【手続補正書】
【提出日】平成18年12月15日(2006.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
Gαq-ガストデューシンキメラGタンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
トランスフェクトされた、本発明のキメラタンパク質と味覚受容体とをコードする遺伝子またはｃＤＮＡを使用する、哺乳類細胞ベースのアッセイを含む請求項１２に記載の方法であって、化合物を細胞に接触させるステップ、および受容体：キメラＧタンパク質複合体における前記化合物の機能的効果を決定するステップを含む、前記方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
機能的効果が、IP3またはカルシウム2+などの細胞内メッセンジャーの変化を測定することにより決定される、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
具体的な態様においては、このような方法は、一過性にトランスフェクトされた、本発明のキメラタンパク質および味覚受容体、特に苦味受容体、甘味受容体およびうま味受容体をコードする遺伝子またはｃＤＮＡを使用する、哺乳類細胞ベースのアッセイを含み、該方法は、化合物を細胞に接触させるステップ、および受容体：キメラＧタンパク質複合体における前記化合物の機能的効果、例えば、細胞質のセカンドメッセンジャーの増加などを決定するステップを含む。
この側面の他の具体的な態様においては、本発明は、安定発現された遺伝子またはcDNAを用いた哺乳類細胞ベースのアッセイに関する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
10−オキソ−ベータ−ラクツシン(Lactucin)、L−ロイシン、L−アラニル−L−アラニル−L−ロイシン、N−[(2R)−6−アミノ−2−[(4S)−2,5−ジオキソ−4−(フェニルメチル)−1−イミダゾリジニル]−1−オキソヘキシル]−L−ロイシル−L−メチオニル−N−メチル−L−フェニルアラニル−,(4−1)−ラクタム、L−ロイシン,グリシル−L−アラニル、L−ロイシン,N−(N2−L−ロイシル−L−グルタミニル)−L−ロイシン、N−(N−L−ロイシル−L−α−グルタミル)−L−ロイシン、N−[N2−[N2−[N−(1−L−ロイシル−L−プロリル)−L−フェニルアラニル]−L−アスパラギニル]−L−グルタミニル]−L−ロイシン、N−[N2−[N−[N−(1−L−ロイシル−L−プロリル)−L−フェニルアラニル]−L−セリル(seryl)]−L−グルタミニル]−L−ロイシン、L−ロイシル−L−バリル−ロイシルロイシン、ロイシルフェニルアラニン、リモニン、リモニンモノラクトン、リナマリン(Linamarin)、ロタウストラリン(Lotaustralin)、ルピナス(Lupine)、ルパニン(Lupanine)、13−ヒドロキシ−ルパニン、7−ヒドロキシ−ルピニン(Lupinine)、エピルピニン(Epilupinine)、ルポキセス(Lupoxes)B、ルポキセスC、ルプロン(Lupulone)、ルプトリオン(Luputrione)、
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
クロロゲン酸、メチルアルファ−D−グルコシド、メチルアルファ−D−グルコシド 2,3−ジ−アラニン、メチルアルファ−D−グルコシド 2,3−ジ−グリシン、メチルアルファ−D−グルコシド 2,3−ジ−プロリン、メチルアルファ−D−グルコシド 2,3−ジ−バリン、アニリン、2−ブトキシ−5−ニトロ−アニリン、2−エトキシ−5−ニトロ−アニリン、2−メトキシ−5−ニトロ−アニリン、3−ニトロ−(+)−バイユノール(Baiyunol)−ベータ−D−グルコシド−アルファ−D−グルコシド、1,3−ヒドロキシ−4−メトキシベンジルアニリン、2−プロポキシ−5−ニトロ− (P4000)ベンゾ−1,4−ジオキサン、2−(3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル)−ベンゾ−1,3−ジオキサン−4−オン、2−(3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル)−安息香酸、2−ベンゾイル−4−メトキシ−安息香酸、2−(4−メトキシベンゾイル)、ベンゾ−1,3(4H)−キサチアン(xathiane),2−(3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル)−ベンゾ−1,4−キサチアン、3−(3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル)−ブタン酸,4−[3,5−ジヒドロキシ−4−[3−(3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル)−1−オキソプロピル]フェノキシ]−2−ヒドロキシ−モノナトリウム塩、
