(57)【要約】  ポイントオブケアにおけるデング熱の検出のための統合的分子診断システム（ｉＭＤｘ）であって、全血からのデングウイルスの選択的分離のための血漿分離、ＲＮＡ抽出のためのデングウイルスのＬＥＤ駆動の光熱溶解、およびデングウイルスＲＮＡの増幅のためのＬＥＤ駆動の高速光キャビティＰＣＲが、単一のマイクロ流体デバイス内にオンチップで統合されている、システム。
2019530459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプルのポイントオブケア診断のためのマイクロ流体チップの形態の統合的分子診断システムであって、
前記マイクロ流体チップ内の第１の位置にあるサンプル入口であり、血液サンプルを受け入れるように構成された、サンプル入口と、
前記マイクロ流体チップ上の第２の位置に位置する血漿分離チャンバであり、前記血液サンプルを受け入れて血漿から赤血球を分離するように前記サンプル入口と流体連通している、血漿分離チャンバと、
前記マイクロ流体チップ上の第３の位置に位置する光熱溶解チャンバであり、前記分離された血漿を受け入れて前記分離された血漿のＲＮＡ抽出を行うように前記血漿分離チャンバと流体連通している、光熱溶解チャンバと、
前記マイクロ流体チップ上の第４の位置に位置する光ＰＣＲキャビティであり、前記分離された血漿中のＲＮＡを増幅するように構成された、光ＰＣＲキャビティと
を含む、システム。
【請求項２】
前記血液サンプルがウイルスを含み、
前記光熱溶解チャンバが、前記ウイルスのＲＮＡを抽出するように構成されており、かつ
光ＰＣＲキャビティを使用するウイルスＲＮＡの増幅が、前記分離された血漿中のウイルスＲＮＡを増幅するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記光ＰＣＲキャビティが、前記血液サンプルを保持するように構成された複数のチャンバ壁により画定された少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバを備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記光ＰＣＲキャビティが、標的核酸のＰＣＲ増幅のために前記分離された血漿を加熱するように構成された金属薄膜を前記光キャビティの表面に備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記金属薄膜が金を含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
金薄膜がＬＥＤ駆動の光熱加熱デバイスとして機能する、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
前記光熱溶解チャンバが、光熱溶解を行うために前記分離された血漿を加熱するように構成された第２の金属薄膜を前記光熱溶解チャンバの表面に備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記第２の金属薄膜が、ＬＥＤ駆動の光熱加熱デバイスとして機能する金薄膜を含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記光ＰＣＲキャビティと流体連通している前記マイクロチップ上の第５の位置に位置する流体ポンピング機構をさらに含み、
前記流体ポンピング機構は、前記入口から前記光ＰＣＲキャビティに前記血液サンプルを引き込むように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
血液サンプルのポイントオブケア診断のための方法であって、
マイクロ流体チップの入口で血液サンプルを受け入れるステップと、
前記入口と流体連通している、前記マイクロ流体チップ内の分離チャンバ内で血漿から赤血球を分離するステップと、
前記マイクロ流体チップ内に前記分離チャンバと流体連通して位置する光熱溶解チャンバ内に前記分離された血漿を受け入れて前記分離された血漿のＲＮＡ抽出を行うステップと、
前記マイクロ流体チップ内に前記光熱溶解チャンバと流体連通して位置する光ＰＣＲキャビティ内に前記分離された血漿を受け入れて前記分離された血漿中の前記抽出ＲＮＡを増幅するステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
血漿から赤血球を分離するステップが、溶血せずに行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液サンプルがウイルスを含み、
ＲＮＡ抽出を行うステップが、前記分離された血漿を加熱して光熱溶解により前記ウイルスからウイルスＲＮＡを抽出するステップを含み、
前記抽出ＲＮＡを増幅するステップが、ＬＥＤ駆動の高速光キャビティＰＣＲによって前記抽出ウイルスＲＮＡを増幅することにより、前記分離された血漿中のウイルスＲＮＡを増幅するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
