(57)【要約】本開示は、ハイブリダイゼーションアプローチを用いて体液中のcfDNAを定量化するために使用することができる方法および組成物を提供する。2019528063.tif 000008
2019528063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞溶解を阻害しかつ体液中のヌクレアーゼを阻害するために十分な濃度で、ホルムアルデヒドドナー、キレート剤、アウリントリカルボン酸、およびポリエチレングリコール（PEG）を含む、溶液。
【請求項２】
ホルムアルデヒドドナーがジアゾリジニル尿素である、請求項1記載の溶液。
【請求項３】
キレート剤がEDTAである、請求項1記載の溶液。
【請求項４】
アジ化ナトリウムをさらに含む、請求項1記載の溶液。
【請求項５】
緩衝剤を含む、請求項1または4記載の溶液。
【請求項６】
体液試料をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の溶液。
【請求項７】
体液試料が、臓器移植を受けたことがあるかまたは腎疾患を有する患者に由来する、請求項1〜6のいずれか一項記載の溶液。
【請求項８】
臓器移植が腎移植である、請求項7記載の溶液。
【請求項９】
以下の工程を含む、体液試料中のセルフリーDNA（cfDNA）内のAluコピー数を検出する方法：
ヒトから体液試料を得る工程；
体液試料からcfDNAを抽出する工程；
核酸プローブに相補的であるcfDNAに核酸プローブがハイブリダイズすることを可能にする条件下で、cfDNAを核酸プローブと接触させることによって、反応混合物を形成させる工程であって、核酸プローブが、3'末端および5'末端を有する核酸配列を有し、核酸プローブが、SEQ ID NO:1の20〜292個の連続ヌクレオチドに相補的であり、3'末端または5'末端が、検出可能な標識に共有結合で連結されている、工程；
該プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を定量化し、それによって、体液試料中のセルフリーDNA（cfDNA）内のAluコピー数を検出する工程。
【請求項１０】
前記プローブがSEQ ID NO:2の少なくとも50個の連続ヌクレオチドに相補的である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
反応混合物を形成させる前に請求項1記載の溶液を体液試料と混合する工程をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
体液試料が尿試料であり、
前記方法が、反応混合物中のクレアチニンの量を定量化する工程をさらに含む、
請求項9記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を、尿試料中のクレアチニンの量に対して正規化して、ハイブリダイズしたDNAの正規化された量を得る工程を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
ハイブリダイズしたcfDNAの正規化された量を、腎臓状態を示すカットオフ値と比較する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブにハイブリダイズしたcfDNAの検出された量またはcfDNAの正規化された量がカットオフ値より大きい場合、患者が腎損傷を有すると決定する工程
をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ヒトが腎移植を受けたことがある患者であり、腎損傷が、患者が急性拒絶エピソードを有することを示す、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
ヒトが腎移植を受けたことがある患者であり、
前記方法が、cfDNAの正規化された量と、尿試料が患者から採取された時点での腎臓移植からの期間とに基づき、腎臓の健康を決定するための予測スコアを生成する工程をさらに含む、
請求項15記載の方法。
【請求項１８】
予測スコアが予測スコアのカットオフ値より大きい時、患者が急性拒絶エピソードを有すると決定される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
尿試料が、BKウイルス性腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、急性尿細管壊死、IgA疾患、および糖尿病性腎疾患からなる群より選択される疾患によって引き起こされた腎損傷を有すると推測される個体に由来する、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
CXCL10の量を定量化する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブが、SEQ ID NO:1に相補的な50〜150ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項9記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブが、SEQ ID NO:1に相補的な70〜100ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項9記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブが、SEQ ID NO:1に相補的な80〜90ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項9記載の方法。
【請求項２４】
ヌクレオチド配列が正確に81個のヌクレオチドを有する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
検出可能な標識がビオチンであり、
前記方法が、ストレプトアビジンと連結されたシグナル生成剤と、検出可能な標識とを接触させる工程を含む、
請求項9〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
シグナル生成剤が、化学発光、色、または蛍光を生成する、請求項9記載の方法。
【請求項２７】
患者の腎移植受容から0〜400日後または10〜100日後または20〜50日後または移植腎の寿命中に、尿試料が採取される、請求項9〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
（i）尿試料から抽出された未増幅のセルフリーDNA（cfDNA）と、
（ii）核酸配列を有し3'末端および5'末端を有する核酸プローブと
を含む反応混合物であって、
核酸プローブがSEQ ID NO:1の20〜292個の連続ヌクレオチドに相補的であり、3'末端または5'末端が検出可能な標識に共有結合で連結されている、反応混合物。
【請求項２９】
臓器移植が肺移植である、請求項7記載の溶液。
【請求項３０】
体液試料が気管支肺胞洗浄（BAL）液試料であり、
前記方法が、BAL液の全体積を定量化する工程をさらに含む、
請求項9記載の方法。
【請求項３１】
前記プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を、全BAL液試料体積に対して正規化して、ハイブリダイズしたDNAの正規化された量を得る工程を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
ハイブリダイズしたcfDNAの正規化された量を、肺状態を示すカットオフ値と比較する工程をさらに含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
プローブにハイブリダイズしたcfDNAの検出された量またはcfDNAの正規化された量が、カットオフ値より大きい場合、患者が肺損傷を有すると決定する工程
をさらに含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
ヒトが肺移植を受けたことがある患者であり、肺損傷が、患者が拒絶エピソードを有することを示す、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
以下の工程を含む、臓器損傷を検出する方法：
損傷を有すると推測されるかまたは損傷を発症する可能性が高い臓器から採取された体液試料において、cfDNAの量および1種または複数種のマーカーの量を測定する工程であって、1種または複数種のマーカーが、
（i）1種または複数種の炎症マーカー、
（ii）1種または複数種のアポトーシスマーカー、
（iii）全タンパク質、および
（iv）DNAメチル化マーカーのうちの1つまたは複数
からなる群より選択される、工程；
cfDNAの量および1種または複数種のマーカーの量を使用して、ITスコアを得る工程；
ITスコアが所定のカットオフより高い場合、患者が臓器に損傷を有するかまたは患者が臓器に損傷を発症し得ることを決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2016年8月17日に出願された米国仮出願第62/376,299号に基づく優先権を主張するものであり、その開示は、参照によって事実上その全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
2600万人の米国人が、慢性腎疾患（CKD）、ならびに臓器移植、例えば、腎移植または肺移植の拒絶および機能障害に関連したもののような臓器損傷に罹患している。これらの損傷の処置は、極めて高コストである。例えば、年間メディケア支出の28パーセント、575億ドルが、CKDの処置に費やされている。しかしながら、これらの多くについて、臨床症状が出現するまで、損傷がいつ切迫するかを予測する手段は存在しない。これらの疾患に関連したコストの大きい割合が、より重度の臓器損傷をもたらし、より高度のより高価な治療的介入を必要とする、早期検出の欠如によるものである。腎臓病理の早期検出の方法は、医療費の低下およびより効果的な治療的介入を可能にするであろう。
【０００３】
臓器損傷、例えば腎損傷の検出は、伝統的に、高コストかつ侵襲性である生検材料の調査に基づいている。より最近、死細胞由来のセルフリーDNA（cfDNA）が、ヒト尿において発見された。最近の努力は、臓器損傷ではなく同種移植片拒絶のマーカーとして、cfDNAについて尿を試験することに集中しており、さらに、その技術は、ドナー特異的SNPの検出またはAlu要素の測定のためのPCRまたは次世代配列決定の使用に限定されている。これらの方法は、腎臓拒絶についての試験に限定されており、消耗品および装置の両方が高価であり、比較的多量のDNAを必要とし、ハイスループットではないため、限界を有する。さらに、断片化されていない完全なDNAが、Aluを測定するためのqPCRに基づくアプローチのために最適であるが、＜150bpの断片サイズのDNAについてDNA定量化の有意な低下（75％の低下）が存在することが見出されたため、それらは、150bpより短い断片長を検出し得ない可能性がある（Sedlackova et al., Biol. Proced. Online (2013) 15: 5. doi: 10.1186/1480-9222-15-5（非特許文献1））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sedlackova et al., Biol. Proced. Online (2013) 15: 5. doi: 10.1186/1480-9222-15-5
【発明の概要】
【０００５】
尿および気管支肺胞洗浄（BAL）のような体液におけるセルフリーDNAの定量分析のための新規方法論が提供される。本明細書中に記載された局面には、体液細胞DNAを安定化することができる保存試薬カクテル、体液中のヒトAluリピートを定量化するハイブリダイゼーションアッセイによってcfDNAを測定する方法、および腎損傷についての定量的リスクスコアを提供するための変量を臨床アッセイにおいて要因として含める新規の分析法が含まれる。いくつかのケースにおいて、メチル化マーカー（例えば、5-メチルシトシン）、組織炎症マーカー（例えば、CXCL10）、アポトーシスマーカー（例えば、クラスタリンのような腎尿細管損傷マーカー）、全タンパク質、および/またはクレアチニンのような、試料中の付加的なマーカーの量が、測定される。これらの局面は、腎移植術および腎疾患の状況において腎臓の健康を査定するために使用され得る。
【０００６】
