(57)【要約】  本発明は、積層遠心濾過によるエクソソームの分離抽出方法を開示する。本発明は、分子生物学及び臨床検査の技術分野に用いられる。また、エクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置、インキュベーションバッファ及びプロテイナーゼＫからなるエクソソームの分離抽出用試薬キットを含む。試薬キットのインキュベーションバッファと適量のプロテイナーゼＫを用い、室温下で対象サンプルをインキュベートしてから、本発明の積層遠心濾過装置に組み合わされる遠心分離機で遠心及び均一混合し、限外濾過管内の分画液を収集することでエクソソームを取得可能である。本発明の方法では遠心分離機以外の大型実験設備を必要としないため、廉価で操作が容易であり、短時間で大量のサンプルを並行操作可能となる。また、取得される高純度のエクソソームによれば臨床での大規模応用を推進したいとのニーズに対応可能である。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置であって、
濾過管と、前記濾過管の外側に覆設される限外濾過管、及び前記限外濾過管の外側に覆設される廃液収集管を含み、前記濾過管の底部には濾過膜が設けられ、前記濾過管の内部には一次濾過管室が形成され、前記限外濾過管の底部には限外濾過膜が設けられ、前記限外濾過管の内部のうち濾過管の下方には二次濾過管室が形成され、前記廃液収集管の内部のうち前記限外濾過管の下方には廃液収集管室が形成され、前記濾過管の先端開口には一次フランジが設けられ、前記限外濾過管の先端開口には二次フランジが設けられ、前記一次フランジと前記二次フランジにはいずれも通気路が設けられ、前記廃液収集管の先端開口にはキャップが設けられ、前記キャップが嵌められると、前記一次フランジが前記二次フランジに押し付けられ、前記二次フランジが前記廃液収集管の先端開口に押し付けられ、前記一次濾過管室と前記二次濾過管室は通気路を介して外部と連通することを特徴とする積層遠心濾過装置。
【請求項２】
前記濾過膜の孔径が１μｍを超えないことを特徴とする請求項１記載のエクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置。
【請求項３】
前記限外濾過膜は、分画分子量３０〜１００ｋＤａの粒子の限外濾過膜であることを特徴とする請求項１記載のエクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置。
【請求項４】
前記限外濾過管のうち濾過管下方の左側管壁及び右側管壁はいずれも中央部に向かって傾斜する平面管壁であり、前記２つの平面管壁の間には断面Ｖ字状の二次濾過管室が形成され、少なくとも一方の前記平面管壁には限外濾過膜用窓が開設されており、限外濾過膜用窓に限外濾過膜ユニットが嵌め込まれ、前記限外濾過膜ユニットは、限外濾過膜固定プレートと限外濾過膜固定プレートの内側に貼り付けられた限外濾過膜を含み、前記限外濾過膜固定プレートの下端には複数の流出孔が設けられることを特徴とする請求項１記載のエクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の積層遠心濾過装置、インキュベーションバッファ及びプロテイナーゼＫを含むことを特徴とするエクソソームの分離抽出用試薬キット。
【請求項６】
前記インキュベーションバッファは、ＤＰＢＳ、６０〜２４０ｍＭのＴｒｉｓ、６０〜１８０ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７〜７．５であることを特徴とする請求項５記載の試薬キット。
【請求項７】
１）対象サンプルに体積の０．１〜５倍のインキュベーションバッファを加え、且つ適量のプロテイナーゼＫを加えて十分に均一混合してから、室温でインキュベートするステップと、
２）前記ステップ１）で処理したサンプルを請求項１〜４のいずれかに記載の前記積層遠心濾過装置の濾過管に移し、前記積層遠心濾過装置を遠心分離機に載置して遠心及び均一混合してから、前記限外濾過管内の分画液を収集してエクソソームを取得するステップ、を含むことを特徴とするエクソソームの分離抽出方法。
【請求項８】
前記インキュベーションバッファは、ＤＰＢＳ、６０〜２４０ｍＭのＴｒｉｓ、６０〜１８０ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７〜７．５であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ１）において、最終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ〜２．０ ｍｇ／ｍＬとなるように適量のプロテイナーゼＫを加えることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ２）において、遠心時の遠心力は５，０００×ｇを超えず、遠心時間は１０〜３０ｍｉｎであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び臨床検査分野に属し、具体的には、積層遠心濾過によるエクソソームの分離抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）とは、真核細胞の多小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ，ＭＶＢｓ）と細胞膜の融合によって細胞外環境へと放出されるナノレベルの膜小胞であり、脂質二重層構造を備え、約３０〜１５０ｎｍの大きさで体液中に広く分布している。