(57)【要約】  本発明は、手足口病（ＨＦＭＤ）の病原体であるエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）に対するヒト化抗体、並びにこれらの抗体を含む医薬組成物、並びにＨＦＭＤの治療、予防法及び診断におけるそれらの使用方法を提供する。これらの抗体は、ＨＦＭＤを有するヒト被験体、又は例えば感染個体への曝露の結果としてＨＦＭＤのリスクがあるヒト被験体への使用に好適である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む抗体であって、
ａ）前記重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）が、以下の８個の置換：Ｙ２７Ｘ６、Ｔ２８Ｘ２、Ｆ２９Ｘ１、Ｔ３０Ｘ４、Ｒ６７Ｘ４、Ｓ９８Ｘ２、Ｖ６８Ｘ１及びＲ７２Ｘ１のうち少なくとも６個を有する配列番号１を含み、任意に最大４個の付加的なフレームワーク置換を有していてもよく、ここで、各Ｘ１残基は独立してＩ、Ａ、Ｌ、Ｍ及びＶからなる群から選択され、各Ｘ２残基は独立してＮ、Ｃ、Ｑ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、各Ｘ４残基は独立してＫ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、Ｘ６残基はＦ及びＷからなる群から選択され、
ｂ）前記軽鎖可変ドメイン（ＶＫドメイン）が配列番号２を含み、任意に最大４個のフレームワーク置換を有していてもよい、抗体。
【請求項２】
ａ）前記重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）が以下の８個の置換：Ｙ２７Ｆ、Ｔ２８Ｎ、Ｆ２９Ｉ、Ｔ３０Ｋ、Ｒ６７Ｋ、Ｓ９８Ｎ、Ｖ６８Ａ及びＲ７２Ａのうち少なくとも６個を有する配列番号１を含み、任意に最大４個の付加的なフレームワーク置換を有していてもよく、
ｂ）前記軽鎖可変ドメイン（ＶＫドメイン）が配列番号２を含み、任意に最大４個のフレームワーク置換を有していてもよい、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｓ７７Ｘ２、Ｋ２３Ｘ２及びＲ３８Ｘ４から選択される１個、２個又は３個の付加的な重鎖ドメインフレームワーク置換を含み、ここで、各Ｘ２残基は独立してＮ、Ｃ、Ｑ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ４残基はＲ、Ｈ及びＫからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
Ｓ７７Ｎ、Ｋ２３Ｔ及びＲ３８Ｋから選択される１個、２個又は３個の付加的な重鎖ドメインフレームワーク置換を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
重鎖ドメインフレームワーク置換Ｓ９８Ｎを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記軽鎖ドメインが群Ｉ２Ｘ１、Ｖ３Ｘ１及びＱ５０Ｘ４から選択される１個、２個又は３個の置換を含み、ここで、各Ｘ１残基は独立してＶ、Ｌ、Ａ、Ｉ及びＭからなる群から選択され、Ｘ４残基はＫ、Ｒ及びＨからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記１個、２個又は３個の置換がＩ２Ｖ、Ｖ３Ｌ及びＱ５０Ｋから選択される、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記ＶＨドメインが置換Ｙ２７Ｆ、Ｔ２８Ｎ、Ｆ２９Ｉ、Ｔ３０Ｋ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ａ及びＳ９８ＮをＳ７７Ｎ、Ｋ２３Ｔ及びＲ３８Ｋから選択される１個、２個又は３個の付加的なフレームワーク置換と共に有する配列番号１を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記付加的なフレームワーク置換がＫ２３Ｔ及びＳ７７Ｎである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ＶＨドメインがＨＭ（配列番号３）、ＨＮ（配列番号４）又はＨＱ（配列番号５）ＶＨドメインを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ＶＫドメインが配列番号２を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号３のＶＨドメインと配列番号２のＶＫドメインとを含む抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む第１の抗原結合部位と、別の感染因子に結合することができる第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体であって、前記別の感染因子が任意にコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）ウイルスであってもよい、二重特異性抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を薬学的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物。
【請求項１５】
別の感染因子に結合する第２の抗体を更に含み、該第２の抗体が任意にコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）ウイルスに結合することができる抗体であってもよい、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１７】
プロモーターに操作可能に連結した請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸又は請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法であって、宿主細胞培養物中で請求項１７に記載のベクターを発現させ、前記抗体を産生させることと、該抗体を前記細胞培養物から回収することとを含む、方法。
【請求項２０】
処置を必要とする個体に、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１４若しくは１５に記載の医薬組成物を有効量投与することによるＨＦＭＤの治療方法又は予防法。
【請求項２１】
ヒト又は動物の身体の処置方法に使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１４若しくは１５に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記処置が個体におけるＨＦＭＤの治療的処置又は予防的処置である、請求項２１に記載の使用のための抗体又は組成物。
【請求項２３】
体液サンプル中のＥＶ７１抗原又はＥＶ７１抗原のＳＰ７０ペプチドエピトープの存在を検出するための診断キットであって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、手足口病（ＨＦＭＤ）の病原体（causative agent）であるエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）に対するヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＦＭＤ
手足口病（ＨＦＭＤ）は、幼児によく見られる感染性疾患である。近年、ＨＦＭＤ感染はアジア太平洋地域で流行しており、重症の病気及び致死を引き起こしている。例えば２０１２年には、合計２１９８４４２件のＨＦＭＤ症例が中国で報告されており、そのうち、神経学的合併症を伴う重症例は２００００件を超え、死亡が５６９件である。
【０００３】
現在、ＨＦＭＤに利用可能な特定のワクチン又は抗ウイルス薬はない。したがって、この非常に感染性の強い疾患に対抗する処置に対して明らかに満たされていない医学的必要性がある。
【０００４】
ＥＶ７１
エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）は、ＨＦＭＤの２つの主要病原体の１つである（もう一方はコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）である）。ＥＶ７１は当初、脳炎を有する生後９ヶ月の小児の糞便からの単離により、１９６９年に米国においてＨＦＭＤの病原体の１つとして同定された。その後５年の間に、脳炎及び無菌性髄膜炎を含む神経感染の小規模の発生がオーストラリア、日本、スウェーデン及び米国にわたって報告され、ＥＶ７１感染に起因すると考えられた（非特許文献１）。１９７０年代には２回のＨＦＭＤの大発生が欧州において報告され、ＥＶ７１感染に起因すると考えられた。１９９７年以来、ＥＶ７１がアジア太平洋地域における発生に関与していることが示され、最大のアジア太平洋での流行が２００８年に中国において報告された。心肺機能不全を伴う脳幹脳炎がアジアにおけるＥＶ７１に関連した流行の注目すべき特徴となっており、主要な死因である。
【０００５】
近年の臨床調査により、２００９年の中国におけるＨＦＭＤ発生時の２６６件の研究室で確認されたＨＦＭＤ症例の５０．４％及び３８．３％が、それぞれＥＶ７１感染及びＣＡ１６感染に起因するものであったことが示されている。ＥＶ７１に感染した個体は通常、発熱、口腔内潰瘍、並びに手、足及び臀部の表面上の発疹を含む軽度の症状を呈する。しかしながら、患者の一部は、最終的に死に至る可能性があるポリオ様麻痺、脳幹脳炎及び肺水腫等の重症の神経学的合併症を発症する。例えば、近年の報告から、９２件の神経学的合併症を伴う重症ＨＦＭＤ症例のうち、６５件がＥＶ７１に感染していたことが示されている。
【０００６】
ＥＶ７１は、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属のメンバーである。ＥＶ７１は、エンベロープのない（unenveloped）２０面体カプシドにパッケージングされた約７．４ｋｂの一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有する。ＥＶ７１カプシドに対する抗体は、許容細胞へのウイルスの侵入を妨げ、したがってウイルス感染を中和する可能性がある。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）がｉｎ  ｖｉｖｏ保護において役割を果たす場合もある。
【０００７】
抗体療法
ＨＦＭＤに対するワクチン接種は、ＥＶ７１又はこの疾患の他の病原体による感染を予防又は軽減する潜在的手段である。しかしながら、感染因子に対するワクチンが存在する場合であっても、この因子に起因する死亡率を低減する最適経路でない可能性がある。例えば、集団にワクチン接種を行うことが経済的に実行可能でない場合があり、又は取込みが発生を予防するのに必要とされるよりも低い場合があり得る。ＥＶ７１等のウイルスについては、代替選択肢は、合併症を発症する感染個体を治療することができる抗体を提供し、及び／又はかかる個体と接触する個体に対する予防的処置を提供することである。
【０００８】
ＥＶ７１に対する抗体
特許文献１は、ＥＶ７１感染の中和に特異的なマウスハイブリドーマ細胞株に由来するモノクローナル抗体を記載している。特許文献１の発明者らは、抗体を、ヒト化抗体を含む様々なフォーマットで投与し得ることを提唱している。特許文献２は、種々のネズミモノクローナル抗ＥＶ７１抗体Ｄ５を記載している。
【０００９】
ヒト化抗体
ヒト被験体への使用のために開発されたネズミ抗体をヒト化することが一般に望ましい。原則として、ネズミ重鎖及び軽鎖可変領域の各々の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ネズミフレームワーク領域に対して或る程度の相同性を有するフレームワーク領域を有するヒト抗体の可変領域へと変換することが含まれる。しかしながら、抗体のヒト化と関連する多数の問題点が見られる。単純にＣＤＲをヒトフレームワークへと変換することは通常、元のネズミ抗体と比較して相当な結合親和性の喪失をもたらす。さらに、ヒト化抗体は作製がより困難である可能性があり、及び／又は凝集傾向若しくは熱安定性の欠如を含む１つ以上の望ましくない物理的若しくは化学的特性を有し得る。このため、ネズミ抗体が候補治療剤と考えられる場合であっても、臨床での使用に好適となる結合親和性と他の望ましい物理的及び化学的特性との組合せを有するヒト化バージョンを提供することが可能でない場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０２９２６９３号
【特許文献２】中国特許出願公開第１０３４２１１１２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Solomon T et al., Lancet Infect Dis, 2010 Nov;10(11):778-90
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らはＤ５抗体を調査した。この抗体が新生仔マウスにおけるＥＶ７１の致死的チャレンジに対する保護をもたらすことが決定された。加えて、ＥＶ７１感染の１日後のＤ５による治療的処置がＥＶ７１感染動物の生存を顕著に改善することも示された。
【００１３】
Ｄ５が許容細胞へのＥＶ７１結合を阻害することができ、Ｄ５がＥＶ７１を付着後段階で中和することができることも見出された。これらの特性により、Ｄ５がＥＶ７１感染に対する効果的な作用物質であり、ＥＶ７１株に感染した個体におけるＨＦＭＤの処置に使用することができることが示される。
【００１４】
本発明の目的は、ヒト被験体への使用に好適なヒト化Ｄ５抗体を提供することである。かかる被験体はＨＦＭＤを有する被験体、又は例えば感染個体への曝露によりＨＦＭＤのリスクがある被験体であり得る。本発明者らは、Ｄ５抗体のＣＤＲに潜在的に好適な担体である一次配列を有する重鎖及び軽鎖ヒトフレームワーク領域を同定した。しかしながら、単純にＤ５  ＣＤＲを明らかに適合したヒトフレームワークへと変換することで、その標的抗原への結合が実質的に低下したヒト化抗体が生じた。抗体の詳細な構造分析及び機能分析後に、本発明者らは改善された中和活性、並びに臨床試薬に望ましい又は必要な他の物理的及び化学的特性を有する修飾抗体を作製することが可能であった。
【００１５】
一態様では、本発明は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含むヒト化Ｄ５抗体であって、
ａ）上記重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）が、以下の８個の置換：Ｙ２７Ｘ６、Ｔ２８Ｘ２、Ｆ２９Ｘ１、Ｔ３０Ｘ４、Ｒ６７Ｘ４、Ｖ６８Ｘ１、Ｒ７２Ｘ１及びＳ９８Ｘ２のうち少なくとも６個を有する配列番号１を含み、任意に最大４個の付加的なフレームワーク置換を有し、ここで、各Ｘ１残基は独立してＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＶからなる群から選択され、各Ｘ２残基は独立してＮ、Ｃ、Ｑ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、各Ｘ４残基は独立してＲ、Ｈ及びＫからなる群から選択され、Ｘ６残基はＦ及びＷからなる群から選択され、
ｂ）上記軽鎖可変ドメイン（ＶＫドメイン）が配列番号２を含み、任意に最大４個のフレームワーク置換を有する、抗体を提供する。
【００１６】
上記及び本明細書の下記の「置換（複数の場合もある）」という用語は、アミノ酸残基「Ｘｎ」（ここで、「ｎ」は１〜６のいずれかである）が配列番号１の対応する位置に存在するアミノ酸とは異なることを意味する。
【００１７】
本発明の抗体の具体例を本明細書で下記に記載する。本明細書において本発明の抗体を含む生成物、その組成物、又はそれに関するプロセス、方法若しくは使用に言及する場合、かかる言及は、本明細書で下記に言及されるかかる抗体の任意の具体的な例を含むが、これに限定されない上記の定義内の任意の本発明の抗体を指すことが理解される。
【００１８】
本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を更に提供する。本発明は、プロモーターに操作可能に連結した核酸を含むベクターを更に提供する。本発明は、かかる核酸又はベクターを含む宿主細胞を更に提供する。
【００１９】
宿主細胞培養物中で本発明の核酸又はベクターを発現させて抗体を産生させ、抗体を細胞培養物から回収することによって本発明の抗体を作製する方法も本発明によって提供される。
【００２０】
本発明は、本発明の抗体を薬学的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物も提供する。
【００２１】
本発明は、処置を必要とする個体に本発明の抗体又は医薬組成物を有効量投与することによるＨＦＭＤの治療方法又は予防法も提供する。個体はＨＦＭＤを有する又はＨＦＭＤに罹るリスクがある個体であり得る。
【００２２】
本発明は、ヒト又は動物の身体を処置する方法に使用される本発明の抗体又はその医薬組成物を更に提供する。処置方法は、個体におけるＨＦＭＤの治療的又は予防的処置であり得る。
【００２３】
本発明は、本発明の抗体を含む診断キットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒト化重鎖の可変ドメインの配列を示す図である。ネイティブネズミＤ５  ＶＨ及びヒト重鎖ドナー候補ＥＦ１７８０５３の配列をアラインメントする。ヒト化重鎖変異体Ｄ５  ＨＡ〜Ｄ５  ＨＱを、ＥＦ１７８０５３中のヒト残基から対応するネズミＤ５残基への復帰突然変異を示す強調表示された残基と共に示す。
【図２ａ−２ｂ】キメラＤ５抗体（ｃＤ５）が、ＥＶ７１  ＶＬＰ（ウイルス様粒子）及びＳＰ７０ペプチドエピトープに、ネズミＤ５（ｍＤ５）抗体を用いて観察されるものと同等のＥＣ５０値で結合することを示す図である。結合を濃度系列にわたるＥＬＩＳＡによって測定した。
【図３】ネズミＤ５（ｍＤ５）及びキメラＤ５（ｃＤ５／ｃｈＤ５）抗体がＥＶ７１−ＶＬＰに同等の見かけのＫＤ値で結合し、それらがウイルスに対して同様の親和性を有することが実証されることを示す図である。濃度系列はバイオレイヤー干渉法（Bio-Layer Interferometry）を用いて行った。
【図４】軽鎖の可変ドメインの配列を示す図である。ネイティブネズミＤ５  ＶＫ軽鎖とヒト軽鎖ドナー候補ＡＪ３８８６４６との間に差異を観察することができる。ヒト化軽鎖変異体Ｄ５  ＫＡ〜Ｄ５  ＫＥを、ヒト残基を同等のネズミＤ５残基に復帰突然変異させた位置を示す強調表示された残基と共に示す。
【図５】キメラＤ５抗体（ｃＤ５  ＣＨＣＫ）と比較し、結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合のＥＶ７１−ＶＬＰ及びＳＰ７０ペプチドエピトープに対するヒト化Ｄ５抗体変異体ｈＥＶ７１  ＨＡＫＡ、ｈＥＶ７１  ＨＡＫＢ、ｈＥＶ７１  ＨＢＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＢＫＢの結合能の低減を示す図である。
