus casei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・カテナフォルミス（Lactobacillus catenaformis）、ラクトバチルス・セロビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・コンフサス（Lactobacillus confusus）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルケンス（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・カルバタス亜種カルバタス（Lactobacillus curvatus subsp. curvatus）、ラクトバチルス・カルバタス亜種メリビオサス（Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・ダイバージェンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・フォルニカリス（Lactobacillus fornicalis）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・フルクトサス（Lactobacillus fructosus）、ラクトバチルス・ガリナルム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）��ラクトバチルス・グラミニス（Lactobacillus graminis）、ラクトバチルス・ハロトレランス（Lactobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamsteri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ヘテロヒオキイ（Lactobacillus heterohiochii）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホモヒオキイ（Lactobacillus homohiochii）、ラクトバチルス・イネルス（Lactobacillus iners）、ラクトバチルス・インテスティナリス（Lactobacillus intestinalis）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）、ラクトバチルス・ケフィルグラナム（Lactobacillus kefirgranum）、ラクトバチルス・クンケーイ（Lactobacillus kunkeei）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus leichmannii）、ラクトバチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindneri）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Lactobacillus malefermentans）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス・マルタロミクス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・マニホチボランス（Lactobacillus manihotivorans）、ラクトバチルス・マイナー（Lactobacillus minor）、ラクトバチルス・ミニタス（Lactobacillus minutus）、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・ムリナス（Lactobacillus murinus）、ラクトバチルス・ナゲリ（Lactobacillus nagelii）、ラクトバチルス・オリス（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラクトバチルス・パラブクネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種トレランス（Lactobacillus paracasei subsp. tolerans）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Lactobacillus parakefiri）、ラクトバチルス・パラリメンタリウス（Lactobacillus paralimentarius）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ペロレンス（Lactobacillus perolens）、ラクトバチルス・ピスシコラ（Lactobacillus piscicola）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ポンチス（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・リマエ（Lactobacillus rimae）、ラクトバチルス・ロゴサエ（Lactobacillus rogosae）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・サケイ亜種カモサス（Lactobacillus sakei subsp. camosus）、ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリシニウス（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Lactobacillus salivarius subsp. salivarius）、ラクトバチルス・サンフランシセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチルス・シャーピー（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・スエビカス（Lactobacillus suebicus）、ラクトバチルス・トリコデス（Lactobacillus trichodes）、ラクトバチルス・ウリ（Lactobacillus uli）、ラクトバチルス・ワクシノステルカス（Lactobacillus vaccinostercus）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、ラクトバチルス・ビリデセンス（Lactobacillus viridescens）ラクトバチルス・ビツリナス（Lactobacillus vitulinus）、ラクトバチルス・キシロサス（Lactobacillus xylosus）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種マリ（Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス亜種ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis subsp. Yamanashiensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィズム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、およびビフィドバクテリウム・インファンチス（Bifidobacterium infantis）が含まれる。一部の例においてＬＡＢは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ）である。
【００７７】
さらなる例において、細菌は、エンテロコッカス・アルセジニス（Enterococcus alcedinis）、エンテロコッカス・アクイマリナス（Enterococcus aquimarinus）、エンテロコッカス・アシニ（Enterococcus asini）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium）、エンテロコッカス・カカエ（Enterococcus caccae）、エンテロコッカス・カメリアエ（Enterococcus camelliae）、エンテロコッカス・カニンテスチニ（Enterococcus canintestini）、エンテロコッカス・カニス（Enterococcus canis）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコラム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・コランバエ（Enterococcus columbae）、エンテロコッカス・デブリエセイ（Enterococcus devriesei）、エンテロコッカス・ジエストラメナエ（Enterococcus diestrammenae）、エンテロコッカス・ジスパー（Enterococcus dispar）、エンテロコッカス・デュランス（Enterococcus durans）、エンテロコッカス・エウレケンシス（Enterococcus eurekensis）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ギルブス（Enterococcus gilvus）、エンテロコッカス・ヘモペロキシダス（Enterococcus haemoperoxidus）、エンテロコッカス・ヘルマニエンシス（Enterococcus hermanniensis）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・イタリクス（Enterococcus italicus）、エンテロコッカス・ラクチス（Enterococcus lactis）、エンテロコッカス・レマニイ（Enterococcus lemanii）、エンテロコッカス・マロドラツス（Enterococcus malodoratus）、エンテロコッカス・モラビエンシス（Enterococcus moraviensis）、エンテロコッカス・ムンディティ（Enterococcus mundtii）、エンテロコッカス・オリバ（Enterococcus olivae）、エンテロコッカス・パレンス（Enterococcus pallens）、エンテロコッカス・フェニクリコラ（Enterococcus phoeniculicola）、エンテロコッカス・プランタルム（Enterococcus plantarum）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Enterococcus pseudoavium）、エンテロコッカス・クエベセンシス（Enterococcus quebecensis）、エンテロコッカス・ラフィノサス（Enterococcus raffinosus）、エンテロコッカス・ラッティ（Enterococcus ratti）、エンテロコッカス・リボルム（Enterococcus rivorum）、エンテロコッカス・ロタイ（Enterococcus rotai）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Enterococcus saccharolyticus）、エンテロコッカス・シレシアクス（Enterococcus silesiacus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococcus solitarius）、エンテロコッカス・スルフレウス（Enterococcus sulfureus）、エンテロコッカス・テルミチス（Enterococcus termitis）、エンテロコッカス・タイランディクス（Enterococcus thailandicus）、エンテロコッカス・ウレアシチクス（Enterococcus ureasiticus）、エンテロコッカス・ウレイリチクス（Enterococcus ureilyticus）、エンテロコッカス・ビイキエンシス（Enterococcus viikkiensis）、エンテロコッカス・ビロルム（Enterococcus villorum）、およびエンテロコッカス・シャンファンゲンシス（Enterococcus xiangfangensis）からなる群から選択される。
【００７８】
さらなる例において、細菌は、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）、ストレプトコッカス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・ジスガラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・エキヌス（Streptococcus equinus）、ストレプトコッカス・イニエ（Streptococcus iniae）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ミレリ（Streptococcus milleri）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサンギニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・ペロリス（Streptococcus peroris）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・シュードニューモニエ（Streptococcus pseudopneumoniae）、ストレプトコッカス・パイオジェンス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッティ（Streptococcus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・チグリヌス（Streptococcus tigurinus）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サンギニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Streptococcus vestibularis）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptococcus zooepidemicus）からなる群から選択されうる。
【００７９】
例示的なＬＡＢ株は、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクチス亜種ホルドニアエ（Lactococcus lactis subsp. hordniae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、およびラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス（Lactococcus lactis subsp. Lactis）を含む、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）またはその亜種のいずれかでありうる。別の態様において、ＬＡＢ株は、Gasson, M.J. (1983) J. Bacterid. 154:1-9に記載されるように正常な増殖能および乳中での酸産生能を失っているプラスミドフリーラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株ＭＧ１３６３などの生物学的封じ込め系、またはSorensen et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258; およびGlenting et al. (2002) 68:5051-5056に記載されるトレオニン−ならびにピリミジン栄養要求誘導体Ｌ．ラクチス（L. lactis）株でありうる。
【００８０】
組換え細菌宿主−ベクター系は、生物学的封じ込め系でありうる。生物学的封じ込めは当業者に公知であり、栄養要求変異、例えばＴｈｙＡ変異またはその同等物などの自殺性栄養要求変異の導入により実現することができる。あるいは、生物学的封じ込めは、例えば数世代後に失われる不安定なエピソーム構築物を使用することなどによって、ＩＬ−２ポリペプチドまたはＩＬ−２変種をコードする遺伝子を有するプラスミドのレベルで実現することができる。望ましければ高レベルの封じ込めを確実にするために、プラスミド不安定性および栄養要求性などのいくつかのレベルの封じ込めを合わせることができる。
【００８１】
構築物
本明細書に記載されるように、ＬＡＢは、ＩＬ−２ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原をその意図される部位、すなわち粘膜に送達する。例えば、ＬＡＢは、ＩＬ−２ポリペプチドを発現し、その後ＩＬ−２ポリペプチドは細胞表面上に露出するか（ＩＬ−２の膜結合型を使用する場合）、または分泌される（ＩＬ−２の分泌型を使用する場合）。従って、特定の実施形態において、Ｌ．ラクチス（L. lactis）などのＬＡＢは、細胞内でＩＬ−２ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原を発現することができる発現ベクターを含む。例えば、ポリペプチドは、意図される粘膜、例えば消化管に存在する条件下で細胞表面上に露出される。ＬＡＢは、ＩＬ−２ポリペプチドが、レシピエントにおいてＴ１Ｄを処置するために有効であるＩＬ−２の低用量を提供するために十分な程度に細胞表面上に露出するように、細胞内でＩＬ−２ポリペプチドを発現することができる発現ベクターを含みうる。より多くの量のＩＬ−２ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原を発現するＬＡＢ株を使用する場合、Ｔ１Ｄの処置に必要なＬＡＢは、より少ない回数でより低用量でありうる。このため、当業者は、ＩＬ−２ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原の所望の量を送達するために提供されるＬＡＢ株の量を調節することができる。
【００８２】
通常、発現系は、典型的に宿主微生物において配列の発現を指示することができるプロモーターに作動可能に連結された、ＩＬ−２ポリペプチドおよび／またはＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む。適切には、発現されるＩＬ−２ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原は、宿主の好ましいコドン使用に適合させた核酸配列によってコードすることができる。構築物はさらに、当業者に公知であるように、選択された宿主において作動可能である、エンハンサー、転写開始配列、シグナル配列、レポーター遺伝子、転写終止配列などを含む、（全ての）他の適した要素を含みうる。
【００８３】
構築物は典型的に、宿主の形質転換にとって適した形態で、および／またはベクター、プラスミド、もしくはミニ染色体などの宿主において安定に維持することができる形態である。ＬＡＢ株、例えばＬ．ラクチス（L. lactis）に導入するための、プロモーター配列、ターミネーター断片、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含む核酸を含有する、適したベクターを選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えばファージ、またはファージミドでありうる。さらなる詳細は、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに見出すことができる。
【００８４】
例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、シークエンシング、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析において、核酸を操作するための多くの公知の技術およびプロトコールは、Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。一実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドのコード配列は、オペロン、すなわちマルチシストロン性発現のための核酸構築物に含有されうる。オペロンにおいて、プロモーターからの転写によって、それぞれが上流に自身の適切に配置されたリボソーム結合部位を有する２つ以上のコード配列を含むｍＲＮＡが得られる。このため、２つ以上のポリペプチドを、単一のｍＲＮＡから翻訳することができる。オペロンの使用により、ＩＬ−２ポリペプチドおよびＴ１Ｄ特異的抗原ポリペプチドの発現を協調させることができる。細菌宿主細胞におけるポリシストロン性発現系は、例えば米国特許出願公開第２０１４／０１０５８６３号明細書に記述されている。
【００８５】
安定にトランスフェクトされたＬＡＢ株を得るために、すなわち、ＩＬ−２ポリペプチドをコードする遺伝子および／またはＴ１Ｄ特異的抗原遺伝子を、宿主ＬＡＢゲノムに組み込むことができる。安定にトランスフェクトされたＬＡＢ株を確立するための技術は、当技術分野で公知である。例えば、ＩＬ−２ポリペプチドおよび／またはＴ１Ｄ特異的抗原遺伝子を、相同組換えによって宿主ゲノムにクローニングしてもよい。典型的に、宿主の必須の遺伝子を、相同組換え事象、例えば遺伝子の欠失、必須の遺伝子によってコードされるタンパク質の不活性型を生じる１つもしくは複数のアミノ酸置換、または必須の遺伝子によってコードされるタンパク質の切断型を生じるフレームシフト変異などによって破壊する。一実施形態において、必須の遺伝子は、ｔｈｙＡ遺伝子である。例示的な技術は、国際公開第０２／０９０５５１号パンフレットに記載される。形質転換プラスミドは、それが破壊された必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子を補完することができない限り、特に限定されない。プラスミドは、自己複製性でありえて、典型的に１つもしくは複数の目的の遺伝子および１つもしくは複数の耐性マーカーを有するか、またはプラスミドが組み込みプラスミドである。後者の場合、必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子の機能が破壊されることから、必須遺伝子座、例えばｔｈｙＡ部位で組み込みを引き起こすことによって、組み込みプラスミドそのものを使用して必須遺伝子を破壊することができる。典型的にｔｈｙＡ遺伝子などの必須遺伝子を、２回の相同組換えによって、ｔｈｙＡ標的部位などの必須遺伝子への挿入を標的とする標的化配列が隣接する目的の遺伝子または複数の遺伝子を含むカセットに置き換える。これらの標的化配列は、標的部位への目的の遺伝子の組み込みを可能にするために十分に長く十分に相同であると認識される。
