(57)【要約】  スラッジの脱水性を高める方法であって、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物、およびプロテアーゼを、慣例の調整および脱水操作の前にスラッジに添加するステップを含む、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スラッジの脱水性を高める方法であって、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物、およびプロテアーゼを、前記スラッジに添加するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜２０００ｇであり、前記プロテアーゼの用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜２０００ｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜１０００ｇであり、前記プロテアーゼの用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜１０００ｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり５０〜５００ｇであり、前記プロテアーゼの用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり５０〜５００ｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり１００〜５００ｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり１００〜５００ｇであり、前記プロテアーゼの用量が、全懸濁固体１乾燥トン当たり１００〜５００ｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、およびプロテアーゼ酵素が、前記スラッジと２０〜６０℃の温度で１分間〜９６時間インキュベートさせられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、およびプロテアーゼ酵素が、前記スラッジと１６〜７２時間インキュベートさせられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、およびプロテアーゼ酵素が、前記スラッジと１〜３日間インキュベートさせられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記スラッジが、慣例の都市および工業廃水処理操作中に生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記スラッジが、嫌気性消化スラッジおよび好気性消化スラッジからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、およびプロテアーゼが、１種以上のエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびベータ−グルコシダーゼと組み合わせて添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、およびプロテアーゼが、１種以上のＧＨ１０キシラナーゼと組み合わせて添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、およびプロテアーゼが、１種以上のベータ−キシロシダーゼと組み合わせて添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物が、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩおよびアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記混合物が、ＧＨ１０キシラナーゼ、ベータ−キシロシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ変異体、および／またはペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＧＨ６１ポリペプチドをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）スラッジを、セルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、および配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するプロテアーゼと接触させるステップと；
（ｂ）前記スラッジから水を除去するステップと
を含む、スラッジを処理する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ可読形式で配列表を含み、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、慣例の廃水処理操作によって生成された残留物（すなわち、スラッジ）の脱水性を高める方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
慣例の廃水処理の過程中に生成されたスラッジは、通常は、焼却、土地施用、埋立て、堆肥化などにより廃棄の前に脱水または濃縮される。基本的な脱水シナリオは、調整剤、例えば、硫酸第二鉄および／またはフロック化剤（例えば、高分子電解質）の添加による強く、せん断耐性のスラッジフロックの形成、続いての、重力ベルト濃縮機、ベルトフィルタプレス、または遠心分離機にわたっての機械的固体／液体分離を伴う。スラッジの脱水によって、廃水処理プラント（ＷＷＴＰ）は、最終的には廃棄されなければならないスラッジの体積単位当たり固体（すなわち、ケーキ固体）の量を高める。より高いケーキ固体の利点には、脱水スラッジ体積の減少（プラントにより「管理される」スラッジがより少ない）；より低い年間輸送費用（埋立てまたは土地施用の場所へのスラッジの運送）；スラッジが焼却され得る前に蒸発されるより少ない水（焼却がコジェネレーション目的に使用される場合、スラッジの正味エネルギー値の増加）；消化装置へのより濃縮された供給物；および／または埋立てもしくは土地施用されるスラッジの体積の減少が含まれる。
【０００４】
スラッジの一般的組成は、一般に約９０〜９９％の水であり、残りの部分は全固体であり、実細胞量（すなわち、細菌細胞）は全固体のおよそ１０％に相当する。全固体の残り９０％は、細菌細胞がその中で分散されている水和マトリックスを形成する細胞外ポリマー性物質（ＥＰＳ）からなる。スラッジを生成させるために使用される手段にかかわらず、スラッジ脱水性は、スラッジ全体のＥＰＳ割合と大きく関連してきた。ＥＰＳは、細胞溶解由来の破片（例えば、核酸、脂質／リン脂質、タンパク質など）、活性分泌細胞外産生物（例えば、多糖類およびタンパク質）、細胞外のＥＰＳ結合酵素活性の産生物（例えば、多糖類）、廃水からの吸着物質（例えば、フミン質、多価カチオン）を含む。ＥＰＳのこの複雑な性質ならびに多糖類およびタンパク質の優勢な存在のために、ＥＰＳは、炭水化物とタンパク質との比（ＥＰＳ炭水化物：タンパク質）によって伝統的に特徴付けられる。ＥＰＳ炭水化物：タンパク質は、ＷＷＴＰの多くの操作パラメータに依存して一次スラッジから一次スラッジへと変わり得る一方で、二次スラッジ内のＥＰＳ組成は、いくらかより消化特異的であり、すなわち、嫌気性消化スラッジＥＰＳ炭水化物：タンパク質は１より小さい傾向があるが、一方で好気性消化スラッジＥＰＳ炭水化物：タンパク質は、１より大きい。いずれの場合も、これらの一次成分は、水に有効に結合し、脱水に耐えるスラッジフロック内の重要な水和性物質であると考えられる。
【０００５】
スラッジフロックの水結合能力および／または機械的完全性を破壊する方法は、ポリマー性フロック化の直後のスラッジ全体の脱水性を増強するとされている。このような方法のほとんどは、ＥＰＳ成分を破壊し、脱水性を改善するために新規な化学（例えば、酸前処理、多価カチオン性コンディショナー）およびプロセス（高温前処理、電気放電、超音波）の能力に焦点を合わせてきた。様々な結果とともに、スラッジ体積を減少させるためのＥＰＳ内の選択的加水分解のための酵素の使用について記載する多数の論文が存在する。例えば、独国特許第１０２４９０８１号明細書、国際公開第９１／１０７２３号パンフレット、および独国特許第３７１３７３９号明細書を参照されたい。
【０００６】
興味のある従来技術には、慣例的廃水処理操作により生成された残留物（すなわち、スラッジ）の脱水性を増強する方法に関するＤｅＬｏｚｉｅｒらへの米国特許出願公開第ＵＳ２００８／０１９０８４５号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。国際公開第９９／２７０８２号パンフレットおよび国際公開第２００３／００６６０２号パンフレット（両方ともそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、それらがプロテアーゼおよびその変異体に関するので興味があるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
スラッジは問題のあるままであり、脱水性は困難であるので、慣例の廃水処理操作によって生成された残留物（すなわち、スラッジ）の脱水性を高める方法を改善するための継続した必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、スラッジを酵素ならびにセルラーゼおよびプロテアーゼを含むその組成物と接触させ、またはそれらで処理するステップを含む、スラッジの脱水性を高める方法に関する。好ましい実施形態において、本開示は、スラッジを、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，ＤＫ）からのＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランド酵素組成物およびプロテアーゼ、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，ＤＫ）からのＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼを含む酵素組成物で処理するステップを含む、スラッジの脱水性を高める方法に関する。実施形態において、本開示は、スラッジを、有効量のＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、ＤＫ）からのＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランド酵素組成物および有効／補足量のプロテアーゼを含む酵素組成物と接触させるステップを含む、スラッジの脱水性を高める方法に関する。プロテアーゼの非限定例には、ＳＡＶＩＮＡＳＥブランド酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，ＤＫ）が含まれる。
【０００９】
