【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む組成物：
(a)  ウイルス様粒子、
(b)  少なくとも１の免疫刺激性物質、および
(c)  少なくとも１の抗原または抗原決定因子、
なお、該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合しており、および該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる
。
【請求項２】
該少なくとも１の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に、少なくとも１の共有結合により結合しており、好ましくは該共有結合が非ペプチド結合である、請求項１の組成物。
【請求項３】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが、対応する正常メランA ペプチドに比して、２の、好ましくは１のアミノ酸置換を有することを特徴とし、好ましくは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１または２の組成物：
(a)  LAGIGILTV (配列番号: 84)、
(b)  MAGIGILTV (配列番号: 85)、
(c)  EAMGIGILTV (配列番号: 86)、
(d)  ELAGIGILTV (配列番号: 50)、
(e)  EMAGIGILTV (配列番号: 87)、
(f)  YAAGIGILTV (配列番号: 88)、および
(g)  FAAGIGILTV (配列番号: 89)。
【請求項４】
該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが配列 ELAGIGILTV (配列番号: 50) を含むか、あるいはこの配列から本質的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項１−３のいずれかの組成物。
【請求項５】
該ウイルス様粒子が少なくとも１の第１接着部位を含み、および該抗原または抗原決定因子が下記：
(a)  該抗原または抗原決定因子には天然には存在しない接着部位および
(b)  該抗原または抗原決定因子に天然に存在する接着部位、
よりなる群から選ばれる少なくとも１の第２接着部位をさらに含み、
なお、該ウイルス様粒子への該抗原または抗原決定因子の該結合は該第１接着部位と該第２接着部位との連関を介して達成され、好ましくは該連関は少なくとも１の非ペプチド結合により介される、および該抗原または抗原決定因子と該ウイルス様粒子が該連関を介して相互作用して、規則正しい反復した抗原アレイを形成する、請求項１−４のいずれかの組成物。
【請求項６】
該第１接着部位がアミノ基またはリシン残基を含むか、または好ましくはそれからなり、および該第２接着部位がスルフヒドリル基またはシステイン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項５の組成物。
【請求項７】
該第１接着部位がリシン残基であり、および該第２接着部位がシステイン残基であるか、あるいは該第１接着部位がアミノ基であり、および該第２接着部位がスルフヒドリル基である、請求項５または６の組成物。
【請求項８】
該第２接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項５−７のいずれかの組成物：
(a)  CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55)、
(b)  CGGELAGIGILTV (配列番号: 57)、
(c)  CSYTTAEELAGIGILTV ILGVL (配列番号: 58)、
(d)  CGGELAGIGILTVILGVL (配列番号: 59)、
(e)  ELAGIGILTVGGC (配列番号: 60)、
(f)  CSPKSLELAGIGILTV (配列番号: 92) および
(g)  ELAGIGILTVILGVLGGC (配列番号: 93)。
【請求項９】
該第２接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログがアミノ酸配列 CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55) を有する、請求項５の組成物。
【請求項１０】
該ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子であり、好ましくは該ウイルス様粒子が下記よりなる群から選ばれる、請求項１の組成物：
(a)  Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、
(b)  麻疹ウイルスの組換えタンパク質、
(c)  シンドビスウイルスの組換えタンパク質、
(d)  ロタウイルスの組換えタンパク質、
(e)  口蹄病ウイルスの組換えタンパク質、
(f)  レトロウイルスの組換えタンパク質、
(g)  ノルウォークウイルスの組換えタンパク質、
(h)  ヒト・パピローマウイルスの組換えタンパク質、
(i)  BK ウイルスの組換えタンパク質、
(j)  バクテリオファージの組換えタンパク質、
(k)  RNA-ファージの組換えタンパク質、
(l)  Ty の組換えタンパク質および
(m)  (a) 〜 (l) のいずれかの組換えタンパク質のフラグメント。
【請求項１１】
該ウイルス様粒子が RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなり、なお、好ましくは該 RNA-ファージは下記：
(a)  バクテリオファージ Qβ、
(b)  バクテリオファージ R17、
(c)  バクテリオファージ fr、
(d)  バクテリオファージ GA、
(e)  バクテリオファージ SP、
(f)  バクテリオファージ MS2、
(g)  バクテリオファージ M11、
(h)  バクテリオファージ MX1、
(i)  バクテリオファージ NL95、 
(j)  バクテリオファージ f2、
(k)  バクテリオファージ PP7 、および
(l)  バクテリオファージ AP205、
よりなる群から選ばれ、さらに好ましくは該ウイルス様粒子がバクテリオファージ Qβまたはバクテリオファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項１−１０のいずれかの組成物。
【請求項１２】
該免疫刺激性物質がトル様受容体活性化物質またはサイトカイン分泌誘発物質であり、好ましくは該トル様受容体活性化物質が下記よりなる、あるいは本質的になる群から選ばれる、請求項１−１１のいずれかの組成物：
(a)  免疫刺激性核酸、
(b)  ペプチドグリカン、
(c)  リポポリサッカライド、
(d)  リポテイコ酸、
(e)  イミダゾキノリン化合物、
(f)  フラジェリン、
(g)  リポタンパク質、
(h)  免疫刺激性有機分子、
(i)  非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および
(j)  (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h) および／または (i) の少なくとも１の物質の混合物。
【請求項１３】
該免疫刺激性核酸が下記：
(a)  リボ核酸、 
(b)  デオキシリボ核酸、