【００８６】
ＩＬ−２ポリペプチドおよび／またはＴ１Ｄ特異的抗原をコードする遺伝子構築物はこのため、宿主細胞の染色体外に、典型的に自身の複製開始点を使用して自律複製して存在しうるか、またはＬＡＢゲノムＤＮＡ、例えばラクトコッカス（Lactococcus）染色体に組み込まれうる。後者の場合、核酸の単一もしくは複数のコピーが組み込まれてもよく、組み込みは、染色体のランダムな部位で起こってもよく、または上記のように、その既定の部位で、例えばラクトコッカス（Lactococcus）、例えばラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のｔｈｙＡ座で起こりうる。
【００８７】
従って、ＩＬ−２ポリペプチドおよび／またはＴ１Ｄ特異的抗原をコードする遺伝子構築物は、宿主ＬＡＢ細胞のゲノム、例えば染色体への遺伝子構築物の挿入をもたらすように構成された配列をさらに含みうる。
【００８８】
一例において、宿主ＬＡＢ細胞のゲノム、例えば染色体内の特定の部位への遺伝子構築物の挿入は、相同組換えによって促進されうる。例えば、本明細書に記載の遺伝子構築物は、宿主ＬＡＢ細胞のゲノム、例えば染色体内の前記組み込み部位に対して１つまたは複数の相同性領域を含みうる。前記ゲノム、例えば染色体部位での配列は、天然、すなわち天然起源でありうるか、または前回の遺伝子操作によって導入された外因性の配列でありうる。
【００８９】
例えば、相同性領域は、少なくとも５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ  ７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、または１０００ｂｐ超でありうる。
【００９０】
一例において、本明細書に記載の遺伝子構築物に存在する関連する発現単位のそれぞれの側に隣接する、２つの相同性領域を含めてもよい。そのような配置は、関連する配列、すなわち、少なくとも、目的の抗原をコードする配列および目的の抗原の発現をもたらす配列を宿主細胞に挿入するために都合がよい。特に細菌宿主において相同組換えを実施する方法、および組換え体に関して選択する方法は、一般的に当技術分野で公知である。
【００９１】
ＬＡＢ株の形質転換方法は当業者に公知であり、例えばプロトプラスト形質転換法および電気穿孔法である。
【００９２】
相同な発現および／またはＬＡＢ、例えばＬ．ラクチス（L. lactis）に存在する発現ベクター上の分泌シグナルを使用することによって、高度の発現を達成することができる。発現シグナルは当業者に明らかである。発現ベクターは、それが組み込まれているＬＡＢ、例えばＬ．ラクチス（L. lactis）に応じて発現に関して最適化することができる。例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、カゼイ（casei）およびプランタルム（plantarum）において十分なレベルの発現を生じる特異的発現ベクターが公知である。その上、非病原性、非定着性、非侵襲性の食品等級の細菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）において異種抗原を発現させるために開発されている系が公知である（例えば、英国特許出願公開第２２７８３５８号明細書）。例示的な構築物は、ＩＬ−２ポリペプチドＴ１Ｄ特異的抗原をコードするヌクレオチド配列が記載されている国際出願番号ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５（国際公開第９６／３２４８７号パンフレット）に記載されるマルチコピー発現ベクターを含む。そのような構築物は、乳酸細菌、特にラクトバチルス（Lactobacillus）において高レベル発現で所望の抗原を発現させるために適しており、同様に発現産物を細菌細胞の表面に向けるために有利に使用することができる。構築物（例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５の構築物）は、ＩＬ−２ポリペプチドおよび／またはＴ１Ｄ特異的抗原をコードする核酸配列の前に、リボソーム認識およびＲＮＡ安定化にとって必要な少なくとも最小の配列を含む５’非翻訳核酸配列が存在するという点において特徴づけられうる。これの後に翻訳開始コドンが続き、この（直）後に、乳酸細菌の遺伝子または断片の構造的もしくは機能的同等物の翻訳された核酸配列の５’末端部分の少なくとも５コドンの断片が続きうる。断片はまた、プロモーターによっても制御することができる。本開示の１つの態様は、宿主において異種遺伝子の高レベルの調節された発現、および発現と分泌とのカップリングを可能にする方法を提供する。別の実施形態において、Ｔ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼおよびその同族のプロモーターを使用して、国際公開第９３／１７１１７号パンフレットに従う強力な発現系を開発する。一実施形態において、発現プラスミドはｐＴ１  ＮＸに由来しうる。
【００９３】
本明細書において用いられるプロモーターは、典型的に細菌において構成的に発現される。構成的プロモーターの使用により、発現を生じるために誘導剤または他の調節シグナルを供給する必要がなくなる。典型的に、プロモーターは、細菌宿主細胞が生存したままで、すなわち増殖が維持されない場合であっても一部の代謝活性を保持するレベルで発現を指示する。その上都合がよいことには、そのような発現は低レベルでありうる。例えば、発現産物が細胞内に蓄積すると、発現レベルによって、細胞タンパク質の約１０％未満、任意選択で約５％または５％未満、例えば約１〜３％の発現産物の蓄積が起こりうる。プロモーターは、用いられる細菌に対して同種でありうる、すなわち天然でその細菌において見出されるプロモーターでありうる。例えば、ラクトコッカスのプロモーターを、ラクトコッカス（Lactococcus）において使用することができる。ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（または他のラクトコッカス（Lactococcus））において使用するための例示的なプロモーターは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の染色体に由来する「Ｐ１」である（Waterfield NR et al., Gene 1995, 165(1):9-15）。プロモーターの別の例は、ｕｓｐ４５プロモーターである。他の有用なプロモーターは、米国特許第８，７５９，０８８号明細書および米国特許出願公開第２０１４／０１０５８６３号明細書に記載されている。
【００９４】
核酸構築物または複数の構築物は、分泌シグナル配列を含みうる。このため、一部の実施形態において、ＩＬ−２および／またはＴ１Ｄ特異的抗原をコードする核酸は、例えばシグナル配列をコードする核酸配列を、ポリペプチドをコードする核酸配列に適切にカップリングさせることによって、ポリペプチドの分泌を提供しうる。核酸を有する細菌が抗原を分泌する能力は、生物の生存を維持する培養条件中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。例示的な分泌シグナル配列は、ＬＡＢ株において活性を有する配列を含む。そのような配列には、バチルス・アミロリケタシエンス（Bacillus amyloliquetaciens）のα−アミラーゼ分泌リーダー、またはグラム陽性およびグラム陰性宿主の両方で機能することが知られているブドウ球菌（Staphylococcus）の一部の株によって分泌されるスタフィロキナーゼ（Staphylokinase）酵素の分泌リーダー（Rapoport, Current Opinion in Biotechnology 1990, 1: 21-27）、または多数の他のバチルス（Bacillus）の酵素もしくはＳ−層タンパク質からのリーダー配列（Harwood and Cutting, “Molecular Biological Methods for Bacillus,” John Wiley & Co. 1990の３４１〜３４４ページを参照されたい）が含まれうる。一実施形態において、前記分泌シグナルは、ｕｓｐ４５に由来する（Van Asseldonk et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 240:428-434）。一部の実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドまたはＩＬ−２変種は構成的に分泌されうる。
【００９５】
ＩＬ−２ポリペプチド
ＩＬ−２ポリペプチドの例は、膜結合型または分泌型のいずれかでの野生型ヒトＩＬ−２、および任意のＩＬ−２変種ポリペプチド、例えば野生型ＩＬ−２または対応する成熟ＩＬ−２ポリペプチドと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。野生型ヒトＩＬ−２の例示的なアミノ酸配列は、配列番号１によって表され、例示的なＩＬ−２コード核酸配列は配列番号２によって表される。成熟野生型ヒトＩＬ−２は、配列番号３によって表される。
【００９６】
ＩＬ−２のシグナルペプチド（配列番号４）を下線で示し、これは配列番号１のアミノ酸１〜２０を表す。ＩＬ−２のシグナルペプチドを、本明細書に記載の細菌の分泌シグナル配列（例えば、ＳＳｕｓｐ４５）に置換してもよい。この実施形態に従う例示的なヌクレオチド配列は、配列番号５によって表される。
【００９７】
用語「ＩＬ−２変種」は、ネイティブＩＬ−２ポリペプチド鎖の１つもしくは複数の部位でのアミノ酸挿入、欠失、置換、および／または改変によって特徴づけられるＩＬ−２ポリペプチドを含む。本開示に従って、任意のそのような挿入、欠失、置換、および改変によって、少なくとも一部のＩＬ−２ＲＰ結合活性を保持するＩＬ−２変種ポリペプチドが得られる。例示的な変種は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１０個超のアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。ＩＬ−２変種は、ＩＬ−２の他の位置での保存的改変および置換（すなわち、変種ポリペプチドの二次または三次構造に対して最小の効果を有する改変）を有しうる。そのような保存的置換は、Dayhoff in ‘The Atlas of Protein Sequence and Structure 5’ (1978), およびArgos in EMBO J., 8:779-785 (1989)によって記載される置換を含む。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化を表す：Ｉ群：アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン；ＩＩ群：システイン、セリン、チロシン、トレオニン；ＩＩＩ群：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン；ＩＶ群：リジン、アルギニン、ヒスチジン；Ｖ群：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン；およびＶＩ群：アスパラギン酸、グルタミン酸。
【００９８】
一部の例において、ＩＬ−２は、野生型またはネイティブ分子の１２５位で通常存在するシステインが、セリンまたはアラニンなどの中性アミノ酸に置換されている、米国特許第４，５１８，５８４号明細書に記載の変種である。あるいは、または共に、ＩＬ−２変種は、野生型またはネイティブ分子の１０４位に通常存在するメチオニンがアラニンなどの中性アミノ酸に置き換えられている、１９８５年１２月１７日に出願された、米国出願第０６／８１０，６５６号明細書に記載の変種でありうる。一部の例において、ＩＬ−２変種は、ネイティブＩＬ−２の最初の５個のＮ末端アミノ酸のうちの１つまたは複数が欠失していてもよい。ＢＡＹ５０−４７９８（ＩＬ−２のＮ８８Ｒ変異を含有する）などの、ＣＤ１２２（より低いＩＬ−２毒性を達成するため）に対する結合親和性が減少したＩＬ−２突然変異タンパク質もまた生成された。
【００９９】
使用されうるＩＬ−２の他の型には、アルデスロイキン、またはプロロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、テセロイキン（Ｒｏｃｈｅ）、バイオロイキン（Ｇｌａｘｏ）において見出される配列などのＩＬ−２変種配列、ならびにTaniguchi et al., Nature 1983, 302(5906):305-10、およびDevos et al., Nucleic Acids Res. 1983, 11(13): 4307-23；欧州特許出願第９１，５３９号明細書および第８８，１９５号明細書；米国特許第４，５１８，５８４号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１１２号明細書；米国特許第７，５６９，２１５号明細書；米国特許第５，２２９，１０９号明細書；米国特許出願公開第２００６／０２６９５１５号明細書；欧州特許出願公開第１７３０１８４号明細書；ならびにＰＣＴ出願国際公開第２００５／０８６７５１号パンフレットに記載の変種が含まれる。
【０１００】
一部の実施形態において、ＩＬ−２変種は、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、高親和性ＩＬ−２受容体に対する結合能が減少しているが、中間親和性のＩＬ−２受容体に結合する変種ＩＬ−２の親和性を保存している。一部の実施形態において、成熟ＩＬ−２ポリペプチドは、１、２、または３つのアミノ酸置換によって特徴づけられ、例えば置換アミノ酸残基は、Ｌ７２、Ｆ４２、およびＹ４５から選択される。一部の実施形態において、ＩＬ−２変種は、Ｌ７２の置換によって特徴づけられ、例えばＬ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、およびＬ７２Ｋからなる群から選択される第１のアミノ酸置換を含む。ＩＬ−２変種は、Ｆ４２の置換によって特徴づけすることができ、例えばＦ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、およびＦ４２Ｋからなる群から選択される第２のアミノ酸置換を含む。さらなる実施形態において、ＩＬ−２変種は、Ｙ４５の置換によって特徴づけられ、例えば、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、およびＹ４５Ｋからなる群から選択される第３のアミノ酸置換を含む。本開示のＩＬ−２変種は、上記で列挙した第１、第２、および第３のアミノ酸置換の任意の組合せを含有しうる。
【０１０１】
本明細書に記載のＩＬ−２変種は、ＩＬ−２変種ポリペプチドが何らかのＩＬ−２活性を保持している限り（機能的ポリペプチド）、対応する野生型ＩＬ−２と約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一でありうる。
【０１０２】
ポリペプチド配列のパーセント同一性は、参照配列（例えば、本開示の配列番号１）をクエリ配列と比較する市販のアルゴリズムを使用して計算することができる。
【０１０３】
当業者は、本開示の方法を使用して対象に送達されるＩＬ−２の最適な量が、例えばＩＬ−２ポリペプチドを発現するＬＡＢ、および遺伝子構築物、例えば遺伝子構築物に使用するプロモーターの強度によって変化することを認識するであろう。典型的に、ＬＡＢは、発現されたＩＬ−２ポリペプチドの特定の量と同等の量で、またはそれぞれの対象におけるそれぞれのＩＬ−２ポリペプチドに関して所望のＰＫプロファイルを生成する量で投与されうる。ＩＬ−２ポリペプチドの例示的な１日用量は、活性なポリペプチドの約１０ｆｇ〜約１００μｇ／日である。他の例示的な用量範囲は、約１ｐｇ〜約１００μｇ／日、または約１ｎｇ〜約１００μｇ／日である。
【０１０４】
上記の用量は、１日あたりの微生物の有効量を対象に投与することによって実現することができ、微生物は、上記の用量などの所望の用量を実現するためにＩＬ−２の十分量を発現するように適合されている。ＩＬ−２ポリペプチドを分泌するＬＡＢは、約１０４コロニー形成単位（ｃｆｕ）〜約１０１２ｃｆｕ／日、特に約１０６ｃｆｕ〜約１０１２ｃｆｕ／日、より特に約１０９ｃｆｕ〜約１０１２ｃｆｕ／日の用量で送達されうる。分泌されるＩＬ−２ポリペプチドの量は、例えばSteidler et al., Science 2000; 289(5483): 1352-1355に記載の方法に従ってまたはＥＬＩＳＡを使用することによって、ｃｆｕに基づいて決定することができる。例えば、ＬＡＢは、１０９ｃｆｕあたり少なくとも約１ｎｇ〜約１μｇの活性ポリペプチドを分泌しうる。そのことに基づいて、当業者は他のｃｆｕ用量で分泌されるＩＬ−２ポリペプチドの範囲を計算することができる。
【０１０５】
上記の用量／用量範囲の各々は、本明細書に記載の任意の投与レジメンに関連して投与されうる。１日用量を、１日を通して１、２、３、４、５、または６回で投与してもよい。さらに、１日用量は、投与期間の間に任意の回数の休止期間を設けて任意の日数、投与してもよい。例えば、対象に、約０．１〜約３  ＭＩＵ／日または隔日、と同等の用量の微生物を、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、または少なくとも約６週間の間投与してもよい。一部の例において、対象に、約０．１〜約５ＭＩＵ／日、または約０．３〜約３ＭＩＵ／日と同等の用量のＬＡＢを、例えば約５日、約７日、または約１４日間投与する。例示的な用量は例えば、Hartemann et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1(4): 295-305に記載される。
【０１０６】
Ｔ１Ｄ特異的抗原ポリペプチド
本開示のＬＡＢは、少なくとも１つの疾患特異的（すなわち、Ｔ１Ｄ特異的）自己抗原遺伝子を含有し、発現にとって十分な条件下でそのような遺伝子を発現することができる。例示的なＴ１Ｄ特異的自己抗原は、ベータ細胞破壊プロセスに関連する膵島抗原を含む。例には、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）および亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）８が含まれるがこれらに限定されない。他の例には、ベータ  ベータ細胞によって発現される分子、例えばクロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリンおよびシトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）が含まれる。
【０１０７】
ＰＩＮＳポリペプチドの例には、野生型ヒトＰＩＮＳおよびそのような野生型ヒトＰＩＮＳと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。野生型ヒトＰＩＮＳの例示的なアミノ酸配列は、配列番号６によって表され、例示的なＰＩＮＳコード核酸配列は配列番号７によって表される（受託番号ＮＭ＿０００２０７．２に含有されるＣＤＳを参照されたい）。
【０１０８】
追加の例示的なＰＩＮＳヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＡＹ８９９３０４（完全なＣＤＳ、選択的スプライシングされた；配列番号８）；ＮＭ＿０００２０７（転写物変種１；配列番号９）；ＮＭ＿００１１８５０９７（転写物変種２；配列番号１０）；ＮＭ＿００１１８５０９８（転写物変種３；配列番号１１）；ＮＭ＿００１２９１８９７（転写物変種４；配列番号１２）、およびその部分的機能的配列のコード配列によって表される。例示的なＰＩＮＳアミノ酸配列は、上記のＰＩＮＳ核酸配列のいずれか１つによってコードされる配列を含む。
【０１０９】
配列番号６のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、もしくは少なくとも約１００連続アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または配列番号６と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用してもよい。
【０１１０】
さらなるＰＩＮＳポリペプチドが、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１３０８およびその中のリンクに記載されている。一部の例において、ＰＩＮＳポリペプチドは、アミノ酸残基２５〜１１０によって表される（配列番号６に従うナンバリング）。
【０１１１】
例示的なＧＡＤ（例えば、ＧＡＤ６５）ポリペプチドには、野生型ヒトＧＡＤ６５、およびそのような野生型ＧＡＤ６５と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。野生型ヒトＧＡＤ６５の例示的なアミノ酸配列は、配列番号１３によって表され、例示的なＧＡＤ６５コード核酸配列は、配列番号１４によって表される（例えば、受託番号Ｍ８１８８２．１に含有されるＣＤＳを参照されたい）。
【０１１２】
配列番号１３によって表される上記のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、もしくは少なくとも約５００連続アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または配列番号１３と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用してもよい。
【０１１３】
他の例示的なグルタミン酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＧＡＤ６５）配列が、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ０５３２９およびその中のリンクに記載されている。一部の例において、ＧＡＤポリペプチドは、約５００個未満、約４００個未満、または約３００個未満の野生型アミノ酸を含有するトリミング変種である。例示的なポリペプチド断片（トリミングＧＡＤ６５変種）は、例えばRobert et al., Benef. Microbes 2015, 6(4): 591-601に記載される。一部の例において、トリミングＧＡＤ変種は、ＬＡＢ（すなわち、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌される。例示的なトリミングＧＡＤ変種は、ＧＡＤ６５３７０−５７５（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０００８０９．１、すなわち配列番号１３と比較したアミノ酸ナンバリング）である。
