(57)【要約】  記載される発明は、１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に成体細胞を機能的に再プログラミングする方法を提供する。再プログラミングは、成体細胞と、臍帯血または末梢血に由来する血小板様細胞を含む血小板に富む画分とを接触させること、およびヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等であるインスリン産生細胞集団を生成する培養条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未熟細胞型を増殖させることによって達成される。理論によって制限されるものではないが、血小板様細胞およびその放出されるミトコンドリアは、免疫細胞の機能および分化を調節し得る免疫寛容関連マーカーを展示する。記載される発明はさらに、機能的に再プログラミングされた成体細胞に由来する治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を含む医薬組成物であって、インスリン産生細胞集団が、ヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、医薬組成物を提供する。
2019530438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成体細胞をインスリン産生細胞に機能的に再プログラミングする方法であって、
（ａ）ヒト対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を単離するステップ；
（ｂ）臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ；
（ｃ）接触がＰＢＭＣを、１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ（ａ）のＰＢＭＣの集団と、ステップ（ｂ）の血小板に富む画分とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ；および
（ｄ）インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、インスリン産生細胞集団を生成するのに有効な培養条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未熟細胞型を増殖させるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配画分からステップ（ａ）の成体ＰＢＭＣを単離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配画分から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
血小板様細胞を含む血小板に富む画分が、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの１つまたは複数を含む、血小板様細胞を含む血小板に富む画分が、転写因子、増殖因子、またはその両方を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
全細胞が、造血幹細胞、造血始原細胞、共通リンパ球始原細胞、共通骨髄始原細胞、巨核球−赤血球始原細胞、顆粒球−単球始原細胞、巨核球系列に決定された始原細胞、巨核球、および血小板様細胞のうちの１つまたは複数を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）に由来する１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する血小板様細胞が、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７０、ガレクチン９、ＴＧＦ−β１、ＡＩＲＥ、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＬ２のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
再プログラミングされた成体細胞が、神経細胞、内皮細胞、心筋細胞、筋細胞、上皮細胞、角膜内皮細胞、網膜色素細胞、破骨細胞、ケラチノサイト、毛嚢細胞、および腺細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞型を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
高血糖を特徴とする疾患に罹患するレシピエント対象を処置するための方法であって、
（ａ）ヒトドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を単離するステップ；
（ｂ）ドナーの臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ；
（ｃ）接触がＰＢＭＣを、１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ（ａ）のＰＢＭＣの集団と、ステップ（ｂ）の血小板に富む画分とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ；
（ｄ）インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を生成するのに有効な培養条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未熟細胞型を増殖させるステップ；および
（ｅ）ステップ（ｄ）に由来する細胞生成物をレシピエント対象に投与するステップ
を含み、
ステップ（ｄ）に由来する治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物が、高血糖症の症状を軽減するのに有効である、方法。
【請求項１０】
ドナーとレシピエント対象が同じ個体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
高血糖症が自己免疫疾患である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
自己免疫疾患が糖尿病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患が１型糖尿病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ドナーがレシピエント対象に対して同種異系である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）において、血小板様細胞を含む血小板に富む画分が、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの１つまたは複数を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ドナーの臍帯血または末梢血に由来する血小板様細胞を含む血小板に富む画分との接触により１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に機能的に再プログラミングされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖および再分化させた成体細胞に由来する治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を含む医薬組成物であって、インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子の発現を特徴とし、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等であり、
ステップ（ｃ）の１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する血小板に富む画分が、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７０、ガレクチン９、ＴＧＦ−β１、ＡＩＲＥ、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＬ２のうちの１つまたは複数について陽性であり、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＸＣＬ１について陰性である細胞の集団を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
細胞生成物が、
（ａ）ヒトドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を単離するステップ；
（ｂ）ドナーの臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ；
（ｃ）接触がＰＢＭＣを、１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ（ａ）のＰＢＭＣの集団と、ステップ（ｂ）の血小板に富む画分とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ；
（ｄ）インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を生成するのに有効な培養条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未熟細胞型を増殖させるステップ；および
（ｅ）細胞生成物を薬学的に許容される担体と共に製剤化して、医薬組成物を形成させるステップ
を含むプロセスによって産生され、
ステップ（ｄ）に由来する治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物が、高血糖を特徴とする疾患を有する対象に投与した場合、高血糖の症状を軽減するのに有効である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記プロセスのステップ（ｂ）において、血小板様細胞を含む血小板に富む画分が、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの１つまたは複数を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
機能的に再プログラミングされた成体細胞の集団が、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＸＣＬ１について陰性である、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７０、ガレクチン９、ＴＧＦ−β１、ＡＩＲＥ、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＬ２のうちの１つまたは複数を提示する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
機能的に再プログラミングされた細胞がインスリンを産生することができる、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、高血糖の対象への送達のために製剤化される薬剤の調製のための、ドナーの臍帯血または末梢血に由来する血小板様細胞を含む血小板に富む画分との接触により１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖および再分化させた成体ＰＢＭＣに由来する治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を含む医薬組成物の使用。
【請求項２２】
高血糖が、自己免疫疾患の結果生じ、治療量が、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
自己免疫疾患が１型糖尿病である、請求項２１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５２０，２４１号、および２０１６年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８０，９１３号の優先権の利益を主張し、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
記載される発明は、一般的には、機能的に改変された成体単核細胞を生成、単離および使用する方法に関する。記載される発明はまた、成体末梢血に由来するインスリン産生細胞を生成、単離、および使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞に基づく療法
組織工学および再生医療における適用のための幹細胞操作は、かなりの注目を集めてきた。
胚性幹細胞（ＥｍＳＣ）は、多能性である胚に由来する幹細胞である、すなわち、それらはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞型に分化することができる。胚性幹（ＥＳ）細胞は、その高い自己再生能力およびその多能性の分化能力のため魅力的であるが、倫理的な問題がその利用性および実用的な有用性を制限してきた。
【０００３】
成体（体細胞）幹細胞は、組織または臓器中の分化した細胞の中に見出される未分化細胞である。ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの主な役割は、それらが見出される組織を維持し、修復することである。成体幹細胞は、脳、骨髄、末梢血、血管、骨格筋、皮膚、歯、消化管、肝臓、卵巣上皮、および精巣などの多くの臓器および組織において同定されている。それらは幹細胞ニッチとして知られる、各組織の特定の局所微小環境に存在し、そこで、それらは、組織を維持するためのより多くの細胞の正常な要求、または疾患もしくは組織傷害によって活性化されるまで、長期間にわたって休止状態（非分裂性）のままであり得る。成体幹細胞の例としては、限定されるものではないが、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、および皮膚幹細胞が挙げられる。
骨髄は、造血細胞（成熟血液細胞の前駆体）および間質細胞（様々な結合組織細胞の前駆体）を含む様々な前駆体および成熟細胞型からなり、それらは両方とも他の細胞型に分化することができると考えられる。Wang, J. S. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 122: 699-705 (2001)；Tomita, S. et al., Circulation 100 (Suppl. II): 247-256 (1999)；Saito, T. et al., Tissue Eng. 1: 327-43 (1995)。
【０００４】
ＣＤ３４＋細胞は、骨髄由来有核細胞の約１％を占める。造血幹細胞（骨髄およびリンパ系細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｍ，Ｌ）、またはＣＤ３４＋細胞としても知られる）は、一生涯の血液細胞の継続的産生を担う造血臓器内の稀な多能性細胞である。ＣＤ３４抗原はまた、未熟な内皮細胞前駆体によって発現される；成熟内皮細胞はＣＤ３４＋を発現しない。Peichev, M. et al., Blood 95: 952-58 (2000)。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、成体骨髄に由来するＣＤ３４＋細胞は、顆粒球／マクロファージ始原細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）の大部分、一部の混合コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）および原始赤血球始原細胞（バースト形成単位、赤血球またはＢＦＵ−Ｅ）の小集団を生じさせる。Yeh, et al., Circulation 108: 2070-73 (2003)。
造血幹細胞によってのみ発現される単一の細胞表面マーカーは存在しないが、ヒトＨＳＣが以下の抗原性プロファイル：ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１＋（ＣＤ９０）、ＣＤ３８ｌｏｗ／−、Ｃ−ｋｉｔ−／ｌｏｗおよびｌｉｎ−を有することは一般的に受け入れられている。ＣＤ４５はまた、ＣＤ４５−である血小板および赤血球を除いて、ＨＳＣの一般的なマーカーでもある。ＨＳＣは、赤血球、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、肥満細胞、単球、組織マクロファージ、破骨細胞、Ｔリンパ球、およびＢリンパ球などの様々な細胞型を生成することができる。造血幹細胞の調節は、自己再生、生存および増殖、分化系列決定および分化を含む複雑なプロセスであり、固有の細胞プログラミングを含む多様な機構ならびに微小環境間質との接着相互作用およびサイトカインの作用などの外部刺激によって調整される。
【０００５】
様々なパラクリン因子が、造血幹細胞を特定の経路に沿って分化させるのに重要である。血液細胞およびリンパ球の形成に関与するパラクリン因子は、サイトカインと呼ばれる。サイトカインは、いくつかの細胞型によって作られ得るが、それらは造血の部位で間質（間葉）細胞の細胞外マトリックスによって収集および濃縮される。例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と多系列増殖因子ＩＬ−３は両方とも、骨髄間質のヘパラン硫酸グリコサミノグリカンに結合する。次いで、細胞外マトリックスは、これらの因子を、それらの受容体に結合するのに十分に高い濃度で幹細胞に提示する。
【０００６】
ＨＳＣは骨髄に存在するが、動員と呼ばれるプロセスによって血液中に強制的に送り込まれ得る。幹細胞動員は、幹細胞が骨髄から血流に出るように刺激されるプロセスであり、したがって、それらは将来の再輸液のための末梢血からの収集のために利用可能となる。主にＧ−ＣＳＦサイトカインの、診療所において使用される現在の動員戦略は、良好に許容されるが、収集されるＨＳＣ数は次善的であることが多い。骨髄ニッチ中のＨＳＣは、主に嫌気的代謝によってエネルギーを生成し、低レベルのＲＯＳを有し、その自己再生を促進する。しかしながら、一度、末梢血に動員されたら、その代謝状態は変化し、より高レベルのＲＯＳの産生をもたらし、細胞の分化を誘導する、老化を受ける、またはアポトーシスをもたらすことができる（Suda, T. et al, "Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche," Cell Devel. 2007; 134(14): 2541-7）。
動員および帰巣は、ケモカイン、ケモカイン受容体、細胞内シグナリング、接着分子およびプロテアーゼの間の相互作用に依存するミラープロセスである。骨髄への帰巣は、細胞生着を最適化するのに必須である。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２と、その受容体ＣＸＣＲ４との相互作用は、骨髄内のＨＳＣを保持するのに重要である（Suarez-Alvarez, B. et al, "mobilization and homing of hematopoietic stem cells," Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 741: 152-70)。
【０００７】
ヒト臍帯血は、いくつかの理由、例えば、（１）それが、体積単位あたりより多数の原始造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有し、骨髄よりも迅速に増殖すること；（２）移植後の拒絶のリスクがより低いこと；（３）移植が完全なＨＬＡ抗原一致を必要としないこと（骨髄の場合とは違う）；（４）ＵＣ血が先天性代謝異常の処置において既に成功裏に使用されていること；ならびに（５）そのような方法は長く確立されているため、ＵＣ血からの単核細胞の収集および保存のための新しい技術が必要ないことから、移植のための幹細胞の重要な供給源として長らく注目の的であった。
胚性分子マーカーを発現する幹細胞は、造血細胞の除去（全ての白血球共通抗原ＣＤ４５陽性細胞の欠失を含む）後の臍帯血から報告されている（McGuckin, CP, et al, "Production of stem cells with embryonic characteristics from human umbilical cord blood," Cell Prolif. 2005; 38: 245-55）。しかしながら、臍帯血中のこの細胞集団の不足は、その実際の適用を大きく制限する。
【０００８】
ある特定の条件下で、成体分化細胞は、分化転換によってその表現型を別の成熟細胞型のものに切換えることができる。分化転換は、細胞が密接に関連する系列に由来するか、または同じ胚性層に由来する場合、非常に容易である。例えば、膵臓と肝臓は両方とも内胚葉由来臓器であるため、系列特異的再プログラミング転写因子の適切なセットを使用して、肝細胞を膵臓ベータ細胞に、およびその逆に転換させることができる（Yi, F. et al, "Rejuvenating liver and pancreas through cell transdifferentiation," Cell Res. 2012; 22(4): 616-619）。
【０００９】
さらに、成体体細胞を、転写因子のセット、例えば、Ｏｃｔ−３／４（またはＰｏｕ５ｆ１、オクタマー転写因子−３／４）、Ｓｏｘファミリーの転写因子（例えば、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、およびＳｏｘ−１５）、Ｋｌｆファミリーの転写因子（Ｋｌｆ−１、Ｋｌｆ−２、Ｋｌｆ−４、およびＫｌｆ−５）、ならびにＭｙｃファミリーの転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、およびＬ−Ｍｙｃ）を強制的に発現させることにより、胚性幹細胞のような状態に入るように再プログラミングすることができる。
【００１０】
例えば、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、幹細胞マーカーを発現し、３つ全ての胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の特徴を有する細胞を生成することができる転写因子を発現するように再プログラミングされた細胞である。Takahashi et al （Hawkins, K. et al, "Cell signalling pathways underlying iPSc reprogramming," World J. Stem Cells 2014; 6(5): 620-28、Takahashi, K., Yamanaka, S., "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors," Cell 2006; 126: 663-76を引用する）により元々公開されたように、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃは、マウスおよびその後、ヒト線維芽細胞の両方においてゲノム組込みレトロウイルスを使用して構成的に発現され、ＥＳ細胞培養条件下で、多能性を誘導することができた。ｉＰＳ細胞は、エピソームプラスミド（同上、Yu, J. et al, "Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells," Science 2007; 318: 1917-20を引用）、センダイウイルス（同上、Fusaki, N. et al, "Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome," Proc. Jpn Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 2009; 85: 348-62を引用）、および再プログラミング因子を送達するためのトランスポゾン（同上、Wang, W. et al, "Rapid and efficient reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic acid receptor gamma and liver receptor homolog 2," Proc. Natl Acad. Sci. USA 2011; 108: 18283-288を引用）、ならびにさらにはタンパク質（同上、Zhou, H. et al, "Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins," Cell Stem Cell 2009; 4: 381-84を引用）または低分子（Hou, P. et al, "Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small molecule compounds," Science 2013; 341: 651-54）のみを使用して成功裏に生成されている。ウイルストランスフェクションの初期の必要性は、催奇形性および免疫原性に関する安全性への懸念を引き起こし、細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションは、患者において安定ではない場合がある。エピソームを使用する再プログラミングは、同じ懸念を引き起こす。同様に、化学的再プログラミングは、患者において安定ではない場合がある。
【００１１】
そうは言っても、多くの多様な細胞型が多能性に上手く再プログラミングされている（同上）。大抵、細胞を再プログラミングするのに必要な最小限の因子は、出発細胞の内因性の「幹細胞性」に依存する；例えば、神経幹細胞は高レベルの他の因子を発現するため、それらを、Ｏｃｔ４のみを使用して再プログラミングすることができる（同上、Kim, JB, et al, "Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells," Cell 2009; 136: 411-19を引用）。
【００１２】
ホメオドメイン転写因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇの「コア回路」は、マウスとヒトの両方のＥＳ細胞における多能性を支配する（同上、Chambers, I., Tomlinson, SR, "The transcriptional foundation of pluripotency," Development 2009; 136: 2311022を引用）。これらの転写因子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは胚盤胞の内部細胞塊中と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは多能性細胞中との両方において発現される。それらの密接な相互作用は、多能性状態を維持するのに必要なコア回路の正確な調節を容易にする；例えば、Ｏｃｔ４の過剰発現は、内胚葉および中胚葉の分化をもたらすが、Ｏｃｔ４の遮断は、トロホブラストの分化を誘導する（同上、Niwa, H. et al, "Quantitative expression of Oct3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells," Nat. Genet. 2000; 24: 372-76を引用）。低レベルのＯｃｔ４は、Ｎａｎｏｇの上方調節をもたらすが、高レベルのＯｃｔ４はＮａｎｏｇの下方調節をもたらす（同上、Loh, YH, et al, "The Oct4 and Nanog transcriptin network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells," Nat. Genet. 2006' 38: 431-440を引用）。同様に、Ｓｏｘ２発現の小さい増加またはＳｏｘ２発現の除去は両方とも、多系列分化を誘導する（同上、Klopp, JL et al, "Small increases in the level of Sox2 trigger the differentiation of mouse embryonic stem cells," Stem Cells 2008; 26: 903-11を引用）。３つ全ての因子が、互いの、ならびに自身の発現を調節することが示されている（同上、Boyer, LA et al, "Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells," Cell 2005; 122: 947-56；Loh, YH, et al, "The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells," Nat. Genet. 2006' 38: 431-440；Pan, G. et al, "A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal," FASEB J. 2006; 20: 1730-32を引用）。
【００１３】
ｉＰＳｃ再プログラミングの基礎となる細胞シグナリング経路
誘導多能性幹細胞再プログラミングは、３つの段階：初期化、成熟、および安定化からなる。Hawkins, K. et al, "Cell signalling pathways underlying iPSc reprogramming," World J. Stem Cells 2014; 6(5): 620-28、Samavarchi-Tehrani et al (36)を引用。
【００１４】
初期化段階は、体細胞遺伝子が、メチル化、細胞増殖の増加、酸化的リン酸化から解糖への代謝スイッチ、テロメラーゼ活性の再活性化および間葉上皮移行（ＭＥＴ）によって切換えられることを特徴とし（同上、David, L, and Polo, JM, "Phases of reprogramming," Stem Cell Res. 2014; 12: 754-61を引用）、運動性などの間葉系の特徴の喪失、ならびに細胞極性およびＥ−カドヘリンの発現などの上皮系の特徴の獲得を含む（同上、Redmer, T et al, "E-cadherin is crucial for embryonic stemcell pluripotency and can replace OCT4 during somatic cell reprogramming," EMBO Rep. 2011; 12: 720-26を引用）。機械的には、Ｓｏｘ２は、ＥＭＴの誘導因子であるＳｎａｉｌの発現を抑制し（同上、Liu, X et al, "Sequential introduction of reprogramming factors reveals a time-sensitive requirement for individual factors and a sequential EMT-MET mechanism for optimal reprogramming," Nat. Cell Biol. 2013; 15: 829-38を引用）、Ｋｌｆ４はＥ−カドヘリン発現を誘導し、かくして、ＭＥＴを促進する（同上、Li, R et al., "A mesenchymal-to-epithelial transition initiates and is required for the nuclear reprogramming of mouse fibroblasts," Cell Stem Cell 2010; 7: 51-63を引用）。ＴＧＦβ阻害は、マウス（同上、Maherali, N et al, "Tgfbeta signal inhibition cooperates in the induction of iPSCs and replaces Sox2 and cMyc," Curr. Biol. 2009; 19: 1718-23；Shi, Y. et al, "A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells," Cell Stem Cell 2008; 2: 525-28を引用）と、ヒトの再プログラミング（同上、Lin, T., et al, "A chemical platform for improved induction of human iPSCs," Nat. Methods 2009; 6: 805-808）の両方の初期化段階を増強することができ、組換えＴＧＦβの付加は、おそらくＴＧＦβシグナリングのＥＭＴ誘導作用のため、ｉＰＳ細胞形成を無効化し、次いで、ＭＥＴを防止する。ＴＧＦβ阻害剤は、Ｎａｎｏｇ発現を促進し、ＴＧＦβにより活性化される、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナリングは、中胚葉遺伝子の発現をさらに誘導する（同上、Thierry, JP, Sleeman, JP, "Complex networks orchestrate epitheial-mesenchymal transitions," Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 2006; 7: 131-42を引用）。したがって、ＭＥＴを促進するために、ＭＡＰＫシグナリングの阻害剤がＴＧＦβ阻害剤と共に使用されている（同上、Lin, T., et al, "A chemical platform for improved induction of human iPSCs," Nat. Methods 2009; 6: 805-808を引用）。
【００１５】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングも、Ｅ−カドヘリン、オクルジンおよび上皮細胞接着分子などの上皮遺伝子の上方調節を介してＭＥＴを促進することによってマウスｉＰＳ細胞再プログラミングの初期化段階において重要な役割を果たす（同上、Samavarchi-Tehrani, P. et al, "Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition In the initiation of somatic cell reprogramming," Cell Stem Cell 2010; 7: 64-77を引用）。しかしながら、構成的ＢＭＰ活性化は、ヒト体細胞再プログラミングを防止する。
【００１６】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナリングも、初期化段階に関与している（同上、Jiao, J. et al, "Promoting reprogramming by FGF2 reveals that the extracellular matrix is a barrier for reprogramming  fibroblasts to pluripotency," Stem Cells 2013; 31: 729-740を引用）。ＦＧＦ２は、細胞増殖の促進、ＭＥＴの容易化および細胞外コラーゲンの除去により再プログラミングの初期段階を促進することが示されている。増殖速度の増大に加えて、再プログラミングを上手く受ける少数の細胞も、トランスジーン発現によるアポトーシスおよび老化に対する耐性を示す（同上、Papp, B, "Reprogramming to pluripotency:  stepwise resetting of the epigenetic landscape," Cell Res. 2011; 21: 486-501を引用）。
【００１７】
初期化段階はまた、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリング（同上、Zhu, S. et al, "Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds," Cell Stem Cell 2010; 7: 651-55；Chen, M. et al, "Promotion of the induction of cell pluripotency through metabolic remodeling by thyroid hormone triiodothyronine-activated PI3K/AKT signal pathway," Biomaterials 2012; 33: 5514-23を引用）を含む、酸化的リン酸化から解糖への代謝スイッチを特徴とする（同上、Panopoulos, AD et al, "The metabolome of induced pluripotent stem cells reveals metabolic changes occurring in somatic cell reprogramming," Cell Res. 2012; 22: 168-77を引用）。
【００１８】
成熟段階の間に、Ｆｂｘｏ１５、Ｓａｌ４、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＥｓｒｒｂを含む、第１の多能性関連遺伝子の発現を可能にするエピジェネティック変化が起こる（同上、David, L, and Polo, JM, "Phases of reprogramming," Stem Cell Res. 2014; 12: 754-61を引用）。マウスｉＰＳ細胞再プログラミングの成熟段階のためには、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナリングが必要である（同上、Tang, Y and Tian, XC, "JAK-STAT3 and somatic cell reprogramming," JAK-STAT 2013; 2: e24935を引用）。Ｗｎｔシグナリングも、マウス体細胞再プログラミングの成熟段階を増強し、それによって、再プログラミングの誘導後にＷｎｔ３ａを使用する経路の外因性刺激は、Ｎａｎｏｇ陽性コロニーの形成を増強する（同上、Ho, R, et al, "Stage-specific regulation of reprogramming to induced pluripotent stem cells by Wnt signaling and T cell factor proteins," Cell Rep. 2013; 3: 2113-26を引用）。
安定化段階は、トランスジーンの独立性を特徴とする；したがって、活性化された内因性多能性遺伝子発現を有する細胞のみが、この後期段階で多能性を維持することができる。
【００１９】
血小板
大きい（直径５０〜１００μｍ）多核性（最大１２８Ｎ）巨核細胞（ＭＫ）から生成される無核の円盤状の細胞断片である血小板（トロンボサイト）は、恒常性（血管傷害の部位での失血の停止を意味する）および血管修復において中心的な役割を果たしている。Principles of Tissue Engineering, 4th Ed., Robert Lanza, Robert Langer, Joseph Vacanti, Eds, Elsevier, Inc.: New York, 2014 at 1047-1048。それらは、末梢血中で約３ｘ１０11細胞／リットルを占める、すなわち、ＲＢＣのものに次いで２番目である。血小板の生存期間は短く、循環中で７〜９日しか続かない。
【００２０】
血小板機能
一次恒常性は、血小板接着および同時的血小板活性化、近隣の血小板を活性化するための血小板分泌、血小板凝集、ならびに最終的には、血小板血栓の形成および凝固因子複合体の集合に適する表面の生成をもたらす受容体／リガンド相互作用の相乗的ネットワークによって達成される。Haley, KM et al, "Neonatal platelets:  mediators of primary hemostasis in the developing hemostatic system," Pediatr. Res. 2014; 76(3): 230-37。
血小板接着。血管傷害および付随する内皮損傷の後、一次恒常性のプロセスを開始させる血小板接着は、段階的様式での受容体／リガンド相互作用によって媒介される。同上。細胞外フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）−血小板糖タンパク質（ＧＰ）Ｉｂ結合は、傷害を受けた領域への初期血小板動員を媒介する。同上。血小板ＧＰＶＩは、線維状コラーゲンと相互作用し、血小板β１インテグリンは、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンと相互作用し、露出した細胞外マトリックスへの血小板の堅い接着を可能にする。同上。
【００２１】
血小板活性化。血小板接着の後、一連の下流シグナリング事象は、凝固因子の集合を可能にする、血小板膜表面上の負に荷電したホスファチジルセリン（ＰＳ）の曝露により示される、細胞内カルシウムの増加およびその後の血小板活性化；ＡＤＰ、カルシウム、セロトニン、ＶＷＦ、凝固因子ＶおよびＶＩＩＩ、ならびにフィブロネクチンの放出をもたらす、血小板アルファおよびデルタ顆粒分泌；ＶＷＦおよびフィブロネクチンの結合のための高親和性状態への血小板膜ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリンの転換；アラキドン酸代謝によるトロンボキサンＡ２生成；ならびに拡張血小板の表面積を増大させるための骨格筋再編成をもたらす。同上。
血小板凝集。安定な血小板凝集体の発生のための重要なステップは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の、その高親和性コンフォメーションへの転換である。同上。これは、受容体と、フィブリノゲン、ＶＷＦ、およびフィブロネクチンとの安定な相互作用を可能にする。血小板は一緒に凝集し、一次恒常性の最終産物である血小板血栓を形成する。
【００２２】
血小板マーカー
活性化前に血小板表面上に出現するマーカー。活性化前に血小板表面上に出現する血小板表面マーカーとしては、ＣＤ４１（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ）、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂ）、およびＣＤ６１（ａｖｂ３、ビトロネクチン受容体）が挙げられる。