(c)  キメラ核酸、および
(d)  (a)、(b) および／または (c) の少なくとも１の核酸の混合物、
よりなる、あるいは本質的になる群から選ばれ、
好ましくは該リボ核酸がポリ-(I:C) またはその誘導体であり、
好ましくは該デオキシリボ核酸が下記：
(i)   非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドおよび
(ii)  非メチル化 CpG モチーフの非含有のオリゴヌクレオチド、
よりなる、あるいは本質的になる群から選ばれる、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
該免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである、請求項１−１３のいずれかの組成物。
【請求項１５】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記の配列を含む、請求項１４の組成物:
5' X1X2CGX3X4 3'、ここで、X1、X2、X3 および X4 はいずれのヌクレオチドであってもよく、好ましくはこれらのうち少なくとも１がホスフェート骨格修飾を有する。
【請求項１６】
該少なくとも１の免疫刺激性物質、好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが、回交構造配列を含むか、あるいはこの配列から本質的になるか、あるいはこの配列からなり、好ましくは該回交構造配列はGACGATCGTC (配列番号: 1)を含むか、あるいはこの配列から本質的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項１−１５のいずれかの組成物。
【請求項１７】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41) を含むか、あるいはこの配列から本質的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項１４の組成物。
【請求項１８】
動物における免疫応答を高めるための方法であって、該動物に請求項１−１７のいずれかの組成物を導入することを含む方法であり、好ましくは該動物が哺乳類であり、さらに好ましくは該哺乳類がヒトであり、好ましくは該組成物が該動物に皮下に、筋肉内に、静脈内に、鼻孔内にまたは直接的にリンパ節へ投与される方法における使用のための、請求項１−１７のいずれかの組成物。
【請求項１９】
該免疫応答が高められた B 細胞応答または高められた T 細胞応答であり、好ましくは該 T 細胞応答が CTL 応答または Th 細胞応答であり、さらに好ましくは該 Th 細胞応答が Th1 細胞応答である、請求項１８に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
動物における免疫応答を高めるための、請求項１−１７のいずれかの組成物を含む医薬、なお、該医薬により該組成物が該動物に投与され、好ましくは該動物が哺乳類であり、さらに好ましくは該哺乳類はヒトであり、好ましくは該組成物が該動物に皮下に、筋肉内に、静脈内に、鼻孔内にまたは直接的にリンパ節へ投与される。
【請求項２１】
該免疫応答が高められた B 細胞応答または高められた T 細胞応答であり、好ましくは該 T 細胞応答が CTL 応答または Th 細胞応答であり、さらに好ましくは該 Th 細胞応答が Th1 細胞応答である、請求項２０に記載の医薬。
【請求項２２】
免疫学的有効量の請求項１の組成物を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含むワクチンであって、好ましくはアジュバントをさらに含むワクチン。
【請求項２３】
動物を免疫付加または処置するための方法であって、該動物に免疫学的有効量の請求項２２のワクチンを投与することを含む方法であり、好ましくは該動物が哺乳類であり、さらに好ましくは該哺乳類がヒトである方法における使用のための、免疫学的有効量の請求項２２のワクチン。
【請求項２４】
動物を免疫付加または処置するための方法であって、該動物において T 細胞応答を免疫起動し、そして該動物において T 細胞応答を追加刺激する工程を含み、好ましくは該免疫起動または追加刺激が免疫学的有効量の請求項２２のワクチンを該動物に投与することにより達成される方法における使用のための、免疫学的有効量の請求項２２のワクチン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
第１実施態様において、本発明は、典型的におよび好ましくは、動物における免疫応答を高めるために、ウイルス様粒子、免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸、さらに好ましくは非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物を提供する。なお、免疫刺激性物質、核酸またはオリゴヌクレオチドは、ウイルス様粒子に共役され、融合され、あるいは接着され、または封入されている。そして、該抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に結合しており、該抗原がヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
さらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は組換えウイルス様粒子である。また、ウイルス様粒子はリポタンパク質包膜がないのが好ましい。好ましくは, 組換えウイルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウイルス、BK ウイルスなどのヒトポリオーマウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄病ウイルス、レトロウイルス、ノルウォークウイルスまたはヒトパピローマウイルス、RNA-ファージ、Qβ-ファージ、GA-ファージ、fr-ファージおよび Ty の組換えタンパク質を含むか、あるいはそのタンパク質からなる。具体的な実施態様において、ウイルス様粒子は、１以上の異なるＢ型肝炎ウイルス・コア (キャプシド) タンパク質 (HBcAg) を含むか、あるいはそのタンパク質からなる。さらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントである。好ましい RNA-ファージは Qβ-ファージ、AP 205-ファージ、GA-ファージ、fr-ファージである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
