(57)【要約】  本発明は、核酸及びキトサンを含む温度感応性ハイドロゲル組成物を提供する。前記ハイドロゲルは、生体適合性と生体安定性に優れ、かつ温度変化に従うゾル−ゲル相転移（ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の性質を帯びているので、常温ではゾルの状態で存在してから人体内注入または表皮皮膚の表面に塗布して温度が高くなれば、ゲル化される。したがって、本発明の温度感応性ハイドロゲルは、治療を必要とする特定部位に直接的な注入及び塗布が可能であり、温度に従うゲル化を通じて薬物の滞留及び付着時間を高めることによって、薬効を十分に発揮するようにすることができるので、様々な治療に活用できることと期待される。
2019501928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸及びキトサンを含み、
前記核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１である、温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項２】
前記核酸及びキトサンの重量比が５０：１〜２０００：１である、請求項１に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項３】
前記核酸及びキトサンの重量比が１００：１〜１０００：１である、請求項２に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項４】
前記核酸の含有量が組成物の総重量を基準として０．０１重量％〜３重量％であることを特徴とする、請求項１に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項５】
前記核酸は、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＮＡ）、
リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＲＮＡ）またはこれらの混合物であることを特徴とする、請求項４に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項６】
前記キトサンの含有量が組成物の総重量を基準として、１×１０−６重量％〜０．１５重量％であることを特徴とする、請求項１に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項７】
前記キトサンは、分子量が３ｋＤａ〜１，０００ｋＤａであることを特徴とする、請求項６に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項８】
前記温度感応性ハイドロゲル組成物は、高分子物質を追加成分として含むことを特徴とする、請求項１に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項９】
前記高分子物質は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリガンマグルタミン酸（ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリアミノ酸（ｐｏｌｙａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、アルジネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、これらの誘導体及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項８に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物の製造方法であって、
１）核酸の貯蔵溶液を製造するステップ；
２）キトサン貯蔵溶液を製造するステップ；
３）前記ステップ１）の核酸貯蔵溶液及び前記ステップ２）のキトサン貯蔵溶液を核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１になるように混合して攪拌するステップ；と
４）前記ステップ３）の核酸−キトサン混合液を攪拌しながら常温に下げるステップ；と
を含むことを特徴とする、温度感応性ハイドロゲル組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記製造方法は、
１）核酸を緩衝溶液（ｂｕｆｆｅｒ）に入れ、６０℃〜７０℃で攪拌しながら１時間〜２時間溶解させて核酸貯蔵溶液を製造するステップと、
２）キトサンを酸性緩衝溶液に溶解させてキトサン貯蔵溶液を製造するステップと、
３）前記ステップ１）の核酸貯蔵溶液及び前記ステップ２）のキトサン貯蔵溶液を核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１になるように混合して５５℃〜６５℃で１時間〜２時間攪拌するステップと、
４）前記ステップ３）の核酸−キトサン混合液を攪拌しながら常温に下げるステップと、
を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物の製造方法。  
【請求項１２】
