(57)【要約】本発明は、（ａ）腫瘍崩壊性ウイルス及び（ｂ）チェックポイント阻害剤を含む、同時、別々又は逐次的な使用のための組合せに、並びにがんの処置のためのその使用に関する。【選択図】  なし
2019501205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする哺乳動物においてがんを処置及び／若しくは予防するか、又は抗腫瘍応答を延長する方法であって、前記哺乳動物に（ａ）複製可能な腫瘍崩壊性ラブドウイルス及び（ｂ）１つ又は複数のチェックポイント阻害剤を含む組合せの有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記チェックポイント阻害剤が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、融合タンパク質又はその組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チェックポイント阻害剤が：細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ヘルペスウイルス侵入媒介物（ＨＶＥＭ）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ガレクチン９（ＧＡＬ９）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）並びにその組合せからなる群から選択されるチェックポイントタンパク質を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１を阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４を阻害し、イピリムマブ及びトレメリムマブから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−１を阻害し、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ラムブロリズマブ及びＡＭＰ−２２４から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−Ｌ１を阻害し、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ３３２８０Ａ、Ｍ１Ｈ１、アテゾリズマブ、デュルバルマブ及びアベルマブから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスが、少なくとも２つのチェックポイント阻害剤と組み合わせて前記哺乳動物に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルス及び前記チェックポイント阻害剤が同時に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルス及び前記チェックポイント阻害剤が逐次的に投与され、チェックポイント阻害剤の第１の投与が腫瘍崩壊性ウイルスの第１の投与の前に行われ、好ましくは腫瘍崩壊性ウイルスの第１の投与から３０日以内に行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスが腫瘍関連抗原を発現する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍関連抗原が、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原、がん精巣抗原１及びその変異体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物が前記腫瘍関連抗原に対する既存の免疫を有する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物の既存の前記免疫が、前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスを投与する前に前記哺乳動物に前記腫瘍関連抗原を投与することによって確立される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物の既存の前記免疫が、前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスを投与する前に前記哺乳動物に前記腫瘍関連抗原をコードする発現ベクターを投与することによって確立される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、プラスミド及び負荷抗原提示細胞から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスが腫瘍崩壊性ベシクロウイルスである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスが野生型又は遺伝子改変ＶＳＶ又はマラバ株ラブドウイルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスがＶＳＶｄｅｌｔａ５１又はマラバＭＧ１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスがマラバＭＧ１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスが、１０６〜１０１４ｐｆｕ、１０６〜１０１２ｐｆｕ、１０８〜１０１４ｐｆｕ、１０８〜１０１２又は１０１０〜１０１２ｐｆｕの１つ又は複数の用量として投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍崩壊性ラブドウイルスが血管内に投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記がんが、結腸直腸がん、肺がん、メラノーマ、膵臓がん、卵巣がん、腎細胞癌、子宮頸がん、肝がん、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、胃食道接合部がん、脳がん及び軟部組織肉腫である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記がんが、ＥＲ／ＰＲ−ＨＥＲ２＋乳がん、三重陰性乳がん、ＥＲ及び／若しくはＰＲ＋ＨＥＲ２＋乳がん、扁平上皮若しくは非扁平上皮非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）又は胃食道接合部がんである、請求項２３に記載の方法。
［請求項２４］
前記チェックポイント阻害剤が抗体又は融合タンパク質であり、．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜８ｍｇ／ｋｇ、３〜７ｍｇ／ｋｇ、４〜５ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの１つ又は複数の用量として投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記チェックポイント阻害剤が１週につき少なくとも３回、１週につき少なくとも４回、１週につき少なくとも５回、毎週、隔週、１週おき又は３週おきに投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記がんが前記腫瘍関連抗原を発現する、請求項１１〜２２及び２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍関連抗原がＭＡＧＥ−Ａ３である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
それを必要とするヒトにおいてがんを処置及び／若しくは予防するか、又は抗腫瘍応答を延長する方法であって、がん精巣抗原メラノーマ抗原ファミリーＡ３（ＭＡＧＥ−Ａ３）を発現するがんを有するヒトに、（ａ）ＭＡＧＥ−Ａ３を発現するマラバＭＧ１及び（ｂ）ＰＤ−１阻害剤を含む組合せの有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
前記がんが、ＥＲ／ＰＲ−ＨＥＲ２＋乳がん、三重陰性乳がん、ＥＲ及び／若しくはＰＲ＋ＨＥＲ２＋乳がん、扁平上皮若しくは非扁平上皮ＮＳＣＬＣ又は胃食道接合部がんである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＤ−１阻害剤がペムブロリズマブである、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒトに、好ましくは筋肉内に、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現するマラバＭＧ１の、好ましくは静脈内の第１の投与の約１〜３週、好ましくは約２週前に、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現するアデノウイルスベクターの単一の初回刺激用量を投与する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
マラバＭＧ１が１０１０〜１０１２ｐｆｕ、好ましくは１０１０又は１０１１ｐｆｕの用量で１回又は複数回投与される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＤ−１阻害剤の第１の用量が、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現するアデノウイルスベクターの単一の初回刺激用量の後、及びＭＡＧＥ−Ａ３を発現するマラバＭＧ１の第１の用量の前に投与される、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記がんが、好ましくは白金−ダブレット療法を含む、少なくとも１サイクルの化学療法による処置の後に進行した、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス学及び医薬品に一般的に関する。ある特定の態様では、本発明は、がんの処置のための腫瘍崩壊性ウイルス、特に腫瘍崩壊性ラブドウイルス及びチェックポイント阻害剤による併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍崩壊性ウイルスは、悪性細胞に特異的に感染し、その中で複製し、死滅させ、正常組織は影響を受けないままである。いくつかの腫瘍崩壊性ウイルスは、様々な新生物の処置のための臨床評価の進行した段階に到達している。
【０００３】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及びマラバウイルスを含め、腫瘍崩壊活性を提示するラブドウイルスが記載されている。これらのウイルスの固有の腫瘍向性は、宿主の免疫応答に対するウイルスの感受性を増加させる突然変異によってさらに強化することができる。
【０００４】
腫瘍崩壊性ウイルスの効力は、それらの細胞溶解活性のみでなく、抗腫瘍免疫を刺激するそれらの能力にも依存する。腫瘍崩壊性ウイルスの臨床効果を強化するための１つのアプローチは、ウイルスから腫瘍抗原を発現させることである。したがって、腫瘍抗原を発現するように工学的に操作されたＶＳＶは、腫瘍崩壊性ウイルスの免疫療法として使用できることが実証された。腫瘍抗原を発現するＶＳＶの抗腫瘍効力は、抗腫瘍免疫を初回刺激するために工学操作ＶＳＶの前に腫瘍抗原を最初に投与し、その後、既存の抗腫瘍免疫を追加免疫するために同じ腫瘍抗原を発現する腫瘍崩壊性ウイルスを投与することによって強化されることが示された（Ｂｒｉｄｌｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１８巻（８号）：１４３０〜１４３９頁（２０１０年））。
【０００５】
腫瘍崩壊性ウイルスの効力を強化するさらなるアプローチが、必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、臨床的に重要ながんモデルへの腫瘍崩壊性ウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤の同時投与が、抗原特異的Ｔリンパ球の刺激の意外な増加を、いずれの薬剤単独の投与と比較してかなりの生存恩恵と同時にもたらすことを発見した。したがって、いくつかの実施形態では、本出願は、哺乳動物においてがん及び／若しくは転移の確立の処置及び／若しくは予防で使用するための、並びに／又は哺乳動物において抗腫瘍応答の開始、強化若しくは延長で使用するための併用療法であって、哺乳動物に、（ｉ）腫瘍崩壊性ウイルスを（ｉｉ）１つ又は複数の免疫性チェックポイント阻害剤と組み合わせて同時投与することを含む併用療法を提供する。ある特定の態様では、がん対象への腫瘍崩壊性ウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤の同時投与は、いずれの処置単独と比較して強化された、さらに相乗的な抗腫瘍免疫を提供する。関連した態様では、併用療法の抗腫瘍効果はウイルスのクリアランスの後にも持続し、１つ又は複数の感染していない腫瘍に延長することができる。他の関連した態様では、チェックポイント阻害剤の効果を増強、強化若しくは延長するための、又はチェックポイント阻害剤の処置の毒性若しくは用量若しくは回数を低減させることを可能にするための方法であって、それを必要とする哺乳動物に、（ｉ）腫瘍崩壊性ウイルスを（ｉｉ）１つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法。
【０００７】
一部の実施形態では、併用療法による腫瘍崩壊性ウイルスは、複製コンピテント腫瘍崩壊性ラブドウイルスである。そのような腫瘍崩壊性ラブドウイルスには、限定されずに、野生型又は遺伝子改変アラハスウイルス、チャンディプラウイルス、コーカルウイルス、イスファハンウイルス、マラバウイルス、ピリーウイルス、水疱性口内炎アラゴアスウイルス、ＢｅＡｎ  １５７５７５ウイルス、ボテクウイルス、カルチャキウイルス、アメリカウナギウイルス、グレイロッジウイルス、フロナウイルス、クラマスウイルス、クワッタウイルス、ラホヤウイルス、マルパイスプリングウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス、ペリネットウイルス、ツパイウイルス、ファーミントン、バヒアグランデウイルス、ミュイアスプリングスウイルス、リードランチウイルス、ハートパークウイルス、フランダーズウイルス、カメセウイルス、モスクエイロウイルス、モスリルウイルス、バルールウイルス、フクオカウイルス、カーン渓谷ウイルス、ヌコルビソンウイルス、ルダンテクウイルス、クウラリバウイルス、コネチカットウイルス、ニューミントウイルス、ソーグラスウイルス、チャコウイルス、セナマドゥレイラウイルス、ティンボウイルス、アルンピバーウイルス、アルアクウイルス、バンゴランウイルス、ビンボウイルス、ビベンスアームウイルス、ワタリガニウイルス、チャールビルウイルス、沿岸平地ウイルス、ＤａｋＡｒＫ  ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス、ガルバウイルス、ゴサスウイルス、ハンプティドゥーウイルス、ジョインジャカカウイルス、カンナマンガラムウイルス、コロンゴウイルス、クールピニヤウイルス、コトンコンウイルス、ランジアウイルス、マニトバウイルス、マルコウイルス、ナソールウイルス、ナバロウイルス、ナインガンウイルス、オークベイルウイルス、オボディアンウイルス、オーイタウイルス、ウアンゴウイルス、パリークリークウイルス、リオグランデカワスズメウイルス、サンジンバウイルス、シグマウイルス、スリプールウイルス、スイートウォーターブランチウイルス、ティブロガーガンウイルス、ジブレマウイルス、ヤタウイルス、ロードアイランド、アデレードリバーウイルス、ベリマーウイルス、キンバリーウイルス又はウシ流行熱ウイルスが含まれる。一部の好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、野生型又は組換えベシクロウイルスである。他の好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、その変異体を含む、野生型又は組換えＶＳＶ、ファーミントン、マラバ、カラハス、ミュイアスプリングス又はバヒアグランデウイルスである。特に好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、ＶＳＶ又はマラバラブドウイルスである。他の特に好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、ウイルスの腫瘍選択性及び／又は腫瘍崩壊性効果を増加させる１つ又は複数の遺伝子改変を含む、ＶＳＶ又はマラバラブドウイルスである。
【０００８】
関連した実施形態では、併用療法による腫瘍崩壊性ウイルスは、ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ２０１４／１２７４７８の段落［００７１］〜［００８２］及び米国特許出願公開第２０１２／００１４９９０号の段落［００４２］で指摘されるものなどの、１つ又は複数の腫瘍抗原を発現するように工学的に操作され、その両方の内容は参照により本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原、又はがん精巣抗原１又はその変異体を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルス（例えば、ＶＳＶ又はマラバ株）である。特に好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原、又はがん精巣抗原１又はその変異体を発現する、マラバＭＧ１及びＶＳＶｄｅｌｔａ５１から選択される腫瘍崩壊性ラブドウイルスである。
【０００９】
一部の態様では、哺乳動物においてがんを処置及び／又は予防するための併用療法であって、哺乳動物に、（ｉ）その哺乳動物が既存の免疫を有する、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原又はがん精巣抗原１、又はその変異体から選択される腫瘍抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルス（例えば、ＶＳＶｄｅｌｔａ５１又はマラバＭＧ１）と、（ｉｉ）チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４又はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体）を同時投与することを含む併用療法が提供される。好ましい実施形態では、哺乳動物における既存の免疫は、腫瘍崩壊性ウイルスの投与の前に腫瘍抗原で哺乳動物をワクチン接種することによって確立される。関連した実施形態では、チェックポイント阻害剤の第１の用量は腫瘍抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスの第１の用量の前に投与され、チェックポイント阻害剤の以降の用量は、腫瘍抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスの第１（又は、第２、第３等）の後に投与することができる。
【００１０】
本明細書に記載される組合せの別の態様では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスはチェックポイント阻害剤を発現し（例えば、腫瘍崩壊性ラブドウイルスはチェックポイント阻害タンパク質に対する単鎖抗体を発現する）、本明細書に記載される腫瘍関連抗原も任意選択で発現する。
【００１１】
組合せの腫瘍崩壊性ウイルスは、１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４又はより多くのウイルス粒子（ｖｐ）又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）の１用量又は複数用量として投与することができる。好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、腫瘍崩壊性ラブドウイルス（例えば、１つ又は複数の腫瘍抗原を任意選択で発現する野生型又は遺伝子改変ＶＳＶ又はマラバ）であり、１０６〜１０１４ｐｆｕ、１０６〜１０１２ｐｆｕ、１０８〜１０１４ｐｆｕ、１０８〜１０１２又は１０１０〜１０１２ｐｆｕ、又はその間の任意の範囲の１投薬量又は複数投薬量としてがんを有するヒトに投与される。投与は、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は鼻腔内投与によることができる。好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、特に注射、かん流などを含む血管内投与によって、全身投与される。
