【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年11月1日(2007.11.1)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  外傷性中枢神経系損傷の処置のための方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】  外傷性中枢神経系損傷を処置するための組成物であって、治療有効量のアロプレグナノロンを含む、組成物。
【請求項２】  前記損傷が、外傷性脳損傷である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】  前記外傷性脳損傷が、鈍器挫傷から生じる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】  前記外傷性ＣＮＳ損傷後の患者における水腫を減少する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】  前記外傷性ＣＮＳ損傷後の患者における炎症性応答を減少する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】  前記外傷性ＣＮＳ損傷後の患者におけるニューロン細胞死を減少する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】  前記アロプレグナノロンが、約１μｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の少なくとも１回の投薬量で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】  前記アロプレグナノロンが、約４μｇ／ｋｇ体重の少なくとも１回の投薬量で投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】  前記アロプレグナノロンの少なくとも１回の投薬量が、外傷性ＣＮＳ損傷後約０．５〜約１００時間で投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】  第１の用量の前記アロプレグナノロンが、外傷性ＣＮＳ損傷後約１時間で投与され、そしてその後のアロプレグナノロン用量が、該損傷後約６時間で投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】  第１の用量の前記アロプレグナノロンが、外傷性脳損傷後約１時間で投与され、第２のアロプレグナノロンの投薬量が、該損傷後約６時間で投与され、そしてその後のアロプレグナノロン投薬量が、２４時間間隔で投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】  前記アロプレグナノロンが、腹腔内投与、皮下投与、静脈内または脳室内投与、あるいはこれらの任意の組み合わせで投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】  前記アロプレグナノロンが、薬学的に受容可能なキャリア中で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】  前記キャリアが、シクロデキストリンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】  前記組成物が、少なくとも１つの他の神経栄養因子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】  中枢神経系に対する外傷性損傷後の被験体における細胞の集団に対する神経変性を減少するための組成物であって、治療有効用量のアロプレグナノロンを含み、ここで該用量は、該患者において神経保護効果を生じる、組成物。
【請求項１７】  前記外傷性ＣＮＳ損傷が、外傷性脳損傷である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】  前記神経変性が、脳水腫に関連する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】  前記神経変性が、鈍器挫傷に関連する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】  前記神経変性が、炎症性応答に関連する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】  外傷性中枢神経系損傷を処置するための組成物であって、治療有効量のプロゲステロンを含む、組成物。
【請求項２２】  外傷性中枢神経系損傷を処置するための組成物であって、治療有効量のプロゲステロンおよびシクロデキストリン含有ビヒクルを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（資金援助された研究または開発）
本研究は、政府機関助成金Ｒ４９／ＣＣＲ４１２３０７およびＲＯＩ  ＮＳ３８６６４によって支援された。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、中枢神経系に対する外傷性損傷を処置するための方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
プロゲステロン、その代謝産物および他の性腺ステロイド（例えば、エストロゲンおよびおそらくテストステロン）は、有効な神経保護因子であるという実験的証拠が増えつつある；しかし、その特定の生理学的機構（この機構によって、これらのホルモンは、修復を増強するように中枢神経系において作用する）は、完全には理解されていない。性腺ステロイドであることに加えて、プロゲステロンはまた、神経ステロイドとよばれるオートクライン／パラクリンホルモンのファミリーに属する。神経ステロイドは、内分泌源とは無関係に、脳に蓄積し、かつ神経細胞におけるステロール前駆物質から合成され得る、ステロイドである。これらの神経ステロイドは、ＧＡＢＡ伝達を強化し、グルタメートの効果を調節し得、ミエリン（ｍｙｃｌｉｎ）の生成を増強し得、活性化小グリア細胞からのフリーラジカルの放出を妨げ得る。
【０００４】
インビボデータにより、損傷を受けた神経系においてプロゲステロンの神経保護効果が実証された。例えば、挫傷による損傷後、プロゲステロンは、損傷後の脳水腫の重篤度を軽減する。プロゲステロンによる水腫の減少は、二次的な神経死からのニューロンの節約（ｓｐａｒｉｎｇ）および認知の結果における改善によって達成される（Ｒｏｏｆら（１９９４）  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １２９：６４−６９）。さらに、ラットにおける虚血損傷の後に、プロゲステロンは、細胞損傷および神経学的障害を軽減することを示した（Ｊｉａｎｇら．（１９９６）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３５：１０１−１０７）。プロゲステロンの保護効果は、ＧＡＢＡレセプターおよび／またはグルタメートレセプターとの相互作用を介して媒介され得る。
【０００５】
プロゲステロンの種々の代謝産物がまた、神経保護特性を有することを示唆した。例えば、そのプロゲステロン代謝産物である、アロプレグナノロンまたはエピプレグナノロンは、ＧＡＢＡレセプターの正のモジュレーターであり、ベンゾジアゼピンとは無関係の様式で、ＧＡＢＡの効果を増大させる（Ｂａｕｌｉｅｕ，Ｅ．Ｅ．（１９９２）Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７：１−１６；Ｒｏｂｅｌら（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．９：３８３−９４；Ｌａｍｂｅｒｔら（１９９５）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１６：２９５−３０３；Ｂａｕｌｉｅｕ，Ｅ．Ｅ．（１９９７）Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５２：１−３２；Ｒｅｄｄｙら（１９９６）ＰＰｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １２８：２８０−９２）。さらに、これらの神経ステロイドは、シグマレセプター（ＮＭＤＡチャネル複合体を活性化し得るレセプター）においてアンタゴニストとして作用する（Ｍａｕｒｉｃｅら（１９９８）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８３：４１３−２８；Ｍａｕｒｉｃｅら（１９９６）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４６：７３４−４３；Ｒｅｄｄｙら（１９９８）  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ９：３０６９−７３）。これらの神経ステロイドはまた、コリン作用性ニューロンの刺激および興奮性によるその後のアセチルコリン放出を軽減することを示した。多くの研究により、前脳底部のコリン作用性ニューロンは、外傷性脳損傷に感受性であり、かつアセチルコリンの過剰放出は、グルタメートよりも興奮毒性であり得ることが示された（Ｌｙｅｔｈら（１９９２）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ９（２）：Ｓ４６３−７４；Ｈａｙｅｓら．（１９９２）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ９（１）：Ｓ１７３−８７）。
【０００６】
中枢神経系への外傷性損傷後に、生理学的事象のカスケードが、ニューロン喪失をもたらす。これらのカスケードとしては、例えば、炎症性免疫応答、ならびに興奮毒性（グルタメート、アセチルコリン、コリン作用性レセプター系、ＧＡＢＡＡレセプター系、およびＮＭＤＡレセプター系を破壊する初期のインパクトから生じる）が挙げられる。さらに、外傷性ＣＮＳ損傷後には、頻繁に、脳水腫および／または脊髄水腫が生じ、このことは、損傷のカスケードを増強し、二次的な細胞死および患者の死亡率の上昇をさらにもたらす。初期の損傷の後に続く事象の複雑な生理学的カスケードの下で、残りの中枢神経系組織にその後の栄養的支援を提供し、従って、機能的修復および回復の増強に成功する、外傷性ＣＮＳ損傷のインビボ処置のための方法が必要とされる。
【０００７】
（発明の開示）
ＣＮＳにおける神経損傷の処置または予防のための方法が提供される。特に、本発明は、治療上有効な濃度のプロゲステロンまたはプロゲスチン代謝産物の投与を介して、ＣＮＳに対する外傷性損傷によって引き起こされた神経損傷を処置または予防するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、鈍い力による挫傷から生じる外傷性脳損傷を処置する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、外傷性脳損傷後の患者における脳水腫および／または炎症応答を軽減する方法を提供する。本発明の方法は、プロゲスチン代謝産物の投与によって、外傷性脳損傷後の患者におけるニューロン細胞死の減少をさらに包含する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、中枢神経系に対する外傷性損傷後の神経変性の処置または予防のための方法および組成物を提供する。「処置または予防」とは、ニューロンの任意の増強された生存、増殖および／または神経突起伸長を意図し、これは、神経変性を予防するかまたは遅らせるかのいずれかである。神経変性は、中枢神経系におけるニューロンの進行的喪失である。本明細書で使用される場合、「神経保護」とは、外傷性中枢神経系損傷の後の神経変性の停止および／または逆方向への進行である。神経保護効果は、改善された形態的回復（すなわち、増強した組織生存性）および／または行動回復の両方を包含する。改善は、外傷性ＣＮＳ損傷後の行動回復および解剖学的回復の速度および／または程度のいずれかの上昇として特徴づけられ得る。本発明の方法において、外傷性ＣＮＳ損傷後の神経保護は、プロゲステロンまたはプロゲスチン代謝産物を含む治療上有効な組成物を、患者（すなわち、哺乳動物、好ましくはヒト）に投与することによって達成される。
【０００９】
複数の生理学的事象は、外傷性ＣＮＳ損傷後のＣＮＳ組織の神経変性をもたらす。これらの事象としては、例えば、脳水腫、血管の完全性の破壊、免疫応答および炎症応答の増大、脱ミエリン化、ならびに脂質の過酸化が挙げられる。従って、本発明の方法はまた、神経変性をもたらす生理学的事象を軽減および／または予防することにおける用途を見出す。具体的には、本発明は、ニューロン細胞死、水腫、虚血を軽減または除去するための方法、および中枢神経系に対する外傷性損傷後の組織生存性を増強するための方法を提供する。
【００１０】
性ホルモンは、化学構造および生理活性に従って機能的グループに分類され得るステロイドであり、性ホルモンとしては、エストロゲン様ホルモン、プロゲステロン性ホルモン、およびアンドロゲン性ホルモンが挙げられる。本発明の方法において特に重要であるのは、プロゲステロン性ホルモンであり、このホルモンは、本明細書で「プロゲスチン」または「プロゲストゲン」、ならびにそれらの誘導体および生物活性代謝産物に言及される。この広いファミリーのメンバーとしては、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（第１８版  １９９０），９９０−９９３に開示されるステロイドホルモンが挙げられる。ステロイドの全ての他の分類と同様に、立体異性性が、性ホルモンで根本的に重要である。従って、種々のプロゲスチン（すなわち、プロゲステロン）およびその誘導体が、合成生成物および天然生成物の両方を含め、本発明によって包含される。本明細書で使用される場合、プロゲスチンの「生物活性代謝産物」または「誘導体」とは、神経変性を予防または遅らせる、任意の天然に生じたプロゲスチンまたは合成されたプロゲスチンが意図される。このようなプロゲスチン誘導体としては、例えば、プロゲステロンの誘導体（例えば、５−デヒドロプロゲステロン、６−デヒドロ−レトロプロゲステロン（ジドロゲステロン）、アロプレグナノロン（アロプレグナン−３α−オール−２０−オンまたはアロプレグナン−３β−オール−２０−オン）、二酢酸エチノジオール、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン（プレグナ−４−エン−３，２０−ジオン，１７−（１−オキソヘキシ）オキシ）；レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）、ノルエチンドロン、酢酸ノルエチンドロン（１９−ノルプレグナ−４−エン−２０−イン−３−オン，１７−（アセチルオキシ）−，（１７α）−）；ノルエチノドレル（ｎｏｒｅｔｈｙｎｏｄｒｅｌ）、ノルゲストレル（ｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）、プレグネノロン、および酢酸メゲストロールが挙げられる。有用なプロゲスチンとしてはまた、アロプレグノン−３αまたは３β，２０αまたは２０β−ジオール（Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  ２５８−２６１を参照のこと）；アロプレグナン−３β，２１−ジオール−１１，２０−ジオン；アロプレグナン−３β，１７α−ジオール−２０−オン；３，２０−アロプレグナンジオン、アロプレグナン，３β，１１β，１７α，２０β，２１−ペントオール；アロプレグナン３β，１７α，２０β，２１−テトロール；アロプレグナン−３αまたは３β，１１β，１７α，２１−テトロール−２０−オン；アロプレグナン３β，１７αまたは２０β−トリオール；アロプレグナン３β，１７α，２１−トリオール−１１，２０−ジオン；アロプレグナン−３β，１１β，２１−トリオール−２０−オン；アロプレグナン３β，１７α，２１−トリオール−２０−オン；アロプレグナン３αまたは３β−オール−２０オン；プレグナンジオール；３，２０−プレグナンジオン；プレグナン−３α−オール−２０−オン；４−プレグネン−２０，２１−ジオール−３，１１−ジオン；４−プレグネン−１１β，１７α，２０β，２１−テトロール−３−オン；４−プレグネン−１７α，２０β，２１−トリオール−３，１１−ジオン；４−プレグ���ン−１７α，２０β，２１−トリオール−３−オン；およびプレグネノロンメチルエーテルが挙げられ得る。さらなるプロゲスチン誘導体としては、非毒性有機酸（例えば、酢酸、安息香酸、マレイン酸、リンゴ酸、カプロン酸、クエン酸などとのエステルが挙げられる。無機塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩および炭酸塩が挙げられる。さらに、本発明における用途を見出し得る化合物としては、米国特許第５，２３２，９１７号（本明細書に参考として援用される）に開示されるプロゲスチン誘導体が挙げられる。