光熱溶解およびＲＮＡ増幅がＬＥＤ駆動である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記光ＰＣＲキャビティが、前記血液サンプルを保持するように構成された複数のチャンバ壁により画定された少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記光ＰＣＲキャビティおよび光熱溶解チャンバそれぞれが、標的核酸のＰＣＲ増幅のために前記分離された血漿を加熱するように構成され、かつ光熱溶解を行うために前記分離された血漿を加熱するように構成された金属薄膜を備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記金属薄膜が金を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
金薄膜がＬＥＤ駆動のプラズモン加熱デバイスとして機能する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記光ＰＣＲキャビティと流体連通している前記流体マイクロチップ上に位置する流体ポンピング機構によって、血液が、前記入口から前記光ＰＣＲキャビティに受動的に引き込まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
血液サンプルのポイントオブケア診断のためのマイクロ流体チップの形態の統合的分子診断システムであって、
前記マイクロ流体チップ内の第１の位置にあるサンプル入口であり、血液サンプルを受け入れるように構成された、サンプル入口と、
前記マイクロ流体チップ上の第２の位置に位置する血漿分離チャンバであり、前記血液サンプルを受け入れて血漿から赤血球を分離するように前記サンプル入口と流体連通している、血漿分離チャンバと、
前記マイクロ流体チップ上の第３の位置に位置する光熱溶解チャンバであり、前記分離された血漿を受け入れて前記分離された血漿のＲＮＡ抽出を行うように前記血漿分離チャンバと流体連通している、光熱溶解チャンバと、
前記マイクロ流体チップ上の第４の位置に位置する光ＰＣＲキャビティであり、前記分離された血漿中のＲＮＡを増幅するように構成された、光ＰＣＲキャビティと
を含み、
前記光ＰＣＲキャビティが、前記血液サンプルを保持するように構成された複数のチャンバ壁により画定された少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバを備える、システム。
【請求項２０】
前記血液サンプルがウイルスを含み、
前記光熱溶解チャンバが、前記ウイルスのＲＮＡを抽出するように構成されており、かつ
光ＰＣＲキャビティを使用するウイルスＲＮＡの増幅が、前記分離された血漿中のウイルスＲＮＡを増幅するように構成されている、請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１６年１０月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／４０６，６９４号に対する優先権およびその利益を主張する。
連邦政府の資金提供を受けた研究または開発に関する記載
該当なし
コンピュータプログラム付録の参照による組み込み
該当なし
著作権保護を受ける資料の通知
本特許文書中の資料の一部は、米国およびその他の国の著作権法の下で著作権保護を受ける場合がある。著作権の権利所有者は、米国特許商標庁の公開されているファイルまたは記録に表される通りに第三者が本特許文書または本特許開示を複製することに異議を唱えないが、それ以外はすべての著作権を留保する。著作権所有者は、これに限定されないが、米国特許法施行規則§１．１４に従う権利を含め、本特許文書を秘密裏に保持しておく権利のいずれも本明細書によって放棄しない。
【０００２】
本開示の技術は一般に、診断システムおよび方法に関し、より詳細には、ウイルス感染症のポイントオブケア診断のためのオンチップ検出システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
デング熱（ＤＦ）は、ＤＥＮＶウイルスによって引き起こされる発熱性熱帯病である。このプラスセンスの１１ｋｂ  ｓｓＲＮＡウイルスはフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、４つの血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４を包含する。異なる血清型が同じ症状（およびゲノムの６０〜７５％）を共有するが、１つの型を捕らえても、他の３つの型に対する免疫を人に与えない。一方、ある地域で以前に発生していない血清型の出現は、デング熱の流行（ｖａｇｕｅ）と同義であることが多い。
ＤＦは蚊媒介性疾患（蚊属：ヤブカ（Ａｅｄｅｓ））であり、これは、主に熱帯諸国におけるその有病率を説明する。毎年、推定５０〜１００百万のＤＦの症例があり、さらに重症型のＤＦの５００’０００の症例がある。未治療の場合、重症のＤＦの死亡率はおよそ２０％であるが、患者が医療を受けているときは０．１％未満に低下させることができる。
したがって、血漿漏出および他の重篤なＤＦの症状の注意深い監視を可能にするために、他の発熱を誘発する疾患に対してＤＦを診断することが医療従事者にとって極めて重要である。さらに、ＤＦと他の熱性疾患とを識別することは、ＤＦの発生を監視するために、かつリスクがある人々に適切な措置を講じるために重要である。
【０００４】