【図６】キメラＤ５抗体（ｃＤ５  ＣＨＣＫ）と比較し、結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合のＳＰ７０ペプチドエピトープに対する更なるヒト化Ｄ５抗体変異体ｈＥＶ７１  ＨＣＫＡ〜ｈＥＶ７１  ＨＪＫＡの結合能の低減を示す図である。
【図７】ヒト化Ｄ５抗体変異体ｈＥＶ７１  ＨＡＫＡ〜ｈＥＶ７１  ＨＪＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＡＫＢ〜ｈＥＶ７１  ＨＪＫＢのＥＶ７１ウイルス中和能を示す図である。ウイルスを中和することが可能な抗体変異体は、ＨＢ重鎖変異体を含むもののみであった。ｃＤ５はキメラＤ５抗体であり、ｍＤ５  ＩｇＧ１はネイティブネズミＤ５抗体である。
【図８】ＳＰ７０ペプチドエピトープに対するＨＢ、ＨＭ、ＨＮ、ＨＰ及びＨＱ重鎖変異体をＫＡ軽鎖と組み合わせて含有するヒト化Ｄ５抗体変異体の結合能を示す図である。結合を結合ＥＬＩＳＡによって測定した。ｈＥＶ７１  ＨＢＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＮＫＡは同様の結合能を示す。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＱＫＡは、ＳＰ７０エピトープに対してキメラＤ５抗体（ｃＤ５  ＣＨＣＫ）と同様の、より大きな結合能を示す。ｈＥＶ７１  ＨＰＫＡはＳＰ７０エピトープに対して低い結合を示す。
【図９】１５個のＳＰ７０ペプチドエピトープの変形に対するｈＥＶ７１  ＨＢＫＡ、ＨＭＫＡ、ＨＮＫＡ、ＨＰＫＡ及びＨＱＫＡ抗体変異体の結合能を示す図である。結合を各抗体のＥＣ８０で結合ＥＬＩＳＡによって測定した。ＳＰ７０エピトープ変異をアラニンスキャニングによって生成した。ＨＭ、ＨＮ、ＨＰ及びＨＱ重鎖を含むｈＥＶ７１変異体は、キメラＤ５抗体（ｃＥＶ７１  ＣＨＣＫ）及びｈＥＶ７１  ＨＢＫＡ変異体と同じＳＰ７０エピトープライブラリーに対する結合パターンを示す。
【図１０】ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ〜ｈＥＶ７１  ＨＱＫＡ抗体変異体のＥＶ７１ウイルス中和能を示す図である。ｈＥＶ７１  ＨＮＫＡはｈＥＶ７１  ＨＢＫＡと比較してウイルス中和に対する僅かな改善を示し、ｈＥＶ７１  ＨＰＫＡはウイルスを中和しない。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＱＫＡは、ＨＢＫＡ変異体に対する顕著な改善及びネズミＤ５抗体（ｍＤ５  ＩｇＧ１）に対するより小さな改善を示す。
【図１１】等温滴定型カロリメトリーによって行ったＳＰ７０ペプチドエピトープに対するキメラＤ５抗体（ｃＤ５）及びｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの結合を示す図である。観測結合定数（ＫＡ）、観測解離定数（ＫＤ）、エンタルピー（ΔＨ）及びエントロピー（ΔＳ）を両方の抗体について算出した。キメラＤ５抗体及びｈＥＶ７１  ＨＭＫＡは同様のＫＡ及びＫＤ値を有し、これらがＳＰ７０エピトープに同様の親和性で結合することを示す。
【図１２】ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の熱安定性を示す図である。図１２ａは、結合ＥＬＩＳＡによって測定された２５℃〜８０℃の温度処理後のＥＶ７１  ＳＰ７０エピトープに対する抗体の結合活性を示す。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡは、エピトープ結合活性を７０℃まで保持した。図１２ｂは、融解温度（Ｔｍ）がサーマルシフトアッセイにおいておよそ７０℃であることを示す。
【図１３】ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡが凝集傾向を有しないことを示す図である。抗体をＨＰＬＣシステムのサイズ排除カラムに０．４ｍｌ／分で注入し、多角度光散乱によって分析して絶対モル質量を決定し、凝集を確認した。プロファイルは凝集の徴候を示さず、およそ１３６．６ｋＤａの平均分子量がＩｇＧモノマーについて予想される。１．００の多分散性値から、抗体が単分散であることが明らかとなり、高い質量回収率（mass recovery）から、抗体がカラムに張り付かないか、又は不溶性凝集体を含有することが示される。
【図１４】ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡが非特異的相互作用の傾向が低く、良好な溶解性を有することを示す図である。相互作用（Cross-Interaction）クロマトグラフィーを、非特異的相互作用及び溶解性を評価するために行った。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの低い保持指数（ｋ’）から、抗体が非特異的相互作用と関わる可能性が低く、良好な溶解性を有することが示される。
【図１５】ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体を最大約１００ｍｇ／ｍｌまで明らかな沈殿なしに濃縮することができることを示す図である。可溶性凝集体について試験するために動的光散乱（ＤＬＳ）を用いた。平均粒径（Ｚ−Ａｖｅ直径）及び多分散指数（ＰＤＩ）をキュムラント分析によって得たが、濃縮前及び濃縮後の抗体サンプルについて同様の値を示す。
【図１６】ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡを凍結／融解処理に供することで凝集が引き起こされないことを示す図である。精製ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡのサンプルを、−８０℃で１５分間に続いて室温で１５分間の融解の１０サイクルにより処理し、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱）によって分析した。処理したｈＥＶ７１  ＨＭＫＡサンプルは、モノマーＩｇＧの範囲の分子量を有する種を含有しており、抗体は単分散であった（すなわち、１つの分子量が存在する）。
【図１７】４℃、２５℃、３７℃又は５０℃に３３日間曝露したｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析を示す図である。抗体の凝集は明らかでなく、分子量はモノマーＩｇＧと同様であり、抗体は単分散である。
【図１８】ｈＥＶ７１抗体がマウス、ヒト及びカニクイザルの血清中で１ヶ月間安定していることを示す図である。抗体を各血清又はＰＢＳ対照中で３０日間インキュベートし、インキュベーション期間後のＳＰ７０ペプチドエピトープへの抗体の結合を結合ＥＬＩＳＡによって測定した。ＳＰ７０ペプチドへの血清とインキュベートした抗体の結合は、ＰＢＳとインキュベートした抗体及び非インキュベート抗体の結合と非常によく似ていた。
【図１９】ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡによる処理が１４日間のＥＶ７１ウイルスによるマウスのチャレンジ後に１００％の生存をもたらすことを示す図である。
【図２０】１０ｍＭ、２５ｍＭ及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ）バッファー中でのサイズ分布の測定によるｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体バッファースカウト（scout）の結果を示す図である。
【図２１】１０ｍＭ、２５ｍＭ及び５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ）バッファー中でのサイズ分布の測定によるｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体バッファースカウトの結果を示す図である。
【図２２】１０ｍＭ、２５ｍＭ及び５０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ６．０、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ）バッファー中でのサイズ分布の測定によるｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体バッファースカウトの結果を示す図である。
【図２３】１０ｍＭ、２５ｍＭ及び５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ）バッファー中でのサイズ分布の測定によるｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体バッファースカウトの結果を示す図である。
【図２４】抗体ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡによる処理が、アカゲザルモデルにおいてＥＶ７１感染後の体温上昇を低減させることを示す図である（モデル対照群と比較した処理群：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；対照抗体群と比較した処理群：＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１）。
【図２５】抗体ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡによる処理が、アカゲザルモデルにおいて感染３、４日後の感染後ウイルス量を低減させることを示す図である（モデル対照群と比較した処理群：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；対照抗体群と比較した処理群：＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の抗体
本発明の抗体は、上記で規定されるように修飾された、それぞれ配列番号１及び配列番号２の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。本明細書では、残基ナンバリングが配列識別子（すなわち、フォーマット配列番号ｎの）に対して規定される場合、残基には最初の残基から通し番号が振られる。以下の実施例及び図面において、アミノ酸のナンバリングは、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)の定義に従っても論考される。Kabatナンバリングが使用される場合、このナンバリングは指定されるか又は文脈から明らかである。
【００２６】
本発明者らは、配列番号１の重鎖可変ドメイン及び配列番号２の軽鎖可変ドメインを含む抗体の特性を修飾するために変更することができる配列番号１及び配列番号２の多数のフレームワーク残基を同定した。以下の実施例では、フレームワーク残基を対応するネズミフレームワーク配列のものに戻るように変更した。しかしながら、ＶＨ及びＶＫドメインのヒトフレームワーク残基の代わりとなるアミノ酸残基のいずれか、例えば上記のようなＫ２３Ｔ置換中のＴｈｒ残基自体を同様の特性を有する別のアミノ酸で置換することができる（すなわち同じ機能グループのアミノ酸への保存的変化）。例えば、Ｔｈｒ及びＳｅｒがどちらも極性非荷電側鎖を有することから、Ｋ２３Ｔ置換をＫ２３Ｓ置換とすることができる。
【００２７】
保存的残基置換については、アミノ酸を以下のようにグループ分けすることができる：グループＸ１（非極性側鎖）：Ａｌａ（Ａ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｖａｌ（Ｖ）；グループＸ２（極性非荷電側鎖）：Ａｓｎ（Ｎ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）；グループＸ３（酸性側鎖）：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；グループＸ４（塩基性側鎖）：Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；グループＸ５（非極性側鎖を有する鎖配向に影響を与える残基）：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）；及びグループＸ６（芳香族非極性側鎖）：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）。
【００２８】
したがって、本発明の重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）は、以下の８個の置換：Ｙ２７Ｘ６、Ｔ２８Ｘ２、Ｆ２９Ｘ１、Ｔ３０Ｘ４、Ｒ６７Ｘ４、Ｖ６８Ｘ１、Ｒ７２Ｘ１及びＳ９８Ｘ２のうち少なくとも６個又は少なくとも７個を有する配列番号１を含み、任意に最大４個の付加的なフレームワーク置換を有する。このセットの置換の８個全てを含有する重鎖可変ドメインを、下記表１ＡでＨＢ’鎖と表す。
【００２９】
少なくとも６個の置換にＳ９８Ｘ２が含まれるのが好ましい。Ｓ９８Ｘ２が存在する場合、好ましくはＳ９８Ｎである。
【００３０】
一態様では、少なくとも６個、又は少なくとも７個、又は８個全ての置換がＹ２７Ｆ、Ｔ２８Ｎ、Ｆ２９Ｉ、Ｔ３０Ｋ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ａ及びＳ９８Ｎの群から選択される。少なくとも６個の置換にＳ９８Ｎが含まれるのが好ましい。この８個の置換の群はまとめてＨＢドメイン群置換と称される。上記の特定の置換の８個全てを含有する重鎖可変ドメインは、ＨＢ鎖（配列番号１１）と表される。
【００３１】
最大４個の付加的なフレームワーク置換が存在し得るが、これは１個、２個、３個又は４個の付加的な置換とすることができる。この置換は、ネズミ重鎖可変ドメインの対応する残基とは異なる配列番号１の残基にあるのが好ましい。置換される残基を、図１に示すアラインメントにおいて指定する。４個の置換のうち３個をＫ２３Ｘ２、Ｒ３８Ｘ４及びＳ７７Ｘ２から選択することができ、ここで、各Ｘ２残基は独立してＮ、Ｃ、Ｑ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ４残基はＲ、Ｈ及びＫからなる群から選択される。概して、ネズミ抗体配列の対応する残基のものへの復帰置換（back-substitutions）が行われていてもよい。４個の置換のうち３個をＫ２３Ｔ、Ｒ３８Ｋ及びＳ７７Ｎから選択することができる。
【００３２】
配列番号１のフレームワーク残基は残基１〜３０、３６〜４９、６７〜９８及び１０８〜１１８である。
【００３３】
以下の実施例において、配列番号１はＨＡドメインと称される。本発明のＶＨドメインの例は、ＨＢ’ドメイン群置換の６個、７個又は８個全てで置換されたＨＡ鎖の配列を含み、表１Ａに提示される組合せを含む。
【００３４】
【表１】
2019528037.tif 000003
【００３５】
ＨＢ’群置換の６個、７個又は８個全てが存在する場合、これらは（ａ）Ｋ２３Ｘ２、Ｒ３８Ｘ４及びＳ７７Ｘ２、（ｂ）Ｋ２３Ｘ２及びＲ３８Ｘ４、（ｃ）Ｒ３８Ｘ４及びＳ７７Ｘ２、（ｄ）Ｋ２３Ｘ２及びＳ７７Ｘ２、（ｅ）Ｋ２３Ｘ２、（ｆ）Ｒ３８Ｘ４又は（ｇ）Ｓ７７Ｘ２と組み合わせることができ、ここで、各Ｘ２残基は独立してＮ、Ｃ、Ｑ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、Ｘ４残基はＲ、Ｈ及びＫからなる群から選択される。これらの置換の任意の組合せを含む重鎖が、本明細書に記載される軽鎖配列のいずれかと組み合わせて抗体中に存在していてもよい。
【００３６】
例えば、Ｈｂ’１は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’２は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’３は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’４は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’５は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’６は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’７は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’８は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’９は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ’１０は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、ＨＢ’は上記に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができる。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明のＶＨドメインは、ＨＢドメイン群置換の６個、７個又は８個全てで置換されたＨＡ鎖の配列を含み、表１Ｂに提示される組合せを含む。
【００３８】
【表２】
2019528037.tif 000004
【００３９】
ＨＢ群置換の６個、７個又は８個全てが存在する場合、これらは（ｉ）Ｋ２３Ｔ、Ｒ３８Ｋ及びＳ７７Ｎ、（ｉｉ）Ｋ２３Ｔ及びＲ３８Ｋ、（ｉｉｉ）Ｒ３８Ｋ及びＳ７７Ｎ、（ｉｖ）Ｋ２３Ｔ及びＳ７７Ｎ、（ｖ）Ｋ２３Ｔ、（ｖｉ）Ｒ３８Ｋ又は（ｖｉｉ）Ｓ７７Ｎと組み合わせることができる。これらの置換の任意の組合せを含む重鎖が、本明細書に記載される軽鎖配列のいずれかと組み合わせて抗体中に存在していてもよい。
【００４０】
例えば、Ｈｂ１は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ２は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ３は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ４は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ５は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ６は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ７は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ８は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ９は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、Ｈｂ１０は（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができ、ＨＢは（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）として提示される更なる置換の組合せのいずれかと組み合わせることができる。
