(57)【要約】  本発明は、ＧＡＡ遺伝子のｃ．５４６突然変異の存在下で利用されるｃ．５４６＋１８４の潜在スプライス部位の近傍の領域を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物を含む。かかるオリゴヌクレオチドはポンペ病の治療に使用しうる。また、化合物を必要とする者へのかかる化合物の投与を含むポンペ病の治療方法も特許請求される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ５４６Ｇ＞Ｔ突然変異に対する天然潜在スプライス部位の近傍の領域を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物であって、前記潜在スプライスがＧＡＡ遺伝子のｃ．５４６＋１８４に位置し、より特定的には配列番号１を標的とし、より特定的には配列番号２〜９０から選択される配列を標的とし、さらにより特定的には配列番号２及び５〜２３から選択される配列を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項２】
配列番号１に結合可能である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項３】
非天然化学骨格、好ましくは、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、モルホリノ、ペプチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴマー、トリシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ホスホロチオエート、２’Ｏ−Ｍｅ−ホスホロチオエート、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択されるものを含む、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項４】
１０から４０ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴマー化合物が、配列番号９１〜１７９からなる群から選択される配列を有し、任意のチミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）と交換されていてもよく、より特定的には前記配列が配列番号９１〜１１１から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項６】
配列番号９１〜１７９に対して少なくとも８０％の同一性を有し、より特定的には前記配列が配列番号９１〜１１１から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項７】
前記オリゴマー化合物が、配列番号９１〜１７９からなる群から選択される配列のヌクレオチドアナログを含み、より特定的には前記配列が配列番号９１〜１１１から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項８】
ポンペ病、より特定的には患者がｃ．５４６突然変異を有するポンペ病の治療に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー化合物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
送達剤をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＧＡＡ遺伝子の核酸配列、特定的には配列番号１に結合可能な化合物、より好ましくは配列番号２〜９０の配列のいずれかに結合可能な化合物。
【請求項１２】
ポンペ病の患者、より特定的には患者がｃ．５４６突然変異を有するポンペ病の患者の治療方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー化合物又は請求項９若しくは１０に記載の医薬組成物の投与を含む、治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポンペ病の治療に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、ＧＡＡ遺伝子のプレｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートする方法及びポンペ病の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
酸性マルターゼ欠損症又はＩＩ型グリコーゲン貯蔵病としても知られるポンペ病は、体全体にわたり筋肉及び神経細胞に損傷を与える常染色体劣性代謝障害である。それはリソソーム酸性α−グルコシダーゼ酵素の欠損に起因してリソソームにグリコーゲンが蓄積することにより引き起こされる。グリコーゲンが蓄積すると体全体にわたり進行性筋力低下（筋症）が起こり、各種生体組織、とくに心臓、骨格筋、肝臓、及び神経系が影響を受ける。
【０００３】
ポンペ病では、リソソームヒドロラーゼである酸性マルターゼとしても知られるタンパク質の酸性α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０）が欠損する。このタンパク質は、通常はグリコーゲン、マルトース、及びイソマルトースのα−１，４結合及びα−１，６結合を分解し細胞グリコーゲンの１〜３％の分解に必要とされる酵素である。この酵素の欠損の結果として、罹患者のリソソーム及び細胞質に通常構造のグリコーゲンが蓄積する。リソソーム内に過剰のグリコーゲンが貯蔵すると他のオルガネラの通常機能が妨害され細胞傷害が起こるおそれがある。欠損タンパク質は、１７ｑ２５．２−２５．３（塩基対ｃｈｒ１７：８０，１０１，５２６対８０，１１９，８８２ビルドＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にある１７番染色体の長腕上のＧＡＡ遺伝子の突然変異により引き起こされる選択的スプライシングの結果である。この遺伝子は約２０ｋｂに及び、最初のエクソンを非コードとして２０個のエクソンを含有する。
【０００４】
４６０を超えるＧＡＡ突然変異が記載されてきたが（http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html）、ごく少数のスプライシング突然変異が特徴付けられているにすぎない。ＧＡＡ酵素活性を完全に抑止する重度の突然変異では、肥大型心筋症、全身性骨格筋力低下、及び呼吸不全を伴う古典的乳児病経過を辿り、１．５年以内の生存年数で死に至る。より軽度の突然変異では、部分的ＧＡＡ酵素活性が残存し、より軽度の表現型で小児期から成人期までのさまざまな時期に発症する。一般的には、初代線維芽細胞のより高い残存酵素活性はポンペ病の後期発症に関連する。組換えヒトＧＡＡタンパク質を２週間ごとに静脈内投与する酵素補充療法（ＥＲＴ）がポンペ病に対して開発されてきた。この治療では、古典的乳児患者の生命の救済及び後期発症患者の疾患進行の遅延が可能であるが、効果は不均一である。
【０００５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマー化合物）は、スプライシングをモジュレートする能力に関して臨床試験で現在試験中である。古典的例は、デュシェンヌ筋ジストロフィー（の治療）である。この疾患では、ある特定のエクソンに突然変異ホットスポットが存在する。アンチセンスオリゴマー化合物を用いて、突然変異エクソンがスキップされ、突然変異がバイパスされる。この結果、依然として部分的に機能するわずかに短いタンパク質が得られる。アンチセンスオリゴマー化合物を関連スプライス部位に標的化しなければならないことは明らかであるので、アンチセンスオリゴマー化合物を用いてエクソンスキッピングを誘導することは容易である。表皮水疱症（国際公開第２０１３０５３８１９号）及びレーバー先天性黒内障症状（国際公開第２０１２１６８４３５号）でも、アンチセンスオリゴヌクレオチドがエクソンスキッピングに使用される。
【０００６】
しかしながら、ポンペ病の非常に一般的な突然変異、いわゆるＩＶＳ１突然変異では、かかるストラテジーは機能しない。ＩＶＳ１突然変異は、エクソン２のスキッピングを引き起こしてカノニカル翻訳開始側の欠失をもたらすとともに、ナンセンス媒介崩壊を招いてタンパク質の転写を行わなくする。ポンペ病のＩＶＳ１突然変異に対してアンチセンス療法を機能させるためには、エクソンインクルージョン即ちエクソンスキッピングとは正反対の作用を誘導する必要がある。しかしながら、確実に予測することができないスプライシングリプレッサー配列を標的とすることに依拠するので、エクソンインクルージョンを誘導するのは非常に難しい。スプライシングリプレッサー配列は、遺伝子のどこにでもエクソン（エクソンスプライシングサイレンサー若しくはＥＳＳと称される）にもイントロン（イントロンスプライシングサイレンサー若しくはＩＳＳと称される）にも存在しうるとともに、突然変異の近傍若しくは遠隔にあるかもしれないし又は影響を受けるスプライス部位の近傍若しくは遠隔にあるかもしれない。
【０００７】
他の突然変異ｃ．５４６Ｇ＞Ｔは、アジアの患者で一般的なサイレント突然変異であり、且つ異常スプライシングを引き起こすことが知られる（Maimaiti, et al., 2009）。Maimaiti et al.にまた、Hermans et al.で帰属された他の突然変異５４６Ｇ＞Ａが記載されている。さらなる変異５４６Ｇ＞Ｃは、Gort et al.に記載されている。これらの研究から、この酵素の野生型スプライシングがリークしやすくそのｍＲＮＡ発現が低減されることが分かった。しかしながら、異常スプライシングを引き起こす因子やスプライス部位は、解明されなかった。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的遺伝子のスプライシングをモジュレート可能ないくつかのアンチセンス化合物が報告されてきたが（たとえば、国際公開第２０１５／１９０９２２号）、とくにｃ．５４６突然変異に対してＧＡＡ遺伝子のスプライシングをモジュレートしうる化合物を同定する必要性が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、とくに突然変異ｃ．５４６Ｇ＞Ｔにより引き起こされるポンペ病の治療のために、ＧＡＡの野生型スプライシングを回復可能なアンチセンス化合物を提供することである。本発明の他の目的は、ヒト疾患の天然潜在スプライス部位の利用を同定してからそれを用いてその利用を防止するＡＯＮを設計し（突然変異により弱められた）カノニカルスプライス部位をスプライシング機構が利用できるようにすることである。本発明のさらに他の目的は、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ突然変異に起因する潜在スプライシングを標的としうるアンチセンス化合物を提供することである。本発明はこうした目的の１つ以上を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
一態様では、本発明は、ＧＡＡ遺伝子のｃ５４６Ｇ＞Ｔ突然変異に起因して使用される天然潜在スプライス部位の周りの領域、より特定的には配列番号１の配列、より特定的には配列番号２〜９０から選択される配列、さらにより特定的には配列番号２及び５〜２３から選択される配列を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物を含む。
【００１１】
特定的な実施形態では、本発明は、好ましくはホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、モルホリノ、ペプチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴマー、トリシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ホスホロチオエート、２’Ｏ−Ｍｅ−ホスホロチオエート、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される非天然化学骨格を含む本発明に係るアンチセンスオリゴマー化合物を含む。
【００１２】
さらなる実施形態では、本発明に係る前記アンチセンスオリゴマー化合物は、１０から４０ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含む。
【００１３】
より特定的には、本発明に係るアンチセンスオリゴマー化合物は、任意のチミン（Ｔ）残基をウラシル（Ｕ）と交換しうる配列番号９１〜１７９からなる群の配列から選択される配列を有する。本発明の他の実施形態では、本発明に係るアンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号９１〜１７９のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有する。さらなる実施形態では、本発明に係るアンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号９１〜１７９からなる群から選択される配列のアナログである。好ましくは、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号９１〜１１１から選択されるか、それらに対して少なくとも８０％の同一性を有するか、又はそれらから選択される配列のアナログである。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、ポンペ病の治療に使用するための本発明に係るアンチセンスオリゴマー化合物に関する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係るアンチセンスオリゴマー化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記医薬組成物は送達剤をさらに含む。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、ＧＡＡ遺伝子のゲノム核酸配列に結合可能で且つ配列番号１に標的化された、より好ましくは配列番号２〜９０の配列の１つ以上さらにより特定的には配列番号２及び５〜２３から選択される配列に標的化された化合物を含む。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係るアンチセンスオリゴマー化合物又は本発明に係る医薬組成物の投与を含むポンペ病患者の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】Ａ）すべてのＧＡＡエクソンのフランキングエクソンＲＴ−ＰＣＲ。これから健常対照者由来細胞に存在していないエクソン２の２つの異常スプライス産物（３６及び３７）が明らかにされた（Bergsma et al., Hum. Mutat. 36(1):57-68, 2015）。
【図１Ｂ】Ｂ）配列解析では、ｃ．４８６の潜在スプライスアクセプター部位の利用を介するエクソン２の完全スキップとして産物３７及びエクソン２の部分スキップとして産物３６を同定した。産物３５は、エクソン２の野生型スプライシングを示した。
【図１Ｃ】Ｃ）コードエクソン２〜２０のエクソン−インターナルＲＴ−ｑＰＣＲ。
【図１Ｄ】Ｄ）シクロヘキシミドで細胞を処理した後のすべてのＧＡＡエクソンのフランキングエクソンＲＴ−ＰＣＲ。
【図１Ｅ】Ｅ）産物３８は、イントロン２リテンション及びｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の利用を示した。産物３９は、ｃ．１７９８Ｃ＞Ｇ対立遺伝子に由来する野生型エクソン２スプライシングを示した。同一異常スプライシングがエクソン３の増幅から検出された。産物４０は、イントロン２の同一部分リテンションを有する産物３８のカウンターパートであり、産物４１は、野生型エクソン３スプライシングを示す。
【図１Ｆ】Ｆ）ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体に関連するエクソン２のスプライスドナー部位のスプライス予測。
【図１Ｇ】Ｇ）ｃ．５４６＋１８４に同定された潜在スプライスドナーを標的とするＡＯＮイントロン２（配列番号１０６）を設計した。ＡＯＮの配列が示されている。ｃ．５４６＋１８４の周りの領域のスプライス予測と共にゲノム領域も示される。
【図１Ｈ】Ｈ）未処理、エンドポーター処理のみ、又はエンドポーター＋ＡＯＮイントロン２（配列番号１０６）処理のいずれかの患者４由来初代線維芽細胞のＧＡＡ酵素活性。データは、モックトランスフェクションを基準にして表され、３回の生物学的レプリケートの平均±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＝０.００１）。
【図２Ａ】Ａ）産物３８のスプライス接合のシーケンシング解析。
【図２Ｂ】Ｂ）産物４０及び４０’の解析。産物４０’は、ＰＣＲサンプルを急冷したときは目に見えるが徐冷したときは消失することから、二次構造の形成を示唆する。
【図２Ｃ】Ｃ）Ａｌａｍｕｔを用いたｃ．５４６＋１８４に存在する天然潜在スプライス部位を含有する領域のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測。
【図３】Ａ）ＧＡＡ遺伝子のエクソン１とエクソン３との間の領域を表す略画図。ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体の存在下で利用される潜在スプライスドナー部位（ｃ．５４６＋１８４）を取り囲む領域が拡大されている。左側に示される５つのアルゴリズムのうち４つは、図１Ｅに示される我々の実験結果に一致するこのスプライスドナー（５’）部位の存在を予測可能であることが、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測の結果から示される。標的領域（矢印で示される配列番号１）の境界を決定するために５つのＡＯＮを作製した。Ｂ）作製したＡＯＮの配列及び対応する配列番号が示される。Ｃ）（Ｂ）に示されるＡＯＮのトランスフェクション後のｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体を有するポンペ病患者由来の初代線維芽細胞のＧＡＡ酵素活性。活性は、４ＭＵ活性アッセイで測定されるモックトランスフェクションを基準にする。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
アンチセンス技術を裏付ける原理は、標的核酸にハイブリダイズするアンチセンス化合物が転写、スプライシング、翻訳などの遺伝子発現活性をモジュレートすることにある。こうした配列特異性のおかげで、アンチセンス化合物は、標的検証及び遺伝子機能付与のツールとしてさらには疾患に関与する遺伝子発現又は遺伝子産物を選択的にモジュレートする治療剤としてきわめて魅力的なものとなる。
【００２０】
いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは、翻訳前に転写物から切除される「イントロン」として知られる１つ以上の領域を含有する。残留する（したがって翻訳される）領域は、「エクソン」として知られ、スプライスにより一体化されて連続ｍＲＮＡ配列を形成するので、エクソンが連結された部位にエクソン−エクソン接合をもたらす。エクソン−エクソン接合を標的とすることは、異常レベルの正常スプライス産物が疾患に関与する状況又は異常レベルの異常スプライス産物が疾患に関与する状況に有用でありうる。また、スプライス部位即ちイントロン−エクソン接合又はエクソン−イントロン接合を標的とすることは、異常スプライシングが疾患に関与する状況又は特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関与する状況にとくに有用でありうる。再構成又は欠失に起因する異常融合接合もまた、好適な標的である。異なる遺伝子源由来の２つ（又はそれ以上）のｍＲＮＡのスプライシングプロセスにより産生されるｍＲＮＡ転写物は、「融合転写物」として知られ、好適な標的でもある。また、たとえばＤＮＡ又はプレｍＲＮＡに標的化されたアンチセンス化合物を用いてイントロンに効果的に標的化しうることが知られている。ＲＮアーゼＨ機序を介して機能するオリゴヌクレオチド化合物などの一本鎖アンチセンス化合物は、プレｍＲＮＡを標的とするのに有効である。占有ベースの機序を介して機能するアンチセンス化合物は、たとえばｍＲＮＡのＲＮアーゼＨ切断を誘発しないがｍＲＮＡをインタクトな状態のまま所望のスプライス産物の収率を向上させるので、スプライシングをリダイレクトするのに有効である。
【００２１】
また、ＤＮＡの同一ゲノム領域から代替ＲＮＡ転写物を産生可能であることも当技術分野で知られている。こうした代替転写物は、「代替スプライス転写物」として一般に知られる。これらは、同一ゲノムＤＮＡから産生される他の転写物と開始位置又は停止位置のいずれかが異なりイントロン配列及びエクソン配列の両方を含有する同一ゲノムＤＮＡから産生される転写物である。１つ以上のエクソン領域若しくはイントロン領域又はそれらの一部がスプライシング時に切除されると、プレｍＲＮＡ転写物はより小さなｍＲＮＡ転写物を産生する。したがって、ｍＲＮＡ代替スプライス転写物は、プロセシングを受けたプレｍＲＮＡ転写物であり、各ユニークプレｍＲＮＡ転写物は、スプライシングの結果として常にユニークｍＲＮＡ転写物を産生するはずである。プレｍＲＮＡ転写物のスプライシングが行われなければ、プレｍＲＮＡ転写物はｍＲＮＡ転写物と同一である。
【００２２】
また、転写を開始又は停止する代替シグナルを用いてかかる代替スプライス転写物を産生可能であること並びにプレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡが２つ以上の開始コドン又は停止コドンを有しうることも当技術分野で知られている。代替開始コドンを用いたプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡに由来する代替スプライス転写物は、そのプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「代替開始転写物」として知られる。代替停止コドンを用いたそうした転写物は、そのプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「代替停止転写物」として知られる。代替停止転写物の特異的タイプの１つは、産生される複数の転写物が転写機構による「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替選択から生じる「ポリＡ転写物」であり、それによりユニークポリＡ部位を末端に有する転写物を産生する。また、転写を開始又は停止する代替シグナルを用いてかかる代替スプライス転写物を産生可能であること並びにプレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡが２つ以上の開始コドン又は停止コドンを有しうることも当技術分野で知られている。代替開始コドンを用いたプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡに由来する代替スプライス転写物は、そのプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「代替開始転写物」として知られる。代替停止コドンを用いたそうした転写物は、そのプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「代替停止転写物」として知られる。代替停止転写物の特異的タイプの１つは、産生される複数の転写物が転写機構による「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替選択から生じる「ポリＡ転写物」であり、それによりユニークポリＡ部位を末端に有する転写物を産生する。本明細書で用いられる場合、「アンチセンス機序」とは、化合物と標的核酸とのハイブリダイゼーションを含み、ハイブリダイゼーションの結果又は効果が、たとえば転写又はスプライシングを含む細胞機構のストーリングを伴う標的分解又は標的占有のいずれかであるものすべてある。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「to comprise（〜を含む）」とは、その非限定的な意味で用いられ、その単語に続くアイテムを含むが特定的に挙げられていないアイテムを除外するものではないことを意味する。そのほか、動詞の「to consist（〜からなる）」は、「to consist essentially of（〜から本質的になる）」で置き換えうる。つまり、本明細書に定義される化合物又は補助化合物は、主題の発明のユニークな特徴を変化させない追加の成分であれば特定的に明記された以外の追加の成分を含みうる。本明細書で用いられる場合、「include（〜を含む）」及び「comprise（〜を含む）」という用語は同義的に用いられる。
【００２４】
冠詞の「a」及び「an」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の１つ以上（即ち少なくとも１つ）を意味するものとして用いられる。代替物の使用（たとえば「or（又は）」）は、代替物の１つ、全部、又はそれらの任意の組合せのいずれかを意味するものと理解すべきである。
【００２５】
「個体」、「患者」、及び「被験者」という用語は、本明細書では同義的に用いられ、哺乳動物とくに霊長動物、好ましくはヒトを意味する。
【００２６】
「エクソン」という用語は、ｍＲＮＡの成熟形に存在する遺伝子の一部を意味する。エクソンは、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）即ちタンパク質をコードする配列さらには５’及び３’ＵＴＲ（非翻訳領域）を含む。ＵＴＲはタンパク質の翻訳に重要である。ＤＮＡ配列のエクソンの予測にアルゴリズム及びコンピュータープログラムを利用可能である（Grail、Grail2、及びGenscan、並びにエクソン−イントロン接合の決定に関しては米国特許出願公開第２００４０２１９５２２号）。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「タンパク質コードエクソン」という用語は、タンパク質（又はタンパク質の一部）をコード（少なくとも部分的にコード）するエクソンを意味する。ｍＲＮＡの最初のタンパク質コードエクソンは、開始コドンを含有するエクソンである。ｍＲＮＡの最後のタンパク質コードエクソンは、停止コドンを含有するエクソンである。開始コドン及び停止コドンは、当技術分野での周知の任意の数のプログラムを用いて予測可能である。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「内部エクソン」という用語は、その５’末端及び３’末端の両方に他のエクソンがフランキングするエクソンを意味する。ｎ個のエクソンを含むｍＲＮＡでは、エクソン２からエクソン（ｎ−１）は内部エクソンである。本明細書では、ｍＲＮＡの最初及び最後のエクソンを「外部エクソン」という。
【００２９】
「天然潜在スプライス部位」又は「天然偽スプライス部位」とは、プレｍＲＮＡスプライシングに通常は使用されないがカノニカルスプライシングが弱まったときに利用されうる部位のことである。それはイントロン又はエクソンのいずれにも位置しうる。「誘導スプライス部位」という用語は、（誘導）突然変異による変化の結果としてプレｍＲＮＡスプライシングに使用される新規スプライス部位を生じたＲＮＡ配列を意味する。「天然偽エクソン」又は「天然潜在エクソン」という用語は、スプライシング時にエクソンとして機能しうるとともにプレｍＲＮＡのイントロン領域に位置するプレｍＲＮＡの領域を意味する。天然偽エクソンは、正常健常細胞では利用されないが遺伝子の突然変異を有する疾患細胞では利用される。天然潜在スプライス部位の強度は、かかる突然変異の存在又は不在に通常は影響を受けないが、いくつかの場合には、その予測強度は、近接突然変異に起因して変化しうる。
【００３０】
