(57)【要約】  組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの組織取り込みを最大化し、一方で組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの酵素活性の阻害を最小化するのに有効なミグルスタットの量と併用した、マンノース−６−リン酸残基での最適なグリコシル化を有する組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与を含む、ポンペ病を処置するための方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミグルスタットと併用してポンペ病の処置に使用するための組換え酸性α−グルコシダーゼであって、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、かつアルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含む、組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項２】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが、配列番号１または配列番号５と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項３】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの少なくとも３０％が、１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有する１つ以上のＮ−グリカン単位を含む、請求項１または２に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項４】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ１モルあたり平均で０．５〜７．０モルの、１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項５】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが、平均して、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ１モルあたり少なくとも２．５モルのマンノース−６−リン酸残基、および組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ１モルあたり少なくとも４モルのシアル酸残基を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項６】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが７つの潜在的なＮ−グルコシル化部位を含み、前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの分子の少なくとも５０％が、第１の部位に２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含み、前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの分子の少なくとも３０％が、第２の部位に１つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含み、前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの分子の少なくとも３０％が、第４の部位に２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含み、および前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの分子の少なくとも２０％が、第４の部位に１つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性αグルコシダーゼ。
【請求項７】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＧＡ−ＡＴＢ−２００もしくはＡＴＢ−２００−００１−Ｘ５−１４またはその継代培養物によって産生される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項８】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、および前記ミグルスタットが約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの用量で経口投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項９】
前記ミグルスタットが前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項１０】
前記ミグルスタットが前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約１時間前に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項１１】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、および前記ミグルスタットが約２３３ｍｇ〜約５００ｍｇの用量で経口投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項１２】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、および前記ミグルスタットが約５０ｍｇ〜約２００ｍｇの用量で経口投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項１３】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、および前記ミグルスタットが約２６０ｍｇの用量で経口投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項１４】
前記ミグルスタットが前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前に投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項１５】
前記ミグルスタットが前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約１時間前に投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための組換え酸性α−グルコシダーゼ。
【請求項１６】
ポンペ病の併用治療であって、それを必要とする患者における併用治療のためのキットであって、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形と、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形と、ミグルスタットを含む前記薬学的に許容される剤形および前記組換え酸性α−グルコシダーゼを含む前記薬学的に許容される剤形を、それを必要とする患者に投与するための説明書とを含み、
前記組換え酸性α−グルコシダーゼが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、かつアルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含む、キット。
【請求項１７】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む前記薬学的に許容される剤形が、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量での静脈内投与のために構成され、およびミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形が約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの用量を含み、かつ経口投与のために構成される、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記説明書が、前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約１時間前に前記ミグルスタットを投与するための説明書を含む、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む前記薬学的に許容される剤形が、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量での静脈内投与のために構成され、およびミグルスタットを含む前記薬学的に許容される剤形が、約５０ｍｇ〜約２００ｍｇの用量を含み、かつ経口投与のために構成される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む前記薬学的に許容される剤形が、約２０ｍｇ／ｋｇの用量での静脈内投与のために構成され、およびミグルスタットを含む前記薬学的に許容される剤形が約２６０ｍｇの用量を含み、かつ経口投与のために構成される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
前記説明書が、ミグルスタットを含む前記薬学的に許容される剤形を、前記組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む前記薬学的に許容される剤形の投与の約１時間前に投与するための説明書を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体に酸性α−グルコシダーゼおよびその薬理学的シャペロンの組み合わせを投与することを含む、ポンペ病を処置するための方法を提供する。より具体的には、本発明は、個体に組換えヒト酸性α−グルコシダーゼとミグルスタットとの組み合わせを投与することを含む、ポンペ病を処置する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ポンペ病は、酸マルターゼ欠乏症またはＩＩ型糖源蓄積症としても知られ、いくつかのリソソーム蓄積症の１つである。リソソーム蓄積症は、リソソームと呼ばれる細胞内区画内の細胞スフィンゴ糖脂質、グリコーゲン、またはムコ多糖類の蓄積を特徴とする常染色体劣性遺伝疾患群である。これらの疾患を有する個体は、これらの物質の１つ以上の加水分解を触媒するのに欠陥がある酵素をコードする変異遺伝子を保有し、それらの物質はリソソームに蓄積する。リソソーム障害の他の例には、ゴーシェ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ムコ多糖症、ハーラー症候群、ニーマン−ピックＡおよびＢ病、およびファブリー病が含まれる。ポンペ病はまた、神経筋疾患または代謝性ミオパチーに分類される。
【０００３】
ポンペ病は、約４０，０００出生で１人発生すると推定されており、酵素リソソームα−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）（一般に酸性α−グルコシダーゼとしても知られる）をコードするＧＡＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。酸性α−グルコシダーゼは、リソソーム内のグルコースへのその加水分解を触媒することにより、動物におけるグルコースの主要な貯蔵形態である分枝多糖、グリコーゲンの代謝に関与する。ポンペ病に罹患している個体は、不活性であるか、または活性が低下した変異体である欠損酸性α−グルコシダーゼを産生するため、グリコーゲン分解はゆっくりと起こるか、または全く起こらず、グリコーゲンは様々な組織、特に線条筋において、リソソームに蓄積し、進行性の筋力低下および呼吸器不全を含む広範囲の臨床症状を生じる。心臓および骨格筋などの組織は特に影響を受ける。
【０００４】
ポンペ病は、酵素欠乏症の程度、発症の重症度および年齢によって大きく異なり、その多くが様々な重症度の疾患症状を引き起こす、ＧＡＡ遺伝子の５００以上の異なる突然変異が同定されている。この疾患は、早期発症または乳児期発症および後期発症という広範なタイプに分類されている。より早期の発症およびより低い酵素活性は、一般に、より重度の臨床経過に関連する。小児ポンペ病は最も重篤であり、完全またはほぼ完全な酸性α−グルコシダーゼ欠乏に起因し、筋緊張の重度な欠如、衰弱、肝臓および心臓の肥大、および心筋症を含む症状を呈する。舌が肥大して突出することがあり、嚥下が困難になることがある。ほとんどの患児は、２歳までに呼吸器または心臓の合併症で死亡する。後期発症のポンペ病は、１２ヵ月以上のいずれの年齢でも存在し得、心臓病の関与がなく、短期予後がより良好であることを特徴とする。症状は進行性の骨格筋機能不全に関連し、体幹、近位下肢および隔膜における一般的な筋力低下および呼吸筋の消耗を伴う。成人患者では、重大な症状または運動制限がない場合もある。予後は、一般に、呼吸筋の関与の程度に依存する。ポンペ病に罹患した対象の大部分は、徐々に車椅子の使用および補助換気を必要とする身体的衰弱が進行し、多くの場合に呼吸不全のために生じる早期死亡を伴う。
【０００５】
ポンペ病の最近の処置の選択肢には、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）による酵素補充療法（ＥＲＴ）が含まれる。従来のｒｈＧＡＡ製品は、アルグルコシダーゼアルファ、ミオザイム（登録商標）またはルミザイム（登録商標）；Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．の名称で知られている。ＥＲＴは、患者の生涯にわたって必要とされる慢性処置であり、静脈内注入によって置換酵素を投与することを含む。次いで、補充酵素は循環中で輸送され、細胞内のリソソームに入り、そこで蓄積されたグリコーゲンを分解するよう作用し、内因性欠損突然変異酵素の欠損した活性を補い、そうして病気の症状を緩和する。乳児期発症ポンペ病患者では、アルグルコシダーゼアルファによる処置は、過去のコントロールと比較して生存率を有意に改善することが示されており、後期発症ポンペ病では、アルグルコシダーゼアルファは、プラセボと比較して、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）および努力性肺活量（ＦＶＣ）の結果において、控えめに言っても統計的に有意な効果を有することが示されてきた。
【０００６】
しかしながら、大部分の対象は、アルグルコシダーゼアルファによる処置を受けている間、安定を維持するか、または悪化し続ける。アルグルコシダーゼアルファによるＥＲＴの明らかに最適下限の効果の理由は不明であるが、根底にある筋肉病変の進行性の性質、または現在のＥＲＴの組織標的化の不十分さに部分的に起因する可能性がある。例えば、注入された酵素は、血漿のｐＨ（約ｐＨ７．４）を含む中性ｐＨで安定でなく、循環中で不可逆的に不活性化され得る。さらに、注入されたアルグルコシダーゼアルファは、場合によりマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基による不十分なグリコシル化のために重要な疾患関連筋肉での不十分な取り込みを示す。そのような残基は、細胞表面で陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合し、酵素が細胞内およびリソソーム内に入ることを可能にする。したがって、十分な量の活性酵素がリソソームに到達するように、高用量の酵素が効果的な処置のために必要とされる場合があり、治療を費用がかかり、時間を要するものとする。
【０００７】
さらに、抗組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ中和抗体の発達は、多くの場合、処置への反復曝露のためにポンペ病患者において発症する。そのような免疫応答は、処置に対する患者の耐性を著しく低下させる可能性がある。アルグルコシダーゼアルファの米国製品ラベルには、過敏反応の潜在的リスクに関する情報が記載された黒枠警告が含まれている。アナフィラキシーショックを含む、生命を脅かすアナフィラキシー反応が、アルグルコシダーゼアルファで処置された対象において観察されている。
【０００８】
これらの欠点に対処するために、次世代ＥＲＴが開発されている。１つの戦略では、組換え酵素は、酵素の適切な立体構造を誘導または安定化し、酵素の分解および／またはその不活性形態へのアンフォールディングをインビトロ（例えば、投与前の保管において）またはインビボで防止または低減し得る薬理学的シャペロンと組み合わせて共投与し得る。そのような戦略は、国際公開第２００４／０６９１９０号パンフレット、国際公開第２００６／１２５１４１号パンフレット、国際公開第２０１３／１６６２４９号パンフレットおよび国際公開第２０１４／０１４９３８号パンフレットに記載されている。
【０００９】
ポンペ病患者に対するミグルスタットとのアルグルコシダーゼアルファの共投与の臨床試験結果が記載されている。イタリアの４つの処置センターにおいて、ポンペ病（３例の早期発症（幼児期）および１０例の後期発症）に罹患した１３人の対象で実施された臨床試験では、２０〜４０ｍｇ／ｋｇのアルグルコシダーゼアルファが単独で投与され、次いで４用量の８０ｍｇミグルスタットが投与された。この実験の結果は、アルグルコシダーゼ単独と比較して、共投与につき酸性α−グルコシダーゼ活性曝露（薬物動態パラメータＡＵＣ（濃度対時間曲線下面積）について測定）において６．８倍の増加を示した（Ｐａｒｅｎｔｉ，Ｇ．，Ｇ．Ａｎｄｒｉａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．“Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｙ．”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６６（１）：４７１−４８６）。さらに、フロリダ大学で実施された実験では、ポンペ病に罹患した対象にアルグルコシダーゼアルファの静脈内注入と共投与した場合の血漿ミグルスタットの薬物動態（ＰＫ）が評価された（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｊ．Ｓ．Ｋｅｌｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｔｈｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈＧＡＡ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＧＡＡ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１１１（２）：Ｓ３８）。
【００１０】
しかしながら、ポンペ病の処置のための酵素補充療法のさらなる改善が求められている。例えば、現在使用されている酵素に対して１つ以上の利点を有し得る、新しい組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ酵素が望ましく、これは、改善された組織取り込み、改善された酵素活性、改善された安定性または低下した免疫原性を含むが、これらに限定されるものではない。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ポンペ病の処置を、それを必要とする患者において行う方法を提供し、本方法は、患者に組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）と組み合わせてミグルスタットを投与することを含み、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、かつアルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含む。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与し、ミグルスタットを約２６０ｍｇの用量で経口投与する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ポンペ病の処置であって、それを必要とする患者における処置のための、本明細書で定義されるミグルスタットおよび組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの併用を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ポンペ病の処置であって、それを必要とする患者における処置のための、薬物の調製における本明細書で定義されるミグルスタットおよび組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの組み合わせの使用を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、ポンペ病の併用治療であって、それを必要とする患者における併用治療のためのキットを提供し、キットは、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形と、本明細書で定義される組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形と、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形および組換え酸性α−グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形を、それを必要とする患者に投与するための説明書とを含む。
【００１５】
本発明のさらなる特徴は、以下の本明細書および添付図面から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】様々なｐＨ値、およびミグルスタットの存在下および非存在下における、温度に対するアンフォールドＡＴＢ２００タンパク質の割合を示すグラフである。
【図２Ａ】それぞれルミザイム（登録商標）およびミオザイム（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を示す。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介して結合したＧＡＡ分子がＣＩＭＰＲに置換された。図２Ａに示すように、ルミザイム（登録商標）におけるＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図２Ｂは、ＧＡＡミオザイム（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。ルミザイム（登録商標）またはミオザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％または２７％のみがＭ６Ｐで溶出された。これらの図は、これら２つの従来のｒｈＧＡＡ製品における大部分のｒｈＧＡＡが、細胞取り込みおよびリソソーム標的化に必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠いていることを示す。
【図２Ｂ】それぞれルミザイム（登録商標）およびミオザイム（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を示す。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介して結合したＧＡＡ分子がＣＩＭＰＲに置換された。図２Ａに示すように、ルミザイム（登録商標）におけるＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図２Ｂは、ＧＡＡミオザイム（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。ルミザイム（登録商標）またはミオザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％または２７％のみがＭ６Ｐで溶出された。これらの図は、これら２つの従来のｒｈＧＡＡ製品における大部分のｒｈＧＡＡが、細胞取り込みおよびリソソーム標的化に必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠いていることを示す。
【図３】ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物で形質転換した。
【図４Ａ】それぞれミオザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示す。図４Ｂから明らかなように、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％はＭ６Ｐを含んでいた。
【図４Ｂ】それぞれミオザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示す。図４Ｂから明らかなように、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％はＭ６Ｐを含んでいた。
【図５Ａ】陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムでの捕捉を伴うおよび伴わないＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示す。
【図５Ｂ】陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムでの捕捉を伴うおよび伴わないＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示す。
【図６】ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのＰｏｌｙｗａｘ溶出プロファイルを示す。
【図７】ＢＰ−ｒｈＧＡＡ、ＡＴＢ２００−１およびＡＴＢ２００−２として同定されたＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの３つの異なる調製物と比較した、ルミザイム（登録商標）のＮ−グリカン構造の概要を示す。
【図８Ａ】ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す。
【図８Ｂ】ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す。
【図８Ｃ】ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す。
【図８Ｄ】ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す。
【図８Ｅ】ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す。
【図８Ｆ】ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す。
【図８Ｇ】ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す。
【図８Ｈ】ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ（左のトレース）とルミザイム（右のトレース）のＣＩＭＰＲ結合親和性を比較する。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのＢｉｓ−Ｍ６Ｐ含有量を比較する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、様々なＧＡＡ濃度で正常線維芽細胞内のＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ活性（左のトレース）とルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右のトレース）とを比較する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、様々なＧＡＡ濃度でポンペ病を有する対象由来の線維芽細胞内のＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ活性（左のトレース）とルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右のトレース）とを比較する。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、健常対象およびポンペ病に罹患した対象由来の線維芽細胞の（Ｋ取り込み）を比較する。