インテグリンアルファ鎖２ｂ（ＣＤ４１）は、ジスルフィド結合により連結される２個のポリペプチド鎖をもたらす翻訳後改変を受けるヘテロ二量体内在性膜タンパク質である。ＣＤ４１は、血小板および巨核球ならびに初期胚性造血幹細胞上に発現される。ベータ３鎖（ＣＤ６１）インテグリンαＩＩＩｂβ３と会合したインテグリンアルファ鎖によって形成されるＣＤ４１／ＣＤ６１複合体は、フィブロネクチン、フィブリノゲン、フォン・ヴィレブランド因子、ビトロネクチンおよびトロンボスポンジンのための受容体であり、凝固において重要な役割を果たしている。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体（インテグリンαＩＩｂβ３）は、総表面タンパク質の約１５％を占める、最も豊富な細胞表面受容体（血小板１個あたり約８００００個）［Wagner CL, Mascelli MA, Neblock DS, Weisman HF, Coller BS, Jordan RE. Analysis of GPIIb/IIIa receptor number by quantitation of 7E3 binding to human platelets. Blood. 1996;88:907-914］の１つである［Jennings, LK, Phillips, DR, "Purification of glycoproteins IIb and III from human platelet plasma membranes and characterization of a calcium-dependent glycoprotein IIb-III complex. J Biol Chem. 1982;257:10458-10466］。休止中の血小板上で、この受容体はフォン・ヴィレブランド因子および血漿フィブリノゲンに対する最小限の結合親和性を示す［French, DL, Seligsohn, U, "Platelet Glycoprotein IIb/IIIa receptors and Glanzmann's throbasthenia," Arteriosclerosis, thrombosis and Vascular Biology 2000: 20: 607-610］。
ＣＤ４２ａ−ｄ複合体は、フォン・ヴィレブランド因子およびトロンビンのための受容体である。ＣＤ４２ａは、血小板糖タンパク質ＧＰＩＸ、ＧＰ９ａとも呼ばれる。ＣＤ４２ｂは、血小板ＧＰＩｂアルファ、または糖タンパク質１ｂ−アルファとも呼ばれる。
活性化中の血小板表面上に出現するマーカー。活性化中の血小板表面上に出現するマーカーの例としては、活性化されたＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）およびＣＤ６３が挙げられる。
【００２３】
活性化状態では、「インサイドアウト」シグナル伝達機構［Shattil SJ, Kashiwagi H, Pampori N. Integrin signaling: the platelet paradigm. Blood. 1998;91:2645-2657］が、接着糖タンパク質に結合し、血小板血栓を形成することができる高親和性リガンド結合状態へのＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａ受容体（インテグリンαＩＩｂβ３）のコンフォメーション変化を誘発する。
【００２４】
Ｐ−セレクチンは、白血球表面上のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）対抗受容体を介して単球および好中球への活性化血小板の初期接着を媒介する［Michelson, AD and Furman, MI, "Markers of Platelet Activation and Granule Secretion," in Contemporary Cardiology:  Platelet Function:  Assessment, Diagnosis and Treatment, M. Quinn and D. Fitzgerald, Eds, Humana Press, Towaco NJ: 2005］。それは、α顆粒分泌後の血小板表面膜上でのみ発現される休止血小板のα顆粒膜の成分である。同上。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、循環している脱顆粒化された血小板は、その表面Ｐ−セレクチンを急速に失うが、循環および機能し続ける。同上。血漿中の可溶性Ｐ−セレクチンは、内因性細胞起源のものであってもよい。同上。
【００２５】
可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血小板活性化の血漿マーカーである。同上。活性化された血小板によるｓＣＤ４０Ｌの放出は、血漿ｓＣＤ４０Ｌの主要な供給源である；ｓＣＤ４０Ｌの放出機構は、血小板表面ＣＤ４０Ｌのタンパク質分解である。同上。ｉｎ  ｖｉｖｏで循環するｓＣＤ４０Ｌの正確な測定には、血清よりも血漿中でのアッセイが必要である。同上。
リソソーム活性化膜タンパク質（ＣＤ６３）は、インテグリンと複合体を形成することが知られる細胞表面糖タンパク質である。それは、血液血小板活性化マーカーとして機能し得る。
血小板表面Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）は、α顆粒分泌後の血小板表面膜上でのみ発現される休止血小板のα顆粒膜の成分である。
【００２６】
巨核球産生および血小板産生
血小板の前駆体である巨核球（ＭＫ）は、血液系に対する血小板の定常的な供給源を提供し、それ自身、巨核球産生のプロセスによって産生される。ＲＢＣに関しては、ＭＫは、造血幹細胞（ＨＳＣ）の一般的な骨髄始原細胞（ＣＭＰ）への初期分化によって生成される（Kaushansky, K., "Historical Review:  megakaryopoiesis and thrombopoiesis," Blood 2008; 111(3): 981-86）。ＣＭＰの巨核球系列への進行的系列決定は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）によって主に調節される。系列決定された巨核球始原細胞であるコロニー形成単位−巨核球（ＣＦＵ−ＭＫ）は、増殖し、巨核球に分化する。同上。巨核球の成熟は、細胞表面マーカーＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＣＤ４１またはαＩＩｂ／βＩＩＩインテグリン受容体としても知られる）およびＧＰＩｂ／ＧＰＩＸ／ＧＰＶ受容体の発現の増加、ならびにα顆粒、濃密体、ならびにフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）および血小板因子−４のような血小板関連タンパク質の細胞質ゾル蓄積をもたらす細胞質量の実質的な増加を含む。同上。数回の核内分裂は、倍数化および最大１２８ＮのＤＮＡ含量を有する細胞をもたらす。同上。一度、倍数体ＭＫが産生されたら、「プロト血小板」と呼ばれるＭＫ体上での細胞プロセスが出現し始め、その最終的な断片化および放出は血小板の生成をもたらす。同上。
【００２７】
末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）およびＣＢに由来するＨＳＣはまた、巨核球および機能的血小板を産生することができる（Norol, F et al, Effects of cytokines on platelet production from blood and marrow CD34+ cells.  Blood 1998; 91(3); 830-43；Bruno, S. et al, In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells；rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica 2003; 88(4): 379-87；Ungerer, M et al, Generation of functional culture-derived platelets from CD34+ progenitor cells to study transgenes in the platelet environment; Cir. Res. 2004; 95(5): e36-44を参照されたい）。
【００２８】
巨核球産生の細胞起源
巨核球のみを含有する２つのコロニー形態が、半固形培地中で記載されている［Kaushansky, K., "Historical review:  megakaryopoiesis and thrombopoiesis, Blood 2001; 111(3): 981-86］。コロニー形成単位−巨核球（ＣＦＵ−ＭＫ）は、３〜５０個の成熟巨核球を含有する単純なコロニーに発達する細胞である；巨核球のサテライト集団を含み、最大で数百個の細胞を含有するより大きく、より複雑なコロニーは、バースト形成単位−巨核球（ＢＦＵ−ＭＫ）に由来する。同上。その増殖能力の差異のため、および赤血球始原細胞との類似性により、ＢＦＵ−ＭＫおよびＣＦＵ−ＭＫは、それぞれ、系列に限定される原始および成熟始原細胞であると考えられる。同上。その赤血球対応物と同様、ＣＦＵ−ＭＫに関するサイトカイン要件は単純である；トロンボポエチンは全てのＣＦＵ−ＭＫの７５％の増殖を刺激し、残りに関してはインターロイキン（ＩＬ）−３がトロンボポエチンと共に必要とされる。原始始原細胞からのより複雑で、より大きいＭＫコロニー形成に関しては、ＩＬ−３またはスチール因子（ＳＦ）がトロンボポエチンと共に必要とされる。
【００２９】
巨核球はまた、１つまたは複数のさらなる造血系列の細胞を含有するクローン性コロニー中でも発生する。最も原始的なｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコロニー形成細胞は、コロニー形成単位−顆粒球−赤血球−単球−巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、混合始原細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）、または一般的な骨髄始原細胞（ＣＭＰ；同上、Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 2000;404:193-19719を引用）と呼ばれ、この細胞に由来するコロニーは、いくらかの巨核球を含有することが多い。ＣＭＰの誘導体は、混合ＭＫ／赤血球始原細胞である（ＭＥＰ；同上、Nakorn TN, Miyamoto T, Weissman IL. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100:205-210を引用）。その精製前に、ＭＥＰの存在は、いくつかの共通の転写因子（ＳＣＬ、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＮＦ−Ｅ２）、細胞表面分子（ＴＥＲ１１９）、およびサイトカイン受容体（ＩＬ−３、ＳＦ、エリスロポエチン、およびトロンボポエチンのための）の発現を含む、赤血球および巨核球系列の細胞の多くの共通の特徴、ならびに多くの赤血球およびＭＫ白血病細胞株が、別の系列の特徴を示すか、または示すように誘導することができるという知見に基づいて主張されていた（同上、McDonald TP, Sullivan PS. Megakaryocytic and erythrocytic cell lines share a common precursor cell. Exp Hematol. 1993;21:1316-1320；Nakahata T, Okumura N. Cell surface antigen expression in human erythroid progenitors: erythroid and megakaryocytic markers. Leuk Lymphoma. 1994;13:401-409を引用）。さらに、造血サイトカインファミリーにおける２つの最も密接に関連するタンパク質である、これらの２つの系列の発生のほとんどを担うサイトカインであるエリスロポエチンおよびトロンボポエチン（同上、Lok S, Kaushansky K, Holly RD, et al. Cloning and expression of murine thrombopoietin cDNA and stimulation of platelet production in vivo. Nature. 1994;369:565-568を引用）は、両方の系列の始原細胞の増殖を刺激する際に相乗作用を示す（同上、Broudy VC, Lin NL, Kaushansky K. Thrombopoietin (c-mpl ligand) acts synergistically with erythropoietin, stem cell factor, and interleukin-11 to enhance murine megakaryocyte colony growth and increases megakaryocyte ploidy in vitro. Blood. 1995;85:1719-1726を引用）。
【００３０】
系列へのその系列決定を可能にする巨核球始原細胞により発現される転写因子としては、ＧＡＴＡ１、およびＦＯＧ２９が挙げられる。ＧＡＴＡ１は、５０ｋＤａの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質をコードするＸ連鎖遺伝子である（同上、Martin DI, Zon LI, Mutter G, Orkin SH. Expression of an erythroid transcription factor in megakaryocytic and mast cell lineages. Nature. 1990;344:444-447を引用）。転写因子の遺伝子除去は、造血におけるこの転写因子の重要な役割を確立した；ＧＡＴＡ１−／−状態は、赤血球産生の失敗のため胚性致死性であり（同上、Pevny L, Simon MC, Robertson E, et al. Erythroid differentiation in chimaeric mice blocked by a targeted mutation in the gene for transcription factor GATA-1. Nature. 1991;349:257-260を引用）、ＧＡＴＡ１の巨核球特異的除去は、巨核球異形成のため重症の血小板減少症をもたらす（同上、Shivdasani RA, Fujiwara Y, McDevitt MA, Orkin SH. A lineage-selective knockout establishes the critical role of transcription factor GATA-1 in megakaryocyte growth and platelet development. EMBO J. 1997;16:3965-3973を引用）。ＧＡＴＡ１は、ＤＮＡに結合することなく転写に影響する別のタンパク質であるＧＡＴＡの仲間（ＦＯＧ２９）と協調して作用する。
【００３１】
ｅｔｓファミリーの転写因子は、プリンボックス配列に結合する約３０種のメンバーを含み、積極的様式と拮抗作用的様式の両方で相互作用するタンパク質からなる。例えば、脾臓フォーカス形成ウイルス産物とのその関連に基づいて最初はＳｐｉ−１と呼ばれたＰＵ１は、赤血球分化を遮断するが、それは巨核球発生を支援する（同上、Doubeikovski A, Uzan G, Doubeikovski Z, et al. Thrombopoietin-induced expression of the glycoprotein IIb gene involves the transcription factor PU. 1/Spi-1 in UT7-Mpl cells. J Biol Chem. 1997;272:24300-24307を引用）。さらに、ｅｔｓ因子Ｆｌｉ−１は、巨核球産生にとって必須であり（同上、Athanasiou M, Clausen PA, Mavrothalassitis GJ, Zhang XK, Watson DK, Blair DG. Increased expression of the ETS-related transcription factor FLI-1/ERGB correlates with and can induce the megakaryocytic phenotype. Cell Growth Differ. 1996;7:1525-1534を引用）、転写因子の遺伝子領域中の変異は、ヒトにおける先天性血小板減少症と関連する（同上、Hart A, Melet F, Grossfeld P, et al. Fli-1 is required for murine vascular and megakaryocytic development and is hemizygously deleted in patients with thrombocytopenia. Immunity. 2000;13:167-177を引用）。
【００３２】
血小板産生
血小板産生は、トロンボサイト（血小板）の形成のプロセスである。分子レベルで、血小板産生は、膜および微小管の洗練された再編成ならびに顆粒およびオルガネラの正確な分布を含む、高度に協調的なプロセスである。血小板は、膜、オルガネラ、顆粒、および可溶性高分子のほぼ全ての細胞質補体を消費するプロセスにおける、前血小板と呼ばれる成熟巨核球膜仮足突起の断片化によって形成する（Kaushansky引用Patel SR, Hartwig JH, Italiano JE., Jr The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 2005;115:3348-3354）。それぞれの巨核球は、残りの核材料がマクロファージ媒介性食作用によって除去される（同上、Radley JM, Haller CJ. Fate of senescent megakaryocytes in the bone marrow. Br J Haematol. 1983;53:277-287を引用）前に、１０００〜３０００個の血小板を生じると見積もられている（同上、Stenberg PE, Levin J. Mechanisms of platelet production. Blood Cells. 1989;15:23-47を引用）。このプロセスは、プロセスの末端が分岐し、血小板を生じる高度に活発な運動プロセスの間に、アクチンおよびチューブリンを含む、巨核球膜および細胞骨格成分の大規模な再編成を含む（同上、Italiano JE, Jr, Lecine P, Shivdasani RA, Hartwig JH. Blood platelets are assembled principally at the ends of proplatelet processes produced by differentiated megakaryocytes. J Cell Biol. 1999;147:1299-1312を引用）。局所的アポトーシスは、アクチン細胞骨格の制約から前血小板プロセスの発生を潜在的に可能にすることによって、血小板形成の最終段階を開始させる役割を果たし得る（同上、Li J, Kuter DJ. The end is just the beginning: megakaryocyte apoptosis and platelet release. Int J Hematol. 2001;74:365-374；De Botton S, Sabri S, Daugas E, et al. Platelet formation is the consequence of caspase activation within megakaryocytes. Blood. 2002;100:1310-1317を引用）。前血小板成熟の最終段階中に、細胞質オルガネラおよび分泌顆粒は、前血小板プロセスの遠位端に移動し、そこで捕捉される（同上、Richardson JL, Shivdasani RA, Boers C, Hartwig JH, Italiano JE., Jr Mechanisms of organelle transport and capture along proplatelets during platelet production. Blood. 2005;106:4066-4075を引用）。互いの上を滑る微小管は、前血小板プロセスの伸長およびオルガネラ輸送を誘導するエンジンである（同上、Patel SR, Richardson JL, Schulze H, et al. Differential roles of microtubule assembly and sliding in proplatelet formation by megakaryocytes. Blood. 2005;106:4076-4085を引用）。トロンボポエチンは血小板産生の主な調節因子であるが、これらの遺伝子のそれぞれにおける欠陥は異常に大きいか、または小さい血小板をもたらすため、成熟血小板のサイズを決定するもの、または血小板形成の機構が転写因子ＧＡＴＡ１、糖タンパク質Ｉｂ／ＩＸ複合体、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）、および血小板ミオシンによってどのように影響されるかに関してはほとんど知られていない（同上、Geddis AE, Kaushansky K. Inherited thrombocytopenias: toward a molecular understanding of disorders of platelet production. Curr Opin Pediatr. 2004;16:15-22を引用）。血小板が生じる完全に成熟した巨核球の生成にとってトロンボポエチンが重要であるにもかかわらず、血小板形成の最終段階でのサイトカインの除去は有害ではない（同上、Choi ES, Nichol JL, Hokom MM, Hornkohl AC, Hunt P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 1995;85:402-413を引用）。
【００３３】
臍帯
２つの型の臍帯幹細胞、すなわち、造血幹細胞（ＵＣ−ＨＳ）および間葉系幹細胞を見出すことができ、順に、臍帯血（ＵＣ−ＭＳ）またはホウォートンゼリー（ＵＣ−ＭＭ）中に見出すことができる。
臍帯（ＵＣ）血管および周囲の間葉（ホウォートンゼリーとして知られる結合組織を含む）は、胚性および／または胚外中胚葉に由来する。かくして、これらの組織、ならびに原始胚細胞は、ＭＳＣおよび多能性を有するさらに一部の細胞を含有する、胚の原線の形成の時点で、近位胚盤葉上層から分化する。ＵＣマトリックス材料は、成体骨髄間葉に向かう遷移状態にある、原始的間葉に由来すると推測される（Mihu, C. et al., 2008, Romanian Journal of Morphology and Embryology, 2008, 49(4):441-446）。
【００３４】
血液の全ての正常な要素−赤血球、白血球、血小板および血漿を含有する、胎盤および臍帯に由来する血液は、抗凝固物質を含有する、通常の献血バッグ中に収集するのが比較的容易である。次いで、単核細胞を、密度勾配遠心分離によって分離する。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離において、抗凝固剤処理され、希釈された臍帯血を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液上に重ね、遠心分離する。遠心分離の間に、赤血球および顆粒球は下層に沈降する。臍帯血単核細胞および低密度のその他のゆっくりと沈降する粒子（例えば、血小板）は、血漿とＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅとの境界面に保持され、そこで、それらを収集することができる（Jaatinen, T., Laine, J. "Isolation of Mononuclear Cells from Human Cord Blood by Ficoll-Paque Density Gradient," Unit 2A, Curr. Protocols in Stem Cell Biol., DOI: 10.1002/9780470151808.sc02a01s1）。血小板増殖因子への境界面の細胞の曝露は、そのような細胞の機能的特性に影響する可能性を有する（Aghideh, AN et al, "Platelet growth factors suppress ex vivo expansion and enhance differentiation of umbilical cord blood CD133+ stem cells to megakaryocyte progenitor cells," Growth Factors 2010; 28(6): 409-16、Voss, et al, "Flow cytometric detection of platelet activation in patients undergoing diagnostic and interventional coronary angiography,"Platelets 1996; 7: 237-41 1996を引用；Gutensohn, K. et al, "Flow cytometric analysis of platelet membrane antigens during and after continuous flow plateletpheresis," Transfusion 1997: 37: 809-15；Gutensohn, K. "Alteration ofplatelet-associated membrane glycoproteins during extracorporeal apheresis of peripheral blood progenitor cells," J. Hematother. 1997; 6: 315-21；Stroncek, et al., "/composition of peripheral blood progenitor cell components collected from a healthy donors [sic]," Transfusion 1997; 37: 411-17；Stroncek, DF et al, "Collection of two peripheral blood stem cell concentrates from healthy donors," Transfus. Med. 1999; 9: 37-50；Bruserud, O et al, "Autologous stem cell transplantation as post-remission therapy in adult acute myelogenous leukemia: Does platelet contamination of peripheral blood mobilized stem cell grafts influence the risk of leukemia relapse?, J. Hematother. Stem cell Res. 2000; 9: 433-43；Saigo, K., et al., "RANTES and p-Selectin in peripheral blood stem," Ther. Apher. Dial. 2001; 5: 517-18）。
【００３５】
単核細胞画分は、２つの幹細胞集団：（１）ある特定の特徴マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ１３３）を発現する、造血幹細胞（ＨＳＣ）；および（２）ある特定の条件下で培養表面（例えば、改変ＭｃＣｏｙ培地およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む血管内壁）に接着することができる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む（Munn, D. et al., Science, 1998, 281: 1191-1193；Munn, D. et al., J Exp Med, 1999, 189: 1363-1372）。臍帯血ＭＳＣ（ＵＣ−ＭＳ）は、サイトカインを産生することができ、骨髄ＭＳＣと比較して、ドナーへの生着およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＳＣ生存を容易にする（Zhang, X et al., Biochem Biophys Res Commun, 2006, 351: 853-859）。
【００３６】
臍帯マトリックスに由来するＭＳＣ（ＵＣ−ＭＭ）は、細胞の供給源、例えば、結合マトリックスに由来する、臍帯静脈に由来する内皮細胞下の細胞に由来する、またはさらには全臍帯外植片に由来するＭＳＣに応じて異なる培養方法によって得られる。それらは一般的には、様々な栄養および増殖因子を補充した、ＤＭＥＭ培地中で良好に培養される；ある特定の場合、ヒアルロン酸で血管を事前に処理することが有益であることが証明されている（Baban, B. et al., J Reprod Immunol, 2004, 61: 67-77）。
ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）は、バースト形成単位および顆粒球−マクロファージコロニー形成単位のための標準的なクローン形成法において測定されるように、造血始原細胞に富む（Broxmeyer, HE et al, "Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hemopoietic stem/progenitor cells," Proc. Natl Acad. Sci. USA (1989) 86: 3828-3719を引用する、Cicuttini, FM and Boyd AW, "Hematopoietic and lymphoid progenitor cells in human umbilical cord blood," Devel. Immunol. 4: 1-11 (1994)）。
【００３７】
ヒト臍帯血のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養は、多能力（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）始原細胞を示した（同上、Leary, AG et al, "Single cell origin of multi-lineage colonies in culture.  Evidence that differentiation of multipotent progenitors and restriction of proliferative potential of monopotent progenitors ar stochastic processes," J. Clin. Invest. (1984); 74: 2193-97を引用）。また、一部のコロニーは、二次寒天培養中に再播種した場合、二次コロニーを形成する始原細胞を含有するが、これは、このコロニーが限定された自己再生特性を有する単一細胞から生じることを示唆している。臍帯血始原細胞の頻度（形成されるコロニー数／播種される細胞数）は、骨髄のものに等しいか、またはそれを超え、成体血液のものを大きく上回る。ＨＵＣＢに由来する始原細胞を、長期液体培養系で数週間にわたって維持することができるが、これは、より原始的な細胞からのそれらの産生を示唆している（同上、Salahuddin, SZ et al, "Long term suspension cultures of human cord blood myeloid cells," 1981; Blood 58:  931-38; Smith, S & Broxmeyer, HE; "The influence of oxygen tension on the long-term growth in vitro of hemopoietic progenitor cells from human cord blood," Brit. J. Haematol. (1986): 63: 29-34を引用）。
【００３８】
免疫枯渇、次いで、陽性ＦＡＣＳ選別によるＨＵＣＢからの高度に精製されたＣＤ３４＋始原細胞の精製は、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の１００倍を超える富化をもたらした。同上。臍帯血始原細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）および最適な増殖因子の存在下で増殖した臍帯血ＣＤ３４＋細胞が５０〜８０％の混合コロニー（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）をもたらしたという点で非常に初期の細胞に傾斜することが示されたが、これは、臍帯血中の幹細胞／始原細胞プールが非常に初期の始原細胞に偏っていることを示唆している。同上。
【００３９】
臍帯血Ｂ細胞
ヒト臍帯血は、成体末梢血と比較してプレＢおよびＢ細胞について富化されることが示されている。同上。プレＢ細胞の平均頻度は、成体血液中の０．２％と比較して、臍帯血中では総リンパ球の０．７％であることが示されている（同上、Okino, F, "Pre-B cells and B lymphocytes in human cord blood and adult peripheral blood," Acta Paediatr. Jpn (1987): 29: 195-201を引用）。臍帯血中のＢリンパ球の平均相対頻度もまたより高く、成体血液中の５．４％と比較して総リンパ球の１１．４％である（同上）。プレＢ細胞の絶対数に関して、臍帯血は成体血液中の１０倍の数を含有する。同上。
【００４０】
抗原ＣＤ１Ｃ、ＣＤ３８、ＣＤ５およびＣＤ２３は、臍帯血Ｂ細胞上で高度に発現されるが、通常、正常な成体中ではごく小さいパーセンテージの循環Ｂ細胞上で発現される。同上。新生児Ｂ細胞はおそらく機能的にはナイーブであるが、十分に強いＴ細胞ヘルプが利用可能である限り、成体Ｂ細胞のものに達する、刺激に関するそれらの固有の能力を実現することができることが示唆されている。同上。
【００４１】
臍帯血Ｔ細胞
一般に、臍帯血Ｔ細胞は、ヘルパー活性を相対的に有さない（同上、Anderson, U et al., Evidence for the ontogenic precedence of suppressor T cell functions in the human neonate," Eur. Immunol. 1983; 13: 6-13を引用）。ＣＤ２（全ての末梢血Ｔ細胞上で発現されるヒトＴリンパ球系列の表面抗原）、ＣＤ３（Ｔリンパ球マーカー）およびＣＤ８（サプレッサーおよび細胞傷害活性を有するＴ細胞のためのマーカー）を発現するリンパ球のパーセンテージは、成体血液中よりも臍帯血中で低い。同上。しかしながら、臍帯血中での白血球数の増加のため、ＣＤ２＋およびＣＤ８＋細胞の絶対数は同等である（同上、Gerli, R et al, Activation of cord T lymphocytes. I. Evidence for a defective T cell mitogens through the CD molecule," J. Immunol. 1989; 142: 2583-89を引用）。対照的に、臍帯血および成体末梢血中のＣＤ４＋細胞（ヘルパー／誘導Ｔ細胞）のパーセンテージは類似しているが、ＣＤ４＋細胞の絶対数は臍帯血中でより高い。同上。それにもかかわらず、臍帯血ＣＤ４＋細胞は、抗体産生のための助けを提供するその能力に欠陥がある。同上。
【００４２】
９０％を超える臍帯血ＣＤ４＋細胞が、高レベルのＣＤ４５ＲＡおよびＬ−セレクチン（Ｌｅｕ−８）を発現し（同上、Clement, LT et al, "Novel immunoregulatory functions of phenotypically distinct subpopulations of CD4+ cells in the human neonate," J. Immunol. (1990): 145: 102-108を引用）、低レベルのＣＤ４５ＲＯを有する（Sanders et al 1988を引用）。そのサイトカインプロファイルは、それらがナイーブなＴＨｐ細胞であることを示唆する。臍帯血ＣＤ４＋細胞の主要な免疫調節表現型は、大きく免疫抑制的であることが示されており、圧倒的多数のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋（およびＣＤ３８＋）細胞と一致している（同上、Tostato, GI et al, "B cell differentiation and immunoregulatory T cell function in human cord blood lymphocytes," 1980; J. Clin. Invest. 66: 383-880；Jacoby, DR and Oldstone, MBA, "Delineation of suppressor and helper activity within the OKTA4-defined T lymphocyte subset in human newborns," 1983; J. Immunol. 131: 1765-70；Clement, LT et al, "Novel immunoregulatory functions of phenotypically distinct subpopulations of CD4+ cells in the human neonate," J. Immunol. (1990): 145: 102-108を引用）。成体Ｂ細胞およびヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）、または抗ＣＤ４＋ｍＡｂと共に培養された臍帯血ＣＤ４＋細胞は、ヘルパー機能を示さなかった（Clement, LT  et al, "Novel immunoregulatory functions of phenotypically distinct subpopulations of CD4+ cells in the human neonate," J. Immunol. (1990): 145: 102-108）。しかしながら、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いる活性化およびＩＬ−２中での培養の後、臍帯血ＣＤ４＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞は、Ｂ細胞分化のための助けを提供する能力を獲得した。この機能的成熟は、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋表現型への転換を伴っていた。臍帯血中の少数のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を精製し、同様に分析した場合、成体ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−のものと同等のヘルパー活性が認められた。同上。このヘルパー機能は、さらに少数の臍帯血（成体ではなく）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の存在によって遮断された。臍帯血ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の照射またはマイトマイシンＣ処理は、その抑制活性を無効化したが、ヘルパー能力を誘導しなかった。系列決定されていない「ナイーブ」なＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞は、ヘルパー機能を行うことができるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−「記憶」細胞へのその想定された活性化依存的胸腺後分化と関連しない加齢関連成熟変化を受けることが提唱されている（同上）。
【００４３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、表面マーカーＣＤ１６およびＣＤ５６の相対的発現に基づいて異なる集団に細分することができる（Poli, A. et al, "CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cell subset," Immunol. 2009 Apr; 126(4): 458-65）。臍帯血ＮＫ細胞は異種性である。ＮＫマーカーＣＤ５７＋を担持する細胞は臍帯血中で無視できるほどのものである（Abo, T et al, "Post natal expansion of the natural killer and killer cell population in humans identified by the monoclonal HNK-1 antibody," J. Exp. Med. 1982; 155: 321-26を引用する、Cicuttini, FM and Boyd AW, "Hematopoietic and lymphoid progenitor cells in human umbilical cord blood," Devel. Immunol. 4: 1-11 (1994)）が、ＣＤ１６＋リンパ球の割合は、成体末梢血のものと等しい（同上、Tarakkanan, J and Saksela, E, "Umbilical cord blood-derived suppressor cells of the human natural killer cell activity are inhibited by interferon," Scand. J. Immunol. 1982; 15: 149-57；Perussia, B et al., "Human natural killer cells analyzed by B73.1, a monoclonal antibody blocking Fcreceptor function. I. Characterization of the lymphocyte subset reactive with B73.1," J. Immunol. 1983; 130: 2133-41を引用）。臍帯血細胞の自発的ＮＫ活性は、成体と比較して顕著に低下している。同上。ＣＤ７＋ＮＫ＋およびＣＤ７＋ＮＫ−集団は、ヒト臍帯血中のＮＫ細胞前駆体間で発生過程を表し、ＣＤ７＋ＮＫ−細胞は、臍帯血中で最も未熟なＮＫ前駆細胞のための候補であると考えられる。同上
【００４４】
造血幹細胞
