(57)【要約】  本発明は、２以上の質量標識のセットに関し、ここで各質量標識は下記式を含み：Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ、式中、Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、Ｍは質量修飾因子であり、ならびにＲｅはａ）質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはｂ）その分析物であり、そのセット中の各質量標識は整数質量を有し、そのセット中の各質量標識は同じ整数質量を有し、かつそのセットは質量標識の２以上のサブセットを含み、各サブセットは１つ、２つまたはそれより多くの質量標識を含み、かつそのサブセットが２以上の質量標識を含む場合、そのサブセット中の各質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量は同じサブセット中のおよび他の全てのサブセット中の質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量と異なり、かつ各質量標識は質量分析によって区別可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の質量標識のセットであって、各質量標識が下記式：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
を含み
式中：
Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、
Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、
Ｍは質量修飾因子であり、ならびに
Ｒｅはａ）前記質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはｂ）前記分析物であり、
前記セット中の各質量標識は整数質量を有し、
前記セット中の各質量標識は同じ整数質量を有し、
前記セットは質量標識の２以上のサブセットを含み、各サブセットは１つ、２つまたはそれより多くの質量標識を含み、
前記サブセットが２以上の質量標識を含む場合、前記サブセット中の各質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量は同じサブセット中のおよび他の全てのサブセット中の質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量と異なり、
各質量標識は質量分析によって区別可能であり、
各質量標識は下記一般式：
【化１】
2019505764.tif 000057
を含むレポーター部分Ｘを有し
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である、２以上の質量標識のセット。
【請求項２】
２以上の質量標識のセットであって、各標識が下記式：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
を有し
式中、Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、Ｍは質量修飾因子であり、ならびにＲｅは前記質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基または前記分析物であり、およびＸは下記一般式：
【化２】
2019505764.tif 000058
を含み
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である、２以上の質量標識のセット。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ４はメチルである、請求項１または２のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項４】
Ｒ２はＨである、請求項１〜３のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項５】
Ｒ３はＨ、メチル、イソプロピル、イソブチルからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項６】
Ｒ５はＨまたはメチルである、請求項１〜５のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項７】
前記レポーター部分Ｘは下記：
【化３】
2019505764.tif 000059
2019505764.tif 000060
から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項８】
前記レポーター部分Ｘは下記：
【化４】
2019505764.tif 000061
2019505764.tif 000062
から選択され
式中、＊は同位体質量調整部分でありかつ酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい、請求項７に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項９】
前記質量修飾因子Ｍは下記：
【化５】
2019505764.tif 000063
から選択され
式中：
各Ｒ１０は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり、
各Ｒ１１は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり、
ｂは１−１０の整数であり、
ｃは０−１０の整数であり、
ｄは１−１０の整数であり、および
ｅは１−１０の整数である、請求項４〜８のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１０】
前記質量修飾因子Ｍは下記：
【化６】
2019505764.tif 000064
から選択され
式中、＊は同位体質量調整部分でありかつ酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい、請求項９に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１１】
各質量標識は少なくとも１つの質量系列修飾基をさらに含み、前記質量系列修飾基は前記レポーター部分Ｘの一部および／または前記質量修飾因子Ｍの一部である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの質量系列修飾基は前記レポーター部分Ｘおよび前記質量修飾因子Ｍの一部である、請求項１１に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの質量系列修飾基は下記：
ｄ）重同位体２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏ；あるいは
ｅ）任意で１つ以上の重同位体置換を含む置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基；あるいは
ｆ）ａ）およびｂ）の組み合わせ
から選択される、請求項１１または１２に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１４】
前記質量系列修飾基は−ＣＨ３、−１３ＣＨ３、−ＣＨＤ２、−１３ＣＨＤ２、−１３ＣＤ３または−ＣＤ３である、請求項１３に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１５】
前記質量標識の各々は下記構造：
【化７】
2019505764.tif 000065
を有する少なくとも１つの質量系列修飾基を含み、
式中：
各Ｒ１２は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり；
ｆは１〜１０の整数であり；
ｇは１〜１０の整数であり；ならびに
ｈは１〜１０の整数である
請求項１１〜１４のいずれかに記載の、セット。
【請求項１６】
Ｒｅが前記分析物であるとき、前記分析物はアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、リン脂質またはそれらの組み合わせの群から選択される１つ以上の分析物を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１７】
各質量標識は下記構造：
【化８】
2019505764.tif 000066
の１つを有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１８】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化９】
2019505764.tif 000067
2019505764.tif 000068
2019505764.tif 000069
2019505764.tif 000070
2019505764.tif 000071
を有するｎ＝２１の質量標識を含む、請求項１７に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項１９】
各質量標識は下記構造：
【化１０】
2019505764.tif 000072
を有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１６のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２０】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化１１】
2019505764.tif 000073
2019505764.tif 000074
を有するｎ＝７の質量標識を含む、請求項１９に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２１】
各質量標識は下記構造：
【化１２】
2019505764.tif 000075
を有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１５のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２２】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化１３】
2019505764.tif 000076
を有するｎ＝５の質量標識を含む、請求項２０に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２３】
各質量標識は下記構造：
【化１４】
2019505764.tif 000077
を有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１６のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２４】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
サブセット
【化１５】
2019505764.tif 000078
を有するｎ＝３の質量標識を含む、請求項２３に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２５】
各質量標識は下記構造：
【化１６】
2019505764.tif 000079
の１つを有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１６のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２６】
各質量標識は下記構造：
【化１７】
2019505764.tif 000080
を有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素は２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１６のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２７】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化１８】
2019505764.tif 000081
2019505764.tif 000082
2019505764.tif 000083
2019505764.tif 000084
2019505764.tif 000085
を有するｎ＝２４の質量標識を含む、請求項２６に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２８】
各質量標識は下記構造：
【化１９】
2019505764.tif 000086
2019505764.tif 000087
の１つを有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１６のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項２９】
各質量標識は下記構造：
【化２０】
2019505764.tif 000088
