(57)【要約】本発明は、Ｂ型肝炎を治療するのに有用な治療用混合物及び治療方法を提供する。本発明は、ＨＢＶなどのウイルス感染症を治療するのに有用な治療用混合物及び治療方法を提供する。本明細書で提供する実施例は、ＨＢＶに対する異なる作用機序を有する薬剤を用いた、多数種混合物（例えば、２種混合物）による試験の結果について開示している。本明細書に記載のとおり、いくつかの薬剤混合物は予想外で相乗的な相互作用を示し、また混合物は、概ね拮抗作用を欠いていた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される担体、ならびに、
ａ）カプシド阻害剤、
ｂ）ｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃ）逆転写酵素阻害剤、
ｄ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｅ）Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、及び、
ｆ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を含む医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも１種のカプシド阻害剤を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記カプシド阻害剤は、Ｂａｙ−４１−４１０９、ＡＴ−６１、ＤＶＲ−０１及びＤＶＲ−２３ｆから選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
少なくとも１種のｓＡｇ分泌阻害剤を含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｓＡｇ分泌阻害剤は、ＰＢＨＢＶ−００１及びＰＢＨＢＶ−２−１５からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
少なくとも１種の逆転写酵素阻害剤を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記逆転写酵素阻害剤は、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン及びテノホビルからなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
少なくとも１種のｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤を含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤は、ＣＣＣ−０９７５及びＣＣＣ−０３４６から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする少なくとも１種のオリゴマーヌクレオチドを含む、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする少なくとも２種のオリゴマーヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする前記オリゴマーヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ１ｍ〜１５ｍの２種ｓｉＲＮＡ混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする前記オリゴマーヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ１ｍ〜１５ｍの３種ｓｉＲＮＡ混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも１種の免疫刺激剤を含む、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記免疫刺激剤は、ＩＦＮ遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）作動薬及びインターロイキンからなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
以下の薬剤の混合物、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びカプシド阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、または、
逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤
を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
以下の薬剤の混合物、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、または、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤
を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
Ｂ型肝炎などのウイルス感染症を治療または予防するのに混合して使用する、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、
ｅ）Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、及び、
ｆ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を含むキット。
【請求項１９】
少なくとも１種の逆転写酵素阻害剤を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記逆転写酵素阻害剤は、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン及びテノホビルからなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
少なくとも１種のカプシド阻害剤を含む、請求項１８から請求項２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
前記カプシド阻害剤は、Ｂａｙ−４１−４１０９、ＡＴ−６１、ＤＶＲ−０１及びＤＶＲ−２３ｆから選択される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
少なくとも１種のｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤を含む、請求項１８から請求項２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
前記ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤は、ＣＣＣ−０９７５及びＣＣＣ−０３４６から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
少なくとも１種のｓＡｇ分泌阻害剤を含む、請求項１８から請求項２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
前記ｓＡｇ分泌阻害剤は、ＰＢＨＢＶ−００１及びＰＢＨＢＶ−２−１５からなる群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする少なくとも１種のオリゴマーヌクレオチドを含む、請求項１８から請求項２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする少なくとも２種のオリゴマーヌクレオチドを含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする前記オリゴマーヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ１ｍ〜１５ｍの２種ｓｉＲＮＡ混合物からなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする前記オリゴマーヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ１ｍ〜１５ｍの３種ｓｉＲＮＡ混合物からなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項３１】
少なくとも１種の免疫刺激剤を含む、請求項１８から請求項３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
前記免疫刺激剤は、ＩＦＮ遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）作動薬及びインターロイキンからなる群から選択される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
以下の、２種の薬剤の混合物、
カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びカプシド阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、または、
逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤
のうちの１つを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項３４】
以下の、３種の薬剤の混合物、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、または、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤
のうちの１つを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項３５】
動物のＢ型肝炎を治療するための方法であって、前記方法は、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、
ｅ）Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、及び、
ｆ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を前記動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項３６】
少なくとも１種の逆転写酵素阻害剤を前記動物に投与する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記逆転写酵素阻害剤は、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン及びテノホビルからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１種のカプシド阻害剤を前記動物に投与する、請求項３５から請求項３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記カプシド阻害剤は、Ｂａｙ−４１−４１０９、ＡＴ−６１、ＤＶＲ−０１及びＤＶＲ−２３ｆからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも１種のｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤を前記動物に投与する、請求項３５から請求項３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤は、ＣＣＣ−０９７５及びＣＣＣ−０３４６から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１種のｓＡｇ分泌阻害剤を前記動物に投与する、請求項３５から請求項４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｓＡｇ分泌阻害剤は、ＰＢＨＢＶ−００１及びＰＢＨＢＶ−２−１５からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする少なくとも１種のオリゴマーヌクレオチドを前記動物に投与する、請求項３５から請求項４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする少なくとも２種のオリゴマーヌクレオチドを前記動物に投与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする前記オリゴマーヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ１ｍ〜１５ｍの２種ｓｉＲＮＡ混合物からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とする前記オリゴマーヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ１ｍ〜１５ｍの３種ｓｉＲＮＡ混合物からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１種の免疫刺激剤を前記動物に投与する、請求項３５から請求項４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記免疫刺激剤は、ＩＦＮ遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）作動薬及びインターロイキンからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１種の薬剤は、経口投与される、請求項３５から請求項４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも２種の薬剤は、経口投与される、請求項３５から請求項４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
オリゴマーヌクレオチドは、静脈内投与される、請求項３５から請求項５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
以下の、２種の薬剤の混合物、
カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びカプシド阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びＢ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、
逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、または、
逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤
のうちの１つを前記動物に投与する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
以下の、３種の薬剤の混合物、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
カプシド阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
カプシド阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、免疫刺激剤及び逆転写酵素阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｓＡｇ分泌阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び免疫刺激剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、カプシド阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
免疫刺激剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び逆転写酵素阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びカプシド阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
免疫刺激剤、逆転写酵素阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、カプシド阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及びｓＡｇ分泌阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、ｓＡｇ分泌阻害剤及び免疫刺激剤、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びカプシド阻害剤、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、または、
逆転写酵素阻害剤、免疫刺激剤及びｓＡｇ分泌阻害剤
のうちの１つを前記動物に投与する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
前記混合物は、カプシド阻害剤及びインターフェロンのみの混合物を含まない、提供する請求項１から請求項５４のいずれか１項。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１６年１月８日出願の米国出願シリアル番号６２／２７６，７２２、２０１６年５月３１日出願の米国出願シリアル番号６２／３４３，５１４、２０１６年６月３日出願の米国出願シリアル番号６２／３４５，４７６、２０１６年１０月１７日出願の米国出願シリアル番号６２／４０９，１８０、及び、２０１６年１１月１１日出願の米国出願シリアル番号６２／４２０，９６９の優先権の利益を主張するものであり、これら出願は参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」と略される）は、ヘパドナウイルスファミリーのメンバーである。ウイルス粒子（ビリオンと呼ばれることもある）は、外側脂質エンベロープ、及び、タンパク質で構成される正二十面体ヌクレオカプシドコアを含む。ヌクレオカプシドは、ウイルスＤＮＡ、及び、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを封入している。外側エンベロープは、感受性細胞（一般的には肝細胞）へのウイルス結合及び進入に関与する包埋タンパク質を収容している。感染性ウイルス粒子に加え、コアの欠落したフィラメント体及び球状体が感染個体の血清中に見つかることもある。これらの粒子は感染性ではなく、ビリオン表面の一部を形成する脂質及びタンパク質で構成されている。この脂質及びタンパク質は表面抗原（ＨＢｓＡｇ）と呼ばれており、ウイルスの生活環中、過剰に産生される。
【０００３】
ＨＢＶのゲノムは環状ＤＮＡからなっているが、そのＤＮＡが完全に二本鎖ではないため異常である。全長鎖の一端は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼと結合している。ゲノムは、３０２０〜３３２０ヌクレオチド長（全長鎖）及び１７００〜２８００ヌクレオチド長（短い鎖）である。ネガティブセンス（非コード）は、ウイルスｍＲＮＡに対して相補的である。ウイルスＤＮＡは、細胞の感染直後における核内において見つかる。ゲノムによりコードされ、Ｃ、Ｘ、Ｐ及びＳと呼ばれる４種類の周知の遺伝子が存在している。コアタンパク質はＣ遺伝子（ＨＢｃＡｇ）によりコードされ、その開始コドンは、そこからプレコアタンパク質が産生される上流インフレームＡＵＧ開始コドンによって先行される。ＨＢｅＡｇは、プレコアタンパク質のタンパク質分解プロセスにより産生される。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐ遺伝子によりコードされている。Ｓ遺伝子は、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする遺伝子である。ＨＢｓＡｇ遺伝子は１つの長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝子を３つの区画（ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２及びＳ）に分割する３つのインフレーム「開始」（ＡＴＧ）コドンを含んでいる。複数の開始コドンが存在することにより、ラージ、ミドル及びスモールと呼ばれる、３つの異なるサイズのポリペプチドが産生される。Ｘ遺伝子がコードするタンパク質の機能は完全には解明されていないが、肝臓癌の進行に関係している。ＨＢＶの複製は複雑なプロセスである。複製は肝臓内において行われるが、ウイルスは血液中に拡散し、ウイルスタンパク質及びそれらに対する抗体が感染した人々において見つかることになる。ＨＢＶの構造、複製及び生態については、Ｄ．Ｇｌｅｂｅ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２，ｐａｇｅｓ  １０３−１１２（２０１３）において考察されている。
【０００４】
ＨＢＶがヒトに感染すると、肝臓の感染性炎症性疾患を引き起こす場合がある。感染個体は、長年にわたり症状を示さないこともある。世界人口の約３分の１が、その生涯において１度は感染していると推定される（慢性保菌者である３億５千万人を含む）。
【０００５】
ウイルスは、感染血液または感染体液に曝露することにより伝染する。周産期感染もまた、主な感染経路となり得る。急性疾患は、肝臓の炎症、嘔吐、黄疸、また場合により、死をもたらす。慢性Ｂ型肝炎が、最終的に肝硬変及び肝臓癌を引き起こす場合もある。
【０００６】
ＨＢＶに感染したほとんどの人々が彼らの免疫系の働きにより感染を除去するにもかかわらず、感染した人々の中には、侵攻性の感染症（劇症肝炎）を患う人々もおり、更に、慢性的な感染により肝疾患となる可能性が高まる人々もいる。現時点でいくつかの薬剤がＨＢＶ感染症治療用に承認されているが、感染個体は、これらの薬剤に対して様々な程度の効果を示しており、これら薬剤のどれも感染個体からウイルスを除去してはいない。
【０００７】
Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の存在下でのみ増殖可能な小型円形包膜ＲＮＡウイルスのことである。詳細には、ＨＤＶは、自身を増殖させるためにＨＢＶ表面抗原タンパク質を必要とする。ＨＢＶ及びＨＤＶの両方に感染することにより、ＨＢＶ単独による感染症と比較してより重大な合併症を引き起こすことになる。これらの合併症は、急性感染症において肝不全を患う可能性が高まること、肝硬変へと急速に進行すること（慢性感染症において肝臓癌を発症する高い可能性を伴う）を含む。Ｂ型肝炎ウイルスと組み合わせると、Ｄ型肝炎は、全ての肝炎感染症中、最も高い死亡率を示す。ＨＤＶの伝染経路は、ＨＢＶの伝染経路と類似している。感染は主に、ＨＢＶ感染症のリスクが高い者、特に、麻薬常用者、及び、凝固因子濃縮製剤を投与している者に限定される。
それゆえ、動物（例えば、ヒト）のＨＢＶ感染症に加え、動物（例えば、ヒト）のＨＢＶ／ＨＤＶ感染症を治療するための組成物及び方法に対する継続的な要望が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄ．Ｇｌｅｂｅ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２，ｐａｇｅｓ  １０３−１１２（２０１３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＨＢＶなどのウイルス感染症を治療するのに有用な治療用混合物及び治療方法を提供する。
【００１０】
本明細書で提供する実施例は、ＨＢＶに対する異なる作用機序を有する薬剤を用いた、多数種混合物（例えば、２種混合物）による試験の結果について開示している。本明細書に記載のとおり、いくつかの薬剤混合物は予想外で相乗的な相互作用を示し、また混合物は、概ね拮抗作用を欠いていた。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、
ｅ）Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、及び、
ｆ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を動物に投与することを含む、動物のＢ型肝炎を治療するための方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、Ｂ型肝炎などのウイルス感染症を治療または予防するのに混合して使用する、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、
ｅ）Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、及び、
ｆ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を含むキットを提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、Ｂ型肝炎などのウイルス感染症を治療または予防するのに混合して使用する、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、
ｅ）Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、及び、
ｆ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも３種の薬剤を含むキットを提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体、ならびに、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、
ｅ）Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、及び、
ｆ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体、ならびに、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、
ｅ）Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、及び、
ｆ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも３種の薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
薬学的に許容される酸または塩基の塩として化合物を投与することが適切な場合がある。薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容されるアニオンを形成する酸で形成された有機酸付加塩であり、例えば、トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩及びα−グリセロリン酸塩である。好適な無機塩もまた形成されてもよく、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩が挙げられる。
【００１７】
薬学的に許容される塩は、当該技術分野において周知の標準的な手順を用いて得てもよく、例えば、アミンなど十分に塩基性の化合物を好適な酸と反応させて、生理学的に許容されるアニオンを生じさせることにより得てもよい。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩もまた調製可能である。
【００１８】
逆転写酵素阻害剤
特定の実施形態では、逆転写酵素阻害剤はヌクレオシド類似体である。
【００１９】
特定の実施形態では、逆転写酵素阻害剤は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＡＲＴＩまたはＮＲＴＩ）である。
【００２０】
特定の実施形態では、逆転写酵素阻害剤は、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮｔＡＲＴＩまたはＮｔＲＴＩ）である。
【００２１】
用語「逆転写酵素阻害剤」としては、エンテカビル、クレブジン、テルビブジン、ラミブジン、アデホビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、テノホビルアラフェナミド、アデホビルジポボキシル、（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ，５Ｒ）−３−（６−アミノ−９Ｈ−９−プリニル）−２−フルオロ−５−（ヒドロキシメチル）−４−メチレンシクロペンタン−１−オール（米国特許番号８，８１６，０７４に記載）、エムトリシタビン、アバカビル、エルブシタビン、ガンシクロビル、ロブカビル、ファムシクロビル、ペンシクロビル及びアムドキソビルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
用語「逆転写酵素阻害剤」としては、エンテカビル、ラミブジン、及び、（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ，５Ｒ）−３−（６−アミノ−９Ｈ−９−プリニル）−２−フルオロ−５−（ヒドロキシメチル）−４−メチレンシクロペンタン−１−オールが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２３】
用語「逆転写酵素阻害剤」としては、上記した逆転写酵素阻害剤の共有結合したホスホラミデートまたはホスホンアミデート部分、または、例えば、米国特許番号８，８１６，０７４、ＵＳ２０１１／０２４５４８４Ａ１及びＵＳ２００８／０２８６２３０Ａ１に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
用語「逆転写酵素阻害剤」としては、メチル（（（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロペンチル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）−（ＤまたはＬ）−アラニネート及びメチル（（（（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ）−３−フルオロ−２−ヒドロキシ−５−メチレン−４−（６−オキソ−１，６−ジヒドロ−９Ｈ−プリン−９−イル）シクロペンチル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）−（ＤまたはＬ）−アラニネートなどのホスホラミデート部分を含む、ヌクレオチド類似体が挙げられるがこれらに限定されない。更に、例えば、メチル（（Ｒ）−（（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロペンチル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）−（ＤまたはＬ）−アラニネート及びメチル（（Ｓ）−（（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−５−ヒドロキシ−２−メチレンシクロペンチル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）−（ＤまたはＬ）−アラニネートを含む、個々のそれらのジアステレオマーが挙げられる。
【００２５】
用語「逆転写酵素阻害剤」としては、テノホビルアラフェナミドなどのホスホンアミデート部分に加えて、ＵＳ２００８／０２８６２３０Ａ１に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されない。活性剤を含有する立体選択的なホスホラミデートまたはホスホンアミデートを調製するための方法については、例えば、米国特許番号８，８１６，０７４に加え、ＵＳ２０１１／０２４５４８４Ａ１及びＵＳ２００８／０２８６２３０Ａ１に記載されている。
【００２６】
カプシド阻害剤
本明細書に記載する場合、用語「カプシド阻害剤」としては、カプシドタンパク質の発現及び／または機能を、直接または間接的のいずれかで阻害可能な化合物が挙げられる。例えば、カプシド阻害剤としては、カプシドアセンブリを阻害する、非カプシドポリマーの形成を誘導する、過剰なカプシドアセンブリまたは誤ったカプシドアセンブリを促進する、カプシドの安定化に悪影響を及ぼす、及び／または、ＲＮＡの封入を阻害する、任意の化合物を挙げてもよいがこれらに限定されない。カプシド阻害剤としてはまた、複製プロセス内の下流イベント（複数可）（例えば、ウイルスＤＮＡ合成、弛緩型開環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）の核内への輸送、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の形成、ウイルスの成熟、出芽及び／または放出など）において、カプシド機能を阻害する、任意の化合物が挙げられる。例えば、特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載のアッセイを用いて測定する際、阻害剤は、カプシドタンパク質の発現レベルまたは生物活性を検出可能に阻害する。特定の実施形態では、阻害剤は、ウイルスの生活環におけるｒｃＤＮＡ及び下流産物のレベルの、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または、少なくとも９０％を阻害する。
【００２７】
用語「カプシド阻害剤」としては、以下の化合物、
【化１】
2019501202.tif 000002
を含む、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３００６３９４、ＷＯ２０１４１０６０１９及びＷＯ２０１４０８９２９６に記載の化合物が挙げられる。
【００２８】
用語「カプシド阻害剤」としてはまた、化合物、Ｂａｙ−４１−４１０９（国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１３／１４４１２９を参照のこと）、ＡＴ−６１（国際特許出願公開番号ＷＯ／１９９８／３３５０１、及び、Ｋｉｎｇ，ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１９９８，４２，１２，３１７９−３１８６を参照のこと）、ＤＶＲ−０１及びＤＶＲ−２３（国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／００６３９４、及び、Ｃａｍｐａｇｎａ，ＭＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１３，８７，１２，６９３１を参照のこと）、ならびに、薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられる。
【化２】
2019501202.tif 000003
【００２９】
ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤
共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）は、細胞核内においてウイルスｒｃＤＮＡから生成され、ウイルスｍＲＮＡの転写鋳型として機能する。本明細書に記載する場合、用語「ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤」としては、ｃｃｃＤＮＡの形成及び／または安定性を、直接または間接的のいずれかで阻害可能な化合物が挙げられる。例えば、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤としては、カプシドディスアセンブリ、核内へのｒｃＤＮＡの進入、及び／または、ｒｃＤＮＡのｃｃｃＤＮＡへの変換を阻害する、任意の化合物を挙げてもよいがこれらに限定されない。例えば、特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載のアッセイを用いて測定する際、阻害剤は、ｃｃｃＤＮＡの形成及び／または安定性を検出可能に阻害する。特定の実施形態では、阻害剤は、ｃｃｃＤＮＡの形成及び／または安定性の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または、少なくとも９０％を阻害する。
【００３０】
用語「ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤」としては、以下の化合物、
【化３】
2019501202.tif 000004
を含む、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３１３０７０３に記載の化合物が挙げられる。
【００３１】
用語「ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤」としては、通常特に、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１５／００３８５１５Ａ１号に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない。用語「ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤」としては、１−（フェニルスルホニル）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド；１−ベンゼンスルホニル−ピロリジン−２−カルボン酸（ピリジン−４−イルメチル）−アミド；２−（２−クロロ−Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−４−（トリフルオロメチル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）アセトアミド；２−（４−クロロ−Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）アセトアミド；２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−４−（トリフルオロメチル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）アセトアミド；２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−４−メトキシフェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）アセトアミド；２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（（１−メチルピペリジン−４−イル）メチル）アセトアミド；２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピペリジン−４−イルメチル）アセトアミド；２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）プロパンアミド；２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）アセトアミド；２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリミジン−５−イルメチル）アセトアミド；２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリミジン−４−イルメチル）アセトアミド；２−（Ｎ−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリジン−４−イルメチル）アセトアミド；２−［（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−アミノ］−Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−アセトアミド；２−［（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−（トルエン−４−スルホニル）−アミノ］−Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−アセトアミド；２−［ベンゼンスルホニル−（２−ブロモ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−アミノ］−Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−アセトアミド；２−［ベンゼンスルホニル−（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−アミノ］−Ｎ−（２−メチル−ベンゾチアゾール−５−イル）−アセトアミド；２−［ベンゼンスルホニル−（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−アミノ］−Ｎ−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンジル］−アセトアミド；２−［ベンゼンスルホニル−（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−アミノ］−Ｎ−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンジル］−アセトアミド；２−［ベンゼンスルホニル−（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−アミノ］−Ｎ−ベンジル−アセトアミド；２−［ベンゼンスルホニル−（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−アミノ］−Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−アセトアミド；２−［ベンゼンスルホニル−（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−アミノ］−Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−プロピオンアミド；２−［ベンゼンスルホニル−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−アミノ］−Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−アセトアミド；４（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−Ｎ−（ピリジン−４−イル−メチル）ブタンアミド；４−（（２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−アセトアミド）−メチル）−１，１−ジメチルピペリジン−１−イウムクロリド；４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−Ｎ−（２−クロロ−５−トリフルオロメチル−フェニル）−ベンズアミド；４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−Ｎ−（２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ベンズアミド；４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−Ｎ−（２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ベンズアミド；４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−Ｎ−（２−メチル−ベンゾチアゾール−５−イル）−ベンズアミド；４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−Ｎ−（２−メチル−ベンゾチアゾール−６−イル）−ベンズアミド；４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−Ｎ−（２−メチル−ベンゾチアゾール−６−イル）−ベンズアミド；４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−Ｎ−ピリジン−４−イルメチル−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノエチル）−２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−アセトアミド；Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−Ｎ−（２−（３，４−ジヒドロ−２，６−ナフチリジン−２（１Ｈ）−イル）−２−オキソエチル）ベンゼンスルホンアミド；Ｎ−ベンゾチアゾール−６−イル−４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−ベンズアミド；Ｎ−ベンゾチアゾール−６−イル−４−（ベンジル−メチル−スルファモイル）−ベンズアミド；ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）アセトアミド）−エチル）カルバメート；及びｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（Ｎ−（２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル）フェニルスルホンアミド）−アセトアミド）−メチル）ピペリジン−１−カルボキシレート、ならびに、任意選択的に、これらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
