【手続補正書】
【提出日】平成18年12月21日(2006.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
リポソームを調製する方法は、当業界では既に知られている。２以上の脂質二重層を有するリポソームである多重膜ベシクルは、最も簡単には、減圧下での回転蒸発によって、ベシクル形成脂質を有機溶媒からフラスコ壁面上の薄膜に析出させることにより調製される。水性緩衝液を加えて、脂質の結晶融解温度以上の温度、または脂質混合物中で最も融解する成分のより高い結晶融解温度以上の温度で、脂質を水和させる。水性緩衝液の添加は、撹拌、例えば、かき混ぜ、超音波処理、渦流を伴って、リポソームの懸濁液を得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
リポソームを形成した後、リポソームをサイズ分けして、より小さなおよび／またはより均一な粒径分布を得る。一般的なサイズ分け方法の１つは、一連のサイズ分けフィルターを通してのリポソーム懸濁液の押出しである。あるいはまた、懸濁液を超音波処理して、リポソームをより小さな粒子へと破砕することにより、リポソームをサイズ分けする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
小単層ベシクルおよび大単層ベシクル（ＳＵＶおよびＬＵＶ）は、１つの脂質二重層をもつリポソームであって、多数の技術により調製することができる。ＳＵＶは、典型的には、２０−５０nmの範囲に直径を有して、脂質の希エタノール溶液の水相への迅速な注入、いわゆるエタノール注入法により形成することができる。ＳＵＶを形成する別の技術は、多重膜ベシクルの激しい超音波処理によるものである。大単層ベシクルは、サイズが数百ナノメーターから数ミクロンとなり得て、典型的には、逆相蒸発法により形成され、ここでは、脂質の油中水型エマルジョン、緩衝液および有機物からの有機溶媒が減圧下に除去される。ＷＯ ９１／１６０３９は、活性物質を含む水性リポソーム懸濁液の製造方法を記載しており、その懸濁液は、最大３個の炭素原子をもつ低級アルコールおよび水相中の、リポソーム形成物質、またはそのような物質の混合物の溶液から製造される。活性成分を脂質溶液および／または水相に溶解または懸濁させる。その方法は、水相をアルコール性溶液中で混合することにより取り込んで、低級アルコールを減圧蒸留により除去することを特徴とする。必要ならば、リポソーム懸濁液を凍結乾燥させる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明のさらに別の態様において、リポソーム組成を決定して、選択されたサイズを有するリポソームを形成する方法を記載して、特許請求する。その方法には、ベシクル形成脂質を脂質溶媒中で混合すること；そして脂質を、リポソームの懸濁液を得るために第二溶媒量で水和すること；が含まれる。懸濁液のリポソーム粒径を測定し、水和および測定工程を繰り返して、リポソーム粒径のプロフィルを脂質溶媒量の関数として得る。プロフィルに基づいて、選択されたリポソーム粒径とするのに必要な脂質溶媒量を選択する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｂは、取り込まれたオリゴヌクレオチドと、卵ホスファチジルコリン、コレステロール、Ｎ,Ｎ−ジオレオイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）および分子量２０００ダルトンのポリエチレングリコールで誘導体化されたセラミド（Ｃ２０ＰＥＧ−セラミド）で調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図１Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図１Ｂにプロットする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
図２Ａ−２Ｂは、取り込まれたオリゴヌクレオチドと、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、ＤＯＤＡＣおよびmＰＥＧで誘導体化された中性脂質（mＰＥＧ−ＤＳ）で調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図２Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図２Ｂにプロットする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
図３Ａ−３Ｂは、取り込まれたオリゴヌクレオチドと、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、ＤＯＤＡＣおよびメトキシ−ポリエチレングリコールで誘導体化されたアニオン性脂質（ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン、ＤＰＳＥ）（mＰＥＧ−ＤＳＰＥ）で調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図３Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図３Ｂにプロットする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
実施例８Ｂに記載するように、脂質 ＨＳＰＣ、mＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびdpＩＵdＲを８９：５：６のモル比でエタノールに溶解した。この脂質ストック溶液を使用して、脂質溶液量を第二溶媒、水性緩衝液で水和することにより、リポソーム懸濁液を調製した。リポソーム懸濁液を８.１、１０.１、１２.２、１４.３、１６.５、２０.８、２５.３および４４.１の最終エタノール重量百分率で三重複調製した。各々のサンプル中のリポソームの平均サイズを準弾性光散乱により測定して、その結果を表８に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
表９
【表２】
2002536316.tif 000001