【００１１】
本発明は、少なくとも１種のプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物を含む治療上有効な組成物の投与を介して、患者（すなわち、哺乳動物、好ましくはヒト）における外傷性ＣＮＳ損傷後に神経保護効果を達成する方法を提供する。ＣＮＳに対する外傷性損傷は、中枢神経系に対する物理的インパクトによって特徴づけられる。例えば、外傷性脳損傷は、脳が物理的力に曝され、進行性のニューロン細胞損傷および／または細胞死を生じるときに生じる。外傷性脳損傷は、頭部に対する強打から生じ得、開放性または閉鎖性いずれかの損傷として現れる。重篤な脳損傷は、裂傷、頭蓋骨折、および逆に、頭部損傷の外部の形跡が見えなくても起こり得る。外傷性脳損傷を生じる物理的な力は、３つの型の損傷を誘導することによってそれらの影響を引き起こす：頭蓋骨折、実質損傷、および血管損傷。
【００１２】
実質損傷としては、震盪、直接的実質損傷および散在性軸索損傷が挙げられる。震盪は、頭部の運動量における変化（隆起した表面に衝突して頭部の運動が止められる）から代表的には生じる頭部損傷に二次的な、意識の変化の臨床的症候群として特徴づけられる。神経活動の突然の妨害の病因は、未知であるが、生じる生化学的異常および生理学的異常としては、例えば、細胞膜を横断する興奮性アミノ酸媒介性イオンフラックスに起因する脱分極、ミトコンドリアのアデノシン三リン酸の減少、および血管透過性の変化が挙げられる。震盪後症候群は、直接的実質損傷の証拠を示し得るが、損傷の証拠がない場合もいくらか存在する。
【００１３】
挫傷および裂傷は、脳への運動エネルギーの伝達および軟組織において見出されるものに類似の打撲（挫傷）によるかまたは物体の貫入および組織の断裂（裂傷）によるかのいずれかで、脳の直接的実質損傷が起こった状態である。脳の表面に対する強打は、急速な組織のずれ、血管通路の破壊、およびその後の出血、組織損傷ならびに水腫をもたらす。ニューロン細胞本体における損傷の形態的証拠としては、核濃縮、細胞質の好酸球増多症（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）、および細胞の崩壊が挙げられる。さらに、軸索腫脹は、損傷ニューロンの付近で、およびインパクト部位から大きく離れたところでも発生し得る。好中球がマクロファージの出現の前に現れる通常の過程の後に、損傷組織に対する炎症応答が起こる。
【００１４】
本発明の方法は、中枢神経系に対する外傷性損傷後の神経保護効果を生じることにおいて用途を見出す。中枢神経系損傷（すなわち、神経変性）の程度を定量し、神経損傷が、プロゲステロンまたはプロゲステロン代謝産物の投与後に処置または予防されたか否かを決定するための方法は、当該分野で周知である。このような神経保護効果は、例えば、外傷性脳損傷後の行動回復および形態回復を促進する（すなわち、組織生存性を増強する）ことによって、種々のレベルでアッセイされ得る。壊死、アポトーシスおよび神経グリア修復に対するプロゲスチン代謝産物の効果を決定するための種々の解剖学的アッセイ、免疫細胞化学的アッセイおよび免疫学的アッセイは、当該分野で公知である。よって、本発明の方法から生じる神経保護は、コントロール群と比較して、神経生存および／または行動回復において少なくとも約１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜６０％、６０％〜８０％またはそれ以上の増大を生じる。
【００１５】
ニューロン生存における増大のための組織学的アッセイおよび分子マーカーアッセイは公知である。例えば、増殖関連タンパク質４３（ＧＡＰ−４３）は、ＣＮＳ損傷後の新たな軸索増殖についてのマーカーとして使用され得る。例えば、Ｓｔｒｏｅｍｅｒら（１９９５）  Ｓｔｒｏｋｅ  ２６：２１３５−２１４４、Ｖａｕｄａｎｏら（１９９５）Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｒｏｓｃｉ  １５：３５９４−３６１１を参照のこと。他の組織学的マーカーとしては、大膠細胞症および小膠細胞症の減少が挙げられ得る。あるいは、細胞死の遅延は、損傷組織においてＴＵＮＥＬ標識を用いてアッセイされ得る。神経保護の増大を決定するために使用され得るさらなる解剖学的尺度は、プロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物が、一般に、特定の細胞型（例えば、コリン作動性細胞）またはニューロンを優先的に保護するか否かを決定するために、特定のニューロン細胞型を計数することを包含する。
【００１６】
さらに、行動アッセイは、処置に応答した、行動回復の速度および程度を決定するために使用され得る。患者の運動能力、空間学習能力、認知機能、感覚認知、会話の改善および／または癲癇の傾向の減少もまた、神経保護効果を測定するために使用され得る。このような機能的／行動試験は、感覚運動および反射機能を評価するために使用され、その試験は、例えば、Ｂｅｄｅｒｓｏｎら（１９８６）  Ｓｔｒｏｋｅ  １７：４７２−４７６、ＤｅＲｙｃｋら（１９９２）  ５７３：４４−６０、Ｍａｒｋｇｒａｆら（１９９２）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７５：２３８−２４６、Ａｌｅｘｉｓら  （１９９５）Ｓｔｒｏｋｅ  ２６：２３３６−２３４６（これらの全ては、本明細書に参考として援用される）に記載される。ニューロンの生存の増強はまた、スカンジナビアンストロークスケール（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｃａｌｅ）（ＳＳＳ）またはＢａｒｔｈｌ指数を使用して測定され得る。行動回復は、ＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ  Ｈｅａｄ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓの小委員会の推奨を用いてさらに評価され得る（Ｈａｎｎａｙら（１９９６）  Ｊ．Ｈｅａｄ  Ｔｒａｕｍａ  Ｒｅｈａｂｉｌ．１１：４１−５０（これは、本明細書に参考として援用される））。行動回復は、例えば、Ｂｅａｕｍｏｎｔら（１９９９）  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｒｅｓ．２１：７４２−７５４；Ｂｅｃｋｅｒら（１９８０）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００：０７−３２０；Ｂｕｒｅｓｏｖら（１９８３）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｓｉｃ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ；Ｋｌｉｎｅら（１９９４）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．４８：７７３−７７９；Ｌｉｎｄｎｅｒら（１９９８）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １５：１９９−２１６；Ｍｏｒｒｉｓ（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１：４７−６０；Ｓｃｈａｌｌｅｒｔら（１９８３）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８：７５３−７５９に記載される得方法を用いてさらに評価され得る。
【００１７】
ＣＮＳに対する外傷性損傷は、神経変性の程度および割合に影響を及ぼす多数の生理学的事象、よって損傷の最終的な臨床結果を生じることが認識されている。ＣＮＳに対する外傷性損傷の処置は、本発明によって規定されるように、最初のインパクトの後に起こる、種々の生理学的事象のうちの１種以上における任意の軽減および／または予防を包含する。従って、本発明の方法は、中枢神経系に対する外傷性損傷の後に神経変性をもたらす生理学的事象における使用を見出す。
【００１８】
例えば、脳水腫は、ＣＮＳに対する外傷性損傷の後に頻繁に発生し、そしてこれは、死亡および障害の主な原因である。皮質性挫傷は、例えば、脳組織中の水分含有量の大量増加を生じ、このことは、次いで、頭蓋圧力増大を引き起こし得、脳血流の減少およびさらなる神経喪失をもたらし得る。よって、本発明の方法は、ＣＮＳに対する外傷性損傷後の脳水腫の軽減および／もしくは除去、ならびに／または水腫の事象の持続を軽減することにおける使用を見出す。水腫の軽減を決定するためのアッセイは、当該分野で公知であり、プロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物の投与後の組織水分含有量の減少（Ｂｅｔｚら（１９９０）Ｓｔｒｏｋｅ  ２１：１１９９−２０４（これは、本明細書に参考として援用される））が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、行動回復における全体的な改善はまた、水腫の減少についての尺度として使用され得る。少なくとも約１５％〜３０％、約３０％〜４５％、約４５％〜６０％、約６０％〜約８０％または約８０％〜９５％またはそれ以上の水腫の、もたらされた組織における軽減は、治療的に有益であり、水腫の事象の持続における任意の減少もまた同様に有益である。
【００１９】
外傷性脳損傷後の血管原性水腫（ｖａｓｏｇｅｎｉｃ  ｅｄｅｍａ）は、脈管構造に対する損傷および血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊と関連していた（Ｄｕｖｄｅｖａｎｉら（１９９５）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １２：６５−７５（本明細書に参考として援用される））。プロゲステロンは、インビトロで、高分子に対するＢＢＢの透過性を減少させることが示されたが、イオン（例えば、ナトリウムイオン）に対しては示されなかった（Ｂｅｔｚら  （１９９０）Ｓｔｒｏｋｅ  ２１：１１９９−２０４；Ｂｅｔａら（１９９０）  Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ．Ｓｕｐｐｌ．５１：２５６−８（これらはともに、本明細書に参考として援用される））。従って、本発明の方法は、外傷性脳損傷の後に起こる血管原性水腫を軽減または排除することにおける使用を見出す。血管原性水腫の減少を決定するためのアッセイは、当該分野で公知であり、例えば、皮質挫傷後のエバンス-ブルー管外遊出の減少が挙げられる（Ｒｏｏｆら（１９９４）  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：９１（本明細書に参考として援用される））。
【００２０】
外傷性脳損傷のさらなる生理学的影響としては、免疫応答が挙げられる。例えば、Ｓｏａｒｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：８２２３−３３；Ｈｏｌｍｉｎら（１９９５）  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ．１３２：１１０−９；Ａｒｖｉｎら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．２０：４４５−５２を参照のこと。皮質へのインパクトの後に、インパクト部位、および損傷の最初の部位から遠位の領域において重篤な炎症反応および神経膠症が起こる。その炎症応答は、脈管表面上の接着分子の発現（これは、免疫細胞の接着およびその後の脳実質への管外遊出を生じる）によって特徴づけられる。サイトカインを放出することによって、浸潤するマクロファージおよび好中球は、反応性星状細胞増加症を刺激する。他の細胞型による異なるケモカインの放出は、これらの免疫細胞がフリーラジカルおよび炎症促進性化合物（例えば、サイトカイン、プロスタグランジン、および興奮毒）の同時放出により食細胞になるように誘導する（Ａｒｖｉｎら（１９９６）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｆ．２０：４４５−５２；Ｒａｉｖｉｃｈら  （１９９６）Ｋｅｌｏ  Ｊ．Ｍｅｄ．４５：２３９−４７；Ｍａｔｔｓｏｎら．（１９９７）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２３：４７−６１（これらは全て、本明細書に参考として援用される））。
【００２１】
本発明の方法は、外傷性ＣＮＳ損傷の後に起こる炎症性免疫反応を軽減または排除するための手段を提供する。さらに、損傷後の炎症応答を軽減することによって、本発明のプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物は、脳腫脹および脳圧を実質的に低下させ、放出される神経毒物質（例えば、フリーラジカルおよび興奮毒）の量を低下させる。従って、ＣＮＳに対する外傷性損傷後の免疫／炎症性応答を軽減することによって、ニューロン生存および／または行動回復が増強される。
【００２２】
