(57)【要約】  便細菌叢の試料の凍結乾燥方法。本発明は、以下の工程: A)ドナー被験者からの便細菌叢の試料とポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程、及びB)-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃で、A)で得られた混合物を凍結させ、次いでそれを凍結乾燥させる工程、を含む、ドナー被験者からの便細菌叢の試料の凍結乾燥方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物を調製する方法であって、以下の工程、
A) ドナー被験者からの便細菌叢の試料を、ポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程、及び
B) A)で得られた前記混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結させ、次いで凍結乾燥させる工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記希釈剤が、(i) ポリオール、二糖〜五糖、又はそれらの混合物から少なくとも選択される凍結保護物質、及び(ii)マルトデキストリンを含む生理食塩水溶液であることによって特徴づけられる、請求項1に記載の凍結乾燥物を調製する方法。
【請求項３】
前記希釈剤が、凍結保護物質として、少なくともガラクトース-ラクトース又はトレハロースを含む生理食塩水溶液であることによって特徴づけられる、請求項1又は2に記載の凍結乾燥物を調製する方法。
【請求項４】
前記希釈剤が、少なくともマルトデキストリンの混合物を、好ましくは、前記溶液の全容量に対して4〜20%の量で含む生理食塩水溶液であることによって特徴づけられる、請求項1〜3の何れか1項に記載の凍結乾燥物を調製する方法。
【請求項５】
前記生理食塩水溶液中の凍結保護物質の全量が、前記溶液の全容量に対して3〜30重量%、好ましくは、前記溶液の全容量に対して4〜20重量%であることによって特徴づけられる、請求項1〜4の何れか1項に記載の凍結乾燥物を調製する方法。
【請求項６】
工程A)が、以下の工程、
A1) 凍結融解によって形成されるイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を任意で調製する工程、
A2) 少なくとも1つのドナー被験者からの便細菌叢の試料とイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3-ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを任意で含む生理食塩水緩衝液を、嫌気条件下で混合する工程、
A3) A2)で得られた前記混合物の沈着物を、A1)で得られた前記勾配下で任意で形成する工程、
A4) A2)又はA3)で得られた前記混合物を、嫌気条件下で低加速度にて連続的に遠心分離又は超遠心分離する工程、
A5) 工程A4)を完了することで形成された前記細菌リング又は前記上清を、嫌気条件下で回収する工程、
A6) A5）で回収された前記細菌リング又は前記上清を、前記希釈剤と混合する工程、
を含むことによって特徴づけられる、請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
【請求項７】
工程A6)として、嫌気条件下で、以下の工程;
a)生理食塩水緩衝液に懸濁されたA5)で得られた前記細菌リング又は前記上清を、3000〜4000×gの加速度、5〜15分の時間、20〜30℃の温度で遠心分離する工程、
b) 工程a)を完了することで得られた前記ペレットを回収し、生理食塩水緩衝液に再懸濁し、次いで200〜500×gの加速度、5〜15分の時間、20〜30℃の温度で遠心分離する工程、
c) 工程b)を完了することで得られた前記上清を回収し、生理食塩水緩衝液に再懸濁し、次いで3000〜4000×gの加速度、5〜15分の時間、20〜30℃の温度で遠心分離する工程、
d) 工程c)を完了することで得られた前記ペレットを回収する工程、及び
e) d)において回収された前記ペレットを、前記希釈剤と混合する工程、
を含むことによって特徴づけられる、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
【請求項８】
工程B)の前記凍結乾燥が、以下の条件:
B1) A)で得られた前記混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結すること、
B2) 大気圧下、-50℃〜-30℃の温度のフリーズドライ凍結乾燥機(freeze-drier lyophilizer)に、B1)で得られた前記凍結混合物を装填すること、次いで
B3) 前記圧力を80〜200μバールの値に低下させること、次いで前記棚の温度を0.2〜0.5℃/分の加熱速度を適用しながら、-20℃〜+25℃まで上昇させることを含む、B2）に装填された前記混合物の一次乾燥の少なくとも1つの工程、次いで
B4) 前記圧力を、80μバール以下の値、及び前記棚の温度を+25℃〜+35℃に0.1℃〜0.3℃/分の加熱温度で上昇させること、及びそれを8〜15時間維持すること、を含むB3)で得られた前記混合物の二次乾燥工程、
で実施されることによって特徴づけられる、請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記生理食塩水緩衝液が、好ましくは、7〜15g/lの濃度で塩化ナトリウムを含むHEPESの水溶液であることによって特徴づけられる、請求項6〜8の何れか1項に記載の方法。
【請求項１０】
A1) 凍結融解によって形成されるイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を、調製する工程、
A2) 少なくとも1つのドナー被験者からの便細菌叢の試料とイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3-ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを含む水溶液に加えられた生理食塩水緩衝液を、嫌気条件下で混合する工程、好ましくは、前記生理食塩水緩衝液は、塩化ナトリウムを含むHEPESの水溶液である、
A3) A2)で得られた前記混合物の沈着物を、A1)で得られた前記勾配下で形成する工程、
A4) A3)で得られた前記混合物を、40〜50分間の時間、2℃〜6℃の温度、13000〜16000×gの速度で超遠心分離する工程、
A5) 工程A4)を完了することで形成された前記細菌リングを、嫌気条件下で回収する工程、
A6) A5）で回収された前記細菌リングを、前記希釈剤と混合する工程、及び
B) A6）で得られた前記混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結させ、次いで凍結乾燥させる工程、
の工程を含むことによって特徴づけられる、請求項1〜9の何れか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程A1)において凍結融解によって形成されるイオジキサノールの連続勾配の調製が、以下の工程、
A1.a) イオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3-ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの溶液を、-70℃〜-100℃の温度で少なくとも12時間、凍結する工程、次いで
