(57)【要約】  抗エストロゲン活性を有する化合物がヒト患者における乳がん又は他のエストロゲン応答性腫瘍の治療方法で使用され、この方法は、選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、選択的エストロゲン受容体抑制薬（ＳＥＲＤ）又はアロマターゼ阻害薬（ＡＩ）であり得る抗エストロゲン活性を有する化合物で患者を処置しながら、患者を２４〜１９０時間の擬絶食の状態とすることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の乳がん（ＢＣ）又は他のエストロゲン応答性腫瘍の治療方法における使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物であって、前記方法は、前記患者を前記抗エストロゲン活性を有する化合物で処置しながら、前記患者に減少させたカロリー摂取量を２４〜１９０時間適用することを含む、前記化合物。
【請求項２】
前記化合物が選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、選択的エストロゲン受容体抑制薬（ＳＥＲＤ）及びアロマターゼ阻害薬（ＡＩ）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項３】
前記化合物が、選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）であり、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、ラソフォキシフェン、オスペミフェン、アルゾキシフェン及びバゼドキシフェンからなる群から選択される、請求項２に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項４】
前記化合物が、選択的エストロゲン受容体抑制薬（ＳＥＲＤ）であり、フルベストラント、ＲＵ５８６６８、ＧＷ７６０４、ＧＤＣ−０８１０、ＡＺＤ９４９６、ピペンドキシフェン、アコルビフェン及びＯＰ−１０７４からなる群から選択される、請求項２に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項５】
前記化合物が、アロマターゼ阻害薬（ＡＩ）であり、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ボロゾール、ホルメスタン及びファドロゾールからなる群から選択される、請求項２に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項６】
前記減少させたカロリー摂取量が１０〜１００％減少させた一日カロリー摂取量である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項７】
前記減少させたカロリー摂取量が５０〜１００％減少させた、より好ましくは７５〜１００％減少させた一日カロリー摂取量である、請求項６に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項８】
前記減少させたカロリー摂取量が１０〜８５％減少させた一日カロリー摂取量であり、前記患者が、一価不飽和脂肪及び多価不飽和脂肪の含有量が高くタンパク質及び炭水化物の含有量が減らされている食品（カロリーの５０％以上が前記脂肪から生じる）を与えられる、請求項６に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項９】
前記減少させたカロリー摂取量の期間が４８時間〜１５０時間、好ましくは１２０時間である、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項１０】
前記患者へ前記抗エストロゲン活性を有する化合物が並行して投与される前記減少させたカロリー摂取量の期間が、前記患者が通常のカロリー摂取量を含む食事に従いつつ前記抗エストロゲン活性を有する化合物を与えられる５〜６０日の期間をそれぞれおいた後に、一回又は複数回反復される、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項１１】
前記減少させたカロリー摂取量が３００ｋｃａｌ／日未満、好ましくは１００〜２００Ｋｃａｌ／日に相当する、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項１２】
前記減少させたカロリー摂取量が、絶食によって、又は、カロリー量及び／若しくはタンパク質含有量は減らされているが栄養失調を防止するために必要な全ての微量栄養素を含有する栄養食によって達成される、請求項１１に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項１３】
前記ヒト患者が、前記抗エストロゲン活性を有する化合物で処置されつつ、さらに化学療法薬で処置される、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項１４】
前記化学療法薬がタキサン類、好ましくはドセタキセル及びパクリタキセル、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン及びドキソルビシンからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物。
【請求項１５】
請求項１及び請求項６〜請求項１２のいずれか一項に記載の患者のがんの治療方法における使用のための、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の抗エストロゲン活性を有する化合物及び薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
化学療法薬をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記化学療法薬がタキサン類、好ましくはドセタキセル及びパクリタキセル、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン及びドキソルビシンからなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