ｓＡｇ分泌阻害剤
本明細書に記載する場合、用語「ｓＡｇ分泌阻害剤」としては、ＨＢＶ感染細胞由来のサブウイルス粒子及び／またはＤＮＡ含有ウイルス粒子を有するｓＡｇ（Ｓ、Ｍ及び／またはＬ表面抗原）の分泌を、直接または間接的のいずれかで阻害可能な化合物が挙げられる。例えば、特定の実施形態では、例えば、当該技術分野において周知または本明細書に記載のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）またはウェスタンブロットを用いて測定する際、阻害剤は、ｓＡｇの分泌を検出可能に阻害する。特定の実施形態では、阻害剤は、ｓＡｇの分泌を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または、少なくとも９０％だけ阻害する。特定の実施形態では、阻害剤は、患者におけるｓＡｇの血清レベルの、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または、少なくとも９０％を低下させる。
【００３３】
用語「ｓＡｇ分泌阻害剤」としては、米国特許番号８，９２１，３８１に記載の化合物に加え、米国特許出願公開番号２０１５／００８７６５９及び２０１３／０３０３５５２に記載の化合物が挙げられる。例えば、この用語としては、化合物、ＰＢＨＢＶ−００１及びＰＢＨＢＶ−２−１５、ならびに、薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられる。
【化４】
2019501202.tif 000005
【００３４】
免疫刺激剤
用語「免疫刺激剤」としては、免疫応答を調節可能な化合物（例えば、免疫応答を刺激する（例えば、アジュバント））が挙げられる。用語「免疫刺激剤」としては、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）及びインターフェロンが挙げられる。
【００３５】
用語「免疫刺激剤」としては、ＩＦＮ遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）作動薬及びインターロイキンが挙げられる。この用語としてはまた、ＨＢｓＡｇ放出阻害剤、ＴＬＲ−７作動薬（ＧＳ−９６２０、ＲＧ−７７９５）、Ｔ細胞刺激剤（ＧＳ−４７７４）、ＲＩＧ−１阻害剤（ＳＢ−９２００）、及び、ＳＭＡＣ模倣薬（ビリナパント）が挙げられる。用語「免疫刺激剤」としてはまた、抗ＰＤ−１抗体及びその断片が挙げられる。
【００３６】
オリゴマーヌクレオチド
用語「Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド」としては、Ａｒｒｏｗｈｅａｄ−ＡＲＣ−５２０が挙げられる（米国特許番号８，８０９，２９３、及び、Ｗｏｏｄｄｅｌｌ  ＣＩ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１３，２１，５，９７３−９８５を参照のこと）。
【００３７】
ＨＢＶゲノムの１つまたは複数の遺伝子及び／または転写物を標的とするように、オリゴマーヌクレオチドを設計してもよい。このようなｓｉＲＮＡ分子の例は、本明細書の表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子である。
【００３８】
用語「Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド」としてはまた、それぞれがセンス鎖及びそのセンス鎖にハイブリダイズしたアンチセンス鎖を含む、単離した二本鎖ｓｉＲＮＡ分子が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、ＨＢＶゲノムの１つまたは複数の遺伝子及び／または転写物を標的とする。ｓｉＲＮＡ分子の例は、本明細書の表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子である。
【００３９】
別の態様では、その用語としては、本明細書の表Ｂに記載の単離したセンス鎖及びアンチセンス鎖が挙げられる。
【００４０】
用語「Ｂ型肝炎ウイルス」（ＨＢＶと略される）とは、オルソヘパドナウイルス属のウイルス種のことを意味し、ウイルスのヘパドナウイルス科ファミリーの一部であり、またヒトにおいて肝臓の炎症を引き起こし得る。
【００４１】
用語「Ｄ型肝炎ウイルス」（ＨＤＶと略される）とは、デルタウイルス属のウイルス種のことを意味し、ヒトにおいて肝臓の炎症を引き起こし得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子または標的配列と同一の細胞内に存在する場合、標的遺伝子または標的配列の発現を抑制または阻害（例えば、分解を媒介するか、または、ｓｉＲＮＡ配列に対して相補的なｍＲＮＡの翻訳を阻害するかによって）することができる二本鎖ＲＮＡ（すなわち、二重鎖ＲＮＡ）のことを意味する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子または標的配列と実質的にまたは完全に同一であってもよく、または、ミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでいてもよい。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１９〜２５（二重鎖）ヌクレオチド長であってもよく、好ましくは、約２０〜２４、２１〜２２または２１〜２３（二重鎖）ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１〜約４ヌクレオチドまたは約２〜約３ヌクレオチドの３´オーバーハング、及び、５´リン酸末端を含んでいてもよい。ｓｉＲＮＡの例としては、２本の別々の鎖分子（一方の鎖はセンス鎖であり、もう一方の鎖は相補的なアンチセンス鎖である）から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４３】
ｓｉＲＮＡは、化学合成されることが好ましい。ｓｉＲＮＡはまた、より長いｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ヌクレオチド長超のｄｓＲＮＡ）をＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩまたはＤｉｃｅｒで開裂させることにより生成してもよい。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡを生物学的に活性なｓｉＲＮＡへと処理する（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９９４２−９９４７（２００２）；Ｃａｌｅｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３６（２００２）；Ｂｙｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｂｉｏｎ  ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ，１０（１）：４−６（２００３）；Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：９８１−９８７（２００３）；Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２６９−２２７１（２００１）；及び、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：８２（１９６８）を参照のこと）。ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド長〜約１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチド長であることが好ましい。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチド長ほどの長さであってもよく、または、それ以上の長さであってもよい。ｄｓＲＮＡは、完全な遺伝子転写物または部分的な遺伝子転写物をコードすることができる。特定の例においては、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによりコードされてもよい（例えば、自動的にヘアピンループを有する二重鎖へと折り畳まれる配列として転写される）。
【００４４】
語句「標的遺伝子の発現を阻害する」とは、標的遺伝子（例えば、ＨＢＶゲノム内の遺伝子）の発現をサイレンシング、抑制または阻害するｓｉＲＮＡの機能のことを意味する。遺伝子サイレンシングの程度を測定するために、試験用試料（例えば、標的遺伝子を発現する目的の生物由来の生体試料、または、標的遺伝子を発現する培養物中の細胞試料）を、標的遺伝子の発現をサイレンシング、抑制または阻害するｓｉＲＮＡと接触させる。試験用試料中における標的遺伝子の発現を、ｓｉＲＮＡと接触させていない対照試料（例えば、標的遺伝子を発現する目的の生物由来の生体試料、または、標的遺伝子を発現する培養物中の細胞試料）中における標的遺伝子の発現と比較する。対照試料（例えば、標的遺伝子を発現する試料）に１００％の数値を割り当ててもよい。特定の実施形態では、対照試料（例えば、緩衝液のみ、異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列、スクランブルｓｉＲＮＡ配列など）と比較した試験用試料の数値が、約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または０％である場合、標的遺伝子発現のサイレンシング、抑制または阻害を行う。好適なアッセイとしては、当業者に周知の手法（例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能に加え、当業者に周知の表現型アッセイ）を用いた、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの試験が挙げられるがこれらに限定されない。治療用核酸（ｓｉＲＮＡなど）の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果をもたらすのに、例えば、ｓｉＲＮＡの不在下で検出された通常の発現レベルと比較して、標的配列の発現を阻害するのに十分な量のことである。特定の実施形態では、対照（例えば、緩衝液のみ、異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列、スクランブルｓｉＲＮＡ配列など）と比較して、ｓｉＲＮＡにより得られた数値が、約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または０％である場合、標的遺伝子発現または標的配列発現の阻害を行う。標的遺伝子発現または標的配列発現を測定するための好適なアッセイとしては、当業者に周知の手法（例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能に加え、当業者に周知の表現型アッセイ）を用いた、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの試験が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおいて、少なくとも２種のヌクレオチド（すなわち、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）を含有し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むポリマーのことを意味する。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、及び、リン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して互いに結合している。「塩基」としてはプリン及びピリミジンが挙げられ、更に、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体、ならびに、プリン及びピリミジンの合成誘導体（新しい反応性基（限定するわけではないが例えば、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート及びハロゲン化アルキル）を導入する修飾を含むがこれらに限定されない）が挙げられる。核酸としては、周知のヌクレオチド類似体、または、修飾主鎖残基もしくは結合部を含有する核酸が挙げられ、それらは合成、天然及び非天然であり、参照核酸と類似した結合特性を有している。このような類似体及び／または修飾残基の例としては、ホスホロチオネート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及び、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。加えて、核酸は、１つまたは複数のＵＮＡ部分を含んでいてもよい。
【００４６】
用語「核酸」としては、最大６０ヌクレオチド（一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれる）を含有する断片、及び、より長い断片（ポリヌクレオチドと呼ばれる）である、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが挙げられる。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、糖の５´炭素及び３´炭素の位置でリン酸と共有結合して、交互の非分枝鎖ポリマーを形成する５−炭素糖（デオキシリボースと呼ばれる）から構成される。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、凝縮前のＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、または、これらの群の誘導体及び組み合わせの形態であってもよい。リボオリゴヌクレオチドは、５−炭素糖がリボースである類似の反復構造から構成される。ＲＮＡは、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びこれらの組み合わせの形態であってもよい。それゆえ、用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」とは、天然の塩基、糖及び糖間（主鎖）結合部からなるヌクレオチドモノマーまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーのことを意味する。用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」としてはまた、非天然モノマーを含むポリマーまたはオリゴマー、またはその一部（同様に機能する）が挙げられる。例えば、高い細胞取り込み性、低い免疫原性、及び、ヌクレアーゼ存在下における高い安定性などの特性を有しているため、多くの場合、このような修飾または置換オリゴヌクレオチドが、天然形態よりも好ましい場合がある。
【００４７】
特に指示がない限り、個々の核酸配列はまた、明確に示した配列に加え、その保存的修飾変異体（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補配列を暗に包含する。具体的には、選択したコドンの１つまたは複数（または全て）における第３の位置を混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することによって、縮重コドン置換体を得てもよい（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８（１９９４））。
【００４８】
「単離した」または「精製した」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、その天然環境とは別に存在するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。単離したＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、精製形態で存在していてもよく、または、非天然環境（例えば、遺伝子組換え宿主細胞など）で存在していてもよい。例えば、「単離した」または「精製した」核酸分子またはその生物活性部位は、組換え技術を用いて生成する際に、その他の細胞性物質または培地を実質的に含まず、または、化学合成を行う際に、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。一実施形態では、「単離した」核酸は、そこから核酸を得る生物のゲノムＤＮＡ内において、通常は核酸に隣接する配列（すなわち、核酸の５´末端及び３´末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離した核酸分子は、そこから核酸を得る細胞のゲノムＤＮＡ内において、通常は核酸分子に隣接する、約５ｋｂ未満の、約４ｋｂ未満の、約３ｋｂ未満の、約２ｋｂ未満の、約１ｋｂ未満の、約０．５ｋｂ未満の、または、約０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００４９】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの生成に必要な部分長または完全長のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列のことを意味する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「遺伝子産物」とは、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドなどの、遺伝子の産物のことを意味する。
【００５１】
用語「アンロックド核酸塩基類似体」（「ＵＮＡ」と略される）とは、リボース環のＣ２’原子及びＣ３’原子が共有結合していない、非環式核酸塩基のことを意味する。用語「アンロックド核酸塩基類似体」としては、構造Ａとして識別した以下の構造、
構造Ａ
【化５】
2019501202.tif 000006
を有する核酸塩基類似体が挙げられ、
式中、Ｒはヒドロキシルであり、Ｂａｓｅは、任意の天然または非天然の塩基、例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）などである。ＵＮＡとしては、米国特許シリアル番号８，３１４，２２７に記載の非環式２’−３’−セコ−ヌクレオチドモノマーとして識別した分子が挙げられる。
【００５２】
用語「脂質」とは、脂肪酸のエステルが挙げられるがこれらに限定されない有機化合物群のことを意味し、水には不溶性であるが、ほとんどの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする。脂質は通常、少なくとも３つの部類、（１）「単純脂質」（脂肪及び油に加えワックスが挙げられる）、（２）「複合脂質」（リン脂質及び糖脂質が挙げられる）、及び、（３）「誘導脂質」（ステロイドなど）に分類される。
【００５３】
用語「脂質粒子」としては、治療用核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）へと送達するのに使用可能な脂質製剤が挙げられる。好ましい実施形態では、脂質粒子は通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び任意選択的に、粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質から形成される。核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）を含む脂質粒子は、核酸−脂質粒子と呼ばれている。通常、核酸は脂質粒子内に完全に封入されており、そのため、核酸は酵素分解から保護される。
【００５４】
特定の例においては、核酸−脂質粒子は、それらが静脈（ｉ．ｖ．）注射後において長期間にわたる循環寿命を示し得ること、それらが遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積可能であること、及び、それらがこれら遠位部位において標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介可能であることから、全身投与において極めて有用である。核酸は、縮合剤と複合体を形成してもよく、またＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０３６８３に記載のとおり、脂質粒子内に封入されてもよい（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【００５５】
脂質粒子は通常、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍまたは１５０ｎｍの平均粒径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸は、脂質粒子内に存在する場合、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に耐性を示す。核酸−脂質粒子及びそれらの調製方法については、例えば、米国特許公開番号２００４０１４２０２５及び２００７００４２０３１に開示されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「脂質封入」とは、ｓｉＲＮＡなどの治療用核酸に、完全な封入、部分的な封入、またはその両方をもたらす脂質粒子のことを意味し得る。好ましい実施形態では、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、脂質粒子内に完全に封入される（例えば、核酸−脂質粒子を形成するために）。
【００５７】
用語「脂質コンジュゲート」とは、脂質粒子の凝集を阻害するコンジュゲート化脂質のことを意味する。このような脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート、例えば、ジアルキルオキシプロピルと結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールと結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールと結合したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと結合したＰＥＧ、及び、セラミドとコンジュゲートしたＰＥＧ（例えば、米国特許番号５，８８５，６１３を参照のこと）など、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ−ＤＡＡコンジュゲート）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲート）、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。ＰＯＺ−脂質コンジュゲートの別の例については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／００６２８２に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺを、脂質に直接コンジュゲートしてもよく、または、リンカー部分を介して脂質に結合させてもよい。ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合させるのに使用可能で好適な任意のリンカー部分としては、例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分が挙げられる。特定の好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分、例えば、アミドまたはカルバメートなどを用いる。
【００５８】
用語「両親媒性脂質」とは部分的に、脂質物質の疎水性部分が疎水相に向く一方で、親水性部分が水相に向くような、任意の好適な物質のことを意味する。親水特性は、極性基または荷電基、例えば、炭化水素基、リン酸基、カルボキシル基、スルファト基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、及び、その他類似の基などの存在に由来する。長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、及び、１個または複数個の芳香族基、脂環基または複素環基（複数可）で置換されたような基が挙げられるがこれらに限定されない無極性基を包含することにより、疎水性が付与され得る。両親媒性化合物の例としては、リン脂質、アミノ脂質及びスフィンゴ脂質が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
リン脂質の代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及び、ジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるがこれらに限定されない。リンを欠くその他の化合物、例えば、スフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール及びβ−アシルオキシ酸などもまた、両親媒性脂質と呼ばれる基に含まれる。加えて、上記の両親媒性脂質を、トリグリセリド及びステロールを含むその他の脂質と混合してもよい。
【００６０】
用語「中性脂質」とは、選択したｐＨにおいて、非荷電形態または中性双性イオン形態のいずれかで存在する、多数の脂質種のうちのいずれかのことを意味する。生理学的ｐＨにおけるこのような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールが挙げられる。
【００６１】
用語「非カチオン性脂質」とは、任意の両親媒性脂質に加え、任意のその他中性脂質またはアニオン性脂質のことを意味する。
【００６２】
用語「アニオン性脂質」とは、生理学的ｐＨにおいて負に荷電した任意の脂質のことを意味する。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−サクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び、中性脂質に結合したその他アニオン性修飾基が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
用語「疎水性脂質」とは、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、及び、１個または複数個の芳香族基、脂環基または複素環基（複数可）で任意選択的に置換されたような基が挙げられるがこれらに限定されない無極性基を有する化合物のことを意味する。好適な例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン、及び、１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
用語「カチオン性脂質」及び「アミノ脂質」は、本明細書において同じ意味で用いられ、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の脂肪酸または脂肪族アルキル鎖、及び、ｐＨ滴定可能なアミノ先端基（例えば、アルキルアミノ先端基またはジアルキルアミノ先端基）を有するような脂質及びそれらの塩が挙げられる。カチオン性脂質は通常、カチオン性脂質のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化し（すなわち、正に荷電する）、そのｐＫａ超のｐＨにおいて実質的に中性である。カチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質とも呼ばれる。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）先端基、Ｃ１８アルキル鎖（それぞれのアルキル鎖は独立して、０〜３（例えば、０、１、２または３）の二重結合を有する）、及び、先端基とアルキル鎖との間にエーテル、エステルまたはケタール結合部を含む。このようなカチオン性脂質としては、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ（ＤＬｉｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＸＴＣ２及びＣ２Ｋとしても周知）、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ（ＭＣ２としても周知）、及び、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（ＭＣ３としても周知）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
用語「塩」としては、任意のアニオン性またはカチオン性の複合体、例えば、カチオン性脂質と１つまたは複数のアニオンとの間に形成された複合体などが挙げられる。アニオンの非限定例としては、無機アニオン及び有機アニオン、例えば、水素化物、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、オキサラート（例えば、ヘミオキサラート）、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素塩、二水素リン酸塩、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、亜硫酸水素塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリレート、ポリアクリレート、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリレート、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、重クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、及びこれらの混合物が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で開示するカチオン性脂質の塩は、結晶性塩である。
【００６６】
用語「アルキル」としては、１〜２４個の炭素原子を含有する、直鎖または分枝鎖の、非環式または環式の、飽和脂肪族炭化水素が挙げられる。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられるがこれらに限定されず、また、飽和分枝鎖アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられるがこれらに限定されない。代表的な飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられるがこれらに限定されず、また、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
用語「アルケニル」としては、隣接した炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義したアルキルが挙げられる。アルケニルとしては、シス異性体及びトランス異性体の両方が挙げられる。代表的な直鎖及び分枝鎖のアルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
用語「アルキニル」としては、隣接した炭素間に少なくとも１つの三重結合を更に含有する、上で定義した任意のアルキルまたはアルケニルが挙げられる。代表的な直鎖及び分枝鎖のアルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
用語「アシル」としては、以下で定義するが、結合点の炭素がオキソ基で置換された、任意のアルキル、アルケニルまたはアルキニルが挙げられる。以下、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、及び、−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルは、アシル基の非限定例である。
【００７０】
用語「複素環」としては、飽和、不飽和または芳香族のいずれかである、５〜７員環単環式または７〜１０員環二環式の複素環が挙げられ、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１または２個のヘテロ原子を含有し、窒素ヘテロ原子及び硫黄ヘテロ原子は任意選択的に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意選択的に四級化されていてもよく、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に縮合した二環式の環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合してもよい。複素環としては、以下で定義するヘテロアリールに加え、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
用語「任意選択的に置換されたアルキル」、「任意選択的に置換されたアルケニル」、「任意選択的に置換されたアルキニル」、「任意選択的に置換されたアシル」及び「任意選択的に置換された複素環」とは、置換される場合、少なくとも１個の水素原子が置換基で置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）について言えば、２個の水素原子が置換されている。これに関連し、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられるがこれらに限定されず、式中、ｎは０、１または２であり、Ｒｘ及びＲｙは同一または異なっており、独立して、水素、アルキルまたは複素環であり、アルキル置換基及び複素環置換基のそれぞれは、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１個または複数個で更に置換されてもよい。置換基のリストの前に用いる場合、用語「任意選択的に置換された」とは、リストの置換基のそれぞれが、本明細書に記載のとおり任意選択的に置換され得るということを意味する。
【００７２】
用語「ハロゲン」としては、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードが挙げられる。
【００７３】
用語「融合」とは、脂質粒子が細胞の膜と融合する能力のことを意味する。膜は、原形質膜、または、オルガネラ（例えば、エンドソーム、核など）を取り囲む膜のいずれかであってもよい。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「水溶液」とは、水を全体的にまたは部分的に含む組成物のことを意味する。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「有機脂質溶液」とは、脂質を有する有機溶媒を全体的にまたは部分的に含む組成物のことを意味する。
【００７６】
脂質粒子について記載するのに用いる場合、用語「電子高密度コア」とは、クライオ透過型電子顕微鏡（「クライオＴＥＭ」）を用いて画像化する際における、脂質粒子内部の暗い外観のことを意味する。一部の脂質粒子は、電子高密度コアを有し脂質二重層構造を欠いている。一部の脂質粒子は、電子高密度コアを有し、脂質二重層構造を欠き、また逆六方相構造または立方相構造を有している。理論に束縛されるものではないが、非二重層の脂質パッキングが、水及び核酸をその内部に含有する脂質シリンダーの三次元ネットワークをもたらす、すなわち、水性チャネルに浸透した脂質液滴が実質的に核酸を収容していると考えられている。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「遠位部位」とは物理的に離れた部位のことを意味し、隣接した毛細血管床に限定されず、生体内の至るところに広く分布した部位を包含する。
【００７８】
核酸−脂質粒子と関連する場合、「血清安定性」とは、遊離ＤＮＡまたは遊離ＲＮＡを有意に分解する血清アッセイまたはヌクレアーゼアッセイに曝露した後に、粒子が有意には分解されないということを意味する。好適なアッセイとしては、例えば、標準的な血清アッセイ、ＤＮａｓｅアッセイまたはＲＮａｓｅアッセイが挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「全身送達」とは、ｓｉＲＮＡなどの活性剤を生体内に広く分布させることにつながる、脂質粒子の送達のことを意味する。一部の投与手法を用いると、特定の薬剤の全身送達がもたらされ得る（その他の薬剤ではもたらされない）。全身送達とは、有用量の、好ましくは治療量の薬剤が、体のほとんどの部位に作用することを意味する。広く体内に分布させるためには通常、投与部位から遠く離れた疾患部位に届く前に、薬剤が急速に分解または消失（初回通過臓器（肝臓、肺など）または急速で非特異的な細胞への結合などによる）しないような血中寿命が必要となる。例えば、静脈内、皮下及び腹腔内を含む当該技術分野において周知の任意の手段を用いて、脂質粒子の全身送達を行ってもよい。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身送達は、静脈内送達により行われる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「局所送達」とは、ｓｉＲＮＡなどの活性剤を、生体内の標的部位へと直接送達することを意味する。例えば、疾患部位、その他標的部位、または、標的臓器（例えば、肝臓、心臓、膵臓、腎臓など）へと直接注射することにより、薬剤を局所送達してもよい。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「ウイルス粒子量」とは、血液などの体液中に存在するウイルス粒子（例えば、ＨＢＶ及び／またはＨＤＶ）数の測定値のことを意味する。例えば、粒子量は、ミリリットル（例えば、血液）あたりのウイルス粒子の数で表してもよい。核酸増幅ベースの試験法に加え、非核酸ベースの試験法を用いて、粒子量試験を実施してもよい（例えば、Ｐｕｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１：Ｓ２７−３６（２０１０）を参照のこと）。
【００８２】
用語「哺乳動物」とは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜類などの任意の哺乳動物種のことを意味する。
表Ａ
【表Ａ−１】
2019501202.tif 000007
【表Ａ−２】
2019501202.tif 000008
【表Ａ−３】
2019501202.tif 000009
【００８３】
オリゴヌクレオチド（表Ｂに記載のセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖など）は、標的ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするか、または、標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的である。本明細書で使用する場合、用語「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」とは、ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定で特異的な結合が生じるように、十分な程度の相補性があることを意味する。特異的にハイブリダイズ可能となるために、オリゴヌクレオチドが、その標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないということを理解されたい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドが標的配列に結合する際に、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であり、標的配列の通常作用に干渉して、その標的配列の発現の有効性を低下させ、また、アッセイを実施する条件下において、特異的結合が望まれる条件下で、すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合、または、インビトロアッセイの場合のような生理学的条件下で、非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるほどの、十分な程度の相補性がある。それゆえ、オリゴヌクレオチドが標的とするまたは特異的にハイブリダイズする、遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比較して、オリゴヌクレオチドには、１、２、３またはそれ以上の塩基置換が含まれていてもよい。