【００４１】
本発明のＶＨドメインの例としては、以下の実施例に提示されるＨＭ（配列番号３）、ＨＮ（配列番号４）及びＨＱ（配列番号６）重鎖が挙げられる。
【００４２】
本発明の軽鎖可変ドメイン（ＶＫドメイン）は配列番号２を含み、任意に最大４個のフレームワーク置換、例えば３個、２個又は１個の置換を有する。配列番号２は本明細書でＫＡドメインと称される。この置換は、ネズミ重鎖可変ドメインの対応する残基とは異なる配列番号２の残基にあるのが好ましい。置換される残基を、図４に示すアラインメントにおいて指定する。この置換はＩ２Ｘ１、Ｖ３Ｘ１及びＱ５０Ｘ４の１つ、２つ又は３つを含むことができ、ここで、各Ｘ１残基は独立してＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＶからなる群から選択され、Ｘ４残基はＲ、Ｈ及びＫからなる群から選択される。「置換」という用語は、アミノ酸残基「Ｘ１」が配列番号２の対応する位置に存在するアミノ酸とは異なることを意味する。これらの置換の任意の組合せを含む軽鎖が、本明細書の上記に記載される重鎖配列のいずれかと組み合わせて抗体中に存在していてもよい。
【００４３】
軽鎖ドメイン置換は概して、ネズミ抗体配列の対応する残基のものへの復帰置換である。ＫＡの置換はＩ２Ｖ、Ｖ３Ｌ及びＱ５０Ｋの１つ、２つ又は３つを含むことができる。置換されたＫＡドメインの例としては、ＫＢ（配列番号７）、ＫＣ（配列番号８）、ＫＤ（配列番号９）及びＫＥ（配列番号１０）と表される可変ドメインが挙げられる。
【００４４】
配列番号２のフレームワーク残基は１〜２３、４０〜５４、６２〜９３及び１０３〜１１２である。
【００４５】
本発明の抗体は、上述のＶＫドメインのいずれか各々と組み合わせた上述の重鎖ＶＨドメインのいずれかを含み得る。一実施形態では、ＫＡドメインが好ましく、これを上述のＶＨドメインのいずれか各々と組み合わせて用いることができる。
【００４６】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３のＶＨドメイン及び配列番号２のＶＫドメインを含む。この抗体は実施例でｈＥＶ７１  ＨＭＫＡと称される。
【００４７】
誤解を避けるために、組合せで解釈される「以下の８個の置換のうち少なくとも６個を有する」及び「任意に最大４個の付加的なフレームワーク置換を有する」という用語は、本発明の重鎖可変ドメインが少なくとも６個、最大で合計１２個のフレームワーク残基の置換を除いて配列番号１の配列を有し、残りの配列が配列番号１に提示される通りであることを示す。１個、２個又は３個の付加的なフレームワーク置換の特定の組合せに言及する場合、重鎖可変ドメインはＹ２７Ｘ６、Ｔ２８Ｘ２、Ｆ２９Ｘ１、Ｔ３０Ｘ４、Ｒ６７Ｘ４、Ｖ６８Ｘ１、Ｒ７２Ｘ１及びＳ９８Ｘ２の８個のうち合計で少なくとも６個を、付加的な特定数の付加的なフレームワーク置換、例えばそれぞれ合計７個〜９個、８個〜１０個又は９個〜１１個のフレームワーク置換と共に有する。同様に、本発明の軽鎖可変ドメインは合計４個、例えば合計０個、１個、２個、３個又は４個の配列番号２のフレームワーク置換を有することができ、残りの配列は配列番号２のものである。
【００４８】
抗体構造
「免疫グロブリン」又は「抗体」という用語は、１つ以上の抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指すために区別なく用いることができる。ネイティブ抗体は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結し、様々な数のジスルフィド連結を異なる抗体アイソタイプの重鎖間に有する。各々の重鎖及び軽鎖も一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。
【００４９】
抗体は、「ドメイン」と呼ばれる重鎖又は軽鎖ポリペプチドの球状領域を含む。ドメインは、例えばβ−プリーツシート及び／又は鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループ、通常は３つ又は４つのループを含む。ドメインは、「定常」ドメインの場合は様々なクラスメンバーのドメイン内の配列変異の相対的欠如、又は「可変」ドメインの場合は様々なクラスメンバーのドメイン内の顕著な変異に基づいて「定常」又は「可変」と本明細書で更に称される。抗体又はポリペプチド「ドメイン」は、当該技術分野で区別なく抗体又はポリペプチド「領域」と称されることが多い。
【００５０】
抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域又は「ＣＬ」ドメインと称することができる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域又は「ＣＨ」ドメインと称することができる。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインとアラインメントする。
【００５１】
抗体のテール領域を含む重鎖の定常ドメインは、本明細書でＦｃ（fragment crystallizable）ドメイン又はＦｃ領域と称される。Ｆｃ領域は、細胞表面Ｆｃ受容体及び補体系の幾つかのタンパク質と相互作用することができ、そのようにして抗体は免疫系を活性化することができる。Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖中に３つの重鎖定常ドメインを含有する。
【００５２】
抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域又は「ＶＬ」ドメインと称することができる（ここでの「Ｌ」は軽鎖アイソタイプ「ラムダ」ではなく「軽（light）」を指す）。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域又は「ＶＨ」ドメインと称することができる。
【００５３】
無傷軽鎖は例えば２つのドメイン（ＶＬ及びＣＬ）を有し、無傷重鎖は例えば４つ又は５つのドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。
【００５４】
軽鎖及び重鎖可変ドメインは、配列が超可変であり、構造的に規定されるループを形成することができる「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」としても知られる「超可変領域」（ＨＶＲ又はＨＶ）を含む。概して、抗体は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）中に散在した重鎖中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つの超可変領域を含む。本発明の抗体では、可変ドメイン及びＣＤＲのアミノ酸配列は図１、図４及び配列表を参照して本明細書で規定される通りである。
【００５５】
各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗原結合部位を形成する。「抗原結合部位」という用語は、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）部位を指す。本発明の抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位（好ましくは２つの抗原結合部位を含む）を含む。抗原結合部位は、フレームワーク領域によって整列した重鎖及び軽鎖ＣＤＲから形成され、それにより特定のエピトープへの結合が可能になる。「抗原結合領域」又は「抗原結合ドメイン」は、抗体結合部位を含む抗体領域又はドメインである。本発明の抗体は、ＥＶ７１のＳＰ７０エピトープを認識することができる少なくとも１つの抗原結合部位を有する。
【００５６】
自然発生抗体鎖又は組換えにより作製された抗体鎖は、細胞プロセシング中に除去され、成熟鎖を生じるリーダー配列により発現させることができる。成熟鎖は、例えば分泌を増強するか、又は対象の特定の鎖のプロセシングを変更するために非自然発生リーダー配列を含有する組換えにより作製されたものであってもよい。
【００５７】
抗体アイソタイプ
抗体を構成する（comprise）重鎖及び軽鎖の定常領域は、表現型変異を示す。抗体軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）又はラムダ（λ）のいずれかに分類され、約２３０残基長である。本発明の抗体は、カッパ軽鎖を含む（カッパ軽鎖の可変ドメインは、本明細書でＶＫと称される）。
【００５８】
ヒト及び高等哺乳動物に由来する重鎖は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はイプシロン（ε）と分類され、約４５０残基〜６００残基長であり、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして規定する。ＩｇＭの２つのサブクラス（Ｈ及びＬ）、ＩｇＡの３つのサブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２及び分泌型ＩｇＡ）、及びＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）が存在する。本発明の抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体であるのが好ましい。本発明の抗体は、より好ましくはＩｇＧ１抗体である。
【００５９】
本発明の抗体は、本明細書に記載される免疫グロブリンアイソタイプのいずれかに属する重鎖を含み得る。本発明の抗体は、２つ以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含んでいてもよい。
【００６０】
本発明の抗体は、細胞傷害活性を示すことができる。かかる抗体では、定常ドメインは通常、補体結合性の定常ドメインであり、クラスは通例、ＩｇＧ１である。ヒトアイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ４が例示的である。
【００６１】
抗体フォーマット
本発明の抗体は、抗体のフラグメントを含んでいてもよい。「フラグメント」という用語は、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は一部分を指し、該一部分は、通常は無傷抗体中に存在する場合にその一部分と関連する機能の少なくとも１つ、好ましくは大部分又は全てを保持するのが好ましい。フラグメントは、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖の化学処理又は酵素処理によって得ることができる。フラグメントは組み換え手段によっても得ることができる。
【００６２】
本発明の抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、化学的に連結したＦ（ａｂ’）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ２、一価ＩｇＧ、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、ｄｉ−ｓｃＦｖ（二価ｓｃＦｖ）、二重特異性ダイアボディ（diabody）、三重特異性トリアボディ（triabody）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ（minibody）及びｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）フラグメントを含むが、これらに限定されないフラグメントとして存在していてもよい。
【００６３】
本発明の抗体のフラグメントは抗原に結合するか、又は抗原結合（すなわち、特異的結合）について無傷抗体（すなわち、フラグメントの元となる無傷抗体）と競合することができる。本発明の抗体は、ＥＶ７１  ＶＰ１カプシドタンパク質上のＳＰ７０ペプチド結合エピトープに結合する。結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ法、又は無傷免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって作製される。本発明の抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、化学的に連結したＦ（ａｂ’）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ２、一価ＩｇＧ、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、ｄｉ−ｓｃＦｖ（二価ｓｃＦｖ）、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ又はｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）を含むが、これらに限定されない結合フラグメントとして存在していてもよく、ＥＶ７１のＳＰ７０エピトープに結合する能力を保持する。
【００６４】
本発明の抗体は、二重特異性又は三重特異性抗体の一部であってもよい。二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる抗原結合部位を有する人工ハイブリッド抗体であり、三重特異性抗体は、３つの異なる重鎖／軽鎖対及び３つの異なる抗原結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性及び三重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって作製することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)、Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照されたい。
【００６５】
例示的な本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる抗原結合部位を含む二重特異性抗体であってもよい。特定の実施形態では、一方の抗原結合部位がＥＶ７１のＳＰ７０ペプチドエピトープに結合することができ、一方の抗原結合部位が別の感染因子に結合することができる、例えばコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）ウイルスに結合することができる抗原結合部位であり得る。
【００６６】
抗体の特徴
本発明の抗体は本明細書に記載される構造的特徴を有し、ＥＶ７１  ＶＰ１タンパク質のＳＰ７０結合エピトープ（配列番号１２）に特異的に結合する（実施例４を参照されたい）。
【００６７】
本発明の抗体は、ＥＶ７１ウイルスを中和することができる（実施例５を参照されたい）。
【００６８】
本発明の抗体は本明細書で下記に、また実施例を参照して説明される望ましい構造的、物理的、生物物理学的及び化学的特性も有し得る。
【００６９】
抗体の結合親和性
本明細書に記載される抗体の親和性は、エピトープ又は抗原への抗体の結合の程度又は強度である。解離定数Ｋｄ及び親和性定数Ｋａは親和性の定量的尺度である。Ｋｄは、抗体がその抗原から解離する速度である抗体解離速度（ｋｏｆｆ）と、抗体がその抗原に結合する速度である抗体の抗体会合速度（ｋｏｎ）との比率である。抗体のその抗原への結合は可逆プロセスであり、結合反応の速度は反応物の濃度に比例する。平衡状態で、（抗体）（抗原）複合体形成の速度は、その構成要素（抗体）＋（抗原）への解離の速度に等しい。反応速度定数の測定を用いて、平衡又は親和性定数Ｋａ（Ｋａ＝１／Ｋｄ）を規定することができる。Ｋｄ値が小さいほど、その標的に対する抗体の親和性は大きくなる。殆どの抗体は、低マイクロモル（１０−６）〜ナノモル（１０−７〜１０−９）範囲でＫｄ値を有する。高親和性抗体は概して、低ナノモル範囲（１０−９）であると考えられ、超高親和性抗体はピコモル（１０−１２）範囲である。
【００７０】
本発明の抗体は少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数（ｋｏｎ）を有し得る。
【００７１】
本発明の抗体は５×１０−１ｓ−１未満、１０−１ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満又は１０−４ｓ−１未満の抗体解離（ｋｏｆｆ）速度を有し得る。別の実施形態では、本発明の抗体は５×１０−５ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満又は１０−１０ｓ−１未満のｋｏｆｆを有し得る。
【００７２】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＥＶ７１のＳＰ７０ペプチド結合エピトープ（配列番号１２）に少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１又は少なくとも１０１１Ｍ−１の親和性定数、すなわちＫａで結合する（例えば、特異的に結合する）。
【００７３】
本発明の抗体は５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満又は１０−１２Ｍ未満のＥＶ７１のＳＰ７０エピトープからの解離定数、すなわちＫｄを有し得る。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＥＶ７１のＳＰ７０エピトープに１０６Ｍ−１〜１０８Ｍ−１のＫａで結合する。更なる例では、本発明の抗体は、ＥＶ７１のＳＰ７０エピトープに１０７Ｍ−１〜５×１０７Ｍ−１のＫａで結合する。また更なる例では、本発明の抗体は、ＥＶ７１のＳＰ７０エピトープに１．５×１０７Ｍ−１〜３．５×１０７Ｍ−１のＫａで結合する（実施例６を参照されたい）。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は１０−６Ｍ〜１０−９ＭのＫｄを有する。更なる例では、本発明の抗体は５×１０−７Ｍ〜５×１０−９ＭのＫｄを有する。また更なる例では、本発明の抗体は１０−７Ｍ〜１０−８ＭのＫｄを有する（実施例６を参照されたい）。
【００７６】
抗体の特異的結合は、抗体が特定の抗原又はエピトープに対して相当の親和性を示し、概して顕著な交差反応性を示さないことを意味する。「顕著な交差反応性を示さない」抗体は、望ましくない実体（例えば、望ましくないタンパク性実体）に対して認識可能には結合しない抗体である。特定のエピトープに特異的な抗体は、例えば同じタンパク質又はペプチド上の遠隔エピトープと顕著に交差反応しない。本発明の抗体の特異的結合、すなわちｋｏｆｆ、ｋｏｎ、Ｋａ及びＫｄは、かかる結合を決定する任意の当該技術分野において認められる手段に従って決定することができる。
【００７７】
生物物理学的特性
本発明の抗体は熱的に安定したものとすることができ、すなわち本発明の抗体は、ＥＶ７１ウイルスのＳＰ７０結合エピトープ（配列番号１２）に３０℃〜８５℃、具体的には最高７５℃の温度で結合することができる（実施例７を参照されたい）。本発明の抗体は５０℃〜１００℃、具体的には６０℃〜８０℃、より具体的には７０℃近くの融解温度を有し得る（実施例７を参照されたい）。
