【手続補正書】
【提出日】平成18年12月19日(2006.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  式(Ｉ)
【化１】
2002533329.tif 000001
[式中、基Ｒ１またはＲ２の１つおよび基Ｒ３またはＲ４の１つは、水素であり、その他は、独立して−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＯＮＲ８Ｒ９、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＯ２、ＮＲ１０Ｒ１１、ＮＨＣＯＲ１２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、−ＣＦ３、Ｏ(Ｃ１−Ｃ４)−アルキル(所望により任意の炭素Ｃ１−Ｃ４においてメチルまたはフェニルにより置換されている)、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、末端炭素が−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＲ８Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２{ｎ＝２−８、および当該ＮＨ２−基はまた、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルにより、またはtert−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２,２,２−トリクロロエトキシカルボニル、２−(トリメチルシリル)エトキシカルボニルのような通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(Ｃ１−Ｃ１６)−アルキルであり、そして基Ｒ５またはＲ６の１つは、水素であり、その他のものは水素、ハロゲン、Ｏ(Ｃ１−Ｃ４)−アルキル(所望により、任意の炭素Ｃ１−Ｃ４でメチルまたはフェニルで置換されている)、−ＮＯ２、ＮＲ１０Ｒ１１、ＮＨＣＯＲ１２、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、末端炭素が−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＲ８Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２{式中、ｎ＝２−８、および当該ＮＨ２−基はまた、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルにより、または通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(Ｃ１−Ｃ１６)−アルキルであり、
Ｒ７は、通常使用されるカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基、
Ｒ８またはＲ９は、水素であり、他方は、低級アルキル(Ｃ１−Ｃ４)、フェニル、ベンジルまたはＲ８およびＲ９は、５または６員環の一部であり、
Ｒ１０およびＲ１１は、独立して水素、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルまたはアミノ保護基(適当な保護基は上記の通り)であり、
Ｒ１２は、何れも(Ｃ１−Ｃ４)アルキルで置換され得る(Ｃ１−Ｃ１０)アルキル、フェニル、保護アミノ基またはハロゲンである]
により示される、化合物。
【請求項２】  以下の構造により示される、請求項１記載の化合物：
【化２】
2002533329.tif 000002
【請求項３】  式(II−III)
Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ｄ'−Ｅ(式(II))
Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅ−Ｄ'−Ｃ(式(III))
[式中、Ａは、固相および溶液相有機化学に適用される標準的物質から選択される固体支持体であり、
Ｂは、Ｄ−Ｃ−Ｄ'−ＥまたはＤ−Ｅ−Ｄ'−Ｃフラグメント、それぞれの遊離のために式(II−III)の蛍光性結合体を切断し得るリンカーであり、
Ｃは、式(Ｉ)から選択された化合物であり、
ＤおよびＤ'は、独立した結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサーであり、
Ｅは、調査される分子である]
により示される、化合物。
【請求項４】  Ａが官能化ポリスチレン基礎樹脂、ポリアクリルアミド基礎ポリマー、ポリスチレン／ポリジメチルアクリルアミド組成物、ＰＥＧＡ樹脂、ポリスチレン−ポリオキシエチレン基礎支持体、Tentagel、ＰＥＧ−ポリスチレングラフトポリマー性支持体、ガラス表面、官能化表面、官能化表面でグラフトした物質またはポリエチレングリコールから選択され、