表Ｂ
【表Ｂ−１】
2019501202.tif 000010
【表Ｂ−２】
2019501202.tif 000011
【００８４】
ｓｉＲＮＡ分子の生成
ｓｉＲＮＡは、例えば、１つまたは複数の単離低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、または、ＤＮＡプラスミド内の転写カセットから転写したｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡを含むいくつかの形態で提供することができる。一部の実施形態では、酵素的にまたは部分的／全面的な有機合成により、ｓｉＲＮＡを調製してもよく、また、酵素的にまたは有機合成により、修飾リボヌクレオチドをインビトロで導入してもよい。特定の例においては、それぞれの鎖を化学的に調製する。ＲＮＡ分子を合成するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）に記載の化学合成法、または、本明細書に記載の方法が挙げられる。
【００８５】
ＲＮＡを単離するための方法、ＲＮＡを合成するための方法、核酸をハイブリダイズするための方法、ｃＤＮＡライブラリを作製及びスクリーニングするための方法、及び、ＰＣＲを行うための方法は、当該技術分野において周知である（（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）、ＰＣＲ法については（米国特許番号４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照のこと））。発現ライブラリもまた当業者に周知である。一般的な方法を開示する別の基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及び、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が挙げられる。これら参照文献の開示内容は、あらゆる目的においてその内容全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００８６】
通常、ｓｉＲＮＡは化学合成される。当該技術分野において周知の様々な手法、例えば、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５（１９８７）；Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５４３３（１９９０）；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：２６７７−２６８４（１９９５）；及び、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４：５９（１９９７）に記載されているような手法のいずれかを用いて、ｓｉＲＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドを合成してもよい。オリゴヌクレオチドの合成においては、一般的な核酸保護基及び核酸カップリング基（例えば、５´末端にジメトキシトリチル、また３´末端にホスホラミダイト）を利用する。非限定例として、０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の合成装置上で、小規模の合成を行ってもよい。あるいは、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）製の９６ウェルプレート合成装置上で、０．２μｍｏｌスケールの合成を行ってもよい。しかしながら、より大規模またはより小規模な合成もまた本範囲に含まれる。オリゴヌクレオチド合成用の好適な試薬、ＲＮＡの脱保護方法、及び、ＲＮＡの精製方法については、当業者に周知である。
【００８７】
２つの異なるオリゴヌクレオチド（一方のオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、もう一方のオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む）から、ｓｉＲＮＡ分子をアセンブルしてもよい。例えば、それぞれの鎖を別々に合成し、合成及び／または脱保護に続いて、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションを行うことで互いに結合させてもよい。
【００８８】
治療用核酸を収容する担体系
脂質粒子
脂質粒子は、１種または複数種のｓｉＲＮＡ（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、脂質粒子内のｓｉＲＮＡ分子が水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に耐性を示すように、脂質粒子の脂質部分の内部に完全に封入される。その他の実施形態では、本明細書に記載の脂質粒子は実質的に、ヒトなどの哺乳動物に対して非毒性である。脂質粒子は通常、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または、約７０〜約９０ｎｍの平均粒径を有する。特定の実施形態では、脂質粒子は、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍの中央粒径を有する。脂質粒子はまた通常、約１：１〜約１００：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約２５：１、約３：１〜約２０：１、約５：１〜約１５：１、または、約５：１〜約１０：１の脂質：核酸比率（例えば、脂質：ｓｉＲＮＡ比率）（重量／重量比率）を有する。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は、約５：１〜約１５：１の脂質：ｓｉＲＮＡ重量比率を有する。
【００８９】
脂質粒子としては、１種または複数種のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）、カチオン性脂質（例えば、本明細書に記載する１種または複数種の式Ｉ〜ＩＩＩのカチオン性脂質またはその塩）、非カチオン性脂質（例えば、１種または複数種のリン脂質及びコレステロールの混合物）、及び、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、１種または複数種のＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む、血清安定性の核酸−脂質粒子が挙げられる。脂質粒子は、本明細書に記載の遺伝子のうちの１種または複数種を標的とする、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）を含んでいてもよい。核酸−脂質粒子及びそれらの調製方法については、例えば、米国特許番号５，７５３，６１３、５，７８５，９９２、５，７０５，３８５、５，９７６，５６７、５，９８１，５０１、６，１１０，７４５及び６，３２０，０１７、ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９６４に記載されている（それら開示内容全体はそれぞれ、あらゆる目的において本明細書に参照として組み込まれる）。
【００９０】
核酸−脂質粒子において、１種または複数種のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）は、粒子の脂質部分の内部に完全に封入されてもよく、それにより、ｓｉＲＮＡはヌクレアーゼ分解から保護される。特定の例においては、核酸−脂質粒子内のｓｉＲＮＡは、粒子を、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５または６０分間、ヌクレアーゼに曝露した後、実質的に分解されない。特定のその他の例においては、核酸−脂質粒子内のｓｉＲＮＡは、粒子を、３７℃で少なくとも約３０、４５もしくは６０分間、または、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４もしくは３６時間、血清中でインキュベートした後、実質的に分解されない。その他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、粒子の脂質部分と複合体を形成する。本製剤における利点の１つは、核酸−脂質粒子組成物が実質的に、ヒトなどの哺乳動物に対して非毒性であるという点である。
【００９１】
用語「完全に封入される」とは、遊離ＤＮＡまたは遊離ＲＮＡを有意に分解する血清アッセイまたはヌクレアーゼアッセイに曝露した後に、核酸−脂質粒子内のｓｉＲＮＡ（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）が有意には分解されないということを意味する。完全に封入された系では、通常１００％の遊離ｓｉＲＮＡが分解される治療薬中において、粒子内の約２５％未満のｓｉＲＮＡしか分解されないことが好ましく、約１０％未満がより好ましく、粒子内の約５％未満のｓｉＲＮＡしか分解されないことが最も好ましい。「完全に封入される」とはまた、核酸−脂質粒子が血清安定性であること、すなわち、インビボ投与時に核酸−脂質粒子が、その構成成分へと急速には分解しないことを意味する。
【００９２】
核酸に関しては、核酸と結合すると高い蛍光を示す色素を用いた、膜不透過性蛍光色素排除アッセイを行うことにより、完全な封入を測定することができる。プラスミドＤＮＡ、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、及び／または、一本鎖リボヌクレオチドもしくは二本鎖リボヌクレオチドの定量測定を行うのに、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの特定の色素が利用可能である。リポソーム製剤に色素を加えて得られた蛍光を測定し、その蛍光を、少量の非イオン性界面活性剤を加えた際に観測される蛍光と比較することによって、封入を測定する。界面活性剤が介在するリポソーム二重層の崩壊により封入核酸が放出されて、膜不透過性色素とその核酸が相互作用するようになる。Ｅ  ＝  （Ｉｏ−Ｉ）／Ｉｏ（式中、Ｉ及びＩｏは、界面活性剤を加える前後の蛍光強度を示す）を用いて、核酸封入を算出することができる（Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，６：２７１−２８１（１９９９）を参照のこと）。
【００９３】
一部の例においては、核酸−脂質粒子組成物は、約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、または、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）の粒子がその内部にｓｉＲＮＡを封入するように、粒子の脂質部分の内部に完全に封入されたｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００９４】
その他の例においては、核酸−脂質粒子組成物は、約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、または、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）の入力ｓｉＲＮＡが粒子の内部に封入されるように、粒子の脂質部分の内部に完全に封入されたｓｉＲＮＡを含む。
【００９５】
脂質粒子の使用目的に応じて構成成分比率を変化させてもよく、また、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを用いて、特定の製剤の送達効率を測定してもよい。
【００９６】
カチオン性脂質
様々なカチオン性脂質またはそれらの塩のいずれかを、単独で、または、１種または複数種のその他カチオン性脂質種または非カチオン性脂質種との混合でのいずれかで、脂質粒子に用いてもよい。カチオン性脂質としては、その（Ｒ）及び／または（Ｓ）エナンチオマーが挙げられる。
【００９７】
一態様では、カチオン性脂質はジアルキル脂質である。例えば、ジアルキル脂質としては、２本の飽和または不飽和アルキル鎖を含む脂質を挙げてもよく、そのアルキル鎖のそれぞれは、置換または非置換であってもよい。特定の実施形態では、２本のアルキル鎖のそれぞれは、少なくとも例えば、８個の炭素原子、１０個の炭素原子、１２個の炭素原子、１４個の炭素原子、１６個の炭素原子、１８個の炭素原子、２０個の炭素原子、２２個の炭素原子、または、２４個の炭素原子を含む。
【００９８】
一態様では、カチオン性脂質はトリアルキル脂質である。例えば、トリアルキル脂質としては、３本の飽和または不飽和アルキル鎖を含む脂質を挙げてもよく、そのアルキル鎖のそれぞれは、置換または非置換であってもよい。特定の実施形態では、３本のアルキル鎖のそれぞれは、少なくとも例えば、８個の炭素原子、１０個の炭素原子、１２個の炭素原子、１４個の炭素原子、１６個の炭素原子、１８個の炭素原子、２０個の炭素原子、２２個の炭素原子、または、２４個の炭素原子を含む。
【００９９】
一態様では、以下の構造を有する式Ｉのカチオン性脂質、
【化６】
2019501202.tif 000012
またはその塩が有用であり、式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一または別々のいずれかであり、独立して、水素（Ｈ）または任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニルもしくはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、または、Ｒ１及びＲ２は結合して、４〜６個の炭素原子、及び、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子、ならびにこれらの組み合わせの任意選択的に置換された複素環を形成してもよく、
Ｒ３は、不在、または、水素（Ｈ）もしくは第四級アミンをもたらすＣ１−Ｃ６アルキルのいずれかであり、
Ｒ４及びＲ５は、同一または別々のいずれかであり、独立して、任意選択的に置換されたＣ１０−Ｃ２４アルキル、Ｃ１０−Ｃ２４アルケニル、Ｃ１０−Ｃ２４アルキニルまたはＣ１０−Ｃ２４アシルであり、式中、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含み、
ｎは０、１、２、３または４である。
【０１００】
一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は独立して、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニルまたはＣ２−Ｃ４アルキニルである。一つの好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、両方ともメチル基である。その他の好ましい実施形態では、ｎは、１または２である。その他の実施形態では、Ｒ３は、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａ超である場合、不在であり、またＲ３は、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａ未満である場合（アミノ先端基がプロトン化されるような）、水素である。代替実施形態では、Ｒ３は、第四級アミンをもたらす、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ４アルキルである。更なる実施形態では、Ｒ４及びＲ５は独立して、任意選択的に置換されたＣ１２−Ｃ２０またはＣ１４−Ｃ２２アルキル、Ｃ１２−Ｃ２０またはＣ１４−Ｃ２２アルケニル、Ｃ１２−Ｃ２０またはＣ１４−Ｃ２２アルキニル、または、Ｃ１２−Ｃ２０またはＣ１４−Ｃ２２アシルであり、式中、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、ドデカジエニル部分、テトラデカジエニル部分、ヘキサデカジエニル部分、オクタデカジエニル部分、イコサジエニル部分、ドデカトリエニル部分、テトラデカトリエニル部分、ヘキサデカトリエニル部分、オクタデカトリエニル部分、イコサトリエニル部分、アラキドニル部分、及び、ドコサヘキサエノイル部分、ならびに、それらのアシル誘導体（例えば、リノレオイル、リノレノイル、γ−リノレノイルなど）からなる群から独立して選択される。一部の例においては、Ｒ４及びＲ５のうちの一方は、分枝鎖アルキル基（例えば、フィタニル部分）、または、そのアシル誘導体（例えば、フィタノイル部分）を含む。特定の例においては、オクタデカジエニル部分は、リノレイル部分である。特定のその他の例においては、オクタデカトリエニル部分は、リノレニル部分またはγ−リノレニル部分である。特定の実施形態では、Ｒ４及びＲ５は両方とも、リノレイル部分、リノレニル部分またはγ−リノレニル部分である。特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレオイルオキシ−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＡＰ）、またはこれらの混合物である。
【０１０２】
一部の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、１つまたは複数のアニオンと塩（好ましくは、結晶性塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、そのオキサラート（例えば、ヘミオキサラート）塩であり、好ましくは、結晶性塩である。
【０１０３】
ＤＬｉｎＤＭＡ及びＤＬｅｎＤＭＡなどのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質の合成については、米国特許公開番号２００６００８３７８０に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ及びＣ２−ＤＬｉｎＤＡＰなどのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質の合成については、国際特許出願番号ＷＯ２０１１／０００１０６に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１０４】
別の態様では、以下の構造を有する式ＩＩのカチオン性脂質（またはその塩）、
【化７】
2019501202.tif 000013
が有用であり、
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一または別々のいずれかであり、独立して、任意選択的に置換されたＣ１２−Ｃ２４アルキル、Ｃ１２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ１２−Ｃ２４アルキニル、または、Ｃ１２−Ｃ２４アシルであり、Ｒ３及びＲ４は、同一または別々のいずれかであり、独立して、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニルまたはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、または、Ｒ３及びＲ４は結合して、４〜６個の炭素原子、ならびに、窒素及び酸素から選択される１または２個のヘテロ原子の任意選択的に置換された複素環を形成してもよく、Ｒ５は、不在、または、水素（Ｈ）もしくは第四級アミンをもたらすＣ１−Ｃ６アルキルのいずれかであり、ｍ、ｎ及びｐは、同一または別々のいずれかであり、ｍ、ｎ及びｐが同時に０ではない場合、独立して、０、１または２のいずれかであり、ｑは０、１、２、３または４であり、Ｙ及びＺは、同一または別々のいずれかであり、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである。好ましい実施形態では、ｑは２である。
【０１０５】
一部の実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、「ＸＴＣ２」または「Ｃ２Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、「Ｃ３Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−４−（４−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、「Ｃ４Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキサン（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−メチルペピアジノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジオレオイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジステアロイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−モルホリノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−ジオキソランクロリド（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、２，２−ジリノレイル−４，５−ビス（ジメチルアミノメチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−メチルピペラジン−［１，３］−ジオキソラン（Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペラジン）、またはこれらの混合物である。一実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡである。
【０１０６】
一部の実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、１つまたは複数のアニオンと塩（好ましくは、結晶性塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、そのオキサラート（例えば、ヘミオキサラート）塩であり、好ましくは、結晶性塩である。
【０１０７】
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡなどのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質の合成については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０８６５５８に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ、ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ及びＤ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペラジンなどのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質の合成については、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１（２００９年１０月９日出願）に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１０８】
更なる態様では、以下の構造を有する式ＩＩＩのカチオン性脂質、
【化８】
2019501202.tif 000014
またはその塩が有用であり、式中、Ｒ１及びＲ２は、同一または別々のいずれかであり、独立して、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニルまたはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、または、Ｒ１及びＲ２は結合して、４〜６個の炭素原子、及び、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）からなる群から選択される１または２個のヘテロ原子、ならびにこれらの組み合わせの任意選択的に置換された複素環を形成してもよく、Ｒ３は、不在、または、水素（Ｈ）もしくは第四級アミンをもたらすＣ１−Ｃ６アルキルのいずれかであり、Ｒ４及びＲ５は、不在または存在のいずれかであり、存在する場合、同一または別々のいずれかであり、独立して、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ１０アルキルまたはＣ２−Ｃ１０アルケニルであり、ｎは０、１、２、３または４である。
【０１０９】
一部の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は独立して、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニルまたはＣ２−Ｃ４アルキニルである。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、両方ともメチル基である。別の好ましい実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、両方ともブチル基である。更に別の好ましい実施形態では、ｎは１である。その他の実施形態では、Ｒ３は、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａ超である場合、不在であり、またＲ３は、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａ未満である場合（アミノ先端基がプロトン化されるような）、水素である。代替実施形態では、Ｒ３は、第四級アミンをもたらす、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ４アルキルである。更なる実施形態では、Ｒ４及びＲ５は独立して、任意選択的に置換されたＣ２−Ｃ６またはＣ２−Ｃ４アルキル、または、Ｃ２−Ｃ６またはＣ２−Ｃ４アルケニルである。
【０１１０】
代替実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、アミノ先端基とアルキル鎖の一方または両方との間にエステル結合を含む。一部の実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、１つまたは複数のアニオンと塩（好ましくは、結晶性塩）を形成する。１つの特定の実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、そのオキサラート（例えば、ヘミオキサラート）塩であり、好ましくは、結晶性塩である。
【０１１１】
式ＩＩＩ中のアルキル鎖のそれぞれは、６位、９位及び１２位のシス二重結合（すなわち、シス、シス、シス−Δ６、Δ９、Δ１２）を含有しているが、代替実施形態では、アルキル鎖の一方または両方におけるこれら二重結合のうちの１、２または３つは、トランス構造であってもよい。
【０１１２】
特定の実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、以下の構造を有する。
【化９】
2019501202.tif 000015
【０１１３】
γ−ＤＬｅｎＤＭＡ（１５）などのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質の合成については、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題された米国仮出願番号６１／２２２，４６２（２００９年７月１日出願）に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１１４】
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（「ＭＣ３」）などのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質（例えば、ＭＣ３の特定の類似体）の合成については、「Ｎｏｖｅｌ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題された米国仮出願番号６１／１８５，８００（２００９年６月１０日出願）、及び、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題された米国仮出願番号６１／２８７，９９５（２００９年１２月１８日出願）に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１１５】
脂質粒子中に含まれていてもよいその他のカチオン性脂質またはその塩の例としては、ＷＯ２０１１／０００１０６（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるもののようなカチオン性脂質に加えて、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミン−カルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス、シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス、シス−９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジ��チルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジミリストレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ）、ジリノレイルメチル−３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ；ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡとしても周知）、及びこれらの混合物などのカチオン性脂質が挙げられるがこれらに限定されない。脂質粒子中に含まれていてもよい別のカチオン性脂質またはその塩については、米国特許公開番号２００９００２３６７３に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１１６】
ＣＬｉｎＤＭＡなどのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質の合成については、米国特許公開番号２００６０２４０５５４に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＣ、ＤＬｉｎＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ及びＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡなどのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質の合成については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０８６５５８に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡなどのカチオン性脂質に加えて、別のカチオン性脂質の合成については、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と題されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１（２００９年１０月９日出願）に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。多数のその他カチオン性脂質及び関連類自体の合成については、米国特許番号５，２０８，０３６、５，２６４，６１８、５，２７９，８３３、５，２８３，１８５、５，７５３，６１３及び５，７８５，９９２、ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９０に記載されている（それら開示内容全体はそれぞれ、あらゆる目的において本明細書に参照として組み込まれる）。加えて、多数のカチオン性脂質市販製剤、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む）、及び、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から市販されているＤＯＧＳを含む）などを用いてもよい。
【０１１７】
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、または、約５５ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％、５１ｍｏｌ％、５２ｍｏｌ％、５３ｍｏｌ％、５４ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、５６ｍｏｌ％、５７ｍｏｌ％、５８ｍｏｌ％、５９ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、６１ｍｏｌ％、６２ｍｏｌ％、６３ｍｏｌ％、６４ｍｏｌ％または６５ｍｏｌ％（またはその任意の端数）を含む。
【０１１８】
その他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、または、約４０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。
【０１１９】
脂質粒子に用いるのに好適なカチオン性脂質における別の百分率及び範囲については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７１２０８、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０００１０６、及び、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７６３３５に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１２０】
脂質粒子中に存在するカチオン性脂質の百分率は目標量であり、製剤中に存在する実際のカチオン性脂質の量は、例えば、±５ｍｏｌ％で変化し得ると理解すべきである。例えば、１つの例示的な脂質粒子製剤において、カチオン性脂質の目標量は５７．１ｍｏｌ％であるが、実際のカチオン性脂質の量は、その他の脂質構成成分からなる配合物の残部として、その目標量の±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または、±０．１ｍｏｌ％であり得る（粒子中に存在する総脂質は合計１００ｍｏｌ％となるが、当業者は、総ｍｏｌ％が、丸めにより、例えば、９９．９ｍｏｌ％または１００．１ｍｏｌ％など、１００％からわずかにずれ得ることを理解するであろう）。
【０１２１】
脂質粒子に包含させるのに有用なカチオン性脂質の更なる例について、以下に記載する。
【化１０−１】
2019501202.tif 000016
【化１０−２】
2019501202.tif 000017
【化１０−３】
2019501202.tif 000018
【０１２２】
非カチオン性脂質
脂質粒子に用いる非カチオン性脂質は、安定した複合体を生成可能な、様々な中性非荷電脂質、双性イオン性脂質またはアニオン性脂質のいずれかであってもよい。
【０１２３】
非カチオン性脂質の非限定例としては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びこれらの混合物などのリン脂質が挙げられる。その他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用することができる。これら脂質中のアシル基は、Ｃ１０−Ｃ２４炭素鎖、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルを有する脂肪酸から誘導したアシル基であることが好ましい。
【０１２４】
非カチオン性脂質の別の例としては、コレステロール及びその誘導体などのステロールが挙げられる。コレステロール誘導体の非限定例としては、５α−コレスタノール、５β−コプロスタノール、コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテル、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテル、及び、６−ケトコレスタノールなどの極性類似体、５α−コレスタン、コレステノン、５α−コレスタノン、５β−コレスタノン、及び、コレステリルデカノエートなどの非極性類似体、ならびにこれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテルなどの極性類似体である。コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテルの合成については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１２５】
一部の実施形態では、脂質粒子中に存在する非カチオン性脂質は、１種または複数種のリン脂質及びコレステロールまたはその誘導体の混合物を含むかまたはそれらから構成される。その他の実施形態では、脂質粒子中に存在する非カチオン性脂質は、１種または複数種のリン脂質（例えば、コレステロールフリーの脂質粒子配合物）を含むかまたはそれらから構成される。更にその他の実施形態では、脂質粒子中に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体（例えば、リン脂質フリーの脂質粒子配合物）を含むかまたはそれらから構成される。
【０１２６】
用いるのに好適な非カチオン性脂質のその他の例としては、非リン含有脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン−ラウリルサルフェート、アルキル−アリールサルフェートポリエチルオキシレート化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
【０１２７】
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、または、約３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％もしくは４５ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。
【０１２８】
脂質粒子がリン脂質及びコレステロールまたはコレステロール誘導体の混合物を含有する実施形態では、その混合物は、粒子中に存在する総脂質の最大約４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％または６０ｍｏｌ％を含んでいてもよい。
【０１２９】
一部の実施形態では、混合物中のリン脂質構成成分は、粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、または、約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含んでいてもよい。特定の実施形態では、混合物中のリン脂質構成成分は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１７ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％〜約１７ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、または、約８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％もしくは１５ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。非限定例として、リン脂質及びコレステロールの混合物を含む脂質粒子配合物は、粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の端数）でＤＰＰＣまたはＤＳＰＣなどのリン脂質を含んでいてもよく、例えば、コレステロールまたはコレステロール誘導体を含む混合物を、約３４ｍｏｌ％（またはその任意の端数）で含んでいてもよい。別の非限定例として、リン脂質及びコレステロールの混合物を含む脂質粒子配合物は、粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の端数）でＤＰＰＣまたはＤＳＰＣなどのリン脂質を含んでいてもよく、例えば、コレステロールまたはコレステロール誘導体を含む混合物を、約３２ｍｏｌ％（またはその任意の端数）で含んでいてもよい。
【０１３０】
更なる例としては、有用な脂質製剤は、約１０：１の脂質：薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）比率を有する（例えば、９．５：１〜１１：１、９．９：１〜１１：１、または、１０：１〜１０．９：１の脂質：薬剤比率）。特定のその他実施形態では、有用な脂質製剤は、約９：１の脂質：薬物（例えば、ｓｉＲＮＡ）比率を有する（例えば、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び、９．８：１を含む、８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１の脂質：薬物比率）。
【０１３１】
その他の実施形態では、混合物中のコレステロール構成成分は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％、または、約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含んでいてもよい。特定の好ましい実施形態では、混合物中のコレステロール構成成分は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３４ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３３ｍｏｌ％、または、約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％もしくは３５ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。
