(57)【要約】  ＢＣＬ−２阻害剤とＭＣＬ１阻害剤とを含む組み合わせ並びにその組成物及び使用。
2019528250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同時、連続的又は別個の使用のための、
（ａ）式（Ｉ）：
【化７】
2019528250.tif 000033
［式中、
Ｘ及びＹは、炭素原子又は窒素原子を表わし、それらは、２つの炭素原子又は２つの窒素原子を同時に表わし得ないと理解され、
Ａ１及びＡ２は、それらを担持している原子と共に、Ｘ又はＹにより表わされた窒素に加えて、酸素、硫黄及び窒素から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含有することができる、５、６又は７個の環員で構成される、場合により置換されている芳香族又は非芳香族複素環Ｈｅｔを形成しており、当該窒素は、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は基−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ａｌｋ（式中、Ａｌｋは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基である）を表わす基により置換されていてよいと理解され、
あるいは、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又はシクロアルキルを表わし、
Ｔは、水素原子、１〜３個のハロゲン原子により場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、基（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−ＮＲ１Ｒ２又は基（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−ＯＲ６を表わし、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
あるいは、Ｒ１及びＲ２は、それらを担持している窒素原子と共に、ヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ３は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、シクロアルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基（ここで、アルキル部分は、直鎖もしくは分枝鎖である）、ヘテロシクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表わし、先行する基又はそれらの可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｒ４は、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、先行する基又はそれらの可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｒ５は、水素原子もしくはハロゲン原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を表わし、
Ｒ６は、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、Ｒ７、ハロゲン原子、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、ヒドロキシ基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル基、トリフルオロメトキシ基、−ＮＲ７Ｒ７’、ニトロ、Ｒ７−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ＮＲ７Ｒ７’−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ＮＲ７Ｒ７’−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−、Ｒ７−ＳＯ２−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ヘテロシクロアルキル基を表わし、あるいは、対（Ｒａ、Ｒｂ）、（Ｒｂ、Ｒｃ）又は（Ｒｃ、Ｒｄ）のうちの１つの置換基は、それらを担持している炭素原子と共に、酸素及び硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を含有することができる、５〜７個の環員で構成される環を形成しており、また、先に定義された環の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよい、又は、ハロゲン及び直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される１〜３個の基により置換されていてよいと理解され、
Ｒ７及びＲ７’は、それぞれ独立して、水素、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、アリール又はヘテロアリールを表わし、あるいは、Ｒ７及びＲ７’は、それらを担持している窒素原子と共に、５〜７個の環員で構成される複素環を形成しており、
式（Ｉ）で示される化合物がヒドロキシ基を含有する場合、後者は、場合により、下記基：−ＯＰＯ（ＯＭ）（ＯＭ’）、−ＯＰＯ（ＯＭ）（Ｏ−Ｍ１＋）、−ＯＰＯ（Ｏ−Ｍ１＋）（Ｏ−Ｍ２＋）、−ＯＰＯ（Ｏ−）（Ｏ−）Ｍ３２＋、−ＯＰＯ（ＯＭ）（Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎＣＨ３）又は−ＯＰＯ（Ｏ−Ｍ１＋）（Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎＣＨ３）のうちの１つに変換されていてよいと理解され、ここで、Ｍ及びＭ’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを表わし、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルは両方とも、５〜６個の環員で構成されており、一方、Ｍ１＋及びＭ２＋は、それぞれ独立して、薬学的に許容し得る一価のカチオンを表わし、Ｍ３２＋は、薬学的に許容し得る二価のカチオンを表わし、ｎは、１〜５の整数であり、
−「アリール」は、フェニル、ナフチル、ビフェニル又はインデニル基を意味し、
−「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの芳香族部分を有し、酸素、硫黄及び窒素（四級窒素を含む）から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する、５〜１０個の環員で構成される、任意の単環式又は二環式の基を意味し、
−「シクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、
−「ヘテロシクロアルキル」は、３〜１０個の環員で構成され、酸素、硫黄、ＳＯ、ＳＯ２及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族、縮合又はスピロ基を意味すると理解され、
該定義されたアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基並びに基アルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシは、ヒドロキシル、モルホリン、３−３−ジフルオロピペリジン又は３−３−ジフルオロピロリジンにより場合により置換されている直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル；（Ｃ３〜Ｃ６）スピロ；モルホリンより場合により置換されている直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ；（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｓ−；ヒドロキシル；オキソ；Ｎ−オキシド；ニトロ；シアノ；−ＣＯＯＲ’；−ＯＣＯＲ’；ＮＲ’Ｒ’’；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル；トリフルオロメトキシ；（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルスルホニル；ハロゲン；１つ以上のハロゲンにより場合により置換されているアリール；ヘテロアリール；アリールオキシ；アリールチオ；シクロアルキル；１つ以上のハロゲン原子又はアルキル基により場合により置換されているヘテロシクロアルキルから選択される１〜３個の基により置換されていることができ、ここで、Ｒ’及びＲ’’は、それぞれ独立して、水素原子又はメトキシにより場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
式（Ｉ）で定義されたＨｅｔ基は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ＮＲ１’Ｒ１’’及びハロゲンから選択される１〜３個の基により置換されていることができ、Ｒ１’及びＲ１’’は、上記言及された基Ｒ’及びＲ’’について定義されたとおりであると理解される］
で示されるＢＣＬ−２阻害剤、そのエナンチオマー、ジアステレオ異性体又は薬学的に許容し得る酸もしくは塩基とのそれらの付加塩と、
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤と
を含む、
組み合わせ。
【請求項２】
同時、連続的又は別個の使用のための、
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）式（ＩＩ）：
【化８】
2019528250.tif 000034
［式中、
Ａは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ基、シアノ、−ＮＷ１０Ｗ１０’、−Ｃｙ６又はハロゲン原子を表わし、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４及びＷ５は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、シアノ、ニトロ基、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−ＮＷ８Ｗ８’、−Ｏ−Ｃｙ１、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−Ｗ９、−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ８Ｗ８’、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８’、−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−ＳＯ２−ＮＷ８Ｗ８’、−ＳＯ２−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）を表わし、
あるいは、対（Ｗ１、Ｗ２）、（Ｗ２、Ｗ３）、（Ｗ１、Ｗ３）、（Ｗ４、Ｗ５）の１つの置換基は、２つの隣接する炭素原子上にグラフトされた場合、それらを担持している炭素原子と共に、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有することができる、５〜７個の環員で構成される芳香族又は非芳香族環を形成しており、得られた環は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、−ＮＷ１０Ｗ１０’、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１又はオキソから選択される基により置換されていてよいと理解され、
Ｘ’は、炭素原子又は窒素原子を表わし、
Ｗ６は、水素、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル基、アリール、ヘテロアリール基、アリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基、ヘテロアリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基を表わし、
Ｗ７は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、−Ｃｙ３、−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−Ｃｙ３−Ｃｙ４、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｏ−Ｃｙ３、−Ｃｙ３−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ４、ハロゲン原子、シアノ、−Ｃ（Ｏ）−Ｗ１１、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ１１Ｗ１１’を表わし、
Ｗ８及びＷ８’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１を表わし、
あるいは、（Ｗ８、Ｗ８’）は、それらを担持している窒素原子と共に、５〜７個の環員で構成される芳香族又は非芳香族環を形成しており、同環員は、窒素原子に加えて、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有することができ、当該窒素は、水素原子を表わす基又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基により置換されていてよいと理解され、可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｗ９は、−Ｃｙ１、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−ＮＷ８−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−Ｃｙ２−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ５、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ８Ｗ８’、−ＮＷ８Ｗ８’、−ＯＷ８、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−ＯＷ８、−ＳＯ２−Ｗ８、−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｗ８、
【化９】
2019528250.tif 000035
を表わし、
該定義されたアンモニウムは、両性イオン形態として存在し、又は、一価のアニオン性対イオンを有することができ、
Ｗ１０、Ｗ１０’、Ｗ１１及びＷ１１’は、それぞれ独立して、水素原子又は場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１２は、水素又はヒドロキシ基を表わし、
Ｗ１３は、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１４は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）（Ｏ−）基、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）（ＯＷ１６）基、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＷ１６）（ＯＷ１６’）基、−Ｏ−ＳＯ２−Ｏ−基、−Ｏ−ＳＯ２−ＯＷ１６基、−Ｃｙ７、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ１５基、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ１５基又は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ１５Ｗ１５’基を表わし、
Ｗ１５及びＷ１５’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１６及びＷ１６’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又はアリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基を表わし、
Ｃｙ１、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ４、Ｃｙ５、Ｃｙ６及びＣｙ７は、それぞれ独立して、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール又はヘテロアリール基を表わし、
ｎは、０又は１に等しい整数であり、
−「アリール」は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、インダニル又はインデニル基を意味し、
−「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの芳香族部分を有し、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、５〜１０個の環員で構成される、任意の単環式又は二環式の基を意味し、
−「シクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、
−「ヘテロシクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有し、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、同非芳香族炭素環基は、縮合、架橋又はスピロ環系を含むことができると理解され、
該定義されたアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基並びにアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、オキソ、−ＮＷ’Ｗ’’、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ’又は−ＣＯ−ＮＷ’Ｗ’’により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル；直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、−ＮＷ’Ｗ’’又はヒドロキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｓ−；ヒドロキシ；オキソ；Ｎ−オキシド；ニトロ；シアノ；−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ’；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ’；−ＣＯ−ＮＷ’Ｗ’’；−ＮＷ’Ｗ’’；−（Ｃ＝ＮＷ’）−ＯＷ’’；直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル；トリフルオロメトキシ；又はハロゲンから選択される１〜４個の基により置換されていることができ、Ｗ’及びＷ’’は、それぞれ独立して、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わすと理解され、先の可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解される］
で示されるＭＣＬ１阻害剤、そのエナンチオマー、ジアステレオ異性体及びアトロプ異性体並びに薬学的に許容し得る酸又は塩基とのそれらの付加塩と
を含む、
組み合わせ。
【請求項３】
ＭＣＬ１阻害剤が、請求項２で定義された式（ＩＩ）で示される化合物である、請求項１記載の組み合わせ。
【請求項４】
ＢＣＬ−２阻害剤が、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミドである、請求項１〜３のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項５】
ＢＣＬ−２阻害剤が、５−（５−クロロ−２−｛［（３Ｓ）−３−（モルホリン−４−イルメチル）−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル］カルボニル｝フェニル）−Ｎ−（５−シアノ−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドである、請求項１〜３のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６】
Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミドが、塩酸塩の形態にある、請求項４記載の組み合わせ。
【請求項７】
５−（５−クロロ−２−｛［（３Ｓ）−３−（モルホリン−４−イルメチル）−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル］カルボニル｝フェニル）−Ｎ−（５−シアノ−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドが、塩酸塩の形態にある、請求項５記載の組み合わせ。
【請求項８】
組み合わせ処置中のＮ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミドの用量が、５０mg〜１５００mgである、請求項４又は６記載の組み合わせ。
【請求項９】
ＢＣＬ−２阻害剤が、週１回投与される、請求項１〜８のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項１０】
Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミドが、組み合わせ処置中に１日１回投与される、請求項６又は８記載の組み合わせ。
【請求項１１】
ＢＣＬ−２阻害剤が、ＡＢＴ−１９９である、請求項１〜３のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項１２】
ＭＣＬ１阻害剤が、（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（５−フルオロフラン−２−イル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−（２−｛［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル］メトキシ｝フェニル）プロパン酸である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項１３】
ＭＣＬ１阻害剤が、（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（４−フルオロフェニル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−（２−｛［２−（２−メトキシフェニル）ピリミジン−４−イル］メトキシ｝フェニル）プロパン酸である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項１４】
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、経口投与される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項１５】
ＢＣＬ−２阻害剤が、経口投与され、ＭＣＬ１阻害剤が、静脈内投与される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項１６】
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、静脈内投与される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項１７】
ガンの処置における使用のための、請求項１〜１６のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項１８】
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に併せて治療上有効な量で提供される、請求項１７記載の使用のための組み合わせ。
【請求項１９】
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に相乗的に有効な量で提供される、請求項１７記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２０】
