【手続補正書】
【提出日】平成19年7月18日(2007.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  新規ワクチン
【特許請求の範囲】
【請求項１】  インフルエンザに対する１用量鼻腔内ワクチン接種のためのワクチン処方物の製造における非生スプリット・インフルエンザウイルス抗原調製物の使用であって、当該１用量ワクチン接種が、当該ワクチン中に存在する全てのインフルエンザ株に関して以下の基準：
（ｉ）ヒト成人集団（18〜60歳）に関して40％以上の、又はヒト老人集団（60歳超）において30％以上のセロコンバージョン率；
（ｉｉ）ヒト成人集団（18〜60歳）に関して70％以上の、又はヒト老人集団（60歳超）において60％以上の血清防御率；及び
（ｉｉｉ）ヒト成人集団（18〜60歳）に関して2.5以上の、又はヒト老人集団（60歳超）において2.0以上のコンバージョン因子；
の内の少なくとも２つを達成する前記使用。
【請求項２】  請求項１に記載の３つの欧州連合判定基準の全てが、前記ワクチン中に提示されるインフルエンザの全ての菌株に関して満たされる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】  前記処方物が少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】  前記界面活性剤が、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（例えば市販のトリトン（商標）シリーズからのもの）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（トゥイーン（商標）シリーズ）、並びに以下の一般式（Ｉ）：
（Ｉ）  ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
（式中、ｎは1〜50であり、Ａは単結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキル又はフェニルＣ１−５０アルキルである）で表される
ポリオキシエチレンエーテル又はエステル、並びにこれらの内の２つ又はそれ以上の組合せから成る群から選択される少なくとも１つの非イオン性界面活性剤である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】  前記非イオン性界面活性剤がｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−100）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80）及びラウレス９あるいはこれらの内の２つまたはそれ以上の組合せから成る群から選択される少なくとも１つの界面活性剤である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】  前記ワクチンが、前記３つの非イオン性界面活性剤の内の２つ、即ちポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80）及びｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−100）の組合せを含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】  前記ワクチンが３つすべての非イオン性界面活性剤の組合せを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】  前記ワクチンが、胆汁酸又はコール酸あるいはそれらの誘導体、例えばナトリウムデオキシコレートをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】  前記ワクチン処方物の各用量が低用量の血球凝集素を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】  インフルエンザ株当たりの血球凝集素含量が30μg／用量又はそれ以下である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】  インフルエンザ株当たりの血球凝集素含量が15μg／用量又はそれ以下である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】  前記血球凝集素含量が7.5μg又はそれ以下の血球凝集素／ウイルス株／ワクチン用量である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】  前記ワクチン処方物が500μl未満の容積／用量で存在する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】  前記容積／用量が300μl未満又は200μl／用量以下である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】  前記ワクチンが２サブ用量の２用量フォーマットでデリバリーされる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】  前記ワクチンが付加免疫刺激剤を含有しない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】  前記ワクチンが、好ましくはモノホスホリルリピドＡ及びジホスホリルリピドＡの非毒性誘導体から選択されるリピドＡの非毒性誘導体をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】  前記ワクチンが３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】  前記ワクチンが３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）及びラウレス９を含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】  鼻腔内デリバリーデバイス、及び付加的免疫刺激剤を含有せずに非生スプリットインフルエンザウイルス抗原調製物を含む１用量ワクチンを包含する薬剤キットであって、当該ワクチン中に存在する全てのインフルエンザ株に関して請求項１に記載の基準の内の少なくとも２つを達成する免疫応答を生じさせる前記キット。
【請求項２１】  鼻腔内デリバリーデバイス、及び当該ワクチン中に存在する全てのインフルエンザ株に関して請求項１に記載の基準の内の少なくとも２つを達成する免疫応答を生じる１用量スプリットインフルエンザワクチンを含む薬剤キット。
【請求項２２】  鼻腔内デリバリーデバイス、及び低ＨＡ用量の、ワクチン中に存在する全てのインフルエンザ株に関して請求項１に記載の基準の内の少なくとも２つを達成する免疫応答を生じさせる非生スプリットインフルエンザウイルス抗原調製物を含む１用量ワクチンを含む薬剤キット。
【請求項２３】  前記デバイスが１回投与で２サブ用量をデリバリーするための２用量デリバリーデバイスである、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の薬剤キット。
【請求項２４】  前記デバイスが鼻腔内噴霧デバイスである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の薬剤キット。
【請求項２５】  鼻適用のための１用量インフルエンザワクチンの製造方法であって、以下の：
（ｉ）慣用的注射インフルエンザワクチンに関するのと本質的に同様に生成され、かつ、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤を含むスプリットインフルエンザウイルス調製物を提供し、
（ｉｉ）任意に、上記調製物中の血球凝集素の濃度及び／又は非イオン性界面活性剤の濃度を調整し、
（ｉｉｉ）上記スプリットインフルエンザウイルス調製物からのワクチン用量であって、任意に２用量フォーマットでの鼻腔内投与に適した容積である用量を鼻腔内デリバリーデバイスに充填する、ここで、１用量適用は、当該ワクチン中に存在する全てのインフルエンザ株に関して請求項１に記載の基準の内の少なくとも２つの達成する免疫応答を生じさせる、を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規の非生スプリットインフルエンザワクチン処方物、それらの製造方法、ならびに予防または治療におけるそれらの仕様に関する。特に本発明は、粘膜への投与のための、特に鼻腔投与のためのワクチンに関する。特に本発明は、単一用量で鼻腔内投与されて、規定要件を満たすのに十分な免疫応答を達成し得る非生スプリットインフルエンザワクチンの使用に関する。
【０００２】
インフルエンザウイルスは、世界中に存在する最も遍在的ウイルスの１つであって、人および家畜類の両方に影響を及ぼす。インフルエンザの経済的影響は、有意である。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、直径約125 nmの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープ化ウイルスである。それは基本的には、脂質二層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた核タンパク質に関連した内部ヌクレオキャプシドまたはリボ核酸（ＲＮＡ）のコア、ならびに外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は主に宿主由来脂質物質で構成される。表面糖タンパク質ノイラミニダーゼ（ＮＡ）および血球凝集素（ＨＡ）は、粒子の表面で10〜12 nm長のスパイクのように見える。インフルエンザサブタイプの抗原特異性を確定するのは、これらの表面タンパク質、特に血球凝集素である。
【０００４】
典型的インフルエンザ流行は、入院または死亡率の増大により照明されるように、肺炎の発生率の増大を引き起こし、呼吸器疾患を低下させる。高齢者または根元的慢性疾患を有する者はこのような合併症にかかり易いように思われるが、しかし乳児も重篤な疾患に罹患し得る。したがってこれらの群は特に、防護される必要がある。
【０００５】
一般に利用可能なインフルエンザワクチンは、不活性化または生弱毒化インフルエンザワクチンである。不活性化フルーワクチンは、３つの型の抗原調製物で構成される:不活性化全ウイルス、精製ウイルス粒子が洗剤またはその他の試薬で崩壊されて、脂質エンベロープを可溶化するサブビリオン（いわゆる「スプリット」ワクチン）、あるいは精製ＨＡおよびＮＡ（サブユニットワクチン）。これらの不活性化ワクチンは、筋肉内投与（i.m.）される。
【０００６】
インフルエンザワクチンは、全ての種類が、通常は三価ワクチンである。それらは一般に、２つのＡ型インフルエンザウイルス株および１つのＢ型インフルエンザウイルス由来の抗原を含有する。ほとんどの症例における標準的0.5 ml注射用量は、単純放射状免疫拡散法（ＳＲＤ）により測定した場合、各株からの15 μgの血球凝集素抗原構成成分を含有する（J.M. Wood et al.:An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen:adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5(1977)237-247；J.M. Wood et al.:International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis technique for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9(1981)317-330）。