エクソソームは様々な細胞から分泌され、各種の蛋白質、脂質、ｍＲＮＡｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ及び信号分子等の生物活性を有する物質を内包している。また、強い標的性を有し、標的細胞の細胞膜と容易に融合して生物活性物質を選択的に標的細胞に伝達する。これにより、各細胞間での情報伝達が行われ、細胞間で信号が受け渡されることで、各種の生物学的機能が発揮される。
【０００３】
現在のところエクソソームの抽出方法としては、主に、超遠心分離法、ポリマー沈殿法、磁気ビーズ法及び限外濾過法が存在する。
【０００４】
一、超遠心分離法は現在のところ最も広く用いられているエクソソームの抽出方法である（非特許文献１〜４）。これら文献では具体的な遠心速度にやや違いはあるが、大体において次の４つのステップを含む。
（１）低速遠心（約３００×ｇ）により残留細胞を除去する。
（２）高速遠心（約１６，５００×ｇ）により細胞断片を除去する。
（３）０．２２μｍの濾過膜で直径の大きな小胞を濾過する。
（４）超遠心分離（約１２０，０００×ｇ）によりエクソソームを沈殿させる。また、純度を高めるためにショ糖密度勾配遠心法を選択的に用いてもよい。
【０００５】
しかし、超遠心分離には主に以下のような欠点がある。
１）操作時間が長い。処理済みの生物体液からエクソソームを収集するまでの全プロセスに約８〜２４ｈを要する。
２）分離効率が低い。現在のところ、当該方法によるエクソソームの回収率は１０％程度にすぎないことが学界で証明されている（非特許文献５）。よって、分析に十分なだけのサンプルを得ようとすると、多くの標本量が必要となる。
３）特定の計器が必要である。抽出に用いられる超遠心分離機は一般的な実験室には備わっていない。
４）並行処理可能なサンプル数に限界がある。遠心分離機の回転子の違いにもよるが、並行操作可能なサンプル数量は一般的に６つ以下である。
【０００６】
二、ポリマー沈殿法は比較的新しいエクソソームの抽出方法である。この方法では超遠心分離法における多くの欠点が解消されているため、現在すでに科学研究分野へ幅広く応用されており（非特許文献６〜８）、関連の商品試薬も販売されている（非特許文献９，１０）。この方法では主に、サンプルとポリマー原液を一定の比率で混合し、一定時間（約３０ ｍｉｎ）インキュベートしてから低速（約１０，０００×ｇ）で遠心して沈殿物を収集する。そして、等張緩衝液を加えて沈殿を溶解させれば、エクソソームが得られる。
【０００７】
ところが、ポリマー沈殿法には主としてのような欠点がある。
１）実験コストが嵩む。例えば、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）社製のＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣといった主要な商用試薬の場合、抽出ごとに１８０人民元を超える試薬を消費することになり、大規模な臨床応用推進には適さない。
２）後続の処理が制限される。抽出プロセスで余分な成分をサンプルに添加する必要があるため、収集されるエクソソームをそのまま細胞培養や回送等に用いることはできいない。
３）大体積のサンプルには適さない。当該方法はその原理やコストの高さから、大体積のサンプル処理には適していない。
【０００８】
三、その他の主なエクソソーム抽出方法としては磁気ビーズ法がある（非特許文献１，１１）。当該方法では、特定の抗体が固定された磁気ビーズとサンプルをインキュベートし、抗原抗体反応を利用して、サンプル中の対応する膜表面抗原を有したエクソソームを結合させる。最後に磁力により磁気ビーズとエクソソームを共に吸着すれば、エクソソームの抽出が実現される。
【０００９】
しかし、磁気ビーズ法にも同様に明らかな欠点が存在する。
１）実験コストが嵩む。磁気ビーズには特殊な加工能力が必要とされるほか、抽出に必要な抗体や、抗体と磁気ビーズの結合においても更に実現コストがかかってしまう。
２）サンプルからの抽出が特定のエクソソームのサブグループに限られる。当該方法は抗原抗体反応に基づくため、サンプルからは既知の膜表面抗原を有するエクソソームのサブグループを特異的に抽出することしかできない。
３）大体積のサンプルには適さない。当該方法はその原理やコストの高さから、大体積のサンプル処理には適していない。
【００１０】
四、一部の研究では限外濾過法によりエクソソームを濃縮しているが（非特許文献１２，１３）、これらの研究で報告されている方法では更に超遠心分離によってエクソソームを沈殿させる必要がある。よって、操作プロセスが冗長となり、臨床での使用には適さない。また、血清／血漿に応用可能な限外濾過によるエクソソーム抽出方法は今のところ存在しない。
【００１１】
