(57)【要約】本明細書の実施形態に従って、液滴アクチュエータを利用してサンプル液滴をマイクロウェルデバイスに移送するステップを含む、デジタルマイクロ流体システムにおいて対象細胞を捕捉する方法を提供する。マイクロウェルデバイスは、マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数のマイクロウェルを有する基板を含む。サンプル液滴は、マイクロウェルに入り込む対象細胞を含む。本方法は、捕捉ビーズをマイクロウェルに導入し、捕捉ビーズには捕捉エレメントが固定されている。本方法は、液滴アクチュエータを利用して、細胞溶解試薬液滴をマイクロウェルデバイスに移送する。細胞溶解試薬液滴の一部がマイクロウェルに入り込み、インキュベーション期間中に対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される。
2019505761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタルマイクロ流体システムに対象細胞を捕捉する方法であって：
（ａ）液滴アクチュエータを利用して、サンプル液滴をマイクロウェルデバイスに移送するステップであって、前記マイクロウェルデバイスは、該マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数のマイクロウェルを有する基板を含み、前記サンプル液滴は前記マイクロウェルに入り込む対象細胞を含む、ステップと；
（ｂ）前記マイクロウェルに捕捉ビーズを導入するステップであって、前記捕捉ビーズ上には捕捉エレメントが固定されている、ステップと；
（ｃ）前記液滴アクチュエータを利用して、細胞溶解試薬液滴を前記マイクロウェルデバイスに移送するステップであって、前記細胞溶解試薬液滴の一部は、前記マイクロウェルに入り込み、インキュベーション期間中に、前記対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、前記捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される、ステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記液滴アクチュエータを利用して、前記サンプル液滴を前記マイクロウェルデバイスから移送する一方、前記マイクロウェルに捕捉された対象細胞の少なくとも一部を残すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象細胞の少なくとも一部が前記マイクロウェルに沈降することを可能にするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面は、前記対象細胞または捕捉ビーズの残りが、前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上に残ることが実質的にはないように、マイクロウェル間に疎水性の隙間範囲を含み得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上に分析物が捕捉された前記捕捉ビーズを、前記マイクロウェルから取り出すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記取り出し操作は、磁石を前記マイクロウェルに近接して位置付けて、前記捕捉ビーズを前記マイクロウェルから引き寄せる磁場を形成することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
磁場を利用して、前記捕捉ビーズを前記マイクロウェルへ、および前記マイクロウェルから動かすステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉ビーズはそれぞれ、前記捕捉エレメントを複数含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の捕捉エレメントは、捕捉配列と特有のバーコード配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉配列は、ｉ）全ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列か、または、ｉｉ）対象遺伝子パネルを標的にする複数の転写物特異的捕捉配列の一方である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉ビーズは、前記捕捉ビーズの１つだけが前記マイクロウェルの１つに合うようなサイズである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記捕捉ビーズは、重力により前記マイクロウェルに置かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記捕捉ビーズは磁性であり、磁気引力を利用して前記マイクロウェルに置かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象細胞を捕捉するためのデジタル流体工学システムであって：
（ａ）液滴操作間隙を含み、前記液滴操作間隙に近接して配列された液滴操作電極を含む、液滴アクチュエータと；
（ｂ）基板を含むマイクロウェルデバイスであって、前記マイクロウェルデバイスは前記基板に形成されたマイクロウェルを含み、前記マイクロウェルは前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口し、前記マイクロウェルデバイスは、前記アクチュエータに連結して、前記マイクロウェルが前記液滴操作間隙に面するように位置付けられる、マイクロウェルデバイスと；
（ｃ）プログラム命令を実行して：
（１）前記液滴アクチュエータに、前記マイクロウェルに入り込む対象細胞を含むサンプル液滴を、マイクロウェルデバイスに移送することを指示し；
（２）捕捉ビーズを前記マイクロウェルに導入し；
（３）前記アクチュエータに、細胞溶解試薬液滴を前記マイクロウェルデバイスに移送することを指示するように構成されたコントローラであって、
前記捕捉ビーズ上には捕捉エレメントが固定されており、
前記溶解試薬液滴の一部が前記マイクロウェルに入り込み、インキュベーション期間中に、前記対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、前記捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される、コントローラとを含む、システム。
【請求項１５】
前記基板は、その上に疎水性層が配置され、該疎水性層は、前記液滴操作表面を形成する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記液滴操作間隙は、前記対象細胞を含有するサンプル液滴を含む充填流体を保持するように構成される、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記マイクロウェルは、前記サンプル液滴中の対象細胞の単一細胞のみを収容し、前記捕捉ビーズを１つのみ収容するように作られたサイズとピッチを有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
前記マイクロウェルは、３０μｍ〜５０μｍの深さを有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１９】
前記マイクロウェルは、３μｍ〜６０μｍの直径を有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２０】
前記マイクロウェルは、互いに８０μｍ未満のピッチで間隔をおいて配置される、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２１】
前記コントローラは、さらに、プログラム命令を実行して、前記インキュベーションの期間中および／または期間前に、前記液滴アクチュエータに、前記細胞溶解試薬液滴と不混和性の流体を前記マイクロウェルデバイスに移送することを指示するように構成され、前記不混和性流体は、前記マイクロウェルにも細胞トラップにも入り込まず、それにより、単一細胞と単一ビーズを細胞溶解試薬と一緒にカプセル化する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２２】
デジタルマイクロ流体システムに対象細胞を捕捉する方法であって：
（ａ）液滴アクチュエータを利用してサンプル液滴をマイクロウェルデバイスに移送するステップであって、前記マイクロウェルデバイスは、前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数のマイクロウェルを有する第１基板と、前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数の細胞トラップとを含み、前記サンプル液滴は、前記細胞トラップに入り込む対象細胞を含む、ステップと；
（ｂ）前記マイクロウェルに捕捉ビーズを導入するステップであって、前記捕捉ビーズ上には捕捉エレメントが固定されている、ステップと；
（ｃ）前記液滴アクチュエータを利用して、細胞溶解試薬液滴を前記マイクロウェルデバイスに移送するステップであって、前記細胞溶解試薬液滴の一部は、前記マイクロウェルと細胞トラップに入り込み、インキュベーション期間中に、前記対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、前記捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される、ステップとを含む、方法。
【請求項２３】
前記捕捉ビーズは、前記捕捉ビーズの１つだけが前記マイクロウェルの１つに合うようなサイズである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞トラップは、前記対象細胞の１つだけが前記細胞トラップの１つに合うようなサイズである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｄ）前記インキュベーションの期間中および／または期間前に、前記液滴アクチュエータを利用して、前記細胞溶解試薬液滴と不混和性の流体を前記マイクロウェルデバイスに移送するステップであって、前記不混和性流体は、前記マイクロウェルにも細胞トラップにも入り込まず、それにより、単一細胞と単一ビーズを細胞溶解試薬と一緒にカプセル化するステップをさらに含む、請求項２２〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
上に前記分析物が捕捉された捕捉ビーズを、前記マイクロウェルから取り出すステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記取り出し操作は、磁石を前記マイクロウェルに近接して位置付けて、前記捕捉ビーズを前記マイクロウェルから引き寄せる磁場を形成することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
磁場を利用して、前記捕捉ビーズを前記マイクロウェルへ、および前記マイクロウェルから動かすステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記捕捉ビーズはそれぞれ、前記捕捉エレメントを複数含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の捕捉エレメントは、捕捉配列と特有のバーコード配列を含み、前記捕捉配列は、任意選択的に、ｉ）全ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列か、または、ｉｉ）対象遺伝子パネルを標的にする複数の転写物特異的捕捉配列の一方である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象細胞を捕捉するためのデジタル流体工学システムであって：
（ａ）液滴操作間隙を含み、前記液滴操作間隙に近接して配列された液滴操作電極を含む、液滴アクチュエータと；
（ｂ）（１）第１基板と（２）第２基板を含むマイクロウェルデバイスであって：
前記マイクロウェルデバイスは、前記第１基板に形成されたマイクロウェルを含み、前記マイクロウェルは、前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口し、前記マイクロウェルデバイスは、前記液滴アクチュエータに連結し、前記マイクロウェルが前記液滴操作間隙に面するように位置づけられ；
前記マイクロウェルデバイスは、前記第２基板上に形成された細胞トラップを含み、前記細胞トラップは、前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する、マイクロウェルデバイスと；
（ｃ）プログラム命令を実行して：
（１）前記液滴アクチュエータに、前記細胞トラップに入り込む対象細胞を含むサンプル液滴を、マイクロウェルデバイスに移送することを指示し；
（２）捕捉ビーズを前記マイクロウェルに導入し；
（３）前記アクチュエータに細胞溶解試薬液滴を前記マイクロウェルデバイスに移送することを指示するように構成されたコントローラであって、
前記捕捉ビーズ上には捕捉エレメントが固定されており、
前記溶解試薬液滴の一部が前記細胞トラップとマイクロウェルに入り込み、インキュベーション期間中に、前記対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、前記捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される、コントローラとを含む、システム。
【請求項３２】
前記第１基板は、その上に疎水性層が配置され、該疎水性層は、前記液滴操作表面を形成する、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記マイクロウェルは、前記捕捉ビーズを１つのみ収容するように作られたサイズとピッチを有する、請求項３１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月２８日出願の米国仮特許出願第６２／３１４０７１号と；２０１６年１月２１日出願の米国仮特許出願第６２／２８１５１０号と；２０１５年１２月１日出願の米国仮特許出願第６２／２６１７８６号と；２０１６年７月６日出願の米国仮特許出願第６２／３５８９６８号に関し、その優先権を主張するものである。上記出願全ての完全な主題は、その全体が、参照により本明細書に明示的に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
単一細胞レベルのデータ（例えば、次世代シーケンシングデータ）の重要性が、多種多様の医学および研究の領域でますます認識されるようになっている。したがって、いくつかの技術が単一細胞の分析のために開発されてきた。これらの技術の多くに共通するのは、個々の細胞を物理的に分離し、後続のプロセシングステップおよび分析ステップにおいて細胞起源の情報を維持する必要性である。一例では、チャネルベースの液滴流体工学が、シーケンシング用サンプル中の多数の単一細胞を自動的に単離し、バーコードを付すために用いられている。しかしながら、シーケンシングライブラリの構築におけるいくつかの下流プロセスのステップは自動化することができず、手動のワークフローを必要とする。単一細胞の単離および後続の分析物の特徴付け（例えば、シーケンシング対応単一細胞ライブラリの調製）のための、フレキシブルで自動化されたプラットフォームに対するニーズが存在する。
【０００３】
〔定義〕
本明細書で用いる場合、以下の用語は、指し示す意味を有する。
【０００４】
１つまたは複数の電極に関して「活性化する」とは、液滴の存在下で液滴操作を引き起こす、１つまたは複数の電極の電気的状態の変化に影響を与えることを意味する。電極の活性化は、交流（ＡＣ）または直流（ＤＣ）を使用して達成することが可能である。液滴操作などの所望の操作に影響を与える、任意の好適な電圧を使用することができる。例えば、電極は、約１５０Ｖ超、または約２００Ｖ超、または約２５０Ｖ超、または約２７５Ｖ〜約１０００Ｖ、または約３００Ｖの電圧を使用して、活性化することができる。ＡＣ信号を使用する場合、液滴操作などの所望の操作に影響を与える、任意の適切な周波数を利用することができる。例えば、約１Ｈｚ〜約１０ＭＨｚ、または約１０Ｈｚ〜約６０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約４０Ｈｚ、または約３０Ｈｚの周波数を有するＡＣ信号を使用して、電極を活性化することができる。
