【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年3月20日(2007.3.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図５】
(結合タンパクとヒト肝細胞成長因子アクチベータ阻害剤(HAI-1)のアミノ酸配列比較)
アミノ酸末端の12アミノ酸(GPPPAPPGLPAG)（配列番号２）および７アミノ酸(TQGFGGS)（配列番号３）配列がそれぞれ40-ｋDa結合タンパクダブレットおよび25-kDa結合タンパクから得られた。またHAI-１のアミノ酸36-47および154-160に一致した。さらに40-kDa結合タンパクダブレットのより大きいバンドのトリプシン分解物から得られた12の固有のペプタイドをMALDI-MSを用いてHAI-１（配列番号１）と比較した。これらのペプタイドは位置135-310もしくは17％の完全なHAI-1をスパンした87残基で構成された。２筋のアミノ末端タンパク配列には２重のアンダーラインを引き、またMALDI-MSを用いて同定された残基135-143、154-164、165-172、173-182、173-190、183-190、194-199、203-214、204-214、288-301、および302-310（配列番号１）を含む12ぺクタイドにアンダーラインを引いている。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
(マトリプターゼcDNAクローン（配列番号４）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列)
逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応反応として用いられるプライマー(５'末端における20塩基および３'末端における18塩基)にアンダーラインを引いている。５'終末のプライマーを超えた33塩基および３'終末プライマーを超えた92塩基はSNC19 cDNAから得られ、組み込まれた。cDNA配列(配列番号４のヌクレオチド３５８−２４０６)がオープンリーディングフレーム内の第５ATGコドンから翻訳された。ヌクレオタイドおよびアミノ酸数は左に示している。マトリプターゼから得られた内部配列に一致する配列は２重のアンダーラインを引いている。His-484、Asp-539、およびSer-633がボックスされ、マトリプターゼの推定触媒性トリアドを示している。潜在性Nグリコシル化部位を示している(△)。RGD配列を示している
2002539093.tif 000001
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１０】
(トリプシン、キモトリプシンを含有した、また他のセリンプロテアーゼの触媒性領域を含有したマトリプターゼのＣ末端領域のアミノ酸配列の比較)
マトリプターゼのＣ末端領域(アミノ酸431-683)（配列番号６）をヒトトリプシン（配列番号１３）(Emiら、Gene(Amst)41:305-10(1986))、ヒトキモトリプシン（配列番号１４）(TomitaらBiochem.Biophys.Res.Commun.158:569-75(1989))、ヒトエンテロペプチダーゼ（配列番号７）の触媒性鎖(Kitamotoら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91:7588-92(1994))、ヒトヘプシン（配列番号１０）(Leytusら、Biochemistry 27:1067-74(1988))、ヒト血液凝固因子XI（配列番号１１）(Fujikawaら、Biochemistry 25:2417-24(1986))、およびヒトプラスミノーゲン（配列番号１２）、および２つの経膜セリンプロテアーゼのセリンプロテアーゼ領域、ヒトTMPRSS2（配列番号８）(Paoni-Giacobinoら、Genomics 44:309-20(1997))およびDrosophila Stubble-stubbloid遺伝子(Sb-sbd)（配列番号９）(Appelら、Proc.Natl.Acad,Sci.USA 90:4937-41(1993))と比較した。相同関係を最大にするギャップをダッシュで示している。触媒性トリアド(マトリプターゼHis-484、Asp-539、およびSer-633)における残基をボックスし、示している(▲)。保存活性モチーフ((R/K)VIGG) （配列番号３４）がボックスされ、タンパク分解活性部位を示している。４個の分子内ジスルフィド結合を形成するために必要な８個の保存シスチンがボックスされた。推定される対は次の通りである。それはCys-469-Cys-485、Cys-604-Cys-618、Cys-629-Cys-658、およびCys-432-Cys-559である。ジスルフィド結合はCys-432-Cys-559である。ジスルフィド結合Cys-432-Cys-559は２本鎖セリンプロテアーゼにおいて認められた。しかしトリプシンおよびキモトリプシンでは認められなかった。基質ポケットにおける残基(Asp-627、Gly-655、およびGly-665)がボックスされ示されている
2002539093.tif 000002
基質ポケットの底部に位置した残基はキモトリプシン内のSer以外に、マトリプターゼを含有したトリプシン様プロテアーゼ内のAspであるということが明白である。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１１】
