(57)【要約】  本発明は、組み換えｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメント、及び個体において癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現する、改変Ｔ細胞の集団の投与による個体における癌の治療に関する。改変Ｔ細胞の集団及び改変Ｔ細胞の集団を作製する方法が、医薬組成物及び治療方法と共に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変Ｔ細胞の集団を作製する方法であって、ドナー個体から得られたＴ細胞の集団を、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントを発現するように改変することを含む、方法。
【請求項２】
前記ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はフラグメントがｃＡＭＰシグナル伝達を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｃＡＭＰ  ＰＤＥがＰＤＥ４及びＰＤＥ７からなる群から選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ細胞がｃＡＭＰ  ＰＤＥのＮ末端フラグメントを発現するように改変される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ細胞がＰＤＥ７ＡのＮ末端フラグメントを発現するように改変される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｎ末端フラグメントが配列番号４の残基１〜５７を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｎ末端フラグメントが配列番号４を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞が、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントをコードする核酸を前記Ｔ細胞に導入することにより改変される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントをコードする核酸が発現ベクターに含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現ベクターがレンチウイルスのベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞が、前記ドナー個体に由来する癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原受容体がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現するように前記Ｔ細胞の集団を更に改変することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞が、前記抗原受容体をコードする核酸を前記Ｔ細胞に導入することにより更に改変される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原受容体をコードする核酸が発現ベクターに含まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターがレンチウイルスのベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原受容体が異種ＴＣＲである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記異種ＴＣＲが親和性増強ＴＣＲである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＣＲが、前記癌細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチドフラグメントを提示するＭＨＣに特異的に結合する、請求項１２及び１７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１１及び１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＡＲが前記癌細胞によって発現される腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍抗原がＮＹ−ＥＳＯ−１又はＭＡＧＥ−Ａ１０である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原受容体をコードする核酸、及び前記ＰＤＥ又はそのフラグメントをコードする核酸が同一の発現ベクターに含まれる、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞が、切断されて前記抗原受容体及び前記ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントを生じる融合タンパク質を発現する、請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記融合タンパク質が、配列番号６若しくは配列番号８のアミノ酸配列、又はその変異体を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質が、配列番号５若しくは配列番号７のヌクレオチド配列、又はその変異体を含む核酸によってコードされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記改変Ｔ細胞集団を拡大することを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記改変Ｔ細胞集団を保管することを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
薬学的に許容可能な賦形剤と共に前記改変Ｔ細胞集団を製剤化することを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞の改変集団をレシピエント個体に投与することを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記レシピエント個体が癌症状を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌症状が、前記抗原受容体に結合する１個以上の癌細胞の存在を特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ドナー個体及び前記レシピエント個体が同じである、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ドナー個体及び前記レシピエント個体が異なる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記レシピエント個体から得られた癌細胞の試料を準備することと、
前記得られた試料中の癌細胞に結合する抗原受容体を識別することと、
を含み、
ここで、前記Ｔ細胞の集団が前記識別された抗原受容体を発現するように改変される、
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
癌細胞に特異的に結合する抗原受容体、及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントを発現する改変Ｔ細胞の集団であって、前記細胞が前記ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）をコードする異種核酸を含む、改変Ｔ細胞の集団。
【請求項３７】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法によって作製される、請求項３６に記載の改変Ｔ細胞の集団。
【請求項３８】
請求項３６又は３７に記載の改変Ｔ細胞の集団と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項３９】
ヒト又は動物の身体の治療方法に使用される、請求項３６又は３７に記載の改変Ｔ細胞の集団。
【請求項４０】
個体における癌の治療方法に使用される、請求項３６又は３７に記載の改変Ｔ細胞の集団。
【請求項４１】
個体における癌の治療に対する医薬の製造における、請求項３６又は３７に記載の改変Ｔ細胞の集団の使用。
【請求項４２】
請求項３６又は３７に記載の改変Ｔ細胞の集団を、癌を有する個体に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項４３】
前記癌が、前記抗原受容体に結合する１個以上の癌細胞の存在を特徴とする、請求項４０に記載の使用に対する集団、請求項４１に記載の使用、又は請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
癌細胞に特異的に結合する抗原受容体をコードするヌクレオチド配列、及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項４５】
請求項４４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４６】
レンチウイルスのベクターである、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
請求項４５又は４６に記載のベクターを含むウイルス粒子。
【請求項４８】
ウイルス粒子を作製する方法であって、
請求項４６に記載のウイルスベクターと、１以上のウイルスのパッケージングベクター及びエンベロープベクターとで哺乳動物細胞を形質導入することと、
前記形質導入された細胞が培養培地中に放出されるレンチウイルス粒子を産生するように、前記細胞を前記培地において培養することと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年９月２３日付で出願された英国特許出願第１６１６２３８．０号の優先権を主張し、その内容及び構成部分は、全ての目的について引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、免疫抑制に対する抵抗性を増すためのＴ細胞の改変、及び例えば癌の治療に対する免疫療法における改変Ｔ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞（すなわちＴリンパ球）は、組織及び腫瘍環境内に広く分布されることがわかっている。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ：T cell receptors）の存在によって他のリンパ球と区別される。ＴＣＲは、Ｔ細胞の抗原特異的活性化を媒介するマルチサブユニット膜貫通複合体である。ＴＣＲは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ：major histocompatibility complex）分子によって標的細胞上に提示される抗原ペプチドリガンドを認識することにより、Ｔ細胞に対して抗原特異性を与える。
【０００４】
腫瘍標的細胞にある変性タンパク質又は突然変異タンパク質に由来するペプチドは特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞によって非自己と認識され得るが、腫瘍細胞上の多くの抗原は単に上方制御される又は過剰発現されるに過ぎず（いわゆる自己抗原）、機能的なＴ細胞応答を誘導しない。したがって、研究は、悪性腫瘍で発現される又は高発現されるが、正常細胞型では発現されない標的腫瘍抗原を識別することに重点を置いてきた。かかる標的の例として、多くのヒト癌で発現されるが、正常組織では限定的な発現を示す癌／精巣（ＣＴ）抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１（非特許文献１）、及び非常に限られた数の健康な組織で発現されるＣＴ抗原のＭＡＧＥ−Ａファミリー（非特許文献２）が挙げられる。
【０００５】
かかる抗原の識別は、特異的で有効な癌治療法を提供する可能性のある、標的化Ｔ細胞に基づく免疫療法の開発を促進した（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。
【０００６】
しかしながら、腫瘍の微小環境は多くの場合、免疫抑制性であり、癌の免疫療法の成功を妨げる（非特許文献７）。細胞外アデノシンは、既知の免疫機能の阻害物質である。腫瘍における高レベルのアデノシンは、抗腫瘍免疫応答の回避に重要な役割を果たすことがわかった（非特許文献８、非特許文献９）。腫瘍におけるアデノシンに富む環境は、Ｔ細胞アネルギー（T cell anergy）を誘導し（非特許文献１０、非特許文献１１）、免疫抑
制性サイトカイン（例えば、ＴＧＦベータ、ＩＬ−１０）の産生を増加させ（非特許文献１０、非特許文献１２）、抗原提示細胞の標的化による細胞性免疫応答を阻止する（非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００７】
また、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）も免疫機能の阻害物質であることが知られており、先天免疫と抗原特異的免疫の両方を抑制することが広く実証されている（非特許文献１５、非特許文献１６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Chen Y-T et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94(5):1914-1918
【非特許文献２】Scanlan M. J. et al. Immunol Rev. 2002; 188:22-32
【非特許文献３】Ho, W.Y. et al. Cancer Cell 2003; 3:1318-1328
【非特許文献４】Morris, E.C. et al. Clin. Exp. Immunol. 2003; 131:1-7
【非特許文献５】Rosenberg, S.A. Nature 2001; 411:380-384
【非特許文献６】Boon, T. and van der Bruggen P. J. Exp. Med. 1996; 183:725-729
【非特許文献７】Rabinovich G.A. et al. Annu Rev Immunol. 2007; 25:267-296
【非特許文献８】Blay J. et al. Cancer Res. 1997; 57:2602-2605
【非特許文献９】Ohta A. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103:13132-13137
【非特許文献１０】Zarek P.E. et al. Blood 2008; 111:251-259
【非特許文献１１】Ohta A. et al. J Immunol. 2009; 183:5487-5493
【非特許文献１２】Nowak M. et al. Eur J Immunol. 2010; 40:682-687
【非特許文献１３】Hasko G. et al. Faseb J. 2000;1 4:2065-2074
【非特許文献１４】Panther E. et al. Blood 2003; 101:3985-3990
【非特許文献１５】Phipps R.P. et al. Immunol Today. 1991; 12:349-352
【非特許文献１６】Harris S.G. et al. Trends Immunol. 2002; 23:144-150
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
好ましくない腫瘍環境に対処することができるＴ細胞に基づく免疫療法は、より有効な癌治療法を提供するのに有用となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、腫瘍細胞を標的とするＴ細胞の細胞傷害性は、例えば、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントの組み換え発現によるｃＡＭＰシグナル伝達の阻害によって増加され得ることを認識した。したがって、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はそのフラグメントを発現するように改変されたＴ細胞は、癌免疫療法において有用となり得る。
【００１１】
本発明の或る態様は、個体において癌を治療する方法であって、組み換えｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメント、及び個体において癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現するＴ細胞の集団を個体に投与することを含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、改変Ｔ細胞の集団を作製する方法であって、
