【手続補正書】
【提出日】平成19年1月12日(2007.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メガヌクレアーゼ変異型が当初のメガヌクレアーゼの認識・切断部位とは異なるDNA標的配列を切断することができ、次の工程：
a) 当初のメガヌクレアーゼからメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを作製する工程；
および
b) 前記変異型により作製されたDNA標的配列中の二本鎖破壊が正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の活性化、あるいは負の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の不活性化を前記DNA二本鎖破壊の組換え媒介遺伝子修復によって導く条件下で、インビボで、前記DNA標的配列を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングする工程
を含むことを特徴とする当初のメガヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼ変異型を製造する方法。
【請求項２】
前記工程b)が、前記DNA標的配列と、活性型の負の選択マーカー、不活性型の正の選択マーカーまたは活性型もしくは不活性型のレポーター遺伝子のコーディング配列とを含む発現ベクターにより少なくとも改変された細胞の使用を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、標的DNA配列とさらなる選択マーカーとを含む介在配列により分離される内部重複を有する改変された正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む発現ベクターにより改変されていることを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、欠失または変異と欠失の位置または変異の近傍に前記標的DNAの挿入とを含む第一の改変された正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む発現ベクターにより改変され、前記細胞が、欠失／挿入の境をなす正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の配列により両側で挟まれる欠失または変異された正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のセグメントによりさらに改変されていることを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記DNA標的配列中の二本鎖破壊が、2つの直列反復間の相同的組換えにより修復されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【請求項６】
前記DNA標的配列中の二本鎖破壊が、遺伝子変換により修復されることを特徴とする請求項1、2および4のいずれか1つに記載の方法。
【請求項７】
前記コーディング配列と前記DNA標的配列とがプラスミド上にあることを特徴とする請求項2〜6のいずれか1つに記載の方法。
【請求項８】
前記コーディング配列と前記DNA標的配列とが、前記細胞の染色体に組み込まれていることを特徴とする請求項2〜6のいずれか1つに記載の方法。
【請求項９】
前記正の選択マーカーが、抗生物質耐性または栄養要求性マーカーであることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が酵母細胞である請求項2〜9のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が哺乳動物細胞である請求項2〜9のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１２】
工程a)と、切断活性の選択工程である工程b)とからなることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１３】
工程a)と、切断活性のスクリーニング工程である工程b)とからなることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１４】
工程a)と、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程の組み合わせである工程b)とからなることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１５】
工程a)と、
− 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程；
− 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程；
− 結合能力の選択工程、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程；または
− 結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程
からなる群から選択される選択工程およびスクリーニング工程の組み合わせに含まれる工程b)とからなることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１６】
前記結合能力の選択工程およびスクリーニング工程が、ファージディスプレイを用いることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記切断活性の選択が、切断が正の選択マーカーの活性化に導く試験を用いることを特徴とする請求項12、14および15のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１８】
前記切断活性のスクリーニングが、切断がレポーター遺伝子の活性化に導く試験を用いることを特徴とする請求項13、14および15のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１９】
前記メガヌクレアーゼ変異型が、DNA標的と接触するかまたは該DNA標的と直接もしくは間接的に相互作用する位置にアミノ酸変異を有することを特徴とする請求項1〜18のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸変異が、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yからなる群より選択されるアミノ酸による当初のアミノ酸の置換であることを特徴とする請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記当初のメガヌクレアーゼが、天然または修飾されたメガヌクレアーゼであることを特徴とする請求項1〜20のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２２】
前記当初のメガヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼが、I-Cre I、I-Dmo I、PI-Sce IおよびPI-Pfu Iからなる群より選択されることを特徴とする請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼがI-Cre Iであることを特徴とする請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記当初のメガヌクレアーゼが、ハイブリッドメガヌクレアーゼであることを特徴とする請求項21に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハイブリッドメガヌクレアーゼが、ハイブリッドホーミングエンドヌクレアーゼI-Dmo I/I-Cre Iであることを特徴とする請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記I-Cre I変異型が、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140からなる群より選択される位置においてアミノ酸多様性を導入することにより作製されることを特徴とする請求項25に記載の方法。
【請求項２９】
前記I-Cre I変異型が、a) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70、T140；b) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70；c) Q26、K28、N30、Y33、Q44、R68、R70；またはd) Q26、K28、Y33、Q38、Q44、R68、R70の位置においてアミノ酸多様性を導入することにより作製されることを特徴とする請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記I-Cre I変異型が、Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70の位置においてアミノ酸多様性を導入することにより作製されることを特徴とする請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記I-Cre IまたはI-Dmo I/I-Cre I変異型が、I-Cre Iの位置75のアスパラギン酸の非荷電アミノ酸への変異をさらに含むことを特徴とする請求項25および27〜30のいずれか1つに記載の方法。
【請求項３２】
前記非荷電アミノ酸がアスパラギン残基であることを特徴とする請求項31に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
選択が負の選択マーカーの不活性化に基づく場合、該方法は、負の選択マーカーのコーディング配列と所望のメガヌクレアーゼについての標的DNA配列を含む発現ベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを含む発現ベクターを含有する細胞の使用を含む。好ましくは、該発現ベクターはプラスミドである。好ましくは、該標的DNA配列は、負の選択遺伝子の近くまたは負の選択遺伝子内のいずれか、好ましくは負の選択遺伝子の発現を駆動するプロモーターとORFとの間に位置する。負の選択マーカーの発現は、メガヌクレアーゼ変異型が切断する機会を有するまで細胞を生存したままにするために、条件的(conditional)でなければならない。このような条件的発現は、条件的プロモーターを用いて容易に行うことができる。しかしながら、用い得る他の条件的システムもある。メガヌクレアーゼ変異型を発現カセット内に導入する。メガヌクレアーゼをエンコードする配列は、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターに動作可能に連結する。もちろん、プロモーターはアッセイで用いられる細胞と矛盾しない。メガヌクレアーゼ変異型が標的DNAを切断する能力を有する場合、負のマーカー遺伝子全体もしくはその部分(コーディング配列またはプロモーター)の欠失またはベクターの分解のいずれかにより負の選択マーカーは不活性化される。負の選択条件での培養は、標的DNA配列を切断できるメガヌクレアーゼ変異型を含む細胞の選択を許容する。