さらに別の実施形態において、その処理剤は、少なくとも１種の追加的酵素、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、またはベータ−キシロシダーゼを含む酵素組成物を含む。
【００１０】
酵素処理剤は、好ましくはスラッジ調整前（すなわち、凝集および／またはフロック化前）および機械的脱水前に添加される。実施形態において、本開示による酵素およびその組成物は、その後の機械的脱水を補助するために都市スラッジに適用され、より低いスラッジ体積、および／または脱水プロセスで使用されるポリマーの使用の減少をもたらす。
【００１１】
実施形態において、本開示の組成物中の活性酵素は、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランド酵素組成物およびプロテアーゼ成分を含む。本開示の組成物は、意外なことに、同様の条件下で単独で適用された酵素と比較して残留物の脱水性を高める。実施形態において、消化スラッジ、例えば、嫌気性または好気性消化スラッジに対してＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランド酵素組成物およびプロテアーゼを接触させ、または添加するステップを含む、スラッジの脱水性を高める方法が開示される。
【００１２】
実施形態において、本開示による使用のための適当なセルラーゼおよびセルローゼ／ヘミセルラーゼ混合物は、国際公開第２０１３／０２８９２８号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本開示による使用のための適当な酵素組成物には、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩ、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−グルコシダーゼまたはその変異体が含まれる。セルロース分解増強活性を有するペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）（エメルソニイ（ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））ＧＨ６１ポリペプチド、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）キシラナーゼ、もしくはアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−キシロシダーゼ、またはそれらのホモログが使用されてもよい。
【００１３】
実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物の用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜２０００ｇであり、プロテアーゼの用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜２０００ｇである。実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜１０００ｇであり、プロテアーゼの用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜１０００ｇである。実施形態において、セルラーゼセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり５０〜５００ｇであり、プロテアーゼの用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり５０〜５００ｇである。実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１００〜５００ｇである。実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１００〜５００ｇであり、プロテアーゼの用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１００〜５００ｇである。本明細書で使用される場合、全懸濁固体１乾燥トン当たりｇ単位の量は、グラム単位で適用される酵素生成物の量を意味する。
【００１４】
実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物およびプロテアーゼ酵素は、スラッジを２０〜６０℃の温度で１分間〜９６時間インキュベートする条件下でスラッジと接触する。実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物およびプロテアーゼ酵素は、スラッジと１６〜７２時間、および実施形態において、１〜３日間インキュベートされる。
【００１５】
実施形態において、本開示による使用のための適当なスラッジは、３次または消化スラッジを含めて、慣例の都市および工業廃水処理操作中に生成される。
【００１６】
実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物は、プロテアーゼと組み合わせてスラッジと接触される。実施形態において、活性酵素は、プロテアーゼ、例えば、配列番号１に示されるプロテアーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するプロテアーゼを含む。実施形態において、プロテアーゼは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。実施形態において、プロテアーゼは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。実施形態において、プロテアーゼは、配列番号１に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。実施形態において、プロテアーゼは、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。実施形態において、プロテアーゼは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。実施形態において、プロテアーゼは、配列番号１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。実施形態において、プロテアーゼは、配列番号１に示されるプロテアーゼを含む、またはそれらからなる。実施形態において、プロテアーゼは、配列番号１に示されるプロテアーゼの成熟形態またはその機能性断片である。
【００１７】
実施形態において、本開示は、
（ａ）スラッジを、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物、および配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するプロテアーゼと接触させるステップと、
（ｂ）スラッジから水を除去するステップと
を含む、スラッジを処理する方法に関する。実施形態は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜２０００ｇの量でのセルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物の用量、および全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜２０００ｇの量でのプロテアーゼの用量を添加するステップをさらに含む。実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物の用量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜１０００ｇの量であり、プロテアーゼの量は、全懸濁固体１乾燥トン当たり１０〜１０００ｇの量である。実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、およびプロテアーゼ酵素のインキュベーションは、適当な温度、例えば、２０〜６０℃下で十分な期間、例えば、１分間〜９６時間行われる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「ファミリー６１グリコシドヒドロラーゼ」または「ファミリーＧＨ６１」もしくは「ＧＨ６１」は、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，１９９１，Ａ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．２８０：３０９−３１６、およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ  ａｎｄ  Ｂａｉｒｏｃｈ，１９９６，Ｕｐｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：６９５−６９６に従う、グリコシドヒドロラーゼファミリー６１に入るポリペプチドを意味する。このファミリーにおける酵素は、１ファミリーメンバーの非常に弱いエンド−１，４−ベータ−Ｄ−グルカナーゼ活性の測定に基づくグリコシドヒドロラーゼファミリーとして元来分類されていた。これらの酵素の作用の構造および様式は、非規範的であり、それらは、真正グリコシダーゼとみなすことはできない。しかしながら、セルラーゼまたはセルラーゼの混合物と併せて使用される場合、リグノセルロースの分解を増強するそれらの能力に基づくＣＡＺｙ分類に保たれる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「断片」は、成熟ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端が欠けている１個以上（例えば、数個）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味し；ここで、断片は、その成熟ポリペプチドとしての活性を有する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「ヘミセルロース分解性酵素」または「ヘミセルラーゼ」は、ヘミセルロース物質を加水分解する１個以上（例えば、数個）の酵素を意味する。例えば、Ｓｈａｌｌｏｍ  ａｎｄ  Ｓｈｏｈａｍ，２００３，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６（３）：２１９−２２８）を参照されたい。ヘミセルラーゼの例には、限定されないが、アセチルマンナンエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、クマル酸エステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルクロノイルエステラーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、およびキシロシダーゼが含まれる。