(57)【要約】【課題】  高い被凝集能を有し、解析を迅速に行うことができ、解析結果のばらつきが少なく、かつ、長期保存性に優れ、大量生産にも適した、従来の赤血球に代わるインフルエンザ抗原性解析用の手段および方法を提供する。【解決手段】  インフルエンザウイルス受容体機能を有する３個ないし６個の糖残基からなる糖鎖を不溶性担体粒子に結合させたことを特徴とするインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子、それを含むインフルエンザウイルス抗原性解析用キット、ならびに該粒子または該キットを用いることを特徴とするインフルエンザウイルス型決定試験方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス受容体機能を有する３個ないし６個の糖残基からなる糖鎖を不溶性担体粒子に結合させたことを特徴とするインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子。
【請求項２】
糖鎖の非還元末端糖残基がシアル酸である請求項１記載のインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子。
【請求項３】
糖鎖が下記構造：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
または
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
［式中、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｇａｌはガラクトース残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｇｌｃはグルコース残基を表す］
を有するものである請求項２記載のインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子。
【請求項４】
不溶性担体粒子がラテックス粒子である請求項１〜３のいずれか１項記載のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子。
【請求項５】
糖鎖と不溶性担体粒子とがリンカーにより結合されている請求項１〜４のいずれか１項記載のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子を構成成分として含む、インフルエンザウイルス抗原性解析用キット。
【請求項７】
検体から得た試料に対して請求項１〜５のいずれか１項記載のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子または請求項６記載のインフルエンザウイルス抗原性解析用キットを使用することを特徴とする、インフルエンザウイルス型決定試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルス抗原性解析用粒子に関する。詳細には、本発明は、インフルエンザウイルス受容体機能を有するオリゴ糖鎖を不溶性担体粒子に結合させたことを特徴とする、インフルエンザウイルス抗原性解析用粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは流行防止に努めなければならない公衆衛生上重要な疾患である。流行防止にはワクチンが重要であるが、毎年流行するウイルスの亜型が異なり、また、その抗原性に変異を起こしやすいウイルスであるので、毎シーズン流行する型と抗原性を予測してワクチン株を選定しなければならない。そのためには迅速な抗原性解析とデータの集積が地球規模で行われることが必要である。現在インフルエンザウイルスの抗原性の解析は、赤血球凝集阻止反応を利用しているが、使用する赤血球の動物種の違い、また同一種であってもロットの違いにより結果に差が出ることが問題となっている。また、生体試料であるため長期保存が困難であり、大量生産にも不向きであった。
【０００３】
このような赤血球凝集阻止反応による解析の問題点を解決するために、インフルエンザウイルス受容体機能を有するオリゴ糖鎖を利用する試みがなされてきた（特許文献１〜４参照）。しかしながら、従来の糖鎖は分枝構造を有すること、糖残基の個数が多いこと（７個またはそれ以上）などから、これらの合成には複雑な工程を要し、大量生産には不向きであった。それゆえ、上記問題のない、従来の赤血球に代わるインフルエンザ抗原性解析用の手段の開発が望まれていた。
【０００４】