血清濃度又はグルコース濃度が減らされた培地中で乳がん（ＢＣ）細胞又はエストロゲン応答性腫瘍細胞を培養すること；及び、
前記細胞を抗エストロゲン活性を有する化合物で処理すること、
を含む、抗エストロゲン活性を有する化合物で乳がん（ＢＣ）細胞又はエストロゲン応答性腫瘍細胞を処理する方法。
【請求項１９】
前記培地中の前記血清濃度が１０〜９０％、好ましくは２０〜９０％減らされている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト患者における乳がん（ＢＣ）又は他のエストロゲン応答性腫瘍の治療方法における使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物であって、前記方法が、前記患者を前記抗エストロゲン活性を有する化合物で処置しながら、前記患者に、一価不飽和脂肪及び多価不飽和脂肪の含有量が高くタンパク質及び炭水化物の含有量が減らされている食品（カロリーの５０％以上が前記脂肪から生じる）のみを、通常の一日カロリー摂取量を確保するような量で２４〜１９０時間与えることを含む、前記化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品産業の技術分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、規定の食事療法と併せて乳がん（ＢＣ）及び他のエストロゲン感受性がんの治療のために使用する、選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、選択的エストロゲン受容体抑制薬（ＳＥＲＤ）及びアロマターゼ阻害薬（ＡＩ）を包含する、抗エストロゲン活性を有する化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
米国では毎年２０万人を超える女性が乳がんを呈している［１］。全ての乳がんのうち約７０％がエストロゲン受容体（ＥＲ）を発現している。これらのがんを治療するために一般的に用いられている治療法は、選択的エストロゲン受容体調節薬（例えば、タモキシフェン）及び選択的エストロゲン受容体抑制薬（フルベストラント）を介してこのエストロゲン受容体を直接標的とするか、又は、卵巣切除若しくはアロマターゼ阻害薬によって内在性エストロゲンレベルを減少させる。しかし、転移性のエストロゲン受容体陽性疾患の女性患者の４０％近くが初期の有効性にも関わらず進行を起こすことから、ホルモン療法抵抗性の発生が大きな問題として残っている［２］［３］。エストロゲン受容体シグナル経路の構成要素の調節解除、細胞周期及び生存促進のシグナル伝達分子における変化、並びに、増殖促進性シグナル伝達カスケード（例えば、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ／哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ））の活性化を含む複数の機構が、内分泌療法抵抗性の原因となる［２］［４］。
【０００４】
抵抗性が生じた後に、乳がんにおけるホルモン療法の効果を改善させる、且つ／又は、これらのホルモン剤の活性を回復させる、ことを可能とした戦略もある。
【０００５】
実験及び臨床の両方において、ｍＴＯＲの阻害がホルモン療法に対する感受性を回復させることが示された。現在、ステロイド性アロマターゼ阻害薬であるエキセメスタンとエベロリムス（ｍＴＯＲ阻害剤）の併用が、レトロゾール又はアナストロゾールでの治療後に再発又は進行を起こした転移性エストロゲン受容体陽性乳がん患者用に、ＦＤＡに認可されている（ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ２０１５年  第３版）［５］。より最近では、一次治療において、アロマターゼ阻害薬レトロゾールへのＣＤＫ４／６阻害剤パルボシクリブの追加も良い成績をあげることが分かり、薬剤承認に至っている［６］。しかし、このような進展があっても、抵抗性の発生を回避又は少なくとも遅延する、エストロゲン受容体陽性乳がんにおけるホルモン療法の有効性を増加させる安全で対費用効果の高いアプローチの特定が、尚も強く求められている。
【０００６】
最近の研究により、短期間の絶食又は擬絶食の利用が、以下の抗悪性腫瘍治療に対するがん細胞の感受性を増加させることが示されている：化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤及び放射線療法［７］［８］［９］［１０］。そのような増感作用はインビトロとインビボの両方で実証されている。インビボでは、この作用は、飢餓（水のみ）によって、又は特別に設計された低カロリー食事（擬絶食）によって得られる。
【０００７】
この絶食又は擬絶食による抗悪性腫瘍薬活性増強能は、増殖促進性シグナル伝達カスケードの異常な活性化（ＲＡＳ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＡＫＴなどの癌遺伝子における変異、又はＰＴＥＮなどの腫瘍抑制因子における変異から生じる）、及びがん細胞の飢餓に応答して起こるｐ５３活性化の増大（ＲＥＶ１によるｐ５３それ自体の阻害の軽減を介した）を主な原因として、悪性細胞が栄養枯渇に適応できないことを本質的に反映している［１１］。
【０００８】
同様に、非癌化組織も、絶食又は擬絶食から影響を受けないか、又は、細胞増殖の減少、サーチュイン活性の増加、及びオートファジーの活性化を特徴とする自己防衛モードに復帰することで、遺伝毒性ストレスに対してより抵抗性となったり、非飢餓細胞であれば致死性であったであろう化学療法剤の用量に対して許容可能となったりすることで、恩恵を受ける場合がある［１２］［１３］［１４］［１５］。特に、絶食又は擬絶食は、一般的に利用されているチロシンキナーゼ阻害剤の活性を増加させるのにも有効であり、このことは、より最近の分子標的治療でさえも、定期的な絶食療法又は擬絶食療法との同時施行から強い恩恵を受け得ることを示唆している［１０］。
【０００９】
