(57)【要約】  本明細書では、改変されたアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼが開示される。このような遺伝子操作された酵素は、例えば、向上したα−グルカン生成物収率および／またはより低いロイクロース収率を示す。さらに、遺伝子操作されたグルコシルトランスフェラーゼがα−グルカンを生成するために使用される反応および方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成し、
（ｉ）前記置換位置のみで前記非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）前記第２のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
（ｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＰｈｅもしくはＬｅｕ残基によるものであるか；
（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−４２８に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｖａｌ残基によるものであるか；
（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｌａ−４７２に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、ＳｅｒもしくはＣｙｓ残基によるものであるか；
（ｉｖ）アミノ酸残基Ａｌａ−５１０に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌもしくはＡｓｐ残基によるものであるか；
（ｖ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｙｒ、ＰｈｅもしくはＴｒｐ残基によるものであるか；
（ｖｉ）アミノ酸残基Ｍｅｔ−５２９に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、ＬｅｕもしくはＡｓｎ残基によるものであるか；
（ｖｉｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−６０７に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＡｓｎ残基によるものであるか；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−６１３に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＭｅｔもしくはＬｅｕ残基によるものであるか；
（ｉｘ）アミノ酸残基Ｇｌｎ−６１６に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｇｌｕ残基によるものであるか；
（ｘ）アミノ酸残基Ｓｅｒ−６３１に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕもしくはＡｒｇ残基によるものであるか；
（ｘｉ）アミノ酸残基Ｇｌｙ−６３３に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｒｐ残基によるものであるか；
（ｘｉｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−６３４に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ａｌａ残基によるものであるか；
（ｘｉｉｉ）アミノ酸残基Ｔｈｒ−６３５に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＨｉｓもしくはＴｙｒ残基によるものであるか；または
（ｘｉｖ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−９５１に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｙｒ残基によるものである、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３】
２つ以上のアミノ酸置換を含み、前記置換の少なくとも１つは、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置におけるものである、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４】
配列番号６２のアミノ酸残基Ａｌａ−５１０またはＰｈｅ−６０７に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
配列番号６２のアミノ酸残基Ａｌａ−５１０およびＰｈｅ−６０７に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項６】
前記α−グルカンは、不溶性であり、かつ少なくとも約５０％のα−１，３結合を含み、任意選択的に、前記α−グルカンは、少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％同一である触媒ドメインを含む、請求項６に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項８】
配列番号４、配列番号６５、配列番号３０、配列番号２８または配列番号２０と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項９】
少なくとも約９０％のα−１，３−結合を有する不溶性α−１，３−グルカンを合成する、請求項７に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１０】
前記α−グルカンは、不溶性であり、かつ少なくとも約７５％のα−１，６−結合を含む、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１１】
配列番号６８、配列番号６８の３７〜１３３８位、配列番号６９、配列番号６９の３７〜１５５４位または配列番号６９の１７０〜１５５４位と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１２】
前記α−グルカン収率は、前記第２のグルコシルトランスフェラーゼの前記α−グルカン収率よりも少なくとも約１０％高い、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１３】
請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、１つ以上の調節配列は、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好ましくは、前記１つ以上の調節配列は、プロモーター配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
水、スクロースおよび請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
【請求項１５】
α−グルカンを生成する方法であって、
（ａ）少なくとも水、スクロースおよび請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、それにより、α−グルカンは、生成される、工程と；
（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された前記α−グルカンを単離する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号４または配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約３０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で同定された前記ポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で前記親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、
（ｉ）前記親グルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）前記親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程と
を含む方法。
【請求項１７】
前記同定する工程は、
（ａ）インシリコで、
（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
（ｃ）タンパク質シーケンシング工程を含む方法を用いて、および／もしくは
（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施され；かつ／または
前記改変する工程は、
（ｅ）インシリコで実施され、その後、前記非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列の合成が行われるか、もしくは
（ｆ）前記親グルコシルトランスフェラーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを使用して実施される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／３９４，３５４号明細書（２０１６年９月１４日に出願された）の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、酵素触媒反応の分野に含まれる。例えば、本開示は、改変されたアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼ酵素に関する。このような改変酵素は、向上した生成物の収率特性を有する。
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式なコピーは、２０１７年９月１１日作成のＣＬ６３９５ＵＳＮＰ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５＿ＥｘｔｒａＬｉｎｅｓＲｅｍｏｖｅｄ．ｔｘｔという名称のファイルにより、６１２キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
様々な用途において多糖類を使用することの要求に駆り立てられて、研究者らは、生分解性であり、かつ再生可能な起源の供給原料から経済的に製造できる多糖類について探索してきた。このような多糖の１つは、α−１，３−グルカンであり、α−１，３−グリコシド結合を有することを特徴とする不溶性グルカンポリマーである。このポリマーは、例えば、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素を用いて作製された（非特許文献１）。また、例えば、特許文献１は、酵素的に生成されたα−１，３−グルカン由来の紡糸繊維の製造を開示した。
【０００５】
様々な他のグルカン材料も、新規または改良された用途を開発するために研究されてきた。例えば、特許文献２は、α−１，３およびα−１，６結合の混在を有するいくつかの不溶性グルカンの酵素的合成を開示している。高率のα−１，６結合を有するものなど、大きい可溶性グルカンも酵素的に合成されている（例えば、特許文献３）。様々な酵素的合成経路は、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８および特許文献９において、食事および他の用途における使用に好適な小さい可溶性グルカン材料の生成に関して開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７００００００号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１６／０１２２４４５号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１５／１８３７２１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１５／１８３７２４号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１５／１８３７２９号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２０１５／１８３７２２号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２０１５／１８３７２６号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２０１５／１８３７１４号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１４５１−１４６０，１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらおよび他の進展が、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を用いたグルカンポリマーの生成においてなされてきた一方、このような酵素のグルカン収率の向上に対して関心がほとんど向けられていないように見える。この技術的空白を解決するために、本明細書では、これらの酵素に高められたグルカン生成特性を付与する改変アミノ酸配列を有するように遺伝子操作されたグルコシルトランスフェラーゼが開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態では、本開示は、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成し、
（ｉ）その置換位置でのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）第２のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼに関する。
【００１０】
別の実施形態では、本開示は、本開示の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、１つ以上の調節配列は、そのヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好ましくは、１つ以上の調節配列は、プロモーター配列を含む、ポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
別の実施形態では、本開示は、水、スクロースおよび本開示の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物に関する。
【００１２】
別の実施形態では、本開示は、α−グルカンを生成する方法であって、（ａ）少なくとも水、スクロースおよび本明細書に開示される非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、それにより、α−グルカンは、生成される、工程と；ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたα−グルカンを単離する工程とを含む方法に関する。
【００１３】
別の実施形態では、本開示は、非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号４または配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約３０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定する工程と；（ｂ）工程（ａ）で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、
（ｉ）親グルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程とを含む方法に関する。
【００１４】
配列の簡単な説明
【００１５】
【表１】
2019530474.tif 000002
【００１６】
【表２】
2019530474.tif 000003
【００１７】
【表３】
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【００１８】
【表４】
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【００１９】
【表５】
2019530474.tif 000006
【発明を実施するための形態】
【００２０】
引用する全ての特許文献および非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２１】
別段の開示がなされていなければ、本明細書で使用される用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１つ以上（すなわち少なくとも１つ）の参照されるものを包含するものとする。
【００２２】
存在する場合、他に特に記載されていない限り、全ての範囲は、包括的かつ結合可能である。例えば、「１〜５」と記載されている場合、記載範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」等の範囲を含むと解釈されたい。
【００２３】
用語「α−グルカン」、「α−グルカンポリマー」等は、本明細書では互換可能に使用される。α−グルカンは、α−グリコシド結合により互いに連結されるグルコースモノマー単位を含むポリマーである。典型的な実施形態では、本明細書のα−グルカンは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のα−グリコシド結合を含む。本明細書のα−グルカンポリマーの例としては、α−１，３−グルカンおよびデキストランが挙げられる。
【００２４】
用語「ポリα−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカンポリマー」などは、本明細書において互換的に使用される。α−１，３−グルカンは、グリコシド結合により互いに連結されるグルコースモノマー単位を含むポリマーであり、少なくとも約５０％のグリコシド結合がα−１，３である。所定の実施形態におけるα−１，３−グルカンは、少なくとも９０％または９５％のα−１，３グリコシド結合を含む。本明細書のα−１，３−グルカンにおける他の結合のほとんどまたは全ては、通常、α−１，６であるが、一部の結合は、α−１，２および／またはα−１，４でもあり得る。
【００２５】
本明細書の用語「デキストラン」は、少なくとも５０％（最大１００％）のα−１，６グリコシド結合（最大４９％のα−１，３グリコシド結合、その一部は、分岐点で起こり得る）を含む水溶性α−グルカンを指す。スクロースからデキストランを合成することができるグルコシルトランスフェラーゼは、任意選択的に、「デキストランスクラーゼ」（ＥＣ２．４．１．５）と記載される場合もある。
【００２６】
用語「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）」、「結合」などは、本明細書において互換可能に使用され、炭水化物（糖）分子を別の炭水化物などの別の基に連結する共有結合を指す。本明細書において使用される用語「α−１，３−グリコシド結合」は、隣接するα−Ｄ−グルコース環の１位および３位の炭素を介してα−Ｄ−グルコース分子を相互に連結する共有結合の種類を指す。本明細書において使用される用語「α−１，６−グリコシド結合」は、隣接するα−Ｄ−グルコース環の１位および６位の炭素を介してα−Ｄ−グルコース分子を相互に連結する共有結合を指す。本明細書におけるグルカンポリマーのグリコシド結合は、「グルコシド結合」とも呼ぶことができる。本明細書では、「α−Ｄ−グルコース」は、「グルコース」と呼ばれることになる。
【００２７】
本明細書のα−グルカンのグリコシド結合プロファイルは、当該技術分野で知られる任意の方法を使用して決定することができる。例えば、結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を使用する方法（例えば、１３Ｃ  ＮＭＲまたは１Ｈ  ＮＭＲ）により決定することができる。使用することができるこれらの方法および他の方法は、例えば、Ｆｏｏｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ．Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２８】