個体から得られたＴ細胞の集団を準備することと、
ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントを発現するようにＴ細胞を改変し、それにより改変Ｔ細胞の集団を作製することと、
を含む、方法を提供する。
【００１３】
幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞は、個体に由来する癌細胞に特異的に結合する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）等の内因性抗原受容体を発現し得る。他の実施の形態では、方法は、個体に由来する癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現するようにＴ細胞を改変することを更に含み得る。Ｔ細胞は、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントを発現するように改変される前、その後、又はそれと同時に抗原受容体を発現するように改変されてもよい。
【００１４】
改変に続いて、改変Ｔ細胞の集団は、拡大され、保管され、及び／又は医薬組成物へと製剤化され得る。
【００１５】
本発明の別の態様は、個体において癌を治療する方法であって、
ドナー個体から得られたＴ細胞の集団を準備することと、
Ｔ細胞をｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントを発現するように改変し、それによって改変Ｔ細胞の集団を作製することと、
上記改変Ｔ細胞の集団をレシピエント個体に投与することと、
を含む、方法を提供する。
【００１６】
幾つかの実施の形態では、Ｔ細胞は、ドナー個体に由来する癌細胞に特異的に結合する内因性抗原受容体を発現し得る。他の実施の形態では、方法は、ドナー個体に由来する癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現するようにＴ細胞を改変することを更に含み得る。Ｔ細胞は、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントを発現するように改変される前、その後、又はそれと同時に抗原受容体を発現するように改変されてもよい。
【００１７】
ドナー個体及びレシピエント個体は同一であってもよく（すなわち、自家治療（autologous treatment）；改変Ｔ細胞を個体から得た後に、該個体を該改変Ｔ細胞で治療する）、又はドナー個体及びレシピエント個体は異なってもよい（同種治療（allogeneic treatment）；改変Ｔ細胞を或る個体から得た後に、異なる個体を治療するために使用する）。
【００１８】
本発明の別の態様は、癌細胞に特異的に結合する抗原受容体、及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントを発現する改変Ｔ細胞の集団であって、上記細胞がｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントをコードする異種核酸を含む、改変Ｔ細胞の集団を提供する。
【００１９】
抗原受容体は内因性であってもよく、又は異種核酸によってコードされる組み換え抗原受容体であってもよい。
【００２０】
本発明の他の態様は、上に記載される改変Ｔ細胞を含む医薬組成物、改変Ｔ細胞又は該医薬組成物を個体に投与することを含む治療方法、及び治療方法、例えば個体における癌の治療方法に使用される改変Ｔ細胞又は医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明の他の態様は、癌細胞に特異的に結合する抗原受容体をコードするヌクレオチド配列及びｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、該核酸を含むベクター（レンチウイルスベクターを含む）、及び該ベクターを含むウイルス粒子を作製する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＤＥ４Ｃ（図１Ａ）又はＰＤＥ７Ａ（図１Ｂ）とタンデムにＮＹ−ＥＳＯc259Ｔ細胞受容体を発現するレンチベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図２】ＰＤＥ７Ａを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞による標的細胞殺傷動態を示す図である。図２Ａ及び図２Ｂ（２名のドナーからのデータ）は、ＰＤＥ７Ａを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞単独と比較して、Ａ３７５黒色腫標的細胞においてアポトーシスを誘導する能力が増したことを示す。
【図３】ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞におけるＰＤＥ７Ａの過剰発現が、プロスタグランジンＥ２の阻害効果に対して抵抗性を与えることを示す図である。図３Ａ及び図３Ｂ（２名のドナーからのデータ）は、ＰＤＥ７Ａを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞が、ＰＧＥ２のＴ細胞阻害効果に抵抗性であることを示し、ＰＧＥ２の不在下で同じＴ細胞によって示されるものに匹敵するＡ３７５黒色腫標的細胞殺傷能力を実証する。
【図４】ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞におけるＰＤＥ７Ａの過剰発現が、Ｔ細胞殺傷能力に対するフォルスコリンの阻害効果に対して部分抵抗性を与えることを示す図である。図４Ａ及び図４Ｂ（２名のドナーからのデータ）は、ＰＤＥ７Ａを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞が、フォルスコリンの存在下で、ＰＤＥ７Ａを過剰発現しないＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞（ＡＤＢ８６９  Ｔ細胞）よりも優れた殺傷能力を実証することを示す。
【図５】ＰＤＥ７Ａを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞が、細胞内ｃＡＭＰを増加させるメディエーターによるサイトカイン放出の阻害に対して部分的に抵抗性であることを示す図である。ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞におけるＰＤＥ７Ａの過剰発現は、ＩＦＮ−γ分泌に対するフォルスコリン（図５Ａ）、アデノシン（図５Ｂ）、及びＰＧＥ２（図５Ｃ）の阻害効果を部分的に克服する。
【図６】ＰＤＥ４Ｃを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞が、細胞内ｃＡＭＰを増加させるメディエーターによるサイトカイン放出の阻害に部分的に抵抗性であることを示す図である。図６Ａ及び図６Ｂ（２名のドナーからのデータ）は、ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞におけるＰＤＥ４Ｃの過剰発現が、ＩＦＮ−γ分泌に対するＰＧＥ２及びフォルスコリンの阻害効果を部分的に遮断することを示す。
【図７】ＮＹ−ＥＳＯ受容体単独（ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ）、全長ＰＤＥ７Ａと組み合わせたＮＹ−ＥＳＯ受容体（ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ＋全長ＰＤＥ７Ａ）、及び短縮型ＰＤＥ７Ａと組み合わせたＮＹ−ＥＳＯ受容体（ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ＋短縮型ＰＤＥ７Ａ）を使用する、レンチウイルス形質導入の結果を示す図である。
【図８】全長及び短縮型のＰＤＥ７Ａによる形質導入の後のＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲに対する形質導入効率及びＴＣＲ発現レベルを示す図である。
【図９】ＰＧＥ２の存在下及び不在下における、全長又は短縮型のＰＤＥ７Ａを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞による標的細胞殺傷動態を示す。図９Ｂは、阻害剤の不在下での全てのコンストラクトについて相当する殺傷能力を示す。図９Ｃは、全長又は短縮型のＰＤＥ７Ａを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞が、ＰＤＥ７Ａを過剰発現しないＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞よりも、ＰＧＥ２の存在下で優れた殺傷能力を実証することを示す。
【図１０】全長又は短縮型のＰＤＥ７Ａを過剰発現するＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞が、細胞内ｃＡＭＰを増加させるメディエーターによるサイトカイン放出の阻害に部分的に抵抗性であることを示す図である。図１０Ａ及び図１０Ｂ（２名のドナーからのデータ）は、ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞における全長又は短縮型のＰＤＥ７Ａの過剰発現が、ＩＦＮ−γ分泌に対するＰＧＥ２及びフォルスコリンの阻害効果を部分的に遮断することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はｃＡＭＰ  ＰＤＥのフラグメントの組み換え発現によって、腫瘍の免疫抑制性微小環境に対する抗腫瘍Ｔ細胞の抵抗性を増加する方法に関する。ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はそのフラグメントの発現によってｃＡＭＰシグナル伝達を減少することで、アデノシン及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）による阻害に対する抗腫瘍Ｔ細胞の抵抗性が増加することが、本明細書において示される。阻害に対する抵抗性が増した改変Ｔ細胞は、改変されていないＴ細胞と比べて、細胞傷害性及び／又はサイトカイン放出の増加を示す可能性がある。本明細書に記載されるｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はｃＡＭＰ  ＰＤＥフラグメントを発現するように改変された抗腫瘍Ｔ細胞は、免疫療法、例えば癌の治療に対する養子細胞移植（ＡＣＴ：adoptive cell transfer）に有用となり得る。
【００２４】
Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす白血球である。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球と区別され得る。Ｔ細胞には幾つかの種類があり、それぞれが全く別の機能を有する。
【００２５】
ヘルパーＴ細胞（ＴH細胞）は、ＣＤ４表面糖タンパク質を発現することから、ＣＤ４+Ｔ細胞として知られている。ＣＤ４+Ｔ細胞は適応免疫系に重要な役割を果たし、Ｔ細胞
サイトカインを放出すること、及び免疫応答を抑制する又は調節するのを支援することによって他の免疫細胞の活性を支援する。ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及び増殖に必須である。
【００２６】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴC細胞、ＣＴＬ、キラーＴ細胞）は、ＣＤ８表面糖タンパク質を
発現することから、ＣＤ８+Ｔ細胞として知られている。ＣＤ８+Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊するように作用する。ほとんどのＣＤ８+Ｔ細胞は、クラスＩ  
ＭＨＣ分子によって感染した細胞又は損傷した細胞の表面上に提示される特異抗原を認識することができるＴＣＲを発現する。抗原及びＭＨＣ分子へのＴＣＲ及びＣＤ８糖タンパク質の特異的結合は、感染した細胞又は損傷した細胞のＴ細胞によって媒介される破壊に結び付く。
【００２７】
本明細書に記載される使用に対するＴ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞；ＣＤ８+Ｔ細胞；又はＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ８+Ｔ細胞であってもよい。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞及び
ＣＤ８+Ｔ細胞の混合集団であってもよい。
【００２８】
本明細書に記載される使用に適したＴ細胞をドナー個体から得てもよい。幾つかの実施形態では、ドナー個体は、本明細書に記載される改変及び拡大の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体と同じ人物でもよい（自家治療）。他の実施形態では、ドナー個体は、本明細書に記載される改変及び拡大の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体とは異なる人物であってもよい（同種治療）。例えば、ドナー個体は、（提供の前又はその後のいずれかで）癌を患うレシピエント個体とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致している健康な個体であってもよい。
【００２９】
本明細書に記載される方法は、個体からＴ細胞を得る工程、及び／又は癌を有する個体から得られた試料からＴ細胞を単離する工程を含んでもよい。
【００３０】
Ｔ細胞の集団は血液試料から単離され得る。Ｔ細胞の単離に適した方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：例えば、Rheinherz et al (1979) PNAS 76 4061を参照されたい）、細胞パニング（panning）（例えば、Lum et al (1982) Cell Immunol 72 122を参照されたい）、及び抗体被覆磁気ビーズを使用する単離（例えば、Gaudernack et al 1986 J Immunol Methods 90 179を参照されたい）が挙げられる。ＣＤ４+及びＣＤ８+のＴ細胞は、血液試料から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離され得る。ＰＢＭＣは標準的な技術を使用して、血液試料から抽出されてもよい。例えば、勾配遠心分離と組み合わせてフィコール（ficoll）を使用し（Boeyum A. Scand J Clin Lab Invest. 1968; 21(Suppl.97):77-89）、全血を血漿の最上層、
続いて、ＰＢＭＣの層、及び多核白血球及び赤血球の底の画分に分離してもよい。幾つかの実施形態では、ＰＢＭＣはＣＤ１４+細胞（単球）が枯渇していてもよい。
【００３１】
単離に続いて、Ｔ細胞を活性化してもよい。Ｔ細胞の活性化に適した方法は、当該技術においてよく知られている。例えば、単離されたＴ細胞をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニストに曝露してもよい。好適なＴＣＲアゴニストとして、樹状細胞等の抗原提示細胞表面上のクラスＩ又はＩＩのＭＨＣ分子に提示されるペプチド等のリガンド、及び抗ＴＣＲ抗体等の可溶性因子が挙げられる。
【００３２】
抗ＴＣＲ抗体は、εＣＤ３、αＣＤ３、又はαＣＤ２８等のＴＣＲの構成要素に特異的に結合し得る。ＴＣＲ刺激に適した抗ＴＣＲ抗体は、当該技術分野でよく知られており（例えばＯＫＴ３）、商業的な供給業者（例えば、米国コロラド州のeBioscience）から入
手可能である。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は抗αＣＤ３抗体及びＩＬ２への曝露によって活性化され得る。Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体及びαＣＤ２８抗体への曝露によって活性化されることがより好ましい。活性化は、ＣＤ１４+単球の存在下又は不在下で生じ得
る。Ｔ細胞は、好ましくは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の抗体被覆ビーズによって活性化され得る。例えば、ＰＢＭＣ、又はＣＤ４+細胞及び／又はＣＤ８+細胞を含むＴ細胞サブセ
ットは、フィーダー細胞（抗原提示細胞）又は抗原によらずに、抗体被覆ビーズ、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ThermoFisher Scientific）等の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で被覆された磁気ビー
ズを使用して活性化され得る。
【００３３】
