【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年8月24日(2007.8.24)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硫酸水素塩処理した核酸を精製するための方法であって：
（ａ）亜硫酸水素塩処理した核酸を含む液体を、多孔性のサイズ区別障壁を含むサイズ排除デバイス中に提供する工程；
（ｂ）該核酸を該障壁により保持させながら該障壁に液体を通すことによって、該サイズ排除デバイス中で該核酸を洗浄する工程；
（ｃ）該洗浄された核酸を該サイズ排除デバイス中にて塩基で処理し、そのｐＨを増加させる工程；および
（ｄ）必要に応じて、工程（ｃ）から得られる該核酸を洗浄して、精製された亜硫酸水素塩処理された核酸を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記工程（ｄ）は、前記サイズ排除デバイス中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多孔性のサイズ区別障壁は、３００Ｋカットオフを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多孔性のサイズ区別障壁は、１００Ｋカットオフを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多孔性のサイズ区別障壁は、３０Ｋカットオフを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸中の１つ以上のシトシン塩基をウラシル塩基へと変換する方法であって：
該核酸を亜硫酸水素塩変換試薬と接触させ、それにより亜硫酸処理された核酸を形成する工程；
該処理された核酸を、多孔性のサイズ区別障壁を含むサイズ排除デバイス中で洗浄する工程であって、該障壁は、該亜硫酸処理された核酸を保持しながら、残存する亜硫酸水素塩変換試薬を通過させる、工程；
該洗浄する工程の間または後に、該保持された亜硫酸水素塩処理された核酸を、ｐＨ１０以上を含む塩基性条件に供して、少なくとも１つのシトシン塩基がウラシル塩基へと変換された核酸を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
前記多孔性のサイズ区別障壁は、膜を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記障壁は、３００Ｋカットオフを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記障壁は、１００Ｋカットオフを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記障壁は、３０Ｋカットオフを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗浄する工程は、圧力下で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記洗浄する工程は、前記デバイスの遠心分離を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記亜硫酸水素塩変換試薬は、亜硫酸水素ナトリウムを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記亜硫酸水素塩変換試薬は、亜硫酸水素マグネシウムを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩基性条件は、０．１Ｍ  ＮａＯＨを含む、請求項６に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】サイズ排除工程を使用する改善された亜硫酸水素塩法
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／４９８，９９６号および２００３年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／５２０，９４１号（これらの各々は、参考として援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
（分野）
本発明は、一般に、亜硫酸水素塩処理した核酸サンプルを精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ＤＮＡのメチル化の評価は、多くの調査分野、診断分野、医療分野、法医学分野、および産業分野において有用である。この評価に対する重要な点は、シトシンをウラシルに変換するが、メチルシトシンをチミンに変換しないことである。亜硫酸水素ナトリウムを使用する、このような変換についての１つの基本的な方法は、周知である。幾年にもわたって、この方法は、冗長な手順、長い反応時間、そしてＤＮＡ分解を包含する不都合を克服するための試みにより改善されてきた。現在、最も一般に使用されるプロトコルは、非特許文献１（本明細書中において、その全体が参考として援用される）により教示される。この方法は、変性、ヒドロキノンの存在下における亜硫酸水素ナトリウムとの反応、そしてその後のＮａＯＨ処理による上記改変の完了を包含する。このプロトコルを改善する試みにもかかわらず、現在の手順はなお、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）への予備変性、新鮮な亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）溶液（代表的には、約３Ｍ）の調製、そして抗酸化剤（例えば、ヒドロキノン）の含有を必要とする。このプロトコルはまた、長い反応時間、および冗長な清浄化手順を包含する。
【０００４】
さらに、現在使用される亜硫酸水素ナトリウムプロトコルは、不完全な変換、再現性のない結果、および他の問題の報告により悩まされている。いくつかの場合において、この反応は、有意なＤＮＡ分解（報告によれば、ほぼ９６％）をもたらし、これによって、さらなる解析のために十分なサンプルを得るのが困難になる。非特許文献２を参照のこと。
【０００５】
亜硫酸水素マグネシウム、ポリアミン化合物、および／または第四級アミン化合物を使用する亜硫酸水素塩法は、亜硫酸水素ナトリウム変換反応に対する有用な代替法を提供することが発見されている。これらの発見は、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｆｏｒ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  Ｔｏ  Ｕｒａｃｉｌ」である共有に係る出願（２００３年８月２９日に出願された米国出願第６０／４９９，１１３号、および２００３年１１月１７日に出願された同じ発明の名称を有する米国出願第６０／５２０，９４２号）、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｆｏｒ  Ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ  Ａｍｉｎｅ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  Ｔｏ  Ｕｒａｃｉｌ」である共有に係る出願（２００３年８月２９日に出願された米国出願第６０／４９９，１０６号明細書、およびまた２００３年１１月１７日に出願された同じ発明の名称を有する米国出願第６０／５２３，０５４号）、ならびに発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｔａｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｃｉｎｅ  ｔｏ  Ｕｒａｃｉｌ」の共有に係る出願（２００３年８月２９日に出願された米国出願第６０／４９９，０８２号、および２００３年１１月１７日に出願された同じ発明の名称を有する米国出願第６０／５２３，０５６号（５１８０Ｐ２））（これらの各々は、本明細書によりその全体が参考として援用される）の主題である。
【０００６】
亜硫酸水素変換反応と関連して使用される２種類の広く報告された精製方法は、吸着樹脂（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ樹脂、または類似のＤＮＡ結合樹脂）、または透析のいずれかを利用する。ＤＮＡメチル化の評価の重要性を考慮すれば、シトシンからウラシルへの変換のため、およびそのような変換産物の精製のための、改善された方法論に対する必要性が存在すると理解され得る。本出願人は、このような改善された方法論を開発した。この方法論は、発明の名称が「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｍｅｔｈｏｄ」である共有に係る出願（２００３年８月２９日に出願された米国出願第６０／４９８，９９６号および２００３年１１月１７日に出願された同じ発明の名称を有する米国出願第６０／５２０，９４１号（これらは、本明細書によりその全体が参考として援用される））の主題である。