造血幹細胞は、全ての血液細胞の共通の祖先である。造血幹細胞成熟は、造血細胞の２つの主要な分岐であるリンパ球および骨髄細胞系列の多様化を含む（Kondo, M. "Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors," Immunol. Rev. 2010 Nov; 238(1): 37-46）。リンパ球系細胞は、Ｔ、Ｂ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。骨髄細胞系列は、巨核球および赤血球（ＭｅｇＥ）ならびに骨髄細胞系列に属する、様々なサブセットの顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）、単球、マクロファージ、および肥満細胞（ＧＭ）を含む（同上、Kondo M, et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 2003;21:759-806、Weissman IL. Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and opportunities. Science (New York, NY. 2000 Feb 25;287(5457):1442-6を引用；また、Iwaskaki, H. and Akashi, K. "Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell,", Immunity 26(6) June 2007, 726-40も参照）。
【００４５】
リンパ球および骨髄細胞系列は、始原細胞レベルで分離可能である。共通リンパ球始原細胞（ＣＬＰ）は、生理的条件下で顕著な骨髄細胞能力がない全ての型のリンパ球に分化することができる（Kondo M, Scherer DC, Miyamoto T, King AG, Akashi K, Sugamura K, et al. Cell-fate conversion of lymphoid-committed progenitors by instructive actions of cytokines. Nature. 2000 Sep 21;407(6802):383-6）が、一部の骨髄関連遺伝子を、実験条件に応じて、ＣＬＰ中で検出することができる（Delogu A, Schebesta A, Sun Q, Aschenbrenner K, Perlot T, Busslinger M. Gene repression by Pax5 in B cells is essential for blood cell homeostasis and is reversed in plasma cells. Immunity. 2006 Mar;24(3):269-81）。
【００４６】
同様に、共通骨髄始原細胞（ＣＭＰ）は、Ｂ細胞能力がないか、またはそのレベルが非常に低い全てのクラスの骨髄細胞を生じることができる（Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 2000 Mar 9;404(6774):193-7）。別の細胞型である樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＬＰまたはＣＭＰのいずれかから生じ得るため、リンパ球系にも骨髄細胞系列にも明確に分類されていない（Manz MG, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL, Akashi K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 2001 Jun 1;97(11):3333-41、Traver D, Akashi K, Manz M, Merad M, Miyamoto T, Engleman EG, et al. Development of CD8alpha-positive dendritic cells from a common myeloid progenitor. Science (New York, NY. 2000 Dec 15;290(5499):2152-4）。
ＣＭＰは、巨核球−赤血球（ＭｅｇＥ）始原細胞および顆粒球−単球（ＧＭ）始原細胞に増殖および分化し、さらに、巨核球、赤血球、顆粒球、単球その他を生じることができる（Iwasaki H, Akashi K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 2007;26:726-740）。
【００４７】
単能性巨核球系列決定された始原細胞（ＭＫＰ）は、巨核球関連表面タンパク質であるＣＤ９によってＭＥＰの下流で単離されている。ＭＫＰは、表現型ＣＤ９＋ＩＬ−７Ｒα−Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１−ｃ−Ｋｉｔ＋Ｔｈｙ１．１−を有し、総骨髄細胞のわずか０．０１％を占める（Iwasaki H, Akashi K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 2007;26:726-740）。ＭＫＰは専ら様々なサイズの巨核球コロニーを生じる（同上、T.N. Nakorn, T. et al, Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 (2003), pp. 205-210を引用）。ＭＥＰは、８日目のＣＦＵ−Ｓ活性の大部分である；ＭＫＰはＣＦＵ−Ｓ活性を有さず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは巨核球のみを生成する。同上。
【００４８】
他の原始造血細胞と同様、両能性ＭＥＰは、小さいリンパ球と似ているが、特定のパターンの細胞表面タンパク質ディスプレイ、ＩＬ−７Ｒα−／Ｌｉｎ−／ｃ−Ｋｉｔ＋／Ｓｃａ−１−／ＣＤ３４−／ＦｃＲγｌｏによって識別することができる（Kaushansky, K., "Historical review:  megakaryopoiesis and thrombopoiesis," Blood 2008; 111(3): 981-86）。次いで、巨核球系列に系列決定された細胞は、ＣＤ４１およびＣＤ６１（インテグリンαＩＩｂβ３）、ＣＤ４２（糖タンパク質Ｉｂ）および糖タンパク質Ｖを発現し始める（同上、Hodohara K, et al., Stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) acts together with thrombopoietin to enhance the development of megakaryocytic progenitor cells (CFU-MK). Blood 2000;95:769-775；Roth GJ, et al., The platelet glycoprotein Ib-V-IX system: regulation of gene expression. Stem Cells 1996;14 Suppl 1:188-193を引用）。赤血球系列に系列決定されたものは、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）を発現し始め、それらが成熟するにつれて、それらはＣＤ４１発現を失うが、トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）、グリコフォリン、および最終的には、グロビンを発現する。同上。
ヒトコロニー形成性共通骨髄始原細胞（ＣＭＰ）およびその下流の子孫である顆粒球／マクロファージ（ＧＭＰ）および巨核球／赤血球始原細胞（ＭＥＰ）は、成体骨髄の系列陰性（ｌｉｎ−）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋画分ならびに臍帯血中に存在する。それらは、初期に作用する造血サイトカインの受容体であるＩＬ−３Ｒα鎖、およびサイトカインシグナリングの負の調節に関与するホスホチロシンホスファターゼのアイソフォームであるＣＤ４５ＲＡの発現によって識別可能である（Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877）。
【００４９】
ヒト成人骨髄から単離されたｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＩＬ−３ＲαloＣＤ４５ＲＡ＋細胞の７５％が、専らＣＦＵ−顆粒球、ＣＦＵ−マクロファージ、およびＣＦＵ−顆粒球／マクロファージを生じたが、ヒト成人骨髄から単離されたｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＩＬ−３Ｒα−ＣＤ４５ＲＡ−細胞の８７％がバースト形成単位赤血球、ＣＦＵ−巨核球、ＣＦＵ−巨核球／赤血球、および２つのＣＦＵ−顆粒球（０．５％）を産生した。規定のマウス始原細胞と同様、ＩＬ−３ＲαｌｏＣＤ４５ＲＡ＋細胞をＧＭＰと呼び、ＩＬ３Ｒα−ＣＤ４５ＲＡ−細胞をＭＥＰと呼んだ。様々なサイトカインの組合せと共にＳｙｓ−１間質細胞上で培養する際に、ＧＭＰとＭＥＰの両方の発生が、培養の７２時間後にＳＣＦ、ＩＬ−１１、ＦＬ、Ｅｐｏ、およびＴｐｏに関して達成された。ＩＬ−３ＲαｌｏＣＤ４５ＲＡ−細胞は、全ての型のコロニー（しかし、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を生じ、ＧＭＰは専ら、顆粒球／マクロファージコロニーを生じ、ＭＥＰは巨核球／赤血球コロニーならびに４つ（１．６％）の顆粒球およびマクロファージコロニーを生じた。したがって、ＣＭＰ集団であるＩＬ−３ＲαloＣＤ４５ＲＡ−細胞は、機能的なＧＭＰおよびＭＥＰを生じることができる（Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877）。
【００５０】
遺伝子発現プロファイル
顆粒球コロニー刺激因子受容体、Ｃ／ＥＢＰε、およびＭＰＯは、ＧＭＰによって発現され、ＭＥＰによって発現されなかったが、ＧＡＴＡ−１、ＥｐｏＲ、ｃ−ｍｐｌ、β−グロビン、およびフォン・ヴィレブランド因子はＭＥＰ中では検出されたが、ＧＭＰ中では検出されなかった。骨髄始原細胞はいずれも、リンパ球に系列決定されたｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０＋始原細胞中で発現されたＴｄＴ、ＧＡＴＡ−３、プレＴα、ＩＬ−７Ｒα、およびＰａｘ−５として、リンパ球発生において関連する検出可能なレベルの遺伝子を発現しなかった（Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877）。
【００５１】
類似する系列制限を有する骨髄始原細胞を、臍帯血中に見出すことができる。異なる表面マーカー発現プロファイルが成体骨髄と類似していたが、骨髄始原細胞集団のパーセンテージは、臍帯血中でわずかに異なっていた：ＩＬ−３ＲαloＣＤ４５ＲＡ−ＣＭＰが、臍帯血の単核細胞画分の約０．４％を占め、ＩＬ−３ＲαloＣＤ４５ＲＡ＋ＧＭＰが約０．３％を占め、ＩＬ−３Ｒα−ＣＤ４５ＲＡ＋ＭＥＰが約０．０５％を占める。ＨＳＣに富むｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞およびＣＭＰは、それぞれ、６８％および８３％のクローニング効率で全ての型のコロニーを形成した。ＧＭＰは専ら顆粒球／マクロファージコロニーを形成し（クローニング効率４１％）、ＭＥＰは巨核球／赤血球コロニーを形成し（クローニング効率８８％）、わずか４％の顆粒球／マクロファージコロニー読出しを示した（Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877）。
【００５２】
ＨＳＣのサブセットは、巨核球系列に限定されるとかつて考えられていた血小板関連ペプチドであるフォン・ヴィレブランド因子の遺伝子を発現することが示されている（Smith, BW, and Murphy, GJ, "Stem cells, megakaryocytes, and platelets," Curr. Opin. Hematol. 2014; 21(5): 430-37）。これらの細胞は、より高い転写レベルのＣ−ｍｐｌを産生し、巨核球系列決定のためにプライミングされる（同上、Sanjuan-Pla, A., et al, "Platelet-biased stem cells reside at the apex of haematopoietic stem-cell hierarchy, " Nature 2013; 502: 232-36を引用）。研究により、移植されたＨＳＣが骨内骨髄ニッチ内の隣接する巨核球に優先的に帰巣し、そこで、ＴＰＯがニッチ拡張を促進し（同上、Olson, TS, et al, "Megakaryocytes promote murine osteoblastic HSC niche expansion and stem cell engraftment after radio-ablative conditioning," Blood 2013; 121: 5238-49を引用）、成熟巨核球はサイトカインを放出して、ＨＳＣ増殖を促進する（Heazlewood, SY et al, "Megakaryocytes co-localise with hemopoietic stem cells and release cytokines that up-regulate stem cell proliferation," Stem Cell Res. 2013; 11:782-92）ことが示される。また、ＨＳＣの直接的な子孫であり得る骨髄限定始原細胞が、正常な造血の重要な中間体であると考えられる少能性始原細胞を完全に迂回することの証拠もある（Yamamoto, R. et l al, "Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells," Cell. 2013; 154: 1112-26）。この集団は、かつて考えられていたものよりも固定的であり、一過的でないＣＤ４１＋ＨＳＣに由来するものであってよい（Gekas, C. and Graf, T., "CD41 expression marks myeloid-biased adult hematopoietic stem cells and increases with age," Blood. 2013; 121: 4463-62）。
【００５３】
転写因子
Ｒｕｎｘ１、Ｇａｔａ１、Ｆｌｉ１およびｃＭｙｂを含む、複数の転写因子は、巨核球の分化を、正と負の両方で調節する複雑なネットワークを形成する（Geddis, A.E., "Megakaryopoiesis," Semin. Hematol. 2010; 47(3): 212-219）。Ｒｕｎｘ１は、Ｇａｔａ１およびＦｌｉ１を含むさらなる巨核球因子と相互作用する。Ｇａｔａ１およびそのコファクター、Ｇａｔａ１の仲間（Ｆｏｇ１）は、巨核球−赤血球分化の促進において重要であるが、同時に、Ｐｕ．１の発現および骨髄分化を阻害する（同上、Nerlov, C. et al, "GATA-1 interacts with the myeloid PU.1 transcription factor and represses PU.1-dependent transcription," Blood 2000; 95: 2543-51；Chou ST et al, "Graded repression of PU.1/SfpiI gene transcription by GATA factors regulates hematopoietic cell fate," Blood 2009; 114: 983-94を引用）。Ｇａｔａ１およびＦｌｌｉ１のための結合部位を、多くの巨核球特異的遺伝子のエンハンサー中に見出すことができ（同上、Eisbacher, M. et al, "Protein-protein interaction between Fli-1 and GATA-1 mediates synergistic expression of megakaryocyte-specific genes through cooperative DNA binding," Mol. Cell Biol. 2003; 23: 3427-41を引用）、Ｆｌｉ１は巨核球プロモーターでＧａｔａ１の活性を増強し、赤血球プロモーターで赤血球因子の活性を抑制する。かくして、Ｆｌｉ１発現は、ＭＥＰを巨核球系列に限定するように作用することができる。対照的に、ＭＥＭ中の癌原遺伝子ｃ−Ｍｙｂの発現は、赤血球産生を好み、ｃ−Ｍｙｂ発現は巨核球産生の間に下方調節される（Metcalf, D et al, "Anamaloous megakaryocytopoiesis in mice with mutations in the c-Myb gene," Blood 2005; 105: 3480-87）。
【００５４】
巨核球
臍帯血由来巨核球の複数の異なる細胞集団がフローサイトメトリーによって観察されており、同様の集団は巨核球Ｍｅｇ−０１細胞株においても観察された（Lindsay, C. et al, 2015; Blood 126(23): 4754）。最も大きい細胞（Ｐ１と呼ばれる）が最も豊富であり、培養物中で３日目に細胞のほぼ１００％を占めていた。Ｐ１よりも小さく、より顆粒状であるＰ２細胞は、６日目に出現し、１３日目までに全体の約５０％であった。Ｐ３は６日目に出現し、最も小さく、そのサイズおよび顆粒性は血小板と大まかに類似していた；１３日目までに、これらの細胞は全体の約３０％であった。Ｐ２でもＰ３でもないＰ１は、培養物中で１３日かけてＣＤ６１／ＣＤ４１／ＣＤ４２陽性およびＣＤ３４陰性になった。Ｐ２およびＰ３細胞の、それぞれ９７％および９３％が、ホスファチジルセリン（ＰＳ）陽性であったが、Ｐ１細胞の９３％がＰＳ陰性であった。ＰＳ陰性（Ｐ１）細胞は、電子顕微鏡により、大きいサイズ、ポリープ状核、ミトコンドリアおよび未熟顆粒などの、骨髄巨核球の多くの典型的な特徴を示したが、境界膜系はあまり発生していなかった。実質的に全てのＰＳ陽性Ｐ２細胞がアポトーシス性であり、顆粒を欠き、識別できる核を有さなかった。Ｐ１はＰ２およびＰ３集団の両方を生じるが、Ｐ２は他の集団を生じないことがわかった。コラーゲン関連ペプチド、トロンビン、プロテアーゼ活性化受容体１活性化ペプチド（ＰＡＲ１−ＡＰ）およびＰＡＲ４−ＡＰを用いるＰ１、Ｐ２およびＰ３集団の刺激は、Ｐ１細胞中での強力なインテグリン活性化を示したが、Ｐ２またはＰ３細胞中では示さなかった。かくして、ほんの一部の臍帯血由来巨核球が機能的である。
【００５５】
増殖因子
増殖因子は、増殖、分化、または他の細胞応答を誘導する、細胞内シグナリング経路を誘発する細胞表面受容体に結合する細胞外ポリペプチド分子である。これらの経路は、タンパク質および他の高分子の蓄積を刺激し、それらは、その合成速度を増大させることと、その分解速度を低下させることの両方によってそうする。
【００５６】
血小板α顆粒は、血小板によって活発に分泌される、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＢＤＧＦ−ＡＢ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、およびインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含むいくつかの異なる増殖因子を含有する（Martieau, I., et al, "Effects of calcium and thrombin on growth factor release from platelet concentrates:  kinetics and regulation of endothelial cell proliferation," Biomaterials 2004; 25: 4489-4502を引用する、Aghideh, AN et al, "Platelet growth factors suppress ex vivo expansion and enhance differentiation of umbilical cord blood CD133+ stem cells to megakaryocyte progenitor cells," Growth Factors 2010; 28(6): 409-16）。巨核球は、アルファ顆粒中に、巨核球産生および造血幹細胞調節の負の調節因子である血小板因子（ＰＦ４）を発現し、貯蔵する（Lambert, MP et al, "Intramedullary megakaryocytes internalize released platelet factor 4 and store it in alpha granules," J. Thromb. Haemost. 2015; 13(10): 1888-99）。
【００５７】
トロンボポエチン
複数の増殖因子が巨核球産生を支援し、その最も重要なものは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）としても知られる、巨核球増殖および発生因子（ＭＧＤＦ）である。巨核球発生および血小板産生の主要な調節因子であり、血小板産生の強力な刺激因子であるトロンボポエチンは、Ｍｐｌ受容体のリガンドである（Muench, M. and Barcena, A., "Megakaryocyte Growth and Development Factor is a Potent Growth Factor for Primitive Hematopoietic Progenitors in the Human Fetus," Ped. Res. 2004; 55(6): 1050-56）。それは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、巨核球産生および巨核球倍数性の増加を刺激することができ、造血に対する広範囲の活性を有し（同上、Kaushansky, K. "Thrombopoietin: the primary regulator of platelet production," 1995; Blood 86: 419-311, 2; Kuter, DJ et al, 2002 Blood; 100: 3457-69を引用)、多能性造血始原細胞および幹細胞の増殖を支援する（同上）。
【００５８】
ＴＰＯは、特に、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、増殖ホルモンおよび白血病阻止因子を含む、４重らせん束ファミリーのサイトカインに属する（Geddis, A.E., "Megakaryyopoiesis," Semin. Hematol. 2010; 47(3): 212-219）。ＴＰＯ受容体ｃ−Ｍｐｌは、マウス骨髄増殖性白血病ウイルスのトランスフォーミング因子としてその時点で既に公知であった、癌遺伝子ｖ−Ｍｐｌとのその相同性に基づいて同定された（同上、Vigon I, et al. Molecular cloning and characterization of MPL, the human homolog of the v-mpl oncogene: identification of a member of the hematopoietic growth factor receptor superfamily. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:5640-5644を引用）。ＴＰＯおよびｃ−Ｍｐｌは、巨核球の増殖および発生にとって重要であり、その一方または他方が存在しないマウスモデルにおいては、血小板および巨核球は正常値の約１０％に減少する（Gurney AL, et al. Thrombocytopenia in c-mpl-deficient mice. Science. 1994;265:1445-1447；Bunting S, et al. Normal platelets and megakaryocytes are produced in vivo in the absence of thrombopoietin. Blood. 1997;90:3423-3429）。巨核球に加えて、ＨＳＣもｃ−Ｍｐｌを発現し、その維持および拡張のためにＴＰＯシグナリングに依存する（同上、Fox N, et al, Thrombopoietin expands hematopoietic stem cells after transplantation. J Clin Invest. 2002;110:389-394を引用）。
【００５９】
ｃ−Ｍｐｌ遺伝子は、２５アミノ酸のシグナルペプチド（１〜２５）、４６５アミノ酸の細胞外ドメイン（２６〜４９１）、２２残基の膜貫通ドメイン（４９２〜５１３）ならびにボックス１（５２８〜５３６）およびボックス２（５６５〜５７４）と呼ばれる２個の保存されたモチーフを含有する細胞内ドメインからなる６３５アミノ酸のタンパク質をコードする。細胞外ドメインは、２個の反復モジュールから構成される；膜遠位モジュールは、その欠失が受容体の構成的活性化をもたらすため、シグナリングに対する阻害効果を有すると考えられる（同上、Sabath DF, Kaushansky K, Broudy VC. Deletion of the extracellular membrane-distal cytokine receptor homology module of Mpl results in constitutive cell growth and loss of thrombopoietin binding. Blood. 1999;94:365-367を引用）。ｃ−Ｍｐｌは、内在性キナーゼ活性を有さないが、その代わりに、そのボックス１ドメインを介して細胞質チロシンキナーゼＪａｎｕｓキナーゼ２（Ｊａｋ２）と会合する（同上、Drachman JG, Kaushansky K. Structure and function of the cytokine receptor superfamily. Curr Opin Hematol. 1995;2:22-28を引用）。さらなるエレメントは、ＴＰＯ結合後に受容体内在化およびその後の分解を調節する。これらのものとしては、ボックス２内に位置するジロイシンリピート、Ｔｙｒ５９１およびＴｙｒ６２５が挙げられる（同上、Dahlen DD, et al., Internalization of the thrombopoietin receptor is regulated by 2 cytoplasmic motifs. Blood. 2003;102:102-108；Hitchcock IS, et al, YRRL motifs in the cytoplasmic domain of the thrombopoietin receptor regulate receptor internalization and degradation. Blood. 2008を引用）。
【００６０】
ＴＰＯシグナリングは、Ｊａｋ２の活性化に依存する。Ｊａｋ２は、そのＦＥＲＭ（バンド４．１／エズリン／ラジキシン／モエシン）ドメインを介してｃ−Ｍｐｌのボックス１と会合する。エリスロポエチン受容体のＸ線結晶研究（同上、Livnah O, et al,  Crystallographic evidence for preformed dimers of erythropoietin receptor before ligand activation. Science. 1999;283:987-990を引用）に基づくと、非リガンド化状態では、ｃ−Ｍｐｌはホモ二量体として存在し、ＴＰＯ結合は受容体の細胞質尾部をより近い位置に架橋するコンフォメーション変化をもたらすと考えられる。結果として、受容体と会合したＪａｋ２分子は、互いに十分近くに位置し、トランス自己リン酸化によって活性化されるようになる（同上、Witthuhn BA, Quelle FW, Silvennoinen O, Yi T, Tang B, Miura O, et al. JAK2 associates with the erythropoietin receptor and is tyrosine phosphorylated and activated following stimulation with erythropoietin. Cell. 1993;74:227-236を引用）。次いで、活性Ｊａｋ２は複数の残基上で自身をリン酸化し、少なくともＴｙｒ６２５およびＴｙｒ６３０上でｃ−Ｍｐｌをリン酸化する（同上、Drachman JG, Kaushansky K. Dissecting the thrombopoietin receptor: functional elements of the Mpl cytoplasmic domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:2350-2355を引用）。これらのホスホチロシン残基は、受容体シグナリングを調節するｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン含有シグナリングタンパク質のためのドッキング部位を提供する。
【００６１】
Ｊａｋ２の活性化後、複数のシグナリング分子が活性化され、ＴＰＯに対する細胞応答を媒介する。これらのものは、シグナル伝達因子および転写の活性化因子（ＳＴＡＴ）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）およびホスホイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路のメンバーを含む（同上、Geddis AE, et al, Thrombopoietin: a pan-hematopoietic cytokine. Cytokine Growth Factor Rev. 2002;13:61-73を引用）。Ｊａｋ２は、ＳＴＡＴ１、３、５ａおよび５ｂを含むＳＴＡＴファミリーメンバーを直接リン酸化する（同上、Schulze H, et al., Thrombopoietin induces the generation of distinct Stat1, Stat3, Stat5a and Stat5b homo- and heterodimeric complexes with different kinetics in human platelets. Exp Hematol. 2000;28:294-304を引用）。一度リン酸化されたら、これらのＳＴＡＴタンパク質は二量体化し、細胞の核に移行し、そこでそれらはｐ２１（同上、Matsumura I, et al. Thrombopoietin-induced differentiation of a human megakaryoblastic leukemia cell line, CMK, involves transcriptional activation of p21(WAF1/Cip1) by STAT5. Mol Cell Biol. 1997;17:2933-2943を引用）、Ｂｃｌ−ｘＬ（同上、Kirito K, et al, Thrombopoietin regulates Bcl-xL gene expression through Stat5 and phosphatidylinositol 3-kinase activation pathways. J Biol Chem. 2002;277:8329-8337を引用）およびサイクリンＤ１（同上、Magne S, et al, STAT5 and Oct-1 form a stable complex that modulates cyclin D1 expression. Mol Cell Biol. 2003;23:8934-8945を引用）などの遺伝子内のＳＴＡＴ応答性転写エレメントに結合することができる。Ｊａｋ２／ＳＴＡＴ経路の構成的活性化は、骨髄増殖性障害におけるＪａｋ２変異体の発見、リンパ球性白血病におけるＪａｋ２を含む転座、および白血病細胞株における構成的に活性なＳＴＡＴ５によって証明されたように、サイトカイン非依存的増殖をもたらし、形質転換に寄与することができる（同上、Harir N, et al. Constitutive activation of Stat5 promotes its cytoplasmic localization and association with PI3-kinase in myeloid leukemias. Blood. 2007;109:1678-1686；Najfeld V, et al, Numerical gain and structural rearrangements of JAK2, identified by FISH, characterize both JAK2617V>F-positive and -negative patients with Ph-negative MPD, myelodysplasia, and B-lymphoid neoplasms. Exp Hematol. 2007;35:1668-1676を引用）。
【００６２】
Ｊａｋ２はまた、小さいＧＴＰａｓｅ  ＲａｓおよびＭＡＰＫカスケードも活性化し、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）１／２の活性化で終わる。複数の研究が、巨核球分化におけるＴＰＯ誘導性ＭＡＰＫシグナリングの重要性を示している（同上、Rouyez MC, et al, Control of thrombopoietin-induced megakaryocytic differentiation by the mitogen-activated protein kinase pathway. Mol Cell Biol. 1997;17:4991-5000；Rojnuckarin P, et al,  Thrombopoietin-induced activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway in normal megakaryocytes: role in endomitosis. Blood. 1999;94:1273-1282；Fichelson S, et al. Megakaryocyte growth and development factor-induced proliferation and differentiation are regulated by the mitogen-activated protein kinase pathway in primitive cord blood hematopoietic progenitors. Blood. 1999;94:1601-1613を引用）。ＴＰＯシグナリングがＲａｓを活性化すると考えられる古典的経路は、アダプタータンパク質Ｓｈｃの、リン酸化されたｃ−Ｍｐｌ  Ｔｙｒ６２５への結合（同上、Drachman JG, Kaushansky K. Dissecting the thrombopoietin receptor: functional elements of the Mpl cytoplasmic domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:2350-2355；Miyakawa Y, et al. Recombinant thrombopoietin induces rapid protein tyrosine phosphorylation of Janus kinase 2 and Shc in human blood platelets. Blood. 1995;86:23-27を引用）ならびにアダプタータンパク質Ｇｒｂ２およびグアニンヌクレオチド交換因子ＳＯＳを含有する複合体の集合（同上、Alexander WS, et al, Tyrosine-599 of the c-Mpl receptor is required for Shc phosphorylation and the induction of cellular differentiation. Embo J. 1996;15:6531-6540；Skolnik EY, et al. The function of GRB2 in linking the insulin receptor to Ras signaling pathways. Science. 1993;260:1953-1955を引用）に依存する。次いで、Ｒａｓは、Ｒａｆ−１、マイトジェン誘導性細胞外キナーゼ（ＭＥＫ）および最終的にはＥｒｋ１／２を活性化する（同上、Avruch J, et al. Ras activation of the Raf kinase: tyrosine kinase recruitment of the MAP kinase cascade. Recent Prog Horm Res. 2001;56:127-155を引用）。ＭＡＰＫの活性化はｃ−Ｍｐｌ  Ｔｙｒ６２５およびＴｙｒ６３０の非存在下では有意に減少するが、消失はしない（同上、Luoh SM, et al. Role of the distal half of the c-Mpl intracellular domain in control of platelet production by thrombopoietin in vivo. Mol Cell Biol. 2000;20:507-515を引用）が、これはＥｒｋ１／２の活性化は、Ｓｈｃ非依存的機構によって、おそらく、Ｊａｋ２に動員されたＧｒｂ２／Ｓｏｓ複合体によって媒介され得ることを示唆している（同上、Brizzi MF, et al,  Discrete protein interactions with the Grb2/c-Cbl complex in SCF- and TPO-mediated myeloid cell proliferation. Oncogene. 1996;13:2067-2076を引用）。あるいは、小さいＧＴＰａｓｅ  Ｒａｐ１は、Ｒａｓとは関係なくＢ−ＲａｆによってＥｒｋ１／２を活性化することができる（同上、Garcia J, et al,  Thrombopoietin-mediated sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in UT7-Mpl cells requires both Ras-Raf-1- and Rap1-B-Raf-dependent pathways. Mol Cell Biol. 2001;21:2659-2670を引用）。
【００６３】
ＰＩ３Ｋ経路も、巨核球産生にとって必須である（同上、Geddis AE, Fox NE, Kaushansky K. Phosphatidylinositol 3-kinase is necessary but not sufficient for thrombopoietin-induced proliferation in engineered Mpl-bearing cell lines as well as in primary megakaryocytic progenitors. J Biol Chem. 2001;276:34473-34479を引用）。ＰＩ３Ｋは、キナーゼ（ｐ１１０）と調節サブユニット（ｐ８５）とから構成される。ＴＰＯは、リン酸化されたｐ８５とアダプターＧａｂとの複合体の形成を誘導するが、この複合体がｃ−Ｍｐｌに直接結合することは見出されていない（同上、Miyakawa Y, et al,  Thrombopoietin induces phosphoinositol 3-kinase activation through SHP2, Gab, and insulin receptor substrate proteins in BAF3 cells and primary murine megakaryocytes. J Biol Chem. 2001;276:2494-2502を引用）；あるいは、ＰＩ３Ｋは、Ｒａｓを介して間接的に活性化されるようになってもよい（同上、Kodaki T, et al,  The activation of phosphatidylinositol 3-kinase by Ras. Curr Biol. 1994;4:798-806を引用）。ＴＰＯにより誘導されたＰＩ３Ｋは、セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔをリン酸化および活性化し、その基質はＦｏｒｋｈｅａｄ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ−３β）およびＢａｄを含み（同上、Geddis AE, Fox NE, Kaushansky K. Phosphatidylinositol 3-kinase is necessary but not sufficient for thrombopoietin-induced proliferation in engineered Mpl-bearing cell lines as well as in primary megakaryocytic progenitors. J Biol Chem. 2001;276:34473-34479；Nakao T, et al, PI3K/Akt/FOXO3a pathway contributes to thrombopoietin-induced proliferation of primary megakaryocytes in vitro and in vivo via modulation of p27(Kip1) Cell Cycle. 2007;7；Soda M, et al, Inhibition of GSK-3beta promotes survival and proliferation of megakaryocytic cells through a beta-catenin-independent pathway. Cell Signal. 2008;20:2317-2323を引用）、集合的に、巨核球の生存および増殖を促進する。ＰＩ３Ｋはまた、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）を活性化し、その標的ＳＫ６および４Ｅ−ＢＰ１は、巨核球始原細胞の増殖および成熟を増加させる（同上、Raslova H, et al. Mammalian target of rapamycin (mTOR) regulates both proliferation of megakaryocyte progenitors and late stages of megakaryocyte differentiation. Blood. 2006;107:2303-2310；Guerriero R, et al. Inhibition of TPO-induced MEK or mTOR activity induces opposite effects on the ploidy of human differentiating megakaryocytes. J Cell Sci. 2006;119:744-752を引用）。ＰＩ３Ｋはそれ自体、造血幹細胞（ＨＳＣ）における休止を促進する腫瘍抑制因子である、ホスファターゼおよびテンシン相同体（ＰＴＥＮ）によって負に調節される（同上、Zhang J, et al. PTEN maintains haematopoietic stem cells and acts in lineage choice and leukaemia prevention. Nature. 2006;441:518-522を引用）。ＰＴＥＮはＡｋｔおよびｍＴＯＲの活性を調節するが、ＴＰＯシグナリングおよび巨核球産生におけるその役割は未だ定義されていない。
