(57)【要約】  本発明は、抗酸化機能及び皮膚細胞増殖効果が増大した不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質並びにそれを有効成分として含有するしわ改善用化粧料組成物に関するものであって、本発明の融合タンパク質は、抗酸化活性に優れ、かつ皮膚細胞増殖効果が高く、皮膚しわ改善、美白などの皮膚再生効果に優れた機能性化粧料の原料として有用である。
2019528759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる抗酸化機能及び皮膚細胞増殖効果が増大した、不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列からなる抗酸化機能及び皮膚細胞増殖効果が増大した、不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の融合タンパク質をコードする、遺伝子。
【請求項４】
前記遺伝子は、大腸菌コドンに最適化された配列番号１ないし４の塩基配列のうち、いずれか１つの塩基配列からなることを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項７】
請求項５に記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換させて、不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させる段階を含む、宿主細胞で不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を生産する、方法。
【請求項８】
前記宿主細胞は、大腸菌であることを特徴とする、請求項７に記載の生産方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法によって生産された、不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１、２または９に記載の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を有効成分として含む、しわ改善用化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化機能及び皮膚細胞増殖効果が増大した不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子を含む融合タンパク質並びにそれを有効成分として含有するしわ改善用化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、表皮、真皮、皮下組織で構成されている。皮膚は、外部から流入される細菌の侵入を防ぐと共に、体内の水分維持と体温維持に重要な役割を行う組織である。表皮は、皮膚保護と体温調節及び水分維持機能を行い、皮膚弾力性及び柔軟性に関与する細胞外基質（extracellular matrix）で構成されている。真皮は、皮膚老化と直接的な関係がある。皮膚老化は、コラーゲンとエラスチン並びに粘液多糖体（グリコサミノグリカン及びムコ多糖）の変性による皮膚の弾力性減少としわの増加が主な原因である。
【０００３】
ヒト上皮細胞成長因子（human epidermal growth factor, hEGF）は、細胞表面に存在する上皮細胞成長因子受容体と結合して上皮細胞成長因子受容体の二量体化を誘導する。二量体の上皮細胞成長因子受容体は、受容体内に存在するチロシンキナーゼを活性化させて、細胞内信号伝逹システムを誘導する（Carpenter G and Cohe S, 1990, The Journal of Biological Chemistry 265(14):7790-7712）。このような過程を通じて、細胞内では、解糖とタンパク質合成などが促進されて最終的に細胞の成長が進められる（Fallon et al., 1984, Science 224(4653):1107-1109）。
【０００４】
皮膚再生の重要な役割を行うヒト上皮細胞成長因子は、老化が進むほど減少する。ヒト上皮細胞成長因子の減少は、皮膚細胞の増殖及び移動を減少させて皮膚の老化、しわ増加、弾力減少などの現象を誘発する。
【０００５】
不凍タンパク質（antifreeze protein、ＡＦＰ）は、零下の温度でも細胞の成長を可能にするポリペプチドの一種であって、小さな氷結晶と結合して氷の再結晶化を妨害する特性を有している。不凍タンパク質は、自動車の不凍液として使用するエチレングリコールと異なり、浸透圧維持、ホルモン、脂肪酸などの運搬及びｐＨ緩衝剤としての機能を行っている。
【０００６】
本発明者らは、ヒト上皮細胞成長因子の皮膚再生機能と共に、老化の原因となる活性酸素から皮膚を保護するための新たなタンパク質の開発を進めた結果、タンパク質を有用に分離するために使用された不凍タンパク質が皮膚細胞再生効果に優れたヒト上皮細胞成長因子と結合されて、優れた皮膚再生効果及び抗酸化効果を示すことを確認した。
【０００７】
一方、韓国登録特許第１１７５８０３号には、アセチルヘキサペプチド−３、カッパーペプチド、パルミトイルペンタペプチド及び上皮細胞成長因子を含む「皮膚細胞再生及びしわ改善化粧料組成物」が開示されており、韓国公開特許第２０１５−００５６０２２号には、「上皮細胞成長因子の融合タンパク質を含む皮膚改善用化粧料組成物」が開示されているが、本発明の抗酸化機能及び皮膚細胞増殖効果が増大した不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子を含む融合タンパク質並びにそれを有効成分として含有するしわ改善用化粧料組成物については記載されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記のような要求によって導出されたものであって、本発明者らは、細胞再生効果に優れることが知られたヒト上皮細胞成長因子タンパク質にケムシカジカまたはオーシャンパウト由来の不凍タンパク質を融合して抗酸化活性と皮膚細胞増殖効果に優れた新規の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を生産した。