(57)【要約】  本明細書において、抗体検出マーカーの少なくとも１つがＡ１ＡＴ、ＬＧＡＬＳ３、及びＣＡＰＣからなる群から選択される、Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される少なくとも２種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む組成物、並びに乳癌の治療の有効性及び乳癌再発の監視におけるそれらの使用を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種類の抗体検出マーカーを含む組成物であって、前記抗体検出マーカーが、Ａ１ＡＴ（α−１アンチトリプシン）（配列番号７）、ＡＮＧＰＴＬ４（アンジオポエチン様４）（配列番号１）、ＬＲＰ１０（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１０）（配列番号５）、ＧＦＲＡ１（ＧＤＮＦファミリー受容体α１）（配列番号３）、ＬＧＡＬＳ３（ガレクチン−３）（配列番号８）、ＣＳＴ２（シスタチンＳＡ）（配列番号６）、ＤＫＫ１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤１）（配列番号２）、ＣＡＰＣ（癌中のサイトケラチン関連タンパク質）（配列番号９）、ＧＲＰ７８（７８ｋＤａのグルコース調節タンパク質）（配列番号１２）及びＧＲＮ（グラニュリン）（配列番号４）からなる群から選択される少なくとも２種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含み、前記タンパク質の少なくとも１種類は、Ａ１ＡＴ、ＬＧＡＬＳ３、及びＣＡＰＣからなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される少なくとも３種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記列挙した群における少なくとも５、６、７、８、又は全９種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
２〜１０００の抗体検出マーカーからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
４〜５００の抗体検出マーカーからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ＡＮＧＰＴＬ、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮの少なくとも２種類に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ＡＮＧＰＴＬ、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮの少なくとも３、４、又は全５種類に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ヒト自己抗体を検出するための試薬が、少なくとも２種類のタンパク質、又はそれらの抗原性断片を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも２種類のタンパク質又はそれらの抗原性断片が、天然の細胞外ドメイン及び／又は天然の分泌タンパク質若しくはその抗原性断片を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記試薬が、検出可能に標識されている、請求項１〜９種類のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも２種類のタンパク質、又はそれらの抗原性断片が、Ｆｃドメインを含むが、これに限定されない検出可能なドメインとの融合物として発現される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記試薬が、固体支持体の表面上に固定化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
乳癌治療を監視する方法であって、
（ａ）Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される１以上のタンパク質に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けているか、又は受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）前記体液試料中の１以上のタンパク質に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
前記対象からの同様の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルなどの対照と比較して自己抗体の量が減少すれば、前記対象における乳癌治療が有効であることを示す、方法。
【請求項１４】
乳癌の再発の予後を診断する方法であって、
（ａ）Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される１以上のタンパク質に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）前記体液試料中の１以上のタンパク質に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
前記対象からの同様の体液試料などの対照における自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が増加すれば、前記対象における乳癌の再発の可能性を示す、方法。
【請求項１５】
前記試薬が、前記列挙したタンパク質のうちの３以上に対する自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記試薬が、前記列挙したタンパク質のうちの５、６、７、８、又は全９種類に対する自己抗体を検出するための試薬を含む、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１以上の試薬が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１以上の試薬が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮからなる群から選択される少なくとも２種類のタンパク質、又はそれらの抗原性断片を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１以上の試薬が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮからなる群から選択される少なくとも３、４、又は全５種類のタンパク質、又はそれらの抗原性断片を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
乳癌治療を監視する方法であって、
（ａ）ＧＲＰ７８（配列番号１２）に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けているか、又は受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）前記体液試料中のＧＲＰ７８に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
前記対象からの同様の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルなどの対照と比較してＧＲＰ７８に対する自己抗体の量が増加すれば、前記対象における乳癌治療が有効であることを示す、方法。
【請求項２１】
乳癌の再発の予後を診断する方法であって、
（ａ）ＧＲＰ７８（配列番号１２）に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）前記体液試料中のＧＲＰ７８に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
前記対象からの同様の体液試料などの対照におけるＧＲＰ７８に対する自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が減少すれば、前記対象における乳癌の再発の可能性を示す、方法。
【請求項２２】
前記接触がＥＬＩＳＡの使用を含む、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記体液試料が、前記対象からの血液試料、血漿試料、又は血清試料を含む、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が前記原発腫瘍を除去する手術を受けたことがある、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が、放射線療法及び化学療法を受けているか、又は受けたことがある、請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触が、長期的アッセイスクリーニング（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ａｓｓａｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の使用を含み、全ての標的バイオマーカーが、単一の試験及び希釈で検出並びに定量化することができる、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象が、ホルモン療法及び化学療法を受けているか、又は受けたことがある、請求項２０〜２４及び２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象からの同様の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が減少しないことが決定され、前記方法がさらに、前記対象に投与される乳癌治療を変更することを含む、請求項１３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年１２月１１日出願の米国仮特許出願第６２／２６６１８９号の優先権を主張する。
【０００２】
米連邦政府の資金調達に関する声明：
本発明は、米国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｐ２０ＧＭ１０３５４８の下で政府の支援によってなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
局所乳癌（ＢＣａ）と診断された女性の５年生存率は９８．６％である。生存率は、所属リンパ節転移期では８３．８％に低下し、遠隔転移期では２３．３％に急落する[３]。最初の診断時に転移性ＢＣａを有するのは米国女性の５％に過ぎない[４]；しかしながら、ほとんどのＢＣａ関連死は、原発腫瘍の診断ではなく、不治の転移性疾患によるものである[５]。残念なことに、患者が、息切れ、慢性的な咳、体重減少又は骨の疼痛などの症状を報告する場合には、ＢＣａの再発が高い頻度で発見される。
