(57)【要約】  本発明は、腫瘍関連マクロファージをターゲティングすることによるガンの処置方法に関する。ＴＡＭを検出及びターゲティングするために、本発明者らは、腫瘍関連マクロファージの表面上に露出した特異的マーカーを調査した。本発明者らは、正常なマクロファージには存在しないｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３が腫瘍関連マクロファージによって発現されることを示した。これは、サンプル中の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を同定するための方法であって、ｉ）該サンプルに含まれる細胞集団上のＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞表面発現を検出する工程、並びにｉｉ）ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーを発現する細胞がＴＡＭであると結論付ける工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を同定するための方法であって、ｉ）該サンプルに含まれる細胞集団上のＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞表面発現を検出する工程、並びにｉｉ）ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーを発現する細胞がＴＡＭであると結論付ける工程を含む、方法。
【請求項２】
サンプルが、血液サンプル、懸濁液中のＰＢＭＣサンプルからなる群より選択される液体サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液体サンプルに含まれる細胞集団上のＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞表面発現の検出を、該マーカーに特異的な抗体のセットを用いて実施する、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
液体サンプルに含まれる細胞集団上のＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞表面発現の検出をフローサイトメトリーによって実施する、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが、脳、頭頸部、副腎、結腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺、脾臓、膀胱、乳房、骨髄及びリンパ節の組織切片からなる群より選択される組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３に特異的な抗体のセットを用いて組織サンプルを染色することからなる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組織サンプル中のＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞発現の検出を免疫化学又は免疫蛍光によって実施する、請求項５〜６に記載の方法。
【請求項８】
ガンに罹患している患者の予防又は治療において使用するための、ＳＦＸＮ３アンタゴニスト。
【請求項９】
前記ガンが、全ての急性白血病及び慢性白血病からなる群より選択される白血病である、請求項８に記載の使用のためのＳＦＸＮ３アンタゴニスト。
【請求項１０】
前記白血病が慢性リンパ球性白血病である、請求項９に記載の使用のためのＳＦＸＮ３アンタゴニスト。
【請求項１１】
前記ガンが、全ての非ホジキンリンパ腫及びホジキンリンパ腫からなる群より選択される白血病である、請求項８に記載の使用のためのＳＦＸＮ３アンタゴニスト。
【請求項１２】
前記ガンが、脳、頭頸部、副腎、結腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺、膀胱、乳房、子宮内膜の腫瘍、多発性骨髄腫、肉腫からなる群より選択される固形腫瘍である、請求項８に記載の使用のためのＳＦＸＮ３アンタゴニスト。
【請求項１３】
前記アンタゴニストがＳＦＸＮ３中和抗体又はアプタマーである、請求項８〜１０に記載の使用のためのＳＦＸＮ３アンタゴニスト。
【請求項１４】
前記アンタゴニストがＳＦＸＮ３遺伝子発現阻害剤であり、前記ＳＦＸＮ３遺伝子発現阻害剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヌクレアーゼ、リボザイム又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのＳＦＸＮ３アンタゴニスト。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれか一項に記載のＳＦＸＮ３アンタゴニストと、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞表面発現を検出することによって、サンプル中の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を同定するための方法に関する。本発明はまた、ガンの処置において使用するためのｓｉｄｏｒｅｆｌｅｘｉｎ３のアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
ガン発生及び腫瘍成長の促進における腫瘍微小環境の重要性は、過去十年間でますます認められている(H. Korkaya JCI, 121, (10),  3804-3809, 2011; E. Lonardo, J. Frias-Aldeguer, Cell Cycle, 11(7), 1282-1290, 2012; J. W. Pollard, Nature Reviews Immunology, 9 (4), 259-270,2009)。
【０００３】
腫瘍微小環境は、腫瘍成長を阻害することに代えて、細胞増殖を刺激し、ガン幹細胞（ＣＳＣ）を活性化し、転移を促進することによって腫瘍形成を促す慢性炎症を特徴とする[V. Plaks, Cell Stem Cell, 16(3), 225-238, 2015; S. M. Cabarcas, L. A. International Journal of Cancer, 129(10), 2315-2327, 2011)。腫瘍炎症反応を主導するのは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である[R. Noy Immunity, 41(1),.49-61, 2014]。多数のＴＡＭと、急速な疾患進行及び不良な患者転帰との間の相関関係が数十年間で観察されている[L. Bingle, Journal of Pathology, 196 (3), 254-265, 2002; B.-Z. Qian Cell, 141(1), 39-51, 2010]；しかしながら、ごく最近、この矛盾した表現型が説明された。この相関関係は、マクロファージ由来因子がＣＳＣコンパートメントを活性化してＣＳＣの幹様特徴を促進し、腫瘍進行、転移及びさらにＣＳＣ化学耐性を悪化させるＴＡＭ媒介性パラクリンシグナリングに起因すると現在理解されている。
【０００４】
腫瘍への単球浸潤は、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１２）、ＣＳＦ−１及び補体カスケードの構成要素によって媒介される[E. Bonavita, Advances in Cancer Research, 128, 141-171, 2015; E. Bonavita, Cell, 160(4), 700-714, 2015]。それらが腫瘍内にあると、腫瘍環境は、腫瘍馴化マクロファージへのそれらの分化を急速に促進する。当初、ＴＡＭは、Ｍ２腫瘍促進マーカーを発現するＭ１表現型からかけ離れていると考えられていた[Biswas SK. Nature Immunology, 11(10), 889-896, 2010]。
【０００５】
Ｍ２様ＴＡＭ及びサブセットをより特異的に同定するために、ヘモグロビン・スカベンジャーレセプターＣＤ１６３[Heusinkveld M. The Journal of Immunology, 187(3), 1157-1165, 2011; Martinez FO., Annual Review of Immunology, 27, 451-483, 2009]、マクロファージ・スカベンジャーレセプター１  ＣＤ２０４[Biswas SK. Nature Immunology, 11(10), 889-896, 2010, Laoui, D. International Journal of Developmental Biology, 55(7-9), 861-867, 2011]、マンノースレセプターＣＤ２０６[Mantovani, A. Trends in Immunology, 23(11), 549-555, 2002]、マクロファージレセプターＣＤ６８(Tang X, Cancer Letter 2013, Takeuchi H, Oncol Lett 2016 ; Hu H, tumour biol 2016 ; Kim KJ, PlosOne 2015)並びにより最近ではＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（Ｔｉｍ−３）[Yan W., Gut, 64(10), 1593-1604, 2015]が使用され大きな成功を収めている。しかしながら、結局のところ、ＴＡＭを適切に分類及び同定する方法に関する論争が依然としてある。ＴＡＭをより良好に分類するために、ＴＡＭの機能、例えば血管新生又は免疫抑制の促進に基づく分類が現在使用されているが、マクロファージは、多くの機能を同時に実行することができる動的な可塑性細胞であることに注目することが重要である。
【０００６】
したがって、このアプローチは自己限定的であり得、ＴＡＭの多機能性能を強調し得る。どのマーカーを使用してどのようにマクロファージに言及するかに関しては、科学界の意見はまだ一致していないので、二元的なＭ１／Ｍ２分類が依然として一般に使用されている[Murray, PJ. Immunity, 41(1), 14-20, 2014]。
【０００７】
したがって、ＴＡＭの新たな生物学的マーカーが必要とされている。特に、信頼性のある検出を可能にし、腫瘍中に存在するＴＡＭのターゲティングも可能にするバイオマーカーが非常に望ましい。
【０００８】
本発明の目的は、ｉ）疾患発症の早期において腫瘍関連マクロファージを同定するための新たな信頼性のある方法、及びｉｉ）ＴＡＭを枯渇させることによってガンを処置するための新たな治療ターゲットを提供することによって、この必要性に対処することである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、サンプル中の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を同定するための方法であって、ｉ）該サンプルに含まれる細胞集団上のＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞表面発現を検出する工程、並びにｉｉ）ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーを発現する細胞がＴＡＭであると結論付ける工程を含む方法に関する。
【００１０】
本発明の第２の目的は、ガンに罹患している患者の予防又は治療において使用するためのＳＦＸＮ３アンタゴニストに関する。
【００１１】
発明の詳細な説明：
本発明は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭとも称される。白血病におけるナース様細胞（ＮＬＣ））におけるｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の存在の同定に基づくものであり、これは、先行技術では全く言及されていなかった。
【００１２】
より具体的には、本発明者らは、正常なマクロファージには存在しないｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３が腫瘍関連マクロファージによって発現されるという証拠を提示する。これは、腫瘍関連マクロファージの表面上に露出しており、その結果として、ＴＡＭを検出及びターゲティングするためのユニークな機会（例えば、ガンの治療）を提供する最初の特異的マーカーである。本発明者らは、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に対する抗体を使用して、ＬＣＣ患者から得られたＰＢＭＣサンプルにおいてＴＡＭを枯渇させ、白血病Ｂ細胞数を大きく減少させたという証拠をさらに提示する。
【００１３】
本明細書では、ＴＡＭを検出及びターゲティングするために、本発明者らは、腫瘍関連マクロファージの表面上に露出した特異的マーカーを調査した。ＬＣＣ患者から得られたＴＡＭでマウスを免疫することによって、本発明者らは、２００個の画分の中から、ＴＡＭを特異的に認識することができる４個の抗体画分を回収する。驚くべきことに、本発明者らは、１）画分中の抗体が、腫瘍関連マクロファージの表面において特異的に発現されたｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３タンパク質を認識することができたこと、２）抗体がＴＡＭに特異的であり、患者若しくは健常ドナー由来の他のＰＢＭＣ（例えば、リンパ球Ｂ及びＴ）又は腫瘍細胞を認識しなかったこと、３）ＬＣＣ患者から得られたＰＢＭＣサンプル中のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体の使用がＴＡＭを枯渇させ、腫瘍細胞数を減少させたこと、４）ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体が、乳房腫瘍サンプル中に存在するＴＡＭを検出することもできたことを見出した。したがって、これらの結果は、ＴＡＭ上に発現されたｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３のターゲティングが、ガンにおいて有益な抗腫瘍免疫を回復させることを可能にすることを示している。