前記融合タンパク質は、高いフリーラジカル消去能を示すだけではなく、ヒト上皮細胞成長因子のタンパク質単独処理に比べて、皮膚線維芽細胞の細胞増殖効果にも優れ、多様な化粧品剤型を製造して皮膚テストを行った結果、被験者のしわ改善及び美白効果を確認することで、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するために本発明は、抗酸化機能及び皮膚細胞増殖効果が増大した不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換させて、不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させる段階を含む、宿主細胞から不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を生産する方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記生産方法によって生産された不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を有効成分として含むしわ改善用化粧料組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質は、抗酸化活性に優れ、皮膚線維芽細胞に対して高い細胞増殖効果を示し、皮膚しわ改善、美白などの皮膚再生効果に優れたアンチエイジング化粧料組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＡＦＰＳＥ又はｐＥＴ２２ｂ：：ＡＦＰＯＥ及びｐＥＴ２２ｂ：：ＥＡＦＰＳ又はｐＥＴ２２ｂ：：ＥＡＦＰＯ）の作製及び形質転換に係る模式図である。ＡＦＰＳＥ，ケムシカジカ由来の不凍タンパク質（ＡＦＰＳＲ）−ヒト上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）融合タンパク質；ＡＦＰＯＥ，オーシャンパウト由来の不凍タンパク質（ＡＦＰＯＰ）−ＥＧＦ融合タンパク質；ＥＡＦＰＳ，ＥＧＦ−ＡＦＰＳＲ融合タンパク質；ＥＡＦＰＯ，ＥＧＦ−ＡＦＰＯＰ融合タンパク質。
【図２】大腸菌で不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質の発現をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて確認した結果である。Ｍ，タンパク質サイズマーカー；発現誘導前の細胞粗溶解物；発現誘導後の細胞粗溶解物；１，ＡＦＰＳＥ（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）；２，ＥＡＦＰＳ（ＥＧＦ−ＡＦＰＳＲ）；３，ＡＦＰＯＥ（ＡＦＰＯＰ−ＥＧＦ）；４，ＥＡＦＰＯ（ＥＧＦ−ＡＦＰＯＰ）。
【図３】ケムシカジカ（sea raven）由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を分離した後、成人ヒト皮膚線維芽細胞（human dermal fibroblasts adult、ＨＤＦａ細胞）に処理した後、皮膚線維芽細胞の細胞増殖効果を確認した写真である。
【図４】オーシャンパウト（ocean pout）由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を分離した後、皮膚線維芽細胞に処理した後、皮膚線維芽細胞の細胞増殖効果を確認した写真である。
【図５】不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質の抗酸化効果を調べるために、ＤＰＰＨ実験を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の目的を達成するために、本発明は、抗酸化機能及び皮膚細胞増殖効果が増大した不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を提供する。
【００１９】
本発明の前記不凍タンパク質は、ケムシカジカ由来の不凍タンパク質（antifreeze protein from sea raven, AFPSR)またはオーシャンパウト由来の不凍タンパク質（antifreeze protein from ocean pout, AFPOP）でもあるが、これに制限されない。
【００２０】
本発明による前記融合タンパク質は、ケムシカジカ由来の不凍タンパク質（ＡＦＰＳＲ）とヒト上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）とが融合された融合タンパク質と、オーシャンパウト由来の不凍タンパク質（ＡＦＰＯＰ）とヒト上皮細胞成長因子とが融合された融合タンパク質である。
【００２１】
本発明による前記融合タンパク質において、ケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質の範囲は、配列番号５（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）または配列番号６（ＥＧＦ−ＡＦＰＳＲ）のアミノ酸配列を有するタンパク質及び前記タンパク質の機能的同等物を含む。「機能的同等物」とは、アミノ酸の付加、置換または欠失の結果、前記配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９５％以上の配列相同性を有するものであって、配列番号５または配列番号６で表される融合タンパク質と実質的に同質の活性を示すタンパク質を意味する。「実質的に同質の活性」とは、抗酸化活性及び皮膚細胞増殖効果を意味する。
【００２２】
本発明の前記融合タンパク質において、ケムシカジカ由来の不凍タンパク質がヒト上皮細胞成長因子のアミノ末端に結合された融合タンパク質（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）は、望ましくは、配列番号５のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のうち、最初〜１３０番目アミノ酸配列からなるケムシカジカ由来の不凍タンパク質と１３１番目〜１８３番目アミノ酸配列からなるヒト上皮細胞成長因子タンパク質とを融合させて作製された新規なタンパク質であってもよい。また、ケムシカジカ由来の不凍タンパク質が、ヒト上皮細胞成長因子のカルボキシル末端に結合された融合タンパク質（ＥＧＦ−ＡＦＰＳＲ）は、望ましくは、配列番号６のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のうち、最初〜５４番目アミノ酸配列からなるヒト上皮細胞成長因子タンパク質と５５番目〜１８３番目アミノ酸配列からなるケムシカジカ由来の不凍タンパク質とを融合させて作製された新規なタンパク質であってもよい。