特定の実施態様において、抗原は細胞毒性 T 細胞エピトープを含むか、あるいはそのエピトープからなる。関連する実施態様において、ウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルス・コアタンパク質を含み、細胞毒性 T 細胞エピトープは該Ｂ型肝炎ウイルス・コアタンパク質の C-末端に融合される。ひとつの実施態様において、これらはロイシン連鎖配列により融合される。特に好ましい実施態様において、抗原は癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチドである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の別の態様において、ヒトまたは他の動物における免疫応答を高める方法を提供する。この方法は、動物に、ウイルス様粒子、免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸、さらに好ましくは非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物を導入することを含む。なお、免疫刺激性物質、好ましくは核酸、さらに好ましくはオリゴヌクレオチドはウイルス様粒子に結合 (すなわち、共役、接着または封入) されている。また、該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはそのアナログから本質的になり、あるいはそのアナログからなり、そして該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログは該ウイルス様粒子に結合している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
免疫刺激性物質: 本明細書で使用される用語 “免疫刺激性物質” は、免疫応答を誘導しおよび／または高め得る物質を意味する。免疫刺激性物質は、本明細書で使用するように、限定でないが、トル様受容体活性化物質およびサイトカイン分泌を誘発する物質を含む。トル様受容体活性化物質は、限定でないが、免疫刺激性核酸、ペプチドグリカン、リポポリサッカライド、リポテイコ酸、 イミダゾキノリン化合物、フラジェリン、リポタンパク質、およびタキソールなどの免疫刺激性有機化合物を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本明細書で使用される用語 “天然のヒト・メラン A ペプチド” または “正常のヒト・メラン A ペプチド” は、正常のヒト・メラン A タンパク質配列のアミノ酸部位 26-35 を提示するアミノ酸配列 EAAGIGILTV (配列番号: 78) または正常のヒト・メラン A タンパク質配列のアミノ酸部位 27-35 を提示するアミノ酸配列 AAGIGILTV (配列番号: 79) を含むか、あるいはこの配列から本質的になるか、あるいはこの配列からなるペプチドを意味する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
2. 免疫応答を高めるための組成物および方法
開示された発明は、動物における１以上の抗体に対する免疫応答を高めるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、ウイルス様粒子、少なくとも１の免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸、さらに好ましくは非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む。なお、免疫刺激性物質、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドはウイルス様粒子に結合しており、該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該抗原は ヒト 黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。さらに、本発明は、例えば、癌の予防および／または治療を含む治療および予防の目的のために、実施者がかかる組成物をつくるのを可能にする。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
VLP の例は、限定でないが、Ｂ型肝炎ウイルスのキャプシドタンパク質、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄病ウイルス、ノルウォークウイルス、レトロウイルス GAG タンパク質、レトロトランスポソン Ty タンパク質 p1、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質、ヒト・パピローマウイルス、ヒト・ポリオーマウイルス、BK ウイルス (BKV)、RNA ファージ、Ty、fr-ファージ、GA-ファージ、AP 205-ファージおよび特に Qβ-ファージを含む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
さらに具体的な実施態様において、VLP は、ロタウイルスの組換えポリペプチド、ノルウォークウイルスの組換えポリペプチド、アルファウイルスの組換えポリペプチド、細菌性 pili または pilus 様構造を形成する組換えタンパク質、口蹄病ウイルスの組換えポリペプチド、麻疹ウイルスの組換えポリペプチド、シンドビスウイルスの組換えポリペプチド、レトロウイルスの組換えポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス (例えば HBcAg) の組換えポリペプチド、タバコモザイクウイルスの組換えポリペプチド、Flock House ウイルスの組換えポリペプチド、ヒト・パピローマウイルスの組換えポリペプチド、ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、および特に、ヒト・ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、および特に BK ウイルスの組換えポリペプチド、バクテリオファージの組換えポリペプチド、RNA ファージの組換えポリペプチド、Ty の組換えポリペプチド、fr-ファージの組換えポリペプチド、GA-ファージの組換えポリペプチド、AP 205-ファージの組換えポリペプチド、および特に、Qβ-ファージの組換えポリペプチドを含み得るか、あるいはこれらからなり得る。このウイルス様粒子は、かかるポリペプチドの１以上のフラグメント、およびかかるポリペプチド変種を含み得るか、あるいはこれらからなり得る。ポリペプチドの変種は、その野生タイプの相当物とアミノ酸レベルで、少なくとも 80%、85%、90%、95%、97% または 99% 同一性をもつ。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。好ましくは、RNA-ファージは下記よりなる群から選ぶ：a) バクテリオファージ Qβ、b) バクテリオファージ R17、c) バクテリオファージ fr、d) バクテリオファージ GA、e) バクテリオファージ SP、f) バクテリオファージ MS2、g) バクテリオファージ M11、h) バクテリオファージ MX1、i) バクテリオファージ NL95、k) バクテリオファージ f2、l) バクテリオファージ PP7、m) バクテリオファージ AP205。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