を有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１６のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項３０】
＊は１３Ｃまたは１５Ｎでありかつ前記セットは下記構造：
【化２１】
2019505764.tif 000089
2019505764.tif 000090
2019505764.tif 000091
2019505764.tif 000092
2019505764.tif 000093
2019505764.tif 000094
を有するｎ＝２７の質量標識を含む、請求項２９に記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項３１】
各質量標識は下記構造：
【化２２】
2019505764.tif 000095
の１つを有し、
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい
請求項１〜１６のいずれかに記載の、２以上の質量標識のセット。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれかに定義される質量標識の２以上のセットを含む、質量標識のアレイ。
【請求項３３】
前記アレイにおける任意の１つのセットの質量標識の各々の整数質量は前記アレイにおける全ての他のセットの質量標識の各々の整数質量とは異なる、請求項３２に記載の、質量標識のアレイ。
【請求項３４】
一セット中の各質量標識は下記：
ａ）前記セット中の全ての他の質量標識と同じ整数質量を有する質量系列修飾基、および
ｂ）前記アレイの全ての他のセットの質量標識と異なる整数質量
を含む、請求項３２または３３に記載の、質量標識のアレイ。
【請求項３５】
一セット中の各質量標識は同じ質量系列修飾基を含む、請求項３２または３３に記載の、アレイ。
【請求項３６】
一セット中の各質量標識は前記アレイの全ての他の質量標識の質量系列修飾基のアイソトポログである質量系列修飾基を含む、請求項３２〜３３のいずれかに記載の、アレイ。
【請求項３７】
分析物と関連付けることができる質量標識または質量標識の組合せを質量分析によって同定することにより分析物を検出することを含む、質量分析の方法であって、前記質量標識は請求項１〜３６のいずれかに定義される質量標識のセットまたはアレイ由来の質量標識である、質量分析の方法。
【請求項３８】
ａ）複数の試料を提供することであって、各試料は１つ以上の分析物を含み、各試料は１つの質量標識または質量標識の組み合わせで示差標識され、１つ以上の標識分析物を得；前記質量標識（複数可）は請求項１〜３６のいずれかに定義される質量標識のセットまたはアレイに由来する、こと；
ｂ）前記複数の示差標識された試料を混合して標識分析物を含む分析混合物を形成すること；
ｃ）任意で前記標識分析物を質量分析計で検出すること；
ｄ）前記標識分析物を質量分析計で解離して質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントを形成すること；
ｅ）前記質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントを検出すること；
ｆ）任意で前記質量標識を前記質量分析計で解離して前記レポーター部分を放出すること、および前記レポーター部分を検出すること；
ｇ）任意で工程ｆ）で形成された前記レポーター部分を解離してフラグメントを形成すること、および前記フラグメントを検出すること；
ｈ）前記標識分析物の質量スペクトル；および／または前記質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトル；および／または前記レポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて分析物を同定すること
を含む、請求項３７に記載の、質量分析の方法。
【請求項３９】
前記分析物は前記標識分析物の質量スペクトルに基づいて同定される、請求項３８に記載の、質量分析の方法。
【請求項４０】
前記分析物は前記質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトルに基づいて同定される、請求項３８に記載の、質量分析の方法。
【請求項４１】
無傷の質量標識を含む前記分析物フラグメントは無傷の質量標識を含むｂ系列イオン、好ましくはｂ１イオンである、請求項４０に記載の、質量分析の方法。
【請求項４２】
前記分析物は前記レポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて同定される、請求項３７に記載の、質量分析の方法。
【請求項４３】
ａ）複数の試料を提供することであって、各試料は１つ以上の分析物を含み、各試料は１つの質量標識または質量標識の組み合わせで示差標識され、１つ以上の標識分析物を得；前記質量標識（複数可）は請求項１〜３６のいずれかに定義される質量標識のセットまたはアレイに由来する、こと；
ｂ）前記複数の示差標識された試料を混合して標識分析物を含む分析混合物を形成すること；
ｃ）前記標識分析物を質量分析計で検出すること；
ｄ）前記標識分析物を質量分析計で解離して前記レポーター部分を放出すること、および前記分析物または前記分析物のフラグメントに付着した前記質量標識の残りを含む相補イオンを検出すること；
ｅ）任意で工程ｄで形成された前記相補イオンを解離してフラグメントを形成する、および前記フラグメントを検出する１つ以上のさらなる工程；
ｆ）前記標識分析物の質量スペクトルおよび／または前記相補イオンおよび／またはそのフラグメントの質量スペクトルに基づいて前記分析物を同定すること
を含む、請求項３７に記載の、質量分析の方法。
【請求項４４】
前記解離は質量分析計における衝突誘起解離である、請求項３８〜４３のいずれかに記載の、方法。
【請求項４５】
４００の質量対電荷比で６０，０００を超える分解能、好ましくは４００の質量対電荷比で１００，０００を超える、最も好ましくは４００の質量対電荷比で２５０，０００を超える分解能を有する質量分析計で実施される、請求項３８〜４４のいずれかに記載の、方法。
【請求項４６】
工程ｄ）において前記相補イオンは結合Ｌからの一酸化炭素のニュートラルロスによって形成される、請求項３８〜４５のいずれかに記載の、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
この発明は、ペプチド、特に複合タンパク質混合物に由来するペプチドを同定し定量するために、ペプチドを標識するための有用な反応性標識およびこれらの反応性標識を使用するための方法に関する。これらの反応性標識は、高分解能および高質量精度の質量分析計、例えばオービトラップ、飛行時間型およびイオンサイクロトロン共鳴質量分析計によるペプチドの分析に特に価値がある。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
生物システムの研究、特にヒト疾患の理解は、疾患により、または疾患に応じて生物システムにおいて引き起こされる変化を検出する能力に依存する。そのような変化は、診断の手段を与え、ワクチンおよび医薬などの治療化合物の標的への洞察を提供する。核酸、タンパク質、ステロイド、糖および脂質を含む幅広い生体分子が疾患過程を理解するために定量的に測定される必要がある。この状況では、質量分析計を用いてそのような生体分子を定量的に検出する能力は、それらの研究ならびにヒトおよび動物疾患への適用においてかなりの進歩をもたらしてきた。同じ進歩が環境解析およびモニタリング、ならびに食品および飲料製造においても起きている。特に、合成の定量基準を提供するための安定な同位体の使用が、全てのクラスの生体分子のモニタリングのための同位体希釈質量分析において開発されてきた。しかしながら、これらの方法は従来、利用可能な合成標準を必要とし、これは常に可能とは限らない。
【０００３】
近年、質量分析による生体分子の定量分析をさらに改良するために、重同位体置換を有する様々な化学質量タグが開発されている。タグ設計に依存して、タグセットのメンバーは、同じ化学構造を有するが異なる絶対質量を有する同位体か、または、同一の構造および絶対質量の両方を有するアイソバリックおよびアイソトポメリックのいずれかである。同位体タグはＭＳモードでの定量化のために典型的に使用され、一方、アイソバリックタグは、特有の質量を有するレポーター断片を放出するためにＭＳ／ＭＳモードでフラグメント化されなければならない。
【０００４】
同位体質量タグの初期の例は同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）（Ｇｙｇｉ，  Ｓ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １７，  ９９４−９９９）であった。ＩＣＡＴ試薬は、１つの（重）タグに重同位体が取り込まれもう一方の（軽）タグでは置換がない、異なる取り込みを有する一対の質量タグである。２つの試料は重タグまたは軽タグのいずれかで標識され、次いで混合され、その後ＬＣ−ＭＳにより分析される。両方の試料中に存在するペプチドは、重同位体原子置換の数に比例して質量が異なるプリカーサーイオンの対を与える。
【０００５】
ＩＣＡＴ法はまた「サンプリング」法の例でもあり、これらは、生成される質量スペクトルの複雑性を低減させるために小さなペプチド集団を扱う一方で、元試料についての十分な情報を保持してその成分を同定する必要性を両立させる方法として有用である。ＩＣＡＴ手順で使用される「同位体コードアフィニティータグ」は、システインを含むペプチドを捕捉するための、チオールに対して反応性である一対のビオチンリンカー同位体を含む。プロテオームにおける典型的には９０〜９５％のタンパク質は少なくとも１つのシステイン含有ペプチドを有し、典型的にはシステイン含有ペプチドは全体で１０個に約１個のペプチドに相当し、そのため、システイン含有ペプチドの分析は、試料についての重大な情報を失うことなく、試料複雑性を大きく低減させる。よって、ＩＣＡＴ法では、１つの起源由来のタンパク質の試料が「軽」同位体ビオチンリンカーと反応させられ、一方、第２の起源由来のタンパク質の試料が、「重」同位体ビオチンリンカー（典型的には軽同位体よりも４〜８ダルトン重い）と反応させられる。２つの試料はその後、プールされ、エンドペプチダーゼで切断される。ビオチン化システイン含有ペプチドはその後、質量分析によるその後の分析のためにアビジン化ビーズ上で単離されてよい。２つの試料は定量的に比較でき：対応するペプチド対は相互標準として機能し、それらの比が定量され得る。ＩＣＡＴサンプリング手順は、依然として正確に起源試料を表すがＭｕｄＰＩＴよりも複雑性が低いペプチドの混合物を生成するが、多数のペプチドが依然として単離され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるそれらの分析は複雑なスペクトルを生成する。２つのＩＣＡＴタグを用いると、標識を含まない分析と比べ質量スペクトル中のペプチドイオンの数が倍加する。
【０００６】
同位体タグのさらなる例としては、４つまでの異なる試薬を提供するＩＣＰＬ試薬が挙げられ、ＩＣＰＬを用いると、質量スペクトルにおけるペプチドイオンの数は標識を含まない分析と比べ４倍になる。この理由のために、単純重同位体タグ設計で非常に高いレベルの多重化を開発することが実用的である可能性は低い。
【０００７】
同位体タグはプロテオミクス研究における定量を可能にし実験の再現性を助けるが、これは質量スペクトルの複雑性の増加という代償を払って達成される。この制限を克服するために、およびタンデム質量分析のより大きな特異性を利用するために、アイソバリック質量タグが開発された。２０００年（ＷＯ０１／６８６６４号）にそれらが導入されて以来、アイソバリック質量タグは、複数の試料の混合および同時分析前のタンパク質およびペプチド中のアミンおよび他の反応性官能基の普遍的標識によるプロテオミクス発現プロファイリングの改善された手段を提供してきた。タグはアイソバリックであり、同じ質量を有するので、それらは質量スペクトルの複雑性を増加させない。なぜなら同じペプチドの全てのプリカーサーはクロマトグラフ分離において全く同じ点で現れ同じ統合質量を有するからである。分子がタンデム質量分析の前にフラグメント化される場合にのみ、特有の質量レポーターが放出され、よって、元の試料の各々中に存在するペプチドの相対または絶対量が決定され得る。
【０００８】
ＷＯ０１／６８６６４号は、アイソバリック質量タグの根底にある原理を提示し、好適なタグの具体例を提供し、この場合、分子内の異なる特定原子が、それぞれ１３Ｃおよび１５Ｎを含む重同位体形態と置換される。ＷＯ０１／６８６６４号は、個々のタグのサイズを不当に増加させずに有効な全体の多重化率を増加させるための、複数のアイソバリックセットを作製するためのオフセット質量の使用をさらに記載する。
【０００９】
ＷＯ２００７／０１２８４９号は、３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＯＳｕ）を含むアイソバリック質量タグのセットをさらに記載する。
【００１０】
