(57)【要約】  バベシア・ミクロチ及びミクロチ様種の連続的インビトロ増殖のための方法が開示される。本方法は、宿主赤血球を含む培地中、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源の存在下でＢ．ミクロチをインキュベートする工程を含む。一実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、実質的にIgG抗体を含まない。一実施形態において、補体の供給源は、補体を分泌する細胞又は細胞株である。
2019528780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バベシア・ミクロチのインビトロ増殖のための方法であって、宿主赤血球を含む培地中、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源の存在下で、Ｂ．ミクロチをインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項２】
Ｂ．ミクロチが、1継代よりも長い間、連続的に増殖される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｂ．ミクロチが、少なくとも200時間、連続的に培養される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源が実質的にIgG抗体を含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源が、宿主赤血球と同じ種に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
補体の供給源が、宿主赤血球と共培養される細胞又は細胞株を含み、前記細胞又は細胞株が、培地中に前記補体を分泌する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞又は細胞株が、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、BALB/c 3T3線維芽細胞、肺胞II型上皮細胞A549、イヌDH82、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞又は細胞株が、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞株である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞又は細胞株が、THP-1、HL60、又はAML-193から選択されるヒト単球/マクロファージ系統に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞又は細胞株が、ヒト内皮細胞、ヒト肝細胞、ヒト消化器系細胞、ヒト上皮細胞、ヒト肺胞細胞、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、BALB/c 3T3線維芽細胞、又は肺胞II型上皮細胞A549に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞又は細胞株が末梢血単核細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞又は細胞株が、宿主赤血球と一緒に又はトランズウェルシステムを用いて宿主赤血球と分離して共培養される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
IgM抗体の供給源が、脾臓リンパ球、B細胞、形質細胞、形質芽球、及びハイブリドーマからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
補体の供給源が、外部から培地に加えられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
補体の供給源が、自動装置により加えられる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
抗Ｂ．ミクロチIgM抗体がポリクローナル又はモノクローナルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂ．ミクロチの倍加時間が、約12時間〜約24時間の範囲である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫の連続的インビトロ増殖のための方法であって、宿主赤血球を含む培地中、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体の供給源の存在下で、Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫をインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項１９】
Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫が、広義のＢ．ミクロチ、Ｂ．ロドハイニ、又は「タイレリア・アンナエ」（スペインのイヌの病原体）から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体がポリクローナル又はモノクローナルである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫の倍加時間が、約12時間〜約24時間の範囲である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂ．ミクロチ又はＢ．ミクロチ関連血液寄生虫を含む増殖培養物であって、補体の供給源、及び抗Ｂ．ミクロチIgM抗体又は抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体の供給源の存在下で、宿主赤血球を含む培地を含む、増殖培養物。
【請求項２３】
実質的にIgG抗体を含まない、請求項２２に記載の増殖培養物。
【請求項２４】
宿主赤血球が、ヒト、マウス、ハムスター、又は他の許容される宿主から選択される、請求項２２又は２３に記載の増殖培養物。
【請求項２５】
補体の供給源が、宿主赤血球と同じ種に由来する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の増殖培養物。
【請求項２６】
抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源又は抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体が、宿主赤血球と同じ種に由来する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の増殖培養物。
【請求項２７】
宿主赤血球と共培養される細胞又は細胞株をさらに含み、前記細胞又は細胞株が、培地中に補体を分泌する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の増殖培養物。
【請求項２８】
抗Ｂ．ミクロチIgM抗体又は抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体が、ポリクローナル又はモノクローナルである、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の増殖培養物。
【請求項２９】
Ｂ．ミクロチ又はＢ．ミクロチ関連血液寄生虫の倍加時間が、約12時間〜約24時間の範囲である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の増殖培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年9月19日に出願された米国仮出願第62/396,697号、及び2017年5月15日に出願された米国仮出願第62/506,429号の利益を主張するものであり、これらは参照によりその全体が引用される。
【０００２】
分野
本開示は、バベシア・ミクロチ（Babesia microti）(「Ｂ．ミクロチ」)及び関連する「ミクロチ様（microti-like）」血液寄生虫（hemoparasite）種の連続的インビトロ増殖のための方法に全体的に関連する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
Ｂ．ミクロチは、もともとはVictor Babesにより1885年に説明され、それ以来ヒトの病原体として認識が高まってきている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nevens, J.R., et al., Affinity chromatographic purification of immunoglobulin M antibodies utilizing immobilized mannan binding protein, J Chrom (1992) 597:247-256
