(57)【要約】本発明は、Ａ、Ｂおよび／もしくはＯ血液型抗原に結合することができる、または酸および／もしくは胆汁耐性である細菌およびそれらの代謝産物、プロバイオティック組成物および食品でのそれらの使用、ならびにそれらの選択方法に関する。本発明はまた、胃腸疾患の予防および／または治療のための前記細菌および代謝産物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
ａ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較して１００％超の平均Ａ抗原接着；および／または
ｂ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較して１００％超の平均Ｂ抗原接着；および／または
ｃ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較して１００％超の平均Ｏ抗原接着；および／または
ｄ）耐酸性評価分析に規定されているように１．５時間ｐＨ２．５で測定してｌｏｇ変化として表される−２．６超の平均酸耐性；および／または
ｅ）耐胆汁性評価分析に規定されているように胆汁なしのＭＲＳでの増殖の百分率として０．９％脱水新鮮胆汁での増殖として表される４０％超の平均胆汁耐性
で特徴付けられる細菌またはその代謝産物。
【請求項２】
前記細菌が、ＤＳＭ  ３２１１１、ＤＳＭ  ３２１０８、ＤＳＭ  ３２１０７、ＤＳＭ  ３２０９８、ＤＳＭ  ３２１０４、ＤＳＭ  ３２１１２、ＤＳＭ  ３２１０９、ＤＳＭ  ３２１０５、ＤＳＭ  ３２１１０、ＤＳＭ  ３２１０３、ＤＳＭ  ３２０９９、ＤＳＭ  ３２１０６、ＤＳＭ  ３２０９７、ＤＳＭ  ３２１１４、ＤＳＭ  ３２１１５またはそれらの突然変異株、変異株および／もしくは後代として寄託されている請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細菌またはその代謝産物と、好適なキャリアとを含むプロバイオティック組成物。
【請求項４】
任意選択で１つ以上のさらなる細菌株と組み合わせて、請求項１または２に記載されるような２、３、４、５または６つの細菌株またはそれらの代謝産物の組み合わせを含む、請求項３に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項５】
前記１つ以上のさらなる細菌株が、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭ；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＢＬ−０４；ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＬＰＣ３７；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＨＮ０１９、および／またはビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）Ｂｉ−０７から選択される、請求項４に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項６】
ＤＳＭ  ３２１０９、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭ；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＢＬ−０４；ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＬＰＣ３７；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＨＮ０１９およびビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）Ｂｉ−０７を含む請求項５に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物の製造方法であって、前記方法が、前記選択された細菌またはその代謝産物を好適なキャリアと組み合わせる工程を含む方法。
【請求項８】
請求項３〜６のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物を含む食品、栄養補助食品、医療食品、栄養補給または医薬組成物。
【請求項９】
ｆ）１つ以上の試験細菌またはそれらの代謝産物を、Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と；
ｇ）１つ以上のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４対照細菌を、Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と；
ｈ）工程ａ．およびｂ．の前記混合物を培養する工程と；
ｉ）前記試験細菌またはそれらの代謝産物およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４の前記Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせへの接着の親和性を比較する工程と；
ｊ）ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４よりも前記Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせへの高い接着の親和性を有する細菌またはその代謝産物を選択する工程と
を含む細菌またはその代謝産物の選択方法。
【請求項１０】
ａ）細菌またはその代謝産物の平均酸耐性を１．５時間ｐＨ２．５で評価分析する工程；および／または
ｂ）前記細菌またはその代謝産物の平均胆汁耐性を０．９％胆汁で評価分析する工程；および
ｃ）１．５時間ｐＨ２．５で測定されるときにｌｏｇ変化として表される−２．６超の平均酸耐性および／または胆汁なしのＭＲＳでの増殖の百分率として０．９％胆汁での増殖として表される４０％超の平均胆汁耐性を有する１つ以上の細菌またはその代謝産物を選択する工程
を含む細菌またはその代謝産物の選択方法。
【請求項１１】
請求項９または１０の方法によって選択される細菌またはその代謝産物。
【請求項１２】
胃腸疾患を予防するおよび／または治療するための調合物の製造のための、請求項１、２もしくは１１のいずれか一項に記載のまたは請求項９もしくは１０のいずれか一項に記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または請求項３〜６のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物の使用。
【請求項１３】
胃腸疾患の予防および／または治療での使用のための、請求項１、２もしくは１１のいずれか一項に記載のまたは請求項９もしくは１０のいずれか一項に記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または請求項３〜６のいずれか一項に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１４】
請求項１、２もしくは１１のいずれか一項に記載のまたは請求項９もしくは１０のいずれか一項に記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または請求項３〜６のいずれか一項に記載の細菌組成物を、薬学的に有効な量で対象者に投与する工程を含む胃腸疾患の予防および／または治療方法。
【請求項１５】
実質的に図面に関連して本明細書に記載されるような細菌、代謝産物、プロバイオティック組成物、食品、方法、使用のための細菌もしくは代謝産物、使用またはそれらの組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規細菌およびそれらの代謝産物、プロバイオティック組成物および食品でのそれらの使用、プロバイオティック細菌の選択方法ならびにプロバイオティック組成物または食品の個人向け方法に関する。本発明はまた、胃腸疾患の予防および／または治療のための前記細菌、代謝産物および組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体は、１０００超の細菌種を表す無数の微生物でコロニー形成される。微生物叢の構成および密度は、各身体場所に特異的である。細菌バイオマスの大半は、２つの個体群（互いに異なる内腔および粘膜関連個体群）が存在する、胃腸管（ＧＩＴ）に、とりわけ大腸の内腔に存在する。微生物叢は、ヒトの健康において重要な役割を持っている。それは、腸管組織の成熟に、宿主栄養摂取、病原菌抵抗性、上皮細胞増殖、宿主エネルギー代謝および免疫反応に寄与する。ＧＩＴ微生物叢の構成および多様性の変更は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、リウマチ性関節炎、アトピー性湿疹、ぜんそくおよび１型糖尿病などの、幾つかの病気と関連している。
【０００３】
成人の微生物叢は、経時的にかなり安定しており、個人内で独特である。支配的な微生物個体群の類似性は、血縁関係がない対象者と比べて一卵性双生児においてより高く、微生物叢構成に関する宿主遺伝因子の役割を示唆する。いくつかの動物研究は、主な組織適合性錯体が腸管微生物叢の遺伝子調節に関与していることを示唆している。しかしながら、どの遺伝子または他の因子が微生物構成のスペクトルを決定するかまたは制御するかに関してほとんど知られていない。
【０００４】
腸管上皮組織を覆う粘膜層は、宿主防衛の第１層としての重要な役割を持っているが、それはまた、腸微生物叢と宿主との間の接触を可能にする。粘液は主に、ムチン（タンパク質コアと結合オリゴ糖とを含有する大きい糖タンパク質）からなる。粘液層は、結腸中の細菌と上皮細胞との直接接触を防ぐけれども、それは、ＧＩＴ細菌向けの接着部位を提供し、したがって細菌コロニー形成において重要な役割を持っている。接着部位に加えて、分泌された粘液は、細菌に内因性基質を提供する。粘液は、他の場所に由来する炭水化物が制限される、状況では主要な栄養源であり得る。
【０００５】