【非特許文献１】Ｊ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，９８２１−２６（１９９６）。
【非特許文献２】Ｓ．Ｊ．Ｃｌａｒｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ２００１，２９、ｎｏ．１３、６５。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
特定の実施形態において、本発明は、亜硫酸水素塩処理した核酸サンプルを精製する方法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプルを調製するための方法を提供し、この方法は、少なくとも１つのシトシン核酸塩基を含む核酸を提供する工程；上記サンプルと亜硫酸水素塩変換試薬とを接触させる工程；および接触したサンプルをサイズ排除デバイスを使用して精製する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記精製工程は、上記サンプルと塩基とを接触させてｐＨを増加させ、そしてウラシルへの変換の達成を容易にする工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記塩基はＮａＯＨ（例えば、約１Ｍの濃度）である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記サイズ排除デバイスは、３００Ｋカットオフ、または１００Ｋカットオフ、あるいは３０Ｋカットオフを有し得る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記亜硫酸水素塩変換試薬は、亜硫酸水素ナトリウムを含む。さらなる実施形態において、亜硫酸水素塩変換試薬は、亜硫酸水素マグネシウムを含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、本発明は、亜硫酸水素塩処理した核酸サンプルを精製する方法を提供し、この方法は、このサンプルを塩基で処理する工程；および処理したサンプルを洗浄する工程を包含し；ここで、上記処理工程および洗浄工程の少なくとも一方は、サイズ排除デバイスを使用して実施される。いくつかの実施形態において、上記処理工程および洗浄工程は、サイズ排除デバイスを使用して実施される。いくつかの実施形態において、上記塩基は、ＮａＯＨ（例えば、約０．１Ｍの濃度）である。いくつかの実施形態において、上記サイズ排除デバイスは、１００Ｋカットオフ、または３０Ｋカットオフ、そしてことによると３００Ｋと同じくらい大きなカットオフを有し得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記亜硫酸水素塩処理は、亜硫酸水素ナトリウムとの反応を包含する。さらなる実施形態において、上記亜硫酸水素塩処理は、亜硫酸水素マグネシウム（例えば、約０．５Ｍ〜約２．５Ｍの濃度）、または亜硫酸マンガン（例えば、約１Ｍ〜約２Ｍの濃度）との反応を包含する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、亜硫酸水素塩処理した核酸の精製のための方法が提供される。この方法は、
（ａ）亜硫酸水素塩処理した核酸サンプルをサイズ排除デバイス中に入れる工程；
（ｂ）必要に応じて、上記サイズ排除デバイス中で上記サンプルを洗浄する工程；
（ｃ）上記サイズ排除デバイス中で上記洗浄されたサンプルを塩基で処理する工程；および
（ｄ）必要に応じて上記サンプルを洗浄する工程、
を包含する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）は、上記サイズ排除デバイス中で実施される。
【００１５】
さらなる実施形態において、この方法は、上記サンプルを緩衝液で抽出する工程をさらに包含し、いくつかの実施形態において、この緩衝液は、ＴＥ緩衝液である。このようないくつかの実施形態において、上記緩衝液による可溶化は、上記サイズ排除デバイス中で実施される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記塩基は、ＮａＯＨ（例えば、約０．１Ｍの濃度）である。いくつかの実施形態において、上記サイズ排除デバイスは、３００Ｋカットオフ、または１００Ｋカットオフ、あるいは３０Ｋカットオフを有し得る。いくつかの実施形態において、この方法は、上記工程（ｂ）および上記工程（ｄ）のうちの１つ以上を繰り返す工程をさらに包含する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記サイズ排除デバイス中で実施されるこの方法の１つ以上の工程は、遠心分離（例えば、約２８００ＲＰＭ）（モデル５４１４  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機において５００×ｇ）を使用して実施される。いくつかの実施形態において、上記遠心分離は、約８分間実施される。いくつかの実施形態において、上記サイズ排除デバイスは、遠心分離を使用するかまたは使用せずに、そのデバイスを通るように溶媒および低分子量種を圧迫するために、この反応混合物の上部に適用される正圧（例えば、ガス性圧力）に供される。
【００１８】
前述の方法の各々のいくつかの実施形態において、上記核酸、亜硫酸水素塩処理した核酸、または核酸サンプルは、約０．３〜約３００ｎｇのＤＮＡを含む。他の実施形態において、さらなるＤＮＡが、上記サンプル中に含まれる。特定の実施形態において、上記洗浄工程の各々は、それぞれ２００〜３５０μＬの洗浄溶液を使用した。
【００１９】
上記亜硫酸水素塩処理した核酸の脱スルホン化に続いて、得られた生成物は、多種多様な分析手順または調製手順（例えば、増幅（例えば、ＰＣＲ、全ゲノム増幅などによる）、配列決定（必要に応じて増幅に続き得る）、ディファレンシャルハイブリダイゼーション、質量分析、または他の技術（例えば、Ａ．Ｈｕｍｅｎｙら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１３（２００３）１６０−１６６；Ｒ．Ｐ．Ｂａｌｏｇら、Ｐａｒａｌｌｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０９（２００２）３０１−３１０；Ｈ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７８（２０００）１６５−１６９；Ｅ．Ｊ．Ｏａｋｅｌｅｙら、ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８４（１９９９）３８９−４００；およびＣ．Ｇｒａｎａｕら、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ
ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（２００１）ｅ６５））のいずれかにおいて使用され得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記標的核酸における１つ以上のシトシンのメチル化状態は、任意の適切な方法により決定され得る。代表的には、以前に非メチル化シトシンであり、かつ上記亜硫酸水素塩処理によりウラシルに変換されたヌクレオチドの位置におけるウラシルの存在または相対量を測定することにより、メチル化状態は決定され得る。所望される場合、（メチルシトシンの存在を示す）同じヌクレオチド位置における残ったシトシンの存在、または相対量は、特定のヌクレオチドの位置におけるメチル化の程度を決定するために、ウラシルの量と比較するために測定され得る。所望される場合、適切なコントロール実験もまた、シトシンからウラシルへの不完全な変換について補正するために実施され得る。
【００２１】
特定のヌクレオチド位置におけるウラシルおよび／またはメチルシトシンの存在あるいは量は、任意の適切な方法（例えば、ＤＮＡ配列決定（例えば、サンガー法、またはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法、またはその引き続く実施形態（例えば、ＷＯ  ０２／３０９４４において議論され、そしてＡｎｓｏｒｇｅらによる、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ−Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｎｄ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７で議論されるような）色素で標識したターミネーター、または色素で標識したプライマーを使用する））、ＰＣＲ（例えば、プライマー特異的ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＯＬＡ）、または他のライゲーションに依存する技術（例えば、米国特許第６，５１１，８１０号、およびその中で引用される参考文献を参照のこと）、（潜在的なメチル化部位にわたる）一塩基伸長、質量分析、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｃおよび／またはＵに相補的である標識プローブを使用する）、配列特異的なプローブを含むマイクロアレイなど）により、測定され得る。種々の例示的な技術はまた、Ｋｉｒｋら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：３２９５−３３１１（２００２）により記載される。
