【手続補正書】
【提出日】平成18年11月16日(2006.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ウイルスに非共有結合的に直接結合している細胞ターゲティングリガンドを含む、宿主動物内の標的細胞にウイルスを送達するためのベクター。
【請求項２】  該ウイルスおよび該リガンドが互いに天然では関連しない、請求項１記載のベクター。
【請求項３】  該ウイルスが治療的核酸を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項４】  該ウイルスが治療的ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項５】  該ウイルスが野生型ｐ５３をコードする核酸を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項６】  該ウイルスがレトロウイルスまたはアデノウイルスである、請求項１記載のベクター。
【請求項７】  該ウイルスが、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、家禽ポックスウイルス、カナリアポックスウイルスまたはシンドビスウイルスからなる群から選択される、請求項１記載のベクター。
【請求項８】  該ウイルスが、キメラウイルス、ハイブリッドウイルス、または組換えウイルスである、請求項１記載のベクター。
【請求項９】  該細胞ターゲティングリガンドが、タンパク質、ペプチド、ホルモン、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項１記載のベクター。
【請求項１０】  該細胞ターゲティングリガンドが、天然タンパク質または組換えタンパク質である、請求項１記載のベクター。
【請求項１１】  細胞ターゲティングリガンドが、インシュリン、毒素、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ヘレグリン、ウイルス性タンパク質、細菌性タンパク質、エストロゲンおよびプロゲステロンからなる群から選択される、請求項１記載のベクター。
【請求項１２】  該細胞ターゲティングリガンドがトランスフェリンである、請求項１記載のベクター。
【請求項１３】  該細胞ターゲティングリガンド対該ウイルスが、１００から１,０００,０００リガンド分子／ビリオンの範囲の比率で存在する、請求項１記載のベクター。
【請求項１４】  該細胞ターゲティングリガンド対該ウイルスが、６,７００から４００,０００リガンド分子／ビリオンの範囲の比率で存在する、請求項１記載のベクター。
【請求項１５】  該細胞ターゲティングリガンド対該ウイルスが、１０１０ビリオン当たり１μｇから１０ｍｇの該リガンドの範囲の比率で存在する、請求項１記載のベクター。
【請求項１６】  該細胞ターゲティングリガンド対該ウイルスが、１０１０ビリオン当たり１０μｇから６００μｇの該リガンドの範囲の比率で存在する、請求項１記載のベクター。
【請求項１７】  細胞ターゲティングリガンドとウイルスを水性媒体中で混合し、それにより該リガンドを該ウイルスに非共有結合的に直接結合させることを含み、該ベクターがウイルスに非共有結合的に結合した細胞ターゲティングリガンドを含むものである、標的細胞にウイルスの全身性送達をさせるためのベクターを製造する方法。
【請求項１８】  該水性溶液が１個またはそれ以上の緩衝剤、浸透圧調節剤または抗生物質を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】  治療的有効量の、動物内の標的細胞にウイルスの送達をするためのベクターを投与することを含み、該ベクターがウイルスに非共有結合的に直接結合した細胞ターゲティングリガンドを含むものである、必要とする動物に治療剤を提供する方法。