【００１２】
一部の態様では、組合せのチェックポイント阻害剤は、生物治療薬又は小分子である。別の態様では、チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、融合タンパク質又はその組合せである。さらなる態様では、チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）並びにそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ヘルペスウイルス侵入媒介物（ＨＶＥＭ）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ガレクチン９（ＧＡＬ９）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）又はその組合せを限定されずに含む、チェックポイントタンパク質を阻害する。さらなる態様では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ又はその組合せを限定されずに含むチェックポイントタンパク質のリガンドと相互作用する。
【００１３】
一部の好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルス（例えば、腫瘍崩壊性ラブドウイルス）は、ＣＴＬＡ４チェックポイント阻害剤と同時投与される。ＣＴＬＡ４チェックポイント阻害剤には、限定されずにイピリムマブ（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）（登録商標）；ＢＭＳ）及びトレメリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）などのモノクローナル抗体が含まれる。
【００１４】
他の好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルス（例えば、腫瘍崩壊性ラブドウイルス）は、ＰＤ−１又はそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤と同時投与される。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤には、限定されずにＰＤ−１に対するモノクローナル抗体、例えばニボルマブ（オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ）（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ；コード名ＢＭＳ−９３６５５８）、ペムブロリズマブ（ケイツルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）（登録商標））及びピジリズマブ、抗ＰＤ−１融合タンパク質、例えばＡＭＰ−２２４（ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧ１のＦｃ領域で構成される）、並びにＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体、例えばＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、アテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ；ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ；ＭＥＤＩ４７３６）及びアベルマブ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）が含まれる。
【００１５】
腫瘍崩壊性ウイルス（例えば、腫瘍崩壊性ラブドウイルス）及び免疫チェックポイント阻害剤は、それを必要とする哺乳動物に同時に又は逐次的に投与され、同じ製剤の一部として又は異なる製剤で投与することができる。好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスによる処置は、チェックポイント阻害剤による処置の開始前に開始される。
【００１６】
本明細書に記載される組合せにより処置されるがんには、限定されずに、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球前骨髄球、骨髄単球性単核球性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球（顆粒球）白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫及び辺縁帯のＢ細胞リンパ腫、真性多血症リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、固形腫瘍、肉腫及び癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイングの腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸直腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムの腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴覚神経腫、希突起膠細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、上咽頭癌、食道癌、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳及び中枢神経系（ＣＮＳ）のがん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮体がん、食道がん、目のがん、頭頸部がん、胃がん、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、肝がん、肺（胸の）がん（小細胞肺がん、扁平上皮非小細胞肺がん及び非扁平上皮非小細胞肺がんを含む）、メラノーマ（転移性メラノーマを含む）、神経芽細胞腫；口腔がん（例えば、唇、舌、口及び咽頭）、卵巣がん、膵臓がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん；気管支のがん、肉腫、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん及び泌尿器系のがんが含まれる。一部の好ましい実施形態では、処置されるがんは、扁平上皮又は非扁平上皮非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん（例えば、ホルモン抗療性転移性乳がん）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮細胞がん）、転移性結腸直腸がん、ホルモン感受性又はホルモン抗療性の前立腺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、肝細胞がん、腎細胞がん、軟部組織肉腫及び小細胞肺がんから選択される。一部の好ましい実施形態では、処置されるがんは、ＥＲ／ＰＲ−、ＨＥＲ２＋乳がん、三重陰性（プロゲステロン受容体、エストロゲン受容体及びヒト上皮増殖因子受容体２の発現が陰性）乳がん、ＥＲ及び／又はＰＲ＋ＨＥＲ２＋乳がん、ＮＳＣＬＣ（扁平上皮及び／又は非扁平上皮）又は胃食道接合部（ＧＥＪ）がんである。
【００１７】
一態様では、組合せで処置される対象は、１つ又は複数の化学療法剤による処置に抗療性である（進行し続けた）及び／又は１つ又は複数の抗体による処置に抗療性であるがんを有するヒトである。本発明のチェックポイント阻害剤及び腫瘍崩壊性ウイルスの組合せは、チェックポイント阻害剤療法の候補と識別されたがんを有するヒトに投与することができる。一部の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスはチェックポイント阻害剤療法の効果を強化するために投与され、チェックポイント阻害剤の投与前に投与される。
【００１８】
一部の態様では、処置は臨床上の転帰、例えば、限定されずに、Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増加、増強又は延長、処置又はその組合せより前の数と比較した抗腫瘍Ｔ細胞又は活性化Ｔ細胞の数の増加によって判定される。別の態様では、臨床上の転帰は、腫瘍の安定化、腫瘍の退行、腫瘍の縮小及び／又は全体的生存の増加である。
【００１９】
さらなる態様では、本方法は、併用療法による処置の前、同時に又はその後に、化学療法剤、標的療法、放射線、寒冷療法又は高体温療法を対象に投与することをさらに含む。
【００２０】
本発明の関連した実施形態は、哺乳動物におけるがんの処置で使用するための、又はがんの処置のための医薬の製造で使用するための医薬組合せであって、腫瘍崩壊性ウイルス、好ましくは腫瘍崩壊性ラブドウイルス及びチェックポイント阻害剤を含む医薬組合せを提供する。一部の実施形態では、医薬組合せは、ＣＴＬＡ４又はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に対するヒト又はヒト化モノクローナル抗体、及び、限定されずにＶＳＶｄｅｌｔａ５１又はマラバＭＧ１などの、がん細胞への選択性を増加させるように任意選択で改変されたＶＳＶ又はマラバ株ラブドウイルスを含む。
【００２１】
さらなる態様では、哺乳動物において免疫応答の誘導で使用するためのキットであって、腫瘍崩壊性ウイルス、好ましくは腫瘍崩壊性ラブドウイルス及びチェックポイント阻害剤を含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、限定されずに、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原、がん精巣抗原１又はその変異体を発現するＶＳＶｄｅｌｔａ５１又はマラバＭＧ１などの、がん細胞への選択性を増加させるように任意選択で改変されたＶＳＶ又はマラバ株ラブドウイルス、並びに、チェックポイント阻害剤、好ましくはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤を含み、任意選択で、それが異種初回刺激−追加免疫ワクチン接種において「初回刺激」として作用することができるように腫瘍崩壊性ラブドウイルスと免疫学的に異なり、腫瘍崩壊性ラブドウイルスと同じ抗原を発現する第２のウイルスをさらに含むことができる。キットは、がんの処置のために組合せを使用するための説明書をさらに含むことができる。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、本出願全体で考察される。本発明の１つの態様に関して考察されるいかなる実施形態も、本発明の他の態様に同様に適用され、逆もまた同じである。詳細な説明及び実施例のセクションの実施形態は、本発明の全ての態様に適用可能である本発明の非限定的な実施形態であると理解される。
【００２３】
用語「阻害する」、「低減する」又は「阻止する」又はこれらの用語の任意の変異形は、請求項及び／又は明細書で使用されるとき、所望の結果を達成する任意の測定可能な減少又は完全な阻害を含む。所望の結果には、限定されずに、癌性又は過剰増殖性状態の緩和、低減、減速又は根絶、並びに生活の質の改善又は延長が含まれる。
【００２４】
請求項及び／又は明細書で用語「含む」と一緒に使用されるとき、単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味することがあるが、それは「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は１つを超える」の意味にも一致する。
【００２５】
本出願全体で、用語「約」は、ある値が、その値を判定するために用いられるデバイス又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００２６】
代替物のみを指すと明示されない限り、又は代替物が互いに排他的でない限り、用語「又は」の請求項での使用は、「及び／又は」を意味するものとして用いられるが、本開示は代替物のみを及び「及び／又は」を指す定義を支持する。
【００２７】
本明細書及び請求項（複数可）で用いられるように、単語「含む（comprising）」（及び任意の形の含む（comprising）、例えば「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」）、「有する（having）」（及び任意の形の有する（having）、例えば「有する（have）」及び「有する（has）」）、「含む（including）」（及び任意の形の含む（including）、例えば「含む（includes）」及び「含む（include）」）又は「含む（containing）」（及び任意の形の含む（containing）、例えば「含む（contains）」及び「含む（contain）」）は、包括的又はオープンエンドであり、列挙されていないさらなる要素又は方法ステップを排除しない。
【００２８】
用語「哺乳動物」は、ヒト並びにヒト以外の哺乳動物を指す。
【００２９】
本明細書で用いるように、「チェックポイント阻害剤」は、限定されずにＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３を含む負の副刺激分子及び／又はＰＤ−Ｌ１を含むそれらのそれぞれのリガンドに結合する薬剤を含む、ＴＮＦ受容体又はＢ７スーパーファミリーのメンバーである表面タンパク質に作用する薬剤を意味する。
【００３０】
用語「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ−１」「ＰＤ−１」及び「ＰＤ１」は互換的に使用され、ヒトＰＤ−１の変異体、アイソフォーム、種相同体及びＰＤ−１と少なくとも１つの共通抗原決定基を有する類似体を含む。完全なＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６４８６３の下で見出すことができる。
【００３１】
用語「細胞傷害性Ｔ細胞関連抗原４」、「ＣＴＬＡ−４」、「ＣＴＬＡ４」及び「ＣＴＬＡ−４抗原」は互換的に使用され、ヒトＣＴＬＡ−４の変異体、アイソフォーム、種相同体及びＣＴＬＡ−４と少なくとも１つの共通抗原決定基を有する類似体を含む。完全なＣＴＬＡ−４核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１５００６の下で見出すことができる。
【００３２】
「併用療法」は、組合せの構成成分の同時、逐次的又は別々の投与を想定することを理解すべきである。本発明の１つの態様では、「併用療法」は腫瘍崩壊性ウイルスとチェックポイント阻害剤の同時投与を想定する。本発明のさらなる態様では、「併用療法」は腫瘍崩壊性ウイルスとチェックポイント阻害剤の逐次投与を想定する。本発明の別の態様では、「併用療法」は腫瘍崩壊性ウイルス及びチェックポイント阻害剤の別々の投与を想定する。腫瘍崩壊性ウイルス及びチェックポイント阻害剤の投与が逐次的であるか又は別々である場合、腫瘍崩壊性ウイルス及びチェックポイント阻害剤は、治療剤が共同的、例えば相乗的効果を示すことを可能にする時間的間隔の範囲内で投与される。好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルス及びチェックポイント阻害剤は、互いに１、２、３、６、１２、２４、４８、７２時間以内に、又は４、５、６若しくは７日以内に、又は８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０若しくは３１日以内に投与される。一部の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスの第１の用量は、チェックポイント阻害剤の第１の用量の前に（すなわち、チェックポイント阻害剤による処置を開始する前に）投与される（すなわち、腫瘍崩壊性ウイルスによる処置が開始される）か、又はその逆であり、腫瘍崩壊性ウイルスによる処置とチェックポイント阻害剤による処置が重なる相を含むことができる。他の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスの第１の用量は、チェックポイント阻害剤の第１の用量と同じ時間に又はほぼ同じ時間に投与することができる。他の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスの第１の用量は、チェックポイント阻害剤の第１の用量（又は第２、第３若しくは以降の用量）の後に投与され、腫瘍崩壊性ウイルスによる処置及びチェックポイント阻害剤による処置が重なる相を含むことができる。
【００３３】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な記載から明らかとなる。しかし、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び改変はこの詳細な記載から当業者に明らかになるので、詳細な記載及び具体例は本発明の具体的な実施形態を示しているものの、例示としてのみ与えられることを理解すべきである。
【００３４】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な記載と一緒にこれらの図面の１つ又は複数を参照することによってより深く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】チェックポイント阻害剤（ａＣＴＬＡ４；抗ＣＴＬＡ４抗体）と腫瘍崩壊性ラブドウイルス（ＭＧ１  ＧＦＰ；緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）を発現するマラバ二重突然変異体）の皮下ＣＴ２６腫瘍を有するマウスへの同時投与のための処置シェーマを示す図である。群１（対照）は、ＰＢＳを受けた；群２（ＭＧ１／ＧＦＰ）は、１、３及び５日目にＭＧ１  ＧＦＰの３回の静脈内注射のみを受けた；群３（ＭＧ１／ＧＦＰ＋ＣＴＬＡ４）は、１、３及び５日目にＭＧ１  ＧＦＰの３回の静脈内注射を受け、１、４、７、１０、１３、１６、１９及び２２日目に抗ＣＴＬＡ４抗体の８回の腹腔内注射を受けた；群４（ＣＴＬＡ４）は、１、４、７、１０、１３、１６、１９及び２２日目に抗ＣＴＬＡ４抗体の８回の腹腔内注射のみを受けた；１０日目に、免疫分析を実行した。
【図２】１０日目のＣＴ２６特異的免疫応答−全体のＩＦＮ−γ応答を示す図である。ＡＨ１、免疫優勢ＣＴ２６エピトープ（ｇｐ７０４２３−４３１）へのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露の後にＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を群ごとに示す。ＭＧ１／ＧＦＰ及びＣＴＬＡ４の同時投与は、ＡＨ１に応答してＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８  Ｔ細胞の百分率を増加させた。
【図３】１０日目のＣＴ２６特異的免疫応答−ＩＦＮ−γ単一陽性Ｔ細胞を示す図である。ＡＨ１、免疫優勢ＣＴ２６エピトープ（ｇｐ７０４２３−４３１）へのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露の後にＩＦＮ−γ（ＴＮＦαではなく）を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を群ごとに示す。ＭＧ１／ＧＦＰ及びＣＴＬＡ４の同時投与は、ＡＨ１に応答してＩＦＮ−γ単一陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率を増加させた。
【図４】１０日目のＣＴ２６特異的免疫応答−ＩＦＮ−γ／ＴＮＦα二重陽性Ｔ細胞を示す図である。ＡＨ１、免疫優勢ＣＴ２６エピトープ（ｇｐ７０４２３−４３１）へのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露の後にＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を群ごとに示す。ＭＧ１／ＧＦＰ及びＣＴＬＡ４の同時投与は、ＡＨ１に応答してＩＦＮ−γ／ＴＮＦα二重陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率を増加させた。
【図５】腫瘍増殖曲線を示す図である。０日目からの経時的な各処置群からのマウスの腫瘍体積を表す。
【図６】カプラン−マイアー生存曲線を示す図である。０日目からの経時的な各処置群からのマウスのパーセント生存を表す。
