(57)【要約】【課題】  少ない試料で、センサ面における高い反応効率を得る。【解決手段】  試料を含む溶液２１が注入される流路１６と対向する位置にはセンサ面１３ａが配置されている。ピペット対１９は、一方のピペット１９ａに溶液２１を吸い込み、１番目のセンサセル１７に溶液２１を注入する。注入後、吸引と吐出を繰り返して、流路１６内の溶液２１を流動させる。この後、一方のピペット１９ｂで溶液２１を吸い出して流路１６から溶液２１を排出する。ピペット対１９は、この溶液２１を保持したまま、２番目のセンサセル１７に移動して、その流路１６へ溶液２１を注入する。こうして溶液２１が複数のセンサセル１７間で使い回される。これにより、少ない試料で、センサ面１３ａに対して試料の固定が可能になり、高い反応効率（使用する溶液に対する固定量の割合）が得られる。【選択図】        図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の化学反応を検出するセンサ面と、このセンサ面に対向して配置され試料を含む試料溶液が注入される流路とによってそれぞれが構成された複数のセンサセルに対して、前記試料溶液を注入してそれぞれのセンサ面へ前記試料溶液を送液する送液方法において、
１つのセンサセルへ前記試料溶液を注入して前記センサ面へ送液した後、当該センサセルから前記試料溶液を排出し、この排出した試料溶液を別のセンサセルへ注入し排出するという処理を繰り返して、前記試料溶液を複数のセンサセル間で使い回すことを特徴とする送液方法。
【請求項２】
複数のセンサセルのすべてに対して、前記試料溶液の注入及び排出が終了した場合には、再び最初に試料溶液を注入したセンサセルから前記試料溶液の注入及び排出を繰り返すことを特徴とする請求項１記載の送液方法。
【請求項３】
前記試料溶液の注入及び排出は、前記流路の両端の開口に、先端がそれぞれ配置される１対のピペットによって行われることを特徴とする請求項１又は２いずれか記載の送液方法。
【請求項４】
１つのセンサセルへの送液に際して、前記センサセルへ前記試料溶液を注入後、そこから試料溶液を排出するまでの間、一方のピペットによる前記試料溶液の吐出と、他方のピペットによる前記試料溶液の吸引とを交互に繰り返して、センサセル内の試料溶液を流動させることを特徴とする請求項３記載の送液方法。
【請求項５】
前記センサは、一方の面が前記センサ面となる金属膜を持ち、前記センサ面における反応状況を表面プラズモン共鳴現象を利用して測定する際に用いられるＳＰＲセンサであることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の送液方法。
【請求項６】
前記試料溶液の使い回しは、前記センサ面に試料を固定する際に行われることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の送液方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の反応を検出するセンサのセンサ面へ、試料を送液する送液方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば、タンパク質やＤＮＡなどの生化学物質の相互作用を調べたり、薬品のスクリーニングを行う場合において、試料の反応を測定する測定装置として、全反射減衰を利用した測定装置が知られている。
【０００３】
全反射減衰を利用した測定装置は、透明な誘電体上に形成された薄膜の一方の面であるセンサ面上において試料の反応を生じさせ、前記センサ面の裏面の光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させ、その反射光の減衰状況を検出することにより前記反応を測定する。こうした全反射減衰を利用した測定装置の１つに、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）現象を利用した測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置という）がある。表面プラズモンとは、金属中の自由電子が集団的に振動することによって生じ、その金属の表面に沿って進む自由電子の粗密波である。
【０００４】
ＳＰＲ測定装置は、透明な誘電体上に形成された薄膜として金属膜を使用し、この金属膜の一方の面をセンサ面として、このセンサ面にＳＰＲを発生させ、そこで生じる物質の反応状況をＳＰＲを検出することにより測定する。
【０００５】
金属膜のセンサ面の裏面から、全反射条件を満足するように（臨界角以上の入射角で）光を照射すると、その光入射面において全反射が起こるが、入射光のうちわずかな光は反射せずに金属膜内を通過して、センサ面に染み出す。この染み出した光波がエバネッセント波と呼ばれる。このエバネッセント波と表面プラズモンの振動数が一致して共鳴すると（ＳＰＲが発生すると）、反射光の強度が大きく減衰する。ＳＰＲ測定装置は、前記光入射面で反射する反射光の減衰を捉えることにより、その裏側のセンサ面で発生するＳＰＲを検出する。
【０００６】
ＳＰＲを発生させるための光の入射角（共鳴角）は、エバネッセント波および表面プラズモンが伝播する媒質の屈折率に依存する。言い換えると、媒質の屈折率が変化すれば、ＳＰＲを発生させる共鳴角が変化する。センサ面と接する物質は、エバネッセント波および表面プラズモンを伝播させる媒質となるので、例えば、センサ面において、２種類の分子間の結合や解離などの化学反応が生じると、それが媒質の屈折率の変化として顕れて、共鳴角が変化する。ＳＰＲ測定装置は、この共鳴角の変化を捉えることにより分子間の相互作用を測定する。
