【手続補正書】
【提出日】平成19年9月4日(2007.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列を連結する方法であって、前記方法が、
ａ）多重分子増幅手順で、単離単一細胞由来のテンプレートを使用して目的とするヌクレオチド配列を増幅するステップと、
ｂ）ステップａ）で増幅された目的とするヌクレオチド配列の連結を生じさせるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記目的とするヌクレオチド配列が、可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が可変領域コード配列の同族対合を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的とするヌクレオチド配列が、免疫グロブリン可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が重鎖可変領域コード配列を伴う軽鎖可変領域コード配列の同族対合を生成する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的とするヌクレオチド配列がＴ細胞受容体可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が、β鎖可変領域コード配列を伴うα鎖可変領域コード配列、またはδ鎖可変領域コード配列を伴うγ鎖可変領域コード配列で構成された同族対合を生成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記多重分子増幅手順が多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、多重ＰＣＲ増幅の前に別個の逆転写（ＲＴ）ステップを含んで成る２ステップ方法である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、逆転写（ＲＴ）および多重ＰＣＲ増幅を実行するのに必要な成分すべてを単一の容器へ最初に添加するステップを含んで成る単一ステップで実行される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
単一細胞または遺伝学的に異なる細胞の集団がリンパ球含有細胞フラクションから得られるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
多重分子増幅の逆転写工程の前に該単一細胞を増殖させて同質細胞の集団を得る、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記目的とするヌクレオチド配列の連関が、前記多重分子増幅と同じ容器で実行される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的とするヌクレオチド配列の連関が、多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを利用する多重ＰＣＲ増幅に伴って達成される、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的とするヌクレオチド配列の連関がライゲーションによって達成される、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的とする連結核酸配列を増幅するために適合されるプライマーミックスを利用する追加の分子増幅が実行される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスがプライマーセットを含んで成り、ここで各プライマーセットの少なくとも１つのプライマーセットメンバーが、第２のプライマーセットのプライマーセットメンバーのオーバーラップ・エクステンションテールとハイブリダイズすることが可能なオーバーラップ・エクステンションテールを含んで成る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスが、
ａ）免疫グロブリン軽鎖領域コード配列のセンス鎖を相補する少なくとも１つのＣＬまたはＪＬプライマーと、
ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列または軽鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖を相補し、かつステップａ）におけるプライマーでプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのＶＬ５’プライマーまたはＶＬＬプライマーと、
ｃ）免疫グロブリン定常重鎖ドメインコード配列または重鎖接合領域コード配列のセンス鎖を相補する少なくとも１つのＣＨまたはＪＨプライマーと、
ｄ）免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列または重鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖を相補し、かつステップｃ）におけるプライマーでプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのＶＨ５’プライマーまたはＶＨＬプライマーと
を含んで成る、請求項１１または請求項１１に従属するかぎりにおいて請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｂ）のプライマーが配列番号９３〜９８の遺伝子特異的領域との少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬＬプライマーであり、かつステップｄ）のプライマーが配列番号８６〜９２の遺伝子特異的領域との少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨＬプライマーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
連結可変領域コード配列を含んで成る同族対合のライブラリーを製造する方法であって、前記方法が、
ａ）ドナーからのリンパ球含有細胞分画を提供するステップと、
ｂ）場合により前記細胞分画から特定のリンパ球集団を強化するステップと、
ｃ）細胞を前記細胞分画から個別に複数の容器へ分配するステップを含んで成る、単離単一細胞の集団を得るステップと、
ｄ）請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法による、単離単一細胞の前記集団に含まれる可変領域コード配列の連関を増幅し、これを生じさせるステップと
を含んで成る方法。
【請求項１８】
単一細胞の集団における個々の単離単一細胞が、増幅および連関を実行する（ステップｄ）前に、同質細胞の集団に拡大される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンパ球を含有する細胞分画が、全血、骨髄、単核細胞、または白血球を構成する、請求項８、１７または１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンパ球を含有する細胞分画がＢリンパ球系列の細胞で強化されている、請求項８または１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記リンパ球を含有する細胞分画またはＢリンパ球系列が形質細胞で強化されている、請求項８または１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンパ球を含有する細胞分画、Ｂリンパ球系列、または形質細胞からの細胞が抗原特異性で強化されている、請求項８または１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンパ球を含有する細胞分画が、前記Ｔリンパ球系列の細胞で強化されている、請求項８または１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
