(57)【要約】【課題】  ２価抗体、とりわけＦ(ａｂ')2分子の製造のための効率的で経済的な方法、および２価および２特異的Ｆ(ａｂ')2分子の修飾を可能とする方法を提供する。【解決手段】  免疫グロブリンＨ鎖Ｆｖ領域および免疫グロブリンＬ鎖Ｆｖ領域を含有し、該Ｈ鎖または該Ｌ鎖が不対システイン残基を遊離チオールとして含むＦｖポリペプチドの製造法であって、該Ｆｖポリペプチドを組換え大腸菌細胞培養液のペリプラズム中に発現および分泌し、ついで該システイン残基を遊離チオールとして実質的に維持する条件下で該ポリペプチドを回収することからなる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＨ鎖の可変領域および免疫グロブリンＬ鎖の可変領域を含有し、該Ｌ鎖の可変領域が不対遊離チオールを含有するＬ鎖定常領域を欠くが、該Ｈ鎖の可変領域は、Ｈ鎖可変領域に対してＣ末端側に位置する少なくとも一つのシステイン残基を遊離チオールとして含んでなる、Ｆｖポリペプチドの調製方法であって、該Ｆｖポリペプチドを組み換え大腸菌細胞培養菌のペリプラズム中に発現および分泌し、ついで、システイン残基を遊離チオールとして実質的に維持する条件下で該ポリペプチドを回収することからなる方法。
【請求項２】
ポリペプチドを回収する間に、前記Ｆｖポリペプチドが還元条件に曝されていない、請求項１の方法。
【請求項３】
前記Ｆｖポリペプチドが、一つのヒンジ領域のシステインを有する、請求項１の方法。
【請求項４】
金属イオンキレート剤が大腸菌培養の間に存在する、請求項１の方法。
【請求項５】
金属イオンキレート剤が前記Ｆｖポリペプチドの回収の間に存在している、請求項１の方法。
【請求項６】
プロテアーゼインヒビターが前記Ｆｖポリペプチドの回収の間に存在している、請求項１の方法。
【請求項７】
プロテアーゼインヒビターが大腸菌培養の間に存在している、請求項６の方法。
【請求項８】
前記Ｆｖポリペプチドが大腸菌培養を凍結解凍し、リゾチームの存在下での浸透圧衝撃に曝すことによって回収される、請求項１の方法。
【請求項９】
アミノ酸配列Ｃｙｓ ＸＸがＦｖポリペプチドのＣ末端に位置している、請求項１の方法。
【請求項１０】
アミノ酸配列がＣｙｓ Ａｌａ Ａｌａである、請求項９の方法。
【請求項１１】
回収したＦｖポリペプチドが異種分子と結合している、請求項１の方法。
【請求項１２】
異種分子が蛍光プローブ、放射性核種、検出可能な標識、毒素又は非ペプチド性剤である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
請求項１の方法によって調製したＦｖポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１又は１１の方法によって調製した異種分子と結合したＦｖポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、微生物宿主中での機能性抗体フラグメントの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在する抗体（免疫グロブリン）は、ジスルフィド結合で連結された２本のＨ鎖および２本のＬ鎖からなり、各Ｌ鎖はこれらＨ鎖の一方とジスルフィド結合により連結されている。各鎖はＮ末端側の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）およびＣ末端側の定常ドメインを有する；Ｌ鎖の定常ドメインはＨ鎖の第一定常ドメインと並んでジスルフィド結合しており、Ｌ鎖可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと並んでいる。Ｈ鎖定常領域は、（Ｎ末端側からＣ末端側の方向に）ＣＨ１領域およびヒンジ領域を含む。Ｌ鎖もまたヒンジドメインを含む。特定のアミノ酸残基がＬ鎖およびＨ鎖可変ドメインの間の界面を形成し、ジスルフィド結合させているものと思われる（たとえば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４参照）。
【０００３】
定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞障害や補体依存性細胞障害への参画などの種々のエフェクター機能に関与している。Ｌ鎖およびＨ鎖の各ペアの可変ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与している。天然のＬ鎖およびＨ鎖のドメインは同じ一般的構造を有し（いわゆる免疫グロブリン折り畳み（fold））、各ドメインは４つのフレームワーク（ＦＲ）領域からなり、これらフレームワーク領域の配列はある程度保存されており、３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結されている（非特許文献５参照）。これら４つのフレームワーク領域は、大部分、β−シートコンホメーションをとり、ＣＤＲは該β−シート構造を連結し、ある場合には該構造の一部を形成するループを形成する。各鎖中のＣＤＲはフレームワーク領域によって極めて近接して保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに抗原結合部位の形成に寄与している。
【０００４】
抗体は、種々の抗原結合フラグメントに分類することができる。Ｆｖフラグメントは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変ドメインのみからなるヘテロダイマーである。Ｆａｂフラグメントは、Ｌ鎖の定常ドメインおよびＨ鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）をも有している。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１または２以上のシステインを含む、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端側に幾つかの残基が付加していることがＦａｂフラグメントと異なっている。Ｆａｂ'−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ'を表すために本明細書において用いる表示である。Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントは、元来、ヒンジシステインの間でＦａｂ'フラグメントのペアとして生成される。
【０００５】
抗体および抗体フラグメントの組換え製造により、抗原結合親和性の増大した抗体、免疫原性の修飾された抗体並びに二官能性の抗体を設計することが容易になる。機能性の抗体を得ることができると報告された最初の発現系は、哺乳動物細胞に対するものであった。たとえば、特許文献１は、Ｌ鎖およびＨ鎖の少なくとも可変領域配列を宿主細胞中で共発現する方法を教示している。当該技術分野における他の研究者は、バキュロウイルス発現系（非特許文献６）、酵母系（非特許文献７）、ファージラムダにおける組み合わせライブラリー（非特許文献８）、および繊維状ファージを用いた仕事（非特許文献９）を報告している。
【０００６】
細菌系、とりわけ大腸菌発現系における抗体および抗体フラグメントの産生が当該技術分野の研究者によって行われている。大腸菌発現系には、構築物の容易な作成および直接的な発現を可能とする充分研究され便利な遺伝子技術、および大腸菌の増殖が速いことおよびその発酵が比較的簡単であることによって可能となる生成物の比較的便利で経済的に大スケールの産生を含む幾つかの利点がある。大腸菌における機能性抗体フラグメントの大スケールの産生は、研究並びに商業的な応用において重要である。
【０００７】
抗体遺伝子の細菌中での発現は非特許文献１０、非特許文献１１によって報告されている。これら報告は細胞質発現を示しており、収率がかなり変動することが報告されている。非特許文献１２は、大腸菌における免疫グロブリンＬ鎖の分泌およびプロセシングを報告している。非特許文献１３は、細胞質ハイブリッドタンパク質の発現、潜在的に移動可能なハイブリッドタンパク質、およびアルカリホスファターゼもしくはβ−ラクタマーゼシグナル配列との融合物としてのＶＬ鎖、ＶＨ鎖、ＶＬＣＬ鎖、およびＶＨＣＨ鎖の発現およびペリプラズム移動を開示している。非特許文献１４は、抗体の可変ドメインの大腸菌ペリプラズムへのペリプラズム分泌およびインビボでの正確な畳み込みを報告している；マウスＦａｂフラグメントの発現についても同様の方法および結果が非特許文献１５によって報告されている。
【０００８】
非特許文献１６は、アミノ酸配列を介したＦｖ領域のＬ鎖およびＨ鎖フラグメントの連結、および単一のポリペプチドとしての該複合体の大腸菌での産生を報告している（特許文献２をも参照）。非特許文献１７も同様の仕事を報告している。非特許文献１８は、「単一ドメイン」抗体（単離したＨ鎖可変ドメイン）の大腸菌中での産生および大腸菌からの分泌を報告している。非特許文献１９は、抗体Ｌ鎖およびＨ鎖をコードするｃＤＮＡの大腸菌中での発現およびＦａｂフラグメントへの再現を開示している。非特許文献２０は、大腸菌およびサッカロミセス・セレビシエからの機能性Ｆａｂフラグメントの発現および分泌を記載している。
【０００９】
プリュックツンおよびスケラは、機能性抗体ＦｖおよびＦａｂフラグメントの大腸菌中での発現技術を記載している（非特許文献２１）。彼らの方法によると、細胞質において、それぞれ細菌のシグナル配列に融合したＶＬおよびＶＨの前駆体タンパク質が還元形にて合成される。内膜を通ってペリプラズム中に移動した後、シグナル配列が開裂し、各ドメインが折り畳まれて集合し、ジスルフィド結合が形成される。彼らは、彼らの方法によるＦａｂフラグメントの発現も同様であることを教示している。同様の発現法は、文献のいたるところに見いだされる。抗体フラグメントの大腸菌発現の概略については、非特許文献２２をも参照。
【００１０】
非特許文献２３は、低い温度（３７℃ではなく２１℃〜３０℃）で増殖する大腸菌細胞においては、κ鎖および末端の切れたＨ鎖（Ｆｄフラグメント）をコードする単一発現プラスミドが高収量の機能性Ｆａｂフラグメントを与えることを教示している。キャビリーは、Ｆａｂフラグメントは大腸菌細胞質中では非共有結合により連結したダイマーとして存在するように思われるが、大腸菌から単離した可溶性のＦａｂフラグメントは細胞破砕後の空気酸化によって生成される共有結合ダイマーとして現れることを議論している。
【００１１】
システアミンなどの穏やかな還元剤の低濃度の存在下では、２価Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントが２つのＦａｂ'フラグメントに解離することが文献で知られている。この解離は、穏やかな酸化によって逆行する。ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２抗体フラグメントの生成はまた、完全な抗体の部分的還元および制限されたタンパク質加水分解によっても示されている（たとえば、非特許文献２４参照）。しかしながら、これらの方法を用いた場合、回収した抗体フラグメントの正確な性質および比率を制御するのが困難である。２価抗体とは、少なくとも２つのエピトープ結合部位（該部位は同じかまたは異なる抗原上に存在していてよい）を有する抗体をいう。
【００１２】
２特異的抗体とは、単一の抗原によって共有されていない２つのエピトープに結合し得る２価抗体をいう。腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原と免疫エフェクター細胞の表面マーカーとに対して二重の特異性を有する２特異的モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂｓ）が記載されている（たとえば、非特許文献２５；非特許文献２６を参照）。これらＢｓＭＡｂｓは、腫瘍細胞標的を殺すようにエフェクター細胞に指令および誘発するのに有効であることが示されている（非特許文献２７）。ＢｓＭａｂｓを産生させる一つの方法は、２つのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを融合させて、親のモノクローナル抗体を含む所望でない鎖の組み合わせに加えてＢｓＭａｂを分泌するクアドローマ（quadromas）（ハイブリッドハイブリドーマ）を生成することである（非特許文献２８）。しかしながら、２特異的なヒト化抗体および抗体フラグメントを産生するには、他の方法が好ましい。
【００１３】
非特許文献２９は、ウサギ抗体を消化し、その後に抗体フラグメントを再結合することを記載している；非特許文献２９は、異なる特異性のペプシン処理抗体の１価フラグメントを組み合わせることにより二重特異性の抗体分子が得られることを開示している。非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；および特許文献３をも参照。
【００１４】
他の方法では、２つの異なるモノクローナル抗体からの２特異的なＦａｂ'フラグメントを部位指定(directed)化学カップリングを利用して、所望の特異性を有するＢｓＭＡｂ（この場合はＦ(ａｂ')２）を組み立てる（たとえば、非特許文献３３を参照）。Ｆａｂ'フラグメントのジチオニトロベンゾエート誘導体の有方向カップリングの化学については、非特許文献３４、および非特許文献３５をも参照。ブレナンらはまた、２つの近接するシステインを架橋するためのヒ酸ソーダの使用をも教示しているが、この反応では非常に毒性の化合物を使用する。非特許文献３６および非特許文献３７）は、チオエーテル結合を有する２特異的Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントの調製を教示している。これら化学はまた、同一のＦａｂ'フラグメントのカップリングにも応用することができる。
【００１５】
非特許文献３８は、抗体中へのシステインの導入（Ｈ鎖のＣＨ１ドメインへ）および該導入されたシステインによるエフェクターまたはレポーター分子の部位特異的結合を教示している。
【００１６】
【特許文献１】キャビリー（Cabilly）ら、米国特許第４,８１６,５６７号明細書
【特許文献２】ラドナーら、米国特許第４,９４６,７７８号明細書
【特許文献３】ポーラス（Paulus）、米国特許第４,４４４,８７８号明細書
【非特許文献１】コチア（Chothia）ら、Journal of Molecular Biology（１９８５）１８６：６５１〜６６３
【非特許文献２】ノボトニー（Novotny）およびハーバー（Haber）、Proceedings of National Academy of Science USA（１９８５）８２：４５９２〜４５９６
【非特許文献３】パドラン（Padlan）ら、Molecular Immunology（１９８６）２３（９）：９５１〜９６０