【０１１４】
他の例示的なＧＡＤヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号Ｍ８１８８２（ＧＡＤ６５；配列番号１５）；Ｍ８１８８３（ＧＡＤ６７；配列番号１６）；ＮＭ＿０００８１８（ＧＡＤ２変種１；配列番号１７）；およびＮＭ＿００１１３４３６６（ＧＡＤ２変種２；配列番号１８）；およびその中に含有されるオープンリーディングフレーム（ＣＤＳ）によって表される。例示的なアミノ酸配列は、受託番号Ｍ８１８８２、Ｍ８１８８３、ＮＭ＿００１１３４３６６、およびＮＭ＿０００８１８の上記のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。
【０１１５】
ＩＡ−２ポリペプチドの例には、野生型ヒトＩＡ−２およびそのような野生型ＩＡ−２と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。野生型ヒトＩＡ−２の例示的なアミノ酸配列は、配列番号１９によって表され、例示的なＩＡ−２コード核酸配列は、配列番号２０（例えば、受託番号ＮＭ＿００２８４６．３のオープンリーディングフレームを参照されたい）によって表される。
【０１１６】
配列番号１９によって表される上記のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、もしくは少なくとも約８００連続アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または配列番号１９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用してもよい。
【０１１７】
例示的なＩＡ−２ヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００２８４６（ヒトＩＡ−２またはタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体Ｎ型（ＰＴＰＲＮ）、転写物変種１；配列番号２１）；ＮＭ＿００１１９９７６３（ヒトＩＡ−２またはタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｎ（ＰＴＰＲＮ）、転写物変種２；配列番号２２）；ＮＭ＿００１１９９７６４（ヒトＩＡ−２またはタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｎ（ＰＴＰＲＮ）、転写物変種３；配列番号２３）によって表される。例示的なＩＡ−２アミノ酸配列は、上記のヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。
【０１１８】
他の例示的なＩＡ−２配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１６８４９およびその中のリンクに記載されている。一部の例において、ＩＡ−２ポリペプチドは、約７００個未満、約６００個未満、約５００個未満、または約４００個未満の野生型アミノ酸を含有するトリミング変種でありうる。例示的なポリペプチド断片（トリミングＩＡ−２変種）は、例えば、Robert et al., Benef. Microbes 2015, 6(4): 591-601に記載されている。一部の例において、トリミングＩＡ−２変種は、ＬＡＢ（すなわち、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌されうる。一部の例において、トリミングＩＡ−２変種は、ＩＡ−２６３５−９７９（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００２８３７．１；すなわち、配列番号１９と比較したアミノ酸ナンバリング）である。
【０１１９】
ＩＧＲＰポリペプチドの例には、野生型ヒトＩＧＲＰ、およびそのような野生型ＩＧＲＰと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。野生型ヒトＩＧＲＰの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２４によって表され、例示的なＩＧＲＰコード核酸配列は、配列番号２５（ＮＣＢＩ受託番号ＢＣ１１３３７６．１のオープンリーディングフレームを参照されたい）によって表される。
【０１２０】
配列番号２４によって表される上記のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、もしくは少なくとも３００アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または配列番号２４と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用してもよい。
【０１２１】
さらに例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２１１７６（Ｇ６ＰＣ２転写物変種１；配列番号２６）；ＮＭ＿００１０８１６８６（ヒトグルコース−６−ホスファターゼ、触媒、２（Ｇ６ＰＣ２）転写物変種２；配列番号２７）；およびＮＭ＿００１２７０３９７（Ｇ６ＰＣ、転写物変種２；配列番号２８）によって表される。例示的なＩＧＲＰアミノ酸配列は、上記のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
他の例示的な配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ９ＮＱＲ９およびその中のリンク、ならびにArden et al., Diabetes 1999; 48(3):531-542; Martin et al., J. Biol. Chem. 2001; 276(27):25197-207; およびDogra et al., Diabetologia 2006; 49(5):953-7に記載される。一部の例において、ＩＧＲＰポリペプチドは、約３００個未満、約２００個未満、約１００個未満、または約５０個未満の野生型アミノ酸を含有するトリミング変種である。一部の例において、トリミングＩＧＲＰ変種は、ＬＡＢ（すなわち、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌されるように選択される。
【０１２３】
ＺｎＴ８ポリペプチドの例には、野生型ＺｎＴ８、およびそのような野生型ＺｎＴ８と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。野生型ヒトＺｎＴ８の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２９によって表され、例示的なＺｎＴ８コード核酸配列は、配列番号３０によって表される（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿１７３８５１．２に含有されるオープンリーディングフレームを参照されたい）。
【０１２４】
配列番号２９によって表される上記のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも２５０、もしくは少なくとも３００アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または配列番号２９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用してもよい。
【０１２５】
さらに例示的なＺｎＴ８ヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＡＹ２１２９１９．１（ヒト亜鉛トランスポーター８、完全長コード配列；配列番号３１）；ＮＭ＿１７３８５１．２（ヒト亜鉛トランスポーター８、転写物変種１；配列番号３２）；ＮＭ＿００１１７２８１４．１（ヒト亜鉛トランスポーター８、転写物変種２；配列番号３３）；ＮＭ＿００１１７２８１１．１（ヒト亜鉛トランスポーター８、転写物変種３；配列番号３４）；ＮＭ＿００１１７２８１３．１（ヒト亜鉛トランスポーター８、転写物変種４；配列番号３５）；ＮＭ＿００１１７２８１５．２（ヒト亜鉛トランスポーター８、転写物変種５；配列番号３６）、およびその部分配列によって表される。例示的なＺｎＴ８アミノ酸配列は、上記のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
他の例示的な配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ８ＩＷＵ４およびその中のリンクに記載されている。一部の例において、ＺｎＴ８ポリペプチドは、約３００個未満、約２００個未満、または約１００個未満の野生型アミノ酸を含むトリミング変種である。一部の例において、トリミングＺｎＴ８変種は、ＬＡＢ（すなわち、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌されるように選択される。
【０１２７】
ｐｐＩＡＰＰポリペプチドの例には、野生型ヒトｐｐＩＡＰＰ、およびそのような野生型ｐｐＩＡＰＰと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。野生型ヒトｐｐＩＡＰＰの例示的なアミノ酸配列は、配列番号３７によって表され、例示的なｐｐＩＡＰＰコード核酸配列は、配列番号３８によって表される（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００４１５．２のオープンリーディングフレームを参照されたい）。
【０１２８】
配列番号３７によって表される上記のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも２５０、もしくは少なくとも３００アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または配列番号３７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用してもよい。
【０１２９】
他の例示的なｐｐＩＡＰＰポリペプチド配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１０９９７およびその中のリンクに開示されている。一部の例において、ｐｐＩＡＰＰポリペプチドは、約８０個未満、約６０個未満、約４０個未満、または約２０個未満の野生型アミノ酸を含有するトリミング変種でありうる。一部の例において、トリミングｐｐＩＡＰＰ変種は、ＬＡＢ株（すなわち、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌されるように選択される。
【０１３０】
ペリフェリンポリペプチドの例には、野生型ヒトペリフェリン、およびそのような野生型と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。野生型ヒトペリフェリンの例示的なアミノ酸配列は、配列番号３９によって表され、例示的なペリフェリンコード核酸配列は、配列番号４０によって表される（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６２６２．３のオープンリーディングフレームを参照されたい）。
【０１３１】
配列番号３９によって表される上記のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、もしくは少なくとも約４００連続アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または配列番号３９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用してもよい。
【０１３２】
他の例示的なペリフェリン配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４１２１９およびその中のリンクに開示されている。一部の例において、ペリフェリンポリペプチドは、約４００個未満、約３００個未満、約２００個未満、または約１００個未満の野生型アミノ酸を含有するトリミング変種である。一部の例において、トリミングペリフェリン変種は、ＬＡＢ（すなわち、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌されるように選択される。
【０１３３】
さらに例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６２６２．３（ヒトペリフェリン；ＰＲＰＨ；配列番号４１）；ＸＭ＿００５２６９０２５．１（予想されるヒトペリフェリン、転写物変種Ｘ１；配列番号４２）；ＸＲ＿９４４６２３．１（予想されるヒトペリフェリン、転写物変種Ｘ２；配列番号４３）、およびその部分配列によって表される。例示的なペリフェリンアミノ酸配列は、上記のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１３４】
ＧＲＰポリペプチドの例には、野生型ヒトＧＲＰ７８／ＢｉＰおよびそのような野生型ＧＲＰと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。野生型ヒトＧＲＰの例示的なアミノ酸配列は、配列番号４４によって表され、例示的なＧＲＰコード核酸配列は、配列番号４５によって表される（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｘ８７９４９．１のオープンリーディングフレームを参照されたい）。
【０１３５】
配列番号４４によって表される上記のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列、またはその少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、もしくは少なくとも約５００連続アミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列、または配列番号４４と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を使用してもよい。
【０１３６】
他の例示的なＧＲＰ配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１１０２１およびその中のリンクに開示されている。一部の例において、ＧＲＰポリペプチドは、約５００個未満、約４００個未満、約３００個未満、または約２００個未満の野生型アミノ酸を含有するトリミング変種である。一部の例において、トリミングＧＲＰ変種は、ＬＡＢ株（すなわち、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））によって効率的に発現および分泌されるように選択される。
【０１３７】
当業者は、本開示の方法を使用して対象に送達される自己抗原の最適な量が、例えば抗原のタイプ、抗原を発現する微生物、および遺伝子構築物、例えば遺伝子構築物に使用されるプロモーターの強度によって変化することを認識するであろう。典型的に、微生物は、発現された抗原の特定の量と同等の量で、またはそれぞれの対象におけるそれぞれの抗原ポリペプチドに関する所望のＰＫプロファイルを生成する量で投与される。例示的な抗原の１日用量は、活性ポリペプチド約１０ｆｇ〜約１００μｇ／日でありうる。他の例示的な用量範囲は、約１ｐｇ〜約１００μｇ／日、または約１ｎｇ〜約１００μｇ／日でありうる。
【０１３８】
上記の抗原用量は、１日あたりのＬＡＢの有効量を対象に投与することによって実現することができ、ＬＡＢは、上記の用量などの所望の用量を実現するために生物活性ポリペプチドの十分量を発現するように適合されている。抗原ポリペプチドを分泌するＬＡＢは、約１０４コロニー形成単位（ｃｆｕ）〜約１０１２ｃｆｕ／日、例えば、約１０６ｃｆｕ〜約１０１２ｃｆｕ／日、または約１０９ｃｆｕ〜約１０１２ｃｆｕ／日の用量で送達されうる。
【０１３９】
分泌された抗原ポリペプチドの量は、例えば、Steidler et al., Science 2000; 289(5483): 1352-1355に記載の方法に従って、またはＥＬＩＳＡを使用することによって、ｃｆｕに基づいて決定することができる。例えば、ＬＡＢは、約１０９ｃｆｕあたり少なくとも約１ｎｇ〜約１μｇの活性ポリペプチドを分泌しうる。そのことに基づいて、当業者は、他のｃｆｕ用量で分泌される抗原ポリペプチドの範囲を計算することができる。
【０１４０】
上記の用量／用量範囲の各々は、本明細書に記載の任意の投与レジメンに関連して投与されうる。活性ポリペプチドの１日用量を、１日を通して１、２、３、４、５、または６回で投与してもよい。さらに、１日用量を、投与期間の間に任意の回数の休止期間を設けて任意の日数、投与してもよい。例えば、約０．１〜約３．０Ｍ  ＩＵ／日／対象の用量を１日おきに全体で６週間投与してもよい。
【０１４１】
製剤およびレジメン
本明細書に記載の方法において、ＩＬ−２およびＴ１Ｄは、同じまたは異なるＬＡＢによって発現されてもよい。２つのポリペプチドが異なる微生物によって発現される場合、それらを対象に同じ（例えば、組み合わせた）製剤で投与してもよく、または個別の（例えば、異なる）製剤で投与してもよい。個別の製剤は、同時または異なる時点で投与してもよい。例えば、ＩＬ−２およびＴ１Ｄ特異的抗原産生微生物をそのそれぞれの製剤で対象に同時に投与することができ、または例えば投与間に休止期間を設けて連続的に投与してもよい。
【０１４２】
ＩＬ−２およびＴ１Ｄ特異的抗原産生ＬＡＢ株は、同時に投与することができる。一部の例において、ＩＬ−２産生微生物およびＴ１Ｄ特異的抗原産生微生物は、同じ医薬製剤に含まれてもよく、または同時に２つ以上の医薬製剤に含まれてもよい。例示的な実施形態において、２つの生物活性ポリペプチドは、ＩＬ−２およびＴ１Ｄ特異的抗原の両方を産生する単一のＬＡＢ株を使用して対象に送達される。
【０１４３】
一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、例えば経口製剤を使用して１日１回、２回、３回、４回、５回、または６回投与される。一部の実施形態において、ＬＡＢ株は、毎日、２日に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、または１週間に４回投与される。他の実施形態において、処置は、２週間毎に１回行われる。他の実施形態において、処置は、３週間毎に１回行われる。他の実施形態において、処置は１カ月に１回行われる。
【０１４４】
方法の処置サイクルの期間は、Ｔ１Ｄを処置するもしくは好転させる、または再燃を防止する必要に応じて、例えば７日間から対象の生涯まででありうる。処置サイクルは約３０日間〜約２年間持続しうる。他の実施形態において、対象は３０日〜１．５年間持続する処置サイクルを有しうる。他の実施形態において、対象は、３０日〜１年間持続する処置サイクルを有しうる。他の実施形態において、対象は、３０日〜１１カ月間持続する処置サイクルを有しうる。他の実施形態において、対象は、３０日〜１０カ月間持続する処置サイクルを有しうる。他の実施形態において、対象は、３０日〜９カ月間持続する処置サイクルを有しうる。対象は、３０日〜８カ月間持続する処置サイクルを有しうる。対象は、３０日〜７カ月間持続する処置サイクルを有しうる。対象は、３０日〜６カ月間持続する処置サイクルを有しうる。対象は、３０日〜５カ月間持続する処置サイクルを有しうる。対象は、３０日〜４カ月間持続する処置サイクルを有しうる。対象は、３０日〜３カ月間持続する処置サイクルを有しうる。対象は、３０日〜２カ月間持続する処置サイクルを有しうる。
【０１４５】
１日の維持用量は、対象において臨床的に望ましい期間、例えば１日から数年まで（例えば、対象の残りの人生の全期間）、例えば約（２、３、もしくは５日、１もしくは２週間、または１カ月）および／または例えば約（５年、１年、６カ月、１カ月、１週間、または３、もしくは５日間）まで投与することができる。約３から約５日間または約１週間から約１年間の１日の維持用量の投与が典型的である。それにもかかわらず、単位用量を、任意選択で、治療効果が観察されるまで、１日２回から２週間毎に１回まで投与することができる。
【０１４６】
ＩＬ−２ポリペプチドおよび抗原ポリペプチドを産生するＬＡＢ株は、Ｔ１Ｄの処置のために単剤療法または併用療法で送達してもよい。一部の実施形態において、本開示の組成物はさらなる治療活性剤を含む。一部の実施形態において、対象の処置は、他の活性成分を伴わない、例えば抗体（例えば、抗ＣＤ３）などの追加の免疫調節物質を伴わない。このため、一部の例において、本開示の医薬組成物は本質的に、本明細書に記載のＬＡＢ（治療的ＩＬ−２および抗原ポリペプチドを発現する）と薬学的に許容される担体とからなる。
【０１４７】
医薬組成物および担体
本明細書に記載のＬＡＢ株（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））は、純粋型、他の活性成分と組み合わせて、および／または薬学的に許容される（すなわち、非毒性の）賦形剤もしくは担体と組み合わせて投与してもよい。用語「薬学的に許容される」は、本明細書において、その当技術分野で認識される意味に従って使用され、医薬組成物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害でない担体を指す。
【０１４８】
本明細書に記載の組成物は、医薬組成物および剤形ならびに栄養製品形態を含む、ＬＡＢ株（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の粘膜への全身送達の提供に使用するために適した任意の公知のまたはそうでなければ有効な用量もしくは製品の形態で調製することができる。
【０１４９】
一部の実施形態において、製剤は、経口製剤または医薬組成物である。本実施形態に従う一部の例において、製剤または医薬組成物は、任意選択で他の乾燥担体と共に、乾燥粉末形態（例えば、フリーズドライ形態）またはその圧縮形態のＬＡＢ株を含む。経口製剤は、一般に、不活性希釈担体または食用担体を含む。
【０１５０】
