(57)【要約】本発明は、抗腫瘍に用いることができる、肺特異的Ｘタンパク質と結合可能な抗体または抗体断片、およびその用途を提供する。また、前記抗体または抗体断片は、重鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６とを含み、または、重鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む。前記抗体はキメラ抗体である。【選択図】図１
2019528049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６とを含み、
または、重鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む、
ことを特徴とする肺特異的Ｘタンパク質と結合可能な抗体または抗体断片。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示すアミノ酸配列と結合することができる請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項３】
前記抗体または抗体断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示し、
および／または前記抗体または抗体断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示す請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
前記抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片および薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含む、試料中の肺特異的Ｘタンパク質を測定するためのキット。
【請求項７】
試料中の肺特異的Ｘタンパク質を測定するための試薬の製造における請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の用途。
【請求項８】
肺癌細胞、好ましくは非小細胞肺癌細胞である癌細胞を阻害するための薬物の製造における請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の用途。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む組み換えベクターまたは形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体の分野に関し、具体的に肺特異的Ｘタンパク質と結合可能な抗体または抗体断片、およびその用途に関する。  
【背景技術】
【０００２】
２１世紀以降、急速な発展の抗体療法は悪性腫瘍の治療において最も成功と最も重要な戦略の一つとなっている。モノクローナル抗体は、高い特異性と低毒性のため、分子標的治療研究の焦点となっている。臨床実践において、モノクローナル抗体の顕著な有効性は、癌治療を前例のない新しい段階に入れさせたことを示した。
【０００３】
肺癌は近年最も高い発生率と死亡率の悪性腫瘍の一つであり、その５年生存率はわずか１３％しかなく、したがって、急務としては効果的な肺癌の生物学的治療標的をさがすことであり、肺癌を標的としたモノクローナル抗体薬物治療に有利する。現在、臨床において、肺癌は主に小細胞肺癌と非小細胞肺癌に分けられ、そのうち８５％以上のは非小細胞肺癌である。肺特異的Ｘタンパク質（ＬｕｎＸ）のｍＲＮＡは肺癌診断のための特異的バイオマーカーとして使用してもよく、非小細胞肺癌の表面に主に発現し、かつ陽性率が９０％に達していることを多数の研究が確認した。まだ、ＬｕｎＸタンパク質の発現が高ければ高いほど、患者がより悪い病理段階、より低い分化状態および生存期間を呈することを発見した。また、正常肺末梢組織、乳腺、肝臓、卵巣等の他の臓器ではいずれもＬｕｎＸの発現が検出されなかった（Ｘｉａｏｈｕ  Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；７５（６）；  １０８０−９０．２０１５  ＡＡＣＲ；  Ｌｙｎｎｅ  Ｂｉｎｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ；  ２００５；  ２０５：  ４９１−４９７）。
【０００４】
肺特異Ｘ蛋白ＬｕｎＸはＰＬＵＮＣ族に属しており、その遺伝子は、Ｉｗａｏ研究チームが２００１年に、人体１３種類の異なる組織から分離されたＲＮＡに対しディファレンシャルディスプレイを用いて発見されたヒト肺組織特異的Ｘタンパク質である。遺伝子は２０ｐ１１．ｌｑｌ２に位置され、全長で１０１５ｂｐであり、２５６個のアミノ酸をコードする７６８個のヌクレオチド酸のオープンリーディングフレームを含む。
【０００５】
ＬｕｎＸが肺癌における過剰発見の機能については、主にＬｕｎＸが腫瘍細胞の増殖、移転および浸潤を促進し、ＬｕｎＸに対する標的妨害が明らかに腫瘍の発生と発展を阻害できることを実証した。ＬｕｎＸは腫瘍関連タンパク質１４‐３‐３に作用し、１４‐３‐３を促進することによって活性化のホモ二量体または異質二量体を形成し、さらに、下流のＥｒｋｌ／２とＪＮＫ信号通路を活性化し、最終的に腫瘍細胞の増殖と移転を引き起こす（Ｘｉａｏｈｕ  Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；７５（６））。