前記温度感応性ハイドロゲル組成物は、浸透圧が１００ｍＯｓｍ〜５００ｍＯｓｍであることを特徴とする、請求項１０に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記温度感応性ハイドロゲル組成物は、ｐＨが６〜８であることを特徴とする、請求項１０に記載の温度感応性ハイドロゲル組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸及びキトサンを含む温度感応性ハイドロゲル組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）とは、水相を含有する３次元の網状構造を有する高分子構造体を意味し（Ｒｏｈｉｎｄｒａ  Ｄ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４：非特許文献１）、親水性高分子との間に共有結合または非共有結合が行われて形成される（Ｈｗａｎｇ  Ｊｕｎｓｅｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８：非特許文献２）。様々な親水性高分子からなるハイドロゲルは、高い含水率を有しているので、生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）に優れているため、生体素材として応用するための多い研究が行われてきた。特に、ｐＨ、温度、電場、磁場、光、超音波などの刺激（ｓｔｉｍｕｌｉ）に敏感なハイドロゲルは、刺激が存在するか否かによって、制御放出可能な薬物送達システムに利用できる（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ａ．Ｓ．，  ２００２：非特許文献３）。
【０００３】
このうち、温度感応性ハイドロゲルは、組織再生用の細胞伝達体と薬物送達システムで最も広く研究されている。これは多くの高分子が温度転移特性を示しているからで、一般的な高分子を水に溶解または膨潤することができる親水基グループを導入することになると、その高分子は、水により溶解または膨潤され、温度の増加によって、水への溶解性は増加するが、親水性と、メチル、エチル、及びプロピルなどの疎水性部分から構成された高分子は、温度の増加によって、水溶解性が減少する低臨界溶液温度（ｌｏｗｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ＬＣＳＴ）を有するようになって、温度が増加する時、凝縮してゲルが形成される（Ｗａｒｄ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１：非特許文献４）。即ち、親水性と疎水性部分から構成された高分子は、低い温度では、高分子の親水基と水分子との間の水素結合力が優勢で、水に溶解されてゾル（ｓｏｌ）状態になるが、温度を増加させると、高分子の疎水基部分の結合力が水素結合力より優勢になるので、高分子の疎水基部分が凝集してゲル（ｇｅｌ）状態に相転移（ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）が発生する。
【０００４】
これらの高分子溶液が、一般的な温度で流体のようなゾル状態の場合には、単純な混合過程を通じて薬物の混合が可能であり、人体の温度以上の熱が加わる場合には、ゲルを形成して薬物の徐放性放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）が可能になる。しかしながら、これらの高分子は、人体内で使用された後、人体の新陳代謝によって体外へ放出されなければならない。したがって、医療用または人体に適用するための温度感応性ハイドロゲルの場合には、生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）及び生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ）性質を帯びるようにすることが重要である。
【０００５】
現在までに研究された温度感応性ハイドロゲル組成物の含有量の割合をみると、疎水性−親水性の結合により表れる温度感応性ハイドロゲルの場合には、組成物の反応濃度が高いことが分かった。反応の濃度が高いということは、ハイドロゲルの人体注入による人体への影響を与えることができるだけでなく、人体内での分解速度にも影響を与えることができる。したがって、低濃度でも温度感応性を示すことができるハイドロゲルの開発は、より安全な生体適合性物質の開発に役立つことができる。  
【０００６】
ハイドロゲルを構成する高分子には、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）（Ｂｅｒｇｅｒ  Ｊ．  ｅｔ．ａｌ．，  ２００４：非特許文献５）、アルジネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）（Ａｕｇｓｔ  Ａ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６：非特許文献６）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）などの天然高分子とポリビニルアルコール（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌ））（Ｂｏｄｕｇｏｚ−Ｓｅｎｔｕｒｋ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９：非特許文献７）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）（Ｊｉｎ  Ｒ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５：非特許文献８）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））（Ｍａｈｏｎｅｙ  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６：非特許文献９）などの合成高分子がある。
【０００７】
キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）は、カニや一般エビ、ザリガニなどの甲殻類、コウイカなどの軟体類、昆虫類や細菌の細胞壁などから得られるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）がβ−（１→４）結合した形態の天然多糖類であるキチンを脱アセチル化（ｄｅａｃｅｔｌｙａｔｉｏｎ）して製造することができる。キトサンは無機酸水溶液に容易に溶解されるので、廃水処理用の凝集剤、重金属吸着体、食品及び化粧品などの様々な分野に活用されている。また、キトサンは天然物から得られる多糖類であって、生体適合性及び生分解性に優れているだけでなく、細胞の結合及び生体組織の培養、抗菌性、香臭性、無毒性、止血作用などの生理活性があるものとして報告された（Ｐａｒｋ  Ｊｕｎｇｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５：非特許文献１０）。
【０００８】
遺伝情報を貯蔵し、伝達する誘電体として認識されてきた核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が疾患組織の周りに分布して細胞の成長と分化、血管生成の促進と炎症抑制の機能をすると知られている。つまり、核酸が細胞外部で小さな部分に分解されて、細胞表面の受容体と結合して細胞内部に信号を刺激する役割をする。
【０００９】
更に他の研究分野では、核酸の固有の自己組立（ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）性質を用いて、非常に精巧なナノ構造物を作るなど、様々な分野で活発に研究が進められている。２００６年にＤＮＡからなるハイドロゲルの形成結果が発表（Ｕｍ  Ｓ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６：非特許文献１１）された以後、多くのグループでＤＮＡを用いたゲルを作製する研究が行われている。
【００１０】
ＤＮＡからなるハイドロゲルの場合、生体適合性が非常に優れて、医学的に様々な分野で研究されている。最近では、熱と酵素に反応して分解及び再結合自在な機能性のＤＮＡハイドロゲルを製造した結果が発表されたこともあった（Ｘｉｎｇ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１：非特許文献１２）。したがって、必要時のみに薬物を流すスマート薬物送達方法が可能になることによって、薬物の過多服用による副作用を減らすことができる長所がある。また、既存のポリマーを用いたハイドロゲルの製造方法とは異なり、ＤＮＡハイドロゲルは、生体物質であるＤＮＡから構成されていて、人体に毒性がないという長所を有しているので、様々な形状の傷口のための人工組織としての使用及び効果的な薬物伝達体として医療分野で様々な応用が期待されている。
【００１１】
しかしながら、核酸は、人体に存在する分解酵素によって容易に分解されて標的となる疾患組織に核酸を適用するための体内滞留性が低くて、薬効持続性が足りないだけでなく、ＤＮＡハイドロゲルに活用する場合、分解酵素による分解によって構造物の崩壊が起こって、人工組織及び薬物送達体としての役割を適切に行うことができなくなる問題点を有している（Ｌｅｅ  Ｊｏｎｇｂｅｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２：非特許文献１３）。したがって、これらの核酸の薬効持続性強化及びＤＮＡハイドロゲルの問題点を解決するための研究の進行が必要である。
【００１２】
ここに、本発明者は、常温ではゾルの状態で存在してから体内に注入すると、ゲルを形成する温度感応性ハイドロゲルを製造するために持続的に研究した結果、キトサンと核酸の組合せを通じて、生体適合性及び生分解性を有する温度感応性ハイドロゲルを製造することによって、本発明を完成することができた。
【００１３】
従来の先行技術として、韓国公開特許第２０１４−００９０６７０号（特許文献１）では、インサイチュ架橋結合性重合体組成物が開示されているが、温度感応性及びハイドロゲルについては全く言及がない。また、この公開特許の架橋結合性重合体組成物は約０．１重量％〜約９５重量％の１種超過の多重陰イオン重合体、約０．１重量％〜約９０重量％の１種超過の多重陽イオン重合体、及び０．１重量％〜９９．８重量％の水を含むものであって、本発明の温度感応性ハイドロゲル組成物の混合割合の構成と差がある。また、前記多重陰イオンとしては、架橋結合性と非架橋結合性多重陰イオンを含むものとして開示しており、非架橋結合性多重陰イオン成分の１つにポリヌクレオチドを提示している。しかしながら、非架橋結合性の多重陰イオンの場合は、追加で含まれるものとして開示されており、架橋結合には影響を与えないことが分かる。一方、本発明の場合、核酸及びキトサンの間の非架橋結合を通じて温度感応性ハイドロゲルを形成するものであって、その構成において差があることが分かる。さらに、韓国公開特許第２０１４−００９０６７０号（特許文献１）で提示された割合を参考にして１重量％の核酸及び０．１重量％のキトサンを混合した結果、不透明な白い沈殿が生じ、３日後には、層分離が起こることを確認した。
【００１４】
ヨーロッパ公開特許第２７４５８４９号（特許文献２）では、ポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＰＤＲＮ）とキトサンの組合せについて開示されているが、温度感応性ハイドロゲルを言及していないし、０．００２〜０．２５重量％のポリデオキシリボヌクレオチド及び１〜１０重量％のキトサンを含むものであって、本発明の構成と差があることが分かる。
【００１５】
また、米国公開特許第２０１５−０１１１８３４号（特許文献３）では、インサイチュ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）ゲルの組成物について開示しており、常温でのゲル化の防止のために、ゲル防止剤を入れることで、本発明の構成と差があることが分かる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】韓国公開特許第２０１４−００９０６７０号
【特許文献２】ヨーロッパ公開特許第２７４５８４９号
