(57)【要約】本出願は、望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを、原核細胞においてユビキチン融合構築物として発現させることによる、ペプチドもしくはタンパク質、またはその誘導体の調製方法に関する。この方法は、ａ）アフィニティータグもしくはＳＩタグ、またはアフィニティータグおよびＳＩタグの組合せをコードするヌクレオチドに任意選択で連結されたユビキチン融合構築物を、発現ベクターにライゲートするステップ、ｂ）前記ユビキチン融合構築物を有する前記発現ベクターを宿主細胞に形質転換するステップ、そして発現を誘導してユビキチン融合タンパク質またはペプチドを得るステップをさらに含み得る。
2019528686.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質もしくはペプチドまたはその誘導体を産生するための方法であって、
ａ）望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを、宿主細胞においてユビキチン融合構築物として発現させるステップであって、ユビキチン融合タグがＳＩタグに連結されている、ステップ、
ｂ）発現されたユビキチン融合タンパク質またはペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記ＳＩタグが、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）またはその誘導体を含む酸性アミノ酸；リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）またはその誘導体を含む塩基性アミノ酸；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、フェニルアラニン（ＰｈａまたはＦ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）またはその誘導体を含む非極性アミノ酸から選択されるペプチド鎖であり、鎖長が１つもしくは複数の酸性アミノ酸、１つもしくは複数の塩基性アミノ酸、１つもしくは複数の非極性アミノ酸、またはその適切な組合せを有する２〜２０個のアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
適切なＳＩタグが、
ａ）ＥＤＥＤ
ｂ）ＥＥＤＥＥＤＥＤ
ｃ）ＥＥＤＤＥＤＤＥＥＤＤＥ
ｄ）ＥＥＤＤＥＤＤＥＥＤＤＥＥＤＥＤ
ｅ）ＲＲＲ
ｆ）ＲＲＲＲＲ
ｇ）ＲＲ
ｈ）ＡＦＶ
ｉ）ＧＡＩＦＬＶ
ｊ）ＧＡＩＦＬＧＡＶ
ｋ）ＧＡＩＦＬＧＡＶＬＧ
ｌ）ＧＡＩＦＬＧＡＶＬＧＶＷ
ｍ）ＧＷＡＩＦＬＶＧＡＶＬＧＶＷ
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
発酵工程によって、生じた融合タンパク質またはペプチドの蓄積を増大させるステップをさらに含み、前記発酵工程は、
ａ）発酵培養培地中で、ユビキチン融合構築物を有する発現ベクターを含む形質転換体原核細胞を誘導することであって、ユビキチン融合タグがＳＩタグに連結されていること、
ｂ）融合タンパク質の蓄積に適した条件下で前記形質転換体原核細胞を培養すること、
ｃ）ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを回収すること、
ｄ）任意選択で、前記ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを精製すること、
ｅ）前記ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを酵素により切断すること、および
ｆ）タンパク質またはペプチドを回収すること、
ｇ）任意選択で、前記タンパク質またはペプチドを精製すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質またはペプチドの前記精製が、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーにより実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＧＬＰ−１アナログが配列番号１のリラペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドの誘導体がリラグルチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ａ）リラペプチドの２０位のＬ−リシンの側鎖ＮＨ２を、式Ｉ
【化１０】
2019528686.tif 000016
（式中、ｎは、０〜６であり、Ｒ１は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
Ｒ２は、Ｃ３〜３９−アルキル、Ｃ３〜３９−アルケニルまたはＣ３〜３９アルカジエニルから選択され、
Ｒ３は、ヒドロキシ、またはその、Ｎ−ヒドロキシイミドエステルなどの反応性エステルから選択される）
のアシル化剤と反応させるステップ、および
ｂ）任意選択で、Ｒ１がＣ１〜６アルキルである場合、リラグルチドを得るために、アシル化リラペプチドを加水分解するステップ
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式Ｉの化合物が、式ＩＩの化合物または式ＩＩＩの化合物
【化１１】
2019528686.tif 000017
から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）リラペプチドの２０位のＬ−リシンの側鎖ＮＨ２を、式ＩＶ
【化１２】
2019528686.tif 000018
（式中、Ｒ１は、水素またはＣ１〜１２−アルキルから選択され、Ｒ３は、ヒドロキシ、またはその、Ｎ−ヒドロキシイミドエステルなどの反応性エステルから選択される）
のアシル化剤と反応させるステップ、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた生成物にパルミトイル基を導入するステップ、
ｃ）任意選択で、Ｒ１がＣ１〜６アルキルである場合、リラグルチドを得るために、ステップ（ｂ）で得られたアシル化リラペプチドを加水分解するステップ
を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを、原核細胞においてユビキチン融合構築物として発現させることによる、ペプチドもしくはタンパク質、またはその誘導体の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景および先行技術の開示
合成ペプチドは、様々な生物学分野における有益な研究手段である。低分子ペプチドは、抗体を生成するのに広く使用されている。免疫学者らは、抗原性の多様性を評価し抗原提示について研究するのに有用なペプチドを発見してきた。細胞生物学者らは低分子ペプチドを使用して、細胞と基質との接着を妨害し、タンパク質を特定の細胞区画に指向させる。ペプチドは、タンパク質の構造、フォールディングまたは会合についての研究におけるモデル系として長らく機能してきた。ペプチドは、有用な治療特性または薬理特性も有する。
【０００３】
固相合成技術を使用してペプチドを得ることは、時間がかかり、面倒で高価な方法である。固相合成では、ペプチドは、各カップリングステップ間で化学物質を変化させながら一度に一残基ずつ構築しなければならない。さらに、ペプチド鎖が伸長するにつれて繰り返しのカップリングがますます必要となる。また短縮型またはそれ以外の異常な合成ペプチドからの望ましい合成ペプチドの精製も、非常に困難であることを確認することができる。
【０００４】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるユビキチン融合タンパク質またはペプチドの発現、およびその後の精製が、Ｍｏｎｉａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻、４０９３〜４１０３頁（１９８９年３月５日）により記載されている。これらのカルボキシル伸長部タンパク質（ＣＥＰ）は、アミノ酸長１２〜８０で、酵母からヒトに至る各種生物に見られる天然に存在するタンパク質である。
【０００５】
Ｅｃｋｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻、７７１５〜７７１９頁（１９８９年５月５日）は、天然の供給源には微量にしか存在しない天然に存在するタンパク質生成物を大量に単離することを可能にするための、微生物における、クローニングされた真核生物遺伝子の発現について開示している。
【０００６】
Ｂｕｔｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８６巻、２５４０〜２５４４頁（１９８９年４月）は、Ｅ．ｃｏｌｉを使用してユビキチン−融合タンパク質をクローニングするための発現系について開示しており、これらのタンパク質のＮ末端に、ユビキチンをそのカルボキシル末端で融合させることで、上記のＥｃｋｅｒらで言及されたタンパク質などの不安定なまたは発現が不十分なタンパク質の収率が増加することを開示している。ユビキチン融合技術は、原核生物および真核生物の両方において、クローニングされた遺伝子生成物の収率を増強させるのに一般的に使用される潜在能力を有するとＢｕｔｔらは結論付けている。
【０００７】
早くも１９８６年には、細菌および酵母の両方において発現されると任意のＮ末端アミノ酸を有する［ベータ］−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を調製するのに、ユビキチンが役立つ可能性があることを、Ｂａｃｈｍａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４巻、１７９〜１８６頁（１９８６年）が示唆している。この先行技術では、天然の細胞内タンパク質のクローニングおよび産生のために、ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを利用する真核および原核細胞両方での発現を使用することが強調されている。これらの天然のタンパク質は大抵ユビキチンより大きい。
【０００８】
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ、２５０巻、３９０〜３９９頁（１９８６年）は、ユビキチンが、標的タンパク質への結合後にコンフォメーション変化を受ける可能性があると推測している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｎｉａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻、４０９３〜４１０３頁（１９８９年３月５日）
【非特許文献２】Ｅｃｋｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻、７７１５〜７７１９頁（１９８９年５月５日）
【非特許文献３】Ｂｕｔｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８６巻、２５４０〜２５４４頁（１９８９年４月）
【非特許文献４】Ｂａｃｈｍａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４巻、１７９〜１８６頁（１９８６年）
【非特許文献５】Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ、２５０巻、３９０〜３９９頁（１９８６年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本出願の目的は、先に論じられた先行技術で報告された方法に関連する問題に取り組む、ユビキチン融合タグの使用を含む、ペプチドまたはタンパク質の調製のための改善された組換え方法を提供することである。
【００１１】
発明の要旨
第１の実施形態では、本発明は、タンパク質もしくはペプチドまたはその誘導体を産生するための方法であって、
ａ）望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを、宿主細胞においてユビキチン融合構築物として発現させるステップ、
ｂ）発現されたユビキチン融合タンパク質またはペプチドを回収するステップ
を含む方法を提供する。
【００１２】
第１の実施形態の第１の態様では、タンパク質もしくはペプチドまたはその誘導体を産生するための方法は、
ａ）アフィニティータグもしくはＳＩタグ、またはアフィニティータグおよびＳＩタグの組合せをコードするヌクレオチドに任意選択で連結されたユビキチン融合構築物を、発現ベクターにライゲートするステップ、
ｂ）前記ユビキチン融合構築物を有する前記発現ベクターを宿主細胞に形質転換するステップ、そして発現を誘導してユビキチン融合タンパク質またはペプチドを得るステップをさらに含む。
【００１３】
第２の実施形態では、本発明は、タンパク質もしくはペプチドまたはその誘導体を産生するための方法であって、
ａ）望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを、宿主細胞においてユビキチン融合構築物として発現させるステップであって、ユビキチン融合タグがＳＩタグに連結されている、ステップ、
ｂ）発現されたユビキチン融合タンパク質またはペプチドを回収するステップ
を含む方法を提供する。
【００１４】
第３の実施形態では、本発明は、アフィニティータグおよびＧＬＰ−１アナログをともに有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００１５】
第４の実施形態では、本発明は、ＧＬＰ−１アナログおよびＳＩタグをともに有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００１６】
第５の実施形態では、本発明は、アフィニティータグおよびＳＩタグの組合せをともに有する、ＧＬＰ−１アナログを有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００１７】
第６の実施形態では、本発明は、リラペプチド（Ｌｉｒａｐｅｐｔｉｄｅ）およびアフィニティータグを有するユビキチンの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００１８】
第７の実施形態では、本発明は、リラペプチドおよびＳＩタグをともに有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００１９】
第８の実施形態では、本発明は、アフィニティータグおよびＳＩタグの組合せをともに有する、リラペプチドを有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００２０】
第９の実施形態では、本発明は、融合タンパク質またはペプチドを高収率で発現させる方法を提供する。
【００２１】
第１０の実施形態では、本発明は、発現のために、単一のプロモーター下または複数のプロモーター下のいずれかでともにクローニングされる、多コピーのユビキチン融合構築物を使用する。任意選択で、多コピーのユビキチン融合構築物は、発現のために単一の構築物としてともにクローニングされ得る。
【００２２】
本発明の第１１の実施形態では、単一コピーのユビキチン融合構築物が、発現のためにともにクローニングされる。
【００２３】
第１２の実施形態では、本発明は、原核細胞においてユビキチン融合構築物を発現させ、ユビキチンからペプチドを酵素により切断し、得られたペプチドを精製することにより、純度の高い合成ペプチドを得る方法を提供する。
【００２４】