【請求項２０】  動物がヒトである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】  該治療剤を全身性に投与する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】  該治療剤を非経口的に投与する、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】  該治療剤を静脈内または動脈内投与する、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】  該治療剤を腫瘍内投与する、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】  該ベクターが野生型ｐ５３をコードする、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】  該細胞ターゲティングリガンドがトランスフェリンである、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】  該治療剤を、該治療剤に加えて化学療法を受けている動物に投与する、請求項１９記載の方法。
【請求項２８】  該治療剤を、該治療剤に加えて放射線治療を受けている動物に投与する、請求項１９記載の方法。
【請求項２９】  該動物が、頭頸部、膀胱、乳、甲状腺、卵巣、脳、前立腺、メラノーマまたはリンパ腫の癌である、請求項１９記載の方法。
【請求項３０】  該ウイルスが野生型ｐ５３をコードする核酸を含み、該細胞ターゲティングリガンドがトランスフェリンであり、それにより治療剤を全身性に投与する、請求項１９記載の方法。
【請求項３１】  該治療剤を、該治療剤に加えて化学療法を受けている動物に投与する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】  該治療剤を、該治療剤に加えて放射線治療を受けている動物に投与する、請求項３０記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
２．背景技術の記載
ウイルスベクターを使用した遺伝子送達および遺伝子治療は、かなり研究の対象となっている。癌の遺伝子治療の長年にわたる目的は、転移を含む腫瘍細胞を選択的に標的とする全身性送達システムである。核酸を、細胞内にウイルスベクターを介して挿入し、これらの細胞内で所望の治療的作用を産生するようにできる。例えば、遺伝子を細胞機能を干渉する欠損遺伝子、例えばｐ５３を置換するように挿入できる。核酸はまた細胞内に宿主動物に所望の治療的効果を産生するために、例えば、予防接種、免疫治療、またはアンチセンス発現のために細胞内に挿入できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
アデノウイルスベクターは、非分割細胞に入ることができ、約８ｋｂの外因性ＤＮＡ配列を運搬できるため、遺伝子治療のある形で利点を提供する。アデノウイルス粒子は精製でき、１０１１ＰＦＵ／ｍＬより大きいタイターを産生できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
Curiel et al., (米国特許第５,５２１,２９１号および５,５４７,９３２号)は、核酸を真核生物細胞に内在化させるための、複数アデノウイルスポリカチオン接合体を記載する。これらの接合体のいくつかは、内在化因子としての核酸に親和性を有する物質に結合したトランスフェリンを使用する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
Cotton et al. (米国特許第５,６９３,５０９号)は、通常浸透できない細胞に効率的に浸透するが、遺伝子発現および／またはそのエンドソーム融解特性を残したままの、報告された能力を有するアデノウイルスを記載する。トランスフェリンはアデノウイルス粒子に共有結合的に結合し、それらはレセプター介在エンドサイトーシスを受けることができる。この方法は、トランスフェリンを、アルデヒド基を炭水化物部分に含む形に酸化し、酸化トランスフェリンを還元条件下でアデノウイルスに結合させる。また、感染性が修飾後維持されているか、予期できないと記載されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
(発明の詳細な説明)
ｗｔｐ５３を欠くマウスの正常な発育およびｐ５３発現細胞における照射後Ｇ１ブロックの観察は、ｗｔｐ５３が、増殖および発育中よりむしろＤＮＡ損傷後またはストレス後に、細胞の調節において機能することを示す。多くの慣用の抗癌治療(化学療法および放射線)はＤＮＡ損傷を誘導し、アポトーシスの誘導により作用するように見えるため、ｐ５３経路の変更は治療レジメの失敗を導くことが考えられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
