(57)【要約】【課題】  反応時に標的物質の捕捉能を有する粒子凝集体を形成させ、多孔質体を構成し、見かけ上の反応表面積の増大と標的物質の拡散距離を短くすることで、標的物質の捕捉反応効率を上げる捕捉方法およびその装置を提供すること。【解決手段】  再分散可能な状態に凝集させることができる粒子に標的物質の捕捉体を担持させて、これを流路の所定領域で凝集させて標的物質を含む検体と反応させて、反応表面積の増大と標的物質の拡散距離を短くすることで、標的物質の捕捉反応効率を上げる。【選択図】    図３
2006010535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的物質を捕捉する方法であって、
前記標的物質の捕捉能を有する粒子を、流体中で分散した状態で用意する工程と、
前記粒子を凝集させる工程と、
凝集した前記粒子に前記検体を接触させることで、前記検体中の標的物質を前記粒子に捕捉させる工程と
を有することを特徴とする標的物質捕捉方法。
【請求項２】
前記捕捉工程後に、捕捉されていない物質を除去する工程を更に有する請求項１に記載の標的物質捕捉方法。
【請求項３】
前記粒子に捕捉された標的物質を検出する工程を更に有する請求項１または２に記載の標的物質捕捉方法。
【請求項４】
前記捕捉工程後に、前記粒子を再分散させた後、前記粒子に捕捉された標的物質を検出する工程を更に有する請求項１乃至３のいずれかに記載の標的物質捕捉方法。
【請求項５】
前記粒子を流体中に再分散させた後、前記粒子を回収する工程を更に有する請求項１乃至４のいずれかに記載標的物質捕捉方法。
【請求項６】
前記粒子は磁性を有し、前記粒子の凝集を外部から磁界を印加することで行う請求項１乃至５のいずれかに記載の標的物質捕捉方法。
【請求項７】
検体中の標的物質を捕捉するための装置であって、
前記検体を搬送するための流路と、
前記流路内に固定され、前記標的物質の捕捉能を有する粒子と、
前記流路中において前記粒子を凝集させるための凝集手段と、
前記流路中に前記検体を搬送するための搬送手段と、
を有することを特徴とする標的物質捕捉装置。
【請求項８】
前記凝集手段により凝集された粒子に前記標的物質が捕捉されたことを検出するための検出手段を更に有することを特徴とする請求項７記載の標的物質捕捉装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性微粒子を利用した標的物質の捕捉方法および該方法を用いた装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質や核酸などの生体物質や、ガスなどの化学物質を検出する目的で使用されるセンサにおいて、反応部位の表面積は、その検出感度や反応速度を支配する重要な因子であり、表面積の増大は即ち、センサの特性向上につながる。従来より基材として多孔質体を用いることにより、検出対象との反応性物質を多量に保持させる方法が提案されている。この目的のため、基材として、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などのミクロフィルター、紙、不織布、糸などを使用する方法が知られている。多孔質体は、実質表面積が見かけの表面積の千倍〜一万倍にも上るため、表面に多くの標的物資捕捉機能を有する成分を固定又は担持することができる。特許文献１または特許文献２には、表面多孔体の製造方法が記載されている。また、特許文献３には、多孔体を用いた高感度小型二酸化窒素濃度モニタリングシステムが提案されている。
【特許文献１】特開２０００−１５６５号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０５号公報
【特許文献３】特開平９−２７４０３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、微量成分を選択的に検出するために捕捉反応後の洗浄時に、高感度化のために表面積を増大させた結果、多孔質体の隅々まで効率よく洗浄することは困難であることが多い。洗浄によって非標的物質など検出対象とならない物質を除去する場合、多孔質体に残存する量が標的物質の量に対して問題とならないほど微量であれば、問題はないが、検体中の標的物質量が微量であると、測定に影響する成分の洗浄除去率が高いことが要求される。また、微小流路中で多孔質体を用いた場合、流動抵抗を現実的な範囲に収めると、多孔質体が散乱体として振る舞い、光学検出には適さない場合がある。ガスセンサの場合は、細孔径がナノメートルオーダーと非常に小さく、このような多孔質体は溶液系で用いるには浸透性・反応性の問題や、微小流路で用いる場合には、流動抵抗などの問題が同様にある。
