【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年10月10日(2007.10.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】メロシアニン染料タンパク質染色
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、メロシアニン染料を用いるポリ(アミノ酸)(溶液中、ゲル中および固体保持体上のペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を包含する)の染色に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリ(アミノ酸)の検出および分析は、基礎研究から酵素産生、法廷分析および診断までの範囲の、多くの種々の活性において極めて重要である。
【０００３】
いくつかの方法(クーマシーブリリアントブルー(CBB)染色、および銀染色、ならびに蛍光染色(例えば、ナイルレッド(nile red))のような比色法を包含する)が、電気泳動ゲル中のタンパク質または他のポリ(アミノ酸)を検出するために利用される。本発明は、ゲル上のポリ(アミノ酸)を染色する公知の方法に対して以下のような多くの利点を有する：染色が迅速であり、簡単であり、そしてポリ(アミノ酸)組成物に対して比較的非感応性(insensitive)である。視覚化が脱染色(destaining)することなく可能であり、そして染色されたバンドは数日間検出可能のままである。現行法において使用される染料は水性染色溶液中に容易に溶解し、そして安定である。さらに、染料は、大きなストークスシフトを示す。最終的に、本発明は、１バンド当たり1ngほどのポリ(アミノ酸)の検出を可能とする。この検出は、危険性および出費を抑えながら、銀染色に匹敵し、そしてCBBまたはナイルレッド染色より１オーダーを上回る程良好である。
【０００４】
本発明はまた、フィルター膜または他の固体保持体上、あるいは溶液中でポリ(アミノ酸)を検出するために使用され得る。溶液中でポリ(アミノ酸)を染色するための本発明の使用はまた、他の公知の方法(吸光度ベースLowry、Bradford、およびビシンコニン酸(bicinchoninic acid)(BCA)法および蛍光ベース法(例えば、ナイルレッドを包含する)より高い感度で、かつより広い動的範囲でポリ(アミノ酸)を定量するために使用され得る(表３)。
【０００５】
本発明に有用なメロシアニン染料の調製および特徴付けを充分に記載する。多くのスチリルメロシアニン染料(RH染料と称される)が細胞膜における電位を測定するために以前に調製されている。種々の他のメロシアニン染料が、写真工業における使用のために記載されている(これらの蛍光特性は示されていない)。本発明(細胞環境の外側でのポリ(アミノ酸)の染色および検出を記載する)は以前の先行文献に対して新規であり、かつ自明でもない。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要旨および好ましい実施態様の記載
ポリ(アミノ酸)を、本発明に従って、ポリ(アミノ酸)を１つまたはそれ以上のメロシアニン染料とインキュベートすることにより、染色する。本明細書中で使用されるように、ポリ(アミノ酸)は、任意のアミノ酸のホモポリマーまたはヘテロポリマーであり、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を包含する。メロシアニン染料は、アミノ酸ポリマーと直接的に、または界面活性剤の存在下のいずれかで会合して強い比色吸収および強い蛍光発光の両方を生ずる。これにより標識化された任意のポリ(アミノ酸)は、溶液中、または固体もしくは半固体保持体上のいずれかにおいて高い感度で検出され得る。
【０００７】
染料の選択
メロシアニン染料は、アルキレン架橋またはポリアルキレン架橋により電子対供与部分に結合する４級窒素ヘテロ環を包含する。広範な種々の電子対供与基は、４級窒素ヘテロ環の正電荷を共鳴により形式上安定化させることが知られている。適切な電子対供与基としては、ジアルキルアミノフェニル、ジアルキルアミノナフチル、電子豊富ヘテロ環および電子対供与基を含有する非環式部分が挙げられる。
【０００８】
好ましいメロシアニン染料は以下の一般式を有する：
Q-B-M
ここで、Qは、４級化窒素ヘテロ環であり、ここで４級化基はTAIL基であり、Bはエテニルまたはポリエテニル部分である共有結合架橋であり、そしてMは、芳香族置換基または活性メチレン置換基である。
【０００９】
共有結合架橋Bは、式-(CR7=CR8)n-を有し、ここで、R7およびR8は独立してH、C1〜C6アルキルまたはフェニルである。あるいは、R7およびR8は一緒になって、５員または６員飽和環を形成する。下付き添字nは、１〜３の値である。nの値がより高くなると、励起および発光がより長波長側にシフトする。代表的には、R7およびR8は両方ともHである。好ましくは、nは１または２である。
【００１０】
４級化窒素ヘテロ環Qは、代表的には、下式を有する置換または非置換ピリジニウム、キノリニウム、ベンゾキノリニウムまたはベンズアゾリウム部分である：
【００１１】
【化１】
1998504108.tif 000001
または
【００１２】
【化２】
1998504108.tif 000002
あるいは式
【００１３】
【化３】
1998504108.tif 000003
であり、
ここで、環置換基R1、R2、R3およびR4は必要に応じて、かつ独立してH、Cl、F、C1〜C6アルキル、C1〜C6パーフルオロアルキル、C1〜C6アルコキシ、アミノ、または１個〜２個のC1〜C6アルキルにより置換されたアミノである。環置換基R5およびR6は、必要に応じて、かつ独立してH、Cl、F、C1〜C6アルキル、C1〜C6パーフルオロアルキル、C1〜C6アルコキシ、アミノ、１個〜２個のC1〜C6アルキルにより置換されたアミノ、またはフェニルである。あるいは、R5およびR6は、一緒になる場合、必要に応じて、かつ独立してCl、F、C1〜C6アルキル、C1〜C6パーフルオロアルキル、C1〜C6アルコキシ、アミノ、または１個〜２個のC1〜C6アルキルにより置換されたアミノにより１回またはそれ以上置換される縮合６員芳香環を形成する（キノリニウム部分を生じる）。キノリニウム環は、必要に応じて、かつ独立してCl、F、C1〜C6アルキル、C1〜C6パーフルオロアルキル、C1〜C6アルコキシ、アミノ、または１個〜２個のC1〜C6アルキルにより置換されたアミノにより１回またはそれ以上置換されるさらなる縮合６員芳香環(ナフト置換ピリジニウム、またはベンゾキノリンを生ずる)により、必要に応じて置換される。代表的には、R5およびR6は、Hであるか、あるいは置換または非置換ベンゾ部分を形成する。好ましくはR5およびR6は、一緒になって置換または非置換の縮合６員ベンゾ部分(キノリニウム環系を生ずる)を形成する。