【０１３２】
脂質粒子がリン脂質フリーである実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の最大約２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％または６０ｍｏｌ％を含んでいてもよい。
【０１３３】
一部の実施形態では、リン脂質フリーの脂質粒子配合物中におけるコレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３９ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％〜約３８ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、または、約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％もしくは４０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含んでいてもよい。非限定例として、脂質粒子配合物は、粒子中に存在する総脂質の約３７ｍｏｌ％（またはその任意の端数）でコレステロールを含んでいてもよい。別の非限定例として、脂質粒子配合物は、粒子中に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％（またはその任意の端数）でコレステロールを含んでいてもよい。
【０１３４】
その他の実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質のみ）、または、約６０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質及びコレステロールまたはその誘導体）（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。
【０１３５】
脂質粒子に用いるのに好適な非カチオン性脂質における別の百分率及び範囲については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７１２０８、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０００１０６、及び、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７６３３５に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１３６】
脂質粒子中に存在する非カチオン性脂質の百分率は目標量であり、製剤中に存在する実際の非カチオン性脂質の量は、例えば、±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または、±０．１ｍｏｌ％で変化し得ると理解すべきである。
【０１３７】
脂質コンジュゲート
カチオン性脂質及び非カチオン性脂質に加え、脂質粒子は、脂質コンジュゲートを更に含んでいてもよい。コンジュゲート脂質は、粒子の凝集を防止するのに有用である。好適なコンジュゲート脂質としては、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート、ＰＯＺ−脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲート、カチオン性のポリマー−脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、及びこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、粒子は、ＣＰＬと共に、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートのいずれか一方を含む。
【０１３８】
好ましい実施形態では、脂質コンジュゲートはＰＥＧ脂質である。ＰＥＧ脂質の例としては、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０２６３７２に記載のジアルキルオキシプロピルと結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、例えば、米国特許公開番号２００３００７７８２９及び２００５００８６８９に記載のジアシルグリセロールと結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質と結合したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、例えば、米国特許番号５，８８５，６１３に記載のセラミドとコンジュゲートしたＰＥＧ、コレステロールまたはその誘導体とコンジュゲートしたＰＥＧ、及びこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。これら特許文献の開示内容は、あらゆる目的においてその内容全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
用いるのに好適な別のＰＥＧ脂質としては、ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧの合成については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０８６５５８に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。更なる別の好適なＰＥＧ−脂質コンジュゲートとしては、１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパノキシ）−カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ）が挙げられるがこれらに限定されない。２ＫＰＥＧ−ＤＭＧの合成については、米国特許番号７，４０４，９６９に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１４０】
ＰＥＧは、２個の末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ反復単位からなる直鎖状の水溶性ポリマーである。ＰＥＧはその分子量により分類され、例えば、ＰＥＧ２０００は、約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、またＰＥＧ５０００は、約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．及びその他の会社から市販されており、以下、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−サクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルサクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）に加え、末端メトキシ基に代えて末端ヒドロキシル基を含有するような化合物（例えば、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２など）が挙げられるがこれらに限定されない。米国特許番号６，７７４，１８０及び７，０５３，１５０に記載されるもののようなその他のＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ（２０ＫＤａ）アミン）もまた、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを調製するのに有用である。これら特許の開示内容は、あらゆる目的においてその内容全体が参照として本明細書に組み込まれる。加えて、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを含む）を調製するのに特に有用である。
【０１４１】
本明細書に記載するＰＥＧ−脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を含んでいてもよい。特定の例においては、ＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン，約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン，約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン，約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトンなど）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
【０１４２】
特定の例においては、ＰＥＧは、アルキル、アルコキシ、アシルまたはアリール基で任意選択的に置換されてもよい。ＰＥＧを、脂質に直接コンジュゲートしてもよく、または、リンカー部分を介して脂質に結合させてもよい。ＰＥＧを脂質に結合させるのに使用可能で好適な任意のリンカー部分としては、例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分が挙げられる。好ましい実施形態では、リンカー部分は非エステル含有リンカー部分である。本明細書で使用する場合、用語「非エステル含有リンカー部分」とは、カルボン酸エステル結合（−ＯＣ（Ｏ）−）を含有しないリンカー部分のことを意味する。好適な非エステル含有リンカー部分としては、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、アミノ（−ＮＲ−）、カルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）、カルバメート（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−）、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、サクシニル（−（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）、スクシンアミジル（−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）に加え、これらの組み合わせ（カルバメートリンカー部分及びアミドリンカー部分の両方を含有するリンカーなど）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、カルバメートリンカーを用いて、ＰＥＧを脂質に結合させる。
【０１４３】
その他の実施形態では、エステル含有リンカー部分を用いて、ＰＥＧを脂質に結合させる。好適なエステル含有リンカー部分としては、例えば、カーボネート（−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、サクシノニル、リン酸エステル（−Ｏ−（Ｏ）ＰＯＨ−Ｏ−）、スルホン酸エステル、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４４】
鎖長及び飽和度が様々な種々のアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧにコンジュゲートさせて、脂質コンジュゲートを形成してもよい。このようなホスファチジルエタノールアミンは市販されているか、または、当業者に周知の通常の手法を用いて単離または合成してもよい。Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲の炭素鎖長の飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸を含有するホスファチジル−エタノールアミンが好ましい。モノ不飽和脂肪酸またはジ不飽和脂肪酸、ならびに、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸の混合物を含有するホスファチジルエタノールアミンもまた用いてもよい。好適なホスファチジルエタノールアミンとしては、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４５】
用語「ＡＴＴＡ」または「ポリアミド」としては、米国特許番号６，３２０，０１７及び６，５８６，５５９に記載の化合物が挙げられるがこれらに限定されない（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。これらの化合物としては、式、
【化１１】
2019501202.tif 000019
を有する化合物が挙げられ、
式中、Ｒは、水素、アルキル及びアシルからなる群から選択される要素であり、Ｒ１は、水素及びアルキルからなる群から選択される要素であり、または任意選択的に、Ｒ及びＲ１ならびにそれらが結合する窒素は、アジド部分を形成し、Ｒ２は、水素、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアリール、及び、アミノ酸の側鎖から選択される基の要素であり、Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノ及びＮＲ４Ｒ５からなる群から選択される要素であり（式中、Ｒ４及びＲ５は独立して、水素またはアルキル）、ｎは４〜８０であり、ｍは２〜６であり、ｐは１〜４であり、ｑは０または１である。その他のポリアミドも可能であることは、当業者には明白である。
【０１４６】
用語「ジアシルグリセロール」または「ＤＡＧ」としては、２本の脂肪酸アシル鎖Ｒ１及びＲ２（その両方が、独立して、グリセロールの１位及び２位にエステル結合で結合した２〜３０個の炭素を有する）を有する化合物が挙げられる。アシル基は、飽和していてもよく、または、様々な不飽和度を有していてもよい。好適なアシル基としては、ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）及びイコソイル（Ｃ２０）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同一、すなわち、Ｒ１及びＲ２は両方ともミリストイル（すなわち、ジミリストイル）、Ｒ１及びＲ２は両方ともステアロイル（すなわち、ジステアロイル）などである。ジアシルグリセロールは、以下の一般式を有する。
【化１２】
2019501202.tif 000020
【０１４７】
用語「ジアルキルオキシプロピル」または「ＤＡＡ」としては、２本のアルキル鎖Ｒ１及びＲ２（その両方が、独立して、２〜３０個の炭素を有する）を有する化合物が挙げられる。アルキル基は、飽和していてもよく、または、様々な不飽和度を有していてもよい。ジアルキルオキシプロピルは、以下の一般式を有する。
【化１３】
2019501202.tif 000021
【０１４８】
好ましい実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、以下の式、
【化１４】
2019501202.tif 000022
を有するＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートであり、
式中、Ｒ１及びＲ２は独立して選択され、約１０〜約２２個の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり、ＰＥＧはポリエチレングリコールであり、Ｌは、上記のとおり、非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。長鎖アルキル基は、飽和または不飽和であってもよい。好適なアルキル基としては、デシル（Ｃ１０）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）及びイコシル（Ｃ２０）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同一、すなわち、Ｒ１及びＲ２は両方ともミリスチル（すなわち、ジミリスチル）、Ｒ１及びＲ２は両方ともステアリル（すなわち、ジステアリル）などである。
【０１４９】
上記の式ＶＩＩにおいて、ＰＥＧは、約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する。特定の例においては、ＰＥＧは、約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン，約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン，約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン，約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトンなど）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、任意選択的に、アルキル、アルコキシ、アシルまたはアリール基で置換されてもよい。特定の実施形態では、末端ヒドロキシル基は、メトキシ基またはメチル基で置換される。
【０１５０】
好ましい実施形態では、「Ｌ」は、非エステル含有リンカー部分である。好適な非エステル含有リンカーとしては、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分は、カルバメートリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＡＡコンジュゲート）である。別の好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分は、アミドリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ａ−ＤＡＡコンジュゲート）である。更に別の好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分は、スクシンアミジルリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＡコンジュゲート）である。
【０１５１】
特定の実施形態では、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、
【化１５−１】
2019501202.tif 000023
【化１５−２】
2019501202.tif 000024
から選択される。
【０１５２】
当業者に周知の標準的な手法及び試薬を用いて、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを合成する。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートが各種アミド結合、アミン結合、エーテル結合、チオ結合、カルバメート結合及び尿素結合を含有することは、理解されるであろう。これら結合を形成するための方法及び試薬は周知であり容易に利用可能であることを、当業者は理解するであろう。例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｗｉｌｅｙ  １９９２）；Ｌａｒｏｃｋ，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ（ＶＣＨ  １９８９）；及び、Ｆｕｒｎｉｓｓ，ＶＯＧＥＬ’Ｓ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，５ｔｈ  ｅｄ．（Ｌｏｎｇｍａｎ  １９８９）を参照のこと。存在する任意の官能基が、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートの合成において、異なる位置に保護及び脱保護を必要とし得るということもまた理解されるであろう。このような手法が周知であることを当業者は認識しているであろう。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｗｉｌｅｙ  １９９１）を参照のこと。
【０１５３】
ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、好ましくは、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、または、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲートである。これらの実施形態では、ＰＥＧは、約７５０〜約２，０００ダルトンの平均分子量を有していることが好ましい。１つの特に好ましい実施形態におけるＰＥＧ−脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡが挙げられる（「２０００」はＰＥＧの平均分子量を意味し、「Ｃ」はカルバメートリンカー部分を意味し、また「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを意味する）。別の特に好ましい実施形態におけるＰＥＧ−脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡが挙げられる（「７５０」はＰＥＧの平均分子量を意味し、「Ｃ」はカルバメートリンカー部分を意味し、また「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを意味する）。特定の実施形態では、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、メチル基で置換される。その他のジアルキルオキシプロピルをＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートに使用可能であることを、当業者は容易に理解するであろう。
【０１５４】
上記に加え、ＰＥＧに代えてその他の親水性ポリマーが使用可能であることは、当業者には容易に明白となるであろう。ＰＥＧに代えて使用できる好適なポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ならびに、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５５】
上記構成成分に加え、脂質粒子は、カチオン性のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質またはＣＰＬを更に含んでいてもよい（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１１：４３３−４３７（２０００）；米国特許番号６，８５２，３３４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６２８１３を参照のこと）（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１５６】
好適なＣＰＬとしては、式ＶＩＩＩの化合物、
Ａ−Ｗ−Ｙ（ＶＩＩＩ）
が挙げられ、
式中、Ａ、Ｗ及びＹについては、以下で説明する。
【０１５７】
式ＶＩＩＩに関して、「Ａ」は、両親媒性脂質、中性脂質、または、脂質アンカーとして機能する疎水性脂質などの脂質部分である。好適な脂質の例としては、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン、及び、１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５８】
「Ｗ」は、親水性ポリマーまたは親水性オリゴマーなどのポリマーまたはオリゴマーである。親水性ポリマーは、非免疫原性であるかまたは元々免疫原性の低い、生体適合性ポリマーであることが好ましい。あるいは、親水性ポリマーは、適切なアジュバントと共に用いる場合、わずかに抗原性であってもよい。好適な非免疫原性ポリマーとしては、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、ポリマーは、約２５０〜約７，０００ダルトンの分子量を有する。
【０１５９】
「Ｙ」はポリカチオン部分である。用語「ポリカチオン部分」とは、選択されたｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨにおいて、正電荷、好ましくは少なくとも２個の正電荷を有する化合物、誘導体または官能基のことを意味する。好適なポリカチオン部分としては、塩基性アミノ酸及びそれらの誘導体、例えば、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン及びヒスチジン、スペルミン、スペルミジン、カチオン性デンドリマー、ポリアミン、ポリアミン糖及びアミノ多糖などが挙げられる。ポリカチオン部分は、直鎖状（例えば、直鎖状のテトラリジンなど）、分枝鎖状、または、デンドリマー構造であってもよい。ポリカチオン部分は、選択されたｐＨ値において、約２〜約１５個の正電荷、好ましくは、約２〜約１２個の正電荷、より好ましくは、約２〜約８個の正電荷を有する。採用するポリカチオン部分の選択は、望まれる粒子用途のタイプによって決定してもよい。
【０１６０】
ポリカチオン部分の電荷は、粒子部分全体に分布するか、または、粒子部分の１箇所の特定領域における離散的な濃度の電荷密度（例えば、電荷スパイク）のいずれかであってもよい。電荷密度が粒子上に分布している場合、電荷密度は、均等に分布していてもよく、または、不均等に分布していてもよい。ポリカチオン部分における電荷分布のあらゆるバリエーションが包含される。
【０１６１】
脂質「Ａ」及び非免疫原性ポリマー「Ｗ」は、様々な方法で、好ましくは、共有結合で結合させることができる。当業者に周知の方法を用いて、「Ａ」及び「Ｗ」を共有結合させてもよい。好適な結合としては、アミド結合、アミン結合、カルボキシル結合、カーボネート結合、カルバメート結合、エステル結合、及び、ヒドラゾン結合が挙げられるがこれらに限定されない。「Ａ」及び「Ｗ」が、結合を生じさせるための相補的な官能基を有していなければならないということは、当業者には明白である。これら２個の基（一方は脂質上、もう一方はポリマー上）が反応することにより、所望の結合がもたらされる。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、例えば、ＮＨＳ及びＤＣＣでその末端ヒドロキシルが活性化している場合、活性エステルが形成され、その後、アミノ基を含有するポリマー（例えば、ポリアミドなど）と反応して（例えば、米国特許番号６，３２０，０１７及び６，５８６，５５９を参照のこと）（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）、２個の基の間にアミド結合が形成される。
【０１６２】
特定の例においては、ポリカチオン部分は、カルシウムと錯体を形成するために結合した配位子、例えば、標的配位子またはキレート化部分などを有していてもよい。配位子の結合後に、カチオン部分が正電荷を維持することが好ましい。特定の例においては、結合した配位子は正電荷を有する。好適な配位子としては、化合物、または、反応性官能基を備えた機器が挙げられるがこれらに限定されず、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生体親和性化合物、バイオマテリアル、バイオポリマー、医用機器、解析的に検出可能な化合物、治療用活性化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激剤、放射能標識、蛍光原、ビオチン、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、リポソーム、ビロゾーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、その他の標的部分、または、毒素を含む。
【０１６３】
一部の実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、または、約０．６ｍｏｌ％、０．７ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、０．９ｍｏｌ％、１．０ｍｏｌ％、１．１ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％、１．３ｍｏｌ％、１．４ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％、１．６ｍｏｌ％、１．７ｍｏｌ％、１．８ｍｏｌ％、１．９ｍｏｌ％、２．０ｍｏｌ％、２．１ｍｏｌ％、２．２ｍｏｌ％、２．３ｍｏｌ％、２．４ｍｏｌ％、２．５ｍｏｌ％、２．６ｍｏｌ％、２．７ｍｏｌ％、２．８ｍｏｌ％、２．９ｍｏｌ％もしくは３ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。
【０１６４】
その他の実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約１８ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、または、約２ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。
【０１６５】
更なる実施形態では、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、または、約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を含む。
【０１６６】
脂質粒子中に存在する脂質コンジュゲートの百分率は目標量であり、製剤中に存在する実際の脂質コンジュゲートの量は、例えば、±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または、±０．１ｍｏｌ％で変化し得ると理解すべきである。
【０１６７】
脂質粒子に用いるのに好適な脂質コンジュゲートにおける別の百分率及び範囲については、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／１２７０６０、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７１２０８、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０００１０６、及び、米国公開出願番号ＵＳ２０１１／００７６３３５に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１６８】
用いる脂質コンジュゲート、及び、脂質粒子が融合する割合に応じて、脂質コンジュゲートの濃度が変化し得るということを、当業者は理解するであろう。
【０１６９】
脂質コンジュゲートの組成及び濃度を調節することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子の外部と交換する割合を調節すること、更には、脂質粒子が融合する割合を調節することが可能となる。例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを脂質コンジュゲートとして用いる場合、脂質粒子が融合する割合は、例えば、脂質コンジュゲートの濃度を変化させることによって、ＰＥＧの分子量を変化させることによって、または、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲート上のアルキル基の鎖長及び飽和度を変化させることによって、変化し得る。加えて、脂質粒子が融合する割合を変化及び／または調節するために用いることができるその他の変動要因としては、例えば、ｐＨ、温度、イオン強度などが挙げられる。脂質粒子が融合する割合を調節するために用いることができるその他の方法については、本開示を読解することで、当業者には明らかとなるであろう。また、脂質コンジュゲートの組成及び濃度を調節することによって、脂質粒径を調節することが可能となる。
【０１７０】
別の担体系
用いるのに好適な別の脂質ベース担体系の非限定例としては、リポプレックス（例えば、米国特許公開番号２００３０２０３８６５；及び、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１００：１６５−１８０（２００４）を参照のこと）、ｐＨ応答性リポプレックス（例えば、米国特許公開番号２００２０１９２２７５を参照のこと）、可逆的にマスクされたリポプレックス（例えば、米国特許公開番号２００３０１８０９５０を参照のこと）、カチオン性脂質ベース組成物（例えば、米国特許番号６，７５６，０５４；及び、米国特許公開番号２００５０２３４２３２を参照のこと）、カチオン性リポソーム（例えば、米国特許公開番号２００３０２２９０４０、２００２０１６００３８、及び、２００２００１２９９８、米国特許番号５，９０８，６３５、ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７２２８３を参照のこと）、アニオン性リポソーム（例えば、米国特許公開番号２００３００２６８３１を参照のこと）、ｐＨ応答性リポソーム（例えば、米国特許公開番号２００２０１９２２７４、及び、ＡＵ２００３２１０３０３を参照のこと）、抗体被覆リポソーム（例えば、米国特許公開番号２００３０１０８５９７、及び、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５０００８を参照のこと）、細胞型特異的リポソーム（例えば、米国特許公開番号２００３０１９８６６４を参照のこと）、核酸及びペプチドを含有するリポソーム（例えば、米国特許番号６，２０７，４５６を参照のこと）、放出可能親水性ポリマーから誘導体化した脂質を含有するリポソーム（例えば、米国特許公開番号２００３００３１７０４を参照のこと）、脂質包括核酸（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０５７１９０及びＷＯ０３／０５９３２２を参照のこと）、脂質封入核酸（例えば、米国特許公開番号２００３０１２９２２１、及び、米国特許番号５，７５６，１２２を参照のこと）、その他のリポソーム組成物（例えば、米国特許公開番号２００３００３５８２９及び２００３００７２７９４、ならびに、米国特許番号６，２００，５９９を参照のこと）、リポソーム及びエマルションの安定混合物（例えば、ＥＰ１３０４１６０を参照のこと）、エマルション組成物（例えば、米国特許番号６，７４７，０１４を参照のこと）、及び、核酸マイクロエマルション（例えば、米国特許公開番号２００５００３７０８６を参照のこと）が挙げられる。
【０１７１】
用いるのに好適なポリマーベース担体系の例としては、カチオン性ポリマー−核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）が挙げられるがこれらに限定されない。ポリプレックスを形成するためには通常、核酸（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子などのｓｉＲＮＡ分子）と、直鎖状、分枝鎖状、星状または樹枝状のポリマー構造を有するカチオン性ポリマーとで複合体を形成させるが、カチオン性ポリマーは、細胞表面においてアニオン性プロテオグリカンと相互作用してエンドサイトーシスにより細胞内に侵入可能な正に帯電した粒子の内部に核酸を凝縮させる。一部の実施形態では、ポリプレックスは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（例えば、米国特許番号６，０１３，２４０を参照のこと、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からＩｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ（商標）として市販されている（直鎖形態のＰＥＩ））、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマー（例えば、Ｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：８１５５−８１５６（２００１）を参照のこと）、キトサン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（例えば、Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：４８９７−４９０２（１９９６）を参照のこと）、ポルフィリン（例えば、米国特許番号６，６２０，８０５を参照のこと）、ポリビニルエーテル（例えば、米国特許公開番号２００４０１５６９０９を参照のこと）、多環式アミジニウム（例えば、米国特許公開番号２００３０２２０２８９を参照のこと）、第一級アミン基、イミン基、グアニジン基及び／またはイミダゾール基を含むその他のポリマー（例えば、米国特許番号６，０１３，２４０、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／９６０２６５５、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２１９３１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１００：１６５−１８０（２００４）；及び、Ｔｉｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，６：５９−７１（２００６）を参照のこと）、及びこれらの混合物などのカチオン性ポリマーと、複合体を形成する核酸（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子などのｓｉＲＮＡ分子）を含む。その他の実施形態では、ポリプレックスは、米国特許公開番号２００６０２１１６４３、２００５０２２２０６４、２００３０１２５２８１及び２００３０１８５８９０、ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０６６０６９に記載のカチオン性ポリマー−核酸複合体、米国特許公開番号２００４００７１６５４に記載の生分解性ポリ（β−アミノエステル）ポリマー−核酸複合体、米国特許公開番号２００４０１４２４７５に記載のポリマーマトリックスを含有するマイクロ粒子、特許公報公開番号２００３０１５７０３０に記載のその他のマイクロ粒子組成物、米国特許公開番号２００５０１２３６００に記載の凝縮核酸複合体、及び、ＡＵ２００２３５８５１４及びＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０９６５５１に記載のナノカプセル組成物及びマイクロカプセル組成物を含��。
【０１７２】
特定の例においては、ｓｉＲＮＡは、シクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体を形成してもよい。シクロデキストリンベース担体系の非限定例としては、米国特許公開番号２００４００８７０２４に記載のシクロデキストリン修飾ポリマー−核酸複合体、米国特許番号６，５０９，３２３、６，８８４，７８９及び７，０９１，１９２に記載の直鎖状シクロデキストリンコポリマー−核酸複合体、及び、米国特許番号７，０１８，６０９に記載のシクロデキストリンポリマー錯化剤−核酸複合体が挙げられる。特定のその他の例においては、ｓｉＲＮＡは、ペプチドまたはポリペプチドと複合体を形成してもよい。タンパク質ベース担体系の一例としては、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２１９３１に記載のカチオン性オリゴペプチド−核酸複合体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７３】
脂質粒子の調製
連続混合法、直接希釈プロセス、及び、インライン希釈プロセスを含むがこれらに限定されない当該技術分野において周知の任意の方法を用いて、核酸−脂質粒子（核酸（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ）が粒子の脂質部分の内部に包括され、分解から保護される）を生成してもよい。
【０１７４】
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ〜ＩＩＩの脂質またはそれらの塩を、単独で、または、その他のカチオン性脂質と混合させて含んでいてもよい。その他の実施形態では、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、１４：０  ＰＥ（１，２−ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ））、１６：０  ＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ））、１８：０  ＰＥ（１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ））、１８：１  ＰＥ（１，２−ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ））、１８：１  トランスＰＥ（１，２−ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ））、１８：０〜１８：１  ＰＥ（１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ））、１６：０〜１８：１  ＰＥ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ））、ポリエチレングリコールベースポリマー（例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、または、ＰＥＧ修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、その誘導体、またはこれらの組み合わせである。
【０１７５】
特定の実施形態では、連続混合法、例えば、ｓｉＲＮＡを含む水溶液を第１のリザーバ内に提供すること、有機脂質溶液を第２のリザーバ内に提供すること（有機脂質溶液中に存在する脂質は、有機溶媒（例えば、エタノールなどの低級アルカノール）中に溶解する）、及び、有機脂質溶液が水溶液と混ざるのとほぼ同時に、ｓｉＲＮＡを脂質ベシクル内に封入する脂質ベシクル（例えば、リポソーム）が生成されるように、水溶液を有機脂質溶液と混合すること、を含むプロセスを用いて、核酸−脂質粒子を調製する。このプロセス及びこのプロセスを実施するための装置については、米国特許公開番号２００４０１４２０２５に詳細が記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１７６】
脂質及び緩衝液を混合環境（例えば、混合漕など）へと連続的に導入する操作を行うことにより、脂質溶液が緩衝液中に連続的に希釈されるようになり、その結果、混合とほぼ同時に脂質ベシクルが生成される。本明細書で使用する場合、語句「脂質溶液を緩衝液中に連続的に希釈する」（及び変形形態）は通常、ベシクルの生成をもたらすのに十分な力を有する水和プロセスにおいて、脂質溶液が十分速やかに希釈されることを意味する。核酸を含む水溶液を有機脂質溶液と混合することによって、緩衝液（すなわち、水溶液）の存在下、有機脂質溶液が連続的に段階的に希釈されて、核酸−脂質粒子が生成される。
