(57)【要約】  本発明は、神経膠腫、特に神経膠芽腫の治療用の医薬品の調製における、式Ａで表される化合物の使用を提供する。特に、特異的な融合タンパク質の発現を処置するための医薬品の調製における、式Ａで表される化合物の使用を提供する。本発明の技術的解決法を用いて、神経膠芽腫の分類を実施でき、特定の患者グループに対して医薬品の投与を行うことができ、正確な処置を実施できる。【化１】2019505581.tif 000016
2019505581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
2019505581.tif 000015
で表される化合物の、神経膠腫の治療用の薬剤の製造における使用。
【請求項２】
前記神経膠腫は神経膠芽腫であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記神経膠腫は二次性神経膠芽腫であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記二次性神経膠芽腫は、融合タンパク質を発現する二次性神経膠芽腫の亜型であり、
前記融合タンパク質は、ＰＴＰＲＺ１のエキソン１、エキソン１〜２、エキソン１〜３、又はエキソン１〜８から翻訳されるタンパク質部分を、ｃ−Ｍｅｔのエキソン２〜２４から翻訳されるタンパク質部分に対して融合することにより形成され、
ＰＴＰＲＺ１の前記タンパク質部分は、ｃ−Ｍｅｔの前記タンパク質部分のＮ末端に配置される
ことを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記融合タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み；
好ましくは、前記融合タンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を更に含み；
より好ましくは、前記融合タンパク質はＮ末端に、配列番号１で示されるアミノ酸配列及び配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
前記融合タンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み；
好ましくは、前記融合タンパク質の前記アミノ酸配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるものである
ことを特徴とする、請求項３〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記二次性神経膠芽腫は、融合転写物を含有する二次性神経膠芽腫の亜型であり、
前記融合転写物は、ＰＴＰＲＺ１のエキソン１、エキソン１〜２、エキソン１〜３、又はエキソン１〜８から転写される１つのＲＮＡ部分と、ｃ−Ｍｅｔのエキソン２〜２４から転写される１つのＲＮＡ部分とを連結することにより形成され、
ＰＴＰＲＺ１の前記ＲＮＡ部分は、ｃ−Ｍｅｔの前記ＲＮＡ部分の５’末端に配置される
ことを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項８】
前記融合転写物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を含み；
好ましくは、前記融合転写物は、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を更に含み；
より好ましくは、前記融合転写物は５’末端に、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする１つのＲＮＡ配列、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする１つのＲＮＡ配列を含む
ことを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記融合転写物は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする１つのＲＮＡ配列を含み；
好ましくは、前記融合転写物のヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする１つのＲＮＡ配列からなる
ことを特徴とする、請求項７又は８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオ医薬品の技術分野に関する。具体的には、本発明は、神経膠腫、特に神経膠芽腫の治療用の医薬品の調製における化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経膠芽腫は、神経膠腫の中でも最も悪性の神経膠腫である。神経膠芽腫は大脳皮質の下に増殖し、テント上大脳半球のほぼ全体で見られる。浸潤性増殖により、神経膠芽腫は通常、いくつかの葉に浸潤し、深部組織に浸潤し、そして脳梁を介して反対側の大脳半球に拡がる。神経膠芽腫は前頭葉で最も多く見られ、続いて、側頭葉及び頭頂葉で見られ、少数の症例では、後頭葉／視床、脳幹神経節等で見られる。
【０００３】
神経膠芽腫は増殖が速く、経過が短い。患者の７０〜８０％は３〜６か月の疾患経過を経験し、１年を超える疾患経過を経験するのはわずか１０％である。稀な症例ではあるが、神経膠芽腫による出血は脳卒中のような症状の発現を引き起こす。神経膠芽腫は急速に増殖し、広範囲にわたる脳浮腫及び明白な頭蓋内圧亢進の明らかな症状を生じる。ほぼ全ての患者が、頭痛、嘔吐、頭痛を伴う鬱血乳頭、精神状態の変化、脚の筋力低下、意識障害及び会話困難に苦しむ。神経膠芽腫は脳組織に浸潤性の損傷を引き起こし、一連の局所症状を生じる。神経膠芽腫の患者は、様々な程度の半身不随、片側知覚不全、失語症、半盲等に苦しむ。片麻痺、脳神経傷害、片側知覚不全及び半盲は、神経学的検査によって発見できる。患者の約３３％はてんかん発作に苦しみ、約２０％にはアパシー、認知症、及び精神遅滞等といった精神症状を有する。