【００１４】
ベンザゾール環Q1において、環フラグメントXは、必要に応じて-S-、-O-、-NR7-または-CR7R8-であり、ここで、R7およびR8は、先に定義した通りである。代表的には、R7およびR8はメチルである。好ましくは、XはOであるか、またはSであり、より好ましくは、XはSである。
【００１５】
４級化部分であるTAILは炭素原子を介してQの窒素原子に結合し、そしてC、O、NまたはSである合計１個〜22個の非水素元素を含有し、この結果TAIL内では、各ヘテロ原子は、少なくとも２個の炭素原子により任意の隣接ヘテロ原子から分離されている。TAILは、炭素-炭素結合(C-C)、エーテル結合(C-O-C)、チオエーテル結合(C-S-C)またはアミン結合(C-NR9-C)からなる群から選択される結合から構成される。TAIL中の任意の炭素原子は、必要に応じてさらにヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、アミノ、またはアンモニウムにより置換される。TAIL中の任意のアミン、アミノまたはアンモニウムは、必要に応じてさらに、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、アミノ、１個〜２個のC1〜C6アルキルで置換されたアミノまたは１個〜３個のC1〜C6アルキルにより置換されたアンモニウムにより置換されるC2〜C6アルキルであるR9により、必要に応じて置換される。あるいは、TAILの窒素原子は、TAIL中の他のC原子またはN原子と共に１つまたは２つのいずれかの飽和５員環または６員環を形成し、この結果得られる環は、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジンまたはモルホリンである。
【００１６】
１つの実施態様において、TAIL部分は、少なくとも１つのジアルキルアミノまたはトリアルキルアンモニウム置換基を含有し、ここで、アルキル置換基はメチルまたはエチルである。好ましくは、TAILは、-CH3またはCH2CH3であるか、あるいは必要に応じて、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、アミノ、１個〜２個のC1〜C6アルキルにより置換されたアミノ、または１個〜３個のC1〜C6アルキルにより置換されたアンモニウムにより１回またはそれ以上置換されるC3〜C22アルキルである。「スルホ」は、スルホン酸(-SO3H)またはスルホン酸の一般アルカリ金属塩を意味する。より好ましくは、TAILは、直線形かつ飽和であり、かつヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、アミノ、１個〜２個のC1〜C6アルキルで置換されたアミノまたは１個〜３個のC1〜C6アルキルにより置換されたアンモニウムによりその遊離末端(free termius)にて置換されるC3〜C12アルキルである。さらにより好ましくは、TAILは、スルホまたはカルボキシにより１回置換されるC3〜C4アルキルである。
部分Ｍは下式を有し：
【００１７】
【化４】
1998504108.tif 000004
または
【００１８】
【化５】
1998504108.tif 000005
ここで、R11およびR12は独立して、H、F、Clまたは-CH3であり；代表的にはHである。R13およびR14は独立して、直線形、分枝状、飽和または不飽和であり、かつ必要に応じてF、ヒドロキシ、またはC1〜C6アルコキシにより１回またはそれ以上置換されるC1〜C18アルキルである。あるいは、R13およびR14は、一緒になる場合、酸素ヘテロ原子を必要に応じて含有する、５員または６員飽和環を形成する。染料の他の実施態様において、R13と一緒になるR11およびR12と一緒になるR10は、独立して５員環または６員環を形成する-(CH2)2-または-(CH2)3-である。好ましくは、R13およびR14は各々直線形アルキル(これらは同一であり得るか、異なり得る)であり、各々は４個〜８個の炭素原子を有し、より好ましくは、各々５個〜７個の炭素原子を有する。
【００１９】
あるいは、Mは、表１に記載のような式を有し、ここでRは、H、フェニル、スルホフェニル、C1〜C6アルキルまたはカルボキシにより置換されたC1〜C6アルキルである。このような染料は、例えばBrookerら、J. AM. CHEM. SOC. 73, 5326(1951)(参考として援用される)により記載される。
【００２０】
【表１−１】
1998504108.tif 000006
【００２１】
【表１−２】
1998504108.tif 000007
【００２２】
全ての染料について、染料により保有される任意の実効正電荷または負電荷をカウンターイオン(Ψ)により平衡化する。一般に、生体分子と共に使用される任意のカウンターイオンが適切である。好ましいカウンターイオンとしては、クロライド、ヨーダイド、パークロレート、種々のスルホネート、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、アンモニウムまたは置換アンモニウムイオンが挙げられる。
【００２３】
【表２−１】
1998504108.tif 000008
【００２４】
【表２−２】
1998504108.tif 000009
【００２５】
【表２−３】
1998504108.tif 000010
【００２６】
【表２−４】
1998504108.tif 000011
【００２７】
メロシアニン染料(スチリル染料を含有する)の合成は、十分に記載されている。例えば、選択されたスチリル染料(RH染料)の調製は、Rina
Hildesheim(Grinvaldら、BIOPHYS. J. 39, 301(1982)、参考として援用される)、Leslie Loew(Loewら、J.