【００２３】
本発明による前記融合タンパク質において、オーシャンパウト由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質の範囲は、配列番号７（ＡＦＰＯＰ−ＥＧＦ）または配列番号８（ＥＧＦ−ＡＦＰＯＰ）のアミノ酸配列を有するタンパク質及び前記タンパク質の機能的同等物を含む。「機能的同等物」とは、アミノ酸の付加、置換または欠失の結果、前記配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、さらに望ましくは、９５％以上の配列相同性を有するものであって、配列番号７または配列番号８で表示される融合タンパク質と実質的に同質の活性を示すタンパク質を意味する。「実質的に同質の活性」とは、前述した通りである。
【００２４】
本発明の前記融合タンパク質において、オーシャンパウト由来の不凍タンパク質がヒト上皮細胞成長因子のアミノ末端に結合された融合タンパク質（ＡＦＰＯＰ−ＥＧＦ）は、望ましくは、配列番号７のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のうち、最初〜６６番目アミノ酸配列からなるオーシャンパウト由来の不凍タンパク質と６７番目〜１１９番目アミノ酸配列からなるヒト上皮細胞成長因子タンパク質とを融合させて作製された新規なタンパク質であってもよい。また、オーシャンパウト由来の不凍タンパク質がヒト上皮細胞成長因子のカルボキシル末端に結合された融合タンパク質（ＥＧＦ−ＡＦＰＯＰ）は、望ましくは、配列番号８のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のうち、最初〜５４番目アミノ酸配列からなるヒト上皮細胞成長因子タンパク質と５５番目〜１１９番目アミノ酸配列からなるオーシャンパウト由来の不凍タンパク質とを融合させて作製された新規なタンパク質であってもよい。
【００２５】
本発明は、また、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。前記遺伝子は、大腸菌コドンに最適化された配列番号１（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）、配列番号２（ＥＧＦ−ＡＦＰＳＲ）、配列番号３（ＡＦＰＯＰ−ＥＧＦ）または配列番号４（ＥＧＦ−ＡＦＰＯＰ）の塩基配列からなるが、これらに制限されない。
【００２６】
本発明による前記融合タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列を含んでもよい。また、前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の塩基配列からなる群から選択される塩基配列とそれぞれ７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、２つの最適に配列された配列と比較領域を比較することで確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参照配列（追加または削除を含まず）に比べて、追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。
【００２７】
「コドン最適化」は、コードされたタンパク質が有機体でさらに効率よく発現されるように、特定有機体で優先的に使用されるものであって、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを変化させることを意味する。大部分のアミノ酸が「同義語」または「同意」コドンという、いくつかのコドンによって表示されるという点で、遺伝子コードが縮退的であるが、特定有機体によるコドン用法は、任意的ではなく、特定コドントリプレットに偏向的である。このようなコドン用法偏向性は、所定遺伝子、共通機能または先祖起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質対低い複製数タンパク質、及び有機体ゲノムの集合的タンパク質コード領域と係わってさらに高い。本発明の前記配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の塩基配列は、ヒト上皮細胞成長因子及び不凍タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子が大腸菌内で発現されるように、大腸菌のコドンに最適化された配列である。
【００２８】
また、本発明は、前記不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター及び前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２９】
用語「組換え」は、細胞が異種の核酸を複製したり、前記核酸を発現したり、またはペプチド、異種のペプチドまたは異種の核酸によって暗号化されたタンパク質を発現する細胞を指称する。組換え細胞は、前記細胞の天然形態では発見されない遺伝子または遺伝子切片を、センスまたはアンチセンスの形態のうち、１つとして発現することができる。また、組換え細胞は、天然状態の細胞で発見される遺伝子を発現することができ、しかし、前記遺伝子は、変形されたものであって、人為的な手段によって細胞内へ再導入されたものである。
【００３０】