【００１４】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を同定するための方法
本発明の目的は、サンプル中の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を同定するための方法であって、ｉ）該サンプルに含まれる細胞集団上のＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞表面発現を検出する工程、並びにｉｉ）ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３を発現する細胞が腫瘍関連マクロファージであると結論付ける工程を含む方法に関する。
【００１５】
「腫瘍関連マクロファージ」（「ＴＡＭ」とも称される）という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、マクロファージ系統に属する細胞のタイプを説明することを意図する。それらは、非常に近接して、又は腫瘍塊内に見られる[ Shih, J-Y., Journal of Cancer Molecules 2(3): 101-106 2006]。ＴＡＭは、多くの腫瘍型の間質内に見られる主要な白血球浸潤物を形成する循環単球又は常在組織マクロファージに由来する。腫瘍促進（例えば、腫瘍血管新生を介した成長及び転移の促進）プロセスにおけるそれらの関与に関する証拠が増加している[ Birbrair, A. American Journal of Physiology. Cell Physiology 307 (1): C25-C38. 2014; Thoreau, M;Oncotarget 6(29) 27832- 27832 2015]。ＴＡＭは、腫瘍微小環境中の広範な成長因子、サイトカイン及びケモカイン（微小環境は、様々なタイプの腫瘍間で異なるので、これらは、ＴＡＭを教育し、それらの特異的表現型及びそれ故に機能的役割を決定すると考えられる）と相互作用する。したがって、ＴＡＭは、それらが関連する腫瘍のタイプに応じて、それらの役割が異なることが示されている[ Lewis, CE.; Cancer Research 66 (2): 605-612. (2006)]。多くの腫瘍型では、ＴＡＭ浸潤レベルは、有意な予後値であることが示されている。ＴＡＭは、乳ガン、卵巣ガン、神経膠腫及びリンパ腫のタイプにおける予後不良；結腸ガン及び胃ガンにおける予後良好、並びに肺ガン及び前立腺ガンにおける予後不良及び予後良好の両方に関連している[ Allavena, P.. Critical Reviews in Oncology/Hematology 66: 1. (2008)]。白血病では、ＴＡＭは、ナース様細胞（ＮＬＣ）とも称される。
【００１６】
ＴＡＭ細胞の調節／抑制機能の実証は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって決定され得る（Qian BZ and Pollard JW, Cell, 2010, vol 141, 1:39-41を参照のこと）。特に、このような試験の例は、実施例のセクションに示されている。具体的には、実施例において具現化されている試験は、ＴＡＭ機能の評価のための標準的なin vitro試験とされている。
【００１７】
いくつかの実施態様では、本発明の腫瘍関連マクロファージは、哺乳動物腫瘍関連マクロファージ、最も具体的にはヒト腫瘍関連マクロファージである。
【００１８】
「サンプル」という用語は、液体サンプル及び「組織サンプル」を指す。
【００１９】
「液体サンプル」という用語は、懸濁液中に腫瘍関連マクロファージの集団を含有しやすい任意のサンプルを指す。非限定的な例としては、生物学的液体、例えば血液（例えば、末梢血又は臍帯血）、尿、リンパ、脳脊髄液若しくは腺管液、又は生理学的溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は組織培養培地）で希釈されたこのような液体、又は（例えば、遠心分離によって）生物学的液体から得られた細胞であって、生理学的溶液に懸濁された細胞が挙げられる。「細胞を含有する液体サンプル」の他の例としては、骨髄穿刺液、針生検吸引液、又は例えばリンパ節若しくは脾臓由来の生検標本から得られた（生理学的溶液中の）細胞懸濁液が挙げられる。
【００２０】
いくつかの実施態様では、液体サンプルは、血液サンプルである。「血液サンプル」という用語は、被験体（例えば、腫瘍関連マクロファージの集団が同定され得るかの決定が関心対象である個体）から得られた全血サンプルを意味する。
【００２１】
いくつかの実施態様では、液体サンプルは、ＰＢＭＣサンプルである。本明細書で使用される場合、「ＰＢＭＣ」又は「末梢血単核細胞」又は「未分画ＰＢＭＣ」という用語は、全ＰＢＭＣ、すなわち、円形の核を有する白血球の集団であって、所定のサブ集団について濃縮されていない集団を指す。典型的には、ＰＢＭＣサンプルは、非接着ＰＢＭＣ（これは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞及びＤＣ前駆体を含有する）を含有するように選択工程に供されたものであり得る。したがって、本発明のＰＢＭＣサンプルは、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）を含有する。典型的には、これらの細胞は、フィコール（血液の層を分離する親水性多糖）を使用して全血から抽出され得、ＰＢＭＣは、血漿の層の下でセルリングを形成する。加えて、ＰＢＭＣは、赤血球を優先的に溶解する低張溶解バッファーを使用して、全血から抽出され得る。このような手順は、当業者に公知である。
【００２２】
いくつかの実施態様では、流体サンプルは、懸濁液中の腫瘍関連マクロファージのサンプルである。典型的には、腫瘍関連マクロファージのサンプルは、ＰＢＭＣサンプルに対して実施されるＦＡＣＳ選別方法によって調製される。例えば、腫瘍関連マクロファージは、ＴＡＭ関連細胞表面マーカーであるＣＤ１６３及びＣＤ６８に対する抗体を使用することによって単離される。腫瘍関連マクロファージのサンプルからこの方法を実施する場合、ＳＦＸＮ３の細胞表面発現の検出のみを実施し得る。したがって、一態様では、本発明は、腫瘍関連マクロファージを同定するための方法であって、ｉ）ＰＢＭＣサンプルからＣＤ１６３＋／ＣＤ６８細胞（「腫瘍関連マクロファージ」）の集団を選択する工程、及びｉｉ）ＳＦＸＮ３の細胞表面発現を検出することによって、腫瘍関連マクロファージの集団を同定する工程を含む方法に関する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「Ｍ１３０」；「ＭＭ１３０」；「ＳＣＡＲＩ１」としても公知の「ＣＤ１６３」(Cluster of Differentiation 163)という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトではＣＤ１６３遺伝子［Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９３３２］によってコードされるタンパク質を指す。ＣＤ１６３は、単球及びマクロファージにおいて専ら発現される。それは、マクロファージによるヘモグロビン／ハプトグロビン複合体のクリアランス及びエンドサイトーシスに関与する急性期調節レセプターとして機能し、それにより、遊離ヘモグロビン媒介性酸化的損傷から組織を保護し得る。このタンパク質はまた、細菌に対する先天性免疫センサー及び局所炎症の誘導因子として機能し得る。分子サイズは、１３０kDaである。このレセプターは、スカベンジャーレセプターシステインリッチファミリータイプＢに属し、１０４８個のアミノ酸残基の細胞外ドメイン、１回膜貫通セグメント及び細胞質尾部からなり、複数のスプライス変異体がある。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ＧＰ１１０」；「ＬＡＭＰ４」及び「ＳＣＡＲＤ１」としても公知の「ＣＤ６８」(Cluster of Differentiation 68)という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトではＣＤ６８遺伝子［Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９６８］によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子は、ヒト単球及び組織マクロファージによって高度に発現される１１０ｋＤの膜貫通糖タンパク質をコードする。それは、リソソーム／エンドソーム関連膜糖タンパク質（ＬＡＭＰ）ファミリーのメンバーである。このタンパク質は、リソソーム及びエンドソームに主に局在し、より小さな画分は細胞表面に循環する。それは、高度にグリコシル化された細胞外ドメインを有するタイプＩ内在性膜タンパク質であり、組織特異的及び器官特異的なレクチン又はセレクチンに結合する。このタンパク質はまた、スカベンジャーレセプターファミリーのメンバーである。スカベンジャーレセプターは、典型的には、細胞残屑を除去し、食作用を促進し、マクロファージのリクルート及び活性化を媒介するように機能する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ＳＦＸ３；」又は「ＢＡ１０８Ｌ７．２」としても公知の「ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３」又は「ＳＦＸＮ３」という用語は、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎタンパク質の一メンバーであり、ヒトではＳＦＸＮ３遺伝子［Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８１８５５］によってコードされるタンパク質を指す。Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎは、一般に、ミトコンドリアにおける鉄輸送に関与するタンパク質と言われている。加えて、ヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎはまた、膵臓β細胞の分化において重要な役割を果たすと報告されている(Yoshikumi Y, J Cell Biochem.,95, 1157-1168 (2005))。野生型ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３ヒトアミノ酸配列の一例は、配列番号：１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１２２３３）に提供されている。配列番号：１の野生型ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一例は、配列番号：２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０３０９７１）に提供されている。
【００２６】
細胞表面（例えば、ＴＡＭ表面）における特定の表面マーカー、例えばＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の発現を検出するための標準的な方法は、当技術分野で周知である。典型的には、表面マーカー（例えば、Ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３）の表面発現を検出することからなる工程は、表面マーカーに対する少なくとも１つのディファレンシャルな結合パートナーを使用することからなり得、前記細胞は、前記表面マーカーに対する前記結合パートナーによって結合される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「表面マーカーに対する結合パートナー」という用語は、高い親和性で表面マーカーに結合することができる任意の分子（天然又は非天然）を指す。結合パートナーは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり得る。別の実施態様では、結合パートナーは、アプタマーのセットであり得る。
【００２８】
本発明のポリクローナル抗体又はそのフラグメントは、公知の方法にしたがって、適切な抗原又はエピトープを、例えばとりわけブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びマウスから選択される宿主動物に投与することによって生成され得る。抗体産生を増強するために、当技術分野で公知の様々なアジュバントが使用され得る。本発明の実施において有用な抗体はポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、抗体分子の生産を提供する任意の技術を使用して、細胞株の連続培養によって調製及び単離され得る。生産及び単離のための技術としては、限定されないが、元々のハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が挙げられる。
【００３０】