最近、絶食又は擬絶食ががん細胞における化学療法の有効性を高め、それと同時に正常細胞を化学療法の毒性から保護するという発見が、医師［１６］及び患者の間で強く注目されている。現在、いくつかのパイロット試験においてヒトにおける化学療法と組み合わせた絶食又は擬絶食が研究されている（ＵＳＣノリス総合がんセンター、ライデン大学、ジェノヴァ大学及びシャリテ・ベルリン大学で行われた研究（ＮＣＴ０１３０４２５１、ＮＣＴ０１１７５８３７、ＮＣＴ００９３６３６４、ＮＣＴ０１１７５８３７、ＮＣＴ０１８０２３４６、ＮＣＴ０２１２６４４９）を含む）。これらの研究は一貫して、化学療法中の飢餓が良好な耐容性を有し、且つ実質的に副作用を有さないことを示すＳａｆｄｉｅらの発見［１７］を確かなものとしている。さらに、数サイクルの絶食又は擬絶食が、骨髄細胞を化学療法の毒性から保護するだけでなく、シクロホスファミド処置によって死滅した前駆細胞及び免疫細胞の幹細胞に基づく再生を促進することも示されている［１８］。
【００１０】
それにもかかわらず、抗エストロゲン活性を有する化合物に基づく抗がん治療の有効性に対し絶食（又は低カロリー食）が有し得る効果に対して、信頼のおける予測は得られていない。「抗エストロゲン活性を有する化合物」という表現は、以下の化合物を意味する：選択的エストロゲン受容体調節薬、選択的エストロゲン受容体抑制薬、及びアロマターゼ阻害薬。
【００１１】
これらの理由から、出願人によって行われた研究では、飢餓又は低カロリー食と、抗エストロゲン活性を有する化合物に基づく抗がん治療との間で起こり得る相互作用を調べることに焦点が当てられた。
【００１２】
本発明は上記の研究活動の成果である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の１つの態様において、本発明は、ヒト患者の乳がん又は他のエストロゲン応答性の腫瘍及びがんの治療方法における使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物であって、前記方法は、前記患者を前記抗エストロゲン活性を有する化合物で処置しながら、前記患者に減少させたカロリー摂取量を２４〜１９０時間適用することを含む、前記化合物に関する。
【００１４】
前記抗エストロゲン活性を有する化合物は、選択的エストロゲン受容体調節薬、選択的エストロゲン受容体抑制薬、及びアロマターゼ阻害薬からなる群から選択されることが好ましい。
【００１５】
本明細書において、減少させたカロリー摂取量とは、通常のカロリー摂取量に対して１０〜１００％減少させた、好ましくは５０〜１００％減少させた、より好ましくは７５〜１００％減少させた一日カロリー摂取量を意味し、完全飢餓も含む。
【００１６】
対象の通常のカロリー摂取量は、前記対象が自身の体重を維持するために消費するｋｃａｌ数である。対象の通常のカロリー摂取量は、対象を問診することにより、又は対象の体重を考慮することによって、推定することができる。大まかな基準として、対象の通常のカロリー摂取量は、男性は平均２６００ｋｃａｌ／日、女性は平均１８５０ｋｃａｌ／日である。
【００１７】
一日カロリー摂取量を１０〜８５％減少させる場合、一価不飽和脂肪及び多価不飽和脂肪の含有量が高くタンパク質及び糖質の含有量が減らされている食品（カロリーの４０％以上が脂肪から生じる）を患者に与えることが好ましい。これは、このような食品をベースとした食事が、飢餓による効果と類似した有益な効果を与えるためである［１３］。
【００１８】
前記減少させたカロリー摂取量の期間は、４８時間〜１５０時間であることが好ましく、約１２０時間であることが最も好ましい。
【００１９】
本発明で使用できる選択的エストロゲン受容体調節薬のうち、以下のものが記載されている：タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、ラソフォキシフェン、オスペミフェン、アルゾキシフェン、バゼドキシフェン。
【００２０】
本発明で使用できる選択的エストロゲン受容体抑制薬のうち、以下のものが記載されている：フルベストラント、ＲＵ５８６６８、ＧＷ７６０４、ＧＤＣ−０８１０、ＡＺＤ９４９６、ピペンドキシフェン、アコルビフェン、ＯＰ−１０７４（（２Ｓ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４−メチル−２−（４−｛２−［（３Ｒ）−３−メチルピロリジン−ｌ−イル］エトキシ｝フェニル）−２Ｈ−クロメン−７−オール）。
【００２１】
本発明で使用できるアロマターゼ阻害薬のうち、以下のものが記載されている：アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ボロゾール、ホルメスタン、ファドロゾール。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「がん」は、制御のない細胞分裂、及び、浸潤を介した隣接組織への直接的な増殖による、又は、転移による遠隔部位への移植性転移による、これら細胞の拡散能、を特徴とする疾患又は障害を指す。本発明は乳がん、特にエストロゲン受容体陽性乳がんの治療に焦点を置いているが、全てのエストロゲン応答性の腫瘍及びがんに適用される。
【００２３】
患者への抗エストロゲン活性を有する化合物が並行して投与される前記減少させたカロリー摂取量の期間は、５〜６０日の期間をそれぞれおいた後に、一回又は複数回反復されることがある。この期間中、患者は通常のカロリー摂取量を含む食事に従いつつ抗エストロゲン化合物を与えられる。
【００２４】
前記減少させたカロリー摂取量療法は、好ましくは８００ｋｃａｌ／日未満、より好ましくは４００Ｋｃａｌ／日未満に相当する。
【００２５】
このような減少させたカロリー摂取量は、カロリー量、糖質含有量、及びタンパク質含有量を減らして不飽和の「良い脂肪」を比較的高含有量含み、栄養失調を防止するために必要な全ての微量栄養素を含む栄養食を用いて達成することができる。
【００２６】
別の態様において、本発明は、ヒト患者の乳がんの治療方法における使用のための上記の抗エストロゲン活性を有する化合物に関し、この方法において、ヒト患者は、抗エストロゲン活性を有する化合物で処置されつつ、さらに化学療法薬で処置される。化学療法薬は、タキサン類、好ましくはドセタキセル及びパクリタキセル、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン及びドキソルビシンからなる群から選択されことが好ましい。