本明細書の大きいα−グルカンポリマーの「分子量」は、重量平均分子量（Ｍｗ）または数平均分子量（Ｍｎ）として表すことができ、その単位は、ダルトンまたはグラム／モルである。あるいは、大きいα−グルカンポリマーの分子量は、ＤＰｗ（重量平均重合度）またはＤＰｎ（数平均重合度）として表すことができる。オリゴ糖などのより小さいα−グルカンの分子量は、通常、「ＤＰ」（重合度）として提供され得、これは、単に、α−グルカン内に含まれるグルコースの数を指す。これらの様々な分子量測定値を計算するために、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などの様々な手段が当該技術分野で知られている。
【００２９】
本明細書の用語「スクロース」は、α−１，２−グリコシド結合によって連結されたα−Ｄ−グルコース分子およびβ−Ｄ−フルクトース分子から構成される非還元二糖を指す。スクロースは、一般には砂糖として知られている。
【００３０】
用語「ロイクロース」および「Ｄ−グルコピラノシル−α（１−５）−Ｄ−フルクトピラノース」は、本明細書では互換的に使用され、α−１，５グルコシル−フルクトース結合を含有する二糖を指す。
【００３１】
用語「グルコシルトランスフェラーゼ」、「グルコシルトランスフェラーゼ酵素」、「ＧＴＦ」、「グルカンスクラーゼ」などは、本明細書では互換的に使用される。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼの活性は、生成物であるα−グルカンおよびフルクトースを作製するための基質スクロースの反応を触媒する。ＧＴＦ反応の他の生成物（副生成物）としては、グルコース、様々な可溶性グルコーオリゴ糖およびロイクロースを挙げることができる。グルコシルトランスフェラーゼ酵素の野生型形態は、一般に（Ｎ末端からＣ末端方向に）、シグナルペプチド（通常、切断プロセスにより除去される）、可変ドメイン、触媒ドメインおよびグルカン結合ドメインを含有する。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼは、ＣＡＺｙ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）によれば、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類される。
【００３２】
本明細書の用語「グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素にα−グルカン合成活性を付与するグルコシルトランスフェラーゼ酵素のドメインを指す。グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、好ましくは、この活性を有する任意の他のドメインの存在を必要としない。
【００３３】
「酵素反応」、「グルコシルトランスフェラーゼ反応」、「グルカン合成反応」、「反応組成物」、「反応配合物」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、通常、水と、スクロースと、少なくとも１種の活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素とを最初に含み、任意選択的に他の成分も最初に含む反応を意味する。通常、グルコシルトランスフェラーゼ反応が開始した後、グルコシルトランスフェラーゼ反応においてさらに存在する可能性のある成分としては、フルクトース、グルコース、ロイクロース、可溶性グルコーオリゴ糖（例えば、ＤＰ２〜ＤＰ７）（そのようなものは、使用されるグルコシルトランスフェラーゼに依存する生成物または副生成物として見なされ得る）および／またはＤＰ８以上（例えば、ＤＰ１００以上）の不溶性α−グルカン生成物が挙げられる。少なくとも８または９の重合度（ＤＰ）を有するα−１，３−グルカンなどの所定のグルカン生成物は、水不溶性であるため、グルカン合成反応では溶解されず、むしろ溶液外に存在する（例えば、反応から沈殿したため）可能性があることが理解されるであろう。それは、水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程が実施されるグルカン合成反応におけるものである。本明細書で使用する用語「好適な反応条件下」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性を介してスクロースからα−グルカン生成物への変換を補助する反応条件を意味する。
【００３４】
本明細書のいくつかの態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ反応でのα−グルカン生成物の「収率」は、変換されたスクロースを基準とするモル収率を表す。α−グルカン生成物のモル収率は、変換されたスクロースのモルによって割られたα−グルカン生成物のモルに基づいて計算することができる。変換されたスクロースのモルは次のように計算することができる：（初期のスクロースの質量−最終のスクロースの質量）／スクロースの分子量［３４２ｇ／ｍｏｌ］。このモル収率計算は、α−グルカンに対する反応の選択性の尺度であると見なすことができる。いくつかの態様では、グルコシルトランスフェラーゼ反応におけるα−グルカン生成物の「収率」は、反応のグルコシル成分を基準とすることができる。このような収率（グルコシルを基準とした収率）は、次の式を使用して評価することができる：
α−グルカン収率＝（（ＩＳ／２−（ＦＳ／２＋ＬＥ／２＋ＧＬ＋ＳＯ））／（ＩＳ／２−ＦＳ／２））×１００％。
グルコシルトランスフェラーゼ反応のフルクトース残余を評価して、該当する場合、ＨＰＬＣデータが範囲外ではない（９０％〜１１０％は、許容されると見なされる）ことを保証し得る。フルクトース残余は、次の式を使用して評価することができる：
フルクトース残余＝（（１８０／３４２×（ＦＳ＋ＬＥ）＋ＦＲ）／（１８０／３４２×ＩＳ））×１００％。
上の２つの式では、ＩＳは、［初期のスクロース］であり、ＦＳは、［最終のスクロース］であり、ＬＥは、［ロイクロース］であり、ＧＬは、［グルコース］であり、ＳＯは、［可溶性オリゴマー］（グルコ−オリゴ糖）であり、およびＦＲは、［フルクトース］である（全てグラム／Ｌ単位の濃度であり、例えばＨＰＬＣにより測定した際の濃度）。
【００３５】
「体積パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｙ  ｖｏｌｕｍｅ）」、「体積パーセント（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒｃｅｎｔ）」、「ｖｏｌ％」、「ｖ／ｖ％」などの用語は、本明細書では互換的に使用される。溶液中の溶質の体積パーセントは、次式を用いて決定することができる：［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％。
【００３６】
「重量パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｙ  ｗｅｉｇｈｔ）」、「重量パーセント（ｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセント（％ｗ／ｗ）」などの用語は、本明細書では互換的に使用される。重量パーセントとは、組成物、混合物または溶液中に含まれる質量を基準とした物質のパーセンテージを指す。
【００３７】
用語「水性条件」、「水性反応条件」、「水性環境」、「水性系」などは、本明細書では互換的に使用される。本明細書の水性条件は、溶媒が例えば少なくとも約６０重量％水である溶液または混合物を指す。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応は、水性条件下で実施される。
【００３８】
本明細書で使用する用語「可溶性」、「水溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水溶性（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」は、本明細書において水および／または水溶液中に溶解する能力を有するグルカンの特性を表す。本明細書の可溶性グルカンの例は、８未満のＤＰを有するα−１，３−グルカンなどの所定のオリゴ糖ならびに参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１８３７２１号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２４号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２９号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２２号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２６号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１８３７１４号パンフレットにおいて開示される所定のオリゴ糖である。対照的に、「不溶性」、「水不溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水不溶性（ｗａｔｅｒ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」（などの用語）であるグルカンは、本明細書において水および／または水溶液中に溶解しない（または認識できるほどに溶解しない）。任意選択的に、溶解度を決定するための条件としては、約１〜８５℃（例えば、２０〜２５℃）の水／溶液温度範囲および／または約６〜８の中性ｐＨ範囲が挙げられる。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸分子」などは、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、任意選択的に、合成の、非天然の、または改変されたヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーであり得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはこれらの混合物の１つ以上のセグメントから構成され得る。
【００４０】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、コード領域からＲＮＡ（ＲＮＡは、ＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）を発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列を指し、このＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（タンパク質をコードする）または非タンパク質コードＲＮＡであり得る。遺伝子は、コード領域のみを指し得、またはコード領域の上流および／もしくは下流に調節配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’転写ターミネーター領域）を含み得る。タンパク質をコードするコード領域は、代わりに、本明細書中で「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と呼ぶことができる。「天然の」または「内在性の」遺伝子は、それ自体の調節配列とともに天然に見出されたままの遺伝子を指し、そのような遺伝子は、宿主細胞のゲノムの本来の場所に位置する。「キメラ」遺伝子は、天然には一緒に見出されることがない（すなわち、調節領域およびコード領域は、互いに非相同である）調節配列およびコード配列を含む、天然遺伝子でない遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見出されるものと異なる方法で配列された調節配列およびコード配列を含む可能性がある。「外来」または「異種」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物内に導入される遺伝子を意味し得る。外来／異種遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主の新規な場所に導入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含む可能性がある。本明細書に開示される所定の実施形態におけるポリヌクレオチド配列は、異種である。「導入遺伝子」は、遺伝子導入手順（例えば、形質転換）によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計されたコドン使用頻度を有する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、定義された配列を通常有するアミノ酸残基の鎖と定義される。本明細書で使用する場合、ポリペプチドという用語は、用語「ペプチド」および「タンパク質」と互換可能である。本明細書のポリペプチドに含有される典型的なアミノ酸としては（括弧書きで示されるそれぞれの３文字および１文字コード）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）が挙げられる。
【００４２】
用語「異種」は、天然には対象位置に見出されないことを意味する。例えば、異種遺伝子は、天然には宿主生物内に見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子であり得る。別の例として、キメラ遺伝子中に存在する核酸分子は、そのような核酸分子がキメラ遺伝子の他のセグメントと自然には関連しないため、異種として特徴付けることができる（例えば、プロモーターは、コード配列に対して異種であり得る）。
【００４３】
本明細書中の細胞または生物に含まれる「非天然」のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、そのような細胞または生物の天然の（自然の）対応物に存在しない。このようなアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、細胞または生物に対して異種であると言うこともできる。
【００４４】
本明細書で使用する「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）、５’非翻訳領域、イントロンおよび３’非コード領域を指し、遺伝子から転写されるＲＮＡの転写、プロセシングもしくは安定性および／または翻訳に影響を及ぼす可能性がある。本明細書の調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造および遺伝子発現の調節に関連する他の要素を含む可能性がある。本明細書の１つ以上の調節エレメントは、本明細書のコード領域に対して異種であり得る。
【００４５】
本明細書中で使用する「プロモーター」は、遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、プロモーター配列は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得、自然界で見出される様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成され得、または合成ＤＮＡセグメントをさらに含み得る。あらゆる状況下のほとんどの時点で遺伝子が細胞内で発現することを誘発するプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターは、誘導可能でもあり得る。本明細書の１つ以上のプロモーターは、本明細書のコード領域にとって異種であり得る。
【００４６】
本明細書で使用する「強力なプロモーター」は、単位時間当たり相当に多数の生成開始を指示できるプロモーターおよび／または細胞内の遺伝子の平均転写レベルよりも高いレベルの遺伝子転写を駆動するプロモーターである。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「３’非コーディング配列」、「転写ターミネーター」、「ターミネーター」などは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列を含む。
【００４８】
本明細書で使用するように、第１核酸配列は、第１核酸配列の一本鎖形が好適なアニーリング条件（例えば、温度、溶液イオン強度）下で第２核酸配列にアニーリングできる場合、第２核酸配列に「ハイブリダイズする」ことができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、よく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）で例証されており、この文献、特に１１章および表１１．１は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
用語「ＤＮＡ操作技術」は、ＤＮＡポリヌクレオチド配列の配列が改変される任意の技術を指す。改変されているＤＮＡポリヌクレオチド配列は、改変のための基質自体として使用できるが、ＤＮＡポリヌクレオチド配列は、所定の技術のために物理的に所有されている必要はない（例えば、コンピューター内に保存された配列を操作技術のための基礎として使用することができる）。ＤＮＡ操作技術は、より長い配列内で１つ以上のＤＮＡ配列を欠失および／または変異させるために使用することができる。ＤＮＡ操作技術の例としては、組換えＤＮＡ技術（制限およびライゲーション、分子クローニング）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および合成ＤＮＡ法（例えば、オリゴヌクレオチド合成およびライゲーション）が挙げられる。合成ＤＮＡ技術に関して、ＤＮＡ操作技術は、インシリコでＤＮＡポリヌクレオチドを観察する工程、ＤＮＡポリヌクレオチドの所望の改変（例えば、１つ以上の欠失）を決定する工程および所望の改変を含有するＤＮＡポリヌクレオチドを合成する工程を必要とする可能性がある。
【００５０】
本明細書の用語「インシリコ」は、例えば、コンピューターなどの情報記憶および／またはプロセシング装置内および上において、コンピューターソフトウェアまたはシミュレーションを使用して実施または生成されること、すなわちバーチャルリアリティを意味する。
【００５１】
ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用する用語「上流」および「下流」は、それぞれ「５’」および「３’」を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する用語「発現」は、（ｉ）コード領域からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡもしくは非タンパク質コードＲＮＡ）の転写および／または（ｉｉ）ｍＲＮＡからのポリペプチドの転写を指す。ポリヌクレオチド配列のコード領域の発現は、所定の実施形態において上方制御または下方制御することができる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方によって影響されるような２つ以上の核酸配列の結合を意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、そのコード配列と作動可能に連結されている。すなわち、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある。コード配列は、例えば、１つ（例えば、プロモーター）または複数（例えば、プロモーターおよびターミネーター）調節配列に作動可能に連結することができる。
【００５４】
「組換え」という用語は、プラスミド、ベクターまたはコンストラクトなどのＤＮＡ配列を特徴付けるために本明細書で使用されるとき、そうしなければ配列の２つの別々のセグメントであったものを、例えば化学合成により、および／または核酸の分離したセグメントを遺伝子工学技術で操作することにより人工的に組み合わせることを指す。
【００５５】