例えば、本発明のＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の結合パートナーは、Abnovaから入手可能な抗ヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体（精製マウス抗ヒトＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３クローン４Ａ３）であるか、又はAbcamから入手可能な抗体（クローンａｂ７７４３１又はクローンａｂ１８１１６３）からなる群より選択される。
【００３１】
本発明の結合パートナー、例えば抗体又はアプタマーは、検出可能な分子若しくは物質、例えば優先的には蛍光分子、又は放射性分子、又は当技術分野で公知の任意の他の標識を使用して標識され得る。一般に、シグナルを（直接的に又は間接的に）提供する標識は、当技術分野で公知である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、抗体又はアプタマーに関する「標識された」という用語は、検出可能な物質、例えばフルオロフォア［例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５）］又は放射性物質を抗体又はアプタマーにカップリング（すなわち、物理的に連結）することによる抗体又はアプタマーの直接的な標識、並びに検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的な標識を包含することを意図する。本発明の抗体又はアプタマーは、当技術分野で公知の任意の方法によって、放射性分子で標識され得る。より具体的には、抗体は、フルオロフォアに既にコンジュゲート（例えば、ＦＩＴＣにコンジュゲート及び／又はＰＥにコンジュゲート）されている。
【００３３】
上記アッセイは、固相支持体への結合パートナー（すなわち、抗体又はアプタマー）の結合を伴い得る。固体表面は、表面マーカーに対する結合パートナーでコーティングされたマイクロタイタープレートであり得る。あるいは、固体表面は、ビーズ、例えば活性化ビーズ、磁気反応性ビーズであり得る。ビーズは、限定されないが、ガラス、プラスチック、ポリスチレン及びアクリルを含む様々な材料から構成され得る。加えて、ビーズは、好ましくは蛍光標識される。好ましい実施態様では、蛍光ビーズは、Becton Dickinson Biosciences, (San Jose, California)から入手可能なTruCount（商標）チューブに含まれるものである。本発明によれば、フローサイトメトリーの方法は、表面マーカー（すなわち、ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３）の表面発現を検出するための好ましい方法である。前記方法は、当技術分野で周知である。したがって、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が使用され得る。区別可能な蛍光色素とカップリングされたＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に対する抗体（又は、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＣＤ６８抗体及びＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体でコーティングされたイムノビーズ）と組み合わせて、表面マーカーに対する蛍光標識抗体（又は、抗体でコーティングされたイムノビーズ）を使用した細胞選別プロトコールは、適切な光学的配置で有する細胞選別機を使用した直接的な選別を可能にし得る。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、組織サンプル中の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を同定するための方法であって、ｉ）ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３マーカーの細胞発現を検出する工程、並びにｉｉ）ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３を発現する細胞が腫瘍関連マクロファージであると結論付ける工程を含む方法に関する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「組織サンプル」という用語は、生物学的細胞のコレクションから典型的に構成されるサンプルを指し、例えば限定されないが、生検サンプル、剖検サンプル、外科的サンプル、細胞塗抹標本、細胞濃縮物、及び支持体上に固定された培養細胞が挙げられる。典型的には、組織サンプルは、一般に、顕微鏡スライド上で調製された材料のサンプルの顕微鏡検査が望まれる任意の材料を含む。組織サンプルは、診断、研究、教育又は他の目的のために収集され得る。前記サンプルは、任意の生物学的組織のものであり得る。組織サンプルの例としては、限定されないが、脳、副腎、結腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺及び脾臓の組織切片が挙げられる。本明細書で使用される場合、「組織サンプル」は、新鮮な組織切片、又は凍結された組織切片、又は固定及び包埋された組織切片であり得る。例えば、組織学的検査のための組織サンプルは支持媒体中に包埋され、標準的なブロックに成形される。パラフィンワックスは、支持媒体として公知の一般に使用されているものであるが、限定されないが、Sakura Finetek製のTissueTek O.C.T、エステル、微結晶セルロース、蜜蝋、樹脂又はポリマー、例えばメタクリル酸塩を含む他の支持媒体もまた、支持媒体として使用され得ると認識されよう。Araldite 502キット、Eponate 12（商標）キット及びメタクリル酸グリコール（ＧＭＡ）キットを含む適切な樹脂及びポリマーは、Ted Pella, Inc., Redding, Califから入手可能である。
【００３６】
いくつかの実施態様では、組織サンプルは、腫瘍サンプルである。「腫瘍サンプル」は、吸引若しくは穿刺、切除によって、又は生検若しくは切除細胞材料（保存材料、例えば新鮮凍結材料、ホルマリン固定材料、パラフィン包埋材料などを含む）をもたらす任意の他の外科的方法によって採取された腫瘍材料、例えば新生物病変由来の組織材料を含有するサンプルである。このような生物学的サンプルは、患者から得られた細胞を含み得る。細胞は、例えば乳頭吸引、乳管洗浄細胞診、微細針生検によって収集された、又は誘発性若しくは自発性乳頭分泌液に由来する細胞「塗抹標本」に見られ得る。
【００３７】
いくつかの実施態様では、組織サンプルは、脳、頭頸部、副腎、結腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺、脾臓、膀胱、乳房、骨髄及びリンパ節の組織切片からなる群より選択される組織サンプルである。
【００３８】
組織サンプル中のＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳＦＸＮ３マーカーの細胞発現の検出は、免疫化学又は免疫蛍光によって実施される。
【００３９】
典型的には、組織サンプル中のマーカーの検出は、ＩＨＣ法を使用して実施される。実際、免疫組織化学（ＩＨＣ）法は、組織サンプル中の腫瘍関連マクロファージの存在を検出するために適切である。具体的には、ＩＨＣは、in situで組織標本中のターゲットを検出する方法を提供する。ＩＨＣでは、サンプルの全体的な細胞完全性が維持されるので、目的のターゲット（すなわち、腫瘍関連マクロファージ）の存在及び位置の両方の検出が可能になる。典型的には、ホルマリンでサンプルを固定し、パラフィンに包埋し、染色及びその後の光学顕微鏡による検査のために切片に切断する。現在のＩＨＣ法は、直接的な標識又は二次抗体ベースの若しくはハプテンベースの標識のいずれかを使用する。公知のＩＨＣシステムの例としては、例えば、EnVision（商標）(DakoCytomation)、Powervision（登録商標）(Immunovision, Springdale, AZ)、NBA（商標）キット(Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA)、HistoFine（登録商標）(Nichirei Corp, Tokyo, Japan)が挙げられる。特定の実施態様では、ＣＤ１６３、ＣＤ６８及びＳｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３マーカーに対する抗体と共にインキュベーションした後、組織切片（例えば、腫瘍関連マクロファージを含むサンプル）をスライド又は他の支持体上にマウントし得る。次いで、適切な固相支持体上にマウントされたサンプルの顕微鏡検査を実施し得る。顕微鏡写真の作成では、目的のタンパク質の存在を選択的に染色することによって強調するために、サンプルを含む切片をスライドガラス又は他の平面支持体上にマウントし得る。したがって、ＩＨＣサンプルは、例えば、（ａ）組織サンプルの調製、（ｂ）前記細胞の固定及び包埋、並びに（ｃ）前記細胞サンプル中の目的のタンパク質の検出を含み得る。いくつかの実施態様では、ＩＨＣ染色手順は、組織の切断及びトリミング、固定、脱水、パラフィン浸潤、薄片への切断、スライドガラス上へのマウント、ベーキング、脱パラフィン処理、再水和、抗原回復、ブロッキング工程、一次抗体の適用、洗浄、（場合により適切な検出可能な標識にカップリングされた）二次抗体の適用、洗浄、対比染色並びに顕微鏡検査などの工程を含み得る。
【００４０】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、サンプル中に存在する腫瘍関連マクロファージのレベルを決定することからなる工程をさらに含む。
【００４１】
治療方法及び使用：
本発明は、ガンを予防又は治療するための方法及び組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明はまた、ガンを阻害又は予防するための方法及び組成物を提供する。
【００４２】
本発明との関連では、「治療又は予防」という用語は、このような用語が適用される障害若しくは症状又はこのような障害若しくは症状の１つ以上の症候の回復、緩和、その進行の阻害又は予防を意味する。特に、この障害の治療は、悪性細胞の数を減少させることからなり得る。最も好ましくは、このような治療は、悪性細胞の完全な枯渇をもたらす。
【００４３】
好ましくは、処置すべき個体は、ガンに罹患しているか又はガンに罹患している可能性があるヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌ又は霊長類）である。好ましくは、個体は、ヒトである。
【００４４】
第１の態様によれば、本発明は、ガンに罹患している患者の予防又は治療において使用するためのｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストに関する。
【００４５】
「ガン」、「悪性腫瘍」及び「腫瘍」という用語は、典型的には無秩序な細胞成長を特徴とする哺乳動物における病理学的症状を指すか又は表す。より正確には、本発明の使用では、疾患、すなわちガンは、腫瘍細胞に共生的に関連することが示されている腫瘍関連マクロファージＴＡＭに関連する。さらに、本発明者らは、ｓｉｄｏｒｅｆｌｅｘｉｎ３に対する抗体と同様に、本発明のアンタゴニストが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を殺傷し、腫瘍細胞成長を減少させることを示す：腫瘍細胞は、腫瘍微小環境において生存因子及び血管新生因子をこれらに提供するＴＡＭをリクルートする（総説Dirkx A.E.M. Journal of Leukocyte Biology vol. 80 no. 6 1183-1196 December 2006を参照のこと）。
【００４６】
特に、ガンは、固形腫瘍又は未分化骨髄細胞の無秩序な成長（すなわち、白血病、リンパ腫）に関連し得る。
【００４７】
限定されないが、以下のものを含む様々なガン及び他の増殖性疾患は、本発明の方法及び組成物を使用して処置され得る：
−膀胱、乳房、子宮／子宮頸部、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、食道、膵臓、前立腺、胃、頸部、甲状腺、結腸直腸、頭頸部及び皮膚のものを含むガン腫（扁平上皮ガンを含む）、
−線維肉腫及び横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)を含む間葉起源の腫瘍；
−メラノーマ、セミノーマ、テラトカルシノーマ、神経芽細胞腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；
−星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫を含む中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍；
−線維肉腫、横紋筋肉腫(rhabdomyoscaroma)及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；並びに
−メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫(keratoacarcinoma)、セミノーマ、甲状腺濾胞ガン及びテラトカルシノーマを含む他の腫瘍。
−リンパ腫、例えば限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫。