【図１１】ＡＴＢ２００の集団薬物動態（ＰＫ）モデルの適合度を示すグラフである。
【図１２】ミグルスタットおよびドゥボグルスタットの用量標準化血漿濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、血漿中のドゥボグルスタットの集団ＰＫモデルの適合度を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、筋肉組織中のドゥボグルスタットの集団ＰＫモデルの適合度を示すグラフである。
【図１４】ミグルスタットの集団ＰＫモデルの適合度を示すグラフである。
【図１５】ヒトにおけるＡＴＢ２００の単回２０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）用量の４時間にわたる注入から生じる、予測される濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｋｇのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス心筋における組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｋｇのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス四頭筋における組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｋｇのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス三頭筋における組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図１７】ＡＴＢ２００のＡＵＣ値に対するミグルスタットのＡＵＣ値の比に対して、ＡＴＢ２００単独で処置したマウスにおけるグリコーゲンレベルに対するＡＴＢ２００の存在下で変動する用量のミグルスタットで処置したマウスにおけるグリコーゲンレベルの比をプロットしたグラフである。
【図１８】４６６ｍｇ、２７０ｍｇおよび２３３ｍｇの用量のミグルスタットを反復投与した後の血漿中のミグルスタットの予測される濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図１９】４６６ｍｇ、２７０ｍｇおよび２３３ｍｇの用量のミグルスタットを反復投与した後の組織リソソーム中のミグルスタットの予測される濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２０】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の心臓、隔膜およびヒラメ筋の一連の顕微鏡写真であり、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）のレベルを示す。
【図２１】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の心臓およびヒラメ筋の一連の顕微鏡写真であり、過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することによりグリコーゲンレベルを示す。
【図２２】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の四頭筋の一連の顕微鏡写真（１０００ｘ）であり、メチレンブルーで染色して空胞を示した（矢印で示す）。
【図２３】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の四頭筋の一連の顕微鏡写真（４００ｘ）であり、これは、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ  ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを示す。
【図２４Ａ】５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０もしくは２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２４Ｂ】５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０もしくは２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２４Ｃ】５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０もしくは２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２４Ｄ】５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０もしくは２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２５Ａ】５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２５Ｂ】５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２５Ｃ】５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２５Ｄ】５、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２６】１３０ｍｇまたは２６０ｍｇのミグルスタットを投与した後のヒト対象における血漿中のミグルスタットの濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２７】野生型およびポンペ線維芽細胞におけるＧＡＡおよびＬＡＭＰ１レベルの一連の免疫蛍光顕微鏡写真である。
【図２８】ジストロフィン、α−およびβ−ジストログリカンおよびジスフェリンレベルを示す野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の筋線維の一連の顕微鏡写真である。
【図２９Ａ】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の大腿直筋（ＲＦ）および外側広筋／内側広筋（ＶＬ／ＶＭ）の筋線維の一連の顕微鏡写真（２００ｘ）であり、ＬＭＡＰ１  ＩＨＣシグナルを示す。
【図２９Ｂ】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の大腿直筋（ＲＦ）および外側広筋／内側広筋（ＶＬ／ＶＭ）の筋線維の一連の顕微鏡写真（２００ｘ）であり、ＬＭＡＰ１  ＩＨＣシグナルを示す。
【図３０Ａ】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来のＲＦおよびＶＬ／ＶＭの筋線維の一連の顕微鏡写真（２００ｘ）であり、ＬＣ３  ＩＩ  ＩＨＣシグナルを示す。
【図３０Ｂ】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来のＲＦおよびＶＬ／ＶＭの筋線維の一連の顕微鏡写真（２００ｘ）であり、ＬＣ３  ＩＩ  ＩＨＣシグナルを示す。
【図３１Ａ】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来のＲＦおよびＶＬ／ＶＭの筋線維の一連の顕微鏡写真（２００ｘ）であり、ジスフェリンＩＨＣシグナルを示す。
【図３１Ｂ】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来のＲＦおよびＶＬ／ＶＭの筋線維の一連の顕微鏡写真（２００ｘ）であり、ジスフェリンＩＨＣシグナルを示す。
【図３２Ａ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３２Ｂ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３２Ｃ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３２Ｄ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３３Ａ】ミグルスタットの存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスのワイヤハンドおよび握力筋肉データを示すグラフである。
【図３３Ｂ】ミグルスタットの存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスのワイヤハンドおよび握力筋肉データを示すグラフである。
【図３４Ａ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３４Ｂ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３４Ｃ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３４Ｄ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３４Ｅ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３４Ｆ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３４Ｇ】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３５】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来のＶＬ／ＶＭの筋線維の一連の顕微鏡写真であり、ＬＡＭＰ１、ＬＣ３およびジスフェリンＩＨＣシグナルを示す。
【図３６】異なるシアル酸含有量を有する２つのバッチのＡＴＢ２００の投与後のＧａａノックアウトマウスにおける血漿中のＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図３７Ａ】溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３７Ｂ】溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３７Ｃ】溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３７Ｄ】溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図３８】ＡＴＢ２００の漸増用量（５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後のヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示すグラフである。
【図３９】ＡＴＢ２００の漸増用量（５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後のヒト患者におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを示すグラフである。
【図４０】ＡＴＢ２００の漸増用量（５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後のヒト患者におけるクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示すグラフである。
【図４１】ＡＴＢ２００の漸増用量（５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後のヒト患者における平均ＡＬＴ、ＡＳＴおよびＣＰＫレベルを示すグラフである。
【図４２】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の外側広筋（ＶＬ）の筋線維の一連の顕微鏡写真（１００ｘおよび２００ｘ）であり、ジストロフィンシグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明に関連してかつ各用語が使用される具体的な文脈において、当該技術分野における通常の意味を有する。当業者に追加的な指針を提供するために、特定の用語について以下または本明細書の他の箇所で説明する。
【００１８】
本明細書では、文言の説明または必要な示唆のために、文脈が他に要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包括的な意味、すなわち、述べられた特徴の存在を特定するために使用され、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「ポンペ病」は、酸マルターゼ欠乏症、ＩＩ型糖源蓄積症（ＧＳＤＩＩ）、およびＩＩ型糖源病とも呼ばれ、ヒト酸性α−グルコシダーゼ酵素をコードするＧＡＡ遺伝子の突然変異を特徴とする、遺伝的リソソーム蓄積症を指すことが意図される。この用語には、乳児期、若年期および成人期発症のポンペ病が含まれるが、これらに限定されない、初期および後期発症形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「酸性α−グルコシダーゼ」は、グリコーゲン、マルトース、およびイソマルトースのＤ−グルコース単位間のα−１，４結合を加水分解するリソソーム酵素を指すことが意図される。別の名称には、リソソームα−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）；グルコアミラーゼ；１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ；アミログルコシダーゼ；ガンマ−アミラーゼおよびエキソ−１，４−α−グルコシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒト酸性α−グルコシダーゼは、１７番染色体の長腕（位置１７ｑ２５．２−ｑ２５．３）にマッピングされているＧＡＡ遺伝子（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２５４８）によってコードされている。５００を超える突然変異が現在ヒトＧＡＡ遺伝子において同定されており、その多くはポンペ病に関連している。酸性α−グルコシダーゼ酵素のミスフォールディングまたは誤処理を生じる突然変異には、Ｔ１０６４Ｃ（Ｌｅｕ３５５Ｐｒｏ）およびＣ２１０４Ｔ（Ａｒｇ７０２Ｃｙｓ）が含まれる。さらに、酵素の成熟および処理に影響を及ぼすＧＡＡ突然変異には、Ｌｅｕ４０５ＰｒｏおよびＭｅｔ５１９Ｔｈｒが含まれる。酸性α−グルコシダーゼタンパク質の活性には、アミノ酸残基５１６〜５２１で保存されたヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥが必要である。本明細書で使用される場合、略語「ＧＡＡ」は、酸性α−グルコシダーゼ酵素を指すことが意図され、イタリック体の略語「ＧＡＡ」は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ酵素をコードするヒト遺伝子を指すことが意図される。イタリック体の略語「Ｇａａ」は、ラットまたはマウス遺伝子を含むがこれらに限定されない、非ヒト酸性α−グルコシダーゼ酵素をコードする非ヒト遺伝子を指すことが意図され、略語「Ｇａａ」は、非ヒト酸性α−グルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。したがって、略語「ｒｈＧＡＡ」は、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「アルグルコシダーゼアルファ」は、［１９９−アルギニン、２２３−ヒスチジン］プレプロ−α−グルコシダーゼ（ヒト）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ登録番号４２０７９４−０５−０として同定された組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを指すことが意図される。アルグルコシダーゼアルファは、ルミザイム（登録商標）およびミオザイム（登録商標）として、２０１４年１０月１日付けで米国におけるＧｅｎｚｙｍｅによる市販が承認されている。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＴＢ２００」は、同時係属中の特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載される組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを指すことが意図され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「グリカン」は、タンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸残基に共有結合した多糖類鎖を指すことが意図される。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ−グリカン」または「Ｎ−結合グリカン」は、アミノ酸残基の窒素原子に共有結合によってタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸残基に結合した多糖類鎖を指すことが意図される。例えば、Ｎ−グリカンは、アスパラギン残基の側鎖窒素原子に共有結合し得る。グリカンは、１個または数個の単糖単位を含み得、単糖単位は共有結合して直鎖または分枝鎖を形成し得る。少なくとも１つの実施形態において、ＡＴＢ２００に結合したＮ−グリカン単位は、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトースまたはシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位を含み得る。タンパク質上のＮ−グリカン単位は、質量分析などの任意の適切な分析技術によって決定し得る。いくつかの実施形態において、Ｎ−グリカン単位は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ（商標）質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ  Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計またはＷａｔｅｒｓＸｅｖｏ（登録商標）Ｇ２−ＸＳ  ＱＴｏｆ質量分析計などの機器を利用する液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって決定され得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「高マンノースＮ−グリカン」は、１〜６個またはそれを超えるマンノース単位を有するＮ−グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、高マンノースＮ−グリカン単位は、アスパラギン残基に結合したビス（Ｎ−アセチルグルコサミン）鎖を含有し、さらに分枝状ポリマンノース鎖に結合し得る。本明細書で交換可能に使用される場合、用語「Ｍ６Ｐ」または「マンノース−６−リン酸」は、６位がリン酸化された、すなわち、６位のヒドロキシル基に結合したリン酸基を有する、マンノース単位を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、１つ以上のＮ−グリカン単位の１つ以上のマンノース単位が６位でリン酸化されて、マンノース−６−リン酸単位を形成する。少なくとも１つの実施形態において、用語「Ｍ６Ｐ」または「マンノース−６−リン酸」は、リン酸基上に「キャップ」としてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するマンノースホスホジエステル、およびＧｌｃＮＡｃキャップを欠く露出したリン酸基を有するマンノース単位の両方を指す。少なくとも１つの実施形態において、タンパク質のＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃキャップを有する少なくとも１つのＭ６Ｐ基およびＧｌｃＮＡｃキャップを欠く少なくとも１つの他のＭ６Ｐ基を有する複数のＭ６Ｐ基を有し得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「複合Ｎ−グリカン」は、１つ以上のガラクトースおよび／またはシアル酸単位を含むＮ−グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、複合Ｎ−グリカンは、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位に、１つまたはマンノース単位がさらに結合した高マンノースＮ−グリカンであり得る。
【００２６】
本明細書で使用される場合、Ｎ−ブチル−１−デオキシノジリマイシンまたはＮＢ−ＤＮＪまたは（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−１−ブチル−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−３，４，５−トリオールとしても知られる化合物ミグルスタットは、以下の化学式を有する。
2019501178.tif 000002
【００２７】
ミグルスタットの１つの製剤は、１型ゴーシェ病の単剤治療として商品名Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）で市販されている。
【００２８】
後述するように、ミグルスタットの薬学的に許容される塩も本発明において使用し得る。ミグルスタットの塩を使用する場合、塩の用量は、患者が受けたミグルスタットの用量がミグルスタットの遊離塩基が使用された場合に受けるであろう用量に等しくなるように調整される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、１−デオキシノジリマイシンまたはＤＮＪまたは（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−３，４，５−トリオールとしても知られる化合物ドゥボグルスタットは、以下の化学式を有する。
2019501178.tif 000003
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「薬理学的シャペロン」または場合により単に用語「シャペロン」は、酸性α−グルコシダーゼに特異的に結合し、以下の効果の１つ以上を有するものを指すことが意図される：
●タンパク質の安定した分子立体構造の形成を促進する；
●タンパク質の小胞体関連分解を防止するために、小胞体から別の細胞位置、好ましくは天然の細胞位置へのタンパク質の適切な輸送を促進する；
●構造的に不安定なタンパク質またはミスフォールドタンパク質の凝集を防止する；
●タンパク質の少なくとも一部の野生型機能、安定性および／または活性を回復および／または向上させる；および／または
●酸性α−グルコシダーゼを有する細胞の表現型または機能を改善する。
【００３１】
したがって、酸性α−グルコシダーゼの薬理学的シャペロンは、酸性α−グルコシダーゼに結合する分子であり、酸性α−グルコシダーゼの適切なフォールディング、輸送、非凝集、および活性をもたらす。本明細書で使用される場合、この用語は、酵素の活性部位に結合する活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）、阻害剤またはアンタゴニスト、およびアゴニストを含むが、これらに限定されるものではない。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンは、酸性α−グルコシダーゼの阻害剤またはアンタゴニストであり得る。本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、酸性α−グルコシダーゼに結合し、酸性α−グルコシダーゼの活性を部分的または完全に遮断、阻害、低減、または中和する任意の分子を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンはミグルスタットである。別の非限定的な酸性α−グルコシダーゼの薬理学的シャペロンは、ドゥボグルスタットである。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「活性部位」は、タンパク質の特異的な生物学的活性に関連しかつ必要であるタンパク質の領域を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、活性部位は、基質または他の結合パートナーに結合し、化学結合の形成および切断に直接関与するアミノ酸残基に寄与する部位であり得る。本発明における活性部位は、酵素の触媒部位、抗体の抗原結合部位、受容体のリガンド結合ドメイン、制御因子の結合ドメイン、または分泌タンパク質の受容体結合ドメインを包含し得る。活性部位はまた、トランス活性化、タンパク質−タンパク質相互作用、または転写因子および制御因子のＤＮＡ結合ドメインを包含し得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＵＣ」は、所与の薬物に対する体の経時的総曝露量を評価するための数学的計算を指すことが意図される。対象に投与された薬物の血中濃度が投薬後の時間と共にどのように変化するかをプロットするグラフにおいて、薬物濃度変数はｙ軸上にあり、時間はｘ軸上にある。所定の時間間隔に対する薬物濃度曲線とｘ軸との間の面積は、ＡＵＣ（「曲線下面積」）である。ＡＵＣは、投薬計画のためのガイドとして使用され、体内での異なる薬物の利用可能性のバイオアベイラビリティを比較するために使用される。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ最大値」は、対象への投与後に達成される薬物の最大血漿濃度を指すことが意図される。
【００３５】
本明細書で使用される用語「分布容積」または「Ｖ」は、血漿中で観測されるのと同じ濃度で投与される薬物の総量を含有するのに必要な理論的容積を指すことが意図され、薬物が血漿でなく体組織に分布する程度を表す。Ｖの値が大きいほど、組織分布の程度が大きいことを示す。「中心分布容積」または「Ｖｃ」は、血液によって高度に灌流された血液および組織内の分布容積を指すことが意図される。「末梢分布容積」または「Ｖ２」は、末梢組織内の分布容積を指すことが意図される。
【００３６】