本明細書で使用する用語「形質転換」は、任意の方法によって核酸分子を宿主生物または宿主細胞に移すことを指す。生物／細胞中に形質転換された核酸分子は、生物／細胞中で自律的に複製するか、または生物／細胞のゲノム中に組み込まれるか、または複製もしくは組み込みなしに細胞中に一過的に存在するものであり得る。例えば、プラスミドおよび直鎖状ＤＮＡ分子など、形質転換のために好適な核酸分子の非限定的な例は、本明細書に開示されている。形質転換核酸配列を含有する本明細書に記載の宿主生物／細胞は、例えば、「トランスジェニック」、「組換え」、「形質転換された」、「遺伝子操作された」、「形質転換体」および／または「外因性遺伝子発現のために改変された」と称することができる。
【００５６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して本明細書で使用する用語「配列同一性」、「同一性」などは、特定の比較ウィンドウにわたって最高一致のために整列させたときに同一である、２つの配列内の核酸残基またはアミノ酸残基に関する。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」、「同一性率（％）」などは、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される数値を意味するが、このとき、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適整列のための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含む可能性がある。パーセンテージは、両方の配列内で同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、そのマッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間の配列相同性を計算するとき、ＤＮＡ配列のＴ残基は、ＲＮＡ配列のＵ残基と合致し、したがってＲＮＡ配列のＵ残基と「同一である」と見なし得ることが理解されるであろう。第１および第２ポリヌクレオチドの「相補率」を決定するために、例えば、（ｉ）第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドの相補配列（またはその逆）との同一性率、および／または（ｉｉ）標準的なワトソン・クリック塩基対を作り出すであろう第１および第２ポリヌクレオチド間の塩基のパーセンテージを決定することによってそれを得ることができる。
【００５７】
同一性率は、全てが参照により本明細書に組み込まれる１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；ならびに５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含むが、これらに限定されない任意の既知の方法によって容易に決定することができる。
【００５８】
同一性率を決定するための方法は、試験される配列間で最大の一致を得るように設計されていることが好ましい。同一性および類似性を決定する方法は、例えば、公開されているコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび同一性率計算は、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて実施することができる。配列のマルチプルアラインメントは、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）によって記載される）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭＥＧＡＬＩＧＮ  ｖ８．０プログラムに見出されるＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法を含む、数種類のアルゴリズムを包含するＣｌｕｓｔａｌアラインメント法を用いて実施することができる。マルチプルアラインメントについて、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応し得る。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性率の計算のためのデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であり得る。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。加えて、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法が使用され得（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４によって記載される）、これは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭＥＧＡＬＩＧＮ  ｖ８．０プログラムに見出され得る。マルチプルアラインメントのためのデフォルトパラメーター（タンパク質／核酸）は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０／１５、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２／６．６６、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０／３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢであり得る。
【００５９】
本明細書では、様々なポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列は、所定の実施形態の特徴として開示されている。本明細書に開示される配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％または９０％〜９５％同一であるこれらの配列のバリアントを使用または参照できる。あるいは、バリアントアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、本明細書で開示される配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有することができる。バリアントアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、開示した配列と同じ機能／活性または開示した配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書に開示される任意のポリペプチドアミノ酸配列は、典型的には、アミノ酸配列のＮ末端で少なくとも１つの開始メチオニンをさらに含む可能性がある。対照的に、メチオニンで始まる本明細書に開示される任意のポリペプチドアミノ酸配列は、任意選択的に、そのようなメチオニン残基を欠く可能性がある。
【００６０】
用語「〜と整列する」、「〜に対応する」などは、本明細書において互換的に使用することができる。本明細書のいくつかの実施形態は、配列番号６２の少なくとも１つの特定のアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むグルコシルトランスフェラーゼに関する。（１）クエリー配列が対象配列と整列し得る場合（例えば、この場合、アラインメントは、クエリー配列および対象配列［または対象配列の部分配列］が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一であることを示す）ならびに（２）クエリーアミノ酸位置が（１）のアラインメントにおいて対象アミノ酸位置と一直線に整列する（一直線に一列に並ぶ）場合、グルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置またはその部分配列は、（例えば、触媒ドメインまたは触媒ドメインに加えてグルカン結合ドメイン）（このようなアミノ酸位置または配列を「クエリー」位置または配列と呼ぶことができる）、配列番号６２の特定のアミノ酸残基（そのようなアミノ酸位置または配列を「対象」位置または配列と呼ぶことができる）に対応するように特徴付けることができる。一般に、開示された本明細書に記載される任意のアラインメントアルゴリズム、ツールおよび／またはソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶ、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ、ＥＭＢＯＳＳ）を用いて、対象配列（配列番号６２または配列番号６２の部分配列）とクエリーアミノ酸配列を整列させて、同一性率を決定することができる。まさにさらなる例として、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ［例えば、バージョン５．０．０以降］，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実行されるようなニードルマン−ヴンシュアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）を使用して、クエリー配列を本明細書の対象配列と整列させることができる。このようなＥＭＢＯＳＳアラインメントのパラメーターとしては、例えば、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスを含み得る。
【００６１】
本明細書の配列番号６２の特定のアミノ酸残基のナンバリング（例えば、Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１）は、配列番号６２の全長アミノ酸配列に関するものである。配列番号６２の最初のアミノ酸（すなわち１位、Ｍｅｔ−１）は、シグナルペプチドの開始点である。別段の開示がなされていなければ、本明細書の置換は、配列番号６２の全長アミノ酸配列に関するものである。
【００６２】
本明細書の「非天然グルコシルトランスフェラーゼ」（あるいは、「変異体」、「バリアント」、「改変された」などの用語は、このようなグルコシルトランスフェラーゼを記載するためにそれに加えて用いられる）は、配列番号６２の特定のアミノ酸残基（例えば、Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１）に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。ほとんどの場合、このような少なくとも１つのアミノ酸置換は、非天然グルコシルトランスフェラーゼの天然対応物（親）において同じ位置で一般に（自然に）存在するアミノ酸残基に代わるものである。天然対応物のグルコシルトランスフェラーゼにおいて関連した位置で一般に存在するアミノ酸は、アラインメントがなされる配列番号６２の特定のアミノ酸残基（例えば、Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１）と同じである（または保存されている）ことが多い。非天然グルコシルトランスフェラーゼは、任意選択的に、その天然対応物配列に対して他のアミノ酸変化（変異、欠失および／または挿入）を有する場合がある。
【００６３】
本明細書の置換／アラインメントを説明することは、有益であり得る。配列番号６９（ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃ  Ｎｏ．ＢＡＣ０７２６５．１、ＧＩ  Ｎｏ．２２１３８８４５）は、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）の天然のグルコシルトランスフェラーゼである。配列番号６９のＰｈｅ−８８６は、配列番号６２のＰｈｅ−９５１に対応することに留意されたい（アラインメントは示さず）。例えば、配列番号６９が８８６位で変異されて、Ｐｈｅ残基を異なる残基（例えば、Ｔｙｒ）で置換する場合、配列番号６９の８８６位で変異したバージョンは、配列番号６２のＰｈｅ−９５１に対応する位置でアミノ酸置換を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼに対応すると言うことができる。本明細書の置換／アラインメントを説明する別の例として、配列番号１２のＬｅｕ−１９３は、配列番号６２のＬｅｕ−３７３に対応することに留意されたい（アラインメントは示さず）。例えば、配列番号１２が１９３位で変異されて、Ｌｅｕ残基を異なる残基（例えば、Ｇｌｎ）で置換する場合、配列番号１２の１９３位で変異したバージョンは、配列番号６２のＬｅｕ−３７３に対応する位置でアミノ酸置換を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼに対応すると言うことができる。
【００６４】
用語「単離された」は、天然に存在しない形態または環境にある物質（またはプロセス）を意味する。単離された物質の非限定的例としては、（１）天然に存在しない任意の物質（例えば、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼ）、（２）限定されないが、自然界では結合している天然に存在する成分の１つ以上または全部から少なくとも部分的に取り出される任意の宿主細胞、酵素、バリアント、核酸、タンパク質、ペプチド、補因子または炭水化物／糖などの任意の物質；（３）自然界で見出される物質に対して人の手により改変された任意の物質（例えば、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼ）；あるいは（４）その物質の量を、それが自然に結合している他の成分に対して増加させることによって修飾された任意の物質が挙げられる。本明細書に開示される実施形態（例えば、酵素および反応組成物）は、合成物／人工物であり、かつ／または天然に存在しない特性を有すると考えられる。
【００６５】
本明細書で使用される「増加した」という用語は、増加した量または活性が比較される量または活性より少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％または２００％多い量または活性を指すことができる。用語「増加した」、「上昇した」、「高められた」、「より多い」、「向上した」などの用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの「過剰発現」または「上方制御」を特徴付けるために使用することができる。
【００６６】
グルコシルトランスフェラーゼ酵素を用いたグルカンポリマーの生成において進展がなされてきた一方、このような酵素のグルカン収率の向上に対して関心がほとんど向けられていないように見える。この技術的空白を解決するために、本明細書では、これらの酵素に高められたグルカン生成特性を付与する改変アミノ酸配列を有するように遺伝子操作されたグルコシルトランスフェラーゼが開示される。
【００６７】
本開示の所定の実施形態は、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成し、
（ｉ）その置換位置でのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）第２のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼに関する。したがって、概して、より多量のα−グルカンを合成することができ、かつ／または主な目的がα−グルカン合成である場合に望ましくないと見なされることが多い副産物であるロイクロースの収率を低くすることができる、変異体グルコシルトランスフェラーゼ酵素が本明細書に開示される。
【００６８】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成する。いくつかの態様では、このようなα−グルカンのグリコシド結合の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、α−１，３結合であり得る。α−グルカンの結合プロファイルは、任意選択的に、これらの値のいずれか２つの間の範囲を有するものとして特徴付けることができる。例えば、１％〜９９％のα−１，３結合を有するこれらの態様のいずれかにおける他の結合は、α−１，６であり得、かつ／またはα−１，４もしくはα−１，２結合のいずれも含み得ない。さらに、他の態様では、α−グルカンのグリコシド結合の約１００％がα−１，６結合であり得る。
【００６９】
いくつかの態様におけるα−グルカンは、例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満のα−１，２またはα−１，４グリコシド結合を有し得る。別の実施形態では、α−グルカンは、α−１，３および／またはα−１，６結合のみを有する。
【００７０】
いくつかの態様におけるα−グルカンは、直鎖／非分岐鎖であり得る。あるいは、本明細書のα−グルカンでは、分岐が存在し得る。例えば、α−グルカンは、ポリマー中の結合のパーセントとして約３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の分岐点を有し得る。
【００７１】
所定の実施形態では、α−グルカンは、少なくとも約１００のＤＰｗまたはＤＰｎでの分子量を有し得る。例えば、ＤＰｗまたはＤＰｎは、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００または１２００であり得る。α−グルカンの分子量は、任意選択的に、これらの値のいずれか２つの間の範囲として表すこともできる。これらの分子量は、特に、例えば本明細書のα−１，３−グルカンに適用される。
【００７２】
さらに、いくつかの態様では、α−グルカンは、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００または２５０のＤＰを有し得る。α−グルカンのＤＰは、任意選択的に、これらの値のいずれか２つの間の範囲として表すこともできる。このようなα−グルカンの特定の例としては、（ｉ）８または９未満のＤＰを有し、かつ大部分（例えば、＞８０〜９０％）または全てがα−１，３結合を有するもの、および（ｉｉ）大部分（例えば、＞８０〜９０％）または全てがα−１，６結合を有するものが挙げられる。
【００７３】
さらにまた、いくつかの態様では、α−グルカンは、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００百万ダルトンのＭｗを有し得る。α−グルカンのＭｗは、任意選択的に、これらの値のいずれか２つの間の範囲として表すこともできる。このようなα−グルカンの特定の例としては、少なくとも約８５％または９０％のα−１，６結合を有するデキストランが挙げられる。
【００７４】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼによって生成されるα−グルカンは、水不溶性または水溶性であり得る。本明細書のα−１，３−グルカンは、通常、大部分の水性環境において不溶性であるのに対して、デキストランは、通常、大部分の水性環境において可溶性である。一般に、本明細書の水性系中のグルカンポリマーの溶解度は、その結合型、分子量および／または分岐度に関連する。α−１，３−グルカンは、一般に、８または９のＤＰｗおよび上記中性（例えば、ｐＨ６〜８）水性条件で不溶性である。
【００７５】
前述の結合プロファイル、分子量プロファイルおよび／または溶解度プロファイルのいずれかを、例えば本明細書において組み合わせて、本開示の非天然グルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン生成物を適切に特徴付けることができる。いくつかの態様では、本明細書のα−グルカン生成物の結合、分子量および／または溶解度プロファイルは、全てが参照により本明細書に組み込まれる以下の刊行物のいずれかにおいて開示され得る：米国特許第７００００００号明細書および同第８８７１４７４号明細書；米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書および同第２０１６／０１２２４４５号明細書；ならびに国際公開第２０１５／１８３７２１号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２４号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２９号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２２号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２６号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１８３７１４号パンフレット。