なお、本発明に関連する技術として、特許文献１〜４のごときものが存在するが、これらはいずれも本発明を開示するものではなく、上記問題を解決するものでもない。特表２００３−５３５９６５号公報（特許文献１）には、少なくとも１種のオリゴ糖鎖を包含するインフルエンザウイルスの結合に用いるための物質に関する発明が記載されているが、本発明のようなインフルエンザウイルス受容体機能を有する３個ないし６個の糖残基からなる糖鎖を不溶性担体粒子に結合させたことを特徴とするインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子については開示がない。特開平７−２７０４１７号公報には、抗体または抗原を担持した水不溶性担体に、側鎖に糖類を有する水溶性高分子が導入されてなる免疫測定用試薬に関する発明が記載されているが、やはり、本発明のようなインフルエンザウイルス受容体機能を有する３個ないし６個の糖残基からなる糖鎖を不溶性担体粒子に結合させたことを特徴とするインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子については開示がない。米国特許第５２２０００８号明細書および第５２５４６７６号明細書には（それぞれ特許文献３および特許文献４）、インフルエンザ受容体機能を有する糖鎖重合物が開示されているが、これらも本発明のようなインフルエンザウイルス受容体機能を有する３個ないし６個の糖残基からなる糖鎖を不溶性担体粒子に結合させたことを特徴とするインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子を開示するものではない。
【特許文献１】特表２００３−５３５９６５号公報
【特許文献２】特開平７−２７０４１７号公報
【特許文献３】米国特許第５２２０００８号明細書
【特許文献４】米国特許第５２５４６７６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高い被凝集能を有し、解析を迅速に行うことができ、解析結果のばらつきが少なく、かつ、長期保存性に優れ、大量生産にも適した、従来の赤血球に代わるインフルエンザ抗原性解析用の手段を提供することが、本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑みて、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、インフルエンザウイルス受容体機能を有する３個ないし６個の糖残基からなる糖鎖を不溶性担体粒子に結合させて得られる人工粒子をインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子として用いると、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は下記ものを提供する：
（１）インフルエンザウイルス受容体機能を有する３個ないし６個の糖残基からなる糖鎖を不溶性担体粒子に結合させたことを特徴とするインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子、
（２）糖鎖の非還元末端糖残基がシアル酸である（１）記載のインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子、
（３）糖鎖が下記構造：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
または
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
［式中、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｇａｌはガラクトース残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｇｌｃはグルコース残基を表す］
を有するものである（２）記載のインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子、
（４）不溶性担体粒子がラテックス粒子である（１）〜（３）のいずれかに記載のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子、
（５）糖鎖と不溶性担体粒子とがリンカーにより結合されている（１）〜（４）のいずれか１項記載のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子、
（６）上の（１）〜（５）のいずれかに記載のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子を構成成分として含む、インフルエンザウイルス抗原性解析用キット、ならびに
（７）検体から得た試料に対して上の（１）〜（５）のいずれかに記載のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子または上の（６）記載のインフルエンザウイルス抗原性解析用キットを使用することを特徴とする、インフルエンザウイルス型決定試験方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、高い被凝集能を有し、解析を迅速に行うことができ、解析結果のばらつきが少なく、かつ、長期保存性に優れ、大量生産にも適したインフルエンザ抗原性解析用の手段および方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、インフルエンザウイルス受容体機能を有する３個ないし６個の糖残基からなる糖鎖を不溶性担体粒子に結合させたことを特徴とするインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子を提供するものである。本明細書において「インフルエンザウイルス受容体機能を有する糖鎖」とは、インフルエンザウイルスの有する糖蛋白に対して親和性があり、これと結合して凝集反応しうる糖鎖をいう。