【０００７】
各シーズンにインフルエンザワクチン中に組入れられるインフルエンザウイルス株は、政府保健当局およびワクチンメーカーと共同して、世界保健機構により決定される。
【０００８】
インフルエンザの毎年の流行に関連した発生および脂肪を制御するための一般的尽力は、筋内投与不活性化インフルエンザワクチンの使用を基礎にしている。呼吸器疾患およびインフルエンザ合併症を防止する場合のこのようなワクチンの効力は、健常成人の75％から高齢者の50％未満の範囲である。
【０００９】
インフルエンザウイルスは、多数の病原体と同様に，最初は上部呼吸路の粘膜表面を侵襲する。粘膜免疫は、宿主のための防御の最前線を構成し、鼻道における、ならびに下部呼吸路の気道における免疫応答の主要な構成成分である。現在用いられている注射用インフルエンザワクチンは、大多数の健常個体における血清ＨＡ特異的ＩｇＧを刺激するが、しかしＨＡ特異的鼻ＩｇＡ抗体の有意の増加は、ワクチン接種被験者の少数にのみ生じる。良好な免疫原性および臨床効能を有する改良型インフルエンザワクチンは、局所性および全身性抗体応答の両方を標的にする必要がある。
【００１０】
不活性化インフルエンザワクチンに対するヒトの実験的鼻腔内曝露は、1940年代まで遡る（Eyles et al. 2000 BioDrugs 13(1):35-59の再検討を参照）。1960年代および70年代においてＩＮ免疫感作のための不活性化ウイルスの使用に再び関心が戻ったが、しかし鼻腔内領域での注意はほとんどが生弱毒化アプローチに向けられてきた。
【００１１】
鼻腔内投与生弱毒化インフルエンザワクチン、例えば寒冷適応ワクチンは粘膜免疫改良を提供し、特に小児における結果を約束する。しかしながら、このアプローチは、今日までのところ、世界的な容認は得られていない。
【００１２】
したがって、市販インフルエンザワクチンのほとんどがスプリットまたはサブユニット注射用ワクチンである。これらのワクチンは、一般的に有機溶媒または洗剤を用いてウイルス粒子を崩壊し、そして種々の程度にウイルスタンパク質を分離または精製することにより調製される。スプリットワクチンは、有機溶媒または洗剤の濃縮物を可溶化し、その後、可溶化剤およびいくつかのまたはほとんどのウイルス脂質物質を除去することを用いて、感染性のまたは不活性化された全インフルエンザウイルスの断片化により調製される。スプリットワクチンは一般に、夾雑マトリックスタンパク質および核タンパク質そして時としては脂質を、ならびに膜エンベロープタンパク質を含有する。スプリットワクチンは通常はウイルス構造タンパク質のほとんどまたは全てを含有するが、しかしそれらが全ウイルス中に生じるのと必ずしも同比率で含有するわけではない。他方、サブユニットワクチンは、本質的に高精製ウイルス表面タンパク質、血球凝集素およびノイラミニダーゼからなり、これらはワクチン接種時に所望のウイルス中和抗体を引き出すのに関与する表面タンパク質である。
【００１３】
さらに近年、成人および高齢者における免疫原性を改良するための試みにおいて、より高精製化され、より良好に特性化されたスプリットインフルエンザワクチンがアジュバントと併合された。マウスにおける免疫応答の有意の増大にもかかわらず、新生成アジュバントを用いた多数のアプローチはヒトにおいて確証し得ることを立証できなかった。
【００１４】
インフルエンザワクチンの効力を測定するために、標準が鼻腔内適用される。インフルエンザに対する有効ワクチンに関する欧州連合公式判定基準を以下の表に記述する。理論的には、欧州連合要件を満たすためには、インフルエンザワクチンは、ワクチン中に含まれるインフルエンザの全ての株に関して、表中の判定基準のうちの１つだけは満たさねばならない。しかしながら実際には、特に新規のワクチン、例えば新規の鼻腔内ワクチンに関しては、少なくとも２つまたは３つ全ての判定基準が全株に関して満たされる必要がある。いくつかの環境下では、２つの判定基準で十分である。例えば全ての株により満たされることが、３つの判定基準のうちの２つに対して許容可能であるが、一方、３つの判定基準は、いくつかのしかし全てではない株（例えば、３つの株の内の２つ）により満たされる。要件は、成人集団（18〜60歳）と高齢者集団（>60歳）とでは異なる。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
＊  セロコンバージョン率は、各ワクチン株に関して、ワクチン接種後の血清血球凝集素抑制（ＨＩ）力価の少なくとも4倍の増大を有するワクチン接種者のパーセンテージと定義される。
【００１７】
＊＊  コンバージョン因子は、各ワクチン株に関して、ワクチン接種後の血清ＨＩ幾何学平均力価（ＧＭＴ）の倍増と定義される。
【００１８】
＊＊＊  防御率は、（各ワクチン株に関する）ワクチン接種後の1:4またはそれより大きい血清ＨＩ力価を有するワクチン接種者のパーセンテージと定義され、通常は防御を示すとして許容される。
【００１９】
商業的に有用である鼻腔内フルーワクチンに関しては、それらの標準を満たすことが必要なだけでなく、実際、少なくとも一般に利用可能な注射用ワクチンと同様に有効である必要がある。抗原の量および必要とされる投与の回数に関して商業的に育ち得ることも必要である。
【００２０】
過去数十年に亘って試験されてきた不活性化ウイルスを基礎にした鼻腔内フルーワクチンは、これらの判定基準を満たしていない。
【００２１】
Fulk等（1969, J. Immunol. 102, 1102-5）は、高齢患者において、死インフルエンザウイルスの鼻腔内投与（鼻腔滴下＋ネブライゼーション）を皮下（s.c.）投与と比較した。S.c.投与を施された患者の56％が抗体力価（ＨＩ）の４倍増を示した一方で、対応する増大は、鼻腔内投与を施された患者の25％に観察されただけであった。２つの鼻腔内投与は、75％セロコンバージョンを生じた。
【００２２】
Gluck等（1999, J. Virol. 73, 7780-6）は、効力のある粘膜アジュバント（大腸菌熱不安定性毒素ＨＬＴ）を含有するスプレーにより投与された連続鼻腔内接種が、筋肉内投与に匹敵するセロコンバージョン（体液性抗体応答において4倍増）を誘導することを必要とした、ということを実証した。アジュバントの存在下での15 μgＨＡ／株の単一鼻腔内投与、またはアジュバントの非存在下での2回投与でさえ、等価のセロコンバージョンを提供できなかった。インフルエンザ抗原は、ヴィロソーム、ホスファチジルコリンを用いて生成された再構成脂質二層および卵由来インフルエンザウイルスから抽出されたウイルス表面タンパク質の形態であった。
【００２３】
より高レベルのセロコンバージョンを達成しようと試みるために２またはそれ以上の鼻腔内投与を用いる概念も、他の研究者により用いられてきた。Petrescu等（1979, Rev. Rom. Med-Virol. 30, 109-115）は、2週間に2回、鼻腔に不活性化ウイルス（1000国際単位／ワクチン接種用量）を投与した。Oh等（1992, Vaccine 10, 506-11）は、1週間間隔で4回、鼻スプレーの形態でスプリットワクチンを投与し、各投与は15 μgＨＡ／株（毎回0.25 ml／鼻孔）であった。Kuno-Sakai等（1994, Vaccine 12,1303-1310）は、1週間間隔で2回、市販スプリットインフルエンザの強度の3倍のエーロゾル不活性化ワクチンを投与した。
文献WO96/33738とRU2086232は、鼻内投与に好適であることができる不活性化インフルエンザ製剤を開示する。
【００２４】
近年、Muszkat等（2000, Vaccine 18,1696-9）は、高齢患者に全不活性化フルーウイルス（20 μgのＡ株およびＢ株、ならびに40 μgの別のＡ株／用量）の2回鼻腔内免疫感作を施して、標準用量の市販不活性化スプリットワクチンの筋内注射の場合より低い鼻腔内投与に関する全身性セロコンバージョンを観察した。
【００２５】
それゆえ、1969年から2000に亘る文献は、不活性インフルエンザワクチンによる鼻腔内ワクチン接種は広範に研究されてきたが、しかし単一用量のワクチンの鼻腔投与により、筋内または皮下注射と投下の全身性セロコンバージョンを達成し得たグループはない、ということを示す。さらに、長期にわたるワクチンの多数回投与による効果を達成するために、用いられる抗原の用量は、各ワクチンに関する15 μgＨＡ／株という標準慣用的両よりかなり大きかった。データは、実際、好ましくは大腸菌ＨＬＴのような強力な免疫刺激剤の存在下での、多数回投与の必要性を指摘する。
【００２６】
Kimura等（1988, Acta Paediatr. Jpn. 30, 601-3）は、ネブライザーによる2用量の不活性化インフルエンザウイルスの投与は単一s.c.投与と同様に有効であるが、しかし鼻腔内噴霧による２用量の投与ははるかに有効性が低い、ということを実証した。ネブライゼーションは、肺に達する非常に微細な噴霧物を生じる。したがって、鼻腔スプレーは有効であり得ず、ネブライゼーションがより良好であり得る、ということが発表済みの臨床試験で示されている。
【００２７】
文献はさらに、鼻腔内ワクチン中の効力のあるアジュバント、特に有効な免疫刺激剤の必要性を示す。
【００２８】
例えばGluck等（前記引用）は、免疫刺激剤の非存在下でのインフルエンザワクチンの鼻腔内投与が、免疫刺激剤の存在下よりも有意に低効率である、ということを実証した。免疫刺激剤を欠くワクチンの2回鼻腔内投与でさえ、皮下投与により達成される同一セロコンバージョンを誘導し得ない、ということを著者等は示す。
【００２９】
Hashigucci等（1996, Vaccine 14, 113-9）は、大腸菌熱不安定毒素およびそのＢサブユニット（ＬＴＢ）の混合物をアジュバント処理されたスプリットインフルエンザワクチンの4週間間隔で2回の鼻腔内投与は50％のセロコンバージョンを生じる、ということを実証した。アジュバントの非存在下では、31％のセロコンバージョンが得られたに過  ぎない。典型的には、s.c.投与は、75〜90％セロコンバージョンを生じる。
【００３０】
したがって、慣用的フルーワクチンで得られるものと投下の全身性セロコンバージョンを達成するために、１回より多い投与が必要とされ、さらにワクチンは毒素でアジュバント処理されるべきである、ということを文献は明らかに示している。
【００３１】
非生スプリットインフルエンザウイルス抗原は、商業的に生育可能な鼻腔内フルーワクチン中に用いられ得る、ということがここで発見された。特に鼻腔内インフルエンザウイルスワクチン製剤の単一投与は、防御レベルで全身免疫を刺激する。さらに、これは有効フルーワクチンに関する国際判定基準を満たす。特に、非生インフルエンザウイルス抗原調製物の鼻腔内投与は、同一ワクチンのs.c.投与により得られるものと等価の全身性セロコンバージョン（抗ＨＡ力価における4倍増）を生じ得る。意外にも、インフルエンザ抗原は、従来技術に示されたよりも有意に低い容量／ワクチンで提供され得る。
【００３２】
注射により得られるものと等価のセロコンバージョンを生じる標準用量の不活性化スプリットインフルエンザウイルスの単一鼻腔投与は、従来報告されていなかった。
【００３３】