上述したように、現在のところ、臨床での大規模応用を推進したいとのニーズに応えられるような廉価で操作が容易であり、短時間で大量のサンプルを並行操作可能なエクソソーム抽出方法は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．，Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．， ａｎｄ Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｕｎｉｔ ３２２ （２００６）．ＰＭＩＤ：１８２２８４９０．
【非特許文献２】Ｖａｌａｄｉ，Ｈ．，Ｅｋｓｔｒｏｍ，Ｋ．，Ｂｏｓｓｉｏｓ，Ａ．， Ｓｊｏｓｔｒａｎｄ，Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｌｏｔｖａｌｌ，Ｊ．Ｏ．Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９，６５４−９（２００７）．ＰＭＩＤ：１７４８６１１３．
【非特許文献３】Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ，Ｓ．，Ｌｉｍ，Ｊ．Ｗ．，Ｔａｕｒｏ，Ｂ．Ｊ．，Ｊｉ，Ｈ．，Ｍｏｒｉｔｚ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａ３３ ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＬＩＭ１２１５ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ９，１９７−２０８（２０１０）．ＰＭＩＤ：１９８３７９８２．
【非特許文献４】Ｔａｕｒｏ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｒｅｅｎｉｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｍａｔｈｉａｓ，Ｒ．Ａ．，Ｊｉ，Ｈ．，Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ，Ｓ．，Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＬＩＭ１８６３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ５６，２９３−３０４（２０１２）．ＰＭＩＤ：２２２８５５９３．
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｄ．，Ｚａｃｈａｒｉａｓ，Ｗ．，ａｎｄ Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ａｎｄ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７２８，２３５−４６（２０１１）．ＰＭＩＤ：２１４６８９５２．
【非特許文献６】Ｃｈｕｇｈ，Ｐ．Ｅ．，Ｓｉｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｏｚｇｕｒ，Ｓ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｄ．Ｈ．，Ｍｅｎｅｚｅｓ，Ｐ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｊ．，Ｅｒｏｎ，Ｊ．Ｊ．， Ｄａｍａｎｉａ，Ｂ．，ａｎｄ Ｄｉｔｔｍｅｒ，Ｄ．Ｐ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ＫＳＨＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ９，ｅ１００３４８４（２０１３）．ＰＭＩＤ：２３８７４２０１．
【非特許文献７】Ｓｏｈｅｌ，Ｍ．Ｍ．，Ｈｏｅｌｋｅｒ，Ｍ．，Ｎｏｆｅｒｅｓｔｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｓａｌｉｌｅｗ−Ｗｏｎｄｉｍ，Ｄ．，Ｔｈｏｌｅｎ，Ｅ．，Ｌｏｏｆｔ， Ｃ．，Ｒｉｎｇｓ，Ｆ．，Ｕｄｄｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｔ．Ｅ．，Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ Ｔｅｓｆａｙｅ，Ｄ．Ｅｘｏｓｏｍａｌ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｅｘｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ Ｅｘｔｒａ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｆｌｕｉｄ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｂｏｖｉｎｅ Ｏｏｃｙｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ７８５０５ ２０１３）．ＰＭＩＤ：２４２２３８１６．