ヘミセルロースである、これらの酵素の基質は、植物細胞壁中のセルロースミクロフィブリルに水素結合を介して結合されており、それらを強固な網状組織中に架橋する分岐および直鎖多糖類の異質の群である。ヘミセルロースはまた、リグニンに共有結合され、セルロースと一緒に高度に複雑な構造を形成する。ヘミセルロースの可変の構造および組織は、その完全な分解のために多くの酵素の協調的作用を必要とする。ヘミセルラーゼの触媒モジュールは、グリコシド結合を加水分解するグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）、またはアセテートもしくはフェルラ酸側基のエステル結合を加水分解する炭水化物エステラーゼ（ＣＥ）のいずれかである。それらの一次配列のホモロジーに基づくこれらの触媒モジュールは、ＧＨおよびＣＥファミリーに割り当てられ得る。全体的な同様の折り畳みを有する一部のファミリーは、アルファベット順（例えば、ＧＨ−Ａ）に印された、一族にさらにグループ化され得る。これらおよび他の炭化水素活性酵素の最も有益な、最新の分類は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＣＡＺｙ）データベースで利用可能である。ヘミセルロース分解性酵素活性は、適当な温度、例えば、５０℃、５５℃、または６０℃、およびｐＨ、例えば、５．０または５．５で、Ｇｈｏｓｅ  ａｎｄ  Ｂｉｓａｒｉａ，１９８７，Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：１７３９−１７５２に従って測定され得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳および任意の翻訳後修飾、例えば、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化などの後の、その最終形態のポリペプチドを意味する。宿主細胞が、同じポリヌクレオチドで発現される、より多くの異なる成熟ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）の２種の混合物を産生し得ることは当技術分野で公知である。異なる宿主細胞がポリペプチドを異なってプロセスし、ひいては、ポリヌクレオチドを発現する１つの宿主細胞は、同じポリヌクレオチドを発現する別の宿主細胞と比較して異なる成熟ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）を産生してもよい。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「セルロース分解増強活性を有するポリペプチド」は、セルロース分解活性を有する酵素によるセルロース物質の加水分解の増強を触媒するＧＨ６１ポリペプチドを意味する。本開示の目的のために、セルロース分解増強活性は、セルロース分解増強活性なしの等しい全タンパク質負荷（ＰＣＳ中１〜５０ｍｇのセルロース分解性タンパク質／セルロース１ｇ）による対照加水分解と比較して、以下の条件：適当な温度、例えば、５０℃、５５℃、または６０℃、およびｐＨ、例えば、５．０または５．５で１〜７日間のＰＣＳ中１〜５０ｍｇの全タンパク質／セルロース１ｇ（ここで、全タンパク質は、５０〜９９．５重量％のセルロース分解性酵素タンパク質およびセルロース分解増強活性を有するＧＨ６１ポリペプチドの０．５〜５０重量％のタンパク質を含む）の下でのセルロース分解性酵素によるセルロース物質の加水分解からの、糖の減少の増加またはセロビオースおよびグルコースの合計の増加を測定することによって決定される。好ましい態様において、セルラーゼタンパク質負荷の、全タンパク質重量の２〜３％のアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ベータ−グルコシダーゼ（国際公開第０２／０９５０１４号パンフレットに従ってアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）で組み換え技術によって産生された）または全タンパク質重量の２〜３％のアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−グルコシダーゼ（国際公開第０２／０９５０１４号パンフレットに記載されたとおりにアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）で組み換え技術によって産生された）の存在下でのＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（登録商標）１．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の混合物が、セルロース分解活性の源として使用される。
【００２３】
セルロース分解増強活性を有するＧＨ６１ポリペプチドは、同じ加水分解度、好ましくは少なくとも１．０１倍、例えば、少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１０倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍に到達するのに必要とされるセルロース分解性酵素の量を減少させることによって、セルロース分解活性を有する酵素により触媒されるセルロース物質の加水分解を増強する。
【００２４】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間、または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって記載される。本開示の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラム、好ましくはバージョン５．０．０以降で実行されるとおりのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して決定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）のアウトプットは、同一性パーセントとして使用され、以下のとおりに計算される：（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アライメント中のギャップの全数）。
【００２５】
本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ｓｕｐｒａ）のＮｅｅｄｌｅプログラム、好ましくはバージョン５．０．０以降で実行されるとおりのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、ｓｕｐｒａ）を使用して決定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）のアウトプットは、同一性パーセントとして使用され、以下のとおりに計算される：（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アライメント中のギャップの全数）。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「変異体」は、１つ以上の（例えば、いくつかの）位置で、変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、すなわち、置換、挿入、および／または欠失を含む酵素活性を有するポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失は、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；挿入は、ある位置を占めるアミノ酸に隣接し、かつその直後のアミノ酸を付加することを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「キシラナーゼ」は、キシラン中の１，４−ベータ−Ｄ−キシロシド結合の内部加水分解（ｅｎｄｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）を触媒する１，４−ベータ−Ｄ−キシラン−キシロヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８）を意味する。本開示の目的のために、キシラナーゼ活性は、３７℃で、０．０１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００中基質として０．２％のＡＺＣＬ−アラビノキシラン、および２００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６によって決定される。キシラナーゼ活性の１単位は、２００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６緩衝液中基質として０．２％のＡＺＣＬ−アラビノキシランから３７℃、ｐＨ６で１分当たりに産生されるアズリン１．０ミリモルと定義される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本開示による廃水処理の概略図である。
【図２】図２は、酵素１がＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼであり、酵素２がＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランドセルラーゼおよびヘミセルラーゼ複合体である、それぞれの酵素投与条件についての脱水に必要な平均ポリマー用量のグラフである。
【図３】図３は、酵素１がＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼであり、酵素２がＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランドセルラーゼおよびヘミセルラーゼ複合体である、試験で生成されたスラッジケーキの平均乾燥固体（ＤＳ）のグラフである。
【図４】図４は、酵素１がＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼであり、酵素２がＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランドセルラーゼおよびヘミセルラーゼ複合体である、試験中に採取されたろ液試料のＣＯＤのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、スラッジ、例えば、慣例の廃水処理中に生成されたスラッジの脱水のプロセスを容易にし、および／または改善する酵素的方法に関する。
【００３０】