本明細書において交換可能に使用される場合、用語「クリアランス」、「全身クリアランス」または「ＣＬ」は、単位時間当たり投与された薬物が完全に除去される血漿の容積を指すことが意図される。「末梢クリアランス」は、単位時間当たりに投与された薬物がクリアされた末梢組織の容積を指すことが意図される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「治療有効用量」および「有効量」は、対象において治療応答を生じる、酸性α−グルコシダーゼおよび／またはミグルスタットおよび／またはその組み合わせの量を指すことが意図される。治療応答は、本明細書に記載され、および当該技術分野で公知の、任意の代理臨床マーカーまたは症状を含む、ユーザ（例えば、臨床医）が治療に対する有効な応答として認識する任意の応答であり得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、治療応答は、当該技術分野で公知のものなどのポンペ病の１つ以上の症状またはマーカーの改善または抑制であり得る。ポンペ病の症状またはマーカーとしては、心筋症、心臓肥大、特に体幹または下肢における進行性筋力低下、重度の低血圧、巨舌（および場合により舌の突出）、嚥下、吸い込み、および／または摂食の困難、呼吸不全、肝腫（中度）、顔面筋肉の弛緩、反射消失、運動不耐性、労作性呼吸困難、起座呼吸、睡眠時無呼吸、朝の頭痛、傾眠、脊柱前弯および／または脊柱側弯症、深部腱反射の減少、腰痛、発達的運動マイルストーンの不達成が挙げられるが、これらに限定されるものではない。酸性α−グルコシダーゼに対する阻害効果を有するミグルスタットの濃度は、希釈（および結果として平衡の変化による結合の変化）、バイオアベイラビリティ、およびインビボ投与時のミグルスタットの代謝のために、本発明の目的にとって「有効量」を構成し得ることに留意すべきである。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「酵素補充療法」または「ＥＲＴ」は、非天然の精製酵素を、そのような酵素の欠乏を有する個体に導入することを指すことが意図される。投与されるタンパク質は、天然源から、または組換え発現により、得ることができる。この用語はまた、その他の点で精製酵素の投与を必要とするか、または精製酵素の投与から恩恵を受ける個体における精製酵素の導入も指す。少なくとも１つの実施形態において、そのような個体は酵素不全を患っている。導入された酵素は、インビトロで産生された精製組換え酵素、または例えば胎盤または動物の乳などの単離された組織または液体から、または植物から精製されたタンパク質であってもよい。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「併用治療」は、２つ以上の個々の治療が同時にまたは連続して投与される任意の治療を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、併用治療の結果は、個々に行われる場合の各治療の効果と比較して強化される。強化は、単独で実施した場合の治療によって達成された結果と比較して有利な結果をもたらし得る、様々な治療の効果の任意の改善を含み得る。強化された効果または結果には、強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果よりも大きい、相乗的強化；強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果と実質的に等しい、相加的強化；または強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果よりも低いが、単独で行われた場合の各治療の効果より優れている、相乗効果未満が含まれ得る。強化された効果は、処置効果または結果を測定し得る当該技術分野で公知の任意の手段によって測定し得る。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、生理学的に許容され、ヒトに投与される場合に典型的には有害な反応を生じない、分子実体および組成物を指すことが意図される。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方または動物、特にヒトにおける使用のための他の一般に認められている薬局方に列挙されることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「担体」は、化合物と投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒を指すことが意図される。適切な薬学的担体は当該技術分野で公知であり、少なくとも１つの実施形態において、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”第１８版または他の版に記載されている。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト動物を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、対象は哺乳動物である。少なくとも１つの実施形態において、対象はヒトである。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「抗薬物抗体」は、対象に投与される薬物、および対象への薬物の投与に対する体液性免疫応答の少なくとも一部として対象により生成される薬物に、特異的に結合する抗体を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、薬物は、治療用タンパク質薬物製品である。対象における抗薬物抗体の存在は、軽度から重度の範囲の免疫応答を起こす可能性があり、これは、アナフィラキシー、サイトカイン放出症候群および重要な機能を媒介する内因性タンパク質の交差反応性中和を含むがこれらに限定されない生命を脅かす免疫応答を含むが、これに限定されるものではない。さらにまたは代替的に、対象における抗薬物抗体の存在は、薬物の有効性を低下させ得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「中和抗体」は、薬物の機能を中和するように作用する抗薬物抗体を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、治療用タンパク質薬物製品は、発現が対象において低減または欠損している内在性タンパク質の対応物である。少なくとも１つの実施形態において、中和抗体は、内因性タンパク質の機能を中和するように作用し得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「約」および「およそ」は、測定の性質または精度を考慮して、測定された量に対する許容可能な程度の誤差を指すことが意図される。例えば、誤差の程度は、当分野で理解されているように、測定に関して提供された有効数字の数によって示すことができ、測定に関して報告された最も正確な有効数字の±１の変化を含むが、これに限定されるものではない。典型的な例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。あるいは、特に生物系において、用語「約」および「およそ」は、所与の値の１桁倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書に記載の数値は、他に明記しない限りおよそのものであり、用語「約」または「およそ」は、明示的に記載されていない場合に推測できることを意味する。
【００４６】
用語「同時に」は、本明細書で使用される場合、当業者に理解されるように、同時または前後の合理的な短い時間以内を意味することが意図される。例えば、２つの処置が互いに同時に投与される場合、２つの処置のうちの後の処置の準備に必要な時間を許容するために、１つの処置は他の処置前または後に投与し得る。したがって、２つの処置の「同時投与」は、１つの処置が２０分以下、約２０分、約１５分、約１０分、約５分、約２分、約１分または１分未満で他の処置に続くことを含むが、これに限定されるものではない。
【００４７】
用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書で使用される場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがなくヒトおよび下等動物の組織との接触に使用するのに適切であり、合理的な利益／危険比に応じ、一般に水溶性または油溶性または分散性であり、それらの意図された用途に有効である塩を意味することが意図される。この用語は、薬学的に許容される酸付加塩および薬学的に許容される塩基付加塩を含む。適切な塩のリストは、例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｉｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，ｐｐ．１−１９に見出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
用語「薬学的に許容される酸付加塩」は、本明細書で使用される場合、遊離塩基の生物学的有効性および性質を保持し、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸などを含むが、これらに限定されない無機酸、および酢酸、トリフルオロ酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、ジグルコン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリセロリン酸、ヘミスルフィック酸、ヘキサン酸、ギ酸、フマル酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）、乳酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メシチレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、フェニル酢酸、３−フェニルプロピオン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデカン酸などを含むが、これらに限定されない有機酸で形成される塩を意味することが意図される。
【００４９】
用語「薬学的に許容される塩基付加塩」は、本明細書で使用される場合、遊離酸の生物学的有効性および性質を保持し、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない、アンモニア、またはアンモニウムもしくはナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩を含むが、これらに限定されない無機塩基で形成される塩を意味することが意図される。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩は、第１級、第２級および第３級アミン、第４級アミン化合物、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェンアミン（ｅｐｈｅｎａｍｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ポリアミン樹脂など、の塩を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明は、ポンペ病の処置を、それを必要とする患者において行う方法を提供し、本方法は、患者に組換えヒト酸性α−グルコシダーゼと組み合わせてミグルスタットまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、かつアルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つまたは２つのマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含む。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、末端ガラクトースを有する低レベルの複合グリカンを有する。別の態様では、本発明は、ポンペ病の処置であって、それを必要とする患者における処置のためのミグルスタットおよび組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの併用を提供する。
【００５１】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは経口投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの経口用量で、または約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇまたは約６００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２３３ｍｇ〜約４００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２５０〜約２７０ｍｇの経口用量で、または約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇもしくは約２７０ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２６０ｍｇの経口用量として投与される。
【００５２】
平均体重が約７０ｋｇの成人患者の場合、約２００ｍｇ〜６００ｍｇの範囲または任意のそれより小さい範囲のミグルスタットの経口用量が適し得ることが当業者に理解されるであろう。乳児、小児または低体重の成人を含むがこれらに限定されない、体重が約７０ｋｇよりも著しく低い患者について、より少ない用量が適切であると医師によって考えられ得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約５０ｍｇ〜約２００ｍｇの経口用量として、または約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇまたは約２００ｍｇの経口用量として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約６５ｍｇ〜約１９５ｍｇの経口用量として、または約６５ｍｇ、約１３０ｍｇもしくは約１９５ｍｇの経口用量として投与される。
【００５３】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、経口投与に適した薬学的に許容される剤形として投与され、これは即時放出、遅延放出、変形放出、持続放出、パルス放出または制御放出用途のための、錠剤、カプセル、胚珠、エリキシル、溶液または懸濁液、ゲル、シロップ、口腔洗浄剤、または使用前に水または他の適切な溶媒で再構成するための乾燥粉末、任意選択により、香味剤および着色剤を含むが、これらに限定されるものではない。錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ピル、ボーラス、粉末、ペースト、顆粒、弾丸状、糖衣錠またはプレミックス調製物などの固体組成物も使用できる。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは錠剤として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットはカプセルとして投与される。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約５０ｍｇ〜約３００ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は約６５ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は約１３０ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は約２６０ｍｇのミグルスタットを含有する。剤形が約６５ｍｇのミグルスタットを含む場合、ミグルスタットは、４剤形の投与量または２６０ｍｇのミグルスタットの総投与量として投与され得ることが企図される。しかしながら、乳児、小児または成人低体重を含むが、これに限定されない平均成人体重の７０ｋｇよりも有意に低い体重を有する患者の場合、ミグルスタットは１剤形（総用量６５ｍｇのミグルスタット）、２剤形（総投与量１３０ｍｇのミグルスタット）、または３剤形（総投与量１９５ｍｇのミグルスタット）の投与量として投与され得る。
【００５４】
経口使用のための固体および液体組成物は、当該技術分野で周知の方法に従って調製し得る。そのような組成物はまた、固体または液体形態であり得る１つ以上の薬学的に許容される担体および賦形剤を含み得る。錠剤またはカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤を含むがこれらに限定されない、薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製し得る。適切な薬学的に許容される賦形剤は当該技術分野で公知であり、アルファ化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、タルク、シリカ、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、グリシンクロスカルメロースナトリウムおよびケイ酸塩複合体を含むが、これらに限定されるものではない。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットはＺａｖｅｓｃａ（登録商標）（Ａｃｔｅｌｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として市販されている製剤として投与される。
【００５５】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、かつアルグルコシダーゼアルファの１つ以上のマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して増加した含有量の、１つ以上のマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含む。少なくとも１つの実施形態において、酸性α−グルコシダーゼは、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されるような、本明細書でＡＴＢ２００と称される組換えヒト酸性α−グルコシダーゼである。ＡＴＢ２００は、高親和性（ＫＤ〜２〜４ｎＭ）でカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合し、ポンペ線維芽細胞および骨格筋芽細胞（Ｋ取り込み〜７〜１４ｎＭ）によって効率的に内在化されることが示されている。ＡＴＢ２００はインビボで特徴付けられ、アルグルコシダーゼアルファ（ｔ１／２〜６０分）よりも短い見かけの血漿半減期（ｔ１／２〜４５分）を有することが示された。
【００５６】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、配列番号１、配列番号２（または配列番号２によってコードされるもの）、配列番号３、配列番号４または配列番号５に記載されるアミノ酸配列を有する酵素である。
2019501178.tif 000004
2019501178.tif 000005
2019501178.tif 000006
2019501178.tif 000007
2019501178.tif 000008
2019501178.tif 000009
2019501178.tif 000010
2019501178.tif 000011
【００５７】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、米国特許第８，５９２，３６２号明細書に記載されるような、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨＥ２４１０４．１（Ｇ１：５６８７６０９７４）を有する。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、配列番号２にコードされる野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有し、そのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ００８３９．１を有する。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、配列番号３に示される野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有する。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、配列番号４に記載されるＧＡＡアミノ酸配列を有し、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）受託番号ＮＰ＿０００１４３．２を有する。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、ＧＡＡ遺伝子の９つの観察されたハプロタイプのうちの最も優勢なものによってコードされるヒト酸性α−グルコシダーゼ酵素である、グルコシダーゼアルファである。
【００５８】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡの全長９５２アミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、アミノ酸の一部、例えば最初の５６アミノ酸を除去する細胞内プロセシングを受ける。したがって、宿主細胞によって分泌される組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、細胞内で最初に発現される組換えヒト酸性α−グルコシダーゼよりも短いアミノ酸配列を有し得る。少なくとも１つの実施形態において、より短いタンパク質は、シグナルペプチドおよび前駆体ペプチドを含む最初の５６アミノ酸が除去され、したがって８９６個のアミノ酸を有するタンパク質が得られる点でのみ配列番号１と異なる、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有し得る。配列番号１または配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超える欠失、置換および／または挿入を有するなど、アミノ酸の数における他の変更も可能である。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡ生成物は、異なるアミノ酸長を有する組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ分子の混合物を含む。
【００５９】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基において翻訳後および／または化学修飾を受ける。例えば、メチオニンおよびトリプトファン残基は酸化を受け得る。別の例として、Ｎ末端グルタミンはピログルタミン酸を形成することができる。別の例として、アスパラギン残基は、アスパラギン酸への脱アミノ化を受け得る。さらに別の例として、アスパラギン酸残基はイソアスパラギン酸への異性化を受け得る。さらに別の例として、タンパク質中の不対システイン残基は、遊離グルタチオンおよび／またはシステインとジスルフィド結合を形成し得る。したがって、いくつかの実施形態において、酵素は、配列番号１、配列番号２（または配列番号２によってコードされるもの）、配列番号３、配列番号４または配列番号５に記載されるアミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、酵素はこれらの翻訳後および／または化学修飾の１つ以上を受ける。そのような改変形態も本開示の範囲内である。
【００６０】
ＧＡＡおよびそのような変異体ヒトＧＡＡをコードするポリヌクレオチド配列も企図され、本発明によるｒｈＧＡＡを組換え発現するために使用され得る。
【００６１】
好ましくは、全組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ分子の７０、６５、６０、５５、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５％以下が、１つ以上のマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を欠くか、または陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合する能力が欠如している。あるいは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ分子の３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％、＜１００％以上が、１つ以上のマンノース−６−リン酸残基を有する少なくとも１つのＮ−グリカン単位を含む、またはＣＩＭＰＲに結合する能力を有する。
【００６２】
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ分子は、そのグリカン上に１、２、３または４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）基を有し得る。例えば、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ分子における１つのＮ−グリカンのみがＭ６Ｐ（モノ−リン酸化）を有していてもよく、単一のＮ−グリカンが２つのＭ６Ｐ基（ビス−リン酸化）を有していてもよく、または同じ組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ分子における２つの異なるＮ−グリカンがそれぞれ単一のＭ６Ｐ基を有していてもよい。組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ分子はまた、Ｍ６Ｐ基を有しないＮ−グリカンを有し得る。別の実施形態において、Ｎ−グリカンは、平均して２．５モル／モルを超えるＭ６Ｐおよび４モル／モルを超えるシアル酸を含み、その結果、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、平均して組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ１モルあたり少なくとも２．５モルのマンノース−６−リン酸残基、および組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ１モルあたり少なくとも４モルのシアル酸を含む。平均して組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける総グリカンの少なくとも約３、４、５、６、７、８、９または１０％は、モノ−Ｍ６Ｐグリカンの形態であってもよく、例えば、総グリカンの約６．２５％が単一のＭ６Ｐ基を有していてもよく、平均して組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける総グリカンの少なくとも約０．５、１、１．５、２．０、２．５、３．０％がビス−Ｍ６Ｐグリカンの形態であり、平均して総組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの２５％未満が、ＣＩＭＰＲに結合するリン酸化グリカンを含まない。
【００６３】
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、０．５〜７．０モル／モル組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの範囲、または０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５または７．０モル／モル組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む部分範囲の任意の中間値のＭ６Ｐを担持するＮ−グリカンの平均含有量を有し得る。組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを分画して、異なる平均数のＭ６Ｐ含有またはビス−Ｍ６Ｐ含有グリカンを有する組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ調製物を提供することができ、これにより、特定の画分を選択することにより、または選択的に異なる画分を組み合わせることにより、標的組織のリソソームへ標的化する組換えヒト酸性α−グルコシダーゼのさらなるカスタマイズが可能となる。
【００６４】
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおけるＮ−グリカンの最大６０％が完全にシアリル化されていてもよく、例えばＮ−グリカンの最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％が完全にシアリル化されていてもよい。いくつかの実施形態において、全Ｎ−グリカンの４〜２０％が完全にシアリル化されている。他の実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおけるＮ−グリカンの５％、１０％、２０％または３０％以下がシアル酸および末端ガラクトース残基（Ｇａｌ）を有する。この範囲には、全ての中間値および部分範囲が含まれ、例えば、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける全Ｎ−グリカンの７〜３０％がシアル酸および末端ガラクトースを運ぶことができる。さらに他の実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおけるＮ−グリカンの５、１０、１５、１６、１７、１８、１９または２０％以下が末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない。この範囲には、全ての中間値および部分範囲が含まれ、例えば、組成物中の組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける全Ｎ−グリカンの８〜１９％が、末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない場合がある。
