【手続補正書】
【提出日】平成19年5月25日(2007.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
[170]  ２．１．  表面の予測
[171]  構造が解明されている抗体セットの可変領域残基の溶媒露出度を、ネズミＭｙ９−６抗体可変領域の表面残基を予測するのに用いた。１２７の独特の抗体構造ファイルのセット（図３）について、アミノ酸の溶媒露出度を、ＭＣソフトウエアパッケージ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９−９７３）を用いて計算した。この１２７の構造のセットに由来する、最も類似した１０の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を、ＮＣＢＩウェブサイト  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／  の配列整列化ソフトウエアを用いて決定した。これらの１０の抗体可変領域の各可変領域残基についての平均溶媒露出度を、エクセル集計表を用いて計算し、そして３０％よりも大きな平均露出度を伴う位置を、表面残基とみなした。２５％〜３５％の平均露出度を伴う位置を、両側に隣接する２つの同一な残基を有するこれらの構造のみについて、個々の残基の露出度を計算することによって、さらにみなした。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
[201]  種々のｃＤＮＡクローン及びペプチド配列解析から得た蓄積データは、図８に示される最終的なネズミＭｙ９−６軽鎖及び重鎖配列を提供した。Ｋａｂａｔ及びＡｂＭ定義を用いて、３つの軽鎖及び重鎖ＣＤＲを同定した（図８及び９）。ＮＣＢＩ  ＩｇＢｌａｓｔデータベースの検索により、ｍｕＭｙ９−６抗体軽鎖可変領域は、マウスＩｇＶκ  ８−２７生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高く、一方、重鎖可変領域は、ＩｇＶｈ  Ｖ１０２生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高いことが、示唆される（図１０）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
【図１】[35]  図１は、競合結合実験の結果を示す。125Ｉ−標識Ｍｙ９−６抗体（３ｘ１０-9Ｍ）のＣＤ３３陽性Ｕ−９３７細胞への結合を、濃度を増加させたＭｙ９あるいはＭｙ９−６抗体の存在下で、アッセイした。
【図２】[36]  図２は、軽鎖シグナル配列に対するＭｙ９−６縮重プライマーを示す。
【図３】[37]  図３は、ｍｕＭｙ９−６可変領域の表面を予測するのに用いたブルックヘブンのデータベースに由来する、１２７の抗体構造のファイル名を示す。
【図４】[38]  図４は、１６のＭｙ９−６の表面再構築化型ならびにキメラＭｙ９−６抗体を構築するのに用いたＰＣＲプライマーを示す。
【図５】[39]  図５は、ヒト化抗体を構築しそして発現するのに用いたプラスミドを示す。（Ａ）：軽鎖クローニングプラスミド。（Ｂ）：重鎖クローニングプラスミド。（Ｃ）：哺乳動物抗体発現プラスミド。
【図６】[40]  図６Ａは、ＲＴ−ＰＣＲにより生成したｍｕＭｙ９−６軽鎖のｃＤＮＡクローンに由来するアミノ酸配列と比較した、エドマン配列決定の結果を示す。  [41]  図６Ｂは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列をそれぞれ含有する、１３１９Ｄａ及び１１２２ＤａのペプチドフラグメントのＭＳ−ＭＳ配列解析による結果を示す。ＣＤＲ配列は、太字で表す。
【図７】[42]  図７は、１７８８ＤａペプチドのＭＳ−ＭＳ配列解析による結果、及び２つのｃＤＮＡクローンに由来する対応した配列を示す。
【図８−Ａ】[43]  図８Ａは、ネズミＭｙ９−６抗体の軽鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列（配列番号９５）を示す。３つのＣＤＲを下線で示す。
【図８−Ｂ】[44]  図８Ｂは、ネズミＭｙ９−６抗体の重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列（配列番号９６）を示す。３つのＣＤＲを下線で示す。
【図９】[45]  図９は、Ｋａｂａｔの定義によって決定された軽鎖及び重鎖ＣＤＲを示す。
【図１０】[46]  図１０は、８−２７及びＶ１０２遺伝子の生殖系列配列とともに整列化させた、ネズミＭｙ９−６抗体の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を示す。点（．）は、配列が同一であることを示す。
【図１１−Ａ】[47]  図１１Ａ及びＢは、ブルックヘブンのデータベースに解明されているファイルを有する、ｍｕＭｙ９−６配列に最も相同的な１０の軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）抗体配列を示す。配列を、最も相同的なものから最も相同的でないものへの順番で整列化した。
【図１１−Ｂ】[47]  図１１Ａ及びＢは、ブルックヘブンのデータベースに解明されているファイルを有する、ｍｕＭｙ９−６配列に最も相同的な１０の軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）抗体配列を示す。配列を、最も相同的なものから最も相同的でないものへの順番で整列化した。
【図１２】[48]  図１２Ａ及びＢは、ｍｕＭｙ９−６抗体軽鎖（Ａ）及び重鎖（Ｂ）の各Ｋａｂａｔ位置の平均露出度を示す。１０の最も相同的な軽鎖及び重鎖配列の各Ｋａｂａｔ位置の相対的な溶媒露出度を、平均しそしてｘ軸上に表す。