Ｂがベンジル、ベンズヒドリル、ベンズヒドリリデン、トリチル、キサンチエニル、ベンゾイン、シリコンまたはアリル基礎リンカーから選択され、
Ｃが式(Ｉ)の化合物から選択され、
Ｅが低分子量化合物、ペプチド、タンパク質、炭化水素、核酸、または結合体形成用の官能基を含む脂質から選択される、請求項３記載の化合物。
【請求項５】  以下の構造により示される、請求項３または４記載の化合物：
【化３】
2002533329.tif 000003
【請求項６】  式(IV)
Ｅ−Ｄ'−Ｃ(式(IV))
[式中、Ｅは、調査する分子、
Ｄ'は、結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサーであり、
Ｃは、式(Ｉ)から選択される化合物である]
により示される、化合物。
【請求項７】  以下の構造を有する、請求項６記載の化合物：
【化４】
2002533329.tif 000004
【請求項８】  均一溶液中のＡＩＤＡ標識分子と結合分子との相互作用の同定のための方法であって、下記ステップ：
ステップ１Ａ：式(IV)から選択されるＡＩＤＡ標識分子を提供すること、
ステップ１Ｂ：式(IV)のＡＩＤＡ標識分子を結合分子と混合すること、そして、次いで、
ステップ１Ｃ：蛍光分光法の方法により、ステップ１Ｂに述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること
を含む方法。
【請求項９】  蛍光分光法が、
・連続波＝プロンプト＝安定状態フルオロメーターのＡＩＤＡ放射の蛍光非等方性／偏光性の増加、
・時間分解蛍光装置における回転相関時間の増加、
・蛍光変動の時間追跡における自己相関算出から決定される単一分子蛍光実験における移行放散時間の増大、
・３００と４００nmの範囲の励起波長による３５０と７００nmの範囲の波長のＡＩＤＡ蛍光放射の増加または減少、
・結合分子中の励起トリプトファン(ドナー)からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、この場合、結合体の分子中のＡＩＤＡ色素(アクセプター)に対するペプチドまたはタンパク質である、
・結合分子の蛍光標識(アクセプター)に対する結合分子(ドナー)中の励起ＡＩＤＡ色素からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、この場合、任意の化合物クラスを含む、
の測定である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】  固相有機化学において通常使用される固体支持体上のＡＩＤＡ標識分子と固体支持体を含む均一溶液中の結合分子との間の相互作用の同定の方法であって、下記ステップ：
ステップ２Ａ：式(IIまたはIII)の結合体としてＡＩＤＡ標識分子を提供すること、
ステップ２Ｂ：式(IIまたはIII)の結合体としてのＡＩＤＡ標識分子を結合分子と混合すること、そして、次いで、
ステップ２Ｃ：結合分子に対する最も高い結合親和性でＡＩＤＡ連結分子を同定する方法を提供する定量的シグナルを生ずる蛍光分光法で使用する方法により、ステップ２Ｂに述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること、
ステップ２Ｄ：式(IIまたはIII)により示される同定されたＡＩＤＡ分子を含む固体支持体の単離、
ステップ２Ｅ：方法１Ａ−Ｃに述べた蛍光分光法を用いる種々の方法により、ステップ２Ｄで述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること
を含む、方法。
【請求項１１】  ステップ２Ｃの蛍光分光法が、
・共焦点顕微鏡および分光技術に適用されるＡＩＤＡ含有固体支持体への蛍光標識巨大分子の結合の直接検出、
・固体支持体上の化合物の合成の間に実施される通常の蛍光分光法に通常使用するための、第２環境的感受性分子へのＡＩＤＡの化学的結合による、分子明度の変化の促進の測定、
・蛍光共鳴エネルギー移動の測定：ＡＩＤＡから適当な長波長色素の蛍光共鳴エネルギー移動であって、それにより、長波長色素の放射波長の分子明度の変化により検出さるＡＩＤＡ ＵＶ−励起を用い増感する蛍光共鳴エネルギー移動、
・蛍光共鳴エネルギー移動の測定：３５１nm励起および４００nm放射波長の、固体支持体に連結する分子上のＡＩＤＡの特定明度の減少、
・時間分解単一分子分光法による分子明度の減少または増加を測定することによる量子収量の変化の検出、
である、請求項１０記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
(背景技術)