【０００５】
液滴アクチュエータ上のビーズに関する「ビーズ」は、液滴アクチュエータ上の、またはそれに近接する液滴と相互作用することが可能な任意のビーズまたは粒子を意味する。
【０００６】
「液滴」は、液滴アクチュエータ上のある量の液体を意味する。典型的には、液滴は、充填流体によって少なくとも部分的に境界される。例えば、液滴は、充填流体によって完全に囲まれるか、または充填流体および液滴アクチュエータの１つもしくは複数の表面によって境界されてもよい。別の例として、液滴は、充填流体、液滴アクチュエータの１つもしくは複数の表面、および／または大気によって境界されてもよい。さらに別の例として、液滴は、充填流体および大気によって境界されてもよい。液滴は、例えば、水性もしくは非水性であり得、または、水性成分および非水性成分を含む、混合物もしくはエマルジョンであってもよい。液滴は、多種多様な形状を成すことができ；非限定的例としては、概して、略円盤形、ナメクジ形、切頭球体、楕円体、球状、部分的に圧縮された球体、半球状、卵形、円筒形、このような形状の組み合わせ、および、混合もしくは分割等の液滴操作中に形成されるか、または液滴アクチュエータの１つもしくは複数の表面とそのような形状との接触の結果として形成される、種々の形状が挙げられる。本開示のアプローチを使用して液滴操作に供され得る液滴流体の非限定的例については、２００７年１０月２５日に公開され、“Droplet-Based Biochemistry”と題された、Eckhardt et al.の国際公開第２００７／１２０２４１号を参照されたい（この全体の開示は参照により本明細書に組み込まれるものとする）。種々の実施態様では、液滴としては、生物学的サンプル、例えば全血、リンパ液、血清、血漿、汗、涙液、唾液、痰、脳脊髄液、羊水、精液、膣排出物、漿液、滑液、心膜液、腹腔液、胸膜液、濾出液、浸出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞便サンプル、単一または多数の細胞を含有する液体、細胞小器官を含有する液体、液化組織、液化器官、多細胞生物を含有する液体、生物学的スワブ、および生物学的洗浄物などが挙げられ得る。さらに、液滴は、水、脱イオン水、食塩水、酸性溶液、塩基性溶液、清浄液、および／または緩衝液などの試薬を含んでよい。液滴は、核酸、例えば、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはそれらの類似体；ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくは、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)；２０１３年９月１２日に公開され、“Improved Methods of Nucleic Acid Sequencing”と題された、Gormley et al.の国際公開第２０１３／１３１９６２号；２００６年６月６日に発行され、“Labelled Nucleotides”と題された、Barnes et al.の米国特許第７０５７０２６号明細書；２００８年４月１０日に公開され、“Compositions and Methods for Nucleotide Sequencing”と題された、Kozlov et al.の国際公開第２００８／０４２０６７号；２０１３年８月１５日に公開され、“Targeted Enrichment and Amplification of Nucleic Acids on a Support”と題された、Rigatti et al.の国際公開第２０１３／１１７５９５号；２００８年２月１２日に発行され、“Methods for Real-Time Single Molecule Sequence Determination”と題された、Hardin et al.の米国特許第７３２９４９２号明細書；２００７年５月１日に発行され、“Enzymatic Nucleic Acid Synthesis: Compositions and Methods for Altering Monomer Incorporation Fidelity”と題された、Hardin et al.の米国特許第７２１１４１４号明細書；２００８年１月１日に発行さ��、“Arrays of Optical Confinements and Uses Thereof”と題された、Turner et al.の米国特許第７３１５０１９号明細書；２００８年７月２９日に発行され、“Fluorescent Nucleotide Analogs and Uses Therefor”と題された、Xu et al.の米国特許第７４０５２８１号明細書；および、２００８年５月８日に公開され、“Polymerase Enzymes and Reagents for Enhanced Nucleic Acid Sequencing”と題された、Ranket al.の米国特許出願公開第２００８０１０８０８２号明細書（これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているようなターミネーター部分を有する類似体；酵素、例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、リコンビナーゼ、もしくはトランスポサーゼなど；結合パートナー、例えば、抗体、エピトープ、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、レクチン、もしくは炭水化物など；または他の生物学的活性分子を含み得る。液滴内容物の他の例としては、試薬、例えば、核酸増幅プロトコル、親和性に基づくアッセイプロトコル、酵素アッセイプロトコル、シーケンシングプロトコル、および／または生物学的流体の分析のためのプロトコルなどの生化学的プロトコルのための試薬などが挙げられる。液滴は、１つまたは複数のビーズを含んでもよい。
【０００７】
「液滴アクチュエータ」は、液滴を操作するためのデバイスを意味する。本発明での使用に適した液滴アクチュエータの種々の構造コンポーネントの例については、２００５年６月２８日に発行され、“Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques”と題された、Pamula et al.の米国特許第６９１１１３２号明細書；２００６年８月３１日に公開され、“Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board”と題された、Pamula et al.の米国特許出願公開第２００６０１９４３３１号明細書；２００７年１０月２５日に公開され、“Droplet-Based Biochemistry”と題された、Pollack et al.の国際公開第２００７／１２０２４１号；２００４年８月１０日に発行され、“Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same”と題された、Shenderovの米国特許第６７７３５６６号明細書；２００３年５月２０日に発行され、“Actuators for Microfluidics Without Moving Parts”と題された、Shenderovの米国特許第６５６５７２７号明細書；２００３年１１月６日に公開され、“Electrowetting-driven Micropumping”と題された、Kim et al.の米国特許出願公開第２００３０２０５６３２号明細書；２００６年７月２７日に公開され、“Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle”と題された、Kim et al.の米国特許出願公開第２００６０１６４４９０号明細書；２００７年２月１日に公開され、“Small Object Moving on Printed Circuit Board”と題された、Kim et al.の米国特許出願公開第２００７００２３２９２号明細書；２００９年１１月１９日に公開され、“Method for Using Magnetic Particles in Droplet Microfluidics”と題された、Shah et al.の米国特許出願公開第２００９０２８３４０７号明細書；２０１０年４月２２日に公開され、“Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation of Droplets on Chip”と題された、Kim et al.の米国特許出願公開第２０１０００９６２６６号明細書；２００９年６月１６日に発行され、“Droplet Transportation Devices and Methods Having a Fluid Surface”と題された、Velevの米国特許第７５４７３８０号明細書；２００７年１月１６日に発行され、“Method, Apparatus and Article for Microfluidic Control via Electrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like”と題された、Sterling et al.の米国特許第７１６３６１２号明細書；２０１０年１月５日に発行され、“Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing”と題された、Becker et al.の米国特許第７６４１７７９号明細書；２００５年１２月２０日に発行され、“Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing”と題された、Becker et al.の米国特許第６９７７０３３号明細書；２００８年２月１２日に発行され、“System for Manipulation of a Body of Fluid”と題された、Decre et al.の米国特許第７３２８９７９号明細書；２００６年２月２３日に公開され、“Chemical Analysis Apparatus”と題された、Yamakawa et al.の米国特許出願公開第２００６００３９８２３号明細書；２０１１年３月３日に公開され、“Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes”と題された、Wuの米国特許出願公開第２０１１００４８９５１号明細書；２００９年７月３０日に公開され、“Electrode Addressing Method”と題された、Fouillet et al.の米国特許出願公開第２００９０１９２０４４号明細書；２００６年５月３０日に発行され、“Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Electrostatic Forces”と題された、Fouillet et al.の米国特許第７０５２２４４号明細書；２００８年５月２９日に公開され、“Droplet Microreactor”と題された、Marchand et al.の米国特許出願公開第２００８０１２４２５２号明細書；２００９年１２月３１日に公開され、“Liquid Transfer Device”と題された、Adachi et al.の米国特許出願公開第２００９０３２１２６２号明細書；２００５年８月１８日に公開され、“Device for Controlling the Displacement of a Drop Between Two or Several Solid Substrates”と題された、Roux et al.の米国特許出願公開第２００５０１７９７４６号明細書；およびDhindsa et al., “Virtual Electrowetting Channels: Electronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality,” Lab Chip, 10:832-836 (2010)を参照されたい（これらの全開示は、参照によって本明細書に組み込まれるものとする）。ある液滴アクチュエータは、間に液滴操作間隙を伴って配列される１つまたは複数の基板と、当該１つまたは複数の基板に関連付けられ（例えば重層され、付着されおよび／または埋め込まれ）、１つまたは複数の液滴の操作を実施するために配列された電極とを含むであろう。例えば、ある液滴アクチュエータは、基部（または底部）基板と、基板に関連付けられた液滴操作電極と、基板および／または電極の上の１つまたは複数の誘電体層と、任意選択的に、液滴操作表面を形成する、基板、誘電体層、および／または電極の上の１つまたは複数の疎水性層とを含むであろう。一般的に液滴操作間隙と称される間隙によって液滴操作表面から分離された、頂部基板も提供され得る。上で言及した特許および出願では、頂部および／または底部の基板上の種々の電極配列が議論されており、本開示の説明ではある新規の電極配列を議論する。液滴操作中に、液滴が、外側電極または基準電極と連続的にまたは頻繁に接触することが好ましい。外側電極または基準電極は、間隙内で、間隙に面する頂部基板、間隙に面する底部基板に関連付けられ得る。両方の基板に電極が提供される場合、電極を制御または監視する目的で液滴アクチュエータ機器に電極を連結するための電気的接触は、一方または両方のプレートに関連し得る。場合によっては、一方の基板上の電極はもう一方の基板と電気的に連結し、その結果、一方の基板のみが液滴アクチュエータと接触状態にある。一実施態様では、導電材料（例えば、ＭＡＳＴＥＲ  ＢＯＮＤ（商標）ポリマー系ＥＰ７９（Master Bond, Inc., ニュージャージー州ハッケンサックより入手可能）などのエポキシ）が、一方の基板上の電極ともう一方の基板上の電気路との間の電気的接続を提供し、例えば、頂部基板上の外部電極を、そのような導電性材料によって底部基板上の電気路に連結することができる。多数の基板を使用する場合、基板間の間隙の高さを決定し、アクチュエータ上の分配リザーバを規定するために、スペーサを基板間に提供することができる。場合によっては、１つまたは複数の開口を、１つまたは複数の電極との相互作用のために整列させることができ、例えば、開口から流出した液体が１つまたは複数の液滴操作電極に十分に接近し、液体を使用する液滴操作電極によって液体操作が行われることを可能にするように整列させることができる。基部（または底部）基板および頂部基板は、��合によっては、１つの一体型コンポーネントとして形成することができる。１つまたは複数の基準電極を、基部（もしくは底部）および／もしくは頂部の基板上、ならびに／または間隙内に提供することができる。基準電極配列の例は、上述の特許および特許出願で提供される。種々の実施形態では、液滴アクチュエータによる液滴の操作は、電極媒介、例えばエレクトロウェッティング媒介、または誘電泳動媒介、またはクーロン力媒介であり得る。本開示の液滴アクチュエータで使用され得る液滴操作を制御するための技法の例としては、流体力学的な流体圧を誘発するデバイスを使用することが挙げられ、例えば、機械的原理（例えば、外部シリンジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空デバイス、遠心力、圧電性ポンプ／超音波ポンプ、および音響力）と；電気的または磁気的原理（例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ、磁性流体プラグ、電磁流体力学ポンプ、磁力を使用した引力または斥力、および電磁流体力学ポンプ）と；熱力学的原理（例えば、気泡発生／相変化誘発型体積膨張）と；他の種類の表面ウェッティング原理（例えば、エレクトロウェッティングおよび光学エレクトロウェッティング、ならびに化学的、熱的、構造的、および放射性誘発型表面張力勾配）と；重力と；表面張力（例えば、毛細管作用）と；静電力（例えば、電気浸透流）と；遠心流（コンパクトディスク上に配置され、回転する基板）と；磁力（例えば、振動するイオンが流動を引き起こす）と；電磁流体力学的力と；真空差または圧力差とに基づき動作するデバイスである。ある実施形態では、前述の技法のうちの２つ以上の組み合わせを利用して、本開示の液滴アクチュエータにおいて液滴操作を行うことができる。同様に、前述のうちの１つまたは複数を使用して、例えば、別のデバイスのリザーバから、または液滴アクチュエータの外部リザーバ（例えば、液滴アクチュエータ基板およびリザーバから液滴操作間隙内への流路に関連付けられたリザーバ）から、液体を液滴操作間隙内に送達することができる。本開示のある液滴アクチュエータの液滴操作表面は、疎水性材料から作製することができ、またはそれらを疎水性にするようにコーティングもしくは処理することができる。例えば、場合によっては、液滴操作表面の一部分または全体を、低表面エネルギー物質または化学反応を用いて、例えば蒸着、またはポリフッ化もしくは過フッ化化合物のような化合物を溶液中で使用するかもしくは重合可能モノマーを使用するｉｎ  ｓｉｔｕ合成を用いることによって誘導することができる。場合によっては、液滴操作表面は、疎水性コーティングを含み得る。さらに、一部の実施形態では、液滴アクチュエータの頂部基板は導電性有機ポリマーを含み、これは次に、疎水性コーティングでコーティングするか、または他の方法で液滴操作表面を疎水性にするように処理する。例えば、プラスチック基板上に蒸着される導電性有機ポリマーは、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホナート）（ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）とすることができる。導電性有機ポリマーの他の例および代替導電層は、２０１１年１月６日に公開され、“Droplet Actuator Devices and Methods”と題された、Pollack et al.の国際公���第２０１１／００２９５７号に記載されており、この全体の開示は参照により本明細書に組み込まれるものとする。一方または両方の基板を、例えば、印刷回路板（ＰＣＢ）、ガラス、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）コーティングガラス、および／または半導体材料を基板として使用して作ることができる。