【００６５】
本発明の他の実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける総Ｎ−グリカンの４０、４５、５０、５５〜６０％が複合型Ｎ−グリカンであり；または組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける総Ｎ−グリカンの１、２、３、４、５、６、７％以下がハイブリッド型Ｎ−グリカンであり；組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける高マンノース型Ｎ−グリカンの５、１０または１５％以下が非リン酸化されており；組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも５％または１０％がリン酸化されたモノ−Ｍ６Ｐであり；および／または組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおける高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも１または２％がリン酸化されたビス−Ｍ６Ｐである。これらの値には、全ての中間値および部分範囲が含まれる。組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、上記の１つ以上の含有量範囲を満たし得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ１モル当たり平均して２．０〜８．０モルのシアル酸残基を有する。この範囲には、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０モル残基／モル組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む、全ての中間値および部分範囲が含まれる。理論に拘束されるものではないが、シアル酸残基を有するＮ−グリカン単位の存在は、アシアロ糖タンパク質受容体による組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの非生産的クリアランスを防止し得ると考えられる。
【００６７】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、組換えヒトリソソームタンパク質の一定のＮ−グリコシル化部位にＭ６Ｐおよび／またはシアル酸単位を有する。例えば、ｒｈＧＡＡには７つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位がある。これらの潜在的なグリコシル化部位は、配列番号５の次の位置に存在する：Ｎ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６およびＮ８６９。同様に、配列番号１の全長アミノ酸配列に関して、これらの潜在的なグリコシル化部位は、以下の位置に存在する：Ｎ１４０、Ｎ２３３、Ｎ３９０、Ｎ４７０、Ｎ６５２、Ｎ８８２およびＮ９２５。ｒｈＧＡＡの他の変異体は、アスパラギン残基の位置に応じて、同様のグリコシル化部位を有し得る。一般に、タンパク質アミノ酸配列におけるＡＳＮ−Ｘ−ＳＥＲまたはＡＳＮ−Ｘ−ＴＨＲの配列は、潜在的なグリコシル化部位を示すが、例外として、ＸはＨＩＳまたはＰＲＯではあり得ない。
【００６８】
様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、特定のＮ−グリコシル化プロファイルを有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第１のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号５のＮ８４および配列番号１のＮ１４０）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第１のＮ−グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ−Ｍ６Ｐおよび／またはビス−Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第１のＮ−グリコシル化部位でモノ−Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第１のＮ−グリコシル化部位でビス−Ｍ６Ｐ単位を有する。
【００６９】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第２のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号５のＮ１７７および配列番号１のＮ２２３）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第２のＮ−グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ−Ｍ６Ｐおよび／またはビス−Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第２のＮ−グリコシル化部位でモノ−Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第２のＮ−グリコシル化部位でビス−Ｍ６Ｐ単位を有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第３のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号５のＮ３３４および配列番号１のＮ３９０）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第３のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第３のＮ−グリコシル化部位は、非リン酸化高マンノースグリカン、ジ−、トリ−、およびテトラ−アンテナリ複合グリカン、ならびに主要な種としてのハイブリッドグリカンの混合物を有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％が第３のＮ−グリコシル化部位でシアリル化される。
【００７０】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第４のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号５のＮ４１４および配列番号１のＮ４７０）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第４のＮ−グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ−Ｍ６Ｐおよび／またはビス−Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第４のＮ−グリコシル化部位でモノ−Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第４のＮ−グリコシル化部位でビス−Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％または２５％が第４のＮ−グリコシル化部位でシアリル化される。
【００７１】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第５のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号５のＮ５９６および配列番号１のＮ６９２）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第５のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第５のＮ−グリコシル化部位は、主要な種として、フコシル化されたジ−アンテナリ複合グリカンを有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第５のＮ−グリコシル化部位でシアリル化される。
【００７２】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第６のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号５のＮ８２６および配列番号１のＮ８８２）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第６のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第６のＮ−グリコシル化部位は、主要な種として、ジ−、トリ−、およびテトラ−アンテナリ複合グリカンの混合物を有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第６のＮ−グリコシル化部位でシアリル化される。
【００７３】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第７のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号５のＮ８６９および配列番号１のＮ９２５）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第７のＮ−グリコシル化部位でリン酸化される。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％未満が第７のＮ−グリコシル化部位に任意のグリカンを有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３０％、３５％または４０％が第７のＮ−グリコシル化部位にグリカンを有する。
【００７４】
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、ＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ−２００またはＡＴＢ−２００−００１−Ｘ５−１４などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により、またはそのようなＣＨＯ細胞培養物の継代培養物もしくは誘導体により好ましく産生される。配列番号１または配列番号５と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一であるものなど、酸性α−グルコシダーゼまたは他の変異体酸性α−グルコシダーゼアミノ酸配列の対立遺伝子変異体を発現するＤＮＡ構築物を構築し、ＣＨＯ細胞で発現させることができる。これらの変異体酸性α−グルコシダーゼアミノ酸配列は、例えば、配列番号１または配列番号５に記載のアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超える欠失、置換および／または挿入を有するなど、配列番号１または配列番号５に対して欠失、置換および／または挿入を含有してもよい。当業者は、そのようなＤＮＡ構築物の産生のためのＣＨＯ細胞の形質転換に適した代替的ベクターを選択し得る。
【００７５】
ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として利用可能なＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、２つの配列間の同一性を計算するために、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用することができ、例えば、デフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載され、好ましくは実質的に同じ機能を示す特定のポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。別段の指示がない限り、類似度スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性割合はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一の高スコア配列対における総残基の数および割合を示す；およびＢＬＡＳＴＰの「陽性」は、整列スコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数および割合を示す。これらの同一性または類似性の程度または本明細書に開示されるアミノ酸配列との類似性の任意の中程度の同一性を有するアミノ酸配列が企図され、この開示によって包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを使用して推定され、従来の手段、特に遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。
【００７６】
本発明者らは、陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）および細胞リソソームを標的とする優れた能力を有する組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ、ならびにインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して産生できることを見出した。これらの細胞は、アルグルコシダーゼアルファなどの従来の組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ製品よりも、１つ以上のマンノース−６−リン酸残基を有する有意に高いレベルのＮ−グリカン単位を有する組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを発現するように誘導し得る。これらの細胞によって産生される組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、例えばＡＴＢ２００によって例示されるように、ルミザイム（登録商標）などの従来の酸性α−グルコシダーゼよりも、有意に多くの筋肉細胞標的化マンノース−６−リン酸（モノ−Ｍ６Ｐ）およびビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）Ｎ−グリカン残基を有する。理論に拘束されるものではないが、この広範なグリコシル化により、ＡＴＢ２００酵素がより効果的に標的細胞に取り込まれることができ、したがって、例えば、はるかに低いＭ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐ含有量を有するアルグルコシダーゼアルファなど、他の組換えヒト酸性α−グルコシダーゼよりも効率的に循環から除去され得ると考えられる。ＡＴＢ２００は、ＣＩＭＰＲに効率的に結合し、骨格筋および心筋によって効率的に取り込まれ、好ましい薬物動態プロファイルを提供しインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンを有することが示されている。
【００７７】
ＡＴＢ２００の特有なグリコシル化は、例えば、アルグルコシダーゼアルファと比較して、ＡＴＢ２００の免疫原性の低下に寄与し得ることも企図される。当業者によって理解されるように、保存された哺乳動物糖によるタンパク質のグリコシル化は、一般に、生成物の溶解性を高め、生成物の凝集および免疫原性を減少させる。グリコシル化は、タンパク質の凝集を最小限にし、免疫系からタンパク質免疫原性エピトープを遮断することにより、タンパク質免疫原性を間接的に変化させる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ-Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４）。したがって、少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与は、抗薬物抗体を誘導しない。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与は、アルグルコシダーゼアルファの投与によって誘導される抗薬物抗体のレベルよりも対象における抗薬物抗体の発生率を低下させる。
【００７８】
同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されるように、ＣＨＯ細胞などの細胞を使用して同文献に記載されるｒｈＧＡＡを生成することができ、このｒｈＧＡＡは、本発明で使用され得る。そのようなＣＨＯ細胞株の例は、ＧＡ−ＡＴＢ−２００またはＡＴＢ−２００−００１−Ｘ５−１４、またはそこに記載されるようなｒｈＧＡＡ組成物を産生するその継代培養物である。そのようなＣＨＯ細胞株は、ＧＡＡをコードする１ポリヌクレオチドにつき５、１０、１５、２０またはそれを超えるコピーなどの遺伝子の複数のコピーを含有し得る。
【００７９】
ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡなどの高Ｍ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐ  ｒｈＧＡＡは、ＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物でＣＨＯ細胞を形質転換する。ＣＨＯ細胞は以前にｒｈＧＡＡを作製するために使用されていたが、形質転換ＣＨＯ細胞は、ＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐグリカンの高い含有量を有するｒｈＧＡＡを産生するように培養および選択できたことは認められなかった。
【００８０】
驚くべきことに、ＣＨＯ細胞株を形質転換し、ＣＩＭＰＲを標的化するＭ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを有するグリカンの高含有量を含有するｒｈＧＡＡを生成する形質転換体を選択し、この高Ｍ６Ｐ  ｒｈＧＡＡを安定に発現させることが可能であることが見出された。したがって、これらのＣＨＯ細胞株を作製するための方法はまた、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されている。この方法は、ＣＨＯ細胞をＧＡＡまたはＧＡＡ変異体をコードするＤＮＡで形質転換すること、ＧＡＡをコードするＤＮＡをその染色体に安定に組み込み、安定にＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択すること、およびＭ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを有するグリカンの高い含有量を有するＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択すること、および任意選択により、高いシアル酸含有量を有するおよび／または低い非リン酸化高マンノース含有量を有するＮ−グリカンを有するＣＨＯ細胞を選択することを含む。少なくとも１つの実施形態において、ＧＡＡは、末端ガラクトースを有する低レベルの複合グリカンを有する。
【００８１】
これらのＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ細胞株を培養し、前記組成物をＣＨＯ細胞の培養物から回収することにより、ｒｈＧＡＡおよびｒｈＧＡＡ組成物を生産するために使用され得る。
【００８２】
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼまたはその薬学的に許容される塩は、ヒトへの投与に適合した医薬組成物として通常の手順に従って製剤化し得る。例えば、好ましい実施形態において、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位において痛みを和らげるための局所麻酔剤を含み得る。一般に、成分は、別個に供給されるか、または単位剤形中で一緒に混合されて、例えば、または活性物質の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、医薬グレードの滅菌水、生理食塩水またはデキストロース／水を含有する注入ボトルで分注し得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【００８３】
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（または組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含有する組成物または医薬）は、適切な経路で投与される。一実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは静脈内投与される。他の実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、心臓もしくは骨格筋（例えば、筋肉内）または神経系（例えば、脳への直接注射；脳室内；髄腔内）などの標的組織への直接投与によって投与される。必要に応じて、複数の経路を同時に使用できる。
【００８４】
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（または組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含有する組成物または医薬）は、治療有効量（例えば、定期的に投与された場合、疾患に関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防または遅延させること、および／または疾患の症状の重症度または頻度を軽減することなどにより、疾患を処置するのに十分な投与量）で投与される。疾患の処置における治療上有効量は、性質および疾患の影響の程度に依存し、標準的な臨床技術によって決定し得る。さらに、インビトロアッセイまたはインビボアッセイを、任意選択により、最適な投与量範囲の同定を促進するために使用し得る。使用される正確な用量は、投与経路および疾患の重症度にも依存し、施術者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から外挿し得る。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇまたは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。特定の個体の有効用量は、個体の必要性に応じて、経時的に変化させる（例えば、増加または減少させる）ことができる。例えば、身体疾患もしくはストレスを有する時、または抗酸性α−グルコシダーゼ抗体が存在するようになったかもしくは増加する場合、または疾患の症状が悪化する場合、その量を増加することができる。
【００８５】
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（または組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含有する組成物または医薬）の治療有効量は、性質および疾患の影響の程度に依存して定期的に、および継続的に投与される。本明細書で使用される場合、「定期的」な投与は、治療有効量が周期的に投与されることを示す（１回投与とは区別される）。間隔は、標準的な臨床技術によって決定することができる。好ましい実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは毎月、隔月；毎週；毎週２回；または毎日投与される。単一の個体に対する投与間隔は、一定間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて、経時的に変化させることができる。例えば、身体疾患もしくはストレスを有する時、抗組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ抗体が存在するようになったかもしくは増加する場合、または疾患の症状が悪化する場合、投与の間隔を減少させることができる。いくつかの実施形態において、治療有効量の５、１０、２０、５０、１００または２００ｍｇ酵素／ｋｇ体重を、シャペロンを伴いまたは伴わず、週に２回、毎週または隔週投与する。
【００８６】
本発明の組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、単位用量のバイアルもしくはシリンジ中、または静脈内投与のための瓶もしくは袋の中など、後の使用のために調製してもよい。組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ、ならびに任意選択による賦形剤またはシャペロンもしくは他の薬物などの他の活性成分を含むキットは、包装材料に封入され、再構成、希釈、またはポンペ病に罹患している患者などの処置を必要とする対象を処置する投与のための説明書を伴い得る。
【００８７】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α−グルコシダーゼは、連続的に投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前にミグルスタットを投与する。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前３時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約２時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前の２時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約１．５時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約１時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約５０分〜約７０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約５５分〜約６５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約３０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約２５分〜約３５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与の約２７分〜約３３分前に投与される。
【００８８】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与と同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前または投与後２０分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前または投与後１５分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前または投与後１０分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与前または投与後５分以内に投与される。
【００８９】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与後２時間までに投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与後約３０分で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与後約１時間で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与後約１．５時間で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与後約２時間で投与される。
【００９０】