近年、高質量分解能質量分析計、例えばオービトラップ（Ｈｕ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ，  （２００５）  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，  ４０，  ４３０−４４３  ＆  Ｍａｋａｒｏｖ，  Ａ．  （２０００）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ７２，  １１５６−１１６２）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析計（Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９８）  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ，  １７，  １−３５）および高分解能飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｇ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，  （２０１１）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８３，  ５４４２−５４４６）により可能になった質量精度および質量分解能における劇的な改善により、イオン質量対電荷比間のミリダルトン差を分解できるようになった。この高分解能は、レポーター領域で１５Ｎに代わる１３Ｃの重核子置換を用いるアイソバリックタンデム質量タグの多重化を増加させるために開拓され、これはＭＳ／ＭＳによる分析で個々のレポーターフラグメント間の６．３２ミリダルトン差をもたらした（ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ，  Ｇ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８４，  ７４６９−７４７８  ＆  Ｗｅｒｎｅｒ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８４，  ７１８８−７１９４）。同様に、ミリダルトン質量差を含むリジン同位体での代謝標識は高分解能質量分析によって分解でき、酵母で試料の多重化および相対定量を可能にすることが示されている（Ｈｅｂｅｒｔ，  Ａ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １０，  ３３２−３３４）。
【００１１】
前に開示されたアイソバリック質量タグの大きな利益に関わらず、今日まで多重化率は、市販の試薬において１０重に限定されている。加えて、ごくわずかな質量差を含むタグは有用である。なぜなら互いに関連する標識イオン、例えば異なる試料由来の対応するペプチドは、容易に認識できかつ他の異なるペプチドの同定を妨害する可能性がはるかに低い非常に特徴的かつ非天然の同位体パターンで、同じイオンエンベロープ中で密集するからである。
【００１２】
よって、各タグが他のものとミリダルトンの質量差だけ異なる、ペプチドおよび生体分子を標識するための、１０倍を優に超える多重化率を有するタグのセットが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
（発明の簡単な説明）
第１の態様では、本発明は２以上の質量標識のセットに関し、ここで各質量標識は下記式を含み：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
式中：
−Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、
−Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、
−Ｍは質量修飾因子であり、ならびに
−Ｒｅはａ）質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはｂ）その分析物であり、
ここでそのセット中の各質量標識は整数質量を有し、ここでそのセット中の各質量標識は同じ整数質量を有し、ここでそのセットは質量標識の２以上のサブセットを含み、各サブセットは１つ、２つまたはそれより多くの質量標識を含み、ここでそのサブセットが２以上の質量標識を含む場合、そのサブセット中の各質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量は同じサブセット中のおよび他の全てのサブセット中の質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量と異なり、ここで各質量標識は質量分析によって区別可能であり、ここで各質量標識は下記一般式を含むレポーター部分Ｘを有し：
【化１】
2019505764.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基；あるいはメチル、エチル、プロピルまたはｎ−プロピル、イソプロピル、ブチルまたはｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である。
【００１４】
別の態様では、本発明は２以上の質量標識のセットに関し、ここで各標識は下記式を含み：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
式中、Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、Ｍは質量修飾因子であり、ならびにＲｅは質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはその分析物であり、およびＸは下記一般式を含み：
【化２】
2019505764.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいはメチル、エチル、プロピルまたはｎ−プロピル、イソプロピル、ブチルまたはｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明による質量標識の２以上のセットを含む、質量標識のアレイに関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は質量分析の方法に関し、その方法は分析物と関連付けることができる質量標識または質量標識の組合せを質量分析によって同定することにより分析物を検出することを含み、ここで質量標識は本発明による質量標識のセットまたはアレイ由来の質量標識である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
（図面の簡単な説明）
【図１】この発明による置換されたピペラジン−２−カルボン酸質量標識レポーターの予測されるフラグメンテーション経路の模式図である（示された構造は仮想上のものであり、予想されるレポーターイオンの質量対電荷比を単に予測するために例示される）。この発明による好適な質量修飾因子リンカーの第１の例もまた示される。
【図２】この発明による置換されたピペラジン−２−カルボン酸質量標識レポーターの予測されるフラグメンテーション経路の模式図（示された構造は仮想上のものであり、予想されるレポーターイオンの質量対電荷比を単に予測するために例示される）。この発明による好適な質量修飾因子リンカーの第２の例もまた示される。
【図３】この発明によるΝ’，Ν’−ジメチルピペラジン−２−カルボン酸レポーター部分のための公開された合成方法の概略図である。
【図４】この発明の環置換のΝ’，Ν’−ジメチルピペラジン−２−カルボン酸レポーター部分の生成のための第２の新規合成方法の概略図である。
【図５】重同位体ドーピングを用いて容易に入手できるα−アミノ酸を、図４で示される合成方法で使用され得るα−アミノアルコールに変換するための合成経路の概略図である。
【図６】この発明の質量タグの合成のために有用な市販の重同位体ドーププリカーサーの例を示し、グリシン、ブロモ酢酸およびメチルアミンなどのアルキルアミンを使用してＮ−アルキルピペラジンを合成できる。図６ａはセリン、エタノールアミン、ホルムアルデヒドおよびスレオニンの重同位体の例を示し、図６ｂはアラニン、バリンおよびロイシンの重同位体の例を示す。
【図７】２つの連続するβ−アラニン残基からなる質量修飾因子リンカーの合成およびのこの発明のレポーター構造へのカップリングの略図である。
【図８】１，４−ジアミノブタンからなる質量修飾因子リンカーの合成およびこの発明のレポーター構造へのカップリングの略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（本発明の詳細な説明）
（質量標識のセット）
本発明は、ペプチドおよび他の生体分子を標識するための、１０重を優に超える多重化率を有するアイソトポメリック反応性タグのセットを提供する。アイソトポメリック（ｉｓｏｔｏｍｏｐｅｒｉｃ）反応性タグの共選択可能なアイソトポログアレイは、いっそうより高いレベルの多重化を支持するミリダルトンの範囲で質量差を有する。
【００１９】
本発明はまた、特に生体試料のセット間の生物学的に有意な違いを発見するための標識ペプチド、タンパク質および他の生体分子の新規の分析形態を可能にするアイソトポメリック反応性タグの共選択可能なアイソトポログアレイの使用の方法を提供する。
【００２０】
第１の態様では、本発明は２以上の質量標識のセット（以下、「発明の質量標識の第１のセット」と呼ばれる）に関し、ここで各質量標識は下記式を含み：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
式中：
−Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、
−Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、
−Ｍは質量修飾因子であり、ならびに
−Ｒｅはａ）質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはｂ）その分析物であり、ここでそのセット中の各質量標識は整数質量を有し、ここでそのセット中の各質量標識は同じ整数質量を有し、ここでそのセットは質量標識の２以上のサブセットを含み、各サブセットは１つ、２つまたはそれより多くの質量標識を含み、ここでそのサブセットが２以上の質量標識を含む場合、そのサブセット中の各質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量は同じサブセット中のおよび他の全てのサブセット中の質量標識のレポーター部分Ｘの精密質量と異なり、ここで各質量標識は質量分析によって区別可能であり、ここで各質量標識は下記一般式を含むレポーター部分Ｘを有し：
【化３】
2019505764.tif 000004
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基；あるいはメチル、エチル、プロピルまたはｎ−プロピル、イソプロピル、ブチルまたはｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である。
【００２１】
「精密質量」という用語は、質量標識またはレポーター部分の理論上の質量を指し、質量標識全体またはレポーター部分の個々の同位体の精密質量の合計であり、例えば１２Ｃ＝１２．００００００、１３Ｃ＝１３．００３３５５、Ｈ１＝１．００７８２５、１６Ｏ＝１５．９９４９１５である。「精密質量」は質量欠損を考慮する。
【００２２】
「整数質量」という用語は、分子を構成する各核の各同位体の整数質量の合計であり、例えば１２Ｃ＝１２、１３Ｃ＝１３、１Ｈ＝１、１６Ｏ＝１６である。同位体の整数質量は、同位体の核を構成する陽子と中性子の合計であり、すなわち、１２Ｃは６個の陽子と６個の中性子を含み、一方、１３Ｃは６個の陽子と７個の中性子を含む。これは、同位体の公称質量、または原子質量数もしくは核子数と呼ばれることも多い。
【００２３】
文献において、「アイソバリック」という用語は、同じ整数質量を有し、かつＭＳ／ＭＳ用に共選択可能である種を示すことが多いが、この発明との関連で我々は、同じ精密質量を有する種に関しては「アイソバリック」という用語を使用し、かつ我々は、同じ整数質量を有するがわずかに異なる精密質量を有し得る種に対しては、「シュードアイソバリック」という用語を使用する。
【００２４】
サブセット中の少なくとも２つの質量標識間の精密質量の差は通常、１００ミリダルトン未満、好ましくは５０ミリダルトン未満、最も好ましくは２０ミリダルトン（ｍＤａ）未満である。好ましくは、セット中の少なくとも２つの質量標識間の精密質量の差は、共通の同位体置換のため、２．５ｍＤａ、２．９ｍＤａ、６．３ｍＤａ、８．３ｍＤａ、９．３ｍＤａ、または１０．２ｍＤａである。例えば、第１の標識が１３Ｃ同位体を含み、第２の標識中で１３Ｃ同位体は１２Ｃに置き換えられるが１４Ｎ同位体が１５Ｎ同位体に置き換えられる場合、２つの標識間の精密質量の差は６．３ｍＤａとなる。
【００２５】
本明細書では、標識という用語はタグという用語と同義である。
【００２６】
「レポーター部分Ｘ」という用語は、典型的には開裂後に、質量分析により、独立して検出される質量標識の部分を示すために使用されるが、しかしながら、相補イオンとして分析物に付着された質量標識の残りの部分も本発明の方法で検出され得ることが理解されるであろう。質量修飾因子Ｘは、質量標識が確実に所望の整数質量を有するように質量標識に組み込まれる部分である。各質量標識のレポーター部分Ｘは、いくつかの実施形態では、重同位体を含まなくてもよい。
