【手続補正書】
【提出日】平成19年10月2日(2007.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  細胞内受容体由来のリガンド結合ドメインと実施可能に連結したヌクレオチド結合ドメインを含む融合タンパク質であって、
該ヌクレオチド結合ドメインが、少なくとも約３ヌクレオチドの隣接するヌクレオチド配列と特異的に相互作用する多趾動物亜鉛フィンガーペプチドまたはそのモジュラー部分であり；かつ
該融合タンパク質が、リガンドで活性化される転写レギュレーターである、
融合タンパク質。
【請求項２】  実施可能に連結した転写制御ドメインをさらに含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】  該細胞内受容体が核ホルモン受容体である、請求項１の融合タンパク質。
【請求項４】  核ホルモン受容体由来の該リガンド結合ドメインが、自然のホルモン受容体と比較してそのリガンド選択性が変化するように改変された、請求項３の融合タンパク質。
【請求項５】  該改変されたリガンド結合ドメインが、内在性のリガンドによって実質的に活性化されない、請求項４の融合タンパク質。
【請求項６】  亜鉛フィンガーペプチドが、式（ＧＮＮ)ｎ、ただしＧはグアニジン、Ｎは任意のヌクレオチド、そしてｎは１ないし６の整数である、のヌクレオチド配列に結合する、請求項１の融合タンパク質。
【請求項７】  ｎが３ないし６である、請求項６の融合タンパク質。
【請求項８】  ヌクレオチド配列と特異的に相互作用し、そして該ヌクレオチド配列を含む外因性または内在性の遺伝子に該融合タンパク質を標的化させる、Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガーペプチドまたはその変異体由来のモジュラーユニットを、該亜鉛フィンガーペプチドが含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項９】  該亜鉛フィンガーペプチドが、標的核酸分子に特異的に結合する少なくとも１つの亜鉛フィンガーまたはその変異体を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１０】  少なくとも３つの亜鉛フィンガーまたはその変異体を含む、請求項９の融合タンパク質。
【請求項１１】  該細胞内受容体が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド−α受容体、グルココルチコイド−β受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体、ＣＯＵＰ−ＴＦ受容体、エクジソン受容体、Ｎｕｒｒ−Ｉ受容体およびオーファン受容体からなる群から選択される核ホルモン受容体である、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１２】  該細胞内受容体がステロイド受容体である、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１３】  該ホルモン受容体が、プロゲステロン受容体変異体またはエストロゲン受容体変異体であって、受容体変異体が、その自然のリガンドと異なる内在性および外因性のリガンドへの選択性と感受性を有するリガンド結合ドメインを含む、請求項４の融合タンパク質。
【請求項１４】  該転写制御ドメインが転写活性化ドメインを含む、請求項２の融合タンパク質。
【請求項１５】  該転写制御ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＴＡ２、ＳＴＡＴ−６、ｐ６５ならびにそれらの転写活性化活性を有する誘導体類、多量体および組合せからなる群から選択される、請求項２の融合タンパク質。
【請求項１６】  該転写制御ドメインが、核ホルモン受容体転写活性化ドメインまたはその転写活性化活性を有する変異体を含む、請求項１４の融合タンパク質。
【請求項１７】  該転写制御ドメインが、ステロイドホルモン受容体転写活性化ドメインまたはその変異体を含む、請求項１４の融合タンパク質。
【請求項１８】  該転写制御ドメインが、ウイルスの転写活性化ドメインまたはその転写活性化活性を有する変異体を含む、請求項１４の融合タンパク質。
【請求項１９】  該転写制御ドメインが、ＶＰ１６の転写活性化ドメインまたはその変異体を含む、請求項１８の融合タンパク質。
【請求項２０】  該転写制御ドメインが転写抑制ドメインを含む、請求項２の融合タンパク質。
【請求項２１】  該転写制御ドメインが、ＥＲＤ、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、デアセチラーゼ、ならびにそれらの誘導体類、多量体および組合せ、例えばＫＲＡＢ−ＥＲＤ、ＳＩＤ−ＥＲＤ、（ＫＲＡＢ）２、（ＫＲＡＢ）３、ＫＲＡＢ−Ａ、（ＫＲＡＢ−Ａ）２、（ＳＩＤ）２、（ＫＲＡＢ−Ａ）−ＳＩＤおよびＳＩＤ−（ＫＲＡＢ−Ａ）、からなる群から選択される、請求項２０の融合タンパク質。
【請求項２２】  配列番号１ないし配列番号１８のいずれかに示すヌクレオチド配列にコードされる、請求項２の融合タンパク質。