本発明は、最初に、鼻腔内送達のための単一投与スプリットインフルエンザワクチンを提供する。ワクチンは、ワクチンは市販１用量ワクチンとして欧州では承認されているように、ワクチン中に存在するインフルエンザのそのまたは全ての菌株に関して本明細書中表中に前記したようなインフルエンザワクチンに関するＥＵ判定基準の少なくとも２つ又は全てを満たす。さらに好ましくは、少なくとも２つの判定基準が全ての株に関して適合され、第三の判定基準は、全ての株、または少なくとも全てのしかしその中の１つの株により満たされる。最も好ましくは、全ての株が３つの判定基準の全てを満たす。
【００３４】
したがって、本発明は、一局面において、インフルエンザに対する１用量鼻ワクチン接種のためのワクチン処方物の製造における非生スプリットインフルエンザウイルス抗原調製物の使用を提供し、ここで、１用量ワクチン接種は請求項１に記載する効果を達成する。ワクチンは、１用量フォーマットまたは２用量フォーマットで投与され得る（一般的には各鼻孔に対して１サブ用量）。
【００３５】
本発明は、別の局面において、インフルエンザに対する免疫感作のための粘膜ワクチンの製造における低用量の非生スプリットインフルエンザウイルス抗原物質の使用を提供する。
【００３６】
好ましくは、非生スプリットインフルエンザウイルス抗原調製物は、特に非イオン性界面活性剤である少なくとも１つの界面活性剤を含有する。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば市販のトリトン（商標）シリーズ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（トゥイーン（商標）シリーズ）、ならびに一般式（Ｉ）：
（Ｉ）  ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
（式中、ｎは1〜50であり、Ａは一結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０のアルキルまたはフェニルＣ１−５０のアルキルである）
のポリオキシエチレンエーテルまたはエステル、ならびにこれらのうちの２つまたはそれ以上の組合せから成る群から選択される。
【００３７】
式（Ｉ）内の好ましい界面活性剤は、ｎが4〜24、さらに好ましくは6〜12、最も好ましくは9であり、Ｒ構成成分がＣ１−５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０のアルキル、最も好ましくはＣ１２のアルキルである分子である。
【００３８】
オクチルフェノキシポリオキシエタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルは、”Surfactant systems” Eds:Attwood and Florence(C1983, Chapman and Hall)に記載されている。オクチルフェノキシポリオキシエタノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−100（商標））も、Merck Index Entry 6858(Page 1162, 12th Edition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J.,USA;ISBN 0911910-12-3)に記載されている。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80（商標））は、Merck Index Entry 7742(Page 1308, 12th Edition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J.,USA;ISBN 0911910-12-3)に記載されている。ともに、そこに記載された方法を用いて製造され得るし、あるいは商業的供給元、例えばSigma Inc.から購入され得る。
【００３９】
特に好ましい非イオン性界面活性剤としては、トリトンＸ−45、ｔ−ポリエトキシエタノール（トリトンＸ−100）、トリトンＸ−102、トリトンＸ−114、トリトンＸ−165、トリトンＸ−205、トリトンＸ−305、トリトンＮ−57、トリトンＮ−101、トリトンＮ−128、Ｂｒｅｉｊ35、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）およびポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ステアレス９）が挙げられる。トリトンＸ−100およびラウレス９が特に好ましい。さらに特に越野は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80（商標））である。
【００４０】
一般式（Ｉ）のさらに適切なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００４１】
ポリオキシエチレンラウリルエーテルに関する代替的用語または名称は、ＣＡＳ登録に開示されている。ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルのＣＡＳ登録番号は、9002-92-0である。ポリオキシエチレンエーテル、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテルは、Merck Index (12th ed:entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J.,USA;ISBN 0911910-12-3)に記載されている。ラウレス９は、エチレンオキシドをドデシルアルコールとはのさせることにより生成され、平均９のエチレンオキシド単位を有する。
【００４２】
界面活性剤中のポリオキシエチレンセクションの長さ対アルキル鎖の長さの比（即ち、ｎ:アルキル鎖長の比）は、水性媒質中のこの種類の界面活性剤の溶解度に影響を及ぼす。したがって、本発明の界面活性剤は溶液中に存在し得るし、あるいはミセルまたは小胞のような粒状構造を形成し得る。溶液として、本発明の界面活性剤は、安全、易滅菌性、易投与性であり、そして均一粒状構造の形成に関連したＧＭＰおよびＱＣ問題を伴わずに簡単な方式で製造され得る。いくつかのポリオキシエチレンエーテル、例えばラウレス９は、非小胞性溶液を生成し得る。しかしながら、ポリオキシエチレン−８パルミトイルエーテル（Ｃ１８Ｅ８）は、小胞を生成し得る。したがって、少なくとも１つの付加的非イオン性界面活性剤と組合せたポリオキシエチレン−８パルミトイルエーテルの小胞は、本発明の処方物中に用いられ得る。
【００４３】
好ましくは、本発明の処方物中に用いられるポリオキシエチレンエーテルは、溶血活性を有する。ポリオキシエチレンエーテルの溶血活性は、以下の検定を参照しながらin vitroで測定され、赤血球の溶解を引き起こし得ない界面活性剤の最高濃度として表される：
１．テンジクネズミからの新鮮な血液を、机上型遠心分離機中でリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄する。元の容積中に再懸濁後、血液をさらに、ＰＢＳ中に10倍希釈する。
【００４４】
２．50 μlのこの血液懸濁液を、洗剤の２倍希釈液を含有するＰＢＳ800 μl中に付加する。
【００４５】
３．8時間後、視覚的に、または上清の光学濃度を測定することにより、溶血を査定する。570 nmで光を吸収する赤色上清の存在は、溶血の存在を示す。
【００４６】
４．結果を、溶血がもはや起こらない最初の洗剤希釈液の濃度として表す。
【００４７】
このような生物学的検定の固有の実験変動性内で、本発明の一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルまたは界面活性剤は、約0.5〜0.0001％、さらに好ましくは0.05〜0.0001％、さらに好ましくは0.005〜0.0001％、最も好ましくは0.003〜0.0004％の溶血活性を有する。理想的には、前記のポリオキシエチレンエーテルまたはエステルは、ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルまたはポリオキシエチレン−８ステアリルエーテルと同様の（すなわち、10倍差）溶血活性を有するべきである。
【００４８】
前記の界面活性剤の異なる群からの２つまたはそれ以上の非イオン性界面活性剤が、本明細書中に記載したワクチン処方物中に存在し得る。特に、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80（商標））およびオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−100（商標））の組合せが好ましい。非イオン性界面活性剤の別の特に好ましい組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルまたはオクトキシノールまたはその両方を含む。
【００４９】
好ましくは、そのまたは各非イオン性界面活性剤は、0.001％〜20％、さらに好ましくは0.01〜10％、最も好ましくは約2％（w/v）までの濃度で最終ワクチン処方物中に存在する。１つまたは２つの界面活性剤が存在する場合、これらは一般に各々約2％まで、典型的には各々約0.6％までの濃度で最終処方物中に存在する。１つまたはそれ以上の付加的界面活性剤は、一般的には各々約1％の濃度までで、典型的には各々約0.2％または0.1％までの微量で存在し得る。界面活性剤の任意の混合物が、本発明のワクチン処方物中に存在し得る。
【００５０】
非イオン性界面活性剤、例えば前記のようなものは、以下のような最終ワクチン組成物中の好ましい濃度を有する:ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばトゥイーン80（商標）：0.01〜1％、最も好ましくは約0.1％（w/v）；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール、例えばトリトンＸ−100（商標）またはトリトンシリーズのその他の洗剤：0.001〜0.1％、最も好ましくは0.005〜0.02％（w/v）；一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエタノール、例えばラウレス９：0.1〜20％、好ましくは0.1〜10％、最も好ましくは0.1〜1％、または約0.5％（w/v）。
【００５１】
ある種のワクチン処方物に関しては、その他のワクチン構成成分が処方物中に含まれ得る。このようなものとして、本発明の処方物は、胆汁酸またはその誘導体を、特に塩の形態で含み得る。これらの例としては、コール酸の誘導体およびその塩、特にコール酸のナトリウム塩またはコール酸誘導体が挙げられる。胆汁酸およびその誘導体の例としては、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸および誘導体、例えば前記の胆汁酸のグリコ−、タウロ−、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸−、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミドが挙げられる。特に好ましい例は、最終ワクチン用量中に存在し得るナトリウムデオキシコーレート（ＮａＤＯＣ）である。
【００５２】
好ましくは、本発明の処方物は、非小胞形態の水性溶液または懸濁液の形態である。このような処方物は、再現可能的に製造するのが容易であり、滅菌するのも容易であり（450または220 nm孔膜を通してターミナル濾過）、そしてアジュバントの複雑な物理的構造の分解を伴わずにスプレーの形態で鼻粘膜に投与するのが容易である。