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、本発明は、少なくとも２種類の抗体検出マーカーを含む組成物を提供し、該抗体検出マーカーは、Ａ１ＡＴ（α−１アンチトリプシン）（配列番号７）、ＡＮＧＰＴＬ４（アンジオポエチン様４）（配列番号１）、ＬＲＰ１０（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１０）（配列番号５）、ＧＦＲＡ１（ＧＤＮＦファミリー受容体α１）（配列番号３）、ＬＧＡＬＳ３（ガレクチン−３）（配列番号８）、ＣＳＴ２（シスタチンＳＡ）（配列番号６）、ＤＫＫ１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤１）（配列番号２）、ＣＡＰＣ（癌中のサイトケラチン関連タンパク質）（配列番号９）、ＧＲＰ７８（７８ｋＤａのグルコース調節タンパク質）（配列番号１２）及びＧＲＮ（グラニュリン）（配列番号４）からなる群から選択される少なくとも２種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含み、該タンパク質の少なくとも１種類は、Ａ１ＡＴ、ＬＧＡＬＳ３、及びＣＡＰＣからなる群から選択される。一実施形態において、該組成物は、Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される少なくとも３種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。別の実施形態において、該組成物は、列挙した群の少なくとも５、６、７、８、又は全９種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。さらなる実施形態において、該組成物は、２〜１０００の抗体検出マーカー、又は４〜５００の抗体検出マーカーからなる。別の実施形態において、該組成物は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮの少なくとも２、３、４、又は全５種類に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。さらなる実施形態において、該組成物はさらに、ＧＡＬ１及びＭＵＣ１のうちの１種類又は両方に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。一実施形態において、ヒト自己抗体を検出するための試薬は、少なくとも２種類のタンパク質、又はそれらの抗原性断片を含む。別の実施形態において、少なくとも２種類のタンパク質、又はそれらの抗原性断片は、天然の細胞外ドメイン及び／又は天然の分泌タンパク質又はその抗原性断片を含む。さらなる実施形態において、該試薬は、検出可能に標識されている。なおさらなる実施形態において、少なくとも２種類のタンパク質、又はそれらの抗原性断片は、Ｆｃドメインを含むが、これに限定されない検出可能なドメインとの融合物として発現される。別の実施形態において、該試薬は、固体支持体の表面上に固定化される。
【０００５】
別の態様において、本発明は、乳癌治療を監視する方法であって、
（ａ）Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される１以上のタンパク質に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けているか、又は受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）体液試料中の１以上のタンパク質に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
該対象からの同様の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルなどの対照と比較して自己抗体の量が減少すれば、該対象における乳癌治療が有効であることを示す、方法を提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、乳癌の再発の予後を診断する方法であって、
（ａ）Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される１以上のタンパク質に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）該体液試料中の１以上のタンパク質に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
該対象からの同様の体液試料などの対照における自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が増加すれば、該対象における乳癌の再発の可能性を示す、方法を提供する。
【０００７】
様々な実施形態において、該試薬は、列挙したタンパク質のうちの３、４、５、６、７、８、又は全９種類の自己抗体を検出するための試薬を含む。別の実施形態において、該試薬は、本発明の任意の実施形態又は実施形態の組合せの組成物を含む。
【０００８】
一実施形態において、１以上の試薬は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮからなる群から選択される２、３、４、又は全５種類のタンパク質、又はそれらの抗原性断片を含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、乳癌治療を監視する方法であって、
（ａ）ＧＲＰ７８に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けているか、又は受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）該体液試料中のＧＲＰ７８に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
該対象からの同様の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルなどの対照と比較してＧＲＰ７８に対する自己抗体の量が増加すれば、該対象における乳癌治療が有効であることを示す、方法を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、乳癌の再発の予後を診断する方法であって、
（ａ）ＧＲＰ７８に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）体液試料中のＧＲＰ７８に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
該対象からの同様の体液試料などの対照におけるＧＲＰ７８に対する自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が減少すれば、該対象における乳癌の再発の可能性を示す、方法を提供する。別の実施形態において、接触は、ＥＬＩＳＡの使用を含む。さらなる実施形態において、体液試料は、対象からの血清試料を含む。一実施形態において、該対象は、本発明の方法を実施する前に原発腫瘍を除去する手術を受けている。別の実施形態において、該対象は、放射線療法と化学療法、又はホルモン療法と化学療法を受けているか、又は受けたことがある。さらなる実施形態において、接触は、全ての標的バイオマーカーを、単一の試験及び希釈で検出及び定量化することができる、長期的アッセイスクリーニング（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ａｓｓａｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の使用を含む。なおさらなる実施形態において、該体液試料は、対象からの血液試料を含む。一実施形態において、対象からの同様の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が減少していないと決定される場合、本方法はさらに、対象に投与される乳癌治療を変更することを含む。別の実施形態において、本方法は、乳癌の再発を検出するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】１２ヶ月の経過観察後の治療計画に従って、１１の腫瘍関連抗原に対する自己抗体レベルのベースラインからの観察された幾何平均変化（９５％信頼区間を共に示す）。＊はｐ値＜０．０５を示す。手術のみ又は個々の療法（すなわち、ホルモン、放射線療法若しくは化学療法）について有意な変化は観察されなかった。
【図２】ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）で治療したＨＥＲ２陽性乳癌と診断された患者におけるＥＲＢＢ２−ｒＦｃに対する抗体反応。手術の直前、手術後６ヶ月及び１２ヶ月の時点での長期的な３回の採血を行った。実線は、１２ヶ月の来院時に、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法をまだ受けている患者を示し、破線は、１２ヶ月の来院前に、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法を中止した患者を表す。明るい緑色の円は、ベースライン採血のみを実施した患者ＢＣ−１６６を表す。幾何平均値は、経時的に４８、１２０６及び６００であった。経過観察のレベルは、ベースラインよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０００１）が、６ヶ月及び１２ヶ月のレベルに差はなかった（ｐ＝０．０９）。
【図３】６ヶ月の経過観察後の治療計画に従って、１１の腫瘍関連抗原に対する自己抗体レベルのベースラインからの観察された幾何平均変化（９５％信頼区間を共に示す）。＊はｐ値＜０．０５を示す。手術のみ又は個々の療法（すなわち、ホルモン、放射線療法若しくは化学療法）について有意な変化は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本出願の範囲内で、特に明記しない限り、利用する技術は、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、遺伝子発現技術（酵素学における方法（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）），Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）、１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、酵素学における方法の中の「タンパク質精製ガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ（編）、（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲプロトコル：方法と応用へのガイド（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｉｎｎｉｓら、１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），動物細胞の培養：基本技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），遺伝子導入と発現プロトコル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），１０９−１２８ページ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ（編），Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、及びＡｍｂｉｏｎ社の１９９８カタログ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などのいくつかの周知の参考文献のいずれかに見出すことができる。
【００１４】
第１の態様において、本発明は、少なくとも２種類の抗体検出マーカーを含む組成物を提供し、該抗体検出マーカーは、Ａ１ＡＴ（α−１アンチトリプシン）（配列番号７）、ＡＮＧＰＴＬ４（アンジオポエチン様４）（配列番号１）、ＬＲＰ１０（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１０）（配列番号５）、ＧＦＲＡ１（ＧＤＮＦファミリー受容体α１）（配列番号３）、ＬＧＡＬＳ３（ガレクチン−３）（配列番号８）、ＣＳＴ２（シスタチンＳＡ）（配列番号６）、ＤＫＫ１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤１）（配列番号２）、ＣＡＰＣ（癌におけるサイトケラチン関連タンパク質）（配列番号９）、ＧＲＰ７８（７８ｋＤａのグルコース調節タンパク質）（配列番号１２）及びＧＲＮ（グラニュリン）（配列番号４）からなる群から選択される少なくとも２種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含み、該タンパク質の少なくとも１種類は、Ａ１ＡＴ、ＬＧＡＬＳ３、及びＣＡＰＣからなる群から選択される。