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置において各化合物に必要とされる用量の減少を可能にする一方で、有効なガン処置を提供し、最終的に副作用の減少をもたらす相乗的に有効な量で提供される、請求項１７記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２１】
ガンが、白血病である、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２２】
白血病が、急性骨髄性白血病、Ｔ−ＡＬＬ又はＢ−ＡＬＬである、請求項２１記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２３】
ガンが、骨髄異形成症候群又は骨髄増殖性疾患である、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２４】
ガンが、リンパ腫である、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２５】
リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫である、請求項２４記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２６】
非ホジキンリンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫又はマントル細胞リンパ腫である、請求項２５記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２７】
ガンが、多発性骨髄腫である、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２８】
ガンが、神経芽細胞腫である、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ。
【請求項２９】
ガンが、小細胞肺ガンである、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の使用のための組み合わせ。
【請求項３０】
１つ以上の賦形剤を更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項３１】
ガン処置用の医薬の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項記載の組み合わせの使用。
【請求項３２】
ガンが、白血病である、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
白血病が、急性骨髄性白血病、Ｔ−ＡＬＬ又はＢ−ＡＬＬである、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
ガンが、骨髄異形成症候群又は骨髄増殖性疾患である、請求項３１記載の使用。
【請求項３５】
ガンが、リンパ腫である、請求項３１記載の使用。
【請求項３６】
リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫である、請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
非ホジキンリンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫又はマントル細胞リンパ腫である、請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
ガンが、多発性骨髄腫である、請求項３１記載の使用。
【請求項３９】
ガンが、神経芽細胞腫である、請求項３１記載の使用。
【請求項４０】
ガンが、小細胞肺ガンである、請求項３１記載の使用。
【請求項４１】
同時、連続的又は別個の投与のための、
（ａ）請求項１で定義された式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤とを、
別個に又は一緒に含有し、
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に有効な量で提供される、
医薬。
【請求項４２】
同時、連続的又は別個の投与のための、
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）請求項２で定義された式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤とを
別個に又は一緒に含有し、
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に有効な量で提供される、
医薬。
【請求項４３】
ガンを処置する方法であって、
同処置を必要とする対象に、併せて治療上有効な量の、（ａ）請求項１で定義された式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤と（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤とを投与することを含む、
方法。
【請求項４４】
ガンを処置する方法であって、
同処置を必要とする対象に、併せて治療上有効な量の、（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と（ｂ）請求項２で定義された式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤とを投与することを含む、
方法。
【請求項４５】
（ｉ）少なくとも１つの化学療法処置に抵抗性である患者又は（ｉｉ）化学療法による処置後に再発した患者又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の患者を感作するための方法であって、
併せて治療上有効な量の、（ａ）請求項１で定義された式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤と（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤とを、前記患者に投与することを含む、
方法。
【請求項４６】
（ｉ）少なくとも１つの化学療法処置に抵抗性である患者又は（ｉｉ）化学療法による処置後に再発した患者又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の患者を感作するための方法であって、
併せて治療上有効な量の、（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と（ｂ）請求項２で定義された式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤とを、前記患者に投与することを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＢＣＬ−２阻害剤とＭＣＬ１阻害剤との組み合わせに関する。また、本発明は、ガン、特に、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫及び肺ガン、とりわけ、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及び小細胞肺ガンの処置における前記組み合わせの使用に関する。このような組み合わせの投与に適した医薬製剤も提供される。
【０００２】
発明の背景
アポトーシスは、発ガン性ストレス及び化学療法剤を含む種々の細胞傷害性刺激により開始される高度にレギュレーションされた細胞死経路である。アポトーシスの回避は、ガンの特徴であり、多くの化学療法剤の有効性は、内因性ミトコンドリア経路の活性化により決まることが示されてきた。ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の３つの異なるサブグループ：（ｉ）アポトーシス促進性ＢＨ３（ＢＣＬ−２ホモロジー３）ｏｎｌｙタンパク質；（ｉｉ）生存促進性メンバー、例えば、ＢＣＬ−２自体、ＢＣＬ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、ＭＣＬ１及びＢＣＬ−２ａ１；並びに（ｉｉｉ）アポトーシス促進性エフェクタータンパク質ＢＡＸ及びＢＡＫにより、内因性アポトーシス経路が制御される（Czabotar et al, Nature Reviews Molecular cell biology 2014 Vol 15:49-63）。ＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバーの過剰発現は、多くのガン、特に、血液悪性腫瘍、例えば、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫／びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＦＬ／Ｄ）及び多発性骨髄腫において観察される（Adams and Cory Oncogene 2007 Vol 26:1324-1337）。抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ及びＢｃｌ−ｗの、近年開発されたＢＨ３模倣薬、例えば、ＡＢＴ−１９９及びＡＢＴ−２６３による薬理学的阻害が、アポトーシスが誘導され、ガンにおいて腫瘍退縮を引き起こす治療戦略として出現した（Zhang et al, Drug Resist Updat 2007 Vol 10(6):207-17）。それにもかかわらず、これらの薬剤に対する耐性のメカニズムが観察され、研究されている（Choudhary GS et al, Cell Death and Disease 2015 Vol 6, e1593; doi:10.1038/cddis.2014.525）。
【０００３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、造血幹細胞のクローン形質転換から生じ、正常な骨髄機能の麻痺及び深刻な汎血球減少症による合併症による死亡をもたらす、急性致死性血液ガンである。ＡＭＬは、成人白血病全体の２５％を占め、最も高い発生率が、米国、オーストラリア及びヨーロッパで発生している（WHO. GLOBOCAN 2012. Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012. International Agency for Research on Cancer）。世界的には、毎年約８８，０００の新規症例が診断されている。ＡＭＬは、全ての白血病のうち生存率が最も低い状態が続いており、予想される５年生存率はわずか２４％である。ＡＭＬの標準治療（シタラビンとアントラサイクリンの併用）は４０年以上前から考えられてきたが、この疾患のターゲット療法の導入の成功は、依然として困難な目標であった。更に、ＡＭＬ患者に対する無化学療法処置の選択肢の必要性が依然として存在する。ＡＭＬにおけるターゲット療法の概念は、この疾患が多クローン階層として進展し、白血病サブクローンの急速な増殖が薬剤耐性及び疾患再発の主因であるという認識によって妨げられている（Ding L et al, Nature 2012 481:506-10）。最近の臨床研究により、ＡＭＬの処置におけるＢＣＬ−２阻害剤の有効性が実証されている（Konopleva M et al, American Society of Hematology 2014:118）。これらの阻害剤は、臨床的に活性であるが、ＡＭＬにおける全体的な有効性を増強するためには、おそらく、他のＢＣＬ−２ファミリーメンバーがターゲット化される必要があるであろう。ＢＣＬ−２に加えて、ＭＣＬ１も、ＡＭＬにおける細胞生存の重要なレギュレーターとして特定されている（Glaser SP et al, Genes & development 2012 26:120-5）。
【０００４】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄（ＢＭ）におけるクローン形質細胞の蓄積を特徴とする、稀で治癒不能な疾患であり、全ての血液悪性腫瘍の１０％を占める。ヨーロッパでは、毎年約２７，８００の新規症例が存在する。近年、ボルテゾミブ及びレナリドミドを含む新薬並びに自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）の登場により、生存率が改善している。しかしながら、これらの新薬に対する応答は持続しないことが多く、それは特に、再発／難治性患者及び予後不良（望ましくない細胞遺伝学的プロファイル）の患者には、新たな処置が必要とされるという証拠となった。最近の研究から、多発性骨髄腫患者のサブグループにおけるＢＣＬ−２阻害剤の有望な活性が示唆されている（Touzeau C, Dousset C, Le Gouill S, et al. Leukemia. 2014; 28(1):210-212）。ＭＣＬ１も、多発性骨髄腫における細胞生存の重要なレギュレーターとして特定されている（Derenne S, Monia B, Dean NM, et al. Blood. 2002;100(1):194-199；Zhang B, Gojo I, Fenton RG. Blood. 2002;99(6):1885-1893）。
【０００５】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、非ホジキンリンパ腫の最も一般的な型（２５〜３５％）であり、新規患者は、２４，０００人／年である。ＤＬＢＣＬは、ダブルヒット／ＭＹＣ転座、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）及び胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）を含む十数以上のサブタイプを有する異種性疾患である。現在の免疫化学療法（Ｒ−ＣＨＯＰ）により、ＤＬＢＣＬ患者の約６０％が治癒されるが、残りの４０％は、治療選択肢がほとんどなく、予後は不良である。このため、生存促進性ＮＦ−κＢ経路の構成的活性化を示すＡＢＣサブタイプ（ＤＬＢＣＬの３５％）などの高リスクＤＬＢＣＬにおいて、治癒率及び臨床アウトカムを向上させるための高い医学的必要性が存在する。
【０００６】
神経芽細胞腫（ＮＢ）は、乳児及び小児において最も一般的な頭蓋外固形腫瘍であり、現在低リスク、中リスク又は高リスクに層別化されている全ての小児腫瘍の８％〜１０％を表わす。神経芽細胞腫（ＮＢ）は、小児集団における全てのガン関連死の約１５％を占める。ＮＢの発生率は、１５歳未満の小児１００万人あたりに１０．２症例であり、年間５００近くの新規症例が報告されている。診断年齢の中央値は、２２ヵ月である。ＮＢ患者のアウトカムは、過去３０年間で着実に改善し、５年生存率は、５２％から７４％に上昇した。しかしながら、高リスク群の患者の５０〜６０％が再発を経験し、したがって、死亡率のわずかな減少しか見られないと推定される。再発までの期間の中央値は、１３．２ヵ月であり、再発した患者の７３人％は、１８ヵ月以上であった。まとめると、ＮＢ全生存率は、より積極的な治療にもかかわらず、非常に悪いままである（５年で約２０％）（Colon and Chung, Adv Pediatr 2013 58:297-311）。処置の中心は、化学療法、外科的切除及び／又は放射線療法からなる。しかしながら、多くの侵襲性ＮＢは、化学療法剤に対する耐性を発達させ、再発の可能性を非常に高くしている（Pinto et al, J Clin Oncol 201533:3008-11）。リスク層別化により決まるＮＢの標準治療は、多くの場合、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ２）及びビンクリスチンである。化学療法に初期に応答した後の再発が、特に高リスクＮＢにおける処置失敗の主な理由である。
【０００７】
化学療法抵抗性は、生存促進性ＢＣＬ−２タンパク質（例えば、ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１タンパク質）の活性化に由来し得る。ＮＢは、高レベルのＢＣＬ−２及びＭＣＬ１を発現し、低レベルのＢＣＬ−ＸＬを発現する。ＢＣＬ−２の阻害は、細胞を死に感作し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＢ腫瘍退縮を誘導する（Ham et al, Cancer Cell 29:159-172）。ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の拮抗作用は、高リスクＮＢにおける化学療法を回復させる（Lestini et al, Cancer Biol Ther 2009 8:1587-1595；Tanos et al, BMC Cancer 2016 16:97）。このため、ナイーブ又は抵抗性患者に、ＢＣＬ−２阻害剤とＭＣＬ１阻害剤とを併用することには、高い合理性が存在する。
【０００８】
本発明は、ＢＣＬ−２阻害剤とＭＣＬ１阻害剤との新規な組み合わせを提供する。その結果から、ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１をターゲットにする強力な小分子の開発により、高度に相乗的なアポトーシス促進活性が、初代ヒトＡＭＬサンプル（図２Ａ及び１７）及びＡＭＬ（図９、１３及び１４）、多発性骨髄腫（実施例４）、リンパ腫（図４及び１２）、神経芽細胞腫（図１０）、Ｔ−ＡＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ細胞系統（図１１）並びに小細胞肺ガン細胞系統（図１５（ａ）〜（ｅ））において明らかにされることが示される。また、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の併用ターゲット化が、マウス及びラットにおけるＡＭＬ及びリンパ腫異種移植モデルにおいて耐容用量で有効であり（図２、５、６、７、８及び１６）、ＡＭＬにおいて再発までの時間を劇的に延ばす（図２Ｂ及び２Ｃ）ことも示す。更に、クローン原性アッセイにおいて、本発明者らは、ＢＣＬ−２＋ＭＣＬ１ターゲット化が、マウスにおける以前のＭＣＬ１遺伝子ターゲット化実験とは対照的に、白血病原性細胞に対して特異的に毒性であるが、正常な造血幹細胞に対しては毒性でないことを実証する（図３）。これらの強力で選択的な阻害剤の開発の前までは、ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の両方のターゲットの実現可能性は依然として不明であった。以前の系統特異的欠失モデルからは、ＭＣＬ１の長期除去の結果として、心臓（Wang X et al, Genes & development. 2013;27(12):1351-1364；Thomas RL et al, Genes & development. 2013;27(12):1365-1377）、顆粒球／造血（Opferman J et al, Science's STKE. 2005;307(5712):1101；Dzhagalov I et al, Blood. 2007;109(4):1620-1626；Steimer DA et al, Blood. 2009;113(12):2805-2815）、胸腺細胞（Dunkle A et al, Cell Death & Differentiation. 2010;17(6):994-1002）、ニューロン（Arbour N et al, Journal of Neuroscience. 2008;28(24):6068-6078）及び肝機能（Hikita H et al, Hepatology. 2009;50(4):1217-1226；Vick B et al, Hepatology. 2009;49(2):627-636）に対する潜在的なリスクが示された。これらの懸念にもかかわらず、週１回、週２回及び毎日（連続５日間）でさえ、ＭＣＬ１の新しい強力な短時間作用性薬理学的阻害剤の静脈内送達が、近年、十分に許容され、ＡＭＬを含むｉｎ  ｖｉｖｏにおける広範なガンに対して活性であることが示されている（Kotschy A et al, Nature. 2016;538(7626):477-482；ＷＯ第２０１５／０９７１２３号）。ＭＣＬ１タンパク質の短い半減期は、重要な臓器におけるその再生のための十分な時間を可能にするため、ＭＣＬ１阻害剤の短期曝露に対する生理学的許容を可能にし得る（Yang T et al, Journal of cellular physiology. 1996;166(3):523-536）。今日まで、薬剤様効果を模倣するＢＣＬ−２及びＭＣＬ１のパルス状阻害は、遺伝子工学的アプローチを使用しては不可能であった。本発明のＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤を使用する研究により、これらの薬剤への間欠的曝露が主要な臓器系への同時毒性を伴わずに、高感受性疾患、例えば、ＡＭＬの間でアポトーシス及び臨床応答をトリガーするのに十分であり得るという概念実証が提供される。
【０００９】
ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の両方をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてターゲット化することの相乗効果並びに両方の抗アポトーシスタンパク質をターゲット化する場合の正常な骨髄産生に対する非毒性は、強力な小分子阻害剤の組み合わせによってのみ実証されている。これらの局面は、遺伝子ターゲティング実験の結果によっては予想されず、ＭＣＬ１欠失が造血幹細胞によりあまり許容されないことを予測したであろう。
【００１０】
発明の概要
本発明は、
（ａ）式（Ｉ）：
【化１】
2019528250.tif 000003
［式中、
Ｘ及びＹは、炭素原子又は窒素原子を表わし、それらは、２つの炭素原子又は２つの窒素原子を同時に表し得ないと理解され、
Ａ１及びＡ２は、それらを担持している原子と共に、Ｘ又はＹにより表わされた窒素に加えて、酸素、硫黄及び窒素から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含有することができる、５、６又は７個の環員で構成される、場合により置換されている芳香族又は非芳香族複素環Ｈｅｔを形成しており、当該窒素は、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は基−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ａｌｋ（式中、Ａｌｋは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基である）を表わす基により置換されていてよいと理解され、
あるいは、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又はシクロアルキルを表わし、
Ｔは、水素原子、１〜３個のハロゲン原子により場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、基（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−ＮＲ１Ｒ２又は基（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−ＯＲ６を表わし、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
あるいは、Ｒ１及びＲ２は、それらを担持している窒素原子と共に、ヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ３は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、シクロアルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基（ここで、アルキル部分は、直鎖もしくは分枝鎖である）、ヘテロシクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表わし、先行する基又はそれらの可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｒ４は、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、先行する基又はそれらの可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｒ５は、水素原子もしくはハロゲン原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を表わし、