【００２７】
別の態様において、本発明は、上記の患者の乳がん及び他のエストロゲン依存性の腫瘍及びがんの治療方法における使用のための上記の抗エストロゲン活性を有する化合物及び薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、化学療法薬をさらに含むことができる。化学療法薬は、タキサン類、好ましくはドセタキセル及びパクリタキセル、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビノレルビン、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン及びドキソルビシンからなる群から選択されることが好ましい。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、
血清濃度又はグルコース濃度が減らされた培地中で乳がん細胞又はエストロゲン応答性腫瘍細胞を培養すること；及び、
前記細胞を抗エストロゲン活性を有する化合物で処理すること、
を含む、抗エストロゲン活性を有する化合物で乳がん細胞又はエストロゲン応答性腫瘍細胞を処理する方法に関する。
【００３０】
培地中の血清濃度は１０〜９０％減らされることが好ましく、培地中のグルコース濃度は２０〜９０％減らされることが好ましい。
【００３１】
以下のセクションで報告される実験結果から明らかとなるように、飢餓、特にＳＴＳ、そして２４〜７２の期間の減少させたカロリー摂取量は、予想外にも、抗エストロゲン活性を有する化合物を用いた併用抗がん治療の抗がん効果に良い影響を与えることが発見された。
【００３２】
抗エストロゲン活性を有する化合物を用いる併用抗がん治療の有効性に対する有用な効果は、前記減少させたカロリー摂取量の期間の代わりに、同様の期間、一価不飽和脂肪及び多価不飽和脂肪の含有量が高くタンパク質及び糖質の含有量が減らされている上述の食品（カロリーの４０％以上が脂肪から生じる）のみを患者に与える通常のカロリー摂取とした場合でも得られる。これは、このような食品をベースとした食事が、飢餓による効果と類似した有益な効果を与えるためである［１０］。
【００３３】
すなわち、一つの態様において、本発明は、ヒト患者のがんの治療方法における使用のための抗エストロゲン活性を有する化合物にも関し、前記方法は、前記患者を前記抗エストロゲン活性を有する化合物で処置しながら、前記患者に、一価不飽和脂肪及び多価不飽和脂肪の含有量が高くタンパク質及び炭水化物の含有量が減らされている食品（カロリーの４０％以上が脂肪から生じる）のみを、通常の一日カロリー摂取量を確保するような量で２４〜１９０時間与えることを含む。
【００３４】
化学療法及び放射線療法によって引き起こされる副作用（すなわち、悪心）及びアレルギー反応に対抗するために副腎皮質ステロイドの投与を一般的に必要とした、ＳＴＳと化学療法又は放射線療法とを組み合わせる既知の治療法とは異なり、抗エストロゲン活性を有する化合物は化学療法又は放射線療法の重篤な副作用を示さないため、本発明の方法は副腎皮質ステロイドの投与を必要としない。
【００３５】
これは、腫瘍細胞の応答の観点から有益な飢餓への代謝的適応（例えば、低血糖、低レベルの血漿中ＩＧＦ−１及びインスリン）が、副腎皮質ステロイドの同時投与によって阻止又は邪魔されないことから、上述の既知の治療に優る非常に重要な利点である。
【００３６】
さらに、エベロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤又はパルボシクリブなどのＣＤＫ４／６阻害剤の投与により抵抗性が生じた後に、乳がんにおけるホルモン療法の効果を改善させる、且つ／又は、これらのホルモン剤の活性を回復させる上述の戦略に関して、本発明を用いて企図される治療は、同じ効果を達成しつつ、良好な耐容性を示し、且つ、重篤な副作用がない。エベロリムス及びパルボシクリブは、共に重大な副作用を引き起こす可能性があり、例えばエベロリムスの場合は口内炎、貧血症及び高血糖症など［５］、パルボシクリブの場合は好中球減少症及び肺血栓塞栓症など［６］が引き起こされる可能性があるが、本明細書にて企図される治療は、ホルモン療法それ自体の副作用の低減、及び再生効果の促進さえも可能となり得る。
【００３７】
本発明の化合物及び組成物は、従来の薬剤的に許容できる無毒の担体、アジュバント及び賦形剤を含有する投薬単位製剤の形態で、経口経路、口腔経路、非経口経路、吸入経路、局所投与、注射、経皮経路又は経直腸経路（例えば、坐剤の使用）を含むがこれらに限定はされない、利用可能で効率的なあらゆる送達系を用いて投与されてよい。非経口経路による投与は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内への注射法又は点滴法を含む。
【００３８】
経口経路による投与のための固体剤形は、例えば、カプセル剤、錠剤、散剤、粒剤及びゲル剤を含む。このような固体剤形では、本活性化合物は、例えば、スクロース、ラクトース又はデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されてよい。これらの剤形は通常、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤などの、前記不活性希釈剤とは異なる追加の物質も含む。
【００３９】
既知の手法に従って、所望により適切な分散剤、湿潤剤及び／又は懸濁化剤を用いて、注射用製剤、例えば水性又は油性の無菌の注射剤又は懸濁剤を調製してもよい。
【００４０】
本発明の医薬品は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１８ｔｈ  Ｅｄ．、１９９０などの、様々な薬局方又は当分野の手引きに記載される、従来の製薬技術を用いて製造してよい。
【００４１】
本発明の化合物の平均一日投与量は、例えば、疾患の重症度及び患者の条件（年齢、体重、性別）などの、多くの要素に依存する。前記投与量は通常、本発明の化合物を１ｍｇ／日から１５００ｍｇ／日の間で変動させてよく、所望により投与回数をさらに分割してもよい。