ｗｔｐ５３機能の欠失はまた放射線耐性の増加に関連する。ｗｔｐ５３の存在および続くＧ１遮断の欠失はまたある種のヒト腫瘍および細胞経における増加した放射線耐性と相関することが発見されている。これらは、頭頸部癌、リンパ腫、膀胱癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌および脳腫瘍に代表されるヒト細胞系を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
これらの考えを基に、ｗｔｐ５３機能を腫瘍細胞内で回復させる遺伝子治療が、ｐ５３依存的細胞周期チェックポイントおよびアポトーシス経路を回復させ、したがって化学物質／放射線耐性表現型の逆転を導くはずである。このモデルと矛盾せず、化学感受性が、アポトーシスに加えて、ｗｔｐ５３を担持する非小細胞肺癌マウス異種移植片におけるｗｔｐ５３の発現により回復した。ｐ５３−ヌル肺腫瘍細胞系Ｈ１２９９およびＴ９８Ｇ膠芽細胞腫細胞を含む異種移植片の化学感受性およびＷｉＤｒ大腸癌異種移植片のシスプラチンに対する感受性が証明されている。ドキソルビシンまたはマイトマイシンＣによる増加した細胞死も、ｗｔｐ５３のアデノウイルス形質導入によりＳＫ−Ｂｒ−３乳腫瘍細胞で示された。しかし、ある矛盾する報告が、ｐ５３発現と化学耐性の間の関係は、組織または細胞タイプ特異的成分を有し得ると示している。ｗｔｐ５３のアデノウイルスベクターによるトランスフェクションはまた卵巣および大腸−直腸腫瘍細胞を放射線に対して感受性にすることも示されている。アデノウイルス介在ｗｔｐ５３送達は、頭頸部腫瘍系の放射線耐性扁平上皮細胞癌(ＳＣＣＨＮ)における機能的アポトーシスを回復させ、これらの細胞をインビトロで放射線感受性にする。より顕著には、腫瘍内注射したアデノ−ｗｔｐ５３と放射線の組合わせが、確立したＳＣＣＨＮ異種移植片腫瘍の完全なそして長期の腫瘍退行を導いた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本発明はまたＭａｂ、リンカー、ポリリジン等を使用して、ウイルスベクターにトランスフェリンを結合させる、先に使用の方法に関連して記載されている苛酷な化学物質および複雑な処理工程を有利に回避する、ウイルスベクター−トランスフェリン混合物の製造法を提供する。
本発明により、リガンド−ウイルス混合物を、任意の担体または媒体(典型的に、水性担体)中で調製でき、インビトロまたはインビボ投与に薬学的に適した組成物を提供する。本組成物は、典型的に適当なｐＨに緩衝化され、浸透圧調節剤、抗生物質等のような適当な補助成分を含み得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
混合物に使用するウイルス粒子の量および最終的に宿主動物に投与する(またはインビトロで細胞に投与する)量は、科学文献に記載の遺伝子移入および遺伝子治療の既知の原則に基づいて、当業者により決定される。本発明の混合物は、ウイルスベクターの投与に関して先に記載のものと類似の方法を介して投与され、インビトロまたはインビボ遺伝子移入または遺伝子治療をする。本発明は、ウイルスベクターの全身投与のための組成物および方法の提供により、現存する方法を改善する。本混合物の非経口投与(特に、静脈内または動脈内投与)が好ましい。ある場合、ウイルス粒子の実質的に(例えば、３０倍)少ない投与量を、本発明によりもたらされる改善された効率により、投与できることが予測される。あるいは、他の場合、既知の投与量を使用でき、増加した遺伝子の移入をもたらす。本発明の組成物中のウイルス粒子、リガンドおよび補助剤の濃度も、適当に選択する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明の具体的態様は、本発明の組成物を、放射線治療および／または化学療法と共に使用するために提供される。
本発明は、特定のウイルスベクターに、またはリガンド−ウイルスベクター混合組成物の投与の特定の経路または形態に限定されない。所望の総量は実験的に決定でき、１回または複数回投与で、遺伝子治療を必要とする患者に提供できる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