抗原特異的Ｔ細胞がリンパ球を含有する細胞分画の刺激によって生成される、請求項８または１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記連結ヌクレオチド配列または同族対合のライブラリーをベクターへ挿入するステップをさらに含んで成る、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクターがクローン化ベクター、シャトルベクター、ディスプレイベクター、または発現ベクターの中から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記連結ヌクレオチド配列または前記同族対合のライブラリーの個々のメンバーが、軽鎖可変領域コード化配列を伴う免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記配列が、１つもしくはそれ以上の免疫グロブリン定常ドメインまたはその断片をコードする配列をすでに含有するベクターへインフレーム挿入される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記連結ヌクレオチド配列または前記同族対合のライブラリーの個々のメンバーが、β鎖可変領域コード配列を伴うＴ細胞受容体α鎖可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記配列が、１つもしくはそれ以上のＴ細胞受容体定常ドメインまたはその断片をコードする配列をすでに含有するベクターへインフレーム挿入される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
所望の標的特異性を有する結合タンパク質をコードする連結可変領域配列の同族対合の一部を選択することによってサブライブラリーを作成し、可変領域コード配列の標的特異的同族対合のライブラリーを生成するステップをさらに含んで成る、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記同族対合または可変領域コード配列の標的特異的同族対合のライブラリーを哺乳類発現ベクターへ移動させるステップをさらに含んで成る、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類発現ベクターが、ヒト免疫グロブリンクラスのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、κ軽鎖、またはλ軽鎖、もしくはヒトＴ細胞受容体α、β、δ、および／またはγ鎖から選択される１つもしくはそれ以上の定常領域ドメインをコードする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ａ）連結ヌクレオチド配列の部分をコードするベクターを宿主細胞へ導入するステップと、
ｂ）発現に適合した条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
ｃ）前記宿主細胞へ挿入される前記ベクターから発現されるタンパク質産物を得るステップと
をさらに含んで成る、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質産物が、重鎖可変領域を伴う軽鎖可変領域の同族対合を含んで成るモノクローナル抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチド産物が、β鎖可変領域を伴うα鎖可変領域の同族対合を含んで成るモノクローナルＴ細胞受容体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
連結可変領域コード配列から成る同族対合のライブラリーであって、個々の同族対合がそれらを発現しうるベクター中に挿入されているライブラリー。
【請求項３６】
前記可変領域コード配列の同族対合が、請求項２２またはそれに従属するいずれかの請求項に記載の方法によって得られる、請求項３５に記載のライブラリー。
【請求項３７】
前記同族対合の個々のメンバーが、重鎖可変領域コード配列を伴う免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列を含んで成る、請求項３５または３６に記載のライブラリー。
【請求項３８】
前記個々のメンバーが、ヒト免疫グロブリンクラスのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭから選択される完全長抗体をコードする、請求項３７に記載のライブラリー。
【請求項３９】
前記同族対合の個々のメンバーが、β鎖可変領域コード配列を伴うＴｃＲα鎖可変領域コード配列またはδ鎖可変領域コード配列を伴うγ鎖可変領域コード配列を含んで成る、請求項３５または３６に記載の同族対合のライブラリー。
【請求項４０】
前記個々のメンバーが完全長ＴｃＲをコードする、請求項３９に記載のライブラリー。
【請求項４１】
特定の標的に対する所望の結合特異性を示すタンパク質をコードする能力によって各構成メンバーが選択されたものである、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の、連結された可変領域コード配列の同族対合のライブラリー。
【請求項４２】
請求項３７または３８に記載された同族対合のライブラリーであって、該ライブラリーから発現されうる抗体が破傷風毒素と反応し、あるいはこれに結合することが可能なものであるライブラリー。
【請求項４３】
請求項３５〜４２のいずれか一項に記載のライブラリーまたはサブライブラリーを含んで成る宿主細胞の集団。
【請求項４４】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞の集団。
【請求項４５】
請求項４３または４４に記載の宿主細胞から発現される組換えポリクローナルタンパク質。
【請求項４６】
個々の抗体のメンバーが全長のものであり、定常重鎖領域がヒト免疫グロブリンクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤまたはＩｇＥから選択されるものであり、定常軽鎖領域がヒトλ鎖またはκ鎖から選択されるものである、請求項４５に記載された組換えポリクローナル抗体。
【請求項４７】
破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル免疫グロブリンまたはその断片。
【請求項４８】
前記個々のメンバーが同族対合である、請求項４７に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリン。
【請求項４９】
配列番号の対合２２９：２７６、２６２：３０９、２４０：２８７、２４５：２９２、２６７：３１４、２４６：２９３、２５８：３０５、２４２：２８９、２３１：２７８、２６３：３１０、２３２：２７９、２３７：２８４、２５５：３０２、２６０：３０７、２５１：２９８、２３３：２８０、２２８：２７５、２４４：２９１、２５０：２９７、２５２：２９９、２６４：３１１、２７２：３１９、２３５：２８２、または２３８：２８５より成る群から選択される個々の配列番号の対合と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域コード配列を伴う免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を含んで成る少なくとも２つの個々の同族対合を含んで成る、請求項４７または４８に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリン。
【請求項５０】
領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を決定する相補性が、請求項４９に記載の１つもしくはそれ以上の配列番号対合由来である、破傷風毒素と反応し、あるいはこれに結合することが可能な組換え免疫グロブリンまたはその断片。
【請求項５１】
少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤と組合せられた有効成分として請求項４５または４６に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリンを含んで成る医薬組成物。
【請求項５２】
医薬上許容される賦形剤と組合せられていてもよい有効成分として破傷風毒素と反応し、あるいはこれに結合することが可能な組換えポリクローナル抗体を含んで成る医薬組成物。
【請求項５３】
薬剤として使用するための請求項５１または５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル抗体を含んで成る組成物を、それを必要とする患者に投与することによって破傷風を発症するリスクがある患者を予防または治療する方法。