【００６４】
恒常性バランスを維持するためには、ＴＰＯシグナリングおよび巨核球産生に関する調査が必要である。シグナルが適切に終結することを確保するために、多くの正の調節因子がそれ自身の阻害因子をも誘導する。例えば、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ経路の活性化は、サイトカインシグナリングの抑制因子（ＳＯＣＳ）ファミリーのメンバーの転写を誘導する（同上、Starr R, et al. A family of cytokine-inducible inhibitors of signalling. Nature. 1997;387:917-921；Endo TA, et al. A new protein containing an SH2 domain that inhibits JAK kinases. Nature. 1997;387:921-924を引用）。このファミリーは、Ｊａｋの活性化ループへの結合およびその分解への標的化、Ｊａｋのための偽基質としての作用、またはサイトカイン受容体自体の中でのリン酸化されたチロシンへの結合を含む、様々な様式でＪａｋシグナリングを阻害することができる少なくとも８つのメンバーを含む（同上、Alexander WS, Hilton DJ. The role of suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins in regulation of the immune response. Annu Rev Immunol. 2004;22:503-529を引用）。ある受容体からのＳＯＣＳ応答の誘導は、別の受容体を負に調節し、それによって、サイトカインクロストークの機構を提供することができる；これは、インターフェロン−αによる巨核球の処理がＳＯＣＳ１を誘導し、次いで、Ｊａｋ２の阻害によってＴＰＯシグナリングを下方調節するという知見によって実証される（同上、Wang Q, Miyakawa Y, Fox N, Kaushansky K. Interferon-alpha directly represses megakaryopoiesis by inhibiting thrombopoietin-induced signaling through induction of SOCS-1. Blood. 2000;96:2093-2099を引用）。
【００６５】
Ｊａｋ２は、その活性を調節する他の結合パートナーを有する。例えば、Ｌｎｋは、ＨＳＣ、赤血球および巨核球における増殖を阻害するアダプタータンパク質である（同上、Tong W, Lodish HF. Lnk inhibits Tpo-mpl signaling and Tpo-mediated megakaryocytopoiesis. J Exp Med. 2004;200:569-580；Seita J, et al. Lnk negatively regulates self-renewal of hematopoietic stem cells by modifying thrombopoietin-mediated signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:2349-2354を引用）。Ｌｎｋは、そのＳＨ２ドメインを介してＪａｋ２内のリン酸化されたチロシンに結合する（同上、Bersenev A, et al, Lnk controls mouse hematopoietic stem cell self-renewal and quiescence through direct interactions with JAK2. J Clin Invest. 2008;118:2832-2844を引用）；しかしながら、それがＴＰＯシグナリングを阻害する正確な機構は理解されていない。負の調節因子に結合するだけでなく、Ｊａｋ２をＦＥＲＭドメイン内でリン酸化し、ｃ−Ｍｐｌからのその解離を誘導し、かくして、シグナリングの「スイッチを切る」別の機構を提供することができる（同上、Funakoshi-Tago M, et al, Receptor specific downregulation of cytokine signaling by autophosphorylation in the FERM domain of Jak2. Embo J. 2006;25:4763-4772を引用）。
【００６６】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む一部の細胞外シグナルタンパク質は、増殖因子とマイトジェンの両方として作用し、細胞増殖と細胞周期進行の両方を刺激することができる。この機能的重複は、部分的には、これらの２つのプロセスを制御する細胞内シグナリング経路における重複によって達成される。例えば、シグナリングタンパク質Ｒａｓは、増殖因子とマイトジェンの両方によって活性化される。それは、ＰＩ３−キナーゼ経路を刺激して、細胞増殖を促進し、ＭＡＰ−キナーゼ経路を刺激して、細胞周期進行を誘発することができる。同様に、Ｍｙｃは細胞増殖と細胞周期進行の両方を刺激する。増殖因子とマイトジェンの両方として作用する細胞外因子は、細胞が増殖する際にその適切なサイズを確実に維持するのを助ける。
【００６７】
多くのマイトジェン、増殖因子、および生存因子は、細胞周期進行、細胞増殖、および細胞生存の正の調節因子であるため、それらは臓器および生物のサイズを増大させる傾向がある。しかしながら、一部の組織では、細胞および組織のサイズは、正の調節因子を阻害し、それによって、臓器増殖を阻害する阻害的細胞外シグナルタンパク質によっても影響される。最もよく理解されている阻害的シグナルタンパク質は、ＴＧＦ−βおよびその関連物である。ＴＧＦ−βは、Ｇ１において細胞周期進行を遮断することにより、またはアポトーシスを刺激することにより、いくつかの細胞型の増殖を阻害する。ＴＧＦ−βは、細胞表面受容体に結合し、Ｓｍａｄと呼ばれる遺伝子調節タンパク質の活性の変化をもたらす細胞内シグナリング経路を開始させる。これは、細胞分裂および細胞死の調節因子をコードする遺伝子の転写の複雑な変化をもたらす。
ＴＧＦ−βファミリーメンバーである骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、マウス足における発生中の指の間の組織を除去するアポトーシスを誘発するのを助ける。ＴＧＦ−βと同様、ＢＭＰは細胞死を調節する遺伝子の転写の変化を刺激する。
【００６８】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーは現在、１２種を超える構造的に関連するメンバーを有する。ＦＧＦ１は、酸性ＦＧＦとしても公知である；ＦＧＦ２は塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）と呼ばれることもある；ＦＧＦ７は、ケラチノサイト増殖因子の名称で通ることもある。１２種を超える異なるＦＧＦ遺伝子が、脊椎動物において公知である；それらは異なる組織においてそのＲＮＡスプライシングまたは開始コドンを変化させることによって数百個のタンパク質アイソフォームを生成することができる。ＦＧＦは、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）と呼ばれる受容体チロシンキナーゼのセットを活性化することができる。受容体チロシンキナーゼは、細胞膜を通って伸長するタンパク質である。パラクリン因子に結合するタンパク質の部分は細胞外側にあるが、休眠チロシンキナーゼ（すなわち、ＡＴＰを分割することによって別のタンパク質をリン酸化することができるタンパク質）は細胞内側にある。ＦＧＦ受容体がＦＧＦに結合する場合（およびそれがＦＧＦに結合する場合のみ）、休眠キナーゼは活性化され、応答する細胞内のある特定のタンパク質をリン酸化し、これらのタンパク質を活性化する。
ＦＧＦは、血管新生（血管形成）、中胚葉形成、および軸索伸長などのいくつかの発生機能と関連する。ＦＧＦは互いに置き換わってもよいことが多いが、その発現パターンは、それらに別々の機能を与える。ＦＧＦ２は血管新生において特に重要であるが、ＦＧＦ８は中脳および手足の発生に関与する。
ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦｍ、アンギオポエチン−１、および幹細胞因子（ＳＣＦ）などの血管形成因子の発現レベルは、骨由来、軟骨由来、および脂肪細胞由来ＭＳＣの中でも異なることがわかっている（Peng et al., 2008, Stems Cells and Development, 17: 761-774）。
【００６９】
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）
インスリンと分子構造が似ているホルモンであるＩＧＦ−１は、体内のほぼ全ての細胞、特に、骨格筋、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚、造血細胞、および肺に対する増殖促進効果を有する。それは、小児の成長において重要な役割を有し、成体において同化効果を継続的に有する。ＩＧＦ−１は、主に内分泌ホルモンとして肝臓によって、ならびにパラクリン／オートクリン様式で標的組織中で産生される。産生は、増殖ホルモン（ＧＨ）によって刺激され、低栄養、増殖ホルモン不感受性、増殖ホルモン受容体の欠如、またはＳＨＰ２およびＳＴＡＴ５Ｂを含む下流のシグナリング分子の不具合によって遅延され得る。その主な作用は、多くの組織の多くの細胞型上に存在する、その特定の受容体であるインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に結合することによって媒介される。受容体チロシンキナーゼであるＩＧＦ１Ｒへの結合は、細胞内シグナリングを開始させる；ＩＧＦ−１は、ＡＫＴシグナリング経路の最も強力な天然の活性化因子の１つであり、細胞の成長および増殖の刺激因子であり、プログラム細胞死の強力な阻害剤である。ＩＧＦ−１は、増殖ホルモン（ＧＨ）の効果の主要なメディエータである。増殖ホルモンは、下垂体中で作られ、血流に放出された後、ＩＧＦ−１を産生するように肝臓を刺激する。次いで、ＩＧＦ−１は、全身の成長を刺激する。そのインスリン様効果に加えて、ＩＧＦ−１はまた、特に、神経細胞中での細胞の増殖および発生、ならびに細胞ＤＮＡ合成を調節することができる。
【００７０】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの３０種を超える構造的に関連するメンバーが存在し、それらは発生中に最も重要な相互作用の一部を調節する。ＴＧＦ−βスーパーファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質は、カルボキシ末端領域が成熟ペプチドを含有するようにプロセッシングされる。これらのペプチドはホモ二量体（それ自身と）またはヘテロ二量体（他のＴＧＦ−βペプチドと）に二量体化し、細胞から分泌される。ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ＴＧＦ−βファミリー、アクチビンファミリー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｖｇ−１ファミリー、ならびにグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ、腎臓および腸ニューロン分化にとって必要である）および哺乳動物の性別決定に関与するミュラー管抑制因子などの他のタンパク質を含む。ＴＧＦ−βファミリーメンバーであるＴＧＦβ１、２、３および５は、細胞間での細胞外マトリックスの形成の調節および細胞分裂の調節（正と負の両方）において重要である。ＴＧＦ−β１は、コラーゲンおよびフィブロネクチン合成を刺激すること、およびマトリックス分解を阻害することの両方によって、細胞外マトリックス上皮細胞の量を増加させる。ＴＧＦ−βは、上皮が分岐して腎臓、肺、および唾液腺の管を形成することができる場所および時を制御する際に重要であり得る。
【００７１】
検査されたさまざまな血液調節サイトカインのうち、ＴＧＦ−β１は、系列特異性の決定である骨髄間質ＴＰＯのｍＲＮＡ発現の圧倒的に最も強力なエンハンサーであった。ＴＰＯは順に、巨核球産生中期段階の巨核球上でＴＧＦ−β受容体ＩおよびＩＩを誘導した。この段階で、ＴＧＦ−β１は用量依存的様式で巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）の成熟を停止させることができた。この効果は、バースト形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）またはＣＦＵ−ＧＭに対するその効果と比較した場合、相対的に特異的であった（Sakamaki, S. et al, "Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) induces thrombopoietin from bone marrow stromal cells, which stimulates the expression of TGF-β receptor on megakaryocytes and, in turn, renders them susceptible to suppression by TGF-β itself with high specificity," Blood 1999; 94: 1961-70）。
【００７２】
アクチビンＡおよびＢＭＰ２は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の非存在下であっても、赤血球産生に向かう細胞系列決定および分化を誘導する。その生物活性は、ヒト骨髄によって発現され、ＴＧＦ−βおよびアクチビンＡによって調節される２つの分泌糖タンパク質であるフォリスタチンまたはＦＬＲＧ（フォリスタチン関連遺伝子）との結合によって拮抗される（Maguer-Satta V, et al., Regulation of human erythropoiesis by activin A, BMP2, and BMP4, members of the TGFbeta family. Exp Cell Res 2003;282:110-120；Maguer-Satta V, Rimokh R., FLRG, member of the follistatin family, a new player in hematopoiesis. Mol Cell Endocrinol 2004;225:109-118を引用する（Jeanpierre, S. et al, "BMP4 regulation of human megakaryocytic differentiation is involved in thrombopoietin signaling," Blood 2008; 112: 3154-63））。ＦＬＲＧおよびフォリスタチンは、フィブロネクチンのＩ型モチーフとフォリスタチンドメインとの直接的相互作用によって未熟造血始原細胞および幹細胞におけるヒト造血細胞接着性の調節に関与する（同上、Maguer-Satta V, et al., A novel role for fibronectin type I domain in the regulation of human hematopoietic cell adhesiveness through binding to follistatin domains of FLRG and follistatin. Exp Cell Res 2006;312:434-442 10を引用）。
【００７３】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）
ＢＭＰファミリーのメンバーは元々、骨形成を誘導するその能力によって発見された。しかしながら、骨形成は、それらの多くの機能の１つに過ぎず、それらは細胞分裂、アポトーシス（プログラム細胞死）、細胞移動、および分化を調節することが見出された。ＢＭＰを、成熟ポリペプチド中に９個というよりはむしろ７個の保存されたシステインを有することによってＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーと区別することができる。ＢＭＰは、Ｎｏｄａｌ（左右軸形成を担う）およびＢＭＰ４（神経管極性、眼の発達、および細胞死において重要である）などのタンパク質を含む。
【００７４】
ヒトでは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７は、増殖、維持（Hutton, JF, et al, "Bone morphogenetic protein 4 contributes to the maintenance of primitive cord blood hematopoietic progenitors in an ex vivo stroma-non contact co-culture system," Stem Cell Dev. 2006; 15: 805-13を引用する、Jeanpierre, S. et al, "BMP4 regulation of human megakaryocytic differentiation is involved in thrombopoietin signaling," Blood 2008; 112:  3154-63）、クローン形成能、およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−原始造血集団の複製能力（同上、Bhatia, M. et al, "Bone morphogenetic proteins regulate the developmental program of human hematopoietic stem cells," J. Exp. Med. 1999; 189: 1139-48を引用）を調節する。ＢＭＰ２およびＢＭＰ４は、単独で、またはアクチビンＡと共に、様々なモデルにおいて赤血球産生を調節することが示されている（同上、Maguer-Satta, V, and Rimokh, R, "FLRG, member of the follistatin family, a new player in hematopoiesis," Mol. Cell Endocrinol. 2004; 225: 109-11を引用）。
ＢＭＰ４はＳＣＦと協働して、他のサイトカインの非存在下でも原始造血幹細胞コンパートメントをモジュレートすることが示されている。同上。
【００７５】
ＴＧＦβファミリーのうち、ＢＭＰ４のみが、ＴＰＯと同じ能力を有し、初期および後期ＭＫマーカー、ならびに倍数化、ＰＦ４の分泌、および血小板産生などの類似する最終分化特性を誘導する（同上）。主に骨髄間質によって産生され（同上、Martinovic, S. et al, "Expression of bone morphogenetic proteins in stromal cells from human bone marrow long-term culture," J. Histochem. Cytochem. 2004; 52: 1159-67を引用）、ヒト巨核球および血小板中に局在化し（同上、Sipe, JB et al, "Localization of bone morphogenetic proteins (BMPs)-2, -4, and -6 within megakaryocytes and platelets," Bone 2004; 35:  1316-22を引用）、ＭＫ始原細胞によって自己産生される、造血「ニッチ」の調節に関与する重要なシグナリング経路のエレメント（同上、Zhang, et al, "Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size," Nature 2003; 425: 836-41を引用）であるＢＭＰ４は、原始的な系列決定されていない始原細胞の維持からＭＫ分化の後期段階までの、ヒト巨核球の全ての段階を効率的に調節することが示されている。さらに、データは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴおよびｍＴＯＲシグナリング経路が、ＴＰＯについて確認されたように、ＢＭＰ４によるＭＫ成熟の調節に関与することを示唆する（同上、Guerriero, R. et. Al., "Inhibition of TPO-induced MEK or mTOR activity induces opposite effects on the ploidy of human differentiating megakaryocytes," J. Cell Sci. 2006; 119: 744-52、Raslova, H et al, "Mammalian target of rapamycin (mTOR) regulates both proliferation of megakaryocyte progenitors and late stages of megakaryocyte differentiation," Blood 2006; 107: 2303-10を引用）。かくして、報告された結果は、ＢＭＰ４とＴＰＯが同様のシグナリング経路を使用してヒトＭＫ分化を調節することを示している。同上。さらに、ＴＰＯまたはＢＭＰ４の特異的細胞外阻害剤を使用して、ＢＭＰ４シグナリング経路のいずれかの阻害剤はＴＰＯの効果を効率的に阻害したが、抗ＴＰＯ−Ｒ抗体は、ＭＫ分化に対するＢＭＰ４の効果を遮断することができないことが示された。同上。さらに、ＴＰＯはＭＫ始原細胞中でＢＭＰ４合成およびＢＭＰ受容体発現を誘導したが、これは、ＴＰＯがＢＭＰ４シグナリング経路を使用してヒトＭＫを調節するが、その逆は当てはまらないと考えられることを示唆している。同上。
【００７６】
ＰＥＡＲ−１、ＲＡＤ００１、Ｗｎｔ３ａ、およびＡＨＲ
巨核球産生の調節因子として関与する他の因子としては、Ｐ１３Ｋ／ＰＴＥＮシグナリングの刺激因子である血小板内皮凝集受容体（ＰＥＡＲ−１）（Kauskot, A. et al, "PEAR1 attenuates megakaryopoiesis via control of the P13K/PTEN pathway," Blood. 2013; 121: 5208-17を引用する、Smith, BW, and Murphy, GJ, "Stem cells, megakaryocytes, and platelets," Curr. Opin. Hematol. 2014; 21(5): 430-37）およびｍＴＯＲ阻害剤であるＲＡＤ００１（同上、Su-Y-C et al, "RAD001-mediated STAT3 upregulation and megakaryocytic differentiation," Thromb. Haemost. 2013; 109: 540-49を引用）が挙げられる。Ｗｎｔ３ａは、ＣＤ４１／ＣＤ２３５二重陽性始原細胞の産生を引き起こすｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｉＰＳＣ誘導系におけるヒト巨核球始原細胞増殖のリプレッサーとして関与している（同上、Paluru, P. et al, "The negative impact of Wnt signaling on megakaryocyte and primitive erythroid progenitors derived from hyman embryonic stem cells," Stem Cell Res. 2014; 12: 441-51を引用）。ｉＰＳＣに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏでの巨核球産生の調節におけるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の役割（同上、Smith, BW et al, "The aryl hydrocarbon receptor directs hematopoietic progenitor cell expansion and differentiation," Blood. 2013; 122: 376-85を引用）が記載されている。
【００７７】
血小板由来マイクロパーティクルおよびエキソソーム
血小板は、恒常性および凝固における明確に記載された生理学的役割を有するが、最近では、それらは免疫、組織修復および発生に関与することも示されている（Elzey BD, et al., The emerging role of platelets in adaptive immunity. Cell Immunol. 2005; 238:1-9；Jenne CN et al., Platelets: bridging hemostasis, inflammation, and immunity. Int J Lab Hematol. 2013;35:254-61；Bertozzi CC et al., Platelets regulate lymphatic vascular development through CLEC-2-SLP-76 signaling. Blood. 2010;116:661-70）。血小板由来細胞外ベシクル（ＥＶ）は、これらの多様な機能を指揮するのに必要な分子を提供することができる。血小板は、形質膜に由来するマイクロベシクルまたはマイクロパーティクル（ＭＰ）、およびエンドソーム経路に由来するエキソソーム（ＥＸＯ）を生成することができる（Aatonen MT et al., Isolation and characterization of platelet-derived extracellular vesicles, J. Extracellular Vesicles, vol. 3 (2014) 24692）。
【００７８】
血小板形質膜由来マイクロパーティクル（ＰＭＰ）は、１００〜１０００ｎｍのサイズであることが一般に公知である。血小板はまた、多小胞体から、４０〜１００ｎｍのサイズであるエキソソームを産生することも公知である。不均一なＰＭＰとは対照的に、エキソソームは一般に、サイズと分子含量の両方によって、より均一な集団を形成するが、血小板においては、２つの通常は異なる形成プロセスがα−顆粒のため乱雑になる。エキソソームの供給源である多小胞体は、α−顆粒の前段階であるとも考えられ、次いで、形質膜との融合物上にエキソソームを遊離し、いくつかのα−顆粒由来分子もＰＭＰ上に存在する。血小板由来マイクロベシクル、形質膜由来マイクロパーティクル、および血小板由来エキソソームの上または中に存在する分子マーカーとしては、限定されるものではないが、以下のもの：ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１などの増殖因子；ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）などの免疫応答因子；Ｒａｎｔｅｓ（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ２３、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＲ４、ＰＦ−４（ＣＸＣＬ４）、ＴＮＦ−ＲＩ−ＩＩ、ＩＬ−１ベータ、ＣＸ３ＣＲ１、およびベータ−トロンボグロブリンなどのケモカイン／サイトカイン；ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ｃ５ｂ−９、Ｃ１ｑ、Ｃ３Ｂ、Ｃ１−ＩＮＨ、Ｈ因子などの補体タンパク質；カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、ＦａｓＲ（ＣＤ９５）などのアポトーシスマーカー；Ｆｖａ、ＦＶＩＩＩ、ＴＦＰＩ、ＴＦ、ＰＡＲ−１、ＦＸＩＩＩＡなどの凝固因子；ＰＤＩ、１２−ＬＯ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ｉＮＯＳ２、へパルナーゼなどの活性酵素；アルファ−リブ／ベータ３（ＣＤ４１／ＣＤ６１）、ＧＰＩｂ（ＣＤ４２ｂ）、ＧＰＩＸ（ＣＤ４２ａ）、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、ＧＰＩＩＩｂ（ＣＤ３６）、ＣＤ４９、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＣＤ９、ＪＡＭ−Ａ、ｖＷＦ、フィブリノゲン、トロンボスポンジン、ビトロネクチンなどの接着タンパク質；ＰＳ、ＡＡ、ＬＰＡ、ＴＸＡ２などの生物活性脂質；Ｐｅｔａ−３（ＣＤ１５１）、ＣＤ６３、ＰＰＡＲ−ガンマ、ＴＩＭＰ３、ラクトアドへリン、ＰＡＩ−１、ＰｒＰＣ、ベータ２ＧＰＩなどの他の混合マーカーが挙げられる（Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012)）。一般的なエキソソームマーカーであるＣＤ６３は、血小板由来エキソソーム中で富化されるだけでなく、ＰＭＰ上にも存在し、その逆もそうであり、多くの一般的なＰＭＰタンパク質がエキソソームのサブセット上で検出される。
【００７９】
血小板由来マイクロベシクル（ＰＭＶ）は、凝固、接着、炎症、免疫、およびアポトーシスなどの多様で時には逆説的な活動に関与すると考えられる。多くのこれらの恒常性活動において、いくつかの細胞型は協調して働き、細胞間コミュニケーションのためのマイクロベシクル（ＭＶ）を提供することができる。この対話は、その目的のために調整された機能的に変化するＭＶの形成に依存する。ＰＭＶの効果は、直接的であってもよい、すなわち、触媒表面として作用するなど、ＰＭＶ自体によって媒介されてもよい、または間接的であってもよい、すなわち、ＰＭＶ融合物上でその表現型を変化させるレシピエント細胞によって媒介されてもよい。しかしながら、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）含有ＰＭＰによって誘導される予想外の抗炎症応答によって示されるように、ある分子の存在はその機能を保証するものではない（Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012)）。ＰＭＶの最終的な効果は、細胞環境（時間と空間の両方）に依存するようであり、例えば、同じＰＭＶの見かけ上相反する凝固促進能力および抗凝固能力を説明することができる。
【００８０】
ＰＭＶは、完全に作動可能な表面受容体（ＣＸＣ４Ｒ、ＣＤ４１）をレシピエント細胞上に移動させることができる。ＰＭＶによる受容体移動は、細胞の起源を複雑にし得る：単球中へのＣＤ３１およびフォン・ヴィレブランド因子のＰＭＰにより媒介される移動は、内皮始原細胞の存在を偽って暗示する。ＰＭＶはまた、活性酵素、例えば、血小板凝集のためのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、内皮機能障害中の誘導性一酸化窒素シンターゼＩＩおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ、ならびに肥満細胞からのリポキシンＡ４産生における１２−リポ−オキシゲナーゼを含有し、移動させる。先天性免疫および適応免疫におけるＰＭＶの関与は、サイトカインおよびケモカインなどのいくつかの分子群ならびにその受容体、ＣＤ４０ＬおよびＰＦ４の存在によってさらに推測される（Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012)）。
血小板は、活性化依存的様式でタンパク質に翻訳されるＲＮＡ分子、例えば、ＰＭＰプロテオームの全メンバーであるＣＤ４１、ＣＤ６１、およびＩＬ−１β33を担持する。血小板トランスレートームのアゴニスト依存的変化が、ＰＭＰ種の分子的、またはさらには機能的な差異の基礎にあり得ることが提唱されている（Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012)）。
【００８１】
成体末梢血血小板を使用する以前の研究
本発明者らの以前の研究において、本発明者らは、多能性細胞の特徴を示す、末梢血幹細胞（ＰＢ−ＳＣ）と命名された、ヒト成人末梢血から単離された胚様幹細胞を同定した。これらの細胞は、それらを幹細胞に基づく療法における使用にとって好適なものにする他の細胞型への増殖および分化の能力を有することが示された。胚性幹細胞の特徴および造血細胞の特徴を示すこれらの細胞は、リンパ球、マクロファージ、単球、および造血幹細胞とは表現型が異なる。
記載される発明は、患者に導入した場合に安定であり得るウイルスまたは薬物誘導性形質導入による誘導多能性幹細胞の生成に関与する安全性の懸念なく成体単核細胞から誘導多能性幹細胞を生成するために使用することができる臍帯血由来血小板様細胞を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００８２】
一態様によれば、記載される発明は、成体細胞をインスリン産生細胞に機能的に再プログラミングする方法であって、（ａ）ヒト対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を単離するステップ；（ｂ）臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ；（ｃ）接触がＰＢＭＣを、１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ（ａ）のＰＢＭＣの集団と、ステップ（ｂ）の血小板に富む画分とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ；および（ｄ）インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、インスリン産生細胞集団を生成するのに有効な培養条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未熟細胞型を増殖させるステップを含む、方法を提供する。一実施形態によれば、方法は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配画分からステップ（ａ）の成体ＰＢＭＣを単離することをさらに含む。別の実施形態によれば、方法は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配画分から、血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離することをさらに含む。別の実施形態によれば、血小板様細胞を含む血小板に富む画分は、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの１つまたは複数を含む。別の実施形態によれば、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの１つまたは複数を含む血小板様細胞を含む血小板に富む画分は、転写因子、増殖因子、またはその両方を含有する。別の実施形態によれば、全細胞は、造血幹細胞、造血始原細胞、共通リンパ球始原細胞、共通骨髄始原細胞、巨核球−赤血球始原細胞；顆粒球−単球始原細胞、巨核球系列に系列決定された始原細胞、巨核球、および血小板様細胞のうちの１つまたは複数を含む。別の実施形態によれば、ステップ（ｃ）に由来する１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する血小板様細胞は、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７０、ガレクチン９、ＴＧＦ−β１、ＡＩＲＥ、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＬ２のうちの１つまたは複数を含む。別の実施形態によれば、再プログラミングされた成体細胞は、神経細胞、内皮細胞、心筋細胞、筋細胞、上皮細胞、角膜内皮細胞、網膜色素細胞、破骨細胞、ケラチノサイト、毛嚢細胞、および腺細胞からなる群から選択される１つまたは複数の細胞型を含む。
【００８３】
別の態様によれば、記載される発明は、高血糖を特徴とする疾患に罹患するレシピエント対象を処置するための方法であって、（ａ）ヒトドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を単離するステップ；（ｂ）ドナーの臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ；（ｃ）接触がＰＢＭＣを、１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ（ａ）のＰＢＭＣの集団と、ステップ（ｂ）の血小板に富む画分とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ；（ｄ）インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を生成するのに有効な培養条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未熟細胞型を増殖させるステップ；および（ｅ）ステップ（ｄ）に由来する細胞生成物をレシピエント対象に投与するステップを含み、ステップ（ｄ）に由来する治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物が、高血糖症の症状を軽減するのに有効である、方法を提供する。一実施形態によれば、ドナーおよびレシピエント対象は、同じ個体である。別の実施形態によれば、自己免疫疾患は糖尿病である。別の実施形態によれば、自己免疫疾患は１型糖尿病である。別の実施形態によれば、ドナーはレシピエント対象に対して同種異系である。別の実施形態によれば、ステップ（ｂ）において、血小板様細胞を含む血小板に富む画分は、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの１つまたは複数を含む。
【００８４】
記載される発明の別の態様によれば、ドナーの臍帯血または末梢血に由来する血小板様細胞を含む血小板に富む画分との接触により１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に機能的に再プログラミングされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖および再分化させた成体ＰＢＭＣに由来する治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を含む医薬組成物であって、インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等であり、ステップ（ｃ）の１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する血小板に富む画分が、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７０、ガレクチン９、ＴＧＦ−β１、ＡＩＲＥ、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＬ２のうちの１つまたは複数について陽性であり、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＸＣＬ１について陰性である細胞の集団を含む、医薬組成物。一実施形態によれば、細胞生成物は、（ａ）ヒトドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を単離するステップ；（ｂ）ドナーの臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ；（ｃ）接触がＰＢＭＣを、１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ（ａ）のＰＢＭＣの集団と、ステップ（ｂ）の血小板に富む画分とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ；（ｄ）インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を生成するのに有効な培養条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未熟細胞型を増殖させるステップ；および（ｅ）ステップ（ｄ）に由来する治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物が、高血糖を特徴とする疾患を有する対象に投与した場合、高血糖の症状を軽減するのに有効である、細胞生成物を薬学的に許容される担体と共に製剤化して、医薬組成物を形成させるステップを含むプロセスによって産生される。別の実施形態によれば、プロセスのステップ（ｂ）において、血小板様細胞を含む血小板に富む画分は、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの１つまたは複数を含む。別の実施形態によれば、機能的に再プログラミングされた成体細胞の集団は、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７０、ガレクチン９、ＴＧＦ−β１、ＡＩＲＥ、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＬ２のうちの１つまたは複数を提示し、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＸＣＬ１について陰性である。別の実施形態によれば、機能的に再プログラミングされた細胞は、インスリンを産生することができる。
【００８５】
別の態様によれば、記載される発明は、高血糖の対象への送達のために製剤化される薬剤の調製のための、ドナーの臍帯血または末梢血に由来する血小板様細胞を含む血小板に富む画分との接触により１つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に機能的に再プログラミングされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖および再分化させた成体ＰＢＭＣに由来する治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を含む医薬組成物の使用であって、インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、使用を提供する。一実施形態によれば、高血糖は、自己免疫疾患の結果生じ、治療量は、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効である。別の実施形態によれば、自己免疫疾患は、１型糖尿病である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１Ａ】パネル（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、偽療法（ＣＢ−ＳＣ教育なし）、ＣＢ−ＳＣ教育、および従来の療法後の、１型糖尿病および２型糖尿病の対象において、接着臍帯血幹細胞（ＣＢ−ＳＣ）の存在下でリンパ球を簡単に同時培養した後、「教育された」リンパ球を患者の循環中に戻す（「幹細胞教育療法」）バイオリアクターを介して患者の血液を循環させることによる血小板の調節を示すデータの棒グラフである（ｙ軸）。（Ａ）血小板数を示すデータ（ｙ軸）。