一つの薬剤ｐ５３遺伝子治療が長期間腫瘍を完全に除去するのに十分でないということは明らかになってきているが、Ｔｆ標的化アデノウイルスと慣用の放射線／化学療法の現在記載の組合わせは、生育阻害だけでなく、腫瘍退行を達成することができ、相乗作用を証明する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
化学療法および放射線に対する腫瘍の増感は、現在の治療モダリティーの効果の増加をもたらす。更に、その可能性は、この慣用の抗癌モダリティーの両方のタイプの必要な用量を減少し、それによりこれらの処置にしばしば関連するひどい副作用を減らすための腫瘍特異的組合わせ処置に存在する。実施例に記載のインビボ実験において、放射線と組合わせたＴｆ−Ａｄｐ５３の全身性投与は、完全なそして長期間の腫瘍退行を、腫瘍ターゲティングウイルスの３×１０８ｐｆｕほど少ない用量を使用してもたらした。この投与量は、Kataoka et al. (1998)により、非標的化Ａｄｐ５３と２−Ｍｅを使用して用いられたものと同様であった。本実験において、部分的腫瘍生育阻害(肺コロニー計数の３分の２減少)が観察された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
このシステムは遺伝子治療ベクターの腫瘍内注射の必要性を除き得るが、非常に攻撃的な癌の場合、また全身性および腫瘍内処置の両方を使用することが有益でもあり得る。このシステムはまた他のウイルス性癌処置の送達を助けるためにも適合し得る。例えば、爪の腫瘍細胞崩壊性ウイルスの現在の試験は全身性送達をサポートしていない。ＯＮＹＸ−０１５は、ｗｔｐ５３腫瘍抑制活性を欠く腫瘍細胞(“ｐ５３−欠失”細胞)中で効率的に複製し、殺し、正常細胞ではしない遺伝子的に修飾されたアデノウイルスである。このウイルスの特異的修飾は、正常細胞中で効率的に複製することを防止する。ＯＮＹＸ−０１５での臨床実験は、現在、頭頸部癌、膵臓癌および卵巣癌のため進行中である(Heise et al., 1997; Hall et al., 1998; Linke, 1998; Krin et al., 1998)。ウイルスが腫瘍を標的とする我々の能力は、ＯＮＹＸ−０１５のような他のウイルスをベースにした癌処置の効率を有意に改善し得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
最も顕著には、全身性投与は、一次腫瘍および離れた転移癌に治療的遺伝子が到達できることを意味する。これは、腫瘍内注射で達成されるものと、明確に対照をなす。本明細書に記載の方法は、現存する組換えウイルスをターゲティングするために適合できる。送達する遺伝子にも無関係である。加えて、このシステムは、上記のように、腫瘍細胞崩壊性ウイルスでも使用できる。ターゲティングのためのＴｆの使用は、広範囲のスペクトルの癌が上昇したレベルのＴｆＲを発現し、５０％を超える癌で、ｐ５３遺伝子が関与するため、ヒト癌のｐ５３遺伝子治療に関連して特に魅力的である。したがって、これらの発見は、このＴｆ標的化アデノウイルス送達システムの、この疾病に対する戦いにおいて、遺伝子治療の最初の約束を果たすことを助ける、新規な、より優れたそして有効な形の癌の遺伝子治療としての臨床的な可能性を証明する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
５×１０４  ＪＳＱ−３細胞／ウェルを２４ウェルプレートで培養した。２４時間後、細胞を一度血清なしのＥＭＥＭで洗浄し、０.３ｍＬの血清なしのＥＭＥＭまたは抗生物質を各ウェルに添加した。２００μＬ  ＥＭＥＭ中のトランスフェリン対ウイルスの異なる比率のＡｄ５ＬａｃＺまたはＴｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ複合体をウェルにデュプリケートで添加した。ウイルス対細胞比率は２０から２０００ウイルス粒子／細胞(ｐｔ／細胞)までであった。４時間、３７℃で５％ＣＯ２中で時々揺すりながらインキュベーションした後、０.５ｍＬの２０％血清含有ＥＭＥＭをウェルに添加した。２日の培養後、細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、１×レポーター融解緩衝液(Promega)に融解した。細胞融解物を１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４５０μＭ  β−メルカプトエタノール含有２０ｍＭ  トリス(ｐＨ７.