単離及び活性化に続いて、Ｔ細胞を環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）又はｃＡＭＰ  ＰＤＥのフラグメントを発現するように改変してもよい。
【００３４】
ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントは、ホスホジエステル結合を加水分解し、アデノシン３’，５’−環状リン酸（環状アデノシン一リン酸；ｃＡＭＰ）のアデノシン５’−リン酸（アデノシン一リン酸；ＡＭＰ）（ＥＣ３．１．４．１７；ＥＣ３．１．４．５３）への分解を触媒することにより、及び／又はｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）を直接阻害することにより（例えば、Han et al (2006) JBC 281 22 15050-15057を参
照されたい）、細胞のｃＡＭＰシグナル伝達を阻害する。例えば、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はｃＡＭＰ  ＰＤＥフラグメントは、（ｉ）ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の触媒（Ｃ）サブユニットを阻害する、（ｉｉ）ｃＡＭＰの分解を触媒する、又は（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方であってもよい。
【００３５】
好適なｃＡＭＰ  ＰＤＥは当該技術分野においてよく知られており、ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ１０及びＰＤＥ１１が挙げられる。幾つかの好ましい実施形態では、ｃＡＭＰ  ＰＤＥはＰＤＥ４又はＰＤＥ７であってもよい。
【００３６】
ＰＤＥ７は、ＰＤＥ７Ａ（遺伝子ＩＤ  ５１５０）を含んでもよく、データベース参照ＣＣＤＳ５６５３８．１；ＮＰ＿００１２２９２４７．１  ＧＩ：３３４０８５２７７（配列番号１）又はＣＣＤＳ３４９０１．１；ＮＰ＿００２５９４．１  ＧＩ：２４４２９５６６を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３７】
ＰＤＥ４は、ＰＤＥ４Ａ（遺伝子ＩＤ  ５１４１）及びＰＤＥ４Ｃ（遺伝子ＩＤ  ５１４３）を含んでもよい。ＰＤＥ４Ａは、データベース参照ＣＣＤＳ４５９６１．１；ＮＰ＿００１１０４７７７．１  ＧＩ：１６２３２９６０８（配列番号２）を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ＰＤＥ４Ｃは、データベース参照ＣＣＤＳ１２３７３．１；ＮＰ＿０００９１４．２  ＧＩ：１１５５２９４４５（配列番号３）を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３８】
他のｃＡＭＰ  ＰＤＥのアミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られており、公的なデータベースで入手可能である。
【００３９】
ｃＡＭＰ  ＰＤＥは、本明細書で引用されるｃＡＭＰ  ＰＤＥ参照アミノ酸配列を含んでもよく、又はその変異体であってもよい。変異体は、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【００４０】
アミノ酸配列同一性は、一般的には、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）、カリフォルニア州サンディエゴのAccelrys）を参照して定義される。ＧＡＰは、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する、ニードルマン＆ウンシュアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）を使用して、２つの完全配
列をアラインメントする。一般的には、ギャップ作成ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝４によるデフォルトパラメーターが使用される。ＧＡＰの使用が好ましいが、他のアルゴリズム、例えば通常デフォルトパラメーターを利用する、ＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する）、又はスミス−ウォーターマンアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197）を使用してもよい。
【００４１】
特定のアミノ酸配列変異体は、１個のアミノ酸、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個、又は２０個〜３０個のアミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失によって参照配列と異なってもよい。幾つかの実施形態では、変異体配列は、挿入、欠失又は置換された１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上の残基を含む参照配列を含んでもよい。例えば、最大１５個、最大２０個、最大３０個、又は最大４０個の残基が挿入、欠失、又は置換されてもよい。
【００４２】
幾つかの好ましい実施形態では、変異体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上の保存的置換によって参照配列と異なってもよい。保存的置換は、同様の特性を有する異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む。例えば、脂肪族残基は別の脂肪族残基で置換され得て、非極性残基は別の非極性残基で置換され得て、酸性残基は別の酸性残基で置換され得て、塩基性残基は別の塩基性残基で置換され得て、極性残基は別の極性残基で置換され得て、又は芳香族残基は別の芳香族残基で置換され得る。保存的置換は、例えば、以下の群内のアミノ酸間であってもよい：
（ｉ）アラニン及びグリシン、
（ｉｉ）グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン及びアスパラギン、
（ｉｉｉ）アルギニン及びリジン、
（ｉｖ）アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、
（ｖ）イソロイシン、ロイシン及びバリン、
（ｖｉ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、
（ｖｉｉ）セリン、トレオニン及びシステイン。
【００４３】
ｃＡＭＰ  ＰＤＥのフラグメントは、全長ｃＡＭＰ  ＰＤＥ配列よりも短いが、ｃＡＭＰシグナル伝達阻害活性の幾らか又は全てを保持する短縮型配列である。フラグメントは、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ活性を示す触媒フラグメントであってもよく、又はより好ましくは非触媒フラグメント、例えばｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）を阻害するフラグメントであってもよい。全長ｃＡＭＰ  ＰＤＥ配列のフラグメントは、全長ｃＡＭＰ  ＰＤＥ配列に由来する少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、又は少なくとも６０個の隣接するアミノ酸を含んでもよい。フラグメントは、６０個以下、１００個以下、２００個以下、又は３００個以下のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００４４】
幾つかの実施形態では、ｃＡＭＰ  ＰＤＥは、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の触媒（Ｃ）サブユニットを結合して阻害し得る。好適なフラグメントは、ＰＫＡ偽基質部位、例えばＲＲＧＡＩモチーフを含む、１６個〜２２個のアミノ酸、好ましくは１８個のアミノ酸の反復配列の１以上のコピーを含んでもよい。好適な反復配列は、アミノ酸配列：
Ｐ（Ｖ／Ｎ）Ｐ（Ｑ／Ｒ）（Ｈ／Ｑ）（Ｖ／Ｌ）（Ｌ／Ｓ）（Ｓ／Ｑ）ＲＲＧＡＩＳ（Ｆ／Ｙ）（Ｓ／Ｓ）ＳＳ
を有し得る。
【００４５】
反復配列の例は、下記配列番号４において強調される。全長ｃＡＭＰ  ＰＤＥ配列のフラグメントは、Ｎ末端フラグメントであってもよく、すなわち、フラグメントのＮ末端残
基は、全長ｃＡＭＰ  ＰＤＥ配列のＮ末端残基に対応し得る。例えば、Ｎ末端フラグメントは、全長ｃＡＭＰ  ＰＤＥ配列のＮ末端に由来する少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７５個、又は少なくとも１００個の隣接するアミノ酸を含んでもよい。幾つかの実施形態では、好適なＮ末端フラグメントは、配列番号４のアミノ酸１〜５７を含み得る。他の実施形態では、好適なＮ末端フラグメントは、配列番号４を含み得る。
【００４６】
Ｔ細胞において発現される組み換えｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はそのフラグメントは、Ｃ末端又はより好ましくはＮ末端に異種性のタグを含んでもよい。タグは、本来はｃＡＭＰ  ＰＤＥとは無関係の、特異的結合対の１つのメンバーを形成する、ペプチド配列である。組み換えｃＡＭＰ  ＰＤＥを発現するＴ細胞は、タグに対する特異的結合対の他のメンバーの結合によって識別及び／又は精製され得る。例えば、タグは、抗タグ抗体によって結合されるエピトープを形成し得る。これは治療中、改変Ｔ細胞を識別するのに有用となり得る。
【００４７】
好適なタグとして、例えば、ＭＲＧＳ（Ｈ）6、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ（商標）
）、Ｔ７−、Ｓ−（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ポリ−Ａｒｇ（Ｒ5〜6）、ポリ−Ｈｉｓ（Ｈ2〜10）、ポリ−Ｃｙｓ（Ｃ4）ポリ−Ｐｈｅ（Ｆ11）ポリ−Ａｓｐ（Ｄ5〜16）、ＳＵＭＯタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  ＳＵＭＯ発現
系）、Ｓｔｒｅｐｔ−タグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ−ＨＡタグ（Murray, P. J. et al (1995) Anal Biochem 229, 170-9）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグ（Stammers, D. K. et al (1991) FEBS Lett 283, 298-302）、Ｔａｇ．１００（Qiagen、哺乳動物マップキナーゼ２に由来する１２アミノ酸
タグ）、Ｃｒｕｚ  ｔａｇ  ０９（商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）、及びＣｒｕｚ  ｔａｇ  ２２（商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ
、Santa Cruz Biotechnology Inc.）が挙げられる。既知のタグ配列は、Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 523-533において概説される。好ましい実施形態では、
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ等のヘマグルチニン（ＨＡ）タグを使用してもよい。
【００４８】
改変Ｔ細胞において発現されるｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントは、異種核酸によってコードされる組み換えタンパク質であり、すなわち、ｃＡＭＰ  ＰＤＥは、組み換え技術によってＴ細胞のゲノムに組み込まれたコード化核酸（encoding nucleic acid）から
発現される。改変Ｔ細胞におけるｃＡＭＰシグナル伝達は、改変されていないＴ細胞におけるｃＡＭＰシグナル伝達と比べて減少され得る。幾つかの実施形態では、改変Ｔ細胞におけるｃＡＭＰ  ＰＤＥ活性は、改変されていないＴ細胞におけるｃＡＭＰ  ＰＤＥ活性よりも少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、又は少なくとも１００倍高くてもよい。
【００４９】
ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントを発現するためのＴ細胞の改変は、Ｔ細胞にｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントをコードする異種核酸を導入することを含んでもよい。Ｔ細胞への異種核酸の導入及び発現に適した方法は、当該技術分野でよく知られており、以下に更に詳しく記載される。
【００５０】
導入に続いて、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントをコードする異種核酸の１以上のコピーを含んでもよい。
【００５１】
また、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、癌細胞に特異的に結合する抗原受容体も発現する。
【００５２】
抗原受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよい。ＴＣＲは、典型的には不変Ｃ
Ｄ３鎖分子との複合体として発現される非常に可変性のアルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖を含むジスルフィド結合膜アンカーヘテロ二量体タンパク質（disulphide-linked membrane anchored heterodimeric proteins）である。これらの種類のＴＣＲを発現するＴ細胞は、α：β（又はαβ）Ｔ細胞と称される。少数のＴ細胞は、可変性のガンマ（γ）鎖及びデルタ（δ）鎖を含む代替ＴＣＲを発現し、γδＴ細胞と称される。
【００５３】
好適なＴＣＲは、腫瘍抗原のペプチドフラグメントを提示する癌細胞表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に特異的に結合する。ＭＨＣは、獲得免疫系が「外来」分子を認識することを可能にする、細胞表面タンパク質のセットである。タンパク質は、細胞内で分解され、ＭＨＣによって細胞表面上に提示される。ウイルス又は癌関連ペプチド等の「外来」ペプチドを提示するＭＨＣは、適切なＴＣＲを有するＴ細胞によって認識され、細胞破壊経路を促進する。癌細胞の表面上のＭＨＣは、腫瘍抗原のペプチドフラグメント、すなわち、癌細胞上に存在するが、対応する非癌性細胞にはない抗原を提示し得る。これらのペプチドフラグメントを認識するＴ細胞は、癌細胞に対する細胞傷害性効果を発揮し得る。
【００５４】
幾つかの実施形態では、癌細胞に特異的に結合するＴＣＲは、Ｔ細胞によって天然に発現され得る（すなわち、内因性ＴＣＲ）。例えば、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であってもよい。ＴＩＬは、標準的な技術を使用して癌症状を有する個体から得られてもよい。
【００５５】
より好ましくは、ＴＣＲは、Ｔ細胞によって天然では発現されない（すなわち、ＴＣＲは外因性又は異種性である）。異種ＴＣＲは、αβＴＣＲヘテロ二量体を含んでもよい。好適な異種ＴＣＲは、腫瘍抗原を発現する癌細胞に特異的に結合し得る。例えば、Ｔ細胞は、特定の癌患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチドフラグメントを提示するＭＨＣに特異的に結合する異種ＴＣＲを発現するように改変されてもよい。癌患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、標準的な技術を使用して識別され得る。
【００５６】
異種ＴＣＲは、合成又は人工のＴＣＲ、すなわち天然には存在しないＴＣＲであってもよい。例えば、異種ＴＣＲは、腫瘍抗原に対するその親和性又は結合活性を増すように操作されてもよい（すなわち親和性増強ＴＣＲ）。親和性増強ＴＣＲは、天然起源のＴＣＲに対する１以上の突然変異、例えば、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の可変領域の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に１以上の突然変異を含んでもよい。これらの突然変異は、癌細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチドフラグメントを提示するＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を増加させる。生成された親和性増強ＴＣＲの好適な方法は、ファージ又は酵母ディスプレイを使用してＴＣＲ突然変異体のライブラリをスクリーニングすることを含み、当該技術分野でよく知られている（例えば、Robbins et al J Immunol (2008) 180(9):6116、San Miguel et al (2015) Cancer Cell 28 (3) 281-283、Schmitt et al (2013) Blood 122 348-256、Jiang et al (2015) Cancer Discovery 5 901を参照されたい）。