【００２７】
本発明によるレポーター部分の構成要素は好ましくは、レポーター部分のフラグメンテーションの部位が衝突誘起解離（ＣＩＤ）、表面誘起解離、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、または高速原子衝撃によって容易に破壊される開裂可能な結合Ｌの導入によって制御できるように、フラグメンテーション抵抗性である。最も好ましい実施形態では、結合はＣＩＤにより容易に破壊される。
【００２８】
所望の整数質量を達成するために、部分ＸとＭの一方もしくは両方、反応性官能基Ｒｅまたは分析物を重同位体で修飾できることが当業者により理解されるであろう。典型的には、重同位体は２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏから選択される。
【００２９】
好ましくは、サブセット中の各質量標識のレポーター部分は、サブセット中の他の全ての質量標識のレポーター部分のアイソトポログである。アイソトポログは、それらの分子の同位体組成のみが異なる化学種である。例えば、水は３つの水素関連アイソトポログ：ＨＯＨ、ＨＯＤおよびＤＯＤを有し、ここでＤは重水素（２Ｈ）を表す。アイソトポログは、同じ数の各同位体を有するが異なる位置で有する同位体異性体であるアイソトポマー（同位体異性体）とは区別される。より好ましくは、２以上の質量標識のセットは、２以上の質量標識を含む少なくとも１つのサブセットを含む。
【００３０】
通常、精密質量の差は、異なる数またはタイプの重同位体置換（複数可）によってもたらされる。
【００３１】
１つの実施形態では、質量標識はＷＯ０１／６８６６４号で定義されるようなタンデム質量タグのアイソトポログである。
【００３２】
好ましい実施形態では、質量標識の統合分子量は６００ダルトン以下、より好ましくは、５００ダルトン以下、さらにより好ましくは、４００ダルトン以下、最も好ましくは３００〜５００ダルトンである。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、レポーター部分の分子量は４００ダルトン以下、好ましくは２５０ダルトン以下、より好ましくは１００〜２５０ダルトン、最も好ましくは１００−２２０ダルトンである。サイズの小さいレポーター部分が特に有利である。なぜならそれは質量スペクトルのサイレント領域でピークを生じ、これが、質量スペクトルからレポーター部分を容易に同定することを可能にし、かつ感度の高い定量も可能にするからである。
【００３４】
本文脈で使用される質量スペクトルのサイレント領域という用語は、標識ペプチドのフラグメンテーションによって生成されるフラグメントの存在に関連するピークによって生じる低いバックグラウンド「ノイズ」を有する質量スペクトルの領域を指すと意図される。よって、サイレント領域という用語は、検出されるペプチドに関連するピークによって生じる低い「ノイズ」を有する質量スペクトルの領域を指すと意図される。ペプチドまたはタンパク質について、質量スペクトルのサイレント領域は２２０ダルトン未満、好ましくは２００ダルトン未満である。
【００３５】
本発明による質量標識は、タンパク質などの生体分子と反応して、標識生体分子、例えば標識タンパク質を形成するように設計される。
【００３６】
１つの実施形態では、Ｒ１およびＲ４はメチルである。
【００３７】
別の実施形態では、Ｒ２はＨである。
【００３８】
別の実施形態では、Ｒ３はＨ、メチル、イソプロピル、イソブチルからなる群より選択される。
【００３９】
別の実施形態では、Ｒ５はＨまたはメチルである。
【００４０】
好ましい実施形態では、レポーター部分Ｘは、下記から選択される：
【化４】
2019505764.tif 000005
【００４１】
より好ましい実施形態では、レポーター部分Ｘは下記から選択され：
【化５】
2019505764.tif 000006
式中、＊は同位体質量調整部分であり、かつ炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００４２】
別の実施形態では、開裂可能な結合Ｌは、限定はされないが、アミド結合、尿素結合、エステル結合またはエーテル結合を含む。好ましい実施形態では、開裂可能な結合Ｌはアミド結合を含む。別の好ましい実施形態では、開裂可能な結合Ｌは尿素結合を含む。別の好ましい実施形態では、開裂可能な結合Ｌはエステル結合を含む。別の好ましい実施形態では、開裂可能な結合Ｌはエーテル結合を含む。
【００４３】
「質量修飾因子Ｍ」という用語は、本明細書で使用する場合、そのセット中の各質量標識が所望の整数質量を有することを確保する部分を指す。質量修飾因子Ｍは、質量分析によって必ずしも検出されるわけではない。しかしながら、質量修飾因子Ｍは相補イオンの一部として検出され得る（下記参照）。質量修飾因子Ｍは構造的に特に限定されず、単に質量標識の全体的な質量を変化させるように機能する。
【００４４】
別の実施形態では、質量修飾因子Ｍは下記から選択され：
【化６】
2019505764.tif 000007
式中：
−各Ｒ１０は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり、
−各Ｒ１１は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり、
−ｂは１−１０の整数であり、
−ｃは０−１０の整数であり、
−ｄは１−１０の整数であり、および
−ｅは１−１０の整数である。
【００４５】
好ましい実施形態では、質量修飾因子Ｍは下記から選択され：
【化７】
2019505764.tif 000008
式中、＊は同位体質量調整部分であり、かつ酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００４６】
別の実施形態では、各質量標識は少なくとも１つの質量系列修飾基をさらに含み、ここで質量系列修飾基はレポーター部分Ｘの一部および／または質量修飾因子Ｍの一部である。
【００４７】
好ましくは、各質量標識は質量系列修飾基を含み、ここで少なくとも１つの質量系列修飾基はレポーター部分Ｘまたは質量修飾因子Ｍの一部またはその両方である。より好ましくは、質量系列修飾基はレポーター部分Ｘの一部である。
【００４８】
好ましくは、質量系列修飾基は下記から選択されてよい：
ａ）重同位体２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎまたは１８Ｏ；
ｂ）任意で１つ以上の重同位体置換を含む、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基；あるいは
ｃ）ａ）およびｂ）の組み合わせ。
【００４９】
１つの実施形態では、質量系列修飾基は−ＣＨ３、−１３ＣＨ３、−ＣＨＤ２、−１３ＣＨＤ２、−１３ＣＤ３または−ＣＤ３から選択される。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、各質量標識は下記構造を有する少なくとも１つの質量系列修飾基を含み：
【化８】
2019505764.tif 000009
式中：
−各Ｒ１２は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換または非置換脂肪族環状基、置換または非置換芳香族基あるいは置換または非置換複素環基あるいはアミノ酸側鎖であり；
−ｆは１〜１０の整数であり；
−ｇは１〜１０の整数であり；ならびに
−ｈは１〜１０の整数である。
【００５１】
本発明による質量標識では、Ｒｅは質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基または分析物のいずれかであってよい。
【００５２】
好ましくは、質量タグは、質量標識が分析物にコンジュゲートされるのを可能にする反応性官能基をさらに含む。質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基は特には限定されず、任意の適切な反応基を含み得る。
【００５３】
反応性官能基は、生体分子上のアミノ基、例えばリジン残基のε−アミノ基と反応し得る。最も単純な実施形態において、これはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり得る。他の反応性官能基、例えば、生体分子中のチオール基と反応するものが本明細書で企図される。特に、これらの反応性官能基は、システイン残基のチオール基と反応するように設計される。システイン残基と反応できる本発明の反応基の例はマレイミド、ハロアセチルおよび２−ジチオピリジン基である。システインのチオール基はマレイミド基の二重結合にまたがる求核付加を受け、かつハロアセチルまたは２−ジチオピリジン基との求核置換を受ける。
【００５４】
生体分子中のカルボニルまたはヒドロキシル基と反応できる反応性官能基もまた、本明細書で企図される。特に、これらの反応性官能基は、ステロイドホルモンのカルボニルまたはヒドロキシル基と反応するように設計される。生体分子中のカルボニルまたはヒドロキシル基と反応できる本発明の反応基は、ヒドラジドまたは−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２（式中、ｎは１〜６であり、好ましくはｎは３である、すなわち、アミノキシプロピルアミド）である。これらの基は、カルボニル基と反応して、それぞれ、ヒドラゾンまたはＯ−アルキルオキシムを形成する。反応性官能基の例は、ＷＯ２０１１／０３６０５９号（その引用が本明細書に組み込まれる）に示される。
【００５５】
好ましくは、反応性官能基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルまたはスルホジクロロフェニルエステルである。
【００５６】
Ｒｅが分析物であるとき、分析物は好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、リン脂質またはそれらの組み合わせを含む。
【００５７】
多重化を改善することは、アイソバリック質量標識の非常に求められている特徴である。なぜならそれは多数の試料の標識を可能にし、分析がたった１回の実験であり、したがって、分析の時間、費用を低減し、かつより多数の試料のための分析条件を標準化もするからである。本発明で開示される一般構造による質量標識中で１５Ｎおよび１３Ｃ置換のみを用いるアイソバリック質量標識用の質量標識を作製するために、２つの異なる元素を含む重同位体質量系列修飾基で置換可能な位置（Ｐ位置）と第１の元素に置換可能な位置（Ａ位置）と第１のものとは異なる第２の元素に置換可能な位置（Ｂ位置）とを考慮する必要がある。Ａ位置の数はＢ位置の数以上であるべきである。質量標識の（Ｐ＋１）個のサブセットが存在しかつ質量標識のｘ番目のサブセットがＣ個の質量標識を含むと仮定すると、Ｃは、（Ｂ＋１）以下であるべきである。各レポーター部分は、第１の元素または第２の元素のいずれかに由来する重同位体で置換された（ｘ−１）個の位置を含み、その場合、質量標識の各サブセットにおけるｗ番目の質量標識は、第１の重同位体元素のｙ個の原子および第１のものとは異なる第２の重同位体元素のｚ個の原子を含み、ｘは、１〜（Ｐ＋１）の値を有する。Ｐ＝（Ａ＋Ｂ）であり、質量標識の総数は、（Ａ＋１）に（Ｂ＋１）を乗じたものである。
【００５８】
好ましい実施形態では、Ｂは２以上である。
【００５９】
例えば、レポーター部分中および質量修飾因子中に７つのドープ可能な炭素と２つのドープ可能な窒素が存在する質量標識は、最大２４重の、すなわち（７＋１）に（２＋１）を乗じた、アイソバリックセットを支持する。１ダルトンの分解能で、これらのレポーターは、異なる整数レポーター質量を有する質量標識の１０重（Ｐ＝７＋２により、（９＋１）個）のサブセットを支持する。明らかに、レポーター部分基を異なるＲ−基で置換できるので、質量標識の異なる異性体が可能であり、異なるフラグメンテーション挙動の選択肢が提供される。
【００６０】
本発明による最も好ましい質量標識が、重同位体質量系列修飾基を含む２以上の質量標識のセットの例と共に、本明細書で、下記の好ましい実施形態１〜６において詳細に記載される。質量標識はセット番号、元のセットサイズおよびレポーターイオン質量により識別され、例えば下記の実施形態またはセット１では、各質量標識はＴＭＴ−１−２１−「レポーター質量」と命名され、ここでＴＭＴは、タンデム質量タグ、すなわちタンデム質量分析用のタグを表し、数字の１はセット番号を指し、２１はセット中の質量標識の数を指し、レポーター質量は衝突誘起解離条件下での予想されるレポーターイオンの質量対電荷比である。様々なレポーターイオンが電子移動解離（ＥＴＤ）または電子捕獲解離（ＥＣＤ）により得られ得る。
【００６１】
（実施形態１：）
質量標識は、下記構造を有し：
【化９】
2019505764.tif 000010
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００６２】
セット例１中のタグの予想されるフラグメンテーションが図１で示される。レポーター構造の合成が図３で示され、二重β−アラニンリンカーの付加が図７で示される。この発明のタグの合成は、この文書の後ろで、より詳細に記載される。
【００６３】
