(57)【要約】本明細書において、アブレーション型フラクショナルレーザー処置、チェックポイント阻害物質、およびエンドソームTLRアゴニスト(例えば、TLR3、TLR7、TLR8、もしくはTLR9アゴニスト)の1つもしくはそれ以上の組み合わせを適用することによって、がん組織において局所免疫応答を引き起こすため、ならびに/または対象におけるがん治療の有効性を高めるために使用することができる方法を提供する。2019501117.tif 000007
2019501117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)腫瘍を有する対象に少なくとも1つの薬物を投与する段階、および
(b)該腫瘍の組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階
を含み、それによって該対象におけるがんを治療する、
対象におけるがんを治療するための方法。
【請求項２】
前記少なくとも1つの薬物が全身的に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1つの薬物が免疫チェックポイント阻害物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫チェックポイント阻害物質が、PD1、PDL1、TIM-3、またはCTLA4の阻害物質である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫チェックポイント阻害物質がイピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも1つの薬物が局所的に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも1つの薬物が、前記腫瘍組織に局所的に投与されるか、または前記腫瘍組織に注入される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも1つの薬物が、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニストである、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記TLR7アゴニストがイミキモド、レシキモド(reiquimod)、またはガーディキモド(gardiquimod)である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも2つの薬物を投与する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも2つの薬物が、イミキモドと少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質とを含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象に薬物を投与する段階が、少なくとも2回行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階が、少なくとも2回行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与する段階と前記接触させる段階が同時に行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与する段階が、前記接触させる段階の前または後に行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記がんがメラノーマまたは膵臓がんである、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記フラクショナルレーザーがCO2レーザーである、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記フラクショナルレーザーが、前記腫瘍組織内に少なくとも0.1mmの深さまで侵入する、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記フラクショナルレーザーによる治療が、前記腫瘍組織において局所免疫応答を誘導する、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記フラクショナルレーザーによる治療が角質層を損傷しない、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記フラクショナルレーザーによる治療が、前記腫瘍組織の瘢痕化または痂皮形成を誘導しない、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
治療の領域が少なくとも0.25mm2を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
前記フラクショナルレーザーのエネルギーが1mJ〜200mJである、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
50mJのエネルギーが表層病変に使用され、かつ200mJのエネルギーが深部腫瘍に使用される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記フラクショナルレーザーのパルス持続時間が100μsec〜10msecである、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
前記フラクショナルレーザーのパルス持続時間が2msecである、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記フラクショナルレーザーのスポットサイズが10μm〜1mmである、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
前記フラクショナルレーザーの侵入深度が前記腫瘍の深さの1/3である、請求項1に記載の方法。
【請求項２９】
(a)腫瘍を有する対象に少なくとも1つの薬物を投与する段階、および
(b)該腫瘍の組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階
を含み、それによってがんの再発に対する該対象の抵抗性を促進する、
がんの再発に対する対象の抵抗性を促進する方法。
【請求項３０】
前記少なくとも1つの薬物が全身的に投与される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも1つの薬物が免疫チェックポイント阻害物質である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫チェックポイント阻害物質が、PD1、PDL1、TIM-3、またはCTLA4の阻害物質である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫チェックポイント阻害物質が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも1つの薬物が局所的に投与される、請求項29に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも1つの薬物が、前記腫瘍組織に局所的に投与されるか、または前記腫瘍組織に注入される、請求項29に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも1つの薬物が、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニストである、請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
前記TLR7アゴニストがイミキモド、レシキモド、またはガーディキモドである、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも2つの薬物を投与する段階をさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも2つの薬物が、イミキモドと少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質とを含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象に薬物を投与する段階が、少なくとも2回行われる、請求項29に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階が、少なくとも2回行われる、請求項29に記載の方法。
【請求項４２】
前記投与する段階と前記接触させる段階が同時に行われる、請求項29に記載の方法。
【請求項４３】
前記投与する段階が、前記接触させる段階の前または後に行われる、請求項29に記載の方法。
【請求項４４】
前記がんがメラノーマまたは転移性メラノーマである、請求項29に記載の方法。
【請求項４５】
前記フラクショナルレーザーがCO2レーザーである、請求項29に記載の方法。
【請求項４６】
前記フラクショナルレーザーが、前記腫瘍組織内に少なくとも0.1mmの深さまで侵入する、請求項29に記載の方法。
【請求項４７】
前記フラクショナルレーザーによる治療が、前記腫瘍組織において局所免疫応答を誘導する、請求項29に記載の方法。
【請求項４８】
前記フラクショナルレーザーによる治療が角質層を損傷しない、請求項29に記載の方法。
【請求項４９】
前記フラクショナルレーザーによる治療が、前記腫瘍組織の瘢痕化または痂皮形成を誘導しない、請求項29に記載の方法。
【請求項５０】
治療の領域が少なくとも0.25mm2を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項５１】
前記フラクショナルレーザーのエネルギーが1mJ〜200mJである、請求項29に記載の方法。
【請求項５２】
50mJのエネルギーが表層病変に使用され、かつ200mJのエネルギーが深部腫瘍に使用される、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記フラクショナルレーザーのエネルギーが100mJである、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
前記フラクショナルレーザーのパルス持続時間が100μsec〜10msecである、請求項29に記載の方法。
【請求項５５】
前記フラクショナルレーザーのパルス持続時間が2msecである、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記フラクショナルレーザーのスポットサイズが10μm〜1mmである、請求項29に記載の方法。
【請求項５７】
前記フラクショナルレーザーの侵入深度が前記腫瘍の深さの1/3である、請求項29に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の分野
本開示は、対象における腫瘍を治療することに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
免疫学的監視において、改変されたタンパク質は、自己タンパク質とは異なり、中枢性免疫寛容によって保護されない。こうした「ネオ抗原」は潜在的に、免疫系によって認識され得る。1つの例として、紫外線(UVR)に関連する遺伝子変異量(mutational burden)は、メラノーマにおけるネオ抗原の存在度に結び付けられる。
【０００３】
メラノーマなどのがんにおける免疫応答の重要性は、60年前に最初に発表された転移性メラノーマの自然退縮の報告があり、長い間認識されてきた6,7。免疫抑制された個体はメラノーマの危険性がより高く8、一部の患者では長期の疾患休眠に続く「超晩期」(ultra-late)の再発が観察される9。メラノーマにおける陽性予後因子としての免疫浸潤細胞および腫瘍特異的抗体の早期発見は、腫瘍と免疫系との相互作用のさらなる証拠を提供した10,11。メラノーマの高い免疫原性は、免疫応答の標的として機能し得るUV誘導性ネオ抗原の優勢を反映している可能性がある。
【０００４】
フラクショナル組織治療は、かなり最近の動向であり、一般的に組織における小さな空間的に分離された損傷領域の形成を含む。損傷された領域は小さく、典型的には、約1mmまたはそれ未満の寸法を有する。このような損傷領域は、レーザーまたは他の光エネルギーによる照射、集束超音波、離間した電極を介する高周波(RF)エネルギーの投与などを含めて、様々な医療機器を使用して組織内に作り出すことができる。典型的には、誘発される損傷の量は、例えば、治療される組織の表面積または投影面積において測定した場合に約5％〜50％であり、損傷領域間の組織の領域または容積は比較的影響を受けないままである。このような空間的に分離された小領域での損傷の生成は、良好な耐容性を示し、例えばほとんど感染のリスクなしに皮膚組織を再生させることができる、治癒応答を誘導することが観察されている。
【０００５】
非アブレーション型(non-ablative)フラクショナルプロセスは、一般に、組織の小領域が組織の除去を伴わずに(典型的には局部加熱によって)損傷されるプロセスを指す。アブレーション型(ablative)フラクショナル治療は、一般に、例えばエネルギー誘発蒸散または機械的抽出によって、ある程度の組織量が除去されるプロセスを指す。アブレーション型フラクショナルプロセスは、しばしば、除去された部分の周囲に局部的な組織損傷をもたらす。
【０００６】
フラクショナル光熱融解(Fractional Photothermolysis)(FP)(フラクショナルリサーフェイシングとも呼ばれる)は、生体組織内に微視的治療ゾーン(MTZ)のパターンを生成するレーザー支援治療である。フラクショナル光熱融解の概念は、例えば、D. Manstein et al., Fractional photothermolysis: a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury, Lasers in surgery and medicine 34, 426-438 (2004)に記載されている。FPは、非アブレーション型(nFP)またはアブレーション型(aFP)のいずれかの様式で行うことができる。nFPは、熱的に損傷された(加熱された)組織の小さなゾーンであるMTZを生成するが、aFPは、典型的には熱損傷組織のカフ(cuff)または層によって囲まれた、物理的に除去された(アブレートされたまたは蒸散された)組織の中心「孔」を特徴とするMTZを生成する。MTZの幅または直径は、典型的には1mm未満であり、多くの場合は約0.5mm未満である。フラクショナル光熱融解技術は、組織のわずかな部分(典型的には約5〜30％の面積分率(areal fraction))のみをレーザー光線に直接曝露することを特徴とし、組織の大部分はレーザー光線を見逃されるか、または曝露されない。フラクショナル光熱融解法(アブレーション型または非アブレーション型)は、現在のところ、色素異常症、顔面のしわ(rhytides)、光損傷した皮膚、および様々な種類の瘢痕、例えば、にきび、手術の跡、熱傷の跡など、の治療を含むがこれらに限定されない、広範囲の皮膚科学的適応症に使用されている。
【０００７】
光線力学療法(photodynamic therapy)(PDT)は、局所がん療法に使用されて成功を収めている。皮膚がん、肺がん、胆管がんおよび膵臓がんを含むがこれらに限定されない、様々なタイプのがんがPDTで治療されている。PDT治療に対する応答は、がんのタイプおよび存在する細胞株に依存する。例えば、皮内に接種したCT26野生型(CT26WT)結腸がん細胞のPDTは、局所腫瘍退縮のみを誘導し、その後再発することが観察された。例えば、P. Mroz et al., Photodynamic therapy of tumors can lead to development of systemic antigen-specific immune response, PloS one, 5(12):e 15194 (2010)に記載されている。CT26WTは、N-ニトロソ-N-メチルウレタン(NMU)誘導性の未分化結腸がんのクローンである。皮内に接種したCT26.CL25腫瘍のPDTも、局所寛解ならびに全身的な腫瘍特異的免疫応答を誘導し、遠隔の未治療の抗原陽性腫瘍の退縮を引き起こすことが観察された。
【０００８】
CT26.CL25腫瘍細胞は、CT26WTにβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)抗原をコードするlacZ遺伝子を形質導入することによって作製されたクローンである。したがって、PDTが全身的な腫瘍特異的抗腫瘍免疫を誘導することができることは、すでに観察されている。しかしながら、PDTは、用量依存的かつ時間依存的に光増感剤の投与を必要とする薬物-デバイス併用療法であるため、いくつかの欠点を有する。PDTの効果はまた、光増感剤の生物学的利用能に依存し、かつ酸素に富む環境を必要とする。両要件とも、腫瘍増殖による血管圧迫および低酸素血症をしばしば特徴とする腫瘍内部の課題であり得る。ほとんどの非皮膚科的腫瘍は光増感剤の全身適用を必要とするので、結果として生じる、患者の長期にわたる光回避の必要条件は、全身的に送達されるPDTの別の否定的側面である。
【０００９】
アブレーション型FPは、以前には皮膚がんを治療するために光線力学療法(PDT)と組み合わせて使用されてきた。しかし、この適応症に関して、FPは光増感剤の局所送達の増強をもたらすために主として使用される。非アブレーション型FPは、前がん性皮膚病変(光線性角化症)を治療するために使用されてきた。しかしながら、そのような治療は、局所皮膚領域の直接照射に限定されており、これまで、FP法を用いて全身的な効果を生み出すことについては研究されてこなかった。