一部の例において、経口製剤は、製剤の腸管への送達を容易にするため、および／または微生物を腸管（例えば、回腸、小腸、または結腸）で放出して水和させる、コーティングを含むか、またはカプセル封入戦略を利用する。ＬＡＢが製剤から放出され、十分に水和されると、ＬＡＢは、生物活性ポリペプチドを発現し始め、次にこれが周囲に放出されるか、または微生物の表面上に発現される。そのようなコーティングおよびカプセル封入戦略（すなわち、徐放戦略）は、当業者に公知である。例えば、米国特許第５，９７２，６８５号明細書；国際公開第２０００／１８３７７号パンフレット；および国際公開第２０００／２２９０９号パンフレットを参照されたい。
【０１５１】
任意選択でデキストラン、グルタミン酸ナトリウム、およびポリオールなどの他の成分と併せて、凍結乾燥またはフリーズドライ形態のＬＡＢ株を含みうる医薬組成物が提供される。例示的なフリーズドライ組成物は、米国特許出願公開第２０１２／００３９８５３号明細書に記載されている。例示的な製剤は、フリーズドライ細菌（例えば、細菌の治療有効量）と薬学的に許容される担体とを含む。フリーズドライ細菌は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、および散剤の形態で調製することができ、その各々を経口投与することができる。あるいは、フリーズドライ細菌は、適した培地中で水性懸濁液として調製してもよく、または凍結乾燥細菌を、使用直前に飲料などの適した媒体に懸濁させてもよい。
【０１５２】
経口投与の場合、製剤は、胃抵抗性経口剤形でありうる。例えば、経口剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、ペレット剤、マイクロペレット剤、顆粒剤など）を、胃での溶解または破壊に抵抗するが腸では抵抗せず、それによって腸（例えば、小腸または結腸）での分解、溶解、および吸収に都合がよいように胃の中を通過することができる賦形剤（通常、ポリマー、セルロース誘導体、および／または親油性材料）の薄層によってコーティングしてもよい。
【０１５３】
一部の例において、経口製剤は、微生物の制御放出、徐放性放出、または持続的放出を提供する化合物を含んでもよく、それによってそこにコードされる所望のタンパク質の制御放出を提供してもよい。これらの剤形（例えば、錠剤またはカプセル剤）は、典型的に従来のおよび周知の賦形剤、例えば親油性、ポリマー、セルロース、不溶性、および膨張性賦形剤を含有する。制御放出製剤はまた、腸、結腸、生物学的接着または舌下送達（例えば、歯科粘膜送達）および気管支送達を含む他の任意の送達部位のために使用することができる。本明細書に記載の組成物を直腸または膣投与する場合、医薬製剤は、坐剤およびクリーム剤を含みうる。この場合、宿主細胞を、同様に脂質を含む一般的な賦形剤の混合物に懸濁させる。上記の製剤の各々は当技術分野で周知であり、例えば以下の参考文献に記載されている：Hansel et al. (1990, PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, NOVEL DRUG DELIVERY, J. Wiley & Sons); Cazzaniga et al., (1994, Int. J. Pharm. 108(1): 77-83)。
【０１５４】
本明細書に記載の経口製剤および組成物は、ＬＡＢによって発現される生物活性ポリペプチドの粘膜送達および／または粘膜取り込みを増強することができる化合物をさらに含みうる。本明細書に記載の製剤／組成物はまた、製剤内の、および／または放出後の微生物の生存率を増強する化合物も含むことができる。
【０１５５】
本明細書に記載のＬＡＢは、処置される疾患を有するヒトまたは動物に投与するための医薬製剤に懸濁させることができる。そのような医薬製剤は、生きたＬＡＢと投与に適した媒体とを含むがこれらに限定されない。ＬＡＢは、ラクトース、他の糖、アルカリおよび／もしくはアルカリ土類のステアリン酸塩、炭酸塩、ならびに／または硫酸塩（例えば、ステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、および硫酸ナトリウム）、カオリン、シリカ、着香料、およびアロマなどの一般的な賦形剤の存在下で凍結乾燥してもよい。そのように凍結乾燥された細菌は、その各々が経口経路によって投与されうる、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、および散剤（例えば、洗口粉末）の形態で調製してもよい。あるいは、ＬＡＢ株を適した媒体中での水性懸濁液として調製してもよく、または凍結乾燥細菌を使用直前に、本明細書に記載の賦形剤ならびにグルコース、グリシン、およびサッカリンナトリウムなどの他の賦形剤を含む媒体などの適した媒体に懸濁してもよい。
【０１５６】
一部の例において、ＬＡＢは、任意の適した方法を使用して対象の消化管に局所送達される。例えば、ミクロスフェア送達系を腸管への送達を増強するために用いることができる。ミクロスフェア送達系は、対象の消化管への局所放出を提供するコーティングを有する微粒子を含む（例えば、腸溶製剤および結腸製剤などの制御放出製剤）。
【０１５７】
経口投与の場合、胃抵抗性経口剤形を製剤化してもよく、剤形はまた、ＬＡＢ株の制御放出を提供し、それによって消化の異なる時点でその中にコードされる所望のタンパク質（例えば、ＩＬ−２）の制御放出を提供する化合物を含んでもよい。例えば、経口剤形（カプセル剤、錠剤、ペレット剤、顆粒剤、散剤を含む）を、胃での溶解または破壊に抵抗するが腸では抵抗せず、それによって腸（例えば、小腸または結腸）での分解、溶解、および吸収に都合がよいように胃の中を通過することができる賦形剤（例えば、ポリマー、セルロース誘導体、および／または親油性材料）の薄層によってコーティングしてもよい。
【０１５８】
経口剤形は、ＬＡＢ株および産生された外因性のタンパク質の遅い放出、例えば制御放出、徐放性放出、持続的放出、持続作用錠または持続作用カプセル剤を可能にするように設計されうる。これらの剤形は通常、親油性、ポリマー、セルロース、不溶性、および膨張性の賦形剤などの従来のおよび周知の賦形剤を含む。そのような製剤は、例えば以下の参考文献：Hansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th edition, William and Wilkins, 1990; Chien 1992, NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM, 2nd edition, M. Dekker; Prescott et al., NOVEL DRUG DELIVERY, J.Wiley & Sons, 1989; and Cazzaniga et al., Int. J. Pharm. 108(1):77-83 (1994) に記載されている。
【０１５９】
薬学的剤形（例えば、カプセル剤）は、典型的に、胃液抵抗性を得るために、ならびにポリマーがｐＨ６．５で溶解する最終の回腸および結腸への意図される送達のために、ｐＨ依存性のＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ポリマーによってコーティングされる。他のＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ポリマー、またはポリマー間の異なる比を使用することによって、細菌を例えば十二指腸または空腸で放出するように、遅延放出プロファイルを調節することができる。
【０１６０】
医薬組成物は一般に、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含有する。適した賦形剤、希釈剤、および担体の非限定的な例には、保存剤、無機塩、酸、塩基、緩衝剤、栄養物、ビタミン、充填剤、および増量剤、例えばデンプン、糖、マンニトール、およびケイ酸誘導体；結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、および他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ならびにポリビニルピロリドン；保湿剤、例えばグリセロール／崩壊剤、例えば炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウム；溶解を遅らせる薬剤、例えばパラフィン；吸収加速剤、例えば第四級アンモニウム化合物；表面活性剤、例えばアセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール；吸着性担体、例えばカオリンおよびベントナイト；担体、例えばプロピレングリコールおよびエチルアルコール、ならびに滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、および固体ポリエチレングリコールが含まれる。
【０１６１】
薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、または類似の性質を有する化合物のいずれかを含有しうる：結合剤、例えば結晶セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、分散剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えばスクロースまたはサッカリン；または着香料、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ着香料。単位剤形がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有しうる。さらに、単位剤形は単位用量の物理的形態を修飾する様々な他の材料、例えば糖、シェラック、または腸溶剤などのコーティングを含有しうる。さらに、シロップ剤は、活性化合物に加えて、甘味料としてのスクロースおよび特定の保存剤、色素、コーティング剤、および着香料を含有してもよい。薬学的に許容される担体の形態および特徴は、合わせられる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変数によって左右されると認識される。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。
【０１６２】
投与のための代替の調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳液を含む。非水性溶媒の例は、ジメチルスルホキシド、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体は、アルコールと水の混合物、緩衝媒体、および食塩水を含む。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給剤、電解質補給剤、例えばリンゲルデキストロースベースの補給剤などが含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在してよい。これらの送達方法に関して、食塩水、アルコール、ＤＭＳＯ、および水ベースの溶液を含む様々な液体製剤が可能である。
【０１６３】
経口水性製剤は、賦形剤、例えば薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および／または炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、マウスウォッシュおよび洗口液などの溶液の形態をとり、例えば水、アルコール／水溶液、食塩水溶液、非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなどの水性担体をさらに含む。
【０１６４】
水性マウスウォッシュ製剤は当業者に周知である。マウスウォッシュおよび洗口液に関する製剤は、例えば、米国特許第６，３８７，３５２号明細書、米国特許第６，３４８，１８７号明細書、米国特許第６，１７１，６１１号明細書、米国特許第６，１６５，４９４号明細書、米国特許第６，１１７，４１７号明細書、米国特許第５，９９３，７８５号明細書、米国特許第５，６９５，７４６号明細書、米国特許第５，４７０，５６１号明細書、米国特許第４，９１９，９１８号明細書、米国特許出願公開第２００４／００７６５９０号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１５２５３０号明細書、および米国特許出願公開第２００２／００４４９１０号明細書に詳細に考察されている。
【０１６５】
他の添加剤、例えば着香料、甘味料もしくは着色剤、または保存剤が本開示の製剤に存在してもよい。ペパーミントまたはスペアミントなどに由来するミント、シナモン、ユーカリ、シトラス、カシア、アニス、およびメントールは、適した着香料の例である。着香料は任意選択で経口組成物中に０〜３％の範囲で存在し、液体組成物の場合には、任意選択で２％まで、例えば０．５％まで、任意選択でおよそ０．２％の量で存在する。
【０１６６】
甘味料は、人工または天然の甘味料、例えばサッカリンナトリウム、スクロース、グルコース、サッカリン、デキストロース、レブロース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、フルクトース、マルトース、キシリトール、ソーマチン、アスパルテーム、Ｄ−トリプトファン、ジヒドロカルコン、アセスルフェームおよびそれらの任意の組合せを含み、それらは経口組成物の０〜２％、任意選択で１ｗ／ｗ％まで、例えば０．０５〜０．３ｗ／ｗ％の範囲の量で存在しうる。
【０１６７】
着色剤は、適した天然または合成着色剤、例えば二酸化チタン、もしくはＣＩ  ４２０９０、またはそれらの混合物である。着色剤は、組成物中に０〜３％の範囲で存在してもよく、液体組成物の場合には任意選択で０．１％まで、例えば０．０５％まで、任意選択でおよそ０．００５〜０．０００５％の量で存在してもよい。通常の保存剤の中で、安息香酸ナトリウムは、典型的に組成物のｐＨを実質的に変化させないために十分な濃度で使用され、そうでなければ、所望のｐＨに達するために緩衝剤の量を調節する必要がありうる。
【０１６８】
他の任意選択の成分は、湿潤剤、界面活性剤（非イオン性、陽イオン性、または両性）、濃化剤、ゴム、および結合剤を含む。湿潤剤は、製剤の統一感を高め、歯磨き組成物において水分を保持する。さらに、湿潤剤は、製剤の保存中の微生物による劣化を防止するために役立つ。湿潤剤はまた、相の安定性を維持するのを助け、透明なまたは半透明な歯磨き剤を処方する方法を提供する。
【０１６９】
適した湿潤剤は、グリセリン、キシリトール、グリセロール、およびプロピレングリコールなどのグリコールを含み、これらは各々５０ｗ／ｗ％までの量で存在しうるが、湿潤剤は全体で、組成物の約６０〜８０ｗ／ｗ％以下でありうる。例えば、液体組成物は、約３０％までのグリセリンと、約５％までの、任意選択で約２ｗ／ｗ％のキシリトールとを含みうる。界面活性剤は、陰イオン性ではなく、ポリソルベート２０またはココアミドベタインなどを組成物の約６％まで、任意選択で約１．５〜３ｗ／ｗ％の量で含みうる。
【０１７０】
本明細書に記載の経口組成物が液体形態の場合、前記組成物は典型的に、経口組成物の約３ｗ／ｗ％まで、例えば０〜０．１％の範囲、任意選択で約０．００１〜０．０１％、例えば約０．００５ｗ／ｗ％の被膜形成剤を含みうる。適した被膜形成剤は、（ヒアルロン酸ナトリウムに加えて）商品名Ｇａｎｔｒｅｚ（商標）として販売されている形成剤を含む。
【０１７１】
経口または経腸投与のための液体栄養製剤は、脂肪、糖質、タンパク質、ビタミン、およびミネラルなどの１つまたは複数の栄養物を含みうる。多くの異なる起源およびタイプの糖質、脂質、タンパク質、ミネラル、およびビタミンが公知であり、そのような栄養物は、選択された製剤中の添加された成分と適合性で、その意図される使用に関して安全かつ有効であり、製品の性能を不当に損ねることがない限り、本明細書に記載の栄養液実施形態において使用することができる。
【０１７２】
これらの栄養液は、典型的に栄養液を飲むまたは投与する際に、粘膜のより有効で鎮静的なコーティングを提供するために十分な粘度、流動性、または他の物理的もしくは化学的特徴を有するように製剤化される。これらの栄養実施形態はまた、個体の唯一の、主要な、または補助的な栄養要求を満たすために適したバランスのとれた栄養源も表しうる。適した栄養液の非限定的な例は、例えば、米国特許第５，７００，７８２号明細書；米国特許第５，８６９，１１８号明細書；および米国特許第５，２２３，２８５号明細書に記載されている。
【０１７３】
本明細書において使用するために適した栄養タンパク質は、加水分解、部分的に加水分解、または非加水分解することができ、乳（例えば、カゼイン、乳清）、動物（肉、魚）、穀物（例えば、コメ、トウモロコシ）、植物（例えば、ダイズ）、またはそれらの組合せなどの任意の公知のまたはそうでなければ適した起源に由来することができる。
【０１７４】
栄養液に使用するために適した脂肪または脂質には、ココナツ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、サフラワー油、高オレイン酸サフラワー油、ＭＣＴ油（中鎖トリグリセリド）、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、構造トリグリセリド、パーム油およびパーム核油、パームオレイン、キャノーラ油、魚油、綿実油、およびそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。栄養液に使用するために適した糖質は、単純糖質もしくは複合糖質、ラクトース含有糖質もしくはラクトースフリー糖質、またはそれらの組合せでありうる。適した糖質の非限定的な例には、加水分解トウモロコシデンプン、マルトデキストリン、グルコースポリマー、スクロース、コーンシロップ、コーンシロップ固体、コメ由来糖質、グルコース、フルクトース、ラクトース、高フルクトースコーンシロップおよび難消化性オリゴ糖、例えばフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ならびにそれらの組合せが含まれる。
【０１７５】
本明細書に記載の栄養液は、任意の多様なビタミンをさらに含んでもよく、その非限定的な例には、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ビタミンＢ１２、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＣ、コリン、イノシトール、それらの塩および誘導体、ならびにそれらの組合せが含まれる。
【０１７６】
本明細書に記載の栄養液は、Ｔ１Ｄのリスクを有するまたはＴ１Ｄに罹っている患者に使用するために公知のまたはそうでなければ適した任意の多様な無機質をさらに含んでもよく、その非限定的な例には、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄、セレン、マンガン、銅、ヨウ素、ナトリウム、カリウム、塩素、およびそれらの組合せが含まれる。
【０１７７】
本明細書に記載のＬＡＢ株はまた、エリキシル剤として、または通常の経口投与もしくは直腸投与のための他の溶液、または非経口投与、例えば筋肉内、皮下、もしくは静脈内経路にとって適切な溶液として製剤化することができる。さらに、ヌクレオシド誘導体も、有効性をさらに増強するために、任意選択で延長された期間または長期間にわたって腸管の特定の部分のみにまたは任意選択で腸管の特定の部分に活性成分を放出する剤形を含む、徐放性または持続放出剤形としての製剤にとって十分に適している。そのような剤形におけるコーティング、エンベロープ、および保護マトリクスは、例えば薬学的技術分野において周知のポリマー物質またはロウから作製することができる。
【０１７８】
本明細書に記載の組成物は、ロゼンジ剤、トローチ剤、または香錠などの薬学的剤形を含みうる。これらは典型的には、適した着香料基剤に活性成分を含有する円板状の固体である。基剤は、硬い氷砂糖、グリセリンゼラチン、または砂糖とその形状を与えるために十分な粘液の組合せでありうる。トローチ剤は、口に入れて、そこでそれらが徐々に溶解し、粘膜と直接接触するように活性成分を放出する。
【０１７９】
トローチ剤の実施形態は、例えば、粉末の活性成分、粉糖、およびゴムの混合物に、柔軟な塊が形成されるまで水を徐々に加えることによって調製することができる。塊に十分な接着性を提供するために、７％アカシア粉末を使用することができる。塊を延ばして、平坦な塊からトローチ片を切り出すか、または塊を円筒形に丸めて分割することができる。それぞれの切断片または分割片を成形して乾燥させ、このようにしてトローチ剤形を形成する。
【０１８０】
活性成分が熱不安定である場合、これを圧縮によってロゼンジ調製物に作製してもよい。例えば、調製における造粒ステップは、任意の圧縮錠に関して使用されるものと類似の様式で実施される。ロゼンジ剤は、剤形が口の中で徐々に溶解または崩壊することが望ましいことから、通常より硬い錠剤を生じるように重い圧縮装置を使用して作製される。成分は典型的に、遅く溶解する特徴を促進するように選択される。
【０１８１】
例示的な製剤において、ＬＡＢ株を、アルファ化デンプンおよび架橋ポリ（アクリル酸）を含有する生体接着担体中に組み入れて、頬側適用にとって適した生体接着錠剤および生体接着ゲル剤を形成してもよい（すなわち、持続的な生体接着および徐放性薬物送達を有する）。
【０１８２】
ＬＡＢ株、生体接着ポリマー（アルファ化デンプンおよび架橋ポリ（アクリル酸）を、噴霧乾燥によって同時処理したもの）、ステアリルフマル酸ナトリウム（滑沢剤）、および二酸化ケイ素（滑剤）の粉末混合物を、錠剤（重量：１００ｍｇ；直径７ｍｍ）に処理してもよい。これらの錠剤を作製する方法は当業者に周知であり、様々な薬物（ミコナゾール、テストステロン、フッ化物、シプロフロキサシン）を含有する生体接着錠の開発の成功に関して過去に記載されている（Bruschi M. L. およびde Freitas O., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2005 31: 293-310）。
【０１８３】
製剤を最適化するために、錠剤への薬物負荷およびデンプンとポリ（アクリル酸）との間の比率を変化させることができる。これまでの研究に基づいて、同時処理された生体接着担体における最大の薬物負荷は、約６０％（ｗ／ｗ）であり、デンプン／ポリ（アクリル酸）比は７５／２５〜９５／５（ｗ／ｗ）の間の範囲でありうる。最適化試験の際に、錠剤の生体接着特性および錠剤からの薬物放出は主要な評価パラメータであり、標準的な錠剤特性（硬度、もろさ）は副次評価基準である。
【０１８４】
ＬＡＢ株をアルファ化デンプンおよび架橋ポリ（アクリル酸）の水性分散液に組み入れてもよい。このポリマー分散液は、高剪断ミキサーを使用して標準的な手順を介して調製される。