【０００７】
生化学分野の実験や研究においては、タンパク質、ＤＮＡ、薬品などが、リガンドやアナライトとして使用される。例えば、薬品のスクリーニングを行う場合には、リガンドとして、タンパク質などの生体物質を使用し、このセンサ面にアナライトとなる複数種類の薬品を接触させて、それらの相互作用を調べる。
【０００８】
下記特許文献１に記載のＳＰＲ測定装置は、金属膜に光を入射させるための光学系として、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置を採用している。Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置では、金属膜の光入射面と、この光入射面に向けて全反射条件を満足するように照射された光を集光するプリズムとが接合される。リガンドとアナライトの反応を調べる場合には、まず、センサ面にリガンドが固定される。この固定処理では、センサ面と対向して配置された流路に対してリガンドを溶媒に溶かしたリガンド溶液を送液して、溶液中のリガンドをセンサ面に予め形成したリンカー膜に結合させる。
【０００９】
センサ面へのリガンド溶液の送液は、流路へリガンド溶液を連続的に流し続けたり、流路へリガンド溶液を注入した後、所定時間静置するなどの方法で行われる。
【特許文献１】特開平６−１６７４４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記送液方法では、リンカー膜へのリガンドの結合量（固定量）を増やしたい場合には、試料となるリガンドの量を多くせざるを得なかった。すなわち、流路へリガンド溶液を連続的に流し続ける方法では、流路以外にも循環路となる配管部分を満たすだけのリガンド溶液が必要となるため、多量のリガンド溶液が必要になる。また、注入後所定時間静置する方法では、リガンド溶液の体積自体は少なくて済むものの、リガンドの拡散を自然まかせにするため、リンカー膜との結合反応効率が悪い。そのため、リガンドの濃度が高い溶液を使わざるをない。試料は非常に高価であるため、できるだけ少ない試料で必要な固定量を得たいという要望が強かった。
【００１１】
本発明は、少ない試料で、センサ面における高い反応効率が得られる送液方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の送液方法は、試料の反応を検出するセンサ面と、このセンサ面に対向して配置され試料を含む試料溶液が注入される流路とによってそれぞれが構成された複数のセンサセルに対して、前記試料溶液を注入してそれぞれのセンサ面へ前記試料溶液を送液する送液方法において、１つのセンサセルへ前記試料溶液を注入して前記センサ面へ送液した後、当該センサセルから前記試料溶液を排出し、この排出した試料溶液を別のセンサセルへ注入し排出するという処理を繰り返して、前記試料溶液を複数のセンサセル間で使い回すことを特徴とする。
【００１３】
複数のセンサセルのすべてに対して、前記試料溶液の注入及び排出が終了した場合には、再び最初に試料溶液を注入したセンサセルから前記試料溶液の注入及び排出を繰り返してもよい。
【００１４】
前記試料溶液の注入及び排出は、前記流路の両端の開口に、先端がそれぞれ配置される１対のピペットによって行われることが好ましい。
【００１５】
１つのセンサセルへの送液に際して、前記センサセルへ前記試料溶液を注入後、そこから試料溶液を排出するまでの間、一方のピペットによる前記試料溶液の吐出と、他方のピペットによる前記試料溶液の吸引とを交互に繰り返して、センサセル内の試料溶液を流動させることが好ましい。
【００１６】
前記センサは、例えば、一方の面が前記センサ面となる金属膜を持ち、前記センサ面における反応状況を表面プラズモン共鳴現象を利用して測定する際に用いられるＳＰＲセンサである。
【００１７】
前記試料溶液の使い回しは、例えば、前記センサ面に試料を固定する際に行われる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の送液方法は、１つのセンサセルへ前記試料溶液を注入して前記センサ面へ送液した後、当該センサセルから前記試料溶液を排出し、この排出した試料溶液を別のセンサセルへ注入し排出するという処理を繰り返して、前記試料溶液を複数のセンサセル間で使い回すようにしたから、少ない試料で、センサ面における高い反応効率が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
図１に示すように、ＳＰＲを利用した測定方法は、大きく分けて、固定工程と、測定処工程（データ読み取り工程）と、データ解析工程との３つの工程からなる。ＳＰＲ測定装置は、固定工程を行う固定機１０と、測定工程を行う測定機１１と、測定機１１によって得られたデータを解析する解析機からなる。
【００２０】
測定は、ＳＰＲセンサであるセンサユニット１２を用いて行われる。センサユニット１２は、一方の面がＳＰＲが発生するセンサ面１３ａとなる金属膜１３と、このセンサ面１３ａの裏面の光入射面１３ｂと接合されるプリズム１４と、前記センサ面１３ａと対向して配置され、リガンドやアナライトが送液される流路１６が形成された流路部材４１とを備えている。
【００２１】