【請求項２３】  請求項１の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２４】  請求項２の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２５】  該融合タンパク質が、配列番号１ないし配列番号１８のいずれかに示すヌクレオチド配列にコードされる、請求項２３の核酸分子。
【請求項２６】  請求項１の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２７】  請求項２の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２８】  請求項２６の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２９】  請求項２７の発現ベクターを含む細胞。
【請求項３０】  真核生物細胞である、請求項２８の細胞。
【請求項３１】  真核生物細胞である、請求項２９の細胞。
【請求項３２】  ウイルスベクターである、請求項２６のベクター。
【請求項３３】  ウイルスベクターである、請求項２７のベクター。
【請求項３４】  該ウイルスベクターがＤＮＡウイルスまたはレトロウイルスに由来する、請求項３２のベクター。
【請求項３５】  アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３４のベクター。
【請求項３６】  ウイルスベクターである、請求項３３のベクター。
【請求項３７】  該ウイルスベクターがＤＮＡウイルスまたはレトロウイルスに由来する、請求項３６のベクター。
【請求項３８】  アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３７のベクター。
【請求項３９】  請求項１の融合タンパク質または該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
該融合タンパク質の核酸結合ドメインに認識される少なくとも１つの応答エレメントを含む、制御可能な発現カセット
を含む組合せ。
【請求項４０】  該カセットが治療的産物をコードする遺伝子を含む、請求項３９の組合せ。
【請求項４１】  医薬的に許容し得る賦形剤の中に、該融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸分子および制御可能な発現カセットを含有する単一の組成物を形成する、請求項３９の組合せ。
【請求項４２】  該融合タンパク質または該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および制御可能な発現カセットが別個の組成物の中にある、請求項３９の組合せ。
【請求項４３】  有効量の請求項１の融合タンパク質または該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
医薬的に許容し得る賦形剤
を含む、遺伝子発現を制御するための組成物。
【請求項４４】  単回投与用に製剤された、請求項４３の組成物。
【請求項４５】  有効量の請求項２の融合タンパク質；および
医薬的に許容し得る賦形剤
を含む、遺伝子発現を制御するための組成物。
【請求項４６】  該制御可能な発現カセットが３個ないし６つの応答エレメントを含む、請求項３９の組合せ。
【請求項４７】  請求項１の融合タンパク質または該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入すること；および
該融合タンパク質中の結合ドメインと相互作用するリガンドに細胞を接触させ、該融合タンパク質が標的核酸分子と相互作用して、コードされる遺伝子の転写を該融合タンパク質によって活性化または抑制すること
を含む、細胞内で遺伝子発現を制御する方法。
【請求項４８】  該リガンド結合ドメインが非天然リガンドと相互作用するように改変された、請求項４７の方法。
【請求項４９】  該標的核酸分子が、細胞にとって内在性である、請求項４７の方法。
【請求項５０】  該標的核酸分子が、発現カセットの部分として細胞に導入される、請求項４７の方法。
【請求項５１】  該発現カセットおよび融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸が、同時に導入される、請求項４７の方法。
【請求項５２】  該発現カセットおよび融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸が、逐次的に導入される、請求項４７の方法。
【請求項５３】  該融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸分子が細胞に導入された後に、リガンドが細胞に送達される、請求項４７の方法。
【請求項５４】  該融合タンパク質をコードする該核酸分子が、ベクターを構成する、請求項４７の方法。
【請求項５５】  該ベクターがウイルスベクターである、請求項５４の方法。
【請求項５６】  該細胞が哺乳動物内にある、請求項４７の方法。
【請求項５７】  該発現カセットがベクターに含有される、請求項５０の方法。
【請求項５８】  該ベクターがウイルスベクターである、請求項５７の方法。
【請求項５９】  該細胞が哺乳動物内にある、請求項５０の方法。
【請求項６０】  核ホルモン受容体由来の該リガンド結合ドメインが、自然のホルモン受容体と比較してそのリガンド選択性が変化するように改変されたものである、請求項４７の方法。