【０００８】
「液滴操作」は、液滴アクチュエータ上での液滴の任意の操作を意味する。液滴操作としては、例えば、液滴アクチュエータへの液滴の装填；液滴源からの１つまたは複数の液滴の分配；２つ以上の液滴への１つの液滴の分割、分離、または分断；ある場所から別の場所への任意の方向での液滴の移送；単一の液滴への２つ以上の液滴の混成または組み合わせ；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の撹拌；液滴の変形；定位置での液滴の保持；液滴のインキュベーション；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴の液滴アクチュエータ外への移送；本明細書に記載する他の液滴操作；および／または前述の任意の組み合わせが挙げられる。「混成する」、「混成」、「組み合わせる」、「組み合わせ」などの用語は、２つ以上の液滴から１つの液滴を作成することを記載するために使用する。２つ以上の液滴に関してそのような用語を使用する場合、１つの液滴への２つ以上の液滴の組み合わせをもたらすために十分な、液滴操作の任意の組み合わせが使用され得ることを理解されたい。例えば、「液滴Ａと液滴Ｂとの混成」は、液滴Ａを静止した液滴Ｂと接触するように移送すること、液滴Ｂを静止した液滴Ａと接触するように移送すること、または液滴ＡおよびＢを相互に接触するように移送することによって達成することが可能である。「分割」、「分離」、および「分断」という用語は、結果として得られる液滴の体積（例えば、結果として得られる液滴の体積は同一または異なり得る）または結果として得られる液滴の数（結果として得られる液滴の数は、２、３、４、５、またはそれ以上であってよい）に関する任意の特定の結果を示唆することを目的としていない。「混合」という用語は、液滴内の１つまたは複数の成分のより均一な分布をもたらす液滴操作を指す。「装填」液滴操作の例としては、微小透析装填、圧力補助装填、ロボット装填、受動装填、およびピペット装填が挙げられる。液滴操作は、電極媒介されてもよい。場合によっては、液滴操作は、表面上の親水性および／もしくは疎水性領域の使用によって、および／または、障害、間隙高さの変化、もしくは表面のへこみなどの物理的特徴によって、さらに容易になる。液滴操作の例については、「液滴アクチュエータ」の定義の下で、上記に引用された特許および特許出願を参照されたい。液滴操作の結果を判定または確認するために、インピーダンスまたは静電容量の感知技法または画像化技法を、時として使用する場合がある。そのような技法の例は、２０１０年８月５日に公開され、“Capacitance Detection in a Droplet Actuator”と題された、Sturmer et al.の米国特許出願公開第２０１００１９４４０８号明細書に記載されており、この全体の開示は参照により本明細書に組み込まれるものとする。一般的に言えば、特定電極の液滴の有無を確認するために、感知技法または画像化技法を用いることができる。例えば、液滴分配操作後に目的電極に分配液滴が存在していることによって、液滴分配操作が有効であったことが確認される。同様に、アッセイプロトコルの適切なステップにおいて検出スポットに液滴が存在することによって、それまでの液滴操作セットが検出用の液滴を首尾よく生成したことが確認され得る。液滴移送時間は、かなり速くあり得る。例えば、種々の実施形態では、１つの電極から次の電極への液滴の移送は、約１秒、または約０．１秒、または約０．０１秒、または約０．００１秒を超え得る。一実施形態では、電極はＡＣモードで操作されるが、画像化のためにＤＣモードに切り替えられる。液滴の占有面積がエレクトロウェッティング面積に類似していることは、液滴操作の実施にとって（絶対条件ではないものの）有益である場合があり、言い換えると、１ｘ、２ｘ、３ｘの液滴は、それぞれ、１つ、２つ、および３つの電極を使用して有用に制御され、操作される。液滴占有面積が、所与の時間で液滴操作を実施するために利用可能な電極の数より大きい場合、液滴サイズと電極数の差は、典型的には１未満であるはずである；言い換えると、２ｘの液滴は１つの電極を使用して有用に制御され、３ｘの液滴は２つの電極を使用して有用に制御される。液滴がビーズを含む場合、液滴サイズが該液滴を制御する、例えば液滴を移送する電極の数に等しいことが有用である。
【０００９】
「充填流体」は、液滴アクチュエータの液滴操作基板に関連付けられる流体を意味し、その流体は、液滴相を電極媒介液滴操作に供するために、液滴相と十分に非混和性である。例えば、液滴アクチュエータの液滴操作間隙は、典型的には充填流体で満たされる。充填流体は、例えば低密度オイル、例えばシリコーンオイルもしくはヘキサデカン充填流体であるか、またはそれを含み得る。充填流体は、ハロゲン化オイル、例えばフッ素化もしくは過フッ素化オイルであるか、またはそれを含み得る。充填流体は液滴アクチュエータの間隙全体を充填するか、または液滴アクチュエータの１つまたは複数の表面をコーティングすることができる。充填流体は導電性でも非導電性でもよい。充填流体は、液滴操作を改善するために、および／または、液滴からの試薬もしくは標的物質の損失を減少させるために、微小液滴の形成を改善するために、液滴間の相互汚染を減少させるために、液滴アクチュエータ表面の汚染を減少させるために、液滴アクチュエータ材料などの分解を減少させるために選択することができる。本明細書に記載する方法および装置で使用するのに適切な充填流体および充填流体製剤の例は、２０１０年６月３日に公開され、“Droplet Actuators, Modified Fluids and Methods”と題された、Srinivasan et alの国際公開第２０１０／０２７８９４号；２００９年２月１２日に公開され、“Use of Additives for Enhancing Droplet Operations”と題された、Srinivasan et alの国際公開第２００９／０２１１７３号；２００９年１月１５日に公開され、“Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads”と題された、Sista et al.の国際公開第２００８／０９８２３６号；および２００８年１１月２０日に公開され、“Electrowetting Devices”と題された、Monroe et al.の米国特許出願公開第２００８０２８３４１４号明細書で提供されており、これらの全開示は、本明細書で言及する他の特許および特許出願と同様に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。フッ素化オイルは、場合によっては、フッ素化界面活性剤、例えば、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＯ-１００（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）および／またはその他でドープしてもよい。充填流体は、典型的には、液体である。一部の実施形態では、充填ガスを液体の代わりに使用することができる。
【００１０】
「リザーバ」は液体を保つ、貯蔵する、および／または供給するために構成された筐体または部分筐体を意味する。本開示の液滴アクチュエータシステムは、カートリッジ上リザーバおよび／またはカートリッジ外リザーバを含み得る。カートリッジ上リザーバとしては、例えば、（１）液滴操作間隙内または液滴操作表面上のリザーバであるアクチュエータ上リザーバ；（２）液滴アクチュエータカートリッジ上にあるが、液滴操作間隙の外側にあり、液滴操作表面と接触しないリザーバである、アクチュエータ外リザーバ；または（３）アクチュエータ上領域およびアクチュエータ外領域を有する、ハイブリッドリザーバが挙げられ得る。アクチュエータ外リザーバ例は、頂部基板内リザーバである。アクチュエータ外リザーバは、典型的には、アクチュエータ外リザーバから液滴操作間隙内に、例えば、アクチュエータ上リザーバ内などに液体を流動させるために配列された、開口または流路と流体連結している。カートリッジ外リザーバは、液滴アクチュエータカートリッジの一部ですらないが、液滴アクチュエータカートリッジの一部の部分に液体を流動させる、リザーバであり得る。例えば、カートリッジ外リザーバは、液滴アクチュエータカートリッジが動作中に連結されるシステムまたはドッキングステーションの一部であり得る。同様に、カートリッジ外リザーバは、カートリッジ上リザーバ内または液滴操作間隙内に流体を押動するために使用される、試薬貯蔵容器またはシリンジであり得る。カートリッジ外リザーバを使用するシステムは、典型的には、流体通過手段を含み、それによって、液体を、カートリッジ外リザーバからカートリッジ上リザーバ内または液滴操作間隙内へ移送することができる。
【００１１】
「頂部」、「底部」、「上方に」、「下に」、および「上に」という用語は、液滴アクチュエータの頂部および底部基板の相対位置などの、液滴アクチュエータのコンポーネントの相対位置に関する説明の全体を通して使用する。液滴アクチュエータは、空間内のその向きとは無関係に機能的であることが理解されよう。
【００１２】
任意の形態の液体（例えば、動いていようと静止していようと、液滴または連続体）が、電極、アレイ、マトリクス、もしくは表面「上に」ある、または電極、アレイ、マトリクス、もしくは表面「に」ある、または電極、アレイ、マトリクス、もしくは表面「の上方に」あると記載する場合、そのような液体は、電極／アレイ／マトリクス／表面と直接接触し得るか、または液体と電極／アレイ／マトリクス／表面との間に置かれた１つもしくは複数の層もしくはフィルムと接触し得るかのいずれかである。一例では、充填流体は、そのような液体と電極／アレイ／マトリクス／表面との間のフィルムとみなすことができる。
【００１３】
液滴が液滴アクチュエータ「の上に」ある、または液滴アクチュエータに「装填され」ていると記載されている場合、液滴は、液滴アクチュエータを用いて液滴に対し１つもしくは複数の液滴操作を実施することを容易にするように、液滴アクチュエータ上に配列されていること、液滴は、液滴の特性もしくは液滴のシグナルの感知を容易にするように液滴アクチュエータ上に配置されていること、および／または液滴は液滴アクチュエータ上で液滴操作に供されていることを理解されたい。
【００１４】
説明の全体を通して使用する「流体工学カートリッジ」、「デジタル流体工学カートリッジ」、「液滴アクチュエータ」、および「液滴アクチュエータカートリッジ」という用語は、同義であり得る。
【発明の概要】
【００１５】
本明細書の実施形態に従って、液滴アクチュエータを利用してサンプル液滴をマイクロウェルデバイスに移送するステップを含む、デジタルマイクロ流体システムにおいて対象細胞を捕捉する方法を提供する。マイクロウェルデバイスは、マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数のマイクロウェルを有する基板を含む。サンプル液滴は、マイクロウェルに入り込む対象細胞を含む。本方法は、捕捉ビーズをマイクロウェルに導入し、捕捉ビーズには捕捉エレメントが固定されている。本方法は、液滴アクチュエータを利用して、細胞溶解試薬液滴をマイクロウェルデバイスに移送する。細胞溶解試薬液滴の一部がマイクロウェルに入り込み、インキュベーション期間中に対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される。
【００１６】
任意選択的に、本方法は、さらに、液滴アクチュエータを利用して、サンプル液滴をマイクロウェルデバイスから移送する一方、マイクロウェルに捕捉された対象細胞の少なくとも一部を残すステップを含み得る。本方法は、対象細胞の少なくとも一部を、マイクロウェルに沈降させることができる。マイクロウェルデバイスの液滴操作表面は、対象細胞または捕捉ビーズの残りが、マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上に残ることが実質的にはないように、マイクロウェル間に疎水性の隙間範囲を含み得る。本方法は、上に分析物を捕捉した捕捉ビーズを、マイクロウェルから取り出すことができる。取り出し操作は、磁石をマイクロウェルに近接して位置付けて、捕捉ビーズをマイクロウェルから引き寄せる磁場を形成することを含み得る。本方法は、磁場を利用して、捕捉ビーズをマイクロウェルへ、またはマイクロウェルから動かすことができる。
【００１７】
任意選択的に、捕捉ビーズはそれぞれ、複数の捕捉エレメントを含み得る。その複数の捕捉エレメントは、捕捉配列と、特有のバーコード配列を含み得る。捕捉配列は、ｉ）全ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列か、または、ｉｉ）対象遺伝子パネルを標的にする複数の転写物特異的捕捉配列の一方であり得る。捕捉ビーズは、捕捉ビーズの１つだけがマイクロウェルの１つに合うようなサイズであり得る。捕捉ビーズは、重力により、マイクロウェルに置かれる。捕捉ビーズは磁性であり得、磁気引力を利用してマイクロウェルに置かれる。
【００１８】
本明細書の実施形態に従って、液滴操作間隙を含む液滴アクチュエータを備えた、対象細胞を捕捉するためのデジタル流体工学システムを提供する。液滴アクチュエータは、液滴操作間隙に近接して配列された液滴操作電極を含む。マイクロウェルデバイスは、基板を含む。マイクロウェルデバイスは、基板上に形成されたマイクロウェルを含む。マイクロウェルは、マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する。マイクロウェルデバイスは、液滴アクチュエータと連結しており、マイクロウェルが液滴操作間隙に面するように置かれる。コントローラは、サンプル液滴をマイクロウェルデバイスに移送するように液滴アクチュエータに指示するプログラム命令を実行するように、構成される。サンプル液滴は、マイクロウェルに入り込む対象細胞を含む。コントローラは、さらに、捕捉ビーズをマイクロウェルに導入し、液滴アクチュエータに、細胞溶解試薬液滴をマイクロウェルデバイスに移送することを指示し、捕捉ビーズには捕捉エレメントが固定されている。溶解試薬液滴の一部がマイクロウェルに入り込み、インキュベーション期間中に対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される。
