【手続補正書】
【提出日】平成19年8月22日(2007.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】    インターフェロンβ活性を示し、そしてインターフェロンβポリペプチドに共有結合した少なくとも１つの第一の非ポリペプチド部分を含むコンジュゲートであって、該インターフェロンβポリペプチドのアミノ酸配列が、前記第一の非ポリペプチド部分のための付着基を含む少なくとも１つの導入されたおよび少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基において野生型ヒトインターフェロンβのものと異なるコンジュゲート。
【請求項２】    第一の非ポリペプチド部分が、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分および有機誘導体化物質からなる群より選択される、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】    第一の非ポリペプチド部分が、ポリマー、好ましくは直鎖または分枝ポリエチレングリコールである、請求項１または２記載のコンジュゲート。
【請求項４】    第一の非ポリペプチド部分が、付着基としてリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン残基を有するポリマー分子からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項５】    第一の非ポリペプチド部分が、付着基としてリジンを有するポリマー分子である、請求項４記載のコンジュゲート。
【請求項６】    インターフェロンβ活性を示し、そしてインターフェロンβポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基にコンジュゲート化した少なくとも１つの第一の非ポリペプチド部分を含むコンジュゲートであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去されたリジン残基において野生型ヒトインターフェロンβのものと異なるコンジュゲート。
【請求項７】    除去されたアミノ酸残基（単数又は複数）が、Ｋ１９、Ｋ３３、Ｋ４５、Ｋ５２およびＫ１２３、特にＫ１９、Ｋ３３、Ｋ４５、Ｋ１２３、そして最も好ましくはＫ１９、Ｋ４５およびＫ１２３からなる群より選択される、請求項６記載のコンジュゲート。
【請求項８】    リジン残基（単数又は複数）が、アルギニンまたはグルタミン残基で置換されている、請求項７記載のコンジュゲート。
【請求項９】    インターフェロンβポリペプチドが、以下の組の突然変異：
【化１】
2003527090.tif 000001
の１つを含む、請求項５〜８のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１０】    リジン残基が、親インターフェロンβにおいて、表面に曝露されるアミノ酸残基に占められる位置に導入されている、請求項５〜９のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１１】    インターフェロンβポリペプチドが、Ｎ４Ｋ、Ｒ１１Ｋ、Ｇ２６Ｋ、Ｒ２７Ｋ、Ｑ４８Ｋ、Ｑ４９Ｋ、Ｒ７１Ｋ、Ｄ７３Ｋ、Ｓ７５Ｋ、Ｅ８５Ｋ、Ａ８９Ｋ、Ｙ９２Ｋ、Ｈ９３Ｋ、Ｆ１１１Ｋ、Ｒ１１３Ｋ、Ｌ１１６Ｋ、Ｒ１２４Ｋ、Ｇ１２７ＫおよびＹ１５５Ｋからなる群より選択される、少なくとも１つの置換を含む、請求項１０記載のコンジュゲート。
【請求項１２】    置換が、Ｑ４９ＫおよびＦ１１１Ｋからなる群より選択される、請求項１１記載のコンジュゲート。
【請求項１３】    少なくとも２つの導入されたリジン残基を含む、請求項５〜１２のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１４】    インターフェロンβポリペプチドが、少なくとも１つの除去されたリジン残基、好ましくは請求項７〜９のいずれかに定義されるものをさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１５】    以下の組の突然変異：
【化２】
2003527090.tif 000002