【００１５】
発明者らは、予想外にも、列挙したタンパク質に対する自己抗体が、ＢＣａ、及び／又はＢＣａの再発について治療される対象に関する療法の有効性の指標を提供することを発見した。そのため、本発明の組成物は、例えば、乳癌の治療の有効性、及び／又は再発を監視するための診断アッセイで使用することができる。一実施形態において、該組成物は、Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される少なくとも２種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。
【００１６】
様々な実施形態において、該組成物は、列挙した群の少なくとも３、４、５、６、７、８、又は全９種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含むか、又はそれらからなる。様々なさらなる実施形態において、該組成物は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮのうちの２、３、４、又は全５種類に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含むか、又はそれらからなる。
【００１７】
さらなる実施形態において、該組成物はさらに、ＧＡＬ１及びＭＵＣ１の１つ又は両方に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。
【００１８】
様々なさらなる実施形態において、該組成物は、２〜１０００、３〜１０００、４〜１０００、５〜１０００、６〜１０００、７〜１０００、８〜１０００、９〜１０００、２〜５００、３〜５００、４〜５００、５〜５００、６〜５００、７〜５００、８〜５００、９〜５００、２〜１００、３〜１００、４〜１００、５〜１００、６〜１００、７〜１００、８〜１００、９〜１００、２〜５０、３〜５０、４〜５０、５〜５０、６〜５０、７〜５０、８〜５０、９〜５０、２〜２５、３〜２５、４〜２５、５〜２５、６〜２５、７〜２５、８〜２５、又は９〜２５の抗体検出試薬を含むか、又はそれらからなる。
【００１９】
当業者によって理解されるように、該組成物は、該組成物の意図される使用に適するように追加の抗体検出マーカー及び対照を含むことができる。
【００２０】
該抗体検出マーカーは、列挙したタンパク質、タンパク質の分泌型（タンパク質の天然の分泌型など）、又はタンパク質の細胞外ドメインを含むが、これらに限定されない列挙したタンパク質に対する抗体を検出するために使用することができる任意の適切な試薬であり得る。分泌タンパク質は、腫瘍細胞からリンパ節により容易に送達され、そこで免疫細胞の相互作用が生じ、大量の高親和性抗体を生じる。膜表面タンパク質は、一般に、メタロプロテイナーゼ依存性切断を介して腫瘍細胞から可溶性形態で放出される。排出されたタンパク質は、細胞内タンパク質よりも容易にリンパ節に転送される。そのため、一実施形態において、該抗体検出マーカーは、列挙したタンパク質の分泌部分又は膜部分であり得る。述べたように、列挙したヒトタンパク質の例示的なアミノ酸配列を、以下に示す：
シグナル配列を含まない完全長タンパク質：ＡＮＧＰＴＬ４、Ａ１ＡＴ、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮ、ＧＲＰ７８、ＧＡＬ１、ＭＵＣ１
シグナル配列を含まない細胞外ドメイン領域：ＣＡＰＣ、ＬＲＰ１０
全長（タンパク質において予測されるシグナル配列を含まない）：ＬＧＡＬＳ３
ANGTPL4 (配列番号１)
KSPRFASWDEMNVLAHGLLQLGQGLREHAERTRSQLSALERRLSACGSACQGTEGSTDLPLAPESRVDPEVLHSLQTQLKAQNSRIQQLFHKVAQQQRHLEKQHLRIQHLQSQFGLLDHKHLDHEVAKPARRKRLPEMAQPVDPAHNVSRLHRLPRDCQELFQVGERQSGLFEIQPQGSPPFLVNCKMTSDGGWTVIQRRHDGSVDFNRPWEAYKAGFGDPHGEFWLGLEKVHSITGDRNSRLAVQLRDWDGNAELLQFSVHLGGEDTAYSLQLTAPVAGQLGATTVPPSGLSVPFSTWDQDHDLRRDKNCAKSLSGGWWFGTCSHSNLNGQYFRSIPQQRQKLKKGIFWKTWRGRYYPLQATTMLIQPMAAEAAS
DKK1 (配列番号２)
VSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH
GFRA1 (配列番号３)
DRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNFSLASGLEAKDECRSAMEALKQKSLYNCRCKRGMKKEKNCLRIYWSMYQSLQGNDLLEDSPYEPVNSRLSDIFRVVPFISDVFQQVEHIPKGNNCLDAAKACNLDDICKKYRSAYITPCTTSVSNDVCNRRKCHKALRQFFDKVPAKHSYGMLFCSCRDIACTERRRQTIVPVCSYEEREKPNCLNLQDSCKTNYICRSRLADFFTNCQPESRSVSSCLKENYADCLLAYSGLIGTVMTPNYIDSSSLSVAPWCDCSNSGNDLEECLKFLNFFKDNTCLKNAIQAFGNGSDVTVWQPAFPVQTTTATTTTALRVKNKPLGPAGSENEIPTHVLPPCANLQAQKLKSNVSGNTHLCISNGNYEKEGLGASSHITTKSMAAPPSCGLSPLLVLVVTALSTLLSLTETS
GRN (配列番号４)
TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL
LRP10 (配列番号５)
HPDRIIFPNHACEDPPAVLLEVQGTLQRPLVRDSRTSPANCTWLILGSKEQTVTIRFQKLHLACGSERLTLRSPLQPLISLCEAPPSPLQLPGGNVTITYSYAGARAPMGQGFLLSYSQDWLMCLQEEFQCLNHRCVSAVQRCDGVDACGDGSDEAGCSSDPFPGLTPRPVPSLPCNVTLEDFYGVFSSPGYTHLASVSHPQSCHWLLDPHDGRRLAVRFTALDLGFGDAVHVYDGPGPPESSRLLRSLTHFSNGKAVTVETLSGQAVVSYHTVAWSNGRGFNATYHVRGYCLPWDRPCGLGSGLGAGEGLGERCYSEAQRCDGSWDCADGTDEEDCPGCPPGHFPCGAAGTSGATACYLPADRCNYQTFCADGADERRCRHCQPGNFRCRDEKCVYETWVCDGQPDCADGSDEWDCSYVLPRK
CST2 (配列番号６)
WSPQEEDRIIEGGIYDADLNDERVQRALHFVISEYNKATEDEYYRRLLRVLRAREQIVGGVNYFFDIEVGRTICTKSQPNLDTCAFHEQPELQKKQLCSFQIYEVPWEDRMSLVNSRCQEA
A1AT （配列番号７)
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK
LGALS3 (配列番号８)
MADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI
CAPC (配列番号９)
QVSATASPSGSLGAPDCPEVCTCVPGGLASCSALSLPAVPPGLSLRLRALLLDHNRVRALPPGAFAGAGALQRLDLRENGLHSVHVRAFWGLGALQLLDLSANQLEALAPGTFAPLRALRNLSLAGNRLARLEPAALGALPLLRSLSLQDNELAALAPGLLGRLPALDALHLRGNPWGCGCALRPLCAWLRRHPLPASEAETVLCVWPGRLTLSPLTAFSDAAFSHCAQPLALRDLAV
GAL1 (配列番号１０)
LRVRGEVAPDAKSFVLNLGKDSNNLCLHFNPRFNAHGDANTIVCNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGSVAEVCITFDQANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEAINYMAADGDFKIKCVAFD
MUC1 (配列番号１１)
APKPATVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPG
GRP78 (配列番号１２)
EEEDKKEDVGTVVGIDLGTTYSCVGVFKNGRVEIIANDQGNRITPSYVAFTPEGERLIGDAAKNQLTSNPENTVFDAKRLIGRTWNDPSVQQDIKFLPFKVVEKKTKPYIQVDIGGGQTKTFAPEEISAMVLTKMKETAEAYLGKKVTHAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGTIAGLNVMRIINEPTAAAIAYGLDKREGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTIDNGVFEVVATNGDTHLGGEDFDQRVMEHFIKLYKKKTGKDVRKDNRAVQKLRREVEKAKRALSSQHQARIEIESFYEGEDFSETLTRAKFEELNMDLFRSTMKPVQKVLEDSDLKKSDIDEIVLVGGSTRIPKIQQLVKEFFNGKEPSRGINPDEAVAYGAAVQAGVLSGDQDTGDLVLLDVCPLTLGIETVGGVMTKLIPRNTVVPTKKSQIFSTASDNQPTVTIKVYEGERPLTKDNHLLGTFDLTGIPPAPRGVPQIEVTFEIDVNGILRVTAEDKGTGNKNKITITNDQNRLTPEEIERMVNDAEKFAEEDKKLKERIDTRNELESYAYSLKNQIGDKEKLGGKLSSEDKETMEKAVEEKIEWLESHQDADIEDFKAKKKELEEIVQPIISKLYGSAGPPPTGEEDTAEKDEL
【００２１】
さらなる実施形態において、該抗体検出マーカーは、その天然型である、上記に開示されたものなどのタンパク質である。添付の実施例に開示されているように、発明者らは、真核生物発現システムを利用して、適切に折り畳まれ、自己抗体の検出に使用するための非連続的なエピトープを含有する立体構造担持腫瘍抗原を生成した。別の実施形態において、該試薬は少なくとも２種類のタンパク質又はそれらの抗原性断片を含み、少なくとも２種類のタンパク質又はそれらの抗原性断片は、検出可能なドメインとの融合物として発現される。該タンパク質は、任意の適切な形式で使用することができる。非限定的な一実施形態において、該タンパク質は、表面に結合したＦｃ融合タンパク質、又は分泌されたＦｃ融合タンパク質であり得る。
【００２２】
上記実施形態の全てにおいて、該抗体検出試薬は、検出可能な標識で標識することができる。一実施形態において、１種類のタンパク質に対する自己抗体を検出するための試薬の検出可能な標識は、他のタンパク質に対する自己抗体を検出するための検出可能な標識と識別可能である。標識を検出する方法には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、物理的又は化学的手法が含まれるが、これらに限定されない。任意の適切な検出可能な標識を使用することができる。
【００２３】