【００４２】
本発明を添付の図面及び特定の実施形態を参照してさらに詳細に説明するが、これらの特定の実施形態は限定ではなく例示を目的として本明細書に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１Ａは、擬絶食条件（血液中の絶食の代謝結果を再現する条件）すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、エストロゲン受容体陽性乳がん細胞であるＭＣＦ７の生存率に対するそれぞれの効果を示すヒストグラムである。  図１Ｂは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、エストロゲン受容体陽性乳がん細胞であるＺＲ−７５−１の生存率に対するそれぞれの効果を示すヒストグラムである。  図１Ｃは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、エストロゲン受容体陽性乳がん細胞であるＴ４７Ｄの生存率に対するそれぞれの効果を示すヒストグラムである。  図１Ｄは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、フルベストラント、及びＦＭＤ＋フルベストラントの、エストロゲン受容体陽性乳がん細胞であるＭＣＦ７の生存率に対する、３つの異なるフルベストラント濃度においての、それぞれの効果を示す３つのヒストグラムを含む。
【図２】図２Ａは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、ＭＣＦ７細胞におけるＧ１細胞周期停止の誘導に対する、それぞれの効果を示すヒストグラムである。  図２Ｂは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、ＺＲ−７５−１細胞におけるＧ１細胞周期停止の誘導に対する、それぞれの効果を示すヒストグラムである。  図２Ｃは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、Ｔ４７Ｄ細胞におけるＧ１細胞周期停止の誘導に対する、それぞれの効果を示すヒストグラムである。  図２Ｄは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞及びＴ４７Ｄ細胞におけるＥ２Ｆ１遺伝子、Ｅ２Ｆ２遺伝子及びＣＣＮＥ１遺伝子の発現に対するそれぞれの効果を示す３つのヒストグラムを含む。
【図３】図３は、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン処理、及びＦＭＤ＋タモキシフェン処理にそれぞれ供された、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞及びＴ４７Ｄ細胞から得られた細胞可溶化物中の、総ｐ７０Ｓ６Ｋ及びリン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９）、総４Ｅ−ＢＰ１及びリン酸化４Ｅ−ＢＰ１、リン酸化ｅｌＦ４Ｅ（Ｓｅｒ２０９）並びにβ−アクチンのレベルを示す免疫ブロッティングである。
【図４】図４Ａは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン処理（５μΜ）、並びにＦＭＤ＋タモキシフェン処理（５μΜ）にそれぞれ供された、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞及びＴ４７Ｄ細胞から得られた細胞可溶化物中の、エストロゲン受容体α（ＥＲα）及びβ−アクチンのレベルを示す免疫ブロッティングである。  図４Ｂは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞及びＴ４７Ｄ細胞におけるＴＴＦ１遺伝子の発現に対する、ＱＰＣＲで確認された、それぞれの効果を示す３つのヒストグラムを含む。
【図５】図５は、ＭＣＦ７細胞における、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）とビヒクルとの間の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）に基づく経路解析を記載した表である。
【図６】図６Ａは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン、及びＦＭＤ＋タモキシフェンの、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞及びＴ４７Ｄ細胞におけるＲＡＤ５１遺伝子の発現に対する、ＱＰＣＲで確認された、それぞれの効果を示す３つのヒストグラムを含む。  図６Ｂは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン処理（５μΜ）、並びにＦＭＤ＋タモキシフェン処理（５μΜ）にそれぞれ供された、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞及びＴ４７Ｄ細胞から得られた細胞可溶化物中の、ＲＡＤ５１及びβ−アクチンのレベルを示す免疫ブロッティングである。
【図７】図７は以下を示す２つのヒストグラムを含む：  １）擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン（５μΜ）、ＦＭＤ＋タモキシフェン（５μΜ）、タモキシフェン（５μΜ）＋ドキソルビシン（１００ｎＭ）、ＦＭＤ＋ドキソルビシン（１００ｎＭ）及びＦＭＤ＋タモキシフェン（５μΜ）＋ドキソルビシン（１００ｎＭ）の、エストロゲン受容体陽性乳がん細胞ＭＣＦ７の生存率に対するそれぞれの効果；  ２）擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）、タモキシフェン（５μΜ）、ＦＭＤ＋タモキシフェン（５μΜ）、タモキシフェン（５μΜ）＋タキソテール（１００ｎＭ）、ＦＭＤ＋タキソテール（１００ｎＭ）、ＦＭＤ＋タモキシフェン（５μΜ）＋タキソテール（１００ｎＭ）の、エストロゲン受容体陽性乳がん細胞ＭＣＦ７の生存率に対するそれぞれの効果。