ORG. CHEM. 49, 2546(1984)、参考として援用される)、などにより記載される。他のメロシアニン染料はBrookerら(J. AM. CHEM. SOC. 73, 5326(1951)、参考として援用される)により記載されている。本発明に有用な多くの染料は、Molecular Probes,
Inc.(Eugene, Oregon)から入手可能である。
【００２８】
４級化部分(「TAIL」)は、代表的には、メチル置換ピリジン、キノリンまたは他の窒素ヘテロ環を、既に他の側鎖置換基を含有するか、またはさらに反応して、Hildesheim(Grinvaldら、上記)に記載のような側鎖置換基を生じるアルキル化剤により４級化することにより得られる。特に、プロパンスルトンまたはブタンスルトンを用いる４級化は、簡便であり、そして好ましい染料を生ずる。他の置換基が、中間体ハロアルキル４級化ヘテロ環による最初のメロシアニン染料の合成前または後のいずれかで通常添加される。しかし、TAILの添加はまた、最初の染料合成に続いて行われる。これは、通常、アザスチルベンまたはその縮合アナログを必要とする(Loewら、上記に記載)。
【００２９】
本方法のスチリル染料を、代表的には、当該分野で周知の方法を用いて、所望のR1、R2、R3およびR4置換基を含むアニリン誘導体をベンズアルデヒド、シンナムアルデヒドまたはペンタジエニル(pentadienal)誘導体に転換することにより調製する。次いで、アルデヒド誘導体を４級化ピリジニウム、キノリニウムまたはベンズアゾリウム塩と縮合して有用な染料を得る。
【００３０】
使用方法
上記のメロシアニン染料を１つまたはそれ以上含有する染色混合物を、照射時に検出可能な比色または蛍光光学応答を与える染料-ポリ(アミノ酸)複合体を形成するに充分な時間、ポリ(アミノ酸)を含有すると考えられているサンプル混合物と組み合わせる。複合体は、必要に応じて上記のような界面活性剤分子を含有する。複合体中に存在するメロシアニン染料は、それ自身のポリ(アミノ酸)または複合体中に存在する上記界面活性剤分子のいずれかと非共有結合的に相互作用する。サンプル混合物、または組み合わせ混合物を、必要に応じて、代表的には90℃を上回る温度に加熱する。さらなる工程が、ポリ(アミノ酸)の分離または精製、ポリ(アミノ酸)の検出の増強、またはポリ(アミノ酸)の定量を提供するために必要に応じて、かつ独立して、任意の組み合わせで使用される。
【００３１】
サンプル混合物
サンプル混合物は、水溶液、または大部分水溶液(mostly aqueous solution)であるか、または固形物、ペースト、乳濁液、または他の溶液(標識化の際に大部分水溶液と組み合わせられる)である。サンプル混合物は、ポリ(アミノ酸)を含有するか、または含有すると考えられている。サンプル混合物が水溶液である場合、ポリ(アミノ酸)の濃度は、代表的には10ng/mL〜50μg/mLであり、より好ましくは、50ng/mL〜5μg/mLである。電気泳動ゲルに対しては、ポリ(アミノ酸)の濃度は、代表的には１ng/バンド〜４μg/バンドである。
【００３２】
本発明に適切なポリ(アミノ酸)としては、合成および天然に存在するポリ(アミノ酸)の両方が挙げられる。ポリ(アミノ酸)は、必要に応じて脂質、ホスフェート、および／または炭水化物部位を包含する非ペプチド部位を取り込む。ポリ(アミノ酸)は、必要に応じて比較的均一な、または不均一なポリ(アミノ酸)の混合物であるか、または多サブユニット(multi-subunit)複合体である。サンプル混合物中のポリ(アミノ酸)は、必要に応じてガラス、プラスチック、または半導体材料のような固体表面に共有結合するか、または非共有結合するか；あるいは結合しない。
【００３３】
ポリ(アミノ酸)は、必要に応じて改変されないか、または例えば、以下の工程により試薬で処理されて、電気泳動ゲルにおけるポリ(アミノ酸)の移動度を向上させるか、または減少させる：ペプチドと複合体化させる工程による(移動を減少させる)、選択されたペプチド結合を開裂する工程による(得られるフラグメントの移動を向上させる)、タンパク質上の相対電荷を変化させる工程による(リン酸化、または脱リン酸化によるような)、またはグリコシル化の間に生ずるような成分を共有結合する工程による。このような相互作用は、非処理ポリ(アミノ酸)と比較して、処理されたポリ(アミノ酸)の電気泳動移動度の変化により検出される。
【００３４】
個々のアミノ酸はこれらの染料を用いて染色されるが、代表的にはポリ(アミノ酸)は、500ダルトンを上回る（より代表的には800ダルトンを上回る）mwのペプチドであるか、またはタンパク質である(表３および５)。大きいポリ(アミノ酸)(200,000ダルトンを上回る)は、ゲル中に充分溶解しない。より小さいポリ(アミノ酸)(1000ダルトン未満)は、ゲルおよびフィルター上で検出するのは困難であるが、溶液中では容易に検出される。本発明の１つの実施態様では、存在するポリ(アミノ酸)は、異なる分子量(例えば、分子量標準)のポリ(アミノ酸)の混合物である。
【００３５】