血液型抗原は、赤血球膜における様々な構成成分に結合しており、赤血球上に発現される抗原が個人の血液型を決定する。主な２つの血液型は、ＡＢＯ（血液型Ａ、Ｂ、ＡＢ、およびＯの）ならびにＲｈ（ＲｈＤプラスまたはＲｈＤマイナスの血液型の）と呼ばれる。ＡＢＯ血液型抗原は、分泌性個人（西洋人のほぼ８０％）の粘液に発現される。ＡＢＯ抗原の発現は部位特異的である。例えば、ＧＩＴにおいて、ＡＢＯ血液型抗原を含むフコシル化グリカンの発現は、腸の遠位部分に向かって減少する。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）などの、いくつかの微生物ならびにいくつかの他の病原性細菌およびウイルスは、ＡＢＯ血液型抗原を接着受容体として使用することが示されている（非特許文献１）。ＡＢＯ抗原結合能力は、菌株特異的に接着する傾向がある、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）についてもまた報告されている（Ｕｃｈｉｄａら  ２００６）。ビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）はまた、例えば、血液型抗原、例えばＡＢＯ抗原のグリカン構造を特異的に利用することができる（Ｍａｒｔｅｎｓら  ２００８、Ｘｉａｏら  ２０１０）。個人のＡＢＯ血液型ステイタスもまた、宿主微生物叢の相対的比率に影響を及ぼす（Ｍａｅｋｉｖｕｏｋｋｏら  ２０１２）。
【０００６】
現在市場で入手可能な多くのプロバイオティック栄養補助食品および微生物叢調節製品は、あらゆる個人にとって所望の健康効果を増進するのに効果がなく、効果は一般に、人によって変わる。したがって、より効率的に健康効果をもたらすことができるより特有のまたは個人に合わせた製品が継続的に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｏｒｅｎら  １９９３，Ｉｍｂｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｖａｒｒｏｔ  ２００８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ある種の細菌株がＡＢＯ血液型抗原の１つ以上への高められたインビトロ接着性を示したという本発明者らの意外な発見に基づくものである。この発見は、プロバイオティック組成物での使用のためのおよび胃腸疾患の治療または予防のためのＡＢＯ血液型特異的細菌の選択を可能にする。
【０００９】
理論に制約されることなく、ＡＢＯ血液型のグリカン構造は粘膜に豊富であり、細菌接着部位および栄養源として機能するので、プロバイオティック細菌による１つ以上のＡＢＯ抗原へのより強い結合は、粘膜とのその相互作用を高めることによって胃腸管における細菌のそのコロニー形成を向上させるであろうと考えられる。プロバイオティック細菌はまた、ＡＢＯ抗原にまた結合するある種の病原微生物の接着および浸潤をブロックすることによって、改善された健康効果を実証し得る。ＡＢＯ抗原に接着するプロバイオティック細菌はまた、宿主細胞とプロバイオティクスとの間のよりしっかりした、かつ、より長続きのする接触を提供することによってプロバイオティック反応を高めることができよう。それはさらに、プロバイオティクスがよりしっかりと、かつ、より長続きしてコロニー形成される場合に、プロバイオティクスによって産生される任意の有益な代謝産物へのより容易なアクセスを宿主に提供することができよう。
【００１０】
本発明者らはさらに、ある種のプロバイオティック細菌が酸および／または胆汁により耐性であることを示してきた。これらの特性は、細菌またはその代謝産物が胃および胃腸管の条件に生き残ることを可能にするのに役立ち得るし、それ故プロバイオティック細菌にとって有利な特性である。酸耐性はまた、菌株がヨーグルトなどの製品において発酵させられる場合にも有益であり得る。
【００１１】
したがって、本発明は、
ａ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の平均Ａ抗原接着；および／または
ｂ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の平均Ｂ抗原接着；および／または
ｃ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の平均Ｏ抗原接着；および／または
ｄ）耐酸性評価分析に規定されているように１．５時間ｐＨ２．５で測定されるときにｌｏｇ変化として表される−２．６超の平均酸耐性；および／または
ｅ）耐胆汁性評価分析に規定されているように胆汁なしのＭＲＳでの増殖の百分率として０．９％脱水新鮮胆汁での増殖として表される４０％超の平均胆汁耐性
で特徴付けられる細菌またはその代謝産物を提供する。
【００１２】
本発明の細菌は、ＤＳＭ  ３２１１１、ＤＳＭ  ３２１０８、ＤＳＭ  ３２１０７、ＤＳＭ  ３２０９８、ＤＳＭ  ３２１０４、ＤＳＭ  ３２１１２、ＤＳＭ  ３２１０９、ＤＳＭ  ３２１０５、ＤＳＭ  ３２１１０、ＤＳＭ  ３２１０３、ＤＳＭ  ３２０９９、ＤＳＭ  ３２１０６、ＤＳＭ  ３２０９７、ＤＳＭ  ３２１１４、ＤＳＭ  ３２１１５またはそれらの突然変異株、変異株および／もしくは後代として寄託された細菌株であり得る。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、本発明による細菌またはその代謝産物と、好適なキャリアとを含むプロバイオティック組成物が提供される。
【００１４】
本発明のプロバイオティック組成物は、任意選択で１つ以上のさらなる細菌株と組み合わせて、２、３、４、５または６つの細菌株またはそれらの代謝産物の組み合わせを含んでもよい。
【００１５】
本プロバイオティック組成物は、プレバイオティック構成成分をさらに含んでもよい。
【００１６】
本発明はまた、本発明のプロバイオティック組成物の製造方法であって、本方法が、選択された細菌またはその代謝産物を好適なキャリアと組み合わせる工程を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明によるプロバイオティック組成物を含む食品をさらに提供する。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、
ａ）１つ以上の試験細菌を、Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と；
ｂ）１つ以上のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４対照細菌を、Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と；
ｃ）工程ａ）およびｂ）の前記混合物を培養する工程と；
ｄ）試験細菌およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４の前記Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせへの接着の親和性を比較する工程と；
ｅ）ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４よりも前記Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせへの高い接着の親和性を有する細菌を選択する工程と
を含む細菌またはその代謝産物の選択方法が提供される。
【００１９】
一実施形態では、混合物は、工程（ｂ）において別個のバイアル中で培養される。
【００２０】
別の実施形態では、本方法は、蛍光ベースの方法である。
【００２１】
さらなる実施形態では、
ａ）５４９超の蛍光の平均Ａ抗原接着強度；
ｂ）５１９超の蛍光の平均Ｂ抗原接着強度；および／または
ｃ）７４６超の蛍光の平均Ｏ抗原接着強度
を有する細菌が選択される。
【００２２】
本発明は、本発明の方法によって選択された細菌またはその代謝産物をさらに提供する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、胃腸疾患を予防するおよび／または治療するための調合物の製造のための、本発明のもしくは本発明の方法によって選択された細菌もしくはその代謝産物、または本発明のプロバイオティック組成物の使用を提供する。
【００２４】
本発明はまた、胃腸疾患の予防および／または治療での使用のための、本発明のもしくは本発明の方法によって選択された細菌もしくはその代謝産物、または本発明のプロバイオティック組成物を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、本発明によるもしくは本発明の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または本発明のプロバイオティック組成物を、薬学的に有効な量で対象者に投与する工程を含む、胃腸疾患の予防および／または治療方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特に定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２０  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示において用いられる用語の多くの一般辞書を当業者に提供する。
【００２７】
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法および原材料によって制限されず、本明細書に記載のものと類似のまたは同等の任意の方法および原材料を、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。
【００２８】
本明細書において提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって持つことができる本開示の種々の態様または実施形態を制限するものではない。したがって、直下に定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってより十分に定義される。
【００２９】
用語の他の定義は、本明細書全体にわたって出現する可能性がある。例示的な実施形態がより詳細に記載される前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、それ自体、当然ながら、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろうから、特定の実施形態を記載する目的のためにすぎず、限定的であることを意図しないことがまた理解されるべきである。
【００３０】