【非特許文献２】Nethery, A., et al, Single-step purification of immunoglobulin M on C1q-Sepharose, J Immunol Meth (1990) 126:57-60
【非特許文献３】Ohta, M., et al, The mechanism of carbohydrate-mediated complement activation by the serum mannan-binding protein, J Biol Chem (1990) 265:1980-1984
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バベシア属の様々な種に属する寄生虫の増殖の大きな進歩にも関わらず、ミクロチ種は、依然として増殖のためにハムスター及び/又はマウスにおける動物の継代を必要とするものの一つである。熟練した研究者らは、一緒になって、このたった一つの種のインビトロでの連続的増殖の模索に何年もの懸命な努力を費やしてきたが、どれも成功していない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
バベシア・ミクロチのインビトロ増殖のための方法が開示される。本方法は、宿主赤血球を含む培地中、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源の存在下でＢ．ミクロチをインキュベートする工程を含む。
【０００７】
一変形において、Ｂ．ミクロチは、1継代よりも長い間、連続的に増殖される。別の変形において、Ｂ．ミクロチは、少なくとも200時間、連続的に培養される。
【０００８】
別の変形において、IgM抗Ｂ．ミクロチ抗体の供給源は、実質的にIgG抗体を含まない。抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、宿主赤血球と同じ種に由来していてもよい。
【０００９】
一実施形態において、補体の供給源は、宿主赤血球と共培養される細胞又は細胞株を含み、該細胞又は細胞株は培地中に補体を分泌する。細胞又は細胞株は、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性（胎仔）線維芽細胞、balb/c 3T3線維芽細胞、肺胞II型上皮細胞A549、イヌDH82、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択されてもよい。一変形において、細胞又は細胞株は、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される哺乳動物細胞又は細胞株である。別の変形において、細胞又は細胞株は、THP-1、HL60、又はAML-193から選択されるヒト単球/マクロファージ系統に由来する。別の変形において、細胞又は細胞株は、ヒト内皮細胞、ヒト肝細胞、ヒト消化器系細胞、ヒト上皮細胞、ヒト肺胞細胞、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、BALB/c 3T3線維芽細胞、又は肺胞II型上皮細胞A549に由来する。いくつかの実施形態において、補体の供給源は、末梢血単核細胞(PBMC)を含む。
【００１０】
別の実施形態において、細胞又は細胞株は、宿主赤血球と、一緒に又はトランズウェル（transwell）システムを用いて分離して共培養される。
【００１１】
一実施形態において、IgM抗体の供給源は、脾臓リンパ球、B細胞、形質細胞、形質芽球、及びハイブリドーマからなる群から選択される。
【００１２】
別の実施形態において、補体の供給源は、外部から培地に加えられる。補体は、自動装置により加えられてもよい。
【００１３】
Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫の連続的インビトロ増殖のための方法が開示され、該方法は、宿主赤血球を含む培地中、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体の供給源の存在下でＢ．ミクロチ関連血液寄生虫をインキュベートする工程を含む。
【００１４】
Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫は、広義のＢ．ミクロチ（B. microti sensu lato）、Ｂ．ロドハイニ（B. rodhaini）、タイレリア・アンナエ（Theileria annae）（スペインのイヌの病原体）、及びＢ．ミクロチ様種からなる群から選択されてもよい。
【００１５】
Ｂ．ミクロチを含む増殖培養物が、別の実施形態に従って開示される。培養物は、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源の存在下、宿主赤血球を含む培地を含む。
【００１６】
増殖培養物は、実質的にIgG抗体を含まないものであってもよい。
【００１７】
増殖培養物の一実施形態において、宿主赤血球は、ヒト、マウス、ハムスター、又は他の許容される宿主から選択される。
【００１８】
増殖培養物の一変形において、補体の供給源は、宿主赤血球と同じ種に由来する。別の変形において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、宿主赤血球と同じ種に由来する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、Ｂ．ミクロチの生育に対する血清補体の補充の効果を示す。全期間にわたって補充無しの対照は、（■）で示し、一方で4時間の時点でのみ2%補体（8X−他の補充濃度について用いられた0.25%の8倍であることを示す）を補った、別のセットの対照は、（●）で示した（すなわち、他の補充の8倍の濃度であり、4時間の印の時点で１回のみ加えた）。0.25%補体の4、8、及び12時間の時点での補充は、（▲）で示し、一方で（◆）は0.25%補体の8及び12時間の時点での補充を示し、（□）は、12時間の時点でのみの0.25%の補充を示す。
【図２】図2A〜図2Dは、インビトロ培養したＢ．ミクロチ、Westport 株、第18継代のギムザ染色薄層塗抹標本を示す。スケールバー＝7 μm。図2Aは、ピーク複製を示すマルタクロス（Maltese cross）体を示す。図2Bは、典型的な輪状体（リング状形態）を示し、一つ（左下）は白色の食胞（feeding vacuole）を有する。図2Cは、低倍率の視野を示し、22細胞中4個が寄生されていることを示す。図2Dは、単一細胞中に複数の寄生虫を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、一種以上の宿主細胞におけるＢ．ミクロチのインビトロ増殖のための方法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、Ｂ．ミクロチの連続的インビトロ増殖のための方法に関する。Ｂ．ミクロチの「連続的」インビトロ増殖、又は培養は、単一継代よりも多い期間の増殖を意味する。いくつかの実施形態において、「継代（passage）」は、元の数の寄生虫（すなわち、元の感染のレベル、感染のパーセント、又は「寄生虫血（parasitemia）」）を有する培養を希釈し、希釈された培養中の寄生虫の数を、細胞分裂によって、寄生虫の数が元のレベルに戻るまで増加させることを意味する。例えば、培養は、1:4、すなわち元の数の寄生虫の1/4に希釈してもよい。したがって、いくつかの実施形態において、単一継代よりも多いとは、1:4（又は感染のレベルに基づいて当業者により決定される別の希釈係数）に希釈された後に、培養が元の（「前継代（pre-passage）」）パーセント感染に戻ることを意味する。いくつかの実施形態において、「連続的」は、数継代の増殖を指す。いくつかの実施形態において、「連続的」は、約1継代よりも長く、約100継代までの増殖を指す。いくつかの実施形態において、「連続的」は、約1日〜約7日間、約1週間〜約4週間、約1ヶ月〜約12ヶ月、及び/又は約1年〜約5年間の長期間の増殖を指す。
【００２１】
いくつかの実施形態において、短期間にわたる「連続的」インビトロ増殖は、少なくとも200時間の増殖を指す。いくつかの実施形態において、短期間にわたる「連続的」インビトロ増殖は、約200時間の増殖を指す。いくつかの実施形態において、短期間にわたる「連続的」インビトロ増殖は、200時間より長い増殖を指す。いくつかの実施形態において、短期間にわたる「連続的」インビトロ増殖は、約100時間〜約10,000時間の増殖を指す。