サンプル混合物は、必要に応じて所望のポリ(アミノ酸)以外の異なる生物学的成分を含有する。この成分は、他のポリ(アミノ酸)、アミノ酸、核酸、炭水化物および脂質を包含する（これらは、本方法において除去され得るか、または除去され得ない）。１つの実施態様では、ポリ(アミノ酸)は、互いに分離されるか、または移動度により、サイズにより、または本方法の際の結合親和力により、サンプル中の他の成分と分離される。代表的には、サンプル混合物中の完全な(intact)、またはフラグメント化された生体膜、リポソーム、または界面活性剤ミセルは除去されるか、破壊されるか、あるいは本方法を用いて標識化する前、またはその際にミセルを形成する濃度(臨界ミセル濃度またはCMC)以下の濃度で分散される。代表的には、サンプル混合物は本質的に細胞を有しない。
【００３６】
染色混合物
染色混合物は、サンプル混合物と組み合わされて、組み合わせ混合物中に存在する任意の染料と任意のポリ（アミノ酸）との間の接触を促進する。染色混合物は、代表的には染料を有機溶媒（例えば、DMSO、DMFまたはメタノール）中に溶解し；次いで実施されるアッセイに従って水溶液で希釈することにより調製される。溶液アッセイについて、染料は、必要に応じて界面活性剤を含有する水溶液中（好ましくは緩衝化された水溶液中）に希釈される。ゲルまたは膜を染色するために、染料は、必要に応じて酢酸（代表的には５％〜７％）を含有する水または緩衝液中に希釈される。
【００３７】
可視色検出のために、染色混合物中の染料濃度は、代表的には１μMと100μMとの間、好ましくは約５μMと約20μMとの間；より好ましくは少なくとも10μM〜15μMまたはこれより高濃度である。蛍光検出のために、染料濃度は、代表的には0.10μMより高く、そして10μM未満；好ましくは約0.50μMより高く、そして約５μM以下；より好ましくは１μM〜３μMである。これらの値を下回る濃度および上回る濃度は、検出方法の感度に応じて、特定のポリ（アミノ酸）に対して検出可能な染色を与える。
【００３８】
特定の染料が、一般的には、１つまたはそれ以上の以下の基準を用いて選択される：ポリ（アミノ酸）に対する感度、動的範囲、光安定性、染色時間、および核酸の存在に対する無感応性。染料の感度および動的範囲は、実施例１および７の手法を用いて決定される。好ましい染料は、電気泳動ゲルにおいて１バンド当たり１ng〜２ngまたはそれ未満のポリ（アミノ酸）、あるいは溶液１mL当たり10ng〜30ngまたはそれ未満のポリ（アミノ酸）の感度を有する。好ましくは、染料は、溶液アッセイのために約３またはそれ以上のオーダーのポリ（アミノ酸）濃度の動的範囲を有する。好ましい染料は、ポリ（アミノ酸）の非存在下、水溶液において0.05未満、より好ましくは0.01未満の量子収率を有する。好ましくは、染料は、ポリ（アミノ酸）と組み合わせる場合、ポリ（アミノ酸）の非存在下における染料と比較して100倍を超える、より好ましくは300倍を超える蛍光増強を示す。好ましい染料は、ポリ（アミノ酸）と組み合わせる場合、488nm、514nm、543nm、または633nmの10nm以内に吸収極大を有する。
【００３９】
界面活性剤
非変性ゲルが使用される場合を除き、本発明は、必要に応じて界面活性剤を包含する。この界面活性剤は、サンプル混合物または染色混合物と同時に、あるいは混合物の一部として添加されるか、あるいは下記のように組み合わせ混合物に添加される。好ましくは、界面活性剤は、染色混合物が添加される前にサンプル混合物と組み合わされる。界面活性剤は、任意の両親媒性界面活性剤またはポリ（アミノ酸）を被覆するために供する（すなわち、ポリ（アミノ酸）と非共有結合的に会合する）界面活性剤である。有用な界面活性剤としては、非イオン性、カチオン性、アニオン性、両性およびフッ素化界面活性剤が挙げられる；多くは市販されている。タンパク質ゲル電気泳動に使用される任意の界面活性剤が好ましい。代表的には、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、好ましくはアルキル硫酸塩またはアルキルスルホン酸塩（代表的には、６個〜18個の炭素）；より好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、オクタデシル硫酸ナトリウム、またはデシル硫酸ナトリウム；最も好ましくは、SDSである。
【００４０】
好ましくは、サンプル混合物、染色混合物、または組み合わせ混合物中の任意の界面活性剤は、ポリ（アミノ酸）を含まないミセルの形成を回避するために、その界面活性剤に対するCMCを下回って存在する。CMCは、使用される界面活性剤と溶液のイオン強度との関数である。適度なイオン強度のSDS溶液について、CMCは約0.1重量％の溶液である。代表的には、SDSを用いる変性ポリ（アミノ酸）の電気泳動分離前のサンプル混合物の予備染色について、界面活性剤の濃度は、約１重量％〜５重量％、より代表的には約２重量％である。組み合わせ混合物が溶液アッセイに使用される場合、組み合わせ混合物中のSDS濃度は、代表的には１重量％未満、好ましくは0.05重量％〜0.1重量％である。PLURONICおよびTRITONのような非イオン性界面活性剤について、組み合わせ混合物中の界面活性剤濃度は、好ましくは約0.05重量％未満である。