【非特許文献４】ミラー（S.Miller）、Journal of Molecular Biology（１９９０）２１６：９６５〜９７３
【非特許文献５】カバット（Kabat, E.A.）ら、免疫学的に重要なタンパク質の配列、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、（１９８７）
【非特許文献６】ハーゼマン（Haseman）ら、Proceedings of National Academy of Science USA（１９９０）８７：３９４２〜３９４６
【非特許文献７】ホーウィッツ（Horwitz）ら、Proceedings of National Academy of Science USA（１９８８）８５：８６７８〜８６８２
【非特許文献８】ヒューズ（Huse）ら、Science（１９８９）２４６：１２７５〜１２８１
【非特許文献９】マッカファーティ（McCafferty）ら、Nature（１９９０）３４８：５５２〜５５４
【非特許文献１０】キャビリーら、Proceedings of National Academy of Science USA（１９８４）８１：３２７３〜３２７７
【非特許文献１１】ボス（Boss）ら、Nucleic Acids Research（１９８４）１２：３７９１〜３８０６
【非特許文献１２】ゼメル−ドリーゼン（Zemel−Dreasen）ら、Gene（１９８４）３１５〜３２２
【非特許文献１３】プリュックツン（Pluckthun）ら、定量的生物学に関するコールドスプリングハーバーシンポジウム、１９８７、ＬII巻、１０５〜１１２頁（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）
【非特許文献１４】スケラ（Skerra）およびプリュックツン、Science（１９８８）２４０：１０３８〜１０４１
【非特許文献１５】ベッター（Better）ら、Science（１９８８）２４０：１０４１〜１０４３
【非特許文献１６】バード（Bird）ら、Nature（１９８８）３３２：３２３〜３２７
【非特許文献１７】ハストン（Huston）ら、Proceedings of National Academy of Science USA（１９８８）８５：５８７９〜５８８３
【非特許文献１８】ウォード（Ward）ら、Nature（１９８９）３４１：５４４〜５４６
【非特許文献１９】コンドラ（Condra）ら、Journal of Biological Chemistry（１９９０）２６５（４）：２２９２〜２２９５
【非特許文献２０】ベッターおよびホーウィッツ、Methods in Enzymology（１９８９）１７８：４７６〜４９６
【非特許文献２１】プリュックツンおよびスケラ、Methods in Enzymology（１９８９）１７８：４９７〜５１５
【非特許文献２２】プリュックツン、Biotechnology（１９９１）９：５４５〜５５１
【非特許文献２３】キャビリー、Gene、（１９８９）８５：５５３〜５５７
【非特許文献２４】パーハム（Parham）、Cellular Immunology（ウェア（Ｅ.Ｍ.Ｗeir）編、ブラックウエル・サイエンティフィック、カリフォルニア州）第４版、（１９８３）１巻、１４章
【非特許文献２５】リウ（Liu）ら、Proceedings of National Academy of Science USA（１９８５）８２：８６４８
【非特許文献２６】ペレツ（Perez）ら、Nature（１９８５）３１６：３５４
【非特許文献２７】ファンガー（Fanger）ら、Immunology Today（１９９１）１２：５１
【非特許文献２８】ミルシュテインおよびクエロ（Cuello, Ａ.Ｃ.）、Nature（１９８３）３０５：５３７
【非特許文献２９】ニソノフ（Nisonoff）およびマンディ（Mandy）Nature（１９６２）４８２６：３５５〜３５９
【非特許文献３０】ハンマーリング（Hammerling）ら、Journal of Experimental Medicine（１９６８）１２８：１４６１〜１４６９
【非特許文献３１】パーハム、Human Immunology（１９８５）１２：２１３〜３３１
【非特許文献３２】ラソ（Raso）およびグリフィン（Griffin）、Cancer Research（１９８１）４１：２０７３〜２０７６
【非特許文献３３】ノラン（Nolan）ら、Biochimica et Biophysica Acta（１９９０）１０４０：１
【非特許文献３４】モーラー（Ｒ.Ａ.Maurer）の博士論文、ハーバード大学（１９７８）
【非特許文献３５】ブレナン（Brennan）ら、Science（１９８５）２２９：８１〜８３
【非特許文献３６】グレニー（Glennie）ら、Journal of Biological Chemistry（１９８５）１４１（１０）：３６６２〜３６７０
【非特許文献３７】グレニー（Glennie）ら、Journal of Immunology（１９７５）１３９：２３６７〜２３７５
【非特許文献３８】リオンズ（Lyons）ら、Protein Engineering （１９９０）３（８）７０３〜７０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
文献に示された機能性抗体フラグメントの大腸菌発現における進歩にもかかわらず、２価抗体、とりわけＦ(ａｂ')２分子の製造のための効率的で経済的な方法、および２価および２特異的Ｆ(ａｂ')２分子の修飾を可能とする方法に対する必要性が存在する。インビトロで都合よくカップリングさせて２価ＦｖまたはＦ(ａｂ')２分子を形成する安定なＦａｂ'−ＳＨポリペプチドを製造するのが望ましい。
【００１８】
それゆえ、Ｆｖドメイン、とりわけＦａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨおよびＦ(ａｂ')２抗体フラグメントからなるポリペプチドを細菌細胞培養液中または細菌細胞培養液から高収率で製造する方法を提供することがこの発明の目的である。
【００１９】
この発明の他の目的は、均一な２価および２特異的なＦ(ａｂ')２抗体フラグメントの効率的な製造方法を提供することである。
【００２０】
この発明の他の目的は、遊離のチオールとして存在する少なくとも一つのヒンジ領域システインを有するＦａｂ'抗体フラグメント（Ｆａｂ'−ＳＨ）を提供することである。完全な抗体からＦａｂ'−ＳＨを生成するうえで内在する問題：タンパク質加水分解の受けやすさの違いおよび非特異的な開裂、低収率、並びにヒンジジスルフィド結合に対して完全には選択的でない部分的還元を回避することが関連する目的である。本発明の他の目的は、近接するチオールをキレート化するための極めて毒性の強い亜ヒ酸塩の使用、または他の非効率的で望ましくない方法に頼ることなく、ヒンジ内ジスルフィド結合の生成を防ぐことである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
この発明の主要な態様は、組換え微生物ペリプラズム抗体フラグメントのＬ鎖−Ｈ鎖界面の外側に位置するシステイン残基におけるシステイン遊離チオールの驚くべき同定、および単一のシステイン残基のみを遊離チオールの形態で含有するＦｖ変種を製造することができるという驚くべき知見に基づいている。このことにより、均一な組換えＦ(ａｂ')２および他のＦｖ含有２価ポリペプチドの製造が容易になる。従って、一つの態様において、この発明は、免疫グロブリンＨ鎖Ｆｖ領域および免疫グロブリンＬ鎖Ｆｖ領域を含有するＦｖポリペプチド（該Ｌ鎖またはＨ鎖はまた遊離のチオールとしての不対システイン残基をも含有する）を、組換え微生物細胞培養物のペリプラズム中に発現および分泌し、ついで該システイン残基を遊離のチオールとして実質的に維持する条件下で該ポリペプチドを回収することからなる。
【００２２】
Ｆｖ Ｌ鎖またはＨ鎖のいずれも、１または２以上のシステイン残基を含有するポリペプチド配列と任意に融合させることができるが、ただし、Ｌ鎖またはＨ鎖Ｆｖのいずれかに対してＣ末端側のドメイン中に位置するそのようなシステイン残基の少なくとも一つはペリプラズム中で遊離のチオールとして存在することを条件とすることが理解されるであろう。適当なポリペプチド配列としては、免疫グロブリン、担体タンパク質、レセプター、成長因子、栄養物質、細胞付着分子、組織特異的付着因子、酵素、毒素などに由来する配列が挙げられるが、これらに限られるものではない。一般に、不対システイン残基は、Ｌ鎖またはＨ鎖ＦｖドメインのいずれかのＣ末端側にて、またはＬ鎖またはＨ鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端側にて置換される。融合ポリペプチド配列はシステイン残基のみからなっていてもよいし、または（１）Ｆｖドメインの一つのＣ末端側、（２）Ｌ鎖定常領域のＣ末端側もしくは（３）Ｈ鎖のＣＨ１ドメインのＣ末端側に融合したポリペプチド中にシステイン残基が存在していてもよい。後者の場合、単一の遊離チオールシステイン残基を有するヒンジ領域、好ましくはシステイン残基を１つだけ含有するヒンジ領域アミノ酸配列変種にＦｖ−ＣＨ１ドメインを融合させる。しかしながら、免疫グロブリンヒンジ領域の代わりに、単一の遊離チオールシステイン残基を含有する他のいかなる配列も有用である。
【００２３】
他の態様において、２以上、一般に２または３の遊離チオール残基を有するヒンジ領域、好ましくは２または３のシステイン残基を含有するヒンジ領域アミノ酸配列変種にＦｖ−ＣＨ１ドメインを融合させる。たとえば、３つのシステイン残基を含有するように修飾したＦａｂ'−ＳＨアミノ酸配列変種を適当な宿主細胞、たとえばＣＨＯ細胞や大腸菌中で組換えにより製造し、インビボで宿主細胞により首尾よくカップリングして３つのジスルフィド結合がＨ鎖を連結したＦ(ａｂ')２を形成させることができる。
【００２４】
さらに詳しくは、この発明の目的は、工程：
ａ．Ｆａｂ'を含む免疫グロブリンプレ配列（presequence）をコードする核酸（微生物宿主細胞によって認識される制御配列に機能的に連結されている）を含むベクターで形質転換した該宿主細胞中で、宿主細胞のペリプラズム腔へのＦａｂ'の分泌およびＦａｂ'−ＳＨの生成に適した条件下にて該核酸を発現させ；ついで
ｂ．該宿主細胞からＦａｂ'−（ＳＨ）n（式中、ｎは１または２以上）を回収する
ことからなる、遊離のチオールとして存在する少なくとも一つのヒンジ領域システインを有するＦａｂ'抗体ポリペプチド（Ｆａｂ'−ＳＨ）の製造法によって達成される。
【００２５】
この発明の方法の別の態様は、ヒンジシステインチオールをプロトン化形態で維持するのに適した条件下でＦａｂ'−ＳＨをその後に回収する（精製を含む）ことからなる。ある種の態様において、形質転換細胞の培養の間またはＦａｂ'−ＳＨの回収に際して金属イオンキレート試薬および／またはプロテアーゼインヒビターを存在させる。
【００２６】
場合により、宿主細胞を凍結−解凍し、浸透ショックに供し、細胞ペーストを調製し、ついで該細胞ペーストからＦａｂ'−ＳＨを精製することにより該宿主細胞からＦａｂ'−ＳＨを放出させる。場合により、たとえばリゾチームを用いた該宿主細胞の酵素的消化により、または物理的破砕、たとえば超音波処理またはフレンチプレスの使用により該細胞からのＦａｂ'−ＳＨの放出を容易にできる。
【００２７】
ある種の態様において、ＦｖまたはＦｖに融合したポリペプチド（一般にヒンジ配列）を、ペリプラズム中で遊離のチオールを示すただ一つのシステイン残基が存在するように修飾させる。それゆえ、たとえば、最初のシステインに対してＣ末端側にあるすべてのヒンジ配列システイン残基を欠失または置換することによりＦａｂアミノ酸配列を修飾させる。同様に、たとえば、３つのシステイン残基が遊離のチオールの形態で存在する態様を得るため、第三のシステインのＣ末端側にあるすべてのヒンジ配列システイン残基を欠失または置換により修飾させる。
【００２８】
この発明はまた、Ｌ鎖とＨ鎖との間にジスルフィド結合を有しないＦｖ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨおよびＦ(ａｂ')２ポリペプチドをも提供する。これらポリペプチドは、本明細書において「非連結（linkless）」と称する。たとえば、鎖間（Ｈ−Ｌ）ジスルフィド結合を形成する２つのシステインのうちの一方または好ましくは両方を置換または欠失させることにより該ポリペプチドのアミノ酸配列を修飾させる。一般に、これらシステインをセリンで置換するが、ジスルフィド結合を形成できないようにシステイン側鎖の一方または両方を共有結合的に修飾することも本発明の範囲に包含される。ある種の態様において、Ｌ鎖とＨ鎖との間には非常に強力な相互反応が存在するので、鎖間ジスルフィドを除いてもＬ鎖とＨ鎖との間で望ましくないレベルの解離とはならない。非連結Ｆａｂ'−ＳＨポリペプチドによって、有利にも、化学カップリングによって均一なＦ(ａｂ')２を調製することが可能となる。
【００２９】
他の観点において、Ｆ(ａｂ')２を含むポリペプチドの製造法は、工程：
ａ．第一Ｆａｂ'を含む免疫グロブリンプレ配列をコードする核酸（微生物宿主細胞によって認識される制御配列に機能的に連結されている）を含むベクターで形質転換した該宿主細胞中で、宿主細胞のペリプラズム腔への該第一Ｆａｂ'の分泌およびＦａｂ'−ＳＨの生成に適した条件下にて該核酸を発現させ（該第一Ｆａｂ'は第一のエピトープに結合し得る）；
ｂ．第二Ｆａｂ'を含む免疫グロブリンプレ配列をコードする核酸（微生物宿主細胞によって認識される制御配列に機能的に連結されている）を含むベクターで形質転換した該宿主細胞中で、宿主細胞のペリプラズム腔への該第二Ｆａｂ'の分泌およびＦａｂ'−ＳＨの生成に適した条件下にて該核酸を発現させ（該第二Ｆａｂ'は第二のエピトープに結合し得る）；
ｃ．該第一Ｆａｂ'−ＳＨおよび第二Ｆａｂ'−ＳＨを該宿主細胞から回収し；ついで
ｄ．該第一Ｆａｂ'−ＳＨおよび第二Ｆａｂ'−ＳＨの遊離のチオールシステイン残基間で共有結合を形成して２価Ｆ(ａｂ')２を形成させる
ことからなる。
【００３０】
本発明の態様において、当該技術分野で知られた部位指定共有結合カップリング法を利用して、効率的な部位指定ジスルフィド結合形成がインビトロで生じ、それによって２特異的な２価抗体が生成する。特に好ましい態様において、第一Ｆａｂ'−ＳＨと第二Ｆａｂ'−ＳＨとの間のジスルフィド結合形成は、下記工程：
ａ．該第一Ｆａｂ'−ＳＨを（ｉ）５,５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応させてチオニトロベンゾエート誘導体Ｆａｂ'−ＴＮＢを生成させるかまたは（ｉｉ）２官能性マレイミドと反応させ；