【００５７】
好ましい親和性増強ＴＣＲは、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１０及びＭＡＧＥ  Ｂ２の１以上の腫瘍抗原を発現する癌細胞に結合し得る。
【００５８】
代替的には、抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよい。ＣＡＲは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）等の免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むように操作されている人工受容体である。ＣＡＲは、例えば、ＴＣＲ  ＣＤ３細胞膜貫通領域及びエンドドメインに融合されたｓｃＦｖを含んでもよい。ｓｃＦｖは、およそ１０個〜２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドによって接合され得る、免疫グロブリンの重鎖（ＶH
）及び軽鎖（ＶL）の可変領域の融合タンパク質である（Huston J.S. et al. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85(16):5879-5883）。リンカーは、柔軟性に関してグリシンリッチ
であってもよく、また溶解度に関してセリン若しくはトレオニンリッチであってもよく、ＶHのＮ末端をＶLのＣ末端に接続してもよく、又はその逆であってもよい。小胞体、そしてその後Ｔ細胞表面にタンパク質を導くシグナルペプチドがｓｃＦｖに先行してもよい。ＣＡＲでは、ｓｃＦｖはＴＣＲ膜貫通領域及びエンドドメインに融合されてもよい。フレキシブルスペーサー（flexible spacer）はｓｃＦｖとＴＣＲ膜貫通ドメインとの間に含
まれて、可変的な配向及び抗原結合を可能とし得る。エンドドメインは、受容体の機能的なシグナル伝達ドメインある。ＣＡＲのエンドドメインは、例えば、ＣＤ３ζ鎖、又はＣＤ２８、４１ＢＢ若しくはＩＣＯＳ等の受容体に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよい。例えば、ＣＡＲは、複数のシグナル伝達ドメイン、例えば、限定されないが、ＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−４１ＢＢ又はＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−ＯＸ４０を含んでもよい。
【００５９】
ＣＡＲは、癌細胞によって発現された腫瘍特異抗原に特異的に結合し得る。例えば、Ｔ細胞は、特定の癌患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するように改変されてもよい。癌患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、標準的な技術を使用して識別され得る。
【００６０】
異種性のＴＣＲ又はＣＡＲ等の異種抗原受容体の発現は、Ｔ細胞が癌を有する個体の癌細胞の表面上に存在する１以上の腫瘍抗原を認識するように又は認識の改善を示すように、Ｔ細胞の免疫原性特異性を変更し得る。
【００６１】
幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は、異種抗原受容体の不在下では、癌細胞に対する結合の減少を示す場合がある、又はそれに対する結合を示さない場合がある。例えば、異種抗原受容体の発現は、改変されていないＴ細胞と比べて、改変Ｔ細胞の癌細胞結合の親和性及び／又は特異性を増す場合がある。
【００６２】
「異種、異種性の」の用語は、宿主細胞等の特定の生体系に対して外来であり、その生体系に天然には存在しないポリペプチド又は核酸を指す。異種性のポリペプチド又は核酸は、例えば、組み換え技術を使用して人工的な手段によって生体系に導入され得る。例えば、ポリペプチドをコードする異種核酸を好適な発現コンストラクトに挿入することができ、これを用いることでポリペプチドを産生する宿主細胞が形質転換される。異種性のポリペプチド又は核酸は、合成若しくは人工であってもよく、又は異なる種若しくは細胞型等の異なる生体系に存在してもよい。内因性のポリペプチド又は核酸は、宿主細胞等の特定の生体系に対して天然であり、その生体系に天然に存在する。組み換えポリペプチドは、人工的な手段によって、例えば組み換え技術を用いて細胞に導入された異種核酸から発現される。組み換えポリペプチドは、細胞に天然に存在するポリペプチドと同一であってもよく、又はその細胞に天然に存在するポリペプチドとは異なってもよい。
【００６３】
Ｔ細胞は、癌患者の癌細胞に特異的に結合する異種抗原受容体を発現するように改変され得る。癌患者は、改変Ｔ細胞によってその後治療されてもよい。改変Ｔ細胞による治療に適した癌患者は、
癌を有する個体から癌細胞の試料を得ることと、
その癌細胞が改変Ｔ細胞によって発現される抗原受容体に結合すると識別することと、を含む方法によって識別され得る。
【００６４】
癌細胞は、癌細胞によって発現される１以上の腫瘍抗原を識別することにより、抗原受容体に結合すると識別され得る。癌を有する個体から得られた癌細胞の表面上の抗原を識別する方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００６５】
幾つかの実施形態では、特定の癌患者の治療に適した異種抗原受容体は、
癌を有する個体から癌細胞の試料を得ることと、
癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を識別することと、
によって識別され得る。
【００６６】
癌細胞に特異的に結合する抗原受容体は、例えば、癌細胞によって発現される１以上の腫瘍抗原を識別することによって識別され得る。癌を有する個体から得られる癌細胞の表面上の抗原を識別する方法は、当該技術分野でよく知られている。１以上の腫瘍抗原に結合する又は１以上の抗原のＭＨＣ提示ペプチドフラグメントに結合する抗原受容体は、その後、例えば、既知の特異性の抗原受容体から、又は多様な特異性を有する抗原受容体のパネル若しくはライブラリをスクリーニングすることによって識別され得る。１以上の定義される腫瘍抗原を有する癌細胞に特異的に結合する抗原受容体は、通例の技術を使用して産生され得る。
【００６７】
Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、識別された抗原受容体を発現するように改変され得る。
【００６８】
本明細書に記載される治療に適した個体の癌細胞は、抗原を発現し得て、抗原受容体を結合するのに適正なＨＬＡ型であり得る。
【００６９】
癌細胞は、１以上の抗原（すなわち腫瘍抗原）の発現によって個体において正常な体細胞と区別され得る。個体において正常な体細胞は、１以上の抗原を発現し得ないか、又は異なった方法で、例えば、より低いレベルで、異なる組織及び／又は異なる発生段階において、抗原を発現し得る。腫瘍抗原は、個体において免疫応答を誘発し得る。特に、腫瘍抗原は、個体において腫瘍抗原を発現する癌細胞に対して、Ｔ細胞媒介免疫応答を誘発し得る。患者において癌細胞によって発現される１以上の腫瘍抗原は、改変Ｔ細胞に対する異種受容体に対する標的抗原として選択され得る。
【００７０】
癌細胞によって発現される腫瘍抗原として、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−Ｉ、及びＸＡＧＥ等の癌−生殖細胞系列遺伝子によってコードされる癌−精巣（ＣＴ）抗原、並びにそれらの免疫原性フラグメントが挙げられる（Simpson et al. Nature Rev (2005) 5, 615-625、Gure et al., Clin Cancer Res (2005) 11, 8055-8062、Velazquez et al., Cancer Immun
(2007) 7, 1 1、Andrade et al., Cancer Immun (2008) 8, 2、Tinguely et al., Cancer Science (2008)、Napoletano et al., Am J of Obstet Gyn (2008) 198, 99 e91-97）
。
【００７１】
他の腫瘍抗原として、例えば、過剰発現された、上方制御された、又は突然変異したタンパク質、及び分化抗原、特に、ｐ５３、ｒａｓ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＰＭＳＡ、ＰＳＡ、チロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５、アルファ−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、ベータ−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合
タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−２及び３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲ．アルファ．融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、ＮＡ−８８、ＳＰ１７、及びＴＲＰ２−Ｉｎｔ２（ＭＡＲＴ−Ｉ）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、アルファ−フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼１７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ−関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ等のメラノサイト分化抗原、並びにＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２等のチロシナーゼ関連タンパク質が挙げられる。
【００７２】
他の腫瘍抗原として、「ストレスを与えた（stressed）」癌細胞によって利用される非ＡＵＧ翻訳開始機構によって生成される、アウトオブフレーム（out-of-frame）ペプチド−ＭＨＣ複合体（Malarkannan et al. Immunity 1999 Jun; 10(6):681-90）が挙げられる。
【００７３】
他の腫瘍抗原は、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第００／２０５８１号、Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Eds Stern, Beverley and Carroll, Cambridge University Press, Cambridgeを参照されたい）。これらの腫瘍抗原の配列
は、公的なデータベースから容易に入手可能であるが、国際公開第１９９２／０２０３５６号、国際公開第１９９４／００５３０４号、国際公開第１９９４／０２３０３１号、国際公開第１９９５／０２０９７４号、国際公開第１９９５／０２３８７４号、及び国際公開第１９９６／０２６２１４号にも見られる。
【００７４】
好ましい腫瘍抗原として、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１０及びＭＡＧＥ  Ｂ２、最も好ましくはＮＹ−ＥＳＯ−１及びＭＡＧＥ−Ａ１０が挙げられる。
【００７５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、癌／精巣（ＣＴ）ファミリーのヒト腫瘍抗原であり、黒色腫、前立腺癌、膀胱移行細胞癌（transitional cell bladder）、乳癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌
、頭頸部癌、及び子宮頸癌を含む種々様々な癌でしばしば発現される（van Rhee F. et al. Blood 2005; 105(10): 3939-3944）。さらに、ＮＹ−ＥＳＯ−１の発現は、通常、生
殖細胞に限定され、体細胞には発現されない（Scanlan M.J. et al. Cancer Immun. 2004; 4(1)）。ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する癌細胞に結合する好適な親和性増強ＴＣＲとして、ＮＹ−ＥＳＯ−１c259が挙げられる。
【００７６】
ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃ259は、野生型ＴＣＲと比べて、アルファ鎖９５：９６ＬＹの９５
位及び９６位で突然変異されている親和性増強ＴＣＲである。ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃ259は
、ＨＬＡ−Ａ２＋クラス１対立遺伝子との関係において、ヒト癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１のアミノ酸残基１５７〜１６５（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）に対応するペプチドに、未改変野生型ＴＣＲと比べて向上した親和性で結合する（Robbins et al J Immunol (2008) 180(9):6116）。
【００７７】
ＭＡＧＥ−Ａ１０は、ＣＴ抗原のＭＡＧＥ−Ａファミリーの高度に免疫原性のメンバーであり、健康な組織でではなく生殖細胞において発現される。ＭＡＧＥ−Ａ１０は、多数の腫瘍に由来する癌細胞で高率に発現される（Schultz-Thater E. et al. Int J Cancer.
2011; 129(5):1137-1148）。
【００７８】
Ｔ細胞の改変及びそれらの後の拡大は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｅｘ  ｖｉｖｏで行われてもよい。
【００７９】
Ｔ細胞は、Ｔ細胞への異種コード化核酸の導入によって、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はｃＡＭＰ  ＰＤＥのフラグメント、及び任意に抗原受容体を発現するように改変され得る。
【００８０】
幾つかの実施形態では、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はｃＡＭＰ  ＰＤＥのフラグメント及び抗原受容体をコードする異種核酸は、同じ発現ベクターでＴ細胞に導入される。これは、形質導入後に両方の遺伝子を発現するＴ細胞の割合を増加させるのに役立つ可能性がある。他の実施形態では、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ及び抗原受容体をコードする異種核酸は、異なる発現ベクターでＴ細胞に導入されてもよい。
【００８１】
ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメント及び抗原受容体は、融合タンパク質として同じ転写産物において発現され、その後、例えば部位特異的プロテアーゼを使用して分離されてもよい。代替的には、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメント及び抗原受容体は、異なる転写産物において発現されてもよい。
【００８２】
例えば、短縮型ｃＡＭＰ  ＰＤＥ及びＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲを含む融合タンパク質が発現され得る。融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列又はその変異体を含んでもよく、配列番号５のヌクレオチド配列又はその変異体を有する核酸によってコードされてもよい。代替的には、短縮型ｃＡＭＰ  ＰＤＥ及びＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲを含む融合タンパク質が発現され得る。融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列又はその変異体を含んでもよく、配列番号７のヌクレオチド配列又はその変異体を有する核酸によってコードされてもよい。
【００８３】
抗原受容体をコードする核酸は、その受容体の全てのサブユニットをコードしてもよい。例えば、ＴＣＲをコードする核酸は、ＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列及びＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００８４】