一つの局面において、本開示は、細胞溶解を阻害しかつ尿中のヌクレアーゼを阻害するために十分な濃度で、ホルムアルデヒドドナー、キレート剤、アウリントリカルボン酸、およびポリエチレングリコール（PEG）を含む溶液、例えば、無菌溶液を提供する。いくつかの態様において、溶液は、アジ化ナトリウムおよび/または緩衝剤をさらに含む。いくつかの態様において、溶液は、体液試料をさらに含む。いくつかの態様において、体液試料は、腎臓または肺の臓器損傷の非侵襲的な測定のために選択される流出液として、尿試料またはBAL試料である。いくつかの態様において、尿試料は、腎移植を受けたことがある患者または急性もしくは慢性の腎損傷を有する患者に由来し、他の態様において、それは、肺移植を受けたことがある患者または肺損傷を有する患者に由来する気管支肺胞洗浄（BAL）液である。
【０００７】
一つの局面において、本開示は、体液試料中のAluコピー数を検出する方法を提供し、本法は、尿またはその他の体液試料をヒトから得る工程；cfDNAを試料から抽出する工程；プローブに相補的であるcfDNA内のDNAにプローブがハイブリダイズすることを可能にする条件の下で、cfDNAを核酸プローブと接触させることによって、反応混合物を形成させる工程であって、核酸プローブは、3'末端および5'末端を有する核酸配列を有し、核酸プローブは、SEQ ID NO:1の20〜292個の連続ヌクレオチドに相補的であり、3'末端または5'末端は、検出可能な標識に共有結合で連結されている、工程；およびプローブにハイブリダイズしたDNAの量を定量化する工程を含む。いくつかの態様において、プローブは、SEQ ID NO:2の少なくとも50個の連続ヌクレオチドに相補的である。いくつかの態様において、プローブは、SEQ ID NO:1に相補的な50〜150ヌクレオチド、70〜100ヌクレオチド、80〜90ヌクレオチド、または正確に81ヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、検出可能な標識はビオチンであり、本方法は、検出可能な標識をストレプトアビジンと連結されたシグナル生成剤と接触させる工程を含む。
【０００８】
いくつかの態様において、反応混合物を形成させる前に、細胞溶解を阻害しかつ尿中のヌクレアーゼを阻害するために十分な濃度で、ジアゾリジニル尿素、EDTA、アウリントリカルボン酸、およびポリエチレングリコール（PEG）を含む溶液を混合する工程。いくつかの態様において、本方法は、反応混合物中のクレアチニンの量を定量化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、cfDNAの正規化された量を得るため、プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を、尿試料中のクレアチニンの量に対して正規化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、ハイブリダイズしたDNAの正規化された量を得るため、プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を、尿試料中のクレアチニンの量に対して正規化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、プローブにハイブリダイズした標的DNA（例えば、cfDNA）の検出された量または標的DNA（例えば、cfDNA）の正規化された量が、カットオフ値より大きい場合、患者が腎損傷を有すると決定する工程をさらに含む。
【０００９】
いくつかの態様において、ヒトは、腎移植または肺移植を受けたことがある患者であり、腎損傷または肺損傷の存在は、患者が急性拒絶エピソードを有する可能性があることを示す。いくつかの態様において、本方法は、標的DNA（例えば、cfDNA）の正規化された量および腎移植後時間に基づき、腎臓または肺の健康を決定するための予測スコアを得る工程をさらに含む。予測スコアが予測スコアのカットオフ値より大きい時、患者は急性拒絶エピソードを有すると決定される。いくつかの態様において、尿試料またはBAL試料は、患者の腎移植または肺移植の受容から0〜400日後または10〜100日後または20〜50日後に採取される。
【００１０】
いくつかの態様において、尿試料は、BKウイルス性腎炎、巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）、腎結石、急性尿細管壊死（ATN）、IgA腎症（IgAN）、ならびに糖尿病性腎疾患、または高血圧および自己免疫障害（例えば、SLY、慢性関節リウマチ）のような全身性疾患からの腎疾患からなる群より選択される疾患によって引き起こされた腎損傷を有すると推測される個体に由来する。
【００１１】
いくつかの態様において、本方法は、炎症負荷を反映するバイオマーカーの追加を通して、より大きい特異度および感度をアッセイに与えるため、反応混合物中のCXCL10の量を定量化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、内因性の組織損傷の存在をさらに定義する循環DNAのメチル化状態を反映するため、メチル化cfDNAおよびヒドロキシメチル化cfDNAの割合または絶対量を定量化する工程をさらに含む。
【００１２】
別の局面において、本開示は、（例えば、いくつかの態様において、腎移植を受けたことがある患者に由来する）尿試料から抽出された未増幅のセルフリーDNA（cfDNA）と、（ii）核酸配列を有し3'末端および5'末端を有する核酸プローブとを含む反応混合物を提供し、ここで、核酸プローブは、SEQ ID NO:1の20〜292個の連続ヌクレオチドに相補的であり、3'末端または5'末端は、検出可能な標識に共有結合で連結されている。反応混合物は、本明細書中に記載された成分のいずれかを含み得る。
【００１３】
別の局面において、肺移植または肺移植臨床状態を有する個体に由来する体液試料中のセルフリーDNA（cfDNA）内のAluコピー数を検出する方法が、本明細書中に提供される。本方法は、体液試料、例えば、気管支肺胞洗浄（BAL）液試料をヒトから得る工程；cfDNAを体液試料から抽出する工程；核酸プローブに相補的であるcfDNA内のDNAに核酸プローブがハイブリダイズすることを可能にする条件の下で、cfDNAを核酸プローブと接触させることによって、反応混合物を形成させる工程であって、核酸プローブは、3'末端および5'末端を有する核酸配列を有し、核酸プローブは、SEQ ID NO:1の20〜292個の連続ヌクレオチドに相補的であり、3'末端または5'末端は、検出可能な標識に共有結合で連結されている、工程；およびプローブにハイブリダイズしたDNAの量を定量化し、それによって、体液試料中のセルフリーDNA（cfDNA）内のAluコピー数を検出する工程を含む。いくつかの態様において、体液試料は、気管支肺胞洗浄（BAL）液試料であり、本方法は、BAL液の全体積を定量化する工程をさらに含む。
【００１４】
いくつかの態様において、本方法は、ハイブリダイズしたcfDNAの正規化された量を得るため、プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量を、全BAL液試料体積に対して正規化する工程をさらに含む。
【００１５】
いくつかの態様において、本方法は、ハイブリダイズしたDNAの正規化された量を、肺状態を示すカットオフ値と比較する工程をさらに含む。
【００１６】
いくつかの態様において、本方法は、プローブにハイブリダイズした標的DNA（例えば、cfDNA）の検出された量または標的DNA（例えば、cfDNA）の正規化された量がカットオフ値より大きい場合、患者が肺損傷を有すると決定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、ヒトは、肺移植を受けたことがある患者であり、肺損傷は、患者が拒絶エピソードを有することを示す。
【００１７】
いくつかの態様において、本方法は、プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量および反応混合物中のクレアチニンの量に基づき、KITスコアを生成する工程をさらに含む。いくつかの態様において、KITスコアは、クレアチニンの量に対する、プローブにハイブリダイズしたDNAの量の比を使用して生成される。いくつかの態様において、KITスコアは、プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量、体液試料中に存在するクレアチニン、1種もしくは複数種の炎症マーカー（例えば、CXCL10）、1種もしくは複数種のアポトーシスマーカー（例えば、クラスタリンのような腎尿細管損傷マーカー）、および/または1種もしくは複数種のDNAメチル化マーカーの量を使用して、ロジスティック回帰のような一般化線形モデルの使用によって生成される。いくつかの態様において、ニューラルネットワーク、一般加法モデル、類似性最小二乗法、および再帰分割法からなる群より選択される非線形回帰モデルが、KITスコアを開発するために使用されてもよい。いくつかの態様において、KITスコアが、KITアッセイにおける個々のマーカーの使用より大きい、臓器損傷の診断および予測のための感度および特異度をもたらすよう、KITスコアは、CXCL10、クラスタリン、およびDNAメチル化マーカーの群より選択される付加的なバイオマーカーを使用して生成される。KIT損傷スコアは、血清クレアチニンもしくは尿タンパク質のような、腎機能の現在のマーカー、または強制呼気量（「FEV」）および努力肺活量（「FVC」）のような、肺機能の現在のマーカーよりも大きい感度で、臓器損傷を検出する。いくつかの態様において、前記のITスコア、例えば、KITスコアの使用は、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％の感度、および/または少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％の特異度で、腎損傷を検出することができる。いくつかの態様において、前記のKITスコアの使用は、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96.9％、または少なくとも99.4％のAUCで、腎損傷を検出することができる。
【００１８】
いくつかの態様において、本開示は、以下の工程を含む臓器損傷を検出する方法を提供する：損傷を有すると推測されるかまたは損傷を発症する可能性が高い臓器から採取された体液試料において、cfDNAの量および1種または複数種のマーカーの量を測定する工程であって、1種または複数種のマーカーは、（i）1種または複数種の炎症マーカー、（ii）1種または複数種のアポトーシスマーカー、（iii）全タンパク質、および（iv）DNAメチル化マーカーのうち1つまたは複数からなる群より選択される、工程；cfDNAの量および1種または複数種のマーカーの量を使用してITスコアを得る工程；ならびにITスコアが所定のカットオフより高い場合、患者が臓器に損傷を有するかまたは患者が臓器に損傷を発症し得ることを決定する工程。いくつかの態様において、臓器損傷は腎損傷である。いくつかの態様において、ITスコアは、クレアチニンをさらに含めることによって得られる。いくつかの態様において、ITスコアは、プローブにハイブリダイズしたcfDNAの量、体液試料中に存在するクレアチニン、1種もしくは複数種の炎症マーカー（例えば、CXCL10）、1種もしくは複数種のアポトーシスマーカー（例えば、クラスタリンのような腎尿細管損傷マーカー）、クレアチニン、および/または1種もしくは複数種のDNAメチル化マーカーの量を使用して、数学モデルを使用することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】DNA保存溶液の非存在下では、72時間で完全にDNAが分解され崩壊するが；DNA保存溶液は、72時間までのDNA完全性の維持を助けることを証明する電気泳動図を示す。
【図１−２】DNA保存溶液の非存在下では、72時間で完全にDNAが分解され崩壊するが；DNA保存溶液は、72時間までのDNA完全性の維持を助けることを証明する電気泳動図を示す。
【図２】図2は、cfDNA分析のためのAlu検出における、本明細書中に開示された方法の使用と、標準的なPCRに基づく方法の使用とを比較する。
【図３】図3は、Aluリピートに相補的な二重ビオチン化オリゴヌクレオチドを示す。
【図４】図4は、化学発光アッセイ系を使用した、少なくとも5桁を有する本明細書中に開示されたアッセイのダイナミックレンジを示す。
【図５Ａ】図5A〜5Dは、腎移植拒絶（図5A〜5B）、ネイティブ腎疾患（図5C）を区別するための本明細書中に開示されたアッセイの使用、および腎損傷の検出におけるタンパク尿より改善されたその性能（図5D）を示す。