【特許文献３】米国公開特許第２０１５−０１１１８３４号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｒｏｈｉｎｄｒａ  Ｄ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４
【非特許文献２】Ｈｗａｎｇ  Ｊｕｎｓｅｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８
【非特許文献３】Ｈｏｆｆｍａｎ  Ａ．Ｓ．，  ２００２
【非特許文献４】Ｗａｒｄ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１
【非特許文献５】Ｂｅｒｇｅｒ  Ｊ．  ｅｔ．ａｌ．，  ２００４
【非特許文献６】Ａｕｇｓｔ  Ａ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献７】Ｂｏｄｕｇｏｚ−Ｓｅｎｔｕｒｋ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９
【非特許文献８】Ｊｉｎ  Ｒ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５
【非特許文献９】Ｍａｈｏｎｅｙ  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献１０】Ｐａｒｋ  Ｊｕｎｇｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５
【非特許文献１１】Ｕｍ  Ｓ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献１２】Ｘｉｎｇ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１
【非特許文献１３】Ｌｅｅ  Ｊｏｎｇｂｅｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、核酸及びキトサンを含む温度感応性ハイドロゲル組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、核酸及びキトサンを含み、核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１である温度感応性ハイドロゲルに関する。
【００２０】
好ましくは、核酸及びキトサンの重量比が５０：１〜２０００：１であり、最も好ましくは、核酸及びキトサンの重量比が１００：１〜１０００：１である温度感応性ハイドロゲル組成物でありうる。
【００２１】
前記核酸の含有量は、組成物の総重量を基準として０．０１重量％〜３重量％でありうる。
【００２２】
前記核酸は、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＮＡ）、リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＲＮＡ）またはこれらの混合物でありうる。
【００２３】
前記キトサンの含有量は、組成物の総重量を基準として、１×１０−６重量％〜０．１５重量％でありうる。
【００２４】
前記キトサンの分子量は、３ｋＤａ〜１，０００ｋＤａでありうる。
【００２５】
また、前記温度感応性ハイドロゲルは、高分子物質を追加成分として含むことができる。
【００２６】
前記高分子物質は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリガンマグルタミン酸（ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリアミノ酸（ｐｏｌｙａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、アルジネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、これらの誘導体及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上でありうる。
【００２７】
また、本発明は、１）核酸の貯蔵溶液を製造するステップ；２）キトサン貯蔵溶液を製造するステップ；３）前記ステップ１）の核酸の貯蔵溶液及び前記ステップ２）のキトサン貯蔵溶液を核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１となるように混合して攪拌するステップ；及び４）前記ステップ３）の核酸−キトサン混合液を攪拌しながら常温に下げるステップ；を含む温度感応性ハイドロゲル組成物の製造方法に関するものである。
【００２８】
前記製造方法は、１）核酸を緩衝溶液（ｂｕｆｆｅｒ）に入れて、６０℃〜７０℃で攪拌しながら１時間〜２時間溶解させて核酸貯蔵溶液を製造するステップ；２）キトサンを酸性緩衝溶液に溶解させてキトサン貯蔵溶液を製造するステップ；３）前記ステップ１）の核酸の貯蔵溶液と、前記ステップ２）のキトサン貯蔵溶液を核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１になるように混合して５５℃〜６５℃で１時間〜２時間攪拌するステップ；及び４）前記ステップ３）の核酸−キトサン混合液を攪拌しながら常温に下げるステップ；を含むことができる。
【００２９】
前記温度感応性ハイドロゲル組成物の浸透圧が１００ｍＯｓｍ〜５００ｍＯｓｍであり、ｐＨが６〜８になるようにする温度感応性ハイドロゲル組成物の製造方法である。
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
前記温度感応性ハイドロゲルとは、温度によってゾル（ｓｏｌ）がゲル（ｇｅｌ）またはゲルがゾルに相転移（ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）が起こるハイドロゲルを称するものであり、ゾルがゲルに変わる現象をゲル化（ｇｅｌａｔｉｏｎ）といい、本発明でのゲル化は、粘弾性を有し、温度が増加するにつれて、高分子が３次元網構造を形成して、溶媒に溶けずに残留する状態になるものとして定義する。