本発明において、前記不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質をコードする遺伝子は、組換え発現ベクター内に挿入される。用語「組換え発現ベクター」は、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、または他のベクターを意味する。概して、任意のプラスミド及びベクターは、宿主内での複製及び安定化が可能であれば、使用することができる。前記発現ベクターの重要な特性は、複製原点、プロモーター、マーカー遺伝子及び翻訳調節要素（translation control element)を有するものである。
【００３１】
不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質をコードする遺伝子配列及び適当な転写／翻訳調節信号を含む発現ベクターは、当業者に周知の方法によって構築される。前記方法は、試験管内の組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術及び生体内組換え技術などを含む。前記ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を導くために、発現ベクター内の適当なプロモーターに効率よく連結される。また、発現ベクターは、翻訳開始部位としてリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含んでもよい。
【００３２】
本発明の一具現例による組換えベクターは、ｐＥＴ２２ｂベクターに合成したヒト上皮細胞成長因子及び不凍タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を５’末端（ＮｄｅＩ制限酵素サイト）と３’末端（ＸｈｏＩ制限酵素サイト）とにインフレーム（in frame）に融合して製造し、前記遺伝子をｌａｃプロモーターとｌａｃＩリプレッサーとによって効率よく発現させて、ヒト上皮細胞成長因子及び不凍タンパク質の融合タンパク質を製造することを特徴とするベクターである。
【００３３】
本発明のベクターを原核細胞に安定しつつ、連続してクローニング及び発現させうる宿主細胞は、当業界に公知された如何なる宿主細胞も利用可能であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そして、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチアマルセッセンス及び多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがある。
【００３４】
また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、出芽酵母（Saccharomyce cerevisiae）、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株）及び植物細胞などが用いられる。
【００３５】
本発明の一具現例による組換えベクターで形質転換された宿主細胞は、望ましくは、大腸菌であり、さらに望ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳであるが、これに制限されない。
【００３６】
本発明のベクターを宿主細胞内に運搬する方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法、ハナハン方法（Hanahan,D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580）及び電気穿孔方法などによって実施される。また、宿主細胞が真核細胞である場合には、微量注入法、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、及び遺伝子ボンバードメントなどによって、ベクターを宿主細胞内に注入することができる。
【００３７】
本発明はまた、本発明の組換えベクターで宿主細胞を形質転換させて、不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させる段階を含む、宿主細胞で不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質の生産方法を提供する。
【００３８】
本発明の一具現例による方法において、前記宿主細胞は、望ましくは、大腸菌であり、さらに望ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳであるが、これに制限されない。
【００３９】
本発明はまた、本発明の生産方法によって生産された不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を提供する。
【００４０】
本発明はまた、抗酸化機能及び皮膚細胞増殖効果が増大した不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を有効成分として含むしわ改善用化粧料組成物を提供する。
【００４１】
本発明の化粧料組成物は、皮膚再生効果及び優れた抗酸化活性を有する不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質を有効成分として含むため、皮膚細胞再生を通じたしわ改善、美白及び抗酸化活性によるアンチエイジング機能を有する化粧料組成物である。
【００４２】
本発明の一具現例による化粧料組成物において、前記融合タンパク質の含量は、化粧料組成物の総重量に対して、０．０００１ないし１．０重量％含むことが望ましい。
【００４３】
前記タンパク質の含量が０．０００１重量％未満である場合には、皮膚内での抗酸化効能の発揮が不可能であって、効果が奏されず、１．０重量％以上である場合には、含有量増加に対する効果増大の程度が微々たるものである。
【００４４】
本発明の化粧料組成物には、前記有効成分以外に化粧品組成物に通常用いられる成分を含み、例えば、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、エッセンシャル・オイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質小胞のような通常の補助剤、そして担体を含む。
【００４５】