【００１９】
任意選択的に、基板は、その上に疎水性層が配置され得る。疎水性層は、液滴操作表面上に形成され得る。液滴操作間隙は、対象細胞を含有するサンプル液滴を含む充填流体を保持するように構成することができる。マイクロウェルは、サンプル液滴中の対象細胞の単一細胞のみを収容し、マイクロビーズを１つのみ収容するように作られたサイズとピッチを有し得る。マイクロウェルは、３０μｍ〜５０μｍの深さを有し得る。マイクロウェルは、３μｍ〜６０μｍの直径を有し得る。マイクロウェルは、互いに８０μｍ未満のピッチで間隔をおいて配置され得る。
【００２０】
他の実施形態では、マイクロウェルデバイスは、マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数の細胞トラップを有する第２基板を含む。細胞トラップは、マイクロウェルに近接して配置される。例えば、第２基板がマイクロウェルデバイスの頂部表面である一方、マイクロウェルは、デバイスの底部表面上にある。一実施形態では、第２基板上の細胞トラップは、第１基板上のマイクロウェルの真上に位置する。サンプル液滴は、細胞トラップに入り込む対象細胞を含む。本方法は、捕捉ビーズをマイクロウェルに導入し、捕捉ビーズ上には捕捉エレメントが固定されている。本方法は、液滴アクチュエータを利用して、細胞溶解試薬液滴をマイクロウェルデバイスに移送する。
【００２１】
一部の実施形態では、デジタルマイクロ流体システムにおいて対象細胞を捕捉する方法を企図し、該方法は：（ａ）液滴アクチュエータを利用して、サンプル液滴をマイクロウェルデバイスに移送するステップであって、前記マイクロウェルデバイスは、該マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数のマイクロウェルを有する第１基板と、前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数の細胞トラップとを含み、前記サンプル液滴は前記細胞トラップに入り込む対象細胞を含む、ステップと、（ｂ）捕捉ビーズを前記マイクロウェルに導入するステップであって、前記捕捉ビーズ上には捕捉エレメントが固定化されている、ステップと、（ｃ）前記液滴アクチュエータを利用して、細胞溶解試薬液滴を前記マイクロウェルデバイスに移送するステップであって、前記細胞溶解試薬液滴の一部は、前記マイクロウェルおよび細胞トラップに入り込み、インキュベーション期間中に、前記対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、前記捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される、ステップとを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、捕捉ビーズは、捕捉ビーズの１つだけがマイクロウェルの１つに合うようなサイズである。他の実施形態では、細胞トラップは、対象細胞の１つだけが細胞トラップの１つに合うようなサイズである。他の実施形態では、本方法は、さらに：（ｄ）前記インキュベーションの期間中および／または期間前に、前記液滴アクチュエータを利用して、前記細胞溶解試薬液滴と不混和性である流体を、前記マイクロウェルデバイスに移送するステップであって、前記不混和性流体が、前記マイクロウェルにも細胞トラップにも入り込まないことにより、単一細胞と単一ビーズを細胞溶解試薬と共にカプセル化するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、さらに、上に分析物を捕捉した捕捉ビーズを、マイクロウェルから取り出すステップを含む。一部の実施形態では、取り出し操作は、捕捉ビーズをマイクロウェルから引き寄せる磁場を形成するために、磁石をマイクロウェルに近接して位置付けることを含む。一部の実施形態では、本方法はさらに、磁場を利用して、捕捉ビーズをマイクロウェルへ、またはマイクロウェルから動かすステップを含む。一部の実施形態では、捕捉ビーズはそれぞれ、複数の捕捉エレメントを含む。一部の実施形態では、複数の捕捉エレメントは、捕捉配列と特有のバーコード配列を含み、前記捕捉配列は、任意選択的に、ｉ）全てのｍＲＮＡの捕捉のためのポリＴ配列か、またはｉｉ）対象遺伝子パネルを標的にする複数の転写物特異的捕捉配列の一方である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】本明細書の実施形態に従う、分析物の特徴付けを目的に単一細胞を単離するための、マイクロウェル配列（例えば、マイクロウェルアレイ）を含む、液滴アクチュエータ例の斜視図である。
【図１Ｂ】本明細書の実施形態に従う、図１Ａの液滴アクチュエータの上面図であり、反応流体を分配し、および／または、収集するための流体リザーバの配列を示す図である。
【図２】本明細書の実施形態に従う、マイクロウェルデバイスの一部と図１の液滴アクチュエータの側面図である。
【図３Ａ】本明細書の実施形態に従う、図１および２に示すマイクロウェルを作るプロセス例を示す図である。
【図３Ｂ】本明細書の実施形態に従う、図１および２に示すマイクロウェルを作るプロセス例を示す図である。
【図３Ｃ】本明細書の実施形態に従う、図１および２に示すマイクロウェルを作るプロセス例を示す図である。
【図３Ｄ】本明細書の実施形態に従う、図１および２に示すマイクロウェルを作るプロセス例を示す図である。
【図４】マイクロウェルデバイスの一部の写真を示す図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｈは、本明細書の実施形態に従う、図２の液滴アクチュエータの側面図であり、分析物の特徴付けのために、マイクロウェルデバイスを使用して単一細胞を単離するプロセスを示す図である。
【図６Ａ】本明細書の実施形態に従う、マイクロウェルにおける細胞と捕捉ビーズの共カプセル化を示す、液滴アクチュエータのマイクロウェルデバイスの一部の上面図である。
【図６Ｂ】本明細書の実施形態に従う、マイクロウェルにおける細胞と捕捉ビーズの共カプセル化を示す、別の液滴アクチュエータのマイクロウェルデバイスの一部の上面図である。
【図７】図７Ａは、本明細書の実施形態に従う、非磁気応答性バーコード付きビーズを使用して単一細胞ＲＮＡを捕捉する、液滴アクチュエータに基づくプロセスから回収したＲＮＡより調製したｃＤＮＡのグラフを示す図である。図７Ｂは、本明細書の実施形態に従う、図７ＡのｃＤＮＡからベンチ上で調製したライブラリ挿入断片の、断片サイズ分布のグラフを示す図である。
【図８】図８Ａは、本明細書の実施形態に従う、各特有のバーコードについての、ヒト転写物とマウス転写物のリードカウントのグラフを示す図である。図８Ｂは、本明細書の実施形態に従う、第２混合種実験における、各特有のバーコードについての、ヒト転写物とマウス転写物のリードカウントのグラフを示す図である。
【図９】本明細書の実施形態に従う、多重単一細胞ライブラリ構築プロトコルを実行する際に使用するのに適切な、液滴アクチュエータの底部基板例の上面図である。
【図１０Ａ】本明細書の実施形態に従う、液滴アクチュエータの底部基板上にマイクロウェルアレイを作るプロセス例を示す図である。
【図１０Ｂ】本明細書の実施形態に従う、液滴アクチュエータの底部基板上にマイクロウェルアレイを作るプロセス例を示す図である。
【図１０Ｃ】本明細書の実施形態に従う、液滴アクチュエータの底部基板上にマイクロウェルアレイを作るプロセス例を示す図である。
【図１１Ａ】本明細書の実施形態に従う、マイクロチャネルデバイスの斜視図であり、不混和相でマイクロウェルアレイをキャッピングして、単離反応コンパートメントを形成するプロセスを示す図である。
【図１１Ｂ】本明細書の実施形態に従う、マイクロチャネルデバイスの斜視図であり、不混和相でマイクロウェルアレイをキャッピングして、単離反応コンパートメントを形成するプロセスを示す図である。
【図１１Ｃ】本明細書の実施形態に従う、マイクロチャネルデバイスの斜視図であり、不混和相でマイクロウェルアレイをキャッピングして、単離反応コンパートメントを形成するプロセスを示す図である。
【図１１Ｄ】本明細書の実施形態に従う、マイクロチャネルデバイスの斜視図であり、不混和相でマイクロウェルアレイをキャッピングして、単離反応コンパートメントを形成するプロセスを示す図である。
【図１１Ｅ】本明細書の実施形態に従う、マイクロチャネルデバイスの斜視図であり、不混和相でマイクロウェルアレイをキャッピングして、単離反応コンパートメントを形成するプロセスを示す図である。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂは、本明細書の実施形態に従う、完全に装填されたマイクロチャネルおよび関連するマイクロウェルと、オイル注入後の「キャッピングされた」マイクロウェルをそれぞれ示す、マイクロチャネルデバイスの一部の上面図である。
【図１３】本明細書の実施形態に従う、長方形の形をしたマイクロウェルを含むマイクロチャネルデバイス１３００の一部の上面図である。
【図１４】本明細書の実施形態に従う、平行性の高いマイクロチャネルアレイの一部の上面図である。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｄは、本明細書の実施形態に従う、「陽性」ウェル構造例を示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｃは、本明細書の実施形態に従う、「陽性」ウェル構造の別の例を示す図である。
【図１７】本明細書の実施形態に従う、液滴アクチュエータを含むマイクロ流体工学システム例のブロック図である。
【図１８】対象細胞を、ビーズを含有するマイクロウェルの上方に物理的に捕えることを可能にする、頂部プレートに細胞トラップ構造を有するデジタルマイクロ流体工学デバイスを示す図である。図１８Ａは、ビーズと細胞が共局在化したデバイスの側面図を提供する。開口長方形は、上蓋に取り付けられた細胞トラップ構造であり、薄灰色ドットは、そのような構造に捕らえられた細胞であり、黒ドットは、底部表面上のマイクロウェル内のビーズである。図１８Ｂは、そのようなデバイスの上面図であり、上蓋の細胞トラップ構造が、捕えた細胞を、底部表面上のマイクロウェル中のビーズと共局在化させることを示す図である。
【図１９】水相液滴を移し、ビーズ／細胞対のカプセル化をもたらすためのオイルがチャネルを通して装填されている、図１８のデバイスを示す図である。図１９Ａは、マイクロチャネル（灰色で影をつけた範囲）に装填されたオイルは、マイクロウェル／細胞トラップ位置を囲むが、それを充填することはなく、細胞、ビーズ、および液滴媒体を、オイルの囲いを有する単一水性マイクロチャンバ内にカプセル化またはコンパートメント化されたままにすることを示す図である。図１９Ｂは、オイルがマイクロウェル／トラップを囲み、細胞およびビーズを一緒に水性マイクロチャンバ内にカプセル化する、オイル装填デバイスの上面図である。
【図２０Ａ】細胞トラップ構造に捕えられた球体の、トラッピングとオイルカプセル化を示す図である。図２０Ａは、図１８のデバイスに捕えられた、可視化を可能にするために細胞の代わりとして使用した１０μｍの蛍光マイクロスフェアの蛍光画像（白い円）である。
【図２０Ｂ】細胞トラップ構造に捕えられた球体の、トラッピングとオイルカプセル化を示す図である。図２０Ｂは、白色光と、細胞トラップ構造に位置する蛍光粒子の蛍光画像の重ね合わせを示す。
【図２０Ｃ】細胞トラップ構造に捕えられた球体の、トラッピングとオイルカプセル化を示す図である。図２０Ｃは、オイルがチャネルに流れ込んで、トラップ構造の形をまねた単離水性液滴の形成をもたらし、次に球体をカプセル化することを示す。細胞トラップ構造におけるデバイスの頂部表面と底部表面の間の間隙高さは、周囲空間の間隙高さよりも低く、オイルは、ゆっくりした流速条件下では、これらの間隙から水を移すことはできない。
【図２０Ｄ】細胞トラップ構造に捕えられた球体の、トラッピングとオイルカプセル化を示す図である。図２０Ｄは、チャネルを通してオイルをフラッシュさせた後の、オイルに囲まれた単離水性チャンバを示す。球体は、水性液滴内にカプセル化されている。
【発明を実施する形態】
【００２４】
本明細書の実施形態は、分析物の特徴付けを目的に単一細胞を単離するためのデバイス、システム、および方法を提供する。一部の実施形態では、デバイスは、エレクトロウェッティングなどの、マイクロ流体工学技術を利用する液滴アクチュエータデバイスである。本発明のデバイス、システム、および方法は、分析物の分析用生物学的サンプル（例えば、細胞懸濁液）を処理するための自動化液体ハンドリングを提供し得る。分析物の例としては、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、タンパク質、オルガネラなどが挙げられる。
【００２５】
種々の実施形態では、液滴アクチュエータは、多数の単一細胞が単離されるマイクロウェルアレイを含む（つまり、各マイクロウェルに単一細胞）。細胞は溶解され得、各単一細胞の分析物が処理され得る。一実施形態では、分析物は、１つまたは複数の捕捉ビーズ上に捕捉される。捕捉ビーズは、例えば、ゲルビーズ、または多孔性ビーズ、または中空ビーズ（例えば、シェル）とすることができ、磁気応答性である場合もない場合もある。捕捉ビーズがその捕捉ビーズに特有のバーコードを含む場合もあるし、捕捉ビーズがバーコードを含まない場合もある。捕捉ビーズは、色コード化など、別の方法でコード化することもできる。
【００２６】
一実施形態では、マイクロウェルアレイは、液滴アクチュエータとは別に形成され、液滴アクチュエータの底部基板に一体化される。アレイは、液滴アクチュエータの液滴操作間隙に一体化され得る。別の実施形態では、アレイは、液滴アクチュエータの底部基板などの基板上に直接作られる。一実施形態では、マイクロウェルのサイズおよび捕捉ビーズのサイズは、アレイの各マイクロウェルが単一の捕捉ビーズに適応するように、選択され得る。
【００２７】
一実施形態では、複数の細胞トラップが、液滴アクチュエータとは別に形成され、液滴アクチュエータの頂部基板に一体化される。複数の細胞トラップは、液滴アクチュエータの液滴操作間隙に一体化され得る。別の実施形態では、複数の細胞トラップは、液滴アクチュエータの頂部基板などの基板上に直接作られる。一実施形態では、細胞トラップのサイズは、複数のトラップそれぞれが単一細胞に適応するように選択され得る。
【００２８】
種々の実施形態では、捕捉ビーズは、ビーズの表面上に固定された複数の捕捉エレメントを含む。一実施形態では、捕捉エレメントは、単一細胞の核酸の捕捉のためにビーズ表面上に固定された、捕捉オリゴヌクレオチドである。捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、核酸捕捉配列、特有の分子識別子（ＵＭＩ）配列、および、特有のビーズ特異的バーコード配列を含み得る。一例では、核酸捕捉配列は、単一細胞由来のＲＮＡを全て捕捉するためのポリＴ配列である。別の例では、核酸捕捉配列は、対象遺伝子パネルを標的にする複数の転写物特異的捕捉配列である。特有のバーコード配列は、各細胞の核酸（例えば、トランスクリプトーム）を元の細胞に関連付けることを可能にする。したがって、任意の所要の単一細胞について、配列が同じ特有のバーコードを共有していることを理由に、遺伝子および転写物を特定し、同一の細胞に割り当てることが可能である。一部の実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、また、捕捉核酸をビーズから解放させるための、切断可能配列を含む。
【００２９】
本発明の液滴アクチュエータは、サンプルを分析へというプロトコルの１つまたは複数のステップを実行するために構成され得る。一実施形態では、液滴アクチュエータは、核酸分析のための１つまたは複数のプロセスステップを実行するように構成され得る。核酸分析としては、例えば、ＰＣＲ分析および／またはシーケンシング分析が挙げられ得る。一例では、液滴アクチュエータは、サンブルをシーケンシング対応ライブラリへというプロトコルの１つまたは複数のステップを実行するように構成され得る。液滴アクチュエータは、多数の単一細胞が、液滴アクチュエータ上の個々のマイクロウェル内に、個々のマイクロウェル内の単一ビーズと一緒に単離され、各単一細胞の核酸が特有のバーコード付きビーズに捕捉されるように構成され得る。次に、液滴アクチュエータ上の各マイクロウェルのバーコード付きビーズが液滴アクチュエータから回収され、ベンチ上で処理されて、シーケンシング対応ライブラリを生成する。