【０００４】
本発明はこのような背景技術に鑑みてなされたものであり、反応時に標的物質の捕捉能を有する粒子凝集体を形成させ、多孔質体を構成し、見かけ上の反応表面積の増大と標的物質の拡散距離を短くすることで、標的物質の捕捉反応効率を上げる捕捉方法およびその装置を提供するものである。また、本発明は、粒子として可逆的な凝集を生じるものを用いて、粒子凝集体と検体との反応後には、粒子凝集体は再分散可能であり、捕捉物質の検出や回収などの別工程に供することができる標的物質の捕捉方法およびそのための装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の検体中の標的物質を捕捉する方法は、
前記標的物質の捕捉能を有する粒子を、流体中で分散した状態で用意する工程と、
前記粒子を凝集させる工程と、
凝集した前記粒子に前記検体を接触させることで、前記検体中の標的物質を前記粒子に捕捉させる工程と
を有することを特徴とする標的物質捕捉方法である。
【０００６】
また、本発明の検体中の標的物質を捕捉するための装置は、
前記検体を搬送するための流路と、
前記流路内に固定され、前記標的物質の捕捉能を有する粒子と、
前記流路中において前記粒子を凝集させるための凝集手段と、
前記流路中に前記検体を搬送するための搬送手段と、
を有することを特徴とする標的物質捕捉装置である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、流路内に標的物質の捕捉能を有する微粒子を導入し、流路中の所望の領域に微粒子を凝集させた後に、検体を流路中に導入し、前記微粒子と検体中の標的物質を反応させることによる標的物質捕捉方法を提供するとともに、捕捉反応後は、前記微粒子凝集体は再分散可能であり、検出や回収などの別工程に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本実施の形態の検体中の標的物質を捕捉する方法は、流路に標的物質の捕捉能を有する粒子を導入する工程と、流路中の所望の領域（捕捉反応領域）で粒子を凝集させて、凝集体としてこの領域内に保持する工程、および凝集工程後に検体を流路中に導入し、粒子に検体中の標的物質を捕捉させる工程を有する。また、後工程として、洗浄工程及び標的物質の検出工程の少なくとも一方を有することができる。
【０００９】
流路中で粒子を搬送するための媒体としては粒子の搬送、凝集、検出などの本発明で目的とする操作を可能とする液体や気体が利用できる。粒子の粒径としては、０．０２μｍ〜２０μｍの範囲とすることが好ましく、更に下限は１μｍであることが更に好ましい。粒子表面は、必要に応じて粒子同士の結着や付着を防ぐ表面処理がなされたものでもよい。表面処理としてはＢＳＡ、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、カゼインなどを表面に付着させる処理を挙げることができる。また、検出時に流路中の粒子を搬送させる媒体は流動させた状態でも、媒体の流れを止めた状態でもよい。
【００１０】
なお、凝集体での検出を行わずに、後工程として粒子の再分散を行ってから、必要に応じて洗浄工程を行ってから、標的物質の検出工程を行うこともできる。更に、後工程として粒子の再分散および回収工程を有することで、捕捉された標的物質や粒子を回収して、検出やその他の用途にこれを利用することもできる。標的物質を捕捉するための粒子は、磁性微粒子であることが好ましく、凝集工程としては、外部磁界印加工程であることが好ましい。
【００１１】
一方、本実施の形態における装置は、検体中の標的物質を捕捉する装置であって、流路に標的物質の捕捉能を有する粒子を導入するための手段と、流路中の所望の領域（捕捉反応領域）で粒子を凝集させるための手段、および粒子の凝集後に検体を流路中に導入し、凝集状態にある粒子に検体中の標的物質を捕捉させるための手段と、を有することを特徴としている。また、後工程として洗浄のための洗浄手段を有するものであってもよい。更に、本実施の形態の標的物質捕捉装置は、標的物質の検出手段を有するものであってもよい。なお、検出手段は、凝集体での検出を行わずに、粒子を再分散させた状態で標的物質の検出を行うものであってもよく、この場合は粒子の再分散手段を有する。また、本実施の形態の装置は、粒子の再分散および回収手段を有することで、捕捉された標的物質や粒子を回収して、検出、分離などの所望の目的にこれらを利用できるような構成を有することもできる。なお、この装置についても、粒子は、磁性微粒子であることが好ましく、凝集手段としては、外部磁界印加手段であることが好ましい。
