(57)【要約】  本発明は、時間分解蛍光光度測定結合アッセイにおいて使用するためのバックグラウンドブロッキングコンセプトに関する。より詳細には、本発明は、ランタニドキレート標識検体特異的生体分子中に、及びバックグラウンドブロッキング剤として又はバックグラウンドブロッキング剤中に、同一又は類似のキレート配位子の使用を含む結合アッセイ及びキットに関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中における１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイであって、
ａ）コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分を提供することと、
ｂ）前記固体担体に、
１．発光ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は前記異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識されている、１組の異なる第２の検体特異的結合成分、
２．前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、非特異的試薬、
３．前記試料、を添加することと、
ｃ）時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって前記特定の検体（単数又は複数）を検出することと、を含む、結合アッセイ。
【請求項２】
前記第２の検体特異的結合成分は、発光ランタニドキレートで標識された検体又は１組の異なる標識された検体で置換され、各検体は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識され、前記非特異的試薬は、
ｖ）第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、前記検体アナログ（単数又は複数）は、前記第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、前記ランタニドイオン（単数又は複数）は、前記ランタニドキレートで標識された検体中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉ）キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、前記検体アナログ（単数又は複数）は、前記第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉｉ）検体アナログを含まない第２のランタニドキレートであって、前記ランタニドイオン（単数又は複数）は、前記ランタニドキレートで標識された検体（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、検体アナログを含まない第２のランタニドキレートか、又は
ｖｉｉｉ）検体アナログ（単数又は複数）及びランタニドイオン（単数又は複数）を含まないキレート配位子、から選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有し、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と類似の発色団部分（単数又は複数）を有する、請求項１又は２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と同一又は類似の構造を有する、請求項１又は２に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子と同一である、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記キレート又はキレート配位子（式Ｉ）は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、１〜５個の同一又は異なる基（単数又は複数）Ｇを含有する１〜５個のピリジン部分を含み、
【化１】
2019532254.tif 000011
Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、前記ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択されるか、又はＬｎ３＋は存在せず、
ｍは、１〜５であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンＬｎ３＋との間の配位結合を表し（存在する場合）、
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）前記ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ、ｉｉ）前記ピリジン部分と前記化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表し、
Ｒ３ｎ（ｎ＝１〜５）の各々は、独立して、ｉ）前記生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記ランタニドイオンは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋、若しくは非ランタニドＹ３＋から選択されるか、又は存在しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記第１及び第２の検体特異的結合成分は、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマーなどから選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記検体アナログは、生体分子の誘導体、融合物、又は変異体などから選択される、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項１０】
結合アッセイにおいて１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出するのに使用するキットであって、
ａ）コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、
ｂ）ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は前記異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識されている、１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、
ｃ）前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、非特異的試薬と、を含む、キット。
【請求項１１】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有し、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレートの前記キレート配位子と類似の発色団部分（単数又は複数）を有する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子と同一又は類似の構造を有する、請求項１０又は１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子と同一である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記キレート又はキレート配位子（式Ｉ）は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、１〜５個の同一又は異なる基（単数又は複数）Ｇを含有する１〜５個のピリジン部分を含み、
【化２】
2019532254.tif 000012
Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、前記ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択されるか、又はＬｎ３＋は存在せず、
ｍは、１〜５であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンＬｎ３＋との間の配位結合を表し（存在する場合）、
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）前記ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ、ｉｉ）前記ピリジン部分と前記化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表し、
Ｒ３ｎ（ｎ＝１〜５）の各々は、独立して、ｉ）前記生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
前記ランタニドは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋、若しくは非ランタニドＹ３＋から選択されるか、又は存在しない、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
前記第１及び第２の検体特異的結合成分は、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマーなどから選択される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって、１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイにおけるバックグラウンド遮断剤の使用であって、前記アッセイは、固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は前記異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識された、１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、を含み、前記バックグラウンド遮断剤は、非特異的試薬であり、これは前記検体並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、バックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１８】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有し、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と類似の発色団部分（単数又は複数）を有する、請求項１７に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１９】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と同一又は類似の構造を有する、請求項１７又は１８に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２０】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレートの前記キレート配位子と同一である、請求項１９に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２１】
前記キレート又はキレート配位子（式Ｉ）は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、１〜５個の同一又は異なる基（単数又は複数）Ｇを含有する１〜５個のピリジン部分を含み、
【化３】
2019532254.tif 000013
Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、前記ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択されるか、又はＬｎ３＋は存在せず、
ｍは、１〜５であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンＬｎ３＋との間の配位結合を表し（存在する場合）、
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）前記ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ、ｉｉ）前記ピリジン部分と前記化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表し、
Ｒ３ｎ（ｎ＝１〜５）の各々は、独立して、ｉ）前記生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２２】
前記ランタニドイオンは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋、若しくは非ランタニドＹ３＋から選択されるか、又は存在しない、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２３】
前記第１及び第２の検体特異的結合成分は、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマーなどから選択される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２４】
前記共役基は、１つ、２つ、又は３つの部分からなり、各部分は、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、及び（ヘテロ）芳香環又は環系のビラジカル（−Ｈｅｔ／Ａｒ−）、例えば、フェニレン、ビフェニレン、ナフチレン、ピリジレン、ピラジニレン、ピリミジニレン、ピリダジニレン、フリレン、チエニレン、ピロリレン、イミダゾリレン、ピラゾリレン、チアゾリレン、イソチアゾリレン、オキサゾリレン、イソオキサゾリレン、フラザニレン、１，２，４−トリアゾール−３，５−イレン、及びオキサジアゾリレンから選択される、請求項２１に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２５】
Ｇは、１つ以上の電子求引性基（単数又は複数）及び／又は１つ以上の電子供与性基（単数又は複数）で置換され、前記電子求引性基（単数又は複数）は、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ５、−ＣＦ３、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、及びハロゲン（即ち、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ）から選択され、前記電子供与性基（単数又は複数）は、−Ｃ１〜６アルキル又は−Ｘ−（Ｒ４）１〜２から選択され、ここで、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、又は−Ｎ（Ｒ５）ＣＯ−であり、Ｒ５は、水素又は−Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ４は、水素、−Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯＮＲ６Ｒ７、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ（ピペラジン−１，４−ジイル）（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ＋−（ＣＨ３）−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３−、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、及びポリエチレングリコールから選択され、Ｒ６及びＲ７は、各々独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）３、−ＣＨ２［ＣＨ（ＯＨ）］１〜６ＣＨ２ＯＨから選択される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２６】