【図７】転移性肺腫瘍を有するマウスに対する、ｈＤＣＴ腫瘍抗原を発現するアデノウイルス（Ａｄ−ｈＤＣＴ）による初回刺激投与に続く、チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ−１抗体）とｈＤＣＴ腫瘍抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルス（ＭＧ１  ｈＤＣＴ）の同時投与のための処置シェーマを示す図である。群１（対照）は、ＰＢＳを受けた；群２（αＰＤ−１）は、８、１０、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２７、２９及び３１日目に抗ＰＤ−１抗体の１１回の腹腔内注射のみを受けた；群３（Ａｄ：ＭＧ１  ｈＤＣＴ）は、２×１０８ｐｆｕのＡｄｈＤＣＴの単回投与を５日目に受け、続いて１４及び１７日目にＭＧ１  ｈＤＣＴの２回の静脈内注射を受けた；群４（Ａｄ：ＭＧ１  ｈＤＣＴ＋αＰＤ−１）は、２×１０８ｐｆｕのＡｄｈＤＣＴの単回投与を５日目に受け、続いて（ｉ）１４及び１７日目にＭＧ１  ｈＤＣＴの２回の静脈内注射を、並びに（ｉｉ）８、１０、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２７、２９及び３１日目に抗ＰＤ−１抗体の１１回の腹腔内注射を受けた。１４、２０及び２７日目に免疫分析を実行した。
【図８】ピークプライム時点（１４日目）の免疫分析を示す図である。Ａ及びＢは、１４日目の各処置群からのＰＢＭＣ中のＣＤ８及びＣＤ４マーカーに陽性染色のリンパ球の百分率を図示する。Ｃは、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（合計）を図示する。Ｄ〜Ｆは、ＳＶＹ、ＤＣＴの免疫優勢エピトープ（ＤＣＴ１８０−１８８）へのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露の後の各処置群からの、ＩＦＮ−γのみを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ｄ）、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ｅ）、並びに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及びＩＬ−２を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ｆ）を図示する。
【図９】ピーク追加免疫時（２０日目）の免疫分析を示す図である。Ａ〜Ｂは、２０日目の各処置群からのＰＢＭＣ中のＣＤ８マーカーに陽性染色のリンパ球の百分率（Ａ）、及び２０日目の各処置群からの血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の数（Ｂ）を図示する。Ｃ〜Ｄは、２０日目のＳＶＹに応答した、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の合計の百分率、及び各処置群からの１μｌあたりのＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の合計数を図示する。
【図１０】ピーク追加免疫時（２０日目）のＳＶＹ特異的Ｔ細胞の表現型分析を示す図である。Ａ〜Ｃは、ＳＶＹへのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露の後の各処置群からの、ＩＦＮ−γのみ（すなわち、ＴＮＦα及び／又はＩＬ−２も分泌するものを排除する）を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ａ）、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ｂ）、並びに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及びＩＬ−２を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ｃ）を図示する。Ｄ〜Ｆは、ＳＶＹへのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露の後の各処置群からの、血液１μｌあたりのＩＦＮ−γのみを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の数（Ｄ）、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の数（Ｅ）、並びに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及びＩＬ−２を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の数（Ｆ）を図示する。
【図１１】免疫分析−後期追加免疫（２７日目）を示す図である。Ａ〜Ｂは、２７日目のＭＧ１−ｈＤＣＴ処置群（「初回刺激：追加免疫」）及び組合せ処置群（ＭＧ１−ｈＤＣＴ＋抗ＰＤ−１抗体；「初回刺激：追加免疫ＰＤ１」）における、ＣＤ８マーカーに陽性染色のリンパ球の百分率（Ａ）、及び、血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の数（Ｂ）を比較する。Ｃ〜Ｄは、２７日目のＳＶＹに応答した、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の合計の百分率及びこれらの処置群からの血液中の１μｌあたりのＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の合計数を比較する。
【図１２】後期追加免疫時（２７日目）のＳＶＹ特異的Ｔ細胞の表現型分析を示す図である。Ａ〜Ｃは、ＳＶＹへのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露の後の指定処置群からの、ＩＦＮ−γのみ（すなわち、ＴＮＦα及び／又はＩＬ−２も分泌するものを排除する）を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ａ）、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ｂ）、並びに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及びＩＬ−２を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（Ｃ）を図示する。Ｄ〜Ｆは、ＳＶＹへのｅｘ  ｖｉｖｏ曝露の後の指定処置群からの、血液１μｌあたりのＩＦＮ−γのみを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の数（Ｄ）、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の数（Ｅ）、並びに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及びＩＬ−２を分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の数（Ｆ）を図示する。
【図１３】カプラン−マイアー生存曲線を示す図である。０日目からの経時的な各処置群からのマウスのパーセント生存を表す。
【図１４】初回刺激−追加免疫のみ（「Ａｂなし」）と比較して、ｈＤＣＴの初回刺激投与と同時に（「Ａｂ７日目（同時）」）単一用量として（Ａ）、ｈＤＣＴの初回刺激投与の３日後に（「Ａｂ１０日目（逐次的）」）単一用量として（Ｂ）、ｈＤＣＴの初回刺激投与の３日後に開始された（「Ａｂ連続的（１０日目に開始）」）複数用量として（Ｃ）投与された抗ＰＤ−１抗体の、マウス重量に及ぼす効果を図示するグラフである。
【図１５】初回刺激−追加免疫処置のみ（「Ａｂなし」）と比較してｈＤＣＴの初回刺激投与と同じ日に開始された（「Ａｂ７日目（同時）」）抗ＰＤ−１抗体処置の、マラバウイルス力価に及ぼす効果を図示するグラフである。
【図１６】Ａは、ＭＧ１−ＧＦＰ又は照射を受けたＭＧ１−ＧＦＰにより３のＭＯＩで２４時間感染させた４Ｔ１細胞のマイクロアレイ分析を示す図である。ヒートマップは、非感染細胞と比較して４倍を超えて濃縮された上位遺伝子を含む。Ｂは、ＭＧ１−ＧＦＰ又は照射を受けたＭＧ１−ＧＦＰにより３のＭＯＩで２４時間感染させたＥＭＴ６細胞のマイクロアレイ分析を示す図である。ヒートマップは、非感染細胞と比較して４倍を超えて濃縮された上位遺伝子を含む。
【図１７】Ａは、ウイルスを消去した、ＭＧ１感染４Ｔ１馴化培地での２４時間のインキュベーションの後の４Ｔ１細胞の表面ＰＤＬ１発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。Ｂは、４Ｔ１腫瘍を有するマウスを、ＭＧ１−ＧＦＰにより５日連続でＩＴ処置したところを示す図である。グラフは、最後のウイルス注射の１２日後の脾臓（左パネル）及び腫瘍（右パネル）中のＴｒｅｇであったＴ細胞の百分率を示す。両側性の対応のないｔ検定：＊＊：ｐ＜０．０１。
【図１８】Ａは、４Ｔ１腫瘍を有するマウスをＭＧ１−ＧＦＰにより５日連続でＩＴ処置し、続いて抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ１（各々１００μｇ）の組合せを２日おきに合計５回、ＩＰ注射し、腫瘍を収集し、測定し、各実験で（グラフには４つの実験が含まれる）、各腫瘍体積を対照動物の平均腫瘍体積で割ったものを示す図である。対応のない両側性ｔ検定を使用した統計分析：＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｂは、腫瘍再チャレンジモデルを使用した４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖（左パネル）及びカプラン−マイヤー生存分析（右パネル）を示す図であり、ここで第１の腫瘍は未処置（ＮＴ）又はＭＧ１−ＧＦＰでＩＴ処置され、第２の腫瘍は、２５日目から開始されて２日おきに合計５回の注射でＩＣＩ（それぞれ１００μｇ、ＩＰ）により処置されたか処置されなかった。破線は、ＭＧ１処置の日数を表す。腫瘍測定のための統計分析：＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。（対応のない複数の両側性ｔ検定）。ＮＴ及びＭＧ１＋ＩＣＩの群の間の差は＊によって示され、ＭＧ１及びＭＧ１＋ＩＣＩの群の間の差は＃によって示され、ＩＣＩ及びＭＧ１＋ＩＣＩの群の間の差はｘによって示される。生存曲線については：＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（マンテル−コックス検定）。
【図１９】不治のＭＡＧＥ−Ａ３を発現する固形腫瘍を有する患者における、各々トランスジェニックＭＡＧＥ−Ａ３挿入を有するアデノウイルスワクチン（ＡｄＭＡ３）及びＭＧ１（ＭＧ１ＭＡＥ３）を用いた初回刺激：追加免疫戦略の効果を調べたフェーズＩ／フェーズＩＩ臨床試験における処置群の概略図である。群Ｂ及びＣは、（−１４）日目に、ＡｄＭＡ３投与を開始する。
【図２０】示された用量のＡｄＭＡ３（「Ａｄ」）、ＭＧ１ＭＡ３（「ＭＧ１」）又は両方で処置された図１９の臨床試験の患者からの個々の腫瘍生検におけるＰＤＬ１発現の変化倍率（処置後対処置前）を示すグラフである。
【図２１】現在の臨床試験の患者の群Ａ、Ｂ及びＣにおける全ての用量についてプールされた腫瘍生検からのＰＤＬ１発現の変化倍率（処置後対処置前）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
腫瘍崩壊性ウイルス（例えば、腫瘍崩壊性ラブドウイルス）及びチェックポイント阻害剤による併用療法は、がんの処置における予想外の改善をもたらすことが見出された。同時、逐次的又は別々に投与されるとき、腫瘍崩壊性ウイルス及びチェックポイント阻害剤は協力的に、さらに相乗的に相互作用して、明らかな有害効果又はウイルス力価の低減なしに、いずれの構成成分の単一投与と比較しても生存を有意に改善する。この予想外の効果は、各構成成分の有効用量の低減を可能にし、副作用の低減と化合物及び処置の臨床効果の増強につながる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物においてがん及び／又は転移の確立の処置及び／又は予防で使用するための併用療法であって、哺乳動物に、（ｉ）複製コンピテント腫瘍崩壊性ウイルスを（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて同時投与することを含む併用療法が提供される。好ましい実施形態では、複製コンピテント腫瘍崩壊性ウイルスは、免疫チェックポイント阻害剤の前に投与される。
【００３８】
腫瘍崩壊性ウイルス
好ましい実施形態では、組合せの複製コンピテント腫瘍崩壊性ウイルスは、腫瘍崩壊性ラブドウイルスである。
【００３９】
腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、以下を含む、組合せで使用するための腫瘍崩壊性ウイルスとしていくつかの利点を有する：（１）腫瘍崩壊性ラブドウイルスに対する抗体は、世界のほとんどの集団において稀ないし存在しない。（２）ラブドウイルスは、アデノウイルス、レオウイルス、はしか、パルボウイルス、レトロウイルス及びＨＳＶなどの他の腫瘍崩壊性ウイルスより速やかに複製する。（３）ラブドウイルスは高力価に増殖し、０．２ミクロンフィルターを濾過する。（４）腫瘍崩壊性ラブドウイルス及びその組換え体は広い宿主範囲を有し、多くの異なるタイプのがん細胞を感染させることができ、特定の細胞の上の受容体によって制限されない（例えば、コクサッキー、はしか、アデノウイルス）。（５）本発明のラブドウイルスは、遺伝子操作に適合する。（６）ラブドウイルスは細胞質ライフサイクルも有し、宿主細胞に遺伝物質を組み入れず、そのことはより良好な安全性プロファイルを付与する。
【００４０】
原型的なラブドウイルスは、このウイルスの科で最も研究されたものである狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。ラブドウイルスは、非分節性（−）センスＲＮＡゲノムを有する弾丸状のウイルスの一科である。ラブドウイルス科には、限定されずに以下のものが含まれる：アラハスウイルス、チャンディプラウイルス（ＡＦ１２８８６８／ｇｉ：４５８３４３６、ＡＪ８１００８３／ｇｉ：５７８３３８９１、ＡＹ８７１８００／ｇｉ：６２８６１４７０、ＡＹ８７１７９９／ｇｉ：６２８６１４６８、ＡＹ８７１７９８／ｇｉ：６２８６１４６６、ＡＹ８７１７９７／ｇｉ：６２８６１４６４、ＡＹ８７１７９６／ｇｉ：６２８６１４６２、ＡＹ８７１７９５／ｇｉ：６２８６１４６０、ＡＹ８７１７９４／ｇｉ：６２８６１４５９、ＡＹ８７１７９３／ｇｉ：６２８６１４５７、ＡＹ８７１７９２／ｇｉ：６２８６１４５５、ＡＹ８７１７９１／ｇｉ：６２８６１４５３）、コーカルウイルス（ＡＦ０４５５５６／ｇｉ：２８６５６５８）、イスファハンウイルス（ＡＪ８１００８４／ｇｉ：５７８３４０３８）、マラバウイルス（米国特許第８，４８１，０２３号の配列番号１〜６、参照により本明細書に組み込まれる；ＨＱ６６００７６．１）、カラハスウイルス（米国特許第８，４８１，０２３号の配列番号７〜１２、参照により本明細書に組み込まれる、ＡＹ３３５１８５／ｇｉ：３３５７８０３７）、ピリーウイルス（Ｄ２６１７５／ｇｉ：４４２４８０、Ｚ１５０９３／ｇｉ：６１４０５）、水疱性口内炎アラゴアスウイルス、ＢｅＡｎ１５７５７５ウイルス、ボテクウイルス、カルチャキウイルス、アメリカウナギウイルス、グレイロッジウイルス、フロナウイルス、クラマスウイルス、クワッタウイルス、ラホヤウイルス、マルパイスプリングウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス（ＤＱ４５７１０３／ｇｉ：９１９８４８０５）、ペリネットウイルス（ＡＹ８５４６５２／ｇｉ：７１８４２３８１）、ツパイウイルス（ＮＣ＿００７０２０／ｇｉ：６６５０８４２７）、ファーミントン、バヒアグランデウイルス（米国特許第８，４８１，０２３号の配列番号１３〜１８、参照により本明細書に組み込まれる、ＫＭ２０５０１８．１）、ミュイアスプリングスウイルス（ＫＭ２０４９９０．１）、リードランチウイルス、ハートパークウイルス、フランダーズウイルス（ＡＦ５２３１９９／ｇｉ：２５１４０６３５、ＡＦ５２３１９７／ｇｉ：２５１４０６３４、ＡＦ５２３１９６／ｇｉ：２５１４０６３３、ＡＦ５２３１９５／ｇｉ：２５１４０６３２、ＡＦ５２３１９４／ｇｉ：２５１４０６３１、ＡＨ０１２１７９／ｇｉ：２５１４０６３０）、カメセウイルス、モスクエイロウイルス、モスリルウイルス、バルールウイルス、フクオカウイルス（ＡＹ８５４６５１／ｇｉ：７１８４２３７９）、カーン渓谷ウイルス、ヌコルビソンウイルス、ルダンテクウイルス（ＡＹ８５４６５０／ｇｉ：７１８４２３７７）、クウラリバウイルス、コネチカットウイルス、ニューミントウイルス、ソーグラスウイルス、チャコウイルス、セナマドゥレイラウイルス、ティンボウイルス、アルンピバーウイルス（ＡＹ８５４６４５／ｇｉ：７１８４２３６７）、アルアクウイルス、バンゴランウイルス、ビンボウイルス、ビベンスアームウイルス、ワタリガニウイルス、チャールビルウイルス、沿岸平地ウイルス、ＤａｋＡｒＫ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス、ガルバウイルス、ゴサスウイルス、ハンプティドゥーウイルス（ＡＹ８５４６４３／ｇｉ：７１８４２３６３）、ジョインジャカカウイルス、カンナマンガラムウイルス、コロンゴウイルス（ＤＱ４５７１００／ｇｉ：９１９８４７９９核タンパク質（Ｎ）ｍＲＮＡ、部分的ｃｄ）；クールピニヤウイルス、コトンコンウイルス（ＤＱ４５７０９９／ｇｉ：９１９８４７９７、ＡＹ８５４６３８／ｇｉ：７１８４２３５４）；ランジアウイルス、マニトバウイルス、マルコウイルス、ナソールウイルス、ナバロウイルス、ナインガンウイルス（ＡＹ８５４６４９／ｇｉ：７１８４２３７５）、オークベイルウイルス（ＡＹ８５４６７０／ｇｉ：７１８４２４１７）、オボディアンウイルス（ＤＱ４５７０９８／ｇｉ：９１９８４７９５）、オーイタウイルス（ＡＢ１１６３８６／ｇｉ：４６０２００２７）、ウアンゴウイルス、パリークリークウイルス（ＡＹ８５４６４７／ｇｉ：７１８４２３７１）、リオグランデカワスズメウイルス、サンジンバウイルス（ＤＱ４５７１０２／ｇｉ：９１９８４８０３）、シグマウイルス（ＡＨ００４２０９／ｇｉ：１６８０５４５、ＡＨ００４２０８／ｇｉ：１６８０５４４、ＡＨ００４２０６／ｇｉ：１６８０５４２）、スリプールウイルス、スイートウォーターブランチウイルス、ティブロガーガンウイルス（ＡＹ８５４６４６／ｇｉ：７１８４２３６９）、ジブレマウイルス、ヤタウイルス、ロードアイランド、アデレードリバーウイルス（Ｕ１０３６３／ｇｉ：６００１５１、ＡＦ２３４９９８／ｇｉ：１０４４３７４７、ＡＦ２３４５３４／ｇｉ：９９７１７８５、ＡＹ８５４６３５／ｇｉ：７１８４２３４８）、ベリマーウイルス（ＡＹ８５４６３６／ｇｉ：７１８４２３５０］）、キンバリーウイルス（ＡＹ８５４６３７／ｇｉ：７１８４２３５２）、又はウシ流行熱ウイルス（ＮＣ＿００２５２６／ｇｉ：１００８６５６１）。
【００４１】
好ましい実施形態では、組合せの腫瘍崩壊性ウイルスは、野生型マラバ株ラブドウイルスであるか、又は、例えば腫瘍選択性を強化するように任意選択で遺伝子改変されたその変異体である。マラバウイルスは、例えば、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０４５，７２９号の第２欄、２４〜４２行目に記載されるように、Ｇタンパク質のアミノ酸２４２及び／又はＭタンパク質のアミノ酸１２３での置換を含有するマラバウイルスであってもよい。特に好ましい実施形態では、マラバウイルスは、Ｂｒｕｎら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１８巻（８号）：１４４０〜１４４９頁（２０１０年）に記載されるマラバＭＧ１である。マラバＭＧ１は、ウイルスをがん細胞において高病原性にするが、正常な細胞において弱毒化するＧタンパク質突然変異（Ｑ２４２Ｒ）及びＭタンパク質突然変異（Ｌ１２３Ｗ）を含有する遺伝子改変マラバ株ラブドウイルスである。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、ＶＳＶ株であるか、又は、例えば腫瘍選択性を強化するように任意選択で遺伝子改変されたその変異体である。特に好ましい実施形態では、ＶＳＶは、その内容は参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｏｊｄｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．、４巻（４号）：２６３〜７５頁（２００３年）に記載されるように、Ｍタンパク質の５１位のメチオニンの欠失を含む。