ｂ．該第一Ｆａｂ'−ＴＮＢまたはマレイミド化Ｆａｂ'を該第二Ｆａｂ'−ＳＨと直接カップリングしてＦ(ａｂ')２を生成させ；ついで
ｃ．該Ｆ(ａｂ')２を回収する
ことからなる。
【００３１】
この発明の方法により、新規なＦ(ａｂ')２組成物が提供される。そのような組成物は、
ａ．天然のＦｖ領域中に認められる天然のジスルフィド結合を例外として、誘導体化スルフヒドリル基を有するシステイン残基を含有するＦ(ａｂ')２Ｆｖ領域を本質的に含まず、
ｂ．ヒンジ領域の鎖内ジスルフィド結合を有するＦ(ａｂ')２を全く含まず、
ｃ．混入する亜ヒ酸塩を全く含まず、
ｄ．Ｈ鎖Ｃ末端アミノ酸残基に関して全く均一である。
【００３２】
他の態様において、誘導プロモーター／オペレーター系の転写制御下で免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸で形質転換した宿主細胞を培養し、それによって誘導後の細胞培養液中のポリペプチドレベルが細胞培養液１リットル当たり約１ｇ以上のポリペプチドとするに充分なように誘導前にポリペプチドの発現が抑制されることからなる方法により、組換え微生物中での免疫グロブリンまたはそのフラグメントの高レベル発現が達成される。一般に、このことは、低コピー数ベクター中またはすべてのｐｈｏＡオペレーター部位を完全に占め該オペロンを完全に抑制するに充分なレベルのリプレッサーを発現すべく修飾した宿主中でｐｈｏＡなどの強力なプロモーターを使用することにより達成される。
【００３３】
以下、本発明を図面を参照して説明する。
図１は、大腸菌からｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８κＬ鎖およびＨ鎖Ｆｄ'フラグメントを共分泌するのに使用するプラスミドｐＡ１９を示す。Ｆａｂ'発現単位は、リン酸飢餓により誘導されるＰｈｏＡプロモーター（チャング（Ｃ.Ｎ.Chang）ら、Gene ４４：１２１（１９８６））の転写制御下にある両鎖について２シストロン（dicistronic）である。ヒト化可変ドメイン（ｈｕＶLおよびｈｕＶH、カーター（P.Carter）ら、Proc. Natl. Acad.Sci.ＵＳＡ、８９（１０）：４２８５〜９（１９９２））が、その５'末端にて熱安定エンテロトキシンII（ｓｔII）シグナル配列をコードする遺伝子切片（ピッケン（Ｒ.Ｎ.Picken）ら、Infect. Immun.４２：２６９（１９８３））に正確に融合しており、その３'部位にてそれぞれ、ヒトκ1（ＣL、パーム（Ｗ. Palm）およびヒルシュマン（Ｎ.Hilschmann）、Ｚ. Physiol. Chem.３５６：１６７（１９７５））およびＩｇＧ１（ＣＨ１、エリソン（J. W. Ellison）ら、Nucleic Acids Res.１０：４０７１（１９８２））定常ドメインに正確に融合している。これらコード領域は８３塩基対によって隔てられており、翻訳の効率的な開始が可能となるようにそれぞれリボソーム結合部位（ピッケンら、上記）によって先行されている。このＦａｂ'発現単位を、テトラサイクリン耐性遺伝子産物のアミノ酸配列を変化させることなくＳａｌＩおよびＳｐｈＩ部位を除去することによって前以て修飾したｐＢＲ３２２（ボリバー（Ｆ.Ｂolivar）ら、Ｇene ２：９５（１９７７））のＥｃｏＲＩ部位中にクローニングした。ＣＨ１遺伝子の末端およびバクテリオファージλｔ0転写ターミネーターの直前に唯一のＳａｌＩおよびＳｐｈＩ部位を設けることにより、種々のＦａｂ'変種の構築を容易にした（ショルティセック（Scholtissek）ら、Nucleic Acids Res.１５：３１８５（１９８７））。
【００３４】
図２は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８のＦａｂ、Ｆａｂ'およびＦ(ａｂ')２（Ｃys Ａla Ａla変種）フラグメントの精製を示す。クーマーシーブリリアントブルー（Ｒ２５０）を用いた非還元条件下、４〜２０％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分析した。示した試料は、タンパク質分子量マーカー（レーン１）、Ｆａｂ（レーン２）；模擬（mock）カップリング反応前（レーン３）および反応後（レーン４）のＦａｂ'−ＳＨ；模擬カップリング反応前（レーン５）および反応後（レーン６）のＦａｂ'−ＴＮＢ；Ｆａｂ'−ＴＮＢとカップリングしたＦａｂ'−ＳＨ（レーン７）、ゲル濾過により精製したＦ(ａｂ')２（レーン８）および哺乳動物細胞中で発現させた完全長のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（カーターら、Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ（１９９２）上記）の制限ペプシン消化（ラモイ（Ｅ.Lamoyi）ら、Methods Enzymol.１２１：６５２（１９８６））により得たＦ(ａｂ')２（レーン９）である。電気泳動前に抗体フラグメント（試料当たり２μｇ）を４ｍＭヨードアセトアミドと反応させた。遠心分離して細胞破砕物を除去し、ＤＥＡＥセファロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、ついでタンパク質ＡＣＬ４Ｂまたはタンパク質Ｇセファロースを用いてアフィニティー精製することにより、発酵上澄み液からｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂフラグメントを精製した。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ'−ＳＨの精製は、２１ｍｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３.５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦ、５μＭペプスタチン、５μＭロイペプチン、２.４ｍＭベンズアミジンの存在下で１５ｇの細胞ペーストを解凍することにより行った。細胞破砕物を遠心分離により除去した（４０,０００ｇ、１０分、４℃）。得られた上澄み液（ｐＨ５.０）をＤＥＡＥセファロースを通過させ、２ｍｌのタンパク質Ｇセファロースカラム上に負荷した。タンパク質は１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３.５）で溶出し、１０ｍＭ ＥＤＴＡを１.５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ4の存在下でｐＨ４.０に調節し、２ｍｌのフェニルトヨパールカラム上に負荷した。Ｆａｂ'−ＳＨは２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.０）、０.８Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＥＤＴＡで溶出し、限外濾過（セントリプレプ−１０、アミコン）により容量を減少させ、緩衝液をＧ２５ゲル濾過により１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡに交換した。Ｆａｂチオニトロベンゾエート誘導体の調製も、ＤＥＡＥフロースルーを５ｍＭ ＤＴＮＢおよびｐＨ７.５に調節する他は同様にして行った。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ ＦａｂおよびＦａｂ'変種の全濃度を、２８０ｎｍにおいて測定した吸光度およびアミノ酸組成分析により決定した吸光係数（ε0.1％＝１.５６）から決定した。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ'−ＳＨの遊離チオール含量の決定は記載（クレイトン（Ｔ.Ｅ.Ｃreighton）、タンパク質構造、実際的アプローチ（ＩＲＬプレス、オックスフォード、英国、１９９０）、１５７頁）に従ってＤＴＮＢを用いて分析することにより行ない、一方、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ'−ＴＮＢのＴＮＢ含量の決定はジチオトレイトールで還元した際の収量により行なった。等モル量のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ'−ＴＮＢ（ＴＮＢ含量により）およびＦａｂ'−Ｓ���（−ＳＨ含量により）を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）および１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、合計濃度≧１.４ｍｇ／ｍｌにて３７℃で１時間カップリングさせた。リン酸緩衝食塩水の存在下でのＳ１００−ＨＲゲル濾過（ファルマシア）により、カップリング反応液からｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆ(ａｂ')２を単離した。このＦ(ａｂ')2試料を滅菌した０.２μｍフィルターに通し、４℃で貯蔵するかまたは液体窒素中でフラッシュ凍結し（flash frozen）−７０℃で貯蔵した。
【００３５】
定義
一般に、下記語句を本記載、実施例および請求の範囲に使用する場合には所定の定義を有する：
Ｆｖなる語は、定常ドメインを含有しない、共有結合によりまたは非共有結合により会合したＨ鎖およびＬ鎖ヘテロダイマーとして定義される。
【００３６】
本明細書においてＦａｂ'なる語は、抗体Ｈ鎖の可変ドメインおよび第一定常ドメイン、抗体Ｌ鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、およびＨ鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端側の１または２以上のシステイン残基を含む少なくとも１つの別のアミノ酸残基のヘテロダイマーからなるポリペプチドとして定義される。Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントは、一対のＦａｂ'抗体フラグメントが共有結合により連結されたものである。
【００３７】
Ｆａｂ' Ｈ鎖にはヒンジ領域が含まれていてよい。これは、いかなる所望のヒンジアミノ酸配列であってもよい。別の態様として、ヒンジは、１または２以上のシステイン残基に有利なように完全に省かれていてもよいし、または好ましくは短い（約１〜１０残基）システイン含有ポリペプチドであってよい。ある種の応用においては、天然に存在する一般的な抗体ヒンジ配列（システインのつぎに２つのプロリン、ついで他のシステイン）を用いる；この配列は、ヒトＩｇＧ1分子のヒンジ中に認められる（カバットら、免疫学的に重要なタンパク質の配列、第３版（国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、１９８７））。他の態様において、ヒンジ領域は他の所望の抗体クラスまたはアイソタイプから選択される。この発明のある種の好ましい態様において、Ｆａｂ'のＣＨ１のＣ末端を配列ＣｙｓＸＸに融合させる。ＸはＡｌａが好ましいが、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＰｒｏなどの他の残基であってもよい。Ｘアミノ酸残基の一方または両方を欠失させることができる。
【００３８】
「ヒンジ領域」とは、天然免疫グロブリンのＣＨ１とＣＨ２との間に位置するアミノ酸配列またはその配列変種である。以下に記載するヒト化４Ｄ５抗体の場合には、ヒンジ領域は残基２２４（．．Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ．．中のＡｓｐ）と２３３（．．Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ．．中のＰｒｏ）との間に位置する。他の免疫グロブリンの類似領域を用いることができるが、ヒンジ領域のサイズおよび配列は大きく変化してよいことが理解されるであろう。たとえば、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域はわずかに約１０の残基であるが、ヒトＩｇＧ3のヒンジ領域は約６０残基である。
【００３９】
本明細書においてＦｖ−ＳＨまたはＦａｂ'−ＳＨなる語は、少なくとも一つのシステインの遊離チオールを有するＦｖまたはＦａｂ'ポリペプチドとして定義される。この遊離のチオールはヒンジ領域に存在し、通常鎖間結合に関与するＬ鎖およびＨ鎖のシステイン残基は天然の形態で存在するのが好ましい。この発明の最も好ましい態様において、Ｆａｂ'−ＳＨポリペプチド組成物には異種のタンパク質加水分解フラグメントが含まれない。ある種の態様において、Ｆａｂ'−ＳＨポリペプチドはまた、Ｈ鎖およびＬ鎖がたとえば異常なジスルフィドやスルフヒドリル付加生成物の生成によって、天然の状態では存在しないように還元されているかまたは他の仕方で誘導体化されているＦａｂ'フラグメントを実質的に（約９０モル％以上）含まない。別の態様において、Ｆａｂ'−ＳＨは、共有結合によりカップリングされていないＨ鎖およびＬ鎖を有する。
【００４０】
本発明の目的のためのヒト化抗体は、前以て決定された抗原に結合することのできる免疫グロブリンアミノ酸配列変種またはそのフラグメントであって、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＦＲ領域と実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＣＤＲまたは前以て選択した抗原に結合するよう修飾した配列とからなるものである。
【００４１】
「制御配列」なる語は、機能的に連結したコード配列を特定の宿主生物中で発現するのに必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適した制御配列としては、たとえば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、および転写ターミネーターが挙げられる。特に好ましいのは、細胞培養物が増殖および成熟している間、たとえば対数増殖期の間に増殖−阻害量以下のレベルでＦａｂ'ポリペプチドの合成を抑制する高度に制御された誘導性プロモーターである。