Ｒ１又はＲ２のいずれかは、Ｌｎ３＋イオンと配位結合を形成するキレート基Ｃｈであり、−ＣＯＯ−、−ＰＯ３２−、−ＰＭｅＯ２−、−ＰＰｈＯ２−、−ＣＨ２ＰＯ３２−などの基であってよいがこれらに限定されない、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２７】
１〜５個のピリジン部分のＲ１又はＲ２は、−ＣＯＮＨＲ９又は−ＣＯＮＲ９Ｒ１０であり、ここで、Ｒ９又はＲ１０は、アルキル基、又は前記生体分子と共有結合する前記反応性基を含有するリンカー基、又はカップリング反応後に前記反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１である、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２８】
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、発色団部分と前記キレートの他の部分、例えば、発色団部分とキレート化部分との間の結合を表す、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項２９】
前記キレート化部分は、少なくとも２個のカルボン酸基又はリン酸基、前記酸のエステル、アミド又は塩を含み、直接的に又は環式若しくは非環式Ｎ−及び／若しくはＯ−含有炭化水素鎖を介してのいずれかで、前記発色団部分の芳香族単位に結合する、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項３０】
前記他の部分は、Ｒ３基を含有するリンカー基を含有し得る、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時間分解蛍光光度測定結合アッセイにおけるバックグラウンドブロッキングコンセプトに関する。より詳細には、本発明は、時間分解蛍光光度測定において非特異的バックグラウンド発光のブロッキングを利用するランタニドキレートを含む結合アッセイ、特に生体親和性アッセイ、かかる非特異的遮断剤の使用、及び結合アッセイにおいて使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
長寿命放出発光ランタニドキレートを用いる時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ、Time-resolved fluorometry）は、非常に低い濃度で目的の検体を測定するために、例えば、イムノアッセイ、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、配位子結合アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ及び免疫組織化学的アッセイなどのバイオイメージング、並びに細胞ベースアッセイなどの、多くの特異的結合アッセイに適用されている。
【０００３】
複数の疎水性芳香族発色団を備えるキレート及び配位子を設計する際の周知の課題は、水溶性が高く、かつ同時に、あらゆるあり得るバイオプロセスに対して及び対象のアッセイに存在する他の物質に対して不活性である分子構造を得ることである。良好な水溶性は、蛍光キレートを生体分子標識化、遺伝子組み換え分子、及び半合成分子又は合成分子に使用する場合に、不可欠である。
【０００４】
最近、様々なキレート又は配位子構造設計で結合された置換４−フェニルエチニルピリジンなどの３つの個別の発色団部分を有するランタニドキレートによって、発光強度の改善が示された。
【０００５】
国際公開第２０１３／０２６７９０号では、ユーロピウムなどのランタニドを備えた発光ランタニドキレート、並びに対応する発光ランタニドキレート配位子について開示している。本出願では更に、発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合反応体（抗体など）を含む検知可能な分子、並びに生体特異的結合アッセイの実施方法、固有発光の時間分解蛍光光度測定法を利用した、特異的生体親和性に基づく結合アッセイにおけるこのような検知可能な分子の使用、及び発光ランタニドキレートと共役した固体担体材料について開示している。
【０００６】
国際公開第２０１３／０９２９９２号では、非環式コアにテザーされた（tethered）３つの４−（フェニルエチニル）ピリジン発色基を有する発光ランタニドキレートについて開示している。いくつかの実施形態では、１つの発色基は反応性基を含み、他の２つの発色基は、オルト及び／又はパラ位に２つ又は３つの−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ基を含む。
【０００７】
国際公開第２０１３／０１１２３６号では、トリアザ大環式コアにテザーされた３つの４−（フェニルエチニル）ピリジン発色基を有する発光ランタニドキレートについて開示している。４−（フェニルエチニル）ピリジン発色基は、フェニル環のパラ位が電子供与性基で置換されている。
【０００８】
国際公開第２０１４／１４７２８８号では、標識試薬として有用なトリアザシクロノナン系ランタニドキレート錯体について開示している。開示されたキレートは、３つの４−（フェニルエチニル）ピリジン発色基を有し、その発色基のうちの１つは、反応性基を含む。他の２つの発色基は、（ｉ）フェニル環のメタ及びパラ位に２つのカルボキシル（−ＣＯ２Ｈ）置換基、又は（ｉｉ）フェニル環のメタ位に２つの−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ基のいずれかを有する。
【０００９】
国際公開第２０１４／１６２１０５号は、２，６−ピリジン−ジ−カルボキシル基が組み込まれた３つの配位子によって形成された、又は１，４，７−トリアザシクロノナン構造を有する大員環によって形成されたキレート化剤を有する発光ランタニド錯体に関する。
【００１０】
国際公開第２０１６／０６６６４１号は、発光ランタニドコアの周りに置換４−（フェニルエチニル）ピリジン発色団を有するアザ大環式ランタニドキレート設計に関する。この発色団は、ランタニドイオンと共に高いモル吸光係数及び発光を有する。本出願では更に、キレートを調製する配位子、生体特異的反応体に結合したキレート、及び様々なアッセイでのそれらの使用について開示している。
【００１１】
発色団の追加により、配位子及びキレートの水への溶解性を低下し、標識化プロセス中の生体特異的結合反応体凝集物の形成を増大し、かつ標識化分子の非特異的結合性を増大することが知られている。凝集物は、精製の問題を生じ、標識化物質の収率を低下させる。更に、標識化分子の非特異的結合が増大すると、生体特異的アッセイのバックグラウンド発光が増強され、そのためアッセイ感度が低下する。同時に、アッセイにおいて特定のシグナル強度が増強される場合、バックグラウンドシグナル及び他の干渉因子を減少させることは、達成が困難な課題である。追加の干渉因子としては、アッセイの試料マトリックス及び他の成分が挙げられ、これら各々が、アッセイの性能へ悪い影響を与え得る（Ｈｅｍｍｉｌａ  Ｉ．，Ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．Ｉｎ：Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ａ．Ｐ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｍ．Ｗ．，ｅｄｓ．，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７，１９３〜２１４）。
【００１２】
イムノアッセイにおいて、不必要な非特異的結合は、１）レポータ抗体とタンパク質との間、２）レポータ抗体と固相との間、３）実際のアッセイ前に生体分子を安定化及び貯蔵するために使用される乾燥試薬間、及び４）レポータ抗体とアッセイに使用される試料マトリックス及び他の試薬の化合物との間の相互作用によって引き起こされる。非特異的結合をもたらす引力は、イオン−イオン相互作用、水素結合、及びファン・デル・ワールス引力（即ち、永久対向双極子を有する２つの分子による引力、双極性分子が他の分子中に双極子を誘起することによる引力、及び非極性分子間による引力）である。
【００１３】
非特異的結合は通常、残存する結合部位をブロッキングすることによって最小化される（Ｊｉａｎｗｅｎ，Ｈｅ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｎ：Ｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ，ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｏｘｆｏｒｄ，２０１３，３８１〜３９４）。タンパク質及び界面活性剤（洗剤）は、ブロッキング剤の２つの主なクラスである（Ｓｔｅｉｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ａｎｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００，２８２：２３２〜２３８）。一般に使用されるブロッキングタンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、無脂肪粉乳、魚ゼラチン、及び全血清が挙げられる（Ｖｏｇｔ，Ｒ．Ｆ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ＥＬＩＳＡ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７，１０１：４３〜５０）。界面活性剤は、非イオン性（Ｔｗｅｅｎ  ２０など）、陰イオン性（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなど）、陽イオン性（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドなど）、及び双性イオン性（ＣＨＡＰＳ水和物など）であり得る。
【００１４】
またポリマー遮断剤（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリアクリルマレイン酸、及びポリエチレングリコールなど）及び無機イオン（ＳＯ４２−、ＨＰＯ４２−、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋、ＯＨ−、及びＰＯ４３−など）は、周知のブロッキング剤である（国際公開第２０１２／１６１２８８号，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）。
【００１５】
当該技術分野において、ランタニド標識レポータを使用して、生体親和性アッセイなどのＴＲＦ結合アッセイにおいて、バックグラウンド及び他の干渉因子などの非特異的結合現象を低減するための新しい改善されたブロッキング試薬を開発することが望まれている。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の目的は、固有発光の蛍光光度測定又は時間分解蛍光光度測定法（ＴＲＦ）を利用した、検体特異的結合アッセイ及び特に生体親和性結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ（均一系及び不均一系の両方）、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、配位子結合アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、及び細胞ベースアッセイ）で使用するための、改善されたバックグラウンドブロッキング試薬を提供することである。本発明の遮断剤を使用して、改善されたアッセイ感度を得ることができる。
【００１７】
特に、本発明では、アッセイに使用される固体担体の表面上で、蛍光標識された検体特異的成分の非特異的結合を防止するバックグラウンドブロッキング試薬を提供する。
【００１８】
この目的は、いくつかの発色団部分（１〜５部分）を含有する、安定性及び水溶性が高く、好ましくは非蛍光性のキレートを有することであり、このキレートは、（所望により）非特異的生体分子と共有結合でき、問題のアッセイで使用される表面上において非特異的結合の傾向を増大させる。同時に、生体分子は、ブロッキング試薬と共役する場合、アッセイで使用される実際の標識化分子又は検体への結合を増加すべきではない。
【００１９】
驚くべきことに、ＴＲＦ結合アッセイでは、特異的生体分子（例えば、抗体）を標識するためにキレート化された蛍光ランタニドイオン（例えば、Ｅｕ３＋）を利用して、非特異的バックグラウンド発光を、標識蛍光ランタニドキレートのものと同一又は類似の発色団キレート配位子構造を共有するブロッキング試薬を使用する（ただし、ブロッキング試薬は異なるランタニド配位イオンを有するか又は全く有さない）ことによって大幅に減らすことができることがわかっている。例えば、検体特異的生体分子が蛍光Ｅｕ３＋イオンキレートで標識されるＴＲＦ結合アッセイでは、好適なブロッキング試薬は、キレート配位子と同一又は類似の形態に基づくことができるが、蛍光配位ランタニドイオンＥｕ３＋は、キレート配位子中で非蛍光ランタニドイオンＧｄ３＋に置換される。更に驚くべきことに、蛍光非環式ランタニドキレートにより、類似の発色団部分（単数又は複数）を備えるが、キレートイオンを有するか又は有さず、任意で非特異的生体分子と共役した、少なくとも１つの環式キレート化部分を有するブロッキング試薬は、バックグラウンドを低減するのに使用できる。あるいは、特異的生体分子を標識するのに使用されるランタニドイオンとは発光波長の異なるランタニドイオンを使用できる。別の代替形態では、ランタニド配位イオンを有さないキレート配位子をブロッキング試薬として使用できる。異なるキレート化されたランタニドイオン（又はイオンなし）の組み合わせは、例えば、内部制御として使用するためにも使用できる。類似又は同一のランタニドキレートで異なる検体特異的結合成分を標識することにより、本発明のブロッキング試薬を適用する同一のアッセイで、異なる検体を検出でき、ここで、各異なる検体特異的結合成分は、それ自体の個別のランタニドイオンで標識され、異なるランタニドイオンは、他のイオンとは別々に検出され得る。ブロッキング試薬は、標識された特異的生体分子の非特異的結合を防止するために、高い非特異的結合性を有するべきである。ブロッキング剤の非特異的結合性を高める方法は、非特異的生体分子（例えば、非特異的タンパク質、ナンセンスＩｇＧ、類似の生体分子）をキレート配位子に結合すること、ビオチンなどのハプテンを有機分子（疎水基）に結合すること、又はポリマーを結合することである。
