(57)【要約】【課題】本発明の目的は、チェックポイント阻害剤をREIC/Dkk-3遺伝子と併用してがんを治療する方法を提供することである。【解決手段】本発明は、REIC/Dkk-3をチェックポイント阻害剤と組合せて含む、がん治療のための組合せ医薬キットであり、がん患者にREIC/Dkk-3およびチェックポイント阻害剤を投与することによるがんの治療方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
REIC/Dkk-3をチェックポイント阻害剤と組合せて含む、がん治療のための組合せ医薬キット。
【請求項２】
チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項１記載の組合せ医薬キット。
【請求項３】
REIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスベクターが含まれる、請求項１記載の組合せ医薬キット。
【請求項４】
がんが前立腺がんである、請求項１記載の組合せ医薬キット。
【請求項５】
がん患者にREIC/Dkk-3遺伝子およびチェックポイント阻害剤を投与することによるがんの治療方法。
【請求項６】
チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
REIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスベクターが含まれる、請求項５記載の方法。
【請求項８】
がんが前立腺がんである、請求項５記載の方法。
【請求項９】
がんを治療するために、REIC/Dkk-3とチェックポイント阻害剤を併用する方法。
【請求項１０】
チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
チェックポイント阻害剤が抗PD-L1抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
がんがPD-1およびPD-L1を細胞表面上で発現し、REIC/Dkk-3遺伝子に対して感受性になるように免疫系を操作するための、抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体の使用（REIC/Dkk-3誘導抗腫瘍免疫；REIC/Dkk-3により誘導されたCTL)。
【請求項１４】
がんを治療するための医薬の製造においてチェックポイント阻害剤とREIC/Dkk-3を併用する方法。
【請求項１５】
チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、REIC/Dkk-3遺伝子およびチェックポイント阻害剤を用いたがんを治療するための併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
REIC/Dkk-3遺伝子は細胞の不死化に関連していることが知られている。この遺伝子の発現はがん細胞で抑制されていることが報告されている。さらに、REIC/Dkk-3遺伝子ががん治療に用いられていることが報告されている（特許文献１）。
【０００３】
抗PD-1（Programmed cell death 1)抗体、抗PD-L1（Programmed cell-death ligand 1)抗体等のチェックポイント阻害剤は種々の悪性腫瘍に有用であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO01/038528
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、チェックポイント阻害剤をREIC/Dkk-3遺伝子と併用することによりがんを治療する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、REIC/Dkk-3とチェックポイント阻害剤の併用のがん治療に対する効果について検討を行った。
【０００７】
本発明者らは、REIC/Dkk-3とチェックポイント阻害剤の併用が全身的Ｔ細胞反応および抗腫瘍反応を促進することを見出した。このことはREIC/Dkk-3とチェックポイント阻害剤の併用ががんの治療に有用であることを示す。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  REIC/Dkk-3をチェックポイント阻害剤と組合せて含む、がん治療のための組合せ医薬キット。
[２]  チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、[１]の組合せ医薬キット。
[３]  REIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスベクターが含まれる、[１]の組合せ医薬キット。
[４]  がんが前立腺がんである、[１]の組合せ医薬キット。
[５]  がん患者にREIC/Dkk-3遺伝子およびチェックポイント阻害剤を投与することによるがんの治療方法。
[６]  チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、[５]の方法。
[７]  REIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスベクターが含まれる、[５]の方法。
[８]  がんが前立腺がんである、[５]の方法。
[９]  がんを治療するために、REIC/Dkk-3とチェックポイント阻害剤を併用する方法。
[１０]  チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、[９]の方法。
[１１]  チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体である、[９]の方法。
[１２]  チェックポイント阻害剤が抗PD-L1抗体である、[９]の方法。