【非特許文献８】Ｒｅｋｋｅｒ，Ｋ．，Ｓａａｒｅ，Ｍ．，Ｒｏｏｓｔ，Ａ．Ｍ．， Ｋｕｂｏ，Ａ．Ｌ．，Ｚａｒｏｖｎｉ，Ｎ．，Ｃｈｉｅｓｉ，Ａ．，Ｓａｌｕｍｅｔｓ， Ａ．，ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４７，１３５−８（２０１４）．ＰＭＩＤ：２４１８３８８４．
【非特許文献９】Ａｎｔｅｓ，Ｔ．Ｊ．，Ｋｗｅｉ，Ｋ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｆ．，（ＵＳ，２０１５）．
【非特許文献１０】Ｖｌａｓｓｏｖ，Ａ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｚｅｒｉｎｇｅｒ，Ｅ．，ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，Ｒ．，（ＷＯ，２０１５）．
【非特許文献１１】Ｗｕｂｂｏｌｔｓ，Ｒ．，Ｌｅｃｋｉｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｖｅｅｎｈｕｉｚｅｎ，Ｐ．Ｔ．，Ｓｃｈｗａｒｚｍａｎｎ，Ｇ．，Ｍｏｂｉｕｓ，Ｗ．，Ｈｏｅｒｎｓｃｈｅｍｅｙｅｒ，Ｊ．，Ｓｌｏｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｇｅｕｚｅ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ，Ｗ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，１０９６３−７２（２００３）．ＰＭＩＤ：１２５１９７８９．
【非特許文献１２】Ｃｈｅｒｕｖａｎｋｙ，Ａ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｐｉｓｉｔｋｕｎ，Ｔ．，Ｋｏｐｐ，Ｊ．Ｂ．，Ｋｎｅｐｐｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｙｕｅｎ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔａｒ，Ｒ．Ａ．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎａｎｏｍｅｍｂｒａｎｅ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｒｅｎａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２９２，Ｆ１６５７−６１（２００７）．ＰＭＩＤ：１７２２９６７５．
【非特許文献１３】Ｌａｍｐａｒｓｋｉ，Ｈ．Ｇ．，Ｍｅｔｈａ−Ｄａｍａｎｉ，Ａ．，Ｙａｏ，Ｊ．Ｙ．，Ｐａｔｅｌ，Ｓ．，Ｈｓｕ，Ｄ．Ｈ．，Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．，ａｎｄ Ｌｅ Ｐｅｃｑ，Ｊ．Ｂ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｒａｄｅ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２７０，２１１−２６（２００２）．ＰＭＩＤ：１２３７９３２６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、積層遠心濾過によるエクソソームの分離抽出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、以下の技術方案を用いる。
【００１５】
エクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置であって、濾過管と、濾過管の外側に覆設される限外濾過管、及び限外濾過管の外側に覆設される廃液収集管を含み、前記濾過管の底部には濾過膜が設けられ、濾過管の内部には一次濾過管室が形成され、限外濾過管の底部には限外濾過膜が設けられ、限外濾過管の内部のうち濾過管の下方には二次濾過管室が形成され、廃液収集管の内部のうち限外濾過管の下方には廃液収集管室が形成され、前記濾過管の先端開口には一次フランジが設けられ、限外濾過管の先端開口には二次フランジが設けられ、一次フランジと二次フランジにはいずれも通気路が設けられ、廃液収集管の先端開口にはキャップが設けられ、キャップが嵌められると、一次フランジが二次フランジに押し付けられ、二次フランジが廃液収集管の先端開口に押し付けられ、一次濾過管室と二次濾過管室は通気路を介して外部と連通する。
【００１６】
好ましくは、前記濾過膜の孔径が１μｍを超えない。
【００１７】
好ましくは、前記濾過膜の孔径が０．８μｍを超えない。
【００１８】
好ましくは、限外濾過膜は分画分子量３０〜１００ｋＤａの粒子の限外濾過膜である。
【００１９】
好ましくは、限外濾過管のうち濾過管下方の左側管壁及び右側管壁はいずれも中央部に向かって傾斜する平面管壁であり、２つの平面管壁の間には断面Ｖ字状の二次濾過管室が形成され、少なくとも一方の平面管壁には限外濾過膜用窓が開設されており、限外濾過膜用窓に限外濾過膜ユニットが嵌め込まれ、前記限外濾過膜ユニットは、限外濾過膜固定プレートと限外濾過膜固定プレートの内側に貼り付けられた限外濾過膜を含み、前記限外濾過膜固定プレートの下端には複数の流出孔が設けられる。