【００７６】
非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、非天然グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有するという点を除いて、本開示のようにα−グルカンを生成することができる、以下の刊行物に開示される任意のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含み得る：米国特許第７００００００号明細書および同第８８７１４７４号明細書；米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書および同第２０１６／０１２２４４５号明細書；ならびに国際公開第２０１５／１８３７２１号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２４号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２９号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２２号パンフレット、国際公開第２０１５／１８３７２６および国際公開第２０１５／１８３７１４号パンフレット（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様では、このような非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）前述の置換の少なくとも１つを有し、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの置換を有しないそれぞれの対応物／親グルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７７】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ（ｉｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、５９、６８（もしくはその３７〜１３３８位）、６９（もしくはその３７〜１５５４位もしくは１７０〜１５５４位）または７０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。これらのアミノ酸配列のいくつかを有する数種のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン生成物に関する所定の情報が表２において提供される。
【００７８】
【表６】
2019530474.tif 000007
【００７９】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むか、またはそれからなる。このような非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、水不溶性であるα−グルカンを生成することができ、かつ少なくとも約５０％（例えば、≧９０％または９５％）のα−１，３結合を含み、また任意選択的に、少なくとも１００のＤＰｗをさらに有すると考えられる。例えば、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位を有するグルコシルトランスフェラーゼは、１００％のα−１，３結合および少なくとも４００のＤＰｗを有するα−１，３−グルカンを生成できる（データは示さず、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／１８０，７７９号明細書または米国特許出願公開第２０１７／０００２３３５号明細書の表６を参照されたい）ことに留意されたい。配列番号６５（ＧＴＦ７５２７）、３０（ＧＴＦ２６７８）、４（ＧＴＦ６８５５）、２８（ＧＴＦ２９１９）および２０（ＧＴＦ２７６５）は、それぞれの野生型対応物と比較して、シグナルペプチドドメインおよび可変ドメインの全部分または大部分を欠くグルコシルトランスフェラーゼを表すことにさらに留意されたい。したがって、これらのグルコシルトランスフェラーゼ酵素のそれぞれは、後にグルカン結合ドメインが続く触媒ドメインを有する。これらの酵素中の触媒ドメイン配列のおよその位置は次のとおりである：７５２７（配列番号６５の残基５４〜９５７）、２６７８（配列番号３０の残基５５〜９６０）、６８５５（配列番号４の残基５５〜９６０）、２９１９（配列番号２８の残基５５〜９６０）、２７６５（配列番号２０の残基５５〜９６０）。ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９および２７６５の（およその）触媒ドメインのアミノ酸配列は、ＧＴＦ７５２７のおよその触媒ドメイン配列（すなわち配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７）とのそれぞれ約９４．９％、９９．０％、９５．５％および９６．４％の同一性を有する。これらの特定のグルコシルトランスフェラーゼの各々（ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９および２７６５）は、１００％のα−１，３結合および少なくとも４００のＤＰｗを有するα−１，３−グルカンを生成できる（データは示さず、米国特許出願６２／１８０，７７９号明細書または米国特許出願公開第２０１７／０００２３３５号明細書の表４を参照されたい）。この活性および前述の触媒ドメインの関連性（高い同一性率）に基づいて、前述のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに有する前述の触媒ドメインの１つを有する本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、少なくとも約５０％（例えば、≧９０％または９５％）のα−１，３結合および少なくとも１００のＤＰｗを含むα−グルカンを生成することができと考えられる。
【００８０】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ（ｉｉ）配列番号６２または配列番号４（その開始メチオニンを有しない）もしくは配列番号４の５５〜９６０位（およその触媒ドメイン）などのその部分配列と少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００８１】
所定の態様における非天然グルコシルトランスフェラーゼは、本明細書の少なくとも１つのアミノ酸置換を有する触媒ドメイン配列のみを有する必要があると考えられているが、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、より広範なアミノ酸配列内に含まれ得る。例えば、触媒ドメインは、そのＣ末端でグルカン結合ドメインに連結され得、かつ／またはそのＮ末端で可変ドメインおよび／もしくはシグナルペプチドに連結され得る。
【００８２】
非天然グルコシルトランスフェラーゼにおけるアミノ酸置換は、配列番号６２における対応する位置に関して本明細書で一般に開示されるが、このような置換は、代わりに、便宜的に、単に非天然グルコシルトランスフェラーゼ自体の配列におけるその位置番号に関して記載され得る。
【００８３】
非天然グルコシルトランスフェラーゼのさらにまた別の例は、本明細書に開示されるもの、ならびにＮ末端および／またはＣ末端に１〜３００（もしくはその間の任意の整数［例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０］）個の残基を含むもののいずれでもあり得る。そのような追加の残基は、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素が由来する対応する野生型配列由来であるか、または（Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかにおける）エピトープタグまたは（Ｎ末端における）異種シグナルペプチドなどの異種配列であり得る。本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、通常、Ｎ末端シグナルペプチドを欠き、このような酵素は、任意選択的に、そのシグナルペプチドが分泌プロセス中に除去された場合、成熟したものとして特徴付けることができる。
【００８４】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、細菌または真菌などの任意の微生物源に由来し得る。細菌グルコシルトランスフェラーゼの例は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種またはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来するものである。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の例としては、Ｓ．サルバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．ソブリナス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．デンチロウセッティ（Ｓ．ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）、Ｓ．ダウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｉ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびＳ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）が挙げられる。ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種の例としては、Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌ．アメリビオスム（Ｌ．ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ）、Ｌ．アルゲンチナム（Ｌ．ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ）、Ｌ．カルノスム（Ｌ．ｃａｒｎｏｓｕｍ）、Ｌ．シトレウム（Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ）、Ｌ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌ．デキストラニカム（Ｌ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）およびＬ．フルクトサム（Ｌ．ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ）が挙げられる。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の例としては、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．デルブリュキイ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ヘルベチクス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．フェルメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。
【００８５】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、適切に遺伝子操作された微生物株の発酵によって製造することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ならびにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属（例えば、Ｔ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））（例えば、ＡｄｒｉｏおよびＤｅｍａｉｎ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ４：１１７−１３９，２０１４を参照されたい（この文献は、参照により本明細書に組み込まれる））などの微生物種を用いる発酵による組換え酵素の製造は、当該技術分野でよく知られている。非天然グルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、典型的には、酵素のための発現カセットを形成するために異種プロモーター配列と連結され、かつ／またはそれに合うようにコドン最適化される。そのような発現カセットは、当該技術分野でよく知られる方法を使用して、適切なプラスミドに組み込まれるかまたは微生物宿主染色体中に組み込まれ得る。発現カセットは、アミノ酸をコードする配列に続いて転写ターミネーターヌクレオチド配列を含み得る。発現カセットは、プロモーター配列とグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸をコードする配列との間に、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の直接的な分泌のために設計されたシグナルペプチド（例えば、異種シグナルペプチド）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。発酵の終わりに、細胞を適宜破壊し得（通常、分泌のためのシグナルペプチドが採用されない場合）、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、沈殿、濾過および／または濃縮などの方法を使用して単離することができる。あるいは、グルコシルトランスフェラーゼを含む溶解物または抽出物をさらに単離することなしに使用することができる。グルコシルトランスフェラーゼが分泌される（すなわち、それが発酵ブロス中に存在する）場合、それは、発酵ブロスから単離されたものとして、または発酵ブロスに含まれるものとして任意選択的に使用され得る。グルコシルトランスフェラーゼ酵素の活性は、スクロースのグルカンポリマーへのその変換率を測定するなどの生化学的分析によって確認することができる。
【００８６】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ａｓｎ−６１３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＬｅｕ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｐｈｅ−９５１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｙｒ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ａｌａ−５１０に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｐ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｐｈｅ−６０７に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｓｎ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｇｌｎ−６１６に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｕ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｌｅｕ−３７３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＰｈｅまたはＬｅｕ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ａｌａ−４７２に対応する位置でのアミノ酸置換は、ＳｅｒまたはＣｙｓ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｇｌｙ−６３３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｌｅｕ−５１３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｔｈｒ−６３５に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＴｙｒ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｍｅｔ−５２９に対応する位置でのアミノ酸置換は、ＬｅｕまたはＡｓｎ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｐｈｅ−６３４に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｓｅｒ−６３１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ｌｅｕ−４２８に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｖａｌ残基によるものであり得る。本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、本開示の置換の１つ、２つ、３つ、４つまたはそれを超えるものを含み得る。いくつかの態様における非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６２のアミノ酸残基Ｖａｌ−５５２に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、Ｇｌｙ残基による置換）を含み得る。
【００８７】
好適な置換部位およびこれらの部位での特定の置換の例としては、（ｉ）ロイクロース産生の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の減少および／または（ｉｉ）グルカン収率の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％もしくは１５０％の増加に関する、実施例１における表３（下記）に列記されるものを挙げることができる。いくつかの態様では、好適な置換としては、グルコース産生の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％の減少に関する、実施例１における表３（下記）に列記されるものが挙げられる。いくつかの態様では、好適な置換としては、グルコ−オリゴ糖（オリゴマー）産生の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％の減少に関する、実施例１における表３（下記）に列記されるものが挙げられる。表３に列記されるような前述の置換は、配列番号６２において列記される残基位置番号と一致するとおりのものである。いくつかの態様では、１つ以上の置換は、保存的置換または非保存的置換であり、このような保存（または非保存）は、例えば、非天然グルコシルトランスフェラーゼが由来する天然のグルコシルトランスフェラーゼにおいて存在するアミノ酸に関するものであり得る。
【００８８】
上に開示されるように、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、種々のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のいずれか１つに基づき得る。簡潔に例示する目的として、少なくとも１つの本明細書で開示されるようなアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼの例は、（ｉ）配列番号４の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列または配列番号４と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列（任意選択的に配列番号４の開始メチオニンを有しない）を含み、かつ（ｉｉ）少なくとも１つの本明細書に開示されるようなアミノ酸置換を有するグルコシルトランスフェラーゼを含む。例えば、配列番号６６は、配列番号４の残基５５〜９６０を表すが、配列番号６２のアミノ酸Ａｌａ−５１０に対応する位置でＧｌｕ残基を有する（すなわちＡｌａ対するＧｌｕ置換）（置換しているＧｌｕは、配列番号６６の２７９位である）。したがって、いくつかの態様における非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６６または配列番号６６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％同一であるが、２７９位でＧｌｕを有するアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。他の態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号７１または配列番号７１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％同一であるが、２７９位でＧｌｕを有するアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００８９】