A1.b) 周囲温度で2〜4時間、A1. a)で得られた前記溶液を解凍し、イオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を得る工程、
に従い実施されることによって特徴づけられる、請求項1〜10の何れか1項に記載の方法。
【請求項１２】
嫌気条件下で以下の工程、
A2) ドナー被験者からの便細菌叢の少なくとも1つの試料を、生理食塩水緩衝液と混合する工程、
A4) A2)で得られた前記混合物を、低加速度で連続的に遠心分離する工程、
A5) 工程A4)を完了することで形成された前記上清を、回収する工程、
A6) A5)で回収された前記上清を、前記希釈剤と混合する工程、及び
B) A6)で得られた前記混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結させ、次いでそれを凍結乾燥させる工程、
を含むことによって特徴づけられる、請求項1〜9又は11の何れか1項に記載の方法。
【請求項１３】
工程A4)の低速での前記連続的な遠心分離が、200〜500×gの加速度、5〜15分の時間、20〜30℃の温度で実施されることによって特徴づけられる、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記自己又は同種の便細菌叢の移植に使用するため、又は腸のディスバイオシスを治療するための、請求項1〜13の何れか1項に記載の方法によって得られるドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物。
【請求項１５】
好ましくはファンクショナルゲノミクス、メタプロテオミクス又は免疫学における研究ツールとしての、請求項1〜13の何れか1項に記載の方法によって得られる凍結乾燥物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、便細菌叢試料の凍結乾燥方法に関する。本発明はまた、便細菌叢の移植において、好ましくは腸のディスバイオシス(dysbioses)、特にクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)感染を治療するため、得られた凍結乾燥物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸内細菌叢は、ヒトの胃腸系（胃、腸及び結腸）に見られる微生物（細菌、酵母及び真菌）の共同体である。微生物多様性は、現在、成人の優性腸内細菌叢を構成する約103の細菌種と推定される。成人は、1014個の豊富な細菌を有し、それらは各個体で200,000〜800,000種の遺伝子の優性細菌メタゲノム、すなわち、ヒトゲノム中の遺伝子の種類の10〜50倍を占める。
【０００３】
腸は、子宮内では無菌であるが、生命の最初の日から、それが独特な個々の細菌叢に発展するまで、コロニー形成される。ヒトそれぞれは、種において比較的近い細菌を有するが、その細菌叢の正確な構成(種、割合)は、大部分（種の2/3以上）が宿主に特異的である。
【０００４】
従って、ヒトの腸内細菌叢は、非常に多様化しており、複雑で個々の個体に特異的な生態系である。
【０００５】
個々の健康のため、変化後も初期状態に戻ることができ、侵襲に抵抗性のある安定した細菌叢を維持することが不可欠である。細菌叢の広い多様性の維持は、その安定性を促進する。しかしながら、特定の疾患又は治療は、細菌叢のバランスを乱し、例えば抗生物質、並びに慢性炎症性腸疾患（CIBD）等の炎症性成分を伴う疾患は、腸内の細菌叢の多様性を制限し得る。
【０００６】
特に抗生物質（又は抗生物質療法）治療は、細菌叢の分解及びそのバリア機能の喪失をもたらし、クロストリジウム・ディフィシル等の病原生物の増殖を促進し得る。
【０００７】
クロストリジウム・ディフィシル感染症は、院内性下痢の原因となる。この細菌は、従来の抗生物質(バンコマイシン又はメトロニダゾール等の広範囲)療法に対する耐性を示すことが出来る。腸内細菌叢を再確立し、及びクロストリジウム・ディフィシル型の感染と戦い、それによって、恒常性（すなわち、共生）再確立を目的に、便細菌叢の移植が、着想され、試験されている。それは、宿主の損傷された腸内細菌叢をリバランス(rebalance)させるために、健康なドナー被験者からの便を、受容患者の消化管に導入することからなる。この便細菌叢の移植は、一般的に同種間(allogenic)(すなわち、健康なドナー個人から患者へ)移植である。クロストリジウム・ディフィシル型の感染で得られた結果は高評価されており、一部の患者は治療に成功した(Tauxe et al, Lab Medicine, Winter 2015, volume 46, Number 1 or van Nood E, Speelman P, Nieuwdorp M, Keller J. 2014 Faecal microbiota transplantation: facts and controversies. Curr Opin Gastroenterol 30(1):34-9)。
【０００８】
しかしながら、実際の移植方法は、経験上のものであり、腸内細菌叢の大部分である嫌気性細菌の生存能力を最善に保つための特別な予防策を取っていない。加えて、便細菌叢の移植の有効性は可変的であり、1回以上の治療を必要とする可能性がある。
【０００９】
従って、特に産業規模で、安全、効果的及び簡単に得られる便細菌叢の利用可能な試料を入手するニーズがある。加えて、細菌の生存率が保たれ、貯蔵寿命が長い便細菌叢の試料が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、凍結乾燥物及び未処理便との間のピアソン相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、これらのニーズに対応することを可能にする。
【００１２】
従って、本発明は、ドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物を調製する方法であって、以下の工程を含む、
A) ドナー被験者からの便細菌叢の試料を、ポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程、及び、
B) A)で得られた混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結させ、次いで凍結乾燥させる工程。
【００１３】
特定の実施形態において、希釈剤は、(i)ポリオール、二糖〜五糖、又はその混合物から少なくとも選択される凍結保護物質、及び(ii)マルトデキストリンを含む生理食塩水溶液である。
【００１４】
先の実施形態と組み合わせることが出来る別の実施形態において、希釈剤は、凍結保護剤として、少なくともガラクトース-ラクトース又はトレハロースを含む生理食塩水溶液である。
【００１５】
先の実施形態と組み合わせることが出来る別の実施形態において、希釈剤は、少なくとも、バルキング剤としてのマルトデキストリンの混合物を含み、好ましくは溶液の全容量に対して4〜20%の量で含む生理食塩水溶液である。
【００１６】
先の実施形態と組み合わせることが出来る別の実施形態において、生理食塩水溶液中の凍結保護物質の全量は、溶液の全容量に対して3〜30質量%、好ましくは、溶液の全容量に対して4〜20質量%である。
