(57)【要約】  ヒト被験体から得られた生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡ中の隣接する遺伝子座におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルの関連性を決定する方法が開示される。遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを検証する方法およびシステムも開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体から得られた生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡ中の隣接する遺伝子座におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルの関連性を決定する方法であって、前記方法は：
ａ．ロングレンジＰＣＲ反応によって前記サンプルのゲノムＤＮＡを増幅する工程；
ｂ．増幅したＤＮＡの配列を決定する工程；
ｃ．遺伝子座の関連性のデータベースを参照し、第１遺伝子座のアレルの遺伝子型と少なくとも１つの隣接する遺伝子座のアレルの遺伝子型との関連性頻度を決定する工程；
ｄ．前記第１遺伝子座のアレルと前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座のアレルの遺伝子型との関連性スコアをリポートし、それによってゲノムＤＮＡ中の隣接する遺伝子座におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルの関連性を決定する工程、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記関連性が３つ以上の遺伝子座の間で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記関連性が４つ以上の遺伝子座の間で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記関連性が５つ以上の遺伝子座の間で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記関連性が１１の遺伝子座の間で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のアレルが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記関連性のデータベースが：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１から選択される少なくとも２つの遺伝子座に関するＨＬＡ遺伝子座の関連性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が前記第１の遺伝子座と連鎖不平衡にある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記３つ以上の遺伝子座のうち、２つ以上の遺伝子座の少なくとも１つが前記第１の遺伝子座と連鎖不平衡にある、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記４つ以上の遺伝子座のうち、３つ以上の遺伝子座の少なくとも１つが前記第１の遺伝子座と連鎖不平衡にある、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記５つ以上の遺伝子座のうち、４つ以上の遺伝子座の少なくとも１つが前記第１の遺伝子座と連鎖不平衡にある、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記１１の遺伝子座のうち少なくとも２つが連鎖不平衡にある、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記関連性スコアを疾患に関連する関連性スコアのデータベースと比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患が自己免疫疾患である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組織適合性を評価するために、前記関連性スコアを異なるヒト被験体から得た関連性スコアと比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第１の遺伝子座および少なくとも１つの追加の遺伝子座に割り当てられるアレルの関連性スコアの分析において使用するデータベースマトリックスであって：
ａ．遺伝子型を決定するアレルに対応するフィールド；
ｂ．異なる遺伝子座における他のアレルに対応する少なくとも１つの別のフィールド；
ｃ．遺伝子座に対する前記遺伝子型を決定するアレルおよび前記少なくとも１つの別のフィールドの確率に対応し、確率として表される少なくとも他のフィールドを含む、前記データベースマトリックス。
【請求項１７】
遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを検証する方法であって：
遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；
前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；
決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、
前記指示をリポートすることを含む、前記方法。
【請求項１８】
生物学的サンプルを処理することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子型情報を作成することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ装置を操作する方法であって、前記方法は：
前記少なくとも１つのプロセッサを実行して遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；および
前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアが存在すると決定された場合：
決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さの可能性を示す指示を作成すること；そして、
前記指示をリポートすることを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が少なくとも２つの隣接する遺伝子座を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が３つ以上の隣接する遺伝子座を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が４つ以上の隣接する遺伝子座を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が５つ以上の隣接する遺伝子座を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座がＨＬＡ遺伝子座である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記アレルバリアントが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１（このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる）から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのプロセッサを実行して、連鎖不平衡のデータベース中にある情報を用いた前記少なくとも１つのプロセッサによる計算によって前記スコアが存在するかどうかを決定することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記連鎖不平衡のデータベースが、少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座の相互の関連性を含み、前記少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座が：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１（このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる）から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記連鎖不平衡のデータベースが前記スコアを含まないと決定された場合に、前記連鎖不平衡のデータベースが前記スコアを含まないことを示す第２の指示を前記少なくとも１つのプロセッサによって作成することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記連鎖不平衡のデータベースが前記スコアを含まないと決定された場合に、前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記アレルバリアントおよび前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントのうち少なくとも１つにフラグを立てることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記連鎖不平衡のデータベースが前記スコアを含まないと決定された場合に、前記少なくとも１つのプロセッサによって、前記アレルバリアントおよび前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントのうち少なくとも１つにフラグを立てることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記指示が数値を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも２つの遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも３つの隣接する遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも３つの隣接する遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも３つの隣接する遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記指示をリポートすることが、前記コンピュータ装置と通信可能に結合された表示装置上に前記指示を表すものを表示することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