【０００６】
したがって、ＬｕｎＸへの標的抗体は、肺癌治療のための潜在的な薬剤である可能性がある。マウス由来モノクローナル抗体は、ヒトに応用されると、強い免疫原性を生成し、異種タンパク質に対する拒絶反応を引き起こすことができ、ヒト抗マウス抗体（Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ＨＡＭＡ）反応をもたらすことが報告されている。繰り返し使用すると患者のアレルギーショックにつながる可能性があり、その他の副作用もマウス由来抗体の体内での迅速な除去、心臓毒性及び迅速薬物耐性等に反映される。これに鑑みて、抗体工学技術を利用して抗体の構造を改造し、動物由来モノクローナル抗体をヒト化し（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）、その免疫原性を低下させるとともに、抗体の特異性を確保することができる。
【０００７】
現在、腫瘍標的抗原へのモノクローナル抗体は、２つのメカニズムを介して抗腫瘍作用を果たすことができる。一つは、抗体が腫瘍細胞表面の抗原に結合した後、抗原の活性化形態または抗原の分解を変化させ、さらに対応する下流癌促進シグナル経路の活性化を阻止し、最終的に腫瘍細胞の増殖と転移を阻害する直接的なメカニズムである。もう一つは、抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，  ＡＤＣＣ）、および補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，  ＣＤＣ）を含む、主に免疫反応の活性化を介して実現される間接的なメカニズムである。より良い抗腫瘍効果を得るためには、抗腫瘍薬は、上記の多種のメカニズムを介して抗腫瘍作用を発揮できることが期待されている。したがって、多種の抗腫瘍メカニズムを仲介できる抗ＬｕｎＸ抗体を開発することが特に必要である。  
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服し、多種の抗腫瘍メカニズムを仲介できる抗体または抗体断片およびその用途を提供することである。
【０００９】
上記の目的を達成するために、第１の態様において、本発明は、重鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６とを含み、
または、重鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む、肺特異的Ｘタンパク質と結合可能な抗体または抗体断片を提供する。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、第１の態様に記載の抗体または抗体断片および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、第１の態様に記載の抗体または抗体断片を含む、試料中の肺特異的Ｘタンパク質を測定するためのキットを提供する。
【００１２】
第４態様において、本発明は、試料中の肺特異的Ｘタンパク質を測定するための試薬の製造における第１の態様に記載の抗体または抗体断片の用途を提供する。
【００１３】
第５態様において、本発明は、癌細胞を阻害するための薬物の製造における第１の態様に記載の抗体または抗体断片の用途を提供する。
【００１４】
第６態様において、本発明は、第１の態様に記載の抗体または抗体断片をコードする核酸を提供する。
【００１５】
第７態様において、本発明は、第６の態様に記載の核酸を含む組み換えベクターまたは形質転換体を提供する。
【００１６】
上述の技術方案により、本発明の抗体又は抗体断片は、多種の抗腫瘍メカニズムを仲介し、抗腫瘍効果が良好である。それに、本発明者らは、さらに抗体又は抗体断片をヒト化し、得たキメラ抗体またはヒト化抗体または抗体断片の特異性および抗腫瘍活性が依然として良好なレベルに維持されている。
【００１７】
本発明の他の特徴と利点は、その後の具体的な実施例で詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
附図は、本発明に対するさらなる理解を提供するものであり、かつ説明書の一部を構成し、以下の具体的な実施形態と共に本発明の解釈に用いるためのものであって、本発明を限定するものではない。附図において、
【図１】本発明の一つの実施形態におけるキメラ抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す図である。
【図２】本発明の一つの実施形態におけるキメラ抗体が肺癌細胞表面のＬｕｎＸ蛋白と結合する活性化の結果を示す図である。
【図３】本フローサイトメトリーでキメラ抗体の抗体依存性細胞傷害を検出する結果を示す図である。
【図４】本本発明の一つの実施形態におけるキメラ抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖活性化を阻害した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明する。ここに説明される具体的な実施形態は、本発明の説明や解釈のみに用いるためのものであって、本発明を限定するものではないと理解すべきである。
【００２０】
本文に開示された範囲内の端点と如何なる値は、いずれも該精確な範囲または値に限らず、これらの範囲または値は、これらの範囲または値に近い値を含むことと理解すべきである。データ範囲内について、それぞれ範囲の端点値の間、各範囲の端点値と単独の点値の間、及び単独での点値の間において、互いに組合せることにより１つまたは複数の新規数値範囲を得、これらの数値範囲は本文で具体的に開示されたと見なすべきである。