【００１７】
好ましくは、工程A)で使用される便細菌叢の試料は、予め精製される。
【００１８】
好ましくは、本発明は、ドナー被験者からの便細菌叢の試料を調製する方法であって、以下の工程を含む、
A1) 凍結融解によって形成されるイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を任意で調製する工程、
A2) 少なくとも1つのドナー被験者からの便細菌叢の試料とイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3-ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを任意で含む生理食塩水緩衝液を、嫌気条件下で混合する工程、
A3) A2)で得られた混合物の沈着物を、A1)で得られた勾配下で任意で形成する工程、
A4) A2)又はA3)で得られた混合物を、嫌気条件下で低加速度にて連続的に遠心分離する、又は超遠心分離する工程、
A5) 工程A4)を完了することで形成された細菌リング又は上清を、嫌気条件下で回収する工程、
A6) A5）で回収された細菌リング又は上清を、ポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程、及び
B) A6）で得られた混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結させ、次いで凍結乾燥させる工程。
【００１９】
そのような方法において、工程A1)並びに、事実上、工程A3)は、任意である。
【００２０】
そのような方法は実際に実施が容易であり、その有効性を、最初の試料と比較して、当該方法の後に得られた微生物個体群を比較することによって推定することが出来る。
【００２１】
本発明はまた、機能的ゲノミクス、メタプロテオミクス又は免疫学における研究ツールとして、本発明による方法によって得ることが出来る便細菌叢の凍結乾燥物の使用に関する。
【００２２】
例えば、本発明による方法によって得られる凍結乾燥物は、アガロース（又は他のゲル）のマトリックスに固定化された際に、クローニング及び機能研究のために使用される非常に大きなサイズのDNAフラグメントの抽出を可能にする細菌ペレットを生成するために使用され得る。メタプロテオーム解析の観点から、細菌性コミュニティのサイトゾルタンパク質又はエンベロープタンパク質の抽出物の調製にも使用され得る。最後に、宿主の免疫系によるインタクトな細菌の認識を研究するために使用することが出来る。
【００２３】
本発明はまた、便細菌叢の自己移植又は同種間移植において、本発明の方法によって得ることが出来るドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物の使用に関する。
【００２４】
本発明はまた、感染、特にクロストリジウム・ディフィシル感染、薬物治療、物理的処理(特に放射線)、外科手術(特に大腸)、大腸内視鏡検査又は栄養摂取によって誘発されるディスバイオシス、に起因する腸のディスバイオシスを治療するための、本発明による方法によって得られるドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物の使用にも関する。本発明はまた、慢性炎症性腸疾患(CIBD)、腸機能障害、肥満、代謝疾患(特に、2型糖尿病、メタボリックシンドローム)及び自己免疫疾患(特に、1型糖尿病)、アレルギー、肝疾患(特に、脂肪肝、肝硬変)、特定の神経疾患(特に、自閉症)及び特定の癌(特に、結腸直腸癌)から選択される病態を治療するための、本発明の方法によって得られるドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物の使用に関する。
【００２５】
腸のディスバイオシスとは、何れかの腸内細菌叢の持続的な不均衡を意味する。腸内細菌叢の不均衡が持続することは、何れかの有益な微生物の損失、及び/又は何れかの微生物の多様性の損失、及び/又は共生生物(病原体)の中の攻撃的な微生物の拡大又は発達、及び/又は何れかの病原微生物(特に、C. ディフィシレ)の増殖を意味する。何れかのヒトの腸内細菌叢の持続的な損傷は、慢性的な様式で病的状態を実際に引き起こすか、又は伴うことがある。特に、細菌叢内の多様性の減少は、ディスバイオシス(特に、肥満、クローン病、糖尿病又はアレルギー)に関連する疾患の特徴である(Sansonetti, College de France, 22 January 2014)。
【００２６】
好ましくは、治療される病状は、腸のディスバイオシスである。
【００２７】
慢性炎症性腸疾患（CIBD）とは、特にクローン病、潰瘍性大腸炎を意味する。
【００２８】
機能性腸障害とは、特に過敏性腸症候群、痙攣性大腸炎を意味する。
【００２９】
従って、本発明のドナー被験者から便細菌叢の凍結乾燥物を調製する方法は、以下の工程を含む:
A) ドナー被験者からの便細菌叢の試料を、ポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程、
B) A)で得られた混合物を-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結させ、次いで凍結乾燥させる工程。
【００３０】
本発明による方法の工程A)は、ドナー被験者からの便細菌叢の試料を、ポリオール、二糖〜五糖等の凍結保護物質; マルトデキストリン等の充填剤、及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合することを含む。
【００３１】
好ましくは、ドナー被験者からの便細菌叢の試料は、前記ドナーからの便の試料である。実際に、便の試料は、ドナー被験者の便細菌叢を含む。好ましくは、本発明によれば、ドナー被験者は、健康なヒト被験者である。「健康な」被験者とは、腸の細菌叢における不均衡、又は医療従事者によって診断/認識された病状に苦しんでいない被験体を意味する。好ましくは、ドナー被験者からの便細菌叢の試料は、予め精製される。
【００３２】
あるいは、好ましくは、本発明によれば、ドナー被験者は、体調不良のヒト被験者である。
【００３３】
好ましくは、便の試料は、少なくとも20gの質量を有する。
【００３４】
便細菌叢の試料は、常に嫌気条件下(すなわち、酸素を含まない雰囲気下)で得られ、混合される。従って、嫌気条件下において、試料中に存在する便細菌叢の常在型の細菌の生存能力は保存される。
【００３５】
好ましくは、その使用に先立って、便細菌叢の試料は、嫌気条件下で濾過される。先立つ濾過工程は、嫌気条件下で、フィルターを備えたスワード（Seward）バッグを用いた濾過を含むことが出来る。
【００３６】
好ましくは、便細菌叢の試料は、エアータイト(air-tight)収集装置を用いて、嫌気条件下で採取される。好ましくは、この装置は、以下を含むタイプの形態である:
- ドナー被験者からの便細菌叢の試料を受け入れることが出来る内部空間を含むボディ、及びボディの内部空間へのアクセスのための開口の範囲を定めるネック、を含むコンテナ、及び
- ネックのアクセス開口部を密閉してボディの内部空間を閉鎖するように、コンテナのネックに取り外し可能且つ、エアータイト様式で取り付けることが出来るカバー、
ここで、コンテナのボディが、フレキシブルパウチで構成され、コンテナ及びカバーの少なくとも1つが、コンテナのボディの内部空間に収容されたガスの少なくとも一部を排気することが可能な排気部材を備える。