【００２０】
好ましくは、キャップと廃液収集管の先端開口はネジ接続又は係合接続される。
【００２１】
エクソソームの分離抽出用試薬キットであって、上記いずれかに記載の積層遠心濾過装置、インキュベーションバッファ及びプロテイナーゼＫを含む。
【００２２】
好ましくは、インキュベーションバッファは、ＤＰＢＳ、６０〜２４０ｍＭのＴｒｉｓ、６０〜１８０ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７〜７．５である。
【００２３】
ＤＰＢＳ、即ちダルベッコリン酸緩衝生理食塩水は、哺乳動物の細胞活性を短期的に維持するための平衡塩溶液である。ＤＰＢＳによれば、一定時間内でｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞の構造及び生理学的完全性を維持可能となる。好ましくは、ＤＰＢＳが、ＫＣｌ ２００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２００ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．１６ｇ／Ｌを含む。
【００２４】
好ましくは、Ｔｒｉｓは固体のまま添加してもよいし、可溶性塩を用いて溶液としてから添加してもよい。
【００２５】
好ましくは、ＥＤＴＡは固体のまま添加してもよいし、可溶性塩を用いて溶液としてから添加してもよい。
【００２６】
好ましくは、インキュベーションバッファのｐＨは塩酸又はＮａＯＨを用いて調整する。
【００２７】
エクソソームの分離抽出方法であって、１）対象サンプルに体積の０．１〜５倍のインキュベーションバッファを加え、且つ適量のプロテイナーゼＫを加えて十分に均一混合してから、室温でインキュベートするステップと、２）ステップ１）で処理したサンプルを上記の積層遠心濾過装置の濾過管に移し、積層遠心濾過装置を遠心分離機に載置して遠心及び均一混合してから、限外濾過管内の分画液を収集してエクソソームを取得するステップ、を含む。
【００２８】
好ましくは、インキュベーションバッファは、ＤＰＢＳ、６０〜２４０ｍＭのＴｒｉｓ、６０〜１８０ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７〜７．５である。
【００２９】
好ましくは、インキュベーションバッファは、ＤＰＢＳ、８０〜２２０ｍＭのＴｒｉｓ、８０〜１６０ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７〜７．５である。
【００３０】
好ましくは、ステップ１）において、最終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ〜２．０ ｍｇ／ｍＬとなるように適量のプロテイナーゼＫを加える。プロテイナーゼＫ溶液の濃度は５〜４０ｍｇ／ｍＬであり、プロテイナーゼＫの添加量はサンプル体積の０．００５〜０．４倍である。
【００３１】
好ましくは、ステップ１）において、プロテイナーゼＫを加えた後に室温で８〜２０ｍｉｎインキュベートする。
【００３２】
好ましくは、ＤＰＢＳが、ＫＣｌ ２００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２００ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．１６ｇ／Ｌを含む。
【００３３】
好ましくは、ステップ２）において、遠心時の遠心力は５，０００×ｇを超えず、遠心時間は１０〜３０ｍｉｎである。
【００３４】
好ましくは、エクソソームの純度を高めたい場合には、ステップ２）の遠心後に濾過管へ適量のＤＢＰＳを加えて再び遠心し、均一に混合する。そして、限外濾過管内の分画液を収集すればエクソソームが得られる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、以下の有益な効果が得られる。
【００３６】
本発明の方法を超遠心分離法と比較すると、
ａ）本発明の方法では超遠心分離法と同等純度のエクソソームを取得可能である。
ｂ）本発明の方法によれば全ての操作を３０ｍｉｎ以内で完了させられるため、操作時間が大幅に短縮される。
ｃ）全プロセスを通じて室温で操作可能なため、操作が容易となる。
ｄ）本発明の方法は、卓上の小型遠心分離機を備える実験室であれば遂行可能であり、基本的にはその他の実験設備を必要としない。
ｅ）遠心分離機のタイプにもよるが、本発明では複数のサンプルを同時に処理可能であり、実験室において一般的な小型の卓上遠心分離機に具備される回転子によって２４ものサンプル抽出を同時に完了させられる。
【００３７】
ポリマー沈殿法と比較すると、
ａ）本発明の方法ではポリマー沈殿法と同等純度のエクソソームを取得可能である。
ｂ）本発明の方法によれば、消耗品コストをより削減可能となる。
ｃ）取得されるエクソソーム産物については、基本的にそれ以上の処理を加えなくとも細胞培養や回送等の用途に利用可能である。