−白血病、例えば限定されないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性の白血病及び骨髄異形成症候群、慢性白血病、例えば限定されないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病。
【００４８】
一実施態様では、前記ガンは、全ての急性白血病及び慢性白血病：慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＬＭＭＣ）、急性前骨髄球性白血病白血病（ＡＰＬ）からなる群より選択される白血病である。
【００４９】
好ましい実施態様では、前記白血病は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
【００５０】
一実施態様では、前記ガンは、全ての非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）からなる群より選択されるリンパ腫である。
【００５１】
一実施態様では、前記ガンは、脳、頭頸部、副腎、結腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺、膀胱、乳房、子宮内膜の腫瘍、多発性骨髄腫及び肉腫からなる群より選択される固形腫瘍である。
【００５２】
上記及び以下において、腫瘍、腫瘍疾患、ガン腫又はガンについて言及する場合、元の器官若しくは組織における、及び／又は他の任意の位置における転移は、あるいは又は加えて、腫瘍及び／又は転移の位置が何でもよいことを暗に意味する。
【００５３】
「患者」又は「それを必要とする被験体」という用語は、アデノシンレセプターが関与する病状に罹患しているか又はそれに罹患しやすい任意の哺乳動物（好ましくは、ヒト）を指す。
【００５４】
「ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニスト」は、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は妨害することができる分子（天然又は合成）又は細胞を指す。ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストとしては、抗体及びその抗原結合フラグメント、キメラ抗原レセプターＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生体有機分子、ペプチド模倣物、薬理学的作用物質及びそれらの代謝産物、転写及び翻訳コントロール配列などが挙げられる。アンタゴニストとしては、タンパク質のアンタゴニスト変異体、タンパク質に対するｓｉＲＮＡ分子、タンパク質に対するアンチセンス分子、アプタマー、及びタンパク質に対するリボザイムも挙げられる。例えば、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストは、ＴＡＭ表面上に発現される場合、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に結合してｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の生物学的活性（例えば、腫瘍細胞成長の誘導及び転移の促進）を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は妨害する分子であり得る。より具体的には、本発明のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストは、抗ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体である。
【００５５】
ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の「生物学的活性」は、ＴＡＭ表面上に発現される場合、腫瘍細胞成長及び／又は生存の誘導、免疫抑制並びに腫瘍転移の促進を意味する。
【００５６】
ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストである化合物の能力を決定するための試験は、当業者に周知である。好ましい実施態様では、アンタゴニストは、ＴＡＭ表面上に発現される場合、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の生物学的活性を阻害するために十分な様式で、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に特異的に結合する。ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に対する結合及びｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の生物学的活性の阻害は、当技術分野で周知の任意の競合アッセイによって決定され得る。例えば、アッセイは、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストとして試験すべき薬剤がｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に結合する能力を決定することからなり得る。結合能力は、Ｋｄ測定によって反映される。「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことを意図する。結合生体分子のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立されている方法を使用して決定され得る。特定の実施態様では、「ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に特異的に結合する」アンタゴニストは、１μM以下、１００nM以下、１０nM以下又は３nM以下のＫＤで、ヒトｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３ポリペプチドに結合する阻害剤を指すことを意図する。次いで、競合アッセイを行って、薬剤がｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の生物学的活性を阻害する能力を決定し得る。機能的アッセイでは、ａ）腫瘍細胞成長及び／若しくは生存（遮断ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体を用いた実施例並びに図２及び３を参照のこと）並びに／又はｂ）腫瘍転移（血管新生の阻害に対するアンタゴニストの効果に基づく試験）及び／若しくは腫瘍細胞遊走（マトリゲルアッセイ）を阻害する能力の評価を使用し得ることが想定され得る。
【００５７】
当業者であれば、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストがｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の生物学的活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は妨害するかを容易に決定し得る。最初に特性評価された遮断ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体と同じ方法で、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストがｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に結合し、及び／又は腫瘍細胞成長を阻害するかをチェックするために、各アンタゴニストを用いて、結合アッセイ並びに／又は細胞増殖及び／若しくは生存アッセイを実施し得る。例えば、細胞増殖アッセイは、ＣＦＳＥ増殖アッセイによって測定され得る。例えば、細胞生存アッセイは、フローサイトメトリーによるヨウ化プロピジウム測定によって測定され得る。例えば、血管新生及び／又は腫瘍細胞遊走アッセイは、マトリゲルアッセイによって測定され得る。
【００５８】
したがって、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストは、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に結合する分子であって、抗体、アプタマー及びポリペプチドからなる群より選択される分子であり得る。
【００５９】
当業者であれば、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストがｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の生物学的活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は妨害するか（（ｉ）ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に対する結合、並びに／又は（ｉｉ）腫瘍細胞成長及び／若しくは生存の阻害、並びに／又は（ｉｉｉ）腫瘍転移の遮断）を容易に決定し得る。
【００６０】
・抗体
別の実施態様では、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストは、ＴＡＭ表面においてｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に結合してＴＡＭ活性（腫瘍細胞成長及び／又は生存の誘導、免疫抑制並びに腫瘍転移の促進）を遮断し得る抗体（この用語は、抗体フラグメント又は部分を含む）であり得る。
【００６１】
好ましい実施態様では、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に対する抗体がＴＡＭ活性を損なうような方法（「中和抗体」）で、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストは、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に対する抗体からなり得る。
【００６２】
よって、本発明では、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の中和抗体は、（ｉ）ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に結合し、並びに／又は（ｉｉ）腫瘍細胞成長及び／若しくは生存を阻害し、並びに／又は（ｉｉｉ）腫瘍転移を遮断する能力について、上記のように選択される。
【００６３】
本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の重鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｃ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、天然に存在する抗体及び天然に存在しない抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにその一価フラグメント及び二価フラグメントを含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、一本鎖抗体及びそれらのフラグメントを含む。抗体は、ヒト抗体又は非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を減少させるためのリコンビナント方法によってヒト化され得る。
【００６５】
抗体は、従来の方法にしたがって調製される。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (Nature, 256:495, 1975)の方法を使用して作製され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、抗原型ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３でマウス又は他の適切な宿主動物を適切な間隔で（例えば、週２回、週１回、月２回又は月１回）免疫する。屠殺の１週間以内に、最終「追加免疫」の抗原を動物に投与し得る。免疫中に免疫学的アジュバントを使用することが望ましいことが多い。適切な免疫学的アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、Hunter’s Titermax、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１若しくはＱｕｉｌＡ、又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは当技術分野で周知である。皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路によって、動物を免疫し得る。複数の経路によって、複数の形態の抗原で所定の動物を免疫し得る。
【００６６】