【０１８５】
錠剤と同様に、食道粘膜に対して最適な接着性を有するゲルを得るために、ゲルの薬物負荷およびデンプン／ポリ（アクリル酸）比を最適化する必要がありうる。ゲルの場合、分散剤中のポリマーの濃度は、それが、ゲルの粘度、従ってその粘膜−接着特性を決定することから追加の変数である。
【０１８６】
食道粘膜に対するポリマー分散液の生体接着特性をスクリーニングするためのモデルは、Batchelor et al.（Int. J. Pharm., 238: 123- 32, 2002）によって詳細に記載されている。
【０１８７】
他の投与経路および投与形態は、生きたＬＡＢ株を含有する食品調製物を含む。一部の例において、生物活性ポリペプチド発現ＬＡＢ株を乳製品に含めてもよい。
【０１８８】
本明細書に記載の医薬組成物は、選択された剤形を製剤化または製造する任意の公知のまたはそうでなければ有効な方法によって調製されうる。例えば、ＬＡＢ株は、一般的な、例えば薬学的に許容される担体、例えば賦形剤および希釈剤と共に製剤化して、経口錠、カプセル剤、スプレー剤、ロゼンジ剤、処置物質（例えば、本明細書に記載の組成物によって処置した経口または局所スワブ、パッド、または使い捨ての難消化性の物質）；経口液剤（例えば、懸濁液剤、液剤、乳剤）、散剤、坐剤、または他の任意の適した剤形を形成することができる。一部の実施形態において、本開示は、医薬組成物を製造するための方法を提供する。例示的な方法には、ＩＬ−２遺伝子およびＴ１Ｄ特異的抗原遺伝子を含有する（またはＩＬ−２およびＴ１Ｄ特異的抗原を発現することができる）ＬＡＢ株（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））に、薬学的に許容される担体を接触させて、それによって医薬組成物を形成することを含む。一部の例において、方法はさらに、培地中でＬＡＢ株を増殖させることを含む。方法はさらに、任意選択で薬学的に許容される担体を含む、微生物を含有する液体をフリーズドライすることを含みうる。
【０１８９】
単位剤形
本開示はさらに、ＬＡＢ株がインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子、および１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）特異的抗原遺伝子を含む、任意選択で食品等級または薬学的に許容される担体と組み合わせたＬＡＢ株のある特定の量を含む単位剤形を提供する。例示的な単位剤形は、ＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の約１×１０３〜約１×１０１４コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含有する。他の例示的な単位剤形は、ＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の約１×１０４〜約１×１０１３コロニー形成単位（ｃｆｕ）、またはＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の約１×１０４〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含有する。他の実施形態において、単位剤形は、ＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の約１×１０５〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０６〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む。他の実施形態において、単位剤形は、ＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の約１×１０８〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９〜約１×１０１２コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む。なお他の実施形態において、単位剤形は、ＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の約１×１０９〜約１×１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む。なお他の実施形態において、単位剤形は、ＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の約１×１０７〜約１×１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０８〜約１×１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む。
【０１９０】
なお他の実施形態において、単位剤形は、ＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））の約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）、または約１×１０９〜約１００×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含む。
【０１９１】
単位剤形は、任意の物理的形態または形状を有しうる。一部の実施形態において、単位剤形は経口投与のために適合されうる。これらの実施形態に従う一部の実施例において、単位剤形は、カプセル剤、錠剤、または顆粒剤の形態でありうる。例示的なカプセル剤には、マイクロ顆粒を充填したカプセル剤が含まれる。一部の実施形態において、剤形に含有されるＬＡＢ（例えば、Ｌ．ラクチス（L. lactis））は、乾燥粉末形態である。例えば、ＬＡＢは、任意選択で圧縮およびコーティングされるフリーズドライ粉末形態である。
【実施例】
【０１９２】
以下の実施例は、本開示のある特定の代表的な実施形態および態様を実証およびさらに説明するために提供され、本明細書または特許請求の範囲を限定しないと解釈すべきである。
【０１９３】
[実施例１]
ｈＩＬ−２を分泌するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ−ＩＬ−２）の構築
ヒトＩＬ−２を分泌することができるラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株（ＬＬ−ＩＬ−２）を、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＭＧ１３６３（親株）に対して構築した。例えば、Gasson MJ, J. Bacteriol. 1983, 154(1):1-9を参照されたい。ＬＬ−ＩＬ−２において、以下の改変を細菌のゲノムに導入した：
【０１９４】
（ａ）環境封じ込めを確認するために、チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９８３５８；位置：ＮＣ＿００９００４．１（９３０２５１．．９３１０９０））を除去した。
【０１９５】
（ｂ）外因性のトレハロースを蓄積させるために、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７１４０；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４４９１９５．．４５１５０４））を除去した。
【０１９６】
（ｃ）  トレハロース−６−リン酸のトレハロースへの変換を促進するために、トレハロース−６−リン酸ホスファターゼ（ｏｔｓＢ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１０３６９１４；座のタグｃ２３１１）を、ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ４５−ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７２１８；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２４６２４４０．．２４６３８２５、相補体））の下流に配置した。
【０１９７】
（ｄ）トレハロースの取り込みを強化するために、ＨＵ−様ＤＮＡ−結合タンパク質遺伝子（ＰｈｌｌＡ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７３５３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４９０２７５．．４９０５５０））の構成的プロモーターを、トレハロースオペロンにおける推定のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；ＬＬＭＧ＿ＲＳ０２３００およびＬＬＭＧ＿ＲＳ０２３０５；それぞれ、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７７７８；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４４６９３７．．４４７４２２）およびＧｅｎｅ  ＩＤ：４７９７０９３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４４７５６３．．４４９１２８））の前に付加した。
【０１９８】
（ｅ）トレハロースの保持を増加させるために、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣ成分をコードする遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９６８９３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４３０２７１．．４３１６０８））、ｐｔｃＣを欠失させた。
【０１９９】
（ｆ）ｈＩＬ−２を発現および分泌させるために、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ６０５６８、アミノ酸２１−１５３）をコードするｈＩＬ−２遺伝子と、ｕｓｐ４５分泌リーダー（Ｓｓｕｓｐ４５）との融合体をコードする遺伝子を、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ遺伝子（ｅｎｏ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７４３２；位置：ＮＣ＿００９００４．１（６０６１８４．．６０７４８５））の下流に配置した。ｈＩｌ−２発現単位を、高度発現Ｌ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子の前に存在する遺伝子間領域（ｒｐｍＤ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７８７３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２３１６７３２．．２３１６９１１、相補体））を使用することによってｅｎｏに転写および翻訳的にカップリングさせた。ｒｐｍＤによって連結されたｅｎｏＡの下流のＳｓｕｓｐ４５およびｈＩＬ−２の上記の融合体をコードする例示的なヌクレオチド配列を、図１（配列番号４６）に示す。
【０２００】
図２は、上記の遺伝子座の概略図を提供する。
【０２０１】
実験はまた、対照株がＩＬ−２の発現のための構築物を含有しないことを除き、ＬＬ−ＩＬ−２と同等の遺伝的形質を有する対照株（ＬＬ−対照）も含む。ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−対照株の遺伝的形質を以下の表１に要約する。
【０２０２】
【表１】
2019505524.tif 000003
【０２０３】
表１を参照して、ｔｒｅＰＴＳ発現（トレハロースオペロンでの）は、野生型（ｗｔ）と同じでありうるか、またはｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ＞＞ＰＴＳ）によって駆動することができる；ｔｒｅＰＰはｗｔでありうるかまたは欠失させることができる（Δ）；ｐｔｃＣはｗｔまたはΔでありうる；ｏｔｓＢは存在しないか（−）またはｕｓｐ４５の下流に位置し、そこから発現されうる（ｕｓｐ４５＞＞ｏｔｓＢ）；ｔｈｙＡはｗｔまたはΔでありうる；ｅｎｏ座は、ｗｔ（−）でありうるか、またはｈＩＬ−２を含有しうる。全てのｇａｐＢ座がｗｔであるのに対し、ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２は本明細書において以下に記載するようにｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓを有する。
【０２０４】
遺伝子改変を、これらの遺伝的形質の５’および３’末端での２回の相同組換えを使用して実行した。類似の方法は、Ｌ．ラクチス（L. lactis）Ｔｈｙ１２の構築に関して記述されており（例えば、Steidler L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7):785-789を参照されたい）、その違いはヘルパープラスミドｐＶＥ６００７を使用しなかったことであった。手順はエリスロマイシン選択を中間ステップとして含み、エリスロマイシン選択マーカーをその後除去した。その結果、ＬＬ−ＩＬ−２は、残存エリスロマイシン耐性を実質的に有しない。
【０２０５】
担体プラスミド
改変方法は、条件的非複製ｐＯＲＩ１９に由来する担体プラスミドを利用する。例えば、Law J., et al., J. Bacteriol. 1995; 177(24):7011-7018を参照されたい。この複製タンパク質Ａ遺伝子欠損（ｒｅｐＡ）−プラスミドは、そのｒｅｐＡ−誘導体の全てと同様に、ｒｅｐＡ−Ｌ．ラクチス（L. lactis）において複製することができない。ｒｅｐＡ＋Ｌ．ラクチス（L. lactis）株ＬＬ１０８（Sanders et al., J. Bacteriol. 1995, 177(18):5254-5260を参照されたい）を構築宿主として使用した。細菌染色体上の野生型配列に隣接する領域と同一である１ｋｂまでのクロスオーバー（ＸＯ）領域がプラスミドを介した改変の５’および３’に位置するように、担体プラスミドを設計した。例示的なプラスミドを使用して、両方がｒｐｍＤ遺伝子間領域によってカップリングされるように、ｅｎｏの下流にｈＩＬ−２を挿入する。プラスミド構築は全て、標準的な分子生物学方法を使用して実施した。
【０２０６】
染色体の改変
プラスミドｐＯＲＩ１９の誘導体は、エリスロマイシン選択マーカー（ｅｒｍＣ、２３Ｓ  ＲＮＡメチラーゼ遺伝子；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１２６３２４５）を有し、ＭＧ１３６３またはその誘導体のいずれにおいても複製することができない。そのようなプラスミドをＭＧ１３６３に導入して、エリスロマイシン選択を培養物に適用した。エリスロマイシンを含有する固体寒天プレート上で耐性コロニーを選択した。担体プラスミドの複製インコンピテンスにより、エリスロマイシン耐性細菌は、５’または３’標的部位のいずれかでの最初の相同組換え後に限って生じることができる。相同組換えはＰＣＲによってさらに確認することができる。
【０２０７】
エリスロマイシン選択の解除により、５’または３’標的部位のいずれかでの２回目の相同組換えにより担体プラスミドを細菌染色体から切り出すことが可能であった。一部のエリスロマイシン感受性の子孫に関しては、２回目の相同組換えが、１回目の相同組換えの部位に対して代替の標的部位で起こりうる。この事象は、細菌染色体上で野生型を変異体に置き換えし、ＰＣＲによって同定することができる。適切な副次培養は、担体プラスミドの全ての残存物を急速に希釈する。
【０２０８】
それがｅｒｍＣと共に繁殖する担体プラスミド中のβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ｕｉｄＡ，Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６１４９）の存在により、エリスロマイシン感受性およびエリスロマイシン耐性コロニーの同定が可能となる。例えば、細菌懸濁液を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−Ｇｌｕｃ）含有固体寒天プレート上に播種した。グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現（従ってエリスロマイシン耐性）クローンは、Ｘ−ｇｌｕｃをその不溶性の青色反応産物であるジクロロジブロモインジゴに変換することにより青色に見えるが、エリスロマイシン感受性クローンはｕｉｄＡ遺伝子を失っており、従って白色のままである。上記のプロセスにおける適切な段階での青色と白色クローンの識別により、このアプローチは大きく促進された。
【０２０９】
ＰＣＲ分析
３’または５’標的部位のいずれかでの適切な相同組換えを示すコロニーをＰＣＲによって分析した。ＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。生成されたＤＮＡ配列は、予想される配列と同一であった。図４は、表２に列挙のオリゴヌクレオチド、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；番号６００６７７）、および適切な温度サイクル５０／１２０／３０を使用して生成されたＰＣＲ断片の１．２％アガロースゲルを示す。結果は、ＬＬ−ＩＬ−２に所望の遺伝的形質が存在することを実証した。
【０２１０】
【表２】
2019505524.tif 000004
【０２１１】
図４において、分子量マーカー（ＭＷＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０４８８−８５  Ｔｒａｃｋｉｔ  １ｋｂプラスＤＮＡラダー）は、塩基対：１００、２００、３００、４００、５００、６５０、８５０、１０００、１６５０、２０００、３０００、４０００、５０００、および５０００超を示す。ＤＮＡ断片の予想されるサイズもまた塩基対で示す。
【０２１２】
ＬＬ−ＩＬ−２の細菌ゲノムをさらにシークエンシングした。親株ＭＧ１３６３の形質とは異なる、ＬＬ−ＩＬ−２における全ての遺伝的形質の実験により決定したＤＮＡ配列は、予想と同一であることが見出された。
【０２１３】
ｈＩＬ−２の発現
ＬＬ−ＩＬ−２によるｈＩＬ−２の発現を、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを使用して測定した。ＥＬＩＳＡ実験（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのｈｕＩＬ−２  ＃ＤＹ２０２を利用する）において、培養上清中に４７．１ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２が測定されたが、対照株はｈＩＬ−２を産生しなかった。
【０２１４】
図５は、ＬＬ−ＩＬ−２の培養上清中のｈＩＬ−２の存在を示すウェスタンブロットである。ヤギ抗ヒトＩＬ−２（１／１０００  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＡＦ−２０２−ＮＡ）を一次抗体として使用して、検出抗体としてのウサギ抗ヤギ−ＡＰ（１／１０００  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃６１６０−０４）と共にインキュベートし、その後ＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色（Ｒｏｃｈｅ  ＮＢＴ／ＢＣＩＰタブレット、＃１１  ６９７  ４７１  ００１）によって、ヒトウェスタンブロットを生成した。ＬＬ−ＩＬ−２および対照株の１ｍｌ細菌培養物の等量をタンパク質ゲルにロードした。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２染色済み標準物質を分子量マーカー（ＭＷＭ）として使用した。データは、ＬＬ−ＩＬ−２が完全長のｈＩＬ−２（すなわち、配列番号４６によってコードされる）を分泌することを示している。
【０２１５】
細菌を、０．５％グルコースを補充したＭ１７ブロス（Ｏｘｆｏｒｄ；＃ＣＭ０８１７）またはＧＭ１７Ｔ培地（２００μＭチミジンを補充したＧＭ１７）である、ＧＭ１７培地中で培養した。
【０２１６】
[実施例２]
ＰＩＮＳおよびｈＩ−２を分泌するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２）