３つの新しい科学的研究分野は、薬物発見過程における予測性の増加の必要性および全体的損耗率低下の必要性を満たす極めて高い見込みを示す。(１)機能ゲノミクスは、新規な革新的分子標的を生ずることを目的とした。(２)コンビナトリアル化学は、標的を探索する分子多様性を生ずる、ますます効率のよい方法を提供する。(３)高速処理量スクリーニング(ＨＴＳ)プラットフォームは、可能性あるリード化合物の発見に効率および品質を提供する。殆どの製薬会社における高速処理スクリーニングは、現在、１年あたり数百万アッセイの実施を含む。同時に、ＨＴＳは、検出／液体を扱う技術および自動化工程と組合せた、生化学、生物物理学および細胞／分子生物学を吸収した確立された学問分野となった。これら新規の科学的研究分野がもたらしたすべての素晴らしい機会と共に、機能ゲノミクスにおける時間のかかる過程は新規タンパク質の生理的機能の同定であるということが明らかとなった。コンビナトリアル化学が、古典的な合成に必要な時間の間に数倍の化合物の合成を行う一方で、５から１０倍のアッセイがスクリーニングからのヒット化合物の同定に必要となることが現在知られている。応用科学の社会が現在直面する挑戦は、合成、タンパク質機能同定およびスクリーニングの過程をスピードアップすることにより時間的に(１)および(２)の利点を十分に利用することである。本発明は、固相上の直接の化合物のスクリーニングに必要な効率を提供することにより、コンビナトリアル化学およびゲノミクスの利点をＨＴＳと統合する新しい可能性を開示する。標的巨大分子は、たとえ機能が知られていなくても、目的化合物に対する直接の結合親和性について試験し得る。以下でＡＩＤＡ化学として一般的に述べられている、新規蛍光化学はまた、ＡＩＤＡ化学と結合する化合物の直接の適用によるか、または既知の化学的もしくは光物理学的手段による固相からのＡＩＤＡ結合物の切断によるか、何れかにより、均一溶液中のスクリーニングアッセイに適当である。固相スクリーニング技術において同定されたＡＩＤＡ結合“バインダー”の解離後、目的の巨大分子への親和性は、マイクロタイタープレートで使用のアッセイ容積における通常の全体平均蛍光分光学的技術により決定され得る。加えて、マイクロタイター容積で実施され、いわゆるナノキャリアーに適用される単一分子分光学的技術が、使用され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
４ｅの量子収率決定[Demans & Cosby, 1971; Chen et al., 1972]：
４ｅの量子収率を、標準としてキニンスルフェートを使用して決定する[Melhuish, 1961]。
４ｅのＵＶスペクトルとキニンスルフェート(ＣＳ)の間の交差をCary 1Eスペクトロフォトメーターでの二つの物質の溶液の測定により決定する。濃度は４ｅに関してはＴＨＦ中２５μMおよびＣＳに関しては１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４中５０mMであった。スペクトルを２６０nmから３８０nm、光学的通過長１０mmの石英キュベットを使用して記録し、ブランクを溶媒吸光を引くことにより補正する。二つの得られるＵＶスペクトルの交差の点は３４８.３nmと決定され、モノクロメーターシフトのために、SLM-8000Cフルオロメーターで３５２.８nmに対応する。４ｅおよびＣＳの蛍光放出スペクトルを、１光子計数モードでのＵＶ測定と同じ溶液を使用して記録する。ランプ強度補正を対照チャンネルにおける量子カウンターを使用して補正する。ゲインは×１００に設定し、適用した高ボルト数は８３０Ｖである。集積時間は０.５秒である。スリット幅は各々励起に関して１nmおよび放出に関して２nmおよび４nmである。放出スペクトルの記録のため、励起を３５２.８に設定し、放出を、ＩＡＥに関しては３６０から５５０nm、ＣＳに関しては３６０から６５０nmでモニターする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
実施例１Ａ
選択実施例４−[３−(４−アリルオキシカルボニル−フェニル)−１Ｈ−インダゾル−１−イル]安息香酸(４ｅ)の詳細な分光学特徴付：
ＡＩＤＡ誘導体４ｅは、３４２nmで吸収最大を、および４０３nmで最大放出強度を示す。本化合物は、約６０nmの大ストークシフトを有し、殆どの巨大分子環境下でトリプトファン類の放出と商品として入手可能な多くのフルオロフォアの間に位置し、生化学でトレーサーとして使用される(図１−２)。吸収と蛍光励起スペクトルの間の殆ど完全な重複は、励起状態における光化学および光物理作用の可能性が低いことを示す。３３７nmでの吸収係数εは３９９２６Ｍ−１cm−１であり、これはフルオレッシンまたはローダミン誘導体から既知の値の約５０％であるが、ナノモル濃度範囲におけるＦＲＥＴ測定においてアクセプターとして働くには十分高い。４ｅの量子収率、Ｑ４ｅは０.５９１である。トリプトファン(≒０.１)またはフルオレッシン(有機溶媒中、≒０.９、タンパク質またはＲＮＡに結合≒０.２−０.４)と比較して、４ｅのような小化合物で、これは良好な蛍光ドナー特性を示す驚くべき高い量子収率である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