核酸は、任意の簡便な方法によってＴ細胞に導入され得る。Ｔ細胞に異種核酸を導入する又は組み込む場合、当業者によく知られているように、特定の注意事項を考慮に入れなければならない。挿入される核酸は、Ｔ細胞において転写を駆動する有効な調節エレメントを含むコンストラクト又はベクター内に構築されなくてはならない。Ｔ細胞にコンストラクタ（constructor）ベクターを輸送する好適な技術は当該技術分野でよく知られてお
り、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション及びレトロウイルス、又は他のウイルス、例えばワクシニア若しくはレンチウイルスを使用する形質導入が挙げられる。例えば、固相形質導入は、レトロネクチン被覆レトロウイルスベクター充填済み組織培養プレート上での培養によって、選択せずに行われ得る。
【００８５】
好ましくは、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメント、及び任意に抗原受容体をコードする核酸は、ウイルスベクター、最も好ましくはガンマレトロウイルスベクター又はＶＳＶｇ−偽型レンチウイルスのベクター等のレンチウイルスベクターに含まれ得る。Ｔ細胞は、核酸を含むウイルス粒子と接触することによって形質導入され得る。形質導入のためのウイルス粒子は、既知の方法に従って産生され得る。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ウイ
ルスのパッケージング及びエンベロープのエレメントをコードするプラスミド、また同様にコーディング核酸を含むレンチウイルスベクターによってトランスフェクトしてもよい。ＶＳＶｇ−偽型ウイルスベクターは、偽型ウイルス粒子を産生するように、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶｇ）のウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇと組み合わせて産生されてもよい。
【００８６】
例えば核酸コンストラクトの作製、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現における核酸の操作及び形質転換に関する多くの既知の技術及びプロトコルが、Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992のに詳し
く記載される。
【００８７】
Ｔ細胞への核酸の導入に続いて、改変Ｔ細胞の初期の集団は、改変Ｔ細胞が増殖し集団を拡大するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。
【００８８】
改変Ｔ細胞集団は、例えば抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で被覆された磁気ビーズを使用して拡大され得る。改変Ｔ細胞は、拡大された集団を生じるように任意の簡便な技術を使用して培養され得る。好適な培養系として、撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、ローラーボトル、培養バッグ又は培養皿、及び他のバイオリアクター、特に中空繊維バイオリアクターが挙げられる。かかるシステムの使用は、当該技術分野でよく知られている。
【００８９】
ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞の増殖における使用に適した多数の培養培地、特にＡＩＭ−Ｖ、Ｉｓｃｏｖｅｓ培地及びＲＰＭＩ−１６４０（Invitrogen-GIBCO）等の完全培地を利用することができる。培地は、血清、血清タンパク質、及び選択剤等の他の因子で補足されてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及び５５μＭ  β−メルカプトエタノールを含み、任意に２０ｎｇ／ｍｌの組み換えＩＬ−２で補足されたＲＰＭＩ−１６４０培地を利用してもよい。培養培地は、当業者によって通例の実験により容易に決定することができる標準濃度で、上に記載されるアゴニスト因子又はアンタゴニスト因子で補足されてもよい。
【００９０】
簡便には、細胞を、好適な培養培地中、５％ＣＯ2を含む湿潤雰囲気で３７℃にて培養
する。
【００９１】
Ｔ細胞及び他の哺乳動物細胞の培養に関する方法及び技術は当該技術分野でよく知られている（例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451、Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223、Culture
of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293、Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52を参照されたい）。
【００９２】
幾つかの実施形態では、上記集団から改変Ｔ細胞を単離及び／又は精製することが簡便な場合がある。ＦＡＣＳ及び抗体被覆磁気粒子を含む、任意の簡便な技術が使用され得る。
【００９３】
任意に、本明細書で記載されるように製造された改変Ｔ細胞の集団は、例えば、使用の前に凍結乾燥及び／又は凍結保存によって保管されてもよい。
【００９４】
改変Ｔ細胞の集団を、バッファー、担体、希釈剤、防腐剤、及び／又は薬学的に許容可能な賦形剤等の他の試薬と混合してもよい。好適な試薬を以下に詳述する。本明細書に記
載される方法は、改変Ｔ細胞の集団と薬学的に許容可能な賦形剤を混合することを含んでもよい。
【００９５】
投与（例えば、注入による）に適した医薬組成物は、酸化防止剤、バッファー、防腐剤、安定剤、静菌剤、及び意図されるレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含み得る、水性及び非水性で等張なパイロジェンフリー（pyrogen-free）の無菌注射溶液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液が挙げられる。かかる製剤における使用に適した等張のビヒクルの例として、塩化ナトリウム注射液、リンガー溶液、又は乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。好適なビヒクルを、標準的な薬学の教科書、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990に見ることができる。
【００９６】
幾つかの好ましい実施形態では、改変Ｔ細胞は、個体への静脈点滴に適した医薬組成物へと製剤化され得る。
【００９７】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」の用語は、適切な医学的良識の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、合理的なベネフィット／リスク比と見合った、被験体（例えばヒト）の組織と接触する使用に適した化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。また、担体、賦形剤等はそれぞれ、製剤の他の原料と適合するという意味でも「許容可能」でなくてはならない。
【００９８】
本発明の態様は、組み換えｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はそのフラグメント、及び癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現する改変Ｔ細胞の集団を提供する。好適な集団は、上に記載される方法によって製造され得る。
【００９９】
改変Ｔ細胞の集団は、医薬としての使用に対するものであってもよい。例えば、本明細書に記載される改変Ｔ細胞の集団は、癌免疫療法の治療法、例えば養子Ｔ細胞療法に使用され得る。
【０１００】
本発明の他の態様は、癌の治療のための医薬の製造に対する本明細書に記載される改変Ｔ細胞の集団の使用、癌の治療に対する本明細書に記載される改変Ｔ細胞の集団を提供し、癌の治療法は、それを必要とする個体に本明細書に記載される改変Ｔ細胞の集団を投与することを含み得る。
【０１０１】
改変Ｔ細胞の集団は、自己由来であってもよい、すなわち、改変Ｔ細胞が、元々は、後に改変Ｔ細胞が投与される個体と同じ個体から得られた（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とが同じである）。個体への投与に対する改変Ｔ細胞の好適な集団は、個体から得られたＴ細胞の初期集団を準備することと、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はそのフラグメント、及び個体の癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現するようにＴ細胞を改変することと、改変Ｔ細胞を培養することとを含む方法によって作製されてもよい。
【０１０２】
改変Ｔ細胞の集団は、同種であってもよい、すなわち、改変Ｔ細胞は、元々は、後に改変Ｔ細胞が投与される個体とは異なる個体から得られた（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とが異なる）。ドナー個体及びレシピエント個体は、ＧＶＨＤ及び他の望ましくない免疫効果を回避するため、ＨＬＡが一致していてもよい。レシピエント個体への投与に対する改変Ｔ細胞の好適な集団は、ドナー個体から得られたＴ細胞の初期集団を準備することと、ｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はそのフラグメント、及びレシピエント個体の癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を発現するようにＴ細胞を改変することと、改変Ｔ細胞を培養することとを含む方法によって作製されてもよい。
【０１０３】
改変Ｔ細胞の投与に続いて、レシピエント個体は、レシピエント個体において癌細胞に対してＴ細胞媒介免疫応答を呈し得る。これは、個体の癌症状に有益な効果を有し得る。
【０１０４】
癌症状は、悪性癌細胞の異常増殖を特徴とし得て、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ及びＣＬＬ等の白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫等のリンパ腫、並びに肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵癌、腎臓癌、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌、及び大脳腫瘍（cerebral cancer）等
の固形癌と並んで、原発不明の癌（ＣＵＰ：cancer of unknown primary）を含み得る。
【０１０５】
個体における癌細胞は、個体において正常な体細胞とは免疫学的に異なってもよい（すなわち、癌性腫瘍が免疫原性であってもよい）。例えば、癌細胞は、個体において、癌細胞によって発現される１以上の抗原に対する全身免疫応答を誘発可能な場合がある。免疫応答を誘発する腫瘍抗原は、癌細胞に特異的であってもよく、又は個体において１以上の正常細胞によって共有されてもよい。
【０１０６】
上に記載される治療に適した個体は、齧歯類（例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えばマウス）、イヌ科動物（例えばイヌ）、ネコ科動物（例えばネコ）、ウマ科動物（例えばウマ）、霊長類、真猿類（simian）（例えばサル（monkey)又は類人猿（ape））、サル（例えばマーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、又はヒト等の哺乳動物であってもよい。
【０１０７】
好ましい実施形態では、個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおける治療有効性を実証するモデルとして従来使用されている哺乳動物（例えば、ネズミ科動物、霊長類、ブタ、イヌ、又はウサギの動物）が利用され得る。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、最初の癌治療の後、個体は微小残存病変（ＭＲＤ：minimal residual disease）を有する場合がある。
【０１０９】
癌を有する個体は、当該技術分野の臨床基準に従って癌の診断を行うのに十分な少なくとも１つの識別可能な兆候、症状、又は検査所見を示し得る。かかる臨床基準の例は、Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al., eds., McGraw-Hill, New York, 2001等の医学の教科書に見ることができる。幾つかの例では、個体における癌の診断は、該個体から得られた体液又は組織の試料中の特定の細胞型（例えば、癌細胞）の識別を含む場合がある。
【０１１０】
治療は、ヒト又は動物（例えば獣医学的適用）にかかわらず、幾つかの所望の治療効果、例えば、病状の進行の阻害又は遅延が達成される、任意の治療及び治療法であってもよく、また該治療効果は、進行速度の減少、進行速度の停止、病状の改善、病状の治癒又は寛解（部分又は完全を問わない）、病状の１以上の症状及び／又は兆候の予防、遅延、軽減、若しくは阻止、又は治療がない状態で期待される期間を超えた被験体若しくは患者の生存期間の延長を含む。
【０１１１】
また、治療は、予防的（すなわち予防法）であってもよい。例えば、癌を発生又は再発しやすい又はそのリスクにある個体が、本明細書に記載されるように治療され得る。かかる治療は、個体において癌の発生又は再発を予防又は遅延し得る。
【０１１２】
特に、治療は、癌の完全寛解及び／又は癌転移の阻害を含む、癌増殖の阻害を含み得る。癌増殖は、一般的には、癌においてより発達した形態への変化を示す多くの指標のいず
れか１つを指す。したがって、癌増殖の阻害を測る指標として、癌細胞生存の減少、腫瘍体積又は形態の減少（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他の画像検査法を使用して決定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏症皮膚試験における成績の改善、Ｔ細胞の活性の増加、及び腫瘍特異抗原のレベルの減少が挙げられる。本明細書に記載されるように改変されたＴ細胞の投与は、癌増殖、特に被験体に既に存在する癌の増殖に抵抗する及び／又は個体における癌増殖の傾向を減少する個体の能力を改善し得る。
【０１１３】
改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞を含む医薬組成物は、全身的／局所的又は所望の作用部位にかかわらず、限定されないが、非経口、例えば注入によるものを含む任意の簡便な投与経路によって被験体に投与され得る。注入は、針又はカテーテルによる好適な組成物中のＴ細胞の投与を含む。典型的には、Ｔ細胞は静脈内又は皮下に注入されるが、Ｔ細胞は筋肉内注射及び硬膜外経路等の他の非経口経路によって注入されてもよい。好適な注入技術は当該技術分野でよく知られており、治療法において一般的に使用される（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med., 319:1676, 1988を参照されたい）。
【０１１４】
典型的には、投与される細胞の数は、必要に応じて治療を繰り返して、例えば数日〜数週間の間隔で、典型的には３０分間の間に、体重１Ｋｇ当たり約１０5個〜約１０10個、
典型的には１個体当たり２×１０8個〜２×１０10個の細胞である。改変Ｔ細胞及び改変
Ｔ細胞を含む組成物の適切な投薬量は、患者によって変化し得ることが十分理解される。最適な投薬量を決定することは、一般的には、本発明の治療のあらゆるリスク又は健康に害のある副作用に対する治療利益のレベルの釣り合いを取ることを含む。選択される投薬量のレベルは、限定されないが、特定の細胞の活性、投与経路、投与時間、細胞の喪失又は不活性化の速度、治療期間、併用される他の薬物、化合物及び／又は物質、並びに患者の年齢、性別、体重、病状、全身の健康状態、及び以前の病歴を含む様々な因子に依存する。細胞の量及び投与経路は、最終的には医師の裁量によるが、一般的には、投薬量は、実質的に有害な又は健康に害のある副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成する、作用部位における局所濃度を達成するものとなる。
【０１１５】
改変Ｔ細胞が単独で投与される場合、幾つかの状況では、改変Ｔ細胞は、改変Ｔ細胞の集団のｉｎ  ｖｉｖｏでの拡大を促進するため、標的抗原、標的抗原を提示するＡＰＣ、及び／又はＩＬ−２と組み合わせて投与される細胞であってもよい。改変Ｔ細胞の集団は、サイトカイン、例えばＩＬ−２、細胞傷害性化学療法、放射線、並びに抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＴＩＭ３、抗ＫＩＲ、抗ＬＡＧ３、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４の抗体等のチェックポイント阻害剤を含む癌免疫療法剤等の１以上の他の治療法と組み合わせて投与されてもよい。