【００３０】
別の例では、液滴アクチュエータは、多数の単一細胞が、液滴アクチュエータ上の個々のマイクロウェル内に、個々のマイクロウェル内の単一ビーズと一緒に単離され、各単一細胞の核酸が特有のバーコード付きビーズに捕捉され、捕捉された核酸を液滴アクチュエータ上で処理してシーケンシング対応ライブラリを生成するように構成され得る。
【００３１】
別の例では、液滴アクチュエータは、多数の単一細胞が、液滴アクチュエータ上の個々の細胞トラップ内に単離され、単一ビーズが、各細胞トラップが個々のマイクロウェルに近接して位置している個々のマイクロウェル内に単離され、各単一細胞の核酸が特有のバーコード付きビーズ上に捕捉され、捕捉された核酸を液滴アクチュエータ上で処理してシーケンシング対応ライブラリを生成するように構成され得る。
【００３２】
液滴アクチュエータ上の一体型マイクロウェルデバイス
液滴アクチュエータは、典型的には、液滴操作を行うための表面または間隙を形成するように構成された１つまたは複数の基盤を含む。その１つまたは複数の基板は、液滴操作を行うための液滴操作表面または間隙を作り、また、液的操作を行うために配列された電極を含み得る。液滴操作基板または基板間の間隙は、液滴を形成する液体とは不混和性の充填流体でコーティングするかまたは充填することができる。
【００３３】
図１Ａは、分析物の特徴付けを目的に対象細胞（例えば、単一細胞）を単離するためのマイクロウェル配列（例えば、マイクロウェルアレイ）を含む、液滴アクチュエータ１００の一例の斜視図を図示する。液滴アクチュエータ１００は、液滴操作間隙により分離された底部基板１１０と頂部基板１１２を含む。底部基板１１０は、例えば、プリント回路板（ＰＣＢ）である。頂部基板１１２は、例えば、プラスチックまたはガラスの基板である。液滴アクチュエータ１００は、頂部基板１１２および底部基板１１０の一方または両方に形成されたコンパートメント１１３を含む。コンパートメント１１３は、マイクロウェルデバイス１１５を収容するように形成され、大きさを決定される。例えば、マイクロウェルデバイス１１５は、底部基板１１０とは別に形成される。次に、マイクロウェルデバイス１１５を、液滴アクチュエータ１００の底部基板１１０にはめ合わされる。そうする際に、マイクロウェルデバイス１１５は、液滴アクチュエータ１００の液滴操作間隙に対して提供される。任意選択的に、マイクロウェルデバイス１１５は、頂部基板１１２のコンパートメントに挿入される場合もあるし、頂部基板１１２および底部基板１１０の一方と一体化して形成される場合もある。
【００３４】
一例では、マイクロウェルデバイス１１５のサイズは、約１０．２ｍｍ×９．５ｍｍである。マイクロウェルデバイス１１５は、例えば、マイクロウェルアレイを含む（図示せず）。
【００３５】
図１Ｂは、図１Ａの液滴アクチュエータ１００の上面図を図示し、反応流体を分配し、および／または、収集するための流体リザーバの配列を示す。液滴アクチュエータ１００は、多数の流体リザーバ１２０（例えば、４つの流体リザーバ１２０ａから１２０ｄ）を含み、これらは、例えば、廃液収集リザーバおよび／または流体分配リザーバとして割り当てられ得る。この例では、流体リザーバ１２０ａは、ある量の対象単一細胞を含む、１つまたは複数のサンプル液滴を分配するためのサンプル分配リザーバとして使用され得；流体リザーバ１２０ｂは、ある量の捕捉ビーズ（例えば、磁気応答性の捕捉バーコード付きビーズ）を含む１つまたは複数の試薬液滴を分配するための試薬分配リザーバとして使用され得；流体リザーバ１２０ｃは、１つまたは複数の細胞溶解緩衝剤液滴を分配するための試薬分配リザーバとして使用され得；流体リザーバ１２０ｄは、使用済み反応液滴を収容するための廃液収集リザーバとして使用され得る。種々の実施形態では、他のリザーバおよび試薬、例えば、図５Ｇに関連して以下で記載するステップによる細胞溶解および分析物結合の後で、マイクロウェルから捕捉ビーズを回収するための緩衝剤も提供され得る。液滴アクチュエータ１００およびマイクロウェルデバイス１１５については、図２に関連してより詳細に記載する。
【００３６】
図２は、図１のマイクロウェルデバイス１１５の一部と液滴アクチュエータ１００の側面図を図示する。底部基板１１０は、液滴操作間隙２１５により頂部基板１１２から分離される。液滴操作は、液滴操作表面上で液滴操作間隙２１５において実行される。マイクロウェルデバイス１１１５は、マイクロウェルデバイス１１５の表面が、液滴操作表面のセグメントを形成するように、コンパートメント１１３に結合され、コンパートメント１１３内に保持される。底部基板１１０は、液滴操作電極２２０（例えば、エレクトロウェッティング電極）の配列を含む。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極２２０で実行される。底部基板１１０と一体化したマイクロウェルデバイス１１５は、基板２２５を含む。一例では、基板２２５はシリコン基板である。疎水性層２３０が、液滴操作間隙２１５に面している基板２２５の表面上に配置される。疎水性層２３０は、マイクロウェルデバイス１１５と位置を揃えた液滴操作間隙２１５の領域の、液滴操作間隙２１５の側面を形成する。一例では、疎水性層２３０は、ＣＹＴＯＰで形成される。複数のマイクロウェル２３５（例えば、アレイ）が、基板２２５および疎水性層２３０に形成され、その基盤および疎水性層の上で開口する。マイクロウェル２３５は、マイクロウェルデバイス１１５の液滴操作表面上で開口する。マイクロウェルデバイス１１５の製作については、図３Ａ〜３Ｄに関連してより詳細に記載する。
【００３７】
サンプル液滴（図示せず）は、液滴操作を使用して、液滴操作電極２２０に沿ってマイクロウェルデバイス１１５に移送され得る。一例では、サンプル液滴は、図５Ａ〜５Ｇに関連してより詳細に記載するように、シーケンシング用の核酸ライブラリの構築のために処理される、複数の対象細胞（例えば、単一細胞）を含有し得る。
【００３８】
図３Ａ〜３Ｄは、図１および２のマイクロウェルデバイス１１５を作るプロセス３００の例を図示する。マイクロウェルデバイス１１５におけるマイクロウェル２３５の密度は、マイクロウェル２３５のサイズおよびピッチを調節することにより、容易に調整可能である。この例では、マイクロウェルデバイス１１５の一部のみを示す。
【００３９】
第１ステップでは、ここでは図３Ａを参照して、基板２２５が提供される。一例では、基板２２５は、サイズが約１０．２ｍｍ×９．５ｍｍのシリコンウェハである。次に、疎水性層２３０（例えば、ＣＹＴＯＰ、ＦＯＴＳ、または他のフッ素化単一層もしくはポリマー）が、基板２２５の表面上に形成される。
【００４０】
次のステップでは、ここでは図３Ｂを参照して、標準的なフォトリソグラフィプロセスを使用して、フォトレジスト層３１０が疎水性層２３０の上に提供される。次に、円形の空隙３１５のアレイが、フォトレジスト層３１０にパターン化される。その際に、シャドーマスクが疎水性層２３０の上に形成されるが、これは、露光された疎水性層２３０の円形領域をそのまま残す。このシャドーマスクは、マイクロウェル２３５の場所を定義し、それをエッチングするために使用される。
【００４１】
円形空隙３１５のそれぞれの直径は、例えば、約３μｍ〜約６０μｍとすることが可能である。一例では、円形空隙３１５のそれぞれの直径は、約４０μｍであり、円形空隙３１５のピッチは約８０μｍである。この例では、基板２２５上の円形空隙３１５の密度は、約１５０個の円／ｍｍ２である。従って、約１５，０００個の円形空隙３１５が、約１０．２ｍｍ×９．５ｍｍの範囲に提供され得る。円形空隙３１５のサイズは、標的分析物（例えば、核酸）を捕捉するための、ビーズによるプロトコルで使用されるマイクロビーズのサイズに基づいて選択される。
【００４２】
次のステップでは、ここでは図３Ｃを参照して、エッチングプロセスを使用して、フォトレジスト層３１０の円形空隙３１５を通して露光された疎水性層２３０と基板２２５の一部から材料を除去することによって、マイクロウェル２３５が形成される。一例では、エッチングプロセスは、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）プロセスである。円形空隙３１５、マイクロウェル２３５は、例えば、約３０μｍ〜約５０μｍの深さまでエッチングされ得る。一例では、マイクロウェル２３５は、約３０μｍの深さまでエッチングされる。マイクロウェル２２５の深さは、マイクロビーズ１つと単一細胞１つのみが任意の１つのマイクロウェル２２５に合うように選択される。
【００４３】
次のステップでは、ここでは図３Ｄを参照して、フォトレジスト層３１０を取り除いて、マイクロウェル２２５の外側に残っている疎水性層２３０の一部を露光する。例えば、フォトレジスト層３１０は、アセトンストリッピングプロトコルを使用して取り除かれる。マイクロウェルデバイス１１５は、「半疎水性」表面を有する、つまり、マイクロウェル２２５の表面が親水性である一方、マイクロウェル２２５間の隙間領域は疎水性層２３０でコーティングされているということができる。
【００４４】
図４は、マイクロウェルデバイス１１５などのマイクロウェルデバイスの一部のセクション４００を示す。この例では、マイクロウェルは、約８０μｍのピッチで、直径は４０μｍである。
【００４５】
液滴アクチュエータにおける単一細胞単離および分析物捕捉
図５Ａ〜５Ｇは、図２の液滴アクチュエータ１００の側面図を図示し、マイクロウェルデバイス（例えば、マイクロウェルデバイス１１５）を使用して、分析物の特徴付けのために単一細胞を単離するプロセス５００を示す。図５Ａ〜５Ｈの方法は、単一細胞がマイクロウェル内で単離され、溶解され、標的分析物が後続の処理のためにビーズに捕捉されるプロトコルの例である。一例では、捕捉ビーズは、磁気応答性のバーコード付きビーズであり、標的分析物はＲＮＡである。プロセス５００は、限定するわけではないが、以下のステップを含み得る。
【００４６】
一ステップでは、ここでは図５Ａを参照して、サンプル液滴５１０が、液滴操作によりマイクロウェルデバイス１１５に移送される。サンプル液滴５１０は、ある量の単一細胞５１５を含む。
【００４７】
別のステップでは、ここでは図５Ｂを参照して、サンプル液滴５１０が、単一細胞５１５がマイクロウェル２３５に（重力により）沈降するのに十分なある期間において（例えば、約３０〜約６０秒）、マイクロウェルデバイス１１５においてインキュベーションされる。マイクロウェル２３５における細胞の捕捉率は、サンプル液滴５１０における単一細胞５１５の初期濃度と、サンプル液滴５１０がマイクロウェルデバイス１１５に位置する時間量の関数である。
【００４８】
別のステップでは、ここでは図５Ｃを参照して、サンプル液滴５１０が、液滴操作を使用してマイクロウェルデバイス１１５から移送される。サンプル液滴５１０がマイクロウェルデバイス１１５から移送されると、マイクロウェル２３５に捕捉された残りのサンプル流体および単一細胞５１５がマイクロウェルデバイス１１５に保持される。マイクロウェル２３５間の隙間領域における疎水性層２３０の存在により、残りのサンプル液体および細胞はマイクロウェル２３５に局在化し、隙間範囲に、サンプルの残りは実質的にはない。
【００４９】
別のステップでは、ここでは図５Ｄを参照して、ある量の磁気応答性捕捉ビーズ５２５を含む試薬液滴５２０が、液滴操作を使用してマイクロウェルデバイス１１５に移送される。各磁気応答性捕捉ビーズ５２５に固定されるのは、捕捉配列と特有のバーコード配列（図示せず）を含む、複数の捕捉エレメント（例えば、核酸捕捉プローブ（図示せず））である。一例では、捕捉配列は、全ｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ配列である。別の例では、捕捉配列は、対象遺伝子パネルを標的にする複数の転写物特異的捕捉配列である。磁気応答性捕捉ビーズ５２５は、例えば、重力によりマイクロウェル２３５に置かれる。別の例では、磁石（図示せず）が、その磁石の磁力が磁気応答性捕捉ビーズ５２５をマイクロウェル２３５に引き付けるように、マイクロウェルデバイス１１５の下に位置付けられる場合もある。試薬液滴５２０における磁気応答性捕捉ビーズ５２５の濃度は、マイクロウェルデバイス１１５の各マイクロウェル２３５が磁気応答性捕捉ビーズ５２５を含有するほど十分に高い。磁気応答性捕捉ビーズ５２５のサイズは、ビーズが１つだけマイクロウェル２３５に合う程度である。
【００５０】
別のステップでは、ここでは図５Ｅを参照して、試薬液滴５２０が、液滴操作を使用して、マイクロウェルデバイス１１５から移送される。試薬液滴５２０は、任意の余分な磁気応答性捕捉ビーズ５２５を含有するが、この試薬液滴がマイクロウェルデバイス１１５から移送されると、マイクロウェル２３５内の残りの試薬液滴および磁気応答性捕捉ビーズ５２５がマイクロウェルデバイス１１５に保持される。
【００５１】
別のステップでは、ここでは図５Ｆを参照して、細胞溶解試薬液滴５３０が、液滴操作を使用して、マイクロウェルデバイス１１５に移送される。細胞溶解試薬液滴５３０は、次に、液滴操作を使用して、マイクロウェルデバイス１１５から移送される。各マイクロウェル２３５は、ここで、ある量の細胞溶解試薬と磁気応答性捕捉ビーズ５２５を含む。いくつかのマイクロウェル２３５は、単一細胞５１５を１つ含み得る。他のマイクロウェル２３５は、２つ以上（例えば、２つ）の単一細胞５１５を含み得る。インキュベーション期間（例えば、約１０分〜約１５分）において、単一細胞５１５はマイクロウェル２３５において溶解され、放出された分析物（例えば、ＲＮＡ）が、磁気応答性捕捉ビーズ５２５に捕捉される。
【００５２】
別のステップでは、ここでは図５Ｇを参照して、捕捉液滴５３５が、液滴操作を使用して、マイクロウェルデバイス１１５に移送される。磁石５４０が、マイクロウェルデバイス１１５がその磁場内にあるように、頂部基板１１２に位置付けられ、マイクロウェルデバイス１１５と位置を揃える。磁石５４０の磁場を使用して、上に捕捉分析物（例えば、ＲＮＡ（図示せず））を有する磁気応答性捕捉ビーズ５２５を、マイクロウェル２３５から捕捉液滴５３５に引き寄せる。
【００５３】
別のステップでは、ここでは図５Ｈを参照して、磁石５４０がマイクロウェルデバイス１１５および頂部基板１１２から動かされる。磁石５４０がマイクロウェルデバイス１１５から動くと、上に捕捉分析物（例えば、ＲＮＡ）を有する磁気応答性捕捉ビーズ５２５が、捕捉液滴５３５に懸濁される。次に、中に磁気応答性捕捉ビーズ５２５を有する捕捉液滴５３５が、液滴操作を使用して、後続の処理ステップ（例えば、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、ＰＣＲ増幅、ライブラリ調製、およびシーケンシング）のために、マイクロウェルデバイス１１５から移送される。
【００５４】
一例では、中に磁気応答性捕捉ビーズ５２５を有する捕捉液滴５３５は、液滴アクチュエータ１００から取り出され、後続の処理ステップ（例えば、サンプル洗浄、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、ＰＣＲ増幅、ライブラリ調製（例えば、Ｎｅｘｔｅｒａプロトコル）およびシーケンシング）が液滴アクチュエータから離れて実行される。
【００５５】
別の例では、後続の処理ステップ（例えば、サンプル洗浄、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、ＰＣＲ増幅、およびライブラリ調製）は、液滴アクチュエータ上で実行されて、シーケンシング対応ライブラリを生成する。シーケンシング対応ライブラリは、後続のシーケンシングのために液滴アクチュエータから取り出される。
【００５６】
図６Ａは、マイクロウェルにおける細胞と捕捉ビーズの共カプセル化を示す、液滴アクチュエータのマイクロウェルデバイス６００の一部の上面図である。この例では、マイクロウェルデバイス６００のマイクロウェルは、直径約３０μｍ（２５０マイクロウェル／ｍｍ２）である。捕捉ビーズは、直径約２０μｍの磁気応答性ビーズである。細胞は赤色で示され、捕捉ビーズは緑色で示される。細胞および捕捉ビーズは、マイクロウェルデバイス６００のマイクロウェルに局在化する。この例では、捕捉ビーズのサイズがマイクロウェルのサイズより小さい場合、マイクロウェルの約９５％超がビーズを含有する。マイクロウェルデバイス６００の表面が疎水性であるため、細胞および／またはビーズの残りがマイクロウェル間の表面で観察されることはない。