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ブタン酸,4−[3,5−ジヒドロキシ−4−[3−(3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル)−1−オキソプロピル]フェノキシ]−3−オキソ− モノナトリウム塩、シクロヘキサジエン−1,4 1−カルボキサルデヒド− 4−(メトキシメチル)−,(E)オキシム、エチルベンゼン,ベータ− (1,3−ヒドロキシ−4−メトキシベンジル)、ヘスペルチンジヒドロカルコン、3'−カルボキシ−ヘスペルチンジヒドロカルコン、3'−ホルミル−イソクマリン、3,4−ジヒドロ− 3−(3−ヒドロキシ−4−メトキシ)−ペリラルチン、8,9−エポキシ−フェニル 3−ヒドロキシ−4−メトキシベンジルエーテル、ホスホン酸、[3−[3,5−ジヒドロキシ−4−[3−(3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル)−1−オキソプロピル]フェノキシ]プロピル]モノカリウム塩、ステビオシド類縁体、スルファミン酸、[2−[3,5−ジヒドロキシ−4−[3−(3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル)−1−オキソプロピル]フェノキシ]エチル]−モノカリウム塩、尿素、およびN−(4−シアノフェニル)−N'−(2−カルボキシエチル)−L−テアニンを言及することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
１．プレートを、例えばFlexstation(Molecular Devices)またはFLIPR(Molecular Devices)などの蛍光マイクロプレートリーダーにセットし、２０μｌの１０×濃縮リガンドストック溶液を添加して、受容体の活性化を開始させる。リガンド添加前１５秒間およびリガンド添加後４５〜７５秒間、継続的に蛍光をモニターする。受容体の活性化レベルは、下記の２つの式により定義される：活性化％＝（最大蛍光−ベースラインの蛍光）／ベースラインの蛍光＊１００または増加蛍光＝最大蛍光−ベースラインの蛍光、ここでベースラインの蛍光は、リガンド添加前の平均蛍光レベルを表す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
他の例においては、既知の機能的ヒト苦味受容体TAS2R10 (Bufe et al, Nature Genetics 32: 397-401参照)と本発明のキメラGタンパク質G16−ガストデューシン 44とが安定にトランスフェクトされたHEK293 T-Rex（登録商標）細胞を、２５０μM ストリキニーネと接触させたところ、強い蛍光シグナルを引き起こすことができた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
リガンドへの結合における受容体の活性およびGタンパク質の受容体への共役は、機能的、化学的および物理的効果を決定するための種々のインビトロおよびインビボのアッセイ、例えば、リガンドの結合、セカンドメッセンジャー（例えばcAMP、cGMP、IP3、DAGまたはCa2+）、イオンフラックス、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベルなどの測定を用いて、評価してもよい。さらに、このようなアッセイは、当分野においてよく知られているように、受容体阻害剤を試験するのに用いることができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
受容体の機能における試験化合物の効果は、上記のパラメータのいずれを調べることによっても測定することができる。受容体活性に影響を与える好適な生理学的変化はいずれも、本発明のGタンパク質への受容体の共役における試験化合物の影響を評価するために用いることができる。インタクトな細胞または動物を用いて機能的な結果が決定される場合には、Ca2+、IP3、またはcAMPなどの細胞内セカンドメッセンジャーの変化等のあらゆる効果を測定することができる。そのような測定を行うための好適なアッセイは、参照により本明細書に組み込まれているWO 01 18050において記載されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
受容体の活性化は典型的には、引き続く細胞内事象、例えばカルシウムイオンの細胞内ストアを放出させるIP3などのセカンドメッセンジャーの増加を開始させる。いくつかのGタンパク質共役型受容体の活性化は、ホスホリパーゼＣを介するホスファチジルイノシトールの加水分解によりイノシトール３リン酸(IP3)の形成を刺激する(Berridge & Irvine, Nature 312:315-21 (1984))。IP3は次に、細胞内カルシウムイオンストアの放出を刺激する。したがって、細胞質カルシウムイオンレベルまたはIP3などのセカンドメッセンジャーレベルの変化は、Gタンパク質共役型受容体の機能を評価するために用いることができる。かかるGタンパク質共役型受容体を発現する細胞は、細胞内ストアおよびイオンチャネルの活性化を介する両方からの寄与の結果として、増加した細胞質カルシウムレベルを示す。このような場合には、内部のストアからのカルシウム放出に由来する蛍光反応を顕著にするために、必須ではないが、任意にEDTAなどのキレート剤が補充されているカルシウムを含有しないバッファー中でかかるアッセイを行うことが望ましい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