(ｂ)ドナーまたはアクセプターとしての１１での共鳴エネルギー伝達試験。
アクセプターとしてのＡＩＤＡ結合体８：(図３ｂ)
差異スペクトル[Ｉ(８(遊離))＋Ｉ(アビジン(遊離))]−Ｉ(８−アビジン複合体)（図３ｂ、曲線５）。
８のインダゾール分子における３位(１１における１位から)へのビオチンの結合は、蛍光スペクトルを変えるだけでなく、トリプトファンからインダゾールＦＲＥＴ特徴も変える：インダゾール蛍光放出(消光の変わりに)の２６％増加により示される、トリプトファンへの増加したエネルギー伝達(１２０％)は、アビジン環境におけるインダゾール量子収率の非常な増加により重ね合わせられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
ドナーとしてのＡＩＤＡ結合体８：(図３ｄ)
インダゾール放出とBODIPY-FL吸収スペクトルの間の重複積分が１１よりも８で小さいが、アクセプターのより大きな増感が、８−アビジン−BODIPY複合体で起こり、４８％蛍光エネルギー伝達および９３.５％インダゾールドナー消光をもたらす。この効果は、高ドナー量子収率により、または８におけるドナー放出とアクセプター吸収双極子の好ましい相対的配向によりもたらされることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
スキーム１に説明するような、ジアリールケトン(１ａ−ｊ)からのアリールヒドラゾン(２ａ−ｊ)の合成。ジアリールケトン(１ａ−ｊ；１０mmol)とアリールヒドラジン(１１mmol)のメタノール(５０mL)中の懸濁液を、５０時間還流する。加熱すると、透明溶液が得られる。一連の反応の間に結晶性沈殿が形成される。氷浴で冷却後、結晶性生産物(２ａ−ｊ)を濾過して回収し、２回冷メタノールで、数回ジエチルエーテルで洗浄する。２ａ−ｊの結晶を、一晩７０℃の乾燥オーブンに保つ。非対称的に置換されたジアリールケトン(１ｂ−ｆ、１ｉ−ｊ)がＥ／Ｚ−異性体混合物として産生され(２ｂ−ｆ；２ｉ−ｊ)それを更に分割することなく次段階に挿入する。
２ａ−ｊの収率および分析的データ
【表１】
2002533329.tif 000005
＊：Ｅ／Ｚ−異性体の比率(指定していない)；１Ｈ／１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：２ａ−ｊの構造に一致して。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
(ｆ)４−[３−(４−カルボキシフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安息香酸のクロロスルホニル化
(４ｂ)。インダゾール誘導体４ｂ(２１mg、０.０６mmol)をクロロ硫酸(１mL)で１２０℃で１０分処理する。反応混合物を氷浴で冷却し、水に滴下する(０℃、４mL)。沈殿を濾過し、水で洗浄し、８０℃で減圧下乾燥させる：１９ｍｇの４−[３−(４−カルボキシフェニル)５−クロロスルホニル−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安息香酸(４ｑ)(６９％)。ＭＳ(ＥＳＩ)：４５７(１００％)(ＭＨ)＋。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
１,３−ジアミノ−プロパン(８０mL)を、４ｄ(１０.０ｇ、２６.８５mmol)に添加する。異成分から成る反応混合物を、９０℃に撹拌下加熱する。４ｄを一度溶媒に反応温度で溶解し、次いで溶液を４時間放置して反応させる。１,３−ジアミノ−プロパンを減圧下蒸留し、粘性油状物を後に残す。粗生産物をメタノール(２００mL)で希釈し、加熱還流する。メタノールが沸騰温度に到達する前に、結晶性生産物は沈殿を始める。懸濁液を１０分還流させ、次いで室温に冷却する。結晶を減圧濾過により集める。無色結晶を氷状メタノールで１回、次いでジエチルエーテルで数回洗浄する。生産物を乾燥オーブン中、減圧下、１２０℃で乾燥させ、９.８６ｇ(８９％)の５を得る：ｍｐ  ２８５−２８８℃(加熱速度に依存；分解)；１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：１.８５−２.０５(ｍ, ２Ｈ)；２.９０−３.０５(ｍ, ２Ｈ)；３.３５−３.５５(ｍ, ２Ｈ)；７.３２(ｔ，１Ｈ)；７.５１(ｔ，１Ｈ)；７.７５−８.３０(ｍ, １０Ｈ)；９.２０(ブロード, ｔ, １Ｈ, ＣＯＮＨ)；ＭＳ：ｅ／ｍ  ４１５(ＭＨ＋)。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
