(57)【要約】  本発明は、未変性コラーゲンに基づくバイオインク、それを含むキット、および、バイオインクを用いて三次元構造をプリントする方法に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
未変性コラーゲンを含むバイオインクであって、
前記バイオインクは、室温において、約１００〜約１５０，０００Ｐａの静剛性および０．００１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で約５０Ｐａ未満の剪断剛性を有する、
バイオインク。
【請求項２】
３ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性コラーゲンを含むバイオインクであって、
ここでコラーゲンは、前記バイオインク内の唯一の細胞外マトリックスタンパク質である、
バイオインク。
【請求項３】
１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性中和化コラーゲンおよび架橋剤を含む、
バイオインク。
【請求項４】
１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性コラーゲンを含むバイオインクであって、
前記バイオインクは、中和した場合に、１０℃よりも高い温度でゲル化する、
バイオインク。
【請求項５】
１０ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性酸性化コラーゲンを含む、
バイオインク。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、沈殿コラーゲンである、
バイオインク。
【請求項７】
１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性沈殿コラーゲンを含む、
バイオインク。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンの濃度は、５ｍｇ／ｍｌよりも高い、
バイオインク。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンの濃度は、１０ｍｇ／ｍｌよりも高い、
バイオインク。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである、
バイオインク。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、テロコラーゲンである、
バイオインク。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、アテロコラーゲンである、
バイオインク。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、テロコラーゲンおよびアテロコラーゲンの混合物である、
バイオインク。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項のバイオインクであって、
１よりも多いタイプのコラーゲンを含む、
バイオインク。
【請求項１５】
請求項１および３から１４のいずれか一項のバイオインクであって、
ここでコラーゲンは、前記バイオインク内の唯一の細胞外マトリックスタンパク質である、
バイオインク。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、前記コラーゲンの架橋を可能にする化学基によって改変される、
バイオインク。
【請求項１７】
請求項１６のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、メタクリレート、アクリレート、ジビニルスルホン、またはそれらの任意の組み合わせによって改変される、
バイオインク。
【請求項１８】
請求項１６または１７のバイオインクであって、
前記化学基は、細胞に非毒性である条件下で架橋を可能にする、
バイオインク。
【請求項１９】
請求項１から１５のいずれか一項のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、前記コラーゲンの化学的改変を伴わずに架橋され得る、
バイオインク。
【請求項２０】
請求項１７のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、リボフラビン、ＧｅｌＭＡ、ＰＥＧＤＡ、アルギン酸、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ゲニピン、アンモニウム誘導体、光開始剤、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）、ＬＡＰ（リチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート）、ルテニウム、またはそれらの任意の組み合わせによって架橋され得る、
バイオインク。
【請求項２１】
請求項１９のバイオインクであって、
前記コラーゲンは、光開始剤および光曝露によって架橋され得る、
バイオインク。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項のバイオインクであって、
添加剤をさらに含む、
バイオインク。
【請求項２３】
請求項２２のバイオインクであって、
前記添加剤は、架橋剤、硬化剤、合成材料、またはそれらの任意の組み合わせである、
バイオインク。
【請求項２４】
請求項２２のバイオインクであって、
前記添加剤は、リボフラビン、ＧｅｌＭＡ、ＰＥＧＤＡ、アルギン酸、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ゲニピン、アンモニウム誘導体、光開始剤、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）、ＬＡＰ（リチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート）、ルテニウム、またはそれらの任意の組み合わせから選択される架橋剤である、
バイオインク。
【請求項２５】
請求項２２のバイオインクであって、
前記添加剤は、カーボンナノチューブ、炭素繊維、バイオガラス、リン酸カルシウムセラミック、ナノセルロース、カーボンナノブラシ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される硬化剤である、
バイオインク。
【請求項２６】
請求項２２のバイオインクであって、
前記添加剤は、タンパク質、グリコサミノグリカン、増殖因子、またはそれらの任意の組み合わせである、
バイオインク。
【請求項２７】
請求項２２のバイオインクであって、
前記添加剤は、細胞外マトリックス分子、脱細胞化組織、またはそれらの任意の組み合わせである、
バイオインク。
【請求項２８】
請求項２７のバイオインクであって、
前記の細胞外マトリックス分子または脱細胞化組織は、心臓、肺、腎臓、肝臓、皮膚、胎盤、腸または膀胱組織由来であり、任意選択で可溶化されていてもよい、
バイオインク。
【請求項２９】
請求項１、３から１４、および１６から２８のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、異なる細胞外マトリックス分子をさらに含む、
バイオインク。
【請求項３０】
請求項２９のバイオインクであって、
前記の異なる細胞外マトリックス分子は、ヒアルロン酸である、
バイオインク。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれか一項のバイオインクであって、
生理学的塩類をさらに含む、
バイオインク。
【請求項３２】
請求項１から３０のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、中性ｐＨである、
バイオインク。
【請求項３３】
請求項１から３０のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、酸性または塩基性ｐＨである、
バイオインク。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、滅菌される、
バイオインク。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、細胞をさらに含む、
バイオインク。
【請求項３６】
請求項３５のバイオインクであって、
前記バイオインクは、１よりも多いタイプの細胞を含む、
