(57)【要約】  本発明は、高周波数で可逆的に光スイッチング可能である蛍光種（Ｐ）を検出する方法に関し、より詳細には、少なくとも１つの可逆的光スイッチング蛍光種を検出する方法であって、波長λ１であり、且つ角周波数ωで周期的に変調される第１の照明光線（ＦＥＸ１）及び角周波数ωで周期的に変調される、λ１と異なる波長λ２の第２の照明光線（ＦＥＸ２）を用いて、可逆的光スイッチング蛍光種を含有する試料を照明することを含むステップを含み、第２の照明光線は、前記第１の照明光線に対して逆位相で変調される、方法に関する。
2019532280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）を検出する方法であって、
（ａ）波長λ１であり、且つ角周波数ωで周期的に変調される第１の照明光線（ＦＥＸ１）及び前記角周波数ωで周期的に変調される、λ１と異なるλ２の第２の照明光線（ＦＥＸ２）を用いて、前記少なくとも１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種を含有する試料を照明するステップと、
（ｂ）そうして照明された前記試料によって発せられた蛍光放射線（ＦＬＵ）を検出するステップと、
（ｃ）前記周期的に変調される第１の照明光線（ＦＥＸ１）と同じ周期性を有し、且つ前記周期的に変調される第１の照明光線（ＦＥＸ１）と直交する位相である前記蛍光放射線（ＦＬＵ）の強度の成分から振幅（ＩＦｏｕｔ）を抽出するステップと
を含み、
・前記第２の照明光線（ＦＥＸ２）は、前記第１の照明光線（ＦＥＸ１）に対して逆位相に変調され、及び
・前記第１の照明光線（ＦＥＸ１）の平均強度、前記第２の照明光線（ＦＥＸ２）の平均強度及びそれらの角周波数ωは、前記蛍光放射線（ＦＬＵ）の前記強度成分の前記振幅の最大に近づくように選択される、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）は、第１の化学状態及び第２の化学状態を有し、前記状態の少なくとも一方は、蛍光であり、前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）又は前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）のそれぞれは、第１の光誘導反応を介して前記第１の状態から前記第２の状態に変換可能であり、次に第２の光誘導反応を介して前記第１の状態に戻ることが可能であり、前記第１の照明光線は、平均強度
【数１】
2019532280.tif 000116
を有し、且つ角周波数ωで変調され、及び前記第２の照明光線は、平均強度
【数２】
2019532280.tif 000117
を有し、
【数３】
2019532280.tif 000118
であり、式中、
【数４】
2019532280.tif 000119
は、それぞれ前記第１の照明光線（ＦＥＸ１）によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数であり、
【数５】
2019532280.tif 000120
は、それぞれ前記第２の照明光線（ＦＥＸ２）によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の照明光線（ＦＥＸ１）の前記平均強度、前記第２の照明光線（ＦＥＸ２）の前記平均強度及びそれらの角周波数ωは、前記蛍光放射線（ＦＬＵ）の前記強度成分の前記振幅と、干渉種によって生成されるものと同じ周期性を有する蛍光強度成分の振幅との間の最小コントラストを保証するようにも選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
異なる動力学的性質を有する少なくとも２つの可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）を検出する方法であって、
（ａ）波長λ１であり、且つ角周波数ωｉで変調される少なくとも２つの第１の照明成分を合算する第１の関数を用いて周期的に変調される第１の照明光線（ＦＥＸ１）を用いて、前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）のそれぞれを含有する試料を照明することであって、前記第１の照明成分のそれぞれの前記角周波数ωｉのそれぞれは、１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）と関連付けられ、且つ１つ又は複数の他の前記角周波数ωｉと異なる、照明することと、λ１と異なる波長λ２であり、且つ前記角周波数ωｉで変調される少なくとも２つの第２の照明成分を合算する第２の関数を用いて周期的に変調される第２の照明光線（ＦＥＸ２）を用いて前記試料を照明することであって、前記第２の照明成分のそれぞれの前記角周波数ωｉのそれぞれは、前記第１の照明成分の前記角周波数ωｉに等しい、照明することとを行うステップと、
（ｂ）そうして照明された前記試料によって発せられた蛍光放射線（ＦＬＵ）を検出するステップと、
（ｃ）前記照明成分のそれぞれと同じ角周波数ωｉを有し、且つ前記第１の照明成分のそれぞれと直交する位相である前記蛍光放射線の強度の成分の各振幅（ＩＦｏｕｔ）を抽出するステップと
を含み、
・前記角周波数ωｉのそれぞれについて、前記角周波数ωｉで変調された前記第２の照明成分のそれぞれは、前記角周波数ωｉで変調された前記第１の照明成分のそれぞれと逆位相であり、及び
・前記第１の照明光線（ＦＥＸ１）の平均強度、前記第２の照明光線（ＦＥＸ２）の平均強度及び前記角周波数は、前記蛍光放射線の前記強度成分の前記振幅のそれぞれの最大に近づくように選択される、方法。
【請求項５】
前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）のそれぞれは、第１の化学状態及び第２の化学状態を有し、前記状態の少なくとも一方は、蛍光であり、前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）のそれぞれは、第１の光誘導反応を介して前記第１の状態から前記第２の状態に変換可能であり、次に第２の光誘導反応を介して前記第１の状態に戻ることが可能であり、前記第１の照明光線（ＦＥＸ１）は、平均強度
【数６】
2019532280.tif 000121
を有し、且つ前記第１の関数で周期的に変調され、及び前記第２の照明光線（ＦＥＸ２）は、平均強度
【数７】
2019532280.tif 000122
を有し、前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）のそれぞれについて、
【数８】
2019532280.tif 000123
であり、式中、
【数９】
2019532280.tif 000124
は、それぞれ前記種を照明する前記第１の照明光線（ＦＥＸ１）によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数であり、
【数１０】
2019532280.tif 000125
は、それぞれ前記第２の照明光線（ＦＥＸ２）によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）に対応する前記角周波数ωｉのそれぞれについて、
【数１１】
2019532280.tif 000126
であり、式中、
【数１２】
2019532280.tif 000127
は、それぞれ前記種を照明する前記第１の光線（ＦＥＸ１）によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの前記角周波数ωｉ間の比率は、厳密に１０よりも高い、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップａ）において、前記試料は、少なくとも１つの実質的に単色の照明光線によって照明される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップｂ）及びｃ）は、前記蛍光放射線の同期検出を介して実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｄ）前記ステップｃ）において抽出される前記蛍光放射線の前記強度の前記成分から前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）又は少なくとも１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）の濃度を特定するステップ