【０１１６】
１以上の他の治療薬を、好ましくは改変Ｔ細胞の投与の部位とは別の部位において、任意の簡便な手段によって投与してもよい。
【０１１７】
改変Ｔ細胞の投与は、１用量で、連続的に又は一連の治療を通して断続的に（例えば、適切な間隔で分割された用量で）達成されてもよい。投与に最も有効な手段及び投薬量を決定する方法は当業者によく知られており、治療法に使用される製剤、治療目的、治療される標的細胞、及び治療される被験体によって変化する。主治医によって選択される用量レベル及び投薬パターンによって単回又は複数回の投与が行われ得る。改変Ｔ細胞は、少なくとも１×１０9個のＴ細胞の単回の注入で投与されることが好ましい。
【０１１８】
本発明の他の態様は、本明細書に記載される改変Ｔ細胞の生成のための核酸及び他の試薬を提供する。
【０１１９】
単離された核酸は、癌細胞に特異的に結合する抗原受容体をコードするヌクレオチド配列、及びｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はｃＡＭＰ  ＰＤＥのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【０１２０】
コーディング配列は、同一の若しくは異なるプロモーター又は他の調節エレメントに制御可能に連結され得る。好適なプロモーターは当該技術分野でよく知られており、ヒト伸長因子−１アルファ（ＥＦ１α）等の哺乳動物プロモーターが挙げられる。幾つかの実施形態では、コーディング配列は、切断認識配列によって分離され得る。これは、ｃＡＭＰ
ＰＤＥ又はフラグメント及び抗原受容体が、フーリン（furin）等の部位特異的プロテ
アーゼによって細胞内での切断を経て２つの別々のタンパク質を生成する、単一融合物として発現されることを可能とする。好適な切断認識配列として、２Ａ−フーリン配列が挙げられる。単一融合物の例として、フーリン切断部位によって分離されるＭＡＧＥ−Ａ４
ＴＣＲとＮ末端ＰＤＥ７Ａフラグメントとを含む配列番号６、及びフーリン切断部位によって分離されるＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲとＮ末端ＰＤＥ７Ａフラグメントとを含む配列番号８が挙げられる。
【０１２１】
好適な単離された核酸の例としてフーリン切断配列によって分離されるＭＡＧＥ−Ａ４
ＴＣＲとＮ末端ＰＤＥ７Ａフラグメントとを含む融合物をコードする配列番号５、及びフーリン切断部位によって分離されるＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲとＮ末端ＰＤＥ７Ａフラグメントとを含む融合物をコードする配列番号７が挙げられる。
【０１２２】
抗原受容体及びｃＡＭＰ  ＰＤＥ又はフラグメントをコードするヌクレオチド配列は、同一の発現ベクターに位置してもよい。例えば、好適な発現ベクターは、上に記載される核酸を含んでもよい。或いは、コーディング配列は、別々のベクターに位置してもよい。
【０１２３】
好適なベクターは当該技術分野でよく知られており、上により詳しく記載される。
【０１２４】
プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含んだ好適なベクターが選択又は構築され得る。ベクターは、哺乳動物細胞において核酸の発現を駆動するため、適切な調節配列を含むことが好ましい。また、ベクターは、Ｅ．コリ（E.coli）等の細菌宿主においてその選択、発現及び複製を可能とする複製起点、プロモーター領域、及び選択マーカー等の配列も含み得る。好ましいベクターとして、ＶＳＶｇ−偽型自己不活性化ベクターを含むレンチウイルスのベクター等のレトロウイルスベクターが挙げられる。
【０１２５】
レンチウイルス等のウイルスベクターは、１以上のウイルスタンパク質によってカプセル化された核酸ベクターを含むウイルス粒子に含まれてもよい。ウイルス粒子は、本明細書中に記載のウイルスベクターと、１以上のウイルスのパッケージングベクター及びエンベロープベクターとで哺乳動物細胞を形質導入することと、形質導入された細胞が培養培地中に放出されるレンチウイルス粒子を産生するように、細胞を培地において培養することとを含む方法によって産生することができる。
【０１２６】
ウイルス粒子の放出に続いて、ウイルス粒子を含む培養培地を収集してもよく、任意にウイルス粒子を濃縮してもよい。
【０１２７】
産生及び任意の濃縮に続いて、ウイルス粒子を、例えば、Ｔ細胞の形質導入における使用の準備が整った状態で−８０℃において凍結することにより保管してもよい。
【０１２８】
本発明の他の態様及び実施形態は、「からなる（consisting of）」の用語によって置
き換えられる「含む、備える（comprising）」の用語を有する上に記載される態様及び実施形態、並びに「本質的にからなる（consisting essentially of）」の用語によって置
き換えられる「含む、備える（comprising）」の用語を有する上に記載される態様及び実施形態を提供する。
【０１２９】
本出願は、別段の指示がない限り、あらゆる上の態様及び上に記載される実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、別段の要望がない限り、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様との全ての組み合わせを開示する。
【０１３０】
上の実施形態の変形、更なる実施形態及びそれらの変形は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。
【０１３１】
本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。
【０１３３】
ここで、本発明の或る特定の態様及び実施形態を例として、また上に記載される図面を参照して解説する。
【実施例】
【０１３４】
実験
１．材料及び方法
１．１  レンチウイルスベクター及びウイルス粒子の製造
レンチウイルス系は、Ｎ末端ヒトインフルエンザヘマグルチニンタグを含むホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）４Ｃ又はＰＤＥ７Ａ、又はＥＦ１αプロモーター由来のＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲのα鎖及びβ鎖といずれもタンデムであるＰＤＥ７Ａ若しくはＰＤＥ７Ａのフラグメントを発現するために使用される第３世代ＶＳＶｇ偽型自己不活性化ベクターであった。各導入遺伝子を２Ａ−フーリン配列によって分離した。
【０１３５】
プラスミドｐＥＬＮＳ−ＡＤＢ１０７６は、ＴＣＲの上流にＰＤＥ４Ｃ（図１Ａ）又はＰＤＥ７Ａ（図１Ｂ）を含む。ＥＦ−１ａプロモーター、並びに下流のＰＤＥ及びＴＣＲ導入遺伝子に加えて、レンチウイルス及び細菌性プラスミドの特徴を表す様々なエレメントが示される。ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ  ７．６．１によってマップを作成した。
【０１３６】
Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔトランスフェクション試薬（ThermoScientific）を使用して、パッケージング及びエンベロープのエレメントをコードする３種類のプラスミド系と並んで、レンチベクタープラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることにより、レンチウイルス粒子を製造した。トランスフェクションの４８時間後〜７２時間後に上清を収集し、一晩濃縮する前に１００００×ｇで遠心分離して濾過した。濃縮していない上清と比べてレンチウイルス粒子が５倍〜１０倍に濃縮されるように培地を除去した。次いで、レンチウイルス調製物をドライアイス上で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０１３７】
１．２  ＰＢＭＣの単離及びＴ細胞の拡大
健康なヒトボランティアの静脈血から単離したＰＢＭＣをＣＤ１４＋細胞枯渇に供し、ＩＬ−２の存在下、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆したビーズと共に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン及びストレプトマイシン、並びに１％Ｌ−グルタミンで補足したＩＭＤＭ培地（Gibco）中で、一晩インキュベートした後、レンチウイルス形質導入
を行って、ＨＡ−ＰＤＥ７Ａ、ＨＡ−ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ７Ａ又はＰＤＥ７Ａのフラグメントとタンデムに発現される、親和性が増強されたＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ又はＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲのいずれかを発現させた。次いで、Ｔ細胞を１４日間培養して拡大し、Ｖβ１３．１（ＴＲＢＶ６−９）について染色することによってフローサイトメトリーによりＴＣＲ形質導入レベルを評価した。
【０１３８】
Dull, T., et al (1998). J. Virol. 72, 8463-8471に記載される４種類のベクター系
を使用して、レンチウイルスの形質導入を行った。
【０１３９】
１．３  癌細胞
ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１６１９）から購入したＮＹ−ＥＳＯ１−陽性Ａ３７５黒色腫細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０（Gibco）を１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン及びストレプトマイ
シン、並びに１％Ｌ−グルタミンで補足した培地（Ｒ１０）で培養した。Ａ３７５黒色腫細胞をトリプシン／０．２５％ＥＤＴＡを使用して採取し、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて標的として使用する前に洗浄した。
【０１４０】
１．４  試薬
アデノシン、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、及びフォルスコリンをSigma Aldrichから購入した。ＰＢＳ中に希釈した０．１３Ｍ  ＮＨ4ＯＨに最終濃度２５ｍＭまでアデノシン粉末を希釈した。フォルスコリンを１００ｍＭでジメチル−スルホキシド（ＤＭＳＯ）に希釈した。プロスタグランジンＥ２を、１０％エタノールを含むＰＢＳに２８５μＭで希釈した。セクション２に示される最終濃度で各試薬を使用した。
【０１４１】
１．５  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡアッセイ及びサイトカイン測定
Ａ３７５黒色腫標的細胞を採取し、再懸濁して、５００００標的細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートに蒔いた。Ｔ細胞を拡大した後に新鮮な状態で使用するか、又は凍結保存し、解凍し、洗浄して使用した。Ｔ細胞をＲ１０培地中、３７℃でおよそ２時間置いてから、１２００００Ｔ細胞／ウェル〜２０００００Ｔ細胞／ウェルの濃度で蒔いた。
【０１４２】
アデノシン、ＰＧＥ２、又はフォルスコリンを指定の最終濃度で添加し、最終容量を２００μｌ／ウェルにした。各アッセイ条件を３回反復にて行った。細胞を３７℃で４８時間培養し、上清を収集してから、凍結し、−２０℃で保管した。どのアッセイの前にも、プレートを解凍してから、遠心分離を行った。次いで、後にアッセイで使用するために上清を新しい９６ウェルプレートに移した。
【０１４３】
９６ウェルハーフエリアプレートを使用し、製造業者の指示書に従って、ヒトＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を使用して、ＩＦＮ−γ濃度を決定した。市販
のＴＭＢ基質溶液を使用してアッセイを発色させ、１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4により反応を停止した。波長補正を５４０ｎｍに設定して、Ｓｐｅｃｔｒｏｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａを使用して４５０ｎｍでアッセイを読み取った。Ｓｐｅｃｔｒｏｓｔａｒデータ分析ソフトウェアを使用してデータを分析した。
【０１４４】
１．６  時間分解細胞傷害性アッセイ
ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）ＦＬＲ技術（Essen Bioscience）は、リアルタイムで３７℃において顕微鏡検査によるカスパーゼ−３／７依存性アポトーシスの直接的な可視化を可能とする。活性化カスパーゼ−３／７認識モチーフ（ＤＥＶＤ）をＤＮＡインターカレー
ター色素であるＮｕｎｃｖｉｅｗ（商標）４８８に連結する、ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ（商標）９６−Ｗｅｌｌ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７試薬（Essen Biosciences）を使用してアポトーシスの動態測定を行った。組織培養培地に添加する際に、この不
活性な非蛍光基質は細胞膜を越え、ここで、該基質は活性化カスパーゼ−３／７によって切断されてＤＮＡ色素の放出及び核ＤＮＡの緑色蛍光染色を生じる。カスパーゼ−３／７の速度論的活性化は、生細胞の画像化を使用して形態学的にモニターし、１ｍｍ2当たり
の蛍光性対象の数としてＩｎｃｕＣｙｔｅ対象計数アルゴリズムを使用して定量することが可能である。１００μｍ2にフィルタ閾値を設定するサイズ排除によってアポトーシス
性Ｔ細胞を分析から除外（gated out）する。
【０１４５】
ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイを次の通り行った。簡潔には、アッセイを始める２４時間前に、Ａ３７５黒色腫標的細胞を５０μｌのＲ１０中に１ウェル当たり１５０００個〜２００００個の細胞で蒔いた。アッセイの日、エフェクター細胞を添加する前に、フォルスコリン又はＰＧＥ２の存在下又は不在下で、１ウェル当たり、１０μＭのＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ（商標）９６−Ｗｅｌｌ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７試薬を含むアッセイ培地５０μｌを添加した。形質導入されていない又は形質導入されたエフェクター細胞を５０μｌのアッセイ培地中、１ウェル当たり６００００個の細胞で３回反復にてウェルに蒔いて、最終容量を１５０μｌとした。３７℃／５％ＣＯ2で９６時間（４日間）に
亘って３時間〜４時間毎に１０倍の倍率を使用して各ウェルの画像を撮影するように、ＩｎｃｕＣｙｔｅを設定した。
【０１４６】
２．結果
２．１  ＮＹ−ＥＳＯ１c259及びＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞の標的細胞殺傷動態
ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ又はＨＡ−ＰＤＥ７ＡとタンデムにＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞のＡ３７５標的細胞のアポトーシスを誘導する能力を、時間分解細胞傷害性アッセイにより測定した。異なる形質導入状態を有する６００００個のＴ細胞（非形質導入（ＮＴＤ）、ｃ２５９ＴＣＲ（ＡＤＢ８６９）、ｃ２５９ＴＣＲ＋ＰＤＥ７Ａ（ＡＤＢ１０７７））を各アッセイウェルに添加し、アッセイの２４時間前に１ウェル当たり１５０００個の細胞で蒔いたＨＬＡ−Ａ２＋／ＮＹＥＳＯ＋Ａ３７５黒色腫標的細胞と同時インキュベートを行った。ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ（商標）９６−Ｗｅｌｌ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７試薬を３．３μＭの最終濃度で全てのウェルに添加した。９６時間に亘って４時間間隔で画像を撮影した。アポトーシスを起こしている標的細胞の尺度である対象数／ｍｍ2を各画像について決定し、時間に対してプロットした。
【０１４７】
ＨＡ−ＰＤＥ７ＡとタンデムなＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲによって形質導入されたＴ細胞は、Ａ３７５標的細胞においてアポトーシスを誘導する基礎能力の改善を示した（図２Ａ及び図２Ｂ）。測定点は、３回反復のウェルの平均値及び平均に対する標準誤差を示す。図２Ａ及び図２Ｂは、２名の健康なドナーから単離されたＴ細胞を用いて行った実験を表す。示されるデータは、５つの異なる実験の代表である。
【０１４８】