該組成物は、凍結して、凍結乾燥形態で、又は溶液として保存することができる。一実施形態において、該組成物は、固体支持体の表面上に配置することができる。任意の適切な固体支持体を使用することができる。このような支持体の例としては、マイクロアレイ、ビーズ、カラム、光ファイバー、ワイプ、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化膜（紙又はナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体材料、コーティングされたビーズ、磁性粒子；ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリスチレンなどのプラスチック；ならびにタンパク質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖類、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｒａｃｒｙｌａｔｅ）ポリマーなどのゲル形成材料；ゾルゲル；多孔性ポリマーヒドロゲル；ナノ構造の表面；ナノチューブ（カーボンナノチューブなど）、及びナノ粒子（金ナノ粒子又は量子ドットなど）が挙げられるが、これらに限定されない。この実施形態は、様々な検出アッセイにおける組成物の使用を容易にする。例えば、抗ＩｇＧは、マイクロウェルプレートのウェルをプレコートするために使用することができ、抗体検出試薬（本明細書で論じるタンパク質など）を、プレコートウェルに添加することができる。
【００２４】
第２の態様において、本発明は、乳癌治療を監視する方法であって、
（ａ）Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される１以上のタンパク質に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けているか、又は受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）体液試料中の１以上のタンパク質に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
該対象からの同様の体液試料などの対照における自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が減少すれば、該対象における乳癌治療が有効であることを示す、方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、乳癌の再発の予後を診断する方法であって、
（ａ）Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される１以上のタンパク質に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）該体液試料中の１以上のタンパク質に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
該対象からの同様の体液試料などの対照における自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が増加すれば、該対象における乳癌の再発の可能性を示す、方法を提供する。
【００２６】
以下の実施例に開示されているように、ベースラインレベル（すなわち、乳癌治療開始前）と比較して、１以上の列挙したマーカーの自己抗体の量の経時的な減少は、好ましい治療応答を示すが、自己抗体のレベルの減少又は増加が無いことは、好ましくない治療応答を示す。本方法は、全ての要因に照らして主治医によって決定される乳癌治療開始後の任意の適切な時点で行うことができる。様々な非限定的な実施形態において、本方法は、治療の開始後少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月などの時点で行うことができる。当業者によって理解されるように、本方法は、主治医が適切と認めるような、所定の対象に対して任意の回数行うことができる。したがって、本方法は、治療の経過を監視するために、所定の対象について１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれより多くの回数行うことができる。非限定的な一実施形態において、本方法は、乳癌治療の開始後６ヶ月及び／又は１２ヶ月の時点で実施される。当業者によって理解されるように、本方法は、治療中に行うことができ、また、乳癌再発の可能性を監視するために、治療終了後に行うことができる。
【００２７】
対象は、ヒト対象を含むがこれに限定されない、乳癌治療を受けている任意の適切な対象であり得る。本明細書では、「乳癌治療」は、原発性乳房腫瘍を除去する手術、放射線療法、化学療法、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法、及びホルモン療法のうちの１以上を含む。非限定的な一実施形態において、該対象は、原発性乳房腫瘍を除去する手術を受けており、放射線療法、化学療法、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法及び／又はホルモン療法から選択される追加の療法を受けている。９種類のＴＡＡ（すなわち、Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＡＰＣ、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮ、ＬＧＡＬＳ３及びＬＲＰ１０）に対する応答レベルのベースラインと１２ヶ月の時点の間の有意な減少が、３つの治療群で観察された。放射線療法＋化学療法、放射線療法＋ホルモン療法、及び放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法では、有意な９種類のＴＡＡの平均幾何平均値がそれぞれ−１１％、−１３％、及び−１８％減少した（図１）。ＤＫＫ１に対する自己抗体が、放射線療法＋化学療法群において有意に減少した。放射線療法＋ホルモン療法群は、Ａ１ＡＴ、ＣＳＴ２、ＧＲＮ及びＬＲＰ１０に対する自己抗体応答の有意な減少を含んた。放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法群において、Ａ１ＡＴ及びＬＲＰ１０は、他の抗原及びレジメンと比較して自己抗体応答レベルの最大の減少（それぞれ−２６％及び−２８％）を有した。放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法の３つの療法は、治療の任意の他の組み合わせよりもＴＡＡに対する自己抗体応答を減少させるのに有効であった。この群は、全ての９種類のＴＡＡに対する自己抗体応答の有意な減少を有した。
【００２８】
一実施形態において、１以上の試薬は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮからなる群から選択される２、３、４、若しくは全５種類のタンパク質又はそれらの抗原性断片を含む。
【００２９】
該抗体検出マーカーは、列挙したタンパク質、タンパク質の分泌型（タンパク質の天然の分泌型など）、又はタンパク質の細胞外ドメインを含むが、これらに限定されない列挙したタンパク質に対する抗体を検出するために使用することができる任意の適切な試薬であり得る。分泌タンパク質は、腫瘍細胞からリンパ節により容易に送達され、そこで免疫細胞の相互作用が起こり、大量の高親和性抗体を生じる。膜表面タンパク質は、一般に、メタロプロテイナーゼ依存性切断を介して腫瘍細胞から可溶性形態で放出される。排出されたタンパク質は、細胞内タンパク質よりもより容易にリンパ節に転送される。そのため、一実施形態において、該抗体検出マーカーは、列挙したタンパク質の分泌部分又は膜部分であり得る。列挙したタンパク質の分泌部分又は膜部分の例示的なアミノ酸配列は、本明細書に開示したとおりである。したがって、使用する試薬は、本発明の組成物の任意の実施形態の試薬、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＬＲＰ１０、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＣＡＰＣ、ＧＲＰ７８、及びＧＲＮからなる群から選択される１以上のタンパク質、その分泌部分、又はその膜部分に対する自己抗体を検出するための任意の適切な１以上の試薬であり得る。様々な非限定的な実施形態において、該試薬は、列挙した群内の少なくとも３、４、５、６、７、８、又は全９種類のタンパク質に対するヒト自己抗体を検出するための試薬を含む。別の非限定的な実施形態において、該試薬は、列挙したタンパク質又はそれらの抗原性断片を含む。そのようなタンパク質は、天然型であり得る。別の実施形態において、該試薬は、少なくとも２種類のタンパク質又はそれらの抗原性断片を含み、少なくとも２種類のタンパク質又はそれらの抗原性断片は、検出可能なドメインとの融合物として発現される。該タンパク質は、任意の適切な形式で使用することができる。非限定的な一実施形態において、該タンパク質（複数可）は、表面に結合したＦｃ融合タンパク質又は分泌Ｆｃ融合タンパク質であり得る。別の実施形態において、該試薬は、検出可能に標識することができる。別の実施形態において、該試薬は、固体支持体の表面に結合させることができる。
【００３０】
様々な実施形態において、該抗体検出マーカーの少なくとも１、２、３、４、又は５種類は、Ａ１ＡＴ、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＣＡＰＣ、及びＣＳＴ２からなる群から選択される。様々なさらなる実施形態において、該抗体検出マーカーの少なくとも１、２、３、４、又は５種類は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＧＦＲＡ１、ＬＧＡＬＳ３、ＤＫＫ１及びＧＲＮからなる群から選択される。
【００３１】
以下の実施例に示すように、ＧＲＰ７８は、ホルモン療法＋化学療法群で生じた、自己抗体応答の有意な増加を示す唯一のＴＡＡであった。したがって、別の態様において、本発明は、乳癌治療を監視する方法であって、
（ａ）ＧＲＰ７８に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けているか、又は受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）体液試料中のＧＲＰ７８に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
該対象からの同様の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルなどの対照と比較してＧＲＰ７８に対する自己抗体の量が増加すれば、該対象において乳癌治療が有効であることを示す、方法を提供する。
【００３２】
別の態様において、本発明は、乳癌の再発の予後を診断する方法であって、
（ａ）ＧＲＰ７８に対する自己抗体を検出するための１以上の試薬と、乳癌治療を受けたことのある対象からの体液試料とを接触させること；並びに
（ｂ）体液試料中のＧＲＰ７８に対する自己抗体の量を決定すること、
を含み、
該対象からの類似の体液試料などの対照におけるＧＲＰ７８に対する自己抗体のベースラインレベルと比較して自己抗体の量が減少すれば、該対象における乳癌の再発の可能性を示す、方法を提供する。
【００３３】
これらの態様のそれぞれの一実施形態において、該対象は、ホルモン療法及び化学療法を受けているか、又は受けたことがある。
【００３４】
当業者によって理解されるように、本方法は、該組成物の意図する使用に適切であるように、追加の抗体検出マーカー及び対照の使用を含むことができる。接触は、検出することができる結合複合体を形成するために、体液試料中の自己抗体と試薬との間の結合を促進するための任意の適切な条件下で行うことができる。適切なそのような条件は、本明細書の教示に照らして、意図したアッセイに基づいて、当業者によって決定することができる。同様に、未結合の試薬を除去するための１以上の洗浄又は他の工程などの方法において、任意の適切な追加の工程を使用することができる。