も含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記可逆的光スイッチング蛍光種又は少なくとも１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種は、
−  フォトクロミック蛍光タンパク質、及び
−  蛍光プローブとの生体分子の複合体
から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料は、生体材料を含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記照明光線（ＦＥＸ）は、ある量の日光を含み、前記量の日光は、前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）によって受け取られる光強度に含まれるが、前記照明光線（ＦＥＸ１、ＦＥＸ２）の前記平均強度以下のままである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の検出方法を実施する蛍光撮像方法。
【請求項１５】
前記試料は、生体を含み得、前記可逆的光スイッチング蛍光種（Ｐ）の存在及び濃度から選択される少なくとも１つの要素は、前記生体の試料をとることなく、前記ステップｃ）において抽出される前記蛍光放射線の前記強度の前記成分に基づいて測定される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高周波数で可逆的に光スイッチング可能な蛍光種を検出する方法に関する。そのような方法は、特に化学、生物学並びに環境測定及びスクリーニングの分野において多くの用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
用語「種」は、分子又は複合体等の化学種又はナノ粒子等の物体を意味するものと理解される。表現「可逆的に光スイッチング可能」は、異なる蛍光特性を有する少なくとも２つの別個の状態を有し、光の作用下である状態から別の状態に遷移させ得る種を意味するものと理解される。可逆的光スイッチング蛍光種の例は、タンパク質「Ｄｒｏｎｐａ」及び複合体「Ｓｐｉｎａｃｈ−ＤＦＨＢＩ」である（「Ｓｐｉｎａｃｈ」は、ＲＮＡアプタマーであり、ＤＦＨＰＩは、蛍光プローブである）。これらの種は、特にプローブ又はマーカーとして使用され得る。可逆性スイッチング蛍光種の他の例は、アゾ誘導体又は実際にタンパク質骨格であり得る。
【０００３】
蛍光撮像、特に蛍光顕微鏡法は、生物学のみならず、材料科学等の他の分野でも必須のツールになった。しかしながら、その用途は、蛍光又はノイズの背景において対象信号を観測する能力によって制限されている。この問題は、検出される蛍光マーカーが複雑な自家蛍光及び／又は散乱媒体内に拡散し、したがって、有用な信号が強い背景ノイズに隠される、動物又は植物のインビボ撮像用途で特に深刻である。
【０００４】
蛍光撮像及び検出技法における別の制限は、可視スペクトル帯の幅に対する、一般に利用されるフルオロフォアのスペクトル帯の幅にあり、放射線スペクトルが重なる傾向があるため、同じ試料内の５つ以上の蛍光マーカーを選択的に検出することが難しい。
【０００５】
これらの制限を解消するために、本願国際公開第２０１５０７５２０９  Ａ１号パンフレット及びＪ．Ｑｕｅｒａｒｄらによる論文“Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｓｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｄｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，２６６−２６３７（２０１５）は、可逆的光スイッチング蛍光種を使用した方法を開示しており、その方法では、光スイッチング蛍光種を含む試料は、周期的に変調される光波で照明される。次に、同じ角周波数においてフルオロフォアによって発せられた強度の成分は、励起波と直交する位相で検出される。この方法では、フルオロフォアの特性に応じて分析的に計算される特定の状況下において、自家蛍光及び／又は試料の媒体内への拡散によって従来の方法で生成されるノイズを最小に抑えながら、特定の可逆的光スイッチングフルオロフォアを選択的に検出することができる。この方法の問題の１つは、連続画像の取得周波数にある。従来技術で使用される様々な可逆的光スイッチング蛍光種は、活性状態から初期の非活性状態に遷移するように熱的に誘導され、この遷移の特徴的な時間は、例えば、５秒〜１０秒であり、この方法を使用して画像を取得する時間に対応する。この時間尺度は、相当な生物学的に妥当な数の測定を得るには長すぎる。
【０００６】
別の従来技術による技法は、Ｙｅｎ−Ｃｈｅｎｇ  Ｃｈｅｎらによる論文（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ．，Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ，Ａ．Ｅ．，Ｉｓｓａｅｖａ，Ｉ．，Ｂｏｕｒａｓｓａ，Ｄ．，Ｈｓｉａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｆａｈｒｎｉ，Ｃ．Ｊ．，＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，２０１５，Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｙｉｅｌｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３７（４０），１２７６４−１２７６７）に開示されており、この論文は、異なる励起波長の２つの単色レーザ光源を使用して、可逆的光スイッチング蛍光種のヘテロダイン励起を達成するフルオロフォア検出方法を提案している。この技法は、種の蛍光の測定パラメータの経験的選択を提案し、これは、このタイプの測定を容易に他の種に置き換えることを妨げる。加えて、可逆的光スイッチング蛍光種の測定中の信号対雑音比は最適でない。最後に、開示された方法は、２つの可逆的光スイッチング蛍光種を同時に観測する方法を当業者に示していない。
【０００７】
可逆的光変換可能プローブの時間的ダイナミックレンジ  −  可逆的光変換可能プローブの時間的ダイナミックレンジに固有であり、干渉するフルフォロフォアのものと異なる  −  を利用して、背景ノイズから有用な信号を抽出できるようにする更に別の従来技術による技法は、光学ロックイン検出（ＯＬＩＤ）として知られている。この技法は、Ｇ．Ｍａｒｒｉｏｔｔらによる論文“Ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｃｋ−ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０５，ｎ°４６，ｐａｇｅｓ  １７７８９−１７７９４（１８  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８）及びＹ．Ｙａｎらによる論文“Ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｃｋ−ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＯＬＩＤ）ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（２０１１），４１１−４２２、並びにＣ．Ｐｅｔｃｈｐｒａｙｏｏｎらによる論文“Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｃｋ−ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＯＬＩＤ）ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９（２０１１），１０３０−１０４０に記載されている。この技法の１つの欠点は、可逆的光変換可能フルオロフォアの濃度についての定量的情報を与えないことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０７５２０９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｑｕｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．“Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｓｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｄｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，２６６−２６３７（２０１５）