(他のタンパクにおける相同領域の配列を伴った非触媒性領域の部分的配列のアラインメント)
A、マトリプターゼのシステインリッチ反復（アミノ酸280-314、315-351、352-387および394-430）（配列番号１５）をヒトLDL受容体（配列番号１６）(SudhofらScience:815-22(1988))、LDL受容体関連タンパク(LRP)（配列番号１７）(Herzら、EMBO J．7:4119-27(1988))、ヒトパーレカン（perlecan）（配列番号１８）(Murdochら、J.Biol.Chem.267:8544-57(1992))、ラットGP-300（配列番号１９）(Raychowdhuryら、Science 244:1163-65(1989))の共通配列と比較する。共通配列がボックスされている。B、Clr/s型の配列のマトリプターゼ（Mt;  アミノ酸42-155および168-268）（配列番号２０及び２１）をヒト補体サブコンポーネントClr(アミノ酸193-298)（配列番号２２）(Leytusら、Biochemistry 25:4855-63(1986): Jurnet. Biochem J.240:783-87(1986))、Cls(アミノ酸175-283) （配列番号２３）(Machinnonら、Eur. J. Biochem. 169:547-53(1987)、Tosiら、Biochemistry 26:8516-24(1987))Ra反応性因子(RaRF)(アミノ酸185-290) （配列番号２４）(Takadaら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1003-9(1993); SatoらInt. Immunol. 6:665-9(1994))、およびカルシウム依存性セリンプロテアーゼ(CSP)(アミノ酸181-289) （配列番号２５）(Kinoshitaら、FEBS Lett.250:411-5(1989))の選択領域と比較する。一致した配列はボックスされている。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１５】
(ヒトマトリプターゼの核酸配列(配列番号２６))
配列番号２６は、切断型のマトリプターゼをコードする配列番号４と比較してコード化されたタンパクのアミノ酸末端に位置した最初の172のアミノ酸をコード化している追加的核酸配列を含む。配列番号２６はマトリプターゼをコード化している核酸の標準の長さを示している。一方配列番号４は切断型である。その配列はGenBank Accession No.AF18224で認められる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１６】
(ヒトマトリプターゼのアミノ酸配列(配列番号２７))
この配列はLinらJ.Biol.Chem.274:18231-6(1999)(配列番号５)で述べられた配列より大きい855のアミノ酸を含有する。配列番号２７はマトリプターゼタンパクの標準の型である。一方配列番号５はアミノ酸末端において172のアミノ酸が欠乏している切断されたマトリプターゼタンパクである。そのタンパク配列はGenBank Accession No.AAD42765で認められる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
本発明のもう一つの目的はマトリプターゼタンパクまたはそのポリペプチド断片をコードしている核酸分子(配列番号４および２６)を提供することである(配列番号５および２７)。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
配列番号５もしくはその断片、配列番号２７もしくはその断片、１本鎖のマトリプターゼ(チモーゲン)もしくは２本鎖(活性)型のマトリプターゼを認識し結合している１つの抗体あるいは複数の抗体を提供することが本発明のさらなる目的である。好ましい抗体はキメラの、ヒト化のまたはヒトの抗体と同様にモノクロナール抗体およびその断片である。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
Ａ．  定義
「マトリプターゼ」は72-kDaと92-kDaの間の分子量をもったトリプシン様タンパクを意味し、配列番号２７に関連し、またはそれはその断片である。それは１本鎖および２本鎖型のタンパクの両方を含む可能性がある。チモーゲン型(不活性型)のマトリプターゼは１本鎖のタンパクである。２本鎖型のマトリプターゼは触媒活性をもった活性型のマトリプターゼである。細胞外マトリックス(ECM)リモデリングは正常および病理学的リモデリングプロセスの両方に必要であるため両方の型のマトリプターゼは母乳およびがん細胞中にある程度認められる。図14は全ての同定された型のマトリプターゼを示している。がん細胞および母乳の両方共、別々の型のマトリプターゼを含有している。しかしながら、母乳においては優位の型がHAI-１にその時結合している活性型のマトリプターゼである。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
Ｂ．  核酸分子