本開示の非天然グルコシルトランスフェラーゼの例は、２つ以上（複数）のアミノ酸置換を含むことができ、このような２つ以上の置換の少なくとも１つは、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置におけるものである。例えば、このような非天然グルコシルトランスフェラーゼは、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含むことができ、置換の少なくとも１つは、前述のリストからのものである。また、例えば、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、前述のリストからの２つまたは３つのアミノ酸置換および任意選択的に１つまたは２つの他のアミノ酸置換を含むことができる。
【００９０】
いくつかの態様では、複数のアミノ酸置換を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｌａ−５１０またはＰｈｅ−６０７に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例として、これらの位置の両方でアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼがある。複数の酸置換を有する本明細書に開示されるこれらおよび他の非天然グルコシルトランスフェラーゼにおいて、追加のアミノ酸置換（存在する場合）は、例えば、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｒｇ−７４１、Ａｓｎ−７４３、Ｌｅｕ−７８４、Ａｓｐ−８２０、Ｐｈｅ−９２９、Ａｓｐ−９４８および／またはＡｒｇ−１１７２位置に対応するにおけるものであり得る。例えば、本明細書の複数の置換を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｒｇ−７４１および／またはＡｓｎ−７４３に対応する位置の一方または両方で置換を含むことができる。さらに、例えば、本明細書の複数の置換を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６２のＡｒｇ−７４１、Ａｓｐ−９４８および／またはＡｒｇ−１１７２の位置で置換を含むことができる。本明細書におけるさらなる例は、以下の（ｉ〜ｘ）のとおりのアミノ酸置換の組み合わせを含む非天然グルコシルトランスフェラーゼを含み、各置換は、配列番号６２のそれぞれのアミノ酸残基：
（ｉ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７およびＡｒｇ−７４１；
（ｉｉ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７およびＡｓｎ−７４３；
（ｉｉｉ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７およびＡｓｐ−９４８；
（ｉｖ）Ａｌａ−５１０、Ａｒｇ−７４１およびＡｓｐ−９４８；
（ｖ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７、Ａｒｇ−７４１およびＡｓｐ−９４８；
（ｖｉ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７、Ａｒｇ−７４１およびＡｒｇ−１１７２；
（ｖｉｉ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｐ−８２０およびＡｓｐ−９４８；
（ｖｉｉｉ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｐ−９４８およびＡｒｇ−１１７２；
（ｉｘ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−７４３、Ａｓｐ−９４８およびＡｒｇ−１１７２；または
（ｘ）Ａｌａ−５１０、Ｐｈｅ−６０７、Ａｒｇ−７４１、Ｌｅｕ−７８４、Ｐｈｅ−９２９およびＡｒｇ−１１７２
に対応する。
複数のアミノ酸置換（例えば、上記の実施形態ｉ〜ｘ）を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼのいくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸Ａｌａ−５１０に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｓｐ、Ｇｌｕもしくは本明細書で開示されるような他の残基（例えば、ＩｌｅまたはＶａｌ）によるものであり得；配列番号６２のアミノ酸Ｐｈｅ−６０７に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｙｒもしくは本明細書で開示されるような他の残基（例えば、ＴｒｐまたはＡｓｎ）によるものであり得；配列番号６２のアミノ酸Ａｒｇ−７４１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｓｅｒ残基によるものであり得；配列番号６２のアミノ酸Ａｓｎ−７４３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｓｅｒ残基によるものであり得；配列番号６２のアミノ酸Ａｓｐ−９４８に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｙ残基によるものであり得；配列番号６２のアミノ酸Ａｒｇ−１１７２に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｃｙｓ残基によるものであり得；配列番号６２のアミノ酸Ａｓｐ−８２０に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｙ残基によるものであり得；配列番号６２のアミノ酸Ｌｅｕ−７８４に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｎ残基によるものであり得；かつ／または配列番号６２のアミノ酸Ｐｈｅ−９２９に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｌｅｕ残基によるものであり得る。複数のアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼのいくつかの例としては、以下の置換（ｘｉ〜ｘｘ）の組み合わせを含むものが挙げられ、各置換は、配列番号６２のそれぞれのアミノ酸残基：（ｘｉ）Ａ５１０Ｄ／Ｆ６０７Ｙ／Ｒ７４１Ｓ、（ｘｉｉ）Ａ５１０Ｄ／Ｆ６０７Ｙ／Ｎ７４３Ｓ、（ｘｉｉｉ）Ａ５１０Ｄ／Ｆ６０７Ｙ／Ｄ９４８Ｇ、（ｘｉｖ）Ａ５１０Ｄ／Ｒ７４１Ｓ／Ｄ９４８Ｇ、（ｘｖ）Ａ５１０Ｄ／Ｆ６０７Ｙ／Ｒ７４１Ｓ／Ｄ９４８Ｇ、（ｘｖｉ）Ａ５１０Ｅ／Ｆ６０７Ｙ／Ｒ７４１Ｓ／Ｒ１１７２Ｃ、（ｘｖｉｉ）Ａ５１０Ｄ／Ｆ６０７Ｙ／Ｄ８２０Ｇ／Ｄ９４８Ｇ、（ｘｖｉｉｉ）Ａ５１０Ｄ／Ｆ６０７Ｙ／Ｄ９４８Ｇ／Ｒ１１７２Ｃ、（ｘｉｘ）Ａ５１０Ｄ／Ｆ６０７Ｙ／Ｎ７４３Ｓ／Ｄ９４８Ｇ／Ｒ１１７２Ｃまたは（ｘｘ）Ａ５１０Ｄ／Ｆ６０７Ｙ／Ｒ７４１Ｓ／Ｌ７８４Ｑ／Ｆ９２９Ｌ／Ｒ１１７２Ｃに対応する。
【００９１】
いくつかの代替的態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｓｎ−７４３（例えば、Ｎ７４３Ｓ）またはＡｒｇ−７４１（例えば、Ｒ７４１Ｓ）に対応する位置で（追加の置換を伴うかまたは伴わずに）少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
【００９２】
複数のアミノ酸置換を有する本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、本明細書に開示されるような種々のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のいずれかに基づき得る。簡潔に例示する目的として、このような非天然グルコシルトランスフェラーゼの例としては、上記のような複数の置換（例えば、実施形態ｉ〜ｘｘのいずれか１つ）を有し、かつ配列番号６５（任意選択的に配列番号６５の開始メチオニンを有しない）、もしくは配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０（任意選択的に配列番号３０の開始メチオニンを有しない）、もしくは配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４（任意選択的に配列番号４の開始メチオニンを有しない）、もしくは配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８（任意選択的に配列番号２８の開始メチオニンを有しない）、もしくは配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０（任意選択的に配列番号２０の開始メチオニンを有しない）もしくは配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるものが挙げられる。
【００９３】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）その置換位置でのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼ（例えば、親グルコシルトランスフェラーゼ）のα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または（ｉｉ）第２のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率を有し得る。いくつかの実施形態では、非天然グルコシルトランスフェラーゼと比較される第２のグルコシルトランスフェラーゼは、その置換位置で天然のアミノ酸残基を有する。本明細書の第２のグルコシルトランスフェラーゼは、例えば、全てまたは大部分が天然のアミノ酸配列で構成され得る。したがって、本明細書の第２のグルコシルトランスフェラーゼは、いくつかの態様において天然のグルコシルトランスフェラーゼであり得るが、それは、他の態様において予め改変されたグルコシルトランスフェラーゼであり得る（例えば、本開示の置換と異なる１つ以上の他のアミノ酸置換を有するグルコシルトランスフェラーゼ）。いくつかの実施形態では、非天然グルコシルトランスフェラーゼと比較される第２のグルコシルトランスフェラーゼは、その置換位置で天然のアミノ酸残基を有する。アミノ酸残基が天然のものであるかどうかの決定は、第２のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を、第２のグルコシルトランスフェラーゼが由来する天然／野生型のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することによってなされ得る。任意選択的に、いくつかの実施形態における非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（副生成物の合成と比較して）α−グルカン合成に対してより高い選択性を有するものとして特徴付けることができる。
【００９４】
いくつかの態様では、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、本明細書に開示されるような第２のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２８０％、３００％、３２０％または３４０％高いα−グルカン収率を有し得る。追加のまたは代替的ないくつかの実施形態では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、第２のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率と比較して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％減少したロイクロース収率を有し得る。これらの判断（α−グルカンおよび／またはロイクロースの収率）は、本明細書に開示されるような（例えば、初期スクロース濃度、温度、ｐＨおよび／または反応時間を考慮する）任意のグルカン合成反応／プロセスに対して、任意の好適な測定技術（例えば、ＨＰＬＣまたはＮＩＲ分光法）を用いてなされ得る。通常、本明細書における非天然グルコシルトランスフェラーゼと第２のグルコシルトランスフェラーゼとの比較は、同一または類似の反応条件下でなされ得る。いくつかの態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ反応の収率は、反応のグルコシル成分を基準にして評価され得る。
【００９５】
特に、α−１，３−グルカンなどの不溶性α−グルカン生成物を生成する非天然グルコシルトランスフェラーゼに関するいくつかの実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼは、可溶性グルコ−オリゴ糖の収率において、第２のグルコシルトランスフェラーゼの可溶性グルコ−オリゴ糖の収率と比較して少なくとも約５％、１０％，１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％の減少を示し得る。いくつかの態様における可溶性グルコ−オリゴ糖は、ＤＰ２〜７またはＤＰ２〜８であり得、本明細書に開示される任意の結合プロファイルを有し得る。いくつかの態様では、ＤＰは、７以上であり、最大で１０、１５、２０または２５であるが、溶解を許容する結合プロファイル（例えば、９０％または９５％を超えないα−１，３）を有する。
【００９６】
特に、α−１，３−グルカンなどの不溶性α−グルカン生成物を生成する非天然グルコシルトランスフェラーゼに関するいくつかの実施形態では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、グルコースの収率において、第２のグルコシルトランスフェラーゼのグルコースの収率と比較して少なくとも約５％、１０％，１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％の減少を示し得る。
【００９７】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示されるような非天然グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。任意選択的に、１つ以上の調節配列は、ヌクレオチド配列と作動可能に連結され、好ましくは、プロモーター配列は、調節配列として含まれる。
【００９８】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、細胞中にヌクレオチド配列を移入するのに有用なベクターまたはコンストラクトであり得る。好適なベクター／コンストラクトの例は、プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルスまたは線状ＤＮＡ（例えば、線状ＰＣＲ産物）から選択することができる。いくつかの態様におけるポリヌクレオチド配列は、細胞内に一過的（すなわちゲノムに組み込まれていない）または安定に（すなわちゲノムに組み込まれている）存在することができる。いくつかの態様におけるポリヌクレオチド配列は、１つ以上の好適なマーカー配列（例えば、選択または表現型マーカ―）を含み得、またはそれらを欠き得る。
【００９９】
所定の実施形態におけるポリヌクレオチド配列は、非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含み得る。例えば、非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター配列（例えば、異種プロモーター）と作動可能な連結状態であり得る。プロモーター配列は、例えば、細胞中（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌細胞；真菌、酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞などの真核細胞）またはインビトロタンパク質発現系での発現に好適であり得る。他の好適な調節配列の例を本明細書に開示する（例えば、転写ターミネーター配列）。
【０１００】
本明細書のいくつかの態様は、本明細書に開示されるようなポリヌクレオチド配列を含む細胞に関し、このような細胞は、本明細書に開示される任意の型であり得る（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌細胞；真菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞）。細胞は、任意選択的に、そのポリヌクレオチド配列によりコードされる非天然グルコシルトランスフェラーゼを発現し得る。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、細胞内に一過的（すなわちゲノムに組み込まれていない）または安定に（すなわちゲノムに組み込まれている）存在する。
【０１０１】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、水、スクロースおよび１種以上の本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼ）を含む反応組成物に関する。このような反応組成物は、少なくとも、開示されるように１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを生成する。
【０１０２】
本明細書の反応組成物の温度は、必要に応じて制御される場合があり、例えば約５〜５０℃、２０〜４０℃、２０〜３０℃、２０〜２５℃であり得る。
【０１０３】
本明細書の反応組成物中のスクロースの初期濃度は、例えば、約２０〜４００ｇ／Ｌ、７５〜１７５ｇ／Ｌまたは５０〜１５０ｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様では、スクロースの初期濃度は、少なくとも約５０、７５、１００、１５０もしくは２００ｇ／Ｌであるか、または約５０〜６００ｇ／Ｌ、１００〜５００ｇ／Ｌ、５０〜１００ｇ／Ｌ、１００〜２００ｇ／Ｌ、１５０〜４５０ｇ／Ｌ、２００〜４５０ｇ／Ｌもしくは２５０〜６００ｇ／Ｌである。「スクロースの初期濃度」は、全ての反応成分（例えば、少なくとも水、スクロース、非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素）が加えられた／合わせられた直後の反応組成物におけるスクロース濃度を指す。
【０１０４】
所定の実施形態における反応組成物のｐＨは、約４．０〜８．０、５．０〜８．０、５．５〜７．５または５．５〜６．５であり得る。いくつかの態様では、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５または８．０であり得る。ｐＨは、好適な緩衝液、例えば、限定はされないが、リン酸塩、トリス、クエン酸塩またはそれらの組み合わせを添加または混入することによって調節または制御できる。本明細書の反応組成物における緩衝液濃度は、例えば、約０．１〜３００ｍＭ、０．１〜１００ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭまたは５０ｍＭであり得る。
【０１０５】