この発明による質量タグのアイソバリックセットの特定の好ましい実施形態では、質量調整部分＊は１３Ｃまたは１５Ｎであり、セットは下記構造を有するｎ＝２１の質量標識を含む：
【化１０】
2019505764.tif 000011
2019505764.tif 000012
2019505764.tif 000013
2019505764.tif 000014
2019505764.tif 000015
【００６４】
上で記載される好ましい実施形態で提示される専門用語を解釈すると、ｍ（上で規定される）は２１であり、ｎ＝８である。１５Ｎを置換できる窒素原子より１３Ｃを置換できる炭素原子が多いので、ａ＝６の置換可能な炭素核およびｂ＝２の置換可能な窒素核が存在する。よって、各タグに組み込まれる６つの原子の第１の重同位体質量調整因子（１３Ｃである）および２つの原子の第２の重同位体質量調整因子（１５Ｎである）が存在し、フルセットの質量タグは、フラグメンテーション可能な結合（上記構造中点線で示される）の両側で質量調整因子の全ての可能な組み合わせを作成することにより作製される。上記リストにおいて、レポーターイオンの整数質量に基づき、（ｎ＋１）＝９のサブセットのタグが存在する、すなわち、サブセット２中のレポーターイオンは、サブセット１中のレポーターイオンよりおよそ１ダルトン重いことがわかる。同様に、サブセット３中のレポーターイオンは、サブセット２中のレポーターイオンよりおよそ１ダルトン重い、など。タグの各サブセット内で、計算した精密質量から、各タグは次のものと６．３２ミリダルトン異なることがわかる。サブセット１では、レポーターイオン中に重同位体質量調整因子は存在せず、このレポーターを構築できる方法は１つしかないため、サブセット１には１つのタグしか存在しない。サブセット２では、レポーターイオン中に重同位体質量調整因子が１つ存在し、レポーターの質量を、サブセット１と比べておよそ１ダルトンだけシフトさせる。質量調整因子を導入するには、１つの１５Ｎ核の導入によるかまたは１つの１３Ｃ核の導入によるかの２つの方法があり、それゆえ、サブセット２には、質量が互いに６．３ミリダルトン異なる２つのタグが存在する。サブセット３では、レポーターイオン中に２つの重同位体質量調整因子が存在し、レポーターの質量を、サブセット２と比べておよそ１ダルトンだけシフトさせる。２つの質量調整因子をサブセット３に導入するには、２つの１５Ｎ核の導入によるかまたは１つの１５Ｎ核と１つの１３Ｃ核の導入によるかまたは２つの１３Ｃ核の導入によるかの３つの方法があり、それゆえ、サブセット３には３つのタグが存在する。サブセット４では、レポーターイオン中に３つの重同位体質量調整因子が存在し、レポーターの質量をサブセット３と比べておよそ１ダルトンだけシフトさせる。この場合も、３つの質量調整因子をサブセット３に導入するには、２つの１５Ｎ核と１つの１３Ｃの導入によるかまたは１つの１５Ｎ核と２つの１３Ｃ核の導入によるかまたは３つの１３Ｃ核の導入によるかの３つの方法しかなく、それゆえ、サブセット４には、３つのタグが存在する。一般に、各サブセットにおけるタグの数は、質量調整因子核のうちどれがその構造中により少ない頻度で存在するかにより制限される。セット例１では、レポーターおよび質量正規化因子中に、２つの窒素核しか存在せず、そのため上で規定されるようにｂ＝２であり、タグの各サブセット中のタグの数は（ｂ＋１）以下であり、これは、最高３つのタグ／サブセットである。８番目のサブセットでは、７つの重同位体質量修飾因子が存在し、アイソバリックタグ構造全体を保持しながら８つの重同位体を有するレポーターイオンを構成するのに、２つの方法しか存在せず、そのため、９番目のサブセット中には２つのタグしか存在せず、同様に９番目サブセットでは、レポーター中に８つ全ての重同位体質量調整因子が存在し、質量修飾因子全てを有するレポーターを構成するのに１つの方法しか存在せず、そのため、サブセット９には１つのタグしか存在しない。
【００６５】
質量正規化官能基（このタグ中で２つのβ−アラニン残基を含む）はかなり多様であり得ることが、当業者には明らかなはずである。明らかな置換としては、アラニン、バリン、ロイシンなどの他のアミノ酸とのまたはγ−アミノ酪酸、アミノペンタン酸またはアミノヘキサン酸などのより長いアミノ酸との置き換えが挙げられる。ポリエチレングリコールリンカーがアミノおよびカルボン酸末端で適切な場合もある。ベンジルエステルの調製および全てのこれらの代替物に対するこれらのエステルの使用は、β−アラニンについて図７で示されるものと本質的に同じである。
【００６６】
単一のアイソバリック質量タグセット、例えば、上で記載される実施形態セット１の多重化率の制限は、固有の追加の質量を各々保有する複数のセットを提供することによって克服できる。追加の質量は、この発明の第２の態様による質量系列修飾基により提供される。質量系列修飾因子を質量正規化リンカーに導入するという概念は、ＵＳ７，２９４，４５６号（本明細書に組み込まれる）およびＷＯ２０１１０３６０５９号（本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＷＯ２０１１０３６０５９号では、発明者らは、追加のβ−アラニン部分を、市販の６重タンデム質量タグジメチルピペラジン−β−アラニンタグ構造のリンカー領域中に付加することにより、アイソバリック質量タグセットのアレイを開発できることを見出した。そのような一元的アプローチは、多重化率を６から１２、１８、２４またはそれより多い試料へと増加させる迅速でかつ費用のかからない手段を提供する。この発明のアイソバリック質量タグセットは、前に開示された質量正規化因子への追加のリンカーの導入によっても修飾できる。
【００６７】
例えば、実施形態セット１は、下で示される実施形態セット１における全てのタグへのさらなるドープされていないＧＡＢＡリンカーの導入により修飾されて、ＧＡＢＡリンカーの質量により実施形態セット１中のタグと区別される２１個のタグの異なるセットを与えることができる。
【化１１】
2019505764.tif 000016
【００６８】
明らかに、２１のタグのさらなるセットは、ドープされていないβ−アラニンリンカーを下で示される実施形態セット１における全てのタグに付加することにより作製できる：
【化１２】
2019505764.tif 000017
【００６９】
その上、２４のタグのさらなるセットは、ドープされたβ−アラニンリンカーを実施形態セット１の全てのタグに付加することにより作製でき、ここで追加のβ−アラニンリンカーは、下で示されるように３つの１３Ｃ核と１つの１５Ｎ核の固定された置換を含む：
【化１３】
2019505764.tif 000018
【００７０】
当業者であれば、この特許で開示されるタグ構造の質量正規化リンカーに追加の質量を導入する特定の手段は特には限定されず、代替手段は本発明の範囲内にあると考えられることを理解するであろう。
【００７１】
この発明は、質量系列修飾因子をこの発明のタグ中に導入するさらなる方法を開示する。レポーター基の質量系列修飾は下の実施形態セット２〜４において記載されるように非常に有利であることが、本発明者らにより見出されている：
【００７２】
（実施形態２：）
質量標識は、下記構造を有し：
【化１４】
2019505764.tif 000019
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００７３】
上記構造では、ピペラジン環中に置換された１’Ｎ−メチル基は、２つの重水素原子の固定されたレポーター質量系列修飾因子置換を有する。この実施例におけるこの固定された置換は、セット例２のレポーターイオンは実施形態セット１のレポーターイオンに比べ最小質量オフセットを有し、よって実施形態セット２における最も重いレポーターは実施形態セット１における最も重いレポーターよりおよそ５．９ミリダルトン重いことを意味する。実施形態セット３における重水素置換もまた、実施形態セット２中のレポーターは全て実施形態セット１中の全てのレポーターとは異なる質量を有することを意味する。
【００７４】
レポーター構造の合成が図３で示され、二重β−アラニンリンカーの付加が図７で示される。この発明のタグの合成は、本文書の実施例においてより詳細に記載される。
【００７５】
質量系列修飾基２Ｈ（すなわちＤ）１３Ｃまたは１５Ｎを含むｎ＝７の質量標識のセットの一例が下に示される：
【化１５】
2019505764.tif 000020
2019505764.tif 000021
2019505764.tif 000022
【００７６】
当業者には明らかなように、実施形態セット２中のタグは全て、実施形態セット１中のタグの同位体であり、実施形態セット２中のタグ（実施形態セット２中のタグ１の親タグ質量：４０５．２１６１８ダルトン）は、実施形態セット１中のタグとおよそアイソバリックである（実施形態セット１中のタグ１の親タグ質量：４０５．２１０３３ダルトン）。これは、質量分析計でのシークエンシングのためにこれらのペプチドが選択される場合、実施形態セット２由来のタグで標識されたペプチドは実施形態セット１由来のタグで標識されたペプチドと共選択できることを意味する。より重要なことには、実施形態セット１中のレポーター部分Ｘは全て実施形態セット２中のレポーター部分Ｘとは異なる。これは、実施形態セット２と一緒に実施形態セット１を用いて、多重化用に最大２８個の試料を標識できることを意味する。実施形態セット２由来のタグで標識されたペプチドは大部分は、実施形態セット１由来のタグで標識されたペプチドと共溶出するが、実施形態セット２のタグ中の重水素の存在のために、移動度がわずかにシフトする可能性がある。タグは互いの同位体であり大部分は共溶出し、かつタグは共選択可能であるので、実施形態セット２で標識されたペプチドは実施形態セット１のペプチドと同時に分析され、タグはタグの単一のシュードアイソバリックセットであるかのように挙動する。タグのこれらの２つのセットは、全てが異なるレポーターイオンを与える質量系列修飾レポーターイオンを含み、そのため、ペプチドが実施形態セット１および２由来のタグで標識された場合、レポーターイオンは、レポーターが全て異なるため依然として、それらの正確なペプチドに帰属できる。セット１中のレポーターとセット２中のレポーターの間の質量の最小差はほぼ５．９ミリダルトンであるが、オービトラップ機器およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴機器はすでに十分な質量分解能を提供して、実施形態セット１および２において示される全てのタグのレポーターイオンの安定した区別を可能にすることに注意されたい。
【００７７】
当業者であれば、２Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎの固定された置換は、上で示した実施例中の特定の場所に示されているが、これは説明のための便宜として行われており、実施形態セット２におけるこれらの固定された置換は、それらを別の場所に配置することがより好都合であるかまたは費用効率的である場合、レポーターイオン内の任意の好適な位置に配置できることを直ちに認識するであろう。
【００７８】
（実施形態３：）
質量標識は下記構造を有し：
【化１６】
2019505764.tif 000023
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素は２Ｈがあることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００７９】
上記構造では、ピペラジン環中に置換されたＮ−メチル基はどちらも２つの重水素原子の固定されたレポーター質量系列修飾因子置換を有する。この実施形態におけるこれらの固定された置換は、実施形態セット３のレポーターイオンは、実施形態セット２のレポーターイオンに比べ最小質量オフセットを有し、よって実施形態セット３における最も重いレポーターは、実施形態セット２における最も重いレポーターよりおよそ５．９ミリダルトン重いことを意味する。実施形態セット３における重水素置換もまた、実施形態セット３中のレポーターは全て実施形態セット２中の全てのレポーターとは異なる質量を有することを意味する。
【００８０】
レポーター構造の合成が図３で示され、二重β−アラニンリンカーの付加が図７で示される。この発明のタグの合成は、本文書の実験セクションにおいてより詳細に記載される。
【００８１】
質量系列修飾基１３Ｃまたは１５Ｎを含むｎ＝５の質量標識のセットの一例が下に示される：
【化１７】
2019505764.tif 000024
【００８２】
実施形態セット２と同様に、実施形態セット３のタグもまた全て、実施形態セット１中のタグの同位体であり、実施形態セット２中のタグ（実施形態セット３中のタグ１の親タグ質量：４０５．２２８３４ダルトン）は、実施形態セット１中のタグ（実施形態セット１中のタグ１の親タグ質量：４０５．２１０３３ダルトン）とおよそアイソバリックである。これは、実施形態セット２および３と一緒に実施形態セット１を用いて、多重化用に最大３３個の試料を標識できることを意味する。また、セット２中のレポーターとセット３中のレポーターの間の質量の最小差はほぼ５．９ミリダルトンであるが、オービトラップ機器およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴機器はすでに十分な質量分解能を提供して、実施形態セット１、２および３で示されるタグ全てのレポーターイオンの安定した区別を可能にする。