【００５７】
図６Ｂは、マイクロウェルにおける細胞と捕捉ビーズの共カプセル化を示す、別の液滴アクチュエータのマイクロウェルデバイス６５０の一部の上面図である。この例では、マイクロウェルデバイス６５０のマイクロウェルは、直径約４０μｍ（１５０マイクロウェル／ｍｍ２）であり、捕捉ビーズは、直径約４０μｍである。細胞は赤色で示され、捕捉ビーズは緑色で示される。細胞および捕捉ビーズは、マイクロウェルデバイス６００のマイクロウェルに局在化する。この例では、捕捉ビーズのサイズがマイクロウェルとほぼ同じサイズである場合、相当な数のマイクロウェルが捕捉ビーズを含有しない。
【００５８】
細胞捕捉効率
液滴アクチュエータのマイクロウェルデバイスへの細胞捕捉効率を評価するため、２つの異なる液滴アクチュエータを使用した。第１液滴アクチュエータは、サイズが９．２ｍｍ×２ｍｍであり、ピッチが約８０μｍで、直径約４０μｍのマイクロウェルを約３０００個含む、マイクロウェルデバイスを含んだ。第２液滴アクチュエータは、サイズが９．２ｍｍ×１０．５ｍｍであり、ピッチが約８０μｍで、直径約４０μｍのマイクロウェルを約１５００個含む、マイクロウェルデバイスを含んだ。各液滴アクチュエータを、細胞の可視化およびカウントが可能になるように、顕微鏡の台に置いた。異なる細胞濃度の３つのサンプル溶液（つまり、５０細胞／μＬ、１００細胞／μＬ、および２５０細胞／μＬ）を使用した。サンプル溶液を液滴アクチュエータに装填し、サンプル液滴を、液滴操作を使用して液滴アクチュエータのマイクロウェルデバイスに移送した。単一細胞が（重力により）マイクロウェルデバイスのマイクロウェルに沈降するのに十分なある期間（例えば、約６０秒）の後で、サンプル液滴を、液滴操作を使用して、マイクロウェルデバイスから移送した。サンプル液滴をマイクロウェルデバイスから移送すると、残りのサンプル流体および単一細胞が、マイクロウェルデバイスのマイクロウェルに保持された。マイクロウェルに捕捉された細胞を可視化し、カウントした。下の表１が、細胞捕捉データを示す。データは、同じ細胞濃度（５０細胞／μＬまたは１００細胞／μＬ）では、単一細胞を含有するマイクロウェル率（「単一細胞／マイクロウェル」）が、９．２ｍｍ×２ｍｍマイクロウェルデバイス（つまり、５０細胞／μＬでは〜２．２％、１００細胞／μＬでは〜３．６％）および９．２ｍｍ×１０．５ｍｍマイクロウェルデバイス（つまり、５０細胞／μＬでは〜２％、１００細胞／μＬでは〜４％）で、ほぼ同じであることを示す。データは、また、サンプル液滴における細胞濃度が上昇すると、細胞捕捉率が増加するが、多数の細胞を有するウェル（例えば、各ウェルに２細胞）の数も増加したことを示す。各マイクロウェルの多数の細胞（例えば、２細胞）は、細胞間汚染または「クロストーク」と定義することができる。単一細胞捕捉効率は、マイクロウェルアレイ範囲のサイズ、サンプル液滴中の細胞濃度、サンプル液滴をマイクロウェルデバイス上でインキュベーションする継続時間を選択することにより調整することができる。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
捕捉単一細胞ＲＮＡからのライブラリ構築
図７Ａは、非磁気応答性バーコード付きビーズを用いて単一細胞ＲＮＡを捕捉する、液滴アクチュエータによるプロセスから回収したＲＮＡより調製したｃＤＮＡについての、グラフ７００およびグラフ７０５を示す。グラフ７００は、ｃＤＮＡに値する単一細胞を１００個含有する、ｃＤＮＡ担持ビーズの第１断片（ＭＷ１１−１）のｃＤＮＡサイズ分布を示す。グラフ７０５は、ｃＤＮＡに値する単一細胞を１００個含有する、ｃＤＮＡ担持ビーズの第２断片（ＭＷ１１−２）のｃＤＮＡサイズ分布を示す。この例では、約５０細胞／μＬを含有する細胞サンプル液滴を液滴アクチュエータに装填し、液滴操作を使用して、液滴アクチュエータ上のマイクロウェルデバイスに移送した。サンプル液滴中の細胞が（重力により）マイクロウェルデバイスのマイクロウェルに沈降するのに十分な時間の後で、サンプル液滴を、液滴操作を使用してマイクロウェルデバイスから移送した。ある量の非磁性バーコード付きビーズを含む試薬液滴を、液滴操作を使用して、マイクロウェルデバイスに移送した。バーコード付きビーズが（重力により）マイクロウェルデバイスのマイクロウェルに沈降するのに十分な時間の後で、試薬液滴を、液滴操作を使用してマイクロウェルデバイスから移送した。溶解試薬液滴（例えば、１％ＬＤＳ溶解緩衝剤液滴）を、液滴操作を使用してマイクロウェルデバイスに移送した。細胞溶解インキュベーション期間（例えば、約１５分）の後で、溶解試薬液滴を、液滴操作を使用してマイクロウェルデバイスから移送した。溶解試薬液滴の除去後、液滴アクチュエータカートリッジを開け、ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、６ｘ  ＳＳＣ）を、マイクロウェルデバイスにピペットで移した。次に、上にＲＮＡが結合した非磁性バーコード付きビーズを、ベンチ上逆転写プロトコルを使用してｃＤＮＡにする後続の処理のために、ピペットにより液滴アクチュエータのマイクロウェルデバイスから取り出した。データは、溶解細胞のＲＮＡがバーコード付きビーズに捕捉され、ベンチ上反応で容易に逆転写されてｃＤＮＡになったことを示す。
【００６１】
図７Ｂは、図７Ａのグラフ７００およびグラフ７０５それぞれのｃＤＮＡからベンチ上で調製されたライブラリ挿入断片の、断片サイズ分布についてのグラフ７１５およびグラフ７２０を示す。データは、２つの異なるライブラリ調製反応間で一貫したライブラリ収率と挿入断片サイズを示す。
【００６２】
クロストークの定量化
各マイクロウェルの多数の細胞（例えば、２細胞）は、細胞間汚染または「クロストーク」と定義することができる。液滴アクチュエータ上での単一細胞単離および核酸捕捉の際のクロストークを定量化するために、ヒト細胞およびマウス細胞が１対１の混合物を使用した。簡潔に言うと、その混合細胞サンプル（５０細胞／μＬ）を液滴アクチュエータに装填し、液滴アクチュエータ上のマイクロウェルデバイスに移送した。単一細胞が（重力により）マイクロウェルに沈降するのに十分な時間の後で、混合サンプル液滴を、液滴操作を使用してマイクロウェルデバイスから移送した。細胞は溶解され、各マイクロウェルで放出されたＲＮＡは特有のバーコード付きビーズに捕捉された。上にＲＮＡを有するバーコード付きビーズを、液滴アクチュエータから回収し、捕捉ＲＮＡをｃＤＮＡライブラリの構築のために処理した。ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、特有のバーコードそれぞれに関連する転写物を決定した。ヒト細胞およびマウス細胞はそれぞれ特有の転写物を含有することから、転写物およびバーコード配列の情報を使用して、各マイクロウェルに関連する細胞タイプまたは複数の細胞タイプを特定した。
【００６３】
図８Ａは、各特有のバーコードについての、ヒト転写物とマウス転写物のリードカウントのグラフ８００を示す。グラフの各ドットは特有のバーコードを表し、これは単一のウェルを表す。単一細胞がマイクロウェルで単離される場合、特定のバーコードに関連する転写物は、ヒト細胞またはマウス細胞の何れかに由来するだろう。クロストーク、例えば、各マイクロウェルに１マウス細胞と１ヒト細胞の場合には、マウスとヒトの両方の転写物が、特定のバーコードに関連するだろう。特定のバーコードに関連するヒト転写物についてのリードカウントを、ｘ軸にプロットする。特定のバーコードに関連するマウス転写物についてのリードカウントを、ｙ軸にプロットする。丸で囲んだ範囲は、特定のバーコードに関連するヒト細胞およびマウス細胞の両方からのリードを示し、これは、クロストーク（つまり、同じマイクロウェルから単離されたヒト転写物とマウス転写物の両方）を示す。この例では、１５８個の特有のバーコードがマウス転写物に関連し、１３７個の特有のバーコードがヒト転写物に関連し、５個の特有のバーコードがヒト転写物およびマウス転写物の混合に関連する。クロストーク率は、約３％で、純度は約９７％である。
【００６４】
図８Ｂは、第２混合種実験における、各特有のバーコードについての、ヒト転写物とマウス転写物のリードカウントのグラフ８０５を示す。実験は、より少ない細胞を使用した以外、本質的には図８Ａに関して上述したように実行した。この例では、５４個の特有のバーコードがマウス転写物に関連し、１８個の特有のバーコードがヒト転写物に関連し、０個の特有のバーコードがヒト転写物およびマウス転写物の混合に関連する。クロストーク率は、約０％で、純度は約９７％である。純度、例えば９７％は、平均して、マウス関連バーコードが９７％のマウス転写物と３％のヒト転写物を含有し；同様に、ヒに関連バーコードが９７％のヒト転写物と３％マウス転写物を含有することを意味する。
【００６５】
細胞サイズおよび捕捉の偏り
細胞サイズの、液滴アクチュエータのマイクロウェルデバイスへの細胞捕捉効率に対する影響を評価するため、２種の細胞、つまり、ヒトＨｅｋ細胞とマウス３Ｔ３細胞を使用した。各細胞種の一定分量を、異なるラベルで染色し、１：１の比率で混合した。細胞を、約１２０μＬの液滴１つと一緒にし、マイクロウェル基板に移送し、次にマイクロ基板から移送した。理想的なケースでは、細胞は、最初の比率に起因して、１：１の比率でマイクロウェルに捕捉される（例えば、３００細胞がマイクロウェルに捕捉され、その半分がマウスで、もう半分がヒトである）。しかしながら、細胞サイズが原因で、偏りが存在する。類似実験では、マイクロウェルに捕捉された、２つの異なるサイズのビーズが、類似した偏りを示した。つまり、より大きい粒子が、より小さい粒子よりもより高い比率で捕捉される。
【００６６】
細胞懸濁液インプットからシーケンシングライブラリアウトプットのために構成された液滴アクチュエータ
図９は、多重単一細胞ライブラリ構築プロトコルを実行する際に使用するのに適切な、液滴アクチュエータの底部基板９００の一例の上面図を図示する。底部基板９００は、例えば、ＰＣＢとすることができる。底部基板９００は、１つまたは複数の単一細胞ライブラリの構築のために、多数の単一細胞を多重処理するように構成された電極配列９１０を含む。液滴操作は、液滴操作表面上の電極配列９１０の上で実行される。この例では、電極配列９１０は、４つの異なる単一細胞シーケンシングライブラリの構築のための専用反応領域において、最大４つの異なるサンプルを並行して処理するように構成されている。
【００６７】
電極配列９１０は、サンプル溶液（例えば、単一細胞懸濁液）をインプットし分配するための、４つのサンプルインプットゾーン９１５（サンプルインプットゾーン９１５ａ〜９１５ｄ）を含む。電極配列９１０は、また、多数の単一細胞を単離し、細胞溶解し、核酸（例えば、ＲＮＡ）を捕捉ビーズ（例えば、バーコード付き捕捉ビーズ）に捕捉するために構成された４つのマイクロウェルアレイ９２０（例えば、マイクロウェルアレイ９２０ａ〜９２０ｄ）を含む。電極配列９１０は、また、単一細胞ライブラリを構築する処理ステップを実行するための、４つの反応ゾーン９２５（例えば、反応ゾーン９２５ａ〜９２５ｄ）を含む。処理ステップには、例えば、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、エキソヌクレアーゼＩ消化、ＰＣＲ増幅、およびＮｅｘｔｅｒａライブラリ調製が含まれる。電極配列９１０は、また、ライブラリアウトプットを収集および回収するための、４つのライブラリアウトプットゾーン９３０（例えば、ライブラリアウトプットゾーン９３０ａ〜９３０ｄ）を含む。
【００６８】
各サンプルインプットゾーン９１５、マイクロウェルアレイ９２０、反応ゾーン９２５、およびライブラリアウトプットゾーン９３０は、液滴操作電極９３５（例えば、エレクトロウェッティング電極）の配列、例えばパスまたはアレイを通して、相互接続している。例えば、サンプルインプットゾーン９１５ａ、マイクロウェルアレイ９２０ａ、反応ゾーン９２５ａ、およびライブラリアウトプットゾーン９３０ａは、液滴操作電極９３５の配列を通して相互接続している。各サンプルインプットゾーン９１５、マイクロウェルアレイ９２０、反応ゾーン９２５、ライブラリアウトプットゾーン９３０、および液滴操作電極９３５の配列は、４つの異なるサンプルを処理するために、底部基板９００上に専門領域を提供する。
【００６９】
液滴アクチュエータ上でのマイクロウェルアレイの製作
マイクロウェルアレイは、液滴アクチュエータの底部基板上に直接作ることができる。一例では、マイクロウェルアレイは、液滴アクチュエータの底部基板の確定した範囲に形成される。
【００７０】
図１０Ａ〜１０Ｃは、液滴アクチュエータの底部基板のマイクロウェルアレイを作るプロセス１０００の例を図示する。ここでは図１０Ａを参照し、底部基板１０１０が提供される。この例では、底部基板１０１０はＰＣＢである。ＰＣＢ材料は、例えば、ＲＩＥを有するポリイミドとすることができる。底部基板１０１０の上に、ポリイミド層１０１５がある。一例では、ポリイミド層１０１５の厚さは、約３０μｍである。ポリイミド層１０１５の上に疎水性層１０２０がある。一例では、ポリイミド層１０１５はＫａｐｔｏｎ層であり、疎水性層１０２０はＣＹＴＯＰ層である。
【００７１】
第１ステップでは、ここでは図１０Ｂを参照して、マスク１０２５（例えば、フォトレジストマスク）が、円形空隙１０３０のアレイを定義するために使用される。別の例では、マスク１０２５は金属マスクである。一例では、円形空隙１０３０は、約８０μｍのピッチで、直径は約５０μｍである。円形空隙１０３０の密度は、約１５０個の円／ｍｍ２である。別の例では、円形空隙１０３０のサイズ範囲は、約６０μｍ〜約１００μｍのピッチ範囲で、直径は約３０μｍ〜約５０μｍである。円形空隙１０３０の密度範囲は、約１００個の円／ｍｍ２〜約１０００個の円／ｍｍ２である。
【００７２】
次のステップでは、ここでは図１０Ｃを参照して、エッチングプロセスを使用して、マスク１０２５を通して露光される疎水性層１０２０およびポリイミド層１０１５の一部から材料を除去することにより、マイクロウェル１０３５が形成される。一例では、エッチングプロセスは、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）プロセスである。この例では、マイクロウェル１０３５は、例えば、約２．５μｍの深さまでエッチングされる。
【００７３】
次のステップでは、ここでは図１０Ｄを参照して、マスク１０２５が除去される。
【００７４】
別の例では、マスク１０２５（例えば、フォトレジストマスク）が別の適切な材料（例えば、金属マスク）と置き換えられ、代わりの製作プロセスが使用されて、ポリイミド層１０１５と底部基板１０１０が約３０μｍ〜約５０μｍの全深さまでエッチングされた、マイクロウェルアレイを形成する。
【００７５】
別の例では、ポリイミド層１０１５は、ＤｕＰｏｎｔ社（デラウェア州ウィルミントン）から入手可能なＰｙｒａｌｕｘ（登録商標）ＰＣ１０００などの感光性物質と置き換えられる。Ｐｙｒａｌｕｘ（登録商標）ＰＣ１０００層の厚さは約５０μｍである。次に、フォトリソグラフィプロセスを使用して、深さが約３０μｍ〜約５０μｍ、ピッチが約１００μｍ、直径が約５０μｍのマイクロウェルアレイが定義され、作成される。次に、ＣＹＴＯＰ層（例えば、疎水性層１０２０）が、感光性層の残りの表面の表面に形成される。
【００７６】
さらに別の実施形態では、マイクロウェル１０３５が、ポリマーフィルム層（例えば、ポリイミド層１０１５）に刻み込むことにより形成される。一例では、ポリマーフィルムはＫａｐｔｏｎである。別の例では、ポリマーフィルムは環状オレフィンである。一例では、刻印プロセスは、ロール・ツー・ロールプロセスであり、これを使用して、ポリマー基板にマイクロウェル構造を作成する。
【００７７】
さらに別の実施形態では、マイクロウェル１０３５が、従来のホットエンボスプロセスを使用してポリマーフィルム層（例えば、ポリイミド層１０１５）に形成されて、ポリマー基板にマイクロウェル構造を作成する。
【００７８】