金属膜１３としては、例えば、金が使用され、その膜厚は、例えば、５００オングストロームである。この膜厚は、金属膜の素材、照射される光の発光波長などに応じて適宜選択される。プリズム１４は、その上面に前記金属膜１３が形成される透明な誘電体であり、光入射面１３ｂに向けて、全反射条件を満たすように照射された光を集光する。流路１６は、略Ｕ字形に屈曲された送液管であり、その両端には液体の注入と排出を行う開口１６ａ，１６ｂが形成されている。流路１６の管径は、例えば、約１ｍｍ程度であり、各開口１６ａ、１６ｂの間隔は、例えば、約１０ｍｍ程度である。
【００２２】
また、流路１６の底部は、開放されており、この開放部位はセンサ面１３ａによって覆われて密閉される。これら流路１６とセンサ面１３ａによってセンサセル１７が構成される。後述するように、センサユニット１２は、こうしたセンサセル１７を複数個備えている（図２参照）。
【００２３】
固定工程は、センサ面１３ａにリガンドを固定する工程である。固定工程は、センサユニット１２を固定機１０にセットして行われる。固定機１０には、１対のピペット１９ａ，１９ｂからなるピペット対１９が設けられている。ピペット対１９は、各ピペット１９ａ，１９ｂが、流路１６の両端に形成された開口１６ａ，１６ｂのそれぞれに対応する位置に配置される。各ピペット１９ａ，１９ｂは、それぞれが流路１６への液体の注入と、流路１６からの吸い出しを行う送排出管であり、後述する連動機構によって、一方が注入動作を行っているときには、他方が吸い出し動作を行うというように、互いに連動する。このピペット対１９を用いて、各開口１６ａ，１９ｂの一方から、リガンドを溶媒に溶かしたリガンド溶液２１が注入され、他方から排出される。
【００２４】
センサ面１３ａのほぼ中央部には、リガンドと結合するリンカー膜２２が形成されている。このリンカー膜２２は、センサユニット１２の製造段階において予め形成される。リンカー膜２２は、リガンドを固定するための固定基となるので、固定するリガンドの種類に応じて適宜選択される。
【００２５】
リガンド溶液２１を注入するリガンド固定化処理を行う前に、前処理として、まず、リンカー膜２２に対して、固定用バッファ液を送液してリンカー膜２２を湿らせた後、リンカー膜２２へリガンドが結合しやすくするためにリンカー膜２２の活性化処理が施される。例えば、アミンカップリング法では、リンカー膜２２としてカルボキシメチルデキストランが使用され、リガンド内のアミノ基をこのデキストランに直接共有結合させる。この場合の活性化液としては、Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）との混合液が使用される。この活性化処理の後、固定用バッファによって流路１６が洗浄される。
【００２６】
固定用バッファや、リガンド溶液２１の溶媒（希釈液）としては、例えば、各種のバッファ液（緩衝液）の他、生理的食塩水に代表される生理的塩類溶液や、純水が使用される。これらの各液の種類、ｐＨ値、混合物の種類及びその濃度等は、リガンドの種類に応じて適宜決められる。例えば、リガンドとして生体物質を使用する場合には、ｐＨを中性付近に調整した生理的食塩水が使用される場合が多い。しかし、上記アミンカップリング法では、リンカー膜２２は、カルボキシメチルデキストランにより負（マイナス）に帯電するので、このリンカー膜２２と結合しやすいようにタンパク質を陽（プラス）に帯電させるため、生理的とはいえない高濃度のリン酸塩を含む緩衝作用の強いリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ：ｐhosphatic−buffered，saline）などが使用される場合もある。
【００２７】
こうした活性化処理及び洗浄が行われた後、センサセル１７へリガンド溶液２１が注入されてリガンド固定化処理が行われる。リガンド溶液２１が流路１６へ注入されると、溶液中で拡散しているリガンド２１ａが徐々にリンカー膜２２へ近づいて、結合する。こうしてセンサ面１３ｂにリガンド２１ａが固定される。固定化には、通常、約１時間数程度かかり、この間、センサユニット１２は、温度を含む環境条件が所定の条件に設定された状態で、保管される。
【００２８】
センサ面１３ａへのリガンド２１ａの固定化が完了すると、前記流路１６からリガンド溶液２１が排出される。リガンド溶液２１は、ピペット１９ｂによって吸い出されて排出される。固定化が完了したセンサ面１３ａは、流路１６へ洗浄液が注入されて洗浄処理が行われる。この洗浄後、必要に応じて、ブロッキング液を流路１６へ注入して、リンカー膜２２のうち、リガンドが結合しなかった反応基を失活させるブロッキング処理が行われる。ブロッキング液としては、例えば、エタノールアミン−ヒドロクロライドが使用される。このブロッキング処理の後、再び流路１６が洗浄される。この後、後述するように、流路１６には、乾燥防止液が注入される。これにより、センサユニット１２は、センサ面１３ａの乾燥が防止された状態で、測定までの間保管される。
【００２９】
測定工程は、センサユニット１２を測定機１１にセットして行われる。測定機１１にも、固定機１０のピペット対１９と同様のピペット対２６が設けられている。このピペット２６によって、各開口１６ａ，１６ｂの一方から、流路１６へ各種の液が注入され、他方から排出される。測定工程では、まず、流路１６へ測定用バッファが注入される。この後、アナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液２７を注入し、その後、再び測定用バッファが注入される。なお、最初に測定用バッファを注入する前に、いったん流路１６の洗浄を行ってもよい。データの読み取りは、基準となる信号レベルを検出するために、最初に測定用バッファを注入した直後から開始され、アナライト溶液２７の注入後、再び測定用バッファが注入されるまでの間行われる。これにより、基準レベルの検出、アナライトとリガンドの反応状況（結合状況）、測定バッファ注入による結合したアナライトとリガンドの脱離までの信号を測定することができる。