バイオインク。
【請求項３７】
請求項２から３６のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、約１００〜約１５０，０００Ｐａの静剛性および０．００１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で約５０Ｐａ未満の剪断剛性を有する、
バイオインク。
【請求項３８】
請求項１から３７のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、２５０μｍ未満の直径を有するノズルまたはオリフィスを通して押し出され得る、
バイオインク。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、室温において３Ｄ構造をプリントするために用いられ得る、
バイオインク。
【請求項４０】
請求項１から３９のいずれか一項のバイオインクであって、
前記バイオインクは、プリントの１分以内に１００Ｐａよりも大きな静剛性を達成する、
バイオインク。
【請求項４１】
１００〜１５０，０００Ｐａの静剛性、および、０．００１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で約５０Ｐａ未満の剪断剛性を有し、プリントの１５分以内にその静剛性の少なくとも２０％を取り戻す、
揺変性バイオインク。
【請求項４２】
プリントの１分以内に１００Ｐａよりも大きな静剛性を達成する、
未変性コラーゲンに基づくバイオインク。
【請求項４３】
請求項１から４２のいずれか一項のバイオインクを含む、
キット。
【請求項４４】
請求項４３のキットであって、シリンジおよび／またはシリンジ連結体をさらに備える、
キット。
【請求項４５】
バイオインクの調製のためのキットであって、
前記キットは、未変性コラーゲンを含む、
キット。
【請求項４６】
請求項４５のキットであって、
前記コラーゲンは、沈殿コラーゲンである、
キット。
【請求項４７】
請求項４５または４６のキットであって、
前記コラーゲンは、架橋を可能にする化学基によって改変される、
キット。
【請求項４８】
請求項４５から４７のいずれか一項のキットであって、
添加剤、バッファー、溶媒、中和溶液、架橋溶液、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、
キット。
【請求項４９】
未変性コラーゲンを含む３Ｄ構造をプリントする方法であって、
前記方法は、３Ｄプリンターにおいて、請求項１から４２のいずれか一項のバイオインクを使用するステップを含む、
方法。
【請求項５０】
請求項４９の方法であって、
前記３Ｄプリンターは、ロボット分注プリンター、インクジェットプリンター、またはレーザーに基づくプリンターである、
方法。
【請求項５１】
請求項４９または５０の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記３Ｄ構造を架橋するステップをさらに含む、
方法。
【請求項５２】
請求項４９から５１のいずれか一項の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記３Ｄ構造の温度を変更するステップをさらに含む、
方法。
【請求項５３】
請求項４９から５２のいずれか一項の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記３Ｄ構造のｐＨを変更するステップをさらに含む、
方法。
【請求項５４】
請求項４９から５３のいずれか一項の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記３Ｄ構造を光に曝露するステップをさらに含む、
方法。
【請求項５５】
請求項４９から５４のいずれか一項の方法であって、
プリントされるときまたはプリントされた後に、前記３Ｄ構造に細胞を添加するステップをさらに含む、
方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法であって、
前記細胞は、前記３Ｄ構造上にプリントされる、
方法。
【請求項５７】
請求項５５の方法であって、
前記細胞は、プリントされた後に、前記３Ｄ構造と共にインキュベートされる、
方法。
【請求項５８】
請求項４９から５７のいずれか一項の方法であって、
前記バイオインクは、支持培地中にプリントされる、
方法。
【請求項５９】
請求項５８の方法であって、
前記支持培地は、細胞のための栄養分を含む、
方法。
【請求項６０】
請求項５８または５９の方法であって、
前記支持培地は、前記３Ｄ構造に対して一時的な支持を提供する、
方法。
【請求項６１】
請求項６０の方法であって、
前記の一時的な支持は、ゼラチンスラリーによって提供される、
方法。
【請求項６２】
請求項６０の方法であって、
前記の一時的な支持は、ヒドロゲル粒子のスラリーによって提供される、
方法。
【請求項６３】
請求項６０の方法であって、
前記の一時的な支持は、親水性粒子のスラリーによって提供される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の陳述］
本発明は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年１０月１２日に出願された米国仮出願番号６２／４０６，９７７、および、２０１７年７月２５日に出願された米国仮出願番号６２／５３６，７２７の利益を主張し、そのそれぞれの内容全体は、本明細書中に参照により援用される。
【０００２】
［本発明の分野］
本発明は、未変性コラーゲンに基づくバイオインク、それを含むキット、および、バイオインクを用いて三次元構造をプリントする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
三次元（３Ｄ）プリントは、３０年間、成長している動的場（ｄｙｎａｍｉｃ  ｆｉｅｌｄ）となっている。初期のワークは、粗い形状を形成するための粉末化金属のレーザー焼結を用いて始まり、それから最終形態に加工された。技術がこれほどまでに進展したので、今では、仕上げられた製品が、外科的移植を含む工業用の最終用途の適用のために、３Ｄプリンターを用いて製造される。
【０００４】
生物学的構築物の３Ｄバイオプリントは、粉末化された生体適合性熱可塑性プラスチックのレーザー焼結を用いて１９９０年代に始まり、何年にもわたって発展して、冷却、沈殿、乾燥、重合、または架橋を介して最終構造へ固化されるポリマーの添加を介して構造を作る精密な押出技術およびインクジェットプリント法を含む。最近の進歩は、生細胞を含む構造の３Ｄプリントを可能にする「バイオインク」の導入であった。最も有名な今日のバイオインクは、アルギン酸、ゼラチン（変性コラーゲン）、ポリエチレングリコール、および官能化ヒアルロン酸を含む。これらのバイオインクは、一部のより初期の合成の熱可塑性プラスチックおよび選択された細胞と組み合わせて、ほぼ天然の空間定位で様々な細胞型を有するオルガノイドを生産するために用いられている。しかしながら、細胞は、これらの構造では、体内で行なうのと同じように付着、遊走または分化しない。
【０００５】
体内のほぼ全ての細胞は、基底膜、腱、および骨のような細胞外マトリックス構造に付着している。これらの細胞外構造は、細胞およびそれらの挙動に対して何らかの影響を有し、細胞は次々に、細胞外マトリックスを再吸収および置換することができる。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびエラスチンのようなタンパク質、およびしばしば、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸のようなプロテオグリカンからなる。これらのＥＣＭ分子は、様々な細胞が付着および遊走するのを可能にする、および、細胞内の様々な挙動をシグナル伝達するのも可能にする、多くの異なる付着部位およびシグナリングモチーフを含む。ＥＣＭの影響は、培地中の多くの偏好性の細胞型を増殖させる細胞生物学者らの能力に対するキーとなっている。動物へのＥＣＭの移植は、インビボでの応答を促進することも示されている。例えば、血管組織ＥＣＭの移植は、血管内皮および平滑筋細胞、ならびに、ＥＣＭを迅速にコロニー形成してそれからそれを用いて新しい血管構造を再建する幹細胞の、迅速な遊走を促進する。
【０００６】