Ｒ６は、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、Ｒ７、ハロゲン原子、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、ヒドロキシ基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル基、トリフルオロメトキシ基、−ＮＲ７Ｒ７’、ニトロ、Ｒ７−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ＮＲ７Ｒ７’−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ＮＲ７Ｒ７’−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−、Ｒ７−ＳＯ２−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ヘテロシクロアルキル基を表わし、あるいは、対（Ｒａ、Ｒｂ）、（Ｒｂ、Ｒｃ）又は（Ｒｃ、Ｒｄ）のうちの１つの置換基は、それらを担持している炭素原子と共に、酸素及び硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を含有することができる、５〜７個の環員で構成される環を形成しており、また、先に定義された環の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよい、又は、ハロゲン及び直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される１〜３個の基により置換されていてよいと理解され、
Ｒ７及びＲ７’は、それぞれ独立して、水素、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、アリール又はヘテロアリールを表わし、あるいは、Ｒ７及びＲ７’は、それらを担持している窒素原子と共に、５〜７個の環員で構成される複素環を形成しており、
式（Ｉ）で示される化合物がヒドロキシ基を含有する場合、後者は、場合により、下記基：−ＯＰＯ（ＯＭ）（ＯＭ’）、−ＯＰＯ（ＯＭ）（Ｏ−Ｍ１＋）、−ＯＰＯ（Ｏ−Ｍ１＋）（Ｏ−Ｍ２＋）、−ＯＰＯ（Ｏ−）（Ｏ−）Ｍ３２＋、−ＯＰＯ（ＯＭ）（Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎＣＨ３）又は−ＯＰＯ（Ｏ−Ｍ１＋）（Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎＣＨ３）のうちの１つに変換されていてよいと理解され、ここで、Ｍ及びＭ’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを表わし、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルは両方とも、５〜６個の環員で構成されており、一方、Ｍ１＋及びＭ２＋は、それぞれ独立して、薬学的に許容し得る一価のカチオンを表わし、Ｍ３２＋は、薬学的に許容し得る二価のカチオンを表わし、ｎは、１〜５の整数であり、
−「アリール」は、フェニル、ナフチル、ビフェニル又はインデニル基を意味し、
−「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの芳香族部分を有し、酸素、硫黄及び窒素（四級窒素を含む）から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する、５〜１０個の環員で構成される、任意の単環式又は二環式の基を意味し、
−「シクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、
−「ヘテロシクロアルキル」は、３〜１０個の環員で構成され、酸素、硫黄、ＳＯ、ＳＯ２及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族、縮合又はスピロ基を意味すると理解され、
該定義されたアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基並びに基アルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシは、ヒドロキシル、モルホリン、３−３−ジフルオロピペリジン又は３−３−ジフルオロピロリジンにより場合により置換されている直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル；（Ｃ３〜Ｃ６）スピロ；モルホリンより場合により置換されている直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ；（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｓ−；ヒドロキシル；オキソ；Ｎ−オキシド；ニトロ；シアノ；−ＣＯＯＲ’；−ＯＣＯＲ’；ＮＲ’Ｒ’’；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル；トリフルオロメトキシ；（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルスルホニル；ハロゲン；１つ以上のハロゲンにより場合により置換されているアリール；ヘテロアリール；アリールオキシ；アリールチオ；シクロアルキル；１つ以上のハロゲン原子又はアルキル基により場合により置換されているヘテロシクロアルキルから選択される１〜３個の基により置換されていることができ、ここで、Ｒ’及びＲ’’は、それぞれ独立して、水素原子又はメトキシにより場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
式（Ｉ）で定義されたＨｅｔ基は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ＮＲ１’Ｒ１’’及びハロゲンから選択される１〜３個の基により置換されていることができ、Ｒ１’及びＲ１’’は、上記言及された基Ｒ’及びＲ’’について定義されたとおりであると理解される］
で示されるＢＣＬ−２阻害剤、又はそのエナンチオマー、ジアステレオ異性体又は薬学的に許容し得る酸もしくは塩基とのそれらの付加塩と、
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤と
を含む、組み合わせに関する。
【００１１】
式（Ｉ）で示される前記化合物、それらの合成、ガンの処置におけるそれらの使用及びそれらの医薬製剤は、ＷＯ第２０１３／１１０８９０号、同第２０１５／０１１３９７号、同第２０１５／０１１３９９号及び同第２０１５／０１１４００号に記載されており、これらの文献の内容は、参照により組み入れられる。
【００１２】
特定の実施態様では、ＭＣＬ１阻害剤は、Ａ−１２２１０４７７（Cell Death and Disease 2015 6, e1590; doi:10.1038/cddis.2014.561）及びＷＯ第２０１５／０９７１２３号、同第２０１６／２０７２１６号、同第２０１６／２０７２１７号、同第２０１６／２０７２２５号、同第２０１６／２０７２２６号又は同第２０１６／０３３４８６号に記載された化合物から選択され、これらの文献の内容は、参照により組み入れられる。
【００１３】
また、本発明は、
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）式（ＩＩ）：
【化２】
2019528250.tif 000004
［式中、
Ａは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ基、シアノ、−ＮＷ１０Ｗ１０’、−Ｃｙ６又はハロゲン原子を表わし、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４及びＷ５は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、シアノ、ニトロ基、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−ＮＷ８Ｗ８’、−Ｏ−Ｃｙ１、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−Ｗ９、−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ８Ｗ８’、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８’、−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−ＳＯ２−ＮＷ８Ｗ８’、−ＳＯ２−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）を表わし、
あるいは、対（Ｗ１、Ｗ２）、（Ｗ２、Ｗ３）、（Ｗ１、Ｗ３）、（Ｗ４、Ｗ５）の１つの置換基は、２つの隣接する炭素原子上にグラフトされた場合、それらを担持している炭素原子と共に、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有することができる、５〜７個の環員で構成される芳香族又は非芳香族環を形成しており、得られた環は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、−ＮＷ１０Ｗ１０’、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１又はオキソから選択される基により置換されていてよいと理解され、
Ｘ’は、炭素原子又は窒素原子を表わし、
Ｗ６は、水素、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル基、アリール、ヘテロアリール基、アリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基、ヘテロアリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基を表わし、
Ｗ７は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、−Ｃｙ３、−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−Ｃｙ３−Ｃｙ４、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｏ−Ｃｙ３、−Ｃｙ３−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ４、ハロゲン原子、シアノ、−Ｃ（Ｏ）−Ｗ１１、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ１１Ｗ１１’を表わし、
Ｗ８及びＷ８’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１を表わし、
あるいは、（Ｗ８、Ｗ８’）は、それらを担持している窒素原子と共に、５〜７個の環員で構成される芳香族又は非芳香族環を形成しており、同環員は、窒素原子に加えて、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有していてよく、当該窒素は、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わす基により置換されていてよいと理解され、可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｗ９は、−Ｃｙ１、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−ＮＷ８−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−Ｃｙ２−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ５、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ８Ｗ８’、−ＮＷ８Ｗ８’、−ＯＷ８、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−ＯＷ８、−ＳＯ２−Ｗ８、−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｗ８、
【化３】
2019528250.tif 000005
を表わし、
該定義されたアンモニウムは、両性イオン形態として存在し、又は、一価のアニオン性対イオンを有することができ、
Ｗ１０、Ｗ１０’、Ｗ１１及びＷ１１’は、それぞれ独立して、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１２は、水素又はヒドロキシ基を表わし、
Ｗ１３は、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１４は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）（Ｏ−）基、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）（ＯＷ１６）基、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＷ１６）（ＯＷ１６’）基、−Ｏ−ＳＯ２−Ｏ−基、−Ｏ−ＳＯ２−ＯＷ１６基、−Ｃｙ７、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ１５基、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ１５基又は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ１５Ｗ１５’基を表わし、
Ｗ１５及びＷ１５’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１６及びＷ１６’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又はアリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基を表わし、
Ｃｙ１、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ４、Ｃｙ５、Ｃｙ６及びＣｙ７は、それぞれ独立して、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール又はヘテロアリール基を表わし、
ｎは、０又は１に等しい整数であり、
−「アリール」は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、インダニル又はインデニル基を意味し、
−「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの芳香族部分を有し、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、５〜１０個の環員で構成される、任意の単環式又は二環式の基を意味し、
−「シクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、
−「ヘテロシクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有し、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、同非芳香族炭素環基は、縮合、架橋又はスピロ環系を含むことができると理解され、
該定義されたアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基並びにアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、オキソ、−ＮＷ’Ｗ’’、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ’又は−ＣＯ−ＮＷ’Ｗ’’により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル；直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、−ＮＷ’Ｗ’’又はヒドロキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていることができる（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｓ−；ヒドロキシ；オキソ；Ｎ−オキシド；ニトロ；シアノ；−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ’；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ’；−ＣＯ−ＮＷ’Ｗ’’；−ＮＷ’Ｗ’’；−（Ｃ＝ＮＷ’）−ＯＷ’’； 直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル；トリフルオロメトキシ；又はハロゲンから選択される１〜４個の基により置換されていることができ、Ｗ’及びＷ’’は、それぞれ独立して、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わすと理解され、先の可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解される］
で示されるＭＣＬ１阻害剤、そのエナンチオマー、ジアステレオ異性体もしくはアトロプ異性体又は薬学的に許容し得る酸もしくは塩基とのそれらの付加塩とを含む、組み合わせに関する。
【００１４】
式（ＩＩ）で示される前記化合物、それらの合成、ガンの処置におけるそれらの使用及びそれらの医薬製剤は、ＷＯ第２０１５／０９７１２３号に記載されており、この文献の内容は、参照により組み入れられる。
【００１５】
特定の実施態様では、ＢＣＬ−２阻害剤は、下記化合物：４−（４−｛［２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル］メチル｝ピペラジン−１−イル）−Ｎ−［（３−ニトロ−４−｛［（オキサン−４−イル）メチル］アミノ｝フェニル）スルホニル］−２−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）オキシ］ベンズアミド（venetoclax又はＡＢＴ−１９９）；４−（４−｛［２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル］メチル｝ピペラジン−１−イル）−Ｎ−（４−｛［（２Ｒ）−４−（モルホリン−４−イル）−１−（フェニルスルファニル）ブタン−２−イル］アミノ｝−３−（トリフルオロメタンスルホニル）ベンゼンスルホニル］ベンズアミド（navitoclax又はＡＢＴ−２６３）；oblimersen（Ｇ３１３９）；obatoclax（ＧＸ１５−０７０）；ＨＡ１４−１；（±）−ゴシポール（ＢＬ−１９３）；（−）−ゴシポール（ＡＴ−１０１）；アポゴシポール；ＴＷ−３７；アンチマイシンＡ、ＡＢＴ−７３７（Oltersdorf T et al, Nature 2005 June 2;435(7042):677-81）並びにＷＯ第２０１３／１１０８９０号、同第２０１５／０１１３９７号、同第２０１５／０１１３９９号及び同第２０１５／０１１４００号に記載された化合物から選択される。これらの文献の内容は、参照により組み入れられる。
【００１６】
本発明の第１の態様によれば、
（ａ）本明細書に記載された式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）本明細書に記載された式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤と
を含む組み合わせが提供される。
【００１７】
別の実施態様では、本発明は、同時、連続的又は別個の使用のための、
（ａ）化合物１：Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミド又はその薬学的に許容し得る塩と、
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤と
を含む組み合わせを提供する。
【００１８】
別の実施態様では、本発明は、同時、連続的又は別個の使用のための、
（ａ）化合物４：５−（５−クロロ−２−｛［（３Ｓ）−３−（モルホリン−４−イルメチル）−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル］カルボニル｝フェニル）−Ｎ−（５−シアノ−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド又はその薬学的に許容し得る塩と、
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤と
を含む組み合わせを提供する。
【００１９】
代替的には、本発明は、同時、連続的又は別個の使用のための、
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）化合物２：（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（５−フルオロフラン−２−イル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−（２−｛［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル］メトキシ｝フェニル）プロパン酸と
を含む組み合わせを提供する。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、同時、連続的又は別個の使用のための、
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）化合物３：（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（４−フルオロフェニル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−（２−｛［２−（２−メトキシフェニル）ピリミジン−４−イル］メトキシ｝フェニル）プロパン酸と
を含む組み合わせを提供する。
【００２１】
別の実施態様では、本発明は、ガンの処置における使用のための、本明細書に記載された組み合わせを提供する。
【００２２】
別の実施態様では、本発明は、ガンの処置用の医薬の製造における、本明細書に記載された組み合わせの使用を提供する。
【００２３】
別の実施態様では、本発明は、同時、連続的又は別個の投与のための、
（ａ）式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤及び
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤
又は
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤及び
（ｂ）式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤
を別個に又は一緒に含有し、
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に有効な量で提供される、医薬を提供する。
【００２４】
別の実施態様では、本発明は、ガンを処置する方法であって、
同処置を必要とする対象に、併せて治療上有効な量の、
（ａ）式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤及び
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤
又は
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤及び
（ｂ）式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤
を投与することを含む、方法を提供する。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つの化学療法処置に抵抗性である患者又は（ｉｉ）化学療法による処置後に再発した患者又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の患者を感作するための方法であって、
併せて治療上有効な量の、
（ａ）式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤及び
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤
又は
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤及び
（ｂ）式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤
を、前記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００２６】