【００３０】
測定用バッファや、アナライト溶液２７の溶媒（希釈液）としては、例えば、各種のバッファ液（緩衝液）の他、生理的食塩水に代表される生理的塩類溶液や、純水が使用される。これらの各液の種類、ｐＨ値、混合物の種類及びその濃度等は、リガンドの種類に応じて適宜決められる。例えば、アナライトを溶けやすくするために、生理的食塩水にＤＭＳＯ（ジメチル−スルホ−オキシド）を含ませてもよい。このＤＭＳＯは、信号レベルに大きく影響するので、これをアナライトの溶媒に含ませた場合には、測定用バッファに対しても、同様の濃度で含ませることが好ましい。
【００３１】
なお、アナライト溶液２７は、長期間（例えば、１年）保管されることも多く、そうした場合には、経時変化によって、初期のＤＭＳＯ濃度と測定時のＤＭＳＯ濃度との間に濃度差が生じてしまう場合がある。厳密な測定を行う必要がある場合には、こうした濃度差をアナライト溶液２７を注入したときの参照信号の信号レベルから推定し、測定データに対して補正（ＤＭＳＯ濃度補正）が行われる。
【００３２】
ここで、参照信号（ｒｅｆ信号）とは、センサ面上に設けられリガンドが固定されない参照領域に対応するＳＰＲ信号であり、リガンドが固定されアナライトとの反応を生じる測定領域の測定信号（ａｃｔ信号）と比較参照される信号である。測定に際しては、前記測定信号と参照信号の２つの信号が検出され、データ解析に際しては、例えば、それら２つのＳＰＲ信号の差分を取り、これを測定データとして解析がなされる。こうすることで、例えば、複数のセンサセル間の個体差や、液体の温度変化など、外乱に起因するノイズをキャンセルすることが可能となり、Ｓ／Ｎ比の良好な信号が得られるようにしている。
【００３３】
ＤＭＳＯ濃度補正のための補正データは、アナライト溶液２７を注入する前に、ＤＭＳＯ濃度が異なる複数種類の測定用バッファをセンサセル１７に注入して、このときのＤＭＳＯ濃度変化に応じた、ｒｅｆ信号のレベルとａｃｔ信号のレベルのそれぞれの変化量を調べることにより求められる。
【００３４】
測定が終了すると、ピペット２６ｂによってアナライト溶液２７が排出口１６ｂから排出される。
【００３５】
測定部３１は、照明部３２と検出部３３からなる。上述したとおり、リガンドとアナライトの反応状況は、共鳴角（光入射面に対して照射された光の入射角）の変化として顕れるので、照明部３２は、全反射条件を満足する様々な入射角の光を光入射面１３ｂに対して照射する。照明部３２は、例えば、光源３４と、集光レンズ、拡散板、偏光板を含む光学系３６とからなり、配置位置および設置角度は、照明光の入射角が、上記全反射条件を満足するように調整される。
【００３６】
光源３４としては、例えば、ＬＥＤ（Light Emitting Diode），ＬＤ（Laser Diode），ＳＬＤ（Super Luminescent Diode）などの発光素子が使用される。こうした発光素子を１個使用し、この単一光源から１つのセンサセルに向けて光が照射される。なお、複数のセンサセルを同時に測定するような場合には、単一光源からの光を分光して複数のセンサセルに照射してもよいし、各センサセルに対して発光素子が１つずつ割り当てられるように複数の発光素子を並べて使用してもよい。拡散板は、光源３４からの光を拡散して、発光面内の光量ムラを抑える。偏光板は、照射光のうち、ＳＰＲを生じさせるｐ偏光のみを通過させる。なお、ＬＤを使用する場合など、光源が発する光線自体の偏光の向きが揃っている場合には、偏光板は不要である。また、偏光が揃っている光源を使用した場合でも、拡散板を通過することにより、偏光の向きが不揃いになってしまう場合には、偏光板を使用して偏光の向きが揃えられる。こうして拡散および偏光された光は、集光レンズによって集光されてプリズム１４に照射される。これにより、光強度にバラツキがなく様々な入射角を持つ光線を光入射面１３ｂに入射させることができる。
【００３７】
検出器３３は、光入射面１３ｂで反射する光を受光して、その光強度に応じたレベルの電気信号を出力する。光入射面１３ｂには、様々な角度で光線が入射するので、光入射面１３ｂでは、それらの光線が、それぞれの入射角に応じて様々な反射角で反射する。検出器３３は、これらの様々な反射角の光線を受光する。センサ面１３ａ上の媒質（表面プラズモンの）に変化が生じると屈折率が変化して、光強度が減衰する反射角（ＳＰＲが発生する共鳴角）も変化する。センサ面１３ａ上にアナライトを送液すると、アナライトとリガンドの反応状況に応じて共鳴角が変化するため、光強度が減衰する反射角も変化する。
【００３８】
検出器３３は、例えば、ＣＣＤエリアセンサやフォトダイオードアレイが使用され、光入射面１３ｂにおいて様々な反射角で反射する反射光を受光し、それらを光電変換してＳＰＲ信号として出力する。リガンドとアナライトの反応状況は、この受光面内における反射光の減衰位置の推移として顕れる。例えば、アナライトがリガンドと接触する前後では、センサ面１３ａ上の屈折率が異なり、ＳＰＲが発生する共鳴角（反射光の減衰位置）が異なる。そして、アナライトがリガンドと接触して反応を開始すると、それに応じて反射光の共鳴角が変化を開始して、前記受光面内における反射光の減衰位置が移動し始める。こうして得た反応状況を表すＳＰＲ信号が、データ解析機に出力される。データ解析工程では、測定機１１で得たＳＰＲ信号を解析して、リガンドとアナライトの相互作用を分析する。