本発明の別の好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-バクテリオファージ Qβまたは RNA-バクテリオファージ fr または RNA-バクテリオファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、組換えタンパク質は、RNA ファージのコートタンパク質を含むか、あるいはこのタンパク質から本質的になるか、あるいはこのタンパク質からなる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。ここで、組換えタンパク質は、RNA ファージの変異コート・タンパク質、好ましくは、上記した RNA ファージの変異コート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。別の好ましい実施態様において、RNA ファージの変異コート・タンパク質を、置換で少なくとも１リシン残基の除去により、または置換で少なくとも１リシン残基の付加により修飾した。あるいは、RNA ファージの変異コート・タンパク質を、少なくとも１リシン残基の除去により、または挿入で少なくとも１リシン残基の付加により修飾した。少なくとも１リシン残基の除去、置換または付加は、共役の程度を変えて、すなわち、RNA-ファージの VLP のサブユニット当たりのヒト黒色腫メランA ペプチドアナログの量をワクチンの必要なものに適合し仕上げる。本発明の好ましい実施態様において、平均でサブユニット当たり少なくとも 1.0 のヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが RNA-ファージの VLP に連結する。この値は、RNA-ファージの VLP の全サブユニットまたはモノマーについての平均として計算する。本発明のさらなる好ましい実施態様において、少なくとも 1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 または少なくとも 2.0 のヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが、RNA-ファージの VLP の全サブユニットまたはモノマーについての共役平均として計算される RNA-ファージの VLP に連結している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
別の好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-バクテリオファージ Qβ の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。ここで、組換えタンパク質は、配列番号:10 のアミノ酸配列を有するコート・タンパク質または配列番号:10 および配列番号: 11 のアミノ酸配列を有するコート・タンパク質の混合物、および配列番号: 11 の変異体を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなり、Ｎ末端のメチオニンが好ましくは切除されている。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、Qβの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。ここで、組換えタンパク質は、Qβ の変異コート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。別の好ましい実施態様において、これらの変異コート・タンパク質を、置換で少なくとも１リシン残基の除去により、または置換で少なくとも１リシン残基の付加により修飾した。あるいは、Qβ の変異コート・タンパク質を、少なくとも１リシン残基の除去により、または挿入で少なくとも１リシン残基の付加により修飾した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
４リシン残基を Qβ コート・タンパク質のキャプシド表面に暴露する。暴露されたリシン残基がアルギニンで置換された Qβ 変異体も本発明で使用できる。下記の Qβ コート・タンパク質変異体および変異 Qβ VLP を本発明の実施に使用できる：“Qβ-240” (Lys13-Arg; 配列番号:20)、“Qβ-243” (Asn 10-Lys; 配列番号:21)、“Qβ-250” (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; 配列番号:22)、“Qβ-251” (配列番号:23) および “Qβ-259” (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; 配列番号:24)。すなわち、本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、a) 配列番号: 20 のアミノ酸配列、b) 配列番号:21 のアミノ酸配列、c) 配列番号: 22 のアミノ酸配列、d) 配列番号:23 のアミノ酸配列および e) 配列番号: 24 のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む変異 Qβ コート・タンパク質の組換えタンパク質を含むか、あるいはこのタンパク質から本質的になるか、あるいはこのタンパク質からなる。上記の Qβ コート・タンパク質、変異 Qβ コート・タンパク質 VLP および キャプシドの構築、発現および精製は、それぞれ WO02/056905 に開示されている。特にこの出願の実施例 18 を引用する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、Qβ 組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。この組換えタンパク質は、Qβ 変異体および対応する A1 タンパク質のいずれか１の混合物を含むか、あるいはこの混合物から本質的になるか、あるいはこの混合物からなる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換えコート・タンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれなる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換え変異コート・タンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換えコート・タンパク質またはそのフラグメントと、RNA-ファージ AP205 の組換え変異コート・タンパク質またはそのフラグメントとの混合物を含むか、あるいはこの混合物から本質的になるか、あるいはこの混合物からなる。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換えコート・タンパク質または組換え変異コート・タンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
ひとつの実施態様において、本発明は、ウイルス様粒子を含む本発明のワクチン組成物を提供する。好ましくは、該ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子である。好ましくは、ウイルス様粒子は、RNA-ファージの、好ましくは RNA ファージのコート・タンパク質の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。あるいは、本発明のワクチン組成物のウイルス様粒子の組換えタンパク質は、RNA ファージの変異コート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。RNA-ファージは下記よりなる群から選択する：(a) バクテリオファージ Q(、(b) バクテリオファージ R17、(c) バクテリオファージ fr、(d) バクテリオファージ GA、(e) バクテリオファージ SP、(f) バクテリオファージ MS2、(g) バクテリオファージ M11、(h) バクテリオファージ MX1、(i) バクテリオファージ NL95、(k) バクテリオファージ f2、(l) バクテリオファージ PP7、(m) バクテリオファージ AP205。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