【０００４】
神経膠芽腫は、２つのタイプ、即ち低悪性度神経膠腫から進行する二次性神経膠芽腫と、低悪性度の前癌病変が存在しない一次性神経膠芽腫とに分類できる。
【０００５】
一次性神経膠芽腫は、最初に診断される場合はグレードIVの神経膠芽腫であり、これらの最も明白な分子的特徴として、ＥＧＦＲの増幅、突然変異、又は過剰発現（４０％）、Ｐ５３の突然変異（３０％）、ＣＤＫＮ２Ａ／Ｂの欠失（３０〜４０％）、ＲＢ１の突然変異又は欠失、１０番染色体の欠損（７０％）、ＰＴＥＮの突然変異（３０％）等が挙げられる。
【０００６】
対照的に、二次性神経膠芽腫は、低悪性度の神経膠腫（グレードII又はグレードIII）から進行するグレードIVの神経膠腫である。最初の臨床診断で低悪性度と診断される神経膠腫は、外科手術又は化学放射線療法後に増殖して元の状態に戻り、グレードIVの神経膠腫へと進行する。研究により、二次性神経膠芽腫の分子マーカー及び遺伝学的細胞経路が一次性神経膠芽腫のものとは異なることが分かっている。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）の突然変異は二次性神経膠芽腫でのみ見られるが、全ての二次性神経膠芽腫がＩＤＨ突然変異を有しているとは限らない。現在のところ、二次性神経膠芽腫の分子マーカーについての研究では、ＩＤＨ１の突然変異（７０％）、Ｐ５３の突然変異（６５％）、ＰＤＧＦＡ及びＰＤＧＦＲＡの過剰発現（６０％）、１９番染色体長碗の欠失（５０％）、並びにＲＢ１の突然変異又は欠失（２５％）に関心が集まっている。これらの分子マーカーの発見は、目的とする神経膠芽腫の治療のための重要な標的を提供する。このような分子マーカーを標的化する多くの標的薬が存在しているが、標的薬は様々な理由のために臨床応用段階に入っていない。根本原因は、ほとんどの場合、標的関係の低い特異性が不十分な治療効果及び医薬品の大きな副作用をもたらすことである。従って、このような標的薬は臨床応用には適さない。
【０００７】
従って、神経膠腫、特に神経膠芽腫について、より高い標的特異性を有しており、正確な治療を実現できる医薬品が、現在必要とされている。
【０００８】
肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔとも呼ばれる）は、ｍｅｔ遺伝子によりコードされ、受容体型チロシンキナーゼファミリーに属する。ＨＧＦＲがそのリガンドである肝細胞増殖因子と結合した後、ＨＧＦＲの細胞内ドメインが自動的にリン酸化されて下流にあるシグナル伝達経路を活性化し、これにより細胞増殖、形態形成、及び運動性を調節する。多くのｃ−Ｍｅｔの異常が見つかっており、大抵は異なる腫瘍に現れている。加えて、研究により、ＰＴＰＲＺ１遺伝子によりコードされるホスファターゼ（受容体型チロシンキナーゼファミリー（ＲＰＲＰＢとも呼ばれる）に属する）が、ｃ−Ｍｅｔから特異的なリン酸化部位を除去してｍｅｔシグナル伝達経路を不活化できることが分かっている。従って、タンパク質はおそらくｃ−Ｍｅｔと特定の結合関係を有しており、疾患の発症及び進行におけるｃ−Ｍｅｔの役割に影響を与えると結論づけることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記課題を目指して、本発明の目的は、高い標的特異性を有しており、神経膠腫、特に神経膠芽腫の個人に合わせた正確な治療を実現できる薬剤を提供することである。
【００１０】
膨大な量の研究に基づいて、本発明の発明者らは、他のｃ−Ｍｅｔ阻害剤と比較して、式Ａで表される化合物が、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤として、神経膠腫、特に神経膠芽腫についてより明白な阻害作用を有していることを見出した。特に、上記化合物は、特異的融合タンパク質を発現し、その結果、より不良な予後につながる神経膠芽腫の亜型に対してより明白な阻害作用を有する。従って、本発明は、以下の技術的解決法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、式Ａで表される化合物の、神経膠腫の治療用の薬剤の製造における使用を提供する。
【００１２】
【化１】
2019505581.tif 000003
【００１３】
式Ａで表される化合物は、中国特許第１０３１２２０００号の実施例４４に記載されているステップ及びスキームにより合成できる。
【００１４】
好ましくは、神経膠腫は神経膠芽腫である。
【００１５】
より好ましくは、神経膠腫は二次性神経膠芽腫である。
【００１６】
一方、研究により、特異的な融合タンパク質が二次性神経膠芽腫において発現され得ることが分かった。この融合タンパク質は、ｃ−Ｍｅｔのアミノ酸配列の大部分と、ｃ−Ｍｅｔのアミノ酸配列のＮ末端に融合されたＰＴＰＲＺ１のアミノ酸配列の一部分とを含む。式Ａで表される化合物は、融合タンパク質を発現する神経膠芽腫の亜型の増殖及び腫瘍形成について良好な阻害作用を有する。
【００１７】
従って、好ましくは、本発明は、二次性神経膠芽腫の治療用の薬剤の製造における式Ａで表される化合物の使用を提供する。ここで、二次性神経膠芽腫は融合タンパク質を発現する二次性神経膠芽腫の亜型であり、上記融合タンパク質（本明細書中では「ＺＭ」とも呼ばれる）は、ＰＴＰＲＺ１のエキソン１、エキソン１〜２、エキソン１〜３、又はエキソン１〜８から翻訳されるタンパク質部分を、ｃ−Ｍｅｔのエキソン２〜２４から翻訳されるタンパク質部分に対して融合することにより形成され、ここではＰＴＰＲＺ１のタンパク質部分はｃ−Ｍｅｔのタンパク質部分のＮ末端に配置される。