前記指示を表すものがグラフィック形式で前記表示装置に表示される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの別のアレルバリアントの前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座への割り当てを表す第２の遺伝子型情報を取得することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
ネットワークを介して前記遺伝子型情報を電子的に取得することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝子型情報が、請求項１に記載の方法とは異なる遺伝子型決定技術を使用して作成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４３】
前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す前記指示を使用して：ＨＬＡタイピング、移植能力、ドナーとレシピエントの適合性、および移植片対宿主病の診断からなる群から選択される用途のうちの１つ以上を評価することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
コンピュータシステムであって、請求項２０〜４３のいずれか一項に記載の方法を実行することによって少なくとも１つの部分的なハプロタイプを遺伝子座に割り当てるように構成されるプロセッサを少なくとも１つ備える、前記コンピュータシステム。
【請求項４５】
被験体から得たサンプルの遺伝子型の正確さを検証するためのシステムであって、
少なくとも１つのプロセッサ；
前記プロセッサと通信可能に結合されるメモリを備え；前記メモリには、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に、
遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；
前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；
決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、
前記指示をリポートすること、
を含む方法を実行するコンピュータにより実行可能な命令が保存されている、前記システム。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が少なくとも２つの隣接する遺伝子座を含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座がＨＬＡ遺伝子座である、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４８】
前記アレルバリアントが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１（このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる）から選択される、ＨＬＡ遺伝子座のアレルである、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４９】
前記スコアを決定することが、連鎖不平衡のデータベースにアクセスすることを含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５０】
前記連鎖不平衡のデータベースが、少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座の相互の関連性を含み、前記少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座が：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１（このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる）から選択される、請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
前記方法が、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントの割り当てを表す第２の遺伝子型情報を取得することをさらに含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５２】
前記方法が、ネットワークを介して前記遺伝子型情報を電子的に取得することをさらに含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５３】
前記遺伝子型情報が、請求項１に記載の方法とは異なる遺伝子型決定技術を使用して作成される、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５４】
前記指示をリポートすることが、前記少なくとも１つのプロセッサと通信可能に結合された表示装置上に前記指示を表すものを表示することを含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５５】
前記指示を表すものが前記グラフィック形式で表示装置に表示される、請求項４５に記載のシステム。
【請求項５６】
少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置であって、前記非一過性のコンピュータ記憶装置には、少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に、
遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；
前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを取得すること；
決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、
前記指示をリポートすることを含む方法を前記少なくとも１つのプロセッサが実行するように、コンピュータにより実行可能な命令が保存されている、前記非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が少なくとも２つの隣接する遺伝子座を含む、請求項５６に記載の少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座がＨＬＡ遺伝子座である、請求項５６に記載の少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項５９】
前記アレルバリアントが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１（このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる）から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである、請求項５６に記載の前記少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項６０】
前記スコアを決定することが、連鎖不平衡のデータベースにアクセスすることを含む、請求項５６に記載の少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項６１】
前記連鎖不平衡のデータベースが、少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座の相互の関連性を含み、前記少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座が：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１（このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる）から選択される、請求項６０に記載の前記少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項６２】
前記方法が、少なくとも１つの別のアレルバリアントの前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座への割り当てを表す第２の遺伝子型情報を取得することをさらに含む、請求項５６に記載の少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項６３】
前記方法が、ネットワークを介して前記遺伝子型情報を電子的に取得することをさらに含む、請求項５６に記載の少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項６４】