最初に、Gα16およびガストデューシンに対応するオーバーラップしている２つのPCRフラグメントを増幅した。16gust44-ASプライマーと組み合わせてT7プライマーを用いて、５’Gα16フラグメントを作製し、一方、３’ガストデューシンフラグメントは、16gust44-Sプライマーと組み合わせてSR6プライマーを用いて作製した。個々のPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して精製した。精製されたPCR産物を混合し、一緒にアニーリングさせ、そして全長キメラフラグメントをT7およびSP6プライマーを用いて増幅した。PCR混合物には、1.5ｍMのMgCl2 が含まれており、PCR産物は、Applied BiosystemsからのGeneAmp PCR System 9700を使用し、94℃45秒、50℃90秒、および72℃120秒の温度サイクルパラメータを用いて増幅した。集められたキメラPCRフラグメントは、pcDNA3.1にサブクローニングされ、DNA配列決定および制限酵素地図により完全であることを確認した。融合タンパク質の適切な発現は、抗Gα16ポリクローナル抗体 (Torrey Pines Biolabs)を用いて、トランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物全体のウェスタンブロットにより確認された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
アッセイの測定については、プレートを、例えばFlexstation(Molecular Devices)などの蛍光マイクロプレートリーダーにセットし、２０μｌの１０×濃縮リガンドストック溶液を添加して、受容体の活性化を開始させる。リガンド添加前１５秒間およびリガンド添加後４５〜７５秒間、継続的に蛍光をモニターする。受容体の活性化レベルは、下記の２つの式により定義される：活性化％＝（最大蛍光−ベースラインの蛍光）／ベースラインの蛍光＊１００または増加蛍光＝最大蛍光−ベースラインの蛍光、ここでベースラインの蛍光は、リガンド添加前の平均蛍光レベルを表す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
例５
異なるGタンパク質を発現する細胞における、苦味グルコシドによるヒトTAS2R16の活性化
hTAS2R16と、野生型Gα16、本発明のキメラであるGα16ガストデューシン44、および比較のキメラGa16z44のいずれかとを発現する細胞に、５ｍＭのフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを添加した。異なるGタンパク質を安定に発現する細胞に、ヒトTAS2R16苦味受容体を２４時間一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞をFluo-4で処理し、細胞内カルシウム蛍光を例２において上記したように測定した。細胞の蛍光は継続的にモニターし、リガンド添加前１５秒間に測定された平均蛍光を刺激されていないレベルの蛍光である、ベースラインとみなした。Gα16ガストデューシン44キメラを発現する細胞は、Gα16を発現する細胞よりも、リガンド刺激後より大きな程度の受容体活性化を示した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
例７
Gα16ガストデューシン44とTAS2R10とを安定発現する細胞における、ストリキニーネによるヒト苦味受容体TAS2R10の活性化
この例は、一過性トランスフェクションの代わりに、ヒトTAS2R10とG16gust44とを安定発現するテトラサイクリン誘導細胞系が用いられた以外は、本質的には例５において記載されているとおり行った。細胞は、７５〜８０％の細胞密度で維持された。下記結果が得られた：
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
例８
Gα16ガストデューシン44とTAS2R38とを安定発現する細胞における、フェニルチオカルバミドまたはプロピルチオウラシルによるヒト苦味受容体TAS2R38の活性化
この例は、一過性トランスフェクションの代わりに、ヒトTAS2R38とG16gust44とを安定発現するテトラサイクリン誘導細胞系が用いられた以外は、本質的には例５において記載されているとおり行った。細胞は７５〜８０％の細胞密度で維持された。下記結果が得られた：
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
例９
Gタンパク質によるヒト苦味受容体（TAS2R43）の機能的活性
一過性トランスフェクションの代わりに、ヒトTAS2R43とG16gust44とを安定発現するテトラサイクリン誘導細胞系が用いられた以外は、例５と同様の方法を用いた。細胞は７５〜８０％の密度で維持された。下記結果が得られた：