【００１８】
好ましくは、融合タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
好ましくは、融合タンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
より好ましくは、融合タンパク質はそのＮ末端に、配列番号１で示されるアミノ酸配列及び配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
最も好ましくは、融合タンパク質は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本発明の特定の実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるものである。本明細書中では、そのアミノ酸配列が配列番号３で示されるものである融合タンパク質は「ＺＭ１−２」と命名され、そのアミノ酸配列が配列番号４で示されるものである融合タンパク質は「ＺＭ２−２」と命名され、そのアミノ酸配列が配列番号５で示されるものである融合タンパク質は「ＺＭ３−２」と命名され、そのアミノ酸配列が配列番号６で示されるものである融合タンパク質は「ＺＭ８−２」と命名される。
【００２３】
上記技術的な解決法に基づいて、神経膠芽腫細胞中での本発明の上記融合タンパク質の発現は、イムノブロッティングにより抗体を用いて検出できる。検出対象のタンパク質のアミノ酸配列がわかっている場合は、そのタンパク質に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体又はマルチクローナル抗体）が、当該分野での従来技術であるイムノブロッティングにより特異的な組織又は細胞中でのタンパク質の発現を検出するために使用される。検出は、融合タンパク質の１つの断片に関して、又は融合タンパク質全体に関して実施できる。本発明の特定の実施形態によれば、ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質に対する抗体を用いて、上記融合タンパク質の発現を検出できる。実際、融合タンパク質のうちのいずれが神経膠芽腫細胞中で発現されるかどうかに基づいて、神経膠芽腫を亜型に分類でき、その後、本発明により提供される式Ａで表される化合物で治療できる。
【００２４】
一方、二次性神経膠芽腫は特異的な融合転写物を含有し得、上記融合転写物は、ｃ−ＭｅｔをコードするＲＮＡの大部分と、ｃ−ＭｅｔをコードするＲＮＡの部分の５’末端に融合されたＰＴＰＲＺ１をコードするＲＮＡの一部分とを含有する。式Ａで表される化合物は、融合転写物を含有する神経膠芽腫の亜型の増殖及び腫瘍形成について、より良好な阻害作用を有する。
【００２５】
従って、好ましくは、本発明は、二次性神経膠芽腫の治療用の薬剤の製造における式Ａで表される化合物の使用を提供する。ここで、二次性神経膠芽腫は、融合転写物を含有する二次性神経膠芽腫の亜型であり、融合転写物は、ＰＴＰＲＺ１のエキソン１、エキソン１〜２、エキソン１〜３、又はエキソン１〜８から転写される１つのＲＮＡ部分と、ｃ−Ｍｅｔのエキソン２〜２４から転写される１つのＲＮＡ部分とを連結することにより形成される。ここではＰＴＰＲＺ１のＲＮＡ部分は、ｃ−ＭｅｔのＲＮＡ部分の５’末端に配置される。
【００２６】
好ましくは、融合転写物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を含む。
【００２７】
好ましくは、融合転写物は、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を更に含む。
【００２８】
より好ましくは、融合転写物はその５’末端に、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする１つのＲＮＡ配列、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする１つのＲＮＡ配列を含む。
【００２９】
最も好ましくは、融合転写物は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする１つのＲＮＡ配列を含む。本発明の特定の実施形態によれば、融合転写物のヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする１つのＲＮＡ配列からなる。
【００３０】
同様に上記技術的な解決法に基づき、神経膠芽腫細胞中での本発明の上記融合タンパク質の発現はまた、上記融合転写物、即ちそのコードＲＮＡ配列に関しても検出できる。検出対象のタンパク質のアミノ酸配列がわかっている場合は、コードＲＮＡ配列の検出もまた当該分野での従来技術に属し、検出は、融合タンパク質の１つの断片に関して、又は融合タンパク質全体に関して実施してよい。例えば、全ＲＮＡを抽出して鋳型として使用できるか、又は全ＲＮＡを、鋳型として使用されるｃＤＮＡに逆転写できる。特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施する。実際、融合転写物が神経膠芽腫細胞中に存在するかどうかに基づいて、神経膠芽腫を亜型に分類でき、その後本発明により提供される式Ａで表される化合物で治療できる。
【００３１】
従って、本発明はまた、配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０でそれぞれ示される融合タンパク質ＺＭ１−２、ＺＭ２−２、ＺＭ３−２、又はＺＭ８−２のｃＤＮＡ配列も提供する。
【００３２】