本発明では、さらに、配列番号５または配列番号２７を有するタンパク質をコードする核酸分子またはそのフラグメント、および関連するタンパク質を、望ましくは分離体で提供する。本明細書で使用する「核酸」は、上記に定義したようにペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡと定義され、あるいは前記ペプチドをコードする核酸配列に相補的であり、または前記核酸とハイブリッド形成して適切で厳重な条件下で安定した結合を維持し、またはペプチド配列でポリペプチドを少なくとも７５％の配列同一性、望ましくは少なくとも８０％、さらに望ましくは少なくとも８５％の配列同一性でコードするＲＮＡまたはＤＮＡである。特に企図しているのはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンス分子、並びに代替となる主要素をベースにした核酸、または自然にもしくは合成により誘導された代替塩基をベースにした核酸である。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
Ｃ．  他の関連する核酸分子の分離
上述のような配列番号４または配列番号２６を有するヒト核酸分子の同定により、熟練した技術者は本明細書に記載したヒト配列に加えてマトリプターゼファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子の単離ができるようになる。さらに現在明らかにされている核酸分子により、熟練した技術者は配列番号５および配列番号２７を有する公開されたタンパク質に加えてタンパク質マトリプターゼファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離できるようになる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
熟練した技術者は、基本的に、適切な細胞から作成された発現ライブラリをスクリーニングするための抗体プローブ産生用に配列番号５または配列番号２７のアミノ酸配列を容易に使用することができる。典型的な例では、精製タンパク質（下記に記述のように）またはモノクロナール抗体で免疫化されたウサギのような哺乳類からのポリクロナール抗血清は、哺乳類ｃＤＮＡまたはλｇｔｌｌライブラリ等のゲノム発現ライブラリのプローブに使用して、タンパク質ファミリーのその他のメンバーの適切なコード配列を得ることができる。クローン化ｃＤＮＡ配列は融合タンパク質として発現される場合があり、それ自体のコントロール配列を用いて直接発現させたり、または酵素の発現に使用される特定の宿主に適切な調節配列を用いて構築することにより発現させる場合がある。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
最初に、配列番号４または２６に示されている核酸分子、あるいは特にマトリプターゼヌクレオチドコード用の、マトリプターゼタンパク質のカルボキシ末端にあるセリンプロテアーゼ触媒ドメインまたはＬＤＬドメイン等、本発明のタンパク質をコードする核酸分子を入手する。コード配列は、イントロンに妨害されないため、いずれの宿主においても、そのままで発現に適している。配列は真核細胞または原核細胞のような宿主細胞に形質移入される。真核宿主には哺乳類細胞（例：ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＰＡＥ−ＰＤＧＦ−Ｒ細胞）、および組換えバキュロウイルスを用いるＳｆ9細胞のような昆虫細胞が含まれる。代わりに、マトリプターゼの１部のみをコードするフラグメントが単独に、あるいは融合タンパク質として発現する場合がある。例えば、セリンプロテアーゼドメインを含むマトリプターゼのＣ末端がＧＳＴ−ｔａｇまたはＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質として細菌に発現する場合がある。こうした融合タンパク質は、その後精製され、ポリクロナール抗体の生成に使用される。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６４】
Ｇ．  結合パートナーの同定法
もう１つの態様として、本発明は、マトリプターゼタンパク質の結合パートナーの単離・同定に使用する方法を提供する。詳細には、本発明のタンパク質と、可能性のある結合パートナーまたは細胞の抽出物もしくはフラクションとを、本発明のタンパク質と可能性のある結合パートナーとが会合可能な条件下で混合する。混合後、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または本発明のタンパク質と会合したその他の分子を混合物から分離する。その後、本発明のタンパク質に結合する結合パートナーを除去して、さらに分析する。結合パートナーを同定し単離するために、全てのタンパク質、例えば配列番号５または配列番号２７の明らかになっているタンパク質全てを使用する。代わりに、タンパク質フラグメントを使用することもできる。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７３】
Ｈ．  マトリプターゼをコードする核酸の発現を調節するエイジェントの同定法
本発明は、配列番号５または配列番号２７のアミノ酸配列を有するタンパク質等の本発明のタンパク質をコードする核酸の発現を調節するエイジェントを同定する方法も包含する。これらの試験では、本発明の核酸の発現レベルの変化のモニタリングを行うために利用できるあらゆる方法を用いても良い。ここでは、エイジェントは、たとえば配列番号５または配列番号２７の配列を有するタンパク質をコードする核酸等の本発明の核酸の発現を調節するものを言うが、ただし、細胞内の核酸の発現を上方または下方に制御できるものとする。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７４】