【００３８】
磁気ビーズ法と比較すると、
ａ）本発明は消耗品コストをより削減可能である。
ｂ）本発明によれば、特定の膜表面抗原に依存することなくサンプル中のエクソソームにおける全てのサブグループを抽出可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の積層遠心濾過装置である。
【図２】図２は、エクソソームの純度測定結果である。
【図３】図３は、エクソソームの純度測定結果である。
【図４】図４は、エクソソームの電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の試薬は次のように配合した。
ＤＰＢＳ：ＫＣｌ ２００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２００ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．１６ｇ／Ｌ
インキュベーションバッファ：ＤＰＢＳ＋６０〜２４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ＋６０〜１８０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．２
プロテイナーゼＫストック溶液：５〜４０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ水溶液
【００４１】
実施例で使用する試薬は、いずれもこの割合で調合した。
【００４２】
本発明の方法は、以下のステップを含む。
１）対象サンプルに体積の０．１〜５倍のインキュベーションバッファを加え、且つ体積の０．００５〜０．４倍のプロテイナーゼＫストック溶液を加えて、十分に均一混合してから、室温で８〜１５ｍｉｎインキュベートする。
２）ステップ１）で処理したサンプルを積層遠心濾過装置の濾過管に移し、遠心、均一混合してから限外濾過管内の分画液を収集する。
【００４３】
好ましくは、エクソソームの純度を高めたい場合、可溶性蛋白質を除去するために限外濾過管にＤＢＰＳを加えて３，０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心し、濾液を捨ててからもう一度これを繰り返せばよい。
【００４４】
好ましくは、均一混合して収集した分画液が後続処理可能なエクソソーム溶液である。
【００４５】
以下に、具体的実施例を組み合わせて本発明につき更に説明するが、これに限定するとの意図ではない。
【００４６】
実施例１  エクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置
本発明は、濾過管１、濾過管１の外側に覆設される限外濾過管２、及び限外濾過管２の外側に覆設される廃液収集管３を含むエクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置を提供する（図１参照）。前記濾過管１の底部には濾過膜１１が設けられており、濾過管１の内部には一次濾過管室１２が形成されている。限外濾過管２の底部には限外濾過膜２１が設けられており、限外濾過管２内部のうち濾過管１の下方には二次濾過管室２２が形成されている。また、廃液収集管３内部のうち限外濾過管２の下方には廃液収集管室３１が形成されている。前記濾過管１の先端開口には一次フランジ１３が、限外濾過管２の先端開口には二次フランジ２３が設けられており、一次フランジ１３と二次フランジ２３にはいずれも通気路が設けられている。廃液収集管３は遠心分離装置と組み合わせて使用される遠心分離管である。廃液収集管３の先端開口にはキャップが設けられており、キャップは廃液収集管３の先端開口に対しネジ接続又は係合接続される。キャップを嵌めると、一次フランジ１３が二次フランジ２３に押し付けられ、二次フランジ２３が廃液収集管３の先端開口に押し付けられる。また、一次濾過管室１２と二次濾過管室２２は通気路を介して外部と連通している。
【００４７】
限外濾過管２のうち濾過管１下方の左側管壁及び右側管壁はいずれも中央部に向かって傾斜する平面管壁であり、２つの平面管壁の間に断面Ｖ字状の二次濾過管室２２が形成されている。また、二次濾過管室２２の外壁にはメモリが設けられている。少なくとも一方の平面管壁には限外濾過膜用窓が開設されており、限外濾過膜用窓に限外濾過膜ユニットが嵌め込まれている。前記限外濾過膜ユニットは、限外濾過膜固定プレートと限外濾過膜固定プレートの内側に貼り付けられた限外濾過膜２１を含む。前記限外濾過膜固定プレートの下端には複数の流出孔が設けられている。
【００４８】
好ましくは、前記濾過膜の孔径が１μｍを超えない。
【００４９】
好ましくは、前記濾過膜の孔径が０．８μｍを超えない。
【００５０】
好ましくは、前記濾過膜の孔径が０．２２μｍである。
【００５１】
通常用いられる濾過膜の孔径は０．１〜１００μｍである。血清中に一般的にみられる妨害物質には高存在量蛋白質と微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＭＶｓ）があるが、本発明ではバッファ及びプロテイナーゼＫ条件で前処理することで、大量の高存在量蛋白質がプロテイナーゼＫにより小片に酵素分解される。一方、微小胞の直径は約２００〜１，０００ｎｍであることから、ここでは０．２２μｍの濾過膜によって大部分の微小胞による妨害を除去可能である。