本発明の組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化されるが、これに限定されるものではない。さらに詳細には、スキン、皮膚軟化剤、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザー、石鹸及びパウダーの化粧品剤形として製造される。
【００４６】
本発明の化粧料組成物の剤型がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられる。
【００４７】
本発明の化粧料組成物の剤型がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられ、特に、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含んでもよい。
【００４８】
本発明の化粧料組成物の剤型が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解剤または油濁剤が用いられ、例えば、水、エチルアルコール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００４９】
本発明の化粧料組成物の剤型が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エチルアルコールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラカントなどが用いられる。
【００５０】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明の例示に過ぎず、本発明の内容は下記実施例に限定されるものではない。
【００５１】
実施例１．不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の生産のための組換え発現ベクター及び形質転換組換え微生物の製造
ケムシカジカ由来の不凍タンパク質（ＡＦＰＳＲ）またはオーシャンパウト由来の不凍タンパク質（ＡＳＰＯＰ）とヒト上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）とを含む融合タンパク質をコードする最適化された遺伝子、組換え発現ベクター及び形質転換組換え微生物は、下記方法で作製した。ケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質またはオーシャンパウト由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を鋳型として宿主微生物内で発現されるように最適化された、１８３個のアミノ酸を暗号化したケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質（配列番号５または配列番号６）をコードする遺伝子（配列番号１または配列番号２）及び１１９個のアミノ酸を暗号化したオーシャンパウト由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質（配列番号７または配列番号８）をコードする遺伝子（配列番号３または配列番号４）の断片を作製、合成した。使用したプライマーは、下記の通りである。
【００５２】
ケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子タンパク質とを含む融合タンパク質合成のためのプライマーは、下記の通りである。
【００５３】
正方向プライマー：５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡ−３’（配列番号９）
逆方向プライマー：５’−ＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＴＣ−３’（配列番号１０）
センスプライマー：５’−ＣＧＣＣＡＴＧＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣ−３’（配列番号１１）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＴＧＴＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴＣＡＴＧＧＣＧ−３’（配列番号１２）。
【００５４】
オーシャンパウト由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子タンパク質とを含む融合タンパク質合成のためのプライマーは、下記の通りである。
【００５５】
正方向プライマー：５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＣＡＧＧＣＡ−３’（配列番号１３）
逆方向プライマー：５’−ＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣ−３’（配列番号１４）
センスプライマー：５’−ＴＡＣＧＣＧＧＣＴＡＡＣＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１５）
アンチセンスプライマー：５’−ＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＣＧＴＡ−３’（配列番号１６）。
【００５６】
前記遺伝子断片と組換えプラスミドとを同じ制限酵素（５’末端側ＮｄｅＩ制限酵素サイト（ＣＡＴＡＴＧ）と３’末端側ＸｈｏＩ制限酵素サイト（ＣＴＣＧＡＧ））で切断して挿入し、図１に示した組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＡＦＰＳＥ又はＡＦＰＯＥ；ｐＥＴ２２ｂ：：ＥＡＦＰＳ又はＥＡＦＰＯ）を作製した。前記で製造された組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＡＦＰＳＥ又はＡＦＰＯＥ；ｐＥＴ２２ｂ：：ＥＡＦＰＳ又はＥＡＦＰＯ）反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０にそれぞれ形質転換させ、宿主微生物から遺伝子コンストラクトを大量に得た。
【００５７】