【図５Ｂ】図5Aに記載の通り。
【図５Ｃ】図5Aに記載の通り。
【図５Ｄ】図5Aに記載の通り。
【図６】図6は、尿中のY染色体コピー数と1番染色体コピー数との間の相関が、本開示の方法をバリデートすることを示す。
【図７】図7は、腎移植を受けかつ急性拒絶エピソードを経験しなかった9人の患者からのデータを使用した、移植術後日数に対するcfDNA/クレアチニン比の変化を示す指数関数的減衰曲線を示す。
【図８】図8Aは、移植術後日数に対するcfDNA/クレアチニン比の変化を示し、図8Bは、移植術後日数に対する腎損傷試験（KIT）スコアの変化を示す。
【図９】図9Aおよび9Bは、患者＃2および患者＃3における急性拒絶を予測するためのcfDNA/クレアチニン比の使用を示す。
【図１０】図10Aおよび10Bは、患者におけるIgA腎症（自然発生腎疾患）を検出するための、本明細書中に開示された方法の使用を示す。この研究において、個体（他の方法によって事前に決定されたように、そのうちの117人が健康であり、85人がIgA腎症を有していた）に由来する尿試料を、本明細書中に開示された方法を使用して分析した。図10Aは、健康な個体（「正常」）とIgA腎症を有する個体（「IgA」）との間の、検出されたcfDNA/クレアチニン比の違いを示す。ROC分析は、ROC曲線のAUCが0.9651であり、その信頼区間が0.9431〜0.9871、P値が＜0.0001であることを示す。図10B。
【図１１】図11は、安定肺移植を有する個体（「STA」）に由来する気管支肺胞洗浄（BAL）液中に見出されたcfDNA濃度と、潜在的な急性または慢性の拒絶を起こした個体（「拒絶」）に由来する気管支肺胞洗浄（BAL）液中に見出されたcfDNA濃度との比較を示す。p値は0.0427であった。
【図１２】図12は、尿からのcfDNAおよびクレアチニンの測定値を使用して生成されたKITスコアの関数としての、腎移植患者における急性腎臓拒絶の確率についての予測曲線を示す。腎移植を受けたことがある41人の患者から、本明細書中に開示されるように、尿試料を収集した。尿中のcfDNAおよびクレアチニンの測定値を、各患者から得た。
【図１３】図13は、腎損傷の複数の原因を有する490の臨床試料のデータセットに基づく、腎損傷を査定するためのKITスコアの使用を示す。
【図１４Ａ】図14A〜Eは、腎損傷、ならびに腎損傷に関連した様々な疾患、即ち、II型糖尿病、免疫応答、腎結石、移植拒絶、および高血圧の確率を予測するための一般化線形モデル、ならびに関連ROC曲線の使用を示す。
【図１４Ｂ】図14Aに記載の通り。
【図１４Ｃ】図14Aに記載の通り。
【図１４Ｄ】図14Aに記載の通り。
【図１４Ｅ】図14Aに記載の通り。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
定義
「a」、「an」、または「the」という用語には、本明細書中で使用されるように、一つのメンバーを含む局面が含まれるのみならず、複数のメンバーを含む局面も含まれる。例えば、単数形「a」、「an」、および「the」には、前後関係が他のことを明白に指示しない限り、複数の指示が含まれる。従って、例えば、「細胞（a cell）」との言及には、複数のそのような細胞が含まれ、「薬剤（the agent）」との言及には、当業者に公知の一つまたは複数の薬剤の言及が含まれ、他も同様である。
【００２１】
「対象」、「患者」、または「個体」という用語は、ヒトまたは動物をさすために、本明細書中で交換可能に使用される。例えば、動物対象は、哺乳動物、霊長類（例えば、サル）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、もしくはヤギ）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）、実験用試験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的に重要な動物、または経済学的に重要な動物であり得る。
【００２２】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖型または二本鎖型のいずれかのそれらのポリマーが含まれる。特に限定されない限り、その用語には、参照核酸と類似した結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有している核酸が包含される。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされたmRNAと交換可能に使用される。
【００２３】
「腎損傷状態」という用語は、患者が腎臓に損傷を示すか否かをさす。本開示の目的のため、腎損傷は、腎移植のような手術に起因してもよいしまたは何らかの腎疾患に起因してもよい。
【００２４】
「腎移植術」または「腎移植」という用語は、患者への腎臓の臓器移植をさす。ドナー腎臓の起源は、死体ドナーに由来してもよいしまたは生体ドナーに由来してもよい。
【００２５】
「Alu」または「Alu要素」または「Aluリピート」という用語は、アルスロバクター・ルテウス（Arthrobacter luteus）制限エンドヌクレアーゼの作用によって最初に特徴決定された、DNAの約300塩基対長の短いストレッチをさす。Alu要素は、ヒトゲノム内の最も豊富な反復要素である。それらは細胞質低分子7SL RNAに由来する。SEQ ID NO:1は、例示的なヒトAluリピートを表す。
【００２６】
「ハイブリダイズする」という用語は、1種または複数種のプローブの標的ヌクレオチド配列へのアニーリングをさす。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的なハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
【００２７】
「体液」または「体液試料」という用語は、例えば、物理学的特徴、生化学的特徴、化学的特徴、および/または生理学的特徴に基づき、特徴決定されかつ/または同定されるべき、個体から採取されるまたは個体に由来する液状組成物をさす。体液の非限定的な例には、血液、血清、血漿、唾液、啖、胃液、精液、涙、および汗が含まれる。一つの態様において、体液は尿である。別の態様において、体液はBALである。
【００２８】
「移植術後」という用語は、臓器、例えば、腎臓または肺のドナーから患者への移植術後の時間をさす。
【００２９】
本明細書中で使用されるように、「AUC」という用語は、ROC（受信者動作特性）曲線分析の範囲内で調査される「曲線下面積」またはC統計量をさす。AUCは、単一の値を有する試験（またはアッセイ）カット点の範囲全体における試験、アッセイ、または方法の感度および特異度の表示を可能にする指標である。アッセイのAUCは、横軸の1-特異度に対して、アッセイの感度が縦軸にプロットされた図から決定される。より高いAUCは、試験のより高い正確度を示し；1のAUC値は、全ての試料が正確に割り当てられたことを意味し（1の特異度および感度）、50％のAUC値は、試料が当て推量の確率で割り当てられており、従って、そのパラメータは意義を有しないことを意味する。
【００３０】
診断的または予後判定的な試験の正確度を評価するためのROC曲線分析を通したAUCの使用は、例えば、Pepe et al.,「Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic,Prognostic,or Screening Marker,」Am.J.Epidemiol 2004,159(9):882-890および「ROC Curve Analysis:An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein levels In Identifying Subjects With Coronary Artery Disease,」Clin.Chem.,1992,38(8):1425-1428に記載されるように当技術分野において周知である。CLSI Document EP24-A2:Assessment of the Diagnostic Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic Curves;Approved Guideline - Second Edition.Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011;CLSI Document I/LA21-A2:Clinical Evaluation of Immunoassays;Approved Guideline - Second Edition.Clinical and Laboratory Standards Institute;2008も参照されたい。
【００３１】
本明細書中で使用されるように、「診断する」という用語は、症状または現象を疾患または損傷に割り当てることを意味する。本発明の目的のため、診断とは、対象における臓器損傷の存在を決定することを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用されるように、「予測する」という用語は、臓器損傷が対象において発生する可能性が高いか否かに関して予測することをさす。
【００３３】
1．腎損傷状態
個体における腎損傷状態、即ち、腎損傷の有無を査定するために使用され得る組成物および方法が、提供される。そのような査定は、医学的問題に取り組むためのより多くの薬物治療の投与、またはもはや医学的に必要でない場合の薬物治療の減少（停止を含む）のような、いつ個体が医学的介入を必要とするかを診断するために役立つ。例えば、本明細書中に記載された組成物および方法は、いつ個体が腎移植または腎疾患による腎損傷を有するかを決定するために使用され得る。
【００３４】
腎損傷は、腎移植を受けた患者において発生し得る。これは、例えば、虚血再灌流損傷、サイズミスマッチ、ドナー関連要因、細胞によって媒介される拒絶、および抗体によって媒介される拒絶のようないくつかの免疫要因および非免疫要因のため、起こり得る。移植後の問題には、移植拒絶（超急性、急性、または慢性）、拒絶のリスクを減少させるために必要とされる免疫抑制薬による感染および敗血症、移植後リンパ増殖性障害（免疫抑制薬によるリンパ腫の一種）、とりわけ骨問題をもたらし得るカルシウムおよびリン酸を含む電解質の不均衡、ならびに胃腸炎ならびに胃および食道の潰瘍形成、多毛（男性パターン分布の過剰な発毛）、脱毛、肥満、ざ瘡、2型糖尿病、高コレステロール血症、ならびに骨粗鬆症を含む薬物治療のその他の副作用が含まれ得る。
【００３５】
腎損傷は、腎疾患を有する患者においても発生し得る。腎疾患は多様であるが、腎疾患を有する個体は、特徴的な臨床的特色を示すことが多い。腎臓が関与する一般的な臨床状態には、腎炎症候群およびネフローゼ症候群、腎膿胞、急性腎損傷、慢性腎疾患、糖尿病誘発腎症、尿路感染、腎結石症、および尿路閉塞、糸球体腎炎（GN）、巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）、IgA腎症（IgAN）、メサンギウム毛細管性腎症、ループス腎症、および膜性腎症等、高血圧性腎症、ならびに薬物誘発腎症が含まれるが、これらに限定されるわけではない。腎疾患には、存在する腎臓の様々な癌も含まれ得る。例えば、そのような癌には、腎細胞癌、腎盂の尿路上皮癌、扁平上皮癌、傍糸球体細胞腫（レニノーマ（reninoma））、血管筋脂肪腫、腎膨大細胞腫、ベリーニ管癌、腎臓の明細胞肉腫、中胚葉腎腫、ウィルムス腫瘍、混合型上皮間質腫瘍、明細胞腺癌、移行上皮癌、内反性乳頭腫、腎リンパ腫、奇形腫、癌肉腫、および腎盂のカルチノイド腫瘍が含まれるが、これらに限定されるわけではない。腎疾患は、ウイルスによっても誘発され得、BKV腎症ならびにEBVおよびCMVによって誘発された腎症を含むが、これらに限定されるわけではない。いくつかの薬物治療は腎毒性である（腎臓を害するリスクが高い）ため、腎疾患は、薬物によって誘発されたものでもあり得る。最悪のケースにおいて、薬物は腎不全を引き起こし、他のケースにおいて、腎臓は損なわれるが不全とはならない。一般的な腎毒性の薬物には、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、いくつかの抗生物質、いくつかの鎮痛薬、およびいくつかの画像法のために使用される造影剤色素が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３６】
いくつかの態様において、腎移植、または前記のリストされた腎障害もしくは前記の腎移植臨床状態のうちの一つを有する個体に由来する尿試料が、本明細書中に記載されるようにアッセイされる。