前記遺伝子型情報が、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得する工程；少なくとも１つの別のアレルバリアントの少なくとも１つの隣接する遺伝子座への割り当てを表す第２の遺伝子型情報を取得する工程；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定する工程；決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成する工程；そして、前記指示をリポートする工程を含む方法とは異なる遺伝子型決定技術を使用して作成される、請求項５６に記載の少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置。
【請求項６５】
少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ装置を操作する方法であって、前記方法は、前記少なくとも１つのプロセッサが：
遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；
連鎖不平衡情報を記憶するコンピュータ可読記憶装置にアクセスし、前記連鎖不平衡情報が前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを含むかどうかを決定すること；
前記連鎖不平衡情報が前記スコアを含むと決定した場合；
決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、
前記指示をリポートすることを含む方法を実行することを含む、前記方法。
【請求項６６】
前記連鎖不平衡情報が前記スコアを含まないと決定された場合に、前記連鎖不平衡情報が前記スコアを含まないことを示す指示を作成することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記連鎖不平衡のデータベースが前記スコアを含まないと決定された場合に、前記アレルバリアントおよび前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントのうち少なくとも１つにフラグを立てることをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記指示をリポートすることが、前記コンピュータ装置と通信可能に結合された表示装置上に前記指示を表すものを表示することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記指示を表すものがグラフィック形式で前記表示装置に表示される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
遺伝子座にアレルを割り当てる方法であって：
ゲノムＤＮＡのサンプルの遺伝子座からコードＤＮＡおよび非コードＤＮＡを増幅してアンプリコンを作製すること；
前記アンプリコンの配列決定をすること；
前記アンプリコンの遺伝子座の少なくとも第１のアレルバリアントおよび第２のアレルバリアントを同定すること；
前記第１のアレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；
決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成することを含む、前記方法。
【請求項７１】
前記コードＤＮＡおよび非コードＤＮＡがエクソンおよび隣接するイントロンに由来する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記配列決定が次世代シーケンシング法によって行われる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記コードＤＮＡが少なくとも２つのエクソンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記コードＤＮＡが少なくとも２つのエクソンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記コードＤＮＡが少なくとも２つのエクソンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記非コードＤＮＡが少なくとも１つのイントロンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記非コードＤＮＡが少なくとも２つのイントロンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
前記非コードＤＮＡが少なくとも２つのイントロンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
前記非コードＤＮＡが少なくとも３つのイントロンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項８０】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が少なくとも２つの隣接する遺伝子座を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項８１】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が３つ以上の隣接する遺伝子座を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項８２】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が４つ以上の隣接する遺伝子座を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が５つ以上の隣接する遺伝子座を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座がＨＬＡ遺伝子座である、請求項７０に記載の方法。
【請求項８５】
前記アレルバリアントが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１（このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる）から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである、請求項７０に記載の方法。
【請求項８６】
前記スコアを決定することが、連鎖不平衡のデータベースにアクセスすることを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項８７】
前記連鎖不平衡のデータベースが、少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座の相互の関連性を含み、前記少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座が：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１（このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる）から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項７０〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記少なくとも２つの遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項８０に記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも３つの隣接する遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項８１に記載の方法。
【請求項９１】
少なくとも４つの隣接する遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項８２に記載の方法。
【請求項９２】
少なくとも５つの隣接する遺伝子座が前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、ゲノム配列情報から個体のハプロタイプを決定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
次世代シーケンシング技術（ＮＧＳ）により、１回の実行で複数のサンプルについてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の遺伝子型を完全な解像度で決定できる。従来の方法である配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）、配列特異的プライマー（ＳＳＰ）、およびサンガーシーケンシングと比較して、ＮＧＳは、ゲノムおよびフェージングされたコンティグ配列のカバレッジがより完全に近く、曖昧さを回避する。ＮＧＳ技術の利点にもかかわらず、現在の技術では最大３フィールドの解像度しか提供できないため、ＨＬＡタイピングの結果の検証が困難である。
【０００３】
本開示は、ＮＧＳ技術に基づいた、４フィールドの解像度で主要ＨＬＡ遺伝子の１１個すべての正確な遺伝子型を決定するコールを作成することができ、当該技術分野で要求される精度の向上および多数のサンプルをコストの面で効果的な方法で迅速に処理するという能力を満たす、ハイスループットタイピング方法を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の第１の態様は、ヒト被験体から得られた生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡ中の隣接する遺伝子座におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルの関連性を決定する方法に関する。この方法は、ロングレンジＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムＤＮＡを増幅する工程；増幅したＤＮＡの配列を決定する工程；遺伝子座の関連性データベースを参照し、第１遺伝子座のアレルの遺伝子型と少なくとも１つの隣接する遺伝子座のアレルの遺伝子型との関連性頻度を決定する工程；前記第１遺伝子座のアレルと前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座のアレルの遺伝子型との関連性スコアをリポートし、それによってゲノムＤＮＡ中の隣接する遺伝子座におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルの関連性を決定する工程を含む。