「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されない遺伝子の部分を意味し、それはゲノムＤＮＡ及びプレｍＲＮＡに存在するが成熟ｍＲＮＡの形成時に除去される。
【００３１】
「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」という用語は、ゲノムＤＮＡから転写されたタンパク質合成用コード配列を有するＲＮＡを意味する。プレｍＲＮＡ（前駆体ｍＲＮＡ）はゲノムＤＮＡから転写される。真核生物では、プレｍＲＮＡはプロセシングを受けてｍＲＮＡとなる。これにはイントロンの除去即ち「スプライシング」と５’末端及び３’末端の修飾（たとえばポリアデニル化）とが含まれる。ｍＲＮＡは、典型的には、５’→３’方向に５’キャップ（修飾グアニンヌクレオチド）、５’ＵＴＲ（非翻訳領域）、コード配列（開始コドンで始まり停止コドンで終わる）、３’ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）テールを含む。
【００３２】
「核酸配列」又は「核酸分子」又は「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、同義的に用いられ、一本鎖若しくは二本鎖の形態のＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子（又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの非天然変異体）を意味する。「単離された核酸配列」とは、もはや単離される前の天然環境にはない、たとえば、細胞内の核酸配列ではない核酸配列を意味する。
【００３３】
核酸分子の「突然変異」とは、野生型配列と比較したときの１つ以上のヌクレオチドの変化、たとえば、１つ以上のヌクレオチドの交換、欠失、又は挿入による変化のことである。「点突然変異」とは、単一ヌクレオチドの交換又は単一ヌクレオチドの挿入若しくは欠失のことである。
【００３４】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバル又はローカルなアライメントアルゴリズムを用いて２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアライメントを行うことにより決定可能である。その際、たとえば、プログラムGAP若しくはBESTFIT又はEmbossプログラム「Needle」（デフォルトパラメーター使用、以下参照）により最適アライメントを行って少なくともある特定の最小限の配列同一性パーセント（以下にさらに定義される）を共有した場合、配列は「実質的に同一である」又は「本質的に類似している」といいうる。これらのプログラムでは、ニードルマン・ブンシュグローバルアライメントアルゴリズムが使用され、マッチ数を最大化するとともにギャップ数を最小化するように２つの配列の全長にわたるアライメントが行われる。一般に、ギャップ生成ペナルティー＝１０及びギャップ伸長ペナルティー＝０．５（ヌクレオチド及びタンパク質のアライメントの両方）のデフォルトパラメーターが使用される。ヌクレオチド用デフォルトスコア行列はDNAFULLであり、タンパク質用デフォルトスコア行列はBlosum62である（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915- 10919）。配列のアライメント及び配列同一性パーセントのスコアは、たとえば、EMBOSS（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）などのコンピュータープログラムを用いて決定しうる。代替的に、配列の類似性又は同一性は、FASTA、BLASTなどのデータベース検索により決定しうるが、ヒットは、配列同一性を比較するためにペアワイズに検索及びアライメントを行うべきである。配列同一性パーセントが少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又はそれ以上、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、又はそれ以上である場合（デフォルトパラメーター、即ち、ギャップ生成ペナルティー＝１０、ギャップ伸長ペナルティー＝０．５を用いて、スコア行列として核酸用DNAFULL、タンパク質用Blosum62を用いて、Emboss「needle」により決定したとき）、２つのタンパク質又は２つのタンパク質ドメイン又は２つの核酸配列は、「きわめて均一」であるか又は「実質的配列同一性」を有する。かかる配列は、本明細書では「相同配列」、たとえば、アンチセンスオリゴマー化合物の他の変異体又はホモログともいう。実質的配列同一性を有する配列は、必ずしも同一の長さを有するとは限らず長さが異なりうることを理解すべきである。たとえば、同一のヌクレオチド配列を有するが３’側及び／又は５’側に追加のヌクレオチドを有する配列は、共有配列部に関する限り１００％同一である。
【００３５】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、当業者には容易に分かることであろうがプローブ配列及び標的配列の性質に依存する適切なストリンジェンシー条件における核酸のハイブリダイゼーションを意味するものとして一般に用いられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は当技術分野で周知であり、インキュベーション時間、温度、及び／又は溶液のイオン強度を変化させることによる所望のストリンジェンシーに依存する条件の調整は容易に達成される。たとえば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照されたい。条件の選択は、ハイブリダイズされる配列の長さとくにプローブ配列の長さ、核酸の相対Ｇ−Ｃ含有率、及び許容されるミスマッチ量により決定される。より低い相補度を有する鎖間の部分ハイブリダイゼーションが望まれる場合、低ストリンジェンシー条件が有利である。完全又はほぼ完全な相補性が望まれる場合、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高ストリンジェンシー条件では、ハイブリダイゼーション溶液は、６×Ｓ．Ｓ．Ｃ．、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、及び０．５％ＳＯＳを含有する。ハイブリダイゼーションは、クローンＤＮＡの断片では約６８℃で約３〜４時間及び全真核細胞ＤＮＡでは約１２〜約１６時間行われる。より低いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーションの温度は、二本鎖の融解温度（ＴＭ）よりも約４２℃低い温度に低下させる。ＴＭは、Ｇ−Ｃ含有率及び二本鎖の長ささらには溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００３６】
「対立遺伝子」という用語は、特定の遺伝子座における遺伝子の１つ以上の代替形態のいずれかを意味し、対立遺伝子はすべて、特異的遺伝子座において１つの形質又は特徴に関連する。相同染色体対の各染色体上には１つの対立遺伝子が存在する。これらは遺伝子の同一対立遺伝子（ホモ接合）又は２つの異なる対立遺伝子（ヘテロ接合）でありうる。
【００３７】
「突然変異対立遺伝子」とは、本明細書では、野生型対立遺伝子と比較して配列（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はゲノムの配列）に１つ以上の突然変異を含む対立遺伝子を意味する。かかる突然変異（たとえば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、反転、欠失、及び／又は交換）は、たとえば、タンパク質がトランケートされたり又はアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が欠失、挿入、若しくは交換されたりするなどが原因で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／若しくはｉｎ  ｖｉｖｏの機能性が低減された（機能低下）コードタンパク質又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／若しくはｉｎ  ｖｉｖｏの機能性がない（機能喪失）コードタンパク質をもたらしうる。かかる変化は、異なるコンフォメーションを有するタンパク質、異なる細胞下の区画に標的化されたタンパク質、触媒ドメインが改変されたタンパク質、核酸又はタンパク質への結合活性が改変されたタンパク質などをもたらしうるとともに、異なるスプライシングイベントももたらしうる。
【００３８】
遺伝子配列又はヌクレオチド配列又はアンチセンスオリゴマー化合物の「断片」とは、それらの分子の任意のサブセット、たとえば、より短いポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３９】
「ＡＯＮ誘導体」とは、アンチセンスオリゴマー化合物又はその断片に実質的に類似した分子、たとえば、１つ以上の置換ヌクレオチドを有するが特定の遺伝子にハイブリダイズする能力を維持するヌクレオチド置換変異体を意味する。好ましくは、ＡＯＮ誘導体は本発明により同定される突然変異を含む。誘導体はまた、より長い配列を含みうる。
【００４０】
「analogue（アナログ）」又は「analog（アナログ）」とは、全分子、その誘導体又は断片のいずれかに実質的に類似した非天然分子又はそれらに関連する機能を発揮する非天然分子を意味する。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、「前駆体ｍＲＮＡ」又は「プレｍＲＮＡ」という用語は、１つ以上の介在配列（イントロン）を含有するメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の未成熟一本鎖を意味する。プレｍＲＮＡは、細胞核内でＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鋳型から転写され、イントロンとコード領域（エクソン）との交互配列で構成される。スプライシングによりイントロン除去及びエクソン連結が行われてプレｍＲＮＡが完全にプロセシングされると、それは「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」というイントロン配列が完全に排除されたＲＮＡとなる。真核生物のプレｍＲＮＡは、完全にプロセシングされてｍＲＮＡになる前に一過的に存在するにすぎない。プレｍＲＮＡが適正にプロセシングされてｍＲＮＡ配列になると、それは核から搬出されて最終的には細胞質内のリボソームによりタンパク質に翻訳される。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「スプライシング」及び「（プレ）ｍＲＮＡプロセシング」という用語は、イントロンが除去されてエクソンが連結される転写後のプレｍＲＮＡの改変を意味する。プレｍＲＮＡスプライシングは、２つの逐次生化学反応を含む。両反応とも、ＲＮＡヌクレオチド間のスプライセオソームエステル交換を含む。第１の反応では、スプライセオソームアセンブリー時に規定されるイントロン内の特異的分岐点ヌクレオチドの２’−ＯＨは、５’スプライス部位のイントロンの最初のヌクレオチドに求核攻撃を行ってラリアット中間体を形成する。第２の反応では、放出された５’エクソンの３’−ＯＨは、３’スプライス部位のイントロンの最後のヌクレオチドに求核攻撃を行うことによりエクソンの連結及びイントロンラリアットの放出を行う。プレｍＲＮＡスプライシングは、イントロンサイレンサー配列（ＩＳＳ）、エクソンサイレンサー配列（ＥＳＳ）、及び末端ステムループ（ＴＳＬ）配列によりレギュレートされる。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「イントロンサイレンサー配列」（ＩＳＳ）及び「エクソンサイレンサー配列」（ＥＳＳ）という用語は、それぞれ、プレｍＲＮＡ内へのトランス作用タンパク質因子の結合によりスプライス部位の使用に差を生じさせて選択的スプライシングを制御するイントロン内及びエクソン内の配列エレメントを意味する。典型的には、イントロンサイレンサー配列は、エクソン−イントロン接合のスプライス部位ほど保存されない。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、「スプライシングのモジュレーション」とは、１つ以上のスプライス産物の増加若しくは減少又は２つ以上のスプライス産物の比の変化を生じるようにプレｍＲＮＡ転写物のプロセシングを改変することを意味する。また、スプライシングのモジュレーションとは、エクソンスキッピング若しくはエクソンインクルージョン、１つ以上のエクソンの欠失、又はスプライシングを受けたｍＲＮＡには通常は見いだされない追加の配列（たとえばイントロン配列）の結果として、スプライシングを受けたｍＲＮＡ分子がエクソンの異なる組合せのいずれかを含有するようにプレｍＲＮＡ転写物のプロセシングを改変することを意味する。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、「スプライス部位」とは、プレｍＲＮＡ（スプライシングを受けていないＲＮＡ）分子のエクソンとイントロンとの間の接合（「スプライス接合」としても知られる）を意味する。「潜在スプライス部位」とは、典型的には使用されないが通常スプライス部位がブロックされたり若しくは利用できなかったりしたときに又は突然変異により通常休止部位が活性スプライス部位になったときに使用しうるスプライス部位のことである。「異常スプライス部位」とは、天然のＤＮＡ及びプレｍＲＮＡの突然変異により生じるスプライス部位のことである。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、「スプライス産物」又は「スプライシング産物」とは、プレｍＲＮＡのスプライシングプロセスから生成される成熟ｍＲＮＡ分子のことである。代替的に、スプライシングを受けたプレｍＲＮＡは、少なくとも２つの異なるスプライス産物を有する。たとえば、第１のスプライシング産物は、第２のスプライシング産物と比べて追加のエクソン又はエクソンの一部を含有しうる。所定のプレｍＲＮＡのスプライス産物は、当業者に周知の多種多様な技術により同定可能である（たとえば、Leparc, G.G. and Mitra, R.D. Nucleic Acids Res. 35(21): e146, 2007）。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「スプライスドナー部位」とは、イントロンの５’末端又は代替的にエクソンの３’末端に見いだされるスプライス部位を意味する。スプライスドナー部位は、「５’スプライス部位」と同義的に用いられる。本明細書で用いられる場合、「スプライスアクセプター部位」とは、イントロンの３’末端又は代替的にエクソンの５’末端に見いだされるスプライス部位を意味する。スプライスアクセプター部位は、「３’スプライス部位」と同義的に用いられる。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、「targeting（〜を標的とする）」又は「targeted to（〜に標的化された）」とは、所定の核酸分子又は核酸分子の領域に化合物がハイブリダイズするようにオリゴマー化合物を設計するプロセスを意味する。特定の標的核酸分子へのオリゴマー化合物の標的化は、多工程プロセスでありうる。プロセスは、通常、発現がモジュレートされる標的核酸の同定から始まる。本明細書で用いられる場合、「標的核酸」及び「ＧＡＡをコードする核酸」という用語は、ＧＡＡをコードするＤＮＡ、かかるＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む）、さらにはかかるＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを包含する。たとえば、標的核酸は、発現が特定の障害若しくは疾患状態に関連する細胞遺伝子（又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）又は感染因子由来の核酸分子でありうる。本明細書に開示されるように、標的核酸はＧＡＡをコードする。ＧＡＡタンパク質は、任意の哺乳動物酵素でありうるが、好ましくはヒトＧＡＡである。
【００４９】
標的化プロセスはまた、通常、所望の効果たとえば発現のモジュレーションを生じるようにアンチセンス相互作用が行われる標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント、又は部位を決定することを含む。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、「標的ｍＲＮＡ」とは、本明細書に提供されるオリゴマー化合物がハイブリダイズするように設計される核酸分子を意味する。本開示との関連では、標的ｍＲＮＡは、通常、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡである。本発明との関連では、標的ｍＲＮＡは、ＧＡＡｍＲＮＡ又はＧＡＡプレｍＲＮＡである。
【００５１】
「領域」とは、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、又は特徴を有する標的核酸の部分として定義される。標的領域は、たとえば、特定のエクソン若しくはイントロンを含みうるか、又は適切な標的領域として同定されるエクソン内又はイントロン内の所定のヌクレオチドのみを含みうる。標的領域はまた、スプライシングリプレッサー部位でありうる。標的核酸の領域内にはセグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さな部分又はサブ部分として定義される。本発明で用いられる「部位」は、標的核酸内のユニークヌクレオ塩基位置として定義される。本明細書で用いられる場合、オリゴマー化合物の「標的部位」は、化合物が結合する標的核酸の最も５’側のヌクレオチドである。
【００５２】
標的分解は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼのＲＮアーゼＨ（の性能）を含みうる。「ＤＮＡ様」の一本鎖アンチセンス化合物は、ＲＮアーゼＨによる切断を誘発することが当技術分野で知られている。アンチセンス化合物がハイブリダイズしても標的の切断を誘発しない占有ベースのアンチセンス機序は、翻訳の阻害、スプライシングのモジュレーション、ポリ（Ａ）部位選択のモジュレーション、及びレギュレートＲＮＡ構造の破壊を含む。本発明では、占有ベースのアンチセンス機序に使用される「ＲＮＡ様」アンチセンス化合物が好ましい。
【００５３】
本開示との関連では、「スプライス部位に標的化された」オリゴマー化合物とは、ｍＲＮＡのスプライシングがモジュレートされるように、スプライス部位をコードする核酸の領域の少なくとも一部にハイブリダイズする化合物、又はスプライス部位に近接するイントロン若しくはエクソンにハイブリダイズする化合物を意味する。
【００５４】
「オリゴマー化合物」という用語は、核酸分子の領域にハイブリダイズ可能な高分子構造を意味する。この用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチドミメティクス、及びこれらのキメラ組合せ物を含む。オリゴマー化合物は、ルーチンで線状に調製されるが、連結させたりさもなければ環状に調製したりすることが可能である。さらに、分岐状構造が当技術分野で公知である。オリゴマー化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分岐状、又はヘアピンの形態で導入しうるとともに、構造要素たとえば内部又は末端のバルジ又はループを含有しうる。オリゴマー二本鎖化合物は、二本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズされた２本の鎖又はハイブリダイゼーション及び完全二本鎖若しくは部分二本鎖の化合物の形成を可能にする十分な自己相補性を有する１本の鎖でありうる。
【００５５】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＯＮ、又はアンチセンスオリゴマー化合物」という用語は、相補的ヌクレオチド配列を有するプレｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡとの相互作用及び／又はそれらへのハイブリダイゼーションにより遺伝子発現及び／又はスプライシングを改変可能なオリゴヌクレオチドを意味する。酵素依存性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡを分解するＲＮアーゼＨ活性に依存する且つ一本鎖のＤＮＡアンチセンス、ＲＮＡアンチセンス、及びホスホロチオエートアンチセンスを含む形態を含む。ステリックブロッキングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮアーゼＨ非依存アンチセンス）は、ｍＲＮＡの標的配列に結合することにより遺伝子発現又は他のｍＲＮＡ依存細胞プロセスを妨害する。ステリックブロッキングアンチセンスは、２’−Ｏアルキルアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明ではステリックブロッキングアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、「ＲＮアーゼＨ非依存」のアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的核酸にハイブリダイズされたときにＲＮアーゼＨによる切断を誘発しない化合物のことである。ＲＮアーゼＨ非依存オリゴマー化合物は、標的占有ベースの機序によりスプライシングなどの遺伝子発現をモジュレートする。本発明ではＲＮアーゼＨ非依存アンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴマー化合物の相補鎖の対合を意味する。本開示との関連では、オリゴマー化合物は、非標的核酸配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な相補度が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。当業者であれば、オリゴマー化合物が特異的にハイブリダイズ可能な場合を決定しうるであろう。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、「相補的」とは、相補的なヌクレオシド間又はヌクレオチド間の伝統的ワトソン・クリック塩基対合又は他の非伝統的タイプの対合（たとえば、フーグスティーン水素結合若しくは逆フーグスティーン水素結合）のいずれかにより他の核酸分子との水素結合を形成可能な核酸分子を意味する。本開示のアンチセンスオリゴマー化合物に関しては、アンチセンスオリゴマー化合物とその相補的配列との結合自由エネルギーは、アンチセンスオリゴマー化合物の関連機能を発揮させるのに十分であり、而も特異的結合が望まれる条件下で、即ち、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの治療処置の場合には生理学的条件下で、非標的配列へのアンチセンスオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な相補度が存在する。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は当技術分野で周知である（たとえば、Turner et ah, CSH Symp. Quant. Biol. 1/7:123-133 (1987)、Frier et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-77 (1986)、及びTurner et al, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785 (1987)を参照されたい）。そのため、「相補的」（又は「特異的にハイブリダイズ可能」）とは、アンチセンスオリゴマー化合物とプレｍＲＮＡ標的又はｍＲＮＡ標的との間で安定且つ特異的な結合が行われるような十分な相補度又は正確な対合を示唆する用語である。当技術分野では、核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能な標的核酸配列に１００％相補的である必要はないものと理解される。即ち、２つ以上の核酸分子は、完全に相補的な状態には至らないこともありうる。相補性は、第２の核酸分子との水素結合を形成可能な核酸分子中の隣接残基のパーセントにより示される。たとえば、第１の核酸分子が１０ヌクレオチドを有し且つ第２の核酸分子が１０ヌクレオチドを有する場合、第１及び第２の核酸分子間の５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドの塩基対合は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性を示す。オリゴマー化合物と標的核酸の領域との相補性パーセントは、当技術分野で公知のBLASTプログラム（basic local alignment search tools）及びPowerBLASTプログラムを用いてルーチンで決定可能である（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410、Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）。相同性パーセント、配列の同一性又は相補性は、たとえば、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を使用するGapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.）によりデフォルト設定を用いて決定可能である。「完全に」又は「十分に」相補的な核酸分子とは、第１の核酸分子のすべての隣接残基が第２の核酸分子の同数の隣接残基と水素結合するものを意味し、この場合、核酸分子は両方とも同数のヌクレオチドを有するか（即ち同一の長さを有するか）又は２つの分子は異なる長さを有するかのいずれかである。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、「均一に改変」又は「十分に改変」とは、本質的に各ヌクレオシドが均一な改変を有する糖改変ヌクレオシドであるオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はヌクレオチドの領域を意味する。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、「キメラオリゴマー化合物」、「キメラアンチセンス化合物」、又は「キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物」とは、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位（即ち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチド）を含む２つ以上の化学的に異なる領域を含有する化合物のことである。「キメラアンチセンス化合物」という用語は、特定的には、同一オリゴマー化合物内の他の糖、ヌクレオチド、及びヌクレオシド間結合と比較して示差的に改変された少なくとも１つの糖、ヌクレオ塩基、及び／又はヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物を意味する。糖、ヌクレオチド、及びヌクレオシド間結合の残りの部分は、独立して改変しうるか又は未改変でありうる。一般的には、キメラオリゴマー化合物は、孤立位置にありうる又は特定のモチーフを規定する領域内に一体的にグループ化しうる改変ヌクレオシドを有するであろう。キメラオリゴマー化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞内取込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加を付与するように改変された少なくとも１つの領域を含有する。本開示との関連では、「キメラＲＮアーゼＨ非依存アンチセンス化合物」とは、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物のことであるが、ただし、標的核酸にハイブリダイズされたときにＲＮアーゼＨによる切断を受けにくいものである。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「ヌクレオシド」とは、塩基−糖の組合せのことであり、「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドのことである。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、改変糖残基を有するヌクレオシドとは、ヌクレオシドのリボース糖が化学改変糖部分で置換された任意のヌクレオシドのことである。本開示との関連では、化学改変糖部分は、限定されるものではないが２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−フルオロ、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−グアニジニウム、２’−Ｏ−グアニジニウムエチル、２’−カルバメート、２’−アミノオキシ、２’−アセトアミド、及びロックド核酸を含む。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、「ＲＮアーゼＨ分解に耐える」化合物とは、ＲＮアーゼＨ切断に対する化合物の耐性を増加させる少なくとも１つの化学改変を有するアンチセンス化合物のことである。かかる改変としては、限定されるものではないが糖改変を有するヌクレオチドが挙げられる。本明細書で用いられる場合、改変糖を有するヌクレオチドとしては、限定されるものではないが２’−デオキシリボース糖が化学改変糖部分で置換された任意のヌクレオチドが挙げられる。本発明との関連では、化学改変糖部分としては、限定されるものではないが、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−フルオロ、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−グアニジニウム、２’−Ｏグアニジニウムエチル、２’−カルバメート、２’−アミノオキシ、２’−アセトアミド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）が挙げられる。ＲＮアーゼＨ切断に耐える改変化合物は、本明細書に十分に記載されており、当業者には周知である。