【００５３】
本発明に用いるための非生フルー抗原調製物は、スプリットウイルス調製物である。
【００５４】
好ましい実施態様では、ワクチン処方物は、スプリットフルーウイルス調製物を、1つまたはそれ以上の非イオン性界面活性剤と組合せて含む。1つまたはそれ以上の非イオン性界面活性剤は、スプリットフルー抗原調製物が精製され、および／または抗原調製物に後に付加される過程からの残留物であり得る。スプリットフルー抗原物質は、非イオン性界面活性剤の存在下で安定化され得ると考えられるが、しかし本発明は、必然的に真実であるこれによらないと理解される。
【００５５】
本発明は、別の局面において、付加的免疫刺激剤を含有スない１用量鼻腔内インフルエンザワクチンの製造における非生スプリットインフルエンザウイルス抗原調製物の使用を提供する。本発明の情況では、免疫刺激剤は、例えば担体と組合せた場合にそれ自体が刺激作用を有する抗原のための担体として作用することにより、間接的に飲み刺激するのと対照したものとして、免疫計の細胞を直接刺激し得る物質である。
【００５６】
本発明の代替的局面では、処方物はさらに、アジュバントまたは免疫刺激剤、例えばコレラ毒素およびそのＢサブユニット、任意の供給源からの解毒化リピドＡ、リピドＡの非毒性誘導体、例えば米国特許第4,912,094号および英国特許第2,220,211号に記載されたもの、例えばモノホスホリルおよびジホスホリルリピドＡ、例えば３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）および３−デ−Ｏ−アシル化ジホスホリルリピドＡ、サポニン、例えばクイルＡ（南米の樹木であるセッケンボクの樹皮から得られる）およびその分画、例えばＱＳ２１およびＱＳ１７（米国特許第5,057,540号；Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2):1-55；EP0 362 279B1；Kensil et al.(1991, J. Immunology vol 146, 431-437；WO99/10008）、ならびに非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドアジュバント系（WO96/02555に記載）を含む。
【００５７】
本発明のこの局面の好ましい実施態様では、処方物は、３Ｄ−ＭＰＬおよびジホスホリルリピドＡの非毒性誘導体、特に３Ｄ−ＭＰＬから選択される非毒性リピドＡを含む。さらに好ましくは、処方物は、本明細書中に記載した一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルまたはエステル、特にラウレス９と一緒に３Ｄ−ＭＰＬを含む。
【００５８】
したがって、本発明はさらに、３Ｄ−ＭＰＬおよびラウレス９の組合せ、インフルエンザウイルス抗原調製物、特にスプリット抗原調製物の組合せを含むワクチンを提供する。このワクチンは特に、本明細書中に記載したような鼻腔内投与を含めた粘膜投与に適しているが、これに限定されない。
【００５９】
好ましくは本発明のこの局面による処方物中に存在するさらに別の構成成分としては、非イオン性界面活性剤、例えば本明細書中に記載したようなオクトキシノールおよびポリオキシエチレンエステル、特にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−100）およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（トゥイーン80）、ならびに本明細書中に記載したような胆汁酸またはコール酸誘導体、特にナトリウムデオキシコレートまたはタウロデオキシコレートが挙げられる。したがって、特に好ましい処方物は、３Ｄ−ＭＰＬ、ラウレス９、トリトンＸ−100、トゥイーン80およびナトリウムデオキシコレートを含み、これらはスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物と組合されて、粘膜または鼻腔内適用に適したワクチンを提供し得る。
【００６０】
本発明は、ワクチンの製造方法であって、３Ｄ−ＭＰＬ、ラウレス９およびスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物、例えば慣用的筋内インフルエンザワクチン中に用いられるスプリット抗原調製物を混和することを包含する方法も提供する。
【００６１】
さらなる局面において、本発明は、鼻腔内噴霧用具、およびワクチン中に存在する全てのインフルエンザ株に関して請求項１に記載の基準の内の少なくとも２つを達成する免疫応答を生じさせる１用量非生スプリットインフルエンザウイルスワクチンを包含する薬剤キットを提供する。
【００６２】
本発明の血球凝集素の低用量は、好ましくは一般的市販フルーワクチンにおける用量に匹敵する血球凝集素用量である。したがって、好ましい低用量は、好ましくは約30 μg以下、さらに好ましくは約15μg以下の血球凝集素／インフルエンザ株である。これは、普通はおよそ0.1〜2 μg/kg体重と等しい。好ましくは、しかし必ずというわけではなく、本発明の低用量ワクチンは、１用量ワクチンとして、例えば各鼻孔に対して１の２サブ用量で投与される。
【００６３】
有益には、本発明のワクチン用量は、一般的に0.5または1ml／用量である慣用的注射スプリットフルーワクチンより小容積で提供される。本発明の低容積用量は、好ましくは500μl未満、さらに好ましくは300μl未満、最も好ましくは約200μl／用量以下である。２サブ用量画投与される場合、サブ用量当たりの好ましい容積は、前記の総用量容積の半分である。
【００６４】
したがって、本発明の好ましいワクチン用量は、低容積中に低抗原用量を有する用量、例えば約200 μlの容積中に約15 μgまたは約7.5 μgＨＡ（／株）である。
【００６５】
本発明は、被験者におけるインフルエンザ感染または疾患の予防方法であって、粘膜表面を介して１用量非生インフルエンザワクチンを被験者に投与することを包含する方法も開示する。
【００６６】
本発明はさらに、被験者におけるインフルエンザ感染または疾患の予防方法であって、粘膜表面を介して低用量の非生インフルエンザウイルスワクチンを被験者に投与することを包含する方法を開示する。
【００６７】
好ましくは、ワクチンは鼻腔内に投与される。
【００６８】
最も好ましくは、ワクチンは局所的に鼻咽頭領域に、好ましくは肺に吸入されることなく、投与される。肺への進入を伴わずに、または実質的に伴わずに、鼻咽頭領域にワクチン処方物を送達する鼻腔内送達用具を用いるのが望ましい。
【００６９】
本発明のワクチンの鼻腔内投与のための好ましい用具は、噴霧用具である。適切な市販の鼻用噴霧用具としては、市販のアキュスプレー（商標）（Becton Dickinson）が挙げられる。ネブライザーは、肺に容易に吸入され、したがって鼻粘膜に効率的に達しない非常に微細な噴霧を生じる。
【００７０】
鼻腔内使用のための好ましい噴霧用具は、用具の性能が使用者により適用される圧力によらない用具である。これらの用具は、圧力閾値用具として知られている。液体は、閾値圧が得られた場合のみ、ノズルから放出される。これらの用具は、定まった小滴サイズを有する噴霧を達成するのを容易にする。本発明とともに用いるのに適した圧力閾値用具は当業界で既知であり、例えばWO 91/13281、EP 311 863 BおよびEP 516 636 Bに記載されている。このような用具は、Pfeiffer GmbHから市販おり、Bommer,R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999にも記載されている。
【００７１】
好ましい鼻腔内用具は、1〜200μm、好ましくは10〜120μmの範囲の小滴（液体として水を用いて測定）を生成する。10μm未満では、吸入の危険があり、したがって、10μmより小さい小滴は約5％以下であるのが望ましい。120μmより大きい小滴は、より小さい小滴と同様には拡散せず、そこで120μmを超える小滴は約5％以下であるのが望ましい。
【００７２】
二用量デリバリーは、本発明のワクチンとともに用いるための鼻腔内送達用具のさらに好ましい特徴である。二用量用具は、単一ワクチン用量の２つのサブ用量を含有し、１サブ用量は各鼻孔への投与のためである。一般に、２つのサブ用量は単一小室中にあり、用具の構築は一度に単一サブ用量を効率的にデリバリーさせ得る。あるいは、一用量用具が、本発明のワクチンを投与するために用いられ得る。
【００７３】
本発明は、さらなる局面において、本発明のワクチン処方物を含有する、本明細書中に記載したような鼻腔内投与用具を含むキットを提供する。
【００７４】
本発明は、必ずしも液体処方物の噴霧デリバリーに限定されない。本発明のワクチンは、他の形態で、例えば粉末として投与され得る。
【００７５】
本発明のインフルエンザワクチンは、好ましくはインフルエンザの２つまたはそれ以上の株を含む多価インフルエンザワクチンである。最も好ましくは、それは３つの株を含む三価ワクチンである。慣用的インフルエンザワクチンは、インフルエンザの３つの株、即ち２つのＡ株と１つのＢ株を含む。しかしながら、例えば汎発性流行性情況で有用であり得る多価ワクチンは、本発明から除外されない。一価汎発性流行性フルーワクチンは、単一Ａ株からのインフルエンザ抗原を最も含有し得る。
【００７６】
非生スプリットインフルエンザウイルス調製物は、慣用的胚芽含有卵法から得られるか、または組織培養を用いてウイルスを増殖する新規の生成法のいずれかから得られる。ウイルスを増殖するための適切な細胞培地としては、例えばイヌ腎臓細胞、例えばＭＤＣＫ細胞またはＭＤＣＫのクローンからの細胞、ＭＤＣＫ様細胞、サル腎臓細胞、例えばＡＧＭＫ細胞、例えばベロ細胞、あるいはワクチン目的のためのインフルエンザウイルスの産生に適した任意のその他の種類の哺乳類細胞が挙げられる。適切な細胞培地としては、ヒト細胞、例えばＭＲＣ−５細胞も挙げられる。適切な細胞培地は細胞株に限定されない。例えば始原細胞、例えばニワトリ胚繊維芽細胞も含まれる。
【００７７】
インフルエンザウイルス抗原調製物は、多数の商業的に適用可能な方法のいずれかにより、例えば特許DD300 833およびDD 211 444に記載されたスプリットフルー法により産生され得る。伝統的には、スプリットフルーは、溶媒／洗剤処理、例えばトリ−ｎ−ブチルホスフェートまたはジエチルエーテルをトゥイーン（商標）と組合せて用いて生成された（「トゥイーン−エーテル」スプリッティングとして知られている）。この方法は、いくつかの製造工場において依然として用いられている。現在用いられるその他のスプリット化剤としては、洗剤またはタンパク質分解酵素または胆汁酸塩、例えば特許DD 155 875に記載されているようなナトリウムデオキシコレートが挙げられる。スプリット化剤として用いられ得る洗剤としては、陽イオン性界面活性剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、その他のイオン性洗剤、例えばラウリルスルフェート、タウロデオキシコレート、または非イオン性洗剤、例えば前記のもの、例えばトリトンＸ−100（例えば、Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103に記載された方法において）およびトリトンＮ−101、あるいは２つまたはそれ以上の洗剤の組合せが挙げられる。
【００７８】
スプリットフルーウイルス調製物を生成するために用いられ得るさらに適切なスプリット化剤としては、以下のものが挙げられる：