【０００５】
本開示の第２の態様は、第１の遺伝子座および少なくとも１つの追加の遺伝子座に割り当てられるアレルの関連性スコアの分析において使用するデータベースマトリックスに関する。データベースマトリックスは、遺伝子型を決定するアレルに対応するフィールド；異なる遺伝子座の他のアレルに対応する少なくとも１つの別のフィールド；遺伝子座に対する前記遺伝子型を決定するアレルおよび前記少なくとも１つの別のフィールドの確率に対応し、確率として表される少なくとも他のフィールドを含む。
【０００６】
本開示の第３の態様は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座へのアレルバリアントの割り当ての正確さを検証する方法に関する。この方法は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む。
【０００７】
本開示の第４の態様は、少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ装置を操作する方法に関し、この方法は、前記少なくとも１つのプロセッサを実行して遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；そして、前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアが存在することが判明した場合、決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さの可能性を示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む。
【０００８】
本開示の第５の態様は、第１から第４の態様のいずれか１つおよびそれらの実施形態による方法を実行することによって少なくとも１つの部分的なハプロタイプを遺伝子座に割り当てるように構成されるプロセッサを少なくとも１つ備えるコンピュータシステムに関する。
【０００９】
本開示の第６の態様は、被験体から得たサンプルの遺伝子型の正確さを検証するためのシステムに関し、前記システムは、少なくとも１つのプロセッサ；前記プロセッサと通信可能に結合されるメモリを備え；前記メモリには、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む方法を実行するコンピュータにより実行可能な命令が保存されている。
【００１０】
本開示の第７の態様は、少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置に関し、記憶装置には、少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを取得すること；取得したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む方法を前記少なくとも１つのプロセッサが実行するように、コンピュータにより実行可能な命令が保存されている。
【００１１】
本開示の第８の態様は、少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ装置を操作する方法に関し、この方法は、前記少なくとも１つのプロセッサを実行して遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；連鎖不平衡情報を記憶するコンピュータ可読記憶装置にアクセスし、前記連鎖不平衡情報が前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを含むかどうかを決定すること；前記連鎖不平衡情報が前記スコアを含むと決定した場合、決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む。
【００１２】
本開示の第９の態様は、遺伝子座にアレルを割り当てる方法に関し、当該方法は：ゲノムＤＮＡのサンプルの遺伝子座からコードＤＮＡおよび非コードＤＮＡを増幅してアンプリコンを作製すること；前記アンプリコンの配列を決定すること；前記アンプリコンの遺伝子座の少なくとも第１のアレルバリアントおよび第２のアレルバリアントを同定すること；前記第１のアレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；そして決定したスコアを用いて、遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座へのアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明は、以下の図面を参照することで理解を深めることができる。図面は、単独でまたは他の特徴と組み合わせて使用することができる特定の特徴を示すための単なる例示であり、本発明は示された実施形態に限定されるべきではない。
【００１４】
【図１】図１はソフトウェアのユーザインターフェースの一例を示す。
【図２】図２は、全遺伝子にわたる隣接したコンティグ配列をもたらすフェージング解析の例示である。
【図３】図３は、遺伝子型決定の結果を要約した表の例示である。
【図４】図４は、親子トリオの血統図の例示である。
【図５】図５は、ヒトゲノムＤＮＡ由来のＨＬＡ遺伝子のロングレンジＰＣＲ増幅のための例示的スキームを示す。
【図６】図６は、被験体集団におけるＨＬＡクラスＩのアレルの頻度を要約したものを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、被験体集団におけるＨＬＡクラスＩＩのアレルの頻度を要約したものを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、被験体集団におけるＨＬＡクラスＩＩのアレルの頻度を要約したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の詳細な説明は、当業者による本発明の製造および使用が可能となるように提示される。説明の目的に、本発明の完全な理解のために特定の命名法が用いられる。しかしながら、これらの特定の詳細が本発明を実施するのに必要とされないことは当業者には明らかである。特定の用途の説明は代表例としてのみ提供される。本発明は、示された実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理および特徴と矛盾しない最も広い可能な範囲に一致することを意図している。
【００１６】
本開示の第１の態様は、ヒト被験体から得られた生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡ中の隣接する遺伝子座におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルの関連性を決定する方法に関する。この方法は、ロングレンジＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムＤＮＡを増幅する工程；増幅したＤＮＡの配列を決定する工程；遺伝子座の関連性データベースを参照し、第１遺伝子座のアレルの遺伝子型と少なくとも１つの隣接する遺伝子座のアレルの遺伝子型との関連性頻度を決定する工程；前記第１遺伝子座のアレルと前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座のアレルの遺伝子型との関連性スコアをリポートし、それによってゲノムＤＮＡ中の隣接する遺伝子座におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルの関連性を決定する工程を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、３つ以上の遺伝子座間で関連性を決定する。さらにいくつかの実施形態では、前記３つ以上の遺伝子座のうち２つ以上の遺伝子座は第１の遺伝子座と連鎖不平衡にある。
【００１８】
他の実施形態では、４つ以上の遺伝子座間で関連性を決定する。さらにいくつかの実施形態では、前記４つ以上の遺伝子座のうち３つ以上の遺伝子座は第１の遺伝子座と連鎖不平衡にある。
【００１９】
さらに他の実施形態では、５つ以上の遺伝子座間で関連性を決定する。さらにいくつかの実施形態では、前記５つ以上の遺伝子座のうち４つ以上の遺伝子座は第１の遺伝子座と連鎖不平衡にある。
【００２０】
さらに他の実施形態では、１１の遺伝子座間で関連性を決定する。さらにいくつかの実施形態では、前記１１の遺伝子座のうち少なくとも２つの遺伝子座が連鎖不平衡にある。
【００２１】
いくつかの実施形態では、第１のアレルは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１からなる群から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、関連性のデータベースは、以下から選択される少なくとも２つの遺伝子座に対するＨＬＡ遺伝子座の関連性を含む：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１。
【００２３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子座は第１の遺伝子座と連鎖不平衡にある。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法には、関連性スコアを疾患に関連する関連性スコアのデータベースと比較することがさらに含まれる。さらにいくつかの実施形態では、疾患は自己免疫疾患である。
【００２５】
他の実施形態では、方法には、組織適合性を評価するために、関連性スコアを異なるヒト被験体から得た関連性スコアと比較することがさらに含まれる。
【００２６】