【００３５】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＬＵＭＩＥＸ（登録商標）システムなどのビーズに基づくアッセイプラットフォーム、ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ（登録商標）などの２−Ｄアレイに基づくアッセイプラットフォーム、並びに単一の試験及び希釈で、患者の試料からの全ての記載の乳癌バイオマーカーを臨床的に適切な濃度で定量することが可能であり得るＩＮＡＮＯＶＡＴＥ（登録商標）「長期的アッセイスクリーニング」プラットフォームを含むが、これらに限定されない任意の適切な検出技術を使用することができる。一実施形態において、該組成物は、マイクロアレイ、スライドガラス、膜、マイクロプレートフォーマット又はビーズなどの固体支持体上に配置することができる。実施形態は、該組成物の使用を容易にする。例示的なそのようなアッセイを、実施例に提供する。
【００３６】
同様に、対象からの血清試料、血漿試料又は血液試料を含むが、これらに限定されない任意の適切な体液を使用することができる。「血漿試料」とは、血漿、血液の液体成分を意味し、例えば、血液細胞を除去するために、全血を遠心分離することによって調製される。血清試料は、血液凝固因子が除去されている血漿試料である。
【００３７】
一実施形態において、対象からの類似の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルと比較して、自己抗体の量が減少していないと決定される場合、本方法はさらに、対象に投与される乳癌治療を変更することを含む。自己抗体が減少しないことは、対象にとって好ましくない治療アウトカムを示しているので、本実施形態は、より好ましい治療アウトカムを達成するために、主治医が適当と認めるように療法を変更すること（すなわち、投与量の増加、治療の変更など）を可能にする。
【００３８】
別の実施形態において、乳癌の再発を検出するために、任意の実施形態又は実施形態の組み合わせの方法を使用する。対象からの同様の体液試料中の自己抗体のベースラインレベルと比較して、自己抗体の量が減少していない（又は増加しない）と決定される場合、本方法は、乳癌再発の指標を提供する。患者の自己抗体レベルが、治療の過程で減少するという事実は、これらの自己抗体レベルの検出を再発の予後指標として使用できる可能性を支持する。癌が再発すると、自己抗体レベルが増加し、この増加をアッセイによって検出する。
【００３９】
実施例１：乳癌患者における治療モダリティに従う腫瘍関連抗原に対する長期的な自己抗体応答の減少
乳癌（ＢＣａ）の早期診断は、初期疾患の時点ならびに再発の両方で、疾患の生存率の延長に不可欠である（１、２）。局所ＢＣａと診断された女性の５年生存率は９８.６％である。生存率は、所属リンパ節転移期では８３．８％に低下し、遠隔転移期にでは２３．３％に急落する[３]。最初の診断時に転移性ＢＣａを有するのは米国女性の５％に過ぎない[４]；しかしながら、ほとんどのＢＣａ関連死は、不治の転移性疾患によるものである[５]。残念なことに、患者が、息切れ、慢性的な咳、頭痛、体重減少又は骨の疼痛などの症状を報告する場合には、ＢＣａの再発が高い頻度で発見される。患者が転移性ＢＣａと診断されると、治療の意図はもはや治癒ではない。その代わりに、目標は、できるだけ長く疾患を制御することである（６、７）。現時点では、理学的検査の臨床所見のない無症候性患者に関して推奨される代替的スクリーニング方法はない（８）。転移が身体症状によって特定されるときには、患者の無病生存期間の見込みは大きく減少する。無症候性患者に関して再発を早期発見できないことは、転移性ＢＣａを治癒することができない要因である。
【００４０】
原発性乳癌（ＢＣａ）腫瘍が早期発見されれば、医師は治癒する意図で患者を治療することができる。しかしながら、ほとんどのＢＣａ関連死は、不治の転移性疾患によるものであり、原発腫瘍によるものではない。ＢＣａの一次診断及び治療後に患者の自己抗体レベルにどのような変化が起こるかは現時点では不明である。ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）マルチプレックスビーズアッセイは、単一の患者試料中の３２の立体構造担持ＴＡＡに対する自己抗体応答の同時測定を可能にするために開発された。抗原は、ＢＣａで高度に発現される膜タンパク質及び分泌タンパク質をコードし、患者において抗体応答を優先的に誘導するはずである膜結合ポリリボソームｃＤＮＡライブラリー（ＭＡＰｃＬ）から選択した。不連続エピトープは、抗原が適切に折り畳まれたときに限って抗体認識のために提示されるので、膜タンパク質及び分泌タンパク質の立体構造は、特に重要である。発現構築物を、ウサギＦＣ（ｒＦＣ）に融合したＴＡＡの細胞外部分をコードするように作製した。小胞体及びゴルジ体を介して処理され、翻訳後修飾により抗原を生成する立体構造担持抗原を生成する、真核生物発現系を開発した。
【００４１】
ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズベースのマルチプレックス技術により、抗原バイオマーカーのパネルと患者の自己抗体との相互作用を測定することができ、単一の試験で全てのバイオマーカーの定量を可能にする。ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）マイクロスフェア技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）は、マイクロスフェアと呼ばれる色分けされた５.６ミクロンのビーズに基づいている。これらのビーズは、領域毎に異なるレベルを有する２つの異なる蛍光色素で内部標識され、混合物中で異なる赤色／赤外発光スペクトルによって同定される。同時に、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）装置は、ビーズ上にあらかじめ負荷されたＴＡＡによって捕捉される自己抗体の量を、個別の検出器チャネルにおける二次抗体の蛍光レベルとして測定する。ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズは、マイクロプレートウェルの領域と比較して、捕捉抗体を固定化するための表面積がはるかに小さい。したがって、必要とされる患者試料の容量はより少なく、プラスチック表面への非特異的結合は減少した。
【００４２】
治療前、術後６ヶ月及び１２ヶ月の時点で、２００人のＢＣａ患者から３つの一連の血液を採取した。これらの試料を、３２のＴＡＡに対する自己抗体応答についてアッセイし、経過観察時の試料中に存在するレベルを、手術時の自己抗体レベルと比較した。患者を、手術、化学療法、放射線療法、トラスツズマブ及びホルモン療法を含む治療レジメンに従って分類した。９種類のＴＡＡ（Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＡＰＣ、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮ、ＬＧＡＬＳ３及びＬＲＰ１０）に対する自己抗体応答は、放射線療法＋化学療法、放射線療法＋ホルモン療法、又は放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法を含む治療レジメンによって、手術後１２ヶ月の時点で有意に低下した。自己抗体レベルは、一般的に、術後６ヶ月よりも１２ヶ月の時点でより低く、治療の過程にわたって患者の腫瘍負荷が減少することと一致する。その結果、このデータは、自己抗体レベルが転移に応答して増加し、この変化の検出を、再発の早期指標として用いることができることを示している。
【００４３】
材料及び方法
プラスミドの構築及びタンパク質生成
簡単に説明すると、膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン又は分泌タンパク質及び細胞内タンパク質の全長配列を、ｐＳｅｃＴａｇ２−ウサギＦｃ又はｐＦＵＳＥ−ｒＦｃ１にクローニングした。これらのプラスミドは、分泌シグナル、並びにＣ末端ウサギＦｃ（ｒＦｃ）タグを含んでいた。ＴＡＡ−ｒＦＣプラスミドを、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、コードされるタンパク質を細胞培養上清中に分泌させた。上清をトランスフェクション後に収集し、ＴＡＡ−ｒＦＣ含有量を、抗ｒＦＣサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００４４】
磁気ビーズへの抗体の結合
ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、製造業者の指示に従って、ｘＭＡＰ（登録商標）ＡｂＣキット（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を利用してＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズに結合させた。簡単に説明すると、ビーズを、ＥＤＣ（１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）及びスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）で２０分間活性化した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７.４）で洗浄した後、抗ｒＦＣ抗体を、１×１０６ビーズあたり２０μｇの濃度でビーズに添加し、遮光して２時間インキュベートした。ビーズを再び洗浄し、使用するまで４℃で遮光保存した。使用時に混合し、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）１００／２００装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、３２個の異なる領域に区別することができる３２ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズ領域上で結合を行った。
【００４５】
腫瘍関連抗原ウサギＦｃ融合タンパク質のビーズへの負荷
抗ｒＦＣ抗体と結合させたビーズを、分泌されたＴＡＡ−ｒＦＣ融合タンパク質を含有する細胞培養上清とのインキュベーションによって、各ＴＡＡ−ｒＦＣ融合タンパク質でコーティングした。３２のＴＡＡ−ｒＦＣ融合体のそれぞれを、１つのＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズ領域に結合させた。ビーズを、４０μｇ／１０６ビーズで融合タンパク質と４℃で一晩インキュベートした。ビーズを、使用するまで、４℃の暗所で、ＰＢＳ−ＴＢＮ緩衝液（０.１％ウシ血清アルブミン、０.０２％Ｔｗｅｅｎ２０及び０.０５％アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ）で保存した。
【００４６】
患者
症例の選択基準は、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｈｅａｌｔｈ，Ｓｉｏｕｘ Ｆａｌｌｓ，ＳＤで、ＢＣａ（任意の型）と新たに診断された３０歳を超える女性であった。患者は、乳房切除術、乳腺腫瘤摘出、放射線療法、化学療法又は他の治療の前に、１０ｍＬのＥＤＴＡ採血管を提供した。任意の種類の癌の既往歴を有する潜在的対象を除外した。２００人のＢＣａ患者からの血液試料を、２００９年１０月０８日〜２０１２年４月１７日の間収集した。試験に登録した患者を、術後１年間追跡調査し、血液は手術後６ヶ月及び１２ヶ月の時点の腫瘍の経過観察来院時に採取した。経過観察中の血液を、２０１０年４月１５日〜２０１３年８月２７日の間採取した。全ての患者は書面によるインフォームドコンセントを提供し、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｈｅａｌｔｈ ＩＲＢは、研究プロトコルを承認した。
【００４７】
血漿の収集及び保存