１．  胆汁酸およびその誘導体、例えば：コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸および誘導体、例えば前記の胆汁酸のグリコ−、タウロ−、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸−、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミド。特に好ましい例は、最終ワクチン用量中に存在し得るナトリウムデオキシコーレート（ＮａＤＯＣ）である。
【００７９】
２．  アルキルグルコシドまたはアルキルチオグルコシド。この場合、アルキル鎖はＣ6〜Ｃ18、典型的にはＣ8〜Ｃ14であり、糖部分は、任意のペントースまたはヘキソースあるいはそれらの組合せで、異なる結合、例えば１−＞６、１−＞５、１−＞４、１−＞３、１−２を有する。アルキル鎖は、飽和、不飽和および／または分枝され得る。
【００８０】
３．  前記の２の誘導体。この場合、1つまたはそれ以上のヒドロキシル基、好ましくは６つのヒドロキシル基が修飾される。例えばエステル、エトキシレート、スルフェート、エーテル、カルボネート、スルホスクシネート、イセチオネート、エーテルカルボキシレート、第四級アンモニウム化合物。
【００８１】
４．  アシル糖。この場合、アシル鎖は、Ｃ6〜Ｃ18、典型的にはＣ8〜Ｃ12であり、糖部分は、任意のペントースまたはヘキソースあるいはそれらの組合せで、異なる結合、例えば１−＞６、１−＞５、１−＞４、１−＞３、１−２を有する。アシル鎖は、飽和または不飽和および／または分枝され、環状または非環状で、1つまたはそれ以上の異種原子、例えばＮ、Ｓ、ＰまたはＯを有することも有さないこともあり得る。
【００８２】
５．  構造式Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−３−アミノ−１−プロパンスルホネートのスルホベタイン（式中、Ｒは、Ｃ6〜Ｃ18、典型的にはＣ8〜Ｃ16の任意のアルキル鎖またはアリールアルキル鎖である。アルキル鎖Ｒは、飽和、不飽和および／または分枝され得る。Ｒ１およびＲ２は、好ましくはＣ1〜Ｃ4、典型的にはＣ1のアルキル鎖であり、あるいはＲ１，Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成し得る）。
【００８３】
６．  構造式Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−グリシンのベタイン（式中、Ｒは、Ｃ6〜Ｃ18、典型的にはＣ8〜Ｃ16の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和および／または分枝され得る。Ｒ１およびＲ２は、好ましくはＣ1〜Ｃ4、典型的にはＣ1のアルキル鎖であり、あるいはＲ１，Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成し得る）。
【００８４】
７．  構造式Ｒ−（Ｎ−Ｒ１）−グルカミドのＮ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（式中、Ｒは、Ｃ6〜Ｃ18、典型的にはＣ8〜Ｃ12の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和および／または分枝され、あるいは環状であり得る。Ｒ１およびＲ２は、好ましくはＣ1〜Ｃ6、典型的にはＣ1のアルキル鎖である。糖部分は修飾され、ペントースまたはヘキソースであり得る）。
【００８５】
８．  構造式Ｒ，−Ｎ＋（−Ｒ１，−Ｒ２，−Ｒ３）の第四級アンモニウム化合物（式中、Ｒは、Ｃ6〜Ｃ20、典型的にはＣ20の任意のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和、不飽和および／または分枝され得る。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、好ましくはＣ1〜Ｃ4、典型的にはＣ1のアルキル鎖であり、あるいはＲ１，Ｒ２は、窒素と一緒になって複素環式環を形成し得る。特定の例は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）である）。
【００８６】
スプリットワクチンの製造方法としては、多数の異なる濾過および／またはその他の分離過程、例えば種々の組合せの超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離およびクロマトグラフィー（例えば、イオン交換）過程、ならびに任意に、例えばホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンまたはＵＶを用いた不活性化過程が挙げられるが、これらはスプリッティングの前または後に実行され得る。スプリッティング法は、バッチ、連続または半連続法として実行され得る。
【００８７】
好ましくは、胆汁酸塩、例えばナトリウムデオキシコレートは、本発明のスプリットワクチン処方物中に極微量で、好ましくは0.05％以下、または約0.01％以下、さらに好ましくは約0.0045％（w/v）の濃度で存在する。
【００８８】
本発明の好ましいスプリットフルーワクチン抗原調製物は、製造過程から残存する残留量のトゥイーン80および／またはトリトンＸ−100を含むが、しかしこれらは付加され得るか、またはそれらの濃度はスプリット抗原の調製後に調整され得る。好ましくは、トゥイーン80およびトリトンＸ−100はともに存在する。ワクチン用量中のこれらの非イオン性界面活性剤の最終濃度のための好ましい範囲を以下に示す：
トゥイーン80：0.01〜1％、好ましくは約0.1％（v/v）
トリトンＸ−100：0.001〜0.1％（w/v）、さらに好ましくは0.005〜0.02％（w/v）。
【００８９】
低濃度でのこれら２つの界面活性剤の組合せの存在は、溶液中の抗原の安定性を促進することが判明した。この増強された安定性は、従来の処方物よりも抗原を鼻腔内的により免疫原性にさせる。このような増強は、小抗原集塊の普及から、または抗原のネイティブコンホメーションの増強から生じ得る。本発明は正しいこの理論的解釈によらない。
【００９０】
スプリットインフルエンザウイルス調製物の場合、ウイルスタンパク質に関連した、またはウイルスタンパク質、特にＨＡを含有する全インフルエンザウイルスの断片の存在は、抗原の提示を保存し、そして強力な免疫応答の誘導に関与し得る、ということを示す証拠もある。したがって、スプリットインフルエンザウイルスは、本発明の種々の局面における使用のために選択される抗原である。
【００９１】
特定の実施態様では、好ましいスプリットウイルス調製物は、好ましくは0.1〜20％、さらに好ましくは0.1〜10％、最も好ましくは0.1〜1％（w/v）の範囲でラウレス９も含有する。
【００９２】
本発明のワクチンは一般に、25％（w/v）以下の、好ましくは15％未満、最も好ましくは約2％以下の洗剤または界面活性剤を含有する。
【００９３】
本発明は、別の局面において、鼻適用のための１用量インフルエンザワクチンの製造方法であって、以下の：
（ｉ）慣用的注射（例えば、筋内）インフルエンザワクチンに関するのと本質的に同様に生成され、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤を含むスプリットインフルエンザウイルス調製物を提供し、
（ｉｉ）任意に、調製物中の血球凝集素の濃度および／または非イオン性界面活性剤の濃度を調整し、
（ｉｉｉ）スプリットインフルエンザウイルス調製物からのワクチン用量であって、任意に２用量フォーマットでの鼻腔内投与に適した容積である用量を鼻腔内送達用具に充填する、ここで１用量適用は、ワクチン中に存在する全てのインフルエンザ株に関して請求項１に記載の基準の内の少なくとも２つを達成する免疫応答を生じさせる、
ことを包含する方法を提供する。
【００９４】
本発明のこの局面の方法におけるさらに任意の過程としては、吸収増強界面活性剤、例えばラウレス９の付加および／またはアジュバント、例えば非毒性リピドＡ誘導体特に３Ｄ−ＭＰＬの付加が挙げられる。
【００９５】
慣用的注射不活性化フルーワクチンの製造方法は周知であり、文献に記載されている。このような方法は、鼻腔内ワクチンが有益には注射ワクチンより小容積のワクチン処方物を用いるため、例えばワクチンの最終滅菌濾過前に濃縮過程を含入することにより、本発明に用いるための１用量粘膜ワクチンを製造するために修正され得る。あるいは、本方法は、他の構成成分、例えば非イオン性界面活性剤の濃度を本発明の鼻腔内ワクチンのために適切な％（w/v）に調整するための過程の含入により、修正され得る。しかしながら、ワクチンの活性成分、即ちインフルエンザ抗原は、慣用的筋内ワクチンおよび本発明の１用量鼻腔内ワクチンに関して本質的に同一であり得る。
【００９６】
【００９７】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【００９８】
実施例
実施例１−スプリットインフルエンザワクチンの調製
以下の手順にしたがって、一価スプリットワクチンを調製した。
【００９９】
ウイルス接種物の調製
胚芽含有卵の接種当日に、作業種子ロットを、0.5 mg/mlのゲンタマイシンスルフェートおよび25 μg/mlのヒドロコルチゾンを含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水と混合することにより、新鮮な接種物を調製する（ウイルス株依存性）。ウイルス接種物を2〜8℃に保持する。
【０１００】
胚芽含有卵の接種法
ウイルス複製のために、9〜11日齢胚芽含有卵を用いる。殻を浄化する。卵に0.2 mlのウイルス接種物を接種する。接種卵を適切な温度（ウイルス株依存性）で48〜96時間インキュベートする。インキュベーション期間の終了時に、冷却により胚を殺し、卵を2〜8℃で12〜60時間貯蔵する。
【０１０１】
収穫
冷却胚芽含有卵から尿膜腔液を収穫する。通常、8〜10 mlの粗製尿膜腔液／卵を収集する。粗製一価ウイルスバルクに、0.100 mg/mlのチオメルサールを任意に付加する。
【０１０２】
尿膜腔液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清澄化
中等度速度の遠心分離（4000〜14000 gの範囲）により、収穫尿膜腔液を清澄化する。
【０１０３】
２．吸着過程
清澄化ウイルスプール中にＣａＨＰＯ４ゲルを生成するために、0.5 mol/LのＮａ２ＨＰＯ４および0.5 mol/LのＣａＣｌ２溶液を付加して、ウイルス株によって、ＣａＨＰＯ４の最終濃度を1.5 g〜3.5 gＣａＨＰＯ４／リットルとする。
【０１０４】
少なくとも8時間沈殿後、上清を除去し、用いられるＣａＨＰＯ４の両によって、0.26 mol/LＥＤＴＡ−Ｎａ２の付加により、インフルエンザウイルスを含有する沈殿物を再可溶化させる。
【０１０５】
３．濾過
再懸濁化沈殿物を6 μmフィルター膜上に濾過する。
【０１０６】
４．スクロース勾配遠心分離
100 μg/mlのチオメルサールを含有する線状スクロース勾配（0.55％（w/v））中での等密度遠心分離により、インフルエンザウイルスを濃縮する。流量は、8〜15リットル／時間である。
【０１０７】
遠心分離終了時に、４つの異なる分画によりローターの内容物を回収する（屈折計でスクロースを測定する）：
−  分画１    55〜52％スクロース
−  分画２    約52〜38％スクロース
−  分画３    38〜20％スクロース＊
−  分画４    20〜0％スクロース＊