【００３９】
なお、図上、光入射面１３ｂへの入射光線及びそこで反射する反射光線の向きが、流路１６内の液体の流れ方向と平行になるように、照明部３２及び検出器３３を配置した形態で示しているが、入射光線及び反射光線の向きが、前記流れ方向と直交する方向に照射されるように、照明部３２及び検出器３３を配置してもよい。
【００４０】
図２は、センサユニット１２の分解斜視図である。センサユニット１２は、流路１６が形成される流路部材４１と、上面に金属膜１３が形成されたプリズム１４と、流路部材４１を、その底面をプリズム１４の上面と接合させた状態で、保持する保持部材４２と、保持部材４２の上方に配置される蓋部材４３とからなる。
【００４１】
流路部材４１には、例えば、３つの流路１６が形成されている。流路部材４１は、長尺状をしており、３つの流路１６は、その長手方向に沿って配列されている。この流路１６は、その底面に接合される金属膜１３とともにセンサセル１７（図１参照）を構成する。そのため、流路部材４１は、金属膜１３との密着性を高めるために、弾性部材、例えば、ゴムや、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）で形成されている。これにより、流路部材４１の底面をプリズム１４の上面に圧接すると、流路部材４１が弾性変形して金属膜１３との接合面の隙間が埋められて、各流路１３の開放された底部がプリズム１４の上面によって水密に覆われる。なお、本例では、流路１６の数が３つの例で説明したが、もちろん、流路１６の数は、３つに限らず、１つ又は２つであってもよいし、４つ以上でもよい。
【００４２】
プリズム１４には、その上面に、蒸着によって金属膜１３が形成される。この金属膜１３は、流路部材４１に形成された複数の流路１６と対向するように短冊状に形成される。この金属膜１３の上面（センサ面１３ａ）には、各流路１６に対応する部位に、リンカー膜２２が形成される。このリンカー膜２２として使用する物質は、固定するリガンドの種類によって適宜決められる。
【００４３】
金属膜１３に金を使用し、リンカー膜２２として、デキストランを使用する場合の製膜は、例えば、次のような手順で行われる。まず、金属膜１３のセンサ面をオゾンクリーニングした後、センサ面１３ａに対して、エタノールと水の混合液を溶媒とするヒドロキシ−ウンデカンチオール溶液を添加し、２５℃の温度で１８時間表面処理を行って、センサ面１３ａをヒドロキシ−ウンデカンチチオールで被膜する。次に、このセンサ面１３ａに１０重量％のエピクロロヒドリン溶液に接触させ、その状態で２５℃の温度で４時間、振盪インキュべート（保温）して反応を進行させる。この後、センサ面１３ａをエタノールと水で洗浄する。この洗浄後、２５重量％のデキストラン水溶液（４０．５ｍｌ）に水酸化ナトリウム（４．５ｍｌ）を添加し、その溶液を、センサ面１３ａに接触させ、その状態で２５℃の温度で２０時間、振盪インキュベートする。この後、表面を５０℃の水で洗浄する。最後に、ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの水酸化ナトリウムで溶液に溶解した混合物をセンサ面１３ａに接触させて、２８℃の温度で１６時間、振盪インキュベートする。これにより、デキストランのリンカー膜２２が生成される。
【００４４】
また、プリズム１４の長手方向の両側面には、保持部材４２の係合部４２ａと係合する係合爪１４ａが設けられている。これらの係合により、流路部材４１が保持部材４２とプリズム１４とによって挟み込まれ、その底面とプリズム１４の上面とが圧接した状態で保持される。こうして、流路部材４１、金属膜１３及びプリズム１４が一体化される。
【００４５】
また、プリズム１４の短辺方向の両端部には、突部１４ｂが設けられている。後述するように、センサユニット１２は、ホルダ５２（図３参照）に収納された状態で、固定が行われる。突部１４ｂは、ホルダ５２と係合することにより、センサユニット１２をホルダー内の所定の収納位置に位置決めするためのものである。
【００４６】
保持部材４２の上部には、各流路１６の各開口１６ａ，１６ｂに対応する位置に、ピペット（１９ａ，１９ｂ，２６ａ，２６ｂ）の先端が進入する受け入れ口４２ｂが形成されている。受け入れ口４２ｂは、ピペットから吐出された液体が各開口１６ａ，１６ｂへ導かれるように、漏斗形状をしている。保持部材４２が流路部材４１を挟み込んでプリズム１４と係合すると、受け入れ口４２ｂの下面は、開口１６ａ，排出口１６ｂと接合して、受け入れ口４２ｂと流路１６とが連結される。
【００４７】
また、これら各受け入れ口４２ｂの両脇には、円筒形のボス４２ｃが設けられている。これらのボス４２ｃは、蓋部材４３に形成された穴４３ａと嵌合して、蓋部材４３を位置決めするためのものである。蓋部材４３は、受け入れ口４２ｂ及びボス４３ａに対応する位置に穴が空けられた両面テープ４４によって、保持部材４２の上面に貼り付けられる。
【００４８】
蓋部材４３は、流路１６に通じる受け入れ口４２ｂを覆うことで、流路１６内の液体の蒸発を防止する。蓋部材４３は、弾性部材、例えば、ゴムやプラスチックで形成されており、各受け入れ口４２ｂに対応する位置に、十字形のスリット４３ｂが形成されている。蓋部材４３は、流路１６内の液体の蒸発を防止するためのものであるから、受け入れ口４２ｂを覆う必要があるが、完全に覆ってしまっては、ピペットを受け入れ口４２ｂに挿入することができない。そこで、スリット４３ｂを形成することで、ピペットの挿入を可能とするとともに、ピペットを挿入していない状態では、受け入れ口４２ｂが塞がれるようにしている。スリット４３ｂは、ピペットが押し込まれると、スリット４３ｂの周辺が弾性変形（図１参照）して、スリット４３ｂの口が大きく開いて、ピペットを受け入れる。そして、ピペットを抜くと、弾性力によってスリット４３ｂが初期状態に復帰して、受け入れ口４２ｂを塞ぐ。