【００１０】
アブレーションのエネルギーはまた、アブレーションレーザーエネルギー源を用いて腫瘍全体を(多くの場合、わずかな周囲の健康な組織と共に)切除/除去することによって、腫瘍を直接治療するために使用されてきた。腫瘍の広範かつ均質な照射は腫瘍の破壊にとって望ましいが、そのような「フル照射」(full-irradiation)のアプローチは潜在的なマイナス面を有する。例えば、腫瘍組織の実質的に完全な破壊はまた、免疫応答を引き起こすのに役立つ可能性のある、近くの免疫コンピテント細胞をも破壊してしまう。このことは、例えば、放射線療法において特に懸念される。なぜならば、免疫コンピテント細胞は損傷閾値が低く、腫瘍細胞そのものよりもフル照射治療に対してよりいっそう脆弱であり得るからである。従来のアブレーション治療は、腫瘍を破壊するように設計されているが、必然的に免疫応答を引き起こすようには設計されていない。細胞死経路は異なる熱量によって変化し、そうした経路があるとしても、どの経路が免疫応答を刺激するのに最も効果的でありうるかは明らかでない。
【００１１】
したがって、身体が十分に耐えられ、かつ局所的および/または全身的抗腫瘍免疫応答の増強、ならびに既存の治療の有効性の改善といった、望ましい効果をもたらすことができる、新しいがん治療法を提供することが望まれている。
【発明の概要】
【００１２】
概要
本開示の態様は、アブレーション型フラクショナルレーザー処置、チェックポイント阻害物質、TLR7アゴニスト、もしくはこれらの組み合わせを適用することによって、がん組織において局所免疫応答を引き起こすため、および/または対象におけるがん治療の有効性を高めるために使用することができる。特定の態様では、フラクショナルレーザー処置は、腫瘍または病変部において局所的免疫応答を誘導する。そのような態様では、腫瘍または病変部からの組織の切除または除去は、必要でないか、または必要とされない。
【００１３】
したがって、本明細書で提供される一局面は、対象におけるがんを治療するための方法に関し、該方法は、(a)腫瘍を有する対象に少なくとも1つの薬物を投与する段階、および(b)該腫瘍の組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階を含み、それによって該対象におけるがんを治療する。
【００１４】
この局面の一態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は全身的に投与される。
【００１５】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は、免疫チェックポイント阻害物質である。
【００１６】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、免疫チェックポイント阻害物質は、PD1、PDL1、TIM-3、またはCTLA4の阻害物質である。
【００１７】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、免疫チェックポイント阻害物質は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである。
【００１８】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は局所的に投与される。
【００１９】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は、腫瘍組織に局所的に投与されるか、または腫瘍組織に注入される。
【００２０】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニストである。
【００２１】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、TLR7アゴニストは、イミキモド、レシキモド(reiquimod)、またはガーディキモド(gardiquimod)である。
【００２２】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記方法は、少なくとも2つの薬物を投与する段階をさらに含む。
【００２３】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記少なくとも2つの薬物は、イミキモドと少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質とを含む。
【００２４】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、対象に薬物を投与する段階は、少なくとも2回行われる。
【００２５】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、腫瘍組織をフラクショナルレーザーと接触させる段階は、少なくとも2回行われる。
【００２６】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記投与する段階と前記接触させる段階は、同時に行われる。
【００２７】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記投与する段階は、前記接触させる段階の前または後に行われる。
【００２８】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、前記がんはメラノーマである。この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、該がんは膵臓がんである。
【００２９】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーはCO2レーザーである。
【００３０】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーは、腫瘍組織内に少なくとも0.1mm(例えば、少なくとも0.2mm、少なくとも0.3mm、少なくとも0.4mm、少なくとも0.5mm、少なくとも1mm、少なくとも1.5mm、少なくとも2mm、少なくとも2.5mm、少なくとも3mm、少なくとも3.5mm、少なくとも4mm、少なくとも4.5mm、少なくとも5mmなど)の深さまで侵入する。
【００３１】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、腫瘍組織において局所免疫応答を誘導する。
【００３２】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、角質層を損傷しない。
【００３３】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、腫瘍組織の瘢痕化または痂皮形成を誘導しない。
【００３４】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、治療の領域は少なくとも0.25mm2を含む。この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、治療の領域は少なくとも0.25mm2から病変部の全表面までを含む。この局面の他の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、治療の領域は腫瘍または病変領域の少なくとも5％を含む。他の態様では、治療の領域は腫瘍または病変領域の少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、またはそれ以上を含む。
【００３５】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、治療の容積(例えば、腫瘍内またはその近傍)は、少なくとも5mm3、少なくとも10mm3、少なくとも15mm3、少なくとも20mm3、少なくとも25mm3、少なくとも30mm3、少なくとも35mm3、少なくとも40mm3、少なくとも45mm3、少なくとも50mm3、少なくとも55mm3、少なくとも60mm3、少なくとも65mm3、少なくとも70mm3、少なくとも75mm3、少なくとも80mm3、少なくとも85mm3、少なくとも90mm3、少なくとも95mm3、少なくとも100mm3、またはそれ以上を含む。
【００３６】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのエネルギーは、1mJ〜200mJである。この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのエネルギーは、1mJ〜5mJ、1mJ〜10mJ、1mJ〜20mJ、1mJ〜30mJ、1mJ〜40mJ、1mJ〜50mJ、1mJ〜75mJ、1mJ〜100mJ、1mJ〜125mJ、1mJ〜150mJ、1mJ〜175mJ、25mJ〜200mJ、50mJ〜200mJ、50mJ〜100mJ、75mJ〜100mJ、75〜125mJ、80〜110mJ、100mJ〜200mJ、125mJ〜200mJ、150mJ〜200mJ、175mJ〜200mJ、50mJ〜100mJ、25mJ〜75mJ、25mJ〜150mJの範囲、またはそれらの間の任意の範囲である。
【００３７】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、約50mJ〜110mJ (例えば、100mJ)のエネルギーが表層病変に使用され、かつ約200mJのエネルギーが深部腫瘍に使用される。
【００３８】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパルス持続時間は100μsec〜10msecである。
【００３９】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパルス持続時間は2msecである。この局面の他の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパルス持続時間は、100μsec〜5msec、100μsec〜1msec、100μsec〜500μsec、100μsec〜250μsec、100μsec〜200μsec、250μsec〜10msec、500μsec〜10msec、750μsec〜10msec、1msec〜10msec、2msec〜10msec、5msec〜10msec、1msec〜5msec、1msec〜3msec、またはそれらの間の任意の範囲である。
【００４０】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのスポットサイズは10μm〜1mmである。この局面の他の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのスポットサイズは、10μm〜750μm、10μm〜500μm、10μm〜250μm、10μm〜150μm、10μm〜100μm、10μm〜50μm、10μm〜25μm、400μm〜1mm、500μm〜1mm、600μm〜1mm、700μm〜1mm、800μm〜1mm、900μm〜1mm、50μm〜750μm、75μm〜500μm、100μm〜500μm、250μm〜500μmの範囲、またはそれらの間の任意の範囲である。
【００４１】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、侵入深度は腫瘍の深さの1/3である。他の態様では、侵入深度は、腫瘍の深さの少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％である。いくつかの態様では、フラクショナルレーザー治療が腫瘍内にまたは腫瘍の縁に沿って局所的免疫応答を誘導するならば、侵入深度は腫瘍組織自体に侵入する必要はない。
【００４２】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーは腫瘍容積の少なくとも0.5％に達し、例えば、腫瘍容積の少なくとも1％、少なくとも1.5％、少なくとも2％、少なくとも2.25％、少なくとも2.5％、少なくとも3％、少なくとも3.5％、少なくとも4％、少なくとも5％、少なくとも10％に達する。この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーは腫瘍容積の0.5％未満に達し、例えば、腫瘍容積の1％未満、1.5％未満、2％未満、2.25％未満、2.5％未満、3％未満、3.5％未満、4％未満、5％未満、または10％未満に達する。
【００４３】
本明細書に記載される別の局面は、がんの再発に対する対象の抵抗性を促進する方法に関し、該方法は、(a)腫瘍を有する対象に少なくとも1つの薬物を投与する段階、および(b)該腫瘍の組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階を含み、それによって、がんの再発に対する該対象の抵抗性を促進する。
【００４４】
この局面の一態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は全身的に投与される。
【００４５】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は、免疫チェックポイント阻害物質である。
【００４６】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、免疫チェックポイント阻害物質は、PD1、PDL1、TIM-3、またはCTLA4の阻害物質である。
【００４７】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、免疫チェックポイント阻害物質は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである。
【００４８】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は局所的に投与される。
【００４９】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は、腫瘍組織に局所的に投与されるか、または腫瘍組織に注入される。
【００５０】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記少なくとも1つの薬物は、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニストである。
【００５１】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、TLR7アゴニストは、イミキモド、レシキモド、またはガーディキモドである。
【００５２】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記方法は、少なくとも2つの薬物を投与する段階をさらに含む。
【００５３】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記少なくとも2つの薬物は、イミキモドと少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質とを含む。
【００５４】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、対象に薬物を投与する段階は、少なくとも2回行われる。
【００５５】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、腫瘍組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階は、少なくとも2回行われる。
【００５６】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記投与する段階および前記接触させる段階は、同時に行われる。
【００５７】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記投与する段階は、前記接触させる段階の前または後に行われる。
【００５８】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、前記がんはメラノーマまたは転移性メラノーマである。
【００５９】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーはCO2レーザーである。
【００６０】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーは、腫瘍組織内に少なくとも0.1mmの深さまで侵入する。
【００６１】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、腫瘍組織において局所免疫応答を誘導する。
【００６２】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、角質層を損傷しない。
【００６３】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、腫瘍組織の瘢痕化または痂皮形成を誘導しない。
【００６４】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、治療の領域は、少なくとも0.25mm2を含む。
【００６５】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのエネルギーは、1mJ〜200mJである。
【００６６】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、50mJのエネルギーが表層病変に使用され、かつ200mJのエネルギーが深部腫瘍に使用される。