ウイルス株依存性:分画３は15％スクロースに低減され得る。
【０１０８】
さらなるワクチン調製のために、分画２および３のみを用いる。
【０１０９】
スクロース含量を約6％未満に低減するために、リン酸塩緩衝液を用いたジア濾過により、分画３を洗浄する。この希釈分画中に存在するインフルエンザウイルスをペレット化して、可溶性夾雑物を除去する。
【０１１０】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して均質懸濁液を得る。分画２、並びに分画３の再懸濁ペレットをプールし、リン酸塩緩衝液を付加して、約40リットルの容積を得る。この生成物は、一価全ウイルス濃縮物である。
【０１１１】
５．ナトリウムデオキシコレートを用いたスクロース勾配遠心分離
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−Ｍａｒｋ  ＩＩ超遠心機に適用する。Ｋ３ローターは線状スクロース勾配（0.55％（w/v））を含有し、この場合、ナトリウムデオキシコレートを付加的に上に載せる。トゥイーン80は、スプリット化中は、0.1％（w/v）まで存在する。最大ナトリウムデオキシコレート濃度は0.7〜1.5％（w/v）であり、株依存性である。流量は8〜15リットル／時間である。
【０１１２】
遠心分離終了時に、３つの異なる分画によりローターの内容物を回収する（屈折計でスクロースを測定する）。さらなる加工処理のために、分画２を用いる。分画限定のためのスクロース含量（47〜18％）は株によって変わり、評価後は固定される。
【０１１３】
６．滅菌濾過
0.2 μm膜で終わるフィルター膜上で、スプリットウイルス分画を濾過する。0.025％（w/v）トゥイーン80を含有するホスフェート緩衝液を、希釈のために用いる。濾過分画２の最終容積は、元の分画容積の５倍である。
【０１１４】
７．不活性化
濾過一価物質を22±2℃でほとんど84時間（ウイルス株によって。このインキュベーションは短縮し得る）、インキュベートする。総タンパク質含量を最大250 μg/mlに下げるために、0.025％トゥイーン80を含有するリン酸塩緩衝液を次に付加する。ホルムアルデヒドを付加して、最終濃度を50 μg/mlとする。不活性化が20℃±2℃で少なくとも72時間起こる。
【０１１５】
８．限外濾過
20kDaＭＷＣＯを有するセルロースアセテート膜を装備した限外濾過ユニット中で、不活性化スプリットウイルス物質を少なくとも２倍に濃縮する。0.025％（w/v）トゥイーン80を含有するリン酸塩緩衝液で、その後、0.01％（w/v）トゥイーンを含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水で、本物質をその後洗浄する。
【０１１６】
９．最終滅菌濾過
限外濾過後の物質を、0.2 μm膜で終わるフィルター膜上で濾過する。ＳＲＤ（ＷＨＯ推奨方法）により測定される血球凝集素の最終濃度は、450 μg/mlを超える必要がある。
【０１１７】
１０．貯蔵
一価最終バルクを、2〜8℃で最大18ヶ月間貯蔵する。
【０１１８】
純度
クーマシー染色ポリアクリルアミドゲルのＯ．Ｄ．走査により、純度を確定した。ピークは手動で確定した。試料結果を、表１に示す：
【０１１９】
【表２】
2003509451.tif 000002
【０１２０】
実施例２−バルクワクチンからのワクチン用量の調製
必要に応じて調整される洗剤濃度を用いて一価バルクから三価ワクチンを処方することにより、最終ワクチンを調製する。
【０１２１】
注射用の水、ＰＢＳ（ｐＨ7.4、10倍濃縮）、トゥイーン80およびトリトンＸ−100を混合して、必要な最終濃度（ＰＢＳ1倍濃縮、トゥイーン80：0.15％およびトリトンＸ−100：0.02％）を得る。以下の３つの不活性化スプリットビリオンを、10分間撹拌しながら付加する：
30 μgＨＡ  A/Beijing/262/95（Ｈ１Ｎ１）
30 μgＨＡ  A/Sydney/5/97（Ｈ３Ｎ２）
30 μgＨＡのB/Harbin/7/94
15分間撹拌後、ｐＨを7.2±0.2に調整する。
【０１２２】
用量容積は、200 μlである。
【０１２３】
ラウレス９を用いて処方するワクチンでは、ｐＨ調整前にラウレス９を付加して、最終濃度を0.5％（w/v）とする。
【０１２４】
実施例３−抗体応答を測定するために用いられる方法
１．ＥＬＩＳＡによるヒト鼻分泌物中の特異的抗フルーおよび総ＩｇＡの検出
ヒト鼻分泌物のための収集方法
有志の下鼻甲介（各鼻孔中）に対して、２つのウィックを適用する。ウィックを鼻の中に１分間放置した後、2 mlのＮａＣｌ、0.9％、ＢＳＡ1％およびアジ化ナトリウム0.1％（保存緩衝液）中に入れる。全試料を氷上に2時間放置する。次にウィックを圧縮して、抗体を回収する。遠心分離（10分、2000 g、4℃）後、全試料の流体を収集し、アリコート化して、試験日まで−20℃で凍結する。ペレットを400 μlの生理学的水中に懸濁し、血球用雑物に関して顕微鏡観察する。鼻用ウィックを用いた収集およびヒト鼻分泌物の処理後、２つの異なるＥＬＩＳＡを用いて総および特異的抗ＦＬＵＩｇＡの検出を実行する。
【０１２５】
総ＩｇＡの検出のための捕獲ＥＬＩＳＡ
微小滴定プレート上に固定された抗ヒトＩｇＡポリクロナールアフィニティー精製Ｉｇを用いて総ＩｇＡを捕獲し、その後、ペルオキシダーゼに結合された異なるポリクロナール抗ヒトＩｇＡアフィニティー精製Ｉｇを用いて検出する。
【０１２６】
精製ヒトｓＩｇＡを標準として用いて、収集鼻分泌物中のｓＩｇＡの定量を可能にする。
【０１２７】
精製ヒトｓＩｇＡの３つの参照を、この検定における低、中および高参照として用いる。
【０１２８】
特異的抗ＦＬＵＩｇＡの検出のための直接ＥＬＩＳＡ
ワクチン処方物中に存在する各ＦＬＵ株に関するものである３つの異なるＥＬＩＳＡを実施する。
【０１２９】
微小滴定プレート上に被覆されたスプリット不活性化ＦＬＵ抗原を用いて特異的抗ＦＬＵＩｇＡを捕獲し、その後、総ＩｇＡＥＬＩＳＡのために用いられたのと同様のペルオキシダーゼに結合された同一の異なるポリクロナール抗ヒトＩｇＡアフィニティー精製Ｉｇを用いて検出する。
【０１３０】
試薬
生物学的試薬
−ヤギ抗ヒトＩｇＡアフィニティー精製Ｉｇ（SigmaＩ−0884）
−精製ヒト分泌ＩｇＡ（ICN-Cappel 55905）（総ＩｇＡ定量のための標準）
−ヒト分泌ＩｇＡ（Colostrum）（Biogenesis 5111-5504）（総ＩｇＡのための参照Ｂｉｏ）。希釈して低、中および高参照を生成。
【０１３１】
−精製ヒトＩｇＡ（SigmaＩ−1010）（総ＩｇＡのための参照Ｓｉｇ）
−特異的抗ＦＬＵ  ＥＬＩＳＡのための陰性参照（３つの株に対する非検出性応答を有する鼻分泌物のプール;カットオフ＝0.6ＯＤ４５０ｎｍ）
−特異的抗ＦＬＵ  ＥＬＩＳＡのための陽性低参照（３つの株に対する低検出性応答を有する鼻分泌物のプール）
−特異的抗ＦＬＵ  ＥＬＩＳＡのための陽性中参照（３つの株に対する中検出性応答を有する鼻分泌物のプール;カットオフ＝0.6ＯＤ）
−ヤギ抗ヒトＩｇＡ血清親和性精製ＨＲＰ（接合化）（ICN 674221）
−スプリット不活性化卵由来抗原A/Beijing/262/95Ｈ１Ｎ１
−スプリット不活性化卵由来抗原A/Sydney/5/97Ｈ３Ｎ２
−スプリット不活性化卵由来抗原B/Harbin/7/94
試薬調製
−飽和緩衝液（ＰＢＳ、トゥイーン20：0.1％、ＢＳＡ：1％、ＮＣＳ：4％）
−ＮａＣｌ  Ｔ20（ＮａＣｌ：9 g/l、トゥイーン20：0.05％）
方法
総ヒトＩｇＡ検出
−ＤＰＢＳ中1 μg/mlのヤギポリクロナール抗ヒトＩｇＡ100 μl／ウエルを付加し、4℃で一夜インキュベートする。
【０１３２】
−200 μl／ウエルの飽和緩衝液を付加し、37℃で1時間インキュベートする。
【０１３３】
−第一列に付加：飽和緩衝液中の標準ＩｇＡの２倍希釈液100 μl／ウエル。250 ng/mlから出発して0.12 ng/mlまで下げる。
【０１３４】
−別の列に付加：飽和緩衝液中の試料（鼻汁）の２倍希釈液100 μl／ウエル。1/100から出発して1/102400まで下げる。カラム１２中の飽和緩衝液100 μlを付加し、22℃で2時間インキュベートする。
【０１３５】
−ＮａＣｌ  Ｔ20中で4回、プレートを洗浄する。
【０１３６】
−1/10000に飽和緩衝液中に希釈したヤギペルオキシダーゼ接合抗ヒトＩｇＡ100 μl／ウエルを付加し、22℃で１1/2時間インキュベートする。
【０１３７】
−ＮａＣｌ  Ｔ20中で4回、プレートを洗浄する。
【０１３８】
−100 μl／ウエルのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を付加し、暗所で10分間室温でインキュベートする。
【０１３９】
−100 μl／ウエルのＨ２ＳＯ４0.4 Nを付加することにより、反応を停止する。
【０１４０】
−630 nmでの参照とともに、450 nmで分光光度計を用いて、各プレートの吸光度（ＯＤ）を測定する。
【０１４１】
特異的抗ＦＬＵ  ＩｇＡ検出
−ＤＰＢＳ中1 μg/mlのＦＬＵウイルスの各株100 μl／ウエルを付加し、4℃で一夜インキュベートする。
【０１４２】
−200 μl／ウエルの飽和緩衝液を付加し、37℃で1時間インキュベートする。
【０１４３】
−飽和緩衝液中の試料の２倍希釈液100 μl／ウエルを付加する。1/5から出発して1/640まで下げて、22℃で2時間、プレートをインキュベートする。
【０１４４】
−ＮａＣｌ  Ｔ20中で4回、プレートを洗浄する。
【０１４５】
−1/10000に飽和緩衝液中に希釈したヤギペルオキシダーゼ接合抗ヒトＩｇＡ100 μl／ウエルを付加し、22℃で１1/2時間インキュベートする。
【０１４６】
−ＮａＣｌ  Ｔ20中で4回、プレートを洗浄する。
【０１４７】
−100 μl／ウエルのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を付加し、暗所で10分間室温でインキュベートする。
【０１４８】
−100 μl／ウエルのＨ２ＳＯ４0.4 Nを付加することにより、反応を停止する。
【０１４９】
−630 nmでの参照とともに、450 nmで分光光度計を用いて、各プレートの吸光度（ＯＤ）を測定する。
【０１５０】
結果−表現および算定
総ＩｇＡ表現
結果は、ソフトマックスプロプログラムを用いて、1 mlの鼻汁中の総ＩｇＡをμgで表す。
【０１５１】
特異的抗ＦｌｕＩｇＡ表現
結果は、終点単位力価として表す。これは、カットオフを上回るＯＤ４５０ｎｍ（ＯＤ４５０ｎｍ＝0.6）を示す最終希釈液の逆数として算定する。
【０１５２】
カットオフ値は、1/5希釈での陰性参照（確認プロトコール参照）の最高光学濃度と定義される。カットオフでの終点単位力価に対応する検出限界は、したがって、５終点単位であると算定され得る。≦５終点単位の力価を有する試料は陰性とみなされ、＞５終点単位の力価を有する試料は陽性とみなされる。
【０１５３】
試料の最終結果を、以下のように表す：
特異的応答および総ＩｇＡ濃度間の比を算定することによる特異的応答の標準化:終点単位／総ＩｇＡ1 μg（文献中で最も一般的に用いられる算定方法）。
【０１５４】
２．Ｆｌｕ−特異的血清Ａｂの血球凝集素抑制（ＨＡＩ）活性