【００４３】
他の好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、１つ又は複数の腫瘍関連抗原、例えば腫瘍胎児性抗原、例えばアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、表面糖タンパク質、例えばＣＡ１２５、オンコジーン、例えばＨｅｒ２、メラノーマ関連抗原、例えばドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）、ＧＰ１００及びＭＡＲＴ１、がん−精巣抗原、例えばＭＡＧＥタンパク質及びＮＹ−ＥＳＯ１、ウイルスオンコジーン、例えばＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７、並びに、ＰＬＡＣなどの胚性又は胚体外組織に通常制限される腫瘍で異所的に発現されるタンパク質、又は腫瘍関連抗原の変異体を発現する。このような場合、併用療法は、腫瘍関連抗原を発現するがんを有するヒトに好ましくは投与される。腫瘍関連抗原の「変異体」は、（ａ）腫瘍関連抗原タンパク質からの少なくとも１つの腫瘍関連抗原エピトープを含み、及び（ｂ）腫瘍関連抗原性タンパク質と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるタンパク質を指す。良好に容認された抗原エピトープを要約するデータベースが、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ、Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ  Ｖ、Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  Ｎ、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  Ｂによって、「Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：２０１３  ｕｐｄａｔｅ。」Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ２０１３  １３：１５及びｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅで提供される。したがって、様々な実施形態では、組合せの腫瘍崩壊性ラブドウイルス（例えば、ＶＳＶｄｅｌｔａ５１又はマラバＭＧ１）は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一である変異体を含むタンパク質をコードする。関連した実施形態では、組合せの腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２又は１４のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の逆相補体及びＲＮＡバージョンを含む。
【００４４】
特に好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原、又はがん精巣抗原１を発現する。これらの腫瘍関連抗原の各々を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、初回刺激−追加免疫戦略の関連する動物がんモデルにおいて生存を増加させることが実証された（ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ２０１４／１２７４７８）。本明細書で用いるように、「初回刺激−追加免疫」は、既存の免疫を増進するために、がんにかかった哺乳動物に、そのがんに関連し、哺乳動物が既存の免疫を有する天然の腫瘍関連抗原を発現する（複製可能な）腫瘍崩壊性ラブドウイルスを投与する（好ましくは血管内に）ことを意味し、ここで、哺乳動物の既存の免疫は、腫瘍崩壊性ラブドウイルスを投与する前の、哺乳動物への腫瘍関連抗原の初回刺激投与によって好ましくは確立される。哺乳動物は、腫瘍関連抗原の発現が検出／同定されたがんを有することが好ましい。
【００４５】
初回刺激ステップは、腫瘍関連抗原それ自体を（静脈内、筋肉内又は鼻腔内投与を含むがこれらに限定される任意の適する投与経路を使用して）投与することによって、又は、好ましくは、腫瘍関連抗原をベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）若しくはアルファウイルス（例えば、セムリキ森林）ベクター若しくはプラスミド、又は樹状細胞などの負荷抗原提示細胞（ｌｏａｄｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を介して投与することによって達成することができる。腫瘍関連抗原による初回刺激投与を投与するために使用されるベクターは、哺乳動物において免疫を増進するために投与される腫瘍関連抗原を発現する腫瘍崩壊性ウイルスとは免疫学的に異なる（すなわち、異種である）（例えば、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍崩壊性ウイルスが腫瘍崩壊性ラブドウイルスである場合には、初回刺激ベクターはラブドウイルスでないか、免疫学的に異なるラブドウイルスである）。一般的に、ベクターは、確立された組換えテクノロジーを使用して抗原を発現するように改変され、哺乳動物において免疫応答を生成するのに有効な量で投与される。例として、腫瘍関連抗原を発現するアデノウイルスベクターの少なくとも約１０７ｐｆｕのマウスへの筋肉内投与は、免疫応答を生成するのに十分である。ヒトの処置の場合、初回刺激免疫応答を生成するために、例えば、腫瘍関連抗原を発現するアデノウイルスベクターの約１０８〜１０１２、１０９〜１０１１又は１０１０ｐｆｕを投与することができる。
【００４６】
腫瘍関連抗原の（例えばアデノウイルスベクターを介した）初回刺激投与によって、免疫応答が哺乳動物で生成されたならば、腫瘍崩壊性ウイルスの療法に有効な量で同じ腫瘍関連抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、例えば少なくとも約２４時間、好ましくは少なくとも２〜４日又はそれよりも長くてもよい適する免疫応答間隔内、例えば約１週以内、約２週以内、約３週以内、又は約４週以内に少なくとも１回投与される。
【００４７】
一部の実施形態では、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスの第１の追加免疫投与は、同じ腫瘍関連抗原の（例えば、アデノウイルスベクターを介した）単一の初回刺激投与の約２週後に行われ、それの後に、単一の初回刺激投与の約１５〜２０日後、約１６〜１９日後又は約１７日後の第２の追加免疫投与が続くことができる。関連した実施形態では、単一の初回刺激投与の後及び同じ腫瘍関連抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスの第１の追加免疫投与の前に、チェックポイント阻害剤の第１の用量が投与され、好ましくは、チェックポイント阻害剤の投与及び同じ腫瘍関連抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスの投与が重なる処置段階を含む。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤の第２の用量が、第１、第２（及び任意選択で第３、第４、第５等）の追加免疫投与の後に投与される。関連した実施形態では、チェックポイント阻害剤は、毎週、隔週又は３週おきに投与される。
【００４８】
腫瘍特異抗原をコードする遺伝子のＭＡＧＥファミリーは、Ｄｅ  Ｐｌａｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４０巻：３６０〜３６９頁（１９９４年）で考察される。ＭＡＧＥＡ３は、メラノーマ、非小細胞肺がん、頭頸部がん、結腸直腸がん及び膀胱がんを含む広範囲の腫瘍で発現される。腫瘍関連抗原エピトープは、ＭＡＧＥＡ３について既に同定されている。したがって、ＭＡＧＥＡ３タンパク質の変異体は、例えば、以下からなる群から選択される少なくとも１つの腫瘍関連抗原エピトープを含み：ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（配列番号１）、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号２）、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号３）、ＴＦＰＤＬＥＳＥＦ（配列番号４）、ＶＡＥＬＶＨＦＬＬ（配列番号５）、ＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（配列番号６）、ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（配列番号７）、ＲＥＰＶＴＫＡＥＭＬ（配列番号８）、ＡＥＬＶＨＦＬＬＬ（配列番号９）、ＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（配列番号１０）、ＷＱＹＦＦＰＶＩＦ（配列番号１１）、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ（配列番号１２）、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号１３）、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ（配列番号１４）、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号１５）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（配列番号１６）、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ（配列番号１７）、ＶＩＦＳＫＡＳＳＳＬＱＬ（配列番号１８）、ＶＩＦＳＫＡＳＳＳＬＱＬ（配列番号１９）、ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬ（配列番号２０）、ＧＤＮＱＩＭＰＫＡＧＬＬＩＩＶ（配列番号２１）、ＴＳＹＶＫＶＬＨＨＭＶＫＩＳＧ（配列番号２２）、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（配列番号２３）及びＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ（配列番号２４）；かつ、ＭＡＧＥＡ３タンパク質と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％同一である、抗原性タンパク質であってもよい。腫瘍関連抗原性タンパク質の変異体が、高い対立遺伝子頻度、例えば集団の４０％を超える頻度を有する抗原エピトープのみを含むことが望ましいかもしれない。したがって、ＭＡＧＥＡ３の変異体の好ましい例は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの抗原エピトープを含み：ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号２５）、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号２６）、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ（配列番号２７）、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号２８）、ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ（配列番号２９）及びＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号３０）；かつ、ＭＡＧＥＡ３タンパク質と少なくとも７０％、８０％、９０％又は９５％同一であるタンパク質を含むことができる。
【００４９】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）腫瘍性タンパク質Ｅ６／Ｅ７は、子宮頸がんで構成的に発現される（Ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ、Ｈ（１９９６年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２８８巻：Ｆ５５〜Ｆ７８頁）。さらに、ＨＰＶタイプ１６及び１８は、子宮頸がんの７５％の原因である（Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ  ＪＭ（１９９９年）Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １８９巻：１２〜１９頁）。腫瘍形成能を除去するために突然変異された、ＨＰＶタイプ１６及び１８のＥ６／Ｅ７腫瘍性タンパク質の融合タンパク質を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、異種初回刺激：追加免疫状況で抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数及び百分率を増加させることが示された。
【００５０】
前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ｈｕＳＴＥＡＰ）は、前立腺がんにおいて過剰発現され、膵臓、結腸、乳房、精巣、頸部、膀胱、卵巣、急性リンパ性白血病及びユーイング肉腫を含む複数のがん細胞株で上方制御されることが示された、最近同定されたタンパク質である（Ｈｕｂｅｒｔ  ＲＳら、（１９９９年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９６巻：１４５２３〜１４５２８頁）。ＳＴＥＡＰ遺伝子は、親水性アミノ末端及びカルボキシル末端ドメインが隣接した６つの潜在的膜貫通領域を有するタンパク質をコードする。ｈｕＳＴＥＡＰを発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、異種初回刺激：追加免疫状況で抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数及び百分率を増加させることが示された。
【００５１】
がん精巣抗原１（ＮＹＥＳ０１）は、正常な成体組織、例えば精巣及び卵巣、並びに様々ながんにおいて発現されるがん／精巣抗原である（Ｎｉｃｈｏｌａｏｕ  Ｔら、（２００６年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８４巻：３０３〜３１７頁）。がん精巣抗原は、正常な成体の精巣胚細胞への制限された発現を有するが、軟部組織肉腫、メラノーマ及び上皮がんを含む様々な固形腫瘍で異常発現される、特異なファミリーの抗原である。ＮＹＥＳ０１を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、異種初回刺激：追加免疫状況で抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数及び百分率を増加させることが示された。
【００５２】
他の実施形態では、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、がんを有する哺乳動物にチェックポイント阻害剤と一緒に同時投与され、ここで、哺乳動物は腫瘍関連抗原に対して天然に存在する免疫を有する。
【００５３】
したがって、いくつかの実施形態では、哺乳動物でがんを処置及び／又は予防する方法であって、がんを有する哺乳動物に、（ｉ）がんと天然に関連し、哺乳動物が既存の免疫を有する天然の腫瘍関連抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルス、及び（ｉｉ）チェックポイント阻害剤、を同時投与することを含む方法が提供され、ここで、哺乳動物の既存の免疫は、腫瘍崩壊性ラブドウイルスを投与する前に哺乳動物に腫瘍抗原を投与することによって好ましくは確立される。好ましい実施形態では、腫瘍崩壊性ラブドウイルスは、哺乳動物に対して血管内に投与される。他の好ましい実施形態では、哺乳動物の既存の免疫は、腫瘍崩壊性ラブドウイルスを投与する前に、哺乳動物に腫瘍関連抗原を発現するウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）を投与することによって確立される。
【００５４】
組合せの腫瘍崩壊性ウイルスの投与経路は、病変の位置及び性質によって当然異なり、例えば、皮内、経皮、非経口、血管内（静脈内又は動脈内）、筋肉内、鼻腔内、皮下、領域内、経皮、気管内、腹腔内、膀胱内、腫瘍内、吸入、かん流、洗浄、直接注入、食事性及び経口の投与及び製剤が含まれる。好ましい実施形態では、組合せの腫瘍崩壊性ウイルス（例えば、腫瘍崩壊性ラブドウイルス）及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物は、腫瘍内注射によってがんを有する哺乳動物に投与され、及び／又は血管内に投与されるが、医薬組成物は、米国特許第５，５４３，１５８号、第５，６４１，５１５号及び第５，３９９，３６３号（各々参照により具体的に本明細書に完全に組み込まれる）に記載されているように、代わりに腫瘍内、非経口的、静脈内、動脈内、皮内、筋肉内、経皮的又はさらに腹腔内に投与することができる。本明細書で用いるように、「担体」には、任意の全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張性及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。いずれかの従来の媒体又は薬剤が有効成分と相容れない場合以外は、治療組成物でのその使用が企図される。補助有効成分を、組成物に組み込むこともできる。
【００５５】
ある特定の実施形態では、処置される腫瘍は、少なくとも最初は、切除可能でなくてもよい。治療的ウイルス構築物による処置は、縁の縮小により、又はある特定の特に侵襲性の部分の排除によって腫瘍の切除可能性を増加させることができる。処置の後に、切除が可能であることがある。切除の後のさらなる処置は、腫瘍部位の顕微鏡的残留性疾患を排除する役目をする。
【００５６】
原発性腫瘍又は切除後腫瘍床のための処置の一般的なコースは、複数の用量を含む。一般的な原発性腫瘍処置は、１、２、３、４、５、６週又はそれよりも長い期間にわたる、１、２、３、４、５、６又はそれよりも大きい用量の適用を含む。２週レジメンを、１、２、３、４、５、６又はそれよりも多くの回数反復することができる。処置コースの間、予定の投与を完了する必要性を再評価してもよい。
【００５７】
処置は、様々な「単位用量」を含むことができる。単位用量は、治療組成物の所定量を含有するものと規定される。投与すべき量並びに特定の経路及び製剤は、臨床分野の技術者の技術の範囲内である。単位用量は単一の注射として投与する必要がなく、設定期間中の連続注入を含むことができる。本発明の単位用量は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）又はウイルス構築物の場合はウイルス粒子の観点から都合良く記載することができる。単位用量は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３ｐｆｕ又はｖｐ及びそれ以上にわたる。或いは、ウイルスの種類及び達成可能な力価によって、人は、１から１００、１０から５０、１００〜１０００、又は最高約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４又は１×１０１５又はそれよりも多くの感染性ウイルス粒子（ｖｐ）を患者又は患者の細胞に送達する。
【００５８】
「薬学的に許容される」又は「薬理的に許容される」というフレーズは、ヒトに投与されるときに、アレルギー性又は類似の厄介な反応を起こさない分子実体及び組成物を指す。有効成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は、当技術分野で十分理解されている。一般的に、そのような組成物は、液体溶液又は懸濁液の注射剤として調製される。注射前の液体中の溶解又は懸濁に適する固体形を調製することもできる。
【００５９】
チェックポイント阻害剤