１０ｍＬのＥＤＴＡ管を、採血後１２時間以内に、１０分間、２０００×ｇで遠心分離した。血漿を上清として収集し、アリコートに入れ、自己抗体のアッセイまで−８０℃で保存した。
【００４８】
マルチプレックス自己抗体ビーズアッセイ
血漿試料中の３２のＴＡＡに対する自己抗体を、マルチプレックスビーズアッセイを利用して、単一ウェル中で同時に測定した。それぞれ異なるＴＡＡ−ｒＦＣ融合体でコーティングした３２個の異なる領域からのｘＭＡＰ（登録商標）ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）磁気ビーズを合わせ、９６ウェル丸底プレートのウェルに分配した。ＢＣａ患者からの血漿試料を、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ウシ胎児血清及び０.１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で１：１０に希釈し、希釈した血漿２００μｌを、単一ウェル中のビーズに添加した。試料を、氷上で２時間ビーズとインキュベートした。次いで、ビーズを磁気によって沈降させ、２回洗浄し、最後に吸引してビーズのみを残した。二次抗体として、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００希釈し、２００μｌを各ウェルのビーズに添加した。氷上で１時間インキュベートした後、ビーズを２回洗浄した。各ウェル中のビーズを、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに再懸濁し、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）１００／２００装置にて分析し、各ビーズ領域について最低１００事象の分析を行った。各プレートは、二次抗体のみの陰性対照、及び陽性対照としてビーズ負荷ＴＡＡ−ｒＦＣ融合体と反応するＰＥヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を含んでいた。全ての洗浄及び吸引の工程を、磁気機能を備えたＢｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレートウォッシャーを用いて実施した。
【００４９】
統計的方法
各９６ウェルプレートは、全ての自己抗体について陰性対照バックグラウンド及び陽性対照標準物質を有していた。加えて、各患者は、同じ９６ウェルプレートで分析される自身のベースライン、６ヶ月及び１２ヶ月の時点での試料を有していた。各自己抗体について、患者の蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値を、そのプレートのＭＦＩバックグラウンドレベルを差し引き、次いで、全ての値を少なくとも１つにするために最小の定数だけシフトさせた。次いで、この値を、全８枚のプレートにわたる標準物質の平均ＭＦＩに対する標準物質のＭＦＩ比によって正規化した。最後に、これらの値を対数変換して、分散を安定化し、より対称的な分布にした。すなわち、自己抗体応答＝ＬＮ[（自己抗体−バックグラウンド＋定数）×（標準物質−バックグラウンド）／平均（標準物質−バックグラウンド）]。精度を測定するために、各ＴＡＡについてのアッセイ間のＣＶを、陽性対照及び陰性対照についてプレート間で計算した。
【００５０】
反復測定ＡＮＯＶＡを用いて、化合物の対称性の相関構造により、探索的分析として、経時的（すなわち、６ヶ月及び１２ヶ月）に各自己抗体のベースラインからの幾何平均変化をモデル化した。このモデルは、経時的な放射線療法、ホルモン療法及び化学療法の指標変数における全ての交互作用を含んでいた。このアプローチは、一次分析で２００人のうち１８３人のＢＣａ患者を含み；その治療の一部としてトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））を与えた１７人の患者は４つの群からなり、その平均応答プロファイルを調べることによって二次分析をした。陽性所見の数によって自己抗体をランク付けするために、６ヶ月及び１２ヶ月の時点でＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を含まない全８つの治療の組み合わせについて、その時点での推定値及び９５％信頼区間（ＣＩ）を計算した。各ＴＡＡは、試験した１６（８つの治療の６ヶ月及び１２ヶ月）の時点の推定値を有していたので、各ＴＡＡについて１つの偽陽性が予想された。したがって、３以上の陽性所見を有する自己抗体レベルについて、観察された幾何平均変化を提示した。統計的に有意であるとするために０.０５未満のｐ値を使用し、ＳＡＳ（Ｃａｒｙ，ＮＣ）バージョン９.３を全ての分析に使用した。
【００５１】
結果
連続の血漿試料を２００人の新たに診断されたＢＣａ患者から収集した（１３）。人口統計情報、腫瘍サイズ、腫瘍マーカーの状態、非侵襲性対侵襲性成分及びリンパ節転移を含む、この研究に登録した２００人のＢＣａ患者の特徴については、以前に発明者らの研究室によって記載されている（１３）。血液を、治療前、原発腫瘍の外科的切除後６ヶ月及び１２ヶ月の時点で採取した。治療の過程で癌抗原に対する患者の自己抗体応答を決定するために、２０の以前に分析したＴＡＡ（１３）及び１２の新たに選択した癌抗原（表１）からなる３２のＴＡＡ−ｒＦＣ融合タンパク質を作製した。以前に開発した真核生物発現系（１３）を用いて、マルチプレックスイムノアッセイのためのＴＡＡ−ｒＦＣ立体構造担持抗原の全てを作製した。独自の赤色／赤外発光スペクトルからなるＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズの３２セットを、抗ウサギＩｇＧでコーティングした。３２のＴＡＡ−ｒＦＣ融合タンパク質を、コーティングしたＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズに結合させ、その後、治療前、手術後６ヶ月及び１２ヶ月の時点で患者から得た血漿試料とインキュベートした。ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）マルチプレックスビーズプラットフォームにより（治療開始前の）ベースラインで測定した３２の自己抗体応答についてのアッセイ間の平均ＣＶは、低い対照値及び高い対照値について、それぞれ１１.１％及び１１.４％であった（表２）。これに対し、ＥＬＩＳＡプラットフォーム自己抗体アッセイのブロッキング緩衝液対照のアッセイ間の平均ＣＶは１２.４％であった（１３）。ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）マルチプレックスシステムは、アッセイスループットを大幅に増加させ、再現性をわずかに改善させた。
【００５２】
表１．ｒＦＣ融合タンパク質の作製のための追加候補
【表１】
2019505763.tif 000002
【００５３】
表２．ビーズプラットフォーム上の３２のＴＡＡについての陰性対照及び陽性対照のアッセイ間の変動係数
【表２】
2019505763.tif 000003
【００５４】
各対象を、初期診断後１２ヶ月の間に受けた治療に基づいて分類した。発明者らの研究に登録した登録ＢＣａ患者は全員、乳房腫瘍摘出手術又は乳房切除を含む、原発腫瘍を除去するための手術を受けた。手術に加えて、治療は、ホルモン療法、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、放射線療法及び細胞毒性化学療法の組み合わせを含んでいた（表３）。７２人の患者に、以下のレジメン：アドリアマイシン／シトキサン＋タキソール＝３３人の患者；シトキサン＋タキソール＝２２人の患者；アドリアマイシン／シトキサン＝５人の患者；カルボプラチン＋タキソール＝６人の患者；アドリアマイシン＋シトキサン／タキソール＝３人の患者；アドリアマイシン／シトキサン＋カルボプラチン／ジェムザール＝１人の患者；カルボプラチン＋タキソテール＋ノバントロン＝１人の患者；タキソール単独＝１人の患者のうちの１つからなる細胞毒性化学療法を行った。治療に使用した細胞毒性化学療法薬のサブクラスに応じて患者を分析しなかった。患者が、上記の化学療法レジメンのいずれか１つを受けていた場合、患者はその化学療法治療群の一部であると考えられた。治療レジメンに基づいて、研究参加者を群分けすると、手術後に治療なしから、全ての治療モダリティの投与に及ぶ１２の群が得られた（表３）。１２群のうちの８群には、手術に加えて、少なくとも２つの療法の組み合わせを行った。３つの群には、手術に加えて単剤療法を行い、１つの群には手術のみを行った。
【００５５】
表３．治療モダリティ及び来院あたりの患者の採血の数
【表３】
2019505763.tif 000004
【００５６】
一次探索的分析には、２００人中１８３人の患者が含まれ、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法を受けていない８つの患者治療群を包含していた（表３）。反復測定ＡＮＯＶＡを用いて、６ヶ月及び１２ヶ月の時点で各自己抗体のベースラインからの幾何平均の変化をモデル化し、このモデルは、経時的な放射線療法、ホルモン療法及び化学療法の指標変数における全ての交互作用を含んだ。ＡＮＯＶＡモデルが、１６（８群×６ヶ月及び１２ヶ月の時点の血液からなる２つの時点）の推定値のうち、１つの抗原について少なくとも３つの有意な変化を予測した場合は、ＡＮＯＶＡモデルをさらなる分析のために選択した。この変数選択基準を使用して、このモデルは、術後１２ヶ月間の治療に応答して自己抗体シグナルを有意に調節した可能性がある１１の抗原を特定した。さらなる研究のために選択したＴＡＡには、Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＡＰＣ、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮ、ＧＲＰ７８、ＬＧＡＬＳ３、ＬＲＰ１０及びＮＹ−ＥＳＯ−１が含まれた。
【００５７】
ベースラインからの実際の幾何平均変化を、６ヶ月及び１２ヶ月の時点で１１のＴＡＡについて計算した（それぞれ図１及び３）。手術のみを受けたか、又は手術及び単一の単剤療法：ホルモン療法、化学療法又は放射線療法で治療した患者について、１１の抗原に対する自己抗体応答に有意な変化は観察されなかった。１２ヶ月の時点で、ＧＲＰ７８は、ホルモン療法＋化学療法の群で生じた４４％の自己抗体応答の有意な増加を示す唯一のＴＡＡであった（図１）。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、反復測定ＡＮＯＶＡモデルにおいて応答レベルの有意な変化を有すると予測されたが、観察された変化は有意ではなかった（図１）。しかしながら、ベースラインと１２ヶ月の時点との間で、１１のＴＡＡ（すなわち、Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＡＰＣ、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮ、ＬＧＡＬＳ３及びＬＲＰ１０）のうちの９種類のＴＡＡに対する応答レベルの有意な減少が、３つの治療群で観察された。放射線療法＋化学療法、放射線療法＋ホルモン療法、及び放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法では、有意な９種類のＴＡＡの平均幾何平均値がそれぞれ、−１１％、−１３％、及び−１８％減少した（図１）。放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法群において、Ａ１ＡＴ及びＬＲＰ１０は、他の抗原及びレジメンと比較して、自己抗体応答のレベルの最大の減少を示した（それぞれ、−２６％及び−２８％）。放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法の３つの療法は、他のいかなる治療の組み合わせ対よりも、ＴＡＡに対する自己抗体応答を減少させるために有効であった。加えて、幾何平均応答の減少は、術後６ヶ月で−１５％であったが、１２ヶ月の時点では−１８％のより大きな減少であった（図３）。自己抗体レベルは治療の過程で減少し、患者が最初の診断からさらに除外されるにつれて、経時的に減少し続けることは明らかである。