【００２２】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、Ｂ．ミクロチの連続的増殖が成功しないのは、寄生虫が、細胞内分裂を、それに続く非感染宿主細胞の貫通（侵入）へ効率的に変換することができないことに起因すると考えられている。例えば、ハムスター及び/又はマウス由来の寄生虫がIgM及び補体で被覆されている場合、寄生虫は数倍の細胞分裂を経たが、母寄生虫を被覆しているIgM及び/又は補体が分解されたか、又は娘寄生虫を被覆するのにIgMも補体も利用できなかった場合は、娘寄生虫は新たな非感染宿主細胞に侵入することができなかった。
【００２３】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、連続的増殖には、新鮮培地中で感染宿主細胞を非感染宿主細胞で希釈することが必要であり、新鮮培地は定期的に加える必要がある。いくつかの実施形態において、寄生虫は、感染宿主細胞（例えば宿主赤血球）の溶解により精製し、その後非感染宿主赤血球を含む培養に戻すことができる。しかし、これは連続的増殖には必要ではない。
【００２４】
いくつかの実施形態において、インビトロ培養は、普通とは異なる2つの成分を加えた、非常にリッチな（栄養の豊富な）基本培地で開始された。いくつかの実施形態において、HL-1培地基本培地（Lonza、Walkersville、MD）に、20〜40%の非加熱ウシ胎児血清、2 mMグルタミナーゼジペプチド（Gibco）、100 μg/mlゲンタマイシン硫酸塩、1 mg/ml AlbuMAX II（Gibco）、1X HT Supplement（Gibco）、1X HB-101 Supplement（Irvine Scientific、Irvine、CA）、1 mM L-システイン-HCl、0.02 mMバソクプロインジスルホン酸（BCS、Sigma Chemical）及び1X Antibiotic-Antimycotic（Gibco）を補った。いくつかの実施形態において、培養は、ヒト及び/又はハムスター血清とウシ胎児血清（FBS）との追加及び/又は混合を含んだが、追加的効果は生じた追加的コストを正当化しなかった。いくつかの実施形態において、普通とは異なる2つの成分、すなわち補体の供給源及びIgMの供給源が、基本培地に加えられた。
【００２５】
いくつかの実施形態において、この基本培地に、急速冷凍されたハムスター又はヒト血清（Innovative Research、Novi、MI）が、-80℃で保存されたアリコートから加えられた。この血清は、「ハムスター補体」及び「ヒト補体」として販売されている。血清は、補体の供給源として作用する。いくつかの実施形態において、使用される希釈は、24ウェルの組織培養トレイでの連続希釈を用いた試行により決定される。いくつかの実施形態において、短期的実験では、1:400希釈（約0.25%の新鮮血清）を用いたが、そのレベルの血清（すなわち、補体の供給源）では、低レベルの連続的感染が通常観察される。頻回、例えば4時間以下毎の血清（補体）補充によってより高いレベルの感染が得られる（図1）。いくつかの実施形態において、およそ1〜2%のレベルの血清では、補充なし又は12時間毎の培地交換によって、24時間サイクルが完遂され得る（図1）。
【００２６】
いくつかの実施形態において、IgMの供給源が基本培地に加えられた。いくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチに対するIgMクラスポリクローナル抗体のための供給源である血清又は血漿は、Ｂ．ミクロチに感染した陽性ドナーユニット（例えばヒト）及びハムスターから得られる。いくつかの実施形態において、供給源である血清又は血漿は、Ｂ．ミクロチに対するIgMクラスモノクローナル抗体の供給源である。
【００２７】
ポリクローナルIgM抗体の供給源として活性なＢ．ミクロチ感染ハムスターから血液を得ることに対する制限を考慮すると、いくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチ感染BALB/cマウスの脾臓リンパ球由来のクローニングされたIgMモノクローナル抗体を使用することができる。例えば、ImmunoPrecise Antibodies, Ltd.、Victoria、BCは、Ｂ．ミクロチ感染BALB/cマウスの脾臓リンパ球の供給を受けてハイブリドーマ融合を起こし、クローニングされたIgMモノクローナル抗体を作製している。いくつかの実施形態において、一種以上の他のIgMの供給源を用いることができる。非限定的な例には、B細胞、形質細胞、形質芽球、ハイブリドーマ等が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、そのようなクローニングされたIgMモノクローナル抗体の使用は、Ｂ．ミクロチのインビトロ増殖を簡素化及び標準化するはずである。いくつかの実施形態において、ポリクローナルIgM抗体が用いられる。いくつかの実施形態において、モノクローナルIgM抗体が用いられる。いくつかの実施形態において、ポリクローナルとモノクローナルの両方のIgM抗体が用いられる。いくつかの実施形態において、IgM抗体は、同じ種に由来する（すなわち同系）。いくつかの実施形態において、IgM抗体は、異なる種に由来してもよい（すなわち同種異系）。いくつかの実施形態において、赤血球、補体、及びIgMは、同じ宿主から得られる。いくつかの実施形態において、赤血球、補体、及びIgMは、一種以上の異なる宿主（例えばヒト、ハムスター、及びマウス）から得られる。
【００２８】
抗Ｂ．ミクロチIgG抗体は、IgM抗体と競合する。IgG抗体は、Ｂ．ミクロチをインビボでオプソニン化し、マクロファージによるＢ．ミクロチのクリアランスをもたらす。いくつかの実施形態において、マクロファージによるクリアランスは、培養物における寄生虫の低収率をもたらす。
【００２９】
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、抗Ｂ．ミクロチIgG抗体は、培養の増殖の速度に悪影響を及ぼすと考えられている。いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、マクロファージの存在下での増殖の場合、IgG抗体は、トロポゾイト期の寄生虫のオプソニン化及びマクロファージによる食作用を引き起こすと考えられている。したがって、いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、IgGオプソニン化された寄生虫が新鮮赤血球に侵入/感染できないことに起因して、及びマクロファージが培養中に存在しない場合は、寄生虫が新鮮赤血球に侵入/感染することを可能にするIgM抗体との競合によって、の両方により、培養中のIgGのパーセントは、寄生虫の収率パーセントと反比例すると考えられている。
【００３０】
したがって、いくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、実質的にIgG抗体を含まない。いくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、当該技術分野で公知の一種以上の市販のIgG除去キットを用いることにより、実質的にIgGを含まない状態にされる。いくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源はIgGを有さないか、又は検出可能なIgGを有さない。いくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、約0.0001%未満、0.001%未満、0.01%未満、0.1%未満、又は1%未満のIgGを有する。いくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、約0.1%未満、0.2%未満、0.3%未満、0.4%未満、0.5%未満、0.6%未満、0.7%未満、0.8%未満、0.9%未満、1%未満、5%未満、若しくは10%未満のIgG、又は前述の値のいずれか2つにより規定された範囲内の値を有する。いくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、約0.0001〜10%の間の任意のパーセンテージのIgGを有する。いくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、完全にIgG抗体を含まない。したがって、いくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、0%のIgG抗体を有する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、血清又は血漿由来のIgMは、クリオグロブリンとして沈殿される。いくつかの実施形態において、沈殿は、適切な透析緩衝液に対する2〜8℃での終夜透析によって行われる。いくつかの実施形態において、透析緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液、10 mM pH 5.4である。いくつかの実施形態において、一種以上の他の透析緩衝液を当業者は用いることができる。いくつかの実施形態において、クリオグロブリンは、冷透析緩衝液で洗浄され、続いて緩衝生理食塩水に溶解される。いくつかの実施形態において、酢酸緩衝生理食塩水（10 mM酢酸pH 5.4）を用いてクリオグロブリンを溶解する。たとえ半精製IgMであっても不安定であることがよく知られているため、等量のIgM Stabilizing Diluent（2X−他の実施例の2倍であることを示す）と混合され、2〜8℃で維持される。IgM Stabilizing Diluent（1X）は、50 mM酢酸緩衝液（pH 5.5）中、20%ソルビトール及び1 Mグリシンからなる。この安定化されたIgM溶液は、赤血球に対する負の作用により、培地中で1:50未満の希釈で用いることができず、その使用希釈は、連続希釈を用いた複数のインビトロ試し培養により決定された。いくつかの実施形態において、長期間の経験の後に、使用希釈は、1%から、安定化IgMのIFA抗体価（およそ1:400）とほぼ等しい値まで低下した。