【００４９】
図３に示すように、固定機１０は、筐体のベースとなる筐体ベース５０上に、複数のセンサユニット１２を載置する載置スペース５１が確保されている。センサユニット１２は、この載置スペース５１で載置された状態で固定工程のすべての処理が施される。したがって、この載置スペース５１は、センサユニット１２に対して固定工程を実行する固定ステージとなる。
【００５０】
センサユニット１２は、ホルダ５２に収納された状態で固定機１０にセットされる。ホルダ５２は、センサユニット１２を複数個（例えば、８個）収納できるようになっている。ホルダ５２には、センサユニット１２の突部１４ｂと嵌合して、センサユニット１２を位置決めする嵌合部が設けられている。また、ホルダ５２の底部は、センサユニット１２の両端部を支持する支持部を除いて、開口になっている。後述するように、測定工程において、センサユニット１２をホルダ５２から取り出す場合には、この開口から押し上げ部材が挿入されてセンサユニット１２が押し上げられる。
【００５１】
載置スペース５１には、ホルダ５２を、例えば、１０個並べて配置することができるようになっており、その数に応じた台座５３が設けられている。各台座５３上には、ホルダ５２を位置決めする位置決め用のボスが設けられている。
【００５２】
固定機１０には、ヘッド本体にピペット対１９を３組連装したピペットヘッド５４が設けられている。このピペットヘッド５４が、載置スペース５１に配列されたセンサユニット１２にアクセスして、液体の注入や排出を行う。ピペットヘッド５４には、ピペット対１９が３組設けられているので、１つのセンサユニット１２に含まれる３つのセンサセル１７に対して同時に液体を注入（及び排出）することができる。固定機１０には、図示しないコントローラが設けられており、各ピペット対１９の吸い込みや吐き出しの動作は、そのタイミング、吸い込み量及び吐き出し量等が、コントローラによって各ピペットヘッド１８毎に制御される。
【００５３】
筐体ベース５０には、このピペットヘッド５４をＸ、Ｙ、Ｚの３方向に移動させるヘッド移動機構５６が設けられている。ヘッド移動機構５６は、例えば、搬送ベルト、プーリ、キャリッジ、モータなどから構成される周知の移動機構であり、ピペットヘッド５４を上下させる昇降機構と、この昇降機構ごとピペットヘッド５４をＹ方向へ移動自在に保持するガイドレール５８を含むＹ方向移動機構と、前記ガイドレール５８を両端で保持し、ガイドレール５８毎、ピペットヘッド５４をＸ方向へ移動させるＸ方向移動機構とからなる。ヘッド移動機構５６は、コントローラによって制御されており、コントローラは、このヘッド移動機構５６を駆動して、ピペットヘッド５４の上下左右の位置を制御する。
【００５４】
筐体ベース５０上には、流路１６へ注入する種々の液体（リガンド溶液、洗浄液、固定用バッファ，乾燥防止液，活性化液，ブロッキング液など）を保管する複数の液保管部６１が設けられている。液保管部の数は、使用する液体の種類に応じて決定される。各液保管部６１には、挿入口が６個並べて設けられている。この挿入口の数及び配列ピッチは、ピペットヘッド５４のピペットの数と配列ピッチに応じて決められる。ピペットヘッド５４は、センサセル１７へ液体を注入する場合には、各液体保管部６１へアクセスして、所望の液体を吸い込み、その後、載置スペース５１へ移動して、センサユニット１２へ注入する。
【００５５】
また、筐体ベース５０上には、ピペットチップ６２を保管するピペットチップ保管部６３が設けられている。ピペットチップ６２は、ピペット１９ａ，１９ｂの先端部に交換可能に取り付けられる。ピペットチップ６２は、液体と直接接触するので、このピペットチップ６２を介して異種の液体の混液が生じないように、使用する液体毎に交換される。各ピペット１９ａ，１９ｂには、ピペットチップ６２のピックアップとリリースを行う機構が設けられており、このピペットチップ６２の交換は、ピペットヘッド５４がピペットチップ保管部６３にアクセスして自動的に行われる。
【００５６】
また、符合６４は、複数のウエル状の升がマトリックスに配列されたウエルプレートであり、ピペットで吸い上げた液体を一時的に保管したり、複数種類の液体を混合して混合液を調整する際に用いられる。
【００５７】
固定を開始する際には、固定機１０の筐体はカバー（図示せず）によって覆われて、載置スペース５１を含む固定機１０の内部は、外部から遮蔽される。固定機１０内の温度は、温度調節器（図示せず）によって調節が可能になっている。リガンドの固定化の進行度合いは、センサユニット１２の環境条件（温度）によって左右される。そのため、温度調節器によって固定機１０の内部温度が所定の温度に保たれる。設定される温度や静置時間などは、リガンドの種類などに応じて適宜決められる。
【００５８】
リガンドの固定化は、載置スペース５１内のセンサユニット１２に対して順次行われる。図４（Ａ）に示すように、まず、液保管部６１から所定量のリガンド溶液２１を吸引したピペット対１９は、１番目（セルＮＯ．１）のセンサセル１７にアクセスして、各ピペット１９ａ、１９ｂのそれぞれの先端が、各開口１６ａ，１６ａの位置にそれぞれ配置される。そして、ピペット１９ａがリガンド溶液２１を流路１６へ注入して、センサ面１３ａにリガンド溶液２１が送液される。
【００５９】
なお、上述したとおり、ピペットヘッド５４には、１つのセンサユニット１２が持つセンサセル１７の数に対応して、３組のピペット対１９が設けられているので、リガンド溶液２１の注入は、１ユニット内の３つのセンサセル１７に対して同時に行われるが、ここでは、便宜上省略して、１組のピペット対１９の動作について説明する。
【００６０】
センサセル１７へリガンド溶液が注入された後、図４（Ｂ）に示すように、各ピペット１９ａ，１９ｂが吐出と吸引動作を交互に繰り返して、流路１６内のリガンド溶液２１を流動させて攪拌される。こうした攪拌を行うことで、溶液中のリガンドの多くを、センサ面１３ａと接触させることができるので、リンカー膜２２との結合効率（固定反応効率）が増加する。
【００６１】
この吐出と吸引動作が所定回数又は所定時間繰り返された後、図４（Ｃ）に示すように、ピペット１９ｂによって、流路１６内のリガンド溶液２１が吸い出されて、流路１６から排出される。
【００６２】
そして、図４（Ｄ）に示すように、ピペット１９ｂが吸い出したリガンド溶液２１を保持したまま、ピペット対１９が２番目（セルＮＯ．２）のセンサセル１７へ移動して、ピペット１９ｂから、リガンド溶液２１がセンサセル１７へ注入される。そして、注入後、図４（Ｅ）に示すように、各ピペット１９ａ，１９ｂで吐出と吸引が繰り返されて、流路１６内のリガンド溶液２１が攪拌される。この吐出及び吸引が所定時間又は回数繰り返された後、図４（Ｆ）リガンド溶液２１がピペット１９ａによって吸い出されて流路１６から排出される。この後、ピペット対１９は、ピペット１９ａで２番目のセンサセル１７から吸い出したリガンド溶液を保持したまま、３番目のセンサセル１７へ移動して、上記と同様の手順で、リガンド溶液２１の送液を行う。こうした処理が、載置スペース５１上のすべてのセンサユニット１２の各センサセル１７に対して順次行われる。すべてのセンサセル１７へ１回ずつ送液が終了した場合には、再び、１番目のセンサセル１７から送液を繰り返してもよい。
【００６３】
このように、リガンド溶液２１を複数のセンサセル１７間で使い回すため、リガンド溶液２１の使用量が少なくて済む。そして、リガンド溶液２１をセンサセル１７に注入した後、排出されるまでの間、各ピペットで吸引と吐出を繰り返すため、流路１６内の攪拌が生じて、注入後放置した場合と比較して、リガンドの固定量を増加させることができる。固定量が増加すると、測定時にレベルの高い信号が得られるので、測定精度が向上する。
【００６４】
なお、ここでは、ピペット対１９で注入と排出を行う場合、各ピペット１９ａ，１９ｂの一方から注入し、他方から排出する例で説明したが、各ピペット１９ａ，１９ｂの一方のみで、注入と排出を行ってもよい。
【００６５】
また、センサセル１７からのリガンド溶液２１の排出に際しては、流路１６内のリガンド溶液２１のうち、吸い出し可能なリガンド溶液２１をすべて排出してもよいし、吸い出し可能なリガンド溶液２１のうち、一部を流路１６内に残して、残りを排出するようにしてもよい。
【００６６】
リガンド溶液２１を１つのセンサセル１７に送液すると、そのセンサ面１３ａに固定される分、排出されるリガンド溶液２１の量は、当然ながら減る。送液を複数のセンサセル１７に対して行っていくと、その減少量は無視できない量になる。流路１６に一部のリガンド溶液２１を残す場合には、その量はさらに増える。そうした場合には、適宜、ピペット対１９内のリガンド溶液２１が液保管部６１から補充される。
【００６７】
以下、本発明の作用効果について、図５に示すフローチャート及び図６に示す実験結果を参照しながら説明する。図５に示すように、まず、ピペット対１９によって、１番目のセンサセル１７に対してリガンド溶液２１が注入される。この注入後、ピペット対１９の吐出と吸入により、流路１６内のリガンド溶液の攪拌が行われる。この後、ピペット対１９によって、流路１６からリガンド溶液２１が吸い出されて排出される。ピペット対１９は、この吸い出したリガンド溶液２１を、２番目のセンサセル１７へ注入する。こうしてリガンド溶液２１を使い回しながら、すべてのセンサセル１７への送液が行われる。
【００６８】
図６に示す表は、本発明の方法（リガンド溶液を使い回す方法）と、従来例（比較例１〜比較例３）との比較表である。まず、各例の共通な実験条件として、反応時間、すなわち、注入後排出されるまでのセンサ面１３ａにリガンド溶液２１が接触している時間は、１５分間とした。リンカー膜２２としては、デキストランを使用し、リガンドには、ｍｏｕｓｅＩｇＧを使用した。固定を行うセンサセル１７の数は、２４個とした。さらに、リガンド注入の前に、センサ面１３ａに対して活性化処理を施した。活性化液としては、上記ＥＤＣ及びＮＨＳの混合液を使用し、これを流路１６に注入して、１５分間放置した。活性化処理の後、混合液を排出し、流路１６を水で３回洗浄後、リガンドの注入を行った。リガンドの注入後、センサ面１３ａに対して、上記ブロッキング処理を施し、この後、水で洗浄し、固定量の測定を行った。固定量の測定は、測定機１１を用いて、固定前後の信号変化を検出することにより行った。なお、流路１６の体積は２０μｌである。リガンド溶液濃度は、比較例２のみ、２５０μｇ／ｍｌであり、その他は、５０μｇ／ｍｌとした。
【００６９】