【００６７】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのエネルギーは、100mJである。
【００６８】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパルス持続時間は、100μsec〜10msecである。
【００６９】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパルス持続時間は、2msecである。
【００７０】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのスポットサイズは、10μm〜1mmである。
【００７１】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーの侵入深度は、腫瘍の深さの1/3である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】UVB関連突然変異は、同系の移植可能なメラノーマモデルにおいて抗腫瘍免疫およびPD-1遮断に対する応答を増強する。図1A：親メラノーマ細胞株に対するUVB突然変異誘発クローンUV2およびUV3の遺伝子改変の概要。塩基置換のタイプおよび一塩基バリアント(SNV)のクラスが示される。
【図１Ｂ】UVB関連突然変異は、同系の移植可能なメラノーマモデルにおいて抗腫瘍免疫およびPD-1遮断に対する応答を増強する。図1B：NSGマウスにおける親、UV2、およびUV3メラノーマの増殖および対応する生存率。データは平均腫瘍サイズ±SDとして示される(1群あたりn＝5)。n.s.：有意ではない(両側t検定およびログランク検定)。
【図１Ｃ】UVB関連突然変異は、同系の移植可能なメラノーマモデルにおいて抗腫瘍免疫およびPD-1遮断に対する応答を増強する。図1C：C57BL/6マウスにおける親、UV2、およびUV3メラノーマの増殖および対応する生存率。腫瘍細胞の接種後8、10、12、14および16日目に、マウスに抗PD-1またはアイソタイプ適合対照抗体を投与した。平均UV腫瘍サイズは、8日目に親メラノーマのサイズと有意に異ならなかった。データは平均腫瘍サイズ±SDとして示される(1群あたりn＝5)。生存率分析では、* p＜0.05、UV2抗PD-1を親抗PD-1と比較する；** p＜0.01、UVクローンアイソタイプを親アイソタイプと、またはUV3抗PD-1を親抗PD-1と比較する(ログランク検定)。
【図２Ａ】推定上のネオ抗原の導入は、腫瘍浸潤免疫細胞の動員を促し、PD-1遮断によって逆転されるT細胞機能不全に関連する。図2A：C57BL/6宿主におけるバルク腫瘍移植片からのRNAシーケンシングデータのGSEA。名目(nominal)p値＜0.01を用いて親メラノーマと比較して、UV2において濃縮された代表的なトップスコアのKEGG遺伝子セットが示される。FDR：偽発見率(false discovery rate)。
【図２Ｂ】推定上のネオ抗原の導入は、腫瘍浸潤免疫細胞の動員を促し、PD-1遮断によって逆転されるT細胞機能不全に関連する。図2B：治療開始5日後に採取した親およびUV2メラノーマにおけるCD3発現が、1群3匹の異なるマウスから無作為に選択した9つの腫瘍内×20視野において免疫組織化学によりアッセイされた(代表的な視野を示す)。データは平均±SEMとして示される。**** p＜0.0001；n.s. 有意ではない(Tukeyの多重比較検定)。
【図２Ｃ】推定上のネオ抗原の導入は、腫瘍浸潤免疫細胞の動員を促し、PD-1遮断によって逆転されるT細胞機能不全に関連する。図2C：フローサイトメトリーによって特徴決定された、抗PD-1治療開始5日後に採取した腫瘍(TIL)および流入領域リンパ節(draining lymph node)(dLN)における免疫浸潤細胞。CD8+ T細胞とTreg T細胞の数が示される(図2C)。データは平均±SEMとして示される(1群あたりn＝12を6つにプールした)。* p＜0.05; ** p＜0.01; *** p＜0.001; **** p＜0.0001 (両側t検定)。
【図２Ｄ】推定上のネオ抗原の導入は、腫瘍浸潤免疫細胞の動員を促し、PD-1遮断によって逆転されるT細胞機能不全に関連する。図2D：フローサイトメトリーによって特徴決定された、抗PD-1治療開始5日後に採取した腫瘍(TIL)および流入領域リンパ節(dLN)における免疫浸潤細胞。CD8+ T細胞：Treg (CD4+FoxP3+)の比率(図2D)が示され、Ki67またはグランザイムBについて陽性のCD8+ T細胞の割合も同様に示される(図2D)。データは平均±SEMとして示される(1群あたりn＝12を6つにプールした)。* p＜0.05; ** p＜0.01; *** p＜0.001; **** p＜0.0001 (両側t検定)。
【図２Ｅ】推定上のネオ抗原の導入は、腫瘍浸潤免疫細胞の動員を促し、PD-1遮断によって逆転されるT細胞機能不全に関連する。図2E：アイソタイプ適合対照抗体で処置したC57BL/6宿主からのバルクメラノーマのTCRシーケンシング。豊富度(固有の相補性決定領域3[CDR3]の再配列）、エントロピー(再配列の多様性)、およびクローン性が親(n＝6)およびUV2(n＝4)について示される。データは平均±SDとして示される。n.s. 有意ではない(両側t検定)。
【図３Ａ】イミキモドおよびaFPを追加することは、低免疫原性のメラノーマおよび膵管腺がん(PDAC)のチェックポイント遮断に対する応答を改善し、長期免疫を付与する。図3A：親メラノーマの接種(0日目)および示した日に投与された抗PD-1とaFPとイミキモドを用いる併用療法の後のC57BL/6マウスの生存率(1群あたりのマウスn＝10)。*** p＜0.001、3剤併用療法を抗PD-1と比較する(ログランク検定)。スパイダープロットは、処置される腫瘍のみにaFPおよび/またはイミキモドを投与する治療の後のC57BL/6マウスの処置(左)および未処置(右)脇腹における個々の腫瘍の増殖を示す。円グラフは完全応答率を示す。
【図３Ｂ】イミキモドおよびaFPを追加することは、低免疫原性のメラノーマおよび膵管腺がん(PDAC)のチェックポイント遮断に対する応答を改善し、長期免疫を付与する。図3B：親メラノーマの接種およびアイソタイプ適合抗体(n＝9)、抗PD-1＋抗CTLA-4(n＝16)、またはPD-1およびCTLA-4の遮断とaFPとイミキモドを用いる4剤併用療法(n＝17)による処置の後のC57BL/6マウスの生存率。* p＜0.05、4剤併用療法を抗PD-1＋抗CTLA-4と比較する(ログランク検定)。
【図３Ｃ】イミキモドおよびaFPを追加することは、低免疫原性のメラノーマおよび膵管腺がん(PDAC)のチェックポイント遮断に対する応答を改善し、長期免疫を付与する。図3C：3剤併用療法は、低免疫原性PDACのマウスモデルにおいて腫瘍退縮を誘導する。KPC膵臓がん細胞の皮下接種およびアイソタイプ適合抗体、抗PD-1、または抗PD-1とaFPとイミキモドを用いる3剤併用療法(1群あたりn＝5)による処置の後のC57BL/6マウスの生存率。** p＜0.01、3剤併用療法を抗PD-1と比較する(ログランク検定)。
【図４Ａ】イミキモドとaFPは、免疫チェックポイント遮断と相乗的に作用して、腫瘍浸潤T細胞の数および機能を高め、かつ野生型腫瘍系統抗原に対する応答を誘導する。図4A：名目p値＜0.01を用いて抗PD-1単剤療法と比較して、3剤併用療法(抗PD-1＋aFP＋イミキモド)で処置したC57BL/6マウスのバルク親メラノーマにおいて濃縮された代表的なトップスコアのKEGG遺伝子セット。FDR：偽発見率。
【図４Ｂ】イミキモドとaFPは、免疫チェックポイント遮断と相乗的に作用して、腫瘍浸潤T細胞の数および機能を高め、かつ野生型腫瘍系統抗原に対する応答を誘導する。図4B：治療開始5日後に採取した親メラノーマにおけるCD3発現が、無作為に選択した6つの腫瘍内×20視野において免疫蛍光によりアッセイされた(代表的な視野を示す)。データは平均±SEMとして示される。* p＜0.05；**** p＜0.0001；n.s. 有意ではない(Tukeyの多重比較検定)。
【図４Ｃ】イミキモドとaFPは、免疫チェックポイント遮断と相乗的に作用して、腫瘍浸潤T細胞の数および機能を高め、かつ野生型腫瘍系統抗原に対する応答を誘導する。図4C：フローサイトメトリーによって特徴決定された、対側の(未処置脇腹)腫瘍における免疫浸潤細胞、ならびに腹腔内(i.p.)抗体処置および処置される脇腹腫瘍へのaFPとイミキモドの適用を開始してから5日後に採取した流入領域リンパ節における免疫浸潤細胞。腫瘍におけるCD8+ T細胞：Treg(CD4+FoxP3+)の比率およびグランザイムBについて陽性であるCD8+ T細胞の割合、ならびに流入領域リンパ節におけるPD-L2+ CD11c+ 樹状細胞の割合が示される。上のパネル：アイソタイプ対照、aFP、イミキモド、およびaFP＋イミキモドについてはn＝7、抗PD-1についてはn＝9；アスタリスクは、Dunnettの多重比較検定により対照と比較して、有意性を示す。下のパネル：1群あたりn＝12を6つにプールした；アスタリスクは、Dunnettの多重比較検定により抗PD-1(2剤または3剤併用の場合)と比較して、または抗PD-l＋抗CTLA-4(4剤併用の場合)と比較して、有意性を示す。データは平均±SEMとして示される。* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；*** p＜0.0001。
【図４Ｄ】イミキモドとaFPは、免疫チェックポイント遮断と相乗的に作用して、腫瘍浸潤T細胞の数および機能を高め、かつ野生型腫瘍系統抗原に対する応答を誘導する。図4D：親メラノーマ細胞をC57BL/6マウスに接種する1週間前に開始して、3日ごとに抗CD8抗体またはアイソタイプ適合対照抗体を投与した。全てのマウスは、イミキモド、FPおよび抗PD-1を用いる3剤併用療法を受けた。1群あたりのマウスn＝10。**** p＜0.0001(ログランク検定)。
【図４Ｅ】イミキモドとaFPは、免疫チェックポイント遮断と相乗的に作用して、腫瘍浸潤T細胞の数および機能を高め、かつ野生型腫瘍系統抗原に対する応答を誘導する。図4E：アイソタイプ適合対照抗体、抗PD-1、または3剤併用療法(イミキモド＋aFP＋抗PD-1)で処置したC57BL/6宿主からのバルクメラノーマのTCRシーケンシング。豊富度(固有のCDR3再配列）、エントロピー(再配列の多様性)、およびクローン性が親(n＝6)およびUV2(n＝4)について示される。データは平均±SDとして示される。n.s.：有意ではない(両側t検定)。
【図４Ｆ】イミキモドとaFPは、免疫チェックポイント遮断と相乗的に作用して、腫瘍浸潤T細胞の数および機能を高め、かつ野生型腫瘍系統抗原に対する応答を誘導する。図4F：低いネオ抗原負荷の患者サブセットならびに3剤併用療法で処置したマウス親メラノーマにおけるイピリムマブレスポンダーでの色素形成遺伝子セットGO:0043473の濃縮を示すGSEAプロット。ES：濃縮スコア。
【図４Ｇ】イミキモドとaFPは、免疫チェックポイント遮断と相乗的に作用して、腫瘍浸潤T細胞の数および機能を高め、かつ野生型腫瘍系統抗原に対する応答を誘導する。図4G：治療開始5日後の処置脇腹親メラノーマ(TIL)およびdLNからのCD8+ T細胞を、gp100：H-2Dbテトラマーへの結合について評価した(1群あたりのマウスn＝8)。データは平均±SEMとして示される。*** p＜0.001；n.s. 有意ではない(Tukeyの多重比較検定)。
【図４Ｈ】イミキモドとaFPは、免疫チェックポイント遮断と相乗的に作用して、腫瘍浸潤T細胞の数および機能を高め、かつ野生型腫瘍系統抗原に対する応答を誘導する。図4H：左は、親メラノーマ細胞による再チャレンジ後に、3剤併用療法に対する完全な応答を有する親メラノーマ(n＝3)またはUV2メラノーマ(n＝3)保有マウスの生存率。右は、B16-F10メラノーマ細胞接種によるチャレンジ後に、3剤併用療法(n＝8)、抗PD-l＋aFP (n＝2)、または抗PD-1＋イミキモド(n＝3)に対する完全な応答を有する親メラノーマ保有マウスの生存率。** p＜0.01；*** p＜0.001(ログランク検定)。
【図５Ａ】UV2およびUV3メラノーマ細胞株の特性評価。図5A：親メラノーマ細胞およびUVクローンの増殖率を、Cell-Titer-Glo ATPベースの発光アッセイを用いて16時間の血清飢餓からのレスキュー後にモニターした。データは、平均±SDとして示され(技術的な三つ組)、2つの独立した実験を代表する。
【図５Ｂ】UV2およびUV3メラノーマ細胞株の特性評価。図5B：細胞カウントによって測定された、16時間の血清飢餓からレスキュー後の親、UV2、およびUV3メラノーマ細胞の同様の増殖率。データは、平均±SDとして示され(技術的な三つ組)、2つの独立した実験を代表する；n.s. 有意ではない(両側t検定)。
【図５Ｃ】UV2およびUV3メラノーマ細胞株の特性評価。図5C：IFN-γで刺激したまたは刺激してないマウスメラノーマ細胞におけるPD-1、PD-L1、MHCクラスIおよびII発現の代表的なフロープロット。
【図６】RNAシーケンシングは、対応した親メラノーマと比較して、UV2メラノーマにおける細胞傷害活性の増強およびT細胞機能不全マーカーのアップレギュレーションを明らかにする。図6A：抗PD-1またはアイソタイプ適合抗体の投与を開始して5日後に採取したバルクマウス腫瘍における転写産物100万個あたりのグランザイムAおよびパーフォリン1 RNA発現の対数平均(幾何平均)として定義される細胞溶解活性。データは平均±SDとして示される(1群あたりn＝3)。* p＜0.05(両側t検定)。図6B：UV2メラノーマと親バルクメラノーマとの間で有意に異なる抑制マーカーおよび疲弊(exhaustion)マーカーのmRNA発現。フローティングバーは、最小値および最大値を平均値のラインと共に示す(1群あたりn＝3)。DESeq2分析で測定して* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001。
【図７Ａ】イミキモドとaFPは、抗PD-1、抗CTLA-4、および二重抗PD-1＋抗CTLA-4と相乗的に作用し、アブスコパル効果を誘発する。図7A：TLR7発現について上位4分の1に入るTCGAメラノーマ患者は、TLR7発現について下位4分の1に入るメラノーマ患者よりもかなり長い生存期間を有していた。
【図７Ｂ】イミキモドとaFPは、抗PD-1、抗CTLA-4、および二重抗PD-1＋抗CTLA-4と相乗的に作用し、アブスコパル効果を誘発する。図7B：併用療法後の親メラノーマの腫瘍増殖。図3Aからのデータは、処置および未処置の両脇腹の腫瘍の平均体積±SEMとして提示される(1群あたりのマウスn＝10)。対応する生存率データは、図3Aおよび3Cに示される。
【図７Ｃ】イミキモドとaFPは、抗PD-1、抗CTLA-4、および二重抗PD-1＋抗CTLA-4と相乗的に作用し、アブスコパル効果を誘発する。図7C：親メラノーマ接種および示したスケジュールに従って抗CTLA-4とaFPとイミキモドを用いた併用処置の後のC57BL/6マウスの腫瘍増殖および生存率(1群あたりn＝8）。データは、両脇腹の腫瘍の平均体積±SEMとして示される。** p＜0.001、3剤併用療法を抗CTLA-4と比較する(ログランク検定)。
【図７Ｄ】イミキモドとaFPは、抗PD-1、抗CTLA-4、および二重抗PD-1＋抗CTLA-4と相乗的に作用し、アブスコパル効果を誘発する。図7D：全身性の抗CTLA-4(1群あたりのマウスn＝8)または抗PD-1(1群あたりのマウスn＝10)に加えて、左の腫瘍のみに投与されるaFPおよびイミキモドを用いた3剤併用療法の後のC57BL/6マウスの左脇腹対右脇腹の腫瘍増殖の比較。データは平均腫瘍サイズ±SEMとして示される。n.s.：有意ではない(左と右の腫瘍の両側t検定比較)。
【図７Ｅ】イミキモドとaFPは、抗PD-1、抗CTLA-4、および二重抗PD-1＋抗CTLA-4と相乗的に作用し、アブスコパル効果を誘発する。図7E：アイソタイプ対照(n＝9）、抗PD-1＋抗CTLA-4(n＝16）、またはPD-1およびCTLA-4の遮断とaFPとイミキモドを用いた4剤併用療法(n＝17）の後のC57BL/6マウスにおける親メラノーマ増殖。データは両脇腹の腫瘍の平均体積±SEMとして示される。対応する生存率データは図3Bに示される。
【図７Ｆ】イミキモドとaFPは、抗PD-1、抗CTLA-4、および二重抗PD-1＋抗CTLA-4と相乗的に作用し、アブスコパル効果を誘発する。図7F：C57BL/6マウスへの接種およびアイソタイプ適合対照、抗PD-1、または抗PD-1とaFPとイミキモドを用いた3剤併用療法(1群あたりn＝5)による処置後のKPC膵管腺がんの増殖。データは両脇腹の腫瘍の平均体積±SEMとして示される。対応する生存率データは図3Cに示される。
【図８Ａ】併用免疫療法は、T細胞応答を改善し、かつ増大した樹状細胞浸潤および機能のマーカーと関連する。図8A：フローサイトメトリーによって特徴決定された、治療開始5日後に採取した未処置および処置脇腹腫瘍(TIL)ならびに流入領域リンパ節(dLN)における免疫浸潤細胞。腫瘍におけるCD8+ T細胞：Treg(CD4+FoxP3+)の比率およびグランザイムBについて陽性であるCD8+ T細胞の割合、ならびに流入領域リンパ節におけるPD-L2+ CD11c+ 樹状細胞の割合が示される。上のパネル：アイソタイプ対照、aFP、イミキモド、およびaFP＋イミキモドについてはn＝7；抗PD-1についてはn＝9；アスタリスクは、Dunnettの多重比較検定により対照と比較して、有意性を示す。下のパネル：1群あたりn＝12を6つにプールした；アスタリスクは、Dunnettの多重比較検定により抗PD-1(2剤または3剤併用の場合)と比較して、または抗PD-l＋抗CTLA-4(4剤併用の場合)と比較して、有意性を示す。未処置の脇腹腫瘍のデータは、図4Cに示したものと同じである。データは平均±SEMとして示される。
【図８Ｂ】併用免疫療法は、T細胞応答を改善し、かつ増大した樹状細胞浸潤および機能のマーカーと関連する。図8B：Van Allenら2015に報告される処置前メラノーマ生検から得られた全エクソームおよびRNAシーケンシングデータを有する40人の患者の全生存(OS)および予測ネオ抗原数。低ネオ抗原サブセットは、HLAクラスIに対して50nM以下の結合親和性を有する予測ネオ抗原が100個より少ない患者として定義された。イピリムマブレスポンダーおよび非レスポンダーが示される。
【図８Ｃ】併用免疫療法は、T細胞応答を改善し、かつ増大した樹状細胞浸潤および機能のマーカーと関連する。図8C：KPC細胞接種によるチャレンジ後の3剤併用療法(n＝3)または4剤併用療法(n＝3)の後に親メラノーマに対して完全な応答を有するマウスの生存率。n.s.：親生存マウスとナイーブC57BL/6マウスとの間に有意差なし(ログランク検定)。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
詳細な説明
本明細書において、アブレーション型フラクショナルレーザー処置、チェックポイント阻害物質、およびエンドソームTLRアゴニスト(例えば、TLR3、TLR7、TLR8、もしくはTLR9のアゴニスト)の1つもしくはそれ以上の組み合わせを適用することによって、がん組織において局所免疫応答を引き起こすため、ならびに/または対象におけるがん治療の有効性を高めるために使用することができる方法が提供される。
【００７４】
定義
本明細書で使用する用語「フラクショナル治療」、「フラクショナルレーザー治療」および「フラクショナル光熱融解」は、一般に、生体組織または他の組織の複数の小さな個々の露光域(例えば、一般に、少なくとも1つの寸法が約1mm未満である)に損傷、加熱、および/またはアブレーション/蒸散が生じると説明することができる。こうした損傷は、機械的手段によって、またはレーザーにより生成される指向性光エネルギーのようなエネルギーに組織を曝露することによって、もたらされ得る。フラクショナル治療の後、実質的に損傷を受けていない、アブレーションされていない、および/または加熱されていない組織の領域もしくは容積が、照射された、損傷を受けた、および/またはアブレーション/蒸散された領域の間に存在する。個々の露光域は、例えば、楕円形、円形、弧状および/または直線状の形状であり得る。
【００７５】
本明細書で使用する用語「非アブレーション」および「サブアブレーション」とは、治療時に治療部位からの生体組織もしくは他の物質の蒸散または他のエネルギーベースの除去を伴わないプロセスを指すことができる。
【００７６】
本明細書で使用する用語「免疫チェックポイント阻害物質」は、1つまたはそれ以上のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減、阻害、干渉、またはモジュレートすることができ、さらにはT細胞の活性化または機能を調節する、分子を指すことができる。多数のチェックポイントタンパク質、例えば、CTLA-4とそのリガンドCD 80およびCD86；PD1とそのリガンドPDL1およびPDL2 (Pardoll, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012)、ならびにTIM3が知られている。これらのタンパク質は、T細胞応答の共刺激性または阻害性相互作用に関与している。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容ならびに生理学的免疫応答の持続時間および大きさを調節し、かつ維持している。免疫チェックポイント阻害物質には、チェックポイントタンパク質に結合する抗体、または抗体の抗原結合ドメインを用いた構築物が含まれる。
【００７７】
用語「減少する」、「低下した」、「低下」、または「抑制する」は全て、本明細書では、特性、レベルまたは他のパラメータが統計的に有意な量で低下するまたは減少することを意味するために使用される。いくつかの態様では、「低下する」、「低下」もしくは「減少する」または「抑制する」は、典型的には、基準レベル(例えば、所与の治療を行わないこと)と比較して、少なくとも10％減少することを意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上減少することを含む。本明細書で使用する「減少」または「抑制」は、基準レベルと比較して、完全な抑制または減少を包含しない。「完全な抑制」は、基準レベルと比較したときの100％抑制である。減少は、所与の障害のない個体の場合の正常範囲内として受け入れられるレベルにまで下がることが好ましい。
【００７８】
用語「増加した」、「増加する」、「高める」、または「活性化する」は全て、本明細書では、特性、レベル、または他のパラメータが統計的に有意な量で増加することを一般に意味するために使用される。誤解を避けるために、用語「増加した」、「増加する」、「高める」または「活性化する」は、基準レベルと比較して、少なくとも10％の増加、例えば、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、または最大100％の増加、つまり基準レベルと比較して10〜100％の間のいずれかの増加、あるいは基準レベルと比較して、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍の増加、少なくとも約20倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、少なくとも約1000倍、またはそれ以上の増加を意味する。
【００７９】
用語「薬学的に許容される」は、過度の毒性なしに対象(例えば、哺乳動物またはヒト)に投与され得る化合物および組成物を指すことができる。
【００８０】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、活性成分と組み合わせたときに、該成分が生物学的活性を保持することを可能にし、かつ対象の免疫系と非反応性である、任意の材料または物質を含むことができる。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルションのようなエマルション、および様々なタイプの湿潤剤など、標準的な薬学的担体のいずれかを含むことができるが、これらに限定されない。用語「薬学的に許容される担体」は組織培養培地を除外する。
【００８１】
本明細書で使用する用語「含む」は、提示された特定の要素に加えて、他の要素も存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなくて包含を示す。
【００８２】
本明細書で使用する用語「から本質的になる」は、所与の態様に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴に実質的に影響を与えない追加の要素の存在を容認する。
【００８３】
用語「からなる」は、その態様の記載に列挙されていない要素を排除する、本明細書に記載の組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成要素を指す。
【００８４】
さらに、文脈で特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００８５】
本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって、それらとは異なっていてよいことを理解すべきである。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【００８６】
フラクショナルレーザー治療
本開示の態様は、1つまたはそれ以上のさらなる治療薬と組み合わせて、腫瘍の点状損傷(fractional damage)を提供することができる。そのような点状損傷は、局所および/または全身免疫応答を促し、かつ/または腫瘍に対する免疫系の攻撃を促進することができる。特定の態様では、腫瘍組織に対するそのような点状損傷はまた、組み合わせて使用し得る他の治療薬の有効性を高めることができる。したがって、いくつかの態様では、フラクショナルレーザー治療と組み合わせて投与される1つまたはそれ以上の治療薬の用量は、フラクショナルレーザー治療(例えば、従来の抗がん治療)の非存在下での該1つまたはそれ以上の治療薬の用量よりも少ない。メラノーマを含むがこれに限定されない皮膚腫瘍の治療によく適合するが、フラクショナル治療は、身体の他の箇所にある腫瘍(例えば、膵臓がん)にも適用することができる。
【００８７】
特定の態様では、点状損傷は、アブレーション型フラクショナル光熱融解(aFP)処置を用いて生じさせることができる。レーザーまたは他の光エネルギー源を使用して腫瘍組織を完全に破壊することを目的とした腫瘍の従来のアブレーション治療とは異なり、フラクショナルレーザー照射治療は、腫瘍組織の領域内に多数の小さな離散した治療ゾーンを作り出すことを含む。したがって、aFP処置中に治療された組織(例えば、腫瘍組織)の領域または容積は、該組織がレーザー照射によって改変された(例えば、部分的もしくは完全にアブレートされたまたは蒸散された)多数の離散した微視的治療ゾーン(microscopic treatment zone)(MTZ)を示す。これらのMTZは、レーザー照射によって実質的に変化しないままである、より大きな容積の組織内に存在する。
【００８８】
さらなる態様では、MTZは、非レーザー光エネルギー、集束超音波、高周波(RF)エネルギーなどの他のモダリティを使用して形成することができる。例えば、RFエネルギーは、組織表面および/または組織内に設けられた複数の表面電極または貫通電極(例えば、針状電極)を用いて組織に複数のMTZを形成するために使用される。
【００８９】
本明細書に記載のフラクショナルレーザー治療法を用いて(例えば、メラノーマの治療のために)皮膚を治療する場合、皮膚内部の広範囲の治療効果は、レーザー治療のパラメータを変化させることによって達成され得る。これらのレーザー治療パラメータとしては、例えば、波長、局所放射照度、局所フルエンス、パルスエネルギー、パルス持続時間、治療ゾーンサイズまたはスポットサイズ、治療ゾーン密度、ビーム径、およびこれらの組み合わせが挙げられる。治療される領域が皮膚でない場合も、実質的に同じパラメータを変化させることができる。レーザーエネルギーは、例えば、カテーテルを介して、または手術中に、内部的に印加することができる。
【００９０】
例えば、MTZの数および密度は、フラクショナル治療のパラメータを選択することによって、予め決定することができる。特定の態様では、治療される組織(例えば、腫瘍組織)の表面上の複数の位置にエネルギービームを向けることによって、フラクショナル治療を行うことができる。さらなる態様では、複数のビームを組織表面上の複数の位置に同時に向けることができる。該複数のビームは、複数のレーザーもしくはレーザーダイオードによって提供されるか、または光学配置を使用して単一のエネルギービームを複数のビームに分割することによって提供され得る。
【００９１】
腫瘍組織のフラクショナル治療は、約0.05〜約0.50mm2である照射組織表面の面積フラクション(areal fraction)を提供することができる。特定の態様では、該面積フラクションは約0.05〜約0.20mm2の間であり得る。このような治療組織のより小さなフラクションは、そこに局所的な損傷を生じさせながら、腫瘍組織の全体的なバルク加熱をより良好に回避することができる。特定のビーム径では、この面積フラクションは、治療される表面領域上の個別のビーム照射位置の数を乗じた個々のビーム断面の面積を、治療される表面領域の面積で割ったものとして決定することができる。面積カバレッジ(areal coverage)の同様の算出は、例えば、楕円、細線などを含む照射パターンを含めた、異なるビーム形状および照射ジオメトリなどについて、治療される領域に向けられた照射エネルギービームの総面積を、治療される領域の面積で割ることによって決定することができる
【００９２】
この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面において、フラクショナルレーザーは腫瘍体積の少なくとも0.5％に達し、例えば、腫瘍体積の少なくとも1％、少なくとも1.5％、少なくとも2％、少なくとも2.25％、少なくとも2.5％、少なくとも3％、少なくとも3.5％、少なくとも4％、少なくとも5％、または少なくとも10％に達する。この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーは腫瘍体積の0.5％未満、例えば、腫瘍体積の1％未満、1.5％未満、2％未満、2.25％未満、2.5％未満、3％未満、3.5％未満、4％未満、5％未満、または10％未満に達する。
【００９３】
組織にMTZを作り出すために使用される個々のエネルギービーム(パルス状であってよい)は、一般に1mm未満の幅または径であり得る。このような幅は、ビームによって形成されるMTZの幅にほぼ対応し、周囲の組織が十分に耐えられ、かつ患者内での腫瘍細胞の広がりにつながる可能性のある腫瘍組織の過剰なまたは広範囲の破壊を防ぐことができる。さらなる態様では、これらのビームの幅は0.5mm未満、または0.2mm未満であり得る。このようなより小さいビーム幅は、患者内での腫瘍細胞の望ましくない広がりまたは「放出」の可能性をさらに減らしつつ、腫瘍組織を破壊するのに十分な狭いMTZを生じさせることができる。MTZは、組織内のアブレートされた孔として形成することができ、こうした孔は形成後すぐに部分的または完全に崩壊する可能性がある。
【００９４】
アブレートされる孔の深さ、および/または腫瘍組織のフラクショナル治療の間に形成されるMTZの深さは、例えば、使用されるエネルギーの波長、フルエンス、エネルギービームの断面積およびパワー、治療される組織の特性などに基づいて、公知の技術を用いて決定することができる。一般的に、MTZは、腫瘍組織内で1つまたはそれ以上の特定の深さまで延びていることが好ましい。例えば、特定の態様では、MTZは、腫瘍表面と腫瘍の中心との間の距離の少なくとも約1/4の深さまで延在することができる。MTZの特定の深さは、治療される腫瘍のサイズおよびタイプに基づいて選択され得る。例えば、MTZの深さは、それらが腫瘍の外層から少なくとも腫瘍の内部(またはコア)領域へ延びるように選択することができる。さらに別の態様では、フラクショナル治療の特徴は、MTZ(例えば、アブレートされた孔)が腫瘍全体を通して完全に延びることができるように選択され得る。いくつかの態様では、フラクショナルレーザーは、腫瘍組織内に少なくとも0.1mm(例えば、少なくとも0.2mm、少なくとも0.3mm、少なくとも0.4mm、少なくとも0.5mm、少なくとも1mm、少なくとも1.5mm、少なくとも2mm、少なくとも2.5mm、少なくとも3mm、少なくとも3.5mm、少なくとも4mm、少なくとも4.5mm、少なくとも5mmなど)の深さまで侵入する。
【００９５】
さらなる態様において、1つまたはそれ以上の治療される腫瘍は、皮膚組織などの別の曝露された組織表面の下に位置することがある。フラクショナル治療のパラメータは、MTZが上を覆っている組織を通って、上述したように腫瘍の中にまたは腫瘍を通して延びるように、選択することができる。当業者であれば、公知のエネルギーおよび組織パラメータを使用する従来の算出を行って、例えば、腫瘍および/または上を覆っている組織の中へ特定の深さまで延びるMTZを生じさせるために、本開示に従って特定の処置のための印加エネルギーのパラメータのセット(例えば、ビーム幅、持続時間、波長、フルエンス、パワーなど)を提供することができる。
【００９６】
さらに別の態様では、体内に(例えば、曝露される組織表面から離れて)位置する腫瘍も治療することができる。そのような腫瘍では、ファイバースコープ、内視鏡、エネルギーを送達するように構成されたカテーテル配置構成体、腹腔鏡装置、集束超音波エネルギーなどを用いて腫瘍にエネルギーを送達することによって、フラクショナル治療を行うことができる。そのような態様では、エネルギー(ビーム)パラメータは、上述したように腫瘍組織内にMTZを生じさせるように選択することができる。
【００９７】
特定の態様では、CO2レーザーを使用して、腫瘍組織のフラクショナル治療中にMTZを形成することができる。さらなる態様では、エネルギー源は、エルビウムレーザー(例えば、Er：YAGレーザー)、または生体組織をアブレートすることができる別のタイプのレーザーとすることができる。
【００９８】
さらに別の態様では、腫瘍組織の点状損傷を非アブレーションにより実施して、完全なままであるが熱的に損傷した組織のMTZを腫瘍内に生じさせることができる。このような非アブレーション型FPは、例えば、パルス色素レーザー、Nd：YAGレーザー、またはアレキサンドライトレーザーなどのエネルギー源を用いて行うことができる。さらに別の態様では、非アブレーションによる点状損傷のMTZは、組織のアブレーションを避けるために十分に低い強度を有する集束超音波エネルギーを用いて、腫瘍組織内に作り出すことができる。
【００９９】
さらに別の態様では、MTZは、機械的損傷を生じさせることによって、例えば、アレイ状ニードルを用いて、または単一ニードルを用いて多数回、腫瘍組織を穿孔することによって、腫瘍組織内に形成され得る。ニードルの直径は、約1mm未満、例えば0.5mm未満、または約0.1〜0.2mmであり得る。特定の態様では、ニードルを、腫瘍組織に挿入する前に加熱して、機械的破壊だけでなく若干の熱的損傷をも生じさせることができる。例えば、ニードルは、加熱浴または他の蓄熱体を使用して、または制御された量の高周波(RF)エネルギーをニードルに供給することによって、加熱することができる。
【０１００】
aFPおよび他のフラクショナル処置の間に形成されたMTZはサイズが小さいため、MTZに生じた組織損傷は、十分に耐えられ、かつ周囲の健康な組織において治癒応答を誘導することができる。このような効果は、様々なタイプのフラクショナル治療の皮膚科学的な適用例において観察されている。