【００１０】
本発明のインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子のうち、好ましいものは、その糖鎖の非還元末端糖残基がシアル酸となっているものである。このシアル酸の存在が、インフルエンザウイルス受容体機能発揮に大きく関与していることはよく知られている。本明細書において「シアル酸」とは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）および９−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（９−Ｏ−Ａｃ−Ｎｅｕ５Ａｃ）を包含するものとする。
【００１１】
非還元末端残基がシアル酸であれば、糖鎖中の残りの糖残基の種類は特に限定されず、いずれのものであってもよい。糖鎖中の糖残基は、メチル化、硫酸化、アミノ化、カルボキシル化などにより修飾されていてもよく、あるいは配糖体となっていてもよい。したがって、本明細書において「糖鎖」という場合、これらの修飾体も包含される。また、糖鎖中の糖残基間の結合も特に限定されず、いずれの結合であってもよい。糖残基および糖残基間の結合を種々組み合わせて所望の糖鎖を作成し、これを不溶性担体粒子に結合させて、インフルエンザウイルス以外の様々なウイルス−受容体の結合性の研究に用いることもできる。
【００１２】
本発明のウイルス抗原性解析用粒子における糖鎖の糖残基の個数は３個ないし６個である。この範囲の糖残基の個数の場合、糖鎖の合成が容易で、大量生産に好適である。糖残基が３個未満の場合、インフルエンザウイルス受容体機能が不十分であり、糖残基が７個以上の場合には糖鎖の合成が困難となり、大量生産性に欠けるので、いずれも好ましくない。
【００１３】
好ましい糖鎖としては、非還元末端シアル酸から２番目の糖残基がガラクトース（Ｇａｌ）であり、非還元末端残基のシアル酸とα２−６結合またはα２−３結合により結合しているものが挙げられる。シアル酸とＧａｌの間の結合がα２−６結合である場合にはヒトインフルエンザウイルスをより強く認識する糖鎖となり、シアル酸とＧａｌの間の結合がα２−３結合である場合にはトリインフルエンザウイルスをより強く認識する糖鎖となる。
【００１４】
さらに好ましい糖鎖は、非還元末端から２番目の糖残基がＧａｌであり、非還元末端から３番目の糖残基がＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であり、非還元末端残基のシアル酸とガラクトースがα２−６結合またはα２−３結合により結合しており、非還元末端から２番目のＧａｌが非還元末端から３番目のＧｌｃＮＡｃとβ１−４結合またはβ１−３結合により結合しているものが挙げられる。
【００１５】
また、本発明のウイルス抗原性解析用粒子における糖鎖の非還元末端から３個までの部分がシアリルラクトースであることも好ましい。このシアリルラクトースに糖残基が１個ないし３個結合していてもよい。
【００１６】
本発明のウイルス抗原性解析用粒子における糖鎖の非還元末端シアル酸のうち好ましいのはＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）である。
【００１７】
本発明のウイルス抗原性解析用粒子における糖鎖のうち、最も好ましいのは下記構造：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
または
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
［式中、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｇａｌはガラクトース残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｇｌｃはグルコース残基を表す］
を有するものである。
【００１８】
なお、本発明のウイルス抗原性解析用粒子の糖鎖において、Ｇｌｃ、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５ＡｃはＤ型である。
【００１９】
上記糖鎖は、公知の方法、例えばグリカール法、固相樹脂ハイブリッド法などの化学合成法、糖転移酵素（例：シアル酸転移酵素、ガラクトース転移酵素）を用いる生化学的方法、あるいは自動糖鎖合成装置などを用いて合成することができる。
【００２０】
本発明のインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子に含まれる糖鎖は１種類であってもよく、２種以上であってもよい。糖鎖の種類は、解析すべきインフルエンザウイルスの種類に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