ある測定フォーマットにおいては、マトリプターゼまたは配列番号４または２６のオープンリーディングフレームと何らかの測定可能な融合相手との間のレポーター遺伝子融合を含む細胞株を作製しても良い。発光飛翔昆虫のルシフェラーゼ遺伝子やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子等の多くの測定可能な融合相手が知られており、容易に入手できる（Alam et al., Anal. Biochem. 188: 245-54（1990））。次に、レポーター遺伝子融合を含んだ細胞株を適切な条件下で適切な時間検査すべきエイジェントに曝露させる。そのエイジェントに曝露させた検体と対照の検体の間のレポーター遺伝子発現の差によって、配列番号５または配列番号２７の配列を有するタンパク質または関連のタンパク質をコードする核酸の発現を調節するエイジェントを同定する。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７５】
別の測定フォーマットを用いて、配列番号５または配列番号２７を有するタンパク質等の本発明のタンパク質をコードする核酸の発現を調節するエイジェントの能力のモニタリングを行ってもよい。たとえば、本発明の核酸とのハイブリダイゼーションによってmRNA発現を直接モニタリングしてもよい。細胞株を適切な条件下で適切な時間検査すべきエイジェントに曝露させ、トータルRNAまたはmRNAをSambrookらが発表した方法（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL., 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等の標準法によって単離する。同エイジェントに曝露させた細胞と対照の細胞の間のRNA発現レベルの差を検出するためのプローブは、本発明の核酸から調製してもよい。非常に厳密な条件下で標的の核酸のみとハイブリダイズするプローブを設計することが望ましいが、不可欠ではない。非常に厳密な条件下では相補性の高い核酸ハイブリッドのみが形成される。したがって、測定条件の厳密さは、ハイブリッドを形成するために２種類の核酸鎖間に存在すべき相補性の量を決定する。プローブ：標的ハイブリッドと潜在的プローブ：非標的ハイブリッドの間の安定性の差を最大とするような厳密さを選択すべきである。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
ハイブリダイゼーションの条件は、 Sambrook et al.（1989）およびAusubel et al.（1995）が示した方法等の既知の方法を用いて、各プローブについて必要なように変更する。細胞のトータルRNAまたはポリA  RNAに富んだRNAのハイブリダイゼーションは、何らかの利用できるフォーマットで実施することができる。たとえば、細胞のトータルRNAまたはポリA  RNAに富んだRNAは固形支持体に付着させ、固形支持体をプローブが特異的にハイブリダイズする条件下で、本発明の配列の少なくとも１つまたはその一部を含む少なくとも１つのプローブに曝露させることができる。または、本発明の配列の少なくとも１つまたはその一部を含む核酸フラグメントは、多孔性のガラスウエファース等の固形支持体に付着させることもできる。次に、付着した配列が特異的にハイブリダイズする条件下で、ガラスウエファースを検体の細胞トータルRNAまたはポリA  RNAに曝露させることができる。これらのガラスウエファースとハイブリダイゼーション法は幅広く利用することができ、例としてはBeattieの方法（WO95/11755）等がある。所定のプローブが未処理細胞集団およびエイジェントに曝露させた細胞集団からのRNA検体と特異的にハイブリダイズする能力を検査することによって、 配列番号５または配列番号２７の配列を有するタンパク質をコードする核酸の発現を上方または下方に制御するエイジェントが同定される。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７８】
Ｉ．  マトリプターゼの少なくとも1つの活性を調節するエイジェントの同定法
本発明の他の態様として、配列番号５または配列番号２７のアミノ酸配列を有するタンパク質等の本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性を調節するエイジェントの同定法が提供される。これらの方法または測定では、求められている活性のモニタリングまたは検出を行うあらゆる方法を用いてよい。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８３】
この方法で作製したポリクローナル抗血清は、いくつかの用途においては充分であるが、医薬品については、モノクローナル抗体の使用が望ましい。Kohler et al.（Nature 256: 495-7（1975））の標準法、または一般的に知られているリンパ球または脾臓細胞の不死化に効果のある変法を用いて、望ましいモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株を作製しても良い。望ましいモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、ペプチドハプテンまたはポリペプチドまたはタンパク質を抗原として用いたイムノアッセイによって選別する。望ましい抗体を分泌する適当な不死化細胞培養が同定された時、その細胞はin vitroでの培養またはin vivo腹水中で維持できる。マトリプターゼの触媒ドメイン（たとえば、配列番号５のアミノ酸432-683）を認識するモノクローナル抗体については特に興味が持たれる。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２８】