【図１Ｂ】（Ｂ）血小板分布幅を示すデータ（ＰＤＷ、ｙ軸）。
【図１Ｃ】（Ｃ）平均血小板体積（ＭＰＶ、ｙ軸）を示すデータ（ｙ軸）。
【図１Ｄ】（Ｄ）ＣＢ−ＳＣを用いる白人Ｔ１Ｄ対象（Ｎ＝８）の処置の前後の血小板数を示すデータ。
【図２Ａ】パネル（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）および（Ｉ）は、血小板様細胞中での免疫調節関連マーカーの発現を示すフローサイトメトリーデータである。血小板様細胞を、ヒト臍帯血（Ａ〜Ｄ）および成体末梢血単位（Ｅ〜Ｉ）から精製した。臍帯血血小板様細胞上でのＣＤ２７０とＣＤ４１およびＣＤ２７０とＣＤ６１の同時発現。
【図２Ｂ】（Ｂ）臍帯血血小板様細胞中でのＣＤ４１とＴＧＦ−β１およびＣＤ４２とＴＧＦ−β１の同時発現。
【図２Ｃ】（Ｃ）７つの臍帯血調製物中でのＡＩＲＥの発現を示すウェスタンブロット。
【図２Ｄ】（Ｄ）ＣＤ４１＋臍帯血血小板様細胞中でのＡＩＲＥの発現を示す二重染色。アイソタイプ一致させたＩｇＧを対照として使用した。
【図２Ｅ】（Ｅ）ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋成体血液の血小板様細胞上での共阻害表面マーカーＣＤ２７０、およびガレクチン９の発現。アイソタイプ一致させたＩｇＧを対照として使用した。
【図２Ｆ】（Ｆ）成体血液由来血小板様細胞上でのＰＤ−Ｌ１およびＣＤ２７０の高発現、ガレクチン９の低発現、ならびにＩＣＯＳの無発現を示す二重免疫染色。代表データは、８つの個々の調製物に由来するものであった。
【図２Ｇ】（Ｇ）ＣＤ４１＋成体血液血小板様細胞中でのＴＧＦ−β１の発現。
【図２Ｈ】（Ｈ）９つの成体血液調製物中でのＡＩＲＥの発現を示すウェスタンブロット。
【図２Ｉ】（Ｉ）ＣＤ４１＋成体血液血小板様細胞中でのＡＩＲＥの発現を示す二重染色。アイソタイプ一致させたＩｇＧを対照として使用した。
【図２Ｊ】（Ｊ）成体血液血小板様細胞上での変化したレベルでの（左から右へ）ケモカイン受容体ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、およびＣＣＲ５（下）ならびにリガンドＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ１０（上）の発現。
【図２Ｋ】（Ｋ）成体血液血小板細胞上での（左から右へ）ケモカイン受容体（上）ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、（下）ＣＸＣＲ３、およびＣＸＣＲ４ならびにＣＤ６２Ｌリガンド（右下）の発現。
【図２Ｌ】パネルＬ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＱは、血小板由来ミトコンドリアが免疫調節特性を示す実験的証拠を記載する。図２Ｌは、Ｔ細胞アネルギーおよび免疫寛容関連遺伝子の発現を示すＣＢ−血小板およびＰＢ−血小板に由来するミトコンドリアＤＮＡのリアルタイムＰＣＲアレイ分析を示す。
【図２Ｍ】ミトコンドリアを、免疫マーカー関連遺伝子の起源を同定するためのミトコンドリアＤＮＡ（ＭｉｔｏＤＮＡ）の遺伝子転写のために、ＣＢ−血小板およびＰＢ−血小板から精製した。ミトコンドリアを、製造業者の推奨プロトコールに従ってＱｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｄｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＢ−血小板から単離した。ミトコンドリアを放出する血小板が免疫寛容関連マーカーＣＤ２７０およびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）を展示したことを示すフローサイトメトリー分析（図２Ｍ）。
【図２Ｎ】末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体＋組換えヒトＩＬ−２（ｒＩＬ−２）と結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓの存在下で、同種異系ＰＢ血小板由来ミトコンドリアで処理した。４日間、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた後、上清中に浮かぶ異なるサイズの多数の細胞クラスターが見られ（図２Ｎ、中央下パネル）、有意なＴ細胞増殖を示唆していた。ミトコンドリアの存在下では、この現象は明らかではなかった（図２Ｎ、右パネル）。
【図２Ｏ】図２Ｏは、ミトコンドリアとの組合せ処理後、細胞数が顕著に減少したことを示す。
【図２Ｐ】図２Ｐは、ミトコンドリアによる処理後、ＣＤ４＋ＰＤ１＋Ｔ細胞のパーセンテージが１５％±０．６４％に増加したことを示す（図２Ｐ）（Ｐ＝０．００１）。
【図２Ｑ】図２Ｑは、ミトコンドリアの存在下で、ＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ細胞のパーセンテージも、２．４３％±１．１８％から６．４６％±０．２８％まで改善されたことをフローサイトメトリーによって示す（図２Ｑ）（Ｐ＝０．０３４）。
【図３Ａ】パネルＡ〜Ｐは、血液中での血小板様細胞と免疫細胞との相互作用を示す、フローサイトメトリーデータ（パネルＡ〜Ｃ、Ｅ、Ｆ）、棒グラフ（パネルＤおよびＭ）、組織切片（パネルＧ〜Ｌ）、ならびに細胞の顕微鏡写真（パネルＮ、ＯおよびＰ）を提供する。  パネル（Ａ）は、ＣＢＭＣのゲート化されていないドットプロットである。４つの主要な集団が示される：リンパ球（Ｌｙ、紫色の丸）、単球（Ｍｏ、黒色の丸）、顆粒球（Ｇｒ、黄色の丸）、および血小板様細胞（Ｐｌ、青色の丸）。最も右側のパネルは４つの集団の異なる領域間の広い分布（緑色）を示すゲート化されたドットプロットである。
【図３Ｂ】パネル（Ｂ）は、ＣＢＭＣのドットプロットにおけるゲート化されたＣＤ４２＋血小板様細胞の分布を示すヒストグラムである。
【図３Ｃ】パネル（Ｃ）は、新鮮に単離されたＣＭＢＣに由来する血小板様細胞および他の免疫細胞の同時分布を例示するフローサイトメトリーデータを示す。このデータは、血小板がＣＤ１４＋単球およびＣＤ６６ｂ＋顆粒球ならびに一部のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞に接着することを示す。
【図３Ｄ】パネル（Ｄ）は、血小板マーカーＣＤ４１＋および系列マーカーについて陽性である細胞を定量化する棒グラフである。代表的なデータは、３つの実験に由来するものであった。
【図３Ｅ】パネル（Ｅ）は、フローサイトメトリーデータを示す。代表的なデータは、３つの実験に由来するものであった。ＣＢＭＣを、室温で５分間、ＥＤＴＡ／トリプシンで処理し、１０００ｒｐｍで５分間、ＰＢＳで洗浄した。対照（左パネル）は、ＥＤＴＡ／トリプシンで処理していないＣＢＭＣであった。中央パネルは、顆粒球上でのＣＤ４１の発現が、ＥＤＴＡ／トリプシンによる処理後に顕著に減少したことを示す。単球（ＣＤ１４＋）に接着する有意な数のＣＤ４１＋血小板様細胞が観察された。右パネルは、ゲート化されたＣＤ１４＋ＣＤ４１＋細胞（青色）を示すドットプロットである。
【図３Ｆ】パネルＦ〜Ｍは、血小板と、単球／マクロファージ（Ｍｏ／Ｍφ）（ＣＤ１４＋）との相互作用を示すデータを示す。血小板を、健康なドナーの成体血液単位（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）から精製した。  パネル（Ｆ）は、フローサイトメトリーデータを示す。ＣＤ１４＋ＣＤ４１ｂ＋およびＣＤ１４＋ＣＤ４２ａ＋細胞のパーセンテージは、透過処理後に増加した。アイソタイプ一致させたＩｇＧを対照として使用した。代表的なデータは、３つの実験に由来するものであった。
【図３Ｇ】パネル（Ｇ）〜（Ｌ）は、血小板とＭφとの相互作用を実証する透過型電子顕微鏡写真である。  パネル（Ｇ）は、血小板（上パネル）およびＭφの超微細構造を示す電子顕微鏡写真である。
【図３Ｈ】パネル（Ｈ）は、血小板中に伸びたＭφに由来する仮足（黄色の矢印）を示す電子顕微鏡写真である。
【図３Ｉ】パネル（Ｉ）〜（Ｋ）は、血小板とＭφの膜との融合を示す電子顕微鏡写真である。赤色の矢印は、血小板とＭφとの融合を同定する。（パネルＩ）上パネルの点線は、下パネル中に示されるより高い拡大率の領域を示す。
【図３Ｊ】（パネルＪ）左上パネル中の囲みは、右パネルおよび左下パネル中で拡大して示される。
【図３Ｋ】（パネルＫ）左パネル中の囲みは、右パネル中で拡大される。
【図３Ｌ】パネル（Ｌ）の左パネルは、Ｍφによる血小板の食作用を示す。右パネルは、高倍率でのものである。
【図３Ｍ】パネル（Ｍ）、（Ｎ）、（Ｏ）、および（Ｐ）：臍帯血に由来する精製されたＭｏ／Ｍφを、トリプシン／ＥＤＴＡで処理して、Ｍｏ／Ｍφから結合した血小板を剥離させた。次いで、トリプシン／ＥＤＴＡ処理されたＭｏ／Ｍφを、５０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下で培養した。トリプシン／ＥＤＴＡで処理していないＭｏ／Ｍφを対照として使用した。パネルＭは、ＥＤＴＡ−トリプシン処理およびＥＤＴＡ−トリプシン非処理細胞中の線維芽細胞様マクロファージ（ｆ−Ｍφ）のパーセンテージを比較する棒グラフである。ｆ−Ｍφのパーセンテージは、トリプシン／ＥＤＴＡによる処理後に顕著に低下した。  ｆ−Ｍφ形成のパーセンテージを、８ウェルのチャンバースライド中で２日間の培養後に定量した。代表的なデータは、４つの実験に由来するものであった。
【図３Ｎ】パネル（Ｎ）は、２４ウェルの組織培養処理プレート中で７日間培養した後のＥＤＴＡ／トリプシン処理されたＭｏＭφ（左パネル）およびＥＤＴＡ／トリプシンで処理されていないＭｏ／Ｍφ（対照）の位相差顕微鏡写真である。代表的なデータは、５つの実験に由来するものであった。細胞数は、トリプシン／ＥＤＴＡによる処理後に目に見えて減少した。
【図３Ｏ】パネル（Ｏ）ｆ−Ｍφを、トリプシン／ＥＤＴＡで処理されたＭｏ／Ｍφ群において１００ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）で処理した（左パネル）。細胞を、２４ウェル組織培養処理プレート中で１０日間分化させた後に検査した後、１：１００の希釈率でマウス抗Ｐａｎ−カドヘリンで免疫染色し、ｘ１００の倍率で見た。代表的なデータは４つの実験に由来するものであった。トリプシン／ＥＤＴＡ処理されたＭｏ／Ｍφの上皮様細胞への分化は、ＥＧＦ処理後に減少した。
【図３Ｐ】パネル（Ｐ）は、三重染色後のＭφ中での血小板マーカーＣＤ４２ａおよび転写因子ＯＣＴ４の発現を示す共焦点顕微鏡により可視化された細胞を含有する。代表的なデータは、４つの実験に由来するものであった。
【図４Ａ】パネル（Ａ）〜（Ｈ）は、ヒト臍帯血（パネルＡ、Ｂ、ＤおよびＥ）ならびに成体末梢血（パネルＣ、ＦおよびＧ）から精製された血小板様細胞により発現された細胞マーカーを示す。代表的な画像は、４つの実験に由来するものであった。  パネル（Ａ）は、フローサイトメトリーによる精製された血小板様細胞の分析である。示されたドットプロット中のゲート化された血小板様細胞（左上パネル、青色）を、示されるようにＥＳマーカーＯＣＴ４と共に、血小板マーカーＣＤ４１およびＣＤ４２を使用することによって分析した。
【図４Ｂ】パネル（Ｂ）は、ＣＢ血小板様細胞中でのＣＤ４１およびＥＳマーカーＳＯＸ２（中央パネル）およびＮＡＮＯＧ（右パネル）による二重染色後のフローサイトメトリー分析を示す。アイソタイプ一致させたＩｇＧを対照として使用した（左パネル）。
【図４Ｃ】パネル（Ｃ）は、ＰＢ血小板様細胞中でのＣＤ４１およびＥＳマーカーＯＣＴ４（右上パネル）、ＳＯＸ２（左下パネル）およびＮＡＮＯＧ（右下パネル）による二重染色後のフローサイトメトリー分析を示す。アイソタイプ一致させたＩｇＧを対照として使用した（左上パネル）。
【図４Ｄ】パネル（Ｄ）は、リアルタイムＰＣＲ産物の電気泳動後の臍帯血に由来する血小板様細胞中でのＥＳマーカーの発現を示す。
【図４Ｅ】パネル（Ｅ）は、臍帯血に由来する血小板様細胞中でのＥＳマーカーの発現を示すウェスタンブロットを示す。
【図４Ｆ】パネル（Ｆ）は、リアルタイムＰＣＲ産物の電気泳動後の末梢血に由来する血小板様細胞中でのＥＳマーカーの発現を示す。
【図４Ｇ】パネル（Ｇ）は、末梢血に由来する血小板様細胞中でのＥＳマーカーの発現を示すウェスタンブロットを示す。
【図４Ｈ】パネル（Ｈ）および（Ｉ）は、臍帯血および末梢血に由来する血小板様細胞から精製されたミトコンドリアＤＮＡのＰＣＲアレイ分析を示す。遺伝子転写物を、ＲＴ2Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲアレイにより分析した。発現値をβ−アクチンに対して正規化した。色は、キーに示されるように、遺伝子発現のレベルを表す。高い発現を示す遺伝子を赤色で、低い発現を示す遺伝子を緑色で、発現を示さない遺伝子をｘ印と共に黒色で示す。パネル（Ｈ）は、ヒト幹細胞転写因子に関するＰＣＲアレイデータである。
【図４Ｉ】パネル（Ｉ）は、ヒト幹細胞遺伝子に関するアレイデータである。示されたデータは、５つの調製物のうちの１つに由来するものである。
【図５Ａ】パネルＡ〜Ｋは、臍帯血（パネルＡ〜ＦおよびＫ、上および中央の行）ならびに末梢血（パネルＧ〜ＪおよびＫ、下の行）に由来する血小板調製物中での膵島β細胞関連マーカーの発現を示すデータを記載する。ｎ＝６。  パネル（Ａ）は、ＣＢ由来血小板様細胞中での膵島関連ホルモン産物およびβ細胞関連機能的マーカーのリアルタイムＰＣＲ分析、次いで、電気泳動に由来するデータを示す。
【図５Ｂ】パネル（Ｂ）は、ＣＢ由来血小板様細胞中での膵島β細胞関連転写因子のリアルタイムＰＣＲ分析、次いで、電気泳動に由来するデータを示す。
【図５Ｃ】パネル（Ｃ）は、ＣＢ由来血小板様細胞中での膵島β細胞特異的転写因子ＭＡＦＡに関するウェスタンブロットである。
【図５Ｄ】パネル（Ｄ）は、新鮮に単離されたヒト膵島細胞中でのヒト膵島関連ホルモン産物に関するフローサイトメトリーデータを示す。アイソタイプ一致させたＩｇＧ（灰色のヒストグラム）を陰性対照として使用した。
【図５Ｅ】パネル（Ｅ）は、ＣＢ由来血小板様細胞中での血小板マーカーＣＤ４１またはＣＤ４２について二重染色された膵島関連ホルモン産物に関するフローサイトメトリーデータを示す。
【図５Ｆ】パネル（Ｆ）は、ＣＢ由来血小板様細胞中での血小板マーカーＣＤ４１またはＣＤ４２について二重染色された膵島β細胞関連転写因子に関するフローサイトメトリーデータを示す。
【図５Ｇ】パネル（Ｇ）は、ＰＢ由来血小板様細胞中での膵島関連ホルモン産物およびβ細胞関連機能的マーカーのリアルタイムＰＣＲ分析、次いで、電気泳動に由来するデータを示す。
【図５Ｈ】パネル（Ｈ）は、ＰＢ由来血小板様細胞中での血小板マーカーＣＤ４１またはＣＤ４２について二重染色された膵島関連ホルモン産物に関するフローサイトメトリーデータを示す。
【図５Ｉ】パネル（Ｉ）は、ＰＢ由来血小板様細胞中での膵島β細胞関連転写因子のリアルタイムＰＣＲ分析、次いで、電気泳動に由来するデータを示す。
【図５Ｊ】パネル（Ｊ）は、ＰＢ由来血小板様細胞中での膵島β細胞関連転写因子のフローサイトメトリーデータを示す。
【図５Ｋ】パネル（Ｋ）は、インスリン（青色）、高密度顆粒マーカーＡＤＰ（赤色）、およびα顆粒マーカーｖＷＦ（緑色）による三重染色後のヒトＣＢおよびＰＢ由来血小板様細胞の共焦点顕微鏡観察に由来するデータを示す。アイソタイプ一致させたＩｇＧによる免疫染色を陰性対照として使用した（挿入された黄色の破線の長方形）。スケールバー、５μｍ。代表的なデータは、６つの実験に由来するものであった。
【図６Ａ】パネルＡ〜Ｏは、血小板様細胞により放出されるミトコンドリアによる膵島β細胞機能の改善を示すデータを記載する。  パネル（Ａ）は、ドットプロット（左パネル）およびヒストグラム（右パネル）形式での血小板様細胞からのミトコンドリアの基底放出を示すフローサイトメトリーデータを示す。
【図６Ｂ】パネル（Ｂ）は、対照と比較した、アゴニストであるＡＤＰ、ＡＲＡおよびトロンビンの存在下での異なる血小板凝集因子による刺激後のミトコンドリアの放出の放出レベルを表す棒グラフプロットを示す。
【図６Ｃ】パネル（Ｃ）は、トランスウェル中での新鮮に単離されたヒト膵島細胞（上）とＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄで標識された血小板様細胞（下）との同時培養のためのトランスウェル培養系の実験設定を記載する。
【図６Ｄ】パネル（Ｄ）は、パネル（Ｃ）に記載された実験に由来するフローサイトメトリーによる動的測定を示す。データは、ヒト膵島細胞が、トランスウェル同時培養物中で血小板様細胞（下）から放出されたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ標識されたミトコンドリアを取り込むことを示す。
【図６Ｅ】パネル（Ｅ）は、血小板様細胞に由来するミトコンドリア上でのケモカインおよびケモカイン受容体（左から右に、フィブロネクチン、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７）およびＣＤ６２Ｌ（接着を媒介する、Ｌ−セレクチン）の発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。
【図６Ｆ】パネル（Ｆ）は、ヒト膵島β細胞上での接着分子（ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ３６）、ケモカインＣＣＬ２、およびケモカイン受容体（ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＣＣＲ４およびＣＣＲ６）の発現に関するフローサイトメトリーデータを示す。
【図６Ｇ】パネル（Ｇ）は、ＣＤ２９またはＴＬＲ４に対する遮断抗体の存在下で血小板由来ミトコンドリアと血小板島とを同時培養することによって得られたデータである。ヒト膵島β細胞によるミトコンドリアの移動および取込みは、抗ＣＤ２９、抗ＴＬＲ４、またはその両方の存在下で顕著に減少した。
【図６Ｈ】パネル（Ｈ）は、パネル６（Ｃ）に示されたトランスウェル中で血小板様細胞および対照の膵島細胞と同時培養したトリプシン／ＥＤＴＡで解離させた単一の膵島β細胞の細胞生存能力を表す棒グラフを示す。細胞生存能力は、単一の膵島β細胞をトランスウェル中で血小板様細胞と同時培養した後に増加した。
【図６Ｉ】パネル（Ｉ）は、パネル６（Ｃ）に示されたトランスウェル中で血小板様細胞および対照の膵島細胞と同時培養したトリプシン／ＥＤＴＡで解離させた単一の膵島β細胞の生細胞数を表す棒グラフを示す。膵島β細胞の数は、トランスウェル中で血小板様細胞と同時培養した後に増加した。
【図６Ｊ】パネル（Ｊ）は、トランスウェル中での新鮮に単離された全ヒト膵島（上）とミトコンドリアで標識された血小板様細胞（下）との同時培養を示す略図である。
【図６Ｋ】パネル（Ｋ）は、パネル６Ｊに示されたトランスウェル中で血小板様細胞由来ミトコンドリアと同時培養した対照膵島および全膵島に関する細胞生存能力（％）を表す棒グラフを示す。細胞生存能力は、全膵島をトランスウェル中で血小板様細胞由来ミトコンドリアと同時培養した場合に増加した。
【図６Ｌ】パネル（Ｌ）は、パネル６Ｊに示されたトランスウェル中で血小板様細胞由来ミトコンドリアと同時培養した対照膵島および全膵島に関する平均膵島サイズを定量するデータを示す。平均膵島サイズは、全膵島をパネル６（Ｊ）に示されたトランスウェル中で血小板様細胞由来ミトコンドリア（下）と同時培養した後に増加した。
【図６Ｍ】パネル（Ｍ）は、対照膵島およびミトコンドリア処理されたヒト膵島に関するＫｉ６７対Ｃ−ペプチドのフローサイトメトリープロットである。このデータは、インスリン＋Ｋｉ６７＋膵島β細胞のパーセンテージが、全膵島をパネル６（Ｊ）に示されたトランスウェル中で血小板様細胞由来ミトコンドリア（下）と同時培養した後に増加したことを示す。
【図６Ｎ】パネル（Ｎ）は、インスリン分泌促進物質である５．５ｍＭグルコース（白色）、１６．７ｍＭグルコース（灰色）、および５．５ｍＭグルコース＋トルブタミド（黒色）の存在下での対照膵島およびミトコンドリア処理された膵島に関するＣ−ペプチド放出の棒グラフを示す。機能的分析は、膵島β細胞からのＣ−ペプチド放出によって測定された場合の膵島β細胞機能が、全膵島を、パネル６（Ｊ）に示された対照膵島と比較して、トランスウェル中で血小板由来ミトコンドリア（下）と同時培養した後に、５ｍＭグルコース＋トルブタミドで処理された細胞中で改善されたことを示す。
【図６Ｏ】パネル（Ｏ）は、糖尿病患者に由来するヒト膵臓組織の膵島β細胞マーカーであるインスリン（赤色）および血小板マーカーであるＣＤ４２ａ（緑色）の免疫組織化学的共局在化を示す。スケールバー、１０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
用語
用語「アルファ細胞」または「α細胞」は、血糖値が低すぎる場合にホルモンであるグルカゴンを作り、放出する膵臓中の細胞型を指すように本明細書では互換的に使用される。グルカゴンは、エネルギーのためにグルコースを血液中に放出するように肝臓を刺激する。
本明細書で使用される用語「ベータ細胞」または「β細胞」は、インスリンを作る膵臓細胞を指す。
本明細書で使用される用語「両能性」とは、２つの細胞系列に分化することができる細胞を指す。
【００８８】
ＣＤ３（ＴＣＲ複合体）は、４つの異なる鎖から構成されるタンパク質複合体である。哺乳動物では、複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２個のＣＤ３ε鎖を含有し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびζ鎖と会合して、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生成する。同時に、ＴＣＲ、ζ鎖およびＣＤ３分子は、ＴＣＲ複合体を含む。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナリング能力にとって必須である免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られる保存されたモチーフを含有する。ＩＴＡＭのリン酸化の際に、ＣＤ３鎖は、Ｔ細胞のシグナリングカスケードに関与するキナーゼであるＺＡＰ７０（ゼータ関連タンパク質）に結合することができる。
インテグリンは、細胞と、その周囲の組織との結合を媒介する受容体であり、細胞間および細胞−マトリックス相互作用に関与する。哺乳動物においては、１８αおよび８βサブユニットが特徴付けられている。αおよびβサブユニットは両方とも、２個の別々の尾部を含有し、それらは両方とも形質膜を貫通し、小さい細胞質ドメインを有する。
【００８９】
インテグリンαＭ（ＩＴＧＡＭ；ＣＤ１１ｂ；マクロファージ−１抗原（Ｍａｃ−１）；補体受容体３（ＣＲ３））は、ヘテロ二量体インテグリンαＭβ２分子のタンパク質サブユニットである。αＭβ２の第２鎖は、共通インテグリンβ２サブユニット（ＣＤ１８）である。αＭβ２は、単球、顆粒球、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞などの多くの白血球の表面上に発現される。一般的には、αＭβ２は、白血球接着および移動を調節することにより、炎症を媒介すると考えられる。さらに、αＭβ２は食作用、細胞媒介性細胞傷害性、走化性および細胞活性化における役割を有し、ならびに不活化された補体成分３ｂ（ｉＣ３ｂ）に結合するその能力のため、補体系に関与すると考えられる。インテグリンαＭβ２のＩＴＧＡＭサブユニットは、細胞の接着および拡散を引き起こすことに直接関与するが、β２（ＣＤ１８）サブユニットの存在なくして細胞移動を媒介することはできない。
【００９０】
ＣＤ１４は、主にマクロファージによって、比較的規模は小さいが、好中球、顆粒球によって発現される細胞表面タンパク質である。ＣＤ１４＋細胞は、異なる細胞の宿主に分化することができる単球である；例えば、樹状細胞への分化は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４などのサイトカインによって促進される。ＣＤ１４は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の検出のための共受容体として（ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４およびリンパ球抗原９６（ＭＤ−２）と共に）作用する。リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）の存在下では、ＣＤ１４のみがＬＰＳに結合することができる。
ＣＤ１５（３−フコシル−Ｎ−アセチル−ラクトサミン；段階特異的胚抗原１（ＳＳＥＡ−１））は、糖タンパク質、糖脂質およびプロテオグリカン上に発現され得る炭水化物接着分子である。ＣＤ１５は、一般的には、好中球上に認められ、食作用および走化性を媒介する。
ＣＤ１６は、ナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球およびマクロファージの表面上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）である。Ｆｃ受容体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合する。
ＣＤ１９は、濾胞樹状細胞およびＢ細胞上に発現されるヒトタンパク質である。この細胞表面分子は、抗原受容体依存的刺激の閾値を低下させるためにＢリンパ球の抗原受容体と共に集合する。一般に、活性化の際に、ＣＤ１９の細胞質尾部はリン酸化されるようになり、Ｓｒｃファミリーのキナーゼによる結合およびホスホイノシチド３（ＰＩ−３）キナーゼの動員を可能にすると考えられる。
【００９１】
ＣＤ２０は、全ての成熟Ｂ細胞の表面上に発現される非グリコシル化リンタンパク質である。研究は、ＣＤ２０がＢ細胞の形質細胞への発達および分化において役割を果たすことを示唆している。ＣＤ２０は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリー（ＭＳ４Ａ）のメンバーによってコードされる。このタンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴を特徴とし、造血細胞および非リンパ系組織の間で独特の発現パターンを示す。
ＣＤ３１（血小板／内皮細胞接着分子；ＰＥＣＡＭ１）は通常、内皮細胞、血小板、マクロファージおよびＫｕｐｆｆｅｒ細胞、顆粒球、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、リンパ球、巨核球、破骨細胞および好中球上に認められる。ＣＤ３１は、組織再生および体内からの好中球の安全な除去において重要な役割を果たしている。接触の際に、マクロファージおよび好中球のＣＤ３１分子が、好中球の健康状態をマクロファージに伝えるために使用される。
【００９２】
ＣＤ３４は、造血細胞、内皮始原細胞、血管の内皮細胞、および肥満細胞上に通常認められる単量体細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ３４タンパク質は、１回通過膜貫通シアロムチンタンパク質ファミリーのメンバーであり、細胞間接着因子として機能する。研究は、ＣＤ３４もまた幹細胞の骨髄細胞外マトリックスへの結合または間質細胞への直接的な結合を媒介し得ることを示唆している。
細胞間相互作用、細胞接着および移動に関与する細胞表面糖タンパク質であるＣＤ４４（「ヒアルロナン受容体」）は、特定の型の間葉細胞を同定するために使用される。
【００９３】
ＣＤ４５（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｃ；ＰＴＰＲＣ）細胞表面分子は、造血細胞中で特異的に発現される。ＣＤ４５は、細胞外ドメイン、単一の膜貫通セグメント、および２個の並列細胞質内触媒ドメインを有するタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）であり、かくして、受容体型ＰＴＰに属する。研究は、それがＴ細胞およびＢ細胞の抗原受容体シグナリングの必須の調節因子であり、抗原受容体複合体の成分との直接的な相互作用により、または抗原受容体シグナリングにとって必要とされる様々なＳｒｃファミリーキナーゼを活性化することにより機能することを示唆している。ＣＤ４５はまた、ＪＡＫキナーゼを抑制し、かくして、サイトカイン受容体シグナリングの調節因子として機能する。ＣＤ４５ファミリーは、単一の複合遺伝子の全生成物である複数のメンバーからなる。ＣＤ４５の様々な公知のアイソフォームとしては、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）が挙げられる。様々なアイソフォームを、様々な細胞上に見出すことができる。例えば、ＣＤ４５ＲＡは、ナイーブなＴ細胞上に認められ、ＣＤ４５ＲＯは記憶Ｔ細胞上に認められる。
【００９４】
ＣＤ５６（神経細胞接着分子、ＮＣＡＭ）は、ニューロン、グリア、骨格筋およびナチュラルキラー細胞の表面上に発現される同種結合性糖タンパク質である。一般に、ＮＣＡＭは細胞間接着、神経突起伸長、およびシナプス可塑性における役割を有すると考えられる。ＮＣＡＭの３つの公知の主なアイソフォームがあり、それぞれ、その細胞質ドメインにおいてのみ異なる：ＮＣＡＭ−１２０ｋＤａ（グリコシルホスファチジル（ｐｈｏｐｈａｒｉｄｙｌ）イノシトール（ＧＰＩ）アンカー）；ＮＡＣＭ−１４０ｋＤａ（短い細胞質ドメイン）；およびＮＣＡＭ（長い細胞質ドメイン）。ＮＣＡＭの異なるドメインは、異なる役割を有し、ＩｇドメインはＮＣＡＭへの同種結合に関与し、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）ドメインは神経突起伸長をもたらすシグナリングに関与する。
ＣＤ５９は、補体媒介性溶解からヒト細胞を保護するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合膜糖タンパク質を指す。
【００９５】
ＣＤ６６抗原ファミリーは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー内に属する、がん胎児抗原ファミリーの接着分子のメンバーによって発現される造血系内の好中球特異的エピトープを同定する。全てのＣＤ６６（ａ〜ｆ）分子の細胞外部分は、ＣＤ−２ファミリーの標準的な内部ｂシートジスルフィドを欠く、Ｎ末端ＶセットＩｇＳＦドメインを有する。ＣＤ６６ａは、６０％を超える質量がシアル化されたＬｅｘ（ｓＬｅｘ、ＣＤ１５ｓ）構造を担持する、Ｎ結合グリカンによって寄与される重度にグリコシル化された１型糖タンパク質である。ＣＤ６６ａ中で、それらはさらに隔たっており、ＶｘＹｘｘＬｘ２１ＩｘＹｘｘＶ、ＳＨＩＰ−１および−２などのチロシンホスファターゼに結合するモチーフに似ている。好中球の活性化は、ＣＤ６６ａ細胞質ドメイン中のチロシン残基のリン酸化をもたらす。ＣＤ６６ａは、顆粒球および上皮細胞上に発現される。７つの機能的ながん胎児抗原（ＣＥＡ）ファミリー遺伝子のうちの４つの生成物であるＣＤ６６ａ〜ｄは、造血細胞上に発現されることが知られている。造血細胞上でのこれらの分子の発現は、一般に、骨髄系列に限定される。これらの分子は、休止している成熟顆粒球上に低レベルで存在するが、発現は、おそらく、貯蔵顆粒からのエキソサイトーシスの結果として、炎症アゴニストによる活性化後に急速に増加する。ＣＤ６６ａは、組織切片中の一部のマクロファージ上に検出され、Ｔ細胞および活性化ＮＫ細胞のサブ集団上で報告されている。
ＣＤ６６ｂ（（ＣＧＭ１）；ＣＤ６７、ＣＧＭ６、ＮＣＡ−９５）は、免疫グロブリンスーパーファミリーおよびがん胎児抗原（ＣＥＡ）様サブファミリーのメンバーであるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質である。顆粒球上に発現されるＣＤ６６ｂは、一般に、ヒト好酸球の接着および活性化の調節に関与すると考えられる。
【００９６】
ＣＤ９０またはＴｈｙ−１は、元々、胸腺細胞抗原として発見された、単一のＶ様免疫グロブリンドメインを有する、２５〜３７ｋＤａの重度にＮ−グリコシル化された、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定された保存的細胞表面タンパク質である。これは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属する。複雑な炭水化物側鎖は、組織および種の間で組成が異なる。一般に、ＣＤ９０は、造血幹細胞およびニューロン上に発現される。ＣＤ９０は、様々な線維芽細胞および間質細胞株上の、結合組織中で高度に発現され、マウスにおいては全ての胸腺細胞および末梢Ｔ細胞上に発現される。ヒトにおいては、ＣＤ９０は、少数の胎児胸腺細胞、骨髄中の血液ＣＤ３４＋細胞の１０％〜４０％、および末梢循環中のＣＤ３＋ＣＤ４＋リンパ球の１％未満の上でのみ発現される。ＣＤ９０はまた、ヒトリンパ節ＨＥＶ内皮中で発現されるが、他の内皮上では発現されず、最後に、限られた数のリンパ芽球様および白血病細胞株上で発現される。
【００９７】
ＣＤ１０５（エンドグリン）は、９０〜９５ｋＤａのジスルフィド結合したサブユニットから構成されるホモ二量体内在性膜糖タンパク質である。ヒトにおいては、それは血管内皮細胞および満期胎盤の合胞体栄養細胞上の高レベルで発現される。ヒトの心臓発生の間に、それは心臓中隔形成および弁形成の間に内皮クッション組織間葉上に高レベルで発現され、続いて、発現は弁が成熟するにつれて低下する。それはまた、前赤芽球、リンパ系および骨髄系列の白血病細胞、ならびに骨髄間質線維芽細胞の集団によって発現される。エンドグリンは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの複数のキナーゼ受容体複合体の補助タンパク質である。ＴＧＦ−β１スーパーファミリーの構造的に関連するペプチドとしては、ＴＧＦ−βアイソフォーム、β１、β２、β３、およびβ５、アクチビンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が挙げられる。ＴＧＦ−β様因子は、胚発生、器官形成、骨および軟骨のような組織の形態形成、血管形成、創傷修復および血管新生、造血、ならびに免疫調節などの生物学的プロセスを制御する、保存された増殖および分化因子の多機能セットである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドによるシグナリングは、２つのサブファミリー、Ｉ型およびＩＩ型に分割される関連するＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ受容体からなる、高親和性、リガンド誘導性の異種複合体によって媒介される。ＩＩ型受容体は、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチ領域中のＩ型受容体をリン酸転移し、活性化する。順に、Ｉ型受容体はリン酸化し、シグナルを、Ｓｍａｄと呼ばれる、最近同定された下流の標的の新規ファミリーに伝達する。エンドグリンは、ＴＧＦ−β  ＩＩ型受容体と会合することによってトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）ＴＧＦ−β１およびβ３に結合し、アクチビン−Ａと相互作用し、アクチビンＩＩ型受容体、ＡｃｔＲＩＩおよびＡｃｔＲＩＩＢを介して骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−７と相互作用し、リガンド結合Ｉ型受容体ＡＬＫ３およびＡＬＫ６と相互作用することによってＢＭＰ−２に結合する。
【００９８】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属する５５６アミノ酸の糖タンパク質であるＣＤ１６６抗原（ＡＬＣＡＭ）は、ヒトにおいては活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）遺伝子によってコードされる。それは、分泌シグナル配列、３個のＩｇ様Ｃ２型ドメインを含有する細胞外ドメイン、２個Ｉｇ様Ｖ型ドメインおよび９個の潜在的なＮ結合グリコシル化部位を含有する細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメインならびに既知のモチーフを有さない３２アミノ酸の細胞質ドメインを含有する。Ｎ末端Ｉｇドメインは、同種親和性相互作用とＣＤ１６６−ＣＤ６相互作用との両方のための結合部位である。ＣＤ１６６は、細胞質ドメインを介してアクチン細胞骨格に固定されるが、この相互作用に関与する受容体は不明である。可溶性ＣＤ１６６は、細胞外ドメインのタンパク質分解的切断によって、または選択的スプライシングによって産生される。それは間葉系幹細胞および始原細胞上ならびに皮質胸腺上皮細胞および髄質胸腺上皮細胞、ニューロン、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、線維芽細胞、内皮、上皮、多能性幹細胞、胚盤胞および子宮内膜を含む造血細胞の原始的サブセット上で発現される。
【００９９】
ＴＲ２、ヘルペスウイルス進入メディエータＡ（ＨＶＥＭＡ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１４、ＴＮＦＲＳＦ１４、腫瘍壊死因子受容体様２としても知られるＣＤ２７０は、約３０ｋＤの推定分子量を有する２個のＴＮＦ受容体ドメインを含有するＩ型膜貫通タンパク質である。ＨＶＥＭは、血管、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、前立腺、脾臓、胸腺および他の臓器中で広く発現される。休止Ｔ細胞およびナイーブな記憶Ｂ細胞も同様に高レベルのＨＶＥＭを発現する。ヒトにおいては、ＨＶＥＭは胚中心Ｂ細胞中では発現されない。未熟樹状細胞は、成熟の際に下方調節される高レベルのＨＶＥＭを発現する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、それはＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＢおよびＴリンパ球関連タンパク質（ＢＴＬＡ）、ならびにエストロゲン受容体アルファと直接相互作用することが示されている［http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd270-hvem-tr2-antibody-3873.html］。
本明細書で使用される用語「ＣＸＣＲ−４」とは、Ｇタンパク質結合ケモカイン受容体を指す。Ｇタンパク質共役ＣＸＣＲ４に結合するアルファ−ケモカインである間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）は、幹細胞／始原細胞輸送の調節において重要な役割を果たしている。
本明細書で使用される用語「細胞」とは、生きている生物の構造的および機能的単位を指し、生きているものとして分類される生物の最小単位である。
本明細書で使用される用語「ケモカイン」とは、特定の方向に移動するように白血球にシグナルを伝達する走化性サイトカインのクラスを指す。
用語「走化性」または「化学走性」とは、それが誘引的と見なす環境条件に向かう、および／またはそれが不快と見る周囲からの化学的濃度勾配に沿った運動性細胞またはその一部の指向的運動を指す。
本明細書で使用される用語「クローン形成能」およびその他の文法的形態は、自己再生による細胞のコロニーを産生する単一の幹細胞の特性を指す。
本明細書で使用される用語「成分」とは、構成要素、エレメントまたは成分を指す。
【０１００】
本明細書で使用される用語「結合ペプチド」または「Ｃペプチド」とは、プロインスリン分子中でインスリンのＡ鎖をそのＢ鎖に接続する短い３１アミノ酸のポリペプチドを指す。それは、糖尿病のような自己免疫疾患におけるマーカーとして使用される。レベルの増大は、それらが等モル量で放出され、患者にとって良好な転帰をもたらすインスリン放出の指標である。非常に低いＣペプチドは、１型糖尿病およびインスリン依存性を確認するものであり、高いグルコース変動性、グルコース恒常性の欠如および転帰不良を伴う合併症の増加と関連する。Ｃペプチドレベルの測定値は、適切なβ細胞機能の評価によって臨床的に検証される［Wahren J. et al., "The clinical potential of C-peptide in replacement in type 1 diabetes", Diabetes, Vol. 61(4), 761-772, (2012)］。
本明細書で使用される用語「接触」およびその様々な文法的形態は、接触またはすぐ近く、もしくは部分的な近くの状態または条件を指す。ある組成物と標的との接触は、当業者には公知の任意の投与手段によって行うことができる。
用語「臍帯血由来幹細胞（ＣＢ−ＳＣ）」および「臍帯血単核細胞」（ＣＢＭＣ）は、用語「臍帯血単核幹細胞」と互換的に使用される。
【０１０１】
本明細書で使用される用語「サイトカイン」とは、他の細胞に対する様々な効果を有する細胞によって分泌される低分子可溶性タンパク質物質を指す。サイトカインは、増殖、発生、創傷治癒、および免疫応答を含む多くの重要な生理学的機能を媒介する。それらは、細胞膜に位置するその細胞特異的受容体への結合によって作用し、異なるシグナル伝達カスケードを細胞中で開始させ、最終的には、標的細胞中での生化学的および表現型的変化をもたらすであろう。一般に、サイトカインは局所的に作用する。それらは、多くのインターロイキン、ならびにいくつかの造血性増殖因子を包含するＩ型サイトカイン；インターフェロンおよびインターロイキン−１０を含むＩＩ型サイトカイン；ＴＮＦαおよびリンホトキシンを含む腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）関連分子；インターロイキン１（「ＩＬ−１」）を含む免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー；ならびに様々な免疫および炎症機能において重要な役割を果たす分子ファミリーであるケモカインを含む。同じサイトカインは、細胞の状態に応じて細胞に対する異なる効果を有してもよい。サイトカインは、他のサイトカインの発現を調節し、そのカスケードを誘発することが多い。サイトカインの非限定例としては、例えば、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３  Ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇｒｏアルファ、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−アルファが挙げられる。
【０１０２】
本明細書で使用される用語「由来する」は、供給源から何かを受け取る、取得する、または改変するための任意の方法を包含する。例えば、血小板様画分に由来する血小板様細胞は、臍帯血に由来してもよく、血小板様細胞が、直接的に、または間接的に、臍帯血から来たことを意味する。別の例として、全血小板様細胞、溶解した血小板様細胞、エキソソーム、マイクロパーティクル、核酸、増殖因子などを含む血小板様細胞の成分は臍帯血に由来してもよく、これらの成分のそれぞれが、直接的または間接的に、臍帯血から来たことを意味する。別の例として、溶解した血小板様細胞は、全血小板様細胞に由来してもよく、溶解した血小板様細胞が、直接的または間接的に、全血小板様細胞から来たことを意味する。