本発明により提供される技術的解決法に基づき、式Ａで表される化合物は、神経膠腫、特に神経膠芽腫を治療するために臨床的に利用でき、これには、必要としている被験体に、有効量の式Ａで表される化合物又は式Ａで表される化合物を含有しているいずれの医薬組成物が投与できることが含まれる。用量及び投与経路は、個々の健康状態、疾患の症状及び重篤度等に依存し、特別な状況の際に医師が判断する必要がある。
【００３３】
具体的には、正確な治療スキームが必要な場合、治療対象の被験体の神経膠芽腫試料等の腫瘍試料を、最初に臨床的に検出して、例えば上記融合タンパク質が発現されるかどうか、若しくは上記融合転写物が神経膠芽腫試料に含有されるかどうかを検出する、並びに／又は試料中の融合タンパク質又は融合転写物の含有量を検出することができる。治療対象の被験体の試料が上記融合タンパク質若しくは融合転写物を含有する場合、又は融合タンパク質若しくは融合転写物の含有量が正常な被験体中若しくは任意の他の関連する試料中の含有量より高い場合は、式Ａで表される化合物又は上記化合物を含有する医薬組成物を投与できる。このような状況では、試料中の融合タンパク質又は融合転写物の存在又は含有量が、当該分野での従来技術、例えば上記イムノブロッティング及びＰＣＲを用いて検出できる。
【００３４】
臨床研究は、本発明で記載される融合タンパク質を発現する、又は本発明で記載される融合転写物を含有する神経膠芽腫が予後不良であり、それら患者の生存期間が、融合タンパク質又は融合転写物を有しない患者の生存期間より明らかに短い（２４８日に対して１２７日）ことを示す。このような神経膠芽腫の患者に関して、本発明により提供される式Ａで表される化合物は、他の同様の薬剤と比較して特別な治療の利点を有する。
【００３５】
更に、神経膠腫、特に神経膠芽腫の治療の間には、式Ａで表される化合物を、他の治療法又は治療薬と共に、同時に、連続して、又は一定の時間間隔をあけて使用できる。用量及び投与経路は、個々の健康状態、疾患の症状及び重篤度等に依存し、特別な状況の際に医師が判断する必要がある。
【００３６】
先行技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する。
【００３７】
神経膠芽腫細胞株のｉｎ−ｖｉｔｒｏでの増殖及びｉｎ−ｖｉｖｏでの腫瘍形成についての式Ａで表される化合物の実験を通して、本発明は初めて、式Ａで表される化合物が他のｃ−Ｍｅｔ阻害剤と比較して、神経膠芽腫の進行をより有意に阻害できることを証明する。具体的に言うと、実験は、同様の構造を有するｃ−Ｍｅｔ阻害剤と比較して、式Ａで表される化合物は、細胞生存性及び動物での腫瘍形成に対して、より強力な阻害作用を有することを証明する。細胞の実験及びｉｎ−ｖｉｖｏでの実験の両方の結果は、式Ａで表される化合物の神経膠芽腫に対する阻害作用が、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）の阻害作用に近いか、又はこれより更に高いことが証明する。特に、クリゾチニブの分子量は式Ａで表される化合物の分子量より大きく、これにより、クリゾチニブが血液脳関門を通過することはより難しく、神経膠芽腫に到達できるクリゾチニブは少なく、限定的な役割しか果たすことができない。更に、クリゾチニブは二重標的医薬品である。研究は、クリゾチニブはｃ−Ｍｅｔを阻害しながらＡＬＫを阻害するため、比較的大きな副作用を有することを示している。対照的に、式Ａで表される化合物はｃ−Ｍｅｔのみを標的化するため、副作用はより小さい。
【００３８】
特に、実験は、式Ａで表される化合物が、特異的な融合タンパク質を発現する二次性神経膠芽腫についてより有意な阻害作用を有すること、及びその作用が、同様の化合物又は公知の治療用医薬品の作用をはるかに上回ることを証明する。融合タンパク質が神経膠芽腫中で発現されるかどうか、又は記載されるような融合転写物が神経膠芽腫中に存在するかどうかの検出を通して、融合タンパク質を発現するか又は融合転写物を含有する神経膠芽腫の亜型を他の神経膠芽腫と区別でき、その後式Ａで表される化合物を採用して有効な治療を提供し、これによって、神経膠芽腫の患者に対する個別の正確な治療が実現され、このような特定のタイプの神経膠芽腫が引き起こす予後不良の問題が根本的に解決される。同時に、式Ａで表される化合物の作用機構に基づいて、副作用を回避でき、患者の疼痛を緩和でき、この薬剤での治療がより安全かつより効果的なものとなる。最後に、疾患の治療及び予後診断についての費用対効果が改善される。
【００３９】
以下、本発明の実施形態を添付の図面を参照して詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明により提供される配列番号３より示される融合タンパク質（ＺＭ１−２）、及び配列番号４で示される融合タンパク質（ＺＭ２−２）のｃＤＮＡの配列決定の結果を示す。
【図２】図２は、本発明により提供される融合タンパク質の構造を示す。
【図３】図３は、実施例３で本発明により提供される融合タンパク質のイムノブロッティングの結果を示している。ここでは、レーン１は融合タンパク質ＺＭ８−２であり、レーン２は融合タンパク質ＺＭ２−２であり、レーン３及び４はそれぞれ対照である。
【図４】図４は、レンチウイルスベクターＰＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏの構造の説明であり、その中に、融合タンパク質をコードする配列の挿入位置が示されている。
【図５】図５は、実施例５のｉｎ−ｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対する阻害についての実験結果を示す。
【図６】図６は、実施例５のマウスの生存実験の結果を示す。