血清（50μl）を200μlのＲＤＥ（受容体破壊酵素）を用いて、37℃で16時間処理する。150 μlの2.5％クエン酸ナトリウムを用いて反応を停止させ、血清を56℃で30分間不活性化する。100 μlＰＢＳを付加することにより、1:10希釈液を調製する。次に、25 μl血清を25 μlＰＢＳで希釈する（1:10）ことにより、96ウエルプレート（Ｖ底）中に２倍希釈シリーズを調製する。25 μlの参照抗原を、４血球凝集素単位／25 μlの濃度で各ウエルに付加する。抗原および抗血清希釈液を微小滴定プレート振盪器を用いて混合し、室温で60分間インキュベートする。次に50 μlのニワトリ赤血球（ＲＢＣ）（0.5％）を付加し、ＲＢＣを室温で1時間沈殿させる。ＨＡＩ力価は、最終血清希釈の逆数に対応し、これはウイルス誘導性血球凝集を完全に抑制する。
【０１５５】
実施例４−健常成人被験者における認可済慣用的非経口ワクチン（フルアリックス（商標））との鼻腔内スプリットインフルエンザワクチンの免疫原性の比較
試験に用いられる処方物
卵由来スプリットインフルエンザ抗原の２つの処方物（Ａ、Ｂ）を評価した。Ａは鼻腔内処方物であり、Ｂは筋肉内投与されるフルアリックス（商標）／α−リックス（商標）である。処方物は、1998／1999期のＷＨＯ推奨株から調製された３つの不活性化スプリットビリオン抗原を含有する。
【０１５６】
ワクチンの投与のために用いられた用具は、Becton Dickinsonからのアキュスプレー（商標）鼻腔内注入器であった。用具に200μlのワクチン処方物を充填し、100 μlのＡ処方物を各外鼻孔中に噴霧する。
【０１５７】
処方物の組成
鼻腔内処方物（Ａ）は、以下の不活性化スプリットビリオンを含有した：
１．  30 μgＨＡ  A/Beijing/262/95（Ｈ１Ｎ１）
２．  30 μgＨＡ  A/Sydney/5/97（Ｈ３Ｎ２）
３．  30 μgＨＡのB/Harbin/7/94
ならびにリン酸塩緩衝化生理食塩水ｐＨ7.4±0.1、0.1％のトゥイーン80、0.015％のトリトンＸ−100、0.0045％のＮａデオキシコレートおよび35 μg/ml未満のチオメルサール。
【０１５８】
１用量の容積は、200 μl（各外鼻孔に対して100 μlサブ用量）であった。
【０１５９】
比較測定器フルアリックス（商標）／α−リックス（商標）は、SmithKline Beecham Biologicalsの市販不活性化三価スプリットインフルエンザワクチンである。500 μlの用量を、筋肉内に投与した。
【０１６０】
本用量は、以下のものを含有する：
15 μgＨＡの前記の３株、500〜1000 μg/ml（0.05％〜0.1％）のトゥイーン80、50〜170 μg/ml（0.005％〜0.017％）のトリトンＸ−100、最大100 μg/mlのナトリウムでオキシコレート、100 μg/mlのチオメルサールおよびリン酸塩緩衝化生理食塩水、ｐＨ6.8〜7.5。
【０１６１】
免疫原性試験
公開対照および無作為化試験は、従来の非経口ワクチン（即ちフルアリックス（商標））と比較した場合の、トゥイーン80＆トリトンＸ−100を用いて処方された鼻腔内スプリットインフルエンザワクチンの免疫原性を評価した。20名の健常成人被験者（年齢18〜40歳）に１用量のフルアリックス（商標）を投与し、10名の被験者には１用量の鼻腔内インフルエンザワクチンを投与した。鼻腔内処方物（200 μl）は、以下の不活性化ビリオンを含有した：30 μgのヘマグルチニンA/Beijing/262/95（Ｈ１Ｎ１）、30 μgのヘマグルチニンA/Sydney/5/97（Ｈ３Ｎ２）、30 μgのヘマグルチニンB/Harbin/7/94、ならびにリン酸塩緩衝化生理食塩水（ｐＨ7.4±0.1）、トゥイーン80（0.1％）、トリトンＸ−100（0.015％）、Ｎａデオキシコレート（0.0045％）およびチオメルサール（＜35 μg/ml）。
【０１６２】
誘発性局所および全身症状に関して8日間追跡調査した。安全性および反応原性に関して、両ワクチンは十分に耐容された。ワクチン接種に関連した重篤な悪性事象は報告されなかった。
【０１６３】
血清の血球凝集抑制（ＨＩ）力価を査定して、セロコンバージョン率（各ワクチン株に関して、0日目に比して21日目に血清ＨＩ力価の少なくとも4倍の増大を有するワクチン接種者のパーセンテージと定義される）、コンバージョン因子（各ワクチン株に関して、0日目に比して21日目に血清ＨＩ幾何学平均力価（ＧＭＴ）の倍増と定義される）、ならびに血清防御率（防御を示すとして許容される（各ワクチン株に関する）ワクチン接種後の≧40の血清ＨＩ力価を有するワクチン接種者のパーセンテージと定義される）を確定することにより、ワクチンの免疫原性を調べた。さらに、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）により、粘膜ＩｇＡ抗体応答を査定した。
【０１６４】
１用量のフルアリックス（商標）または鼻腔内処方物の投与後21日目のＨＩ血清陽性、セロコンバージョンおよび血清防御率を、表２に示す。コンバージョン因子は、表２ａから判る。
【０１６５】
【表３】
2003509451.tif 000003
【０１６６】
全ての場合に、コンバージョン因子（ワクチン接種後の血清ＨＩ  ＧＭＴの倍増）は2.5より大きく、これは好結果のインフルエンザワクチンを要するレベルであった。
【０１６７】
21日目および0日目（１用量）間の特異的／総粘膜ＩｇＡ抗体比の2倍または4倍増を有する被験者のパーセンテージを、表３に示す。
【０１６８】
【表４】
2003509451.tif 000004
【０１６９】
要約
上に表記した免疫原性結果は、鼻腔内処方物が、１用量後21日目に慣用的非経口ワクチン（フルアリックス（商標））により生じたのと同様レベルの血清陽性、セロコンバージョンおよび血清防御を生じたことを示す。鼻腔内処方物は、１用量後に、慣用的非経口ワクチン（フルアリックス（商標））より良好な粘膜ＩｇＡ応答を生じた。
【０１７０】
実施例５−健常成人被験者における、ラウレス９、トリトンＸ−100およびトゥイーン80を用いて処方した鼻腔内スプリットインフルエンザワクチンの免疫原性と、認可済慣用的非経口ワクチン（フルアリックス（商標））の免疫原性との比較
ラウレス９、トリトンＸ−100およびトゥイーン80を用いて処方した卵由来スプリットインフルエンザ抗原の鼻腔内処方物（Ａ）を評価し、フルアリックス（商標）／α−リックス（商標）（Ｂ）と比較した。処方物は、1998／1999期のＷＨＯ推奨株から調製された３つの不活性化スプリットビリオン抗原を含有した。ワクチンの投与のために用いられた用具は、Becton Dickinsonからのアキュスプレー（商標）鼻腔内注入器であった。用具は、慣用的注射器と同様の原理で作動するが、しかし圧力がプランジャー上に発揮される場合でも、噴霧の生成を生じる螺旋溝を含有する特殊先端を有する。100 μlの処方物を各外鼻孔中に噴霧した。
【０１７１】
処方物の組成
鼻腔内処方物（Ａ）は、以下の不活性化スプリットビリオンを含有した：
１．  30 μgＨＡ  A/Beijing/262/95（Ｈ１Ｎ１）
２．  30 μgＨＡ  A/Sydney/5/97（Ｈ３Ｎ２）
３．  30 μgＨＡのB/Harbin/7/94
ならびにリン酸塩緩衝化生理食塩水ｐＨ7.4±0.1、0.1％のトゥイーン80、0.015％のトリトンＸ−100、0.0045％のＮａデオキシコレートおよび35 μg/ml未満のチオメルサール。
【０１７２】
１用量の容積は、200 μl（各外鼻孔に対して100 μlサブ用量）であった。ラウレス９を用いて処方物Ａを処方して、0.5％（w/v）の最終濃度を得た。
【０１７３】
比較測定器フルアリックス（商標）／α−リックス（商標）は、SmithKline Beecham Biologicalsの市販不活性化三価スプリットインフルエンザワクチンで、これを、500 μlの用量で筋肉内に投与する。
【０１７４】
免疫原性試験
公開対照および無作為化試験は、従来の非経口ワクチン（即ちフルアリックス（商標））と比較した場合の、トゥイーン80＆トリトンＸ−100を補充したラウレス９を用いて処方した鼻腔内スプリットインフルエンザワクチンの免疫原性を評価した。20名の健常成人被験者（年齢18〜40歳）に１用量のフルアリックス（商標）を投与し、10名の被験者には１用量（２サブ用量、１／鼻孔）の鼻腔内インフルエンザワクチンを投与した。
【０１７５】
誘発性局所および全身症状に関して8日間追跡調査した。安全性および反応原性に関して、両ワクチンは十分に耐容された。ワクチン接種に関連した重篤な悪性事象は報告されなかった。
【０１７６】
血清の血球凝集抑制（ＨＩ）力価を査定して、セロコンバージョン率（各ワクチン株に関して、0日目に比して21日目に血清ＨＩ力価の少なくとも4倍の増大を有するワクチン接種者のパーセンテージと定義される）、コンバージョン因子（各ワクチン株に関して、0日目に比して21日目に血清ＨＩ幾何学平均力価（ＧＭＴ）の倍増と定義される）、ならびに血清防御率（防御を示すとして許容される（各ワクチン株に関する）ワクチン接種後の≧40の血清ＨＩ力価を有するワクチン接種者のパーセンテージと定義される）を確定することにより、ワクチンの免疫原性を調べた。さらに、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）により、粘膜ＩｇＡ抗体応答を査定した。
【０１７７】
１用量のフルアリックス（商標）または鼻腔内処方物の投与後21日目のＨＩ血清陽性、セロコンバージョンおよび血清防御率を、表４に示す。
【０１７８】
【表５】
2003509451.tif 000005
【０１７９】
全ての場合に、コンバージョン因子（ワクチン接種後の血清ＨＩ  ＧＭＴの倍増）は2.5より大きく、これは好結果のインフルエンザワクチンを要するレベルであった。
【０１８０】
21日目および0日目（１用量）間の特異的／総粘膜ＩｇＡ抗体比の2倍または4倍増を有する被験者のパーセンテージを、表５に示す。
【０１８１】
【表６】
2003509451.tif 000006
【０１８２】
要約
上に表記した免疫原性結果は、鼻腔内処方物が、１用量後21日目に慣用的非経口ワクチン（フルアリックス（商標））により生じたのと同様レベルの血清陽性、セロコンバージョンおよび血清防御を生じたことを示す。鼻腔内処方物は一般に、１用量後に、慣用的非経口ワクチン（フルアリックス（商標））より良好な粘膜ＩｇＡ応答を生じた。
【０１８３】
実施例６−感作マウスにおけるラウレス９＋３Ｄ−ＭＰＬを含有する場合および含有しない場合の鼻腔内フルーワクチンの評価
６．１．  最初の実験において、それらの初回免疫に用いられるものと同一のインフルエンザ株を含有する候補処方物をマウスにワクチン接種した。
【０１８４】
実験手順
ヒトにおいて起こる天然初回免疫を模倣するために、β−プロピオラクトン不活性化卵由来三価全インフルエンザウイルスA/Beijing/262/95、A/Sydney/5/97およびB/Harbin/7/94；5 μgＨＡ／株を用いて、０日目に雌Balb/cマウス（8週齢）に鼻腔内「初回免疫」を施した。28日目に、マウス（10匹／群）に、初回免疫に用いたものと同一株を含有する以下の三価ワクチン処方物を鼻腔内接種した：
【０１８５】
【表７】
2003509451.tif 000007
【０１８６】
マウスに投与した鼻腔内ワクチン処方物は、実施例７でヒトに投与したものと同様であるが、但し、マウスに対する投与量は、ヒト用量の1/10に対応する。
【０１８７】
血清試料を42日目に収集し、血球凝集抑制（ＨＩ）抗体に関して試験した。屠殺（42日目）後、鼻洗浄を実施して、ＥＬＩＳＡによりＩｇＡ抗体力価に関して試験した。特異的ＩｇＡ抗体は終点力価（ＥＰＴ）として測定した。試料採集方法によるあらゆる差異を排除するために、特異的ＩｇＡ  ＥＰＴ／μgとして結果を表した。
【０１８８】
結果
