【手続補正書】
【提出日】平成19年4月19日(2007.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期ｐＨで、少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも３種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも３種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項２】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期ｐＨで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項３】
荷電分子がタンパク質である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
溶媒が水である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
バッファー成分が、重複するｐＫａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持される請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有している請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミンおよびビス−トリスプロパンを含んでいる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
初期ｐＨと初期ｐＨとは異なるｐＨの間の差が、約１単位から約１２単位までである請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
外部で定めた傾きが、ほぼ直線勾配または非直線勾配である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
初期ｐＨが、初期ｐＨとは異なるｐＨより高い請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
初期ｐＨが、初期ｐＨとは異なるｐＨより低い請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
荷電分子を加えるところから分離した荷電分子を収集するところまで吸着剤に沿って上昇する温度勾配が存在するように吸着剤を加熱することをさらに含む請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
荷電分子を加えるところから分離した荷電分子を収集するところまで吸着剤に沿って下降する温度勾配が存在するように吸着剤を冷却することをさらに含む請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法であって、
イオン交換吸着剤に、前記荷電分子を温度Ｔ０で加えるステップと、
前記イオン交換吸着剤に、初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップであって、ここでイオン交換吸着剤は荷電分子と反対の電荷をもつ、ステップと、
イオン交換吸着剤の温度をＴ１に変化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップであって、Ｔ０とＴ１の間の差が０℃と８０℃の間であるステップと
を含む方法。
【請求項２１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する方法であって、
イオン交換吸着剤に、温度Ｔ０において、初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒を含浸させるステップであって、ここでイオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、ステップと、
イオン交換吸着剤の温度をＴ１に変化させるステップと、
分離すべき荷電分子をイオン交換吸着剤に加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出されるバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨの前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれがイオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップであって、Ｔ０とＴ１の間の差が０℃と８０℃の間であるステップと
を含む方法。
【請求項２２】
異なる等電点を有する荷電分子をイオン交換樹脂でクロマトグラフィーにより分離するためのバッファー組成物であって、予め定めたｐＨの前記組成物が別の予め定めたｐＨの前記組成物により滴定するとき、その２つの組成物の混合物のｐＨの変化が、その２つの組成物のそれぞれによって表される混合物の画分に直線的に正比例するような少なくとも３つのバッファー組成物の水溶液を含む組成物。
【請求項２３】
予め定めたｐＨと別の予め定めたｐＨの間の差が、１から１０のｐＨ単位である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ｐＨをイオン交換カラムの出口で測定する請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有している請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
各バッファー成分が０．００１ｍＭから１０００ｍＭの濃度で存在する請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミンおよびビス−トリスプロパンを含んでいる請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムであって、
初期ｐＨの少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期ｐＨの前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
前記第１および第２の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で定めたｐＨ勾配を吸着剤に形成させ、カラム内に保持されていないｐＨ勾配を出現させる手段と
を備えたシステム。
【請求項２９】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が、直線状である請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が、非直線状である請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
カラム内の非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
陰イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ最高の初期ｐＨで、少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも３種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも３種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
陽イオン交換吸着剤が荷電分子と反対の電荷をもつ初期ｐＨで、バッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨとは異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される、時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合割合を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項３４】
バッファー成分が、重複するｐＫａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
荷電分子を分離するためのクロマトグラフシステムであって、
初期ｐＨの少なくとも３種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記少なくとも３種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
前記第１および第２の溶液の外部で作製した混合物を送り込んで外部で定めた初期ｐＨから最終ｐＨまでのｐＨ勾配を形成させ、カラム内に保持されていないｐＨ勾配を出現させる手段と
を備えたシステム。
【請求項３７】
クロマトグラフシステムによって発生する前もってプログラムされた時間依存性ｐＨ勾配におけるｐＨ偏差を自動的に補正するためのフィードバック制御システムであって、
測定ｐＨの既知関数である出力電圧を生ずるｐＨ測定装置と、
フィードバック制御装置であって、