【００６４】
本開示との関連では、「細胞内取込み」とは、細胞内へのオリゴマー化合物の送達及び内在化を意味する。オリゴマー化合物は、たとえば、培養下で成長させた細胞により（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、動物から採取された細胞により（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、又は動物への投与後に組織により（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、内在化可能である。
【００６５】
「被験者」とは、外植細胞のドナー若しくはレシピエントの生物又は細胞自体を意味する。また、「被験者」とは、本開示の核酸分子を投与可能な生物を意味する。本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、被験者は哺乳動物又は哺乳動物細胞である。他の実施形態では、被験者はヒト又はヒト細胞である。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「治療有効量」という用語は、投与対象の被験者（たとえばヒト）において明記された疾患、障害、又は病態を治療又は予防するのに十分なアンチセンスオリゴマー化合物の量を意味する。本開示のアンチセンスオリゴマー化合物は、個別に、組み合わせて、又は他の薬剤と併用して、本明細書で考察される疾患又は病態を治療するために使用可能である。たとえば、特定の疾患、障害、又は病態を治療するために、アンチセンスオリゴマー化合物は、治療に好適な条件下で単独で若しくは１つ以上の薬剤と組み合わせて患者に投与可能であるか又は当業者に明らかな他の適切な細胞に投与可能である。本発明では、疾患は好ましくはポンペ病である。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能」という語句は、生理学的に耐容性がある且つ典型的にはヒトに投与したときに胃の不調、眩暈などのアレルギー性又は類似の有害反応を引き起こさない分子エンティティー及び組成物を意味する。好ましくは、本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能」という用語は、連邦政府若しくは州政府の監督官庁により承認されているか、又は米国薬局方、若しくは動物で、より特定的にはヒトで使用するための他の一般に公認された薬局方に列挙されていることを意味する。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、「単離された」という用語は、参照された物質がその天然環境たとえば細胞から取り出されたことを意味する。そのため、単離された生体物質は、いくつかの又はすべての細胞成分、即ち、当然ながら天然物質が存在する細胞の成分（たとえば、細胞質成分又は膜成分）がフリーでありうる。
【００６９】
本明細書で用いられる「精製された」という用語は、物質が取得される天然物質（たとえば組織培養物）を含めて非関連物質即ち汚染物質の存在を低減又は排除する条件下で単離された物質を意味する。たとえば、精製されたＤＮＡアンチセンスオリゴマー化合物は、好ましくは、組織培養成分、汚染物質などを含めて細胞成分又は培養物成分が実質的にフリーである。本明細書で用いられる場合、「実質的にフリー」という用語は、操作上、物質の分析試験との関連で用いられる。好ましくは、汚染物質が実質的にフリーである精製された物質は、少なくとも５０％の純度、より好ましくは少なくとも９０％の純度、さらにより好ましくは少なくとも９９％の純度である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫アッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、及び当技術分野で公知の他の方法により評価可能である。
【００７０】
本明細書では、濃度範囲、パーセント範囲、比範囲、又は整数範囲はいずれも、とくに指定がない限り、挙げられた範囲内の任意の整数値＋適切であればその一部（たとえば、整数の１／１０及び１／１００）を含むものと理解すべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズ、厚さなどのいずれかの物理的特徴に関連する本明細書に列挙された数範囲はいずれも、とくに指定がない限り、挙げられた範囲内の任意の整数を含むものと理解すべきである。
【００７１】
「ａｂｏｕｔ（約）」又は「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（約）」という用語は、統計的に有意な値の範囲内を意味する。かかる範囲は、所与の値又は範囲の桁数内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内でありうる。「ａｂｏｕｔ（約）」又は「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（約）」という用語に包含される許容偏差は、試験下の特定の系に依存し、当業者であれば容易に認識可能である。
【００７２】
一態様では、本発明は、配列番号１（ただし、前記配列番号１は５’−ａｇｃａｇｔｇｇｇｇａｃａｃｃａｃｇｇｔｇａｃａｇｇｔａｃｔｃｃａｇａａｇｇｃａｇｇｇｃｔｃｇｇｇｇ−３’である）又はこの配列のＲＮＡ等価体（即ち、チミン残基がウラシルと交換される）又は混合ＤＮＡ／ＲＮＡ配列（ただし、かかる交換はチミン残基のうちごく少数に対してのみ行われる）を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物に関する。より特定的には、この標的部位は、５’−ａｃｇｇｔｇａｃａｇｇｔａｃｔｃｃａｇａａｇｇｃａ−３’（配列番号２）である。
【００７３】
他者によるこれまでの研究の結果として、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）をはじめとするいくつかのヒト障害でエクソンエクスクルージョンを促進するアンチセンスオリゴマー化合物が設計された。ストラテジーは単純明快であり、明確に規定されたスプライス部位のブロッキングに依拠する。この結果として、病原性遺伝子変異体を含有するエクソンがエクソンスキッピングにより除去される。得られるｍＲＮＡはわずかに短く、少なくとも部分的には疾患を軽減するのに十分なかなりの残存活性を有するトランケートタンパク質の発現をもたらす。実質的にすべての遺伝子に対してカノニカルスプライス部位が知られているので、ストラテジーは単純である。唯一の要件は、プレｍＲＮＡのカノニカルスプライス部位に結合してその部位のブロッキング及び関与するエクソンのスキッピングをもたらすアンチセンスオリゴマー化合物を設計することである。
【００７４】
はるかに困難な課題は、エクソンのエクスクルージョンではなくインクルージョンを促進するリバースプロセスである。エクソンインクルージョンを促進するために、アンチセンスオリゴマー化合物を用いてスプライスリプレッサーをブロックしうる。しかしながら、スプライスリプレッサーがどこに位置するか不明である。これらはイントロン又はエクソンに存在しうるとともに、イントロンスプライスサイレンサー又はエクソンスプライスサイレンサー（それぞれＩＳＳ又はＥＳＳ）と名付けられている。かかるサイレンスの存在の予測に利用可能なソフトウェアが存在するが、これらは非常に信頼性が低い。
【００７５】
他者によるこれまでの研究から、カノニカルスプライス部位又は潜在スプライス部位をブロックしてスプライシングをモジュレートすることは容易であることが示された。たとえば、カノニカルスプライス部位をブロックすることによりエクソンスキッピングを誘導可能であり、これはスキップされたエクソンが病原性突然変異を含有する場合に有益でありうる。かかるスキッピングの最終結果はリーディングフレームの回復でありうる。たとえば、デュシェンヌ筋ジストロフィーでは、かかるストラテジーは臨床試験に入っている。他の例は、病原性突然変異により形成された潜在スプライス部位をブロックすることにより提供される。かかる新たに形成された潜在スプライス部位を単に回避するだけで、カノニカルスプライシングを回復可能である。それほど直接的でないシナリオはカノニカルスプライス部位を弱化させることであり、それにより通常は使用されない天然潜在スプライス部位が利用できるようになる。カノニカルスプライス部位は突然変異により弱化されるので、天然潜在スプライス部位をブロックしてもカノニカルスプライシングが回復されるかは明らかでなく、それは機能しない可能性があるか又は代替天然潜在スプライス部位がより強力である可能性もある。かかる場合には２つの課題に取り組む必要がある。第１に、異常スプライシングイベントを正確に同定することが必要である。これは非常に困難でありうる。なぜなら、異常にスプライシングされた転写物は、細胞内に存在する豊富なＲＮアーゼにより分解されてかかる転写物の存在率が非常に低くなる可能性があるからである。第２に、潜在スプライス部位の利用を防止するＡＯＮを設計することが必要であり、カノニカルスプライシングにどのような効果を及ぼしうるかは、対象遺伝子及びおそらく対象細胞型にも依存するであろう。いずれの場合にも、ＡＯＮ媒介干渉とスプライシング解析とを組み合わせて異常スプライシングを注意深く同定することが必要とされる。ｃ．５４６位置の突然変異の場合には、もしあったとしてもどのような異常スプライシングイベントであるかは明らかでなかった。我々は、あまり豊富でない異常スプライシングを検出し、新規なスプライシングイベントを同定した。これは、ｃ．５４６＋１８４に位置する天然潜在アクセプタースプライス部位を利用するものであり、イントロンの一部のインクルージョンをもたらすものであった。その際、カノニカルスプライス部位が突然変異により著しく弱化されていたので、この潜在部位をブロックすることによりカノニカルエクソン２スプライシングが回復されるかも明らかでなかった。驚くべきことに、ＡＯＮを用いて天然潜在スプライス部位の利用を防止することによりカノニカルスプライシングが促進された。
【００７６】
そのほか、我々は、ｃ．５４６の突然変異がエクソン２のスキッピングも誘導することを見いだした。かかるイベントは、他の突然変異ＩＶＳ１でも起こることが知られているが、そうしたことがｃ．５４６突然変異で起こることは知られていなかった（それはかなり異なる位置にある。即ち、ＩＶＳ１はエクソン２の前にあるｐＹトラクトに位置し、ｃ．５４６はエクソン２のスプライスドナー部位に位置する）。我々が最近出願した他の特許（オランダ特許第２０１７２９４号）には、ＩＶＳ１突然変異に起因するエクソン２のスキッピングがイントロン１に存在する天然偽エクソンの利用をもたらすことが記載されている。ＡＯＮを用いて偽エクソンをブロックするとカノニカルエクソン２スプライシングが回復する。偽エクソンをブロックするＡＯＮとｃ．５４６＋１８４の天然潜在スプライス部位をブロックするＡＯＮとを組み合わせれば、ｃ．５４６の近傍の突然変異との関連でカノニカルエクソン２スプライシングがさらに改善されるであろうと、我々は予想している。
【００７７】
配列番号１への標的化に利用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、５’−ＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＡＣＣＧＴ−３’（配列番号１０６）である。このＡＯＮはＧＡＡエクソン２のインクルージョンを増強することによりＧＡＡ酵素の発現を修正可能であることが分かった。標的化とは、たとえば、配列番号１の配列の少なくとも一部若しくはその配列にハイブリダイズする配列又は配列番号１の少なくとも一部に結合する配列が、好ましくは潜在スプライス部位ｃ．５４６＋１８４を含めて配列番号１の配列の少なくとも一部に標的化されることを意味する点に留意すべきである。標的化される配列は、標的配列よりも短くても長くてもよい。
【００７８】
好適には、配列番号１を標的とする配列は、配列番号１の少なくとも一部にハイブリダイズする。ハイブリダイズする配列は、標的配列よりも短くても長くてもよい。
【００７９】
一態様若しくは態様の一実施形態及び／又はそれらの実施形態では、本発明は、表１に示される配列番号２〜２７、好ましくは配列番号２又は配列番号５〜２３を含む群から選択される標的配列並びに少なくとも８０％の同一性を有するそれらの変異体及び断片に結合可能なアンチセンスオリゴマー化合物（ＡＯＮ）に関する。
【００８０】
【表１】
2019528056.tif 000002
【００８１】
配列番号２〜２７の全長を標的とする必要がないこともあり、より短い又はより長い配列を有する断片も想定されることに留意すべきである。とくに、より短い断片、たとえば配列番号２〜２７、好ましくは配列番号２又は配列番号５〜２３の１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチドを有する断片、たとえば以下の表２及び３に示されるものが想定される。
【００８２】
【表２】
2019528056.tif 000003
【００８３】
【表３】
2019528056.tif 000004
【００８４】
上述したように、本出願においてポンペ病の原因となる突然変異はｃ．５４６Ｇ＞Ｔ点突然変異である。突然変異は、エクソン２のカノニカルスプライスドナーに位置する。この突然変異によりカノニカルエクソン２スプライスドナー部位が弱化されるため、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位が利用される。アンチセンスオリゴマー化合物は、突然変異の位置ではなくｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位を標的とするものと理解される。我々の知見を裏付ける原理は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてｃ．５４６＋１８４のこの潜在スプライスドナー部位の利用を防止することにより、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ突然変異により弱化されているにもかかわらずエクソン２のカノニカルスプライスドナー部位が利用可能になることにある。アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の上流のヌクレオチド及び下流のヌクレオチドを含む配列に標的化しうる。好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の２〜５０ヌクレオチド上流及び／又は２〜５０ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の３〜４５ヌクレオチド上流及び／又は３〜４５ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の５〜４０ヌクレオチド上流及び／又は５〜４０ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の６〜３５ヌクレオチド上流及び／又は６〜３５ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の７〜３３ヌクレオチド上流及び／又は７〜３３ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の８〜３０ヌクレオチド上流及び／又は８〜３０ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の９〜２８ヌクレオチド上流及び／又は９〜２８ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の１０〜２５ヌクレオチド上流及び／又は１０〜２５ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の１１〜２２ヌクレオチド上流及び／又は１１〜２２ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の１２〜２０ヌクレオチド上流及び／又は１２〜２０ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の１３〜１８ヌクレオチド上流及び／又は１３〜１８ヌクレオチド下流を含む配列を標的とし、より好適には、アンチセンスオリゴマー化合物は、ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の位置の１４〜１６ヌクレオチド上流及び／又は１４〜１６ヌクレオチド下流を含む配列を標的とする。
【００８５】
また、エクソン２が（完全に及び部分的に）スキップされることも図から分かる。したがって、ｃ．５４６＋１８４配列を標的とするＡＯＮと偽エクソン（同時係属のオランダ特許第２０１７２９４号を参照されたい）を標的とするＡＯＮとの組合せは、単一ＡＯＮよりも良好に機能する可能性がある。
【００８６】
命名法は当業者には周知であり、Dunnen and Antonarakis Human mutation 15:7-12(2000) 、及びAntonarakis SE, the Nomenclature Working Group. 1998. Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Hum Mutat 11:1-3、及びウェブサイト（http://www.dmd.nl/mutnomen.html）に見いだしうる。ゲノム位置は、www.pompecenter.nlにも見いだしうる。これらはすべて参照により組み込まれる。
【００８７】
好ましくは、ゲノム核酸配列はプレｍＲＮＡである。
【００８８】
これらのアンチセンスオリゴマー化合物は、ＩＩ型グリコーゲン貯蔵病／ポンペ病の治療に有用である。
【００８９】
好ましくは、標的配列は、配列番号１の配列：５’−ａｇｃａｇｔｇｇｇｇａｃａｃｃａｃｇｇｔｇａｃａｇｇｔａｃｔｃｃａｇａａｇｇｃａｇｇｇｃｔｃｇｇｇｇ−３’である。配列番号１、特定的には配列番号２〜９０を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物は、ポンペ病患者の治療に非常に好適である。配列番号１〜９０を標的とする例示的なアンチセンスオリゴマー化合物は、以下に提供される配列番号９１〜１７９、特定的には配列番号９１〜１１１の配列、より特定的には配列番号１０６である。しかしながら、本発明はこれらの配列に限定されるものではない。当業者であれば、配列番号１〜９０の標的配列に対するアンチセンスオリゴマー化合物を設計可能である。配列番号１〜９０の標的配列に対するアンチセンスオリゴマー化合物は、１０〜１００ヌクレオチド、好ましくは１１〜７５ヌクレオチド、好ましくは１２〜７３ヌクレオチド、好ましくは１３〜７０ヌクレオチド、好ましくは１４〜６５ヌクレオチド、好ましくは１５〜６０ヌクレオチド、好ましくは１６〜５５ヌクレオチド、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、好ましくは１８〜４５ヌクレオチド、好ましくは１９〜４０ヌクレオチド、好ましくは２０〜３８ヌクレオチド、好ましくは２１〜３５ヌクレオチド、好ましくは２２〜３３ヌクレオチド、好ましくは２３〜３０ヌクレオチド、好ましくは２４〜２９ヌクレオチド、好ましくは２５〜２８ヌクレオチド、好ましくは２６〜２７ヌクレオチドの長さを有しうる。
【００９０】
以下に、配列番号１〜９０を標的とする例示的なアンチセンスオリゴマー化合物が与えられる。
【００９１】
【表４】
2019528056.tif 000005
【００９２】
【表５】
2019528056.tif 000006
【００９３】
【表６】
2019528056.tif 000007
【００９４】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、存在するチミン（Ｔ）残基のそれぞれ又はすべてをウラシル（Ｕ）残基と交換しうる。配列番号１〜９０の１つ以上の配列に対する配列番号９１〜１７９の１つの配列のかかる誘導体オリゴヌクレオチドの結合親和性は、以上の表に挙げたオリゴヌクレオチドと異ならないであろう。
【００９５】
以上の例では、配列は１８、２１、及び２５ヌクレオチド長であるが、より長い誘導体又はより短い断片も想定される。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明の好ましいいくつかの実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号９１〜１７９、好ましくは配列番号９１〜１１１、並びに少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらの断片及び誘導体からなる群から選択される。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明の好ましいいくつかの実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、配列番号９１〜１７９、好ましくは配列番号９１〜１１１、並びに配列番号９１〜１７９に対して少なくとも８０％、８３％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％の配列同一性を有するそれらの断片及び誘導体からなる群から選択される。
【００９６】
又は配列番号９１〜１７９に対して少なくとも８０％同一、好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも８５％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも８８％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９０％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９１％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９２％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９３％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９４％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９５％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９６％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９７％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９８％同一、より好ましくは配列番号９１〜１７９に対して少なくとも９９％同一である配列。
【００９７】
本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明の好ましいいくつかの実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、断片配列番号９１〜１７９、好ましくは配列番号９１〜１１１からなる群から選択される。ただし、断片は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチド長である。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明の好ましいいくつかの実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、断片配列番号９１〜１７９からなる群から選択される。ただし、断片は、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド長である。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明の好ましいいくつかの実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、断片配列番号９１〜１７９、好ましくは配列番号９１〜１１１からなる群から選択される。ただし、断片は、１９、２０、又は２１ヌクレオチド長である。
【００９８】
最も好ましいのは、配列番号１を標的とするＧＡＡ遺伝子のゲノム核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴマー化合物である。ａｇｃａｇｔｇｇｇｇａｃａｃｃａｃｇｇｔｇａｃａｇｇｔａｃｔｃｃａｇａａｇｇｃａｇｇｇｃｔｃｇｇｇｇ（配列番号１）。
【００９９】