【００３７】
2．肺損傷状態
肺損傷状態、即ち、個体における肺損傷の有無を査定するために使用され得る組成物および方法が、本明細書中に提供される。そのような査定は、医学的問題に取り組むためのより多くの薬物治療の投与、またはもはや医学的に必要でない場合の薬物治療の減少（停止を含む）のような、いつ個体が医学的介入を必要とするかを診断するために役立つ。例えば、本明細書中に記載された組成物および方法は、いつ個体が肺移植による肺損傷を有するかを決定するために使用され得る。
【００３８】
肺損傷は、肺移植を受けた患者において発生し得る。これは、例えば、虚血再灌流損傷、サイズミスマッチ、ドナー関連要因、細胞によって媒介される拒絶、および抗体によって媒介される拒絶のようないくつかの免疫要因および非免疫要因のため、起こり得る。肺移植術後の問題には、超急性拒絶、急性拒絶、拘束性同種移植片症候群（RAS）または閉塞性細気管支炎症候群（BOS）のようないくつかの型の慢性拒絶または慢性肺同種移植片機能障害（CLAD）、拒絶のリスクを減少させるために必要とされる免疫抑制薬による感染および敗血症が含まれ得る。
【００３９】
いくつかの態様において、肺移植または前記の肺移植臨床状態を有する個体に由来する体液試料、例えば、気管支肺胞洗浄（BAL）液試料が、本明細書中に記載されるようにアッセイされる。従って、いくつかの態様において、肺移植または肺移植臨床状態を有する個体に由来する体液試料中のセルフリーDNA（cfDNA）内のAluコピー数を検出する方法が、本明細書中に提供される。本方法は、体液試料、例えば、気管支肺胞洗浄（BAL）液試料をヒトから得る工程；体液試料からcfDNAを抽出する工程；プローブに相補的であるcfDNA内のDNAにプローブがハイブリダイズすることを可能にする条件の下でcfDNAを核酸プローブと接触させることによって反応混合物を形成させる工程；およびプローブにハイブリダイズしたDNAの量を定量化し、それによって、体液試料中のセルフリーDNA（cfDNA）内のAluコピー数を検出する工程を含み、ここで、核酸プローブは3'末端および5'末端を有する核酸配列を有し、核酸プローブはSEQ ID NO:1の20〜292個の連続ヌクレオチドに相補的であり、3'末端または5'末端は検出可能な標識に共有結合で連結されている。
【００４０】
ハイブリダイズしたDNAの正規化された量を得るため、プローブにハイブリダイズしたDNAの量を、体液試料の全体積に対して正規化することができる。いくつかのケースにおいて、ハイブリダイズしたDNAの正規化された量は、肺状態を示すカットオフ値と比較される。いくつかのケースにおいて、本方法は、プローブにハイブリダイズした標的DNA（例えば、cfDNA）の検出された量または標的DNA（例えば、cfDNA）の正規化された量がカットオフ値より大きい場合、患者が肺損傷を有すると決定する工程をさらに含む。
【００４１】
3．保存カクテル
いくつかの局面において、体液セルフリーDNA（「cfDNA」）を安定化することができる保存試薬カクテルが提供される。いくつかの態様において、保存カクテルは、ホルムアルデヒドドナーおよびカルシウムキレート剤のようなキレート剤を含む溶液である。ホルムアルデヒドドナーの非限定的な例には、ジアゾリジニル尿素およびイミダゾリジニル尿素が含まれる。キレート剤の非限定的な例には、EDTAおよびEGTAが含まれる。いくつかの態様において、溶液は、PEG、アウリントリカルボン酸の一方または両方をさらに含む。いくつかの態様において、溶液は、アジ化ナトリウムおよび緩衝剤をさらに含む。緩衝剤の非限定的な例には、PBS、TAPS、ビシン、トリス、トリシン、HEPES、TES、MOPS、PIPES、カコジル酸、およびMESが含まれる。いくつかの態様において、溶液は、ヌクレアーゼによるcfDNAの分解を防止しかつ/または細胞溶解を阻害することによって、体液（例えば、尿）を保存することができる濃度で、それぞれの成分を含む。cfDNAの安定化に加えて、溶液は、体液中に存在する細胞の安定化を通してゲノムDNA混入を防止することもできる。様々な分子量のPEGおよび様々な型のEDTAを、前記の所望の特性を提供するため、このカクテルにおいて使用することができる。一つの態様において、カクテルにおいて使用されるPEGは、PEG 35,000である。一つの態様において、EDTAは、Na2EDTAである。一つの態様において、EDTAは、K2EDTAである。一つの態様において、EDTAは、K3EDTAである。
【００４２】
典型的には、カクテルは、濃縮されたストック溶液、例えば、100倍、20倍、10倍、5倍、または2倍に濃縮されたストック溶液として調製され、アッセイすべき体液、例えば、尿試料と混合され、最終ワーキング濃度に希釈される。例えば、尿と混合した後に10倍希釈されるであろう10倍濃度のカクテルの場合、ジアゾリジニル尿素の濃度は、0.1g/L〜50g/L、例えば、0.5g/L〜30g/L、1g/L〜20g/L、5g/L〜20g/L、5g/L〜15g/L、または5g/L〜10g/Lであり得；PEG 35,0000の濃度は、0.2g/L〜50g/L、例えば、0.5g/L〜40g/L、1g/L〜30g/L、20g/L、または15g/L〜25g/Lであり得；アウリントリカルボン酸の濃度は、0.1mM〜10mM、例えば、0.2mM〜10mM、0.5mM〜5mM、0.5mM〜2mM、または1mM〜2mMであり得る。EDTAの濃度は、1mM〜100mM、例えば、2mM〜50m、5mM〜40mM、5mM〜20mM、または10mM〜20mMであり得る。10倍濃縮ストック溶液は、1mM〜100mM、2mM〜50mM、5mM〜20mM、または10mM〜15mMの濃度でアジ化ナトリウムを含み得る。カクテルは、リン酸緩衝液生理食塩水（PBS）のような緩衝液、例えば、10倍濃縮ストック溶液においては10×PBSを含み得る。
【００４３】
いくつかのケースにおいて、カクテルは、粉末または固体錠剤のフォーマットで提供され、水もしくは水性緩衝液または体液自体を添加することによって、溶液へと再生される。
【００４４】
ある種の態様において、カクテルは、約10g/Lジアゾリジニル尿素、約20g/Lポリエチレングリコール、約1mMアウリントリカルボン酸、約10mM K2EDTA、約10mMアジ化ナトリウム、および/または約1×リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4を含む。
【００４５】
4．核酸プローブ
Alu遺伝子は、癌を有する患者においてcfDNAの量を査定するため、様々な領域の増幅について広範に研究されている（Biol Proced Online(2013);Park et al.,Oncol Lett(2012)）。一つの局面において、本発明は、cfDNA内のAluリピートにハイブリダイズする標識された核酸プローブを使用することによって、体液中のcfDNAの量を査定する方法を提供する。
【００４６】
いくつかの態様において、核酸プローブは、SEQ ID NO:1：
2019528063.tif 000003
の少なくとも20〜300個、例えば、20〜292個、20〜180個、50〜150個、70〜100個、80〜90個の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれらに完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
いくつかの態様において、プローブは、SEQ ID NO:2：
2019528063.tif 000004
の少なくとも20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、または81個の連続ヌクレオチドを含むかまたはそれらに完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
核酸プローブに関して本明細書中で言及されたヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、例えば、シトシン、グアニン、チミン、アデノシン、または修飾型ヌクレオチドであり得る。修飾型ヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドに所望の特性（例えば、標的核酸内の相補的なヌクレオチドと塩基対形成する能力）を提供する異なるヌクレオチドに、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも1個のヌクレオチドが交換される改変をさす。修飾型ヌクレオチドの非限定的な例には、ロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、モルホリノ、および米国特許公開第20160177377号に記載されたものが含まれる。
【００４９】
いくつかの態様において、プローブのヌクレオチド配列は、検出可能な標識にコンジュゲートされる。標的、即ち、cfDNA内のAluリピートへのプローブのハイブリダイゼーションを阻害しない限り、検出可能な標識はプローブの任意のヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列の5'末端は、1個または複数個（例えば、2個以上）の検出可能な標識にコンジュゲートされる。いくつかの態様において、検出可能な標識は、それ自体、シグナル生成剤にコンジュゲートされる。いくつかの態様において、検出可能な標識は、結合パートナーに結合することができる分子であり、結合パートナーは、シグナル生成剤に連結される。例えば、いくつかの態様において、検出可能な標識がビオチンであり、結合パートナーがストレプトアビジンであるか、またはその逆である。いくつかの態様において、検出可能な標識がジゴキシゲニンであり、その結合パートナーが抗ジゴキシゲニンであるか、またはその逆である。いくつかの態様において、検出可能な標識が2,4-ジニトロフェノール（DNP）であり、結合パートナーが抗DNPであるか、またはその逆である。当業者に公知の他の標識も、本明細書中に開示された核酸プローブにおいて使用され得る。シグナル生成剤は、化学発光、色、または蛍光を含むが、これらに限定されるわけではない定量可能なシグナルを生成する任意の薬剤であり得る。シグナル生成剤の非限定的な例には、酵素、蛍光分子等が含まれる。検出可能な標識およびシグナル生成剤の他の非限定的な例は、参照によって本明細書に組み入れられるUS20130209990に見出され得る。一つの好ましい態様において、シグナル生成剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。
【００５０】
いくつかのケースにおいて、プローブのヌクレオチド配列の3'末端が、1個または複数個の検出可能な標識にコンジュゲートされる。いくつかのケースにおいて、ヌクレオチド配列の5'末端および3'末端の両方が、1個または複数個の検出可能な標識にコンジュゲートされる。プローブにコンジュゲートされる検出可能な標識の数は、変動することができ、例えば、その数は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、10、15、18、またはそれ以上であり得る。通常より多数の検出可能な標識は、より高いシグナルをアッセイにおいて生成するであろう（Division et al., Nucleic Acids Res. (1988) 16: 4077-4095）。当業者は、体液に由来するセルフリーDNA内の標的、例えば、Aluリピートを検出するために必要とされるシグナルの量に基づき、使用すべき検出可能な標識の数を容易に決定することができる。
【００５１】
一つの態様において、プローブの核酸配列の5'末端または3'末端は、1個のビオチンにコンジュゲートされる。一つの態様において、核酸配列にコンジュゲートされるビオチンの総数は、1もしくは18またはその中間の任意の数である。1個または複数個のビオチンは、全て、核酸プローブの同一の5'末端または3'末端にコンジュゲートされ得る。1個または複数個のビオチンは、任意の組み合わせで、両端にコンジュゲートされてもよい。いくつかの態様において、2個のビオチンが、プローブの核酸配列にコンジュゲートされる。一つの態様において、2個のビオチンが、プローブの核酸配列の5'末端にコンジュゲートされる。
【００５２】