[１３]  がんがPD-1およびPD-L1を細胞表面上で発現し、REIC/Dkk-3遺伝子に対して感受性になるように免疫系を操作するための、抗PD-1抗体および抗PD-L1抗体の使用（REIC/Dkk-3誘導抗腫瘍免疫；REIC/Dkk-3により誘導されたCTL)。
[１４]  がんを治療するための医薬の製造においてチェックポイント阻害剤とREIC/Dkk-3を併用する方法。
[１５]  チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、[１４]の方法。
【０００９】
本明細書は本願の優先権の基礎となる米国仮出願番号62/276,371の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１０】
REIC/Dkk-3遺伝子およびチェックポイント阻害剤はがん治療に相乗的効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ad-REIC/Dkk-3の構造の例を示す図である。
【図２】Ad-REIC/Dkk-3の配列を示す図である。
【図３】実施例の生存群の試験計画を示す図である。
【図４】腫瘍内MTG-201単独での治療、およびCTLA4およびPD-1に対する抗体を併用した治療後の腫瘍増殖を示す図である。
【図５】腫瘍内MTG-201単独での治療、およびCTLA4およびPD-1に対する抗体を併用した治療後の全生存を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の併用療法においては、REIC/Dkk-3遺伝子とチェックポイント阻害剤を組合せて用いる（併用する）。
【００１４】
チェックポイント阻害剤は抗PD-1(Programmed cell death 1)抗体、抗PD-L1(Programmed cell-death ligand 1)抗体等を含む。
【００１５】
REIC/Dkk-3 DNAの塩基配列は、配列表の配列番号１に表される。また、REIC/Dkk-3 DNAがコードするREIC/Dkk-3タンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に表される。配列番号１に表される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（NCBI)（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは少なくとも90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、特に好ましくは少なくとも97％以上の配列同一性を有しているDNAはREIC/Dkk-3 DNAに含まれる。
【００１６】
REIC/Dkk-3の断片ヌクレオチドも使用できる。配列番号１に表わされるREIC/Dkk-3 DNAの塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第117番目の塩基〜第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列を含むヌクレオチドの例は、1番目の塩基から117番目の塩基の範囲のポリヌクレオチド（配列番号３）および1番目の塩基から234番目の塩基の範囲のポリヌクレオチド（配列番号４）を含む。
【００１７】
REIC/Dkk-3遺伝子は、従来法により被験体に導入することができる。被験体に遺伝子を導入する方法として、ウイルスベクターを用いた方法および非ウイルスベクターを用いた方法が挙げられる。
【００１８】
REIC/Dkk-3遺伝子は、上記ウイルスを用いなくとも、プラスミドベクター等遺伝子発現ベクターを導入したリコンビナント発現ベクターを用いて、細胞または組織に導入することができる。
【００１９】
遺伝子導入に用いる代表的なウイルスベクターとして、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスが挙げられる。無毒化したレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免疫不全症ウイルス(HIV)等のDNAまたはRNAウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞をそのようなリコンビナントウイルスにより感染させることによって、細胞内に標的遺伝子を導入することが可能である。好ましくは、アデノウイルスベクターを用いる。
【００２０】
ベクターは、REIC/Dkk-3遺伝子を含むコンストラクトを含む。REIC/Dkk-3 DNAを含むコンストラクトは、適宜、プロモーター、遺伝子転写のためのエンハンサー、ポリAシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識および／または選別のためのマーカー遺伝子等を含んでいてもよい。この際のプロモーターとしては、公知のプロモーターを用いることができる。
【００２１】
該コンストラクトは、REIC/Dkk-3遺伝子と少なくとも１つの第１のプロモーターの下流に位置するポリA付加配列を含み、エンハンサーもしくは第２のプロモーターが該DNAコンストラクトの下流に連結した構造を有する。
【００２２】