【００１２】
以下に、磁性微粒子を用いた場合について本発明の標的物質捕捉方法および装置を、図面を用いてより詳細に説明する。本発明の標的物質捕捉方法および装置の一般的な構成は、図１に代表されるようなマイクロ流体チップ型であることが好ましいが、キャピラリー等のマイクロ流体チップ型以外であってもよいことは言うまでもない。また、図２に検出部５と凝集手段６が流路３に対して同じ位置に設けられている例を示す。この場合、凝集手段６が永久磁石や電磁石等の磁界発生手段であることが好ましく、検出部５は、光電子増倍管、CCD等の光学的な検出素子を有して構成されたものであることが好ましい。
【００１３】
磁性微粒子を含む搬送液は、図１に示す基材に設けられたインレット２より流路３に導入され、流路３中をシリンジポンプ等（不図示）を有する搬送手段により搬送される。なお、図２は、凝集手段６を作動させていない状態を示している。また、この装置では、磁性微粒子導入手段及び検体搬送手段をこのシリンジポンプ等を有する搬送手段が構成している。
【００１４】
ここで、磁界印加による凝集手段６を動作させると磁性微粒子７は図３に模式的に表したように捕捉反応領域としての微粒子凝集部に凝集体を形成する。この凝集体は、多孔質体と同様の機能を有し、流体の搬送を考慮すると、マイクロメートルオーダーの空隙を有するものであることが好ましい。言うまでもないが、空隙サイズや割合は、微粒子の粒径や凝集度で制御することができる。また、凝集度は、外部から印加する磁界の強度と磁性微粒子の磁性との組合せによって調整することができる。更に、凝集密度を捕捉反応効率を向上させ、かつ洗浄効果が良好である程度に調整することで、より高感度の標的物質の捕捉及びその検出を行なうことができる。すなわち、本発明における標的物質捕捉用の粒子は、上記の磁性微粒子を用いている場合に代表されるように、最初の分散状態に再分散可能な凝集、すなわち可逆的な凝集を生じ得るものである。そして、その凝集状態は、検体中の標的物質との効果的な反応に必要な粒子密度を捕捉反応領域中に形成した状態となっており、磁性微粒子を用いた場合はこの凝集状態を磁界の強度などで調整可能である。
【００１５】
磁性微粒子は、以下に挙げるようなものであればいずれも可能である。磁性粒子の材料は特に限定はされず、例えばＮｉ粒子や金属鉄、Ｆｅ3Ｏ4、γ-Ｆｅ2Ｏ3、Ｃｏ-γ-Ｆｅ2Ｏ3、（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ2Ｏ3、（ＭｎＺｎ）Ｏ・Ｆｅ2Ｏ3、（ＮｉＺｎ）Ｏ・Ｆｅ2Ｏ3、ＳｒＯ・６Ｆｅ2Ｏ3、ＢａＯ・６Ｆｅ2Ｏ3、ＳｉＯ2で被覆したＦｅ3Ｏ4（粒径２００Å）[Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.,ｖｏｌ.２，ｐ２-１０（１９８０）参照]等の各種フェライトと各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等）との複合粒子などを挙げることができる。
【００１６】
図３のような状態では、微粒子は微粒子凝集部に凝集体としてトラップされ、搬送液はこの凝集体の中を流れていく。また、微粒子表面には、標的物質を特異的に捕捉するために抗体等の捕捉体が固定化されていることで、図４（Ａ）にあるような捕捉能を有する。これにより、凝集体は標的物質を特異的に捕捉できるような機能性の多孔質として利用することができる。各々の微粒子は、溶液中の標的物質と反応することで、図４(Ｂ)のように微粒子７の表面に固定した捕捉体８により標的物質９を特異的に捕捉することができる。よって、言うまでもないが、このような多孔質体は、対象溶液中から特定の物質を検出することや、特定の物質を分離・除去することに用いることができる。
【００１７】