さらに別の実施形態では、マイクロウェル１０３５が、ポリマーフィルム層（例えば、ポリイミド層１０１５）の上に配置された樹脂層に形成される。この例では、刻印処理またはエンボス処理が次に使用されて、マイクロウェル構造（例えば、マイクロウェル１０３５）を作成する。続いて、樹脂層は、例えば、熱または光の処置を使用して硬化されて、ポリマーフィルムの頂部に剛性のマイクロウェル構造を作る。続いて、フィルムが、電極を含有するデジタルマイクロ流体ＰＣＢ上に積層され、疎水性層、例えばＣＹＴＯＰが、ポリマー層の上に堆積される。マイクロウェルを形成するプロセスにおいて、熱開始パターン転写および／またはＵＶ開始パターン転写を使用するロール・ツー・パネルプロセスなどのさらに他のプロセスも使用可能である。
【００７９】
細胞トラップ構造の組み込み
一部の実施形態では、本明細書に記載するデバイスは、液滴操作を実行するための表面または間隙を形成するように構成された、１つまたは複数の基盤を有する液滴アクチュエータを含む。その１つまたは複数の基板は、液滴操作を行うために液滴操作表面または間隙を成し、また、液的操作を行うために配列された電極を含み得る。本明細書に記載の一部の実施形態では、マイクロウェルデバイスは、マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数のマイクロウェルを有する第１基板を含む。一部の実施形態では、デバイスは、さらに、マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する複数の細胞トラップを含む第２基板を含む。一部の実施形態では、細胞トラップは、第１基板上のマイクロウェルに近接し、さらに該マイクロウェルに対し開口して、第２基板上に位置する。一部の実施形態では、頂部基板上の細胞トラップは、それぞれ、デバイスの底部基板上のマイクロウェルの上方に位置する。
【００８０】
細胞トラップは、Di Carlo, et al., “Dynamic single cell culture array,” Lab Chip 2006, 6, 1445-1449に記載されているような構造を含み、カップ型、Ｕ型、またはブリッジ型、またはそれらの組み合わせなどの、任意の適切な形とすることができる。細胞トラップの寸法（幅、長さ、深さ）は、標的対象細胞のサイズに従って、容易に最適化することができる。細胞トラップは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの任意の適切な材料で作ることができ、ガラスまたは他の適切な材料であり得る第２基板上に成型することができる。一部の実施形態では、細胞トラップは、非対称的にずれた列で配列されている。トラッピングアレイデバイス用の型は、ネガティブフォトレジストまたは当技術分野で既知の他の適切な方法を使用して、作ることができる。
【００８１】
図１８Ａ〜１８Ｂは、対象細胞を、マイクロウェルの上方で、ビーズを含有する底部基板に物理的に閉じ込めることを可能にする、頂部プレートに細胞トラップ構造を有するデジタルマイクロ流体工学デバイスを図示する。図１８Ａは、ビーズと細胞が共局在化したデバイスの側面図を提供する。開口長方形は、頂部基板１７１０に取り付けられた細胞トラップ構造であり、薄灰色ドットは、そのような構造に捕えられた細胞であり、黒ドットは、底部基板１１０上のマイクロウェル内の捕捉ビーズ５２５である。両基板とも、液滴操作間隙２１５上で開口する。底部基板１１０は、液滴操作電極２２０（例えば、エレクトロウェッティング電極）の配列を含む。図１８Ｂは、そのようなデバイスの上面図を図示し、頂部基板上の細胞トラップ構造は、底部基板上のマイクロウェルに、捕えられた細胞とビーズを共局在化させるように機能する。
【００８２】
不混和相を用いたサンプル−ウェルの「キャッピング」またはカプセル化
本発明は、マイクロウェルアレイに個々の反応をコンパートメント化するためのマイクロチャネルデバイスおよび方法を提供する。マイクロチャネルデバイスは、マイクロチャネルが、単一の端または面に沿って、各マイクロウェルと交わるように、マイクロチャネルの底に形成されたマイクロウェルアレイを含む。各マイクロウェルは、水性反応混合物で充填され、次に、各マイクロウェル（および中の内容物）が、他のマイクロウェルそれぞれから単離されるように不混和相（例えば、オイル）で「キャッピング」され得る、反応コンパートメントである。一実施形態では、反応混合物は、個々の反応コンパートメントにおけるカプセル化のために、ある量の単一細胞を含む。
【００８３】
図１１Ａ〜１１Ｅは、マイクロチャネルデバイスの斜視図を図示し、不混和相でマイクロウェルアレイをキャッピングして単離反応コンパートメントを形成する、プロセス１１００を示す。プロセス１１００は、限定するわけではないが、以下のステップを含み得る。
【００８４】
一ステップでは、ここでは図１１Ａを参照して、マイクロチャネルデバイス１１１０は、マイクロチャネル１１１５を含む。マイクロチャネル１１１５の底部表面に形成されるのは、マイクロウェル１１２０のラインまたはアレイである。一例では、マイクロウェル１１２０は円形ウェルである。別の例では、マイクロウェル１１２０は、長方形の形をしている。
【００８５】
他のステップでは、ここでは図１１Ｂおよび１１Ｃを参照して、反応混合物１１２５を、マイクロチャネル１１１５に流し、マイクロチャネル１１１５およびマイクロウェル１１２０を充填する。一例では、反応混合物１１２５は、後続の処理ステップのために個々のマイクロウェル１１２０にカプセル化される、ある量の単一細胞（図示せず）を含む。一例では、単一細胞は、単一細胞ゲノムプロトコルにおける処理のために、個々のマイクロウェル１１２０においてカプセル化される。反応混合物１１２５は、単一細胞（図示せず）が（重力により）マイクロウェル１１２０に沈降するのに十分な時間の間、マイクロチャネルデバイス１１１０に残される。マイクロウェル１１２０における細胞（図示せず）の捕捉率は、反応混合物中の単一細胞の初期濃度、および、反応混合物１１２５がマイクロチャネルデバイス１１１０に保持される時間の量の関数である。
【００８６】
他のステップでは、ここでは図１１Ｄおよび１１Ｅを参照して、不混和相１１３０を、マイクロチャネル１１１５に装填する。一例では、不混和相１１３０はオイルである。不混和相１１３０がマイクロチャネル１１１５に装填されると、反応混合物１１２５がマイクロチャネル１１１５から移動させられ、反応混合物１１２５はマイクロウェル１１２０に保持される。その際に、マイクロウェル１１２０は、そこで各マイクロウェル１１２０が他の全てのマイクロウェル１１２０から単離され、後続の反応（例えば、逆転写またはＰＣＲ増幅）が単離されたコンパートメントにおいて実行されるように、不混和相１１３０で「キャッピング」される。各マイクロウェル１１２０における反応生成物は、例えば、第２水相溶液（図示せず）を流し、収集することにより、回収することが可能である。
【００８７】
図１２Ａおよび１２Ｂは、例えば、図１１Ａ〜１１Ｅのマイクロチャネルデバイス１１１０の一部の上面図であり、完全に装填されたマイクロチャネルおよび関連するマイクロウェルと、オイル注入後の「キャッピングされた」マイクロウェルをそれぞれ示す。
【００８８】
図１３は、長方形の形をしたマイクロウェルを含むマイクロチャネルデバイス１３００の一部の上面図である。この例では、マイクロウェルは、水性溶液で充填され、不混和相（例えば、オイル）でキャッピングされる。
【００８９】
図１４は、平行性の高いマイクロチャネルアレイ１４００の一部の上面図である。
【００９０】
代わりの実施形態では、本開示は、マイクロウェルアレイを、細胞トラップアレイと一緒に使用して個々の反応をコンパートメント化するための、マイクロチャネルデバイスおよび方法を提供する。マイクロチャネルデバイスは、マイクロチャネルが単一の端または面に沿って各マイクロウェルと交わるように、マイクロチャネルの底に形成されたマイクロウェルアレイを含む。マイクロチャネルデバイスは、マイクロチャネルが第２の端または面に沿って各細胞トラップと交わるように、マイクロチャネルの天井に形成された細胞トラップ構造アレイを含む。各マイクロウェル／細胞トラップ位置は反応コンパートメントであり、これは、各マイクロウェル／細胞トラップユニット（および中の内容物）が他のマイクロウェル／細胞トラップユニットそれぞれから単離されるように、水性反応混合物で充填され、次に、不混和相（例えば、オイル）でカプセル化され得る。例えば、水性媒体を使用して、いったん細胞およびビーズが、細胞トラップおよびマイクロウェルそれぞれに共局在化したら、不混和性流体をシステムに導入して、水性媒体を移動させることができる。マイクロウェル／細胞トラップユニットの位置における頂部基板と底部基板の間の間隙の縮小により、その位置で水性媒体が移動することを防止する。図１９Ａ〜１９Ｂに示すように、細胞は、頂部基板１７１０上の細胞トラップに装填されており、ビーズ５２５は、底部基板１１０上のマイクロウェルに装填されている。オイルは、マイクロチャネル２１５を通して装填され、水相液滴を移動させ、ビーズ／細胞対のカプセル化を生じさせる。図１９Ａは、マイクロチャネルに装填されたオイル（灰色で影をつけた範囲）は、マイクロウェル／細胞トラップ位置を囲むが、それを充填することはなく、細胞、ビーズ、および水性媒体を、オイルの囲いを有する単一水性マイクロチャンバ内にカプセル化またはコンパートメント化されたままにすることを図示する。図１９Ｂは、オイルがマイクロウェル／トラップを囲み、細胞およびビーズを一緒に水性マイクロチャンバ内にカプセル化する、オイルが装填されたデバイスの上面図を図示する。
【００９１】
例示的な実施形態では、図２０Ａ〜Ｄは、細胞トラップ構造上で捉えられた球体の、トラッピングとオイルカプセル化を図示する。図２０Ａは、図１８のようにデバイスに捕えられた、可視化を可能にするために細胞の代わりとして使用した１０μｍの蛍光マイクロスフェアの蛍光画像（白い円）である。図２０Ｂは、細胞トラップ構造上に位置する蛍光粒子の蛍光画像と白色光の重ね合わせを示す。図２０Ｃは、オイルがチャネルに流れ込んで、トラップ構造の形によく似た単離水性液滴の形成をもたらし、次に球体がカプセル化されることを示す。細胞トラップ構造の所でのデバイスの頂部表面と底部表面の間の間隙高さは、周囲空間の間隙高さよりも低く、オイルは、ゆっくりした流速条件下では、これらの間隙から水を移動させることはできない。図２０Ｄは、チャネルを通してオイルをフラッシュさせた後の、オイルに囲まれた単離水性チャンバを示す。球体は、水性液滴内にカプセル化されている。
【００９２】
「陽性」ウェル
図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、および１５Ｄは、「陽性」ウェル構造１５００の例を示す。上記に記載したウェル設計の大部分は、基板にくぼみが形成された形状を含む。くぼんだウェルで、水性流体は、表面エネルギー差（２３５ｖｓ２３０）を含んで、または、表面エネルギー差なしで（１４００）、捕えられ／単離され／コンパートメント化され得る。これらの場合では、捕えられた流体の塊は、基板の表面に、または表面の下方にある。しかしながら、表面エネルギーに実質的な差がある場合、ごくわずかなくぼみでもまたはくぼみがなくても（つまり、「陽性」ウェル）、同様の効果を達成することが可能であり、この場合、捕えられた流体の塊は、基板表面の高さか、またはそれよりも上方にあるだろう。
【００９３】
陽性ウェル構造１５００は、ガラス、酸化ケイ素、および／または、親水性処置済みポリマーなどの、親水性層１５１０を含む。疎水性層１５１２、例えば、ＣＹＴＯＰ、パリレン、および／またはＦＯＴＳの層は、親水性層１５１０の上にある。空隙が疎水性層１５１２に形成されることにより、「陽性」ウェル１５１４（つまり、くぼんだ深さはほとんどないが、表面エネルギー差はある）は形成され、ここで、親水性層１５１０の一部が露出する。より大きい水性液滴またはボーラス１５１３が「陽性」ウェル１５１４を通過すると、水性液滴またはボーラス１５１３の一部が、「陽性」ウェル１５１４内のより小さい単離体積１５３０として捕えられたままになろう。
【００９４】
ここで、図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃを参照すると、例えば、細胞１５２０および／またはビーズ１５２２の、「陽性」ウェル１５１４内での捕捉を促進するために、「陽性」ウェル１５１４の表面を、細胞１５２０および／またはビーズ１５２２に対し親和性を有する化学物質でコーティングすることが可能である。加えて、親水性トラップ機能１５１６の対を、親水性層１５１０の上と「陽性」ウェル１５１４内に形成することが可能である。つまり、ある親水性トラップ機能１５１６を使用して、細胞１５２０および／またはビーズ１５２２を、それらが「陽性」ウェル構造１５００に流された際に、物理的に捕えることが可能である。例えば、装填液滴１５１３が複数の細胞１５２０および／またはビーズ１５２２を含有する場合、その液滴が「陽性」ウェル１５１４の上を流れると、親和性化学物質が細胞１５２０および／またはビーズ１５２２に結合して、それらを「陽性」ウェル１５１４に維持するか、または、適切な形状（ここでは、捕捉される細胞１５２０および／またはビーズ１５２２のサイズより小さいテーパーで示される）の親水性トラップ機能１５１６が、１つまたは複数の細胞１５２０および／またはビーズ１５２２を、「陽性」ウェル１５１４内に捕えることが可能である。
【００９５】
システム
図１７は、流体カートリッジの一例である液滴アクチュエータ１７０５を含むマイクロ流体工学システム１７００の一例の機能ブロック図である。デジタルマイクロ流体技術は、液滴アクチュエータ１７０５などの液滴アクチュエータの別個の液滴に対し、その表面張力の電気制御（エレクトロウェッティング）により、液滴操作を行う。液滴は、液滴アクチュエータ１７０５の２つの基板、液滴操作間隙により分離された底部基板と頂部基板の間に挟まれ得る。底部基板は、電気的にアクセス可能な電極の配列を含み得る。頂部基板は、例えば、導電性インクまたは酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）からできた基準電極面を含み得る。底部基板および頂部基板は、疎水性材料でコーティングされ得る。液滴操作は、液滴操作間隙において実行される。液滴周りの空間（つまり、底部基板と頂部基板の間の間隙）は、液滴の蒸発を防ぎ、デバイス内での液滴の移送を容易にするように、シリコンオイルなどの不混和性の不活性流体で充填され得る。他の液滴操作は、電圧活性化のパターンを変えることにより生じさせることができ；例としては、液滴の混成、分割、混合、および分配が挙げられる。
【００９６】
液滴アクチュエータ１７０５は、マイクロ流体工学システム１７００の機器デッキ（図示せず）に合うように設計され得る。機器デッキは、液滴アクチュエータ１７０５を保持し、他の液滴アクチュエータ機能、例えば、限定するわけではないが、１つまたは複数の磁石および１つまたは複数の加熱デバイスなどを収容することができる。例えば、機器デッキは、永久磁石であり得る１つまたは複数の磁石１７１０を収容することができる。任意選択的に、機器デッキは、１つまたは複数の電磁石１７１５を収容し得る。磁石１７１０および／または電磁石１７１５は、磁気応答性ビーズの固定のために、液滴アクチュエータ１７０５に対して位置付ける。任意選択的に、磁石１７１０および／または電磁石１７１５の位置は、モータ１７２０により制御され得る。加えて、機器デッキは、例えば、液滴アクチュエータ１７０５の反応ゾーンおよび／または洗浄ゾーン内の温度を制御するために、１つまたは複数の加熱デバイス１７２５を収容し得る。一例では、加熱デバイス１７２５は、液滴アクチュエータ１７０５に対し、その熱制御を提供するために位置付けられる、ヒーターバーであり得る。
【００９７】
マイクロ流体工学システム１７００のコントローラ１７３０は、本明細書に記載する装置の種々のハードウェアコンポーネント、例えば、液滴アクチュエータ１７０５、電磁石１７１５、モータ１７２０、および加熱デバイス１７２５、ならびに、検出器１７３５、インピーダンス感知システム１７４０、および任意の他のインプットおよび／またはアウトプットデバイス（図示せず）に、電気的に連結している。コントローラ１７３０は、マイクロ流体工学システム１７００の操作全体を制御する。コントローラ１７３０は、例えば、汎用コンピュータ、特殊用途コンピュータ、パーソナル・コンピュータ、または、他のプログラム可能なデータ処理装置であり得る。コントローラ１７３０は、ソフトウェア命令を記憶し、解釈し、および／または実行し、ならびに、システムの操作全体を制御するなどの処理能力を提供するように機能する。コントローラ１７３０は、データおよび／またはこれらのデバイスの電力状況を制御するように構成およびプログラムされ得る。例えば、一態様では、液滴アクチュエータ１７０５に関し、コントローラ１７３０は、電極を作動させる／作動を停止させることにより、液滴操作を制御する。