【００４１】
組み合わせ混合物
本発明の１つの局面において、組み合わせ混合物は、溶液（例えば、実施例７；表３）；代表的には、実質的にポリ（アミノ酸）、１つまたはそれ以上のメロシアニン染料、特に好ましい染料、および界面活性剤からなる水溶液（好ましくは緩衝化される）である。水溶液は、必要に応じて沈降勾配（例えば、スクロース勾配）の範囲内のような分離媒体として、またはキャピラリー電気泳動を実施する場合に使用される。サンプル混合物または組み合わせ混合物は、必要に応じてポリ（アミノ酸）の検出または定量前に加熱および冷却される。
【００４２】
【表３】
1998504108.tif 000012
１吸収極大は、2.0mL容積中の１μM 染料＋0.05％ SDS+/-150μg/mL BSA（ウシ血清アルブミン）を用いて測定する。
２蛍光励起および発光スペクトルは、2.0mL容積中の１μM 染料＋150μg/mL BSA＋0.05％ SDSを用いて測定する。
３蛍光増強は、蛍光励起および発光極大で、2.0mL中の１μM 染料+/-500μg/mL BSAを用いて計算する。
４動的範囲の限界は、１μMの染料を、200μL容積の96ウェルマイクロプレート中の0.05μg〜50μgのタンパク質で滴定することにより測定する。３つのタンパク質溶液は、各染料に対して別々に滴定される：等重量濃度のIgG、アビジン、ストレプトアビジン、セルラーゼおよびオバルブミンを含有するリゾチーム、BSAおよびタンパク質混合物。検出の下限は、バックグラウンドの10％を超える蛍光を生じるに必要とされるタンパク質の量である。上限は、タンパク質濃度に関するシグナルの直線性が、最低濃度でシグナル飽和を生じるタンパク質タイプに対して低下し始める時点である。
【００４３】
本発明の別の局面において、メロシアニン染料は、必要に応じて分離前にポリ（アミノ酸）を予備染色するために使用されるか；あるいはゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動における分離（例えば、実施例12）の間に移動相の成分として存在する。あるいは、電気泳動（変性または非変性）ゲル中で分離したポリ（アミノ酸）は、染色混合物を用いて後染色されるか、または染色混合物と組み合わされる前にフィルター膜、またはブロット、あるいは他の固体もしくは半固体マトリックスに移動される（実施例１、２、３、および５）。代表的には、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルが、電気泳動のために使用される。あるいは、ゲルは、等電性フォーカスゲル（focusing gel）、勾配ゲル、２次元ゲルであるか、またはゲルは、ゲル移動シフト分析に使用される。サンプル混合物または組み合わせ混合物は、必要に応じて変性ゲルに付与される前に加熱される。電気泳動ゲルを後染色するために使用される際の本発明の選択染料の感度を、表４に挙げる。
【００４４】
【表４−１】
1998504108.tif 000013
【００４５】
【表４−２】
1998504108.tif 000014
１全ての電気泳動ゲルは、SDSアクリルアミドミニゲル（Bio-rad）である。
２色とは、＊を付した場合（ここで色とは、白色光下での比色的様相をいう）を除き、染色されたタンパク質バンドの蛍光発光の色をいう。
３感度とは、BSAの4X希釈系列を用いる（実施例１の手法を用いる）、１バンド当たりのタンパク質検出の下限をいう。感度は、最適露光で撮った白黒ポラロイド（登録商標）写真において目で容易に検出可能な最小量のタンパク質を含有するバンドであると定義される。「低」感度とは、CBBおよびナイルレッドを用いて見出される検出限界に匹敵する検出限界を意味し；「高」感度とは、銀染色を用いて見出される検出限界に匹敵する検出限界を意味し；「中」感度とは、２つの範囲間の中間である。
種々のポリ（アミノ酸）に対する本方法の感度を、銀染色およびCBB染色分子量の感度と比較した（表５）。
【００４６】
【表５−１】
1998504108.tif 000015
【００４７】
【表５−２】
1998504108.tif 000016
【００４８】
本発明を用いると、染色されたゲルの脱染色は、一般的に比色検出または蛍光検出のいずれかに必要でない。非常に高い染料濃度で、脱染色は、必要に応じてゲルにおける可視色検出を改善するために使用される。ゲルは、染料の他の表面への移動を防止するために、染色後に必要に応じて簡単に洗浄される。
【００４９】
さらなる試薬
本発明の方法は、さらなる試薬を同時にまたは連続してサンプル混合物、染色混合物、または組み合わせ混合物に加える工程を必要に応じてさらに包含する。さらなる試薬により、検出可能応答を生じる性質（means）が組み込まれる。この検出可能応答としては、色、蛍光、反射、pH、化学発光、赤外スペクトル、磁気特性、放射性、光散乱、ｘ線散乱の変化または出現、あるいは電子豊富基質の生成が挙げられる。さらなる試薬は、必要に応じて、概してポリ（アミノ酸）または特定のポリ（アミノ酸）と同時に局在化する検出試薬であるか；またはサンプル混合物の特定の成分に対するプローブ（例えば、核酸染色；特異的結合対の検出可能なメンバー）であるか；または上記のようなポリ（アミノ酸）の移動性を変化させる。本発明の１つの実施態様（上記の好ましい実施態様を包含する）において、さらなる試薬は、１つまたはそれ以上のさらなるメロシアニン染料である。さらなるメロシアニン染料が、エネルギー転移が起こるような重なりスペクトル特性を有する場合、標識化ポリ（アミノ酸）は、拡張ストークスシフトを示す。あるいは、さらなる試薬は、別のタンパク質染色（例えば、CBBまたは銀染色）であり、その結果ポリ（アミノ酸）の標識化が、染色の同時局在化により増強される。
【００５０】
照射および観察
染料とサンプルとの組み合わせ混合物は照射されて、可視光の吸収（比色応答）であるか、蛍光発光（蛍光応答）であるか、またはその両方である光学応答を与える。照射は、代表的には染料−ポリ（アミノ酸）複合体の最大吸収波長、またはその付近で染料−ポリ（アミノ酸）複合体を励起し得る光源（例えば、紫外（254nm〜370nm）または可視（490nm〜550nm）波長発光ランプ、アークランプ、レーザー、あるいは日光または普通の室内光）による。好ましくは、サンプルは、染料−ポリ（アミノ酸）複合体の最大吸収の20nmの範囲内の波長で励起される。
【００５１】
好ましくは、染料−ポリ（アミノ酸）複合体は、480nmと650nmとの間、より好ましくは488nmと550nmとの間、最も好ましくはレーザー照射源の波長と適合する吸収極大を有する。複合体はまた、好ましくは300nmまたはその付近のUVにおいて励起する。
【００５２】
光学応答は、視覚検査、CCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、または機器（例えば、レーザースキャン装置、蛍光光度計、光ダイオード、量子カウンター、エピ蛍光（epifluorescence）顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー）の使用を包含する方法によるか、あるいはシグナルを増幅する方法（例えば、光増倍管）により定性的、または必要に応じて定量的に検出される。POLAROID（登録商標）フィルムを用いる光学応答の記録により、シグナルの感度が増強される。
【００５３】
ポリ（アミノ酸）の定量は、代表的には光学応答と、既知濃度のポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）混合物の標準希釈物から得られる調製標準または校正曲線との比較により行われる。あるいは、標準曲線は、標的染料−ポリ（アミノ酸）複合体に対して標準化された参照染料または染色粒子との比較により作製される。
【００５４】
本染料の使用の単純さにより、上記染料は、ポリ（アミノ酸）の標識化のためのキットの処方において特に有用である。このキットは、１つまたはそれ以上のメロシアニン染料（好ましくはストック溶液中）および染料の使用のための説明書を包含し、これは、必要に応じて標準試料を包含する。１つの実施態様において、説明書は、サンプル混合物および染色混合物を、同時または連続のいずれかで固体または半固体保持体に付与し、次いで得られた色または蛍光を校正標準と比較して、サンプル混合物中に存在するポリ（アミノ酸）の存在、および必要に応じて濃度を決定することを詳細に記載する。保持体、染料溶液、校正標準および使用のための説明書は、「浸液棒」タンパク質アッセイキットを包含し、これによりタンパク質濃度の迅速かつ便利な測定が可能となる。
本発明の実施を説明するために、実施例を以下に挙げる。それらは本発明の範囲全体を限定または定義することを意図しない。
【実施例】
【００５５】
実施例１．SDS-ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質の検出：
純粋なタンパク質またはタンパク質混合物を、ローディング緩衝液（50mM Tris-HCl、pH6.8、２％ SDS、10％グリセロール、および0.015％ブロモフェノールブルー）中で調製する。ジチオトレイトールを、各サンプルに0.1Mまで加える。サンプルを、90℃〜95℃で４分〜５分加熱し、そして４％スタッキングゲルと共に、0.05％〜0.1％ SDSを含有する15％トリスグリシンポリアクリルアミドミニゲルまたはフルサイズゲル上にロードする。このゲルを、標準条件下、0.05％〜0.1％ SDSを含有するTris-グリシン緩衝液中で電気泳動させる。得られるゲルを、7.5％酢酸（水中）中の１μM〜３μM Dye 304を含有する染色皿に移す。染色溶液を、45分〜60分間穏やかに撹拌する。10分後、タンパク質バンドは容易に明らかになるが、感度を約30分〜40分にわたって改善する。ゲルを染色皿から取り出し、7.5％酢酸中で簡単にすすぎ、そしてUVトランスイルミネーター（transilluminator）に移す。ゲルを、300nmの透光（transillumination）およびWratten 9ゼラチンフィルタを有する白黒POLAROID 667プリントフィルムを用いるか、または300nm付近のUV照射を有するCCDカメラを用いて写真を撮る。染色バンドは、鮮明な橙色蛍光を発する。通常の室内光下で染色バンドは橙色バンドに見える。本発明の他の染料（表３を参照のこと）は、黄色〜紫色の可視発色および緑色〜赤色の蛍光発光を有するバンドを有する染色されたゲルを生じる。