【００２０】
生体親和性に基づく結合アッセイなどの結合アッセイにおいてバックグラウンド及び他の干渉因子などの非特異的結合現象を減少させるために、検体特異的成分（例えば、生体分子）に結合されたランタニド標識に構造が類似した化合物及び／又は複合体を使用する発想は、これまでのところ開示されていない。
【００２１】
全体として、本発明のバックグラウンドブロッキング原理は、個々のキレート及び配位子、好適な結合成分（特に抗体などの生体分子）と共役したキレート及び配位子、ポリマーと共役した配位子、有機分子と共役した配位子、ビオチンなどのハプテンと共役した配位子、及びこのように、ストレプトアビジンコーティング表面又は検出生体特異的分子若しくは他のタンパク質でコーティングされた表面に固定化された配位子を使用することによって効果的に適用できる。
【００２２】
第１の態様では、本発明は、試料中における１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイに関し、
コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は異なる検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分を提供することと、
１）発光ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は異なるランタニドイオンを含む発光ランタニドキレートで標識された、異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分、２）ランタニドキレート若しくはキレート配位子を含む、又はランタニドキレート若しくはキレート配位子である非特異的試薬であって、この試薬は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的である、非特異的試薬、
及び３）試料、を添加することと、
時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって特定の検体（単数又は複数）を検出することと、を含む。
【００２３】
標識された検体特異的結合成分（単数又は複数）が添加される前、同時に、又は後に、非特異的試薬を添加してもよい。アッセイに応じて、これは、標識された検体特異的結合成分（単数又は複数）を、例えば、インキュベーション緩衝液、試料、又は洗浄流体に添加することによって実施され得る。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、結合アッセイにおいて試料中における１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出するのに使用するキットに関し、このキットは、１）コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は異なる検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、２）ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は異なるランタニドイオンを含む発光ランタニドキレートで標識された、この異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、３）この検体（単数又は複数）並びにこの第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドキレート又はキレート配位子であるか、又はこれらを含む、非特異的試薬と、を含む。
【００２５】
好ましい実施形態では、この第１及び第２の検体特異的結合成分のうちの少なくとも１つは、生体分子である。より好ましくは、第１及び第２の検体特異的結合成分の両方は、生体分子である。
【００２６】
第１の検体特異的結合成分又は１組の異なる検体特異的結合成分は、コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に、又は１対の結合配位子を介してコーティングされた又はコーティングされていない固体担体に、直接固定化される。
【００２７】
第１及び第２の態様の好ましい実施形態では、結合アッセイ及びキットは、試料中の１つの特定の検体を検出するためのものであり、コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された第１の検体特異的結合成分、発光ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、及びこの非特異的試薬を含む。
【００２８】
第３の態様では、本発明は、時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって、試料中における１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出するための結合アッセイにおけるバックグラウンドブロッキング試薬の使用に関し、コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は異なるランタニドイオンを含む発光ランタニドキレートで標識された、異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、を含み、バックグラウンドブロッキング試薬は、非特異的試薬であり、これは検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドキレート又はキレート配位子であるか、又はこれらを含む。
【００２９】
好ましい実施形態では、非特異的試薬であるか又は非特異的試薬に含まれるキレート配位子は、検体（単数又は複数）を標識するのに使用される発光ランタニドキレート（単数又は複数）に含まれるキレート配位子と類似する。異なる検体を標識するのに使用される発光ランタニドキレートは、異なるランタニドを含み、同一又は異なるキレート配位子であってもよい。別の好ましい実施形態では、非特異的試薬であるか又は非特異的試薬に含まれるキレート配位子は、検体（単数又は複数）を標識するのに使用される発光ランタニドキレート（単数又は複数）に含まれるキレート配位子と同一である。
【００３０】
本発明の全ての態様では、非特異的試薬は、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される。
【００３１】
一実施形態では、第２の検体特異的結合成分は、発光ランタニドキレートで標識された検体又は１組の異なる標識された検体で置換され、各検体は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識され、非特異的試薬は、
ｖ）第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、この検体アナログ（単数又は複数）は、第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、ランタニドイオン（単数又は複数）は、発光ランタニドキレートで標識された検体中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉ）キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、この検体アナログ（単数又は複数）は、第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉｉ）検体アナログを含まない第２のランタニドキレートであって、ランタニドイオン（単数又は複数）は、ランタニドキレートで標識された検体（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、検体アナログを含まない第２のランタニドキレートか、又は
ｖｉｉｉ）検体アナログ（単数又は複数）及びランタニドイオン（単数又は複数）を含まないキレート配位子、から選択される。
【００３２】
別の実施形態では、非特異的試薬に使用される生体分子は、検出される検体（単数又は複数）とは異種であるか、あるいは完全に無関係である。別の実施形態では、生体分子は、例えば、誘導体、融合物、変異体などの検体アナログである。しかし、非特異的試薬において有用な生体分子は、第１及び第２の検体特異的結合成分、又は第２の検体特異的結合成分が置換された場合は発光ランタニドキレートで標識された検体によって認識されないことが必要条件である。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、非特異的試薬として又は非特異的試薬中で使用されるキレート配位子は、第２の検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用されるキレート配位子と同一又は類似の構造を有する。更により好ましくは、非特異的試薬として又は非特異的試薬中で使用されるキレート配位子は、第２の検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用されるキレート配位子と同一である。第２の検体特異的結合成分は、存在しないか、又は非特異的試薬中の非特異的結合成分（特に、ナンセンス抗体又は他のタンパク質などの生体分子）によって置換されるかのいずれかである。非特異的試薬中のキレート化されたランタニドイオンは、第２の検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用されるランタニドイオンとは異なる。キレート配位子はまた、配位イオンを含まない非特異的試薬として又は非特異的試薬中で使用できる。最も好ましい実施形態では、非特異的試薬は、生体分子と共役せず、かつ配位イオンを含まない。更に、非特異的試薬は、好ましくは少なくとも１つの環式キレート化部分を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】スキーム１を示す図である。
【図２】スキーム２を示す図である。
【図３】スキーム３を示す図である。
【図４】スキーム４を示す図である。
【図５】スキーム５を示す図である。
【図６】スキーム６を示す図である。
【図７】スキーム７を示す図である。
【図８】スキーム８を示す図である。
【図９】異なるバックグラウンド遮断剤の相対的なバックグラウンドシグナルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、ランタニドキレート（単数又は複数）又はキレート配位子（単数又は複数）を含む、例えば、生体親和性アッセイなどの時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）結合アッセイにおいて使用するバックグラウンドブロッキング試薬に関する。
【００３６】
本発明では、アッセイにおいて特異的結合成分（例えば、抗体などの生体分子）を標識するのに使用される蛍光ランタニドイオンをキレート化するために使用されるブロッキング剤において、同一又は類似のキレート配位子構造を使用することによってＴＲＦ結合アッセイにおけるバックグラウンド発光を著しく減らすことができるという発見を利用している。キレート配位子は、キレート配位子として又は好適な配位ランタニドイオンを含むキレートとして使用してよい。従って、本発明は、使用されるアッセイ担体の表面上で、蛍光標識された検体特異的結合成分（単数又は複数）の非特異的結合を防止するバックグラウンドブロッキング試薬を提供する。
【００３７】
本発明の文脈において、用語「試料」は、生体試料（血液、血清、血漿、尿、口腔液、大便、脳脊髄液、羊水、頸管粘液、組織液、組織ホモジネート、汗、精液、乳、創傷滲出液、腹水など）、環境調査からの試料（廃水、土壌試料、浸出物）、工業プロセスからの試料（処理溶液、生成物）、並びに化合物ライブラリ（有機化合物、天然生成物、生物抽出物、天然、合成、及び組換えタンパク質及びペプチド、ヌクレオチドなどを含み得るスクリーニングライブラリ）を意味する。
【００３８】
本発明の文脈において、用語「生体分子」は、好ましくは、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマー、成形プラスチックインプリント（分子インプリント）などから選択される、天然又は合成生体分子化合物を意味する。
【００３９】
本発明の文脈において、用語「検体」は、試料中で検出される特定の目的の分子、特に生体分子を意味する。目的の検体の例は、抗体、抗原、酵素、ホルモン、タンパク質、及び糖タンパク質、例えば、メンブレン受容体及びメンブレンマーカー、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチド配列などである。
【００４０】
本発明の文脈において、用語「検体特異的結合成分」は、この検体に特異的に結合する、結合分子又は配位子、特に生体分子を意味する。用語「第１の検体特異的結合成分」は、固体担体に固定化された検体特異的結合成分を指す。用語「第２の検体特異的結合成分」は、ランタニドキレートで標識された検体特異的結合成分を指す。
【００４１】
用語「非特異的成分」は、この成分が検体（単数又は複数）、固定化された第１の検体特異的結合生体分子（単数又は複数）、又は標識された第２の検体特異的結合成分（単数又は複数）によって認識されないことを意味する。
【００４２】
本発明の文脈において、用語「検体アナログ」は、生体分子の誘導体、融合物、又は変異体などを意味する。
【００４３】
本発明の第１の態様では、標識化剤に類似したブロッキング剤を使用する新しい原理が、試料中における１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイであって、
ａ）コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は１組の異なる第１の検体特異的結合成分を提供することと、
ｂ）この固体担体に、
１）発光ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識されている、１組の異なる第２の検体特異的結合成分、
２）検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された検体特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された検体特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、非特異的試薬、
３）試料、を添加することと、
ｃ）時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって特定の検体（単数又は複数）を検出することと、を含む、結合アッセイに使用されている。
【００４４】
この標識された検体特異的結合成分（単数又は複数）が添加される前、同時に、又は後に、非特異的試薬を添加してもよい。アッセイに応じて、これは、標識された検体特異的結合成分（単数又は複数）を、例えば、インキュベーション緩衝液、試料、又は洗浄流体に添加することによって実施され得る。
【００４５】