本発明のインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子は、上記糖鎖の還元末端を不溶性担体粒子に結合させることにより得ることができる。不溶性担体が粒子状であることの利点は、結合表面積が大きくなり、より高感度の解析を行うことができること、取り扱いが容易であることなどである。本明細書において「不溶性担体粒子」は水不溶性の担体粒子をいう。「粒子状」とは、球形のみならず、多面体のものや、任意の形態のものまでも包含する。粒子サイズは使用目的に応じて選択可能であり、典型的には０．１ないし１００ミクロン、好ましくは０．５ないし５０ミクロン、より好ましくは１ないし１０ミクロンの範囲であろう。不溶性担体粒子は、糖鎖または後述するリンカーと結合することのできるものであればよい。また、不溶性担体粒子は、免疫学的に不活性であることが好ましい。かかる不溶性樹脂は種々のものが知られており、市販もされている。本発明のウイルス抗原性解析用粒子に用いる不溶性担体粒子は、例えば、ラテックス粒子、ゼラチン、中空ガラスビーズ、無機微小粒子、天然微小粒子などであってもよい。これらの不溶性担体粒子の材料、形状、サイズは当業者が適宜選択できるものであり、当業者は所望の不溶性担体粒子を容易に入手あるいは作成することができる。本発明のウイルス抗原性解析用粒子の好ましい不溶性担体粒子はラテックス粒子である。ラテックス粒子は保存性に優れ、結合反応も容易である。
【００２２】
上記糖鎖を不溶性担体粒子に結合させる方法としては種々の有機化学的方法が用いられる。糖鎖および不溶性担体粒子の性質を考慮することにより、適切な方法を選択して用いることができる。例えば、Ｔｅｎｔａ Ｇｅｌ（登録商標）（ドイツＲａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社製）上に直接糖鎖を構築していく方法もある。
【００２３】
糖鎖と不溶性担体粒子との間にリンカーを介在させて糖鎖と不溶性担体粒子を結合させてもよい。リンカーも種々のものが知られており、糖鎖および不溶性担体粒子の特性を考慮することにより、適宜選択して用いることができる。リンカーは、免疫学的に不活性であることが好ましい。リンカーの例としては、脂質（リポソーム、セラミド）、ポリアクリルアミドなど、あるいは樹脂を主体としたバックボーンなどが挙げられる。リンカーはウシ血清アルブミンなどの蛋白であってもよい。リンカーが蛋白である場合には、糖鎖を有しないものが好ましい。例えば、インフルエンザウイルス受容体機能を有する糖鎖としてＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを用い、不溶性担体粒子としてラテックス粒子を用いる場合において、リンカーはウシ血清アルブミンであってもよい。
【００２４】
さらに本発明は、上記インフルエンザウイルス抗原性解析粒子を構成成分として含む、インフルエンザウイルス抗原性解析用キットを提供するものである。該キットは、上記インフルエンザウイルス抗原性解析粒子のほかにリファレンス抗原、マイクロタイタープレート、被検ウイルス希釈用バッファーなどを含んでいてもよい。通常、キットには取扱説明書を添付する。
【００２５】
さらに本発明は、検体から得た試料に対して本発明のインフルエンザウイルス抗原性解析粒子またはインフルエンザウイルス抗原性解析用キットを使用することを特徴とする、インフルエンザウイルス抗原解析方法、とりわけインフルエンザウイルス型決定試験方法を提供するものである。
【００２６】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２７】
材料と方法
凝集反応に用いたインフルエンザウイルスは、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１３／９８、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１０２／０２、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株については、国立感染症研究所よりインフルエンザウイルス同定キットとして配布されるウイルス同定用のリファレンス抗原を用いた。ＡもしくはＢ／Ｏｓａｋａ／で始まる株名で示される分離株については、当研究所で患者検体からＭＤＣＫ細胞を用いて分離したウイルスを用いた。