ＣＯＳ−７細胞中でのＨＡＩ−１の発現：ＨＡＩ−１がマトリプターゼの結合タンパク質をコードすることを証明するために、我々は、ＭＴＳＶ１．１Ｂ不死化ヒト管腔乳房上皮細胞からのｍＲＮＡを使用して、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＨＡＩ−１  ｃＤＮＡ断片を単離した。ＨＡＩ−１のプライマー配列（５’−ＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡ−３’（配列番号２８）と５’−ＴＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＧ−３’（配列番号２９））は、公表されている配列から得た。アドバンテージ（Advantage）ＲＴ−ＰＣＲキット（クロンテク（Clontech）：パロアルト、カリホルニア州）を使用して標準的ＲＴ−ＰＣＲを行い、生成物をＴＡクローニングによりｐＣＲ２．１（インビトロゲン（Invitrogen）：カールスバード（Carlsbad）、カリホルニア州）に結合させた。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列は、標準的方法により得られ、公表されているＨＡＩ−１配列で確認した（ミヤザワ（Miyazawa）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１００２４−８（１９９３））。市販のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロゲン（Invitrogen）：カールスバード（Carlsbad）、カリホルニア州）を使用して、真核生物発現ベクターを作製した（ｐｃＤＮＡ／ＨＡＩ−１）。ＨＡＩ−１  ｃＤＮＡを含有する１．６kbのＥｃｏＲＩ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。この作製体は、ＣＭＶプロモーターに指令されるＨＡＩ−１の読みとり枠（ＯＲＦ）を含有する。ＨＡＩ−１  ｃＤＮＡの正しい挿入は、制限マッピングにより証明した。トランスフェクションは、スーパーフェクト（SuperFect）トランスフェクション試薬（キアゲン（Quiagen）：バレンシア、カリホルニア州）を使用して製造業者のハンドブックに記載のように行った。４８時間後、ＨＡＩ−１でトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を、２０mMトリス−塩酸（ｐＨ７．４）中の１％トリトンＸ−１００で抽出した。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４２】
Ｔ−４７Ｄ乳癌細胞からのＳＮＣ１９  ｃＤＮＡの増幅：Ｔ−４７Ｄヒト乳癌細胞からのｍＲＮＡを使用して、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＳＮＣ１９  ｃＤＮＡクローンを作成した。ＳＮＣ１９のプライマー配列（５’−ＣＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＣＴＧＧＧＧ−３’（配列番号３０）および５’−ＡＧＡＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧ−３’）（配列番号３１）は、公表されている配列から得られた。アドバンテージ（Advantage）ＲＴ−ＰＣＲキット（クロンテク（Clontech）：パロアルト、カリホルニア州）を使用して標準的ＲＴ−ＰＣＲを行った。生成物を０．８％アガロースゲルで分析し、予測された生成物サイズに対応する得られた約２．８kbのバンドをゲルから切り出し、精製し、ＴＡクローニング（ｐＣＲ−ＳＮＣ１９）によりｐＣＲ２．１（インビトロゲン（Invitrogen）、カールスバード（Carlsbad）、カリホルニア州）中に連結させた。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４９】
４０kDa結合タンパク質の配列分析は、これがセリンプロテアーゼインヒビター（後述）であることを証明したが、９５kDaマトリプターゼ／インヒビター複合体について、いくらかの残存ゼラチン分解活性が観察された（図８Ｃ）。マトリプターゼとその結合タンパク質をＮ末端配列決定に付すと、比較的低い回収率でマトリプターゼから１１個のみのアミノ酸残基（ＶＶＧＧＴＤＡＤＥＧＥ）（配列番号３２）が得られ、４０kDa結合タンパク質のアミノ末端からは１２個のアミノ酸残基（ＧＰＰＰＡＰＰＧＬＰＡＧ）（配列番号２）が得られた。マトリプターゼからの１１個のアミノ酸残基は、ＳＮＣ１９（受け入れ番号Ｕ２０４２８）と呼ぶ２．９kbのｃＤＮＡからの推定アミノ酸配列と同一であった。この寄託されたＳＮＣ１９配列中に多くの停止コドンが観察され、いくつかの小さな予測された翻訳産物が得られた。すなわち、ＳＮＣ１９の配列に基づく２つのプライマーを使用する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により、２，８３０bpのｃＤＮＡ断片が得られた。我々の配列とＳＣＮ１９の配列の間には、大きな差（１３２塩基）がある。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５１】
マトリプターゼcDNAクローンのヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列：マトリプターゼのヌクレオチド（配列番号４）およびアミノ酸配列（配列番号５）が図９に示される。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応に用いられたプライマー（５’末端における２０個の塩基および３’末端における１８個の塩基）には下線が付けられている。５’末端プライマーを越える３３個の塩基および３’末端プライマーを越える９２個の塩基がSNC19 cDNAから取られ、組み込まれた。このcDNA配列はオープンリーディングフレームで５番目のATG（Met）コドンから翻訳された。ヌクレオチドとアミノ酸の数は左側に示されている。二重下線は、マトリプターゼから得られた内部配列と一致した配列を示す。His-484、Asp-539およびSer-633は箱に入れられたが、それらはマトリプターゼの推定触媒三つ組であることを示す。潜在的なＮ−グリコシル化部位はΔで示される。RGD配列は
2002539093.tif 000003
で示される。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５２】
マトリプターゼcDNAは、SNC19由来の５’末端の３３個の塩基と３’末端の９２個の塩基がRT-PCRフラグメント（塩基対の長さ２，８３０）に付加されたときは、塩基対の長さが２，９５５となる可能性がある。翻訳開始部位は、配列GTCATGGが有利なコザク合意配列（Kozak consensus sequence）（Kozak等のNucl. Acid. Res.，12：857-72（1984））に合っているので、５番目のメチオニンコドンに割り当てられた。このメチオニンの後に４個の正に帯電したアミノ酸、および推定シグナルペプチドである１４個のアミノ酸の長さの疎水性領域（Ser-18-Ser-31）が続いている。このメチオニンコドンがイニシエーターであると仮定すると、オープンリーディングフレームは塩基対の長さが２，０４９であることを示し、従ってそれより推定されるアミノ酸配列は６８３個の残基から構成され、その計算された分子質量は７５，６２６であった。マトリプターゼから得られたアミノ酸配列の２つのストレッチ（stretch）（DYVEINGEK（配列番号３３）およびVVGGTDADEGE（配列番号３２））はアミノ酸２２８−２３６として、およびアミノ酸４４３−４５３として存在している；従って翻訳フレームは正しい可能性がある。基準のAsn-X-(Ser/Thr)およびRGD配列を有する３つの潜在的なＮ−グリコシル化部位が存在する。細胞外基質の蛋白質に由来するRGD配列は、インテグリン類との相互作用を媒介することが見いだされた（Ruoslahti等のScience，238：491-7（1987））。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５３】
マトリプターゼ触媒ドメインの構造：Swiss-ProtTMデーターベースでのBLASTによる推定アミノ酸配列の相同性に関する研究は、（１）マトリプターゼの残基位置４３２−６８３（配列番号５）におけるカルボキシル末端は他のセリンプロテアーゼと相同であること；（２）マトリプターゼは不変触媒三つ組を含んでいること；（３）マトリプターゼは特性ジスルフィド結合パターンを含んでいること；およびマトリプターゼは総配列類似性を有していることを明らかにしている。図９を参照して説明すると、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応に用いられたプライマー（５’末端における２０個の塩基（配列番号３０）および３’末端における１８個の塩基（配列番号３１））には下線が付けられている。５’末端プライマーを越える３３個の塩基および３’末端プライマーを越える９２個の塩基がSNC19 cDNAから取られ、組み込まれた。このcDNA配列はオープンリーディングフレームで５番目のATGコドンから翻訳された。ヌクレオチドとアミノ酸の数は左側に示されている。二重下線は、マトリプターゼから得られた内部配列と一致した配列を示す。His-484、Asp-539およびSer-633は箱に入れられ、それらはマトリプターゼの推定触媒三つ組であることを示した。潜在的なＮ−グリコシル化部位はΔで示される。RGD配列は
2002539093.tif 000004
で示される。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５５】
図１０を参照してさらに具体的に説明すると、マトリプターゼの（アミノ酸４３１−６８３）Ｃ−末端領域（配列番号６）が、ヒトトリプシン（配列番号１３）、ヒトキモトリプシン（配列番号１４）、ヒトエンテロペプチダーゼの触媒鎖（配列番号７）、ヒトヘプシン（配列番号１０）、ヒト血液凝固因子ＸＩ（配列番号１１）およびヒトプラスミノゲン（配列番号１２）、並びに２種の膜内外セリンプロテアーゼ、ヒトTMPRSS2（配列番号８）およびショウジョウバエ属スタブル−スタブロイド（Stubble-stubbloid）遺伝子（Sb-sbd）（配列番号９）と比較される。残基は１文字コードで表現される。触媒三つ組（マトリプターゼHis-484、Asp-539およびSer-633）中の残基で示される相同性を最大化するギャップは、箱に入れられ、◆で示された。保存活性化モチーフ（conserved activation motif）（R/KVIGG）（配列番号３４）は箱に入れられて、その蛋白分解性活性化部位が示された。４つの分子内ジスルフィド結合を形成するのに必要とされる８つの保存システインは箱に入れられているが、その可能性のある対合は次のとおりである：Cys-469-Cys-485、Cys-604-Cys-618、Cys-629-Cys-658およびCys-432-Cys-559）。ジスルフィド結合（Cys-432-Cys-559）は２本鎖セリンプロテアーゼ中に観察されるが、トリプシンおよびキモトリプシン中には観察されない。基質ポケット中の残基（Asp-627、Gly-655およびGly-665）は箱に入れられて、