本発明のプロゲスチン代謝産物が、外傷性ＣＮＳ損傷の後に、抗炎症効果および免疫系に対する非特異的抑制効果を付与しているか否かを決定するために使用され得るアッセイとしては、例えば、インビトロでのサイトカイン誘導性の小グリア増殖の低下（Ｈｏｆｆｍａｎら（１９９４）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １１：４１７−３１；Ｇａｒｃｉａ−Ｅｓｔｒａｄａら  （１９９３）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６２８：２７１−８（これらはともに、本明細書に参考として援用される）；活性化マクロファージによる細胞毒性フリーラジカルの発生の減少（Ｃｈａｏら（１９９４）  Ａｍ．J．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：４３−５２；Ｒｏｂｅｒｔら  （１９９７）  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  １：４５３−６２；Ｋｅｌｌｙら  （１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３９：５５７−６１；Ｇａｎｔｅｒら（１９９２）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：２１８−３０（これらは全て本明細書に参考として援用される））；マクロファージによる誘導型一酸化窒素シンターゼの発現および一酸化窒素放出量の減少（Ｒｏｂｅｒｔら（１９９７）  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  １：４５３−６２；Ｍｉｌｌｅｒら  （１９９６）  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５９：４４２−５０（これらはともに、本明細書に参考として援用される））；ナチュラルキラー細胞活性を阻害する「プロゲステロン誘導性遮断因子（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）」の放出（Ｃｈｅｅｋら  （１９９７）  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１７−２０；Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏら（１９９７）  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９４−９；Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏら  （１９９６）  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：３４８−５１（これらは全て本明細書に参考として援用される））；脳損傷後のＧＦＡＰ陽性星状細胞の数の減少（これは二次的損傷が少ないことを示唆する）（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｓｔｒａｄａら  （１９９３）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６２８：２７１−８；Ｇａｒｃｉｅ−Ｅｓｔｒａｄａら  （１９９９）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１４５−５１；Ｃｈｅｅｋら（１９９７）  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１７−２０；Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏら  （１９９７）  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９４−９；Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏら（１９９６）  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：３４８−５１（これらはすべて本明細書に参考として援用される））；炎症性免疫細胞（ＯＸ４２陽性細胞）の数の減少；ＣｈＡＴ陽性かつＣＯＸ陽性ニューロンの喪失の低下；ＴＵＮＥＬ陽性かつＭｎＳＯＤ陽性ニューロンの数の減少；ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼおよびシトクロームオキシダーゼ活性の強度の増大が挙げられる。
【００２３】
さらに、外傷性脳損傷後の炎症性免疫反応の低下は、偽コントロール  対  プロゲスチン処置被験体における損傷後のサイトカインレベルを測定することによってアッセイされ得る。サイトカインは、炎症のメディエーターであり、脳損傷後に高濃度で放出される。炎症促進性サイトカイン（例えば、インターロイキン１−β、腫瘍壊死因子、およびインターロイキン６）のレベルおよび抗炎症性サイトカイン（例えば、インターロイキン１０およびトランスホーミング増殖因子−β）のレベルが、測定され得る。例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ｍＲＮＡシグナル強度を測定するために使用され得、ＥＬＩＳＡは、タンパク質レベルを決定するために使用され得る。さらに、異なる炎症性細胞型（例えば、反応性星状細胞、マクロファージおよび小グリア）についての組織学的分析は、炎症応答の低下を測定するために使用され得る。
【００２４】
本発明の方法はまた、外傷性脳損傷の後に起こる虚血を減少させるために使用され得る。虚血事象の減少についてのアッセイとしては、例えば、梗塞領域の減少、体重の好転、および改善した神経学的結果が挙げられる。
【００２５】
外傷性ＣＮＳ損傷の別の生理学的結果は、脂質過酸化の増大である。本発明の方法は、フリーラジカルによる損傷を軽減し、よって脂質過酸化を減少または排除することにおける使用を見出す。この効果は、内因性のフリーラジカル除去（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ）システムの増強を介して生じ得る。脳ホモジネートおよびミトコンドリアの両方における脂質過酸化の減少を測定するためのアッセイが、当該分野で公知であり、例えば、チオバルビツール酸法（Ｒｏｏｆら（１９９７）  Ｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．３１：１−１１；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（１９９３）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１５５：１５１−４；Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６：１８３６−４４；Ｖｅｄｄｅｒら（１９９９）７２：２５３１−８（これらは全て、本明細書に参考として援用される））および種々のインビトロフリーラジカル発生システムが挙げられる。さらに、重要なフリーラジカルスカベンジャー酵素のレベルの変化（例えば、ミトコンドリアグルタチオン）が、アッセイされ得る。例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（１９９３）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１５５：１５１−４；およびＶｅｄｄｅｒら  （１９９９）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７２：２５３１−８（これらはともに、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【００２６】
さらに、培養したサイトカイン刺激マクロファージは、亜硝酸、スーパーオキシド、および過酸化水素を発生させる。マクロファージは、外傷性脳損傷後４８時間〜７日間の間で非常に活性であることが公知であるので、これらの反応性細胞の減少は、ニューロンへの二次的な損傷を減少させる。例えば、Ｆｕｌｏｐら（１９９２）  ２２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８：１７８；Ｓｏａｒｅｓら（１９９５）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：８２２３−３３；Ｈｏｌｍｉｎら（１９９５）  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ  １３２：１１０−９（これらは全て本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【００２７】
本発明は、治療有効量のプロゲスチンまたはその誘導体を被験体に投与することによって、外傷性脳損傷を処置する方法を提供する。「治療有効量」とは、治療的効果を誘起するに十分である、プロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物の濃度を意味する。従って、本発明に従って投与される投薬単位のプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物の濃度は、ＣＮＳに対する外傷性損傷の後に起こる神経損傷の処置または予防において有効であり、よって、神経保護効果を誘起する。この治療有効量は、多くの要因（例えば、プロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物の比活性、外傷性損傷の重篤度およびパターン、生じたニューロン損傷、患者の応答、患者の体重、加えて他の個体内変動、投与方法、ならびに使用されるプロゲスチンまたはプロゲスチン処方物が挙げられる）に依存する。投与の効力、投薬量および経路を決定するための方法は、当業者に公知である。
【００２８】
本発明の方法において使用されるプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物は、無機性または有機性の、固体または液体の、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。このキャリアはまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、安定化剤、緩衝剤、溶媒および塩を含み得る。組成物は、安定化され得、そして固体、顆粒（ｐａｒｔｉｃｕｌａｎｔ）、または散剤、溶剤、懸濁液またはエマルジョンとして存在し得る。
【００２９】
このプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物は、薬学的に有用な組成物を（例えば，薬学的に受容可能なキャリアビヒクルと混合することによって）調製するために、公知の方法に従って処方され得る。適切なビヒクルおよびそれらの処方は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．（編），Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９８０））に記載される。有効な投与に適した薬学的に受容可能な組成物を形成するために、このような組成物は、単独で、または適切な量のキャリアビヒクルと一緒にかのいずれかで、有効量のプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物を含む。
【００３０】
本発明の薬学的に受容可能なキャリアは、薬物投与方法に依存して変動する。使用される薬学的キャリアは、例えば、固体か、液体か、または徐放性かのいずれかであり得る。代表的な固体キャリアは、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、微結晶性セルロース、ポリマー性ヒドロゲルなどである。代表的な液体キャリアとしては、糖蜜、落花生油、オリーブ油、シクロデキストリンおよび同様のエマルジョンが挙げられる。当業者は、一般に利用される投与法の各々についての適切なキャリアに精通している。さらに、プロゲスチンの総量または治療有効用量として投与されるプロゲスチンが、投与される薬学的組成物（すなわち、使用されているキャリア）および投与様式の両方に依存して変動することを認識する。
【００３１】
本発明の一実施形態は、約０．１ｎｇ〜約１００ｇ／ｋｇ体重、約１０ｎｇ〜約５０ｇ／ｋｇ体重、約１００ｎｇ〜約１ｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重；および約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量での非経口投与を介した、プロゲスチン代謝産物またはそのアナログの投与を提供する。あるいは、治療有効用量を達成するために投与されるプロゲスチン代謝産物の量は、約０．１ｎｇ／ｋｇ体重、１ｎｇ／ｋｇ体重、１０ｎｇ／ｋｇ体重、１００ｎｇ／ｋｇ体重、１μｇ／ｋｇ体重、１０μｇ／ｋｇ体重、１００μｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、２ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、４ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、６ｍｇ／ｋｇ体重、７ｍｇ／ｋｇ体重、８ｍｇ／ｋｇ体重、９ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、１１ｍｇ／ｋｇ体重、１２ｍｇ／ｋｇ体重、１３ｍｇ／ｋｇ体重、１４ｍｇ／ｋｇ体重、１５ｍｇ／ｋｇ体重、１６ｍｇ／ｋｇ体重、１７ｍｇ／ｋｇ体重、１８ｍｇ／ｋｇ体重、１９ｍｇ／ｋｇ体重、２０ｍｇ／ｋｇ体重、３０ｍｇ／ｋｇ体重、４０ｍｇ／ｋｇ体重、５０ｍｇ／ｋｇ体重、６０ｍｇ／ｋｇ体重、７０ｍｇ／ｋｇ体重、８０ｍｇ／ｋｇ体重、９０ｍｇ／ｋｇ体重、１００ｍｇ／ｋｇ体重、５００ｍｇ／ｋｇ体重以上である。
【００３２】
本発明のプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物の投与は、当該分野で公知の多くの方法によって行われ得る。本発明は、用量投与の全ての形態を包含し、その形態としては、全身注射、非経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、口内投与、皮下投与および脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、このプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物は、任意の脳室内での手技（例えば、脳室外注射（ｌａｔｅｒａｌ  ｃｅｒｅｂｒｏ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腰椎穿刺または患者の脳室内に外科的に挿入されたシャントが挙げられる）によって、脳室液（ｂｒａｉｎ  ｆｌｕｉｄ）または脳脊髄液に直接投与され得る。投与方法は、投薬（ｄｏｓｅ）によって、または徐放性ビヒクルによって行われ得る。
【００３３】
本発明の方法は、いかなる理論にも拘束されないが、外傷性ＣＮＳ損傷は、血液脳関門をより透過性にして、通常は血液脳関門を横断しない高分子を侵入させて、脳脊髄液の中に入ることを可能にし得ると考えられる。ＣＮＳ損傷を処置するための神経栄養因子の静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与および皮下投与の例については、例えば、米国特許第５，７３３，８７１号およびＷＯ  ９７／２１４４９号（これらはともに本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００３４】
さらなる薬学的方法は、作用の持続時間を制御するために使用され得る。制御放出調製物は、プロゲスチン代謝産物を複合体化するかまたは吸収するためにポリマーを使用することによって達成され得る。制御送達は、適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−ビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン）を選択することによって行われ得る。薬物放出の速度はまた、このような高分子の濃度を変化させることによって制御され得る。
【００３５】