【００２２】
（詳細な説明）
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的であるだけであり、本発明の限定ではないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は、そうではないと具体的に示されない限り、複数形を含む。本出願において、他のように示されない限り、「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、ならびに他の語形（例えば、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、および「含まれる、包含される（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」）の使用は、限定的であるとは意図されない。また、「要素」または「成分」のような用語は、そうではないと具体的に示されない限り、１つのユニットを含む要素および成分、ならびに１つより多いサブユニットを含む要素および成分の両方を包含する。
【００２３】
本明細書中で使用される節の表題は、組織化の目的のみのためのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。本出願において引用される全ての
文書（特許、特許出願、論文、書籍、および学術論文が挙げられるが、これらに限定されない）または文書の一部は、任意の目的のためにその全体が本明細書により参考として明白に援用される。
【００２４】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「ｇＤＮＡ」とは、ゲノムＤＮＡをいう。
【００２５】
用語「ＰＣＲ」は、当該分野で周知であるように、ポリメラーゼ連鎖反応を示すように意図される。用語「ＭＳＰ」は、Ｊ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，９８２１−２６（１９９６）により記載され、そして本明細書中で議論されるとおりに改変されたようなメチル特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）を示す。
【００２６】
用語「核酸」は、例えば、核酸塩基含有ポリマー化合物（その天然に存在する形態または天然に存在しない形態を含む）（例えば、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、フラグメント化した核酸、細胞の下小器官（例えば、ミトコンドリア、またはクロロプラスト）から得られた核酸、および生物学的サンプル上もしくは生物学的サンプル中において存在し得る微生物から得られた核酸、または生物学的サンプル上もしくは生物学的サンプル中において存在し得るＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスから得られた核酸）を包含する。
【００２７】
「精製」とは、本明細書中で使用される場合、亜硫酸水素塩処理した核酸サンプルから、１種以上の混入した種（例えば、限定されないが、過剰な塩（例えば、亜硫酸水素塩））を取り除くプロセスである。同様に、精製された産物または精製された核酸とは、このような精製から得られた産物をいう。
【００２８】
用語「サイズ排除デバイス」とは、物質のサイズに基づいてその物質を分離可能な濾過デバイスをいう。このようなデバイスの１つの非限定的な例示的クラスは、濾過型クラスであり、ここで、サンプルの成分は、小さな分子が大きな分子よりも素早く通過することを可能にするマトリックスを通ることにより、分子量に基づいて分離される。代表的には、濾過型デバイスは、上記マトリックスを通過可能である分子の分子量の上限を表す分子量カットオフにより特徴付けられる。代表的には、サンプル溶液または反応混合物は、（遠心分離による）遠心分離の力の適用、または正圧の適用（例えば、ガス性圧力の適用、またはその溶液もしくは反応混合物の上へのピストンの適用）により分子量分離マトリックスの通過を強制される。いくつかの実施形態において、このマトリックスは、膜として提供される。このようなデバイスは、代表的には、上部チャンバと下部チャンバとの間に一体化したフィルター材料を有する。このようなサイズ排除デバイスの例は、市販のＭｉｃｒｏｃｏｎ  ３００、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ５０、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ３０、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ３、およびＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３Ｋ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０Ｋ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ５０Ｋ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １００Ｋ、およびＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３００Ｋ（全てＭｉｌｌｉｐｏｒｅから）、ならびに１０Ｋカットオフ、３０Ｋカットオフ、１００Ｋカットオフ、および３００Ｋカットオフにおいて利用可能なＮａｎｏｃｅｐ（全てＰａｌｌ  Ｃｏｒｐから）がある。ＭｉｃｒｏｃｏｎユニットおよびＣｅｎｔｒｉｃｏｎユニットは、同じデバイスであるが、使用され得る溶液の容積において異なる。また、多くのサンプルを同時に処理するために、９６ウェルプレートも利用可能である。このような複数サンプルウェルのプレートの使用は、精製プロセスをより簡便にする。従って、いくつかの実施形態において、「サイズ排除デバイス」は、小さい分子（例えば、上に例示されるように、所定の分子量カットオフよりも小さい分子）を通過させながら（上記カットオフよりも大きな分子量を有する）大きな分子を保持することが可能な、多孔性のサイズ区別障壁を含む。例えば、このようなデバイスは、多孔性の膜を備える超遠心分離デバイス（例えば、直前に記載された型のＭｉｃｒｏｃｏｎ濾過デバイスまたはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ濾過デバイス）であり得る。
【００２９】
他の実施形態において、「サイズ排除デバイス」は、サイズ排除（ゲル濾過）粒子（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ）を含み得、あるいは本明細書中で報告される配列決定において使用されるＥｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｒｆｏｒｍａサイズ排除デバイスもまた、使用され得る。このような実施形態は、より大きな分子が大量の溶出物とともに通過する間に、粒子の孔中に一過性に捕らえられ得るより小さな分子を保持することにより作動し、その結果より大きな分子は、最初に溶出する。
【００３０】
亜硫酸水素塩イオンは、ＨＳＯ−３という慣習的な意味を有する。代表的に、亜硫酸水素塩は、亜硫酸水素塩（例えば、式Ｍｇ（ＨＳＯ３）２を有する亜硫酸水素マグネシウム、または、式ＮａＨＳＯ３を有する亜硫酸水素ナトリウム）の水溶液として使用される。
【００３１】
ｓｓＤＮＡは、代表的には、ＤＮＡを変性することから生じた一本鎖ＤＮＡ（しかし、常にそうとは限らない）をいう。
【００３２】
ＴＥ緩衝液は、核酸分析で使用されかつ当該分野で周知である標準溶液である、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡの緩衝化溶液を指す。
【００３３】
他に特定されない限り、本明細書中で「シトシン」に対する言及は、非メチル化シトシンをいい、そして「変換」は、非メチル化シトシンからウラシルへの特定の変換を指す。メチルシトシンは、チミンに変換されない。
【００３４】
用語「亜硫酸水素塩変換試薬」は、シトシンからウラシルへの亜硫酸水素塩変換のために使用される試薬を示すことが意図される。亜硫酸水素塩変換試薬の例としては、亜硫酸水素ナトリウムまたは亜硫酸水素マグネシウムの溶液が挙げられる。
【００３５】
用語「亜硫酸水素塩処理した核酸」は、当該分野で公知の亜硫酸水素塩変換プロトコル、または本明細書中に記載される同時提出された出願において報告される亜硫酸水素塩変換プロトコルに対し、適切な量の亜硫酸水素塩イオンと接触された核酸を意味することが意図される。従って、用語「亜硫酸水素塩処理した核酸」は、塩基での処理の前に、例えば、亜硫酸水素マグネシウムまたは亜硫酸水素ナトリウムと接触された核酸を包含する。