５)中、１００μＬの１５０μＭ  Ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドで３７℃で３０分処理した。反応を１５０μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３の添加により停止させた。吸光度４０５ｎｍで測定した。精製β−ガラクトシダーゼ(Boehringer)を使用して標準曲線を作成した。結果は、全タンパク質のｍｇ当たりのβ−ガラクトシダーゼ等量のミリ単位(ｍＵ)として示した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
Ｄ．結果および考察
Ｔｆ対ウイルスまたはウイルス対細胞の一定の比率で、Ｔｆ−ＡｄＬａｃＺでの発現は、非標的化ＡｄＬａｃＺで見られるよりも３倍から４倍の間高かった(図１参照)。５００ｐｔ／細胞または２.５ＭＯＩ(感染効率、またはｐｆｕ／ウェル)、レポーター遺伝子産物のβ−ガラクトシダーゼの１０ｍＵ／ｍｇタンパク質が、ＡｄＬａｖＺ単独で発現された。トランスフェリン−ウイルス混合物Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５００Ｔｆ分子／ｐｔ)での形質導入は、レポーター遺伝子発現の２５ｍＵ／ｍｇタンパク質を産生し、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５,０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は３０ｍＵ／ｍｇ発現を産生し、そしてＴｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５０,０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は３８.８ｍＵ／ｍｇ発現を産生し、これはＡｄ５ＬａｃＺ単独よりも各々２.５倍、３倍および３.８倍より遺伝子導入が達成されたことを示す。１,０００ｐｔ／細胞または５ＭＯＩで、Ａｄ５ＬａＺ単独よりも、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５００Ｔｆ分子／ｐｔ)は２.４倍多いレポーター遺伝子発現を、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は３.３倍多い遺伝子発現を提供した。Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ(５０,０００Ｔｆ分子／ｐｔ)は、見かけ上の飽和である、２.６倍多い発現をした。したがって、Ｔｆ−Ａｄ５ＬａｃＺ複合体の最適比は、約５００−５０,０００Ｔｆ分子／ｐｔ、好ましくは約５０００Ｔｆ分子／ｐｔであるように見える。ウイルス粒子の表面をコートするのに使用する大量のトランスフェリン分子は、血流を移動するとき、その安定性を増加させると考えられる。ビリオン表面上の大量のトランスフェリン粒子は、またウイルスの免疫原性のウイルス抗原曝露の遮断による減少のために働き得る。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
二つのタイプのヒト腫瘍を、上記培養実験で使用したＳＣＣＨＮ細胞系(ＪＳＱ−３)またはヒト前立腺癌細胞系ＤＵ１４５(Isaacs et al., 1991; Asgari et al., 1997)のいずれかの皮下注射によりヌードマウスに異種移植片として確立させた。ヌードマウス腫瘍モデルを、４−６週齢雌ヌードマウスの脇腹にＪＳＱ−３細胞またはＤＵ１４５細胞を皮下注射することにより確立させた(Xu et al., 1997)。腫瘍を１−２ｃｍ３のサイズまで生育させた。１×１０９−１×１０１０ｐｔ  Ａｄ５ＬａｃＺ複合体と異なる量の２００−３００μＬのＴｆを各マウスに、１ｃｃシリンジで３０Ｇ針で尾静脈から注射した。コントロールグループにおいて、Ａｄ５ＬａｃＺを注射した。注射３日後、腫瘍ならびにマウス組織を摘出し、１ｍｍ切片に切断し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％ホルムアルデヒド／０.２％グルタールアルデヒドで４時間室温で固定した。固定した腫瘍切片を４回、各１時間洗浄し、Ｘ−Ｇａｌ溶液＋０.１％ＮＰ−４０(ｐＨ８.５)で一晩３７℃で染色した。染色した腫瘍切片を、通常の組織学的方法を使用して包埋させて薄片化にし、nuclear fast redで対比染色した。腫瘍当たり４個の切片を試験し、青色染色細胞で示される、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現を評価した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例３