【００５６】
実施例２．非変性ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質の検出：
タンパク質希釈系列を、天然ゲルローディング緩衝液（125mM Tris-HCl、pH6.8、10％グリセロールおよび0.015％ブロモフェノールブルー）中で調製する。サンプルを、Tris-HCl非変性ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そしてゲルを標準条件下で電気泳動させる。電気泳動ゲルを、実施例１のように染色および写真を撮る。これらの条件下での染色感度は、代表的にはいくらかタンパク質選択性である。
【００５７】
実施例３．Tris-トリシンゲル中のペプチドの検出：
短ペプチドの希釈系列を、ローディング緩衝液中で調製する。各サンプルに、ジチオトレイトールを0.1Mまで加え、サンプルを90℃〜95℃で４分〜５分間加熱し、次いで16.5％ Tris-トリシンゲル上にロードする。ゲルを標準条件下で電気泳動させる。実施例１のように、ゲルを染色し、そしてタンパク質バンドを視覚化する。20アミノ酸以下のポリペプチドを、この方法を用いて容易に検出する。真核細胞RNAポリメラーゼIIのC末端で見出されるへプタペプチド反復のテトラマー、トリプシンのトリプシンペプチドおよびβ−ブンガロトキシンの小サブユニットのようなペプチド（CBBおよび銀染色のいずれでも染色されない）は、容易に検出可能である。
【００５８】
実施例４．２次元ゲル中のタンパク質の検出：
マウスの細胞質ゾル抽出物（すなわち、全細胞溶解産物）を、標準条件下、２次元ゲルで調製および分離する。ゲルを、実施例１のように染色および視覚化する。同一のゲルを、市販のキット（Bio-Rad）を用いて銀と平行して染色する。本発明を用いて染色したゲルは、銀染色したゲルよりも多くのタンパク質スポット（protein spot）を示し、これは本発明が銀染色よりもタンパク質選択性が低いことを示す。本方法を用いて得られたシグナル強度は、銀染色を用いて得られたシグナル強度よりもタンパク質濃度により直接比例する。本発明を用いる染色の感度は、低分子量タンパク質の検出用の銀染色の感度よりも優れている（表３）。
【００５９】
実施例５．フィルター膜上のタンパク質の検出：
タンパク質をTBS（20mM Tris-HCl、pH7.5、500mM NaCl）中で希釈し、次いでナイロンまたはニトロセルロースフィルター膜に適用する。膜をTBSで洗浄し、次いで7.5％酢酸またはTBS中の２μM Dye 803でインキュベートする。あるいは、タンパク質を、まずゲル電気泳動により分離し、そして標準の手法を用いてナイロンまたはニトロセルロースフィルター膜に移す。このブロットを上記のように染色する。ブロットを300nm〜365nmで照射する。タンパク質スポットまたはバンドは、蛍光性である。ブロットを実施例１のように撮影する。染色されたタンパク質は、淡白色（faint white）スポットまたは白色バンドに見える。これらの条件下での染色は、いくらかタンパク質選択性である。タンパク質を、必要に応じてレーザー照射源を用いて検出する。
【００６０】
実施例６．染色タンパク質のウェスタンブロット：
ウシ心臓チトクロームオキシダーゼ複合体（COX）の希釈系列を、水中で調製する。サンプルを12％ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そしてゲルを標準条件下で電気泳動させる。得られるゲルを半分に切断し、一方の半体（half）を、上記実施例１のように移入緩衝液（20％ MeOH、25mM Tris-グリシン、pH8.3、192mMグリシン）中でDye
801で染色し、そして視覚化する。タンパク質を、標準の方法に従って、ゲルの両半体からフィルター膜まで電気泳動的に移す。ブロットを阻止し、特異的COXサブユニットに対するマウスモノクロナール抗体でプローブし、そして得られるシグナルを、標準の方法を用いて、ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートを用いて視覚化する。ブロットの２つの半体は、COXサブユニットの検出に対して同等の感度を示し、これは本発明を用いるタンパク質の染色が、次の免疫学的検出を妨害しないことを示す。
【００６１】
実施例７．溶液中のタンパク質の検出：
タンパク質の希釈系列を10mM Tris-HCl(pH7.5、0.05%SDS含有)中で調製する。等量の２μM Dye 307を各サンプルに添加する。サンプルを15分間室温にてインキュベートする。各サンプルの蛍光強度を、蛍光光度計または蛍光マイクロプレートリーダーを用いて490nm励起にて測定する。緩衝液中のDye 307のみ(コントロール)の蛍光をタンパク質含有サンプルの蛍光から引く。タンパク質濃度を、正味の蛍光とウシ血清アルブミンまたはタンパク質混合物のような標準の蛍光とを比較することにより、決定する(図３)。