用語「検出可能マーカー」は、選択マーカーと、アッセイマーカーとの両方を包含する。用語「選択マーカー」とは、薬物耐性マーカー、蛍光活性化細胞選別において有用な抗原性マーカー、選択的接着を可能にする接着リガンドのための受容体などの接着マーカーなどの発現構築物で形質転換された細胞を選択またはスクリーニングすることができる様々な遺伝子産物を指す。
【０１０３】
用語「検出可能応答」とは、検出試薬を用いて、または用いずに実施することができるアッセイにおいて検出することができる任意のシグナルまたは応答を指す。検出可能応答としては、限定されるものではないが、放射性崩壊およびエネルギー（例えば、蛍光、紫外線、赤外線、可視光線）放出、吸収、偏光、蛍光、リン光、伝送、反射または共鳴移動が挙げられる。検出可能応答としては、クロマトグラフィー移動度、濁度、電気泳動移動度、質量スペクトル、紫外スペクトル、赤外スペクトル、核磁気共鳴スペクトルおよびｘ線回折も挙げられる。あるいは、検出可能応答は、融点、密度、伝導率、表面音響波、触媒活性または元素組成などの生物材料の１つまたは複数の特性を測定するためのアッセイの結果であってもよい。「検出試薬」は、目的の物質の存在または非存在を示す検出可能応答を生成する任意の分子である。検出試薬は、抗体、核酸配列および酵素などの様々な分子のいずれかを含む。検出を容易にするために、検出試薬は、マーカーを含んでもよい。
本明細書で使用される用語「示差標識」とは一般的には、単一の細胞または生物の構造、成分またはタンパク質を特徴付ける、または対比するために使用される染料、色素、マーカー、または抗体を指す。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「分化」とは、より特殊化された機能を伴う、細胞または組織の編成または複雑性のレベルの増加を示す発生のプロセスを指す。本明細書で使用される用語「分化誘導因子」とは、細胞分化のプロセスの直接的または間接的な原因物質である化合物を指す。「分化誘導因子」は、分化を引き起こすのに十分であるが、分化にとって必須ではない。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「富化する」とは、所望の物質の割合を増加させること、例えば、細胞集団中のその天然の頻度と比較して細胞のサブタイプの相対頻度を増加させることを指す。陽性選択、陰性選択、またはその両方が、任意の富化スキームにとって必要であると一般的に考えられる。選択方法としては、限定されるものではないが、磁気分離およびＦＡＣＳが挙げられる。富化のために使用される特定の技術に関係なく、発生段階および活性化特異的応答は細胞の抗原プロファイルを変化させ得るため、選択プロセスにおいて使用される特定のマーカーが重要である。一部の実施形態によれば、陰性磁気選択を、抗体により印を付けられた細胞集団を、抗体タグに結合する常磁性粒子の懸濁液と混合することによって達成することができる。次いで、磁場の適用は、印を付けられていない細胞からビーズ−細胞凝集体を分離し、吸引により収集することができる。一部の実施形態によれば、陽性磁気選択を、目的の細胞を、既知の細胞マーカーを指向する抗体標識磁気粒子で標識することによって達成することができる；一般に、選択された細胞の生物学に対する抗体−粒子複合体の潜在的な効果を最小化するために、小さい粒子（例えば、５０ｎｍ）が使用される（Spangrude, Gerald J. and Slayton, William B, "Isolation and Characterization of Hematopoietic Stem Cells," Handbook of Stem Cells, Vol. 2, Robert Paul Lanza, Ed. Elsevier Inc. (2004) Chapter 54, pages 610-11）。市販の磁気陽性選択システムは、例えば、磁場が、標識された細胞と磁化されたカラムマトリックスとの間の距離が短い高流量磁場を作出する誘導によって導入される、線維性金属を充填したフローカラムを使用する。これにより、カラム中に標識された細胞が保持される。一度、未標識細胞がカラムを通過し、洗浄除去されたら、カラムを磁場から取り出し、選択された細胞を収集する。一部の実施形態によれば、ＦＡＣＳ分離は、様々な表面マーカーの陽性および陰性選択の同時的適用を可能にする。一部の実施形態によれば、ＦＡＣＳによる陽性および陰性選択を、同じ抗体組合せを使用して磁気選択を置換することによって改変することができる。一部のそのような実施形態によれば、コンジュゲートしていない一次抗体を、陰性選択のために二次免疫グロブリンにコンジュゲートした磁気ビーズを共に使用する；陽性選択のために、ビオチン化された抗体、次いで、アビジンコンジュゲート化微小ビーズを使用するアビジン−ビオチンシステムを使用することができる。一部の実施形態によれば、陰性選択を、ＦＡＣ選別の前に使用して、試料の細胞性を低下させることができる。一部の実施形態によれば、陽性選択にかけた試料を、続いて、ＦＡＣＳにより特定の細胞サブセットを単離するためにプロセッシングすることができる。ＦＡＣＳ前の標的集団の予備富化は、単離された細胞集団の最終的な純度に対する有意な影響を有してもよい。
【０１０６】
本明細書で使用される用語「因子」は、化学的または物理的効果を有する非生物成分を指す。例えば、「パラクリン因子」は、組織中の別の細胞型に対して作用するある細胞型から分泌される拡散性シグナリング分子である。「転写因子」は、特定のＤＮＡ配列に結合し、それによって、ＤＮＡからｍＲＮＡへの遺伝子情報の転移を制御するタンパク質である。
本明細書で使用される用語「断片」とは、より大きい単位の所望の生物学的活性を保持するより大きい単位に由来する、それから切断された、またはそれから破壊された小さい部分を指す。
【０１０７】
本明細書で使用される用語「フローサイトメトリー」とは、細胞の表現型および特徴を尋問するための手段を指す。それは、細胞または粒子が感知領域を通過したレーザー（放射線の刺激された放出による光増幅）／光線を通る液体流中で移動する際にそれらを感知する。顕微鏡粒子の相対的光散乱および色で識別される蛍光を測定する。細胞のフロー分析および分化は、サイズ、粒度、および細胞が抗体または色素のいずれかの形態で蛍光分子を運搬しているかどうかに基づく。細胞がレーザー光線を通過する際に、光はあらゆる方向に散乱し、軸から低い角度（０．５〜１０°）で前方方向に散乱した光は、球体の半径の二乗に比例し、したがって、細胞または粒子のサイズに比例する。光は細胞に進入することができる；かくして、９０°の光（右角、側方）散乱を、蛍光色素結合抗体で標識するか、または蛍光膜、細胞質、または核色素で染色することができる。かくして、細胞型の分化、膜受容体および抗原、膜電位、ｐＨ、酵素活性、およびＤＮＡ含量の存在を容易化することができる。フローサイトメーターは、各細胞上でのいくつかの測定値を記録する、多パラメータである；したがって、異種集団内の同種下位集団を同定することができる［Marion G. Macey, Flow cytometry: principles and applications, Humana Press, 2007］。サイズまたは密度によって分離しようとする物理的特徴において似すぎている異なる細胞集団の単離を可能にする蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、示差的に発現される表面タンパク質を検出するための蛍光タグを使用し、細胞の物理的に均一な集団間で微細な区別を行うことができる。
用語「機能的等価物」または「機能的に等価な」は、類似するか、または同一の効果または使用を有する物質、分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指すように本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される用語「増殖因子」とは、細胞内シグナリング経路を誘発し、増殖、分化、または他の細胞応答を誘導する細胞表面受容体に結合する細胞外ポリペプチド分子を指す。増殖因子としては、限定されるものではないが、サイトカインおよびホルモンが挙げられる。
【０１０８】
用語「造血幹細胞（ＨＳＣ）」とは、自身を再生し、様々な特殊化された細胞に分化し、骨髄から循環血液中に移動し、プログラム細胞死（アポトーシス）を受けることができる血液または骨髄から単離される細胞を指す。記載される発明の一部の実施形態では、ヒト対象に由来する造血幹細胞は、限定されるものではないが、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ５９、Ｓｃａ−１、Ｔｈｙ−１、および／またはＣＸＣＲ−４、またはその組合せなどの、少なくとも１つの型の細胞表面マーカーを発現する。
【０１０９】
本明細書で使用される用語「単離された」とは、限定されるものではないが、機械的分離または選択的培養などの１つまたは複数の単離方法による集団からの細胞の分離を指す。細胞の「単離された」集団は、純粋である必要はない。他の細胞型が存在してもよい。一部の実施形態によれば、特定の細胞型の単離された集団は、１０％を超えて純粋、２０％を超えて純粋、３０％を超えて純粋、４０％を超えて純粋、５０％を超えて純粋、６０％を超えて純粋、７０％を超えて純粋、８０％を超えて純粋、９０％を超えて純粋、または９５％を超えて純粋であることを指す。
本明細書で使用される用語「標識化」とは、追跡可能な構成要素を導入することによって化合物、構造、タンパク質、ペプチド、抗体、細胞または細胞成分を識別するプロセスを指す。一般的な追跡可能な構成要素としては、限定されるものではないが、蛍光抗体、フルオロフォア、色素または蛍光色素、染料または蛍光染料、マーカー、蛍光マーカー、化学染料、分別染料、分別標識、および放射性同位体が挙げられる。
本明細書で使用される用語「不安定」とは、分解の増加を受けやすいことを指す。
【０１１０】
用語「マーカー」または「細胞表面マーカー」は、特定の細胞型の表面上に認められる抗原決定基またはエピトープを指すように本明細書で互換的に使用される。細胞表面マーカーは、細胞型の特性評価、その同定、および最終的にはその単離を容易にすることができる。細胞選別技術は、細胞表面マーカーを陽性選択または陰性選択のいずれかのために、すなわち、細胞集団からの含有または排除のために使用することができる細胞バイオマーカーに基づくものである。
用語「マトリックス」とは、何かが含有される、または包埋される周囲の物質を指す。
本明細書で使用される用語「機械的撹拌」とは、機械的手段によって組織が物理的に振とうまたはかき混ぜられるプロセスを指す。そのような機械的手段としては、限定されるものではないが、ミキサーまたは他の機械的デバイスが挙げられる。
本明細書で使用される用語「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」とは、様々な組織中に認められる非血液性成体幹細胞を指す。それらは、その紡錘状の形態；その細胞表面上での特定のマーカーの発現により；および適切な条件下で少なくとも３つの系列（骨形成、軟骨形成および脂肪生成）に沿って分化するその能力を特徴とする。骨または軟骨に言及する場合、単一のＭＳＣは培地に応じて、軟骨細胞または破骨細胞に分化する能力を示したため、ＭＳＣは一般的には、骨軟骨形成性、骨形成性、または軟骨形成性として知られる。
【０１１１】
ＭＳＣは、インターロイキン６、７、８、１１、１２、１４、および１５、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦおよびＭＣＰ１などの多くの生物学的に重要な分子を分泌する（Majumdar, et al., J. Cell Physiol. 176: 57-66 (1998)、Kinnaird et al, Circulation 109: 1543-49 (2004)）。２００４年に、ＭＳＣ表現型の多様な参照文献のコンセンサスがないため、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＳＣを明確に同定する単一のマーカーは未だ同定されていないと報告された。Baksh, et al., J. Cell. Mol. Med. 8(3):  301-16, 305 (2004)。一般に、ＭＳＣは典型的な造血抗原、すなわち、ＣＤ１４、ＣＤ３４、およびＣＤ４５を欠くという合意がある（同上、Pittenger, M.F. et al., Science 284: 143-47 (1999)を引用）。
本明細書で使用される用語「多系列分化能力」とは、異なる型の成熟子孫を生成する単一幹細胞の特性を指す。
本明細書で使用される用語「多能性」とは、間葉系幹細胞および複数の細胞系列に分化することができるが、３つの胚葉に由来する全ての系列には分化することができないいくつかの他の成体幹細胞などの細胞を指す。
本明細書で使用される用語「非拡張」とは、細胞集団中の細胞数を増加させるために培養物（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で増殖させていない細胞集団を指す。
【０１１２】
本明細書で使用される用語「血小板由来増殖因子」（ＰＤＧＦ）とは、結合組織細胞およびある特定の他の細胞型のための主要なマイトジェンを指す。それは、ホモおよびヘテロ二量体に結合する、ジスルフィド結合した、構造的に類似するＡおよびＢポリペプチド鎖からなる二量体分子である。ＰＤＧＦアイソフォームは、２つの構造的に関連するタンパク質チロシンキナーゼ受容体であるα受容体およびβ受容体に結合し、これらを活性化することによってその細胞効果を発揮する。ＰＤＧＦ受容体の活性化は、細胞増殖の刺激を誘導するが、細胞形状および運動性の変化も誘導する；ＰＤＧＦは、アクチンフィラメントシステムの再編成を誘導し、走化性を刺激する、すなわち、ＰＤＧＦの勾配に向かう指向的細胞移動を刺激する。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＰＤＧＦは、胚発生において、および創傷治癒の間に役割を果たしている。
【０１１３】
本明細書で使用される用語「血液の血小板に富む画分」または「血小板に富む血液画分」または「血小板に富む画分」は、血小板が画分中の総細胞数の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を占める、血液の１つまたは複数の成分を分離する分画方法により得られるヒトまたは動物の血液の画分を指す。血液の血小板に富む画分は、限定されるものではないが、血清、始原細胞を含む単核細胞、顆粒球、赤血球、マイクロパーティクル、エキソソーム、タンパク質（例えば、増殖因子、転写因子）、脂質、および核酸などの、血液の他の成分を含んでもよい。血液の血小板に富む画分をさらにプロセッシングして、血小板に富む画分中に存在する血液の１つまたは複数の成分を単離または除去することができる。非限定例として、一部の実施形態によれば、血液の血小板に富む画分を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配分離によって取得することができる。一部の実施形態によれば、血液のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離された画分は、（上から下へ）血漿画分、単核細胞画分、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ媒体画分、および顆粒球／赤血球画分を含んでもよい。一部の実施形態によれば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離された血液の血小板に富む画分は、１つまたは複数の血漿画分および単核細胞画分を含む。一部の実施形態によれば、臍帯血に由来する血小板に富む画分は、臍帯血血小板様細胞を含む。
【０１１４】
本明細書で使用される用語「血小板様細胞」とは、血小板機能（例えば、接着、活性化、凝集）を行うことができる、または１つもしくは複数の血小板マーカー、血小板増殖因子、もしくは血小板核酸を含む、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配の血小板に富む画分中の細胞を指す。この定義のために、血小板様細胞は、細胞前駆体および１つまたは複数のエキソソームまたはマイクロパーティクルを含む。
本明細書で使用される用語「多能性」とは、身体の臓器、神経系、皮膚、筋肉および骨格を形成する、３つの胚葉の全ての細胞に発生する能力を指す。例としては、胚盤胞、胚性幹細胞の内部細胞塊、およびｉＰＳ細胞などの再プログラミングされた細胞が挙げられる。
【０１１５】
本明細書で使用される用語「始原細胞」とは、分化することだけはできるが、最早自身を再生することはできない、幹細胞の初期子孫を指す。始原細胞は、前駆細胞に成熟し、成熟表現型に成熟する。造血始原細胞は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）またはコロニー形成細胞（ＣＦＣ）と称される。特定の系列の始原細胞は、限定されるものではないが、ＣＦＵ−Ｅ（赤血球）、ＣＦＵ−Ｆ（線維芽細胞）、ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球／マクロファージ）、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭ（多能性造血始原細胞）などの接尾辞によって示される。血小板系列の例としては、限定されるものではないが、共通骨髄始原細胞（ＣＭＰ）、巨核球／赤血球始原細胞（ＭＥＰ）、巨核球−赤血球始原細胞（ＭｅｇＥ）、および巨核球系列に決定された始原細胞（ＭＫＰ）が挙げられる。
本明細書で使用される用語「増殖させる」とは、任意のプロセスによって数、量または程度を複製する、増加させる、または増大させることを指す。
本明細書で使用される用語「精製」とは、外来、外部、または好ましくないエレメントから単離する、または遊離させるプロセスを指す。
本明細書で使用される用語「自己再生」とは、親細胞と同じ特性を有する幹細胞の大規模な増殖および生成の能力を指す。
【０１１６】
用語「幹細胞」とは、多系列に分化することができる自己再生およびクローン形成特性と共に高い増殖能力を有する未分化の細胞を指す。幹細胞は、２つの特徴によって他の細胞型と区別される。第１に、それらは、時には長期間活動しない後でも、細胞分裂によって自身を再生することができる特殊化されていない細胞である。第２に、ある特定の生理学的または実験的条件下で、それらを特殊な機能を有する組織または臓器特異的細胞になるように誘導することができる。腸および骨髄などの一部の臓器では、幹細胞は規則的に分裂して疲弊した、または損傷した組織を修復し、置き換える。しかしながら、膵臓および心臓などの他の臓器では、幹細胞は特殊な条件下でのみ分裂する。
本明細書で使用される用語「分化全能性」とは、胚および胎盤のトロホブラストを形成することができる幹細胞を指す。
本明細書で使用される用語「トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）シグナリング経路」とは、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、細胞恒常性および他の細胞機能などの、成体生物と、発生中の胚との両方における多くの細胞プロセスに関与するシグナリング経路を指す。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドは、Ｉ型受容体を動員し、リン酸化するＩＩ型受容体に結合する。次いで、Ｉ型受容体は、受容体により調節されるＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ）をリン酸化し、ここで、ｃｏＳＭＡＤ  ＳＭＡＤ４に結合することができる。Ｒ−ＳＭＡＤ／ｃｏＳＭＡＤ複合体は、核に蓄積し、そこでそれらは転写因子として作用し、標的遺伝子発現の調節に関与する。
本明細書で使用される用語「分化単能性」とは、ただ１つの成熟細胞系列に分化することができる細胞を指す。
【０１１７】
成体単核細胞を再プログラミングするための方法
一態様によれば、成体単核細胞を再プログラミングするための方法は、以下を含む。
１．血小板に富む画分を単離するためにＵＣ血細胞または成体末梢血細胞を準備する。
２．ＵＣ血細胞または成体末梢血細胞から、血小板様細胞を含む血小板に富む画分を収集する。
３．対象由来末梢血を準備し、対象の末梢血から単核細胞画分を収集する。
４．再プログラミングにとって好適な細胞の対象の単核細胞画分と、血小板に富む画分とを接触させる。
５．接触は、バイオマーカーによって同定することができる細胞を再プログラミングするのに有効である。
６．場合により、再プログラミングされた成体単核細胞を拡張する。
【０１１８】
一部の実施形態によれば、再プログラミングにとって好適な細胞の単核細胞画分は、成体単核細胞を含有する。一部の実施形態によれば、成体単核細胞は、末梢血、骨髄、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、脳、脊髄、甲状腺、肺、胃腸、または自己免疫疾患によって影響され得る任意の他の身体部分から単離される。
一部の実施形態によれば、ＵＣ血細胞または成体末梢血細胞の収集ステップは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配によって実施される。一部の実施形態によれば、臍帯血または成体末梢血の血小板に富む画分は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配の画分から得られる。
一部の実施形態によれば、成体単核細胞と、臍帯血の血小板に富む画分との接触は、臍帯血の血小板に富む画分の１つまたは複数の成分を成体単核細胞に移動させるのに有効である。
【０１１９】
一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、３７℃で１０分〜２時間、２ｍＭ  ＣａＣｌ2の存在下で行われる（Baj-Krzyworzeka et al., Platelet derived microparticles stimulate proliferation, survival, adhesion, and chemotaxis of hematopoietic cells, Exp. Hematology 30 (2002) 450-459）。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも１０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも２０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも３０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも４０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも５０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも６０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも７０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも８０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも９０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも１００分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも１１０分間である。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、血小板に富む画分との接触は、少なくとも１２０分間である。
【０１２０】
一部の実施形態によれば、接触は、３７℃で撹拌せずに細胞懸濁液中で行われる。一部の実施形態によれば、血小板様細胞を含む血小板に富む画分は、接触の前に活性化される。一部の実施形態によれば、接触は、血小板の食作用にとって十分な時間；例えば、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間にわたって３７℃で撹拌せずに細胞懸濁液中で行われる。
一部の実施形態によれば、単離された単核細胞の接触は、溶解された血小板に富む画分とのものである。一部の実施形態によれば、血液の血小板に富む画分を、全細胞溶解バッファーを用いて溶解する。一部の実施形態によれば、血液の溶解された血小板に富む画分を、遠心分離によって清澄化する。
【０１２１】
一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも１０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも２０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも３０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも４０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも５０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも６０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも７０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも８０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも９０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも１００分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも１１０分間にわたる。一部の実施形態によれば、単離された単核細胞と、溶解された血小板に富む画分との接触は、少なくとも１２０分間にわたる。
一部の実施形態によれば、接触ステップの後、単離された単核細胞をバッファー中で洗浄した後、培養して、再プログラミングされた細胞の総数を拡張する。
【０１２２】
一部の実施形態によれば、成体単核細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態によれば、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの単離された成体ＰＢＭＣと、臍帯血の血小板に富む画分とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣおよび臍帯血の血小板に富む画分は、遺伝的に異なる個体に由来する。一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣおよび臍帯血の血小板に富む画分は、同じ個体に由来する。
一部の実施形態によれば、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの単離された成体末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、臍帯血に由来する血小板様細胞の富化された集団とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣを、接触前にトリプシン／ＥＤＴＡで処理して、ＰＢＭＣの表面から成熟または成体血小板を除去する。
【０１２３】
一部の実施形態によれば、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの成体末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、血液の血小板に富む画分の溶解物とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、末梢血単核細胞を、血液の血小板に富む画分に由来する全細胞溶解物と接触させる。一部の実施形態によれば、血液の血小板に富む画分の溶解物は、ミトコンドリアおよびアルファ顆粒内容物を含む。一部の実施形態によれば、接触は、ＰＢＭＣと、血液の血小板に富む画分の溶解物の１つまたは複数の成分とを融合させることを含む。
【０１２４】
一部の実施形態によれば、方法は、成体末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、血小板に富む画分に由来する１つまたは複数のマイクロパーティクルおよびエキソソームと接触させることを含む。一部の実施形態によれば、マイクロパーティクルおよびエキソソームは、臍帯血の血小板に富む画分に由来する。一部の実施形態によれば、マイクロパーティクルおよびエキソソームは、１つまたは複数の胚性幹細胞様ｍＲＮＡおよびタンパク質を含む。一部の実施形態によれば、マイクロパーティクルおよび／またはエキソソームは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−ベータなどの増殖因子；ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）などの免疫応答因子；Ｒａｎｔｅｓ（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ２３、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＲ４、ＰＦ−４（ＣＸＣＬ４）、ＴＮＦ−ＲＩ−ＩＩ、ＩＬ−１ベータ、ＣＸ３ＣＲ１、およびベータ−トロンボグロブリンなどのケモカイン／サイトカイン；ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ｃ５ｂ−９、Ｃ１ｑ、Ｃ３Ｂ、Ｃ１−ＩＮＨ、Ｈ因子などの補体タンパク質；カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、ＦａｓＲ（ＣＤ９５）などのアポトーシスマーカー；Ｆｖａ、ＦＶＩＩＩ、ＴＦＰＩ、ＴＦ、ＰＡＲ−１、ＦＸＩＩＩＡなどの凝固因子；ＰＤＩ、１２−ＬＯ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ｉＮＯＳ２、へパルナーゼなどの活性酵素；アルファ−ｌｉｂ／ベータ３（ＣＤ４１／ＣＤ６１）、ＧＰＩｂ（ＣＤ４２ｂ）、ＧＰＩＸ（ＣＤ４２Ａ）、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、ＧＰＩＩＩｂ（ＣＤ３６）、ＣＤ４９、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＣＤ９、ＪＡＭ−Ａ、ｖＷＦ、フィブリノゲン、トロンボスポンジン、ビトロネクチンなどの接着タンパク質；ＰＳ、ＡＡ、ＬＰＡ、ＴＸＡ２などの生物活性脂質；Ｐｅｔａ−３（ＣＤ１５１）、ＣＤ６３、ＰＰＡＲ−ガンマ、ＴＩＭＰ３、ラクトアドへリン、ＰＡＩ−１、ＰｒＰＣ、ベータ２ＧＰＩなどの他の混合マーカーのうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態によれば、方法は、成体末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、血小板様細胞のアルファ顆粒とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、アルファ顆粒を、臍帯血の血小板に富む画分から獲得する。
【０１２５】
一部の実施形態によれば、ヒト血液の血小板に富む画分は、血小板、血小板様細胞または幹細胞と関連する他の成分を含む。一部の実施形態によれば、ヒト血液の血小板に富む画分は、誘導多能性幹細胞再プログラミングの基礎となるシグナリング経路と関連する細胞シグナリング分子を含む。一部の実施形態によれば、ヒト血液の血小板に富む画分は、胚性幹細胞マーカーを含む血小板様細胞を含む。一部の実施形態によれば、ヒト血液の血小板に富む画分は、転写因子ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２を含む（図１Ａおよび１Ｂを参照）。一部の実施形態によれば、ヒト血液の血小板に富む画分は、タンパク質ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＣＲＩＰＴＯ、ＧＡＴＡ−４、およびＣ−ｍｙｃのうちの１つまたは複数を含む（図１Ｃを参照）。一部の実施形態によれば、ヒト血液の血小板画分は、タンパク質ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＣ−ｍｙｃのうちの１つまたは複数を含む（図１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆを参照）。
一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣは、マーカーＣＤ１４、ＣＤ６６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ４１ｂ、およびＣＤ４２ａのうちの１つまたは複数を含む。
【０１２６】
一部の実施形態によれば、方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、血液の血小板に富む画分とを接触させて、単球およびマクロファージをより幹細胞のような状態に再プログラミングすることを含む。一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣを、血液の血小板に富む画分と接触させて、単球およびマクロファージを、末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ−ＩＰＣ）に再プログラミングする。一部の実施形態によれば、方法は、ＰＢＭＣと、血液の血小板に富む画分とを接触させることを含み、１つまたは複数の転写因子および核酸が血小板に富む画分から単核細胞に移動する。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来する血小板様細胞は、ＰＢＭＣと融合し、それによって、血小板に由来する転写因子および核酸をＰＢＭＣに移動させる。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来するマイクロパーティクルは単核細胞と融合し、それによって、１つまたは複数の転写因子および核酸をＰＢＭＣに移動させる。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来するエキソソームは、ＰＢＭＣと融合し、それによって、１つまたは複数の転写因子または核酸を移動させる。
一部の実施形態によれば、血液の血小板に富む画分と接触させて、テトラスパニンＣＤ９、白血球共通抗原ＣＤ４５、および幹細胞因子受容体ＣＤ１１７のうちの１つまたは複数を展示することによって、ＰＢＭＣを再プログラミングする。
【０１２７】
血小板に富む画分と接触させたＰＢ−ＩＰＣ
一部の実施形態によれば、方法は、末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ−ＩＰＣ）と、血小板に富む細胞画分とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣを、疎水性表面を有する容器内に培養することによって単離されたＰＢ−ＩＰＣを誘導する。一部の実施形態によれば、ＰＢ−ＩＰＣを、成体ヒト末梢血の試料を準備すること；試料から赤血球を除去して、単核細胞を取得すること；正味の正電荷を有する疎水性表面上の単核細胞を培養すること、および表面に結合した細胞集団を取得することによって取得することができる（全体が参照により本明細書に組み込まれるZhou Y. et al.の米国特許第８，８３５，１６３号）。
【０１２８】
一部の実施形態によれば、方法は、ＰＢＭＣから単離されたＰＢ−ＩＰＣと、臍帯血の血小板に富む画分とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、方法は、ＰＢＭＣから単離されたＰＢ−ＩＰＣと、臍帯血の血小板に富む画分から獲得された１つまたは複数のマイクロパーティクルおよびエキソソームとを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、方法は、ＰＢＭＣから単離されたＰＢ−ＩＰＣと、成体末梢血から獲得された１つまたは複数のマイクロパーティクルおよびエキソソームとを接触させることを含む。
【０１２９】
一部の実施形態によれば、方法は、末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ−ＩＰＣ）と、血液の血小板に富む画分とを接触させて、インスリン産生の能力を増強することを含む。一部の実施形態によれば、ＰＢ−ＩＰＣは、造血マーカーＣＤ９、ＣＤ４５、およびＣＤ１１７と共に、ＯＣＴ−４およびＮＡＮＯＧを含む胚性幹細胞関連転写因子を展示する。一部の実施形態によれば、ＰＢ−ＩＰＣは造血幹細胞マーカーＣＤ３４ならびにリンパ球および単球／マクロファージマーカーの発現を欠く。一部の実施形態によれば、ＰＢ−ＩＰＣは、ベータ細胞特異的インスリン遺伝子転写因子およびプロホルモン転換酵素の発現、インスリンの産生、ならびにインスリン顆粒の形成などの膵島ベータ細胞始原細胞の特徴を示す。一部の実施形態によれば、ＰＢ−ＩＰＣは、糖尿病マウスへの移植後に、高血糖を軽減し、膵島に移動する能力を有する。
一部の実施形態によれば、本発明は、成体血液に由来するＰＢ−ＩＰＣと、臍帯血の血小板に富む画分または成体血液の血小板に富む画分とを接触させることにより、ＰＢ−ＩＰＣのインスリン産生特性を増強し、高血糖を軽減し、膵島に移動する能力を改善する方法を開示する。一部の実施形態によれば、ＰＢ−ＩＰＣを、全臍帯血または全成体血液から直接得る。一部の実施形態によれば、ＰＢ−ＩＰＣを、疎水性組織培養表面上で単核細胞を培養することによって全血から単離する。一部の実施形態によれば、ＰＢ−ＩＰＣを、血液の血小板に富む画分と接触させ、１つまたは複数の転写因子および核酸を血小板に富む画分からＰＢ−ＩＰＣに移動させる。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来する血小板様細胞は、ＰＢ−ＩＰＣと融合し、それによって、転写因子および核酸を血小板様細胞からＰＢ−ＩＰＣに移動させる。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来するマイクロパーティクルは、ＰＢ−ＩＰＣと融合し、それによって、１つまたは複数の転写因子または核酸を、ＰＢ−ＩＰＣに移動させる。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来するエキソソームはＰＢ−ＩＰＣと融合し、それによって、１つまたは複数の転写因子または核酸を移動させる。
一部の実施形態によれば、血小板に富む画分と接触したＰＢ−ＩＰＣは、膵島に移動し、インスリンの機能的産生細胞になる増強された能力を有する。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分と接触したＰＢ−ＩＰＣは、ベータ細胞に分化する。
【０１３０】
接触の結果：
一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣと、ヒト血液の血小板に富む画分との接触は、線維芽細胞様マクロファージを産生する。
一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣと、血液の血小板に富む画分との接触は、未分化の細胞および／または分化した細胞の特定のマーカーについてある割合の細胞を含む細胞集団を産生する。例えば、Ｏｃｔ４などの未分化細胞のマーカー、ネスチンおよびＮｇｎ−３などの神経始原細胞マーカー、ならびにベータ−チューブリンおよびＴＰＨ２などの成熟ニューロンマーカーのマーカーに関する転写産物の相対比率を、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。また、未分化細胞のマーカーの産生および局在化を、免疫細胞化学によって評価することができる。
【０１３１】
未分化細胞および分化した細胞のマーカーを、特定のマーカーについて特異的な抗体を使用する抗体に基づく検出技術などの様々な方法のいずれかによってアッセイする。抗体に基づく技術としては、免疫蛍光および免疫ブロッティングが挙げられる。さらなるアッセイとしては、特定のマーカーをコードするｍＲＮＡの検出のためのアッセイが挙げられる。そのようなアッセイとしては、ポリメラーゼ連鎖反応、ブロットハイブリダイゼーション（ノーザンブロットとしても知られる）およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。これらのアッセイおよび他のそのようなアッセイの詳細は、本明細書ならびにJ. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd ed., 2001；F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th ed., 2002；およびE. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988などの標準的な参考文献に記載されている。
【０１３２】
一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣと、血液の血小板に富む画分との接触は、ＰＢＭＣを含む以下の細胞型：単球、マクロファージ、およびリンパ球のうちの１つまたは複数の再プログラミングをもたらす。一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣと、血液の血小板に富む画分との接触は、ＰＢＭＣを含む１つまたは複数の細胞型の、機能的なインスリン産生細胞への再プログラミングをもたらす。一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣと、血液の血小板に富む画分との接触は、ＰＢＭＣを含む１つまたは複数の細胞型の、機能的な膵島ベータ細胞への再プログラミングをもたらす。
一部の実施形態によれば、ＰＢＭＣと、血液の血小板に富む画分との接触は、対象に投与した場合、再プログラミングされた細胞に対する免疫応答を最小化する、または除去するためのＰＢＭＣを含む１つまたは複数の細胞型の再プログラミングをもたらす。
【０１３３】