【００７８】
本発明の抗体は凝集の傾向が低いものとすることができる。一例では、凝集の傾向は多角度光散乱を用いて分析され、別の例では、凝集の傾向は動的光散乱を用いて分析される。本発明の抗体は、非特異的タンパク質間相互作用の傾向が低く、良好な溶解性を有するものとすることができる（実施例８を参照されたい）。
【００７９】
本発明の抗体は、濃縮した場合に凝集の傾向が低いものとすることができる（実施例８を参照されたい）。本発明の配合物は、例えばダルベッコＰＢＳにより生理的ｐＨに維持された水溶液中で可溶性凝集体を形成することなく５０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば７５ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８０ｍｇ／ｍｌ〜１２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは９０ｍｇ／ｍｌ〜１１０ｍｇ／ｍｌ（好ましい濃度は約１００ｍｇ／ｍｌである）まで濃縮された抗体を含み得る。
【００８０】
本発明の抗体は、凍結融解の繰り返し又は長時間の正常体温を超える温度に供した場合に凝集の傾向が低いものとすることができる。一例では、長時間の温度はダルベッコＰＢＳ中、５０℃で３３日間である。
【００８１】
本発明の抗体は、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．６の等電点（ｐＩ）を有し得る。一例では、本発明の抗体はｐＨ７〜ｐＨ７．５のｐＩを有する。また更なる例では、本発明の抗体はｐＨ７．３〜ｐＨ７．４のｐＩを有し、好ましくはｐＨ７．４のｐＩを有する（実施例８を参照されたい）。
【００８２】
本発明の抗体は、ＥＶ７１のＳＰ７０ペプチドエピトープ（配列番号１２）に対する結合能をマウス、ヒト及び／又はカニクイザル霊長類に由来する血清中３７℃でのインキュベーション後に保持することができる（実施例９を参照されたい）。一例では、本発明の抗体はマウス、ヒト及び／又はカニクイザル血清中で１０日間〜５０日間、好ましくは２０日間〜４０日間、より好ましくは３０日間のインキュベーション後にＳＰ７０ペプチドエピトープに対する結合能を保持することができる。一例では、結合能の保持は、血清中でインキュベートしなかった、又は対照溶液中でインキュベートした抗体中で観察されるものと同じ又は実質的に同じ結合能を３７℃で示す抗体を指す。
【００８３】
一実施形態では、本発明の抗体は本明細書に記載される構造的特徴を有し、以下の活性又は機能的特徴の少なくとも１つを更に有する：（ｉ）ＥＶ７１に結合する；（ｉｉ）ＥＶ７１のＳＰ７０エピトープに結合する；（ｉｉｉ）ＥＶ７１ウイルス感染を中和する；（ｉｖ）本明細書に記載されるＫａ値を有する；（ｖ）本明細書に記載されるＫｄ値を有する；（ｖｉ）ＳＰ７０エピトープ結合活性を７５℃まで保持する；（ｖｉｉ）７０℃の融解温度を有する；（ｖｉｉｉ）１００ｍｇ／ｍｌまで濃縮した場合に凝集しない；（ｉｘ）相互作用クロマトグラフィーによって分析した場合に０．０３７未満の保持指数（ｋ’）を有する；（ｘ）凍結融解の繰返しサイクルに供した場合又は最高５０℃で最長３３日間処理した場合に凝集しない；（ｘｉ）本明細書に記載される等電点（ｐＩ）を有する；（ｘｉｉ）マウス、ヒト又はカニクイザル血清中で最長３０日間インキュベートした場合にＥＶ７１のＳＰ７０エピトープに結合する能力を保持する。
【００８４】
アグリコシル化（Aglycosylated）抗体
本明細書で開示される抗体は、「アグリコシル化」抗体であってもよい。ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を保有し、Ｆｃフラグメントのグリコシル化はＦｃ受容体媒介活性に不可欠である。この部位に付着したＮ−グリカン炭水化物部分は、主として複合型のコア−フコシル化ジアンテナ（diantennary）構造である。加えて、これらのＮ−グリカンの少量がバイセクティングＧｌｃＮＡｃ及びα−２，６連結シアル酸残基も保有する。
【００８５】
「アグリコシル化」は、限定されるものではないが、化学的又は酵素的プロセス、１つ以上のグリコシル化部位の突然変異又は細菌中での発現により１つ以上の炭水化物部分を欠いた抗体を指す。本発明のアグリコシル化抗体は、Ｆｃ炭水化物が、例えば化学的又は酵素的に除去された抗体である脱グリコシル抗体であってもよい。代替的には、本発明のアグリコシル化抗体は、例えばグリコシル化パターンをコードする１つ以上の残基の突然変異、又は炭水化物をタンパク質に付加しない生物、例えば細菌中での発現によってＦｃ炭水化物部分なしに発現された抗体である、非グリコシル化又は未グリコシル化（unglycosylated）抗体であってもよい。
【００８６】
本明細書に記載される抗体は、「アフコシル化（afucosylated）」、すなわち抗体のＦｃ領域中の炭水化物部分が任意のフコース糖単位を有しないように改変されたものであってもよい。代替的には、本明細書に記載される抗体は、減少した数のフコース糖単位を有し得る。アフコシル化抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害においてより効果的である（下記を参照されたい）。本明細書に記載されるアフコシル化抗体はＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（商標）  ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株（BioWa／Lonza）、ＧｌｙｍａｘＸ（商標）改変細胞（ProBioGen）又はアヒル胚性幹細胞株ＥＢ６６（Valneva）等のアフコシル化タンパク質を産生するように改変された細胞株中で産生させることができる。
【００８７】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
本明細書に記載される抗体は、その抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強するように修飾することができる。ＡＤＣＣは、非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応である。かかる細胞はヒト細胞であり得る。抗体のＡＤＣＣ活性は概して、例えばキラー細胞、ナチュラルキラー細胞及び活性化マクロファージ等のエフェクター細胞の表面上に存在する抗体受容体に対する抗体のＦｃ領域の結合を必要とすると考えられる。ヒト化抗体の炭水化物構造（すなわち、Ｆｃ領域中）のフコシル化を変更する（例えば、低減又は除去する）ことによって、抗体のＡＤＣＣ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば非修飾ヒト化抗体に対して１０倍又は２０倍又は３０倍又は４０倍又は５０倍又は１００倍又は５００倍又は６００倍又は７００倍又は１０００倍に増強することができる。ＡＤＣＣ活性の増大のために、かかる修飾抗体はそれらの非修飾対応物よりも少ない投与量で使用することができ、概して患者においてより少ない又は低減した副作用を有する。
【００８８】
補体依存性細胞傷害
本明細書に記載される抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）において使用することができる。ＣＤＣは、適応免疫のエフェクターとして作用する中央自然補体系に関与する。古典的ＣＤＣ経路は、標的細胞上の抗原に結合する抗体分子によって誘発され、結合抗体のＦｃドメインに対するＣ１ｑタンパク質の結合によって開始する。生じる補体カスケードは膜侵襲経路を活性化し、標的細胞の溶解を誘導する膜侵襲複合体の形成をもたらす。本明細書に記載される抗体は、限定されるものではないが、抗体重鎖の定常ドメイン中にアミノ酸残基置換を含有するようなタンパク質主鎖の改変等の当該技術分野で既知の任意の方法によってＣＤＣを誘発するその能力を増強するように修飾することができる。ＣＤＣ活性を増強するために用いられるＩｇＧ１アミノ酸置換の組合せの例については、Moore et al., mAbs, 2(2), 181-189 (2010)を参照されたい。本明細書に記載される修飾抗体のＣＤＣ活性は、例えば非修飾ヒト化抗体に対して１０倍又は２０倍又は３０倍又は４０倍又は５０倍又は１００倍又は５００倍又は６００倍又は７００倍又は１０００倍に増強することができる。
【００８９】
抗原
「抗原」は、免疫グロブリン又は抗体（又はその抗原結合フラグメント）が特異的に結合する実体（例えば、タンパク性実体又はペプチド）である。
【００９０】
本発明の抗体は、ＥＶ７１の抗原性１５アミノ酸ＳＰ７０ペプチドエピトープ（配列番号１２）に結合することができる（実施例４）。ＳＰ７０エピトープは、ＥＶ７１のＶＰ１カプシドタンパク質上の残基２０８〜２２２に位置する。ＳＰ７０のアミノ酸配列は、ウイルスの様々な遺伝子亜型からのＥＶ７１株のＶＰ１配列中に高度に保存されている。このため、ＳＰ７０エピトープ（配列番号１２）を含む非エンベロープ一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであるＥＶ７１は、ＳＰ７０エピトープに結合する本発明の抗体によって中和することができる。
【００９１】
エンテロウイルス７１
ＥＶ７１及びコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）は、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属（ポリオウイルス等のウイルスも含む）に属する非エンベロープ一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。ヒトエンテロウイルス種は４つの血清型（Ａ〜Ｄ）を含有し、ＥＶ７１及びＣＡ１６は血清型Ａに属する。
【００９２】
ＥＶ７１は幾つかの遺伝子型群：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを有する。遺伝子型Ｂ及びＣは遺伝子亜型Ｂ１〜Ｂ５及びＣ１〜Ｃ５に更に分けることができ、各亜群は互いに約１５％の相違を示す。これらの遺伝子亜型に属する種々のＥＶ７１株が、ＨＦＭＤの大発生について報告されている。群Ａは、１９７０年に米国カリフォルニア州において初めて同定され、もはや循環していないと考えられる１つのメンバーのみからなる。Ｂ遺伝子型はマレーシア及びシンガポールにおいて顕著であり、Ｃ遺伝子型は中国及びベトナムにおいて顕著であることが示されている。Bessaud et al（PLOS ONE; March 2014, Volume 9, Issue 3, e90624）は、１つのインドの遺伝子型群（遺伝子群Ｄ）及び２つのアフリカの遺伝子型群（Ｅ及びＦ）を含む３つの付加的な遺伝子型群を報告している。
【００９３】
ＥＶ７１及びＣＡ１６はどちらも比較的高いゲノム進化速度を有し、新たな遺伝子亜型が生じ続けている。１７％〜２２％の差異が新たな遺伝子型の指定についてのカットオフであり、ＥＶ７１は過去４０年間に２つの遺伝子型に分岐している。中国では、ＥＶ７１のＣ４遺伝子亜型のみが固有であり、分子基盤は不明確ではあるが、Ｃ４ａ進化分岐がより高い罹患率及び死亡率、並びにより大きな神経毒性を示すようである（Zhang et al., PLoS One, 2011、Zhang et al., J. Clin Microbiol, 2010）。
【００９４】
全てのヒトエンテロウイルスの構造は同様であり、したがってＥＶ７１及びＣＡ１６はどちらも、およそ７．４ｋｂの一本鎖プラス鎖ポリアデニル化ウイルスＲＮＡを含有する小さな２０面体粒子から構成される同様の構造を有する。ウイルスカプシド中の各プロトマーは、４つの構造ウイルスタンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ４）のコピーを含有し、そのうちＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は外部にあるが、ＶＰ４は完全に内在化しているため、宿主抗体応答に曝露されない。これらの構造タンパク質の全てがゲノムのＰ１領域によってコードされる。ＶＰ１はＥＶ７１の主要カプシドタンパク質であり、本発明の抗体が結合し、ウイルスを中和するＳＰ７０エピトープを含む中和エピトープとクラスター化する。このため、本発明の抗体は、配列番号１２であるＳＰ７０エピトープを含む主要カプシドタンパク質（ＶＰ１）を含むおよそ７．４ｋｂの一本鎖プラス鎖ポリアデニル化ゲノムを有するピコルナウイルスであるＥＶ７１に対して効果的である。
【００９５】
侵入プロセスにおいては、ウイルスは初めに細胞受容体に結合することによって許容細胞に付着する。ＥＶ７１がヒト及び動物モデルにおいてニューロンに感染し得て、ＣＮＳにおいて神経脳炎（neuroencephalitis）、無菌性髄膜炎及び脳幹脳炎につながる神経炎症を引き起こすことがよく認められている（Weng KF et al., Microbes Infect, 2010によって概説される）。結合後に、一連の構造変化がウイルスカプシドにおいて生じ、細孔が細胞膜中に形成されることで、ウイルスがエンドサイトーシスにより原形質膜を通過した後、カプシド立体構造変化を受けてウイルスＲＮＡを放出する。
【００９６】
神経学的合併症の頻度はアジアでの発生ごとに異なることが示されており、どの要因によってＥＶ７１又はＣＡ１６感染が神経学的合併症を引き起こすか否かが決まるかは知られていない。しかしながら、特定のウイルス株が重症の神経疾患の病因に関与し得ることが示唆されている。１９９９年には、亜群Ｂ３及びＣ２がオーストラリアにおいて循環していることが報告された。１９９８年には、重症の神経疾患を有する台湾の小児からの単離株がＣ２亜群のものであることが示された。対照的に、１９９７年の流行におけるサラワクの合併症のないＨＦＭＤを有する小児からの単離株がＢ３亜群のものであることが示された。これにより、未だ完全に確認されてはいないが、Ｃ２亜群のＥＶ７１ウイルスがＣＮＳ合併症を引き起こす可能性がより高いことが示唆された。しかしながら、より最近では、中国においてＣ４ａ亜群がより神経毒性であることが報告されている。
【００９７】
世界のその他の地域と比較したアジアにおけるＨＦＭＤの高い発生率から、ＨＦＭＤに対する宿主感受性の可能性の調査が行われた。Changらによって行われた遺伝学的研究では、ＨＬＡ−Ａ３３がＥＶ７１感染に対する感受性の増大と関連し、ＨＬＡ−Ａ３３が白人集団よりもアジア人集団に多く見られることが報告された（Chang LY et al., Pediatrics, 2008）。この研究から、その機構は不明ではあるが、ＨＬＡ−Ａ２がＥＶ７１感染患者における心肺機能不全のリスクと関係する可能性があることも示唆された。ＨＦＭＤと関連する神経学的合併症について提唱される別の理論は二重感染であり、これがＨＦＭＤについて示されている。ＥＶ７１  Ｂ３亜群とアデノウイルス２１型との二重感染が、１９９７年のサラワクでの発生において報告されている（Ooi MH et al., Clin Infect Dis 2007）。ＥＶ７１とデング熱及び日本脳炎との二重感染も報告されている（Ooi et al., 2007）。しかしながら、現在、二重感染がＨＦＭＤにおけるＣＮＳ障害に関与していることを示唆する決定的な証拠はない。
【００９８】
ＥＶ７１カプシドタンパク質に対する抗体は、ウイルス表面に結合することで受容体結合部位を占有し、ウイルス／受容体相互作用を妨げることが示されている。これにより細胞へのウイルス侵入の阻害（中和と称される）が生じる。マウスモノクローナル抗体Ｄ５は、ＥＶ７１に対して強力な中和効果を示し、上記の作用機構を支持する。Ｄ５は０．３μｇ／ｍｌのＩＣ９５を有し（Ku Z et al., J Virol Methods, 2012）、許容細胞へのＥＶ７１結合を阻害することができる。加えて、Ｄ５は付着後段階でＥＶ７１を中和することができる。
【００９９】
これまでにＨＦＭＤ処置のためのワクチン又は特異的（化学的又は生化学的）抗ウイルス薬は認可されておらず、発熱及び痛みを和らげる対症アプローチ並びに適切な水分摂取による支持療法のみが現在利用可能なこの疾患の処置方針である。西洋諸国では、医師は疾患を自然に治癒させる。しかしながら、上記で論考されるように、重症の合併症がアジアでの発生においてより一般的である。
【０１００】
本発明者らは、マウスＤ５抗体が、そのウイルス中和能からヒトへの治療的使用に好適な抗体を作製するためのヒト化の候補であると考えた。
【０１０１】
本発明の抗体は予防的利益に加えて治療的利益をもたらし、これまでに探求されたワクチン接種アプローチよりもＨＦＭＤの治療に有用である。ＨＦＭＤを防ぐためのワクチンはまた、大衆の相当数が任意のワクチン接種を受けることを選ぶ場合にのみＨＦＭＤの発生の予防に効果的である。本発明の抗体は予防的処置を提供するだけでなく、個体が罹病した後に有益な療法も提供する。
【０１０２】
組成物
医薬組成物
本発明の抗体は、活性治療用抗体剤と様々な他の薬学的に許容可能な構成要素とを含む医薬組成物として配合及び／又は投与することができる。Remington: The Science and Practice of Pharmacy (22nd ed., Pharmaceutical Press, London, Pa. (2013))を参照されたい。好ましい形態は、意図される投与方法及び治療用途によって決まる。組成物は所望の配合に応じて、動物又はヒトへの投与用の医薬組成物を配合するために一般に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容可能な非毒性の担体又は希釈剤を含んでいてもよい。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例は蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液及びハンクス液である。加えて、医薬組成物又は配合物は他の担体、アジュバント又は非毒性の非治療的な非免疫原性安定剤等を含んでいてもよい。
【０１０３】
本発明の抗体を含有する医薬組成物は、タンパク質等の大きなゆっくりと代謝される高分子、キトサン等の多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（例えば、ラテックス官能化セファロース（商標）、アガロース、セルロース等）、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び脂質凝集体（油滴又はリポソーム等）も含み得る。付加的に、これらの担体は免疫賦活剤（すなわち、アジュバント）として機能することができる。
【０１０４】
非経口投与については、本発明の抗体又は組成物は水、油、生理食塩水、グリセロール又はエタノール等の滅菌液であり得る医薬担体を含む生理学的に許容可能な希釈剤中の物質の溶液又は懸濁液の注射剤（injectable dosages）として投与することができる。付加的に、例えば湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質等の補助物質が組成物中に存在していてもよい。医薬組成物の他の構成要素は石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばラッカセイ油、ダイズ油及び鉱油である。概して、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等のグリコールが、特に注射溶液に好ましい液体担体である。抗体は、活性成分の持続放出を可能にするように配合することができる蓄積注射又は移植調製物の形態で投与することができる。
【０１０５】
本明細書で使用される非経口という用語は、本発明の抗体又は組成物の皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内及び髄腔内投与を含む。本発明の抗体又は組成物は、経鼻法又は胃内法によっても投与することができる。
【０１０６】
通例、組成物は、溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製されるが、注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態も調製することができる。調製物は、上記で論考されるようなアジュバント効果の増強のためのポリラクチド、ポリグリコリド又はコポリマー等のリポソーム又は微粒子中に乳化又はカプセル化することもできる（Langer, Science 249: 1527 (1990)及びHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)を参照されたい）。本発明の作用物質は、活性成分の持続放出又はパルス放出を可能にするように配合することができる蓄積注射又は移植調製物の形態で投与することができる。
【０１０７】
他の投与方法に好適な付加的な配合物には、経口、鼻腔内及び経肺配合物、坐剤及び経皮適用が含まれる。坐剤については、結合剤及び担体として、例えばポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙げられ、かかる坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成することができる。経口配合物は医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース及び炭酸マグネシウム等の賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出配合物又は粉末の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含有する。
【０１０８】
局所適用は経皮又は皮内送達をもたらすことができる。局所投与は、作用物質とコレラ毒素、又はその無害化誘導体若しくはサブユニット、又は他の同様の細菌毒素との同時投与によって促進することができる（Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)を参照されたい）。同時投与は混合物、又は化学的架橋若しくは融合タンパク質としての発現によって得られる連結分子として構成要素を使用することによって達成することができる。
【０１０９】
代替的には、経皮送達は皮膚パッチを用いるか、又はトランスフェロソーム（transferosomes）を用いて達成することができる（Paul et al., Eur. J. Immunol. 25:3521 (1995)、Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15 (1998)）。
【０１１０】
本発明の組成物は本発明の抗体と、本明細書に記載される薬学的に許容可能な担体と、ＨＦＭＤ、ＨＦＭＤ関連疾患、及び／又はＥＶ７１ウイルスの感染の予防、管理又は治療に有用な他の治療剤、特に予防剤又は治療剤とを含み得る。かかる治療剤は鎮痛薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、発熱又は体温の上昇を回復させる薬物、及び痛みを紛らわせるように設計された治療用化合物、例えば口痛を紛らわせることができる洗口液又はスプレーを含み得る。本発明の組成物は、例えば静脈内療法による被験体の水分補給のための組成物を付加的に含んでいてもよい。本発明の組成物は本発明の抗体と、別の感染因子に結合する抗体、例えばコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）ウイルスに結合することができる抗体等の本発明のものではない少なくとも１つの他の抗体とを含んでいてもよい。
【０１１１】
本発明の組成物は、本明細書で開示される抗体をコードする核酸、すなわちＤＮＡ又はＲＮＡ、及び上記で論考される他の組成物の化合物のいずれかを用いる又は用いないかかる核酸の任意の送達方法を含み得る。組成物はベクター、例えば限定されるものではないが、それ自体が本発明の核酸を含む本明細書に記載される発現ベクターを含んでいてもよい。
【０１１２】
本発明の組成物は、細胞への核酸の送達系として使用されるウイルスベクターを含んでいてもよい。好適なウイルスベクター核酸送達系としては、レトロウイルス系、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルス及び鳥類ポックスウイルスを含むポックスウイルス科のウイルスベクター、並びにアルファウイルス属のウイルスベクターが挙げられる。本発明の抗体をコードする核酸又はそれを含有するベクターは、記載のように組成物に組み込むことができる、個体又は細胞への送達のためのリポソームにパッケージングすることができる。抗体をコードするベクター及び核酸は、粒子担体に吸着又は会合させることもできる。
【０１１３】
本発明の組成物は、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する遺伝子療法ベクター、又は本発明による裸の抗体ポリペプチド鎖を含んでいてもよい。組成物は、かかるベクター又はポリペプチドを本発明の抗体及び上記の任意の他の組成物の構成要素と組み合わせて含むことができる。
【０１１４】
キット
本発明の抗体はキットに用いることができる。「キット」という用語は、試薬及びサンプル分析を容易にする他の材料の組合せに関して使用される。幾つかの実施形態では、本発明の免疫測定キットは好適な抗原、検出可能な部分を含む結合剤、及び検出試薬を含む。検出可能な部分によって生じるシグナルを増幅するためのシステムがキットに含まれていても又は含まれていなくてもよい。さらに、他の実施形態では、キットは、限定されるものではないが、サンプル採取のための装置、サンプルチューブ、ホルダー、トレイ、ラック、ディッシュ、プレート等の構成要素、キットのユーザーに対する使用説明書、溶液又は他の化学試薬、及び標準化、正規化に使用されるサンプル、及び／又は対照サンプルを含む。
【０１１５】
キットは少なくとも１つの本発明の抗体を含み得る。一実施形態では、キットは１つ以上の容器内に本発明の組成物を含む。別の実施形態では、キットは１つ以上の容器内の本発明による組成物と、ＨＦＭＤ、ＨＦＭＤ関連疾患及び／又はＥＶ７１ウイルスの感染の予防、管理又は治療に有用な１つ以上の他の予防剤又は治療剤とを含む。投与のための構成要素を含有する組成物が、経口送達等の消化管を介した送達のために配合されない場合、キットの構成要素を他の経路により送達することが可能なデバイス、例えば注射器が含まれていてもよい。キットはＨＦＭＤ、ＨＦＭＤ関連疾患、及び／又はＥＶ７１ウイルスの感染を予防、治療、管理又は回復させるための使用説明書、並びに副作用及び投与方法の投与量の情報を更に含み得る。
【０１１６】
本発明は診断キットも提供する。本発明の抗体はＨＦＭＤ、ＨＦＭＤ関連疾患、及び／又はＥＶ７１ウイルスの感染の発生又は進行についてのモニタリング、診断又は予後の提示に有用であり、かかる目的に好適なキットに使用することができる。本発明の抗体は、個体から採取された体液のサンプル中のＥＶ７１抗原又はＥＶ７１抗原のＳＰ７０ペプチドエピトープの存在を検出するための診断キットに使用することができ、個体はヒト、又は非ヒト霊長類等の哺乳動物、又はマウス、ラット及びウサギを含む実験動物であり得る。限定されるものではないが、血液、血清又は脳脊髄液等の体液のサンプルを個体から採取し、本発明の抗体を用いて抗原の存在について試験する。本発明の抗体を用いた個体の血液中のＥＶ７１レベルの測定により、かかる個体の処置のための本発明の抗体又は組成物の好適な投与スケジュール及び用量についての情報を得ることができる。上記の方法は概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０１１７】
上記の診断に有用なキットは、限定されるものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ等のＥＩＡ及びＥＬＩＳＡを含むアッセイに使用される様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン等の補欠分子族；凝集試験に使用されるラテックスビーズ又は細菌等の粒子；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリン等の蛍光物質；限定されるものではないが、ルミノール等の発光物質；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン等の生物発光物質；限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｓｎ等の放射性物質；様々なポジトロン断層法を用いるポジトロン放出金属、非放射性常磁性金属イオン、並びに放射標識された又は特定の放射性同位体にコンジュゲートした分子を含むが、これらに限定されない検出可能な物質に結合させた本発明の抗体を含み得る。容易に測定することができる任意の検出可能な標識は、本発明の抗体にコンジュゲートし、本明細書に記載される疾患の診断に使用することができる。検出可能な物質は、当該技術分野で既知の技法を用いて抗体に直接、又は中間物（例えば、当該技術分野で既知のリンカー等）を介して間接的に結合又はコンジュゲートすることができる。例えば、診断剤として使用される抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。
【０１１８】
上記の方法又は検出可能な物質のいずれかを用いた抗原の検出は、本明細書に記載されるキット中の本発明の抗体を用い、ＥＶ７１ウイルス又はＳＰ７０ペプチドの存在について陽性結果を生じさせることができ、個体がＨＦＭＤ、ＨＦＭＤ関連疾患、及び／又はＥＶ７１ウイルスの感染を有することを診断することができる。かかる個体は続いて本明細書に記載されるＨＦＭＤの治療を必要とし、及び／又はそれを受けることができる。
【０１１９】
療法
本発明は特に、手足口病（ＨＦＭＤ）を含むエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）及び関連の疾患及び障害の処置に関する。本発明は、処置を必要とする個体に本明細書に記載される本発明の抗体又は組成物を有効量投与することによるＨＦＭＤの治療方法又は予防法にも関する。本発明の抗体又は組成物、好ましくは医薬組成物（例えば、本発明の抗体と、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）ウイルスに結合することができる抗体等の或る付加的な治療剤とを含む組成物）は、ヒト又は動物の身体の処置方法に使用することができる。本発明の抗体又は組成物、好ましくは医薬組成物は、ヒト又は動物の身体の処置方法に使用することができ、ここで処置は個体におけるＨＦＭＤの治療的又は予防的処置である。
【０１２０】
上述の処置方法は、個体において例えばＨＦＭＤの予防又は治療に有益な治療的応答を生じる条件下での本発明の抗体又は組成物（例えば、本発明の抗体と、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）ウイルスに結合することができる抗体等の或る付加的な治療剤とを含む組成物）の個体への投与を含み得る。
【０１２１】
かかる個体はＥＶ７１に感染していても、又はＨＦＭＤ若しくはＨＦＭＤ関連疾患を患っていてもよい。本明細書に記載される処置方法は、無症候患者及び疾患、特にＨＦＭＤの症状を現在示している患者の両方に対して用いることができる。本発明の抗体は、ＥＶ７１に感染しておらず、ＨＦＭＤを有しない個体に対して予防的に投与してもよい。本発明の抗体は、ＥＶ７１に感染しており、ＨＦＭＤを有しない又はＨＦＭＤの症状を示さない個体に投与してもよい。本発明の抗体は、ＨＦＭＤ又はＨＦＭＤ関連疾患を有する又は有するようである個体に投与してもよい。かかる個体は、ＥＶ７１が存在するか否かが知られていない個体であってもよい。処置に適している個体には、ＥＶ７１関連障害又はＨＦＭＤ関連障害に罹るリスクがあるが、症状を示していない個体、及びＥＶ７１関連障害又はＨＦＭＤ関連障害を有する疑いがある個体、並びに症状を現在示している個体が含まれる。本発明の抗体は、被験個体のリスクを評定する必要なく一般集団に予防的に投与することができる。
【０１２２】
「処置する」（"treat"， "treating"）又は「処置」という用語（又は文法的に同等の用語）は、個体の病態の重症度が低減するか、又は少なくとも部分的に改善若しくは回復すること、及び／又は少なくとも１つの臨床症状の幾らかの軽減、緩和又は減少が達成され、及び／又は病態の進行の阻害若しくは遅延及び／又は疾患若しくは病気の発症の予防若しくは遅延が見られることを意味する。
【０１２３】
ＥＶ７１感染及び／又はＨＦＭＤ若しくはＨＦＭＤ関連疾患の処置方法に使用することができる本発明の抗体は、ＥＶ７１のＳＰ７０ペプチドエピトープに特異的に結合する本明細書に記載される任意の配列及びフォーマットの抗体であり得る。本明細書に記載される処置方法に使用される抗体は本発明の抗体のフラグメント、例えば抗原結合フラグメントであってもよい。本発明の抗体は、Ｂ１〜Ｂ５又はＣ１〜Ｃ５等の任意の遺伝子亜型群に分類されるＥＶ７１を含む任意の遺伝子型群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦのＥＶ７１に感染した個体に投与することができる。
【０１２４】
本発明による抗体は、処置を必要とする個体に医薬担体若しくは医薬組成物と共に、又は本明細書に記載される任意の組成物中で投与することができる。
【０１２５】
代替的には、少なくとも１つの抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを投与することによって抗体を個体に投与することができる。ポリヌクレオチドは、患者において抗体鎖が産生されるように発現される。任意に、ポリヌクレオチドは抗体の重鎖及び軽鎖をコードする。ポリヌクレオチドは、個体において重鎖及び軽鎖が産生されるように発現される。
【０１２６】
本発明の抗体は、有効投与量の本明細書に記載される抗体を患者に投与することを含む、ＨＦＭＤ又は関連疾患若しくは障害を予防又は治療する方法に使用することができる。本明細書で使用される場合、本発明の治療用抗体の「有効量」又は「有効投与量」又は「十分量」（又は文法的に同等の用語）は、所望の効果を生じるのに効果的な本発明の抗体又は組成物の量を指し、上記効果は任意に治療効果である（すなわち、治療有効量を投与することによる）。例えば、「有効量」又は「有効投与量」又は「十分量」は個体の病態、例えばＨＦＭＤの重症度が低減するか、又は少なくとも部分的に改善若しくは回復すること、及び／又は少なくとも１つの臨床症状の幾らかの軽減、緩和又は減少が達成され、及び／又は病態の進行の阻害若しくは遅延及び／又は疾患若しくは病気、例えばＨＦＭＤの発症の予防若しくは遅延が見られるような量であり得る。
【０１２７】
「患者」、「個体」又は「被験体」という用語は、１つ以上の本発明の作用物質（例えば、免疫療法剤又は抗体）による予防的又は治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物の被験体を含む。哺乳動被験体には霊長類、例えば非ヒト霊長類が含まれる。哺乳動物被験体には、限定されるものではないが、ウサギ、並びにラット及びマウス等の齧歯動物等の研究に一般に使用される実験動物も含まれる。哺乳動物被験体はウシ、ヒツジ、ウマ及びブタ家畜を含む飼育動物、並びにネコ及びイヌ等の愛玩動物であってもよい。
【０１２８】
投与量
治療的又は予防的処置を達成するのに適切な本発明の抗体又は組成物の量は効果的な用量、例えば治療的又は予防的に効果的な用量として規定される。予防的及び治療的処置レジームの両方において、試薬を十分な免疫応答が達成されるまで幾つかの投与量で投与することができる。「免疫応答」又は「免疫学的応答」という用語は、レシピエント被験体における抗原に対する液性（抗体により媒介される）及び／又は細胞性（抗原特異的Ｔ細胞又はそれらの分泌産物により媒介される）応答の発生を含む。通例、免疫応答はモニタリングされ、免疫応答が衰え始めた場合に反復投与が行われる。
【０１２９】
上記の病態の処置に効果的な本発明の組成物の用量は投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的であるか又は治療的であるかを含む多くの異なる要因に応じて変化する。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ウサギ、ラット及びマウスを処置することもできる。処置投与量は、安全性及び有効性を最適化するために滴定する必要がある。
【０１３０】
本発明の抗体による受動免疫化については、投与量は約０．０００１ｍｇ／ｋｇ（宿主体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）の範囲である。例えば、投与量は１ｍｇ／ｋｇ（体重）若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、又は１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。別の例では、投与量は０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）若しくは１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。別の例では、投与量は０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）若しくは２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。別の例では、投与量は０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）若しくは３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。好ましい例では、投与量は約３０ｋｇ／ｍｇであり得る。
【０１３１】