反応組成物は、本明細書に開示される反応条件の１つ以上を適用するために好適な任意の容器（例えば、不活性容器／コンテナ）内に含有することができる。いくつかの態様における不活性容器は、ステンレス鋼、プラスチックまたはガラス（またはこれらの成分の２つ以上を含む）であり得、かつ特定の反応を含有するのに好適な寸法であり得る。不活性容器は、任意選択的に撹拌装置を備えることができる。
【０１０６】
本明細書の反応組成物は、１種、２種またはそれを超えるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を、例えば、まさにその酵素の少なくとも１つが本明細書に開示される非天然グルコシルトランスフェラーゼである限り、含有することができる。いくつかの実施形態では、１種または２種のグルコシルトランスフェラーゼ酵素のみが反応組成物に含まれる。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応は、無細胞（例えば、細胞全体が存在しない）であり得、通常、無細胞（例えば、細胞全体が存在しない）である。
【０１０７】
反応組成物に関して本明細書に開示される（例えば、前述および以下の実施例において）特徴のいずれも、本明細書のグルカン生成方法の適切な態様を特徴付けることができ、その逆も同様である。
【０１０８】
本開示は、α−グルカンを生成するための方法であって、（ａ）少なくとも水、スクロースおよびα−グルカンを生成する本明細書に開示される少なくとも１種の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、それにより、α−グルカンは、生成される、工程と；ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたα−グルカンを単離する工程とを含む方法にも関する。任意選択的に、グルカン合成法として特徴付けることができるこのような方法の実施は、典型的には、本明細書の反応組成物を実施する際にも実行される。
【０１０９】
本明細書に開示されるようなグルカン合成法は、少なくとも水、スクロースおよびα−グルカンを生成する本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼを接触させる工程を含む。これらおよび任意選択的に他の試薬を一緒に添加し得、または下記で考察するような任意の順序で添加し得る。この工程は、水、スクロースおよびα−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応組成物を提供する工程として任意選択的に特徴付けることができる。本明細書の接触させる工程は、多くの方法において実施できる。例えば、所望の量のスクロースを最初に水に溶解させ（任意選択的に、他の成分、例えば緩衝液成分もこの調製段階で添加され得る）、その後、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を添加することができる。溶液は、静止させたままであり得、または例えば撹拌もしくはオービタルシェイカーによる振盪によってかき混ぜられ得る。グルカン合成法は、バッチ、フェドバッチ、継続的な方法またはこれらの方法のいずれかの変形形態によって実施され得る。
【０１１０】
所定の実施形態における反応の完了は、視覚的に（例えば、所定の実施形態では不溶性グルカンのさらなる蓄積がない）、かつ／または溶液中に残されたスクロース（残留スクロース）の量を測定することによって決定できるが、このとき、少なくとも約９０％、９５％または９９％のスクロース消費率が反応完了を示し得る。開示されたプロセスの反応は、例えば、約１時間〜約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４または１６８時間にわたって行われ得る。
【０１１１】
本明細書のグルカン合成法のいくつかの態様において生成されるα−グルカンの収率は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％であり得る。いくつかの態様におけるこの収率は、反応のグルコシル成分を基準にして評価され得る。追加のまたは代替的ないくつかの実施形態では、ロイクロースの収率は、約１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満であり得る。いくつかの態様におけるα−グルカンおよび／またはロイクロースのそのような収率は、約１６〜２４時間（例えば、約２０時間）にわたって行われる反応において達成され、かつ／またはＨＰＬＣもしくはＮＩＲ分光法を用いて測定されるものである。
【０１１２】
本明細書のグルカン合成法において生成されるα−グルカンは、任意選択的に単離され得る。所定の実施形態では、α−グルカン生成物を単離する工程は、遠心分離、濾過、分画、クロマトグラフィーによる分離、透析、蒸発または希釈の工程を少なくとも行うことを含む。簡単な例として、不溶性α−グルカンは、遠心分離または濾過によって分離され得る一方、可溶性α−グルカンは、クロマトグラフィーによる分離または透析によって分離され得る。単離は、任意選択的に、α−グルカン生成物を水または他の水性液体で１回、２回もしくはそれを超えて洗浄する工程および／またはα−グルカン生成物を乾燥させる工程をさらに含み得る。
【０１１３】
前述または下記実施例において記載されるものなど、α−グルカンを合成するための開示された条件のいずれかを、本明細書に開示される反応組成物の実施に適用することができ（逆も同様である）、かつ／または非天然グルコシルトランスフェラーゼの特徴／活性を特徴付けるために適宜使用することができる。
【０１１４】
本開示は、非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法にも関する。本方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号４または配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約３０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、（それによりコードされる親グルコシルトランスフェラーゼにおいて）配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、
（ｉ）親グルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程と
を含む。このような方法は、任意選択的に、そのポリヌクレオチドによってコードされる非天然グルコシルトランスフェラーゼを発現する方法において、このようにして作製されるポリヌクレオチドを使用する工程をさらに含み得る。このような発現方法は、例えば、当該技術分野で知られる任意の異種タンパク質発現法に従い得る。ポリヌクレオチドを作製する本方法は、任意選択的に、グルコシルトランスフェラーゼの生成物収率を増加させる方法として代替的に特徴付けることができる。
【０１１５】
本明細書の同定工程（ａ）は、ある例において、親グルコシルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を同定する工程を含み得る。ポリヌクレオチド配列は、親グルコシルトランスフェラーゼが同定された種において使用される遺伝暗号などの遺伝暗号（コドン）に従うこのアミノ酸配列から決定することができた。
【０１１６】
本明細書の親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを同定する工程は、例えば、（ａ）インシリコで、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、（ｃ）タンパク質シーケンシング工程を含む方法を用いて、および／または（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施することができる。
【０１１７】
インシリコ検出に関して、例えば、コンピューターまたはデータベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、ＲＥＦＳＥＱ、ＧＥＮＥＰＥＰＴ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＰＤＢなどの公開データベース）に保存された候補となる親グルコシルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列（および／またはそのようなグルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列）をインシリコで精査して、配列番号４（任意選択的にその開始メチオニンを有しない）または配列番号４の５５〜９６０位（およその触媒ドメイン）と少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定することができる。そのような精査は、例えば、上述したようなアラインメントアルゴリズムまたはソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶ、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ、ＥＭＢＯＳＳ）の使用を介する、当該技術分野において知られる任意の手段の使用を含み得る。単に参照を目的として、開始メチオニンを有しない配列番号４が配列番号６２の部分配列であることに留意されたい。
【０１１８】
上に開示されるような親グルコシルトランスフェラーゼを同定する工程は、任意選択的に、核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を介して実施することができる。そのような方法は、例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロット、ドットブロット）、ＲＮＡハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット）または核酸ハイブリダイゼーション工程（例えば、全てがオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含み得るＤＮＡシーケンシング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）を有する任意の他の方法の使用を含むことができる。配列番号４またはその部分配列（例えば、配列番号４の５５〜９６０の部分配列）をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、そのようなハイブリダイゼーションにおいてプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーション法を実施するための条件およびパラメーターは、一般によく知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦおよびＭａｎｉａｔｉｓ  ＴのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｓｉｌｈａｖｙ  ＴＪ，Ｂｅｎｎａｎ  ＭＬおよびＥｎｑｕｉｓｔ  ＬＷのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版されたＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）；ならびにＩｎｎｉｓ  ＭＡ、Ｇｅｌｆａｎｄ  ＤＨ、Ｓｎｉｎｓｋｙ  ＪＪおよびＷｈｉｔｅ  ＴＪ（Ｅｄｉｔｏｒｓ）のＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）において開示される。
【０１１９】
上に開示されるような親グルコシルトランスフェラーゼを同定する工程は、任意選択的に、タンパク質シーケンシング工程を含む方法を介して実施することができる。そのようなタンパク質シーケンシング工程は、例えば、Ｎ末端アミノ酸分析、Ｃ末端アミノ酸分析、エドマン分解法または質量分析法などの１つ以上の手法を含むことができる。
【０１２０】
上に開示されるような親グルコシルトランスフェラーゼを同定する工程は、任意選択的に、タンパク質結合工程を含む方法を介して実施することができる。そのようなタンパク質結合工程は、例えば、配列番号４内（例えば、配列番号４の５５〜９６０位内）のモチーフまたはエピトープに結合する抗体を用いて実施することができる。
【０１２１】
工程（ａ）（すなわち工程［ｂ］における改変前）で同定されたポリヌクレオチドは、いくつかの態様において、表１に開示される任意のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と同一であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼをコードすることができる。そのようなグルコシルトランスフェラーゼによって生成されるα−グルカンは、例えば、本明細書に開示されるものであり得る。
【０１２２】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法は、工程（ａ）で同定された（親グルコシルトランスフェラーゼをコードする）ポリヌクレオチド配列を改変する工程（ｂ）を含む。そのような改変により、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸が置換される。そのような１つ以上の置換から生じる（改変ポリヌクレオチド配列によってコードされる）非天然グルコシルトランスフェラーゼは、任意選択的に、本明細書において「子グルコシルトランスフェラーゼ」として特徴付けることができる。
【０１２３】
工程（ｂ）におけるポリヌクレオチドの好適な改変は、当該技術分野で知られる任意のＤＮＡ操作技術に従って行うことができる。改変する工程（ｂ）は、任意選択的に、インシリコで実施することができ、その後、非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の合成が行われる。例えば、工程（ａ）で同定されたポリヌクレオチド配列は、好適な配列操作プログラム／ソフトウェア（例えば、ＶＥＣＴＯＲ  ＮＴＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；ＤＮＡＳｔｒｉｄｅｒ；ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてインシリコで操作され得る。そのような仮想的な操作後、改変ポリヌクレオチド配列を、任意の好適な技術（例えば、オリゴヌクレオチドのアニーリングに基づく連結またはＨｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４９８：２７７−３０９（この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）において開示される任意の技術）によって人工的に合成することができる。前述の方法論が（親グルコシルトランスフェラーゼをコードする）既存のポリヌクレオチドを有していることに必ず依存するとは考えられないことが理解されるはずである。
【０１２４】
改変する工程（ｂ）は、任意選択的に、工程（ａ）で同定された親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを用いて実施することができる。例として、そのようなポリヌクレオチドは、増幅された産物が本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするような方法で設計されたプライマーを用いる、増幅のための鋳型として役立ち得る（例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．を参照されたい）。
【０１２５】
本方法におけるアミノ酸置換は、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置での本明細書に開示されるようなそれらの置換のいずれかであり得る。本明細書に開示されるような２つ以上のアミノ酸置換は、いくつかの態様において適用され得る。基本的には、本明細書で開示されるような任意の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、本方法によって作製されるようなポリヌクレオチドによってコードされ得、例えば、結果として、本明細書に開示されるより高いα−グルカン収率および／またはより低いロイクロース収率プロファイルを有し得る。
【０１２６】
本明細書に開示される組成物および方法の非限定的例としては、以下が挙げられる：
１．配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｖａｌ−５５２、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成し、（ｉ）その置換位置でのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または（ｉｉ）第２のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２７】
２．（ｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＰｈｅもしくはＬｅｕ残基によるものであるか；（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−４２８に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｖａｌ残基によるものであるか；（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｌａ−４７２に対応する位置でのアミノ酸置換は、ＳｅｒもしくはＣｙｓ残基によるものであるか；（ｉｖ）アミノ酸残基Ａｌａ−５１０に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌもしくはＡｓｐ残基によるものであるか；（ｖ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｙｒ、ＰｈｅもしくはＴｒｐ残基によるものであるか；（ｖｉ）アミノ酸残基Ｍｅｔ−５２９に対応する位置でのアミノ酸置換は、ＬｅｕもしくはＡｓｎ残基によるものであるか；アミノ酸残基Ｖａｌ−５５２に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｙ残基によるものであるか；（ｖｉｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−６０７に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＡｓｎ残基によるものであるか；（ｖｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−６１３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＭｅｔもしくはＬｅｕ残基によるものであるか；（ｉｘ）アミノ酸残基Ｇｌｎ−６１６に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｕ残基によるものであるか；（ｘ）アミノ酸残基Ｓｅｒ−６３１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕもしくはＡｒｇ残基によるものであるか；（ｘｉ）アミノ酸残基Ｇｌｙ−６３３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ残基によるものであるか；（ｘｉｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−６３４に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ残基によるものであるか；（ｘｉｉｉ）アミノ酸残基Ｔｈｒ−６３５に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＨｉｓもしくはＴｙｒ残基によるものであるか；または（ｘｉｖ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−９５１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｙｒ残基によるものである、実施形態１の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２８】