本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、８〜８０ヌクレオチド長、９〜５０ヌクレオチド長、１０〜３０ヌクレオチド長、１２〜３０ヌクレオチド長、１５〜２５ヌクレオチド長、又は約２０ヌクレオチド長である。これには８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０ヌクレオチドのアンチセンス化合物が含まれることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１００】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１３〜８０ヌクレオチドを含む。これには１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９  ３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０ヌクレオチドのアンチセンス化合物が含まれることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１０１】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１３〜５０ヌクレオチドを含む。これには１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９の３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチドのアンチセンス化合物が含まれることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１０２】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１３〜３０ヌクレオチドを含む。これには１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドのアンチセンス化合物が含まれることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１０３】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は２０〜３０ヌクレオチドを含む。これには２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドのアンチセンス化合物が含まれることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１０４】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１５〜２５ヌクレオチドを含む。これには１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５のアンチセンス化合物が含まれることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１０５】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は２０ヌクレオチドを含む。
【０１０６】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１９ヌクレオチドを含む。
【０１０７】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１８ヌクレオチドを含む。
【０１０８】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１７ヌクレオチドを含む。
【０１０９】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１６ヌクレオチドを含む。
【０１１０】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１５ヌクレオチドを含む。
【０１１１】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１４ヌクレオチドを含む。
【０１１２】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は１３ヌクレオチドを含む。
【０１１３】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、化合物は、特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも８連続ヌクレオチド、好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも９連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１０連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１１連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１２連続ヌクレオチド及びより好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１３連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１４連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１５連続ヌクレオチド及びより好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１６連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１７連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１８連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも１９連続ヌクレオチド、より好ましくは特許請求されたアンチセンス化合物の１つに由来する少なくとも２０連続ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
オリゴヌクレオチドの残りのヌクレオチドはいずれも、ＲＮアーゼＨに対する耐性を向上させるオリゴヌクレオチド、細胞標的化配列、細胞透過性配列、マーカー配列、又は任意の他の配列でありうる。
【０１１５】
本明細書に開示されるアンチセンス化合物を備える当業者であれば、過度の実験を行うことなくさらなるアンチセンス化合物を同定可能であろう。
【０１１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の成功を達成するために、オリゴヌクレオチド化学は適正な細胞内取込みを可能にするものでなければならない（Kurreck, J. (2003) Eur. J. Biochem. 270:1628-1644）。スプライシングオリゴヌクレオチドは、伝統的には、オリゴヌクレオチドをＲＮＡ様にしてＲＮアーゼＨによる切断に耐えるようにした均一改変体で構成されてきた。これはスプライシングのモジュレーションの達成に重要である。本明細書にはスプライシングをモジュレートするためのアンチセンス化合物が提供される。
【０１１７】
本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は、ＲＮＡ様及びＤＮＡ様の化学領域を有するキメラである。ＤＮＡ様の化学領域にもかかわらず、キメラ化合物は、好ましくはＲＮアーゼＨ耐性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで標的ｍＲＮＡのスプライシングを効果的にモジュレートする。他の好ましい実施形態では、開示されたアンチセンスオリゴマー化合物は、均一改変オリゴヌクレオチドと比較して向上した細胞内取込み及びより大きな薬理活性を示す。
【０１１８】
アンチセンス化合物の活性を排除することなくミスマッチを含みうることは、当業者であれば分かる。したがって、本明細書に提供される化合物は、標的へのアンチセンス化合物の塩基対合を破壊する約２０％までのヌクレオチドを含有しうるアンチセンス化合物に関する。好ましくは、化合物は、約１５％以下、より好ましくは約１０％以下、最も好ましくは５％以下のミスマッチを含有するか、又はミスマッチを含有しない。残りのヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを破壊しない（たとえばユニバーサル塩基）。
【０１１９】
ヌクレオチド親和性改変の組込みは、非改変化合物と比較してより多数のミスマッチを許容しうるものと当技術分野で理解される。同様に、ある特定のオリゴヌクレオチド配列は、他のオリゴヌクレオチド配列よりもミスマッチに対してより許容性がありうる。当業者であれば、融解温度の決定などによりオリゴヌクレオチド間又はオリゴヌクレオチドと標的核酸との間の適切なミスマッチ数を決定可能である。
【０１２０】
標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションが条件に依存することは、当業者に公知である。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェント条件」とは、オリゴマー化合物がその標的配列にはハイブリダイズするが他の配列には最小限の数でハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェント条件は配列依存であり、且つ異なる状況では異なるものとなろう。また、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェント条件」は、オリゴマー化合物の性質又は組成及び研究に用いられるアッセイにより決定される。
【０１２１】
アンチセンス化合物又はその一部は、配列番号への規定の同一性パーセントを有しうる。本明細書で用いられる場合、配列は、同一のヌクレオ塩基対合能力を有する限り、本明細書に開示される配列と同一である。たとえば、開示される配列のチミジンの代わりにウラシルを含有するＲＮＡは、両方ともアデニンと対合するので、同一であるとみなされよう。この同一性は、オリゴマー化合物の全長にわたりうるか、又はアンチセンス化合物の一部でありうる（たとえば、２７マーのヌクレオチド１〜２０と２０マーとを比較して配列番号へのオリゴマー化合物の同一性パーセントを決定しうる）。アンチセンス化合物が本明細書に記載のアンチセンス化合物と同様に機能するために本明細書に記載のものと同一の配列を有する必要はないことは、当業者であれば分かる。本明細書に教示されるアンチセンス化合物の短縮体又は本明細書に教示されるアンチセンス化合物の非同一体も企図される。非同一体とは、各塩基が本明細書に開示されるアンチセンス化合物と同一の対合活性を有していないもののことである。塩基は、より短ければ又は少なくとも１つの脱塩基部位を有していれば、同一の対合活性を有していない。代替的に、非同一体は、異なる対合活性を有する異なる塩基と交換された少なくとも１つの塩基を含みうる（たとえば、Ｇは、Ｃ、Ａ、又はＴと交換可能である）。同一性パーセントは、比較される配列番号又はアンチセンス化合物に対応する同一の塩基対合を有する塩基数に従って計算される。非同一塩基は、互いに隣接していてもよいし、オリゴヌクレオチド全体にわたり分散していてもよいし、又はその両方であってもよい。
【０１２２】
たとえば、２０マーのヌクレオチド２〜１７と同一の配列を有する１６マーは、２０マーに対して８０％同一である。代替的に、２０マーと同一ではない４つのヌクレオチドを含有する２０マーもまた、２０マーに対して８０％同一である。１８マーのヌクレオチド１〜１４と同一の配列を有する１４マーは、１８マーに対して７８％同一である。かかる計算は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１２３】
同一性パーセントは、改変配列の部分に存在する元の配列のヌクレオチドを基準にしたパーセントに基づく。したがって、２０ヌクレオ塩基活性標的セグメントの相補体の全長配列を含む３０ヌクレオ塩基アンチセンス化合物は、２０ヌクレオ塩基活性標的セグメントの相補体に対して１００％の同一性の部分を有するであろうが、追加の１０ヌクレオ塩基部分をさらに含む。活性標的セグメントの相補体は単一部分を構成しうる。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に提示される活性標的セグメントの少なくとも相補体部分に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましく少なくとも９５％同一である。
【０１２４】
活性を排除することなくアンチセンス化合物の長さを増加若しくは減少させたり及び／又はミスマッチ塩基を導入したりできることは、当業者に周知である。たとえば、Woolf et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7310, 1992（参照により本明細書に組み込まれる）では、標的ＲＮＡの切断を誘導する能力に関して１３〜２５ヌクレオチド長の一連のアンチセンスオリゴマー化合物が試験された。アンチセンスオリゴマー化合物の末端近傍に８又は１１ミスマッチ塩基を有する２５ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴマー化合物は、ミスマッチを含有しないアンチセンスオリゴマー化合物ほどではないが標的ｍＲＮＡの特異的切断を誘導可能であった。同様に、１又は３ミスマッチを有するものを含めて１３ヌクレオ塩基アンチセンスオリゴマー化合物を用いて標的特異的切断が達成された。Maher and Dolnick（Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988（参照により本明細書に組み込まれる））では、ウサギ網状赤血球アッセイでヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させる能力に関して、一連の１４ヌクレオ塩基タンデムアンチセンスオリゴマー化合物並びにタンデムアンチセンスオリゴマー化合物の２つ又は３つの配列でそれぞれ構成された２８及び４２ヌクレオ塩基アンチセンスオリゴマー化合物が試験された。３つの１４ヌクレオ塩基アンチセンスオリゴマー化合物は、それぞれ単独で、２８又は４２ヌクレオ塩基アンチセンスオリゴマー化合物よりも控えめのレベルであるが翻訳を阻害可能であった。アンチセンス化合物は、所望の活性が維持される限り長さ及び標的に対する相補性パーセントを変化させうるものと理解される。所望の活性の決定方法は、本明細書に開示されており、当業者には周知である。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマー化合物は、標的ｍＲＮＡに対して少なくとも８０％の相補性、より好ましくは標的ｍＲＮＡに対して少なくとも８５％の相補性、より好ましくは標的ｍＲＮＡに対して少なくとも９０％の相補性、より好ましくは標的ｍＲＮＡに対して少なくとも９５％の相補性、より好ましくは標的ｍＲＮＡに対して少なくとも９６％の相補性、より好ましくは標的ｍＲＮＡに対して少なくとも９７％の相補性、より好ましくは標的ｍＲＮＡに対して少なくとも９８％の相補性、より好ましくは標的ｍＲＮＡに対して少なくとも９９％の相補性、より好ましくは標的ｍＲＮＡに対して少なくとも１００％の相補性を有する。
【０１２５】
当技術分野で公知のように、ヌクレオシドは塩基−糖の組合せ物である。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、ヘテロ環式塩基（「ヌクレオ塩基」又は単に「塩基」ということもある）である。かかるヘテロ環式塩基の２つの最も一般的なクラスはプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’、３’、又は５’ヒドロキシル部分に結合可能である。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、隣接ヌクレオシドを互い共有結合して線状高分子化合物を形成する。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は、通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものとして参照される。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又は骨格は、３’→５’ホスホジエステル結合である。それらの活性を改変するために、多くの場合、オリゴヌクレオチドに化学改変を含むことが好ましい。化学改変は、たとえば、標的ＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を増加させたり、ヌクレアーゼ耐性を増加させたり、及び／又はオリゴヌクレオチドの薬動学を改変したりすることにより、オリゴヌクレオチド活性を改変可能である。標的へのオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる化学を用いて、より短いオリゴヌクレオチド化合物を使用できるようにしうる。
【０１２６】
本明細書に提供されるアンチセンス化合物はまた、糖部分を改変した１つ以上のヌクレオシドを含有しうる。ヌクレオシドのフラノシル糖環は、いくつかの方法により、たとえば、限定されるものではないが置換基の付加、２個の非ジェミナル環原子の架橋による二環式核酸（ＢＮＡ）の形成、及び−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）などの原子又は基による４’位の環酸素の置換により、改変可能である。改変糖部分は周知であり、標的へのアンチセンス化合物の親和性の改変、典型的には増加及び／又はヌクレアーゼ耐性の増加に使用可能である。好ましい改変糖の代表的なリストには、ＬＮＡ及びＥＮＡ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋）をはじめとする二環式改変糖（ＢＮＡ）、並びに置換糖、とくに２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ２、又は２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３の置換基を有する２’−置換糖が含まれるが、これらに限定されるものではない。糖はまた、とくに糖ミメティック基と交換可能である。改変糖の調製方法は当業者に周知である。好適な化合物は、次のもの、即ち、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルキニル、又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、（式中、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル若しくはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルでありうる）の１つを２’位に含みうる。そのほかに好適なのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２（式中、ｎ及びｍは１〜約１０である）である。他のオリゴヌクレオチドは、次のもの、即ち、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリ−アルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬動学的性質を向上させるための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を向上させるための基、及び類似の性質を有する他の置換基の１つを２’位に含む。１つの改変は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、即ち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる改変は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、即ち、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。他の改変は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリ���（２’−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２）、２’−Ｏアリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−改変は、アラビノ（上）位又はリボ（下）位でありうる。２’−アラビノ改変の１つは２’−Ｆである。オリゴヌクレオチドの他の位置、とくに、３’末端ヌクレオチド又は２’−５’結合オリゴヌクレオチドの糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位にも類似の改変を行いうる。アンチセンス化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖ミメティックを有しうる。かかる改変糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、同第５，７００，９２０号、及び同第６，１４７，２００号が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
本発明の一態様では、オリゴマー化合物は、３’−エンド糖コンフォメーションを誘導するように改変されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、所望の３’−エンド糖コンフォメーションを誘導するようにヘテロ環式塩基、糖部分、又はその両方の改変を組込み可能である。こうした改変ヌクレオシドを用いてＲＮＡ様ヌクレオシドをミミックすることにより、望ましい３’−エンドコンフォメーショナルジオメトリーを維持しつつオリゴマー化合物の特定の性質を増強可能である。
【０１２８】
本発明では、ＲＮアーゼＨ耐性であることからＲＮＡ型二本鎖（Ａ型ヘリックス、主に３’−エンド）を優先する。より安定な３’−エンドヌクレオシドを用いて増強可能な性質としては、限定されるものではないが、タンパク質結合、タンパク質オフ速度、吸収、及び排除の改変による薬動学的性質のモジュレーション、ヌクレアーゼ安定性さらには化学的安定性のモジュレーション、オリゴマーの結合親和性及び特異性（酵素さらには相補的配列に対する親和性及び特異性）のモジュレーション、並びにＲＮＡ切断の有効性の増加が挙げられる。
【０１２９】
ヌクレオシドコンフォメーションは、ペントフラノシル糖の２’、３’、又は４’位の置換をはじめとする各種因子による影響を受ける。電気陰性置換基は、一般に、アキシアル位が有利であり、一方、立体的に嵩高い置換基は、一般に、エクアトリアル位が有利である（Principles of Nucleic Acid Structure, Wolfgang Sanger, 1984, Springer-Verlag）。３’−エンドコンフォメーションに有利な２’位の改変は、２’−ＯＨを認識エレメントとして維持しつつ達成可能である（Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713、Harry-O’kuru et al., J. Org. Chem., (1997), 62(6), 1754-1759、及びTang et al., J. Org. Chem. (1999), 64, 747-754）。代替的に、３’−エンドコンフォメーションの優先性は、３’−エンドコンフォメーションを採用して電気陰性フッ素原子をアキシアル位に配置する２’−デオキシ−２’−Ｆ−ヌクレオシド（Kawasaki et al., J. Med. Chem. (1993), 36, 831-841）により例証されるように２’−ＯＨの欠失により達成可能である。得られる二本鎖にＡ型コンフォメーション性（３’−エンド）を与える本発明に適した代表的な２’−置換基としては、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−置換アルキル、及び２’−フルオロ置換基が挙げられる。他の好適な置換基は、各種のアルキル及びアリールのエーテル及びチオエーテル、アミン、並びにモノアルキル置換及びジアルキル置換のアミンである。
【０１３０】
リボース環の他の改変、たとえば、４’−Ｆ改変ヌクレオシドを与える４’位の置換（Guillerm et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (1995), 5, 1455-1460及びOwen et al., J. Org. Chem. (1976), 41, 3010-3017)）、又はたとえば、メタノカルバヌクレオシドアナログを生成する改変（Jacobson et al., J. Med. Chem. Lett. (2000), 43, 2196-2203及びLee et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (2001), 11, 1333-1337）もまた、３’−エンドコンフォメーションの優先性を誘導する。類似の方針に沿って、Ｃ３’−エンド型コンフォメーション、即ち、ロックド核酸（ＬＮＡ、Singh et al, Chem. Commun. (1998), 4, 455-456）及びエチレン架橋核酸（ＥＮＡ（ＴＭ）、Morita et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2002), 12, 73-76）にコンフォメーションをロックするように、１つ以上のヌクレオシドを改変可能である。
【０１３１】
糖の好ましい改変は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−フルオロ、２’―ジメチルアミノオキシエトキシ、２’―ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−グアニジニウム、２’−Ｏグアニジニウムエチル、２’−カルバメート、２’−アミノオキシ、２’−アセトアミド、及びロックド核酸からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、糖改変は２’−Ｏ−メチル又は２’−Ｏ−メトキシエチルである。
【０１３２】
オリゴマー化合物はまた、ヌクレオ塩基（当技術分野ではヘテロ環式塩基又は単に「塩基」ということが多い）の改変又は置換を含みうる。本明細書で用いられる場合、「非修飾」又は「天然」のヌクレオチドは、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。「置換」とは、非改変塩基又は天然塩基と他の非改変塩基又は天然塩基との交換のことである。「改変」ヌクレオチドとは、他の合成及び天然のヌクレオチド、たとえば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ[identical to]Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン、並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロとくに５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアアデニンを意味する。さらなる改変ヌクレオチドは、三環式ピリミジン、たとえば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（たとえば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）を含む。改変ヌクレオチドはまた、プリン塩基又はピリミジン塩基が他のヘテロ環、たとえば、７−デア−ザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンと交換されたものを含みうる。さらなるヌクレオチドは、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859、Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されるもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されるもの、及びSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302、Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されるものを含む。これらのヌクレオチドのいくつかは、本発明の化合物の結合親和性の向上に好適なものとして当業者に公知である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリン、た��えば、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃向上させることが示されており、さらにより特定的には２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせたとき、現在のところ好適な塩基置換である。核酸配列置換の生成に関する塩基の改変は、かかる化学改変を必要としないものと当技術分野で理解される。