工業および都市廃水を処理するための様々なプロセスは、しばしば適切な操作の副生成物としてスラッジを生成する。廃水処理工業により生成されるスラッジは、廃水の源（例えば、都市または工業）によってのみならず、廃水処理プロセスの具体的段階によっても分類される。最も広い分類では、スラッジは、一次、二次または三次と考えられる。一次スラッジは、それらがしばしば、一次除濁装置にわたって通された原廃水流入物からの固体の沈降の結果であるので、通常は「原料のまま（ｒａｗ）」と考えられる。ほとんどの場合、清澄水は、次いで、活性化スラッジ溜池（ＡＳＢ）に送られ、ここで、微生物の懸濁フロックにより、水から可溶性汚染物質が除去される。微生物が複製する場合、それらは、異常増殖を回避するためにＡＳＢから定期的に除去されなければならない。それらの除去は、ＡＳＢからの流入物を受ける二次除濁装置で行われる。この「二次スラッジ」は、「廃棄物活性スラッジ」（ＷＡＳ）と考えられ、生物学的栄養素除去（ＢＮＲ）システムを用いるＷＷＴＰで比較的に普遍的存在を有する。この二次スラッジの体積を減少させ（、およびこの二次スラッジを安定化させ）るために、スラッジは、中温または高温条件下で操作されてもよい好気性（大気曝気または純酸素）または嫌気性消化装置に送られてもよい。その場合、得られた「三次」スラッジは、「消化スラッジ」として知られ、消化の特質によってさらに分類されてもよい（例えば、高温好気性消化スラッジ）。したがって、わかるとおりに、数えきれないスラッジの種類が、廃水の処理中に生成される。しかしながら、それらは、
１．一次または原スラッジ；
２．二次または廃棄物活性スラッジ；および
３．三次、安定化または消化スラッジ
と大まかにグループ化され得る。
【００３１】
それが生成された手段にかかわらず、通常は生物学的栄養素除去の一部の手段を用いて、廃水処理操作中に生成されたスラッジは、酵素的加水分解のための物質として役立つ物質を含有する。ほとんどの場合、この物質は、スラッジ固体の大部分を含む細胞外ポリマー性物質（ＥＰＳ）の成分として存在する。ＥＰＳの組成は、処理される廃水の性質、用いられる処理プロセスおよび処理条件を含む多数の可変要素に依存してスラッジからスラッジへと変わる。具体的な単糖類（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトースなど）は、スラッジＥＰＳ内に普遍的に存在する傾向がある。これを考慮すると、スラッジのＥＰＳの組成全体は非常に異なってもよいが、スラッジ成分中に存在するグルコシド結合の種類にいくらかの類似度がある。
【００３２】
本開示によれば、本明細書に記載されるセルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物、およびプロテアーゼは、具体的には脱水性を改善するために慣例の廃水処理に関連したすべてのスラッジに適用され得る。好ましい実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物、およびプロテアーゼ酵素、ならびにそれらの組成物は、工業および都市廃水の処理中に生成される三次スラッジに適用される。実施形態において、本開示のセルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物、およびプロテアーゼ、ならびに組成物は、消化スラッジ形態、例えば、嫌気性または好気性消化スラッジに適用される。本開示の目的は、慣例のスラッジ調整および脱水操作の前に、スラッジを、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物とプロテアーゼとの組み合わせで処理するステップを含む、スラッジ脱水のプロセスを容易にするか、または改善することである。
【００３３】
本開示によるスラッジの脱水性を高める方法は、以下のステップ：
ａ）スラッジを、例えば、慣例の廃水処理中に生成させ、または得るステップと
；
ｂ）スラッジを、本開示によるセルラーゼ酵素またはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物およびプロテアーゼ酵素で処理するステップと；
ｃ）任意選択で、スラッジを、凝集および／またはフロック化添加剤で調整するステップと；
ｄ）酵素処理されたスラッジを慣例の設備で脱水するステップと
を含む、またはそれらからなる。
【００３４】
上記ステップに加えて、さらなる任意選択のステップ、例えば、消化後且つ脱水段階前にスラッジを酵素で処理するステップなどが含まれてもよい。実施形態において、本開示の酵素組成物は、廃水プロセスストリームにおけるスラッジの機械的脱水前にスラッジと接触されている。
【００３５】
一態様において、本開示のセルラーゼ又はセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物は、セルラーゼ、セルロース分解増強活性を有するＧＨ６１ポリペプチド、およびヘミセルラーゼからなる群から選択される１種以上（例えば、数種）のタンパク質を含む。実施形態において、プロテアーゼが、同時に、またはセルラーゼもしくはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物と組み合わせてプロセスストリームに添加される。
【００３６】
実施形態において、セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびベータ−グルコシダーゼからなる群から選択される１種以上（例えば、数種）の酵素である。
【００３７】
実施形態において、ヘミセルラーゼは、アセチルマンナンエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、クマリン酸エステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルクロノイルエステラーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される１種以上（例えば、数種）の酵素である。
【００３８】
実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物もしくは酵素組成物は、１種以上（例えば、数種）のセルロース分解性酵素を含む。別の態様において、酵素組成物は、１種以上（例えば、数種）のヘミセルロース分解性酵素を含むか、またはさらに含む。別の態様において、酵素組成物は、１種以上（例えば、数種）のセルロース分解性酵素および１種以上（例えば、数種）のヘミセルロース分解性酵素を含む。別の態様において、酵素組成物は、セルロース分解性酵素およびヘミセルロース分解性酵素からなる群から選択される１種以上（例えば、数種）の酵素を含む。別の態様において、酵素組成物は、エンドグルカナーゼを含む。別の態様において、酵素組成物は、セロビオヒドロラーゼを含む。別の態様において、酵素組成物は、ベータ−グルコシダーゼを含む。別の態様において、酵素組成物は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む。別の態様において、酵素組成物は、エンドグルカナーゼ、およびセルロース分解活性を有するポリペプチドを含む。別の態様において、酵素組成物は、セロビオヒドロラーゼ、およびセルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む。別の態様において、酵素組成物は、ベータ−グルコシダーゼ、およびセルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む。別の態様において、酵素組成物は、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを含む。別の態様において、酵素組成物は、エンドグルカナーゼおよびベータ−グルコシダーゼを含む。別の態様において、酵素組成物は、セロビオヒドロラーゼおよびベータ−ブルコシダーゼを含む。別の態様において、酵素組成物は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびセルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む。別の態様において、酵素組成物は、エンドグルカナーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、およびセルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む。別の態様において、酵素組成物は、セロビオヒドロラーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、およびセルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む。別の態様において、酵素組成物は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびベータ−グルコシダーゼを含む。別の態様において、酵素組成物は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、およびセルロース分解増強活性を有するポリペプチドを含む。
【００３９】
別の態様において、酵素組成物は、ガラクトシダーゼ（例えば、アルファ−ガラクトシダーゼおよび／またはベータ−ガラクトシダーゼ）を含む。別の態様において、酵素組成物は、キシラナーゼを含む。好ましい態様において、キシラナーゼは、ファミリー１０キシラナーゼである。別の態様において、酵素組成物は、国際公開第２００６／０７８２５６号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたようなアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＧＨ１０キシラナーゼを含む。別の態様において、酵素組成物は、キシロシダーゼ（例えば、ベータ−キシロシダーゼ）を含む。別の態様において、酵素組成物は、国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたようなアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−キシロシダーゼを含む。
【００４０】
酵素組成物の１種以上（例えば、数種）の成分は、野性型タンパク質、組換えタンパク質、または野性型タンパク質と組換えタンパク質との組み合わせであってもよい。例えば、１種以上（例えば、数種）の成分は、細胞の天然タンパク質であってもよく、これは、酵素組成物の１種以上（例えば、数種）の他の成分を組み換え的に発現するために宿主細胞として使用される。酵素組成物の１種以上（例えば、数種）の成分は、単一成分として産生されてもよく、次いで、これは、酵素組成物を形成するために組み合わされる。酵素組成物は、多成分および単一成分タンパク質調製物の組み合わせであってもよい。
【００４１】
本開示の方法で使用される酵素は、使用に適した任意の形態、例えば、醗酵ブロス配合物もしくは細胞組成物、細胞破片と一緒もしくはそれなしの細胞溶解物、半精製もしくは精製酵素調製物、または酵素の源としての宿主細胞であってもよい。酵素組成物は、乾燥粉末もしくは顆粒、非ダスティング顆粒、液体、安定化液体、又は安定化保護酵素であってもよい。液体酵素調製物は、例えば、安定剤、例えば、糖、糖アルコールもしくは別のポリオール、および／または乳酸もしくは確立されたプロセスによる別の有機酸を添加することによって安定化されてもよい。
【００４２】