本開示の第２の態様は、第１の遺伝子座および少なくとも１つの追加の遺伝子座に割り当てられるアレルの関連性スコアの分析において使用するデータベースマトリックスに関する。データベースマトリックスは、遺伝子型を決定するアレルに対応するフィールド；異なる遺伝子座における別のアレルに対応する少なくとも１つの別のフィールド；遺伝子型決定するアレルの遺伝子座および少なくとも１つの別のフィールドへの確率に対応し、確率として表される少なくとも他のフィールドを含む。
【００２７】
本開示の第３の態様は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座へのアレルバリアントの割り当ての正確さを検証する方法に関する。この方法は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；決定したスコアを用いて、前記アレルバリアントの遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座への割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、方法には、生物学的サンプルを処理することがさらに含まれる。
【００２９】
別の実施形態において、方法には、遺伝子型情報を作成することがさらに含まれる。
【００３０】
本開示の第４の態様は、少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ装置を操作する方法に関し、この方法は、前記少なくとも１つのプロセッサを実行して遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；そして、前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアが存在することが判明した場合、決定したスコアを用いて、前記アレルバリアントの遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座への割り当ての正確さの可能性を示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は少なくとも２つの隣接する遺伝子座を含む。さらにいくつかの実施形態では、前記少なくとも２つの遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００３２】
他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は３つ以上の隣接する遺伝子座を含む。さらにいくつかの実施形態では、少なくとも３つの遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００３３】
他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は４つ以上の隣接する遺伝子座を含む。さらにいくつかの実施形態では、前記少なくとも４つの遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００３４】
他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は５つ以上の隣接する遺伝子座を含む。さらにいくつかの実施形態では、少なくとも５つの遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００３５】
さらに他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座はＨＬＡ遺伝子座である。
【００３６】
他の実施形態では、前記アレルバリアントは、以下から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１であり、このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる。
【００３７】
他の実施形態では、方法には、少なくとも１つのプロセッサを実行して、連鎖不平衡のデータベースである情報を用いた前記少なくとも１つのプロセッサによる計算によってスコアが存在するかどうかを決定することがさらに含まれる。いくつかのさらなる実施形態では、前記連鎖不平衡のデータベースは少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座の相互の関連性を含み、前記少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座は以下から選択される：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１であり、このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる。さらに別の実施形態では、方法は、連鎖不平衡のデータベースがスコアを含まないと決定された場合に、連鎖不平衡のデータベースがスコアを含まないことを示す第２の指示を少なくとも１つのプロセッサによって作成することをさらに含む。さらに他の実施形態では、方法は、連鎖不平衡のデータベースがスコアを含まないと決定された場合に、少なくとも１つのプロセッサによって、アレルバリアントおよび少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントのうち少なくとも１つにフラグを立てることをさらに含む。さらに別の実施形態では、方法は、連鎖不平衡のデータベースがスコアを含まないと決定された場合に、少なくとも１つのプロセッサによって、アレルバリアントおよび少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントのうち少なくとも１つにフラグを立てることをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、前記指示は数値を含む。
【００３９】
他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００４０】
いくつかの実施形態では、指示をリポートすることは、コンピュータ装置と通信可能に結合された表示装置上に前記指示を表すものを表示することを含む。いくつかのさらなる実施形態では、前記指示を表すものはグラフィック形式で表示装置に表示される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つの別のアレルバリアントの少なくとも１つの隣接する遺伝子座への割り当てを表す第２の遺伝子型情報を取得することをさらに含む。
【００４２】
別の実施形態において、方法には、ネットワークを介して遺伝子型情報を電子的に取得することがさらに含まれる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、遺伝子型情報は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを検証する方法とは異なる遺伝子型決定技術を使用して作成され、この方法は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、方法は、遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を使用して、以下からなる群から選択される以下の用途のうちの１つ以上を評価することをさらに含む：ＨＬＡタイピング、移植能力、ドナーとレシピエントの適合性、および移植片対宿主病の診断。
【００４５】
本開示の第５の態様は、第１から第４の態様のいずれか１つおよびそれらの実施形態による方法を実行することによって少なくとも１つの部分的なハプロタイプを遺伝子座に割り当てるように構成されるプロセッサを少なくとも１つ備えるコンピュータシステムに関する。
【００４６】
本開示の第６の態様は、被験体から得たサンプルの遺伝子型の正確さを検証するためのシステムに関し、前記システムは、少なくとも１つのプロセッサ；前記プロセッサと通信可能に結合されるメモリを備え；前記メモリには、前記少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む方法を実行するコンピュータにより実行可能な命令が保存されている。
【００４７】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は少なくとも２つの隣接する遺伝子座を含む。
【００４８】
他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座はＨＬＡ遺伝子座である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、前記アレルバリアントは、以下から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１であり、このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、スコアを決定することは、連鎖不平衡のデータベースにアクセスすることを含む。さらにいくつかの実施形態では、前記連鎖不平衡のデータベースは少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座の相互の関連性を含み、前記少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座は以下から選択される：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１であり、このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、システムは、少なくとも１つの別のアレルバリアントを少なくとも１つの隣接する遺伝子座への割り当てを表す第２の遺伝子型情報を取得することをさらに含む。
【００５２】
別の実施形態において、システムには、ネットワークを介して遺伝子型情報を電子的に取得することがさらに含まれる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、遺伝子型情報は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを検証する方法とは異なる遺伝子型決定技術を使用して作成され、この方法は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む。