【００４２】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に「機能的に連結している」。たとえば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されるなら、該ポリペプチドのＤＮＡと機能的に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼすなら該配列に機能的に連結している；リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置しているならコード配列に機能的に連結している。一般に、「機能的に連結している」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接していること、および分泌リーダーの場合には隣接して同じリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は都合のよい制限部位でライゲーションすることにより行うことができる。そのような部位が存在しない場合には、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。
【００４３】
本明細書において「外来」要素とは、細胞にとって外来のものであるか、または該宿主細胞のものと相同ではあるが該要素が通常は認められない該細胞核酸内の位置に認められるものをいう。
【００４４】
本明細書において「細胞」および「細胞培養物」なる表現は同じ意味で用いられ、そのような表示はすべて子孫を含む。それゆえ、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる語は、継代の数のいかんにかかわらず、初代目的細胞およびそれに由来する培養物を包含する。また、時間をかけたまたは偶然の突然変異により、すべての子孫のＤＮＡ含量が正確に同一である必要はないことも理解されるであろう。最初の形質転換細胞でスクリーニングしたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫も包含される。異なる表示は、前後関係の文脈から明らかとなるであろう。
【００４５】
「プラスミド」は、小文字のｐと、それに先立つおよび／またはそれに続く大文字および／または数字によって表示される。本明細書において出発プラスミドは市販されており、制限されることなく公的に利用でき、またはそのような利用可能なプラスミドから刊行された手順に従って構築することができる。加えて、当該技術分野で知られた他の等価なプラスミドは当業者にとって明らかであろう。
【００４６】
ＤＮＡの所定断片の制限消化物からの「回収」または「単離」とは、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上での電気泳動による該消化物の分離、目的断片の移動度を分子量が知られたマーカーＤＮＡ断片の移動度と比較することによる該断片の同定、該所望の断片を含有するゲル切片の除去、および該ゲルのＤＮＡからの分離を意味する。この手順は一般に知られている。たとえば、ローン（Lawn）らのNucleic Acids Res. ９：６１０３〜６１１４（１９８１）およびゲッデル（Goeddel）らのNucleic Acids Res. ８：４０５７（１９８０）を参照。
【００４７】
細胞からのＤＮＡの「調製」とは、宿主細胞の培養物からのプラスミドＤＮＡの単離を意味する。一般に使用されているＤＮＡの調製法は、サンブルック（Sambrook）らのモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル ニューヨーク：コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、１９８９の第１.２５〜１.３３節に記載されている大スケールおよび小スケールのプラスミド調製法である。ＤＮＡ調製物の精製は、当該技術分野でよく知られた方法により行った（上記サンブルックらの第１.４０節を参照）。
【００４８】
本発明を実施するための適当な方法
一般に、培養微生物宿主細胞を、形質転換した該宿主細胞によって認識される制御配列に機能的に連結したＦａｂ'コード核酸（すなわち、Ｈ鎖ＦｄフラグメントおよびＬ鎖をコードする核酸）を含むベクターで形質転換する（以下、「Ｆａｂ」を特別の態様として言及するが、ペリプラズムで遊離チオールを生成することのできるシステイン残基がＦｖ領域またはそれに融合した配列中に存在する限りにおいて、Ｆｖを含有するいかなる抗体フラグメントまたはその融合／配列誘導体をも使用することができることが理解されるであろう）。細胞の培養は、宿主細胞のペリプラズム腔中へのＦａｂ'の分泌および遊離チオールの形成に適した条件下で行う。一般に、対応Ｌ鎖およびＨ鎖フラグメントの共発現を指令するため２シストロンオペロンを用いる。別法として、同じまたは異なるプラスミドで別々の鎖を別々のプロモーターから発現させる。第二に、ペリプラズム腔中への分泌を指令するためシグナル配列をＦａｂ鎖に先行させるが、該腔では、酸化還元環境は、Ｌ鎖フラグメントとＨ鎖フラグメントとを会合させるためのジスルフィド結合の形成には有利であるが、ヒンジのシステイン残基間でのジスルフィド結合形成には有利ではないと思われる。特に好ましい態様において、発現制御配列はリン酸飢餓によって誘導される大腸菌ｐｈｏＡプロモーター（チャングら、Gene ４４：１２１（１９８６））であり、シグナル配列は熱安定エンテロトキシンIIシグナル配列（ピッケンら、Infect. Immun..４２：２６９（１９８３））である。
【００４９】
現在のところ、発酵槽中で高細胞密度で増殖している細菌細胞で抗体フラグメントを発現させるのが好ましい。適当な発酵条件は、下記実施例に記載されている。
【００５０】
遊離チオールを含むポリペプチドを発酵培地から回収しおよび／または凍結−解凍細胞から（一般に浸透ショックにより）回収し、ついで精製する。回収（精製を含む）は、Ｆａｂ'−ＳＨがプロトン化形態で維持されている場合に最もうまく行える。プロトン化形態を維持するための他の条件としては、有機溶媒または−ＳＨの解離ｐＫａをシフトさせるための他の試薬の使用が挙げられる。このことは、酸性のｐＨ、すなわちヒンジまたは不対システインチオールのｐＫａよりも好ましくは２またはそれ以上のｐＨ単位小さいｐＨにて達成される。別法として、その後の反応に適した均一な状態にＦａｂ'を維持するため、Ｆａｂ'−ＳＨをＴＮＢまたはｐ−メトキシベンジルなどの保護基と反応させる。さらに別の態様として、ピリジンジスルフィドをＦａｂ'−ＳＨに加えて混合ジスルフィドを形成させる；このことにより、カップリングまたは他のプロセシングのために脱保護するまで遊離のスルフヒドリルを安定にする。さらに別の態様において、遊離のスルフヒドリルを保護せず、カップリングまたはさらにプロセシングする前に還元する。当該技術分野で知られた適当な保護基は、グロス（Ｅ.Gross）およびマイエムホーファー（Ｊ．Meiemhofer）、ペプチド：分析、構造、生物学 Vol ３：ペプチド合成における官能基の保護（アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８１）に記載されている。
【００５１】
酸性ｐＨ（一般に約ｐＨ４〜ｐＨ６、好ましくは約ｐＨ５.０）でのストレプトコッカスタンパク質Ｇセファロースまたはスタフィロコッカスタンパク質Ａ上などでのアフィニティー精製が好ましい。別法として、２相液体抽出を用いることができる。少量の混入したタンパク質分解断片は、たとえばシリカゲルおよび／またはアルキルもしくはアリール置換クロマトグラフィー樹脂（フェニルトヨパールなど）を用いた疎水性相互反応クロマトグラフィーにより容易に除くことができる。宿主プロテアーゼを不活化または阻害するためのプロテアーゼインヒビターのカクテル（フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンおよび／またはベンズアミジンなど）を使用すること、および培養および回収手順にＥＤＴＡなどの金属イオンキレート試薬を用いることが好ましい。キレート試薬を選択し、ジスルフィド結合形成の金属イオン触媒反応を防ぐ量で用いる。
【００５２】
ある種の態様において、Ｆａｂ'−(ＳＨ)n（式中、ｎは１またはそれ以上）は組換え手順の間にインビボでＦ(ａｂ')２を生成する。これら態様において、好ましくは２以上のシステイン残基を含有するようにＦａｂ'−(ＳＨ)アミノ酸配列を修飾しておいた。たとえば、大腸菌中でのＦａｂ'−ＳＨ３の培養後、Ｈ鎖の間に３つのジスルフィド結合を有するＦ(ａｂ')２を大腸菌細胞ペーストから直接回収する。
【００５３】
他の態様において、架橋剤または溶解酸素などの不定の酸化剤を用いたインビトロ化学カップリングにより精製Ｆａｂ'−(ＳＨ)n（式中、ｎは１またはそれ以上）からＦ(ａｂ')２を調製する。後者の場合、精製Ｆａｂ'は単に空気酸化によってＦ(ａｂ')２を生成するであろう。加えて、別個のＦａｂ'のカップリングを指令し２価の１特異的Ｆ(ａｂ')２の形成を回避させるＦａｂ'−ＳＨ誘導体の使用により２特異的Ｆ(ａｂ')２が製造される。１特異的または２特異的なＦ(ａｂ')２のための一つの適当な化学は、上記ブレナンらによって記載された方法である。凍結−解凍細胞から浸透ショックによって放出されたＦａｂ'−ＳＨを過剰のＤＴＮＢの存在下で約ｐＨ７.５に調節する他はＦａｂ'−ＳＨと同様の方法によりＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体を調製する。等モル量のＦａｂ'−ＳＨとＦａｂ'−ＴＮＢとをＥＤＴＡの存在下でのジスルフィド交換反応により効率的にカップリングさせてＦ(ａｂ')２フラグメントを形成させる。
【００５４】
この発明の非連結Ｆｖ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨおよびＦ(ａｂ')２ポリペプチドは、Ｌ鎖とＨ鎖との間にジスルフィド結合を有しない。一般に、ポリペプチドの修飾は、修飾したポリペプチドの直接発現の結果として、または化学的手段または酵素手段により行う。該ポリペプチドの典型的なアミノ酸配列修飾は、鎖間（Ｈ−Ｌ）ジスルフィド結合を形成する２つのシステインの一方または好ましくは両方を置換もしくは欠失させることである。一般に、これらシステインはセリンと置換させるが、ジスルフィド結合を形成することができないように該システイン側鎖の一方または両方を共有結合的に修飾することも本発明の範囲に包含される。
【００５５】
上記システインの一方または両方は、脂肪酸または他の化学基を用いて修飾し、種々の公知法によりジスルフィド結合を形成できないようにすることができる。そのような公知法としては、下記方法：（１）Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）やエトキシ−エトキシカルボニル−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）などの脱水剤または活性化剤を用いた共有結合修飾；（２）ケテン、無水物、イソチオシアネート、またはβ−ラクトンを用いたアシル化；（３）シアネートを用いたカルバモイル化；（４）アルデヒドおよびある種のケト酸を用いたヘミメルカプタールまたはヘミメルカプトール生成；（５）活性二重結合への付加（Ｎ−エチルマレイミドを使用）による、キノンとの反応による、ハロ酸およびそのアミドとの反応（ヨード酢酸、またはα−ブロモヘキサデカン酸を使用）による、メチル化反応（ジメチルサルフェートを用いたものなど）による、スルホアルキル化による、アリール化（ニトロベンゼン化合物を使用）による、またはジアゾ化合物との反応による、アルキル化およびアリール化；（６）銀や有機水銀化合物（塩化第二水銀など）などの金属イオンとの反応；（７）亜ヒ酸化合物との反応；（８）亜硫酸塩との反応；（９）酸化反応；および（１０）ハロゲン化スルフェニルとの反応による混合ジスルフィドの生成が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００５６】
ポリペプチドの修飾は、宿主細胞内で行うか、または組換えにより生成したポリペプチドに翻訳後修飾を行ってもよい。現在のところ、翻訳後修飾は、宿主細胞または微生物から回収してから２４時間以内、好ましくは数時間以内に起こるのが好ましい。
【００５７】
この発明のポリペプチドのシステインに対する修飾の存在の検出法としては、ポリペプチド試料の質量分析など一般に知られている。別法としては、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を試料に対して行う。このペプチド分析法は当該技術分野で一般的であるが、たとえばスチュアート（Stuart）およびヤング（Young）、固相ペプチド合成、１０３〜１０７、および１１８〜１２２頁（ピアス・ケミカル（Pierce Chem.Co.）、第２版、１９８４）を参照。
【００５８】
ある種の態様において、Ｌ鎖とＨ鎖との間には非常に強い相互作用が存在するので、鎖間ジスルフィドを除去したためにＬ鎖とＨ鎖との間での解離は望ましくないレベルのものにはならない。非連結Ｆａｂ'−ＳＨポリペプチドは、有利にも、化学カップリングによって均一なＦ(ａｂ')２を調製することを可能にする。
【００５９】
この発明のＦａｂは、抗体の通常の入手源から得ることができる。抗原に対するポリクローナル抗体は、一般に、該抗原およびアジュバントを動物に複数回、皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することによって産生される。抗原または標的抗原アミノ酸配列を有する断片を、免疫しようとする種において免疫原であるタンパク質（たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター）に、２官能性または誘導体化試薬、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基）を用いてコンジュゲートするのが有用である。
【００６０】
動物の免疫の経路および手順または該動物からの培養抗体−産生細胞は、一般に抗体刺激および産生のための確立された通常法に準じて行う。試験モデルとしてはマウスがしばしば用いられるが、あらゆる哺乳動物またはそれから得られた抗体産生細胞を使用可能であることが考えられる。
【００６１】
免疫後、免疫した動物から免疫リンパ球細胞（一般に脾臓細胞またはリンパ節組織からのリンパ球）を回収し、通常の方法、たとえばミエローマ細胞との融合またはエプスタイン−バー（ＥＢ）−ウイルス形質転換により該細胞を不死化し、ついで所望の抗体を発現するクローンをスクリーニングすることによりモノクローナル抗体を調製する。ケーラーとミルシュテインによって最初に記載されたハイブリドーマ法（Nature  ２５６：５２〜５３（１９７５））は、多くの特定抗原に対して高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞株を作成するために広く用いられている。所望の抗体を分泌するハイブリドーマの同定は、常法による。ついで、通常の方法を用いて、選択した抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡをハイブリドーマから得る。別法として、免疫した動物のＢ細胞から抗体特異的な伝令ＲＮＡを抽出し、これを相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し、ついで該ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅するかまたは細菌発現系中にクローニングする。Ｈ鎖およびＬ鎖配列ソースを得るのに適した他の方法では、バクテリオファージλベクター系（発現されたＦａｂタンパク質をペリプラズム腔内に分泌するリーダー配列を含む）を用い、所望の活性を示すものについての多数の機能性抗体フラグメントの生成およびスクリーニングを行う。この系は市販されている。