【００３２】
前記核酸及びキトサンを含む温度感応性ハイドロゲル組成物は、核酸及びキトサンの配合割合によってゾル−ゲル転移温度が変わることができ、この際、使用する目的によって配合割合を変えてゾル−ゲル転移温度を調節することができる。
【００３３】
前記核酸及びキトサンを含む温度感応性ハイドロゲル組成物は、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）の状態を維持し、層分離が起こらない安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が高いものであって、核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１の範囲のものが好ましく、核酸及びキトサンの重量比が５０：１〜２０００：１の範囲のものがより好ましく、核酸及びキトサンの重量比が１００：１〜１０００：１の範囲のものが最も好ましい。
【００３４】
前記核酸の含有量が組成物の総重量を基準として０．０１  重量％〜３重量％であることができ、好ましくは  ０．１重量％〜２重量％であり、最も好ましくは１重量％〜１．５重量％でありうる。
【００３５】
前記核酸の分子量は、１ｋＤａ〜１００，０００ｋＤａでありうる。好ましくは１０ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａであり、最も好ましくは５０ｋＤａ〜３，５００ｋＤａでありうる。
【００３６】
前記核酸は、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＮＡ）、リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＲＮＡ）、またはこれらの混合物でありうる。好ましくは、デオキシリボ核酸でありうる。
【００３７】
また、前記デオキシリボ核酸は、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、及びポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＰＤＲＮ）でありうる。
【００３８】
前記核酸は、キトサンとの結合を通じてハイドロゲルを形成することができ、体内での治療薬物として作用することができる。
【００３９】
また、前記キトサンの含有量は、組成物の総重量を基準として、１×１０−６重量％〜０．１５重量％であることができ、好ましくは、１×１０−５重量％〜０．１重量％であり、最も好ましくは、１×１０−４重量％〜０．０７５重量％でありうる。
【００４０】
前記キトサンの分子量は、３ｋＤａ〜１，０００ｋＤａのものが好ましいが、これに限定されるものではない。  
【００４１】
また、前記温度感応性ハイドロゲル組成物には、高分子物質を追加成分として含むことができ、この際の高分子物質は、核酸及びキトサンを含む温度感応性ハイドロゲルの使用用途に従う物性変化の調整を強固にするために追加することができる。
【００４２】
前記高分子物質には、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリガンマグルタミン酸（ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリアミノ酸（ｐｏｌｙａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、アルジネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、これらの誘導体、及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上が使用できるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
また、前記温度感応性ハイドロゲル組成物は、医療用や化粧用として用いることができる。
【００４４】
前記温度感応性ハイドロゲルの製造方法は、１）核酸を緩衝溶液（ｂｕｆｆｅｒ）に入れて、６０℃〜７０℃で攪拌しながら１時間〜２時間の間溶解させて、核酸の貯蔵溶液を製造するステップ；２）キトサンを酸性緩衝溶液に溶解させてキトサン貯蔵溶液を製造するステップ；３）前記ステップ１）の核酸の貯蔵溶液、及び前記ステップ２）のキトサン貯蔵溶液を核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１となるように混合して５５℃〜６５℃で１時間〜２時間攪拌するステップ；及び４）前記ステップ３）の核酸−キトサン混合液を攪拌しながら常温に下げるステップ；を含む製造方法である。
【００４５】
前記核酸の貯蔵溶液の製造時に用いることができる緩衝溶液としては、二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｏｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ）、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、塩化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、塩化  カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）、またはＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝溶液があり、好ましくは、二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｏｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