【００３７】
あるいは、エアータイト収集装置は、以下を含むタイプの形態で提供される:
- ドナー被験者からの便細菌叢の試料を受け入れることが出来る内部空間を含むボディ、及びボディの内部空間へのアクセスのための開口の範囲を定めるネック、を含むコンテナ、及び
- ネックのアクセス開口部を密閉してボディの内部空間を閉鎖するように、コンテナのネックに取り外し可能且つ、エアータイト様式で取り付けることが出来るカバー、
ここで、コンテナのボディの内部空間が、任意で酸素を中和する化学装置を含む。
【００３８】
希釈剤は、以下の化合物から選択することが出来る：
- 二糖〜五糖、すなわち二糖類、三糖類、四糖類及び五糖類等の凍結保護物質; 又はグリセロール、マンニトール、ソルビトール、プロピレングリコール又はエチレングリコール等のポリオール、
- 充填剤、例えばデンプンの部分加水分解物、特に、大量のマルトデキストリンを含む、コムギ若しくはトウモロコシ、又はフェクラ(fecula)の部分加水分解物、又は
- 及びそれらの混合物。
【００３９】
好ましくは、希釈剤は、少なくとも凍結保護物質及び/充填剤を含む生理食塩水溶液である。従って、典型的に生理食塩水溶液は、水及び生理学的に許容される塩を含む。典型的に、塩は、塩素イオン、グルコン酸イオン、酢酸イオン又は炭酸水素イオンを有するカルシウム塩、ナトリウム塩又はマグネシウム塩である。
【００４０】
生理食塩水溶液はまた、任意で少なくとも1つの酸化防止剤を含むことが出来る。酸化防止剤は、特に、アスコルビン酸及びその塩（アスコルビン酸塩）、トコフェロール（特にα-トコフェロール）、システイン及びその塩形態（特に塩酸塩）及びそれらの混合物から選択される。
【００４１】
好ましくは、生理食塩水溶液は、以下を含む:
- 塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムから選択される少なくとも1つの塩、及び
- 任意で、好ましくは、L-アスコルビン酸ナトリウム、トコフェロール、L-システイン塩酸塩一水和物及びそれらの混合物から選択される少なくとも1つの抗酸化剤を含む。
【００４２】
典型的に、塩は、5〜20g/L、好ましくは7〜10g/Lの濃度で生理食塩水溶液中に存在する。
【００４３】
典型的に、酸化防止剤は、溶液の全容量に対して0.3〜1重量%、好ましくは、溶液の全容量に対して0.4〜0.6重量%の量で、生理食塩水溶液中に存在する。
【００４４】
好ましくは、酸化防止剤が、L-アスコルビン酸ナトリウム及びL-システイン塩酸塩一水和物の混合物である場合、L-アスコルビン酸ナトリウムは、溶液の全容量に対して0.4〜0.6重量％の量で存在し、L-システイン塩酸塩一水和物溶液の全容量に対して0.01〜0.1重量％の量で存在する。
【００４５】
好ましくは、生理食塩水溶液は、少なくとも1つの凍結保護物質を含む。凍結保護物質は、特に氷結晶の形成の結果において、凍結による損傷から試料を保護するために使用される物質である。
【００４６】
好ましくは、凍結保護物質は、ポリオール、二糖〜五糖(すなわち、二糖類、三糖類、四糖類及び五糖類)、及びそれらの混合物から選択される。好ましくは、凍結保護物質は、ポリオール、三糖類及び二糖類、及びそれらの混合物から選択される。より優先的には、生理食塩水溶液に存在する凍結保護物質は、二糖類又は三糖類である。
【００４７】
使用することが出来るポリオールの中でも、特に、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、さらにはプロピレングリコール又はエチレングリコールが挙げられ得る。
【００４８】
使用することが出来る二糖〜五糖類のうち、同一又は異なるユニットの二量体、三量体、四量体及び五量体が挙げられ得、前記ユニットは、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フコース及びN-アセチルノイラミン酸から選択される。
【００４９】
使用することが出来る二糖類のうち、トレハロース又はそのアナログの1つ、又はサッカロースが特に挙げられ得る。
【００５０】
これらの凍結保護物質は、単独又は混合物として使用され得る。
【００５１】
典型的に、生理食塩水溶液中に存在する凍結保護物質の全量は、溶液の全容量に対して3〜30重量%、好ましくは溶液の全容量に対して4〜20重量%である。
【００５２】
好ましくは、凍結保護物質は、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、プロピレングリコール、エチレングリコール、トレハロース及びそのアナログ、サッカロース、ガラクトース-ラクトース及びそれらの混合物から選択される。より優先的には、凍結保護物質は、ガラクトース-ラクトース又はトレハロースである。
【００５３】
好ましくは、本発明による生理食塩水溶液は、少なくとも1つの充填剤を含む。
【００５４】
充填剤は、好ましくは、デンプン又はフェクラの部分加水分解物から選択される。特にコムギ又はトウモロコシのデンプンの部分加水分解物、並びにジャガイモのフェクラの部分加水分解物は、多量のマルトデキストリンを含む。マルトデキストリンは、デンプン又はフェクラの部分加水分解から得られ、異なる糖（グルコース、マルトース、マルトトリオース、オリゴ糖及び多糖）によって構成され、その割合は加水分解の程度によって異なる。
【００５５】
好ましくは、生理食塩水溶液中に存在する充填剤は、マルトデキストリンの混合物であり、マルトデキストリンの量は、溶液の全容量に対して4〜20重量%で含まれる。
【００５６】
好ましくは、工程A)は、細菌叢の重量比、好ましくは1:1〜1:10に含まれる希釈剤(mL)の精製(g)/容量での便細菌叢の試料を希釈剤と混合することによって実施される。
【００５７】
次いで、A)で得られた混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結し、次いで凍結乾燥に供する: これは工程B)である。好ましくは、工程B)は、以下の条件で行われる:
B1) A)で得られた混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃、好ましくは約-80℃の温度で凍結すること、
B2) 大気圧下、-50℃〜-30℃の温度に予め冷却されたフリーズドライ凍結乾燥機(freeze-drier lyophilizer)に、B1)で得られた凍結混合物を装填すること、次いで
B3) 圧力を80〜200μバール（好ましくは100〜150μバール）の値に低下させること、次いで棚の温度を0.2〜0.5℃/分の加熱速度を適用しながら、-20℃〜+25℃（好ましくは-10℃）まで上昇させることを含む、B2）に装填された混合物の一次乾燥の少なくとも1つの工程。圧力及び棚の温度の値は、昇華中の産物の温度が崩壊温度以下に維持されるように選択される。パラメータは、混合物から氷が完全になくなるまで一定に保たれ、次いで
B4) 圧力を80μバール未満又は等しい値、好ましくは装置の取り得る最低値まで低下させること、及び棚の温度を+25℃〜+35℃、優先的には25℃、0.1℃〜0.3℃/分の加熱温度で、上昇させること、及びそれを8〜15時間維持すること、を含むB3)で得られた混合物の二次乾燥工程。
【００５８】
好ましくは、工程B1)の凍結は、-50℃未満の温度、好ましくは、-70℃〜-100℃の温度で実施される。好ましくは、凍結温度は、-70℃〜-100℃が含まれ、より好ましくは約-80℃又は約-100℃である。凍結させることを目的に、A）で得られた混合物を、一定容量の試料を確実に得るために事前に等分することが出来る。
【００５９】
このようにして、凍結試料を、大気圧下で、-50℃〜-30℃の温度に予め冷却したフリーズドライ凍結乾燥機に装填する; これは工程B2)である。
【００６０】
次に、B2)で装填された混合物の一次乾燥が行われる; これは工程B3である。それは、圧力を、80〜200μバール(好ましくは100〜150μバール)の値に低下させること、次いで0.2℃〜0.5℃/分の加熱速度を適応しながら棚の温度を-20℃〜+25℃(好ましくは-10℃)の値に上昇させることを含む、B2)で装填された混合物の一次乾燥の少なくとも1つの工程を含む。棚の圧力及び温度の値は、昇華中に産物の温度が崩壊温度以下に維持されるように選択される。パラメータは、混合物から氷が完全になくなるまで一定に保たれる。
【００６１】
最後に、B4) B3)で得られた混合物の二次乾燥を行う。この工程は、圧力を80μバール以下、好ましくは装置に取り得る最小値まで下げること、及び棚の温度を、0.1〜0.3℃/分の加熱速度で、+25℃〜+35℃、好ましくは25℃の値に上昇させること、及び8〜15時間保持することを含む。
【００６２】
最終的に、このようにして本発明による凍結乾燥物が得られる。
【００６３】
好ましくは、本発明による方法は、工程A)において、便細菌叢の試料を希釈剤と混合する前に、試料を処理する前工程を含む。
【００６４】
従って、好ましくは、工程A)は、以下のサブステップを含む。
A1) 任意で、凍結融解により形成されたイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を調製する工程、
A2) 少なくとも1つのドナー被験者からの便細菌叢の試料とイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3-ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを任意で含む生理食塩水緩衝液を、嫌気条件下で混合する工程、
A3) 任意でA2)で得られた混合物の沈着物を、A1)で得られた勾配下で形成する工程、
A4) A2)又はA3)で得られた混合物を嫌気条件下で低加速度にて連続的に遠心分離又は超遠心分離する工程、
A5) 工程A4)を完了することで形成された細菌リング又は上清を、嫌気条件下で回収する工程、
A6) A5）で回収された細菌リング又は上清を、ポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程。
【００６５】
このような方法では、工程A1)、並びに事実上の工程A3)は、任意である。
【００６６】
好ましくは、上記の異なるサブステップで使用される生理食塩水緩衝液は、好ましくは7〜15g/lの濃度で塩化ナトリウムを含むHEPESの水溶液である。好ましくは、HEPESは、8〜50mM、好ましくは9〜42mMの濃度で存在する。
【００６７】
第1の代替案
好ましくは、第1の代替案によれば、本発明による方法は、以下の工程を含む:
A1) 凍結融解により形成されたイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を調製する工程、
A2) 少なくとも1つのドナー被験者からの便細菌叢の試料とイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3-ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを任意で含む生理食塩水緩衝液(好ましくは、前記生理食塩緩衝液は、塩化ナトリウムを含むHEPESの水溶液)を、嫌気条件下で混合する工程、
A3) 任意でA2)で得られた混合物の沈着物を、A1)で得られた勾配下で形成する工程、
A4) A3)で得られた混合物を、40〜50分の時間、13000〜16000×gの加速度、2℃〜6℃の温度で超遠心分離する工程、
A5)工程A4)を完了することで形成された細菌リングを、嫌気条件下で回収する工程、
A6) A5）で回収された細菌リングを、ポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程、及び
B) A6）で得られた混合物を-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結させ、次いでそれを凍結乾燥させる工程。
【００６８】
故に、工程A1)は、凍結融解により形成されたイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を調製する工程を含む。
【００６９】
イオジキサノールの連続勾配とは、1.03〜1.24の範囲、好ましくは1.06〜1.24の範囲の密度を有する連続勾配を意味する。
【００７０】
5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配とは、1.03〜1.22の範囲の密度を有する5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を意味する。
【００７１】
好ましくは、この工程A1)は、以下の工程によって実施される:
A1. a) -70℃〜-100℃の温度で少なくとも12時間、イオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの溶液を、凍結する工程。好ましくは、前記溶液は脱気される。オジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの脱気された溶液とは、溶存空気の濃度が、例えば、真空下等で減少されたイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの溶液を意味する。これにより、精製方法の間で細菌の生存に有利な微小-嫌気状態を作り出すことが可能になる; 次いで
A1. b) 周囲温度で2〜4時間、A1. a)で得られた溶液を解凍し、イオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配を得る工程。
【００７２】
好ましくは、工程A1）で使用されるイオジキサノールの溶液は、溶液の容量(w/v)でイオジキサノールの重量の15〜25%、優先的には、約20%の濃度を含む溶液である。より優先的には、使用されるイオジキサノールの溶液を、OptiPrepの名称で市販されているイオジキサノールの市販の60%水溶液(水中、イオジキサノールの滅菌60%w/v溶液)を生理食塩水緩衝液で、優先的にはpH7.0、15mM HEPES及びNaCl 9g/Lを含む緩衝液で3倍希釈することによって得た。
【００７３】
好ましくは、5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの溶液は、溶液の容量(w/v)で5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの20重量%を含む溶液である。より優先的には、使用される5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドは、Nycodenzの名称でProgen Biotechnikより市販される。
【００７４】
好ましくは、工程A1. a)において、イオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの溶液を凍結する工程は、数日間、又はさらには1か月間、実施され得る。