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）（L. lactis）ＭＧ１３６３の誘導体である株ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２の構築および選択を説明する。ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２は、以下の遺伝的形質を含む：（ａ）環境封じ込めを保証するために、チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９８３５８；位置：ＮＣ＿００９００４．１（９３０２５１．．９３１０９０））を除去した；（ｂ）外部から添加したトレハロースを蓄積させるために、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７１４０；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４４９１９５．．４５１５０４））を除去した；（ｃ）トレハロース−６−リン酸のトレハロースへの変換を促進するために、トレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１０３６９１４；座のタグｃ２３１１）を、ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ４５−ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７２１８；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２４６２４４０．．２４６３８２５、相補体））の下流に配置した；（ｄ）高度発現Ｌ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子の前に存在する遺伝子間領域（ｒｐｍＤ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７８７３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２３１６７３２．．２３１６９１１、相補体））を使用して、ｏｔｓＢ発現単位をｇａｐＢに転写および翻訳的にカップリングさせた；（ｅ）トレハロースの取り込みを強化するために、ＨＵ−様ＤＮＡ−結合タンパク質遺伝子（ＰｈｌｌＡ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７３５３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４９０２７５．．４９０５５０））の構成的プロモーターが、トレハロースオペロンにおける推定のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；ＬＬＭＧ＿ＲＳ０２３００およびＬＬＭＧ＿ＲＳ０２３０５；それぞれ、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７７７８；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４４６９３７．．４４７４２２）およびＧｅｎｅ  ＩＤ：４７９７０９３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４４７５６３．．４４９１２８））の前に存在する；（ｆ）蓄積後のトレハロース保持を確認するために、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣ成分（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９６８９３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（４３０２７１．．４３１６０８））、ｐｔｃＣを破壊した（４４６のコドン位置３０でのｔｇａ；ｔｇａ３０）；（ｇ）プロインスリンを発現および分泌させるために、ヒトプロインスリン（ＰＩＮＳ；Ｕｎｉｐｒｏｔ；Ｐ０１３０８、アミノ酸２５〜１１０）をコードするｐｉｎｓ遺伝子と、ｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）との融合体をコードする遺伝子を、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐＢ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７８７７；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２４９２５０９．．２４９３５１９、相補体））の下流に配置する；（ｈ）高度発現Ｌ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子の前に存在する遺伝子間領域（ｒｐｍＤ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７８７３；位置：ＮＣ＿００���００４．１（２３１６７３２．．２３１６９１１、相補体））を使用することによって、ｐｉｎｓ発現単位をｇａｐＢに転写および翻訳的にカップリングさせた；ならびに（ｉ）ｈＩＬ−２を発現および分泌させるために、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ６０５６８、アミノ酸２１〜１５３）をコードするｈＩＬ−２遺伝子と、ｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）との融合体をコードする遺伝子を、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ遺伝子（ｅｎｏ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７４３２；位置：ＮＣ＿００９００４．１（６０６１８４．．６０７４８５））の下流に配置した。ｈＩｌ−２発現単位を、高度発現Ｌ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子の前に存在する遺伝子間領域（ｒｐｍＤ；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７９７８７３；位置：ＮＣ＿００９００４．１（２３１６７３２．．２３１６９１１、相補体））を使用することによってｅｎｏに転写および翻訳的にカップリングさせた。
【０２１７】
ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２の全ての遺伝的形質は、細菌染色体上に存在する。この株の遺伝的バックグラウンドは、ＰＩＮＳおよびｈＩＬ−２の構成的分泌；増殖および生存が、外部から添加したチミジンに厳密に依存すること；ならびに例えば胆汁酸溶解に抵抗するためにトレハロースを蓄積および保持する能力を保証する。
【０２１８】
遺伝子間領域ｒｐｍＤによって連結されたｇａｐＢ遺伝子の下流で、ＳＳｕｓｐ４５とＰＩＮＳの上記の融合体をコードする例示的なヌクレオチド配列を、図６（配列番号５７）に示す。図７は、上記の遺伝子座の概略図を提供する。遺伝的形質を、実施例１に概要するように細菌ゲノムに導入した。細菌株を上記の実施例１に記述するように増殖させて、分析した。ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２の構築および分析に使用したオリゴヌクレオチドを以下の表３に要約する。
【０２１９】
【表３】
2019505524.tif 000005
【０２２０】
図９は、ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２からのＰＣＲ断片の１．２％アガロースゲル分析を表し、所望の遺伝的形質：ｔｒｅＰＴＳ、ｐｔｃＣ−、ｅｎｏ＞＞ｈｉｌ−２、ｏｔｓＢ、ｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓが存在することを示している。図９において、分子量マーカー（ＭＷＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０４８８−８５  Ｔｒａｃｋｉｔ  １  ｋｂプラスＤＮＡラダー）は、塩基対：１００、２００、３００、４００、５００、６５０、８５０、１０００、１６５０、２０００、３０００、４０００、５０００、および５０００超を示す。ＤＮＡ断片の予想されるサイズもまた塩基対で示す。
【０２２１】
ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２の細菌ゲノムをさらにシークエンシングした。親株ＭＧ１３６３の配列とは異なる、ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２における全ての遺伝的形質の実験によって決定したＤＮＡ配列は、予想と同一であることが見出された。
【０２２２】
相同組換え法は、上記のように条件的非複製ｐＯＲＩ１９から誘導した担体プラスミドを伴った。細菌染色体上の野生型配列に隣接する配列と同一である１ｋｂまでのクロスオーバー（ＸＯ）領域が、プラスミドを介した改変の５’および３’に位置するように、担体プラスミドを設計した。担体プラスミドの例はｐＡＧＸ１１４５であり、そのダイアグラムを図８に示す。プラスミドを使用して、両方がｒｐｍＤ遺伝子間領域によってカップリングされるように、ｇａｐＢの下流にｐｉｎｓを挿入する。類似のプラスミド、ｐＡＧＸ１３７２（ａｎｎｅｘ：ｐＡＧＸ１３７２．ｇｂｋを参照されたい）を使用して、ｈｉｌ−２をｅｎｏの下流に挿入する。プラスミド構築は全て、標準的な分子生物学の方法を使用することによって実施した。
【０２２３】
ＰＩＮＳおよびｈＩＬ−２発現
ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２によるＰＩＮＳおよびｈＩＬ−２の発現を、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを使用して測定した。ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２の培養上清は、０．６ｎｇ／ｍＬのＰＩＮＳおよび２８．２ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２を含有したが、対照株（ＬＬ−対照）は、いずれのポリペプチドも産生しなかった。プラスミドベクターからのＰＩＮＳを発現するＭＧ  １３６６３細菌株（ＬＬ−ＰＩＮＳ）を陽性対照として使用した。上清中のＰＩＮＳ含有量を、Ｍｅｒｃｏｄｉａカタログ番号１０−１１１８−０１を使用して決定し、ｈＩＬ−２含有量をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのｈＩＬ−２  ＃ＤＹ２０２を使用して決定した。
【０２２４】
図１０は、ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２の培養上清中のＰＩＮＳおよびｈＩＬ−２の存在を示すウェスタンブロットである。１ｍｌ細菌培養物の等量をタンパク質ゲルにロードした。ヤギポリクローナル抗インスリンＢ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｎ−２０：ｓｃ−７８３８）およびヤギ抗ヒトＩＬ−２（１／１０００  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ−２０２−ＮＡ）をそれぞれ、ＰＩＮＳおよびｈＩＬ−２の一次抗体として使用して、検出抗体としてのウサギ抗ヤギ−ＡＰ（１／１０００  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃６１６０−０４）と共にインキュベートし、その後ＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色（Ｒｏｃｈｅ  ＮＢＴ／ＢＣＩＰタブレット、＃１１  ６９７  ４７１  ００１）によって、ウェスタンブロットを生成した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２染色済み標準物質を分子量マーカー（ＭＷＭ）として使用した。データはＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２が完全長のＰＩＮＳおよびｈＩＬ−２を分泌することを示している。
【０２２５】
細菌を、０．５％グルコースを補充したＭ１７ブロス（Ｏｘｆｏｒｄ；＃ＣＭ０８１７）またはＧＭ１７Ｔ培地（２００μＭチミジンを補充したＧＭ１７）である、ＧＭ１７培地中で培養した。
【０２２６】
[実施例３]
糖尿病の進行に及ぼす２つの細菌株、プロインスリン（ＬＬ−ＰＩＮＳ）およびｈＩＬ−２（ＬＬ−ＩＬ−２）を分泌するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）の効果を調べるための薬力学試験
細菌は、Takiishi, T. et al., J. Clin. Inv. 2012, 122(5): 1717-1725に記載されるように培養した。
【０２２７】
例えば、それぞれのＬ．ラクチス（L. lactis）の単一のコロニーをＧＭ１７Ｔ（Ｍ１７、Ｏｘｏｉｄ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＫ、０．５％グルコース、２００μＭチミジンを補充）に接種して、飽和するまで一晩増殖させた。この培養物の１／２５希釈液をＧＭ１７Ｔ中で３時間予め増殖させた。細菌を遠心分離によって収集して、緩衝培養培地（２００μＭチミジンを補充した、１×ＢＭ９塩、０．５％カシトン（Ｄｉｆｃｏ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．５％グルコース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１μＭ  ＣａＣｌ２（ＢＭ９培地）（Schotte, et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 27(10):761-765））（ＢＭ９Ｔ）中でさらに３時間インキュベートした。細菌を遠心分離によって除去し、上清の試料をウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによる分析のために採取した。ウェスタンブロットに関して、タンパク質を、デオキシコール酸塩／ＴＣＡ／アセトン沈殿により粗製ＢＭ９Ｔ  Ｌ．ラクチス（L. lactis）上清から調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に溶解した。細菌細胞ペレットを破壊して細胞内分画を得た。培養上清（１ｍｌ培養物と同等）および細胞内（５０μｌ培養物と同等）タンパク質分画をＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥによって分離し、イムノブロットを行い、ヤギ抗ｈＩＬ−２によって顕色し、ウサギ抗ヤギ抗体およびＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用して検出した。
【０２２８】
全ての株の保存溶液を５０％グリセロールのＧＭ１７溶液中、−２０℃で保存する。細菌をＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）中で培養する。
【０２２９】
糖尿に関して陽性で、２回の連続する血糖値測定が２００ｍｇ／ｄｌ超えである、新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスを実験の設定に使用した。マウスを３つの実験処置群：（１）無処置対照、（２）ＬＬ−ＰＩＮＳ処置、および（３）ＬＬ−ＰＩＮＳとＬＬ−ＩＬ−２の組合せによって処置したマウス、に６週間の期間割付した。
【０２３０】
この実験は２つの異なるＬＬ株を伴った。１つの株は、ＰＩＮＳを構成的に発現するが、他の株はＩＬ−２を構成的に発現する。マウスを２×１０９ＣＦＵの用量で週に５回の強制経口投与によって６週間処置した。
【０２３１】
マウスを４２日間（治療の中止）または１００日間（治療中止後８週間）追跡した。疾患寛解に関する１００日までの初回追跡期間の他に、追加のマウス（無処置およびＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＬＩ−２処置）を処置開始後４２日目に安楽死させて、末梢血および異なる臓器をさらなる分析のために使用した。インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、炎症性サイトカイン、およびグルコース刺激Ｃ−ペプチドを測定する血清試料を、処置前および治療中止後（４２日目）に収集した。全ての実験群（疾患の寛解体および非寛解体の両方）において、末梢免疫系（表現型および機能）をアセスメントした。膵臓試料を、治療中止（４２日）時に組織学（膵島炎）およびインスリン含有量の決定（ＩＣ）のために採取した。
【０２３２】
Ｔ１Ｄおよび膵島炎のアセスメント
ＮＯＤマウスを、尿中（Ｃｌｉｎｉｓｔｉｘ；Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および静脈血中（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（登録商標）Ａｖｉｖａ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のグルコース濃度を評価することによって、糖尿病の発症に関してスクリーニングした。無作為に飼料を与えた場合の血中グルコース測定を、午前８時から１１時の間に収集した。糖尿に関して陽性で、かつ２回連続した血中グルコース測定が２００ｍｇ／ｄｌ超であれば、マウスを糖尿病と分類した。糖尿病の寛解は、糖尿が存在せず、かつ２連続日に血糖症の値が２５０ｍｇ／ｄｌ未満であることとして定義した。
【０２３３】
膵臓試料をホルムアルデヒド溶液中で固定して、パラフィン包埋のために処理した。厚さ７μｍの切片をヘマトキシリン／エオジンで染色して、膵島炎の程度を顕微鏡により評価した。膵島に対する損傷を以下のように等級付けした：０：浸潤なし；１：膵島周囲炎；２：リンパ球の浸潤が領域の５０％未満である膵島；３：リンパ球の浸潤が領域の５０％超である膵島；４：完全に破壊された膵島。
【０２３４】
自己抗体の検出
血清中ＩＡＡを、疾患の発症時および治療の停止時（４２日目）にＲＩＡアッセイによって測定した。ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ−２ワクチン接種が高血糖症を治すことができるか否か（疾患の寛解）、および新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスにおける正常血糖を維持できるか否かを試験した。血中グルコース濃度を処置開始後１４週間追跡した。
【０２３５】
結果  −  疾患の寛解
図１１は、処置後糖尿病のままであるマウスの割合を示す。ＮＯＤマウスが高血糖症（２日連続して血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄｌ超）を発症すると、マウスは一般的に自然に寛解することはほとんどなく、重度の高血糖症へと進行し、ほとんどが３〜６週間以内に死亡した（ｎ＝２７）。
【０２３６】
ＬＬ−ＰＩＮＳ接種（２×１０９ＣＦＵ／日、週に５日を６週間；ｎ＝８）による単独治療は、マウスの１５％において高血糖症を治した。特に、ＬＬ−ＰＩＮＳおよびＬＬ−ＩＬ−２の組合せによって処置した新規糖尿病マウス（ｎ＝４５）の４３％は、正常血糖を急速に再度確立した。治癒したマウスは治療の中止後８週間のさらなる追跡期間の間、正常血糖を維持したことから、ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ−２治療は、安定で永続的な糖尿病の寛解を誘導した。
【０２３７】
ＬＬ−ＰＩＮＳおよびＬＬ−ＩＬ−２治療の臨床有効性は、処置開始時の血中グルコース濃度によって明らかに影響を受ける。最近発症した糖尿病ＮＯＤマウスを、初回血中グルコース濃度が３５０ｍｇ／ｄＬより下であるかまたは上であるかに基づいて分類した。ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ−２治療は、開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄＬ未満であるマウスの５７％を治癒したのみならず、開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄＬ超のマウスの２２％も治癒した（図１２）。これらのデータは、組換えＬ．ラクチス（L. lactis）細菌によるＩＬ−２と共にＰＩＮＳの粘膜送達が、明白な最近発症したＴ１Ｄを有するＮＯＤマウスにおいて高血糖を有効に治し、β細胞に対する免疫寛容を回復することを初めて実証する。
【０２３８】
全てのカプラン−マイヤー生存曲線において、群の間の統計学的有意性は、マンテルコックスログランク検定（＊：ｐ＜０．０５）によって決定した。
【０２３９】
[実施例４]
Ｌ．ラクチス（L. lactis）（ＬＬ−ＩＬ−２）によって分泌されたｈＩＬ−２は組換えｈＩＬ−２と同等の生物活性を有する
本実験は、本明細書に記載のヒトＩＬ−２を発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株（ＬＬ−ＩＬ−２）（例えば、実施例１を参照されたい）および対照株を伴った。
【０２４０】
ＬＬ−ＩＬ−２の生物活性を、マウスＴリンパ球細胞株ＨＴ２クローンＡ５ＥのＩＬ−２依存的生存／増殖に基づいて測定した。ＨＴ２細胞を、ＩＬ−２を含まない培地で３回洗浄し、４×１０３個／９６ウェルの密度で播種した。一連の組換えｈＩＬ−２（例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２０２−ＩＬ−０１０）またはＬＬ−ＩＬ−２および対照株からの上清の連続希釈液を、播種した細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ２、および高湿度で２４時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ３５８２）を使用して測定した。ウェルあたりＭＴＴ溶液２０μｌを加えて、３７℃、５％ＣＯ２、および高湿度で４時間インキュベートした後、プレートを、参照波長として７００ｎｍを使用して、４９０ｎｍで読み取った。組換えｈＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＬＬ−ＩＬ−２由来のｈＩＬ−２は、同等の用量依存的応答を示したが、Ｌ．ラクチス（L. lactis）対照株は不活性であった。結果を図１３に示す。
【０２４１】
[実施例５]
ＬＬ−ＩＬ−２は、ｈＩＬ−２の低用量を、経口投与後の非肥満糖尿病マウスのＧＩ管に送達する
本実験は、本明細書において、例えば実施例１に記載のヒトＩＬ−２を発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株（ＬＬ−ＩＬ−２）を伴った。
【０２４２】
生きた細菌
ＧＩ管の異なる組織における生きた細菌の濃度（ＣＦＵ／組織およびＣＦＵ／ｇ）を、強制経口投与によるＬＬ−ＩＬ−２の１０１０ＣＦＵの単回用量投与後の様々な時点で測定した。結果をそれぞれ、図１４Ａおよび１４Ｂに表し、各バーはマウス３匹（ｎ＝３）の平均値を表す。図１４Ａ（ＣＦＵ／組織）を参照すると、２、４、６、および８時間後にＬＬ−ＩＬ−２細菌の有意な量が、盲腸（ＣＡＥ）、近位結腸（ＣＯＰ）、および遠位結腸（ＣＯＤ）において見出された。小腸における細菌濃度は、１０６ＣＦＵ／組織未満であることが見出された。図１４Ｂ（ＣＦＵ／ｇ）を参照すると、２、４、６、および８時間後にそれぞれ、ＬＬ−ＩＬ−２細菌の濃度が、近位小腸（ＳＩＰ）、遠位小腸（ＳＩＤ）、盲腸（ＣＡＥ）、近位結腸（ＣＯＰ）、および遠位結腸（ＣＯＤ）において見出された。血液中に細菌は検出されなかった。
【０２４３】
ｈＩＬ−２タンパク質
ＧＩ管の異なる組織におけるｈＩＬ−２タンパク質の濃度（ｐｇ／組織およびｐｇ／ｇ）を、ＬＬ−ＩＬ−２細菌（１０１０ＣＦＵ）の単回用量の投与後に測定した。ｈＩＬ−２タンパク質濃度は、２および４時間後に盲腸（ＣＡＥ）、近位結腸（ＣＯＰ）、および遠位結腸（ＣＯＤ）において見出された。小腸におけるｈＩＬ−２タンパク質濃度は、定量限界（ＬＬＯＱ＝１０ｐｇ／ｍＬ）未満であることが見出された。試験したマウスの血流中にｈＩＬ−２タンパク質は検出されなかった。測定されたｈＩＬ−２タンパク質濃度を以下の表４および５に要約する。