免疫チェックポイントは、免疫系のＴ細胞機能を調節する。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演ずる。チェックポイントタンパク質は、シグナルをＴ細胞に送ってＴ細胞機能をスイッチオフするか阻害する特異的リガンドと相互作用する。がん細胞はそれらの表面でチェックポイントタンパク質の高レベル発現を促進することによって次にこれを利用し、腫瘍微小環境に入るＴ細胞の表面でチェックポイントタンパク質を発現するＴ細胞の制御をもたらし、このように抗がん免疫応答を抑制する。
【００６０】
組合せで使用するための免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物である。阻害は、機能の低減及び完全な遮断を含む。特に、免疫チェックポイントタンパク質は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質である。したがって、免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくはヒト免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である。免疫チェックポイントタンパク質は、当技術分野で記載されている（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２巻（４号）：２５２〜２６４頁（２０１２年）を参照）。
【００６１】
チェックポイントタンパク質には、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌｌ及びＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ及びＢＴＬＡが限定されずに含まれる。ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３及びＫＩＲを含む経路は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１依存性経路と類似の免疫チェックポイント経路を構成すると当技術分野で認識されている（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２年。Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２巻：２５２〜２６４頁；Ｍｅｌｌｍａｎら、２０１１年。Ｎａｔｕｒｅ  ４８０巻：４８０〜４８９頁を参照）。
【００６２】
好ましい免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体、好ましくはヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。いくつかのＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤＬ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ及びＫＩＲ阻害剤が記載されている。
【００６３】
ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤には、イピリムマブ（現在、名称ヤーボイ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の下で市販されている完全ヒトＣＴＬＡ−４ブロッキング抗体）、トレメリムマブ（Ｒｉｂａｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３１巻：６１６〜６２２頁（２０１３年）で参照される）、各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開番号２００５／０２０１９９４、２００２／００３９５８１及び２００２／０８６０１４に開示される抗体、並びに各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８１１，０９７号、５，８５５，８８７号、６，０５１，２２７号、６，９８４，７２０号、６，６８２，７３６号、６，２０７，１５６号、５，９７７，３１８号、６，６８２，７３６号、７，１０９，００３号及び７，１３２，２８１号に開示される抗体が限定されずに含まれる。
【００６４】
ＰＤ−１阻害剤には、限定されずに、ヒトＰＤ−１をブロックするヒト化抗体、例えばラムブロリズマブ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５４，５０９号に；並びにＨａｍｉｄら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９巻：１３４〜１４４頁（２０１３年）にｈＰＤ１０９Ａとして、及びそのヒト化誘導体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６及びｈ４０９Ａ１７として開示される）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４巻：４０９〜４１８頁（２０１１年）に開示される）、並びに完全ヒト抗体、例えばニボルマブ（ＣＡＳレジストリ番号：９４６４１４−９４−４；旧称ＭＤＸ−１１０６又はＢＭＳ−９３６５５８、Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６巻：２４４３〜２４５４頁（２０１２年）、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示される）又は、これらの抗体のいずれかの重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体が含まれる。ピジリズマブは、ヒト臨床試験で散在性の大Ｂ細胞リンパ腫の処置のために効力を示した、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブは、進行した抗療性の悪性腫瘍（例えば、メラノーマ、腎細胞癌及びＮＳＣＬＣ）の処置のために効力を示した、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。他のＰＤ−１阻害剤には、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ又はＡＭＰ−２４４（Ｍｋｒｔｉｃｈｙａｎ  Ｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９巻：２３３８〜４７頁、２０１２年に開示される）としても知られるＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質などの融合タンパク質を含めることもできる。ＡＭＰ２２４は、進行したがんにかかった対象の処置における単独療法としてフェーズＩ試験中である。
【００６５】
好ましい実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ又はニボルマブの重鎖可変領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／若しくはニボルマブの軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗ＰＤ−１抗体である。ニボルマブの重鎖配列は、以下の通りである：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号３１）
【００６６】
ニボルマブの軽鎖配列は、以下の通りである：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３２）
【００６７】
一部の好ましい実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ニボルマブの重鎖及び／又は軽鎖配列に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％である重鎖及び／又は軽鎖配列を含む。
【００６８】
免疫チェックポイント阻害剤には、限定されずに、ＰＤ−Ｌ１をブロックするヒト化又は完全ヒト抗体、例えばペムブロリズマブ（ＣＡＳレジストリ番号１３７４８５３−９１−４；別名ＭＫ−３４７５）（ＷＯ２００９／１１４３３５に開示される）、ＭＥＤＩ−４７３６（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７７９，１０８号に開示される）、ＭＰＤＬ３３２８０Ａ（その内容は参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２１７，１４９号に開示される）、ＭＩＨ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅを通して入手できるアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（１６．５９８３．８２））、ＢＭＳ−９３６５５９及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）、又は、これらの抗体のいずれかの重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体も含まれる。ＢＭＳ−９３６５５９は、ヒト臨床試験（隔週で投与される）においてメラノーマ、ＮＳＣＬＣ、腎細胞癌及び卵巣がんの処置における効力を示すことが実証された、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペムブロリズマブは、進行性であるか、局所的に進行したか又は転移性の癌腫、メラノーマ又はＮＳＣＬＣの処置のための臨床試験が進行中の、Ｆｃ領域に安定化させるＳＥＲ２２８ＰＲＯ配列変更を有するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体であり、それはＰＤ−１に結合して、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２との相互作用を阻止する。ＭＰＤＬ３３２８０Ａは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００突然変異転移性メラノーマを有する対象においてはＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブと組み合わせて、及び進行した固形腫瘍を有する対象ではＶＥＧＦＲを標的とするベバシズマブと組み合わせて試験されているモノクローナル抗体である。ＭＥＤＩ−４７３６は、進行した悪性のメラノーマ、腎細胞癌、ＮＳＣＬＣ及び結腸直腸がんを有する患者におけるフェーズＩ臨床試験中である。
【００６９】
特に好ましい実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ又はペムブロリズマブの重鎖可変領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／若しくはペムブロリズマブの軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗ＰＤ−１抗体である。ペムブロリズマブの重鎖配列は、以下の通りである：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号３３）
【００７０】
ペムブロリズマブの軽鎖配列は、以下の通りである：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３４）
【００７１】
一部の好ましい実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブの重鎖及び／又は軽鎖配列に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％である重鎖及び／又は軽鎖配列を含む。
【００７２】
好ましい実施形態では、組合せの免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば、限定されずに、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、ラブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ−２４４、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ３３２８０Ａ又はＭＩＨ１から選択される。これらの免疫チェックポイントタンパク質の公知の阻害剤はこのように使用することができ、又は、類似体を、特にキメラ、ヒト化若しくはヒトの形態の抗体を使用することができる。
【００７３】
当業者ならば知るように、上で指摘したある特定の抗体のために、代わりの及び／又は同等の名称を使用することができる。そのような代わりの及び／又は同等の名称は、本発明の場面で互換性である。例えば、ラムブロリズマブは、代わりの及び同等の名称ＭＫ−３４７５及びペムブロリズマブの下でも知られていることが知られている。
【００７４】
組合せの他の免疫チェックポイント阻害剤には、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３及びＴＩＧＩＴを含む免疫チェックポイントタンパク質及び経路を標的とする薬剤が限定されずに含まれる。例えば、当技術分野で公知のヒトＰＤ−Ｌ２阻害剤には、ＭＩＨ１８（Ｐｆｉｓｔｅｒｓｈａｍｍｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６巻：１１０４〜１１１３頁（２００６年）に記載される）が含まれる。当技術分野で公知のＬＡＧ３阻害剤には、可溶性ＬＡＧ３（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号２０１１−０００８３３１、及びＢｒｉｇｎｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５巻：６２２５〜６２３１頁（２００９年）に開示されるＩＭＰ３２１又はＬＡＧ３−Ｉｇ）、並びにヒトＬＡＧ３をブロックするマウス若しくはヒト化抗体（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号２０１０−０２３３１８３に記載されるＩＭＰ７０１及び他のもの）、又はヒトＬＡＧ３をブロックする完全ヒト抗体（例えば、ＢＭＳ−９８６０１６、及び、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号２０１１−０１５０８９２に開示される抗体）が含まれる。
【００７５】
組合せのＢＴＬＡ阻害剤には、限定されずにそのリガンドとのヒトＢＴＬＡの相互作用をブロックする抗体が含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５６３，６９４号に開示される４Ｃ７）。
【００７６】
Ｂ７Ｈ４チェックポイント阻害剤には、限定されずにヒトＢ７Ｈ４に対する抗体（参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３０２５７７９ＡＩ、及び米国特許出願公開番号２０１４／０２９４８６１に開示される）、又はＢ７Ｈ４の可溶性組換え形（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号２０１２／０１７７６４５に開示される、又は抗ヒトＢ７Ｈ４クローンＨ７４：ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅ＃１４−５９４８）が含まれる。
【００７７】
Ｂ７−Ｈ３チェックポイント阻害剤には、ヒトＢ７−Ｈ３を中和する抗体が限定されずに含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号２０１２／０２９４７９６にＢＲＣＡ８４Ｄ及び誘導体として開示されるＭＧＡ２７１）。
【００７８】
ＴＩＭ３チェックポイント阻害剤には、限定されずにヒトＴＩＭ３を標的とする抗体が含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８４１，４１８号に開示される、又はＪｏｎｅｓら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、２０５巻（１２号）：２７６３〜７９頁（２００８年）に開示される抗ヒトＴＩＭ３ブロッキング抗体Ｆ３８−２Ｅ２）。ＫＩＲチェックポイント阻害剤には、限定されずにリリルマブが含まれる（Ｒｏｍａｇｎｅら、Ｂｌｏｏｄ、１１４巻（１３号）：２６６７〜２６７７頁（２００９年）に記載される）。免疫チェックポイントタンパク質の公知の阻害剤はそれらの公知の形態で使用することができ、又は、類似体を、特にキメラの形態の抗体、最も好ましくはヒト化の形態を使用することができる。ＴＩＧＩＴチェックポイント阻害剤は、好ましくはポロウイルス受容体（ＣＤ１５５）とのＴＩＧＩＴの相互作用を阻害し、限定されずに、ヒトＴＩＧＩＴを標的とする抗体、例えば、米国特許第９，４９９，５９６号及び米国特許出願公開番号２０１６０３５５５８９、２０１６０１７６９６３に開示されるもの、並びにポロウイルス変異体、例えば米国特許第９，３２７，０１４号に開示されるものが含まれる。
【００７９】
一部の態様では、本明細書に記載される組合せは、本発明の様々な態様の中の（ｉ）１つを超える免疫チェックポイント阻害剤及び（ｉｉ）腫瘍崩壊性ウイルスを含む。好ましくは、１つを超える免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤から選択される。例えば、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）とニボルマブ（抗ＰＤ１）の同時療法は、単独療法で得られるものと異なるようである臨床活性を実証した（Ｗｏｌｃｈｏｋら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３６９巻：１２２〜３３頁（２０１３年））。他の例には、ＬＡＧ３チェックポイント阻害剤及び抗ＰＤ−１チェックポイント阻害剤（Ｗｏｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２巻：９１７〜２７頁（２０１２年））、又はＬＡＧ３チェックポイント阻害剤及びＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤（Ｂｕｔｌｅｒら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：１８８〜１９５頁（２０１１年））が含まれる。
【００８０】
他の態様では、本明細書に記載される組合せは（ｉ）１つ又は複数のチェックポイント阻害剤、及び１つ又は複数のチェックポイント阻害剤の効力を改善することが示された１つ又は複数のさらなる治療剤、並びに（ｉｉ）腫瘍崩壊性ウイルスを含む。例えば、イピリムマブ（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＮＣＴ０１７５０５８０）と、又はニボルマブ（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＮＣＴ０１７１４７３９）と組み合わせたリリルマブ（抗ＫＩＲ、ＢＭＳ−９８６０１５又はＩＰＨ２１０２としても知られる、米国特許第８１１９７７５号に開示される）。別の例は、ＩＣＯＳを標的とする薬剤及びＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤（Ｆｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、７１巻：５４４５〜５４頁（２０１１年）又は４−１ＢＢを標的とする薬剤（例えば、ウレルマブ）及びＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤（Ｃｕｒｒａｎら、ＰｌｏＳ６巻（４号）：９４９９頁（２０１１年））である。他の例には、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤及びパゾパニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ＩＮＣＲ０２４３６０、ＰｅｇＩＦＮ−２ｂ、タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）、コビメチニブ及び／又はトラメチニブ、デブラフィニブが含まれる。一部の好ましい実施形態では、組合せは、腫瘍崩壊性ラブドウイルス及び（ｉ）ニボルマブ＋パゾパニブ／スニチニブ／イピリムマブ、（ｉｉ）ニボルマブ＋ダサチニブ、（ｉｉｉ）ペムブロリズマブ＋ＩＮＣＲ０２４３６０（ｉｖ）ペムブロリズマブ＋パゾパニブ（ｖ）ペムブロリズマブ＋ＰｅｇＩＦＮ−２ｂ（ｖｉ）ＭＥＤ１４７３６＋ダブラフェニブ／トラメチニブ（ｖｉｉ）ＭＰＤＬ３２８０Ａ＋タルセバ又は（ｖｉｉｉ）ＭＰＤＬ３２８０Ａ＋コビメチニブを含む。