【０１０１】
本明細書に記載されるMTZのサイズ(例えば、幅および深さ)は、体内の免疫系への腫瘍内部の限定された曝露を容易にし、それによって、自己免疫応答を刺激または活性化することができる。例えば、特定の腫瘍組織のaFP治療後に実施された組織学は、赤血球のレベルの上昇を明らかにし、aFP治療から生じる腫瘍内の血流の高まりを示している。腫瘍における明らかな血流の増加は、腫瘍細胞の腫瘍外への多少限られた輸送を促進することができるが、免疫コンピテント細胞の腫瘍のコア領域への接近をも促進することができる。例えば、急速に増殖する腫瘍のコア内の増大した組織圧力は、そのコア領域を、腫瘍の血管灌流を当てにしている免疫コンピテント細胞に、接近できなくする可能性がある。また、理論に縛られることを望むものではないが、腫瘍組織内のアブレートされた溝(例えば、MTZ)は、それらの崩壊が観察されるにもかかわらず、腫瘍内のがん細胞への免疫コンピテント細胞の接近を容易にすることができる。
【０１０２】
アブレーション型FP CO2レーザー治療は、100℃を超える温度でのその蒸散により、組織内に小さな孔を形成する。これにより、蒸散孔(vaporized hole)を含む個々のMTZを取り囲んで急な温度勾配が生じる。この急な温度勾配は、レーザー誘導孔に隣接する腫瘍細胞を、ピーク温度から正常な体温までの範囲の温度にさらす。したがって、理論に縛られるものではないが、aFPまたは他のエネルギーベースの技術(例えば、加熱ニードルを腫瘍組織に挿入することによって達成され得るような、局所加熱を伴う機械的損傷を含む)を用いた腫瘍組織のフラクショナル治療は、弱体化した(例えば、熱的に損傷した)腫瘍細胞をもたらし、さらに生体の免疫系の成分へのそれらの曝露を容易にすることができる。このような曝露は、生体防御を「打ち負かす」ことなく、またはそのようなフラクショナル治療後に多数の活性腫瘍細胞を身体中に広がらせることなく、がん組織に対する自己免疫応答および/または他の応答を促進し得る。いくつかの態様では、アブレーション型FPによる腫瘍の治療は、該腫瘍内の免疫細胞を大幅に損失させない設定を用いて実施される。
【０１０３】
MTZを取り囲む細胞のある温度範囲への曝露は、フラクショナル治療される組織容量の著しいバルク加熱を伴わずに起こり、腫瘍組織内の融合性熱傷の欠如を示している。腫瘍組織内のこの特定の熱傷パターンは、腫瘍組織のaFP治療を、典型的には腫瘍組織全体にわたって比較的均質な線量のエネルギーを供給する、電離放射線療法または古典的熱アブレーション法などの、物理療法を使用する以前のエネルギーベースの腫瘍治療アプローチから区別している。
【０１０４】
したがって、FP治療に特徴的である熱損傷パターンの1つの予想される利点は、腫瘍全体を通して、がん細胞が、宿主の正常な体温からMTZで生成され100℃を超えてもよい蒸散温度まで変化し得る温度範囲に曝露される、という点である。本研究では、ただ1つの特定のaFP治療パターンとパルスエネルギーが用いらされたが、腫瘍体積に与えられた全体的な熱損傷の量が最小限であるにもかかわらず、顕著な全身免疫応答の誘発が観察された。全腫瘍体積の約2.4％がレーザーに曝露され、したがって熱的に損傷されたと推定された。
【０１０５】
また、本明細書において、他の局面において、対象におけるがんを治療するための方法が提供され、例えば、腫瘍の組織にフラクショナルレーザーを接触させ、それにより対象のがんを治療する段階を含む方法である。この局面の一態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、がんを治療するための該方法は、腫瘍からの組織の実質的なアブレーションまたは除去を含まない(すなわち、全腫瘍組織の5％未満がアブレーション/除去される；4％未満、3.5％未満、3％未満、2.5％未満、2.25％未満、2％未満、1.75％未満、1.5％未満、1.25％未満、1％未満、0.5％未満、またはそれ未満)。
【０１０６】
この局面の一態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーはCO2レーザーである。この局面の一態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパラメータは、該レーザーが非アブレーションであるように調整される。
【０１０７】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーは、腫瘍組織内に少なくとも0.1mm(例えば、少なくとも0.2mm、少なくとも0.3mm、少なくとも0.4mm、少なくとも0.5mm、少なくとも1mm、少なくとも1.5mm、少なくとも1.75mm、少なくとも2mm、少なくとも2.25mm、少なくとも2.5mm、少なくとも3mm、少なくとも3.5mm、少なくとも4mm、少なくとも4.5mm、少なくとも5mmなど)の深さまで侵入する。
【０１０８】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、腫瘍組織において局所免疫応答を誘導する。
【０１０９】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、角質層を損傷しない。この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザー治療は、腫瘍からの組織の実質的なアブレーションまたは除去をもたらさない(すなわち、全腫瘍組織の5％未満がアブレーション/除去される）。
【０１１０】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーによる治療は、腫瘍組織の瘢痕化または痂皮形成を誘導しない。
【０１１１】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、治療の領域は少なくとも0.25mm2を含む。この局面の他の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、治療の領域は、少なくとも0.25mm2から病変部の全表面を含む該全表面までを含む。この局面の他の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、治療の領域は腫瘍または病変領域の少なくとも5％を含む。他の態様では、治療の領域は腫瘍または病変領域の少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、またはそれ以上を含む。
【０１１２】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのエネルギーは、1mJ〜200mJである。この局面の別の態様および本明細書に記載される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのエネルギーは、1mJ〜5mJ、1mJ〜10mJ、1mJ〜20mJ、1mJ〜30mJ、1mJ〜40mJ、1mJ〜50mJ、1mJ〜75mJ、1mJ〜100mJ、1mJ〜125mJ、1mJ〜150mJ、1mJ〜175mJ、25mJ〜200mJ、50mJ〜200mJ、100mJ〜200mJ、125mJ〜200mJ、150mJ〜200mJ、175mJ〜200mJ、50mJ〜100mJ、25mJ〜75mJ、25mJ〜150mJの範囲、またはそれらの間の任意の範囲である。この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、40〜60mJ (例えば、50mJ)のエネルギーが表層病変に使用され、かつ150〜200mJ (例えば、200mJ)のエネルギーが深部腫瘍に使用される。一態様では、表層または深部の病変には100mJのエネルギーが使用される。
【０１１３】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパルス持続時間は100μsec〜10msecである。この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパルス持続時間は2msecである。この局面の他の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのパルス持続時間は、100μsec〜5msec、100μsec〜1msec、100μsec〜500μsec、100μsec〜250μsec、100μsec〜200μsec、250μsec〜10msec、500μsec〜10msec、750μsec〜10msec、1msec〜10msec、2msec〜10msec、5msec〜10msec、1msec〜5msec、1msec〜3msec、またはそれらの間の任意の範囲である。
【０１１４】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのスポットサイズは10μm〜1mmである。この局面の他の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、フラクショナルレーザーのスポットサイズは、10μm〜750μm、10μm〜500μm、10μm〜250μm、10μm〜150μm、10μm〜100μm、10μm〜50μm、10μm〜25μm、400μm〜1mm、500μm〜1mm、600μm〜1mm、700μm〜1mm、800μm〜1mm、900μm〜1mm、50μm〜750μm、75μm〜500μm、100μm〜500μm、250μm〜500μmの範囲、またはそれらの間の任意の範囲である。
【０１１５】
この局面の別の態様および本明細書で提供される他の全ての局面では、侵入深度は腫瘍の深さの少なくとも1/3(33％)である。他の態様では、侵入深度は、腫瘍の深さの少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％である。いくつかの態様では、フラクショナルレーザー治療が腫瘍内にまたは腫瘍の縁に沿って局所的免疫応答を誘導するならば、侵入深度は腫瘍組織自体に侵入する必要はない。
【０１１６】
免疫チェックポイント阻害物質
免疫系は、自己寛容を維持し、かつ免疫応答をモジュレートするために極めて重要な、複数の阻害経路を有する。T細胞では、応答の振幅および質は、T細胞受容体による抗原認識を介して開始され、共刺激シグナルと抑制シグナルのバランスをとる免疫チェックポイントタンパク質によって調節される。
【０１１７】
細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4 (CTLA-4)は、T細胞活性化の経路をダウンレギュレートする免疫チェックポイントタンパク質である(Fong et al., Cancer Res. 69(2):609-615, 2009; Weber Cancer Immunol. Immunother, 58:823-830, 2009)。CTLA-4の遮断は、T細胞の活性化および増殖を増大させることが示されている。CTLA-4の阻害物質としては、抗CTLA-4抗体が挙げられる。抗CTLA-4抗体は、CTLA-4に結合して、CTLA-4とその抗原提示細胞上に発現されたそのリガンドCD80/CD86との相互作用を遮断し、それによりこれらの分子の相互作用によって誘発される免疫応答の負のダウンレギュレーションを阻止する。抗CTLA-4抗体の例は、米国特許第5,811,097号; 同5,811,097; 同5,855,887号; 同6,051,227号; 同6,207,157号; 同6,682,736号; 同6,984,720号; および同7,605,238号に記載されている。1つの抗CTLA-4抗体は、トレメリムマブ(チシリムマブ、CP-675,206)である。一態様では、抗CTLA-4抗体は、CTLA-4に結合する完全ヒトモノクローナルIgG抗体のイピリムマブ(10D1、MDX-D010としても知られる)である。イピリムマブは、Yervoy(商標)の名称で市販されており、切除不能なまたは転移性のメラノーマの治療薬として承認されている。
【０１１８】
遮断または阻害の標的とすることができるチェックポイント分子のさらなる例には、限定するものではないが、以下が含まれる：PDL2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、VISTA、KIR、2B4 (CD2ファミリーの分子に属し、全てのNK、γδおよびメモリーCD8+(αβ)T細胞上に発現される)、CD160 (BY55とも呼ばれる)、CGEN-15049、CHK1およびCHK2キナーゼ、A2aR、TIGIT、DD1-α、TIM-3、Lag-3、および種々のB-7ファミリーリガンド。B7ファミリーリガンドには、限定するものではないが、以下が含まれる：B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6およびB7-H7。
【０１１９】
別の免疫チェックポイントタンパク質は、プログラム細胞死1(PD-1)である。PD1は、感染に対する炎症反応時に末梢組織におけるT細胞の活動を制限し、かつ自己免疫を制限する。インビトロでのPD1遮断は、特異的抗原標的によるチャレンジ、または混合リンパ球反応における同種異系細胞によるチャレンジに応答して、T細胞増殖およびサイトカイン産生を高める。PD1発現と応答との間の強い相関は、PD1の遮断により示された(Pardoll, Nature Reviews Cancer, 12: 252-264, 2012)。PD1遮断は、PD1またはそのリガンドPDL1に結合する抗体を含めて、様々なメカニズムによって達成することができる。PD1およびPDL1遮断剤の例は、米国特許出願第7,488,802; 同7,943,743号; 同8,008,449号; 同8,168,757号; 同8,217,149号、ならびにPCT公開特許出願番号WO03042402、同WO2008156712 、同WO2010089411、同WO2010036959、同WO2011066342、同WO2011159877、同WO2011082400、および同WO2011161699に記載されている。特定の態様では、PD1遮断剤は、抗PD-L1抗体を含む。特定の他の態様では、PD1遮断剤は、抗PD1抗体および類似の結合タンパク質を含み、例えば、PD-1に結合して、そのリガンドPD-L1およびPD-L2によるPD-1の活性化をブロックする完全ヒトIgG4抗体、ニボルマブ(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538)；PD-1に対するヒト化モノクローナルIgG4抗体、ランブロリズマブ(MK-3475またはSCH 900475)；PD1に結合するヒト化抗体CT-011；B7-DCの融合タンパク質AMP-224；抗体Fc部分；PD-L1(B7-H1)遮断のためのBMS-936559 (MDX-1105-01)である。他の免疫チェックポイント阻害物質には、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)阻害物質、例えば、可溶性Ig融合タンパク質であるIMP321などが含まれる(Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179:4202-4211)。その他の免疫チェックポイント阻害物質には、B7阻害物質、例えば、B7-H3およびB7-H4阻害物質などが含まれる。特に、抗B7-H3抗体MGA271 (Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834)。また、TIM3 (T細胞免疫グロブリンドメイン・ムチンドメイン3) 阻害物質も含まれる(Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86およびSakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94)。
【０１２０】
追加の抗CTLA4アンタゴニストには、限定するものではないが、以下が含まれる：コグネイトリガンドに結合するCD28抗原の能力を破壊することができる阻害物質、コグネイトリガンドに結合するCTLA4の能力を抑制する阻害物質、共刺激経路を介してT細胞応答を増強させる阻害物質、CD28および/またはCTLA4に結合するB7の能力を破壊する阻害物質、共刺激経路を活性化するB7の能力を破壊する阻害物質、CD28および/またはCTLA4に結合するCD80の能力を破壊する阻害物質、共刺激経路を活性化するCD80の能力を破壊する阻害物質、CD28および/またはCTLA4に結合するCD86の能力を破壊する阻害物質、共刺激経路を活性化するCD86の能力を破壊する阻害物質、ならびに、一般には活性化されないように、共刺激経路を破壊する阻害物質。これには、必然的に以下が含まれる：共刺激経路のメンバーの中でも特に、CD28、CD80、CD86、CTLA4の小分子阻害物質；共刺激経路のメンバーの中でも特に、CD28、CD80、CD86、CTLA4に対する抗体；共刺激経路のメンバーの中でも特に、CD28、CD80、CD86、CTLA4に対するアンチセンス分子；共刺激経路のメンバーの中でも特に、CD28、CD80、CD86、CTLA4に対するアドネクチン；共刺激経路のメンバーの中でも特に、CD28、CD80、CD86、CTLA4のRNAi阻害物質(一本鎖と二本鎖の両方)；とりわけ、抗CTLA4アンタゴニスト。
【０１２１】
いくつかの態様において、本明細書に記載のがんの治療は、TLR7アゴニスト(例えば、イミキモド、レシキモド、ガーディキモド、GS-9620、GS-986)と組み合わせて、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質を投与することを含む。以下のファミリー由来のTLR7アゴニストもまた、本明細書に記載の方法および組成物と共に使用することが意図される：(i)イミダゾキノリン類(例えば、イミキモド、レシキモド、ガーディキモド、CL097、852A)、(ii)グアノシン類似体(例えば、ロキソリビン)、または(iii)ウイルス性もしくは合成の一本鎖RNA。