【００８３】
（実施形態４：）
質量標識は下記構造を有し：
【化１８】
2019505764.tif 000025
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００８４】
上記構造では、ピペラジン環中に置換されたＮ−メチル基はどちらも３つの重水素原子の固定されたレポーター質量系列修飾因子を有することに注意されたい。この実施形態におけるこれらの固定された置換は、実施形態セット４のレポーターイオンが実施形態セット３のレポーターイオンに比べ最小質量オフセットを有し、よって実施形態セット４における最も重いレポーターは実施形態セット３における最も重いレポーターよりおよそ５．９ミリダルトン重いことを意味する。実施形態セット４における重水素置換もまた、実施形態セット４中のレポーターは全て実施形態セット４中の全てのレポーターとは異なる質量を有することを意味する。
【００８５】
質量系列修飾基１３Ｃまたは１５Ｎを含むｎ＝３の質量標識のセットの一例が下に示される：
【化１９】
2019505764.tif 000026
【００８６】
別の重同位体置換も、下で示されるように、水素、重水素、１２Ｃまたは１４Ｎの追加の固定された置換を用いて導入できる。
【化２０】
2019505764.tif 000027
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい。
【００８７】
（実施形態５：）
質量標識は下記構造を有し：
【化２１】
2019505764.tif 000028
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００８８】
レポーター構造の合成が、スレオニンを使用して図４で示され、二重β−アラニンリンカーの付加が図７で示される。この発明のタグの合成は、この文書において後により詳細に記載される。
【００８９】
質量系列修飾基１３Ｃまたは１５Ｎを含むｎ＝２４の質量標識のセットの一例が下に示される：
【化２２】
2019505764.tif 000029
2019505764.tif 000030
2019505764.tif 000031
2019505764.tif 000032
2019505764.tif 000033
2019505764.tif 000034
【００９０】
別の重同位体置換も、下で示されるように、水素、重水素、１２Ｃまたは１４Ｎの追加の固定された置換を用いて導入できる：
【化２３】
2019505764.tif 000035
2019505764.tif 000036
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい。
【００９１】
（実施形態６：）
質量標識は、下記構造を有し：
【化２４】
2019505764.tif 000037
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、ここで１つ以上の＊が存在してもよい。
【００９２】
実施形態６のレポーター部分Ｘの合成は図４で示され、ジアミノブタンリンカーの付加は図８で示される。この発明のタグの合成は、本文書の実験セクションにおいてより詳細に記載される。
【００９３】
質量系列修飾基１３Ｃまたは１５Ｎを含むｎ＝２７の質量標識のセットの一例が下に示される：
【化２５】
2019505764.tif 000038
2019505764.tif 000039
2019505764.tif 000040
2019505764.tif 000041
2019505764.tif 000042
2019505764.tif 000043
【００９４】
別の重同位体置換も、下で示されるように、水素、重水素、１２Ｃまたは１４Ｎの追加の固定された置換を用いて導入できる：
【化２６】
2019505764.tif 000044
式中、＊は酸素が１８Ｏであり、炭素が１３Ｃであり、窒素が１５Ｎでありまたは水素が２Ｈであることを表し、かつ１つ以上の＊が存在してもよい。
【００９５】
示される追加の重水素化タグセットは全て実施形態セット６中のタグの同位体であり、実施形態セット６中のタグとおよそアイソバリックであるタグのセットを提供するために、全ての可能な重水素化タグのサブセットを選択できることが、直ちに認識されるであろう。これは、実施形態セット６由来のタグで標識されたペプチドは、任意の関連する重水素化タグで標識されたペプチドと共に共選択できることを意味する。
【００９６】
別の態様では、本発明は、以下で「発明の質量標識の第２のセット」と呼ばれる、２以上の質量標識のセットに関し、ここで各標識は下記式を有し：
Ｘ−Ｌ−Ｍ−Ｒｅ
式中、Ｘは精密質量を有するレポーター部分であり、Ｌは質量分析計における衝突によって開裂可能な結合であり、Ｍは質量修飾因子であり、ならびにＲｅは質量標識を分析物に付着させるための反応性官能基またはその分析物であり、およびＸは下記一般式を含み：
【化２７】
2019505764.tif 000045
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は独立してＨ、置換または非置換直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、あるいはメチル、エチル、プロピルまたはｎ−プロピル、イソプロピル、ブチルまたはｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチルおよび３−ペンチルから選択される構造である。
【００９７】
発明の質量標識の第１のセットの定義ならびに特定のおよび好ましい実施形態は、等しく発明の質量標識の第２のセットに適用可能である。
【００９８】
発明の第１および第２の質量標識のセットとの関連で前に記載される個々の質量標識は、本発明の追加の態様を構成する。
【００９９】
（質量標識のアレイ）
本発明はまた、以下「発明の質量標識のアレイ」と呼ばれる、発明の第１および第２の質量標識のセットによる質量標識の２以上のセットを含む、質量標識のアレイを提供する。
【０１００】
発明の質量標識の第１のセットとの関連で詳細に記載される定義ならびに特定のおよび好ましい実施形態は、等しく、発明の質量標識のアレイに適用される。
【０１０１】
一実施形態では、アレイにおける任意の１つのセットの質量標識の各々の整数質量は、アレイにおける他の全てのセットの質量標識の各々の整数質量とは異なる。
【０１０２】
好ましい実施形態では、一セット中の各質量標識は下記を含む：
ａ）そのセット中の他の全ての質量標識と同じ整数質量を有する質量系列修飾基、および
ｂ）アレイの他のセット全ての質量標識と異なる整数質量。
【０１０３】
特に好ましい実施形態では、レポーター部分Ｘは質量系列修飾基を含む。
【０１０４】
１つの実施形態では、一セット中の各質量標識は同じ質量系列修飾基を含む。
【０１０５】
別の実施形態では、一セット中の各質量標識は
ａ）同じである；または
ｂ）アレイの他の質量標識全ての質量系列修飾基のアイソトポログである、
質量系列修飾基を含む。
【０１０６】
好ましい実施形態では、一セット中の各質量標識は、アレイの他の質量標識全ての質量系列修飾基のアイソトポログである質量系列修飾基を含む。
【０１０７】
（質量分析の方法）
本発明はまた、以下「発明の質量分析の方法」と呼ばれる、質量分析の方法を提供し、この方法は、分析物と関連付けることができる質量標識または質量標識の組合せを質量分析によって同定することにより分析物を検出することを含み、ここで質量標識は、本発明の前の態様に定義されるような、発明の質量標識の第１のまたは第２のセット、あるいは発明の質量標識のアレイ由来の質量標識である。
【０１０８】
１つの実施形態では、発明の質量分析の方法は下記を含む：
ａ）複数の試料を提供することであって、各試料は１つの質量標識または質量標識の組み合わせで示差標識され、質量標識（複数可）は発明の質量標識の第１のまたは第２のセット、あるいは発明の質量標識のアレイに由来する、こと；
ｂ）複数の標識された試料を混合して標識分析物を含む分析混合物を形成すること；
ｃ）任意で標識分析物を質量分析計で検出すること；
ｄ）標識分析物を質量分析計で解離して質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントを形成すること；
ｅ）質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントを検出すること；ｆ）任意で質量標識を質量分析計で解離してレポーター部分を放出すること、およびレポーター部分を検出すること；
ｇ）任意で工程ｆ）で形成されたレポーター部分を解離してフラグメントを形成すること、およびフラグメントを検出すること；
ｈ）標識分析物の質量スペクトル；および／または質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトル；および／またはレポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて分析物を同定すること。
【０１０９】
特定の実施形態では、解離は、好ましくは、質量分析計での衝突誘起解離である。
【０１１０】
別の特定の実施形態では、相補イオンは、リンカーＬからの一酸化炭素のニュートラルロスによって工程ｄ）で形成される。
【０１１１】
好ましくは、本明細書で記載される方法は、４００の質量対電荷比で６０，０００を超える分解能、好ましくは４００の質量対電荷比で１００，０００を超える、最も好ましくは４００の質量対電荷比で２５０，０００を超える分解能を有する質量分析計で実施され得る。
【０１１２】
分析物は、ｉ）標識分析物の質量スペクトル；またはｉｉ）質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトル；またはｉｉｉレポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて同定され得る。ｉｉ）による同定が行われるとき、無傷の質量標識を好ましくは含む分析物フラグメントは無傷の質量標識を含むｂ系列イオン、好ましくはｂ１イオンである。分析物はレポーター部分Ｘまたはレポーター部分Ｘのフラグメントの質量スペクトルに基づいて同定されてよい。
【０１１３】
よって、１つの実施形態では、分析物は標識分析物の質量スペクトルに基づいて同定されてよい。
【０１１４】
別の実施形態では、分析物は質量標識および／または無傷の質量標識を含む分析物フラグメントの質量スペクトルに基づいて同定されてよい。好ましい実施形態では、無傷の質量標識を含む分析物フラグメントは無傷の質量標識を含むｂ系列イオン、好ましくはｂ１イオンである。
【０１１５】
別の実施形態では、発明の質量分析の方法は下記を含む：
ａ）複数の試料を提供することであって、各試料は１つの質量標識または質量標識の組み合わせで示差標識され、質量標識（複数可）は発明の質量標識の第１のまたは第２のセット、あるいは発明の質量標識のアレイに由来する、こと；
ｂ）複数の標識された試料を混合して標識分析物を含む分析混合物を形成すること；
ｃ）標識分析物を質量分析計で検出すること；
ｄ）標識分析物を質量分析計で解離してレポーター部分を放出すること、および分析物または分析物のフラグメントに付着した質量標識の残りを含む相補イオンを検出すること；
ｅ）任意で工程ｄで形成された相補イオンを解離してフラグメントを形成する、およびフラグメントを検出する１つ以上のさらなる工程；
ｆ）標識分析物の質量スペクトルおよび／または相補イオンおよび／またはそのフラグメントの質量スペクトルに基づいて分析物を同定すること。
【０１１６】
特定の実施形態では、解離は、好ましくは、質量分析計での衝突誘起解離である。
【０１１７】
別の特定の実施形態では、相補イオンは、リンカーＬからの一酸化炭素のニュートラルロスによって工程ｄ）で形成される。
【０１１８】
好ましくは、本明細書で記載される方法は、４００の質量対電荷比で６０，０００を超える分解能、好ましくは４００の質量対電荷比で１００，０００を超える、最も好ましくは４００の質量対電荷比で２５０，０００を超える分解能を有する質量分析計で実施され得る。
【０１１９】
この発明の質量標識の多くは、時にはたった１ミリダルトン程度の、ごくわずかな質量差によって互いに区別される。現在のオービトラップ計測手段が６．３ミリダルトンの質量差を有するレポーターイオンを分解できることは既に立証されている（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８、上記で引用）。しかしながら、最小の質量差により互いに区別される質量標識では、より高い分解能が必要となる場合があり、これは、現在のところ市販のフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計でルーチン的に達成できる。
【０１２０】
飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計は、飛行管の長さに応じて高分解能、高質量精度データが取得され得るタイプの質量分析計のさらなる例である。市販の、マルチターン（Ｏｋｕｍｕｒａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｅｎｇ），  １１，  ２６１−２６６）およびスパイラルＴＯＦ（Ｓｈｉｍｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ７，  ｅ３７１０７）配置は、オービトラップと同様の質量分解能を既に達成できる。