【請求項６１】  該改変されたリガンド結合ドメインが、内在性のリガンドによって実質的に活性化されない、請求項６０の方法。
【請求項６２】  亜鉛フィンガーペプチドが、式（ＧＮＮ)ｎ、ただしＧはグアニジン、Ｎは任意のヌクレオチド、そしてｎは１ないし６の整数である、のヌクレオチド配列に結合する、請求項４７の方法。
【請求項６３】  ｎが３ないし６である、請求項６２の方法。
【請求項６４】  ヌクレオチド配列と特異的に相互作用し、そして該ヌクレオチド配列を含む外因性または内在性の遺伝子に該融合タンパク質を標的化させる、Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガーペプチドまたはその変異体由来のモジュラーユニットを、該亜鉛フィンガーペプチドが含む、請求項４７の方法。
【請求項６５】  該亜鉛フィンガーペプチドが、標的核酸分子に特異的に結合する少なくとも１つの亜鉛フィンガーまたはその変異体を含む、請求項４７の方法。
【請求項６６】  少なくとも３つの亜鉛フィンガーまたはその変異体を含む、請求項６５の方法。
【請求項６７】  該細胞内受容体が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド−α受容体、グルココルチコイド−β受容体、ミネラルコルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体、ＣＯＵＰ−ＴＦ受容体、エクジソン受容体、Ｎｕｒｒ−Ｉ受容体およびオーファン受容体からなる群から選択される核ホルモン受容体である、請求項４７の方法。
【請求項６８】  該細胞内受容体がステロイド受容体である、請求項４７の方法。
【請求項６９】  該多趾動物亜鉛フィンガーペプチドまたはそのモジュラー部分が、少なくとも約３ヌクレオチドないし約１８ヌクレオチドの隣接するヌクレオチド配列と特異的に相互作用する、請求項１の融合タンパク質。
【請求項７０】  請求項１の融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、非ウイルスの送達システム。
【請求項７１】  発現カセットを含む核酸分子をさらに含み、該発現カセットは、該融合タンパク質の核酸結合ドメインが相互作用するヌクレオチド配列を含有するものである、請求項７０の非ウイルスの送達システム。
【請求項７２】  該非ウイルスの送達システムが、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ４沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポソーム法およびリポフェクションからなる群から選択される、請求項７０の非ウイルスの送達システム。
【請求項７３】  該亜鉛フィンガーペプチドが、標的核酸分子と約１．０ナノモルより小さい解離定数で特異的に結合する少なくとも１つの亜鉛フィンガーまたはその変異体を含む、請求項９の融合タンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
発明の背景
細胞内受容体は、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモンおよびビタミンＡおよびＤを含むさまざまなホルモンおよびエフェクター分子の核への作用を介在する関連タンパク質のスーパーファミリーである。細胞内受容体の本ファミリーのメンバーは、基本型のリガンド活性化転写因子である。これらの受容体は、２つの基本的な機能のドメイン：約６６アミノ酸を含むＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)および約３００アミノ酸を有する受容体のＣ末端側の半分に位置するリガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)を含む。受容体は、熱ショックタンパク質のような不活性化因子と関連しているため、ホルモン(リガンド)の不存在下では不活性である。リガンドが結合すると、受容体は不活性複合体から解離してダイマー化し、このことによりそれらはＤＮＡと結合できるようになり、転写を調節できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
リガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)
ＬＢＤは細胞内受容体、特にステロイドホルモン受容体由来のものである。ＬＢＤの由来となる受容体は、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体、ＣＯＵＰ−ＴＦ受容体、エクジソン受容体、Ｎｕｒｒ−Ｉ受容体、オーファン受容体およびその変異体を含むが、これらに限定されない。これらの種類の受容体は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド−α受容体、グルココルチコイド−β受容体、アンドロゲン受容体および甲状腺ホルモン受容体を含むが、これらに限定されない。ＬＢＤは、好ましくは、内在性のリガンドと比較して外因性のリガンド、例えば薬物と優先的に結合するようにリガンド選択性を改変するように修飾される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