【００３２】
いくつかの実施形態において、バベシア種のインビトロ増殖をサポートするポリクローナルIgMの濃度は、約0.001 μg/ml〜約100 μg/mlの範囲である。いくつかの好ましい実施形態において、バベシア種のインビトロ増殖をサポートするポリクローナルIgMの濃度は、約0.01 μg/ml〜約10 μg/mlの範囲である。いくつかの実施形態において、0.001 μg/ml〜約100 μg/mlの濃度範囲のポリクローナルIgMが、バベシアのインビトロ増殖を、約2日間〜約4日間サポートし、倍加時間は約24時間である。いくつかの好ましい実施形態において、約0.01 μg/ml〜約10 μg/mlの濃度範囲のポリクローナルIgMが、バベシアのインビトロ増殖を、約4日間サポートし、倍加時間は約12時間である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、バベシア種のインビトロ増殖をサポートするモノクローナルIgMの濃度は、約0.005 μg/ml〜約500 μg/mlの範囲である。いくつかの好ましい実施形態において、バベシア種のインビトロ増殖をサポートするモノクローナルIgMの濃度は、約0.05 μg/ml〜約50 μg/mlの範囲である。いくつかの実施形態において、約0.005 μg/ml〜約500 μg/mlの濃度範囲のモノクローナルIgMが、バベシアのインビトロ増殖を、約2日間〜約4日間サポートし、倍加時間は約24時間である。いくつかの好ましい実施形態において、約0.05 μg/ml〜約50 μg/mlの濃度範囲のモノクローナルIgMが、バベシアのインビトロ増殖を、約4日間サポートし、倍加時間は約12時間である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、IgM抗体の異なるクローンの混合物（すなわち、IgM抗体の一種以上のクローンの組合せ）が、バベシアのインビトロ生育に用いられる。いくつかの実施形態において、IgM抗体の異なるクローンの混合物は、個別に用いられるIgM抗体の異なるクローンと比較して、より効率的にバベシアのインビトロ生育をサポートする。いくつかの実施形態において、IgM抗体の異なるクローンの混合物は、個別に用いられるIgM抗体の異なるクローンと比較して、約10%〜約90%効率的である。いくつかの実施形態において、IgM抗体の異なるクローンの混合物は、個別に用いられるIgM抗体の異なるクローンと比較して、約10、20、30、40、50、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、若しくは90%、又は前述の値のいずれか2つにより規定された範囲内の値で、効率的である。いくつかの実施形態において、異なるIgM抗体のクローン混合物が、バベシアのインビトロ生育に用いられる。いくつかの実施形態において、IgM抗体の異なるクローンの至適濃度は、当業者により、当該技術分野で公知の標準的な手法（例えばELISA）を用いて決定することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、異なるエピトープ特異性を有する少なくとも2つのIgMモノクローナル抗体を用いて、ポリクローナルIgMと同じレベルでインビトロのバベシア生育をサポートする。いくつかの実施形態において、異なるエピトープ特異性を有する2〜約20個のIgMモノクローナル抗体を用いて、ポリクローナルIgMと同じレベルでインビトロのバベシア生育をサポートする。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ上清は、モノクローナルIgMの供給源である。いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ上清は、希釈されて、モノクローナルIgMの供給源として用いられる。いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ上清は、20% v/v〜約60% v/vに希釈され、モノクローナルIgMの供給源として用いられる。いくつかの実施形態において、インビトロのバベシア生育をサポートするハイブリドーマ上清中のIgMの濃度は、約0.2 μg/ml〜約200 μg/mlの範囲である。いくつかの実施形態において、インビトロのバベシア生育をサポートする希釈されたハイブリドーマ上清中のIgMの濃度は、約2 μg/ml〜約4 μg/mlの範囲である。いくつかの実施形態において、インビトロのバベシア生育をサポートする希釈されたハイブリドーマ上清中のIgMの濃度は、約4 μg/ml〜約6 μg/mlの範囲である。いくつかの実施形態において、インビトロのバベシア生育をサポートする希釈されたハイブリドーマ上清中のIgMの濃度は、約6 μg/ml〜約12 μg/mlの範囲である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、一種以上の商用グレードのIgM精製方法を利用して、本願明細書中に記述する方法の実施形態のためのミリグラムの量を生産することができる。非限定的な例には、固定化したマンナン結合タンパク質に基づくキット（Nevens, J.R., et al., Affinity chromatographic purification of immunoglobulin M antibodies utilizing immobilized mannan binding protein, J Chrom (1992) 597:247-256; Nethery, A., et al, Single-step purification of immunoglobulin M on C1q-Sepharose, J Immunol Meth (1990) 126:57-60; Ohta, M., et al, The mechanism of carbohydrate-mediated complement activation by the serum mannan-binding protein, J Biol Chem (1990) 265:1980-1984に記述されるものであり、参照によりその全体が本願明細書に引用される）、ハイドロキシアパタイトに基づく精製（bioprocessintl.com/upstream-processing/biochemicals-raw-materials/igm-purification-with-hydroxyapatite-349783/、参照によりその全体が本願明細書に引用される）、及びセファロースに基づく精製（labs.mcb.harvard.edu/Gaudet/Resources_Files/GEHealthcare_chromatography/Don%27t%20move/18103746AA.pdfにより記述されるものであり、参照によりその全体が本願明細書に引用される）が含まれる。モノクローナル抗体の分離及び精製における他の進歩が、例えばbioprocessintl.com/upstream-processing/biochemicals-raw-materials/igm-purification-w