作用の持続時間を制御するための別の考えられる方法は、上記治療剤をポリマー物質（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマー）の粒子に組み込むことを包含する。あるいは、例えば、コアセルべーション技術によって、または界面重合によって、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルまたはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルの使用によって、またはコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、またはマクロエマルジョンにおいて）において、治療剤を調製されたマイクロカプセルの中に捕捉することが可能である。このような教示は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）において開示されている。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態において、少なくとも１つのさらなる神経保護因子は、外傷性ＣＮＳ損傷後の神経保護を増強するために、プロゲスチン代謝産物と組み合わせられ得る。このような因子としては、そのプロゲスチン誘導体の任意の組み合わせが挙げられる。目的の他の神経保護因子としては、例えば、グルタメート興奮毒性を減少し、ニューロン再生を高める化合物が挙げられる。このような因子は、増殖因子を含む群から選択され得るが、これらに限定されない。「増殖因子」とは、細胞を刺激して成長または増殖させる細胞外ポリペプチドシグナル伝達分子を意味する。好ましい増殖因子は、広い範囲の細胞型が応答する増殖因子である。神経栄養性増殖因子の例としては、線維芽細胞増殖因子ファミリーメンバー（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ａｂｒａｈａｍら（１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：５４５−４８）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）（Ｊａｙｅら．（１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：５４１−４５）、ｈｓｔ／Ｋｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ−３（Ｄｉｃｋｓｏｎら．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２６−８３３）、ＦＧＦ−４（Ｚｈａｎら．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３４８７−３４９５）、ＦＧＦ−６（ｄｅＬａｐｅｙｒｉｅｒｅら．（１９９０）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：８２３−８３１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）（Ｆｉｎｃｈら．（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：７５２−７５５）、およびアンドロゲン誘導性増殖因子（ＡＩＧＦ）（Ｔａｎａｋａら  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８９２８−８９２３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
さらなる神経保護因子としては、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）（Ｓｅｉｌｅｒ，Ｍ．（１９８４）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３００：３３−３９；Ｈａｇｇ  Ｔ．ら（１９８８）  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １０１：３０３−３１２；Ｋｒｏｍｅｒ  Ｌ．Ｆ．（１９８７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：２１４−２１６；およびＨａｇｇ  Ｔ．ら．（１９９０）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １０（９）：３０８７−３０９２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｋｉｐｒｉａｎｏｖａ，Ｉ．ら．（１９９９）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５６：２１−２７）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、トランスホーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）（Ｈｅｎｒｉｃｋ−Ｎｏａｃｋ，Ｐ．ら（１９９６）  Ｓｔｒｏｋｅ  ２７：１６０９−１４）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２）（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ａ．ら（１９９９）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７２：２２６４−７１）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｈ．ら（１９９９）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８９：６４３−７）、活動依存性神経栄養因子（ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）（ＡＤＮＦ）（Ｚａｍｏｓｔｉａｎｏ，Ｒ．ら（１９９９）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔｅｒ  ２６４：９−１２）、サイトカイン白血球阻害因子（ＬＩＦ）（Ｂｌｅｓｃｈ，Ａ．ら（１９９９）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：３３５６−６６）、オンコスタチンＭ、インターロイキン、ならびにインスリン様増殖因子１および２が挙げられる。
【００３８】
他の形態の神経保護性治療剤としては、例えば、クロメチアゾール（Ｚｅｎｄｒａ）（Ｍａｒｓｈａｌ，Ｊ．Ｗ．ら（１９９９）  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒａｌ．１５６：１２１−９）；キヌレン酸（ＫＹＮＡ）（Ｓａｌｖａｔｉ，Ｐ．ら（１９９９）  Ｐｒｏｇ  Ｎｅｒｕｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２３：７４１−５２）、Ｓｅｍａｘ（Ｍｉａｓｏｅｄｏｖａ，Ｎ．Ｆ．ら（１９９９）  Ｚｈ  Ｎｅｖｒｏｌ  Ｐｓｉｋｈｉａｔｒ  Ｉｍｓｓ  Ｋｏｒｓａｋｏｖａ  ９９：１５−１９）、ＦＫ５０６（タクロリムス）（Ｇｏｌｄ，Ｂ．Ｇ．ら（１９９９）  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８９：１２０２−１０）、Ｌ−スレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ，Ｊ．ら（１９９８）  Ａｃｔ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｐｏｌ  ４５：４７９−９２）、アンドレノコルチコトロピン−（４−９）アナログ（ＯＲＧ  ２７６６）およびディゾルシピン（ｄｉｚｏｌｃｉｐｉｎｅ）（ＭＫ−８０１）（Ｈｅｒｚ，Ｒ．Ｃ．ら（１９９８）  Ｅｕｒ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３４６：１５９−６５）、大脳インターロイキン−６）（Ｌｏｄｄｉｃｋ，Ｓ．Ａ．ら（１９９８）  Ｊ．Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  １８：１７６−９）、セレギリン（Ｓｅｍｋｏｖａ，Ｉ．ら（１９９６）  Ｅｕｒ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３１５：１９−３０）、ＭＫ−８０１（Ｂａｒｔｈ，Ａ．ら（１９９６）  Ｎｅｕｒｏ  Ｒｅｐｏｒｔ  ７：１４６１−４；グルタメートアンタゴニスト（例えば、ＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ８０１（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｗ．Ａ．ら（１９９９）  Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６７：１８７１−３）、ＧＶ１５０５２６（Ｄｙｋｅｒ，Ａ．Ｇ．ら（１９９９）  Ｓｔｒｏｋｅ  ３０：９８６−９２））；ＡＭＰＡアンタゴニスト（例えば、ＮＢＱＸ（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｗ．Ａ．（１９９９）ら．Ａｒａｎ．Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６７：１８７１−３）、ＰＤ１５２２４７（ＰＮＱＸ）（Ｓｃｈｉｅｌｋｅ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９９）  Ｓｔｒｏｋｅ  ３０：１４７２−７）、ＳＰＤ  ５０２（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｅ．Ｏ．ら（１９９９）  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｒｉｅｒ  ２８９：１４９２−５０１）、ＬＹ３０３０７０およびＬＹ３００１６４（Ｍａｙ，Ｐ．Ｃ．ら（１９９９）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ  ２６２：２１９−２２１））が挙げられる。
【００３９】
本発明のプロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物が、他の薬学的に活性な因子（すなわち、他の神経保護因子）と共同して投与される場合、ましてやプロゲスチン代謝産物は治療上有効であり得る。上記プロゲスチン代謝産物は、１日に１回または１日に数回投与され得る。処置の継続時間は、２週間から３週間の期間にわたって１日１回であり得、数ヶ月またはさらには数年の期間にわたって継続され得る。一日の用量は、個々の投薬単位もしくはいくつかのより小さな投薬単位の形態において単一用量で、または特定の間隔でより小さく分けられた投薬量の複数回の投与によって、投与され得る。
【００４０】
例えば、投薬単位は、損傷後、０時間〜１時間、１時間〜２４時間または２４時間〜少なくとも１００時間で投与され得る。あるいは、上記投薬単位は、損傷後、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３０時間、４０時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、またはそれ以上で投与され得る。その後の投薬単位は、治療効果が達成されるように、最初の投与後任意の時間で投与され得る。例えば、さらなる投薬単位は、損傷後最初の数日を超えて起こり得る水腫の第２波から被験体を保護するために投与され得る。
【００４１】
上記プロゲスチンまたはプロゲスチン代謝産物は、それ自体で投与されてもよいし、薬学的に受容可能な塩の形態で投与されてもよい。医薬において使用される場合、上記プロゲスチン代謝産物の塩は、薬理学的かつ薬学的に受容可能であるべきであるが、非薬学的に受容可能な塩は、遊離の活性化合物またはその薬学的に受容可能な塩を調製するために都合よく使用され得、本発明の範囲から除外されない。このような薬理学的かつ薬学的に受容可能な塩は、プロゲスチン代謝産物と有機酸または無機酸との反応によって、文献中に詳述される標準的方法を使用して調製され得る。薬学的に受容可能な塩の例は、生理学的に受容可能なアニオン（例えば、トシル酸塩（ｔｏｓｇｌａｔｅ）、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩などから形成される有機酸塩である。無機酸塩は、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸水素酸塩および炭酸塩から形成され得る。また、薬学的に受容可能な塩は、カルボン酸基のアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩）として調製され得る。
【００４２】
従って、本発明はまた、プロゲスチン代謝産物またはその薬学的に受容可能な塩を、１種以上のその薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて任意の他の治療的成分（例えば、他の神経栄養因子）とともに含む、脊椎動物医療用途およびヒト医療用途の両方のための薬学的処方物または組成物を提供する。上記キャリアは、上記処方物の他の成分と適合性でありかつそのレシピエントに対して過度に有害でないという意味で、薬学的に受容可能でなければならない。
【００４３】
上記組成物は、経口投与、直腸投与、局所投与、経鼻投与、眼科的投与、または非経口投与（腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、または筋肉内注射が挙げられる）について適したものを包含する。上記組成物は、都合よく単位投薬形態において提示されてもよいし、薬学分野で周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。全ての方法は、上記活性な因子を、１種以上の補助成分を構成するキャリアと合わせる工程を包含する。一般に、上記組成物は、上記活性化合物を液体キャリア、微細に分割された固体キャリアまたはその両方と均一かつ完全に合わせ、次いで、必要であれば、その生成物を所望の処方物に形作ることによって調製される。
【００４４】
経口投与に適している本発明の組成物は、別個の単位（例えば、カプセル剤、カシェ剤、錠剤、ロゼンジなど）として提示され得、各々は、所定量の活性な因子を、粉末もしくは顆粒；または水性液体もしくは非水性液体における懸濁液（例えば、シロップ、エリキシル、エマルジョン、水薬（ｄｒａｕｇｈｔ）などとして含む。
【００４５】
錠剤は、圧縮または成形によって、必要に応じて、１種以上の補助成分とともに製造され得る。圧縮錠剤は、適切な機械において、自由に流動する形態（例えば、粉末または顆粒）にある活性化合物（必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤、または分散剤と混合される）とともに圧縮することによって、調製され得る。適切なキャリアとともに構成される成形錠剤は、適切な機械において成形することによって作製され得る。
【００４６】
シロップは、上記活性化合物を糖（例えば、スクロース）の濃縮水溶液（この溶液に、任意の補助成分もまた添加され得る）に添加することによって製造され得る。このような補助成分としては、矯味矯臭剤、適切な保存剤、上記糖の結晶化を遅らせる薬剤、および任意の他の成分の溶解度を増大させる薬剤（例えば、多価アルコール（例えば、グリセロールまたはソルビトール））が挙げられ得る。
【００４７】
非経口投与に適した処方物は、都合よく、活性化合物の滅菌水性調製物（これは、レシピエントの血液と等張性であり得る）を含み得る。
【００４８】
経鼻スプレー処方物は、保存剤および等張剤とともに、上記活性な因子の精製水溶液を含む。このような処方物は、好ましくは、鼻粘膜と適合するｐＨおよび等張状態に合わせられる。
【００４９】
直腸投与のための処方物は、適切なキャリア（例えば、カカオ脂）、または硬化脂もしくは水素付加脂肪性カルボン酸を用いた坐剤として提示され得る。
【００５０】
眼科用処方物は、ｐＨおよび等張性因子が好ましくは眼のものにマッチするように調製されることを除いて、経鼻スプレーに類似した方法によって調製される。
【００５１】
局所用処方物は、１種以上の媒体（例えば、鉱油、石油（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）、ポリヒドロキシアルコールまたは局所用処方物のために使用される他の基剤）中に溶解または懸濁された活性化合物を含む。上記のような他の補助成分の添加が望ましい。
【００５２】
さらに、本発明は、プロゲスチン代謝産物およびその塩のリポソーム処方物を提供する。リポソーム懸濁液を形成するための技術は、当該分野で周知である。上記プロゲスチン代謝産物またはその塩が、水溶性の塩である場合、従来のリポソーム技術を使用して、上記プロゲスチン代謝産物またはその塩は、脂質小胞に組み込まれ得る。このような場合において、その化合物または塩の水への溶解度に起因して、上記化合物または塩は、リポソームの親水性中心またはコア内に実質的に混入される。上記使用される脂質層は、任意の従来の組成であり得、そしてコレステロールを含んでいてもよいし、コレステロールを含んでいなくてもよい。目的の化合物またはその塩が、水に不溶性である場合、従来のリポソーム形成技術をさらに使用して、その塩は、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に実質的に混入され得る。いずれの場合においても、製造される上記リポソームは、標準的な超音波処理技術およびホモジナイゼーション技術の使用を介するのと同様に、サイズが減少され得る。プロゲステロン代謝産物またはその塩を含むリポソーム処方物は、リポソーム懸濁液を再生するために薬学的に受容可能なキャリア（例えば、水）で再構成され得る凍結乾燥物を製造するために凍結乾燥され得る。