値の範囲が提供される場合、前後関係が明らかに特に指示しない限り、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値は、下限の単位の少数第一位まで、具体的にまた開示されていると理解される。表示範囲内の任意の表示値または介在値間のそれぞれのより狭い範囲、およびその表示範囲内の任意の他の表示値または介在値は、本開示内に包含される。これらのより狭い範囲の上限および下限は独立して、その範囲内に包含されるかまたは除外される可能性があり、そのより狭い範囲内にいずれかもしくは両方の限度が含まれるか、または両方の限度が含まれない各範囲はまた、表示範囲内で任意の限度が具体的に除外されることを前提として本開示に包含される。表示範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限度のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本開示に含まれる。
【００３１】
本明細書でおよび添付の特許請求の範囲で用いられるところでは、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、前後関係が明らかに特に指示しない限り、複数形指示対象を含むことが留意されなければならない。
【００３２】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示について専ら提供される。本明細書では何も、そのような刊行物が本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの容認と解釈されるべきでない。
【００３３】
下記において、本発明の１つの幅広い態様との関連で言及される好ましい実施形態は、本明細書に記載される本発明の他の幅広い態様のそれぞれに等しく適用できることが理解されるであろう。前後関係が特に指示しない限り、本明細書に記載される好ましい実施形態は組み合わせられてもよいことがさらに理解されるであろう。
【００３４】
用語「細菌」または「細菌の」は、任意の細菌種、菌株またはそれらの組み合わせを意味するために本明細書で用いられ、プロバイオティクスとして現在認められている菌株に限定されない。しかしながら、本発明に使用される細菌株は、ヒトおよび／または動物の摂取に好適なものである。当業者は、食品産業および／または農産業において使用され、かつ、ヒトおよび／または動物の摂取に好適と一般に考えられている、本明細書に記載される属内からの特定の種およびまたは菌株を容易に知るであろう。そのような細菌株は、典型的には非病原性であり、ヒトの使用に安全であると一般に見なされ得る（例えばＧＲＡＳ）。
【００３５】
用語「細菌」は一般に、全細菌、例えば全生菌を意味するために用いられる。
本発明に使用するのに好適な細菌には、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ステレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペジオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属および／またはオエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属が含まれるが。それらに限定されない。
【００３６】
一実施形態では、細菌は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する。
【００３７】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の好適な菌株には、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．フェルメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．バギナリス（Ｌ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、Ｌ．クルバチス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｉｓ）、Ｌ．デルブルエキイ・ブルガリクス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．ムコサエ（Ｌ．ｍｕｃｏｓａｅ）、Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ））、Ｌ．シルバリウス（Ｌ．ｓｉｌｖａｒｉｕｓ）およびＬ．ルミニス（Ｌ．ｒｕｍｉｎｉｓ）が含まれる。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は、新規細菌株ＤＧＣＣ１１８８４、ＤＧＣＣ１１８６４、ＤＧＣＣ１１８６０、ＤＧＣＣ１１８７３、ＤＧＣＣ１１８５２、ＤＧＣＣ１１８５３、ＤＧＣＣ１１８６５、ＤＧＣＣ１９２５、ＤＧＣＣ１１８６６、ＤＧＣＣ５１１１、ＤＧＣＣ１１８５４、ＤＧＣＣ１１８５８、ＤＧＣＣ１１８８７、ＤＧＣＣ１１８６２およびＤＧＣＣ１１８８１を提供する。これらの菌株は、ＤｕＰｏｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡｐＳ，Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ  １，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １７，ＤＫ−１００１  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ｋによって、Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（特許手続きのための微生物の寄託の国際認識に関するブタペスト条約）の下で、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７  Ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇにおいて２０１５年７月２９日に受入番号ＤＳＭ  ３２１１１、ＤＳＭ  ３２１０８、ＤＳＭ  ３２１０７、ＤＳＭ  ３２０９８、ＤＳＭ  ３２１０４、ＤＳＭ  ３２１１２、ＤＳＭ  ３２１０９、ＤＳＭ  ３２１０５、ＤＳＭ  ３２１１０、ＤＳＭ  ３２１０３、ＤＳＭ  ３２０９９、ＤＳＭ  ３２１０６、ＤＳＭ  ３２０９７、ＤＳＭ  ３２１１４、ＤＳＭ  ３２１１５の下で寄託されている。
【００３９】
我々は本明細書によって、寄託者が本出願の寄託生物学的物質について言及する権限を本出願人に与えており、そして寄託物質が公衆に利用可能にされることに寄託者の無条件のおよび取消不能の同意を与えていることを確認する。
【００４０】
本発明は、寄託細菌株の突然変異株、変異株および／または後代をさらに提供する。
【００４１】
本明細書で用いるところでは、用語「突然変異株」は、親（すなわち、寄託）株の変性によって生じる任意の微生物を意味する。例えば、突然変異株は、寄託菌株の遺伝子組み換えから生じる微生物であってもよい。
【００４２】
本明細書で用いるところでは、用語「変異株」は、親株（すなわち、寄託株）に由来する天然由来の微生物を意味する。例えば、変異株は、特定の細胞培養条件への順応から生じる微生物であってもよい。
【００４３】
本明細書で用いるところでは、用語「後代」は、寄託株のいずれか１つの再生産または増殖から生じる任意の微生物を意味する。それ故、「後代」は、寄託株のいずれか１つの任意の直系の子孫を意味する。したがって、後代株はそれ自体、親（すなわち、寄託）株と同じ菌株と特定され得る。無性再生産のプロセスのために、後代株が親株と遺伝子学的に実質的に同一であることは当業者に明らかであろう。したがって、一実施形態では、後代は、親株と遺伝子学的に同一であり得るし、親株の「クローン」であると考えられ得る。代替として、後代は、親株と実質的に遺伝子学的に同一であり得る。
【００４４】
突然変異株、変異株または後代は、それらの親株と、細菌ゲノムの全体長さにわたって少なくとも９０、９５、９８、９９、９９．５または９９．９％の配列同一性を有し得る。さらに、突然変異株、変異株または後代は、寄託親株と同じ表現型を保持しているであろうし、例えば突然変異株または変異株は、Ａ、Ｂおよび／またはＯ血液型抗原への親株と同じまたは同等レベルのインビトロ接着を実証し得る。
【００４５】
本明細書で用いるところでは、用語「代謝産物」は、プロバイオティック製品製造および貯蔵中のならびに哺乳類での胃腸通過中の細菌の増殖、生存、存続、通過または存在の間に細菌の代謝の結果として細菌によって産生されたまたは変性された全ての分子を意味する。例としては、全ての有機酸、無機酸、塩基、タンパク質およびペプチド、酵素および補酵素、アミノ酸および核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、ビタミン、全ての生物活性化合物、無機成分を含有する代謝産物、ならびに全ての小分子、例えば亜硝酸分子または亜硫酸を含有する分子が挙げられる。
【００４６】
１つまたは複数の代謝産物は典型的には、それから細菌細胞が除去された細胞培養物の上清から得られる。一実施形態では、細胞は、３７℃で６〜２４時間嫌気条件下にＭＲＳ培地で増殖させられてもよい。さらなる実施形態によれば、細菌細胞培養物は、少なくとも約ＯＤ６００  ０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、または３．０、例えば１．５〜２．５ＯＤ６００の細胞密度まで増殖させられてもよい。細胞は、遠心分離によってまたは濾過によって好適にも除去され得る。上清が本発明の調合物に直接使用されてもよいこと、または代謝産物の１つ以上が、使用前に任意の好適な手段によって上清から単離されてもよいことは明らかであろう。
【００４７】
本発明での使用に好適な代謝産物には、上述の細菌のいずれかからの代謝産物が含まれるが、それらに限定されない。
【００４８】
本発明によれば、細菌またはその代謝産物は、対照菌株に関して、特定のＡＢＯ血液型抗原へのその接着で特徴付けられる。抗原への接着は、細菌またはその代謝産物を抗原と混合し、そして任意の好適な試験または評価分析に従って接着を測定することによって測定され得る。一実施形態では、本方法は蛍光ベースの方法である。例えば、血液型抗原は、ビオチン化され、試験されるべき細菌の試料と組み合わせられ、次にストレプトアビジン被覆プレートに移され、結合細菌が、蛍光染料などの、好適な染料で検出されてもよい。抗原は、親和性結合評価分析のための任意の固定化マトリックスに結合していてもよく、それへの細胞の結合は、好適な抗体、蛍光分析もしくは比色分析染色剤を使用して、または放射性標識化などの任意の標識化技法で細菌を標識化することによって検出することができよう。それは、細菌構成成分を固定化マトリックスに結合させることによって、および血液型抗原が結合できるかどうかを研究することによって、逆にして行うことができよう。