【００２１】
本発明において、逆の説明がない場合、用語「抗体断片」とは、一般的に、抗原結合性抗体断片と指し、完全な抗体の一部を含むことができ、通常、抗原結合領域または可変領域であって、抗体断片の実例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ、二重抗体、線状抗体、単鎖抗体分子等を含む。
【００２２】
用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲアミノ酸配列」または「ＣＤＲ配列」とは、抗体における抗原結合性アミノ酸配列と指し、例えば、軽鎖可変領域中の２３−３４（Ｌｌ）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）に近接するアミノ酸残基と、重鎖可変領域中の３１−３５Ｂ（Ｈｌ）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）に近接するアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．（ｌ９９１））、および／または「高度可変ループ」（例えば、軽鎖可変領域中の２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）に近接するアミノ酸残基と、重鎖可変領域中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）に近接するアミノ酸残基（Ｃｈｏｔｈｉａ  とＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．  １９６：  ９０１−９１７（１９８７））に由来するものを含む。
【００２３】
本発明が提供された肺特異的Ｘタンパク質と結合可能な抗体または抗体断片は、重鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（Ｎ末端からＣ末端）と、軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（Ｎ末端からＣ末端）とを含み、
または、重鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（Ｎ末端からＣ末端）と、の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（Ｎ末端からＣ末端）を含む。
【００２４】
本発明において、前記抗体または抗体断片は、肺特異的なＸタンパク質（抗原）に、特に以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示すアミノ酸配列に結合することができる。好ましくは、本発明の抗体または抗体断片と肺特異的Ｘタンパク質との親和定数（Ｋ）は、８×１０８以上である。用語「親和定数」は、抗原と抗体との結合の緊密な程度を示す。競合ＥＬＩＳＥ法によって測定して得ることができ、計算式はＫ＝１／Ｋｄ且つＡ０／（Ａ０−Ａ）＝１＋Ｋｄ／ａ０であって、式中、Ａ０は競争抗原が０であるときのＯＤ値、Ａは各抗原濃度のＯＤ値、ａ０は抗原の総量、Ｋｄは解離定数である。
MNNIIDIKVT DPQLLELGLV QSPDGHRLYV TIPLGIKLQV NTPLVGASLL RLAVKLDITA    60
EILAVRDKQE RIHLVLGDCT HSPGSLQISL LDGLGPLPIQ GLLDSLTGIL NKVLPELVQG   120
NVCPLVNEVL RGLDITLVHD IVNMLIHGLQ FVIKV                              155(SEQ ID NO:9)
【００２５】
本発明の好ましい実施例において、前記抗体または抗体断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示す。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記抗体または抗体断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示す。前述のように（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）、前記抗体または抗体断片の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の９７番目のアスパラギン酸残基（Ｄ）をグルタミン酸残基（Ｅ）に置き換えた後のアミノ酸配列に示してもよく、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の９７番目のグルタミン酸残基（Ｅ）をアスパラギン酸残基（Ｄ）に置き換えた後のアミノ酸配列に示してもよい。
【００２７】
本発明の最も好ましい実施形態によれば、前記抗体または抗体断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示し、且つ軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示す；または、前記抗体または抗体断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示し、且つ軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示す。