一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、幹細胞様、造血、または分化した表現型特性を示す。一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、以下の膵臓マーカー：ＭａｆＡ、Ｎｋｘ６．１、Ｐｄｘ−１、Ｏｎｅｃｕｔ１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｋｘ２．２、インスリン、グルカゴン、膵ポリペプチド、ソマトスタチン、グレリン、Ｓｕｒ−１およびＫｉｒ６．２のうちの１つまたは複数を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、以下の胚性／造血マーカー：テトラ−スパニンＣＤ９、白血球共通抗原ＣＤ４５、幹細胞因子受容体ＣＤ１１７のうちの１つまたは複数を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、少量の以下のもの：造血幹細胞マーカーＣＤ３４、リンパ球マーカーＣＤ３（Ｔ細胞）およびＣＤ２０（Ｂ細胞）のうちの１つもしくは複数またはその非存在を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、造血系列に由来し、末梢血に由来する間葉系列ではない。一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、少量の単球／マクロファージ特異的抗原ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１、またはその非存在を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、少量のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、およびＣＤ８０、またはその非存在を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、胚性幹細胞関連転写因子Ｏｃｔ−４およびＮＡＮＯＧを展示する。
一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、以下の分子：ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、Ｓｕｒ１、Ｓｕｒ２、ＰＤＬ−１、ＣＤ２７０、ガレクチン９のうちの１つまたは複数を展示する。
【０１３４】
一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液細胞は、他の胚性幹（ＥＳ）細胞関連遺伝子、亜鉛フィンガーおよびＳＣＡＮドメイン含有１０（ＺＮＦ２０６、ＺＳＣＡＮ１０という名称でも知られる）、Ｚｉｃファミリーメンバー３ヘテロタキシ１（ＺＩＣ３）、Ｚｉｃファミリーメンバー２（ＺＩＣ２）、増殖関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）、ＰＲドメイン含有１４（ＰＲＤＭ１４）、タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｚポリペプチド１（ＰＴＰＲＺ１）、ポドカリキシン様（ＰＯＤＸＬ）、ポリホメオティックホモログ１（ＰＨＣ１）、および亜鉛フィンガータンパク質５８９（ＺＮＦ５８９）と共に、１つまたは複数の幹細胞マーカーＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２を含む胚性幹細胞の特徴を示す。Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２の配列を、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２７０１、Ｚ１１８９８およびＱ０１８６０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４８６５およびＮＰ＿０７９１４１；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ３１５６０およびＣＡＡ８３４３５の下に見出すことができる。
【０１３５】
一部の実施形態によれば、機能的に調節される成体血液単核細胞は、ＣＤ４５＋である。一部の実施形態によれば、機能的に調節される成体血液単核細胞は、それらが以下の抗原マーカー：ＣＤ３、ＣＤ２０（Ｂリンパ球細胞表面抗原Ｂ１、受託番号Ｍ２７３９４）、ＣＤ１１ｃ（インテグリン、アルファＸ、受託番号ＮＭ＿００８８７）、ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１（補体成分３受容体３サブユニット、受託番号ＮＭ＿０００６３２）およびＣＤ１４（受託番号ＮＭ＿００１０４００２１およびＰ０８５７１）マーカーのうちの１つまたは複数について陰性であるという点で、表現型においてリンパ球、樹状細胞、マクロファージおよび単球とは異なる。一部の実施形態によれば、機能的に調節される成体血液単核細胞は、それらがＣＤ３４陰性（造血始原細胞抗原ＣＤ３４、受託番号Ｐ２８９０６）であるという点で、表現型において造血幹細胞と異なる（Craig et al. 1994, British Journal of Haematology, 88:24-30；Lansdorp, P. A I. and Dragowaka, W. (1992) J. Exp. Med. 175:1501-1509；Sutherland, H. J., et al. (1989), Blood 74.1563-1570）。
一部の実施形態によれば、機能的に調節される成体血液単核細胞は、限定されるものではないが、インスリン産生細胞などの他の細胞型に分化することができる。一部の実施形態によれば、インスリン産生細胞である機能的に調節される成体血液単核細胞は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体を展示する。一部の実施形態によれば、ＧＬＰ−１の長期作用型アゴニストであるエキセンジン−４の投与は、機能的に調節される成体血液単核細胞のインスリン産生および細胞分化を増加させる。
【０１３６】
一部の実施形態によれば、再プログラミングされた機能的に調節される成体血液単核細胞を、培養物中で拡張することができる。一部の実施形態によれば、拡張された再プログラミングされた成体末梢血単核細胞は、機能的膵島ベータ細胞に分化し得る多能性幹細胞の特徴を有する細胞を含む。
一部の実施形態によれば、再プログラミングされた機能的に調節される成体血液単核細胞は、臍帯血小板様細胞に由来する１つまたは複数の胚性幹細胞マーカー、ヒト膵島ベータ細胞特異的転写因子またはその両方を含む。一部の実施形態によれば、再プログラミングされた機能的に調節される成体血液単核細胞は、免疫寛容関連マーカーを発現する。
【０１３７】
臍帯血単核細胞
一態様によれば、成体単核細胞を再プログラミングするための方法は、以下を含む：
１．血小板に富む画分を単離するためにＵＣ血を準備する。
２．１つまたは複数の血小板様細胞および単核細胞を含む血小板に富む画分を、ＵＣ血細胞から収集する。
３．バイオマーカーによって同定することができる、再プログラミングされた単核細胞を選択する。
４．場合により、再プログラミングされた成体単核細胞を拡張する。
【０１３８】
一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、幹細胞様、造血、または分化した表現型特性を示す。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、以下の膵臓マーカー：ＭａｆＡ、Ｎｋｘ６．１、Ｐｄｘ−１、Ｏｎｅｃｕｔ１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｋｘ２．２、インスリン、グルカゴン、膵ポリペプチド、ソマトスタチン、グレリン、Ｓｕｒ−１およびＫｉｒ６．２のうちの１つまたは複数を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、以下の胚性／造血マーカー：テトラ−スパニンＣＤ９、白血球共通抗原ＣＤ４５、幹細胞因子受容体ＣＤ１１７のうちの１つまたは複数を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、少量の以下のもの：造血幹細胞マーカーＣＤ３４、リンパ球マーカーＣＤ３（Ｔ細胞）およびＣＤ２０（Ｂ細胞）のうちの１つもしくは複数、またはその非存在を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、造血系列に由来し、末梢血に由来する間葉系列ではない。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、少量の単球／マクロファージ特異的抗原ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１、またはその非存在を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、少量のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、およびＣＤ８０、またはその非存在を展示する。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、胚性幹細胞関連転写因子Ｏｃｔ−４およびＮＡＮＯＧを展示する。
一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、以下の分子：ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、Ｓｕｒ１、Ｓｕｒ２、ＰＤＬ−１、ＣＤ２７０、ガレクチン９のうちの１つまたは複数を展示する。
【０１３９】
一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、他の胚性幹（ＥＳ）細胞関連遺伝子、亜鉛フィンガーおよびＳＣＡＮドメイン含有１０（ＺＮＦ２０６、ＺＳＣＡＮ１０という名称でも知られる）、Ｚｉｃファミリーメンバー３ヘテロタキシ１（ＺＩＣ３）、Ｚｉｃファミリーメンバー２（ＺＩＣ２）、増殖関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）、ＰＲドメイン含有１４（ＰＲＤＭ１４）、タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｚポリペプチド１（ＰＴＰＲＺ１）、ポドカリキシン様（ＰＯＤＸＬ）、ポリホメオティックホモログ１（ＰＨＣ１）、および亜鉛フィンガータンパク質５８９（ＺＮＦ５８９）と共に、幹細胞マーカーＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２のうちの１つまたは複数を含む、胚性幹細胞の特徴を示す。Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２の配列を、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２７０１、Ｚ１１８９８およびＱ０１８６０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４８６５およびＮＰ＿０７９１４１；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ３１５６０およびＣＡＡ８３４３５の下に見出すことができる。
【０１４０】
一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、ＣＤ４５＋である。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、それらが以下の抗原マーカー：ＣＤ３、ＣＤ２０（Ｂリンパ球細胞表面抗原Ｂ１、受託番号Ｍ２７３９４）、ＣＤ１１ｃ（インテグリン、アルファＸ、受託番号ＮＭ＿００８８７）、ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１（補体成分３受容体３サブユニット、受託番号ＮＭ＿０００６３２）およびＣＤ１４（受託番号ＮＭ＿００１０４００２１およびＰ０８５７１）マーカーのうちの１つまたは複数について陰性であるという点で、表現型においてリンパ球、樹状細胞、マクロファージおよび単球とは異なる。一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、それらがＣＤ３４陰性（造血始原細胞抗原ＣＤ３４、受託番号Ｐ２８９０６）であるという点で、表現型において造血幹細胞と異なる。
【０１４１】
一部の実施形態によれば、臍帯血の血小板に富む画分は、血小板、血小板様細胞または幹細胞と関連する他の成分を含む。一部の実施形態によれば、臍帯血の血小板に富む画分は、誘導多能性幹細胞再プログラミングの基礎となるシグナリング経路と関連する細胞シグナリング分子を含む。一部の実施形態によれば、臍帯血の血小板に富む画分は、胚性幹細胞マーカーを含む血小板様細胞を含む。一部の実施形態によれば、臍帯血の血小板に富む画分は、転写因子ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２を含む（図１Ａおよび１Ｂを参照）。一部の実施形態によれば、臍帯血の血小板に富む画分は、タンパク質ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＣＲＩＰＴＯ、ＧＡＴＡ−４、およびＣ−ｍｙｃのうちの１つまたは複数を含む（図１Ｃを参照）。一部の実施形態によれば、臍帯血の血小板画分は、タンパク質ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＣ−ｍｙｃのうちの１つまたは複数を含む（図１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆを参照）。
一部の実施形態によれば、臍帯血単核細胞は、マーカーＣＤ１４、ＣＤ６６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ４１ｂ、およびＣＤ４２ａのうちの１つまたは複数を含む。
【０１４２】
細胞生成物
別の態様によれば、記載される発明は、記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞を含有する医薬組成物を含む細胞生成物を開示する。
一部の実施形態によれば、それを必要とする対象を処置するための方法は、対象の膵臓中での機能的細胞集団を増加させるのに有効であり得る細胞生成物を、糖尿病の哺乳動物対象に投与することを含む。一部の実施形態によれば、細胞生成物は、対象の膵臓中の機能的β細胞の集団を増加させるのに有効であり得る。一部の実施形態によれば、細胞生成物は、投与後に対象の膵臓に移動するのに有効であり得る。
【０１４３】
一部の実施形態によれば、機能的に調節される成体血液単核細胞を含有する医薬組成物を、限定されるものではないが、溶媒などの賦形剤、担体またはビヒクルと共に製剤化することができる。本明細書で使用される用語「賦形剤」、「担体」または「ビヒクル」とは、本明細書に記載の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物の製剤化および投与にとって好適な担体材料を指す。本明細書において有用な担体およびビヒクルとしては、非毒性的であり、他の成分と相互作用しない当技術分野で公知の任意のそのような材料が挙げられる。本明細書で使用される語句「薬学的に許容される担体」とは、記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物が安定かつ生体利用可能なままである記載される発明の組成物の製剤化および投与のために使用可能な任意の実質的に非毒性的な担体を指す。
【０１４４】
薬学的に許容される担体は、処置される哺乳動物への投与にとって好適なものにするのに十分に高い純度および十分に低い毒性のものでなければならない。さらに、それは活性薬剤の安定性および生体利用性を維持するべきである。薬学的に許容される担体は、液体または固体であってよく、活性薬剤および所与の組成物の他の成分と組み合わせた場合に所望の嵩、稠度などを提供するために、計画される投与様式を考慮しながら選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、結合剤（例えば、プレゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド性二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）であってもよい。記載される発明の組成物のための他の好適な薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。そのような担体溶液はまた、バッファー、希釈剤および他の好適な添加剤を含有してもよい。本明細書で使用される用語「バッファー」とは、化学組成がｐＨの有意な変化なく酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。記載される発明によって想定されるバッファーの例としては、限定されるものではないが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液、水中の５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）、および正常／生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）が挙げられる。一部の実施形態によれば、注入溶液は、対象組織に対して等張性である。一部の実施形態によれば、注入溶液は、対象組織に対して高張性である。非経口投与のためのものである記載される発明の組成物は、アルコールなどの一般的な溶媒中の滅菌水性溶液、非水性溶液、または液体油基剤中の溶液などの薬学的に許容される担体を含んでもよい。
【０１４５】
記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物を、滅菌注射性水性または油性懸濁液の形態で非経口投与することができる。本明細書で使用される用語「非経口的な」または「非経口的に」とは、限定されるものではないが、注入技術などの、注射を用いた体内への導入（すなわち、注射による投与）を指す。
【０１４６】
記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物は、非毒性的な非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌溶液または懸濁液であってもよい。一般に、溶液は、２つ以上の物質の均一な混合物と考えられる；それは、必須ではないが、液体であることが多い。溶液中で、溶質（または溶解した物質）の分子は、これらの溶媒間で均一に分布する。懸濁液は、微細に分割された種が別の種と混合する分散物（混合物）であり、前者は非常に微細に分割および混合され、それは急速に沈降しない。日常生活では、最も一般的な懸濁液は、液体の水の中の固体のものである。特に、用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル溶液、および等張性塩化ナトリウム（塩水）溶液である。一部の実施形態では、高張性溶液を使用する。さらに、滅菌された固定油を、溶媒または懸濁媒体として慣例的に使用する。非経口的適用のために、好適なビヒクルは、溶液、例えば、油性または水性溶液、ならびに懸濁液、乳濁液、または埋込み体からなる。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有してもよく、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが挙げられる。
【０１４７】
さらなる記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物を、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th or 19th editions, published by the Mack Publishing Company of Easton, Pa.に記載されたものなどの、当技術分野で公知の技術を使用して直ちに調製することができる。
本明細書で使用される用語「治療有効」または「薬学的有効量」とは、対象へのその投与後に治療効果または有益な効果をもたらす本発明の組成物の量を指す。組成物の有効量は、処置される生物学的対象の年齢および身体状態、状態の重篤度、処置の持続期間、併用療法の性質、注入のタイミング、使用される特定の化合物、組成物または他の活性成分、使用される特定の担体などの因子に応じて変化してもよい。
【０１４８】
当業者であれば、本明細書では以後「単位用量」と称される、所与の効果の強度を惹起する用量単位（使用単位を意味する）中の用量を決定することにより、本発明の組成物の薬学的有効量を決定することができる。用語「用量−強度関係」とは、個々のレシピエントにおける効果の強度が用量と関係する様式を指す。一般的に指定される効果の強度は、最大強度の５０％である。対応する用量は、５０％有効用量または個体のＥＤ５０と呼ばれる。用語「個体」の使用は、本明細書で使用される効果の強度に基づくＥＤ５０と、集団における応答データの頻度から決定された、省略されたＥＤ５０とも呼ばれる中央有効用量とを区別する。本明細書で使用される「効能」とは、所望の応答を達成する記載される発明の組成物の特性を指し、「最大効能」とは、最大の達成可能な効果を指す。特定の障害または状態の処置において有効である記載される発明の医薬組成物中の走化性造血幹細胞生成物の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができ（例えば、Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Joel G. Harman, Lee E. Limbird, Eds.; McGraw Hill, New York, 2001；THE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE, Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J., 1995；およびDRUG FACTS AND COMPARISONS, FACTS AND COMPARISONS, INC., St. Louis, Mo., 1993を参照されたい）、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。記載される発明の製剤中で使用される正確な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重症度に依存し、医師の判断およびそれぞれの対象の環境に従って決定するべきである。
【０１４９】
一部の実施形態によれば、記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物を最初に投与し、その後、さらなる投与によって維持することができる。例えば、一部の実施形態によれば、記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物を、１つの注射方法によって投与し、その後、同じか、または異なる方法によってさらに投与することができる。
【０１５０】
一部の実施形態によれば、記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物を、全身的に、所望の部位に直接注射により、または薬学的に許容される担体と共に対象に投与することができる。一部の実施形態によれば、記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物の増殖および／または分化、ならびに記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物の治療効果をモニタリングすることができる。例えば、糖尿病を処置するために投与される記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物を、対象における血糖値および／またはインスリンレベルを試験することによってモニタリングすることができる。一部の実施形態によれば、投与後の記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞生成物に対する対象の免疫学的寛容を、当技術分野で公知の様々な方法によって試験することができる。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、それぞれの介在する値、本文が別途明確に記述しない限り、下限の単位の１０分の１まで、およびその記述された範囲中の任意の他の記述された値または介在する値が本発明に包含されることが理解される。より小さい範囲に独立に含まれていてもよいこれらのより小さい範囲の上限および下限も、記述された範囲中の任意の特に排除される限界に依存して、本発明に包含される。記述された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかの両方を含まない範囲も、本発明に含まれる。
【０１５１】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する、または等価である任意の方法および材料を、記載される発明の実施または試験において使用することもできるが、例示的な方法および材料を記載してきた。本明細書に記載の全ての刊行物は、その刊行物が引用されるものと関連する開示および記載された方法および／または材料を参照することにより本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎｄ）」および「その（ｔｈｅ）」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日以前のその開示についてのみ提供されるものであり、それぞれその全体が参照により組み込まれる。本明細書の何も、記載される発明が以前の発明との理由でそのような刊行物に先行する資格がないとの承認と解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立に確認される必要がある実際の発行日とは異なっていてもよい。
【実施例】
【０１５２】
以下の実施例は、当業者に、記載される発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであり、発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものでもなく、以下の実験が実施された全ての、または唯一の実験であると表すことを意図したものでもない。使用される数（例えば、量、温度など）に関する精度を確保するための努力が為されたが、いくらかの実験誤差および偏差があるはずである。別途指摘しない限り、部は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧にあるか、または大気圧に近い。
【０１５３】
プロトコール
血液画分の単離
簡単に述べると、抗凝固剤処理された成体血液または臍帯血を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで１：２〜１：４の範囲で希釈して、赤血球の凝集を軽減する。次いで、希釈された血液を、混合せずに、遠心チューブ中、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液上に層化する。層化した血液／Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを、遠心ブレーキを使用せずに、１８〜２０℃、４００ｘｇで４０分間遠心分離する。これにより、上から下に、血漿および血小板様細胞を含む第１の画分；単核細胞および血小板様細胞を含む第２の画分；Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ媒体を含む第３の画分；ならびに顆粒球および赤血球を含む第４の画分を含む血液画分が形成される。
【０１５４】
一実施形態によれば、画分をさらにプロセッシングして、特定の画分成分を単離する。簡単に述べると、単核細胞をさらにプロセッシングするために、単核細胞および血小板様細胞を含む第２の画分を、パスツールピペットを使用してＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配から注意深く取り出す。次いで、第２の画分を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで３回、洗浄し、１８℃〜２０℃、３００ｘｇで遠心分離し、各回の後、上清を廃棄する。
一部の実施形態によれば、画分をさらにプロセッシングして、血小板様細胞を単離する。簡単に述べると、血漿および血小板様細胞を含む第１の画分を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配から取り出す。次いで、１μＭのプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を含む等量のＨＥＰバッファーを、血小板に富む画分に添加し、穏やかに混合する。次いで、画分を、ブレーキを用いずに室温で１５〜２０、１００ｘｇで遠心分離して夾雑している赤血球または白血球を沈降させる。次いで、上清を新しい容器に移し、室温で１５〜２０分間、８００ｘｇで遠心分離する。次いで、沈降した血小板様細胞を、血小板活性化を避けるために再懸濁せずに２回洗浄する。
【０１５５】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析を、以前に記載されたように実施した（Zhao Y. et al., Exp. Cell Res., 312, 2454 (2006)）。簡単に述べると、トリプシン／ＥＤＴＡで処理した、または未処理のままである細胞を、遠心分離によって収集し、ＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を、３７℃で１０分間、４％ホルムアルデヒド中で固定した。抗体を用いる細胞外染色のために、細胞を透過処理しなかった。細胞内染色のために、氷冷１００％メタノールを予め冷やした細胞に、９０％メタノールの最終濃度で添加することによって細胞を透過処理し、氷上で３０分間インキュベートした。最初にインキュベーションバッファー中に細胞を再懸濁し、製造業者の推奨される希釈率に従って一次抗体を添加することにより、細胞を免疫染色した。細胞を室温で１時間、一次抗体と共にインキュベートした後、インキュベーションバッファーで３回洗浄した。次いで、細胞を、室温で３０分間、製造業者の推奨された希釈率でコンジュゲート化二次抗体を含むインキュベーションバッファー中に再懸濁した後、インキュベーションバッファー中で３回洗浄した。次いで、染色された細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１５６】
表面および細胞内マーカーのフローサイトメトリー分析を、Zhao Y, et al., Human cord blood stem cell modulated regulatory T lymphocytes reverse the autoimmune-caused type 1 diabetes in non-obese diabetic (NOD) mice. PLoS ONE 2009, 4: e4226に以前に記載されたように実施した。簡単に述べると、血小板を、３０００ｒｐｍで１５分間、ＰＢＳで洗浄した。ヒト膵島を、繰り返しピペッティングしながら室温で５分間、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで解離させた後、ＰＢＳ中で洗浄した。ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＣＤ４２ａ、抗ＣＤ６１、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化抗ＣＤ８β、抗ＣＸＣＲ４、抗ＣＣＲ７およびフィコエリトリン−Ｃｙ７（ＰＥ−Ｃｙ７）コンジュゲート化抗ＣＤ４１、抗ＣＤ５６および抗ＣＣＲ７、ＡＰＣコンジュゲート化抗ＩＣＯＳ、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０コンジュゲート化抗ＣＤ４および抗ＣＤ６６ｂ、パシフィックブルー（ＰＢ）コンジュゲート化抗ＣＤ３８、Ｋｒｏｍｅ  Ｏｒａｎｇｅコンジュゲート化抗ＣＤ８α、抗ＣＤ１４、および抗ＣＤ１９抗体を含む、マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）と共に、細胞をインキュベートした。ＡＦ６４７コンジュゲート化抗Ｆｏｘｐ３、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート化マウス抗ヒトＰＤＸ−１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート化マウス抗ヒトソマトスタチンおよび抗ＰＤＸ−１、ＰＥコンジュゲート化マウス抗ＮＥＵＲＯＤ１および抗グルカゴン、および抗ＦＯＸＡ２、および抗ＮＫＸ６．１、ＢＶ４２１コンジュゲート化マウス抗ヒトグルカゴン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート化マウス抗ヒトインスリン、抗ヒトＣ−ペプチド、抗ＮＫＸ６．１、抗ＳＯＸ９、抗ＰＴＦＡ１、および抗ＮＡＮＯＧ、ならびにＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート化マウス抗ヒトＳＯＸ１７  ｍＡｂなどの他の抗体を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入した。ＦＩＴＣコンジュゲート化マウス抗ヒトインテグリンβ１（ＣＤ２９）、ＰＥコンジュゲート化マウス抗ヒトＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）ｍＡｂ、抗ＴＬＲ４、抗ＴＬＲ６および抗ＣＸＣＬ１０、ＡＰＣコンジュゲート化抗ＴＧＦ−β１、およびＡＰＣ／Ｆｉｒｅ  ７５０コンジュゲート化抗ＣＤ３６  ｍＡｂを、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ウサギ抗ＡＩＲＥポリクローナル抗体を、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＣＸＣＲ１および抗ＳＯＸ２、ＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、抗ＣＸＣＲ２、抗ＣＣＲ３、抗ＣＣＲ５、および抗フィブロネクチン、ＡＰＣコンジュゲート化抗ＣＣＬ２、ｅＦｌｕｏｒ６６０コンジュゲート化抗ガレクチン９、ＣＸＣＲ３、および抗ＣＸＣＬ１、ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ７１０コンジュゲート化抗ＣＣＲ４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート化ラット抗ヒトＯｃｔ３／４  ｍＡｂならびに非コンジュゲート化マウス抗ヒトＮＡＮＯＧを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＭＡＦＡ  ａｂは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓａｌｅｍ、ＭＡ）からのものであった。ＤｙＬｉｇｈｔ４０５コンジュゲート化抗ｋｉ６７は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）から購入した。
【０１５７】
細胞を、室温で３０分間染色した後、フロー分析の前にＰＢＳで洗浄した。アイソタイプ一致させたマウス抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を、全てのフルオレセインコンジュゲート化ＩｇＧ  ｍＡｂのための陰性対照として使用した。細胞内染色のために、ＰｅｒＦｉｘ−ｎｃキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、細胞を固定し、透過処理した。染色後、細胞を収集し、最大１０色までの同時的読取りのために３個のレーザー（４８８ｎｍの青色、６３８の赤色、および４０５の紫色レーザー）を備えた、Ｇａｌｌｉｏｓ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。最終データを、Ｋａｌｕｚａ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。
【０１５８】
蛍光色素を使用する血小板のミトコンドリア染色のために、血小板画分を、３７℃で１５分間、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  ＦＭ（１００ｎＭ）またはＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ（１００ｎＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で標識した後、３０００ｒｐｍで１５分間、ＰＢＳで２回洗浄した。血小板によるミトコンドリアの放出を決定するために、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄで標識された血小板を、３７℃で１５分間、０．５ｍｌの無血清Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養培地（Ｌｏｎｚａ）中の、２０μＭのＡＤＰ、０．５ｍＭのアラキドン酸（ＡＲＡ）、および１ユニット／ｍｌのトロンビンなどの血小板凝集因子で処理した。そのような処理の後、４℃で１５分間、２．７ｇでの遠心分離によって血小板を除去した。上清を収集し、４℃で１５分間、１４ｇで再度遠心分離して、フロー分析のために放出されたミトコンドリアを収獲した。
【０１５９】
免疫蛍光
標準的な免疫蛍光プロトコールを使用した。簡単に述べると、接着細胞を、室温で１５分間、温めたＰＢＳ中に希釈した４％ホルムアルデヒドで固定した。固定剤を吸引し、細胞をそれぞれ５分間、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を室温で６０分間、ブロッキングバッファーでブロックした。次いで、ブロッキングバッファーを吸引し、製造業者の指示書に従って希釈された一次抗体の溶液を、４℃で終夜、細胞と共にインキュベートした。次いで、細胞をそれぞれ５分間、ＰＢＳで３回すすいだ後、室温で１〜２時間、製造業者の指示書に従って希釈された蛍光色素コンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートした。次いで、細胞をそれぞれ５分間、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡によって可視化した。
【０１６０】
免疫細胞化学および組織学
糖尿病患者に由来する膵臓組織のパラフィンスライドを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）から購入した。Zhao Y, et al., Identification of stem cells from human umbilical cord blood with embryonic and hematopoietic characteristics. Exp Cell Res 2006, 312: 2454-2464に以前に記載されたように、免疫染色を実施した。非特異的染色を遮断するために、室温で２０分間、２．５％ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するバッファー中で切片をインキュベートした。一次抗体は、モルモットポリクローナル抗インスリンＡｂ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、血小板マーカーであるＦＩＴＣコンジュゲート化ＣＤ４２ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、血小板α顆粒マーカーであるフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）Ａｂ（Ｓｉｇｍａ）、および血小板高密度顆粒マーカーであるＡＤＰ  Ａｂ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含み、二次Ａｂは、Ｃｙ３コンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を含んでいた。アイソタイプ一致させた対照のために、マウスＩｇＧ1κを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、モルモット血清をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。全ての実験について、アイソタイプ一致抗体を、陰性対照として使用した。細胞を、ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｃカメラおよびＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲ  Ｒｅｖ３ソフトウェアを備えたＺＥＩＳＳ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ１を用いて写真撮影したか、またはＮｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡によって写真撮影した。
【０１６１】
トランスウェル中のミトコンドリアによる処理後の膵島のサイズを比較するために、膵島を、ＥＣ５００デジタルカメラを備えたＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔを用いて写真撮影した。膵島のサイズを、ＮＩＨのウェブサイト（http://rsbweb.nih.gov/ij/）からダウンロードしたＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用する点計数形態学的分析（Meier JJ, et al., Direct evidence of attempted beta cell regeneration in an 89-year-old patient with recent-onset type 1 diabetes. Diabetologia 2006, 49: 1838-1844）によって測定および算出した。
【０１６２】
電子顕微鏡