【００７５】
イオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの連続勾配が、工程A1)で得られると、続く工程A2)、A4)及びA5)は、嫌気条件下で実施される。
【００７６】
工程A2)は、ドナー被験者からの便細菌叢の少なくとも1つの試料を、嫌気条件下でイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを含む水溶液に加えられた生理食塩水緩衝液と混合する工程を含む。好ましくは、前記生理食塩水緩衝液は、塩化ナトリウムを含むHEPESの水溶液である。好ましくは、HEPESは、生理食塩水緩衝液中に30〜50mMの濃度で存在する。好ましくは、塩化ナトリウムは、生理食塩水中に7〜15g/lの濃度で存在する。好ましくは、イオジキサノールの水溶液は、50%〜70%、好ましくは約60%(w/v)の濃度である。好ましくは、生理食塩水緩衝液 : イオジキサノールの水溶液の比は、約1 : 3である。
【００７７】
好ましくは、5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの水溶液は、60%(w/v)の濃度である。好ましくは、生理食塩水緩衝液 : 5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの水溶液の比は、約1 : 3である。
【００７８】
故に、工程A2)に従い、生理食塩水緩衝液を、予めイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの水溶液と混合する; このようにして、イオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを含む生理食塩水緩衝液が得られる。次いで、得られた混合物を、便細菌叢の試料と混合する。
【００７９】
好ましくは、便細菌叢の試料とイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを含む生理食塩水緩衝液を混合することを、3〜4グラムの試料対22〜30mLのイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドを含む生理食塩水緩衝液の比で実施する。
【００８０】
好ましくは、便細菌叢の試料が、工程A2)とA3)の間で濾過される場合、嫌気条件下で特にフィルターを備えたスワードバッグを用いることによって、A2)で得られた混合物を濾過する工程に供される。
【００８１】
次いで、任意で濾過された、A2)で得られた混合物を、A1)下で得られた勾配下で沈着させる: これは、工程A3)である。工程A3)を、好気又は嫌気条件下で行うことが出来る。
【００８２】
好ましくは、A2)で得られた混合物は、針を備えたシリンジ中に存在し、及びイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの勾配は、チューブタイプのコンテナ中に存在する。この場合、A2)で得られた混合物を、シリンジの針をイオジキサノール又は5-（N-2,3-ジヒドロキシプロピルアセトアミド）-2,4,6-トリヨード-N,N'-ビス（2,3ジヒドロキシプロピル）イソフタルアミドの勾配を含むチューブの底部に押し込むことによって、及びシリンジの内容物を出すことによって沈着させる。
【００８３】
次いで、A3）で得られた調製物を、低加速度、真空下で超遠心分離機において遠心分離する：これは工程A4）である。この超遠心分離は、2℃〜6℃の温度で、13000〜16000×gの速度で、40〜50分の時間行われる。好ましくは、超遠心分離は、約4℃の温度で、約14500〜14600×gの速度で、40〜50分の時間行われる。
【００８４】
この工程を終了すると、勾配内に細菌リングが形成される。このリングは、工程A5)において嫌気条件下で回収される。それは、目的の細菌を含む。
【００８５】
第2の代替案
好ましくは、第2の代替案に従い、調製方法は、以下の工程を含む:
A2) ドナー被験者からの便細菌叢の少なくとも1つの試料を、生理食塩水緩衝液と嫌気条件下で混合する工程、
A4) A2)で得られた混合物を、嫌気条件下で低速で連続的に遠心分離する工程、
A5) 工程A4)を完了することで形成された上清を、嫌気条件下で回収する工程、
A6) A5)で回収された上清を、ポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程、及び
B) A6)で得られた混合物を、-50℃未満、好ましくは-70℃〜-100℃の温度で凍結させ、次いでそれを凍結乾燥させる。
【００８６】
この第2の代替案は、低加速度で連続的に遠心分離する工程を含む。低加速度とは、200〜500×gの加速を、意味する。従って、便細菌叢の試料(破片、次いで細菌細胞)に存在する異なる粒子が沈降する。
【００８７】
工程A2)は、嫌気条件下で、ドナー被験者からの便細菌叢の少なくとも1つの試料を生理食塩水緩衝液と混合する工程を含む。好ましくは、前記生理食塩水緩衝液は、塩化ナトリウムを含むHEPESの水溶液である。好ましくは、HEPESは5〜15mMの濃度で存在する。好ましくは、塩化ナトリウムは、7〜15g/lの濃度で存在する。
【００８８】
好ましくは、便細菌叢の試料と食塩水緩衝液を混合することは、試料 : 緩衝液の重量比1 : 20〜1 : 25で行われる。
【００８９】
好ましくは、便細菌叢の試料が、工程A2）と工程A4）の間で濾過される場合、A2)で得られた混合物は、嫌気条件下で、特にフィルターを備えたスワードバッグを用いて濾過する工程に供される。
【００９０】
次いで、任意で濾過したA2)で得られた混合物を、嫌気条件下で、低加速で連続的に遠心分離に供する: これは工程A4)である。
【００９１】
工程A4)の低下速度での連続的な遠心分離は、20〜30℃の温度で、5〜15分の時間、200〜500×gの加速度で実施することが好ましい。より優先的には、低下速度での連続的な遠心分離は、20〜25℃の温度、5〜15分の時間、約300×gの加速度で実施される。
【００９２】
この工程の終了時に、上清を、嫌気条件下で回収する(工程A5))。それは目的の細菌叢を含む。
【００９３】
好ましくは、工程d)の低加速での連続的な遠心分離及び次いで上清e)の回収工程が、数回、好ましくは、2回実施され、各工程d)は、200〜500×gの加速度、5〜15分の時間及び20〜30℃の温度である。
【００９４】
故に、好ましくは、工程A5)において、
A5.1) 工程A4)を完了することで形成された上清を、回収し、
A5.2) A4)で得られたペレットを、生理食塩水緩衝液(工程A2)のものと同じ)と混合し、次いで、工程A4)に記載されているように低下速度で連続的な遠心分離に供し、及びこのように得られた上清を、画分A5.1)の上清と混合する。このペレットを洗浄する操作は、ペレットが細菌から排出されるまで、随意で繰り返すことが出来る。実際問題並びに時間及び抽出容量の経済性のために、ペレットの一回の洗浄が典型的に実施される。
【００９５】
本発明の方法（第1又は第2の代替案）がどのようなものであっても、後半は、工程A6）として、嫌気条件下で以下の工程を含むことが出来る:
a) 生理食塩水緩衝液に懸濁されたA5)で得られた細菌リング又は上清を、3000〜4000×gの加速度、5〜15分の時間、20〜30℃の温度で遠心分離する工程、