本発明の別の態様は、ポンペ病の併用治療であって、それを必要とする患者における併用治療のためのキットを提供する。キットは、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形と、本明細書で定義される組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形と、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形および組換え酸性α−グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形を、それを必要とする患者に投与するための説明書とを含む。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形は、錠剤またはカプセルを含むが、これに限定されない、本明細書に記載される経口剤形である。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形は、本明細書に記載の注射に適した滅菌溶液である。少なくとも１つの実施形態において、剤形を投与するための説明書は、本明細書に記載されるように、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形を静脈内注入によって投与する前に、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形を投与するための説明書を含む。
【００９１】
理論に拘束されるものではないが、ミグルスタットは組換えヒト酸性α−グルコシダーゼＡＴＢ２００の薬理学的シャペロンとして作用し、その活性部位に結合すると考えられている。このように、図１に示すように、ミグルスタットは、アンフォールドＡＴＢ２００タンパク質の割合を減少させ、ＡＴＢ２００の活性立体構造を安定化させ、血漿の中性ｐＨでの変性および不可逆的な不活性化を防止し、循環中で組織に到達して取り込まれるのに十分な長さの生存条件を許容することが見出された。しかしながら、ミグルスタットのＡＴＢ２００の活性部位への結合はまた、天然基質であるグリコーゲンが活性部位にアクセスすることを防止することにより、ＡＴＢ２００の酵素活性の阻害をもたらし得る。ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α−グルコシダーゼが本明細書に記載の条件下で患者に投与される場合、血漿および組織内のミグルスタットおよびＡＴＢ２００の濃度は、ＡＴＢ２００が組織に取り込まれ、リソソームを標的化するまで安定化される程度であるが、ミグルスタットのクリアランスが迅速であるために、リソソーム内のＡＴＢ２００によるグリコーゲンの加水分解は、ミグルスタットの存在によって過度に阻害されず、酵素は治療的に有用な十分な活性を保持すると考えられる。
【００９２】
上記の全ての実施形態を組み合わせてもよい。これは、以下に関する特定の実施形態を含む：
薬理学的シャペロン、例えばミグルスタットの性質；およびそれが特異的である活性部位；
投与量、薬理学的シャペロン（ミグルスタット）の投与経路、および担体の性質および市販の組成物の使用を含む医薬組成物のタイプ；
薬の性質、例えば対象において発現が低下または欠損している内因性タンパク質の対応物であってもよい、治療用タンパク質薬物製品、好適には、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、１つ以上のアルグルコシダーゼのアルファマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位の含有量と比較した場合、増加した含有量の１つ以上のマンノース−６−リン酸残基を有するＮ−グリカン単位を含む、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ；および好適には、配列番号１、配列番号２（または配列番号２によってコードされるもの）、配列番号３、配列番号４または配列番号５に記載されるアミノ酸配列を有するもの；
組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおけるＮ−グリカン単位の数およびタイプ、例えば、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼに結合したＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸またはこれらの組み合わせから形成された複合Ｎ−グリカン；
マンノース−６−リン酸および／またはビス−マンノース−６−リン酸を形成する組換えヒト酸性α−グルコシダーゼにおけるマンノース単位のリン酸化の程度；
補充酵素（組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ）の投与量および投与経路（例えば静脈内投与、特に静脈内注入または標的組織への直接投与）および担体および治療有効量を含む製剤のタイプ；
薬理学的シャペロン（ミグルスタット）および組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの投与間隔；
治療応答の性質および併用治療の結果（例えば、個々に行われる各治療の効果と比較して強化された結果）；
併用治療の投与タイミング、例えば、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの同時投与または逐次投与、例えば、ミグルスタットが、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの前、または組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの後、または投与前または投与後の一定時間内に投与される場合；および
処置患者の性質（例えば、ヒトなどの哺乳動物）および個体が罹患している病状（例えば、酵素不全）。
【００９３】
上記リストの任意の実施形態は、リストの他の実施形態の１つ以上と組み合わせることができる。
【実施例】
【００９４】
本発明のさらなる特徴は、例として、本発明の原理を説明する以下の非限定的な実施例から明らかになる。
【００９５】
実施例１：既存のミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡ製品の限界
現在承認されている唯一のポンペ病処置薬であるミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの能力を評価するために、これらのｒｈＧＡＡ調製物を（Ｍ６Ｐ基を有するｒｈＧＡＡに結合する）ＣＩＭＰＲカラムに注入し、続いて遊離Ｍ６勾配で溶出した。画分を９６ウェルプレートに集め、ＧＡＡ活性を４ＭＵ−α−グルコース基質によってアッセイした。結合および未結合ｒｈＧＡＡの相対量をＧＡＡ活性に基づいて決定し、全酵素の割合として報告した。
【００９６】
図２Ａ〜Ｂは、従来のＥＲＴ（ミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標））に関連する問題を記載する：ミオザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの７３％（図２Ｂ）およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの７８％（図２Ａ）は、ＣＩＭＰＲに結合しなかった（各図の一番左のピークを参照）。ミオザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの２７％およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの２２％のみが、筋肉細胞上のＣＩＭＰＲに標的化し得るＭ６Ｐを含んでいた。
【００９７】
ミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）の有効用量は、筋肉細胞上のＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐを含有するｒｈＧＡＡの量に対応する。しかしながら、これら２つの従来製品におけるｒｈＧＡＡの大部分は、標的筋肉細胞上のＣＩＭＰＲ受容体を標的としない。ｒｈＧＡＡの大部分が筋肉細胞に標的化されていない従来のｒｈＧＡＡの投与は、非標的化ｒｈＧＡＡに対するアレルギー反応または免疫誘導のリスクを増加させる。
【００９８】
実施例２：高含有量のモノ−またはビス−Ｍ６Ｐ含有Ｎ−グリカンを有するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡを産生するＣＨＯ細胞の調製
ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を図３に示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。
【００９９】
トランスフェクション後、安定的に組み込まれたＧＡＡ遺伝子を含むＤＧ４４  ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞をヒポキサンチン／チミジン欠損（−ＨＴ）培地で選択した。これらの細胞におけるＧＡＡ発現の増幅は、メトトレキサート処理（ＭＴＸ、５００ｎＭ）によって誘導された。大量のＧＡＡを発現する細胞プールはＧＡＡ酵素活性アッセイによって同定され、ｒｈＧＡＡを産生する個々のクローンを確立するために使用された。個々のクローンを半固体培地プレート上で生成し、ＣｌｏｎｅＰｉｘシステムにより採取し、２４ディープウェルプレートに移した。個々のクローンをＧＡＡ酵素活性についてアッセイして、高レベルのＧＡＡを発現するクローンを同定した。ＧＡＡ活性を決定するための条件培地は、４−ＭＵ−α−グルコピラノシドα−グルコシダーゼ基質を用いた。ＧＡＡ酵素アッセイによって測定される、より高レベルのＧＡＡを産生するクローンを生存能力、成長能力、ＧＡＡ生産性、Ｎ−グリカン構造および安定なタンパク質発現についてさらに評価した。強化されたモノ−Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンを有するｒｈＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ−２００を含むＣＨＯ細胞株を、この手順を用いて単離した。
【０１００】
実施例３：ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの捕捉および精製
本発明によるｒｈＧＡＡの複数のバッチを、ＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ−２００を用いて振盪フラスコおよび灌流バイオリアクタで産生し、ＣＩＭＰＲ結合を測定した。異なる産生バッチからの精製ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡについて、図４Ｂおよび図５Ａに示されるものと同様のＣＩＭＰＲ受容体結合（約７０％）が観察され、これはＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡが一貫して産生され得ることを示す。図２Ａ、２Ｂ、４Ａおよび４Ｂに示されるように、ミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡよりも有意に低いＣＩＭＰＲ結合を示した。
【０１０１】
実施例４：ルミザイム（登録商標）に対するＡＴＢ２００の分析比較
弱いアニオン交換（「ＷＡＸ」）液体クロマトグラフィーを使用して、末端リン酸によりＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡを分画した。溶出プロファイルは、増加する量の塩でＥＲＴを溶出することによって生成された。プロファイルをＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）でモニターした。ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡをＣＨＯ細胞から得て精製した。ルミザイム（登録商標）は商業的供給源から入手した。ルミザイム（登録商標）は、その溶出プロファイルの左側に高いピークを示した。ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）の右側に溶出する４つの顕著なピークを示した（図６）。これにより、この評価がＣＩＭＰＲ親和性ではなく末端電荷によるものであるため、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡがルミザイム（登録商標）よりも大幅にリン酸化されたことを確認される。
【０１０２】
実施例５：ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのオリゴ糖特性
精製したＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡおよびルミザイム（登録商標）グリカンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで評価し、各ＥＲＴ上に見出される個々のグリカン構造を決定した（図７）。ＡＴＢ２００試料は、ルミザイム（登録商標）より少ない量の非リン酸化高マンノース型Ｎ−グリカンを含有することが判明した。ルミザイム（登録商標）よりもＡＴＢ２００のＭ６Ｐグリカンの含有量が高いほど、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡが筋肉細胞をより効果的に標的とする。ＭＡＬＤＩによって決定されるモノ−リン酸化およびビス−リン酸化構造の高いパーセンテージは、ＣＩＭＰＲ受容体へのＡＴＢ２００の結合が有意に大きいことを示したＣＩＭＰＲプロファイルと一致する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によるＮ−グリカン分析は、平均して各ＡＴＢ２００分子が少なくとも１つの天然ビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカン構造を含有することを確認した。ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ上の、このビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンのより高い含有量は、Ｍ６Ｐ受容体プレート結合アッセイ（ＫＤ約２〜４ｎＭ）においてＣＩＭＰＲへの高親和性結合と直接相関していた、図９Ａ。
【０１０３】
ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡも、２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を用いて部位特異的Ｎ−グリカンプロファイルについて分析した。第１の分析では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析前にタンパク質を変性させ、還元し、アルキル化し、消化した。タンパク質の変性および還元中、２００μｇのタンパク質試料、５μｌの１ｍｏｌ／Ｌトリス−ＨＣｌ（最終濃度５０ｍＭ）、７５μＬの８ｍｏｌ／ＬグアニジンＨＣｌ（最終濃度６Ｍ）、１μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（最終濃度５ｍＭ）、２μＬの１ｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ（最終濃度２０ｍＭ）およびＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を１．５ｍＬチューブに添加して、１００μＬの全容量を提供した。試料を混合し、乾燥浴中において５６℃で３０分間インキュベートした。アルキル化中、変性および還元タンパク質試料を５μＬの１ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド（ＩＡＭ、最終濃度５０ｍＭ）と混合し、次いで暗所で３０分間インキュベートした。アルキル化後、４００μＬの予冷されたアセトンを試料に加え、混合物を−８０℃で４時間凍結させた。次いで、試料を４℃、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。予冷されたアセトン４００μｌをペレットに添加し、次いでこれを４℃、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。試料を暗所にて氷上で風乾し、アセトン残留物を除去した。４０μＬの８Ｍ尿素および１６０μＬの１００μＭＮＨ４ＨＣＯ３を試料に添加して、タンパク質を溶解させた。トリプシン消化中、５０μｇのタンパク質をトリプシン消化緩衝液と添加して最終容積１００μｌとし、５μＬの０．５μｇ／ｍＬトリプシン（タンパク質対酵素比２０／１ｗ／ｗ）を添加した。溶液をよく混合し、３７℃で一晩（１６±２時間）インキュベートした。２．５μｌの２０％ＴＦＡ（最終濃度０．５％）を加えて反応を停止させた。次に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ（商標）質量分析計を用いて試料を分析した。
【０１０４】
第２のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、ＩＡＭの代わりにアルキル化試薬としてヨード酢酸（ＩＡＡ）を用いた以外、同様の変性、還元、アルキル化および消化手順に従ってＡＴＢ２００試料を調製し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ  Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計を用いて分析した。
【０１０５】
第３のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、アルキル化試薬としてヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を用いた同様の変性、還元、アルキル化および消化手順に従ってＡＴＢ２００試料を調製し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計を用いて分析した。
【０１０６】
第１および第２の分析の結果を図８Ｂ〜８Ｈに示し、第３の分析の結果を図８Ａに示す。図８Ｂ〜８Ｈにおいて、第１の分析の結果は左のバー（濃い灰色）で表され、第２の分析の結果は右のバー（薄い灰色）で表される。図８Ｂ〜８Ｈにおいて、グリカンの記号命名法はＶａｒｋｉ，Ａ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．，Ｅｓｋｏ  Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９）に従う。図８Ａ〜８Ｈにおいて、グリコシル化部位は、配列番号５：Ｎ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６およびＮ８６９に対して付与される。配列番号１の全長アミノ酸配列に関して、これらの潜在的なグリコシル化部位は、以下の位置に存在する：Ｎ１４０、Ｎ２３３、Ｎ３９０、Ｎ４７０、Ｎ６５２、Ｎ８８２およびＮ９２５。
【０１０７】
図８Ｂ〜８Ｈから分かるように、最初の２つの分析は同様の結果を示したが、その結果の間にはある程度の差異があった。この変化は、使用機器およびＮ−グリカン分析の完全性を含む多くの要因に起因し得る。例えば、リン酸化されたグリカンのいくつかの種が同定されていないか、および／または定量化されていない場合、リン酸化されたグリカンの総数は過小評価される可能性があり、その部位でリン酸化されたグリカンを有するｒｈＧＡＡのパーセンテージは、過小評価される可能性がある。別の例として、非リン酸化グリカンのいくつかの種が同定されていないか、および／または定量化されていない場合、非リン酸化グリカンの総数は過大評価される可能性があり、その部位でリン酸化されたグリカンを有するｒｈＧＡＡのパーセンテージは、過大評価される可能性がある。
【０１０８】
図８Ａは、ＡＴＢ２００のＮ−グリコシル化部位占有率を示す。図８Ａから分かるように、第１、第２、第３、第４、第５および第６のＮ−グリコシル化部位は、それぞれの潜在的部位で検出されたグリカンを有するＡＴＢ２００酵素のおよそ９０％〜最大約１００％により、大部分が占有される。しかしながら、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、約半分の時間でグリコシル化される。
【０１０９】
図８Ｂは、第１の部位であるＮ８４のＮ−グリコシル化プロファイルを示す。図８Ｂから分かるように、主要なグリカン種はビス−Ｍ６Ｐグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の７５％以上が第１の部位にビス−Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。
【０１１０】
図８Ｃは、第２の部位であるＮ１７７のＮ−グリコシル化プロファイルを示す。図８Ｃから分かるように、主要なグリカン種は、モノ−Ｍ６Ｐグリカンおよび非リン酸化高マンノースグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の４０％以上が第２の部位にモノ−Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。
【０１１１】
図８Ｄは、第３の部位であるＮ３３４のＮ−グリコシル化プロファイルを示す。図８Ｄから分かるように、主要なグリカン種は、非リン酸化高マンノースグリカン、ジ−、トリ−、およびテトラ−アンテナリ複合グリカン、ならびにハイブリッドグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の２０％以上が第３の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【０１１２】
図８Ｅは、第４の部位であるＮ４１４のＮ−グリコシル化プロファイルを示す。図８Ｅから分かるように、主要なグリカン種はビス−Ｍ６Ｐおよびモノ−Ｍ６Ｐグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の４０％以上が第４の部位にビス−Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の２５％以上が第４の部位にモノ−Ｍ６Ｐグリカンを有していたことも検出された。
【０１１３】
図８Ｆは、第５の部位であるＮ５９６のＮ−グリコシル化プロファイルを示す。図８Ｆから分かるように、主要なグリカン種は、フコシル化されたジ−アンテナリ複合グリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の７０％以上が第５の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【０１１４】
図８Ｇは、第６の部位であるＮ８２６のＮ−グリコシル化プロファイルを示す。図８Ｆから分かるように、主要なグリカン種は、ジ−、トリ−、およびテトラ−アンテナリ複合グリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の８０％以上が第６の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【０１１５】
図８Ｈは、最初の６つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位のそれぞれにおけるリン酸化の概要を示す。図８Ｈから分かるように、第１および第２の分析の両方で、第１、第２および第４の部位における高いリン酸化レベルが検出された。両方の分析は、ＡＴＢ２００の８０％以上が第１の部位でモノ−またはジ−リン酸化されていたこと、ＡＴＢ２００の４０％以上が第２の部位でモノ−リン酸化されていたこと、およびＡＴＢ２００の８０％以上が第４の部位でモノ−またはジ−リン酸化されていたことを検出した。
【０１１６】
実施例６：ＡＴＢ２００のＣＩＭＰＲ親和性特性
ＣＩＭＰＲに結合し得るｒｈＧＡＡの割合がより高いことに加え、その相互作用の質を理解することが重要である。ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ受容体結合を、ＣＩＭＰＲプレート結合アッセイを用いて測定した。簡潔には、ＣＩＭＰＲ被覆プレートを用いてＧＡＡを捕捉した。様々な濃度のｒｈＧＡＡを、固定化した受容体に適用し、未結合ｒｈＧＡＡを洗い流した。残りのｒｈＧＡＡ量は、ＧＡＡ活性によって決定された。図９Ａに示すように、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）より有意に良好に、ＣＩＭＰＲに結合した。
【０１１７】
図９Ｂは、ルミザイム（登録商標）、従来のｒｈＧＡＡ、および本発明によるＡＴＢ２００におけるビス−Ｍ６Ｐグリカンの相対含有量を示す。ルミザイム（ルミザイム）（登録商標）では、平均して１０％の分子のみがビス−リン酸化グリカンを有する。これを、平均して全てのｒｈＧＡＡ分子が少なくとも１つのビス−リン酸化グリカンを有するＡＴＢ２００と対比する。
【０１１８】
実施例７：ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）よりも線維芽細胞により効率的に内在化された
ＡＴＢ２００およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡの相対的な細胞取り込みを、正常およびポンペ（Ｐｏｍｐｅ）線維芽細胞系を用いて比較した。比較は、本発明による５〜１００ｎＭのＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡと１０〜５００ｎＭの従来のｒｈＧＡＡルミザイム（登録商標）との比較を含んでいた。１６時間のインキュベーション後、外部ｒｈＧＡＡをＴＲＩＳ塩基で不活性化し、細胞を収集前にＰＢＳで３回洗浄した。内在化ＧＡＡは、４ＭＵ−α−グルコシド加水分解によって測定され、総細胞タンパク質に対してグラフ化され、その結果は図１０Ａ〜Ｂに表される。
【０１１９】
ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡはまた、それぞれ効率的に細胞内に内在化することが示され（図１０Ａおよび１０Ｂ）、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ正常およびポンペ線維芽細胞の両方に内在化し、従来のルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡよりも高度に内在化していること示す。ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡは、約２０ｎＭで細胞受容体を飽和させる一方、ルミザイム（登録商標）は約２５０ｎＭ必要である。これらの結果から外挿される取り込み効率定数（Ｋ取り込み）は、図１０Ｃに示すように、ＡＴＢ２００では２〜３ｎｍであり、ルミザイム（登録商標）では５６ｎＭである。これらの結果は、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡがポンペ病によく標的化された処置であることを示唆している。
【０１２０】
実施例８：ＡＴＢ２００およびミグルスタットの集団薬物動態（ＰＫ）モデル
サンプリング時間、投与歴および酸性α−グルコシダーゼの血漿濃度を含む酸性α−グルコシダーゼ（ＡＴＢ２００）の薬物動態データは、ＡＴＢ２００を静脈注射によって投与したマウス、ラットおよびサルから得られる。血漿および組織中のミグルスタットおよびドゥボグルスタットの薬物動態データは、ヒトまたはマウスから収集される。
【０１２１】
モデリングおよびシミュレーションは、Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＮＬＭＥ（商標）ｖ１．３を使用して実行される。区画ＰＫモデルを構築して、血漿中のＡＴＢ２００のＰＫを評価する。モデルは以下を含む：
●血漿濃度と時間との関係の説明；
●モデルパラメータにおける動物間変動および動物内変動を特徴付ける分散要素；および
●重要なモデル要素に関する知識状態の不確実性を説明する要素。
【０１２２】
非線形混合効果（ＮＬＭＥ）モデルの式は次の通りである：
Ｃｐｊ＝Ｃ（Ｄｉ，ｔｊ，θｉ）＋εｉｊ
θｉ＝（θｉ１，…，θｉｍ）
ここで、Ｃｐｉｊは動物ｉにおけるｊ番目の収集時での濃度であり、Ｄｉは動物ｉにおける投薬履歴を表し、θｉは動物ｉにおけるＰＫパラメータのベクトルであり、εｉｊは動物ｉにおけるｊ番目の濃度に関連するランダム誤差である。
【０１２３】
パラメータにおける対象間変動（ＢＳＶ）は、対数正規分布としてモデル化される：
θｉｎ＝θＴＶｎｅｘｐ（ηｉｎ）
（η１，…，ηＭ）〜ＭＶＮ（０，Ω）