好ましい実施形態では、検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用され、かつ非特異的試薬に使用されるキレート配位子は、同一又は類似の構造を有する。より好ましくは、検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される、及び非特異的試薬に使用されるキレート配位子は、同一の構造を有する。しかし、検体特異的結合成分（単数又は複数）は、非特異的試薬中の非特異的生体分子（ナンセンス抗体又は他のタンパク質など）によって置換されるか、又は非特異的試薬に全く存在しない。非特異的試薬中のキレート化されたランタニドイオンは、検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用されるランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる。異なる標識された検体特異的結合成分が同一のアッセイにおいて異なる特定の検体を検出するために使用される場合、キレート配位子は、同一又は異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。ランタニドイオンは、異なる標識された検体特異的結合成分ごとに異なる。キレート配位子はまた、非特異的生体分子を含む又は含まない、配位イオンを含まない非特異的試薬として使用できる。最も好ましい実施形態では、非特異的試薬は、生体分子と共役せず、かつ配位イオンを含まない。更に、非特異的試薬は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有することが好ましい。
【００４６】
本発明のアッセイの一実施形態によれば、非特異的試薬は、１つ以上の検体特異的生体分子（単数又は複数）が１つ以上の特定の検体（単数又は複数）をキャプチャするために固定化された固体担体に添加され、続いて、発光ランタニドキレートで標識された検体特異的結合成分、又は異なる検体に特異的な１組の異なる検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識されている、１組の異なる検体特異的結合成分を添加する。試料の添加後、固体担体をインキュベートし洗浄する。他の実施形態では、非特異的試薬及び標識された検体特異的結合成分（単数又は複数）を固体担体に試料と同時に、その前に、又は後に添加する。更なる実施形態では、非特異的試薬、試料、及び洗浄物を添加後に、標識された検体特異的成分（単数又は複数）を固体担体に添加する。
【００４７】
本発明のアッセイの別の実施形態によれば、第２の検体特異的結合成分は、発光ランタニドキレートで標識された検体又は１組の異なる標識された検体で置換され、各検体は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識され、非特異的試薬は、
ｖ）第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、この検体アナログ（単数又は複数）は、第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、ランタニドイオン（単数又は複数）は、発光ランタニドキレートで標識された検体中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉ）キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、この検体アナログ（単数又は複数）は、第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉｉ）検体アナログを含まない第２のランタニドキレートであって、ランタニドイオン（単数又は複数）は、ランタニドキレートで標識された検体（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、検体アナログを含まない第２のランタニドキレートか、又は
ｖｉｉｉ）検体アナログ（単数又は複数）及びランタニドイオン（単数又は複数）を含まないキレート配位子、から選択される。
【００４８】
アッセイは、選択された特定の結合アッセイに適合した、１回以上の追加の洗浄工程、１回以上のインキュベーション工程、１回以上の熱サイクリング工程、１回以上の乾燥工程（単数又は複数）などの更なる工程を含んでもよく、この追加工程は当業者に知られており瑣末なことである。
【００４９】
本発明の第２の態様では、標識化剤に類似したブロッキング試薬を使用する新しい原理が、結合アッセイにおいて１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出するのに使用するキットであって、
ａ）コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、
ｂ）ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識されている、１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、
ｃ）検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、非特異的試薬と、を含む、キットに使用されている。
【００５０】
キットは、本発明の第１の態様に従ったアッセイで使用するのに好適である。キットに含まれるキレート／キレート配位子は、本発明の第１の態様に従ったアッセイで使用するために選択されている。
【００５１】
本発明の第１及び第２の態様の一実施形態では、第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）は、固体担体に直接固定化される。他の実施形態では、第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）は、ビオチン−ストレプトアビジン、ビオチン−アビジン、又は当該技術分野において既知の他の好適な対などの特異的結合対を介して固体担体に固定化され、対のうちの一方がこの第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に結合し、もう一方が固体担体に固定化される。また、例えば、空間的理由などのため、所望によりリンカーが固定化に適用されてもよい。
【００５２】
第３の態様では、本発明は、時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって、１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイにおけるバックグラウンド遮断剤の使用に関し、このアッセイは、固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識された、１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、を含み、バックグラウンド遮断剤は、非特異的試薬であり、これは検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される。
【００５３】
第４の態様では、本発明は、時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって、１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイにおいて使用するキットの調製におけるバックグラウンドブロッキング試薬の使用に関し、このアッセイは、固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、ランタニドキレートで標識された第１の検体特異的結合成分、又は異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識された、１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、を含み、バックグラウンドブロッキング試薬は、非特異的試薬であり、これは検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、この生体分子は、検体（単数又は複数）並びに第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、ランタニドイオンは、ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中のランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される。
【００５４】
より詳細には、本発明で使用するキレート配位子は、ランタニド（Ｌｎ）に対して７〜１０個の配位ヘテロ原子を有する式（Ｉ）のピリジン部分を含み（このランタニドが存在する場合）、
【化１】
2019532254.tif 000002
ｍは、１〜５の正の整数であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンとの間の配位結合を表す（このランタニドイオンが存在する場合）。
【００５５】
式Ｉの１〜５個のピリジン部分を含むこのキレート又はキレート配位子は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、同一又は異なる基Ｇを１〜５個含有する。
【００５６】
Ｇは、電子求引性基及び／又は電子供与性基で置換される。電子求引性基は、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ５、−ＣＦ３、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、及びハロゲン（即ち、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ）であり得るが、これらに限定されない。Ｇは好ましくは、−Ｃ１〜６アルキル又は−Ｘ−（Ｒ４）１〜２であり得るが、これらに限定されない電子供与性基で置換され、ここで、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、又は−Ｎ（Ｒ５）ＣＯ−であり、Ｒ５は、水素又は−Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ４は、水素、−Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯＮＲ６Ｒ７、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ（ピペラジン−１，４−ジイル）（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ＋−（ＣＨ３）−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３−、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、及びポリエチレングリコールから選択され、Ｒ６及びＲ７は、各々独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）３、−ＣＨ２［ＣＨ（ＯＨ）］１〜６ＣＨ２ＯＨから選択される。
【００５７】
共役基は、１つ、２つ、又は３つの部分からなり、各部分は、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、及び（ヘテロ）芳香環又は環系のビラジカル（−Ｈｅｔ／Ａｒ−）、例えば、フェニレン、ビフェニレン、ナフチレン、ピリジレン、ピラジニレン、ピリミジニレン、ピリダジニレン、フリレン、チエニレン、ピロリレン、イミダゾリレン、ピラゾリレン、チアゾリレン、イソチアゾリレン、オキサゾリレン、イソオキサゾリレン、フラザニレン（fyrazanylene）、１，２，４−トリアゾール−３，５−イレン、及びオキサジアゾリレンから選択される。
【００５８】
Ｒ３ｎの各々（ｎは、１〜５の正の整数）は、独立して、ｉ）生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される。
【００５９】
反応性基Ｚ２は、非特異的生体分子との共役を促進するか、又は他の試薬（例えば、ジアミノヘキサン、実施例参照）又はポリマーとの共有結合の形成を促進する。
【００６０】
反応性基の例は、アジド基（−Ｎ３）、アルキニル基（−Ｃ≡ＣＨ）、アルキレン基（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アミノ基（−ＮＨ２）、アミノオキシ基（−Ｏ−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、メルカプト基（−ＳＨ）、マレイミド基、又はこれらの活性化誘導体から選択されるものであり、イソシアナト（−ＮＣＯ）、イソチオシアナト（−ＮＣＳ）、ジアゾニウム（−Ｎ＋≡Ｎ）、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、反応性エステル、ピリジル−２−ジチオ、及び６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノを含む。
【００６１】
６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ中の置換基は、水素、ハロゲン、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、１〜６個の炭素原子のアルキル、置換アミノ又はチオエーテルからなる群から選択でき、好ましくは、クロロ、フルオロ、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ、又はエトキシカルボニル−チオメトキシからなる群から選択できる。置換アミノ又はチオエーテルは、好ましくは一置換又は二置換であり、各置換基は、好ましくは独立して、１〜６個の炭素原子のアルキル又はアルコキシ、フェニル、カルボニル、又はカルボキシルからなる群から選択される。
【００６２】
非特異的生体分子又は他の試薬（１，６−ジアミノヘキサンなど）又はポリマーと反応すると、反応性基Ｚ２は、この非特異的生体分子又はこの他の試薬又はこのポリマーへの結合（例えば、下記の種類のうちの１つ）を確立する：チオ尿素（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＣＨ３−ＣＯ−及び−ＣＯ−ＮＣＨ３−）、及び脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン、
【化２】
2019532254.tif 000003
（式中、ｎ＝１〜６）、及びトリアゾール（例えば、いわゆる「クリック」ケスミトリーによって形成される）。
【００６３】
疎水基は、このキレート又はキレート配位子の非特異的結合性を増加させ、以下の基の１〜６個の組み合わせから選択できる：１〜２０個の炭素原子のアルキル、及び追加で酸素、硫黄、及び窒素などの０〜４個の他の原子（−（ＣＨ２）０〜２０ＣＨ３、−ＮＨ（ＣＨ２）１〜２０ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ２）１〜６Ｏ（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２、−ＮＨ［（ＣＨ２）２〜６Ｏ］１〜１０（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２など）、アリール、ビアリール（フェニル、ビフェニルナフチルなど）、又は１〜２０個のアミノ酸残基を有するオリゴペプチドなど。
【００６４】