前記キトサン貯蔵溶液の製造時に用いられる酸性緩衝溶液としては、酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、塩酸（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、乳酸（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、硝酸（ｎｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）があり、好ましくは、酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００４７】
前記核酸及びキトサンの混合は、核酸及びキトサンの重量比が２０：１〜１００００：１となるように混合し、この際、核酸の含有量が組成物の総重量を基準として０．０１重量％〜３重量％になり、キトサンの含有量が組成物の総重量を基準として、１×１０−６重量％〜０．１５重量％になるようにすることが好ましい。
【００４８】
前記製造方法により製造された温度感応性ハイドロゲル組成物は、浸透圧及びｐＨが人体内に注入または皮膚に塗布することができるように調節できる。
【００４９】
前記製造方法により製造された温度感応性ハイドロゲル組成物のｐＨを調節するために、製造方法のステップのうち、前記ステップ４）にｐＨを調節するステップをさらに含むことができる。
【００５０】
前記製造方法により製造された温度感応性ハイドロゲル組成物の浸透圧は１００ｍＯｓｍ〜５００ｍＯｓｍであることができ、好ましくは１５０ｍＯｓｍ〜４５０ｍＯｓｍであり、最も好ましくは２００ｍＯｓｍ〜４００ｍＯｓｍでありうる。
【００５１】
前記製造方法により製造された温度感応性ハイドロゲル組成物のｐＨは６〜８であることができ、好ましくはｐＨが６．５〜７．５であり、最も好ましくは、ｐＨが７でありうる。
【発明の効果】
【００５２】
本発明は、核酸及びキトサンを含む温度感応性ハイドロゲル組成物を提供する。前記のハイドロゲルは、生体適合性と生体安定性に優れ、かつ温度変化によるゾル−ゲル相転移（ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の性質を帯びているので、常温ではゾルの状態で存在してから人体内注入または表皮皮膚の表面に塗布して温度が高くなれば、ゲル化される。
【００５３】
したがって、本発明の温度感応性ハイドロゲルは、治療を必要とする特定の部位に直接的な注入及び塗布が可能であり、温度に従うゲル化を通じて薬物の滞留及び付着時間を高めることによって、薬効を十分に発揮するようにすることができるので、様々な治療に活用できることと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】核酸及びキトサンの混合割合に従う温度感応性ハイドロゲルの物性状態を確認した結果である。各々の組成物を混合した後、３日間、透明度と粘弾性有無（Ａ）及び沈殿物の生成及び層分離有無（Ｂ）を確認した。
【図２】ゲルの溶解性有無を確認した結果を示している。
【図３】温度感応性ハイドロゲル組成物のゾル−ゲル転移を確認した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。
むしろ、ここで紹介される内容が徹底し、完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
＜実施例１．核酸−キトサンハイドロゲルの製造＞
【００５６】
核酸−キトサンハイドロゲルを製造するために、核酸及びキトサン貯蔵溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を以下の表１の実施例に該当する濃度で準備した。この際、核酸の場合、２００ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｏｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ）緩衝溶液に入れて６５℃の熱攪拌機を用いて１時間以上溶解させた。
【００５７】
キトサンは、１００ｍＭ酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を用いて溶解させた。
【００５８】
以下の表１の濃度で準備した核酸及びキトサン貯蔵溶液を１：１の重量比で混合して、６０℃の熱攪拌機で１時間撹拌した。その後、温度を常温に下げ、１時間攪拌して、核酸−キトサンハイドロゲルを製造した。
＜比較例１、比較対象の核酸−キトサンハイドロゲルの製造＞
【００５９】
以下の表１の比較例に該当する濃度条件で核酸及びキトサン貯蔵溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を準備した。実施例１の方法と同様に、比較対象核酸−キトサンハイドロゲルを製造した。
【００６０】
【表１】
2019501928.tif 000003
【００６１】
＜実施例２．核酸−キトサン−ヒアルロン酸ハイドロゲルの製造＞
【００６２】
核酸−キトサン−ヒアルロン酸ハイドロゲルは、次のような過程を経て製造した。
【００６３】
核酸は、２．２重量％の濃度になるように２００ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｏｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ）緩衝溶液に溶解させた。この際、６５℃の熱攪拌機を用いて１時間以上溶解させた。
【００６４】
キトサンは、０．４重量％濃度になるように１００ｍＭ酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）に溶解させた。
【００６５】
ヒアルロン酸ナトリウムは、２重量％の濃度になるように２００ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｏｄｅｃａｈｙｃｒａｔｅ）緩衝溶液に溶解させた。この際、４０℃の熱攪拌機を用いて３０分間溶解させた後、攪拌機で攪拌させながら常温になるように冷ました。