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ．，Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ，Ａ．Ｅ．，Ｉｓｓａｅｖａ，Ｉ．，Ｂｏｕｒａｓｓａ，Ｄ．，Ｈｓｉａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｆａｈｒｎｉ，Ｃ．Ｊ．，＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，２０１５，Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｙｉｅｌｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３７（４０），１２７６４−１２７６７
【非特許文献３】Ｇ．Ｍａｒｒｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．“Ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｃｋ−ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０５，ｎ°４６，ｐａｇｅｓ  １７７８９−１７７９４（１８  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８）
【非特許文献４】Ｙ．Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｃｋ−ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＯＬＩＤ）ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（２０１１），４１１−４２２
【非特許文献５】Ｃ．Ｐｅｔｃｈｐｒａｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｌｏｃｋ−ｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＯＬＩＤ）ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９（２０１１），１０３０−１０４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来技術の上記欠点を改善することを目的とし、特に、
・複数の異なるフルオロフォアを区別しながら試料を撮像し、
・自家蛍光／散乱ノイズを除去することを可能にする技法を使用して、フルオロフォアが高周波数で撮像されることを可能にし、
・一般に、混合物中の１つ又は複数の蛍光プローブを選択的且つ定量的に撮像することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的を部分的又は全体的に達成することができる本発明の１つの主題は、少なくとも１つの可逆的光スイッチング蛍光種を検出する方法であって、
（ａ）波長λ１であり、且つ角周波数ωで周期的に変調される第１の照明光線及び前記角周波数ωで周期的に変調される、λ１と異なるλ２の第２の照明光線を用いて、前記少なくとも１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種を含有する試料を照明するステップと、
（ｂ）そうして照明された前記試料によって発せられた蛍光放射線を検出するステップと、
（ｃ）前記周期的に変調される第１の照明光線と同じ周期性を有し、且つ前記周期的に変調される第１の照明光線と直交する位相である前記蛍光放射線の強度の成分から振幅を抽出するステップと
を含み、
・前記第２の照明光線は、前記第１の照明光線に対して逆位相に変調され、及び
・前記第１の照明光線の平均強度、前記第２の照明光線の平均強度及びそれらの角周波数ωは、前記蛍光放射線の強度成分の前記振幅の最大に近づくように選択される、方法である。例えば、振幅は、最大の少なくとも７５％、好ましくは８０％、更に好ましくは９０％に等しい値を有し得る。
【００１２】
そのような方法の特定の一実施形態によれば、少なくとも１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種は、第１の化学状態及び第２の化学状態を有し得、前記状態の少なくとも一方は、蛍光であり、前記可逆的光スイッチング蛍光種又は前記可逆的光スイッチング蛍光種のそれぞれは、第１の光誘導反応を介して前記第１の状態から前記第２の状態に変換可能であり、次に第２の光誘導反応を介して前記第１の状態に戻ることが可能であり、前記第１の照明光線は、平均強度
【数１】
2019532280.tif 000003
を有し得、且つ角周波数ωで変調され得、及び前記第２の照明光線は、平均強度
【数２】
2019532280.tif 000004
を有し得、
【数３】
2019532280.tif 000005
であり、式中、
【数４】
2019532280.tif 000006
は、それぞれ前記第１の照明光線によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数であり、
【数５】
2019532280.tif 000007
は、それぞれ前記第２の照明光線によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数である。
【００１３】
更に、前記第１の照明光線の前記平均強度、前記第２の照明光線の前記平均強度及びそれらの角周波数ωは、前記蛍光放射線の強度成分の前記振幅と、干渉種によって生成されるものと同じ周期性を有する蛍光強度成分の振幅との間の最小コントラストを保証するようにも選択され得る。
【００１４】
本発明の別の主題は、異なる動力学的性質を有する少なくとも２つの可逆的光スイッチング蛍光種を検出する方法であって、
（ａ）波長λ１であり、且つ角周波数ωｉで変調される少なくとも２つの第１の照明成分を合算する第１の関数を用いて周期的に変調される第１の照明光線を用いて、前記可逆的光スイッチング蛍光種のそれぞれを含有する試料を照明することであって、前記第１の照明成分のそれぞれの前記角周波数ωｉのそれぞれは、１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種と関連付けられ、且つ１つ又は複数の他の前記角周波数ωｉと異なる、照明することと、λ１と異なる波長λ２であり、且つ前記角周波数ωｉで変調される少なくとも２つの第２の照明成分を合算する第２の関数を用いて周期的に変調される第２の照明光線を用いて試料を照明することであって、前記第２の照明成分のそれぞれの前記角周波数ωｉのそれぞれは、前記第１の照明成分の前記角周波数ωｉに等しい、照明することとを行うステップと、
（ｂ）そうして照明された前記試料によって発せられた蛍光放射線（ＦＬＵ）を検出するステップと、
（ｃ）前記照明成分のそれぞれと同じ角周波数ωｉを有し、且つ前記第１の照明成分のそれぞれと直交する位相である前記蛍光放射線の強度の成分の各振幅（代数）を抽出するステップと