【０１７７】
連続混合法を用いて生成された核酸−脂質粒子は通常、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満もしくは８０ｎｍ未満、または、約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍもしくは１５０ｎｍ（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）のサイズを有する。このように生成された粒子は凝集せず、均一な粒径となるよう任意選択的にサイジングされる。
【０１７８】
別の実施形態では、核酸−脂質粒子は、脂質ベシクル（例えば、リポソーム）溶液を生成して、その脂質ベシクル溶液を、調節した量の希釈緩衝液を入れた回収容器へと直ちに直接導入することを含む、直接希釈プロセスを用いて調製される。好ましい態様では、回収容器は、回収容器の内容物を攪拌して希釈を促進させるように構成された、１つまたは複数の部品を備える。一態様では、回収容器内に存在する希釈緩衝液の量は、そこへ導入する脂質ベシクル溶液の容積とほぼ同等である。非限定例として、等容積の希釈緩衝液を入れた回収容器内へと導入する際、４５％エタノール中の脂質ベシクル溶液は、有利により小さい粒子を生じさせる。
【０１７９】
更に別の実施形態では、希釈緩衝液を入れた第３のリザーバが第２の混合領域と流動的に連結したインライン希釈プロセスを用いて、核酸−脂質粒子を調製する。この実施形態では、第１の混合領域内で生成された脂質ベシクル（例えば、リポソーム）溶液は、第２の混合領域内の希釈緩衝液と直ちに直接混合される。好ましい態様では、第２の混合領域は、脂質ベシクル溶液及び希釈緩衝液の流れが、対向する１８０°の流れで合流するように調整されたＴ型コネクタを備えているが、浅い角度、例えば、約２７°〜約１８０°（例えば、約９０°）となるコネクタを用いてもよい。ポンプ機構を用いて、第２の混合領域へと緩衝液を流量制御可能に供給する。一態様では、第２の混合領域へと供給する希釈緩衝液の流量は、第１の混合領域からそこへと導入する脂質ベシクル溶液の流量とほぼ同等に調節される。この実施形態では、有利に、第２の混合領域内で脂質ベシクル溶液と混合させる希釈緩衝液の流れをより調節すること、及び、またその結果として、第２の混合プロセス中、緩衝液中における脂質ベシクル溶液の濃度をより調節することが、可能となる。希釈緩衝液流量をこのように調節することによって、低濃度での小粒径生成が有利に可能となる。
【０１８０】
これらのプロセスならびにこれら直接希釈プロセス及びインライン希釈プロセスを実施するための装置については、米国特許公開番号２００７００４２０３１に詳細が記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１８１】
直接希釈プロセス及びインライン希釈プロセスを用いて生成された核酸−脂質粒子は通常、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満もしくは８０ｎｍ未満、または、約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍもしくは１５０ｎｍ（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）のサイズを有する。このように生成された粒子は凝集せず、均一な粒径となるよう任意選択的にサイジングされる。
【０１８２】
リポソームをサイジングするのに利用可能な方法のいずれかを用いて、脂質粒子をサイジングしてもよい。所望のサイズ範囲及び比較的狭い粒径分布とするために、サイジングを実施してもよい。
【０１８３】
粒子を所望のサイズへとサイジングするためのいくつかの手法が利用可能である。リポソームに用いられ本粒子にも同様に応用可能な１つのサイジング法については、米国特許番号４，７３７，３２３に記載されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。浴超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかで粒子懸濁液を超音波処理することによって、約５０ｎｍ未満のサイズの粒子へと、サイズを段階的に小さくさせる。ホモジナイゼーションとは、せん断エネルギーに頼り大きな粒子から小さな粒子へと細分化させる別の方法である。通常のホモジナイゼーション工程では、設定した粒径（一般的に約６０〜約８０ｎｍ）が観察されるまで、標準的なエマルションホモジナイザー内に粒子を再循環させる。両方の方法において、通常のレーザービーム粒径識別装置またはＱＥＬＳを用いて、粒径分布をモニターしてもよい。
【０１８４】
小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通して粒子を押し出すこともまた、粒径を比較的明確な粒径分布へと小さくさせるための効果的な方法である。通常は、所望の粒径分布となるまで、１回または複数回、膜を通して懸濁液を循環させる。続けて、孔のより小さな膜を通して粒子を押し出し、段階的に粒径を小さくしてもよい。
【０１８５】
一部の実施形態では、例えば、米国特許出願番号０９／７４４，１０３に記載のとおり、粒子中に存在する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）を予備濃縮する（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１８６】
その他の実施形態では、方法は、本組成物を用いた細胞のリポフェクションを達成するのに有用な非脂質ポリカチオンを加えることを更に含んでいてもよい。好適な非脂質ポリカチオンの例としては、ヘキサジメトリンブロミド（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから商標名ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）で販売されている）またはその他ヘキサジメトリンの塩が挙げられる。その他の適切なポリカチオンとしては、例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリアリルアミン及びポリエチレンイミンの塩が挙げられる。これらの塩の添加は、粒子が生成された後が好ましい。
【０１８７】
一部の実施形態では、生成した核酸−脂質粒子における核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）：脂質比率（重量／重量比率）は、約０．０１〜約０．２、約０．０５〜約０．２、約０．０２〜約０．１、約０．０３〜約０．１、または、約０．０１〜約０．０８の範囲で変動する。出発物質（入力）の比率もまた、この範囲内に収まる。その他の実施形態では、粒子製剤に、１０ｍｇの総脂質あたり約４００μｇの核酸を用いるか、または、約０．０１〜約０．０８、より好ましくは、約０．０４の核酸：脂質重量比率（５０μｇの核酸あたり１．２５ｍｇの総脂質に相当）を用いる。その他の好ましい実施形態では、粒子は、約０．０８の核酸：脂質重量比率を有する。
【０１８８】
その他の実施形態では、生成した核酸−脂質粒子における脂質：核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）比率（重量／重量比率）は、約１（１：１）〜約１００（１００：１）、約５（５：１）〜約１００（１００：１）、約１（１：１）〜約５０（５０：１）、約２（２：１）〜約５０（５０：１）、約３（３：１）〜約５０（５０：１）、約４（４：１）〜約５０（５０：１）、約５（５：１）〜約５０（５０：１）、約１（１：１）〜約２５（２５：１）、約２（２：１）〜約２５（２５：１）、約３（３：１）〜約２５（２５：１）、約４（４：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２０（２０：１）、約５（５：１）〜約１５（１５：１）、約５（５：１）〜約１０（１０：１）、もしくは、約５（５：１）、６（６：１）、７（７：１）、８（８：１）、９（９：１）、１０（１０：１）、１１（１１：１）、１２（１２：１）、１３（１３：１）、１４（１４：１）、１５（１５：１）、１６（１６：１）、１７（１７：１）、１８（１８：１）、１９（１９：１）、２０（２０：１）、２１（２１：１）、２２（２２：１）、２３（２３：１）、２４（２４：１）もしくは２５（２５：１）、またはその任意の端数もしくはその中の範囲で変動する。出発物質（入力）の比率もまた、この範囲内に収まる。
【０１８９】
前述したように、コンジュゲート脂質は、ＣＰＬを更に含んでいてもよい。脂質粒子−ＣＰＬ（ＣＰＬ含有脂質粒子）を調製するための様々な一般的な方法について、本明細書で説明する。２つの一般的な手法としては、「挿入後」手法、すなわち、例えば、予備生成した脂質粒子へのＣＰＬの挿入、及び、「標準」手法（例えば、脂質粒子の生成工程中、脂質混合物中にＣＰＬを含有させる）が挙げられる。挿入後手法により、主に脂質粒子二重層膜の外面にＣＰＬを有する脂質粒子がもたらされる一方、標準手法は、内面及び外面の両方にＣＰＬを有する脂質粒子をもたらす。方法は、リン脂質から調製されたベシクル（コレステロールを含有していてもよい）に特に有用であり、ＰＥＧ−脂質を含有するベシクル（ＰＥＧ−ＤＡＡ及びＰＥＧ−ＤＡＧなど）にもまた有用である。脂質粒子−ＣＰＬの調製方法については、例えば、米国特許番号５，７０５，３８５、６，５８６，４１０、５，９８１，５０１、６，５３４，４８４及び６，８５２，３３４、米国特許公開番号２００２００７２１２１、ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６２８１３において教示されている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１９０】
脂質粒子の投与
脂質粒子（例えば、核酸−脂質粒子）は、それらと混合または接触させたほぼ全ての細胞型に吸着され得る。一旦吸着されると、粒子は、細胞の一部にエンドサイトーシスされるか、細胞膜と脂質を交換するか、または、細胞と融合するかのいずれかとなり得る。粒子のｓｉＲＮＡ部分の移行または取り込みは、これら経路のいずれか１つを介して起こり得る。詳細には、融合が起こる際、粒子の膜が細胞膜内に取り込まれて、粒子の内容物が細胞内液と混ざる。
【０１９１】
脂質粒子（例えば、核酸−脂質粒子）を、単独で、または、投与経路及び標準的な薬学的手法に従い選択した、薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）との混合物として、のいずれかで投与してもよい。一般的に、標準的な緩衝生理食塩水（例えば、１３５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ）を薬学的に許容される担体として用いる。その他の適切な担体としては、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられ、また、安定性を高めるための糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）も挙げられる。別の好適な担体については、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に記載されている。本明細書で使用する場合、「担体」としては、全ての溶媒、分散媒、賦形剤、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び抗カビ剤、等張化剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。語句「薬学的に許容される」とは、ヒトに投与した際に、アレルギー反応または同様の有害反応を引き起こさない分子要素及び組成物のことを意味する。
【０１９２】
薬学的に許容される担体は通常、脂質粒子の生成後に添加される。それゆえ、脂質粒子が生成された後に、粒子を、標準的な緩衝生理食塩水などの薬学的に許容される担体中に希釈してもよい。
【０１９３】
医薬品製剤中における粒子の濃度は、広い範囲で、すなわち、約０．０５重量％未満から、通常は（または少なくとも）約２〜５重量％、約１０〜９０重量％ほどまでと様々であってもよく、また、選択する個々の投与方法に従い、主に液量、粘度などに基づき選択される。例えば、粒子濃度を上昇させて、治療に関連する液体量を低下させてもよい。このことは、アテローム性動脈硬化症に関連したうっ血性心不全または重篤な高血圧症を有する患者において、特に望ましい場合がある。あるいは、炎症性脂質からなる粒子を低濃度まで希釈して、投与部位の炎症を抑えてもよい。
【０１９４】
通常のよく知られた滅菌法を用いて、医薬組成物を滅菌してもよい。使用用に水溶剤を包装してもよく、または、無菌条件下で水溶剤を濾過してから凍結乾燥してもよく、その凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水溶液と混合する。組成物は、ｐＨ調整剤及びｐＨ緩衝剤、等張化剤など、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化カルシウムを含有していてもよい。加えて、粒子懸濁液は、保管時におけるフリーラジカル損傷及び脂質過酸化損傷から脂質を保護する、脂質保護剤を含んでいてもよい。α−トコフェロールなどの親油性フリーラジカル停止剤、及び、フェリオキサミンなどの水溶性の鉄特異的キレート剤が好適である。
【０１９５】
インビボ投与
インビボ治療のための全身送達、例えば、循環など身体システムを介した、遠く離れた標的細胞への本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（表Ａに記載のｓｉＲＮＡなど）の送達は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／００７１９６、ＷＯ０５／１２１３４８、ＷＯ０５／１２０１５２及びＷＯ０４／００２４５３に記載されるもののような核酸−脂質粒子を用いて、行われている（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１９６】
インビボ投与において、当該技術分野において周知の任意の方法、例えば、注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）、経皮投与または直腸投与により、投与を行ってもよい。単一用量または分割用量を用いて、投与を行ってもよい。非経口で、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内で、医薬組成物を投与してもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注入により静脈内投与または腹腔内投与される（例えば、米国特許番号５，２８６，６３４を参照のこと）。細胞内の核酸送達についてはまた、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：５１２（１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，６：２３９（１９８９）；及び、Ｂｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６：２７４（１９９３）において考察されている。脂質ベース医薬品を投与するための更なるその他の方法については、例えば、米国特許番号３，９９３，７５４、４，１４５，４１０、４，２３５，８７１、４，２２４，１７９、４，５２２，８０３、及び、４，５８８，５７８に記載されている。疾患部位に直接注射することにより、または、疾患部位から遠く離れた部位に注射することにより、脂質粒子を投与してもよい（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４）を参照のこと）。上記参照文献の開示内容は、あらゆる目的においてその内容全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０１９７】
脂質粒子を静脈内投与する実施形態では、粒子の総注射用量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％または２５％が、注射後約８、１２、２４、３６または４８時間において、血漿中に存在する。その他の実施形態では、脂質粒子の総注射用量の約２０％超、３０％超、４０％超、及び、約６０％、約７０％または約８０％ほどが、注射後約８、１２、２４、３６または４８時間において、血漿中に存在する。特定の例においては、多数の粒子のうち約１０％超が、投与後約１時間において、哺乳動物の血漿中に存在する。特定のその他の例においては、脂質粒子の存在は、粒子の投与後少なくとも約１時間において検出可能である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の存在は、投与後約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間において、細胞内で検出可能である。その他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子による標的配列（ウイルス配列または宿主配列など）の発現の下方制御は、投与後約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間において検出可能である。更にその他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子による標的配列（ウイルス配列または宿主配列など）の発現の下方制御は、感染細胞及び／または感染可能細胞において優先的に生じる。更なる実施形態では、投与部位の近位部位または遠位部位の細胞内におけるｓｉＲＮＡ分子の存在または効果は、投与後約１２、２４、４８、７２または９６時間において、または、投与後約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６または２８日において検出可能である。別の実施形態では、脂質粒子は、非経口投与または腹腔内投与される。
【０１９８】
組成物を、単独でまたはその他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）で投与するエアゾール製剤に調製してもよい（すなわち、エアゾール製剤を「霧状」にしてもよい）（Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）を参照のこと）。加圧された許容される噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に、エアゾール製剤を入れてもよい。
【０１９９】
特定の実施形態では、経鼻スプレー、吸入、及び／または、その他のエアゾール送達媒体を用いて、医薬組成物を送達してもよい。経鼻エアゾールスプレーを用いた、核酸組成物を直接肺へと送達するための方法については、例えば、米国特許番号５，７５６，３５３及び５，８０４，２１２に記載されている。同様に、経鼻微粒子樹脂及びリソホスファチジル−グリセロール化合物を用いた薬物の送達（米国特許５，７２５，８７１）もまた、医薬技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックス形態による、経粘膜の薬物送達については、米国特許番号５，７８０，０４５に記載されている。上記特許の開示内容は、あらゆる目的においてその内容全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０２００】
例えば、関節内（関節の内部）経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮膚内経路、腹腔内経路及び皮下経路などによる非経口投与に好適な製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び、製剤を目的のレシピエントの血液と等張とする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張性滅菌注射用液剤、ならびに、沈殿防止剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含有し得る水性及び非水性の滅菌懸濁剤を含む。
【０２０１】
通常、静脈内投与する場合、脂質粒子製剤は、好適な医薬品担体を用いて製剤化される。好適な製剤については、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に記載されている。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを用いてもよく、また、安定性を高めるための糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を挙げてもよい。一般的に、標準的な緩衝生理食塩水（１３５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ）を薬学的に許容される担体として用いるが、その他の好適な担体でも十分である。通常のリポソーム滅菌法（例えば、濾過）を用いて、これらの組成物を滅菌してもよい。組成物は、ｐＨ調整剤及びｐＨ緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含有していてもよい。上記の手法を用いてこれらの組成物を滅菌してもよく、あるいは、これらの組成物を滅菌条件下で調製してもよい。使用用に、得られた水溶剤を包装してもよく、または、無菌条件下で水溶剤を濾過してから凍結乾燥してもよく、その凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水溶液と混合する。
【０２０２】
特定の用途では、経口投与により、本明細書で開示した脂質粒子を個体へと送達してもよい。粒子を賦形剤と混合させて、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、ロゼンジ剤、エリキシル剤、含嗽剤、懸濁剤、経口スプレー、シロップ剤、カシェ剤などの形状で用いてもよい（例えば、米国特許番号５，６４１，５１５、５，５８０，５７９及び５，７９２，４５１を参照のこと）（その開示全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。これらの経口剤形はまた、以下の、結合剤、ゼラチン、添加剤、滑沢剤及び／または風味剤を含有していてもよい。単位投与剤形がカプセル剤である場合、上記の原料に加えて、液体担体を含有していてもよい。コーティング剤として、または別の場合、投与単位の物理的形状を調節するために、様々なその他の原料を提供してもよい。当然、任意の単位投与剤形を調製するのに用いる任意の原料は、用いる量において、薬学的に純粋かつ実質的に非毒性でなければならない。
【０２０３】
通常、これらの経口製剤は、当然、粒子の百分率は様々であってもよく、都合よく、総配合物の重量または容積の約１％または２％〜約６０％もしくは７０％またはそれ以上であってもよいが、少なくとも約０．１％またはそれ以上の脂質粒子を含有していてもよい。当然、化合物の任意の単位用量で好適な投与量が得られるように、それぞれの治療的に有効な組成物における粒子の量を調製してもよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命などの因子に加え、このような医薬品製剤を調製するためのその他薬理学的な考察について、当業者は予期するであろうし、それゆえ、様々な用量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
【０２０４】
経口投与に好適な製剤は、（ａ）液剤（希釈剤（例えば、水、生理食塩水またはＰＥＧ４００）中に懸濁させた有効量の包装ｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）など）、（ｂ）カプセル剤、サッシェ剤または錠剤（それぞれが、所定量のｓｉＲＮＡ分子を、液体、固体、顆粒またはゼラチンとして含有）、（ｃ）適切な液体中の懸濁剤、及び、（ｄ）好適なエマルション剤からなってもよい。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状の二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ならびに、その他の添加剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、風味剤、染料、崩壊剤、及び、薬学的に相溶性のある担体のうちの１種または複数種を含んでいてもよい。ロゼンジ剤形態は、風味剤（例えば、スクロース）中のｓｉＲＮＡ分子に加え、不活性基剤（例えば、ゼラチン及びグリセリンのエマルション剤、ゲル剤、または、スクロース及びアカシアのエマルション剤、ゲル剤など）中の治療用核酸を含むパステル剤（ｓｉＲＮＡ分子に加え、当該技術分野において周知の担体を含有）を含んでいてもよい。
【０２０５】
それらの使用に関する別の例においては、広範囲の局所投与剤形中に脂質粒子を混合させてもよい。例えば、核酸−脂質粒子を含有する懸濁液を、ゲル剤、油剤、エマルション剤、局所クリーム剤、パスタ剤、軟膏剤、ローション剤、発泡剤、ムース剤などとして製剤化して、投与してもよい。
【０２０６】
投与する粒子の量は、ｓｉＲＮＡ分子：脂質の比率、用いる個々のｓｉＲＮＡ、治療するＨＢＶ株、患者の年齢、体重及び症状、ならびに、臨床医の判断に応じて決まるが、一般的には、体重１キログラムあたり約０．０１〜約５０ｍｇ、好ましくは、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ（体重）、または、投与（例えば、注射）あたり約１０８〜１０１０個の粒子である。
【０２０７】
１ｍ〜１５ｍ（表Ａを参照のこと）と名付けたｓｉＲＮＡの群から選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡにおける、全ての可能な「２種」混合物について、以下に記載する。用語「混合物」とは、混ぜ合わせたｓｉＲＮＡ分子が同一組成の物質中に共に存在することを意味する（例えば、同一溶液中に共に溶解すること、同一脂質粒子中に共に存在すること、または、同一脂質粒子医薬品製剤中に共に存在すること（医薬品製剤中のそれぞれの脂質粒子は、ｓｉＲＮＡ混合物のそれぞれ異なるｓｉＲＮＡを含んでいてもいなくてもよいが））。混ぜ合わせたｓｉＲＮＡ分子は通常、互いに共有結合していない。
【０２０８】
個々のｓｉＲＮＡはそれぞれ、表Ａに示すように、１ｍ〜１５ｍの名称で区別されている。混合物中のそれぞれのｓｉＲＮＡ番号は、ダッシュ（―）で区切られており、例えば、表記「１ｍ―２ｍ」は、ｓｉＲＮＡ番号１ｍ及びｓｉＲＮＡ番号２ｍの混合物を表す。ダッシュは、混合物中の異なるｓｉＲＮＡ分子が互いに共有結合しているということを意味しない。異なるｓｉＲＮＡ混合物は、セミコロンで区切られている。混合物中におけるｓｉＲＮＡ番号の順番は重要ではない。例えば、混合物１ｍ―２ｍは混合物２ｍ―１ｍと同等である。なぜなら、これら表記の両方は、ｓｉＲＮＡ番号１ｍ及びｓｉＲＮＡ番号２ｍからなる同一の混合物を示しているからである。
【０２０９】
ｓｉＲＮＡ２種及び３種混合物は、例えば、ヒトのＨＢＶ感染症及び／またはＨＤＶ感染症を治療するのに有用であり、また、ＨＢＶ感染症及び／またはＨＤＶ感染症に関連する少なくとも１つの症状を改善するのに有用である。
【０２１０】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、核酸−脂質粒子を介して投与される。
【０２１１】
特定の実施形態では、脂質粒子内に封入したｓｉＲＮＡのカクテルの使用を含む方法に関して、異なるｓｉＲＮＡ分子は、同一の脂質粒子内に同時封入される。
【０２１２】
特定の実施形態では、脂質粒子内に封入したｓｉＲＮＡのカクテルの使用を含む方法に関して、カクテル内に存在するそれぞれのタイプのｓｉＲＮＡ種は、それ独自の粒子内に封入されている。
【０２１３】
特定の実施形態では、脂質粒子内に封入したｓｉＲＮＡのカクテルの使用を含む方法に関して、いくつかのｓｉＲＮＡ種が同一粒子内に同時封入される一方で、別のｓｉＲＮＡ種は異なる粒子内に封入される。
【０２１４】
２種またはそれ以上の薬剤の配合及び投与
薬剤を単一製剤へと共に製剤化してもよいこと、または、薬剤を別々に製剤化してもよいこと、またそれゆえ、同時にまたは連続的に、別々に投与してもよいことが理解されるであろう。一実施形態では、薬剤を連続的に（例えば、別々の時点で）投与する場合、それらの生物学的作用がオーバーラップする（すなわち、それぞれの薬剤が、単一の任意の期間に生物学的作用を生じさせる）ように、薬剤を投与してもよい。
【０２１５】
選択した薬剤に応じた任意の許容される投与経路用に薬剤を製剤化してもよく、また、選択した薬剤に応じた任意の許容される投与経路を使用して薬剤を投与してもよい。例えば、好適な経路としては、経口、舌下、頬側、局所、経皮、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び経鼻、必要に応じ、局所療法、病巣内投与が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、本明細書中で特定した低分子薬剤を経口投与してもよい。別の実施形態では、注射（例えば、静脈などの血管内に）または皮下で、オリゴマーヌクレオチドを投与してもよい。一部の実施形態では、それを必要とする対象は、１種または複数種の薬剤を経口投与され（例えば、丸剤で）、また、注射または皮下で、１種または複数種のオリゴマーヌクレオチドを投与される。
【０２１６】
通常、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチドは、例えば、脂質ナノ粒子製剤で静脈内投与されるが、本発明は、オリゴマーヌクレオチドを含む静脈内製剤、または、オリゴマーヌクレオチドを静脈内投与する治療方法に限定されない。
【０２１７】
周囲温度、適切なｐＨ及び所望の純度で、生理学的に許容される担体（すなわち、採用する用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性の担体）と混合することによって、薬剤を個別に製剤化してもよい。製剤のｐＨは主に、化合物の個々の使用及び濃度によって決まるが、通常、約３〜約８のどこかの範囲であってもよい。凍結乾燥製剤または水溶剤でも許容されるが、薬剤は通常、固体組成物で保存される。
【０２１８】
良好な医学的手法に合った方法で、薬剤を含む組成物を製剤化し、投薬量を決め、投与してもよい。この状況において検討される因子としては、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者における臨床症状、疾患の原因、投与部位、投与方法、投与スケジュール、及び、医師に周知のその他因子が挙げられる。
【０２１９】
薬剤は、任意の簡便な投与形態で、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、液剤、分散液剤、懸濁剤、シロップ剤、噴霧剤、坐剤、ゲル剤、エマルション剤、貼付剤などで投与されてもよい。このような組成物は、医薬製剤に通常用いる構成成分、例えば、希釈剤、担体、ｐＨ調整剤、甘味剤、増量剤、及び、更なる活性剤を含有していてもよい。非経口投与が望まれる場合、組成物は、滅菌であり、また、注射または注入に好適な溶液形態または懸濁液形態となるであろう。
【０２２０】
好適な担体及び添加剤は当業者にとって周知であり、例えば、Ａｎｓｅｌ，Ｈｏｗａｒｄ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００４；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００；及び、Ｒｏｗｅ，Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２００５に詳細が記載されている。製剤はまた、１種または複数種の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、沈殿防止剤、防腐剤、酸化防止剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味剤、着香剤、風味剤、希釈剤、及び、薬剤に上品な外観をもたらすか、または、医薬品（すなわち、薬剤）の製造に役立つその他周知の添加剤を含んでいてもよい。
【０２２１】
薬剤は通常、少なくとも所望の生物学的作用に達する濃度で投与される。それゆえ、効果的な投与レジメンでは、少なくとも、所望の生物学的作用または生物学的有効量に達する最低量を投与するが、用量は、生物学的作用の利点が許容できない副作用を伴う量を上回るほど高い必要はない。したがって、効果的な投与レジメンでは、最大耐量（「ＭＴＤ」）以下を投与する。最大耐量は、許容される比率の用量制限毒性（「ＤＬＴ」）をもたらす最高用量として定義される。許容できない比率のＤＬＴを引き起こす用量は、非耐容であるとみなされる。通常、特定のスケジュールにおけるＭＴＤは、第１相臨床試験中に設定される。これら第１相試験は通常、げっ歯類における重度の中毒量（ｍｇ／ｍ２基準）の１／１０（「ＳＴＤ１０」）である安全な開始用量で始め、３人のコホートに患者を増やし、最も高い漸増ステップが最も低い相対増分（例えば、１００％、６５％、５０％、４０％、及び、３０％〜３５％以降で増える用量）を有するというフィボナッチ変法に従い、用量を漸増させることによって、患者に対して実施される。３人の患者のコホートにおいて、非耐量に達するまで用量漸増を継続する。許容される比率のＤＬＴを生じさせる投与濃度よりも１段階低い濃度がＭＴＤとみなされる。
【０２２２】
投与する薬剤の量は、用いる特定の薬剤、治療するＨＢＶ株、患者の年齢、体重及び症状、ならびに、臨床医の判断に応じて決まるが、一般的には、１日あたり約０．２〜２．０グラムである。
【０２２３】
キット
一実施形態では、キットを提供する。キットは、混合物を含む容器を含んでいてもよい。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル瓶、シリンジ、ブリスターパックなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料で形成されていてもよい。容器は、症状を治療するのに有効な混合物を収容してもよく、また、滅菌アクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル瓶であってもよい）を有していてもよい。
【０２２４】
キットは、容器表面上または容器に付随した、ラベルまたは添付文書を更に含んでいてもよい。用語「添付文書」とは、通常は治療薬の市販パッケージ内に含まれる取扱説明書を意味するために用いられ、このような治療薬の使用に関する表示、用法、用量、投与、禁忌及び／または警告についての情報が含まれる。一実施形態では、ラベルまたは添付文書は、治療薬を用いてＢ型肝炎などのウイルス感染症を治療可能であることを示す。
【０２２５】
特定の実施形態では、キットは、治療薬の固体経口形態（例えば、錠剤またはカプセル剤など）を運搬するのに好適である。このようなキットは、多数の単位用量を含んでいることが好ましい。このようなキットは、キットの使用目的順に合わせた用量を示すカードを含んでいてもよい。このようなキットの一例は、「ブリスターパック」である。ブリスターパックは、包装業界において周知であり、医薬品の単位投与剤形を包装するために広範に使用されている。必要に応じ、記憶の補助になるもの（例えば、数字、文字またはその他の印の形態）を提供してもよく、または、用量を投与し得る治療スケジュールの日程を示すカレンダー文書と共にそれらを提供してもよい。
【０２２６】
別の実施形態によれば、キットは、（ａ）第１の薬剤をその中に収容した第１の容器、及び、（ｂ）第２の薬剤をその中に収容した第２の容器を含んでいてもよい。代替または別の場合、キットは、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びブドウ糖輪液などを含む第３の容器を更に含んでいてもよい。キットは、市販及びユーザーの観点から望ましいその他の材料（例えば、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む）を更に含んでいてもよい。
【０２２７】
キットは、治療薬の投与に関する説明書を更に含んでいてもよい。例えば、キットは、治療薬を、それを必要とする患者に同時、連続的または別々に投与するための説明書を更に含んでいてもよい。
【０２２８】
特定のその他実施形態では、キットは、分離したボトルまたは分離したホイルパケットなど、個々の組成物を収容するための容器を含んでいてもよいが、個々の組成物はまた、単一の分離していない容器内に収容されていてもよい。特定の実施形態では、キットは、個々の治療薬の投与に関する説明書を含む。キット形態は、個々の治療薬を異なる投薬形態（例えば、経口及び非経口）で投与する際に、個々の治療薬を異なる投与間隔で投与する際に、または、混合物における個々の治療薬の処方医による滴定が望ましい場合に、特に有利である。
【０２２９】
一実施形態では、本発明は、化合物３、化合物４、エンテカビル、ラミブジン及びＳＩＲＮＡ−ＮＰからなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を動物に投与することを含む、動物のＢ型肝炎を治療するための方法を提供する。
【０２３０】
一実施形態では、本発明の方法は、相乗有効量のｉ）共有結合閉環状ＤＮＡの形成阻害剤、及び、ｉｉ）ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を動物に投与することを含む、動物のＢ型肝炎を治療するための方法を除外する。
【０２３１】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、ｉ）共有結合閉環状ＤＮＡの形成阻害剤、及び、ｉｉ）唯一の活性Ｂ型肝炎治療薬としてのヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を含む組成物を除外する。
【０２３２】
一実施形態では、本発明のキットは、ｉ）共有結合閉環状ＤＮＡの形成阻害剤、及び、ｉｉ）唯一のＢ型肝炎薬としてのヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を含むキットを除外する。
【０２３３】
一実施形態では、本発明の方法は、ｉ）Ｂ型肝炎ウイルスを標的とする１種または複数種のｓｉＲＮＡ、及び、ｉｉ）逆転写酵素阻害剤を動物に投与することを含む、動物のＢ型肝炎を治療するための方法を除外する。
【０２３４】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、ｉ）Ｂ型肝炎ウイルスを標的とする１種または複数種のｓｉＲＮＡ、及び、ｉｉ）唯一の活性Ｂ型肝炎治療薬としての逆転写酵素阻害剤を含む組成物を除外する。
【０２３５】
一実施形態では、本発明のキットは、ｉ）Ｂ型肝炎ウイルスを標的とする１種または複数種のｓｉＲＮＡ、及び、ｉｉ）唯一のＢ型肝炎薬としての逆転写酵素阻害剤を含むキットを除外する。
【０２３６】
一実施形態では、本発明は、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、及び、
ｅ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を動物に投与することを含む、動物のＢ型肝炎を治療するための方法を提供する。
【０２３７】
一実施形態では、本発明は、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、及び、
ｅ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも２種の薬剤を含むキットを提供する。
【０２３８】
一実施形態では、本発明は、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、ならびに、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、及び、
ｅ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも１種の別の薬剤を動物に投与することを含む、動物のＢ型肝炎を治療するための方法を提供する。
【０２３９】
一実施形態では、本発明は、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、ならびに、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、及び、
ｅ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも１種の別の薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【０２４０】
一実施形態では、本発明は、Ｂ型肝炎ゲノムを標的とするオリゴマーヌクレオチド、ならびに、
ａ）逆転写酵素阻害剤、
ｂ）カプシド阻害剤、
ｃ）ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、
ｄ）ｓＡｇ分泌阻害剤、及び、
ｅ）免疫刺激剤
からなる群から選択される少なくとも１種の別の薬剤を含むキットを提供する。
【０２４１】
治療薬混合物がＢ型肝炎を治療する能力については、当業者に周知の薬理学モデルを用いて測定してもよい。
【０２４２】
ここから以下の非限定例を挙げながら、本発明について説明する。
【実施例】
【０２４３】
以下の化合物について、実施例で言及する。化合物３〜４は、周知の手順を用いて調製可能である。国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１０６０１９及びＷＯ２０１３／００６３９４もまた、化合物３〜４を調製するために使用可能な合成方法について記載している。
【化１６−１】
2019501202.tif 000025
【化１６−２】
2019501202.tif 000026
【０２４４】
実施例１
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のマウスモデルを用いて、免疫刺激剤及びＨＢＶ標的化ｓｉＲＮＡの抗ＨＢＶ効果を評価した（独立した治療薬として、互いを混合しての両方で）。
【０２４５】
ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡを送達するために、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いた。表に記載した数値はモル百分率である。略語ＤＳＰＣとは、ジステアロイルホスファチジルコリンのことを意味する。
【化１７】
2019501202.tif 000027
【０２４６】
カチオン性脂質は、以下の構造（１３）を有していた。
【化１８】
2019501202.tif 000028
【０２４７】
ＨＢＶゲノムを標的とする３種類のｓｉＲＮＡの混合物を用いた。３種類のｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す。