【０１２１】
オービトラップ質量分析計は、クアドロ対数（ｑｕａｄｒｏ−ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ）ポテンシャル分布を有する静電場を形成する外側バレル様電極および同軸内側スピンドル様電極から構成される（Ｈｕ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ，  （２００５）  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，  ４０，  ４３０−４４３  ＆  Ｍａｋａｒｏｖ，  Ａ．  （２０００）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ７２，  １１５６−１１６２）。動的にトラップされたイオンからのイメージ電流が検出され、デジタル化され、フーリエ変換を用いて周波数領域データに変換され、その後質量スペクトルに変換される。イオンはオービトラップ中に注入され、そこでイオンは内側電極周囲の軌道経路に落ち着く。内側電極周囲の軌道振動の周波数がイメージ電流として記録され、それに対してフーリエ変換アルゴリズムが適用されて、超高分解能を有する質量スペクトルに周波数領域信号を変換できる。
【０１２２】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）質量分析では、イオンの試料がキャビティのようなイオントラップ内に保持されるが、ＦＴＩＣＲ  ＭＳでは、イオンは交差電磁場によって高真空チャンバー中にトラップされる（Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９８）  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ，  １７，  １−３５  ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ａ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｃ．Ｌ．  （２００８）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  （Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  Ｃａｌｉｆ），  １，  ５７９−５９９）。電場は、箱の２つの側面を形成する１対のプレート電極によって形成される。この箱は、超伝導磁石の磁場に収容され、この超伝導磁石は、２枚のプレート、トラッピングプレートとともに、印加された磁場に直交する、トラッピングプレート間の円形軌道に注入されたイオンを拘束する。箱の２つのさらなる対向側面を形成する２枚の「送信プレート」に高周波パルスを印加することにより、イオンはより大きな軌道に励起される。イオンのサイクロイド運動は、「受信プレート」を含む箱の残り２つの対向側面で対応する電場を発生する。励起パルスはより大きな軌道にイオンを励起し、この軌道は、イオンのコヒーレントな運動が衝突によって失われるときに崩壊する。受信プレートによって検出される対応する信号は、フーリエ変換（ＦＴ）分析によって質量スペクトルに変換される。ＦＴＩＣＲ機器の質量分解能は、印加される磁場の強度とともに増加し、超高分解能（＞１、０００，０００）分析を達成できる（Ｓｃｈａｕｂ，  Ｔ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  （２００８）  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  ８０，  ３９８５−３９９０）。
【０１２３】
誘起フラグメンテーション実験では、ＦＴＩＣＲ機器は、イオントラップと同様の様式で作動でき−対象の単一種を除く全てのイオンをＦＴＩＣＲキャビティから放出できる。衝突ガスをＦＴＩＣＲキャビティ中に導入し、フラグメンテーションを誘起できる。フラグメントイオンをその後分析できる。一般に、「受信プレート」により検出される信号のＦＴ分析によって分析される場合フラグメンテーション生成物と浴ガスが組み合わさり低い分解能を与えるが、しかしながら、フラグメントイオンをキャビティから放出し、例えば、四重極型または飛行時間型装置とのタンデム構成で分析できる。
【０１２４】
飛行時間型質量分析計では、狭い運動エネルギー分布を有するイオンのパルスをフィールドフリードリフト領域に進入させる。機器のドリフト領域で、各パルスにおける異なる質量対電荷比を有するイオンは異なる速度で移動し、したがって異なる時間でドリフト領域の末端に位置するイオン検出器に到達する。ドリフト領域の長さはＴＯＦ機器の質量分解能を決定し、これは容易に増大させることができる。到達イオンに応答して検出器によって生成されるアナログ信号は、時間−デジタル変換器によってすぐにデジタル化される。イオン飛行時間の測定は、各到達イオンの質量対電荷比を決定する。飛行時間型機器には多くの異なる設計がある。設計は、イオン源の性質によってある程度決定される。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ）質量分析では、イオンのパルスが、金属ターゲット上に結晶化した試料材料のレーザー励起によって生成される。これらのパルスは、それらがそこから加速される飛行管の一端で形成する。
【０１２５】
エレクトロスプレーイオン源から質量スペクトルを取得するために、直交軸ＴＯＦ（ｏａＴＯＦ）配置が使用される。エレクトロスプレーイオン源で生成されるイオンのパルスは、「プッシャー」プレートによって連続流からサンプリングされる。プッシャープレートは、起源から直交配置される飛行管中にイオンを加速する一時的な電位差を用いて、飛行時間型質量分析計中にイオンを注入する。質量対電荷比に対するイオン到達数のヒストグラムを作成するために、プッシャープレート〜検出器の飛行時間が記録される。このデータは、時間−デジタル変換器を用いてデジタル記録される。
【０１２６】
この発明の全ての可能なタグを分解するために、高分解能を有する質量分析計が必要とされるが、機器の性質は、本発明の実施にとって特に重要ではない。加えて、本出願に記載されているタグの多くは、１ダルトンの質量差で分離される可能なタグのサブセットが使用される限り、１ダルトンの分解能しか有しない機器ででも分解され得る。
【０１２７】
発明について下記実施例により、下で詳細に記載するが、実施例は例示にすぎず、発明の範囲を決して制限するものではない。
【実施例】
【０１２８】
（質量標識の合成）
（実施例１：Ｎ，Ｎ−ジメチルピペラジン−２−カルボン酸環同位体の合成）
Ν，Ν’−直交保護ピペラジン−２−カルボン酸の合成は文献において前に記載されている（Ｗａｒｓｈａｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７，  Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６２：６４３９−４０）。図３で、生成物５までの概略工程は、この以前に公開された経路を示し、この場合ＢＯＣ−保護セリンを改良光延条件（Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９８５，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １０７：７１０５−９）を使用して対応する保護セリンβ−ラクトンに変換して生成物１を得、これをその後アリルアミンとの反応により開環して生成物２を得る。開環反応はアミドまたはアミンのいずれかを生じることができ、この反応の選択性は溶媒および求核剤の影響を受ける（Ｒａｔｅｍｉ  ＆Ｖｅｄｅｒａｓ，  １９９４，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５：７６０５−８）。得られた二級アミンを、標準Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ条件を使用してＣＢｚ基で保護して生成物３を得る。生成物３をその後、アルケンのオゾン分解による閉環反応およびジメチルスルフィドとのワークアップを受けるように誘導してアルデヒドを得、これはその後自然に閉環を受けて生成物４、環ヘミアミナールを形成する。ヘミアミナールの化学選択的還元は、ＣＨ２Ｃｌ２中のトリエチルシランおよびボロントリフルオリド−ジエチルエーテルコンプレックスを用いて実施でき（Ｐｅｄｒｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５  ：２０５３−６）、生成物５を得る。二重保護環の１’位のＢＯＣ基は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で選択的に除去でき、生成物６を得る。ＢＯＣの除去に続いて、ホルムアルデヒドをトリアセトキシボロヒドリドと共に使用して還元的メチル化し、生成物７を得る。ＣＢｚ基をその後、パラジウム／木炭触媒をメタノール中で用いて水素による還元により４’位から除去して生成物８を得る。最後に、これに続いて今度は４’窒素でさらなる還元的メチル化を実施してＮ，Ｎ’−ジメチル−ピペラジン−２−カルボン酸を得る（生成物９）。セリンおよびホルムアルデヒドの多くの市販の同位体が存在する（図６を参照されたい、しかしこれは完全に包括的なリストではない）が、アリルアミンの重同位体はカタログ品目ではない。しかしながら、アリルアミンの重同位体はかなり容易に作ることができる。ホルムアルデヒドの重水素化形態は市販されており、還元的メチル化工程のためにトリアセトキシボロジュウテリドを使用することにより、追加の重水素を環に導入できる。このように、ピペラジン−２−カルボン酸環の複数の重同位体バージョンを調製してこの発明のタグを生成できる。環中の窒素中心でのメチル置換を独立して実行して重水素原子の数を独立して制御できるようにすることも、また有利である。この合成により、１、２、３、４、５または６個の重水素原子を有する環を作製できる。
【０１２９】
アリルアミン同位体は容易に市場で入手できないが、エタノールアミンの重同位体は容易に入手できるので、図４は図３で示される経路のバリエーションを示す。図４では、ＢＯＣ−保護セリン（すなわち、Ｒ５は水素である）を、デス−マーチンペルヨージナン（ＤＭＰ）を用いて対応する保護アルデヒドに変換して（Ｄｅｓｓ  ＆  Ｍａｒｔｉｎ，  １９８３，  Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ４８：４１５５−６）生成物１を得、これに、エタノールアミン（ここで、図４において、Ｒ３は水素である）およびトリアセトキシボロヒドリドとの反応により還元的アルキル化を受けさせ、生成物２を得る。得られた二級アミンを、標準Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ条件を用いてＣＢｚ保護基で保護し、生成物３を得る。生成物３をその後、アルコールのＤＭＰによるアルデヒドへの変換による閉環反応を受けるように誘導し、これはその後自然に閉環を受けて生成物４、環ヘミアミナールを形成する。アミナールの化学選択的還元は、ＣＨ２Ｃｌ２中のトリエチルシランおよびボロントリフルオリド−ジエチルエーテルコンプレックスを用いて実施でき（Ｐｅｄｒｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４、上記で引用）、生成物５を得る。二重保護環の１’のＢＯＣ基は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で選択的に除去でき、生成物６を得る。ＢＯＣの除去に続いて、ホルムアルデヒドをトリアセトキシボロヒドリドと共に使用して還元的メチル化し、生成物７を得る。ＣＢｚ基をその後、パラジウム／木炭触媒をメタノール中で用いて水素による還元により４’位から除去して、生成物８を得る。最後に、これに続いて今度は、４’窒素で還元的メチル化を実施してＮ，Ｎ’−ジメチル−ピペラジン−２−カルボン酸を得る（生成物９）。
【０１３０】
より多くの置換基を有するピペラジン環を、図４で示されるものと同じ合成経路を使用するが、異なる開始成分を用いて合成できる。例えば、セリンを、スレオニン（すなわちＲ５はＣＨ３である）に置き換えてＮ，Ｎ’−ジメチル−５−メチル−ピペラジン−２−カルボン酸を得ることができる。同様に、エタノールアミンをＬ−アラニノール（ここで、Ｒ３はＣＨ３である）に置き換えてよく、これは図５で示されるようにアラニンから誘導できる。あるいは、エタノールアミンをＬ−バリノールに置き換えてよく（ここで、Ｒ３はイソプロピルである）、これは図５で示されるようにバリンから誘導できる。さらに、エタノールアミンをＬ−ロイシノールに置き換えてよく（ここで、Ｒ３はイソブチルである）、これは図５で示されるようにロイシンから誘導できる。この発明による多数のタグの合成を可能にするスレオニン、アラニン、バリンおよびロイシンの様々な安定な重同位体バージョンが市販されている（入手可能な重同位体の非包括的なリストについては図６を参照されたい）。多数の他のα−アミノ酸を、この発明の質量タグの合成のための対応するα−アミノアルコールに変換できることは、当業者には明らかなはずである。