細胞が３Ｄプリント構造に付着、遊走、および、改造することができるように、ＥＣＭを含むバイオインクにおける強い興味が今日存在する。ゼラチンが試みられている。それは、室温またはそれより下でゲルに固化するが、細胞に好ましいより高い温度（例えば、３７℃）で液化する。したがって、３７℃で構造を維持するためには、化学的に改変または他の材料と混合して、ゼラチンが架橋されるのを可能にしなければならない。ゼラチンは、メタクリレート化されてよく、３Ｄ形状にプリントされてよく、それから、光開始剤の存在下でＵＶ光への曝露によって架橋されてよい。ゼラチンは、フィブリノゲンと混合されてよく、フィブリン架橋のためにトロンビンに曝露されてよい。また、ゼラチンは、アルギン酸と混合されてもよく、アルギン酸架橋のために二価の塩類に曝露されてよい。溶液中のゼラチン粒子は、他のバイオインクを用いたバイオプリントの場合、支持培地としても有用である。反応基によって改変されたヒアルロン酸もまた、同様の様式で用いられている。
【０００７】
コラーゲンは、体内の主なＥＣＭ分子であり、多くの細胞は、それに結合、遊走、再吸収、および改造する能力を有する。少なくとも２８個のタイプのコラーゲンが存在し、１型が最も一般的である。その変性された形態であるゼラチンと同様に、コラーゲンは、低濃度でバイオインクに添加されていて、３７℃でゲル化して細胞付着を促す。しかしながら、そのような低濃度では、シグナリング部位および細胞付着の密度は異常に低く、コラーゲンは、最終的な３Ｄ構造に最小限の構造的一体性を与えることのみ可能である。
【０００８】
ＥＣＭ分子を含む現在のバイオインクは、いくつかの短所を有する。細胞は、合成材料上では付着せず正常に挙動せず、天然ＥＣＭによる材料を再吸収して置換することができない。以前に試験されたＥＣＭバイオインク製剤は、現在、３Ｄプリントに必要とされる機械的特性を有していない。現在までのところのネイティブ材料は、プリントされたときに、剪断減粘して（ｓｈｅａｒ  ｔｈｉｎ）、剛性を取り戻す能力がない。中和化コラーゲンインクは、シリンジ内でゲル化して、プリンターを詰まらせる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、完全にまたは主にコラーゲンで作られたバイオインクおよびそれを用いる方法を提供することによって、当該分野における以前の短所を対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、完全にまたは主にコラーゲンで作られたバイオインクに関する。これらのバイオインクは、例えば中性ｐＨで、細胞と混合され得て、それから、細胞培養培地中にプリントされる。バイオインクは、細胞培養培地中にプリントされた場合、優れた作業時間および剛性を提供する。
【００１１】
したがって、本発明の一態様は、未変性コラーゲンを含むバイオインクに関する。
【００１２】
本発明の別態様は、未変性コラーゲンを含むバイオインクに関し、ここでバイオインクは、室温において、約１００〜約１５０，０００Ｐａの静剛性および０．００１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で約５０Ｐａ未満の剪断剛性を有する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、３ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性コラーゲンを含むバイオインクに関し、ここでコラーゲンは、バイオインク内の唯一の細胞外マトリックスタンパク質である。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性中和化コラーゲンおよび架橋剤を含むバイオインクに関する。
【００１５】
本発明の別態様は、１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性コラーゲンを含むバイオインクに関し、ここでバイオインクは、中和した場合に、１０℃よりも高い温度でゲル化する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、１０ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性酸性化コラーゲンを含む、バイオインクに関する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性沈殿コラーゲンを含む、バイオインクに関する。
【００１８】
本発明の別態様は、１００〜１５０，０００Ｐａの静剛性および０．００１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で約５０Ｐａ未満の剪断剛性を有し、プリントの１５分以内にその静剛性の少なくとも２０％を取り戻す、揺変性バイオインクに関する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、プリントの１分以内に１００Ｐａよりも大きな静剛性を達成する、未変性コラーゲンに基づくバイオインクに関する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、本発明のバイオインクを含むキットに関する。
【００２１】
本発明の別態様は、バイオインクの調製のためのキットに関し、ここでキットは、未変性コラーゲンを含む。
【００２２】
本発明の別態様は、未変性コラーゲンを含む３Ｄ構造をプリントする方法に関し、当該方法は、３Ｄプリンターにおいて本発明のバイオインクを使用するステップを含む。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】支持槽中に中和およびプリントされた、ＴｅｌｏＣｏｌ（登録商標）バイオインクを用いてオーダーメイドの３Ｄプリンター上にプリントされた格子を示す。
【図２】冷却した支持槽中に中和およびプリントされた、ＦｉｂｒｉＣｏｌ（登録商標）バイオインクを用いてオーダーメイドの３Ｄプリンター上にプリントされた大動脈リングを示す。
【図３】中和されて冷却された支持槽中にプリントされてそれからＵＶ架橋された、メタクリレート化コラーゲンバイオインクを用いてオーダーメイドの３Ｄプリンター上にプリントされた格子を示す。
【図４】プリント直後のヒト脂肪由来幹細胞の生存能力を示す。緑の細胞は生存できて、一方で、赤で染色された細胞は死んでいる。生：死の高い比は、コラーゲンバイオインクが剪断減粘性であり、細胞が重大な損傷を受けずに押し出されることが可能であることを示す。
【図５】コラーゲンゲル中にプリントされたヒト脂肪由来幹細胞を示す。プリントされたフィラメントの幅は、１６０ミクロンである。
【図６】２日培養後にＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００中に３Ｄバイオプリントされたヒト線維芽細胞を示す。高い緑：赤（生：死）比は、高い細胞生存能力を示す。
【図７】高濃度での純粋な未変性コラーゲンゲルの剪断減粘性の特性を示す。
【図８】純粋なコラーゲンバイオインク、ＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００を用いて３Ｄバイオプリントされた鼻を示す。
【図９】プリントおよびＵＶ架橋された、沈殿コラーゲンと混合されたメタクリレート化ゼラチンの１０層の高さの構造を示す。
【図１０】３０ゲージの針を通してうまく３Ｄバイオプリントされた後の、３０：７０比でＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００コラーゲンバイオインク全体にわたって完全に分散したバイオガラスの顕微鏡画像（５×）を示す。
【図１１】３ｍｇ／ｍｌでＴｅｌｏＣｏｌ（登録商標）テロコラーゲンを用いてプリントされた構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ここで本発明は、本発明の好ましい実施態様が示される付随する図面を参照して、より詳細に説明される。本発明は、しかしながら、異なる形態で実現され得て、本明細書に示される実施態様に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であるように、および本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。
【００２６】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において、本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明を制限することを意図しない。
【００２７】