簡潔に言えば、リコンビナントｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３は、リコンビナント細胞株による発現によって提供され得る。リコンビナント型ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３は、任意の前記方法を使用して提供され得る。免疫レジメンの後、動物の脾臓、リンパ節又は他の臓器からリンパ球を単離し、次いでポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。融合後、記載されているように(Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996)、標準的な方法を使用して、融合パートナーではなくハイブリドーマが成長可能な培地中に細胞を置く。ハイブリドーマの培養後、所望の特異性の（すなわち、抗原に選択的に結合する）抗体の存在について、細胞上清を分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降及びウエスタンブロッティングが挙げられる。他のスクリーニング技術は当技術分野で周知である。好ましい技術は、コンフォメーションがインタクトな抗原であって、ネイティブにフォールディングされた抗原に対する抗体の結合を確認するもの、例えば非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降である。
【００６７】
重要なことに、当技術分野で周知であるように、抗体分子のごく一部（パラトープ）のみが、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一般的に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照のこと）。Ｆｃ’領域及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された抗体、又はｐＦｃ’領域なしで生産された抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称される）は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された抗体、又はＦｃ領域なしで生産された抗体（Ｆａｂフラグメントと称される）は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。さらに進めて、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖と、抗体重鎖の一部（Ｆｄと称される）とからなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させずに、最大１０個の異なる軽鎖に結合され得る）、Ｆｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持する。
【００６８】
当技術分野で周知であるように、抗体の抗原結合部分内には、抗原のエピトープと直接的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とが存在する（一般的に、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より具体的には重鎖ＣＤＲＳは、抗体特異性に大きく関与する。
【００６９】
元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域を同種抗体又は異種特異的抗体の類似領域で置換し得ることは、現在では当技術分野で十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して機能的抗体を生産する「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明確に具現されている。
【００７０】
特定の実施態様では、本発明は、ヒト化型抗体を含む組成物及び方法を提供する。本明細書で使用される場合、「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を表す。ヒト化の方法としては、限定されないが、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号及び米国特許第５，８５９，２０５号（これらは、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているものが挙げられる。また、上記米国特許第５，５８５，０８９及び米国特許第５，６９３，７６１並びに国際公開公報第９０／０７８６１号では、ヒト化抗体の設計に使用され得る４つの可能な基準が提案されている。第１案は、アクセプターの場合、ヒト化すべきドナー免疫グロブリンと特に相同的な特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、又は多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が通常のものではなく、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的なのものである場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択し得ることであった。第３案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲに直接隣接する位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択し得ることであった。第４案は、抗体の三次元モデルにおいて、アミノ酸がＣＤＲの３Ａ以内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置にドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記方法は、当業者がヒト化抗体の作製に用い得るいくつかの方法の単なる例示である。当業者であれば、他の抗体ヒト化方法を熟知しているであろう。
【００７１】
ヒト化型抗体の一実施態様では、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分又は全部は不変である。アミノ酸のわずかな付加、欠失、挿入、置換又は改変は、それらが、所定の抗原に対する抗体の結合能を抑制しない限り許容可能である。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子が挙げられる。「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保持する。しかしながら、特定ヒト化の方法を使用して、抗体の結合の親和性及び／又は特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は、参照により本明細書に組み入れられる）によって記載されている「指向性進化」方法を使用して増加させ得る。
【００７２】
また、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫することによって、完全ヒトモノクローナル抗体を調製し得る。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５９８，３６９号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５４５，８０７号、米国特許第６，１５０，５８４号及びそこで引用されている参考文献（その内容は、参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子的に改変されている。これらの動物を免疫すると目的の抗原に対する完全ヒト抗体が産生されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するように前記動物をさらに改変する。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ(Abgenix)、ＨｕＭＡｂマウス(Medarex/GenPharm)）の免疫後、標準的なハイブリドーマ技術にしたがって、モノクローナル抗体を調製し得る。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するので、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘発しない。
【００７３】
ヒト抗体を生産するためのin vitro方法も存在する。これらとしては、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号及び米国特許第５，５７３，９０５号）及びヒトＢ細胞のin vitro刺激（米国特許第５，２２９，２７５号及び米国特許第５，５６７，６１０号）が挙げられる。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００７４】
したがって、当業者には明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラ抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体；並びに、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体を含む。
【００７５】
様々な抗体分子及びフラグメントは、限定されないが、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含む一般的に公知の免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００７６】
別の実施態様では、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体である。用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」は、軽鎖を本来的に欠くラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは、「nanobody（登録商標）」とも称される。本発明によれば、ｓｄＡｂは、特にラマｓｄＡｂであり得る。
【００７７】
中和抗ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体の例は、実施例のセクションに開示されている。これらの抗体の抗原−結合配列（例えば、ＣＤＲ）を使用して、本明細書に開示されるガンの処置のためのヒト化抗体を作製するために、当業者であれば、ルーチンな技術を使用し得る。
【００７８】
キメラ抗原レセプターＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）
いくつかの実施態様では、抗ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３抗体の抗原結合フラグメントは、キメラ抗原レセプターＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）の一部である。
【００７９】
特定の実施態様では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、本発明の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施態様では、抗原結合ドメインは、リンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に位置し得る。
【００８０】
本明細書で使用される場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞とも称される「キメラ抗原レセプターＴ細胞」という用語は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するリンパ球を指す。「キメラ抗原レセプター」又は「ＣＡＲ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナリングドメインに連結された抗体（例えば、ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドを指す。ＣＡＲの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞特異性及び反応性を選択ターゲットに対して非ＭＨＣ拘束的に再指向させるそれらの能力が挙げられる。非ＭＨＣ拘束性抗原認識は、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識して主要な腫瘍回避機構を回避する能力を、ＣＡＲを発現するＴ細胞に与える。また、Ｔ細胞において発現される場合、ＣＡＲは、有利には、内因性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量体化しない。このようなＣＡＲを設計及び生産するための戦略は当技術分野で周知であり、参考文献は、例えば、Bonini and Mondino, Eur. J. Immunol. 2015 (19)、Srivastava and Riddell, Trends Immunol. 2015 (20)、Jensen and Riddell, Curr. Opin. Immunol. 2015 (21)、Gill and June, Immunol. Rev. 2015 (22)に見られ得る。
【００８１】
・アプタマー
別の実施態様では、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストは、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に対するアプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物となる分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で、実質的に任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載されているようにランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ法）を介して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得られ得る。このライブラリーでは、各メンバーは、ユニークな配列の最終的には化学的に改変される線状オリゴマーである。このクラスの分子の可能な改変、使用及び利点は、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法(Colas et al., 1996)によってコンビナトリアルライブラリーから選択されるプラットフォームタンパク質（例えば、E. coliチオレドキシンＡ）によって提示されるコンフォメーション的に制限された抗体可変領域からなる。