【０２４４】
屠殺時、組織全体（ＳＩＰ、ＳＩＤ、ＣＡＥ、ＣＯＰ、またはＣＯＤ）秤量してホモジナイズした。ホモジネート試料を、播種するため（ＣＦＵを決定するため）およびＥＬＩＳＡのため（ｈＩＬ−２を決定するため）に使用した。この状況における全組織は、ホモジネート試料中で決定した細菌またはタンパク質の濃度を、全組織の重量に対して再計算していることを意味する。
【０２４５】
【表４】
2019505524.tif 000006
【０２４６】
【表５】
2019505524.tif 000007
【０２４７】
生きたＬ．ラクチス（L. lactis）がＧＩ管全体に見出され、ほとんどの細菌が大腸の近位および遠位部分ならびに盲腸に位置した。細菌濃度は、ここでは小腸の遠位および近位部分より１０００倍高かった。これは、小腸のこれらの部分における大量の粘液および低い運動性によって説明されうる。投与されたＬ．ラクチス（L. lactis）の約５０％を、投与の２時間後に結腸の遠位部分から回収することができた。十二指腸を通過しても生存しているのは、経口投与されたＬ．ラクチス（L. lactis）の約１０〜３０％に過ぎないことがこれまでに報告されていることから（Drouault S, et al., Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65(11): 4881-6）、この知見は意外である。細菌をＢＭ９接種緩衝液と共に接種することが、細菌をＧＩ条件から（少なくとも部分的に）保護しうると推測された。
【０２４８】
約１０１０ＣＦＵのＬＬ−ＩＬ−２の投与後、ＩＬ−２の約１．２ＩＵに相当する（１ＩＵ＝７３ｐｇに基づく）ＩＬ−２約９０ｐｇが組織に送達されると推定された。
【０２４９】
[実施例６]
プロインスリン（ＰＩＮＳ）およびｈＩＬ−２の両方を分泌する臨床等級のラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ）株の効果を調べるための薬力学およびメカニズム試験
本実験は、本明細書に記載のＰＩＮＳおよびＩＬ−２の両方を発現するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株（ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２）を伴う（例えば、実施例２を参照されたい）。細菌はこれまでに記述されているように培養することができる。Takiishi, T. et al., J. Clin. Inv. 2012, 122(5): 1717-1725を参照されたい。ＮＯＤマウスを、上記の実施例３に記載のようにスクリーニングして、処置し、分析した。マウスを細菌によって、例えば２×１０９ＣＦＵの用量の強制経口投与によって週に５回、６週間処置することができる。
【０２５０】
局所および末梢免疫系の表現型分析
末梢臓器（すなわち、血液、腸間膜および膵臓リンパ節、ならびに膵臓）を治療停止後（例えば、４２日目）に単離することができ、例えば、カノニカルおよび非カノニカルＴｒｅｇマーカー（すなわち、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ３９、ＣＤ４９ｂ、ＬＡＧ−３、およびＣＤ７３）に関してフローサイトメトリー分析によって表現型を調べることができる。例えば、ＣＤ４９ｂとＬＡＧ−３の同時発現は、高度に抑制性のＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の特徴づけを可能にするが（例えば、Gagliani, N. et al., Nat. Med. 2013, 19(6): 739-746を参照されたい）、外酵素ＣＤ３９およびＣＤ７３の両方を発現するＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇの抑制メカニズムの１つであると考えられている高濃度のアデノシンを産生する。例えば、Antonioli, L., et al., Trends Mol. Med. 2013, 19(6): 355-367を参照されたい。
【０２５１】
細胞内サイトカイン染色に関して、免疫細胞を、例えば１μｇ／ｍｌホルボルミリスチン酸（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．５μｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、１μｇ／ｍｌ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ＢＤ）の存在下で４時間、再度刺激することができる。細胞表面の染色後、例えばＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キット（ＢＤ）（すなわち、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γ）を使用して、細胞内染色を実施することができる。
【０２５２】
ｐＳＴＡＴ−５検出の場合、屠殺後、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後、細胞懸濁液を例えば１．５％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液１０倍量中において室温で１０分間、急速に固定することができる。細胞を、例えば０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液中で洗浄し、例えば１００％メタノールによって氷上で１０分間透過性にすることができる。細胞を、例えば０．２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液によってさらに洗浄してもよく、目的の抗体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ１２２）と組み合わせたホスホ特異的抗体と共に、例えば室温の暗所で３０分間インキュベートすることができる。一部の例において、抗Ｋｉ６７抗体を抗Ｆｏｘｐ３抗体と一緒に添加することができる。ｐＳＴＡＴ５陰性閾値は、非刺激細胞、またはｐＳＴＡＴ５を除く全ての蛍光抗体によって染色した細胞において定義することができる。
【０２５３】
マルチパラメータ分析を、例えばＦＡＣＳ  Ｇａｌｌｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ））、またはＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）を使用して実施し、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）によって分析することができる。死細胞（生死判定イエロー４０５染色）およびダブレットは、全ての分析から除外することができる。
【０２５４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏポリクローナル抑制アッセイおよびＩＦＮ−γ検出
脾臓およびリンパ節から単離した（理想的にはｈＣＤ２．Ｆｏｘｐ３  ＮＯＤマウスから単離した）末梢Ｔｒｅｇの抑制機能を、例えば記載のように行ったｉｎ  ｖｉｔｒｏポリクローナル抑制アッセイにおいてアセスメントすることができる。例えば、Takiishi, T., et al., J Clin.Invest. 2012. 122(5):1717-1725を参照されたい。ＩＦＮ−γを、無細胞上清中で測定する。
【０２５５】
結果
ＬＬ−ＰＩＮＳ／ＩＬ−２処置は、Ｔｒｅｇを刺激して動員し、例えば本明細書において実施例３および８に記載されるＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ処置と同等の生物活性を有すると予想される。
【０２５６】
[実施例７]
プロインスリンを分泌するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）（ＬＬ−ＰＩＮＳ）の構築
ヒトプロインスリン（ｈｐｉｎｓ）をコードするＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＮＭ＿００２０７．２）から検索した。ｈｐｉｎｓ  ＤＮＡ配列を、ＴＡＡ終止コドンおよびＳｐｅＩ制限部位によって３’末端で伸長させた。４０量体オリゴヌクレオチド（ｏＡＧＸ０３６２〜ｏＡＧＸ０３７７）のＰＣＲアセンブリによってＤＮＡ断片を合成し、Ａｃｃｕ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡポリメラーゼを増幅のために使用した。増幅断片を、ｔｈｙＡラクトコッカスのプロモーター（ＰｔｈｙＡ）の下流のｕｓｐ４５分泌シグナル（ＳＳｕｓｐ４５）に融合させて、これをＥｃｏＲＩ制限部位によって５’末端で伸長させた。５’ＥｃｏＲＩ末端および３’ＳｐｅＩ末端を有する増幅産物を、プラスミドｐＴ１ＮＸ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ５８５３７１．１）のＥｃｏＲＩとＳｐｅＩ制限部位との間に挿入し、ライゲートした。ライゲーションを、電気穿孔法によってＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３に導入し、コロニーをＰＣＲ分析によってスクリーニングした。得られたプラスミドをｐＡＧＸ００５３と命名した（図１５）。
【０２５７】
ＭＧ１３６３［ｐＡＧＸ００５３］から、ｏＡＧＸ０１６９およびｏＡＧＸ０１７０を使用して、ＰｔｈｙＡ＞＞ＳＳｕｓｐ４５：：ｈｐｉｎｓ発現モジュールを含有するＰＣＲ断片を生成した。断片を精製し、ＭＧ１３６３［ｐＡＧＸ００５３］のＤＮＡ配列が予想される配列と同一であることを確認した。プラスミドの構築は，標準的な分子生物学の方法を使用して実行した。
【０２５８】
ＰＩＮＳ発現を、Ｅｌｉｓａおよびウェスタンブロットによって［ＭＧ１３６３］ｐＡＧＸ００５３からの培養上清（ＳＮ）に関して試験した。ＭＧ１３６３［ｐＡＧＸ００５３］は、プロインスリンＥｌｉｓａ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  ＃１０−１１１８−０１）を使用することによって決定すると、２．４７ｎｇ／ｍのＰＩＮＳを分泌する。粗製ＳＮ試料をウェスタンブロットのために調製した。［ＭＧ１３６３］ｐＡＧＸ００５３ならびに基準株ＭＧ１３６３［ｐＴ１ＮＸ］およびｓＡＧＸ００３７の１ｍｌ細菌培養物の等量をタンパク質ゲルにロードした。試料をヤギポリクローナル抗インスリンＢ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｎ−２０：ｓｃ−７８３８、１／５００）と共にインキュベートした。ウサギ抗ヤギＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃６１６０−０４、１／１０００）とのインキュベーションおよびその後のＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色（Ｒｏｃｈｅ  ＮＢＴ／ＢＣＩＰタブレット＃１１  ６９７  ４７１  ００１；製造元の指示通りに使用する）によって検出を行った。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ−２染色済み標準物質を分子量マーカー（ＭＷＭ）として使用した。ＬＬ−ＰＩＮＳによる完全長のＰＩＮＳの分泌を示すデータを図１６に表す。
【０２５９】
ＰＩＮＳ以外のＴ１Ｄ特異的抗原、例えばＧＡＤ６５、ＩＡ−２、ＩＧＲＰ、ＺｎＴ８、ｐｐＩＡＰＰ、ペリフェリン、クロモグラニンＡ、およびＧＲＰをコードする外因性核酸を含有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）株を、ｈｐｉｎｓの代わりに適切な核酸を使用して上記の手順に従って作製することができる。
【０２６０】
[実施例８]
ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２と比較したＬＬ−ＩＬ−２単独の経口投与の薬物動態プロファイリング
細菌培養
細菌を、Takiishi, T. et al., J. Clin. Inv. 2012, 122(5): 1717-1725に既に記載されているように培養した。例えば、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸおよびＬＬ−ＰＩＮＳは、ＧＭ１７ＴＥ培地（０．５％グルコース、２００ｍＭチミジン、および５μｇ／ｍＬエリスロマイシンを補充したＭ１７ブロス）において培養した。ＬＬ−ＩＬ−２は、ＧＭ１７Ｔ培地（０．５％グルコース、および２００μＭチミジンを補充したＭ１７ブロス）において培養した。ＬＬ株の保存溶液をグリセロール中、−８０℃で保存した。保存溶液を増殖培地（それぞれ、ＧＭ１７ＴＥまたはＧＭ１７Ｔ）で１／１０００希釈し、３０℃で１６時間インキュベートし、飽和密度２×１０９ＣＦＵ／ｍＬに到達させた。細菌を、４℃、２９００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって収集し、胃内接種のためにＢＭ９Ｔ培地（５×Ｍ９塩、１０％カシトン、１０％グルコース、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１００Ｍ  ＣａＣｌ２、および１００ｍＭチミジン）で１０倍濃縮した。処置は、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ、ＬＬ−ＰＩＮＳ、およびＬＬ−ＩＬ−２に関してこの懸濁液の１００μＬからなった。ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２は、ＬＬ−ＰＩＮＳとＬＬ−ＩＬ−２懸濁液の等量を混合することによって調製した。処置は、この浮遊液２００μＬからなった。
【０２６１】
投与スケジュールおよび投与
新規発症した糖尿病ＮＯＤマウス（２回連続した血中グルコース測定が２００ｍｇ／ｄＬ超であり、かつ糖尿陽性）に、生きた遺伝子改変ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）細菌２×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）を週に５回（平日）、６週間投与した。ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２で処置するマウスは、ＬＬ−ＰＩＮＳの２×１０９ＣＦＵおよびＬＬ−ＩＬ−２の２×１０９ＣＦＵを受けた。対照１のマウスは処置を受けず、対照２のマウスは、空のベクターを有する細菌（ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ）を受けた。６週間の処置期間の後、一部のマウスを処置開始１４週間後のさらなる解析のために残しておいた。
【０２６２】
正常血糖ＮＯＤマウス（２２週齢）は、ＬＬ−ＩＬ−２の２×１０９ＣＦＵの１用量を受けた。用量投与の２、４、６、または８時間後に、マウスを安楽死させ、全血および血清を収集した。近位小腸（ＰＳＩ）、遠位小腸（ＤＳＩ）、盲腸（ＣＡＥ）、近位結腸（ＰＣＯ）、および遠位結腸（ＤＣＯ）をホモジナイゼーション緩衝液（１０×Ｍ９塩、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、１０％ウシ血清アルブミン、蒸留水）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で収集し、機械的に解離させた。腸組織のホモジネートおよび全血を、細菌の回収を定量するためにＧＭ１７プレート上に連続希釈液で播種した。血清およびホモジネート中のＩＬ−２濃度はＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２６３】
臓器の採取
処置開始の６週間後、マウスをＣＯ２で安楽死させた。ヘパリン処理した針による心穿刺によって血液を収集した。血液を、フローサイトメトリーのためおよび血漿分離（２０００ｇ、室温で１０分間遠心分離）のために単細胞に処理するためにアリコート（２００μＬ）にした。膵臓を、組織学分析のために収集し、５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で保存した。以下のリンパ系臓器を、フローサイトメトリーによる分析のために除去した：脾臓（ＳＰＬ）、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、および膵臓流入領域リンパ節（ＰＬＮ）。
【０２６４】
膵臓の組織学および膵島炎の分類
ＰＦＡ固定パラフィン包埋膵臓を６μｍの切片に切断し、１００μｍ離して収集した後、ヘマトキシリンおよびエオジンによって染色した。キシレンの後に１００％−９０％−７０％−５０％エタノール溶液によるエチルアルコール脱水を使用してパラフィンを除去した。切片を水道水および蒸留水で再度水和した。切片をヘマトキシリン中で３分間染色し、水道水ですすいだ。切片を酸エタノール中で３回、手短にすすいだ後、水道水で十分に洗浄した。試料を飽和Ｌｉ２ＣＯ３水溶液に入れて、水道水ですすいだ。次に、試料をエオジンＹ溶液（０．５％水溶液）に入れて、水道水ですすいだ。スライドガラスを５０％エタノール、７０％エタノール、９０％エタノール、１００％エタノールで２回、およびキシレンで２回、各ステップ１０秒間脱水した。カバーガラスを載せて、膵島を光学顕微鏡下、２０倍または４０倍で観察し、客観的に等級を分類した。膵島の浸潤を以下のように採点した：０−浸潤なし；１−膵島周囲炎；２−浸潤が領域の５０％未満である膵島；３−浸潤が領域の５０％超である膵島；４−完全に破壊された膵島／重度の膵島炎。
【０２６５】
Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡ
ラット／マウスＣ−ペプチドのための市販のＥＬＩＳＡキット（ＥＺＲＭＣＰ２−２１Ｋ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｔ．  Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ）を使用して血漿中のＣ−ペプチドレベルを決定した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートを１×ＨＲＰ洗浄緩衝液（蒸留水で１：１０に希釈したＴｗｅｅｎ２０を含有する５０ｍＭトリス緩衝食塩水）によって３回洗浄した。マトリクス溶液（０．００８％アジ化ナトリウムを含有する血清マトリクス）をブランク、標準物質、および品質対照ウェルに添加した。次いで、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍリン酸食塩水、０．０２５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．０８％アジ化ナトリウム、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．４）を全てのウェルに添加した。既知レベルのラットＣ−ペプチドを含有する標準および品質対照をそれぞれのウェルに加えて、非希釈マウス血漿を添加した。抗体溶液混合物（予め滴定した捕捉抗体とＣ−ペプチドに対するビオチン化検出抗体の１：１混合物）を添加して、プレートを中速のオービタルマイクロタイタープレートシェーカー上、室温で２時間インキュベートした。ウェルを１×ＨＲＰ洗浄緩衝液によって３回洗浄し、酵素溶液（予め滴定したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ）を各ウェルに添加して、固定したビオチン化抗体に西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートさせた。プレートを、中速に設定したマイクロタイタープレートシェーカー上、室温で３０分間インキュベートした。ウェルを１×ＨＲＰ洗浄緩衝液によって十分に洗浄した。３，３’、５，５’−テトラ−メチルベンジジンを含有する基質溶液を各ウェルに添加して、プレートを１５分間振とうさせた。酵素活性を、停止溶液（０．３Ｎ  ＨＣｌ）によって停止させ、５分以内に吸光度をＶｉｃｔｏｒ分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において４５０ｎｍで測定した。
【０２６６】
リンパ系臓器からのリンパ球の単離
臓器を採取して、氷冷洗浄培地（４．５％抗生物質（Ｇ４１８硫酸塩）および２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に置いたた。臓器を洗浄培地と共に７０μｍストレーナの中に通過させてすりつぶした。細胞を遠心分離によってペレットにした。脾臓に関して、ＮＨ４Ｃｌを３７℃で３分間添加後、ＰＢＳによって洗浄した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）１５０μＬに再懸濁させた。以下の蛍光色素コンジュゲート抗体を、染色のために使用した：ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４−ＡＰＣ−Ｈ７（ＧＫ１．５，  ＢＤ）、ＣＤ８α−ｅＦｌｕｏｒ４５０（５３−６．７）、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７（ＰＣ６１．５）、ＣＴＬＡ４−ＰＥ（ＵＣ１０−４８９）、Ｆｏｘｐ３−ＡＰＣ（ＦＪＫ−１６５）。抗体は、特に言及していなければ全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た。蛍光色素コンジュゲート抗体の非特異的結合を低減させるために、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（９３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＦｃ−γＩＩおよびＩＩＩ受容体を遮断した。死細胞を染色するために、製造元の説明書に従って、Ｚｏｍｂｉｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用した。
【０２６７】
Ｔｒｅｇ細胞の染色