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載の本発明の様々な特性は、任意の組み合わせで用いられ得ることが明確に意図される。
【００２８】
さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特性または特性の組み合わせが、除外または省略され得ることも検討する。
【００２９】
説明すると、複合体は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書が述べる場合、任意のＡ、ＢまたはＣ、またはそれらの組み合わせが、単独または任意の組み合わせで、省略および放棄され得ることが明確に意図される。
【００３０】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で本明細書中に参照により援用される。
【００３１】
本明細書において用いられる、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つまたは１つよりも多くを意味してよい。例えば、「ａ」細胞は、単一の細胞または多数の細胞を意味してよい。
【００３２】
また、本明細書において用いられる「および／または」は、１つまたは複数の関係がある挙げられたアイテムの任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠如を指し、包含する。
【００３３】
さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、本発明の化合物または薬剤の量、投与量、時間、温度などのような測定可能な値を指す場合、規定される量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することが意味される。
【００３４】
文脈が別段の要求をしない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「制限されないが含む」と同様に、オープンの包括的意味で解釈されるべきである。
【００３５】
「からなる」によって、語句「からなる」に続くもの全てを含み、それに制限されることを意味する。したがって、語句「からなる」は、挙げられたエレメントが必要または必須であること、および、他のエレメントが存在し得ないことを示す。
【００３６】
本発明の組成物に適用される用語「から本質的になる」（および文法上の変形）は、さらなる構成要素が組成物を実質的に変更しない限り、組成物がさらなる構成要素を含んでよいことを意味する。組成物に適用される用語「実質的に変更する」は、挙げられた構成要素からなる組成物の有効性と比較して、少なくとも約２０％またはそれよりも多い、組成物の有効性における増大または低減を指す。
【００３７】
本明細書において用いられる用語「機能」および「機能性」などは、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
【００３８】
「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「上昇した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量は、典型的に、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載の量またはレベルの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０倍またはそれよりも多い（例えば、１００、５００、１０００倍）（全ての整数および間の小数点および１よりも上、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４などを含む）、増大を含んでよい。
【００３９】
「低減した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」または「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」または「より少ない（ｌｅｓｓｅｒ）」量は、典型的に、「統計的に有意な量」であり、本明細書に記載の量またはレベルの約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０倍またはそれよりも多い（例えば、１００、５００、１０００倍）（全ての整数および間の小数点および１よりも上、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）、低減を含んでよい。
【００４０】
「から得られる」によって、例えば、細胞または組織のようなサンプルが、所望の生物または所望の生物内の特定の組織のような、特定の由来から単離または取得されることを意味する。
【００４１】
用語「細胞外マトリックス分子」または「ＥＣＭ」は、細胞の外側の組織において見られる高分子を指す。これらの組織は、基底膜、臓器のための足場、および、腱および靭帯の構造のような、体内の多くの機能を行なう。コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、およびヒアルロン酸は、一般的な細胞外マトリックス分子である。
【００４２】
「ネイティブコラーゲン」は、不可逆的に加水分解されているコラーゲンであるゼラチンとは違って正常な構造を保持するコラーゲンとして定義される。
【００４３】
「ゼラチン」は、＞９０％、例えば、＞９９％加水分解または変性されたコラーゲンとして定義される。
【００４４】
「コラーゲン」は、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、トロポコラーゲン、プロコラーゲン、高分子コラーゲン、繊維コラーゲン、静電紡糸コラーゲン、不溶性コラーゲン、可溶性コラーゲン、沈殿コラーゲン、またはコラーゲン生地として知られる分子構造を有する天然タンパク質として定義される。
【００４５】
用語「未変性コラーゲン」は、５０％未満が加水分解または変性された、例えば、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が加水分解または変性されたコラーゲンを指す。
【００４６】
「バイオインク」は、３Ｄプリントされ得る細胞適合性材料として定義される。バイオインクは、０〜３７℃の針を通して押し出されてよく、それからゲル化または固化され得る。それらは、インクジェット、レーザーアシスト、またはマイクロバルブ３Ｄプリント装置のために処方され得る。
【００４７】
「架橋」は、共有結合またはイオン結合によって高分子を化学的に結合することとして定義される。
【００４８】
「主に」は、溶液またはゲル内の固形質量の３０％よりも多く、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％よりも多くを構成することとして定義される。
【００４９】
「純粋」は、溶液またはゲル内の固形質量の７０％よりも多く、例えば、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも多くを構成することとして定義される。
【００５０】
「毒性」は、環境内の細胞の５％未満がそれでもなお分裂および複製する環境として定義される。
【００５１】
「室温」は、約１５℃〜約３０℃として定義される。
【００５２】
「光」は、赤外線から紫外線までの範囲内のいずれかの電磁気放射線として定義される。
【００５３】
「揺変性」は、特定のゲルによって示される、剪断（例えば、撹拌または振とう）された場合に流動性になって、静置すると半固形状態に戻る特性として定義される。例えば、揺変性バイオインクは、剪断されると粘性または剛性が減少するが、剪断が止まると時間をかけて元の値に向かって戻るものである。
【００５４】
本発明は、一般に、天然ＥＣＭ分子単独または合成材料と混合して作られる３Ｄプリントインクに関する。より特に、これらのバイオインクは、制限されないが、Ｉ型コラーゲン、他のタイプのコラーゲン、グリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸および他のＥＣＭ分子を含む、ＥＣＭ分子を主に含む、から本質的になる、またはからなる。これらのバイオインクは、様々な濃度で処方および生産されていて、一部は、完全にネイティブであり、一部は、化学的改変がされていて、一部は、ネイティブの細胞外マトリックス分子の一部が除去されて、一部は、合成材料と混合される。バイオインクを生産するために、様々な処方および改変が特になされていて、両方とも天然組成物であり、３Ｄプリンターを用いたプリントに適している。市販される天然のバイオインクがないことは、今日の３Ｄバイオプリント技術の発展に対する１つの最も大きな障害である。