【００６６】
準備した２．２重量％の核酸と０．４重量％のキトサン溶液を９：１の重量比で混合して６５℃の熱撹拌機で１０分間攪拌した。核酸−キトサン混合溶液に２重量％のヒアルロン酸ナトリウムを１：１の重量比で追加混合して６５℃の熱攪拌機で１時間攪拌した後、撹拌を維持しながら、常温になるように冷まして実施例２の核酸−キトサン−ヒアルロン酸ハイドロゲルを製造した。
【００６７】
＜比較例２．比較対象キトサン−ヒアルロン酸ハイドロゲルの製造＞
【００６８】
キトサン及びヒアルロン酸貯蔵溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を以下の表２の濃度で準備した。
【００６９】
キトサンは、１００ｍＭ酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を用いて溶解させた。
【００７０】
ヒアルロン酸ナトリウムは、２００ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｏｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ）緩衝溶液に溶解させた。この際、４０℃の熱攪拌機を用いて３０分間溶解させた後、撹拌を維持しながら、常温になるように冷ました。
【００７１】
準備したキトサンとヒアルロン酸溶液を１：１の重量比で混合して、６５℃の熱攪拌機で１時間の間撹拌した。その後、温度を常温に下げ、１時間攪拌してキトサン−ヒアルロン酸ハイドロゲルを製造した。
【００７２】
【表２】
2019501928.tif 000004
【００７３】
＜実験例１．核酸−キトサンハイドロゲルの物性確認＞
【００７４】
実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２のハイドロゲル組成物を用いてゲル化、ゲルの安定性及び溶解性有無を確認した。
【００７５】
各々の組成物を混合した後、３日間、透明度とゲル化状態を肉眼で観察し、ゲル化は粘弾性有無を、ゲルの安定性は沈殿物の生成及び層分離有無で確認した。
【００７６】
ゲルの溶解性有無は、３７．５℃の水溶液に、実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２のハイドロゲル組成物を点滴してゲル化させた後、温度を  ３７．５℃に維持しながら４００ｒｐｍで５分間攪拌しながらゲルの溶解有無を確認し、その結果を表３、図１、及び図２に示した。
【００７７】
【表３】
2019501928.tif 000005
【００７８】
前記表３及び図１を見ると、実施例１−１〜実施例１−１１の温度感応性ハイドロゲル組成物の場合には、核酸及びキトサンを混合してから３日が経過しても沈殿物分離及び層分離現象が表れないながらも粘弾性を維持していることが分かる。しかしながら、比較例１−１〜比較例１−４のように、本発明の核酸及びキトサンの重量比を外れる場合には、沈殿物が生成され、層分離が起こるとか、粘弾性が表れなかった。
【００７９】
また、＜表３＞及び図２のゲルの溶解性を見ると、実施例１−１〜実施例１−１１の温度感応性ハイドロゲル組成物は、３７．５℃でゲルを形成し、形成されたゲルが持続的に維持される一方、比較例１−１〜比較例１−４は、３７．５℃でゲル化されないか、またはゲル化されたとしても２０秒以内にすべて溶解されることが分かった。
【００８０】
核酸及びキトサンに追加成分としてヒアルロン酸が含まれた実施例２の場合にも、沈殿物分離及び層分離現象が表れないながらも粘弾性を維持し、ゲル化された後、持続的なゲルを維持している一方、比較例２−２のように核酸が含まれていない場合には、粘弾性を有し、沈殿物分離及び層分離現象が表れなかったが、３７．５℃でゲルが形成された後、２０秒以内に溶解されることを確認した（表３及び図１を参照）。
【００８１】
これによって、本発明のハイドロゲル組成物が温度感応性質を示し、安定性が高く、ゲル化された後にゲルの形態を持続的に維持することが分かり、この際、核酸及びキトサンの重量比が重要な役割をすることを確認した。
【００８２】
＜実験例２．温度に従うゾル−ゲル転移（ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を確認＞
【００８３】
実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２で製造したハイドロゲル組成物を用いて、ゾル−ゲル転移を確認した。
【００８４】
ゾル−ゲル転移を確認するためにレオメーター（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を用いた。この際、使用した測定条件は、ＰＵ２０、間隔（Ｇａｐ）０．５ｍｍ、０．１Ｈｚ、１％応力−ひずみ（ｓｔｒｅｓｓ  ｓｔｒａｉｎ）で２４℃から４０℃まで１℃ずつ上げながら１分間維持させてＧ’（弾性）及びＧ”（粘性）の変化を測定した。また、各々の組成物に温度を加えて、３６℃前・後のゾル−ゲル転移を肉眼で観察し、その結果を図３に示した。
【００８５】
図３に示すように、実施例１−３の温度感応性ハイドロゲル組成物が、温度感応性ハイドロゲルが有する特徴である、温度が増加するにつれてＧ’（弾性）の減少幅が緩やかでＧ”（粘性）が上昇する（図３Ａ）性質を示すことを観察した。また、実施例１−３の温度感応性ハイドロゲル組成物が３６℃未満の温度では、ゾルの形態を帯びる一方、３６℃を超えるとゲル化されることを観察した（図３Ｂ）。このような結果は、実施例１及び実施例２の温度感応性ハイドロゲル組成物の両方とも同一に表れることを確認した。これを通じて、本発明のハイドロゲル組成物が温度感応性の性質を示すことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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