本明細書中に記載された核酸プローブは、当技術分野において公知の任意の適当な方法、例えば、化学合成、天然に存在する起源からの単離、組換え作製、および非対称PCRによって作製され得る（McCabe,1990 In:PCR Protocols:A guide to methods and applications.San Diego,Calif.,Academic Press,76-83）。1種または複数種のセグメントとしてプローブを化学合成し、その後、セグメントを連結することが好ましい場合もある。いくつかの化学合成法が、参照によって本明細書中に組み入れられる、Narangら（1979 Meth.Enzymol.68:90）、Brownら（1979 Meth.Enzymol.68:109）、およびCaruthersら（1985 Meth.Enzymol.154:287）によって記載されている。あるいは、クローニング法によって、プロモータープライマーとして使用するために単離され得る便利な核酸断片が提供され得る。二本鎖DNAプローブを、最初に、例えば、従来の変性法を使用して一本鎖にした後、体液中のcfDNA内の標的にハイブリダイズさせてもよい。
【００５３】
5．使用の方法
いくつかの態様において、本方法は、（事前に増幅されていない）cfDNAを固体支持体に連結する工程、Aluリピートに特異的なプローブをcfDNAにハイブリダイズさせる工程、未結合のプローブを除去（例えば、洗浄して除去）する工程、次いで、特異的にハイブリダイズしているプローブの量を検出し、それによって、試料中のcfDNAの量を決定する工程を含む。
【００５４】
a．体液試料の採取
個体、例えば、臓器損傷を有すると推測される個体に由来する体液試料、例えば、尿またはBALを、医療従事者によって推奨される任意の様式で収集することができ、例えば、中間尿を無菌容器に収集することができる。いくつかの態様において、次いで、細胞成分を除去し、それによって、セルフリー試料を作製するため、遠心分離を通して試料を加工する。任意で、試料は、緩衝液（例えば、PBSもしくはトリス）および/または前記の保存カクテルと混合されてもよい。試料は、さらなる分析まで、-80℃で保管されてもよい。いくつかの態様において、前記の保存カクテルが、混合物を作製するため、体液試料に添加される。いくつかの態様において、混合物は、cfDNAの抽出のため、等分され得る。
【００５５】
b．セルフリーDNAの抽出
セルフリーDNAを抽出する方法は、当技術分野において周知であり、市販のキット、例えば、Qiagen（Valencia,California）のQIAamp（登録商標）Circulating Nucleic Acids Kitが、容易に入手可能である。通常細胞片を分解し、DNaseおよびRNaseを除去するため、試料を処理して、溶解物を作製することができる。例えば、溶解物をDNA結合カラムに通すことによって、溶解物中のDNAを抽出することができ、結合したDNAを水または緩衝液で溶出させることができる。任意で、溶出液のアリコートを、回収されたcfDNAの濃度を決定するために採取することができる。
【００５６】
cfDNAは、その後、固体支持体に連結される。固体支持体は、含有容器、ビーズ、またはその他の固体支持体であり得る。いくつかの態様において、cfDNAは、所望の容器、例えば、マルチウェルプレートのウェルに置かれ、cfDNAがウェルの表面に結合することを可能にするために十分な期間、インキュベートされる。いくつかの態様において、インキュベーションは、任意で、室温で、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも4時間の期間、行われる。いくつかの態様において、インキュベーションは、4℃で、少なくとも8時間行われる。インキュベーションの後、容器を洗浄し、非特異的結合を最小化するため、ブロッキング溶液、例えば、5％BSAを含む溶液でブロッキングすることができる。ブロッキング溶液は、緩衝液（例えば、PBS）を含んでいてよい。次いで、ブロッキング溶液を除去した後、標的、即ち、Aluリピートとハイブリダイズさせるため、核酸プローブを添加することができる。
【００５７】
c．核酸プローブのAluリピートとのハイブリダイゼーション
核酸プローブのcfDNA内のAluリピートとのハイブリダイゼーションアッセイは、マルチウェルプレート、例えば、96穴プレート、例えば、96穴LUMITRAC 600（Greiner Bio-One）を含むが、これに限定されるわけではない、任意の反応容器において実施され得る。ハイブリダイゼーションアッセイは、対費用効果が高く、より高次（例えば、384/バッチ）に多重化され得るため、標的核酸を事前に増幅することなく、ハイブリダイゼーションアッセイ、即ち、検出可能な標識にコンジュゲートされたプローブのハイブリダイゼーションを使用して、cfDNAを検出するアッセイは、PCRに基づくアプローチと比較して望ましい。さらに、プローブは、断片長に関係なく、体液中の一本鎖および二本鎖の全てのcfDNAを検出するため、ハイブリダイゼーションアプローチは、cfDNAのより完全でより正確な定量化を可能にする。
【００５８】
例示的なハイブリダイゼーションアッセイにおいては、前記の体液から抽出された所定の体積のcfDNAを、支持体、例えば、マイクロプレートウェルの底に結合させる。いくつかの態様において、反応容器の表面に対するcfDNAの結合親和性を増加させるため、支持体の表面を事前に処理する。いくつかの態様において、緩衝液（例えば、PBS）および塩（例えば、MgCl2）を、プローブとcfDNAとの間のハイブリダイゼーションを容易にするため、添加する。塩の最終ワーキング濃度は、0.05M〜0.5M、例えば、0.05M〜0.2Mまたは0.1Mであり得る。任意で、既知量のヒトDNA抽出物を使用して、標準曲線を作出することができる。
【００５９】
cfDNAと核酸プローブとのハイブリダイゼーションは、標準的なハイブリダイゼーション条件の下で実施され得る。プローブの核酸配列とのハイブリダイゼーションのための反応条件は、プローブ長、配列内のGヌクレオチドおよびCヌクレオチドの数、ならびにハイブリダイゼーション反応において利用される緩衝液の組成のような要因に依って、プローブによって変動する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、完全に塩基対形成した二本鎖DNAの融解温度よりおよそ20℃〜50℃、例えば、25℃〜40℃低い条件と、当業者によって一般に理解される。より高い特異性は通常、より高い温度を有するインキュベーション条件、換言すると、よりストリンジェントな条件を利用することによって達成される。（参照によって本明細書中に組み入れられる）Sambrook at al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1990)の周知の実験マニュアルのチャプター11が、特異的なハイブリダイゼーションを保証するために必要な、含まれる要因およびストリンジェンシーのレベルの説明を含め、オリゴヌクレオチドプローブのためのハイブリダイゼーション条件をより詳細に記載している。ハイブリダイゼーションは、典型的には、緩衝水性溶液において実施され、温度、塩濃度、およびpHのようなそのための条件は、プローブがそれぞれの標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、他の配列にはハイブリダイズしないよう十分なストリンジェンシーを提供するため、選択される。
【００６０】
通常、核酸プローブと標的、例えば、cfDNA内のAluリピートとの間のハイブリダイゼーションの効率は、添加されるプローブの量が鋳型に対してモル過剰である条件の下で改善される。いくつかの態様において、本発明の核酸プローブは、10ng/μl〜200ng/μl、例えば、20ng/μl〜100ng/μl、30ng/μl〜75ng/μl、30ng/μl〜50ng/μlの濃度で、5％BSAで希釈される。具体的な態様において、核酸プローブは、二重ビオチン化されており、30〜40ng/μlの濃度で使用される。プローブとcfDNA内のAluリピートとのハイブリダイゼーションを可能にするため、プレートにおいて核酸プローブおよびcfDNAをインキュベートすることができる。次いで、プレートのウェルを、（例えば、PBSまたはその他の緩衝液で）洗浄し、任意で、乾燥させた後、検出することができる。
【００６１】
d．シグナルの検出
検出可能な標識によって生成されたシグナルを検出する方法は、当技術分野において周知であり、本方法は、シグナルを生成するために利用される化学反応の性質に依って変動する。前記のように、いくつかの態様において、検出可能な標識は、それ自体、適切な装置、例えば、プレートリーダを使用して直接読み取り可能なシグナルを生成するシグナル生成剤である。いくつかの態様において、検出可能な標識は、シグナルを間接的に生成するものであり、シグナルを生成するためには、シグナル生成剤にコンジュゲートされた標識の結合パートナーを含む溶液がプレートに添加される。シグナル生成剤には、例えば、酵素または酵素基質、反応基、色素または有色粒子のような発色団、生物発光モエティ、リン光モエティ、または化学発光モエティを含む発光モエティ、および蛍光モエティが含まれる。一つの態様において、検出可能な標識はビオチンであり、結合パートナーはストレプトアビジンであり、シグナル生成剤は西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。この具体的な態様において、シグナルは、当技術分野において周知の方法によって容易に検出され定量化され得る化学発光シグナルである。
【００６２】
e．クレアチニンレベルの検出
本明細書中に開示されたcfDNAの定量化を、尿タンパク質の測定と組み合わせることができる。一つの具体的な態様において、尿タンパク質はクレアチニンである。クレアチニンは、吸光度に基づく方法であるヤッフェ反応を使用して測定され得る。mgクレアチニン/デシリットル尿でアウトプットを与えるQuantiChrom（商標）Creatinine Assay Kit（BioAssay Systems）のような、クレアチニンを測定するための市販のアッセイが、容易に入手可能である。例えば、www.bioassaysys.com/Datasheet/DICT.pdfを参照されたい。いくつかの態様において、尿クレアチニン測定は、尿試料中のcfDNAの抽出および定量化の前または後に行われる。いくつかの態様において、尿クレアチニン測定およびcfDNA定量化は、例えば、クレアチニンを測定するための尿試料を、これらの尿試料から抽出されたcfDNAと同一のマイクロプレートに置くことによって、同一のマルチウェルプレート（しかし異なるウェル）において実施される。同一のプレート/アッセイにおけるクレアチニンおよびcfDNAの測定は、cfDNAの増幅生成物の量を読み取るための一つのアッセイとクレアチニンレベルを読み取るための一つのアッセイとを必要とする従来のPCR法と比較して、時間およびコストを節約する。
【００６３】
f．付加的なマーカーの検出
臓器損傷の検出の感度および/または特異度をさらに改善するため、付加的な公知のマーカーを測定することができる。いくつかの態様において、付加的なマーカーには、1種または複数種の組織炎症マーカー、例えば、CXCL10、例えば、腎臓における炎症が含まれる。いくつかの態様において、CXCL10が検出され定量化される。例えば、最初に、捕獲抗体をプレートに吸着させ、次いで、試料中のCXCL10が捕獲されることを可能にするため、試料を添加する、サンドイッチELISAアプローチを使用して、CXCL10を測定する方法は、周知である。その後、捕獲されたCXCL10に結合する検出抗体を添加する。これを、文献において周知の一般的な二次抗体-HRPコンジュゲーションアプローチを使用して、検出することができる。標準濃度の精製されたCXCL10タンパク質によって、標準曲線を生成する。CXCL10の測定のための市販のキット、例えば、R&D systemsのHuman CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA Kitは、容易に入手可能である。尿CXCL10は、cfDNA測定の前または後に測定され得る。例えば、最初にマイクロプレート内の指定されたウェルにCXCL10捕獲抗体をコーティングし、これらの指定されたウェルに、CXCL10を測定するための尿試料を置くことによって、尿CXCL10をcfDNAと同一のマルチウェルプレートにおいて測定することもできる。
【００６４】
さらに、尿中のcfDNAのディファレンシャルなメチル化状態は、腎損傷についての付加的な意義を与え、メチル化状態と相関しているマーカーを測定し、腎損傷の検出のための前記のアッセイに追加することができる。従って、いくつかの態様において、付加的なマーカーは、1種または複数種のDNAメチル化マーカーを含む。一つの具体的な態様において、DNAメチル化マーカーは、試料中の核酸に取り込まれている5-メチルシトシンである。
【００６５】