２．２  ＰＧＥ２の存在下でＮＹ−ＥＳＯ１c259及びＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞の標的細胞殺傷動態
ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ、又はＨＡ−ＰＤＥ７ＡとタンデムにＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞のＡ３７５標的細胞のアポトーシスを誘導する能力を、プロスタグランジンＥ２の不在下及び存在下で時間分解細胞傷害性アッセイによって測定した。
【０１４９】
異なる形質導入状態を有する６００００個のＴ細胞を各アッセイウェルに添加し、アッセイの２４時間前に１ウェル当たり１５０００個で蒔いたＨＬＡ−Ａ２＋／ＮＹＥＳＯ＋Ａ３７５黒色腫標的細胞と同時インキュベートを行った。各ウェルにて１μＭの最終濃度でプロスタグランジンＥ２を添加した。ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ（商標）９６−Ｗｅｌｌ  
Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７試薬を３．３μＭの最終濃度で全てのウェルに添加した。９６時間に亘って４時間間隔で画像を撮影した。アポトーシスを起こしている標的細胞の尺度である対象数／ｍｍ2を各画像について決定し、時間に対してプロットし
た。
【０１５０】
標的Ａ３７５細胞単独、非形質導入細胞（ＮＴＤ）、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞（ＡＤＢ８６９）、及びＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲとＰＤＥ７Ａの両方を発現するＴ細胞（ＡＤＢ１０７７）を、ＰＧＥ２の不在下（塗りつぶした記号）又は存在下（白抜きの記号）で標的細胞のアポトーシスを誘導するそれらの能力について調べた。ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞におけるＰＤＥ７Ａの過剰発現は、ＰＧＥ２の阻害効果に対して抵抗性を与える（図３Ａ及び図３Ｂ）。ＰＤＥ７Ａによって形質導入されたＴ細胞は、ＰＤＥ７Ａ／ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ  Ｔ細胞によってＰＧＥ２不在下で示されるものと同様の殺傷動態をＰＧＥ２の存在下で示した。
【０１５１】
測定点は、３回反復のウェルの平均値及び平均に対する標準誤差を示す。図３Ａ及び図３Ｂは、２名の健康なドナーから単離されたＴ細胞を用いて行った実験を表す。示されるデータは、６つの実験の代表である。
【０１５２】
２．３  フォルスコリンの存在下でＮＹ−ＥＳＯ１c259及びＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞の標的細胞殺傷動態
ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ、又はＨＡ−ＰＤＥ７ＡとタンデムにＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞のＡ３７５標的細胞のアポトーシスを誘導する能力を、フォルスコリンの不在下及び存在下で時間分解細胞傷害性アッセイによって測定した。
【０１５３】
符号で示すように異なる形質導入状態を有する６００００個のＴ細胞を各アッセイウェルに添加し、アッセイの２４時間前に１ウェル当たり１５０００個で蒔いたＨＬＡ−Ａ２＋／ＮＹＥＳＯ＋Ａ３７５黒色腫標的細胞と同時インキュベートを行った。各ウェルにて３０μＭの最終濃度でフォルスコリンを添加した。ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ（商標）９６−Ｗｅｌｌ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７試薬を３．３μＭの最終濃度で全てのウェルに添加した。９６時間に亘って４時間間隔で画像を撮影した。アポトーシスを起こしている標的細胞の尺度である対象数／ｍｍ2を各画像について決定し、時間に対して
プロットした。
【０１５４】
非形質導入細胞（ＮＴＤ）、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞（ＡＤＢ８６９）、及びＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲとＰＤＥ７Ａの両方を発現するＴ細胞（ＡＤＢ１０７７）を、フォルスコリンの不在下（塗りつぶした記号）又は存在下（白抜きの記号）で標的細胞のアポトーシスを誘導するそれらの能力について調べた。ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞におけるＰＤＥ７Ａの過剰発現は、標的細胞殺傷能力に対するフォルスコリンの阻害効果に対して部分抵抗性を与える（図４Ａ及び図４Ｂ）。測定点は、３回反復のウェルの平均値及び平均に対する標準誤差を示す。図４Ａ及び図４Ｂは、２名の健康なドナーから単離されたＴ細胞を用いて行った実験を表す。示されるデータは、６つの異なる実験の代表である。
【０１５５】
２．４  ＮＹ−ＥＳＯ１c259及びＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌
フォルスコリン、アデノシン及びＰＧＥ２は、細胞内のｃＡＭＰレベルを増加し得る。これらのメディエーターのＴ細胞からのＩＦＮ−γ分泌に対する効果を調べるため、サンドイッチＥＬＩＳＡによってＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞、及びＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲとＰＤＥ７Ａの両方を発現するＴ細胞に対してサイトカイン分析を行った。
【０１５６】
ＮＹ−ＥＳＯ１−特異的ＴＣＲ  ｃ２５９を単独で又はホスホジエステラーゼ７Ａ（ＰＤＥ７Ａ）とタンデムに発現するレンチベクターによって形質導入された、健康なドナーから単離された２０００００個のＴ細胞を各アッセイウェルに添加し、１ウェル当たり５００００個で蒔いたＨＬＡ−Ａ２＋／ＮＹＥＳＯ＋Ａ３７５黒色腫標的細胞と同時インキュベートを行った。最終濃度３０μＭのフォルスコリン、２５０μＭのアデノシン、及び１μＭ又は０．３μＭのプロスタグランジンＥ２を添加した。Ｔ細胞及び標的細胞を４８時間に亘って共培養し、サイトカイン分析のため上清を収集した。
【０１５７】
ＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞は、フォルスコリン（図５Ａ）、アデノシン（図５Ｂ）、及びＰＧＥ２（図５Ｃ）によるＩＦＮ−γ放出の阻害に部分抵抗性である。示されるデータは、６つの実験の代表である。
【０１５８】
２．５  ＮＹ−ＥＳＯ１c259及びＰＤＥ４Ｃを発現するＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌
サンドイッチＥＬＩＳＡを利用して、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞、及びＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲとＰＤＥ４Ｃの両方を発現するＴ細胞からのＩＦＮ−γ分泌に対するフォルスコリン及びＰＧＥ２の効果を調べた。
【０１５９】
ＮＹ−ＥＳＯ１−特異的ＴＣＲ  ｃ２５９を単独で又はホスホジエステラーゼ４Ｃ（ＰＤＥ４Ｃ）とタンデムに発現するレンチベクターによって形質導入された、健康なドナーから単離された２０００００個のＴ細胞を各アッセイウェルに添加し、１ウェル当たり５００００個で蒔いたＨＬＡ−Ａ２＋／ＮＹＥＳＯ＋Ａ３７５黒色腫標的細胞と同時インキュベートを行った。最終濃度３０μＭのフォルスコリン、及び１μＭのプロスタグランジンＥ２を添加した。Ｔ細胞及び標的細胞を４８時間に亘って共培養し、サイトカイン分析のため上清を収集した。
【０１６０】
ＰＤＥ４Ｃを発現するＴ細胞は、ＩＦＮ−γ放出に対するＰＧＥ２及びフォルスコリンの阻害効果に対して部分抵抗性を示す（図６Ａ及び図６Ｂ）。図６Ａ及び図６Ｂは、２名の健康なドナーから単離されたＴ細胞を用いて行った実験を表す。
【０１６１】
２．６  ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ及び全長形態又は短縮形態のＰＤＥ７Ａを含むレンチウイルスコンストラクトの生物学的力価
様々なレンチウイルス調製物をＰＢＬに対して力価測定し、それらの有効な生物学的力価を決定した。Ｔ細胞形質導入レベルをＴＣＲのＶβ鎖（Ｖβ１３．１）に対して染色することにより決定した。
【０１６２】
同じ濃度のレンチウイルスを使用する場合、Ｔ細胞形質導入は、常に、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ単独で形質導入された細胞と比較して、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ＋全長ＰＤＥ７Ａ形質導入細胞について遥かに低かったが、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ＋短縮型ＰＤＥ７Ａ形質導入細胞については、形質導入は中間レベルであった（図７）。形質導入効率の違いは、おそらくは、コンストラクトのサイズが異なることによって説明され得る。
【０１６３】
２．７  ＮＹ−ＥＳＯ１c259及び全長形態又は短縮形態のＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞の形質導入効率及びＴＣＲ発現レベル
Ｔ細胞形質導入レベルをＴＣＲのＶβ鎖（Ｖβ１３．１）に対して染色することにより決定した。形質導入に使用したウイルスの量をレンチウイルス力価測定後に正規化したところ、全てのコンストラクトについて非常によく似た形質導入効率をもたらした（図８Ａ）。Ｖβ１３．１の中央値蛍光強度（ＭＦＩ：median fluorescence intensity）によっ
て測定されるＴＣＲ発現レベルは、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ単独で形質導入されたＴ細胞と比較して、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ＋全長ＰＤＥ７Ａで形質導入されたＴ細胞についてはかなり低かった（図８Ｂ）。ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ＋短縮型ＰＤＥ７Ａで形質
導入されたＴ細胞は、中間のＴＣＲ発現レベルを示した。
【０１６４】
２．８  ＰＧＥ２の存在下でＮＹ−ＥＳＯ１c259及び全長形態又は短縮形態のＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞の標的細胞殺傷動態
（ｉ）ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ、（ｉｉ）ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ及び全長ＰＤＥ７Ａ、又は（ｉｉｉ）ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲ及び短縮型ＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞のＡ３７５標的細胞のアポトーシスを誘導する能力を、プロスタグランジンＥ２の不在下及び存在下で、時間分解細胞傷害性アッセイによって測定した。
【０１６５】
異なる形質導入状態を有する６００００個のＴ細胞を各アッセイウェルに添加し、アッセイの２４時間前に１ウェル当たり２００００個で蒔いたＨＬＡ−Ａ２＋／ＮＹ−ＥＳＯ＋Ａ３７５黒色腫標的細胞と同時インキュベートを行った。各ウェルにて１μＭの最終濃度でプロスタグランジンＥ２を添加した。ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ（商標）９６−Ｗｅｌｌ
Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７試薬を３．３μＭの最終濃度で全てのウェルに添加した。９６時間に亘って３時間間隔で画像を撮影した。アポトーシスを起こしている標的細胞の尺度である対象数／ｍｍ2を各画像について決定し、時間に対してプロット
した。
【０１６６】
非形質導入Ｔ細胞（ＮＴＤ）、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲと全長ＰＤＥ７Ａの両方を発現するＴ細胞、及びＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲと短縮型ＰＤＥ７Ａの両方を発現するＴ細胞を、ＰＧＥ２の不在下（塗りつぶした記号）又は存在下（白抜きの記号）で、標的細胞のアポトーシスを誘導するそれらの能力について調べた（図９Ａ）。ＮＹ−ＥＳＯ特異的Ｔ細胞における全長及び短縮型のＰＤＥ７Ａの過剰発現はいずれも、その効果は短縮型ＰＤＥ７Ａについて僅かに減少されるものの、ＰＧＥ２の阻害効果に対して抵抗性を与える（図９Ｃ）。両方の形態のＰＤＥ７Ａによって形質導入されたＴ細胞は、ＰＧＥ２の存在下で、ＰＧＥ２の不在下で対応する細胞によって示されるものと同様の殺傷動態を示した（図９Ｂ）。
【０１６７】
測定点は、３回反復のウェルの平均値及び平均に対する標準誤差を示す。図９は、１名の健康なドナーから単離されたＴ細胞を用いて行った実験を表す。示されるデータは、４つの実験の代表である。
【０１６８】
２．９  ＮＹ−ＥＳＯ１c259及び全長形態又は短縮形態のＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌
サンドイッチＥＬＩＳＡを利用して、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲを発現するＴ細胞、ＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲと全長ＰＤＥ７Ａの両方を発現するＴ細胞、及びＮＹ−ＥＳＯ１c259ＴＣＲと短縮型ＰＤＥ７Ａの両方を発現するＴ細胞からのＩＦＮ−γ分泌に対するフォルスコリン及びＰＧＥ２の効果を調べた。
【０１６９】
ＮＹ−ＥＳＯ１−特異的ＴＣＲ  ｃ２５９を単独で、又は全長ホスホジエステラーゼ７Ａ若しくは短縮型ホスホジエステラーゼ７Ａとタンデムに発現するレンチベクターで形質導入された健康なドナーから単離された１２００００個のＴ細胞を、各アッセイウェルに添加し、１ウェル当たり５００００個で蒔いたＨＬＡ−Ａ２＋／ＮＹＥＳＯ＋Ａ３７５黒色腫細胞と同時インキュベートを行った。最終濃度５０μＭのフォルスコリン並びに０．３μＭ及び１μＭのプロスタグランジンＥ２を添加した。Ｔ細胞及び標的細胞を４８時間に亘って共培養し、サイトカイン分析のため上清を収集した。
【０１７０】
両方の形態のＰＤＥ７Ａを発現するＴ細胞は、ＩＦＮ−γ放出に対するＰＧＥ２及びフォルスコリンの阻害効果に対して抵抗性を示した（図１０）。図１０は、２名の健康なドナーから単離されたＴ細胞を用いて行われた実験を表す。示されるデータは４つの実験の
代表である。
配列
MEVCYQLPVLPLDRPVPQHVLSRRGAISFSSSSALFGCPNPRQLSQRRGAISYDSSDQTALYIRMLGDVRVRSRAGFESERRGSHPYIDFRIFHSQSEIEVSVSARNIRRLLSFQRYLRSSRFFRGTAVSNSLNILDDDYNGQAKCMLEKVGNWNFDIFLFDRLTNGNSLVSLTFHLFSLHGLIEYFHLDMMKLRRFLVMIQEDYHSQNPYHNAVHAADVTQAMHCYLKEPKLANSVTPWDILLSLIAAATHDLDHPGVNQPFLIKTNHYLATLYKNTSVLENHHWRSAVGLLRESGLFSHLPLESRQQMETQIGALILATDISRQNEYLSLFRSHLDRGDLCLEDTRHRHLVLQMALKCADICNPCRTWELSKQWSEKVTEEFFHQGDIEKKYHLGVSPLCDRHTESIANIQIGFMTYLVEPLFTEWARFSNTRLSQTMLGHVGLNKASWKGLQREQSSSEDTDAAFELNSQLLPQENRLS
配列番号１(PDE7A) NP_001229247.1