【０１３１】
（実施例２：置換されたピペラジン−２−カルボン酸環のリンカーへのカップリング）
この発明の基礎を形成する置換されたピペラジン−２−カルボン酸環を、図１および２に示されるアイソバリック質量タグ中のレポーターイオンとして使用する。レポーター部分Ｘを、質量正規化官能基Ｍに連結して、前に説明されるような、アイソバリックおよびシュードアイソバリックタグならびに質量系列オフセットタグを作製する。
【０１３２】
図７は、置換されたピペラジン−２−カルボン酸環への二重β−アラニンリンカーのカップリングを示す。アミノ基がＢＯＣ保護基により保護されたβ−アラニン（生成物１０）を、カルボキシル基がベンジル保護基で保護されたβ−アラニン（生成物１１）にカップリングして、保護された二重−βアラニンリンカー（生成物１２）を得る。ＢＯＣ基を除去して遊離アミンを有するリンカー（生成物１３）を得、これを今度は、置換されたピペラジン−２−カルボン酸環（９）にカップリングする。ベンジル保護基をその後除去して遊離酸を得、これをその後、アミノ基との反応のための活性エステルに変換でき、またはカルボン酸基を下で記載する他の反応基を導入するために使用できる。この文書で示される二重β−アラニンリンカーのいずれかの生成を可能にするβ−アラニンの複数の同位体が市販されている。
【０１３３】
図８は、置換されたピペラジン−２−カルボン酸環への１，４−ジアミノブタンリンカーのカップリングを示す。アミノ基の１つがＢＯＣ保護基で保護された１，４−ジアミノブタン（生成物１０）を、置換されたピペラジン−２−カルボン酸環（９）に直接カップリングしてＢＯＣ保護生成物（１１）を得る。モノ−ＢＯＣ保護対称ジアミンの調製は文献においてよく知られている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：７３７−４２）。ＢＯＣ保護基をその後除去して遊離アミン（生成物１２）を得、これをその後、炭酸ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）との反応によりＮＨＳカルバメート（生成物１３）に変換できる。ＮＨＳカルバメートは遊離アミノ基に対して反応性である。あるいは、遊離アミノ基を使用して、図８で示される他の反応基を導入できる。遊離アミン１２をヨード酢酸無水物と反応させて、ヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔｍｉｄｅ）生成物（１４）を得ることができる。あるいは、遊離アミン生成物１２を、（ＢＯＣ−アミノオキシ）酢酸（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）にカップリングできる。ＢＯＣ基をＴＣＡ／ＤＣＭで除去してアミノオキシ−誘導体化タグ（１５）を得ることができる。
【０１３４】
（実施例３：反応基）
図７で示されるタグ例は、遊離カルボン酸で官能化されて示される。カルボン酸タグを、好適なカップリング剤、例えば、Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミドのようなカルボジイミドを用いて、アミノ基にカップリングできる。より好ましくは、遊離カルボン酸を修飾して、いわゆる活性エステルを形成し、この活性エステルは、追加のカップリング剤を必要とせずに遊離アミノ基と容易に反応する安定な試薬である。好ましくは、遊離カルボン酸を有する質量標識を、遊離酸を炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルと、ジクロロメタンなどの好適な有機溶媒中で接触させることにより、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに活性化できる。
【化２８】
2019505764.tif 000046
【０１３５】
他の好ましい活性エステルは、好適なアルコールを、遊離カルボン酸を有するこの発明の質量タグにカルボジイミドを用いてカップリングすることにより調製してもよい。あるいは、遊離カルボン酸を、アルコールとの反応前に、塩化チオニルを用いて活性化して酸塩化物を形成してもよい。よって、ペンタフルオロフェノール活性エステルは、質量標識をペンタフルオロフェノールとカップリングすることにより調製され、同様にニトロフェノールエステルは質量標識をニトロフェノールとカップリングさせることにより調製される。スルホジクロロフェノール（ＳＤＰ）エステルは、質量タグの酸塩化物を３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸と反応させることにより調製できる。同様に、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、２，３，５，６−テトラフルオロフェノールエステル、４−スルホ−２、３，５，６−テトラフルオロフェノールエステルおよび３，４−デヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジニル（ＤＨＢＴ）エステルは全て、対応するアルコールから調製できる。ＤＨＢＴエステルは典型的には、貯蔵されまたは分配され得る試薬として調製されない。それは典型的には使用直前にインサイチューで調製される。
【０１３６】
この発明の質量標識のアミノキシ活性化形態は、Ｂｏｃ−保護アミノキシプロピルアミンをこの発明の２つの質量標識のＮＨＳエステル活性化形態にカップリングすることにより調製できる。ＢＯＣ保護基をその後酸条件下で除去して、アミノキシ試薬を提供する。
【化２９】
2019505764.tif 000047
【０１３７】
アミノキシ基はカルボニル官能基と反応して、かなり安定であるオキシム結合を形成する。カルボニル官能基は酸化された炭水化物およびステロイドで見られ、アミノキシ官能化タギング試薬で標識するためのステロイド含有試料、炭水化物含有試料または糖タンパク質含有試料を調製するための様々な方法が当技術分野で知られている。
【０１３８】
同様に、ヒドラジド活性化試薬はカルボニル基と反応して、ヒドラゾン結合を形成する。ヒドラゾンは中程度に安定であり、このように標識された化合物は直接分析でき、またはカップリング反応が逆転する可能性を回避するために、ヒドラゾンを二級アミンに還元してもよい。この発明の質量標識のヒドラジド活性化形態の合成は、この発明の質量標識の２つのＮＨＳエステル活性化形態にヒドラジンをカップリングすることにより実施できる。
【化３０】
2019505764.tif 000048
【０１３９】
この発明の質量標識のピリジルジチオ活性化形態は、質量タグの活性エステル形態へのチオピリジン−保護システアミンのカップリングにより調製され得る。チオピリジン−保護システアミンは、システアミンをジチオピリジンと反応させることにより調製されて、遊離アミノ基を残して保護チオールを生成する：
【化３１】
2019505764.tif 000049
【０１４０】
このアミン中間体をその後、この発明の質量標識の２つのＮＨＳエステル活性化形態にカップリングして、この発明の質量標識のピリジルジチオ活性化形態を得る。
【化３２】
2019505764.tif 000050
【０１４１】
この発明の質量標識のピリジルジチオ活性化形態を使用して、この発明の質量標識をチオール官能基、例えば、タンパク質またはペプチド中の還元されたシステイン残基にカップリングしてもよい。２−ジチオピリジン基はいくつかの利点を有する：それは、プロテオミクス研究において有用なバッファー溶液（例えば、重炭酸トリエチルアンモニウムＴＥＡＢ）中でしばしば使用される高いｐＨでさえも、システイン残基を標識する高い選択性を示し、かつそれは水への曝露に対して不安定ではない。さらに、この基は、望ましい場合、任意のジスルフィド還元試薬による処理によってペプチドから容易に再切断できる。
【０１４２】
質量標識のアミノ官能化形態もまた、カルボン酸誘導体化タグから調製できる。この反応スキームでは、ＢＯＣ−保護エチレンジアミンを、この発明の質量標識の２つのＮＨＳ−エステル活性化形態と反応させ、続いてＢＯＣ基を除去して、この発明の質量標識のアミノ官能化形態を得る。アミノ官能化質量標識はそれら自体で有用であり、これを用いて、得られるイミンの還元を伴って、この発明の質量標識をカルボニル基にカップリングできる。
【化３３】
2019505764.tif 000051
【０１４３】
アミノ官能基化タグにハロ酢酸無水物、例えばヨード酢酸無水物をカップリングさせることにより、この発明の質量標識のアミノ官能化形態を反応させてさらに、この発明の質量タグのハロアセチル形態を生じることができる。この発明の質量標識の得られたヨードアセトアミド活性化形態を用いて、この発明の質量標識をチオール官能基、例えば、タンパク質またはペプチド中の還元されたシステイン残基にカップリングしてもよい。
【化３４】
2019505764.tif 000052
【０１４４】
マレイミド化合物もまた、チオール標識のための優れた試薬であり、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの不活性溶媒中でのアミン修飾タグの無水マレイン酸との反応により、続いて閉環を実行するための五酸化リンによる脱水により、この発明によるタグに容易に導入できる。
【化３５】
2019505764.tif 000053
【０１４５】
この発明の質量タグのアルキン活性化形態の合成を下に示す。
【化３６】
2019505764.tif 000054
【０１４６】
この反応スキームでは、プロパルギルアミンを、この発明の質量標識の２つのＮＨＳ−エステル活性化形態と反応させて、この発明の質量標識のアルキン官能化形態を得る。あるいは、この発明のアミン−誘導体化タグをプロピン酸にカップリングしてアルキン官能化タグを得ることができる：
【化３７】
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【０１４７】
アルキン−官能化質量標識を、銅触媒アジドアルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応によりアジド官能基と反応させて、トリアゾール結合を形成してもよい。これは、時として「Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ反応」と呼ばれる（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４１  ：２５９６−９）。生細胞の代謝標識用の様々なアジドベースの試薬が市販されており、そのような細胞に由来するアジド標識分子が本発明の質量標識で標識されるのを可能にしている。
【０１４８】
市販のＮＨＳ−アジド試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ’ｓ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  ＵＳＡ）をアミノ官能化質量標識にカップリングすることにより、この発明の質量標識のアミノ官能化形態を反応させてさらに、この発明の質量標識のアジド−官能化形態を生成してもよい。あるいは、アミノ−官能化質量標識を、アジド化試薬イミダゾール−１−スルホニルアジドとの反応によりアジドに直接変換できる。イミダゾール−１−スルホニルアジドは、アセトニトリル中にて塩化スルフリルをアジ化ナトリウムで処理し、続いて過剰のイミダゾールを添加することにより調製される（Ｇｏｄｄａｒｄ−Ｂｏｒｇｅｒ  ＆  Ｓｔｉｃｋ，  ２００７，  Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ  ９：３７９７−８００）。
【化３８】
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【０１４９】
アジド−官能化タグを、「Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ反応」または銅触媒アジドアルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応を介して、アルキン官能基と反応させて、トリアゾール結合を形成してもよい。生細胞の代謝標識用の様々なアルキンベースの試薬が市販されており、そのような細胞に由来するアルキン標識分子がこの発明のタグで標識されるのを可能にしている。
【０１５０】
本明細書で記載される実施例は、発明の質量標識の第１のセットとの関連で前に記載される実施形態１〜６で設定される質量標識および質量標識のセットを作製するための手段を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
2019505764.tif 000102
【図７−１】
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【図７−２】
2019505764.tif 000104
【図８−１】
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【図８−２】
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【国際調査報告】
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