を含み、
・前記角周波数ωｉのそれぞれについて、前記角周波数ωｉで変調された前記第２の照明成分のそれぞれは、前記角周波数ωｉで変調された前記第１の照明成分のそれぞれと逆位相であり、及び
・前記第１の照明光線の平均強度、前記第２の照明光線の平均強度及び前記角周波数は、前記蛍光放射線の強度成分の前記振幅のそれぞれの最大に近づくように選択される、方法である。
【００１５】
そのような方法の特定の実施形態によれば、
−  前記可逆的光スイッチング蛍光種のそれぞれは、第１の化学状態及び第２の化学状態を有し得、前記状態の少なくとも一方は、蛍光であり、前記可逆的光スイッチング蛍光種のそれぞれは、第１の光誘導反応を介して前記第１の状態から前記第２の状態に変換可能であり、次に第２の光誘導反応を介して前記第１の状態に戻ることが可能であり、前記第１の照明光線は、平均強度
【数６】
2019532280.tif 000008
を有し得、且つ前記第１の関数で周期的に変調され得、及び前記第２の照明光線は、平均強度
【数７】
2019532280.tif 000009
を有し得、前記可逆的光スイッチング蛍光種のそれぞれについて、
【数８】
2019532280.tif 000010
であり、式中、
【数９】
2019532280.tif 000011
は、それぞれ前記種を照明する前記第１の照明光線によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数であり、
【数１０】
2019532280.tif 000012
は、それぞれ前記第２の照明光線によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数である。
−  １つの前記可逆的光スイッチング蛍光種に対応する前記角周波数ωｉのそれぞれについて、
【数１１】
2019532280.tif 000013
が可能であり、式中、
【数１２】
2019532280.tif 000014
は、それぞれ前記種を照明する前記第１の光線によって光誘導される前記第１の反応及び前記第２の反応のレート定数である。有利には、少なくとも２つの前記角周波数ωｉ間の比率は、厳密に１０よりも高い。
−  前記ステップａ）において、前記試料は、少なくとも１つの実質的に単色の照明光線によって照明され得る。
−  前記ステップｂ）及びｃ）は、前記蛍光放射線の同期検出を介して実施され得る。
−  本方法は、
ｄ）前記ステップｃ）において抽出される前記蛍光放射線の強度の成分から前記可逆的光スイッチング蛍光種又は少なくとも１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種の濃度を特定するステップ
も含み得る。
−  前記可逆的光スイッチング蛍光種又は少なくとも１つの前記可逆的光スイッチング蛍光種は、フォトクロミック蛍光タンパク質、及び蛍光プローブとの生体分子の複合体から選択される。
−  試料は、生体材料を含有し得る。
【００１６】
本発明の別の主題は、そのような検出方法を実施する蛍光撮像（特に蛍光顕微鏡）方法である。この場合、前記試料は、生体を含み得、前記可逆的光スイッチング蛍光種の存在及び濃度から選択される少なくとも１つの要素は、前記生体の試料をとることなく、前記ステップｃ）において抽出される前記蛍光放射線の強度の成分に基づいて測定され得る。
−  前記照明光線は、ある量の日光を含み、前記量の日光は、前記可逆的光スイッチング蛍光種によって受け取られる光強度に含まれるが、前記照明光線の平均強度以下のままである。
【００１７】
以下の説明のための記載から、本発明がよりよく理解され、本発明の他の利点、詳細、及び特徴が明らかになり、以下の説明のための記載は、添付図面を参照して例として与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明による可逆的光スイッチング蛍光種Ｐを検出する方法を示す。
【図２】従来技術に属する一実施形態の場合における可逆的光スイッチング蛍光種Ｐの応答の理論的な計算を提示するチャートを示す。
【図３】本発明の一実施形態による可逆的光スイッチング蛍光種の応答の理論的な計算を提示するチャートを示す。
【図４】複数の可逆的光スイッチング蛍光種を同じ画像検出において撮像することを可能にする本発明の一実施形態を示す。
【図５】干渉化合物Ｘの存在下での可逆的光スイッチング蛍光種の定量化に対応する数値シミュレーションを示す。
【図６】可逆的光スイッチング蛍光種の組の光学特性を示すグラフである。
【図７】従来技術の実施形態と本発明の一実施形態との実験比較を示す写真の組である。
【図８】本発明の一実施形態による細胞の蛍光画像の検出を示す。
【図９】本発明の一実施形態による方法を実施するシステムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１は、本発明による可逆的光スイッチング蛍光種Ｐを検出する方法を示す。方法は、波長λ１の第１の照明光線ＦＥＸ１及びλ１と異なる波長λ２の第２の照明光線ＦＥＸ２を用いて試料Ｅを照明することを含む。照明光線ＦＥＸ１、ＦＥＸ２のそれぞれは、好ましくは、実質的に単色であり、すなわち、そのスペクトルは、１つの強度最大及び／又は５０ｎｍ以下のスペクトル幅を有する。
【００２０】
可逆的光スイッチング蛍光種Ｐは、光の作用下で交換可能な２つの異なる状態を有する。動力学的挙動を光の作用下での２つの状態間の交換としてモデリングし得るフォトクロミック蛍光種又は任意の他の系の問題であり得、これらの状態は、分子の異なる立体化学構成、複合体の結合／非結合状態等に対応し得る。図１では、第１の状態  −  熱力学的により安定している  −  は、１で示され、中実の正方形で表されており、第２の状態  −  熱力学的により不安定  −  は、２で示され、中空の正方形で表されている。これらの２つの状態は、異なる輝度を有する。簡潔にするために、非限定的な例として、状態１のみを有意な蛍光と見なす。
【００２１】
試料Ｅ、より詳細には試料Ｅが含む種Ｐは、第１の照明光線ＦＥＸ１及び第２の照明光線ＦＥＸ２によって照明されると、蛍光放射線ＦＬＵを発し、蛍光放射線ＦＬＵの強度も変調され、
−  図においてＩＦｉｎで示される、第１の照明光線ＦＥＸ１と同相の成分、及び
−  図においてＩＦｏｕｔで示される、励起ビームと直交する成分
に分解され得る。特許出願国際公開第２０１５０７５２０９  Ａ１号パンフレットは、種Ｐの観測中に成分ＩＦｏｕｔを観測する利点及び根拠を開示している。
【００２２】
可逆的光スイッチング蛍光種Ｐの動力学的挙動は、以下のように記述され得る。波長λ１の第１の照明光線ＦＥＸ１及び波長λ２の第２の照明光線ＦＥＸ２にそれぞれ対応する２つの成分Ｉ１（ｔ）及びＩ２（ｔ）を含む強度Ｉ（ｔ）の光で種Ｐを照明すると、種Ｐの動力学的挙動は、２つの状態間の以下の交換によって記述され得：
【数１３】
2019532280.tif 000015
式中、熱力学的により安定している状態１は、レート定数ｋ１２（ｔ）＝σ１２，１Ｉ１（ｔ）＋σ１２，２Ｉ２（ｔ）で光化学反応によって熱力学的に不安定な状態２に変換され、レート定数
【数１４】
2019532280.tif 000016
で光化学プロセス及び／又は熱的プロセスを介してより安定した初期状態１に戻り得、式中、σ１２，１Ｉ１（ｔ）、σ１２，２Ｉ２（ｔ）、σ２１，１Ｉ１（ｔ）、σ２１，２Ｉ２（ｔ）は、光化学寄与を表し、
【数１５】
2019532280.tif 000017
は、レート定数への熱的寄与を表し、σ１２，１は、光線ＦＥＸ１の照明の場合での状態１から状態２への光変換の断面であり、σ１２，２は、光線ＦＥＸ２の照明の場合での状態１から状態２への光変換の断面であり、σ２１，１は、光線ＦＥＸ１の照明の場合での状態２から状態１への光変換の断面であり、σ２１，２は、光線ＦＥＸ２の照明の場合での状態２から状態１への光変換の断面である。これらの定数の全ては、一緒に種Ｐの挙動を定義する。
【００２３】
系は、均一に照明されると仮定されるか、又は随時均一であると見なされ得る。次に、濃度１（種Ｐの状態１における濃度）及び濃度２（種Ｐの状態２における濃度）の変動は、以下の連立方程式によって記述され得る。