第１３の実施形態では、本発明は、タンパク質またはペプチドを生産するための方法であって、
ａ）発酵培養培地中で、発現ベクターおよびユビキチン融合構築物を含む形質転換体原核細胞を誘導するステップであって、ユビキチン融合タグがＳＩタグに連結されているステップ、
ｂ）融合タンパク質の蓄積に適した条件下で形質転換体原核細胞を培養するステップ、
ｃ）ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを回収するステップ、
ｄ）任意選択で、ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを精製するステップ、
ｅ）ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを酵素により切断するステップ、および
ｆ）タンパク質またはペプチドを回収するステップ、
ｇ）任意選択で、タンパク質またはペプチドを精製するステップ
を含む、方法を提供する。
【００２５】
第１４の実施形態では、本発明は、その等電点（ｐＩ）で沈殿させることによるタンパク質またはペプチドの精製を提供する。
【００２６】
第１５の実施形態では、本発明は、リラグルチドまたはその誘導体を調製するための方法であって、
ａ）リラペプチドの２０位のＬ−リシンの側鎖ＮＨ２を、式Ｉ
【化１】
2019528686.tif 000003
（式中、ｎは、０〜６であり、Ｒ１は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
Ｒ２は、Ｃ３〜３９−アルキル、Ｃ３〜３９−アルケニルまたはＣ３〜３９アルカジエニルから選択され、
Ｒ３は、ヒドロキシ、またはその、Ｎ−ヒドロキシイミドエステルなどの反応性エステルから選択される）
のアシル化剤と反応させるステップ、および
ｂ）任意選択で、Ｒ１がＣ１〜６アルキルである場合、リラグルチドを得るために、アシル化リラペプチドを加水分解するステップ
を含む、方法を提供する。
【００２７】
第１６の実施形態では、本発明は、リラグルチドまたはその誘導体を調製するための方法であって、
ａ）リラペプチドの２０位のＬ−リシンの側鎖ＮＨ２を、式ＩＶ
【化２】
2019528686.tif 000004
（式中、Ｒ１は、水素またはＣ１〜６−アルキルから選択され、Ｒ３は、ヒドロキシ、またはその、Ｎ−ヒドロキシイミドエステルなどの反応性エステルから選択される）
の化合物と反応させるステップ、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた生成物にパルミトイル基を導入するステップ、
ｃ）任意選択で、Ｒ１がＣ１〜６アルキルである場合、リラグルチドを得るために、ステップ（ｂ）で得られたアシル化リラペプチドを加水分解するステップ
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、組換え構築物の制限酵素分析の図である。組換えプラスミド（多コピー五量体を有するｐＵＣ５７−Ｕｂｉ−リラペプチド）を、制限酵素消化により分析し、ローディングパターンについて１．２％アガロースゲルで分離し、次いでＥｔＢｒで染色し、ＵＶ光を使用して画像を捕捉した。
【００２９】
【図２】図２は、実施例１に従って調製された、ユビキチン融合構築物を有するリラペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析についての図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
本出願は、ＧＬＰ−１アナログに対してユビキチン融合タグを使用することによる、改善された組換えタンパク質産生方法に関する。ユビキチンは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙから構成されるＣ末端を有する、高度に保存された７６残基のタンパク質であり、全ての真核細胞で、遊離した状態と、様々な細胞タンパク質に共有結合でコンジュゲートした状態の両方で見出される。ユビキチンは、哺乳動物、酵母およびセロリと多岐にわたる細胞に見られる。ユビキチンは、そのカルボキシル末端で他のタンパク質のアミノ基に結合する。ユビキチンがアルファ−アミノ末端に結合した場合、このような生成物は文献ではユビキチンカルボキシル伸長部タンパク質と呼ばれる。真核細胞では、伸長部タンパク質は加水分解酵素（ペプチダーゼ）によりユビキチン分子から切断される。ユビキチンがタンパク質に結合することは、タンパク質分解による後者の分解のシグナルであると仮定されてきた。ユビキチンは中性の等電点６．７および分子量８５６５を有する。
【００３１】
ユビキチンは熱および極端なｐＨに対して極めて安定であり、これは、望ましいアミノ酸配列のペプチドの調製を促進し、適切な酵素による切断を可能にする基質としてのユビキチンの使用に不可欠な特性である。
【００３２】
ユビキチン、その特性および機能の詳細な分析については、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８年）出版、Ｍａｒｔｉｎ  Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ編集の書籍「Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ」を参照する。
【００３３】
任意の望ましいアミノ酸配列を有する様々なペプチドを、ユビキチンを融合タグとして利用することにより調製することができ、そこでは、望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドのアミノ末端が、ユビキチン遺伝子のカルボキシル末端と融合される。
【００３４】
ユビキチン−ペプチド融合生成物からペプチドを切断する真核生物酵素は、純度の高いペプチドの産生に必要な成分である。ユビキチンおよび切断酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物には存在しないか、またはユビキチン−伸長ペプチド結合を切断できないほど少量で存在するかのいずれかである。したがって、合成ペプチドによりカルボキシル末端が伸長したユビキチン融合タンパク質またはペプチドの切断は、適切な切断酵素の添加なくして発生しない。
【００３５】
個々のペプチド融合体に最適なコドンの組合せは、高い比収率に一部関与すると考えられ、それにより本技術は非常に有益なものとなっている。生物の生理学的性質を操作するのではなく、本発明でなされるように培養物中のバイオマスを最大にすることに集中することにより、比収率が増加し、それにより下流プロセシングの量が減少することで全体の収率が増加する。本発明によれば、リラペプチドのアミノ酸配列は以下の配列番号１を有する：
【化３】
2019528686.tif 000005
【００３６】
本発明によれば、リラグルチドのアミノ酸配列は以下の配列番号２を有する：
【化４】
2019528686.tif 000006
【００３７】
本明細書では、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する、一般的に公知の３文字シンボルまたは１文字シンボルのいずれかで呼ばれ得る。同様に、ヌクレオチドは一般的に許容される１文字記号で呼ばれ得る。
【００３８】
第１の実施形態では、本発明は、タンパク質もしくはペプチドまたはその誘導体を産生するための方法であって、
ａ）望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを、宿主細胞においてユビキチン融合構築物として発現させるステップ、
ｂ）発現されたユビキチン融合タンパク質またはペプチドを回収するステップ
を含む方法を提供する。
【００３９】
第１の実施形態の一態様では、本発明は、望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドのアミノ末端を、ユビキチンのカルボキシル末端と融合させることを含む、ユビキチン融合構築物の調製を含む。本発明によれば、ユビキチン融合構築物は、アフィニティータグもしくはＳＩタグ、またはアフィニティータグおよびＳＩタグの組合せとさらに融合させてもよい。
【００４０】
第１の実施形態の別の態様では、任意選択でアフィニティータグもしくはＳＩタグ、またはアフィニティータグおよびＳＩタグの組合せとともに、ユビキチンと融合させた望ましいタンパク質またはペプチドの合成オリゴヌクレオチド構築物は、クローニングベクターにクローニングされ得る。さらに、クローニングベクターにクローニングされた合成構築物は、クローニング原核細胞株に形質転換され、形質転換体は、クローニングベクターに存在する抗生物質選択マーカーにより選択することができる。ユビキチン融合構築物は、制限酵素による組換えプラスミドの制限酵素消化により単離される。
【００４１】
第１の実施形態の第１の態様では、タンパク質もしくはペプチドまたはその誘導体を産生するための方法は、
ａ）アフィニティータグもしくはＳＩタグ、またはアフィニティータグおよびＳＩタグの組合せをコードするヌクレオチドに任意選択で連結されたユビキチン融合構築物を、発現ベクターにライゲートするステップ、
ｂ）ユビキチン融合構築物を有する前記発現ベクターを宿主細胞に形質転換するステップ、そして発現を誘導してユビキチン融合タンパク質またはペプチドを得るステップをさらに含む。
【００４２】
ステップａ）によれば、得られたユビキチン融合構築物を発現ベクターにライゲートすることができる。発現ベクターは、ライゲーションにとって望ましい制限部位を予め有していてもよいし、制限酵素を使用することにより発現ベクターによって導入されてもよい。
【００４３】
任意選択でアフィニティータグもしくはＳＩタグ、またはアフィニティータグおよびＳＩタグの組合せをコードするヌクレオチドに連結された、ライゲートされたユビキチン融合構築物、ならびに発現ベクターは、発現を誘導するため宿主細胞に形質転換され得る。
【００４４】
第１の実施形態の第２の態様では、ライゲートされたユビキチン融合構築物および発現ベクターは、任意選択でクローニング原核生物株に形質転換されてよく、形質転換体は、発現ベクターに存在する抗生物質選択マーカーにより選択することができる。ユビキチン合成構築物は、任意選択で、ゲル電気分解または当技術分野で周知の任意の他の技術により精製することができる。組換え発現ベクター（発現ベクターおよびユビキチン融合構築物）を含む原核生物株の組換えクローンの陽性コロニーはまず、プライマーを使用してＰＣＲ増幅によりスクリーニングされる。ＰＣＲ後、ユビキチン融合構築物を有する増幅された合成構築物生成物を単離し、最後に制限酵素分析により確認した。任意選択で、合成構築物はゲル電気泳動または当技術分野で周知の任意の他の技術により精製され得る。
【００４５】
第１の実施形態の第３の態様では、ユビキチン融合構築物は、発現宿主細胞に形質転換され、形質転換体は、発現ベクターに存在する抗生物質選択マーカーにより選択することができる。
【００４６】
第１の実施形態の第１の態様のステップ（ｂ）によれば、組換え発現宿主におけるタンパク質発現は化学薬剤により誘導される。発現後、融合タンパク質またはペプチドを有する発現宿主の陽性コロニーが選択マーカーの助けにより選択され、さらに発酵工程に使用することができる。
【００４７】
第２の実施形態では、本発明は、タンパク質もしくはペプチドまたはその誘導体を産生するための方法であって、
ｃ）望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを、宿主細胞においてユビキチン融合構築物として発現させるステップであって、ユビキチン融合タグがＳＩタグをコードするヌクレオチドに連結されている、ステップ、
ｄ）発現されたユビキチン融合タンパク質またはペプチドを回収するステップ
を含む方法を提供する。
【００４８】
本発明の第２の実施形態の第１の態様では、ユビキチン融合構築物の溶解性は、適切なＳＩタグをユビキチン融合タンパク質のＮ末端に付加することにより調節することができる。ＳＩタグが融合したユビキチン融合構築物の目標ｐＩは、３．０〜１０．０、好ましくは４〜９とすることができる。
【００４９】
第２の実施形態の第２の態様では、本発明は、望ましいタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチド、ユビキチン融合タグを含み、任意選択でアフィニティータグ、ＳＩタグ、またはアフィニティータグおよびＳＩタグの組合せを有するユビキチン融合構築物を提供する。
【００５０】
第２の実施形態の第３の態様では、本発明は、ユビキチン融合構築物と融合され得る、以下の適切な非限定的なＳＩタグを開示する：
【表Ａ】
2019528686.tif 000007
【００５１】
第２の実施形態の第４の態様では、本発明は、アフィニティータグなしでも設計可能なユビキチン融合構築物を開示する。本発明者は、非アフィニティークロマトグラフィー法により融合タンパク質を精製することを目的として、前記ユビキチン融合構築物を設計した。これを実現するため、融合構築物のアフィニティータグを適切なＳＩタグで置き換えることができる。ＳＩタグが融合したユビキチン構築物により、部分的にもしくは完全に不溶性の融合タンパク質、または部分的にもしくは完全に可溶性の融合タンパク質の発現がもたらされ、これが、封入体単離、封入体の可溶化、その後のリフォールディングにより精製され得る。
【００５２】
適切なアフィニティータグは、ポリアルギニン−タグ（Ａｒｇ−タグ）、ポリヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−タグ）、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ（ストレプトアビジン結合ペプチド）、マルトース結合タンパク質、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）などから選択することができる。
【００５３】
適切なＳＩタグは、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸または非極性アミノ酸のペプチド鎖であり、鎖長は、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸またはそれらの適切な組合せを有する２〜２０個のアミノ酸である。
【００５４】
一態様では、前記ＳＩタグは、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、またはそれらの誘導体から選択される１つまたは複数の酸性アミノ酸を含むペプチド鎖であり、鎖長は、１〜２０個の酸性アミノ酸である。
【００５５】
別の態様では、前記ＳＩタグは、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）またはそれらの誘導体から選択される１つまたは複数の塩基性アミノ酸を含むペプチド鎖であり、鎖長は、１〜２０個の塩基性アミノ酸である。
【００５６】
さらに別の態様では、前記ＳＩタグは、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）もしくはイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）もしくはプロリン（ＰｒｏまたはＰ）またはそれらの誘導体から選択される１つまたは複数の非極性アミノ酸を含むペプチド鎖であり、鎖長は、１〜２０個の非極性アミノ酸である。
【００５７】
本発明の他の態様では、ＥＤＥＤ；ＥＥＤＥＥＤＥＤ；ＥＥＤＤＥＤＤＥＥＤＤＥ；ＥＥＤＤＥＤＤＥＥＤＤＥＥＤＥＤ；ＲＲＲ；ＲＲＲＲＲまたはＲＲから選択される適切なＳＩタグが、可溶性形態での融合タンパク質の発現に使用可能である。
【００５８】