【００３６】
サイズ排除に基づく少なくとも１つの分離を使用した、亜硫酸水素塩処理した核酸サンプルの調製または精製のための方法もまた、提供される。本明細書中に記載される方法は、公知の精製方法を使用する場合に代表的に報告されるものの１／１０〜１／２０のサンプルを使用するにもかかわらず、適切なＰＣＲ基質を提供し得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、この方法は、少なくとも１つのシトシン核塩基を含む核酸を提供する工程；上記サンプルを亜硫酸水素塩変換試薬と接触させる工程；および、サイズ排除デバイスを使用して上記接触したサンプルを精製する工程を包含する。この核酸サンプルを亜硫酸水素塩変換試薬と接触させる工程は、亜硫酸水素塩変換反応を実施するために現在公知の手段のいずれかにおいて、または本明細書中に記載される同時提出された出願において開示される方法のいずれかにより、達成され得る。例えば、Ｊ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，９８２１−２６（１９９６）を参照のこと。
【００３８】
亜硫酸水素塩処理した核酸サンプルを精製または調製する方法も、提供される。この方法は、サンプルを塩基で処理する工程；および、処理したサンプルを洗浄する工程を包含し、ここで、処理工程および洗浄工程の少なくとも一方は、サイズ排除デバイスを使用して実施される。本発明のいくつかの実施形態によれば、処理工程および洗浄工程の両方は、サイズ排除デバイス中で実施され得る。このようないくつかの実施形態において、核酸と亜硫酸水素塩含有試薬との間の反応産物は、本明細書中に記載されるようにサイズ排除デバイス中におかれ、次いでインサイチュで亜硫酸水素塩変換反応を完了するのに十分な（すなわち、上記のシトシンのスルホン酸塩付加物を脱スルホン化するのに十分な）塩基性溶液（代表的には、約０．１ＭのＮａＯＨ）で処理される。次いで、得られた脱スルホン化サンプルは、必要に応じてインサイチュにおいてサイズ排除デバイス中で洗浄される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、この方法は、緩衝液（代表的には限定されないがＴＥ緩衝液を使用してサンプルを抽出する工程（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９））をさらに包含する。ＤＮＡを回収するための緩衝液を用いた可溶化もまた、インサイチュにおいてサイズ排除デバイス中で実施され得る。本発明の方法はまた、複数の洗浄工程を包含し得、この洗浄工程は、インサイチュにおいて、サイズ排除デバイス中で実施され得る。いくつかの実施形態において、亜硫酸水素塩処理反応が、このデバイス中で実施される。
【００４０】
このようにして、いくつかの実施形態において、本発明の方法はインサイチュにおいて上記サイズ排除デバイス中で実施され得、１つ以上の工程後の遠心分離（例えば、約８分間、約２８００ＲＰＭ（製造者の通知によると、５００×ｇ））し、その後、濾液を取り除く。１つの代表的ではあるが非限定的なプロトコルにおいて、核酸サンプルを、まず水で希釈する。次いで、遠心分離後および分別後、上記サンプルを水で１〜３回さらに洗浄し、各々の工程後、遠心分離し、そして濾液を取り除く。次いで、水で洗浄し、続いて０．１Ｎ  ＮａＯＨで洗浄し、そして約６〜８分間遠心分離し、そして濾液を分別する。もう一度水で洗浄し、続いて再度遠心分離して、濾液を除去する。最終的に、ＴＥ緩衝液（代表的にｐＨは約８）を上記サンプルに添加し、次いで、約５分間静置しておき、その後、このサンプルを回収する。上記サンプルはピペットによりＴＥの除去する工程か、またはデバイスを逆さにして、遠心分離による内容物を回収する工程のいずれかにより、回収され得る。
【００４１】
サイズ排除デバイスの分子量カットオフは、所望の成分を保持し、そして所望でない種（例えば、亜硫酸水素塩）が通過するように選択される。いくつかの実施形態において、上記サイズ排除デバイスは、３００Ｋカットオフ、または１００Ｋカットオフ、または３０Ｋカットオフを有する。しかし、任意の適切なカットオフを有するサイズ排除デバイスが、本発明の方法において使用され得ることが理解される。
【００４２】
本明細書で記載される清浄化プロセスを使用することにより、使用される亜硫酸水素塩変換反応に関係なく、亜硫酸水素塩で（シトシンをウラシルへ）変換されたＤＮＡの回収において改善が見られたことが、本発明に従って発見されている。従って、本発明の方法は、その後のＰＣＲおよび／または他のプロセスのための亜硫酸水素塩処理したＤＮＡを作成するための、周知かつ受容された亜硫酸水素ナトリウム変換反応に適用可能である。シトシンをウラシルに変換する他の方法はまた、例えば、上記の同時に提出された出願において記載される方法で使用され得る。
【００４３】
また、亜硫酸水素塩変換において見られる、報告された核酸分解レベルは、報告されたように変換反応中は起こらず、冗長な清浄化プロセスからの材料の損失に起因して、かなり低収量であることが、本発明に従って発見されている。従って、本発明は、サンプル中の核酸の損失を低減し得る容易かつ効率的な清浄化プロセスを提供する。
【００４４】
特定の理論に束縛を受けるのは望ましくないが、シトシンからウラシルへの変換は、以下のスキームＩに示されるように、２つの別の、動力学的に別個の工程において起こると考えられている。
【００４５】
【化１】
2007503813.tif 000001
第１工程は、シトシン環の６位へ−ＳＯ３部分を付加し、およびこのシトシン環の５位へ水素原子を付加して、スルホネート付加物を形成する工程である。得られた付加物は、未改変のシトシンと平衡して存在し、そして低反応温度、および低ｐＨ（通常、ｐＨ５最適とされる）の両方が推奨される。従って、低ｐＨは、シトシンからウラシルへの全体的な変換に対して必要である。この変換の第２工程は、脱アミノ化である。脱アミノ化反応の速度は、ウラシル形態の６−スルホネート付加物の濃度に一次であることが報告されている。Ｈａｙａｔｓｕ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７６  １６，７５−１２４を参照のこと（本明細書中でその全体が参考として援用される）。ウラシル−６−スルホネートの脱スルホン化は、酸性反応条件下で容易でないことから、ｐＨ１０またはそれ以上の塩基による処理が、ＰＣＲまたは他のプロセス前にウラシルを脱スルホン化するために通常必要とされる。
【００４６】
いずれかの特定の理論に束縛を受けるのは望ましくないが、本開示の方法の成功のための１つの可能性のある根拠は、亜硫酸水素塩変換したＤＮＡとｇＤＮＡとの可溶性における差異である。変換後のｇＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡであり、そして初期には上記のスキーム１に見られるように、新規に形成されたウラシル環の６−Ｃ位においてスルホン化されると考えられる。スルホン化された付加物は、塩基性条件下で容易に変換されてウラシルを生じる。このような処理の前に、ｓｓＤＮＡはまた、高度に負電化に帯電し、そして異なる可溶性および結合特性を有すると考えられている。従って、本発明のサイズ排除精製方法のいくつかの実施形態において、ウラシルの６−スルホネート付加物を含むサンプルは、塩基で処理されてウラシルを形成し、そして得られた処理された核酸は、緩衝液中で十分に可溶性である。脱スルホン化後、ＴＥ緩衝液が使用されて、サンプルを回収し得る。
【００４７】
本明細書中に記載される実施例は、本発明を例示するために選択された特定の実施形態であり、限定することは意図されない。むしろ、当業者は、本明細書中に開示される本発明の範囲および精神とは異ならないさらなる実施形態を容易に理解するであろう。
【実施例】
【００４８】
亜硫酸水素塩処理のための核酸サンプルを、本発明の方法において使用する前に、任意の従来の回収プロセスおよび精製プロセスにより得ることができる。以下で議論される実施例は、市販の公知のメチル化状態のサンプル株（ＣｏｒｉｅｌｌまたはＩｎｔｅｒｇｅｎより）を使用して、種々の方法を評価した。
【００４９】
本明細書中で議論される各サンプルを、メチル特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により分析した。ＭＳＰは、はい／いいえの答えを提供して亜硫酸水素塩処理したＤＮＡサンプルのメチル化状態についての相対的に迅速な分析方法を提供する。この方法は、プライマー対のセットの使用に基づく。一方のプライマー対は、全てのシトシンが、首尾よくウラシルに変換される場合にのみ、アニーリング／ＰＣＲ増幅するように設計され、そのセットにおける他方のプライマー対は、メチル化シトシン（ＣｐＧシトシンのみ）がメチル化される場合、従ってウラシルに変換されない場合に、アニーリング／ＰＣＲ増幅される。
【００５０】
特定の遺伝子フラグメントを増幅するＭＳＰペア、および予測したサイズのアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）は、以下のとおりである。