ひとつの実施態様において、ウイルス様粒子は、BK ウイルス (BKV) の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。この組換えタンパク質は、配列番号:12 のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、あるいはこのタンパク質から本質的になるか、あるいはこのタンパク質からなる。BK ウイルス (BKV) は、papovaviridae のポリオーマウイルス・サブファミリーに属する非包膜の二本鎖 DNA ウイルスである。VP1 は、BKV の主要キャプシドタンパク質である。VP1 は 362 アミノ酸 (配列番号: 12, Gene Bank entry: AAA46882) を有し、大きさが 42 kDa である。E. coli 中でつくられるとき、挿入細胞またはイースト VP1 は自発的にキャプシド構造を形成する (Salunke D.M et al., Cell 46(6):895-904 (1986); Sasnauskas, K., et al., Biol. Chem. 380(3):381-6 (1999); Sasnauskas, K., et al., 3rd International Workshop “Virus like particles as vaccines” Berlin, September 26-29 (2001); Touze, A., et al., J Gen Virol. 82(Pt 12):3005-9 (2001)。キャプシドは、２０面体を形成する 72 VP1 ペンターマー中に編成される。このキャプシドは直径が約 45 nm である。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
本発明で使用できるＢ型肝炎ウイルス様粒子の調製は、例えば、WO 00/32227、特に実施例 17 〜 19 および 21 〜 24、WO 01/85208、特に実施例 17 〜 19、21 〜 24、31 および 41 ならびに WO 02/056905 に開示されている。後者の出願について、特に実施例 23、24、31 および 51 を引用する。全３文献を出典明示により本明細書の一部とする。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
上記の HBcAg 変種および前駆体のアミノ酸配列は互いに比較的類似している。配列番号:28 の特定の部位に対応する部位に位置する HBcAg 変種のアミノ酸残基についての言及は、配列番号:28 に示されるアミノ酸配列でのその部位に存在するアミノ酸残基を意味する。これらの HBcAg 変種の間における相同性は、大部分、哺乳類に感染するＢ型肝炎ウイルスで十分高く、当業者が、配列番号:28 に示されるアミノ酸配列と特定の HBcAg 変種で “対応する” アミノ酸残基を同定するものとの両方を再検討するのにほとんど難しくないであろう。さらに、配列番号:27 に示される HBcAg アミノ酸配列は、ウッドチャックを感染するウイルスから誘導される HBcAg のアミノ酸配列であって、配列番号:28 に示されるアミノ酸配列を有する HBcAg に十分な相同性を持ち、３アミノ酸残基の挿入が配列番号:28 のアミノ酸残基 155 と 156 の間に配列番号:27 において存在することが容易に明らかである。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
本発明はまた、鳥に感染するＢ型肝炎ウイルスの HBcAg 変種を含むワクチン組成物、およびこれらの HBcAg 変種のフラグメントを含むワクチン組成物を含む。当業者が認識するように、これらのポリペプチドに天然に存在する１、２、３またはそれ以上のシステイン残基は、本発明のワクチンに挿入する前に、他のアミノ酸残基で置換するか、または除去できる。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
上記のように、遊離システイン残基の消失は、毒性成分が HBcAg に結合し得る部位の数を減じ、そしてまた、同じか隣接する HBcAg 分子のリシンとシステイン残基との橋かけリンカーが生じ得る部位をなくする。従って、本発明の別の実施態様において、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシド・タンパク質の１以上のシステイン残基を除去または他のアミノ酸残基で置換する。HBcAg-Lys 変種の発現および精製は、WO 02/056905 の実施例 24 に記載され、遊離のシステイン残基がなく、挿入されたリシン残基を含有する HBcAg の構築は、WO 02/056905 の実施例 31 に記載されている。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
本発明はさらに、上記の切除変異体に少なくとも 80%、85%、90%、95%、97% または 99% 類似のアミノ酸配列を含むか、あるいはこの配列から本質的になるか、あるいはこの配列からなる HBcAg ポリペプチドをそれぞれ含む組成物およびワクチン組成物を含む。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
上記の開示のように、本発明は、免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸、さらに好ましくは DNA オリゴヌクレオチドあるいはポリ (I:C) を VLP 中に充填し得るとの驚くべき発見に部分的に基づく。予想外にも、VLP 中に存在する核酸を、免疫刺激性物質により、好ましくは免疫刺激性核酸により、さらに好ましくは DNA-オリゴヌクレオチド含有の CpG モチーフまたはポリ (I:C) により特異的に置換できる。例えば、CpG-VLP は、より免疫原性であり、その CpG-のないものよりも特異的な作用を誘発し、高められた B および T 細胞応答を誘導する。VLP に共役され、融合されあるいは接着された抗原に対する免疫応答は、VLP 自体に対する免疫応答と同様に高められる。さらに、VLP と抗原の両者に対する T 細胞応答が Th1 タイプに特異的に向けられる。さらに、充填された核酸および CpG はそれぞれ、減成から保護される、すなわちより安定である。さらに、先天性免疫系からの細胞の非特異的活性化が劇的に減じる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
好ましくは、非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは下記の配列を含む。
5' X1X2CGX3X4 3'