【００２８】
本発明の好ましい実施例において、抗体の生物学的受容性をさらに向上させるために、抗体をヒト化してもよい。すなわち、前記抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である。用語「キメラ抗体」とは、組み換えＤＮＡ技術を使用し、１つの物種（例えばマウス）に由来するモノクローナル抗体の定常領域のアミノ酸配列を、他の物種（例えばヒト）に由来する抗体の定常領域（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示す核酸でコードする）に置換することによって得られた組み換え抗体を指す。用語「ヒト化抗体」とは、組み換えＤＮＡ技術を使用し、１つの物種（例えばマウス）に由来するモノクローナル抗体の定常領域と可変領域の非ＣＤＲ（Ｆｖフレームワーク領域（ＦＲ））アミノ酸配列の全部を、他の物種（例えばヒト）に由来する抗体の定常領域と可変領域の非ＣＤＲアミノ酸配列に置換することによって得られた組み換え抗体を指す。即ち、抗体の定常領域はヒト化されたときにキメラ抗体と呼ばれ、定常領域と可変領域の非ＣＤＲアミノ酸配列はすべてヒト化された後にヒト化抗体と呼ばれている。ヒト化の方法は通常の抗体工学技術を参照すればよいが、ここではもう贅言しない。
【００２９】
例えば、本発明によって提供されるキメラ抗体のアミノ酸配列は、下記のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示すことができる。
DIVVTQSPAA LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSGYTYMHWY QQKPGQPPKL LIYLASKLES       60
GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRDLTF GSGTKLEIKR AGGGGSGGGG      120
SGGGGSQVQL QQSGPELVKP GASVKISCKT SGYAFSRSWM SWVKQRPGQG LEWIGRIYPG      180
DGDTKYSGKF EGKATLTADK SSSTAYMQLS SLTSVDSAVY FCARSGGIQG YGMDYWGQGT      240
SVTVSSEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE      300
DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP      360
APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN      420
NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK        478(SEQ ID NO:18)
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TAGYSYMHWY QQKPGQTPKL LIYLASKLES       60
GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELTF GSGTKLEIKR AGGGGSGGGG      120
SGGGGSQVQL QQSGPELVKP GASVKISCKT SGYAFSRSWM SWVKQRPGQG LEWIGRIYPG      180
DGDTNYNGKF KGKATLTADK SSSTAYMQLS SLTSVDSAVY FCARSGGIQG YGMDYWGQGT      240
SVTVSSEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE      300
DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP      360
APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN      420
NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK        478(SEQ ID NO:19)
【００３０】
本発明によって提供される組成物は、上記の抗体または抗体断片および薬学的に許容可能な担体を含む。
【００３１】
用語「薬学的に許容可能な」は、組成物が被験者に投与することができるが、組成物投与に妨害する望ましくない生理反応を生じないことを示している。例えば、「薬学的に許容可能な担体」とは、一般的な安全性、非毒性、および使用可能な医薬組成物を製造するための有用担体を指す。好ましくは、これらの担体または希釈剤の例としては、水、塩水、リンゲル液、グルコース溶液および５％のヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。これらの担体または希釈剤は不揮発性油等のリポソームおよび非水性媒体を使用することもできる。
【００３２】
本発明の組成物は、互いに組合せて、または１つ以上の他の治療化合物と組合せて投与することもでき、例えば化学療法剤と組合せて投与する。したがって、前記組成物は、まだ、化学療法剤を含むことができる。
【００３３】