MEPPTVPSERSLSLSLPGPREGQATLKPPPQHLWRQPRTPIRIQQRGYSDSAERAERERQPHRPIERADAMDTSDRPGLRTTRMSWPSSFHGTGTGSGGAGGGSSRRFEAENGPTPSPGRSPLDSQASPGLVLHAGAATSQRRESFLYRSDSDYDMSPKTMSRNSSVTSEAHAEDLIVTPFAQVLASLRSVRSNFSLLTNVPVPSNKRSPLGGPTPVCKATLSEETCQQLARETLEELDWCLEQLETMQTYRSVSEMASHKFKRMLNRELTHLSEMSRSGNQVSEYISTTFLDKQNEVEIPSPTMKEREKQQAPRPRPSQPPPPPVPHLQPMSQITGLKKLMHSNSLNNSNIPRFGVKTDQEELLAQELENLNKWGLNIFCVSDYAGGRSLTCIMYMIFQERDLLKKFRIPVDTMVTYMLTLEDHYHADVAYHNSLHAADVLQSTHVLLATPALDAVFTDLEILAALFAAAIHDVDHPGVSNQFLINTNSELALMYNDESVLENHHLAVGFKLLQEDNCDIFQNLSKRQRQSLRKMVIDMVLATDMSKHMTLLADLKTMVETKKVTSSGVLLLDNYSDRIQVLRNMVHCADLSNPTKPLELYRQWTDRIMAEFFQQGDRERERGMEISPMCDKHTASVEKSQVGFIDYIVHPLWETWADLVHPDAQEILDTLEDNRDWYYSAIRQSPSPPPEEESRGPGHPPLPDKFQFELTLEEEEEEEISMAQIPCTAQEALTAQGLSGVEEALDATIAWEASPAQESLEVMAQEASLEAELEAVYLTQQAQSTGSAPVAPDEFSSREEFVVAVSHSSPSALALQSPLLPAWRTLSVSEHAPGLPGLPSTAAEVEAQREHQAAKRACSACAGTFGEDTSALPAPGGGGSGGDPT
配列番号２(PDE4A) NP_001104777.1
MENLGVGEGAEACSRLSRSRGRHSMTRAPKHLWRQPRRPIRIQQRFYSDPDKSAGCRERDLSPRPELRKSRLSWPVSSCRRFDLENGLSCGRRALDPQSSPGLGRIMQAPVPHSQRRESFLYRSDSDYELSPKAMSRNSSVASDLHGEDMIVTPFAQVLASLRTVRSNVAALARQQCLGAAKQGPVGNPSSSNQLPPAEDTGQKLALETLDELDWCLDQLETLQTRHSVGEMASNKFKRILNRELTHLSETSRSGNQVSEYISRTFLDQQTEVELPKVTAEEAPQPMSRISGLHGLCHSASLSSATVPRFGVQTDQEEQLAKELEDTNKWGLDVFKVAELSGNRPLTAIIFSIFQERDLLKTFQIPADTLATYLLMLEGHYHANVAYHNSLHAADVAQSTHVLLATPALEAVFTDLEILAALFASAIHDVDHPGVSNQFLINTNSELALMYNDASVLENHHLAVGFKLLQAENCDIFQNLSAKQRLSLRRMVIDMVLATDMSKHMNLLADLKTMVETKKVTSLGVLLLDNYSDRIQVLQNLVHCADLSNPTKPLPLYRQWTDRIMAEFFQQGDRERESGLDISPMCDKHTASVEKSQVGFIDYIAHPLWETWADLVHPDAQDLLDTLEDNREWYQSKIPRSPSDLTNPERDGPDRFQFELTLEEAEEEDEEEEEEGEETALAKEALELPDTELLSPEAGPDPGDLPLDNQRT
配列番号３(PDE4C) NP_000914.2
2019528748.tif 000002
配列番号４  ＰＤＥ７Ａの非触媒Ｎ末端フラグメント（反復を下線で示し、ＰＫＡ疑基質部位を太字で示す）
ATGGAAGTGTGCTACCAGCTGCCCGTGCTGCCCCTGGATAGACCTGTGCCTCAGCATGTGCTGAGCAGAAGAGGCGCCATCAGCTTCAGCAGCAGCTCCGCCCTGTTCGGCTGCCCCAATCCTAGACAGCTGAGCCAGAGAAGGGGAGCCATCTCCTACGACAGCAGCGACCAGACCGCCCTGTACATCAGAATGCTGGGCGACGTGCGCGTGCGGAGCAGAGCCGGATTTGAGAGCGAGAGAAGAGGCTCCCACCCCTACATCGACTTCCGGATCTTCCACAGCCAGAGCGAGATCGAGGTGTCCGTGTCCGCCCGGAACATCAGACGGCTGCTGAGCTTCCAGAGATACCTGAGAAGCAGCCGGTTCTTCCGGGGCACCGCCGTGTCCAACAGCCTGAACATCCTGGACGACGACTACAACGGCCAGGCCAAGCGGGCCAAGAGATCTGGATCTGGCGCGCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGACCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAAAGCAACCCTGGCCCCATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATCCTGTGGCTGTACTTCTACCGGGGCAACGGCAAGAACCAGGTGGAACAGAGCCCCCAGAGCCTGATCATCCTGGAAGGCAAGAACTGCACTCTGCAGTGCAACTACACCGTGTCCCCCTTCAGCAACCTGCGCTGGTACAAGCAGGATACCGGCAGAGGCCCTGTGTCCCTGACCATCCTGACCTTCAGCGAGAACACCAAGAGCAACGGCCGGTACACCGCCACCCTGGACGCCGATACAAAGCAGAGCAGCCTGCACATCACCGCCTCCCAGCTGAGCGATAGCGCCAGCTACATCTGCGTGGTGTCCGGCGGCACAGACAGCTGGGGCAAGCTGCAGTTTGGCGCCGGAACACAGGTGGTCGTGACCCCCGACATCCAGAACCCTGACCCTGCC
GTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACTCCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGATATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAATAGCGCCGTGGCCTGGTCTAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAATTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCCGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGTCCTCTGGCTCTCGGGCCAAGAGAAGCGGCAGCGGCGCCACCAATTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCAGGGGATGTGGAAGAGAATCCCGGCCCTAGAATGGCCTCCCTGCTGTTTTTCTGCGGCGCCTTCTACCTGCTGGGGACCGGCAGCATGGACGCTGACGTGACCCAGACCCCCCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCAGCCAGACAAAGGGCCACGACCGGATGTACTGGTACAGACAGGATCCAGGACTGGGCCTGAGGCTGATCTACTACAGCTTCGATGTGAAGGACATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCCAGACAGGCCCAGGCCAAGTTCTCCCTGAGCCTGGAAAGCGCCATCCCCAACCAGACCGCCCTGTACTTTTGTGCCACAAGCGGCCAGGGCGCCTACGAGGAACAGTTCTTTGGCCCTGGCACCCGGCTGACAGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCAGTGTTCGAGCCTAGCGAGGCCGAGATCTCCCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGATTCTACCCCGACCATGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAATCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAGCCCGTGACTCAGATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGCGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTGA
配列番号５  ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲを含む短縮型ＰＤＥ７Ａのコーディング配列
MEVCYQLPVLPLDRPVPQHVLSRRGAISFSSSSALFGCPNPRQLSQRRGAISYDSSDQTALYIRMLGDVRVRSRAGFESERRGSHPYIDFRIFHSQSEIEVSVSARNIRRLLSFQRYLRSSRFFRGTAVSNSLNILDDDYNGQAKRAKRSGSGAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTILTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSGGTDSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGQGAYEEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*
配列番号６  ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲを含む短縮型ＰＤＥ７Ａ（下線）に対するアミノ酸配列
ATGGAAGTGTGCTACCAGCTGCCCGTGCTGCCCCTGGATAGACCTGTGCCTCAGCATGTGCTGAGCAGAAGAGGCGCCATCAGCTTCAGCAGCAGCTCCGCCCTGTTCGGCTGCCCCAATCCTAGACAGCTGAGCCAGAGAAGGGGAGCCATCTCCTACGACAGCAGCGACCAGACCGCCCTGTACATCAGAATGCTGGGCGACGTGCGCGTGCGGAGCAGAGCCGGATTTGAGAGCGAGAGAAGAGGCTCCCACCCCTACATCGACTTCCGGATCTTCCACAGCCAGAGCGAGATCGAGGTGTCCGTGTCCGCCCGGAACATCAGACGGCTGCTGAGCTTCCAGAGATACCTGAGAAGCAGCCGGTTCTTCCGGGGCACCGCCGTGTCCAACAGCCTGAACATCCTGGACGACGACTACAACGGCCAGGCCAAGCGGGCCAAGAGATCTGGAAGCGGAGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGATCTGCTGAAACTGGCCGGCGACGTGGAAAGCAACCCTGGCCCCATGGAAACACTGCTGGGACTGCTGATCCTGTGGCTGCAGCTGCAGTGGGTGTCCAGCAAGCAGGAGGTGACCCAGATCCCTGCCGCCCTGAGCGTGCCCGAGGGCGAGAACCTGGTGCTGAACTGCAGCTTCACCGACTCCGCCATCTACAACCTGCAGTGGTTCCGGCAGGACCCCGGCAAGGGCCTGACCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCAGCCAGCGGGAGCAGACCAGCGGACGGCTGAACGCCAGCCTGGACAAGAGCAGCGGCCGGAGCACCCTGTACATCGCCGCCAGCCAGCCCGGCGACAGCGCCACCTACCTGTGCGCTGTGCGGCCTCTGTACGGCGGCAGCTACATCCCCACCTTCGGCAGAGGCACCAGCCTGATCGTGCACCCCTACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGTCTGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAATGTGAGCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGAGCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACCTTCTTCCCCAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGAGCTTCGAGACCGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGCGGCTCCCGGGCCAAGAGAAGCGGATCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGAGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCTAGGATGAGCATCGGCCTGCTGTGCTGCGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCAGGACCCGTGAACGCCGGAGTGACCCAGAC
CCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTATCGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACTCTGTGGGAGCCGGAATCACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAATGTGAGCCGGAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGCGGCTGCTGAGCGCTGCCCCCAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGCAACACCGGCGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCTCCAGGCTGACCGTGCTGGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCCGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACACTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTCTACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGTCCTCCAGACTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCCGGTGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATTGTGAGCGCCGAGGCCTGGGGCAGGGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCTAA
配列番号７  ＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲを含む短縮型ＰＤＥ７Ａのコーディング配列
MEVCYQLPVLPLDRPVPQHVLSRRGAISFSSSSALFGCPNPRQLSQRRGAISYDSSDQTALYIRMLGDVRVRSRAGFESERRGSHPYIDFRIFHSQSEIEVSVSARNIRRLLSFQRYLRSSRFFRGTAVSNSLNILDDDYNGQAKRAKRSGSGAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMETLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPLYGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRMSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*
配列番号８  ＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲを含む短縮型ＰＤＥ７Ａ（下線）に対するアミノ酸配列
【図１Ａ】
2019528748.tif 000003
【図１Ｂ】
2019528748.tif 000004
【図２】
2019528748.tif 000005
【図３】
2019528748.tif 000006
【図４】
2019528748.tif 000007
【図５】
2019528748.tif 000008
【図６】
2019528748.tif 000009
【図７】
2019528748.tif 000010
【図８】
2019528748.tif 000011
【図９】
2019528748.tif 000012
【図１０】
2019528748.tif 000013
【配列表】
2019528748000001.app
【国際調査報告】
2019528748.tif 000014
2019528748.tif 000015
2019528748.tif 000016