の１つを含む、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１６】    ポリマー分子が、ＳＳ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、アルデヒド−ＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ＰＥＧ−ＳＣＭおよびｍＰＥＧ−ＢＴＣからなる群より選択される、請求項３〜１５のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１７】    インターフェロンβ活性を示し、そしてインターフェロンβポリペプチドの少なくとも１つのシステイン残基にコンジュゲート化した少なくとも１つの第一の非ポリペプチド部分を含むコンジュゲートであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２のＦ８、Ｌ９、Ｒ１１、Ｓ１２、Ｆ１５、Ｑ１６、Ｑ１８、Ｌ２０、Ｗ２２、Ｌ２８、Ｌ３２、Ｍ３６、Ｐ４１、Ｔ５８、Ｑ６４、Ｎ６５、Ｆ６７、Ｉ８３、Ｅ８５、Ｎ８６、Ａ８９、Ｎ９０、Ｙ９２、Ｈ９３、Ｈ９７、Ｔ１００、Ｌ１０２、Ｅ１０３、Ｌ１０６、Ｍ１１７、Ｌ１２０、Ｈ１２１、Ｒ１２４、Ｇ１２７、Ｒ１２８、Ｌ１３０、Ｈ１３１、Ｈ１４０、Ｉ１４５、Ｒ１４７、Ｖ１４８、Ｅ１４９、Ｒ１５２、Ｙ１５５、およびＦ１５６からなる群より選択される位置に導入された少なくとも１つのシステイン残基があることで異なるコンジュゲート。
【請求項１８】    インターフェロンβポリペプチドが、除去されたシステイン残基、好ましくはＣ１７をさらに含む、請求項１７記載のコンジュゲート。
【請求項１９】    インターフェロンβポリペプチドが、突然変異Ｃ１７Ｓおよび／またはＮ８０Ｃ、好ましくはＣ１７Ｓ＋Ｎ８０Ｃを含む、請求項１７または１８記載のコンジュゲート。
【請求項２０】    第一の非ポリペプチド部分がポリマー分子である、請求項１７〜１９のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項２１】    インターフェロンβ活性を示し、そして付着基として酸基を有する少なくとも１つの第一の非ポリペプチド部分を含み、該部分がインターフェロンβポリペプチドの少なくとも１つのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基にコンジュゲート化しており、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去されたアスパラギン酸またはグルタミン酸残基があることで野生型ヒトインターフェロンβのものと異なる、コンジュゲート。
【請求項２２】    少なくとも１つのアミノ酸残基が、親インターフェロンβ分子において、表面に曝露されるアミノ酸残基に占められる位置を占めている、請求項２１記載のコンジュゲート。
【請求項２３】    少なくとも２つの導入されたアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含む、請求項２１または請求項２２記載のコンジュゲート。
【請求項２４】    少なくとも２つの第一の非ポリペプチド部分を含む、請求項２１〜２３のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項２５】    第一の非ポリペプチド部分がポリマー分子である、請求項２１〜２４のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項２６】    第二の非ポリペプチド部分を含む、請求項１〜２５のいずれかの請求項に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】    第二の非ポリペプチド部分が、糖部分、好ましくはＮ−連結糖部分である、請求項２６記載のコンジュゲート。
【請求項２８】    インターフェロンβポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去されたｉｎ  ｖｉｖｏ糖鎖形成部位をさらに含む、請求項２７記載のコンジュゲート。
【請求項２９】    ポリペプチドが、第一の非ポリペプチド部分のための付着基を含む、少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基、および第二の非ポリペプチド部分のための付着基を含む少なくとも１つの導入されたアミノ酸残基を含む、請求項２６〜２８のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項３０】    インターフェロンβポリペプチドのアミノ酸配列が、第一の非ポリペプチド部分のための付着基を含む少なくとも２つの除去されたアミノ酸残基、および第二の非ポリペプチド部分のための付着基を含む少なくとも１つの導入されたアミノ酸残基を含む、請求項２９記載のコンジュゲート。
【請求項３１】    第一の非ポリペプチド部分が、付着基としてリジンを有するポリマー分子である、請求項２８または３０記載のコンジュゲート。
【請求項３２】    インターフェロンβ活性を示し、そしてインターフェロンβポリペプチドに共有結合した少なくとも１つのポリマー分子および少なくとも１つの糖部分を含むコンジュゲートであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が
ａ）ポリマー分子のための付着基を含む少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基、および
ｂ）糖部分のための付着基を含む少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基
があることで野生型ヒトインターフェロンβのものと異なる、
但し、ポリマー分子のための付着基がシステイン残基であり、そして糖部分がＮ−連結糖部分である場合、システイン残基は、Ｎ−糖鎖形成部位が破壊される方式で挿入されていないコンジュゲート。
【請求項３３】    ポリマー分子が、付着基としてリジンを有する、請求項３２記載のコンジュゲート。
【請求項３４】    ポリペプチドが、第一の非ポリペプチド部分のための付着基を含む少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基、および第二の非ポリペプチド部分のための付着基を含む少なくとも１つの導入されたアミノ酸残基を含む、請求項３３記載のコンジュゲート。
【請求項３５】    インターフェロンβポリペプチドが、以下の組の突然変異：
【化３】
2003527090.tif 000003
の１つを含む、請求項２６〜３４のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項３６】    インターフェロンβポリペプチドが、非ポリペプチド部分のコンジュゲート化に利用不能である修飾Ｎ末端を含む、請求項１〜３５のいずれかの請求項に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】    インターフェロンβ活性を示し、そしてインターフェロンβポリペプチドを含むコンジュゲートであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つの導入された糖鎖形成部位があることで野生型ヒトインターフェロンβのものと異なり、導入された糖鎖形成部位に付着した少なくとも１つの非ＰＥＧ化糖部分をさらに含むコンジュゲート。
【請求項３８】    インターフェロンβ活性を示し、そしてインターフェロンβポリペプチドを含むコンジュゲートであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、野生型ヒトインターフェロンβにおいて表面に曝露されるアミノ酸残基に占められた位置における、糖鎖形成部位の一部を構成するアミノ酸残基（単数又は複数）の導入または除去により、糖鎖形成部位が導入されているかまたは除去されていることで野生型ヒトインターフェロンβのものと異なる、コンジュゲート。
【請求項３９】    インターフェロンβポリペプチドが
【化４】
2003527090.tif 000004
からなる群より選択される、少なくとも１つの突然変異を含む、請求項３７または３８記載のコンジュゲート。
【請求項４０】    インターフェロンβポリペプチドが、以下の組の置換：Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ；Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ；またはＱ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｒ７１Ｎ＋Ｄ７３Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔの１つを含む、請求項３９記載のコンジュゲート。
【請求項４１】    アミノ酸配列が、除去された糖鎖形成部位、特に除去されたＮ−糖鎖形成部位を持つことでさらに異なる、請求項３７〜４０のいずれか記載のコンジュゲート。
【請求項４２】    インターフェロンβ活性を示し、そしてインターフェロンβポリペプチドに共有結合した糖部分を含むコンジュゲートであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも１つの除去された糖鎖形成部位があることで野生型ヒトインターフェロンβのものと異なるコンジュゲート。
【請求項４３】    Ｎ−糖鎖形成部位が、突然変異Ｎ８０Ｃにより除去されている、請求項４１または４２記載のコンジュゲート。
【請求項４４】    インターフェロンβポリペプチドが、請求項３８に記載される突然変異の少なくとも１つを含む、請求項４２または４３記載のコンジュゲート。
【請求項４５】    インターフェロンβポリペプチドが、位置Ｍ１、Ｃ１７、Ｎ８０またはＶ１０１における少なくとも１つの置換、特に置換Ｍ１ｄｅｌ、Ｍ１ＫまたはＣ１７Ｓの１つをさらに含む、上記いずれかの請求項に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】    請求項１〜４５のいずれかに記載のコンジュゲートのインターフェロンβポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４７】    請求項４６記載のヌクレオチド配列を宿する発現ベクター。
【請求項４８】    請求項４６記載のヌクレオチド配列または請求項４７記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４９】    ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞またはＳＦ９細胞である、請求項４８記載の宿主細胞。
【請求項５０】    インターフェロンβポリペプチドの免疫原性を減少させる方法、および／または機能的ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期及び／又は血清半減期を増加させる方法であって、第一の非ポリペプチド部分のための付着基を構成するアミノ酸残基をそのような基を含まないタンパク質の表面に曝露される位置に導入すること、第一の非ポリペプチド部分のための付着基を構成するアミノ酸残基を取り出すこと、および、得られた修飾ポリペプチドを第一の非ポリペプチド部分とのコンジュゲート化に供することを含む方法。
【請求項５１】    非ポリペプチド部分が、ポリマー分子、糖部分、親油性基および有機誘導体化物質からなる群より選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】    インターフェロンβポリペプチドを、コンジュゲート化を行うことが可能な条件下で、コンジュゲート化しようとする分子と反応させ、そして該コンジュゲートを回収する、請求項１〜４５のいずれか記載のコンジュゲートを調製するための方法。
【請求項５３】    請求項１〜４５のいずれか記載のコンジュゲートおよびｂ）薬学的に許容しうる希釈剤、キャリアーまたはアジュバントを含む、薬剤組成物。
【請求項５４】    疾患、特に多発性硬化症の治療のための、請求項１〜４５のいずれか記載のコンジュゲートまたは請求項５３記載の組成物。
【請求項５５】    疾患、特に多発性硬化症の治療における使用のための、請求項１〜４５のいずれか記載のコンジュゲート、請求項５３記載の組成物。
【請求項５６】    疾患、特に多発性硬化症の治療のための医薬品製造のための、請求項１〜４５のいずれか記載のコンジュゲートまたは請求項５３記載の組成物の使用。
【請求項５７】    多発性硬化症の哺乳動物を治療する方法であって、請求項１〜４５のいずれか記載のコンジュゲートまたは請求項５０記載の薬剤組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項５８】    インターフェロンβ  １ａおよび／または１ｂに対する循環抗体を有する哺乳動物を治療する方法であって、哺乳動物を、請求項１−４５のいずれか記載のコンジュゲートまたは請求項５３記載の薬剤組成物で治療する方法。
【請求項５９】    ａ）インターフェロンβ活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞、およびｂ）前記ヌクレオチド配列の発現により産生される前記ポリペプチドを含む培地を含む細胞培養組成物であって、前記宿主細胞からの前記ポリペプチドの分泌から直接生じ、前記ポリペプチドの量が少なくとも８００，０００  ＩＵ／ｍｌ培地、特に８００，０００−３，５００，０００  ＩＵ／ｍｌ培地の範囲であるところの組成物。
【請求項６０】    宿主細胞が、請求項４８または４９の宿主細胞である、請求項５９記載の細胞培養。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
さらに別の側面において、本発明は、インターフェロンβ活性を示し、そしてインターフェロンβポリペプチドを含み、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、野生型ヒトインターフェロンβにおいて、表面に曝露されるアミノ酸残基に占められる位置における、糖鎖形成部位の一部を構成するアミノ酸残基（単数又は複数）の導入または除去を介し、糖鎖形成部位が導入されているかまたは除去されていることで野生型ヒトインターフェロンβのものと異なる、コンジュゲートに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
定義
本出願および本発明の事情において、以下の定義があてはまる：
用語「コンジュゲート」（または「コンジュゲート化ポリペプチド」と言い換えて用いることができる）は、１以上の非ポリペプチド部分への１以上のポリペプチド（単数又は複数）の共有結合により形成される不均一な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）（複合体またはキメラの意味で）分子を示すことが意図される。用語「共有結合」は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分が、互いに直接的に共有的に連結しているか、またはそうでなければ、ポリペプチドに存在する付着基を用いて、架橋、スペーサーのような介在部分もしくはその部類、または連結部分もしくはその部類を通じて互いに間接的に共有的に連結していることを意味する。好ましくは、コンジュゲートは、適切な濃度および条件で可溶性であり、すなわち血液などの生理学的液に可溶性である。本発明のコンジュゲート化ポリペプチドの例には、糖鎖形成および／またはＰＥＧ化ポリペプチドが含まれる。用語「非コンジュゲート化ポリペプチド」は、コンジュゲートのポリペプチド部分について使用してもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