使用糖鎖ＬＳ−Ｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａ（ＬＳＴａ：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧＡｌβ１−４Ｇｌｃ）およびＬＳ−Ｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃ（ＬＳＴｃ：Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧＡｌβ１−４Ｇｌｃ）はそれぞれＤｅｘｔｒａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．とＳＩＧＭＡより購入した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶ、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）はＳＩＧＭＡより、２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物（ＭＥＳ）、ＮａＢＨ３ＣＮは和光純薬株式会社より、ＣＯＯＨ官能基を有するラテックス粒子（ＣＭ−ＭＰｓ）はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．より購入し実験に用いた。溶液は特に断りのない限り、溶媒として蒸留水を用いた。
【００２８】
糖鎖とＢＳＡの結合はＧａｍｉａｎ，Ａ．，らの示した方法（Can. J. Microbiol. 1991 Vol 37 p.233-237）にて作成した。すなわち、ＬＳＴａまたはＬＳＴｃ ２．０ｍｇとＢＳＡ ２．１４ｍｇは０．２Ｍリン酸バッファー ｐＨ８．７ ３００μｌにて溶解し５５℃で１時間加温後、ＮａＢＨ３ＣＮ ５．２ｍｇを添加して５５℃で２４時間撹拌した。２４時間後、蒸留水にて透析し、凍結乾燥し、糖−蛋白複合体２．６ｍｇを得た。
得られた糖蛋白は０．３Ｍリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．４に１ｍｇ／１ｍＬになるよう溶解し、粒子との結合に用いるまで凍結保存した。
【００２９】
ＣＭ−ＭＰｓ（直径１μｍ、２．５％溶液）との結合は、まず、２．５％ ＣＭ−ＭＰｓ １６０μｌ、５００ｍＭ ＭＥＳ溶液（ｐＨ６．１）４０μｌ、ＮＨＳ（５０ｍｇ／ｍｌ溶液）９２μｌ、ＥＤＡＣ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液）１６μｌ、蒸留水９２μｌをあらかじめ混和後、ロータリーシェーカーにて回転撹拌を室温３０分行い官能基の活性化を行った。粒子は遠心沈殿（１５０００ｒｐｍ、５分）し、上清を廃棄後、５０ｍＭ ＭＥＳ溶液５００ｍｌにて再浮遊させ、再度遠心沈殿させて洗浄した。その後、５００ｍＭ ＭＥＳ溶液２０μｌ、保存糖蛋白８０μｌ、蒸留水１００μｌを添加し、室温１時間回転撹拌して糖蛋白との結合を行った。作成粒子は前述のように洗浄し、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＢＳＡ添加０．１Ｍ グリシンＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．１）８ｍｌに浮遊させ、０．０５％溶液を試験に用いた。
【００３０】
従来法との比較として用いた血球である、モルモット、ニワトリ、ヒト（Ｏ型）については、採血後アルセバ液に浮遊させ冷蔵保存し、使用時に０．５％（ニワトリ）または０．７％（モルモット、ヒト）になるようＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に調製し、使用した。
赤血球凝集反応（ＨＡ反応）、赤血球凝集抑制反応（ＨＩ反応）は、定法に従った。すなわち赤血球凝集反応（ＨＡ反応）は、９６ウェルマイクロプレートを用い、全ウェルにＰＢＳを５０μｌ分注した後、Ｈ列に各被検ウイルス液を５０μｌずつ添加した。添加された被検ウイルス液は、ウェル内で充分に混和後５０μｌを分取し、Ｇ列のウェルへと添加し、さらに混和後、Ｆ列へと添加することを繰り返し、ＨからＡ列への２倍階段希釈を各行作成した（図１）。作成後、全ウェルに調整した赤血球液を等量（５０μｌ）添加し、プレートミキサーにて混和、４℃で１８時間静置したのち、判定に供した。
赤血球凝集抑制反応（ＨＩ反応）は、ＨＡ反応の結果、凝集が認められる最大のウイルス液の希釈倍数を１単位ととったときの、８倍濃い濃度（８単位）にＰＢＳを用いて調製したウイルス液を使用した。まず、９６ウェルマイクロプレートの全ウェルに２５μｌずつＰＢＳを分注した。次いで、インフルエンザウイルス同定キットに含まれる、フェレット感染血清、またはヒツジ高度免疫血清を１列目に２５μｌずつ添加し、１〜１２列まで順に２倍階段希釈を行った。各行１〜１２列には８単位のウイルス液を２５μｌずつ添加し（図２）、２５℃１時間静置後、調製赤血球液を５０μｌ添加し４℃で１８時間静置し、判定に供した。
粒子凝集反応（ＰＡ反応）、粒子凝集抑制反応（ＰＩ反応）はＨＡ，ＨＩ反応と同様の試験を赤血球液の代わりに０．０５％糖蛋白結合ラテックス粒子液を用いて行った。
【００３１】
結果１．リファレンス抗原を用いて行ったＰＡ反応の、ＨＡ反応との比較
赤血球はヒトＯ型血球を用い、ＬＳＴａ−ＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓ、ＬＳＴｃ−ＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓ、対照としてＢＳＡのみを粒子と結合させたＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓを用いて比較検討を行った（図３）。