ith-hydroxyapatite-349783/に記述されるように当業者に公知であり、参照によりその全体が本願明細書に引用される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本方法は、共培養法を含む。いくつかの実施形態において、共培養法により、補体を毎日加える必要無く、培養を進行させることができる。いくつかの実施形態において、共培養法は、一以上の細胞（例えば、初代細胞）又は細胞株（例えば、「初代」又は連続的細胞株）を、一種以上の補体因子の供給源として含む。いくつかの実施形態において、補体因子は、活性補体因子である。いくつかの実施形態において、補体の供給源は、連続的に補体を生産する細胞又は細胞株である。いくつかの実施形態において、補体の供給源は、初代細胞又は細胞株である。いくつかの実施形態において、初代細胞又は細胞株は、連続的に補体を生産する。いくつかの実施形態において、初代細胞又は細胞株は、培地が2〜3日毎に交換される限り、無限に補体を生産する。いくつかの実施形態において、初代細胞又は細胞株は、補体因子を生産及び分泌する。いくつかの好ましい実施形態において、補体生産初代細胞又は細胞株は、培養中に用いられる赤血球の供給源と同じ種に由来する。いくつかの実施形態において、補体の供給源は、連続的に補体を生産する単球性白血病細胞株である。いくつかの実施形態において、一種以上の補体因子の供給源である細胞又は細胞株は、宿主赤血球と、一緒に又はフィルターを介したインターフェース（例えばトランズウェルシステム）を用いて分離して共培養される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、補体の供給源は、補体因子C3の供給源である。いかなる理論にも拘束されるものではないが、寄生虫結合IgM分子は、今度は一以上の補体因子C3の分子により結合され、これが続いて赤血球上の一以上のC3受容体に結合すると考えられている。いかなる理論にも拘束されるものではないが、Ｂ．ミクロチに対するIgMクラス抗体は、補体因子C3を固定し、それにより「補体代替経路」が開始すると考えられている。この経路では、C3は五量体IgM分子に結合し、自発的にC3a及びC3bに切断される。IgM-C3複合体が付着することができる、C3b（及びC4b）に対する赤血球受容体（CR1）が存在する。この結合の完全な多重度が、寄生虫の赤血球への侵入に必要であり、またこれを可能にする。赤血球受容体（CR1）は、流体膜（fluid membrane）中に埋め込まれており、初期付着部位まで遊走して、全体の作用を何倍にも増加させる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、刺激によって又はよらずに、補体因子C3を分泌又は合成かつ分泌することができる任意の細胞又は細胞株を共培養中に用いることができることが考えられる。いくつかの実施形態において、補体の供給源は、刺激によって又はよらずに、補体因子C3を分泌又は合成かつ分泌することができる任意の細胞又は細胞株である。いくつかの実施形態において、刺激によって又はよらずに、補体因子C3を分泌又は合成かつ分泌することができる細胞又は細胞株は、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、balb/c 3T3線維芽細胞、肺胞II型上皮細胞A549、イヌDH82、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、補体の供給源は、末梢血単核細胞（PBMC）を含む。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞株が補体因子C3を分泌又は合成かつ分泌するための刺激は、当該技術分野で周知である。例えば、限定するものではないが、特定の細胞型に応じて、また特定の細胞型による補体分泌の天然の及び/又は医薬的な誘導因子（インデューサー）に基づいて、マクロファージ又は他の補体分泌細胞若しくは細胞株を刺激する多数の方法がある。例えば、いくつかの実施形態において、マクロファージ/単球細胞株については、PMA（ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート）を用いてマクロファージ表現型を誘導し、フェニレフリンを用いてケモカイン及び補体の生産をさらに刺激する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、共培養法に用いられる一種以上の補体生産細胞又は細胞株は、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、balb/c 3T3線維芽細胞、肺胞II型上皮細胞A549、イヌDH82、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株である。いくつかの実施形態において、補体の供給源は、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞株である。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、ヒト細胞又はヒト細胞株である。いくつかの実施形態において、ヒト細胞又は細胞株は、ヒト補体の供給源である。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、非ヒト細胞又は非ヒト細胞株である。いくつかの実施形態において、補体の供給源は、末梢血単核細胞（PBMC）を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、必要な補体生産細胞の数は、各細胞又は細胞株について実験的に決定される。いくつかの実施形態において、必要な補体生産細胞の数は、所望の結果に基づいて、各細胞又は細胞株について実験的に決定される。いくつかの実施形態において、共培養中の補体生産細胞の数は、約1×103/mL〜約1×105/mLの範囲である。いくつかの実施形態において、共培養中の補体生産細胞の数は、約1×105/mL〜約1×108/mLの範囲である。いくつかの実施形態において、共培養中の補体生産細胞の数は、約1×108/mL〜約1×1010/mLの範囲である。いくつかの実施形態において、共培養中の補体生産細胞の数は、約1×102/mL、1×103/mL、1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL、1×107/mL、1×108/mL、1×109/mL、若しくは1×1010/mL、又は前述の値のいずれか2つにより規定された範囲内の値である。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、活性な代謝的及び/又は生化学的表現型を有している。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、例えば、マクロファージに類似する、活性な代謝的及び/又は生化学的表現型を有している。
【００４３】
いくつかの実施形態において、一種以上の補体因子は、培養中の一以上の細胞又は細胞株により提供されない。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞株以外の他の補体の供給源の使用も検討される。非限定的な例には、血漿、血清、及び市販の精製補体タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態において、一種以上の補体因子は、外部から培養に加えられる。例えば、いくつかの実施形態において、補体因子C3又はC3bは、外部から培養に加えられる。いくつかの実施形態において、一種以上の補体因子は、手動で培養に加えられる。いくつかの実施形態において、一種以上の補体因子は、自動化された方法で培養に加えられる。いくつかの実施形態において、一種以上の補体因子は、自動機械を用いて自動化された方法で培養に加えられる。いくつかの実施形態において、一種以上の補体因子は、自動機械を用いて自動化された方法で培養に加えられ、該機械は、一種以上の補体因子を決まった時間に加えるようにプログラムすることができる。いくつかの実施形態において、該機械は、一以上の特定の量の一種以上の補体因子を、決まった時間に加えるようにプログラムすることができる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、補体因子は、培養に入る培地の流れに投入される一つ以上の凍結ペレットとして提供される。いくつかの実施形態において、一つ以上の凍結ペレットは、培養に入る培地の流れに投入され、培養中に所望の濃度で提供される。いくつかの実施形態において、一つ以上の凍結ペレットは、培養に入る培地の流れに手動で投入され、培養中に所望の濃度で提供される。いくつかの実施形態において、一つ以上の凍結ペレットは、機械を用いて自動化された方法で培養に入る培地の流れに投入され、培養中に所望の濃度で提供される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、培養物中の感染した赤血球の画分（「寄生虫血」と表現される）は、約0.001%〜約80%の範囲である。いくつかの実施形態において、補体の供給源の存在により、寄生虫血は約4倍〜約10倍改善される。いくつかの実施形態において、寄生虫血の改善は、増殖されるＢ．ミクロチの株に基づく。いくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチの株は、GI、Westport、及びRMNSの各株を含む狭義のＢ．