ここで、X1、X2、X3 および X4 はいずれのヌクレオチドであってもよい。さらに、このオリゴヌクレオチドは、約 6 〜 約 100,000 ヌクレオチド、好ましくは約 6 〜 約 2000 ヌクレオチド、より好ましくは約 20 〜 約 2000 ヌクレオチド、さらに好ましくは約 20 〜 約 300 ヌクレオチドを含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、100 以上〜 約 2000 ヌクレオチド、好ましくは 100 以上〜 約 1000 ヌクレオチド、より好ましくは 100 以上〜 約 500 ヌクレオチドを含み得る。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
本発明の好ましい実施態様は、動物における免疫応答を高めるために、(a) ウイルス様粒子、(b) 少なくとも１の免疫刺激性物質および (c) 少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物を提供することである。ここで、該抗原または該抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合している。該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合している。該免疫刺激性物質は非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該回交構造配列は GACGATCGTC (配列番号: 1) である。該回交構造配列は、その 3'-末端およびその 5'-末端で、２を超え１１より少ないグアノシン実在物または好ましくは 8-10 グアノシン実在物または最も好ましくは 10 グアノシン実在物を側有する。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
本発明の好ましい実施態様において、回交構造配列は、GACGATCGTC (配列番号: 1) を含むか、あるいはこの配列から本質的になるか、あるいはこの配列からなる。該回交構造配列は、その 5'-末端で少なくとも 3、最大 10 グアノシン実在物を側有し、該回交構造配列は、その 3'-末端で少なくとも 6、最大 10 グアノシン実在物を側有する。別の実施態様において、回交構造配列は、その 5'-末端で少なくとも 3、最大 10 グアノシン実在物を側有し、該回交構造配列は、その 3'-末端で少なくとも 6、最大 10 グアノシン実在物を側有する。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
本発明の非常に好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該非メチル化は配列番号: 41 の核酸配列を有し、すなわち免疫刺激性物質は G10-PO である。このように、非常に好ましい実施態様において、本発明は、動物における免疫応答を高めるために、(a) ウイルス様粒子、(b) 少なくとも１の免疫刺激性物質および (c) 少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物を提供する。ここで、該抗原または該抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合している。該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合している。該免疫刺激性物質は非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該回交構造配列は GACGATCGTC (配列番号: 1) である。該回交構造配列は、その 3'-末端およびその 5'-末端で、10 グアノシン実在物を側有する。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
本発明のさらなる実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログを Ty VLP 中に組み込まれ得る Ty タンパク質に融合する。より具体的な実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログを TYA 遺伝子によりコードされる p1 またはキャプシドタンパク質 (Roth, J.F., Yeast 16:785-795 (2000)) に融合する。イースト・レトロトランスポソン Ty 1、2、3 および 4 は Saccharomyces Serevisiae から単離されており、一方、レトロトランスポソン Tf1 は Schizosaccharomyces Pombae から単離されている (Boeke, J.D. and Sandmeyer, S.B., “Yeast Transposable elements,” in The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, p. 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991))。レトロトランスポソン Ty1 および 2 は動植物エレメントの copia クラスに関係し、一方、Ty3 は動植物のレトロウイルスに関係するレトロトランスポソンのジプシーファミリーに属する。Ty1 レトロトランスポソンにおいて、p1 タンパク質は、Gag またはキャプシドタンパク質も意味し、長さ 440 アミノ酸をもつ。P1 は VLP の成熟時に部位 408 で解裂されて、p2 タンパク質、VLP の本質的成分となる。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
本発明の具体的な実施態様において、高められた免疫応答が望まれる抗原は、フレーム中でＢ型肝炎ウイルスキャプシド (コア) タンパク質 (HBcAg) に共役され、融合され、あるいは接着されている。しかし、当業者には、他のウイルス様粒子を本発明の融合タンパク質構築体に使用できることは明らかであろう。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は少なくとも１の第１接着部位を含み、抗原または抗原決定因子は少なくとも１の第２接着部位を含む。好ましくは、第１接着部位は１のアミノ基または１のリシン残基を含み、好ましくはそれからなる。第２接着部位は、(a) 該抗原または抗原決定因子には天然には存在しない接着部位; および (b) 該抗原または抗原決定因子に天然に存在する接着部位よりなる群から好ましくは選択する。さらに好ましくは、第２接着部位はスルフヒドリル基またはシステイン残基を含み、好ましくはこれからなる。好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子のウイルス様粒子との結合は、第１接着部位と第２接着部位との連関を介して達成され、好ましくは、連関は少なくとも１の非ペプチド結合を介し、そして好ましくは、抗原または抗原決定因子とウイルス様粒子とは、該連関を介して相互作用して、規則正しいかつ反復した抗原アレイを形成する。ひとつの実施態様において、第１接着部位はリシン残基であり、第２接着部位はシステイン残基である。別の実施態様において、第１接着部位はアミノ基であり、第２接着部位はスルフヒドリル基である。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