【００５３】
薬学的処方物がまた提供され、これは、エアロゾルとして、吸入によって投与するために適している。これらの処方物は、望ましいプロゲスチン代謝産物またはその塩あるいはその化合物または塩の複数の固体粒子の溶液または懸濁液を含む。その望ましい処方物は、小さなチャンバ中に入れられて霧状にされ得る。霧状化は、その化合物もしくは塩を含む複数の液滴または固体粒子を形成するために、圧縮空気によるかまたは超音波エネルギーによって達成され得る。
【００５４】
上記の成分に加えて、本発明の組成物は、希釈剤、緩衝化剤、矯味矯臭剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、濃化剤、滑沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）などからなる群より選択される、１種以上の補助成分をさらに含み得る。
【００５５】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示目的でのみ本明細書中に含められ、別段特定されない限り、本発明の限定として解釈されるべきではない特定の具体例に言及することによってよりよく理解される。
【００５６】
（実験）
（実施例１：損傷後水腫を減少することにおけるプロゲステロン代謝産物の有効性）
手術：
空気式インパクターデバイス（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を使用する内側前頭皮質（ＭＦＣ）への挫傷を生成した。動物を、ネンブタール（５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ）を注射することによって麻酔し、身体の中心温度を恒温加熱ブランケットシステムで維持しながら、定位装置の中に配置した。無菌技術を使用して、正中切開を頭皮において行い、頭蓋を曝すために、膜（ｆａｓｃｉａ）を引っ込めた。
【００５７】
中心から両側性の開頭術（ｃｅｎｔｅｒｅｄ，ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｃｒａｎｉｏｔｏｍｙ）を、６ｍｍ直径の穿頭器を使用してブレグマから３ｍｍ前方に行った。骨を除去した後、インパクターの先端を、ＡＰ：３．０；ＭＬ：０．０へと動かし、適切な隙間（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）についてチェックし、その持ち上げた位置に引っ込め、３．５ｍｍ  ＤＶに下げ、皮質２ｍｍを貫通するようにした。挫傷を、脳接触時間０．５秒で、２．２５ｍ／ｓの速度で作成した。この手順の後に、創傷空洞（ｗｏｕｎｄ  ｃａｖｉｔｙ）を完全に清浄にし、膜および頭皮を縫合して閉じる前に、全ての出血を止めた。全ての実験において、ラット群の正体を、行動試験および後の組織学検査の間の実験の偏りを避けるために手術および処置に関してコード化した。
【００５８】
注射（プロゲステロン、アロプレグナノロン、およびエピプレグナノロン）によって与えられる全ての実験的処置を、溶媒として２−ヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリン（ＨＢＣ；Ｈ２Ｏ中４５％  ｗ／ｖ  溶液）を用いてストック溶液で行った。次いで、これらの実験溶液を、２２．５％のＨＢＣ最終濃度になるように滅菌水で１：１に希釈した。
【００５９】
（皮質インパクトの後の組織変化（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）：）
ＭＦＣに対する皮質インパクト損傷は、一定範囲の組織変化を生じる。例えば、インパクトの部位において、大きな壊死空洞が、損傷後７日目までに形成する。大膠細胞症および小膠細胞症が、損傷後約７２時間で開始し、損傷後約７日間でピークに達する（Ｆｕｌｏｐら．（１９９２）  ２２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８：１７８（これは本明細書中に参考として援用される））。損傷後１８日間までに、重篤な神経膠症が付随する、視床（背内側視床核、腹内側視床核、および腹外側視床核）における有意な細胞損失が存在する（Ｈｏｆｆｉｎａｎら．（１９９４）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １１：４１７−３１（本明細書中に参考として援用される）。同時に、前脳基底部におけるコリン作用性大細胞核（基底核大型細胞（ｎｕｃｌｅｕｓ  ｂａｓａｌｉｓ  ｍａｇｎｏｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）；ＮＢＭ；大脳皮質へのコリン作動性入力の唯一の供給源）はまた、コリンアセチルトランスフェラーゼ陽性細胞およびニッスル染色細胞の両方の有意な喪失を示す（Ｈｏｆｆｉｎａｎら．（１９９７）  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１１：１−１２（本明細書中に参考として援用される））。結果は、遅延した細胞死が、海馬のＣＡ１層およびＣＡ３層両方においてＴＵＮＥＬ標識することによって明らかにされるように、損傷後数日間に生じていることを示す。そのデータは、これら細胞の形態が顆粒ニューロンの形態に似ていることを示すようである。
【００６０】
群割り当ておよび薬物処置：
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（手術時に約９０日齢）を使用した。ラットを、１２：１２の明暗サイクルで個々のケージ中で飼育した。飼料および水は、実験の間中、自由給餌とした。コントロールラットには、偽手術を受けさせ、残りには、一般的方法において記載されるように、正中前頭皮質挫傷を受けさせた。偽手術したコントロールには、ビヒクル（シクロデキストリン）を与えた。挫傷を与えたラットを、コントロール（ビヒクル）、プロゲステロン（４ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ）、アロプレグナノロン（４ｍｇ／ｋｇ  Ｓｉｇｍａ）、またはエピプレグナノロン（４ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ）に無作為に割り当てた。処置を、挫傷を生成して１時間後に開始した。プロゲステロン、アロプレグナノロン、およびエピプレグナノロンを、最初に腹腔内に与えて、迅速な吸収を確実にした。その後、より逐次的である吸収のために、損傷の６時間後に２回目の皮下注射を与えた。コントロールラットは、同じ経路でかつ同時にビヒクルの注射を受ける。ラットを、損傷後２４時間で殺傷した。この時点は、損傷後６時間と７２時間との間でピーク水腫が生じることを示す以前の研究に基づいて選択した。
【００６１】
水腫測定：
２時間、２４時間および７２時間で、ラットを麻酔し、断頭し、それらの脳を、頭蓋腔から素早く取り出した。臭球、脳幹、および小脳を取り出し、廃棄した。脳を、予め秤量したディッシュに配置し、サンプルの全体の重量を、測定した。次いで、脳を、プラスチック製の脳の型（Ｚｉｖｉｃ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｌａｂｓ）に入れ、前頭葉極を、インパクト領域を通る２つの等しく４ｍｍ厚の切片に解剖し、次いで、残りの脳組織から分離した。この２つの切片を、乾燥したゴム表面上に配置し、３ｍｍの生検組織パンチを、損傷皮質にすぐ隣接した皮質の組織サンプルを採取するために使用した。さらに、後頭皮質から２つのサンプルも回収し、アッセイした。各領域からのこの組織サンプルをプールし、以下のように含水量についてアッセイした：サンプルを、予め秤量した容器の中に入れ、蓋を締め、直後に、０．０００１ｇの単位まで秤量した。次いで、この容器の蓋を外し、真空オーブン中に置き、６０℃、０．３気圧で２４時間にわたって乾燥させた。次いで、この容器の蓋を再び締めて再度秤量し、乾燥重量パーセンテージおよび湿重量パーセンテージを得た。
【００６２】
結果：
損傷して２４時間後に、全ての損傷ラットは、偽手術より有意に大きい水腫を有した（ｐ＜０．０５）。アロプレグナノロン（３αＴＨＰ）は、ビヒクルのみを投与したラットと比較して、注射後２時間、２４時間および７２時間で試験したとき、脳水腫を有意に減少させた（図１）。プロゲステロンまたはエピプレグナノロンを与えた脳損傷ラットにおける水腫レベルは、損傷コントロールとアロプレグナノロン処置損傷ラットとの間の中間であった。図１を参照のこと。これらの実験において使用した実験物質のいずれも、回復の妨害ではないことが判明した；すなわち、処置の現在の用量／レジメンで観察された検出可能なネガティブな副作用は存在しなかった。これらのデータは、プロゲステロン代謝産物が、この比較的低用量において、脳水腫を減少することに対して中程度の効果を有することを示すように解釈され得る。
【００６３】
（実施例２：外傷性脳損傷後の行動回復に対するアロプレグナノロンの効果）
手術：
実施例１に記載されるように、ＭＦＣに対する挫傷を行った。
【００６４】
群割り当ておよび薬物処置：
成体雄性ラットに、ビヒクル（シクロデキストリン）、プロゲステロン、アロプレグナノロン、またはエピプレグナノロン（全て４ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの５回の注射を与えた。これらの注射を、腹腔内注射で損傷の１時間後に開始し、次いで、損傷の６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後および１２０時間後に皮下注射を繰り返した。
【００６５】
ＭＷＭ試験手順：
モリス水迷路（ＭＷＭ）は、不透明な水（２０±１℃、非毒性ＡｒｔｉｓｔａＴＭ  ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｔｅｍｐｕｒａ  ｐａｉｎｔ）を深さ６４ｃｍ（タンクの頂部から２３ｃｍ）まで満たした直径１３３ｃｍの円形タンクから構成した。プラットフォーム（１１ｃｍ×１１ｃｍ）を、深さ２ｃｍに沈め、北東４分円の中心においてプールの壁から約２８ｃｍに配置した。プラットフォームの位置は、実験の間中一定のままである。ＭＷＭ試験を、手術して７日後に開始した。各動物を、５日間ブロックを２回、合計１０日間試験した（１日あたり２回試験）。各試験の開始時に、実験者は、４つのスタート位置のうちの１つにおいてプールの中へラットを入れ、同時に、コンピューターインターフェースカメラ追跡システムを作動させた。各ラットを、プラットフォームに達するまでまたは９０秒間過ぎるまでプール中で泳がせた。ラットが９０秒間のうちにプラットフォームを見つけられなかった場合、ラットを物理的にプラットフォームに導いた。一旦ラットがプラットフォームを見いだしたら、２０秒間そこに放置し、次いで、２０秒間の試験間インターバルの間、プールから出した。次いで、各ラットを、別のスタート地点においてプールに入れ、上記の手順を繰り返した。各ラットの能力を、プラットフォームへの潜時、プラットフォームまでの経路の長さ、および水泳戦略（ｓｗｉｍ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）（すなわち、外側環対内側環において過ごす合計時間のパーセント）に関して測定した。
【００６６】
結果：
水迷路についての学習曲線を、アロプレグナノロンの投与が学習速度を変化させたか否かを決定するために、各学習曲線の傾きを比較することによって測定する。アロプレグナノロンを与えられたラットは、試験の最後の３ブロック（各ブロックは、２日間の試験に等しい）にビヒクルを与えた損傷ラットより有意に優れていた。図２を参照のこと。試験の全ての日に、アロプレグナノロンを与えた群は、本発明者らが試験した他の郡よりもよい空間的学習課題に関してよりよい能力スコアを有した。具体的には、対数回帰は、アロプレグナノロン処置群の傾きが、ビヒクルのみを受けた損傷ラットのもののほぼ２倍であったことを実証した。このことは、アロプレグナノロンで処置した損傷ラットは、ビヒクルのみを受けた損傷ラットの速度のほぼ２倍の速度で学習したことを示す。これらの結果は、アロプレグナノロンの４ｍｇ／ｋｇ注射による５日間の処置が、ラットにおける前頭皮質の重篤な両側性挫傷の後の行動回復を高めたことを示すように解釈され得る。従って、アロプレグナノロンを与えた両側性前頭皮質挫傷を有するラットは、未処置コントロールよりも急速に空間的水路課題を学習した。
【００６７】
神経細胞数と行動との間の関係を決定するために、ニューロンおよびグリアの数を計数して、これら細胞の生存と行動能力との間の相関関係を決定した（図３）。具体的には、基底核大型細胞におけるＣＨＡＴ陽性細胞の数の組織学的分析によって、アロプレグナノロン処置ラットが、未処置コントロールよりもこの構造物において残っている生存ニューロンが多いことが明らかになった。図３を参照のこと。自発的運動行動における差異も、壊死空洞サイズにおいても差異は見いだされなかった。
【００６８】
（実施例３：アロプレグナノロンが炎症性免疫反応を減少させる能力）
損傷に対する炎症応答を減少することによって、脳腫脹および頭蓋内圧の実質的低下が結果として起こり得る。炎症性免疫応答を減少することの別の結果は、より少ない神経毒性物質（例えば、フリーラジカルおよび興奮毒（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｎｓ））が放出されることである。免疫細胞からの神経毒の放出を減少させることは、酸化的ストレスを減少させることにより、外傷性脳損傷後のより大きな神経生存および行動回復を生じる。
【００６９】
（Ｉ．ＴＢＩ後のｍＲＮＡ炎症性サイトカインの増加）
本発明者らは、プロゲステロンおよびその代謝産物アロプレグナノロンが、脳水腫を減少させ、外傷性脳損傷の齧歯類モデルにおいて空間動作を改善することを示したが、回復をもたらす具体的な機構は未知である。しかし、本発明者らは、水腫および細胞喪失に加えて、ＴＢＩが、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα）の有意な増大をもたらし、次に、脳水腫および神経細胞死に寄与することを認識している。近年、プロゲステロンおよびアロプレグナノロンは、炎症性サイトカインの放出を立証することによってインビトロで細胞死を防ぐことを示した。この実験を、プロゲステロンまたはアロプレグナノロンの投与が、ＴＢＩ後にＩＬ−１βおよびＴＮＦαの発現に影響を与え得るか否かを決定するために設計した。
【００７０】
手順：
成体雄性ＳＤラットに、両側性の前頭葉前部皮質挫傷または偽手術のいずれかを与えた。神経ステロイド注射を、挫傷の１時間後および６時間後に与え、損傷後最大５日間連続で１日に１回継続した。損傷の３時間後、８時間後、１２時間後および６日間後に、ラットを殺傷し、それらの脳を、ｍＲＮＡ抽出のために処理した。ＩＬ−１βおよびＴＮＦαについてのｍＲＮＡの発現を、リアルタイム定量ＰＣＲを使用して評価した。
【００７１】
結果：
この研究からの結果は、損傷して３時間後および６日間後に、プロゲステロンおよびアロプレグナノロンがＩＬ−１βおよびＴＮＦαの発現を減少したことを示す。図３および図４を参照のこと。アロプレグナノロン（しかしプロゲステロンではない）は、損傷して８時間後にＩＬ−１β発現を高め（図４）、損傷して１２時間後にＴＮＦα発現を高めた（図３）。本発明者らの知見は、プロゲステロンおよびアロプレグナノロンが、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの発現を妨げないが、その処置は、これら炎症性サイトカインの合成および活性レベルを遅らせることを示唆するように解釈され得る。このような作用は、中程度から重篤な外傷性脳損傷にしばしば付随する病状および行動徴候学を有意に減少することができた。