診断法では、可能性がある血流中の標的には、次の３つの異なるカテゴリーが存在する：ウイルス自体、感染細胞により産生されたタンパク質（ＮＳ１）、および感染に反応して人体により産生されたタンパク質（ＩｇＭ、ＩｇＧなど）。ＮＳ１、ＩｇＭおよびＩｇＧは、一次感染であるか、二次感染であるかによって非常に異なる濃度および分析感度を有する。したがって、最も速いウイルスＲＮＡ検出法：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ウイルス自体を標的にすることが重要である。
過去２０年の間に、ＤＥＮＶの血清型をオフチップで検出するために、いくつかのＲＴ−ＰＣＲ法が開発された。しかし、公開された方法の評価は、感度不足および／または特異性の欠如を示し、方法の８０％について改善が必要である。最近では、いくつかのアッセイが商業化され、８３．３〜１００％の間の感度および１００％の特異性を示した。しかし、それらは、臨床現場または病院においてのみ実施されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本開示の目的は、ポイントオブケアにおける血液サンプル中のＲＴ−ＰＣＲによりウイルスＲＮＡを検出する分子診断プラットホームである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の技術は、ポイントオブケアにおけるデング熱の検出のための統合的分子診断システム（ｉＭＤｘ）を対象とする。１つの実施形態において、全血からのデングウイルスの選択的分離のための血漿分離、ＲＮＡ抽出のためのデングウイルスのＬＥＤ駆動の光熱溶解、およびデングウイルスＲＮＡの増幅のためのＬＥＤ駆動の高速光キャビティＰＣＲが、単一のデバイス内にオンチップで統合されている。これらの構成要素を統合することにより、臨床的に意義のあるデングウイルス濃度と同等の優れた検出限界で、デング熱の診断の時間、コストおよびステップを大幅に削減することができる。併せて、デング熱のポイントオブケア診断のための高感度、高速かつ低コストのｉＭＤｘも得ることができる。
本技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するウイルス粒子の核酸増幅、またはループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）などの等温増幅、およびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）によるポイントオブケアにおけるデング熱の検出のために容易に使用することができる。また、本技術を使用して、ＨＩＶ、エボラおよび西ナイルウイルスなどの任意のウイルス性疾患を検出することができる。
本明細書に記載の技術の別の態様を本明細書の以下の部分で説明するが、詳細な説明は、本技術の好ましい実施形態を十分に開示するためのものであり、それらを制限しない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本明細書に記載の技術は、例示のみを目的とする以下の図面を参照することによってさらに詳しく理解されるであろう。
【図１Ａ】本明細書による、デング熱などの疾患の検出のための統合的分子診断システム（ｉＭＤｘ）の概略斜視図である。
【図１Ｂ】図１ＡのｉＭＤｘシステムの個々の層の概略斜視図である。
【図２Ａ】デングウイルスの熱溶解温度に応じた、抽出ＲＮＡと、熱溶解デングウイルス粒子（ＶＰ）との間のＲＴ−ｑＰＣＲの閾値サイクル（Ｃt）の比較を示すプロットである。熱溶解を所与の温度で１０分間実施した。
【図２Ｂ】熱溶解時間に応じたＲＴ−ｑＰＣＲの閾値サイクル（Ｃt）の変化を示すプロットである。
【図２Ｃ】ＲＴ−ｑＰＣＲの反応容量における血漿のパーセントに応じたリボヌクレアーゼ阻害剤ありとなしのＲＴ−ｑＰＣＲの閾値サイクル（Ｃt）の比較を示すプロットである。
【図２Ｄ】デングウイルスの熱溶解時の血漿のパーセントに応じたＲＴ−ｑＰＣＲの閾値サイクル（Ｃt）の変化を示すプロットである。
【図３】デングウイルスの熱溶解時の異なるパーセントの血漿での熱溶解デングウイルスのＲＴ−ｑＰＣＲの閾値サイクル（Ｃt）をまとめたプロットである。
【図４Ａ】異なる濃度のデングウイルス粒子をスパイクした血漿を使用したＲＴ−ｑＰＣＲのリアルタイム蛍光強度を示すプロットである。従来の遠心分離法および本明細書によるオンチップ血漿分離デバイスにより血漿（ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍｓ）を分離した。
【図４Ｂ】異なる方法を使用して調製された血漿を使用したＲＴ−ｑＰＣＲの閾値サイクル（Ｃt）をまとめたプロットである。
【図４Ｃ】本明細書によるオンチップ血漿分離デバイスおよび従来の遠心分離法により分離された血漿を使用したＲＴ−ｑＰＣＲ時の産物の生成を示す２％アガロースゲルの結果の画像である。
【図５Ａ】異なる濃度のデングウイルス粒子をスパイクした血漿を使用したＲＴ−ｑＰＣＲのリアルタイム蛍光強度を示すプロットである。従来の遠心分離法および本明細書のオンチップ血漿分離デバイスにより血漿を分離した。
【図５Ｂ】異なる方法を使用して調製された血漿を使用したＲＴ−ｑＰＣＲの閾値サイクル（Ｃt）をまとめたプロットである。