【００５８】
１２の治療群のうち４群（合計１７人の患者）を、以下：放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法＋ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）＝８人の患者；ホルモン療法＋化学療法＋ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）＝５人の患者；放射線療法＋化学療法＋ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）＝３人の患者；放射線療法＋ホルモン療法＋ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）＝１人の患者（表２）のようにＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法で治療した。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗体療法は、一般的に、３週間ごとに１年間投与される（２７）。発明者らは、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズベースアッセイを使用して、患者の血液中を循環するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗体がＥＲＢＢ２抗原に対するシグナルを生成していることを確認した。ＥＲＢＢ２抗体応答における幾何平均レベルは、ベースラインでの４８の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）から６ヶ月の時点での１２０６ ＭＦＩに増加し、その後、１２ヶ月の時点で６００ ＭＦＩに減少した（図２）。ベースラインと比較した変化は、６ヶ月及び１２ヶ月の時点で有意であった（両方ともｐ＜０.０００１）が、６ヶ月と１２ヶ月のレベル間に有意差はなかった（ｐ＝０.０９）。ほとんどの患者は、６ヶ月の時点でＥＲＢＢ２に対して高い反応を有しており、患者がこの期間にＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法を受けていたという事実と一致する。患者ＢＣ−１６６（図２、薄緑色の円）は、オフサイト医療センターで治療を受けたので、６ヶ月及び１２ヶ月の採血は行われなかった。６人の患者（図２、破線）は、１２ヶ月の来院に先立ってＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法を中止した。対象ＢＣ−０２１は、ＥＲＢＢ２に対して非常に低い抗体応答を有しており、療法を中止する前に、２回の治療のみを受けたことと一致する。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法を中止した他の５人の患者については、１２ヶ月の時点で採取された血液の抗ＥＲＢＢ２抗体応答は、患者の最後のＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）注入からの月数に反比例した。患者ＢＣ−０８２は、６ヶ月の時点での来院後にＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）の使用を中止し、１２ヶ月の時点での来院までに、ＭＦＩ値はベースラインに戻った。患者ＢＣ−１４９、ＢＣ−０１３及びＢＣ−８４は、４ヶ月間、治療から外され、それぞれ１１０ ＭＦＩ、２４４  ＭＦＩ及び９９４ ＭＦＩのレベルを有していた。患者ＢＣ−０１６は、最後のＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）注入後３ヶ月の時点で最後の採血を行い、彼女の応答レベルは４１８ ＭＦＩであった。ＢＣ−０１３は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）での治療前にＥＲＢＢ２に対する強い内因性の自己抗体応答を有しており、ベースラインの時点で高いシグナルを生じた（図２）。残りの１０人の患者（ＢＣ−０１８、ＢＣ−０１９、ＢＣ−０３３、ＢＣ−０３８、ＢＣ−０５１、ＢＣ−０５４、ＢＣ−１３０、ＢＣ−１５８、ＢＣ−１８８及びＢＣ−１８９）には、長期的な血液採取中にＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を投与し続け、ＥＲＢＢ２抗原に対する抗ＥＲＢＢ２抗体応答は、６ヶ月と１２ヶ月の訪問の間で定常状態に達した（図２）。
【００５９】
考察
この研究は、術後、ＢＣａ患者で生じる自己抗体応答の長期的な変化に対して重要なデータを提供する。発明者らは、独自のマルチプレックスビーズアッセイと同時に、多くのＴＡＡを評価することができた。加えて、病理及び治療情報の豊富なデータにより、本研究の知見を、各患者に投与される治療レジメンと関連付けることができる。発明者らの結果は、選択された９種類の抗原の組み合わせが、転移性疾患の早期発見に向けた自己抗体アッセイの開発に有望であることを示している。
【００６０】
本研究において採取した長期的な血液の分析から収集されたデータは、原発腫瘍を外科的に切除し、治療を開始した後に、ＴＡＡに対する自己抗体応答が時間の関数として減少することを示している（図１）。大きな腫瘍塊がないことは、おそらく、ＴＡＡに対する自己抗体生成の低減を説明する。癌細胞の大部分が除去されると、免疫系が曝露される癌抗原はより少なくなる。癌抗原への継続的な暴露がないために、免疫系は、自己抗体生成のレベルを低減させる。驚くべきことに、発明者らはまた、原発腫瘍の除去後に投与される治療がこれらの患者の自己抗体プロファイルに大きな影響を与えることを見出した。抗体応答における有意な変化は、６ヶ月の時点で検出することができ（表２）、術後１２ヶ月の時点でより広範な減少を検出することができる（表３）。これらの試料に見られる変化は、その患者に投与される療法に起因するが、これらの療法は、ＢＣａの各サブタイプの特徴の関数であることが認められている。
【００６１】
そのため、自己抗体応答レベルの最大減少を示した治療モダリティー群は、放射線療法＋ホルモン療法；放射線療法＋化学療法；及び放射線療法＋ホルモン療法＋化学療法であった（図１）。自己抗体応答レベルの有意な変化について、３つの最も影響を受けた群の共通因子は、放射線治療である。しかしながら、放射線治療のみでは、自己抗体の応答レベルを有意に減少させるのに十分ではない。全ての療法（手術、ホルモン療法、化学療法及び放射線療法）との組み合わせで治療した患者では、８つの個別の抗原について自己抗体応答レベルが有意に減少した（図１）。最後に、ホルモン療法＋化学療法レジメンは、ＧＲＰ７８抗原に対する自己抗体応答の有意な変化を含んでいた。患者のこの群は放射線療法を受けず、ＧＲＰ７８に対する自己抗体応答は、減少ではなく、応答が手術後１２ヶ月の時点で劇的に増加した（図１）ので、独自であった。
【００６２】
データの初回分析により、患者の群がＥＲＢＢ２抗原に対して高い応答を有していたことを明らかにした（図２）。さらなる評価の際に、発明者らは、患者から摘出した腫瘍ではＨＥＲ２が増幅されていたことを決定し、患者をＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法の候補とした。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗体は、天然のＥＲＢＢ２ポケット状結合領域を認識し、結合する（３３、３４）。発明者らの立体構造担持抗原の作製法を用いて、天然ＥＲＢＢ２タンパク質の立体構造を模倣するＥＲＢＢ２−ｒＦＣ融合タンパク質を生成した（１３）。発明者らのアッセイは、患者の末梢循環中に存在し、ビーズに結合したＥＲＢＢ２抗原に対するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）治療抗体の応答を測定していた（図２）。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法は、一般的に、注入によって３週間ごとに１年間投与される（２７）ので、この応答は、発明者らのマルチプレックスビーズアッセイの「インビボヒトスパイク対照」として役立った。患者の循環中に存在するＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗体は、患者のＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）治療のタイミングに応じて、ＥＲＢＢ２−ｒＦＣ融合タンパク質に対する高レベルの応答をもたらした。これまでに、第ＩＩ相試験において、３週間毎に投与した場合、トラスツズマブの半減期が１８〜２７日であると決定された（３５）。この時間の長さは、ＨＥＲ２増幅腫瘍を有する患者について、トラスツズマブ治療の間及び終了時に測定された抗ＥＲＢＢ２抗体応答のレベルと一致している。トラスツズマブ治療を終えた後３ヶ月及び４ヶ月の時点で最後の採血を行った患者については、ＥＲＢＢ２に対する抗体応答が劇的に減少した。１人の患者は、最後のトラスツズマブ注入後６ヶ月の時点で採血を行い、彼女の応答は治療前のレベルに戻っていた（図２）。
【００６３】
自己抗体応答が、治療の過程で有意に低下した、図２に報告する９種類の抗原（Ａ１ＡＴ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＡＰＣ、ＣＳＴ２、ＤＫＫ１、ＧＦＲＡ１、ＧＲＮ、ＬＧＡＬＳ３及びＬＲＰ１０）のうち４つ：ＡＮＧＰＴＬ４、ＤＫＫ１、ＧＦＲＡ１及びＧＲＮは、ＢＣａの存在を予測することが以前に判明した７種類の抗原の群にも存在していた（１３）。
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１０． Ｌａｃｏｍｂｅ  Ｊ，  Ｍａｎｇｅ  Ａ，  Ｓｏｌａｓｓｏｌ  Ｊ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２０１４；２０１４：５７４９８１．
１１． Ｈｅｎｒｙ  ＮＬ，  Ｈａｙｅｓ  ＤＦ，  Ｒａｍｓｅｙ  ＳＤ，  Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ  ＧＮ，  Ｂａｒｌｏｗ  ＷＥ，  Ｇｒａｌｏｗ  ＪＲ．  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃａｒｅ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．  ２０１４；１０６：ｄｊｕ０３４．
１２． Ｅｇｌａｎｄ  ＫＡ，  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＪＪ，  Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ，  Ｌｅｅ  Ｂ，  Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ＢＡＳＥ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｎｒｉｃｈ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００３；１００：１０９９−１０４．
１３． Ｅｖａｎｓ  ＲＬ，  Ｐｏｔｔａｌａ  ＪＶ，  Ｅｇｌａｎｄ  ＫＡ．  Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  Ｐａｎｅｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  ２０１４．