本発明の方法は単回投与としての、２回投与又は複数回投与での被験体への抗体の投与を含み得る。抗体の用量は約１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）、約３００μｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）又は約１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）であり得る。被験体に、かかる用量を毎日、１日おきに、毎週、又は実証的分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って投与することができる。処置は長期にわたる、例えば少なくとも６ヶ月の複数回投与での投与を含み得る。付加的な処置レジームは、２週間に１回又は月１回又は３ヶ月〜６ヶ月に１回の投与を含み得る。例示的な投与スケジュールとしては、連日１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ又は毎週６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体、少なくとも１つの本発明による抗体を同時に投与することができ、この場合、投与される各抗体の投与量は指定の範囲に含まれる。
【０１３２】
本発明の抗体は複数回投与することができる。単回投与間の間隔は週単位、月単位又は年単位とすることができる。間隔は、患者におけるＥＶ７１に対する抗体の血液レベルを測定することによって指定されるような不規則であってもよい。一部の方法では、投与量は１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、一部の方法では２５μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度が達成されるように調整される。代替的には、本発明の抗体は持続放出配合物として投与することができ、この場合、より低頻度の投与が必要とされる。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。概して、ヒト化抗体はキメラ及び非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。
【０１３３】
投与量及び投与頻度は、処置が予防的であるか又は治療的であるかに応じて変化させることができる。予防用途では、本発明の抗体又はそのカクテルを含有する組成物は、患者の抵抗力を増強するために未だ疾患状態にない患者に投与される。かかる量は、「予防的に効果的な用量」として規定される。この用途においても、正確な量は患者の健康状態及び全身免疫によって異なるが、概して投与１回当たり０．１ｍｇ〜２５ｍｇ、特に投与１回当たり０．５ｍｇ〜２．５ｍｇの範囲である。比較的低い投与量が比較的低頻度の間隔で長期にわたって投与される。
【０１３４】
治療用途では、比較的短い間隔での比較的高い投与量（例えば、投与１回当たり約１ｍｇ〜２００ｍｇの抗体；５ｍｇ〜２５ｍｇの投与量がより一般に使用される）が、疾患の進行が低減又は終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な回復を示すまでに必要とされる場合がある。
【０１３５】
本発明の抗体をコードする核酸の用量は、患者１人当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ又は３０μｇ〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、投与１回当たり１０〜１００又はそれ以上のビリオンである。
【０１３６】
本発明の抗体及び組成物は、治療的及び／又は予防的処置のために本明細書に記載されるような非経口、局所、静脈内、経口、胃内、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内又は筋肉内方法によって投与することができる。筋肉内注射又は静脈内注入が抗体の投与に好ましい。
【０１３７】
核酸の投与
ＥＶ７１に対する免疫応答は、本発明の抗体をコードする核酸の投与によって誘導することができる。かかる核酸は、配列表内に記載され、配列表を参照したＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。本発明の抗体をコードする核酸セグメントは、意図される患者の標的細胞における核酸セグメントの発現を可能とするプロモーター及びエンハンサー等の調節要素に連結することができる。血液細胞における発現については、免疫応答の誘導に望ましいように、例示的なプロモーター及びエンハンサー要素として、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン遺伝子及び／又はＣＭＶ主要中間初期プロモーター及びエンハンサーに由来するものが挙げられる（Stinskiの米国特許第５，１６８，０６２号及び同第５，３８５，８３９号）。連結した調節要素及びコード配列がベクターにクローニングされることが多い。二重鎖抗体の投与については、２つの鎖を同じ又は別個のベクターにクローニングすることができる。
【０１３８】
レトロウイルス系（例えば、Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993)を参照されたい）；アデノウイルスベクター（例えば、Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993)を参照されたい）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867 (1994)を参照されたい）、ワクシニアウイルス及び鳥類ポックスウイルスを含むポックスウイルス科に由来するウイルスベクター、シンドビスウイルス及びセムリキ森林熱ウイルスに由来するもののようなアルファウイルス属に由来するウイルスベクター（例えば、Dubensky et al., J. Virol. 70:508 (1996)を参照されたい）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Johnston et al.の米国特許第５，６４３，５７６号を参照されたい）、並びに水疱性口内炎ウイルス等のラブドウイルス（Roseの米国特許第６，１６８，９４３号を参照されたい）、並びにパピローマウイルス（Ohe et al., Human Gene Therapy 6:325 (1995)、Woo et al.の国際公開第９４／１２６２９号及びXiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)）を含む多数のウイルスベクター核酸送達系が利用可能である。
【０１３９】
本発明の抗体をコードする核酸又はそれを含有するベクターは、個体又は細胞への送達のためにリポソームにパッケージングすることができる。好適な脂質及び関連類似体がEppstein et al.の米国特許第５，２０８，０３６号、Felgner et al.の米国特許第５，２６４，６１８号、Roseの米国特許第５，２７９，８３３号及びEpand et al.の米国特許第５，２８３，１８５号に記載されている。かかる抗体をコードするベクター及び核酸を粒子担体に吸着又は会合させてもよく、その例としては、ポリメタクリル酸メチルポリマー及びポリラクチド及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が挙げられる。例えば、McGee et al., J. Micro Encap. (1996)を参照されたい。
【０１４０】
本発明の核酸を含有する遺伝子療法ベクター又は裸のポリペプチドは、個々の患者への投与、通例、全身投与（例えば静脈内、腹腔内、鼻内、胃内、皮内、筋肉内、皮下又は頭蓋内注入）又は局所適用（例えば、Anderson et al.の米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい）によってｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。「裸のポリヌクレオチド」という用語は、トランスフェクション促進剤と会合させて送達されないポリヌクレオチドを指す。裸のポリヌクレオチドは、場合によってはプラスミドベクターにクローニングされる。かかるベクターは、ブピバカイン等の促進剤を更に含んでいてもよい（Weiner et al.の米国特許第５，５９３，９７２号）。ＤＮＡは、遺伝子銃を用いて投与することもできる。Xiao & Brandsma（上掲）を参照されたい。抗体をコードするＤＮＡを、微細金属ビーズの表面上に沈着させる。マイクロプロジェクティル（microprojectiles）は衝撃波又は膨張性ヘリウムガスによって加速し、幾つかの細胞層の深さまで組織に浸透する。例えば、Agricetus, Inc.（Middleton Wis.）製のＡｃｃｅｌ（商標）  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｄｅｖｉｃｅが好適である。代替的には、裸のＤＮＡを、単純にＤＮＡを化学的又は機械的刺激により皮膚上にスポッティングすることによって血流中まで皮膚を通過させることができる（Howell et al.の国際公開第９５／０５８５３号を参照されたい）。
【０１４１】
更なる変形形態では、本発明の抗体をコードするベクターは、個々の患者から外植した細胞（例えばリンパ球、骨髄吸引液、組織生検試料）又はユニバーサルドナー造血幹細胞等の細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで送達し、続いて通常はベクターが組み込まれた細胞の選択後に患者への細胞の再移植を行うことができる。
【０１４２】
核酸、宿主細胞及び抗体の産生
本発明は、開示の抗体ポリペプチド鎖をコードする核酸に更に関する。本発明の核酸は配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３によるヌクレオチド配列を有し得る。核酸は、チミン核酸塩基がウラシルで置換されたＲＮＡ配列であってもよい。
【０１４３】
本発明の抗体は、組み換え発現によって作製することができる。定常領域に任意に連結した軽鎖及び重鎖可変領域をコードする上記のような核酸を、発現ベクターに挿入することができる。本発明の抗体をコードする核酸を含むベクターは、それ自体が本発明の一部である。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングすることができる。本発明の抗体鎖をコードする核酸を、抗体ポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（複数の場合もある）中の１つ以上の制御配列に操作可能に連結する。発現制御配列としては、プロモーター（例えば、自然に会合した又は異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ又はＥｘｐｉ２９３細胞）を形質転換又はトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。かかるベクターを適切な宿主に組み込むことができ、宿主は高レベルのヌクレオチド配列の発現、並びに抗体の採取及び精製に好適な条件下で維持される。
【０１４４】
一実施形態では、核酸は本明細書に記載される本発明の抗体をコードする。別の実施形態では、ベクター、好ましくは発現ベクターは、本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸を含む。更なる実施形態では、ベクターは、プロモーターに操作可能に連結した本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸を含む。例示的な発現ベクターは、本明細書で開示される核酸と組み合わせて本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むｐＨｕＫ及びｐＨｕＧ１である。抗体軽鎖及び重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列をもたらす他のベクターを使用することもできる。
【０１４５】
本発明に使用される発現ベクターは通例、宿主生物においてエピソーム又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性又はネオマイシン耐性）を含有する（例えば、Itakura et al.の米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。
【０１４６】
宿主細胞を発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所要の配列をコードする遺伝子の増幅に好適な従来の栄養培地中で培養する。本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞は、それ自体が本発明の一部である。
【０１４７】
本発明は、本発明による抗体を作製する方法であって、宿主細胞培養物中で同様に本発明によるベクターを発現させて上記抗体を産生させ、抗体を細胞培養物から回収することを含む、方法にも関する。この方法は、上記の抗体又は抗体鎖をコードする１つ以上の核酸を含むベクターを本明細書に記載される宿主細胞に移入し、核酸（複数の場合もある）の発現を可能にする条件下で宿主細胞培養物を増殖させ、発現された抗体を当該技術分野で既知の任意の好適な方法によって回収することを含む。一例では、ベクターはｐＨｕＫ及びｐＨｕＧ１であり、核酸は配列番号２２及び配列番号２３に提示されるヌクレオチド配列を含み、宿主細胞はヒトＥｘｐｉ２９３懸濁細胞である（実施例１を参照されたい）。
【０１４８】
本発明の核酸のクローニングへの使用に好適な微生物宿主生物としては、原核生物宿主；大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）等の桿菌、並びにサルモネラ、セラチア及び様々なシュードモナス種等の他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核生物宿主においては、通例、宿主細胞に適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製することもできる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、又はファージラムダに由来するプロモーター系等の幾つもの様々な既知のプロモーターが存在する。プロモーターは通例、任意にオペレーター配列と共に発現を制御し、転写及び翻訳の開始及び終了のためのリボソーム結合部位配列等を有する。原核細胞中で使用されるベクターも複製起点構成要素を必要とする。
【０１４９】
酵母等の他の微生物を本発明の抗体、核酸又はベクターを発現させるために使用することもできる。サッカロミセスが好ましい酵母宿主であり、好適なベクターは発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終結配列等を所望に応じて有する。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素が挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、特にアルコール脱水素酵素、イソシトクロム（isocytochrome）Ｃ、並びにマルトース及びガラクトースの利用に関与している酵素に由来するプロモーターが挙げられる。
【０１５０】
微生物に加えて、哺乳動物の組織細胞培養物を、本発明の抗体ポリペプチド（例えば、抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を本発明の核酸及びベクターから発現及び産生させるために使用することもできる。Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)を参照されたい。本発明の核酸又はベクターを含む真核生物又は哺乳動物細胞宿主は、それ自体が本発明の一部である。異種タンパク質（例えば、無傷抗体）を分泌することが可能な多数の好適な宿主細胞株が当該技術分野で開発されていることから、実際には真核細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、又は形質転換Ｂ細胞若しくはハイブリドーマが挙げられる。細胞はヒトであっても、又は非ヒト、例えば非ヒト哺乳動物細胞であってもよい。細胞がＥｘｐｉ２９３ヒト細胞であるのが好ましい。本発明の抗体は、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（商標）  ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株（BioWa／Lonza）、ＧｌｙｍａｘＸ（商標）改変細胞（ProBioGen）又はアヒル胚性幹細胞株ＥＢ６６（Valneva）等のアフコシル化タンパク質を産生するように改変された細胞株中で産生させることができる。哺乳動物細胞の発現ベクターとしては、概して、以下の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：シグナル配列、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、並びに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列。好ましい発現制御配列は免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)を参照されたい。
【０１５１】
真核生物宿主細胞に使用される本発明のベクターは、対象の成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドを含有していてもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるのが好ましい。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列及びウイルス分泌型リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１５２】
代替的には、本発明の抗体をコードする配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入及びその後のトランスジェニック動物の乳汁中での発現のための導入遺伝子に組み込むことができる（例えば、Deboer et al.の米国特許第５，７４１，９５７号、Rosenの米国特許第５，３０４，４８９号及びMeade et al.の米国特許第５，８４９，９９２号を参照されたい）。好適な導入遺伝子としては、カゼイン又はβラクトグロブリン等の乳腺特異的遺伝子に由来するプロモーター及びエンハンサーと操作可能に連結した軽鎖及び／又は重鎖のコード配列が挙げられる。
【０１５３】