親水基の例は、単糖及びオリゴ糖、例えば、単糖及び二糖、オリゴアルキレングリコール（例えば、１〜２０個の繰り返し単位を有するもの）、例えば、２０個のオリゴエチレングリコール及びオリゴプロピレングリコールなどである。
【００６５】
一実施形態において、親水基は、単糖、二糖、−（ＣＨ２）１〜６ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、−Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３−（ＣＨ２）１〜３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）０〜５−Ｈ、−（ＣＨ２）１〜３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）０〜５−Ｃ１〜４アルキル、−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜６−Ｈ、及び−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜６−Ｃ１〜４アルキル、特に、単糖から選択される。
【００６６】
本文脈において、用語「単糖」は、非環式又は環式のいずれかの形態のＣ５〜Ｃ７炭水化物を意味することを意図する。単糖の例は、Ｃ６炭水化物であり、例えば、以下から選択される。
【化３】
2019532254.tif 000004
【００６７】
本文脈において、用語「二糖」は、好ましくはグリコシド結合によって、互いに結合した２個の単糖（上記参照）を意味することを意図する。
【００６８】
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ（このランタニドイオンが存在する場合）、ｉｉ）ピリジン部分と化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表す。
【００６９】
好ましくは、Ｒ１又はＲ２のいずれかは、Ｌｎ３＋イオンと配位結合を形成するキレート基Ｃｈであり、−ＣＯＯ−、−ＰＯ３２−、−ＰＭｅＯ２−、−ＰＰｈＯ２−、−ＣＨ２ＰＯ３２−などの基であってよいがこれらに限定されない。１〜５個のピリジン部分における１つのＲ１又はＲ２は、−ＣＯＮＨＲ９又は−ＣＯＮＲ９Ｒ１０であり得、ここで、Ｒ９又はＲ１０は、アルキル基、又は生体分子と共有結合する反応性基を含有するリンカー基、又はカップリング反応後にこの反応性基Ｚ２及び生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１である。
【００７０】
更に、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、発色団部分とキレートの他の部分、例えば、発色団部分とキレート化部分との間の結合を表す。少なくとも２個のカルボン酸基又はリン酸基、これらの酸のエステル、アミド又は塩を含むキレート化部分は、直接的に又は環式若しくは非環式Ｎ−及び／若しくはＯ−含有炭化水素鎖を介してのいずれかで、発色団部分の芳香族単位に結合する。この他の部分は、Ｒ３基を含有するリンカー基を含有することができる。
【００７１】
固有発光の蛍光光度測定法又は時間分解蛍光光度測定法を利用する特異的生体親和性に基づく結合アッセイとしては、イムノアッセイ（均一系及び不均一系の両方）、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、及び細胞ベースアッセイが挙げられる。本発明のブロッキング試薬は、改善されたアッセイ感度を得るための手段を提供する。
【００７２】
本発明の一実施形態では、ブロッキング試薬中でキレート化されたＬｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択される。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、Ｌｎ３＋基はブロッキング試薬に存在しない。
【００７４】
ブロッキング剤にキレート化されたランタニドを使用する場合、標識された検体特異的結合成分又は１組の異なる標識された検体特異的結合成分で使用するランタニドとは異ならなければならない。同一のアッセイで異なる検体特異的結合成分を使用して異なる特定の検体を検出する場合、これらは異なるキレート化されたランタニドで標識される。
【００７５】
驚くべきことに、Ｇｄ３＋キレートは、Ｇｄ３＋キレートから最も近くに位置するＥｕ３＋キレートへのエネルギー転移により、特定のＥｕ３＋発光シグナルを増加させることが観察された。これにより、好ましい実施形態では、Ｅｕ３＋は、特異的生体分子を標識するのに使用され、Ｇｄ３＋は、ブロッキング試薬に使用される。ブロッキング試薬は、共役された非特異的生体分子を含んでも含まなくてもよい。配位イオンを含まず、非特異的生体分子と共役しないキレート配位子により、バックグラウンドを有意に減少させることは、更に驚くべきことであった。従って、最も好ましい実施形態では、非特異的試薬は、この非特異的生体分子と共役せず、かつ配位イオンを含まず、かつ更に非特異的試薬は、環式キレート化部分を有する。
【００７６】
検出可能な発光波長を有するランタニド（Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋など）を使用して特異的生体分子を標識することができ、標識された特異的生体分子の発光波長の発光バンドを有さない他のランタニドのうちのいずれかをブロッキング試薬に使用でき得る。更に、他の蛍光ランタニドは、内部アッセイ又は測定制御として使用でき得る。例えば、他の蛍光ランタニドは、ビオチンと共役でき、ストレプトアビジンコーティング表面に固定化できる。固定化された表面上での他の蛍光ランタニドのシグナル及び既知の量の検体からのシグナル、即ちＴＲＦ測定後に得られる２つの異なる発光シグナルを使用して、様々な個々の装置を調整することができ、他の蛍光ランタニドと共役したビオチンと試料又は液体制御中の検体の測定に使用される蛍光ランタニドとの発光の違いにおける既知の関係を使用して、同量の試料又は液体制御から同一のシグナルレベルを与える。
【００７７】
本発明の更なる実施形態では、Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択され、１つのＲ３基は、生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び非特異的生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１である。
【００７８】
本発明の更に別の実施形態では、Ｌｎ３＋基は存在せず、１つのＲ３基は、生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び非特異的生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１である。
【００７９】
好ましい実施形態では、Ｅｕ３＋キレートは、検体特異的化合物を標識するのに使用され、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｙｂ３＋、又はＹ３＋キレートは、ブロッキング剤として使用され、標識及びブロッキング剤中のキレート配位子は、同一又は構造的に類似している。より好ましい実施形態では、Ｅｕ３＋キレートは、特異的生体分子を標識するのに使用され、Ｇｄ３＋キレートは、ブロッキング剤として使用され、標識及びブロッキング剤中のキレート配位子は、同一又は構造的に類似している。最も好ましい実施形態では、Ｅｕ３＋キレートは、特異的生体分子を標識するのに使用され、キレート配位子は、ブロッキング剤として使用され、ブロッキング剤は、同一又は構造的に類似しており、環式又は非環式のキレート化部分を有する。
【００８０】
式（Ｉ）のピリジン部分の非限定的な例を以下に示す：
【化４】
2019532254.tif 000005
【化５】
2019532254.tif 000006
【化６】
2019532254.tif 000007
【００８１】
ピリジン系化合物、例えば、種々のフェノール系化合物の他に（例えば、Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｓｔ１９８４，１０９，１４４９；米国特許第４，６７０，５７２号；Ｋａｎｋａｒｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９２，２６６，２０５；国際公開第２０００／０４８９９１号及び国際公開第２００８／０６３７２１号）、１，２−ヒドロキシピリジノン（例えば、国際公開第２００８／００８７９７号）化合物、及びＤＴＰＡカルボシリル（carbosyril）１２４複合体（Ｓｅｌｖｉｎ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１６  ６０２９）をこの目的に使用できる。
【００８２】
本発明に従ってＴＲＦ結合アッセイにおいて使用するための特異的生体分子（Ｌｎ３＋＝Ｅｕ３＋）及び非特異的生体分子（Ｌｎ３＋＝Ｇｄ３＋）それぞれのカップリングのための反応性基を含む、「一対の」キレートの例を以下に示す。
【化７】
2019532254.tif 000008
【００８３】
検体特異的生体分子（単数又は複数）は通常、共有結合又は非共有結合のいずれかにより固体担体に固定化される。一実施形態において、検体特異的生体分子（単数又は複数）は、固体担体に直接固定化される。他の実施形態では、検体特異的生体分子（単数又は複数）は、ビオチン−ストレプトアビジン、ビオチン−アビジンなどの結合対を介して固定化され、対のうちの一方が検体特異的生体分子（単数又は複数）に結合し、もう一方が固体担体に固定化される。例えば、空間的理由などのため、所望によりリンカーが固定化に適用されてもよい。
【００８４】
アッセイ固体担体は、特定の結合アッセイに最良に適合するように選択された、ポリスチレン表面、ポリマービーズ、ガラスビーズ、金粒子、ナノ粒子、組織、組織断片、細胞などの水不溶性粒子及び表面である。固体担体は、ナノ粒子、マイクロ粒子、スライド、プレート、及び固相合成樹脂から選択されてもよい。このような固体担体は当業者に知られており、当業者は容易に選択及び使用できる。一例としては、マイクロタイタープレートが挙げられ得る。異なるアッセイフォーマットは、このアッセイを準備するために更なる成分を含んでもよい。キットはまた、本発明による好適なアッセイにおいて内容物を使用するための指示書を含んでもよい。
【００８５】
上述の既知の技術に記載されているように、キレート配位子を得て、ランタニド配位イオンを有するランタニドキレートを調製するのに使用することができる。キレート及びキレート配位子は、既知の技術に記載されているように、検体特異的結合成分、又は１組の異なる検体特異的結合成分、又は非特異的試薬とも共役されてもよい。例えば、ブロッキング試薬として使用する活性化キレート及び活性化キレート配位子は、ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３〜３２０１に記載されているように、過剰量のキレート／配位子を使用することによって、ナンセンスＩｇＧ抗体とカップリングできる。カップリング反応を室温で一晩実施し、例えば好適なゲルろ過カラムで過剰な試薬から生成物を分離し、抗体を含有する画分をプールする。共役したキレート／配位子濃度は、異なる特定の波長におけるＵＶ吸光度を使用して測定することができる。抗体ごとのカップリングしたキレート／配位子の量は通常、平均１〜５０の間、特に２〜４０の間、より詳細には１０〜１５などの５〜３０の間で変化する。
【００８６】
本発明のブロッキング試薬を含む及び含まないアッセイバックグラウンドを、トロポニンＩ（ＴｎＩ）サンドイッチイムノアッセイで比較し、ここで、Ｇｄ３＋キレートの構造と比較可能なＥｕ３＋キレートで標識されたトレーサ抗体を使用した。トレーサ抗体及びＴｎＩ標準溶液をピペットで、ストレプトアビジン及びＴｎＩに対するビオチン化捕捉抗体及び試験される化合物でコーティングされた予めコーティングされたアッセイウェルへと取る。この反応混合物をインキュベートし、その後洗浄及び乾燥し、蛍光光度計により測定した。バックグラウンドシグナルの有意な減少が見られた。本出願に記載されている異なるブロッキング試薬を用いて、特定のシグナルの驚くほど大きい増加（最大４０％までも）が観察された。
【００８７】
アッセイで使用される発光キレートと比較して、高濃度でのブロッキング試薬として強力なキレート配位子を使用する場合であっても、Ｌｎ系ブロッキング試薬（例えば、Ｇｄ３＋系ブロッキング試薬）の使用に相当する、有意なバックグラウンドの減少が得られ、得られる特定のシグナルに悪影響を与えることはないということは注目に値する。
【００８８】
全体として、個別のキレート及び配位子、抗体と共役したキレート及び配位子、ポリマーと共役した配位子、有機分子（疎水基）と共役した配位子、及びビオチンなどのハプテンと共役した配位子、及びこのように、ストレプトアビジンコーティング表面に固定化された配位子を使用することにより、本発明のバックグラウンドブロッキング原理を効果的に適用することができる。
【００８９】
実験の項
以下の非限定的な実施例は、本発明を更に実証することを目的とする。用いられた構造及び合成ルートは、スキーム１〜８に提示されている。スキーム８は、イムノアッセイ試験において必要な抗体トレーサ標識化に使用されたＥｕ３＋キレート（２０及び２１）を表す。
【実施例】
【００９０】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＤＲＸ  ５００ＭＨｚで記録した。内部基準としてテトラメチルシランを使用した。質量スペクトルは、α−シアノ−４−ケイ皮酸マトリックスを使用して、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置で記録した。ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３３００  ｐｒｏで記録した。蛍光光度測定は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ（商標）プレート蛍光光度計を用いて実施し、イムノアッセイは、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  ＡＱＴ  ９０  Ｆｌｅｘイムノアッセイ分析装置を用いて実施した。
【００９１】
ＨＰＬＣ精製の条件は、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８カラム）である。溶媒Ａは、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡ）（２０ｍＭ、ｐＨ７）であり、溶媒Ｂは、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）中に５０％のアセトニトリルであった。グラジエントは、５％の溶媒Ｂから開始して、溶媒Ｂの量を３０分間で１００％まで直線的に増やした。
【００９２】
シリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ）を充填したカラムを用いてカラムクロマトグラフィーを実施した。ＦＣ＝フラッシュクロマトグラフィー、ＲＴ＝室温。
【００９３】
実施例１．化合物２の合成（スキーム１、図１）