(ｃ)４−{３−{４−［(３−メチルアミノプロピル)−アミノカルボニル］−フェニル}−１Ｈ−インダゾール−１−イル}−安息香酸(５ａ)の合成。インダゾール４ｄ(１８６mg、０.５mmol)に、３−メチルアミノ−プロピルアミン(５mL)を添加する。溶液を還流温度に８時間保つ。反応混合物を室温に冷却し、水(２０mL)で希釈し、濃塩酸で酸性化する。無色沈殿が形成される。懸濁液を遠心(４５００ｒｐｍ)する。水性層を廃棄する。残りのゲルを塩酸(０.１Ｎ、３０ｍＬ、５回)で洗浄し、真空で７０℃で８時間乾燥させる。粗材料を温ＤＭＦ(２mL)に溶解させる。溶液を室温に冷却し、エーテル(２０mL)で希釈する。白色懸濁液が形成され、茶色沈殿がフラスコの底に分離する。懸濁液を分離し、遠心(４５００ｒｐｍ)する。有機層を除去する。残りの無色固体をエーテル(２ｍＬ、２回)で洗浄し、真空で２時間乾燥させる：９３mg(４３％)の５ａ：ｍｐ  １８６−１９０℃；ＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ＝４２９(１００％)(Ｍ＋Ｈ)＋；１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：１.８５−１.８９(ｍ, ２Ｈ, ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２)；２.５６(ｓ, ＯＨ, ＮＨＣＨ３)；２.９６(ｔ, ブロード, ２Ｈ, ＣＨ２ＮＨ)；３.３３−３.４５(ｍ, ２Ｈ, ＣＯＮＨＣＨ２)；７.４５(ｔ, １Ｈ, インダゾール−Ｈ)；７.６４(ｔ, １Ｈ, インダゾール−Ｈ)；７.９５−８.２８(ｍ, １０Ｈ)；８.８９(ｔ, １Ｈ, ＣＯＮＨＣＨ２)。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
(ａ)２５μM  ４ｅのＴＨＦ溶液の吸収スペクトルおよび蛍光励起スペクトル(---)。蛍光励起スペクトルの小さな赤シフトは、ＵＶと蛍光装置の間の単色光分光器のずれによる。
(ｂ)１μMのＴＨＦ溶液の蛍光放出、３４２nmで励起。
【図２】
(ａ)  −(ｉ)ＡＩＤＡ−結合体１１、９および８(グラフでは各々ＢＬＩ、ＢＰＩおよびＩＰＢと示している)、およびアビジン−トリプトファン、アビジンLucifer Yellowおよびアビジン−BODIPY-FLの励起および放出スペクトルは、トリプトファン、BODIPY-FLおよびLucifer Yellow放出および励起の間の各々の重複を示す。
【図３】
上部パネル：
１１(ＢＬＩ)(ａ)および８(ＩＰＢ)(ｂ)トリプトファンアビジン複合体における蛍光共鳴エネルギー伝達および基底状態消光。曲線は番号１−５で示す。差異スペクトル[(Ｉ(１１または８(遊離))＋Ｉ(アビジン(遊離))]−Ｉ(１１−または８−アビジン複合体)を曲線５に示す。１１蛍光は、アビジン結合部位における複合体形成により、約２５.５％まで消光する。約６２％のこの総消光効果は、蛍光共鳴エネルギー伝達である。２５０から３０５nmで、トリプトファンとチロシン蛍光強度の促進は、１１とアビジンの合計を基本にして７２％である。ビオチンのインダゾール分子の３位への結合(１１では１位)は、蛍光スペクトルだけでなく、トリプトファン→インダゾールＦＲＥＴ特性も変える：インダゾール蛍光放出(消光の変わりに)の２６％増加により示される、トリプトファンへの増加したエネルギー伝達(１２０％)は、アビジン環境におけるインダゾール量子収率の非常な増加により重ね合わせられる。
下部パネル：
１１(ｃ)および８(ｄ)BODIPY-FLアビジン複合体における蛍光共鳴エネルギー伝達および基底状態消光。曲線は番号１−５で示す。両方の分子両方の分子幾何学で、１位(１１)および３位(８)を介して結合したインダゾールトレーサー、BODIPY-FL標識アビジンの結合は、インダゾール放出の７０−９０％消光をもたらす。シグナル強度におけるこの減少は、アビジンにおけるインダゾールまたはＦＲＥＴのＢＯＤＩＰＹ標識に対する基底状態消光により、励起状態の同時非放射デポピュレーションと共にもたらされることができる。インダゾール放出とBODIPY-FL吸収スペクトルの間の重複積分は１１よりも８で小さいが、アクセプター蛍光のより大きな増感が８−アビジンBODIPY複合体でもたらされ、４８％エネルギー伝達および９３.５％インダゾールドナー消光をもたらす。この効果は、８における高いドナー量子収率、またはドナー放出とアクセプター吸収双極子の好ましい相対的配向によりもたらすことができる。