【００８１】
本明細書に開示されるチェックポイント阻害剤は、例えば、経口的又は非経口的、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、包内、腹腔内、直腸内、大槽内、腫瘍内、脈管内、皮内、又は、例えば皮膚パッチ若しくは経皮イオントフォレシスをそれぞれ使用する皮膚を通しての受動若しくは促進された吸収を含む、様々な経路によって投与することができる。チェックポイント阻害剤は、例えば、腫瘍に供給する血管の中への静脈内又は動脈内投与により、病的状態の部位に投与することもできる。
【００８２】
本発明の方法の実施で投与される薬剤の全量は、ボーラスとして若しくは比較的短い期間わたる注入によって、単一の用量として対象に投与することができるか、又は、長期にわたって複数用量が投与される分割処置プロトコルを使用して投与することができる。当業者は、対象で病的状態を処置するための組成物の量は、対象の年齢及び一般健康状態並びに投与経路及び投与される処置の数を含む多くの因子に依存することを知るだろう。これらの因子を考慮して、当業者は必要に応じて特定の用量を調整するだろう。一般に、組成物の製剤並びに投与の経路及び頻度は、最初に、フェーズＩ及びフェーズＩＩ臨床試験を使用して判定される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２〜０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜３ｍｇ／ｋｇ、３〜４ｍｇ／ｋｇ、４〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜６ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、８〜９ｍｇ／ｋｇ、９〜１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又はその任意の組合せ用量で投与される。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、少なくとも週１回、少なくとも週２回、少なくとも週３回、２週ごとに少なくとも１回、３週ごとに少なくとも１回、又は１カ月若しくは数カ月ごとに少なくとも１回投与される。関連した実施形態では、チェックポイント阻害剤は、週に１回、隔週に１回、３週ごとに１回又は１カ月に１回投与される。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、単一の用量として、２つの用量で、３つの用量で、４つの用量で、５つの用量で、又は６以上の用量で投与される。好ましい一実施形態では、チェックポイント阻害剤はペムブロリズマブであり、２ｍｇ／ｋｇを３週おきに１回（好ましくは、３０分にわたる静脈内注入として）のスケジュールで投与される。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を例示するために与えられ、決して本発明を限定するものでない。目的を実行し、指摘した結末及び利点、並びに本明細書に内在する目的、結末及び利点を得るように本発明が良く構成されていることを、当業者は容易に認めるであろう。本実施例は、本明細書に記載される方法と一緒に、現在好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。請求項の範囲によって規定される本発明の精神の範囲内に包含されるその中の変更及び他の使用は、当業者に思いつくであろう。
【００８５】
実施例１
腫瘍崩壊性ラブドウイルス＋チェックポイント阻害剤
チェックポイント阻害剤及び腫瘍崩壊性ラブドウイルスの同時投与の効果を、臨床的に関連する免疫適格同系腫瘍モデルで評価した。
【００８６】
材料及び方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、皮下に５×１０５のＣＴ２６（結腸癌）細胞を移植した。概ね２５０ｍｍ３に到達するまで、腫瘍を増殖させた。４群（表１）のうちの１つにマウスを無作為化して、等しい平均腫瘍及び分散を確実にした：
【表１】
2019501205.tif 000003
ＭＧ１／ＧＦＰ、Ｇタンパク質突然変異（Ｑ２４２Ｒ）及びＭタンパク質突然変異（Ｌ１２３Ｗ）を含有し、異種タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光性タンパク質）を発現する遺伝子改変マラバ株ラブドウイルスを、１及び３日目に静脈内に２×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）の用量で、及び５日目に静脈内に５×１０８ＰＦＵで投与した。マウス由来の抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（クローン９Ｄ９；ＢｉｏＸＣｅｌｌカタログ＃ＢＥ０１６４）を、３日おきに１００μｇの用量で腹腔内注射によって投与した。同時投与レジメンを、図１に表す。腫瘍測定は、ノギス測定によって週につき３日記録した。腫瘍体積は、以下の式を使用して計算した：４／３＊π＊Ｌ／２＊（Ｗ／２）２−ここで、Ｌ＝長さ及びＷ＝幅である。全てのマウスについて、生存を記録した。腫瘍が１５００ｍｍ３を超えたならば、マウスはエンドポイントにあると考えた。
【００８７】
ＭＧ１／ＧＦＰの第１の用量の後の１０日目に、免疫分析を実行した。免疫分析は、ｅｘ  ｖｉｖｏペプチド再刺激によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で完了し、ＣＴ２６  ＡＨ１特異的Ｔ細胞の量を評価するのみでなく多官能性を判定するために、サイトカインの一団について染色した。ＩＦＮ−γ単一陽性及びＩＦＮ−γ／ＴＮＦα二重陽性を数量化することによって、多官能性を評価した。フローサイトメトリーのための抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのものであった：ＩＦＮγ−ＡＰＣカタログ＃５５４４１３；ＴＮＦα−ＦＩＴＣカタログ＃５５４４１８；ＣＤ１０７ａ−ＰＥカタログ＃５５８６６１、又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから：ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００カタログ＃５６−００８１−８２；ＣＤ４−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５カタログ＃４５−００４２−８２。再刺激のためのペプチドは、Ｂｉｏｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのものであった：ＣＴ２６  ＡＨ１−ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ；ＶＳＶ／ＭＧ１  Ｎ−ＭＰＹＬＩＤＦＧＬ。簡潔には、ＣＴ２６特異的Ｔ細胞応答を、１０日目に測定した。ＣＴ２６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（再）刺激のために、末梢血単核細胞をＣＴ２６  ＡＨ１ペプチドと一緒に完全ＲＰＭＩにインキュベートした。インキュベーションは５時間４０分の間インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度）の中で実行し、最後の４時間はブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍｌ）と一緒であった。ＣＤ１６／ＣＤ３２を標的とする抗体で細胞を処置し、その後、Ｔ細胞表面マーカーを標的とする蛍光標識抗体で染色した。次に、細胞を透過性にし、細胞内サイトカインのために固定し、染色した。データは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターを使用して取得した。
【００８８】
結果
抗腫瘍応答。抗ＣＴＬＡ４抗体とＭＧ１／ＧＦＰの同時投与は、抗ＣＴ２６免疫応答の増加につながった。図２は、４群の各々のマウスについてＣＴ２６抗原に応答してＩＦＮ−γを発現したＣＤ８＋Ｔ細胞の合計百分率を図示する。図３及び図４は、ＣＴ２６抗原に応答して、それぞれＩＦＮ−γのみを分泌する（単一陽性、ＴＮＦ−αも発現する細胞を除く）、並びにＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを分泌する（二重陽性、ＩＦＮ−γのみを発現する細胞を除く）ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を図示する。図２〜４は、チェックポイント阻害剤を腫瘍崩壊性ラブドウイルスと同時投与することが、免疫優勢ＣＴ２６抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を増加させることを実証する。
【００８９】
腫瘍サイズ。対照動物（対照、図５）の腫瘍は、１５日目までに２，０００ｍｍ３の平均サイズに到達した。抗ＣＴＬＡ４抗体のみによる処置は、腫瘍増殖を減速させなかった（ＣＬＴＡ４、図５）。ＭＧ１／ＧＦＰのみによる処置は腫瘍増殖を減速させたが、２２日目までに、全てのマウスの腫瘍は１８００ｍｍ３の平均サイズに到達した（ＭＧ１／ＧＦＰ、図５）。ＭＧ１／ＧＦＰ及びＣＴＬＡ４阻害剤の組合せによる処置は、対照よりも統計的に優れており、抗ＣＴＬＡ−４及びＭＧ−１／ＧＦＰ単独は、ＭＧ１／ＧＦＰ及びＣＴＬＡ４の組合せで処置した動物における腫瘍増殖及び腫瘍に関して、評価期間全体で１５００ｍｍ３を超えなかった（ＭＧ１／ＧＦＰ＋ＣＴＬＡ４、図５）。
【００９０】
生存分析。各処置群からの動物の生存を分析した。データは、カプラン−マイアー曲線として図６に提示する。抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせたＭＧ１／ＧＦＰのレジメンは、いずれかの薬剤のみによる処置又は対照よりも統計的に優れていた（ログランクマンテル−コックス検定；ｐ値０．００５１組合せをＭＧ１／ＧＦＰ単独と比較した）。生存期間中央値は、８日間（対照）、１０日間（抗ＣＴＬＡ４のみ）、１８日間（ＭＧ１／ＧＦＰのみ）及び２９日間（組合せ）であった。組合せ処置群の９匹のマウスのうちの４匹は、研究の終わりの４７日目に生きていた。対照的に、ＭＧ１／ＧＦＰのみを投与した群のマウスのいずれも、２２日目過ぎに生存していなかった。
【００９１】
チェックポイント阻害剤、つまり抗ＣＴＬＡ−４、及び腫瘍崩壊性ラブドウイルス−ＭＧ１／ＧＦＰによる組合せ処置は、いずれかの処置単独と比較して腫瘍増殖を有意に遅延させ、いずれかの薬剤単独と比較して組合せ処置で有意な生存恩恵が観察された。
【００９２】
実施例２
チェックポイント阻害剤＋腫瘍崩壊性ラブドウイルスによる初回刺激−追加免疫
チェックポイント阻害剤、つまり抗ＰＤ−１抗体、及び腫瘍抗原を発現するマラバラブドウイルスの同時投与（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｌら、ＭｏｌＴｈｅｒ２２巻（２号）：４２０〜４２９頁（２０１４年）に記載されているように、同じ腫瘍抗原による初回刺激投与の後）の、抗腫瘍免疫応答への影響を、臨床的に関連する同系Ｂ１６肺転移モデルにおいて評価した。
【００９３】
材料及び方法。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して２．５×１０５のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を静脈内に移植し、腫瘍を５日間播種させた。マウスを、４群のうちの１つに割り当てた（表２）。
【表２】
2019501205.tif 000004
ヒトドーパクロムトートメラーゼ（ｈＤＣＴ）導入遺伝子を発現するように工学的に操作されたヒト血清型５に基づく複製欠損アデノウイルス（Ｅ１／Ｅ３欠失）であるＡｄ−ｈＤＣＴを、２×１０８ｐｆｕの用量で筋肉内に投与した。ｈＤＣＴ導入遺伝子を発現するように工学的に操作されたＭＧ１マラバウイルスであるＭＧ１−ｈＤＣＴを、１×１０９ｐｆｕの用量で静脈内に投与した。抗ＰＤ−１抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌカタログ＃ＢＥ０１４６）を、５週間にわたって週に３日、２５０μｇの用量で腹腔内注射によって投与した。処置シェーマのグラフィカルな概要は、図７にある。
【００９４】
１４日目（初回刺激の後）及び２０日目（予想されたピークの追加免疫）及び２７日目に、免疫分析を実行した。免疫分析は、ｅｘ  ｖｉｖｏペプチド再刺激によってＰＢＭＣで完了し、ＤＣＴ特異的Ｔ細胞の量を評価するのみでなく多官能性を判定するために、サイトカインの一団について染色した。ＩＦＮ−γ単一陽性、ＩＦＮ−γ／ＴＮＦα二重陽性、及びＩＦＮ−γ／ＴＮＦα／ＩＬ−２三重陽性細胞を数量化することによって、多官能性を評価した。ＣＤ１０７ａマーカー染色は、細胞溶解の必要条件である脱顆粒を測定することによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を検出する。フローサイトメトリーのための抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのものであった：ＩＦＮ−γ−ＡＰＣカタログ＃５５４４１３；ＴＮＦα−ＦＩＴＣカタログ＃５５４４１８；ＩＬ−２−ＢＶ４２１カタログ＃５６２９６９；ＣＤ１０７ａ−ＰＥカタログ＃５５８６６１、又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから：ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００カタログ＃５６−００８１−８２；ＣＤ４−ＰｅｒＣｐ−ＣＹ５．５カタログ＃４５−００４２−８２。ＤＣＴ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（再）刺激のために、末梢血単核細胞を、ＳＶＹペプチド（Ｈ−２Ｋｂに結合するＤＣＴの免疫優勢エピトープ（ＤＣＴ１８０〜１８８）に対応する；２μｇ／ｍｌ）と一緒に完全ＲＰＭＩにインキュベートした。インキュベーションは５時間４０分の間インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度）の中で実行し、最後の４時間はブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍｌ）と一緒であった。ＣＤ１６／ＣＤ３２を標的とする抗体で細胞を処置し、その後、Ｔ細胞表面マーカーを標的とする蛍光標識抗体で染色した。次に、細胞を透過性にし、細胞内サイトカインのために固定し、染色した。データは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターを使用して取得した。
【００９５】
全てのマウスについて、生存を記録した。重度の呼吸窮迫を示す場合は、マウスはエンドポイントにあると考えた。
【００９６】
結果。ピークの初回刺激時点（１４日目）の末梢血の５時間４０分のペプチド刺激の後の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２を認識する抗体による染色）は、以下のサイトカイン（複数可）について染色するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率の増加を明らかにした：組合せ処置群対いずれかの処置単独についてＩＦＮ−γ（単一陽性）、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦα（二重陽性）及びＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋ＩＬ−２（三重陽性）。結果は、図８Ａ〜Ｆに図示する。図８Ａ〜Ｂから分かるように、チェックポイント阻害剤及び腫瘍崩壊性ラブドウイルスによる組合せ処置は、他の処置群と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率の増加をもたらした。チェックポイント阻害剤のみによる処置は、ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の全体の包括的百分率（ＴＮＦ−α及び／又はＩＬ−２も発現するものを含む）、又はＩＦＮ−γのみを発現する（ＴＮＦ−α及び／又はＩＬ−２も発現する細胞を除く）か、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを発現するか、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率に影響しなかった（図８Ｃ〜Ｆ；レーン「ＰＤ１」を「対照」レーンと比較する）。腫瘍抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスとチェックポイント阻害剤による組合せ処置（同じ腫瘍抗原の初回刺激投与に続く）は、腫瘍抗原を発現する腫瘍崩壊性ラブドウイルスのみによる処置と比較して、ＩＦＮ−γを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の全体の包括的百分率（図８Ｃ）、単一陽性（ＩＦＮ−γ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（図８Ｄ）、二重陽性（ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦα）ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（図８Ｅ）及び三重陽性（ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦα＋ＩＬ−２）ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（図８Ｆ）を有意に増加させた（図８Ｃ〜Ｆ；レーン「初回刺激：追加免疫ＰＤ１」をレーン「初回刺激：追加免疫」と比較する）。
【００９７】
ピークの追加免疫時点（２０日目）で採取された末梢血のために同じ条件を使用したＩＣＳ染色は、単一処置群（「ＰＤ１」又は「初回刺激：追加免疫」）と比較して、組合せ処置群（「初回刺激：追加免疫ＰＤ１」）の血液におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及び数の統計的に有意な増加を実証した。図９Ａ〜図９Ｂを参照する。同じ時点で、初回刺激／追加免疫又は抗ＰＤ−１処置単独に対して、組合せ処置の後にＤＣＴ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の有意な増加があった（図９Ｄ）。ＰＤ−１の追加は、ＩＦＮ−γ／ＴＮＦα二重陽性（図１０Ｂ）及びＩＦＮ−γ／ＴＮＦα／ＩＬ−２三重陽性細胞（図１０Ｃ）の、より高品質のＤＣＴ特異的Ｔ細胞の有意な増加にもつながった。ＣＤ８頻度を評価したとき、ＤＣＴ特異的Ｔ細胞に差がなかった（図９Ａ）。しかし、ＤＣＴ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が有意に増加したのは、ＰＤ−１組合せ群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞プールの増殖が増加したためである。
【００９８】
後の追加免疫時点（研究の２７日目）で採取された末梢血のために同じ条件を使用したＩＣＳ染色は、初回刺激／追加免疫群と比較したとき、組合せ群の血液におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加を実証した（図１１Ａ）が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加は実証されなかった（図１１Ｂ）。この時点で、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞における差は注目されなかった（図１１Ｃ〜１１Ｄ）。この時点で、群のいずれの間でも、単一、二重及び三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度又は数に統計的に有意な差はなかった（図１２Ａ〜図Ｆ）。
【００９９】