ミクロチ（B. microti sensu stricto）、Aw1 (Kobe)、Ho234 (Hobetsu)の各株を含む広義のＢ．ミクロチ（B. microti sensu lato）（ミクロチ様）からなる群から選択される。そして、他のミクロチ様種には、Ｂ．ロドハイニ及び「スペインのイヌ/イヌ科の病原体」（以前はタイレリア・アンナエとして知られていた）が含まれる。いくつかの実施形態において、本開示は、他のバベシアの種に適用することができる。非限定的な例には、齧歯類の寄生虫であるＢ．ロドハイニ、イヌのバベシア種、及びＢ．ウルペス（B. vulpes）が含まれる。いくつかの実施形態において、本願明細書中に提示される方法は、いずれも当業者によって任意のＢ．ミクロチ様種に適応させることもできる。他のミクロチ様寄生虫が、これらの中に含まれる。例えば、いかなる理論にも拘束されるものではないが、ミクロチの群は、全ゲノムシーケンシング及び解析の後に、新たな属として浮上してくると考えられる。したがって、追加的シーケンシングデータが入手可能となった後に分類及び/又は再分類される、この新たな属の中の他の寄生虫もまた含まれる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、培養条件によって、バベシアの倍加時間は、約12時間未満〜約24時間の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、倍加時間は、約8時間〜約24時間の範囲である。いくつかの実施形態において、倍加時間は、約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、若しくは24時間、又は前述の値のいずれか2つにより規定された範囲内の値である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、バベシア種は、遺伝的に、また赤血球への侵入の共通した手段の両方で関連しており、そのため、本願明細書中に記述する方法の実施形態による連続的増殖に適している。したがって、いくつかの実施形態において、本願明細書中に記述する方法の実施形態は、狭義の及び広義のバベシア・ミクロチの両方を含む、現在バベシア属中にいる密接に関連したミクロチ様の群（ミクロチ群）の血液寄生虫全体を包含する。これらには、現在は日本の種であるAw1 (Kobe)、Ho234 (Hobetsu)、バベシア・ウルペス（以前はタイレリア・アンナエ又は「スペインのイヌ」）、バベシア・ロドハイニ、バベシア・フェリス（Babesia felis）、及び他のものが含まれる。いくつかの実施形態において、任意のＢ．ミクロチ様種が、本願明細書中に記述される方法の実施形態による連続的増殖に適している。
【００４８】
追加的実施形態
いくつかの実施形態において、バベシア・ミクロチのインビトロ増殖のための方法、該方法は、宿主赤血球を含む培地中、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源の存在下で、Ｂ．ミクロチをインキュベートする工程を含む。本方法のいくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチは、1継代よりも長い間、連続的に増殖される。本方法のいくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチは、少なくとも200時間、連続的に増殖される。本方法のいくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、実質的にIgG抗体を含まない。本方法のいくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源は、宿主赤血球と同じ種に由来する。本方法のいくつかの実施形態において、補体の供給源は、宿主赤血球と共培養される細胞又は細胞株を含み、該細胞又は細胞株は培地中に補体を分泌する。本方法のいくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、balb/c 3T3線維芽細胞、肺胞II型上皮細胞A549、イヌDH82、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、ヒトTHP-1、ヒトHL60、ヒトHeLa 229、HSB-2リンパ性白血病、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される哺乳動物細胞又は細胞株である。本方法のいくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、THP-1、HL60、又はAML-193から選択されるヒト単球/マクロファージ系統に由来する。本方法のいくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、ヒト内皮細胞、ヒト肝細胞、ヒト消化器系細胞、ヒト上皮細胞、ヒト肺胞細胞、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、BALB/c 3T3線維芽細胞、又は肺胞II型上皮細胞A549に由来する。本方法のいくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、末梢血単核細胞である。本方法のいくつかの実施形態において、細胞又は細胞株は、宿主赤血球と、一緒に又はトランズウェルシステムを用いて分離して共培養される。本方法のいくつかの実施形態において、IgM抗体の供給源は、脾臓リンパ球、B細胞、形質細胞、形質芽球、及びハイブリドーマからなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態において、補体の供給源は、外部から培地に加えられる。本方法のいくつかの実施形態において、補体の供給源は、自動装置により加えられる。本方法のいくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルである。本方法のいくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチの倍加時間は、約12時間〜約24時間の範囲である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫の連続的インビトロ増殖のための方法、該方法は、宿主赤血球を含む培地中、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体の供給源の存在下で、Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫をインキュベートする工程を含む。連続的インビトロ増殖のための方法のいくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫は、広義のＢ．ミクロチ、Ｂ．ロドハイニ、又は「タイレリア・アンナエ」（スペインのイヌの病原体）、及びＢ．ミクロチ様種からなる群から選択される。連続的インビトロ増殖のための方法のいくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルである。連続的インビトロ増殖のための方法のいくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫の倍加時間は、約12時間〜約24時間の範囲である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチ又はＢ．ミクロチ関連血液寄生虫を含む増殖培養物、該増殖培養物は、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチIgM抗体又は抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体の供給源の存在下、宿主赤血球を含む培地を含む。いくつかの実施形態において、増殖培養物は、実質的にIgG抗体を含まない。増殖培養物のいくつかの実施形態において、宿主赤血球は、ヒト、マウス、ハムスター、又は他の許容される宿主から選択される。増殖培養物のいくつかの実施形態において、補体の供給源は、宿主赤血球と同じ種に由来する。増殖培養物のいくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体又は抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体の供給源は、宿主赤血球と同じ種に由来する。いくつかの実施形態において、増殖培養物は、宿主赤血球と共培養される細胞又は細胞株をさらに含み、該細胞又は細胞株は培地中に補体を分泌する。増殖培養物のいくつかの実施形態において、抗Ｂ．ミクロチIgM抗体又は抗Ｂ．ミクロチ関連血液寄生虫IgM抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルである。増殖培養物のいくつかの実施形態において、Ｂ．ミクロチ又はＢ．ミクロチ関連血液寄生虫の倍加時間は、約12時間〜約24時間の範囲である。