【図１３−Ａ】[49]  図１３Ａは、ＭＣソフトウエアを用いて計算した、１０の最も相同的な軽鎖構造の残基の溶媒露出度を示し、そして、エクセルを用いて作表した各Ｋａｂａｔ位置の平均を示す。この表は、２５％よりも大きな平均溶媒露出度である、ＣＤＲでない位置のデータを示す。表面残基を、３０％よりも大きな平均溶媒露出度である残基として定義する。２５％〜３５％の平均露出度である位置を、その位置及び両側に隣接する２つの位置にて同一の残基を有する構造のみの平均露出度を計算することによって、さらに解析した。ＮＡは、同一の隣接する位置が利用可能でないことを指す。位置１５及び７０は、最終列に与えられた最終的な表面予測に到達するのに、さらに計算を要した。
【図１３−Ｂ】[50]  図１３Ｂは、ＭＣソフトウエアを用いて計算した、１０の最も相同的な重鎖構造の残基の溶媒露出度を示し、そして、エクセルを用いて作表した各Ｋａｂａｔ位置の平均を示す。この表は、２５％よりも大きな平均溶媒露出度である、ＣＤＲでない位置のデータを示す。表面残基を、３０％よりも大きな平均溶媒露出度である残基として定義する。２５％〜３５％の平均露出度である位置を、その位置及び両側に隣接する２つの位置にて同一の残基を有する構造のみの平均露出度を計算することによって、さらに解析した。ＮＡは、同一の隣接する位置が利用可能でないことを指す。
【図１４】[51]  図１４は、ＣＤＲ残基から５Å以内に入るＭｙ９−６フレームワークの表面残基を示す。
【図１５】[52]  図１５は、Ｋａｂａｔデータベースから抽出した上位５つのヒト配列を示す。整列化を、ＳＲ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，１９９３年）によって行った。ＣＤＲから５Å以内に入るｍｕＭｙ９−６の残基を、下線で示す。
【図１６−Ａ】[53]  図１６Ａ及びＢは、１６のヒト化Ｍｙ９−６軽鎖可変領域配列（Ａ）及び１６のヒト化重鎖可変領域配列（Ｂ）を、マウスＭｙ９−６と整列化させたものを示す。点（．）は、ヒト化型１．０と配列が同一であることを表す。ネズミとヒトのＭｙ９−６で異なる表面残基を、下線で示す。
【図１６−Ｂ】[53]  図１６Ａ及びＢは、１６のヒト化Ｍｙ９−６軽鎖可変領域配列（Ａ）及び１６のヒト化重鎖可変領域配列（Ｂ）を、マウスＭｙ９−６と整列化させたものを示す。点（．）は、ヒト化型１．０と配列が同一であることを表す。ネズミとヒトのＭｙ９−６で異なる表面残基を、下線で示す。
【図１７】[54]  図１７は、ＨＬ−６０膜及びＨＬ−６０全細胞における直接的結合アッセイならびにＨＬ−６０膜における競合的結合アッセイによって計算された、Ｍｙ９−６のＫD値を示す。Ｎ＝２である＊を除き、Ｎ＝３。
【図１８】[55]  図１８は、ｈｕＭｙ９−６  Ｖ１．０に対する結合曲線を示す。（Ａ）：ＨＬ−６０膜における直接的結合。（Ｂ）：ＨＬ−６０全細胞における直接的結合。（Ｃ）：ＨＬ−６０膜における競合的結合。
【図１９】[56]  図１９は、ＨＬ−６０細胞におけるＭｙ９−６−ＤＭ１及びＭｙ９−６抗体の結合性を比較したものを示す。
【図２０】[57]  図２０は、ＣＤ３３発現ヒト腫瘍細胞に対するＭｙ９−６−ＤＭ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。
【図２１】[58]  図２１は、ＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおける、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の有効性実験の結果を示す。ＨＬ−６０腫瘍の増殖における、Ｍｙ９−６−ＤＭ１（Ａ）及び修飾されていないＭｙ９−６抗体（Ｃ）の効果を、評価した。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ、Ｄ）。
【図２２】[59]  図２２は、ＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の有効性を非結合型の薬物であるメイタンシンと比較したものを示す（Ａ）。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ）。２例の治療マウスにおいて再発した腫瘍を、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の第二クールで治療した。
【図２３】[60]  図２３Ａ及びＢは、大きなＨＬ−６０異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の抗腫瘍有効性を標準的な化学療法と比較したものを示す（Ａ）。マウス体重を、毒性の指標としてモニターした（Ｂ）。２例の治療マウスにおいて再発した腫瘍を、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の第二クールで再治療した。
【図２４】[61]  図２４Ａ及びＢは、ＨＬ−６０生存モデルにおいて、Ｍｙ９−６−ＤＭ１の抗腫瘍有効性をゲムツズマブ・オゾガマイシン及び標準的な化学療法と比較したものを示す。ＨＬ−６０細胞を、ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。示した治療を、細胞注射後第１１日に開始した。治療は、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（１日４回ｘ３）を除き、１日１回ｘ５の静脈内投与であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006505277000001.app