特定の実施態様では、ＢＣＬ−２阻害剤は、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミド  塩酸塩（化合物１，ＨＣｌ）である。
【００２７】
特定の実施態様では、ＢＣＬ−２阻害剤は、５−（５−クロロ−２−｛［（３Ｓ）−３−（モルホリン−４−イルメチル）−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル］カルボニル｝フェニル）−Ｎ−（５−シアノ−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド  塩酸塩（化合物４，ＨＣｌ）である。
【００２８】
別の実施態様では、ＢＣＬ−２阻害剤は、ＡＢＴ−１９９である。
【００２９】
別の実施態様では、ＭＣＬ１阻害剤は、（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（５−フルオロフラン−２−イル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−（２−｛［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル］メトキシ｝フェニル）プロパン酸（化合物２）である。
【００３０】
別の実施態様では、ＭＣＬ１阻害剤は、（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（４−フルオロフェニル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−（２−｛［２−（２−メトキシフェニル）ピリミジン−４−イル］メトキシ｝フェニル）プロパン酸（化合物３）である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の発現は、ＡＭＬにおいて優勢である。７つのＡＭＬ細胞系統と７０％超の芽球を有する１３個の初代ＡＭＬサンプルを、示されたタンパク質について免疫ブロットした結果、ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１タンパク質は、より低い割合のサンプルにおいて発現されたＢＣＬ−ＸＬとは対照的に、優勢に発現されることが示された。
【図２】組み合わせＢＣＬ−２／ＭＣＬ１ターゲッティングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＭＬにおける相乗活性を有する。（Ａ）５４個の初代ＡＭＬサンプルをＲＰＭＩ／１５％ ＦＣＳにおいて、６−ｌｏｇ濃度範囲の化合物１（ＨＣｌ塩）、化合物２又は１：１濃度と共に４８時間インキュベーションし、ＬＣ５０を決定した。（Ｂ）ＮＳＧマウスの４つのコホートに、ルシフェラーゼを発現するＭＶ４；１１細胞を生着した。腫瘍生着を１０日目（ベースライン）に確認し、ついで、４週間にわたる、１００mg/日（遊離塩基として表される） 化合物１，ＨＣｌの平日の経口投与、又は、２５mg/kg 化合物２の週２回ＩＶ投与を開始した。化合物２及び化合物１との組み合わせの影響を、治療開始後１４日目及び２８日目のルシフェラーゼ量の減少並びに全生存の増加により証明した（Ｃ）。
【図３】正常ドナー由来の正常ＣＤ３４＋細胞又は白血病芽球におけるＢＣＬ−２／ＭＣＬ１併用ターゲッティングの毒性評価。選別された正常なＣＤ３４＋又は白血病芽球を播種し、化合物１，ＨＣｌ及び化合物２を１：１の比で、示された濃度で処置した。化合物１＋化合物２の組み合わせは、白血病細胞には毒性であるが、正常なＣＤ３４＋前駆細胞には毒性ではない。
【図４】ＤＢ細胞（Ａ）及びＴｏｌｅｄｏ細胞（Ｂ）における化合物１，ＨＣｌと組み合わせた化合物３により提供される細胞増殖阻害（左）及びＬｏｅｗｅ過剰阻害（右）についての細胞増殖阻害効果及び相乗効果組み合わせマトリックス。効果マトリックスにおける値は、０（阻害なし）から１００（全阻害）の範囲である。相乗効果マトリックスにおける値は、試験した濃度での化合物３及び化合物１，ＨＣｌの単剤活性に基づいて算出された理論的相加性を超える程度の増殖阻害を表わす。相乗効果は、広範囲の単剤濃度にわたって生じた。
【図５】ラットにおけるリンパ腫Ｋａｒｐａｓｓ４２２異種移植モデルでの、化合物１，ＨＣｌ、化合物３及び化合物１，ＨＣｌ＋化合物３の組み合わせの抗腫瘍効果。
【図６】ラットにおけるリンパ腫Ｋａｒｐａｓｓ４２２異種移植モデルでの、化合物１，ＨＣｌ、化合物３及び化合物１，ＨＣｌ＋化合物３の組み合わせで処置された動物における体重変化。
【図７】マウスにおけるＤＬＢＣＬ  Ｔｏｌｅｄｏ異種移植モデルでの、化合物１，ＨＣｌ、化合物３及び化合物１，ＨＣｌ＋化合物３の組み合わせの抗腫瘍効果。
【図８】マウスにおけるＤＬＢＣＬ  Ｔｏｌｅｄｏ異種移植モデルでの、化合物１，ＨＣｌ、化合物３及び化合物１，ＨＣｌ＋化合物３の組み合わせで処置された動物における体重変化。
【図９】２つの独立した実験におけるＡＭＬ細胞系統ＯＣＩ−ＡＭＬ３での、化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される細胞増殖阻害（左）及びＬｏｅｗｅ過剰阻害（右）についての細胞増殖阻害効果及び相乗効果組み合わせマトリックス。効果マトリックスにおける値は、０（阻害なし）から１００（全阻害）の範囲である。相乗効果マトリックスにおける値は、試験した濃度での化合物３及び化合物１，ＨＣｌの単剤活性に基づいて算出された理論的相加性を超える程度の増殖阻害を表わす。相乗効果は、広範囲の単剤濃度にわたって生じた。
【図１０】２つの独立した実験（Ｎ１：上側パネル；Ｎ２：下側パネル）におけるＮＢ細胞系統ＬＡＮ−６での、化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される細胞増殖阻害（左）及びＬｏｅｗｅ過剰阻害（右）についての細胞増殖阻害効果及び相乗効果組み合わせマトリックス。効果マトリックスにおける値は、０（阻害なし）から１００（全阻害）の範囲である。相乗効果マトリックスにおける値は、試験した濃度での化合物３及び化合物１，ＨＣｌの単剤活性に基づいて算出された理論的相加性を超える程度の増殖阻害を表わす。
【図１１】２つの独立した実験（Ｎ１：上側パネル；Ｎ２：下側パネル）におけるＢ−ＡＬＬ細胞系統ＮＡＬＭ−６での化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される細胞増殖阻害（左）及びＬｏｅｗｅ過剰阻害（右）についての細胞増殖阻害効果及び相乗効果組み合わせマトリックス。
【図１２】ＭＣＬ細胞系統Ｚ−１３８での、化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される細胞増殖阻害（左）及びＬｏｅｗｅ過剰阻害（右）についての細胞増殖阻害効果及び相乗効果組み合わせマトリックス。
【図１３】２つの独立した実験（Ｎ１：上側パネル；Ｎ２：下側パネル）におけるＡＭＬ細胞系統ＯＣＩ−ＡＭＬ３での、ＡＢＴ−１９９（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される細胞増殖阻害（左）及びＬｏｅｗｅ過剰阻害（右）についての細胞増殖阻害効果及び相乗効果組み合わせマトリックス。
【図１４】ＡＭＬ細胞系統（ＡはＭＬ−２細胞及びＢはＯＣＩ−ＡＭＬ−３）における、化合物４，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される細胞増殖阻害（左）及びＬｏｅｗｅ過剰阻害（右）についての例示的な細胞増殖阻害効果及び相乗効果組み合わせマトリックス。
【図１５（ａ）】ＳＣＬＣ細胞系統のパネルにおける、化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される阻害（左）、Ｌｏｅｗｅ過剰阻害（中央）及び増殖阻害についての用量マトリックス。
【図１５（ｂ）】ＳＣＬＣ細胞系統のパネルにおける、化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される阻害（左）、Ｌｏｅｗｅ過剰阻害（中央）及び増殖阻害についての用量マトリックス。
【図１５（ｃ）】ＳＣＬＣ細胞系統のパネルにおける、化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される阻害（左）、Ｌｏｅｗｅ過剰阻害（中央）及び増殖阻害についての用量マトリックス。
【図１５（ｄ）】ＳＣＬＣ細胞系統のパネルにおける、化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される阻害（左）、Ｌｏｅｗｅ過剰阻害（中央）及び増殖阻害についての用量マトリックス。
【図１５（ｅ）】ＳＣＬＣ細胞系統のパネルにおける、化合物１，ＨＣｌ（ＢＣＬ−２阻害剤）と組み合わせた化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）により提供される阻害（左）、Ｌｏｅｗｅ過剰阻害（中央）及び増殖阻害についての用量マトリックス。
【図１６（ａ）】マウスにおける患者由来初代ＡＭＬモデルＨＡＭＬＸ５３４３での、化合物１，ＨＣｌ、ＡＢＴ−１９９、化合物３及び化合物１，ＨＣｌ又はＡＢＴ−１９９＋化合物３の組み合わせの抗腫瘍効果。
【図１６（ｂ）】マウスにおける患者由来初代ＡＭＬモデルＨＡＭＬＸ５３４３での、化合物１，ＨＣｌ、ＡＢＴ−１９９、化合物３及び化合物１，ＨＣｌ又はＡＢＴ−１９９＋化合物３の組み合わせの抗腫瘍効果。
【図１７】４８時間曝露後の、化学療法（イダルビシン）と比較した、ＢＨ３模倣物単剤療法又は薬剤併用（１：１の比で試験）に対するＡＭＬ感受性（ＬＣ５０）のヒートマップ比較。ＤＭＳＯ中で４８時間後の各初代ＡＭＬサンプルの細胞生存率を示す。
【００３２】
発明の詳細な説明
したがって、本発明は、実施態様Ｅ１において、
同時、連続的又は別個の使用のための、
（ａ）式（Ｉ）：
【化４】
2019528250.tif 000006
［式中、
Ｘ及びＹは、炭素原子又は窒素原子を表わし、それらは、２つの炭素原子又は２つの窒素原子を同時に表し得ないと理解され、
Ａ１及びＡ２は、それらを担持している原子と共に、Ｘ又はＹにより表わされた窒素に加えて、酸素、硫黄及び窒素から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含有することができる、５、６又は７個の環員で構成される、場合により置換されている芳香族又は非芳香族複素環Ｈｅｔを形成しており、当該窒素は、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は基−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ａｌｋ（式中、Ａｌｋは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基である）を表わす基により置換されていてよいと理解され、
あるいは、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又はシクロアルキルを表わし、
Ｔは、水素原子、１〜３個のハロゲン原子により場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、基（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−ＮＲ１Ｒ２又は基（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−ＯＲ６を表わし、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
あるいは、Ｒ１及びＲ２は、それらを担持している窒素原子と共に、ヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ３は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、シクロアルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基（ここで、アルキル部分は、直鎖もしくは分枝鎖である）、ヘテロシクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基を表わし、先行する基又はそれらの可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｒ４は、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、先行する基又はそれらの可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｒ５は、水素原子もしくはハロゲン原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を表わし、
Ｒ６は、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、Ｒ７、ハロゲン原子、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、ヒドロキシ基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル基、トリフルオロメトキシ基、−ＮＲ７Ｒ７’、ニトロ、Ｒ７−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ＮＲ７Ｒ７’−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ＮＲ７Ｒ７’−ＣＯ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−、Ｒ７−ＳＯ２−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、Ｒ７−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（Ｃ０〜Ｃ６）アルキル−、ヘテロシクロアルキル基を表わし、あるいは、対（Ｒａ、Ｒｂ）、（Ｒｂ、Ｒｃ）又は（Ｒｃ、Ｒｄ）のうちの１つの置換基は、それらを担持している炭素原子と共に、酸素及び硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を含有することができる、５〜７個の環員で構成される環を形成しており、また、先に定義された環の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよい、又は、ハロゲン及び直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される１〜３個の基により置換されていてよいと理解され、
Ｒ７及びＲ７’は、それぞれ独立して、水素、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、アリール又はヘテロアリールを表わし、あるいは、Ｒ７及びＲ７’は、それらを担持している窒素原子と共に、５〜７個の環員で構成される複素環を形成しており、
式（Ｉ）で示される化合物がヒドロキシ基を含有する場合、後者は、場合により、下記基：−ＯＰＯ（ＯＭ）（ＯＭ’）、−ＯＰＯ（ＯＭ）（Ｏ−Ｍ１＋）、−ＯＰＯ（Ｏ−Ｍ１＋）（Ｏ−Ｍ２＋）、−ＯＰＯ（Ｏ−）（Ｏ−）Ｍ３２＋、−ＯＰＯ（ＯＭ）（Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎＣＨ３）又は−ＯＰＯ（Ｏ−Ｍ１＋）（Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎＣＨ３）のうちの１つに変換されていてよいと理解され、ここで、Ｍ及びＭ’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを表わし、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキルは両方とも、５〜６個の環員で構成されており、一方、Ｍ１＋及びＭ２＋は、それぞれ独立して、薬学的に許容し得る一価のカチオンを表わし、Ｍ３２＋は、薬学的に許容し得る二価のカチオンを表わし、ｎは、１〜５の整数であり、
−「アリール」は、フェニル、ナフチル、ビフェニル又はインデニル基を意味し、
−「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの芳香族部分を有し、酸素、硫黄及び窒素（四級窒素を含む）から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する、５〜１０個の環員で構成される、任意の単環式又は二環式の基を意味し、
−「シクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、
−「ヘテロシクロアルキル」は、３〜１０個の環員で構成され、酸素、硫黄、ＳＯ、ＳＯ２及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族、縮合又はスピロ基を意味すると理解され、
該定義されたアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基並びに基アルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシは、ヒドロキシル、モルホリン、３−３−ジフルオロピペリジン又は３−３−ジフルオロピロリジンにより場合により置換されている直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル；（Ｃ３〜Ｃ６）スピロ；モルホリンより場合により置換されている直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ；（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｓ−；ヒドロキシル；オキソ；Ｎ−オキシド；ニトロ；シアノ；−ＣＯＯＲ’；−ＯＣＯＲ’；ＮＲ’Ｒ’’；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル；トリフルオロメトキシ；（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルスルホニル；ハロゲン；１つ以上のハロゲンにより場合により置換されているアリール；ヘテロアリール；アリールオキシ；アリールチオ；シクロアルキル；１つ以上のハロゲン原子又はアルキル基により場合により置換されているヘテロシクロアルキルから選択される１〜３個の基により置換されていることができ、ここで、Ｒ’及びＲ’’は、それぞれ独立して、水素原子又はメトキシにより場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
式（Ｉ）で定義されたＨｅｔ基は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、ＮＲ１’Ｒ１’’及びハロゲンから選択される１〜３個の基により置換されていることができ、Ｒ１’及びＲ１’’は、上記言及された基Ｒ’及びＲ’’について定義されたとおりであることが理解される］
で示されるＢＣＬ−２阻害剤、又はそのエナンチオマー、ジアステレオ異性体又は薬学的に許容し得る酸もしくは塩基とのそれらの付加塩と、
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤と
を含む、組み合わせを提供する。
【００３３】
また、本発明は、実施態様Ｅ２において、
同時、連続的又は別個の使用のための、
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）式（ＩＩ）：
【化５】
2019528250.tif 000007
［式中、
Ａは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ基、シアノ、−ＮＷ１０Ｗ１０’、−Ｃｙ６又はハロゲン原子を表わし、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４及びＷ５は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、シアノ、ニトロ基、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−ＮＷ８Ｗ８’、−Ｏ−Ｃｙ１、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ１、−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−Ｗ９、−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ８Ｗ８’、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８’、−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−ＳＯ２−ＮＷ８Ｗ８’、−ＳＯ２−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）を表わし、
あるいは、対（Ｗ１、Ｗ２）、（Ｗ２、Ｗ３）、（Ｗ１、Ｗ３）、（Ｗ４、Ｗ５）の１つの置換基は、２つの隣接する炭素原子上にグラフトされた場合、それらを担持している炭素原子と共に、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有することができる、５〜７個の環員で構成される芳香族又は非芳香族環を形成しており、得られた環は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、−ＮＷ１０Ｗ１０’、−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１又はオキソから選択される基により置換されていてよいと理解され、
Ｘ’は、炭素原子又は窒素原子を表わし、
Ｗ６は、水素、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル基、アリール、ヘテロアリール基、アリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基、ヘテロアリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基を表わし、
Ｗ７は、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基、−Ｃｙ３、−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−アルケニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｃｙ３、−Ｃｙ３−Ｃｙ４、−アルキニル（Ｃ２〜Ｃ６）−Ｏ−Ｃｙ３、−Ｃｙ３−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ４、ハロゲン原子、シアノ、−Ｃ（Ｏ）−Ｗ１１、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ１１Ｗ１１’を表わし、
Ｗ８及びＷ８’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ１を表わし、
あるいは、（Ｗ８、Ｗ８’）は、それらを担持している窒素原子と共に、５〜７個の環員で構成される芳香族又は非芳香族環を形成しており、同環員は、窒素原子に加えて、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有してよく、当該窒素は、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わす基により置換されていてよいと理解され、可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解され、
Ｗ９は、−Ｃｙ１、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−ＮＷ８−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ２、−Ｃｙ１−Ｃｙ２−Ｏ−アルキル（Ｃ０〜Ｃ６）−Ｃｙ５、−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ８Ｗ８’、−ＮＷ８Ｗ８’、−ＯＷ８、−ＮＷ８−Ｃ（Ｏ）−Ｗ８’、−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−ＯＷ８、−ＳＯ２−Ｗ８、−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ８、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｗ８、
【化６】
2019528250.tif 000008
を表わし、
該定義されたアンモニウムは、両性イオン形態として存在し、又は、一価のアニオン性対イオンを有することができ、