光学的に検出できる標識を利用する場合は、例えば図４(Ｃ)にあるように、標的物質９を特異的に認識する２次抗体（標識抗体）１０を利用することができる。これにより、酵素標識抗体との組合せによる電極による検出、蛍光標識抗体、化学発光標識抗体との組合せによる光検出が可能である。酵素標識には、例えば、グルコース酸化酵素、コリン酸化酵素、ラクトース酸化酵素などが挙げられる。また、蛍光標識物質としては、例えば、５−カルボキシフルオレセイン、Ｑｕｅｎｅ−１（８−アミノ−２−（トランス−２−アミノスチリル）−６−メトキシキノリン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸，テトラナトリウム塩）、ＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−４または５−カルボキシフルオレセイン）、ローダミン等が挙げられる。化学発光標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ等が挙げられる。特異的に標識された微粒子は、凝集体のまま保持し、その場で検出してもよいし、凝集手段を解除し、微粒子を再分散させてから検出してもよい。検出部は、凝集部と重なっていてもよいし、流路の下流に位置していてもよい。また、光学的検出手段を用いない場合は、光散乱等の影響を受けないので、特に再分散させる必要は無い。更に、微粒子を再分散させてから別途設けた洗浄用の領域で十分に洗浄してから検出手段での検出を行なうようにしてもよい。
【００１８】
検出対象物質としては、生体物質（タンパク質、核酸、糖鎖）やアレルゲン、バクテリア、ウイルス等の抗体により特異的に認識され、磁性粒子との複合体を形成するものを対象とすることが好ましい。αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＢＣＡ２２５、免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）等の疾患関連たんぱく質は好適である。これらを標的物質とする場合には、これらに特異的な抗体を捕捉体として用いることができる。
【００１９】
一方、分離・除去装置として利用する場合は、凝集体のまま保持させ、特異的に物質を除去するフィルターとして用いてもよいし、凝集手段を解除し、微粒子を再分散させて、標的物質を補足した微粒子を回収してもよい。
【００２０】
本発明の標的物質捕捉方法および装置により、反応時に標的物質の捕捉能を有する微粒子凝集体を形成させ、多孔質体を構成し、見かけ上の反応表面積の増大と標的物質の拡散距離を短くすることで、標的物質の捕捉反応効率を上げることができる。また、反応後には、微粒子凝集体は磁界の印加を解除することで再分散可能であり、捕捉物質の検出や回収などの別工程に供することができる。
【００２１】
本発明における標的物質捕捉用の粒子は、上記の磁性微粒子を用いている場合に代表されるように、最初の分散状態に再分散可能な凝集、すなわち可逆的な凝集を生じ得るものである。そして、その凝集状態は、検体中の標的物質との効果的な反応に必要な粒子密度を捕捉反応領域中に形成した状態となっており、磁性微粒子を用いた場合はこの凝集状態を磁界の強度などで調整可能である。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
[第１の実施例]
図５は、本発明の第１の実施例の標的物質の捕捉方法を説明するための概略図である。図５の標的物質捕捉装置は、基材（基板）１に、流路３と、流路３に微粒子や標的物資を含む搬送液を導入するインレット２と、流路３から微粒子や標的物質を搬送した搬送液を排出するアウトレット４と、が形成されている。インレット２とアウトレット４の間には、微粒子凝集部と検出部が複数ある。
【００２３】
次に、図５の捕捉装置は、基板１としてＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）樹脂基板とガラス基板とを貼り合わせたものを用いる。シリコン基板上にフォトリソグラフィ技術により微細構造を形成した厚膜感光性樹脂を鋳型としてモールディング法によりＰＤＭＳ基板の所定部を除去することで幅１００μｍ、深さ５０μｍの流路３を形成し、更に、溝の上部開口に平坦なガラス基板の覆いと張り合わせて得られたものである。搬送液と標的物質とを流路３に導入するインレット２からの送液は、シリンジポンプなどにより行う。
【００２４】