【００６２】
アミノ酸配列変種
この発明はまた、天然のＦａｂポリペプチド配列のアミノ酸配列変種をも包含する。これら変種は、ＦａｂをコードするＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入するか、または所望のＦａｂのインビトロ合成により調製する。そのような変種には、たとえば、非ヒト抗体のヒト化変種、並びに特定のアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換が含まれる。最終生成物が所望の特性を有することを条件として、欠失、挿入および置換のあらゆる組み合わせを用いて最終構築物を得ることができる。これらアミノ酸変化はまた、グリコシレーション部位の数および位置の変化、定常ドメイン中への膜固着配列の導入または天然Ｆａｂのリーダー配列の修飾などの、標的ポリペプチドの翻訳後プロセシングをも変えるかもしれない。
【００６３】
標的ポリペプチドのアミノ酸配列変種を設計するに際して、変異部位の位置および変異の性質は、修飾しようとする標的ポリペプチドの特性に依存するであろう。変異部位の修飾は、たとえば、（１）得られる結果に依存して、まず保存アミノ酸の選択で、ついで一層過激な選択での置換、（２）標的残基の欠失、または（３）位置する部位に隣接して同じかまたは異なるクラスの残基を挿入すること、または（１）〜（３）の組み合わせによって、個々にまたは連続して行うことができる。
【００６４】
突然変異誘発にとって好ましい位置である標的ポリペプチドの残基または領域を同定するのに有用な方法は、カニンガム（Cunningham）およびウエルズ（Wells）（Science、２４４：１０８１〜１０８５［１９８９］）、およびダンカン（Duncan, Ａ.Ｒ.）およびウインター（Winter, G.）（Ｎature、３２２：７３８〜７４０［１９８８］）によって記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発（alanine scanning mutagenesis）」と称される。本発明では、残基または標的残基のグループを同定し（たとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、これらアミノ酸の細胞内または細胞外の周囲の水性環境との相互反応に影響を与えるため中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換する。それゆえ、アミノ酸配列変化を導入する部位は前以て決定するが、変異それ自体の性質は前以て決定する必要はない。たとえば、所定部位での突然変異を最適にするため、Ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で行い、発現された標的ポリペプチド変種を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。
【００６５】
アミノ酸配列変種の構築には２つの主要な変数、すなわち変異部位の位置および変異の性質が存在する。一般に、選択した変異の位置および性質は、修飾しようとする標的ポリペプチドの特性に依存するであろう。
【００６６】
アミノ酸配列挿入としては、長さが１残基から１００またはそれ以上の残基を含有するポリペプチドまでのアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入（すなわち、標的ポリペプチド配列内の挿入）は、一般に、約１〜１０残基、一層好ましくは１〜５残基、最も好ましくは１〜３残基の範囲であってよい。末端挿入の例としては、組換え宿主細胞からの成熟Ｆｖポリペプチドの分泌を容易にするためのＦｖポリペプチドのＮ末端への異種Ｎ末端シグナル配列の融合が挙げられる。そのようなシグナル配列は、一般に、目的宿主細胞種から得られるため、該細胞種と同種であろう。大腸菌に適した配列としては、ＳＴIIまたはｌｐｐが挙げられる。
【００６７】
標的ポリペプチドの他の挿入変種としては、該標的ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端への免疫原性ポリペプチド、たとえばβ−ラクタマーゼや大腸菌ｔｒｐ遺伝子座によってコードされる酵素などの細菌ポリペプチドまたは酵母タンパク質の融合、および免疫グロブリン定常領域（または他の免疫グロブリン領域）、アルブミン、またはフェリチンなどの長い半減期を有するタンパク質とのＣ末融合が挙げられる（ＷＯ ８９／０２９２２（１９８９年４月６日発行）に記載）。他の適当なポリペプチド配列としては、免疫グロブリン、担体タンパク質、レセプター、成長因子、栄養物質、細胞付着分子、組織特異的付着因子、酵素、毒素などに由来する配列が挙げられるが、これらに限られるものではない。これらの例示は、遊離のチオールシステインを与えるヒンジ領域などのシステインまたはシステイン含有ポリペプチドの挿入とは別のものであろう。
【００６８】
他のグループの変種は、アミノ酸置換変種である。これら変種は、免疫グロブリンポリペプチド中の少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発のために最も重要な部位は、ＣＤＲ、ＦＲおよびヒンジ領域である。これには、システインの他の残基への置換、および側鎖のかさばり、電荷、および／または疎水性において実質的に異なる挿入が含まれる。置換のための他の部位については、置換による特定標的抗体の抗原結合、親和性および他の特性に対する影響を考慮して以下に記載する。
【００６９】
Ｆａｂ自体、Ｈ鎖のＣＨ１から下流の定常ドメインが欠失した完全免疫グロブリンの欠失変種である。さらに、好ましい態様において、このＣＨ１ドメインのＣ末端側にＣｙｓ Ａｌａ Ａｌａなどのシステイン含有配列または２以上のＣｙｓを有する配列が続いている。
【００７０】
Ｆａｂアミノ酸配列変種をコードするＤＮＡは、当該技術分野で公知の種々の方法により調製することができる。これら方法としては、天然採取源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変種の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒体（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および標的ポリペプチドの前もって調製した変種または非変種型のカセット式突然変異誘発によるまたは全遺伝子合成による調製が挙げられるが、これらに限られるものではない。これら方法では、標的ポリペプチドの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または標的ポリペプチドの核酸に相補的な核酸を用いることができる。オリゴヌクレオチド媒体突然変異誘発は、標的ポリペプチドＤＮＡの置換、欠失、および挿入変種を調製するのに好ましい方法である。
【００７１】
ＰＣＲ突然変異誘発もまた、Ｆａｂポリペプチドのアミノ酸変種を調製するのに適している。以下ではＤＮＡについて記載するが、該技術をＲＮＡにも応用できることは理解されるであろう。ＰＣＲ法とは、一般に以下の手順をさす（エーリッヒ、上記、ヒグチ（R. Higuchi）による章、６１〜７０頁参照）：ＰＣＲにおいて少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として用いる場合、鋳型ＤＮＡ中の対応領域とはわずかに配列が異なるプライマーを用い、該プライマーが該鋳型と異なる部位でのみ配列が異なる特定ＤＮＡ断片を比較的大量に生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に変異を導入するには、該変異の位置と重複するように、また該変異を有するようにプライマーの一方を設計する；他方のプライマーは該プラスミドの他方の鎖の配列と同一でなければならないが、この配列はプラスミドＤＮＡのいずれの位置にあってもよい。しかしながら、これらプライマーによって結合された全増幅領域のＤＮＡを最終的に容易にシークエンシングできるように、第二のプライマーは第一のプライマーから２００ヌクレオチド内に位置しているのが好ましい。記載された通りのプライマーペアを用いたＰＣＲ増幅の結果、該プライマーによって特定された変異の部位、およびおそらく他の位置でも異なる（鋳型コピーは若干エラーを起こしやすいので）ＤＮＡ断片の集団が得られる。
【００７２】
生成物に対する鋳型の比率が極めて低いならば、生成物ＤＮＡ断片の大部分は所望の変異を導入している。この生成物は、標準ＤＮＡ法を用い、ＰＣＲの鋳型として機能したプラスミド中の対応領域を置換するのに用いる。別々の位置における変異の同時導入は、変異第二プライマーを用いるか、または異なる変異プライマーを用いて第二のＰＣＲを行い、得られた２つのＰＣＲ断片を３（またはそれ以上）部ライゲーションにおいてベクター断片中に同時にライゲートすることにより、行なうことができる。
【００７３】
変種を調製するための他の方法（カセット式突然変異誘発）は、ウエルズらによって記載された方法（Gene、３４：３１５［１９８５］）に基づいている。出発物質は、変異しようとするＦａｂ ＤＮＡを含有するプラスミド（または他のベクター）である。変異しようとするＦａｂポリペプチドＤＮＡ中のコドンを同定する。同定した変異部位の各部位に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在していなければならない。そのような制限部位が存在しない場合には、上記オリゴヌクレオチド媒体突然変異誘発法を用いてＦａｂポリペプチドＤＮＡ中の適当な位置に導入することにより該部位を生成させる。これら制限部位をプラスミド中に導入した後、これら部位にてプラスミドを切断して線状にする。これら制限部位の間のＤＮＡ配列をコードしているが所望の変異を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを標準法を用いて合成する。２本の鎖を別々に合成し、ついで標準法を用いてハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、該プラスミド中に直接ライゲートできるように、線状化プラスミドの末端と適合した３'および５'末端を有するように設計してある。このプラスミドは、こうして、変異したＦａｂポリペプチドＤＮＡ配列を含有している。
【００７４】
ベクター中へのＤＮＡの挿入
ＦａｂポリペプチドをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、さらにクローニングするため（該ＤＮＡの増幅）または発現させるために複製可能なベクター中に挿入する。多くのベクターを利用でき、適当なベクターの選択は、（１）ＤＮＡ増幅のために用いるのかコードタンパク質の発現のために用いるのか、（２）ベクター中に挿入するＤＮＡのサイズ、および（３）該ベクターで形質転換しようとする宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する宿主細胞に依存して種々の成員を含有する。ベクター成員としては、一般に、以下の１または２以上が挙げられるが、これらに限られるものではない：シグナル配列、複製起点、１または２以上のマーカー遺伝子、プロモーター、および転写停止配列。
【００７５】
（ａ）シグナル配列成員
一般に、シグナル配列はベクターの成員であるか、またはベクター中に挿入する標的ポリペプチドＤＮＡの一部である。本発明に包含されるのは、天然のシグナル配列が欠失され、異種シグナル配列で置換されたＦａｂポリペプチドである。選択する異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングを受ける（すなわち、シグナルペプチダーゼで開裂される）ものでなければならない。天然のＦａｂポリペプチドシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞の場合は、該シグナル配列を、たとえばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定エンテロトキシンIIリーダーから選ばれた原核シグナル配列で置換する。
【００７６】
（ｂ）複製起点成員
発現およびクローニングベクターは、１または２以上の選択した宿主細胞中でのＦａｂ核酸の複製を可能にする核酸配列を含有していてもよいが、含有する必要はない。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は宿主染色体ＤＮＡと独立に該ベクターを複製させるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、種々の微生物について非常によく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適している。
【００７７】
ＤＮＡはまた、宿主ゲノム中に挿入することによっても複製される。このことは、宿主としてバシラス種を用い、たとえばバシラスゲノムＤＮＡ中に認められる配列に相補的なＤＮＡ配列をベクター中に導入することによって容易に達成できる。このベクターでバシラスをトランスフェクションすると、該ゲノムと相同組換えが起こり、標的ポリペプチドＤＮＡが挿入される。しかしながら、標的ポリペプチドＤＮＡの切り出しに制限酵素消化が必要とされるので、外部で複製されるベクターの場合に比べて標的ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの回収は一層複雑である。同様に、ＤＮＡはまた、脊椎動物および哺乳動物細胞のゲノム中に常法に従って挿入することができる。
【００７８】
（ｃ）選択遺伝子成員