適切に短時間の間隔の入力として、クロマトグラフシステムによって発生する溶離液のｐＨを監視するｐＨ測定装置から電圧を受け取り、その電圧を、前もってプログラムされた時間依存性ｐＨ勾配の予想されるｐＨ値に対応するセットポイント電圧と比較し、
その絶対値が誤差と見なされる入力電圧（すなわち測定ｐＨ）とセットポイント電圧（すなわち予想ｐＨ）の間の差を計算し、かつ
クロマトグラフシステムの勾配を発生させるポンプのポンピング速度を、誤差の絶対値が最小となるように、適宜電流または電圧いずれかとしての訂正信号を計算するための任意の既知のフィードバックアルゴリズムを使用して調節する
制御装置と
を備えたシステム。
【請求項３８】
荷電分子を分離するためおよびカラム内に調節された保持されていないｐＨ勾配を出現させるためのクロマトグラフシステムであって、
初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期ｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
第１および第２の溶液を混合するための第１の貯蔵器ポンプおよび第２の貯蔵器ポンプであって、前記第１の貯蔵器ポンプおよび前記第２の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配を形成するべく調節される、ポンプと、
ｐＨ測定装置がｐＨフローセルである、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配の形成を監視および補正する請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムと
を備えたシステム。
【請求項３９】
カラム内の調節された保持されていないｐＨ勾配が、直線状である請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
カラム内の調節された保持されていないｐＨ勾配が、非直線状である請求項３８に記載のシステム。
【請求項４１】
カラム内の調節された非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
ｐＨフローセルが、第１および第２溶液が混合される場所から下流に位置する請求項３８に記載のシステム。
【請求項４３】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨに依存する電圧信号が発生し、第１の貯蔵器および第２の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムによって、外部から定め調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように変動することを可能にするｐＨフローセルを通ってミキサーから溶離液を流すステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項４４】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される初期ｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からミキサー中にポンプで送出される異なるｐＨのさらなるバッファー成分があるかまたはない前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨに依存する電圧信号が発生し、第１の貯蔵器および第２の貯蔵器からポンプで送出される溶液の比率が、請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムによって、外部から定め調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように変動することを可能にするｐＨフローセルを通ってミキサーから溶離液を流すステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項４５】
少なくとも１種のバッファー成分が、少なくとも２つの成分であるとき、該複数成分が、重複するｐＫａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１種のバッファー成分が、少なくとも２つの成分であるとき、成分の１つが強酸であるかまたは強塩基であり、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
荷電分子を分離するためおよびカラム内に調節された保持されていないｐＨ勾配を生じさせるためのクロマトグラフシステムであって、
初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸したイオン交換吸着剤を含有するカラムであって、ここで前記イオン交換吸着剤は、分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ、カラムと、
初期ｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第１の溶液を含有する第１の貯蔵器と、
初期ｐＨとは異なるｐＨの前記少なくとも１種のバッファー成分を含む第２の溶液を含有する第２の貯蔵器と、
第１および第２の溶液を前記第１の溶液の所定の容量を含有する混合チャンバー中にポンピングするための第１の貯蔵器ポンプおよび第２の貯蔵器ポンプであって、前記第１の貯蔵器ポンプおよび前記第２の貯蔵器ポンプのポンピング速度は、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配を形成するべく調節される、ポンプと、
ｐＨ測定装置が混合チャンバー中に浸されたｐＨ電極である、制御された流速で外部で定めた溶離液ｐＨ勾配の形成を監視および補正する請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムと、
当該混合溶液を混合チャンバーから制御された流速でポンピングするための手段と
を備えたシステム。
【請求項４８】
カラム内の調節された保持されていないｐＨ勾配が、直線状である請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
カラム内の調節された保持されていないｐＨ勾配が、非直線状である請求項４７に記載のシステム。
【請求項５０】
カラム内の調節された非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離するクロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるｐＨの前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨ依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したｐＨ電極を用いて溶離液のｐＨを測定するステップと、
第１の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第２の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から定め調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように、ｐＨ電極からの電圧信号および請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を混合チャンバーから陰イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陰イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５２】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する逆クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を加えるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器から混合チャンバー中にポンプで送出される異なるｐＨの前記の少なくとも１種のバッファー成分を含有する溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップと、
ｐＨ依存性の電圧信号を発生する混合チャンバー中に浸したｐＨ電極を用いて溶離液のｐＨを測定するステップと、
第１の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度および第２の貯蔵器から送られる溶液のポンピング速度を、外部から定め調節する勾配により保持されていないｐＨ勾配が維持されるように、ｐＨ電極からの電圧信号および請求項３７に記載のフィードバックコントロールシステムを利用することによって補正するステップと、
溶離液を陽イオン交換吸着剤を含有するカラムを通して供給するステップと、
それぞれが陽イオン交換吸着剤からその実効等電点において別々に溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５３】