【００８２】
よって、本発明では、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の中和アプタマーは、（ｉ）ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に結合し、並びに／又は（ｉｉ）腫瘍細胞成長及び／若しくは生存を阻害し、並びに／又は（ｉｉｉ）腫瘍転移を遮断する能力について、上記のように選択される。
【００８３】
・ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現阻害剤
さらに別の実施態様では、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストは、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現阻害剤である。「発現の阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。したがって、「ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現阻害剤」は、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を示す。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様では、前記ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ヌクレアーゼ又はリボザイムである。
【００８５】
本発明において使用するためのｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとするものであり得る。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３  ｍＲＮＡに結合してタンパク質翻訳を防止するか、又はｍＲＮＡ分解を増加させることによって、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３  ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断し、それにより、細胞内のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３のレベル及び活性を低下させるように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３をコードするｍＲＮＡ転写配列のユニーク領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば通常のホスホジエステル技術によって合成し、例えば静脈内注射又は静脈内注入によって投与し得る。その配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；米国特許第６，５６６，１３１号；米国特許第６，３６５，３５４号；米国特許第６，４１０，３２３号；米国特許第６，１０７，０９１号；米国特許第６，０４６，３２１号；及び米国特許第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
【００８６】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明において使用するためのｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現阻害剤として機能し得る。ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現が特異的に阻害されるように、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は低分子二本鎖ＲＮＡの生成を引き起こすベクター若しくは構築物を使用することによって、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現を減少させ得る（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。その配列が公知の遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び米国特許第６，５０６，５５９号；並びに国際公開公報第０１／３６６４６号、国際公開公報第９９／３２６１９号及び国際公開公報第０１／６８８３６号を参照のこと）。
【００８７】
ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３に対する前記ｓｉＲＮＡの例としては、限定されないが、Yoshikumi Y (2005) J Cell Biochem. Aug 15;95(6):1157-68に記載されているものが挙げられる。
【００８８】
リボザイムもまた、本発明において使用するためのｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現阻害剤として機能し得る。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。それにより、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３  ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的及び効率的に触媒する人工ヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。リボザイム切断部位（これらとしては、典型的には、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣが挙げられる）についてターゲット分子をスキャンすることによって、任意のＲＮＡターゲット候補内の特異的リボザイム切断部位を最初に同定する。同定したら、切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る予測構造的特徴（例えば、二次構造）について評価し得る。また、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセシビリティを試験することによって、候補ターゲットの適切性を評価し得る。
【００８９】
ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３遺伝子発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、公知の方法によって調製され得る。これらとしては、例えば、固相ホスホラミダイト(phosphoramadite)化学合成などによるによる化学合成技術が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitro又はin vivo転写によって作製され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた様々なベクターに組み込まれ得る。細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変を導入し得る。可能な改変としては、限定されないが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドフランキング配列を分子の５’及び／若しくは３’末端に付加すること、又はホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート若しくは２’−Ｏ−メチルをオリゴヌクレオチド骨格内で使用することが挙げられる。
【００９０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターに結合してin vivo送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞（好ましくは、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３を発現する細胞）へのアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の運搬を促進することができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在で起こり得る分解程度と比べて低減した分解で、核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明に有用なベクターとしては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスに由来する核酸配列が挙げられる。命名されていないが当技術分野で公知の他のベクターも容易に用い得る。
【００９１】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとするものである。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に承認されている。最も有用なのは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することはできるが、感染性粒子を製造することができない）レトロウイルスである。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける高効率な遺伝子トランスダクションについて全般的な有用性を有する。複製欠損性レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株によってリコンビナントレトロウイルスを生産する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及びウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）は、KRIEGLER (A Laboratory Manual,“ W.H. Freeman C.O., New York, 1990) and in MURRY (“Methods in Molecular Biology,” vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991)に示されている。
【００９２】
特定の用途に好ましいウイルスは、遺伝子治療におけるヒトへの使用が既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性となるように操作することができ、広範囲の細胞型及び種に感染することができる。それはさらに、熱安定性及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに、重複感染阻害がないので複数回のトランスダクションが可能であるなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことにより、挿入突然変異誘発の可能性及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子の発現の変動性を最小限にし得る。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００継代回以上にわたって組織培養液中で観察されており、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能し得る。
【００９３】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野で広く記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。ここ数年間では、プラスミドベクターは、in vivoにおいて抗原をコードする遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念がないので、特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは当業者に周知である。加えて、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加する制限酵素及びライゲーション反応を使用して、プラスミドをカスタム設計し得る。プラスミドは、様々な非経口経路、粘膜経路及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は点鼻液、直腸坐剤によって及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドを水溶液に加えてもよいし、金粒子上に乾燥してもよいし、又は別のＤＮＡ送達システム（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート及びマイクロカプセル化を含む）と併用してもよい。
【００９４】
ガンを予防又は治療する方法