【００５２】
好ましくは、限外濾過膜は分画分子量３０〜１００ｋＤａの粒子の限外濾過膜である。
【００５３】
微小胞は濾過膜によって濾過管内に分画される。二次濾過管室には、血清中の高存在量蛋白質がプロテイナーゼＫにより酵素切断されて得られたポリペプチド断片が主な不純物として進入する。本発明において、処理済みのポリペプチド断片の多くは分子量約５〜１０ｋＤａの線状分子であるため、３０ｋＤａ以上の限外濾過膜を選択的に用いてこれを濾過する。また、当該範囲内の限外濾過膜の孔径はエクソソームの直径よりも大幅に小さいことから、エクソソームは二次濾過室内に分画される。
【００５４】
本発明のエクソソームを分離抽出する積層遠心濾過装置を用いれば、対象の血清サンプルを濾過管に加えると、遠心作用によって血清サンプルが濾過管１底部の濾過膜１１を通過する。通常は、濾過膜１１として孔径が１μｍを超えない、好ましくは０．２２μｍの精密ろ過膜を使用する。そのため、ほとんどの微小胞は濾過管１内に分画される。これに対し、エクソソーム、可溶性蛋白質、高存在量プロテイナーゼ断片等は、この濾過膜を通過して限外濾過管２に進入する。限外濾過管２の管壁下方は限外濾過膜２１となっており、底部に二次濾過管室２２が備わっている。遠心プロセスでは、血清中の可溶性部分、高存在量プロテイナーゼ断片及びより微小な粒子が側壁の限外濾過膜２１から滲出し、廃液収集管３に進入する。限外濾過管２の底部には二次濾過管室２２が備わっているため、遠心プロセスでは液体の一部が保持されて、この液体中にエクソソームが保存される。遠心が終了すると限外濾過管２を取り出し、ピペットで保持室内の液体を吹き付けて均一混合してから分画液を収集する。これが即ち最終産物としてのエクソソーム溶液となる。
【００５５】
実施例２  エクソソームの分離抽出用試薬キット
試薬キットは以下を含む。
１）実施例１で述べた積層遠心濾過装置。
２）ＤＰＢＳ、６０〜２４０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌバッファ、６０〜１８０ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７〜７．５のインキュベーションバッファ。
３）濃度５〜４０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫストック溶液。
４）ＤＰＢＳ：ＫＣｌ ２００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２００ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．１６ｇ／Ｌ。
【００５６】
実施例３  エクソソームの分離抽出方法
実施例２の試薬キットを用いてエクソソームを分離抽出する。
【００５７】
当該方法は、以下のステップを含む。
１）対象サンプルに体積の０．５倍のインキュベーションバッファを加え、且つ体積の０．０５倍のプロテイナーゼＫストック溶液を加えて、十分に均一混合してから、室温で８〜１５ｍｉｎインキュベートする。
２）ステップ１）で処理したサンプルを積層遠心濾過装置（図１参照）の濾過管に移し、遠心、均一混合してから限外濾過管内の分画液を収集する。
【００５８】
好ましくは、エクソソームの純度を高めたい場合、可溶性蛋白質を除去するために限外濾過管にＤＢＰＳを加えて３，０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心し、濾液を捨ててからこのステップをもう一度繰り返せばよい。
【００５９】
好ましくは、均一混合して収集した分画液が後続処理可能なエクソソーム溶液である。
【００６０】
次に、本発明の方法と、従来技術又は市販の商用試薬による抽出方法とを比較する。
【００６１】
本発明の方法と商用試薬による抽出方法との比較実験
現在市販されている主なエクソソーム抽出用試薬としては、ＳＢＩ社のＥｘｏＱｕｉｃｋシリーズとＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社のＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔシリーズがあるが、これらは原理及び抽出純度の双方において類似している。ここでは、血清に適用されるＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製の試薬製品と、同一の血清サンプルに対する本発明（実施例３）の抽出効果とを比較した。
【００６２】
商用試薬による抽出方法は以下のステップからなった。
（１）血清２００μＬを取り、新しいＥＰ管に投入した。
（２）Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ Ｓｅｒｕｍ）を４０μＬ加えて均一に混合した。
（３）４℃で３０ ｍｉｎインキュベートした。