【００５５】
本発明のバイオインクでは、細胞は、体内で自然に行なうのとより類似して挙動する。バイオインク内の細胞は、足場を改造することができて、足場は続けてインビボで再吸収され得る。細胞は、付着することができて、構造を通って遊走することができる。細胞は、これらの天然のバイオインクと組み合わせた場合、従来の３Ｄプリント装置を用いて３Ｄプリントされる厳しさを簡単に生き残る。天然のバイオインクは、形状および構造を保持する３Ｄ構築物のプリントを可能にする機械的特性を有する。
【００５６】
本発明の一態様は、未変性コラーゲンを含むバイオインクに関する。一部の実施態様では、コラーゲンは、任意のＩ型コラーゲンであってよい。コラーゲンＩの最も一般的な由来は、ラットの尾、ウシの皮膚および腱またはブタの皮膚である。一部の実施態様では、コラーゲンは、沈殿コラーゲンである。一部の実施態様では、溶液中のコラーゲンは、増大したイオン強度（塩濃度）、ｐＨおよび／または温度を用いて沈殿される。沈殿コラーゲンは、ネイティブタイプの原繊維を形成して、それから濃縮されて、等張生理食塩水中に再懸濁される。一部の実施態様では、コラーゲンは酸性化コラーゲンであり、例えば、ｐＨ＜４．０、例えば、＜３．５、３．０、２．５、または２．０を有する。バイオインクは、１よりも多いタイプのコラーゲンを含んでよい。一部の実施態様では、コラーゲンは、テロコラーゲン、アテロコラーゲン、またはそれらの組み合わせである。一部の実施態様では、コラーゲンは、バイオインク内の唯一のＥＣＭ分子（例えば、ＥＣＭタンパク質または糖タンパク質）である。
【００５７】
バイオインクは、濃縮された溶液中に形成され得る。一部の実施態様では、未変性コラーゲンは、１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度でバイオインク内に存在する。一部の実施態様では、未変性コラーゲンは、３ｍｇ／ｍｌよりも大きな濃度である。一部の実施態様では、未変性コラーゲンは、５ｍｇ／ｍｌよりも大きな濃度である。一部の実施態様では、未変性コラーゲンは、１０ｍｇ／ｍｌよりも大きな濃度である。一部の実施態様では、未変性コラーゲンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｍｌよりも大きな濃度である。
【００５８】
バイオインクは、約１００〜約１５０，０００Ｐａ、例えば、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、または１５０，０００Ｐａまたはその中の任意の範囲の静剛性を有してよい。一部の実施態様では、バイオインクは、プリントの１分以内、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５５秒以内またはプリントの１、２、３、４、または５分以内に、１００Ｐａよりも大きな、例えば、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、または１５０，０００Ｐａの静剛性を達成する。
【００５９】
一部の実施態様では、バイオインクは、０．００１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で、例えば、０．０１または０．１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で、約５０Ｐａ未満、例えば、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、または１Ｐａ未満の剪断剛性を有してよい。
【００６０】
本発明の別の態様は、未変性コラーゲンを含むバイオインクに関し、ここでバイオインクは、室温において、約１００〜約１５０，０００Ｐａの静剛性および０．００１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で約５０Ｐａ未満の剪断剛性を有する。
【００６１】
本発明のさらなる態様は、３ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性コラーゲンを含むバイオインクに関し、ここでコラーゲンは、バイオインク内の唯一の細胞外マトリックスタンパク質である。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性中和化コラーゲンおよび架橋剤を含むバイオインクに関する。
【００６３】
本発明の別態様は、１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性コラーゲンを含むバイオインクに関し、ここでバイオインクは、中和した場合に、１０℃よりも高い温度でゲル化する。
【００６４】
本発明のさらなる態様は、１０ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性酸性化コラーゲンを含むバイオインクに関する。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、１ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度の未変性沈殿コラーゲンを含むバイオインクに関する。
【００６６】
本発明の別態様は、１００〜１５０，０００Ｐａの静剛性、および、０．００１ｓｅｃ−１よりも大きな剪断速度で約５０Ｐａ未満の剪断剛性を有し、プリントの１５分以内、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０分以内に、その静剛性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を取り戻す、揺変性バイオインクに関する。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、プリントの１分以内に１００Ｐａよりも大きな静剛性を達成する、未変性コラーゲンに基づくバイオインクに関する。
【００６８】
コラーゲンは温度感受性であり、したがって、ほとんどの滅菌手順は、その繊維構造を変更する。低い機械的特性、滅菌での困難性、および、一般に観察される細胞活性に応答したコラーゲン足場の収縮は、材料の主な制限である。機械的安定性を改善して、分解速度を低減するために、コラーゲンは架橋されてよく、他のポリマーと混合されて二重ネットワークを形成してよく、または、無機粒子と混合されて複合材料を形成してよい。
【００６９】
コラーゲンは、コラーゲンの架橋を可能にする化学基によって改変され得る。一部の実施態様では、化学基は、細胞に非毒性である条件下で架橋を可能にする。任意の適切な化学基が用いられ得る。化学基の例は、制限されずに、メタクリレート、アクリレート、ジビニルスルホン、またはそれらの組み合わせを含む。
【００７０】
一部の実施態様では、コラーゲンは、最初に化学基によって改変されずに架橋され得る。コラーゲンは、架橋剤を用いて架橋され得る。任意の適切な架橋剤を用いてよい。例は、制限されずに、リボフラビン、メタクリレート化ゼラチン（ＧｅｌＭＡ）、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、アルギン酸、フィブリノゲンおよびトロンビン、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ゲニピン、アンモニウム誘導体、光開始剤、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）、リチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰ）、ルテニウム、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施態様では、コラーゲンは、化学的に改変されずに架橋され得る。一部の実施態様では、コラーゲンは、光開始剤および光曝露によって架橋され得る。
【００７１】
Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）は、有名な光開始剤であるが、多くの他の候補が存在する。ＬＡＰは広く用いられて、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）よりも細胞に対して毒性が低いと考えられる。それは可視光によって活性化される。メタクリレート化コラーゲンは、分子が依然として未変性であり、細胞がそれに付着して、ネイティブのメカニズム（ＭＭＰ）を用いてそれを改造するので、非常に魅力的な架橋剤である。バイオインクは、ＰＥＧＤＡを用いても架橋され得るが、分子はかなり不活性であり、細胞は自然にはそれに付着しない。コラーゲンはまた、光、熱、脱水、アルデヒド類、ゲニピン、およびリボフラビンを用いて架橋されてもよい。