【図８】図８Ａは、エストラジオールペレットを皮下に植え込み、ＭＣＦ７細胞を注入した後の、絶食、タモキシフェン処置、及びタモキシフェン処置＋絶食の状態にそれぞれおかれた、ＢＡＬＢ／ｃ胸腺欠損マウス（ｎｕ＋，ｎｕ＋）で発生した腫瘍の体積を示すダイアグラムである。  図８Ｂは、エストラジオールペレットを皮下に植え込み、ＭＣＦ７細胞を注入した後の、絶食、フルベストラント処置、及びフルベストラント処置＋絶食の状態にそれぞれおかれた、ＢＡＬＢ／ｃ胸腺欠損マウス（ｎｕ＋，ｎｕ＋）で発生した腫瘍の体積を示すダイアグラムである。  図８Ｃは、図８Ａの実験のマウス体重を示すダイアグラムである。  図８Ｄは、図８Ｂの実験のマウス体重を示すダイアグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本出願人らは、擬絶食条件すなわち擬絶食（１％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇ／ｄｌグルコース；ＦＭＤ）が乳がん細胞のタモキシフェン感受性及びフルベストラント感受性を増加させるかどうかのいくつかの評価実験を行った。実際には、試験された全てのエストロゲン受容体陽性乳がん細胞モデル（ＭＣＦ７、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ）において、ＦＭＤ条件によるタモキシフェン活性の強い増強（図１Ａ〜図１Ｃ）が認められた。同様に、ＭＣＦ７細胞におけるフルベストラントの抗増殖効果の顕著な増大も容易に示すことができた（図１Ｄ）。
【００４５】
詳細には、図１Ａ〜図１Ｄの実験では、３×１０３個のＭＣＦ７細胞（Ａ、Ｄ）、ＺＲ−７５−１細胞（Ｂ）又はＴ４７Ｄ細胞（Ｃ）を、通例の１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、９６ウェルプレート内に播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を同一培地（ＣＴＲ）又は１％ＦＢＳ含有低グルコース（０．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ培地（ＦＭＤ）中で２４時間インキュベートした。２４時間後、表示濃度のタモキシフェン（Ｔａｍ）又はフルベストラント（Ｆｕｌｖ）を培地に添加した。
【００４６】
その後の実験は、擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）による乳がん細胞株におけるタモキシフェン活性及びフルベストラント活性の増強の基礎にある機序を明らかにすることを目的とした。これらの実験によって、ＦＭＤ条件がタモキシフェン及びフルベストラントのＧ１細胞周期停止誘導能を本質的に増加させたことが示された（図２Ａ〜図２Ｃ）。
【００４７】
興味深いことにこれは、Ｒｂリン酸化の低減（Ｓｅｒ７８０、図示せず）、及び細胞周期促進遺伝子（Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、及びＣＣＮＥ１）の発現減少の低減と相関していた。この細胞周期促進遺伝子（Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、及びＣＣＮＥ１）の発現減少の低減は、単一処理に対してよりも、擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）とタモキシフェンとの組み合わせに対してより顕著であった（前記細胞株の全てで観察された効果）（図２Ｄ）。
【００４８】
具体的には、図２Ａ〜図２Ｄの実験では、５×１０５個のＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞又はＴ４７Ｄ細胞を、通例の１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、６ウェルプレート内に播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を同一培地中（ＣＴＲ）、又は擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）において、２４時間インキュベートした。表示されているものについては、２４時間後に１０μΜタモキシフェン（Ｔａｍ）を培地に添加した。２４時間後、細胞を細胞周期解析に使用するか、又はｍＲＮＡを抽出してＱＰＣＲによりＥ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ４及びＣＣＮＥ１の発現を測定するために使用した。
【００４９】
Ｔ４７Ｄ細胞では、細胞周期停止、並びにＥ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２及びＣＣＮＥ１の発現減少が、擬絶食条件すなわち擬絶食＋タモキシフェンの併用処理のみに応答して生じた。すなわち、これらの結果によって、絶食又は擬絶食が、ホルモン療法によるエストロゲン受容体陽性細胞系の増殖阻止能を増加させる可能性があることが明確に示された。
【００５０】
本出願人は次に、乳がんのホルモン治療に対する抵抗性におけるその役割を考慮して、特にＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲ経路に焦点を置いて（［２］［５］）、タモキシフェン、擬絶食条件すなわち擬絶食、及びこれらの組み合わせの細胞情報伝達に対する効果を調べた。
【００５１】
タモキシフェンと擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）との組み合わせが、ＭＣＦ７、ＺＲ−７５−１、及びＴ４７Ｄにおいて、リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ及びリン酸化ｅＩＦ４Ｅのレベル減少によって検出されるｍＴＯＲ活性の著しい阻害をもたらしたことは、興味深い知見である（図３）。
【００５２】