核酸結合ドメイン(ＤＢＤ)は、少なくとも１、好ましくは少なくとも２亜鉛フィンガー核酸結合ポリペプチドのモジュラーユニットを含み、各モジュラーユニットは３塩基のヌクレオチド配列を特異的に認識する。得られるＤＢＤは、３〜約１８ヌクレオチドの隣接するヌクレオチド配列に結合する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
組成物、組合せおよびキット
融合タンパク質または融合タンパク質をコードするベクターを含む組成物も提供される。融合タンパク質または該タンパク質をコードしている核酸および融合タンパク質による活性化のために選択された制御領域を有する標的遺伝子をコードする核酸の組合せも提供される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
既に述べたように、標的制御領域および目的の遺伝子は、細胞中に内在的に存在し得、または目的の遺伝子をコードしている発現カセットの一部として別々に投与され得る。別々に投与される場合、それは遺伝子および融合タンパク質のヌクレオチド結合ドメインにより認識される遺伝子に関する少なくとも１つの応答エレメントを含む制御可能な発現カセットの一部として投与される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
ここで使用されるように、“宿主細胞”は、ベクターを増加させ、そしてそのＤＮＡを発現させることのできる細胞である。対象の宿主細胞の後代も含む。すべての後代が親細胞と同一であるとはいえず、なぜなら、複製中に発生する突然変異があり得るからである。用語“宿主細胞”が使用されるとき、そのような後代が含まれる。安定的導入の方法であって、ここで、外因性ＤＮＡが宿主に継続的に維持される方法は、当業界で既知である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
ここで使用されるように、リガンドは、受容体のリガンド結合ドメインと相互作用し、その活性を調節する任意の化合物を意味する；リガンドは典型的に受容体を活性化する。リガンドは、結合なく受容体を活性化する化合物も含むことができる。天然のリガンドは、その受容体と通常は相互作用する化合物である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
ここで、融合タンパク質は、標的遺伝子に結合するように選択された、細胞内受容体から１以上の亜鉛フィンガードメインへ、ＬＢＤドメインを実施可能なように連結することにより作成する。転写調節ドメインはまた、実施可能なように連結し得る。これは、当業者に既知の任意の方法により行われる。一般的に融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸を発現することにより産生される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド変異体は既知モチーフから構成され得る。当該変異体は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方のような細胞性ヌクレオチド配列に結合および特異的に結合し、細胞性ヌクレオチド配列の機能を調節する、少なくとも２つおよび好ましくは少なくとも約４つの亜鉛フィンガーモジュールを含む。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
第二のリプレッサータンパク質は、Krueppel-associated box(KRAB)ドメインを用い産生された(Margolin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513)。このリプレッサードメインは、亜鉛フィンガータンパク質のＮ末端で通常発見され、ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＫＡＰ−１(Friedman et al. (1996) Genes & Dev. 10: 2067-2078)との相互作用により、距離および方向独立性方法(Pengue et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1015-1020)でＴＡＴＡ依存転写の抑制活性があると推定される。亜鉛フィンガータンパク質ＫＯＸ１のアミノ酸１から９７の間に見られるＫＲＡＢドメイン(Margolin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4509-4513)を用いた。この場合、６フィンガータンパク質とのＮ末端融合が構成された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
４．医薬組成物および組合せ
医薬的に許容される担体において、治療的に有効量の融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子が含まれる医薬組成物もまた提供される。別の亜鉛フィンガーヌクレオチド結合ドメインを有する１以上の融合タンパク質を含む医薬組成物を意図する。発現カセットを含む医薬組成物および当該リガンドを含む組成物もまた提供する。多数の組成物を含む組合せもまた提供する。