発現およびクローニングベクターは選択遺伝子（選択マーカーとも呼ばれる）を含有すべきである。この遺伝子は、選択培地中で増殖させた形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されなかった宿主細胞は培地中で生存できないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質や他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）複合培地からは利用できない重要な栄養を供給するタンパク質（たとえばバシラスの場合のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）をコードする。
【００７９】
選択計画の一つの例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬剤を利用することである。異種遺伝子で形質転換されている細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を発現し、それゆえ選択条件を生き残る。そのような主要な選択の例示としては、薬剤のネオマイシン（サザーン（Southern）ら、Ｊ. Molec. Appl. Genet.、１：３２７［１９８２］）、ミコフェノール酸（マリガン（Mulligan）ら、Science、２０９：１４２２［１９８０］）またはハイグロマイシン（サグデン（Sugden）ら、Mol. Cell. Biol.、５：４１０〜４１３［１９８５］）の使用が挙げられる。上記３つの例では、それぞれ適当な薬剤、Ｇ４１８すなわちネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を付与するため真核制御下で細菌遺伝子を使用する。
【００８０】
（ｄ）プロモーター成員
発現ベクターおよびクローニングベクターには、通常、宿主生物によって認識されＦａｂポリペプチド核酸と機能的に連結したプロモーターが含まれるであろう。プロモーターは、Ｆａｂ構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ内）の開始コドンの上流（５'側）に位置する非翻訳配列であって、該構造遺伝子の転写および翻訳を制御する。そのようなプロモーターは、一般に誘導性および構成的の２つのクラスに分けられる。誘導プロモーターとは、培養条件におけるある種の変化、たとえば栄養物の存在もしくは不在または温度変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの増加したレベルでの転写を開始するプロモーターである。
【００８１】
高制御下の誘導プロモーターが、Ｆｖ含有ポリペプチドの微生物発現には好ましい。現在、種々の可能な宿主細胞により認識される多数のプロモーターがよく知られている。これらプロモーターは、採取源のＤＮＡから制限酵素消化によって取り出し、単離したプロモーター配列をベクター中に挿入することによってＦａｂポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的に連結される。ＦａｂポリペプチドＤＮＡの増幅および／または発現を指令するため、天然のＦａｂポリペプチドプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方とも用いることができる。しかしながら、一般に異種プロモーターの方が天然標的ポリペプチドプロモーターに比べて大きな転写および発現される標的ポリペプチドの高収率を可能とするので異種プロモーターが好ましい。
【００８２】
原核宿主に用いるのに適したプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（チャングら、Nature、２７５：６１５［１９７８］；およびゲッデル（Goeddel）ら、Nature、２８１：５４４［１９７９］）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲッデル、Nucleic Acids Res.、８：４０５７［１９８０］およびＥＰ３６,７７６）およびｔａｃプロモーター（デュボア（de Boer）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ、８０：２１〜２５［１９８３］）などのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の知られた細菌プロモーターも適している。それらのヌクレオチド配列は刊行されているので、当業者は、必要な制限部位を与えるためのリンカーまたはアダプターを用い、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的にライゲートさせることができる（ジーベンリスト（Siebenlist）ら、Cell、２０：２６９［１９８０］）。細菌系に使用するプロモーターはまた、一般に標的ポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的に連結したシャイン−ダルガーノ（Ｓ.Ｄ.）配列を含有するであろう。
【００８３】
上記成員の１または２以上を含有する適当なベクターを構築するには、標準的なライゲーション法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、修飾し（tailored）、必要なプラスミドを生成するのに望ましい形態で再ライゲートさせる。
【００８４】
宿主細胞の選択および形質転換
Ｆａｂを発現するのに適した宿主細胞は、酵母、真菌、および原核生物などの微生物細胞である。適当な原核生物としては、グラム陰性菌やグラム陽性菌などの真正細菌、たとえば、大腸菌、枯草菌（Ｂ.subtilis）などのバシラス（Bacilli）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）などのシュードモナス種、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、またはセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescans）が挙げられる。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１,４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌χ１７７６（ＡＴＣＣ ３１,５３７）、大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１,６０８）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７,３２５）などの他の株も適している。これらは単に例示であって本発明を限定するものではない。宿主細胞は最小量のタンパク質分酵素を分泌するのが好ましく、さらにプロテアーゼインヒビターを細胞培養液中に添加するのが望ましい。
【００８５】
宿主細胞をこの発明の上記発現ベクターまたはクローニングベクターでトランスフェクションおよび好ましくは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように修飾した通常の栄養培地で培養する。
【００８６】
宿主細胞の培養
この発明のＦａｂポリペプチドを生成させるのに使用する細胞の培養は、サンブルックら（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル ニューヨーク：コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、１９８９）により一般に記載されているようにして適当な培地中で行う。他の必要な添加物も、当業者に知られた適当な濃度にて用いることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現選択のために宿主細胞で用いたのと同様であり、当業者には明らかであろう。
【００８７】
現在のところ、３７℃〜２９℃の温度で宿主細胞を培養するのが好ましいが、２０℃という低い温度も適している。最適温度は、宿主細胞、Ｆａｂ配列および他のパラメータに依存するであろう。一般に３７℃が好ましい。
【００８８】
Ｆａｂポリペプチドの精製
組換え細胞培養液から可溶性ポリペプチドを回収し、Ｆａｂに関して実質的に均一な調製物を得る。第一工程として、培地またはペリプラズム調製物を遠心分離にかけて微粒の細胞破砕物を除去する。ペリプラズム調製物を、通常の仕方、たとえば凍結−解凍法または浸透ショック法により得る。ついで、膜および可溶性タンパク質画分を分離する。ついで、Ｆａｂポリペプチドを可溶性タンパク質画分から精製する。以下の手順が適当な精製手順の例示である：イムノアフィニティーカラムまたはイオン交換カラム上での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；たとえばセファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過；タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇアフィニティーマトリックス（たとえば、セファロース）カラム；および疎水性相互反応クロマトグラフィー。
【００８９】
残基が欠失、挿入または置換したＦａｂポリペプチド変種も、該変異に伴う特性の実質的変化を考慮に入れて同様にして回収することができる。たとえば、他のタンパク質やポリペプチド（たとえば、細菌またはウイルス抗原）とのＦａｂポリペプチド融合物の調製により、該融合物を吸着させるために該抗原に対する抗体を含有するイムノアフィニティーカラムを用いることができるので精製が容易になる。ウサギポリクローナル抗標的ポリペプチドカラムなどのイムノアフィニティーカラムを用い、標的ポリペプチド変種を少なくとも一つの残留免疫エピトープに結合させることにより該ポリペプチド変種を吸着させることができる。精製中のタンパク質加水分解を阻害するためにプロテアーゼインヒビターが有用であり、偶発的な汚染物の増殖を防ぐために抗生物質を用いることもできる。
【００９０】
Ｆａｂ含有ポリペプチドの有用性
この発明の抗体フラグメントは、特定の細胞、流体もしくは組織中の抗原の診断アッセイ、抗原のイムノアフィニティー精製、および抗原拮抗作用に基づく治療に有用である。
【００９１】
Ｆａｂによって結合される抗原の分析法は通常のものであり、Ｆａｂに結合した標識を用いることができる。Ｆａｂポリペプチドに使用する標識は、Ｆａｂへの結合を妨害しない検出可能な官能基である。放射性同位元素３２Ｐ、３２Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、蛍光団、たとえば希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、たとえば発光飛翔昆虫（ホタル）ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４,７３７,４５６号）、ルシフェリン、２,３−ジヒドロフタールアジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロ環オキシダーゼ、たとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ラクトベルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、造影放射性核種（テクネチウムなど）などを含む多くの標識が知られている。
【００９２】
これら標識をタンパク質またはポリペプチドに共有結合により結合させるには、通常の方法を利用することができる。たとえば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベンジジンなどのカップリング剤を用い、上記蛍光標識、化学ルミネセンス標識および酵素標識で抗体を標識することができる。たとえば、米国特許第３,９４０,４７５号（蛍光測定）および同第３,６４５,０９０号（酵素）；ハンター（Hunter）ら、Nature、１４４：９４５（１９６２）；デービッド（David）ら、Biochemistry、１３：１０１４〜１０２１（１９７４）；ペイン（Pain）ら、Ｊ.Immunol. Methods、４０：２１９〜２３０（１９８１）；およびニグレン（Nygren）、Ｊ.Histochem.and Cytochem.、３０：４０７〜４１２（１９８２）を参照。本発明において好ましい標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素である。そのような標識（酵素を含む）のＦａｂ含有ポリペプチドへの結合は、イムノアッセイ法における当業者にとって標準的な操作手順である。たとえば、オサリバン（O'Sullivan）ら、「エンザイムイムノアッセイに使用するための酵素−抗体結合体の調製法」（Methods in Enzymology、ランゴン（Ｊ.Ｊ.Langone）およびバン・ブナキス（Ｈ.Van Vunakis）編、Ｖol.７３（アカデミックプレス、ニューヨーク、ニューヨーク、１９８１）、１４７〜１６６頁）を参照。そのような結合法は、この発明のＦａｂポリペプチドに使用するのに適している。
【００９３】
Ｆａｂ含有ポリペプチドはまた、イムノトキシンをも包含する。たとえば、ＡＩＤＳ治療に使用するリシンなどの細胞毒素にＦａｂ Ｈ鎖を任意に結合させることができる。別の態様として、毒素は、細胞毒性薬剤または細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのような毒素の酵素的に活性な断片であってよい。酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサから）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、α−サルシン（alpha-sarcin）、アレウリテス・フォルディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、フィトラカ・アメリカナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（momordica charantia）インヒビター、クルシン（curcin）、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）およびトリコテセン（tricothecenes）が挙げられる。他の態様において、シス−プラチンや５ＦＵなどの非ペプチド性薬剤に抗体を結合させる。モノクローナル抗体とそのような細胞毒性残基との結合体は、種々の２官能性タンパク質カップリング剤を用いて調製する。そのような試薬の例示としては、ＳＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステルの２官能性誘導体、たとえばジメチルアジピミデートＨＣｌ、活性エステル、たとえばジスクシンイミジルスベレート、アルデヒド、たとえばグルタルアルデヒド、ビス−アジド化合物、たとえばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン、ビス−ジアゾニウム誘導体、たとえばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン、ジイソシアネート、たとえばトリレン２,６−ジイソシアネートおよびビス−活性フッ素化合物、たとえば１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼンが挙げられる。毒素の溶解部分をＦａｂ抗体フラグメントに結合させてよい。