＊ 組成物を押し出すことができなかった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
実施例８
dpＩＵdＲを含有するリポソーム
Ａ．３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシウリジン（dpＩＵdＲ）の合成
パルミトイルクロリドを、触媒として４−ジメチルピリジンを含む、デオキシウリジンのピリジン溶液またはピリジン／クロロホルム溶液中にゆっくり添加した。黄色になるまで溶液を混合し、一晩放置して沈殿させた。混合物をクロロホルム中に溶解させ、１０％ 水性クエン酸溶液および飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。クロロホルムを除去し、メタノールを添加して、白色沈殿を得、これは３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシウリジンと同定された（収率６６％）。合成反応スキームを図８に示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
Ｂ．さまざまなエタノール含量のリポソームの調製
８９／５／６のモル比の脂質水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）およびメトキシ−ポリエチレングリコールで誘導体化されたジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＥ−mＰＥＧ）およびdpＩＵdＲを７０℃で完全に溶解するまでエタノール中で溶解させた（約１時間）。この脂質ストック溶液を、必要に応じて脂質濃度を一定に維持するために希釈した後、１０％ シュクロース溶液で７０℃で水和して、エタノール濃度を８重量％から４４重量％まで変化させた。リポソーム混合物のそれぞれを１時間撹拌して、リポソーム懸濁液を調製した。準弾性光散乱を用いて各混合物のリポソーム粒径を測定し、結果を表８に示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ−１Ｂは、取り込まれたオリゴヌクレオチドと、卵ホスファチジルコリン、コレステロール、Ｎ,Ｎ−ジオレオイル−Ｎ,Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）および分子量２０００ダルトンのポリエチレングリコールで誘導体化されたセラミド（Ｃ２０ＰＥＧ−セラミド）で調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図１Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図１Ｂにプロットする。
【図２】  図２Ａ−２Ｂは、取り込まれたオリゴヌクレオチドと、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、ＤＯＤＡＣおよびmＰＥＧで誘導体化された中性脂質（mＰＥＧ−ＤＳ）で調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図２Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図２Ｂにプロットする。
【図３】  図３Ａ−３Ｂは、取り込まれたオリゴヌクレオチドと、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、ＤＯＤＡＣおよびメトキシ−ポリエチレングリコールで誘導体化されたアニオン性脂質（ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン、ＤＰＳＥ）（mＰＥＧ−ＤＳＰＥ）で調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図３Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図３Ｂにプロットする。
【図４】  図４Ａ−４Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステロールおよびmＰＥＧ−ＤＳＰＥで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図４Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図４Ｂにプロットする。
【図５】  図５Ａ−５Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリンおよびコレステロールで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図５Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図５Ｂにプロットする。
【図６】  図６Ａ−６Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリン、コレステロールおよびmＰＥＧ−ＤＳＰＥで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図６Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図６Ｂにプロットする。
【図７】  図７Ａ−７Ｂは、部分的に水素化された大豆ホスファチジルコリンおよびコレステロールで調製されたリポソーム懸濁液に対応し、ここでは、各々の懸濁液の組成を図７Ａの相図に示し、そして各々の懸濁液中のリポソームの平均粒径（nm単位）を脂質の重量％およびエタノールの重量％の両方の関数として図７Ｂにプロットする。
【図８】  図８は、３',５'−ジパルミトイル−５−ヨード−２'−デオキシウリジンの合成に関する合成反応スキームである。
【図９】  図９は、ＨＳＰＣ、mＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびdpＩＵdＲからなるリポソーム脂質の水和の間のエタノールの重量％の関数としての、リポソームサイズ（nm単位）のプロットである。
【図１０】  図１０は、エタノール、水中にdpＩＵdＲが含まれるリポソームの形成に関する相図であって、好ましい操作領域を示す。