試験の第一目的は、鼻腔内ワクチン処方物が非経口投与から得られるものと有意に異ならない血清ＨＩ力価を引き出し得ることを確証することであった。図１は、種々のワクチンを用いて42日目（即ち、ワクチン接種後14日目）に血清中で観察されたＨＩ力価を示す。
【０１８９】
鼻腔内ワクチンを非経口ワクチンと比較するために、観察されたＨＩ力価に関して、統計学的分析（Tukey-HSD統計比較検定）を実施した。Plain１および２群で観察されたＨＩ力価は、３つのフルー株農地の２つ（Ａ／Ｈ１Ｎ１およびＢ株）に関して非経口ワクチンにより誘導されたものとは有意に異なった（ｐ＜0.05）。抗Ａ／Ｈ３Ｎ２株力価は有意に異ならなかった。Ｌ９処方物は、３つの株のうちの２つ（Ａ／Ｈ３Ｎ２およびＢ株）に関して非経口ワクチンと同様に免疫原性であった。対比すると、Ｌ９＋ＭＰＬ処方ワクチンは、３つのフルー株に対するＨＩ抗体を引き出し、その力価は非経口ワクチンで観察されたものと有意に異ならなかった。
【０１９０】
第二の目的は、鼻腔内ワクチン接種に対する鼻ＩｇＡ応答が筋内追加免疫された動物で観察されたものより優れているか否かを確定することであった。図２は、追加免疫接種後14日目に（42日目）に記録された鼻ＩｇＡ応答を示す。
【０１９１】
鼻腔内処方物のいずれかにより誘導された応答間に有意差は認められなかった。鼻腔内投与は、非経口経路と比較して、2〜4倍高い応答を引き出した。最後に、Ｌ９＋ＭＰＬを用いて処方したワクチンは、他の鼻腔内ワクチンと比較して同一レベルの応答を維持し得たが、しかし抗原用量は低かった。
【０１９２】
結論
Ｌ９＋ＭＰＬを用いて処方した三価スプリットインフルエンザ抗原（0.75 μgＨＡ＋0.5％ラウレス９＋5 μgＭＰＬ）は、ＨＩ抗体応答に関して、最高免疫原性の鼻腔内ワクチン処方物であった。
【０１９３】
試験した鼻送達ワクチンは全て、局所的ＩｇＡ抗体の誘導に際して、非経口投与ワクチンより効力が高かった。Ｌ９＋ＭＰＬ処方物は、他の処方物と同様の応答を誘導したが、しかし低抗原含量であった。
【０１９４】
６．２  第二の実験では、初回免疫に用いたものとは異なる株を用いて、マウスを鼻腔内免疫感作した。
【０１９５】
抗原ドリフトは、年毎の流行に関与する．フルーワクチンに毎年含入される株は、最も一般的に見出されるものである。多少は関連があるさらに別の株も、野外に見出され得る。その結果、最良の候補フルーワクチンは、有効な広範囲の株に対する防御を誘導しなければならない。したがって、ワクチンに含有されたものとは異種の株による「初回免疫」後に所定の鼻腔内処方物がどの程度免疫応答を引き出し得るかを調べることは興味深いことであった。
【０１９６】
実験手順
ヒトにおいて起こる天然初回免疫を模倣するために、β−プロピオラクトン不活性化卵由来三価全インフルエンザウイルス（A/Johannesburg/82/96Ｈ１Ｎ１、A/ Johannesburg/33/94Ｈ３Ｎ２およびB/Panama/45/90；5 μgＨＡ／株を用いて、０日目に雌Balb/cマウス（8週齢）に鼻腔内「初回免疫」を施した。
【０１９７】
28日目に、マウス（10匹／群）に、以下の三価ワクチン処方物（異種株としてA/Beijing/262/95Ｈ１Ｎ１、A/Sydney/5/97Ｈ３Ｎ２およびB/Harbin/7/94を含有する）を鼻腔内接種した：
【０１９８】
【表８】
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【０１９９】
マウスに関して試験した種々の鼻腔内ワクチン処方物中に含入された三価スプリットビリオンの量は、実施例７でヒト有志に投与した用量の1/10に対応する。
【０２００】
血清試料を42日目に収集し、血球凝集抑制（ＨＩ）抗体に関して試験した。屠殺（42日目）後、鼻洗浄を実施して、ＥＬＩＳＡによりＩｇＡ抗体力価に関して試験した。特異的ＩｇＡ抗体は終点力価（ＥＰＴ）として測定し、試料採集方法によるあらゆる差異を排除するために、特異的ＩｇＡ  ＥＰＴ／μgとして結果を表した。
【０２０１】
結果
試験の第一目的は、初回免疫のためにヘテロサブタイプ株が用いられる場合、鼻腔内ワクチン処方物がワクチン抗原に対する血清ＨＩ応答を引き出し得るか否かを確定することであった。図３は、種々のワクチン処方物を用いてワクチン接種後14日目（42日目）に血清中で観察されたＨＩ力価を示す。
【０２０２】
Ｌ９またはＬ９＋ＭＰＬを用いた鼻腔内処方物はすべて、３つのインフルエンザ株に対して向けられる免疫応答を引き出し得たが、これはプレーンワクチンの非経口投与により引き出されたものに匹敵した。統計学的分析（Tukey-HSD統計比較検定）は、全ての鼻腔内処方物により引き出された応答が非経口投与応答と有意に異ならない（ｐ＞0.05）ことを確証した。鼻腔内処方物内では、統計学的差は観察されなかった。さらにＬ９＋ＭＰＬおよびＬ９処方物は一般に、より免疫原性であり、前者は後者の半分の抗原含量を含有した（0.75 μg対1.5 μg  ＨＡ）。
【０２０３】
第二の目的は、（１）異種株に対する鼻特異的ＩｇＡ応答が鼻腔内ワクチン接種後に測定されるか否か、そして（２）この応答が筋内接種された動物で観察されたものより優れているか否かを確定することであった。図４は、免疫接種後14日目に（42日目）に記録された鼻特異的抗異種ＩｇＡ応答を示す。
【０２０４】
第二の目的の判定基準は、ともに満たされた。鼻腔内処方物は全て、プレーンワクチンを筋内注射した場合に観察されたものより３〜８倍高い３つの異種株に対するＩｇＡ応答を誘導した。ＩｇＡ応答の幅は、鼻腔内処方物ないでは有意に異ならなかった。
【０２０５】
異種ワクチン接種で観察された応答の大きさは、同種ワクチンに関するものと同一範囲に達した（図２参照）。さらに、Ｌ９＋ＭＰＬ処方ワクチンは、プレーンまたはＬ９処方物（3および1.5 μgＨＡ）と比較して、低容量の抗原（0.75 μgＨＡ）で同一の大きさの応答幅を維持し得た。
【０２０６】
結論
三価スプリットインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、吸収増強性界面活性剤またはアジュバント付加を用いても用いなくても、血清ＨＩ抗体およびフルーワクチン株に特異的な鼻腔内ＩｇＡの両方に関して、異種サブタイプ応答を誘導し得た。
【０２０７】
群間の差は統計学的に有意でなかったが、しかし、三価スプリットビリオンがＬ９またはＬ９＋ＭＰＳを用いて処方される場合、ワクチンは一般に、より有効な全身性ならびに局所性免疫応答を誘導した。さらに、Ｌ９含有ワクチンと比較して、Ｌ９＋ＭＰＬを用いて処方したワクチンは、同一レベルの免疫性を誘導したが、しかし低抗原投与量であった。
【０２０８】
実施例７−年齢18〜40歳の健常成人における筋内投与三価スプリットビリオンインフルエンザワクチンと比較した場合の１用量スケジュール後に投与されるラウレス９またはラウレス９＋３Ｄ−ＭＰＬを含有する場合および含有しない場合の鼻腔内投与卵由来三価スプリットビリオンインフルエンザワクチンの評価
この試験では、約120名の健常男女被験者において、ワクチンに対する局所粘膜および全身免疫応答を評価する。
【０２０９】
候補ワクチンの組成
卵由来スプリットインフルエンザ抗原の４つの処方物を、本試験で評価する。候補ワクチンを鼻腔内投与する。さらに、SmithKline Beecham Biologicalsのフルアリックス（商標）−筋内投与される不活性化スプリットビリオンインフルエンザワクチン−を、比較体として用いる。
【０２１０】
候補鼻腔内ワクチンは、フルアリックス（商標）の処方物中に用いられる３つの不活化スプリットビリオン抗原を含有する。株は、2000年南半球シーズン用にＷＨＯが推奨したものである。種々の処方物の一般的説明を表６に示す。
【０２１１】
【表９】
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【０２１２】
Ｌ９またはＭＰＬを含有しない鼻腔内三価スプリットインフルエンザワクチン（30 μg用量および15 μg用量）
１用量の容積は、0.2 mlである。
【０２１３】
表７：
【０２１４】
【表１０】
2003509451.tif 000010
【０２１５】
Ｌ９を用いて処方した鼻腔内三価スプリットインフルエンザワクチン（15 μg用量および7.5 μg用量）
１用量の容積は、0.2 mlである。処方物は、表７に示すようなものであり、さらに1 mgのラウレス９／用量を、15または7.5 μg用量のＨＡ／株と一緒に含む。ラウレス９は、Kreussler（Germany）から得られる。
【０２１６】
Ｌ９＋３Ｄ−ＭＰＬを用いて処方した鼻腔内三価スプリットインフルエンザワクチン（7.5 μg用量）
１用量の容積は、0.2 mlである。処方物は、表７に示すようなものであり、さらに1 mgのラウレス９および50 μgの３Ｄ−ＭＰＬ／用量を、7.5 μgのＨＡ／株と一緒に含む。
【０２１７】
比較体として用いられるフルアリックス（商標）市販不活性三価スプリットインフルエンザワクチン
フルアリックス（商標）2000（南半球）を比較体として用いる。この0.5 ml用量ワクチンは、筋内投与される。
【０２１８】
１用量は、各インフルエンザウイルス株（A/New Caledonia/20/99（Ｈ１Ｎ１）−A/Sydney/5/97（Ｈ３Ｎ２）−B/Yamanashi/166/98）の15 μg／用量の血球凝集素、ならびに防腐剤としての50 μg／用量のチオメルサールを含有する。
【０２１９】
三価スプリットインフルエンザ候補ワクチンの処方
１．３つの不活性化スプリットビリオンの濃縮
最終候補ワクチンの処方前に、接線流動濾過により、３つの不活性化スプリットビリオンを別々に1000〜1500 μgＨＡ／mlまで濃縮した。10kDaのカットオフを有するセルローストリアセテート膜を備えた膜カセットを用いた。
【０２２０】
２．三価スプリットインフルエンザワクチンの処方
処方流れ図を以下に示す：
【０２２１】
【表１１】
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【０２２２】
ラウレス９含有処方物に関しては、ｐＨ調整直前に0.5％までのラウレス９を付加し、室温で15分間、撹拌を継続する。
【０２２３】
ラウレス９＋３Ｄ−ＭＰＬ含有処方物に関しては、ラウレス９付加の直前に250 μg/mlの３Ｄ−ＭＰＬを付加し、処方物を15分間撹拌後、ラウレス９を付加する。
【０２２４】
三価スプリットインフルエンザ候補ワクチンの充填
最終バルクを、Pfeiffer(Germany)からのタイプ−１(Ph. Eur.)ガラスバイアル中に無菌的に充填する。充填直後に、これらのバイアルをゴム栓で密閉する。操作は全て、無菌室（層流系）で実施する。
【０２２５】
充填および密閉後、栓をしたバイアルをプラスチック製プランジャー中に挿入し、噴霧発生のための噴霧ノズル用具に組み立てる。この用具は、100 μlの２回の噴霧の投与を可能にする。
【０２２６】
結果
全被験者に関して、以下の分析を実行する：
１．  0、21＆42日目：粘膜ＩｇＡ（局所免疫応答）ＥＬＩＳＡ力価。ワクチン中に示される３つのインフルエンザウイルス株の各々に対して別々に試験する。
【０２２７】
２．  0、21＆42日目：血清血球凝集素抑制（ＨＩ）抗体力価。３つのインフルエンザ株の各々に対して別々に試験する。
【０２２８】
これらから、以下のものが得られる：
１．全時点での血清ＨＩ抗体ＧＭＴ（95％信頼区間を有する）
２．ＨＩに関して：21日目のセロコンバージョン率
３．ＨＩに関して：21日目のコンバージョン率
４．ＨＩに関して：21＆42日目の防御率
５．ＩｇＡのみに関して：0〜21日目および0〜42日目にＩｇＡ力価の2倍および4倍増を有する被験者のパーセンテージ。