2002539093.tif 000005
で示される。基質ポケットの底に位置する残基が、マトリプターゼを含むトリプシン様プロテアーゼ中ではAspであるが、キモトリプシン中ではSerであることは明らかである。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５６】
Arg-Val-Val-Gly-Gly（RVVGG）（配列番号３５）のモチーフ中におけるマトリプターゼの推定蛋白分解活性化部位（Arg-442）は、他のセリンプロテアーゼ類中の特性RIVGG（配列番号３６）モチーフと同様である。しかしIle残基はVal残基により置換されている。この置換はまれではあるが、プラスミノゲン中に観察される。前記のように、保存分子内ジスルフィド結合は、１本鎖チモーゲンとして合成されるそれらセリンプロテアーゼ中に見いだされ、そして蛋白分解式で活性化されて活性な２本鎖形態になる。このジスルフィド結合は活性触媒フラグメントをそれらの非触媒Ｎ−末端フラグメントと共に保持し、従って蛋白質−蛋白質相互作用ドメインとして役立つことが提案される。この保存分子内ジスルフィド結合はマトリプターゼ中でも観察された（Cys-432-Cys-559）。これらの配列分析は、マトリプターゼは１本鎖チモーゲンとして合成することができ、そして蛋白分解式で２本鎖形態に活性化されるようになることを示唆している。これが事実であるならば、T-47D乳癌細胞の調整培地中におけるマトリプターゼの大部分はチモーゲンである可能性があり；活性な２本鎖マトリプターゼは小割合を占めるに過ぎず、それは還元条件下で８０−kDaという見掛けの大きさを示すT-47Dヒト乳癌細胞由来の精製マトリプターゼと一致する。この結論は、また、マトリプターゼの触媒鎖に対する提案されたＮ−末端配列は、マトリプターゼがＮ−末端配列決定（sequencing）に付されたときに非常に低い回収率で得られたアミノ酸配列（VVGGTDADEGE）（配列番号３７）のストレッチと同一であるという観察結果によっても支持される。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５７】
マトリプターゼの基質特異性（S1）ポケットはその底に位置するAsp-627から構成され、そのネックにGly-655およびGly-665を有している可能性がある。このことは、マトリプターゼが典型的なトリプシン様セリンプロテアーゼであることを示している。正に帯電した側鎖を有するアミノ酸残基の場所での、予測される優先的切断は、Ｐ１部位としてArg残基およびLys残基を持つ各種合成基質により確認された。具体的に説明すると、マトリプターゼは、次のとおり、最も速いものから最も遅いものまでその順に与えられる次の基質を切断することができた：Boc-Gln-Ala-Arg-AMC、Boc-ベンジル-Glu-Gly-Arg-AMC、Boc-Leu-Gly-Arg-AMC、Boc-ベンジル-Asp-Pro-Arg-AMC、Boc-Phe-Ser-Arg-AMC、Boc-Leu-Arg-Arg-AMC、Boc-Gly-Lys-Arg-AMCおよびBoc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC。［Boc＝ｔ−ブチルオキシカルボニル；AMC＝７−アミノ−４−メチルクマリン；LDL＝低密度リポ蛋白質］。これは、マトリプターゼはＰ２部位としてAlaおよびGlyのような小さい側鎖を含んでいるアミノ酸残基を有する基質の方を好むという見解を支持するものである。これらの結果は、マトリプターゼは、トリプシンに似て、広範囲の切断特異性を示すことを示唆している。この広範囲の切断活性は、そのゼラチン分解（gelatinolytic）活性の説明となっている可能性がある。そのトリプシン様活性は、最も豊富な（ほとんど１／３までの）ゼラチン中アミノ酸残基であるグリシン残基の所でゼラチンを切断することができるゼラチナーゼＡおよびＢとは性質が異なるように思われる。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５８】
マトリプターゼの非触媒領域の構造モチーフ：マトリプターゼの非触媒領域は、他の蛋白質との相互作用のための調節および／または結合ドメインとしての役割を果たすことができる２組の反復配列を含んでいる。６個の保存システイン残基を含む約３５個のアミノ酸の４個の直列反復（図１１Ａ）が、そのセリンプロテアーゼドメインのアミノ末端領域（アミノ酸280-430）の所に見いだされた。それらはLDL受容体（Sudhof等のScience，228：815-22（1985））および関連蛋白質（Herz等のEMBO J.，7：4119-27（1988））のシステイン含有反復と相同である。これらシステイン残基は全てジスルフィド結合中に含まれている可能性がある。LDL受容体において、相同の７個の反復配列は配位子結合用ドメインとしての役割を果たす。類推によって、４個の直列システイン含有反復も、他の巨大分子との相互作用部位となることができるだろう。加えて、このシステイン含有LDL受容体ドメインは、エンテロペプチダーゼ（Matsushima等のJ. Biol. Chem.，269：19976-82（1994）；およびKitamoto等のProc. Natl. Acad. Sci. USA，91：7588-92（1994））のような他のプロテアーゼ中にも見いだされた。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５９】