【００４９】
本発明の一態様によれば、抗原接着は、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９（ＢＣＣＭ／ＬＭＧコレクションから入手可能な）と比較される。本発明の別の態様によれば、抗原接着は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｈａｎｓｅｎ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能な）と比較される。
【００５０】
本発明の別の態様によれば、細菌またはその代謝産物は、胆汁および／または酸への耐性に基づいて選択される。これらの特性は、細菌またはその代謝産物が胃および胃腸管の条件に生き残ることを可能にするのに役立つ場合があり、それ故プロバイオティック細菌にとって有利な特性である。
【００５１】
任意の好適な耐胆汁性評価分析が、平均胆汁耐性を測定するために用いられ得る。一実施形態では、耐胆汁性評価分析は、嫌気性条件下に２４時間３７℃で０．９％または０．３％などの、規定量の脱水新鮮胆汁（例えば雄牛の胆汁（ｏｘｇａｌｌ）、ＢＤから銘柄名ＤｉｆｃｏＴＭで入手可能な）を含有する培地（例えばＭＲＳ）で菌株培養物を培養することを含む。増殖は、培養の前後で測定され、胆汁耐性結果は、胆汁なしの増殖と比較して胆汁ありの％増殖（ＯＤ）として表される。
【００５２】
任意の好適な耐酸性評価分析が平均耐酸性を測定するために用いられ得る。一実施形態では、酸耐性評価分析は、３７℃で少なくとも９０分間中性ｐＨ（すなわち、ｐＨ７．２）レベルでおよび比較酸性ｐＨ（ｐＨ２．５またはｐＨ３．５などの）で好適な培地（例えばＰＢＳ）で細菌細胞を培養することを含む。１０倍希釈シリーズがＭＲＳ寒天上で増殖させられ、コロニーが、３７℃で嫌気性条件下に４８時間培養後にカウントされる。耐酸性についての結果は、中性ｐＨと比較して酸性条件への暴露後のＣＦＵの増殖ｌｏｇ減少として表される。
【００５３】
好ましい実施形態では、細菌またはその代謝産物は、対照菌株に関して、特定のＡＢＯ血液型抗原へのその接着で、ならびにその酸および／または胆汁耐性での両方で特徴付けられる。したがって、本発明は、
ａ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の平均Ａ、Ｂおよび／またはＯ抗原接着；ならびに
ｂ）耐酸性評価分析に規定されているように１．５時間ｐＨ２．５で測定されるときにｌｏｇ変化として表される−２．６超の平均酸耐性、および／または耐胆汁性評価分析に規定されているように胆汁なしのＭＲＳでの増殖の百分率として０．９％脱水新鮮胆汁での増殖として表される４０％超の平均胆汁耐性で特徴付けられる細菌またはその代謝産物を提供する。
【００５４】
本発明は、本発明の方法に従って選択された１つ以上の細菌株を含むプロバイオティック組成物をさらに提供する。組成物は、本発明の単一菌株、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０つの菌株の組み合わせを含んでもよい。プロバイオティック組成物は、追加の菌株、例えば商業的に入手可能なプロバイオティック細菌株をさらに含んでもよい。
【００５５】
一実施形態によれば、本発明のプロバイオティック組成物は、１つ以上のさらなる細菌株をさらに含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、さらなる微生物は、以下の属：ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ステレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペジオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、およびバゴコッカス（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）属の１つ以上からの細菌であり得る。１つの好ましい実施形態では、少なくとも１つのさらなるプロバイオティクス微生物は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属から選択される。
【００５７】
好ましい実施形態では、さらなるプロバイオティック微生物は、細菌、好ましくはプロバイオティック乳酸菌および／またはプロバイオティックビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。一実施形態では、好ましくは、さらなる微生物は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属もしくはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からのものであるか、またはそれらの混合物である。好適にも、微生物は、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）種、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）種、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）種、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）種、Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）種、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｂ．ラクチス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）種、Ｂ．アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）種、Ｂ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）種および／またはＢ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）種からの菌株であり得る。一実施形態では、好ましくは、微生物は、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）種、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）種、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）種、および／またはＢ．ラクチス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）種からの菌株であり得る。
【００５８】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属は、プロバイオティック効果を有する任意のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり得るし、典型的にはビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）種、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）種、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）種、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）種、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）種、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）種およびビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）種に属する菌株が使用される。
【００５９】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌は、次のもの：ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・デルブルエキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ペントサセウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、およびラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のいずれかであり得る。
【００６０】
一実施形態によれば、本発明のプロバイオティック組成物は、次の商業的に入手可能な菌株：ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭ；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＢＬ−０４；ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＬＰＣ３７；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＨＮ０１９、および／またはビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）Ｂｉ−０７の２、３、４または５つの組み合わせなどの、１つ以上をさらに含む。
【００６１】