【００５４】
他の実施形態では、指示をリポートすることは、少なくとも１つのプロセッサと通信可能に結合された表示装置上に前記指示を表すものを表示することを含む。いくつかのさらなる実施形態では、前記指示を表すものはグラフィック形式で表示装置に表示される。
【００５５】
本開示の第７の態様は、少なくとも１つの非一過性のコンピュータ記憶装置に関し、記憶装置には、少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを取得すること；取得したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む方法を前記少なくとも１つのプロセッサが実行するように、コンピュータにより実行可能な命令が保存されている。
【００５６】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は少なくとも２つの隣接する遺伝子座を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座はＨＬＡ遺伝子座である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、前記アレルバリアントは、以下から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１であり、このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、スコアを決定することは、連鎖不平衡のデータベースにアクセスすることを含む。いくつかのさらなる実施形態では、前記連鎖不平衡のデータベースは少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座の相互の関連性を含み、前記少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座は以下から選択される：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１であり、このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つの別のアレルバリアントの少なくとも１つの隣接する遺伝子座への割り当てを表す第２の遺伝子型情報を取得することをさらに含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、方法には、ネットワークを介して遺伝子型情報を電子的に取得することがさらに含まれる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、遺伝子型情報は、遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得する工程；少なくとも１つの別のアレルバリアントの少なくとも１つの隣接する遺伝子座への割り当てを表す第２の遺伝子型情報を取得する工程；アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定する工程；決定したスコアを用いて、アレルバリアントの遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座への割り当ての正確さを示す指示を作成する工程；そして、その指示をリポートする工程を含む方法とは異なる遺伝子型を決定する技術を使用して作成される。
【００６３】
本開示の第８の態様は、少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ装置を操作する方法に関し、この方法は、前記少なくとも１つのプロセッサを実行して遺伝子上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当てを表す遺伝子型情報を取得すること；連鎖不平衡情報を記憶するコンピュータ可読記憶装置にアクセスし、前記連鎖不平衡情報が前記アレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを含むかどうかを決定すること；前記連鎖不平衡情報が前記スコアを含むと決定した場合、決定したスコアを用いて、前記遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座に対するアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成すること；そして、その指示をリポートすることを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、方法は、連鎖不平衡情報がスコアを含まないと決定された場合に、連鎖不平衡情報がスコアを含まないことを示す指示を作成することをさらに含む。さらにいくつかの実施形態では、方法は、連鎖不平衡情報がスコアを含まないと決定された場合に、アレルバリアントおよび少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントのうち少なくとも１つにフラグを立てることをさらに含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、指示をリポートすることは、コンピュータ装置と通信可能に結合された表示装置上に前記指示を表すものを表示することを含む。
【００６６】
別の実施形態では、前記指示を表すものはグラフィック形式で表示装置に表示される。
【００６７】
本開示の第９の態様は、遺伝子座にアレルを割り当てる方法に関し、当該方法は：ゲノムＤＮＡのサンプルの遺伝子座からコードＤＮＡおよび非コードＤＮＡを増幅してアンプリコンを作製すること；前記アンプリコンの配列を決定すること；前記アンプリコンの遺伝子座の少なくとも第１のアレルバリアントおよび第２のアレルバリアントを同定すること；前記第１のアレルバリアントと少なくとも１つの隣接する遺伝子座の少なくとも１つの別のアレルバリアントとの関連性を表すスコアを決定すること；そして決定したスコアを用いて、遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座へのアレルバリアントの割り当ての正確さを示す指示を作成することを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、コードＤＮＡおよび非コードＤＮＡはエクソンおよび隣接するイントロンに由来する。
【００６９】
他の実施形態では、配列決定は次世代シーケンシング法によって行われる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、コードＤＮＡは少なくとも２つのエクソンを含む。
【００７１】
他の実施形態において、コードＤＮＡは少なくとも３つのエクソンを含む。
【００７２】
さらにいくつかの実施形態において、コードＤＮＡは少なくとも４つのエクソンを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、非コードＤＮＡは少なくとも１つのイントロンを含む。
【００７４】
他の実施形態において、非コードＤＮＡは少なくとも２つのイントロンを含む。
【００７５】
さらにいくつかの実施形態において、非コードＤＮＡは少なくとも３つのイントロンを含む。
【００７６】
さらに他の実施形態において、非コードＤＮＡは少なくとも４つのイントロンを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００７８】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は少なくとも２つの隣接する遺伝子座を含む。さらにいくつかの実施形態では、前記少なくとも２つの遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００７９】
他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は３つ以上の隣接する遺伝子座を含む。さらにいくつかの実施形態では、少なくとも３つの遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００８０】
他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は４つ以上の隣接する遺伝子座を含む。さらにいくつかの実施形態では、少なくとも４つの遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００８１】
他の実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座は５つ以上の隣接する遺伝子座を含む。さらにいくつかの実施形態では、少なくとも５つの遺伝子座は遺伝子上のＨＬＡ遺伝子座と連鎖不平衡のデータベース中にある。
【００８２】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの隣接する遺伝子座はＨＬＡ遺伝子座である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、前記アレルバリアントは、以下から選択されるＨＬＡ遺伝子座のアレルである：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１であり、このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、スコアを決定することは、連鎖不平衡のデータベースにアクセスすることを含む。いくつかのさらなる実施形態では、前記連鎖不平衡のデータベースは少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座の相互の関連性を含み、前記少なくとも２つのＨＬＡ遺伝子座は以下から選択される：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１およびＨＬＡ−ＤＰＡ１であり、このうちＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５は一緒に１つの遺伝子座として見なされる。