【００７２】
ＩＩ．損傷ラットにおける提唱される処置に伴う、この実験において達成されるべきさらなる技術的目的は、以下である：１）炎症性免疫細胞（ＯＸ４２陽性細胞）および星状細胞（ＧＦＡＰ陽性細胞）の数を減少させること；２）ＣｈＡＴ陽性ニューロンおよびＣＯＸ陽性ニューロンの喪失を減少させること；３）ＴＵＮＥＬ陽性ニューロンおよびＭｎＳＯＤ陽性ニューロンの数を減少させること；そして４）スクシネートデヒドロゲナーゼおよびシトクロームオキシダーゼ活性の強さを増すこと。
【００７３】
Ａ．群割り当ておよび薬物処置：
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（研究の開始時に約９０日齢）を使用する。ラットは、１２：１２の明暗スケジュールで吊り下げラックに取り付けたケージ中で個々に飼育し、実験の間中、飼料および水を自由給餌で入手できるようにする。手術前に、ラットを、偽挫傷群または挫傷群のいずれかに割り当てる。次いで、両方の群を、コントロール条件（ビヒクル）またはプロゲステロン条件（４ｍｇ／ｋｇ）またはアロプレグナノロン（４ｍｇ／ｋｇ）またはエピプレグナノロン（４ｍｇ／ｋｇ）のいずれかおよび生存期間（６時間、２４時間、７２時間、７日間、１４日間、および２８日間）に無作為に割り当てる。手術および薬物プロトコルは、実施例１に記載される手順に従う。
【００７４】
Ｂ．組織学：
所定の生存期間において、動物を殺傷し、それらの脳を本明細書中に記載されるように組織学用に処理した。両方の実験は、同じラットからの隣接した切片を使用する；９個の連続切片を、各ラットの脳から回収する。５つの異なるシリーズを、ＭｎＳＯＤ、シトクロームオキシダーゼサブユニットＩＶ、ＣｈＡＴ、ＯＸ４２、およびＧＦＡＰに対する抗体で染色する。２つのシリーズは、スクシネートデヒドロゲナーゼまたはシトクロームオキシダーゼのいずれかについての組織化学的反応を受ける。１つのシリーズは、ＴＵＮＥＬ法の後にインサイチュハイブリダイゼーションを受ける。最後のシリーズは、チオニンによる全体細胞の計数のために残しておく。
【００７５】
Ｃ．免疫組織化学
生存性大型細胞ニューロンの標識のために、ＣｈＡＴに対する抗体（モノクローナル抗体；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｒｍｈｅｉｍ）、ＭｎＳＯＤに対する抗体（ポリクローナル抗体；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、およびシトクロームオキシダーゼサブユニットＩＶに対する抗体（モノクローナル抗体；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、使用する。反応性星状細胞、小膠細胞／マクロファージの標識のために、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体（モノクローナル抗体；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびＯＸ４２に対する抗体（モノクローナル抗体；Ｓｅｒａｔｅｃ）をそれぞれ使用する。次いで、その組織を、実施例４に記載されるように処理する。
【００７６】
（Ｄ．組織化学：）
シトクロームオキシダーゼ活性を可視化するために、以下の組織化学的手順を使用する。組織切片を、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中で３回洗浄する。次いで、その切片を、遮光して３７℃で５０分間、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、シトクロームｃ、ＤＡＢ、スクロース、およびニッケルアンモニウムスルフェートを含む溶液とともにインキュベートする。その反応を、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液中で３回洗浄して停止させる。次いで、その切片を脱水し、カバーガラスをかける。
【００７７】
スクシネートデヒドロゲナーゼ活性を可視化するために、組織切片を、０．０６Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で３回洗浄する。次いで、その切片を、ニトロブルーテトラゾリウムとコハク酸二ナトリウムとを含むリン酸緩衝液中、３７℃で６０分間インキュベートする。その反応を、中性の緩衝化４％  ホルムアルデヒド中で１０分間その切片を洗浄することによって停止する。その組織切片を脱水し、カバーグラスをかける。
【００７８】
Ｅ．ＴＵＮＥＬ陽性細胞の検出：
ＮＢＭ、海馬、ＬＭＤＮ、およびインパクト部位付近の皮質領域におけるアポトーシス細胞の組織学的位置および存在を、インサイチュ細胞死検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して試験する。以下は、凍結組織のための方法である。ホルマリン固定組織切片をＰＢＳ中で３回洗浄した後、２００ｍｌの０．１Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を含むプラスチック製のジャーの中にスライドを入れ、７５０Ｗ（高）マイクロ波照射を、１分間適用する。８０ｍｌの蒸留水（２０〜２５℃）中での冷却期間後に、そのスライドをＰＢＳ（２０〜２５℃）の中に移し、次いで、３％  ＢＳＡと２０％  正常ウシ血清とを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に、室温（ＲＴ）で３０分間浸漬する。次いで、そのスライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、５０μｌのＴＵＮＥＬ反応混合物を、各切片上に配置し、加湿雰囲気中で３７℃において６０分間インキュベートする。３回さらに洗浄した後、内因性ＰＯＤ活性を、室温で１０分間、メタノール中０．３％  Ｈ２Ｏ２でブロックする。Ｔｒｉｓ−ＢＳＡ−ウシ血清混合物中で組織を再洗浄した後、ブロッキング溶液中で予め１：１希釈した５０μｌのＣｏｎｖｅｒｔｅｒ−ＰＯＤを添加し、次いで、その組織を、加湿雰囲気下で３７℃で３０分間インキュベートする。３回さらに洗浄した後、アポトーシス細胞を、５０μｌの０．０５％  ＤＡＢ基質溶液を添加することによって可視化する。さらに、ＰＢＳ中で３回洗浄し、Ｔｒｉｓ中で３回洗浄した後、その組織を対比染色し、カバーグラスをかける。
【００７９】
Ｆ．組織学的分析：
ニューロンの定量
ＣｈＡＴ陽性ニューロンおよびＭｎＳＯＤ陽性ニューロンの定量的立体的計数を使用することは、ＮＢＭ中で行われる（Ｍｉｃｈｅｌら．（１９８８）  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．１５０：１１７−３６；Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら．（１９８６）  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．１４３：３−４５；Ｗｅｓｔら．（１９９１）  Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２３１：４８２−９７；これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）。ＮＢＭ測定を、ＮＢＭが内側前頭皮質に対する多くの遠心性神経および求心性神経を有することに基づいて行う。このＮＢＭを、内包（ＩＣ）によって背側および内側に、尾状−被殻（ＣＰｕ）によって左右に、そして扁桃の中心核（ＣＮＡ）によって腹側に区別する。ＬＭＤＮにおけるチオニン染色ニューロンの数を、実施例４に記載されるように行う。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を、４０×光学顕微鏡下で計数し、その細胞がＴＵＮＥＬ陽性でありかつアポトーシス細胞の解剖学的特徴を満たす場合、アポトーシスであると決定する。細胞を、Ｇｏｌｄら．（１９９４）  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：２１９−２５（本明細書中に参考として援用される）に従って、アポトーシスおよび染色の形態特性について評価する。以下の変化を、プログラムされた細胞死を表すとみなす：１）クロマチンおよび細胞質の凝縮（アポトーシス細胞）；２）凝縮したクロマチン（アポトーシス小体）ありまたはなしの細胞質断片；ならびに３）クロマチン断片（小核）。細胞計数を、海馬、ＮＢＭ、ＬＭＤＮ、および損傷部位付近の皮質領域において、以下のＬＭＤＮについて例示された立体的手順を使用して行う。データを、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の総数およびアポトーシス細胞の特性を満たすものの両方について評価する。
【００８０】
Ｇ．反応性グリアおよび免疫応答生細胞の定量：
ＧＦＡＰ陽性細胞およびＯＸ４２陽性細胞の定量的立体的計数を使用することは、ＮＢＭおよびＬＭＤＮにおいて行われる。これらは、ＭＦＣ挫傷後に、有意なニューロン変性および神経膠症の両方を有することが公知の領域である。定量は、実施例４に記載される同じ立体的手順に従う。
【００８１】
Ｈ．ミトコンドリア酵素についての細胞ミクロデンシトメトリー：
ＮＢＭ、ＬＭＤＮ、海馬、および損傷部位付近の皮質領域を、上記の脳レベルにおいて細胞ミクロデンシトメトリーによって分析する。核の画像を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ９８ＴＭ／Ｐｅｎｔｉｕｍ  ＩＩコンピューター上で動くＭｅｄｉａ  ＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓによるＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ（登録商標）  Ｐｌｕｓを使用して、コンピューター補助デンシトメトリーによるオフライン分析のためにデジタル化する。各捕捉画像に関して、３回、内包の密度測定値をとり、平均し、バックグラウンドの差し引きのために使用した。次いで、完全に見える細胞体を有する個々のニューロンを選択し、個々のデンシトメトリー読み取りを行う。次いで、各細胞読み取りをバックグラウンドについて補正し、各レベルについて平均する。
【００８２】
（実施例４：外傷性脳損傷後の神経保護および行動回復を促進することにおけるアロプレグナノロンの有効性）
プロゲスチン代謝産物（例えば、アロプレグナノロンおよびエピプレグナノロン）が外傷性脳損傷によって引き起こされる二次的損傷を減少することにおいて有効であるか否かを決定するために、前頭皮質の両側性インパクトの後の認知障害および感覚・運動障害を調査した。このことは、２種類のプロゲスチン代謝産物がニューロン生存を増大し得かつ外傷性脳損傷によって引き起こされる炎症性免疫反応を減少し得るか否かを、外傷性脳損傷後の神経保護、神経膠症、および行動回復を種々の以下に記載されるアッセイを用いてアッセイすることによってさらに決定される。
【００８３】
群割り当ておよび薬物処置：
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（手術時に約９０日齢）を使用する。ラットを、１２：１２の明暗周期で個々のケージの中で飼育する。飼料および水は、実験の間中自由給餌とする。１６匹のラットに、偽手術を受けさせ、残りに、一般的方法において記載されるように、内側前頭皮質挫傷を受けさせる。偽手術したコントロールに、ビヒクル（ＨＢＣ；Ｓｉｇｍａ）を与える。挫傷ラットを、コントロール（ビヒクル）、プロゲステロン（４ｍｇ／ｋｇ）、エピプレグナノロン（１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、または１６ｍｇ／ｋｇ）およびアロプレグナノロン（１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、または１６ｍｇ／ｋｇ）に無作為に割り当てる。挫傷を生成した１時間後に処置を開始する。プロゲステロン、アロプレグナノロン、およびエピプレグナノロンを、迅速な吸収を確実にするために腹腔内に最初に与える。この次に、より徐々に吸収させるために損傷の６時間後に皮下注射を行い、次いで、さらなる注射を、次の５日間にわたって１日１回与える。コントロールラットに、同じ経路でかつ同時にビヒクルの注射を受けさせる。有益な効果は、プロゲステロンをわずか１回注射した後２時間以内に観察されうるが、さらなる用量は、損傷後の最初の７日間にわたって起こりえる水腫の第２波から動物を保護するために使用されている。手術および試験を、実験群（以下を参照のこと）の各々から１匹のラットを小群のために選択して、１２匹のラットの小群を形成することによって行う。
【００８４】
「触覚による接着物除去（ｔａｃｔｉｌｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｒｅｍｏｖａｌ）」：
損傷後７日目および２７日目に、ラットを、彼らが前脚から粘着性の紙を剥がすために要することによる、焦点の体性感覚刺激（ｆｏｃａｌ  ｓｏｍａｔｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｓｔｉｍｕｌｉ）に対する彼らの応答性について、評価する。円形の接着性の紙の対を、各前脚の遠位橈骨領域に貼り付け、動物を、その飼育ケージに戻す一方で、調査者は、前脚を離して保持し、ラットの口から離しておく。ラットの口で刺激を除去するためのラットの潜時を記録する。「試験」試行の最大長は、２分である。各ラットに、２分間試行間間隔で４回の試行を受けさせる。ラットが２分後に接着ディスクを剥がせない場合、そのディスクを、実験者が外す。
【００８５】
組織学：
損傷後２８日で、動物にｉ．ｐ．で過剰用量のペントバルビタール（７５ｍｇ／ｋｇ）を与え、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で心臓を経て灌流し、続いて、リン酸緩衝液中の４％  パラホルムアルデヒドで灌流する。脳を取り出し、４％  パラホルムアルデヒド中で１時間後固定し、０．１Ｍ  リン酸緩衝液中の２０％  スクロース中に４℃で３日間浸漬し、ドライアイス上で凍結させ、低温保持装置上で２０μｍで冠状面に沿って切片化する。８枚目毎の切片を、チオニンでのニッスル染色のために採取する。これらの切片を、外傷再構築および全体のニューロン計数のために使用する。３つのさらなるシリーズを、ＣｈＡＴ、ＯＸ４２、およびＧＦＡＰに対する抗体を用いて標識する。
【００８６】
免疫細胞化学：
基底核大型細胞（ＮＢＭ）において生存性大型細胞コリン作動性ニューロンを標識するために、ＣｈＡＴに対する抗体（モノクローナル抗体；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用する。ＮＢＭ、海馬、左右の（ｌａｔｅｒａｌ）背内側視床核およびインパクト部位周辺の領域における反応性星状細胞およびミクログリア／マクロファージの標識のために、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体（モノクローナル抗体；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびＯＸ４２に対する抗体（モノクローナル抗体；Ｓｅｒａｔｅｃ）をそれぞれ使用する。免疫細胞化学のための組織切片を、ＴＢＳ中で４×１５分間洗浄し、内因性ペルオキシダーゼインヒビター（ＴＢＳ中、３％  Ｈ２Ｏ２）中、１０分間インキュベートする。ＴＢＳ中で３×１０分間洗浄した後、組織を、１０％  ＮＧＳ−ＴＢＳ  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴＢＳ／ＴＸ）ブロッカー中で１時間インキュベートする。一次抗体を、１０％  ＮＧＳ−ＴＢＳ／ＴＸ中で希釈し、組織に適用し、振盪機上で４℃で４８時間インキュベートする。組織を、ＴＢＳ中で３×１０分間洗浄し、一次抗体についての宿主動物に対して指向された適切なビオチン化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）中で１時間インキュベートする。