図１１Ａを参照して説明すると、マトリプターゼのシステインに富む反復（アミノ酸280-314、アミノ酸315-351、アミノ酸352-387およびアミノ酸394-430）（配列番号１５）が、ヒトLDL受容体（配列番号１６）；LDL受容体関連蛋白質（LRP）（配列番号１７）；ヒトパーレカン（perlecan）（配列番号１８）；およびラットGP-300（配列番号１９）の合意配列と比較されている。この合意配列は箱に入れられている。図１１Ｂにおいては、マトリプターゼのC1r/sタイプ配列（アミノ酸42-155およびアミノ酸168-268）（配列番号２０および２１）がヒト補体サブ成分C1r（アミノ酸193-298）（配列番号２２）、C1s（アミノ酸175-283）（配列番号２３）、Ra−反応因子（RaRF）（アミノ酸185−290）（配列番号２４）およびカルシウム依存性セリンプロテアーゼ（CSP）（アミノ酸181-289）（配列番号２５）の選択されたドメインと比較されている。ほとんどの合意配列は箱に入れられている。
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６０】
マトリプターゼのアミノ末端領域（アミノ酸42-268）（配列番号２０および２１）は、内部相同性を持つもう２個の直列セグメントを含んでいる。これらのセグメントは、元々は補体サブ成分C1r（Leytus等のBiochemistry，25：4855-63（1986）；およびJournet等のBiochem. J.，240：783-7（1986））、および同C1s（Mackinnon等のEur. J. Biochem.，169：547-53（1987）；およびTosi等のBiochemistry，26：8516-24（1987））において同定された部分配列に似ている。このC1r/sドメインは、また、Ra−反応因子、Ｃ４／Ｃ２−活性化成分、エンテロペプチダーゼ、トリプシノゲンの活性化因子（Matsushima等（1994）；Kitamoto等（1994）、および細胞外基質を分解させることができるカルシウム依存性セリンプロテアーゼを含めて他のセリンプロテアーゼ中でも見いだされた。これらのC1r/s−含有セリンプロテアーゼは、プロテアーゼ活性化カスケードまたは細胞外基質分解のいずれかにおいて伴われると思われる。さらに、このC1r/sドメインを含んでいることが見いだされた、亜鉛メタロプロテアーゼのアスタシン亜族（subfamily）の内の少なくとも６つの員子が存在する。これらは、骨形態形成蛋白質−１（Wozney等のScience，242：1528-34（1988））、およびショウジョウバエ属トロイド（tolloid）遺伝子、背側−腹側パターン化用蛋白質（Shimell等のCell，67：469-81（1991））、卵殻基質の分解においてある役割を果たし得るウズラの１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘発アスタシン様メタロペプチダーゼ、（外胚葉系列の分化とそれに続く胎芽のパターン化に関わり得ると思われる）海ウニ胞胚プロテアーゼ−１０、発生段階のマーカーであるアフリカツメガエル胚蛋白質UVS.2.、並びに発生の極く初期の胞胚段階中に空間制限パターンで発現される海ウニVEB遺伝子を含む。これらのC1r/s−含有アスタシンメタロプロテアーゼの大半は、蛋白質−蛋白質相互作用および胚の発生においてある役割を果たしていると思われる。C1r/sドメインは、また、非プロテアーゼ蛋白質にも見いだされた。これらを挙げると、神経系で発生的に発現されるカルシウム独立・細胞接着分子であるニューロピリン（neuropilin）（Ａ５蛋白質）、および炎症および腫瘍形成中に細胞−細胞間および細胞−基質間相互作用に関わりがあり得るだろうヒアルロネート結合性蛋白質である腫瘍壊死因子−誘発性蛋白質TSG-6がある。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７７】
マトリプターゼの２本鎖形態生成のための切断部位の位置を決めるために、４５−kDaおよび２５−kDa成分を各々Ｎ−末端アミノ酸配列分析に付した。２５−kDaのＢ鎖から得られたアミノ酸残基はVVGGTDADEGEWP（配列番号３７）であった。この配列は、多分マトリプターゼ中の活性化モチーフ内の切断部位から始まる。４５−kDaのＡ鎖（２つの主要スポットと１つの副次的スポットを含む）を配列させたとき、２つの部分的に重なり合っている配列（SFVVTSVVAFPTDSKTVQRT（配列番号３８）；TVQRTQDNSCSFGLHARGVE（配列番号３９））が得られ、そしてその両者はマトリプターゼのアミノ末端に近い配列に合った。これら２つの異なるアミノ末端配列はマトリプターゼＡ鎖の２つの主要スポットに由来し、そしてこの２成分の異なる移動速度は異なるアミノ末端に由来することを示唆している。