３．２つ以上のアミノ酸置換を含み、置換の少なくとも１つは、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置におけるものである、実施形態１または２の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２９】
４．配列番号６２のアミノ酸残基Ａｌａ−５１０またはＰｈｅ−６０７に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、実施形態３の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３０】
５．配列番号６２のアミノ酸残基Ａｌａ−５１０およびＰｈｅ−６０７に対応する位置でアミノ酸置換を含む、実施形態４の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３１】
６．α−グルカンは、不溶性であり、かつ少なくとも約５０％のα−１，３結合を含み、任意選択的に、α−グルカンは、少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、実施形態１、２、３、４または５の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３２】
７．配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％同一である触媒ドメインを含む、実施形態６の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３３】
８．配列番号４、配列番号６５、配列番号３０、配列番号２８または配列番号２０と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態７の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３４】
９．非天然グルコシルトランスフェラーゼは、少なくとも約９０％（または少なくとも９５％）のα−１，３−結合を有する不溶性α−１，３−グルカンを合成する、実施形態７または８の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３５】
１０．α−グルカンは、不溶性であり、かつ少なくとも約７５％のα−１，６−結合を含む、実施形態１、２、３、４または５の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３６】
１１．配列番号６８、配列番号６８の３７〜１３３８位、配列番号６９、配列番号６９の３７〜１５５４位または配列番号６９の１７０〜１５５４位と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１０の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３７】
１２．α−グルカン収率は、第２のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも少なくとも約１０％高い、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３８】
１３．任意選択的に、１つ以上の調節配列は、ヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好ましくは、１つ以上の調節配列は、プロモーター配列を含む、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【０１３９】
１４．水、スクロースおよび実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
【０１４０】
１５．α−グルカンを生成する方法であって、（ａ）少なくとも水、スクロースおよび実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、それにより、α−グルカンは、生成される、工程と；（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたα−グルカンを単離する工程とを含む方法。
【０１４１】
１６．非天然グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、実施形態１〜１２のいずれか１つの）をコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号４または配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約３０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定する工程と；（ｂ）工程（ａ）で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｖａｌ−５５２、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、（ｉ）親グルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または（ｉｉ）親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程とを含む方法。
【０１４２】
１７．（ｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＰｈｅもしくはＬｅｕ残基によるものであるか；（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−４２８に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｖａｌ残基によるものであるか；（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｌａ−４７２に対応する位置でのアミノ酸置換は、ＳｅｒもしくはＣｙｓ残基によるものであるか；（ｉｖ）アミノ酸残基Ａｌａ−５１０に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌもしくはＡｓｐ残基によるものであるか；（ｖ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｙｒ、ＰｈｅもしくはＴｒｐ残基によるものであるか；（ｖｉ）アミノ酸残基Ｍｅｔ−５２９に対応する位置でのアミノ酸置換は、ＬｅｕもしくはＡｓｎ残基によるものであるか；アミノ酸残基Ｖａｌ−５５２に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｙ残基によるものであるか；（ｖｉｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−６０７に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＡｓｎ残基によるものであるか；（ｖｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−６１３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＭｅｔもしくはＬｅｕ残基によるものであるか；（ｉｘ）アミノ酸残基Ｇｌｎ−６１６に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｕ残基によるものであるか；（ｘ）アミノ酸残基Ｓｅｒ−６３１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕもしくはＡｒｇ残基によるものであるか；（ｘｉ）アミノ酸残基Ｇｌｙ−６３３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ残基によるものであるか；（ｘｉｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−６３４に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ残基によるものであるか；（ｘｉｉｉ）アミノ酸残基Ｔｈｒ−６３５に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＨｉｓもしくはＴｙｒ残基によるものであるか；または（ｘｉｖ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−９５１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔｙｒ残基によるものである、実施形態１６の方法。
【０１４３】
１８．同定する工程は、（ａ）インシリコで、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、（ｃ）タンパク質シーケンシング工程を含む方法を用いて、および／もしくは（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施され；かつ／または改変する工程は、（ｅ）インシリコで実施され、その後、非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列の合成が行われるか、または（ｆ）親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを使用して実施される、実施形態１６または１７の方法。
【実施例】
【０１４４】
本開示を以下の実施例において詳細に説明する。これらの実施例は、本明細書の所定の好ましい態様を示しているが、単に説明の目的でのみ記されていることを理解されたい。上述の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本明細書に開示した実施形態の本質的な特徴を確認することができ、本発明の趣旨および範囲を逸脱しない範囲で、本明細書に開示した実施形態を様々な使用および条件に適合させるために様々な変更形態および修飾形態をなし得る。
【０１４５】
実施例１
α−グルカン合成に対するグルコシルトランスフェラーゼの選択性に影響を及ぼすアミノ酸部位の分析
本実施例は、スクロースからのα−グルカンの合成に対して向上した選択性を有するグルコシルトランスフェラーゼバリアントに関するスクリーニングについて記載する。このスクリーニングの別の目的は、ロイクロースおよびグルコ−オリゴ糖などの副生成物の合成の減少を示すグルコシルトランスフェラーゼバリアントを同定することであった。これらの収率特性のいずれかまたは両方を有するバリアントを同定した。
【０１４６】
本実施例におけるアミノ酸置換を作製するために使用されるグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号４（ＧＴＦ６８５５）であり、これは、本質的にはストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＳＫ１２６（表１を参照されたい）由来の全長野生型グルコシルトランスフェラーゼ（配列番号６２によって表される）のＮ末端がトランケートされた（シグナルペプチドおよび可変領域が除去された）バージョンである。配列番号４においてなされる置換は、配列番号４の各アミノ酸残基／位置（配列番号４のＭｅｔ−１残基を除く）が配列番号６２内のアミノ酸残基／位置と適宜に対応するため、天然のアミノ酸残基に対する置換として特徴付けられ得る。少なくともスクロースおよび水を含む反応において、配列番号４のグルコシルトランスフェラーゼは、通常、約１００％のα−１，３結合および４００以上のＤＰｗを有するα−グルカンを生成する（例えば、米国特許第８８７１４７４号明細書および同第９１６９５０６号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１７／０００２３３６号明細書（これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。不溶性であるこのα−グルカン生成物は、例えば、濾過を介して酵素的合成後に単離することができる。
【０１４７】
本実施例を要約すると、部位評価ライブラリー（ＳＥＬ）由来のＧＴＦ６８５５バリアント（各々が単一のアミノ酸置換を有する）は、それぞれ細菌に発現され、精製され、かつ１００ｐｐｍの濃度に標準化された。次に、α−１，３グルカン合成反応における基質としてスクロースを用いて各酵素調製物を（三重に）選別した。各反応において生成されるα−１，３グルカンポリマーの量を決定することに加えて、可溶性糖生成物（フルクトース、グルコース、ロイクロース、グルコ−オリゴ糖）および各反応の残留スクロースをおよそ２０時間のインキュベーション後にＨＰＬＣによって分析した。
【０１４８】
バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主においてＧＴＦ６８５５（配列番号４）の種々の単一アミノ酸置換バリアントを個別に発現するためのプラスミドを作製した。このようなプラスミドを次のとおり作製した。（５’から３’方向に作動可能に連結された）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター、配列番号４（ＧＴＦ６８５５）をコードするコドン最適化配列およびＢＰＮ’ターミネーターを有するＤＮＡ発現カセットを合成した。この発現カセットを（ｐＨＹＴ−ＧＴＦ６８５５を形成する）ｐＨＹＴ複製型シャトルベクターにクローン化し、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＢＳ１２−１に形質転換した。ｐＨＹＴベクターは、ＢｓｔＥＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を使用してテトラサイクリン耐性遺伝子の後ろにターミネーター配列（配列番号６７）を加えることによりｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）から誘導された。ｐＨＹ３００ＰＬＫにおけるＨｉｎｄＩＩＩ部位は、リンカー配列（示さず）をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化することにより除去された。ｐＨＹＴ−ＧＴＦ６８５５プラスミドを増幅し、ＳＥＬを生成するために使用した。結果として得られる単一アミノ酸置換ＧＴＦをコードするプラスミドは、各置換を検証するために配列決定された。
【０１４９】
ＧＴＦ６８５５（配列番号４）およびその単一アミノ酸置換バリアントを生成するために、ｐＨＹＴ−ＧＴＦ６８５５またはその変異したバージョンで個別に形質転換されたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をトリプトンソーヤブロス（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）およびＧｒａｎｔ’ｓ  ＩＩ培地で培養した。ハートインフュージョン寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＩ）を使用して、形質転換体を選択した。プラスミドの完全性は、２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンの添加によって維持した。３７℃での約６時間のインキュベーション後、発現の対象となった各ＧＴＦを増殖培地において検出した。遠心分離および濾過後、発現したＧＴＦを有する培養上清を得た。上清中に存在するＧＴＦ酵素は、洗浄された（２×ＭＩＬＬＩＱ  １×２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．７、中間の遠心分離工程１００×ｇを伴う）ＳＵＰＥＲＤＥＸ  ２００レジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる親和性クロマトグラフィーにより、明らかに一様になるまで精製された。各ＧＴＦを、２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．７中のデキストラン  Ｔ１（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）の１５％溶液を用いて１００×ｇの遠心分離によって溶出した。精製された各ＧＴＦを、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓの９６ウェルＤＩＳＰＯＤＩＡＬＹＺＥＲ（１００００ダルトン  ＭＷＣＯ）を用いて、２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．７緩衝液（少なくとも１００×）に対して透析した。
【０１５０】
透析後、精製されたＧＴＦ６８５５を標準として用いて、ＯＤ２８０によりＧＴＦ酵素濃度を決定した。精製された各ＧＴＦの１００ｐｐｍへの標準化は、２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．７により適切に希釈することによって達成された。各サンプルのタンパク質濃度は、ＡＧＩＬＥＮＴ  ＢＩＯ  ＳＥＣ３ガードカラムカラム（３μｍ  １００Å（４．６×５０ｍｍ）を装着したＡＧＩＬＥＮＴ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣを用いて確認された。５μＬのサンプルを測定毎にカラムに注入した。均一濃度流の２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ６．８＋０．１Ｍ  ＮａＣｌにより流速０．５ｍＬ／分で１．３分間化合物を溶出した。
【０１５１】
各ＧＴＦ（ＧＴＦ６８５５およびその各バリアント）をスクロースとともに反応に投入して、収率および選択性を決定した。各反応を次のとおり実施した：３７．５μＬの１００ｐｐｍ酵素サンプル（ＢＳＡ検量線に基づくｐｐｍ）を２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．７中の２６２．５μＬの８６ｇ／Ｌスクロース（７５ｇ／Ｌ終濃度）に添加し、３０℃で一晩（約２０時間）インキュベートした。このインキュベーション後、各反応を８０℃で１時間のインキュベーションによりクエンチした。クエンチされた各反応の一定分量２００μＬを、０．４５μｍフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０．４５μｍ  親水性）を介して真空濾過し、各濾液をＨＰＬＣ糖分析のための調製物中において５倍希釈した（１０μＬのサンプル＋４０μＬの２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）。
【０１５２】
希釈された各濾液中のスクロース濃度、グルコース濃度、フルクトース濃度、ロイクロース濃度および相対的なオリゴ糖濃度を、１５０×７．８０ｍｍ  ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ  ＲＥＺＥＸ  ＲＮＭ炭水化物Ｎａ＋８％カラムＰＨＥＮＯＭＥＮＸ  ＫＲＵＤＫＡＴＣＨＥＲ０．５μｍガードカラムを装着したＡＧＩＬＥＮＴ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣを用いて決定した。カラムは、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ６．７を用いて流速０．９ｍＬ／分の均一濃度により８０℃で操作された（１サンプル当たり５分）。５μＬの希釈サンプルを注入した。適切なスクロース、グルコース、フルクトースおよびロイクロースの検量線を使用して糖濃度を決定した。精製されたグルコ−オリゴ糖の混合物を使用してオリゴマー濃度を決定した。
【０１５３】
上記方法論により測定されるような反応（約２０時間）のプロファイルが表３において提供される。
【０１５４】
【表７】
2019530474.tif 000008
【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
【表９】
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【０１５７】
【表１０】
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【０１５８】
表３のデータに基づくと、ＧＴＦ６８５５（配列番号４）における所定の単一アミノ酸置換により、例えばグルカン合成反応において、この酵素のα−１，３−グルカン収率を増加させることができ、かつ／またはそのロイクロース収率を減少させることができることは明白である。