（４）前記混合物を取り出して、１０，０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心した。
（５）上清を除去し、ＤＰＢＳを２０μＬ加えて沈殿を再懸濁させ、エクソソーム溶液を取得した。
【００６３】
上記により取得したエクソソームと実施例３で取得したエクソソームの純度について、図２に測定結果を示す。
【００６４】
図２において、Ａは商用試薬で抽出したエクソソームの結果、Ｂは本発明により抽出したエクソソームの純度の結果を示す。図２の結果より、本発明で抽出したエクソソームの純度は商用試薬と同等であることがわかる。また、本発明は商用試薬に比べて操作に要する時間が短縮されるほか、コストメリットも有する。
【００６５】
抽出システムの比較実験
エクソソームの試薬キットにおける各成分が最低濃度、最高濃度、本発明の濃度の場合で、エクソソームの抽出効果を比較した。
【００６６】
具体的な抽出方法は以下の通りとした。
【００６７】
本発明のインキュベーションバッファ（ＤＰＢＳ＋９０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ＋９０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７．２）、高濃度のインキュベーションバッファ（ＤＰＢＳ＋ ２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ＋２００ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７．２）、低濃度のインキュベーションバッファ（ＤＰＢＳ＋５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ＋５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７．２）をそれぞれ調合した。
【００６８】
また、プロテイナーゼＫストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）、低濃度のプロテイナーゼＫストック溶液（５ｍｇ／ｍＬ）、高濃度のプロテイナーゼＫストック溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）を調合した。
【００６９】
３つの新しいＥＰ管を取り、各管に血清を２００μＬずつ投入した。そして、添加する試薬濃度の違いに基づき、高濃度インキュベーションバッファ１００μＬと高濃度プロテイナーゼＫストック溶液１０μＬを使用する高濃度群と、低濃度インキュベーションバッファ１００μＬと低濃度プロテイナーゼＫストック溶液１０μＬを使用する低濃度群と、インキュベーションバッファ１００μＬとプロテイナーゼＫストック溶液１０μＬを使用する本発明群とに分けて比較した。
【００７０】
前記混合物を室温で１０ ｍｉｎインキュベートし、混合物を積層遠心濾過装置の濾過管に移して３，０００×ｇで１０ ｍｉｎ遠心した。そして、限外濾過管内の分画液を収集し、エクソソームの純度を測定した。図３に純度の測定結果を示す。
【００７１】
エクソソームの純度測定結果から明らかなように（図３）、本発明群と低濃度群は得られるエクソソーム濃度が同等であり、それぞれ２．７３×１０8粒子／ｍＬ、２．０４×１０8粒子／ｍＬであった。ただし、本発明で得られたエクソソームの粒子径が主に（＞８０％）２００ ｎｍ以下の領域に集中して分布していたのに対し、低濃度群で得られた産物は約６０％のみが２００ｎｍ以下の領域に分布しており、大きな粒子が存在していた。
【００７２】
また、本発明群と高濃度群を比較すると、粒子径の分布は同等であった。しかし、抽出されたエクソソームの濃度については、高濃度群の抽出総粒子濃度（１．２０×１０8粒子／ｍＬ）は本発明の抽出粒子濃度（２．７３×１０8粒子／ｍＬ）の約５０％にとどまった。
【００７３】
以上より、本発明のバッファ及びプロテイナーゼＫの作用濃度で得られるエクソソームが最良であった。
【００７４】
透過型電子顕微鏡によるエクソソームの測定
本発明の実施例３で血漿サンプルから抽出したエクソソームについて、２ｍＬのＤＰＢＳで分画物を２度洗浄して遠心した。そして、限外濾過管内の分画液を収集し、銅メッシュ上に固定して染色してから、透過型電子顕微鏡で測定した。結果を図４に示す。
【００７５】
図４の結果から明らかなように、本発明で血漿から抽出されたエクソソームは完全な膜状構造を有していた。また、直径が３０〜１５０ｎｍの範囲内であり、文献で報告されている特徴と一致していた。
【００７６】
上記実施例は本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態は上記実施例に限定されない。本発明の主旨、本質及び原理を逸脱することなく実施されるその他あらゆる変形、補足、置換、組み合わせ、簡略化はいずれも等価の置き換えとみなされ、本発明の保護の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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