本発明のさらに他の態様では、ＡＦＶ；ＧＡＩＦＬＶ；ＧＡＩＦＬＧＡＶ；ＧＡＩＦＬＧＡＶＬＧ；ＧＡＩＦＬＧＡＶＬＧＶＷまたはＧＷＡＩＦＬＶＧＡＶＬＧＶＷから選択される適切なＳＩタグが、不溶性形態での融合タンパク質の発現に使用可能である。
【００５９】
本発明の好ましい態様では、ＳＩタグは、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）またはその誘導体を含む酸性アミノ酸；リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）またはその誘導体を含む塩基性アミノ酸；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、フェニルアラニン（ＰｈａまたはＦ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）またはその誘導体を含む非極性アミノ酸から選択されるペプチド鎖であり、鎖長が１つもしくは複数の酸性アミノ酸、１つもしくは複数の塩基性アミノ酸、１つもしくは複数の非極性アミノ酸、またはその適切な組合せを有する２〜２０個のアミノ酸である。
【００６０】
クローニングに使用される適切なベクターは、ｐＵＣ５７、ｐＴＺ、ｐＢＲ３２２などから選択することができる。
【００６１】
クローニングに使用される適切な原核宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｉｌ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｔｉｓなどから選択することができる。
【００６２】
クローニングに使用される適切なＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ  １０などから選択することができる。
【００６３】
クローニングに使用される適切な制限酵素は、Ｎｄｅ１およびＸｈｏ１、Ｂａｍ  ＨＩ、ＳａｐＩ、ＥｃｏＲｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｋｐｎｌなどから選択することができる。
【００６４】
発現に使用される適切な原核発現宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｔｉｓなどから選択することができる。
【００６５】
発現に使用される適切なＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｏｒｉｇａｍｉなどから選択することができる。
【００６６】
誘導に使用される適切な化学薬剤は、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）、トリプトファン、ナリジクス酸（ｎａｌｉｄｅｘｉｃ  ａｃｉｄ）、オキソリニン酸（ｏｘａｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、窒素または糖アナログから選択されてよく、糖アナログはラクトース、マルトース、アラビノースなどから選択することができる。
【００６７】
形質転換方法は、熱ショック法、エレクトロポレーションなどから選択することができる。
【００６８】
一変更形態では、熱ショック法は、細胞に対する約３０秒〜１２０秒間の約４２℃の熱ショック、次いで氷上に約２〜１０分間維持することを含む。
【００６９】
一態様では、本発明の方法に使用される発現ベクターは、ｐＥＴベクター、ｐｄ４５１ｓＲなどから選択される、市販の発現ベクターまたはカスタム設計されたベクターとすることができる。ｐＥＴベクターは、ｐＥＴ２４ａ、ｐＥＴ２８ａ、または当業者に公知の任意の他のｐＥＴベクターから選択することができる。
【００７０】
本発明の一態様では、発現は、ｐＨ約５．０〜約７．５および／または温度約２５℃〜約４２℃で実施することができる。
【００７１】
本発明による発現ベクターは、プロモーター、選択マーカー、複数のクローニング領域、複製起点およびオペレーター／リプレッサー系を含む。
【００７２】
適切なプロモーターは、Ｔ７、ＴＲＣ、ＴＲＰ、ＢＡＤ、ＬａｃＵＶ５もしくはその誘導体、またはその組合せから選択することができる。
【００７３】
適切な選択マーカーは、野生型または突然変異形態の、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン、またはその組合せから選択することができる。
【００７４】
適切な複製起点は、野生型または突然変異形態の、ｐＵＣ  ＯＲＩ、ｐＰＲ３２２などから選択することができる。
【００７５】
適切なオペレーター／リプレッサー系は、Ｌａｃオペロン系（Ｍｉｌｌｅｒら「Ｔｈｅ  ｏｐｅｒｏｎ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８０年、およびＨｉｌｌｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７２巻、１８５〜２０１頁［１９８４年］を参照のこと）から選択することができる。
【００７６】
第３の実施形態では、本発明は、アフィニティータグおよびＧＬＰ−１アナログをともに有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００７７】
第４の実施形態では、本発明は、ＧＬＰ−１アナログおよびＳＩタグをともに有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００７８】
第５の実施形態では、本発明は、アフィニティータグおよびＳＩタグの組合せをともに有する、ＧＬＰ−１アナログを有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００７９】
第６の実施形態では、本発明は、リラペプチド（Ｌｉｒａｐｅｐｔｉｄｅ）およびアフィニティータグを有するユビキチンの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００８０】
第７の実施形態では、本発明は、リラペプチドおよびＳＩタグをともに有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００８１】
第８の実施形態では、本発明は、アフィニティータグおよびＳＩタグの組合せをともに有する、リラペプチドを有するユビキチン融合タグの合成オリゴヌクレオチド構築物を提供する。
【００８２】
第９の実施形態では、本発明は、融合タンパク質またはペプチドを高収率で発現させる方法を提供する。
【００８３】
第１０の実施形態では、本発明は、発現のために、ともにクローニングされる、多コピーのユビキチン融合構築物を使用する。任意選択で、多コピーのユビキチン融合構築物は、発現のために単一の構築物としてともにクローニングされ得る。
【００８４】
第１０の実施形態の一態様では、本発明は、発現のためにともにクローニングされる、２コピーのユビキチン融合構築物を使用する。
【００８５】
本発明の第１１の実施形態では、単一コピーのユビキチン融合構築物が、発現のためにともにクローニングされる。
【００８６】
第１２の実施形態では、本発明は、原核細胞においてユビキチン融合構築物を発現させ、ユビキチンからペプチドを酵素により切断し、得られたペプチドを精製することにより、純度の高い合成ペプチドを得る方法を提供する。
【００８７】
第１３の実施形態では、本発明は、タンパク質またはペプチドを生産するための方法であって、
ａ）発酵培養培地中で、発現ベクターおよびユビキチン融合構築物を含む形質転換体原核細胞を誘導するステップであって、ユビキチン融合タグがＳＩタグに連結されているステップ、
ｂ）融合タンパク質の蓄積に適した条件下で形質転換した原核細胞を培養するステップ、
ｃ）ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを回収するステップ、
ｄ）任意選択で、ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを精製するステップ、
ｅ）ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを酵素により切断するステップ、および
ｆ）タンパク質またはペプチドを回収するステップ、
ｇ）任意選択で、タンパク質またはペプチドを精製するステップ
を含む、方法を提供する。
【００８８】
第１３の実施形態の一態様では、本発明は、培養培地中で、発現ベクターおよびユビキチン融合構築物を有する形質転換体原核細胞を化学薬剤で誘導することにより、生じたユビキチン融合タンパク質またはペプチドの蓄積を増大させるための発酵工程を含む。
【００８９】
発酵は、ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを産生するため、フェドバッチまたはフェドモードで実施することができる。本発明のユビキチン融合構築物を使用する改善されたタンパク質発現は、発酵工程の各種パラメーター次第である。適切なパラメーターのうちのいくつかは、発酵培地、誘導因子濃度、供給培地および栄養供給速度である。
【００９０】
発酵培地は、発酵槽規模での、形質転換体原核細胞の増殖および発現に必要な培地である。通常、発酵培地は、適切な塩、ビタミン、炭素供給源および窒素供給源を含む。適切な塩は、塩化アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ＥＤＴＡナトリウム塩、モリブデン酸ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸鉄、硫酸銅、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウムなど、またはその組合せから選択することができる。炭素供給源は、グルコース、グリセロール、マルトース、スクロース、デキストロース、フルクトースもしくはマンニトールなど、またはその組合せを含み得る。窒素供給源は、アンモニア、硝酸塩、ペプトン、ダイズペプトン、酵母抽出物、トリプトンなど、またはその組合せを含み得る。適切なビタミンは、チアミン（ビタミンＢまたはその関連化合物）など、またはその組合せから選択することができる。発酵培地は、クエン酸、ホウ酸など、またはその組合せから選択される酸をさらに含む。
【００９１】
供給培地は、塩、炭素供給源、窒素供給源、抗生物質および微量元素を含む。適切な塩、炭素供給源および窒素供給源は、本明細書で先に定義されたものと同じである。供給培地は、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなどから選択される抗生物質を含んでいてよく、ベクターに組み込まれた抗生物質マーカー遺伝子によって決まる。
【００９２】
細胞の細胞質に蓄積されたユビキチン融合タンパク質またはペプチドは、従来の細菌細胞溶解技術により回収／採取することができる。
【００９３】
本発明の一態様は封入体の調製を含む。一態様では、封入体調製は、トリス−ＨＣｌ、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液を含み、任意選択で尿素または塩酸グアニジンなどのカオトロピック薬剤を含有する非変性溶解緩衝液で、細胞ペレットを再懸濁させることを含む。
【００９４】
本発明の別の態様では、封入体調製は、室温で撹拌しリゾチームで処理することにより、非変性溶解緩衝液で細胞ペレットを再懸濁させることを含む。再懸濁された細胞は、冷却条件下でホモジナイズされ、遠心分離されてもよい（Ｓｏｒｖａｌｌ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。未破壊の細胞、大きな細胞の残骸、および封入体を沈殿させてペレットを得て、上清をペレットから移動させてもよい。封入体とともに存在するタンパク質性および非タンパク質性の混入物は、洗浄により除去してもよい。ペレットは、これらに限定されないがデオキシコール酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎおよびＴｗｅｅｎから選択される界面活性剤を含有する洗浄緩衝液で再懸濁してもよい。懸濁液は遠心分離されてもよい（Ｓｏｒｖａｌｌ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。混入物を含有する上清をペレットから移動させてもよい。封入体ペレットは、トリス−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡを含む洗浄緩衝液で再懸濁され、遠心分離されてもよい。混入物を含有する上清は、封入体ペレットから注意深く移動させてもよい。得られた封入体ペレットは、トリス−ＨＣｌ、またはトリス−ＨＣｌと尿素もしくは塩化グアニジウムの組合せから選択される変性緩衝液で可溶化してもよい。
【００９５】
一態様では、得られた封入体ペレットは、変性緩衝液（トリス−ＨＣｌおよび尿素）で可溶化され、遠心分離されてもよい。上清をペレットから移動させてもよい。得られた上清を任意選択でタンジェンシャルフロー濾過により清澄化することにより、ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを得ることができる。
【００９６】
本発明の一態様では、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による溶解物の清澄化は、不溶性残骸を除去し清澄性を改善するため、先に得られた上清を、０．６５μｍの中空繊維（旭化成）系を使用するＴＦＦにかけることを含む。
【００９７】
本発明の別の態様では、細胞溶解は、封入体調製なしに実施することができる。細胞ペレットは、変性緩衝液（トリス−ＨＣｌ、尿素）で直接再懸濁され、ホモジナイズされ、遠心分離され得る。上清をペレットから移動させてもよい。得られた上清は、任意選択でタンジェンシャルフロー濾過により清澄化されて、ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを含有する清澄化された上清を得ることができる。
【００９８】
本発明の一態様では、ユビキチン融合タンパク質またはペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーすなわちＮｉ  ＮＴＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（カチオンまたはアニオン）、逆相クロマトグラフィーまたは当技術分野で周知の任意の他の技術から選択される精製技術によって精製することができる。
【００９９】
本発明の一態様では、融合タンパク質の等電点（ｐＩ）を調節することによって融合タンパク質またはペプチドを精製するために、イオン交換クロマトグラフィーを使用することができる。融合タンパク質またはペプチドの等電点（ｐＩ）を約４〜約９の間に調節するため、適切なＳＩタグがユビキチン融合構築物のＮ末端に付加されてもよい。
【０１００】
本発明の一態様では、タンパク質発現のため、ユビキチン融合構築物とともに塩基性アミノ酸ＳＩタグまたは非極性アミノ酸が使用される場合、カチオン交換クロマトグラフィーを精製に使用することができる。
【０１０１】
本発明の一態様では、タンパク質発現のため、ユビキチン融合構築物とともに酸性アミノ酸ＳＩタグまたは非極性アミノ酸が使用される場合、アニオン交換クロマトグラフィーを精製に使用することができる。
【０１０２】
本発明の一態様では、タンパク質発現のため、ユビキチン融合構築物とともに塩基性アミノ酸ＳＩタグまたは非極性アミノ酸、およびアフィニティータグの組合せが使用される場合、カチオン交換クロマトグラフィーを精製に使用することができる。
【０１０３】