ここで、θＴＶｎは、ｎ番目のＰＫパラメータ（例えば、クリアランス）に対する集団標準値であり、ηｉｎは、動物ｉに対するｎ番目のパラメータにおけるランダムな動物間効果である。ランダム効果（η１，…ηｍ）は、ＯＭＥＧＡ（Ω）行列に含まれる平均０および推定分散ω２で正規分布した。
【０１２４】
ＰＫは種に依存しないと仮定され、動物の体重の力に応じて処分をスケールする一般化されたＤｅｄｒｉｃｋのアプローチに従ってスケールされる：
ＣＬ（ｐ）ｉ＝ａ（ｐ）ＢＷｉｂ
Ｖ（ｐ）ｉ＝ｃ（ｐ）ＢＷｉｄ
ここで、ＣＬは全身クリアランス、Ｖは分布体積、ＢＷは体重、ｐは末梢、ｂおよびｄはアロメトリック指数、ならびにａおよびｃはＢＷ＝１の典型値である。この筋書きでは、指数ｂおよびｄを、文献で認められた、より一般化された値と比較し得る（ｂ＝０．７５およびｄ＝１．０）。公称ＢＷ（０．０２５、０．２５および２．５ｋｇ）を分析に使用する。
【０１２５】
Ｃベースラインは種特異的であり、ＡＴＢ２００の濃度に依存せず、ヒトにおいてポンペ病で知られているため、ベースライン酸性α−グルコシダーゼ濃度は、Ｃベースライン＝酸性α−グルコシダーゼ合成／ＣＬの割合としてモデル化され、ヒトに外挿し得る。１または２区画モデルのいずれがデータに最も適合するかを評価するために、Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＦＯＣＥ−ＥＬＳを使用してベースモデルを決定する。酸性α−グルコシダーゼのＰＫ変動の発生源は、視覚的に、およびＰＫに対する様々な野生型／種／用量関連効果の影響を調べることによっても探究される。
【０１２６】
ＡＴＢ２００の場合、線形除去を伴う２区画モデルは、動物種間の全用量レベルについての酸性α−グルコシダーゼ活性の濃度−時間プロファイルを適切に特徴付けている。モデルには、クリアランス（ＣＬ）および分布容積（Ｖｃ）に関する動物種間の体重の差異を説明する理論的アロメトリック成分が含まれる。ＡＴＢ２００の集団ＰＫモデルの適合度を図１１に示す。非臨床試験におけるＡＴＢ２００の集団ＰＫパラメータを表１に示す。
【０１２７】
2019501178.tif 000012
【０１２８】
ポンペ病患者におけるミグルスタット（２００ｍｇ）の濃度−時間プロファイルを、正常で健康なボランティア（用量範囲：５０、１００、２５０、６００および１０００ｍｇ）におけるドゥボグルスタットの投与後に得られたものと比較する。ミグルスタットおよびドゥボグルスタットの用量標準化血漿濃度−時間プロファイルを図１２に示す。ポンペ病に罹患した患者のミグルスタットの濃度−時間プロファイルは、健康な対象のドゥボグルスタットの投与後２４時間以上で観察されたものと類似しているため、末梢組織においてドゥボグルスタットについて収集されたＰＫデータをミグルスタットへの曝露モデルの代用として使用した。線形除去を伴う２区画モデルを用いて、組織におけるドゥボグルスタットの濃度−時間プロファイルを特徴付ける。
【０１２９】
ドゥボグルスタットのＰＫモデルの適合度を図１３Ａおよび１３Ｂに示す。血漿および組織におけるドゥボグルスタットの最終モデルＰＫパラメータを表２に示す。
【０１３０】
2019501178.tif 000013
【０１３１】
ミグルスタットの集団ＰＫモデルは、Ｇａａノックアウト（ＫＯ）マウスでの経口投与に基づいて構築される。ＧａａＫＯマウスにおけるミグルスタットの集団ＰＫパラメータを表３に示す。適合度は図１４に示される。このモデルは、０．４７５ｎｇ／ｍＬの残留相加誤差を有する。
【０１３２】
2019501178.tif 000014
【０１３３】
実施例９：ヒトにおける組換え酸性α−グルコシダーゼ（ＡＴＢ２００）薬物動態（ＰＫ）パラメータのモデル化
薬物動態モデル（実施例８）を用いてシミュレーションを実施し、ＡＴＢ２００の投与後の、後期ステージのポンペ病に罹患した対象における酸性α−グルコシダーゼの濃度−時間プロファイルを予測した。アロメトリック関数は、体重とクリアランスおよび分布量との連関を可能にし、したがって体重７０ｋｇの典型的なヒト対象におけるＰＫパラメータの予測を可能にした。このモデルは、ヒトにおける酸性α−グルコシダーゼの内因性合成速度を含むことによってカスタマイズされる（Ｕｍａｐａｔｈｙｓｉｖａｍ  Ｋ，Ｈｏｐｗｏｏｄ  ＪＪ，Ｍｅｉｋｌｅ  ＰＪ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓｐｏｔｓ  ａｓ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．（２００１）Ａｕｇ；４７（８）：１３７８−８３）。
【０１３４】
ヒトにおけるＡＴＢ２００の４時間にわたる注入の単回２０ｍｇ／ｋｇＩＶ用量は、図１５に示す濃度−時間プロファイルを生じると予測される。典型的な７０ｋｇのヒトにおけるＰＫパラメータおよび４時間にわたるＡＴＢ２００の２０ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入後の結果として得られる曝露パラメータを表４に示す。
【０１３５】
2019501178.tif 000015
【０１３６】
典型的な７０ｋｇの患者におけるＡＴＢ２００の予測される全身クリアランス（ＣＬ）および分布容積（Ｖ）は、それぞれ０．７６８Ｌ／ｈおよび２．４１Ｌである。
【０１３７】
ルミザイム（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ）の製品ラベルによれば、後期ステージのポンペ病に罹患した患者におけるルミザイム（登録商標）の反復投与後第５２週で酸性α−グルコシダーゼの全身クリアランスは６０１ｍＬ／ｈ（０．６０１Ｌ／ｈ）であり、ルミザイム（登録商標）の半減期は２．４時間である。上記のモデルに基づいて、ポンペ病の成人対象におけるＡＴＢ２００の全身クリアランスは、ルミザイム（登録商標）について報告されたものよりおよそ２８％速いと予想される。さらに、２０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＴＢ２００の後のヒトにおいて予測されるＡＵＣは、２０ｍｇ／ｋｇ用量のルミザイム（登録商標）（約２７００μｇ・ｈ／ｍＬ）の後に報告されたＡＵＣよりも約２５％低い（ＡＵＣ０−ｉｎｆ：１８２２ｍｇ・ｈ／Ｌ）ことが予想される。
【０１３８】
実施例１０：グリコーゲン減少の曝露応答モデル
Ｇａａノックアウトマウスに、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に酸性α−グルコシダーゼ（ＡＴＢ２００）を投与し、５または１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量のＡＴＢ２００に伴うミグルスタットの経口用量を上昇させ（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）、または２０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量のＡＴＢ２００に伴うミグルスタットの経口用量を上昇させた（１、３、５、１０、２０、および３０ｍｇ／ｋｇ）。グリコーゲンレベルは、以前に記載されたように測定される（Ｋｈａｎｎａ，Ｒ，Ｆｌａｎａｇａｎ，ＪＪ，Ｆｅｎｇ，Ｊ，Ｓｏｓｋａ，Ｒ，Ｆｒａｓｃｅｌｌａ，Ｍ，Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ，ＬＪ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．“Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ＡＴ２２２０  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（７）：ｅ４０７７６）。単剤治療後に観察されるグリコーゲンレベルに対する各併用治療処置後に観察されるグリコーゲンレベルの比（グリコーゲン比）を計算する。結果を表５に示す。
【０１３９】
2019501178.tif 000016
【０１４０】
さらに、図１５Ａ〜１５Ｃは、アルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））およびＡＴＢ２００の、Ｇａａノックアウトマウスにおける投与の効果を示す。動物は２回のＩＶボーラス投与（隔週）を受ける。最終投与の２週間後に組織を収集し、酸性α−グルコシダーゼ活性およびグリコーゲン含有量について分析する。
【０１４１】
表５の結果から分かるように、ＡＴＢ２００は、酸性α−グルコシダーゼ（Ｇａａ）ノックアウトマウスの組織グリコーゲンを用量依存的に激減させることが判明した。２０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＴＢ２００は、Ｇａａノックアウトマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量レベルよりも大きい割合で貯蔵グリコーゲンを一貫して除去した。しかしながら、図１５Ａ〜１５Ｃに見られるように、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＡＴＢ２００は、マウス心臓および骨格筋（四頭筋および三頭筋）におけるグリコーゲンの、２０ｍｇ／ｋｇで投与されたルミザイム（登録商標）と同様の減少を示した一方、１０および２０ｍｇ／ｋｇで投与されたＡＴＢ２００は、ルミザイム（登録商標）よりも骨格筋におけるグリコーゲンレベルの著しく良好な低下を示した。
【０１４２】
さらに、２０ｍｇ／ｋｇでのＡＴＢ２００と共投与された１０および２０ｍｇ／ｋｇ用量のミグルスタットは、Ｇａａノックアウトマウスのグリコーゲンレベルをそれぞれ１１８および１２２μｇ／ｍｇタンパク質に減少させた。３０ｍｇ／ｋｇでミグルスタットを投与すると、グリコーゲンの減少がより小さかった。理論に拘束されるものではないが、より高い濃度のミグルスタットでは、リソソーム中の酸性α−グルコシダーゼの阻害が有益なシャペロン効果を超え、それによりリソソーム中のグリコーゲンの分解が減少し得ると考えられる。
【０１４３】
薬物動態モデル（実施例８）を使用して、表５の組織リソソームグリコーゲンレベルの値に時間を合わせた酸性α−グルコシダーゼおよびミグルスタットへの曝露を予測する。ミグルスタット／ＡＴＢ２００の定常状態曝露（ＡＵＣ）比（平均曝露２４時間）は、試験された各処置の組み合わせについて導かれ、対応するグリコーゲン比（表５）に対してプロットされ、数学的関数に適合される。曝露応答曲線を図１７に示す。
【０１４４】
図１７の結果から分かるように、２０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＴＢ２００との１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ用量のミグルスタットの共投与は、グリコーゲン減少を最大にしながら、血漿中の酸性α−グルコシダーゼ活性の良好な安定性を提供する。より低用量のミグルスタット（１、３および５ｍｇ／ｋｇ）は、酸性α−グルコシダーゼ活性の最適下限の安定化をもたらすと考えられているが、ミグルスタットの最高用量（３０ｍｇ／ｋｇ）は、リソソーム内のα−グルコシダーゼ活性の過剰な阻害をもたらすと考えられる。
【０１４５】
薬物動態モデル（実施例８）に基づき、観測されたミグルスタット／ＡＴＢ２００のＡＵＣ比０．０１１５９（２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と共投与される１０ｍｇ／ｋｇのミグルスタット）が、典型的な７０ｋｇのヒトにおける、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と共投与される約２７０ｍｇのミグルスタット用量に対応すると予想される。０．０１および０．０２のＡＵＣ比は、典型的な７０ｋｇの対象において、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と共投与された２３３ｍｇおよび４６６ｍｇのミグルスタット用量にそれぞれ対応するであろう。
【０１４６】
実施例１１：ヒトにおけるミグルスタット／ドゥボグルスタット濃度のモデリング
薬物動態モデル（実施例８）を用いて、ドゥボグルスタット（ミグルスタットの代用物）の血漿または組織濃度が、血漿およびリソソーム中のミグルスタットのＩＣ５０（酸性α−グルコシダーゼ活性の最大阻害の５０％を与える濃度）より上にとどまる時間の長さを予測した。酸性α−グルコシダーゼ活性の阻害は、以前に記載された方法によって測定される（Ｆｌａｎａｇａｎ  ＪＪ，Ｒｏｓｓｉ  Ｂ，Ｔａｎｇ  Ｋ，Ｗｕ  Ｘ，Ｍａｓｃｉｏｌｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  １−ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ．”Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ３０：１６８３-１６９２）。血漿のｐＨ（ｐＨ７．０）でのミグルスタットのＩＣ５０値は１７０μｇ／Ｌと測定され、リソソーム区画のｐＨ（ｐＨ５．２）でのＩＣ５０値は３７７μｇ／Ｌと測定された。
【０１４７】
モデル予測の結果を表６に示す。反復投与後の血漿およびリソソーム中のミグルスタットの予測される濃度−時間プロファイルをそれぞれ図１７および１８に示す。
【０１４８】
2019501178.tif 000017
【０１４９】
表６ならびに図１７および１８に示される結果に基づき、２６０ｍｇの用量のミグルスタットは、血漿中のＡＴＢ２００に結合し、１８時間まで安定化すると予想されるが、リソソーム中の酸性α−グルコシダーゼ活性の阻害は、４時間のみ持続すると予想される。
【０１５０】
実施例１２：Ｇａａノックアウトマウスにおける筋肉生理学および形態学
Ｇａａノックアウトマウスに隔週で２０ｍｇ／ｋｇの組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００）の２回のＩＶボーラス投与を与える。ミグルスタットは、ＡＴＢ２００の投与の３０分前にＡＴＢ２００で処置した動物のサブセットに１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与される。コントロールマウスは、溶媒のみで処置する。ヒラメ筋、四頭筋および隔膜組織は、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの最後の投与の２週間後に収集される。ヒラメ筋および隔膜組織は、グリコーゲンレベルについて過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することにより、およびリソソーム増殖についてポンペ病においてアップレギュレートされたリソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）マーカーのレベルを測定することにより分析する。エポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ）に包埋された四頭筋の半薄切片をメチレンブルーで染色し、電子顕微鏡（１０００×）で観察し、空胞の存在の程度を決定する。四頭筋試料を免疫組織化学的に分析して、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ  ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを決定する。
【０１５１】
同様の実験において、Ｇａａノックアウトマウスに隔週で２０ｍｇ／ｋｇの組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００）の４回のＩＶボーラス投与を与える。ミグルスタットは、ＡＴＢ２００の投与の３０分前にＡＴＢ２００で処置した動物のサブセットに１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与される。コントロールマウスは、溶媒のみで処置する。心臓筋肉組織を組換えヒト酸性α−グルコシダーゼの最後の投与の２週間後に収集し、グリコーゲンレベルについて過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することにより、およびリソソーム増殖についてＬＡＭＰ１のレベルを測定することにより分析する。
【０１５２】
図２０に見られるように、ＡＴＢ２００の投与は、アルグルコシダーゼアルファによる従来の処置と比較して、心臓および骨格筋（ヒラメ筋）組織におけるリソソーム増殖の減少を示し、ＡＴＢ２００とのミグルスタットの共投与は、リソソーム増殖において、野生型（ＷＴ）マウスに見られるレベルに近づいていることを示した。さらに、図２１に見られるように、ＡＴＢ２００の投与は、アルグルコシダーゼアルファによる従来の処置と比較して、心臓および骨格筋（ヒラメ筋）組織における点状のグリコーゲンレベルの減少を示し、ＡＴＢ２００とのミグルスタットの共投与は、再び野生型（ＷＴ）マウスに見られるレベルに近づいていることを示した。
【０１５３】
同様に、図２２に見られるように、ミグルスタットとＡＴＢ２００との共投与は、未処置のマウスおよびアルグルコシダーゼアルファで処置したマウスと比較して、Ｇａａノックアウトマウスの四頭筋における筋線維中の空胞の数を有意に減少させた。図２３に見られるように、ＬＣ３ＩＩおよびｐ６２の両方のレベルは、野生型マウスと比較してＧａａノックアウトマウスで増加するが、ＡＴＢ２００およびミグルスタットでの処置で有意に減少し、これは酸性α−グルコシダーゼ欠乏に関連するオートファジーの増加がＡＴＢ２００およびミグルスタットの共投与で減少することを示唆している。さらに、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルは、野生型マウスと比較してＧａａノックアウトマウスにおいて増加するが、再びＡＴＢ２００およびミグルスタットでの処置で有意に低下する。酸性α−グルコシダーゼ欠乏に関連する上昇したＧＬＵＴ４およびＧＬＵＴ１レベルは、筋線維へのグルコース取り込みの増加に寄与し得、基礎および食物摂取後の両方でグリコーゲン合成の増加をもたらす。したがって、ＡＴＢ２００およびミグルスタットでの併用処置は、ポンペ病のマウスモデルにおける骨格筋の形態学および生理学を改善することが見出された。
【０１５４】
実施例１３：カニクイザルにおけるミグルスタットと共投与したＡＴＢ２００の毒性
カンボジア由来の未処置のカニクイザルを表７に示す用量群に割り当てた。動物は、１８日（雌）〜１９日（雄）にわたり実験室に順応させた。順応の最後の日に、動物の体重は２．２４３ｋｇ〜５．４１３ｋｇであり、２〜３歳であった。
【０１５５】
2019501178.tif 000018
【０１５６】
試験用量レベルは、非ヒト霊長類における以前の実験に基づいて選択され、実施例８の薬物動態モデルから予測されるような、２６０ｍｇのミグルスタットおよび２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の用量を投与したヒトにおいて予想される臨床的ＡＵＣ（それぞれおよそ２０．９ｈｒ・μｇ／ｍＬ、およびおよそ１８２２ｈｒ・μｇ／ｍＬ）と同等、またはわずかに高い（２５ｍｇ／ｋｇのミグルスタットおよび５０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００群について）、またはおよそ１０倍および３倍高い（１７５ｍｇ／ｋｇのミグルスタットおよび／または１００ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００群について）曝露（ＡＵＣ）を提供する。非ヒト霊長類における以前の研究では、１００ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００のＩＶ用量は、５３３０ｈｒ・μｇ／ｍＬのＡＵＣを生じることが判明し、１７５ｍｇ／ｋｇのミグルスタットの経口用量は、外挿して１９６ｈｒ・μｇ／ｍＬのＡＵＣを生じた。
【０１５７】
ＡＴＢ２００は、２．９２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、２０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、および０．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（製剤緩衝液）を含有する２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６中で製剤化される。試験物質（ＡＴＢ２００またはミグルスタット）およびコントロール物質／溶媒（製剤緩衝液）を、１日目に開始して８５日目に終了する１３週間、隔週に１回投与した。ＡＴＢ２００およびコントロール物質／溶媒は、０ｍｇ／ｋｇ（グループ１、コントロール物質）、５０ｍｇ／ｋｇ（グループ２）、または１００ｍｇ／ｋｇ（グループ３および５）での２時間（±１０分）静脈内（ＩＶ）注入により投与された。組み合わせて投与する場合、ミグルスタットは、ＡＴＢ２００の注入開始の３０分（±２分）前に２５ｍｇ／ｋｇ（グループ２）または１７５ｍｇ／ｋｇ（グループ３および４）の注射用滅菌水（ＵＳＰ）中で経鼻投与した。全ての群の投与量は１０ｍＬ／ｋｇであった。
【０１５８】
実験の生存段階で評価したパラメータは、体重、食物摂取、臨床観察、詳細な臨床観察、身体検査、心電図、眼科的評価、臨床病理学（血液学、凝析、血清化学）、抗薬物抗体（ＡＤＡ）評価、中和ＡＤＡ評価、尿検査、およびミグルスタットおよびＡＴＢ２００活性および総タンパク質の血漿毒性動態（ＴＫ）を含んでいた。動物の最終剖検を９９日目（最後の用量投与の１４日後）に行った。剖検では、肉眼観察および臓器重量を記録し、顕微鏡検査のために組織を採取した。
【０１５９】
全ての動物は予定された安楽死まで生存し、身体検査中、または食物摂取、臨床観察、詳細な臨床観察、体重、眼科、またはＥＣＧパラメータの評価中、ＡＴＢ２００、ミグルスタットの投与またはＡＴＢ２００およびミグルスタットの共投与に起因する変化はなかった。さらに、尿検査、血清化学、血液学、もしくは凝固パラメータにおいて、または肉眼観察、臓器重量、もしくは組織病理学の評価中、ＡＴＢ２００、ミグルスタット、またはＡＴＢ２００／ミグルスタット関連の変化はなかった。
【０１６０】
総抗薬物抗体（ＡＤＡ）および中和抗体（ＮＡｂ）
血漿中の総抗薬物抗体（ＡＤＡ）および中和抗体（ＮＡｂ）レベルを測定する。順応中、投与前（ミグルスタット投与前）ならびに１、８５、および９９日目に全ての動物からＫ２ＥＤＴＡチューブに血液試料（およそ１．６ｍＬ）を収集した。試料は処理するまで濡れた氷の上に維持した。２℃〜８℃で遠心分離して血漿を得、アリコート（およそ０．２ｍＬ）をポリプロピレンバイアルに移し、血液収集から１時間以内に−６０℃〜−８６℃で凍結保存した。ＡＤＡのための試料の分析は、グループ１、２、３および５の動物から収集した試料について行った（ミグルスタットのみの試料は分析しなかった）。中和抗体の分析は、蛍光性基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵ−Ｇｌｃ）による酵素アッセイを用いて行った。
【０１６１】
ＡＴＢ２００投与グループ（グループ２、３および５）の全ての動物は、８５日目および９９日目において抗薬物抗体（ＡＤＡ）について陽性であった（発生率１００％）。力価は８５日目に２５６００〜４０９６００、９９日目に５１２００〜８１９２００の範囲であった。ＡＴＢ２００用量レベルの増加に伴って力価が増加する明らかな傾向はなかった。グループ２（２５ｍｇ／ｋｇミグルスタットと併用した５０ｍｇ／ｋｇＡＴＢ２００）において、８匹の動物中５匹は、８５日目および９９日目に中和抗体（ＮＡｂ）陽性であった。グループ３（１７５ｍｇ／ｋｇミグルスタットと併用した１００ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００）において、８匹中２匹は８５日目にＮＡｂ陽性であり、８匹中４匹は９９日目に陽性であった。グループ５（１００ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００単剤治療）において、８匹中２匹は８５日目にＮＡｂ陽性であり、８匹中３匹は９９日目に陽性であった。ＡＴＢ２００曝露または他のＴＫパラメータに対するＡＤＡの明らかな影響はなかった。
【０１６２】
ＡＴＢ２００毒性動態
ＡＴＢ２００の毒物動態を、以下の時点において、１日目および８５日目に動物からＫ２ＥＤＴＡチューブに採取した血液試料で測定した：
グループ１、２、３、および５の場合：投与前（ミグルスタット投与前）；注入の開始から１時間；注入の開始から２時間；注入の開始から２．５時間；注入の開始から３時間；注入の開始から４時間；注入の開始から６時間；注入の開始から１２時間；注入の開始から２６時間；注入の開始から１６８時間；注入の開始から３３６時間（１５日目の投与前に収集）；および
グループ４の場合：投与前（ミグルスタット投与前）；ミグルスタットの投与後１．５時間；ミグルスタットの投与後２．５時間；ミグルスタットの投与後３．５時間；ミグルスタットの投与後４．５時間；ミグルスタットの投与後６．５時間；ミグルスタットの投与後１２．５時間；ミグルスタットの投与後２６．５時間；ミグルスタットの投与後１６８．５時間；ミグルスタットの投与後３３６．５時間（１５日目の投与前に収集）。
【０１６３】
２℃〜８℃で遠心分離して血漿を得、アリコート（およそ０．１ｍＬ）をポリプロピレンバイアルに移し、−６０℃〜−８６℃で凍結保存した。ＡＴＢ２００酸性α−グルコシダーゼ活性およびＡＴＢ２００総タンパク質の分析を、グループ１の動物からの投与後２時間の試料について、およびグループ２、３および５における動物から収集した全ての試料から行った。総ＡＴＢ２００タンパク質を、タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に連結した液体クロマトグラフィーによって測定した。２つの特徴的なペプチド（ＴＴＰＴＦＦＰＫおよびＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫ）をＡＴＢ２００の尺度として使用した。これらの２つのペプチドからの結果は一貫しており、分析した血漿試料中にインタクトなＡＴＢ２００が存在したことを示している。蛍光性基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵ−Ｇｌｃ）を用いて酸性α−グルコシダーゼ活性をアッセイした。
【０１６４】
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｈｏｅｎｉｘ、バージョン６．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、グループ２、３および５の動物からの監査／検証データセット（濃度および時間）について、毒物動態（ＴＫ）データの分析を行った。個々の対象血漿の非区画分析濃度データを用いて、ＩＶ注入後の酸性α−グルコシダーゼ活性およびＡＴＢ２００総タンパク質（２つのシグネチャーペプチド、ＴＴＰＴＦＦＰＫおよびＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫに基づく）につき、ＴＫパラメータを推定した。用量レベルは、個々の動物それぞれの用量、体重、および平均用量濃度に基づいて計算された実際のＡＴＢ２００用量（ｍｇ）として入力した。各投薬の開始時間（ＡＴＢ２００の注入開始）は、投薬レジメンにおける全てのプロファイルについてゼロに設定した。公称試料収集時間を全ての分析に使用した。ＡＴＢ２００（総タンパク質および活性アッセイデータセット）について生成された血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）は、対数線形台形ルールにより推定した。λｚを推定するために用いた回帰は、一様に重み付けされた濃度データに基づいていた。
【０１６５】
以下のパラメータを、各ＡＴＢ２００データセット（総ＡＴＢ２００アッセイにおける２つのシグネチャーペプチドおよびＡＴＢ２００活性アッセイから生成した）について計算した：
●Ｒ２−λｚαを推定するために使用される線形回帰の相関係数の二乗。濃度対時間プロファイルの最終段階（または特定の時間範囲）を定義するために設定されたポイント数が使用される場合に使用される；
●Ｒ２ａｄｊ−λｚβの推定に使用されるポイント数に合わせて調整した、λｚを推定するために使用される線形回帰の相関係数の二乗。濃度対時間プロファイルの最終段階を定義するために使用されるポイント数が可変であり得る場合に使用される；
●λｚポイント数−λｚを推定するために使用される線形回帰分析のポイント数；
●λｚα−ｔ最大値以降の最初の３つの時点での排出速度定数；
●λｚβ−末端排出速度定数；