【図５Ｃ】本明細書のオンチップ血漿分離デバイスおよび従来の遠心分離法により分離された血漿を使用したＲＴ−ｑＰＣＲ時の産物の生成を示す２％アガロースゲルの結果の画像である。
【図６】異なる濃度のデングｃＤＮＡ鋳型を使用した高速光キャビティＰＣＲによる産物の生成を示す２％アガロースゲルの結果の画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
図１Ａ〜図６は、ポイントオブケアにおけるデング熱（ＤＦ）の高速かつ高感度の診断のための技術を対象とする。本技術の１つの特定の利点は、最小限のステップの核酸増幅による統合的オンチップサンプル調製および検出を使用してデング熱を検出するためのサンプルツーアンサー（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ａｎｓｗｅｒ）分子診断システムを提供することである。別の利点には、資源が限られた状況での高速、高感度かつ低コストの診断が含まれ得る。システムおよび方法は、デング熱の高速かつ高感度の検出に特に適しているが、本明細書の技術を使用して、他の病状、ならびにこれらに限定されないが、エボラ、ＨＩＶおよび西ナイルウイルスなどの任意のウイルス性疾患を検出することができると理解される。
ここで図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、図１Ａは、デング熱などの疾患の検出のための統合的分子診断システム１０（ｉＭＤｘ）の概略斜視図を示し、図１Ｂは、図１ＡのｉＭＤｘシステムの個々の層の概略斜視図を示す。
【０００９】
ｉＭＤｘシステム１０は、結合層１４ａおよび１４ｂによって互いに接着された上層１２、中層１６および底層１８から構成される多層チップを備える。１つの実施形態において、上層１２、中層１６および底層１８は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などのポリマーを含み、結合層は、３つの層１２、１６および１８のそれぞれを適切に結合する指定のパターンにしたがってレーザ切断された感圧接着剤（ＰＳＡ）、例えば、両面感圧接着剤（ｄｓＰＳＡ）を含む。しかし、当技術分野において利用可能な他のポリマーまたは材料を適宜使用することができると理解される。そのような実施形態において、上層１２および中層１６はそれぞれ厚さ１ｍｍおよび２ｍｍに射出成形されており、底層１８は０．８ｍｍ厚にレーザ切断されている。
【００１０】
サンプル血液は、入口２０でｉＭＤｘシステム１０内に投与される。標的ウイルスを含む血漿は、溶血しない血漿分離法を使用して、分離区画２２によりまず分離される。次いで、分離された血漿は、ＬＥＤ駆動の光熱溶解によりウイルスからウイルスＲＮＡを抽出するために、加熱区画３４により加熱される。オンチップ熱溶解を使用することにより、ウイルスＲＮＡを抽出する時間、コストおよびステップが、従来のオフチップＲＮＡ抽出キットと比べて大幅に削減される。最後に、抽出ウイルスＲＮＡがオンチップＬＥＤ駆動高速光キャビティＰＣＲ区画２４によって増幅される。区画２２、２４および３４のそれぞれは、層１２、１６および１８内のフィーチャにより可変的に形成され、その詳細を以下の本文において説明する。
【００１１】
血液入口２０は、上層１２内の第１の開口部４０と、底層１８により画定された底面を有する受け入れウェルを形成する中層１６内の貫通孔６０とを備える。各結合層１４ａおよび１４ｂ内の開口部５０および７０は、層間の流体連通を可能にする。貫通孔６０は、孔６０と孔６２との間の接続チャネル６１により、中層１６内の貫通孔６２と流体連通している。貫通孔６２は、血液分離区画２２のための第２の受け入れウェルを形成する。
【００１２】
１つの実施形態において、血液分離は、中層１６と上層１２との間（結合層１４ｂ内の開口部５４の上方）に配置されたフィルタ５２により実現する。フィルタは、赤血球の上行を制限する孔径（例えば、０．４μｍ）を有する多孔質材料（例えば、ポリエステル）を含み、したがって、濾過された血漿を区画２２内に供給する。代替の実施形態において、他の濾過構成が、フィルタ５２と組み合わせて、またはフィルタ５２の代わりに使用されてもよい。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１６年２月８日に出願された米国特許出願第１５／０１７，８５１号に記載のものと同様の重力による沈降（ｇｒａｖｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に基づく、懸濁液スキミング（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｓｋｉｍｍｉｎｇ）機構を使用するマイクロクリフ（ｍｉｃｒｏ−ｃｌｉｆｆ）構造４２を血漿分離区画２２が含んでもよい。全血中の血漿と血球との分離は、タンパク質検出および核酸分析の両方にとって極めて重要であり得る。例えば、赤血球中のヘモグロビンは、その不透明性のために、光学的読み取りを不明瞭にする可能性がある。キレート化する特性がサンプル中のイオン濃度を乱し、したがってポリメラーゼ活性を阻害するため、ヘモグロビンは周知のＮＡ増幅阻害物質でもある。
【００１３】