細胞懸濁液を沈降させた後、ｐＨ７．０のリン酸バッファー中の過剰量の２．５％グルタルアルデヒド中に細胞を再懸濁し、室温で１０分間インキュベートすることによって固定した。次いで、細胞を沈降させ、新鮮な固定剤を添加した。細胞を４℃で２〜３時間、新鮮な固定剤中でインキュベートした後、細胞損傷を防止するために試料の浸透圧に調整されたリン酸バッファー中で洗浄した。固定および洗浄の後、４％の低融点アガロースを細胞に添加し、すぐに遠心分離して細胞を沈降させた。次いで、細胞沈降物を氷に２０分間移して、アガロースを固化させた後、バッファー中で穏やかに洗浄した。次いで、細胞を４℃で１〜２時間、リン酸バッファー中の１％四酸化オスミウムで処理した後、蒸留水中で少なくとも５回洗浄した。次いで、細胞を、暗室中、４℃で２時間、２％水性酢酸ウラニルで染色した。次いで、細胞を、以下の系列のアセトン洗浄：３０％アセトンで１５分間；５０％アセトンで１５分間；７０％アセトンで１５分間；９０％アセトンで１５分間；１００％アセトンで３０分間を３回により脱水した。次いで、細胞を、以下の系列のプロピレンオキシドおよび樹脂混合物：２：１のプロピレンオキシド：樹脂で１時間；１：１のプロピレンオキシド：樹脂で１時間；１：２のプロピレンオキシド：樹脂で１時間；１００％樹脂で終夜；新鮮な１００％樹脂で１時間により、樹脂に埋め込んだ。次いで、樹脂を、６０〜７０℃で１２〜２４時間にわたって重合させた。次いで、細胞沈降物をスライスに切断し、電子顕微鏡によって画像化した。
【０１６３】
ウェスタンブロッティング
標準的なウェスタンブロッティングプロトコールを使用した。簡単に述べると、細胞を冷やした溶解バッファーで溶解し、遠心分離して、細胞破片を沈降させた。上清のタンパク質濃度を、タンパク質定量アッセイ（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定した。次いで、溶解物上清を等量の２Ｘ  ＳＤＳ試料バッファーと混合し、１００℃で５分間沸騰させた。試料バッファー中の等量のタンパク質を、分子量マーカーと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェル中にロードし、１００Ｖで１〜２時間、電気泳動した。次いで、タンパク質をニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜に転移させた。次いで、ブロッキングバッファーを使用して室温で１時間、膜をブロックした。次いで、膜を、製造業者の指示書に従ってブロッキングバッファー中の一次抗体の適切な希釈液と共にインキュベートした後、２０Ｍｎ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中で５分間、３回洗浄した。次いで、膜を、室温で１時間、ブロッキングバッファー中の製造業者により推奨された希釈率のコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートした後、それぞれ５分間、ＴＢＳＴ中で３回洗浄した。化学発光検出のための暗室現像技術を使用して、または比色もしくは蛍光検出のための画像走査技術を使用して、ブロットの画像を取得した。
【０１６４】
血小板様細胞を含有する画分を、ヒト臍帯血単位（Ｃｏｒｄ：Ｕｓｅ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ）および成体末梢血試料（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から収集した。血小板様細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）と共に、Ｃｅｌｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて可溶化した。試料（それぞれ２０μｇのタンパク質）を、１：１の体積比でＬａｅｍｍｌｉ試料バッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合し、煮沸し、ロードして、１０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上での電気泳動によって分離した。次いで、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＴＢＳＴ中の５％無脂肪ドライミルクで１時間ブロックし、室温で２時間、５％ミルク−ＴＢＳ中、１：１，０００の希釈率のウサギ抗ＡＩＲＥポリクローナルＡｂ、抗ＣＲＩＰＴＯ  ｐＡｂ、および抗ＧＡＴＡ４  ｐＡｂ（Ａｂｃａｍ）、ラット抗ヒトＯＣＴ４  Ａｂ、ラット抗ヒトＳＯＸ２  Ａｂ、マウス抗ヒトＮＡＮＯＧ  Ａｂ、マウス抗ヒトＣ−ｍｙｃ  Ａｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびウサギ抗ＭＡＦＡ  ｐＡｂ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を含む様々な抗体と共にインキュベートした。洗浄後、ブロットを、５％ミルク−ＴＢＳ中の西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（１：２，０００；Ｐｉｅｒｃｅ）に曝露した。結合した免疫複合体を、増強化学発光（ＥＣＬ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）方法によって可視化した。β−アクチンを、内部ローディング対照として使用した。
【０１６５】
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ技術を、以前に記載されたように実施して、ｍＲＮＡの発現レベルを分析した（Zhao Y. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 360 (2007) 205-211）。簡単に述べると、総ＲＮＡを、Ｑｕｉａｇｅｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を使用して細胞から抽出した後、ランダムヘキサマープライマー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ  ＭＤ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成した。目的の各遺伝子のための検証された遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲプライマーセットを使用して４０サイクルにわたって、Ｍｘ３０００ｐ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、各試料に対してリアルタイムＰＣＲを実施した。各転写物の相対発現レベルを、内部対照としてのハウスキーピング遺伝子ベータ−アクチンのものについて補正した。
【０１６６】
血小板様細胞中での様々なｍＲＮＡの発現を、定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。各試料に由来する総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して抽出した。第１鎖ｃＤＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｇＤＮＡ  Ｃｌｅａｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、総ＲＮＡから合成した。リアルタイムＰＣＲを、以下の条件：９５℃で１０分、次いで、９５℃で１５秒、および６０℃で６０秒の４０サイクルの下、ＥＳ細胞関連マーカー（例えば、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびＣ−ｍｙｃ）ならびに膵島細胞関連マーカー（例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ＰＰＹ、グレリン、ＧＣＫ、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、ＭＡＦＡ、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ−１、ＮＥＵＲＯＤ１、およびＮＧＮ３）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を含む各遺伝子のための検証された遺伝子特異的ＲＴ２  ＰＣＲプライマーセットを使用する、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）を使用して３回、各試料に対して実施した。内部対照としてのβ−アクチンと比較した、各遺伝子の発現レベルを決定した。遺伝子発現を確認するために、リアルタイムＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動によって検査した。
【０１６７】
ＲＴ2ＰｒｏｆｉｌｅｒリアルタイムＰＣＲアレイのために、ヒト幹細胞キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号ＰＡＨＳ−４０５Ｚ、製品３３０２３１）（遺伝子一覧：幹細胞特異的マーカー：細胞周期の調節：ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ１（ＣＤＣ２）、ＣＤＣ４２、ＥＰ３００、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２  (ＢＦＧＦ)、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ２、ＰＡＲＤ６Ａ、ＲＢ１；クロマチン改変酵素＆再モデリング因子：ＫＡＴ２Ａ(ＧＣＮ５Ｌ２)、ＨＤＡＣ２、ＫＡＴ８(ＭＹＳＴ１)、ＫＡＴ７(ＭＹＳＴ２)、ＲＢ１、ＴＥＲＴ；対称性＆非対称性細胞分裂：ＤＨＨ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＵＭＢ、ＰＡＲＤ６Ａ；自己再生マーカー：ＨＳＰＡ９、ＫＡＴ８(ＭＹＳＴ１)、ＫＡＴ７(ＭＹＳＴ２)、ＮＥＵＲＯＧ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２；サイトカイン＆増殖因子：ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＣＸＣＬ１２(ＳＤＦ１)、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２(ＢＦＧＦ)、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＧＤＦ２(ＢＭＰ９)、ＧＤＦ３(ＶＧＲ−２)、ＩＧＦ１、ＪＡＧ１；細胞間コミュニケーション：ＤＨＨ、ＤＬＬ１(ＤＥＬＴＡ１)、ＧＪＡ１(ＣＸ４３)、ＧＪＢ１(ＣＸ３２)、ＧＪＢ２(ＣＸ２６)、ＪＡＧ１；細胞接着分子：ＡＰＣ、ＢＧＬＡＰ、ＣＤ４、ＣＤ４４、ＣＤＨ１(Ｅ−カドヘリン)、ＣＤＨ２(Ｎ−カドヘリン)、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＴＮＮＡ１、ＣＸＣＬ１２(ＳＤＦ１)、ＮＣＡＭ１；代謝マーカー：ＡＢＣＧ２(ＢＣＲＰ)、ＡＬＤＨ１Ａ１(ＲＡＬＤＨ１)、ＡＬＤＨ２、ＦＧＦＲ１；幹細胞分化マーカー：胚性細胞系列マーカー：ＡＣＴＣ１、ＡＳＣＬ２、ＦＯＸＡ２(ＨＮＦ３Ｂ)、ＰＤＸ１(ＩＰＦ１)、ＩＳＬ１、ＫＲＴ１５、ＭＳＸ１、ＭＹＯＤ１、Ｔ(Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ)；造血細胞系列マーカー：ＣＤ３Ｄ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＭＭＥ；  ＭＭＥ；間葉細胞系列マーカー：ＡＣＡＮ(ＡＧＣ１)、ＡＬＰＩ、ＢＧＬＡＰ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＰＰＡＲＧ；神経細胞系列マーカー：ＣＤ４４、ＮＣＡＭ１、ＳＩＧＭＡＲ１、Ｓ１００Ｂ、ＴＵＢＢ３；幹細胞維持にとって重要なシグナリング経路：Ｎｏｔｃｈシグナリング：ＤＬＬ１(ＤＥＬＴＡ１)、ＤＬＬ３、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、ＤＶＬ１、ＥＰ３００、ＫＡＴ２Ａ(ＧＣＮ５Ｌ２)、ＨＤＡＣ２、ＪＡＧ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＵＭＢ；ＷＮＴシグナリング：ＡＤＡＲ、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＢＴＲＣ(ｂＴｒＣＰ)、ＣＣＮＤ１、ＦＲＡＴ１、ＦＺＤ１、ＭＹＣ、ＰＰＡＲＤ、ＷＮＴ１)およびヒト幹細胞転写因子キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号ＰＡＨＳ−５０１Ｚ、製品番号３３０２３１）（９６ウェル形式）（遺伝子一覧：体性幹細胞維持：ＣＤＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１(Ｏｃｔ４)、ＳＯＸ２；胎盤発生：ＣＤＸ２：胎盤発生：ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧ、ＳＰ１、ＶＤＲ；誘導多能性および胚性幹細胞：ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１(Ｏｃｔ４)、ＳＯＸ２、ＳＴＡＴ３；軸／対称／断片化：ＣＤＸ２、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＦＯＸＡ２(ＨＮＦ３Ｂ)、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ４、��ＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ４、ＬＭＸ１Ｂ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲ２Ｆ２、ＰＡＸ１、ＰＩＴＸ２、ＳＭＡＤ２（ＭＡＤＨ２）、ＴＢＸ５、ＴＤＧＦ１、ＺＩＣ１；胚発生：ＣＤＸ２、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＦＯＸＡ２(ＨＮＦ３Ｂ)、ＧＡＴＡ６、ＧＬＩ２、ＨＡＮＤ１、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ４、ＫＬＦ４、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＳＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＯＴＣＨ２、ＰＡＸ１、ＳＩＸ２、ＳＭＡＤ２(ＭＡＤＨ２)、ＳＯＸ２、ＳＰ１、ＴＢＸ５、ＴＤＧＦ１、ＺＦＰＭ２、ＺＩＣ１；外胚葉、内胚葉および中胚葉の形成および分化：ＦＯＸＡ２(ＨＮＦ３Ｂ)、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ１３、ＩＳＬ１、ＫＬＦ４、ＳＭＡＤ２(ＭＡＤＨ２)、ＳＯＸ９；器官形態形成：ＣＤＸ２、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＧＬＩ２、ＨＡＮＤ１、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ４、ＩＳＬ１、ＪＵＮ、ＫＬＦ４、ＭＳＸ２、ＭＹＣ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲ２Ｆ２、ＰＡＸ１、ＰＡＸ５、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ２、ＰＩＴＸ３、ＰＰＡＲＧ、ＲＵＮＸ１(ＡＭＬ１)、ＳＩＸ２、ＳＭＡＤ２(ＭＡＤＨ２)、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＰ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＸ５、ＴＤＧＦ１、ＶＤＲ、ＷＴ１、ＺＦＰＭ２、ＺＩＣ１；血管新生：ＣＤＸ２、ＨＡＮＤ１、ＪＵＮ、ＮＲ２Ｆ２、ＲＵＮＸ１(ＡＭＬ１)、ＷＴ１；神経発生：ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２(ＨＮＦ３Ｂ)、ＦＯＸＰ３、ＧＬＩ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＤ１０、ＩＳＬ１、ＬＭＸ１Ｂ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２−２、ＮＲ２Ｆ２、ＯＬＩＧ２、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ３、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＰＡＲＧ、ＳＯＸ２、ＳＴＡＴ３、ＴＬＸ３；造血：ＲＢ１、ＲＵＮＸ１(ＡＭＬ１)、ＳＯＸ６、ＳＰ１、ＳＴＡＴ１；骨形成：ＧＬＩ２、ＨＯＸＡ２、ＳＯＸ２、ＳＰ１；他の幹細胞転写因子：ＤＡＣＨ１、ＥＧＲ３、ＥＳＲ１(ＥＲα)、ＥＺＨ２、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＰ２、ＧＡＴＡ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＴＲ７、ＩＲＸ４、ＫＬＦ２、ＬＩＮ２８Ｂ、ＮＦＡＴＣ１、ＰＡＸ９、ＰＣＮＡ、ＴＥＲＴ、ＷＲＮ）を、製造業者の指示書に従って使用した。製造業者によって提供されたウェブに基づくＰＣＲアレイデータ分析ソフトウェアを使用して、データを分析した。
【０１６８】
ｆ−マクロファージの培養および分化
ｆ−Ｍφの培養を、Zhao Y, et al., A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100: 2426-2431に以前に記載されたように実施した。簡単に述べると、精製された単球を、１ｘ１０5細胞／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含む無血清Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中に０．５ｍｌ／ウェルで８ウェルのＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に播種した。血小板と、単球／マクロファージとの相互作用を調査するために、精製された単球を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで予備処理した後、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの存在下で無血清Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地で処理した。単球／マクロファージによる血小板様細胞の食作用を決定するために、精製された単球／マクロファージを、２７ｍｍのＮｕｎｃ  Ｇｌａｓｓ  Ｂａｓｅ  Ｄｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）上に播種した後、血小板マーカーＣＤ４２ａおよびＥＳ細胞関連マーカーＯＣＴ４で免疫染色した。試料を、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡によって観察し、写真撮影した。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって血小板と単球／マクロファージとの相互作用をさらに決定するために、精製された血小板および単球（トリプシン／ＥＤＴＡで処理しない）を、ＴＥＭバッファー（０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４中の２％ホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒド）で固定した。細胞試料を、包埋および切片化のために提供した。試料を、ＡＭＴ−ＸＲ４１デジタルカメラを備えたＪＥＯＬ  １２００ＥＸ透過型電子顕微鏡を用いて観察した。
【０１６９】
接着臍帯血幹細胞の存在下でのリンパ球の同時培養による全血から得られたリンパ球の「教育」（「幹細胞教育療法」）
Zhao et alは、全血からリンパ球を分離し、接着ＣＢ−ＳＣの存在下でリンパ球を簡単に同時培養した後、「教育された」リンパ球を患者の循環中に戻すバイオリアクターデバイスと呼ばれる連続密閉ループシステムを介して患者の血液を循環させる手順を開発した［Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med, Vol. 10:3, (2012)］。非盲検１／２相試験において、Ｔ１Ｄを有するアジア系統の１２人の患者が、バイオリアクターデバイスによる単回処置を受け、アジア系統の３人の患者が、接着ＣＢ−ＳＣを含まないバイオリアクターデバイスによる単回処置（すなわち、プロセスのみの対照）を受けた。１６ゲージのＩＶ針を、左（または右）肘正中皮静脈に入れ、製造後業者の推奨プロトコールに従って、患者の血液を、３５ｍＬ／分で６〜７時間、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  ＭＣＳ＋（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ）に通過させて、リンパ球を単離した。収集されたリンパ球を、同種異系ＣＢ−ＳＣ（またはＣＢ−ＳＣを用いないプロセス対照）への曝露のためにデバイスに移し、他の血液成分を患者に戻した。デバイス中で２〜３時間後、リンパ球を、生理食塩水を用いる重力流対照（２〜３ｍＬ／分）の下、手の中の背部静脈を介して患者の循環に戻した。約１０，０００ｍＬの血液を、手順の間に処理したところ、リンパ球画分の約２回の反復教育が得られた。患者を２日間入院させて、体温をモニタリングし、そのような処置の後の有害反応に関する日常的な臨床血液検査を行った。
【０１７０】
患者がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの診断基準を満たした場合、患者を選択し、血液検査により、Ｔ１Ｄ対象に関する膵島β細胞に対する少なくとも１つの自己抗体の存在を確認した。除外基準は、臨床的に有意な肝臓、腎臓、もしくは心臓疾患；妊娠；免疫抑制薬；ウイルス疾患；または免疫不全と関連する疾患を含んでいた。幹細胞教育（ＳＣＥ）療法の実現可能性および安全性に関する主要試験評価項目は、他の場所に公開されている（Zhao Y, et al.: Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Med 2012, 10: 3；Zhao Y, et al.: Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Med 2013, 11: 160；Delgado E, et al.: Modulation of Autoimmune T-Cell Memory by Stem Cell Educator Therapy: Phase 1/2 Clinical Trial. EBioMedicine 2015, 2: 2024-2036）。現在の試験評価項目は、Ｔ１ＤおよびＴ２Ｄ対象における血小板に対するＳＣＥ療法の効果の予備的証拠であった。ベースライン血液試料を、ＳＣＥ療法の前に収集した。
【０１７１】
幹細胞教育療法およびヒト患者の処置を、Zhao et al., BMC Medicine 2013, 11:160に以前に記載されたように実施した。簡単に述べると、針を患者の静脈に入れ、患者の血液を、６〜７時間、血球分離装置ＭＣＳ（登録商標）＋（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に通して、単核細胞を単離した。収集された単核細胞を、ヒト臍帯血由来幹細胞（ＣＢ−ＳＣ）などの教育細胞型への曝露のために幹細胞教育デバイスに移した。次いで、教育された単核細胞を、患者の静脈を介して生理食塩水中で患者の循環に戻した。
【０１７２】
ＣＢ−ＳＣを取得し、幹細胞教育装置中、８％ＣＯ2中、３７℃にて無血清培養培地中で培養した。一部の実施形態によれば、幹細胞境域装置は、積み重ねたプレートにより形成されるチャンバーがそれぞれ隣接するチャンバーを介して連続的である、積み重ねた組織培養プレートの密閉システムを含む。患者の血液から分離された末梢血単核細胞を、幹細胞教育装置の一方の末端に導入し、強く接着するＣＢ−ＳＣ中でカバーされた積み重ねたプレートを通して、教育装置の他方の末端で収集する。次いで、教育された末梢血単核細胞を患者の静脈中に再導入した。
【０１７３】
（例１）
幹細胞教育療法による血小板の調節
血小板の調節を、偽療法を受けた対象（ｎ＝３）と比較して１９人の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）および２０人の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者において分析した。従来の療法を受けた、年齢および性別を一致させたＴ１Ｄ（ｎ＝８）およびＴ２Ｄ（ｎ＝１０）対象を、それぞれ、追加の対照として使用した。臨床結果により、血小板数は幹細胞教育療法を受けた後にＴ２Ｄ対象において顕著に増加する（Ｐ＝０．０２７）が、対象の５／８はＴ１Ｄ処置において改善することが示された（図１Ａ）。血小板分布幅（ＰＤＷ）の値は、幹細胞教育療法による処置後にＴ１ＤとＴ２Ｄ対象の両方において有意に増加した（図１Ｂ）が、その平均血小板体積（ＭＰＶ）は、Ｔ１ＤとＴ２Ｄ対象の両方において減少した（図１Ｃ）。処置後にＴ１ＤとＴ２Ｄ対象の両方において、血小板クリット（ＰＣＴ）に関しては顕著な変化はなかった。白人のＴ１Ｄ対象（Ｎ＝８）に由来する臨床データもまた、ＳＣＥ療法を受けた後に血小板数の増加を示した（Ｐ＝０．０４、図１Ｄ）。このデータは、血小板の調節が、糖尿病患者の自己免疫および代謝制御における幹細胞教育療法の臨床効能に寄与し得ることを示唆している（Zhao Y, et al., Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Med 2012, 10: 3；Zhao Y, et al.,Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Med 2013, 11: 160）。
【０１７４】
（例２）
血小板様細胞中での免疫寛容関連マーカーの発現
臍帯血の細胞成分が免疫応答を調節することができるかどうかを探索するために、血小板様細胞中での免疫寛容関連マーカーの発現を精査した。
血小板様細胞（図２Ａ〜Ｄ）または成体末梢血（図２Ｅ〜Ｉ）を含むヒト臍帯血に由来する血小板に富む画分を、上記のように調製した。次いで、血小板様細胞を、様々な免疫関連マーカーについて検査した。
フローサイトメトリーにより、臍帯血由来（図２Ａ）および成体血液由来（図２Ｅ）血小板様細胞の両方が、同時阻害的免疫調節表面分子を展示することが示された。図２Ａに示されるように、フローサイトメトリーは、血小板様細胞がＣＤ２７０／ＣＤ４１およびＣＤ２７０／ＣＤ６１を発現することを示す。図２Ｂに示されるように、透過処理された臍帯血血小板様細胞の細胞内染色により、ＴＧＦ−β１／ＣＤ４１、ＴＧＦ−β１／ＣＤ４２、Ｆｏｘｐ３／ＣＤ４１、およびＦｏｘｐ３／ＣＤ４２の発現が示された。
【０１７５】
ヒト臍帯血由来血小板様細胞は、自己免疫調節因子であるＡＩＲＥを発現する（図２ＣおよびＤ）。図２Ｃに示されるように、ウェスタンブロット分析により、臍帯血血小板様細胞の７つの異なる試料がそれぞれ、ＡＩＲＥタンパク質を含むことが示された。図２Ｃ中の各ブロットの右側の数字は、任意の相対的強度単位でのタンパク質の定量された平均量を表す。図２Ｄに示されるように、血小板マーカーＣＤ４１について陽性の８５％を超える臍帯血血小板様細胞が、ＡＩＲＥタンパク質についても陽性であった（右パネル）。アイソタイプ一致させたＩｇＧ、ＩｇＧ−ＦＩＴＣ／ＩｇＧ−ＰＣ７を、陰性対照（左パネル）として使用した。
【０１７６】
図２Ｅに示されるように、９９％を超える成体末梢血血小板様細胞が、ＣＤ４２とＣＤ４１の両方を発現し（右上パネル）、８９％を超えるこれらの細胞が同時阻害分子ＣＤ２７０およびガレクチン９も発現する（右下パネル）。アイソタイプ一致させたＩｇＧを対照として使用した（左パネル）。さらに、図２Ｆに示されるように、９５％を超える成体末梢血血小板様細胞が、ＣＤ４１と、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２７０の両方を発現する（上パネル）。対照的に、０．２％未満のＣＤ４１発現血小板様細胞が、ＩＣＯＳも発現し（左下パネル）、約２０％のＣＤ４１発現血小板様細胞が、ガレクチン９も発現する（右下パネル）。ＩｇＧ−ＦＩＴＣ／ＩｇＧ−ＰＣ７（左上パネル）およびＩｇＧ−ＰＥ／ＩｇＧ−ＡＰＣ（左下パネル）を陰性対照として用いた。
かくして、フローサイトメトリーにより、成体血液由来血小板様細胞上でのＰＤ−Ｌ１およびＣＤ２７０の高発現、ガレクチン９の低発現、ならびにＩＣＯＳの無発現が示された。代表的なデータは、８つの個々の調製物に由来するものであった。
【０１７７】
ガレクチン９は、好酸球化学誘引物質および活性化因子として初めて同定された、２つの炭水化物認識ドメインを有するタンデムリピート型ガレクチンである；それは、細胞凝集および接着、ならびに腫瘍細胞のアポトーシスを含む、様々な生物学的機能を調節する（Fujihara, S. et al, "Galectin-9 in cancer therapy," Recent Pat. Endocr. Metab. Immune Drug Discov. (2013); 7(2): 130-7）。ガレクチン９は、リンパ球に対する免疫調節的役割を有し、ＴＩＭ−３との特異的相互作用を示し、Ｔｈ１免疫を負に調節することができる（Zhu, C. et al, "The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity," Nat. Immunol. 2005; 6(1220: 1245-62）。
図２Ｇに示されるように、細胞内染色およびフローサイトメトリーにより、９８％を超えるヒト成体末梢血血小板様細胞が、ＣＤ４１とＴＧＦβ１とを同時発現することも示された（右パネル）。ＩｇＧ−ＡＰＣ／ＩｇＧ−ＰＣ７を陰性対照として使用した（左パネル）。
【０１７８】
ヒト成体末梢血血小板も、自己免疫調節因子であるＡＩＲＥを発現することが示された（図２ＨおよびＩ）。図２Ｈに示されるように、ウェスタンブロット分析により、ヒト成体末梢血血小板のそれぞれ９つの異なる試料がＡＩＲＥタンパク質を含むことが示された。各ブロットの右外側の数字は、任意相対強度単位でのタンパク質の定量された平均量を表す。さらに、図２Ｉに示されるように、９６％を超えるヒト成体末梢血血小板がＣＤ４１およびＡＩＲＥタンパク質について陽性である（右パネル）。ＩｇＧ−ＦＩＴＣ／ＩｇＧ−ＰＣ７を陰性対照として用いた。
追加的なフローサイトメトリーデータにより、臍帯血由来血小板様細胞および成体血液由来血小板様細胞の両方を含む血小板に富む細胞画分が、同時阻害的表面分子であるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を展示することが示された（データは示さない）。プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、多くのがん細胞型、ならびに活性化Ｔ細胞および抗原提示細胞によって発現される（Coombs, MR. et al, "Apigenin inhibits the inducible expression of programmed death ligand 1 by human and mouse mammary carcinoma cells," Cancer Lett. 2016; 380(2): 424-33）。
【０１７９】
ヒト成体末梢血血小板は、様々な程度で様々なケモカイン受容体を発現することが示された。図２Ｊ〜Ｋに示されるように、フローサイトメトリーデータは、高いパーセンテージのヒト成体末梢血由来血小板が高レベルのＣＣＲ３（８２％を超える）およびＣＸＣＲ４（９４％を超える）を発現することを示していた（図２Ｊ、左下；図２Ｋ、中央下）。また、６１％を超えるヒト成体血小板が高レベルのＣＣＬ２を発現することも示された（図２Ｊ、左上パネル）。高レベルのＣＸＣＬ１０（９．９％）、ＣＣＲ４（２．０１％）、ＣＣＲ５（６．７９％）、ＣＣＲ７（２７．３％）、ＣＸＣＲ１（９．９５％）、ＣＸＣＲ２（１０．５７％）、ＣＸＣＲ３（２２．７７％）、およびＣＤ６２Ｌ（４．３６％）を発現するものと同定されたヒト成体血小板のパーセンテージを、括弧内に示す。実質的に、成体血小板はいずれも、高レベルのＣＸＣＬ１を発現しなかった（１％未満）。図２ＪおよびＫ中のそれぞれのフローサイトメトリーチャートのｘ軸は、マーカーＣＤ４１を表す。かくして、フローサイトメトリーは、成体血液血小板様細胞上での変化したレベルでのケモカイン受容体およびリガンドの発現を示す。
理論によって限定されるものではないが、血小板様細胞を含む臍帯血の血漿に富む画分と接触する成体単核細胞は、免疫調節分子の移動、またはその誘導により免疫寛容を誘導することができることが想定できる。
【０１８０】
フローサイトメトリーにより、臍帯血（ＣＢ）と成体末梢血（ＰＢ）の両方の血小板様細胞が、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７０（ヘルペスウイルス進入メディエータ、ＨＶＥＭ）およびガレクチン９などの１つまたは複数の同時阻害表面分子を展示することが示された。図２Ｆに示されるように、ＰＤ−Ｌ１（９５．４２％）およびＣＤ２７０（９５．８１％）の発現は、成体血液由来血小板上でＩＣＯＳ（０．２０％）の発現よりもはるかに高かった（図２ＥおよびＦ）。
【０１８１】
ガレクチン９の発現は、４人の個体（４／８のドナー、５４．０７％±２７．５９）の血小板様細胞において陽性であった（データは示さない）。細胞内染色により、血小板様細胞がサイトカインであるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）も発現することが示された（図２ＢおよびＧ）。本発明者らはまた、ＣＤ４２＋Ｆｏｘｐ３＋血小板の９６．２２％およびＣＤ４１＋Ｆｏｘｐ３＋血小板の９６．４４％がそれぞれ、免疫調節関連転写因子Ｆｏｘｐ３を展示することも見出した（図２Ｂ）。注目すべきことに、ウェスタンブロッティングおよびフローサイトメトリーにより、臍帯血血小板様細胞（図２ＣおよびＤ）ならびに成体血液血小板様細胞（図２ＨおよびＩ）中での自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）の発現が示された。さらなるフローサイトメトリーにより、血小板が、高レベルのケモカイン受容体ＣＣＲ３およびＣＸＣＲ４、中レベルのＣＣＬ２、低レベルのＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、およびＣＤ６２Ｌを展示し、ＣＸＣＬ１の発現については陰性であることが示された（図２Ｊ〜Ｋ）。理論によって限定されるものではないが、これらのデータは、マーカー発現に基づいて、血小板様細胞が免疫調節因子として作用し、免疫寛容を誘導することができるとの結論を支持する。
【０１８２】
血小板由来ミトコンドリアは免疫調節を示す
ミトコンドリアを、免疫マーカー関連遺伝子の起源を同定するためのミトコンドリアＤＮＡ（ＭｉｔｏＤＮＡ）の遺伝子転写のために、ＣＢ−血小板およびＰＢ−血小板から精製した。ミトコンドリアを、製造業者の推奨プロトコールに従ってＱｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｄｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＢ−血小板から単離した。リアルタイムＰＣＲアレイ分析により、Ｔ細胞アネルギーおよび免疫寛容関連遺伝子の発現が示された（図２Ｌ）。フローサイトメトリーはさらに、ミトコンドリアを放出する血小板が免疫寛容関連マーカーＣＤ２７０およびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）を展示したことを示した（図２Ｍ）。
【０１８３】
Ｔ細胞上でのミトコンドリアの免疫調節活性を決定するために、末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体＋組換えヒトＩＬ−２（ｒＩＬ−２）と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓの存在下、同種異系ＰＢ−血小板由来ミトコンドリアで処理した。このモノクローナル抗体（ｍＡｂ）組合せを用いて４日間、Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた後、上清中に浮かぶ異なるサイズの多数の細胞クラスターが見られ（図２Ｎ、中央下パネル）、有意なＴ細胞増殖が示唆された。ミトコンドリアの存在下では、この現象は明らかではなかった（図２Ｎ、右パネル）、その代わり、ミトコンドリアとの組合せ処理後、細胞数は顕著に減少した（図２Ｏ）。
【０１８４】
次に、細胞上での免疫チェックポイント受容体ＰＤ−１（プログラム細胞死受容体−１）の発現を、Ｔ細胞上で検査した。ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１のリガンド（ＣＤ２７４）である。ＣＤ４＋ＰＤ１＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ミトコンドリアによる処理後、１５％±０．６４％に増加した（図２Ｐ）（Ｐ＝０．００１）。さらなるフローサイトメトリーにより、ＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ細胞のパーセンテージも、ミトコンドリアの存在下で２．４３％±１．１８％から６．４６％±０．２８％まで改善されることが示された（図２Ｑ）（Ｐ＝０．０３４）。
理論によって限定されるものではないが、これらの知見は、血小板およびそのミトコンドリアの分子含量が、免疫調節因子として作用し、免疫寛容を誘導することができることのさらなる証拠を提供する。
【０１８５】
（例３）
血小板による単球分化の調節
血小板様細胞と他の血液免疫細胞との相互作用を特徴付けるために、臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）を、マーカーＣＤ４１ｂおよびＣＤ４２ａと共に様々な系列特異的マーカーで免疫染色した。ＣＤ４１ｂは、糖タンパク質ＩＩＩａ（またはインテグリンβ３、ＣＤ６１）と会合する糖タンパク質ＩＩｂ（ＣＤ４１として知られる）のβ鎖であり、ヒト巨核球および血小板上に存在するヘテロ二量体ｇｐＩＩｂ／ｇｐＩＩＩａ複合体を形成する；血小板糖タンパク質ＧＰＩＸとも呼ばれるＣＤ４２ａ  ＧＰ−ＩＸ（ＣＤ４２ａ）、ＧＰ９は、ＧＰ−Ｉｂ（ＣＤ４２ｂ）と非共有複合体を形成する低分子膜タンパク質糖タンパク質である。ＣＤ４２ａ−ｄ複合体は、フォン・ヴィレブランド因子およびトロンビンの受容体であり、損傷した内皮中に露出する内皮下マトリックスへの血小板の接着を媒介し、トロンビンに対する血小板応答を増幅する。
【０１８６】
フローサイトメトリーによれば、血小板様細胞は、多くのＣＤ１４＋単球およびＣＤ６６ｂ＋顆粒球、ならびに一部のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞に接着する（図３Ａ〜Ｃ）。図３Ａは、ＣＢＭＣの非ゲート化ドットプロットであり、４つの主要な細胞集団：リンパ球（Ｌｙ、紫色の丸）、単球（Ｍｏ、黒色の丸）、顆粒球（Ｇｒ、黄色の丸）、および血小板（Ｐｌ、青色の丸）が存在する。細胞解離試薬であるトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％）で処理した後、ＣＢＭＣ中のＣＤ６６ｂ＋ＣＤ４１＋顆粒球のパーセンテージは、未処理のＣＢＭＣのものと比較して顕著に低下した（Ｐ＝０．００７、図３Ｄ）；しかしながら、ＣＢＭＣ中のＣＤ１４＋ＣＤ４１＋単球のパーセンテージは、有意な変化を示すことができなかった（Ｐ＝０．９５、図３ＤおよびＥ）。このデータは、血小板様細胞が、顆粒球および他の免疫細胞よりも単球に強く接着することを示唆している。
以前の研究により、ヒト成人単球／マクロファージ（Ｍｏ／Ｍφ）が、誘導因子によるｅｘ  ｖｉｖｏでの処理の後に多能性幹細胞（線維芽細胞様Ｍφ、ｆ−Ｍφと命名された）に脱分化することができることが示された（Zhao Y, Glesne D, Huberman E: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 2426-2431）。血小板とＭｏ／Ｍφとの相互作用がこの脱分化に寄与するかどうかを決定するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、細胞固定および透過処理後にフローサイトメトリーによって分析した。透過処理したＰＢＭＣ中のＣＤ１４＋ＣＤ４１＋およびＣＤ１４＋ＣＤ４２＋Ｍｏ／Ｍφのパーセンテージは、新鮮に単離されたＰＢＭＣ中のものと比較して４倍増加した（図３Ｆ）。
精製されたＭφを、透過型電子顕微鏡（図３Ｇ〜Ｌ）および共焦点顕微鏡（図３Ｐ）によって検査した。電子顕微鏡により、細胞融合（図３Ｉ〜Ｋ）およびＭφによる血小板様細胞の食作用（図３Ｌ）を含む、血小板様細胞とＭφとの密接な相互作用が示された。
【０１８７】
図３Ｉは、電子顕微鏡によるマクロファージ（Ｍφ）と血小板様細胞（Ｐ）との密接な会合のズームアウト（上パネル）およびズームイン（下パネル）画像を示す。下パネルは、上パネル中の破線の囲みによって概略される画像を表す。文字「Ｎ」は、Ｍφの核を示す。図３Ｉに示されるように、マクロファージ（Ｍφ）の膜境界は、血小板様細胞（Ｐ）の膜境界と融合しているように見える（下パネルの矢印で示される見かけの融合物の結合部を参照されたい）。同様に、図３Ｊは、左上から右に、左下に向かって、増大する拡大率の一連のズーム画像を示し、Ｍφと血小板様細胞との相互作用を示す。図３Ｊに示されるように、Ｍφと血小板様細胞の膜は、融合しているように見える（右パネル、左下パネルの矢印で示される見かけ上融合した膜を参照されたい）。一部の場所では、細胞膜境界が消失している（図３Ｊ、右および左下パネル、三角形の矢印で示される）。図３Ｋもまた、Ｍφと血小板様細胞との密接な会合のズームアウト（左パネル）およびズームイン（右パネル）画像を示す。図３Ｋに示されるように、Ｍφおよび血小板様細胞の膜は、密接に会合しているか、または融合しているように見える（例えば、矢印、右パネルを参照されたい）。
図３Ｌは、血小板様細胞（Ｐ）と密接に接触している／それを飲み込んだように見えるマクロファージのズームアウト（左パネル）およびズームイン（右パネル）画像を示す。マクロファージの波状の核が示される（Ｎ）。図３Ｌに示されるように、血小板様細胞は、Ｍφ膜の境界によって完全に取り囲まれている。
【０１８８】
以前の研究により、ヒト成人単球／マクロファージ（Ｍｏ／Ｍφ）が、誘導因子を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで処理した後、線維芽細胞様Ｍφ（ｆ−Ｍφ）と命名された多能性幹細胞に脱分化することができることが示されたため（Zhao Y, Glesne D, Huberman E: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 2426-2431）、血小板様細胞の幹細胞性に由来するｆ−Ｍφの多能性を精査した。臍帯血の血小板に富む画分と接触させたマクロファージ（Ｍφ）を、トリプシン／ＥＤＴＡで処理したか、または未処理のままにした。トリプシン処理されたