【手続補正書】
【提出日】平成19年7月19日(2007.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  （ｉ）組換え宿主細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞は桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損し、適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含んでいること、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記組換え細胞を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収すること
を含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸の生成方法。
【請求項２】  前記チロシンアンモニアリアーゼが触媒効率約４．１４×１０3Ｍ-1ｓｅｃ-1から約１×１０9Ｍ-1ｓｅｃ-1であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】  チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする前記遺伝子が配列番号８または配列番号１０で記載したポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】  桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損し、適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項５】  前記チロシンアンモニアリアーゼの触媒効率が４．１４×１０3Ｍ-1ｓｅｃ-1から約１×１０9Ｍ-1ｓｅｃ-1であることを特徴とする請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】  ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ４０７およびＰＴＡ４０９を有する細胞から成る群から選択された適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項７】  配列番号１０に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするチロシンアンモニアリアーゼ遺伝子。
【請求項８】  配列番号１０に記載のポリペプチド。
【請求項９】  （ｉ）組換え酵母細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞が、
ａ）植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子、および
ｂ）適切な調節配列と制御可能に結合した酵母フェニルアンモニア−リアーゼ活性をコードする遺伝子を含むこと、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記組換え細胞を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収すること
を含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸の生成方法。
【請求項１０】  植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする前記遺伝子がキクイモ、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウモロコシ、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、緑色種子作物、テンサイ、サトウキビ、インゲンマメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草から成る群から選択される植物から得られたことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする前記遺伝子が配列番号１１および配列番号１３に記載されていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】  酵母ＰＡＬ活性をコードする前記遺伝子がＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種およびＳｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ種から成る群から得られたことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】  酵母ＰＡＬ活性をコードする前記遺伝子が配列番号８に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】  ＡＴＣＣ名称、ＰＴＡ４０８を有することを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項１５】  （ｉ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ＡＴＣＣ１３２７３、ＡＴＣＣ１３９６８、ＴＵ６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ４２７７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｅｔｒａｋｉｉ（ＡＴＣＣ１２３３７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ１０５４９）およびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｒｏｂｕｓｔａ（ＡＴＣＣ１１８５６）から成る群から選択された微生物細胞を桂皮酸と接触させること、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記微生物を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収すること
を含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸を生成方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
本発明はさらに以下の実施例で明確に説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のためだけに記載するものである。前記の解説およびこれらの実施例から、当業者等は本発明の本質的な特性を把握することができ、それらの精神および範囲を逸脱することなく、様々な用途および条件に適応させるために本発明の様々な変化および変更を実施できる。
以下に、本発明の好ましい態様を示す。
［１］  （ｉ）組換え宿主細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞は桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損し、適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含んでいること、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記組換え細胞を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収することを含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸の生成方法。
［２］  前記発酵可能な炭素基質が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、蟻酸および炭素を含むアミンから成る群から選択されることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］  前記発酵可能な炭素基質がグルコースであることを特徴とする［２］に記載の方法。
［４］  前記組換え宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌、藻類および植物細胞から成る群から選択されることを特徴とする［１］に記載の方法。
［５］  前記組換え宿主細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｍｕｃｏｒ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓから成る群から選択されることを特徴とする［４］に記載の方法。
［６］  前記組換え宿主細胞がダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウモロコシ、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、緑色種子作物、テンサイ、サトウキビ、インゲンマメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草から成る群から選択されることを特徴とする［１］に記載の方法。
［７］  前記チロシンアンモニアリアーゼが触媒効率約４．１４×１０3Ｍ-1ｓｅｃ-1から約１×１０9Ｍ-1ｓｅｃ-1であることを特徴とする［１］に記載の方法。
［８］  チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする前記遺伝子が配列番号８または配列番号１０で記載したポリペプチドをコードすることを特徴とする［１］に記載の方法。
［９］  チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする前記遺伝子がＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種から得られることを特徴とする［１］に記載の方法。
［１０］  ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ４０７およびＰＴＡ４０９を有する細胞から成る群から選択された適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
［１１］  桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損し、適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、前記チロシンアンモニアリアーゼの触媒効率が４．１４×１０3Ｍ-1ｓｅｃ-1から約１×１０9Ｍ-1ｓｅｃ-1であることを特徴とする宿主細胞。
［１２］  配列番号１０に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするチロシンアンモニアリアーゼ遺伝子。
［１３］  配列番号１０に記載のポリペプチド。
［１４］  （ｉ）組換え酵母細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞が、
ａ）植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子、および
ｂ）適切な調節配列と制御可能に結合した酵母フェニルアンモニア−リアーゼ活性をコードする遺伝子を含むこと、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記組換え細胞を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収することを含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸の生成方法。
［１５］  前記発酵可能な炭素基質が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、蟻酸および炭素を含むアミンから成る群から選択されることを特徴とする［１４］に記載の方法。
［１６］  前記発酵可能な炭素基質がグルコースであることを特徴とする［１５］に記載の方法。
［１７］  前記組換え酵母細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｍｕｃｏｒ、ＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍから成る群から選択されることを特徴とする［１４］に記載の方法。
［１８］  植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする前記遺伝子がキクイモ、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウモロコシ、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、緑色種子作物、テンサイ、サトウキビ、インゲンマメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草から成る群から選択される植物から得られたことを特徴とする［１４］に記載の方法。
［１９］  植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする前記遺伝子が配列番号１１および配列番号１３に記載されていることを特徴とする［１８］に記載の方法。
［２０］  酵母ＰＡＬ活性をコードする前記遺伝子がＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種およびＳｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ種から成る群から得られたことを特徴とする［１４］に記載の方法。
［２１］  酵母ＰＡＬ活性をコードする前記遺伝子が配列番号８に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする［２０］に記載の方法。
［２２］  ＡＴＣＣ名称、ＰＴＡ４０８を有することを特徴とする組換え宿主細胞。
［２３］  （ｉ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ＡＴＣＣ１３２７３、ＡＴＣＣ１３９６８、ＴＵ６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ４２７７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｅｔｒａｋｉｉ（ＡＴＣＣ１２３３７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ１０５４９）およびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｒｏｂｕｓｔａ（ＡＴＣＣ１１８５６）から成る群から選択された微生物細胞を桂皮酸と接触させること、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記微生物を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ酸を回収することを含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸を生成方法。
［２４］  チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子の同定方法であって、
（ｉ）チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードすることが推測される外来遺伝子を含むチロシン要求組換え微生物を、パラ−ヒドロキシ桂皮酸を代謝するために十分な時間パラ−ヒドロキシ桂皮酸と接触させること、および
（ｉｉ）前記組換え微生物の生育を監視することであって、前記生物が生育することによってチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子の存在が示されることを含むことを特徴とする遺伝子の同定方法。
［２５］  チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子の同定方法であって、
（ｉ）単一の炭素源としてパラ−ヒドロキシ桂皮酸を使用する宿主細胞を、チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードすることが推測される遺伝子で形質転換して形質転換体を生成すること、
（ｉｉ）形質転換体の生育速度を単一の炭素源としてパラ−ヒドロキシ桂皮酸を使用することができる非形質転換宿主細胞と比較して、形質転換体の生育速度が加速するとＴＡＬ活性をコードする遺伝子の存在が示されることを含むことを特徴とする遺伝子の同定方法。
［２６］  酵母ＰＡＬ活性をコードする前記遺伝子が配列番号１０で記載したポリペプチドをコードすることを特徴とする［２０］に記載の方法。
［２７］  ＡＴＣＣ名称、ＰＴＡ４０９を有することを特徴とする組換え宿主細胞。