【００７２】
バイオインクは、１つまたは複数の添加剤を含んでよい。一部の実施態様では、添加剤は、架橋剤、硬化剤、合成材料、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。架橋剤の例は、制限されずに、リボフラビン、ＧｅｌＭＡ、ＰＥＧＤＡ、アルギン酸、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ゲニピン、アンモニウム誘導体、光開始剤、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）、ＬＡＰ、ルテニウム、またはそれらの任意の組み合わせを含む。硬化剤の例は、制限されずに、カーボンナノチューブ、炭素繊維、バイオガラス、リン酸カルシウムセラミック、ナノセルロース、カーボンナノブラシ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００７３】
添加剤は、例えば、タンパク質、グリコサミノグリカン、増殖因子、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。一部の実施態様では、添加剤は、ＥＣＭ分子、脱細胞化組織、またはそれらの組み合わせであってよい。ＥＣＭ分子または脱細胞化組織は、任意の組織または臓器、例えば、心臓、肺、腎臓、肝臓、皮膚、胎盤、腸、または膀胱組織由来であってよい。ＥＣＭ分子または脱細胞化組織は、任意選択で可溶化されていてもよい。一部の実施態様では、コラーゲンは、バイオインク内の唯一のＥＣＭ分子である。特定の実施態様では、バイオインクは、異なるＥＣＭ分子を含んでよい。一部の実施態様では、異なるＥＣＭ分子は、ヒアルロン酸であってよい。一部の実施態様では、バイオインクは、細胞を含んでよい。バイオインクは、１つまたは複数のタイプの細胞を含んでよい。
【００７４】
体内の組織の間の違いに起因して、全ての異なる組織をプリントするために１つの標準的なバイオインクが用いられ得ることはないだろう。さらなるタンパク質をバイオインクに加えて、プリントされる特定の組織に関する特注のバイオインクを作製する必要性がある。さらなるＥＣＭ分子を加えるために、インクに添加される細胞培養培地／細胞懸濁液にＥＣＭ分子が添加され得る。組み合わせはシリンジに添加されてよく、シリンジは、バイオインクを含むシリンジに連結されて、それから例えば＞４０回前後に混合されて、徹底的な混合を確実にする。
【００７５】
この同一の技術を用いて、架橋剤をバイオインクに添加することができる。これらの架橋剤は、アクリレートによって改変されたポリエチレングリコール、メタクリレート化ゼラチン、メタクリレート化ヒアルロン酸、ゲニピン、リボフラビン、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、および、アクリレートまたはジビニルスルホンのような他の架橋可能な基によって改変された高分子を含んでよい。この同一の技術を用いて、バイオインク硬化剤、例えば、バイオガラス、カーボンナノチューブ、ナノブラシ、またはセルロースを添加することもできる。
【００７６】
一部の実施態様では、バイオインクは、液体担体を含んでよい。一部の実施態様では、バイオインクは、生理学的な塩類、バッファー、および／または細胞生存を支持する他の構成要素を含む。
【００７７】
バイオインクは、塩基性ｐＨ、中性ｐＨ、または酸性ｐＨであってよい。
【００７８】
一部の実施態様では、バイオインクは滅菌される。一部の実施態様では、バイオインクは、滅菌状態を促す抗生物質または他の薬剤を含む。細胞と共に培養されるバイオプリント構造は、好ましくは滅菌される。この要件は時折、抗菌剤の使用によって提供され得る。しかしながら、それらのｐＨを４．６未満まで下げて、それから細胞と混合する前にそれらを中和することによって、コラーゲンに基づくバイオインクを滅菌することが相対的に簡単である。それらは濾過によって滅菌されてもよく、それから、無菌処理して所望の濃度に到達する。バイオバーデンは、照射（ＵＶ、Ｅ−ビーム、ガンマ）またはオゾンを用いて減少されてもよい。
【００７９】
一部の実施態様では、バイオインクは、ノズルまたはオリフィスを通した押し出しに適切な粘性を有する。一部の実施態様では、ノズルまたはオリフィスは、２５０μｍ未満、例えば、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、または１００μｍ未満の直径を有する。
【００８０】
一部の実施態様では、本発明のバイオインクは、室温において３Ｄ構造をプリントするために用いられ得る。
【００８１】
本発明の別態様は、本発明のバイオインクを含むキットに関する。キットは、バイオインクの１つまたは複数のコンテナーを備えてよい。一部の実施態様では、キットは、さらなる構成要素、例えば、シリンジ、シリンジ連結体、添加剤、バッファー、溶媒、中和溶液、架橋溶液、またはそれらの任意の組み合わせを含んでよい。
【００８２】
本発明の別態様は、本発明のバイオインクの調製のためのキットに関し、例えば、新鮮なバイオインクを提供するために一緒に混合される構成要素を含む。一部の実施態様では、キットは、未変性コラーゲンを含んでよい。一部の実施態様では、コラーゲンは、沈殿コラーゲンである。一部の実施態様では、コラーゲンは、架橋を可能にする化学基によって改変され得る。一部の実施態様では、キットは、添加剤、バッファー、溶媒、中和溶液、架橋溶液、またはそれらの任意の組み合わせを含んでよい。
【００８３】
本発明の別態様は、未変性コラーゲンを含む３Ｄ構造をプリントする方法に関する。当該方法は、３Ｄプリンターにおいて本発明のバイオインクを使用するステップを含んでよい。３Ｄプリンターを使用する方法は、当技術分野でよく知られている。３Ｄプリンターは、現在利用可能な任意の３Ｄプリンター、または後に開発される、例えば、インクジェットプリンター、ロボット分注プリンター、押し出しに基づくプリンター、またはレーザーに基づくプリンターであってよい。
【００８４】
インクジェットプリントは、最終的な多層パターンを形成するために、予めデザインされた様式でのバイオインクドロップの沈着に基づく非接触ストラテジーである。ロボット分注プリントは、空気式または機械的な力またはマイクロバルブに基づく液滴噴出（インクジェットおよび標準的な押出技術の間の技術である）によってインクが分注される連続的な押し出しであってよい。レーザーに基づくプリントは、正確に規定された位置を標的化するレーザービームパルスによって制御されるドナー基質からレシーブ基質へのバイオインクの転写に基づく。
【００８５】
一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされるときに、例えば、構造のプリントが終わる前に、３Ｄ構造を架橋するステップを含んでよい。一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされた後に３Ｄ構造を架橋するステップを含んでよい。
【００８６】
一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされるときに、３Ｄ構造の温度を変更するステップを含んでよい。一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされた後に生じる、３Ｄ構造の温度を変更するステップを含んでよい。温度変化は、例えば、構造のゲル化および／または架橋を促進するために、より冷たい温度（例えば、０〜１０℃または２０〜３０℃または室温）から、より温かい温度（例えば、３５〜４０℃または３７℃）であってよい。
【００８７】
一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされるときに、３Ｄ構造のｐＨを変更するステップを含んでよい。一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされた後に、３Ｄ構造のｐＨを変更するステップを含んでよい。ｐＨ変更は、例えば、構造のゲル化および／または架橋を促進するために、酸性または塩基性ｐＨから、中性ｐＨであってよい。ｐＨは、例えば、構造がプリントされる培地中に存在するバッファーを有することによって変更され得る。