【０１２２】
薬学的に許容される担体
本明細書に開示される作用物質の治療用組成物は、生理学的に許容できる担体を、その中に活性成分として溶解または分散された、本明細書に記載の免疫応答を誘導する作用物質と共に、含むことができる。本明細書で使用する用語「薬学的に許容される」、「生理学的に許容できる」およびそれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬を指すとき、交換可能に使用され、この物質が、毒性を示すことなく、または悪心、めまい、胃の不調などの望ましくない生理作用を起こすことなく、哺乳類に投与することができることを表す。薬学的に許容される担体は、それと混合される作用物質に対する免疫反応の惹起を、そのように望まない限り、それ自体が促進することはない。組成物中に溶解または分散された活性成分を含む薬理学的組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されており、処方・配合に基づいて限定される必要はない。典型的には、このような組成物は、局所薬として調製されるか、または溶液もしくは懸濁液として注射可能であるが、使用前に液体中に溶解または懸濁するのに適した固体形態でも調製することができる。この調製物はまた、乳化されてもよいし、リポソーム組成物として提示されてもよい。活性成分は、薬学的に許容されかつ活性成分に適合する賦形剤と、本明細書に記載の治療方法での使用に適した量で、混合することができる。
【０１２３】
適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが含まれる。さらに、所望により、前記組成物は、活性成分の有効性を高める少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などを含むことができる。本明細書で使用される治療用組成物は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩(ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される)が含まれる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩を、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【０１２４】
生理学的に許容できる担体は当技術分野において周知である。例示的な液状担体は、活性成分と水の他に物質を含まない無菌水溶液、または生理学的pH値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水もしくは両方、例えばリン酸緩衝生理食塩水、を含む無菌水溶液である。さらに、水性担体は、複数種類の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムまたはカリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含むことができる。液体組成物は、水に加えて、また水を除外して、液相を含んでもよい。そのような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油エマルションである。本明細書に記載の方法で使用される活性作用物質の、特定の障害または疾患の治療に有効な量は、該障害または疾患の性質に左右され、標準的な臨床技術によって決定することができる。
【０１２５】
いくつかの態様では、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、上記薬学的組成物を投与単位形態に製剤化することが有利であり得る。投与単位形態または単位用量形態は、単位用量として適切な、物理的にばらばらの単位を指し、各単位は、所要の薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるように算出された活性成分の所定量を含有する。そのような投与単位形態の例は、錠剤(分割錠またはコーティング錠を含む）、カプセル剤、丸薬、粉末パケット、ウエハー、注射用溶液または懸濁液、茶さじ1杯、大さじ1杯など、およびそれらの分離された倍数である。
【０１２６】
投与量および投与
本明細書に記載の治療方法では、腫瘍(例えば、固形腫瘍またはメラノーマ)を患っているかまたは腫瘍と診断された患者に、免疫応答を誘導するのに有効な量の作用物質が投与される。一局面では、本明細書に記載の方法は、対象におけるがんを治療するための方法を提供する。一態様では、該対象は哺乳動物(例えば、霊長類または非霊長類の哺乳動物)であり得る。別の態様では、哺乳動物はヒトであり得るが、このアプローチは全ての哺乳動物に対して有効である。「有効量」とは、治療を受けている対象に所望の治療上または予防上の利益をもたらすのに一般的に十分な量または用量を意味する。
【０１２７】
本明細書に記載される治療のための免疫誘導試薬の有効量または用量は、モデリング、用量漸増研究または臨床試験などの常法により、通常の要因、例えば、投与または送達の方法もしくは経路、組成物の薬物動態、障害または疾患の重症度と経過、対象の以前のまたは進行中の治療法、対象の健康状態および薬物に対する応答、ならびに治療担当医師の判断を考慮に入れて、確認することができる。ヒトのための例示的な用量は、単回投与単位または分割投与単位(例えば、BID、TID、QID)で、約0.001〜約8mg/kg対象の体重/日、約0.05〜300mg/日、または約50〜400mg/日の範囲である。
【０１２８】
免疫応答を誘導する作用物質を含む組成物の投与量範囲は、該組成物の効力によって決まり、所望の効果(例えば、腫瘍治療の改善)をもたらすほど多い量を含むが、その投与量は、許容できない有害な副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般に、投与量は、その製剤(例えば、経口、静脈または皮下製剤)によって、また患者の年齢、症状および性別によって変化する。投与量は、当業者が決定することができ、何らかの合併症が発生した場合には、医師個人が調整してもよい。典型的には、投与量は0.001mg/日〜400mg/日の範囲である。いくつかの態様では、投与量範囲は、0.001mg/日〜400mg/日、0.001mg/日〜300mg/日、0.001mg/日〜200mg/日、0.001mg/日〜100mg/日、0.001mg/日〜50mg/日、0.001mg/日〜25mg/日、0.001mg/日〜10mg/日、0.001mg/日〜5mg/日、0.001mg/日〜1mg/日、0.001mg/日〜0.1mg/日、0.001mg/日〜0.005mg/日である。あるいは、用量範囲は、0.1μg/mL〜30μg/mLの血清レベルを維持するように漸増される。
【０１２９】
本明細書では、所望の効果を生み出すための例えばチェックポイント阻害物質の用量は、がん(例えば、メラノーマ)の従来の治療のために投与される用量と比較して、例えばアブレーション型FPおよびイミキモドと併用される場合に低減され得ることも意図される。
【０１３０】
上述した用量の投与は、限られた期間、または必要に応じて、繰り返すことができる。いくつかの態様では、用量は、1日1回、または1日に複数回、例えば、限定するものではないが1日3回、投与される。一態様では、上記の用量を数週間または数ヶ月にわたって毎日投与する。治療の持続期間は、対象の臨床経過および治療に対する応答性によって決まる。初期のより高い治療量の後に、継続的な比較的低い維持量が企図される。
【０１３１】
本明細書に記載の方法および組成物に有用な作用物質は、腫瘍の部位に応じて、局所、静脈内(ボーラスまたは連続注入による)、腫瘍内、経口、吸入、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内に投与することができ、また、必要に応じて、蠕動手段によって、または当業者に知られた他の手段によって送達することができる。ある種のがん(例えば、転移性疾患)の治療では、該作用物質を全身的に投与することができる。
【０１３２】
少なくとも1つの作用物質を含む治療用組成物は、通常、単位用量で投与され得る。用語「単位用量」は、治療用組成物に関して使用する場合、対象のための用量単位として適切な、物理的にばらばらの単位を指し、各単位は、所要の生理学的に許容される希釈剤、すなわち担体、またはビヒクルと共に所望の治療効果を生じるように算出された活性物質の所定量を含有する。
【０１３３】
併用療法：  本明細書において、少なくとも2つの異なる作用物質(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10種類の作用物質)の組み合わせを投与する段階を含む、がんの治療方法が提供される。一態様では、この併用療法は、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質を、少なくとも1つのエンドソームTLRアゴニスト(例えば、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニスト)と共に投与することを含む。別の態様では、該併用療法は、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質を、フラクショナルレーザー治療処置と組み合わせて投与することを含む。別の態様では、該併用療法は、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質、少なくとも1つのエンドソームTLRアゴニスト(例えば、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニスト)、および少なくとも1つのフラクショナルレーザー治療処置を投与することを含む。別の態様では、該併用療法は、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質、少なくとも1つのエンドソームTLRアゴニスト(例えば、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニスト)、少なくとも1つのフラクショナルレーザー治療処置、およびCTLA-4阻害物質(例えば、CTLA-4に対する抗体)を投与することを含む。
【０１３４】
併用療法として少なくとも2つの作用物質を投与する場合、それらを同時に投与することができる。他の態様では、少なくとも2つの作用物質を別々に投与するか、または同時並行して投与する。該作用物質は、当業者によって所望の順序で送達され得る。免疫チェックポイント阻害物質は、腫瘍内に、全身に、経口的に、または他の所望の投与形態で投与することができる。エンドソームTLRアゴニストは、腫瘍内注入、腫瘍の血液供給への注入、または局所投与による送達が企図される。
【０１３５】
一態様において、記載される併用療法に対する抗腫瘍応答は、相乗的である。
【０１３６】
有効性測定
免疫応答(例えば、局所腫瘍内免疫応答、腫瘍または病変の大きさの縮小、チェックポイント阻害物質による治療に対する感受性の向上など)を誘発する作用物質を含む治療の有効性は、熟練した臨床医によって判定され得る。しかしながら、1つの例として、がんの兆候または症状のいずれか1つもしくは全てが有益な方法で変化し、他の臨床的に認められた疾患の症状またはマーカーが、例えば阻害物質による治療後に少なくとも10％、改善または向上する場合に、治療は、本明細書で使用される「効果的な治療」とみなされる。有効性はまた、入院または医療介入の必要性により評価して、個体が悪化しない(例えば、疾患の進行が止まるか、または少なくとも遅くなる)ことによっても測定することができる。患者の集団における有効性はまた、進行性の転移性疾患による死亡率を測定することによって決定することができる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ/または本明細書に記載される。治療は、個体または動物(いくつかの非限定的な例は、ヒトまたは哺乳動物を含む)における疾患のあらゆる治療を含み、以下が含まれる：(1)疾患を抑制すること、例えば、がんの進行を止めるかもしくは遅らせること；または(2)疾患を緩和すること、例えば、症状の退行を引き起こすこと；および(3)転移性メラノーマを含めて、転移の発生の可能性を予防もしくは低減すること。
【０１３７】
本発明は、番号を付した以下の項目のいずれかにおいて定義されてもよい。
1  (a)腫瘍を有する対象に少なくとも1つの薬物を投与する段階、および(b)該腫瘍の組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階を含み、それによって該対象におけるがんを治療する、対象におけるがんを治療するための方法。
2  前記少なくとも1つの薬物が全身的に投与される、項目1に記載の方法。
3  前記少なくとも1つの薬物が免疫チェックポイント阻害物質である、項目1に記載の方法。
4  前記免疫チェックポイント阻害物質が、PD1、PDL1、TIM-3、またはCTLA4の阻害物質である、項目3に記載の方法。
5  前記免疫チェックポイント阻害物質がイピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである、項目3に記載の方法。
6  前記少なくとも1つの薬物が局所的に投与される、項目1に記載の方法。
7  前記少なくとも1つの薬物が、前記腫瘍組織に局所的に投与されるか、または前記腫瘍組織に注入される、項目6に記載の方法。
8  前記少なくとも1つの薬物が、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニストである、項目6に記載の方法。
9  前記TLR7アゴニストがイミキモド、レシキモド(reiquimod)、またはガーディキモド(gardiquimod)である、項目8に記載の方法。
10  少なくとも2つの薬物を投与する段階をさらに含む、項目1に記載の方法。
11  前記少なくとも2つの薬物が、イミキモドと少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質とを含む、項目10に記載の方法。
12  前記対象に薬物を投与する段階が、少なくとも2回行われる、項目1に記載の方法。
13  前記腫瘍組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階が、少なくとも2回行われる、項目1に記載の方法。
14  前記投与する段階と前記接触させる段階が同時に行われる、項目1に記載の方法。
15  前記投与する段階が、前記接触させる段階の前または後に行われる、項目1に記載の方法。
16  前記がんがメラノーマまたは膵臓がんである、項目1に記載の方法。
17  前記フラクショナルレーザーがCO2レーザーである、項目1に記載の方法。
18  前記フラクショナルレーザーが、前記腫瘍組織内に少なくとも0.1mmの深さまで侵入する、項目1に記載の方法。
19  前記フラクショナルレーザーによる治療が、前記腫瘍組織において局所免疫応答を誘導する、項目1に記載の方法。
20  前記フラクショナルレーザーによる治療が角質層を損傷しない、項目1に記載の方法。
21  前記フラクショナルレーザーによる治療が、前記腫瘍組織の瘢痕化または痂皮形成を誘導しない、項目1に記載の方法。
22  治療の領域が少なくとも0.25mm2を含む、項目1に記載の方法。
23  前記フラクショナルレーザーのエネルギーが1mJ〜200mJである、項目1に記載の方法。
24  50mJまたは100mJのエネルギーが表層病変に使用され、かつ200mJのエネルギーが深部腫瘍に使用される、項目23に記載の方法。
25  前記フラクショナルレーザーのパルス持続時間が100μsec〜10msecである、項目1に記載の方法。
26  前記フラクショナルレーザーのパルス持続時間が2msecである、項目25に記載の方法。
27  前記フラクショナルレーザーのスポットサイズが10μm〜1mmである、項目1に記載の方法。
28  前記フラクショナルレーザーの侵入深度が前記腫瘍の深さの1/3である、項目1に記載の方法。
29  (a)腫瘍を有する対象に少なくとも1つの薬物を投与する段階、および (b)該腫瘍の組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階を含み、それによってがんの再発に対する該対象の抵抗性を促進する、がんの再発に対する対象の抵抗性を促進する方法。
30  前記少なくとも1つの薬物が全身的に投与される、項目29に記載の方法。
31  前記少なくとも1つの薬物が免疫チェックポイント阻害物質である、項目30に記載の方法。
32  前記免疫チェックポイント阻害物質が、PD1、PDL1、TIM-3、またはCTLA4の阻害物質である、項目31に記載の方法。
33  前記免疫チェックポイント阻害物質が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである、項目31に記載の方法。
34  前記少なくとも1つの薬物が局所的に投与される、項目29に記載の方法。
35  前記少なくとも1つの薬物が、前記腫瘍組織に局所的に投与されるか、または前記腫瘍組織に注入される、項目29に記載の方法。
36  前記少なくとも1つの薬物が、TLR3、TLR7、TLR8、またはTLR9のアゴニストである、項目34に記載の方法。
37  前記TLR7アゴニストがイミキモド、レシキモド、またはガーディキモドである、項目36に記載の方法。
38  少なくとも2つの薬物を投与する段階をさらに含む、項目29に記載の方法。