【化１９−１】
2019501202.tif 000029
【化１９−２】
2019501202.tif 000030
【０２４８】
２７日目に、１０マイクログラムのプラスミドｐＡＡＶ／ＨＢＶ１．２（Ｄｒ．Ｐｅｉ−Ｊｅｒ  Ｃｈｅｎから入手（当初は、Ｈｕａｎｇ，ＬＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００６，１０３（４７）：１７８６２−１７８６７）に記載）を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにハイドロダイナミクス法で投与した（ＨＤＩ；尾静脈内に１．３ｍＬを急速注入）。このプラスミドは、ＨＢＶゲノムの１．２倍過剰に長い複製を有し、その他のＨＢＶ産物間でＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現している。酵素免疫アッセイを用いて、マウスにおける血清ＨＢｓＡｇ発現をモニターした。血清ＨＢｓＡｇレベルに基づき、ａ）全ての動物がＨＢｓＡｇを発現することが確認されるように、及び、ｂ）治療開始前のＨＢｓＡｇ群における平均値が互いに類似となるように、動物を群へと分類した（無作為化した）。
【０２４９】
免疫刺激剤を用いて、以下のように動物を治療した。０日目に、２０マイクログラムの高分子量ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））をＨＤＩで投与した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入したＨＢＶ標的化ｓｉＲＮＡを用いて、以下のように動物を治療した。０日目、７日目及び１４日目のそれぞれにおいて、１ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡに相当する量の試験薬を静脈内投与した。陰性対照群には、このＨＢＶマウスモデルにおいてＨＢｓＡｇ発現レベルが完全には安定していないマウスが含まれており、個々の動物における血清ＨＢｓＡｇの絶対濃度は通常、経時的に低下した。治療薬に特異的な効果を明らかにするために、治療群を陰性対照動物と比較した。
【０２５０】
０日目（治療前）、３日目、７日目、１４日目及び２１日目に少量の血液を採取して、それらの血清ＨＢｓＡｇ含有量を解析することにより、治療薬の効果を測定した。定量が可能なアッセイ範囲内の数値を得るために、試料を必要に応じて希釈した。定量下限値（ＬＬＯＱ）未満内に含まれる個々の数値を、ＬＬＯＱの２分の１と設定した。０日目における治療前のベースライン値に対する個々の動物の百分率として表される、治療群の平均（ｎ＝４または５；±標準誤差）血清ＨＢｓＡｇ濃度を表１に示す。
【０２５１】
データは、ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡ及びポリ（Ｉ：Ｃ）の混合物に応答してＨＢｓＡｇが低下する度合いに加え、低下効果の持続期間を示している。２種の治療薬を混合することにより、一方の治療薬単独の場合と比較して、より優れた効果が得られた。
表１．３種のＨＢＶ  ｓｉＲＮＡ及び免疫刺激剤  ポリ（Ｉ：Ｃ）による、ＨＢＶ感染症マウスモデルの血清ＨＢｓＡｇにおける単独及び混合の治療効果
【表１−１】
2019501202.tif 000031
【表１−２】
2019501202.tif 000032
【０２５２】
実施例２
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のマウスモデルを用いて、ＨＢＶ封入低分子阻害剤（化合物３）及びＨＢＶ標的化ｓｉＲＮＡの抗ＨＢＶ効果を評価した（独立した治療薬として、互いを混合しての両方で）。
【０２５３】
ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡを送達するために、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いた。表に記載した数値はモル百分率である。略語ＤＳＰＣとは、ジステアロイルホスファチジルコリンのことを意味する。
【化２０】
2019501202.tif 000033
【０２５４】
カチオン性脂質は、以下の構造（７）を有していた。
【化２１】
2019501202.tif 000034
【０２５５】
ＨＢＶゲノムを標的とする３種類のｓｉＲＮＡの混合物を用いた。３種類のｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す。
【化２２】
2019501202.tif 000035
【０２５６】
７日目に、１０マイクログラムのプラスミドｐＨＢＶ１．３（Ｇｕｉｄｏｔｔｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，６９（１０）：６１５８−６１６９のとおり）を、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊマウスにハイドロダイナミクス法で投与した（ＨＤＩ；尾静脈内に１．６ｍＬを急速注入）。このプラスミドは、ＨＢＶゲノムの１．３倍過剰に長い複製を有し、発現時、その他のＨＢＶ産物間のＨＢＶ  ＤＮＡを含むＢ型肝炎ウイルス粒子を産生する。定量ＰＣＲアッセイ（Ｔａｎａｋａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，７２：２２３−２２９に記載のプライマー配列／プローブ配列）を用い、様々な治療薬における抗ＨＢＶ効果の測定値として、マウスにおける血清ＨＢＶ  ＤＮＡ濃度を総抽出ＤＮＡから測定した。
【０２５７】
化合物３を用いて、以下のように動物を治療した。０日目から開始して、５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ用量の化合物３を、０日目〜７日目に毎日２回の頻度、合計１４回の用量で、動物に経口投与した。投与するために、化合物３を共溶媒製剤中に溶解させた。陰性対照動物に、共溶媒製剤単独、または、生理食塩水のいずれかを投与した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入したＨＢＶ標的化ｓｉＲＮＡを用いて、以下のように動物を治療した。０日目に、０．１ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡに相当する量の試験薬を静脈内投与した。このＨＢＶマウスモデルにおけるＨＢＶ発現レベルは完全には安定ではなく、治療薬に特異的な効果を明らかにするため、ここで、治療群を陰性対照動物と比較する。
【０２５８】
０日目（治療前）、４日目及び７日目に血液を採取して、それらの血清ＨＢＶ  ＤＮＡ含有量を解析することにより、これら治療薬の効果を測定した。０日目における治療前のベースライン値に対する個々の動物の百分率として表される、治療群の平均（ｎ＝７または８；±標準誤差）血清ＨＢＶ  ＤＮＡ濃度を表２に示す。
【０２５９】
データは、化合物３及びＨＢＶ  ｓｉＲＮＡの混合物に応答して血清ＨＢＶ  ＤＮＡが低下する度合いに加え、低下効果の持続期間を示している。２種の治療薬を混合することにより、一方の治療薬単独の場合と比較して、より優れた効果が得られた。
表２．化合物３及び３種のＨＢＶ  ｓｉＲＮＡによる、ＨＢＶ感染症マウスモデルの血清ＨＢＶ  ＤＮＡにおける単独及び混合の治療効果
【表２−１】
2019501202.tif 000036
【表２−２】
2019501202.tif 000037
【０２６０】
実施例３
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のマウスモデルを用いて、ＨＢＶ封入低分子阻害剤（化合物３）の抗ＨＢＶ効果を評価した（独立した治療薬として、承認済み化合物エンテカビル（ＥＴＶ）を混合しての両方で）。
【０２６１】
７日目に、１０マイクログラムのプラスミドｐＨＢＶ１．３（Ｇｕｉｄｏｔｔｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，６９（１０）：６１５８−６１６９のとおり）を、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊマウスにハイドロダイナミクス法で投与した（ＨＤＩ；尾静脈内に１．６ｍＬを急速注入）。このプラスミドは、ＨＢＶゲノムの１．３倍過剰に長い複製を有し、発現時、その他のＨＢＶ産物間のＨＢＶ  ＤＮＡを含むＢ型肝炎ウイルス粒子を産生する。定量ＰＣＲアッセイ（Ｔａｎａｋａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，７２：２２３−２２９に記載のプライマー配列／プローブ配列）を用い、様々な治療薬における抗ＨＢＶ効果の測定値として、マウスにおける血清ＨＢＶ  ＤＮＡ濃度を総抽出ＤＮＡから測定した。
【０２６２】
化合物３を用いて、以下のように動物を治療した。０日目から開始して、１００ｍｇ／ｋｇ用量の化合物３を、０日目〜７日目に毎日２回の頻度、合計１４回の用量で、動物に経口投与した。投与するために、化合物３を共溶媒製剤中に溶解させた。陰性対照動物に、共溶媒製剤単独、または、生理食塩水のいずれかを投与した。ＥＴＶを用いて、以下のように動物を治療した。０日目から開始して、１００ｎｇ／ｋｇ用量または３００ｎｇ／ｋｇ用量のいずれかの用量のＥＴＶを、０日目〜６日目に毎日１回の頻度、合計７回の用量で、動物に経口投与した。投与するために、ＥＴＶをＤＭＳＯ中に２ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させてから、生理食塩水中に希釈した。このＨＢＶマウスモデルにおけるＨＢＶ発現レベルは完全には安定ではなく、治療薬に特異的な効果を明らかにするため、ここで、治療群を陰性対照動物と比較する。
【０２６３】
０日目（治療前）、４日目及び７日目に血液を採取して、それらの血清ＨＢＶ  ＤＮＡ含有量を解析することにより、これら治療薬の効果を測定した。群の平均値を計算するために、定量下限値（ＬＬＯＱ）未満のＣｔ値を有する試料を、ＬＬＯＱの２分の１と設定した。０日目における治療前のベースライン値に対する個々の動物の百分率として表される、治療群の平均（ｎ＝５〜８；±標準誤差）血清ＨＢＶ  ＤＮＡ濃度を表３に示す。
【０２６４】
データは、化合物３及びＥＴＶの混合物に応答して血清ＨＢＶ  ＤＮＡが低下する度合いに加え、低下効果の持続期間を示している。２種の治療薬を混合することにより、一方の治療薬単独の場合と比較して、より優れた効果が得られた。
表３．化合物３及びＥＴＶによる、ＨＢＶ感染症マウスモデルの血清ＨＢＶ  ＤＮＡにおける単独及び混合の治療効果
【表３−１】
2019501202.tif 000038
【表３−２】
2019501202.tif 000039
【０２６５】
実施例４〜６
インビトロ混合物試験の目的：
ＨＢＶ細胞培養モデル系を用いて、ＨＢＶ封入低分子阻害剤（化合物３）、エンテカビル（ＥＴＶ）（ＨＢＶポリメラーゼ逆転写酵素阻害剤）、及び、ＳＩＲＮＡ−ＮＰ（全てのウイルスｍＲＮＡ転写物及びウイルス抗原の強力なノックダウンを促進することを目的とするｓｉＲＮＡ）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０２６６】
ＳＩＲＮＡ−ＮＰの組成物：
ＳＩＲＮＡ−ＮＰは、ＨＢＶゲノムを標的とする３種類のｓｉＲＮＡの混合物の脂質ナノ粒子製剤である。本明細書で報告する試験では、ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡを送達するために、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いた。表に記載した数値はモル百分率である。略語ＤＳＰＣとは、ジステアロイルホスファチジルコリンのことを意味する。
【化２３】
2019501202.tif 000040
【０２６７】
カチオン性脂質は、以下の構造（７）を有していた。
【化２４】
2019501202.tif 000041
【０２６８】
３種類のｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す。
【化２５−１】
2019501202.tif 000042
【化２５−２】
2019501202.tif 000043
【０２６９】
インビトロ混合物試験プロトコル：
Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎの方法（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ  Ｃ  Ｊｒ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，１４（４−５），１８１−２０５；及び、Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，ｅｔ．ａｌ．，ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ）を用いて、インビトロ混合物試験を実施した。Ｃａｍｐａｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｍｐａｇｎａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１３，８７（１２），６９３１−６９４２）に記載のとおり、ＡＭＬ１２−ＨＢＶ１０細胞株を分化させた。ＨＢＶゲノムを安定的にトランスフェクトされ、ＨＢＶ  ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡを発現してＨＢＶ  ｒｃＤＮＡ（弛緩型開環状ＤＮＡ）合成をテトラサイクリン制御様式で補助できるのは、マウス肝細胞細胞株である。ＡＭＬ１２−ＨＢＶ１０細胞を、９６ウェルの組織培養処理済みマイクロタイタープレートを用いて、１０％ウシ胎児血清＋１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（テトラサイクリン非含有）中に播種し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を新鮮な培地へと移してから、阻害剤Ａ及び阻害剤Ｂを用い、それらの対応するＥＣ５０値付近の濃度範囲で治療し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間の間インキュベートした。阻害剤を、１００％ＤＭＳＯ中（ＥＴＶ及び化合物３）または増殖培地中（ＳＩＲＮＡ−ＮＰ）のいずれかで希釈し、アッセイ中の最終ＤＭＳＯ濃度を≦０．５％とした。それぞれの濃度の阻害剤Ａをそれぞれの濃度の阻害剤Ｂと混合させるようなチェッカー盤様式で、２種類の阻害剤について、単独に加えて混合物の両方で試験し、ｒｃＤＮＡ産生阻害におけるそれら混合物の効果を測定した。４８時間のインキュベーション後、ＨＢＶ特異的カスタムプローブセット及び製造業者の取扱説明書を備えたｂＤＮＡアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、阻害剤治療したウェル中に存在するｒｃＤＮＡレベルを測定した。それぞれのウェルから生成したＲＬＵデータを、未治療対照ウェルの％阻害として計算し、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩプログラムを用いて解析し、Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎが定めた以下のような判定ガイドライン、９５％ＣＩにおける相乗容積＜２５μＭ２％（対数容積＜２）＝おそらく有意ではない；２５〜５０μＭ２％（対数容積＞２かつ＜５）＝小さいが有意、５０〜１００μＭ２％（対数容積＞５かつ＜９）＝中程度、はインビボで重要となり得る；１００μＭ２％超（対数容積＞９）＝強い相乗作用、おそらくインビボで重要；１０００μＭ２％に近い容積（対数容積＞９０）＝異常に高くデータチェックを要する、を用いて、混合物が相乗的であるか、相加的であるかまたは拮抗的であるかを明らかにした。同時に、製造業者の取扱説明書に従いｃｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存能の測定値としてのＡＴＰ含有量を測定するのに使用した複製プレートを用いて、細胞生存能に対する阻害剤混合物の効果を評価した。
【０２７０】
実施例４：化合物３及びエンテカビルのインビトロ混合物：
化合物３（２倍希釈系列及び９点滴定における、２．５μＭ〜０．０１μＭの濃度範囲）をエンテカビル（３倍希釈系列及び５点滴定における、０．０７５μＭ〜０．００１μＭの濃度範囲）と混合して試験した。化合物３またはエンテカビルによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたｒｃＤＮＡの平均％阻害及び４点の複製の標準偏差については、表１に記載している。化合物３及びエンテカビルのＥＣ５０値については、表４に記載している。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用（表１）から予想される値と比較すると、混合物が相加的であることが判明した（表４）。
【０２７１】
実施例５：化合物３及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物：
化合物３（２倍希釈系列及び９点滴定における、２．５μＭ〜０．０１μＭの濃度範囲）をＳＩＲＮＡ−ＮＰ（３倍希釈系列及び５点滴定における、０．５μｇ／ｍＬ〜０．００６μｇ／ｍＬの濃度範囲）と混合して試験した。化合物３またはＳＩＲＮＡ−ＮＰによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたｒｃＤＮＡの平均％阻害及び４点の複製の標準偏差については、表２に記載している。化合物３及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのＥＣ５０値については、表４に記載している。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用（表２）から予想される値と比較すると、混合物が相加的であることが判明した（表４）。
【０２７２】
実施例６：エンテカビル及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物：
エンテカビル（３倍希釈系列及び５点滴定における、０．０７５μＭ〜０．００１μＭの濃度範囲）をＳＩＲＮＡ−ＮＰ（２倍希釈系列及び９点滴定における、０．５μｇ／ｍＬ〜０．００２μｇ／ｍＬの濃度範囲）と混合して試験した。エンテカビルまたはＳＩＲＮＡ−ＮＰによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたｒｃＤＮＡの平均％阻害及び４点の複製の標準偏差については、表３に記載している。エンテカビル及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのＥＣ５０値については、表４に記載している。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用（表３）から予想される値と比較すると、混合物が相加的であることが判明した（表４）。
表１：エンテカビル（ＥＴＶ）及び化合物３のインビトロ混合物：
【表１−３】
2019501202.tif 000044
【表１−４】
2019501202.tif 000045
【表１−５】
2019501202.tif 000046
【表１−６】
2019501202.tif 000047
【表１−７】
2019501202.tif 000048
表２：化合物３及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物
【表２−３】
2019501202.tif 000049
【表２−４】
2019501202.tif 000050
【表２−５】
2019501202.tif 000051
【表２−６】
2019501202.tif 000052
【表２−７】
2019501202.tif 000053
表３：エンテカビル及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物
【表３−３】
2019501202.tif 000054
【表３−４】
2019501202.tif 000055
【表３−５】
2019501202.tif 000056
【表３−６】
2019501202.tif 000057
表４：ｂＤＮＡアッセイを用いたｒｃＤＮＡ定量を伴うＡＭＬ１２−ＨＢＶ１０細胞培養系によるインビトロ混合物試験の結果の要約：
【表４−１】
2019501202.tif 000058
【表４−２】
2019501202.tif 000059
【０２７３】
実施例７〜９
インビトロ混合物試験の目的：
ＨＢＶ  ＤＮＡ複製プロセス、ｃｃｃＤＮＡ形成プロセス及びｃｃｃＤＮＡ発現プロセス、ならびに、安定性に関する、２種化合物混合物を用いた混合物治療の効果を測定することである。化合物３及び化合物４（２種ＨＢＶ封入低分子阻害剤）、エンテカビル（ＥＴＶ）及びラミブジン（３ＴＣ）（２種ＦＤＡ承認済みＨＢＶポリメラーゼ逆転写酵素阻害剤）、ならびに、ＳＩＲＮＡ−ＮＰ（脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で製剤化されたウイルスｍＲＮＡ及びウイルス抗原発現のｓｉＲＮＡ阻害剤）について検証した。試験は、ＨＢＶ細胞培養モデル系を用いて、混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることを目的とした。
【０２７４】
ＬＮＰ製剤：
ＳＩＲＮＡ−ＮＰは、ＨＢＶゲノムを標的とする３種類のｓｉＲＮＡの混合物の脂質ナノ粒子製剤である。本明細書で報告する試験では、ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡを送達するために、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いた。表に記載した数値はモル百分率である。略語ＤＳＰＣとは、ジステアロイルホスファチジルコリンのことを意味する。
【化２６】
2019501202.tif 000060
【０２７５】
カチオン性脂質は、以下の構造（７）を有していた。
【化２７】
2019501202.tif 000061
【０２７６】
ｓｉＲＮＡ
３種類のｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す。
【化２８−１】
2019501202.tif 000062
【化２８−２】
2019501202.tif 000063
【０２７７】
インビトロ混合物試験プロトコル：
Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２．Ｖｏｌ  ５６（８）：４２７７−８８）に記載されているアッセイ系の調整を用いて、インビトロ混合物試験を実施した。これまでに開発されているＨｅｐＤＥ１９細胞培養系（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００７）８１（２２）：１２４７２−１２４８４）は、ＨＢＶ  ＤＮＡ複製及びｃｃｃＤＮＡ形成をテトラサイクリン（Ｔｅｔ）制御様式で補助し、ｃｃｃＤＮＡの産生及び維持に依存する検出可能なレポーター分子を産生する。
【０２７８】
ＨｅｐＤＥ１９細胞培養系において、レポーターは、プレコアＲＮＡ及びその関連タンパク質産物、分泌ＨＢＶ「ｅ抗原」（ＨＢｅＡｇ）である。ＨｅｐＤＥ１９細胞において、プレコアＲＮＡ及びＨＢｅＡｇはｃｃｃＤＮＡ環状鋳型のみから産生される。その理由としては、ＨＢｅＡｇのＯＲＦ及びその５´ＲＮＡリーダーが、一体化したウイルスゲノムの相対する両末端に離れて位置しており、ｃｃｃＤＮＡの形成に続いて起こるに過ぎないからである。ＨｅｐＤＥ１９細胞培養系に基づいたアッセイは、活性を測定するには効果的ではあるが、ＨＢｅＡｇ  ＥＬＩＳＡが、ＨｅｐＤＥ１９細胞内において主にｃｃｃＤＮＡに依存した方法で発現するコア抗原（ＨＢｃＡｇ）である、ウイルスＨＢｅＡｇホモログと交差反応するため、ハイスループットスクリーニングの結果が複雑になる場合がある。この複雑化を克服するために、ＨＢＶ複製、ｃｃｃＤＮＡ転写及びＨＢｅＡｇ分泌にとって重要ないかなるシスエレメントも破壊することなく、ＤＥＳＨＡｅ８２細胞の導入遺伝子内におけるＨＢｅＡｇのＮ末端コード配列中にインフレームＨＡエピトープタグを含む、代替的な細胞培養系（本明細書ではＤＥＳＨＡｅ８２細胞培養系と呼び、ＰＣＴ／ＥＰ／２０１５／０６８３８に記載されている）が開発されている。
【０２７９】
捕捉抗体として機能するＨＡ抗体及び検出抗体として機能するＨＢｅＡｇを用いてＨＡタグを付加したＨＢｅＡｇを検出するための化学発光ＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＬＩＡ）（ＨＢｃＡｇ由来の汚染シグナルを排除する）が開発されている。ＨＡ−ＨＢｅＡｇ  ＣＬＩＡアッセイと結合したＤＥＳＨＡｅ８２細胞株は、高レベルのｃｃｃＤＮＡ合成ならびにＨＡ−ＨＢｅＡｇ産生及び分泌、ならびに、低いノイズで高い特異的読み出しシグナルを発揮する。加えて、ＤＥ１９細胞内またはＤＥＳＨＡｅ８２細胞内のいずれかにおけるプレコアＲＮＡの検出に特化した定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）用のプロトコルが開発されており、翻訳されてＨＢｅＡｇまたはＨＡ−ＨＢｅＡｇを産生するｃｃｃＤＮＡ依存性ｍＲＮＡ（プレコアＲＮＡ）の検出としても用いられている。
【０２８０】
化合物混合物を試験するために、ＤＥＳＨＡｅ８２細胞またはＤＥ１９細胞（例に記載のしたとおり）を、９６ウェルの組織培養処理済みマイクロタイタープレートを用いて、１０％ウシ胎児血清＋１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｔｅｔ含有）中に播種し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を新鮮な培地（Ｔｅｔ非含有）へと移してから、阻害剤Ａ及び阻害剤Ｂを用い、それらの対応するＥＣ５０値付近の濃度範囲で治療し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間の間インキュベートした。阻害剤を、１００％ＤＭＳＯ中（ＥＴＶ、３ＴＣ、化合物３及び化合物４）または増殖培地中（ＳＩＲＮＡ−ＮＰ）のいずれかで希釈し、アッセイ中の最終ＤＭＳＯ濃度を０．５％とした。それぞれの試験濃度の阻害剤Ａをそれぞれの試験濃度の阻害剤Ｂと混合させるようなチェッカー盤様式で、２種類の阻害剤について、単独に加えて混合物の両方で試験し、ｃｃｃＤＮＡ形成阻害及びｃｃｃＤＮＡ発現阻害におけるそれら混合物の効果を測定した。それぞれのプレートの複数のウェル内に、未治療陰性対照試料（０．５％  ＤＭＳＯまたは培地のみ）を含有させた。９日間のインキュベーションの後、培地を除去し、細胞をＲＮＡ抽出に供してから、ｃｃｃＤＮＡ依存性プレコアｍＲＮＡレベルを測定した。製造業者の取扱説明書に従い（吸引マニホールド処理、緩衝液ＲＡ４による２回以上の追加洗浄）、９６ウェル式総ＲＮＡ単離キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ，Ｃａｔ．７４０４６６．４）を用いて、総細胞ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料をＲＮＡａｓｅフリー水中に溶出させた。ｃｃｃＤＮＡ依存性プレコアＲＮＡを特異的に検出するプライマー及び条件を用いたＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０及びＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｂｅ（カタログ番号  ０４９９１８８５００１，Ｒｏｃｈｅ）で、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルについてもまた、標準的な方法を用いて検出し、プレコアＲＮＡレベルを正規化するために用いた。プレコアＲＮＡレベル阻害、及びその結果であるｃｃｃＤＮＡ発現阻害を、未治療対照ウェルの％阻害として計算し、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙＩＩプログラム（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，Ｓｈｉｐｍａｎ  Ｃ  Ｊｒ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０．Ｖｏｌ  １４（４−５）：１８１−２０５；Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，Ａｓｅｌｔｉｎｅ  ＫＲ，及び  Ｓｈｉｐｍａｎ，Ｃ．ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  １９９２）を利用したＰｒｉｃｈａｒｄ−Ｓｈｉｐｍａｎ混合物モデルを用いて解析し、Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎが定めた以下のような判定ガイドライン、９５％ＣＩにおける相乗容積＜２５μＭ２％（対数容積＜２）＝おそらく有意ではない；２５〜５０μＭ２％（対数容積＞２かつ＜５）＝小さいが有意、５０〜１００μＭ２％（対数容積＞５かつ＜９）＝中程度、はインビボで重要となり得る；１００μＭ２％超（対数容積＞９）＝強い相乗作用、おそらくインビボで重要；１０００μＭ２％に近い容積（対数容積＞９０）＝異常に高くデータチェックを要する、を用いて、混合物が相乗的であるか、相加的であるかまたは拮抗的であるかを明らかにした。
【０２８１】
同時に、細胞生存能及び細胞増殖に対する阻害剤混合物の効果について、２つの方法、１）試験ウェルの直接顕微鏡観察、及び、２）１０〜２０％の細胞密度で播種した複製プレートを用いて、４日後、製造業者の取扱説明書に従いＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内ＡＴＰ含有量を定量すること、により評価した。細胞生存能及び細胞密度を、未治療陰性対照ウェルの百分率として計算した。
【０２８２】
実施例７：化合物３及びエンテカビルのインビトロ混合物：
化合物３（ｈａｌｆ−ｌｏｇ希釈系列及び６点滴定における、１０μＭ〜０．０３１６μＭの濃度範囲）をエンテカビル（ｈａｌｆ−ｌｏｇ、３．１６倍希釈系列及び６点滴定における、０．０１０μＭ〜０．００００３μＭの濃度範囲）と混合して試験した。この混合物の抗ウイルス活性については表７ａに示し、相乗容積及び拮抗容積については表７ｂに記載している。Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎに従った相乗容積及び拮抗容積の測定値の２点の複製による混合物の結果及び判定については、表９ｄに記載している。このアッセイ系において、この混合物は、プレコアＲＮＡ発現の相乗的阻害をもたらした。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、顕微鏡で観察されなかった。
表７ａ．化合物３及びエンテカビルの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した平均パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝２試料）
【表７ａ】
2019501202.tif 000064
表７ｂ．化合物３及びエンテカビルの混合物におけるＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ容積計算：
９９．９９％信頼レベルにおける「相加的を超える」阻害レベル
【表７ｂ】
2019501202.tif 000065
【０２８３】
実施例８：化合物４及びエンテカビルのインビトロ混合物：
化合物４（ｈａｌｆ−ｌｏｇ希釈系列及び６点滴定における、１０μＭ〜０．０３１６μＭの濃度範囲）をエンテカビル（ｈａｌｆ−ｌｏｇ、３．１６倍希釈系列及び６点滴定における、０．０１０μＭ〜０．００００３μＭの濃度範囲）と混合して試験した。この混合物の抗ウイルス活性については表８ａに示し、相乗容積及び拮抗容積については表８ｂに記載している。Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎに従った相乗容積及び拮抗容積の測定値の２点の複製による混合物の結果及び判定については、表９ｄに記載している。このアッセイ系において、この混合物は、プレコアＲＮＡ発現の相乗的阻害をもたらした。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、顕微鏡で観察されなかった。
表８ａ．化合物４及びエンテカビルの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した平均パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝２試料）
【表８ａ−１】
2019501202.tif 000066
【表８ａ−２】
2019501202.tif 000067
表８ｂ．化合物４及びエンテカビルの混合物におけるＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ容積計算：
９９．９９％信頼区間における「相加的を超える」阻害レベル
【表８ｂ】
2019501202.tif 000068
【０２８４】
実施例９：化合物３及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物：
化合物３（ｈａｌｆ−ｌｏｇ希釈系列及び６点滴定における、１０μＭ〜０．０３１６μＭの濃度範囲）をＳＩＲＮＡ−ＮＰ（ｈａｌｆ−ｌｏｇ、３．１６倍希釈系列及び６点滴定における、０．１０μＭ〜０．０００μｇ／ｍｌの濃度範囲）と混合して試験した。この混合物の抗ウイルス活性については表９ａに示し、相乗容積及び拮抗容積については表９ｂに記載している。Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎに従った相乗容積及び拮抗容積の測定値の４点の複製による混合物の結果及び判定については、表９ｄに記載している。このアッセイ系において、この混合物は、プレコアＲＮＡ発現の相乗的阻害をもたらした。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、顕微鏡またはＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイで観察されなかった（表９ｃ）。
表９ａ．化合物３及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した平均パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝４試料）
【表９ａ】
2019501202.tif 000069
表９ｂ．化合物３及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物におけるＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ容積計算：
９９．９９％信頼レベルにおける「相加的を超える」阻害レベル
【表９ｂ−１】
2019501202.tif 000070
【表９ｂ−２】
2019501202.tif 000071
表９ｃ．化合物３及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の細胞傷害性：
対照と比較した細胞生存能の平均パーセント
【表９ｃ】
2019501202.tif 000072
表９ｄ．ｑＲＴ−ＰＣＲを用いたｃｃｃＤＮＡ誘導プレコアＲＮＡ定量を伴うＤＥＳＨＡｅ８２細胞培養系によるインビトロ混合物試験の結果の要約
【表９ｄ】
2019501202.tif 000073
【０２８５】
実施例１０
この実施例の目的は、化合物３（ＨＢＶ封入低分子阻害剤）及びＳＩＲＮＡ−ＮＰ（ＨＢＶ標的化ｓｉＲＮＡ封入脂質ナノ粒子製剤）に加え、確立されたＨＢＶ標準治療治療薬、エンテカビル（ＥＴＶ）、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体（ｄｅ  Ｍａｎ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３４（３），５７８−８２（２００１））及びＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ（ｐｅｇＩＮＦ  α−２ａ）（１型インターフェロン受容体を活性化させることによりウイルスの伝播を制限する）（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，５１（１２），１２０６−１７（２００４））を含む、様々な混合物治療薬の抗ＨＢＶ活性を比較することであった。これら混合物の力価を、化合物３、ＳＩＲＮＡ−ＮＰ及びＥＴＶを単独で含む単剤治療薬に加え、化合物３の溶媒を含む陰性対照治療条件と比較した。
【０２８６】
この作業は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染が定着したヒト化肝臓キメラマウスモデルで行った（Ｔｓｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４２（５），１０４６−５４（２００５））。０日目に開始する治療フェーズに先立ち、動物におけるＨＢＶ感染症持続レベルを確認した。試験薬用量は以下の通りであった。化合物３、経口１００ｍｇ／ｋｇを１日２回；ＳＩＲＮＡ−ＮＰ、静脈内３ｍｇ／ｋｇを１週間おきに；ＥＴＶ、経口１．２μｇ／ｋｇを毎日；ｐｅｇＩＦＮ  α−２ａ、皮下３０μｇ／ｋｇを週に２回。
【０２８７】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＧＳ  ＨＢｓＡｇ  ＥＩＡ  ３．０酵素結合免疫吸着アッセイキットを用いて製造業者の取扱説明書に従い、血清ＨＢｓＡｇレベルを基準として、抗ＨＢＶ効果を評価し、また、定量ＰＣＲアッセイ（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，２２３−２２９（２００４）に記載のプライマー配列／プローブ配列）を用いて、総抽出ＤＮＡから血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルを測定した。
【０２８８】
より高い抗ウイルス活性（例えば、単剤治療薬を基準とした血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルのより強い抑制のような）が得られる２種混合物治療薬及び３種混合物治療薬について検証した。詳細には、２８日目において、血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルは、ＥＴＶ、化合物３またはＳＩＲＮＡ−ＬＮＰの単剤治療薬で観察された１．０〜１．５ｌｏｇ１０の低下と比較して、化合物３及びＳＩＲＮＡ−ＬＮＰの混合物または化合物３及びｐｅｇＩＦＮ  α−２ａの混合物での治療後に２．５ｌｏｇ１０だけ、また、化合物３及びＥＴＶの混合物での治療後に２ｌｏｇ１０だけ低下した。２８日目において、化合物３、ＳＩＲＮＡ−ＮＰ及びＥＴＶを含有する、または、化合物３、ＳＩＲＮＡ−ＮＰ及びｐｅｇＩＮＦ  α−２ａを含有する３種混合物治療薬は、２種混合物治療薬と比較して、ＨＢＶ  ＤＮＡレベルに対するわずかに優れた効果を示した。ＳＩＲＮＡ−ＮＰのＢ型肝炎タンパク質（抗原）産生阻害能は（例えば、血清ＨＢｓＡｇレベルに基づく）維持されていた（その他の抗ウイルス治療薬と併用して同時投与した際）。
表１０ａ：血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルに対する混合物治療薬及び単剤治療薬の効果
【表１０ａ−１】
2019501202.tif 000074
【表１０ａ−２】
2019501202.tif 000075
表１０ｂ：血清ＨＢｓＡｇレベルに対する混合物治療薬及び単剤治療薬の効果
【表１０ｂ−１】
2019501202.tif 000076
【表１０ｂ−２】
2019501202.tif 000077
【０２８９】
実施例１１
インビトロ混合物試験の目的：
ＨＢＶ細胞培養モデル系を用いて、ＨＢＶ封入低分子阻害剤（化合物３）及びテノホビル（ＴＤＦ）、ＨＢＶポリメラーゼヌクレオシド類似体阻害剤からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【化２９】
2019501202.tif 000078
【０２９０】
インビトロ混合物試験プロトコル：
Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎの方法（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ  Ｃ  Ｊｒ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，１４（４−５），１８１−２０５；及び、Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，ｅｔ．ａｌ．，ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ）を用いて、インビトロ混合物試験を実施した。ＨｅｐＤＥ１９細胞培養系は、ＨＢＶ  ＤＮＡ複製及びｃｃｃＤＮＡ形成をテトラサイクリン（Ｔｅｔ）制御様式で補助し、ＨＢＶ  ｒｃＤＮＡ、ならびに、ｃｃｃＤＮＡの産生及び維持に依存する検出可能なレポーター分子（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８１：１２４７２−１２４８４）を産生する、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌）由来の細胞株である。ＨｅｐＤＥ１９（５０，０００個の細胞／ウェル）を、９６ウェルのコラーゲンコート組織培養処理済みマイクロタイタープレートを用いて、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に播種し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、テトラサイクリンを含有しない新鮮な培地へと移してから、３７℃、５％ＣＯ２下で４時間インキュベートした。その後、細胞を、テトラサイクリンを含有しない新鮮な培地へと移してから、阻害剤Ａ及び阻害剤Ｂを用い、それらの対応するＥＣ５０値付近の濃度範囲で治療し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で７日間の間インキュベートした。阻害剤テノホビル（ＴＤＦ）及び化合物３を１００％ＤＭＳＯ中で希釈し、アッセイ中の最終ＤＭＳＯ濃度を≦０．５％とした。それぞれの濃度の阻害剤Ａをそれぞれの濃度の阻害剤Ｂと混合させるようなチェッカー盤様式で、２種類の阻害剤について、単独に加えて混合物の両方で試験し、ｒｃＤＮＡ産生阻害におけるそれら混合物の効果を測定した。化合物混合物を用いた７日間の細胞インキュベーション後、ＨＢＶ特異的カスタムプローブセット及び製造業者の取扱説明書を備えたＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０  ｂＤＮＡアッセイキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、阻害剤治療したウェル中に存在するｒｃＤＮＡレベルを測定した。Ｖｉｃｔｏｒ蛍光プレートリーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いてプレートを読み、それぞれのウェルから生成した相対発光量（ＲＬＵ）データを、未治療対照ウェルの％阻害として計算し、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩプログラムを用いて解析し、Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎが定めた以下のような判定ガイドライン、９５％ＣＩにおける相乗容積＜２５μＭ２％（対数容積＜２）＝おそらく有意ではない；２５〜５０μＭ２％（対数容積＞２かつ＜５）＝小さいが有意、５０〜１００μＭ２％（対数容積＞５かつ＜９）＝中程度、はインビボで重要となり得る；１００μＭ２％超（対数容積＞９）＝強い相乗作用、おそらくインビボで重要；１０００μＭ２％に近い容積（対数容積＞９０）＝異常に高くデータチェックを要する、を用いて、混合物が相乗的であるか、相加的であるかまたは拮抗的であるかを明らかにした。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘ���ｅｌのＸＬ−Ｆｉｔモジュールを用いて単剤化合物治療細胞のＲＬＵデータを解析し、４パラメータカーブフィッティングアルゴリズムを用いてＥＣ５０値を測定した。同時に、製造業者の取扱説明書に従いｃｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏ試薬（ＣＴＧ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて細胞生存能の測定値としてのＡＴＰ含有量を測定するための複製プレート（５，０００個の細胞／ウェルの密度で播種し４日間インキュベート）を用いて、細胞生存能に対する化合物の効果を評価した。