次いで、分離された血漿は、上層１２内および中層１６内それぞれの開口部６３および６５を経由して、加熱区画３４の中層１６内に形成された保持ウェル６４まで進む。好ましい実施形態において、加熱区画３４は、底層１８の上面に配置された金属層として形成されたオンチップ加熱要素８２を備える。加熱要素８２は、要素８２に電流を供給するために、電源（例えば、図示されていないバッテリー）に接続されてもよい。好ましい実施形態において、分離された血漿は、チャネル６６およびインジケータ２６と共にＬＥＤ駆動の光熱溶解によりウイルスからウイルスＲＮＡを抽出するために、中層１６内の光キャビティとしての加熱区画３４により加熱される。ＬＥＤ／光キャビティのさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４２５５およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３２を参照して見出すことができる。
【００１４】
光キャビティＰＣＲ増幅を行うために、その上に血液が引き込まれる中層１６内のチャンバ６８とチャネル６６は連通している。ＰＣＲ増幅区画２４は、底層１８の上面に配置された金属層として形成されたオンチップ加熱要素８４を備える。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１７年７月１３日に出願された米国出願第１５／６４９，３２８号に開示されているＬＥＤ駆動のプラズモン加熱デバイスおよび方法と同様の、プラズモン光熱による光熱変換（ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｌｉｇｈｔ−ｔｏ−ｈｅａｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を促進するＬＥＤを加熱要素８４が形成するように、ＰＣＲ増幅区画２４およびチャンバ６８がマイクロ流体熱サイクルチャンバとして構築されてもよい。
【００１５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するウイルス粒子の核酸増幅に加えて、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）などの等温増幅、またはリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のために増幅区画が構成されてもよいと理解される。
好ましい実施形態において、光熱溶解および標的核酸のＰＣＲ増幅のための光キャビティを形成するために、加熱要素８２、８４は、電子ビーム蒸着により堆積させた金薄膜を備える。結合層１４ｂ内のカットアウト７２および７４は、各光キャビティに開口部を与える。
血液成分の定量的なデジタル検出の形態でサンプル分析するためのサンプルのデジタル処理のためのＰＣＲ増幅区画２４と流体連通させるために、複数のチャネル３０が上層１２内に配置されている。ｉＭＤｘシステム１０を使用して取得されたデータは、費用のかかる熱サイクラー、マイクロプレート分光光度計または他の複雑なリーダが与え得るデータと同等である。しかし、ｉＭＤｘシステム１０は、構築および実施に数ドルしかかからない。１つの実施形態において、終点の結果を読み取ることにより、蛍光を発する陽性ウェル数を計数して、濃度データを得ることが可能である。単純な蛍光および陽性ウェルの終点計数は、フィルタを備えたスマートフォン（図示せず）により行うことができる。
【００１６】
最後に、上層１２内の凹部４４内、ならびに中層１４ａ、１６および１４ｂ内それぞれの長方形のカットアウト５６、６５および７６内にキャビティ３２が形成されてもよい。キャビティ３２は、チャネル３０と連通しており、入口２０から様々なオンチップ区画を経由してサンプルを引き込むために使用される、流体を偏らせる（ｆｌｕｉｄ  ｂｉａｓｉｎｇ）デバイスもしくはポンプ（図示せず）を備える、または収容するように構成されている。
これら３つの構成要素（分離区画２２、加熱区画３４およびＰＣＲ増幅区画２４）を単一のデバイス内に統合することにより、ポイントオブケア試験のためのチップデバイス上のサンプルツーアンサーラボが得られる。
【実施例】
【００１７】
（例１）
まず、デングウイルスからウイルスＲＮＡを抽出するための熱溶解の温度および時間を図２Ａおよび図２Ｂに示す通り最適化した。熱溶解の温度が上昇し、時間が増加するにつれて、特定の温度（５０℃）および時間（１０分）で閾値（Ｃt）は低下するが、熱溶解のＣtは依然として抽出ＲＮＡより高い。これは、デングウイルスのホルムアルデヒド不活性化によって引き起こされるＲＮＡ損傷に起因し得る。ＲＴ−ｑＰＣＲ時および熱溶解時の血漿のパーセントの影響を図２Ｃおよび図２Ｄに示す通り調査した。２０％の血漿で、反応時にリボヌクレアーゼ阻害剤が含まれていたが、ＲＴ−ｑＰＣＲが著しく阻害され、高い閾値サイクルを示した。また、熱溶解時の血漿のパーセントが高くなるにつれて、閾値が高くなる。したがって、感度を損なわずに単一ステップのデング熱オンチップ検出を実現するためには、熱溶解時ならびにＲＴ−ＰＣＲ時の血漿の最大パーセントは、これらの結果に基づいて、およそ１０％である。
図３は、熱溶解時の血漿のパーセントに応じた、デングウイルスの熱溶解により抽出されたウイルスＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲの閾値サイクル（Ｃt）の概要を示す。血漿の増加と共に閾値サイクルは増加するが、検量線は良好なＲ2値を示す。