【００８８】
一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされるときに、３Ｄ構造を光に曝露するステップを含んでよい。一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされた後に、３Ｄ構造を光に曝露するステップを含んでよい。光は、例えば、光開始剤の存在下で、例えば、構造のゲル化および／または架橋を促進するために、紫外光、可視光、または赤外光であってよい。
【００８９】
一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされるときに、３Ｄ構造に細胞を添加するステップを含んでよい。一部の実施態様では、当該方法は、３Ｄ構造がプリントされた後に、３Ｄ構造に細胞を添加するステップを含んでよい。一部の実施態様では、当該方法は、プリント中またはプリント後に、３Ｄ構造上に細胞をプリントするステップを含んでよい。例えば、２以上のノズルを備える３Ｄプリンターは、交互に、またはいくつかの他のパターンで、バイオインクの層および細胞の層をプリントし得る。一部の実施態様では、細胞が構造の上または中に遊走し得るように、細胞は、３Ｄ構造がプリントされた後に、３Ｄ構造と共にインキュベートされる。
【００９０】
３Ｄバイオプリントによって細胞のネイティブ環境を最もよく模倣するために、多数の押出機がしばしば採用される。それぞれの押出機は、異なるバイオインクおよび細胞型が充填されてよく、多層の組織のプリントを可能にする。マルチヘッドシステムは、一方のヘッドを用いて合成材料の外に構造的足場をプリントして、それから、別の押出機を用いてネイティブ材料をその中に充填するために用いられてもよい。
【００９１】
バイオインクは、支持培地または槽中にプリントされ得る。一部の実施態様では、支持培地は、細胞のための栄養分を含む。一部の実施態様では、支持培地は、例えば、構造がゲル化または架橋するまで、３Ｄ構造に対して一時的な支持を提供する。一時的な支持は、培地中の支持薬剤、例えば制限されずに、ゼラチンスラリー、ヒドロゲル粒子のスラリー、または親水性粒子のスラリーによって提供され得る。
【００９２】
本発明に関する最初のコラーゲンの突破口は、ＴｅｌｏＣｏｌ（登録商標）Ｉ型ウシコラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ）の使用によってなされた。コラーゲンは、ｐＨ＜４に酸性化して、１〜１０℃に冷やすことによって可溶化され得る。細胞を＜１０℃まで冷やして、コラーゲンを中和するのに十分な細胞培養培地中でコラーゲンと混合することによって、または、冷却された細胞溶液と混合する直前にコラーゲンを中和するのに十分な塩基を添加することによって、細胞がバイオインクに添加される。このバイオインクは、それから、３Ｄプリンター中にロードされ得て、所望の構造中に押し出され得る。バイオインクは、温かい細胞培養培地中にプリントされた場合など、１０℃よりも上に温まった場合、迅速にゲル化する。優れた解像度による複雑な構造は、図１に示されるように、このバイオインクによってプリントされ得る。したがって、純粋な未変性コラーゲンからなる第一の有用なバイオインクは、成功的に調製された。しかしながら、バイオインクは、１〜１０℃で維持されなければならず、さもなければプリンター中でゲル化して、冷たいバイオインクを維持することができる３Ｄプリンターはほとんどない。結果として、３Ｄ構造をプリントするための作業時間は、このバイオインク製剤を用いて、しばしば１０分以下である。
【００９３】
この作業時間の制限を克服するために、新しいバイオインクがＦｉｂｒｉＣｏｌ（登録商標）から開発された（濃縮された未変性のアテロ−ペプチドＩ型コラーゲン溶液）。ＦｉｂｒｉＣｏｌは、中和され得るが、室温でゲル化が始まらない。３７℃に温めると、硬いゲルを形成する。この材料は、より使用しやすく、合理的に良好に作用したが、コラーゲンが、温められてゲル化するまで細胞培養培地中に拡散するので、プリントした場合に解像度が低かった。図２を参照。
【００９４】
拡散の問題を克服するために、ＰｈｏｔｏＣｏｌ（登録商標）からバイオインクが開発された（Ｉ型メタクリレート化ウシコラーゲン）。基本材料はテロコラーゲンであり、したがって、中和されると迅速にゲル化する。この材料は、濃縮された（１０ｍｇ／ｍｌ）酸性溶液として中性バッファー中にプリントされて、コラーゲンを中和して、ゲル形成が開始するのを可能にした。拡散を制限するのを助けるために、コラーゲン分子上の反応性メタクリレート部位に起因して、押し出しのときにコラーゲンをＵＶ架橋した。図３を参照。ＵＶ架橋は、コラーゲンを即座に強化して、拡散を制限する。この材料は、作業しやすくて、良好なプリント解像度を与える。細胞は、構造上で培養され得て、架橋後にコラーゲン中に浸透することが可能になる。
【００９５】
Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘは、リジン基の２５〜４０％がメタクリレート化されたそのようなコラーゲン（パート番号ＢＲＤ５２０１）を販売する。１０〜５０ｐｐｍ  Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９を含みＵＶ光（３６５ｎｍ波長）によって架橋された、溶液中３〜１０ｍｇ／ｍｌのこのコラーゲンにより作られたバイオインクは、２００〜８０００Ｐａの範囲の弾性率を有するゲルを形成する。この架橋可能なコラーゲンは、他のコラーゲン、他の細胞外マトリックス分子、脱細胞化組織、または実に合成材料とさえも混合され得る。図５は、純粋な未変性１型コラーゲンとメタクリレート化コラーゲンのブレンドにおける、プリントの２日後の線維芽細胞の生存能力を示す。
【００９６】
多くの状況において、細胞がインクに添加され得るように、ｐＨ中性であるバイオインクを用いることが有利であるが、室温で迅速にゲル化しない。典型的に、コラーゲンの濃度の増大は、ゲル化速度および生じるゲルの剛性を増大させる。剪断力がゲル剛性よりも大きな場合は、コラーゲン溶液がゲル化した時点で壊れる。もしゲルに細胞を混合しようとすれば、溶液中の細胞を有する領域およびゲル化したコラーゲンのアイランドを得る。もし微細な針を通してゲル化したコラーゲンを押し出せば、フィラメント内が頻繁に壊れた溶液の噴出を得る。
【００９７】
驚くべきことに、濃縮された沈殿コラーゲンのゲルは、非常に良好に作用することが見いだされた。このバイオインクは、ＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００として知られて、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からパート番号＃５２０２−１ＥＡで購入され得る。この材料は、押し出し中に強力なフィラメントを維持し、支持槽中にプリントされるときに、ほぼ拡散しない。混合またはプリントノズルを通して押し出されると、弾性率は、１Ｐａよりも下まで落ちる。ノズルを離れた後、ゲルは、その元のゲル強度をほぼ取り戻して、３７℃では、約１０００Ｐａの弾性率を有するゲルを形成して、このゲルが、剪断減粘して迅速に回復することを示す。この剪断減粘性の特性は、細胞が混合されて、それから、図４に示されるように損傷されずにノズルを通して押し出されることを可能にする。バイオインクが押し出された時点で、再度ゲル化して、図５に示されるように高い忠実性でその形状を維持する。このインクは保存され得て、中性ｐＨで用いられ得て、細胞と混合され得て、少なくとも３８．５℃までの温度でプリントされ得る。ＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００中にプリントされた細胞は、図６に見られるようにネイティブのコラーゲン環境において生育する。
【００９８】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。
【実施例】
【００９９】
［実施例１］
メタクリレート化コラーゲンバイオインク（ＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）１００）
リジンの４０％がメタクリレート化されて、それから凍結乾燥された、テロ−ペプチドを含むＩ型コラーゲン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘパート番号ＢＲＤ５２０１）は、８ｍｇ／ｍｌの濃度で２０ｍＭ酢酸中に可溶化された。それから、溶液を２℃に冷却して、冷たいアルカリ性のリン酸緩衝生理食塩水を用いて中和した。Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９を添加して２０ｐｐｍ溶液を作製して、溶液を皿の中に注いで、３７℃でゲル化した。１５分間のゲル化後、ＵＶ光によって５分間、溶液を架橋した。ゲルの剛性をＢｏｈｌｉｎレオメータ（ＤＶＯ−１００）で測定して、６０００Ｐａであることが分かった。