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中で化合物１（１２５ｍｇ、７５μｍｏｌ、国際公開第２０１３／０２６７９０号に記載のとおり合成）及び０．５ＭのＫＯＨの混合物を室温で３０分間撹拌し、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）を添加した。室温で３時間撹拌した後、ＥｔＯＨを蒸発させ、残留物を室温で２０時間撹拌し、ｐＨを６ＭのＨＣＩで約６．５に調整した。ＧｄＣｌ２×６Ｈ２Ｏ（２８ｍｇ、７５μｍｏｌ）のＨ２Ｏ（０．４ｍＬ）溶液を１０分間以内に添加し、ｐＨを固体ＮａＨＣＯ３で５〜７に維持した。室温で一晩撹拌した後、ｐＨを１ＭのＮａＯＨで８．５に調整し、沈殿を遠心分離し、上清を蒸発乾燥固した。生成物を２０ｍｍｏｌのＴＥＡＡ緩衝液（１ｍＬ）中に溶解させ、半分取ＨＰＬＣで精製した。収率：１１６ｍｇ（７２％）。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１５．７分。ＵＶＡ／ＩＳ＝３５７ｎｍ。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋２Ｈ＋）１４３９．２０；測定値１４３９．２１。
【００９４】
実施例２．化合物３の合成（スキーム１、図１）
化合物２（１１６ｍｇ、５４μｍｏｌ）の水溶液（２ｍＬ）のｐＨを固体ＮａＨＣＯ３で約７．０−７．５に調整し、ＣＳＣｌ２（５８μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（７２ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）及びＣＨＣｌ３（２ｍＬ）の混合物に５分間以内に添加した。室温で４０分間撹拌した後、水相をＣＨＣｌ３（３×２ｍＬ）で洗浄した。生成物をアセトン（約４０ｍＬ）で沈殿させ、遠心分離し、アセトン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した。
【００９５】
実施例３．化合物５の合成（スキーム２、図２）
ＥｔＯＨ（８０ｍＬ）中で化合物４（１．３１ｇ  ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、国際公開第２０１６／０６６６４１号に記載のとおり合成）及び０．５ＭのＫＯＨの混合物を室温で１時間撹拌し、Ｈ２Ｏ（４０ｍＬ）を添加した。室温で４時間撹拌した後、ＥｔＯＨを蒸発させ、混合物を室温で一晩撹拌した。氷冷混合物のｐＨを６ＭのＨＣｌで約２．０〜２．５に調整し、１５分間氷浴中で撹拌し、遠心分離し、冷Ｈ２Ｏ（２×１０ｍＬ）、冷ＥｔＯＨ（２×１０ｍｌ）を加え、乾燥した。収率：１．０２ｇ（９９％）。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１７．４分。ＵＶＡ／ＩＳ＝３４６ｎｍ。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋１Ｈ＋）１２９４．３４；測定値１２９４．３８。
【００９６】
実施例４．化合物６の合成（スキーム２、図２）
この化合物６は、実施例２に記載の合成と類似の方法を使用して、化合物５から合成した。
【００９７】
実施例５．化合物７の合成（スキーム３、図３）
化合物５（１５ｍｇ、１２μｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５ｍＬ）溶液中における懸濁液のｐＨを１ＭのＮａＯＨで約６．５に調整した。クエン酸（８ｍｇ、４２μｍｏｌ）のＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）溶液を添加後、ｐＨを１ＭのＮａＯＨで約６．５に調整した。ＧｄＣｌ２×６Ｈ２Ｏ（５ｍｇ、１４μｍｏｌ）のＨ２Ｏ（０．２５ｍＬ）溶液を１０分間以内に添加し、ｐＨを１ＭのＮａＯＨで約９．５に調整した。混合物を９５℃で４〜６週間撹拌した（分析ＨＰＬＣのクロマトグラムが錯化の完了を示すまで）。ｐＨを１ＭのＨＣｌで約７．０に調整し、混合物を蒸発乾燥固し、２０ｍｍｏｌのＴＥＡＡ緩衝液（０．４ｍＬ）中に溶解させ、半分取ＨＰＬＣで精製した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１５分。ＵＶ＝３５０ｎｍ。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋）１４４８．２３；測定値１４４８．５２（生成物は、対応するＥｕ３＋キレートと比較して同一の保持時間を有する、国際公開第２０１３／０２６７９０号参照）。
【００９８】
実施例６．化合物８の合成（スキーム３、図３）
化合物８は、実施例２に記載の合成と類似の方法を使用して、化合物７から合成した。
【００９９】
実施例７．化合物９〜１５の合成（スキーム４、図４）
５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３緩衝液（１ｍＬ）中で化合物６（５９ｍｇ、４０μｍｏｌ）及び対応のアミン（０．４ｍｍｏｌ）の混合物を室温で一晩撹拌した。生成物をアセトン（４０ｍＬ）で沈殿させ、遠心分離し、アセトン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した。
【表１】
2019532254.tif 000009
【０１００】
実施例８．化合物１６の合成（スキーム５、図５）
化合物８（５９ｍｇ、４０μｍｏｌ）をポリリシン（１３ｍｇ、２μｍｏｌ）及び５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３緩衝液（１ｍＬ）の混合物に添加した。一晩反応させた後、１，６−ジアミノヘキサン（４６ｍｇ）を添加し、混合物を室温で一晩置いて反応させた。生成物をアセトン（４０ｍＬ）で沈殿させ、遠心分離し、アセトン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した。
【０１０１】
実施例９．化合物１７の合成（スキーム６、図６）
５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３緩衝液（２ｍＬ）中で化合物６（７３ｍｇ、５０μｍｏｌ）及びビオチン−（ＰＥＧ）４−ＮＨ２（２３ｍｇ、５０μｍｏｌ）の混合物を室温で一晩撹拌した。タウリン（１３ｍｇ、０．１ｍｍｏ）を添加後、混合物を室温で一晩撹拌し、蒸発乾燥固した。生成物を２０ｍｍｏｌのＴＥＡＡ緩衝液（１ｍＬ）中に溶解させ、半分取ＨＰＬＣで精製した。収率：１０ｍｇ。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２１．１分。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋１Ｈ＋＋Ｎａ＋＋Ｋ＋）１８５９．５５；測定値１８５９．６１。
【０１０２】
実施例１０．化合物１８及び１９の合成（スキーム７、図７）
これら２つのＧｄ錯体は、実施例１及び実施例２に記載の合成と類似の方法を使用して、対応する配位子エステルから調製した。エステルは、国際公開第２０１３／０２６７９０号及び国際公開第２０１６／０６６６４１号に記載の方法及び手順を使用して調製した。
【０１０３】
実施例１１．活性化Ｇｄキレート３、８、１９及び活性化配位子６の抗マウスＩｇＧとのカップリング
抗マウスＩｇＧの一般のカップリング反応は、ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３〜３２０１）に記載されているように、使用される化合物３、６、８、又は１９の３００倍過剰量を使用することによって実施した。反応は、室温で一晩実施した。溶離剤としてトリス生理食塩水アジド（Tris-saline-azide）（５０ｍＭトリス、０．９％ＮａＣＩ、ｐＨ７．７５）緩衝液を使用することによって、生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０ゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で過剰な反応体から分離した。抗体を含有する画分は、プールされた。キレート（３、８、１９）及び配位子（６）の濃度は、それぞれ３５０ｎｍ及び３３０ｎｍでのＵＶ吸光度を使用して測定した。抗体ごとのカップリングしたキレート／配位子の量は、平均１０〜１５の間で変化した。
【０１０４】
実施例１２．トロポニンＩイムノアッセイ、並びに本発明のブロッキング試薬を使用する場合及びしない場合のアッセイバックグラウンドの比較
バックグラウンドブロッキングは、心臓マーカーのトロポニンＩのサンドイッチイムノアッセイで評価した。トレーサ抗体は、Ｇｄ３＋キレート３の構造と比較できるＥｕ３＋キレートで標識された（国際公開第２０１３／０２６７９０参照）。ＴｎＩ抗体の標識化は、ｖｏｎ  Ｌｏｄｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．に記載されているように、Ｅｕ３＋キレート（２０及び２１（スキーム８、図８））の３００倍過剰量を使用することによって実施した。反応は、室温で一晩実施した。溶離剤としてトリス生理食塩水アジド（トリス５０ｍＭ、ＮａＣＩ０．９％、ｐＨ７．７５）緩衝液を使用することによって、標識された抗体をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０ゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で過剰なＥｕ３＋キレートから分離した。抗体を含有する画分は、プールされ、Ｅｕ濃度は、Ｅｕ標準物質に対してＶｉｃｔｏｒ（商標）プレート蛍光光度計で、又は３４０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定した。
【０１０５】
希釈されたトレーサ抗体（１０μＬ、５ｎｇ／μＬ）及びＴｎＩ標準溶液（４０μＬ）をピペットで予めコーティングされたアッセイウェルへと取る（９６ウェルプレートフォーマットのシングルウェル、ウェルはストレプトアビジン及びＴｎＩに対するビオチン化捕捉抗体（Ｉｎｎｏｔｒａｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｏｙ）、及び試験される化合物（２００ｎｇ／ウェル）でコーティングされる。この反応混合物を３６℃で２０分振盪しながらインキュベートした。ウェルを６回洗浄し、乾燥し、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）プレート蛍光光度計で測定した。その結果は表２及び図９にまとめられている。表２では、Ａ及びＢの標準の両方を最低６回繰り返して測定した。標準Ａはブランクに相当し、標準Ｂは中域の試料濃度に相当する。
【表２】
2019532254.tif 000010
＊：異常値として除外された値。
【０１０６】
表２の結果から、バックグラウンドシグナルの有意な減少（３分の１を超える減少）が明らかである。また驚くべきことに、化合物３に対する特定のシグナルの増加が観察される。更に驚くべきことに、本出願に記載されている異なるブロッキング試薬を用いて、特定のシグナルの高い増加（最大４０％までも）が観察された。
【０１０７】
いくつかの異なるトレーサ抗体及びアッセイのコンセプトで、化合物３及び８を試験した。本出願に記載されている他のブロッキング化合物の性能と共に、図９に両化合物についての平均性能を示す。図９では、基準値は、追加のバックグラウンド遮断剤を用いない標準アッセイのバックグラウンドシグナルを表す。化合物８とのシグナル比較により、化合物６、９、及び１９の値を得た。化合物６との比較により、化合物１０〜１６の値を得た。
【０１０８】
アッセイに使用する発光キレートに比べて高濃度で、ブロッキング試薬として強力なキレート配位子を使用する場合であっても、得られる特定のシグナルに悪影響を与えることはないということは注目に値する。
【０１０９】
全体として、個別のキレート及び配位子、抗体と共役したキレート及び配位子、ポリマーと共役した配位子、有機分子（疎水基）と共役した配位子、及びビオチンなどのハプテンと共役した配位子、及びこのように、ストレプトアビジンコーティング表面に固定化された配位子を使用することにより、本発明のバックグラウンドブロッキング原理を効果的に適用することができる。
【図１】
2019532254.tif 000014
【図２】
2019532254.tif 000015
【図３】
2019532254.tif 000016
【図４】
2019532254.tif 000017
【図５】
2019532254.tif 000018
【図６】
2019532254.tif 000019
【図７】
2019532254.tif 000020
【図８】
2019532254.tif 000021
【図９】
2019532254.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月12日(2018.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中における１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイであって、
ａ）コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分を提供することと、
ｂ）前記固体担体に、
１．発光ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は前記異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識されている、１組の異なる第２の検体特異的結合成分、
２．前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、非特異的試薬、
３．前記試料、を添加することと、
ｃ）時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって前記特定の検体（単数又は複数）を検出することと、を含み、
前記第２の検体特異的結合成分は、発光ランタニドキレートで標識された検体又は１組の異なる標識された検体で置換され、各検体は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識され、前記非特異的試薬は、
ｖ）第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、前記検体アナログ（単数又は複数）は、前記第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、前記ランタニドイオン（単数又は複数）は、前記ランタニドキレートで標識された検体中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉ）キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、前記検体アナログ（単数又は複数）は、前記第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉｉ）検体アナログを含まない第２のランタニドキレートであって、前記ランタニドイオン（単数又は複数）は、前記ランタニドキレートで標識された検体（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、検体アナログを含まない第２のランタニドキレートか、又は
ｖｉｉｉ）検体アナログ（単数又は複数）及びランタニドイオン（単数又は複数）を含まないキレート配位子、から選択され、