【０１３３】
いくつかの上述の改変ヌクレオチドさらには他の改変ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第４，８４５，２０５号、さらには上述の米国特許第３，６８７，８０８号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，６８１，９４１号、及び同第５，７５０，６９２号が挙げられる。
【０１３４】
本発明のオリゴマー化合物はまた、１つ以上の天然に存在するヘテロ環式塩基部分の代わりに多環式ヘテロ環式化合物を含みうる。いくつかの三環式ヘテロ環式化合物は以前に報告されている。これらの化合物は、標的鎖への改変鎖の結合性を向上させるためにアンチセンス用途にルーチンで使用される。最も研究された改変は、グアノシンに標的化されるため、Ｇ−クランプ又はシチジンアナログと称されてきた。第２の鎖のグアノシンと３つの水素結合を生成する代表的なシトシンアナログとしては、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Kurchavov, et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846）、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874）及び６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388）が挙げられる。オリゴヌクレオチドに組み込まれると、これらの塩基改変は相補的グアニンにハイブリダイズすることが示されるとともに、後者は、アデニンにもハイブリダイズして拡張されたスタッキング相互作用によりヘリックスの熱安定性を向上させることが示された（米国特許出願公開第２００３／０２０７８０４号及び同第２００３／０１７５９０６号も参照されたい）。
【０１３５】
シトシンアナログ／代替物が剛性１，３−ジアザフェノキサジン−２−オンスキャフォールドに結合されたアミノエトキシ部分を有する場合、さらなるヘリックス安定化性が観測された（Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532）。単一改変で親和性を大きく向上させる５−メチルシトシンと比べて１８℃までのΔＴｍを伴って相補的標的ＤＮＡ又はＲＮＡへのモデルオリゴヌクレオチドの結合親和性を単一組込みにより向上可能であることが、結合試験から実証された。一方、ヘリックス安定性の向上は、オリゴヌクレオチドの特異性を損なわない。
【０１３６】
本発明の使用に適したさらなる三環式ヘテロ環式化合物及びその使用方法は、米国特許第６，０２８，１８３号及び同第６，００７，９９２号に開示されている。
【０１３７】
配列特異性を損なうことなくフェノキサジン誘導体の結合親和性が向上するため、より強力なアンチセンスベースの薬剤の開発用として価値あるヌクレオ塩基アナログが得られる。実際に、フェノキサジン置換を含有するヘプタヌクレオチドがＲＮアーゼＨを活性化し、細胞内取込みを増強し、且つ増加したアンチセンス活性を呈しうることを実証するin vitro実験から、有望なデータが得られている(Lin, K-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532）。単一置換が２０マーの２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を有意に向上させることが示されたので、Ｇ−クランプの場合には活性向上がさらに顕著であった（Flanagan, W. M.; Wolf, J. J.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513-3518）。
【０１３８】
ヘテロ環式塩基として有用なさらなる改変多環式ヘテロ環式化合物は、限定されるものではないが、上述の米国特許第４，８４５，２０５号、さらには米国特許第３，６８７，８０８号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，６４６，２６９号、同第５，７５０，６９２号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、及び同第５，６８１，９４１号、並びに米国特許出願公開第２００３０１５８４０３号に開示されている。
【０１３９】
本明細書に記載の化合物は、ヌクレオシドさもなければ改変モノマー単位を結合一体化させてアンチセンス化合物を形成するヌクレオシド間結合基を含みうる。ヌクレオシド間結合基の２つの主要なクラスは、リン原子の存在又は不在により規定される。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、限定されるものではないがホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、及びホスホロチオエートが挙げられる。代表的なリン非含有ヌクレオシド間結合基としては、限定されるものではないが、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）、シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）、及びＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられる。改変ヌクレオシド間結合は、天然ホスホジエステル結合と比較してアンチセンス化合物のヌクレアーゼ耐性の改変、典型的には向上に使用可能である。キラル原子を有するヌクレオシド間結合は、ラセミ、キラル、又はそれらの混合として調製しうる。代表的なキラルヌクレオシド間結合としては、限定されるものではないがアルキルホスホネート及びホスホロチオエートが挙げられる。リン含有結合及びリン非含有結合の調製方法は当業者に周知である。
【０１４０】
好適な改変ヌクレオシド間結合基は、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルのホスホネート、たとえば、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、たとえば、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホノアセテート、及びチオホスホノアセテート（Sheehan et al., Nucleic Acids Research, 2003, 31(14), 4109-4118及びDellinger et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 940-950を参照されたい）、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、及び１つ以上のヌクレオチド間結合が３’→３’、５’→５’、又は２’→２’結合である逆極性を有するものである。逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合に単一３’→３’結合、即ち、脱塩基でありうる単一反転ヌクレオシド残基（ヌクレオ塩基は、欠失しているか又はその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。また、各種塩、混合塩、及び遊離酸形も含まれる。
【０１４１】
Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホルアミデートは、相補的ＲＮＡ鎖への高い親和性及びヌクレアーゼ耐性の両方を呈することが報告された（Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144）。Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホルアミデートの研究が行われ、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートするのにｉｎ  ｖｉｖｏでいくらかの成功を収めている（Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 3966-3971、及びFaira et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 40-44）。
【０１４２】
以上のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号、及び同第５，６２５，０５０号が挙げられる。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合及び／又はヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特定的には−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ただし、天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、−Ｏ−Ｐ（−Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として表される）を有しうる。ＭＭＩ型ヌクレオシド間結合は、以上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号に開示されている。アミドヌクレオシド間結合は、以上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号に開示されている。
【０１４４】
リン原子を中に含まないいくつかのオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルとの混合ヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環式のヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成部分を有する他のものを包む。
【０１４５】
以上のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号、及び同第５，６７７，４３９号が挙げられる。
【０１４６】
本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート又はホスホロジアミデートである。
【０１４７】
本発明のオリゴマー化合物の１つ以上に対して、限定されるものではないが所定の用途における活性などの性質を向上させるために、１つ以上のモノマーサブユニット及び／又はヌクレオシド間結合の複数の部位（ヌクレオシドが好適である）に複数の改変を行いうることがさらに意図される。
【０１４８】
本発明に適した多くの改変ヌクレオシドの合成は、当技術分野で公知である（たとえば、Chemistry of Nucleosides and Nucleotides Vol 1-3, ed. Leroy B. Townsend, 1988, Plenum pressを参照されたい）。改変ヌクレオシド及びそのオリゴマーのコンフォメーションは、分子動力学計算、核磁気共鳴分光法、ＣＤ測定などの当業者にはルーチンの各種方法により推定可能である。
【０１４９】
本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物は、モルホリノホスホロチオエート又はホスホロジアミデートモルホリノである。
【０１５０】
他のグループのオリゴマー化合物としては、オリゴヌクレオチドミメティックが挙げられる。本明細書で用いられる場合、「ミメティック」という用語は、糖、ヌクレオ塩基、及び／又はヌクレオシド間結合が置換されたグループを意味する。一般に、ミメティックは、糖又は糖−ヌクレオシド間結合の組合せの代わりに使用され、ヌクレオ塩基は、所定の標的へのハイブリダイゼーションのために維持される。糖ミメティックの代表的な例としては、限定されるものではないがシクロヘキセニル又はモルホリノが挙げられる。糖−ヌクレオシド間結合の組合せのミメティックの代表的な例としては、限定されるものではないが非荷電アキラル結合により結合されたペプチド核酸（ＰＮＡ）及びモルホリノ基が挙げられる。いくつかの場合には、ヌクレオ塩基の代わりにミメティックが使用される。代表的なヌクレオ塩基ミメティックは当技術分野で周知であり、限定されるものではないが三環式フェノキサジンアナログ及びユニバーサル塩基を含む（Berger et al., Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14（参照により本明細書に組み込まれる））。糖、ヌクレオシド、及びヌクレオ塩基のミメティックの合成方法は当業者に周知である。ヘテロ環塩基部分又は改変ヘテロ環塩基部分は、好ましくは、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【０１５１】
本明細書に記載の化合物は、１つ以上の不斉中心を含有しうるので、アミノ酸などに対して（Ｒ）若しくは（Ｓ）、［α］若しくは［β］、又は（Ｄ）若しくは（Ｌ）として絶対立体化学により定義しうる鏡像異性体、ジアステレオマー、及び他の立体異性配座を生成しうる。本開示は、かかる可能な異性体さらにはそれらのラセミ形態及び光学的に純粋な形態をすべて含むものとみなされる。
【０１５２】
かかるオリゴマー化合物の１つ、即ち、優れたハイブリダイゼーション性を有することが示されたオリゴヌクレオチドミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という（Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500）。ＰＮＡは、有利なハイブリダイゼーション性、高い生物学的安定性を有し、且つ静電的に中性の分子である。ＰＮＡ化合物は、トランスジェニックマウスモデルにおいて異常スプライシングの修正に使用されてきた（Sazani et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20, 1228-1233）。ＰＮＡオリゴマー化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格とくにアミノエチルグリシン骨格と交換される。ヌクレオチドは、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合される。ＰＮＡオリゴマー化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号が挙げられる。ＰＮＡ化合物は、Applied Biosystems (Foster City, Calif., USA)から市販品として入手可能である。基本ＰＮＡ骨格への多くの改変が当技術分野で公知であり、とくに有用なのは、一方又は両方の末端にコンジュゲートされた１つ以上のアミノ酸を有するＰＮＡ化合物である。たとえば、ＰＮＡ分子の末端にコンジュゲートする場合、１〜８個のリシン残基又はアルギニン残基が有用である。細胞透過を向上させるためにポリアルギニンテールが好適である。
【０１５３】
研究されてきた他のクラスのオリゴヌクレオチドミメティックは、モルホリノ環に装着されたヘテロ環式塩基を有する結合モルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸のモルホリノモノマー単位を結合するいくつかの結合基が報告されている。結合基の１クラスは、非イオン性オリゴマー化合物を与えるように選択されてきた。モルホリノ系オリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を生成する可能性が低いオリゴヌクレオチドの非イオン性ミメティックである（Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510）。モルホリノ系オリゴマー化合物は、ゼブラフィッシュ胚で研究されてきた（Genesis, volume 30, issue 3, 2001 and Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214を参照されたい）。モルホリノ系オリゴマー化合物のさらなる研究も報告されている（Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220、及びLacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596）。モルホリノ系オリゴマー化合物は、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。オリゴマー化合物のモルホリノクラスは、モノマーサブユニットを連結する多種多様な結合基を用いて調製されてきた。結合基は、キラルなものからアキラルなものまで及び帯電したものから中性のものまでさまざまでありうる。米国特許第５，１６６，３１５号には、−Ｏ−Ｐ（−Ｏ）（Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−を含む結合が開示されており、米国特許第５，０３４，５０６号には、アキラルモルホリノ間結合が開示されており、そして米国特許第５，１８５，４４４号には、リン含有キラルモルホリノ間結合が開示されている。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドミメティックのさらなるクラスは、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）という。ＣｅＮＡオリゴヌクレオチドでは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に通常存在するフラノース環はシクロヘキセニル環と交換される。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホロアミダイトモノマーは、古典的ホスホロアミダイト化学に従ってオリゴマー化合物の合成のために調製及び使用されてきた。ＣｅＮＡで改変された特定位置を有する完全改変のＣｅＮＡオリゴマー化合物及びオリゴヌクレオチドの調製及び研究が行われてきた（Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602）。一般的には、ＤＮＡ鎖にＣｅＮＡモノマーを組み込むと、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性が増加する。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然複合体に類似した安定性を有するＲＮＡ及びＤＮＡの核酸相補体との複合体を形成した。容易なコンフォメーション適合化を進めるために、ＣｅＮＡ構造を天然核酸構造に組み込む研究がＮＭＲ及び円二色性により示された。さらに、ＲＮＡを標的とする配列へのＣｅＮＡの組込みは、血清に対して安定であり、Ｅ．コリ（E.coli）ＲＮアーゼＨを活性化して標的ＲＮＡ鎖の切断をもたらしうる。
【０１５５】
さらなる改変は、リボシル糖環の２’−ヒドロキシル基を糖環の４’炭素原子に結合することにより２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成して二環式糖部分を形成した「ロックド核酸」（ＬＮＡ）などの二環式糖部分を含む（Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561、Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8 1-7、及びOrum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243にレビューされており、米国特許第６，２６８，４９０号及び同第６，６７０，４６１号も参照されたい）。結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基でありうるとともに、ＬＮＡという用語は、この二環式部分に対して用いられており、この位置がエチレン基の場合には、ＥＮＡ（ＴＭ）という用語が用いられる（Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456、ENA(TM): Morita et al., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226）。ＬＮＡ及び他の二環式糖アナログは、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二本鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３から＋１０［度］Ｃ）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、及び良好な溶解性を示す。ＬＮＡは、ProLigo(Paris, France and Boulder, Colo., USA)から市販されている。
【０１５６】
同様に研究されてきたＬＮＡの異性体は、３’−エキソヌクレアーゼに対する優れた安定性を有することが示されているα−Ｌ−ＬＮＡである。α−Ｌ−ＬＮＡは、強力なアンチセンス活性を示すアンチセンスギャップマー及びキメラに組み込まれた（Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372）。
【０１５７】
調製及び研究が行われてきた他の類似の二環式糖部分は、単一メチレン基を介して３’−ヒドロキシル基から糖環の４’炭素原子に及ぶ架橋を有し、これにより３’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成する（米国特許第６，０４３，０６０号を参照されたい）。
【０１５８】
ＬＮＡは、きわめて安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖を形成することが示されている（Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 13252-13253）。ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは、最も熱安定性の良い核酸型二本鎖系であることが示され、ＬＮＡのＲＮＡミミック特性は、二本鎖レベルで確立された。３つのＬＮＡモノマー（Ｔ又はＡ）の導入によりＤＮＡ相補体に対する融点が有意に増加した（Ｔｍ＝＋１５／＋１１℃）。ＬＮＡ媒介ハイブリダイゼーションの普遍性は、きわめて安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖の形成により強調されてきた。ＬＮＡのＲＮＡミミック性は、モノマーのＮ型コンフォメーション制限及びＬＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の二次構造に関して反映された。
【０１５９】
ＬＮＡはまた、高い熱親和性を有して相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＬＮＡと二本鎖を形成する。完全改変ＬＮＡ（とりわけＬＮＡ：ＲＮＡ）に関与する二本鎖は、構造的にＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖に類似していることが、円二色性（ＣＤ）スペクトルから示された。ＬＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の核磁気共鳴（ＮＭＲ）検査からは、ＬＮＡモノマーの３’−エンドコンフォメーションが確認された。二本鎖ＤＮＡの認識もまた実証されたことから、ＬＮＡによる鎖侵入が示唆される。ＬＮＡは、対応する非改変参照鎖と比較して一般に向上した選択率でワトソン・クリック塩基対合則に従うことが、ミスマッチ配列の研究から示される。ＤＮＡ−ＬＮＡキメラは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ内のさまざまな領域（５’非翻訳領域、開始コドン領域、又はコード領域）に標的化されたときに遺伝子発現を効率的に阻害することが示されている（Braasch et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30, 5160-5167）。
【０１６０】
ＬＮＡを含有する強力で非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sc U.S.A., 2000, 97, 5633-5638）。著者らは、ＬＮＡがいくつかの所望の性質を付与することを実証した。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、血清中及び細胞抽出物中で容易に分解されなかった。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、生きているラット脳におけるＧタンパク質共役レセプターシグナリング及びエシェリキア・コリ（Escherichia coli）におけるレポーター遺伝子の検出と同様にまったく異なるいくつかのアッセイシステムで強力なアンチセンス活性を呈した。生きているヒト乳癌細胞へのＬＮＡのリポフェクチン媒介の効率的送達も達成された。ＬＮＡを含むさらなる成功したｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、毒性を伴うことなラットδオピオイドレセプターのノックダウンが示され（Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 5633-5638）、他の研究では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの大サブユニットの翻訳をブロックすることが示された（Fluiter et al., Nucleic Acids Res., 2003, 31, 953-962）。
【０１６１】
ＬＮＡモノマーのアデニン、シトシン、グアニン、５−メチルシトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調製が、それらのオリゴマー化及び核酸認識性と共に記載されている（Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630）。ＬＮＡ及びその調製もまた、国際公開第９８／３９３５２号及び国際公開第９９／１４２２６号に記載されている。
【０１６２】
ＬＮＡアナログ、ホスホロチオエート−ＬＮＡ、及び２’−チオ−ＬＮＡも調製されてきた（Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を含有するロックドヌクレオシドアナログの調製も記載されている（Wengel et al.,国際公開第９９／１４２２６号）。さらに、２’−アミノ−ＬＮＡの新規なコンフォメーション制限高親和性オリゴヌクレオチドアナログの合成が当技術分野で記載されている（Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039）。そのほか、２’―アミノ−ＬＮＡ及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡが調製され、それらと相補的ＲＮＡ鎖及び相補的ＤＮＡ鎖との二本鎖の熱安定性が以前に報告されている。