対象のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖及び軽鎖をコードする配列並びに発現制御配列）を含有する本発明のベクターは、細胞宿主の種類に応じた既知の方法によって宿主細胞に移植することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞に一般に利用され、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃（biolistics）又はウイルスベースのトランスフェクションを他の細胞宿主に用いることができる（概して、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 4th ed., 2012)を参照されたい）。哺乳動物細胞の形質転換に用いられる他の方法としては、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションが挙げられる（概して、Sambrook et al.（上掲）を参照されたい）。トランスジェニック動物の作製については、導入遺伝子を受精卵母細胞にマイクロインジェクトするか、又は胚性幹細胞のゲノム、及び除核卵母細胞に移植したかかる細胞の核に組み込むことができる。
【０１５４】
重鎖及び軽鎖を別個の発現ベクター上でクローニングする場合、ベクターを同時トランスフェクトして本発明の無傷抗体の発現及び集合を達成する。発現した後、本発明の全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリン形態を硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動等を含む当該技術分野の標準手順に従って精製することができる（概して、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)を参照されたい）。少なくとも約９０％〜９５％の均一性の実質的に純粋な抗体が好ましく、９８％〜９９％又はそれ以上の均一性が本明細書に記載される製薬学的用途に最も好ましい。当該技術分野で既知の標準タンパク質精製法を用いることができる。以下の手順が好適なタンパク質精製手順の例示である：イムノアフィニティ（immunoaffinity）又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥ等の陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング（chromatofocusing）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿及びゲル濾過。
【０１５５】
本発明の抗体の作製は、本明細書に記載される技法及び当業者に既知の技法を含む任意の好適な技法によって行うことができる。本発明の抗体は、抗体の大規模製造のための当該技術分野で既知の方法を用いて商業規模で作製することができる。例えば、これは本明細書に記載されるような組み換え発現系を用いて達成することができる。
【０１５６】
本明細書で言及する全ての特許、特許出願及び文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１５７】
理解を明確にする目的で説明及び例を用いて多少詳しく開示を行ったが、本開示の趣旨又は範囲から逸脱することなく様々な変更及び修正を行うことができることが当業者には明らかである。したがって、説明及び例は限定的であると解釈されるものではない。
【０１５８】
本発明を以下の実施例によって説明する。
【実施例】
【０１５９】
本明細書の実施例は、マウスに由来する抗ＥＶ７１  Ｄ５抗体のヒト化バージョンの生成及び特性を記載する。
【０１６０】
実施例１．  Ｄ５ヒト化抗体変異体の設計
予備調査により、キメラＤ５抗体の結合能が天然ネズミＤ５抗体のものと同様であることが示された。キメラＤ５抗体が機能及びＥＶ７１ウイルスへの結合を保持することが見出されたため、抗体の更なるヒト化を行った。
【０１６１】
ネズミＤ５抗体カッパ軽鎖（ＶＨ）及び重鎖（ＶＫ）に由来する可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅し、カッパ／ＩｇＧ発現ベクター（それぞれｐＨｕＫ及びｐＨｕＧ１）に導入した。構築物をＥｘｐｉ２９３懸濁細胞に同時トランスフェクトし、ヒト定常領域とネズミＤ５可変領域とを含むキメラＤ５（ｃＤ５）抗体を生成した。
【０１６２】
ＥＶ７１−ＶＬＰ（ウイルス様粒子）及びＳＰ７０ペプチド結合エピトープへのキメラＤ５抗体の結合をＥＬＩＳＡによって測定し、キメラ抗体はネズミＤ５抗体と同等の、むしろ僅かに低いＥＣ５０値を有することが見出された（図２ａ及び図２ｂ）。ＥＶ７１−ＶＬＰへのマウス及びキメラＤ５抗体の結合の更なる特性化をバイオレイヤー干渉法によって行った。ＥＶ７１−ＶＬＰへのマウス及びキメラＤ５抗体の結合の図３中の定常状態プロットから、２つの抗体がＥＶ７１−ＶＬＰに同等の見かけのＫＤ値で結合することが示される。
【０１６３】
ヒト化には、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のフレームワーク領域としての好適なヒト可変領域の同定が必要とされる。ヒト可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＫ）配列データベースを、Ｄ５抗体ＶＨ及びＶＫタンパク質配列と照合した。マウスＤ５抗体の構造中のＣＤＲ残基の４Å以内のフレームワーク残基を同定し、「４Å近接残基」と指定した。４Å近接残基中のＤ５  ＶＨに対して最も高い同一性を有するヒトＶＨ配列アラインメントを好適なフレームワーク配列とみなした。
【０１６４】
配列ＥＦ１７８０５３を、ネズミＤ５  ＶＨとの高い配列同一性からヒト重鎖ドナー候補として選んだ。ネズミＤ５抗体重鎖に由来するＣＤＲ１、２及び３をＥＦ１７８０５３のフレームワークに導入し、Ｄ５  ＨＡ（配列番号１）と表される配列を生成した。同定された８つの４Å近接残基を同等のマウス残基へと復帰突然変異して、８つの突然変異：Ｙ２７Ｆ、Ｔ２８Ｎ、Ｆ２９Ｉ、Ｔ３０Ｋ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ａ及びＳ９８Ｎを含有するＤ５  ＨＢ（配列番号１１）と表されるヒト化抗体変異体を生成した。ＨＣ（配列番号１３）、ＨＤ（配列番号１４）、ＨＥ（配列番号１５）、ＨＦ（配列番号１６）、ＨＧ（配列番号１７）、ＨＨ（配列番号１８）、ＨＩ（配列番号１９）及びＨＪ（配列番号２０）と表され、各々が８つの突然変異の１つを上記の順序で含む８つの更なる重鎖変異体を生成した（すなわち、例えば変異体ＨＣはＹ２７Ｆ突然変異のみを含有し、ＨＤはＴ２８Ｎ突然変異のみを含有する）。図１を参照されたい。
【０１６５】
配列ＡＪ３８８６４６をヒトカッパ軽鎖ドナー候補として選んだ。ネズミＤ５  ＶＫに由来するＣＤＲ１、２及び３をＡＪ３８８６４６のフレームワークに導入した。得られる構築物をＤ５  ＫＡ（配列番号２）と指定した。Ｄ５  ＫＡ中の２つの不適合４Å近接残基を同等のマウス残基へと復帰突然変異（Ｉ２Ｖ及びＶ３Ｌ）させた、別の変異体であるＤ５  ＫＢ（配列番号７）を生成した。ＫＣ（配列番号８；Ｉ２Ｖ）、ＫＤ（配列番号９；Ｖ３Ｌ）及びＫＥ（配列番号１０；Ｉ２Ｖ、Ｖ３Ｌ及びＱ５０Ｋ）と表される置換ＫＡドメインを有する３つの更なる変異体を生成した。配列及び突然変異を図４に示す。
【０１６６】
以下の実施例において論考するヒト化抗体は、「ｈＥＶ７１（重鎖変異体）（軽鎖変異体）」として記載する。例えば、「ｈＥＶ７１  ＨＢＫＡ」は、ＨＢ重鎖及びＫＡ軽鎖を含有するＤ５抗体（ＥＶ７１ウイルスに結合する）のヒト化形態である。
【０１６７】
実施例２．  Ｄ５ヒト化抗体の生成
実施例１において生成したＥＦ１７８０５３（ＨＡ〜ＨＪ）及びＡＪ３８８６４６（ＫＡ〜ＫＥ）の修飾可変ドメインヌクレオチド配列を発現ベクターｐＨｕＫ及びｐＨｕＧ１に導入し、大腸菌細胞において発現させた。プラスミドＤＮＡを抽出し、ヒト化ＶＨ及びＶＫ鎖をコードする発現プラスミド調製物を用いてＥｘｐｉ２９３細胞をトランスフェクトした。細胞を無血清培地中で５日間〜７日間培養し、得られる分泌抗体を採取した。
【０１６８】
実施例３．  初期Ｄ５ヒト化抗体変異体の有効性
本実施例により、実施例１において生成したヒト化Ｄ５抗体変異体は、キメラＤ５抗体と比較した場合により低いＥＶ７１−ＶＬＰとの結合及び実質的に低い関連ＥＶ７１  ＳＰ７０ペプチドＤ５エピトープとの結合を示すことが示される。
【０１６９】
ＥＶ７１−ＶＬＰ又はＳＰ７０ペプチド抗原に対するヒト化Ｄ５抗体のＫＡ／ＫＢ軽鎖バージョンと組み合わせたＨＡ／ＨＢ重鎖の結合を結合ＥＬＩＳＡによって行った（Ku et al., (2012) J. Virol Methods 71 186:193-197に記載される）。抗体変異体の段階希釈物（約１００μｇ／ｍｌから出発する）を固定化ＥＶ７１−ＶＬＰ又はＳＰ７０ペプチドエピトープに添加し、室温で１時間振盪し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。抗ヒトカッパ鎖ＨＲＰを添加し、インキュベーション及び洗浄工程を繰り返した。ＴＭＢ／Ｋ−Ｂｌｕｅ基質を、反応物と共に室温で５分間〜１０分間インキュベートした後、反応をＨ２ＳＯ４  ＲＥＤ  ＳＴＯＰで停止させた。光学密度を４５０／６５０ｎｍで読み取った。
【０１７０】
図５に、カッパ軽鎖のＫＡ又はＫＢバージョンの存在が抗原に対する抗体の結合能に観察可能な差異を生じさせなかったことが示される。ＫＢに導入した２つの復帰突然変異は、抗体結合に不可欠ではないようである。
【０１７１】
ＨＡ及びＨＢ重鎖を含有するヒト化抗体変異体は、キメラＤ５抗体と比較した場合にＥＶ７１  ＳＰ７０ペプチドエピトープに対する結合能の減少を示した（図５）。図６に、ＳＰ７０ペプチドエピトープに対する更なるヒト化Ｄ５抗体バージョンｈＥＶ７１  ＨＣＫＡ〜ｈＥＶ７１  ＨＪＫＡの結合能がキメラＤ５抗体と比較した場合に著しく損なわれたことが示される。
【０１７２】
ＫＡ又はＫＢカッパ軽鎖のいずれかと組み合わせたヒト化抗体重鎖変異体ＨＡ〜ＨＪを、それらの中和能について試験した。図７に、ＨＢ重鎖を含有する抗体変異体のみがＥＶ７１ウイルスを中和することが可能な変異体であることが示される。
【０１７３】
多くの場合、ヒト化抗体では、非ヒトＣＤＲ配列のおよそ４Å以内のヒトフレームワーク中の残基（すなわち、４Å近接残基）を、抗体機能を維持するために対応する非ヒト残基によって置き換える必要がある。しかしながら、図５、図６及び図７には、重鎖ＨＢ〜ＨＪを含有するヒト化Ｄ５抗体変異体中で４Å近接残基をネズミ残基へと復帰突然変異することで、予想される抗体機能の維持が達成されず、実施例３に記載されるヒト化Ｄ５抗体の結合能がキメラＤ５抗体と比較して大幅に低減することが示される。
【０１７４】
実施例４．  ｈＥＶ７１  ＨＭ〜ＨＱヒト化重鎖の有効性
実施例３におけるヒト化抗体変異体の結合活性の予期せぬ喪失に応答して、新たな及び／又は異なるネズミ残基への復帰突然変異の組合せを含有するヒト化Ｄ５重鎖の新たなバージョンを生成し、結合能が改善されたヒト化Ｄ５抗体を得ようとした。３つの有望な重鎖配列変異をＨＭ（配列番号３）、ＨＮ（配列番号４）及びＨＱ（配列番号６）と指定した。
【０１７５】
ＨＭ〜ＨＱ重鎖をカッパ軽鎖のＫＡバージョンと組み合わせた。ＳＰ７０ペプチドエピトープに対するｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ、ｈＥＶ７１  ＨＮＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＱＫＡ抗体の結合活性を、図８に示される結合ＥＬＩＳＡによって測定した。ｈＥＶ７１  ＨＮＫＡバージョンは、ＨＢＫＡ候補と同様の結合能を示した。しかしながら、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＱＫＡバージョンは、ＳＰ７０ペプチドエピトープへの結合について予期せぬ改善を示し、キメラＤ５抗体に対する同様の結合能が示された。ＨＭ重鎖に存在する２つの補助的突然変異（配列番号３中のＫ２３Ｔ及びＳ７７Ｎ）が、ＨＢ重鎖変異体中に既に存在する突然変異に加えて、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡヒト化Ｄ５抗体の結合を改善した。ＨＱ重鎖変異体はＨＢ重鎖中に存在する全ての突然変異、ＨＭ重鎖中の２つの追加の突然変異及び付加的な突然変異：Ｒ３８Ｋを含有する。ｈＥＶ７１  ＨＱＫＡは、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡに対して優れた結合能を有しないようであり、Ｒ３８Ｋ突然変異は抗体機能に極めて重要であるようには思われない。
【０１７６】
ＨＰ（配列番号５）と表される他の１つのヒト化Ｄ５重鎖を生成した。しかしながら、ｈＥＶ７１  ＨＰＫＡは、ＳＰ７０ペプチドエピトープに対して弱い結合を示した（図８）。
【０１７７】
１５個のＳＰ７０ペプチドエピトープの変形に対するｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ〜ｈＥＶ７１  ＨＱＫＡ変異体の結合を、各抗体のＥＣ８０で結合ＥＬＩＳＡによって試験した。エピトープ変異を、ＳＰ７０ペプチド配列（配列番号１２）中の各アミノ酸をアラニン残基へと一つずつ突然変異させることによって生じさせた。結合ＥＬＩＳＡアッセイを前述のように行った。図９に、ＨＭ〜ＨＱ抗体変異体がＳＰ７０ペプチドアラニンスキャニングライブラリーに対してキメラＤ５抗体及びＨＢＫＡ変異体と同じパターンの結合を示すことが示される。図８の結合ＥＬＩＳＡにおいて観察されるように、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＱＫＡ変異体は、ＳＰ７０ペプチドエピトープ変異に対して最高の結合能を示した。
【０１７８】
実施例５．  ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡウイルス中和
中和アッセイを行い、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ〜ｈＥＶ７１  ＨＱＫＡヒト化Ｄ５抗体変異体のＥＶ７１ウイルス中和能を評価した（図１０）。ｈＥＶ７１  ＨＮＫＡ変異体は、ｈＥＶ７１  ＨＢＫＡと比較して僅かなウイルス中和の改善を示した。ｈＥＶ７１  ＨＰＫＡは、ウイルスを中和することができなかった。しかしながら、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＱＫＡ変異体、並びに比較的程度は低いがｈＥＶ７１  ＨＮＫＡは、ｈＥＶ７１  ＨＢＫＡよりも顕著に良好に機能し、マウスＤ５抗体と比較しても予期せぬ改善を示した。
【０１７９】
実施例６．  ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体は、キメラＤ５抗体と同様のＳＰ７０ペプチドに対する結合親和性を示す
本実施例により、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の観測結合定数（ＫＡ）及び観測解離定数（ＫＤ）が実証される。Ｋａは、（抗体）＋（抗原）への構成要素の解離の速度との平衡が達成された反応点で存在する（抗体）（抗原）複合体の量を説明する。高親和性抗体は、低親和性抗体よりも短時間でより多量の抗原に結合し、１０７Ｍ−１よりも大きいＫａ値を有する。Ｋｄが低いほど、その抗原又はエピトープに対する抗体の親和性は大きくなる。Ｋｄ値は通常、殆どの抗体について低マイクロモル（１０−６）〜ナノモル（１０−７〜１０−９）の範囲、又は高親和性抗体若しくは超高親和性抗体について低ナノモル（１０−９）若しくは更にはピコモル範囲（１０−１２）である。
【０１８０】
ＳＰ７０ペプチドエピトープに対するキメラＤ５及びｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の結合を、「観測」ＫＡ及びＫＤ値をもたらす熱力学法である等温滴定型カロリメトリー（ＩＴＣ；図１１）を用いて行った。ＫＤはギブス自由エネルギー、エンタルピー及びエントロピーを用いて算出することができる：ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳ及びΔＧ＝ＲＴ  ｌｎ  ＫＤ。ＫＡはＫＡ＝１／ＫＤを用いて算出される。
【０１８１】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体は、２．６２×１０７Ｍ−１の観測ＫＡでＳＰ７０ペプチドに結合した。キメラＤ５抗体は、５．６６×１０７Ｍ−１の観測ＫＡでＳＰ７０ペプチドに結合した。どちらの抗体もＳＰ７０エピトープに対して高い親和性を有する。
【０１８２】
図１１から、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体がキメラＤ５抗体の観測ＫＤ値１７．１ｎＭ（１．７１×１０−８Ｍ）と同等であり、高親和性抗体についての一般的ＫＤ範囲に近い観測ＫＤ値３８．２ｎＭ（３．８２×１０−８Ｍ）でＳＰ７０ペプチドに結合することも明らかとなる。
【０１８３】
このため、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体は、ＥＶ７１ウイルスのＶＰ１カプシドタンパク質上のＳＰ７０ペプチドエピトープに対して、キメラＤ５抗体について算出される値と同様の高い観測結合定数及び低い観測解離定数を有する。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡのフレームワーク領域中に導入したネズミ突然変異により、エピトープ結合に必要とされる必須のネズミＤ５特徴を有する重鎖を有する抗体が作製された。このため、本発明の抗体は臨床用途、例えば治療的若しくは予防的用途、又は本明細書に記載される他の用途に使用することができる。特に、本発明の抗体は、ＥＶ７１感染及び／又はＨＦＭＤ及び関連疾患の処置、又は本発明の抗体をＥＶ７１のＳＰ７０ペプチドエピトープに結合させる必要がある状況で使用することができる。
【０１８４】
以下の実施例では、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の詳細な生物物理学的分析を提示し、臨床試薬に望ましい又は必要とされる抗体の特性を論考する。
【０１８５】
実施例７．  ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの熱安定性
モノクローナル抗体は比較的脆弱であり、高温により不可逆的凝集に感受性が高いタンパク質を生じる抗体変性が引き起こされる可能性がある。加えて、より安定した抗体は患者血清中より長い半減期を有し、治療的投与戦略に対して有益な効果を有し得る。
【０１８６】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の熱安定性を試験した。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体を１００μｌの１％ミルク／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０でＥＣ８０濃度まで希釈した。抗体を２５℃〜８０℃の温度処理に５℃間隔で１０分間供し、４℃まで冷却し、結合ＥＬＩＳＡによって試験した。図１２ａに、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡが、ＳＰ７０への結合が減少する７０℃まで安定しており、ＥＶ７１  ＳＰ７０ペプチドエピトープに対するその結合能を保持することが示される。