【０２９１】
化合物３及びテノホビル（ＴＤＦ）のインビトロ混合物：
化合物３（３倍希釈系列及び５点滴定における、３μＭ〜０．０３７μＭの濃度範囲）をテノホビル（２倍希釈系列及び９点滴定における、１μＭ〜０．００４μＭの濃度範囲）と混合して試験した。化合物３またはＴＤＦによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたｒｃＤＮＡの平均％阻害及び４点の複製の標準偏差については、表１１ａに記載している。この試験で測定した化合物３及びＴＤＦのＥＣ５０値については、表１１ｂに記載している。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、それぞれの化合物における個々の寄与を基準として上記濃度範囲における相加的相互作用（表１１ｂ）から予想される値と比較すると、混合物が相加的であることが判明した（表１１ａ及び表１１ｂ）。
表１１ａ．ｂＤＮＡアッセイを用いたｒｃＤＮＡ定量を伴うＨｅｐＤＥ１９細胞培養モデルによる、化合物３及びＴＤＦの混合物における抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した平均パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝４試料）
【表１１ａ−１】
2019501202.tif 000079
【表１１ａ−２】
2019501202.tif 000080
【表１１ａ−３】
2019501202.tif 000081
表１１ｂ：ｂＤＮＡアッセイを用いたｒｃＤＮＡ定量を伴うＨｅｐＤＥ１９細胞培養系によるインビトロ混合物試験の結果の要約：
【表１１ｂ】
2019501202.tif 000082
【０２９２】
実施例１２
インビトロ混合物試験の目的：
混合物治療薬における２種の化合物が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）をトランスフェクトした細胞培養物に対して相乗的効果、拮抗的効果または相加的効果をもたらすかどうかを明らかにすることである。化合物、化合物５はＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）分泌の低分子阻害剤であり、ＳＩＲＮＡ−ＮＰは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）封入ＲＮＡｉ阻害剤（ウイルスｍＲＮＡ及びウイルス抗原発現を標的とする）である。このインビトロ試験では、ＨＢＶ細胞培養系を用いて混合物治療薬の効果を測定した。
低分子の化学構造：
【化３０】
2019501202.tif 000083
【０２９３】
ＬＮＰ製剤：
ＳＩＲＮＡ−ＮＰは、ＨＢＶゲノムを標的とする３種類のｓｉＲＮＡの混合物の脂質ナノ粒子製剤である。本明細書で報告する試験では、ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡを送達するために、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）産物を用いた。表に記載した数値はモル百分率である。ジステアロイルホスファチジルコリンはＤＳＰＣと略される。
【化３１】
2019501202.tif 000084
カチオン性脂質は、以下の構造を有していた。
【化３２】
2019501202.tif 000085
【０２９４】
ｓｉＲＮＡ
３種類のｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す。
【化３３】
2019501202.tif 000086
【０２９５】
インビトロ混合物試験プロトコル：
Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎの方法（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ  Ｃ  Ｊｒ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，１４（４−５），１８１−２０５；及び、Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，ｅｔ．ａｌ．，ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ）を用いて、インビトロ混合物試験を実施した。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞培養系は、これまでＳｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９８７．Ｖｏｌ  ８４：１００５−１００９）が説明しているように、ａｄｗ２−サブタイプＨＢＶゲノムを安定的にトランスフェクトしたヒト肝芽腫ＨｅｐＧ２細胞に由来する細胞株である。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、デーン様ウイルス粒子を分泌し、ＨＢＶ  ＤＮＡを産生し、ウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）もまた産生する。
【０２９６】
化合物混合物を試験するために、ＨｅｐＧ２．２．１５（３０，０００個の細胞／ウェル）を、９６ウェル組織培養処理済みマイクロタイタープレートを用いて、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、２０μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８）、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ＋Ｌ−グルタミン培地中に播種し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞に新鮮な培地を補充してから、１００％ＤＭＳＯ中に溶解させた化合物５を、０．１μＭ〜０．００００１５μＭの濃度範囲で添加した。ＳＩＲＮＡ−ＮＰを１００％ＲＰＭＩ培地中に溶解させてから、２．５ｎＭ〜０．０２５ｎＭの濃度範囲で細胞へと加えた。マイクロタイター細胞プレートを、６日間の間、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした。系列希釈は、それぞれの化合物のＥＣ５０値に対応した濃度範囲とし、アッセイの最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％とした。チェッカー盤様式による化合物の混合物試験に加えて、化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの両方についてもまた単独で試験した。
【０２９７】
それぞれのプレートの複数のウェル内に、未治療陽性対照試料（培地中０．５％  ＤＭＳＯ）を含有させた。６日間のインキュベーション後、ＨＢｓＡｇ化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）（Ａｕｔｏｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃａｔ  Ｎｏ．ＣＬ０３１０−２）に用いるために、治療細胞から培地を除去した。ＨＢｓＡｇの標準曲線を生成して、ＨＢｓＡｇ定量レベルがアッセイの検出限界内であることを確認した。残る阻害剤治療細胞の細胞傷害性については、製造業者の取扱説明書に従いＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を測定することにより、また、阻害剤治療期間中にわたる細胞の顕微鏡解析を行うことにより評価した。細胞生存能を、未治療陽性対照ウェルの百分率として計算した。
【０２９８】
ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチモードプレートリーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２１０４）を用いてプレートを読んだ。それぞれのウェルから生成した相対発光量（ＲＬＵ）データを用いて、ＨＢｓＡｇレベルを、未治療陽性対照ウェルのパーセント阻害として計算し、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙＩＩプログラム（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，Ｓｈｉｐｍａｎ  Ｃ  Ｊｒ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０．Ｖｏｌ  １４（４−５）：１８１−２０５；Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，Ａｓｅｌｔｉｎｅ  ＫＲ，及び  Ｓｈｉｐｍａｎ，Ｃ．ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  １９９２）を利用したＰｒｉｃｈａｒｄ−Ｓｈｉｐｍａｎ混合物モデルを用いて解析し、Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎが定めた以下のような判定ガイドライン、９５％ＣＩにおける相乗容積＜２５μＭ２％（対数容積＜２）＝おそらく有意ではない；２５〜５０μＭ２％（対数容積＞２かつ＜５）＝小さいが有意、５０〜１００μＭ２％（対数容積＞５かつ＜９）＝中程度、はインビボで重要となり得る；１００μＭ２％超（対数容積＞９）＝強い相乗作用、おそらくインビボで重要；１０００μＭ２％に近い容積（対数容積＞９０）＝異常に高くデータチェックを要する、を用いて、混合物が相乗的であるか、相加的であるかまたは拮抗的であるかを明らかにした。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌのＸＬ−Ｆｉｔモジュールを用いて単剤化合物治療細胞のＲＬＵデータを解析し、４パラメータカーブフィッティングアルゴリズムを用いてＥＣ５０値を測定した。
【０２９９】
化合物５（ｈａｌｆ−ｌｏｇ、３．１６倍希釈系列及び８点滴定における、０．１μＭ〜０．００００１５μＭの濃度範囲）をＳＩＲＮＡ−ＮＰ（ｈａｌｆ−ｌｏｇ、３．１６倍希釈系列及び６点滴定における、２．５ｎＭ〜０．０２５ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。４回の技術的反復からなるそれぞれのアッセイを３回行うことで、混合物の結果を完了させた。Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎに従った相乗容積及び拮抗容積の測定値ならびに判定については、表１２ｅに記載している。この混合物の抗ウイルス活性については表１２ａ１、表１２ａ２及び表１２ａ３に記載し、相乗容積及び拮抗容積については表１２ｂ１、表１２ｂ２及び表１２ｂ３に記載している。この混合物の相加的阻害活性については表１２ｄ１、表１２ｄ２及び表１２ｄ３に記載している。このアッセイ系において、混合物は、ＨＢｓＡｇ分泌の相加的阻害をもたらした。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、顕微鏡またはＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイで観察されなかった（表１２ｃ１、表１２ｃ２及び表１２ｃ３）。
試験１
表１２ａ１．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した平均パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝４試料）
【表１２ａ１−１】
2019501202.tif 000087
【表１２ａ１−２】
2019501202.tif 000088
表１２ｂ１．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物のＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ容積計算：
９９．９９％信頼区間（ボンフェローニ調整  ９６％）
【表１２ｂ１】
2019501202.tif 000089
表１２ｃ１．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の細胞傷害性：
対照と比較した細胞生存能の平均パーセント
【表１２ｃ１】
2019501202.tif 000090
表１２ｄ１．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した相加的パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝４試料）
【表１２ｄ１−１】
2019501202.tif 000091
【表１２ｄ１−２】
2019501202.tif 000092
試験２
表１２ａ２．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した平均パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝４試料）
【表１２ａ２】
2019501202.tif 000093
表１２ｂ２．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物のＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ容積計算：
９９．９％信頼区間（ボンフェローニ調整  ９６％）
【表１２ｂ２−１】
2019501202.tif 000094
【表１２ｂ２−２】
2019501202.tif 000095
表１２ｃ２．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の細胞傷害性：
対照と比較した細胞生存能の平均パーセント
【表１２ｃ２−１】
2019501202.tif 000096
【表１２ｃ２−２】
2019501202.tif 000097
表１２ｄ２．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した相加的パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝４試料）
【表１２ｄ２】
2019501202.tif 000098
試験３
表１２ａ３．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した平均パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝４試料）
【表１２ａ３】
2019501202.tif 000099
表１２ｂ３．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物のＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ容積計算：
９９．９９％信頼区間（ボンフェローニ調整  ９６％）
【表１２ｂ３−１】
2019501202.tif 000100
【表１２ｂ３−２】
2019501202.tif 000101
表１２ｃ３．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の細胞傷害性：
対照と比較した細胞生存能の平均パーセント
【表１２ｃ３】
2019501202.tif 000102
表１２ｄ３．化合物５及びＳＩＲＮＡ−ＮＰの混合物の抗ウイルス活性：
陰性対照と比較した相加的パーセント阻害（データポイントあたりｎ＝４試料）
【表１２ｄ３】
2019501202.tif 000103
表１２ｅ．ＣＬＩＡを用いたＨＢｓＡｇ定量を伴うＨｅｐＧ２．２．１５細胞培養系によるインビトロ混合物試験の結果の要約
【表１２ｅ】
2019501202.tif 000104
【０３００】
実施例１３
インビトロ混合物試験の目的：
この試験の目的は、ＨＢＶ細胞培養モデル系を用いて、テノホビル（プロドラッグであるテノホビルジソプロキシルフマレート、すなわちＴＤＦの形態、ＨＢＶポリメラーゼのヌクレオチド類似体阻害剤）、またはエンテカビル（エンテカビル水和物、すなわちＥＴＶの形態、ＨＢＶポリメラーゼのヌクレオシド類似体阻害剤）、及び、ＳＩＲＮＡ−ＮＰ（全てのウイルスｍＲＮＡ転写物及びウイルス抗原の強力なノックダウンを促進することを目的とするｓｉＲＮＡ）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
テノホビル及びエンテカビルの化学構造：
【化３４】
2019501202.tif 000105
【０３０１】
ＳＩＲＮＡ−ＮＰの組成：
ＳＩＲＮＡ−ＮＰは、ＨＢＶゲノムを標的とする３種類のｓｉＲＮＡの混合物の脂質ナノ粒子製剤である。ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡを送達するために、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いた。表に記載した数値はモル百分率である。略語ＤＳＰＣとはジステアロイルホスファチジルコリンのことを意味し、またＰＥＧとはＰＥＧ２０００のことを意味する。
【化３５】
2019501202.tif 000106
カチオン性脂質は、以下の構造を有していた。
【化３６】
2019501202.tif 000107
【０３０２】
３種類のｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す。
【化３７−１】
2019501202.tif 000108
【化３７−２】
2019501202.tif 000109
【０３０３】
インビトロ混合物試験プロトコル：
Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎの方法（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，Ｓｈｉｐｍａｎ  Ｃ，Ｊｒ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ，１４，１８１−２０５（１９９０））を用いて、インビトロ混合物試験を実施した。Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８１，１２４７２−１２４８４（２００７））に記載のとおり、ＨｅｐＤＥ１９細胞株を分化させた。ＨＢＶゲノムを安定的にトランスフェクトされ、ＨＢＶ  ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡを発現してＨＢＶ  ｒｃＤＮＡ（弛緩型開環状ＤＮＡ）合成をテトラサイクリン制御様式で補助できるのは、ヒト肝細胞癌細胞株である。ＨｅｐＤＥ１９細胞を、９６ウェルの組織培養処理済みマイクロタイタープレートを用いて、１０％ウシ胎児血清＋１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（テトラサイクリン非含有）中に播種し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を新鮮な培地へと移してから、阻害剤Ａ及び阻害剤Ｂを用い、それらの対応するＥＣ５０値付近の濃度範囲で治療し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で７日間の間インキュベートした。阻害剤を、１００％ＤＭＳＯ中（ＥＴＶ及びＴＤＦ）または増殖培地中（ＳＩＲＮＡ−ＮＰ）のいずれかで希釈し、アッセイ中の最終ＤＭＳＯ濃度を≦０．５％とした。それぞれの濃度の阻害剤Ａをそれぞれの濃度の阻害剤Ｂと混合させるようなチェッカー盤様式で、２種類の阻害剤について、単独に加えて混合物の両方で試験し、ｒｃＤＮＡ産生阻害におけるそれら混合物の効果を測定した。４８時間のインキュベーション後、ＨＢＶ特異的カスタムプローブセット及び製造業者の取扱説明書を備えたｂＤＮＡアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、阻害剤治療したウェル中に存在するｒｃＤＮＡレベルを測定した。それぞれのウェルから生成したＲＬＵデータを、未治療対照ウェルの％阻害として計算し、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩプログラムを用いて解析し、Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎが定めた以下のような判定ガイドライン、９５％ＣＩにおける相乗容積＜２５μＭ２％（対数容積＜２）＝おそらく有意ではない；２５〜５０μＭ２％（対数容積＞２かつ＜５）＝小さいが有意、５０〜１００μＭ２％（対数容積＞５かつ＜９）＝中程度、はインビボで重要となり得る；１００μＭ２％超（対数容積＞９）＝強い相乗作用、おそらくインビボで重要；１０００μＭ２％に近い容積（対数容積＞９０）＝異常に高くデータチェックを要する、を用いて、混合物が相乗的であるか、相加的であるかまたは拮抗的であるかを明らかにした。同時に、製造業者の取扱説明書に従いＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存能の測定値としてのＡＴＰ含有量を測定するのに使用した複製プレートを用いて、細胞生存能に対する阻害剤混合物の効果を評価した。
【０３０４】
結果及び判定：
ＴＤＦ及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物：
ＴＤＦ（２倍希釈系列及び１０点滴定における、１．０μＭ〜０．００４μＭの濃度範囲）をＳＩＲＮＡ−ＮＰ（３倍希釈系列及び５点滴定における、２５ｎｇ／ｍＬ〜０．３０９ｎｇ／ｍＬの濃度範囲）と混合して試験した。ＴＤＦまたはＳＩＲＮＡ−ＮＰによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたｒｃＤＮＡの平均％阻害及び４点の複製の標準偏差については、表１３ａに記載している。ＴＤＦ及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのＥＣ５０値については、表１３ｃに記載している。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ．１９９２．ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用（表１３ａ）から予想される値と比較すると、混合物が相加的であることが判明した（表１３ｃ）。
【０３０５】
エンテカビル及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物：
エンテカビル（２倍希釈系列及び１０点滴定における、４．０ｎＭ〜０．００４μＭの濃度範囲）をＳＩＲＮＡ−ＮＰ（３倍希釈系列及び５点滴定における、２５ｎｇ／ｍＬ〜０．３０９μｇ／ｍＬの濃度範囲）と混合して試験した。ＥＴＶまたはＳＩＲＮＡ−ＮＰによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたｒｃＤＮＡの平均％阻害及び４点の複製の標準偏差については、表１３ｂに記載している。ＥＴＶ及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのＥＣ５０値については、表１３ｃに記載している。２種の阻害剤を上記濃度範囲で混合した場合、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いると、その濃度の混合物が相加的であることが判明した。
表１３ａ：テノホビルジポボキシルフマレート及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物
【表１３ａ−１】
2019501202.tif 000110
【表１３ａ−２】
2019501202.tif 000111
【表１３ａ−３】
2019501202.tif 000112
【表１３ａ−４】
2019501202.tif 000113
【表１３ａ−５】
2019501202.tif 000114
表１３ｂ：エンテカビル及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物
【表１３ｂ−１】
2019501202.tif 000115
【表１３ｂ−２】
2019501202.tif 000116
【表１３ｂ−３】
2019501202.tif 000117
【表１３ｂ−４】
2019501202.tif 000118
表１３ｃ：ｂＤＮＡアッセイを用いたｒｃＤＮＡ定量を伴うＡＭＬ１２−ＨＢＶ１０細胞培養系によるインビトロ混合物試験の結果の要約：
【表１３ｃ−１】
2019501202.tif 000119
【表１３ｃ−２】
2019501202.tif 000120
【０３０６】
実施例１４
以下の化合物について、実施例で言及する。化合物２０は、周知の手順を用いて調製可能である。例えば、化合物２０は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５１１３９９０に記載のとおりに調製することができる。
【化３８】
2019501202.tif 000121
【０３０７】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のマウスモデルを用いて、ｓＡｇ産生低分子阻害剤及びＨＢＶ標的化ｓｉＲＮＡ（ＳＩＲＮＡ−ＮＰ）の抗ＨＢＶ効果を評価した（独立した治療薬として、互いを混合しての両方で）。
【０３０８】
ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡを送達するために、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いた。表に記載した数値はモル百分率である。略語ＤＳＰＣとは、ジステアロイルホスファチジルコリンのことを意味する。
【化３９】
2019501202.tif 000122
【０３０９】
カチオン性脂質は、以下の構造を有していた。
【化４０】
2019501202.tif 000123
ＡＡＶ１．２の１Ｅ１１ウイルスゲノム（Ｈｕａｎｇ，ＬＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１２，１４２（７）：１４４７−５０に記載されている）を、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに尾静脈投与した。このウイルスベクターは、ＨＢＶゲノムの１．２倍過剰に長い複製を有し、ＨＢＶ産物の中でも特にＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現している。酵素免疫アッセイを用いて、マウスにおける血清ＨＢｓＡｇ発現をモニターした。血清ＨＢｓＡｇレベルに基づき、ａ）全ての動物がＨＢｓＡｇを発現することが確認されるように、及び、ｂ）治療開始前のＨＢｓＡｇ群における平均値が互いに類似となるように、動物を群へと分類した（無作為化した）。
【０３１０】
化合物２０を用いて、以下のように動物を治療した。０日目から開始して、３．０ｍｇ／ｋｇ用量の化合物２０を、０日目〜２８日目に毎日２回の頻度、合計５６回の用量で、動物に経口投与した。投与するために、化合物２０を共溶媒製剤中に溶解させた。陰性対照動物に対して、共溶媒製剤単独の投与か、または、いかなる試験薬でも治療しないか、のいずれかを行った。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入したＨＢＶ標的化ｓｉＲＮＡを用いて、以下のように動物を治療した。０日目に、０．３ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡに相当する量の試験薬を静脈内投与した。それぞれの治療におけるＨＢｓＡｇ発現レベルを、その群における０日目（投与前）の値と比較した。
【０３１１】
０日目（治療前）、７日目、１４日目及び２８日目に血液を採取して、それらの血清ＨＢｓＡｇ含有量を解析することにより、これら治療薬の効果を測定した。０日目における治療前のベースライン値に対する個々の動物の百分率として表される、治療群の平均（ｎ＝５（ｓｉＨＢＶ及び溶媒の混合物治療薬ではｎ＝４）；±標準誤差）血清ＨＢｓＡｇ濃度を表１４に示す。
【０３１２】
データは、化合物２０及びＨＢＶ  ｓｉＲＮＡの混合物（単独及び混合の両方で）に応答して血清ＨＢｓＡｇが低下する度合いを示している。試験を行った全時点において、化合物２０及びＨＢＶ  ｓｉＲＮＡの混合物治療薬は、個々の単剤治療薬のいずれかと同等またはそれらより優れた血清ＨＢｓＡｇ低下を生じさせた。
表１４．化合物２０及び３種のＨＢＶ  ｓｉＲＮＡによる、ＨＢＶ感染症マウスモデルの血清ＨＢＶ  ｓＡｇにおける単独及び混合の治療効果
【表１４】
2019501202.tif 000124
【０３１３】
実施例１５〜２４
初代ヒト肝細胞試験における原料及び方法
動物
ＦＲＧマウスをＹｅｃｕｒｉｓ（Ｔｕａｌａｔｉｎ，ＯＲ，ＵＳＡ）から購入した。マウスの詳細な情報については、以下の表に記載している。本試験は、ＷｕＸｉ  ＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＣＵＣ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｒ２０１６０３１４−Ｍｏｕｓｅ）により承認済みであった。マウスを新しい環境に７日間馴化させた。全身健康、ならびに、生理学的異常及び行動異常に関するあらゆる徴候について、マウスを毎日観察した。
ＦＲＧマウスのテクニカルデータ
【化４１】
2019501202.tif 000125
【０３１４】
試験薬
化合物３、２２、２３、２４及び２５は、Ａｒｂｕｔｕｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａから提供された。Ｐｅｇ−インターフェロンα−２ａ（Ｒｏｃｈｅ，１８０μｇ／０．５ｍｌ）は、ＷｕＸｉから提供された。ＴＡＦ、エンテカビル、テノホビル、ラミブジン及びＴＤＦは、ＤＭＳＯ溶液でＷｕＸｉから提供された。化合物に関する情報については、以下の表に記載している。
試験薬の情報
【化４２】
2019501202.tif 000126
【０３１５】
ウイルス
ＨｅｐＧ２．２．１５培養上清から、Ｄ型ＨＢＶを濃縮した。ウイルスの情報については、以下の表に記載している。
ＨＢＶの情報
【化４３−１】
2019501202.tif 000127
【化４３−２】
2019501202.tif 000128
【０３１６】
試薬
本試験に用いた主な試薬は、ＱＩＡａｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃５１１６１）、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  ＃０４９１４０５８００１）、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）（Ｂｉｏｌｉｔｅ  ＃３５００４）、ＨＢｅＡｇ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ａｎｔｕ  ＃ＣＬ０３１２）、及び、ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ａｎｔｕ  ＃ＣＬ０３１０）であった。
【０３１７】
機器
本試験に用いた主な機器は、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２，ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）、及び、Ｑｕａｎｔｉｓｔｕｄｉｏ  ６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）であった。
【０３１８】
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の採取
マウスに対して肝灌流を行いＰＨＨを単離した。単離肝細胞をパーコールで更に精製した。細胞を培地に再懸濁させてから、９６ウェルプレート（６×１０４個の細胞／ウェル）または４８ウェルプレート（１．２×１０５個の細胞／ウェル）内に播種した。播種の１日後（１日目）に、ＰＨＨをＤ型ＨＢＶに感染させた。
【０３１９】
ＰＨＨの培養及び治療
２日目、試験化合物を希釈してから細胞培養プレートに加えた。化合物を含有する培地を１日おきに新しいものに交換した。ＨＢＶ  ＤＮＡ測定及び抗原測定のため、細胞培養上清を８日目に回収した。
【０３２０】
ＥＣ５０値の測定
化合物を、７種の濃度、３倍希釈で３回試験した。
【０３２１】
２種混合物試験
３枚のプレートを用い、２種の化合物を５×５マトリックスで試験した。
【０３２２】
８日目におけるＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８による細胞傷害アッセイ
細胞培養プレートから培地を除去してから、ＣＣＫ８（Ｂｉｏｌｉｔｅ  ＃３５００４）希釈標準溶液を細胞に加えた。プレートを３７℃でインキュベートしてから、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘを用いて、吸光度を４５０ｎｍ波長で測定し、また参照吸光度を６５０ｎｍ波長で測定した。
【０３２３】
ｑＰＣＲによる培養上清中ＨＢＶ  ＤＮＡの定量
８日目に回収した培養上清中のＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ−５１１６１）で単離した。それぞれの試料につき、１００μｌの培養上清を用いてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを１００μｌ、１５０μｌまたは１８０μｌのＡＥで溶出させた。培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡをｑＰＣＲで定量した。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙソフトウェアを用いて、混合物の効果を解析した。プライマーについて以下に記載する。
プライマー情報
【化４４】
2019501202.tif 000129
【０３２４】
ＥＬＩＳＡによる培養上清中ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの測定
８日目に回収した培養上清中のＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇを、マニュアルに従いＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ａｕｔｏｂｉｏ）で測定した。標準曲線範囲のシグナルを得るために、試料をＰＢＳで希釈した。以下の式を用いて阻害率を計算した。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙソフトウェアを用いて、混合物の効果を解析した。
【数１】
2019501202.tif 000130
【０３２５】
ＳＩＲＮＡ−ＮＰ
ＳＩＲＮＡ−ＮＰは、ＨＢＶゲノムを標的とする３種類のｓｉＲＮＡの混合物の脂質ナノ粒子製剤である。ＨＢＶ  ｓｉＲＮＡを送達するために、以下の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いた。表に記載した数値はモル百分率である。略語ＤＳＰＣとは、ジステアロイルホスファチジルコリンのことを意味する。
【化４５】
2019501202.tif 000131
【０３２６】
カチオン性脂質は、以下の構造を有していた。
【化４６】
2019501202.tif 000132
【０３２７】
３種類のｓｉＲＮＡの配列を、以下に示す。
【化４７−１】
2019501202.tif 000133
【化４７−２】
2019501202.tif 000134
【０３２８】
ＰＥＧ化インターフェロンα２ａ（ＩＦＮα２ａ）の組成
この薬剤は、商業的供給源から購入した。
【化４８】
2019501202.tif 000135
【０３２９】
以下の化合物もまた用いた。
【化４９−１】
2019501202.tif 000136
【化４９−２】
2019501202.tif 000137
【０３３０】
実施例１５
化合物２４及びＴＤＦのインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物２４（アミノクロマン化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及びテノホビル（プロドラッグであるテノホビルジソプロキシルフマレート、すなわちＴＤＦの形態、ＨＢＶポリメラーゼのヌクレオチド類似体阻害剤）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３３１】
結果及び判定
ＴＤＦ（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ｎＭ〜０．１２ｎＭの濃度範囲）を２４（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０００ｎＭ〜１２．３６ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。２４またはＴＤＦによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表１５ａ、表１５ｂ及び表１５ｃに記載している。ＴＤＦ及び２４のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表１５ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３３２】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相乗的または相加的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表１５ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表１５ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対する化合物２４及びＴＤＦのインビトロ混合物の効果
【表１５ａ−１】
2019501202.tif 000138
【表１５ａ−２】
2019501202.tif 000139
【表１５ａ−３】
2019501202.tif 000140
【表１５ａ−４】
2019501202.tif 000141
表１５ｂ：ＨＢｓＡｇに対する化合物２４及びＴＤＦのインビトロ混合物の効果
【表１５ｂ−１】
2019501202.tif 000142
【表１５ｂ−２】
2019501202.tif 000143
【表１５ｂ−３】
2019501202.tif 000144
【表１５ｂ−４】
2019501202.tif 000145
表１５ｃ：ＨＢｅＡｇに対する化合物２４及びＴＤＦのインビトロ混合物の効果
【表１５ｃ−１】
2019501202.tif 000146
【表１５ｃ−２】
2019501202.tif 000147
【表１５ｃ−３】
2019501202.tif 000148
【表１５ｃ−４】
2019501202.tif 000149
【表１５ｃ−５】
2019501202.tif 000150
表１５ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中における化合物２４及びＴＤＦのインビトロ混合物試験の結果の要約
【表１５ｄ】
2019501202.tif 000151
【０３３３】
実施例１６
化合物２３及びＴＤＦのインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物２３（アミノクロマン化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及びテノホビル（プロドラッグであるテノホビルジソプロキシルフマレート、すなわちＴＤＦの形態、ＨＢＶポリメラーゼのヌクレオチド類似体阻害剤）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３３４】
結果及び判定