39  前記少なくとも2つの薬物が、イミキモドと少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害物質とを含む、項目38に記載の方法。
40  前記対象に薬物を投与する段階が、少なくとも2回行われる、項目29に記載の方法。
41  前記腫瘍組織にフラクショナルレーザーを接触させる段階が、少なくとも2回行われる、項目29に記載の方法。
42  前記投与する段階と前記接触させる段階が同時に行われる、項目29に記載の方法。
43  前記投与する段階が、前記接触させる段階の前または後に行われる、項目29に記載の方法。
44  前記がんがメラノーマまたは転移性メラノーマである、項目29に記載の方法。
45  前記フラクショナルレーザーがCO2レーザーである、項目29に記載の方法。
46  前記フラクショナルレーザーが、前記腫瘍組織内に少なくとも0.1mmの深さまで侵入する、項目29に記載の方法。
47  前記フラクショナルレーザーによる治療が、前記腫瘍組織において局所免疫応答を誘導する、項目29に記載の方法。
48  前記フラクショナルレーザーによる治療が角質層を損傷しない、項目29に記載の方法。
49  前記フラクショナルレーザーによる治療が、前記腫瘍組織の瘢痕化または痂皮形成を誘導しない、項目29に記載の方法。
50  治療の領域が少なくとも0.25mm2を含む、項目29に記載の方法。
51  前記フラクショナルレーザーのエネルギーが1mJ〜200mJである、項目29に記載の方法。
52  50mJのエネルギーが表層病変に使用され、かつ200mJのエネルギーが深部腫瘍に使用される、項目51に記載の方法。
53  前記フラクショナルレーザーのエネルギーが100mJである、項目51に記載の方法。
54  前記フラクショナルレーザーのパルス持続時間が100μsec〜10msecである、項目29に記載の方法。
55  前記フラクショナルレーザーのパルス持続時間が2msecである、項目54に記載の方法。
56  前記フラクショナルレーザーのスポットサイズが10μm〜1mmである、項目29に記載の方法。
57  前記フラクショナルレーザーの侵入深度が前記腫瘍の深さの1/3である、項目29に記載の方法。
【実施例】
【０１３８】
実施例1：ネオ抗原欠損がんにおいて免疫チェックポイント遮断に対する応答をレスキューする
細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4)およびプログラム細胞死-1(PD-1)経路2,3を標的とする免疫チェックポイント阻害物質は、持続的な抗腫瘍効果をもたらすことができる。しかし、転移性メラノーマおよび他のがんを有する患者の大部分は、チェックポイント遮断療法に応答しない4。最近の研究では、チェックポイント遮断の有効性は、治療前または治療誘導性のT細胞浸潤およびより高い腫瘍特異的ネオ抗原の負荷量と相関することが示されている5-12。メラノーマでの紫外線(UVR)誘発性体細胞突然変異の優勢は、免疫療法に対する応答において重要な役割を果たすことが提案されてきた。しかし、チェックポイント阻害物質への応答性は、白斑(vitiligo)の発症にも関連しており、白斑は、抗PD-1療法を受けているメラノーマ患者の約25％で報告されているが、他のがん患者では報告されていない13。メラノーマ関連白斑と、抗PD-1に対する客観的腫瘍応答の有意に高い割合との関連は、野生型メラノサイト抗原の免疫認識に向けた進化が有益であり得ることを示唆している。ここでは、BrafV600E/Pten-/-同系マウスメラノーマモデルを使用して、チェックポイント遮断の有効性がUVR関連ネオ抗原の存在によってモジュレートされるかどうかを最初に試験した。多数のUVB誘発性突然変異を有するメラノーマクローンは、それらの適合親メラノーマよりも著しく多く炎症を起こし、PD-1阻害に対して応答性であることが観察された。ネオ抗原欠損腫瘍におけるチェックポイント遮断に対する応答性を「レスキューする」ために、チェックポイント阻害物質を、Toll様受容体(TLR)7アゴニストである局所イミキモドに加えて、瘢痕化および光老化の治療に一般的に使用されるレーザー法であるアブレーション型フラクショナル光熱融解(aFP)と組み合わせた14。難治性のメラノーマおよび膵臓腺がんのモデルでは、抗PD-1にイミキモドとaFPを追加すると、局所および全身/遠隔のいずれの腫瘍にも退縮が生じ、50〜60％の症例において長期生存が認められた。この併用療法は、野生型メラノサイト抗原認識に特異的なCD8+ T細胞の増殖を刺激し、かつ長期メラノーママウスにおける無関係のB16メラノーマの生着を予防した。さらに、UVB突然変異保有メラノーマの併用療法は、突然変異欠損メラノーマに対してさえも持続的な免疫を付与したが、これは共通のメラノサイト抗原に対するエピトープスプレッディング(epitope spreading)のメカニズムと一致する。これらの結果は、抗腫瘍免疫における突然変異荷重(mutational load)およびネオ抗原の機能的重要性を実証する。治療関連白斑に関するヒトデータ13と合わせると、それらはまた、野生型腫瘍系統自己抗原に対する応答を増強する治療戦略、例えば、イミキモドとaFPとチェックポイント阻害物質の新規な組み合わせが、ネオ抗原の必要条件を擦り抜けて、非免疫原性の腫瘍の大きな退縮をもたらし得ることを示している。
【０１３９】
最近の研究では、肉腫15のマウスモデルならびにメラノーマ16-20および胆管がん21の患者において、ネオ抗原反応性のT細胞が同定された。しかしながら、特異的T細胞が検出され得るネオ抗原をコードする非同義突然変異の割合は多くの腫瘍型において低く、応答に関連するネオ抗原の再発クラスが全てのコホートに見られるとは限らず、また、ネオ抗原負荷量(neoantigen burden)は個々の患者の臨床的有益性を予測しない8,11。ネオ抗原の抗腫瘍免疫への寄与を理解することは、患者腫瘍における突然変異ランドスケープの独自性、ヒトの免疫応答のばらつき、および腸内微生物叢の組成のような環境要因によって制限されている22,23。
【０１４０】
チェックポイント遮断に応答する腫瘍特異的ネオ抗原の役割を研究するために、C57BL/6バックグラウンドに完全に戻し交配されたTyr::CreER;BrafCA;Ptenlox/loxマウス25から樹立した低免疫原性D4M.3Aメラノーマ細胞株24に基づいて、移植可能なマウスメラノーマモデルを開発した。安定な細胞株(「親」)は、D4M.3Aの単一細胞クローンに由来した。皮膚がんの1番の環境リスク因子である日光曝露の変異誘発効果を模倣するために、この親メラノーマをインビトロでUVB照射にかけて、一連の単一細胞「UVクローン」を単離した。2つのクローン、D3UV2 (「UV2」)およびD3UV3 (「UV3」)は、親細胞株と同じインビトロ増殖速度論と、PD-L1、PD-1、MHCクラスIおよびIIの発現とを有していた(図5A〜5C)。親細胞株と比較して、UV2およびUV3は、それぞれ、1Mbあたり追加の79および87個の遺伝子変異を含み、これは0.1〜100/Mbの範囲にわたるヒトメラノーマの体細胞遺伝子変異率に匹敵する26。予想通り、ほとんどの突然変異は、UVB突然変異誘発に関連するC＞Tトランジションから生じ、非同義イベント対同義イベント2：1の比で起こった(図1A)。
【０１４１】
培養中の増殖速度と一致して、親細胞またはUVB突然変異細胞の皮下接種後の免疫不全NOD/SCID/γ鎖ヌル(NSG)マウスにおいて腫瘍増殖速度論に有意差はなかった(図1B)。免疫コンピテント(同系)C57BL/6宿主では、UV2およびUV3腫瘍も容易に生着した(図1C)。しかしながら、親メラノーマとは対照的に、UVクローン腫瘍を有するマウスの生存率は、抗PD-1によって著しく改善され、親メラノーマの0％に対してこれらの腫瘍の20〜60％の安定した完全なクリアランスが示された(図1C)。
【０１４２】
ネオ抗原が腫瘍微小環境にどのように影響するかを理解するために、全腫瘍のRNAシーケンシングを行った。遺伝子セット濃縮分析(gene set enrichment analysis)(GSEA)27は、親メラノーマと比較して、UV2メラノーマにおいて多数の免疫関連遺伝子セットの強い濃縮を明らかにし、それらは自然免疫と適応免疫に広がっていた(図2A、表1)。免疫組織化学的分析により、UV2メラノーマ中の腫瘍浸潤T細胞の数は、親メラノーマ中よりも有意に高いことが確認された(図2B)。UV2腫瘍は、有意に多いCD8+ T細胞数を含み(図2C)、対応してより大きな免疫細胞溶解活性を有していた28(図6A)。しかし、これはT細胞機能不全を伴い、Ki67+CD8+ T細胞の減少、より多くのCD4+FOXP3+Treg細胞数、より低いCD8：Treg比、ならびに阻害性受容体および分子の発現増加が見られた(図2C、2D、および6B)。抗PD-1によるUV2腫瘍の処置は、腫瘍内CD8：Treg比を回復させ、かつKi67およびグランザイムBに陽性のCD8+ T細胞の割合を増加させた(図2D)。対照的に、親メラノーマでは、抗PD-1処置はCD8：Treg比を改善せず、Ki67+およびグランザイムB+のCD8+ T細胞集団に対してより小さな影響を及ぼした(図2D)。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のT細胞受容体(TCR)β鎖シーケンシングは、TCRクローン型の豊富度、クローン性、または多様性に変化を示さなかった(図2E)が、このことは、1つのまたは少数の優性クローンの出現を伴うことなく、ネオ抗原の存在が多数のCD8+ T細胞クローンの応答を惹起し得ることを示している。
【０１４３】
これらの結果は、予測されるネオ抗原負荷がより高い患者集団におけるチェックポイント遮断のより高い有効性を実証したヒトバイオインフォマティクス分析を支持する8-10,12。さらに、UV2メラノーマにおいてより多くの炎症を起こした腫瘍微小環境の観察は、チェックポイント阻害物質に対する応答が腫瘍への既存のT細胞浸潤に関連していることを示す複数の研究と一致する5-7,11。
【０１４４】
次に、より低い突然変異荷重を有しかつ抗PD-1療法に失敗した低炎症性のヒト腫瘍を再現する、親メラノーマモデルに関心が向けられた。非炎症性のネオ抗原欠損腫瘍を有する患者の場合、腫瘍微小環境における炎症の高まりは、チェックポイント遮断に対する応答を改善する可能性がある。局所炎症を誘発するために、局所イミキモドとアブレーション型フラクショナル光熱融解(aFP)との組み合わせを試験した。イミキモドは、I型インターフェロン(IFN)を含む前炎症性サイトカインを誘導するもので、基底細胞がん、光線性角化症、および悪性黒子型メラノーマの治療に臨床的に使用される29,30。TLR7のより高い発現は、メラノーマ患者におけるより長い生存と関連している(図7A)。aFPは、無傷の組織が散在した熱傷の微視的柱状物を多数作り出し14、したがって、多くの腫瘍浸潤免疫細胞を傷つけないで部分的腫瘍アブレーションを生じさせることができるという理由で、aFPが選択された31。aFPパラメータは、皮下腫瘍のわずかに約2.4％をアブレートするように調整され、それによって、腫瘍内の免疫細胞集団を排除することなく炎症を強めることを目標としている。
【０１４５】
免疫チェックポイント遮断を伴う組み合わせ効果を評価するために、左右の脇腹に親メラノーマを有するマウスを、イミキモド、aFPおよび/または抗PD-1の全ての組み合わせで処置した(図3Aおよび7B)。aFPと局所イミキモドはマウス1匹につき1つの腫瘍にのみ適用したが、抗PD-1は全身投与した。両腫瘍の完全な退縮を伴う完全応答率は、単剤療法での0％から、2つの処置の任意の組み合わせで10％に改善し、イミキモド＋aFP＋抗PD-1の3剤併用療法後には50％に改善した(図3A、図7B)。抗PD-1の代わりに抗CTLA-4を用いた3剤併用療法(イミキモド＋aFP＋抗CTLA-4)の組み合わせ効果も観察したところ、25％のマウスで完全な応答が認められた(図7C)。片側のイミキモド＋aFP処置にもかかわらず、マウスの両脇腹の腫瘍では、実質的に同一の増殖低下が観察された(図3D)；このことは、イミキモドとaFPの局所投与が、チェックポイント阻害と組み合わせたときに、ネオ抗原欠損親メラノーマに対するアブスコパル効果を媒介することを示している。
【０１４６】
転移性メラノーマにおけるPD-1とCTLA-4の二重遮断の相補的活性および最近の臨床上の成功と一致して32,33、親メラノーマを有するマウスにおける抗PD-1＋抗CTLA-4に対する応答は、いずれか単独よりも優れていた(図3B)。イミキモドとaFPを追加すると、完全な両側応答率が75％にさらに増加した(図3B、図7E)；これは、イミキモドとaFPが二重チェックポイント遮断とも相乗的であることを実証している。さらに、3剤併用療法は、臨床試験でチェックポイント遮断に不応性であった膵管腺がんのための処置として、移植可能な同系のKPCマウスモデル(KrasLSL.G12D;p53R172H;Pdx1::Cre)を用いて試験された。PD-1単剤療法は何の効果も与えなかったが、3剤併用療法は両側の膵臓腫瘍の退縮を誘発し、マウスの60％に持続的な完全応答が認められた(図3C、図7F)。
【０１４７】
イミキモドとaFPを追加することがネオ抗原欠損状況において抗腫瘍応答を促進するメカニズムを調べるために、処置した親メラノーマにおいてRNAシーケンシングにより遺伝子発現を比較した。抗PD-1単独と比較して3剤併用療法で処置したメラノーマでは、GSEAにより、いくつかの免疫関連KEGG遺伝子セットの顕著な濃縮が確認された(図4A、表2)。親メラノーマでは、チェックポイント阻害抗体へのイミキモドおよびaFPの追加は、アイソタイプ対照抗体と比較して、腫瘍内CD3+ T細胞の密度およびCD8：Treg比を大幅に増加させた(図4B、4C)。イミキモド単独、または抗PD-1もしくはaFPと一緒のイミキモドは、CD8+ TILのグランザイムB+画分を増加させた(図4C)。流入領域リンパ節(dLN)において、CD11c+ 樹状細胞(DC)上のプログラム細胞死1リガンド2(PD-L2)の発現はイミキモドによって減少し、イミキモドはDCをあまり抑制的にしないことを示している(図4C)。注目すべきことに、直接処置した腫瘍と反対側の(未処置)腫瘍の両方およびdLNにおいて同様の変化が観察され、局所イミキモドが広い免疫効果を有することを示している(図4A)。これらのデータは、イミキモドが抗原提示を増強し、かつ抗PD-1または抗CTLA-4とは独立してT細胞区画を活性化するが、腫瘍へのT細胞浸潤を増加させるためにはチェックポイント遮断が必要であることを示している。
【０１４８】
CD8+ T細胞の枯渇は、3剤併用療法により媒介される親メラノーマの退縮および生存を無効にし、治療上の利益にとってのそれらの重要な役割が確認された(図4D)。しかしながら、アイソタイプ適合対照群、抗PD-1群、および3剤併用療法群の間に、TCRレパートリーの豊富度、多様性またはクローン性の測定可能な変化は検出されず(図4E)、3剤併用療法の早期有効性が、オリゴクローナルT細胞の増殖または固有のT細胞クローンの動員によるものではないことを示している。代わりに、3剤併用療法は、ポリクローナルT細胞の増殖または抗原特異的CD8+ T細胞のプライミング、質、もしくは機能の増強をもたらすことができる。
【０１４９】
ネオ抗原負荷量が低いがチェックポイント遮断への応答に成功したヒトメラノーマの特徴を調べるために、イピリムマブを投与された患者からの処置前メラノーマ生検のデータセットを検討した11。ネオ抗原負荷が低い患者を、本明細書の「方法」のセクションに記載されるように、イピリムマブレスポンダーまたは非レスポンダーとして分類した。RNAシークエンシングプロファイルのGSEAは、非レスポンダーよりもレスポンダーにおいてIFN-αおよびIFN-γシグナル伝達に関連する遺伝子の有意に高い発現を明らかにした(表3)。これは、自然発生的な腫瘍炎症に関連している、処置前腫瘍におけるより大きなI型インターフェロンシグナル伝達を反映している可能性が高い34-37。低ネオ抗原レスポンダーにおいて濃縮された上位GO生物学的プロセス遺伝子セットは色素形成関連であり(表3)、そして最重要のGO色素形成遺伝子セット(GO：0043473)もレスポンダーにおいて顕著に濃縮された(図4F)。同じGO色素形成遺伝子セットは、3剤併用療法後の親マウスメラノーマにおいて濃縮されたが、抗PD-1単剤療法では濃縮されず、3剤併用療法は、IFN-α応答およびIFN-γ応答の増加にも関連している(表2、図4F)。これは、aFPとイミキモドの追加が、ヒト低ネオ抗原レスポンダーと非レスポンダーとの間の差を部分的に繰り返す、腫瘍遺伝子発現プロファイルの変化を媒介することを示している。
【０１５０】
GO色素形成遺伝子セットには、gp100およびチロシナーゼなどのメラノサイト分化抗原が含まれる。理論に縛られることを望むものではないが、これは、アップレギュレートされた野生型メラノサイト抗原が3剤併用療法後にT細胞の標的となり得ることを示している。したがって、gp100：H-2Dbテトラマー染色を用いて、腫瘍浸潤T細胞によるメラノサイト抗原の認識についてマウス親メラノーマを分析した。3剤併用療法は、処置なしまたは抗PD-1単独と比較して、gp100テトラマー陽性のCD8+ TILの強い誘導(p＜0.001)をもたらした(図4G)。したがって、イミキモドとaFPの追加は、抗PD-1で処置したメラノーマ内の野生型メラノサイト抗原を認識することができるCD8+ T細胞集団の測定可能な増殖につながる。
【０１５１】
最後に、長期免疫を評価するために、3剤併用療法後に完全なメラノーマ退縮を有するマウスを、2回目のメラノーマ接種で再チャレンジした(図4H)。予期せざることに、UV2メラノーマ(ネオ抗原発現)生存マウス3匹のうちの3匹は、親(ネオ抗原欠損)メラノーマの拒絶を媒介するメモリー応答を有していた。したがって、突然変異の追加はより強い抗メラノーマ免疫応答を引き起こすのに十分であったが(図1C)、3剤併用療法後の長期応答は推定上のネオ抗原に制限されなかった。さらに、併用療法後の親メラノーマ生存マウスの30％は、無関係のB16-F10マウスメラノーマから保護された(図4H)。対照的に、親メラノーマ生存マウスには、KPC膵臓腫瘍に対する免疫がなかった(図8C)。gp100を認識するCD8+ T細胞の頻度の増加と一致して(図4G)、これらの結果は、併用免疫療法に成功したレスポンダーには、ネオ抗原に制限されない共通系統腫瘍エピトープの長期間の免疫認識があることを示している。