b) 工程a)を完了することで得られたペレットを回収し、及び生理食塩水緩衝液に再懸濁し、次いで200〜500×gの加速度、5〜15分の時間、20〜30℃の温度で遠心分離する工程、
c) 工程b)を完了することで得られた上清を回収し、及び生理食塩水緩衝液に再懸濁し、次いで3000〜4000×gの加速度、5〜15分の時間、20〜30℃の温度で遠心分離する工程、
d) 工程c)を完了することで得られたペレットを回収する工程、及び
e) d)において回収されたペレットを、ポリオール、二糖〜五糖、マルトデキストリン及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する工程。
【００９６】
故に、これらの工程a)〜e)は、工程A6)のサブステップであり得る。工程a)〜d)は、A5)において得られた細菌叢を洗浄することを目的とする。好ましくは、工程a)〜d)の温度は、20〜25℃である。
【００９７】
好ましくは、これら工程a)〜d)において、生理食塩水緩衝液は、好ましくは、7〜15g/lの濃度で塩化ナトリウムを含むHEPESの水溶液である。好ましくは、HEPESは、8〜15mMの濃度で存在する。
【００９８】
工程d)で得られたペレットは、目的の細菌叢を含む。故に、工程e)に記載されているように、希釈剤と混合され得る。
【００９９】
工程A5)又はd)(第1又は第2の代替案による方法にかかわらず)を完了することでは、回収された画分を、例えば、ポリオール、二糖〜五糖等の凍結保護物質; 例えば、マルトデキストリン等の充填剤; 及びそれらの混合物から選択される希釈剤と混合する。
【０１００】
次いで、上記のように、凍結及び凍結乾燥の工程B)が行われる。
【０１０１】
本発明はまた、特に上記のようなファンクショナルゲノミクス、メタプロテオミクス又は免疫学における研究ツールとして、本発明の方法によって得ることが出来る凍結乾燥物の使用に関する。
【０１０２】
本発明はまた、本発明による方法によって得られるドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物を自己又は同種の便細菌叢の移植におけるその使用に関する。実際に、本発明による便細菌叢の精製凍結乾燥物を、受容患者に投与することが出来る。
【０１０３】
受容患者は、ドナー被験者と異なる場合があり、その際の移植は、同種間である。
【０１０４】
受容患者はまた、ドナー被験者と同一であり得、その際の移植は、自己由来である; このタイプの移植は、被験者が健康な時に、それら細菌叢の損傷前に試料を提供する場合に実施され得る。次いで、凍結乾燥物を保存し、特にクロストリジウム・ディフィシル感染症が存在する場合、これは同じ被験者(受容患者)に移植される。自己の便細菌叢の移植は、他のドナーからの病原性物質の伝達を回避するという利点を有する。
【０１０５】
本発明はまた、クロストリジウム・ディフィシル感染症を治療するための使用に関して本発明の方法によって得ることが出来るドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物に関する。本発明はまた、治療に付随する使用のため、又は慢性炎症性腸疾患(CIBD)、機能性腸疾患、肥満、代謝疾患及び自己免疫疾患、アレルギー、神経疾患及び癌から選択される病状を治療するための、本発明の方法によって得ることが出来るドナー被験者からの便細菌叢の凍結乾燥物に関する。本発明はまた、特に消化器系の抗生物質療法、化学療法、放射線療法及び外科手術から選択される治療の副作用を低減することに関する使用のための、本発明の方法によって得られる凍結乾燥物に関する。
【０１０６】
本発明の方法により得られる凍結乾燥物は、実施例4に示すように、存在する細菌の良好な生存率を有する。
【０１０７】
典型的に、便細菌叢の細菌の生存率は、ThermoFisher Scientificによって市販されているLIVE/DEAD（登録商標）BacLight（商標）Bacterial Viability Kitで染色することによって測定される。このキットは実際に、SYTO9（登録商標）とヨウ化プロピジウム（PI）の2つのフルオロフォアを使用して、膜の完全性に基づいて生きた細菌と死んだ細菌を区別することを可能にする。第１に、完全又は完全でない全ての細胞に浸透し、DNAに固定し、470nm（青色レーザー）での励起後に540nm（緑色）で発光させる。PIはまた、DNAを標的にするが、膜が損傷している細胞にのみ浸透する。470nmでの励起後に635nm（赤色）で発光する。そのようなキットを、フローサイトメトリー又は落射蛍光顕微鏡と組み合わせることが出来る。
【０１０８】
好ましくは、2つのSYTO9（登録商標）/PIフルオロフォアの混合物で細菌を染色することは、嫌気条件下で行われる。
【０１０９】
好ましくは、本発明は、以下の実験例を用いて例示されるが、これに限定されない。
【実施例】
【０１１０】
実施例1: 本発明によるイオジキサノール（OptiPrep）の連続勾配によるドナー被験者からの便細菌叢のサンプルの精製
【０１１１】
原理:
凍結融解により自動的に形成されたOptiPrepの連続勾配内の浮力による全細菌画分の分離。OptiPrepにおける大量の便の希釈液は、凍結融解により予め形成されたOpriPrepの連続勾配下に置かれる。遠心分離の間、細菌は浮遊密度（1.110-1.190）まで勾配内で上昇するが、食物及び内因性デブリは勾配の底に沈む。全ての方法は、嫌気条件下である。
【０１１２】
材料及び方法:
Hepes-NaCl緩衝液
【表１】
2019501156.tif 000002
【０１１３】
凍結融解による連続勾配の調製（工程A1））：
−  脱気したOptiPrep-20溶液16mLをピペットで吸引し、溶液の通気を避けながらチューブに移す
−  -80℃で一晩チューブを凍結させる
−  使用前に周囲温度で2〜3時間静かに、動かさずにチューブを解凍する; 1.03〜1.22の連続密度勾配が自動的に形成される。
【０１１４】
嫌気条件チャンバーでの便希釈液の調製(工程A2)：
−  便の試料を、嫌気条件チャンバーに入れる
−  秤の上に、二重の濾過滅菌スワードバッグを置き、所望の便の重量を測定する(1勾配については最大3.5g、おそらくそれ以下であり; この場合、10mM Hepes-9g/L NaCl緩衝液で3.5gとする)
−  スワードバッグのフィルターに便懸濁用希釈液24mLを加える、
−  混合物をホモジナイズする
−  濾過しホモジナイズした便懸濁液を50mLのファルコンタイプチューブに移す
−  このチューブから、便希釈液を入れた針を備えた20mLシリンジを満たす
【０１１５】
嫌気条件チャンバーの外側に勾配を生成する(工程A3)及びA4))：
−  A1）で得られた凍結融解により予め形成された勾配の底部に、A2）で得られたシリンジの針を突き刺す
−  予め形成された勾配の下で20mLの便希釈液を静かにロードする
−  他の勾配に関し再開する
−  全てのチューブを秤量し、10mMのHepes-9g/LのNaCl緩衝液で正確に同じ重量になるようにペアでチューブを調製する
−  振動ローター用の冷やした遠心分離バケットにチューブを注意深く挿入する
−  4℃で45分間、14,567×gで遠心分離する
【０１１６】
細菌細胞を嫌気条件チャンバー（工程A5）、A6）及びa）〜d））中で回収及び洗浄する：
−  遠心バケットを開かずに嫌気条件チャンバーに挿入する
−  バケットを開く
−  ピペットを用いて、上相を除去する