【図７】図７は、実施例５の神経膠芽腫のｉｎ−ｖｉｖｏでの腫瘍形成実験についての脳の磁気共鳴撮像の結果を示す。ここでは、パネル７Ａは、モデル化により得たベクターマウス（２）の脳画像を示し、パネル７Ｂは、モデル化により得たＺＭ２−２マウス（２）の脳画像を示し、パネル７Ｃは、式Ａで表される化合物の最初の投与後１６日目のＺＭ２−２マウス（２）の脳画像を示し、パネル７Ｄは、式Ａで表される化合物の最初の投与後１６日目に化合物の投与が停止されてから１０日のＺＭ２−２マウス（２）の脳画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、本発明を、具体的な実施例を参照して説明する。当業者であれば、これらの実施例が本発明の範囲の何らかの限定ではなく、単に本発明を記述するために使用されることを理解できる。
【００４２】
特別の定めのない限りは、以下の実施例の方法は従来法である。特別の定めのない限りは、以下の実施例で使用される医薬品の原材料及び試薬の材料等は、全て市販の製品である。
【００４３】
実施例１
神経膠芽腫のＲＮＡ及びｃＤＮＡを得る
８０個の神経膠芽腫試料を医薬品倫理委員会の基準に従った手術により収集した。各試料は、試料を提供した患者及びその患者の医師から同意書を得て収集した。試料の性別、年齢、及び疾患のタイプを表１に示す。
【００４４】
【表１】
2019505581.tif 000004
2019505581.tif 000005
【００４５】
ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社から購入）を使用して、その中の説明書に従って、各神経膠芽腫試料の全ｍＲＮＡを抽出した。全ｍＲＮＡの完全性を分析器を用いて検出し、各試料由来の全ｍＲＮＡのＲＩＮ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）が７．０超であることを確認した。
【００４６】
逆転写キット（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｋ１６２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を用いて、その中の説明書に従って、各試料に由来する全ｍＲＮＡを鋳型として２０μｌの反応系に逆転写を実施し、これにより各試料について二本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００４７】
実施例２
神経膠芽腫中における本発明の融合タンパク質の検出
実施例１で調製した各試料の二本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー配列を使用して増幅させた。
順方向プライマー：
配列番号１１    ＡＴＧＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＧＣＧＴＴＴＣＣＴＣＧ
逆方向プライマー：
配列番号１２    ＣＴＡＴＧＡＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴ
【００４８】
２０μｌの増幅系は以下を含んでいた：１０μＭの順方向プライマー、１μｌ；１０μＭの逆方向プライマー、１μｌ；１００ｎｇの鋳型；２×Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ、製品番号Ｍ０５３１）、１０μｌ；ヌクレアーゼフリー水、２０μｌになるように。
【００４９】
ＰＣＲプログラムの設定は以下を含んでいた：９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１．５分間を計３０サイクル；７２℃で５分間；１２℃で維持。
【００５０】
ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル電気泳動により分析し、生じたバンドをＤＮＡゲル回収キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社から購入）により回収し、その後Ｔベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）にクローニングし、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７３０×ｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）により配列決定した。
【００５１】
配列決定の結果は、２つの異なるヌクレオチド配列が増幅により得られたことを示していた。これらは６６個の異なるヌクレオチドを有し、それぞれ配列番号７及び配列番号８で示す。ヌクレオチド配列の配列決定結果を図１に示す。更に、特定の試料の全ゲノムＤＮＡの配列決定により、融合タンパク質ＺＭ３−２及び融合タンパク質ＺＭ８−２のゲノムＤＮＡ配列を見出した。
【００５２】
試料の供給源に基づいて、表１に列挙したＮｏ．６０試料、Ｎｏ．６４試料、Ｎｏ．７７試料、Ｎｏ．７８試料、Ｎｏ．８０試料が、対応する融合タンパク質のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを有していたことが分かった。融合タンパク質ＺＭ１−２はＮｏ．６０試料中で見られ、融合タンパク質ＺＭ２−２はＮｏ．６４試料及びＮｏ．７８試料の両方で見られ、融合タンパク質ＺＭ３−２はＮｏ．７７タンパク質中で見られ、融合タンパク質ＺＭ８−２はＮｏ．８０試料中で見られた。結果は、本発明による融合タンパク質及びそのコードＲＮＡ又はゲノムＤＮＡが一部の神経膠芽腫に特異的に存在しており、別の神経膠芽腫には存在せず、またほぼ全てが二次性神経膠芽腫において見られたことを示した。
【００５３】