図３の実験では、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞及びＴ４７Ｄ細胞を、図２の実験と同様に処理した。タモキシフェン（５μΜ）添加の２４時間後、細胞をタンパク質可溶化液作製に用い、免疫ブロッティングで総ｐ７０Ｓ６Ｋ及びリン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９）、総４Ｅ−ＢＰ１及びリン酸化４Ｅ−ＢＰ１、リン酸化ｅＩＦ４Ｅ（Ｓｅｒ２０９）、ＨＥＲ２、並びにβ−アクチンを検出した。
【００５３】
４Ｅ−ＢＰ１（ｍＲＮＡ翻訳抑制因子であり、通常ｍＴＯＲによってリン酸化され、その結果４Ｅ−ＢＰ１はｅＩＦ４Ｅから解離し、ｃａｐ依存的ｍＲＮＡ翻訳が活性化される）の場合、前記エストロゲン受容体陽性細胞系の全てにおいて、タモキシフェンと擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）の組み合わせに応答して非リン酸化型の顕著な蓄積が検出された。これは、ｍＴＯＲシグナル伝達障害とも一致している。
【００５４】
全体として、これらの知見により、タモキシフェンと擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）との組み合わせによる強力な抗癌活性には、タンパク質翻訳の遮断が寄与している可能性が示唆された。
【００５５】
続く実験で、タモキシフェンへの擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）の追加が、ＨＥＲ２の発現に影響を与えたかどうかの評価も行った。ＨＥＲ２の発現上昇は乳がんのホルモン治療に対する抵抗性の機構として示唆されている［２］。
【００５６】
注目すべきことに、３種の乳がん細胞株のうちの２種（ＺＲ−７５−１、及びＴ４７Ｄ）において、擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）を、タモキシフェンと組み合わせて適用すると、ＨＥＲ２発現が顕著に減少した（図３）。ＨＥＲ２シグナル伝達はエストロゲン受容体陽性乳がん細胞のホルモン療法への抵抗を助けることから、擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）のこのような効果は、それ自体、ホルモン療法に対する乳がん細胞の感受性を増強するのに寄与し得る［２］。
【００５７】
エストロゲン受容体α発現及びエストロゲン受容体α介在性転写の研究（ＴＴＦ１発現のＱＰＣＲ検出）によって、擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）が、エストロゲン受容体αのレベルを低下させ、一貫して、タモキシフェンのＴＴＦ１発現を低減させる能力を高めることが示された（図４）。
【００５８】
図４の実験では、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞又はＴ４７Ｄ細胞を、図２の実験と同様に処理した。タモキシフェン（５μΜ）添加の２４時間後、細胞をタンパク質可溶化液の作製又はｍＲＮＡ抽出に用い、免疫ブロッティングでエストロゲン受容体及びβ−アクチンを検出した。ＴＴＦ１発現はＱＰＣＲで測定した。
【００５９】
擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）によるタモキシフェン活性の増強の根底にある機構についてのさらなる洞察を得るために、標準的な遺伝子発現マイクロアレイによって検出されるＭＣＦ７細胞の包括的遺伝子発現の観点から、タモキシフェン、擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）、及びそれらの組み合わせの効果を比較した（データは４つの独立したバイオロジカルレプリケート／条件から推定した）。発現量が異なる遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析によれば、擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）、及びＦＭＤのタモキシフェンとの組み合わせは、細胞周期、ＤＮＡ複製、ＤＮＡの巻き戻し、有糸分裂のＧ１期〜Ｇ１／Ｓ期の経路に対して同様の効果を示したことを含め、同様の遺伝子発現変化を誘導したようであった。しかし、タモキシフェンに擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）を追加すると、擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）単独又はタモキシフェン単独に曝された細胞では見られなかったＤＮＡ修復関連経路における顕著な変化がもたらされたことは印象的である（図５）。
【００６０】
タモキシフェン及び擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）で処理されたＭＣＦ７において最も大きく発現減少したことが判明した、これらの経路由来の遺伝子は、ＲＡＤ５１（ｌｏｇ２  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ：−１．８６４）、ＰＣＮＡ（ｌｏｇ２  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ：−１．６５８）、ＴＩＰＩＮ（ｌｏｇ２  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ：−１．６０４）、ＥＸＯ１（ｌｏｇ２  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ：−１．５８３）、及びＢＲＣＡ１（ｌｏｇ２  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ：−１．３７２）であった。これらのデータの検証として、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞及びＴ４７Ｄ細胞におけるタモキシフェン＋擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）に応答した強いＲＡＤ５１発現減少を、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方において（図６Ａ、図６Ｂ）、直ちに検証した。