前記抗体または抗体断片は、通常、治療有効量で投与されると、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分である。例えば、治療される疾患に関連して引き起こした症状を予防または軽減する量であり、前記疾患は肺特異的Ｘタンパク質に係る疾患である。被験者に組成物を投与する治療有効量は、疾患のタイプおよび重症度、並びに一般的な健康状況、年齢、性別、体重、および薬剤耐性ような個人の特性に応じて変化する。まだ、疾患の重症度およびタイプに応じて変化し、本分野の技術者はこれらの要因に応じて適切な投与量を確定することができる。
【００３４】
本発明によって提供される試料中の肺特異的Ｘタンパク質を測定するためのキットは、上記の抗体または抗体断片を含む。前記試料は、肺組織または鎖骨下リンパ組織等の癌患者（特に肺癌患者、より好ましくは非小細胞肺癌患者である）の組織であってもよい。前記キットは、また、コーティング液（ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）等の肺特異的Ｘタンパク質を測定するための一般的な試薬を含むこともできる。
【００３５】
本発明は、また、試料中の肺特異的Ｘタンパク質を測定するための試薬の製造における上述の抗体または抗体断片の用途を提供する。上述で述べたように、前記試料は、肺組織または鎖骨下リンパ組織等の癌患者（特に肺癌患者、より好ましくは非小細胞肺癌患者である）の組織であってもよい。本発明の抗体または抗体断片は、肺特異的Ｘタンパク質と良好な親和性を有し、試料中の肺特異的Ｘタンパク質を効果的に測定することができる。
【００３６】
本発明は、また、癌細胞を阻害するための薬物の製造における上述の抗体または抗体断片の用途を提供する。前記癌細胞は、好ましくは肺癌細胞であり、より好ましくは非小細胞肺癌細胞である。
【００３７】
また、本発明はまた、癌細胞を生体外で阻害する方法に関し、該方法は、有効量の癌細胞（前述のように）を本発明の抗体または抗体断片または組成物と接触させることを含む。
【００３８】
また、本発明はまた、患者体内での癌細胞（前述のように）を阻害する方法に関し、該方法は、治療有効量の本発明の抗体または抗体断片または組成物を患者に投与することを含む。そのうち、投与方法は静脈内投与および／または腹腔内投与であってもよい。
【００３９】
用語「阻害」は、癌細胞の増殖、成長および／または転移を阻害することを含む。本発明に関する「患者」または「被験者」は、一般的に霊長類動物および／または齧歯類動物、特にヒトやマウスなどの哺乳類動物を指す。
【００４０】
本発明はまた、上記の抗体または抗体断片をコードする（分離的）核酸と、該核酸を含む組み換えベクターおよび形質転換体を提供する。前記核酸は、好ましくは遺伝子工学手段によって得られる発現カセットである。
【００４１】
本発明の抗体または抗体断片の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸は、本発明の範囲内にあり、重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列によって、本分野の技術者は相応する核酸配列を容易に得ることができる。例えば、抗体または抗体断片の重鎖をコードする核酸の塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示し、抗体または抗体断片の軽鎖をコードする核酸の塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す。
【００４２】
組み換えベクターはクローニングベクターであってもよく、発現ベクターであってもよい。組み換えベクターは、前記核酸を市販から購入されたベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）と操作可能な接続をすることによって得られ、一般的に使用されるプラスミドはｐＳｅＴａｇ２、ＰＥＥ１４、ｐＭＨ３などを含む。
【００４３】
形質転換体は、上記核酸または組み換えベクターを宿主細胞に形質転換することによって得ることができ、前記宿主細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ等の一般的に使用されるさまざまな細胞であることができる。
【００４４】
以下、実施例を使用して本発明を詳細に説明する。実施例または測定例では、具体的な条件を明記しない実験方法については、いずれも通常の条件によって行われる。
実施例１
（Ｉ）抗ＬｕｎＸモノクローナル抗体の製造
【００４５】
従来のハイブリドーマ細胞融合技術（Ｓｔ  Ｇｒｏｔｈ  とＳｈｅｉｄｅｇｇｅｒ  １９８０，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１；  Ｋｏｈｌｅｒ  とＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：５１１−５１９；  Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ  ２００７，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７８：１−１３）を参照し、少し調整後に抗ＬｕｎＸモノクローナル抗体を製造し、詳細は以下の通りである。そしてさらに分析するために、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）において高い結合活性を持つモノクローナル抗体を選択した。
（１）免疫及び結合確認に用いられる組み換えＬｕｎＸタンパク質
【００４６】
ＬｕｎＸフルレングス遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＮＭ＿０１６５８３．３）を人工的に合成した。ＰＣＲによって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９に示す抗原断片を増幅し、ターゲット配列のＣ端において、６Ｈｉｓ−Ｔａｇと停止コドンを順次に導入し、且つｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローンし、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）コンピテント菌（Ｎｏｖａｇｅｎ社、製品番号７０９５４−３）に導入し、ＬｕｎＸ原核組み換え融合タンパク質の発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＬｕｎＸ（ＬｕｎＸ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＥＴ２２ｂ−ＬｕｎＸ）を生じた。選択したモノクローナルコロニーをＬＢ培地に接種し、３７℃のシェーカーで２００  ｍｍ／ｍｉｎでＯＤ  ６００  ｎｍ＝０．６〜０．８まで培養した時に、ｌｍＭイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えて、４−６時間を継続的に培養しタンパク質の発現を誘導した。４℃と６０００  ｇで１０分間遠心分離して菌を収集し、沈殿物は、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  、１００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ８．５）で洗浄した後、高圧圧砕によって細胞崩解した。細胞崩解後の混合物をニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ターゲットタンパク質を異なる濃度のイミダゾールで溶出し、１００ｍＭのイミダゾール溶出液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００  ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール、ｐＨ９）において所定純度の組み換えターゲットタンパク質を得て、さらに、分子篩クロマトグラフィー法（Ｓ−２００）により精製して、純度が９０％より大きく、濃度がｌｍｇ／ｍｌのターゲット組み換えタンパク質を得た。質量分析法により、ターゲットタンパク質のペプチドがＬｕｎＸ配列と一致することで、該組み換えタンパク質が組み換えＬｕｎＸタンパク質であることを証明した。
【００４７】
（2） 動物免疫、ハイブリドーマ細胞融合およびクローンスクリーニング
ＬｕｎＸタンパク質は、等体積の完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）と十分に混合し、８−１０週の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣから購入、体重約２０ｇ）を初回免疫付与し、マウス当たりに腹腔内に４０〜６０μｇのＬｕｎＸタンパク質を注入した。あと２週間に１回免疫付与し、同じ量のＬｕｎＸタンパク質は、等体積の不完全フロインドアジュバンと混合し、計５回の免疫付与後、ＥＬＩＳＡ測定法により測定したマウス血清力価は１：１０５以上であった時に、最後に４０〜６０μｇのＬｕｎＸタンパク質を注射して強化した。強化後第３日目において、標準技術（Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，  １９７７  Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，３：２３１−２３６）を使って脾臓の細胞を分離し、そしてマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８０）と融合した。ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳの両者での評価がいずれも陽性シグナルを示すハイブリドーマ細胞をサブクローン化し、スクリーニングして２株のハイブリドーマ細胞Ａｂ２とＡｂ１を得た。
【００４８】
（3） モノクローナル抗体の発現と精製
モノクローナル抗体はマウス腹腔内接種法により作製した。まず、５００μｌの無菌性液体パラフィンを腹腔内にて８−１０週のＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫付与し、１週間後にｌ×１０６ハイブリドーマ細胞を腹腔注射し、第７−１０日目に腹水を収集し、高速遠心分離して上澄液を回収した。上述の方法によって得られた抗体を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製し、精製された２種のモノクローナル抗体（ＰｒＡｂ２とＰｒＡｂ１）は、純度が９０％より大きく、抗体の重鎖は約４５ｋＤａ、軽鎖は約２５ｋＤａである。
（II）抗ＬｕｎＸモノクローナル抗体の可変領域配列
【００４９】