対象の生存の分析を実行した。データは、カプラン−マイアー曲線として図１３に示す。抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｄ−ｈＤＣＴ：ＭＧ１  ｈＤＣＴのレジメンは、いずれかの薬剤のみによる処置又は対照よりも統計的に有意に優れていた（ログランクマンテル−コックス検定、ｐ値０．０３８８組合せを初回刺激／追加免疫単独と比較した）。生存期間中央値は、２０日間（「対照」）、２０日間（抗ＰＤ−１のみ（「ＰＤ１」））及び６７日間（「初回刺激／追加免疫」）であった。研究の終わり（８０日目）までに、組合せ群（「初回刺激：追加免疫ＰＤ１」）の９匹の動物のうちの８匹はエンドポイントに到達しなかったので、この群について生存期間中央値は計算されなかった。
【０１００】
ｈＤＣＴの初回刺激投与（初回刺激−追加免疫）の後の、抗ＰＤ−１及びｈＤＣＴを発現するＭＧ１マラバラブドウイルスによる併用療法のマウス重量に及ぼす効果を、初回刺激−追加免疫単独と比較して評価した。図１４Ａ〜図１４Ｃから分かるように、抗体が、初回刺激（Ａｄ−ｈＤＣＴ投与）と同時に単一の用量として（図１４Ａ）、初回刺激の３日後に単一の用量として（図１４Ｂ）、又は初回刺激の３日後に開始された複数用量として連続的に（図１４Ｃ）与えられたか否かを問わず、抗ＰＤ−１抗体を投与することは初回刺激−追加免疫単独と比較してマウスの重量に影響を与えなかった。したがって、投与レジメンに関係なく、併用療法の毒性は初回刺激−追加免疫単独より大きくない。
【０１０１】
ｈＤＣＴの初回刺激投与（初回刺激−追加免疫）の後の、抗ＰＤ−１及びｈＤＣＴを発現するＭＧ１マラバラブドウイルスによる併用療法のマラバウイルス力価に及ぼす効果を、初回刺激−追加免疫単独と比較して評価した。図１５から分かるように、抗ＰＤ−１抗体を投与することは、腫瘍崩壊性ウイルスの送達に悪影響を与えなかった。
【０１０２】
Ｂ１６担がん動物において、チェックポイント阻害剤、つまり抗ＰＤ−１の追加は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及び品質に関して、Ａｄ−ＤＣＴ初回刺激を改変する。抗ＰＤ−１の追加は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数（概ね２倍多くのＡｇ特異的Ｔ細胞）によって例示されるように、マラバ−ＤＣＴ追加免疫も強化する。重要なことに、併用療法のこれらの有益な効果は、単独の初回刺激／追加免疫又は抗ＰＤ−１処置と比較したとき、生存の著しい増加に関連していた。併用療法で毒性の副作用は観察されず、併用療法は腫瘍崩壊性ウイルスの送達に悪影響を及ぼさなかった。
【０１０３】
実施例３
三重陰性乳がんモデルにおいて、ＭＧ１及び免疫チェックポイント阻害剤の組合せは効力を大いに改善する
背景
三重陰性乳がんは、利用可能な処置が限られた侵襲的な全身性疾患である。三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びヒト上皮増殖因子受容体−２の発現に関して陰性であり、したがって、ホルモン感受性乳がんのために一般的に使用されるタモキシフェン及びトラスツズマブを含む従来の内分泌処置に抗療性であり（Ｈｕｄｉｓ、Ｃ．Ａ．＆  Ｇｉａｎｎｉ、Ｌ．Ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎ  ｕｎｍｅｔ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｎｅｅｄ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １６巻  増補１、１〜１１頁（２０１１年））、後期の段階の形態の播種性は、処置をさらに複雑にする。化学療法抵抗性形態を有する患者のためのオプションがないため、代替戦略の迅速な開発が進められている。
【０１０４】
臨床試験候補ラブドウイルスマラバＭＧ１を使用して、ＴＮＢＣ処置のためのこの免疫応答の重要性が実証される。処置した原発性腫瘍の外科的切除の後に、動物に正常位腫瘍が再抗原投与される、臨床的に関連するモデルの開発が記載される。ＴＮＢＣのために臨床的に関連する状況における疾患の再発を模倣するために、外科的切除及び新しい腫瘍の移植の前に原発性腫瘍がＭＧ１で処置される、強制再発のマウスモデルの開発が記載される。ウイルスは効率的な腫瘍特異的免疫応答を誘導し、腫瘍に免疫細胞を動員する。重要なことに、ＭＧ１による処置は腫瘍細胞によるＰＤＬ１の誘導を引き起こし、腫瘍において活性な調節性Ｔ細胞がより多く見出された。
【０１０５】
方法
細胞株及び培養。ベロ腎臓上皮、４Ｔ１及びＥＭＴ６ネズミ乳癌細胞株を、アメリカ基準株保存機構（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加えたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で細胞を維持し、５％ＣＯ２の３７℃で培養した。
【０１０６】
ウイルス生成及び数量化。ＭＧ１−ＧＦＰの増殖及び精製は、以前に記載された（Ｂｒｕｎ、Ｊ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｒａｂａ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ。Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８巻、１４４０〜９頁（２０１０年））。簡潔には、ベロ細胞を０．０１のＭＯＩで２４時間感染させ、その後収集、濾過（０．２２μｍボトルトップフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ））及び培養上清の遠心分離（３０１００ｇで９０分）をした。ペレットをダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に再懸濁させ、−８０℃で保存した。ウイルスの力価は、プラークアッセイによって判定した。簡潔には、連続希釈試料をベロ細胞の単層に移して１時間インキュベートし、次に、１０％ＦＢＳを追加した０．５％アガロース／ＤＭＥＭを重層した。プラークを、２４時間後に数えた。一部の実験では、以前に記載されたＳｐｅｃｔｒｏｌｉｎｋｅｒ  ＸＬ−１０００ＵＶ架橋剤を使用して、２分間の１２０ｍＪ／ｃｍ２への曝露によってウイルスを照射した（Ｚｈａｎｇ、Ｊ．らＭａｒａｂａ  ＭＧ１  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｐｏｓｔ  ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ。Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２巻、１３２０〜３２頁（２０１４年））。
【０１０７】
マイクロアレイ分析。４Ｔ１又はＥＭＴ６細胞の単層を、ＭＧ１−ＧＦＰ又は照射されたＭＧ１−ＧＦＰにより３のＭＯＩで２４時間処置した。ＣＢＡ及びＥＬＩＳＡ分析のために培養上清を収集し、ＲＮｅａｓｙＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞からＲＮＡを抽出した。ＭｏＧｅｎｅ２．０−ｓｔ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップで２反復の全ＲＮＡ試料を処理し、分析した。トランスクリプトーム分析コンソールｖ３．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ソフトウェアを使用して、生のファイルを分析した。Ｒパッケージ「ｐｈｅａｔｍａｐ」ｖ１．０．８を使用して、Ｒ．Ｈｅａｔｍａｐｓでさらに処理された、正規化された転写物発現値を生成した。オンラインＥｎｒｉｃｈＲツール（ＰＭＩＤ２７１４１９６１）を使用して、ＧＯ  Ｔｅｒｍ濃縮分析を実行した。濃縮分析のために選択される遺伝子は、感染していない細胞と比較してＭＧ１感染によって少なくとも４倍上方制御される遺伝子のサブセットである。
【０１０８】
フローサイトメトリー分析。脾細胞を、前述のとおり処理した（Ｒｏｙ、Ｄ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ。Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２２０巻、２１０〜２２１頁（２０１５年））。簡潔には、脾臓を収集し、７０μｍストレーナー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を通してつぶし、その後、ＡＣＫ溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＢＳ）に再懸濁させた。腫瘍細胞抽出のために、製造業者のプロトコルに従ってマウス腫瘍カクテル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ管及びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて使用した。ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３及びＰＤＬ１（全て、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）の様々な組合せを使用して細胞を染色し、ＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して固定した。細胞核内染色のために、ＦｏｘＰ３染色緩衝液セットを使用した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。フローサイトメトリー分析は、Ｃｙａｎ  ＡＤＰ９（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ）で実行した。
【０１０９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験及び腫瘍モデル。４Ｔ１腫瘍を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移植した。正常位モデルのために、１×１０５細胞を右から２番目の乳房脂肪パッドに注射した。処置のために、インスリンシリンジ（Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｃｏ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ）を使用して、全量１００μＬのＰＢＳ中の１×１０８（プラーク形成単位−ｐｆｕ）のウイルスを、示した時点に腫瘍内（ＩＴ）又は静脈内（ＩＶ）に注射した。免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１（クローンＲＭＰＩ−１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）及び抗ＣＴＬＡ４（クローン９Ｄ９、ＢｉｏＸｃｅｌｌ））を、合計５回の注射のために２日ごとに各々１００μｇの用量で腹腔内（ＩＰ）に注射した。腫瘍再抗原投与モデルのために、１×１０５細胞を動物の左わき腹に皮下注射した。示した時点に腫瘍を処置し、第１の処置の７日後に切除した。手術の４日後に、腫瘍細胞の最高用量（３×１０５細胞）を、右から２番目の脂肪パッドに播種した。腫瘍播種から１００日を超えた後に２回目の再抗原投与をしたマウスのサブセットに対して、両側の脂肪パッド内に３×１０５個のＥＭＴ６及び４Ｔ１細胞を注射した。
【０１１０】
結果
免疫細胞を活性化するために炎症誘発性シグナルが必要とされるが、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）ＰＤＬ１の発現もしばしば誘発する（Ｒｉｔｐｒａｊａｋ、Ｐ．＆  Ａｚｕｍａ、Ｍ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＰＤ−Ｌ１  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ。Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．５１巻、２２１〜２２８頁（２０１５年））。ウイルスが抗腫瘍免疫を誘導する機構に光をあてるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルス又はｉｒｒＭＧ１に感染させた４Ｔ１及びＥＭＴ６腫瘍細胞のマイクロアレイ分析を実行した。驚くべきことに、本発明者らの結果は、ｉｒｒＭＧ１がほんの少数の遺伝子を弱く誘導することを実証し、それは、未感染細胞より最高３００倍高いレベルで多数の遺伝子を上方制御するＭＧ１と鋭く対照的である。マイクロアレイ分析は、ＭＧ１処置によるそれぞれ４Ｔ１及びＥＭＴ６細胞によるＰＤＬ１の上方制御も示した（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。
【０１１１】
さらに、ウイルスを消去した４Ｔ１馴化培地は、フローサイトメトリーによって判定される通り、ＰＤＬ１の表面発現を誘導した（図１７Ａ）。本発明者らは、次に処置動物におけるＴｒｅｇ（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋細胞）の存在を評価し、ウイルス処置の１０日後に、Ｔｒｅｇの百分率は動物の脾臓において不変だったが、数は腫瘍中のＴ細胞の４０％弱から６０％を超えるまで増加したことを観察した（図１７Ｂ）。クリニックにおけるＩＣＩの近年の成功、並びにＩＣＩ処置が効率的になるために既存の抗腫瘍免疫が必要とされることを示唆する様々な報告書、及びＭＧ１処置が腫瘍特異的免疫応答を誘導することを示す本発明者らのデータを考慮して、本発明者らは、両方の療法の組合せが転帰をさらに改善できるかどうかについて判定しようと追求した。本発明者らは、ＭＧ１を抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ４処置の両方と組み合わせようと試みた。正常位４Ｔ１モデルでは、ウイルス処置の１２日後に収集された腫瘍の量における有意な低減が観察され、最小のものはＭＧ１及びＩＣＩ処置の両方を受けた動物からの腫瘍であった（図１８Ａ）。結果は有望のようであったが、この治療レジメンを使用して治癒又は生存利点は観察されなかった（示さず）。第１の腫瘍がＭＧ１で処置されるかされず、第２の腫瘍がＩＣＩで処置されるのみである腫瘍再抗原投与モデルを使用したとき、両方の処置を受けた群で腫瘍制御の重要な改善並びに６０％の治癒を観察した（図１８Ｂ）。これは、手術前に乳がん患者をＭＧ１で処置することが、再発の場合にＩＣＩ療法によってさらに強化することができる防御免疫応答を生成することを示唆する。
【０１１２】
興味深いことに、ＭＧ１処置の後の増加したＰＤＬ１発現並びにＴｒｅｇの蓄積（図１７Ａ、１７Ｂ及び１８Ａ）は、ＩＣＩ療法との組合せの機会を提供する。４Ｔ１腫瘍モデルにおいて６０％治癒に到達することによって（図１８Ｂ）、ＭＧ１−ＩＣＩ組合せが極めて有望であると考える。単独のＩＣＩ療法は、原発性腫瘍負荷を低減するものの、いかなる生存利点も付与しないが、既存のＭＧ１によって誘導される効力を大いに強化することは、注目に値する。この知見は、既存の抗腫瘍免疫応答が効率的なＩＣＩ処置のために必要とされることを示唆する様々な報告と一致している。
【０１１３】
サイトカイン及びケモカインはウイルス処置によって誘導されるが、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）分子ＰＤＬ１もＭＧ１感染の後に腫瘍細胞によって上方制御される。ウイルス処置が抗腫瘍免疫応答を誘導することを考慮すると、さもなければＩＣＩ療法に抗療性であろうがんは、今や感受性にできるかもしれない。ＩＣＩ療法の近年の成功を考慮し、この第２の処置との組合せが転帰をさらに改善できるかどうかについて調査した。ＩＣＩとのＭＧ１の組合せが大部分の動物を効果的に治癒したことを、データは実証する。両方の処置の組合せは、侵襲的な４Ｔ１ＴＮＢＣネズミモデルにおいて生存を６０％に増加させた。
【０１１４】
実施例４
腫瘍崩壊性ウイルスワクチンによる処置前後の患者からの腫瘍生検におけるＰＤＬ発現レベル
背景
ＭＧ１ＭＡ３は、少なくとも２つの主要な機構を通してがん細胞を選択的に死滅させる可能性を有するヒトＭＡＧＥ−Ａ３（トランスジェニックＭＡＧＥ−Ａ３挿入）を発現するＲＮＡ腫瘍崩壊性ウイルス（マラバラブドウイルスＭＧ１）である。これらは、正常な細胞と比較して欠陥があるインターフェロン応答を介したがん細胞中の選択的ウイルス複製を含む。がん細胞におけるこのウイルスの複製に加えて、ウイルスは、ＭＡＧＥ−Ａ３腫瘍関連抗原を発現するように工学的に操作されてもいる。したがって、宿主は、宿主免疫系が外来のウイルスタンパク質に応答するのと同時にこの腫瘍抗原へのＴ細胞免疫応答を生成する。ＭＧ１ＭＡ３の送達の前にＭＡＧＥ−Ａ３腫瘍抗原への特異的免疫応答を開始又は「初回刺激」するために、別のウイルス（ＡｄＭＡ３；ヒトＭＡＧＥ−Ａ３をコードする導入遺伝子を有する、複製欠損、Ｅ１−及びＥ３−欠失アデノウイルス血清型５）が使用される場合は、この免疫応答はかなり増幅される。腫瘍崩壊性ウイルスワクチンは、ＭＧ１ＭＡ３の効力増加につながる。
【０１１５】
腫瘍崩壊性ウイルスワクチン臨床試験
組入基準。アデノウイルスワクチン（ＡｄＭＡ３）の有る無しのＭＧ１マラバ／ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＧ１ＭＡ３）のフェーズＩ／ＩＩ研究を、不治の進行した／転移性ＭＡＧＥ−Ａ３発現固形腫瘍を有する患者で開始した。フェーズ１では、登録患者は、ＭＡＧＥ−Ａ３の陽性発現を有し（原発性又は転移性病変）、公知の延命標準療法のない、組織学的に確認された、切除不能な局所的に進行した／転移性の固形腫瘍を有する。フェーズＩＩでは、登録患者は、以下のような、ＭＡＧＥ−Ａ３の陽性発現を有し（原発性又は転移性病変）、組織学的に確認された、切除不能な局所的に進行した／転移性の固形腫瘍を有する：非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、具体的には腺癌及び扁平上皮癌；ＥＲ／ＰＲ−ＨＥＲ２＋である乳がん；三重陰性；ＥＲ及び／又はＰＲ＋ＨＥＲ２；食道／ＧＥＪ（胃食道接合部）がん。
【０１１６】
治験設計；群Ａ−ＭＧ１ＭＡ３（ウイルス）単独−患者は１日目及び４日目にＩＶ投与される１×１０１０ｐｆｕの用量レベルのＭＧ１ＭＡ３の開始用量を受ける。ＭＧ１ＭＡ３用量は、用量制限毒性（ＤＬＴ）に到達するまで漸増される。群Ｂ−ＡｄＭＡ３（ワクチン初回刺激）単独−患者は、（−１４）日目にＩＭ投与される１×１０１０ｐｆｕの用量の初回刺激ＡｄＭＡ３ワクチンを受ける。用量漸増は計画されない。群Ｃ−ＡｄＭＡ３とＭＧ１ＭＡ３（初回刺激＋追加免疫）−患者は（−１４）日目に１×１０１０ｐｆｕの単一用量としてＩＭ投与される初回刺激ＡｄＭＡ３ワクチンを受け、続いて、研究の群Ａで判定される推奨最大耐容用量（ＭＴＤ）の１  ｌｏｇ低い開始用量で１日目及び４日目にＩＶ投与される、ＭＧ１ＭＡ３追加免疫の用量漸増を受ける。その用量を受ける患者の大半でＤＬＴに到達するまで、ＭＧ１ＭＡ３用量は漸増される。群Ａ及びＣについては、ＭＴＤに到達するまで、最低３人の患者が各用量レベルで入れられる。コア／摘出腫瘍生検を処置前及び処置後にとり、ＰＤＬ１を含む腫瘍微小環境における鍵マーカーの遺伝子発現の変化について分析する。
【０１１７】
方法
キットプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、７４７０４）に従ってＲＮＥａｓｙ線維組織ミニキットを使用して、患者のコア生検からＲＮＡを抽出した。簡潔には、Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒホモジナイザーを使用して、ＲＬＴ緩衝液中で組織を破壊した。プロトコルに従って自動化ＱＩＡｃｕｂｅ試料調製を使用して、ＲＮＡを次に抽出した。抽出に続いて、２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＲＮＡを数量化し、次に、カスタム仕様のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＣｏｄｅＳｅｔ及びｎＣｏｕｎｔｅｒ１４４−プレックスＥｌｅｍｅｎｔｓ  ＴａｇＳｅｔを使用した分析のために最高１００μｇを使用した。結果として生じたデータを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析ソフトウェア（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。
【０１１８】
結果