Ｗ１０、Ｗ１０’、Ｗ１１及びＷ１１’は、それぞれ独立して、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１２は、水素又はヒドロキシ基を表わし、
Ｗ１３は、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１４は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）（Ｏ−）基、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）（ＯＷ１６）基、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＷ１６）（ＯＷ１６’）基、−Ｏ−ＳＯ２−Ｏ−基、−Ｏ−ＳＯ２−ＯＷ１６基、−Ｃｙ７、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ１５基、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ１５基又は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＷ１５Ｗ１５’基を表わし、
Ｗ１５及びＷ１５’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は直鎖もしくは分枝鎖アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わし、
Ｗ１６及びＷ１６’は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又はアリールアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）基を表わし、
Ｃｙ１、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ４、Ｃｙ５、Ｃｙ６及びＣｙ７は、それぞれ独立して、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール又はヘテロアリール基を表わし、
ｎは、０又は１に等しい整数であり、
−「アリール」は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、インダニル又はインデニル基を意味し、
−「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの芳香族部分を有し、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、５〜１０個の環員で構成される、任意の単環式又は二環式の基を意味し、
−「シクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、
−「ヘテロシクロアルキル」は、３〜１０個の環員を含有し、酸素、硫黄及び窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含有する、任意の単環式又は二環式の非芳香族炭素環基を意味し、同非芳香族炭素環基は、縮合、架橋又はスピロ環系を含むことができると理解され、
該定義されたアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基並びにアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシは、直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、オキソ、−ＮＷ’Ｗ’’、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ’又は−ＣＯ−ＮＷ’Ｗ’’により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル；直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル基；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル、直鎖又は分枝鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、−ＮＷ’Ｗ’’又はヒドロキシを表わす基により置換されていてよい直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ；直鎖又は分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｓ−；ヒドロキシ；オキソ；Ｎ−オキシド；ニトロ；シアノ；−Ｃ（Ｏ）−ＯＷ’；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｗ’；−ＣＯ−ＮＷ’Ｗ’’；−ＮＷ’Ｗ’’；−（Ｃ＝ＮＷ’）−ＯＷ’’； 直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）ポリハロアルキル；トリフルオロメトキシ；又はハロゲンから選択される１〜４個の基により置換されていることができ、Ｗ’及びＷ’’は、それぞれ独立して、水素原子又は直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシを表わす基により置換されていてよい直鎖もしくは分枝鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表わすと理解され、先の可能性のある置換基の１つ以上の炭素原子は、重水素化されていてよいと理解される］
で示されるＭＣＬ１阻害剤、そのエナンチオマー、ジアステレオ異性体もしくはアトロプ異性体又は薬学的に許容し得る酸もしくは塩基とのそれらの付加塩と
を含む、組み合わせも提供する。
【００３４】
本発明の更に列挙される実施態様（Ｅ）が、本明細書において記載される。各実施態様において特定された特徴は、本発明の更なる実施態様を提供するために、他の特定された特徴と組み合わせることができると認識されたい。
【００３５】
Ｅ３．ＭＣＬ１阻害剤が、Ｅ２で定義された式（ＩＩ）で示される化合物である、Ｅ１記載の組み合わせ。
【００３６】
Ｅ４．ＢＣＬ−２阻害剤が、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミドである、Ｅ１〜Ｅ３のいずれかに記載の組み合わせ。
【００３７】
Ｅ５．ＢＣＬ−２阻害剤が、５−（５−クロロ−２−｛［（３Ｓ）−３−（モルホリン−４−イルメチル）−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル］カルボニル｝フェニル）−Ｎ−（５−シアノ−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドである、Ｅ１〜Ｅ３のいずれかに記載の組み合わせ。
【００３８】
Ｅ６．Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミドが、塩酸塩の形態にある、Ｅ４記載の組み合わせ。
【００３９】
Ｅ７．５−（５−クロロ−２−｛［（３Ｓ）−３−（モルホリン−４−イルメチル）−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル］カルボニル｝フェニル）−Ｎ−（５−シアノ−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドが、塩酸塩の形態にある、Ｅ５記載の組み合わせ。
【００４０】
Ｅ８．組み合わせ処置中のＮ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミドの用量が、５０mg〜１５００mgである、Ｅ４又はＥ６記載の組み合わせ。
【００４１】
Ｅ９．ＢＣＬ−２阻害剤が、週１回投与される、Ｅ１〜Ｅ８のいずれかに記載の組み合わせ。
【００４２】
Ｅ１０．Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミドが、組み合わせ処置中に１日１回投与される、Ｅ６又はＥ８記載の組み合わせ。
【００４３】
Ｅ１１．ＢＣＬ−２阻害剤が、ＡＢＴ−１９９である、Ｅ１〜Ｅ３のいずれかに記載の組み合わせ。
【００４４】
Ｅ１２．ＭＣＬ１阻害剤が、（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（５−フルオロフラン−２−イル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−（２−｛［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル］メトキシ｝フェニル）プロパン酸である、Ｅ１〜Ｅ１１のいずれかに記載の組み合わせ。
【００４５】
Ｅ１３．ＭＣＬ１阻害剤が、（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（４−フルオロフェニル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−（２−｛［２−（２−メトキシフェニル）ピリミジン−４−イル］メトキシ｝フェニル）プロパン酸である、Ｅ１〜Ｅ１１のいずれかに記載の組み合わせ。
【００４６】
Ｅ１４．ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、経口投与される、Ｅ１〜Ｅ１３のいずれかに記載の組み合わせ。
【００４７】
Ｅ１５．ＢＣＬ−２阻害剤が、経口投与され、ＭＣＬ１阻害剤が、静脈内投与される、Ｅ１〜Ｅ１３のいずれかに記載の組み合わせ。
【００４８】
Ｅ１６．ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、静脈内投与される、Ｅ１〜Ｅ１３のいずれかに記載の組み合わせ。
【００４９】
Ｅ１７．ガンの処置における使用のための、Ｅ１〜Ｅ１６のいずれかに記載の組み合わせ。
【００５０】
Ｅ１８．ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に併せて治療上有効な量で提供される、Ｅ１７記載の使用のための組み合わせ。
【００５１】
Ｅ１９．ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に相乗的に有効な量で提供される、Ｅ１７記載の使用のための組み合わせ。
【００５２】
Ｅ２０．ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置において各化合物に必要とされる用量の減少を可能にする一方で、有効なガン処置を提供し、最終的に副作用の減少をもたらす相乗的に有効な量で提供される、Ｅ１７記載の使用のための組み合わせ。
【００５３】
Ｅ２１．ガンが、白血病である、Ｅ１７〜Ｅ２０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ。
【００５４】
Ｅ２２．ガンが、急性骨髄性白血病、Ｔ−ＡＬＬ又はＢ−ＡＬＬである、Ｅ２１記載の使用のための組み合わせ。
【００５５】
Ｅ２３．ガンが、骨髄異形成症候群又は骨髄増殖性疾患である、Ｅ１７〜Ｅ２０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ。
【００５６】
Ｅ２４．ガンが、リンパ腫である、Ｅ１７〜Ｅ２０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ。
【００５７】
Ｅ２５．リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫である、Ｅ２４記載の使用のための組み合わせ。
【００５８】
Ｅ２６．非ホジキンリンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫又はマントル細胞リンパ腫である、Ｅ２５記載の使用のための組み合わせ。
【００５９】
Ｅ２７．ガンが、多発性骨髄腫である、Ｅ１７〜Ｅ２０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ。
【００６０】
Ｅ２８．ガンが、神経芽細胞腫である、Ｅ１７〜Ｅ２０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ。
【００６１】
Ｅ２９．ガンが、小細胞肺ガンである、Ｅ１７〜Ｅ２０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ。
【００６２】
Ｅ３０．１つ以上の賦形剤を更に含む、Ｅ１〜Ｅ１６のいずれかに記載の組み合わせ。
【００６３】
Ｅ３１．ガン処置用の医薬の製造における、Ｅ１〜Ｅ１６のいずれかに記載の組み合わせの使用。
【００６４】
Ｅ３２．ガンが、白血病である、Ｅ３１記載の使用。
【００６５】
Ｅ３３．ガンが、急性骨髄性白血病、Ｔ−ＡＬＬ又はＢ−ＡＬＬである、Ｅ３２記載の使用。
【００６６】
Ｅ３４．ガンが、骨髄異形成症候群又は骨髄増殖性疾患である、Ｅ３１記載の使用。
【００６７】
Ｅ３５．ガンが、リンパ腫である、Ｅ３１記載の使用。
【００６８】
Ｅ３６．リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫である、Ｅ３５記載の使用。
【００６９】
Ｅ３７．非ホジキンリンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫又はマントル細胞リンパ腫である、Ｅ３６記載の使用。
【００７０】
Ｅ３８．ガンが、多発性骨髄腫である、Ｅ３１記載の使用。
【００７１】
Ｅ３９．ガンが、神経芽細胞腫である、Ｅ３１記載の使用。
【００７２】
Ｅ４０．ガンが、小細胞肺ガンである、Ｅ３１記載の使用。
【００７３】
Ｅ４１．同時、連続的又は別個の投与のための、
（ａ）Ｅ１で定義された式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤とを、
別個に又は一緒に含有し、
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に有効な量で提供される、
医薬。
【００７４】
Ｅ４２．同時、連続的又は別個の投与のための、
（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と、
（ｂ）Ｅ２で定義された式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤とを
別個に又は一緒に含有し、
ＢＣＬ−２阻害剤及びＭＣＬ１阻害剤が、ガンの処置に有効な量で提供される、
医薬。
【００７５】
Ｅ４３．ガンを処置する方法であって、
同処置を必要とする対象に、併せて治療上有効な量の、（ａ）Ｅ１に定義された式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤と（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤とを投与することを含む、
方法。
【００７６】
Ｅ４４．ガンを処置する方法であって、
同処置を必要とする対象に、併せて治療上有効な量の、（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と（ｂ）Ｅ２に定義された式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤とを投与することを含む、
方法。
【００７７】
Ｅ４５．（ｉ）少なくとも１つの化学療法処置に抵抗性である患者又は（ｉｉ）化学療法による処置後に再発した患者又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の患者を感作するための方法であって、
併せて治療上有効な量の、（ａ）Ｅ１に定義された式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤と（ｂ）ＭＣＬ１阻害剤とを、前記患者に投与することを含む、
方法。
【００７８】
Ｅ４６．（ｉ）少なくとも１つの化学療法処置に抵抗性である患者もしくは（ｉｉ）化学療法による処置後に再発した患者又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の患者を感作するための方法であって、
併せて治療上有効な量の、（ａ）ＢＣＬ−２阻害剤と（ｂ）Ｅ２に定義された式（ＩＩ）で示されるＭＣＬ１阻害剤とを、前記患者に投与することを含む、
方法。
【００７９】
「組み合わせ」は、１つの単位剤形（例えば、カプセル剤、錠剤又は小袋）での固定用量の組み合わせ、非固定用量の組み合わせ又は併用投与のためのパーツキットのいずれかを指す。同キットの場合、本発明の化合物及び１つ以上の組み合わせパートナー（例えば、以下に説明される別の薬剤、「治療剤」又は「補助剤」とも呼ばれる）が、同じ時間で独立して又は時間間隔内で別個に投与することができ、特に、これらの時間間隔は、組み合わせパートナーが協同的、例えば、相乗効果を示すのを可能にする。
【００８０】
本明細書で利用する場合、「同時投与」又は「併用投与」等の用語は、選択された組み合わせパートナーの、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）への投与を包含することを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路により又は同時に投与されるわけではない処置計画を含むことを意図している。
【００８１】
「固定用量の組み合わせ」という用語は、有効成分、例えば、式（Ｉ）で示される化合物及び１つ以上の組み合わせパートナーが両方とも、単一の実体又は投与量の形態で患者に同時に投与されることを意味する。
【００８２】
「非固定用量の組み合わせ」という用語は、有効成分、例えば、本発明の化合物及び１つ以上の組み合わせパートナーが両方とも、別個の実体として、同時に又は連続的に、特別な期限なしに患者に投与されることを意味し、ここで、このような投与により、患者の体内における２つの化合物の治療上有効なレベルが提供される。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の有効成分の投与にも適用される。
【００８３】
「ガン」は、一群の細胞が制御されない増殖を示す病気の部類を意味する。ガンの種類は、血液ガン（リンパ腫及び白血病）及び固形腫瘍（ガン腫、肉腫、又は芽細胞腫を含む）を含む。特に、「ガン」は、白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫を指し、より具体的には、急性骨髄性白血病を指す。
【００８４】
「併せて治療上有効」という用語は、治療薬が処置される温血動物、特にヒトにおいて依然として、（好ましくは相乗的な）相互作用（共同治療効果）を示す好ましいような時間間隔で、別々に（時間的に互い違いの様式、特に、順序特異的な様式で）与えることができることを意味する。これが当てはまるかどうかは、とりわけ、両方の化合物が少なくとも特定の時間間隔の間に、処置されるヒトの血液中に存在することを示す血中レベルを追跡することによって決定することができる。
【００８５】
「相乗的に有効」又は「相乗」は、２つ以上の薬剤の投与後に観察される治療効果がそれぞれの単剤の投与後に観察される治療効果の合計よりも大きいことを意味する。
【００８６】
本明細書で使用する場合、任意の疾患又は障害を「処置する」、「処置すること」又はその「処置」という用語は、一実施態様において、疾患又は障害を改善すること（すなわち、疾患又はその臨床兆候の少なくとも１つの進行を遅らせ、又は停止させ、又は、減少させること）を指す。別の実施態様では、「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、患者により識別できないものを含む少なくとも１つの身体的パラメータを緩和又は改善することを指す。更に別の実施態様では、「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、疾患又は障害を、物理的（例えば、識別可能な兆候の安定化）、生理学的（例えば、身体的パラメータの安定化）のいずれか又は両方でモデュレーションすることを指す。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、対象は、このような対象が生物学的、医学的又は生活の質においてこのような処置から利益を得る場合、処置を「必要とする」。
【００８８】
別の態様では、（ｉ）少なくとも１つの化学療法処置に抵抗性であるヒト又は（ｉｉ）化学療法による処置後に再発したヒト又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方のヒトを感作するための方法であって、本明細書に記載されたように、式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤を、ＭＣＬ１阻害剤と組み合わせて、患者に投与することを含む、方法が提供される。感作される患者は、本明細書に記載されたように、式（Ｉ）で示されるＢＣＬ−２阻害剤のＭＣＬ１阻害剤との組み合わせでの投与を含む処置に応答性の患者又はこのような処置に対する抵抗性を生じていない患者である。
【００８９】
「医薬」は、１つ以上の賦形剤の存在下で１つ以上の有効成分を含有する、医薬組成物又は幾つかの医薬組成物の組み合わせを意味する。
【００９０】
「ＡＭＬ」は、急性骨髄性白血病を意味する。
【００９１】
「Ｔ−ＡＬＬ」及び「Ｂ−ＡＬＬ」は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病及びＢ細胞急性リンパ芽球性白血病を意味する。
【００９２】
「遊離塩基」は、塩形態でない場合の化合物を指す。
【００９３】
本発明の医薬組成物において、有効成分の重量比（組成物の全重量に対する有効成分の重量）は、５〜５０％である。
【００９４】
本発明の医薬組成物の中でも、経口、非経口、特に、静脈内、経皮、鼻、直腸、経舌、眼又は呼吸経路による投与に適切なもの、より具体的には、錠剤、糖衣錠、舌下錠、硬ゼラチンカプセル剤、グロセット、カプセル剤、ロゼンジ剤、注射用製剤、エアロゾル剤、点眼剤又は点鼻剤、坐剤、クリーム剤、軟膏剤、皮膚ゲル剤等が、とりわけ使用されるのであろう。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、吸収剤、着色剤、甘味料、香味料等から選択される１つ以上の賦形剤又は担体を含む。
【００９６】
非限定的な例として、以下に言及することができる。
希釈剤として：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリセロール、
潤滑剤として：シリカ、タルク、ステアリン酸並びにそのマグネシウム及びカルシウム塩、ポリエチレングリコール、
結合剤として：ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びポリビニルピロリドン、
崩壊剤として：アガー、アルギン酸及びそのナトリウム塩、発泡性混合物。
【００９７】
組み合わせの化合物は、同時に又は連続的に投与することができる。投与経路は、好ましくは、経口経路であり、対応する医薬組成物は、有効成分の即時放出又は遅延放出を可能にし得る。組み合わせの化合物は、更に、それぞれが有効成分の１つを含有する２つの別個の医薬組成物の形態又は有効成分が混合されている単一の医薬組成物の形態で投与することができる。
【００９８】
錠剤である医薬組成物が好ましい。
【００９９】
【表１】
2019528250.tif 000009
【０１００】
薬理データ
実施例１〜３の材料及び方法：
初代ＡＭＬ患者サンプル：ＡＭＬ患者からの骨髄又は末梢血サンプルをAlfred Hospital Human research ethics committeeにより承認されたガイドラインに従って、インフォームドコンセント後に採取した。単核細胞を、Ficoll-Paque（GE Healthcare, VIC, Aus）密度勾配遠心分離、続けて、３７℃で１０分間の塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）溶解バッファー中での赤血球枯渇により単離した。ついで、細胞を２％ ウシ胎児血清（Sigma,NSW,Aus）を含有するリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させた。ついで、単核細胞をペニシリン及びストレプトマイシン（GIBCO）並びに１５％ 熱不活化ウシ胎児血清（Sigma）を含有するRPMI-1640（GIBCO VIC, Aus）培地に懸濁させた。
【０１０１】
細胞系統、細胞培養及びルシフェラーゼレポーター細胞系統の発生：細胞系統ＭＶ４；１１、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、ＨＬ−６０、ＨＥＬ、Ｋ５６２、ＫＧ−１及びＥＯＬ−１を１０％（v/v） ウシ胎児血清（Sigma）並びにペニシリン及びストレプトマイシン（GIBCO）を補充したRPMI-1640（GIBCO）中において、３７℃、５％ ＣＯ２で維持した。ＭＶ４；１１ルシフェラーゼ細胞系統を、レンチウイルストランスダクションにより発生させた。