【００１８】
（例２）
全血からの選択的なデングウイルス分離を調査するために、従来のオフチップ遠心分離およびオンチップ血漿分離デバイスを使用して、異なる濃度のデングウイルスを含む全血漿を分離した。血漿分離後、ウイルスＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。図４Ａは、デングウイルスのＲＴ−ｑＰＣＲのリアルタイム蛍光強度を示す。オンチップ法により分離された血漿を使用したＲＴ−ｑＰＣＲは、図４Ｂに示す通り、従来の遠心分離法により調製された血漿と同様の閾値サイクルを示す。図４Ｃは、２％アガロースゲルの結果を示し、異なる濃度のデングウイルスを含む血漿を使用したＲＴ−ｑＰＣＲ時の特定のＰＣＲ産物の生成が確認される。ウイルス粒子の回収は、ｉＭＤｘ  １０のプラスチック面の表面パッシベーションを最適化することによってさらに改善することができる。
【００１９】
（例３）
２つの金薄膜（１０ｎｍ厚および１２０ｎｍ厚）を備えた光キャビティチャンバ内のオンチップＬＥＤ駆動光熱溶解も図５に示す通り実施した。ウイルスＲＮＡを抽出するために、異なる濃度のデングウイルスを含む血漿を熱処理した。比較する目的で、オフチップ熱溶解のために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰＣＲ熱サイクラーを使用した。図５Ｂおよび図５Ｃに示す通り、オンチップＬＥＤ駆動光熱溶解は、オフチップ熱溶解と同様の結果を示し、このオンチップ熱溶解が、ポイントオブケアにおけるサンプルツーアンサー分子診断デバイスのためにデングウイルスからウイルスＲＮＡを効果的に抽出することができることを示す。
最後に、図６に示す通り、デングｃＤＮＡを増幅するためにＬＥＤ駆動の高速光キャビティＰＣＲを使用した。１０ｎｍ厚および１２０ｎｍ厚を有する光キャビティをＰＣＲのために使用した。デングｃＤＮＡ鋳型の増幅が、１０3〜１０6ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬの範囲の濃度で首尾よく実証された。
本明細書の説明から、以下が含まれるがこれらに限定されない複数の実施形態を本開示が包含することを理解されたい。
【００２０】
１．血液サンプルのポイントオブケア診断のためのマイクロ流体チップの形態の統合的分子診断システムであって、マイクロ流体チップ内の第１の位置にあるサンプル入口であり、血液サンプルを受け入れるように構成された、サンプル入口と、マイクロ流体チップ上の第２の位置に位置する血漿分離チャンバであり、血液サンプルを受け入れて血漿から赤血球を分離するようにサンプル入口と流体連通している、血漿分離チャンバと、マイクロ流体チップ上の第３の位置に位置する光熱溶解チャンバであり、分離された血漿を受け入れて分離された血漿のＲＮＡ抽出を行うように血漿分離チャンバと流体連通している、光熱溶解チャンバと、マイクロ流体チップ上の第４の位置に位置する光ＰＣＲキャビティであり、分離された血漿中のＲＮＡを増幅するように構成された、光ＰＣＲキャビティとを含む、システム。
【００２１】
２．血液サンプルのポイントオブケア診断のための方法であって、マイクロ流体チップの入口で血液サンプルを受け入れるステップと、入口と流体連通している、マイクロ流体チップ内の分離チャンバ内で血漿から赤血球を分離するステップと、マイクロ流体チップ内に分離チャンバと流体連通して位置する光熱溶解チャンバ内に分離された血漿を受け入れて分離された血漿のＲＮＡ抽出を行うステップと、マイクロ流体チップ内に光熱溶解チャンバと流体連通して位置する光ＰＣＲキャビティ内に分離された血漿を受け入れて分離された血漿中の抽出ＲＮＡを増幅するステップとを含む、方法。
【００２２】
３．血液サンプルのポイントオブケア診断のためのマイクロ流体チップの形態の統合的分子診断システムであって、マイクロ流体チップ内の第１の位置にあるサンプル入口であり、血液サンプルを受け入れるように構成された、サンプル入口と、マイクロ流体チップ上の第２の位置に位置する血漿分離チャンバであり、血液サンプルを受け入れて血漿から赤血球を分離するようにサンプル入口と流体連通している、血漿分離チャンバと、マイクロ流体チップ上の第３の位置に位置する光熱溶解チャンバであり、分離された血漿を受け入れて分離された血漿のＲＮＡ抽出を行うように血漿分離チャンバと流体連通している、光熱溶解チャンバと、マイクロ流体チップ上の第４の位置に位置する光ＰＣＲキャビティであり、分離された血漿中のＲＮＡを増幅するように構成された、光ＰＣＲキャビティとを含み、光ＰＣＲキャビティが、血液サンプルを保持するように構成された複数のチャンバ壁により画定された少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバを備える、システム。
【００２３】
４．デング熱のポイントオブケア診断のための統合的分子診断システムであって、血液サンプル中の全血からのデングウイルスの選択的分離のためのオンチップ血漿分離チャンバと、デングウイルスのＲＮＡ抽出のためのオンチップＬＥＤ駆動光熱溶解チャンバと、デングウイルスＲＮＡの増幅のためのオンチップＬＥＤ駆動高速光ＰＣＲキャビティとを含む、システム。