【数１６】
2019532280.tif 000018
【００２４】
試料Ｅが波長λ１及びλ２の２つの連続照明源によってそれぞれ急に照明されると考えると、照明は、強度
【数１７】
2019532280.tif 000019
を特徴とし、レート定数は、
【数１８】
2019532280.tif 000020
の形態で記述され得、式中、
【数１９】
2019532280.tif 000021
である。
【００２５】
初期状態が種１のみを含むと考えると、濃度１及び２は、以下：
【数２０】
2019532280.tif 000022
のように変動し、式中、
【数２１】
2019532280.tif 000023
は、可逆的光スイッチングフルオロフォアの緩和時間に対応し、１０及び２０は、時間
【数２２】
2019532280.tif 000024
において達成される光平衡状態における濃度１及び２に対応する。したがって、
【数２３】
2019532280.tif 000025
であり、式中、
【数２４】
2019532280.tif 000026
であり、種Ｐの総濃度は、Ｐｔｏｔ＝１＋２である。
【００２６】
可逆的光スイッチング蛍光種Ｐが、本発明の実施形態に対応して、２つの周期的に変調される光線ＦＥＸ１、ＦＥＸ２を受けたとき、可逆的光スイッチング蛍光種Ｐの蛍光放射又は蛍光放射線ＦＬＵに関して応答を分析することが可能である。
【００２７】
一般に、可逆的光スイッチング蛍光種Ｐが、対応する２つの成分を含む照明：波長λ１における周期照明Ｉ１（ｔ）及び波長λ２における照明Ｉ２（ｔ）を受ける場合、前記照明は、一定であり得（これは、本発明によらない一実施形態に対応する）、又は周期的に変調し得る（これは、本発明の実施形態に対応する）。最も一般的な場合、
Ｉ（ｔ）＝Ｉ１（ｔ）＋Ｉ２（ｔ）  （３５）
及び
【数２５】
2019532280.tif 000027
と記述することが可能であり、ｊ＝１又は２である。式（３６）では、、αは、光変調の振幅に対応し、ｈｊ（ｔ）は、周期関数に対応する。式（４）及び（５）は、ここで、
【数２６】
2019532280.tif 000028
になる。関数ｆ（ｔ）を導入することにより、以下のように濃度について式を記述することが可能である。
２＝２０＋αｆ（ｔ）  （３９）
及び
１＝１０−αｆ（ｔ）  （４０）
式（２）及び（３）を用いて、濃度１及び２の時間の関数としての変動を支配する微分連立方程式を解いて、
【数２７】
2019532280.tif 000029
を得ることができ、式中、
【数２８】
2019532280.tif 000030
であり、式中、
【数２９】
2019532280.tif 000031
は、静止状態での式（１）に対応する反応速度（１０及び２０は、式（１２）によって与えられる）及び状態１から状態２又は状態２から状態１にそれぞれ繋がるレート定数への変調照明の平均（
【数３０】
2019532280.tif 000032
のそれぞれ）の相対寄与の差をそれぞれ示す。
【００２８】
緩和時間
【数３１】
2019532280.tif 000033
後、ｆ（ｘ）が連続周期関数である定常状態領域に入る。より一般的には、ｆ（ｘ）は、周期関数であり得る。本発明の様々な実施形態では、照明光線ＦＥＸ１、ＦＥＸ２は、基本角周波数ω、２つの基本角周波数（ω１及びω２）又は少なくとも２つの基本角周波数を用いて変調され得、様々な基本角周波数のそれぞれは、この場合、総称ωｉで示される。
【００２９】
最初の場合、ｆ（ｘ）に対応するフーリエ級数は、
【数３２】
2019532280.tif 000034
の形態で記述され得、式中、
【数３３】
2019532280.tif 000035
であり、式中、ａｎ，ｃｏｓ及びｂｎ，ｓｉｎは、フーリエ級数のｎ番目の成分の振幅を示す。
【００３０】
２番目の場合、ｆ（ｘ）に対応するフーリエ級数は、
【数３４】
2019532280.tif 000036
の形態で記述され得、式中、
【数３５】
2019532280.tif 000037
であり、式中、ａ０、ａｎ，ｍ，ｃｏｓ及びｂｎ，ｍ，ｓｉｎは、フーリエ級数の０番目及び｛ｎ，ｍ｝番目の成分の振幅に対応する。ａ０、及び／又はａｎ，ｍ，ｃｏｓ、及び／又はｂｎ，ｍ，ｓｉｎは、同じ次数の成分を識別することによって式（４１）から抽出され得る。
【００３１】
得られた全ての式は、全ての角周波数で濃度変調を明確にするように変換され得る。したがって、
【数３６】
2019532280.tif 000038
として記述され得、式中、
２０＝２０＋αａ０  （５７）
１０＝１０−αａ０  （５８）
２ｎ，ｓｉｎ＝−１ｎ，ｓｉｎ＝ｂｎ，ｓｉｎ  （５９）
２ｎ，ｃｏｓ＝−１ｎ，ｃｏｓ＝ａｎ，ｃｏｓ  （６０）
であり、又は実際に、
【数３７】
2019532280.tif 000039
であり、式中、
２０＝２０＋αａ０  （６３）
１０＝１０−αａ０  （６４）
２ｎ，ｍ，ｓｉｎ＝−１ｎ，ｍ，ｓｉｎ＝ｂｎ，ｍ，ｓｉｎ  （６５）
２ｎ，ｍ，ｃｏｓ＝−１ｎ，ｍ，ｃｏｓ＝ａｎ，ｍ，ｃｏｓ  （６６）
である。
【００３２】
蛍光強度を表現することも可能である。式（６７）は、ｊ＝１又は２である波長λｊにおける観測に対応するオブザーバブルを定義する。
Ｏｊ（ｔ）＝Ｑ１，ｊ１（ｔ）＋Ｑ２，ｊ２（ｔ）  （６７）
蛍光放射Ｉｆ（ｔ）を抽出すると、式（６８）が与えられる。
ＩＦ（ｔ）＝Ｏ１（ｔ）Ｉ１（ｔ）＋Ｏ２（ｔ）Ｉ２（ｔ）  （６８）
したがって、式（５５）及び（５６）によって時間依存性を用いて、
【数３８】
2019532280.tif 000040
であり、
【数３９】
2019532280.tif 000041
であり、且つ
【数４０】
2019532280.tif 000042
である。
【００３３】
項Ｏｊ（ｔ）の振幅の式は、一般的であるが、項ＩＦ（ｔ）の振幅の式は、照明の時間依存性に伴って変動する。
【００３４】
式（６１）及び（６２）によって与えられる時間依存性１（ｔ）及び２（ｔ）を用いて、
【数４１】
2019532280.tif 000043
であり、式中、
【数４２】
2019532280.tif 000044
であり、式中、同様に、項Ｏｊ（ｔ）の振幅の表現は、一般的であり、項ＩＦ（ｔ）の振幅の表現は、照明の時間依存性に伴って変動する。
【００３５】
本発明者らは、まず照明光線の２つの振幅の変調が小さい場合を考え、以下ではαの代わりにεを示した。この場合、式を線形化することができ、分析式を導出することができる。
【００３６】
従来技術による実施形態では、２つの照明光線の一方は、正弦的に変調され（例えば、角周波数ωにおいて約平均強度
【数４３】
2019532280.tif 000045
及び小さい振幅
【数４４】
2019532280.tif 000046
で振動する波長λ１における照明光線ＦＥＸ１）、これに一定強度
【数４５】
2019532280.tif 000047
及び波長λ２の照明光線が重ねられる。したがって、
【数４６】
2019532280.tif 000048
ｈ１（ｔ）＝ｓｉｎ（ωｔ）  （８０）
ｈ２（ｔ）＝０  （８１）
である。光スイッチングの一次式に発展させて、式（４１）は、
【数４７】
2019532280.tif 000049
になる。式（１１）によって与えられる緩和時間
【数４８】
2019532280.tif 000050
後、
２０＝２０  （８３）
１０＝１０  （８４）
【数４９】
2019532280.tif 000051
を導出することが可能である。
【００３７】
２つの異なる波長を使用して、状態１と状態２との間の交換は、基本的に、平均強度
【数５０】
2019532280.tif 000052
が
【数５１】
2019532280.tif 000053
であるように選択される場合、光化学寄与によって支配される。
【００３８】
図２は、従来技術に属する一実施形態の場合での可逆的光スイッチング蛍光種Ｐの応答の論理的な計算を示すチャートを示す。図２のチャートは、制御パラメータ
【数５２】
2019532280.tif 000054
の関数として、濃度１
【数５３】
2019532280.tif 000055
の直交位相における振動の正規化された振幅の値を示す。この事例は、角周波数ωで約平均強度