前記で製造された組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＡＦＰＳＥ又はＡＦＰＯＥ；ｐＥＴ２２ｂ：：ＥＡＦＰＳ又はＥＡＦＰＯ）反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にそれぞれ形質転換させ、宿主微生物に遺伝子コンストラクトが挿入されている不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質生産のための組換え微生物を作製した。さらに詳細な模式図は、図１に示した。
【００５８】
実施例２．不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の発現誘導並びに融合タンパク質の分離
実施例１で製造した不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質発現大腸菌であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）をそれぞれ１ｌのＬＢあるいはＢＳＢ培地に回分培養する際、ＯＤ６００値が０．６〜０．８になるまで培養させるか、２０ｌ発酵器を使用して連続培養する際、ＯＤ６００＝１５〜２０になるまで培養した。以後、これらをそれぞれ最終１〜５ｍＭ  ＩＰＴＧまたは２％ラクトースを加えてクローンの遺伝子の発現を誘導した。その後、４〜５時間さらに培養した後、細胞を遠心分離方法で回収した。この細胞を緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＮａＣｌ  ８ｇ，ＫＣｌ  ０．２ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４  １．４４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４  ０．２４ｇ／ｌ，ｐＨ７．４）に完全に懸濁させた後、超音波破砕機を使用して細胞を破壊し、細胞内のタンパク質含有溶液を得た。その後、不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質をＮｉ−アガロースカラムに前記タンパク質を１〜３ｍＬ／ｍｉｎの速度で通過させた。次いで、バインディング用緩衝溶液でカラムを数回洗浄した後、５０、１００及び２５０ｍＭイミダゾール溶液（ｐＨ７．４）をそれぞれカラムに適用して不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質をカラムから分画溶出させて分離、精製した。
【００５９】
図２では、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の大腸菌細胞内発現の如何を確認した結果、不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質がＩＰＴＧまたはラクトース処理によって大腸菌細胞内で発現誘導されたことを確認した。
【００６０】
実施例３．不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の皮膚細胞増殖効果
実施例２で分離、精製された不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の存在が確認された分画で試料を選び、成人ヒト皮膚線維芽細胞（Human Dermal Fibroblasts adult、ＨＤＦａ細胞）の細胞増殖効果を確認した。
【００６１】
不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の活性測定のために培養した皮膚線維芽細胞に０．０２、０．２、２及び２０ｐｐｍ濃度の不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質を処理した後、３日間３７℃で培養し、以後クリスタルバイオレット染色法で細胞増殖の如何を確認した。
【００６２】
その結果、単一タンパク質処理群（図３のＥＧＦ）に比べて、ケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質（図３のＡＦＰＳＲ：ＥＧＦ、ＥＧＦ：ＡＦＰＳＲ）の細胞増殖効果がさらに高く観察された。これは、融合タンパク質内のＥＧＦが全長（full-length）タンパク質に該当しない不凍タンパク質との融合タンパク質の製造に用いられた活性ドメインに該当し、同じ濃度（例えば、０．０２ｐｐｍ）の単一ＥＧＦ及びＥＧＦと不凍タンパク質との融合タンパク質を処理した場合、融合タンパク質のモル数は、ＥＧＦに比べておよそ１／２となる。したがって、同じ濃度に対して類似した皮膚線維芽細胞増殖効果が示されるならば、ヒト上皮細胞成長因子と不凍タンパク質との融合タンパク質は、ＥＧＦに比べて２倍程度の皮膚線維芽細胞増殖効果を有する。図３から分かるように、ヒト上皮細胞成長因子と不凍タンパク質との融合タンパク質を処理した場合は、ＥＧＦに比べて、皮膚線維芽細胞数がさらに多いことから、少なくとも２倍以上の皮膚線維芽細胞増殖効果を有するということが分かる。前記結果を通じて、ヒト上皮細胞成長因子と不凍タンパク質との融合タンパク質は、皮膚細胞増殖効果が増加したことを類推することができた。
【００６３】
また、それぞれの単一タンパク質処理群（図４のＥＧＦ、ＡＦＰＯＰ）に比べて、オーシャンパウト由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質（図４のＡＦＰＯＰ：ＥＧＦ、ＥＧＦ：ＡＦＰＯＰ）の細胞増殖効果がさらに高く観察された。これは、前述したように、融合タンパク質内のＥＧＦ及びＡＦＰＯＰがそれぞれの全長（full-length）タンパク質に該当しない融合タンパク質製造に用いられたそれぞれの活性ドメインに該当し、同じ濃度（例えば、０．０２ｐｐｍ）のＥＧＦまたはＡＦＰＯＰそれぞれのタンパク質及びヒト上皮細胞成長因子と不凍タンパク質との融合タンパク質を処理した場合、融合タンパク質のモル数は、それぞれのＥＧＦ及びＡＦＰＯＰに比べておよそ１／２となる。したがって、同じ濃度に対して類似した皮膚線維芽細胞増殖効果が示されるならば、ヒト上皮細胞成長因子と不凍タンパク質との融合タンパク質はそれぞれのＥＧＦ及びＡＦＰＯＰに比べて２倍程度の皮膚線維芽細胞増殖効果を有する。図４で分かるように、ヒト上皮細胞成長因子と不凍タンパク質との融合タンパク質を処理した場合はそれぞれのＥＧＦ及びＡＦＰＯＰに比べて皮膚線維芽細胞数がさらに多いことから、少なくとも２倍以上の皮膚線維芽細胞増殖効果を有するということが分かる。前記結果を通じて、ヒト上皮細胞成長因子と不凍タンパク質との融合タンパク質は、皮膚細胞増殖効果が増加したことを類推することができた。