本発明はさらに、被験体におけるガンを予防又は治療する方法であって、治療有効量のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストを該被験体に投与することを含む方法を企図する。
【００９５】
一態様では、本発明は、被験体における腫瘍成長及び／又は生存を阻害する方法であって、治療有効量のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。
【００９６】
「治療有効量」のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストは、膵管腺ガンを予防又は治療するために十分な量のアンタゴニストを意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解されよう。任意の特定の被験体の具体的な治療有効用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、被験体の年齢、体重、一般健康、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；治療期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；及び医療分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低レベルで化合物の投与を開始して、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当業者の範囲内である。しかしながら、生成物の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg/成人/日の広範囲で変動し得る。好ましくは、治療される被験体への投与量を対症的に調整するために、組成物は、有効成分 ０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には、有効成分 約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは有効成分 １mg〜約１００mgを含有する。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重/日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。
【００９７】
本発明はまた、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストを用いて、血中でｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３を発現する高レベルのＴＡＭを有する被験体におけるガンを処置するための方法に関する。
【００９８】
本発明はまた、血中でｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３を発現する高レベルのＴＡＭを有する被験体におけるガンの処置において使用するためのｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストに関する。
【００９９】
上記方法及び使用は、前記被験体から得られた血液サンプル中のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３タンパク質を発現するＴＡＭのレベルを測定し、参照コントロール値と比較する工程を含む。
【０１００】
ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３を発現する高レベルのＴＡＭは、ガンを有するか又は発症する高リスクを予測するものであり、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストを使用しなければならないことを意味する。
【０１０１】
典型的には、被験体から体液サンプルを得、このサンプル中のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３のレベルを測定する。実際、統計的分析により、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３を発現するＴＡＭのレベルの減少は、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３を発現する高レベルのＴＡＭを示す患者において特に有益であることが明らかになった。
【０１０２】
本発明の医薬組成物：
上記ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストを、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により徐放性マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療用組成物を形成し得る。
【０１０３】
したがって、本発明は、本発明のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストと、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
【０１０４】
本発明はまた、ガンの予防又は治療において使用するための医薬組成物であって、本発明のｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３アンタゴニストと、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
【０１０５】
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与した場合に有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入剤又は任意の種類の製剤化助剤を指す。
【０１０６】
治療用途では、組成物は、記載されているように、疾患の症候及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に停止するために十分な量で、疾患を既に患っている患者に投与される。医薬組成物の適切な投与量は、いくつかの十分に確立されたプロトコールのいずれか１つにしたがって容易に決定される。例えば、体重１キログラム当たりの生物活性剤の最大許容用量を決定するために、（例えば、マウス又はラットの）動物研究が一般に使用される。一般に、試験される動物種の少なくとも１つは、哺乳動物である。例えば、動物研究の結果から、ヒトなどの他の種において使用するための用量を推定し得る。有効量を構成するものはまた、疾患又は症状の性質及び重症度、並びに患者の健康の一般的状態に依存する。
【０１０７】
治療的処置では、医薬組成物に含まれるアンタゴニストは、所望の応答が達成されるまで、複数回投与量で又は単回用量として投与され得る。典型的には、処置はモニタリングされ、必要に応じて反復投与量が投与され得る。ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の不活性化が必要である場合には常に、本発明の化合物は、確立された投与レジメンにしたがって投与され得る。
【０１０８】
製品の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg/成人/日の広範囲で変動し得る。好ましくは、処置すべき患者への投与量の症候性調整のために、組成物は、有効成分 ０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には、有効成分 約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは有効成分 約１mg〜約１００mgを含有する。有効量の薬物は、通常、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重/日、特に約０．００１mg/kg〜１０mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。しかしながら、任意の特定の患者のための特定の用量レベル及び投与頻度は変動し得、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及びその作用の長さ、年齢、体重、一般的健康、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の症状の重症度、並びに治療を受けている宿主を含む様々な要因に依存すると理解されよう。
【０１０９】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、活性成分は単独で、又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与され得る。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口用懸濁剤又は液剤などの経口経路剤形、舌下及び口内投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。
【０１１０】
適切な単位投与形態としては、経口投与のための形態、例えば錠剤、ゼラチンカプセル、粉末、経口摂取すべき顆粒及び溶液又は懸濁液、舌下及び口腔投与のための形態、エアロゾル、インプラント、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は眼内投与のための形態並びに直腸投与のための形態が挙げられる。
【０１１１】
本発明の医薬組成物では、活性成分は、一般に、毎日投与の投与量単位当たり前記活性成分 ０．５〜１０００mg、好ましくは１〜５００mg、より好ましくは２〜２００mgを含有する投与量単位として製剤化される。
【０１１２】
錠剤の形態の固体組成物を調製する場合、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤を、場合により微粉化された活性成分に追加し、次いで、これをシリカ、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴムなどの薬学的ビヒクルと混合する。錠剤は、スクロースで、様々なポリマー若しくは他の適切な物質でコーティングされ得るか、又はそれらは、長期的若しくは遅発的な活性を有するように、及び所定量の活性成分を連続的に放出するように処理され得る。
【０１１３】
ゼラチンカプセルの形態の調製物は、活性成分を希釈剤、例えばグリコール又はグリセロールエステルと混合し、得られた混合物を軟質ゼラチンカプセル又は硬質ゼラチンカプセルに注ぐことによって得られる。
【０１１４】
シロップ又はエリキシル剤の形態の調製物は、甘味料（これは、好ましくはカロリーフリーである）、防腐剤としてメチル−パラベン及びプロピルパラベン、香味料及び適切な着色料と一緒に、活性成分を含有し得る。
【０１１５】
水分散性粉末又は顆粒は、分散剤又は湿潤剤又は懸濁剤、例えばポリビニルピロリドン及びさらには甘味料又は味修正剤と混合された活性成分を含有し得る。
【０１１６】
直腸投与は、直腸温度で融解する結合剤、例えばカカオバター又はポリエチレングリコールを用いて調製された坐剤を使用して行われる。
【０１１７】
非経口、鼻腔内又は眼内投与は、薬理学的に適合性の分散剤及び／又は湿潤剤、例えばプロピレングリコール、ブチレングリコール又はポリエチレングリコールを含有する水性懸濁液、等張性生理食塩水溶液又は滅菌注射溶液を使用して行われる。
【０１１８】
したがって、共溶媒、例えばアルコール、例えばエタノール又はグリコール、例えばポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコール及び親水性界面活性剤、例えばTween. RTM. 80は、静脈内経路によって注射可能な水溶液を調製するために使用され得る。筋肉内経路によって注射可能な油性溶液を調製するために、活性成分は、トリグリセリド又はグリセロールエステルによって可溶化され得る。
【０１１９】
経皮投与は、活性成分がアルコール溶液の形態である多層パッチ又はリザーバを使用して行われる。
【０１２０】
吸入による投与は、例えば、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は任意の他の生物学的に適合性の推進剤ガスと一緒にトリオレイン酸ソルビタン又はオレイン酸を含有するエアロゾルを使用して行われる。
【０１２１】
活性成分はまた、場合により１つ以上の担体又は添加剤と共に、マイクロカプセル又はミクロスフェアとして製剤化され得る。
【０１２２】
慢性処置の場合に有用な持続放出形態では、インプラントが使用され得る。これらは、油性懸濁液の形態で、又は等張性媒体中のミクロスフェアの懸濁液の形態で調製され得る。
【０１２３】
活性成分はまた、シクロデキストリン、例えばα、β若しくはγ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン又はメチル−β−シクロデキストリンとの複合体の形態で提示され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】４つの抗ＮＬＣ抗体によるＮＬＣの高染色。Ａ．４つの抗ＮＬＣ抗体による、ＣＬＬ患者からゲーティングしたＢ−ＣＬＬ及びＮＬＣ並びに健常ドナーの血液サンプル由来の単球、Ｔ細胞及びＢ細胞の染色（実線：アイソタイプコントロール；破線：抗体）。Ｂ．６−２５抗体による、ゲーティングしたＣＤ１６３＋ＮＬＣに対する陽性染色及び他の細胞に対する陰性染色。Ｃ．アイソタイプコントロールのものと比較した、ゲーティングしたＮＬＣに対する４つの抗体染色の蛍光強度の平均。