ＬＳＴａはトリ型のインフルエンザウイルスのレセプターであると言われているので、ＬＳＴａ−ＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓを用いた凝集反応の結果、ヒト社会で流行しているウイルス株では、一部凝集されない株があった（図３−ｂ）。ヒト型のレセプターと言われるＬＳＴｃ−ＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓとヒトＯ型血球の凝集反応の結果を比較すると、ほぼ同等の成績が得られた（図３−ａ、ｃ）。また、ＢＳＡのみを粒子に結合させたＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓでは凝集は見られず（図３−ｄ）、ＢＳＡに結合させた糖鎖の種類が凝集には重要であることが分かった。
【００３２】
結果２．分離ウイルス株を用いて行ったＰＡ反応の、ＨＡ反応との比較
次に組織培養である、ＭＤＣＫ細胞を用いて分離したウイルス株を用いて凝集反応を比較した。ヒトＯ型血球とＬＳＴｃ−ＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓとの凝集反応の結果を比較すると、ほぼ同等の成績が得られた（図４）。
【００３３】
結果３．作成３ヶ月後のＬＳＴｃ−ＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓを用いた凝集反応の結果
作成後、３ヶ月を経過したＬＳＴｃ−ＢＳＡ−ＣＭ−ＭＰｓを用いて凝集反応を行ったが、作成直後と同様の安定した凝集性を示した（データ示さず）。
【００３４】
結果４．リファレンス抗原を用いて行ったＨＩ反応とＰＩ反応の比較
ＨＡ、ＰＡにてそれぞれ得られた８単位抗原を作成して、凝集抑制反応を行った（表１）。リファレンス抗原と、それに対応する感染血清（または免疫血清）によるＨＩ価（ホモ価）はＡ型ではＨＩ価に比べ２２〜２４倍低い値であったが、Ｂ型では２倍高い値となった。この結果より、糖鎖とウイルスの結合は特異的な抗体の存在により阻害されることが示された。実際に抗原解析に使用する際には、ホモ価と分離株とのＨＩ価の比較を行うので、作成した人工粒子は凝集抑制反応にも使用できることが分かった。
【表１】
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【００３５】
以上のことより、作成した本発明のインフルエンザウイルス抗原性解析用粒子は、インフルエンザウイルスの抗原解析に現在用いられている赤血球に代わる安定な人工粒子として使用できることがわかった。また、他の糖鎖を同様に結合させることで、様々なウイルス-受容体の結合性の研究に用いることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、インフルエンザウイルスに関する医薬品開発、公衆衛生、研究用の試薬やキットとして利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、マイクロタイタープレートを用いた赤血球凝集反応（ＨＡ反応）のフォーマットの一例を示す図である。本発明の粒子を用いた粒子凝集反応（ＰＡ反応）も同様のフォーマットで行った。
【図２】図２は、マイクロタイタープレートを用いた赤血球凝集抑制（ＨＩ反応）のフォーマットの一例を示す図である。抗原はそれぞれ８単位に調節して使用した。
【図３】図３は、ＨＡおよびＰＡの結果を示す図である。ａは０．７％ヒトＯ型血球によるＨＡ反応、ｂは０．０５％ＬＳＴａ−ＢＳＡ結合ラテックス粒子によりＰＡ反応、ｃは０．０５％ＬＳＴｃ−ＢＳＡ結合ラテックス粒子によるＰＡ反応、ｄは０．０５％ＢＳＡ結合ラテックス粒子によるＰＡ反応の結果を示す。抗原として感染症研究所より配布されるインフルエンザウイルス同定キットを用いた。抗原は、各パネルとも、１行目より順にＡ／Ｍｏｓｃｏｗ／１３／９８、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ１０２／０２、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９、陰性コントロール（ＰＢＳのみ）。凝集反応陽性を示す最終希釈倍数に黒線で印をつけている。
【図４】図４は、分離株を用いたＨＡ反応とＰＡ反応の比較を示す図である。ａは０．７％ヒトＯ型結球を使用した場合、ｂは０．０５％ＬＳＴｃ−ＢＳＡ結合ラテックスを使用した場合である。各分離株を左に示す。陰性コントロールはＰＢＳのみである。凝集反応陽性を示す最終希釈倍数に黒線で印をつけている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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