候補ハイブリドーマ細胞の総数を１０６に培養し、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を収集し、またＴｒｉｚｏｌキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡをテンプレートとして使用し、逆転写によりｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を合成し、ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲによりハイブリドーマ細胞の対応する可変領域核酸配列を増幅した。ＰＣＲ増幅反応に使用されるプライマー配列は、抗体可変領域の第１フレームワーク領域またはシグナルペプチド領域および定常領域と相補する（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，１２１−１２８とＣｏｌｏｍａ，Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １１，  １５２−１５６）。５０μｌの反応システムにおいて、ｃＤＮＡ  ２μｌ、１０×ＰＣＲバッファ  ５μｌ、上流および下流プライマー  ２μｌ（５μｍｏｌ）、ｄＮＴＰ  ２μｌ、Ｔａｑ酵素  １μｌ（Ｉ（Ｔａｋａｒａ，Ｅｘ  Ｔａｑ）、Ｈ２Ｏ  ３８μ１をそれぞれ加え、９５℃での５分間初期変性し、温度サイクルに入ってＰＣＲ増幅を行った。反応条件としては、９４℃で３０秒間の変性、５８℃で４５秒間のアニーリングおよび７２℃で５０秒間の伸長による３２サイクルと、それに続く最終的な７２℃での７分間の伸長であった。増幅産物の配列を測定した後、得られたハイブリドーマ細胞Ａｂ２とＡｂ１の重鎖および軽鎖の可変領域の配列（アミノ酸配列と核酸配列を含む）は下記の表１に示しているが、表１に記載の配列において、太字且つ下線で表記するのはＣＤＲアミノ酸配列である。
【００５０】
【表１】
2019528049.tif 000003
（III）キメラ抗体とｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターの構築
【００５１】
ヒト血液細胞（安徽血液センター）から重鎖定常領域におけるＦｃ断片の定常領域（核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１に示す）をクローンし、ＤＮＡ組み換え技術とアンカーＰＣＲ（ａｎｃｈｏｒｅｄ  ＰＣＲ）技術を通して、順次に軽鎖、結合配列（（ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣ）３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２）、重鎖、Ｆｃ断片を接続してｓｃＦｖ−Ｆｃ断片を形成し、しかもｓｃＦｖ−Ｆｃの両端に二重制限酵素切断部位を導入し、相応する二重制限酵素切断プラスミドをクローンし、ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターを得た。そして配列測定によりクローンＤＮＡの配列を確定した。その後の実験材料は、これらのプラスミドで細胞をトランスフェクションした後、精製によりキメラ抗体ＣｈＡｂ２とＣｈＡｂｌを得た。
測定例１
【００５２】
（Ｉ）キメラ抗体のＬｕｎＸ結合活性（ＥＬＩＳＡ）
実施例１で構築されたキメラ抗体は、ヒトＬｕｎＸタンパク質と高い特異性と強さで結合し、このＬｕｎＸタンパク質は、実施例１に記載の組み換えタンパク質である。実施例１で構築されたキメラ抗体に対してＥＬＩＳＡ分析を行った。すなわち、コーティング液（Ｏ．１Ｍ炭酸塩バッファーｐＨ９．６）で組み換えＬｕｎＸタンパク質を１０μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／穴で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一晩かけた後にＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ  ｐＨ７．４）で３回洗浄して、１．０％  ＢＳＡ中にブロックし、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳＴで３回洗浄し、それぞれに倍の希釈後のキメラ抗体を添加し、４つの段差を設定し、ＩｇＧをネガティブコントロールして、ＰＢＳをゼロホールに設けて、１００μｌ／穴に３７℃で１時間培養した。ＰＢＳＴで３回洗浄し、各穴には１００μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ネズミ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｏｓｔｅｒ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．，  １：１０００希釈）を加え、３７℃で１時間培養した。洗浄後、各穴には１００μｌのＴＭＢ基質溶液を加え、暗所で１０〜１５分間顕色させ、各穴には１００μｌの終了液（１ＭのＨＣＬ）を入れ、終了直後にＥＬＩＳＡリーダーで検出し、波長４５０  ｎｍの光吸収値（ＯＤ  ４５０）及び６３０  ｎｍの光吸収値（ＯＤ  ６３０）を読み取り、△ＯＤ４５０＝ＯＤ４５０−ＯＤ６３０で算出し、結果は図１に示す。
【００５３】
図１のＥＬＩＳＡ結果に示すように、キメラ抗体ＣｈＡｂ２とＣｈＡｂ１は、特異的にＬｕｎＸタンパク質と結合することができる。
【００５４】