●ｔ１／２α−ｔ最大値以降の最初の３つの時点に基づく半減期；
●ｔ１／２β−λｚに基づく末端排出半減期（０．６９３／λｚ）；
●ｔ最大値−血漿中の分析対象の最大濃度の時間；
●Ｃ最大値−血漿中の分析対象で観測される最大濃度；
●ＡＵＣ０−ｔ−時間０（前投与）から最後の測定可能な濃度を有する時点まで測定した血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）；
●ＡＵＣ０−∞−無限大時間に外挿したＡＵＣ；
●ＡＵＣｅｘｔ−時間無限大に外挿されたＡＵＣ部分は、全ＡＵＣ０−∞の％として表される；
●ＣＬＴ−総クリアランス（λｚβに基づく）；実際の体重からの総投与量（ｍｇ）に基づく；
●ＣＬＴ／Ｆ−総クリアランス（λｚβに基づく）；生物学的に利用可能な画分で割った実際の体重からの総投与量（ｍｇ）に基づく；
●Ｖｓｓ−平衡時の見かけの分布容積；
●Ｖｚ−最終段階に基づく（λｚβに基づく）分布容積；実際の体重からの総投与量（ｍｇ）に基づく；
●Ｖｚ／Ｆ−最終段階に基づく（λｚβに基づく）分布容積；生物学的に利用可能な画分で割った実際の体重からの総投与量（ｍｇ）に基づく；および
●蓄積率−ＡＲＣ最大値＝８５日目の１日目に対するＣ最大値の比率；ＡＲＡＵＣ＝８５日目の１日目に対するＣ０−ｔの比率。
【０１６６】
ＡＴＢ２００濃度およびＴＫパラメータは、雄と雌で同様であった。２５ｍｇ／ｋｇのミグルスタットと併用した５０ｍｇ／ｋｇの２時間ＩＶ  ＡＴＢ２００注入後の血漿濃度は、投与後１２〜２６時間まで測定可能であった。１００ｍｇ／ｋｇ用量レベル（１７５ｍｇ／ｋｇのミグルスタットを伴うまたは伴わない）において、ＡＴＢ２００濃度は投与後２６〜１６８時間まで測定可能であった。単回投与の毒物動態パラメータ（１日目）を表８に示す。
【０１６７】
2019501178.tif 000019
【０１６８】
反復投与の毒物動態パラメータ（８５日目）を表９に示す。
【０１６９】
2019501178.tif 000020
【０１７０】
最大ＡＴＢ２００血漿濃度（ｔ最大値）までの時間は、３つの用量群全てにおいて、投与後およそ２時間であった。１日目および８５日目のＡＴＢ２００血漿濃度およびＴＫパラメータは、総ＡＴＢ２００タンパク質アッセイによって測定したところ、２つの評価されたシグネチャーペプチド、ＴＴＰＴＦＦＰＫおよびＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫ間で一致していた。酸性α−グルコシダーゼ活性アッセイによって測定した場合、Ｃ最大値およびＡＵＣ０−ｔによって測定した曝露は比較的低かった。総タンパク質アッセイは活性酵素および不活性酵素の両方の濃度を測定するが、酸性α−グルコシダーゼ活性アッセイは活性酵素のみの濃度を測定するため、これは予想される。ＡＴＢ２００曝露は、５０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルの投与で増加した。ｔ最大値を過ぎた最初の３つの時点に基づく１日目の初期ｔ１／２α（雄と雌を合わせたもの）の平均は、１．２８〜３．０７時間の範囲であった。１日目の平均末端半減期（ｔ１／２β）は、１．７０〜１１．１時間の範囲であった（より長いｔ１／２β値は、投与後１６８時間まで測定可能な濃度を有する動物の影響を受けた）。同様の範囲の値が、８５日目の投与後に観測された。隔週に１回の反復投与では、蓄積がほとんどまたは全く観察されなかった。１００ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００用量に１７５ｍｇ／ｋｇのミグルスタットを添加すると、１００ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単剤治療と比較して、ＡＴＢ２００クリアランスが減少し、血漿曝露がおよそ２倍増加するようであった。
【０１７１】
有害な試験物質に関連する変化が確認されなかったため、カニクイザルにおけるＡＴＢ２００の有害効果が観察されないレベル（ＮＯＡＥＬ）は、ミグルスタット投与を伴いまたは伴わず、隔週で１３週間、２時間の注入により投与した場合、試験された最高用量である１００ｍｇ／ｋｇ／注入であった。この用量レベルでは、８５日目における平均の性別平均ＡＵＣ０−ｔおよびＣ最大値（総タンパク質）は、ＡＴＢ２００単独の場合、それぞれ７８３０（ＴＴＰＴＦＦＰＫ）および７７９０（ＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫ）ｈｒ・μｇ／ｍＬならびに２０２０  （ＴＴＰＴＦＦＰＫ）または２０１０（ＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫ）μｇ／ｍＬであり、１７５ｍｇ／ｋｇのミグルスタットと併用した場合、それぞれ１３９００（ＴＴＰＴＦＦＰＫ）または１３８００  （ＶＴＳＥＧＡＧＬＱＬＱＫ）  ｈｒ・μｇ／ｍＬおよび２２７０（両ペプチド）μｇ／ｍＬであった。
【０１７２】
ミグルスタット毒性動態
ミグルスタットの毒物動態を、以下の時点において、１日目および８５日目に動物からＫ２ＥＤＴＡチューブに採取した血液試料で測定した：
グループ１、２、３、および５の場合：投与前（ミグルスタット投与前）；ミグルスタットの投与後１５分；０時間（注入の開始前）；注入の開始から０．５時間；注入の開始から１時間；注入の開始から２時間；注入の開始から４時間；注入の開始から６時間；注入の開始から１２時間；注入の開始から２６時間；注入の開始から５０時間；注入の開始から７４時間；および
グループ４の場合：投与前（ミグルスタット投与前）；ミグルスタットの投与後１５分；ミグルスタットの投与後３０分；ミグルスタットの投与後１時間；ミグルスタットの投与後１．５時間；ミグルスタットの投与後２．５時間；ミグルスタットの投与後４．５時間；ミグルスタット投与後６．５時間；ミグルスタットの投与後１２．５時間後；ミグルスタットの投与後２６．５時間；ミグルスタットの投与後５０．５時間；ミグルスタットの投与後７４．５時間であった。
【０１７３】
２℃〜８℃で遠心分離して血漿を得、アリコート（およそ０．２ｍＬ）をポリプロピレンバイアルに移し、−６０℃〜−８６℃で凍結保存した。ミグルスタット濃度の分析は、Ｒｉｃｈｉｅ  Ｋｈａｎｎａ、Ａｌｌａｎ  Ｃ．Ｐｏｗｅ  Ｊｒ．、Ｙｉ  Ｌｕｎ、Ｒｅｂｅｃｃａ  Ｓｏｓｋａ、Ｊｅｓｓｉｅ  Ｆｅｎｇ、Ｒｏｈｉｎｉ  Ｄｈｕｌｉｐａｌａ、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ｆｒａｓｃｅｌｌａ、Ａｎａｄｉｎａ  Ｇａｒｃｉａ、Ｌｅｅ  Ｊ．  Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ、Ｓｕ  Ｘｕ、Ｎａｓｔｒｙ  Ｂｒｉｇｎｏｌ、Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｊ．Ｔｏｔｈ、Ｈｕｎｇ  Ｖ．Ｄｏ、Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｏｃｋｈａｒｔ、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａ．Ｗｕｓｔｍａｎ、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｊ．Ｖａｌｅｎｚａｎｏ．によってドゥボグルスタット濃度の分析について記載されているのと同様のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いて行われた。“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ＡＴ２２２０  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ａｌｐｈａ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｍｐｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ．”ＰＬＯＳ  ＯＮＥ（１  Ｊｕｌｙ  ２０１４）９（７）：ｅ１０２０９２。
【０１７４】
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）、バージョン６．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、グループ２、３および４の動物からの監査／検証データセット（濃度および時間）について、ミグルスタットの毒物動態（ＴＫ）データの分析を行った。個々の血漿濃度データの非区画分析を用いてＴＫパラメータを推定した。ミグルスタットＴＫパラメータは、対数線形台形ルールにより推定した。λｚを推定するために用いた回帰は、一様に重み付けされた濃度データに基づいていた。以下のパラメータを計算した：
●Ｒ２ａｄｊ−λｚの推定に使用されるポイント数に合わせて調整した、λｚを推定するために使用される線形回帰の相関係数の二乗。濃度対時間プロファイルの最終段階を定義するために使用されるポイント数が可変であり得る場合に使用される；
●λｚポイント数−λｚを推定するために使用される線形回帰分析のポイント数；
●λｚ−末端排出速度定数；
●ｔ１／２−λｚに基づく末端排出半減期（０．６９３／λｚ）；
●ｔ最大値−血漿中の分析対象の最大濃度の時間；
●Ｃ最大値−血漿中の分析対象で観測される最大濃度；
●ＡＵＣ０−ｔ−時間０（前投与）から最後の測定可能な濃度を有する時点まで測定した血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）；
●ＡＵＣ０−∞−無限大時間に外挿したＡＵＣ；
●ＡＵＣｅｘｔ−時間無限大に外挿されたＡＵＣ部分は、全ＡＵＣ０−∞の％として表される；
●ＣＬＴ／Ｆ−実際の体重からの総投与量（ｍｇ）に基づく生物学的に利用可能な画分で割った総クリアランス；
●Ｖｚ／Ｆ−実際の体重からの総投与量（ｍｇ）に基づく生物学的に利用可能な画分で割った最終段階に基づく分布容積；
●蓄積率−ＡＲＣ最大値＝８５日目の１日目に対するＣ最大値の比率；およびＡＲＡＵＣ＝８５日目の１日目に対するＣ０−ｔの比率。
【０１７５】
ミグルスタットＴＫパラメータにつき、性別による一貫した影響はなかった。５０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００または１７５ｍｇ／ｋｇのＮＧ投与（１００ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００を伴うまたは伴わない）と併用した２５ｍｇ／ｋｇの経鼻胃（ＮＧ）投与後のミグルスタット血漿濃度は、７４．５時間（最後に測定された時点）まで測定可能であった。単回投与（１日目）および反復投与（８５日目）の毒物動態パラメータを表１０に示す。
【０１７６】
2019501178.tif 000021
【０１７７】
ｔ最大値は、投与後およそ２〜４時間の範囲であった。ミグルスタット曝露は、２５〜１７５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで増加した。平均ｔ１／２（雄と雌とを合わせたもの）は、１日目と８５日目で一致し、６．６６〜８．２３時間の範囲であった。隔週に１回の反復ＮＧ投与では、蓄積がほとんどまたは全く観察されなかった。全体的なミグルスタット曝露（すなわち、ＡＵＣ０−ｔ）またはＴＫパラメータにＡＴＢ２００共投与の観察可能な効果はなかった。
【０１７８】
有害な試験物質に関連する変化が確認されなかったため、カニクイザルにおけるミグルスタットの有害効果が観察されないレベル（ＮＯＡＥＬ）は、ＡＴＢ２００投与を伴いまたは伴わず、隔週で１３週間経鼻胃投与した場合、試験された最高用量である１７５ｍｇ／ｋｇ／用量であった。この用量レベルでは、８５日目における平均の性別平均ＡＵＣ０−ｔおよびＣ最大値は、ミグルスタット単独の場合、それぞれ２０４０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬおよび１４７００ｎｇ／ｍＬであり、１００ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と併用した場合、それぞれ２１６０００ｈｒ・ｎｇ／ｍＬおよび２２０００ｎｇ／ｍＬであった。
【０１７９】
実施例１４：組換え酸性α−グルコシダーゼ（ＡＴＢ２００）の単独投与、およびミグルスタットとの共投与に関する臨床実験のプロトコル
実験設計：
これは、静脈内（ＩＶ）組換え酸性α−グルコシダーゼ（ＡＴＢ２００、凍結乾燥粉末を注射用滅菌水で再構成し、０．９％塩化ナトリウムで注射用に希釈した）単独および経口ミグルスタット（ハードゼラチンカプセル、６５ｍｇ）と共投与した場合の安全性、忍容性、および薬物動態（ＰＫ）を評価するための、非盲検、固定配列、用量漸増、ヒト初回投与実験である。実験は２つのステージで実施される。ステージ１では、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの３つの投薬期間で、およそ４時間の静脈内注入として２週間ごとに投与されるＡＴＢ２００の逐次単回漸増投与後、安全性、忍容性およびＰＫを評価する。ステージ２では、安全性、忍容性、およびＰＫが、以下の単回および複数回の漸増用量の組み合わせ後に評価される：２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００を１３０ｍｇのミグルスタット（６５ｍｇのカプセル剤２つ）と２週間毎に共投与し、ミグルスタットは、３用量について、ＡＴＢ２００のおよそ４時間の静脈内注入の１時間前に経口摂取し、次いで、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００を２６０ｍｇのミグルスタット（６５ｍｇのカプセル剤４つ）と共投与し、ミグルスタットは、３用量について、ＡＴＢ２００のおよそ４時間の静脈内注入の１時間前に経口摂取する。
【０１８０】
ポンペ病に罹患した１２人の酵素補充療法（ＥＲＴ）経験対象（およそ歩行可能６人、歩行不能６人）がステージ１に登録される。これら同一の対象は、ステージ２で実験を続行する。歩行不能対象が登録される前に、少なくとも４人の歩行可能対象が登録され、投与される。ＥＲＴ経験（歩行可能）対象は、登録前の２〜６年間ＥＲＴを受けたことがあり、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）で少なくとも２００メートル歩くことができ、予測正常値の３０〜８０％のＦＶＣを有する。ＥＲＴ経験（歩行不能）対象は、完全に車椅子生活で、補助なしでの歩行ができず、登録の２年以上前からＥＲＴを受けている者と定義される。処置の割り当てを表１１に示す。
【０１８１】
2019501178.tif 000022
【０１８２】
対象は、少なくともミグルスタット経口投与前２時間および投与後２時間、絶食する必要がある。ＡＴＢ２００のＩＶ注入は、ミグルスタットの経口投与の１時間後に開始しなければならない。
【０１８３】
実験手順
この実験は、スクリーニング、ベースライン、ステージ１（３期間、固定シーケンス、ＡＴＢ２００のみの単回漸増用量）、およびステージ２（２期間、固定シーケンス、ミグルスタットの複数漸増用量と共投与した２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の複数回用量）からなる。
【０１８４】
スクリーニング：
全ての対象はインフォームドコンセントを提供し、適格基準のレビューを受ける。全ての対象の評価には、過去の注入関連反応（ｌＡＲ）および転倒歴を含む病歴；先行薬および併用薬および非薬物療法のレビュー；バイタルサイン（心拍数［ＨＲ］、呼吸数［ＲＲ］、血圧［ＢＰ］、および温度）；身長；体重；総合的な身体検査（ＰＥ）；１２誘導心電図（ＥＣＧ）；臨床安全性試験評価（血清化学、血液学、および尿検査）；尿妊娠検査；ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）の尿試料；およびＧＡＡ遺伝子型判定（スクリーニング時にＧＡＡ遺伝子型判定報告を提供できない対象について）が含まれる。免疫原性の試験的評価（全抗体および中和抗体、試験的サイトカイン／免疫系活性化の他のバイオマーカー、アルグルコシダーゼアルファとの交差反応性、および免疫グロブリンＥ［ＩｇＥ］）のため、血液試料も採取される。参加基準の全てを満たし、除外基準のいずれも満たさない対象は、表１１に記載されるようにステージ１に割り当てられる。
【０１８５】
ベースライン：
全ての対象の安全性評価には、適格基準のレビュー；注入関連反応（ｌＡＲ）および転倒歴、有害事象（ＡＥ）および重篤なＡＥ（ＳＡＥ）の問診、先行薬および併用薬および非薬物療法のレビュー；バイタルサイン（ＨＲ、ＲＲ、ＢＰ、および温度）；体重；概要ＰＥ；ＥＣＧ；Ｒａｓｃｈ−ｂｕｉｌｔポンペ特異的活性（Ｒ−ＰＡｃｔ）スケール；ロッテルダムハンディキャップスケール；および疲労重症度スケール；臨床安全性試験評価（血清化学、血液学、および尿検査）；尿妊娠検査；薬力学的（ＰＤ）評価（Ｈｅｘ４およびクレアチニンホスホキナーゼ［ＣＰＫ］）；免疫原性評価（全抗体および中和抗体、アルグルコシダーゼアルファとの抗体交差反応性、試験的サイトカインおよび免疫系活性化の他のバイオマーカー、アルグルコシダーゼアルファへの交差反応性、および必要に応じてＩｇＥ）；肺機能試験（ＰＦＴ）；運動機能試験；および全ての対象の筋力試験が含まれる。
【０１８６】
ステージ１、期間１、２および３：
このステージは以下を含む：
●安全性：重篤有害事象（ＳＡＥ）およびＩＡＲを含むＡＥのレビュー；併用薬および非薬物療法のレビュー；バイタルサイン（ＨＲ、ＲＲ、ＢＰ、および温度）；重量；概要ＰＥ；ＥＣＧ；臨床安全性試験評価（血清化学、血液学、および尿検査）；および尿妊娠検査
●ＰＤ：尿中Ｈｅｘ４および血清ＣＰＫ
●免疫学：抗組換え酸性α−グルコシダーゼ抗体力価（抗組換え酸性α−グルコシダーゼ全抗体および中和抗体価ならびにアルグルコシダーゼアルファとの抗体交差反応性）のための血液試料および炎症促進性サイトカインおよび他の免疫系活性化バイオマーカーの測定のための血液試料。必要に応じて、ＩｇＥ測定も行われる。
●連続２４時間薬物動態（ＰＫ）：期間１（訪問３、１日目）、期間２（訪問４、１５日目）、および期間３（訪問５、２９日目）中、血漿酸性α−グルコシダーゼ活性レベルおよび総酸性α−グルコシダーゼタンパク質濃度のための血液試料を、全ての対象についてとる。
【０１８７】
ステージ２、期間４および５：
●安全性：ＳＡＥおよびＩＡＲを含むＡＥのレビュー；併用薬および非薬物療法のレビュー；バイタルサイン（ＨＲ、ＲＲ、ＢＰ、および温度）；重量；ＰＥ；ＥＣＧ；臨床安全性試験評価（血清化学、血液学、および尿検査）；および尿妊娠検査
●ＰＤ：尿中Ｈｅｘ４および血清ＣＰＫ
●免疫学：抗組換え酸性α−グルコシダーゼ抗体力価（抗組換え酸性α−グルコシダーゼ全抗体および中和抗体価ならびにアルグルコシダーゼアルファとの抗体交差反応性）のための血液試料および炎症促進性サイトカインおよび他の免疫系活性化バイオマーカーの測定のための血液試料。必要に応じて、ＩｇＥ測定も行われる。
●連続２４時間ＰＫ：期間４（訪問６、４３日目および訪問８、７１日目）、および期間５（訪問９、８５日目および訪問１１、１１３日目）中、血漿酸性α−グルコシダーゼ活性レベル、総酸性α−グルコシダーゼタンパク質濃度およびミグルスタット濃度のための血液試料を、全ての対象についてとる。
【０１８８】
薬物動態段階の終了：
●安全性：ＳＡＥおよびＩＡＲを含むＡＥのレビュー；併用薬および非薬物療法のレビュー；バイタルサイン（ＨＲ、ＲＲ、ＢＰ、および温度）；重量；ＰＥ；ＥＣＧ；臨床安全性試験評価（血清化学、血液学、および尿検査）；および尿妊娠検査
●ＰＤ：尿中Ｈｅｘ４および血清ＣＰＫ
●免疫学：抗組換え酸性α−グルコシダーゼ抗体力価（抗組換え酸性α−グルコシダーゼ全抗体および中和抗体価ならびにアルグルコシダーゼアルファとの抗体交差反応性）のための血液試料および炎症促進性サイトカインおよび他の免疫系活性化バイオマーカーの測定のための血液試料。必要に応じて、ＩｇＥ測定も行われる。
【０１８９】
実験から早期離脱した対象は、早期終了の訪問のために来て、ＰＫ訪問の終了時に実施されるべき評価の全てを受ける。被験薬は投与されない。センチネル対象のうちのいずれかが実験から早期離脱する場合、その対象は実験に登録された次の歩行可能対象で置き換えられる（例えば、対象１が離脱した場合、対象３［歩行可能］はその対象をセンチネル対象として置き換える）。
【０１９０】
この実験を完了した対象および／または他の適格な対象には、長期の延長実験に参加する機会が与えられ、ミグルスタットと共投与されるＡＴＢ２００の安全性および忍容性について引き続き評価される。さらに、ポンペ病に関連する機能評価は、延長実験において定期的に実施される。
【０１９１】
安全モニタリング
安全性は、メディカルモニターおよび研究者によって継続的に、かつＳａｆｅｔｙ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＳＳＣ）によって定期的にモニタリングされる。
【０１９２】
センチネル投与
この実験における最初の２人の歩行可能対象は、実験のセンチネル対象となり、実験の各期間（期間１〜５）において投与される最初の２人の対象となる。センチネル対象が実験から早期離脱する場合、その対象は別の歩行可能対象に置き換えられる。注：歩行不能対象に投与する前に少なくとも４人の歩行可能対象に５ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００を投与する。
【０１９３】
ステージ１（期間１、２および３）では、対象にＡＴＢ２００の単回漸増用量（５ｍｇ／ｋｇ［期間１］、１０ｍｇ／ｋｇ［期間２］、および２０ｍｇ／ｋｇ［期間３］）を投与する。
【０１９４】
ステージ１での各実験期間の２人のセンチネル対象の投与後、入手可能な安全性データ（ＰＥ、バイタルサイン、ＡＥ、注入反応、ＥＣＧ、および入手可能な局所的に実施された実験室試験）の評価は、メディカルモニターと研究者によって２４〜４８時間以内に行われる。ＳＳＣは、各用量レベルで両方のセンチネル対象ついて中央安全性試験データが入手可能であるときに、正式な安全性レビューのために開催される。ＳＳＣが、その期間に割り当てられた用量での投与を妨げる安全性の懸念がないと判断した場合、１０人の追加対象が登録され、投与される。ＳＳＣはまた、全ての対象について３ステージ１用量レベル全てにおける安全性データ（中央試験安全性データを含む）が入手可能であるときに、安全性レビューのために開催される。
【０１９５】
ステージ２（期間４および５）では、２人のセンチネル対象に投与され、ステージ１の各期間についてと同様に、初回投与後に安全性が評価される。ＳＳＣが、１３０ｍｇのミグルスタットと共投与される２０ｍｇ／ｋｇでのＡＴＢ２００（期間４）、または２６０ｍｇのミグルスタットと共投与される２０ｍｇ／ｋｇでのＡＴＢ２００（期間５）の追加投与を妨げる安全性の懸念がないと判断した場合、１０人の追加対象は、その期間に割り当てられた用量で３回の隔週投与を受ける。ＳＳＣは、ステージ２の終了時に全ての対象について全ての安全性データ（中央安全性試験データを含む）が入手可能であるときに再び開催される。ＳＳＣは、ＳＡＥまたは安全性の懸念が特定されている場合にも臨機応変に開催される。
【０１９６】
ＳＳＣは、次のいずれかのレビューを推奨する場合がある：
●変更なしに実験を続行する
●変更（補正）して実験を続行する
●一時的な投与の休止
●永久的な投薬の停止。
【０１９７】
ＳＳＣの意見でセンチネル対象に継続した実験投与を妨げ得るＡＥまたは安全性の懸念がない場合、残りの対象全てについてその用量レベルで投与を続ける。対象の安全性は、メディカルモニターおよび実験研究者によって継続的に、かつＳＳＣによって定期的に、継続して密接にモニタリングされる。
【０１９８】
対象数（予定）：
ポンペ病に罹患した１２人の成人のＥＲＴ経験対象（およそ歩行可能６人、歩行不能６人）がステージ１に登録される。これら同一の対象は、ステージ２で実験を続行する。
【０１９９】
診断および適格基準：
スクリーニング訪問において、ポンペ病に罹患した成人のＥＲＴ経験対象は、下記概要の適格基準を用いて評価される。各対象は、参加基準の全てを満たさなければならず、除外基準のいずれも満たしてはならない。参加／除外基準の免除は認められない。
【０２００】
参加基準
ＥＲＴ経験対象（歩行可能）
１．１８歳以上６５歳以下の男性および女性の対象；
２．対象は、実験関連手順前にインフォームドコンセントに署名しなければならない；
３．妊娠可能性のある対象は、実験中および最後のＡＴＢ２００＋ミグルスタット共投与後の３０日間、医学的に認められた避妊方法を使用することに同意しなければならない；
４．対象が、実証された酸性α−グルコシダーゼ酵素活性の欠乏に基づき、またはＧＡＡ遺伝子型判定よってポンペ病の診断を有する；
５．対象が、過去２〜６年でアルグルコシダーゼアルファを用いたＥＲＴを受けたことがある；
６．対象が、現在隔週に１回の頻度でアルグルコシダーゼアルファを受けている；
７．対象が、投与中断を生じる薬物関連有害事象なしに最後２回の注入を受けて完了した；
８．対象は、６ＭＷＴで２００〜５００メートル歩けなければならない；および
９．直立努力性肺活量（ＦＶＣ）は、予測正常値の３０％〜８０％でなければならない。
ＥＲＴ経験対象（歩行不能）
１０．１８歳以上６５歳以下の男性および女性の対象；
１１．対象は、実験関連手順前にインフォームドコンセントに署名しなければならない；
１２．妊娠可能性のある対象は、実験中および最後のＡＴＢ２００＋ミグルスタット共投与後の３０日間、医学的に認められた避妊方法を使用することに同意しなければならない；
１３．対象が、実証された酸性α−グルコシダーゼ酵素活性の欠乏に基づき、またはＧＡＡ遺伝子型判定よってポンペ病の診断を有する；
１４．対象が、アルグルコシダーゼアルファを用いたＥＲＴを２年以上受けたことがある；
１５．対象が、現在隔週に１回の頻度でアルグルコシダーゼアルファを受けている；
１６．対象が、投与中断を生じる薬物関連有害事象なしに最後２回の注入を受けて完了した；および
１７．対象が、完全に車椅子生活であり、補助なしで歩行することができない。
【０２０１】
除外基準
ＥＲＴ経験対象（歩行可能）
１．対象が、ベースライン訪問前３０日以内に、アルグルコシダーゼアルファ以外のポンペ病の治験を受けたことがある、または実験中に受けることが予想される；
２．対象が、ベースライン訪問前３０日以内に、禁止薬物（ミグリトール（例えば、Ｇｌｙｓｅｔ（登録商標）））；ミグルスタット（例えば、Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標））；アカルボース（例えば、Ｐｒｅｃｏｓｅ（登録商標）、Ｇｌｕｃｏｂａｙ（登録商標））；ボグリボース（例えば、Ｖｏｌｉｘ（登録商標）、Ｖｏｃａｒｂ（登録商標）、およびＶｏｌｉｂｏ（登録商標））；アルブテロールおよびクレンブテロール；または任意の治験薬／実験薬）での処置を受けたことがある；
３．対象が、女性の場合、スクリーニング時に妊娠中または授乳中である；
４．対象が、男女問わず、実験中に子供を授かる予定である。
５．対象が侵襲的換気補助を要する。
６．対象が、覚醒時に６時間以上の非侵襲的な換気補助を使用する；
７．対象が、研究者の意見において、対象に過度の安全性リスクをもたらすか、またはプロトコル要求事項を遵守する能力を損なう可能性のある、医学的または他の斟酌すべき条件または状況を有する；
８．対象がアルグルコシダーゼアルファに対するアナフィラキシーの病歴を有する；
９．対象が、高持続性の抗組換え酸性α−グルコシダーゼ抗体力価の病歴を有する；
１０．対象が、ミグルスタットまたは他のイミノ糖に対するアレルギーまたは過敏症の病歴を有する；
１１．対象が、ループス、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、または関節リウマチの既往歴を有する；および
１２．対象が気管支喘息の既往歴を有する。
ＥＲＴ経験対象（歩行不能）
１３．対象が、ベースライン訪問前３０日以内に、アルグルコシダーゼアルファ以外のポンペ病の治験を受けたことがある、または実験中に受けることが予想される；
１４．対象が、ベースライン訪問前３０日以内に、禁止薬物（ミグリトール（例えば、Ｇｌｙｓｅｔ（登録商標）））；ミグルスタット（例えば、Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標））；アカルボース（例えば、Ｐｒｅｃｏｓｅ（登録商標）、Ｇｌｕｃｏｂａｙ（登録商標））；ボグリボース（例えば、Ｖｏｌｉｘ（登録商標）、Ｖｏｃａｒｂ（登録商標）、およびＶｏｌｉｂｏ（登録商標））；アルブテロールおよびクレンブテロール；または任意の治験薬／実験薬）での処置を受けたことがある；
１５．対象が、女性の場合、スクリーニング時に妊娠中または授乳中である；