本明細書で用いるところでは、用語「プロバイオティック」は、十分な量で投与された場合に、受容体に健康利益を与える生きた微生物を意味する。それらは、ヒトの摂取に好適であり、それ故非病原性および非毒性である。これらのプロバイオティク株は一般に、消化管の上部を通り抜けて生き残る能力を有する。プロバイオティック細菌は典型的には、一方で消化管において常在微生物叢との生態学的相互作用によって、かつ、他方で「ＧＡＬＴ」（腸管関連リンパ系組織）を介して積極的に免疫系に影響を与えるそれらの能力によって、それらの有益な影響を健康に及ぼす。プロバイオティック細菌は、十分な数で与えられる場合、生きて腸を通過する能力を有する。しかしながら、それらは腸バリアを越えないし、それらの主な効果はそれ故、胃腸管の内腔および／または壁に誘導される。それらは次いで、投与期間中に常在微生物叢の一部を形成する。このコロニー形成（または一時的コロニー形成）は、プロバイオティック細菌が、微生物叢中に存在する潜在的病原性微生物の抑制および腸の免疫系との相互作用などの、有益な影響を及ぼすことを可能にする。
【００６２】
プロバイオティック使用について下限または上限は全くないが、１日用量として少なくとも１０６〜１０１０などの、少なくとも１０６〜１０１２、例えば１０８〜１０９）ｃｆｕが対象者において所望の健康効果を達成するのに有効である得ることが示唆されている。したがって、本発明に従って使用されるプロバイオティック細菌は、支持体の１ｇ当たり１０６〜１０１２ＣＦＵの細菌、より特に支持体の１ｇ当たり１０８〜１０１２ＣＦＵの細菌、典型的には凍結乾燥形態について１ｇ当たり１０９〜１０１２ＣＦＵを含んでもよい。
【００６３】
好適にも、細菌は、１回分当たり約１０６〜約１０１２ＣＦＵの微生物、典型的には１回分当たり約１０８〜約１０１２ＣＦＵの微生物の投与量で投与されてもよい。用語「１回分当たり」とは、この量の微生物が、１日当たりかまたは１回の摂取量当たりかのどちらかで、典型的には１日当たり対象者に与えられることを意味する。例えば、微生物が食品中（例えば、ヨーグルト中）で投与される場合、そのヨーグルトは典型的には、約１０８〜約１０１２ＣＦＵの微生物を含有するであろう。しかしながら、代替として、この量の微生物は、任意の特定の時間（例えば２４時間の期間ごとに）で対象者が受ける微生物の全体量が、約１０８〜約１０１２ＣＦＵの微生物などの、約１０６〜約１０１２ＣＦＵの微生物である限り、それぞれがより少量の微生物使用量からなる複数回投与に分けられてもよい。
【００６４】
本発明に従って、微生物の少なくとも１菌株の有効量は、１回分当たり少なくとも１０６ＣＦＵの微生物、例えば、１回分当たり約１０８〜約１０１２ＣＦＵの微生物などの、１回分当たり約１０６〜約１０１２ＣＦＵの微生物であり得る。
【００６５】
ＣＦＵは、「コロニー形成単位」を表す。「支持体」とは、食品、栄養補助食品または薬学的に許容される支持体またはキャリアを意味する。
【００６６】
本発明による細菌または代謝産物を単独で（すなわち、いかなる支持体、希釈剤または賦形剤もなしで）投与することが可能であるが、それらは典型的には、製品の一部として、特に食品、栄養補助食品または医薬製剤の一構成成分としてキャリアもしくは支持体上でまたはキャリアもしくは支持体中で投与される。これらの製品は典型的には、当業者によく知られた追加の構成成分を含有する。
【００６７】
組成物から恩恵を受けることができる任意の製品が、本発明に使用され得る。これらには、食品、特に果物砂糖漬ならびに乳製品および乳製品派生製品、ならびに医薬製品が含まれるが、それらに限定されない。
【００６８】
本発明の細菌組成物は、栄養補助食品として調合され得る。細菌組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、粉末剤またはエマルションの形態にあってもよい。
【００６９】
典型的なプロバイオティック成分は、１グラム当たり、例えば、１０１０〜１０１２の生プロバイオティック細菌細胞を含有する凍結乾燥粉末である。粉末は、スキムミルクまたは糖などの、好適なキャリア、典型的には、スクロースまたはトレハロースなどのオリゴ糖をさらに含んでもよい。
【００７０】
代替として、細菌組成物は、アルギン酸塩、デンプンまたはキサンタンなどのキャリアを使用してカプセル化されてもよい。典型的なカプセル製剤は、１カプセル当たりおよそ１０９〜１０１１の生プロバイオティック細菌細胞を含有してもよい。
【００７１】
本発明のプロバイオティック組成物は、１つ以上のプレバイオティクスをさらに含有してもよい。用語「プレバイオティック構成成分」は、本明細書で用いるところでは、所望のプロバイオティック健康効果を支えるもしくは高めるために、またはプロバイオティック細菌の増殖および／もしくは活性を支援するために使用される任意の化合物、栄養物または追加微生物を意味する。典型的には、プレバイオティクスは、炭水化物（オリゴ糖などの）であるが、その定義は、非炭水化物を排除するものではない。プレバイオティクスの最も広く行き渡っている形態は、可溶性繊維として栄養学的に分類される。ある程度、食物繊維の多くの形態は、あるレベルのプレバイオティック効果を示す。
【００７２】
一実施形態では、プレバイオティクスは、宿主の幸せおよび健康に利益を与える胃腸微生物叢の構成および／または活性の両方で、特定の変化を可能にする選択的発酵成分である。
【００７３】
好適には、プレバイオティクスは、０．１〜５０ｇ／日、または０．５〜２０ｇ／日などの、０．０１〜１００ｇ／日の量で本発明に従って使用され得る。一実施形態では、プレバイオティクスは、２〜９ｇ／日、または３〜８ｇ／日などの、１〜１０ｇ／日の量で本発明に従って使用され得る。別の実施形態では、プレバイオティクスは、１０〜２５ｇ／日などの、５〜５０ｇ／日の量で本発明に従って使用され得る。
【００７４】
プレバイオティクスの食事供給源の例としては、ダイズ、イヌリン源（エルサレム・アーティチョーク、ジカマ、およびチコリー根などの）、生オート麦、未精製小麦、未精製大麦ならびにヤーコンが挙げられる。
【００７５】
好適なプレバイオティクスの例としては、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グァーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ポリデキストロース（すなわち、Ｌｉｔｅｓｓｅ（登録商標））、ラクチトール、ラクトスクロース、ダイズオリゴ糖、イソマルツロース（ＰａｌａｔｉｎｏｓｅＴＭ）、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖、キシロオリゴ糖、マンノオリゴ糖、ベータ−グルカン、セロビオース、ラフィノース、ゲンチオビオース、メリビオース、キシロビオース、シクロデキストリン、イソマルトース、トレハロース、スタキオース、パノース、プルラン、バーバスコース、ガラクトマンナン、および全ての形態の難消化性デンプンが挙げられる。プレバイオティクスの特に好ましい例は、ポリデキストロースである。
【００７６】
本発明のプロバイオティック組成物は、食品として、または食品の調製において使用され得る。本明細書では、用語「食品」は、幅広い意味で用いられ、ヒト用の食品ならびに動物用の食品（すなわち、飼料）を包含する。一態様では、食品は、ヒトの摂取のためのものである。
【００７７】
食品は、用途および／または適用方法および／または投与方法に応じて溶液の形態にあってもまたは固体としてであってもよい。
【００７８】
典型的なプロバイオティック食品は、１日用量当たりおよそ１０９〜１０１１の生プロバイオティック細菌細胞を含有してもよい。プロバイオティック細菌は、凍結乾燥粉末などの、プロバイオティック成分として食品中に組み込まれてもよいし、または製品において培養されてもよい。
【００７９】
機能性食品などの、食品としてまたは食品の調製において使用される場合、本発明の組成物は、栄養学的に許容されるキャリア、栄養学的に許容される希釈剤、栄養学的に許容される賦形剤、栄養学的に許容されるアジュバント、および栄養学的に活性な成分の１つ以上と併用され得る。
【００８０】
例として、本発明のプロバイオティック組成物は、ソフトドリンク、乳清タンパク質を含む果汁または飲料、健康茶、ココア飲料、ミルク飲料および乳酸菌飲料、ヨーグルトおよび飲用ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、水氷およびデザート、菓子、ビスケットケーキおよびケーキミックス、スナック食品、バランスの取れた食品および飲料、フルーツフィリング、保護グレーズ、チョコレートベーカリーフィリング、チーズケーキ風味付けフィリング、フルーツ風味付けケーキフィリング、ケーキおよびドーナツの糖衣、即席ベーカリーフィリングクリーム、クッキー用のフィリング、直ちに使用できるベーカリーフィリング、低カロリーフィリング、成人用栄養飲料、酸性化大豆／ジュース飲料、無菌／レトルトチョコレート飲料、バーミックス、飲料粉末、カルシウム強化大豆／プレーンおよびチョコレートミルク、カルシウム強化コーヒー飲料中の成分として使用することができる。
【００８１】
プロバイオティック組成物は、アメリカンチーズソース、粉および細切りチーズ用の固化防止剤、チップディップ、クリームチーズ、ドライブレンドホイップトッピング無脂肪サワークリーム、凍結／解凍乳製品ホイップクリーム、凍結／解凍に安定なホイップトッピング、低脂肪および低カロリーナチュラルチェダーチーズ、低脂肪スイス型ヨーグルト、気泡入り冷凍デザート、ハードパックアイスクリーム、ラベルフレンドリーで、改善された経済性および道楽のハードパックアイスクリーム、低脂肪アイスクリーム：ソフトクリーム、バーベキューソース、チーズディップソース、コテッジ・チーズドレッシング、ドライミックスアルフレドソース、ミックスチーズソース、ドライミックストマトソースなどの食品中の成分としてさらに使用することができる。
【００８２】
用語「乳製品」は、本明細書で用いるところでは、動物および／または植物由来のミルクを含む媒体を含むことを意図する。動物由来のミルクとしては、ウシの、ヒツジの、ヤギのまたはバッファローのミルクを挙げることができる。植物由来のミルクとしては、本発明により使用することができる植物由来の、特に大豆、米または穀類由来の任意の発酵性物質を挙げることができる。
【００８３】
１つの特定の態様によれば、本発明に従って用いられる食品は、発酵ミルクまたは人乳近似（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）ミルクである。
【００８４】
ある種の態様については、本発明は、発酵ヨーグルト飲料、ヨーグルト、飲用ヨーグルトなどの、ヨーグルト生産、チーズ、発酵クリーム、ミルク系デザートなどに関連して用いられ得る。
【００８５】
好適には、組成物は、チーズ用途、食肉用途、または保護培養物を含む用途の１つ以上における成分としてさらに使用することができる。
【００８６】
本発明はまた、食品または食品成分の調製方法であって、本方法が本発明による組成物を別の食品成分と混ぜ合わせる工程を含む方法を提供する。