【００５１】
本願明細書中の教示に基づき、当業者は、本願発明の完全な範囲を実行する方法を理解する。例えば、本願明細書中の教示に基づき、当業者は、長期間の連続的増殖を行うことができる。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、非限定的であり、当業者により検討される他の変形（バリアント）が、本開示の範囲に含まれる。
【００５３】
実施例1
ハムスター赤血球を、EDTA抗凝固剤を含む全血として購入し（BioChemed Services、Winchester、VA）、ヒトO型赤血球を、発明者から、EDTA抗凝固剤を含む全血として、近隣の医療施設において、2週間間隔で採血した。
【００５４】
24ウェル細胞培養プレート（Sarstedt）中で、37℃、空気中5%CO2雰囲気（好ましい）又は微好気性定常期（MASP）雰囲気（5% CO2、2% O2、及び93%窒素）のいずれかにおいて、モジュール式インキュベーションチャンバー（Billups-Rothenberg Inc.、Del Mar、CA）を用いて、培養を確立し維持した。
【００５５】
MASP雰囲気を用いて感染パーセンテージが増加するにつれて、いわゆるクライシス又は変性体という、小型で高密度の赤血球内の物体への規則的な傾向があった。酸素が最も明らかな変数であったため、これらの培養をMASP雰囲気から空気中5%CO2へ移動した。驚くべきことに、余剰の酸素により、通常の輪状体及び複数の梨状のメロゾイトの優位に一晩で復帰し、クライシス体はおそらく状態が改善すれば再生できることが示唆された。この現象は、ハムスター感染の後期でもインビボで見られる。
【００５６】
実施例2
24ウェルのウェル培養プレート中でのインビトロ培養を用いて、補体及びIgM抗体の両方について力価測定を行い至適濃度を決定した。ヒト赤血球を用いた培養物をヒト補体及びヒトIgM抗体と合わせた。同様に、最適な効果のために、ハムスター赤血球を用いた培養物を、ハムスター補体及びハムスターIgM抗体と合わせた。変動因子（補体又はIgM抗体）を、赤血球及びワーキング培養（変動成分を引いたもの）を加える前に、培養ウェル内で少量に段階希釈した。4ウェル力価測定については、1個の生育培養ウェルを滅菌PBSで2回洗浄し、細胞を、追加の新鮮赤血球及び力価測定する変動成分を既に補った4つの培養ウェルに加えた。8ウェル力価測定については、2個の培養ウェルを一緒に処理し、1:4の分割を作製した。ストック培地を続いて加えて、ウェルあたりの総量を1.25 mLにした。終夜インキュベーションの後、様々な培地を除去し、1 μLアリコートの赤血球を、ダルベッコPBS（DPBS）中で1:100に希釈し、試験のために1 μLのアリコートを12ウェルのIFAスライド上にスポットした。試験する成分に応じて、スライドを以下の一つ以上で染色した：抗IgM蛍光コンジュゲート、抗補体C3蛍光コンジュゲート、又は抗Ｂ．ミクロチIgG（二次コンジュゲートを含む）。Ｂ．ミクロチについてのおよそ20〜24時間のインビボ倍加速度に基づいて、力価は一般的にはプラトーを示し、その後それより高い希釈では400Xの顕微鏡視野あたりの蛍光寄生虫が50%低下する。
【００５７】
実施例3−補体価測定
補体活性を経時的に追跡するために、4ウェル分の培養物をプールし、PBSで2回洗浄し、続いて非感染赤血球及び新鮮培地で割って、同一の出発物質を有する全量の24ウェルの培養プレートを作製した。様々な間隔をおいて、培養物にヒト補体を補い、軽く混合し、インキュベーターに戻した（図1）。
【００５８】
図1は、Ｂ．ミクロチの生育に対する血清補体の補充の効果を示す。全期間にわたって補充無しの対照は、（■）で示し、一方で4時間の時点でのみ2%補体（8X）を補った、別のセットの対照は、（●）で示した。0.25%補体の4、8、及び12時間の時点での補充は、（▲）で示し、一方で（◆）は8及び12時間の時点での補充を示し、（□）は、12時間の時点でのみの0.25%の補充を示す。ヒト細胞及び成分のウェルを、24時間にわたってサンプリングし、IgG免疫血清及び抗IgGコンジュゲートを用いて染色した。
【００５９】
補体が活性を維持した短い時間により、3〜4時間毎の補充の必要性を回避するために通常よりも数倍多く使用するという戦略が示唆されたが、この追加の補体は、8時間未満しか活性でなかったか、又は寄生虫の増殖の増加を伴わない赤血球の溶解の増加をもたらした。生じたゴースト宿主赤血球は、免疫血清で間接的に、抗C3コンジュゲートで直接染色され、補体を介した溶解が示唆された。
【００６０】
実施例4
実施例1及び2において記述された力価測定を、類似の方法で用いて、モノクローナル抗Ｂ．ミクロチIgM抗体を、個別に及び複数での両方で、最適化する。Ｂ．ミクロチの倍加時間によって、個別の又は混合されたクローンの有用性を決定するための1日（終夜）アッセイ又はより長いアッセイ（より複雑だが非常に有用）を行うことができる。ポリクローナル抗体と類似の機能をするそのようなクローンが利用可能であることによって、本技術は、研究者により広く利用可能になる。
【００６１】
IgMモノクローナル抗体を用いた培養により、IgMモノクローナル抗体が良好に作用すること、及びＢ．ミクロチを血清を含まない培地中でうまく生育させることができることが示された。培地は、グルタミンを含むRPMI 1640-HEPES（50%）及びLeibovitz L15（50%）、抗生物質、並びにTHP-1細胞用2X Insulin-Transferrin-Selenium補充を含んだ。倍加時間は、24時間未満（12時間により近い）であった。
【００６２】
実施例5
培養された種の一つであり、現在培養において増殖（expand）されているものは、薄層塗抹標本で特徴的な寄生虫血によって診断され、IFA試験によりＢ．ミクロチに対する抗体価の4倍より高い増加を示した、単純性（合併症のない）バベシア症のドナーに由来した。薄層塗抹寄生虫血は、0.12%（800個のカウントされた赤血球あたり1個のメロゾイト）と記録され、インビトロで8継代後（1:4培養分割）、感染率は種々の培養ウェルにおいて4〜6%であった。GI株を用いた少なくとも3〜4日間毎の継代は、2ヶ月より長い間一貫（安定）していたが、手法の改善毎にパーセンテージが増加した。最終的にこの株（Westport株として分類された）は、凍結されるまでに19継代に達し、2750億倍増加し、その間に培養は凍結ストックから3回起こされた。図2は、インビトロ培養したＢ．ミクロチ、Westport 株、第18継代の薄層塗抹標本を示す。
【００６３】
成分及び手法が商業的に入手可能であることにより、バベシア症のより明確な試験並びに治療、医薬、及び診断法の開発か可能になり、またＢ．ミクロチの生活環についての基礎研究の一助となる。
【００６４】
実施例6
血清又は血漿由来のIgMは、Dialysis Buffer（リン酸カリウム緩衝液、10 mM pH 5.4）に対する2〜8°Cでの終夜の透析によって、クリオグロブリンとして沈殿される。クリオグロブリンは、冷Dialysis Bufferで洗浄され、続いて酢酸緩衝生理食塩水（10 mM酢酸pH 5.4）に溶解された。たとえ半精製IgMであっても不安定であることがよく知られているため、等量のIgM Stabilizing Diluent（2X−他の実施例の2倍であることを示す）と混合され、2〜8℃で維持される。IgM Stabilizing Diluent（1X）は、50 mM酢酸緩衝液（pH 5.5）中、20%ソルビトール及び1 Mグリシンからなる。この安定化されたIgM溶液は、赤血球に対する負の作用により、培地中で1:50未満の希釈で用いることができず、その使用希釈は、連続希釈を用いた複数のインビトロ試し培養により決定された。いくつかの実施形態において、長期間の経験の後に、使用希釈は、1%から、安定化IgMのIFA抗体価（およそ1:400）とほぼ等しい値まで低下した。
【００６５】
実施例7
IgMは、細胞培養上清から、マンナン結合タンパク質カラムを含むPierce IgM Purification Kit (44897)を用いて精製した。100 mLの上清から約2 mgのIgMが得られた。IgM抗体は、IgGと比較して、アフィニティは低いがアビディティは高い。しかし、IgMハイブリドーマは、IgGハイブリドーマと比較して、より高濃度の抗体を分泌する傾向がある。ハイブリドーマからのIgM分泌の濃度は、約30 μg/ml〜約50 μg/mlの範囲であった。これは、約5 μg/ml〜約20 μg/mlの範囲であるIgG分泌とは対照的である。
【００６６】
実施例8