実施形態において、セルロース分解性酵素活性またはヘミセルロース分解性酵素活性を有するポリペプチドは、例えば、細菌、真菌、酵母、植物、又は哺乳動物起源を含む、任意の適当な起源に由来するかまたはそれから得ることができる、セルロース分解増強活性を有するＧＨ６１ポリペプチドを含めて、本開示による使用に適する。用語「得られる」はまた、酵素が、本明細書に記載される方法を用いて宿主生物で組み換え的に産生されていてもよく、ここで、組み換え的に産生される酵素は、宿主生物に対して未変性もしくは外来であるか、または例えば、欠失、挿入および／もしくは置換されている１個以上（例えば、数個）のアミノ酸を有する、修飾アミノ酸配列を有する、のいずれかであり、すなわち、変異体および／もしくは未変性アミノ酸配列の断片、または当技術分野で公知の核酸シャッフリングプロセスによって産生された酵素である組み換え的に産生される酵素である、ことを本明細書で意味する。未変性酵素の意味内に包含されるものは、天然変異体であり、外来酵素の意味内に包含されるものは、組み換え的に得られた変異体である。
【００４３】
実施形態において、１種以上（例えば、数種）のセルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物は、市販のセルロース分解性酵素調製物を含む。本開示における使用に適した市販のセルロース分解性酵素調製物の例には、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ３（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＮＯＶＯＺＹＭ（商標）１８８（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＥＲＥＦＬＯ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、およびＵＬＴＲＡＦＬＯ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＡＣＣＥＬＥＲＡＳＥ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＬＡＭＩＮＥＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＦＩＬＴＲＡＳＥ（登録商標）ＮＬ（ＤＳＭ）；ＭＥＴＨＡＰＬＵＳ（登録商標）Ｓ／Ｌ１００（ＤＳＭ）、ＲＯＨＡＭＥＮＴ（商標）７０６９Ｗ（Ｒｏｅｈｍ  ＧｍｂＨ）、ＦＩＢＲＥＺＹＭＥ（登録商標）ＬＤＩ（Ｄｙａｄｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、ＦＩＢＲＥＺＹＭＥ（登録商標）ＬＤＲ（Ｄｙａｄｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）、またはＶＩＳＣＯＳＴＡＲ（登録商標）１５０Ｌ（Ｄｙａｄｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）が含まれる。セルラーゼ酵素は、約０．００５重量％からの有効な量の固体、例えば、約０．０１重量からの有効な量の固体または約０．１重量％からの有効な量の固体で添加される。セルラーゼ酵素は、約０．００５〜０．１重量％の有効な量の固体で添加される。
【００４４】
本開示で有用なセロビオヒドロラーゼの例には、限定されないが、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０５９７４０号パンフレット）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩ（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット）、ケトミウム・サーモフィラム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）セロビオヒドロラーゼＩ、ケトミウム・サーモフィラム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セロビオヒドロラーゼＩ、ミセリオフィトラ・サーモフィラム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０４２８７１号パンフレット）、チエラビア・ヒルカニエ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｈｙｒｃａｎｉｅ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（国際公開第２０１０／１４１３２５号パンフレット）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＥＬ６Ａ、国際公開第２０１０／０７４４３５号パンフレット）、トリコダーマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコダーマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、およびトリコファエア・サカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（国際公開第２０１０／０５７０８６号パンフレット）が含まれる。
【００４５】
本開示で有用なベータ−グルコシダーゼの例には、限定されないが、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ  １７３：２８７−２８８）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／０４７４９９号パンフレット）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−グルコシダーゼ変異体（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０４９９１５号パンフレット）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４９７３−４９８０）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（国際公開第２００２／０９５０１４号パンフレット）、ペニシリウム・ブラシリアナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ）ＩＢＴ２０８８８（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０１９４４２号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０８８３８７号パンフレット）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０３５０２９号パンフレット）、およびトリコファエア・サカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０１９４４２号パンフレット）からのベータ−グルコシダーゼが含まれる。
【００４６】
ベータ−グルコシダーゼは、融合タンパク質であってもよい。一態様において、ベータ−グルコシダーゼは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ベータ−グルコシダーゼ変異体ＢＧ融合タンパク質（国際公開第２００８／０５７６３７号パンフレット）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ベータ−グルコシダーゼ融合タンパク質（国際公開第２００８／０５７６３７号パンフレット）である。
【００４７】
他の有用なエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびベータ−グルコシダーゼは、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ．，１９９１，Ａ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９−３１６、およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ  ａｎｄ  Ｂａｉｒｏｃｈ，１９９６，Ｕｐｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：６９５−６９６に従う分類を使用して多数のグリコシルヒドロラーゼファミリーに開示されている。
【００４８】
一態様において、本開示によって使用のための１種以上（例えば、数種）のヘミセルロース分解性酵素には、市販のヘミセルロース分解性酵素調製物が含まれる。本開示における使用に適した市販のヘミセルロース分解性酵素調製物の例には、例えば、ＳＨＥＡＲＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＨＴｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＨＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＨＴｅｃ３（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＶＩＳＣＯＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＵＬＴＲＡＦＬＯ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＰＵＬＰＺＹＭＥ（登録商標）ＨＣ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＡＣＣＥＬＬＥＲＡＳＥ（登録商標）ＸＹ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＡＣＣＥＬＬＥＲＡＳＥ（登録商標）ＸＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＥＣＯＰＵＬＰ（登録商標）ＴＸ−２００Ａ（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ＨＳＰ６０００キシラナーゼ（ＤＳＭ）、ＤＥＰＯＬ（商標）３３３Ｐ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｌｉｍｉｔ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）、ＤＥＰＯＬ（商標）７４０Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｌｉｍｉｔ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）、およびＤＥＰＯＬ（商標）７６２Ｐ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｌｉｍｉｔ，Ｗａｌｅｓ，ＵＫ）が含まれる。
【００４９】