プロモーターはDNAを鋳型に転写を開始するDNA上の特定の塩基配列であり、一般的に、共通の配列を持つ。例えば、大腸菌などの原核生物では、通常、転写開始部位の-10塩基対部位にTATAATG配列を、-35塩基対部位にTTGACA配列を持つ。また、真核生物では、通常、-20塩基対部位にTATAボックスを持つ。本発明の発現用カセットは、発現させようとする遺伝子の上流に必ず第１のプロモーターを有し、また発現させようとする遺伝子の下流に第２のプロモーターを有してもよい。これら第１のプロモーター及び第２のプロモーターとして用いるプロモーターは限定されず、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同じであっても異なっていてもよい。あらゆる細胞や組織で外来遺伝子の発現を促進させ得る非特異的プロモーターも組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等の特異的あるいは選択的プロモーターも用いることができる。例えば、第１のプロモーターとして特異的プロモーターを用いて、第２のプロモーターとして、非特異的なプロモーターを用いることができる。本発明において用いるプロモーターとして、癌または腫瘍特異的プロモーターとしてはhTERT（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、PSA（前立腺特異的抗原）、c-myc、GLUTプロモーターなどが、ES細胞・癌幹細胞特異的プロモーターとしてはOCT3/4、NANOGプロモーターなどが、神経幹細胞特異的プロモーターとしてはNestinプロモーターなどが、細胞ストレス感知プロモーターとしてはHSP70、HSP90、p53プロモーターなどが、肝細胞特異的プロモーターとしてはアルブミンプロモーターなどが、放射線感受性プロモーターとしてはTNF-alphaプロモーターなどが、感染プラスミドのコピー数を上げるプロモーターとしてはSV40プロモーターなどが、増殖性細胞特異的プロモーターとしてEF1-alphaプロモーターなどが挙げられる。さらに具体的には、例えば、第１のプロモーターとして、CMV-iプロモーター（hCMV + イントロンプロモーター）、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、第２のプロモーターとしてCMVプロモーター等が用いられる。βアクチンプロモーターの由来動物種は限定されず、哺乳類βアクチンプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーターやニワトリアクチンプロモーターが用いられる。また、上記のCMV-iプロモーター等の人工的なハイブリッドプロモーターを用いることもできる。CMV-iプロモーターは米国特許第5,168,062号明細書や米国特許第5,385,839号明細書の記載に基づいて合成することができる。プロモーターはプロモーター活性を有する最小配列からなるコアプロモーターの部分を用いてもよい。コアプロモーターとは、正確な転写開始を導く働きをもつプロモーター領域をいい、TATAボックスを含むことがある。上記のプロモーターのうち、hTERTプロモーター等の癌および／または腫瘍特異的プロモーターは、癌をターゲットとして遺伝子発現による遺伝子治療、癌診断用に好適に用いることができる。
【００２３】
ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）の由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列を発現用カセットに含ませることにより、転写効率が増大する。BGAポリA付加配列の塩基配列は配列番号５に示す塩基配列の13番目の塩基以降の配列に示される。
【００２４】
エンハンサーは、転写により生成するメッセンジャーRNA(mRNA)の量を結果的に増加させるものであれば限定されない。エンハンサーはプロモーターの作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、一般的には100bp前後からなるものが多い。エンハンサーは配列の向きにかかわらず転写を促進することができる。本発明で用いられるエンハンサーは１種類でもよいが、２つ以上の同一のエンハンサーを複数用いたり、又は異なる複数のエンハンサーを組み合わせて用いてもよい。また、異なる複数のエンハンサーを用いる場合、その順番は限定されない。例えば、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー、hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー等を用いることができる。一例として、hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したものが挙げられる。
【００２５】
さらに発現させようとするタンパク質をコードするDNA及びポリA付加配列を含むDNAコンストラクトの上流に複数のエンハンサー、例えば１〜４個のエンハンサーが連結されていてもよい。この上流に連結するエンハンサーは限定されないが、CMVエンハンサーが好ましい。例えば、CMVエンハンサーを４つ連結した４×CMVエンハンサー等があげられる。
【００２６】
エンハンサーを「プロモーター−発現させようとする遺伝子−poly A付加配列」からなるDNAコンストラクトのすぐ下流に挿入すると、従来の一般の遺伝子発現システムと比べて、強力な発現させようとする遺伝子のタンパク質発現が可能となる。
【００２７】
特に、CMV iプロモーターとCMVエンハンサーの組合せにより、ほぼ全ての細胞（宿主細胞）において、あらゆる遺伝子を挿入した場合に、如何なるトランスフェクション試薬を用いた場合においても、発現させようとする遺伝子の強力なタンパク質発現が可能となる。
【００２８】
さらに、RU5’が発現させようとするタンパク質をコードするDNAの直ぐ上流に連結されていてもよい。直ぐ上流とは、他の特定の機能を有するエレメントを介さず直接連結していることをいうが、リンカーとして短い配列が間に含まれていてもよい。RU5'はHTLV由来のLTRで、挿入することにより、タンパク質発現を上昇させるエレメントである（Mol.Cell.Biol.,Vol.8(1),p.466-472,1988）。RU5'を報告されているのと逆に挿入することにより、プロモーターのエンハンサー挿入による発現増強効果が打ち消されることがある。
【００２９】
さらに、エンハンサー及び／又はプロモーターの直ぐ上流にUASが連結されていてもよい。UASとは、GAL4遺伝子の結合領域であり、後にGAL4遺伝子を挿入することにより、タンパク質発現が上昇させられる。