従って、本発明のさらなる態様および本発明の非常に好ましい実施態様は、(a) ウイルス様粒子および (b) 免疫刺激性物質を含み、動物における免疫応答を高めるための組成物を提供する。該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合する。該組成物は少なくとも１の抗原または抗原決定因子をさらに含む。該抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に結合する。該少なくとも１の抗原または抗原決定因子はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログは該ウイルス様粒子に結合する。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４５】
他の好ましい実施態様において、抗原は、下記よりなる群から限定なしに選ばれるアミノ酸配列を有するヒト・黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる： (a) LAGIGILTV (配列番号: 84)、(b) MAGIGILTV (配列番号: 85)、(c) EAMGIGILTV (配列番号: 86)、(d) ELAGIGILTV (配列番号: 50、(e) EMAGIGILTV (配列番号: 87)、(f) YAAGIGILTV (配列番号: 88)、(g) FAAGIGILTV (配列番号: 89)、(h) GHGHSYTTAE ELAGIGILTV (配列番号: 51)、(i) SYTTAEELAGIGILTVILGVL (配列番号: 52) および (j) ELAGIGILTVILGVL (配列番号: 53)。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
非常に好ましい実施態様において、抗原は、下記よりなる群から限定なしに選ばれるアミノ酸配列を有するヒト・黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる：(a) LAGIGILTV (配列番号: 84)、(b) MAGIGILTV (配列番号: 85)、(c) EAMGIGILTV (配列番号: 86)、(d) ELAGIGILTV (配列番号: 50)、(e) EMAGIGILTV (配列番号: 87)、(f) YAAGIGILTV (配列番号: 88) および (g) FAAGIGILTV (配列番号: 89)。これらのペプチドアナログおよびその合成は、Valmori at al., J. Immunol. 160: 1750-1758 (1998) に記載されている。これらのペプチドアナログは、天然の黒色腫ペプチドに対する５種の細胞毒性 T 細胞クローンによる相対的な認識および標的細胞分解を増加する。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
本発明の非常に好ましい実施態様において、ヒト・黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログは、配列 ELAGIGILTV (配列番号: 50) を含むか、あるいはこの配列から本質的になるか、あるいはこの配列からなる。実施例を通して示すように、この非常に好ましい実施態様は、HLA-A2 形質転換マウスにおける機能的メランA-特異的 CD8+T 細胞の拡大を誘導し、HLA-結合と TCR-認識の優れた妥協を提示する (参考、Valmori at al., J. Immunol. 160: 1750-1758 (1998))。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
本発明はまた、VLP および免疫刺激性物質、好ましくは VLP に結合する非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドを含み、動物における免疫応答を高めるための組成物をつくる方法を提供する。これは、VLP を免疫刺激性物質およびオリゴヌクレオチドそれぞれとインキュベートし、RNase を加え、該組成物を精製することを含む。好ましくは、この方法は抗原または抗原決定因子を該ウイルス様粒子に結合する工程を含む。該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６０】
好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、ウイルス様粒子を免疫刺激性物質とインキュベートする前に、結合している。他の好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、組成物を精製した後に、結合する。同じく好ましい実施態様において、方法は、VLP を RNase とインキュベートし、それぞれ免疫刺激性物質およびオリゴヌクレオチドを加え、組成物を精製する。好ましくは、この方法は抗原または抗原決定因子を該ウイルス様粒子に結合する工程をさらに含む。該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、ウイルス様粒子を RNase とともにインキュベートする前に結合している。別の好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、組成物を精製した後に結合する。ひとつの実施態様において、VLP を細菌性発現系でつくる。他の実施態様において、RNase は RNase A である。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
本発明はさらに、免疫刺激性物質、好ましくは 非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドに結合する VLP を含み、動物における免疫応答を高める組成物をつくるための方法を提供する。これは、VLP を解集合し、免疫刺激性物質およびオリゴヌクレオチドそれぞれを加え、VLP を再集合することを含む。この方法は、解集合された VLP の核酸を除去すること、および／または再集合の後に組成物を精製することを含む。好ましくは、この方法はさらに、抗原または抗原決定因子をウイルス様粒子に結合する工程を含む。該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、ウイルス様粒子を解集合する前に結合している。別の好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、ウイルス様粒子を再集合した後、そして好ましくは組成物を精製した後に結合する。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６２】
本発明はまた、疾患または病態を予防および／または軽減するのに使用できるワクチン組成物を提供する。本発明のワクチン組成物は、免疫学的有効量の本発明の免疫を高める組成物を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含むか、あるいはこれらから本質的になるか、あるいはこれらからなる。このワクチンはアジュバントも選択的に含み得る。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