【０１６３】
調製及び研究が行われてきた他のオリゴヌクレオチドミメティックはトレオース核酸である。このオリゴヌクレオチドミメティックは、リボースヌクレオシドの代わりトレオースヌクレオシドに基づく。（３’，２’）−α−Ｌ−トレオース核酸（ＴＮＡ）への初期の関心は、ＴＮＡをコピーするＤＮＡポリメラーゼが存在するかという問題に向けられていた。ある特定のＤＮＡポリメラーゼは、ＴＮＡ鋳型の限られたストレッチをコピー可能であることが分かった（Chemical and Engineering News, 2003, 81, 9に報告された）。他の研究では、ＴＮＡは、相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＴＮＡオリゴヌクレオチドとの逆平行ワトソン・クリック塩基対合が可能であることが確認された（Chaput et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 856-857）。
【０１６４】
一研究では、（３’，２’）−α−Ｌ−トレオース核酸が調製され、２’及び３’アミデートアナログと比較された（Wu et al., Organic Letters, 2002, 4(8), 1279-1282）。アミデートアナログは、ＲＮＡ／ＤＮＡと同程度の強度でＲＮＡ及びＤＮＡに結合することが示された。
【０１６５】
二環式及び三環式のヌクレオシドアナログを含むようにさらなるオリゴヌクレオチドミメティックが調製されてきた（Steffens et al., Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 2426-2439、Steffens et al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 3249-3255、Renneberg et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5993-6002、及びRenneberg et al., Nucleic acids res., 2002, 30, 2751-2757を参照されたい）。これらの改変ヌクレオシドアナログは、ホスホロアミダイト法を用いてオリゴマー化され、三環式ヌクレオシドアナログを含有する得られたオリゴマー化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれ自体にハイブリダイズしたときに向上した熱安定性（Ｔｍ）を示した。二環式ヌクレオシドアナログを含有するオリゴマー化合物は、ＤＮＡ二本鎖に近い熱安定性を示した。
【０１６６】
他のクラスのオリゴヌクレオチドミメティックは、骨格にリン基が組み込まれたホスホノモノエステル核酸というものである。このクラスのオリゴヌクレオチドミメティックは、核酸検出用のプローブとして及び分子生物学用途の補助剤として、遺伝子発現阻害の分野（アンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチド、及び三本鎖形成オリゴヌクレオチド）で有用な物理的及び生物学的及び薬理学的な性質を有すると報告されている。天然に存在するフラノシル環とシクロブチル環とを交換した本発明に適したさらなるオリゴヌクレオチドミメティックが調製されてきた。
【０１６７】
本発明のオリゴマー化合物の他の改変は、オリゴマー化合物の性質を向上させる１つ以上の部分又はコンジュゲート、たとえば、オリゴマー化合物の活性、細胞内分布、又は細胞内取込みを向上させる１つ以上の部分又はコンジュゲートをオリゴマー化合物に化学的結合することを含む。これらの部分又はコンジュゲートは、第１級又は第２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合されたコンジュゲート基を含みうる。本発明のコンジュゲート基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬動学的性質を向上させる基、及びオリゴマーの薬力学的性質を向上させる基を含む。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、ホレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料を含む。薬力学的性質を向上させる基は、本発明との関連では、取込みを向上させる基、耐分解性を向上させる基、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬動学的性質を向上させる基は、本発明との関連では、本発明の化合物の取込み、分布、代謝、又は排泄を向上させる基を含む。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号並びに米国特許第６，２８７，８６０号及び同第６，７６２，１６９号に開示されている。
【０１６８】
コンジュゲート部分としては、限定されるものではないが、脂質部分、たとえば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオール残基若しくはウンデシル残基、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール若しくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン鎖若しくはポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン部分若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。本発明のオリゴマー化合物はまた、薬剤物質、たとえば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、ホリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン（indomethicin）、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤、又は抗生物質にコンジュゲートしうる。オリゴヌクレオチド−薬剤コンジュゲート及びその調製は、米国特許第６，６５６，７３０号に記載されている。
【０１６９】
かかるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、及び同第５，６８８，９４１号が挙げられる。
【０１７０】
オリゴマー化合物はまた、たとえばヌクレアーゼ安定性などの性質を向上させるためにオリゴマー化合物の一方又は両方の末端に一般に装着された１つ以上の安定化基を有するように改変可能である。安定化基にはキャップ構造が含まれる。「キャップ構造又は末端キャップ部分」とは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学改変を意味する（たとえば、Wincottらの国際公開第９７／２６２７０号を参照されたい）。こうした末端改変は、末端核酸分子を有するオリゴマー化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内への送達及び／又は局在化を向上させることが可能である。キャップは、５’末端（５’キャップ）若しくは３’末端（３’キャップ）のいずれかに存在可能であるか、又は一本鎖の両方の末端若しくは二本鎖化合物の両方の鎖の１つ以上の末端に存在可能である。このキャップ構造は、天然ｍＲＮＡ分子の５’末端に存在する反転メチルグアノシン「５’キャップ」と混同してはならない。限定されるものではないが例として、５’キャップは、反転脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、改変塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、ｔｈｒｅｏ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分、３’−３’−反転脱塩基部分、３’−２’−反転ヌクレオチド部分、３’−２’−反転脱塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分（より詳細については、WincottらのＰＣＴ国際公開第９７／２６２７０号を参照されたい）を含む。
【０１７１】
とくに好適な３’キャップ構造は、たとえば、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１，２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、改変塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、ｔｈｒｅｏ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分、５’−５’−反転脱塩基部分、５’−ホスホルアミデート、５’−ホスホロチオエート、１，４−ブタンジオールホスフェート、５’−アミノ、架橋及び／又は非架橋５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋メチルホスホネート、並びに５’−メルカプト部分（より詳細については、Beaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925を参照されたい）を含む。
【０１７２】
オリゴマー化合物の一方又は両方の末端をキャップしてヌクレアーゼ安定性を付与するために使用可能なさらなる３’及び５’安定化基としては、２００３年１月１６日公開の国際公開第０３／００４６０２号に開示されるものが挙げられる。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、多種多様な異なる正荷電ポリマーにコンジュゲートしうる。正荷電ポリマーの例としては、アルギニン（argine）リッチペプチドなどのペプチドが挙げられる。本発明の実施に使用しうる正荷電ペプチドの例としては、Ｒ９Ｆ２Ｃ、（ＲＸＲ）４ＸＢ（式中、Ｘは任意のアミノ酸でありうる）、Ｒ５Ｆ２Ｒ４Ｃ、（ＲＦＦ）３、Ｔａｔタンパク質、たとえば、ＴＡＴ配列ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、及び（ＲＦＦ）３Ｒ、カチオン性ポリマー、たとえば、デンドリマーオクタグアニジン（octaguanindine）ポリマー、並びにアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物へのコンジュゲーション用として当技術分野で公知の他の正荷電分子が挙げられる。本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１，０００〜２０，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を有するポリマーを含む正荷電ポリマーにコンジュゲートされる。正荷電ポリマーの他の例は、分岐状又は非分岐状の鎖に複数の正荷電アミン基を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩはそのほかに、遺伝子及びオリゴマーの送達ベシクルとして幅広く使用されてきた。
【０１７４】
本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は細胞透過性配列で改変される。好適な細胞透過性配列としては、ＴＡＴペプチド、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＭＡＰ、膜融合性ペプチド、抗微生物性ペプチド（ＡＭＰ）、殺細菌性ペプチド、殺真菌性ペプチド、殺ウイルス性ペプチドなどの細胞透過性ペプチドが挙げられる。
【０１７５】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、本発明の粒子の細胞内取込みを促進する短鎖ペプチドである。本発明の粒子は、共有結合による化学結合又は非共有結合相互作用のいずれかを介してＣＰＰペプチドに関連付けられる。ＣＰＰの機能は、粒子を細胞内に送達することであり、通常、生きている哺乳動物細胞のエンドソームに送達されたカーゴのエンドサイトーシスを介して行われるプロセスである。ＣＰＰは、典型的には、リシンやアルギニンなどの正荷電アミノ酸を高い相対存在率で含有するか又は極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互パターンを含有する配列を有するかのいずれかのアミノ酸組成を有する。これらの２つの型の構造は、それぞれ、ポリ陽イオン性又は両親媒性という。第３のクラスのＣＰＰは、正味電荷の少ない無極性残基のみを含有する疎水性ペプチドであるか又は細胞内取込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。
【０１７６】
例示的な細胞透過性ペプチドは、培養下で多くの細胞型により周囲培地から効率的に取込み可能なヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）である。他の細胞透過性ペプチドは、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、トランスポータン、ペネトラチン、ＣＡＤＹ、ＴＰ、ＴＰ１０、アルギニンオクタマー、ポリアルギニン配列、Ａｒｇ８、ＶＰ２２  ＨＳＶ−１構造タンパク質、ＳＡＰプロリンリッチモチーフ、Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）ペプチド、ｈＣＴ（９−３２）、ＳｙｎＢ、Ｐｖｅｃ、及びＰＰＴＧ１である。細胞透過性ペプチドは、その一次配列にポリアルギニンのクラスターを本質的に含有してカチオン性でありうるか又は両親媒性でありうる。ＣＰＰは、一般に、天然又は非天然のタンパク質又はキメラ配列に由来する３０アミノ酸未満のペプチドである。
【０１７７】
好適な実施形態では、オリゴマー化合物は、ナノ粒子への組込みさもなければ関連付けが行われる。ナノ粒子は、好適には、特異的細胞を標的とするように改変しうるとともに細胞を透過するように最適化しうる。当業者であれば、オリゴマー化合物を細胞に送達するためのナノ粒子の利用方法を心得ている。
【０１７８】
本発明の好適な実施形態では、オリゴマー化合物は、エンドソーム脱出剤部分を用いて改変される。エンドサイトーシス経路は、細胞の主要取込み機序である。エンドサイトーシス経路により取り込まれた化合物は、エンドソームに閉じ込められた状態となり、リソソームにおいて特異的酵素により分解されうる。これは、目的に依存して望まれることもあれば望まれないこともある。エンドソームによる取込みが望まれない場合、エンドソーム脱出剤を使用しうる。好適なエンドソーム脱出剤は、クロロキン、ＴＡＴペプチドでありうる。
【０１７９】
所与のオリゴマー化合物のすべての位置で均一に改変を行う必要があるわけではなく、而も実際には、単一化合物に上述した改変を２つ以上組み込んでもよいし、さらにはオリゴマー化合物内の単一ヌクレオシド内に組み込んでもよい。
【０１８０】
本発明はまた、キメラ化合物であるオリゴマー化合物を含む。キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドはオリゴマー化合物の一形態である。こうしたオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞内取込みの増加、電荷の変化、安定性の増加、及び／又は標的核酸への結合親和性の増加をオリゴヌクレオチドに付与するように改変された少なくとも１つの領域を含有する。
【０１８１】
本発明のキメラオリゴマー化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドミメティック、又はそれらの領域若しくは部分の複合構造として形成可能である。かかる化合物は、当技術分野ではハイブリッド又はギャップマーともいわれてきた。かかるハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第５，０１３，８３０号、同第５，１４９，７９７号、同第５，２２０，００７号、同第５，２５６，７７５号、同第５，３６６，８７８号、同第５，４０３，７１１号、同第５，４９１，１３３号、同第５，５６５，３５０号、同第５，６２３，０６５号、同第５，６５２，３５５号、同第５，６５２，３５６号、及び同第５，７００，９２２号が挙げられる。
【０１８２】
アミダイト及びその中間体を含めて、次の前駆体化合物は、当業者にはルーチンの方法により調製可能である。５−メチルｄＣアミダイト用の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン中間体、５−メチル−ｄＣアミダイト用の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−５−メチルシチジン中間体、５−メチルｄＣアミダイト用の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジンペナルティメート中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（５−メチルｄＣアミダイト）、２’−フルオロデオキシアデノシン、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、２’−フルオロデオキシシチジン、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）改変アミダイト、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン中間体、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジンペナルティメート中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏイル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＭＯＥ  Ｔアミダイト）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジン中間体、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ＜４＞−ベンゾイル−５−メチルシチジンペナルティメート中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ＜４＞−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＭＯＥ  ５−Ｍｅ−Ｃアミダイト）、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ＜６＞−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＭＯＥ  Ａアミダイト）、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ＜４＞−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＭＯＥ  Ｇアミダイト）、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト及び２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ＜２＞−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（（２−フタルイミドキシ）エチル）−５’−ｔ−ブチル−ジフェニルシリル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（（２−ホルマドキシミノオキシ）エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（Ｎ，Ｎジ���チルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−（（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−（（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト、２’−Ｏ−（２−（２−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル）−５−メチルウリジン及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト。
【０１８３】
オリゴヌクレオチド合成用のかかる前駆体化合物の調製は、当技術分野ではルーチンであり、米国特許第６，４２６，２２０号及びＰＣＴ国際公開第０２／３６７４３号に開示されている。
【０１８４】
２’−デオキシ及び２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは、供給業者から購入可能である（たとえば、Chemgenes, Needham, Mass. or Glen Research, Inc. Sterling, Va.）。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは米国特許第５，５０６，３５１号に記載されるように調製可能である。
【０１８５】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、市販のホスホロアミダイト（Glen Research, Sterling Va. or ChemGenes, Needham, Mass.）を用いて既報の方法（Sanghvi, et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203）に従ってルーチンで合成可能である。
【０１８６】
２’−フルオロオリゴヌクレオチドは、(Kawasaki, et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841)及び米国特許第５，６７０，６３３号に記載のようにルーチンで合成可能である。
【０１８７】
２’−Ｏーメトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは、Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法に従ってルーチンで調製可能である。
【０１８８】
アミノオキシエチル及びジメチルアミノオキシエチルのアミダイトは、米国特許第６，１２７，５３３号の方法に従ってルーチンで調製可能である。
【０１８９】
ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチド（Ｐ−Ｓ）は、当業者にはルーチンの方法により合成可能である（たとえば、Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Pressを参照されたい）。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，５０８，２７０号に記載されるように調製可能である。
【０１９０】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように調製可能である。
【０１９１】
３’デオキシ３’メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６１０，２８９号又は同第５，６２５，０５０号に記載されるように調製可能である。
【０１９２】
ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，２５６，７７５号又は米国特許第５，３６６，８７８号に記載されるように調製可能である。
【０１９３】
アルキルホスホノチオアートオリゴヌクレオチドは、公開ＰＣＴ出願国際公開第９４／１７０９３号及び国際公開第９４／０２４９９号に記載されるように調製可能である。
【０１９４】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，４７６，９２５号に記載されるように調製可能である。
【０１９５】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０２３，２４３号に記載されるように調製可能である。
【０１９６】
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１３０，３０２号及び５，１７７，１９８に記載されるように調製可能である。
【０１９７】
４’ーチオ含有オリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６３９，８７３号に記載されるように合成可能である。
【０１９８】
ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及びアミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及びアミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、さらには混合骨格化合物、たとえば、ＭＭＩとＰ−Ｏ又はＰ−Ｓとの交互結合を有するものは、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、同第５，６０２，２４０号、及び同第５，６１０，２８９号に記載されるように調製可能である。
【０１９９】
ホルムアセタール結合オリゴヌクレオシド及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号及び同第５，２６４，５６４号に記載されるように調製可能である。
【０２００】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号に記載されるように調製可能である。
【０２０１】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23で参照される各種手順のいずれかに従って調製可能である。また、それらは米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７００，９２２号、同第５，７１９，２６２号、同第６，５５９，２７９号、及び同第６，７６２，２８１号に従って調製しうる。
【０２０２】
オリゴマー化合物は、当技術分野のルーチンの方法に従って調製される少なくとも１つの２’−Ｏ−保護ヌクレオシドを組込み可能である。組込み及び適切な脱保護の後、２’−Ｏ−保護ヌクレオシドは、組込み位置でリボヌクレオシドに変換されよう。最終オリゴマー化合物中の２−リボヌクレオシドユニットの数及び位置は、任意の部位に１つのものからさまざまでありうるか、又は完全２’−ＯＨ改変オリゴマー化合物のものまで調製するストラテジーを使用可能である。
【０２０３】
現在商用されている主要ＲＮＡ合成ストラテジーは、５’−［β］−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−［１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］（ＦＰＭＰ）、２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）３（ＴＯＭ）、及び５’−Ｏ−シリルエーテル−２’−ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）を含む。ＲＮＡ製品を現在提供しているいくつかの会社としては、Pierce Nucleic Acid Technologies (Milwaukee, Wis.)、Dharmacon Research Inc. (a subsidiary of Fisher Scientific, Lafayette, Colo.)、及びIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, Iowa)が挙げられる。１つの会社即ちPrinceton Separationsは、とくにＴＯＭ及びＴＢＤＭＳの化学を用いたときにカップリング時間が削減されるという謳い文句でＲＮＡ合成アクチベーターを市販している。かかるアクチベーターはまた、本発明のオリゴマー化合物にも適しているであろう。