用語「ポリマー分子」は、２以上の単量体の共有結合により形成される分子と定義され、ポリマーがヒトアルブミンまたは別の豊富な血漿タンパク質である場合を除き、単量体のいずれもアミノ酸残基でない。用語「ポリマー」は、用語「ポリマー分子」と言い換えて用いることが可能である。該用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ糖鎖形成、すなわち所望により架橋剤を用い、通常、ポリペプチドの付着基に炭水化物分子を共有結合させることを伴う、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる合成糖鎖形成により付着される炭水化物分子を含むよう意図される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ糖鎖形成、例えばＮ−またはＯ−糖鎖形成（以下にさらに記載されるようなもの）により付着される炭水化物分子は、本明細書において、「糖部分」と称される。コンジュゲート中のポリマー分子（単数又は複数）または糖部分などの非ポリペプチド部分の数が明白に示される場合を除き、本発明のコンジュゲートに含まれるかまたは別の方式で本発明に用いられる「非ポリペプチド部分」に対する言及はすべて、コンジュゲート中の、１以上のポリマー分子（単数又は複数）または糖部分のような非ポリペプチド部分の言及であるものとする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
１つの態様において、インターフェロンβポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つの除去されたリジン残基、例えば１−５の除去されたリジン残基、特に１−４または１−３の除去されたリジン残基があることで、ヒト野生型インターフェロンβのものと異なる。好ましくは置換により、除去されるリジン残基（単数又は複数）は、Ｋ１９、Ｋ３３、Ｋ４５、Ｋ５２、Ｋ９９、Ｋ１０５、Ｋ１０８、Ｋ１１５、Ｋ１２３、Ｋ１３４およびＫ１３６からなる群より選択される。リジン残基（単数又は複数）は、いかなる他のアミノ酸残基で置換してもよいが、好ましくは、最小の構造的相違を生じるため、アルギニンまたはグルタミン残基により置換される。特に、ポリペプチド部分は、Ｋ１９、Ｋ４５、Ｋ５２および／またはＫ１２３、好ましくはＫ１９、Ｋ４５および／またはＫ１２３が、別のいかなるものでもよい他のアミノ酸残基、好ましくはアルギニンまたはグルタミンで置換されているものであり得る。例えば、本発明のコンジュゲートのインターフェロンβポリペプチド部分は、以下のリストより選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む：
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
アミノ酸残基の除去の場合、インターフェロンβポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つの除去されたアスパラギン酸またはグルタミン酸残基、例えば１−５の除去された残基、特に１−４または１−３の除去されたアスパラギン酸またはグルタミン酸残基があることで、ヒト野生型インターフェロンβのものと異なる。好ましくは置換により、除去される残基（単数又は複数）は、Ｄ３４、Ｄ３９、Ｄ５４、Ｄ７３、Ｄ１１０、Ｅ２９、Ｅ４２、Ｅ４３、Ｅ５３、Ｅ６１、Ｅ８１、Ｅ８５、Ｅ１０３、Ｅ１０４、Ｅ１０７、Ｅ１０９、Ｅ１３７およびＥ１４９からなる群より選択される。アスパラギン酸またはグルタミン酸残基（単数又は複数）は、いかなる他のアミノ酸残基で置換してもよいが、好ましくは、アルギニンまたはグルタミン残基により置換される。第一の非ポリペプチド部分は、こうした特性を持ついかなる非ポリペプチド部分であってもよく、非ポリペプチド部分が、付着基として酸基を有するポリマー分子または有機誘導体化物質、特にポリマー分子、例えばＰＥＧであり、そしてコンジュゲートが、例えばＳａｋａｎｅおよびＰａｒｄｒｉｄｇｅ，  Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．１４，  Ｎｏ．８，  １９９７，  ｐｐ  １０８５−１０９１に記載されるように、調製されることが現在好ましい。通常、酸基へのコンジュゲート化のため、非ポリペプチド部分は、約５または１０  ｋＤａの分子量を有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