DNAメチル化マーカーは、ELISAに基づくアプローチを使用して、検出され定量化され得る。DNAメチル化マーカーを測定するために使用される市販のキット、例えば、DNAに取り込まれている5-メチルシトシンの量を測定するために使用されるEpiGentekのMethylFlash Urine 5-Methylcytosine（5-mC）Quantification Kitは、容易に入手可能である。簡単に説明すると、メチル化DNAを有するプレートを、試料およびメチル化マーカーを認識する抗体と共にインキュベートする。この溶液をインキュベートし、次いで、洗浄し、検出抗体および/または基質でさらに検出する。
【００６６】
いくつかの態様において、付加的なマーカーは、体液試料中の全タンパク質を含む。全タンパク質の量は、タンパク質を測定するために使用され得る、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定され得る。一つの態様において、全タンパク質を測定するアッセイは、比色定量アッセイ、例えば、ブラッドフォードタンパク質アッセイである。
【００６７】
いくつかの態様において、付加的なマーカーはクラスタリンを含む。クラスタリンは、細胞片のクリアランスおよびアポトーシスに関連しているタンパク質である。クラスタリンの存在も、Human Clusterin DuoSet ELISAのようなELISAに基づくアッセイを使用して検出され測定することができる。他のサンドイッチELISAと同様に、クラスタリンに対する捕獲抗体が結合しているプレートを、任意で、試料希釈剤で希釈された、尿試料と共にインキュベートする。次いで、クラスタリンに対する検出抗体をプレートと共にインキュベートし、吸光度を測定するため、HRP検出系を使用する。
【００６８】
g．オプションの試薬およびデバイス
本方法は、多様なアッセイデバイスおよび/またはフォーマットで使用され得る。アッセイデバイスには、例えば、（ターゲティング剤またはその他の結合試薬を含み得る）アッセイ試薬が、アッセイモジュールのウェル、チャンバー、またはアッセイ領域に、アッセイの進行中に添加されるかまたは予め負荷される、アッセイプレート、カートリッジ、マルチウェルアッセイプレート、反応容器、試験管、キュベット、フローセル、アッセイチップ、ラテラルフローデバイス等が含まれ得る。これらのデバイスは、特異的結合アッセイ、例えば、イムノアッセイまたは免疫クロマトグラフィアッセイのための多様なアッセイフォーマットを利用することができる。例示的なアッセイデバイス、例えば、マイクロウェルプレートおよびフォーマット、96穴プレートフォーマットは、本明細書中に後に記載される。
【００６９】
ある種の態様において、本方法は、乾燥状態で保管されるアッセイ試薬を利用することができ、アッセイデバイス/キットには、アッセイ試薬を乾燥状態に維持するための乾燥剤材料がさらに含まれるかまたは供給されていてもよい。アッセイ試薬が予め負荷されたアッセイデバイスは、保管中の優れた安定性を維持しながら、アッセイ測定のスピードを大いに改善し、複雑度を低下させることができる。アッセイ試薬には、ブロッキング剤、安定化剤、界面活性剤、塩、pH緩衝剤、保存剤等を含むが、これらに限定されるわけではない、検出の機序には直接関与しないが、アッセイにおいて補助的な役割を果たす物質も含まれ得る。試薬は、遊離型で存在してもよいし、またはアッセイモジュール内のコンパートメント（例えば、チャンバー、チャンネル、フローセル、ウェル等）の表面、もしくはコロイド、ビーズ、もしくはその他の粒状支持体の表面を含む固相に存在してもよい。
【００７０】
いくつかの態様において、前記の方法は、ラテラルフローアッセイ（「LFA」）において実施され得る。LFAは、関心対象の抗原に対する捕獲試薬を含有しているパッドに吸収された液体試料の毛管作用に依る。いくつかの態様において、体液試料は、デバイス、例えば、ディップスティックまたはテストストリップへ適用された時に、競合フォーマットで可視マーカー（例えば、コロイド金）に結合する精製された関心対象の抗原、または可視マーカーに結合しており、非競合フォーマットで体液試料中の関心対象の抗原を認識する抗体のいずれかである試薬と混合される。関心対象の抗原は、体液試料中の任意の分子、例えば、クレアチニン、cfDNA、メチル化マーカー、CXCL10、および/またはクラスタリンのような、本願において開示されたマーカーのいずれかであり得る。いくつかの態様において、LFAの競合フォーマットが、クレアチニンおよび/またはメチル化マーカーを測定するために使用される。いくつかの態様において、非競合フォーマットLFAが、cfDNA、CXCL10、および/またはクラスタリンを測定するために使用される。
【００７１】
6．臓器損傷状態の決定
a．cfDNAの量に基づく臓器の健康の決定
いくつかの態様において、個体の臓器の健康の決定は、体液試料中のcfDNAの量を、臓器損傷状態を示すカットオフ値または予測確率推定値と比較する工程を含む。カットオフ値は、所定の値または予測確率推定値、例えば、医療従事者によって推奨された値であり得る。状況に依って、決定のためのカットオフ値を確立することが、いくつかのケースにおいて、必要であり得る。本明細書中に開示された方法を実施するためのそのようなカットオフ値を確立するためには、臓器移植術後に臓器損傷を有していない個体の群のような、健康な個体の群が選択される。これらの個体は、適用可能な場合、本発明の方法を使用して臓器損傷状態を決定する目的のため、適切なパラメータの範囲内である。例えば、個体は、類似した年齢、性別、および比較可能な健康状態を有していてよい。
【００７２】
いくつかの態様において、腎損傷を査定するためには、最初に、cfDNAの正規化された量を得るため、尿中のcfDNAの検出された量、即ち、核酸プローブにハイブリダイズしたDNAの量を、尿クレアチニンの量に対して正規化する。いくつかのケースにおいて、cfDNAの正規化された量は、尿中のクレアチニンの量に対するcfDNAの検出された量の比である。腎損傷状態を決定するため、cfDNAの正規化された量を、カットオフ値と比較する。このカットオフ値も、医療従事者によって腎損傷状態を示すと決定されたまたは前記のように確立された尿中のクレアチニン量に対するcfDNA量の相対的な比である。
【００７３】
尿中のcfDNAの量またはcfDNAの正規化された量が、それぞれのカットオフ値より高い場合、患者は、腎損傷を有すると決定される；通常より高い値は、より高度の腎損傷を示す。いくつかのケースにおいて、cfDNAの量またはcfDNAの正規化された量がカットオフ値より高いが近い場合、患者は、無症候性損傷を有すると決定される。尿中のcfDNAの量またはcfDNAの正規化された量が、それぞれのカットオフ値と等しいかまたはそれより低い場合、患者は、腎損傷を有しない、即ち、良好な腎臓の健康を有すると決定される。腎移植を受けたことがある患者について、尿からの腎損傷の検出は、急性拒絶エピソードを有する可能性が高いことを示す。ある種の腎疾患を有すると推測される患者について、いくつかの態様において、腎損傷の検出は、患者が腎疾患を有する可能性が高いことを示す。
【００７４】
主として腎移植のレシピエントに由来するcfDNAが混入しているであろう血液においてcfDNAを検出する従来の方法とは対照的に、尿において検出されるcfDNAは、全cfDNAを試験する時ですら、ドナー由来のDNAを特異的に反映する。図6は、尿中のY染色体コピー数と1番染色体コピー数との間の相関を示す。強力な線形相関（R2＝0.9253）は、全cfDNAの定量化が、ドナー由来の負荷を反映し、腎移植による腎損傷状態を正確に反映することを示す。
【００７５】
b．ITスコアを使用した臓器移植術患者の臓器損傷状態の決定
ある種の態様において、臓器移植を受けたことがある患者が臓器損傷を有するか否かを診断するため、または患者が臓器損傷を将来発症する可能性を予測するため、予測スコア、即ち、ITスコアが使用される。臓器移植後に発生した臓器損傷は、典型的には、移植された臓器に対する急性拒絶エピソードに関連している。
【００７６】
ITスコアは、臓器に由来する体液試料中のcfDNAの量、および体液試料中のcfDNAの量を正規化するために使用され得る因子（「ノーマライジング因子」）に基づき計算され得る複合値であってよい。一つの態様において、クレアチニンの量を、尿中のcfDNAを正規化するために使用する。別の態様において、BALの試料体積を、肺由来のBAL中のcfDNAを正規化するために使用する。体液試料が採取される時点、即ち、移植術後日数も、ITスコアに含まれていてよい。患者は、必ずしも移植された臓器の拒絶によらない損傷、例えば、虚血再灌流からの移植された臓器に対する進行中の腎毒性損傷、ならびに感染およびカルシニューリン阻害薬曝露による腎毒性傷害をしばしば経験するため、移植術後時間は臓器損傷の交絡要因であり得る。これらの損傷は、急性拒絶を示すものではなく、そのような損傷の程度は、異なる移植術後時点で変動し得る。従って、移植術後時点を含む時間を考慮したITスコアは、患者が、移植された臓器に対する急性拒絶エピソードを有するか否かを正確に予測することができる。
【００７７】
いくつかの態様において、臓器損傷を診断しかつ/または予測するために使用され得るITスコアが形成されるよう、体液試料中のcfDNAの測定を、体液試料中の他のバイオマーカーと組み合わせることができる。いくつかの態様において、ITスコアを計算するため、これらの他のバイオマーカー、例えば、CXCL10およびDNAメチル化マーカーを組み入れるため、多変量法を使用することができる。いくつかの態様において、cfDNA濃度は、クレアチニンに対するcfDNAの比を得るか、または（例えば、回帰分析を通して）cfDNAおよびクレアチニンの対数測定値を比例スケーリングすることによって、試料中のクレアチニンの量に対して正規化される。いくつかの態様において、cfDNA濃度は、体積に対するcfDNAの比を得るか、または（例えば、回帰分析を通して）cfDNAおよび体積の対数測定値を比例スケーリングすることによって、BALの試料体積に対して正規化される。いくつかのケースにおいて、生成された値は、準二項分布およびロジスティックリンク関数が組み入れられた一般化線形モデルを使用して回帰分析される。いくつかのケースにおいて、結果として得られた、急性拒絶についてのモデル確率推定値は、ITスコアが形成されるよう、0〜100にスケーリングし直され、予測性曲線を生成するために使用される。図12は、結果として得られた、腎損傷を査定するためのITスコア（「KIT」）の関数としての、腎移植患者における急性腎臓拒絶の確率を示す例示的な態様を示す。
【００７８】
いくつかの態様において、ITスコア、例えば、KITスコアは、高い特異度および感度で、臓器損傷を予測するかまたは診断するために使用され得る。いくつかの態様において、ITスコアは、損傷を有すると推測される臓器または損傷を将来発症する可能性が高いと推測される臓器に由来する体液試料中に存在する、cfDNAの量、DNAメチル化マーカーおよび/または炎症マーカーの量を含めることによって生成される。いくつかの態様において、ITスコアは、腎損傷を査定するためのKITスコアである。いくつかの態様において、KITスコアは、クレアチニンの量および/または腎尿細管損傷マーカー（例えば、クラスタリン）の量をさらに含めることによって生成される。いくつかの態様において、前記の複数のマーカーを含めることによって得られたITスコアは、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％の感度、および/または少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％の特異度で、臓器損傷を検出することができる。いくつかの態様において、前記のKITスコアの使用は、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96.9％、または少なくとも99.4％のAUCで、腎損傷を検出することができる。図13は、腎損傷の複数の原因を有する490の臨床的な患者試料のデータセットに基づく、腎損傷（「KIT」）の査定のためのITスコアを示す、例示的な態様を提供する。結果として得られたKITスコアは、cfDNA、クレアチン、CXCL10、クラスタリン、タンパク質、およびDNAメチル化マーカーの完全な測定値を有する299の臨床的な患者試料のサブセットに基づく；111のII型糖尿病、71の免疫、50の腎結石、20の移植拒絶、19の高血圧、および28の対照。結果として得られたKITスコアは、腎損傷の検出のための91％を超える感度および特異度（AUC＝96.9％）を有する。
【００７９】