本発明の一態様では、タンパク質発現のため、ユビキチン融合構築物とともに酸性アミノ酸ＳＩタグまたは非極性アミノ酸、およびアフィニティータグの組合せが使用される場合、アニオン交換クロマトグラフィーを精製に使用することができる。
【０１０４】
本発明の一態様では、細胞を採取および溶解し、尿素または塩酸グアニジンなどのカオトロピック薬剤を含有する緩衝液中に、発現されたタンパク質を放出させた。精製方法は概して、粗細胞溶解物から組換えタンパク質生成物を産生するための１または２ステップを含む。ユビキチン融合タンパク質またはペプチドを使用するペプチド調製の別の特有の特徴は、産生が細胞内で起こることである。目的のタンパク質が不溶性封入体として発現される場合、精製の早期のステージで、宿主細胞のタンパク質、ＤＮＡ、ポリサッカライドなどの、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の可溶性物質から封入体を分離するのは容易である。本発明によれば、望ましいペプチドは、一部は可溶性、一部は不溶性の形態で得られる。目的のタンパク質は、電荷、溶解性、サイズ、疎水性などの差を使用することにより細胞内タンパク質から回収することができる。
【０１０５】
本発明の一態様では、ユビキチン融合タンパク質またはペプチドは、ユビキチン融合タグと目的のタンパク質またはペプチドとの間の接合部分を切断する切断酵素により、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで（純度の高いまたは部分的に精製された融合体特異的プロテアーゼを使用して）酵素により切断され、アミノ末端に望ましいアミノ酸を有する目的のタンパク質またはペプチドを生成することができる。ユビキチン融合タンパク質またはペプチド切断のための切断酵素は、酵母ユビキチン加水分解酵素（ＹＵＨ１）などから選択することができる。
【０１０６】
本発明の別の態様では、ユビキチン融合タンパク質は、精製とそれに続くペプチド単離を行わずに、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素により直接切断することができる。
【０１０７】
本発明の好ましい態様では、不溶性タグがユビキチン融合構築物とともに使用される場合、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィーによる発現された融合タンパク質の精製が回避可能である。
【０１０８】
本発明の一態様では、発酵中の発現は、ｐＨ約５．０〜約７．５および／または温度約２５℃〜約４２℃で実施することができる。
【０１０９】
本発明の第９の実施形態では、タンパク質またはペプチドの精製は、等電点（ｐＩ）での沈殿により実施される。
【０１１０】
第９の実施形態の別の態様では、タンパク質またはペプチドの精製は、タンパク質またはペプチドを含む反応混合物のｐＨを、その等電点（ｐＩ）に調整し、純度の高いタンパク質またはペプチドを単離することを含む。
【０１１１】
本発明の一態様では、等電点で単離されたタンパク質またはペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定して純度約８０％または約９０％または約９５％を有する。
【０１１２】
本発明の一態様では、等電点で単離されたリラペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定して純度約８０％または約９０％または約９５％を有する。
【０１１３】
本発明の好ましい態様では、等電点で単離されたリラペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定して純度約８０％を有する。
【０１１４】
望ましいタンパク質またはペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたは当技術分野で周知の任意の他の方法から選択できる精製方法を使用してさらに精製することができる。
【０１１５】
ユビキチン融合系はペプチド調製に使用される。ユビキチン融合系は極めて安定で、可溶性形態または不溶性形態として高レベルで発現される。Ｅ．ｃｏｌｉは、２０リットルのバッチ培養物におけるユビキチン−ペプチド融合系のモデルとして使用されてきた。ユビキチン融合タンパク質またはペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび関連宿主において非常に高いレベルで産生される。比収率は、ローディング緩衝液に溶解させて直接ローディングした全細胞試料について泳動させたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定により測定される、総細胞タンパク質に対する組換えタンパク質生成物の比率として算出されるパーセンテージで定義される。記載通り増殖および誘導されたＥ．ｃｏｌｉユビキチン融合系での比収率は２０％を上回り、３０％に近付く。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の報告された最大の蓄積は総細胞タンパク質の５０％、すなわち比収率５０％である。別のＥ．ｃｏｌｉ発現系は、いくつかの組換えタンパク質について比収率４０％をうたっている。本発明で指定される条件下で、回収された融合タンパク質またはペプチドの収率は、細菌培養物１リットルあたり融合タンパク質またはペプチド１グラム〜４グラムである。このタンパク質またはペプチドは可溶性かつ回収可能である。溶解させた細胞の上清中のタンパク質またはペプチドの大部分が、生成物である。宿主タンパク質の大部分が沈殿し、ユビキチン融合体が溶液中に留まる８５℃の熱ステップにより、融合体は宿主タンパク質からさらに精製され得る。
【０１１６】
本発明の一態様は、タンパク質またはペプチドをその誘導体に転換するステップを含む。
【０１１７】
本発明の別の態様は、ＧＬＰ−１アナログから選択されるタンパク質またはペプチドを、その誘導体に転換するステップを含む。
【０１１８】
本発明の好ましい態様では、前記誘導体はリラグルチドである。
【０１１９】
第１５の実施形態では、本発明は、リラグルチドまたはその誘導体を調製するための方法であって、
ａ）リラペプチドの２０位のＬ−リシンの側鎖ＮＨ２を、式Ｉ
【化５】
2019528686.tif 000008
（式中、ｎは、０〜６であり、Ｒ１は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
Ｒ２は、Ｃ３〜３９−アルキル、Ｃ３〜３９−アルケニルまたはＣ３〜３９アルカジエニルから選択され、
Ｒ３は、ヒドロキシ、またはその、Ｎ−ヒドロキシイミドエステルなどの反応性エステルから選択される）
のアシル化剤と反応させるステップ、および
ｂ）任意選択で、Ｒ１がＣ１〜６アルキルである場合、リラグルチドまたはその誘導体を得るために、アシル化リラペプチドを加水分解するステップ
を含む、方法を提供する。
【０１２０】
第１５の実施形態のある態様では、式Ｉの化合物は、式ＩＩの化合物または式ＩＩＩの化合物
【化６】
2019528686.tif 000009
から選択される。
【０１２１】
第１６の実施形態では、本発明は、リラグルチドまたはその誘導体を調製するための方法であって、
ａ）リラペプチドまたはその誘導体の２０位のＬ−リシンの側鎖ＮＨ２を、式ＩＶ
【化７】
2019528686.tif 000010
（式中、Ｒ１は、水素またはＣ１〜６−アルキルから選択され、Ｒ３は、ヒドロキシ、またはその、Ｎ−ヒドロキシイミドエステルなどの反応性エステルから選択される）
のアシル化剤と反応させるステップ、
ｂ）ステップ（ａ）で得られた生成物にパルミトイル基を導入するステップ、
ｃ）任意選択で、Ｒ１がＣ１〜６アルキルである場合、リラグルチドまたはその誘導体を得るために、ステップ（ｂ）で得られたアシル化リラペプチドを加水分解するステップ
を含む、方法を提供する。
【０１２２】
第１６の実施形態の一態様では、式ＩＶの化合物は、式Ｖの化合物または式ＶＩの化合物：
【化８】
2019528686.tif 000011
から選択される。
【０１２３】
第１６の実施形態の一態様では、カップリング試薬および溶媒の存在下で、ステップ（ａ）で得られた生成物にパルミトイル基が付加されてもよい。パルミトイル基は、パルミチン酸またはパルミトイルハロゲン化物またはパルミチン酸エステルを、下文に示すグルタミン酸−リラペプチドと反応させることによって付加される。
【化９】
2019528686.tif 000012
【０１２４】
パルミトイルハロゲン化物のための適切なハロゲン化物は、塩化物、臭化物またはヨウ化物から選択することができる。パルミチン酸エステルは、Ｃ１〜６アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、プロパ−２−イル、ブチル、ブタ−２−イル、２−メチルプロパ−１−イル、２−メチル−プロパ−２−イル（ｔｅｒｔ−ブチル）、ヘキシルなどから選択されるアルキル基を含有し得る。
【０１２５】
本発明の一態様では、リラペプチドまたはその誘導体のアシル化は、
ａ）タンパク質またはペプチドの遷移金属複合体を形成させるために、タンパク質またはペプチドを適切な遷移金属薬剤と反応させるステップ、ならびに
ｂ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩまたは式ＩＶまたは式Ｖまたは式ＶＩの化合物から選択されるアシル化剤により、タンパク質またはペプチドの遷移金属複合体をアシル化するステップ
をさらに含む。
【０１２６】
本発明の一態様では、適切な遷移金属薬剤は、遷移金属水酸化物、遷移金属炭酸塩、遷移金属塩化物、遷移金属硫酸塩、遷移金属酢酸塩などを含む。
【０１２７】
遷移金属は、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）など、またはその組合せから選択することができる。
【０１２８】
本発明の一態様では、遷移金属薬剤は、硫酸銅、硫酸ニッケル、酢酸ニッケル、酢酸銅および酢酸コバルト、硫酸コバルトなど、またはその組合せを含む群から選択することができる。
【０１２９】
アミノ酸のカップリングに使用されるカップリング剤は、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＥＤＣ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＢＯＰなど、またはその組合せから選択することができる。
【０１３０】
一態様では、カップリング試薬とともに、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ、ＨＯＡｔなど、またはその組合せから選択できる添加剤を添加することができる。
【０１３１】
カップリング反応に使用される溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など、またはその組合せから選択することができる。
【０１３２】
一態様では、本発明で得られる前記アシル化リラペプチドは、エステルなどの官能基を含有していてもよく、このような基は、Ｃ１〜６アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、プロパ−２−イル、ブチル、ブタ−２−イル、２−メチルプロパ−１−イル、２−メチル−プロパ−２−イル（ｔｅｒｔ−ブチル）、ヘキシルなどから選択することができる。
【０１３３】
本発明によれば、エステルは、塩基性加水分解または酸性加水分解により加水分解され得る。塩基性加水分解は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化物リチウムなどを含むアルカリ金属水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどを含むアルカリ金属炭酸塩；アンモニア、ナトリウムｔ−ブトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、ナトリウムメトキシドなどの塩基を使用して実施することができる。酸性加水分解は、カルボン酸でない無機または有機酸を使用して実施することができる。適切な無機酸は、室温で、水溶液でｐＫａ値約４．０未満を有するものである（Ｍｏｅｌｌｅｒ、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９５２年）、３１４〜３１５頁を参照のこと）。このような酸の特定の例は、好ましい強酸触媒である硫酸、ならびに塩酸、過塩素酸、硝酸、リン酸、およびフッ化水素酸である。本明細書での強酸触媒に適した有機酸は、室温で、水中でｐＫａ値２．０未満を有する非カルボン酸である（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、第５８版、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｄ−１５０頁以降を参照のこと）。適切な有機酸の例は、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、トリフルオロメチルスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸である。強酸触媒の混合物も使用可能である。
【０１３４】
前記エステル加水分解に使用可能な適切な溶媒には、水；メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、２，２，２−トリメチルエタノール、１−デカノール、ベンジルアルコールなどのＣ１〜Ｃ１０直鎖もしくは分岐鎖アルコール；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル；テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジイソプロピルエーテル、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、２−メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテルもしくはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどのエーテル；ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、プロパン酸メチル、プロパン酸エチル、ブタン酸メチルもしくはブタン酸エチルなどのエステル；アセトン、ブタノン、ペンタノン、メチルイソブチルケトンなどのケトン；ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン、ジクロロエタン、クロロベンゼンもしくはジクロロベンゼンなどのハロゲン化溶媒；メチルシクロヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタンもしくはヘキサンなどの脂肪族炭化水素溶媒；トルエン、ベンゼン、クロロベンゼン、４−クロロトルエン、トリフルオロトルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレンもしくはｐ−キシレンなどの芳香族炭化水素溶媒；例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ホルムアミド、アセトアミド、プロパンアミドなどの極性非プロトン溶媒；またはその混合物が含まれる。エステル加水分解の反応時間は、当業者には一般的に公知のように、反応を完了するのに十分であるべきであり、規模および混合手法によって決まる。通常、反応時間は約数分間〜数時間で変動し得る。例えば、反応時間は、約１０分間〜約２４時間、または任意の他の適切な期間とすることができる。前記加水分解に適した温度は、１２０℃未満、１００℃未満、８０℃未満、６０℃未満、４０℃未満、２０℃未満、１０℃未満、または任意の他の適切な温度とすることができる。
