【手続補正書】
【提出日】平成19年3月27日(2007.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無傷の精子生細胞およびＤＮＡ選択的蛍光色素を含む染色用混合物を形成し、次いで、該染色用混合物を４０℃を超える温度に付すことを特徴とする精子細胞を染色するための方法。
【請求項２】
色素が、ビスベンズイミド、ＳＹＢＲ−１４ならびにそのコンジュゲート、アナログおよび誘導体よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
色素濃度が、約０.１μＭ〜約１０００μＭであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
染色用混合物が、約４１℃を超える温度に付されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
染色用混合物が、約４１℃〜約５０℃の間の温度に付されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
染色用混合物がさらに運動阻害剤を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
運動阻害剤が、炭酸塩ベースの運動阻害剤を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
炭酸塩ベースの運動阻害剤が、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３およびＣ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏを含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
炭酸塩ベースの運動阻害剤が、水中の０.０９７モル／ＬのＮａＨＣＯ３、０.１７３モル／ＬのＫＨＣＯ３、０.０９０モル／ＬのＣ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
染色用混合物が、細胞内または細胞外で酸化／還元反応を調節する組成物をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
細胞内または細胞外で酸化／還元反応を調節する組成物が、ピルビン酸塩、ビタミンＫ、リポ酸、グルタチオン、フラビン、キノン、スーパーオキシドジスムターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼミミックよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、精子の蛍光強度が３９℃および４１℃にてHoechst３３３４２色素の濃度を変化させて染色した精子について測定される実施例１において行った試験結果をグラフとして示す。
【図２】図２Ａ−２Ｄは、精子の蛍光強度が３９℃および４１℃にてHoechst３３３４２色素の濃度を変化させて染色した精子について測定される実施例２において行った試験結果をグラフとして示す。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、精子の蛍光強度が３９℃および４３℃にてHoechst３３３４２色素の濃度を変化させて染色した精子について測定される実施例３において行った試験結果をグラフとして示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、精子の蛍光強度が３９℃および４３℃にてHoechst３３３４２色素の濃度を変化させて染色した精子について測定される実施例４において行った試験結果をグラフとして示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、精子の蛍光強度が３９℃および４５℃にてHoechst３３３４２色素の濃度を変化させて染色した精子について測定される実施例５において行った試験結果をグラフとして示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、精子の蛍光強度が３９℃および４７℃にてHoechst３３３４２色素の濃度を変化させて染色した精子について測定される実施例６において行った試験結果をグラフとして示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４１℃および４３℃にて６０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色していないか、または染色した精子について測定される実施例７において行った試験結果をグラフとして示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が３９℃および４５℃にて６０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色していないか、または染色した精子について測定される実施例８において行った試験結果をグラフとして示す。
【図９】図９Ａ−９Ｃは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４１℃、４３℃および４５℃にて８０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色していないか、または染色した精子について測定される実施例９において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｃは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４１℃、４３℃および４５℃にて１００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色していないか、または染色した精子について測定される実施例１０において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１１】図１１は、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４７℃にて１００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色していないか、または染色した精子について測定される実施例１１において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１２】図１２は、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４９℃にて１００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色していないか、または染色した精子について測定される実施例１２において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４３℃にて染色していないか、または１２５μＭ Hoechst３３３４２色素で染色したか、あるいは１５０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例１３において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４３℃にて染色していないか、または２００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色したか、あるいは２５０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例１４において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４５℃にて染色していないか、または１２５μＭ Hoechst３３３４２色素で染色したか、あるいは１５０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例１５において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｃは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４５℃にて、染色していないか、２００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色したか、２５０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色したか、３５０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例１６において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｃは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４３℃にて、染色していないか、３００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色したか、３５０μＭ Hoechst３３３４２色素で染色したか、４００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例１７において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｃは、精子のパーセント運動率およびパーセント前進運動率が４３℃にて、染色していないか、０.６μＭ ＳＹＢＲ１４で染色したか、６.０μＭ ＳＹＢＲ１４で染色したか、６０μＭ  ＳＹＢＲ１４で染色した精子について測定される実施例１８において行った試験結果をグラフとして示す。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂは、精子の蛍光強度が、３９℃および４５℃にて１００μＭビスベンズイミド−ＢＯＤＩＰＹコンジュゲート（ＢＢＣ）または６μＭ ＳＹＢＲ１４で染色された精子について測定される実施例１９において行った試験結果をグラフとして示す。
【図２０】図２０は、精子のパーセント前進運動率が、ＴＣＡ緩衝液または１０ｍＭピルビン酸塩を含有するＴＣＡ緩衝液のいずれかにおいて、４１℃にて、４００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例２０において行った試験結果をグラフとして示す。
【図２１】図２１は、精子のパーセント前進運動率が、ＴＣＡ緩衝液または１０μＭビタミンＫを含有するＴＣＡ緩衝液のいずれかにおいて、４１℃にて、４００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例２１において行った試験結果をグラフとして示す。
【図２２】図２２は、精子のパーセント前進運動率が、ＴＣＡ緩衝液または１００μＭビタミンＫを含有するＴＣＡ緩衝液のいずれかにおいて、４１℃にて、４００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例２２において行った試験結果をグラフとして示す。
【図２３】図２３は、精子のパーセント前進運動率が、ＴＣＡ緩衝液または１ｍＭリポ酸を含有するＴＣＡ緩衝液のいずれかにおいて、４１℃にて、４００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子について測定される実施例２３において行った試験結果をグラフとして示す。
【図２４】図２４は、精子細胞のパーセント前進運動率が、１０ｍＭピルビン酸塩を含有するＴＣＡにおいて、４１℃にて、３００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色し、次いで、１０ｍＭピルビン酸塩または炭酸塩ベースの阻害剤のいずれかで１〜３に希釈した精子について測定される実施例２４において行った試験結果をグラフとして示す。
【図２５】図２５は、精子細胞のパーセント前進運動率が、（１）１０ｍＭピルビン酸塩を含有するＴＣＡにおいて、４１℃にて、３００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色し、次いで、１０ｍＭピルビン酸塩を含有するＴＣＡで１〜３に希釈するか、（２）ｐＨ７.３の炭酸ベースの緩衝液において、４１℃にて、３００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色し、次いで、ｐＨ６.２の炭酸ベースの阻害剤で１〜３に希釈した精子について測定される実施例２４において行った試験結果をグラフとして示す。
【図２６】図２６は、精子細胞のパーセント前進運動率が、１０ｍＭピルビン酸塩またはｐＨ６.２の炭酸ベースの阻害剤を含有するＴＣＡにおいて、４１℃にて、３００μＭ Hoechst３３３４２色素で染色した精子細胞について測定される実施例２４において行った試験結果をグラフとして示す。