【００３０】
さらに、発現用カセットの最上流にSV40-oriが連結されていてもよい。SV40-oriはSV40遺伝子の結合領域であり、SV40遺伝子を挿入することにより、タンパク質発現が上昇する。上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
【００３１】
上記DNAコンストラクトは、REIC/Dkk-3 DNAの上流にCMV（cytomegarovirus）プロモーターが連結され、REIC/Dkk-3 DNAの下流に、ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）が連結される。さらに、該ポリA付加配列の下流にhTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMV（cytomegarovirus）エンハンサーをこの順で連結したもの（３×enh)が連結されている。すなわち、上記DNAコンストラクトは、5'末端側から(i) CMVプロモーター、(ii) REIC/Dkk-3 DNA、(iii) polyA付加配列、並びに(iv) hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結したコンストラクトである。
【００３２】
本発明のREIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトのCMVプロモーターを除く部分の構造を図２に示し、配列を配列番号６に示す。図２中、REIC/Dkk-3 DNAと3×enhの間にBGA polyA配列が含まれる。本発明のREIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトは配列番号４に示す配列の上流（5'側）にCMVプロモーターを有する。配列番号７に上記コンストラクトに含まれるBGH poly Aと３つのエンハンサーを含む領域の塩基配列を示す。図２の塩基配列中の（１）及び（２）の枠で囲んだ部分は、それぞれREIC/Dkk-3タンパク質をコードするDNA及び３つのエンハンサー（3xenh)を示す。
【００３３】
上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
【００３４】
上記の発現用カセットは、例えば、市販のCMVプロモーターの下流に外来遺伝子挿入部位を含み、さらにその下流にBGA polyA配列を含むpShuttleベクター（Clonetech社）にREIC/Dkk-3 DNAを挿入し、さらにBGA polyA配列の下流にhTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結することにより得ることができる。
【００３５】
REIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトは、
[１]  5'末端側から、
(i) CMVプロモーター;
(ii) 以下のREIC/Dkk-3 DNA:
(a)  配列番号１に表される塩基配列からなるDNA、
(b)  配列番号１に表される塩基配列と少なくとも90％、95％、97％または98％の配列同一性を有するDNA、
(iii) polyA付加配列；並びに
(iv) hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサーおよびCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結した、REIC/Dkk-3 DNAを発現させるためのDNAコンストラクト。
[２]  polyA付加配列がウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列（BGA polyA)である、[１]のDNAコンストラクト。
[３]  配列番号６に示す、(ii) REIC/Dkk-3 DNA、(iii) polyA付加配列、および(iv) hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサーおよびCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結した塩基配列を含む、[１]または[２]のDNAコンストラクト。
【００３６】
DNAコンストラクトは、国際公開第WO2011/062298号、米国特許出願公開第2012-0309050号明細書、国際公開第WO2012/161352号および米国特許出願公開第2014-0147917号明細書の記載に従って、調製することができる。これらの刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【００３７】
本発明において、REIC/Dkk-3 DNAを含むアデノウイルスベクターを「Ad-REIC」または「Ad-REIC/Dkk-3」と呼ぶ。
【００３８】
本発明のDNAコンストラクトを含むベクターシステムをSGE(Super Gene Expression)システムと呼び、例えば、REIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトを含むアデノウイルスベクターをAd5-SGE-REIC/Dkk-3と呼ぶ。図１は、Ad-REIC/Dkk-3の構造を例示し、図２はAd-REIC/Dkk-3の配列を例示する。
【００３９】
上記のDNAコンストラクトを含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターに上記DNAコンストラクトを導入して組換えアデノウイルスを作製することにより得られる。アデノウイルスへのDNAコンストラクトの導入は、例えば上記の本発明のDNAコンストラクトを含むpShuttleベクター中のDNAコンストラクトをアデノウイルスに導入することにより行うことができる。
【００４０】
アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（10〜11PFU/mｌ以上）のウイルスが得られる、（４）in vivoの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。
【００４１】
遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、E1/E3領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター（Miyake,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,1320,1996）から、E1/E3領域に加え、E2もしくはE4領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター（Lieber,A.,et al.,J.Virol.,70,8944,1996;Mizuguchi,H.& Kay,M.A.,Hum.Gene Ther.,10,2013,1999）、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（GUTLESS）第３世代のアデノウイルスベクター（Steinwaerder,D.S.,et al.,J.Virol.,73,9303,1999）が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されずいずれのアデノウイルスベクターでも使用可能である。
【００４２】
本発明のREIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトを含む組換えアデノウイルスベクターをヒトやその他の哺乳動物である被験体に投与することにより、被験体の癌細胞に癌治療用遺伝子がデリバリーされ、癌細胞中で遺伝子が発現し、腫瘍細胞増殖を抑制し癌治療効果を発揮する。
【００４３】
本発明のアデノウイルスベクターは、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。特に、本発明のアデノウイルスベクターは特定の組織、細胞への指向性が大きく、標的遺伝子を効率的に特定の組織、細胞へデリバリーすることができるので、血管内投与によっても、効率的に診断、治療を行うことができる。
【００４４】
アデノウイルスベクターは、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。例えば、アデノウイルスベクターを、0.5×1011〜2.0×1012 viral genome／kg体重、好ましくは1.0×1011〜1.0×1012 viral genome／kg体重、さらに好ましくは1.0×1011〜5.0×1011 viral genome／kg体重の量で投与すればよい。viral genomeは、アデノウイルスのゲノムの分子数（ウイルス粒子数）を表し、particleということもある。すなわち、「ウイルスゲノム」という語は「ウイルス粒子(vp)」という語と同じである。
【００４５】
抗PD-1（Programmed cell death 1）抗体および抗PD-L1（Programmed cell-death ligand 1）抗体等のチェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントとして機能し、T細胞の活性化を妨げることによって免疫系をダウンレギュレートする。チェックポイント阻害剤の阻害効果は、リンパ節における抗原特異的T細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進し、制御性T細胞（Treg）のアポトーシスを減少させることによって達成される。
【００４６】
チェックポイント阻害剤は、公知の方法で投与することができる。例えば、投与量は、症状、年齢、体重および他の状態により変化する。0.001mg〜100mgの用量を数日、数週間または数ヶ月の間隔で、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射により、投与することができる。
【００４７】
アデノウイルスベクターまたはチェックポイント阻害剤は、製剤の分野で一般的に用いられる担体、希釈剤および賦形剤を含有する。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトース、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
【００４８】
REIC/Dkk-3遺伝子によってコードされるREIC/Dkk-3タンパク質は、抗がん免疫系をアップレギュレートすることによってがんを治療または予防することができる。さらに、がん細胞のアポトーシスを誘導する。具体的には、REIC/Dkk-3タンパク質はCTL（細胞傷害性Ｔリンパ球）を誘導し、CTLは全身のがん細胞を攻撃する。CTLによって攻撃されたがん細胞は防御機能を発揮し、がん細胞はPD-L1を発現する。チェックポイント阻害剤は、がん細胞の防御機能を阻害する。
【００４９】
REIC/Dkk-3遺伝子単独で、全身性のCD8 Ｔ細胞プライミングを促進する。さらに、REIC/Dkk-3遺伝子単独で、浸潤性のCD8 Ｔ細胞にPD-1を誘導し、そしておそらくは注射された微小環境においてPD-L1を誘導する。これは、CD8（および腫瘍特異的）Ｔ細胞の増殖を弱める働きをする。さらに、REIC/Dkk-3遺伝子単独で、より高いレベルのCD4記憶Ｔ細胞の疲弊を導く。REIC/Dkk-3遺伝子を抗PD-1または抗PD-L1と組合せると、全身性のＴ細胞反応および抗腫瘍反応が増強される。この組合せは、また、注射された腫瘍微小環境中にM2マクロファージを誘導し、その全体的な有効性を低下させ得る。制御性Ｔ細胞（Tregs）に特別な影響はなかった。
【００５０】