本発明の方法による実験では、ピペット対１９で１００μｌのリガンド溶液２１を吸引し、１番目のセンサセル１７の流路１６へ注入した。そして、５０μｌ／秒の速度で２秒間吐出、同じ速度で２秒間吸引することにより、リガンド溶液２１を流動させた。この吐出及び吸引を３回繰り返した。この後、ピペット対１９でリガンド溶液２１を吸い出して、このリガンド溶液２１を同様の手順で２番目のセンサセル１７へ注入した。この送液を２４番目のセンサセル１７まで繰り返し、２４番目のセンサセル１７に対する送液が終了した後、そこから吸い出したリガンド溶液２１を使用して、１番目のセンサセル１７注入し、再び、２４番目のセンサセル１７まで送液を繰り返した。こうした送液を、各センサセル１７について、１０回行った。こうして、１つのセンサセル１７について、リガンド溶液２１とセンサ面１３ａの接触時間の合計が１５分間となるようにした。リガンド溶液の使用量は、２．５ｍｌで、２４個の流路１６の体積の合計の約５倍量であった。
【００７０】
比較例１は、２４個のセンサセル１７に対して、リガンド溶液２１を注入し、１５分間静置した例である。比較例２は、比較例１と同様に、リガンド溶液２１の注入後、１５分間静置する例であるが、リガンド溶液２１として、リガンド溶液濃度が比較例２の５倍の濃度（２５０μｇ／ｍｌ）のものを使用した。これら比較例１及び２のリガンド溶液の使用量は、２．５ｍｌで、２４個の流路１６の体積の合計の約５倍量であった。
【００７１】
比較例３は、２４個のセンサセル１７の流路１６を配管で連結することにより、リガンド溶液２１を循環させる循環路を形成し、１５分間の連続送液を行った例である。送液速度は、１０μｌ／秒である。各流路１６をつなぐ配管部分の体積はそれぞれ２０μｌである。このため、リガンド溶液の使用量は、約９．６ｍｌであった。
【００７２】
表からわかるように、本発明と比較例１とを比較すると、同じリガンド使用量でも、結合効率（２４個のセンサセルの平均固定量をリガンド使用量で割った値）が、本発明の方が高い。このことから、本発明の方が、同じ試料であれば、より多くの固定量が得られるので、少ない試料で必要な固定量が得られることがわかる。また、比較例２と本発明とでは、ほぼ同量の固定量が得られるものの、比較例２のリガンド使用量は、本発明と比較して、約５倍に達するので、結合効率で比較すると、大きく下回る。
【００７３】
比較例３では、本発明と比較して、配管部分の体積が増える分、必要なリガンド溶液使用量が増えるので、リガンド使用量も増加する。このため、本発明と比較して結合効率も低くなる。
【００７４】
上記実施形態では、本発明の送液方法を、センサ面へリガンドを固定する場合を例に説明しているが、固定時だけでなく、測定時に、センサ面へ試料としてアナライトを送液する場合に適用してもよいし、さらに、測定や固定の他にも、センサ面の表面処理を行う場合に適用することもできる。
【００７５】
また、リガンド溶液を流路へ注入した後、排出するまでの間、流路内のリガンド溶液を、ピペット対を用いて攪拌させているが、攪拌手段としてはピペット対でなくてもよく、例えば、ポンプを使って液を攪拌させてもよいし、超音波発生装置を使って液を攪拌させてもよい。さらに、スターラー（かきまぜ棒）を流路内に差し込み、そのスターラーを回転させることにより、攪拌させてもよい。もちろん、注入及び排出を行うピペット対を攪拌手段として利用すれば、装置構成の点で最も有利である。
【００７６】
また、センサとして、センサ面を構成する金属膜、流路、プリズムを一体化したセンサユニットを例に説明したが、ガラス基板上に金属膜を形成し、流路やプリズムを持たないチップ型のセンサを使用してもよい。
【００７７】
また、本実施形態では、センサ面上にＳＰＲを発生させて、そのときの反射光の減衰を検出するＳＰＲセンサを例に説明したが、ＳＰＲセンサに限らず、全反射減衰を利用した測定に用いられる他のセンサに送液を行う場合にも適用することができる。全反射減衰を利用するセンサとしては、ＳＰＲセンサの他に、例えば、漏洩モードセンサが知られている。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を通過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において弾性表面波（surface acoustic wave，SAW）が生じると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。弾性表面波が生じる入射角は、ＳＰＲの共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応が測定される。
【００７８】
また、全反射減衰を利用した測定を行うためのセンサへの送液に限らず、本発明は、センサ面における化学反応状況を調べる種々のセンサに適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＳＰＲ測定方法の説明図である。
【図２】センサユニットの構成図である。
【図３】固定機の構成図である。
【図４】リガンド溶液の送液方法を示す説明図である。
【図５】送液手順を示すフローチャートである。
【図６】本発明と従来例の実験結果を示す説明図である。
【符号の説明】
【００８０】
１０  固定機
１１  測定機
１２  センサユニット
１３  金属膜
１３ａ  センサ面
１６  流路
１７  センサセル
１９  ピペット対
１９ａ，１９ｂ  ピペット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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