【００５１】
【化２】
2007503813.tif 000002
【００５２】
【化３】
2007503813.tif 000003
【００５３】
【化４】
2007503813.tif 000004
２×ＴａｑＧｏｌｄ  ＰＣＲマスターミックスは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。順方向プライマー配列および逆方向プライマー配列は、上に列挙される配列である。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡを、本特許出願全体にわたって記載される種々の亜硫酸水素塩変換実験から得た。
【００５４】
【化５】
2007503813.tif 000005
５’ＦＡＭ標識を有する各々のセットにおけるプライマーの一方を、合成した。上記ＰＣＲ反応物の１μＬのアリコートを、ＲＯＸ  ５００サイズ標準を添加したＨｉＤｉホルムアミドに添加し、９５℃にて５分間加熱することにより変性した。ＦＡＭ標識プライマーを使用することにより、ＰＣＲアンプリコンを、ＰＯＰ−４ＴＭポリマーとともに、走査モジュール「ＧＳ  ＰＯＰ４（１ｍＬ）Ａ」を使用して、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで直接分析した（試薬および装置は、全てＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した）。
【００５５】
上記３１０において見られる正確な大きさのＰＣＲアンプリコンの存在は、反応が成功した証拠であった。さらに、ピーク（またはエリア）の大きさを経験的に使用して、どれだけの量のテンプレート（すなわち、亜硫酸水素塩処理したｇＤＮＡ）が、最初に存在するかを決定した。ピークが大きければ大きいほど、より多いＤＮＡが、最初に存在した。
【００５６】
次いで、ＭＳＰ−ＰＣＲ産物を、さらなる「溶解」のために前もって（ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ）配列決定した。ＤＮＡ配列決定を、標準的なプロトコルおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの試薬により行った。
【００５７】
ＰＣＲアンプリコンの配列決定の前に、ＰＣＲ反応物の４μＬアリコートを各々２単位のＳｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼ１（ｅｘｏ）（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を含む等量の混合物で処理することにより、ＭＳＰ−ＰＣＲの間に使用したプライマーおよび過剰量のｄＮＴＰを取り除いた。その反応物を、３７℃にて１時間インキュベートし、次いで７５℃にて１５分間加熱変性した。ｅｘｏ／ＳＡＰ反応物の４μＬアリコートを、１〜４μＬのＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２μＬのＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  ５×ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ、２μＬの逆方向ＰＣＲプライマー（５μＭ）（ＦＡＭ−標識を有さない）、および２０μＬの最終容量のための十分な水を含む溶液に添加した。熱サイクル：９５℃／１分間、「９６℃／１０秒間、５２℃／１０秒間、６０℃／４分間」を５０回、そして４℃で保存した。ｃｙｃｌｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ反応産物を、Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｒｆｏｒｍａ（登録商標）９６ウェルプレートにより精製し、減圧下で乾燥し、２０μＬのＨｉＤｉホルムアミドに溶解し、ＫＢ  ｂａｓｅｃａｌｌｅｒを備えたＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、または３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。
【００５８】
（Ｍｉｃｒｏｃｏｎデバイスを使用するサイズ排除精製と市販のプロトコルとの比較）
ｇＤＮＡサンプルの亜硫酸水素塩変換のための市販のキットを、新規のサイズ排除方法と比較した。Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈより入手可能なキット（ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔＴＭ）は、標準的な亜硫酸水素塩変換プロトコルおよび標準的な清浄化手順を有する。このＺｙｍｏの亜硫酸水素塩プロトコルに正確に従い、８サンプ
ル（すなわち、４サンプルで２連）について、６時間の反応、および推奨される１５時間反応の各々について、５０℃にて反応させた。このようにして、合計１６サンプルを、この実験について使用した。各々の場合において、３００ｎｇのｇＤＮＡを、亜硫酸水素塩変換工程に使用した。これらのサンプルは、Ｃｏｒｉｅｌｌ＃３５、Ｃｏｒｉｅｌｌ＃１３７０５、ｐ１６Ｍ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎのｐ１６キットより）、およびＵｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）であった。両方とも５０℃にて、一方のプレートを６時間反応させ、他方を１５時間反応させた。各々のプレートについて、４サンプルを、標準Ｚｙｍｏプロトコルを使用して精製し、残った２連の４サンプルを、本発明者のサイズ排除精製方法を使用して精製した。
【００５９】
詳細には、Ｚｙｍｏの精製プロトコルは、そのキットの４００μＬの「Ｍ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ」をＤＮＡサンプルに添加し、そして混合する工程を指示する。次いで、このサンプルを、「Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ  Ｉ  Ｃｏｌｕｍｎ」に充填し、２ｍｌの回収チューブに入れ、最高速（１０，０００ｒｐｍを超える）で１５〜３０秒間遠心分離する。次いで、貫流物を除去する。２００μＬのＭ−Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、そのサンプルを、再度、最高速で１５〜３０秒間スピンさせる。２００μＬのＭ−Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、室温で１５分間立たせておく。次いで、このサンプルを、再度、最高速で１５〜３０秒間スピンさせる。もう一度２００μＬのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、このサンプルを、最高速で１５〜３０秒間スピンさせる。さらに２００μＬのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、最高速で３０秒間スピンさせる。このスピンをより長くし、この洗浄緩衝液の残渣の除去を完全にする。このプロセス全体を通して、貫流物の逆流によるコンタミネーションを防ぐために必要なので、この貫流物を除去する。最後に、１０μＬのＭ−Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを、そのカラムマトリクスに直接添加する。サンプルを、１．５ｍＬチューブ中でスピンさせ、ＤＮＡを溶出させ、このＤＮＡを回収してＰＣＲに備える。Ｚｙｍｏは、各々のＰＣＲ反応について２〜４μＬを推奨している。この実験において、サンプルを保存するために１．５μＬを使用した。
【００６０】
代替的に、以下の工程ａ〜ｈに従い、本明細書中での亜硫酸水素塩処理したサンプルを処理した：
ａ．サンプルを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００デバイス中で２００μＬの水で希釈した；
ｂ．このサンプルを、約２８００ＲＰＭにて約８分間遠心分離し、その濾液を取り除いた；
ｃ．３００μＬの水をこのデバイスに添加し、約２８００ＲＰＭにて約８分間遠心分離し、その濾液を取り除いた；
ｄ．３００μＬの水をこのデバイスに添加し、約２８００ＲＰＭにて約８分間遠心分離し、その濾液を取り除いた；
ｅ．３００μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨをこのデバイスに添加し、約２８００ＲＰＭにて約８分間遠心分離し、その濾液を取り除いた；
ｆ．３００μＬの水をそのデバイスに添加し、約２８００ＲＰＭにて約６〜８分間遠心分離し、その濾液を取り除いた；
ｇ．５０μＬのＴＥ緩衝液を、上部チャンバに添加し、５分間静置させた；
ｈ．このデバイスを反転させ、精製したサンプルをＰＣＲにおける使用のために回収した。