少なくとも１種のバッファー成分が、少なくとも２つの成分であるとき、該複数成分が、重複するｐＫａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項４３、４４、５１または５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも１種のバッファー成分が、少なくとも２つの成分であるとき、成分の１つが強酸であるかまたは強塩基であり、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項４３、４４、５１または５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨで、少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最高の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５６】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨの少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、両方の交換体を最低の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液がさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導き、かつ
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５７】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、後に陽イオン交換吸着剤が直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで陽イオン交換吸着剤または陰イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陰イオン交換吸着剤と陽イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５８】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、後に陰イオン交換吸着剤が直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこでそれぞれの分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
それぞれが最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項５９】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が直線状である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が非直線状である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
カラム内の非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
荷電分子がタンパク質である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
溶媒が水である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
バッファー成分が、重複するｐＫａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有している請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
各バッファー成分が０．００１ｍＭから１０００ｍＭの濃度で存在する請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
陰イオン交換吸着剤を、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
陽イオン交換吸着剤を、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
初期ｐＨと初期ｐＨとは異なるｐＨの間の差が、＞０単位から約１２単位までである請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
分離すべき分子を加えるところから分離した分子を収集するところまで１または複数の吸着剤に沿って上昇する温度勾配が存在するように第１の吸着剤または第２の吸着剤または両方の吸着剤を加熱することをさらに含む請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
分離すべき分子を加えるところから分離した分子を収集するところまで１または複数の吸着剤に沿って降下する温度勾配が存在するように第１の吸着剤または第２の吸着剤または両方の吸着剤を冷却するステップをさらに含む請求項５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換吸着剤の温度をＴ１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ０の溶媒中で測定した最高の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ０で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ０で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ１における所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項７８】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換吸着剤の温度をＴ１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ０の溶媒中で測定した最低の初期ｐＨで平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ０で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ０で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ１における所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ１で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項７９】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をＴ１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ１で変化させた最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
温度Ｔ１の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ１の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ１で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ１で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導き、かつ
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ１で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ１における所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８０】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、温度をＴ１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ１で変化させた最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