ポリペプチドへのポリマー分子（単数又は複数）の共有結合を達成するため、ポリマー分子のヒドロキシル端基は、活性化型で、すなわち反応性官能基を持って、提供されなければならない（この例には、第一級アミノ基、ヒドラジン（ＨＺ）、チオール、スクシネート（ＳＵＣ）、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、炭酸ベンゾトリアゾール（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）、およびトレシレート（ＴＲＥＳ）が含まれる）。適切に活性化されたポリマー分子が、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｉｎｃ．、米国アラバマ州ハンツビルより商業的に入手可能である。あるいは、ポリマー分子は、当該技術分野に知られる慣用法により、例えばＷＯ  ９０／１３５４０に開示されるように、活性化させることが可能である。本発明で使用するための活性化直鎖または分枝ポリマー分子の特定の例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  １９９７および２０００カタログ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、本明細書に援用される）に記載される。活性化ＰＥＧポリマーの特定の例には、以下の直鎖ＰＥＧ類：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えばＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧ、およびＳＣＭ−ＰＥＧ）、並びにＮＯＲ−ＰＥＧ）、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、およびＭＡＬ−ＰＥＧ、並びに分枝ＰＥＧ類、例えばＰＥＧ２−ＮＨＳ、並びにどちらも本明細書に援用されるＵＳ  ５，９３２，４６２およびＵＳ  ５，６４３，５７５に開示されるものが含まれる。さらに、本明細書に援用される以下の刊行物は、有用なポリマー分子および／またはＰＥＧ化化学反応を開示する：ＵＳ  ５，８２４，７７８、ＵＳ  ５，４７６，６５３、ＷＯ  ９７／３２６０７、ＥＰ  ２２９，１０８、ＥＰ  ４０２，３７８、ＵＳ  ４，９０２，５０２、ＵＳ  ５，２８１，６９８、ＵＳ  ５，１２２，６１４、ＵＳ  ５，２１９，５６４、ＷＯ  ９２／１６５５５、ＷＯ  ９４／０４１９３、ＷＯ  ９４／１４７５８、ＷＯ  ９４／１７０３９、ＷＯ  ９４／１８２４７、ＷＯ  ９４／２８０２４、ＷＯ  ９５／００１６２、ＷＯ  ９５／１１９２４、ＷＯ  ９５／１３０９０、ＷＯ  ９５／３３４９０、ＷＯ  ９６／０００８０、ＷＯ  ９７／１８８３２、ＷＯ  ９８／４１５６２、ＷＯ  ９８／４８８３７、ＷＯ  ９９／３２１３４、ＷＯ  ９９／３２１３９、ＷＯ  ９９／３２１４０、ＷＯ  ９６／４０７９１、ＷＯ  ９８／３２４６６、ＷＯ  ９５／０６０５８、ＥＰ  ４３９  ５０８、ＷＯ  ９７／０３１０６、ＷＯ  ９６／２１４６９、ＷＯ  ９５／１３３１２、ＥＰ  ９２１  １３１、ＵＳ  ５���７３６，６２５、ＷＯ  ９８／０５３６３、ＥＰ  ８０９  ９９６、ＵＳ  ５，６２９，３８４、ＷＯ  ９６／４１８１３、ＷＯ  ９６／０７６７０、ＵＳ  ５，４７３，０３４、ＵＳ  ５，５１６，６７３、ＥＰ  ６０５  ９６３、ＵＳ  ５，３８２，６５７、ＥＰ  ５１０  ３５６、ＥＰ  ４００  ４７２、ＥＰ  １８３  ５０３およびＥＰ  １５４  ３１６。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
ポリペプチドおよび活性化ポリマー分子のコンジュゲート化は、慣用法いずれかを用いて、例えば、以下の参考文献（ポリマー分子の活性化に適した方法もまた記載する）に記載されるように行う：ＨａｒｒｉｓおよびＺａｌｉｐｓｋｙ監修，  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＡＺＣ，  ワシントン；  Ｒ．Ｆ．  Ｔａｙｌｏｒ，（１９９１），  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ．  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ニューヨーク；  Ｓ．Ｓ．  Ｗｏｎｇ，（１９９２），  “Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ．”，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ボカラトン；  Ｇ．Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら，（１９９３），  “Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク。当業者は、用いられる活性化法および／またはコンジュゲート化化学反応は、インターフェロンβポリペプチドの付着基（単数又は複数）と共に、ポリマーの官能基（例えばアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドまたはスルフィドリル）に応じることに気づくであろう。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上のすべての利用可能な付着基（すなわちポリペプチドの表面に曝露されている付着基）へのコンジュゲート化に対して向けられてもよいし、または特定の付着基、例えばＮ末端アミノ基に対して向けられてもよい（ＵＳ  ５，９８５，２６５）。さらに、コンジュゲート化は、一工程で、または段階的方式で達成してもよい（例えばＷＯ  ９９／５５３７７に記載されるように）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
インターフェロンβのアミノ酸残基への炭水化物部分の共有ｉｎ  ｖｉｖｏカップリングを用い、炭水化物置換基の数またはプロフィールを修飾するかまたは増加させてもよい。用いるカップリング様式に応じ、炭水化物（単数又は複数）を、ａ）アルギニンおよびヒスチジン（ＬｕｎｄｂｌａｄおよびＮｏｙｅｓ、  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  フロリダ州ボカラトン）、ｂ）未結合カルボキシル基（例えばＣ末端アミノ酸残基、アスパラギンまたはグルタミンのもの）、ｃ）システインのものなどの未結合スルフィドリル基、ｄ）セリン、スレオニン、チロシンまたはヒドロキシプロリンのものなどの未結合ヒドロキシル基、ｅ）フェニルアラニンまたはトリプトファンのものなどの芳香族残基、あるいはｆ）グルタミンのアミド基に、付着させてもよい。これらのアミノ酸残基は、インターフェロンβポリペプチドに導入してもそして／または除去してもよい炭水化物部分のための付着基の例を構成する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏカップリングの適切な方法は、ＷＯ  ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎら,  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｐｐ．２５９−３０６，  １９８１に記載される。炭水化物部分またはＰＥＧの、タンパク質およびペプチド結合Ｇｌｎ残基へのｉｎ  ｖｉｔｒｏカップリングはまた、トランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）により、例えばＳａｔｏら,  １９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５,  １３０７２−１３０８０により、またはＥＰ  ７２５１４５に記載されるように、行ってもよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
有機誘導体化物質へのカップリング
インターフェロンβポリペプチドの共有修飾は、有機誘導体化物質とポリペプチドの付着基（単数又は複数）を反応させることにより、行うことが可能である。適切な誘導体化剤および方法は、当該技術分野に公知である。例えば、システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（４−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル  ２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により、誘導体化される。ヒスチジル残基は、ｐＨ  ５．５−７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応により、誘導体化される。これは、この剤が、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり；該反応は、好ましくはｐＨ  ６．０の０．１  Ｍ  カコジル酸ナトリウム中で行われる。リジニルおよびアミノ末端残基は、無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応する。