本開示の方法で有用なキシラナーゼの例には、限定されないが、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）（ＧｅｎｅＳｅｑＰ：ＡＡＲ６３７９０；国際公開第９４／２１７８５号パンフレット）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／０７８２５６号パンフレット）、ペニシリウム・ピノフィラム（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０４１４０５号パンフレット）、ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）（国際公開第２０１０／１２６７７２号パンフレット）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＮＲＲＬ８１２６（国際公開第２００９／０７９２１０号パンフレット）、およびトリコファエア・サカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）ＧＨ１０（国際公開第２０１１／０５７０８３号パンフレット）からのキシラナーゼが含まれる。
【００５０】
本開示の方法で有用なベータ−キシロシダーゼの例には、限定されないが、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−キシロシダーゼ（国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット）、ノイロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセション番号Ｑ７ＳＯＷ４）、トリコダーマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ＵｎｉＰｒｏｔＢ／ＴｒＥＭＢＬアクセション番号Ｑ９２４５８）、およびタラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセション番号Ｑ８Ｘ２１２）が含まれる。
【００５１】
実施形態において、本開示による使用のための適当なセルラーゼおよびセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物は、国際公開第２０１３／０２８９２８号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本開示による使用のための適当な酵素組成物は、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩ、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−グルコシダーゼまたはそれらの変異体を含む。セルロース分解増強活性を有するペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）（エメルソニイイ（ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））ＧＨ６１ポリペプチド、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）キシラナーゼ、もしくはアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−キシロシダーゼ、またはそれらのホモログが使用されてもよい。
【００５２】
実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物は、好ましくは、慣例のスラッジ調整および脱水操作、例えば、濃縮および機械的脱水ステップの前に、スラッジをセルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物と接触させるか、またはそれらで処理するステップを含むスラッジ脱水のプロセスを容易にするか、または改善するために有効な量で適用される。適当量の例には、全懸濁固体１ｋｇ当たり１０〜２０００ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり５０〜５００ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり１００〜５００ｇのタンパク質が含まれる。
【００５３】
実施形態において、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ３（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）は、スラッジ固体の１乾燥トン当たり０．０１〜２ｋｇで適用される。実施形態において、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ３（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）は、スラッジ固体の１乾燥トン当たり０．１〜１ｋｇで適用される。実施形態において、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ３（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）は、スラッジ固体１乾燥トン当たり０．５ｋｇで適用される。実施形態において、ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ３（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）は、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．００２〜０．４ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．００２〜０．２ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．０１〜０．１ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．０２〜０．１ｇのタンパク質を含む適当な量で適用される。
【００５４】
セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物は、スラッジ処理条件の適当な条件、例えば、２０〜６０℃の温度、４〜１０のｐＨ条件、および１〜１００時間、１６〜７２時間、または１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日の処理時間の下で適用されてもよい。
【００５５】
実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物は、好ましくは慣例のスラッジ調整および脱水操作の前に、スラッジをセルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物およびプロチアーゼで処理するステップを含む、スラッジ脱水のプロセスを容易にするか、または改善するために有効な量でプロテアーゼと組み合わせて適用される。プロテアーゼと組み合わせるためのセルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物の適当な量の例には、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．００２〜０．４ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．０１〜０．１ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．０２〜０．１ｇのタンパク質が含まれる。実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物は、１〜１００ｇＥＰ／ＤＴで投与される。実施形態において、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物は、約５０ｇＥＰ／ＤＴ（約５０ｐｐｍ）で投与される。
【００５６】
実施形態において、本開示による使用のための適当なセルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物は、国際公開第２０１３／０２８９２８号パンフレットに記載されている。本開示による使用のための適当な酵素組成物は、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩ、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−グルコシダーゼまたはそれらの変異体を含む。セルロース分解増強活性を有するペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）（エメルソニイイ（ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））ＧＨ６１ポリペプチド、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）キシラナーゼ、もしくはアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ−キシロシダーゼ、またはそれらのホモログが使用されてもよい。
【００５７】
本開示による適当なプロテアーゼには、タンパク質のアミド結合を切断することができる酵素、または（交換可能に）ペプチダーゼが含まれる（Ｗａｌｓｈ，１９７９，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ３参照）。
【００５８】
セリンプロテアーゼは、本開示による使用のために適している。セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、ここで、その活性部位に必須のセリン残基がある（Ｗｈｉｔｅ，Ｈａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９７３  “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，ｐｐ．２７１−２７２）。
【００５９】
細菌セリンプロテアーゼは、２０，０００〜４５，０００ダルトンの範囲で分子量を有する。それらは、ジイソプロピルフルオロホスフェートによって阻害される。それらは、簡単な末端エステルを加水分解し、やはりセリンプロテアーゼである、真核生物キモトリプシンに対する活性で類似している。下位群に及ぶ、より狭い用語アルカリプロテアーゼは、ｐＨ９．０〜１１．０の、セリンプロテアーゼの一部の高いｐＨ最適値を反映する（概要については、Ｐｒｉｅｓｔ，１９７７，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．４１：７１１−７５３参照）。
【００６０】