【０２０４】
上述したＲＮＡ合成ストラテジーはすべて、本発明のオリゴマー化合物に適している。一方のストラテジーによる５’−保護基と他方のストラテジーによる２’−Ｏ−保護とを用いた以上のハイブリッドのストラテジーもまた、本明細書で企図される。
【０２０５】
キメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド、及び混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，６２３，０６５号に従って合成可能である。
【０２０６】
向上した細胞内取込み及びより大きな薬理活性を呈するキメラオリゴマー化合物は、米国特許第８，５０１，７０３号に従って作製しうる。
【０２０７】
オリゴマー化合物の他の形態は、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。トリシクロ−ＤＮＡヌクレオチドとは、骨格のコンフォメーション柔軟性を制限し捩れ角γの骨格ジオメトリーを最適化するためにシクロプロパン環の導入により改変されたヌクレオチドのことである。ホモ塩基のアデニン及びチミンを含有するｔｃ−ＤＮＡは、相補的ＲＮＡとの並外れて安定なＡ−Ｔ塩基対を形成する。６〜２２トリシクロヌクレオチド長、特定的には８〜２０トリシクロヌクレオチド長、より特定的には１０〜１８又は１１〜１８トリシクロヌクレオチド長を含有するアンチセンスオリゴマー化合物が好適である。トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの例については、たとえば、国際公開第２０１０１１５９９３号を参照されたい。つまり、本発明では、以上の表のいずれかに示される８〜２０、好ましくは１０〜１８、より好ましくは１１〜１８、より好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、又は１７ヌクレオチドの配列はいずれも、かかる配列がｔｃ−ＤＮＡの形である場合に有用でありうることを意味する。
【０２０８】
改変ヌクレオシド及び非改変ヌクレオシドのオリゴマー化は、ＤＮＡ（Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press）及び／又はＲＮＡ（Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217、Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36、Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713）の文献に記載の手順に従ってルーチンで実施可能である。
【０２０９】
アンチセンス化合物は、適宜、固相合成の周知の技術によりルーチンで作製可能である。かかる合成用の装置は、たとえばApplied Biosystems (Foster City, Calif.)をはじめとするいくつかの販売業者により販売されている。当技術分野で公知のかかる合成用の任意の他の手段を追加的又は代替的に利用しうる。ホスホロチオエートやアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドの類似の調製技術を使用することは周知である。本開示は、アンチセンス化合物の合成方法により限定されるものではない。
【０２１０】
オリゴヌクレオチドの精製及び分析の方法は当業者に公知である。分析方法としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びエレクトロスプレー質量分析が挙げられる。かかる合成及び分析の方法は、マルチウェルプレートで実施可能である。本明細書に記載の方法は、オリゴマーの精製方法により限定されるものではない。
【０２１１】
本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアンチセンス化合物はＲＮアーゼＨ分解に対して耐性がある。
【０２１２】
本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス化合物は各位置に改変ヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、アンチセンス化合物は各位置が均一に改変される。
【０２１３】
スプライシングのモジュレーションは、当技術分野で公知のさまざまな方法によりアッセイ可能である。標的ｍＲＮＡレベルは、たとえば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイムＰＣＲによる定量可能である。ＲＮＡ分析は、当技術分野で公知の方法により全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施可能である。ＲＮＡの単離方法は、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 and 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993に教示されている。
【０２１４】
ノーザンブロット分析は、当技術分野ではルーチンで行われ、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996に教示されている。リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、適宜、PE-Applied Biosystems, Foster City, Calif.から入手可能な市販のABI PRISM(TM) 7700 Sequence Detection Systemを用いて達成可能であり、製造業者の取扱い説明書に従って使用可能である。
【０２１５】
標的ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルは、当技術分野で周知のさまざまな方法により、たとえば、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（免疫ブロッティング）、ＥＬＩＳＡ、又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、定量可能である。標的ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質に対する抗体は、ＭＳＲＳ抗体カタログ（Aerie Corporation, Birmingham, Mich.）などのさまざまな供給元から同定・取得可能であるか、又は従来の抗体産生方法により調製可能である。ポリクローナル抗血清の調製方法は、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997に教示されている。モノクローナル抗体の調製は、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997に教示されている。
【０２１６】
免疫沈降法は、当技術分野で標準的であり、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998に見いだしうる。ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析は、当技術分野で標準的であり、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997に見いだしうる。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、当技術分野で標準的であり、たとえば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991に見いだしうる。
【０２１７】
本発明のオリゴマー化合物の効果は、ＲＴ  ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、フランキングエクソンＰＣＲ、及び／又はｍＲＮＡに対応する各内部エクソンに対してフランキングエクソンＰＣＲを行って１つ以上のフランキングエクソン増幅産物を得ることと、前記フランキングエクソン増幅産物の存在及び長さを検出することと、さらに前記ｍＲＮＡの各タンパク質コードエクソンを定量することと、を含む方法により分析しうる。
【０２１８】
本明細書に提供されるオリゴマー化合物は、治療又は研究に利用しうる。さらに、遺伝子発現の阻害又はスプライシングのモジュレーションを特異的に行うことが可能なアンチセンス化合物を用いて、特定の遺伝子又は遺伝子産物の機能を解明したり生物学的経路の各種メンバーの機能を識別したりしうる。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマー化合物はポンペ病の治療に使用される。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマー化合物はＧＡＡ遺伝子の機能の研究に使用される。
【０２１９】
本明細書に記載の化合物は、後生動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて標的ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするために使用可能である。限定されるものではないが本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、標的ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートする有効量のアンチセンス化合物を前記動物に投与する工程を含む。
【０２２０】
たとえば、標的ｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーションは、動物の体液、組織、器官、又は細胞においてｍＲＮＡスプライシング産物のレベルを決定することにより測定可能である。体液としては、限定されるものではないが、血液（血清又は血漿）、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、滑液、及び唾液が挙げられ、当業者にはルーチンの方法により取得可能なものである。組織、器官、又は細胞としては、限定されるものではないが、血液（たとえば、造血細胞、たとえば、ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞ＣＤ４＋細胞）、リンパ球及び他の血液系列細胞、皮膚、骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節、脳、脊髄、心臓、骨格筋、肝臓、結合組織、膵臓、前立腺、腎臓、肺、口腔粘膜、食道、胃、腸骨、小腸、結腸、膀胱、頸、卵巣、精巣、乳腺、副腎、及び脂肪（白色及び褐色）が挙げられる。組織、器官、及び細胞のサンプルは、生検によりルーチンで取得可能である。いくつかの代替状況では、組織又は器官のサンプルは、死後の動物から回収可能である。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、スプライシングのモジュレーションは、線維芽細胞、好ましくは初代線維芽細胞、好ましくはポンペ病に罹患している患者由来の初代線維芽細胞で測定される。
【０２２１】
本明細書に記載の単一オリゴマー化合物の使用にほぼ準じて、以上に記載のＡＯＮと以上に記載の任意の他のＡＯＮとの組合せの使用も可能である。さらに、本発明のＡＯＮは、ポンペ病の他のスプライス突然変異に対する１つ以上のＡＯＮ、たとえば、次の突然変異、即ち、ｃ．−３２−１３Ｔ＞Ｇ、ｃ．−３２−３Ｃ＞Ｇｃ．−３２−１０２Ｔ＞Ｃ、ｃ．−３２−５６Ｃ＞Ｔ、ｃ．−３２−４６Ｇ＞Ａ、ｃ．−３２−２８Ｃ＞Ａ、ｃ．−３２−２８Ｃ＞Ｔ、ｃ．−３２−２１Ｇ＞Ａ、ｃ．７Ｇ＞Ａ、ｃ．１１Ｇ＞Ａ、ｃ．１５＿１７ＡＡＡ、ｃ．１７Ｃ＞Ｔ、ｃ．１９＿２１ＡＡＡ、ｃ．２６＿２８ＡＡＡ、ｃ．３３＿３５ＡＡＡ、ｃ．３９Ｇ＞Ａ、ｃ．４２Ｃ＞Ｔ、ｃ．９０Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１２Ｇ＞Ａ、ｃ．１３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．１６４Ｃ＞Ｔ、ｃ．３４８Ｇ＞Ａ、ｃ．３７３Ｃ＞Ｔ、ｃ．４１３Ｔ＞Ａ、ｃ．４６９Ｃ＞Ｔ、ｃ．４７６Ｔ＞Ｃ、ｃ．４７６Ｔ＞Ｇ、ｃ．４７８Ｔ＞Ｇ、ｃ．４８２Ｃ＞Ｔ、ｃ．５１０Ｃ＞Ｔ、ｃ．５１５Ｔ＞Ａ、ｃ．５２０Ｇ＞Ａ、ｃ．５４６＋１１Ｃ＞Ｔ、ｃ．５４６＋１４Ｇ＞Ａ、ｃ．５４６＋１９Ｇ＞Ａ、ｃ．５４６＋２３Ｃ＞Ａ、ｃ．５４７−６、ｃ．１０７１、ｃ．１２５４、ｃ．１５５２−３０、ｃ．１２５６Ａ＞Ｔ、ｃ．１５５１＋１Ｇ＞Ｔ、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ、．１７Ｃ＞Ｔ、ｃ．４６９Ｃ＞Ｔ、ｃ．５４６＋２３Ｃ＞Ａ、ｃ．−３２−１０２Ｔ＞Ｃ、ｃ．−３２−５６Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１Ｇ＞Ａ、ｃ．１１２Ｇ＞Ａ、ｃ．１３７Ｃ＞Ｔの１つ以上に対するＡＯＮと容易に組み合わせうる。これらの突然変異に対するＡＯＮは、同時係属出願の国際公開第２０１５／１９０９２２号に開示されており、より特定的にはそこに開示されている配列番号２〜３３、３７〜４０、及び４１〜５４０である。
【０２２２】
本発明のＡＯＮに基づくさらなる療法は、ポンペ病の治療を改善するために酵素補充療法（ＥＲＴ）と容易に組み合わせうる。ＥＲＴ用化合物は、一般に知られ使用されており、同時係属出願の国際出願第ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０８４９号に挙げられた化合物、たとえば、ＧＡＡ、Myozyme（登録商標）、Lumizyme（登録商標）、neoGAA、GiltGAA（ＢＭＮ−７０１）、又はオキシラン（oxyrane）であり、任意選択的に、ゲニステイン、デオキシノジリマイシン−ＨＣｌ、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン、Ｃ１０Ｈ１９ＮＯ４、Ｃ１２Ｈ２３ＮＯ４（この同時係属出願に開示される）、リツキシマブとメトトレキセートとの組合せと組み合わされる。本発明のＡＯＮと組み合わされる国際出願第ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０８４９号に挙げられたＥＲＴスケジュールはすべて、そこに挙げられた投与スキーム及び量で使用しうる。
【０２２３】
オリゴマー化合物による治療の効果は、当技術分野で公知のルーチンの臨床方法により１種以上の化合物に接触させた動物から採取される上述した流体、組織、又は器官において標的ｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーションに関連するバイオマーカーを測定することにより評価可能である。これらのバイオマーカーとしては、限定されるものではないが、グルコース、コレステロール、リポタンパク質、トリグリセリド、遊離脂肪酸、並びにグルコース及び脂質代謝の他のマーカー、肝トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチン、クレアチニン、並びに腎機能及び肝機能の他のマーカー、インターロイキン、腫瘍壊死因子、細胞内接着分子、Ｃ反応性タンパク質、及び炎症の他のマーカー、テストステロン、エストロゲン、及び他のホルモン、腫瘍マーカー、ビタミン、ミネラル、及び電解質が挙げられる。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、バイオマーカーはグリコーゲンである。
【０２２４】
本明細書に開示される化合物は、有効量の化合物を好適な薬学的に許容可能な希釈剤又は担体に添加することにより医薬組成物として利用可能である。化合物はまた、スプライシングの改変に関連する疾患及び障害の治療用医薬の製造に使用可能である。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、疾患はポンペ病である。
【０２２５】
体液、器官、又は組織を有効量の１つ以上の本開示のアンチセンス化合物又は組成物に接触させる方法も企図される。体液、器官、又は組織を１つ以上の本開示の化合物に接触させることにより、体液、器官、又は組織の細胞において標的ｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーションを引き起こすことが可能である。有効量は、標的核酸又はその産物に及ぼす１つ又は複数のアンチセンス化合物又は組成物のモジュレート効果を当業者にはルーチンの方法でモニターすることにより決定可能である。細胞又は組織を被験者から単離し、有効量の１つ又は複数のアンチセンス化合物又は組成物に接触させ、そして当業者に公知のルーチン法により被験者に再導入するｅｘ  ｖｉｖｏ治療方法がさらに企図される。
【０２２６】
投与されるアンチセンスオリゴマー化合物の十分量は、望ましくない疾患症状の寛解を誘導するのに十分な量であろう。かかる量は、患者の性別、年齢、体重、全身の健康状態などの因子にとくに依存して異なりうるとともに、個別症例ごとに決定しうる。量は、治療される病態のタイプ及び治療プロトコルの他の要因（たとえば、ステロイドなどの他の医薬の投与など）によっても異なりうる。量は、全身的又は局所的などの投与方法によっても異なりうる。
【０２２７】
医薬製剤でのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の典型的な投与量は、約０．０５〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、特定的には約５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内でありうる。本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、投与量は、２週間に１回、１週間に１回若しくは２回、又は治療効果を達成するのに必要な任意の頻度で約５０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重である。好適には、量は、３〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好適には１０〜４０ｍｇ／ｋｇ、より好適には１５〜２５ｍｇ／ｋｇである。
【０２２８】
投与される投与量は、当然ながら、使用及び既知の因子、たとえば、活性成分の薬力学的特性、レシピエントの年齢、健康、及び体重、症状の性質及び程度、併用治療の種類、治療頻度、並びに所望の効果に依存して異なるであろう。レシピエントは、任意のタイプの哺乳動物、好ましくはヒトである。本発明の一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物の投与製剤（組成物）は、１ユニット当たり約１マイクログラムから５０，０００マイクログラムの活性成分、特定的には１ユニット当たり約１０〜１０，０００マイクログラムの活性成分を含有しうる。（ここで１ユニットが１回の注射用のバイアル又はパッケージを意味する場合、患者の体重が５０ｋｇのときは１５ｇまでかなり多くなるであろう。）静脈内送達では、医薬製剤のユニット用量は、一般的には０．５から５００マイクログラム／ｋｇ体重を含有するであろうし、好ましくは５から３００マイクログラム、特定的には１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、又は３００マイクログラム／ｋｇ体重（［μ］ｇ／ｋｇ体重）のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含有するであろう。好ましい静脈内投与量は、１０ｎｇから２０００μｇ、好ましくは３から３００μｇ、より好ましくは１０から１００μｇの化合物／ｋｇ体重の範囲内である。代替的に、ユニット用量は、２から２０ミリグラムのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含有しうるとともに、上記の一日用量を与えるように所望により複数回投与される。これらの医薬組成物では、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、組成物の全重量を基準にして約０．５から９５重量％の量で通常存在するであろう。
【０２２９】
特定の一実施形態では、個別の患者の反応に基づいて投与量を増減可能であることを認識すべきである。使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の実際量は、利用される特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド分子、製剤化される特定の組成物、適用形態、及び特定の投与部位によって異なることは、分かるであろう。
【０２３０】
好ましくは、化合物は、毎日、２日に１回、３日に１回、週１回、２週間に１回、又は月１回投与される。
【０２３１】
他の好ましい実施形態では、投与は、たとえばウイルスベクターを使用する場合には１回のみである。
【０２３２】
ウイルスベースのアンチセンスオリゴマー化合物の送達が選択される場合、好適用量が、利用されるウイルス株、送達経路（筋肉内、静脈内、動脈内など）などの因子に依存することは、当業者であれば分かるであろう。かかるパラメーターが通常は臨床試験時に算出されることとは、当業者であれば分かるであろう。さらに、本明細書に記載の治療により疾患症状が完全に軽減されうるが、これが必要とされない場合もあることとは、当業者であれば分かるであろう。症状の部分的又は間欠的な軽減であっても、レシピエントにきわめて有益なこともある。そのほか、患者の治療は通常は単一イベントではない。より正確には、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物は、おそらく複数回投与されるであろう。それは、得られる結果に依存して、数日間隔、数週間隔、又は数ヶ月間隔、さらには数年間隔でありうる。
【０２３３】
タンパク質の機能のレベルを決定又は測定したり治療プロトコルなどに反応して機能が増加又は減少するレベルを決定したりする方法が多く存在することは、当業者であれば分かるであろう。かかる方法としては、限定されるものではないが、タンパク質の活性の測定や検出などが挙げられる。かかる測定は、一般に、標準又は対照又は「正常」サンプルと比較して行われる。そのほか、タンパク質の機能の欠如が疾患プロセスに関与している場合、疾患症状は、適正に機能するタンパク質の存在若しくは不在を間接的に検出するために、又はタンパク質の機能の欠如を取り除くことが意図された治療プロトコルの成功を評価するために、監視及び／又は測定を行いうる。好ましい実施形態では、ＧＡＡタンパク質の機能が測定される。これは、当業者には周知の酵素活性アッセイを用いて好適に実施される。
【０２３４】
本発明の特定の実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで単独で又はベクターを併用して送達しうる。最広義の意味では、「ベクター」とは、細胞への本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入を促進可能な任意の媒体のことである。好ましくは、ベクターは、ベクターの不在下で生じる思われる分解の程度と比べて低減された分解を有して細胞に核酸を輸送する。一般的には、本発明に有用なベクターとしては、限定されるものではないが、ネイキッドプラスミド、非ウイルス送達系（エレクトロポレーション、ソノポレーション、カチオン性トランスフェクション剤、リポソーム剤など…）、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド核酸配列の挿入又は組込みにより操作されたウイルス源又は細菌源に由来する他の媒体が挙げられる。ウイルスベクターは好ましいタイプのベクターであり、限定されるものではないが、次のウイルス、即ち、ＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルス、たとえば、レトロウイルス（たとえば、モロニーネズミ白血病ウイルス及びレンチウイルスに由来するベクター）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス、ネズミ乳房腫瘍ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスに由来する核酸配列が挙げられる。挙げられていないが当技術分野で公知の他のベクターを容易に利用可能である。
【０２３５】
本発明に係る好ましいウイルスベクターとしては、遺伝子療法でヒトでの使用がすでに承認されているＤＮＡウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスが挙げられる。実際に、１２の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１から１２）が知られており、それぞれ異なる組織指向性を有する（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。組換えＡＡＶは、依存パルボウイルスＡＡＶに由来する（Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07）。１〜１２型アデノ随伴ウイルスは、複製欠損になるように工学操作可能であり、広範にわたる細胞型及び種に感染可能である（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。それは熱安定性及び脂質溶媒安定性、造血細胞をはじめとするさまざまな系列の細胞での高いトランスダクション頻度、及び複数の一連のトランスダクションを可能にする重感染阻害の欠如などの利点をさらに有する。そのほか、選択圧の不在下で１００継代超の組織培養で野生型アデノ随伴ウイルス感染が継続されたことから、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安定なイベントであることが示唆される。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能しうる。
【０２３６】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当技術分野で広範囲に記載されており、当業者に周知である。たとえば、Sambrook et al, 1989を参照されたい。それは多くのウイルスベクターと同じ安全上の問題がないので、とくに有利である。しかしながら、宿主細胞に適合可能なプロモーターを有するこうしたプラスミドは、プラスミド内に機能的にコードされた遺伝子からペプチドを発現可能である。いくつかの通常使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。そのほか、プラスミドは、ＤＮＡの特異的断片の除去及び付加を行う制限酵素及びライゲーション反応を用いてカスタム設計しうる。プラスミドは、さまざまな非経口経路、粘膜経路、及び局所経路により送達しうる。たとえば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、真皮内、皮下、又は他の経路により注射可能である。それはまた、鼻腔内スプレー剤又は滴剤、肛門坐剤、及び経口で投与しうる。好ましくは、前記ＤＮＡプラスミドは、筋肉内又は静脈内に注射される。また、遺伝子銃を用いて表皮又は粘膜表面にも投与しうる。プラスミドは、水性溶液中に与えうるか、金粒子上に乾式付着しうるか、又は限定されるものではないがリポソーム、デンドリマー、コクリエート、及びマイクロカプセルをはじめとする他のＤＮＡ送達系を併用しうる。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド核酸配列は、異種プロモーターなどの異種レギュレート領域の制御下にある。プロモーターはまた、たとえば、ＣＭＶプロモーターや任意の合成プロモーターなどのウイルスプロモーターでありうる。
【０２３７】
本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、ベクターは、２つ以上のアンチセンスオリゴマー化合物をコードしうる。各アンチセンスオリゴマー化合物は、異なる標的に方向付けられる。
【０２３８】
本明細書に記載のアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、若しくはかかるエステルの塩、又はヒトをはじめとする動物に投与したときに生物学的活性代謝物又はその残基を（直接的又は間接的に）提供可能な任意の他の機能性化学等価体を含みうる。したがって、たとえば、本開示はまた、アンチセンス化合物のプロドラッグ及び薬学的に許容可能な塩、かかるプロドラッグの薬学的に許容可能な塩及び他のバイオ等価体に関する。
【０２３９】
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素、化学剤、及び／又は条件の作用により体内又はその細胞内で活性形態（即ち薬剤）に変換される不活性又は低活性の形態で調製された治療剤を意味する。特定的には、オリゴヌクレオチドのプロドラッグ体は、国際公開第９３／２４５１０号又は国際公開第９４／２６７６４号に開示される方法に従ってＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート）誘導体として調製される。プロドラッグはまた、（たとえば、末端にホスホジエステル骨格結合を組み込むことにより）切断されて活性化合物を生成するヌクレオチドを一方又は両方の末端に含むアンチセンス化合物を含みうる。
【０２４０】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、化合物の生理学的及び薬学的に許容可能な塩、即ち、親化合物の所望の生物学的活性を保持するとともに望ましくない毒性作用を付与しない塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩は有用であり、ヒトへの治療的投与が十分に許容される。本発明の他の実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ化合物のナトリウム塩もまた提供される。
【０２４１】
本明細書に記載のアンチセンス化合物はまた、混合、カプセル化、コンジュゲート化、又は他の分子、分子構造、若しくは化合物の混合物との併用を行いうる。
【０２４２】
本開示はまた、本明細書に記載のアンチセンス化合物を含む医薬組成物及び製剤を含む。医薬組成物は、局所治療又は全身治療が望ましいか及び治療される領域に依存して、いくつかの方法で投与しうる。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、投与は筋肉内又は静脈内である。
【０２４３】
適宜、ユニット製剤で提供しうる医薬製剤は、医薬品産業で周知の従来技術に従って調製しうる。かかる技術は、活性成分と医薬担体又は賦形剤とを一体化させる工程を含む。一般的には、製剤は、活性成分と、液体担体、微細化固体担体、又はその両方と、を均一且つ密接に一体化させることにより、次いで、必要であれば、生成物を造形することにより（たとえば、送達のために特定の粒子サイズに）調製される。本発明の好ましい一実施形態及び／又は本発明のいくつかの実施形態では、医薬製剤は、水や正常生理食塩水などの適切な溶媒に入れて筋肉内投与に供すべく、おそらく担体又は他の作用剤を含む無菌製剤として調製される。
【０２４４】
「医薬担体」又は「賦形剤」は、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁化剤、又は１つ以上の核酸を動物に送達するための任意の他の薬理学的に不活性な媒体でありうるとともに、当技術分野で公知である。賦形剤は、液体であっても固体であってもよく、核酸と所与の医薬組成物の他の成分とを組み合わせたときに所望のバルク、稠度などを提供するように、計画された投与方式を踏まえて選択される。
【０２４５】
本明細書に提供される組成物は、２つ以上のアンチセンス化合物を含有しうる。他の関連実施形態では、組成物は、配列番号１に標的化された１つ以上のアンチセンス化合物とくにオリゴヌクレオチドと、治療される患者に適しうる第２の核酸標的に標的化された１つ以上の追加のアンチセンス化合物と、を含有しうる。代替的に、本明細書に提供される組成物は、同一の核酸標的の異なる領域に標的化された２つ以上のアンチセンス化合物を含有しうる。２つ以上の組み合わされる化合物は、一緒に又は逐次的に使用しうる。組成物はまた、他の非アンチセンス化合物治療剤と組み合わせることも可能である。
【０２４６】
本明細書に記載のアンチセンスオリゴマー化合物は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合状態でありうる。かかる賦形剤は、懸濁化剤、たとえば、ポリビニルピロリドン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、ナトリウムアルギネート、トラガカントガム、アカシアガムであり、分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、たとえば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、たとえば、ポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖状脂肪族アルコールとの縮合生成物、たとえば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、たとえば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物、たとえば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートでありうる。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存剤、たとえば、エチル又はｎ−プロピルのｐ−ヒドロキシベンゾエートを含有しうる。水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性の粉末剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤、及び１つ以上の保存剤と混合して活性成分を提供する。アンチセンスオリゴマー化合物の組成物は、無菌注射剤の水性又は油性の懸濁液の形態でありうる。サスペンジョン剤は、以上に挙げた好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて公知の技術に従って製剤化しうる。無菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒に入れた無菌の注射用の溶液剤又はサスペンジョン剤、たとえば、１，３−ブタンジオールの溶液剤でありうる。利用しうる許容可能な媒体及び溶媒は、とくに、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液である。そのほかに、無菌固定油が溶媒又は懸濁媒体として従来から利用されている。この目的では、合成モノ又はジグリセリドをはじめとする任意の無刺激性固定油を利用可能である。そのほか、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用される。
【０２４７】
本開示はまた、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤の中に薬学的有効量の所望の化合物を含む貯蔵用又は投与用のアンチセンスオリゴマー化合物の組成物を含む。治療に使用される許容可能な担体又は希釈剤は、製薬技術分野で周知であり、たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., A.R. Gennaro edit., 1985)に記載されている。たとえば、保存剤及び安定化剤を提供可能である。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを含む。そのほか、抗酸化剤及び懸濁化剤を使用可能である。
【０２４８】
本開示の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態をとることも可能である。油性相は、植物油又は鉱油又はこれらの混合物でありうる。好適な乳化剤は、天然に存在するガム、たとえば、アカシアガム又はトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、たとえば、ダイズ、レシチン、及び脂肪酸とヘキシトール、その無水物とから誘導されるエステル又は部分エステル、たとえば、ソルビタンモノオレエート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートでありうる。
【０２４９】
本開示のアンチセンスオリゴマー化合物は、治療に好適な組成物を形成するための安定化剤、緩衝液などを用いて又は用いずに任意の標準的手段により患者に投与しうる。リポソーム送達機序の使用が望ましい場合、リポソーム剤形成用の標準プロトコルに従いうる。そのため、本開示のアンチセンスオリゴマー化合物は、任意の形態で、たとえば、筋肉内注射により、又は局所、全身、若しくは脊髄内の注射により投与しうる。
【０２５０】
本開示はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ改変又は長期循環性のリポソーム又はステルスリポソーム）を含有する表面改質リポソームを含むアンチセンスオリゴマー化合物の組成物の使用を特徴とする。こうした製剤は、標的組織へのアンチセンスオリゴマー化合物の蓄積を増加させる方法を提供する。このクラスの薬剤担体は、単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン化及び排除に対して耐性があるので、カプセル化アンチセンスオリゴマー化合物は、血液循環時間が長くなり組織暴露が増加する（Lasic et al, Chem. Rev. 95:2601-2627 (1995) and Ishiwata et al, Chem. Pharm. Bull. 43:1005-1011 (1995)。長期循環性リポソームは、とくに、ＭＰＳの組織に蓄積することが知られる従来のカチオン性リポソームと比較して、アンチセンスオリゴマー化合物の薬動学及び薬力学を向上させる（Liu et al, J. Biol. Chem. 42:24864-24870 (1995)、ChoiらのＰＣＴ国際公開第９６／１０３９１号、AnsellらのＰＣＴ国際公開第９６／１０３９０号、HollandらのＰＣＴ国際公開第９６／１０３９２号）。長期循環性リポソームはまた、肝臓や脾臓などの代謝的侵攻性ＭＰＳ組織への蓄積を回避する能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較してヌクレアーゼ分解からアンチセンスオリゴマー化合物を保護する可能性が高い。
【０２５１】
本開示の製剤及び方法に係るアンチセンスオリゴマー化合物の組成物の投与後、試験被験者は、プラセボ治療被験者又は他の好適な対照被験者と比較して、治療された疾患又は障害に関連付けられる１つ以上の症状が約１０％から約９９％までの低減を呈するであろう。
【実施例】
【０２５２】
実施例
細胞培養、シクロヘキシミド処理、及びＡＯＮトランスフェクション
皮膚生検により初代線維芽細胞を取得し、５％ＣＯ２中３７℃で１０％ＦＢＳ（Hyclone）及びペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Gibco）を含む高グルコース（Ｌｏｎｚａ）ＤＭＥＭ中で培養した。４８時間にわたり１００μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）の濃度でシクロヘキシミド処理を行った。ＡＯＮのトランスフェクションは、４．５μｌエンドポーター試薬（Gene Tools）／ｍｌ培地を用いて実施した。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー骨格を有するＡＯＮ（Gene Tools）を２０μＭでトランスフェクトした。
【０２５３】
ｍＲＮＡ分析
すでに記載されているようにｍＲＮＡ分析を実施した（Bergsma, et al., 2015）。簡単に言えば、ＲＮＡを採取し、製造業者のプロトコルに従ってRNAeasyミニプレップキット（Qiagen）を用いて精製した。製造業者の取扱い説明書に従ってiScript（Biorad）を用いて８００ｎｇのＲＮＡに対してｃＤＮＡ合成を実施した。さらなる分析の前にｃＤＮＡを５倍希釈した。FastStart Taqポリメラーゼ（Roche）を用いてサンプルに対してＲＴ−ＰＣＲを実施した。BigDye Terminator v3.1(Thermo)を用いてＰＣＲサンプルに対して配列解析を直接実施した。産物が非常に低レベルで存在した場合、TOPO（登録商標）TA Cloning Kit (Thermo)を用いてTOPOクローニングを実施した。ITaq universal SYBR Green Supermix (Biorad)を用いてＲＴ−ｑＰＣＲを行った。β−アクチンをＲＴ−ｑＰＣＲ分析用の内部対照として使用した。使用したプライマーはすべて、表Ａ及びＢに示される。
【０２５４】
スプライシング予測
５つのアルゴリズム、即ち、SpliceSiteFinder-like (SSF)、MaxEntScan (MES)、NNSplice (NNS)、GeneSplicer (GS)、及びHuman Splicing Finder (HSF)を適用するAlamut Visual v. 2.4.2 (Interactive Biosoftware)を用いてスプライシング予測を実施した。設定は、Molecular Diagnostics at the Department of Clinical Genetics, Erasmus MC, Rotterdam, The Netherlands and are published in Bergsma et al., 2015で標準的診断に使用されるものと同一であった。５つのアルゴリズムで異なる最大スコアが使用される。比較のために、最大スコアを基準にした％としてスコアを計算した。２つ以上のアルゴリズムで≧１０％の変化を有意な閾値として使用した。２００ベースのウィンドウ範囲を用いて相対スプライス部位強度も予測した(Mucaki et al., 2013)を有するASSEDA (http://splice.uwo.ca/; version August 2014)。
【０２５５】
シーケンシング
Molecular Diagnostics at the Department of Clinical Genetics, Erasmus MC, Rotterdam, The NetherlandsでゲノムＤＮＡ変異体を同定した。Big Dye Terminator kit v3.1 (Applied Biosystems)を用いてフランキングエクソンＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングを実施した。純粋ＤＮＡサンプルを取得するために、ゲル上に見えるＰＣＲ産物を２０μｌピペットチップで突き刺し、チップ上のＤＮＡを１０μｌ  Ｈ２Ｏに再懸濁させた。単一鋳型由来のＤＮＡを取得するために、続いて１μｌアリコートを新しいＰＣＲ（以上に記載の通り）で使用した。製造業者のプロトコルに従ってFastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (Thermo Scientific)を用いて過剰のプライマー及びｄＮＴＰを除去した。セファデックスG-50 (GE Healthcare)を用いてサンプルを精製し、AB3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi)で配列を決定した。
【０２５６】
【表７】
2019528056.tif 000008
【０２５７】
【表８】
2019528056.tif 000009
【０２５８】
タンパク質活性アッセイ
標準溶解緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１％Ｔｘ−１００、プロテアーゼ阻害剤）中で細胞を溶解させた。BCA Protein Assay (Thermo)を用いてタンパク質定量を行った。すでに記載されているように(Kroos, et al., 2007)、ＧＡＡ酵素活性を測定するために４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）−α−Ｄ−グルコピラノシドアッセイを実施した。
【０２５９】
残存ＧＡＡ酵素活性が低いが不在ではない日本人患者由来の初代線維芽細胞の分析を行って調べた。ここに記載の患者はポンペ病と診断されており、２つの病原性ＧＡＡ変異体ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ及びｃ．１７９８Ｃ＞Ｇを含有する。ｃ．１７９８Ｃ＞Ｇ変異体はｐ．Ａｒｇ６００Ｈｉｓミスセンス変異体である。ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体はサイレントＧＡＡ変異体である。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測分析では、エクソン２のスプライスドナー部位を弱化しうることが示された（Maimaiti et al., 2009; Figure 1F）。以前の分析ではＧＡＡの低レベルのリーキー野生型発現を引き起こすことが示されたが、これまでのところ異常スプライシング産物は報告されていない（Maimaiti et al., 2009）。我々は、この度、以下に記載される我々のスプライシングアッセイを用いてこれらを検出した。以下の記載では、文字Ａ、Ｂ、Ｃなどは、図１のパネルを意味する。図１Ａ）では、すべてのＧＡＡエクソンのフランキングエクソンＲＴ−ＰＣＲを実施した。これから健常対照者由来細胞に存在していないエクソン２の２つの異常スプライス産物（３６及び３７）が明らかにされた（Bergsma et al., 2015）。図１Ｂ）配列解析では、ｃ．４８６の潜在スプライスアクセプター部位の利用を介するエクソン２の完全スキップとして産物３７及びエクソン２の部分スキップとして産物３６を同定した。産物３５は、エクソン２の野生型スプライシングを示した。エクソン２のこうしたスプライシングイベントは、通常のｃ．−３２−１３Ｃ＞Ｔ（ＩＶＳ１）ＧＡＡ変異体を有する患者で観測されるものに類似していていた（Bergsma et al., 2015）。しかしながら、異常産物３６及び３７のレベルは、ＩＶＳ１患者と比較してかなり低いことから、エクソン２の部分スキッピング及び完全スキッピングは、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体の病原作用の主な原因ではないことが示唆される。図１Ｃ）コードエクソン２〜２０のエクソン−インターナルＲＴ−ｑＰＣＲでは、エクソンはすべて、健常対照者由来細胞で観測されるものの５０％のレベルで発現されることが示された。ＧＡＡ発現の大多数は、エクソン１３の配列解析（データは示されていない）により示唆されるようにｃ．１７９８Ｃ＞Ｇ対立遺伝子に由来する。このことから、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ対立遺伝子は、適正なｍＲＮＡ発現を妨害してきわめて病原性であることが示唆される。図１Ｄ）では、ナンセンス媒介崩壊経路によるｍＲＮＡ分解を阻害するために、我々はＲＮＡ単離及びフランキングエクソンＲＴ−ＰＣＲ分析の前にシクロヘキシミドで細胞を処理した。これによりＡ）で観測されなかったいくつかの追加の産物が同定された。図１Ｅ）産物３８は、イントロン２リテンション及びｃ．５４６＋１８４の潜在スプライスドナー部位の利用を示した（図２Ａの配列も参照されたい）。この産物は、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体によりエクソン２のカノニカルスプライスドナー部位が弱化されることにより次に利用可能なｃ．５４６＋１８４のスプライスドナーの利用をもたらすとして説明可能である。産物３８は、フレーム外にありｍＲＮＡ分解を受ける可能性が高いので、シクロヘキシミド処理を行わない細胞内でなぜ検出されなかったが説明される。産物３９は、ｃ．１７９８Ｃ＞Ｇ対立遺伝子に由来する野生���エクソン２スプライシングを示した。同一異常スプライシングがエクソン３の増幅から検出された。産物４０は、イントロン２の同一部分リテンションを有する産物３８のカウンターパートであり、産物４１は、野生型エクソン３スプライシングを示す。産物４０’は、産物４０と同一であり、変性／再生のサイクル後に消失したＰＣＲ産物のコンフォメーション変化の結果であった（図２Ｂ）。図１Ｆ）では、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体との関連でエクソン２のスプライスドナー部位のスプライス予測を実施した。このことから、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体に起因して予測スプライス部位強度の顕著な弱化が示された。図１Ｇ）では、ｃ．５４６＋１８４に同定された潜在スプライスドナーを標的とするＡＯＮイントロン２を設計した。ＡＯＮの配列が示されている。図２Ｃでは、ｃ．５４６＋１８４の近傍の領域のスプライス予測と共にゲノム領域が示されている。このことから、ｃ．５４６＋１８４潜在スプライス部位は強い天然スプライスドナー部位であると予測されることが示された。図１Ｈ）患者４由来の初代線維芽細胞は、未処理、エンドポーターのみで処理、又はエンドポーター＋ＡＯＮイントロン２で処理のいずれかであった。４８時間後、細胞を採取し、記載されるように４−ＭＵを基質として用いてＧＡＡ酵素活性を決定した（Bergsma et al., 2015）。このことから、ＡＯＮイントロン２はＧＡＡ酵素活性を３倍に増加させることが示された。
【０２６０】
ｃ．５４６＋１８４の潜在スプライス部位を取り囲む標的領域を明確化するために、５つのＡＯＮを作製した（図３Ａ及び３Ｂ）。ＡＯＮは、ｃ．５４６Ｇ＞Ｔ変異体を有する患者に由来する初代線維芽細胞にトランスフェクトした。ＡＯＮ２及び３（それぞれ、配列番号９３及び１０６）は、それぞれ、ＧＡＡ活性を１．８倍及び２．２倍に増加させることが、結果から示唆される（図３Ｃ）。さらに、ＡＯＮ１は、ＧＡＡ活性の変化をなんら示さず、ＡＯＮ４及び５は、両方ともＧＡＡ活性をわずかに減少させた（１．３倍）。これによりｃ．５４６＋１６２とｃ．５４６＋２０５との間の好ましい標的領域が決定され、前記領域の少なくとも一部を標的とする好ましいＡＯＮが得られる。
【０２６１】
参照文献
Ｂｅｒｇｓｍａ  ＡＪ，Ｋｒｏｏｓ  Ｍ，Ｈｏｏｇｅｖｅｅｎ−Ｗｅｓｔｅｒｖｅｌｄ  Ｍ，Ｈａｌｌｅｙ  Ｄ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ  ＡＴ，Ｐｉｊｎａｐｐｅｌ  ＷＷ．２０１５．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ＧＡＡ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ３６（１）：５７−６８．
Ｇｏｒｔ  Ｌ，Ｃｏｌｌ  ＭＪ，Ｃｈａｂａｓ  Ａ．２００７．Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｉｎ  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃ．１０７６−１Ｇ＞Ｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ９２：１８３−１８７．
Ｈｅｒｍａｎｓ  ＭＰ，ｖａｎ  Ｌｅｅｎｅｎ  Ｄ，Ｋｒｏｏｓ  ＭＡ，Ｂｅｅｓｌｅｙ  ＣＥ，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ  ＡＴ，ＳａｋｕｒａｂａＨ，Ｗｅｖｅｒｓ  Ｒ，Ｋｌｅｉｊｅｒ  Ｗ，ＭｉｃｈｅｌａｋａｋｉｓＨ，Ｋｉｒｋ  ＥＰ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  Ｊ，Ｂｏｓｓｈａｒｄ  Ｎ，Ｂａｓｅｌ−Ｖａｎａｇａｉｔｅ  Ｌ，Ｂｅｓｌｅｙ  Ｇ，Ｒｅｕｓｅｒ  ＡＪＪ．２００４．Ｔｗｅｎｔｏ−Ｔｗｏ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｇｅｎｅ（ＧＡＡ）Ｕｎｄｅｒｓｃｏｒｅ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ  ２３：４７−５６．
Ｋｒｏｏｓ  ＭＡ，Ｐｏｍｐｏｎｉｏ  ＲＪ，Ｈａｇｅｍａｎｓ  ＭＬ，Ｋｅｕｌｅｍａｎｓ  ＪＬ，Ｐｈｉｐｐｓ  Ｍ，ＤｅＲｉｓｏ  Ｍ，Ｐａｌｍｅｒ  ＲＥ，Ａｕｓｅｍｓ  ＭＧ，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｅｅｋ  ＮＡ，Ｖａｎ  Ｄｉｇｇｅｌｅｎ  ＯＰ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ．２００７．Ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｃ．−３２−１３Ｔ−＞ＧＨａｐｌｏｔｙｐｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６８（２）：１１０−５．
Ｍａｉｍａｉｔｉ  Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｏｋａｊｉｍａ  Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，Ｏｈｉｎａｔａ  Ｊ，Ａｒａｋｉ  Ａ，ＴａｎａｋａＨ，Ｍｕｋａｉ  Ｔ，Ｆｕｊｉｅｄａ  Ｋ．２００９．Ｓｉｌｅｎｔ  ｅｘｏｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｉｄ−ａｌｐｈａ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｂｙ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．ＪＨｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５４（８）：４９３−６．
【図１Ａ】
2019528056.tif 000010
【図１Ｂ】
2019528056.tif 000011
【図１Ｃ】
2019528056.tif 000012
【図１Ｄ】
2019528056.tif 000013
【図１Ｅ】
2019528056.tif 000014
【図１Ｆ】
2019528056.tif 000015
【図１Ｇ】
2019528056.tif 000016
【図１Ｈ】
2019528056.tif 000017
【図２Ａ】
2019528056.tif 000018
【図２Ｂ】
2019528056.tif 000019
【図２Ｃ】
2019528056.tif 000020
【図３】
2019528056.tif 000021
【配列表】
2019528056000001.app
【国際調査報告】
2019528056.tif 000022
2019528056.tif 000023