（II）キメラ抗体の肺癌細胞表面のＬｕｎＸタンパク質と結合する活性（フローサイトメトリー）
新鮮な肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２（上海中国科学院細胞バンクから購入）を取って２組に分けて、１組はキメラ抗体を標記し、別の組はヒトＩｇＧ（対照）を標記した。また、それぞれ抗ヒトＩｇＧのＦＩＴＣマークのマウス抗ヒトＩｇＧ抗体を更に標記し、毎度の抗体マークの条件としては、４０℃で３０分間培養し、３５０ｇ、５分間での遠心分離によって細胞を収集し、ｌ×ＰＢＳで３回洗浄する。フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標））で検出された結果を図２に示した。キメラ抗体ＣｈＡｂ１は、生きている肺癌細胞表面のＬｕｎＸタンパク質と結合できることを示した。似たように、フローサイトメトリー検出結果、キメラ抗体ＣｈＡｂ２は生きている肺癌細胞表面のＬｕｎＸタンパク質と結合できることが示された。
【００５５】
（III）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
Ｆｉｃｏｌｌ（末梢血リンパ球分離液，Ｓｏｌａｒｂｉｏ社製）遠心分離法を使用し、３８０ｇで３０分間、正常のヒトの末梢血からリンパ球を分離し、ｌ×ＰＢＳで再懸濁した。次にＮＫ細胞選別キット（Ｍｉｎｎｉｅ、Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてＮＫ細胞を精製した。ＮＫを奏効細胞として、肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２（中国科学院上海細胞バンク）を標的細胞として、奏効細胞：標的細胞＝２０：１に従って、３７℃で４時間共培養・殺害の実験を行った。その共培養システムにおいて、それぞれＩｇＧ（１０μｇ）、ＰｒＡｂ１（１０μｇ）、ＣｈＡｂ１（１μｇ）、ＣｈＡｂ１（１０μｇ）を加え、本発明のキメラ抗体が、ＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果を仲介するかどうかを検討した。図３に示したように、７ＡＡＤを用いて殺傷された腫瘍細胞を検出し、その結果、キメラ抗体ＣｈＡｂ１はＡＤＣＣ効果を仲介することができ、そして用量依存性を有することが示された。似たように、細胞媒介細胞毒性効果分析結果、キメラ抗体ＣｈＡｂ２はＡＤＣＣ効果を仲介することができ、且つ用量依存性を有することが示された。
【００５６】
（IV）キメラ抗体の腫瘍生体内増殖阻害の活性
ＮＣＩ−Ｈ２９２とＡ５４９細胞（上海中国科学院細胞バンク）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖し、細胞を収集して、且つｌ×ＰＢＳで１回洗浄し、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を収集し、生理食塩水で再懸濁し、６−７週のヌードマウスの腋に濃度２×１０７個／ｍｌの細胞液を２００μｌ皮下注射し、合計２４匹接種した。一週後、ＮＣＩ−Ｈ２９２とＡ５４９細胞を接種したマウスをそれぞれ抗体群とＩｇＧ群の２組に分けて、群あたりに６匹があり、２０ｍｇ／ｋｇ（マウスのキログラムあたり２０ｍｇの抗体）を１日おきに尾静脈内に注射し、１０回の治療を行った。また、皮下腫瘍の長辺と短辺を測定し、重さを量った。経験式（腫瘍サイズ＝長辺×短辺×短辺／２）によれば、腫瘍サイズを検出することができ、結果は図４（そのうち、図４ＡはＡ５４９細胞を接種したマウスの腫瘍大きさの測定結果であり、図４ＢはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を接種したマウスの腫瘍重さの測定結果である）に示した。その結果、キメラ抗体ＣｈＡｂ１は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を阻害することができ、そして最初に得られたマウス抗体ＰｒＡｂ１に比べてより強い阻害の活性を持つことが示された。似たように、生体内活性試験の結果、キメラ抗体ＣｈＡｂ２はｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を阻害する活性を持つことも示された。
【００５７】
測定結果から見ると、本発明によって得られたキメラ抗体は、特異性と抗腫瘍活性が比較的よい。
【００５８】
以上、本発明の好適な実施形態を詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に述べた細かい内容に限定されるものではなく、本発明の技術的発想の範囲内で、本発明の技術方案に対して様々な簡単な変更を行うことができる、それらの簡単な変更はいずれも本発明の保護の範囲に属している。
【００５９】
他に説明する必要がある。即ち、上記の具体的な実施形態に記載される個々の具体的な技術的特徴は、矛盾がなければ、任意の適切な方法で組み合わせることができる。不要な重複を避けるために、種々の組み合わせ方法については、別途説明しない。
【００６０】
また、本発明の種々の実施形態は任意に組み合わせることができるが、本発明の思想に反しない限り、本発明に開示した内容と同じであるとみなされるべきである。
【図１】
2019528049.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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