いくつかの態様において、cfDNAおよび前記の1種または複数種のマーカーの量を使用して、ITスコアを開発するため、数学モデル/アルゴリズムが使用される。そのようなモデルには、ロジスティック回帰のような一般化線形モデル；ならびにニューラルネットワーク、一般化相加モデル、類似性最小二乗法、および再帰分割法のような非線形回帰モデルが含まれ得る。いくつかの態様において、ITスコアを生成するために使用される数学モデル/アルゴリズムは、1種または複数種のコンピュータプロセッサによって実行される。好ましくは、ITスコアを開発するために使用される数学モデルは、十分なサンプルサイズを含むデータベースに基づく。いくつかの態様において、データベースは、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、または少なくとも400のサンプルを含む。図14a〜14eは、腎損傷の確率を提供するための一般化線形モデル適合および関連ROC曲線の使用の例示的な態様、ならびに各疾患原因；即ち、II型糖尿病、免疫応答、腎結石、移植拒絶、および高血圧による腎損傷の確率を提供する。一つの具体的な態様において、図14A〜Eに示されるように、結果として得られたアルゴリズムは、腎損傷の各原因の検出のための92％を超える感度および特異度（AUC＞99.4％）を有する。
【００８０】
いくつかの態様において、ITスコアについてのカットオフ値は、臓器移植術後の臓器損傷を有していない個体の群のような、健康な個体の群に由来する、同一または類似の型の臓器に由来する体液試料中に存在するマーカーを測定することによって確立され得る。これらの個体は、適用可能な場合、本発明の方法を使用して臓器損傷状態を決定する目的のため、適切なパラメータの範囲内である。例えば、個体は、類似した年齢、性別、および比較可能な健康状態を有していてよい。次いで、試験される患者についてのITスコアを生成するために使用されるものと同一の数学モデルおよび/またはマーカーを使用して、ITスコアのカットオフ値が得られる。
【００８１】
いくつかの態様において、KITスコアをさらに改良するため、cfDNAおよびクレアチニンと共に、複数のバイオマーカー、例えば、CXCL10およびDNAメチル化マーカーを組み入れるため、多変量法が使用されており、そのKITスコアは、I型糖尿病、II型糖尿病、腎結石、癌、およびIgA腎症のような免疫複合体のような複数の臨床状態によって誘導された腎損傷を診断しかつ/または予測するために使用され得る。
【００８２】
KITスコアを得るため、多数の方式が使用され得る。いくつかの態様において、最初に、拒絶を示していない腎移植患者に由来する尿試料からの正規化された（例えば、クレアチニンレベルに対して正規化された）cfDNA値に基づき、cfDNA/クレアチニン比のカットオフ値を決定する。これらの尿試料は、移植術後期間の所定の時点で収集され得る。次いで、患者の正規化されたcfDNA値に基づき、患者についてのKITスコアを決定することができる。次いで、正規化された値が腎機能の健康または疾患を予測するか否かを決定するため、そのような正規化された値を、それらの時点についてのカットオフ値と比較することができる。所望により、そのような比較は、コンピュータ上で実施されてもよい。
【００８３】
いくつかの態様において、カットオフ値は、腎移植術を受けたが、移植術後期間のそれぞれの時点において臓器損傷を示していない患者におけるcfDNA/クレアチニン比である。いくつかの態様において、正規化されたcfDNAレベルの予測バンドを生成し、患者の実際の正規化されたcfDNA値を、同一の移植術後時点に対応する予測バンドの値と比較することができる。予測バンドは、多様な方式で確立され得る。いくつかの態様において、多数の安定非拒絶患者を経時的に調査し、指数関数的減衰曲線を、移植後時間に対するcfDNA/クレアチニン値に適合させた。その後、サンプリングされたのと同一の群からの将来の観察の値をカバーするため、規定された確率に基づき、予測バンドを生成した。例えば、95％予測バンドは、様々な移植術後時点で調査された安定非拒絶患者の95％からのcfDNA/クレアチニン比の上限からなる。次いで、特定の移植術後時間におけるKITスコアを、cfDNA/クレアチニンの実際の測定値、およびその時点に対応する予測バンド値に基づき決定する。
【００８４】
いくつかのアプローチにおいて、例えば、対数変換のような一般的な数学的変換、またはロジスティックモデルもしくは一般化線形モデルのような統計モデルのいずれかを使用することによって、クレアチニン値に対するcfDNA値を、他の形態の情報へ加工する。結果の、集団の平均値に対するノーマライゼーション等のような、他のデータ加工アプローチも、当業者に周知であり、使用され得る。
【００８５】
KITスコアは、典型的には、定義されたスケールでの、または定義された値の範囲内の、数的スコアである。KITスコアは、患者が急性拒絶エピソードを有するか否かを予測するKITスコアのカットオフ値と比較され得る。KITスコアがKITスコアのカットオフ値より高い場合、患者は腎損傷を有すると予測され、そのことは、その患者が急性拒絶（AR）エピソードを有する可能性が高いことを示す。いくつかのケースにおいて、より高いKITスコアは、ARエピソードによるより高度の損傷を示す。例えば、KITスコアが、比のカットオフ値で割った、特許のcfDNA/クレアチニン比の対数であるケースにおいて、KITスコアのカットオフ値は0である。
【００８６】
KITスコアは、急性拒絶に関連した臓器損傷を高度に予測し、患者が急性拒絶エピソードを有するか否かを決定するために使用され得る。図5Aを参照されたい。受信者動作特性曲線（ROC）分析は、KITスコアを使用して急性拒絶を検出するためのROC曲線のAUCが、0.9649であり、そのp値が0.0001、95％信頼区間が0.9346〜0.9952であったことを示し、このことは、本方法の感度および特異度が高いことを示す。図5B。対照的に、従来の腎損傷予測方法、即ち、タンパク尿の検出は、0.6498というはるかに低いAUCを有し、そのp値は0.07479、信頼区間は0.5032〜0.7963であった。差の有意性を、同一の患者セットからの結果から、マクネマーの対応のあるカイ二乗を使用して試験した。p値は0.021であり、このことから、KITがタンパク質を上回る情報を提供すること、それらが感度に関して有意に異なることを示唆している。この比較は、KIT法が、急性拒絶の決定において、タンパク尿法より鋭敏であることを示唆する。
【００８７】
マクネマー検定の結果：
2019528063.tif 000005
a．マクネマー検定
b．連続修正
【００８８】
いくつかの態様において、KITスコアは、アッセイ感度を増加させるため、様々な移植術後時点において、cfDNA/クレアチニン比に加えて、他の公知の腎損傷マーカーの測定値をさらに含めることによって生成される。これらのマーカーには、前記のように、CXCL10およびDNAメチル化マーカーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。関心対象のバイオマーカーについて、これらのバイオマーカーの各々についての長期傾向曲線を生成することができ、指数関数的減衰曲線、即ち、90％または95％の予測バンドを、cfDNA/クレアチニン比の予測バンドを生成するために使用されるものと同様に確立することができる。
【００８９】
前記で開示されたもの、即ち、KITスコアを生成し、生成されたKITスコアを腎損傷を査定するために使用する方法と類似したアプローチを、他の臓器の損傷、例えば、臓器移植後に発生した損傷を査定するためのKITスコアを得るために使用することができる。
【００９０】
従って、本発明は、移植術後期間の指定の時点に対応する正規化された（例えば、クレアチニンレベルに対して正規化された）cfDNA量またはITスコアのいずれかを使用することによって、急性拒絶エピソードに関連した臓器損傷について臓器移植患者を便利にモニタリングするために使用され得る。期間は、処置する医師によって必要であると見なされる任意の長さ、例えば、少なくとも20日、少なくとも50日、少なくとも100日、少なくとも150日、少なくとも200日、または少なくとも400日、少なくとも500日、または移植腎の寿命であり得る。cfDNAおよびクレアチニンの測定は、必要であると見なされる任意の頻度、例えば、少なくとも1年に1回、少なくとも1年に2回、少なくとも3ヶ月毎、少なくとも2ヶ月毎、または少なくとも1ヶ月毎、または少なくとも20日毎、または少なくとも10日毎に実施され得る。そのようにして急性拒絶エピソードを有すると決定された患者は、例えば、免疫抑制薬を投与することによって、可能な限り早く処置され得る。免疫抑制薬の非限定的な例には、タクロリムスおよびシクロスポリンのようなカルシニューリン阻害剤；ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、およびアザチオプリンのような抗増殖剤；シロリムスのようなmTOR阻害剤、プレドニゾンのようなステロイド、およびサイモグロブリン、IL2R遮断、またはベラタセプトのような導入剤が含まれる。他方、ITスコアがカットオフ値以下である場合、患者は腎損傷を有しないと決定され、従って、介入は必要とされない。患者がカットオフ値に近いITスコアを有する場合、患者は無症候性損傷を有すると決定される。ITスコアは、腎移植術が成功したか否か、そして介入が必要であるか否か、いつ必要であるかを決定するため、処置する医師を支援することができる。さらに、ITスコアの患者特異的な傾向も、臨床的介入が必要であるか否かを決定するために分析され得る。例えば、ITスコアの増加の傾向は、患者が急性拒絶エピソードを発症しており、従って、臨床的介入が必要であり得ることを示唆する。
【００９１】
c．腎疾患の検出
腎疾患に関連した腎損傷のケースにおいて、KITスコアは適用可能でなく、決定は、前記のcfDNA/クレアチニン比に基づく。いくつかのケースにおいて、cfDNAプレートに多重化され得る他のバイオマーカー、例えば、CXCL10の追加が、検出のための予測モデルの作出において適用可能であり得る。本方法は、巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）、IgA腎症、および初期糖尿病性腎疾患、BKウイルス性腎炎（BKVN）、巣状分節性糸球体硬化症（FSGS）、糸球体腎炎（GN）、急性尿細管壊死（ATN）、IgA疾患、および糖尿病性腎疾患のような腎疾患を検出するために使用され得る。図4Cは、BKVNを有する患者を、疾患を有しないものから分離するための、cfDNA/クレアチニン比の使用を示す。
【００９２】
d．コンピュータデバイスおよびスマートフォンデバイス
いくつかの態様において、例えば、ラテラルフローアッセイから検出された、本明細書に記載された1種または複数種のマーカー、例えば、cfDNA、クレアチニンからのシグナルは、コンピュータデバイス、カメラ、またはスマートフォンに送信される。いくつかの態様において、シグナルは、加工のため、スマートフォンアプリケーションに送信される。
【実施例】
【００９３】
実施例1．Alu要素を標的とするプローブ
体液中のcfDNAレパートリーのより完全なカバー度を提供するため、cfDNAの長い断片長および極めて短い断片長の両方を捕獲することができるよう、Aluリピートを標的とする核酸プローブのため、＜100bpの長さを選択した。この具体的なアッセイにおいて、プローブ長は、81bpであったが（図2）、18〜22bpのPCRプライマーによって通常利用されるもののような、より短い長さも、同様に機能するはずである。
【００９４】
参照ALU配列（SEQ ID NO:1）が以下にリストされ、Aluプローブのために標的とされた81bp部位（SEQ ID NO:2）が太字で強調される。
2019528063.tif 000006
【００９５】
適合性である試薬の広い利用可能性のため、ビオチンを選択した。しかしながら、ジゴキシゲニン-抗ジゴキシゲニン抗体またはさらには直接HRPコンジュゲーションのような多数の増幅スキームが、機能するであろう。
【００９６】
Alu要素に相補的な二重ビオチン化オリゴヌクレオチド
2019528063.tif 000007
を設計し合成した。これを、ストレプトアビジン-HRPおよび化学発光基質（SuperSignal（商標）ELISA Femto Substrate）溶液を使用した化学発光に基づく検出系を使用して、cfDNAを定量化するために使用した（図3）。
【００９７】
比色定量法および蛍光定量法も機能するであろうが、HRP検出のため、マイクロウェルにおいて利用可能な最も高感度の方法であるため、化学発光を選択した（図4）。比色定量法も良好であることが判明している。しかしながら、比色定量法は、インキュベートし、結果を得るために、より長い時間を要する。
【００９８】
実施例2．DNA安定化溶液の有効性の試験