温度Ｔ１の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ１の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ１で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ１で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ１で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ１における所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ１で所定の最小ｐＨに達するまで陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最高の初期ｐＨおよび温度Ｔ０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を陰イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陽イオン交換体の温度をＴ１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ０で測定した最高の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ０で所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ１でさらに分離されるように陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ０で所定の最小ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ１における所定の最小ｐＨから所定の最高の初期ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ１で所定の最高の初期ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陽イオン交換樹脂の温度をＴ２に変化させるステップと、
温度Ｔ２における所定の最高の初期ｐＨから所定の２番目の最大ｐＨまで時を合わせて増大するｐＨ勾配を有する陽イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から、温度Ｔ２において前記所定の２番目の最大ｐＨに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるｐＨ勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Ｔｆに達するまで陽イオン交換吸着剤から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から２番目の最大ｐＨから所定の究極の最大ｐＨまで時を合わせて増大するｐＨ勾配を有する陽イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Ｔｆで究極の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８２】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
最低の初期ｐＨおよび温度Ｔ０における少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を陽イオン交換吸着剤の後に直列に接続し、陰イオン交換体の温度をＴ１に変化させ、両方の交換体を温度Ｔ０で測定した最低の初期ｐＨにおいて平衡化させるステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に温度Ｔ０で供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ０で所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、温度Ｔ１でさらに分離されるように陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を陰イオン交換吸着剤に温度Ｔ０で所定の最大ｐＨに達するまで結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ１における所定の最大ｐＨから所定の最低の初期ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に温度Ｔ１で所定の最低の初期ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
陰イオン交換樹脂の温度をＴ２に変化させるステップと、
温度Ｔ２における所定の最低の初期ｐＨから所定の２番目の最小ｐＨまで時を合わせて減少するｐＨ勾配を有する陰イオン交換吸着剤を含浸させ続けるステップと、
それぞれがその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から、温度Ｔ２において前記所定の２番目の最小ｐＨに達するまで別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
増大しつつあるｐＨ勾配を使用する溶離が後に続く段階的な温度の変化を繰り返し、それぞれが最終温度Ｔｆに達するまで陰イオン交換体から時を合わせて別々に溶離する荷電分子を収集するステップと、
所定の最後から２番目の最小ｐＨから所定の究極の最小ｐＨまで時を合わせて減少するｐＨ勾配を有する陰イオン交換吸着剤の含浸を継続するステップと、
それぞれが別々に最終温度Ｔｆで究極の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８３】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、温度Ｔ０の陰イオン交換吸着剤に、続いて温度Ｔ１で直列に接続されている陽イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの温度Ｔ０で測定される初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの少なくとも１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を温度Ｔ０で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を温度Ｔ１で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで温度Ｔ０で陰イオン交換吸着剤または温度Ｔ１で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ０で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ０で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ０で最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ１で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ１で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ１で最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８４】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
分離すべき荷電分子を、温度Ｔ０の陽イオン交換吸着剤に、続いて温度Ｔ１で直列に接続されている陰イオン交換吸着剤に適用し、その結果、その２つの吸着剤が、少なくとも１つの温度Ｔ０で測定される初期ｐＨのバッファー成分を含む溶媒により含浸され、そこで分離すべき荷電分子が、３つの荷電の種類、すなわち、初期ｐＨより低い見掛けのｐＩを有する荷電分子は負に帯電したもの、初期ｐＨで陰イオン交換吸着剤または陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子は中性のもの、初期ｐＨより高い見掛けのｐＩを有する荷電分子は正に帯電したものの１つに分類されるステップと、
初期ｐＨで正に帯電した荷電分子を温度Ｔ０で陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで負に帯電した荷電分子を温度Ｔ１で陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
初期ｐＨで温度Ｔ０で陰イオン交換吸着剤または温度Ｔ１で陽イオン交換吸着剤のいずれにも結合できない荷電分子のものを収集するステップと、
陽イオン交換吸着剤と陰イオン交換吸着剤との初期ｐＨにおける接続を互いから切り離すステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ０で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に増加するｐＨを有する溶離液を、前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ０で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ０で最終の最大ｐＨに達するまでその実効等電点において陽イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと、
第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される、温度Ｔ１で測定して初期ｐＨに始まる時間依存的に減少するｐＨを有する溶離液を、前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで温度Ｔ１で維持するために変動させるステップと、