【００６１】
この実施形態では、標準のＴＥ緩衝液に加えて、水および単純なＮａＯＨ溶液のみが必要とされる。工程ｅにおいて、ＮａＯＨを添加し、インサイチュにおける脱スルホン化を容易にし、その反応を完了させて、その６−スルホネート付加物からウラシルを得る。ＮａＯＨを添加することなくサイズ排除によりそのサンプルを精製する、以前の試みは、成功しなかった。
【００６２】
特定の遺伝子を標的とする、５種類のプライマーセットを使用して、２種類の精製プロトコルの成功を評価した。これらのプライマーは、亜硫酸水素変換したＤＮＡのみ増幅する。精製工程より回収したＤＮＡの量を見積もるため、アンプリコン（ＰＣＲ産物）の量を使用した。各々のサンプルは、正しく亜硫酸水素塩変換されたことから、得られたＰＣＲ産物の量の比較は、精製からの原料の首尾よい回収の直接的な比較であった。全ての場合において、微細濾過（限外濾過とも称される）をベースとする精製は、Ｚｙｍｏキットにより教示される精製プロセスよりもより良好かつ／またはより首尾よいアンプリコン形成を達成した。
【００６３】
いくつかの実験において、サイズ排除により精製した産物の量と比較する場合に、約５倍以上のＺｙｍｏにより精製したＤＮＡサンプルを、ＰＣＲのワークアップ（ｗｏｒｋ  ｕｐ）に使用した。この差異にもかかわらず、微細濾過により精製したサンプルはなお、より大きくかつより強い産物ピークを得た。例えば、Ｅ２Ｆ２テンプレートについてのＡＢＩ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで得られたピークは、Ｚｙｍｏプロトコルにより精製されたＣｏｒｉｅｌｌ＃３５サンプルの産物のピークを、存在するにしてもほとんど示さず、一方で、サイズ排除により精製された同じサンプルについて、非常に強い産物ピークが得られる。同様の比較を、他のサンプルで行い得る。これらの結果を、その後のＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙにより確認した。このようにして、Ｚｙｍｏ精製の回収の少なくとも５倍の回収物が、得られた。
【００６４】
Ｚｙｍｏ亜硫酸水素塩キットにより処理し、そして本明細書中に記載されるサイズ排除方法に従って精製したｇＤＮＡの量の系列希釈物に関するさらなる研究において、わずか０．３ｎｇ（３００ｐｇ）が亜硫酸水素塩変換され得ること、および最終Ｍｉｃｒｏｃｏｎにより回収した産物の１／１０（３０ｐｇ）がＰＣＲにて首尾よく使用され得ることが、見出された。３００ｎｇおよび３０ｎｇの実施例について、５０μＬのＴＥをＭｉｃｒｏｃｏｎ  １００から精製した亜硫酸水素塩処理したＤＮＡの回収のために使用した。３ｎｇおよび０．３ｎｇのサンプルについて、わずか１０μＬのＴＥを使用した。全ての場合において、１μＬのＴＥ溶液をＰＣＲにおいて使用した。８つの異なるＰＣＲ実験について、もっとも希釈したもののいくつかを除く全ての希釈物において、ＰＣＲアンプリコンが見られた。しかし、希釈したサンプル（３０ｐｇ）であってもそのほとんどはなお、そのときの少なくとも５０％のＰＣＲ産物を得た。
【００６５】
（他のデバイスを用いたさらなる比較）
さらなる研究を、異なるサイズおよび異なるブランドのサイズ排除デバイスを使用して行った。３００ｋデバイス（Ｎａｎｏｓｅｐ３００）は、おそらく亜硫酸水素塩処理したＤＮＡが（より）多孔性な膜に捕捉されたか、またはＤＮＡが亜硫酸水素塩処理の間に３００Ｋ未満の断片にフラグメントされていたかのいずれかに起因して、ＤＮＡを捕捉しなかった。１００Ｋデバイス（例えば、Ｎａｎｏｓｅｐ１００、およびＭｉｃｒｏｃｏｎ１００）は成功し、３０Ｋデバイス（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０）もまた同様であった。１０Ｋデバイス（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１０）は、亜硫酸水素塩変換反応において必要な高い塩含有量に起因して使用には適切ではなかった；１０Ｋデバイスにおいて必要とされる遠心分離時間は、非常に長かった。これらの研究から、少なくとも１００Ｋカットオフを有するデバイス、および３０Ｋカットオフを有するデバイスは、本明細書に開示される方法の種々の実施形態において有用であることを結論付けた。しかし、サイズ排除デバイス中の濾過素材は、例えば、ブランドおよび／または素材により変動し得るので、カットオフ値単独では、指針にはなるが、どのデバイスが本開示の方法において機能し得るかについて決定的でないことを、当業者は容易に理解する。
【００６６】
上記デバイスの内の濾過素材は、ブランドにより変化する。Ｍｉｃｒｏｃｏｎは、改変
したセルロースを使用し、一方Ｎａｎｏｓｅｐは、「ポリエチレン基材上の改変ポリエーテルスルホン」を使用する。Ｚｙｍｏキットにより調製され、そしてＮａｎｏｓｅｐ１００またはＭｉｃｒｏｃｏｎ１００のいずれかにより精製されたサンプルの比較は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００は、より良い結果を提供するようであるが、約２８００ＲＰＭの遠心分離速度を超えなければ、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００と、Ｎａｎｏｓｅｐ１００とは、全て実質的に同様の結果をもたらすことを示す。以下の全ての実験は、そうではないと示されない限り、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００を使用して行った。
【００６７】
（亜硫酸水素マグネシウムおよび触媒化変換のプロトコルへの適用）
本発明の方法はまた、亜硫酸水素マグネシウムおよび／またはアミン／第四級アミンにより触媒される変換プロトコルに適用可能であり、そして、以前のいくつかの方法において見られる一晩の沈殿工程を使用することなく良好な結果およびより迅速な分析を提供する。このことは、上記変換反応のより迅速な評価、そしてまた収量の増加を可能にする。
【００６８】
このようなプロトコルにおいて、亜硫酸水素ナトリウムは、亜硫酸水素マグネシウムおよび上記の同時出願された「Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｆｏｒ  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  Ａｍｉｎｅ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  Ｔｏ  Ｕｒａｃｉｌ」という発明の名称の出願に記載される触媒と、置き換えられ得る。
【００６９】
（抗酸化剤の効果および第四級アミンの濃度）
以下の表１に示す実施例１〜４は、抗酸化剤の存在および第四級アミンの量に関して変動する。
【００７０】
【化６】
2007503813.tif 000006
実施例１〜４における反応物の各々を、５０℃にて４時間インキュベートした。実施例４における反応混合物は、大量の沈殿物を速やかに形成し、この沈殿物はインキュベーション後であっても残ったままであり、そして実施例４をさらなる研究から除外した。実施例３は、妨害しない量の沈殿物を有し、そして実施例３はこの研究において保持した。４時間のインキュベーション後、残った３つのサンプルを、サイズ排除精製プロセス（この場合においては、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）サイズ排除デバイス）を使用して精製した。このサンプルおよび２００μＬの水をＭｉｃｒｏｃｏｎ１００デバイスに添加し、次いでこのサンプルを（製造者の推奨に従って）デバイス中で２８００ＲＰＭにて約８分間スピンした。生じた濾液を取り除いた。続いて、約３００μＬの水を使用して２回洗浄し、各々、約２８００ＲＰＭにて８分間のスピンを続けた。各々の洗浄後、濾液を再度取り除いた。約３００μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加し、約２８００ＲＰ
Ｍにて約８分間スピンした。再度、濾液を取り除いた。約３００μＬの水を添加した後、このサンプルをデバイス中で２８００ＲＰＭにて約６〜８分間スピンした。その濾液を取り除き、約５０μＬのＴＥ緩衝液を添加した。約５分後、そのデバイスを反転させて、遠心分離器中の精製したＤＮＡサンプルを回収した。約６０μＬを回収した。
【００７１】
亜硫酸水素塩処理したＤＮＡを、以下のＭＳＰプライマーセットを使用してＭＳＰにより分析した：ｐ１５Ｍ、ｐ１５Ｕ、Ｄａｐｋ  Ｍ、ＤａｐＫ  Ｕ、Ｍｇｍｔ  Ｍ、Ｍｇｍｔ  Ｕ、ｐ１６Ｍ、およびｐ１６Ｕ。ヒドロキノンは、ＰＣＲ収量を大幅に増幅するようではなかった。Ｅｔ４ＮＯＨサンプルは、ヒドロキノンを使用するにせよまたは使用しないにせよ、ＴＢＡＣよりも非常に大きな産物のピークを示した。１回のＰＣＲあたり、わずか約６ｎｇの亜硫酸塩処理したｇＤＮＡを使用した。公開された精製プロトコル（Ｗｉｚａｒｄ  ｒｅｓｉｎ）を使用した以前の実験では、首尾よいＰＣＲのために必要とされる量に基づくと非常に少ない単離ＤＮＡを提供した。これらのデータは、触媒として第四級アミン、および特にＥｔ４ＮＯＨの使用を支持する。