【０１０２】
抗体：ウエスタンブロット分析に使用された一次抗体は、ＭＣＬ１、ＢＣＬ−２、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、ＢＣＬ−ＸＬ（社内ＷＥＨＩで生成）及びチュ−ブリン（Ｔ−９０２６、Sigma）とした。
【０１０３】
細胞生存率：ＡＭＬ患者サンプルから新たに精製された単核細胞を濃度２．５×１０５／ｍｌに調整し、細胞 １００μLを９６ウェルプレ−ト（Sigma）の１ウェルあたりにアリコートした。ついで、細胞を化合物１，ＨＣｌ、化合物２、ＡＢＴ−１９９（Active Biochem, NJ, USA）又はイダルビシン（Sigma）で、１nM〜１０μMの６ｌｏｇ濃度範囲にわたって４８時間処理した。組み合わせアッセイでは、薬剤を１nM〜１０uMの１：１の比で加え、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベーションした。ついで、細胞をsytox blue核酸染色（Invitrogen, VIC, Aus）で染色し、蛍光をLSR-II Fortessa（Becton Dickinson, NSW, Aus）を使用するフローサイトメトリー分析により測定した。FACSDivaソフトウェアをデ−タ収集に使用し、FlowJoソフトウェアを分析に使用した。芽細胞を前方及び側方散乱特性を使用してゲーティングした。sytox blueを含まない生存細胞を各薬剤について６濃度で決定し、５０％致死濃度（ＬＣ５０、μM単位）を決定した。
【０１０４】
ＬＣ５０の決定及び相乗効果：Graphpad Prismを使用して、非線形回帰を使用しＬＣ５０を計算した。相乗効果は、記載されたＣｈｏｕ  Ｔａｌａｌａｙ法（Chou Cancer Res; 70(2) January 15, 2010）に基づいて、組み合わせ指数（ＣＩ）を計算することにより決定した。
【０１０５】
コロニーアッセイ：コロニー形成アッセイをＡＭＬ患者由来の新たに精製され凍結された単核画分について行った。初代細胞を１×１０４〜１×１０５個で、３５mmディッシュ（Griener-bio, Germany）中で、デュープリケートで培養した。細胞を０．６％ アガー（Difco NSW, Aus）：ＮａＨＣＯ３、デキストラン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｂメルカプトエタノール及びアスパラギンを補充したＡＩＭＤＭ  ２×（ＩＭＤＭ粉末−Invitrogen）：ウシ胎児血清（Sigma）（比２：１：１）に播種した。最適な増殖条件のために、全てのプレートに、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng/プレート）、ＩＬ−３（１００ng/プレート、R&D Systems、USA）、ＳＣＦ（１００ng/プレート、R&D Systems）及びＥＰＯ（４U/プレート）を含ませた。増殖は、薬剤の存在下及び非存在下で、３７℃、５％ ＣＯ２で、高湿度インキュベーター中において、２〜３週間とした。インキュベ−ション後、プレートを生理食塩水中の２．５％ グルタルアルデヒドにより固定し、Oxford Optronix（Abingdon, United Kingdom）からのGelCountを使用してスコアした。
【０１０６】
ウエスタンブロット：ライセートを、プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche, Dee Why, NSW, Australia）を補充したＮＰ４０溶解バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１３７mM ＮａＣｌ、１０％ グリセロ−ル、１％ ＮＰ４０）中において調製した。タンパク質サンプルを還元ローディング色素中で煮沸し、その後、４〜１２％ ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（Invitrogen, Mulgrave, VIC, Australia）において分離し、特定の抗体と共にインキュベーションするために、Hybond Cニトロセルロース膜（GE, Rydalmere, NSW, Australia）にトランスファーした。全ての膜ブロッキング工程及び抗体希釈を０．１％（v/v） Tween-20を含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（ＰＢＳＴ）又はＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中の５％（v/v） スキムミルクを使用して行い、洗浄工程をＰＢＳＴ又はＴＢＳＴにより行った。ウエスタンブロットを増強化学発光（GE）により可視化した。
【０１０７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験ＡＭＬ生着：動物研究をAlfred Medical Research and Education Precinct Animal Ethics ComMitteeにより承認された施設ガイドラインに基づいて行った。ルシフェラーゼレポーター（ｐＬＵＣ２）によりトランスダクションされたＭＶ４；１１細胞を１×１０５個で、以前に記載されたように（Jin et al., Cell Stem Cell 2 July 2009, Volume 5, Issue 1, Pages 31-42）照射された（１００Rad）非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ）マウスに静脈内注射した。生着を、フローサイトメトリー及び生物発光ＭＶ４；１１細胞のＩＶＩＳイメージングにより、ＰＢ中におけるｈＣＤ４５＋細胞の割合を定量することによって、７日目に測定した。１０日目に、マウスに、４週間にわたって、ＰＥＧ４００（Sigma）、無水エタノール（Sigma）及び蒸留水  ４０：１０：６０に溶解させた化合物１，ＨＣｌ（２００μL、１００mg/kg 遊離塩基として表す用量）を毎日又は５０％ ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Sigma）及び５０％ ５０mM ＨＣｌに溶解させた化合物２（２００μL、２５mg/kg）を１週間に２回又は薬剤組み合わせ又は媒体を強制投与した。血液数を血液分析器（BioRad, Gladesville, NSW）を使用して決定した。
【０１０８】
ＩＶＩＳイメージング：生物発光イメージングをCaliper IVIS Lumina III XRイメージングシステムを使用して行った。マウスをイソフルランで麻酔し、１２５mg/kg ルシフェリン（Perkin Elmer, Springvale, VIC）１００μLを腹腔内注射した。
【０１０９】
実施例４の材料及び方法：
細胞系統：ヒト骨髄腫細胞系統（ＨＭＣＬ）を、ＩＬ−６依存性細胞系統のために、５％ ウシ胎児血清及び３ng/mL リコンビナントＩＬ−６を補充したRPMI 1640培地中で培養した初代骨髄腫細胞から得た。ＨＭＣＬは、表現型及びゲノムの不均一性並びに治療に対する患者の応答における変動性を表わす。
【０１１０】
ＭＴＴアッセイ：細胞生存率をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色生存アッセイを使用して測定する。細胞を１００μl/ウェルの最終容量を含む９６ウェルプレート中で化合物と共にインキュベーションする。（２Ｒ）−２−｛［（５Ｓａ）−５−｛３−クロロ−２−メチル−４−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］フェニル｝−６−（５−フルオロフラン−２−イル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ｝−３−｛［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル］メトキシ｝フェニルプロパン酸（化合物２）を単剤感受性に応じて９種類の異なる濃度で使用する。Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−３−｛６−［（（３Ｓ）−３−（４−モルホリニルメチル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）カルボニル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル｝−Ｎ−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１−インドリジンカルボキサミド塩酸塩（化合物１，ＨＣｌ）を固定用量−１μMで使用する。各処理の終わりに、細胞を１mg/mL ＭＴＴ（各ウェルについて２．５mg/ml ＭＴＴ溶液 ５０μl）と共に３７℃で３時間インキュベーションし、ＭＴＴを代謝させる。溶解バッファー（溶解バッファー １００μl：ＤＭＦ（２：３）／ＳＤＳ（１：３））を各ウェルに加えて、ホルマザン結晶を溶解し、１８時間のインキュベーション後、生存細胞における吸光度を、分光光度計を使用して５７０nmで測定する。
【０１１１】
対照として、細胞を培地単独及び０．１％ ＤＭＳＯを含有する培地と共にインキュベーションする。骨髄腫細胞の増殖対照として、骨髄腫細胞の吸光度を毎日（Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４）記録する。
【０１１２】
全ての実験を３回繰り返し、各実験において、各実験条件を少なくともトリプリケートウェルで繰り返す。
【０１１３】
阻害効果を以下の式で計算する。
阻害効果（％）＝（１−処理細胞の吸光度／対照細胞の吸光度）＊１００
【０１１４】
実施例１：ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１はＡＭＬにおいて発現される優性生存促進性タンパク質である
７つのＡＭＬ細胞系統及び７０％超の芽球を有する１３個の初代ＡＭＬサンプルを図１に示されたタンパク質について免疫ブロットした。
【０１１５】
図１に示されたように、ＡＭＬにおけるＢＣＬ−２ファミリーメンバーの発現のプロテオミクス調査から、ＢＣＬ−２に加えて、ほとんどの初代ＡＭＬサンプル及びＡＭＬ細胞系統は、生存促進性タンパク質ＭＣＬ１を同時発現していたことが示された。ＢＣＬ−ＸＬは、多くの場合、ＡＭＬでは低く発現される。
【０１１６】
実施例２：ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の併用ターゲッティングはＡＭＬにおいて相乗的な殺傷を示す
５４個のＡＭＬ患者サンプルをＲＰＭＩ／１５％ ＦＣＳ中における６ｌｏｇ濃度範囲の化合物１（ＨＣｌ塩）、化合物２又は１：１濃度と共に４８時間インキュベーションし、ＬＣ５０を決定した（図２Ａ）。
【０１１７】
初代ＡＭＬサンプルの約２０％は、化合物１又は化合物２のいずれかに対して高度に感受性であり、４８時間後に初代ＡＭＬ芽球の５０％を殺傷するのに必要とされる薬剤の致死濃度（ＬＣ５０）は、低ナノモル濃度範囲であった（ＬＣ５０＜１０nM）（図２Ａ）。対照的に、化合物１及び化合物２を組み合わせた場合、感受性であったＡＭＬサンプルの割合が、７０％まで劇的に向上し、このことは、ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１が同時にターゲッティングされた場合に相乗活性を示す（図２Ａ）。幾つかの結果を図１７に示す。
【０１１８】
このアプロ−チのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を検証するために、ルシフェラーゼ発現ＭＶ４；１１  ＡＭＬ細胞をＮＳＧマウスに生着し、化合物１（ＨＣｌ塩）又は化合物２単独又は組み合わせで処置し、腫瘍負荷を治療の１４及び２１日後に評価した（図２Ｂ）。２８日間の治療の完了時に、マウスの生存を追跡した（図２Ｃ）。これらの実験から、化合物１と化合物２との組み合わせがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて非常に有効であり、このことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで初代ＡＭＬ細胞を使用して観察された優れた活性が検証されたことが示された。
【０１１９】
本明細書における図２Ａ〜２Ｃに示されたデ−タは、ＡＭＬにおける化合物１，ＨＣｌと化合物２との間の相乗的組み合わせ活性を示す。
【０１２０】
実施例３：ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の併用阻害は白血病をターゲットにするが、正常な前駆細胞機能はターゲットにしない
正常ヒトＣＤ３４＋細胞又はＡＭＬ患者からのフィコールされた芽球に対するＭＣＬ１阻害と組み合わせられたＢＣＬ−２阻害の毒性を評価するために、クローン原性能を組み合わせ治療への２週間の曝露後に評価した。コロニーを１０％ ＦＣＳ、ＩＬ３、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＰＯを補充したアガー中において、１４日間にわたって増殖させ、コロニーを自動Gelcount（登録商標）分析器により数えた。初代ＡＭＬサンプルについてのアッセイをデュープリケートで行い、平均した。ＣＤ３４＋についての誤差を２つの独立した正常ドナーサンプルの平均＋／−ＳＤとして表わす。結果をＤＭＳＯ対照においてカウントしたコロニー数に対して正規化した。示された薬剤濃度をＤ１において撒いた。特に、化合物１＋化合物２により、正常なＣＤ３４＋コロニー増殖の機能に影響を及ぼすことなく、ＡＭＬコロニー形成活性が抑制された。
【０１２１】
まとめると、実施例２及び３から、ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の二重薬理学的阻害は、更なる化学療法を必要とせず、かつ、許容し得る治療安全ウィンドウで、ＡＭＬを処置するための新規なアプロ−チであることが示される。
【０１２２】
実施例４：単剤として又はＢＣＬ−２阻害剤との組み合わせでのＭＣＬ１阻害剤に応答した多発性骨髄腫細胞生存のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
化合物１、化合物２又は１μM 化合物１の存在下での化合物２に対する２７個のヒト多発性骨髄腫細胞系統の感受性を、ＭＴＴ細胞生存率アッセイを使用することにより分析した。５０％阻害濃度（ＩＣ５０、nM）を決定した。
【０１２３】
結果を以下の表に示す。
【０１２４】
【表２】
2019528250.tif 000010
【０１２５】
化合物単独と比較して、大部分の細胞系統において化合物１と化合物２とを組み合わせた場合、強い相乗活性が実証された。
【０１２６】
実施例５：１７個のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞系統のパネルにおけるＭＣＬ１阻害剤とＢＣＬ−２阻害剤との組み合わせの増殖に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
材料及び方法
表１に示されたように、細胞系統を入手し、ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を補充した基本培地において維持した。加えて、全ての培地には、ペニシリン（１００ＩU/ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）及びＬ−グルタミン（２mM）を含有させた。特に断りない限り、培地及びサプリメントをAmimed/Bioconcept（Allschwil,Switzerland）から得た。
【０１２７】
細胞系統を５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で培養し、Ｔ−７５フラスコ中で増殖させた。全ての場合において、細胞を凍結ストックから解凍し、適切な希釈を使用して、１回以上の継代により増殖させ、カウントし、CASY細胞カウンター（Omni Life Science, Bremen, Germany）を使用して生存について評価し、その後、表１に示された密度で、３８４ウェルプレート（Corning）に２５ul/ウェルを撒いた。全ての細胞系統について、Idexx Radil（Columbia, MO, USA）で行ったＰＣＲアッセイによりマイコプラズマ汚染がないと判定し、誤特定をAsuragen（Austin, TX, USA）又は社内での４８の小ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）のパネルの評価により除外した。
【０１２８】
化合物のストック溶液をＤＭＳＯ（Sigma）中の１０mM濃度で調製し、−２０℃で保存した。完全な用量−応答曲線を得るのに必要な場合、ストック溶液を、ＤＭＳＯ中で所望の開始濃度の１，０００倍に予め希釈した（表２を参照のこと）。細胞播種の翌日に、各化合物の８つの２．５倍系列希釈液を、図４に概説されたように、チェッカーボード様式において個々に又は全ての可能性のある順序でのいずれかで、非接触300D Digital Dispenser（TECAN, Mannedorf, Switzerland）を使用して、細胞アッセイプレートに直接分注した。ＤＭＳＯの最終濃度は、全てのウェルにおいて０．２％とした。
【０１２９】
細胞生存率に対する単剤及びそれらのチェッカーボードの組み合わせの効果を、３７℃／５％ ＣＯ２での２日間のインキュベーション後に、CellTiterGlo（Promega, Madison, WI, USA）を使用し、試薬２５μL／ウェル及び条件あたりにｎ＝２重複プレートで、細胞内ＡＴＰレベルを定量することにより評価した。発光を、M1000多目的プレートリーダー（TECAN, Mannedorf, Switzerland）で定量した。化合物添加時の細胞の数／生存率を同様に評価し、特定の細胞系統の集団倍加時間の程度を評価するのに使用した。
【０１３０】
単剤ＩＣ５０を、標準的な４パラメータ曲線当て嵌めを使用して計算した。化合物の組み合わせ間の潜在的な相乗的相互作用をＬｏｅｗｅ加法モデルに従って、過剰阻害２Ｄマトリックスを使用して評価し、相乗効果スコアとして報告する（Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）。全ての計算を、社内ソフトウェアである組み合わせ分析モジュールを使用して行った。ＩＣ５０を、ＣＴＧシグナルが媒体（ＤＭＳＯ）対照について測定されたシグナルの５０％に低下する化合物濃度として定義する。
【０１３１】
相乗効果スコアの解釈は、以下のとおりである。
ＳＳ〜０→相加的
ＳＳ＞１→弱い相乗効果
ＳＳ＞２→相乗効果
【０１３２】
【表３】
2019528250.tif 000011
【０１３３】
【表４】
2019528250.tif 000012
【０１３４】
結果
ＭＣＬ１阻害剤化合物３をＢＣＬ−２阻害剤化合物１，ＨＣｌと組み合わせることの増殖に対する効果を、１７個のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞系統のパネルにおいて評価した。
【０１３５】
単剤としての化合物３は、試験された１７個のＤＬＢＣＬ系統の大部分の増殖を強く阻害した（表１）。このため、１４個の細胞系統は、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、更に１つの細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。２つの細胞系統のみが、１uMを上回るＩＣ５０を示した。
【０１３６】
また、単剤としての化合物１，ＨＣｌは、試験された１７個のＤＬＢＣＬ系統の大部分の増殖も阻害したが、わずかに効力は低かった（表２）。このため、２つの細胞系統は、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、６つの細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。９つの細胞系統は、１uMを上回るＩＣ５０（そのうちの４つは１０uMを上回る）を示した。
【０１３７】
組み合わせにおいて、化合物３及び化合物１，ＨＣｌ処理により、試験された１７個のＤＬＢＣＬ細胞系統のうち１６個において（表２）、相乗的増殖阻害が生じた（すなわち、２を上回る相乗効果スコア−Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）。５つの細胞系統において、相乗効果が顕著であり、相乗効果スコアは、５〜１０であった。４つの細胞系統において、相乗効果が非常に優れており、１０〜１７．３の相乗効果スコアを達成した。重要なことに、相乗効果は、単剤抗増殖効果に依存せず、実際、それ自体で抗増殖効果を示さなかった化合物３及び化合物１の濃度で特に強かった。例えば、ＤＢ細胞において、試験された２番目に低い濃度での化合物３及び化合物１により、それぞれわずか１及び２％の増殖阻害が誘発されたが、２つの化合物のそれぞれの組み合わせは、９６％の増殖阻害を与え（図４Ａ、左パネル）、このため、単剤活性に基づいて計算された相加性（図４Ａ、右パネル）を９１％上回った。更なる例として、化合物３がより効力が低く、試験された最高濃度で部分的増殖阻害（４６％）のみしか達成しなかったＴｏｌｅｄｏ細胞において、２番目に低い濃度の化合物１との組み合わせにより、９８％の相乗的増殖阻害（図４Ｂ、左パネル）がもたらされ、このため、単剤活性に基づいて計算された相加性（図４Ｂ、右パネル）を５２％上回った。
【０１３８】
更に、相乗効果が広範囲の単剤濃度にわたって生じ、これが、投与レベル及び計画に関する柔軟性に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで有益であると立証することは注目に値する。
【０１３９】
まとめると、化合物３と化合物１との組み合わせにより、試験されたＤＬＢＣＬ細胞系統の大部分において、強力〜非常に優れた相乗的増殖阻害が与えられた。
【０１４０】
実施例６：ＭＣＬ１阻害剤（化合物３）とＢＣＬ−２阻害剤（化合物１）との組み合わせによるＫａｒｐａｓ４２２異種移植片におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
材料及び方法
腫瘍細胞培養及び細胞接種
Ｋａｒｐａｓ４２２ヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞系統を化学療法抵抗性ＮＨＬ患者の胸水から確立した。細胞をＤＳＭＺ細胞バンクから取得し、１０％ ＦＣＳ（BioConcept Ltd. Amimed）、２mM Ｌ−グルタミン（BioConcept Ltd. Amimed）、１mM ピルビン酸ナトリウム（BioConcept Ltd. Amimed）及び１０mM ＨＥＰＥＳ（Gibco）を補充したRPMI-1640培地（BioConcept Ltd. Amimed）中において、大気中の５％ ＣＯ２の雰囲気下３７℃で培養した。細胞を０．５〜１．５×１０６個/mLで維持した。Ｋａｒｐａｓ４２２異種移植片を確立するために細胞を収集し、ＨＢＳＳ（Gibco）に再懸濁させ、Matrigel（BD Bioscience）（１：１v/v）と混合し、その後、イソフルランで麻酔された動物の右側腹部に、１×１０７個の細胞を含有する２００μLを皮下注射した。細胞接種の２４時間前に、全ての動物に、γ線照射器を使用して２分間にわたり５Gyを照射した。
【０１４１】
腫瘍成長
腫瘍成長を細胞接種後に定期的にモニタリングし、腫瘍体積が適切な体積に達した時点で、動物を処置群（ｎ＝５）にランダム化した。処置期間中、腫瘍体積を、ノギスを使用して約週２回測定した。腫瘍サイズ（mm3）を（Ｌ×Ｗ２×π／６）から計算した。式中、Ｗは、腫瘍の幅、Ｌは、腫瘍の長さである。
【０１４２】
処置
腫瘍を有する動物（ラット）を、それらの腫瘍が約４５０mm3の平均腫瘍体積を有する群を形成するのに適したサイズに達した時点で、処置群（ｎ＝５）に登録した。処置群は、表３に概説されたとおりとした。化合物１，ＨＣｌ用の媒体又は化合物１，ＨＣｌを経口（ｐｏ）強制投与により投与し、１時間後に、化合物３用の媒体又は化合物３を１５分間のｉｖ注入により投与した。ｉｖ注入のために、動物をイソフルラン／Ｏ２により麻酔し、媒体又は化合物３を、カニューレを介して尾静脈に投与した。動物の体重を投与日に測定し、用量を体重調整し、投与容量を両方の化合物について１０ml/kgとした。
【０１４３】
体重
動物の体重を週に少なくとも２回測定し、何らかの有害作用の明白な徴候について頻繁に調べた。
【０１４４】
データ分析及び統計評価
腫瘍データを、GraphPad Prism 7.00（GraphPad Software）を使用して統計的に分析した。データにおける分散が正規分布していた場合、データを、治療群と対照群とを比較するための事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定と共に一方向ＡＮＯＶＡを使用して分析した。事後Ｔｕｋｅｙ検定を群内比較に使用した。そうでない場合には、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓランク付け検定事後Ｄｕｎｎを使用した。該当する場合、結果を平均±ＳＥＭとして示す。