【００８５】
本開示の特定の態様では、ハイスループット適用のために開発されたＮＧＳに基づくＨＬＡタイピング方法を導入し、そして疾患関連研究から取得した親子トリオの大規模のコホートの血統分析を通してその正確さを得る。このハイスループットタイピング方法は、ＮＧＳ技術に基づいて、４フィールドの解像度で主要ＨＬＡ遺伝子の１１個すべての正確な遺伝子型を決定するコールを作成することができる。データ分析のために、３つの直交アルゴリズムを組み合わせて候補遺伝子型をランク付けし、そして個々のアレルについてのコンセンサス配列を作成する。曖昧さは、ＤＰＢ１における特定のアレルの組み合わせを除いて、フェージング解析によってヘテロ接合サンプルに関して回避される。この方法は、レジストリータイピング、疾病関連性および集団研究を含む、ハイスループットＨＬＡタイピング用途のための１回のシーケンシングランで９６〜３８４個のサンプルをタイピングするために使用することができる。親子トリオに関しては、３フィールド解像度での遺伝子型決定結果の正確さは血統分析を通して評価される。一致は、子供のアレル決定のコールを親のアレル決定のコールと比較することによって計算される。また、自動コールの正確性を評価するために、自動コールと確認済みコールの間の一致度を計算する。
【００８６】
この方法で約１５００の親子トリオがタイピングされ、ソフトウェアによって行われた遺伝子型のコールは、すべての品質測定基準に基づいて手動で確認される。血統分析に基づく検証は、３および４フィールド解像度でのＨＬＡ遺伝子型決定の方法の正確さを評価する方法を提供する。自動コールと確認済みのコールとの間の一致率が高い場合、ソフトウェアが高品質のコールを提供し、熟練した技術者にとって確認プロセスが簡単であることを示す。
【００８７】
図１は、ＩｍｍｕｃｏｒのＭｉａＦｏｒａソフトウェアのユーザインターフェースの例示である。ソフトウェアＧＵＩは、マッピング統計とフェージング結果に関する豊富な情報を統合する。スマートフラグシステムは、遺伝子型コールに信頼性スコア、一般的および十分に裏付けされた（ＣＷＤ）アレル、およびＬＤ情報をアノテーションし、手動の確認プロセスを容易にする。
【００８８】
図２は、コンティグと参照との間の例示的なアラインメントを示す。フェージング解析によって、遺伝子全体にわたる連続的なコンティグ配列がもたらされ、正しいマッチを見つけるために複数の参照とのアラインメントが可能である。コンティグ配列と参照との間のミスマッチはハイライトされ、候補アレルを比較し、新規アレルを同定する。
【００８９】
図３は、遺伝子型決定結果を要約した表である。要約した表は、プロジェクト中の９６〜３８４個のサンプルに関する全遺伝子座についての遺伝子型コールを列挙している（１回のシーケンシングラン）。遺伝子型のコールには、連鎖不平衡（ＬＤ）情報をフラグに組み込むスマートフラグシステムでアノテーションされている。手動で確認が必要な遺伝子座もハイライトされており、確認の提案がユーザに提供される。
【００９０】
方法
マッピング分析
全てのペアの末端リードをデータベース中の参照配列と比較して、最も一致する候補参照アレルを見つける。
フェージング解析
【００９１】
高度なアルゴリズムを使用して、ペアの端末リードから新規配列アセンブリを構築する。次に、ヒトゲノム計画以来開発されてきたフェージング解析から２つのコンティグ配列が構築される。
【００９２】
統計モデリング
遺伝子多型を特徴付け、サンプルと参照との間の一致の可能性を最大にするためにベイジアンモデルが開発された。
【００９３】
参照データベース
高品質の遺伝子型決定コールを作成するために内部参照をクローン化配列から構築し、ＩＭＧＴ参照と組み合わせた。
【００９４】
連鎖不平衡アノテーション
手動の確認プロセスを容易にし、タイピング結果の確定を提供するために、ハプロタイプのブロックをスマートフラグでフラグを立てた。
【００９５】
結果
親子トリオを使用して、ソフトウェアによる自動コール、および手動確認後に確定されたコールを検証した。血統分析を通して、子供のアレル決定のコールと両親のアレル決定のコールを比較することによって、遺伝子型決定結果の正確さを評価する。
【００９６】
図４は、親子トリオの血統図の例示である。子供の２つのアレルはそれぞれ、父親または母親のどちらかに一致するべきである。この規則に違反した場合、子供側のタイピングミスとしてカウントした。
【００９７】
表１は、６桁の解像度で主要ＨＬＡ遺伝子座について検証された正確さを列挙する。「自動」はソフトウェアによって行われたコールの正確さを示す。「確認済み」は確認済みコールの正確さを示す。「一致」は自動コールと確認済みコールを比較し、手動の確認と修正を必要とするのはコールの１％未満であることを示唆している。
表１  遺伝子型決定の正確さと一致
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【００９８】
結論
本開示は、１回あたり９６〜３８４個のサンプルを有するハイスループットプロジェクトのためのＮＧＳ技術に基づく正確なＨＬＡタイピングのための新規なシステムを提供する。いくつかのＤＰＢ１アレルの組み合わせを除いて、１１個の主要なＨＬＡ遺伝子座すべてを、８桁の解像度で正確にタイピングすることができる。
【００９９】
ソフトウェアは、６桁での自動コールに関して９８．８％を超える検証済みの正確さを提供する。手動確認の後、検証率は９９．８％を超える。
【０１００】
自動結果と確認結果の間の全体的な一致は９９．４％である。ＣＷＤおよびＬＤ情報を含むドメイン知識を組み込んだスマートフラッグシステムと組み合わせると、確認プロセスは実行者にとって非常に簡単なものとなる。
【０１０１】
本開示の第２の態様は、ＨＬＡ型を特徴付けるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、以前に特徴付けられていなかった連鎖アレルを同定する。別の実施形態では、この方法は移植片適合性を識別する。別の実施形態では、この方法は、アレルと疾患との関連性、または疾患へのかかりやすさを定義する。さらにいくつかの実施形態では、疾患は自己免疫疾患である。さらに別の実施形態では、疾患は感染性疾患である。
【０１０２】
例示的な実施形態では、この方法は、以前は特徴付けが不十分であった集団の一部である被験体群のサンプルに適用された。アフリカ人は世界で最も遺伝的に多様な人口を表すが、西側諸国の人口と比較すると彼らのＨＬＡタイピングは同じレベルで研究が進んでいない。本開示のハイスループットＨＬＡシーケンシング技術は、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対するＴ細胞応答の研究の一部として、南アフリカのケープタウンの４０２人の健康な若者のコホートに適用された。
【０１０３】
方法
４０３人の若者から収集し、前もって凍結保存しておいたＰＢＭＣサンプルを処理し、ＭＩＡ  ＦＯＲＡ  ＮＧＳキットおよび分析ソフトウェアを使用して高解像度ＨＬＡタイピングを実施した。ＭＩＡ  ＦＯＲＡ  ＮＧＳは、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−ＤＰＡ１、−ＤＱＡ１、および−ＤＱＢ１については全遺伝子カバレッジ、−ＤＲＢ１および−ＤＲＢ３／４／５についてはエクソン６およびイントロン１の部分的なカバレッジを除いてすべてのエクソンおよびイントロン、ＨＬＡ−ＤＰＢ１についてはエクソン２とエクソン４の間のすべてのエクソンおよびイントロンを含む、すべての主要ＨＬＡ遺伝子領域の正確かつ包括的なカバレッジを提供するＨＬＡタイピング用に設計された。ＮＧＳシーケンシングライブラリーを半自動プロトコルを用いて準備し、そしてイルミナＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームでハイスループットフォーマット（１回の実行につき３８４サンプル）で配列決定した。ＭＩＡ  ＦＯＲＡ  ＮＧＳ分析ソフトウェアを使用して、候補ＨＬＡアレルを計算し、そして最終ＨＬＡタイピングを確定した。１１個のＨＬＡ遺伝子座の高解像度ＨＬＡタイピングにより、異常なハプロタイプを含む特有の集団、および、ＩＭＧＴデータベースでこれまでに報告されていない約３０の新規アレルが明らかになった。
【０１０４】
各ＨＬＡ遺伝子は、単一のロングレンジＰＣＲ反応を用いてゲノムＤＮＡから増幅した。図５に示すように、９つのオールインワンマスターミックス中１１個のＨＬＡ遺伝子をターゲットにして、ヒトゲノムＤＮＡをロングレンジＰＣＲで増幅した。全遺伝子カバレッジには、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−ＤＰＡ１、−ＤＱＡ１、および−ＤＱＢ１；−ＤＲＢ１および−ＤＲＢ３／４／５についてはエクソン６およびイントロン１の部分的カバレッジを除くすべてのエクソンおよびイントロン；ＨＬＡ−ＤＰＢ１についてはエクソン２とエクソン４の間のすべてのエクソンおよびイントロンが含まれた。増幅後、ＰＣＲ産物を測定してバランスをとり、次に断片化し、修復し、そして唯一のバーコードを含むインデックスアダプターにライゲーションした。次に、バーコード化したサンプルを単一のシーケンシングライブラリーに統合し、サイズを選択し、そして数回増幅して、イルミナフローセルへの結合に必要なＰ５およびＰ７アダプター配列を組み込んだ。サンプルを９６個のサンプルセットで処理し、シーケンスライブラリで最大３８４個のサンプルと組み合わせて、イルミナＮｅｘｔＳｅｑ装置で配列決定した。半自動化されたワークフローは、Ｂｉｏｍｅｋリキッドハンドラーを使用して容易化した。
【０１０５】
手を加えていないＮＧＳ配列リードをＭＩＡ  ＦＯＲＡ  ＮＧＳソフトウェアへのインプットとして使用して、異なるサンプルからインデックスアダプターを分け、１１個の主要ＨＬＡ遺伝子すべてについての正確な遺伝子型決定コールを高解像度で作成した。３つの直交アルゴリズムを組み合わせて候補遺伝子型をランク付けし、そして個々のアレルについてのコンセンサス配列を作成した。ソフトウェアが自動的に行ったＨＬＡ遺伝子型のコールは、複数の研究にわたって検証されており、９７％を超える一致であることが示されている。同じ研究で、遺伝子型のコールの手動の確認により、一致は９９％を超えるまでとなった。ハプロタイプ分析は、コンピュータパッケージＰＹＰＯＰ（ｒｅｆ）を用いて行った。アレル頻度は、ブランク頻度がないと仮定して、直接計数によって得た。