【００６２】
実施例８．核酸の存在下、ゲル中のタンパク質の検出：
E. coli由来の抽出物を、標準法を用いて細菌細胞ペレットをローディング緩衝液中に直接懸濁し、そして実施例１におけるように加熱することにより調製する。得られたサンプルを、細径(fine bore)シリンジにより上下に反復してピペットで移し、大きいDNA分子を剪断する。サンプルを連続的に希釈し、そして２つの二重希釈系列中で変性SDSゲル上にロードし、そして実施例１のように電気泳動する。電気泳動ゲルを半分に切る。片方を実施例１に従いDye 304を用いて染色する。他方を標準法に従い銀を用いて染色する。銀染色した半体は、核酸、ならびにタンパク質に対応するバンドの染色を示す。Dye 304を用いて染色された半体は、タンパク質染色から得られるバンドのみを示す。
【００６３】
実施例９．レーザー励起ゲルスキャナーを用いるゲル中のタンパク質の検出：
ゲルを実施例１、２、３または４におけるように調製し、そして染色する。染色されたゲルをレーザー励起ゲルスキャナーを用いて走査する。染色されたタンパク質は、タンパク質バンド当たり１桁のngの感度をともなって、少なくとも３オーダーの大きさの動的範囲のタンパク質濃度を有する蛍光発光を示す(図４、表２)。染色されたゲルはまた、可視光レーザー、または使用される染料に対する励起スペクトルと重複する光源を有する他のスキャナーを用いて分析し得る。
【００６４】
実施例１０．TLCプレートまたはフィルター膜上にスポットされたタンパク質の検出：
BSA、リゾチーム、ならびにミオシン、β-ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼB、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、カーボニックアンヒドラーゼ、トリプシンインヒビター、リゾチームおよびアプロチニンの等量(equi-mass)混合物の希釈系列を、10mM Tris-HCl、pH7.5(0.05% SDS含有)中で調製する。同一の緩衝液中のDye 803の等容量を各サンプルに添加し、そしてサンプルを15分間インキュベートする。各混合物の１μL〜５μLのアリコートを薄層クロマトグラフィープレートまたはナイロン、あるいはニトロセルロースフィルター膜上にスポットする。タンパク質含有スポットを室内光下で比色的に検出するか、あるいは紫外照射または可視照射に引き続く蛍光により検出する。得られたスポットの色強度または蛍光強度は、このスポットに存在するタンパク質の量を示す。未知サンプル中のタンパク質の量を、比色強度または蛍光強度のいずれかを標準の既知濃度の強度と比較することにより決定する。
【００６５】
実施例１１．ランニング緩衝液(running buffer)中の染料を用いるタンパク質ゲルの染色：
ランニング緩衝液が0.05% SDSおよび１μM〜３μM Dye 801を含むこと以外は標準法を用いて、タンパク質を標準SDSゲル上にロードし、そして走査する。染色されたゲルを電気泳動後、直接写真を撮る(実施例１におけるように)か、または写真を撮る前に20分間〜50分間7.5% 酢酸中で脱染色する。得られた感度は、電気泳動後にゲルを染色することにより得られた感度とほぼ同一である。タンパク質バンドの移動を、電気泳動の間ゲルを保持するガラスプレートを介してモニターし得る。
【００６６】
実施例１２．電気泳動前のタンパク質の予備染色(prestaining)：
タンパク質をローディング緩衝液中で希釈し、90℃〜95℃まで４分間〜５分間加熱し、次いで室温まで冷却する。Dye 304を10mMまで添加し、そしてサンプルを12% ポリアクリルアミドゲル上にロードする。ゲルを電気泳動し、そして実施例１または実施例９におけるように紫外照射を用いるか、あるいはCCDカメラを用いて視覚化する。この方法による感度は、幾分実施例１および１１における感度より低い。
本発明が、説明および実施例により詳細に記載されるが、多くの改変、置換および変更が、請求の範囲に記載されるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく可能であることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ポリ(アミノ酸)の存在下での標準化励起スペクトルおよび発光スペクトル。蛍光スペクトルを、10mM Tris-HCl、pH7.5中、１μMのDye 801、150μg/mLウシ血清アルブミン(BSA)および0.05% SDSについて得た。
【図２】ポリ(アミノ酸)の添加時の蛍光増強。スペクトルを500μg/mL BSAの非存在下および存在下、10mM Tris-HCl、pH7.5中、1μM Dye 801および0.05% SDSについて得た。
【図３】表３、注釈４におけるように、ポリ(アミノ酸)濃度とDye 307に対する蛍光発光(485nm励起および590nm発光を用いる)との間の相関関係。
【図４】実施例９におけるように、バンド蛍光とDye801に対するゲルバンド中に存在する全ポリ(アミノ酸)との間の相関関係。