ＤＵ１４５異種移植片ヌードマウスモデルにおけるインビボのｐ５３のトランスフェリン標的化アデノウイルス介在遺伝子送達およびタンパク質発現
トランスフェリン標的化アデノウイルスベクターがｐ５３遺伝子を腫瘍細胞に選択的に送達する能力を試験した。正常ヒトｐ５３遺伝子を担持する非増殖性アデノウイルス抗原型５を本実験に使用した。Ａｄｐ５３と名付けたこのウイルスをＴｆ−Ａｄｐ５３の製造に使用した。Ｔｆ−Ａｄｐ５３を、ホロ−トランスフェリンとＡｄｐ５３の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４中で１.５×１０５Ｔｆ分子／ビリオンの比率での混合により、製造した。１０分、４℃でインキュベーション後、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、ｐＨ７.４を添加して最終容量３００μＬ／マウスとし、５％デキストロースの最終濃度にした。皮下ＤＵ１４５腫瘍担持ヌードマウスへのこれらのウイルスのｉ.ｖ.注射３日後、マウスを殺し、腫瘍および臓器を摘出し、ｐ５３タンパク質発現のウェスタンブロット分析を行った(図３)。この実験に使用した抗体は、ヒトｐ５３の正常および変異形の両方と反応し、マウスｐ５３と交差反応する。ｐ５３バンドはウイルス性に形質導入された野生型ｐ５３が、ＤＵ１４５細胞において見られるｐ５３の変異形の上に、ゲル中で移動することを示す。これは、図３の左の二つのレーンで見られ、ＤＵ１４５細胞を、Ａｄｐ５３との培養で感染させたＤＵ１４５細胞と比較する。ウイルス性にコードしたｗｔｐ５３を示す上部のバンドは、ＤＵ１４５細胞がインビトロでＡｄｐ５３に感染することを明らかにした。第１レーン(ＤＵ１４５＋Ａｄｐ５３)は、２.５μｇのタンパク質しか含まず、他方、図３の他の全てのレーンは１００μｇの総タンパク質を含むことは注意すべきである。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
異種移植片を、４−６週齢雌無胸腺ヌード(Ncr nu-nu)マウスに、各動物の尾の上の背中の下の方への４×１０６  ＪＳＱ−３細胞(コラーゲンマトリックスであるMatrigel(登録商標)中)の皮下注射により誘導させた。ＪＳＱ−３細胞系は再発性ＳＣＣＨＮ由来であり、非常に放射線耐性であることが既知である。腫瘍を１００−２００ｍｍ３のサイズまで発育させた。標的化Ａｄ−ｐ５３と名付けた標的化アデノウイルスを、実施例１のように、トランスフェリンと、ｗｔｐ５３をコードするＤＮＡを担持するアデノウイルスの混合により製造した。アデノウイルス粒子(ｐｔ)／プラーク形成単位(ｐｆｕ)を、この実験のために計算した。動物を４つのグループに分けた：(ｉ)非処理(−)照射；(ii)非標的化Ａｄ−ｐ５３(＋)照射；(iii)標的化Ａｄ−ｐ５３(−)照射；(iv)標的化Ａｄ−ｐ５３(＋)照射。１×１０１０ｐｔ／マウス／注射(約３×１０８ｐｆｕと等量)の標的化(Ｔｆリガンドとウイルスの混合物を注射)または非標的化(リガンドなし)Ａｄ−ｐ５３を、マウス(グループii、iiiおよびiv)に、尾静脈から、３から４日毎に注射した。合計６回の注射を行った。最初のｉ.ｖ.注射後、動物(グループiiおよびivの)を、腫瘍領域のみへの照射を可能にするリードホルダーに固定し、２.０Ｇｙの１３７Ｃｓ電離放射線の最初の分割用量を、J.L. Shepard and Associates Mark I照射器を使用して投与した。その後、動物は２.０Ｇｙ／日を５日連続で投与され、続く２日は照射処置なしであった。このサイクルを、合計３０Ｇｙが投与されるまで続けた。腫瘍サイズを、毎週、盲験法(blinded manner)で測定した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ遺伝子、ＲｖＬａｖＺ(A Lac Z, Gene Transfer Vector Gore, University of Iowa)を含む非増殖性レトロウイルスを、３×１０７形質転換単位(ＴＵ)／ｍＬを含む１×１０１０粒子(ｐｔ)／ｍＬで本実験に使用した。