【００８７】
有利には、本発明は、本発明のプロバイオティック組成物と（および任意選択で他の構成成分／成分と）接触させた製品であって、この組成物が製品の栄養摂取および／または健康利益を向上させることができる量で使用される製品に関する。
【００８８】
本明細書で用いるところでは、用語「接触させた」は、製品への本発明の組成物の間接的または直接的適用を意味する。用いられ得る適用方法の例としては、組成物を含む材料中で製品を処理すること、組成物を製品と混合することによる直接的適用、製品表面上へ組成物を噴霧すること、または製品を組成物の調合液中へ浸漬することが挙げられるが、それらに限定されない。
【００８９】
本発明の製品が食材である場合、本発明の組成物は典型的には、製品と混ぜ合わせられる。代替として、組成物は、食材のエマルションまたは未加工成分中に含められ得る。さらなる代替では、組成物は、香味料、グレーズ、着色剤混合物などとして適用され得る。
【００９０】
一部の用途向けには、組成物が、影響を受ける／処理される製品の表面上でまたは表面上に利用可能にされることが重要である。これは、組成物が次の有利な特徴：すなわち、栄養摂取および／または健康利益の１つ以上を付与することを可能にする。
【００９１】
本発明の組成物は、制御された量の微生物を製品に散在させる、被覆するおよび／または含浸させるために適用され得る。
【００９２】
一実施形態では、組成物は、ミルクまたはスクロース強化乳またはスクロースおよび／もしくはマルトース入り乳酸菌用培地を発酵させるために使用され、この場合に、組成物のすべての構成成分、すなわち、本発明による前記微生物−を含有する結果として生じた培地は、例えば、１０６〜１０１０ｃｆｕの１日用量を与える最終製品中の濃度でなどの、好適な濃度でヨーグルトミルクに成分として添加することができる。本発明による微生物は、ヨーグルトの発酵前または発酵後に使用され得る。
【００９３】
有利には、製品が食品である場合、プロバイオティック細菌は、食品が小売業者によって販売のために提供される、通常の「販売期限」または「賞味期限」日まで有効なままであるべきである。有効期間は有益にも、食品損傷が明らかになる通常の鮮度保持期間の終わりまでそのような期日を越えて延ばし得る。所望の期間の長さおよび通常の保存可能期間は、食材によって変わるであろうし、当業者は、保存可能時間が食材の種類、食材のサイズ、貯蔵温度、加工条件、包装材料および包装設備によって変わることを認めるであろう。
【００９４】
本発明の細菌組成物は、機能性食品として使用されてもよく、または機能性食品に添加されてもよい。本明細書で用いるところでは、用語「機能性食品」は、栄養学的効果および／または味覚を提供することができるだけでなく、追加の健康利益などの、さらなる有益な効果をまた消費者にもたらすことができる食品を意味する。
【００９５】
したがって、機能性食品は、純粋な栄養学的効果以外の、医学的または生理学的利益などの、特定の機能的利益をその食品に与える構成成分または成分（本明細書で記載されたものなどの）がそれらの中へ組み込まれている普通の食品である。機能性食品の法的な定義は全くないけれども、それらは一般に、特定の健康効果を有するとして市場に出されている食品である。
【００９６】
いくつかの機能性食品は、栄養補助食品である。本明細書で用いるところでは、用語「栄養補助食品」は、栄養学的効果および／または味覚の満足感を提供することができるだけでなく、消費者に治療上の（または他の有益な）効果をもたらすことができる食品を意味する。栄養補助食品は、食品と薬剤との間の伝統的な境界線を横断するものである。
【００９７】
さらなる態様によれば、本発明は、胃腸疾患の予防および／または治療のための、少なくとも１つのＡＢＯ血液型抗原への結合が実証されている細菌もしくはその代謝産物、または１つ以上のそのような細菌を含むプロバイオティック組成物の使用に関する。
【００９８】
本明細書で用いるところでは、用語「胃腸疾患」には、胃腸管に関するいかなる病気または疾患も含まれる。疾患は、例えば、ＧＩＴ微生物叢の構成および多様性の変更に関連していることが知られているものであり得る。胃腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病、潰瘍性結腸炎、便秘または下痢であり得る。
【００９９】
医薬品として−またはその調製において使用される場合、本発明の組成物は、薬学的に許容されるキャリア、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容されるアジュバント、薬学的に有効な成分の１つ以上と併用され得る。
【０１００】
薬学的に許容される支持体は、例えば、圧縮錠剤、錠剤、カプセル剤、軟膏、坐薬または飲用溶液の形態での支持体であり得る。他の好適な形態は以下に提供される。
【０１０１】
医薬品は、用途および／または適用方法および／または投与方法に応じて、溶液の形態にあっても、または固体としてであってもよい。
【０１０２】
細菌もしくはその代謝産物またはプロバイオティック組成物は、−単独の場合であろうと、または他の構成成分もしくは成分との組み合わせで存在する場合であろうと−任意の好適な形態で本発明に従って使用され得る。本発明で使用される細菌は、本明細書では「組成物」と言われることがある。同様に、本発明の組成物と、他の構成成分および／または成分（すなわち、食品成分、機能性食品成分または医薬品成分などの成分）とを含む組み合わせが、任意の好適な剤形で使用され得る。
【０１０３】
細菌もしくはその代謝産物またはプロバイオティック組成物は、固体もしくは液体製剤またはそれらの代替の形態で本発明に従って使用され得る。固体製剤の例としては、水和性でも、噴霧乾燥されていても、または凍結乾燥されていてもよい錠剤、カプセル剤、粉剤、粒剤および粉末剤が挙げられるが、それらに限定されない。液体製剤の例としては、水溶液、有機もしくは水性有機溶液、懸濁剤およびエマルションが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０４】
剤形の好適な例としては、即時放出、遅延放出、調節放出、持続放出、パルス放出または制御放出用途向けの、香味剤または着色剤を含有してもよい、錠剤、丸剤、カプセル剤、オビュール剤、液剤または懸濁剤の１つ以上が挙げられる。
【０１０５】
例として、本発明の組成物が、機能性成分として使用するためなどの−錠剤形態で使用される場合、錠剤はまた、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤；デンプン（トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプンなどの）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複雑なケイ酸塩などの崩壊剤；ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアゴムなどの造粒結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクなどの平滑剤の１つ以上を含有してもよい。
【０１０６】
剤形を調製するのに使用するための栄養学的に許容されるキャリアの例としては、例えば、水、食塩水、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエスラル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１０７】
剤形用の好適な賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。
【０１０８】
水性懸濁剤および／またはエリキシル剤のためには、本発明の組成物は、様々な甘味剤または香味剤、色素または染料と、乳化剤および／または懸濁化剤と、そして水、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの希釈剤、ならびにこれらの組み合わせと組み合わせられ得る。
【０１０９】
これら剤形にはまた、ゼラチンカプセル剤、食物繊維カプセル剤、食物繊維錠剤または食物繊維飲料が含まれ得る。
【０１１０】
調合物が理想的には胃腸管の通過中に安定なままであり得るべきであることは、当業者に明らかであろうし；例えば、それは、タンパク質分解に耐性を示し、酸性ｐＨで安定であり、かつ、胆汁の洗浄効果に耐性を示し得る。
【０１１１】
本発明は、番号付き段落の形態で提示される、以下の開示をさらに提供する：
１．下記：
ａ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の平均Ａ抗原接着；および／または
ａ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の平均Ｂ抗原接着；および／または
ｂ）Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の平均Ｏ抗原接着
で特徴付けられる細菌またはその代謝産物。
【０１１２】
２．前記細菌またはその代謝産物が、
ｃ）耐酸性評価分析に規定されているように１．５時間ｐＨ２．５で測定されるときにｌｏｇ変化として表される−２．６超の平均酸耐性；および／または
ｄ）耐胆汁性評価分析に規定されているように胆汁なしのＭＲＳでの増殖の百分率として０．９％脱水新鮮胆汁での増殖として表される４０％超の平均胆汁耐性
でさらに特徴付けられる段落１に記載の細菌またはその代謝産物。
【０１１３】
３．前記細菌が、ＤＳＭ  ３２１１１、ＤＳＭ  ３２１０８、ＤＳＭ  ３２１０７、ＤＳＭ  ３２０９８、ＤＳＭ  ３２１０４、ＤＳＭ  ３２１１２、ＤＳＭ  ３２１０９、ＤＳＭ  ３２１０５、ＤＳＭ  ３２１１０、ＤＳＭ  ３２１０３、ＤＳＭ  ３２０９９、ＤＳＭ  ３２１０６、ＤＳＭ  ３２０９７、ＤＳＭ  ３２１１４、ＤＳＭ  ３２１１５またはそれらの突然変異株、変異株および／もしくは後代として寄託されている段落１または２に記載の細菌。
【０１１４】
４．段落１〜３のいずれか１つに記載の細菌またはその代謝産物を含むプロバイオティック組成物。
【０１１５】
５．好適なキャリアをさらに含む段落４に記載のプロバイオティック組成物。
【０１１６】
６．任意選択で１つ以上のさらなる細菌株と組み合わせて、請求項１〜３のいずれか１つに記載されるような２、３、４、５または６つの細菌株またはそれらの代謝産物の組み合わせを含む、段落４または５のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物。
【０１１７】
７．１つ以上のさらなる細胞株をさらに含む、段落４〜６のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物。
【０１１８】
８．前記１つ以上のさらなる細菌株が、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭ；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＢＬ−０４；ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＬＰＣ３７；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＨＮ０１９、および／またはビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）Ｂｉ−０７から選択される、段落７に記載のプロバイオティック組成物。
【０１１９】
９．ＤＡＶＥ０３４、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭ；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＢＬ−０４；ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＬＰＣ３７；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＨＮ０１９およびビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）Ｂｉ−０７を含む段落８に記載のプロバイオティック組成物。
【０１２０】
１０．適切な血液型抗原についてＬ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の抗原接着を実証する１つ以上の細菌を含むことによってＡ、Ｂ、ＡＢまたはＯ血液型個人のために個人向けにされている、段落４〜９のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物。
【０１２１】
１１．少なくとも１つのプレバイオティック構成成分をさらに含む、段落４〜１０のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物。
【０１２２】
１２．段落４〜１１のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物の製造方法であって、本方法が、選択された細菌またはその代謝産物を好適なキャリアと組み合わせる工程を含む方法。
【０１２３】
１３．段落４〜１１のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物を含む食品、栄養補助食品、医療食品、栄養補給または医薬組成物。
【０１２４】
１４．
ａ）１つ以上の試験細菌を、Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と；
ｂ）１つ以上のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４対照細菌を、Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせと混ぜ合わせる工程と；
ｃ）工程ａ）およびｂ）の前記混合物を培養する工程と；
ｄ）試験細菌およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４の前記Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせへの接着の親和性を比較する工程と；
ｅ）ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４よりも前記Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｏ抗原またはそれらの組み合わせへの高い接着の親和性を有する細菌を選択する工程と
を含む細菌またはその代謝産物の選択方法。
【０１２５】
１５．前記混合物が、工程（ｂ）において別個のバイアル中で培養される段落１４に記載の方法。
【０１２６】
１６．蛍光ベースの方法である、段落１４または１５に記載の方法。
【０１２７】
１７．段落１６に記載の方法であって、
ｉ）５４９超の蛍光の平均Ａ抗原接着強度；
ｉｉ）５１９超の蛍光の平均Ｂ抗原接着強度；および／または
ｉｉｉ）７４６超の蛍光の平均Ｏ抗原接着強度
を有する細菌が選択される方法。
【０１２８】
１８．段落１４〜１７のいずれか１つに記載の方法であって、前記方法が、
ｆ）工程ｅ）において選択された細菌の平均酸耐性を１．５時間ｐＨ２．５で評価分析する工程；および／または
ｇ）工程ｅ）において選択された細菌の平均胆汁耐性を０．９％胆汁で評価分析する工程；および
ｈ）１．５時間ｐＨ２．５で測定されるときにｌｏｇ変化として表される−２．５６超の平均酸耐性および／または胆汁なしのＭＲＳでの増殖の百分率として０．９％胆汁での増殖として表される４０．１６％超の平均胆汁耐性を有する１つ以上の細菌を選択する工程
をさらに含む方法。
【０１２９】
１９．段落１４〜１８のいずれか１つに記載の方法によって選択された細菌またはその代謝産物。
【０１３０】
２０．段落１９に記載の細菌であって、前記細菌が、ＤＳＭ  ３２１１１、ＤＳＭ  ３２１０８、ＤＳＭ  ３２１０７、ＤＳＭ  ３２０９８、ＤＳＭ  ３２１０４、ＤＳＭ  ３２１１２、ＤＳＭ  ３２１０９、ＤＳＭ  ３２１０５、ＤＳＭ  ３２１１０、ＤＳＭ  ３２１０３、ＤＳＭ  ３２０９９、ＤＳＭ  ３２１０６、ＤＳＭ  ３２０９７、ＤＳＭ  ３２１１４、ＤＳＭ  ３２１１５またはそれらの突然変異株、変異株および／もしくは後代として寄託されている細菌。
【０１３１】
２１．段落１９〜２０のいずれか１つに記載の細菌またはその代謝産物を含むプロバイオティック組成物。
【０１３２】
２２．好適なキャリアをさらに含む段落２１に記載のプロバイオティック組成物。
【０１３３】
２３．任意選択で１つ以上のさらなる細胞株と組み合わせて．段落１９〜２０のいずれか１つに記載されるような２、３、４、５または６つの細菌またはその代謝産物の組み合わせを含む、段落２１または２２のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物。
【０１３４】
２４．１つ以上のさらなる細胞株をさらに含む、段落２１〜２３のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物。
【０１３５】
２５．前記１つ以上のさらなる細胞株が、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭ；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＢＬ−０４；ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＬＰＣ３７；ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＨＮ０１９、および／またはビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）Ｂｉ−０７から選択される、段落２４に記載のプロバイオティック組成物。
【０１３６】
２６．段落２１〜２５のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物を含む食品、栄養補助食品、医療食品、栄養補給または医薬組成物。
【０１３７】
２７．胃腸疾患を予防するおよび／または治療するための調合物の製造のための、段落１〜３もしくは１９〜２０のいずれか１つに記載のまたは段落１４〜１８のいずれか１つに記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または段落４〜１１もしくは２１〜２５のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物の使用。
【０１３８】
２８．胃腸疾患の予防および／または治療での使用のための、段落１〜３もしくは１９〜２０のいずれか１つに記載のまたは段落１４〜１８のいずれか１つに記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または段落４〜１１もしくは２１〜２５のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物。
【０１３９】
２９．段落１〜３もしくは１９〜２０のいずれか１つに記載のまたは段落１４〜１８のいずれか１つに記載の方法によって選択された細菌もしくは代謝産物、または段落４〜１１もしくは２１〜２５のいずれか１つに記載のプロバイオティック組成物を、薬学的に有用な量で対象者に投与する工程を含む胃腸疾患の予防および／または治療方法。
【０１４０】
３０．適切な血液型抗原についてラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４またはＬ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９と比較されるときに１００％超の抗原接着を実証する１つ以上の細菌を、プロバイオティック組成物または食品への包含のために選択することによる、Ａ、Ｂ、ＡＢまたはＯ血液型の個人のためのプロバイオティック組成物または食品の個人向け方法。
【０１４１】
３１．実質的に図面に関連して本明細書に記載されるような細菌、代謝産物、プロバイオティック組成物、食品、方法、使用のための細菌もしくは代謝産物、使用またはそれらの組み合わせ。
【０１４２】
本発明は、以下の実施例に関連して、ほんの例として、説明される。
【実施例】
【０１４３】
原材料および方法
菌株のプロバイオティック特性