【００６１】
図６の実験では、ＭＣＦ７細胞、ＺＲ−７５−１細胞又はＴ４７Ｄ細胞を、図２の実験と同様に処理した。タモキシフェン（５μΜ）添加の２４時間後、細胞をＲＮＡ抽出又はタンパク質可溶化液作製に用いた。図６Ａでは、ＱＰＣＲでＲＡＤ５１発現を検出した。図６Ｂでは、免疫ブロッティングでＲＡＤ５１及びβ−アクチンを検出した。
【００６２】
同様のＲＡＤ５１発現減少がフルベストラント及び擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）の併用で処理されたＭＣＦ７細胞でも認められた（データ未記載）。興味深いことに、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）によって、細胞周期進行、染色体分離、及びゲノム安定性に関与する癌原遺伝子であるＦＯＸＭ１が、タモキシフェンと擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）との組み合わせで処理された乳がん細胞の遺伝子発現プロファイルにおけるこれらの変化（互いに組み合わされたこれらの刺激による阻害）を媒介している可能性が非常に高い転写因子として明らかとなった（１９）。
【００６３】
タモキシフェン＋擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ）で処理された乳がんのＤＮＡ修復能の機能障害を示している、遺伝子発現マイクロアレイより得られたデータに基づいて、これらの条件下で、ＭＣＦ７細胞が化学療法剤に対してより感受性になるかどうかを調べた。具体的には、乳がん治療に一般的に使用される２種類の薬剤であるタキソテール（ドセタキセル）及びドキソルビシンを調べた。実際には、短期間の生存アッセイ（７２時間）で検出した場合、三重処理（タモキシフェン＋ドキソルビシン又はタキソテール＋擬絶食条件すなわち擬絶食（ＦＭＤ））が、細胞生存率の最も顕著な減少を達成した処理であった（図７）。
【００６４】
図７の実験では、１ウェル当たり５×１０３個のＭＣＦ７細胞を、通例の１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、９６ウェルプレート内に播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を同一培地又は１％ＦＢＳ含有低グルコース（０．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ培地（擬絶食条件）中で２４時間インキュベートした。表示されているものについては、２４時間後に１０μΜタモキシフェン（Ｔａｍ）を培地に添加した。２４時間後、表示濃度のドキソルビシン又はタキソテールで細胞を刺激した。７２時間後、スルホローダミンＢアッセイで生存率を測定した。
【００６５】
これらのデータに基づいて、ＭＣＦ７異種移植片における最初の概念実証（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ；ＰｏＣ）試験を行って、短期間の絶食（４８時間、水のみ、週１回）がそれ自体で抗癌活性を有するかどうか、並びに、最も重要な、短期間の絶食がインビボにおいてもタモキシフェン活性及びフルベストラント活性を増強するかどうか、を確認した。
【００６６】
インビトロのデータと一貫して、タモキシフェン及び数サイクルの絶食は両方ともＭＣＦ７異種移植片の成長を低減した（図８Ａ、図８Ｂ）。しかし、これらの２つの処置を組み合わせると、いずれかの種類の処置単独よりも有意により効果的であった。
【００６７】
図８Ａ〜図８Ｄの実験では、エストラジオールペレットの皮下植え込みの２４時間後に、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ胸腺欠損マウス（ｎｕ＋／ｎｕ＋）に、５×１０６個のＭＣＦ７細胞を皮下注射した。腫瘍が触知可能となったところで、マウスを６つの群の１つに無作為に割り当てた（１治療群あたり６匹のマウス）：コントロール（普通食）；タモキシフェン（普通食＋タモキシフェン、３０ｍｇ／ｋｇ／日；強制経口投与）；フルベストラント（普通食＋フルベストラント、３０ｍｇ／ｋｇを週１回；皮下）；絶食（水のみ、４８時間）；絶食＋タモキシフェン；絶食＋フルベストラント。腫瘍サイズ（Ａ、Ｂ）及びマウス体重（Ｃ、Ｄ）を毎日モニターした。＊：ｐ＜０．０５。
【００６８】
全ての処置が耐容性良好であった。また、絶食はマウス体重の有意な体重減少をもたらしはしたが（図８Ｃ、図８Ｄ）、マウスはある処置サイクルと次の処置サイクルとの間で体重を完全に回復させ、さらには、絶食へのタモキシフェンの追加は体重減少を悪化させなかった。
【００６９】
全体として、上記の実験結果は、絶食又は擬絶食が、乳がんに対して一般的に処方されるホルモン療法の活性を高めることができること、乳がん細胞におけるエストロゲン受容体α（ＥＲα）を下方制御させることができること、及び、いくつかの既知のホルモン療法耐性機構に対抗できることを明確に示している。加えて、上記の実験結果は、ホルモン療法と、絶食又は擬絶食の結果生じる代謝条件との組み合わせが、如何にして、がん細胞のＤＮＡ修復装置における主な欠陥を引き起こし、がん細胞の化学療法剤に対する感受性を増加させるかを明確に示している。
【００７０】
以上から、絶食又は擬絶食を介した減少させたカロリー摂取量は、化学療法と共に又は化学療法を伴わずに行われるホルモン治療と同時に適用した場合に、ホルモン療法の活性を高めるための、これらの薬剤に対する抵抗性を回避するための（又は少なくとも顕著に遅延するための）、及び、場合によっては腫瘍再増殖を防止する又は腫瘍細胞を完全に根絶するための、新たなアプローチである。
【００７１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2019505555.tif 000011
2019505555.tif 000012
2019505555.tif 000013