【０１３５】
任意選択で、リラグルチドまたはその誘導体は、当技術分野で公知の技術により単離され得る。例えば、生成物を含有する溶液から溶媒を除去することにより単離を行うことができる。溶媒の除去に使用可能な適切な技術には、蒸発、フラッシュ蒸発、単純な蒸発、回転乾燥、噴霧乾燥、撹拌式薄膜乾燥、撹拌式ヌッチェフィルター乾燥、圧力ヌッチェフィルター乾燥、フリーズドライまたは凍結乾燥、または当技術分野で公知の任意の他の技術が含まれるがこれらに限定されない。任意選択で、本発明による方法を実施する際に、本発明の方法を経済的かつ商業的により実行可能なものにするため、そうすることが適切である限り、任意選択でそれまでのステップで使用されたものと同じ試薬の存在下で、所与のステップの反応生成物を、それまでのステップから生成物を単離することなく次のステップへ進めることができる、すなわち、所与の方法における１つまたは複数の反応をワンポット法としてｉｎ−ｓｉｔｕで実施することができる。生じた化合物は、任意選択でさらに乾燥してもよい。乾燥は、トレイ式乾燥機、真空オーブン、エアオーブン、円錐型真空乾燥機、回転式真空乾燥機、流動層乾燥機、スピンフラッシュ乾燥機、フラッシュ乾燥機、凍結乾燥機などで実施することができる。乾燥は、温度約６０℃未満、約５０℃未満、約４０℃未満、約３０℃未満、約２０℃未満、または任意の他の適切な温度で、大気圧または減圧下で、リラグルチドの質が劣化しない限り実施することができる。乾燥は、必要な生成物の質が実現されるまで、任意の望ましい時間実施することができる。乾燥に適した時間は、数分間〜数時間、例えば約３０分間〜約２４時間またはそれを超える時間変動し得る。任意選択で、本発明による方法を実施する際に、所与のステップの反応生成物を、方法の次のステップで使用する前に、本明細書に記載される方法または当業者に公知の方法によって単離および精製することができる。
【０１３６】
本発明の一態様では、タンパク質またはペプチドの精製は、１〜５回実施することができる。精製方法には、分取逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは当技術分野で周知の任意の他の技術が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３７】
本発明の一態様では、タンパク質またはペプチドの精製は、
ａ）適切な緩衝液でタンパク質またはペプチド試料を調製するステップ、
ｂ）任意選択で、フィルターを通して精製するステップ、
ｃ）試料を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のシリカゲルカラムにかけるステップ、
ｄ）シリカゲルカラムからタンパク質またはペプチドを溶出するステップ、
ｅ）純度の高いタンパク質またはペプチドを得るステップ
を含む。
【０１３８】
上記ステップ（ａ）の一態様では、試料は、粗タンパク質またはペプチドを適切な緩衝液に溶解させることにより調製され得る。
【０１３９】
一態様では、ステップ（ａ）に使用可能な適切な緩衝液は酸性または塩基性であってよい。適切な緩衝液は、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどから選択できるがこれらに限定されない。
【０１４０】
上記ステップ（ｂ）の一態様では、適切な緩衝液中のタンパク質またはペプチド試料は、約０．１μｍ〜約１μｍのフィルターを通して濾過され得る。
【０１４１】
上記ステップ（ｃ）に使用可能な適切なシリカゲルカラムタイプは、以下のシリカゲル吸着材から選択できるがこれらに限定されない：Ｄａｉｓｏｇｅｌ（商標）、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｃ１８  １００−１６、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｃ１８  １００−１０、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｃ８  １００−１６、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｃ４  １００−１６、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｐｈｅｎｙｌ  １００−１０、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｃ１８  Ｅｔｅｒｎｉｔｙ  １００−５、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｃ４  Ｅｔｅｒｎｉｔｙ  １００−５、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ（商標）Ｃ１８  ＳＭＢ  １００−１５  ＨＥ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ（商標）Ｃ８  ＳＭＢ  １００−１５  ＨＥ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ（商標）Ｃ４  ＳＭＢ  １００−１５  ＨＥ、Ｄａｉｓｏｐａｋ（商標）ＳＰ  １２０−１５  ＯＤＳ−ＡＰ、Ｄａｉｓｏｐａｋ（商標）ＳＰ  １２０−１０−Ｃ４−Ｂｉｏ、Ｄａｉｓｏｐａｋ（商標）ＳＰ  ２００−１０−Ｃ４−Ｂｉｏ、Ｚｅｏｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｃ１８  １００−１５、Ｚｅｏｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｃ８  １００−１５、Ｚｅｏｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｃ４  １００−１５、ＳｅｐＴｅｃｈ  ＳＴ  １５０−１０  Ｃ１８、Ｌｕｎａ  Ｃ１８  １００−１０、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８  １１０−１０、ＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８  １２０−５およびＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ８  ２００−１０。
【０１４２】
上記ステップ（ｄ）の一態様では、シリカゲルカラムからのタンパク質またはペプチドの溶出は、溶出剤により実施することができる。本発明によれば、溶出は、グラジエント法またはアイソクラティック法により実施することができる。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に使用される溶出剤は、極性溶媒、水またはその適切な混合物から選択することができる。
【０１４３】
上記ステップ（ｄ）の別の態様では、極性溶媒および水は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のシリカゲルカラムを通る、異なる／独立した溶出剤のランタイムで使用され得る。極性溶媒は、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールまたはその適切な混合物などから選択することができる。
【０１４４】
上記ステップ（ｄ）の一態様では、溶出前に、改質剤が溶出剤に添加されてよく、改質剤はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。
【０１４５】
上記ステップ（ｄ）の別の態様では、溶出中、水溶液の総体積に対し、体積で約０．１％〜約０．００１％のトリフルオロ酢酸が使用され得る。
【０１４６】
上記ステップ（ｄ）のある態様では、純度の高いタンパク質またはペプチドは、極性溶媒を除去し、任意選択で凍結乾燥することにより、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から収集される純度の高い画分から得られる。
【０１４７】
上記ステップ（ｄ）の別の態様では、純度の高いタンパク質またはペプチドは、純度の高い画分から極性溶媒を除去し、等電点（ｐＩ）で沈殿させ、得られたペレットを任意選択で凍結乾燥することにより、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から収集される純度の高い画分から得られる。
【０１４８】
上記ステップ（ｄ）の別の態様では、純度の高いタンパク質またはペプチドは、純度の高い画分から極性溶媒を除去し、凍結乾燥することにより、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から収集される純度の高い画分から得られる。
【０１４９】
上記ステップ（ｄ）の一態様では、等電点（ｐＩ）沈殿に酸が使用され得る。適切な酸は、有機酸または無機酸から選択することができる。適切な有機酸は、ギ酸、酢酸およびプロピオン酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸などのハロゲン化酢酸など、またはその組合せから選択することができる。適切な無機酸は、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸などのハロゲン化水素、硫酸、硝酸もしくはホウ酸など、またはその組合せから選択することができる。
【０１５０】
別の態様では、等電点（ｐＩ）沈殿は、純度の高いタンパク質またはペプチドを得るために１回または複数回、例えば５回実施することができる。
【０１５１】
上記ステップ（ｄ）によれば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から収集された純度の高い画分は、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどから選択されるアルカリ炭酸塩を使用することにより中和され得る。
【０１５２】
上記ステップ（ｄ）の一態様では、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製されたタンパク質またはペプチドは、少なくとも純度約８５％を有する。
【０１５３】
本発明の好ましい態様では、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製されたタンパク質またはペプチドは、少なくとも純度約９５％を有する。
【０１５４】
本発明の別の態様では、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製されたリラペプチドは、少なくとも純度約８５％を有する。
【０１５５】
本発明の好ましい態様では、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製されたリラペプチドは、少なくとも純度約９５％を有する。
分析：ＨＰＬＣ
【０１５６】
ＡＣＥ  ５  Ｃ１８  ２５０×４．６ｍｍ、３００Å（部品番号：ＡＣＥ−２２１−２５４６）を固定相として使用した。移動相は２成分からなる；移動相ＡはＭｉｌｌ−Ｑ水およびアセトニトリル中にトリフルオロ酢酸０．１％を含有し、移動相Ｂはグラジエント様式でＭｉｌｌ−Ｑ水およびアセトニトリル中にトリフルオロ酢酸０．１％を含有する。検出は波長２２０ｎｍで測定された。注入体積は１０．０μＬであった。６ＭグアニジンＨＣｌを希釈剤として使用する。
【０１５７】
定義
文脈で別途示されない限り、本出願で使用される単語または句に関して以下の定義が使用され得る。
【０１５８】
「アミノ酸」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのアミノ基および少なくとも１つの酸性基を含む有機化合物を指す。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、または合成起源のアミノ酸、またはアミノ酸誘導体もしくはアミノ酸アナログであってよい。
【０１５９】
「増幅」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸配列のさらなるコピーの産生を指し、概して、当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，  Ｃ．  Ｗ．およびＧ．  Ｓ．  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５年）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  ２５  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）を使用して実施される。
【０１６０】
「ペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド連結により結合された２つまたはそれよりも多いアミノ酸残基を含む任意のペプチドを指す。
【０１６１】
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の特定の順序のアミノ酸鎖から構成される大きい分子を指す。
【０１６２】
「タンパク質またはペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、２つまたはそれよりも多い末端および／または側鎖アミノ基を含有する、ＧＬＰ−１アナログまたは任意の他のタンパク質もしくはペプチドを指す。
【０１６３】
「ＧＬＰ−１アナログ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＧＬＰ−１（１〜３５）、ＧＬＰ−１（１〜３６）、ＧＬＰ−１（１〜３６）アミド、ＧＬＰ−１（１〜３７）、ＧＬＰ−１（１〜３８）、ＧＬＰ−１（１〜３９）、ＧＬＰ−１（１〜４０）、ＧＬＰ−１（１〜４１）などから選択されるＧＬＰ−１を指す。好ましいＧＬＰ−１として、Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（１〜３７）；Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ２６−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１−（７〜３７）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７〜３８）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）；Ａｒｇ３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（７〜４０）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）；Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３６−ＧＬＰ−１（７〜３７）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ３４Ｌｙｓ４０ＧＬＰ−１（７〜４０）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，３９−ＧＬＰ−１（７〜３９）；Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６，４０−ＧＬＰ−１（７〜４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