それぞれが温度Ｔ１で最終の最小ｐＨに達するまでその実効等電点において陰イオン交換吸着剤から溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項８５】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が直線状である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
カラム内の保持されていないｐＨ勾配が非直線状である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
カラム内の非直線状のｐＨ勾配が、凹形、凸形または階段状である請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
荷電分子がタンパク質である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
溶媒が水である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
バッファー成分が、重複するｐＫａを有しており、各成分のモル比率が初期ｐＨと最終ｐＨの間の変遷を通して一定に維持されるかまたは変動する請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
各バッファー成分が、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボキシル、スルホン、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を含有している請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
各バッファー成分が０．００１ｍＭから１０００ｍＭの濃度で存在する請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
バッファー成分が、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含んでいる請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
陰イオン交換吸着剤を、強陰イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
陰イオン交換吸着剤が、強陰イオン交換樹脂である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
陽イオン交換吸着剤を、強陽イオン交換樹脂および弱陽イオン交換樹脂からなる群から選択する請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
陽イオン交換吸着剤が、強陽イオン交換樹脂である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
初期ｐＨと初期ｐＨとは異なるｐＨの間の差が、＞０単位から約１２単位までである請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
温度勾配の範囲が、０℃と８０℃の間である請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
温度Ｔ０で測定した最高の初期ｐＨにおける少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陰イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陰イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陰イオン交換吸着剤を、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度である温度Ｔ１から前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である温度Ｔ２までの温度勾配の下におくステップと、
陰イオン交換吸着剤の後に、陰イオン交換吸着剤からの溶出液が陽イオン交換体に入るときの陽イオン交換吸着剤の温度である温度Ｔ３から前記溶出液が陽イオン交換体を出るときの温度である温度Ｔ４までの温度勾配の下におく陽イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度Ｔ０で測定した最高の初期ｐＨにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度Ｔ０の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ０の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、温度Ｔ１から温度Ｔ２の勾配にかけた前記陰イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ０で測定した所定の最小ｐＨに達するまでその実効等電点で陰イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陰イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤中に導くステップと、
正帯電している荷電分子を、温度Ｔ０で測定した所定の最小ｐＨに達するまで温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陰イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤を温度Ｔ０で測定した所定の最小ｐＨから所定の最大ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度Ｔ０で測定して所定の最大ｐＨに達するまで、その実効等電点において温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配の下においた陽イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項１０１】
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーにより分離する複合外部勾配クロマトフォーカシング方法であって、
温度Ｔ０で測定した最低の初期ｐＨにおける少なくとも１種のバッファー成分を含む溶媒を含浸した陽イオン交換吸着剤であって分離すべき荷電分子と反対の電荷をもつ陽イオン交換吸着剤に、分離すべき荷電分子を適用して結合させるものであって、前記陽イオン交換吸着剤を、前記溶媒が吸着剤に入るときの温度である温度Ｔ１から前記溶媒が吸着剤を出るときの温度である温度Ｔ２までの温度勾配の下におくステップと、
陽イオン交換吸着剤の後に、陽イオン交換吸着剤からの溶出液が、陰イオン交換体に入るときの陰イオン交換吸着剤の温度である温度Ｔ３から前記溶出液が陰イオン交換体を出るときの温度である温度Ｔ４までの温度勾配の下におく陰イオン交換吸着剤を直列に接続し、温度Ｔ０で測定した最低の初期ｐＨにおける両方のイオン交換体を平衡化させるステップと、
温度Ｔ０の第１の貯蔵器からポンプで送出される少なくとも１種のバッファー成分を含有する初期ｐＨの溶液を、温度Ｔ０の第２の貯蔵器からポンプで送出される前記少なくとも１種のバッファー成分を含有するｐＨの異なる溶液との連続混合で形成される時間依存性のｐＨを有する溶離液を、温度Ｔ１から温度Ｔ２の勾配にかけた前記陽イオン交換吸着剤に供給するステップであって、その混合比率を、保持されていないｐＨ勾配を外部で定めた傾きで維持するために変動させるステップと、
荷電分子の溶離であって、それぞれが、温度Ｔ０で測定した所定の最大ｐＨに達するまでその実効等電点で陽イオン交換吸着剤から別々に溶離するステップと、
荷電分子を含有する陽イオン交換吸着剤から得られた溶出液が、さらに分離されるように、温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤中に導くステップと、
負帯電している荷電分子を、温度Ｔ０で測定した所定の最大ｐＨに達するまで温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤に結合させるステップと、
陽イオン交換吸着剤を取り除くステップと、
温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤を温度Ｔ０で測定した所定の最大ｐＨから所定の最小ｐＨまで展開するように含浸させてｐＨ勾配を逆転させるステップと、
それぞれが別々に、温度Ｔ０で測定して所定の最小ｐＨに達するまで、その実効等電点において温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配の下においた陰イオン交換吸着剤から、溶離する荷電分子を収集するステップと
を含む方法。
【請求項１０２】
ｎ∈｛０，１，２，３，４｝およびｍ∈｛０，１，２，３，４｝の場合に、任意の一組の温度についての温度差の絶対値｜Ｔｎ〜Ｔｍ｜が０℃から８０℃の範囲である、請求項１００または請求項１０１に記載の方法。