細胞を染色前、１×ＰＢＳで洗浄した。細胞およそ１×１０９個を９６ウェルプレートにペレットにし、１×ＰＢＳで１／５００希釈したＺｏｍｂｉｅ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）５０μｌに懸濁させた。細胞を室温の暗所で２０分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液２００μＬによって洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した細胞外エピトープに対する抗体と共に４℃の暗所で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液２００μＬによって洗浄した。細胞を、固定／透過処理溶液（Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中、室温で３０分間固定および透過処理した。細胞内エピトープに対する抗体を１×透過処理緩衝液で希釈して、４℃の暗所で細胞と共に３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して再懸濁させ、画像取得のために濾過した。以下の抗体を以下の希釈で使用した：ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；１／１００）；ＣＤ２５（ＰＥ−Ｃｙ７；１／６２５）；ＣＤ４（ＡＰＣ−Ｈ７；１／１６０）；ＣＤ８ａ（ｅＦｌｕｏｒ４５０；１／３００）；ＣＴＬＡ４（ＰＥ；１／２００）；Ｆｏｘｐ３（ＡＰＣ  １／２００）。
【０２６８】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーデータを、ＦＡＣＳＤｉｖａを備えたＢＤ  ＣａｎｔｏＩＩにおいて取得し、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）によって分析した。補正の設定に関してはＵｌｔｒａＣｏｍｐ  ｅＢｅａｄｓ（商標）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。
【０２６９】
統計分析
統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを使用して実施した。
【０２７０】
結果
結果は一般的に、（ａ）自己抗原としてのプロインスリン（例えば、ＬＬ−ＰＩＮＳとして投与）を伴う、または伴わない低用量ＩＬ２（ＬＬ−ＩＬ−２を介した粘膜投与）が、マウスにおける新規発症した糖尿病から安全に回復させることができること、（ｂ）Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋）の誘導および活性化が、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治療の可能性がある作用機序であること、ならびに（ｃ）初回血中グルコース濃度がマウスにおける治療成功の予測因子であることを示している。
【０２７１】
ＬＬ−ＩＬ−２の粘膜送達は、ＮＯＤマウスにおいて長期間持続する糖尿病の寛解を誘導する
糖尿病の発症は、マウスが、糖尿陽性と合わせて２連続日に２００ｍｇ／ｄＬ超の血中グルコース測定を有した場合に診断された。処置の成功（「寛解」）は、２回連続する血中グルコース測定が２００ｍｇ／ｄＬ未満であり、かつ糖尿陽性が完全に存在しないこととして定義された。
【０２７２】
無処置糖尿病ＮＯＤマウスは、高血糖のままであり、自身の初回体重の２０％超を失った場合に安楽死させた。ＬＬ−ｐＴ１ＮＸによる処置は、糖尿病マウスにおいて正常血糖を回復しなかった。ＬＬ−ＰＩＮＳの粘膜送達は、新規発症した糖尿病マウスの約１２％において糖尿病を好転させた。意外にも、処置の６週間後、ＬＬ−ＩＬ−２単独は、新規発症した糖尿病マウスの約２７％において糖尿病の好転を引き起こした（すなわち、正常血糖が再度確立をもたらす）。ＬＬ−ＰＩＮＳと組み合わせたＬＬ−ＩＬ−２（ＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ）の粘膜送達からなる併用治療は、マウスの約３０％において糖尿病後に正常血糖を回復した。ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳは、処置終了後少なくともさらに８週間の追跡期間、糖尿病の長期間持続する寛解を誘導した。ＬＬ−ＩＬ−２治療単独と比較すると、ＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治療は、より急速に糖尿病を好転させうる。結果を図１７に示す。
【０２７３】
治療開始時の血中グルコース濃度は治療成功に影響を及ぼす
ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳによる６週間の治療はそれぞれ、開始時血中グルコース測定が３５０ｍｇ／ｄＬ未満であるマウスのそれぞれ、約４５％および約５０％において糖尿病から回復させた。比較すると、開始時血中グルコース測定が３５０ｍｇ／ｄＬ超のマウスが寛解したのはわずか約８％に過ぎなかった。これらの結果は、処置開始時の残存ベータ細胞量が、治療の成功を予測しうることを示している。結果を図１８に示す。図２２Ａおよび２２Ｂは、処置期間および追跡期間にわたる、ＬＬ−ＩＬ−２単独（図２２Ａ）およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ（図２２Ｂ）で処置した、最近発症した糖尿病マウスにおける血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。
【０２７４】
ＬＬ−ＩＬ−２の粘膜送達は、機能的ベータ細胞量を保存する
血漿中Ｃ−ペプチドは、膵臓のインスリン含有量を反映することができる（例えば、Suarez-Pinzon WL et al., Combination therapy with glucagon-like peptide-1 and gastrin restores normoglycemia in diabetic NOD mice. Diabetes 2008; 57:3281-8を参照されたい）。ＬＬ−ＩＬ−２（１１３．２３±２８．１６ｐＭ、ｎ＝３）およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ（１６７．６３±６４．３８ｐＭ，ｎ＝９）によって処置して治癒したマウスにおけるＣ−ペプチドレベルはそれぞれ、長期間の正常血糖ＮＯＤマウスにおいて測定されたＣ−ペプチド値（６０２．９３±２９３．４３ｐＭ，ｎ＝６）の１９％および２８％であり、無処置の長期糖尿病のＮＯＤマウスにおいて見出される値（ｎ＝４；５８．２３±１００．８６ｐＭ）の約２倍高かった。Ｃ−ペプチドレベルは、残存膵島によって産生される内因性のインスリンの量の測定でありうる。ＮＯＤマウスが糖尿病になるとＣ−ペプチドレベルは低下し、無処置の長期糖尿病マウスでは、Ｃ−ペプチドレベルは非常に低いかまたは検出不能であると予測された。このことは、実際に分析したマウス４匹中３匹で観察された。マウス１匹のみが検出可能レベルのＣ−ペプチドを有した。この観察は、糖尿病の診断時に機能的ベータ細胞がなおも存在し、治療によって保存されることを示唆している。ＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳで処置し、糖尿病の寛解を示したマウスは、新規発症した糖尿病マウスと比較すると統計学的に有意により高いＣ−ペプチドレベルを有した（ｐ＜０．０５）。非治癒マウスは、ほとんどの長期糖尿病マウスにおいて見出されるものと類似の、検出不能Ｃ−ペプチド値を有した。結果は、最近発症した動物では一部のベータ細胞機能が残っていることを示している。治癒したマウスは、最近発症した糖尿病マウスにおいて見出されるレベルと同等のＣ−ペプチドレベルを有した。非治癒動物はベータ細胞機能を失ったが、これは、Ｃ−ペプチドレベルが検出不能であることによって表される。結果を図１９に示す。
【０２７５】
ＬＬ−ＩＬ−２の粘膜送達は膵島炎の進行を停止させる
糖尿病発症後の膵臓の組織学分析により、白血球が重度に浸潤した膵島およびベータ細胞が残存しているごく少数の膵島が明らかとなった。ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳは、膵島炎を停止させた（すなわち、悪化を防止した）。膵島炎の悪化は、典型的に、新規発症から長期糖尿病への進行の間に観察される。意外にも、いずれの治療も、長期間の正常血糖ＮＯＤマウスにおいて見出される膵島炎と比較して膵島炎の程度を改善した。重度の膵島炎を有する膵島の割合は有意に影響を受けなかったが、いずれの治療も、膵島炎のない領域を劇的に増加させた。さらにより意外にも、この改善はまた、正常血糖に達していない動物（「非治癒」動物）においても観察された。結果を図２０に示す。
【０２７６】
ヘマトキシリンおよびエオジン染色では、どの免疫細胞、すなわちエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）対Ｔｒｅｇ細胞が、膵臓に浸潤したかを決定することができなかった。
【０２７７】
ＬＬ−ＩＬ−２の粘膜送達は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ−細胞の増大を誘導する
異なる免疫細胞サブセットに及ぼすＬＬ−ＩＬ−２の効果を、局所的（すなわち、ＭＬＮ）、全身性（すなわち、脾臓および血液）の両方、および標的臓器（すなわち、ＰＬＮ）で、フローサイトメトリー分析を使用して測定した。全身投与した低用量ＩＬ−２は、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、およびＣＴＬＡ４を含むＴｒｅｇ細胞関連タンパク質の発現を誘導することができることから、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞またはそれらの活性化状態（ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ）の頻度を決定した。
【０２７８】
生きたＣＤ３＋Ｔ細胞内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団をアセスメントした。ＭＬＮにおけるＣＤ４＋  Ｔ細胞の小さい減少が、治癒動物と比較して、非治癒マウスにおけるＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治療によって検出された（それぞれ、ｐ＝０．０４４およびｐ＝０．０６８）。試験した末梢臓器（すなわち、血液および脾臓）および標的臓器（すなわち、ＰＬＮ）において、これらの白血球数に統計学的に有意な変化はなかった。ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度の差は、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳに局所的に曝露された部位に限定された。逆に、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、治癒マウスと比較して、ＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治療の非治癒マウスのＭＬＮにおいて増加した（ｐ＝０．０１２）。この傾向はまた、ＬＬ−ＩＬ−２治療にも存在した。さらに、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ処置の非治癒マウスは、新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスと比較して有意により高いＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞を有した（それぞれ、ｐ＝０．０２５およびｐ＝０．０１１）。この系統的変化は、Ｌ．ラクチス（L. lactis）に基づく治療ではなくてむしろ疾患進行の結果でありうる。
【０２７９】
Ｔｒｅｇ細胞の存在をまた、フローサイトメトリーを使用してアセスメントした。治療開始の６週間後、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治癒マウスのＰＬＮは、新規発症した糖尿病マウスと比較してＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞の頻度がより高い傾向を示した（新規発症したマウスにおける約１０％と比較していずれも約１７％）。この傾向はまた、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ処置非治癒マウスにおいても観察された（それぞれ、約１４％および約１７％）。
【０２８０】
脾臓において、非治癒マウスは、治癒マウスと比較しておよび無処置の最近発症したマウスと比較して、このＴｒｅｇ細胞区画の減少を示した。血中では、いずれの治療も、新規発症した糖尿病マウスと比較した場合に循環中のＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞の増加傾向を誘導した。この場合も、この増加は、治療転帰とは無関係であり、非治癒ＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ処置マウスにおいて、この増加は有意であった（ｐ＝０．００９）。ＭＬＮにおいて、ＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ非治癒マウスはまた、新規発症した糖尿病マウスと比較してＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞の有意により高い頻度を有する（ｐ＝０．００２）。上記の結果を図２１に示す。
【０２８１】
Ｔｒｅｇ細胞区画を、ＣＤ２５発現を測定してさらに定義した。かなりの数のＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ２５を発現しなかったが（ＣＤ２５−）、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳによる治療はなおも、この集団において変化を誘導した。ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞は、血液中で比較的豊富に存在し、ＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ非治癒マウス（ｐ＝０．００４）およびＬＬ−ＩＬ−２治癒マウスにおいて増加した。脾臓において、このサブセットにおける減少傾向が、治癒マウスと比較してＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ処置非治癒マウスにおいて観察された（それぞれ、ｐ＝０．０６およびｐ＝０．０６）。腸間膜リンパ節において、ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ−４＋Ｔｒｅｇｓに及ぼすＬＬ−ＩＬ−２またはＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳの効果はほとんどなかった。標的リンパ節（すなわち、ＰＬＮ）において、このＴｒｅｇ細胞サブセットは、新規発症した糖尿病マウスと比較してＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治癒マウスにおいて増加した。
【０２８２】
以下の傾向がＣＤ２５＋細胞に関して観察された：ＭＬＮにおいて、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳによって処置した非治癒マウスにおいて、新規発症した糖尿病マウスと比較して増加した（それぞれ、１２％および１４％対７％）。これは、後者の群において統計学的に有意であった（ｐ＝０．００１）。ＰＬＮにおいて、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ処置群ではこのサブセットの目に見える増加傾向があった。
【０２８３】
血液および脾臓において認められるＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞の分布パターンは、ＣＤ２５発現に基づいてさらに分類すると類似であった。局所および標的リンパ節（すなわち、ＭＬＮおよびＰＬＮ）において、Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞の増加はＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＩＬ−２治療の両方の後に認められ、これはほとんどがＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞区画に起因しうる。
【０２８４】
ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＩＬ−２によって処置した、新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスにおける脾臓のサイズを、６週間の期間全体でアセスメントした（ｎ＝３）。脾腫は観察されなかった。ＬＬ−ＩＬ−２ならびにＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳによる処置は安全かつ良好に忍容された。
【０２８５】
結論
ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治療は、安全かつ良好に忍容され、新規発症した糖尿病ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の寛解を誘導した。いずれの治療も有益な代謝効果および免疫効果を有する。意外にも、一部の効果はまた、非治癒マウスにも存在し、実験の経過の間正常血糖に達しなかった対象、または処置開始時の残存ベータ細胞量がある特定の閾値より下であったことから治療が遅すぎた対象に関しても潜在的恩典を示唆した（ＮＯＤマウスにおいて、ベータ細胞喪失のプロセスは、ヒトにおいて観察される喪失と比較してより速い）。このため、免疫効果は全ての処置動物において観察されているが、この効果は、処置開始時に十分なベータ細胞量が残存している動物に限って明確な治療効果につながった可能性がある。
【０２８６】
ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治療は、おそらくＴｒｅｇ細胞の増大を伴う機序を通して膵島炎の進行を停止させた。処置および無処置の新規発症した糖尿病マウスの間のＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋Ｔｒｅｇ細胞の割合の差が、ＬＬ−ＩＬ−２およびＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治療後のＰＬＮにおいて見出された。治療によって誘導されたＴｒｅｇ細胞数の増加は、Ｔｒｅｇ細胞の生存が改善された結果でありうる（例えば、Tang Q, Bluestone JA. Nat. Immunol. 2008; 9(3): 239-244を参照されたい）。あるいは、Ｔｒｅｇ細胞数の増加は、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の誘導Ｔｒｅｇ細胞への変換の結果でありうるか（Zheng Y, Rudensky AY. Nat. Immunol. 2007; 8(5): 457-462）、またはＴｒｅｇ細胞のＰＬＮへの動員が増加した結果でありうる（Grinberg-Bleyer Y. et al., J. Exp. Med. 2010; 207(9):1871-1878）。
【０２８７】
[実施例９]
糖尿病の寛解率に及ぼす抗ＣＤ３抗体投与の効果
抗ＣＤ３抗体の用量設定試験をマウスにおいて実施した。開始時血中グルコースレベルが２００ｍｇ／ｄｌ超であるマウスに２．５μｇ／日、５μｇ／日、１０μｇ／日、２５μｇ／日、または５０μｇ／日の抗ＣＤ３抗体（テプリズマブ）をＩＶ注射によって投与した。２５μｇ／日または５０μｇ／日の用量は何らかの毒性を示した。処置を５日の期間行い、このことは抗ＣＤ３抗体の累積用量が１２．５μｇ、２５μｇ、５０μｇ、１２５μｇ、または２５０μｇであったことを意味する。１０μｇ／日を受けた処置群では、およそ５０％の最大寛解誘導が得られた。しかし、より長期間にわたる処置による毒性を低減するために、治療下用量（低用量）であると考えられる２．５μｇ／日の用量（１２．５μｇの累積）を選択した。抗ＣＤ３抗体の２．５μｇ／日による処置は、より高い１０μｇ／日より有効性が低く、結果として、寛解誘導はおよそ２０％であった。
【０２８８】
実施例８と同様に、ＬＬ−ＰＩＮＳ、ＬＬ−ＩＬ−２、ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２を、胃内接種（２×１０９ＣＦＵ／日）によって新規発症した糖尿病マウスに週に５回、６週間投与した。さらに、ハムスター抗マウスＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（１４５−２Ｃ１１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＳＡ）を、ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２を、接種を受けたマウスに５日間連続して静脈内投与した（２．５μｇ／日）。試験した全ての新規発症したマウスは、開始時血中グルコース濃度が３５０ｍｇ／ｄｌ未満であった。体重および血糖症を週に３回測定した。糖尿病の寛解は、糖尿の非存在および２日間連続して血糖症の値が２００ｍｇ／ｄｌ未満として定義した。
【０２８９】
図２３に示すように、ＬＬ−ＰＩＮＳ（ｎ＝５）、ＬＬ−ＩＬ２（ｎ＝１３）、およびＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２の混合物（ｎ＝３１）の接種による治療はそれぞれ、マウスの２０％、３０．８％、および４５．２％において高血糖症を治した。ＬＬ−ＰＩＮＳ＋ＬＬ−ＩＬ２および抗ＣＤ３の組合せによって処置した新規糖尿病マウス（ｎ＝３）は、マウスの６６．７％において正常血糖を再度確立した。これらのデータは、追加の免疫調節物質、例えば抗ＣＤ３抗体が、より低い開始時血中グルコース濃度を有する対象においてＬＬ−ＩＬ−２＋ＬＬ−ＰＩＮＳ治療の転帰を改善することを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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