５．デング熱のポイントオブケア診断のための方法であって、溶血しない血漿分離を使用して、デングウイルスを含む血漿を分離するステップと、分離された血漿を加熱してＬＥＤ駆動の光熱溶解によりウイルスからウイルスＲＮＡを抽出するステップと、オンチップＬＥＤ駆動高速光キャビティＰＣＲによって、抽出ウイルスＲＮＡを増幅するステップとを含む、方法。
【００２４】
６．血液サンプルがウイルスを含み、光熱溶解チャンバが、ウイルスのＲＮＡを抽出するように構成されており、かつ光ＰＣＲキャビティを使用するウイルスＲＮＡの増幅が、分離された血漿中のウイルスＲＮＡを増幅するように構成されている、実施形態１から５まで、または実施形態７から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
７．光ＰＣＲキャビティが、血液サンプルを保持するように構成された複数のチャンバ壁により画定された少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバを備える、実施形態１から６までのいずれか１項に記載のシステム。
【００２５】
８．光ＰＣＲキャビティが、標的核酸のＰＣＲ増幅のために分離された血漿を加熱するように構成された金属薄膜を光キャビティの表面に備える、実施形態１から７まで、または実施形態９から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
９．金属薄膜が金を含む、実施形態１から８まで、または実施形態１０から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
１０．金薄膜がＬＥＤ駆動の光熱加熱デバイスとして機能する、実施形態１から９まで、または実施形態１１から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
１１．光熱溶解チャンバが、光熱溶解を行うために分離された血漿を加熱するように構成された第２の金属薄膜を光熱溶解チャンバの表面に備える、実施形態１から１０まで、または実施形態１２から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
【００２６】
１２．第２の金属薄膜が、ＬＥＤ駆動の光熱加熱デバイスとして機能する金薄膜を含む、実施形態１から１１まで、または実施形態１３から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
１３．光ＰＣＲキャビティと流体連通しているマイクロチップ上の第５の位置に位置する流体ポンピング機構をさらに含み、流体ポンピング機構は、入口から光ＰＣＲキャビティに血液サンプルを引き込むように構成されている、実施形態１から１２まで、または実施形態１４から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
１４．血漿から赤血球を分離するステップが、溶血せずに行われる、実施形態１から１３まで、または実施形態１５から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
１５．血液サンプルがウイルスを含み、ＲＮＡ抽出を行うステップが、分離された血漿を加熱して光熱溶解によりウイルスからウイルスＲＮＡを抽出するステップを含み、抽出ＲＮＡを増幅するステップが、ＬＥＤ駆動の高速光キャビティＰＣＲによって、抽出ウイルスＲＮＡを増幅することにより、分離された血漿中のウイルスＲＮＡを増幅するステップを含む、実施形態１から１４まで、または実施形態１６から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
【００２７】
１６．光熱溶解およびＲＮＡ増幅がＬＥＤ駆動である、実施形態１から１５まで、または実施形態１７から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
１７．光ＰＣＲキャビティが、血液サンプルを保持するように構成された複数のチャンバ壁により画定された少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバを備える、実施形態１から１６まで、または実施形態１８から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
１８．光ＰＣＲキャビティおよび光熱溶解チャンバそれぞれが、標的核酸のＰＣＲ増幅のために分離された血漿を加熱するように構成され、かつ光熱溶解を行うために分離された血漿を加熱するように構成された金属薄膜を備える、実施形態１から１７まで、または実施形態１９から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
１９．金属薄膜が金を含む、実施形態１から１８まで、または実施形態２０から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
【００２８】
２０．金薄膜がＬＥＤ駆動のプラズモン加熱デバイスとして機能する、実施形態１から１９まで、または実施形態２１から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