１６．対象が、男女問わず、実験中に子供を授かる予定である；
１７．対象が、研究者の意見において、対象に過度の安全性リスクをもたらすか、またはプロトコル要求事項を遵守する能力を損なう可能性のある、医学的または他の斟酌すべき条件または状況を有する；
１８．対象がアルグルコシダーゼアルファに対するアナフィラキシーの病歴を有する；
１９．対象が、高持続性の抗組換え酸性α−グルコシダーゼ抗体力価の病歴を有する；
２０．対象が、ミグルスタットまたは他のイミノ糖に対するアレルギーまたは過敏症の病歴を有する；
２１．対象が、ループス、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、または関節リウマチの既往歴を有する；および
２２．対象が気管支喘息の既往歴を有する。
【０２０２】
治験薬、投与量、および投与様式：
ステージ１（２週間間隔で３回の投与期間からなる）
●期間１：５ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の単回ＩＶ注入；
●期間２：期間１を完了した全ての対象に１０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の単回ＩＶ注入；および
●期間３：期間２を完了した全ての対象に２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の単回ＩＶ注入。
ステージ２（２つの投薬期間からなり、それぞれ３週間の被験薬用量を含み、２週間間隔である）
●期間４：期間３（２週間ごとに反復して合計３回の投与）を完了した全ての対象に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の単回ＩＶ注入の１時間前に１３０ｍｇのミグルスタットを経口投与する；および
●期間５：期間４（２週間ごとに反復して合計３回の投与）を完了した全てのＥＲＴ経験対象に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の単回ＩＶ注入の１時間前に２６０ｍｇのミグルスタットを経口投与する。
注：対象は、経口ミグルスタットの投与前２時間前および投与後２時間、絶食する必要がある。
実験の全期間：２２週間まで（４週間までのスクリーニング期間、次いでおよそ１８週間の実験処置［ステージ１および２］）
単回投与ＰＫ観察期間（ステージ１、期間１、２および３）：６週間
複数回投与ＰＫ観察期間（ステージ２、期間４および５）：１２週間
安全性、忍容性、および免疫原性の観察期間（期間１、２、３、４および５）：１８週間。
【０２０３】
評価基準：
プライマリ：
安全性評価：
●ＰＥ
●体温、ＲＲ、ＨＲ、およびＢＰを含むバイタルサイン
●ＩＡＲを含むＡＥ
●１２誘導ＥＣＧ
●臨床安全性試験評価：血清化学、血液学および尿検査。
【０２０４】
血漿ＡＴＢ２００およびミグルスタットのＰＫ：
●血漿酸性α−グルコシダーゼ活性レベルおよび総酸性α−グルコシダーゼタンパク質濃度ＰＫパラメータ：最大観測血漿濃度（Ｃ最大値）、最大観測血漿濃度に達する時間（ｔ最大値）、時間０から最後の測定可能濃度までの血漿−薬物濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、時間０から無限大へ外挿した血漿−薬物濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）、半減期（ｔ１／２）、およびＩＶ投与後の総クリアランス（ＣＬＴ）
●全ての投与レジメンについて、血漿酸性α−グルコシダーゼ活性および総酸性α−グルコシダーゼタンパク質Ｃ最大値およびＡＵＣ０−∞の割合
●血漿ミグルスタットＰＫパラメータ：Ｃ最大値、ｔ最大値、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−∞およびｔ１／２、経口投与後の薬物の見かけの総クリアランス（ＣＬＴ／Ｆ）および各用量レベルにつき経口投与後の最終段階の分布容積（Ｖｚ／Ｆ）
●各用量レベルにおける血漿ミグルスタットＣ最大値およびＡＵＣ０−∞の比。
【０２０５】
機能評価（ベースライン時に実施）
歩行可能対象の場合
●運動機能試験
●６分間歩行試験（６ＭＷＴ）
●１０メートル歩行テスト
●歩行、階段、ガウワー、椅子のスコア
●タイムアップアンドゴー（ＴＵＧ）
●上肢および下肢の筋力試験（医学実験基準［ＭＲＣ］およびハンドヘルドダイナモメーター）
●ＰＦＴ（ＦＶＣ、ＭＩＰ、ＭＥＰ、およびＳＮＩＰ）
歩行不能対象の場合
●筋力試験  −  上肢のみ
●上肢のみで実施のＭＲＣおよび手持ち式ダイナモメーター
●肺機能試験（ＰＦＴ）（努力性肺活量［ＦＶＣ］、最大吸気圧［ＭＩＰ］、最大呼気圧［ＭＥＰ］、鼻吸気圧［ＳＮＩＰ］）。
【０２０６】
患者報告の結果（ベースライン時に実施）
●疲労重症度スケール
●ロッテルダムハンディキャップスケール
●Ｒａｓｃｈ−ｂｕｉｌｔポンペ特異的活性（Ｒ−ＰＡｃｔ）。
【０２０７】
診査
●抗ＡＴＢ２００抗体価（全抗体および中和抗体）
●抗組換え酸性α−グルコシダーゼ抗体のアルグルコシダーゼアルファに対する交差反応性
●炎症促進性サイトカインおよび免疫系活性化の他のバイオマーカー
●ＰＤマーカー（Ｈｅｘ４およびＣＰＫ）。
【０２０８】
分析方法：
統計的方法：
ＰＫパラメータに関する記述統計が提供される。概括統計量は、ＰＫパラメータではない全ての変数に対して提供される。５、１０および２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独での酸性α−グルコシダーゼ活性および総酸性α−グルコシダーゼタンパク質曝露（Ｃ最大値、ＡＵＣ０−ｔ、およびＡＵＣ０−∞）割合について用量比例評価。２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独対２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋１３０ｍｇのミグルスタット、対２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋２６０ｍｇのミグルスタットの、酸性α−グルコシダーゼ活性のＡＮＯＶＡおよび総酸性α−グルコシダーゼタンパク質曝露（Ｃ最大値、ＡＵＣ０−ｔおよびＡＵＣ０−∞）比。２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋１３０ｍｇのミグルスタットおよび２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋２６０ｍｇのミグルスタットについて、酸性α−グルコシダーゼ活性のＡＮＯＶＡおよび歩行可能対象および歩行不能対象間の総酸性α−グルコシダーゼタンパク質曝露（Ｃ最大値、ＡＵＣ０−ｔおよびＡＵＣ０−∞）比。各対象集団内および全体での１３０ｍｇ〜２６０ｍｇのミグルスタットの曝露割合（Ｃ最大値、ＡＵＣ０−ｔおよびＡＵＣ０−∞）に対する用量比例評価。ＰＫ、ＰＤ、および安全性に対する免疫原性結果の影響が評価される。
【０２０９】
中間分析：
少なくとも５０％（ｎ＝６）の対象が実験のステージ２を完了したときに、中間解析が行われる。この実験では、２つまでの追加的な中間分析を行ってもよい。
【０２１０】
最初のＰＫ結果：
対象のＧＡＡ活性およびＧＡＡ総タンパク質のＰＫ概要をそれぞれ表１２および１３に示す。
【０２１１】
表１２〜１５および図２４〜２６において、ミグルスタットおよびＡＴＢ２００の単回投与後に単回投与（ＳＤ）測定を行い、ミグルスタットおよびＡＴＢ２００の３回目の隔週投与後に複数回投与（ＭＤ）測定を行った。
【０２１２】
2019501178.tif 000023
【０２１３】
2019501178.tif 000024
【０２１４】
図２４Ａは、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の投与後の平均血漿ＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを示す。図２４Ｂはまた、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇＡＴＢ２００の投与後の平均血漿ＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを提供するが、血漿ＧＡＡ活性は対数スケールで表示される。図２４Ａ〜２４Ｂおよび表１２から分かるように、ＡＴＢ２００は、血漿ＧＡＡ活性について、用量比例的な曝露よりわずかに大きいことを実証した。
【０２１５】
図２４Ｃは、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独、ならびに２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇまたは２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の平均血漿ＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを示す。図２４Ｄはまた、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独、１３０ｍｇのミグルスタットを伴う場合、または２６０ｍｇのミグルスタット伴う場合の投与後の平均血漿ＧＡＡ活性を提供するが、血漿ＧＡＡ活性は対数スケールで表示される。
【０２１６】
図２５Ａは、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００の投与後の平均血漿ＧＡＡ総タンパク質の濃度−時間プロファイルを示す。図２５Ｂはまた、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇＡＴＢ２００の投与後の平均血漿ＧＡＡ総タンパク質の濃度−時間プロファイルを提供するが、血漿ＧＡＡ総タンパク質は対数スケールで表示される。図２５Ａ〜２５Ｂおよび表１３から分かるように、ＡＴＢ２００は、血漿ＧＡＡ総タンパク質について、用量比例的な曝露よりわずかに大きいことを実証した。
【０２１７】
図２５Ｃは、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、および２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の平均血漿ＧＡＡ総タンパク質の濃度−時間プロファイルを示す。図２５Ｄはまた、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独、１３０ｍｇのミグルスタットを伴う場合、または２６０ｍｇのミグルスタット伴う場合の投与後の平均血漿ＧＡＡ総タンパク質を提供するが、血漿ＧＡＡ総タンパク質は対数スケールで表示される。
【０２１８】
表１３に示すように、ミグルスタットの共投与は、単独で投与されたＡＴＢ２００と比較して総ＧＡＡタンパク質血漿半減期をおよそ３０％増加させた。分布容積は、全ての処置について３．５〜５．７Ｌの範囲であり、これはＡＴＢ２００のグリコシル化がＡＴＢ２００の組織への効率的な分布を可能にすることを示唆している。
【０２１９】
ミグルスタットのＰＫ概要を表１４に示す。
【０２２０】
2019501178.tif 000025
【０２２１】
図２６は、１３０ｍｇまたは２６０ｍｇのミグルスタットを投与した後のヒト対象における血漿中のミグルスタットの濃度−時間プロファイルを示す。
【０２２２】
表１４および図２６から分かるように、ＡＴＢ２００注入の１時間前に経口投与した血漿ミグルスタットは、注入２時間でピーク濃度に達し、用量比例動態を実証した。
【０２２３】
部分ＡＵＣを決定するために、ＧＡＡ活性および総タンパク質の血漿濃度曲線の様々な部分について分析を行った。表１５は、ＧＡＡ活性および総タンパク質について０〜ｔ最大値、ｔ最大値〜６ｈ、ｔ最大値〜１０ｈ、ｔ最大値〜１２ｈ、およびｔ最大値〜２４ｈｒからの部分ＡＵＣの概要を提供する。
【０２２４】
2019501178.tif 000026
【０２２５】
表１５から分かるように、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独に対する２０ｍｇ／ｋｇ＋ミグルスタットのｐＡＵＣｔ最大値−２４ｈのＧＡＡ活性平均増加率は、１３０ｍｇ  ＳＤ、１３０ｍｇ  ＭＤおよび２６０ｍｇ  ＳＤについてそれぞれ２１．４％、１７．８％、４０．２％であった。
【０２２６】
同様に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独に対する２０ｍｇ／ｋｇ＋ミグルスタットのｐＡＵＣｔ最大値−２４ｈのＧＡＡ総タンパク質平均増加率は、１３０ｍｇ  ＳＤ、１３０ｍｇ  ＭＤおよび２６０ｍｇ  ＳＤについてそれぞれ１２．５％、１６．４％、３７．５％であった。
【０２２７】
したがって、部分ＡＵＣ分析は、ミグルスタットの共投与が、ＡＴＢ２００の最終段階部分ＡＵＣ（ｔ最大値−２４ｈ）を、１３０ｍｇ用量のミグルスタットについておよそ１５％、２６０ｍｇミグルスタットについておよそ４０％、有意に増加させることを実証する。
【０２２８】
初期バイオマーカーの結果
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを、ルミザイム（登録商標）からＡＴＢ２００へ切り替えたヒト患者においてモニタリングした。患者はＡＴＢ２００（５、１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量を受け、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与を受けた。高レベルのＣＰＫ酵素は、筋肉組織、心臓、または脳への損傷またはストレスを示し得る。上昇したＡＬＴおよびＡＳＴは、それぞれポンペ病による肝臓および筋肉の損傷のマーカーである。ＡＬＴ、ＡＳＴおよびＣＰＫレベルの初期分析を図３８〜４１に示す。
【０２２９】
図３８〜４１から分かるように、２人の患者は、３つのバイオマーカー全てにおいて改善への早期の傾向を示し、２人の患者は安定したままであった。１人の患者は、ＣＰＫ、ＡＳＴおよびＡＬＴにおいて、それぞれ４４％、２８％および３４％の減少を示した。別の患者は、ＣＰＫ、ＡＳＴおよびＡＬＴにおいて、それぞれ３１％、２２％および１１％の減少を示した。
【０２３０】
これまでのところ、重篤な有害事象（ＳＡＥｓ）はなかった。ＡＥは一般に軽度かつ一時的であった。登録された全ての患者に１００回以上注入した後の日付において、注入関連の反応はなかった。全ての患者はベースライン時に抗ｒｈＧＡＡ抗体を有し、一般に安定していた。サイトカインは、注入中、低く安定したままであった。
【０２３１】
実施例１５：野生型およびポンペ線維芽細胞におけるＧＡＡおよびＬＡＭＰ１レベル
免疫蛍光顕微鏡法は、共通のスプライシング変異を有する野生型線維芽細胞およびポンペ線維芽細胞におけるＧＡＡおよびＬＡＭＰ１レベルを検出するために利用された。図２７に示すように、ＧＡＡは、野生型線維芽細胞の別個のリソソーム区画にある。図２７はまた、ポンペ線維芽細胞における豊富なＧＡＡシグナルを示し、ポンペ線維芽細胞におけるＧＡＡシグナルおよびＬＡＭＰ１シグナルの両方が、遠位リソソームよりもＥＲおよびゴルジに局在しているようである。これは、ポンペ線維芽細胞におけるＧＡＡタンパク質輸送が変化した証拠である。
【０２３２】
実施例１６：Ｇａａノックアウトマウスにおける細胞機能障害および筋肉機能の改善
ＧＡＡ欠乏によるリソソームグリコーゲン異化作用の障害は、蓄積されたグリコーゲンで満たされた膜結合細胞内区画の顕著で持続的なオートファジーならびに増殖および蓄積によって証明されるように、実質的な細胞機能不全を引き起こすことが示されている（Ｎ．Ｒａｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）。本発明者らの免疫組織学的データは、ジストロフィン、α−およびβ−ジストログリカン、様々なサルコグリカンならびにジストロフィン糖タンパク質複合体を含む他のものなどの筋膜の安定性に不可欠ないくつかの重要なタンパク質、およびジスフェリンなどの筋肉修復に関与するタンパク質を含む、多くのタンパク質についてタンパク質輸送が有意に変化していることを示している。これらの重要な筋肉タンパク質は、それらが機能する筋肉細胞膜への適切なタンパク質輸送を必要とする。図２８に示すように、本発明者らの免疫組織学的データは、ポンペ病のＧａａノックアウト（ＫＯ）マウスモデルの筋肉において、これらの重要な筋肉タンパク質のかなりの部分が細胞内局在を有することを明らかにする。これらのデータは、これらの重要な筋肉タンパク質の誤った輸送が疑似筋肉ジストロフィーを誘発し、最終的には筋肉の衰弱および喪失に至ることを示唆している。
【０２３３】
アルグルコシダーゼアルファ（ミオザイム（登録商標））ならびに１０ｍｇ／ｋｇのミグルスタットを伴うおよび伴わないＡＴＢ２００を、隔週の投与スケジュールにより、同等のＥＲＴ用量（２０ｍｇ／ｋｇ）で、ＧａａＫＯマウスで評価した。２回の投与後、溶媒処置マウスと比較して、アルグルコシダーゼアルファは、骨格筋における蓄積リソソームグリコーゲンを穏やかに減少させ（図３２Ａ〜３２Ｃ）、オートファジー（図３０Ａ〜３０Ｂ）またはリソソーム増殖（図２９Ａ〜２９Ｂ）の低減につき無視できる程度の効果を有していた。対照的に、実質的により良好なリソソームグリコーゲンクリアランスが、同じ条件下、ＡＴＢ２００／ミグルスタットで観察された（図３２Ａ〜３２Ｄ）。ＡＴＢ２００／ミグルスタットは、十分に確立されたオートファジーバイオマーカーである、低減したＬＣ３  ＩＩレベル（図３０Ａ〜３０Ｂ）により、ならびに公知の常在性リソソーム膜タンパク質であるＬＡＭＰ１（図２９Ａ〜２９Ｂ）および筋肉修復に関与する公知の細胞表面タンパク質であるジスフェリン（図３１Ａ〜３１Ｂ）で染色された、蓄積された細胞内小胞のクリアランスにより証明されるように、全体的な筋肉の生理学を改善するようである。さらに、ＡＴＢ２００／ミグルスタットは、野生型マウスの筋線維に似た筋肉構造を有意に改善した。
【０２３４】
また、図２９〜３２は、２つの異なるバッチのＡＴＢ２００（初期および後期世代の製造プロセス）が同等の結果を生じたことを示している。図３２Ａ〜３２Ｄにおいて、＊は、ミオザイム（登録商標）単独と比較して統計的に有意であることを示す。
【０２３５】
実施例１７：Ｇａａノックアウトマウスにおける筋肉機能
１２回の隔週投与の長期実験では、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋１０ｍｇ／ｋｇのミグルスタットは、握力およびワイヤハング試験（図３３Ａ〜３３Ｂ）の両方によって測定されたベースラインからＧａａＫＯマウスの機能的筋力を進行的に増加させた。同一のＥＲＴ用量（２０ｍｇ／ｋｇ）を受けたアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））処置マウスは、実験の大部分を通して同一条件下で低下することが観察された（図３３Ａ〜３３Ｂ）。短期実験と同様に、ＡＴＢ２００／ミグルスタットは、アルグルコシダーゼアルファよりも処置の３ヶ月後（図３４Ａ〜３４Ｃ）および６ヶ月後（図３４Ｄ〜Ｇ）に実質的により良好なグリコーゲンクリアランスを有していた。ＡＴＢ２００／ミグルスタットはまた、アルグルコシダーゼアルファと比較して、３ヶ月の処置後、オートファジーおよびＬＡＭＰ１およびジスフェリンの細胞内蓄積を減少させた（図３５）。図３３Ａにおいて、＊は、ルミザイム単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、両側ｔ検定）。図３４Ａ〜３４Ｇにおいて、＊は、ルミザイム（登録商標）単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ分析の下でＤｕｎｎｅｔｔの方法を用いた多重比較）。
【０２３６】
まとめると、これらのデータは、ＡＴＢ２００／ミグルスタットが効率的に筋肉を標的とし、細胞機能障害を逆行させ、筋肉機能を改善したことを示す。重要なことに、筋肉構造の明らかな改善ならびにＬＡＭＰ１およびジスフェリンのオートファジーおよび細胞内蓄積の減少は、機能的筋力の改善と相関する改善された筋肉生理学のための良い代替となり得る。これらの結果は、臨床実験における筋肉生検から有用なバイオマーカーであると判明する可能性のあるＧａａＫＯマウスにおけるポンペ病の治療的処置の効果を評価するために、オートファジーおよびこれらの重要な筋肉タンパク質のモニタリングが合理的で実用的な方法であることを示唆している。
【０２３７】
図４０は、ミグルスタットを伴うまたは伴わない６ヶ月のＡＴＢ２００投与が、ＧａａＫＯマウスにおけるジストロフィンの細胞内蓄積を低下させることを示す。ＡＴＢ２００±ミグルスタットについて、ルミザイム（登録商標）よりもジストロフィンの蓄積が大幅に減少した。
【０２３８】
実施例１８：ＧａａノックアウトマウスにおけるＡＴＢ２００に対するシアル酸含有量の影響
異なるシアル酸含有量を有するＡＴＢ２００の２つのバッチを、ＧａａＫＯマウスにおける薬物動態および有効性について評価した。表１６に２つのバッチの特性の概要を示す。
【０２３９】
2019501178.tif 000027
【０２４０】
表１６から分かるように、バッチＢは、バッチＡよりも高いシアル酸含有量を有したが、バッチＡよりもわずかに低いＭ６Ｐ含有量を有した。
【０２４１】
図３６は、ＡＴＢ２００の単回ＩＶボーラス投与後のＧａａＫＯマウスにおける血漿中のＧＡＡ活性の濃度−時間プロファイルを示す。バッチＡおよびＢの半減期を以下の表１７に示す。
【０２４２】
2019501178.tif 000028
【０２４３】
表１７から分かるように、バッチＢはバッチＡよりも半減期が短い。半減期の減少はわずかであったが、この半減期の減少は統計学的に有意であった（両面ｔ検定おいてｐ＜０．０５）。
【０２４４】
関連する実験では、ＡＴＢ２００（バッチＡおよびＢ）およびルミザイム（登録商標）のＩＶボーラス尾静脈注射を、隔週で合計２回の注射についてＧａａＫＯマウスに与えた。最後の投与の１４日後、組織中のグリコーゲンレベルを測定した。図３７Ａ〜図３７Ｄに示すように、バッチＢは、同様の用量でグリコーゲンを減少させることにおいてバッチＡよりも一般により有効であった。バッチＡおよびバッチＢは、いずれもグリコーゲンの低減においてルミザイム（登録商標）より優れていた。図３７Ａ〜図３７Ｄにおいて、＊は、ルミザイム（登録商標）と比較して統計的に有意であることを示し（ｐ＜０．０５、ｔ検定）、＾は、同じ用量でのバッチＡとバッチＢとの統計的に有意な比較を示す（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【０２４５】
本明細書に記載の実施形態は、本発明の組成物および方法を例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に全体として一致し、当業者に容易に明らかである様々な改変形態および変更形態が含まれることが意図される。添付の特許請求の範囲は、実施例に記載された特定の実施形態によって限定されるべきではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【０２４６】
特許、特許出願、刊行物、製品説明、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号およびプロトコルは、本出願を通して引用され、これらの開示は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019501178.tif 000029
【図２Ａ】
2019501178.tif 000030
【図２Ｂ】
2019501178.tif 000031
【図３】
2019501178.tif 000032
【図４Ａ】
2019501178.tif 000033
【図４Ｂ】
2019501178.tif 000034
【図５Ａ】
2019501178.tif 000035
【図５Ｂ】
2019501178.tif 000036
【図６】
2019501178.tif 000037
【図７】
2019501178.tif 000038
【図８Ａ】
2019501178.tif 000039
【図８Ｂ】
2019501178.tif 000040
【図８Ｃ】
2019501178.tif 000041
【図８Ｄ】
2019501178.tif 000042
【図８Ｅ】
2019501178.tif 000043
【図８Ｆ】
2019501178.tif 000044
【図８Ｇ】
2019501178.tif 000045
【図８Ｈ】
2019501178.tif 000046
【図９Ａ】
2019501178.tif 000047
【図９Ｂ】
2019501178.tif 000048
【図１０Ａ】
2019501178.tif 000049
【図１０Ｂ】
2019501178.tif 000050
【図１０Ｃ】
2019501178.tif 000051
【図１１】
2019501178.tif 000052
【図１２】
2019501178.tif 000053
【図１３Ａ】
2019501178.tif 000054
【図１３Ｂ】
2019501178.tif 000055
【図１４】
2019501178.tif 000056
【図１５】
2019501178.tif 000057
【図１６Ａ】
2019501178.tif 000058
【図１６Ｂ】
2019501178.tif 000059
【図１６Ｃ】
2019501178.tif 000060
【図１７】
2019501178.tif 000061
【図１８】
2019501178.tif 000062
【図１９】
2019501178.tif 000063
【図２０】
2019501178.tif 000064
【図２１】
2019501178.tif 000065
【図２２】
2019501178.tif 000066
【図２３】
2019501178.tif 000067
【図２４Ａ】
2019501178.tif 000068
【図２４Ｂ】
2019501178.tif 000069
【図２４Ｃ】
2019501178.tif 000070
【図２４Ｄ】
2019501178.tif 000071
【図２５Ａ】
2019501178.tif 000072
【図２５Ｂ】
2019501178.tif 000073
【図２５Ｃ】
2019501178.tif 000074
【図２５Ｄ】
2019501178.tif 000075
【図２６】
2019501178.tif 000076
【図２７】
2019501178.tif 000077
【図２８】
2019501178.tif 000078
【図２９Ａ】
2019501178.tif 000079
【図２９Ｂ】
2019501178.tif 000080
【図３０Ａ】
2019501178.tif 000081
【図３０Ｂ】
2019501178.tif 000082
【図３１Ａ】
2019501178.tif 000083
【図３１Ｂ】
2019501178.tif 000084
【図３２Ａ】
2019501178.tif 000085
【図３２Ｂ】
2019501178.tif 000086
【図３２Ｃ】
2019501178.tif 000087
【図３２Ｄ】
2019501178.tif 000088
【図３３Ａ】
2019501178.tif 000089
【図３３Ｂ】
2019501178.tif 000090
【図３４Ａ】
2019501178.tif 000091
【図３４Ｂ】
2019501178.tif 000092
【図３４Ｃ】
2019501178.tif 000093
【図３４Ｄ】
2019501178.tif 000094
【図３４Ｅ】
2019501178.tif 000095
【図３４Ｆ】
2019501178.tif 000096
【図３４Ｇ】
2019501178.tif 000097
【図３５】
2019501178.tif 000098
【図３６】
2019501178.tif 000099
【図３７Ａ】
2019501178.tif 000100
【図３７Ｂ】
2019501178.tif 000101
【図３７Ｃ】
2019501178.tif 000102
【図３７Ｄ】
2019501178.tif 000103
【図３８】
2019501178.tif 000104
【図３９】
2019501178.tif 000105
【図４０】
2019501178.tif 000106
【図４１】
2019501178.tif 000107
【図４２】
2019501178.tif 000108
【配列表】
2019501178000001.app
【国際調査報告】
2019501178.tif 000109
2019501178.tif 000110
2019501178.tif 000111