【００９４】
イムノトキシンは、本明細書に記載するように、種々の仕方で作製することができる。一般に知られた架橋剤を用いて安定な結合体を生成することができる。  インビボの治療用に用いる場合、本発明のＦａｂ含有フラグメントを、完全免疫グロブリンと同様にして治療学的有効量（すなわち、所望の治療学的効果を示す量）にて患者に投与する。この発明の方法に従って調製した生成物は、実質的な分子的均一性という利点を有し、それゆえこれまでＦ(ａｂ')２の調製に使用された毒性汚染物が回避される。
【００９５】
治療に使用する抗体組成物を調合し、投与量は、治療しようとする疾患、個々の患者の状態、該組成物を投与する部位、投与方法および実務家に知られた他の因子を考慮に入れて良好な医療実務に従った仕方にて確立される。抗体組成物は、以下の投与のためのポリペプチドの調製の記載に従って投与のために調製される。
【００９６】
実施例：活性なＦａｂ、Ｆａｂ'、およびＦ(ａｂ')２抗体フラグメントの発現
ＨＥＲ２癌原遺伝子産物（ｐ１８５HER2）の過剰発現は、種々の浸潤性のヒト悪性物（aggressive human malignancies）と関連している。ヒト化抗体ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の機能性ＦａｂおよびＦａｂ'フラグメントを、抗原ｐ１８５HER2への結合によって決定されるように１リットル当たり約１から過剰で約２グラムの力価にて分泌する大腸菌発現系を開発した。２価Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントを生成するためのインビトロでの効率的な部位指定ジスルフィド結合生成が可能となるように、単一のヒンジ領域システインが主として遊離チオールとして存在する（約９０モル％まで）ようにしてＦａｂ'フラグメントを回収した。この分子は、抗原結合親和性においておよびヒト乳腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ−３（ｐ１８５HER2を過剰発現する）に対する抗増殖活性において完全な抗体のタンパク質加水分解から得られたＦ(ａｂ')２と区別することができないが、該タンパク質加水分解産物と違って本発明のＦ(ａｂ')２はＣ末端側が均一である。この発明は、研究および治療目的のための天然由来またはヒト化抗体フラグメントを含む１特異的および２特異的Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントの構築を容易にする。この発明は、ＨＥＲ２癌原遺伝子の過剰発現によって特徴付けられる腫瘍病巣などの標的抗原に診断用残基または治療用残基を指向させることのできる抗体フラグメントを開発するのにとりわけ適している。
【００９７】
ｍｕＭＡｂ４Ｄ５（フェンドリー（Fendly,Ｂ.Ｍ.）ら、Cncer Res.５０：１５５０〜１５５８（１９９０））として知られるマウスモノクローナル抗体は、ｐ１８５HER2の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の対して向けられる。ｍｕＭＡｂ４Ｄ５およびその用途については、同時継続中のＰＣＴ出願ＷＯ ８９／０６６９２号（１９８９年７月２７日公開）に記載されている。このマウス抗体はＡＴＣＣに寄託してあり、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３の番号が付与されている。この記載において、ｍｕＭＡｂ４Ｄ５、ｃｈＭＡｂ４Ｄ５およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５なる語は、それぞれモノクローナル抗体４Ｄ５のマウス態様、キメラ化態様およびヒト化態様を表す。
【００９８】
ｍｕＭＡｂ４Ｄ５は、ｐ１８５HER2を過剰発現するヒト腫瘍細胞株の増殖を特異的に阻害し（２,３）標的細胞によって迅速にインターナリゼーションされるので（データは示していない）、臨床的介入の可能性を有する。ＨＥＲ２の増幅および／または過剰発現は複数のヒト悪性物と関係しており、主要なヒト乳癌および卵巣癌の２５〜３０％の進行に完全に関与していると思われる（５）。ｍｕＭＡｂ４Ｄ５は、免疫原性を減少させヒトエフェクター機能を支持するのを可能にすることによって臨床的有効性を改善するための試みにおいて以前に「ヒト化」されている（６）。ヒト化抗体ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８は、本質的に、マウス親抗体の抗原結合ループとヒト可変領域フレームワーク残基および定常ドメインのみを含む。このヒト化抗体は、マウス親抗体に比べてｐ１８５HER2ＥＣＤに対する親和性が３倍高く、ｐ１８５HER2を過剰発現する腫瘍細胞に対して匹敵する抗増殖活性を有し、抗体依存性細胞障害を支持する。
【００９９】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８のＦａｂおよびＦ(ａｂ')２抗体フラグメントを包含するように抗ｐ１８５HER2抗体試薬の範囲を広げることが望まれた。完全な抗体に比べてこれらフラグメントのサイズが小さいことは、腫瘍への侵入の改善および血清からの一層迅速な除去の促進によって、固体腫瘍への特異的局在化を向上させると思われる（文献８を参照）。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２フラグメントを、これらフラグメントの処理を容易にするために直接組み合え発現によって得た。さらに、この方法により、完全抗体の制限タンパク質加水分解および部分還元によって得られるものよりも一層均一な抗体フラグメントの調製物を得ることができた（文献９を参照）。機能性のＦｖおよびＦａｂフラグメントが大腸菌から分泌された（１０）。
【０１００】
本発明における抗体フラグメントの大腸菌分泌のための方法は（図１）、他の研究者の仕事と２つの基本的な類似点を有する（１０）。第一に、対応Ｌ鎖およびＨ鎖フラグメントの同時発現を指令するためにジシストロンオペロンを用いている。第二に、大腸菌のペリプラズム腔中への分泌を指令するために抗体鎖に細菌シグナル配列が先行しており、該ペリプラズム腔ではジスルフィド結合形成には酸化還元環境が有利であり、Ｌ鎖およびＨ鎖フラグメントが組み立てられる。本発明の系は従来の方法と３つの基本的な点で異なっている。第一に、転写単位に、リン酸飢餓によって誘導される高度に制御されたプロモーター、大腸菌ＰｈｏＡプロモーター（１１）、および熱安定なエンテロトキシンIIシグナル配列（１２）を利用している。第二に、Ｌ鎖の遺伝子切片がＨ鎖Ｆｄフラグメント（ＶHおよびＣＨ１ドメイン）の遺伝子切片に先行している。第三に、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８のＦａｂ'フラグメントを発現させるため、ＣＨ１遺伝子切片がシステイン含有抗体ヒンジ領域の一部をコードするべく延長されている。システインのつぎに２つのプロリンおよび他のシステインが続く配列（ＣＰＣ末端）を最初に選択した。というのは、該配列がｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の完全長態様（６）を含むヒトＩｇＧ1分子のヒンジ領域に認められるからである（１７）。ｐＢＲ３２２ベース発現ベクターのカセット突然変異誘発（１８）による別のＦａｂ'変種の構築を、ＣＨ１遺伝子切片の末端および停止コドンのすぐ３'側にそれぞれ唯一のＳａｌＩおよびＳｐｈＩ制限部位を設けることにより容易にした。
【０１０１】
発酵槽中で高細胞密度にて増殖させた（２０）大腸菌ＲＶ３０８のファージ耐性誘導体（１９）中にてｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂフラグメントを発現させた。発酵培地中での機能性ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂの力価は、ｐ１８５HER2ＥＣＤ結合ＥＬＩＳＡによって決定されるように、普通に１リットル当たり１〜２グラムである。適度の量（通常、＜２００ｍｇ／ｌ）のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８Ｆａｂが細胞ペーストに含まれることが認められ、浸透ショックによって放出させることができる。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂフラグメントのコンセンサスフレームワーク領域はスタフィロコッカスタンパク質Ａおよびストレプトコッカスタンパク質Ｇの両方に強く結合することがわかり、これらをアフィニティー精製に利用することができた。抗原結合ＥＬＩＳＡに先立つタンパク質Ａ上のアフィニティー精製後の培地または細胞ペースト試料で極めて類似した力価評価が得られる。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ変種（システイン、２つのプロリンおよび他のシステイン）および以下に記載する別のＦａｂ'変種についても、同様のｐ１８５HER2ＥＣＤ結合活性の発現力価が得られた。
【０１０２】
Ｆ(ａｂ')２分子の生成には、完全な抗体の場合には可能なＣＨ３ドメイン間の広範囲の相互作用の助けを借りることなく、Ｆａｂ'ヒンジシステインチオールが偶然に出会ってジスルフィド結合を形成する必要がある。それゆえ、インビボでのＦ(ａｂ')２の形成を促進するため、大腸菌のペリプラズム腔中でのＦａｂ'の高レベル発現を先行させる。事実、ＣＰＣ末端を有するＦａｂ'分子（培地または細胞ペーストのいずれかから単離された）の＜１０％が、タンパク質Ａ精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように２価の形態で回収された。高分解能マススペクトルおよび他の研究は、２つのヒンジシステイン残基間で分子内ジスルフィド結合の実質的な生成が起こっていることを示唆していた。この可能性は、単一のヒンジシステイン残基を有しＣｙｓ Ａｌａ ＡｌａのＣ末端配列を有するＦａｂ'変種を構築することにより排除した。このＦａｂ'変種が大腸菌から分泌されＤＴＮＢ分析で遊離のチオールが検出されない場合には、ごくわずかな量のＦ(ａｂ')２が生成する。
【０１０３】
Ｆａｂ' 分子をヒンジシステインが遊離のチオールとして存在するように維持する条件下で回収し、ついでインビトロで直接カップリングすることにより容易かつ有効にＦ(ａｂ')2に生成させる。たとえば、ブレナンら（２３）は、Ｆａｂ'遊離チオール（Ｆａｂ'−ＳＨ）をＤＴＮＢと反応させてチオニトロベンゾエート誘導体（Ｆａｂ'−ＴＮＢ）を生成させ、ついでこれを第二のＦａｂ'(Ｆａｂ'−ＳＨ）とカップリングさせて２特異的Ｆ(ａｂ')２を生成させた。以下の方法により、完全な機能性ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ' Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ変種の日常的な精製が可能となり、ＤＴＮＢ分析により決定されるように（図２）該分子の７５〜９０％が遊離のヒンジチオールを含有している。第一に、増殖条件をうまく修飾して（２０）、Ｆａｂ'の分泌を培地中（Ｆａｂ'ヒンジチオールが定量的および共有結合によりブロックされることがわかった）にではなく大腸菌のペリプラズム腔中になるようにした。第二に、Ｆａｂ'フラグメントを細胞ペーストから単離し、システインのチオールを一層反応性の小さいプロトン化形態に維持するために低ｐＨ（ｐＨ５.０）にてタンパク質Ｇセファロース上でアフィニティー精製した。第三に、ＥＤＴＡを加え、ジスルフィド結合生成を触媒し得る金属イオンをキレート化し、メタロプロテアーゼを不活化した。最後に、プロテアーゼインヒビターのカクテル（フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンおよびベンズアミジン）により、精製中の大腸菌プロテアーゼによるＦａｂ'のタンパク質加水分解を実質的に排除した。Ｆａｂ'調製物中の小量の混入タンパク質加水分解断片を、疎水性相互反応クロマトグラフィーにより容易に除去した。浸透ショックによって凍結−解凍細胞から放出されたＦａｂ'−ＳＨを過剰のＤＴＮＢの存在下で中性のｐＨに調節した他は、同様にしてＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体を調製した。
【０１０４】
等モル量のＦａｂ'−ＳＨとＦａｂ−ＴＮＢとをカップリングさせ、ジスルフィド交換反応によりＦ(ａｂ')２抗体フラグメントを有効に生成させた（図２）。カップリング反応をチオニトロベンゾエートアニオンの放出による４１２ｎｍにおける吸光度の増加をモニタリングすることにより追跡し、３７℃で３０〜６０分後に完了することがわかった。カップリング後の反応混合物では遊離のチオールは検出されず、残留するＦａｂ'の量はＦａｂ'−ＳＨおよびＦａｂ'−ＴＮＢ調製物中の未反応物質の量と一致している。Ｆ(ａｂ')２をＳ１００−ＨＲサイジングカラム上のゲル濾過によりＦａｂ'から分離した。文献記載されているように（２３）、Ｆａｂ'−ＳＨまたはＦａｂ'−ＴＮＢのいずれかのみを含有する模擬カップリング反応では、痕跡量のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆ(ａｂ')２しか生成しなかった。
【０１０５】