菌株の酸耐性は、１．５時間ｐＨ２．５およびｐＨ３．５において、胆汁耐性は、２４時間０．９％および０．３％Ｏｘｇａｌｌ（Ｄｉｆｃｏ）胆汁濃度において試験した（Ｓａａｒｅｌａら  ２００９）。手短に言えば、菌株を、１８時間３７℃で嫌気性条件下にＭＲＳブロスで正副２通り培養した。ペレット化細胞を１０ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ７．２で２回洗浄し、試料の光学密度（ＯＤ６００）が１である（１×１０８ＣＦＵ／ｍｌに等しい）ように０．０１モル／ＬのＰＢＳ  ｐＨ７．２に再懸濁させた。酸耐性は、細胞を、３７℃で９０分間ＰＢＳ  ｐＨ７．２、ＰＢＳ  ｐＨ２．５およびＰＢＳ  ｐＨ３．５において培養することによって試験した。１０倍希釈シリーズをＭＲＳ寒天上で増殖させ、コロニーを、３７℃で嫌気性条件下に４８ｈ培養後にカウントした。酸耐性についての結果は、ｐＨ７．２と比較してｐＨ２．５または３．５への暴露後のＣＦＵの増殖ｌｏｇ減少として表した。胆汁耐性は、１：１０希釈菌株培養物を、嫌気性条件下に２４時間３７℃で０．９％Ｏｘｇａｌｌ雄牛の胆汁を含有するＭＲＳ、０．３％Ｏｘｇａｌｌを含有するＭＲＳでおよび平板ＭＲＳで培養することによって試験した。増殖は、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）によってＯＤ５９５として培養前後に測定した。胆汁耐性結果は、胆汁なしのＭＲＳでの増殖（ＯＤ）と比較して０．９％または０．３％Ｏｘｇａｌｌ入りＭＲＳでの％増殖（ＯＤ）として表した。さらに、菌株の酸および胆汁耐性を、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＬＧＧ（ＶＴＴ  Ｅ−９６６６６）菌株のそれと比較した。測定は全て、正副２通り行い、菌株のほとんどについて２回繰り返した。
【０１４４】
ＡＢＨ抗原接着
ＡＢＨ接着能は、全ての菌株について試験した（Ｈ抗原は、血液型Ｏ表現型に相当する）。試験される血液型抗原Ａ、ＢおよびＨ（Ｅｌｉｃｉｔｙｌ）を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に懸濁させ、ビオチン化した。菌株を、４８〜７２時間３７℃でＭＲＳ平板において嫌気条件下に培養した。単一コロニーを１０ｍｌのＭＲＳブロスに再植菌し、３７℃で嫌気条件下に一晩培養した。細胞を１０ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ７．２で２回洗浄し、試料のＯＤ（６００ｎｍ）が１に設定される（１×１０８ｃｆｕ／ｍｌに等しい）ように、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に再懸濁させた。１ｍｌの試料と１ｍｌの１０μｇ／ｍｌのビオチン化抗原溶液とを混合し、室温で３０分間ゆっくり振盪して培養し、１００μｌの混合物を、Ｄｅｌｆｉａ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ストレプトアビジン）被覆９６ウェルプレート（Ｗａｌｌａｃ）へ移し、平板を２００μｌのＰＢＳ  ｐＨ７．２で２回洗浄し、これに、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）３回（２×２００μｌ＋１×１００μｌ）でのおよび１回２００μｌの滅菌水での洗浄が続いた。ストレプトアビジン−ビオチン相互作用については、平板を、ゆっくりとかき混ぜて室温で３０分間培養し、その後ウェルを２００μｌの滅菌水で３回洗浄した。洗浄の間に、平板を５分間培養した。結合した細菌を検出するために、２００μｌのＳｙｔｏ９染料（１：６希釈された）（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）をウェルに添加し、暗所で１５分間培養した。ウェル中のＳｙｔｏ−９菌株の強度は、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｋｔｏｒ２１４２０マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。測定は全て４反復で行い、結果は少なくとも２回繰り返した。菌株の接着は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ−１４（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｈａｎｓｅｎ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能な）と比較した。
【０１４５】
実施例１
多数の異なる判定基準を用いて、プロバイオティック組成物の製造にとって有利な特性を有するだろう本発明の細菌を選択した。
【０１４６】
用いられた判定基準および選択されたカットオフ値を表２において下に示す。
【０１４７】
【表１】
2019528738.tif 000002
【０１４８】
評価分析は、原材料および方法セクションにおいて上に示されたように実施した。これらの分析の結果を、対照菌株Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＬＧＧ、ＲＣ−１４、ＧＲ−１およびＬ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９などの、多数の菌株について下に提示する。
【０１４９】
【表２】
2019528738.tif 000003
【０１５０】
【表３】
2019528738.tif 000004
【０１５１】
【表４】
2019528738.tif 000005
【０１５２】
【表５】
2019528738.tif 000006
【０１５３】
【表６】
2019528738.tif 000007
【０１５４】
【表７】
2019528738.tif 000008
【０１５５】
【表８】
2019528738.tif 000009
【０１５６】
【表９】
2019528738.tif 000010
【０１５７】
【表１０】
2019528738.tif 000011
【０１５８】
【表１１】
2019528738.tif 000012
【０１５９】
【表１２】
2019528738.tif 000013
【０１６０】
【表１３】
2019528738.tif 000014
【０１６１】
この評価分析においてＤＳＭ  ３２０９７についてデータは全く得られなかった。
【０１６２】
上で得られたデータおよび用いられた選択判定基準に基づき、多数の菌株を、プロバイオティック組成物での使用のそれらの好適性に従って選択した。下の表１１は、Ａ、ＢおよびＯ抗原接着に基づき対照菌株よりも良好に機能したそれらの菌株、およびどの菌株が改善された胆汁および／または酸耐性を示したかを示す。５つの菌株（ＤＳＭ  ３２１０４、ＤＳＭ  ３２１１２、ＤＳＭ  ３２１０９、ＤＳＭ  ３２１１０およびＤＳＭ  ３２１０６）のＡ、Ｂおよび／またはＯ接着は、Ａ抗原により良く接着する（Ｕｃｈｉｄａら  ２００６）、対照菌株Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＭＧ１８１９９の接着に等しいかまたはそれよりも良好であった。
【０１６３】
【表１４】
2019528738.tif 000015
【０１６４】
実施例３（胃腸の健康−痛み）
およそ２００〜２２０ｇの重さがある雄ラットを、後で結腸拡張への疼痛反応を測定するために腹部筋肉の筋電図検査用に外科的に準備する。ラットを次に、結腸直腸拡張試験前の７〜２１日間各プロバイオティクス（１０７、１０８および／もしくは１０９ＣＦＵの１日用量）または生理食塩水で強制飼養する。ラットを、拡張試験前に３〜５日ポリプロピレン・トンネルに慣れさせる。膨張のために使用されるバルーンを、塞栓除去プローブから取り、肛門から１ｃｍのところで直腸中へ挿入し、尾の基底で固定する。拡張のレベルの増加を次に、圧調節器に連結されたプローブで誘導させる。機能性成分は、直腸壁を鈍感にさせ、痛覚閾値の増加または腹部筋肉の収縮の減少をもたらす。各圧力レベルに対応する収縮を測定し、グループ間で比較する。
【０１６５】
実施例４（胃腸の健康−炎症）
およそ２００〜２２０ｇの重さがある雄ラットを、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）結腸炎を誘導する前に１５日間各プロバイオティクスまたは生理食塩水で強制飼養する。ＴＮＢＳを、０．３ｍｌの５０％エタノール中最大８０ｍｇ／ｋｇで一晩絶食後に直腸内に注入する。ＴＮＢＳ注入の２〜４日後に、ラットを直腸拡張試験にかけ、犠牲にする。犠牲にして、組織検体、血液およびＧＩ内容物を、下記の１つ以上などの、さらなる分析のために集める：
【０１６６】
炎症の採点
新鮮な組織検体を、炎症のレベルを測定するために経験を積んだ科学者によって目視採点する。
【０１６７】
炎症性指標の発現
結腸のセクションを、液体窒素中で瞬間凍結する。ＲＮＡを抽出し、商業的に入手可能なキットでｃＤＮＡに変換する。直腸組織中の、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびそれらの組織阻害剤などの、炎症性指標の発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲで分析する。
【０１６８】
直腸組織構造
組織学試料は、パラフィン中に埋め込まれた組織からカットし、浸潤免疫細胞を数えるために顕微鏡下で可視化する。
【０１６９】
血中炎症性指標
血液を遠心分離して血清を分離する。炎症性指標（ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、ｈｓＣＲＰなどの）を次に、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットで測定する。
【０１７０】
血中リポ多糖
血液を遠心分離して血清を分離する。リポ多糖類は、商業的に入手可能である、Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞抽出物（ＬＡＬキット）をベースとする標準キットを使用して血清試料から分析する。
【０１７１】
腸管微生物叢解析
腸管微生物叢は、ＤＮＡを抽出することによって糞または盲腸から解析する。試料は次に、腸管微生物シークエンシングを受ける。結果は、熟練したバイオインフォーマティシアンによって解析される。
【０１７２】
上記の本明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に援用される。本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、特許請求されるような本発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された方式の種々の修正は、以下の特許請求の範囲内にあることを意図される。
【国際調査報告】
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