すなわち、好ましい実施態様において、本発明は, 免疫学的有効量の本発明の免疫を高める組成物を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含むか、あるいはこれらから本質的になるか、あるいはこれらからなるワクチンを提供する。この組成物は、(a) ウイルス様粒子; (b) 少なくとも１の免疫刺激性物質; および (c) 少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含み; 抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に結合しており、そして免疫刺激性物質はウイルス様粒子に結合しており、そして抗原はヒト黒色腫 メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。好ましくは、ワクチンはアジュバントをさらに含む。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】
さらなる態様において、本発明は、典型的におよび好ましくは、動物における免疫応答を高めるための組成物を提供する。これは、(a) ウイルス様粒子、(b) 免疫刺激性物質; 該免疫刺激性物質 (b) は該ウイルス様粒子 (a) に結合している、(c) 抗原；該抗原は該ウイルス様粒子 (a) を混合している、を含む。該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから本質的になるか、あるいはこのアナログからなる。本明細書で使用される用語 “混合” は、ともに加えられる２以上の物質、成分またはエレメントの組合せ物が互いに化学的に結合しないで、分離され得ることを意味する。抗原をウイルス様粒子と混合する方法は WO 04/000351 に記載されている（出典明示により本明細書の一部とする）。
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８２】
実施例１
p33-HBcAg VLP の生成
LCMV 由来のペプチド p33 を含有する HBcAg の DNA 配列を配列番号: 15 に示す。p33-HBcAg VLP を下記のように生成せしめた。Ｂ型肝炎ウイルスの完全ウイルスゲノムを含有する肝炎 B クローン pEco63 を ATCC から入手した。HBcAg をコードする遺伝子を、発現ベクター pkk223.3 (Pharmacia) の EcoRI/HindIII 制限部位に強力な tac プロモーターの制御下に導入した。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (LCMV) から誘導された p33 ペプチド (KAVYNFATM) (配列番号: 80) を HBcAg (1-185) の C-末端に、３ロイシン-リンカーを介して標準 PCR 法で融合した。優れた発現について選択された E. coli K802 のクローンをプラスミドでトランスフェクトし、細胞を生育し、5 ml 分解緩衝液 (10 mM Na2HPO4, 30 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.25 % Tween-20, pH 7.0) 中に再懸濁した。 200 μの リゾチーム 溶液 (20 mg/ml) を加えた。音波破壊の後に, 4 μl ベンゾナーゼおよび 10 mM MgCl2 を加え、懸濁液を 30 分間 RT でインキュベートし、15 分間 15,000 rpm で 4℃ で遠心分離し、上澄みを保持した。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
プラスミド 355.24 を E. coli JM109 中に形質転換した。発現を本質的に、QβVLP について記載されているように行った。単一のコロニーを、20 mg/L アンピシリンを含有する LB 培地に一夜振盪せずに接種した。この接種物に次の日に、1% カサミノ酸、0.2% グルコースおよび 20 mg/L アンピシリンを補充した M9 培地を含有する大きいフラスコ中に移し、14-20 時間振盪しながらインキュベートした。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８７】
GA VLP を本質的に、QβVLP について記載のように単離した。細胞を分解し、澄んだ溶解質を Sepharose CL-4B カラム (Amersham Pharmacia) に入れた。溶出液を硫酸アンモニウム沈澱で濃縮し、Sepharose CL-6B カラム (Amersham Pharmacia) で再クロマトグラフィーにかけた。最終工程をスクロース勾配 (20-50% w/v) または CsCl の超遠心分離で行った。単離された VLP をついで 20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 8.0 で透析した。
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３２】
B. 付加オリゴヌクレオチドの不存在で再集合しない解集合材料を用いる AP205 VLP の再集合
解集合: 100 mg の精製かつ乾燥の組換え AP205 VLP を上記のように解集合について使用した。すべての工程を本質的にパート A に記載のように行ったが、硫酸アンモニウムのペレットの溶解のために 8 M 尿素を使用し、再集合の前の CL-4B カラムを用いるゲルろ過工程を省略した。Sephadex G-75 カラムの集めたフラクションは 21 mg のタンパク質を含有した。これは分光法によりパート A に記載の式を用いて決定した。サンプルの 280 nm での吸収の 260 nm での吸収に対する比は 0.16 対 0.125 であった。サンプルは測定のために 50 倍に希釈した。
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３５】
再集合 AP205 VLP を、上記の EM、アガロースゲル電気泳動および非還元条件での SDS-PAGE により解析した。
解集合材料の EM 解析によると、AP205 VLP の塩化グアニジニウムでの処置が VLP のキャプシド集合を本質的に混乱させた。この解集合材料のオリゴヌクレオチドでの再集合はキャプシドをもたらす。これを精製し、さらにゲルろ過で富化した。２サイズの粒子を得た。約 25 nm 直径の粒子と、より小さい粒子が電子ミクログラフで見える。再集合がオリゴヌクレオチドの不存在でなかった。再集合粒子のアガロース電気泳動上の保持によると、再集合粒子が核酸を含有した。核酸のフェノールによる抽出および続くエチジウムブロマイド染色アガロースゲル上の保持によると、粒子が再集合に使用されたオリゴヌクレオチドを含有した。充填されたオリゴヌクレオチドの同一性を、このオリゴヌクレオチドのサンプルを粒子から抽出された核酸材料の端から端に保持することにより調整した。再集合 AP205 VLP が保持され、前にエチジウムブロマイドで染色されているアガロースゲルを、ついでクーマシーブルーで染色して、オリゴヌクレオチド内容物と粒子のタンパク質内容物との共移動を表し、オリゴヌクレオチドが粒子中に充填されていることを示す。ゲル上に保持されるのは、非処置 AP205 VLP、h CyCpG で再集合された AP205 VLP の異なる量をもつ 3 サンプル、および非処置 Qβ VLP であった。