【０１０６】
新規アレル
高解像度遺伝子型決定により、新規ＨＬＡバリアントの発見が可能になった。この研究では、２つ以上のサンプルで１２個の異なるバリアントが観察された。これにはクラスＩおよびクラスＩＩの遺伝子座における一塩基置換、ならびに組換えまたはエクソンの再配列から生じた可能性があるバリアントであるアレルが含まれる。表２にすべて記載している。
表２  ケープタウンのコホートにおける一般的な新規アレルのリスト
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【０１０７】
ケープタウンのコホートでは、ＨＬＡ−Ａの５８個の異なるアレル、ＨＬＡ−Ｂの７１個の異なるアレル、およびＨＬＡ−Ｃの４７個の異なるアレルが見つかった。これらのうち、ＨＬＡ−Ａの２１個のアレル、ＨＬＡ−Ｂの２６個のアレル、およびＨＬＡ−Ｃの１８個のアレルが世界規模で高い頻度で発見された。また、５つのアフリカ人集団（Ｃａｏら）および米国人口のアフリカ系アメリカ人（Ｍａｉｅｒｓら）を含む、アフリカの以前のデータとの比較も行われた。一般的に、ケープタウンで高頻度で発見されたアレルは他のアフリカ集団と類似していたが、例外もあった。例えば、アジアでより一般的な５つのＨＬＡ−Ｂ（０．０４４の頻度）、３つのＨＬＡ−Ａおよび２つのＨＬＡ−Ｃアレルがあった。ケープタウンの上位１５のアレルの頻度は、ＨＬＡ−Ａでは０．６８、ＨＬＡ−Ｂでは０．６５、ＨＬＡ−Ｃでは０．７７であり；アフリカ系アメリカ人の値はより高く、すなわち、ＨＬＡ−Ａいついては０．８５、ＨＬＡ−Ｂについては０．７３およびＨＬＡ−Ｃについては０．９４であった。図６はコホートにおけるＨＬＡ−Ｃのアレル分布を示す。
【０１０８】
図７ＡはＨＬＡ−ＤＱＢのアレル分布を示し、図７ＢはコホートにおけるＨＬＡ−ＤＲＢのアレル分布を示す。４つ以上のケープタウンサンプルにおいて３１個のＡ−Ｂ−ＤＲＢ１ハプロタイプが発見され、表３に記載されている。ハプロタイプの半分は米国のドナー集団で見つかり、半分は見つからなかった。アフリカ系アメリカ人のコホートでは、３つを除いてすべて（２８ハプロタイプ）見つかったが、ヨーロッパ人口では９つ、ヒスパニック系群では１３個しか見つからなかった。アフリカ系アメリカ人の最も頻度の高いハプロタイプ（Ａ＊３０：０１：０１−Ｂ＊４２：０１：０１−ＤＲＢ１＊０３：０２：０１）もケープタウンで最も頻度が高かった。アジア太平洋諸島系のコホートと共通するハプロタイプは５つしかなかったが、そのうちの１つは３番目に一般的なハプロタイプであった（Ａ＊３３：０３：０１−Ｂ＊４４：０３：０２−ＤＲＢ１＊０７：０１：０１：０２）。
表３  ケープタウンＡ−−Ｂ−−ＤＲＢ１ハプロタイプ（頻度別）
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【０１０９】
ケープタウンのコホートにおける２つの遺伝子座ハプロタイプは、Ａ−Ｂについては３４１個、Ａ−Ｃについて３０２個、およびＢ−Ｃについて１６７個を含んでいた。それぞれの上位５つのハプロタイプは、それぞれ０．１０８、０．１３３および．２３６の頻度で発見された（表３）。連鎖不平衡は、Ａ−ＢおよびＡ−Ｃハプロタイプでは中程度（Ｄ’０．３３４−０．７２２）であったが、Ｂ−Ｃ（Ｄ’０．６２８−１．０）ではより強く、それらの遺伝子座間の遺伝的距離が近いことを反映していた。上位４つのＡＢハプロタイプは、Ｃａｏらによって報告されたアフリカ人口の少なくとも３つにおいても発見され、そしてＭａｉｅｒｓらによって報告された米国人口のアフリカ系アメリカ人における最も頻度の高いハプロタイプであった。５番目のハプロタイプは、どのアフリカ群でも観察されなかった（Ｃａｏら）が、これは米国人口の２番目に多いハプロタイプであり、ヨーロッパの祖先を持つドナーでは５倍の頻度で高かった（Ｍａｉｅｒら）上位４つのＢ−ＣハプロタイプもＣａｏらによって報告されているが、５番目に頻度の高いハプロタイプ（Ｂ＊１５：０３〜Ｃ＊０２：１０）は以前に報告されておらず、おそらくＣ＊０２：１０がＣ＊０２：０１と以前の研究で区別されなかったためである。
表４  ケープタウンで観察された上位５つの２つの遺伝子座ハプロタイプ
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【０１１０】
高解像度ＨＬＡタイピングは、集団研究においてＨＬＡアレルとハプロタイプの多様性を特徴付けるための強力な方法である。全遺伝子カバレッジにより、エクソン間の物理的連鎖を定義する広範な遺伝子多型部位が提供され、フェージングにおけるトランスまたは組み合わせのあいまいさを解決するのに役立つ。一塩基の解像度までのＨＬＡタイピングにより、コード配列の変化を含む、以前には報告されていないバリアントの検出を可能にした。
【０１１１】
上記の説明は、当業者に本発明を実施する方法を教示することを目的としており、当業者が読んだ際に明らかとなるであろう全ての明白な修正および変形を詳述することを意図するものではない。しかしながら、そのような明白な修正および変形はすべて本開示の範囲内に含まれることが意図されている。本開示は、文脈が明確に反対を示さない限り、意図される目的を達成するのに有効である任意の順序で成分および工程を網羅することを意図する。
参照
１）Ｃａｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｌｏｃｉ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ６３：２９３−３２５．
２）Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ａ，Ｎｅｌｓｏｎ  ＭＰ，Ｍｅｙｅｒ  Ｄ，Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＭ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｇ．２００３．ＰｙＰｏｐ：ａ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｍｕｌｔｉ−ｌｏｃｕｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｄａｔａ．Ｐａｃ  Ｓｙｍｐ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．２００３：５１４−５２５．
３）Ｍａｉｅｒｓ，Ｍ．，Ｇｒａｇｅｒｔ，Ｌ．，Ｋｌｉｔｚ，Ｗ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＨＬＡ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．２００７．Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６８：７７９−７８８．
４）Ｏ’Ｇａｒｒａ，Ａｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１：４７５−５２７．
５）Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＭ，Ｍｅｙｅｒ  Ｄ，Ｍａｃｋ  ＳＪ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ａ，Ｅｒｌｉｃｈ  ＨＡ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｇ．２００７．１４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨＬＡ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ｄａｔａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ６９  Ｓｕｐｐｌ  １：１８５−１８７．
６）Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｋｒｉｓｈｎａｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｗｉｌｈｅｌｍｙ，Ｊ．，Ｂａｂｒｚａｄｅｈ，Ｆ．，Ｓｔｅｐａｎｙａｎ，Ｌ．，Ｓｕ，Ｌ．Ｆ．，Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖｉｎａ，Ｍ．，Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ，Ｍ．２０１２．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＨＬＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９（２２）：８６７６−８６８１．
７）Ｗａｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＨＬＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＮＡＳ  １０９（２２）：８６７６−８６８１．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図４】
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【図５】
2019530476.tif 000012
【図６】
2019530476.tif 000013
【図７Ａ】
2019530476.tif 000014
【図７Ｂ】
2019530476.tif 000015
【配列表】
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【国際調査報告】
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