【０１４５】
有効性の尺度として、％  Ｔ／Ｃ値を実験の最後に、次式に従って計算する。
（Δ腫瘍体積ｔｒｅａｔｅｄ／Δ腫瘍体積ｃｏｎｔｒｏｌ）＊１００
【０１４６】
腫瘍退縮を次式に従って計算した。
−（Δ腫瘍体積ｔｒｅａｔｅｄ／腫瘍体積ｔｒｅａｔｅｄ  ａｔ  ｓｔａｒｔ）＊１００
式中、Δ腫瘍体積は、評価日の平均腫瘍体積から実験開始時の平均腫瘍体積を引いたものを表す。
【０１４７】
【表５】
2019528250.tif 000013
【０１４８】
処置を平均腫瘍体積が約４５０mm3になった時点で開始した。化合物１，ＨＣｌをＰＥＧ４００／ＥｔＯＨ／Ｐｈｏｓａｌ５０  ＰＧ（３０／１０／６０）中に配合し、化合物３を溶液中に入れた。
【０１４９】
ＱＷは、週１回を意味する。
【０１５０】
結果
化合物１の遊離塩基を１５０mg/kg  ｐｏで１時間、その後、化合物３を２０mg/kgでｉｖ注入することによる組み合わせ処置により、処置開始から３０日目までに全てのＫａｒｐａｓ４２２腫瘍において完全な退縮が誘引される（図５）。処置群の全ての動物は、処置を３５日目から９０日目まで停止した後も腫瘍のないままであった。正の組み合わせ効果が、単剤活性と比較して、組み合わせ群において観察される。３４日目に、単剤化合物３及び組み合わせ群における腫瘍応答は、媒体群とは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。組み合わせ処置は、体重変化に基づいて十分許容される（図６）。
【０１５１】
実施例７：ＭＣＬ１阻害剤（化合物３）とＢＣＬ−２阻害剤（化合物１，ＨＣｌ）との組み合わせによるＤＬＢＣＬ  Ｔｏｌｅｄｏ異種移植片におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
材料及び方法
細胞移植
異種移植モデルは、ＳＣＩＤ／ベ−ジュマウスの皮下領域に、５０％matrigelを含む３００万個のＴｏｌｅｄｏ細胞懸濁液を直接皮下（ｓｃ）移植することにより確立した。全ての手順を、無菌技術を使用して行った。手順の全期間中、マウスを麻酔した。
【０１５２】
一般的には、１群あたりに合計６匹の動物を有効性試験に登録した。単剤及び併用試験のために、動物に、化合物１については経口強制投与（ｐｏ）により投与し、化合物３については尾静脈経由で静脈内投与（ｉｖ）を行った。化合物１，ＨＣｌをＰＥＧ３００／ＥｔＯＨ／水（４０／１０／５０）中の溶液として配合し、化合物３を溶液とした。腫瘍が細胞移植後２６日目に約２２０mm3に達した時点で、腫瘍を有するマウスを処置群にランダム化した。
【０１５３】
全ての処置群についての投与計画を含む研究設計を、以下の表に要約する。動物を投与日に秤量し、用量を体重調整し、投与容量を１０ml/kgとした。腫瘍の寸法及び体重をランダム化の時点及びその後週２回研究期間の間、収集した。以下のデータをデータ収集の各日後に提供した：死亡率、個体及び群の平均体重並びに個体及び群の平均腫瘍体積。
【０１５４】
【表６】
2019528250.tif 000014
【０１５５】
Ｔｏｌｅｄｏモデルにおける研究のために、処置を細胞移植後２６日目に開始した。この時、平均腫瘍体積は、約２１８〜２２８mm3であった。
【０１５６】
ＱＷは、週１回を意味する。
【０１５７】
体重（ＢＷ）
体重の変化％は、（ＢＷｃｕｒｒｅｎｔ−ＢＷｉｎｉｔｉａｌ）／（ＢＷｉｎｉｔｉａｌ）×１００として計算した。データは、処置開始日からの体重変化％として表わされる。
【０１５８】
腫瘍体積及び試験中に残ったマウスのパ−セント
％  処置／対照（Ｔ／Ｃ）値を、以下の式を使用して計算した。
％  Ｔ／Ｃ＝１００×ΔＴ／ΔＣ（ΔＴ＞０の場合）
％  回帰＝１００×ΔＴ／Ｔ０（ΔＴ＜０の場合）
式中
Ｔ＝試験の最終日における薬剤処置群の平均腫瘍体積
ΔＴ＝試験の最終日における薬剤処置群の平均腫瘍体積−投与開始日における薬剤処置群の平均腫瘍体積
Ｔ０＝コホ−ト当日における薬剤処置群の平均腫瘍体積
Ｃ＝試験の最終日における対照群の平均腫瘍体積、及び
ΔＣ＝試験の最終日における対照群の平均腫瘍体積−投与開始日における対照群の平均腫瘍体積
【０１５９】
試験中に残ったマウスのパ−セント＝６−エンドポイントに達したマウス数／６＊１００
【０１６０】
統計分析
全てのデータを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表わした。デルタ腫瘍体積及び  体重変化％を統計分析に使用した。群間の比較を一元配置ＡＮＯＶＡ、続けて、事後Ｔｕｋｅｙ検定を使用して行った。全ての統計的評価について、有意水準をｐ＜０．０５に設定した。特に断りない限り、媒体対照群と比較した有意性を報告する。
【０１６１】
結果
【表７】
2019528250.tif 000015
【０１６２】
Ｔｏｌｅｄｏモデルにおいて、１００mg/kgでの化合物１の遊離塩基により、３７％ Ｔ／Ｃでの統計的に有意な抗腫瘍効果が生じた。２５mg/kgでの化合物３により、１０２％ Ｔ／Ｃで、抗腫瘍効果がもたらされなかった（図７）。化合物１＋化合物３の組み合わせにより、媒体、化合物１及び化合物３で処置された腫瘍と比較して、統計的に有意な３％ Ｔ／Ｃでの腫瘍停止がもたらされた（一元配置ＡＮＯＶＡ検定による、ｐ＜０．０５）。
【０１６３】
したがって、ＤＬＢＣＬにおけるＢＣＬ−２及びＭＣＬ１の併用阻害は、臨床において治療的利益を提供する可能性がある。加えて、Ｔｏｌｅｄｏについての平均体重変化を図８に示す。化合物１，ＨＣｌ及び化合物３によるマウス処置は、体重増加（それぞれ１．０８１％及び２．３％）を示す。併用群では、わずかな体重減少（−３．２％）を示した。この試験では、有害事象の他の徴候は観察されなかった。６匹の動物は全て、試験を通して生存した。
【０１６４】
まとめると、実施例２、６及び７から、ＭＣＬ１阻害剤とＢＣＬ−２阻害剤との組み合わせは、急性骨髄性白血病及びリンパ腫ヒト由来細胞系統の異種移植片を有するマウス及びラットにおいて、耐容用量で有効であることが示された。このことから、適切な治療ウィンドウをこれらの疾患においてこの組み合わせにより達成可能であることが示唆される。
【０１６５】
実施例８：１３個の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系統のパネルにおいて、ＭＣＬ１阻害剤をＢＣＬ−２阻害剤と組み合わせることの増殖に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
材料及び方法
表１に示されたように、細胞系統を入手し、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を補充した基本培地中で維持した。加えて、全ての培地に、ペニシリン（１００IU/ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）及びＬ−グルタミン（２mM）を含有させた。
【０１６６】
細胞系統を５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で培養し、Ｔ−１５０フラスコ中で増殖させた。全ての場合において、細胞を凍結ストックから解凍し、適切な希釈を使用して、１回以上の継代により増殖させ、カウントし、CASY細胞カウンターを使用して生存について評価し、その後、表１に示された密度で、９６ウェルプレートに１５０ul/ウェルを撒いた。全ての細胞系統は、マイコプラズマ汚染を含まないと自社で決定した。
【０１６７】
化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中の５mM濃度で調製し、−２０℃で保存した。
【０１６８】
単剤としての化合物の活性を分析するために、細胞を播種し、細胞アッセイプレートに個々に直接分注された各化合物の９つの２倍系列希釈液により処理した。細胞生存率に対する化合物の効果を３７℃／５％ ＣＯ２での３日間のインキュベーション後に、試薬 ７５μL／ウェルでCellTiterGloを使用して、細胞内ＡＴＰレベルの定量により評価した。全ての実験をトリプリケートで行った。発光を多目的プレートリーダーで定量した。単剤ＩＣ５０を、標準的な４パラメータ曲線当て嵌めを使用して計算した。ＩＣ５０は、ＣＴＧシグナルが媒体（ＤＭＳＯ）対照について測定されたものの５０％に低下する化合物濃度として定義される。
【０１６９】
組み合わせにおける化合物の活性を分析するために、細胞を播種し、図９に示されたように、チェッカーボード様式で細胞アッセイプレートに個々に又は全ての可能性のある順序でのいずれかで直接分注された各化合物の７つ又は８つの３．１６倍系列希釈液により処理した。細胞生存率に対する単剤及びそれらのチェッカーボードの組み合わせの効果を、試薬 ７５μL／ウェルでCellTiterGloを使用して、細胞内ＡＴＰレベルを定量することにより、３７℃／５％ ＣＯ２での３日間のインキュベーション後に評価した。それぞれデュープリケートで行った２つの独立した実験を行った。発光を多目的プレートリーダーで定量した。
【０１７０】
化合物の組み合わせ間の潜在的な相乗的相互作用をＬｏｅｗｅ加法性モデルに従って過剰阻害２Ｄマトリックスを使用して評価し、相乗効果スコアとして報告する（Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）。全ての計算を、Clalice（商標）Bioinformaticsソフトウェアを使用して行った。
【０１７１】
表３に示された倍加時間は、細胞の解凍から９６ウェルプレートでのそれらの播種までを行った（Ｔ−１５０フラスコ中での）異なる継代で得た倍加時間の平均である。
【０１７２】
相乗効果スコアの解釈は、以下のとおりである。
ＳＳ〜０→相加的
ＳＳ＞１→弱い相乗効果
ＳＳ＞２→相乗効果
【０１７３】
【表８】
2019528250.tif 000016
【０１７４】
【表９】
2019528250.tif 000017
【０１７５】
【表１０】
2019528250.tif 000018
【０１７６】
【表１１】
2019528250.tif 000019
【０１７７】
【表１２】
2019528250.tif 000020
【０１７８】
【表１３】
2019528250.tif 000021
【０１７９】
結果
組み合わせ（ａ）．ＭＣＬ１阻害剤である化合物３をＢＣＬ−２阻害剤である化合物１と組み合わせることの増殖に対する効果を１３個の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系統のパネルにおいて評価した。
【０１８０】
単剤としての化合物３は、試験された１３個のＡＭＬ系統の大部分の増殖を強く阻害した（表４ａ）。このため、１０個の細胞系統は、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、更に２個の細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。１つの細胞系統のみが、１uMを上回るＩＣ５０を示した。
【０１８１】
単剤としての化合物１，ＨＣｌも、試験された幾つかのＡＭＬ系統の増殖を阻害したが、わずかに効力は低かった（表４ａ）。このため、５つの細胞系統は、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、２つの細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。６つの細胞系統は、１μMを上回るＩＣ５０を示した。
【０１８２】
組み合わせにおいて、化合物３及び化合物１，ＨＣｌ処理により、試験された１３個の細胞系統全てにおいて相乗的増殖阻害（すなわち、２を上回る相乗効果スコア）が生じた（表５ａ）。２つの細胞系統において、相乗効果が顕著であり、相乗効果スコアは、５〜１０であった。１０個の細胞系統において、相乗効果が非常に優れており、相乗効果スコアは、１０〜１９．８に達した。重要なことに、相乗効果は、単剤抗増殖効果に依存せず、実際、それ自体では抗増殖効果を有さなかった化合物３及び化合物１の濃度で特に強かった。例えば、ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞において、試験された３番目に低い濃度での化合物３及び化合物１により、それぞれ５％及び１％の増殖阻害が誘発されたが、２つの化合物のそれぞれの組み合わせにより、８４％の増殖阻害が与えられた（図９Ａ、左上パネル）ため、単剤活性に基づいて計算された相加性を７９％上回った（図９Ａ、右上パネル）。
【０１８３】
更に、相乗効果が広範囲の単剤濃度にわたって生じ、これが、投与レベル及び計画に関する柔軟性に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで有益であると立証することは注目に値する。
【０１８４】
まとめると、化合物３と化合物１との組み合わせにより、試験された１３個全てのＡＭＬ細胞系統において、相乗的増殖阻害が与えられた。重要なことに、非常に優れた相乗的増殖阻害が、試験された大部分のＡＭＬ細胞系統（１０／１３）において観察された。
【０１８５】
組み合わせ（ｂ）．ＭＣＬ１阻害剤である化合物３をＢＣＬ−２阻害剤であるＡＢＴ−１９９と組み合わせることの増殖に対する効果を８個の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系統のパネルにおいて評価した。
【０１８６】
単剤としての化合物３は、試験された８個のＡＭＬ系統の大部分の増殖を強く阻害した（表４ｂ）。このため、５個の細胞系統は、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、更に２個の細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。１つの細胞系統のみが、１uMを上回るＩＣ５０を示した。
【０１８７】
単剤としてのＡＢＴ−１９９も、ＡＭＬ系統の増殖を阻害したが、効力は低かった（表４ａ）。このため、１つのみの細胞系統が、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、２つの細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。５つの細胞系統は、１uMを上回るＩＣ５０を示した。
【０１８８】
組み合わせにおいて、ＭＣＬ１阻害剤とＡＢＴ−１９９との処理により、試験された８個の細胞系統の全パネルにおいて相乗的増殖阻害（すなわち、２を上回る相乗効果スコア）が生じた（表５ｂ）。大部分の細胞系統において、相乗効果が非常に優れており、相乗効果スコアは、１０〜１７．６に達した。重要なことに、相乗効果は、単剤抗増殖効果に依存せず、実際、それ自体では抗増殖効果を有さなかったＭＣＬ１阻害剤及びＡＢＴ−１９９の濃度で特に強かった。例えば、ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞において、試験された３番目に低い濃度でのＭＣＬ１及びＡＢＴ−１９９により、それぞれ２６％及び１８％の増殖阻害が誘発されたが、２つの化合物のそれぞれの組み合わせにより、９１％の増殖阻害が与えられた（図１３、左上パネル）。
【０１８９】
更に、相乗効果が広範囲の単剤濃度にわたって生じ、これが、投与レベル及び計画に関する柔軟性に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで有益であると立証することは注目に値する。
【０１９０】
まとめると、化合物３とＡＢＴ−１９９との組み合わせにより、試験された８個全てのＡＭＬ細胞系統において、相乗的増殖阻害が与えられた。重要なことに、非常に優れた相乗的増殖阻害が、試験された大部分のＡＭＬ細胞系統（７／８）において観察された。
【０１９１】
組み合わせ（ｃ）．ＭＣＬ１阻害剤である化合物３をＢＣＬ−２阻害剤である化合物４と組み合わせることの増殖に対する効果を５個の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系統のパネルにおいて評価した。
【０１９２】
単剤としての化合物３は、試験された５個のＡＭＬ系統の増殖を強く阻害した（表４ｂ）。このため、全て細胞系統は、２００nMを下回るＩＣ５０を示した。単剤としての化合物４，ＨＣｌも、試験された５個の細胞系統のうちの４つの増殖を阻害し、４０nM以下のＩＣ５０を示した。１つの細胞系統は、化合物４に対して抵抗性であり、１０μMのＩＣ５０を示した。組み合わせにおいて、化合物３及び化合物４，ＨＣｌ処理により、試験された５個の細胞系統全てにおいて相乗的増殖阻害（すなわち、２を上回る相乗効果スコア）が生じた（表５ｃ）。２つの細胞系統において、相乗効果が顕著であり、相乗効果スコアは、５〜１０であった。１つの細胞系統において、相乗効果が非常に優れており、相乗効果スコアは、１６．５に達した。重要なことに、相乗効果は、単剤抗増殖効果に依存せず、実際、それ自体では抗増殖効果を有さない、又は、抗増殖効果が低い化合物４，ＨＣｌ及び化合物３の濃度で特に強かった。例えば、ＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞において、試験された３番目に低い濃度での化合物４，ＨＣｌ及び化合物３により、それぞれ１％及び４０％の増殖阻害が誘発されたが、２つの化合物のそれぞれの組み合わせにより、９８％の増殖阻害が与えられた（図１４Ａ、左パネル；２つの独立した実験の代表値）ため、単剤活性に基づいて計算された相加性を５３％上回った（図１４Ａ、右パネル）。ＭＬ−２において、試験された５番目に低い濃度での化合物４，ＨＣｌ及び化合物３により、それぞれ１８％及び２６％の成長阻害が誘発されたが、２つの化合物のそれぞれの組み合わせにより、１００％の成長阻害が与えられた（図１４Ｂ、左パネル；２つの独立した実験の代表値）ため、単剤活性に基づいて計算された相加性を５１％上回った（図１５、右パネル）。
【０１９３】
まとめると、化合物４と化合物３との組み合わせにより、試験された５個全てのＡＭＬ細胞系統において、相乗的増殖阻害が与えられた。
【０１９４】
実施例９：１２個の神経芽細胞腫（ＮＢ）細胞系統のパネルにおける、ＭＣＬ１阻害剤とＢＣＬ−２阻害剤との組み合わせの増殖に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
材料及び方法
表１に示されたように、細胞系統を入手し、ＦＢＳを補充した基本培地中で維持した。加えて、全ての培地に、ペニシリン（１００IU/ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）及びＬ−グルタミン（２mM）を含有させた。細胞系統を５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で培養し、Ｔ−１５０フラスコ中で増殖させた。全ての場合において、細胞を凍結ストックから解凍し、適切な希釈を使用して、１回以上の継代により増殖させ、カウントし、CASY細胞カウンターを使用して生存について評価し、その後、表６に示された密度で、９６ウェルプレートに１５０ul/ウェルを撒いた。全ての細胞系統は、マイコプラズマ汚染を含まないと自社で決定した。
【０１９５】
化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中の５mM濃度で調製し、−２０℃で保存した。単剤としての化合物の活性を分析するために、細胞を播種し、細胞アッセイプレートに個々に直接分注された各化合物の９つの３．１６倍系列希釈液により処理した。細胞生存率に対する化合物の効果を３７℃／５％ ＣＯ２での２又は３日間のインキュベーション（図６に示されたように）後に、試薬 １５０μL／ウェルでCellTiterGloを使用して、細胞内ＡＴＰレベルの定量により評価した。それぞれデュープリケートで行った２つの独立した実験を行った。全ての実験をトリプリケートで行った。発光を多目的プレートリーダーで定量した。単剤ＩＣ５０を、標準的な４パラメータ曲線当て嵌めを使用して計算した。ＩＣ５０は、ＣＴＧシグナルが媒体（ＤＭＳＯ）対照について測定されたものの５０％に低下する化合物濃度として定義される。
【０１９６】
化合物の組み合わせ間の潜在的な相乗的相互作用を評価するために、同一の実験を行った。相乗効果スコアをＬｏｅｗｅ加法性モデルに従って過剰阻害２Ｄマトリックスを使用して評価した（Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）。全ての計算を、Clalice（商標）Bioinformaticsソフトウェアを使用して行った。
【０１９７】
表６に示された倍加時間は、細胞の解凍から９６ウェルプレートでのそれらの播種までを行った（Ｔ−１５０フラスコ中での）異なる継代で得た倍加時間の平均である。
【０１９８】
相乗効果スコアの解釈は、以下のとおりである。
ＳＳ〜０→相加的
ＳＳ＞１→弱い相乗効果
ＳＳ＞２→相乗効果
【０１９９】
【表１４】
2019528250.tif 000022
【０２００】
【表１５】
2019528250.tif 000023
【０２０１】
【表１６】
2019528250.tif 000024
【０２０２】
結果
ＭＣＬ１阻害剤である化合物３をＢＣＬ−２阻害剤である化合物１と組み合わせることの増殖に対する効果を１２個の神経芽腫細胞系統のパネルにおいて評価した。試験された１２個の細胞系統のうちの３つは、単剤としての化合物３に感受性である（表７）。１つの細胞系統は、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、更に２つの細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。
【０２０３】
全ての細胞系統は、単剤としての化合物１，ＨＣｌに対して抵抗性であり、試験された全ての細胞系統は、１μMを上回るＩＣ５０を示した。組み合わせにおいて、化合物３及び化合物１処理により、試験された１２個のＮＢ細胞系統のうちの１１個において相乗的増殖阻害（すなわち、２を上回る相乗効果スコア−Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）が生じた（表８）。５つの細胞系統において、相乗効果が非常に優れており、相乗効果スコアは、１０〜１７．８１に達した。重要なことに、相乗効果は、単剤抗増殖効果に依存せず、実際、それ自体では抗増殖効果を有さなかった化合物３及び化合物１，ＨＣｌの濃度で特に強かった。例えば、ＬＡＮ−６細胞において、６３０nMでの化合物３及び化合物１，ＨＣｌにより、それぞれわずか１２％及び０％の増殖阻害が誘発されたが、２つの化合物のそれぞれの組み合わせにより、９５％の増殖阻害が与えられた（図１０、左上パネル）ため、単剤活性に基づいて計算された相加性を７６％上回った（図１０、右上パネル）。
【０２０４】
まとめると、化合物３と化合物１との組み合わせにより、試験された大部分の神経芽腫細胞系統において、強い〜非常に優れた相乗的増殖阻害が与えられた。
【０２０５】
実施例１０：８個のＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）及び１０個のＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞系統のパネルにおける、ＭＣＬ１阻害剤をＢＣＬ−２阻害剤と組み合わせることの増殖に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
材料及び方法
表１に示されたように、細胞系統を入手し、ＦＢＳを補充した基本培地中で維持した。加えて、全ての培地に、ペニシリン（１００IU/ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）及びＬ−グルタミン（２mM）を含有させた。細胞系統を５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で培養し、Ｔ−１５０フラスコ中で増殖させた。全ての場合において、細胞を凍結ストックから解凍し、適切な希釈を使用して、１回以上の継代により増殖させ、カウントし、CASY細胞カウンターを使用して生存について評価し、その後、表９に示された密度で、９６ウェルプレートに１５０ul/ウェルを撒いた。全ての細胞系統は、マイコプラズマ汚染を含まないと自社で決定した。
【０２０６】
化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中の５mM濃度で調製し、−２０℃で保存した。単剤としての化合物の活性を分析するために、細胞を播種し、細胞アッセイプレートに個々に直接分注された各化合物の９つの２倍系列希釈液により処理した。細胞生存率に対する化合物の効果を３７℃／５％ ＣＯ２での３日間のインキュベーション後に、試薬 ７５μL／ウェルでCellTiterGloを使用して、細胞内ＡＴＰレベルの定量により評価した。全ての条件をトリプリケートで試験した。発光を多目的プレートリーダーで定量した。単剤ＩＣ５０を、標準的な４パラメータ曲線当て嵌めを使用して計算した。ＩＣ５０は、ＣＴＧシグナルが媒体（ＤＭＳＯ）対照について測定されたものの５０％に低下する化合物濃度として定義される。