【００８７】
ＴＢＳ中で３×１０分間洗浄した後、抗体シグナルを、ビオチン化二次抗体と結合するＨＲＰ結合体化アビジン（Ａ−ＨＲＰ）とともにインキュベートすることによって色素原と関連させる。洗浄後、組織を、続いて、並行してビオチン化二次抗体と結合するＡ−ＨＲＰ中でインキュベートする。次いで、結合したＨＲＰを、Ｈ２Ｏ２の存在下で３，３’ジアミノベンジジンテトラクロリド（ＤＡＢ）とインキュベーションすることによって可視化する。その反応を、ＴＢＳ中で洗浄することによって停止させる。組織を、ゲルを被覆したスライドガラス上に載せ、室温で一晩乾燥させ、アルコール中で脱水し、キシレン中で清浄にし、Ｓｈａｎｄｏｎ−Ｍｏｕｎｔを用いてカバースリップをかけた。
【００８８】
ＴＵＮＥＬ陽性細胞の検出：
アポトーシス細胞の組織学的位置および存在を、インサイチュ細胞死検出キット、ＰＯＤおよび凍結組織についての方法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて試験する。ホルマリン固定組織切片をＰＢＳ中で３回洗浄した後、そのスライドを、２００ｍｌの０．１Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を含むプラスチック製のジャーに中にスライドを入れ、７５０Ｗ（高）マイクロ波照射を、１分間適用する。８０ｍｌの蒸留水（２０〜２５℃）中での冷却期間後に、そのスライドをＰＢＳ（２０〜２５℃）の中に移し、次いで、３％  ＢＳＡと２０％  正常ウシ血清とを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に、室温（ＲＴ）で３０分間浸漬する。次いで、そのスライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、５０μｌのＴＵＮＥＬ反応混合物を、各切片上に配置し、加湿雰囲気中で３７℃において６０分間インキュベートする。３回さらに洗浄した後、内因性ＰＯＤ活性を、室温で１０分間、メタノール中０．３％  Ｈ２Ｏ２でブロックする。Ｔｒｉｓ−ＢＳＡ−ウシ血清混合物中で組織を再洗浄した後、ブロッキング溶液中で予め１：１希釈した５０μｌのＣｏｎｖｅｒｔｅｒ−ＰＯＤを添加し、次いでその組織を、加湿雰囲気下で３７℃で３０分間インキュベートする。３回さらに洗浄した後、アポトーシス細胞を、５０μｌの０．０５％  ＤＡＢ基質溶液を添加することによって可視化する。さらに、ＰＢＳ中で３回洗浄し、Ｔｒｉｓ中で３回洗浄した後、その組織を対比染色し、カバーグラスをかける。
【００８９】
組織学的分析：
ニューロンの定量：
ＣｈＡＴ陽性ニューロンの定量的立体的計数を使用することは、ＮＢＭ中で行われる（Ｐｏｖｅｒら．（１９９３）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：１２３−３１；Ｍｉｃｈｅｌら．（１９８８）  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．１５０：１１７−３６；Ｓｔｅｒｉｏ，Ｄ．Ｃ：（１９８４）．J．Ｍｉｃｒｏｓｃ．１３４：１２７−３６；Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら．（１９８６）  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．１４３：３−４５；これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）。ＮＢＭが内側前頭皮質に対する多くの遠心性神経および求心性神経を有するので、ＮＢＭ測定を行う。このＮＢＭを、内包（ＩＣ）によって背側および内側に、尾状−被殻（ＣＰｕ）によって左右に、そして扁桃の中心核（ＣＮＡ）によって腹側に区別する。チオニン染色ニューロンの数を、視床の背内側核（ＬＭＤＮ）の左右の一部において行う。この構造が内側前頭皮質との相互的接続を有するので、そのＬＭＤＮ測定を行う。さらに、この損傷モデルを用いた以前の研究によって、これらニューロンの有意な喪失が存在し、プロゲステロンがこのニューロン喪失を有意に減少させうることが実証される（Ｒｏｏｆら．（１９９９）  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２９：６４−９）。このＬＭＤＮを、外側手綱部（ＬＨｂ）によって背側に、外側中心核（ＣＬ）によって左右に、内側中心核によって腹側に、そして背内側核（ＭＤＮ）によって内側に区別する。さらに、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を、ＮＢＭおよびＬＭＤＮに加えて、海馬のＣＡ１層およびＣＡ３層において計数する。
【００９０】
基準容積（Ｖ（Ｒｅｆ））の概算のために、Ｃａｖａｌｉｅｒｉ法を使用する（Ｍｉｃｈｅｌら．（１９８８）  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．１５０：１１７−３６）。４×という低倍率を使用して、平均基準容積を、ＬＭＤＮについて概算する。０．０１ｍｍ対物マイクロメーターの補助で較正した接眼マイクロメーターにおけるスケールを使用する。各動物について、３つの等しく間隔を空けた切片を選択し、最初の切片は、１〜ｋの間の無作為に決定した数で始まる。較正した接眼マイクロメーターを使用して、各切片についての各指定した解剖学的領域の幅および長さを、３つの別個の点で測定して、その切片についての平均表面積を出す。これらの平均は、各構造の概算二次元平均表面積を決定するために、３つの切片全てについて平均する。次いで、その基準容積を、式
【００９１】
【数１】
2004532796.tif 000001
で計算する（ここで
【００９２】
【数２】
2004532796.tif 000002
は平均表面積であり、「ｔ」は、切片厚であり、そして「ｓ」は、切片数である）。
【００９３】
切片厚（２０μｍ）および脳の３つの別個のシリーズへの解剖に起因して、光学解剖器具法を粒子計測のために使用する。この解剖器具の高さは、既知の厚みの切片を用いて種々の倍率でその下位区分の高さを測定することによって顕微鏡の微小ねじを経験的に較正することによって決定される。この焦点深度の較正は、基準切片と検査切片との間の正確かつ容易な動きを可能にする。次いで、解剖器具の高さは、全ての数値密度計数のために使用される。この解剖器具容積は、式
【００９４】
【数３】
2004532796.tif 000003
で決定する（ここで
【００９５】
【数４】
2004532796.tif 000004
は、基準切片の平均面積であり、「ｈ」は解剖器具高さである）。各動物について、接眼鏡における５×５（０．１６ｍｍ２）グリッドを使用して、頂点の数を、３つの選択した基準切片の各々において４０×倍率下で各面積について計数する。
【００９６】
（実施例５：神経ステロイドの改善効果に対するストレス関連ホルモンの効果）
興奮毒性に対する感受性および脳損傷後のシナプス可塑性に対するコルチコステロイドの有害効果は十分に実証されている。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら．（１９９６）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６：１８３６−４４；Ｓｕｐｋｏら．（１９９４）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２７０：１０５−１３；Ｓｃｈｅｆｆら．（１９８６）  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．９３：４５６−７０；ＤｅＫｏｓｋｙら．（１９８４）  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｒａｏｌｏｇｙ  ３８：３３−８（これらの全ては本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。高レベルの循環ストレスホルモン（例えば、コルチコステロン）下で投与される場合、どの程度プロゲスチン代謝産物が有効であるかは未知である。この実験の目的は、雄性および雌性の両方で高レベルのコルチコステロンの存在下で、最も有効な神経ステロイド（すなわち、プロゲステロン、アロプレグナノロン、またはエピプレグナノロン）の有効性を決定することである。この相互作用を評価するために、抑制ストレスを、高ストレスレベルと関連するホルモン環境を模倣するために使用する。雄性および雌性のラットを、外傷性脳損傷に供する前に長期間の抑制ストレスに供する。この方法は、生理学的ストレスを模倣することが予測され、従って、本発明者らが、外傷性脳損傷のプロゲスチン処置でこの価値のある相互作用を調査することが可能になる。従って、コルチコステロンの上昇したレベルが、外傷性脳損傷後のプロゲスチンの改善効果に対して有する作用を調査する。この相互作用を評価するために、本発明者らの以前のプロジェクトにおいて記載されるのと同じ生理学的かつ解剖学的変数を試験する。これらは、実施例１、実施例２、実施例３、および実施例４において記載されるとおりの、行動回復、ニューロン生存、炎症性免疫応答、および脳水腫アッセイを含む。
【００９７】
（実施例６：ＴＢＩによって引き起こされる壊死性損傷および行動異常に対するプロゲステロンの効果）
方法：
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００ｇ）を、ワイヤケージの中で個々に飼育し、逆転した明暗周期（０８００−２０００ｈ）で維持した。動物を、４つの群のうちの１つに割り当てた：（１）外傷（ｎ＝７）；（２）外傷＋３日間のプロゲステロン（ＬＰ３；ｎ＝７）；（３）外傷＋５日間のプロゲステロン（ＬＰ５；ｎ＝７）；および（４）偽手術（ｎ＝８）。動物に関する全ての手順は、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（米国保健福祉省，刊行物番号８５−２３，１９８５）において記載されるガイドラインに従い、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。
【００９８】
内側前頭皮質の両側性挫傷を、以前に記載されるように［４０］、空気式インパクターデバイスによって作製した。簡潔に言えば、ラットをケタミン／キシラジン（９０ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、そして定位装置の中に配置した。頭蓋骨局部切除術（直径６ｍｍ）を、ブレグマに対してその中心１．５ｍｍ  ＡＰで、前頭皮質の正中線上に作製した。骨を除去した後、そのインパクターの先端（直径５ｍｍ）を、（ブレグマから）＋３．０ｍｍ  ＡＰ；１．０ｍｍ  ＭＬへ動かし、適切な隙間（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）についてチェックした。外傷を、脳接触時間０．５秒で、３ｍ／ｓの速度で−２ｍｍＤＶ（硬膜から）をインパクトするためにピストンを空気により作動させることによって生成した。
【００９９】
プロゲステロンを、落花生油に溶解し（Ｓｉｇｍａ；４ｍｇ／ｋｇ）、注射を、損傷の１時間後および６時間後に与え、次いで、３連続日または５連続日のいずれかにわたって１日に１回与えた。コントロール動物に、類似の時点でビヒクルの注射を受けさせた。動物を、行動試験および後の組織学検査の間の実験の偏りを避けるために手術および処置に関してコード化した。
【０１００】
手術後２１日間、動物を、１００ｍｌの０．１Ｍ  リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）、続いて、４００ｍｌの０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ＰＢ；ｐＨ７．４）中４％  パラホルムアルデヒドで灌流した。３０％  スクロース中での低温保護の後に、冠状面の４０μｍ厚切片を、凍結ミクロトームで切断し、すぐにゲル被覆スライドガラスに載せ、チオニンでニッスル染色して、損傷の位置および程度を決定した。
【０１０１】
外傷サイズの平均面積測定値を、３００μｍ間隔を空けて１５の吻側−尾側レベルで切片から定量した。壊死性空洞の周囲（損傷した周縁部を含む）を、トレースされた各レベルについてｍｍ２単位でその面積を計算するために較正されたＪａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳｉｇｍａＳｃａｎソフトウェアを使用してデジタル化画像上でトレースした。線条および側脳室の周縁部もまたトレースし、平均面積を、７つの吻側−尾側レベル（３００μｍ離して）から定量した。
【０１０２】
細胞計数を、接眼鏡マイクロメーターグリッド（×４００倍率でサンプル面積＝４０μｍ２）を備えるＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２顕微鏡で行った。ニッスル染色ニューロンの両側性の細胞計数を、以下の領域の各々において３つの別個の切片に対して行った：（１）ＳＴＲ（＋１．８〜＋１．２ｍｍ  ＡＰ）、（２）ＧＰ（−０．３〜−１．２ｍｍ  ＡＰ）、（３）ＤＭＮ（−２．３〜−２．９ｍｍ  ＡＰ）、および（４）ＶＭＮ（−２．３〜−２．９ｍｍ  ＡＰ）。ニューロン核およびインタクトな膜を有する細胞のみを、ニューロンとして計数した。
【０１０３】
研究の処置条件を知らない経験を積んだ個人が、全ての組織学的分析および行動分析を行った。全てのデータを、パラメトリック分散分析（ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）によって分析する前に、正常性および等分散性（ｈｏｍｏｓｃｈｅｄａｓｔｉｃｉｔｙ）について検定した。ＭＷＭ結果を、２回の５日間の試験期間の各々（それぞれ、習得および保持）に関して、別個の混合要因（４群×５日間）分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。ＢＳＮ課題の結果を、混合要因ＡＮＯＶＡ（４群×２回の損傷後試験）を用いて分析した。平均デンシトメトリー記録、面積測定、および細胞計数における組織学的比較を、一元ＡＮＯＶＡを用いて行った。全ＡＮＯＶＡが群間で有意であった（ｐ＜０．０５）場合、全ての群間比較を、多重Ｔｕｋｅｙ事後検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）（ｐ＜０．０５）を用いて行った。ピアソンｒ係数を計算して、有意な相関が、組織学的パラメーター（例えば、外傷サイズおよび細胞密度）と行動パラメーター（例えば、ＭＷＭ課題の習得および保持ならびに感覚的怠慢（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｇｌｅｃｔ）の尺度）との間で検出されうるか否かを決定した。
【０１０４】
手術後最初の１週間で、空間学習能力を、先に記載されるモリス水迷路（ＭＷＭ）課題において評価した。各動物を、２回の５日間試験ブロック（それぞれ、習得および保持）において合計１０日間にわたって試験した。動物を、４つの無作為に決定したスタート位置（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｅ、Ｗ）のうちの１つにおいてプールの中に入れた（鼻がプールの壁に向いている）。各ラットを、隠されたプラットフォームを見つけるかまたは９０秒が過ぎるまで、プールの中で自由に泳がせた。動物が９０秒間でプラットフォームを見いだせなかった場合、プラットフォームまで人間の手で導いた。一旦プラットフォームに着いたら、動物を１０秒間休ませ、次いで、プールから退かせ、暖めるために加熱ランプ付近に置いた。各ラットに、２０秒間の試験間の間隔（ＩＴＩ）で１日あたり２回の試験を受けさせた。この課題についての依存性の尺度は、隠されたプラットフォームおよび水泳戦略（例えば、外側環対内側環において過ごす時間のパーセント）を見いだすための潜時であった。泳ぐ速度の測定値を、学習障害から運動機能不全を線引きするために、毎日記録した。