【図２】４つの抗体と共に培養した場合のＮＬＣ枯渇及び白血病細胞死。アイソタイプ条件と比較した、各抗ＮＬＣ抗体の存在下における６日後の、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣ培養物中のＮＬＣ（囲み枠）の枯渇の顕微鏡による可視化。各抗体を含む条件では、これらの培養物中のＮＬＣの絶対数は、ほぼ０であった。
【図３】２つの市販の抗ＳＦＸＮ３抗体及び６−２５抗体又はアイソタイプによって明らかにしたリコンビナントｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３のウエスタンブロット。
【図４】６−２５抗体若しくはアイソタイプコントロールと共に又は６−２５抗体若しくはアイソタイプコントロールなしで１０日間培養したＣＬＬ患者由来ＰＢＭＣからの顕微鏡検査及びＢ  ＣＬＬ生存分析。ＦＡＣＳ：死Ｂ  ＣＣＬの割合は囲み枠で示されている。
【図５】６−２５若しくはアイソタイプコントロールと共に又は６−２５若しくはアイソタイプコントロールなしでＣＬＬ患者のＰＢＭＣを１０日間培養した後のＮＬＣの数。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：腫瘍関連マクロファージをターゲティングするためのｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ
材料及び方法
フィコールを使用して患者由来のＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中、細胞 １０  １０６個／mlで１０日間培養した。次いで、上清を除去し、接着細胞（ＮＬＣ）をＰＢＳで２回洗浄した。セルスクレーパーを使用してＮＬＣを分離し、カウントし、乾燥ペレットを凍結した。非接着細胞の乾燥ペレットも凍結した。複数の患者由来のＮＬＣをプールし、“Proteo-extract native membrane protein extraction kit” (Calbiochem)を使用して、膜タンパク質を抽出した。
【０１２６】
Pierce（商標）High Capacity Streptavidin Agarose beads (thermo Fisher Scientific)をヤギ抗マウスＩｇＧビオチン(Sigma Aldrich, B7401)と共に室温で２０分間インキュベーションし、３回洗浄し、次いで、ハイブリドーマ上清培養培地又はコントロール培地と共に４℃で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄した後、コーティングビーズをＮＬＣ又は非接着細胞由来の膜タンパク質 ５００μgと共に４℃で一晩インキュベーションした。ビーズを洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ溶液で溶出した。これらの溶液をアクリルアミドゲルにロードし、移動後にinstant blue (euromedex)で着色した。ゲルストリップを切断し、ペプチドを抽出した。簡潔に言えば、アセトニトリル及び重炭酸アンモニウムでストリップを洗浄し、還元し、ＤＴＴ及びヨードアセトアミド(iodoacetamin)でアルキル化し、トリプシンで消化し、次いで、アセトニトリル及びギ酸でペプチドを抽出した。次いで、質量分析(mass spectometry)によって、ペプチドを同定した。各条件（ハイブリドーマの上清なし、タンパク質なし、非接着細胞由来及びＮＬＣ由来のタンパク質あり）で同定したペプチドを比較した。
【０１２７】
結果
ＮＬＣを特異的に認識する４つの抗体のターゲットを決定するために、本発明者らは、免疫沈降によって、４つのハイブリドーマ培養上清を試験した。このようにして、本発明者らは、質量分析によって、各ハイブリドーマに関連するペプチドを同定した。
【０１２８】
本発明者らは、これらのペプチド：
６−１６：ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３及びＧＲＰ７８
６−２５：ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３
６−６６−４９：ＧＲＰ７８
６−６６−７４：エンドプラスミン及びＧＲＰ７８
を見出した。
【０１２９】
実施例２：腫瘍関連マクロファージのターゲティング
材料及び方法
ＮＬＣに対する抗体の生産
ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中、細胞 １０  １０６個／mlで、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者の血液サンプルから単離したＰＢＭＣの培養物から、ＮＬＣを生成した。３７℃及び５％ＣＯ２雰囲気で１４日間培養した後、Ｂ白血病細胞を除去し、接着細胞（ＮＬＣ）を収集した。異なるドナー由来のＮＬＣ ３〜１５００万個をマウスに１５日ごとに４回腹腔内注射した。次いで、脾臓から脾細胞を単離し、α６３ｓ２マウス骨髄腫細胞株と融合して、ハイブリドーマ ２００個を生産した。これらのハイブリドーマ培養物の馴化培地 ２００をＮＬＣ又は白血病細胞と共に４℃で３０分間インキュベーションし、次いで、蛍光二次抗マウス抗体と共にインキュベーションした。次いで、フローサイトメトリーによって、これらの細胞を分析した。
【０１３０】
フローサイトメトリー分析
各ハイブリドーマ培養上清 ５０μlを細胞（ＮＬＣ、Ｂ白血病細胞又はＣＬＬ患者若しくは健常ドナー由来のＰＢＭＣ） ２２０万個と共に４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、蛍光色素にカップリングしたヤギ抗マウス抗体と共に４℃で３０分間インキュベーションした。洗浄した後、細胞を、異なる蛍光色素にカップリングした抗ヒトＣＤ１６３、抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ１９及び抗ヒトＣＤ１４と共に４℃で１５分間インキュベーションした。洗浄した後、フローサイトメトリーによって、細胞を分析した。
【０１３１】
抗体との培養
ＣＬＬ患者から単離したＰＢＭＣを、５μl/mlハイブリドーマ培養上清由来精製抗体と共に若しくは前記精製抗体なしで、又は５μl/mlアイソタイプコントロールと共に６日間培養した。次いで、顕微鏡下でカウントすることによってＮＬＣの数を推定し、生存について、ヨウ化プロピジウムを使用して細胞カウンタによって、生白血病細胞を評価した。
【０１３２】
免疫組織化学
隣接正常組織を有する腫瘍標本のルーチンに処理された厚さ４μmのホルマリン固定パラフィン包埋切片に対して、ＩＨＣを実施した。クエン酸バッファー（ｐＨ６）中で、熱誘導性エピトープ回復技術を実施した。各抗体を３０分間インキュベーションし、製造業者のプロトコールにしたがってEnVision G|2 System/AP (Dako)酵素コンジュゲートポリマー骨格を使用して明らかにし、キットに含まれるPermanent Red Chromogen (Fas Red)によって可視化した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で厚さμmの切片を染色した。Autostainer plus (Dako)スライドプロセッサーを使用して、ＩＨＣを処理した。
【０１３３】
結果
ＮＬＣに対する４つの特異的抗体のフローサイトメトリー分析．
ＮＬＣは、ＣＬＬの腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）として説明されている。
【０１３４】
ＮＬＣをターゲティングするために、本発明者らは、ＮＬＣに対する特異的抗体を生産することを決定した。したがって、本発明者らは、ＬＬＣ患者(patients with LLC)由来の精製ＮＬＣでマウスを免疫した。患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のin vitro培養によって、ＮＬＣを生成した。１４日後、ＮＬＣを単離し、次いで、マウスに注射した。ハイブリドーマ 約２００個を得、患者由来のＮＬＣを認識する能力について、フローサイトメトリーでそれらの上清を試験した。これらの上清 ２００個のうち、４つ（６−１６、６−２５、６−６６−４９、６−６６−７４）はＮＬＣを認識及び固定したが、白血病細胞を認識及び固定せず、ＬＬＣ患者(patient with LLC)由来の単球をほとんど認識及び固定しなかった。図１Ａは、アイソタイプ（黄色）と比較した各上清（青色）による染色を示す。これらの上清は、健常ドナー由来のＴ（ＣＤ３＋）又はＢ（ＣＤ１９＋）リンパ球を固定しなかった（図１Ａ）。図１Ｂは、ＣＤ１６３、ＴＡＭ／ＮＬＣに対する特異的抗体及び６−２５抗体によるＮＬＣの二重染色を示すが、他のＰＢＭＣは、これら２つの抗体によって認識されなかった。これらの上清は、ＮＬＣに対する特異的抗体（このアイソタイプはＩｇＧ１であると決定された）を含有する。４つの抗体の平均蛍光強度は、アイソタイプのものと比較して図１Ｃに表されている。
【０１３５】
抗体の機能性
抗体の機能性を試験するために、本発明者らは、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣを４つの各抗体と共に培養したところ、６日間の培養において、抗体なしの培養又はアイソタイプコントロールとの培養と比較して、ＮＬＣの数が大きく減少し（囲み枠内の大きな細胞）、生Ｂ白血病細胞の数が減少することを示した（図２）。
【０１３６】
乳房腫瘍におけるＴＡＭの検出
４つの抗体が、ＣＬＬにおいてＮＬＣ以外のＴＡＭを認識することができたかを試験するために、本発明者らは、４つの抗体を用いて乳房腫瘍のＩＨＣ染色を実施した。本発明者らは、ｐＨ６条件では、これらの抗体の２つ（６−２５及び６−６６−４９）が、炎症領域に特徴的な腫瘍端部及び腫瘍内部において優先的に、マクロファージに特異的な褐色染色をもたらしたことを示した。しかしながら、腫瘍から離れると（すなわち、「健常」組織では）、ごくわずかな染色が検出された。また、ガン細胞又は他の免疫細胞は、褐色に染色されなかった。
【０１３７】
実施例３
材料及び方法
６−２５抗体と共に培養した後のＢ  ＣＬＬ細胞及びＮＬＣの生存
ＣＬＬ患者の血液サンプルから単離したＰＢＭＣを、５μg/ml精製６−２５抗体と共に若しくは５μg/ml精製６−２５抗体なしで、又は５μg/mlアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１）と共に６日間培養した。Ｂ  ＣＬＬの枯渇前後に、位相差顕微鏡（２０倍）で写真を取得した。マラッセラメラでＮＬＣをカウントした。７ＡＡＤ及びアネキシンＶによる染色、次いでＦＡＣＳ分析によって、生白血病細胞を評価した。
【０１３８】
ウエスタンブロット
リコンビナントｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の５、１０、５０又は１００ngをウエスタンブロッティングに供し、ウサギポリクローナル抗ＳＦＸＮ３又はマウスモノクローナル抗ＳＦＸＮ３又は６−２５抗体又はマウスＩｇＧ１アイソタイプを含む１０μg/ml抗体溶液によって４℃で一晩プローブした。洗浄した後、膜を二次抗体溶液（１／１００００、ＨＲＰ）と共に室温で１時間インキュベーションした。次いで、ＥＣＬを用いて、視覚化を行った。
【０１３９】
結果
６−２５抗体によるウエスタンブロットでは、ヒトリコンビナントｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３が認識され、バンドは、２２kDaのサイズに対応していた。２つの市販の抗体（ウサギポリクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体）によるウエスタンブロットによって、このヒトリコンビナントｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３の認識をチェックした。これら２つの抗体を用いて２つのバンドが得られたが、その一方は、ｓｉｄｅｒｏｆｌｅｘｉｎ３のサイズ（２２kDa）に対応していた（図３）。
【０１４０】
６−２５抗体の機能性を分析するために、本発明者らは、ＣＬＬ患者のＰＢＭＣを、６−２５若しくはアイソタイプコントロールと共に、又は６−２５若しくはアイソタイプコントロールなしで６日間培養した。６日後、６−２５との培養では、ＮＬＣの枯渇が示された。Ｂ  ＣＣＬの排除後、枯渇はより明白であった。アイソタイプコントロールとの培養又は抗体なしの培養では、ＮＬＣ発生は影響を受けなかった。実際、これらの培養では、６−２５抗体との培養と比較して、円形の接着細胞が可視化された。次いで、これら３つの培養において、アネキシンＶ及び７−ＡＡＤによる染色並びにＦＡＣＳ分析によって、Ｂ  ＣＬＬ細胞の生存を分析した。アイソタイプコントロールと共に又はアイソタイプコントロールなしで６日間培養した後では、Ｂ  ＣＬＬの生存率は高く、死細胞はわずか６．４％であった。しかしながら、６−２５抗体の存在下では、６日間の培養後、Ｂ  ＣＬＬの８１．５％が死滅した（図４）。
【０１４１】
６−２５若しくはアイソタイプコントロールと共に、又は６−２５若しくはアイソタイプコントロールなしで培養したＣＬＬ患者 ２人由来のＰＢＭＣにおいても、ＮＬＣをカウントした。６−２５との培養では、アイソタイプコントロールとの培養又はアイソタイプコントロールなしの培養と比較して、ＮＬＣの数はほぼ０であった（図５）。
【表１】
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【０１４２】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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