【０１５２】
まとめると、これらの結果は、免疫チェックポイント遮断に対するがん応答を増強することができる2つの機序、すなわち、ネオ抗原の導入およびaFPとイミキモドの追加、を実証している。抗PD-1耐性BRAF(V600E)/Pten-/-メラノーマモデル25におけるUVB関連突然変異の誘発は、チェックポイント遮断に対する耐性を克服するのに十分であった。低免疫原性の親腫瘍とは対照的に、突然変異誘発されたUV2メラノーマは、抗PD-1によって再活性化された機能不全T細胞の蓄積を特徴とし、結果的に完全な腫瘍退縮および長期生存をもたらした。これらの知見は、ヒトがんで観察される高い突然変異荷重の機能的重要性を立証している38,39。
【０１５３】
遺伝子変異量が低いがんのために、チェックポイント遮断に対する応答を達成することができる新規な治療戦略が検討された。チェックポイント遮断へのイミキモドとaFPの追加は、メラノーマおよび膵臓腺がんにおける炎症を強めて、自然免疫の活性化とCD8+ T細胞機能の増加が全身的な完全応答につながる。注目すべきことに、3剤併用療法は、低ネオ抗原サブセットの患者のうちのイピリムマブレスポンダー由来のヒト治療前メラノーマ生検で観察された、IFNシグナル伝達および色素関連転写産物レベルの上昇に匹敵する遺伝子発現の変化をもたらした。
【０１５４】
白斑は、PD-1遮断の臨床効果と関連しており13、メラノーマ患者では治療に関連する副作用であるが、他のがんではそうではない1-3。白斑はネオ抗原に対する免疫応答から生じる可能性は低い；ネオ抗原はUVRによってランダムに分布されており、皮膚メラノサイトの斑点間で共有されていそうにない。代わりに、メラノサイトの自己免疫破壊は、正常なメラノサイトおよびメラノーマ細胞によって共有される野生型抗原に対する応答から生じる可能性がある。この研究におけるメラノーマ保有マウスは、明らかな白斑または白毛症を発症しなかったが、依然としてメラノサイト抗原へのエピトープスプレッディングの証拠を示し、gp100を認識するCD8+ T細胞、腫瘍退縮のアブスコパル効果、および無関係なメラノーマに対する長期免疫が誘発された。野生型メラノサイト抗原に対するこのようなエピトープスプレッディングは、ヒトメラノーマ患者において起こり、顕性白斑のない個体においてさえも免疫療法の有効性に寄与することが可能である。実際、抗PD-1に応答するメラノーマ患者のかなりの割合は白斑を発症しない。メラノーマおよび膵臓腺がんモデルにおける白斑または膵炎の欠如を伴う、これらのデータは、イミキモド＋aFP＋免疫チェックポイント遮断のような組み合わせが、腫瘍系統自己抗原に対する応答を引き起こすことができ、かつ腫瘍起源の臓器の自己免疫破壊を伴う危険な毒性なしに臨床的有益性を有するような、治療域(therapeutic window)が存在することを示している。したがって、このような治療戦略は、臨床段階でチェックポイント阻害物質に不応性である非炎症性のがんにおいて顕著な効果を安全に達成するために、使用することができる。
【０１５５】
方法
細胞株および組織培養：  KPCはStephanie Douganから寄贈されたものであり、B16-F10はATCCから購入した。D4M.3A.3（「親」）細胞株は、D4M.3Aの単一細胞クローニングに由来した。D3UV2（「UV2」）およびD3UV3（「UV3」）細胞株を作製するために、D4M.3A.3細胞にインビトロで25mJ/cm2のUVBを3回連続照射し、その後生存集団から単一細胞クローンを分離して培養した。全ての細胞株を、10％ウシ胎仔血清を補充したDMEM中で培養した。
【０１５６】
細胞生存度アッセイ：  メラノーマ細胞をトリパンブルー中で計数し、96ウェルプレート上に1ウェルあたり4,000個の生存細胞でまいた。16時間の血清飢餓の後、細胞を10％FBS含有DMEMによりレスキューした(0日目)。CellTiter-Glo(商標)Cell Viabilityアッセイキット(Promega(商標)社)の発光を0、1、2、および3日目にメーカーの説明書に従って測定した。
【０１５７】
細胞計数：  メラノーマ細胞をトリパンブルー中で計数し、24ウェルプレート上に1ウェルあたり12,500個の生存細胞で0.5％FBS含有DMEM中にまいた。16時間の血清飢餓の後、細胞を10％FBS含有DMEMによりレスキューした(0日目)。1ウェルあたりの生存細胞の総数を0、1、2、および3日目に数えた。
【０１５８】
全エクソーム解析：  メラノーマ細胞株由来のDNAを、Gentra Puregene(商標)Cell Kit (Qiagen(商標)社)を用いてメーカーの説明書に従って抽出した。Agilent(商標)全エクソームキャプチャーキット(SureSelect(商標)Mouse All Exon)を用いて、全エクソームの解析を行った。キャプチャーした材料を、Wellcome Trust Sanger Institute(商標)でIllumina(商標)プラットフォーム上にてインデックスを付けて、配列決定した。生のペアエンド(pair end)シーケンシングリードを、GRCm38マウス参照ゲノムにBWA-MEMを用いてアライメントした1。SAMTools(商標)Mpileup(商標)マルチサンプル・バリアント・コーリング・アプローチを使用して、親株と派生株のアライメントした配列データからバリアントを同時に検出した。次いで、親株と同時発生したバリアントを排除することによって、派生株におけるデノボ(de novo)バリアントを検出した。これらのデノボバリアントは、Mouse Genome variation Projectによって同定された低品質バリアントおよび生殖細胞系列バリアントを除去することによって、さらに純化した2。
【０１５９】
インビボマウス研究：  8週齢の雌C57BL/6およびNSGマウスをJackson Laboratory(商標)(Bar Harbor, ME)から入手した。これらの実験での病原体曝露のばらつきを最小限にするために、全てのマウスを同じ年齢で同じマウス施設から得て、一緒に飼育した。メラノーマ細胞(PBS中の部位1個あたり細胞1×106個)を脇腹に皮下接種した。ブロッキング抗体をマウス1匹につき200μgの用量で腹腔内投与した。UVクローン実験のために、腫瘍細胞の接種後8、10、12、14、および16日目に抗体を投与した。抗PD-1 (29F.1A12)はGordon Freemanから寄贈されたものであり、アイソタイプ適合(2A3)抗体はBioXCell(商標)社から購入した。併用療法実験のために、抗PD-1(29F.1A12)またはアイソタイプ適合(2A3)抗体および抗CTLA-4(9D9)またはアイソタイプ適合(MPC-11)抗体を6、8、および10日目(3剤併用療法)に、または8、10、および12日目(4剤併用療法)に投与した。左脇腹の腫瘍を、抗体処置と同時に5％イミキモド(Strides Pharma(商標)社)またはビヒクルローションで処置し、抗体処置の最初と最後の日にCO2レーザー(UltraPulse DeepFX(商標), Lumenis(商標)社, Yokneam, イスラエル)を用いたaFPで処置した。aFPでは、1パルスあたり100mJのエネルギー、5％のカバレッジ、120μmの公称スポットサイズを有する5mm×5mmの走査パターンを適用した。AFP線量測定：1パルスあたり100mJのエネルギーが皮膚表面から約2.5mmの深さまで侵入し、したがって50mm3の腫瘍が皮膚表面下約0.3mmから広がっていると仮定すると(Hansen et al, Anat Rec 210:569-573, 1984に基づいて推定する)、5×5mmのaFPパターンは100％の腫瘍カバレッジをもたらし、腫瘍体積の約2.4％に達する(5％×[23.5/50mm3]）。再チャレンジ実験のために、マウスの一方の脇腹に1×105個の細胞を接種した。CD8枯渇のために、ラット抗マウスCD8a(クローン2.43)またはアイソタイプ適合(LTF-2)抗体を、腫瘍接種の6日前から開始して、実験期間中3日ごとに投与した。腫瘍体積は、長さ×(幅2/2)としてキャリパー測定値から算出した。生存を評価する実験では、マウス1匹あたり1つまたは2つの腫瘍を用いる実験において腫瘍がそれぞれ4000mm3または500mm3の最大体積に達したときに、マウスを屠殺した。対象動物を含む全ての研究および手順は、マサチューセッツ総合病院の動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって承認された方針およびプロトコールに従って行った。
【０１６０】
生存率分析および腫瘍応答分析：  ログランク(Mantel-Cox)検定を用いてKaplan-Meier分析を行い、0.05未満のp値を統計的に有意とみなした。
【０１６１】
免疫組織化学的分析：  マウス腫瘍を処置開始5日後に採取し、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)した。スライドを60℃のオーブンで60分間乾燥させ、Bond III(商標)染色プラットフォームに入れた。スライドをBond(商標)Epitope Retrieval 1中100℃で30分間抗原賦活化し、次いでBond(商標)一次抗体希釈液で1：150に希釈したCD3 (abeam(商標)社, ab16669)と共に室温で30分間インキュベートした。一次抗体を、Bond(商標)Polymer Refine Detectionキットを用いて検出し、スライドをDAB中で発色させ、次に脱水して、カバースリップをのせた。1グループあたり3つのサンプルのそれぞれについて、定量化のために3つのランダムな20×倍率視野を腫瘍中心で選択した。オープンソースのCellProfiler(商標)細胞画像解析ソフトウェア3を使用して、各画像の陽性染色細胞を定量化した。解析パイプラインとしてUnmixColorsモジュールを用いて、各画像をヘマトキシリン染色の1つおよびDAB染色の1つに分離した。EnhanceOrSuppressFeaturesモジュールをDAB画像に適用して細胞の特徴を増強させた。最後に、Identify PrimaryObjectsモジュールを使用して、増強した画像に存在する細胞の数をカウントした。
【０１６２】
免疫蛍光分析：  マウス腫瘍を処置開始5日後に採取し、室温で4％PFA中に4時間固定し、続いて30％スクロース中に4℃で一晩浸漬し、OCT中に包埋し、New England Biomedical Services(商標)HM505Eクライオスタット上で10μmの切片にした。固定および透過処理のために、サンプルを以下のうちの1つに供した：(1)アセトンに室温で5分間浸漬する、(2)4％PFA中に室温で10分間浸漬した後、0.2％Triton溶液中に室温で3分間浸漬する、(3)eBioscience(商標)Foxp3固定/透過試薬中に室温で20分間浸漬する。次いで、サンプルを2％BSA 0.02％Tween溶液で洗浄し、2％BSA溶液を用いて室温で5分間ブロッキングした。サンプルを2％BSA溶液またはFoxp3 Fix Perm Kit透過緩衝液中で室温にて1時間染色し、PBS溶液で2回洗浄した。サンプルをLeica(商標)共焦点顕微鏡で画像化した。
【０１６３】
統計分析：  GraphPad(商標)Prism(商標)を用いて統計分析を行った。有意性は、2群比較のためのスチューデントの両側t検定、および多重比較のためのTukeyの方法またはDunnettの方法によるANOVAで決定した。0.05未満のp値を統計的に有意とみなした。
【０１６４】
フローサイトメトリー：  屠殺すると、腫瘍および鼠径(流入領域)リンパ節を単離し、秤量して乾燥させた。両方をコラゲナーゼI型(400U/ml; Worthington Biochemical(商標)社)中で機械的にばらばらにした後、シェーカー上に37℃で30分間置いた。70μmフィルターを通して消化物を破砕し、単細胞懸濁液を得た。腫瘍については、Percoll(商標)勾配(40/70％、GE Healthcare(商標)社)を用いて白血球(TIL)を濃縮した。TILおよびdLN細胞を緩衝液(1％FCSおよび2mM EDTAを含むPBS)中に再懸濁した。テトラマーアッセイのために、細胞を最初にAPC結合H-2Db gp100テトラマーEGSRNQDWL(MBL(商標)International社)で染色した。次いで、サンプルを以下の蛍光結合抗体(BioLegend(商標)社)の組み合わせで染色した：抗CD45.2 (104)、抗CD3ε(145-2c11)、抗CD8α(53-6.7)、抗CD4 (RM4-5)、抗CD11b (M1/70)、抗CD11c (N418)、抗I-A/I-E (M5/114.15.2)、抗PD-L1 (CD274; 10F.9G2)、抗PD-L2 (CD273; TY25)、抗B7-l (CD80; 16-10A1)、抗B7-2 (CD86;GL-1)、抗CD40 (HB14)、抗CD44 (BJ18)、および抗PD-1 (RMP1-30)。細胞内染色のために、細胞を固定し、表面染色後、FoxP3 Transcription Factor Staining Kit (eBioscience(商標)社)を用いて透過処理し、以下の蛍光結合抗体で染色した：抗FoxP3 (FJK-16s; ebioscience社)、抗Ki67 (B56; BD Biosciences(商標)社)、および抗Granzyme B (GB11; BioLegend(商標)社)。フローサイトメトリーデータをBD(商標)LSRIIフローサイトメーターで取得し、FlowJo(商標)ソフトウェア(Tree Star(商標)社)を用いて解析した。
【０１６５】
TCRディープシーケンシングおよびクロノタイプ多様性分析：  C57BL/6マウスに腫瘍細胞を接種した11日後に皮下マウスメラノーマ移植片を採取した。抗PD-1またはアイソタイプ対照による処置をサンプル採取の5日前に開始した。DNAを抽出し、「サーベイ」シーケンシング深度("survey" sequencing depth)を用いてAdaptive Biotechnologies(商標)社で配列決定した。エントロピーは、各クローンの頻度に、サンプル中の全ての再配列にわたって同じ頻度の対数(底2)を掛け合わせることによって算出した。クローン性は、ユニークな再配列の総数を用いてエントロピーを正規化し、その結果を1から減算することによって算出した。
【０１６６】
TCGAメラノーマの分析：  UZH(商標)Cancer Browser4を使用して、発現ベースの患者層別化に基づく生存率分析を実施した。
【０１６７】
バルクマウス腫瘍のRNAシーケンシング：  TissueLyser(商標)IIおよびRneasy(商標)抽出キット(Qiagen(商標)社)を用いて、全RNAをマウスメラノーマから腫瘍細胞接種の11日後に分離して精製した。Illumina(商標)HiSeq2500機器でTruSeq(商標)RNA Sample Preparation Kit v2を使用して76bpのペアエンドシーケンシングを行った。ライブラリーを、長さ76bpの1,550万ペアエンドリード(paired-end read)の平均深度まで配列決定した。該リードを、Bowtie(商標)25を用いてUCSC(商標)マウストランスクリプトーム(ゲノム構築mm10)にマッピングし、全ての遺伝子の発現レベルをRSEMにより定量化した6。平均79.8％のリードが各サンプルにおいて該トランスクリプトームにマッピングされた(範囲78.4〜81.6％)。RSEMは、推測された遺伝子カウント数の発現マトリクス(遺伝子×サンプル)をもたらし、これをTPM (transcripts per million)に変換した。
【０１６８】
発現量の異なる遺伝子および濃縮された遺伝子セットの決定：  正規化されたRNAシーケンシングデータをフィルターにかけて、平均TPMが1未満の遺伝子を除去した。遺伝子セット濃縮分析は、GSEAソフトウェア(Broad Institute of Harvard and MIT(商標))を用いてデフォルト設定で行った。KEGG、GOターム(term)(生物学的プロセスおよび分子機能)、およびHallmark遺伝子セットのデータベースを評価した。GSEA統計学は、遺伝子セット順列の1000回反復によって評価した。遺伝子発現の変動は、DESeq2 Rパッケージを用いて推定した。
【０１６９】
ヒトメラノーマ遺伝子発現の分析：  イピリムマブで治療したメラノーマ患者の以前に発表されたデータセットには、全エクソームシーケンシングとRNAシーケンシングの両方を有する40人のメラノーマ患者が含まれていた7。本研究では、低ネオ抗原の患者サブセットを、HLAクラスI分子に対して≦50nMの結合親和性を有する予測ネオ抗原が100個より少ないものを含むと定義した。これらのうち、8人の患者をイピリムマブレスポンダー(全生存＞987日)、10人の患者を非レスポンダー(全生存＜211日)として分類した(図8B)。低ネオ抗原レスポンダーを、上記のようなGSEAで非レスポンダーと比較した。
【０１７０】
参照文献
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【０１７１】
方法に関する参照文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｃ−３】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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