このようにして、配列番号３（融合タンパク質ＺＭ１−２）、配列番号４（融合タンパク質ＺＭ２−２）、配列番号５（融合タンパク質ＺＭ３−２）、配列番号６（融合タンパク質ＺＭ８−２）に示すような、融合タンパク質のアミノ酸配列が得られる。配列のアラインメントから、これらの４つの融合タンパク質が全て、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のほぼ全体に対してＰＴＰＲＺ１タンパク質の一部を融合することにより形成されていることが分かった。特に、融合タンパク質ＺＭ１−２は、ｃ−Ｍｅｔのエキソン２〜２４にＰＴＰＲＺ１のエキソン１を融合することにより得られ、融合タンパク質ＺＭ２−２は、ｃ−Ｍｅｔのエキソン２〜２４にＰＴＰＲＺ１のエキソン１〜２を融合することにより得られ、融合タンパク質ＺＭ３−２は、ｃ−Ｍｅｔのエキソン２〜２４にＰＴＰＲＺ１のエキソン１〜３を融合することにより得られ、融合タンパク質ＺＭ８−２は、ｃ−Ｍｅｔのエキソン２〜２４にＰＴＰＲＺ１のエキソン１〜８を融合することにより得られた。４つの融合タンパク質はいずれも、ｃ−Ｍｅｔのプロモーター及びエキソン１（非機能エレメント）に相当する部分を含有しなかった。従って、融合遺伝子がＰＴＰＲＺ１のプロモーターを用いて転写されると推測した。４つの融合遺伝子の構造の説明を図２に示す。
【００５４】
更に、臨床研究により、本発明で記載する融合タンパク質を有する神経膠芽腫の症例の生存期間の中央値が１２７日であり、報告されている神経膠芽腫の症例の生存期間の中央値（２４８日）より短いことが分かった。このようにして、二次性神経膠芽腫のうち、本発明で記載する融合タンパク質を発現する神経膠芽腫の亜型が予後不良であることが証明される。
【００５５】
実施例３
神経膠芽腫中の融合タンパク質のイムノブロッティングによる確認
実施例１で収集した８０個の神経膠芽腫試料の全タンパク質を、融合タンパク質のイムノブロッティングによる確認に供した。
【００５６】
イムノブロッティングによる確認で使用した抗体は、ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質に対する抗体であった（ウサギ抗体、Ａｂｃａｍ社から購入、製品番号ａｂ５１０６７）。非融合ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質の分子量は１４５ｋＤａであるが、融合タンパク質の分子量はより大きい。イムノブロッティングの操作は、抗体の説明書及びイムノブロッティングキットの説明書に従って実施した。
【００５７】
イムノブロッティングの結果は、得られた免疫ブロットのバンドが実施例２の結果と一致していることを示した。免疫ブロットのバンドは、表１に列挙した試料のうち、Ｎｏ．６０、Ｎｏ．６４、Ｎｏ．７７、Ｎｏ．７８、Ｎｏ．８０の試料で見られた（全て二次性神経膠芽腫の試料であった）。図３は、ＺＭ８−２及びＺＭ２−２のイムノブロッティングの結果を示している。ここでは、ＺＭ８−２の分子量は約１９０ｋＤａであり、ＺＭ２−２の分子量は、ほぼ重なり合った免疫ブロットのバンドで示されるように、非融合体であるヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質の分子量に近かった。
【００５８】
このように、本発明で記載する融合タンパク質が、一部の神経膠芽腫において特異的に発現され、別の神経膠芽腫では発現されないことを知ることができる。従って、神経膠芽腫は、融合タンパク質を発現する神経膠芽腫の亜型と、融合タンパク質を発現しない神経膠芽腫の亜型とに分類できる。
【００５９】
実施例４
神経膠芽腫細胞の増殖に対する式Ａで表される化合物の阻害活性の決定
式Ａで表される化合物及びクリゾチニブ、並びに式Ａの構造と同様の構造をそれぞれ有する式Ｂ〜Ｈで表される化合物を使用して、神経膠芽腫細胞の増殖に対する阻害活性を試験する実験を行った。
【００６０】
式Ａ〜Ｈで表される化合物を、中国特許第１０３１２２０００号において開示されているステップ及びスキームにより合成した。
【００６１】
【化２】
2019505581.tif 000006
【００６２】
【化３】
2019505581.tif 000007
【００６３】
【化４】
2019505581.tif 000008
【００６４】
【化５】
2019505581.tif 000009
【００６５】
【化６】
2019505581.tif 000010
【００６６】
【化７】
2019505581.tif 000011
【００６７】
【化８】
2019505581.tif 000012
【００６８】
【化９】
2019505581.tif 000013
【００６９】
クリゾチニブ（ＣＲＩＺＯＴＩＮＩＢ；ＰＦ−０２３４１０６６）：製品番号Ｓ１０６８、Ｓｅｌｌｅｃｋ社（米国）から購入。
【００７０】
最初に、レンチウイルスベクターＰＣＤＨ（ＰＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ、ＳＢＩ、製品番号ＣＤ５１０Ｂ−１、図４に示す構造）を使用し、配列番号７又は配列番号８で示すヌクレオチド配列をその説明書に従ってベクターにクローニングして、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ表される融合タンパク質を発現する発現ベクターを調製した。発現ベクターをそれぞれ「ＰＣＤＨ−ＺＭ１−２」及び「ＰＣＤＨ−ＺＭ２−２」と命名し、印をつけた。次に、ウイルスパッケージングプラスミド（ＳＢＩ、製品番号ＬＶ５００Ａ−１）を用いて、レンチウイルスを調製するためのベクターのうちの１つと共に２９３Ｔ細胞を同時感染させた。レンチウイルスベクターＰＣＤＨをパッケージングし、２９３Ｔ細胞に同時感染させるために同じ方法を実施して、ブランクベクターを有するレンチウイルスを調製した。これを「ＰＣＤＨ−ｂｌａｎｋ」と命名した。
【００７１】
ヒト神経膠腫細胞株Ｕ８７（これは本発明により提供される融合タンパク質をいずれも発現しなかった）をＣｅｌｌ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。Ｕ８７細胞を上で調製したレンチウイルスのうちのいずれに感染させ、ピューロマイシン（スクリーニング用に０．５μｇ／ｍＬ、維持用に０．２μｇ／ｍＬ）を加えることによりスクリーニングし、融合タンパク質を安定して発現する細胞モデルを確立した。これらの細胞モデルを融合タンパク質の発現及び融合遺伝子の転写に関して、イムノブロッティング及び逆転写ＰＣＲにより確認し、融合タンパク質ＺＭ１−２及びＺＭ２−２をそれぞれ安定に発現した細胞株を最終的に得て、これらをそれぞれ「ＰＣＤＨ−ＺＭ１−２発現細胞」及び「ＰＣＤＨ−ＺＭ２−２発現細胞」と命名した。同様に、Ｕ８７細胞に、ブランクベクターを有するレンチウイルスＰＣＤＨ−ｂｌａｎｋを感染させて、「ＰＣＤＨ−ｂｌａｎｋ発現細胞」をブランク対照として得た。
【００７２】
大きな皿で培養された、対数増殖期にあったこれらのＵ８７細胞を、滅菌ＰＢＳで１回洗浄し、その後０．２５％のトリプシンで２分間消化した。全ての細胞を消化して分離させた後、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する完全ＤＭＥＭ培地を用いて消化を停止させた。細胞を計数し、細胞濃度を２００００細胞／ｍｌに調整した。その後、細胞をマルチチャンネルピペットを用いてＣｏｒｎｉｎｇ  ９６ウェルプレートに播種し（２０００細胞／ウェル）に播種し、５％のＣＯ２インキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベートした。試験対象の化合物（クリゾチニブ及び式Ａ〜Ｈで表される化合物）をそれぞれＤＭＳＯに溶解させてストック溶液を調製し、その後ストック溶液及び完全培地を使用して、様々な薬剤濃度（０、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００μΜ）の溶液を調製した。細胞を、更に７２時間インキュベータでインキュベートし、その後２０μｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）を各ウェルに添加した。インキュベータ中での１〜３時間の後、マイクロプレートリーダを用いて４９０ｎｍでの吸光度を決定した。各濃度に対応する阻害率を計算し、ＩＣ５０の値をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで決定した。結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
2019505581.tif 000014
【００７４】
表２から、ヒト神経膠腫細胞株Ｕ８７自体及びブランク対照細胞株Ｕ８７において、同様の構造を有する式Ｆ〜Ｇで表される化合物と比較して、式Ａで表される化合物が細胞生存性の阻害についてより著しく強力な作用を発揮すること、及びクリゾチニブの作用と同様であるか又はクリゾチニブの作用よりはるかに高い増殖に対する阻害作用を発揮することを知ることができる。
【００７５】
加えて、実験の間に、融合タンパク質ＺＭ１−２及びＺＭ２−２の発現を伴う神経膠芽腫が明らかに速く増殖することが分かった。細胞に共通して、細胞生存性は式Ａで表される化合物によってのみ阻害され得、式Ｂ〜Ｈで表される化合物及びクリゾチニブの細胞生存性に対する阻害作用は、式Ａで表される化合物の阻害作用に明らかに劣っていた。
【００７６】
実施例５
神経膠芽腫のｉｎ−ｖｉｖｏでの腫瘍形成に対する式Ａで表される化合物の阻害活性の決定
神経膠芽腫のｉｎ−ｖｉｖｏでの腫瘍形成の阻害についての実験を、式Ａで表される化合物及びクリゾチニブを用いて実施した。
【００７７】
（１）腫瘍増殖の阻害についての実験
最初に、腫瘍を保有するマウスモデルを確立した。約１６〜１８ｇの体重の６〜８週齢の、母系ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）ヌードマウスをＶｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ社から購入した。実施例４で調製した「ＰＣＤＨ−ｂｌａｎｋ発現細胞」及び「ＰＣＤＨ−ＺＭ２−２発現細胞」をそれぞれＰＢＳで１０７細胞／ｍｌの懸濁液になるように調製した。７５％のエタノールで消毒したヌードマウスに、右の肩甲骨領域に１００μｌの細胞懸濁液を皮下注射した。ここでは、ＰＣＤＨ−ｂｌａｎｋ発現細胞を７匹のヌードマウスに注射し、ＰＣＤＨ−ＺＭ２−２発現細胞を２１匹のヌードマウスに注射した。皮下接種後、約２〜３日で、固形腫瘍の形成が観察され始め、約１５日後に腫瘍が形成されたことが分かった。腫瘍の大きさ及びマウスの体重の変化を１週間に２回測定した。「ＰＣＤＨ−ｂｌａｎｋ発現細胞」の注射により得た腫瘍を保有するマウスを「ベクターマウス（１）」と命名し、「ＰＣＤＨ−ＺＭ２−２発現細胞」の注射により得た腫瘍を保有するマウスを「ＺＭ２−２マウス（１）」と命名した。
【００７８】
腫瘍が約１００ｍｍ３の体積を有するまでに増殖したら、ＺＭ２−２マウス（１）を腫瘍の大きさの平均値により以下を含む３つのグループに分けた：式Ａで表される化合物を投与した７匹のマウスのグループ；クリゾチニブを投与した７匹のマウスのグループ；７匹のマウス対照グループ。前の２つのグループには、式Ａで表される化合物を１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、又はクリゾチニブを５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、強制栄養により投与した。これらの２種類の薬剤はそれぞれ、通常の生理食塩水を用いて懸濁液になるように調製し、継続投与のために連続して撹拌しながら、１日に１回投与した。対照グループには、通常の生理食塩水を強制栄養により投与した。腫瘍の大きさ及びマウスの体重の変化を１週間に２回測定した。腫瘍の直径はノギスで測定した。腫瘍の体積を計算するための方程式は以下であった：腫瘍の体積＝０．５＊長さ＊幅２。腫瘍の大きさの変化を図５に示す。結果は、式Ａで表される化合物がＺＭ２−２マウス（１）において腫瘍の増殖を有意に阻害できたこと、阻害作用がクリゾチニブの阻害作用より強力であったことを示していた。