一つの実験において、Ｂ．ミクロチに対して反応性を示した82クローンのIgMモノクローナル抗体中、17クローンのIgMモノクローナル抗体が、インビトロでの増殖も可能にした。これらの17クローンのIgMモノクローナル抗体は、インビトロの培養中、2日の時点で、バックグラウンドレベルの3倍より大きく、増殖をサポートした。17クローンは、狭義のＢ．ミクロチ及び広義のＢ．ミクロチ株の生育をインビトロでサポートした。
【００６７】
実施例9
別の実験において、274クローンのIgMモノクローナル抗体中、96クローンのIgMモノクローナル抗体の、Ｂ．ミクロチに対する反応性は、部分的/弱い反応性〜強い反応性の範囲であった。96クローン中、16クローンがインビトロでの増殖を可能にした。IgM上清の抗体価は、未希釈〜約1:100の範囲、例えば、未希釈、1:2、1:10、及び1:100であった。
【００６８】
16クローン中、倍加時間が24時間のインビトロでの増殖も可能にし、インビトロ培養において、3日の時点でバックグラウンドレベルに対し少なくとも4倍の増加（免疫蛍光アッセイにより決定）をもたらした、10クローンが選択された。7クローンに関して、60% v/v希釈の培養上清を用いてインビトロ増殖を試験した。60% v/v希釈した上清中のIgMの濃度は、ELISAにより決定すると、約6 μg/ml〜約12 μg/mlであった。
【００６９】
ポリクローナルIgM及びモノクローナルIgMでの生育速度の比較は、IgMのクローンを混合することが有益である、すなわちIgMのクローン混合物の使用が、単一のIgMクローンを個別に使用するのと比べて有益であることを示唆している。
【００７０】
本開示において引用される全ての引用文献は、参照によりその全体が本願明細書に引用される。
【００７１】
本開示は、本願中に記述される特定の実施形態に関して限定されるものではなく、該実施形態は、様々な態様の例示として意図されるものである。当業者に明らかなように、その主旨及び範囲を逸脱することなく、多数の改変及び変形を行うことができる。本願明細書中に列挙されたものに加えて、本開示の範囲内の機能的に等価な方法及び装置が、上述の発明の詳細な説明から当業者には明らかである。そのような改変及び変形は、添付の特許請求の範囲の内に含まれることが意図される。本開示は、添付の特許請求の範囲の文言、及びそのような特許請求の範囲に権利が与えられた均等物の全範囲によってのみ限定されるものである。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系に限定されないことが理解され、これらはもちろん変動し得る。また、本願明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、限定を意図するものではないことも理解される。
【００７２】
当業者は、本願明細書中に開示されるこの並びに他のプロセス及び方法について、該プロセス及び方法において発揮される機能を、異なる順序で実行してもよいことを理解する。さらに、概説した工程及び操作は、例として提示しただけであり、該工程及び操作の一部は、開示した実施形態の本質を損なうことなく、任意選択的なものであってもよく、より少ない工程及び操作にまとめてもよく、又は追加的な工程及び操作に拡張してもよい。
【００７３】
当業者に理解されるように、ありとあらゆる目的のために、例えば明細書の記載（written description）の提示に関して、本願明細書中に開示される全ての範囲は、そのありとあらゆる部分的な範囲（サブレンジ）及び部分的な範囲の組合せも包含する。列挙されたあらゆる範囲は、少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分、十等分等に分解された同範囲を十分に説明しまた実施可能にしていると容易に理解することができる。非限定的な例として、本願明細書中で検討された各範囲は、下3分の1、中央3分の1、及び上3分の1にたやすく分解することができる。また、これも当業者に理解されるように、全ての言語、例えば「最大」、「少なくとも」等は、記載された数字を含み、上述のように後に部分的な範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者に理解されるように、範囲は、各々の個々の構成要素を含む。したがって、例えば、1〜3個の細胞を有する群は、1個、2個、又は3個の細胞を有する群を指す。同様に、1〜5個の細胞を有する群は、1個、2個、3個、4個、又は5個の細胞を有する群を指す等。
【００７４】
上述の内容から、本開示の様々な実施形態が、本願明細書中に例示の目的のために記述され、本開示の範囲及び主旨を逸脱することなく、様々な改変を行うことができることが理解される。したがって、本願明細書中に開示される様々な実施形態は、限定的なものとして意図されず、真の範囲及び主旨は、以下の特許請求の範囲により示される。
【図１】
2019528780.tif 000003
【図２Ａ−２Ｄ】
2019528780.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月23日(2019.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バベシア・ミクロチのインビトロ増殖のための方法であって、宿主赤血球を含む培地中、補体の供給源及び抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源の存在下で、Ｂ．ミクロチをインキュベートする工程を含み、前記抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源が、実質的にIgG抗体を含まず、約0%〜10%のIgG抗体を有し、前記補体の供給源が、前記宿主赤血球と共培養される細胞又は細胞株を含み、前記細胞又は細胞株が、前記培地中に前記補体を分泌する、方法。
【請求項２】
Ｂ．ミクロチが、1継代よりも長い間、連続的に増殖される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｂ．ミクロチが、少なくとも200時間、連続的に培養される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗Ｂ．ミクロチIgM抗体の供給源が、宿主赤血球と同じ種に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞又は細胞株が、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、BALB/c 3T3線維芽細胞、肺胞II型上皮細胞A549、イヌDH82細胞株、ヒトTHP-1細胞株、ヒトHL60細胞株、ヒトHeLa 229細胞、HSB-2リンパ性白血病細胞、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞又は細胞株が、ヒトTHP-1細胞株、ヒトHeLa 229細胞、HSB-2リンパ性白血病細胞、及び単球性白血病細胞株からなる群から選択される哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞又は細胞株が、THP-1細胞株、HL60細胞株、又はAML-193細胞株から選択されるヒト単球/マクロファージ系統に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞又は細胞株が、ヒト内皮細胞、ヒト肝細胞、ヒト消化器系細胞、ヒト上皮細胞、ヒト肺胞細胞、マウスPD388D1、ハムスターNIL-8胚性線維芽細胞、BALB/c 3T3線維芽細胞、又は肺胞II型上皮細胞A549に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞又は細胞株が末梢血単核細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞又は細胞株が、宿主赤血球と一緒に又はトランズウェルシステムを用いて宿主赤血球と分離して共培養される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
IgM抗体の供給源が、脾臓リンパ球、B細胞、形質細胞、形質芽球、及びハイブリドーマからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
補体の供給源が、外部から培地に加えられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
補体の供給源が、自動装置により加えられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抗Ｂ．ミクロチIgM抗体がポリクローナル又はモノクローナルである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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