【０１０５】
注意能力の尺度を、両側性の感覚的怠慢（ＢＳＮ）課題を使用して、手術の１日前（ベースライン）および手術後６日目および２０日目に記録した。円形の接着性の紙の対（２ｃｍ直径）を、各前脚の遠位橈骨領域に貼り付け、刺激を除去するためのラットの潜時を記録した。各ラットに、最大２分間試行時間で、各試験期間につき４回の試行（２分間  ＩＴＩ）を受けさせた。ラットが標準時間内に接着ディスクを剥がせない場合、その試験についての合計潜時を２分間と記録した。
【０１０６】
（結果：）
組織学．
大部分の動物において、壊死組織を、主に、内側前前頭皮質および帯状皮質に制限した。しかし、いくつかの場合、より重篤な組織損傷が、脳梁、ならびに内側中隔および線条の最も背側の面（ａｓｐｅｃｔ）に拡がった（データは示さず）。壊死空洞形成に対する主な有意な効果は、損傷群間で観察された（Ｆ２，１９＝３．５７，Ｐ＜０．０５）。Ｔｕｋｅｙ事後分析（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって、壊死空洞形成における用量依存性減少が明らかになった。データは示さず。顕著には、プロゲステロンを与えられた全ての動物は、ビヒクル注射を与えられた損傷動物と比較して、より小さな外傷を有する傾向にあった。しかし、わずか５日間のプロゲステロンが、全体の壊死空洞形成において有意な減少を生じた（Ｐ＜０．０５）。本発明者らはまた、コントロール動物と比較して、全ての損傷群において側脳室の拡大を観察した（Ｆ３，２５＝５．２８，Ｐ＜０．０１）が、プロゲステロンは、この尺度に関して何の効果も有さなかった。データは示さず。群間の差異は、平均線条体面積の尺度に関して認められなかった。
【０１０７】
一元ＡＮＯＶＡによって、ＳＴＲ（Ｆ３，２５＝１５．５８，Ｐ＜０．０１）、ＧＰ（Ｆ３，２５＝４．４７，Ｐ＜０．０１）、ＤＭＮ（Ｆ３，２５＝５．３７，Ｐ＜０．０１）、およびＶＭＮ（Ｆ３，２５＝８．６８，Ｐ＜０．０１）において行った計数に対する群間での平均細胞密度の主要な効果が明らかになった。Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定の結果は、ＬＰ３およびＬＰ５両方の処置が、試験した全ての脳領域において損傷誘導性ニューロン喪失の有意な減少を生じることを示した。しかし、５日間のプロゲステロンは、ＶＭＮ（損傷周縁部に対して最も遠位にある領域）におけるニューロン喪失を減ずることにおいて３日間よりも有効であった。データは示さず。
【０１０８】
行動試験．
ＭＷＭ課題において、最初の５日間の習得相の間に、損傷群の全てが、コントロール動物と比較して、空間学習能力において障害を示した（Ｆ３，２５＝１９．４５，Ｐ＜０．０１）。しかし、Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定は、第２の５日間試験ブロックの間に動物において、ＬＰ５において改善された空間学習能力を検出したが、ＬＰ３においては検出しなかった（Ｆ３，２５＝６．７６，Ｐ＜０．０１）。データは示さず。
【０１０９】
ＡＮＯＶＡによって、ＭＷＭ課題の習得（Ｆ３，２５＝２８．２３，Ｐ＜０．０１）および保持（Ｆ３，２５＝１２．２５，Ｐ＜０．０１）の間の水泳パターンに対して主要な有意な効果が明らかになった。データは示さず。全ての損傷動物は、最初の５日間のＭＷＭ試験ブロックの間に、持続した接触走性（ｔｈｉｇｍｏｔａｘｉｃ）（壁にしがみついている）水泳パターンを示した。しかし、接触走性行動の減少は、この群において認められたプラットフォームを見つけ出す潜時の減少と一致して、ＭＷＭ試験の第２の相の最後の２日間においてＬＰ５処置動物において認められた（コントロールと比較してＰ＞０．０５）。試験のいずれの日においても水泳速度測定値に関する群間の差異はなかった。
【０１１０】
手術の１日前に記録した感覚的怠慢のベースライン測定値においては群間差異はなかった。群間の主要な有意な効果（Ｆ３，２５＝６．１７，Ｐ＜０．０１）は、内側前前頭皮質に対する制御された皮質挫傷の後のＢＳＮ課題の結果において認められた。Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ分析は、ＬＰ３処置動物のみが、損傷の６日後および２０日後にコントロール動物と比較して、この課題に対して障害があったことを示した（データは示さず）。
【０１１１】
本発明者らはまた、ＭＷＭ課題において組織学的尺度と能力との間に有意な相関関係を検出した。具体的には、第２の５日間の試験ブロックの間に、壊死空洞形成と改善されたＭＷＭ能力との間に正の相関関係があった。このことは、より小さな外傷がこの課題の保持の改善を生じたことを示唆する（ｒ２１＝＋．４４，Ｐ＜０．０５）。同様に、本発明者らは、細胞密度とＭＷＭ試験の第２相の間の空間学習能力との間に負の相関関係を認めた（ｒ２１＝−．５０，Ｐ＜０．０５）。これは、プロゲステロン媒介性ニューロン節約が、より大きな機能回復を可能にしたことを示す（データは示さず）。最終的に、本発明者らは、外傷サイズまたは細胞密度のいずれかと、感覚的怠慢の尺度との間に何ら有意な相関関係を認めなかった。
【０１１２】
まとめ：
損傷誘導性壊死空洞形成の減少は、損傷後神経ステロイド介入が、この動物モデルにおいてＴＢＩ後の外傷容積を減少し得るという証拠を提供する。本研究において、本発明者らは、プロゲステロン処置動物における壊死空洞形成において用量依存性減少を認めた。具体的には、わずか３日間のプロゲステロン（ＬＰ３）で処置した動物の脳における壊死空洞が、損傷動物の脳におけるものより小さい傾向があったが、わずか５日間の処置レジメン（ＬＰ５）が、有意に小さな外傷を生じた。本発明者らの研究はいまや、プロゲステロンがまたＴＢＩ誘導性組織喪失を減じ得るという初めての証拠を提供する。
【０１１３】
本発明者らの研究において、プロゲステロンはまた、損傷ゾーンに対して近位（例えば、ＳＴＲ）および遠位（例えば、ＧＰ、ＤＭＮ、およびＶＭＮ）の両方の脳領域における二次的細胞喪失から保護した。興味深いことに、本研究において、３日間および５日間のプロゲステロン処置はともに、ＳＴＲ、ＧＰ、およびＤＭＮにおけるニューロン喪失を減少させたが、ＬＰ５処置のみが、未処置コントロールと比較して、ＶＭＮの細胞喪失における有意な減少を生じた。
【０１１４】
そして最後に、本研究において、全ての損傷群は、ＭＷＭ試験の習得相に対して機能が損なわれた。このＬＰ５動物は、この課題の維持相の間の空間能力において明らかな改善を示したものの、コントロールレベルにまでは改善を示さなかった。有意な相関関係が、神経病理学的パラメーター（例えば、壊死空洞形成およびニューロン節約）とＭＷＭ能力との間に認められた。このことは、外傷サイズ、細胞死におけるプロゲステロン媒介性減少が、プラットフォームを見いだす潜時の付随した減少を生じたことを示す。
【０１１５】
（実施例７：シクロデキストリンビヒクル中でプロゲステロンを投与したときの、ＴＢＩ後の行動回復についての用量応答曲線）
方法：
外傷性脳損傷を誘導するための手術は、実施例１において概説されるとおりに行った。モリス水迷路を使用する行動試験を、実施例１において概説されるとおりに行い、触覚による接着物除去のための方法を、実施例４に概説されるとおりに行った。
【０１１６】
結果：
図６Ａおよび図６Ｂは、低用量および中用量のプロゲステロン（シクロデキストリン含有ビヒクル中に８ｍｇ／ｋｇおよび１６ｍｇ／ｋｇ）は、モリス水迷路能力において一致した改善を生じたのに対して、高用量のプロゲステロン（シクロデキストリン含有ビヒクル中に３２ｍｇ／ｋｇ）は、何ら有益な効果を示さなかったことを実証する。
【０１１７】
ステッカー除去課題は、前頭損傷についての一次的障害である感覚的怠慢についての試験である。この課題において、全ての用量は、最初に行動回復を生じるが、高用量のプロゲステロンを受けた群は、外傷コントロールレベルにまで低下し、そして最初に病変コントロールレベルにあった中用量は、損傷後２１日目までに、偽手術レベルにまで改善された。図７を参照のこと。
【０１１８】
実験Ａ：プロゲスチンは、長期間ストレスの状況において外傷性脳損傷後に神経保護性であるのか？
群割り当ておよび薬物処置：
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性および雌性ラット（研究開始時に約９０日齢）を使用する。このラットを、１２：１２の明暗スケジュールで吊り戸棚においたケージにおいて個々に飼育し、試料および水は、実験の間中自由給餌とする。手術の前に、そのラットを、偽手術または挫傷群および長期間拘束ストレスまたはストレスなしの群のいずれかに割り当てる。次いで、両方の群を、コントロール（ビヒクル）または神経ステロイド（上記の実施例から決定されるように、最も有効な投薬量において最も有効な神経ステロイド）のいずれかに無作為に割り当てる。手術プロトコルおよび薬物プロトコルは、実施例１に記載される手順に従う。
【０１１９】
長期間拘束ストレス：
長期間ストレスを受けるラットを、手術前の２１日間にわたって、彼らの飼育ケージの中で各日同時に６時間（１０：００〜１６：００）の強制拘束に供する。ラットを、プラスチック製の動物用注射保定器に拘束する。コルチコステロン血清アッセイのための血液サンプルを、手術前ストレス期間の間の１日目、５日目、１４日目、および２１日目に、９：００および１９：００の１日２回、尾静脈から採取する。このサンプルを遠心分離にかけ、血清を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のために処理するまで、−８０℃で保存する。このアッセイは、ストレスの生理学的「レベル」と、形態回復および行動回復のその後の速度および程度との間の相関を可能にする。
【０１２０】
コルチコステロンについての血液アッセイ：
血漿コルチコステロン（５μｌ）を、トレーサーとしての［ｌ２５Ｉ］コルチコステロンを用いて、ＩＣＮ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓのＲＩＡキットを使用して測定する。コルチコステロン抗体は、コルチコステロンと１００％交差反応し、デスオキシコルチコステロン（０．３４％）、テストステロン、およびコルチゾール（０．１０％）とはわずかに交差反応するが、プロゲスチンともエストロゲンとも交差反応しない（＜０．０１％）。このアッセイの検出限界は、０．２μｇ／ｄｌである。
【０１２１】
ＭＷＭ試験手順、組織学、免疫細胞化学、ならびにニューロンおよびグリアの定量を、実施例１、実施例２、実施例３および実施例４に記載されるように行う。
【０１２２】
（実験Ｂ：脳水腫のプロゲスチン関連性の減少に対するストレスの効果）
群割り当ておよび薬物処置：
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性および雌性ラット（研究開始時に約９０日齢）を使用する。このラットを、１２：１２の明暗スケジュールで吊り戸棚においたケージにおいて個々に飼育し、試料および水は、実験の間中自由給餌とする。手術の前に、そのラットを、偽手術または挫傷群および長期間拘束ストレスまたはストレスなしの群のいずれかに割り当てる。次いで、両方の挫傷群を、コントロール（ビヒクル）または神経ステロイド（上記の実施例から決定されるように、最も有効な投薬量において最も有効な神経ステロイド）のいずれかに無作為に割り当てる。手術プロトコルおよび薬物プロトコルは、実施例１に記載される手順に従う。この実験についての時点を、損傷後６時間と７２時間との間に水腫のピークが発生することを示す先の研究に基づいて選択した。最も重要な時点に集中するために、本発明者らは、２４時間および４８時間で最初に調べ、ストレスに曝したラットにおいて差異があるか否かについて、次いで、本発明者らは、６時間および７２時間の時点を含める。客観的分析の目的で、各実験群からの動物を、各実験条件から１匹選択して、各々１２匹の群を形成することによって、小群にする。
【０１２３】
長期間拘束ストレス：
長期間ストレスを受けるラットを、彼らの飼育ケージの中で各日同時に６時間（１０：００〜１６：００）の拘束ストレスに供する。ラットを、プラスチック製の動物用注射保定器に拘束する。コルチコステロン血清アッセイのための血液サンプルを、手術前ストレス期間の間の１日目、７日目、１４日目、および２１日目に、９：００および１９：００の１日２回、尾静脈から採取する。
【０１２４】
（コルチコステロンについての血液アッセイ：）
実施例Ａに記載されるものと同じプロトコルに従う。
【０１２５】
（水腫測定：）
実施例１に記載されているものと同じプロトコルに従う。
【０１２６】
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルの指標である。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度にまで、参考として援用される。
【０１２７】
前述の発明は、理解の明瞭さの目的で図示および例示によって幾分詳細に記載されているが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施されうることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】  図１は、損傷後約２時間、２４時間および７２時間の、プロゲステロン（ｐ）、エピプレグナノロン（ＥＰ）、アロプレグナノロン（ＡＰ）、ビヒクル（Ｖｅｈ）および偽手術による脳水腫の軽減のレベルを示す。
【図２】  図２は、皮質への挫傷損傷後のアロプレグナノロンの投与が、モリス水迷路における習得課題に関する改善された能力を生じることを示す。１つのアスタリスク（＊）は、ビヒクルを与えた損傷ラットと、アロプレグナノロンで処置したラットとの間の差異を示す。ｐ＜０．０５）。
【図３】  図３は、両側の前頭皮質挫傷、ならびにプロゲステロン（ＬＰ）、アロプレグナノロン（ＬＡＰ）、エピプレグナノロン（ＬＥＰ）、偽ビヒクル（偽）、および損傷ビヒクル（外傷（Ｌｅｓｉｏｎ））でその後に処置した後の基底核大型細胞におけるＣＨＡＴ陽性細胞の数の組織学的分析からの結果を示す。１つのアスタリスク（＊）は、偽からの有意差を示し、２つのアスタリスク（＊＊）は、偽コントロールおよび外傷（ｌｅｓｉｏｎ）コントロール両方からの有意差を示す。
【図４】  図４は、両側の前頭皮質挫傷後の脳組織におけるＴＮＦ  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。神経ステロイド注射を、挫傷の１時間後および６時間後に与え、損傷後に、１日に１回を５日間連続で続けた。損傷して３時間後、８時間後、１２時間後、および６日間後に、ＴＮＦ  ｍＲＮＡ発現のレベルを決定した。偽−ビヒクル（ＳＶ）；偽−プロゲステロン（ＳＰ）；偽−アロプレグナノロン（ＳＡ）；外傷−ビヒクル（ＬＶ）；外傷−プロゲステロン（ＬＰ）；外傷−アロプレグナノロン。＊＝Ｐ＜０．０５。
【図５】  図５は、両側前頭皮質挫傷後の脳組織におけるＩＬ−１  ｍＲＮＡ発現のレベルを示す。神経ステロイド注射を、挫傷の１時間後および６時間後に与え、損傷後１日１回を５日間連続で続けた。損傷の３時間後、８時間後、１２時間後および６日後に、ＩＬ−１  ｍＲＮＡの発現レベルを決定した。偽−ビヒクル（ＳＶ）；偽−プロゲステロン（ＳＰ）；偽−アロプレグナノロン（ＳＡ）；外傷−ビヒクル（ＬＶ）；外傷−プロゲステロン（ＬＰ）；外傷−アロプレグナノロン。＊＝Ｐ＜０．０５。
【図６】  図６は、外傷性脳損傷後の行動回復についての投与量応答曲線を示す。図６Ａおよび６Ｂは、シクロデキストリン含有キャリア中の、低用量（８ｍｇ／ｋｇ）、中用量（１６ｍｇ／ｋｇ）、および高用量（３２ｍｇ／ｋｇ）のプロゲステロンでの処置後に、プロゲステロンの低用量および中用量はともに、モリス水迷路能力における一致した改善を生じたことを実証する。
【図７】  図７は、シクロデキストリン含有キャリア中の、低用量（８ｍｇ／ｋｇ）、中用量（１６ｍｇ／ｋｇ）、および高用量（３２ｍｇ／ｋｇ）のプロゲステロンでの処置後の、「ステッカー除去課題」からの結果を示す。