精製ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２の物理的および化学的完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２）、アミノ末端配列、アミノ酸組成および遊離チオール含量の分析、および円偏光二色性により評価した。非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した精製ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ（Ｍｒ＝４７.７ｋｄａｌ）およびＦ(ａｂ')2（Ｍｒ＝９６.０ｋｄａｌ）フラグメントは、それぞれ、期待される移動度の単一の主要なバンドを与えた。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの後では、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２抗体フラグメントの両方とも、遊離のＬ鎖（２３.４ｋｄａｌ）およびＨ鎖Ｆｄ（２４.３ｋｄａｌ）またはＦｄ'（２４.６ｋｄａｌ）フラグメントの化学量論的な量の放出により期待される同様の強度の二本のバンドを与えた（示していない）。ＦａｂおよびＦ(ａｂ')2抗体フラグメントのアミノ末端配列分析（８サイクル）は、Ｌ鎖とＨ鎖との化学量論的１：１混合から期待される混合配列を与え（ＶL／ＶH：Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｇｌｎ／Ｇｌｎ、Ｍｅｔ／Ｌｅｕ、Ｔｈｒ／Ｖａｌ、Ｇｌｎ／Ｇｌｕ、Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、およびＰｒｏ／Ｇｌｙ）、別の配列の証拠はなかった。ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２調製物のいずれにおいても、期待されるようにＤＴＮＢ分析によって遊離のチオールは検出されなかった。酸加水分解したＦａｂまたはＦ(ａｂ')２のアミノ酸分析（２７）は、期待される組成と極めてよく一致していた（６）。Ｆａｂフラグメントの円偏光二色性スペクトルは、免疫グロブリンの畳み込みに特徴的なものである。
【０１０６】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２抗体フラグメントの機能を、ｐ１８５HER2ＥＣＤに対する結合親和性を測定することにより、および
ｐ１８５HER2を過剰発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３の増殖に及ぼす影響を調べることにより調べた（表１）。
【０１０７】
表１．ｐ１８５HER2ＥＣＤ結合親和性および乳癌ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する抗増殖活性によるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８フラグメントの分析
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８変種    採取源    Ｋｄ＊ ｐＭ  相対的細胞増殖+
Ｆａｂ                    大腸菌        ５７０          ９１
Ｆ(ａｂ')2‡               大腸菌        ２９０          ５３
Ｆ(ａｂ')2              ２９３細胞       ３００           ５０
＊ｐ１８５HER2ＥＣＤのＫｄ値はすでに記載されたようにして決定し（５）、推定値の標準誤差は≦±１０％である。
+ｈｕＭＡｂ４Ｄ５変種とともに９６時間インキュベートしたＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖は、記載に従い（５）、未処理コントロールのパーセントとして示した。データは、各変種について１０μｇ／ｍｌのフラグメント濃度にて３回決定したものの平均として計算した最大抗増殖作用を表す。データはすべて同じ実験からのものであり、推定標準誤差は≦±１５％である。
‡Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ変種
【０１０８】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントのｐ１８５HER2ＥＣＤに対する結合親和性は、哺乳動物中で発現された完全抗体の制限タンパク質加水分解からの対応フラグメントのものと同一である。大腸菌由来の２価Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する抗増殖活性が、２９３細胞由来の完全な２価ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８親抗体（６）および完全な抗体の制限ペプシン消化から得られるＦ(ａｂ')２抗体フラグメントの両方のものと同一である。対照的に、一価Ｆａｂ分子はＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖に有意な影響を及ぼさない。このことは、細胞表面上のｐ１８５HER2の架橋が細胞の増殖を阻害するのに必要であることを示唆している。Ｆ(ａｂ')２に比べてＦａｂの抗原結合親和性が２倍弱いことが、Ｋｄの数百倍上までの濃度でＦａｂの抗増殖活性が存在しないことを説明しているとは極めて考えにくいと思われる。さらに、２価親抗体ｍｕＭＡｂ４Ｄ５の抗増殖活性を１価ｈｕＭＡｂ４Ｄ４ Ｆａｂフラグメントでブロックすることが可能である。
【０１０９】
この実施例では、機能性Ｆａｂフラグメントの発現力価は、大腸菌について文献で報告されているものに比べて約１０００倍から１リットル当たり１〜２グラムに増加した。加えて、Ｆａｂ'分子を回収した。この増大した発現は、高細胞密度（１０〜２０倍）および簡単なシェークフラスコに比べて一層正確に制御した発酵槽の環境、誘導前発現の非常に厳格な制御および使用したヒト化可変ドメイン配列の特徴にのみその一部が原因すると極めて強く思われる。ｐｈｏＡプロモーターを用いて本発明で得られたＦａｂ'の力価は驚くほど高く、この強力なプロモーターを低コピー数の（ｐＢＲ３２２ベースの）ベクターに使用した結果である。それゆえ、このリプレッサーは一層有効でないレベルでは滴定されない。細胞はまた、余分のリプレッサーを作製するために形質転換することができた。重要なことは、プロモーターが誘導前に不活性であることである。ベクターの設計およびＦａｂフラグメントの高い熱安定性（Ｔm＞８０℃）も重要であることもあり得る。この系は、大量の抗体フラグメントを必要とする臨床的または生物物理学的研究を極めて容易にするに違いない。
【０１１０】
抗原結合ループ中またはフレームワーク残基の近傍に１または２以上のアミノ酸変化を有するｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂの別の変種についても同様の高い発現レベルが観察された（６）。抗原結合残基をうまく置換することにより２つの別の抗原結合特異性をｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ'中に補充し、高発現力価を示すことがわかった。このことは、実質的にｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ'からなるポリペプチドのフレームワークが高度に発現されたヒト化Ｆａｂ' 分子に一般に有用であるという概念と一致する。
【０１１１】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ' Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａは、可変領域内のドメイン内ジスルフィドのみかけ上定量的な生成にもかからわず、インビボでＦ(ａｂ')２を生成する傾向は非常に小さい。しかしながら、インビトロでは、ｐＨ７.５、ＥＤＴＡの不在下、インビボで認められるよりも少なくとも１０倍低い濃度にてＦａｂ'−ＳＨの空気酸化によりＦ(ａｂ')２が容易に生成する。
【０１１２】
特別の機構に付することなく、大腸菌のペリプラズム腔の酸化還元電位は充分に酸化的であり、ドメイン内ジスルフィド結合の生成を可能とするがＨ鎖間のジスルフィド（おそらく熱力学的に有利でない）は生成させないと思われる。にもかかわらず、不対ヒンジシステインを主として遊離のチオールとして有する大腸菌のペリプラズム腔中に分泌された機能性Ｆａｂ'フラグメントの回収により、部位指定カップリングのための必須の出発物質が得られる（２３、３２、３３）。本発明者らは、さらに、ｐ１８５HER2ＥＣＤを溶液からアフィニティー精製することを可能とするため、すでに記載されたように（３４）、活性化チオール支持体上へのｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ'フラグメントの固定化のために遊離チオールを利用した。遊離ヒンジチオールはまた、蛍光−活性化細胞選別のための蛍光プローブの付着のために使用した。造影または治療のため放射性核種の部位特異的付着のために遊離システインチオールを使用することもこの発明の範囲に包含される。このことは、抗原結合親和性を損なう危険もなく、所定の化学量論および付着部位の通常の標識法に対して利点を提供するであろう。
【０１１３】
引用文献
１．フェンドリーら、Cancer Res.５０：１５５０（１９９０）
２．ハドジアク（Ｒ.Ｍ.Ｈudziak）ら、Mol. Cell. Biol. ９：１１６５（１９８９）
３．ルプー（Ｒ. Lupu）ら、Science ２４９：１５５２（１９９０）
５．スラモン（D. J. Slamon）ら、Science ２３５：１７７（１９８７）；スラモンら、Ｓcience ２４４：７０７（１９８９）
６．カーター（P. Carter）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA８９（１０）：４２８５〜９（１９９２）
７．ジョーンズ（P. T. Jones）ら、Nature ３２１：５２２（１９８６）；リーチマン（Ｌ.Riechmann）ら、Ｎature ３３２：３２３（１９８８）；フェアホーエン（M. Verhoeyen）ら、Ｓcience ２３９：１５３４（１９８８）
８．ブルメンタール（R. D. Blumenthal）ら、Adv. Drug  Del. Rev.４：２７９（１９９０）
【０１１４】
９．パーハム（P. Parham）、細胞免疫学（ウエア（E. M. Weir）編、ブラックウエル・サイエンティフィック、カリフォルニア州）第４版、１巻、１４章（１９８３）
１０．スケラ（A. Skerra）およびプリュックツン（A. Pluckthun）、Science ２４０：１０３８（１９８８）；ベッター（M. Better）ら、同書、１０４１頁
１１．チャングら、Gene ４４：１２１（１９８６）
１２．ピッケン（R. N. Picken）ら、Infec. Immun.４２：２６９（１９８３）
１３．パームおよびヒルシュマン、Z. Physiol. Chem.３５６：１６７（１９７５）
１４．エリソン（Ｊ.Ｗ.Ellison）ら、Nucleic Acids Res.１０：４０７１（１９８２）
【０１１５】
１５．ボリバー（F. Bolivar）ら、Gene ２：９５（１９７７）
１６．ショルティセック（S. Scholtissek）ら、Nucleic Acids Res.１５：３１８５（１９８７）
１７．カバット（E. A. Kabat）ら、免疫学的に重要なタンパク質の配列、第３版（国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、１９８７）
１８．ウエルズ（J. A. Wells）ら、Ｇene ３４：３１５（１９８５）
１９．モーラー（Ｒ.Ａ.Ｍaurer）、博士論文、ハーバード大学（１９８７）
２０．ｔｏｎＡ遺伝子を不活化することにより株ＲＶ３０８（参照２２、ＡＴＣＣ＃３１６０８）から得た大腸菌株２５Ｆ２中でｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ Ｆａｂ'フラグメントを発現した。最初に１２ｇ ｌ−１消化カゼイン、１７ｍＭグルコース、２.４ｍＭイソロイシン塩酸塩、４７ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１８ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、４.１ｍＭクエン酸三ナトリウム、１２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１２５μＭ ＦｅＣｌ３および各２０μＭのＺｎＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＣｏＣｌ２、Ｈ３ＢＯ３およびＮａＭｏＯ４プラス１２ｍｇ ｌ−１テトラサイクリンを含有する培地中、低い撹拌速度（６５０ｒｐｍ、Ｋｌａ〜６００ミリモル ｌ−１ｈｒ−１ａｔｍ−１）にて、３７℃で曝気１０リットル発酵槽中、３２〜４０時間細胞を増殖させ、ｐＨを７.０に維持するためにアンモニアを自動的に供給し、８０〜１００ＯＤ５５０の細胞密度に依存してわずかな過剰を維持または嫌気生活を回避するためにグルコースも供給した。回収時の細胞密度は、通常、１２０〜１５０ＯＤ５５０である。
【０１１６】
２１．エルマン（G. L. Ellman）、Arch. Biochem.Biophys. ８２：７０（１９５９）
２３．ブレナンら、Science ２２９：８１（１９８５）
２４．ラモイ（E, Lamoyi）ら、Methods Enzymol. １２１：６５２（１９８６）
２５．クレイトン（T. E. Creighton）、タンパク質構造、実際的アプローチ（ＩＲＬプレス、オックスフォード、英国、１９９０）、１５７頁
２６．マツダイラ（P. Matsudaira）、J. Biol Chem. ２６２：１００３５（１９８７）
２７．ムア（S. Moore）およびスタイン（W. H. Stein）、Methods Enzymol. ６：８１９（１９６３）
３２．グレニー（Ｍ.Ｊ.Glennie）ら、Ｊ.Immunol. １３９：２３６７（１９８７）；グレニーら、Ｊ.Immunol. １４１：３６６２（１９８８）
３３．ニッタ（Ｔ.Nitta）ら、Ｊ.Immunol. １９：１４３７（１９８９）；ニッタら、Lancet ３３５：３６８（１９９０）
３４．カーターおよびウエルズ、Science ２３７：３９４（１９８７）
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】大腸菌からｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８κＬ鎖およびＨ鎖Ｆｄ'フラグメントを共分泌するのに使用するプラスミドｐＡ１９を示す。
【図２】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８のＦａｂ、Ｆａｂ'およびＦ(ａｂ')２（Ｃys Ａla Ａla変種）フラグメントの精製を示す。
【図１】
2006001943.tif 000002
【図２】
2006001943.tif 000003