【数５４】
2019532280.tif 000056
及び小さい振幅
【数５５】
2019532280.tif 000057
で振動する波長λ１の照明光線ＦＥＸ１に対応し、これに一定強度
【数５６】
2019532280.tif 000058
及び波長λ２の照明光線が重ねられる。対象の可逆的スイッチング可能蛍光種Ｐは、「Ｄｒｏｎｐａ−２」であり、本発明者らは、これについてレートパラメータを測定し、これらは、σ１２，１＝１９６ｍ２．ｍｏｌ−１、σ２１，１＝０ｍ２．ｍｏｌ−１、σ１２，２＝０ｍ２．ｍｏｌ−１、σ２１，２＝４１３ｍ２．ｍｏｌ−１、及び
【数５７】
2019532280.tif 000059
に対応し、
【数５８】
2019532280.tif 000060
である。
【００３９】
この場合、
【数５９】
2019532280.tif 000061
は、共振の２つの以下の条件が満たされる場合、１つの最大を有する。
【数６０】
2019532280.tif 000062
【００４０】
この最適化により、式（８６）の項α１及びθ／［１＋θ２］から独立した最適化に繋がる。α１は、振幅ジャンプ
【数６１】
2019532280.tif 000063
後の定常状態領域２０における変動Δ２０に対応する。これは、２つの照明光線によって誘導される光化学反応のレート定数が等しい場合に最大化される。２番目の最適化項θ／［１＋θ２］は、θ＝１を得るように角周波数ωを緩和時間
【数６２】
2019532280.tif 000064
に調整することによって最大化される。
【数６３】
2019532280.tif 000065
である場合、交換は、照明の変動よりも遅く、対｛１，２｝は、応答する時間がなく、項ｉ１，ｓｉｎ及びｉ１，ｃｏｓは、消失する。これとは対照的に、
【数６４】
2019532280.tif 000066
である場合、ｉ１，ｃｏｓは、相殺され、濃度１及び２は、照明の変調と同相で振動する。より一般的には、本発明の全ての実施形態では、前記第１の照明光線（ＦＥＸ１）の平均強度、前記第２の照明光線（ＦＥＸ２）の平均強度及びそれらの角周波数ωは、第１の照明光線と直交する位相において前記蛍光放射線（ＦＬＵ）の強度成分の振幅を最大化するように選択される。
【００４１】
本発明の実施形態では、２つの照明光線ＦＥＸ１、ＦＥＸ２は、同じ角周波数ωにおいて正弦的に（より一般的には周期的に）変調される。本発明者らは、第２の照明光線が種Ｐを一定強度で励起する場合と比較して、種Ｐの照明変調に対する応答の振幅を一次まで増大させることが可能であることを発見した。例として、Ｉ（ｔ）は、一方では約平均強度
【数６５】
2019532280.tif 000067
及び角周波数ωにおいて、他方では波長λ２、約平均強度
【数６６】
2019532280.tif 000068
及び角周波数ωにおいて、小さい振幅の２つの正弦変調の重畳を含むと見なされる。したがって、
【数６７】
2019532280.tif 000069
ｈ１（ｔ）＝ｓｉｎ（ωｔ）  （９３）
ｈ２（ｔ）＝ｓｉｎ（ωｔ＋ψ）  （９４）
であり、式中、ε＜＜１である。
【００４２】
照明によって生じる切り替えを一次まで展開させると、ｆ（ｘ）＝ｆ１（θｘ）＋ｆ２（θｘ）は、ｆ１（θｘ）及びｆ２（θｘ）が以下の式（９５）：
【数６８】
2019532280.tif 000070
の解である場合、式（４１）の解であり、式中、それぞれｊ＝１又は２である。この式が式（８２）と同様であることに留意されたい。式（１１）によって与えられる緩和時間
【数６９】
2019532280.tif 000071
後、
２０＝２０  （９６）
１０＝１０  （９７）
【数７０】
2019532280.tif 000072
を導出することが可能である。
【００４３】
本発明の実施形態において使用される種Ｐでは、非限定的に、状態１からその状態２（又は状態２から状態１のそれぞれ）への光化学誘導遷移は、波長λ１（又はλ２のそれぞれ）における照明によって専ら支配される。状態２から状態１への遷移を主に光化学によって支配させる反応のレート定数を考えると、α１＝−α２を推測することが可能である。式９８及び９９は、
【数７１】
2019532280.tif 000073
になる。
【００４４】
式（１００）及び（１０１）は、ψ＝πが、通常、蛍光応答の振幅を増大させるために好都合であることを示す。したがって、式（１００）及び（１０１）は、
【数７２】
2019532280.tif 000074
になり、蛍光強度の項は、
【数７３】
2019532280.tif 000075
である。
【００４５】
特に、本発明者らは、ψ＝πである式（９２）に対応する照明変動が、定性的に、式（７９）によって支配される光励起として、
【数７４】
2019532280.tif 000076
について同じ結果であるが、理論上、２倍の振幅で生成することを発見した。振幅のこの増大により、式（９０）及び（９１）によって支配される共振条件に従う種Ｐをより高い時間分解能及びより高い信号対雑音比で選択的に撮像することができるため、幾つかの従来技術による技術的問題を解決することができる。より一般的には、第１の照明光線ＦＥＸ１が角周波数ωにおいて周期的に変調され、第２の照明光線が同じ角周波数ωにおいて周期的に変調される本発明の全ての実施形態では、第２の照明光線ＦＥＸ２は、第１の照明光線ＦＥＸ１に対して逆相、すなわちψ＝πにおいて変調される。
【００４６】
図３は、本発明の一実施形態における可逆的光スイッチング蛍光種Ｐの応答の理論的な計算を示すチャートを示す。図３のチャートは、制御パラメータ
【数７５】
2019532280.tif 000077
の関数として、濃度１
【数７６】
2019532280.tif 000078
で直交する位相での振動の正規化された振幅の値を示す。この事例は、角周波数ωで約平均強度
【数７７】
2019532280.tif 000079
及び小さい振幅
【数７８】
2019532280.tif 000080
で振動する波長λ１の照明光線ＦＥＸ１に対応し、これに、角周波数ω及び小さい振幅
【数７９】
2019532280.tif 000081
で約平均強度
【数８０】
2019532280.tif 000082
で振動する波長λ２の照明光線ＦＥＸ２が重ねられる。他のパラメータは、図２に対応する実施形態で使用されたパラメータと同様である。この場合、
【数８１】
2019532280.tif 000083
は、図２に示される実施形態と同様に、式（９０）及び（９１）に対応する共振の２つの条件が満たされる場合に１つの最大を有するが、このノルムは、実質的に２倍であり、この結果として、信号対雑音比は、４倍になる。信号対雑音比は、信号対干渉（ＳＩＲ）比と見なすことができる。
【００４７】
図４は、同じ画像検出中、複数の可逆的光スイッチング蛍光種を撮像することができる本発明の一実施形態を示す。本発明のこの実施形態では、波長λ１の第１の照明光線ＦＥＸ１は、角周波数ωｉで変調される少なくとも２つの第１の照明成分を合算する第１の関数を用いて周期的に変調され、角周波数は、互いに異なる。図４に示される非限定例では、第１の照明光線ＦＥＸ１は、角周波数成分ω１及び角周波数成分ω２を合算する関数を用いて変調される。各角周波数ωｉは、撮像される試料Ｅの可逆的光スイッチング蛍光種に関連又は対応する。図４に示される場合、角周波数ω１は、中実の正方形及び中空の正方形で表される種Ｐに対応し、角周波数ω２は、中実の六角形及び中空の六角形で表される種Ｐ’に対応する。円で表される種Ｐ’’は、特定の角周波数に対応しない。試料は、波長λ２の第２の照明光線ＦＥＸ２を用いても照明され、第２の照明光線ＦＥＸ２は、同じ角周波数ωｉ、すなわち図４の非限定的な事例では角周波数ω１及びω２で変調される少なくとも２つの第１の照明成分を合算する第２の関数を用いて周期的に変調される。
【００４８】
分析的に、非限定的に、照明強度Ｉ（ｔ）を波長λ１において約平均強度
【数８２】
2019532280.tif 000084
及び波長λ２において約平均強度
【数８３】
2019532280.tif 000085
で振動する角周波数ω１及びω２における２つの小振幅正弦変調の重畳と見なすことが可能である。本発明の他の実施形態では、変調は、異なる形態の周期性及びより大きい振幅を有し得る。