２１．光ＰＣＲキャビティと流体連通している流体マイクロチップ上に位置する流体ポンピング機構によって、血液が、入口から光ＰＣＲキャビティに受動的に引き込まれる、実施形態１から２０まで、または実施形態２２から２４までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
２２．血液サンプルがウイルスを含み、光熱溶解チャンバが、ウイルスのＲＮＡを抽出するように構成されており、かつ光ＰＣＲキャビティを使用するウイルスＲＮＡの増幅が、分離された血漿中のウイルスＲＮＡを増幅するように構成されている、実施形態１から２１まで、または実施形態２３もしくは２４のいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
２３．光ＰＣＲキャビティが、血液サンプルを保持するように構成された複数のチャンバ壁により画定された少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバを備える、実施形態１から２２まで、または実施形態２４のいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
２４．光ＰＣＲキャビティが、光熱溶解および標的核酸のＰＣＲ増幅のための光キャビティを形成するための一対の金薄膜を備える、実施形態１から２３までのいずれか１項に記載のシステムまたは方法。
【００２９】
本明細書において使用されるとき、単数の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により特に明確に定められていない限り、複数の指示対象を含む。単数の対象物への言及は、明示的にそのように記載されていない限り、「ただ１つ」を意味するものではなく、「１つまたは複数」を意味するものである。
本明細書において使用されるとき、「組（ｓｅｔ）」という用語は、１つまたは複数の対象物の集合を指す。したがって、例えば、１組の対象物は、単一の対象物または複数の対象物を含み得る。
本明細書において使用されるとき、「実質的に」および「約」という用語は、わずかなばらつきを表し、説明するために使用される。事象または状況と共に使用されるとき、これらの用語は、事象または状況が正確に発生する場合の例、ならびに事象または状況がほぼ正確に発生する場合の例を指し得る。数値と共に使用されるとき、これらの用語は、その数値の±１０％以下、例えば、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下または±０．０５％以下のばらつきの範囲を指し得る。例えば、「実質的に」整列した（“ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ”  ａｌｉｇｎｅｄ）は、±１０°以下、例えば、±５°以下、±４°以下、±３°以下、±２°以下、±１°以下、±０．５°以下、±０．１°以下または±０．０５°以下の角度のばらつきの範囲を指し得る。
【００３０】
さらに、量、比および他の数値は、場合によって、本明細書において範囲形式で提示されることがある。そのような範囲形式は、利便性と簡潔さから使用されると理解されるべきであり、範囲の限界値として明示的に指定されている数値を含むだけでなく、その範囲内に包含されるすべての個々の数値または部分範囲も、それぞれの数値および部分範囲が明示的に指定されている場合と同様に含むと柔軟に理解されるべきである。例えば、約１〜約２００の範囲内の比は、明示的に記載されている約１および約２００の限界値を含むが、約２、約３および約４などの個々の比、ならびに例えば、約１０〜約５０、約２０〜約１００などの部分範囲も同様に含むと理解されるべきである。
本明細書の説明は多くの詳細を含むが、これらは、本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではなく、単に、本発明に好ましい実施形態の一部の例示を提供するものと解釈すべきである。したがって、本開示の範囲は、当業者には明らかになるであろう他の実施形態を完全に包含することを理解されたい。
【００３１】
当業者に既知の開示されている実施形態の要素のすべての構造的および機能的な均等物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、本特許請求の範囲により包含されるものである。さらに、本開示の要素、構成要素または方法ステップは、要素、構成要素または方法ステップが特許請求の範囲に明示的に記載されているかに関わらず、公開専用であることを意図しない。本明細書における請求項の要素は、要素が、「のための手段（ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ）」という語句を使用して明示的に記載されていない限り、「ミーンズプラスファンクション」要素と解釈されるべきではない。本明細書における請求項の要素は、要素が、「のためのステップ（ｓｔｅｐ  ｆｏｒ）」という語句を使用して明示的に記載されていない限り、「ステッププラスファンクション」要素と解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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