【０１００】
［実施例２］
純粋なコラーゲンバイオインク（ＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００）
テロ−ペプチドを含まないＩ型コラーゲンを、沈殿によって高濃度で調製した。このコラーゲンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ（パート番号＃５２０２−１ＥＡ）から得ることができる。この溶液を皿の中に注いで、Ｂｏｈｌｉｎレオメータで試験する前に３０分間、３７℃でゲル化させた。ゲルは初め、１３００Ｐａの剛性を有したが、やや低い速度で剪断されると、非常に低い値まで落ちた。剪断力が除去されると、ゲルは、その最初の高い剛性を取り戻した。プロセスは、図７に示されるように、それぞれの試験の間を１５分間隔で、多数サイクルにわたって繰り返し可能であることが分かった。
【０１０１】
［実施例３］
純粋なコラーゲンバイオインクを用いたプリント（ＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００）
Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ（パート番号＃５２０２−１ＥＡ）からのＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００を、空気式に基づく押出プリンターを用いてプリントして、鼻の描写を作製した。コラーゲンバイオインクは、１時間の工程にわたって室温でプリントされた。押出機の圧力は、全ての時間において＜３０ｐｓｉであり、バイオインクは、約１６０マイクロメートルの最終的な解像度で３０ゲージの針を通して押し出された。最終的なプリント構造は、＞３０ｍｍの長さおよび１０ｍｍの高さであった（図８）。構造は、６ヶ月を超える期間、細胞培養培地中でその形状を維持した。
【０１０２】
［実施例４］
純粋なコラーゲンおよびゼラチンメタクリレートの混合物のプリント
Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏｍａｔｒｉｘからのＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００（パート番号＃５２０２−１ＥＡ）を、１０分間、室温に置いた。Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９を３５℃に温められた溶液中でメタクリレート化ゼラチンに添加した。５ｍＬのメタクリレート化ゼラチンをシリンジ中にピペッティングして、＜３０℃まで冷却させた。メタクリレート化ゼラチンシリンジをＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００コラーゲンバイオインクに連結して、それから、前後に＞４０回混合して、徹底的な混合を確実にした。これは、メタクリレート化ゼラチンに対してコラーゲンの１：１混合物を作製した。生じる混合物は、空気式プリンター上にプリントされて、１０層の高さの構造を作ることが可能であった（図９）。プリント構造を硬化するためにＵＶ光を用いた。
【０１０３】
［実施例５］
リボフラビンによるコラーゲンの架橋
Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏｍａｔｒｉｘからのＦｉｂｒｉＣｏｌ（登録商標）（パート番号＃５１３３−２０ＭＬ）を中和して、皿の中に注いで、３７℃で３０分間インキュベートした。それから、サンプルのゲル剛性をＢｏｈｌｉｎレオメータで測定した。ＦｉｂｒｉＣｏｌ（登録商標）の別のサンプルを、リボフラビンと混合した。材料を皿の中に置いて、３７℃でゲル化させた。３０分後、このサンプルをＵＶチャンバー内に置いて、ＵＶ光に５分間曝露した。ゲル剛性を、Ｂｏｈｌｉｎレオメータで測定した。表１は、リボフラビン（架橋剤）をコラーゲンバイオインク中に取り込むことによる、ゲル剛性の増大を示す。
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【０１０４】
［実施例６］
純粋なコラーゲンバイオインクに対するヒアルロン酸の添加
１，３００，０００Ｄａの分子量を有する０．８５ｍＬの３％ヒアルロン酸および１．１５ｍＬの細胞培養培地を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏｍａｔｒｉｘからのＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００（パート番号＃５２０２−１ＥＡ）５ｍＬに添加した。生じるバイオインクは、天然ＥＣＭとさらに似ていて、約１２％のグリコサミノグリカン、および８８％のＩ型コラーゲンから構成された。バイオインクの混合物は、それから、３０ゲージの針を通して押し出されて、生じるフィラメント強度を、正当なＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００のフィラメント強度と比較した。フィラメントは、強度の忠実性において同程度であり、バイオインク混合物は、同等のプリント可能性を示した。
【０１０５】
［実施例７］
純粋なコラーゲンバイオインクに対する生体活性ガラスの添加
生体活性ガラスは、針の中にガラスが定着して目詰まりが生じるのを防ぐために、３Ｄバイオプリント用の粘性材料中に懸濁される必要がある。生体活性ガラスを、ＬｉｆｅＩｎｋ（登録商標）２００に様々な比（１０：９０、３０：７０、６５：３５ガラス／コラーゲン）で添加して、３０ゲージの針を通して支持槽中に３Ｄバイオプリントした（図１０）。生じる材料は、模擬体液に曝すことができて、ヒドロキシアパタイトに変化する。この新しい環境は、骨芽細胞が骨を生産するのに理想的である。
【０１０６】
［実施例８］
ｐＨ中性の１０ｍｇ／ｍｌのＩ型アテロコラーゲンを用いたバイオプリント
Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏｍａｔｒｉｘからのＦｉｂｒｉＣｏｌ（登録商標）（ｃａｔａｌｏｇ＃５１３３−２０ＭＬ）は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＩ型アテロコラーゲンである。この材料を中和して、室温で支持培地中にプリントした。アテロコラーゲンは、プリントの前にゲル化せずに室温でのプリントを可能にする。プリントされた時点で、構造を３７℃でインキュベートして、コラーゲンの熱的ゲル化を可能にした。コラーゲンのゲル強度は、３０分のインキュベーション後、約１０００Ｐａであった。
【０１０７】
［実施例９］
ｐＨ中性の３ｍｇ／ｍｌのＩ型テロコラーゲンを用いたバイオプリント
Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏｍａｔｒｉｘからのＴｅｌｏＣｏｌ（登録商標）（５０２６−５０ＭＬ）は、３ｍｇ／ｍｌのテロコラーゲンである。この材料を中和して、プリント前のシリンジにおけるコラーゲンのゲル化を防ぐために、冷たい環境（＜１０℃）においてプリントした。材料を室温の支持槽中にプリントして、プリントの際にコラーゲンがゲル化するのを可能にした。プリント後、３７℃で３０分間、構造をインキュベーター内に置いて、さらなるゲル化を可能にした（図１１）。
【０１０８】
前述は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義されて、特許請求の範囲の等価物はその中に含まれる。本明細書における、全ての刊行物、特許出願、特許、特許公報、および任意の他の参考文献は、その参考文献が示される文章および／または段落と関連する教示のために、それらの全体で参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月20日(2019.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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【国際調査報告】
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