【数８４】
2019532280.tif 000086
ｈ１（ｔ）＝ｓｉｎ（ω１ｔ）＋βｓｉｎ（ω２ｔ）  （１２２）
ｈ２（ｔ）＝−ｓｉｎ（ω１ｔ）−βｓｉｎ（ω２ｔ）  （１２３）
を考慮し、式中、ε＜＜１である。この場合、
【数８５】
2019532280.tif 000087
は、第１の関数に対応し、
【数８６】
2019532280.tif 000088
は、第２の関数に対応する。
【００４９】
照明によって生じる切り替えを一次まで展開させると、ｆ（ｘ）＝ｆ１（θ１ｘ）＋βｆ２（θ２ｘ）は、ｆ１（θ１ｘ）及びｆ２（θ２ｘ）が以下の式（１２４）：
【数８７】
2019532280.tif 000089
の解である場合、式（４１）の解であり、式中、それぞれｊ＝１又は２である。緩和時間
【数８８】
2019532280.tif 000090
後、
２０＝２０  （１２５）
１０＝１０  （１２６）
【数８９】
2019532280.tif 000091
を導出することが可能である。
【００５０】
式（１２７）〜（１３０）は、
【数９０】
2019532280.tif 000092
をもたらし、振動蛍光放射に関連する項は、
【数９１】
2019532280.tif 000093
である。
【００５１】
この実施形態では、２つの異なる角周波数ω１及びω２における２つの小振幅逆相変調の重畳に対する試料Ｅの蛍光応答により、図１及び図３に対応する本発明の実施形態を使用して、２つの種Ｐ’及びＰ’’を同時に選択的に検出することができる。有利には、光スイッチング種は、照明強度
【数９２】
2019532280.tif 000094
に関して同一の共振条件を共有し、これらの条件は、式（９０）に対応する。有利には、各光スイッチング種は、式（９１）において定義される等の角周波数ω１及びω２に関連し、これらの種Ｐ’及びＰ’’のそれぞれの共振角周波数に対応する。特に式（１３６）及び（１３７）において導出される蛍光式は、式（１０７）と同様であるが、特にα１＝−α２である本発明のこの実施形態の場合、２倍の振幅により、２つの別個の種Ｐ’及びＰ’’の選択的な同時検出が可能である。
【００５２】
有利には、第１の照明光線ＦＥＸ１及び第２の照明光線ＦＥＸ２の強度に適用される周期変調は、これらの照明光線の平均強度と比較して小さくない。それらは、例えば、同じ桁であり得る。照明光線ＦＥＸ１、ＦＥＸ２の強度の大振幅新規変調の場合、すなわちα＜１の場合、本発明者らは、上述した条件が有効なままであることを発見した。これらの検証は、対応する関数が、小振幅強度変調を考慮した前の事例において線形化された、様々な次数の切り捨てフーリエ級数を数値計算することによって実行された。
【００５３】
図４の矢印は、強度信号ＩＦｏｕｔの事後処理後に得られた様々な画像Ｉｍを示す。これらの画像Ｉｍは、対象である可逆的光スイッチング種に対応する角周波数ωｉに関連する取得信号を復調することによって取得され得る。
【００５４】
図５は、干渉化合物Ｘの存在下での種Ｐの定量化に対応する数値シミュレーションを示す。試料に存在する様々な蛍光種についての情報がない状態において、式（９０）及び（９１）において与えられる共振条件を満たす三つ組
【数９３】
2019532280.tif 000095
を選択することにより、一次直交位相蛍光応答ＩＦｏｕｔを最適化して、干渉種Ｘのなかで１つの種Ｐを選択的且つ定性的に撮像することが可能であり、干渉種Ｘは、パラメータの組
【数９４】
2019532280.tif 000096
によって定義され、総濃度Ｘｔｏｔである。種Ｘは、この場合、光スイッチング可能ではないことができ、この事例は、パラメータσ１２，ｉ，Ｘ＝σ２１，ｉ，Ｘ＝０（ｉ＝１又は２）、及び
【数９５】
2019532280.tif 000097
に対応する。図５は、状態１のみが蛍光によって放射する複数の可逆的スイッチング可能蛍光種Ｐの混合物の場合を示し、前記種は、同じ輝度Ｑ１，ｊを特徴とする。この場合、一定強度
【数９６】
2019532280.tif 000098
で照明することを含むプロトコルは、
【数９７】
2019532280.tif 000099
であるような様々な蛍光の寄与の和に比例する信号
【数９８】
2019532280.tif 000100
を与え、式中、
【数９９】
2019532280.tif 000101
である。
【００５５】
信号
【数１００】
2019532280.tif 000102
が種Ｐの滴定に使用される場合、干渉種の寄与により、滴定の結果は、総濃度を過大評価する。これとは対照的に、照明への一次直交位相応答
【数１０１】
2019532280.tif 000103
は、
【数１０２】
2019532280.tif 000104
として表現され得、式中、
【数１０３】
2019532280.tif 000105
であり、これにより、三つ組みパラメータ
【数１０４】
2019532280.tif 000106
が種Ｐの共振条件下で調整される場合、Ｐｔｏｔを特定することができる。特に、項
【数１０５】
2019532280.tif 000107
は、最大である一方、項
【数１０６】
2019532280.tif 000108
は、ごく僅かである。種Ｐによって生成される信号は、他の干渉種の信号よりも顕著であり、滴定結果
【数１０７】
2019532280.tif 000109
は、Ｐｔｏｔに概ね等しい。
【００５６】
図５のパネルＡは、５つ組（σ１２，１，σ２１，１，σ１２，２，σ２１，２，ｋ２１Δ）を特徴とする標的種及び１６の他の干渉種を含む４つの等モル混合物の正規化された振幅
【数１０８】
2019532280.tif 000110
（グレーの円盤で示される）及び正規化された振幅
【数１０９】
2019532280.tif 000111
（黒色の正方形で示される）の数値シミュレーションを示す。ｎと示された各試料において、これらの干渉種は、１６の５つ組に対応し、５つ組のうちの４つの光化学パラメータは、（σ１２，１，σ２１，１，σ１２，２，σ２１，２）からｎ桁異なる。
【００５７】
図６は、可逆的光スイッチング蛍光種の組の光化学特性を示す。対象の種のそれぞれについて、式（９０）及び（９１）による共振の条件が測定され、一次直交位相蛍光応答の正規化された振幅の絶対値の等曲線によって示される。曲線（ａ）は、種「Ｄｒｏｎｐａ」に対応し、曲線（ｂ）は、種「Ｄｒｏｎｐａ−２」に対応し、曲線（ｃ）は、種「Ｄｒｏｎｐａ−３」に対応し、曲線（ｄ）は、種「ＲＳ−ＦａｓｔＬｉｍｅ」に対応し、曲線（ｅ）は、種「Ｐａｄｒｏｎ」に対応し、曲線（ｆ）は、種「Ｋｏｈｉｎｏｏｒ」に対応し、曲線（ｇ）は、種「ｒｓＥＦＧＰ」に対応し、曲線（ｈ）は、種「ｒｓＥＦＧＰ２」に対応する。
【００５８】
本発明の実施形態の１つにおいて、試料Ｅは、異なる波長の２つの照明光線を用いて照明され、各照明光線は、周期的に変調されて、図４に示されるように複数の可逆的光スイッチング種を選択的に撮像し、各種の三つ組
【数１１０】
2019532280.tif 000112
は、蛍光放射線の成分ＩＦｏｕｔを最大化するように選択される。
【００５９】
特定の一実施形態では、照明光線の２つの平均強度、すなわち関係
【数１１１】
2019532280.tif 000113
によって設定される共振の条件を利用する。図では、この解は、図６における同じ垂直線に実質的に近い点で共振の条件を示し得る２つの可逆的光スイッチング種を撮像することを含む。
【００６０】
本発明の一変形形態は、これらの条件を利用し、各種の共振の条件を満たす２つの周波数ω１及びω２を選択する（２つの種Ｐ’及びＰ’’を検出する場合）ことを含む。換言すれば、各角周波数ωは、条件
【数１１２】
2019532280.tif 000114
を満たす。この実施形態では、各一次直交位相蛍光応答ＩＦｏｕｔの振幅を最大化することができる。
【００６１】
本発明の別の変形形態は、関係
【数１１３】
2019532280.tif 000115