【０１５９】
実施例２
他のグルコシルトランスフェラーゼにおける単一アミノ酸置換の効果の分析
本実施例は、ＧＴＦ６８５５（配列番号４）以外のグルコシルトランスフェラーゼの活性における所定の単一アミノ酸置換の効果について記載する。概して、α−グルカン収率および／またはロイクロース収率に著しい効果を有する実施例１において観察される置換に対応する（または類似する）置換は、異なるグルコシルトランスフェラーゼに対して類似の効果を与えるのに有用であり得ると思われる。
【０１６０】
Ｐｈｅ−６０７−Ｔｙｒ
実施例１は、例えば、配列番号６２の６０７位に対応する位置でのＧＴＦ６８５５（配列番号４）における置換が酵素活性に影響を及ぼしたことを実証した（表３）。具体的には、ＡｓｎまたはＴｒｐ残基によるＰｈｅ残基の置換の両方は、非置換酵素のそれぞれの収率と比較して、α−１，３グルカン収率（増加）およびロイクロース収率（減少）に対して著しい効果を有した。
【０１６１】
異なるＧＴＦにおいて類似の置換が収率に同様に影響を及ぼすことができたかを試験するために、配列番号６２の６０７位に対応するＧＴＦ７５２７（ＧＴＦＪ、配列番号６５）の位置で置換を行い、ＰｈｅをＴｙｒ残基に交換した。ＧＴＦ７５２７（配列番号６５）は、本質的にはストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（表１を参照されたい）由来の全長野生型グルコシルトランスフェラーゼ（配列番号６０によって表される）のＮ末端がトランケートされた（シグナルペプチドおよび可変領域が除去された）バージョンである。配列番号６５においてなされる置換は、配列番号６５の各アミノ酸残基／位置（配列番号６５のＭｅｔ−１残基を除く）が配列番号６０内のアミノ酸残基／位置と適宜に対応するため、天然のアミノ酸残基に対する置換として特徴付けられ得る。少なくともスクロースおよび水を含む反応において、配列番号６５のグルコシルトランスフェラーゼは、通常、約１００％のα−１，３結合および４００以上のＤＰｎを有するα−グルカンを生成する（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０００２３３５号明細書［出願番号第１５／１８２，７４７号］（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。グルカン合成反応は、配列番号６２の６０７位に対応する位置でのＰｈｅからＴｙｒへの置換を含むＧＴＦ７５２７（配列番号６５）またはそのバージョンを用いて、以下のとおり準備される：容器、１００ｒｐｍで撹拌される２５０ｍＬのくぼみ付き振盪フラスコ；初期ｐＨ、５．５；反応容量、５０ｍＬ；スクロース、１００．１ｇ／Ｌ；ＧＴＦ、１００Ｕ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ；温度、２５℃；時間、２０時間。二重に実行された各反応のプロファイル（実施例１において開示されるものと類似の方法論により測定される）が表４において提供される。
【０１６２】
【表１１】
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【０１６３】
表４のデータに基づくと、ＧＴＦ７５２７（配列番号６５）におけるＦ６０７Ｙ置換により、例えばグルカン合成反応において、この酵素のα−１，３−グルカン収率を増加させることができ、かつ／またはそのロイクロース収率を減少させることができることは明白である。
【０１６４】
Ａｌａ−５１０−Ｇｌｕ、Ａｌａ−５１０−ＶａｌまたはＡｌａ−５１０−Ｃｙｓ
実施例１は、例えば、配列番号６２の５１０位に対応する位置でのＧＴＦ６８５５（配列番号４）における置換が酵素活性に影響を及ぼしたことを実証した（表３）。具体的には、Ｇｌｕ、ＩｌｅまたはＶａｌ残基によるＡｌａ残基の置換の全ては、非置換酵素のそれぞれの収率と比較して、α−１，３グルカン収率（増加）およびロイクロース収率（減少）に対して著しい効果を有した。
【０１６５】
異なるＧＴＦにおいてこれらまたは類似の置換が収率に同様に影響を及ぼすことができたかを試験するために、配列番号６２の５１０位に対応するＧＴＦ２９１９（配列番号２８）、０４２７（配列番号２６）、５９２６（配列番号１４）、０８４７（配列番号２）、０５４４（配列番号１２）、２３７９（配列番号６）、５６１８（配列番号１８）、４２９７（配列番号１６）、１３６６（配列番号２４）および６９０７（配列番号３６）の位置で置換を行い、ＡｌａをＧｌｕ、ＶａｌまたはＣｙｓ残基に交換した。これらのＧＴＦの各々は、本質的には全長野生型グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、表１に列記されるものなど、それぞれのＧＥＮＢＡＮＫの注釈情報を参照されたい）のＮ末端がトランケートされた（シグナルペプチドおよび可変領域が除去された）バージョンである。配列番号２８、２６、１４、２、１２、６、１８、１６、２４および３６の各々においてなされる置換は、これらの配列（各々のＭｅｔ−１残基を除く）の各アミノ酸残基／位置が各々の対応する全長野生型グルコシルトランスフェラーゼ対応物内のアミノ酸残基／位置と適宜に対応するため、天然のアミノ酸残基に対する置換として特徴付けられ得る。表２は、少なくともスクロースおよび水を含む反応において配列番号２８、２６、１４、２、１２、６、１８、１６、２４および３６の各々によって通常生成されるα−グルカンを列記する。
【０１６６】
ＧＴＦ２９１９（配列番号２８）、０４２７（配列番号２６）、５９２６（配列番号１４）、０８４７（配列番号２）、０５４４（配列番号１２）、２３７９（配列番号６）、５６１８（配列番号１８）、４２９７（配列番号１６）、１３６６（配列番号２４）もしくは６９０７（配列番号３６）または配列番号６２の５１０位に対応する位置で置換を含むそのバージョンの作製は、以下のとおり実施された。これらのＧＴＦの各々をコードするコドン最適化（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用）配列を細菌発現のための好適なプラスミドに個別にクローン化した。次に、各コンストラクトを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に形質転換した。形質転換株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する１０ｍＬの自動誘導培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．７５％グリセロール、０．０７５％グルコース、０．０５％アラビノース）中において３７℃で２０時間、２００ｒｐｍの撹拌下で増殖させた。細胞を４℃における８０００ｒｐｍでの遠心分離により回収し、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ）を伴う１ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０中で製造業者の指示書に従って再懸濁した。加えて、再懸濁した細胞を１回以上の凍結融解サイクルに付して、細胞溶解を確実にした。溶解された細胞を、室温において１０分間１２，０００ｇで遠心分離した。結果として生じた各上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、発現されている特定のＧＴＦ酵素の発現を確認した。各上清を、酵素活性が決定され得るまで４℃において氷上に保持し（１時間以内）、かつ／または−２０℃で保存した。
【０１６７】
グルカン合成反応を準備し、その生成物を米国特許出願公開第２０１４／００８７４３１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）の開示におおむね従って分析した。各反応を２４〜３０時間実行した。各反応のプロファイルが表５において提供される。
【０１６８】
【表１２】
2019530474.tif 000013
【０１６９】
【表１３】
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【０１７０】
表５のデータに基づくと、配列番号６２の５１０位に対応する位置での種々のＧＴＦにおけるいくつかの置換により、例えばグルカン合成反応において、ＧＴＦのα−グルカン収率を増加させることができ、かつ／またはそのロイクロース収率を減少させることができることは明白である。
【０１７１】
Ｐｈｅ−９５１−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−３７３−ＰｈｅまたはＬｅｕ−３７３−Ｍｅｔ
ＧＴＦ６８５５（配列番号４）における置換が酵素活性に影響を及ぼしたことを実証した（表３）。具体的には、Ｔｙｒ残基によるＰｈｅ−９５１残基の置換は、非置換酵素のそれぞれの収率と比較して、ロイクロース収率（減少）に対して著しい効果を有した。Ａｌａ、ＧｌｎまたはＶａｌ残基によるＬｅｕ−３７３残基の置換は、ロイクロース収率に対して著しい低下効果も有した。
【０１７２】
類似の置換が異なるＧＴＦにおいて収率に影響を及ぼすことができたかを試験するために、ＧＴＦ５６０４（配列番号６８）の８３９位（ＰｈｅをＴｙｒに交換する）およびＧＴＦ８８４５（配列番号６９、下記の代用となるＧＴＦを参照されたい）の８８６位（ＰｈｅをＴｙｒに交換する）で置換を行い、これらの各々の位置は、配列番号６２の９５１位に対応する。他の分析では、ＧＴＦ５６０４（配列番号６８）の３１６位（ＬｅｕをＰｈｅまたはＭｅｔに交換する）およびＧＴＦ８８４５（配列番号６９、下記の代用のＧＴＦを参照されたい）の３６３位（ＬｅｕをＰｈｅまたはＭｅｔに交換する）で置換を行い、これら各々の位置は、配列番号６２の３７３位に対応する。
【０１７３】
ＧＴＦ５６０４（配列番号６８）は、ストレプトコッカス・クリセティ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）（表１を参照されたい）由来の全長野生型グルコシルトランスフェラーゼ（残基１〜３６のシグナルペプチドを含む）であり、そのため、発現された成熟形態の酵素は、配列番号６８の残基３７〜１３３８を有すると予想された。ＧＴＦ８８４５（配列番号６９）は、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）（表１を参照されたい）由来の全長野生型グルコシルトランスフェラーゼ（残基１〜３６のシグナルペプチドを含む）である。ＧＴＦ８８４５の代用物は、本明細書において配列番号７０の形態で発現され、これは、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＡｐｒＥシグナルペプチドと融合した全長野生型グルコシルトランスフェラーゼのＮ末端がトランケートされたバージョンに対応する（ＧＴＦ８８４５について列記される上記置換は、実際に代用のＧＴＦに関して試験された）。具体的には、配列番号７０の残基３０〜１４１４は、ＧＴＦ８８４５（配列番号６９）の残基１７０〜１５５４に対応する一方、配列番号７０の残基１〜２９は、シグナルペプチドを含む異種アミノ酸に対応する。したがって、発現された成熟形態の代用のＧＴＦは、ＧＴＦ８８４５（配列番号６９）の残基１７０〜１５５４を有すると予想された。少なくともスクロースおよび水を含む反応において、成熟形態のＧＴＦ５６０４（配列番号６８）は、約１００％のα−１，６結合を有するＤＰ８および上記（すなわちＤＰ８＋）（例えば、ＤＰ１８または１９）のオリゴ糖を生成すると考えられる（国際公開第２０１５／１８３７１４号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１７／０２１８０９３号明細書（これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる）の表４［サンプルＳＧ１０１８］を参照されたい）。少なくともスクロースおよび水を含む反応において、ＧＴＦ８８４５（配列番号６９）の残基１７０〜１５５４を有する成熟ＧＴＦは、約８０％のα−１，６結合、３％のα−１，３結合および１７％のα−１，３，６結合を有するＤＰ８＋のオリゴ糖（例えば、ＤＰ１１６または１１７）を生成すると考えられる（国際公開第２０１５／１８３７１４号パンフレットの表４［サンプルＳＧ１０５１］を参照されたい）。
【０１７４】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（タンパク質分泌）において前述のＧＴＦおよびその単一アミノ酸置換バリアントを発現するためのプラスミドを適宜作製した。次に、これらのプラスミドを個別にバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＢＧ６００６に形質転換し、形質転換クローンをテトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍＬ）プレートで選択した。ＢＧ６００６は、よく知られたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）基準株１６８に由来する９つのプロテアーゼの欠損株であり、遺伝子型：ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ＤｓｐｏＩＩＥ３５０１、ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、Δｅｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ、Δｖｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ−ｙｂｆＪ、ΔｎｐｒＢを有する。各形質転換株を、最初に１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地において増殖させ、次に１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＧｒａｎｔｓ  ＩＩ培地に継代し、３７℃で２日間増殖させた。培養物を４℃、１５，０００ｇで３０分間旋回させ、上清を０．２２μｍフィルターで濾過した。各培養物から濾過された上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ＧＴＦの発現を確認した。ＧＴＦバリアントとそれらの対応する非バリアントの親との間で発現レベルの明らかな相違は観察されなかった。
【０１７５】
グルカン合成反応を準備し、その生成物を以下のとおり分析した。発現されたＧＴＦを含有する上記で作製したＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の上清を使用して、基質としてスクロースを含む反応を準備した。各反応は、１００ｇ／Ｌのスクロース、１０％（ｖ／ｖ）のＧＴＦ上清、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含み、３７℃で１日または２日間保持した。α−グルカン生成物（例えば、ＤＰ３〜８またはＤＰ８＋の可溶性グルコ−オリゴ糖）の形成の他に、各反応は、例えば、フルクトース副産物およびロイクロース副生成物も生成した。反応を濾過し、ＨＰＬＣにより分析した。ＢｉｏＲａｄ  ＡＭＩＮＥＸ  ＨＰＸ−８７Ｃカラムを使用して小さい糖（単糖および二糖）を分析した。直列の２つのＢｉｏＲａｄ  ＡＭＩＮＥＸ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（３００ｃｍ×７．８ｍｍ）を８５℃の外部ヒーター中に配置した。標準のカートリッジホルダー（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１２５−０１３１）は、ＭＩＣＲＯＧＵＡＲＤ  ＣＡＲＢＯ−Ｃカートリッジ（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１２５−０１２８）を収容した。移動相は、流速０．６ｍＬ／分のｄ．ｄ．Ｈ２Ｏであった。注入量は、１０μＬであった。ＲＩ検出器を４０℃で４１０に設定した。分析時間は、各サンプルについて３５分であった。ＢｉｏＲａｄ  ＡＭＩＮＥＸ  ＨＰＸ−４２Ａカラムを使用してオリゴ糖を分析した。ＢｉｏＲａｄ  ＡＭＩＮＥＸ  ＨＰＸ−４２Ａカラム（３００ｃｍ×７．８ｍｍ）を８５℃の外部ヒーター中に配置した。脱灰カートリッジホルダー（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１２５−０１３９）は、脱灰再充填カートリッジ（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１２５−０１１８）を収容した。移動相および検出は、ＨＰＸ−８７Ｃカラムについてのものと同様であった。下の表６は、各ＧＴＦ反応における糖およびオリゴ糖のＨＰＬＣ分析を要約している。データは、それぞれの反応を４回繰り返したものの平均であり、それぞれの標準偏差は、７％未満であった。
【０１７６】
【表１４】
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【０１７７】
表６に示されるように、親ＧＴＦ５６０４は、約１０．６ｇ／Ｌのロイクロースを生成した。ＧＴＦ５６０４のＬ３７３Ｆ、Ｌ３７３ＭおよびＦ９５１Ｙバリアントを使用する反応では、ロイクロースは、それぞれ３．４ｇ／Ｌ、７．１ｇ／Ｌおよび１．１ｇ／Ｌ生成された。このロイクロース副生成物の減少と一致して、各バリアントＧＴＦの反応は、フルクトース副産物レベルとＤＰ８＋オリゴマーの推定レベルとの両方において増加した。これらの反応プロファイルは、概して、ＧＴＦ８８４５およびＬ３７３Ｆを除くそのバリアントによって反映された。
【０１７８】
表６に列記される反応生成物の結合プロファイルは、ＧＣ／ＭＳによって分析された。非バリアントの親ＧＴＦによる生成物とそれらの対応する単一アミノ酸置換バリアントの生成物との間で、結合において著しい相違は観察されなかった。
【０１７９】
要するに、表６のデータに基づくと、配列番号６２の３７３位または９５１位に対応する位置での種々のＧＴＦにおけるいくつかの置換により、例えばグルカン合成反応において、ＧＴＦのα−グルカン収率を増加させることができ、かつ／またはそのロイクロース収率を減少させることができることは明白である。
【０１８０】
実施例３
α−グルカン合成に対するグルコシルトランスフェラーゼの選択性における２つ以上のアミノ酸置換の効果の分析
本実施例は、グルコシルトランスフェラーゼに対する複数のアミノ酸置換の導入の効果およびα−グルカン合成に対する酵素選択性におけるそれらの効果を決定することについて記載する。
【０１８１】
簡潔に述べると、配列番号４（ＧＴＦ６８５５、このグルコシルトランスフェラーゼの説明については、表１および実施例１を参照されたい）に対して所定のアミノ酸置換を行った。これらの置換は、下の表７に列記される。各バリアント酵素を、以下と同じまたは類似のパラメーターを用いてグルカン合成反応に投入した：容器、１２０ｒｐｍで撹拌される２５０ｍＬのくぼみ付き振盪フラスコ；初期ｐＨ、５．７；反応容量、５０ｍＬ；スクロース、７５ｇ／Ｌ；ＧＴＦ、酵素を異種性発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の１．５ｍＬの溶解物；ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ；温度、３０℃；時間、約２０〜２４時間。各反応のα−１，３グルカン収率（実施例１において開示されるものと類似の方法論により測定される）が表７において提供される。
【０１８２】
【表１５】
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【０１８３】
表７のデータに基づくと、ＧＴＦ６８５５（配列番号４）への複数のアミノ酸置換の導入により、この酵素のα−１，３−グルカン収率を増加させることができる。例えば、これらの収率を、表３に示される置換を有しないＧＴＦ６８５５（配列番号４）のものと比較されたい。表７に列記されるバリアントＧＴＦ酵素の各々は、ロイクロース、グルコースおよびグルコ−オリゴマーの収率の著しい減少も示した（データは示さず）。
【０１８４】
例えば、配列番号６２の５１０位および／または６０７位に対応する位置などで複数の置換を有するＧＴＦがＧＴＦのα−グルカン収率を増加させることができることは明白である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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