【００６４】
実施例４．不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の抗酸化効能
不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の抗酸化効能を測定するために、フリーラジカル消去効果測定方法の１つである１，１−ジフェニル−２−ピクリル−ヒドラジル（1,1-Diphenyl-2-pycryl-Hydrazyl；ＤＰＰＨ）方法を使用した。この試薬は、比較的安定したフリーラジカルとして存在してフリーラジカル消去活性の確認に一次的に使用される試験管的方法の１つである。
【００６５】
不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質の抗酸化効能を調べるために、対照群としてＬ−アスコルビン酸を使用した。実験方法は、不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質とＬ−アスコルビン酸とをそれぞれ１μＭ濃度で準備し、ＤＰＰＨは、０．２ｍＭ濃度で準備した。それぞれを１：１で混合した後、３７℃で３０分間放置した。その後、５２０ｎｍ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒで吸光度を観察した。フリーラジカル消去活性（％）は、下記式１で計算し、その結果を図５に示した。
【００６６】
【数１】
2019528759.tif 000003
【００６７】
その結果、不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質は、対照群より約２〜４倍のフリーラジカル消去効果を示した。したがって、本発明の不凍タンパク質及びヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質は、高い抗酸化効能を有しており、これは、前記融合タンパク質が抗酸化効能による皮膚老化防止効果を有しているということを意味する。
【００６８】
実験例１．しわ改善及び美白などの皮膚再生機能並びに抗酸化効能に関する皮膚刺激官能試験
前記実施例１で最終分離、精製されたケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）を有効成分とする製造例１、２、３及び４並びに比較例１、２、３及び４の化粧料組成物を製造して官能試験を実施した。
【００６９】
具体的には、皮膚再生機能項目のうち、しわ改善事項を確認するために３０歳以上６０歳未満の女性及び男性合計３０人（３０代１０人、４０代１０人、５０〜６０代１０人）を対象に、顔面の左目尻部分には、比較例（対照群）を、顔面の右目尻部分には、製造例（試験群）を１日１回２週間持続的に使用させた。評価は、目の周りのしわ伸び現象で評価した。また、前記機能項目の１つである美白関連事項に対しても、同じ方法で皮膚トーンの変化程度を評価した。また、抗酸化効能関連事項は、アンチエイジング効果を老化緩和効果として分析し、肉眼で相対比較して観察した。皮膚刺激項目に対しても、同じ方法で皮膚のかゆみ、ひりつき及び紅斑現象などについて官能試験を実施した。評価基準は、非常に優れる（５点）、優れる（４点）、普通（３点）、悪い（２点）、非常に悪い（１点）の５点法基準によって行った。
【００７０】
＜製造例１及び比較例１＞
ケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）を有効成分として添加（または未添加）して、下記表１に記載の成分及び含量でスキンを製造した。
【００７１】
【表１】
2019528759.tif 000004
【００７２】
前記表１の製造例１及び比較例１を使用した官能試験の結果は、下記表２の通りである。
【００７３】
【表２】
2019528759.tif 000005
【００７４】
＜製造例２及び比較例２＞
ケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）を有効成分として添加（または未添加）して、下記表３に記載の成分及び含量でエッセンスを製造した。
【００７５】
【表３】
2019528759.tif 000006
【００７６】
前記表３の製造例２及び比較例２を使用した官能試験の結果は、下記表４の通りである。
【００７７】
【表４】
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【００７８】
＜製造例３及び比較例３＞
ケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）を有効成分として添加（または未添加）し、下記表５に記載の成分及び含量でローションを製造した。
【００７９】
【表５】
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【００８０】
前記表５の製造例３及び比較例３を使用した官能試験の結果は、下記表６の通りである。
【００８１】
【表６】
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【００８２】
＜製造例４及び比較例４＞
ケムシカジカ由来の不凍タンパク質とヒト上皮細胞成長因子との融合タンパク質（ＡＦＰＳＲ−ＥＧＦ）を有効成分として添加（または未添加）し、下記表７に記載の成分及び含量でクリームを製造した。
【００８３】
【表７】
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【００８４】
前記表７の製造例４及び比較例４を使用した官能試験の結果は、下記表８の通りである。
【００８５】
【表８】
2019528759.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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