に関する条件を利用し、照明光線を変調する２つの各周波数を選択することを含み、これらの各周波数のそれぞれは、１つの可逆的光スイッチング種に関連し、前記各周波数の比率は、例えば、厳密に１０超、好ましくは１００超である。特に、関係（９０）に関する場合、２つの種Ｐ’及びＰ’’に固有の共振角周波数の比率は、低いことができ、例えば１０未満であり得る。この場合、関係（９１）を満たす条件が利用される場合、各種に対応する振幅ＩＦｏｕｔは、最大化されるが、所与の種に関連する振幅への干渉の寄与により、種間で最適なコントラストを得ることが妨げられる。この変形形態において、関係（１０６）を使用して、コントラストを増大させるように、予め定義される値、例えば１０よりも高い角周波数間の比率を得るように照明光線ＦＥＸ１、ＦＥＸ２を変調するのに使用される角周波数を選択することが可能である。
【００６２】
より一般には、１つ又は複数の対象種に関してコントラストを増大させるために、蛍光信号の最大振幅から逸脱することが可能である。例えば、最小コントラストを得る制約下で蛍光の振幅を最大化すること、最小の振幅（一般に最大振幅の割合で表現される）が得られる場合にコントラストを最大化すること、又は更に十分に高い振幅及び十分に高いコントラストの両方が得られることを保証するパラメータ空間（ω／Ｉ１，Ｉ１／Ｉ２）の領域を特定することが可能である。同様に、信号振幅の低減を犠牲にして１つの蛍光種を検出しようとする場合、干渉蛍光種とのコントラストを改善するために共振の条件から逸脱することが有利であり得る。しかしながら、殆どの場合、信号の振幅が達成可能な最大信号の少なくとも７５％、好ましくは８０％、更に好ましくは９０％に等しいことを保証する照明条件が選択される。
【００６３】
図７は、従来技術の実施形態と本発明の一実施形態との実験比較を示す写真の組である。
【００６４】
図７のパネルＡは、種Ｐを用いてマークされた細胞核を示す写真である。写真は、従来技術による方法を使用して、周期的に変調された波長λ１＝４８０ｎｍの第１の照明光線及び強度が一定に保たれた波長λ２＝４０５ｎｍの第２の照明光線を用いて生成された信号ＩＦｏｕｔを撮像することによって撮影された。
【００６５】
図７のパネルＢは、同じ種Ｐを用いてマークされた同じ細胞核を示す写真である。写真は、従来技術による方法を使用して、強度が一定に保たれた波長λ１＝４８０ｎｍの第１の照明光線及び周期的に変調された波長λ２＝４０５ｎｍの第２の照明光線を用いて生成された信号ＩＦｏｕｔを撮像することによって撮影された。
【００６６】
図７のパネルＣは、同じ種Ｐを用いてマークされた同じ細胞核を示す写真である。写真は、本発明による方法を使用して、周期的に変調された波長λ１＝４８０ｎｍの第１の照明光線及び同じ周期及び逆位相で変調された波長λ２＝４０５ｎｍの第２の照明光線を用いて生成された信号ＩＦｏｕｔを撮像することによって撮影された。
【００６７】
図７のパネルＡでは、強度は、２倍になった。図７のパネルＢでは、強度は、１／２倍になった。ピーク強度は、図の全てのパネルで略等しく、１つのみの周期的に変調される照明光線又は１つの周期的に変調される照明光線及び一定強度の第２の照明光線が使用される場合と比較して、周期的に変調される逆相の２つの照明光線を利用する実施形態が使用される場合、図３に示されるような達成される信号の増大を示した。従来技術による実施形態において測定された振幅ＩＦｏｕｔ及び／又は本発明の実施形態において測定された振幅ＩＦｏｕｔは、代数的である。測定されたＩＦｏｕｔの絶対値及び／又は符号を使用してそれらを区別し得る。
【００６８】
図８は、本発明の一実施形態による細胞の蛍光画像の検出を示す。この例では、種Ｐ、この場合には「Ｄｒｏｎｐａ−２」を用いて細胞核がマークされた。細胞のミトコンドリアは、別の種Ｐ’「Ｐａｄｒｏｎ」を用いてマークされた。種Ｐ’「Ｐａｄｒｏｎ」は、暗状態１及び蛍光状態２を特徴とする。この例では、２つの変調角周波数を利用した。２つの変調角周波数の比率は、１００に設定した。第１の角周波数ｎ１００ω（Ｄ−２）は、種Ｐ’「Ｄｒｏｎｐａ−２」に関連し、この角周波数は、「Ｄｒｏｎｐａ−２」の共振角周波数よりも高かった。第２の角周波数ω（Ｐａｄｒｏｎ）は、種Ｐ’’「Ｐａｄｒｏｎ」に関連し、この角周波数は、「Ｐａｄｒｏｎ」の共振角周波数よりも低かった。画像の左側にある凡例「Ｐａｄｒｏｎ」及び「Ｄ−２」は、「Ｐａｄｒｏｎ」及び「Ｄｒｏｎｐａ−２」にそれぞれ関連する角周波数における蛍光信号の復調を示す。画像の右側にある凡例「Ｐ」及び「Ｎ」は、示されるＩＦｏｕｔの振幅がそれぞれ正符号（Ｐ）又は負符号（Ｎ）であることを示す。
【００６９】
図８の左側の列は、本発明の一実施形態によって得られた画像を示し、細胞は、異なる波長の２つの照明光線を用いて照明され、前記光線は、角周波数ｎ１００ω（Ｄ−２）で逆相に変調される。細胞核は、ＩＦｏｕｔの正振幅に対応し、Ｄ−２に対応する角周波数における復調に対応する画像においてかなりよく見える。
【００７０】
図８の中央列は、本発明の一実施形態によって得られた画像を示し、細胞は、異なる波長の２つの照明光線ＦＥＸ１、ＦＥＸ２を用いて照明され、前記光線は、角周波数ω（Ｐａｄｒｏｎ）で逆位相に変調された。細胞のミトコンドリアは、ＩＦｏｕｔの負振幅に対応し、Ｐａｄｒｏｎに対応する角周波数における復調に対応する画像においてかなりよく見える。
【００７１】
図８の右側の列は、本発明の一実施形態によって得られた画像を示し、細胞は、異なる波長の２つの照明光線ＦＥＸ１、ＦＥＸ２を用いて照明され、前記光線は、角周波数ｎ１００ω（Ｄ−２）及びω（Ｐａｄｒｏｎ）において成分を用いて変調され、第２の照明光線ＦＥＸ２の各成分は、第１の照明光線ＦＥＸ１の対応する成分と逆相である。細胞核は、ＩＦｏｕｔの正振幅に対応し、Ｄ−２に対応する角周波数における復調に対応する画像においてかなりよく見え、細胞のミトコンドリアは、ＩＦｏｕｔの負振幅に対応し、Ｐａｄｒｏｎに対応する角周波数における復調に対応する画像においてかなりよく見える。
【００７２】
図９は、本発明の一実施形態による方法を実施するシステムを示す。このシステムは、非限定的な例として示され、それぞれ発光ダイオードからなる２つの光源ＳＬＭ１及びＳＬＭ２を含む。光源ＳＬＭ１は、電源ＡＭ１によって給電され、光源ＳＬＭ２は、電源ＡＭ２によって給電される。光源ＳＬＭ１及びＳＬＭ２のそれぞれの変調は、２つの独立した出力を有する関数発生器ＧＦにより、各供給電力を変調することによって得られる。発光ダイオードの放射は、広帯域であるため、ＳＬＭ１及びＳＬＭ２によってそれぞれ放射される光線ＦＥＸ１及びＦＥＸ２は、レンズによってコリメートされ、次に２つの光学フィルタによってフィルタリングされ、その後、微小流体デバイスＤＭＦからなる試料に向けられ、簡潔にするために光学フィルタは図示されていない。照明された試料は、裏面を介して対物レンズＯＢＪを用いて観測され、対物レンズＯＢＪは、蛍光放射線を収集し、それをビームＦＬＵに集束させる。ビームＦＬＵは、フィルタリングされ（フィルタＦ２）、ミラーＭ及びレンズＬＦを介してビデオカメラＣＡＭのセンサに向けられる。コンピュータは、上述した等の直交位相を検出するようにビデオカメラＣＡＭを制御するプロセッサＰＲを含む。有利には、ビデオカメラの取得周波数は、ソースＦＥＸ１、ＦＥＸ２の変調周波数と釣り合う。撮像なしで単純な検出及び／又は単純な滴定を達成するために、ビデオカメラＣＡＭは、点光センサで置換され得る。
【図１】
2019532280.tif 000128
【図２】
2019532280.tif 000129
【図３】
2019532280.tif 000130
【図４】
2019532280.tif 000131
【図５】
2019532280.tif 000132
【図６】
2019532280.tif 000133
【図７】
2019532280.tif 000134
【図８】
2019532280.tif 000135
【図９】
2019532280.tif 000136
【国際調査報告】
2019532280.tif 000137
2019532280.tif 000138
2019532280.tif 000139
2019532280.tif 000140
2019532280.tif 000141
2019532280.tif 000142
2019532280.tif 000143
2019532280.tif 000144
2019532280.tif 000145
2019532280.tif 000146