上記の「任意の他のペプチド」はテデュグルチドであってよい。
【０１６５】
「誘導体」という用語は、未修飾のタンパク質もしくはペプチドまたはそのアナログには少なくとも１つの置換基が存在しない、化学的に修飾されたタンパク質もしくはペプチドまたはそのアナログ、すなわち共有結合により修飾されたペプチドである。典型的な修飾は、アミド、糖、アルキル基、アシル基、エステルなどである。
【０１６６】
「アシル化する」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質またはペプチドの遊離アミノ基に共有結合した１つまたは複数のアシル基の導入を指す。
【０１６７】
「アシル化」という用語は、タンパク質またはペプチドのアミノ基のアシル化を意味する。
【０１６８】
「リラペプチド」という用語は、アシル化前のリラグルチドであるＡｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７〜３７）である。
【０１６９】
「Ｕｂｉ−リラペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ユビキチン融合タグおよびリラペプチドの合成オリゴヌクレオチド構築物を指す。
【０１７０】
「発酵」という用語は、本明細書で使用される場合、組換えタンパク質生成物の産生を含む方法を指すことを意図する。
【０１７１】
「Ｐａｌ」という用語は、パルミトイルである。
【０１７２】
「ＨＡＴＵ」という用語は、２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩である。
【０１７３】
「ＥＤＣ」という用語は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである。
【０１７４】
「ＤＣＣ」という用語は、ジシクロヘキシルカルボジイミドである。
【０１７５】
「ＤＩＣ」という用語は、ジイソプロピルカルボジイミドである。
【０１７６】
「ＢＯＰ」という用語は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩である。
【０１７７】
「ＨＯＢｔ」という用語は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。
【０１７８】
「ＨＯＳｕ」という用語は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。
【０１７９】
「ＨＯＡｔ」という用語は、１−ヒドロキシ−７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾールである。
【０１８０】
「リンカー」または「ＳＩタグ」という用語は、本明細書では同義語として使用され、可溶性または不溶性タグを意味する。
【０１８１】
「室温」という用語は、本明細書で使用される場合、物品が位置する空間、例えば部屋またはドラフトの温度に近いか同じである物品の温度を指す。通常、室温は約２０℃〜約３０℃、または約２２℃〜約２７℃、または約２５℃であってよい。
【０１８２】
本明細書に記載される方法の反応は、空気中または不活性雰囲気下で実施することができる。通常、実質的に空気と反応する試薬または生成物を含む反応は、当業者に周知である空気感受性の合成技術を使用して実施することができる。
【０１８３】
本明細書で例示される手法は、本発明の実施についてその実施形態の一部で示しているが、手法は本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。当業者には、現在の科学的知識の範囲内での明細書および実施例の考察からの改変が明らかである。
【実施例】
【０１８４】
（実施例１）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリラペプチド−ユビキチン融合構築物のクローニングおよび発現
ステップａ．ユビキチン融合タグを有するリラペプチドの合成遺伝子構築物のクローニング
ユビキチン融合タグおよび６ＸＨｉｓアフィニティータグを有するリラペプチドの合成遺伝子構築物を、合成構築物として調製しｐＵＣ５７にクローニングした。クローニングされた合成構築物を、熱ショック法によりＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を沈殿させてペレットを得て、再懸濁させた。再懸濁させた細胞をアンピシリン培地に拡げ、一晩（１８時間）インキュベートしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの組換えコロニーを得た。ｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチド構築物を含有するプラスミドを、制限消化酵素としてのＮｄｅ１およびＸｈｏ１を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの組換えコロニーの一晩増殖させた培養物から単離した。
【０１８５】
図１は、組換えプラスミド（五量体コピーでのｐＵＣ５７−Ｕｂｉ−リラグルチド）の制限酵素分析を指す。組換えプラスミドを、制限酵素消化（Ｎｄｅ１およびＸｈｏ１）により分析し、ローディングパターンのように１．２％アガロースゲルで分離し、次いでＥｔＢｒで染色し、ＵＶ光を使用して画像を捕捉した。
【０１８６】
ステップｂ．サブクローニングおよび特性決定
付着末端ライゲーションのため、発現ベクターｐＥＴ２４ａもＮｄｅ１およびＸｈｏ１で消化した。ライゲーションのため、消化されたプラスミド（ｐＥＴ２４ａ）および上記の単離された合成構築物を、インサート：ベクターのモル比３：１でライゲートし、１６℃で１８時間インキュベートした。ライゲーション生成物（ｐＥＴ２４ａ：：ｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチド）を熱ショック法によりコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、形質転換体を抗生物質選択マーカー（カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ））により選択した。まず陽性コロニーを、Ｔ７プライマーを使用するＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ＰＣＲ後、ｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチドを有する合成構築物の増幅生成物を、１．２％アガロースゲルで分離した。さらに、前記合成構築物を単離し、最後に制限酵素消化（Ｎｄｅ１−Ｘｈｏ１）により確認した。
【０１８７】
ステップｃ：Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主におけるリラペプチドの発現研究
組換え発現プラスミド（ｐＥＴ２４ａ＋ｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチド）を熱ショック法によりＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を沈殿させてペレットを得て、再懸濁させた。再懸濁させた細胞をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に拡散させ、一晩（１８時間）インキュベートしてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の単離された組換えコロニーを得た。
【０１８８】
発現のため、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３７℃で振とうしながら一晩（１８時間）インキュベートした。発現について調べるため、試料を様々な期間（３時間、１８時間）で収集した。誘導された試料および未誘導の試料を全て１．２％アガロースゲルで分離した。ゲルで分離した後、ゲルを色素（クーマシーブルー色素）で染色し、その後脱染溶液（水：メタノール：酢酸）で脱染した。カナマイシンを有する培養培地１００ｍｌに陽性コロニーを播種することにより研究細胞バンクを調製し、３７℃で、２５０ｒｐｍで振とうしながら一晩増殖させた。一晩培養物を５０％滅菌グリセロールと混合し、リラペプチド融合タンパク質を含有するＥ．ｃｏｌｉの組換えクローンを有するアリコートを得た。得られたアリコートをクライオバイアルに注ぎ、−８０℃で保存した。
【０１８９】
（実施例２）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリラペプチド−ユビキチン融合構築物のクローニングおよび発現
ステップａ．ユビキチン融合タグを有するリラペプチドの合成遺伝子構築物のクローニング
プライマー、フォワードプライマー（ＳａｐＩ  −ＦＰ−用Ｅｌｅｃｔｒａ  Ｌｉｒａ−  ５’−ＣＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  Ｃ−３’）リバースプライマー（Ｅｌｅｃｔｒａ  Ｌｉｒａ  Ｒａｖ  ＳａｐＩ  −ＲＰ−  ５’−ＴＴＧ  ＡＣＧ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  Ｃ−３’）を使用するＰＣＲにより、ｐＵＣ５７−ｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチド５鋳型から、ｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチド融合構築物を増幅させた。単一コピー、２コピーおよび３コピーのｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチド融合構築物を増幅させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して精製した。ゲルで精製されたＰＣＲアンプリコン、単一コピー、２コピーおよび３コピーのｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチド融合構築物をＳａｐＩで制限酵素消化し、ＱＩＡ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。
【０１９０】
ステップｂ．サブクローニングおよび特性決定
上記実施例で得られた単一コピー、２コピーおよび３コピーのｈｉｓタグ−ユビキチン−リラペプチド融合構築物を、直鎖状ｐＤ４５１ＳＲ発現ベクター（ＤＮＡ２．０）のＳａｐＩ部位に別々にライゲートし、熱ショック法により化学的にコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシンプレートで組換えクローンを選択した。形質転換されたクローンを、ＰＣＲおよび制限酵素消化により、ユビキチン−リラペプチド融合タンパク質をコードする遺伝子の存在について確認した。
【０１９１】
ステップｃ：Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主におけるリラペプチドの発現研究
確認された組換えプラスミド、ｐＤ４５１ＳＲ−ｈｉｓＵｂｉＬｉｒａ１（単一コピー）ｐＤ４５１ＳＲ−ｈｉｓＵｂｉＬｉｒａ２（２コピー）およびｐＤ４５１ＳＲ−ｈｉｓＵｂｉＬｉｒａ３（３コピー）を、熱ショック法によりＥ．ｃｏｌｉ発現宿主、ＪＭ１０９ＤＥ３およびＨＭＳ１７４ＤＥ３に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシンプレートで選択した。ＪＭ１０９（ＤＥ３）およびＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の組換えＥ．ｃｏｌｉ発現クローンを、１ｍＭのＩＰＴＧにより３７℃で一晩誘導することにより、ユビキチン−リラペプチド融合タンパク質の発現についてスクリーニングした。一晩培養物を５０％滅菌グリセロールと混合し、リラペプチド融合タンパク質を含有するＥ．ｃｏｌｉの組換えクローンを有するアリコートを得た。得られたアリコートをクライオバイアルに注ぎ、−８０℃で保存した。
【０１９２】
（実施例３）
発酵工程：
ステップａ）：播種前物の調製：
酵母抽出物２０ｇｍ／Ｌおよび塩化ナトリウム１０ｇｍ／Ｌを溶解させることにより播種前培地（５００ｍｌ）を調製し、２Ｌフラスコに分注して滅菌する。滅菌された播種前培地に、カナマイシンストック溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを添加した。リラペプチド融合構築物を含有するＥ．ｃｏｌｉの組換えクローンを有するグリセロールストック２５０μｌを接種し、インキュベーター振とう機で、３７℃で８〜１２時間インキュベートした。
【０１９３】
ステップｂ）：播種発酵槽における播種培地の調製：
播種発酵槽において播種培地を調製するのに以下の成分を使用した：
【表１】
2019528686.tif 000013
【０１９４】
播種培地（１．８Ｌ）の調製のため、上記表１の通りの成分（１〜４）を秤量し、ＤＭ水（１．５Ｌ）に溶解させ、３．０リットル発酵槽に分注する。さらに、表１により言及される成分（５〜６）を秤量し、ＤＭ水に溶解させて２００ｍｌにし、５００ｍｌビンに分注した。グルコースおよび硫酸マグネシウムを含むビンに、無菌条件下でカナマイシンストック溶液１．８ｍｌを添加した。さらに、グルコース、硫酸マグネシウムおよびカナマイシンを有するビンのストック溶液を播種発酵槽に移した。上記ステップａ）の、リラペプチド融合タンパク質を含有するＥ．ｃｏｌｉの組換えクローンを有する播種前培養培地９０ｍｌを播種発酵槽に移し、播種発酵槽を、ｐＨ７、約３７℃の温度、約２５％の溶存酸素、約３００〜６００ｒｐｍのかき混ぜ速度で維持した。
【０１９５】
ステップｃ）：産生タンク発酵槽用の培養培地の調製：
表２に言及される成分に従って産生タンク発酵培地２０リットルを調製して滅菌した。発酵培地を産生タンク発酵槽に注ぎ、滅菌した。
【表２】
2019528686.tif 000014
【０１９６】
ステップｃ）発酵の補助成分の調製：
１）グルコース（１０ｇ／ｌ；１９９．９８ｇｍ）および硫酸マグネシウム七水和物（１．２ｇ／ｌ；２４．０２）をＲＯ水１リットルで調製した。
２）アンモニア液（１２．５％）をＲＯ水約１５００ｍｌで調製した。
３）Ａｎｔｉｆｏｒｍ  ２０４（５％）をＲＯ水約５００ｍｌで調製した。
【０１９７】
ステップｄ）供給物調製：
表３の成分に従って、発酵のための供給培地１２リットルを調製し、滅菌した。
【表３】
2019528686.tif 000015
【０１９８】
ステップｅ）発酵工程の手法：
温度が産生タンク培地の設定点３７℃に到達した後、グルコースおよび硫酸マグネシウム七水和物をバイオ容器に無菌的に添加し、アンモニア水溶液を使用することによりｐＨ７．０に調整した。さらに、タンク培地にカナマイシンを添加してカナマイシン最終濃度５０μｇ／ｍｌにし、成熟播種物（１Ｌ）を播種発酵槽から産生タンクに播種して、バッチを通して、アンモニア液によりｐＨ７．０±０．２；ＤＯ２≧２０〜３０％および温度３７±１℃を維持した。総バッチ周期は、２１±３時間となるように使用された。ｐＨおよびＤＯが上昇すると供給物を発酵槽に添加した。さらに、ＯＤが７０±５に到達すると、１ＭのＩＰＴＧ溶液によりタンク培地を誘導して最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを得た。全ての他のパラメーターをそれまでと同じに維持し、誘導後６〜８時間維持した。発酵完了後、ブロスの温度を１０〜１５℃に低下させ、遠心分離し、細胞塊を収集し、−８０℃で保存した。
【０１９９】
ステップｆ）細胞塊の溶解、融合タンパク質の可溶化およびＴＦＦによるその清澄化：