超音波処理されたゲノムDNAを含有している尿においてDNA安定化溶液の有効性を試験するため、本発明者らは、QiaAMP DNA Blood Mini Kit（Qiagen）を使用して、全血からゲノムDNAを精製し、強度設定3で、Model 550 probe Sonic Dismembrator（ThermoFisher Scientific）を使用して、10分間、超音波処理した。サイクルを、10秒オンおよび20秒オフに設定した。得られたおよそ150〜250塩基対の断片サイズを確立するため、1％ゲル電気泳動上で試料を実行した。超音波処理によって、本発明者らは、移植拒絶におけるcfDNAを最も良く表す範囲である、およそ150〜250塩基対というサイズのDNA断片を獲得した（図1）。次に、本発明者らは、10g/Lジアゾリジニル尿素、20g/Lポリエチレングリコール、1mMアウリントリカルボン酸、10mM K2EDTA、10mMアジ化ナトリウム、および1×リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4を含有している保存溶液を製剤化した。実験は、DNAの完全性の保存のためのDNA保存溶液の有効性を試験するために設計された。断片化されたゲノムDNA（およそ150〜250塩基対のサイズ）を、保存溶液と共に尿を含有している1000μLチューブおよび保存溶液なしで尿を含有している1000μLチューブに添加した。実験を、4℃および室温で、平行して実行した。図1は、DNA保存溶液の非存在下では、72時間で完全にDNAが分解され崩壊するが、DNA保存溶液が、72時間までのDNA完全性の維持を助ける様子を証明する電気泳動図を示す。
【００９９】
実施例3．腎移植患者のための急性拒絶状態の決定
a．試料収集
移植術後期間の異なる時点において、腎移植を受けた3人の患者（患者＃1〜＃3）から、中間尿試料を無菌容器に収集した。患者＃1に由来する尿試料は、1日目、16日目、22日目、51日目、および180日目に採取され；患者＃2に由来する尿試料は、23日目、41日目、および103日目に採取され；患者＃3に由来する尿試料は、100日目、132日目、185日目、および337日目に採取された。リストされた時点において、尿の収集に加えて、急性拒絶を確認するため、生検材料を採取する。例えば、この研究における患者＃1についてのリストされた時点は、22日目である。尿試料を、H2O中の20μlの溶出体積で、製造業者の説明書に従って、QiaAmp（登録商標）Circulating Nucleic Acids Kit（Qiagen）によって抽出するため、2mLに等分した。
【０１００】
96穴LUMITRAC 600（Greiner Bio-One）のような白色不透明ELISAプレートを使用して、5マイクロリットルの溶出cfDNAを、必要に応じて、1回反復、2回反復、または3回反復のいずれかでプレートに播種した。これらのサンプルウェルに、1ウェル当たり10マイクロリットルの5×PBSおよび0.5M MgCl2緩衝液を添加し、次いで、全部で50マイクロリットルになるよう、35マイクロリットルの分子グレードH2Oを添加した。標準曲線を作出するため、既知量のヒトDNA抽出物を、200,000〜およそ12 GE/mLの1:3の滴定系列で、2回反復で添加した。GE（ゲノム当量）とは、6.6pgのヒトDNAとして定義される。これも、1×PBSおよび0.1M MgCl2の最終ワーキング濃度で、同一緩衝液中にあった。
【０１０１】
cfDNAプレートを、300RPMで振とうしながら、4Cで一晩、またはRTで最低2時間、インキュベートした。次いで、液体を廃棄し、プレートを吸収ペーパータオルに軽く叩きつけることによって乾燥させた。次いで、プレートを、300RPMで振とうしながら、RTで最低1時間、1ウェル当たり300マイクロリットルで、5％BSAを含むPBSによってブロッキングした。次いで、液体を廃棄し、プレートを吸収ペーパータオルに軽く叩きつけることによって乾燥させた。次いで、プレートを、35.56ng/マイクロリットルの濃度で5％BSAで希釈された50マイクロリットルの二重ビオチン化Aluオリゴヌクレオチドプローブにおいてインキュベートした。これを、300RPMで振とうしながら、RTで最低1時間、インキュベートした。次いで、液体を廃棄し、次いで、ウェルを、300マイクロリットルの1×PBSで3回洗浄した。次いで、洗浄液を廃棄し、プレートを吸収ペーパータオルに軽く叩きつけることによって乾燥させた。次いで、プレートを、製造業者の説明書に従い、5％BSAで1:200希釈された50マイクロリットルのストレプトアビジン-HRPにおいてインキュベートし、300RPMで振とうしながらRTで高々1時間インキュベートした。次いで、液体を廃棄し、次いで、ウェルを300マイクロリットルの1×PBSで3回洗浄した。次いで、洗浄液を廃棄し、プレートを吸収ペーパータオルに軽く叩きつけることによって極めて完全に乾燥させた。次いで、150μlのSuperSignal ELISA Femto化学発光基質溶液（ThermoFisher）を各ウェルに添加した。プレートを、1分混合した後に、全発光に基づき分析した。
【０１０２】
次いで、生成された値を、GraphPadプリズムに提供されるもののような5パラメータS字形曲線適合を使用して回帰分析し、結果として得られたセルフリー濃度値を、マイクロウェルにおいて行われた希釈および2mLの尿から20μlの溶出液へ行われた濃縮について補正した。
【０１０３】
クレアチニンを、製造業者の説明書に従い、QuantiChrom Creatinine Assay Kit（BioAssay Systems）を使用して測定した。https://www.bioassaysys.com/Datasheet/DICT.pdfを参照されたい。
【０１０４】
b．cfDNA/クレアチニン比のカットオフ値の決定
患者＃1〜＃3を含む研究の前に、腎移植を受けかつ生検によって確認される腎損傷を有しなかった9人の患者からのデータに基づき、cfDNA/クレアチニン比のカットオフ値を確立した。これらの9人の患者に由来する尿試料からのcfDNAおよびクレアチニンの量は、本明細書中に記載されるように決定された。最初に、尿クレアチニン値をmg/mLに変換し、セルフリーDNA値を、このクレアチニン測定値によって割り、[GE/mg]の単位を有するcfDNA/クレアチニンを得た。GE（ゲノム当量）とは、6.6pgのヒトDNAとして定義される。移植術後日数に対するcfDNA/クレアチニン比を、図7に示されるようにプロットし、移植後時間に依存する95％予測バンド（点線）を、以下の方程式によって指数関数的減衰曲線としてモデル化した。
cfDNA/クレアチニン[GE/mg] ＝ 10^((5.612-4.007)*EXP(-0.05977*(移植後日数))+4.007)/100
【０１０５】
この片側95％予測区間の各データ点は、同一の移植術後時点における、将来の非拒絶患者の95％からのcfDNA/クレアチニン比より高いと95％の信頼度で予測される、cfDNA/クレアチニン比の上限の推定値に相当する。最初に、尿クレアチニン値をmg/mLに変換し、[GE/mg]の単位を有するcfDNA/クレアチニンを生成するため、セルフリーDNA値をこのクレアチニン測定値で割った。cfDNA/クレアチニン比を移植術後日数に対してプロットした。図8A。KIT予測スコアを前記のように計算し、移植術後日数に対してプロットした。図8B。第1点と第2点との間で、cfDNA/クレアチニン比は低下するが（図8A）、予測スコアは、生検によって確認された急性拒絶エピソードの前に、相対リスクが実際に増加することを示した（図8B）。KITは時点22において0より高く、このことから、患者＃1が腎損傷および急性拒絶エピソードを有することが示された。急性拒絶状態は、リストされた時点で採取された生検材料を調査することによって確認された。患者＃1〜＃3は、全員、リストされた時点の後に免疫抑制薬を与えられ：患者＃1にはタクロリムス、MMF、ステロイド、患者＃2にはタクロリムス、MMF、ステロイド、患者＃3にはタクロリムスおよびシロリムスが与えられた。
【０１０６】
尿試料についての患者＃2〜＃3のcfDNA/クレアチニン比を、移植術後日数に対してプロットした。図9Aおよび9B。両方の患者について、リストされた時点より前の時点において、本明細書中に開示された方法を使用して急性拒絶が予測され、その後、生検によって確認された。さらに、図9Bに示されるように、リストされた時点以降の免疫抑制薬の投与は、cfDNA比を安定領域へと減少させ、このことから、処置の成功が示された。移植片損傷の臨床的決定は、決定された閾値を超えたcfDNA値の絶対的な上昇および患者特異的な閾値データを使用した経時的なcfDNA負荷の増加に基づき、なされ得る。移植片損傷は最適でない免疫抑制曝露に起因すると仮定され、異常な上昇したcfDNAは、以下の臨床的措置を誘発し得る：（1）より密接なフォローアップのための患者の再診；（2）プロトコル生検を受ける予定である患者におけるより早期のプロトコル生検の考慮；（3）無症候性急性拒絶および/または移植片損傷のその他の原因について評価するための適応（indication）生検の考慮；（4）免疫抑制薬の型または投薬の変化。反対に、低く安定したcfDNA結果は、以下の臨床的措置を誘発し得る：（1）フォローアップ診察頻度の低下；（2）無症候性移植片損傷を探すために行われる不必要なプロトコル生検の回避；（3）免疫抑制薬の型または投薬の変化。
【０１０７】
実施例4．肺移植患者についての拒絶状態の決定
肺移植を受けた76人の患者に由来する気管支肺胞洗浄（BAL）液試料を、安定期間中または拒絶エピソード中に、無菌容器に収集した。BAL液を、H2O中の20μLの溶出体積で、製造業者の説明書に従い、QIAamp Circulating Nucleic Acids Kit（Qiagen）によって抽出するため、400μLに等分した。実施例2に開示されるように、cfDNAを測定した。
【０１０８】
生成された値を、GraphPad Prismに提供されるもののような5パラメータS字形曲線適合を使用して回帰分析し、結果として得られたセルフリー濃度値を、マイクロウェルにおいて行われた希釈および400μLのBAL液から20μLの溶出液へ行われた濃縮について補正した。
【０１０９】
BAL液からの正規化されたcfDNA濃度を、安定患者と拒絶患者との間で比較した。図10。拒絶患者におけるcfDNAの平均レベルは、安定患者より有意に高かった。異常な上昇したcfDNAの結果は、実施例2に開示されたものに類似した臨床的措置を誘発し得る。
【０１１０】
実施例5．KITスコアを使用した腎損傷状態の決定
図13は、腎損傷の複数の原因を有する490の臨床的な患者試料のデータセットに基づく、腎損傷の査定のためのITスコア（「KIT」）を示す例示的な態様を提供する。結果として得られたKITスコアは、cfDNA、クレアチニン、CXCL10、クラスタリン、タンパク質、およびDNAメチル化マーカーの完全な測定値を有する299の臨床的な患者試料のサブセットに基づいていた；111のII型糖尿病、71の免疫、50の腎結石、20の移植拒絶、19の高血圧、および28の対照。結果として得られたKITスコアは、腎損傷の検出のための91％を超える感度および特異度（AUC＝96.9％）を有していた。図14A〜Eは、一般化線形モデル適合の結果および関連ROC曲線を提供する。これらの結果は、腎損傷の確率を示すことに加えて、基礎をなすアルゴリズムが、各疾患原因；即ち、II型糖尿病、免疫応答、腎結石、移植拒絶、および高血圧による腎損傷の確率を正確に提供し得ることを例示する。これらのデータについて、結果として得られたアルゴリズムは、腎損傷の各原因の検出のための92％を超える感度および特異度（AUC＞99.4％）を示した。
【０１１１】
本明細書中に記載された例および態様は、例示を目的とするものに過ぎず、それらを考慮すれば、様々な修飾または変化が、当業者に示唆され、本願の本旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用された刊行物、特許、および特許出願は、全て、参照によって事実上その全体が本明細書に組み入れられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月16日(2019.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019528063000001.app
【国際調査報告】
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2019528063.tif 000032
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