【００７９】
（２）マウスの生存についての実験
最初に、腫瘍を保有するマウスモデルを確立した。実施例４で調製した「ＰＣＤＨ−ｂｌａｎｋ発現細胞」及び「ＰＣＤＨ−ＺＭ２−２発現細胞」をそれぞれ、ＰＢＳで１０５細胞／５μｌの懸濁液になるように調製した。７５％のエタノールで消毒したヌードマウスに１００μｌの細胞懸濁液を接種した。（大泉門の右側に２ｍｍ、後ろ側に２ｍｍ離れた）細胞接種位置をマウス用の脳の定位固定装置を用いて決定した。注射の深さは３．５ｍｍであり、その後０．６ｍｍ上昇させた。５μｌの細胞溶液をそれぞれ、各マウスに注射した。注射後、マウスを更に１時間そのまま維持し、次に、従来の皮膚閉鎖を行った。頭蓋内腫瘍を観察した後、「ＰＣＤＨ−ｂｌａｎｋ発現細胞」を用いて得た腫瘍を保有するマウスを「ベクターマウス（２）」と命名し、「ＰＣＤＨ−ＺＭ２−２発現細胞」を用いて得た腫瘍を保有するマウスを「ＺＭ２−２マウス（２）」と命名した。
【００８０】
マウスの脳を核磁気共鳴撮像により検出した。ベクターマウス（２）の頭蓋内腫瘍が、ＺＭ２−２マウス（２）の頭蓋内腫瘍より明らかに小さいことが分かった。このように、本発明により提供される融合タンパク質の発現は、マウスにおける神経膠芽腫の腫瘍形成の明白な増強につながったことが証明される。結果を、パネル７Ａ及び７Ｂにそれぞれ示す。
【００８１】
８匹のベクターマウス（２）及び８匹のＺＭ２−２マウス（２）にそれぞれ、式Ａで表される化合物を５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で投与した。この化合物を強制栄養により１日に１回投与した。同時に、対照グループとして、８匹のＺＭ２−２マウス（２）の別のグループに、通常の生理食塩水を投与した。この実験を６週間にわたり継続した。結果は、図６に示すように、通常の生理食塩水をのみを投与したＺＭ２−２マウス（２）が２０日目から徐々に死亡したが、一方で式Ａで表される化合物を投与したベクターマウス（２）は全て生存しており、式Ａで表される化合物の投与により、ＺＭ２−２マウス（２）の生存期間が明らかに延びたことを示した。
【００８２】
式Ａで表される化合物を投与したＺＭ２−２マウス（２）の脳を、式Ａで表される化合物を最初に投与した後１６日目に、核磁気共鳴撮像により検出した。頭蓋内腫瘍が明らかに小さくなったことが分かった。パネル７Ｃを参照のこと。同様に、式Ａで表される化合物が、ＺＭ２−２マウスにおける腫瘍の増殖を明白に阻害できることが証明される。
【００８３】
別の８匹のＺＭ２−２マウス（２）にもまた、式Ａで表される化合物を５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で投与した。この化合物を１日に１回、強制栄養により投与した。その後、最初の投与後１６日目に化合物の投与を停止し、化合物の中止後１０日目に核磁気共鳴撮像により脳を検出した。腫瘍が再び急速に増殖し始めたことが分かった。結果をパネル７Ｄに示す。
【００８４】
上述の実験結果によると、式Ａで表される化合物が、本発明により提供される融合タンパク質を発現する神経膠芽腫の増殖を有意に阻害でき、患者の生存を延長できること、及び神経膠芽腫は上記化合物を停止した後に再発しやすいことが確認できる。式Ａで表される化合物の腫瘍阻害作用は、クリゾチニブの腫瘍阻害作用よりもはるかに強力であり、従って、上記化合物をクリゾチニブの代替として使用できる。
【００８５】
更に、本発明の融合タンパク質を発現する神経膠芽腫の症例の生存期間の中央値が、他の報告されている神経膠芽腫の症例の生存期間の中央値よりも短いことが証明されており、これは、神経膠芽腫の中でも、融合タンパク質を発現する神経膠芽腫の症例が予後不良であることを意味する。予後不良であるこのような神経膠芽腫の亜型に関して、式Ａで表される化合物は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤として機能できる他の化合物、及びクリゾチニブと比較して優れた治療効果を発揮できる。
【００８６】
本発明の実施形態に関する上の説明は、本発明の限定を意図したものではなく、当業者は、本発明に従って様々な変更及び変形を実施でき、これらは本発明の精神から逸脱することなく本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
2019505581.tif 000017
【図２】
2019505581.tif 000018
【図３】
2019505581.tif 000019
【図４】
2019505581.tif 000020
【図５】
2019505581.tif 000021
【図６】
2019505581.tif 000022
【図７Ａ】
2019505581.tif 000023
【図７Ｂ】
2019505581.tif 000024
【図７Ｃ】
2019505581.tif 000025
【図７Ｄ】
2019505581.tif 000026
【配列表】
2019505581000001.app
【国際調査報告】
2019505581.tif 000027
2019505581.tif 000028
2019505581.tif 000029
2019505581.tif 000030
2019505581.tif 000031
2019505581.tif 000032