トランスフェリンとＴｆ−ＲｖＬａｖＺ複合体を、実施例１の記載と同様に製造した。簡単に、Ｔｆを０.５ｍｇ／ｍＬに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７.４中で希釈し、異なる量のＴｆを５０μＬ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に連続希釈で添加した。ＲｖＬａｃＺを次いで試験管に添加し、Ｔｆ対ウイルス比が１×１０２から１×１０６Ｔｆ分子／ビリオンまでの範囲となるようにした。試験管を室温で１０−１５分、２分に１回揺すりながらインキュベートし、次いで血清なしの１５０μＬ  ＥＭＥＭを各試験管に添加した。インビトロレトロウイルス形質導入を、実施例１に記載のように行った。ウイルス対細胞比は１００から２０００ウイルスｐｔ／細胞であった。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
トランスフェリンは、複製コンピテントウイルスベクターであるＨＳＶの形質導入効率を促進する。ＨＳＶを熱不活性化したとき、Ｔｆとの複合体化はまだ促進された形質導入効率を示した。５００００のＴｆ／ビリオン比率およびＭＯＩ＝１で、ＴｆＨＳＶはＴｆターゲティングなしのＨＳＶよりも２倍以上大きいレポーター遺伝子発現をした。結果は、トランスフェリンターゲティングストラテギーが、ＨＳＶのような複製コンピテントウイルスベクターで使用できることを証明する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
実施例９
化学療法剤ドセタキセル(タキソテール)と組合わせたＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片ヌードマウスモデルにおけるインビボトランスフェリン標的化全身性アデノウイルス介在遺伝子送達
この標的化アデノウイルス送達システムの有用性を更に証明するために、第２の腫瘍モデルであるヒト乳癌由来細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を使用した。更に、化学療法がしばしば選り抜きの乳癌の処置であるため、この実験は、本発明の送達システムが、確立されたヒト乳癌異種移植片の慣用的に使用されている化学療法剤ドセタキセル(タキソテール)に対する増感をする能力を試験した。異種移植片を４−６週齢雌無胸腺ヌード(NCr nu-nu)マウスに、２.５×１０６  ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を各動物の乳房脂肪パッドに皮下注射することにより誘導させた。腫瘍を４０−５０ｍｍ３のサイズに発育させた。Ｔｆ−Ａｄｐ５３と名付けた標的化アデノウイルスを、実施例１に記載のように、トランスフェリンと、ｗｔｐ５３をコードするＤＮＡを担持するアデノウイルスの混合により製造した。動物を５つのグループに分けた：(ｉ)非処置(−)タキソテール；(ii)タキソテール単独；(iii)非標的化Ａｄｐ５３(＋)タキソテール；(iv)標的化Ａｄ−ｐ５３(−)タキソテール；(ｖ)標的化Ａｄｐ５３(＋)タキソテール。マウスに、３から４日毎に、標的化(Ｔｆリガンドとウイルスの混合物を注射した)または非標的化(リガンドなし)Ａｄｐ５３を、５×１０１０ｐｔ／マウス／注射で、尾静脈から、ｉ.ｖ.注射した。合計１２回の注射をした。最初の静脈注射の翌日、薬剤処置を開始した。動物は、タキソテールを７.５ｍｇ／ｋｇ、３から４日毎にｉ.ｖ.投与され、合計１１回注射した。腫瘍サイズを毎週盲験法で、合計６−８腫瘍／グループで測定した。腫瘍容量の平均サイズ／グループ(ｍｍ３)±標準誤差対時間(日)をプロットした(図６)。Ｔｆ−Ａｄｐ５３単独での処置は効果がなかったが、タキソテール単独または非標的化Ａｄｐ５３＋タキソテールでの処置はある生育阻害を誘導し、薬の効果を示す。しかし、より劇的なレベルの生育阻害が、Ｔｆ標的化Ａｄ−ｐ５３をタキソテールと組み合わせて投与された動物の腫瘍から観察された。これらの発見は、組合わせ処置の相乗作用を示し、本発明のトランスフェリン標的化Ａｄｐ５３複合体が多くのヒト腫瘍モデルで有効なだけでなく、腫瘍の化学療法剤への増感に使用できることを証明する。