【００７２】
（Ｅｔ４ＮＯＨに触媒された亜硫酸水素マグネシウム反応における減少したｇＤＮＡ濃度）
表２に示す実施例５〜８におけるサンプルは、減少量のＤＮＡについての亜硫酸水素塩変換を示す。これらのサンプルは、使用したＤＮＡ量、または亜硫酸水素マグネシウム／Ｅｔ４ＮＯＨの減少濃度のいずれかに関して変動している。
【００７３】
【化７】
2007503813.tif 000007
【００７４】
【化８】
2007503813.tif 000008
実施例５（３μＬのＣｏｒｉｅｌｌ）における反応物は、約１μｇのＤＮＡを含み、そして実施例６〜８（１μＬのＣｏｒｉｅｌｌ）は約３００ｎｇのＤＮＡを含む。これらのサンプルの各々を、以前に議論したように５０℃にて４時間反応させた。このインキュベーション期間に続いて、各々を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００デバイスを使用して上に議論されたサイズ排除精製プロセスに供した。このプロセスは、わずかに多い水を使用したこと、そして約３５０μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用したことにおいてのみ、以前に議論したプロセスと異なっていた。各々を、約５０μＬのＴＥ緩衝液中に回収し、そして１μＬをその後のＰＣＲに使用した。驚いたことに、１．３Ｍ亜硫酸水素マグネシウムにおける３００ｎｇのサンプル（実施例６）は、１μｇのサンプル（実施例５）よりも多いＰＣＲ産物を提供することが観察された。
【００７５】
より低い亜硫酸水素塩濃度（０．８Ｍおよび１．０Ｍ）の亜硫酸水素塩変換は、明らかに不完全であった（実施例６〜８）。従って、反応収率を最適にするためには、反応条件を変更することが望ましくあり得る。
【００７６】
（ＭＳＰにおける酵素濃度およびテンプレート（ｇＤＮＡ）の濃度の効果）
上記と同じ亜硫酸水素塩処理したサンプル（詳細には、実施例５および実施例６）を、代替の条件下：（ａ）さらなるポリメラーゼ（ＴａｑＧｏｌｄ）および（ｂ）より少ない亜硫酸水素塩で処理したｇＤＮＡテンプレートにおいてＭＳＰによりさらに分析した。ＭＳＰ条件を、以下の表３に示す。
【００７７】
【化９】
2007503813.tif 000009
本明細書中の他に記載されるＭＳＰ分析において記載されるとおりに、各々のＰＣＲを調製した。使用したＭＳＰプライマーセットは、Ｍｌｈ  Ｍ、Ｍｌｈ  Ｕ、Ｄａｐｋ  Ｍ、Ｄａｐｋ  Ｕ、Ｍｇｍｔ  Ｍ、Ｍｇｍｔ  Ｕ、ｐ１６Ｍおよびｐ１６Ｕであった。過剰なＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼを使用する場合、さらに２μＬ（２ユニット）を、その反応物に添加した。
【００７８】
その結果は、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中の余分な酵素が、「ミスプライミング（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ）」を生じさせることを示す（その後の配列決定により決定した）。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００により精製した亜硫酸水素塩処理したｇＤＮＡの１／１０希釈物、１／２０希釈物、および１／３０希釈物はなお、ほとんど全ての反応について、ＭＳＰのために十分なｇＤＮＡテンプレートを提供した。たった０．２ｎｇのｇＤＮＡをＭＳＰにおいて使用する場合においてさえも、首尾よいＰＣＲが見られた。「ドロップアウトした」２つのデータ点が存在したが、全体にわたってデータは優良であった。従って、わずか０．２ｎｇのＤＮＡが、良好なＰＣＲ収量を提供し得ることは明らかである。
【００７９】
（さらなるテンプレートを使用した研究）
以下の実験は、非メチル化ｇＤＮＡに対するメチル化ｇＤＮＡの並列比較（ｓｉｄｅ  ｂｙ  ｓｉｄｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を包含する。５種類のさらなる「コントロール」反応物を、メチル化ｇＤＮＡおよび非メチル化ｇＤＮＡの両方を使用して評価した。これらのサンプルは、Ｃｏｒｉｅｌｌ由来の１μＬのＤＮＡまたはＩｎｔｅｒｇｅｎ  ｐ１６キット由来の３μＬのＤＮＡ（各々約３００ｎｇ  ＤＮＡ）、３５μＬの水、１０μＬの２０％Ｅｔ４ＮＯＨ、および８５μＬの２Ｍ亜硫酸水素マグネシウムを含有し、そして５０℃にて約４時間加熱した。このサンプルは、Ｃｏｒｉｅｌｌ＃３４およびＣｏｒｉｅｌｌ＃３５、およびＩｎｔｅｒｇｅｎのｐ１６「キット」、ｐ１６Ｕ、ｐ１６Ｍ由来のＤＮＡおよびｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｙｔｅｄ  ｇＤＮＡであった。各々を、５０℃にて４時間インキュベートし、５０ｍＬのＴＥを入れたＭｉｃｒｏｃｏｎ１００フィルトレーションユニットを使用して、サイズ排除清浄化方法に供した。１ｍＬを、
以下のＭＳＰプライマー対とともにＭＳＰにおいて使用した：ＭＬＨ  Ｍ、ＭＬＨ  Ｕ、Ｄａｐｋ  Ｍ、Ｄａｐｋ  Ｕ、Ｍｇｍｔ  Ｍ、Ｍｇｍｔ  Ｕ、ｐ１６Ｍ、およびｐ１６Ｕ。正確なサイズのアンプリコンによる証拠として非常に高いＭＳＰ収量が得られ、ＰＣＲ産物の幾分かを、直接配列決定に供した。
【００８０】
（６時間および１５時間の反応時間後の亜硫酸水素マグネシウム／Ｅｔ４ＮＯＨプロトコルと亜硫酸水素ナトリウムプロトコルとの比較）
Ｊ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，９８２１−２６（１９９６）の亜硫酸水素ナトリウムプロトコルにより調製されたサンプルと、上記の実施例１０に記載される亜硫酸水素マグネシウムプロトコルにより調製されたサンプルとの間の直接的な比較を、Ｅｔ４ＮＯＨ、ＮａＯＨを使用し、そして添加物なしで行った。一方は６時間の分析のため、そしてもう一方は１５時間の分析のために、２つのプレートを準備した。両方の反応を５０℃で行った。非メチル化ｇＤＮＡサンプルのみを調べた。全ての反応産物を、上記のサイズ排除清浄化手順により精製し、そして５０μＬの最終容量のＴＥを回収した。ＭＳＰを、変換したＤＮＡを分析するために使用した。亜硫酸水素ナトリウム手順により、ＭＳＰにおいて非常に良い結果を示すｇＤＮＡを提供した。亜硫酸水素マグネシウムで変換したｇＤＮＡは、ＭＳＰにおいて、亜硫酸水素ナトリウムで変換したＤＮＡよりもずっと弱いシグナルを与えた。しかし、亜硫酸水素マグネシウム／Ｅｔ４ＮＯＨは、重要な点において、亜硫酸水素ナトリウムプロトコルとは異なる。亜硫酸水素マグネシウム／Ｅｔ４ＮＯＨは、前もった変性工程なしで、例えば、ずっと低濃度の亜硫酸水素塩、正確なｐＨコントロールなし、抗酸化剤なしで、そして「既成のもの（ｏｆｆ
ｔｈｅ  ｓｈｅｌｆ）」であり新規に調製してない試薬で、達成した。
【００８１】
上記のサイズ排除精製は、亜硫酸水素ナトリウムのサンプルおよび亜硫酸水素マグネシウムのサンプルに対して、良好に作動した。
【００８２】
（メチル化ｇＤＮＡおよび非メチル化ｇＤＮＡの両方に対するＥｔ４ＮＯＨを用いた亜硫酸水素マグネシウム反応と亜硫酸水素ナトリウム反応との直接的な比較）
Ｅｔ４ＮＯＨ反応物を用いた１．３Ｍ（最終濃度）の亜硫酸水素マグネシウムを、公知の方法に従って、亜硫酸水素ナトリウムで処理したサンプルと比較した。亜硫酸水素マグネシウムの配合表は、１μＬのＣｏｒｉｅｌｌまたは３μＬのＩｎｔｅｒｇｅｎ、３２μＬまたは３４μＬの水、１０μＬの２０％  Ｅｔ４ＮＯＨ、８５μＬの２Ｍ亜硫酸水素マグネシウムである。亜硫酸水素ナトリウムおよび亜硫酸水素マグネシウムを用いた並行した反応において、２種類のメチル化サンプルと２種類の非メチル化サンプルとを比較した。処理した全１６のサンプルについて、これらを、５０℃にて６時間、および１５時間反応させた。上記のサイズ排除プロセスによる精製を実施した。この非常に厳密な比較において、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００により精製した１６のサンプルを、配列決定により全て分析した。（配列決定分析は、所与の領域内の全てのシトシンについて、ウラシルへの亜硫酸水素塩変換の完了についての分析を可能にする）。
【００８３】
特定の遺伝子標的のための１１種の異なるプライマーセットを使用した：Ｅ２Ｆ２、ＦＲＡＰ、ＸＰＤ、ＣＤＫＮ、ＲａｌＤＧＳ、ＩＤＴ、ＣＤＨ１、ＡＰＣ１，およびＥＳＲ。
【００８４】
（公知の腫瘍抑制因子遺伝子の標的を用いた評価）
Ｃｏｒｉｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｌｏｃｕｓ．ｕｍｄｎｊ．ｅｄｕ／ｎｉｇｍｓ／ｐｄｒ．ｈｔｍｌ）からＤＮＡを購入した．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）から、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡを購入した。以下は改変されている、Ｊ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，９８２１−２６（１９９６）に従って、３００ｎｇの