実施形態において、サブチラーゼは、本開示による使用のために適している。サブチラーゼは、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４：７１９−７３７およびＳｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：５０１−５２３により提案されたとおりの、セリンプロテアーゼの下位群を意味する。それらは、以前にサブチリシン様プロテアーゼと称された、セリンプロテアーゼの１７０超のアミノ酸配列の相同性解析によって定義される。サブチリシンは、グラム陽性細菌または真菌により産生されたセリンプロテアーゼと依然にしばしば定義され、Ｓｉｅｚｅｎらによって、今やサブチラーゼの下位群である。多種多様なサブリラーゼが、同定されており、いくつかのサブチリラーゼのアミノ酸配列が決定されている。このようなサブチラーゼおよびそれらのアミノ酸配列参照のより詳細な記載については、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）が挙げられる。
【００６１】
本開示による使用のためのサブチラーゼの下位群の１つは、Ｉ−Ｓ１または「真の」サブチリシンを包含し、「古典的な」サブチリシン、例えば、サブチリシン１６８（ＢＳＳ１６８）、サブチリシンＢＰＮ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ  Ａ／Ｓ）、およびサブチリシンＤＹ（ＢＳＳＤＹ）を含む。
【００６２】
本開示による使用のためのサブチラーゼのさらなる下位群には、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｓｕｐｒａ）により認められたとおりの、サブチラーゼＩ−Ｓ２または高アルカリサブチリシンが含まれる。下位群Ｉ−Ｓ２プロテアーゼは、高アルカリサブチリシンと記載されており、酵素、例えば、サブチリシンＰＢ９２（ＢＡＡＬＫＰ）（ＭＡＸＡＣＡＬ（登録商標）、Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ  ＮＶ）、サブチリシン３０９（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ  Ａ／Ｓ）、サブチリシン１４７（ＢＬＳ１４７）（ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ  Ａ／Ｓ）、およびアルカリエラスターゼＹａＢ（ＢＳＥＹＡＢ）を含む。
【００６３】
実施形態において、ＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼは、本開示による使用に適している。ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）は、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ  Ａ／Ｓにより市場化されている。それは、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）由来のサブチリシン３０９である。ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００６４】
実施形態において、プロテアーゼは、市販のプロテアーゼ酵素組成物ＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．またはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから利用可能）である。実施形態において、適当なプロテアーゼは、それらの両方ともがそれらの全体で参照により組み込まれる、国際特許公開第９９／２７０８２号パンフレットおよび国際特許公開第２００３／００６６０２号パンフレットに記載されている。実施形態において、酵素組成物は、配列番号１に示されるプロテアーゼに対して少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するプロテアーゼを含む。本開示の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）、好ましくはバージョン５．０．０またはそれ以降で実行されるとおりのＮｅｅｄｌｅ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して決定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）のアウトプットは、同一性パーセントとして使用され、以下のとおりに計算される：（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アライメント中のギャップの全数）。
【００６５】
実施形態において、プロテアーゼ、例えば、ＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼは、好ましくは、限定されないが、濃縮および機械的脱水を含む、慣例のスラッジ調整および脱水操作の前に、スラッジをセルラーゼおよびプロテアーゼで処理するステップを含む、スラッジ脱水のプロセスを容易にするか、または改善するために有効な量で適用される。プロテアーゼの適当な量の例には、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．００４〜０．０９ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．００２〜０．０２ｇのタンパク質、全懸濁固体１ｋｇ当たり０．００４〜０．０２ｇのタンパク質が含まれる。実施形態において、ＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼは、０．４〜９０ｇＥＰ／ＤＴで投与される。実施形態において、ＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼは、２０ｇＥＰ／ＤＴ（約２０ｐｐｍ）で投与される。
【００６６】
プロテアーゼ、例えば、ＳＡＶＩＮＡＳＥプロテアーゼは、スラッジ処理条件、例えば、２０〜６０℃の温度、４〜１０のｐＨ条件など、および１〜１００時間、１６〜７２時間、または１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日の処理時間に適した条件下で適用されてもよい。
【００６７】
本開示によるセルラーゼ／プロテアーゼ処理はまた、１種以上の追加的酵素の添加を伴ってもよい。
【００６８】
本開示によるセルラーゼ／プロテアーゼ処理はまた、脱水プロセスに予想外の相乗的酵素効果をもたらし得る。本開示によれば、セルラーゼ／プロテアーゼ処理の適用は、セルラーゼおよびプロテアーゼの適用が別個に行われる場合の脱水プロセスに対する効果の総和と比較して脱水プロセスのかなり良い増強をもたらす。
【００６９】
実施形態において、本開示による処理は、ポリマーが現在使用されているスラッジ調整ステップで適用される。酵素生成物は、消耗可能であり、廃水処理プラントによりそれを適切に施す能力以外にそれに関していかなるハードウェアを必要としない。酵素が本開示による条件下で適用され得るように、緩衝液槽が実施形態で適用されてもよい。実施形態において、本開示による処理は、廃水処理におけるポリマー使用を完全に置き換える。実施形態において、本開示による処理は、廃水処理におけるポリマー使用を減少させる。実施形態において、酵素の使用は、システム／構成にとらわれない。特定のプラントが、脱水前にスラッジを調整している限り、本開示による提案セルラーゼ／プロテアーゼ組成物は使用され得る。
【００７０】
図１を参照すると、本開示の実施形態の非限定概略図が示される。ここで、原廃水（２０）が処理に入り、プロセスストリーム（２２）を形成する廃水処理（１０）が示される。非限定例において、プロセスストリーム（２２）は、プロセスストリームを再循環する、それから外にでる、またはそれを下って進む、のいずれかの前に、沈砂池（２４）、除濁装置（２６）、生物学的処理（２８）および除濁装置（３０）を通って流れる。一次スラッジ（３２）および二次スラッジ（３４）が、濃縮（３６）に向かって進むのが示される。スラッジは、消化（３８）に入り、三次または消化スラッジ（４０）を形成するのが示され、これは、機械的脱水（４２）、フロック化剤（４４）との接触およびスラッジ産出の前のインキュベーションのための緩衝液槽（３９）に入る。図１は、濃縮（３６）および機械的脱水（４２）の前にプロセスストリームと接触されている本開示の酵素（４８）、例えば、セルラーゼまたはセルラーゼ／ヘミセルラーゼ混合物、およびプロテアーゼを示す。図１は、本開示による酵素（４８）が消化後および／または脱水前もしくはその間にプロセスストリームと接触し得るという点において非限定である。
【００７１】
実施形態において、および図１に示されるとおりに、有効量のセルラーゼまたは有効量のセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素混合物、ならびに有効量のプロテアーゼを含む本開示による酵素処理剤は、好ましくはスラッジ調整前（すなわち、凝集および／またはフロック化前）および機械的脱水前に添加される。
【実施例】
【００７２】
実施例１
材料
都市廃水プラントからの消化スラッジ
Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランドセルラーゼおよびヘミセルラーゼ複合体（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）
ＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）
加熱キャビネット（３０℃）
【００７３】
前処理方法
１．３０ｍＬのスラッジを５０ｍＬの試験管中に計量する。
２．十分量の液体Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランドセルラーゼおよびヘミセルラーゼ複合体ならびにＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼをスラッジ試料に添加する。
３．反応管を密封し、３０℃の加熱キャビネットに入れる。
４．反応時間２４時間後に加熱キャビネットから取り出す。
５．スラッジ試料は、今や前処理スラッジ組成物であり、脱水試験に使える状態である。
【００７４】
実験室規模脱水：材料および方法
材料
・ジャガイモライサーまたはプレス
・フロック化剤−カチオン性ポリアクリルアミド高分子量ポリマー
・スラッジおよびフロック化剤を混合するためのビーカー
・ろ布
・乾燥固体分析のための坩堝
【００７５】
方法
１．ポリマー（固体またはエマルジョン形態での）を必要量の脱イオン水中に混合して、０．２５％の活性溶液を調製することによって、ポリマー溶液を調製する。必要とされる３０分前に調製する。
２．ポリマーが準備できると直ぐに、スラッジ試料をビーカーに注ぎ入れる。
３．ピペットを使用して、既知体積のポリマー溶液を添加する。均一だが激し過ぎない動作で直ちに撹拌する。最大で０．５ｍＬが一度に添加されるべきである。
４．大部分のスラッジ固体がフロックになり、自由水が透明になるまで、ポリマー溶液をスラッジに添加し続ける。添加したポリマー溶液の体積を記録し、フロックの質も書き留める。