REIC/Dkk-3遺伝子は、治療効果を妨害する免疫抑制を誘導することができるが、PD-1遮断を伴う併用療法は、マウス前立腺がんにおける腫瘍阻害効果を促進することができる。併用療法（チェックポイント阻害剤とREIC/Dkk-3遺伝子）は、同側および反対側の両方の腫瘍においてSpas-1 + CD8細胞を促進することができる。しかし、併用療法は、Treg細胞に対しては最小限の効果を奏するのみであった。併用療法は免疫抑制を解消することができるが、腫瘍浸潤骨髄細胞を潜在的に補充または増加させる可能性がある。
【００５１】
REIC/Dkk-3遺伝子およびチェックポイント阻害剤は、がんの治療において相乗的効果を奏する。抗PD-1および抗PD-L1抗体は、がんがPD-1およびPD-L1を細胞表面上で発現し、REIC/Dkk-3遺伝子に対して感受性になるように免疫系を操作する（REIC/Dkk-3誘発抗腫瘍免疫; REIC/Dkk-3によって誘発されたCTL）。REIC/Dkk-3遺伝子とチェックポイント阻害剤の併用は、REIC/Dkk-3遺伝子単独またはチェックポイント阻害剤単独よりも癌の治療に有効である。
【００５２】
REIC/Dkk-3遺伝子は、チェックポイント阻害剤の投与と同時に、別々にまたは連続して投与することができる。REIC/Dkk-3遺伝子は、チェックポイント阻害剤の投与前または投与後に投与することもできる。好ましくは、REIC/Dkk-3遺伝子は、チェックポイント阻害剤の投与前に投与される。チェックポイント阻害剤を別々に投与する場合、チェックポイント阻害剤は、REIC/Dkk-3遺伝子の投与の1〜24時間前、1〜30日前または後に投与される。さらに、チェックポイント阻害剤は、REIC/Dkk-3遺伝子と同じ間隔で投与することができる。REIC/Dkk-3遺伝子を複数回投与する場合、チェックポイント阻害剤を1回投与する。あるいは、チェックポイント阻害剤複数回投与する場合、REIC/Dkk-3遺伝子を1回投与する。
【００５３】
治療対象となるがんとしては、限定されないが、例えば、前立腺がん、脳・神経腫瘍、皮膚がん、胃がん、肺がん、肝がん、リンパ腫・白血病、結腸がん、膵がん、肛門・直腸がん、食道がん、子宮がん、乳がん、副腎がん、腎がん、腎盂尿管がん、膀胱がん、尿道がん、陰茎がん、精巣がん、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。
【００５４】
本発明はまた、REIC/Dkk-3遺伝子およびチェックポイント阻害剤を含む組合せ、組合せ製剤または組合せ医薬キットを含む。
【００５５】
発明はまた、がんを治療するための医薬品の製造におけるREIC/Dkk-3とチェックポイント阻害剤とを組合せる方法を含む。
【００５６】
本発明はまた、REIC/Dkk-3およびチェックポイント阻害剤を含む医薬を含む。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５８】
マウス前立腺（TRAMP）モデルのトランスジェニック腺がんにおけるMTG-201とチェックポイント阻害剤（抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体および抗CTLA-4抗体）の組み合わせの有効性
【００５９】
1.  要約
この実施例の目的は、トランスジェニック腺がんマウス前立腺（TRAMP）モデルを用いて、3つのチェックポイント阻害剤、抗PD1抗体および抗CTLA-4抗体と併用したMTG-201（Ad5-SGE-REIC/Dkk-3）の潜在的な免疫学的効果および有効性を評価することである。この試験では、MTG-201の腫瘍内治療単独、ならびにCTLA4およびPD-1に対する抗体との併用における腫瘍増殖および全生存期間を評価した。
【００６０】
マウス当たり5×1010 vpの用量レベルでのMTG-201の単一の腫瘍内注射の後、他の治療群および対照と比較して、MTG-201 + 抗PD-1抗体群で腫瘍体積の統計的に有意な減少が認められ（p <0.01）、ad-LacZ単独の対照と比較して非常に有意な減少が認められた（p <0.001）。さらに、MTG-201 + 抗PD-1抗体で治療したマウスの全生存率は、他の治療群および対照と比較して有意に高かった（p <0.01-p <0.001）。
【００６１】
2.  序論
2.1.  試験の目的
この試験の目的は、トランスジェニック腺がんマウス前立腺（TRAMP）モデルを用いて、3つのチェックポイント阻害剤、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、および抗CTLA-4抗体と併用したMTG-201（Ad5-SGE-REIC/Dkk-3）の潜在的な免疫学的効果および有効性を評価することである。
【００６２】
3.  用量剤形および調製
3.1.  試験品とビヒクル
試験品、ビヒクルおよび使用した対照は以下のとおりである。
【００６３】
3.1.1  試験品
試験品名：MTG-201（Ad5-SGE-REIC/Dkk3）-標的細胞に感染するとREICタンパク質を産生するヒトトランスジーン（Dikkopf-3遺伝子）を含むウイルスベクター。
保管条件：冷凍（-60〜-90℃）
【００６４】
MTG-201（Ad5-SGE-REIC/Dkk3）は、国際公開第WO2011/062298号、米国特許出願公開第2012-0309050号明細書、国際公開第WO2012/161352号および米国特許出願公開第2014-0147917号明細書の記載に従って、調製することができる。
【００６５】
3.1.2  ビヒクル
ビヒクル名：トリス緩衝液/NaCl/pH8.0/2.5％グリセロール
【００６６】
3.1.3.  対照
対照名：Ad-LacZ（β-ガラクトシダーゼを発現するアデノウイルス）
保管条件：冷凍（-60〜-90℃）
【００６７】
4.  試験品の製剤化
4.1.  調製
試験品は冷凍で供給された。投与の日に、試験品を解凍し、投与まで最大6時間氷上に保持した。
【００６８】
4.2.  濃度