【０２０７】
組み合わせでの化合物の活性を分析するために、図１に示されたように、細胞を播種し、チェッカーボード様式において個々に又は全ての可能性のある順序でのいずれかで、細胞アッセイプレートに直接分注された各化合物の７つ又は８つの３．１６倍系列希釈液により処理した。細胞生存率に対する単剤及びそれらのチェッカーボード組み合わせの効果を３７℃／５％ ＣＯ２での３日間のインキュベーション後に、試薬 ７５μL／ウェルでCellTiterGloを使用して、細胞内ＡＴＰレベルの定量により評価した。Ｂ−ＡＬＬ細胞系統について、それぞれデュープリケートで行った２つの独立した実験を行った。Ｔ−ＡＬＬ細胞系統について、１回の実験をトリプリケートで行った。発光を多目的プレートリーダーで定量した。化合物の組み合わせ間の潜在的な相乗的相互作用をＬｏｅｗｅ加法性モデルに従って過剰阻害２Ｄマトリックスを使用して評価し、相乗効果スコアとして報告する（Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）。全ての計算を、Horizon websiteから入手できるClalice（商標）Bioinformaticsソフトウェアを使用して行った。
【０２０８】
表９に示された倍加時間は、細胞の解凍から９６ウェルプレートでのそれらの播種までを行った（Ｔ−１５０フラスコ中での）異なる継代で得た倍加時間の平均である。
【０２０９】
相乗効果スコアの解釈は、以下のとおりである。
ＳＳ〜０→相加的
ＳＳ＞１→弱い相乗効果
ＳＳ＞２→相乗効果
【０２１０】
【表１７】
2019528250.tif 000025
【０２１１】
【表１８】
2019528250.tif 000026
【０２１２】
【表１９】
2019528250.tif 000027
【０２１３】
結果
ＭＣＬ１阻害剤をＢＣＬ−２阻害剤と組み合わせることの増殖に対する効果を８個のＢ−ＡＬＬ及び１０個のＴ−ＡＬＬ細胞系統のパネルにおいて評価した。
【０２１４】
単剤としてのＭＣＬ１阻害剤は、試験されたＡＬＬ細胞系統の大部分の増殖を強く阻害した（表１０）。このため、１３個のＡＬＬ細胞系統は、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、更に２個のＡＬＬ細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。３つのＡＬＬ細胞系統のみが、１uMを上回るＩＣ５０を示した。
【０２１５】
また、単剤としてのＢＣＬ−２阻害剤は、試験された幾つかのＡＬＬ細胞系統の増殖も阻害したが、効力は低かった（表１０）。このため、５つの細胞系統は、１００nMを下回るＩＣ５０を示し、２つの細胞系統は、１００nM〜１uMのＩＣ５０を示した。１１個のＡＬＬ細胞系統は、１uMを上回るＩＣ５０を示した。
【０２１６】
組み合わせにおいて、ＭＣＬ１阻害剤及びＢＣＬ−２阻害剤処理により、試験された全ての１７／１８個のＡＬＬ細胞系統において（表１１）、相乗的増殖阻害が生じた（すなわち、２を上回る相乗効果スコア−Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）。６つの細胞系統において、相乗効果が顕著であり、相乗効果スコアは、５〜１０であった。５つの細胞系統において、相乗効果が非常に優れており、１０〜１５．９の相乗効果スコアを達成した。重要なことに、相乗効果は、単剤抗増殖効果に依存せず、実際、それ自体で抗増殖効果を示さなかったＭＣＬ１阻害剤及びＢＣＬ−２阻害剤の濃度で特に強かった。例えば、ＭＡＬＭ−６細胞において、試験された４番目に低い濃度でのＭＣＬ１阻害剤及びＢＣＬ−２阻害剤により、それぞれ６及び８％の増殖阻害が誘発されたが、２つの化合物のそれぞれの組み合わせは、６１％の増殖阻害を与えた（図１１、左上パネル）。
【０２１７】
更に、相乗効果が広範囲の単剤濃度にわたって生じ、これが、投与レベル及び計画に関する柔軟性に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏで有益であると立証することは注目に値する。
【０２１８】
まとめると、ＭＣＬ１阻害剤とＢＣＬ−２阻害剤との組み合わせにより、試験された大部分（１７／１８個）のＡＬＬ細胞系統において、相乗的増殖阻害が与えられた。重要なことに、非常に優れた相乗的増殖阻害が、試験された５／１８個のＡＬＬ細胞系統において観察された。
【０２１９】
実施例１１：５つのマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞系統のパネルにおける、ＭＣＬ１阻害剤をＢＣＬ−２阻害剤と組み合わせることの増殖に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
材料及び方法
表１２に示されたように、細胞系統を入手し、ＦＢＳを補充した基本培地中で維持した。加えて、全ての培地に、ペニシリン（１００IU/ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）及びＬ−グルタミン（２mM）を含有させた。
【０２２０】
細胞系統を５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で培養し、Ｔ−１５０フラスコ中で増殖させた。全ての場合において、細胞を凍結ストックから解凍し、適切な希釈を使用して、１回以上の継代により増殖させ、カウントし、CASY細胞カウンターを使用して生存について評価し、その後、表１２に示された密度で、９６ウェルプレートに１５０ul/ウェルを撒いた。全ての細胞系統は、マイコプラズマ汚染を含まないと自社で決定した。
【０２２１】
化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中の５mM濃度で調製し、−２０℃で保存した。単剤として又は組み合わせでの化合物の活性を分析するために、細胞を播種し、チェッカーボード様式において個々に又は全ての可能性のある順序でのいずれかで、細胞アッセイプレートに直接分注された各化合物の７つ又は８つの３．１６倍系列希釈液により処理した。細胞生存率に対する単剤及びそれらのチェッカーボード組み合わせの効果を３７℃／５％ ＣＯ２での２日間のインキュベーション後に、試薬 １５０μL／ウェルでCellTiterGloを使用して、細胞内ＡＴＰレベルの定量により評価した。全ての条件をトリプリケートで試験した。発光を多目的プレートリーダーで定量した。
【０２２２】
化合物の組み合わせ間の潜在的な相乗的相互作用をＬｏｅｗｅ加法性モデルに従って過剰阻害２Ｄマトリックスを使用して評価し、相乗効果スコアとして報告する（Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）。全ての計算を、Horizon websiteから入手できるClalice（商標）Bioinformaticsソフトウェアを使用して行った。
【０２２３】
単剤ＩＣ５０を、標準的な４パラメータ曲線当て嵌めを使用して計算した。ＩＣ５０は、ＣＴＧシグナルが媒体（ＤＭＳＯ）対照について測定されたものの５０％に低下する化合物濃度として定義される。
【０２２４】
表１２に示された倍加時間は、細胞の解凍から９６ウェルプレートでのそれらの播種までを行った（Ｔ−１５０フラスコ中での）異なる継代で得た倍加時間の平均である。
【０２２５】
相乗効果スコア
ＳＳ〜０→相加的
ＳＳ＞１→弱い相乗効果
ＳＳ＞２→相乗効果
【０２２６】
【表２０】
2019528250.tif 000028
【０２２７】
【表２１】
2019528250.tif 000029
【０２２８】
【表２２】
2019528250.tif 000030
【０２２９】
結果
ＭＣＬ１阻害剤をＢＣＬ−２阻害剤と組み合わせることの増殖に対する効果を５つのマントル細胞リンパ腫細胞系統のパネルにおいて評価した。
【０２３０】
単剤としてのＭＣＬ１阻害剤は、ＢＣＬ−２阻害剤と比較して優れた活性を示した。このため、３つの細胞系統は、ＭＣＬ１阻害剤について１００nMを下回るＩＣ５０を示し、一方で、１つの細胞系統のみが、ＢＣＬ−２阻害剤について１００nMを下回るＩＣ５０を示した（表１３）。
【０２３１】
組み合わせにおいて、ＭＣＬ１阻害剤及びＢＣＬ−２阻害剤処理により、試験された全ての細胞系統において（表１４）、図１２に例示されたように、相乗的増殖阻害が生じた（すなわち、２を上回る相乗効果スコア−Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666）。重要なことに、４／５個の細胞系統において、相乗効果が顕著であり、相乗効果スコアは、５を上回った。
【０２３２】
実施例１２：５つの小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）細胞系統のパネルにおける、ＭＣＬ１阻害剤をＢＣＬ−２阻害剤と組み合わせることの増殖に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
全ての細胞系統をＡＴＣＣから得た。１０％ ＦＢＳ（HyClone）を補充したRPMI1640（Invitrogen）を含有する培養培地をＣＯＲ−Ｌ９５、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ２１１、ＳＨＰ−７７、ＳＷ１２７１、ＮＣＩ−Ｈ１３３９、ＮＣＩ−Ｈ１９６３及びＮＣＩ−Ｈ８８９に使用した。１０％ ＦＢＳを含むWaymouth’s MB 752/1（Invitrogen）を含有する培養培地をＤＭＳ−２７３に使用した。５％ ＦＢＳを含有し、０．００５mg/mL インスリン、０．０１mg/mL トランスフェリン及び３０nM 亜セレン酸ナトリウム溶液（Invitrogen）、１０nM ヒドロコルチゾン（Sigma）、１０nM β−エストラジオ−ル（Sigma）及び２mM Ｌ−グルタミン（HyClone）を補充したDMEM/F12（Invitrogen）を含有する培養培地をＮＣＩ−Ｈ１１０５に使用した。
【０２３３】
細胞系統を３７℃及び５％ ＣＯ２インキュベーター中で培養し、Ｔ−７５フラスコ中で増殖させた。全ての場合において、細胞を凍結ストックから解凍し、１：３希釈を使用して、１回以上の継代により増殖させ、カウントし、ViCellカウンター（Beckman-Coulter）を使用して生存について評価し、その後、３８４ウェルに撒いた。細胞系統を分割し、増殖させるために、細胞をフラスコから、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO）を使用して取り出した。全ての細胞系統はIdexx Radil（Columbia, MO, USA）で行われるＰＣＲ検出法により決定されるように、マイコプラズマ汚染を含まないと決定され、ＳＮＰのパネルの検出により正確に特定した。
【０２３４】
細胞増殖を７２時間CellTiter-Glo（商標）（ＣＴＧ）アッセイ（Promega G7571）で測定し、示された全ての結果は、少なくともトリプリケートの測定の結果である。CellTiter-Glo（商標）アッセイのために、細胞をウェルあたりに培地３５μLの最終容量及び５０００個の密度で、組織培養処理された３８４ウェルプレート（Corning 3707）に分注した。撒いてから２４時間後、各化合物希釈系列 ５μLを、細胞を含有するプレートに移し、化合物濃度範囲０〜１０uM及び最終ＤＭＳＯ（Sigma D8418）濃度０．１６％とした。プレートを７２時間インキュベーションし、細胞増殖に対する化合物の効果を、CellTiter-Glo（商標） Luminescent Cell Viability Assay（Promega G7571）及びEnvisionプレートリーダー（Perkin Elmer）を使用して決定した。
【０２３５】
CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assayは、代謝的に活性な細胞の存在を示すＡＴＰの存在の定量に基づいて、培養中の生存細胞の数を決定する均一な方法である。この方法は、Technical Bulletin, TB288 Promegaに詳細に記載されている。簡潔には、細胞を不透明壁マルチウェルプレートの上記された培養培地中に撒いた。また、細胞を含まない培地を含有する対照ウェルも、バックグラウンド発光についての値を得るために準備した。ついで、CellTiter-Glo（登録商標）試薬 １５uLを添加し、内容物をオービタルシェーカーで１０分間混合して、細胞溶解を誘引した。次に、発光を、プレートリーダーを使用して記録した。
【０２３６】
増殖阻害％及び過剰阻害を、Chaliceソフトウェア（CombinatoRx, Cambridge MA）を使用して分析した。ＤＭＳＯに対する増殖阻害％をラベル付き阻害のパネルに示し、予測量の過剰での阻害量をラベル付きＡＤＤ過剰阻害のパネルに示す（図１５（ａ）〜（ｅ））。化合物１，ＨＣｌの濃度を左から右へ下の列に沿って示し、化合物３の濃度を下から上へ最も左の列に沿って増加させる。グリッド表示中の残りの全ての点は、２つの軸上に示される単剤濃度に対応する２つの阻害剤の組み合わせからの結果を示す。細胞増殖のデータ分析を、Chalice分析器を使用して、Lehar et al, Nat Biotechnol. 2009 July ; 27(7): 659-666に記載されたように行った。過剰阻害を２つの薬剤が用量相加的様式で挙動した場合に予想されるであろう効果に対して、増殖に対する効果を測定するＬｏｅｗｅ相乗モデルを使用して計算した。正の数字は、相乗効果が増加する領域を表わす。
【０２３７】
相乗効果スコア
ＳＳ〜０→用量相加的
ＳＳ＞２→相乗効果
ＳＳ＞１→弱い相乗効果
【０２３８】
結果
組み合わせにおいて、化合物１及び化合物３処理により、８／１０個の小細胞肺ガン細胞系統において、相乗的増殖阻害が生じた（すなわち、２を上回る相乗効果スコア）。重要なことに、６つの細胞系統において、相乗効果は顕著であり、相乗効果スコアは６を上回った。
【０２３９】
実施例１３：ＭＣＬ１阻害剤（化合物３）とＢＣＬ−２阻害剤（化合物１，ＨＣｌ又はＡＢＴ−１９９）との組み合わせによる、患者由来初代ＡＭＬモデルＨＡＭＬＸ５３４３におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
材料及び方法
材料
動物
体重１７〜２７グラム ＮＯＤｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）メスマウス（Jackson Laboratories）を操作前に３日間、自由に食餌及び水へのアクセスに順応させた。
【０２４０】
初代腫瘍モデル
ＫＲＡＳ突然変異及び野生型ＦＬＴ３を有する患者由来初代ＡＭＬモデルＨＡＭＬＸ５３４３をDana Farber Cancer Instituteから入手した。
【０２４１】
試験化合物、配合物
化合物１，ＨＣｌを静脈内投与用の溶液としての５％ エタノール、２０％ Dexolve-7中に配合するか、又は、経口投与用のＰＥＧ３００／ＥｔＯＨ／水（４０／１０／５０）中に配合した。ＡＢＴ−１９９を経口投与用のＰＥＧ３００／ＥｔＯＨ／水（４０／１０／５０）中に配合した。それらは全て、４℃において少なくとも１週間安定である。化合物３を静脈内製剤用の溶液としてのリポソーム製剤中に配合した。同配合物は、４℃で３週間安定である。媒体及び化合物投与溶液を必要に応じて調製した。全ての動物に、１０mL/kg 化合物１（遊離塩基として表わされる）もしくはＡＢＴ−１９９又は５mL/kg 化合物３を投与した。
【０２４２】
方法
試験設計
８つの処置群を表１５に要約されたように、研究７８４４ＨＡＭＬＸ５３４３−ＸＥＦにおいて使用した。全ての処置を平均腫瘍量（％ＣＤ−４５陽性細胞）が８％〜１５％となった時点で開始した。
【０２４３】
この試験では、化合物１を５０mg/kgで週１回、経口強制投与（ｐｏ）又は静脈内投与により投与した。ＡＢＴ−１９９を２５mg/kgで週１回での経口強制投与（ｐｏ）により、単剤として又は、１２．５mg/kgで週１回での化合物３との組み合わせでのいずれかで、それぞれ１８日間投与した。
【０２４４】
化合物１（遊離塩基として表される）及びＡＢＴ−１９９の両方を１０mL/kgで投与した。化合物３を５mL/kgで投与した。用量を体重調整した。体重を２回／週で記録し、腫瘍量を１回／週で記録した。
【０２４５】
【表２３】
2019528250.tif 000031
【０２４６】
初代ＡＭＬモデル
この実験のために、３２匹のマウスに初代ＡＭＬ系統ＨＡＭＬＸ５３４３を移植した。マウスに２００万個 白血病細胞を静脈内注入した。腫瘍量が８％〜１５％となった時点で、動物を媒体、化合物１（ｐｏ）、化合物１（ｉｖ）、ＡＢＴ−１９９、化合物３又は組み合わせ処置について、それぞれ４匹のマウスの８つの群にランダム化した。処置の１８日後、腫瘍量が９９％に達した時点で試験を終了した。腫瘍量をＦＡＣＳ分析により測定した。
【０２４７】
動物のモニタリング
動物の健康及び行動（身づくろい及び歩行を含む）を１日２回モニタリングした。マウスの一般的な健康状態をモニタリングし、死亡率を毎日記録した。瀕死の動物はいずれも殺処分した。
【０２４８】
腫瘍測定
マウスは、１週間に１回、尾の切断により採血した。血液を９６ウェルプレートのＩｇＧ対照ウェル及びＣＤ３３／ＣＤ４５ウェルに分割した。血液をＲＢＣ溶解バッファー ２００μlにより、室温で２回溶解し、ついで、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の５％ ＦＢＳ）で１回洗浄した。ついで、サンプルをブロッキングバッファー（５％ マウスＦｃブロック＋５％ ヒトＦｃブロック＋９０％ ＦＡＣＳバッファー） １００μl中において、４℃で１０〜３０分間インキュベーションした。ＩｇＧ対照ミックス（マウスｉｇＧ１Ｋアイソタイプ対照−ＰＥ ２．５μl＋マウスｉｇＧ１Ｋアイソタイプ対照−ＡＰＣ ２．５μl＋ＦＡＣＳバッファー １５μl） ２０μlをＩｇＧ対照ウェルに加え、ＣＤ３３／ＣＤ４５ミックス（マウス抗ヒトＣＤ３３−ＰＥ ２．５μl＋マウス抗ヒトＣＤ４５−ＡＰＣ ２．５μl＋ＦＡＣＳバッファー １５μl）２０μlを加えた。サンプルを４℃で３０〜６０分間インキュベーションし、ついで、分析前に２回洗浄した。サンプルを、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用してCantoで行った。分析を、FloJoソフトウェアを使用して行った。ＣＤ４５陽性の生きている単一細胞％を腫瘍量として報告した。
【０２４９】
データの分析
％  処置／対照（Ｔ／Ｃ）値を以下の式を使用して計算した。
ΔＴ＞０の場合、％  Ｔ／Ｃ＝１００×ΔＴ／ΔＣ
ΔＴ＜０の場合、％  回帰＝１００×ΔＴ／Ｔｉｎｉｔｉａｌ
式中、
Ｔ＝試験の最終日における薬剤処置群の平均腫瘍量
ΔＴ＝試験の最終日における薬剤処置群の平均腫瘍量−投与開始日における薬剤処置群の平均腫瘍量
Ｔｉｎｉｔｉａｌ＝投与開始日における薬剤処置群の平均腫瘍量
Ｃ＝試験の最終日における対照群の平均腫瘍量
ΔＣ＝試験の最終日における対照群の平均腫瘍量−投与開始日における対照群の平均腫瘍量
【０２５０】
全てのデータを平均±ＳＥＭとして表わした。デルタ腫瘍量及び体重を統計分析に使用した。最終測定値についての群間比較を、Ｔｕｋｅｙ検定と共にＡＮＯＶＡを使用して行った。統計分析をGraphPad Prismを使用して行った。
【０２５１】
統計分析
全てのデータを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表わした。デルタ腫瘍体積及び体重を統計分析に使用した。群間比較を、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡ、続けて、事後Ｄｕｎｎ検定又はＴｕｋｅｙ検定を使用して行った。全ての統計評価について、有意水準をｐ＜０．０５に設定した。特に断りない限り、媒体対照群と比較した有意性を報告する。薬理試験に使用される標準的なプロトコールは、それぞれの単剤処置に対する組み合わせの統計的に有意な優越性を実証するために事前検出力を有さない。統計的検出力は、多くの場合、強力な単剤応答及び／又はモデル変動性により制限される。一方、組み合わせ対単剤処置についてのｐ値が提供される。
【０２５２】
結果
組み合わせられたＭＣＬ１及びＢＣＬ−２阻害の相乗的抗腫瘍効果
７８４４ＨＡＭＬＸ５３４３−ＸＥＦ試験において、化合物１、ＡＢＴ−１９９又は化合物３単独では、ＫＲＡＳ突然変異を有するＨＡＭＬＸ５３４３モデルにおいて、それぞれ５０mg/kg（経口又はｉｖ）、２５mg/kg（経口）又は１２．５mg/kg（ｉｖ）で週１回投与した場合、抗腫瘍活性を示さなかった（それぞれ％  Ｔ／Ｃ  ９８、９２、９８又は９９％、ｐ＞０．０５）。
【０２５３】
５０mg/kg 化合物１又は２５mg/kg ＡＢＴ−１９９を化合物３（１２．５mg/kg ｉｖ）との組み合わせで週１回経口投与した場合、このモデルでは腫瘍が停滞した（それぞれ％  Ｔ／Ｃ  ３％又は６％、ｐ＜０．０５）。
【０２５４】
一方、静脈内投与された化合物１と化合物３との組み合わせにより、ほぼ完全な腫瘍退縮（％  退縮  １００％）が誘引され、これは、単剤（ｐ＜０．０５）又は化合物１／化合物３  ｐｏ／ｉｖの組み合わせのいずれとも有意に異なる。各処置群についての平均腫瘍量を、図１６（ａ）に示されたように、１８日間の処置期間の時間に対してプロットした。腫瘍量の変化、％  Ｔ／Ｃ又は％  回帰を表１６及び図１６（ａ）〜（ｂ）に示す。
【０２５５】
【表２４】
2019528250.tif 000032
【０２５６】
結論
ＡＭＬは、遺伝的変化の獲得による造血前駆細胞のトランスフォーメーションにより引き起こされる、侵襲的で不均一な血液悪性腫瘍である（Patel et al, New England Journal of Medicine 2012 366:1079-1089）。ＡＭＬの５年生存率は、有効な治療が存在しないため低かった。アポトーシスの回避は、ガンの特徴である（Hanahan et al Cell 2000 100:57-70）。ガン細胞がアポトーシスを回避する主要な手段の１つは、生存促進性ＢＣＬ−２ファミリータンパク質、例えば、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ｘＬ及びＭＣＬ１のアップレギュレーションによる。
【０２５７】
ＭＣＬ１遺伝子は、ガン患者において最も一般的に増幅される遺伝子である（Beroukhim et al, Nature 2010 463:899-905）。更に、ＢＣＬ−２及びＭＣＬ１は両方とも、ＡＭＬにおいて高度に発現される。したがって、化合物１（ＢＣＬ−２ｉ）及び化合物３（ＭＣＬ１）の組み合わせは、ＡＭＬに対する一般的なメカニズムとしてアポトーシス促進シグナルを増強することによる相乗効果を提供することができる。
【０２５８】
本発明者らにより、ここでは、化合物３（ＭＣＬ１阻害剤）と組み合わせたＢＣＬ−２阻害剤である化合物１又はＡＢＴ−１９９がＫＲＡＳ突然変異（ｗｔ  ＦＬＴ３）を有するＡＭＬ異種移植モデルにおけるＡＭＬの処置において劇的な相乗効果を有することが示される。ｉｖ／ｉｖ  化合物１／化合物３の組み合わせは、同じ用量レベルでのｐｏ／ｉｖ  組み合わせ処置よりも優れている。結果から、ＭＣＬ１阻害剤との組み合わせがＡＭＬに有効な治療であろうことが示される。
【図１】
2019528250.tif 000036
【図２】
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【図３】
2019528250.tif 000038
【図４】
2019528250.tif 000039
【図５】
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【図６】
2019528250.tif 000041
【図７】
2019528250.tif 000042
【図８】
2019528250.tif 000043
【図９】
2019528250.tif 000044
【図１０】
2019528250.tif 000045
【図１１】
2019528250.tif 000046
【図１２】
2019528250.tif 000047
【図１３】
2019528250.tif 000048
【図１４】
2019528250.tif 000049
【図１５（ａ）】
2019528250.tif 000050
【図１５（ｂ）】
2019528250.tif 000051
【図１５（ｃ）】
2019528250.tif 000052
【図１５（ｄ）】
2019528250.tif 000053
【図１５（ｅ）】
2019528250.tif 000054
【図１６（ａ）】
2019528250.tif 000055
【図１６（ｂ）】
2019528250.tif 000056
【図１７】
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【国際調査報告】
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