５．スラッジがフロック化されると直ぐに、それはプレスすることができる。ろ布をプレスの中に入れ、スラッジをその中に注ぎ入れる。布の周りでいかなるスラッジも失わないように注意し、ビーカーをプレスの下に置いて、ろ液を捕捉する。
６．スラッジがろ布内にあると直ぐに、それを、プレスがかけられるやいなやスラッジが逃げることができないように注意深く包む。ろ液全てを確実に捕捉する。
７．スラッジを可能な限りプレスし、次いで、迅速つなぎ材（ｑｕｉｃｋ−ｔｉｅ）を使用してそのハンドルを一緒につなぐ。これは、次の試料のための参照圧力になる。
８．１２０〜１８０秒後、迅速つなぎ材を取り除くことによって圧力を解除し、スラッジケーキの包みを開ける。
９．スラッジケーキを布から注意深く剥がし、前秤量坩堝に入れる。坩堝＋ケーキを秤量し、次いで、１０５℃で少なくとも１２時間乾燥させる。
１０．乾燥後に坩堝を取り出し、坩堝＋乾燥ケーキを秤量する。次いで、ケーキの乾燥固体含量を計算することができる。
１１．ろ液を採取し、ＣＯＤおよび濁度分析を行い、使用した体積を書き留める。その残りを使用して、１０５℃で乾燥固体分析を行う。
【００７６】
結果
各試料を三通りで処理した。試験結果は、表１にある。
【００７７】
【表１】
2019501018.tif 000002
【００７８】
結果は、単独で適用された場合のＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／ＳからのＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ブランドプロテアーゼなどのプロテアーゼならびにＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／ＳからのＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランドセルラーゼおよびヘミセルラーゼ複合体などのセルラーゼが、スラッジのみの試料と比較して、それぞれ、ポリマー必要量の５％および２％減少をもたらした。酵素の同じ用量が一緒に適用された場合、ポリマー必要量の１８％減少が実現された。
【００７９】
プロテアーゼおよびセルラーゼの組み合わせも、酵素が単独で適用された場合と比較してろ液の質の改善をもたらす。プロテアーゼおよびセルラーゼの一緒の適用は、スラッジのみの対照試料と比較して、より低いケーキ乾き度、またはろ液の質の劣化をもたらさなかった。
【００８０】
実施例１の結論
・プロテアーゼおよびセルラーゼの別個の適用は、固体フロック化およびプレス法を使用しての脱水性の良好なレベルを達成するのに必要とされるポリマー消費の有意な減少を与えなかった。
・プロテアーゼおよびセルラーゼの一緒の適用は、ろ液の質および脱水プロセスで達成されるケーキの乾き度を維持しながら、ポリマー必要量の有意な減少をもたらす。
【００８１】
実施例２
材料
都市廃水プラントからの消化スラッジ
Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ３ブランドセルラーゼおよびヘミセルラーゼ複合体（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）
ＳＡＶＩＮＡＳＥブランドプロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）
加熱キャビネット（３０℃）
【００８２】
方法
１．３０ｍＬのスラッジを５０ｍＬの試験管中に計量する。
２．必要量の液体酵素生成物をスラッジ試料に添加する。
３．反応管を密封し、３０℃の加熱キャビネットに入れる。
４．必要反応時間（２４時間、４８時間および７２時間）後に加熱キャビネットから取り出す。
５．スラッジ試料は、今や脱水試験に使える状態である。
【００８３】
【表２】
2019501018.tif 000003
【００８４】
実験室規模脱水：材料および方法
材料
・ジャガイモライサーまたはプレス
・フロック化剤−脱イオン水で０．３％溶液に調製されたＦｌｏｐａｍ  ＦＯ−４４９０（ＳＮＦ）
・スラッジおよびフロック化剤を混合するためのビーカー
・ろ布
・乾燥固体分析のための坩堝
・Ｈａｃｈ  Ｌａｎｇｅ  ＣＯＤキット（０〜１５００ｍｇ／Ｌ）
【００８５】
方法
上の実施例１に示したのと同じ方法ステップを適用する。
【００８６】
結果
試験の結果は、脱水についての３つの重要なパラメータに焦点を合わせた：
１．必要とされるポリマー用量
２．生成されたケーキの乾燥固体
３．脱水プロセスで生成されたろ液のＣＯＤ
【００８７】
必要とされるポリマー用量を考慮する場合、結果を、図２に提示する。試料は、２４時間、４８時間および７２時間後に採取した。
【００８８】
２４時間後、２４％の減少（２．８５ｋｇ−ポリマー／ｔ−ＤＳに等しい）の、脱水に必要とされるポリマー用量が、酵素１＋２を使用して、スラッジを前処理した場合に達成された。４８時間および７２時間後、必要とされるポリマー用量の１３％の減少が、２種の酵素を一緒に使用して、スラッジを前処理した場合に達成された（１．４３ｋｇ−ポリマー／ｔ−ＤＳに等しい）。
【００８９】
２４時間後、ＳａｖｉｎａｓｅおよびＣＴｅｃ３酵素の一緒の添加は、酵素を単独で添加した場合と比較して、ポリマー必要量のかなり大きな減少をもたらした。これは、２種の酵素が、嫌気性消化スラッジに対して一緒に使用される場合に、ポリマー必要量を減少させることに対して相乗効果を有することを示す。
【００９０】
それぞれの場合、達成されたポリマー減少は＞１０％であった。
【００９１】
脱水試験で生成されたケーキの乾燥固体（ＤＳ）を、図３に提示する。試料は、２４時間、４８時間および７２時間後に採取した。
【００９２】
インキュベーション時間２４時間後、酵素１の適用は、２％点のＤＳの平均増加をもたらす。酵素２単独、または両方の酵素の一緒の適用は、対照試料と同じであるＤＳをもたらした。スラッジのみの試料に関して、ポリマーを酵素前処理試料で必要とされる最低レベルで投与した場合、ケーキのＤＳは、対照または酵素処理試料よりもかなり低かった。これは、酵素前処理が脱水に必要とされるポリマー用量の減少を可能にするのみならず、現状況（対照試料）と比較して、生成されたケーキのＤＳを維持または改善する潜在性も有することを示す。
【００９３】
インキュベーション４８時間後、対照試料と比較した場合、ケーキのＤＳに対する酵素前処理の正の影響はまったくなかった。両酵素生成物とともにインキュベートされた試料は対照と同じＤＳ維持をすることができた一方で、単一酵素インキュベート試料は、ケーキＤＳのわずかな平均減少を示した。酵素前処理試料のすべては、スラッジのみの試料よりも良好であった。
【００９４】
インキュベーション７２時間後、両酵素とともにインキュベートされた試料は、対照試料よりも２％高い平均ＤＳ含量を有した。１種の酵素のみをスラッジ試料に適用した場合、ケーキＤＳに対する有意な影響はなかった。酵素前処理試料のすべては、スラッジのみの試料よりも良好であった。
【００９５】
ケーキＤＳ結果は、酵素前処理が、達成されるケーキＤＳに対して正の効果を有することを示す。２４時間後、酵素１生成物は、ＤＳの増加を与えることができた。
【００９６】
すべての場合、酵素前処理は、スラッジのみの試料で与えられるより低いポリマー用量を相殺することができ、脱水プロセスが、ポリマーのかなり低い用量とともに、同じまたは改善されたケーキＤＳを達成することを可能にするように思われる。結果は、その場所でのより長い保持時間が、脱水プロセスで生成されるケーキのＤＳ増加に対して正の利益をもたらし得たことを示す。
【００９７】
ろ液の質は、ろ液中のＣＯＤの測定によって試験中にモニターした。全ＣＯＤを使用し、ろ液中の可溶性および不溶性成分の両寄与を捕捉した。この分析の結果を、図４に提示する。試料は、２４時間、４８時間および７２時間後に採取した。
【００９８】
すべての場合で、保持時間が長ければ長いほど、ろ液中のＣＯＤはより高かった。これは、スラッジでの自然のプロセスによって、または酵素活性により補助された、のいずれかによるスラッジの可溶化に起因するようである。２４時間後、ろ液中のＣＤＯに対する酵素の影響は、最小である。しかしながら、４８時間および７２時間後、酵素活性の明らかな効果があり−これは、ろ液中のＣＯＤの相当に増加した濃度に見られる。これは、２４時間後に、酵素が、スラッジの「可溶性」バイオコロイド成分に対してのみ活性であったことを示す。これは、２４時間後に見られる相当なポリマ―用量減少によって確認される。しかしながら、保持時間が増加するにつれて、酵素は、スラッジ中のバルク固体に対してさらに相当の影響を有する。この酵素活性は、より多くのバイオコロイドタイプの物質をスラッジ中に放出し、それにより、ろ液のＣＯＤを増加させるが、スラッジのより良好な機械的脱水を可能にする（固体をより良好に圧縮することができる）。これらの結果は、ポリマー用量減少およびケーキＤＳ増加について上に提示された結果を支持する。
【００９９】
スラッジのみの試料（ここでは、ポリマーのより低い用量を、酵素で前処理されないスラッジに対して使用した）のろ液中のＣＯＤは、対照試料、または酵素前処理試料よりも常にかなり高かった。これは、ろ液中の固体に起因するＣＯＤの増加とともに、これらの試料でのより不十分な固体捕捉のためである。
【０１００】
まとめると、各保持時間についての最良性能試料を表３に一覧にする：
【０１０１】
【表３】
2019501018.tif 000004
【０１０２】
実施例２の結論
全体として、スラッジ消化スラッジ試料への酵素の適用は、ポリマー減少およびケーキ固体増加に対しての両方で、正の結果を示した。消化スラッジに対するこの試験からの重要な所見には、
・ＳａｖｉｎａｓｅおよびＣＴｅｃ３の組み合わせは、対照試料または酵素が別個に添加された場合と比較して、脱水プロセスで必要とされるポリマー減少のかなり高いレベルをもたらした。これは、酵素が一緒に添加される場合に相乗効果があることを示す。
・恐らくはスラッジ固体に対する酵素の活性のために、ポリマー減少に対する酵素の効果は時間にわたって低下し、より多くの「可溶性」バイオコロイドを放出する。これは、ろ液ＣＯＤの結果に反映される。
・全般的に、結果は、酵素インキュベーション時間が短ければ短いほど、ポリマー減少により適する一方で、より長い保持時間は、相当なケーキＤＳ利益を与え得る。この成果は、適用される酵素生成物を考慮すると良く適合し、スラッジ中のバルク固体に対するそれらの活性は、ＣＯＤ結果で確認される。
【０１０３】
様々な変更が、本明細書に開示される実施形態になされてもよいことが理解される。したがって、上記記載は、限定するものとしてではなく、単に実施形態の例示として解釈されるべきである。当業者は、本明細書に添付された特許請求の範囲および精神の範囲内で他の変更を想定する。さらに、用語は、個別のステップの順序が明示的に記載されない限り、およびそれが明示的に記載される場合を除いて、本明細書に開示される様々なステップの内またはそれらの間のいずれかの特定の順序を暗示すると解釈されるべきでない。
【図１】
2019501018.tif 000005
【図２】
2019501018.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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