これらの剤での誘導体化は、リジニル残基の荷電を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化させるのに適した他の試薬には、イミドエステル、例えばメチルピコリニミデート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｃｏｌｉｎｉｍｉｄａｔｅ）；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロホウ化水素、トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、１つまたはいくつかの慣用的試薬との反応により修飾され、これらの中には、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、反応が、アルカリ条件で行われることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基と共にアルギニングアニジノ基と反応する可能性がある。カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミルまたはＣ末端アミノ酸残基）は、カルボジイミド類（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、式中、ＲおよびＲ’は異なるアルキル基である、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）との反応により、選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
こうしたポリペプチドの例には、Ｎ４、Ｆ８、Ｌ９、Ｑ１０、Ｒ１１、Ｓ１３、Ｌ２４、Ｎ２５、Ｇ２６、Ｌ２８、Ｅ２９、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｑ４８、Ｑ４９、Ｑ６４、Ｎ６５、Ｉ６６、Ｆ６７、Ａ６８、Ｉ６９、Ｆ７０、Ｒ７１、Ｑ７２、Ｄ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｓ７６、Ｔ７７、Ｇ７８、Ｗ７９、Ｎ８０、Ｅ８１、Ｔ８２、Ｉ８３、Ｖ８４、Ｌ８７、Ｌ８８、Ａ８９、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｙ９２、Ｈ９３、Ｑ９４、Ｄ１１０、Ｆ１１１、Ｔ１１２、Ｒ１１３、Ｒ１２８、Ｈ１４０、Ｔ１４４、Ｉ１４５、Ｒ１４７、Ｖ１４８、Ｌ１５１、Ｒ１５２、Ｆ１５４、Ｙ１５５、Ｎ１５８およびＮ１６６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＣおよびＮからなる群より選択される、異なるアミノ酸残基で置換されることで、野生型ヒトインターフェロンβのものと異なるアミノ酸配列を有するものが含まれる。上に明記されるアミノ酸残基は、ヒトインターフェロンβの解析された３Ｄ構造により立証されるように、ヒトインターフェロンβ分子の表面に曝露されるところに位置する。これらの残基の１以上を、非ポリペプチド部分のためのＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＣおよびＮ付着基（単数又は複数）のいずれかで置換することにより、特に、ポリマー付着基または炭水化物部分による修飾を受けやすいアミノ酸残基が、ヒトインターフェロンβに導入される。生じる修飾ヒトインターフェロンβ分子は、非修飾ヒトインターフェロンβ分子に比較した際、改善された特性を有する、インターフェロンβコンジュゲート調製に適した出発化合物である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
本発明のポリペプチドは、上に明記される置換のいずれかに加え、さらに置換Ｃ１７Ｓおよび／またはＭ１の欠失または置換Ｍ１Ｋを含んでもよい。さらに、本発明のポリペプチドは、Ｋ１９、Ｋ３３、Ｋ４５、Ｋ５２、Ｋ９９、Ｋ１０５、Ｋ１０８、Ｋ１１５、Ｋ１２３、Ｋ１３４、およびＫ１３６からなる群より選択される少なくとも１つのリジン残基の、好ましくは置換による、除去があることで、配列番号２のものとさらに異なるアミノ酸配列を含んでもよい。リジン残基（単数又は複数）は、いかなる他のアミノ酸残基で置換されてもよいが、好ましくは、アルギニンまたはグルタミンで置換される。特に、本発明のポリペプチドは、Ｋ４５、Ｋ５２および／またはＫ１２３が別のアミノ酸残基で、しかし好ましくはアルギニンまたはグルタミン残基で置換されているものであってもよい。また、ポリペプチドは、例えば「タグ化インターフェロンβポリペプチドのコンジュゲート化」と題される上記項にさらに記載されるように、タグと共に発現させてもよい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
インターフェロンβポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列は、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を持つ、親インターフェロンβをコードするヌクレオチド配列を単離するかまたは合成し、そしてその後、適切なアミノ酸残基（単数又は複数）の導入（すなわち挿入または置換）または欠失（すなわち除去または置換）を達成するように、ヌクレオチド配列を変化させることにより、構築してもよい。