２０ｍＭトリス（２４２ｇｍ）および８Ｍ尿素（４８ｋｇ）を含有し、室温でｐＨ９．４〜９．６を有する溶解緩衝液１００リットルを調製した。細胞４０００ｇを溶解緩衝液３０〜４０Ｌに懸濁させた。次いで、可溶化のため、細胞をホモジナイザーで溶解させ、２時間インキュベートした。ホモジナイズ後に得られた細胞溶解物を、中空繊維のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）系に通し、透過物（２５ｌ）を収集して、透過物の洗浄液が約４０〜５０Ｌになるまで、溶解緩衝液により透析濾過を実施した。透過物および透過物の洗浄液を希ＨＣＬで８±０．１に調整した。
【０２００】
（実施例４）
ニッケルＮＴＡクロマトグラフィーを使用する、融合タンパク質の精製：
ユビキチン融合タンパク質を有する透過物（４Ｌ）を、尿素緩衝液（１Ｍ尿素＋２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で平衡化されたアフィニティークロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ）に流速１０ＣＶ／ＨＲでローディングした。ローディングした後、マトリックスを同じ尿素緩衝液で洗浄し、２０ｍＭイミダゾール、その後２００ｍＭイミダゾールを含有する溶出緩衝液による不純物の溶出を開始して、ユビキチン融合タンパク質を有する溶出液（８Ｌ）を得た。融合タンパク質の純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣで決定して６０％であった。
【０２０１】
（実施例５）
適切なＳＩタグ（可溶性タグ）を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリラペプチド−ユビキチン融合構築物の発現、溶解および精製
ステップａ）発現
４個のアミノ酸（ＥＤＥＤ）および８個のアミノ酸（ＥＥＤＥＥＤＥＤ）を有する適切なＳＩタグを有するユビキチン融合構築物を、特定のフォワードおよびＴ７リバースプライマーを用いてユビキチン融合遺伝子をＰＣＲ増幅することにより構築した。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、適切に消化されたｐＥＴ２４ａベクターにクローニングした。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。一晩培養物をカナマイシン含有ＬＢに新たに接種し、振とう機において増殖させた。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧにより３７℃で発現を誘導した。未誘導の対照とともに、誘導された培養物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、融合タンパク質発現について決定した。
【０２０２】
ステップｂ）細胞溶解：
発現された細胞を、ｐＨ７．８を有する４０ｍＭトリス−ＨＣｌの溶解緩衝液２５ｍＬで懸濁させた。溶解物を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を別々のチューブに収集した。残りのペレットを４０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．８  ２５ｍＬで再懸濁させた。上清および再懸濁させたペレットを両方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０２０３】
ステップｃ）精製：
上記ステップｂ）で得られた上清を、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いるアニオン交換クロマトグラフィーにかけた。マトリックス５ｍｌをカラムに充填し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．７で平衡化した。次いで上清をカラムにローディングし、通過画分を収集した。未結合のタンパク質およびゆるく結合したタンパク質を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．７で洗浄した。最後に、１ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．７で融合タンパク質を溶出させた。培養物ブロス１Ｌから得られた融合タンパク質の量は約１ｇであり、ＲＰ−ＨＰＬＣで決定して純度は約８０％であった。ペプチドを融合タグから放出させるため、先に得られた融合タンパク質をＹＵＨ１酵素で消化した。消化は２５℃で実施し、融合タンパク質の約５０％が切断された。
【０２０４】
（実施例６）
適切なＳＩタグ（不溶性タグ）を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリラペプチド−ユビキチン融合構築物の発現、溶解および精製
ステップａ）発現
６個のアミノ酸（ＧＡＩＦＬＶ）を有する適切なＳＩタグを有するユビキチン融合構築物を、特定のフォワードおよびＴ７リバースプライマーを用いてユビキチン融合遺伝子をＰＣＲ増幅することにより構築した。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、適切に消化されたｐＥＴ２４ａベクターにクローニングした。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。一晩培養物をカナマイシン含有ＬＢに新たに接種し、振とう機において増殖させた。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧにより３７℃で発現を誘導した。
【０２０５】
未誘導の対照とともに、誘導された培養物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、融合タンパク質発現について決定した。
【０２０６】
ステップｂ）細胞溶解：
発現された細胞を、ｐＨ７．８を有する４０ｍＭトリス−ＨＣｌの溶解緩衝液２５ｍＬで懸濁させた。溶解物を遠心分離し、上清を別々のチューブに収集した。残りのペレットを４０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．８  ２５ｍＬで再懸濁させた。上清および再懸濁させたペレットを両方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０２０７】
ステップｃ）不溶性融合タンパク質の精製：
先に得られたペレットを、０．５％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、その後１％デオキシコール酸塩（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｔａｅ）、最後に４０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．８で洗浄した。次いでペレットを、８Ｍ尿素を含有する４０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．８  ２０ｍＬに溶解させた。ペレットが完全に溶解した後、溶液を遠心分離して、上清を収集した。純度および融合タンパク質定量化について上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。培養物ブロス１Ｌから得られた融合タンパク質の量は約１ｇであり、純度は約８０％であった。ペプチドを融合タグから放出させるため、先に得られた融合タンパク質をＹＵＨ１酵素で消化した。消化は２５℃で実施し、融合タンパク質の約５０％が切断された。
【０２０８】
（実施例７）
リラペプチドを得るための融合タンパク質の切断
酵素による消化のため、ユビキチン加水分解酵素（２０５ｍｌ）を、アフィニティークロマトグラフィーからの２００ｍＭ溶出液（ユビキチン融合タンパク質８ｌ）に１：２０の比で添加し（融合タンパク質２０部に酵素１部を添加）、撹拌しながら３０℃で４〜８時間インキュベートした。
【０２０９】
（実施例８）
等電点（ｐＩ）沈殿によるリラペプチドの精製
実施例４で得られた消化混合物に、３．５Ｍ塩化ナトリウムを添加して、溶解のため３０分間撹拌した。溶解後、希ＨＣｌでｐＨを４．７〜４．８に調整し、２〜８℃で２〜１０時間試料をインキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離し、収集されたペレットをｐＨ４．７±０．２の酸性化した水で洗浄してリラペプチドペレット（１４２ｇｍ）を得た。
【０２１０】
（実施例９）
逆相によるリラペプチド精製：
リラペプチド粗生成物（１０．８６ｇ）を、濃度１．２９ｇ／Ｌで、２Ｍ尿素および１００ｍＭトリスｐＨ８．５±０．１（８．４Ｌ）に溶解させた。溶液を、１．２μｍ、その後０．４５μｍ、および０．２０μｍのＰＰ／ＰＥＳフィルターを通して濾過した。Ｄａｉｓｏｇｅｌ  ４０μｍ  Ｃ８  １２０Å樹脂を充填したカラム（寸法６０×２２．８ｍｍ、６４４ｍＬ  ＣＶ）を、ローディング前に、１０％の移動相Ｂ｛移動相Ｂ：１００％アセトニトリル；移動相Ａ：０．３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミンｐＨ８．５±０．１（５．５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ調整）｝；）で、線流速１２７ｃｍ／時間で平衡化した。次いで、生成物の樹脂に対する比を、１６．８６ｇ／Ｌ樹脂または３．３７％ｇ／ｇ樹脂として、生成物をローディングした。次いでカラムを、２カラム分の体積（ＣＶ）の１０％の移動相Ｂ、その後３ＣＶの２８％の移動相Ｂで、線流速１２７ｃｍ／時間で洗浄した。次いで、画分（５００ｍＬ）が収集されると、９ＣＶの２８〜５０％の移動相Ｂでリラペプチドを溶出させた。分析ＨＰＬＣで純度が９０．００％を超えるピーク画分をプールした（４．２Ｌ）。回収率８２％で溶出プールの純度は９４．２５％であった。通常、溶出プールに存在するアセトニトリルは３０〜４５％（ｖ／ｖ）であり、２２℃でｒｏｔａ−ｖａｐｏｕｒを使用して蒸発させ、最後に次のステップに進めた。
【０２１１】
（実施例１０）
５−ｔ−ブチル−１−メチルパルミチルグルタメートの調製
２０００ｍＬ乾燥底部フラスコにおいて、アルゴン雰囲気下で、室温でパルミチン酸（６３．８ｇ、２４８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン７００ｍＬに溶解させた。次いでトリエチルアミン（４２．５ｍＬ、３０３ｍｍｏｌ）を滴下により添加し、混合物を５分間撹拌した。２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（１１５．５９ｇ、３０３ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１０分間撹拌した。別の丸底フラスコにおいて、Ｌ−グルタミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７０ｇ、２７６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３００ｍＬに取り、次いで上記の活性化されたパルミチン酸のジクロロメタン溶液に滴下により添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。懸濁液を濾過し、水でクエンチし、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウムを使用して乾燥した。次いでこれを、メタノールおよびジクロロメタンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色固体（８５ｇ、１８０ｍｍｏｌ、収率６５％）として５−ｔ−ブチル−１−メチルパルミチルグルタメートを得る。ＥＳＩ−ＭＳ（＋ｖｅ）ｍ／Ｚ：４５６．６３（ＭＨ＋）。
【０２１２】
（実施例１１）
１−メチルパルミチルグルタミン酸の合成
トリフルオロ酢酸（１３９ｍＬ、１８００ｍｍｏｌ）を、５−（ｔ−ブチル）−１−メチルパルミチルグルタメート（８２ｇ、１４７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４５０ｍＬ）溶液に添加し、室温で２時間撹拌した。生じた溶液を水でクエンチし、ジクロロメタンを使用して抽出した。減圧下で溶媒を除去して、定量的収率で乾燥白色固体として１−メチルパルミチルグルタミン酸を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（＋ｖｅ）ｍ／ｚ：４００．６２（ＭＨ＋）
【０２１３】
（実施例１２）
５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）１−メチルパルミトイル−Ｌ−グルタメートの合成
ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、２９ｍＬ、１８６ｍｍｏｌ）を、室温で１−メチルパルミトイルグルタミン酸（７４．５ｇ、１８６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（６３０ｍＬ）溶液に添加し、１５分間撹拌した。さらに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２１．４ｇ、１８６ｍｍｏｌ）を上記溶液に添加し、室温で一晩撹拌した。懸濁液を水（５００ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（２０００ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発後の粗乾燥固体を、ヘキサン／ＤＣＭ溶媒系を使用するシリカＲｅｄｉｓｅｐカートリッジ４０μｍ、７５０ｇにより３００ｍＬ／分で精製し、乾燥白色生成物（１５３ｍｍｏｌ、８２％）７６ｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ（＋ｖｅ）ｍ／ｚ：４９７．５２（ＭＨ＋）
【０２１４】
（実施例１３）
硫酸銅の存在下での、リラペプチドのパルミチルグルタメート誘導体とのコンジュゲーション
室温で、１．２ＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ溶液（５μｌ、５．９μｍｏｌ）をリラペプチド（２０ｍｇ、５．９μｍｏｌ）に直接添加し、トルエンを使用して共沸により乾燥し、ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に懸濁させた。次いで、トリエチルアミンを１０分の期間添加し、懸濁液を５分間撹拌した。そこにｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（４．５ｍｇ、２９．５μｍｏｌ）を添加し、さらに１０分間撹拌した。次いで、ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）中の２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（２．２６ｍｇ、５．９６μｍｏｌ）で活性化された１−メチルパルミチルグルタミン酸（２．３８ｍｇ、５．９６μｍｏｌ）および２，６−ルチジン（１．４μｌ、１１．９２μｍｏｌ）を上記反応混合物に滴下により添加した。さらなる６当量の２，６−ルチジン（４．１μｌ、３５．７μｍｏｌ）および２当量の活性化１−メチルパルミチルグルタミン酸を添加して、転換を最大にした。反応の進行をＵＰＬＣによりモニタリングし（リラペプチド範囲に基づき８６％転換）、ＨＰＬＣにより推定される収率は５１％であった。