【００９８】
コントローラ１７３０は、プログラム命令を実行して本明細書に記載のプロセスを実施するように構成される。コントローラ１７３０は、液滴アクチュエータに指示して、サンプル液滴をマイクロウェルデバイスに移送する。サンプル液滴は、マイクロウェルに入り込む対象細胞を含む。コントローラ１７３０は、さらに、システムを操って捕捉ビーズをマイクロウェルに導入し、コントローラは、液滴アクチュエータに、細胞溶解試薬液滴をマイクロウェルデバイスに移送することを指示し、前記捕捉ビーズには、捕捉エレメントが固定されている。溶解試薬液滴の一部がマイクロウェルに入り込み、インキュベーション期間中に対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される。コントローラ１７３０は、液滴アクチュエータに、サンプル液滴をマイクロウェルデバイスから移送することを指示する一方、マイクロウェルに捕捉された対象細胞の少なくとも一部を残す。コントローラ１７３０は、上に分析物を捕捉した捕捉ビーズを、マイクロウェルから取り除くように、システムのコンポーネントに指示する。例えば、コントローラ１７３０は、捕捉ビーズをマイクロウェルから引き寄せる磁場を形成するように、（マイクロウェルに近接して位置付けられた）磁石１７１０および／または電磁石１７１５に指示する。任意選択的に、コントローラ１７３０は、磁石１７１０および電磁石１７１５を操って磁場を利用して、捕捉ビーズをマイクロウェルに動かし、マイクロウェルから動かす。
【００９９】
一部の実施形態では、システムコントローラは、プログラム命令を実行して、インキュベーションの期間中および／または期間前に、液滴アクチュエータに、細胞溶解試薬液滴と不混和性である流体をマイクロウェルデバイスに移送することを指示し、その不混和性流体は、マイクロウェルにも細胞トラップにも入り込まず、それにより、単一ビーズと単一細胞を細胞溶解試薬と共にカプセル化するように、さらに構成される。
【０１００】
一例では、検出器１７３５は、液滴アクチュエータ１７０５に対して位置付けられる画像化システムであり得る。一例では、画像化システムは、１つまたは複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）（つまり、照明光源）と、デジタル画像取込デバイス、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを含み得る。特定の試薬または使用ラベルに適した装置を使用して、検出を実行することが可能である。例えば、光検出器、例えば、蛍光検出器、吸光度検出器、発光検出器などを使用して、適切な光ラベルを検出することが可能である。アレイによる検出向けに設計されたシステムが、特に有用である。例えば、本明細書に記載する方法で使用する光システムは、２０１２年８月１４日に発行され、「Systems and Devices for Sequence by Synthesis Analysis」と題された、Banerjee et al.の米国特許第８２４１５７３号明細書,；２００８年２月１２日に発行され、「Confocal Imaging Methods and Apparatus」と題された、Feng et al.の米国特許第７３２９８６０号明細書；２０１１年１０月１８日に発行され、「Compensator for Multiple Surface Imaging」と題された、Feng et al.の米国特許第８０３９８１７号明細書；２００９年１１月５日に公開され、「Compensator for Multiple Surface Imaging」と題された、Feng et al.の米国特許出願公開第２００９０２７２９１４号明細書；および、２０１２年１０月２５日公開され、「Systems, Methods, and Apparatuses to Image a Sample for Biological or Chemical Analysis」と題された、Reed et al.の米国特許出願公開第２０１２０２７０３０５号明細書（これらの全体の開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている種々のコンポーネントおよびアセンブリを含むように構築され得る。このような検出システムは、核酸シーケンシング実施形態に対し特に有用である。
【０１０１】
インピーダンス感知システム１７４０は、液滴アクチュエータ１７０５の特定の電極でのインピーダンスを検出するための任意の回路であり得る。一例では、インピーダンス感知システム１７４０は、インピーダンス分光計であり得る。インピーダンス感知システム１７４０を使用して、液滴を有するまたは有さない、任意の電極、例えば、任意の液滴操作電極などの静電容量負荷を監視することができる。適切な静電容量検出技法の例としては、２００９年１２月３０日に公開され、「Capacitance Detection in a Droplet Actuator」と題された、Sturmer et al.の国際公開第２００８／１０１１９４号；２００４年２月２６日に公開され、「System and Method for Dispensing Liquids」と題された、Kale et al.の国際公開第２００２／０８０８２２号を参照されたい（これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれるものとする）。
【０１０２】
液滴アクチュエータ１７０５は、破壊デバイス１７４５を含み得る。破壊デバイス１７４５は、液滴アクチュエータ内の物質、例えば、組織、細胞、および胞子の破壊（溶解）を促進する任意のデバイスを含み得る。破壊デバイス１７４５は、例えば、超音波処理機構、加熱機構、機械的せん断機構、ビーズ叩き機構、液滴アクチュエータ１７０５に組み込まれた物理的機能、電界発生機構、熱サイクル機構、およびこれらの組み合わせであり得る。破壊デバイス１７４５は、コントローラ１７３０により制御され得る。
【０１０３】
一部の実施形態では、本開示は、対象細胞を捕捉するためのデジタル流体工学システムを企図し、該システムは：（ａ）液滴操作間隙を含む液滴アクチュエータであって、前記液滴操作間隙に近接して配列された液滴操作電極を含む、液滴アクチュエータと；（ｂ）（１）第１基板と（２）第２基板を含むマイクロウェルデバイスであって、前記マイクロウェルデバイスは、前記第１基板に形成されたマイクロウェルを含み、前記マイクロウェルは、前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口し、前記マイクロウェルデバイスは、液滴アクチュエータに連結し、前記液滴操作間隙に面するように位置付けられ、前記マイクロウェルデバイスは前記第２基板に形成された細胞トラップを含み、前記細胞トラップは、前記マイクロウェルデバイスの液滴操作表面上で開口する、マイクロウェルデバイスと；（ｃ）プログラム命令を実行して：（１）前記液滴アクチュエータに、前記細胞トラップに入り込む対象細胞を含むサンプル液滴をマイクロウェルデバイスに移送し；（２）前記マイクロウェルに捕捉ビーズを導入し；（３）前記液滴アクチュエータに、細胞溶解試薬液滴を前記マイクロウェルデバイスに移送することを指示するように構成されたコントローラであって、前記捕捉ビーズには捕捉エレメントが固定されており、前記溶解試薬液滴の一部が細胞トラップおよびマイクロウェルに入り込み、インキュベーション期間中に、前記対象細胞に分析物を放出させ、該分析物は、前記捕捉ビーズ上の捕捉エレメントにより捕捉される、コントロールとを含む。
【０１０４】
システムの一部の実施形態では、第１基板は、その上に疎水性層が配置され、その疎水性層は、液滴操作表面を形成する。一部の実施形態では、マイクロウェルは、捕捉ビーズを１つのみ収容するように作られたサイズとピッチを有する。
【０１０５】
本開示の種々の態様は、方法、システム、コンピュータ可読媒体、および／またはコンピュータプログラム製品として具現化され得る。本開示の態様は、ハードウェア実施形態、ソフトウェア実施形態（ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコードなどを含む）、または、ソフトウェア態様とハードウェア態様を組み合わせた実施形態の形態をとり得、これらは全て、概して、本明細書では、「回路」、「モジュール」、または「システム」ということができる。さらに、本開示の方法は、コンピュータ使用可能記憶媒体上の、その媒体において具現化されるコンピュータ使用可能プログラムコードを有するコンピュータプログラム製品の形態をとり得る。
【０１０６】
任意の適切なコンピュータ使用可能媒体を、本開示のソフトウェア態様に利用することができる。コンピュータ使用可能媒体またはコンピュータ可読媒体は、例えば、限定するわけではないが、電子的、磁気的、光学的、電磁気的、赤外的又は半導体の、システム、機器、デバイス又は伝達媒体であり得る。コンピュータ読取可能媒体は、一時的な実施形態を含み得る。コンピュータ可読媒体のより具体的な例（非包括的リスト）には、以下の：１本もしくは複数のワイヤを有する電気的接続、ポータブルコンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読取専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラム可能読取専用メモリ（ＥＰＲＯＭもしくはフラッシュメモリ）、光ファイバ、ポータブルコンパクトディスク読取専用メモリ（ＣＤ?ＲＯＭ）、光学記憶デバイス、インターネットもしくはイントラネットをサポートするもの等の伝送媒体、または磁気記憶デバイスのうち、いくつかまたは全てが含まれるであろう。例えば、紙または他の媒体の光学的スキャンを介してプログラムを電子的に捕捉し、次いで、必要に応じて、コンパイルし、解釈し、または別様に好適な様式で処理し、次いで、コンピュータメモリに記憶することができるため、コンピュータ使用可能媒体またはコンピュータ可読媒体は、プログラムが印刷された紙または別の好適な媒体ですらあり得ることに留意されたい。本明細書の文脈では、コンピュータ使用可能媒体またはコンピュータ可読媒体は、命令実行のシステム、装置、またはデバイスで使用するためまたはそれらに関連したプログラムを含有する、記憶する、伝達する、伝搬する、または輸送することが可能な、任意の媒体であり得る。
【０１０７】
本明細書に記載する方法および装置の操作を実行するためのプログラムコードは、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、またはＣ＋＋等のオブジェクト指向プログラミング言語で書かれ得る。しかしながら、本明細書に記載する方法および装置の操作を実行するためのプログラムコードは、また、「Ｃ」プログラミング言語または類似のプログラミング言語などの従来の手続き型プログラミング言語で書かれてもよい。プログラムコードは、プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、またはプログラムコードを実行する他のコンポーネントによって実行され得る。プログラムコードは、単に、メモリ（上記で論じたコンピュータ可読媒体など）に記憶されるソフトウェアアプリケーションということができる。プログラムコードは、プロセッサ（または任意のプロセッサ制御デバイス）にグラフィカルユーザインターフェース（「ＧＵＩ」）を生成させることができる。グラフィカルユーザインターフェースはディスプレイ装置に視覚的に生成され得、さらにグラフィカルユーザインターフェースは可聴機能を有し得る。しかしながら、プログラムコードは、任意のプロセッサ制御デバイス、例えばコンピュータ、サーバ、携帯情報端末、電話機、テレビ、またはプロセッサおよび／もしくはデジタル信号プロセッサを利用する任意のプロセッサ制御デバイスなどで動作し得る。
【０１０８】
プログラムコードはローカルでおよび／またはリモートで実行され得る。プログラムコードは、例えば、プロセッサ制御デバイスのローカルメモリに完全にまたは部分的に記憶され得る。しかしながら、プログラムコードは、また、少なくとも部分的に遠隔に記憶され、アクセスされ、プロセッサ制御デバイスにダウンロードされ得る。ユーザのコンピュータは、例えば、プログラムコードを完全に実行する場合も、プログラムコードを部分的にのみ実行する場合もある。プログラムコードは、少なくとも部分的にユーザのコンピュータ上にある、および／または、リモートコンピュータ上で部分的に実行されるか、もしくは完全にリモートコンピュータもしくはサーバ上にある、独立型ソフトウェアパッケージであり得る。後者のシナリオでは、リモートコンピュータは、通信ネットワークを通してユーザのコンピュータに接続され得る。
【０１０９】
本明細書に記載する方法および装置は、ネットワーク環境にかかわらず適用され得る。通信ネットワークは、高周波ドメインおよび／またはインターネットプロトコル（ＩＰ）ドメイン内で動作するケーブルネットワークであり得る。しかしながら、通信ネットワークには、また、インターネット（あるいは時に「ワールドワイドウェブ」として知られているもの）、イントラネット、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、および／または広域ネットワーク（ＷＡＮ）などの分散コンピューティングネットワークも含まれ得る。通信ネットワークには、同軸ケーブル、銅線、光ファイバーライン、および／またはハイブリッド同軸ラインが含まれ得る。通信ネットワークには、電磁スペクトルの任意の部分および任意の信号規格（例えばＩＥＥＥ８０２標準ファミリ、ＧＳＴＭ／ＣＤＭＡ／ＴＤＭＡまたは任意の無線規格、および／またはＩＳＭバンド）を利用する無線部分さえ含まれ得る。通信ネットワークには、信号が電気配線によって伝達される、パワーライン部さえ含まれ得る。本明細書に記載する方法および装置は、物理的コンポーネント、物理的構成、または通信規格に関わらず、任意の無線／有線通信ネットワークに適用され得る。
【０１１０】
本開示のある態様を、種々の方法および方法のステップに関して説明する。それぞれの方法のステップは、プログラムコードおよび／または機械命令によって実行され得ることが理解されよう。プログラムコードおよび／または機械命令は、当該方法で特定される機能／行為を実行する手段を作成し得る。
【０１１１】
プログラムコードは、また、コンピュータ読取可能メモリに記憶され得、前記プログラムコードは、コンピュータ読取可能メモリに記憶されたそのプログラムコードが、本方法の種々の態様を実行する命令手段を含む製品を製造または変換するように、プロセッサ、コンピュータ、または他のプログラム可能なデータ処理機器に特定の方法で動作するように指示することが可能である。
【０１１２】
プログラムコードは、また、コンピュータまたは他のプログラム可能データ処理装置に搭載されて、一連の操作ステップを実行させてプロセッサ／コンピュータ実装プロセスを生成し、その結果、プログラムコードは、本開示の方法で特定する種々の機能／行為を実行するためのステップを提供することができる。
【０１１３】
結論
前述の実施形態の詳細な説明は、本開示の具体的な実施形態を図示する添付の図面を参照する。異なる構造および操作を有する他の実施形態も、本発明の範囲から逸脱しない。「本発明」などの用語は、本明細書に記載する本出願人の発明の多くの別の態様または実施形態のある具体例に関して使用され、その使用も非存在も、本出願人の発明の範囲または特許請求の範囲を限定することを目的としていない。本明細書は、読者の便宜上のためだけに、節に分割されている。見出しは、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。定義は、本発明の説明の一部として意図される。本発明の種々の詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更され得ることが理解されよう。さらに、前述の説明は、例示を目的とするのみであり、限定を目的としない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【国際調査報告】
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