精製ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した。最終容量が２００μＬであり、かつ鉱油なしでサーマルサイクラー中でミクロチューブをインキュベートするような反応スケールにした。あるいは、亜硫酸水素塩変換を、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）により提供される試薬、および製造者の推奨プロトコル（亜硫酸水素塩処理のみを行うが、Ｚｙｍｏキットより提供される精製カートリッジを使用しない）を使用して調査した。使用しないかわりに、亜硫酸水素塩溶液中で５０℃にて１５時間インキュベーションした後、Ｚｙｍｏで処理したサンプルおよびＨｅｒｍａｎに従って調製したサンプルを、本出願人らのサイズ排除法により精製した。亜硫酸水素塩−ＤＮＡを、以下の工程のより精製した：
１．全量が３５０μＬ〜４５０μＬとなるように、水を用いて亜硫酸水素塩反応物を希釈する。
【００８５】
２．溶液を、組み立てたＭｉｃｒｏｃｏｎ  １００デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移す。
【００８６】
３．製造者に従い、８〜１０分間最大で５００×ｇで２８００ｒｐｍにて遠心分離する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１４）
４．濾液を捨て、３５０μＬの水を上部チャンバに添加し、６〜８分間２８００ｒｐｍにて遠心分離する。
【００８７】
５．濾液を捨て、３５０μＬの水を上部チャンバに添加し、６〜８分間２８００ｒｐｍにて遠心分離する。
【００８８】
６．濾液を捨て、３５０μＬの０．１μＭ  ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）を上部チャンバに添加し、そして６分間２８００ｒｐｍにて遠心分離する（インサイチュにおける脱スルホン化）
７．濾液を捨て、３５０μＬの水を上部チャンバに加え、そして６〜８分間２８００ｒｐｍにて遠心分離し、その上部チャンバ中にわずかに湿気／少量の液体を残す。
【００８９】
８．５０μＬの１×ＴＥ緩衝液を添加し、数回上下のピペッティングで混合し、５分間カラム中に静置させることにより、サンプルを溶出させる。
【００９０】
９．デバイスを反転させ、清浄なラベルを付けたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＴＥ溶液を回収する。
【００９１】
次いで、回収したサンプルを、ＰＣＲに供した。代表的には、０．５μＬ（収率１００％であれば、約３ｎｇ）の亜硫酸水素塩変換したＤＮＡを、２×ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて調製し、かつ各々２５０ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含有する２０μＬのＰＣＲ反応物において使用した。熱サイクルは：９５℃で５分間、９５℃／３０秒間と、６０℃／４５秒間と、７２℃／１分間とを４０サイクルであり、そして４℃で貯蔵した。ＦＡＭ−標識プライマーを使用することにより、ＰＣＲアンプリコンを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで、ＰＯＰ−４ＴＭポリマーを使用し、「ＧＳ  ＰＯＰ４（１ｍＬ）Ａ」の実行モジュールを使用して直接解析した。
【００９２】
ＰＣＲアンプリコンの配列決定の前に、ＰＣＲ反応物の４μＬアリコートと等量の各々２ユニットのＳｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼ１（ｅｘｏ）（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）で処理することにより、プライマーおよび過剰のｄＮＴＰを取り除いた。この反応物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで７５℃で１５分間加熱変性した。ｅｘｏ／ＳＡＰ反応物の４μＬアリコートを、１〜４μＬのＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｌ．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２μＬのＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｌ．１  ５×ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ、２μＬの逆方向ＰＣＲプライマー（５μＭ）、および２０μＬの最終容量のための十分な水を含有する溶液に添加した。熱サイクルは：９５℃／１分間、「９６℃／１０秒間、５２℃／１０秒間、６０℃／４分間」を５０サイクル、であり、そして４℃で貯蔵した。サイクル−配列決定反応産物を、Ｅｄｇｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ９６ウェルプレートにより精製し、減圧下で乾燥し、２０μＬのＨｉＤｉホルムアミドに溶解し、そしてＫＢ  ｂａｓｅｃａｌｌｅｒを備えたＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、または３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。
【００９３】
メチル化サンプルおよび非メチル化サンプルの両方が、１つのプライマー対を用いてアンプリコンを生成するように、プライマーを、その配列内にＣｐＧを含まないように設計した。これらのプライマーは、ウェブサイト「ｈｔｔｐ：／／ｉｔｓａ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／〜ｕｒｏｌａｂ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／」の使用により、しばしば自動的に選択した。目的のゲノム配列のセクションを、カットアンドペースト（ｃｕｔｔｉｎｇ  ａｎｄ
ｐａｓｔｉｎｇ）することにより、このソフトウェアプログラムは、ＣをＴに変換し、ＣｐＧに目印を付け（ｆｌａｇ）、プログラムの基準を満たす順方向プライマーおよび逆方向プライマーを推薦する。
【００９４】
本明細書中に記載される亜硫酸水素塩配列決定プロトコルを確認するために、完全にメチル化した「コントロール」およびＣｏｒｉｅｌｌの細胞貯蔵所から入手したサンプルを使用して、多くの以前に報告された腫瘍抑制因子遺伝子標的（１８）（報告では、メチル化状態と遺伝子発現（または癌）との相関を示す）を、配列決定した（データは示さず）。シトシンは、メチル化されているＣｐＧにおいてのみ見出された。Ｃｏｒｉｅｌｌから得られた不死化細胞は、ほとんどの領域において非メチル化であったが、いくつかの領域中でメチル化されていた（ＣｐＧであった）。配列決定した全てのＣｏｒｉｅｌｌサンプルは、メチル化された場合、同じ領域においてメチル化されていた。
【００９５】
全部で２５の遺伝子標的を調べ、首尾よく配列決定した。但し、９個より多い連続したＴを含むアンプリコンを避けた。ＰＣＲアンプリコンにおける複数のＴは、「すべり（ｓｌｉｐｐａｇｅ）」を引き起こした。このすべりは、正しい配列に対して重ね合わせると、Ｎ＋１および／またはＮ−１の配列として、配列決定のトレースにおいて観察された。プライマー設計に対する単純な変更により、９以上のＴを有するアンプリコンを避けることができ、それにより、すべりを減らす。一般に、すべりは、配列を正確に決定する能力を妨害しなかった。
【００９６】
本明細書中に開示される方法は、亜硫酸水素ナトリウム反応に対する実現性のある代替物である。本明細書中における研究は、２Ｍの亜硫酸水素マグネシウム溶液を利用した。亜硫酸水素マグネシウム溶液は、サンプル中で約１．３Ｍに希釈した。より濃縮した亜硫酸水素マグネシウムの使用は、反応物の容量を最小限に維持したままで変換に対してより高い亜硫酸水素塩濃度をもたらす。このような反応混合物中の亜硫酸水素塩の濃度の増加は、容易に使用され得、そしてＰＣＲ収量を増加することが期待される。このような反応パラメーターの最適化（亜硫酸水素マグネシウム溶液の容量および／または濃度、温度、ｐＨ、および他の反応条件が挙げられる）は、より完全な変換に到達することが期待され、かつ十分に当業者の技量の範囲内である。
【００９７】
本明細書中に記載されるサイズ排除精製プロセスは、より短い反応時間で、かつより簡
便な清浄化法を用いて、より大きくかつより強い産物のピークを提供し得る。
【００９８】
上記のＰＣＲおよび配列決定の方法は、現在のところ本明細書に記載される精製方法との使用のために好ましいが、これらは、使用可能なただ１つの方法ではない。本発明は、これらの任意の特定の実施形態にも、上のいずれの実施例にも限定されない。むしろ、これらの方法の他の改良は、当業者に明らかであり、本明細書中に開示される本発明の範囲および精神内である。