ＴＤＦ（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ｎＭ〜０．１２ｎＭの濃度範囲）を化合物２３（３倍希釈系列及び５点滴定における、２０００ｎＭ〜２４．６９ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。化合物２３またはＴＤＦによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表１６ａ、表１６ｂ及び表１６ｃに記載している。ＴＤＦ及び化合物２３のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表１６ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３３５】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相乗的または相加的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表１６ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表１６ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対する化合物２３及びＴＤＦのインビトロ混合物の効果
【表１６ａ−１】
2019501202.tif 000152
【表１６ａ−２】
2019501202.tif 000153
【表１６ａ−３】
2019501202.tif 000154
【表１６ａ−４】
2019501202.tif 000155
表１６ｂ：ＨＢｓＡｇに対する化合物２３及びＴＤＦのインビトロ混合物の効果
【表１６ｂ−１】
2019501202.tif 000156
【表１６ｂ−２】
2019501202.tif 000157
【表１６ｂ−３】
2019501202.tif 000158
【表１６ｂ−４】
2019501202.tif 000159
表１６ｃ：ＨＢｅＡｇに対する化合物２３及びＴＤＦのインビトロ混合物の効果
【表１６ｃ−１】
2019501202.tif 000160
【表１６ｃ−２】
2019501202.tif 000161
【表１６ｃ−３】
2019501202.tif 000162
【表１６ｃ−４】
2019501202.tif 000163
【表１６ｃ−５】
2019501202.tif 000164
表１６ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中における化合物２３及びＴＤＦのインビトロ混合物試験の結果の要約
【表１６ｄ】
2019501202.tif 000165
【０３３６】
実施例１７
化合物２３及びＴＡＦのインビトロ混合物
インビトロ混合物試験の目的：
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物２３（アミノクロマン化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及びテノホビル（プロドラッグであるテノホビルアラフェナミド、すなわちＴＡＦの形態、ＨＢＶポリメラーゼのヌクレオチド類似体阻害剤）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３３７】
結果及び判定
ＴＡＦ（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ｎＭ〜０．１２ｎＭの濃度範囲）を化合物２３（３倍希釈系列及び５点滴定における、２０００ｎＭ〜２４．６９ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。化合物２３またはＴＡＦによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表１７ａ及び表１７ｂに記載している。ＴＡＦ及び化合物２３のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表１７ｃに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３３８】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相加的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表１７ｃ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表１７ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対する化合物２３及びＴＡＦのインビトロ混合物の効果
【表１７ａ−１】
2019501202.tif 000166
【表１７ａ−２】
2019501202.tif 000167
【表１７ａ−３】
2019501202.tif 000168
【表１７ａ−４】
2019501202.tif 000169
【表１７ａ−５】
2019501202.tif 000170
表１７ｂ：ＨＢｓＡｇに対する化合物２３及びＴＡＦのインビトロ混合物の効果
【表１７ｂ−１】
2019501202.tif 000171
【表１７ｂ−２】
2019501202.tif 000172
【表１７ｂ−３】
2019501202.tif 000173
【表１７ｂ−４】
2019501202.tif 000174
表１７ｃ：ＰＨＨ細胞培養系中における化合物２３及びＴＡＦのインビトロ混合物試験の結果の要約
【表１７ｃ−１】
2019501202.tif 000175
【表１７ｃ−２】
2019501202.tif 000176
【０３３９】
実施例１８
ＩＦＮα２ａ及び化合物２５のインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物２５（ジヒドロキノリジノン化学クラスに属するＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの低分子阻害剤）及びＰＥＧ化インターフェロンα２ａ（ＩＦＮα２ａ、肝細胞の自然免疫経路を活性化する抗ウイルス性サイトカイン）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３４０】
結果及び判定
ＩＦＮα２ａ（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ＩＵ／ｍＬ〜０．１２３ＩＵ／ｍＬの濃度範囲）を化合物２５（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ｎＭ〜０．１２ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。ＩＦＮα２ａまたは化合物２５による治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表１８ａ、表１８ｂ及び表１８ｃに記載している。ＩＦＮα２ａ及び化合物２５のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表１８ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３４１】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相乗的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表１８ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表１８ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対するＩＦＮα２ａ及び化合物２５のインビトロ混合物の効果
【表１８ａ−１】
2019501202.tif 000177
【表１８ａ−２】
2019501202.tif 000178
【表１８ａ−３】
2019501202.tif 000179
【表１８ａ−４】
2019501202.tif 000180
【表１８ａ−５】
2019501202.tif 000181
表１８ｂ：ＨＢｓＡｇに対するＩＦＮα２ａ及び化合物２５のインビトロ混合物の効果
【表１８ｂ−１】
2019501202.tif 000182
【表１８ｂ−２】
2019501202.tif 000183
【表１８ｂ−３】
2019501202.tif 000184
【表１８ｂ−４】
2019501202.tif 000185
表１８ｃ：ＨＢｅＡｇに対するＩＦＮα２ａ及び化合物２５のインビトロ混合物の効果
【表１８ｃ−１】
2019501202.tif 000186
【表１８ｃ−２】
2019501202.tif 000187
【表１８ｃ−３】
2019501202.tif 000188
【表１８ｃ−４】
2019501202.tif 000189
【表１８ｃ−５】
2019501202.tif 000190
表１８ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中におけるＩＦＮα２ａ及び化合物２５のインビトロ混合物試験の結果の要約
【表１８ｄ】
2019501202.tif 000191
【０３４２】
実施例１９
化合物２５及び化合物３のインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物３（スルファモイルベンズアミド化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及び化合物２５（ジヒドロキノリジノン化学クラスに属するＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの低分子阻害剤）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３４３】
結果及び判定
化合物２５（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ｎＭ〜０．１２ｎＭの濃度範囲）を化合物３（３倍希釈系列及び５点滴定における、５０００ｎＭ〜６１．７３ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。化合物２５または化合物３による治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表１９ａ、表１９ｂ及び表１９ｃに記載している。化合物２５及び化合物３のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表１９ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３４４】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相乗的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表１９ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、解析試料の顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表１９ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対する化合物２５及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表１９ａ−１】
2019501202.tif 000192
【表１９ａ−２】
2019501202.tif 000193
【表１９ａ−３】
2019501202.tif 000194
【表１９ａ−４】
2019501202.tif 000195
【表１９ａ−５】
2019501202.tif 000196
表１９ｂ：ＨＢｓＡｇに対する化合物２５及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表１９ｂ−１】
2019501202.tif 000197
【表１９ｂ−２】
2019501202.tif 000198
【表１９ｂ−３】
2019501202.tif 000199
【表１９ｂ−４】
2019501202.tif 000200
表１９ｃ：ＨＢｅＡｇに対する化合物２５及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表１９ｃ−１】
2019501202.tif 000201
【表１９ｃ−２】
2019501202.tif 000202
【表１９ｃ−３】
2019501202.tif 000203
【表１９ｃ−４】
2019501202.tif 000204
表１９ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中における化合物２５及び化合物３のインビトロ混合物試験の結果の要約
【表１９ｄ−１】
2019501202.tif 000205
【表１９ｄ−２】
2019501202.tif 000206
【０３４５】
実施例２０
化合物３及びＴＡＦのインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物３（スルファモイルベンズアミド化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及びテノホビル（プロドラッグであるテノホビルアラフェナミド、すなわちＴＡＦの形態、ＨＢＶポリメラーゼのヌクレオチド類似体阻害剤）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３４６】
結果及び判定
ＴＡＦ（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ｎＭ〜０．１２ｎＭの濃度範囲）を化合物３（３倍希釈系列及び５点滴定における、５５６０ｎＭ〜６８．６４ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。ＴＡＦまたは化合物３による治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表２０ａ、表２０ｂ及び表２０ｃに記載している。ＴＡＦ及び化合物３のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表２０ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３４７】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相加的または相乗的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表２０ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、解析試料の顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表２０ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対するＴＡＦ及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表２０ａ−１】
2019501202.tif 000207
【表２０ａ−２】
2019501202.tif 000208
【表２０ａ−３】
2019501202.tif 000209
【表２０ａ−４】
2019501202.tif 000210
表２０ｂ：ＨＢｓＡｇに対するＴＡＦ及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表２０ｂ−１】
2019501202.tif 000211
【表２０ｂ−２】
2019501202.tif 000212
【表２０ｂ−３】
2019501202.tif 000213
【表２０ｂ−４】
2019501202.tif 000214
表２０ｃ：ＨＢｅＡｇに対するＴＡＦ及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表２０ｃ−１】
2019501202.tif 000215
【表２０ｃ−２】
2019501202.tif 000216
【表２０ｃ−３】
2019501202.tif 000217
【表２０ｃ−４】
2019501202.tif 000218
表２０ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中におけるＴＡＦ及び化合物３のインビトロ混合物試験の結果の要約
【表２０ｄ】
2019501202.tif 000219
【０３４８】
実施例２１
ＩＦＮα２ａ及び化合物２２のインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物２２（スルファモイルベンズアミド化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及びＰＥＧ化インターフェロンα２ａ（ＩＦＮα２ａ、肝細胞の自然免疫経路を活性化する抗ウイルス性サイトカイン）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３４９】
結果及び判定
ＩＦＮα２ａ（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ＩＵ／ｍＬ〜０．１２３ＩＵ／ｍＬの濃度範囲）を化合物２２（３倍希釈系列及び５点滴定における、５０００ｎＭ〜６１．７２１ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。ＩＦＮα２ａまたは化合物２２による治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表２１ａ、表２１ｂ及び表２１ｃに記載している。ＩＦＮα２ａ及び化合物２２のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表２１ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３５０】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相加的から相乗的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表２１ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、解析試料の顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表２１ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対するＩＦＮα２ａ及び化合物２２のインビトロ混合物の効果
【表２１ａ−１】
2019501202.tif 000220
【表２１ａ−２】
2019501202.tif 000221
【表２１ａ−３】
2019501202.tif 000222
【表２１ａ−４】
2019501202.tif 000223
表２１ｂ：ＨＢｓＡｇに対するＩＦＮα２ａ及び化合物２２のインビトロ混合物の効果
【表２１ｂ−１】
2019501202.tif 000224
【表２１ｂ−２】
2019501202.tif 000225
【表２１ｂ−３】
2019501202.tif 000226
【表２１ｂ−４】
2019501202.tif 000227
【表２１ｂ−５】
2019501202.tif 000228
表２１ｃ：ＨＢｅＡｇに対するＩＦＮα２ａ及び化合物２２のインビトロ混合物の効果
【表２１ｃ−１】
2019501202.tif 000229
【表２１ｃ−２】
2019501202.tif 000230
【表２１ｃ−３】
2019501202.tif 000231
【表２１ｃ−４】
2019501202.tif 000232
【表２１ｃ−５】
2019501202.tif 000233
表２１ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中におけるＩＦＮα２ａ及び化合物２２のインビトロ混合物試験の結果の要約
【表２１ｄ】
2019501202.tif 000234
【０３５１】
実施例２２
化合物２２及びＴＡＦのインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物２２（スルファモイルベンズアミド化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及びテノホビル（プロドラッグであるテノホビルアラフェナミド、すなわちＴＡＦの形態、ＨＢＶポリメラーゼのヌクレオチド類似体阻害剤）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３５２】
結果及び判定
ＴＡＦ（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ｎＭ〜０．１２ｎＭの濃度範囲）を化合物２２（３倍希釈系列及び５点滴定における、５０００ｎＭ〜６１．７２１ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。化合物２２またはＴＡＦによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表２２ａ、表２２ｂ及び表２２ｃに記載している。ＴＡＦ及び化合物２２のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表２２ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３５３】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相加的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表２２ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、解析試料の顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表２２ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対する化合物２２及びＴＡＦのインビトロ混合物の効果
【表２２ａ−１】
2019501202.tif 000235
【表２２ａ−２】
2019501202.tif 000236
【表２２ａ−３】
2019501202.tif 000237
【表２２ａ−４】
2019501202.tif 000238
【表２２ａ−５】
2019501202.tif 000239
表２２ｂ：ＨＢｓＡｇに対する化合物２２及びＴＡＦのインビトロ混合物の効果
【表２２ｂ−１】
2019501202.tif 000240
【表２２ｂ−２】
2019501202.tif 000241
【表２２ｂ−３】
2019501202.tif 000242
【表２２ｂ−４】
2019501202.tif 000243
表２２ｃ：ＨＢｅＡｇに対する化合物２２及びＴＡＦのインビトロ混合物の効果
【表２２ｃ−１】
2019501202.tif 000244
【表２２ｃ−２】
2019501202.tif 000245
【表２２ｃ−３】
2019501202.tif 000246
【表２２ｃ−４】
2019501202.tif 000247
【表２２ｃ−５】
2019501202.tif 000248
表２２ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中における化合物２２及びＴＡＦのインビトロ混合物試験の結果の要約
【表２２ｄ−１】
2019501202.tif 000249
【表２２ｄ−２】
2019501202.tif 000250
【０３５４】
実施例２３
化合物２２及び化合物２５のインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物２２（スルファモイルベンズアミド化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及び化合物２５（ジヒドロキノリジノン化学クラスに属するＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの低分子阻害剤）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３５５】
結果及び判定
化合物２５（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ｎＭ〜０．１２ｎＭの濃度範囲）を化合物２２（３倍希釈系列及び５点滴定における、５０００ｎＭ〜６１．７３ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。化合物２５または化合物２２による治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表２３ａ、表２３ｂ及び表２３ｃに記載している。化合物２５及び化合物２２のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表２３ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３５６】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相乗的または相加的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表２３ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、解析試料の顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表２３ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対する化合物２２及び化合物２５のインビトロ混合物の効果
【表２３ａ−１】
2019501202.tif 000251
【表２３ａ−２】
2019501202.tif 000252
【表２３ａ−３】
2019501202.tif 000253
【表２３ａ−４】
2019501202.tif 000254
【表２３ａ−５】
2019501202.tif 000255
表２３ｂ：ＨＢｓＡｇに対する化合物２２及び化合物２５のインビトロ混合物の効果
【表２３ｂ−１】
2019501202.tif 000256
【表２３ｂ−２】
2019501202.tif 000257
【表２３ｂ−３】
2019501202.tif 000258
【表２３ｂ−４】
2019501202.tif 000259
表２３ｃ：ＨＢｅＡｇに対する化合物２２及び化合物２５のインビトロ混合物の効果
【表２３ｃ−１】
2019501202.tif 000260
【表２３ｃ−２】
2019501202.tif 000261
【表２３ｃ−３】
2019501202.tif 000262
【表２３ｃ−４】
2019501202.tif 000263
【表２３ｃ−５】
2019501202.tif 000264
表２３ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中における化合物２２及び化合物２５のインビトロ混合物試験の結果の要約
【表２３ｄ】
2019501202.tif 000265
【０３５７】
実施例２４
ＩＦＮα２ａ及び化合物３のインビトロ混合物
試験の目的
細胞培養モデル系中のＨＢＶ感染ヒト初代肝細胞を用いて、化合物３及びＰＥＧ化インターフェロンα２ａ（ＩＦＮα２ａ、肝細胞の自然免疫経路を活性化する抗ウイルス性サイトカイン）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３５８】
結果及び判定
ＩＦＮα２ａ（３倍希釈系列及び５点滴定における、１０．０ＩＵ／ｍＬ〜０．１２３ＩＵ／ｍＬの濃度範囲）を化合物３（３倍希釈系列及び５点滴定における、５０００ｎＭ〜６１．７３ｎＭの濃度範囲）と混合して試験した。ＩＦＮα２ａまたは化合物３による治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの平均％阻害、及び３点の複製の標準偏差については、以下に示す表２４ａ、表２４ｂ及び表２４ｃに記載している。ＩＦＮα２ａ及び化合物３のＥＣ５０値については前の試験で測定しており、表２４ｄに記載している（異なるロットのＰＨＨ細胞に若干の違いが認められた）。
【０３５９】
ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用から予想される値と比較すると、混合物が相乗的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表２４ｄ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、解析試料の顕微鏡またはＣＣＫ８アッセイで観察されなかった。
表２４ａ：ＨＢＶ  ＤＮＡに対するＩＦＮα２ａ及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表２４ａ−１】
2019501202.tif 000266
【表２４ａ−２】
2019501202.tif 000267
【表２４ａ−３】
2019501202.tif 000268
【表２４ａ−４】
2019501202.tif 000269
表２４ｂ：ＨＢｓＡｇに対するＩＦＮα２ａ及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表２４ｂ−１】
2019501202.tif 000270
【表２４ｂ−２】
2019501202.tif 000271
【表２４ｂ−３】
2019501202.tif 000272
【表２４ｂ−４】
2019501202.tif 000273
【表２４ｂ−５】
2019501202.tif 000274
表２４ｃ：ＨＢｅＡｇに対するＩＦＮα２ａ及び化合物３のインビトロ混合物の効果
【表２４ｃ−１】
2019501202.tif 000275
【表２４ｃ−２】
2019501202.tif 000276
【表２４ｃ−３】
2019501202.tif 000277
【表２４ｃ−４】
2019501202.tif 000278
表２４ｄ：ＰＨＨ細胞培養系中におけるＩＦＮα２ａ及び化合物３のインビトロ混合物試験の結果の要約
【表２４ｄ】
2019501202.tif 000279
【０３６０】
実施例２５
ＴＡＦ及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物
試験の目的
ＨＢＶ細胞培養モデル系を用いて、テノホビル（プロドラッグであるテノホビルアラフェナミド、すなわちＴＡＦの形態、ＨＢＶポリメラーゼのヌクレオチド類似体阻害剤）及びＳＩＲＮＡ−ＮＰ（全てのウイルスｍＲＮＡ転写物及びウイルス抗原の強力なノックダウンを促進することを目的とするｓｉＲＮＡ）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３６１】
ＨｅｐＤＥ１９試験プロトコルにおけるインビトロ混合物
Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎの方法（１９９０）（Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ，Ｓｈｉｐｍａｎ  Ｃ，Ｊｒ．１９９０．Ａ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ａｎａｌｙｚｅ  ｄｒｕｇ−ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  １４：１８１−２０５  ＡＮＤ  Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ＭＮ．１９９２．ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を用いて、インビトロ混合物試験を実施した。Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）（Ｇｕｏ  Ｈ，Ｊｉａｎｇ  Ｄ，Ｚｈｏｕ  Ｔ，Ｃｕｃｏｎａｔｉ  Ａ，Ｂｌｏｃｋ  ＴＭ，Ｇｕｏ  ＪＴ．２００７．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚｅｄ  ｒｅｌａｘｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｏｆ  ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：１２４７２−１２４８４）に記載のとおり、ＨｅｐＤＥ１９細胞株を分化させた。ＨＢＶゲノムを安定的にトランスフェクトされ、ＨＢＶ  ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡを発現してＨＢＶ  ｒｃＤＮＡ（弛緩型開環状ＤＮＡ）合成をテトラサイクリン制御様式で補助できるのは、ヒト肝細胞癌細胞株である。ＨｅｐＤＥ１９細胞を、９６ウェルの組織培養処理済みマイクロタイタープレートを用いて、１０％ウシ胎児血清＋１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（テトラサイクリン非含有）中に播種し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を新鮮な培地へと移してから、阻害剤Ａ及び阻害剤Ｂを用い、それらの対応するＥＣ５０値付近の濃度範囲で治療し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で７日間の間インキュベートした。阻害剤を、１００％ＤＭＳＯ中（ＴＡＦ）または増殖培地中（ＳＩＲＮＡ−ＮＰ）のいずれかで希釈し、アッセイ中の最終ＤＭＳＯ濃度を≦０．５％とした。それぞれの濃度の阻害剤Ａをそれぞれの濃度の阻害剤Ｂと混合させるようなチェッカー盤様式で、２種類の阻害剤について、単独に加えて混合物の両方で試験し、ｒｃＤＮＡ産生阻害におけるそれら混合物の効果を測定した。４８時間のインキュベーション後、ＨＢＶ特異的カスタムプローブセット及び製造業者の取扱説明書を備えたｂＤＮＡアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、阻害剤治療したウェル中に存在するｒｃＤＮＡレベルを測定した。それぞれのウェルから生成したＲＬＵデータを、未治療対照ウェルの％阻害として計算し、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩプログラムを用いて解析し、Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎが定めた以下のような判定ガイドライン、９５％ＣＩにおける相乗容積＜２５μＭ２％（対数容積＜２）＝おそらく有意ではない；２５〜５０μＭ２％（対数容積＞２かつ＜５）＝小さいが有意、５０〜１００μＭ２％（対数容積＞５かつ＜９）＝中程度、はインビボで重要となり得る；１００μＭ２％超（対数容積＞９）＝強い相乗作用、おそらくインビボで重要；１０００μＭ２％に近い容積（対数容積＞９０）＝異常に高くデー��チェックを要する、を用いて、混合物が相乗的であるか、相加的であるかまたは拮抗的であるかを明らかにした。同時に、製造業者の取扱説明書に従いＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存能の測定値としてのＡＴＰ含有量を測定するのに使用した複製プレートを用いて、細胞生存能に対する阻害剤混合物の効果を評価した。
【０３６２】
結果及び判定
ＴＡＦ（２倍希釈系列及び９点滴定における、２００．０ｎＭ〜０．７８１ｎＭの濃度範囲）をＳＩＲＮＡ−ＮＰ（３倍希釈系列及び５点滴定における、６０ｎｇ／ｍＬ〜０．７４１ｎｇ／ｍＬの濃度範囲）と混合して試験した。ＴＡＦまたはＳＩＲＮＡ−ＮＰによる治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたｒｃＤＮＡの平均％阻害及び４点の複製の標準偏差については、表２５Ａに記載している。ＴＡＦ及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのＥＣ５０値については、表２５Ｂに記載している。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用（表２５Ａ）から予想される値と比較すると、混合物が相加的である（拮抗作用を有さない）ことが判明した（表２５Ｂ）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、解析試料の顕微鏡またはＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイで観察されなかった。
表２５Ａ：テノホビルアラフェナミド及びＳＩＲＮＡ−ＮＰのインビトロ混合物
【表２５Ａ−１】
2019501202.tif 000280
【表２５Ａ−２】
2019501202.tif 000281
【表２５Ａ−３】
2019501202.tif 000282
【表２５Ａ−４】
2019501202.tif 000283
【表２５Ａ−５】
2019501202.tif 000284
表２５Ｂ：ｂＤＮＡアッセイを用いたｒｃＤＮＡ定量を伴うＤＥ１９細胞培養系によるインビトロ混合物試験の結果の要約：
【表２５Ｂ】
2019501202.tif 000285
【０３６３】
実施例２６
化合物３及びＧＬＳ４のインビトロ混合物
試験の目的
ＨＢＶ細胞培養モデル系を用いて、化合物３（スルファモイルベンズアミド化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）及びＧＬＳ４（ヘテロアリールジヒドロピリミジン、すなわちＨＡＰの化学クラスに属するＨＢＶ封入低分子阻害剤）からなる２種薬物混合物が、インビトロで相加的、相乗的または拮抗的であるかどうかを明らかにすることである。
【０３６４】
ＨｅｐＤＥ１９試験プロトコルにおけるインビトロ混合物
Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎの方法（１９９０）を用いて、インビトロ混合物試験を実施した。Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）に記載のとおり、ＨｅｐＤＥ１９細胞株を分化させた。ＨＢＶゲノムを安定的にトランスフェクトされ、ＨＢＶ  ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡを発現してＨＢＶ  ｒｃＤＮＡ（弛緩型開環状ＤＮＡ）合成をテトラサイクリン制御様式で補助できるのは、ヒト肝細胞癌細胞株である。ＨｅｐＤＥ１９細胞を、９６ウェルの組織培養処理済みマイクロタイタープレートを用いて、１０％ウシ胎児血清＋１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（テトラサイクリン非含有）中に播種し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を新鮮な培地へと移してから、阻害剤Ａ及び阻害剤Ｂを用い、それらの対応するＥＣ５０値付近の濃度範囲で治療し、加湿インキュベータ内、３７℃、５％ＣＯ２下で７日間の間インキュベートした。両方の阻害剤を１００％ＤＭＳＯ中で希釈し、アッセイ中の最終ＤＭＳＯ濃度を≦０．５％とした。それぞれの濃度の阻害剤Ａをそれぞれの濃度の阻害剤Ｂと混合させるようなチェッカー盤様式で、２種類の阻害剤について、単独に加えて混合物の両方で試験し、ｒｃＤＮＡ産生阻害におけるそれら混合物の効果を測定した。４８時間のインキュベーション後、ＨＢＶ特異的カスタムプローブセット及び製造業者の取扱説明書を備えたｂＤＮＡアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、阻害剤治療したウェル中に存在するｒｃＤＮＡレベルを測定した。それぞれのウェルから生成したＲＬＵデータを、未治療対照ウェルの％阻害として計算し、ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩプログラムを用いて解析し、Ｐｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎが定めた以下のような判定ガイドライン、９５％ＣＩにおける相乗容積＜２５μＭ２％（対数容積＜２）＝おそらく有意ではない；２５〜５０μＭ２％（対数容積＞２かつ＜５）＝小さいが有意、５０〜１００μＭ２％（対数容積＞５かつ＜９）＝中程度、はインビボで重要となり得る；１００μＭ２％超（対数容積＞９）＝強い相乗作用、おそらくインビボで重要；１０００μＭ２％に近い容積（対数容積＞９０）＝異常に高くデータチェックを要する、を用いて、混合物が相乗的であるか、相加的であるかまたは拮抗的であるかを明らかにした。同時に、製造業者の取扱説明書に従いＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存能の測定値としてのＡＴＰ含有量を測定するのに使用した複製プレートを用いて、細胞生存能に対する阻害剤混合物の効果を評価した。
【０３６５】
結果及び判定
化合物３（３倍希釈系列及び５点滴定における、３．０μＭ〜０．０４μＭの濃度範囲）をＧＬＳ４（２倍希釈系列及び９点滴定における、２．０μＭ〜０．００８μＭの濃度範囲）と混合して試験した。化合物３またはＧＬＳ４による治療（単独または混合）のいずれかにおいて測定されたｒｃＤＮＡの平均％阻害及び４点の複製の標準偏差については、表２６ａに記載している。化合物３及びＧＬＳ４のＥＣ５０値については、表２６ｂに記載している。ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ解析に従い、またＰｒｉｃｈａｒｄ及びＳｈｉｐｍａｎ（１９９２）による上記の判定基準を用いて、２種阻害剤混合物の測定値を、上記濃度範囲における相加的相互作用（表２６ａ）から予想される値と比較すると、混合物が、ほぼ相加的で極めてわずかに拮抗的であることが判明した（表２６ｂ）（拮抗作用の度合いは小さいが有意）。細胞生存能または細胞増殖に対する有意な阻害は、解析試料の顕微鏡またはＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイで観察されなかった。
表２６ａ：化合物３及びＧＬＳ４のインビトロ混合物
【表２６ａ−１】
2019501202.tif 000286
【表２６ａ−２】
2019501202.tif 000287
【表２６ａ−３】
2019501202.tif 000288
【表２６ａ−４】
2019501202.tif 000289
【表２６ａ−５】
2019501202.tif 000290
表２６ｂ：ｂＤＮＡアッセイを用いたｒｃＤＮＡ定量を伴うＤＥ１９細胞培養系によるインビトロ混合物試験の結果の要約：
【表２６ｂ】
2019501202.tif 000291
【０３６６】
全ての刊行物、特許及び特許文献は、あたかも個別に参照として組み込まれるように、参照により本明細書に組み込まれる。様々な特定及び好ましい実施形態及び手法を参照しながら、本発明について記載してきた。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲を維持しつつ、多数の変更及び改良を行うことができると言うことを理解すべきである。
【配列表】
2019501202000001.app
【国際調査報告】
2019501202.tif 000292
2019501202.tif 000293
2019501202.tif 000294
2019501202.tif 000295