−  中間の細胞相をピペットで分取し、2つの50mLファルコンチューブに分注する
−  2つのファルコンチューブの目盛50まで洗浄緩衝液（10mM Hepes-9g/L NaCl）を加える
−  同様の方法で全ての勾配の細菌相を除去する
−  振動ローターで10分間4000×g、22℃で遠心分離する
−  吸引により上清を除去する
−  洗浄緩衝液をファルコンチューブ25mLの目盛まで加える
−  ピペットを用いて慎重に細菌を懸濁し、50mLにする
−  振動ローターで5分間、300×g、22℃で遠心分離し、残ったデブリを除去する
−  上清(残渣を有しない細菌を含む)を、2つの新しい50mLファルコンにピペットで移す; デブリのペレットを捨てる
−  振動ローターで10分間、3500×g、22℃で遠心分離を行う
−  上清を除去する
得られた残渣のない細菌ペレットを、選択された賦形剤中に再懸濁することが出来る。
【０１１７】
実施例2: 本発明による、低下速度で連続的に遠心分離することによってのドナー被験者からの便細菌叢の試料の精製
【０１１８】
原理:
低下速度で連続的に遠心分離することにより、全細菌画分を分離する。
【０１１９】
材料及び方法
Hepes-NaCl緩衝液
【表２】
2019501156.tif 000003
【０１２０】
嫌気条件チャンバーでの便希釈液の調製:
−  便の試料を、嫌気条件チャンバーに入れる
−  所望の重量の便を、スワードバッグのフィルターに移す
−  14gの便（すなわち1:25希釈）に対して10mMのHepes-9g/LのNaClを含むQS 350gを調製し、ホモジナイズする（工程b））
−  50mLの濾過しホモジナイズした便懸濁液を、6つの50mLファルコンタイプチューブに移す
−  振動ローターで10分間300×g、22℃の遠心分離を行い、デブリを除去する（工程d））
−  上清（細菌を含む）を、12個の新しい50mLチューブ（25mLまで/チューブ）に分注する
−  6つのペレットを50mLの10mM Hepes-9g/L NaClに再懸濁し、振動ローターで10分間300×g、22℃で遠心分離を行う(工程d)）
−  6つの新しい上清を、予め第1の上清が入っている待機中の12本のチューブに分注する。10mM Hepes-9g/L NaClで12本のチューブについてQS50mLにする
−  細菌をペレット化するために、12本のチューブを振動ローター中で3500×g、22℃で10分間遠心分離を行う
−  ピペットを用い、上清を慎重に除去する
最後に、得られた残渣のない細菌ペレットを、選択された賦形剤に再懸濁する。
【０１２１】
実施例3: 実施例1及び2で得られた便細菌叢の凍結乾燥物を得る工程
【０１２２】
実施例1及び2の方法の最後に得られた画分を以下の希釈剤と混合した:
−  NaCl: 9g/L
−  9g/L NaCl中、マルトデキストリン : トレハロース、15/5又は5/15
−  イオジキサノール：40mM HEPES-9g/L NaCl緩衝液で3倍希釈した60mMの市販水溶液
次いで、それらを-80℃〜-100℃で凍結させた
【０１２３】
次いで、それらを以下の凍結サイクルに供した:
【表３】
2019501156.tif 000004
【０１２４】
二次乾燥は、+25℃、圧力80μバールで約900分間実施する。
【０１２５】
凍結乾燥機を、装填する前に-40℃に予冷した。試料を受け取った瞬間から、ドライアイス中で保存されたフラスコを、装置に装填し、凍結乾燥機を、装填の終わりから真空下に置いた。2つのPT100温度プローブを、2つのフラスコに入れた。装填前に産物が凍結されたので、プローブは産物の上にあり、産物の中には無い。
【０１２６】
サイクルの持続時間は45時間である。サイクルの終わりに、フラスコを凍結乾燥機内、真空下で栓をし、次いで取り出し後にキャップをする。
【０１２７】
実施例4: 実施例3で得られた便細菌叢の凍結乾燥物中に存在する細菌の生存率
【０１２８】
プロトコル
実施例3で得られた便細菌叢の凍結乾燥物中に存在する細菌の生存率を、以下のプロトコルに従って測定した:
−  染色しようとする試料において約106細菌/mLの最終希釈を達成するために嫌気条件雰囲気下での連続的な10倍希釈; この操作は、選択された賦形剤中に残渣を含まない細菌ペレットを再懸濁することを直ちに連続して行わなければならない; 最後の希釈液の染色も直ちに行わなければならない、
−  賦形剤が栄養基質を含む場合、生存している個体群が急速に増殖するため、再懸濁と染色との間に30分未満の経過が必要である: 周囲温度で4時間待ち、嫌気条件下及び単一の栄養基質の存在下において個体群は、半対数増加し、細菌の割合は10%増加する、
−  製造元の指示に従って、LIVE/DEAD（登録商標）BacLight(商標)Bacterial Viability Kitを使用して細菌を染色する、
−  フローサイトメトリーによる生菌及び死菌の定量: 染色されたサンプル（常に光から隠れている）を室温又は砕いた氷上で待機させるか否かにかかわらず、染色と定量との間の時間は、20分を超えてはならない、
【０１２９】
結果
結果を、下記の表に示す。
【表４】
2019501156.tif 000005
【０１３０】
故に、この結果は、細菌がマルトデキストリンで凍結乾燥された場合、本発明の精製試料中に存在する細菌の生存率が非常に良好であることを示す。
【０１３１】
実施例5: 便細菌叢の非精製凍結乾燥物中に存在する細菌を得る工程及び生存率
【０１３２】
細菌叢を回収し、以下の溶液に懸濁した:
−  NaCl: 9g/L
−  9g/L NaCl中、マルトデキストリン : トレハロース、15/5又は5/15
次いで、懸濁液を、-80℃又は-100℃で凍結した。
【０１３３】
次いで、それらを以下の凍結乾燥サイクルに供した：
【表５】
2019501156.tif 000006
【０１３４】
装填する前に凍結乾燥機を、-45℃に予冷した。試料を受け取り、ドライアイス中に保たれた産物を、装置にロードし、凍結乾燥機を装填の終わりから真空下に置いた。
【０１３５】
サイクルの持続時間は48時間である。サイクルの終わりに、フラスコを凍結乾燥機内、真空下で栓をし、次いで取り出し後にキャップをする。
【０１３６】
細菌個体群の質は、DNA抽出及びrDNA16S遺伝子の配列決定によるその解析を介して多様性の観点から評価された。次いで、それらを比較するために異なる試料のプロファイルを確立することを目的に、系統発生解析を行った。結果を図1に示す。
【０１３７】
このように、結果は、3つの製剤について分類学的プロファイル間の相関レベルが非常に高く、この方法が細菌個体群の約90％を効果的に保存することを実証する。
【０１３８】
実施例4に示されたものと同じ方法で生存率を評価し、10ヶ月間の貯蔵後の結果を以下に示す：
【表６】
2019501156.tif 000007
【０１３９】
10ヶ月後、NaClで生成された懸濁液は、他の2つの懸濁液より明らかに低い生存率を有する。
【０１４０】
このように、この方法に従って得られた細菌叢は、系統発生プロファイルの相関が非常に高く、さらに細菌をNaCl製剤よりも長く保存することを可能にするので、同時に細菌個体群を保存することを可能にする。
【図１】
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【国際調査報告】
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