１４． Ｃａｒｓｏｎ  ＲＴ，  Ｖｉｇｎａｌｉ  ＤＡ．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  １５  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １９９９；２２７：４１−５２．
１５． Ｅｇｌａｎｄ  ＫＡ，  Ｌｉｕ  ＸＦ，  Ｓｑｕｉｒｅｓ  Ｓ，  Ｎａｇａｔａ  Ｓ，  Ｍａｎ  ＹＧ，  Ｂｅｒａ  ＴＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｍａｎｙ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００６；１０３：５９２９−３４．
１６． Ｆｏｓｓａ  Ａ，  Ａｌｓｏｅ  Ｌ，  Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｒ，  Ｆｕｎｄｅｒｕｄ  Ｓ，  Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ  Ｇ，  Ｓｍｅｌａｎｄ  ＥＢ．  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｐｈａｇｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ：  ＣＩＩ．  ２００４；５３：４３１−８．
１７． Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗ  Ｍ，  Ｃｕｃｈａｃｏｖｉｃｈ  Ｍ，  Ｌｌａｎｏｓ  Ｃ，  Ｕｒｚｕａ  Ｃ，  Ｇａｗｄｉ  Ｇ，  Ｐｉｚｚｏ  ＳＶ．  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｅｒｕｍ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００６；６６：１１４２４−３１．
１８． Ｌｉｕ  Ｗ，  Ｄｅ  Ｌａ  Ｔｏｒｒｅ  ＩＧ，  Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｒｉｖｅｒａ  ＭＣ，  Ｗａｎｇ  Ｂ，  Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｄａｉ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  （ＴＡＡｓ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ２０１５；３６：１３０７−１２．
１９． Ｌｏｐｅｚ−Ａｒｉａｓ  Ｅ，  Ａｇｕｉｌａｒ−Ｌｅｍａｒｒｏｙ  Ａ，  Ｆｅｌｉｐｅ  Ｊａｖｅ−Ｓｕａｒｅｚ  Ｌ，  Ｍｏｒｇａｎ−Ｖｉｌｌｅｌａ  Ｇ，  Ｍａｒｉｓｃａｌ−Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｉ，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｐｈａ  １−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  ２０１２；３３：２１３０−７．
２０． Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  ＤＪ，  ＤｉＪｏｈｎｓｏｎ  ＤＡ，  Ｃａｉａｚｚｏ  ＲＪ，  Ｊｒ．，  Ｎｅｌｓｏｎ  ＪＣ，  Ｕｒｅ  Ｄ，  Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ＭＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｒｏｍ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｃｌｉｎｉｃａ  ｃｈｉｍｉｃａ  ａｃｔａ；  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２０１２；４１３：５６１−７．
２１． Ｘｉｅ  Ｃ，  Ｋｉｍ  ＨＪ，  Ｈａｗ  ＪＧ，  Ｋａｌｂａｓｉ  Ａ，  Ｇａｒｄｎｅｒ  ＢＫ，  Ｌｉ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｌｕｓ  ＰＳＡ  ｈａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎ−ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃａｓｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０１１；９：４３．
２２． Ｘｕ  Ｙ，  Ｊｉｎ  Ｙ，  Ｌｉｕ  Ｌ，  Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｃｈｅｎ  Ｙ，  Ｗｅｉ  Ｊ．  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ＢＩＲＣ５  ａｎｄ  ＭＹＣ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  ＦＥＢＳ  ｏｐｅｎ  ｂｉｏ．  ２０１５；５：１９８−２０１．
２３． Ｙａｎｇ  Ｚ，  Ｃｈｅｖｏｌｏｔ  Ｙ，  Ｇｅｈｉｎ  Ｔ，  Ｓｏｌａｓｓｏｌ  Ｊ，  Ｍａｎｇｅ  Ａ，  Ｓｏｕｔｅｙｒａｎｄ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｅｒａ．  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ．  ２０１３；４０：３８５−９２．
２４． Ｙｅ  Ｈ，  Ｓｕｎ  Ｃ，  Ｒｅｎ  Ｐ，  Ｄａｉ  Ｌ，  Ｐｅｎｇ  Ｂ，  Ｗａｎｇ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｎｉ−ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  （ＴＡＡｓ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ．  ２０１３；５：６６３−８．
２５． Ｚｈｏｕ  ＳＬ，  Ｙｕｅ  ＷＢ，  Ｆａｎ  ＺＭ，  Ｄｕ  Ｆ，  Ｌｉｕ  ＢＣ，  Ｌｉ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  Ｐ５３，  ＩＭＰ１，  Ｐ１６，  ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１，  Ｐ６２，  Ｃ−ｍｙｃ，  Ｓｕｒｖｉｖｎ，  ａｎｄ  Ｋｏｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ／  ＩＳＤＥ．  ２０１４；２７：７９０−７．
２６． Ｚｕｏ  Ｘ，  Ｃｈｅｎ  Ｌ，  Ｌｉｕ  Ｌ，  Ｚｈａｎｇ  Ｚ，  Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｙｕ  Ｑ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ  （ＬＧＡＬＳ３，  ＰＨＢ２，  ＭＵＣ１，  ａｎｄ  ＧＫ２）  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＡ１５−３  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ２０１５．
２７． ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(R)  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．  ２０１５．
２８． Ｈｅｏ  ＣＫ，  Ｂａｈｋ  ＹＹ，  Ｃｈｏ  ＥＷ．  Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．  ＢＭＢ  ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１２；４５：６７７−８５．
２９． Ｌｉｕ  Ｗ，  Ｐｅｎｇ  Ｂ，  Ｌｕ  Ｙ，  Ｘｕ  Ｗ，  Ｑｉａｎ  Ｗ，  Ｚｈａｎｇ  ＪＹ．  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ．  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｒｅｖ．  ２０１１；１０：３３１−５．
３０． Ｚｈｕ  Ｑ，  Ｌｉｕ  Ｍ，  Ｄａｉ  Ｌ，  Ｙｉｎｇ  Ｘ，  Ｙｅ  Ｈ，  Ｚｈｏｕ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  （ＴＡＡｓ）  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ．  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｒｅｖ．  ２０１３；１２：１１２３−８．
３１． Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ  Ｆ，  Ｍａｒｏｕｎ  ＭＣ．  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２０１４；６４：２２１−４０．
３２． Ｌｕ  Ｈ，  Ｇｏｏｄｅｌｌ  Ｖ，  Ｄｉｓｉｓ  ＭＬ．  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００８；７：１３８８−９４．
３３． Ｃｈｏ  ＨＳ，  Ｍａｓｏｎ  Ｋ，  Ｒａｍｙａｒ  ＫＸ，  Ｓｔａｎｌｅｙ  ＡＭ，  Ｇａｂｅｌｌｉ  ＳＢ，  Ｄｅｎｎｅｙ  ＤＷ，  Ｊｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｆａｂ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００３；４２１：７５６−６０．
３４． Ｇａｒｒｅｔｔ  ＪＴ，  Ｒａｗａｌｅ  Ｓ，  Ａｌｌｅｎ  ＳＤ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｇ，  Ｆｏｒｎｉ  Ｇ，  Ｍｏｒｒｉｓ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｖｅｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７；１７８：７１２０−３１．
３５． Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ  Ｂ，  Ｇｅｌｍｏｎ  Ｋ，  Ａｙｏｕｂ  ＪＰ，  Ａｒｎｏｌｄ  Ａ，  Ｖｅｒｍａ  Ｓ，  Ｄｉａｓ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，  ｓａｆｅｔｙ，  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｅｖｅｒｙ  ｔｈｒｅｅ  ｗｅｅｋｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００３；２１：３９６５−７１．
【図１】
2019505763.tif 000005
【図２】
2019505763.tif 000006
【図３】
2019505763.tif 000007
【配列表】
2019505763000001.app
【国際調査報告】
2019505763.tif 000008
2019505763.tif 000009
2019505763.tif 000010
2019505763.tif 000011
2019505763.tif 000012