試験品の製剤濃度は、1mLあたりのウイルス粒子（vp）に基づいて計算した。純度は調整しない。投与前に、被験物質を冷生理食塩水で希釈して、所望の投与濃度を得た（表１）。試験品は濾過しなかった。使用前に各濃度について新鮮な製剤を調製した。
【００６９】
【表１】
2019501924.tif 000002
【００７０】
4.3.  保存
調製後、製剤を冷蔵保存（2〜8℃）または湿氷上で保存した。
【００７１】
4.4.  安定性
試験品は投与期間中安定であることを確認した。試験品は解凍から4時間以内に使用した。
【００７２】
5.  試験システム
5.1.  種、系統、サプライヤ
この試験で使用するために、Jackson Laboratoriesから86匹のオスのC57BL/6マウスを得た。試験に使用したマウスは78匹であった。
【００７３】
5.2.  仕様
マウスは到着時に8〜9週齢であった。8〜10週齢のマウスに腫瘍を注射する。マウスは、約20週齢のときに（腫瘍成長速度論に基づいて）MTGで治療した。
【００７４】
マウスの到着から3日以内に測定したところ、20〜30gであった。実際の範囲は変化しているかもしれないが、データとして記録した。
【００７５】
5.3.  飼育
マウスをケージあたり5匹入れた。温度および湿度は標準の室温と湿度に維持した。蛍光灯は、自動タイマーにより1日約12時間照射した。時には、暗サイクルが試験関連の活動のため断続的に中断された可能性がある。
【００７６】
水道水は、特段の指定がない限り、自動給水システムによりすべての動物に自由に与えられた。基本食はPicoLab（登録商標）マウスダイエット20、製品5058、カタログ番号0007689、Lab Diet（ミズーリ州セントルイス）であった。この食事は、特段の指定がない限り、自由に得られた。
【００７７】
5.4.  試験システムの正当性
マウスにおける前立腺がんを調べるために、前立腺特異的プロモーター下でのSV40ラージＴ抗原がんタンパク質の発現の結果として、トランスジェニック腺がんマウス前立腺（TRAMP）マウスから生じた前立腺腫瘍から同系移植可能な前立腺がん細胞株を確立した。 Fong博士のグループは、このモデルを利用して前立腺がんの免疫療法を試験している。これらの細胞株は、インビトロまたはインビボでSV40ラージＴ抗原を発現せず、免疫療法試験に適している。TRAMP細胞は、TRAMP細胞の同系宿主である雄の野生型C57BL/6マウスの背部の左右両側の皮下（2腫瘍/マウス;各腫瘍部位は5×105個の腫瘍細胞を含む）に注射した。次に、腫瘍の1つをAd-LacZまたはMTG-201のいずれかで治療した。特定の群では、Ad-LacZまたはMTG-2011による治療の3〜7日後に、2つのチェックポイント阻害剤（抗PD-1および抗CTLA-4マウス抗体）とMTG-201を併用して治療した。この試験では、腫瘍内MTG201治療単独で、ならびにCTLA4およびPD-1に対する抗体と併用したときの腫瘍増殖および全生存を評価した。抗CTLA-4および抗PD-1については、用量は200μg/マウスで、腹腔内（IP）である。
【００７８】
6.  試験設計
6.1.  異種移植モデル
生存群：TRAMP-C2細胞（5×105）をTRAMP細胞の同系宿主である雄の野生型C57BL/6マウスの背部皮下（1腫瘍/マウス）に注射した。
免疫応答群：TRAMP-C2細胞（5×105）を、TRAMP細胞の同系宿主である雄の野生型C57BL/6マウスの背部の左右両方に皮下（2腫瘍/マウス）注射した。
【００７９】
6.2.  群の割り当て
各前立腺腫瘍の容積は約150mm3に達した。腫瘍を保持しているマウスを無作為に対照群または治療群に割り当てた（表2および表3）。
【００８０】
【表２】
2019501924.tif 000003
【００８１】
生存群の試験計画を図３に示す。
【００８２】
【表３】
2019501924.tif 000004
【００８３】
6.3.  試験品とビヒクル投与
6.3.1.  用量レベルの正当化
用量レベルは、以前の研究から入手可能なデータに基づいて選択した。この用量レベルは、ラットおよびイヌにおける3つの他のGLP毒性試験によって裏付けられている。1件の試験（1718-003）においては、Ad-SGE-REIC/Dkk-3が含まれ、この試験で使用したのと同じ用量（5×1010vp/動物）で前立腺に注射した。他の2つの試験（1718-001および1718-002）は、REICタンパク質（Ad-CAG-REIC/Dkk-3）を産生する、プロモーター配列が異なる同様のウイルスベクターを用いて、同じ容量でラットに、1.0×1012vpの用量でイヌに対して行った。
【００８４】
6.3.1.  投与経路の正当性
腫瘍への注射は、ヒトへの意図された投与経路の1つである。
【００８５】
6.3.2.  投与
0日目に、腫瘍の1つを、Ad-LacZまたはMTG-201のいずれかの50μLの体積の腫瘍内への直接注射によって治療した。PBS緩衝液で0.05mL容量に調整したアデノウイルスベクター（Ad-LacZおよびMTG-201）の5×1010プラーク形成単位を腫瘍内に注射した。動物は、注射前にイソフルランで麻酔をかけた。
【００８６】
特定の群（表２および表３）では、マウスを抗CTLA-4マウス抗体で治療し、MTG-201と2つのチェックポイント阻害剤（抗PD-1および抗CTLA-4マウス抗体）のいずれかとをAd-LacZまたはMTG-201の治療の0日および7日後に併用した。
【００８７】
6.4.  試験の評価
6.4.1.  ケージサイドでの観察
マウスを週に3回モニタリングし、罹患率、死亡率、傷害および食物および水を利用できるかについて観察した。健康状態の悪い動物は、さらなるモニタリングおよび安楽死の可能性があることを確認した。
【００８８】
6.4.2.  腫瘍増殖の評価
腫瘍は、ノギスを使用して3〜4日毎に測定、記録し、腫瘍体積を式V = 0.52（L * W * W）、Vは体積、Lは長さ（長径）、Wは幅（短径）を用いて計算した。