【０１８７】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの融解温度（Ｔｍ）をサーマルシフトアッセイにおいて試験した。１μＭ又は２μＭの最終濃度の抗体を、蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ）と共にｑＰＣＲサーマルサイクラーにおいて１サイクル当たり１℃上昇させながら２５℃から９５℃まで７１サイクルにわたってインキュベートした。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡのＴｍは６９℃〜７０℃と算出された（図１２ｂ）。
【０１８８】
６９℃〜７０℃の融点、並びにその融点までの及び融点を超える温度でＳＰ７０エピトープに結合する能力から、本発明の抗体が治療的及び予防的用途に好適であり、患者の身体中で変性する可能性が低く、長い半減期を有し得るため、患者がＨＦＭＤ、関連疾患及び／又はＥＶ７１感染を処置するためにより少ない用量の抗体を必要とし得ることが実証される。
【０１８９】
実施例８．  ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの凝集及び溶解性
本実施例により、本発明の抗体を濃縮し、モノマー形態のままにすることができることが示される。
【０１９０】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体をＨＰＬＣシステムのサイズ排除カラムに０．４ｍｌ／分で注入し、多角度光散乱によって分析して絶対モル質量を決定し、凝集を確認した。図１３中のプロファイルは、検出される種が本分析におけるＩｇＧモノマーの予想範囲である約１３６．６ｋＤａの平均分子量を有していたことから、凝集の徴候を示さない。抗体は単分散である（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．０５）。質量回収率は９９．６％〜９９．９％であり（注入質量に対する算出質量）、良好なタンパク質回収率を示し、サンプルがカラムに付着しない、又はガードカラムによって保持される不溶性凝集体を含有しないようである。全体として、データからｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体について凝集の問題がないことが示唆される。
【０１９１】
相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）分析を行い、非特異的タンパク質間相互作用を伴う抗体の傾向を評価し、下流で製造問題を生じ得る任意の溶解性の問題の指標を得た。ＣＩＣは、可溶性抗体と不溶性抗体とを区別するために用いることができる。保持指数（ｋ’）の上昇は、自己相互作用の傾向及び低い溶解性を示す。サンプルを、一方が３０ｍｇのヒトポリクローナルＩｇＧを含む１ｍｌのＮＨＳ活性化樹脂、他方が１ｍｌのＮＨＳ活性化対照カラムへの２回の別個の２０μｌの注入によって分析した。溶出サンプルをＵＶ吸光度によって検出した。サンプルピーク保持時間を用いて保持因子ｋ’を算出した。図１４に、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体が０．０３７未満の保持指数を示し、非特異的相互作用の低い傾向及び良好な溶解性を示すことが示される。
【０１９２】
動的光散乱（ＤＬＳ）を、可溶性凝集体の検出のための相補的な技法（すなわち、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ等の静的光散乱に対する）として用いた。ダルベッコＰＢＳ（Sigma；２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３８．０ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；生理的ｐＨ）中のｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の三連の３０ｍｌサンプルを、溶媒吸収濃縮装置（ＭＷＣＯ  ７５００ｋＤａ）を用いて濃縮し、濃度を定期間隔で測定した（図１５）。抗体は明らかな沈殿なしに９８．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。凝集評定ＤＬＳで示されるように、濃縮後に抗体がモノマーと一致する流体力学的半径及び多分散性を有することが見出された。データから、抗体が９８ｍｇ／ｍｌまでの濃度で沈殿する傾向にないことが示唆される。平均粒径（Ｚ−Ａｖｅ直径）及び多分散指数（ＰＤＩ）はキュムラント分析によって得たが、濃縮前及び濃縮後の抗体サンプルについて同様の値を示す。
【０１９３】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体を、凍結／融解ストレス中の凝集傾向について更に試験した。精製候補抗体のサンプルを、−８０℃で１５分間に続いて室温で１５分間の融解の１０サイクルに供した。次いで、「非ストレス」及び「ストレス」サンプルをＳＥＣ−ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱）によって分析し、下流の製造問題を生じ得る凝集体の存在及び／又は誘導を確認した。図１６中のデータから、凍結／融解がｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体において凝集を引き起こさないことが示唆される。ストレス後のｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの分子量は、約１４１．５ｋＤａであり、ＩｇＧのモノマー重量に近い。抗体は単分散（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．０５）であり、１つの分子量のみが存在することを意味し、モノマー質量分率は９９．８％である。
【０１９４】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体を熱誘導ストレス分析に供し、凝集を調査した。精製候補抗体のサンプルをａ）４℃、ｂ）２５℃、ｃ）３７℃及びｄ）５０℃に３３日間曝露した。次いで、サンプルを上記のようなＳＥＣ−ＭＡＬＳによって分析し、凝集を確認した。図１７に、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの分子量が４つ全ての温度で１３６ｋＤａのモノマー重量の前後のままであることが示される。抗体は単分散（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．０５）であり、１つの分子量のみが存在することを意味し、質量分率値は熱処理に影響を受けなかった。
【０１９５】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の等電点（ｐＩ）を、対向端を酸性（アノード）及び塩基性（カソード）溶液中に浸漬する、キャピラリー場にわたる電圧の印加によるｐＨ勾配によるタンパク質のｐＩに基づく分離を可能にする方法であるキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）によって決定した。タンパク質は等電点に達した後に移動を停止し、中性電荷を有する。この技法は、以下のバッファー中で５０ｍＭ以下のＮａＣｌを含有する５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を用いて行った：アノード液（２００ｍＭリン酸）、カソード液（３００ｍＭ水酸化ナトリウム）、化学動員剤（chemical mobilizer）（３５０ｍＭ酢酸）、カソード安定剤（５００ｍＭアルギニン）、アノード安定剤（２００ｍＭイミノ二酢酸）、４．３Ｍ尿素溶液及び３Ｍ尿素−ｃＩＥＦゲル溶液。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体についての主ピークのｐＩは、ｐＨ７．４にあることが決定された。全体として、データからｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体が優れた生物物理学的特性を有し、凝集又は溶解性の問題がないことが示唆される。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体はモノマー状態のままであり、低い非特異的相互作用の傾向を示し、任意の溶解性の問題を有しないようであり、濃縮した場合に凝集又は沈殿せず、凍結融解の繰返しサイクルに供した場合に凝集を起こさず、長時間の熱処理に供した場合に凝集する傾向を示さない。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体は、生物物理学的特性についての全てのＱＣ基準に合格する。組み合わせると、これらのデータから、本発明の抗体が、かかる処理によって損傷を受ける又は使用不能となることなく本明細書に記載されるように製造、保管及び使用することができることが実証される。
【０１９６】
実施例９．  ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの血清安定性評定
本実施例では、哺乳動物血清中でのｈＥＶ７１抗体の安定性を実証する。
【０１９７】
ＰＢＳ中のｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の精製サンプルを、マウス、ヒト及びカニクイザルの血清中、３７℃で５日、１０日、２０日及び３０日間インキュベートした。インキュベーション後の抗体の結合親和性を、ＳＰ７０ペプチドエピトープに対する結合ＥＬＩＳＡによって測定した。３つの異なる血清中でインキュベートしたｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの結合を、任意のインキュベーションを行わなかった抗体結合及びＰＢＳ中でインキュベートした抗体と比較した。図１８中のＥＬＩＳＡアッセイから、３１日後に血清とインキュベートした抗体のＳＰ７０ペプチドエピトープに対する結合が、ＰＢＳとインキュベートした抗体及びインキュベートしなかった抗体の結合と非常によく似ていることが示される。したがって、１ヶ月にわたるマウス、ヒト及びカニクイザルの血清中でのｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体のインキュベーションは、ＳＰ７０ペプチドエピトープに対する抗体の結合機能に影響を有しない。
【０１９８】
抗体の血清安定性は、抗体を被験体又はかかる被験体の細胞において使用する場合に重要である。本発明の抗体は、血清ベースの環境においてＳＰ７０エピトープに対する結合能を保持し、したがって治療的及び予防的処置に有用である。
【０１９９】
実施例１０．  抗体機能に極めて重要な残基
ＳＰ７０ペプチドとの複合体中でのキメラＤ５抗体のｆａｂ領域の構造を、Ｘ線結晶構造解析によって分解した。構造の分析から、マウスＤ５重鎖のアスパラギン残基番号７６の側鎖（Kabatに従うナンバリング；配列番号３中の復帰突然変異した残基Ｎ７７と同等である）が、フェニルアラニン２７及びアスパラギン２８の主鎖に対して水素結合を形成することが明らかとなった。これら２つの残基は可変重鎖のＣＤＲループ１の開始から２アミノ酸前に位置し、抗原認識のためのこのループの安定化に必要であるようである。したがって、このアスパラギン残基（Ｎ７６（Kabat））がこの機能の保存のために保持されることが重要である。
【０２００】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ及びｈＥＶ７１  ＨＱＫＡヒト化抗体変異体（それぞれ配列番号３及び配列番号６）は、復帰突然変異したネズミＤ５  Ｎ７７残基をＤ５  Ｆ２７及びＮ２８残基に加えて含有する。これにより、アスパラギンではなくヒトセリン残基を７７位に含有する重鎖変異体ＨＢ突然変異（配列番号１１）を含有する抗体と比較した場合のＨＭＫＡ及びＨＱＫＡ変異体のより高い結合親和性及びウイルス中和能が説明される。
【０２０１】
実施例１１．  ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡによる処理は、ＥＶ７１を感染させたマウスの１００％の生存率をもたらす。
【０２０２】
治療研究のために、７日齢ＩＣＲマウスの群に５×１０５  ＴＣＩＤ５０のＥＶ７１／ＭＡＶ−Ｗを腹腔内接種した。次いで、感染の１日後にマウスに単回用量（１０μｇ／ｇ（体重））のｍＡｂ（マウスＤ５（ｎ＝１５）、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ（ＥＶＭ００；ｎ＝１５）又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｎ＝１６））を腹腔内注射によって投与した。全てのマウスを、生存及び臨床徴候について１４日間にわたって毎日モニタリングした。臨床スコアを以下のように格付けした：０、健常；１、運動性の低下；２、四肢脱力；３、麻痺；４、死亡。図１９に示されるように、対照抗体を与えたマウスは最終的に重症の疾患を発症し、死亡した（約６７％の死亡率）。対照的に、マウスＤ５又はヒト化Ｄ５（ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ；ＥＶＭ００）のいずれかを与えた全てのマウスが重症の臨床徴候なしに生存し続けた。これらの結果から、本発明の抗体が治療能力を完全に保持し、ＥＶ７１ウイルスをｉｎ  ｖｉｖｏで中和するように作用するため、本明細書に記載される治療的及び予防的用途に使用することができることが示される。
【０２０３】
実施例１２．  ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体バッファースカウティング（Scouting）
バッファースカウティングを、Malvern Zetasizer APSの機器での動的光散乱法を用いたサイズ分布の測定によりｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体について行った。０．５ｍｇ／ｍｌの抗体濃度を全ての測定について用いた。
【０２０４】
ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の流体力学的半径を、室温で３回の単一測定を行うことにより下記表２に示すバッファー中で測定した。室温で、ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体は、ＰＢＳ対照と同等の程度まで酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びコハク酸ナトリウムバッファー中で可溶性のままであった（表３）。凝集体は検出されなかった。
【０２０５】
昇温（temperature ramp）を同じバッファー中で行い、抗体が凝集し始める温度を決定した。５０℃から８０℃までに２℃の増分の温度で１回の測定を行った。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体は、ＰＢＳバッファー中では７０℃前後で凝集し、１０ｍＭ、２５ｍＭ及び５０ｍＭ酢酸ナトリウム−１３０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．２）バッファー（図２０）、１０ｍＭ、２５ｍＭ及び５０ｍＭリン酸ナトリウム−１３５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）バッファー（図２１）、並びに１０ｍＭ、２５ｍＭ及び５０ｍＭコハク酸ナトリウム−１２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）バッファー（図２２）中で７０℃の同様の凝集温度を有することが示された。１０ｍＭ、２５ｍＭ及び５０ｍＭクエン酸ナトリウム−１２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）バッファー中では、凝集温度は７２℃前後まで上昇した（図２３）。
【０２０６】
これらの結果から、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウム配合物をｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体に使用することができ、クエン酸ナトリウムバッファー配合物がｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ抗体の安定性を増大することが示された。
【０２０７】
【表３】
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【０２０８】
【表４】
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【０２０９】
実施例１３．  ＥＶ７１に感染した乳児サルにおけるｈＥＶ７１  ＨＭＫＡの保護効果
１．５±０．５月齢アカゲザルの群に、１×１０６ＣＣＩＤ５０のＥＶ７１を気管注入によって感染させた。サルに単回静脈内用量のｈＥＶ７１  ＨＭＫＡ（「抗体処理」、５ｍｇ／ｋｇ（体重）、ｎ＝４）、対照ヒトＩｇＧ１ｋ抗体（「ｈＩｇＧ１Ｋ対照」、５ｍｇ／ｋｇ（体重）、ｎ＝３）又は空溶媒対照（「モデル対照」、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、ｎ＝２）を感染と同じ日に投与した。全てのサルを感染後１４日間にわたってモニタリングした。体温及び血液ウイルス量の変化を記録した。
【０２１０】
ＥＶ７１ウイルス感染後に、溶媒対照群は、ＨＦＭＤの臨床症状と一致する体温の顕著な上昇及び血液中のウイルス量の増大を示した。
【０２１１】
溶媒処理群及び対照抗体処理群の動物は、感染後に体温の顕著な上昇を示した（図２４、表４）。ｈＥＶ７１  ＨＭＫＡで処理した群の動物は、感染後に体温の僅かな上昇を示したが、上昇は他の２つの群よりも少なかった。ＥＶ７１感染の３日〜７日後に、ｈｕＥＶ７１  ＨＭＫＡで処理した群の体温は、他の２つの群よりも有意に低かった。
【０２１２】
血液ウイルス量は各群で感染後に増大した。ＥＶ７１感染の４日〜５日後に、抗体処理群の血液サンプル中のウイルス量は、他の２つの群よりも有意に低かった（図２５、表５）。
【０２１３】
対照群に対する抗体で処理した動物の体温及びウイルス量の低下が観察されたことから、ｈｕＥＶ７１  ＨＭＫＡが、このｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいてＥＶ７１ウイルス感染を処置する効果を有することが示される。
【０２１４】
【表５】
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【０２１５】
【表６】
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【０２１６】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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