処置前及びＭＧ１の第１の用量の後の処置２日後の腫瘍生検のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析によって、臨床ＰＤＬ１発現データを生成した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析はＰＤＬ１転写物レベルを調べ、結果は、処置前レベル対処置後レベルにおける変化倍率として表し、処置後発現レベルを処置前発現レベルによって割ることによって計算し、２つの異なる方法でグラフに示した。図２０は、現在の臨床試験の群Ａ（Ａｄのみ）、Ｂ（ＭＧ１のみ）及びＣ（Ａｄ／ＭＧ１）の各用量での個々の腫瘍生検におけるＰＤＬ１レベルの変化倍率（処置後対処置前）を示す。図２１は、現在の臨床試験の群Ａ（Ａｄのみ）、Ｂ（ＭＧ１のみ）及びＣ（Ａｄ／ＭＧ１）の全用量についてのプールされた腫瘍生検からのＰＤＬ１レベルの変化倍率（処置後対処置前）を示す。データは、ＭＧ１及びＡｄ／ＭＧ１処置が多くの患者の腫瘍におけるＰＤＬ１発現の増加につながることを実証し、本明細書に記載される方法によるチェックポイント阻害剤との併用療法を支持する。
【０１１９】
実施例５
腫瘍崩壊性ウイルスワクチンとチェックポイント阻害剤の組合せ処置臨床試験
以前に処置された転移性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有する患者における、ペムブロリズマブと組み合わせたトランスジェニックＭＡＧＥ−Ａ３挿入（ＡｄＭＡ３）によるアデノウイルスワクチン（初回刺激：追加免疫レジメン）とのＭＧ１マラバ／ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＧ１ＭＡ３）のフェーズＩ／ＩＩ多施設非盲検臨床試験が記載される。ＭＧ１ＭＡ３及びペムブロリズマブは、標準療法として投与される。
【０１２０】
患者は、ＭＡＧＥ−Ａ３の陽性発現（原発性又は転移性病変）を有する組織学的サブタイプ扁平上皮又は非扁平上皮ＮＳＣＬＣ腫瘍を有し、白金をベースとした化学療法による第１の標準療法を完了している。
【０１２１】
患者は、（−１４）日目に筋肉内（ＩＭ）投与された１×１０１０ｐｆｕの用量の初回刺激ＡｄＭＡ３ワクチンの単一用量を受け、１日目及び４日目に１×１０１０ｐｆｕの用量レベルのＩＶ注入によりＭＧ１ＭＡ３を投与される（追加免疫）。この用量が、ペムブロリズマブと組み合わせたときに耐容性であるならば、第２のコホートは１日目及び４日目に１×１０１１のＭＧ１ＭＡ３で処置される。患者は、（−１３）日目、８日目、及びその後Ｘ線撮影で確定された進行が観察されるまで３週ごとに、２００ｍｇの用量のペムブロリズマブをＩＶ投与される。腫瘍生検を処置前及び処置後にとり、ＰＤＬ１を含む腫瘍微小環境における鍵マーカーの遺伝子発現の変化について分析する。ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１に基づく客観的な腫瘍応答速度（ＯＲＲ）を、フェーズ２において評価する。
【０１２２】
付録Ａ−タンパク質及びヌクレオチド配列
完全長、野生型、ヒトＭＡＧＥＡ３のタンパク質配列（配列番号３５）：
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSWGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVL 
REGEE*
完全長、野生型、ヒトＭＡＧＥＡ３をコードするＤＮＡ配列（配列番号３６）：
ATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAGCACTGCAAGCCTGAAGAAGGCCTTGAGGCCCGAGGAGAGGCCCTGGGCCTGGTGGGTGCGCAGGCTCCTGCTACTGAGGAGCAGGAGGCTGCCTCCTCCTCTTCTACTCTAGTTGAAGTCACCCTGGGGGAGGTGCCTGCTGCCGAGTCACCAGATCCTCCCCAGAGTCCTCAGGGAGCCTCCAGCCTCCCCACTACCATGAACTACC CTCTCTGGAGCCAATCCTATGAGGACTCCAGCAACCAAGAAGAGGAGGGGCCAAGCACCTTCCCTGACCTGGAGTCCGAGTTCCAAGCAGCACTCAGTAGGAAGGTGGCCGAGTTGGTTCATTTTCTGCTCCTCAAGTATCGAGCCAGGGAGCCGGTCACAAAGGCAGAAATGCTGGGGAGTGTCGTCGGAAATTGGCAGTATTTCTTTCCTGTGATCTTCAGCAAAGCTTCCAGTTCCTTGCAGCTGGTCTTTGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGCCACTTGTACATCTTTGCCACCTGCCTGGGCCTCTCCTACGATGGCCTGCTGGGTGACAATCAGATCATGCCCAAGGCAGGCCTCCTGATAATCGTCCTGGCCATAATCGCAAGAGAGGGCGACTGTGCCCCTGAGGAGAAAATCTGGGAGGAGCTGAGTGTGTTAGAGGTGTTTGAGGGGAGGGAAGACAGTATCTTGGGGGATCCCAAGAAGCTGCTCACCCAACATTTCGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTACCGGCAGGTCCCCGGCAGTGATCCTGCATGTTATGAATTCCTGTGGGGTCCAAGGGCCCTCGTTGAAACCAGCTATGTGAAAGTCCTGCACCATATGGTAAAGATCAGTGGAGGACCTCACATTTCCTACCCACCCCTGCATGAGTGGGTTTTGAGAGAG GGGGAAGAGTGA
完全長、野生型、ヒトＭＡＧＥＡ３タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号３７）：
ATGCCCCTGGAGCAGCGGTCTCAGCATTGCAAGCCAGAGGAGGGCCTCGAGGCGAGGGGCGAGGCCCTCGGCTTGGTGGGGGCGCAGGCTCCTGCAACCGAGGAGCAAGAGGCCGCATCCAGTTCCTCTACCCTGGTTGAGGTGACCTTGGGTGAGGTGCCCGCCGCGGAGAGCCCCGACCCGCCTCAAAGCCCCCAGGGTGCCAGCTCCCTGCCCACAACAATGAACTACCCACTCTGGAGTCAGTCTTACGAGGACAGTAGTAACCAAGAGGAGGAGGGACCCTCCACATTCCCAGACCTGGAGTCTGAATTCCAGGCAGCATTGTCTAGAAAAGTGGCCGAATTGGTGCACTTCCTGCTGCTGAAGTATCGCGCCCGCGAGCCAGTCACAAAAGCTGAAATGCTGGGTTCTGTCGTGGGAAATTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCAGTAAAGCGTCCAGCTCCTTGCAGCTGGTCTTTGGTATCGAGCTGATGGAGGTGGATCCCATCGGCCATCTGTATATCTTTGCCACATGCCTGGGCCTGAGCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAACCAGATCATGCCAAAAGCTGGCCTGCTGATCATCGTTCTGGCTATCATCGCTAGAGAAGGAGATTGCGCCCCTGAAGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTCCTGGAAGTCTTTGAGGGTCGTGAAGACAGCATTCTCGGGGATCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGC AGGAGAACTATCTGGAGTACCGCCAGGTTCCCGGCAGCGACCCCGCTTGCTACGAGTTCCTGTGGGGCCCCAGGGCCCTGGTCGAGACATCCTACGTGAAGGTCCTGCACCATATGGTTAAAATCAGCGGCGGCCCCCATATCTCTTATCCGCCGCTCCACGAGTGGGTGCTCC GGGAGGGAGAGGAG
完全長、野生型、ヒトＭＡＧＥＡ３の変異体のタンパク質配列（配列番号３８）：
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSWGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVL REGEEDYKDDDDK*
完全長、野生型、ヒトＭＡＧＥＡ３の変異体をコードするＤＮＡ配列（配列番号３９）：
ATGCCCCTGGAACAGCGGAGCCAGCACTGCAAGCCCGAGGAAGGCCTGGAAGCCAGAGGCGAAGCCCTGGGACTGGTGGGAGCCCAGGCCCCTGCCACAGAAGAACAGGAAGCCGCCAGCAGCAGCTCCACCCTGGTGGAAGTGACCCTGGGCGAAGTGCCTGCCGCCGAG AGCCCTGATCCCCCTCAGTCTCCTCAGGGCGCCAGCAGCCTGCCCACCACCATGAACTACCCCCTGTGGTCCCAGAGCTACGAGGACAGCAGCAACCAGGAAGAGGAAGGCCCCAGCACCTTCCCCGACCTGGAAAGCGAGTTCCAGGCCGCCCTGAGCCGGAAGGTGGCAGAGCTGGTGCACTTCCTGCTGCTGAAGTACAGAGCCCGCGAGCCCGTGACCAAGGCCGAGATGCTGGGCAGCGTGGTGGGAAACTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCTCCAAGGCCAGCAGCTCCCTGCAGCTGGTGTTCGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGCCACCTGTACATCTTCGCCACCTGTCTGGGCCTGAGCTACGACGGCCTGCTGGGCGACAACCAGATCATGCCCAAGGCCGGCCTGCTGATCATCGTGCTGGCCATCATTGCCCGCGAGGGCGACTGCGCCCCTGAGGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTGCTGGAAGTGTTCGAGGGCAGAGAGGACAGCATCCTGGGCGACCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGCAGGAAAACTACCTGGAATACCGCCAGGTGCCCGGCAGCGACCCCGCCTGTTACGAGTTCCTGTGGGGCCCCAGGGCTCTGGTGGAAACCAGCTACGTGAAGGTGCTGCACCACATGGTGAAAATCAGCGGCGGACCCCACATCAGCTACCCCCCACTGCACGAGTGG GTGCTGAGAGAGGGCGAAGAGGACTACAAGGACGACGACGACAAATGA
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号４０）：
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFWYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKPGGGGGAAYMHGP KATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLWESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQ*
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質のＤＮＡ配列（配列番号４１）：
ATGCATCAGAAGCGAACTGCTATGTTTCAGGACCCTCAGGAGCGGCCACGCAAACTGCCTCAGCTGTGCACCGAACTGCAGACAACTATCCACGACATCATTCTGGAATGCGTGTAC TGTAAGCAGCAGCTGCTGAGGAGAGAGGTCTATGACTTCGCTTTTCGCGATCTGTGCATCGTGTACCGAGACGGAAACCCATATGCAGTCGATAAGCTGAAGTTCTACAGCAAGATCTCCGAATACAGGCATTACTGTTACAGCGTGTACGGGACCACACTGGAGCAGCAGTATAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCAGAATTAATCAGAAGCCCCTGTGCCCTGAGGAAAAACAGAGGCACCTGGATAAGAAACAGAGATTTCATAACATCCGAGGACGATGGACCGGGCGGTGCATGTCCTGCTGTAGAAGCTCCCGGACTCGACGAGAGACCCAGCTGGGCGGAGGAGGAGGAGCAGCTTACATGGCACGATTCGAGGACCCTACCCGAAGGCCATATAAGCTGCCCGACCTGTGCACAGAACTGAATACTTCTCTGCAGGACATCGAGATTACATGCGTGTACTGTAAAACCGTCCTGGAGCTGACAGAAGTGTTCGAGTTTGCTTTCAAGGACCTGTTTGTGGTCTACCGGGATTCAATCCCTCACGCAGCCCATAAAATCGACTTCTACAGCAGGATCAGGGAACTGCGCCACTACTCCGACAGCGTGTACGGGGATACACTGGAGAAGCTGACAAACACTGGCCTGTACAATCTGCTGATCCGACTGCGACAGAAGCCACTGAACCCAGCCGAAAAACTGAGACACCTGAACGAGAAGAGACGGTTTCACAATATTGCAGGCCATTATAG GGGACAGTGCCATAGTTGCTGTAATCGAGCCAGGCAGGAAAGACTGCAGCGCCGAAGGGAGACTCAAGTCGGCGGAGGAGGAGGAGCTGCATACATGCACGGCGACACCCCCACACTGCATGAATATATGCTGGATCTGCAGCCTGAGACTACCGACCTGTACCAGCTGAACGATTCTAGTGAGGAAGAGGACGAAATCGACGGACCAGCAGGACAGGCAGAGCCTGACC GGGCCCACTATAATATTGTGACATTCTGCTGTAAGTGCGATTCTACTCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGTACTCATGTCGACATCCGCACCCTGGAGGATCTGCTGATGGGGACTCTGGGCATCGTCCCAATTTGTAGCCAGAAACCAGGCGGCGGCGGCGGAGCAGCTTACATGCACGGACCCAAGGCTACCCTGCAGGACATCGTGCTGCATCTGGAACCTCAGAATGAGATTCCAGTCGACCTGCTGCAGCTGAGTGATTCAGAAGAGGAAAACGACGAGATCGACGGCGTGAATCACCAGCATCTGCCTGCTAGACGGGCAGAGCCACAGCGACACACAATGCTGTGCATGTGCTGTAAGTGTGAAGCCAGGATCAAGCTGGTGGTCGAGTCAAGCGCCGACGATCTGCGCGCCTTCCAGCAGCTGTTCCTGAATACTCTGTCATTTGTCCCTTGGTGTGCCTC CCAGCAGTGA
ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質のタンパク質配列（配列番号４２）：
MESRKDITNQEELWKMKPRRNLEEDDYLHKDTGETSMLKRPVLLHLHQTAHADEFDCPSELQHTQELFPQWHLPIKIAAIIASLTFLYTLLREVIHPLATSHQQYFYKIPILVINKVLPMVSITLLALVYLPGVIAAIVQLHNGTKYKKFPHWLDKWMLTRKQFGLLSFFFAVLHAIYSLSYPMRRSYRYKLLNWAYQQVQQNKEDAWIEHDVWRMEIYVSLGIVGLAILALLAVTSIPSVSDSLTWREFHYIQSKLGIVSLLLGTIHALIFAWNKWIDIKQFVWYTPPTFMIAVFLPIWLIFKSILFLPCLRKKILKIRHGWEDVTKINKTEICSQLKL*
ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号４３）：
ATGGAATCACGGAAGGACATCACTAATCAGGAGGAACTGTGGAAAATGAAGCCAAGAAGGAATCTGGAAGAGGACGACTATCTGCACAAGGACACCGGCGAAACAAGTATGCTGAAACGACCAGTGCTGCTGCACCTGCATCAGACTGCTCACGCAGACGAGTTTGATTGCCCCTCTGAACTGCAGCACACCCAGGAGCTGTTCCCACAGTGGCATCTGCCCATCAAGATTGCCGCTATCATTGCTTCACTGACATTTCTGTACACTCTGCTGAGAGAAGTGATCCACCCCCTGGCCACCAGCCATCAGCAGTACTTCTATAAGATCCCTATCCTGGTCATCAACAAGGTCCTGCCAATGGTGAGCATCACACTGCTGGCCCTGGTCTACCTGCCTGGAGTGATCGCAGCCATTGTCCAGCTGCACAATGGGACAAAGTATAAGAAATTTCCACATTGGCTGGATAAGTGGATGCTGACTAGGAAACAGTTCGGACTGCTGTCCTTCTTTTTCGCCGTGCTGCACGCTATCTACAGCCTGTCCTATCCCATGAGGAGGAGCTACCGGTATAAGCTGCTGAACTGGGCTTACCAGCAGGTGCAGCAGAACAAGGAGGACGCATGGATTGAACATGACGTGTGGCG CATGGAAATCTACGTGAGCCTGGGCATTGTCGGACTGGCCATCCTGGCTCTGCTGGCAGTGACCAGTATCCCTTCTGTCAGTGACTCACTGACATGGAGAGAGTTTCACTACATTCAGAGCAAGCTGGGGATCGTGTCCCTGCTGCTGGGCACCATCCATGCACTGATTTTTGCCTGGAACAAGTGGATCGATATCAAGCAGTTCGTGTGGTATACTCCCCCTACCTTTATGATTGCCGTCTTCCTGCCCATCGTGGTCCTGATCTTCAAGTCCATCCTGTTCCTGCCTTGTCTGCGGAAGAAAATCCTGAAAATTCGGCACGGATGGGAGGATGTCACCAAAATCAATAAGACTGAAATCTGTAGCCAGCTGAAGCTTTAA
ＮＹＥＳＱ１  ＭＡＲタンパク質のタンパク質配列（配列番号４４）：
MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPG
GGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLP
VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR*
ＮＹＥＳ０１  ＭＡＲのＤＮＡ配列（配列番号４５）：
ATGCAGGCCGAGGGCAGAGGCACAGGCGGATCTACAGGCGACGCCGATGGCCCTGGCGGCCCTGGAATTCCTGACGGACCTGGCGGCAATGCCGGCGGACCCGGAGAAGCTGGCGCCACAGGCGGAAGAGGACCTAGAGGCGCTGGCGCCGCTAGAGCTTCTGGACCAGGCGGAGGCGCCCCTAGAGGACCTCATGGCGGAGCCGCCTCCGGCCTGAACGGCTGTTGCAGATGTGGAGCCAGAGGCCCCGAGAGCCGGCTGCTGGAATTCTACCTGGCCATGCCCTTCGCCACCCCCATGGAAGCCGAGCTGGCCAGACGGTCCCTGGCCCAGGATGCTCCTCCTCTGCCTGTGCCCGGCGTGCTGCTGAAAGAATTCACCGTGTCCGGCAACATCCTGACCATCCGGCTGACTGCCGCCGACCACAGACAGCTCCAGCTGTCTATCAGCTCCTGCCTGCAGCAGCTGAGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTCCTGGCTCAGCCCCCCAGCGGCCAGAGAAGATGA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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