【００８９】
6.5.  データ分析
指定された時間の個々のデータは、群平均値±標準誤差と共に報告される。
【００９０】
7.  統計
生データを各時間間隔内に集計し、平均および標準偏差を群ごとに各エンドポイントについて計算した。各エンドポイントについて、治療群を、対照群および他の治療群のそれぞれと、表４に概要を示す分析により比較した。
【００９１】
2つの群を比較すると、統計的分析のために対応のないスチューデントt検定が実施され、その差はp <0.05で有意であると考えられた。群間の比較のために、ポストホックボンフェローニ補正を用いた一元配置ANOVAを用いた。
【００９２】
【表４】
2019501924.tif 000005
【００９３】
エンドポイントは次のとおりであった。
実験1：腫瘍増殖および全生存。腫瘍が300mm3に達したマウスを安楽死させた。
【００９４】
群内の分散（平均二乗誤差またはMSE）の推定値を、ボンフェローニ補正を用いた一方向分散分析（ANOVA）から計算した。治療対対照の一対比較は、スチューデントのt検定を用いて行った。
【００９５】
すべての一対比較の結果は、0.05および0.01有意水準で報告された。別段の指示がない限り、両側検定を用いてすべてのエンドポイントを分析した。
【００９６】
8.  結果
8.1.  腫瘍増殖の評価
腫瘍内MTG-201治療単独およびCTLA4およびPD-1に対する抗体との併用後の腫瘍成長を評価した。図４にその結果を示す。図４において、白四角（□）は、同じマウスモデルを用いて同じ研究室により作製した抗PD-1（α-PD1）履歴データを示す。図４に示すように、MTG-201 + 抗PD-1群で見られた腫瘍体積は、他の治療群および対照群（p <0.01）と比較して統計的に有意に減少し、ad-LacZ単独の対照（p <0.001）と比較して非常に有意に減少した。さらに、抗PD-1単独群と比較して、MTG-201 + 抗PD-1群において、腫瘍体積は非常に有意に減少した。これらの結果は、MTG-201 + 抗PD-1が腫瘍増殖を阻害することを実証する。
【００９７】
8.2.  全生存
腫瘍内MTG-201治療単独およびCTLA4およびPD-1に対する抗体との併用での全生存を評価した。図５に示すように、MTG-201 + 抗PD-1群におけるマウスの全生存は、他の治療群および対照群と比較して有意に高かった（p <0.01-p <0.001）。これらの結果は、MTG-201 + 抗PD-1が生存利益をもたらすことを示唆している。
【００９８】
9.  結論
この研究では、腫瘍内MTG-201治療単独とCTLA4およびPD-1に対する抗体との併用における腫瘍増殖および全生存を評価した。
【００９９】
マウス当たり5×1010 vpの用量レベルでのMTG-201の単一の腫瘍内注射に続いて、MTG-201 + 抗PD-1群において、他の治療群および対照と比較して腫瘍体積の統計的に有意な減少があった（p <0.01）、また、ad-LacZ単独対照と比較して非常に有意な減少が認められた（p <0.001）。さらに、MTG-201 + 抗PD-1で治療したマウスの全生存は、他の治療群および対照と比較して有意に高かった（p <0.01-p <0.001）。
【０１００】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019501924.tif 000006
【図２】
2019501924.tif 000007
【図３】
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【図４】
2019501924.tif 000009
【図５】
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【配列表】
2019501924000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月18日(2018.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
REIC/Dkk-3遺伝子をチェックポイント阻害剤と組合せて含む、がん治療のための組合せ医薬キット。
【請求項２】
チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項１記載の組合せ医薬キット。
【請求項３】
REIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスベクターが含まれる、請求項１または２に記載の組合せ医薬キット。
【請求項４】
がんが前立腺がんである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組合せ医薬キット。
【請求項５】
REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含むチェックポイント阻害剤と併用される医薬。
【請求項６】
チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項５記載の医薬。
【請求項７】
REIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスベクターが含まれる、請求項５または６に記載の医薬。
【請求項８】
がんが前立腺がんである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
がんを治療するための医薬の製造においてチェックポイント阻害剤とREIC/Dkk-3遺伝子を併用する方法。
【請求項１０】
チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
がんが前立腺がんである、請求項９または１０に記載の方法。
【国際調査報告】
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