凝集体形成に用いる磁性微粒子として、市販の超常磁性微粒子表面をプロテインＡによりコートしたＭｉｃｒｏｍｏｄ社（ドイツ）製のｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ  １０μｍ径を用いた。これによってプロテインＡとＩｇＧ抗体のＦｃ領域は特異的に結合するため、任意の抗体の固定化を行うことができるようにする。ここでは、標的物質として、ヒトαフェトプロテイン（ＡＦＰ）及びヒト塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）の２種類をリン酸緩衝液に溶解したものを用いる。ヒトＡＦＰに対するウサギ由来ポリクローナル抗体とヒトＢＦＰに対するウサギ由来ポリクローナル抗体をそれぞれ別の磁性微粒子に固定化する。
【００２５】
本実施例では、２種類の検出対象物質を扱うので、まず、凝集部Ｂで凝集体を形成させる抗ヒトＡＦＰ抗体修飾磁性微粒子を、凝集部Ａでの凝集が生じないようにして（例えば、凝集部Ａでは磁界をかけずにおいて）インレット２より導入する。この時、図６のように凝集部Ｂに備えられた磁石１１により凝集部Ｂに抗ヒトＡＦＰ抗体修飾磁性微粒子の凝集体が形成される。この凝集体を保持したまま、インレット２より更に凝集部Ａに凝集体を形成させる抗ヒトＢＦＰ抗体修飾磁性微粒子をインレット２より導入し、同様に凝集部Ａに抗ヒトＢＦＰ抗体修飾磁性微粒子の凝集体を形成し保持する。
【００２６】
ここで、検出対象物質である、ヒトＡＦＰおよびヒトＢＦＰを含むリン酸緩衝液をインレット２より導入し、それぞれ凝集部Ｂおよび凝集部Ａに特異的に捕捉させる。リン酸緩衝液を流し、非特異的に流路内に残存している物質の洗浄を行う。更に、検出対象物質にそれぞれ特異的に結合する、５−カルボキシフルオレセイン標識抗ヒトＡＦＰ抗体およびローダミン標識抗ヒトＢＦＰ抗体をインレット２より導入し、検出対象物質を補足した磁性微粒子を蛍光標識する。同様にリン酸緩衝液を流し、非特異的に流路内に残存している物質の洗浄を行う。
【００２７】
捕捉された標的物質の検出は、図７にあるような検出系を検出部ＡおよびＢに構成し、ガラスからなる覆いを介してレーザー光を照射することで前記標識に蛍光を生じさせ、その強度を基材１を介して光電子倍増管１７で測定し、濃度既知の標的物質により予め作成しておいた検量線から標的物質ヒトＡＦＰおよびヒトＢＦＰの定量を行う。検出に先立って、リン酸緩衝液を導入しながら凝集部より磁界を除くことで、磁性微粒子を再分散させ、検出部に搬送する。好ましくは、下流に位置する凝集部Ｂおよび検出部Ｂでの検出から実施した方が都合がよいということは言うまでもない。
【００２８】
[第２の実施例]
第１の実施例と同様に、標的物質を流路中の微粒子凝集部に特異的に補足する。本実施例では、対象溶液中に含まれるウィルスの除去を目的とし、アデノウィルスに特異的に結合する抗体を磁性微粒子表面に固定化し、微粒子凝集部に特異的に補足し、対象溶液からアデノウィルスを除去する。アデノウィルスを補足した磁性微粒子は、凝集部の磁界を除き再分散させ、同時にリン酸緩衝液をインレット２より導入してアウトレット４から回収することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の標的物質捕捉方法および装置の１例を示す概略図である。
【図２】図１の流路内の様子を示す概略図である。
【図３】図１の微粒子凝集部を示す概略図である。
【図４】本発明の微粒子の構成を示す概略図である。
【図５】第１の実施例を示す概略図である。
【図６】第１の実施例の微粒子凝集部を示す概略図である。
【図７】第１の実施例の検出部を示す概略図である。
【符号の説明】
【００３０】
１  基材
２  インレット
３  流路（微小流路）
４  アウトレット
５  検出部
６  凝集手段
７  粒子（微粒子、磁性微粒子）
７ａ  標的物質を捕捉した粒子
７ｂ  捕捉された標的物質を更に標識した粒子
８  捕捉体
９  標的物質
１０  標識抗体
１１  磁石
１２  レーザーダイオード
１３、１５  コリメータレンズ
１４ａ  平行入射光
１４ｂ  透過光
１６  光学フィルター
１７  光電子倍増管
【図１】
2006010535.tif 000003
【図２】
2006010535.tif 000004
【図３】
2006010535.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2006010535.tif 000008
【図７】
2006010535.tif 000009