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有し、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と類似の発色団部分（単数又は複数）を有し、
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と同一又は類似の構造を有し、
前記キレート又はキレート配位子（式Ｉ）は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、１〜５個の同一又は異なる基（単数又は複数）Ｇを含有する１〜５個のピリジン部分を含み、
【化１】
2019532254.tif 000023
Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、前記ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択されるか、又はＬｎ３＋は存在せず、
ｍは、１〜５であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンＬｎ３＋との間の配位結合を表し（存在する場合）、
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）前記ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ、ｉｉ）前記ピリジン部分と前記化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表し、
Ｒ３ｎ（ｎ＝１〜５）の各々は、独立して、ｉ）前記生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される、結合アッセイ。
【請求項２】
前記ランタニドイオンは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋、若しくは非ランタニドＹ３＋から選択されるか、又は存在しない、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記第１及び第２の検体特異的結合成分は、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマーなどから選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって、１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイにおけるバックグラウンド遮断剤の使用であって、前記アッセイは、固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は前記異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識された、１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、を含み、前記バックグラウンド遮断剤は、非特異的試薬であり、これは前記検体並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、バックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項５】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有し、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と類似の発色団部分（単数又は複数）を有する、請求項４に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項６】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と同一又は類似の構造を有する、請求項４又は５に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項７】
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレートの前記キレート配位子と同一である、請求項６に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項８】
前記キレート又はキレート配位子（式Ｉ）は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、１〜５個の同一又は異なる基（単数又は複数）Ｇを含有する１〜５個のピリジン部分を含み、
【化２】
2019532254.tif 000024
Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、前記ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択されるか、又はＬｎ３＋は存在せず、
ｍは、１〜５であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンＬｎ３＋との間の配位結合を表し（存在する場合）、
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）前記ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ、ｉｉ）前記ピリジン部分と前記化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表し、
Ｒ３ｎ（ｎ＝１〜５）の各々は、独立して、ｉ）前記生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される、請求項４〜７のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項９】
前記ランタニドイオンは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋、若しくは非ランタニドＹ３＋から選択されるか、又は存在しない、請求項４〜８のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１０】
前記第１及び第２の検体特異的結合成分は、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマーなどから選択される、請求項４〜９のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１１】
前記共役基は、１つ、２つ、又は３つの部分からなり、各部分は、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、及び（ヘテロ）芳香環又は環系のビラジカル（−Ｈｅｔ／Ａｒ−）、例えば、フェニレン、ビフェニレン、ナフチレン、ピリジレン、ピラジニレン、ピリミジニレン、ピリダジニレン、フリレン、チエニレン、ピロリレン、イミダゾリレン、ピラゾリレン、チアゾリレン、イソチアゾリレン、オキサゾリレン、イソオキサゾリレン、フラザニレン、１，２，４−トリアゾール−３，５−イレン、及びオキサジアゾリレンから選択される、請求項８に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１２】
Ｇは、１つ以上の電子求引性基（単数又は複数）及び／又は１つ以上の電子供与性基（単数又は複数）で置換され、前記電子求引性基（単数又は複数）は、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ５、−ＣＦ３、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、及びハロゲン（即ち、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ）から選択され、前記電子供与性基（単数又は複数）は、−Ｃ１〜６アルキル又は−Ｘ−（Ｒ４）１〜２から選択され、ここで、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、又は−Ｎ（Ｒ５）ＣＯ−であり、Ｒ５は、水素又は−Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ４は、水素、−Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯＮＲ６Ｒ７、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ（ピペラジン−１，４−ジイル）（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ＋−（ＣＨ３）−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３−、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、及びポリエチレングリコールから選択され、Ｒ６及びＲ７は、各々独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）３、−ＣＨ２［ＣＨ（ＯＨ）］１〜６ＣＨ２ＯＨから選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１３】
Ｒ１又はＲ２のいずれかは、Ｌｎ３＋イオンと配位結合を形成するキレート基Ｃｈであり、−ＣＯＯ−、−ＰＯ３２−、−ＰＭｅＯ２−、−ＰＰｈＯ２−、−ＣＨ２ＰＯ３２−などの基であってよいがこれらに限定されない、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１４】
１〜５個のピリジン部分のＲ１又はＲ２は、−ＣＯＮＨＲ９又は−ＣＯＮＲ９Ｒ１０であり、ここで、Ｒ９又はＲ１０は、アルキル基、又は前記生体分子と共有結合する前記反応性基を含有するリンカー基、又はカップリング反応後に前記反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１５】
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、発色団部分と前記キレートの他の部分、例えば、発色団部分とキレート化部分との間の結合を表す、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１６】
前記キレート化部分は、少なくとも２個のカルボン酸基又はリン酸基、前記酸のエステル、アミド又は塩を含み、直接的に又は環式若しくは非環式Ｎ−及び／若しくはＯ−含有炭化水素鎖を介してのいずれかで、前記発色団部分の芳香族単位に結合する、請求項８〜１５のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【請求項１７】
前記他の部分は、Ｒ３基を含有するリンカー基を含有し得る、請求項８〜１６のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
全体として、個別のキレート及び配位子、抗体と共役したキレート及び配位子、ポリマーと共役した配位子、有機分子（疎水基）と共役した配位子、及びビオチンなどのハプテンと共役した配位子、及びこのように、ストレプトアビジンコーティング表面に固定化された配位子を使用することにより、本発明のバックグラウンドブロッキング原理を効果的に適用することができる。
［発明の態様］
[１]
試料中における１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイであって、
ａ）コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分を提供することと、
ｂ）前記固体担体に、
１．発光ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は前記異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識されている、１組の異なる第２の検体特異的結合成分、
２．前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、非特異的試薬、
３．前記試料、を添加することと、
ｃ）時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって前記特定の検体（単数又は複数）を検出することと、を含む、結合アッセイ。
[２]
前記第２の検体特異的結合成分は、発光ランタニドキレートで標識された検体又は１組の異なる標識された検体で置換され、各検体は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識され、前記非特異的試薬は、
ｖ）第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、前記検体アナログ（単数又は複数）は、前記第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、前記ランタニドイオン（単数又は複数）は、前記ランタニドキレートで標識された検体中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、第２のランタニドキレートで標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉ）キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）であって、前記検体アナログ（単数又は複数）は、前記第１の検体特異的結合成分（単数又は複数）に認識されず、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された検体アナログ（単数又は複数）か、
ｖｉｉ）検体アナログを含まない第２のランタニドキレートであって、前記ランタニドイオン（単数又は複数）は、前記ランタニドキレートで標識された検体（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、検体アナログを含まない第２のランタニドキレートか、又は
ｖｉｉｉ）検体アナログ（単数又は複数）及びランタニドイオン（単数又は複数）を含まないキレート配位子、から選択される、１に記載のアッセイ。
[３]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有し、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と類似の発色団部分（単数又は複数）を有する、１又は２に記載のアッセイ。
[４]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と同一又は類似の構造を有する、１又は２に記載のアッセイ。
[５]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子と同一である、４に記載のアッセイ。
[６]
前記キレート又はキレート配位子（式Ｉ）は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、１〜５個の同一又は異なる基（単数又は複数）Ｇを含有する１〜５個のピリジン部分を含み、
【化８】
2019532254.tif 000025
Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、前記ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択されるか、又はＬｎ３＋は存在せず、
ｍは、１〜５であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンＬｎ３＋との間の配位結合を表し（存在する場合）、
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）前記ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ、ｉｉ）前記ピリジン部分と前記化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表し、
Ｒ３ｎ（ｎ＝１〜５）の各々は、独立して、ｉ）前記生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される、１〜４のいずれか一項に記載のアッセイ。
[７]
前記ランタニドイオンは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋、若しくは非ランタニドＹ３＋から選択されるか、又は存在しない、１〜６のいずれか一項に記載のアッセイ。
[８]
前記第１及び第２の検体特異的結合成分は、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマーなどから選択される、１に記載のアッセイ。
[９]
前記検体アナログは、生体分子の誘導体、融合物、又は変異体などから選択される、２に記載のアッセイ。
[１０]
結合アッセイにおいて１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出するのに使用するキットであって、
ａ）コーティングされた又はコーティングされていない固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、
ｂ）ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は前記異なる検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識されている、１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、
ｃ）前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、非特異的試薬と、を含む、キット。
[１１]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有し、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレートの前記キレート配位子と類似の発色団部分（単数又は複数）を有する、１０に記載のキット。
[１２]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子と同一又は類似の構造を有する、１０又は１１に記載のキット。
[１３]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子と同一である、１２に記載のキット。
[１４]
前記キレート又はキレート配位子（式Ｉ）は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、１〜５個の同一又は異なる基（単数又は複数）Ｇを含有する１〜５個のピリジン部分を含み、
[化２]
Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、前記ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択されるか、又はＬｎ３＋は存在せず、
ｍは、１〜５であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンＬｎ３＋との間の配位結合を表し（存在する場合）、
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）前記ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ、ｉｉ）前記ピリジン部分と前記化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表し、
Ｒ３ｎ（ｎ＝１〜５）の各々は、独立して、ｉ）前記生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される、１０〜１３のいずれか一項に記載のキット。
[１５]
前記ランタニドは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋、若しくは非ランタニドＹ３＋から選択されるか、又は存在しない、１０〜１４のいずれか一項に記載のキット。
[１６]
前記第１及び第２の検体特異的結合成分は、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマーなどから選択される、１０〜１５のいずれか一項に記載のキット。
[１７]
時間分解蛍光光度測定（ＴＲＦ）によって、１つ以上の特定の検体（単数又は複数）を検出する結合アッセイにおけるバックグラウンド遮断剤の使用であって、前記アッセイは、固体担体に固定化された、第１の検体特異的結合成分、又は１組の異なる第１の検体特異的結合成分と、ランタニドキレートで標識された第２の検体特異的結合成分、又は前記異なる特定の検体に特異的な１組の異なる第２の検体特異的結合成分であって、各結合成分は、異なるランタニドイオンを含む異なる発光ランタニドキレートで標識された、１組の異なる第２の検体特異的結合成分と、を含み、前記バックグラウンド遮断剤は、非特異的試薬であり、これは前記検体並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、かつ、
ｉ）ランタニドキレートで標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、ランタニドキレートで標識された生体分子か、
ｉｉ）キレート配位子で標識された生体分子であって、前記生体分子は、前記検体（単数又は複数）並びに前記第１及び第２の検体特異的結合成分に非特異的であり、ランタニドイオンが存在しない、キレート配位子で標識された生体分子か、
ｉｉｉ）生体分子を含まないランタニドキレートであって、前記ランタニドイオンは、前記ランタニドキレートで標識された特異的結合成分（単数又は複数）中の前記ランタニドイオン（単数又は複数）とは異なる、生体分子を含まないランタニドキレートか、又は
ｉｖ）生体分子及びランタニドイオンを含まないキレート配位子、から選択される、バックグラウンド遮断剤の使用。
[１８]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、少なくとも１つの環式キレート化部分を有し、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と類似の発色団部分（単数又は複数）を有する、１７に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[１９]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレート（単数又は複数）の前記キレート配位子（単数又は複数）と同一又は類似の構造を有する、１７又は１８に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２０]
前記非特異的試薬の前記キレート配位子は、前記検体特異的結合成分（単数又は複数）を標識するのに使用される前記発光ランタニドキレートの前記キレート配位子と同一である、１９に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２１]
前記キレート又はキレート配位子（式Ｉ）は、ｉ）共役基、ｉｉ）単結合、及びｉｉｉ）水素から選択される、１〜５個の同一又は異なる基（単数又は複数）Ｇを含有する１〜５個のピリジン部分を含み、
[化３]
Ｌｎ３＋は、ランタニドイオン又はイットリウムイオンであり、前記ランタニドイオンは、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｌｕ３＋、Ｐｒ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、及びＹｂ３＋から選択されるか、又はＬｎ３＋は存在せず、
ｍは、１〜５であり、破線は、ピリジン窒素とランタニドイオンＬｎ３＋との間の配位結合を表し（存在する場合）、
Ｒ１及びＲ２は、ｉ）前記ヘテロ原子とランタニドとの間に１つ以上の配位結合を形成する追加のキレート化部分Ｃｈ、ｉｉ）前記ピリジン部分と前記化合物の他の部分との間の結合、又はｉｉｉ）式（Ｉ）の個々のピリジン部分間における結合を表し、
Ｒ３ｎ（ｎ＝１〜５）の各々は、独立して、ｉ）前記生体分子へのカップリング後に反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１、ｉｉ）疎水基、ｉｉｉ）親水基、及びｉｖ）水素から選択される、１７〜２０のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２２]
前記ランタニドイオンは、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｓｍ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋、Ｈｏ３＋、Ｔｍ３＋、及びＹｂ３＋、若しくは非ランタニドＹ３＋から選択されるか、又は存在しない、１７〜２１のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２３]
前記第１及び第２の検体特異的結合成分は、遺伝子的又は化学的に修飾されていてもよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖、オリゴ糖、多糖類、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡプローブ、ハプテン、レクチン、酵素、受容体、アプタマーなどから選択される、１７〜２２のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２４]
前記共役基は、１つ、２つ、又は３つの部分からなり、各部分は、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチンジイル（−Ｃ≡Ｃ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、及び（ヘテロ）芳香環又は環系のビラジカル（−Ｈｅｔ／Ａｒ−）、例えば、フェニレン、ビフェニレン、ナフチレン、ピリジレン、ピラジニレン、ピリミジニレン、ピリダジニレン、フリレン、チエニレン、ピロリレン、イミダゾリレン、ピラゾリレン、チアゾリレン、イソチアゾリレン、オキサゾリレン、イソオキサゾリレン、フラザニレン、１，２，４−トリアゾール−３，５−イレン、及びオキサジアゾリレンから選択される、２１に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２５]
Ｇは、１つ以上の電子求引性基（単数又は複数）及び／又は１つ以上の電子供与性基（単数又は複数）で置換され、前記電子求引性基（単数又は複数）は、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ５、−ＣＦ３、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、及びハロゲン（即ち、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ）から選択され、前記電子供与性基（単数又は複数）は、−Ｃ１〜６アルキル又は−Ｘ−（Ｒ４）１〜２から選択され、ここで、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、又は−Ｎ（Ｒ５）ＣＯ−であり、Ｒ５は、水素又は−Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ４は、水素、−Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯＮＲ６Ｒ７、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ（ピペラジン−１，４−ジイル）（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ＋−（ＣＨ３）−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３−、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）１〜６ＣＯＯＨ、及びポリエチレングリコールから選択され、Ｒ６及びＲ７は、各々独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）３、−ＣＨ２［ＣＨ（ＯＨ）］１〜６ＣＨ２ＯＨから選択される、２１〜２４のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２６]
Ｒ１又はＲ２のいずれかは、Ｌｎ３＋イオンと配位結合を形成するキレート基Ｃｈであり、−ＣＯＯ−、−ＰＯ３２−、−ＰＭｅＯ２−、−ＰＰｈＯ２−、−ＣＨ２ＰＯ３２−などの基であってよいがこれらに限定されない、２１〜２５のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２７]
１〜５個のピリジン部分のＲ１又はＲ２は、−ＣＯＮＨＲ９又は−ＣＯＮＲ９Ｒ１０であり、ここで、Ｒ９又はＲ１０は、アルキル基、又は前記生体分子と共有結合する前記反応性基を含有するリンカー基、又はカップリング反応後に前記反応性基Ｚ２及び前記生体分子中の対応する基から形成された共有結合基Ｚ１である、２１〜２６のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２８]
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、発色団部分と前記キレートの他の部分、例えば、発色団部分とキレート化部分との間の結合を表す、２１〜２７のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[２９]
前記キレート化部分は、少なくとも２個のカルボン酸基又はリン酸基、前記酸のエステル、アミド又は塩を含み、直接的に又は環式若しくは非環式Ｎ−及び／若しくはＯ−含有炭化水素鎖を介してのいずれかで、前記発色団部分の芳香族単位に結合する、２１〜２８のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
[３０]
前記他の部分は、Ｒ３基を含有するリンカー基を含有し得る、２１〜２９のいずれか一項に記載のバックグラウンド遮断剤の使用。
【国際調査報告】
2019532254.tif 000026
2019532254.tif 000027
2019532254.tif 000028