【０２１５】
（実施例１４）
硫酸ニッケルの存在下での、リラペプチドのパルミチルグルタメート誘導体とのコンジュゲーション
室温で、ＮｉＳＯ４  ６Ｈ２Ｏ（３．１１ｍｇ、０．０１１８２ｍｍｏｌ、１当量）をリラペプチド（４０ｍｇ、０．０１１８２ｍｍｏｌ）に直接添加し、トルエンを使用して共沸により乾燥し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に懸濁させた。ＤＭＡＰ（５．８ｍｇ、０．０４７２８ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を５分間撹拌した。次いで、ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中の２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（４．５４ｍｇ、０．０１１９４ｍｍｏｌ）で活性化された１−メチルパルミチルグルタミン酸（４．７７ｍｇ、０．０１１９４ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２．８９ｍｇ、０．０２３６４ｍｍｏｌ）を、上記反応混合物に滴下により添加した。さらなる１当量の活性化１−メチルパルミチルグルタミン酸を添加して、転換を最大にした。反応の進行をＵＰＬＣによりモニタリングし、１５時間で９０％転換であった。
【０２１６】
（実施例１５）
酢酸ニッケル４水和物の存在下での、リラペプチドのパルミチルグルタメート誘導体とのコンジュゲーション
室温で、Ｎｉ（ａｃ）２  ４Ｈ２Ｏ（２．９４ｍｇ、０．０１１８２ｍｍｏｌ、１当量）をリラペプチド（４０ｍｇ、０．０１１８２ｍｍｏｌ）に直接添加し、トルエンを使用して共沸により乾燥し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に懸濁させた。ＤＭＡＰ（５．８ｍｇ、０．０４７２８ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を５分間撹拌した。次いで、ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中の２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（４．５４ｍｇ、０．０１１９４ｍｍｏｌ）で活性化された１−メチルパルミチルグルタミン酸（４．７７ｍｇ、０．０１１９４ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２．８９ｍｇ、０．０２３６４ｍｍｏｌ）を、上記反応混合物に滴下により添加した。さらなる１当量の活性化１−メチルパルミチルグルタミン酸を添加して、転換を最大にした。反応の進行をＵＰＬＣによりモニタリングし、５０％転換であった。
【０２１７】
（実施例１６）
酢酸銅の存在下での、リラペプチドのパルミチルグルタメート誘導体とのコンジュゲーション
室温で、Ｃｕ（ａｃ）２（２．１４ｍｇ、０．０１１８２ｍｍｏｌ、１当量）をリラペプチド（４０ｍｇ、０．０１１８２ｍｍｏｌ）に直接添加し、トルエンを使用して共沸により乾燥し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解させた。ＤＭＡＰ（５．８ｍｇ、０．０４７２８ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を５分間撹拌した。次いで、ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中の２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（４．５４ｍｇ、０．０１１９４ｍｍｏｌ）で活性化された１−メチルパルミチルグルタミン酸（４．７７ｍｇ、０．０１１９４ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２．８９ｍｇ、０．０２３６４ｍｍｏｌ）を、上記反応混合物に滴下により添加した。さらなる１当量の活性化１−メチルパルミチルグルタミン酸を添加して、転換を最大にした。反応の進行をＵＰＬＣによりモニタリングし、リラペプチド範囲に基づき９０％転換であった。
【０２１８】
（実施例１７）
酢酸コバルトの存在下での、リラペプチドのパルミチルグルタメート誘導体とのコンジュゲーション
室温で、Ｃｏ（ａｃ）２（１．０５ｍｇ、０．００５９１ｍｍｏｌ、０．５当量）をリラペプチド（４０ｍｇ、０．０１１８２ｍｍｏｌ）に直接添加し、トルエンを使用して共沸により乾燥し、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解させた。ＤＭＡＰ（５．８ｍｇ、０．０４７２８ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を５分間撹拌した。次いで、ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中の２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（４．５４ｍｇ、０．０１１９４ｍｍｏｌ）で活性化された１−メチルパルミチルグルタミン酸（４．７７ｍｇ、０．０１１９４ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２．８９ｍｇ、０．０２３６４ｍｍｏｌ）を、上記反応混合物に滴下により添加した。さらなる１当量の活性化１−メチルパルミチルグルタミン酸を添加して、転換を最大にした。反応の進行をＵＰＬＣによりモニタリングし、リラペプチド範囲に基づき９４％転換であった。
【０２１９】
（実施例１８）
有機培地における、リラペプチドの、パルミトイルグルタミン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのコンジュゲーション
室温で、トリエチルアミン（０．８μｌ、５．９μｍｏｌ）を、リラペプチド（１０ｍｇ、２．９５μｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１ｍＬ）溶液に添加し、懸濁液を５分間撹拌した。次いで、１．２ＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ溶液（２．４μｌ、５．９μｍｏｌ）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。次に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２．２ｍｇ、１４．７４μｍｏｌ）を上記反応混合物に添加し、さらに１０分間撹拌した。最後に、０．０８Ｍの、Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのＮ−メチルピロリドン（３７μｌ、２．９５μｍｏｌ）溶液、および２，６−ルチジン（２．４μｌ、２０．６５μｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌した。さらなる２当量のＮ−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１１．８μｍｏｌ）を使用して、反応混合物中７２％の生成物を得た（ＨＰＬＣデータ）。
【０２２０】
（実施例１９）
水性培地における、リラペプチドの、パルミトイルグルタミン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのコンジュゲーション（方法Ｉ）
トリエチルアミン（４０μｌ、０．２７ｍｍｏｌ）、その後１．２ＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ溶液（４９３μｌ、０．５９ｍｍｏｌ）を、リラペプチド（約２ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）の水（４００ｍＬ）溶液に０℃で添加し５分間撹拌した。さらに、ｐＨ約９．５を維持するため、さらなるトリエチルアミン（８３μｌ、０．６０ｍｍｏｌ）を上記反応混合物に添加した。次に、０．０８Ｍの、Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのＮ−メチルピロリドン（７．５ｍＬ、０．５９ｍｍｏｌ）溶液を０℃で添加し、室温までゆっくりと温め、一晩撹拌した。Ｎ−メチルピロリドン１１ｍＬ中のさらなるＥｔ３Ｎ  ２０μｌ（０．１４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル４４０ｍｇ（０．８９μｍｏｌ）を添加して、転換を最大にした。反応の進行をＵＰＬＣによりモニタリングした（リラペプチド範囲に基づき９３％転換）。
【０２２１】
リラペプチドの、パルミトイルグルタミン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのコンジュゲーション（方法ＩＩ）
０．５ＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ溶液（０．６３４ｇ、２．５４ｍｍｏｌ）を、１２．０±１℃およびｐＨ８でリラペプチド（約３４ｇ、１０．０４ｍｍｏｌ）の水（９６２０ｍＬ）溶液に添加し、５分間撹拌した。さらに、ｐＨ約１０．０を維持するために、トリエチルアミン（１０．５ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）を上記反応混合物に添加した。次に、０．００４５Ｍの、Ｎ−ヘキサデカノイルグルタミン酸γ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのアセトニトリル（４５００ｍＬ、２０．０８ｍｍｏｌ）溶液を、１２．０±１℃でシリンジポンプを使用して３０分間添加し、反応が９５％超の完了を示すまでその温度で撹拌した。ｐＨ約１０を維持するため、反応中にさらなるトリエチルアミン１０ｍＬ（７１．７ｍｍｏｌ）を添加した。ＨＰＬＣクロマトグラムは１時間で９５％超の転換を示した。
【０２２２】
（実施例２０）
リラグルチドを得るための、リラグルチドメチルエステルの加水分解（方法Ｉ）
水酸化ナトリウム溶液（５Ｎ、２．５ｍＬ、１２．５ｍｍｏｌ）を、脱イオン水４３５ｍＬにリラグルチドメチルエステル（２．２ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を含有する粗反応混合物に添加し、生じた溶液を室温、ｐＨ１２．８で３時間撹拌した。反応の完了をＵＰＬＣによりモニタリングし、クロマトグラムは反応の１００％完了を示した。
【０２２３】
リラグルチドを得るための、リラグルチドメチルエステルの加水分解（方法ＩＩ）
水酸化リチウム一水和物（１８．９ｇ、４５１ｍｍｏｌ）の１．９Ｍ溶液２３７．５ｍＬを、８．０±１℃で、水／アセトニトリル溶媒混合物（Ｈ２Ｏ中にＭｅＣＮ約３１％）１４１２０ｍＬ中にリラグルチドメチルエステル（１０．０４ｍｍｏｌ）を含有する粗反応混合物に添加し、ＬＣＭＳが９２％超の転換を示すまで、生じた溶液をｐＨ＝１２．９０±０．１で撹拌した。
【０２２４】
加水分解完了後、６Ｎ  ＨＣｌ  ５２．５ｍＬ（３１７ｍｍｏｌ）を使用してｐＨを約８．５まで下げ、０．２５ＭのＥＤＴＡ  ６０ｍＬ（１５ｍｍｏｌ、ｐＨ＝８．５±０．１）を添加して８．０±１℃で１時間撹拌した。次いで６Ｎ  ＨＣｌ  １６ｍＬにより溶液のｐＨを４．７に調整し、懸濁液を遠心分離し、ペレットに精製を行った。
【０２２５】
（実施例２１）
高圧逆相精製系を使用するリラグルチドの精製
リラグルチド粗生成物（湿潤ペレット１４．２グラム）を、濃度１．９５ｇ／Ｌで１００ｍＭトリスｐＨ８．５±０．１（９１３ｍｌ）に溶解させた。粗ローディング物を、１．２μｍ、その後０．８μｍおよび０．４５μｍのＰＥＳフィルターに通して濾過した。Ｄａｓｉｏｇｅｌ  １０μｍ  Ｃ８  １００Å（寸法５０×２５０ｍｍ、４９１ｍｌ  ＣＶ）で充填されたカラムを、ローディング前に、１０％の移動相Ｂ（移動相Ａ：１０ｍｍトリスｐＨ８．５±０．１；移動相Ｂ：１００％アセトニトリル）で、線流速２３０ｃｍ／時間で平衡化した。分析ＨＰＬＣで純度が９０．００％を超えるピーク画分をプールした（４．２Ｌ）。回収率８２％で溶出プールの純度は９４．２５％であった。通常、溶出プールに存在するアセトニトリルは３０〜４５％（ｖ／ｖ）であり、２２℃でｒｏｔａ−ｖａｐｏｕｒを使用して蒸発させ、最後に次のステップに進めた。
【０２２６】
生成物４．３６ｇ／Ｌ樹脂または０．７３％ｇ生成物／ｇ樹脂の比で、生成物を樹脂にローディングした。カラムを、３カラム分の体積（ＣＶ）の１０％の移動相Ｂ、次いで３ＣＶの２５％の移動相Ｂで、線流速２３０ｃｍ／時間で洗浄した。画分（２３ｍＬ）が収集されると、１５ＣＶの２８〜４２％の移動相Ｂで、線流速２２０ｃｍ／時間でリラグルチドを溶出させた。ＨＰＬＣで純度が９８％を超えるピーク画分をプールした（３８０ｍｌ）。通常、溶出プールに存在するアセトニトリルは３１〜３４％（ｖ／ｖ）であり、２２℃でロータリーエバポレーターを使用して蒸発させ、酢酸（１００μＬ）を使用してｐＩ沈殿させ、８５００ｒｐｍで２０分間、５±２℃で遠心分離した。最後に、ペレットを０．１６ｍｂａｒで２４時間凍結乾燥させ、９８．４６％の純度の白色粉末１．０８グラムを得た。
【０２２７】
（実施例２２）
高圧逆相精製系を使用するリラグルチドの精製
リラグルチド粗生成物（湿潤ペレット１４０グラム）を、濃度２．３４ｇ／Ｌで１００ｍＭトリスｐＨ８．５±０．１（４０００ｍｌ）に溶解させた。粗ローディング物を、１．２μｍ、その後０．８μｍおよび０．４５μｍのＰＥＳフィルターに通して濾過した。Ｄａｓｉｏｇｅｌ  １０μｍ  Ｃ８  １００Å（寸法１００×２６８ｍｍ、２１０４ｍｌ  ＣＶ）で充填されたカラムを、ローディング前に、１０％の移動相Ｂ（移動相Ａ：１０ｍｍトリスｐＨ８．５±０．１；移動相Ｂ：１００％アセトニトリル）で、線流速２２０ｃｍ／時間で平衡化した。
【０２２８】
分析ＨＰＬＣで純度が９０．００％を超えるピーク画分をプールした（４．２Ｌ）。回収率８２％で溶出プールの純度は９４．２５％であった。通常、溶出プールに存在するアセトニトリルは３０〜４５％（ｖ／ｖ）であり、２２℃でｒｏｔａ−ｖａｐｏｕｒを使用して蒸発させ、最後に次のステップに進めた。
【０２２９】
次いで、生成物４．４５ｇ／Ｌ樹脂または０．７４％ｇ生成物／ｇ樹脂の比で、線流速１９１ｃｍ／時間で生成物を樹脂にローディングした。カラムを、４カラム分の体積（ＣＶ）の１０％の移動相Ｂ、次いで３ＣＶの２５％の移動相Ｂで、線流速２２０ｃｍ／時間で洗浄した。画分（約２２０ｍＬ）が収集されると、１８ＣＶの２８〜４０％の移動相Ｂで、線流速２２０ｃｍ／時間でリラグルチドを溶出させた。ＨＰＬＣで純度が９８％を超えるピーク画分をプールした（２０００ｍｌ）。通常、溶出プールに存在するアセトニトリルは３２〜３４％（ｖ／ｖ）であり、２２℃でロータリーエバポレーターを使用して蒸発させ、ＨＣｌ（５．５Ｎ、４．８ｍＬ）を使用してｐＩ沈殿させ、８０００ｒｐｍで３０分間、５±２℃で遠心分離した。最後に、ペレットを０．０４ｍｂａｒで２４時間凍結乾燥させ、９９．１％の純度の白色粉末５．２５グラムを得た。
【図１】
2019528686.tif 000019
【図２】
2019528686.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月28日(2019.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019528686000001.app
【国際調査報告】
2019528686.tif 000021
2019528686.tif 000022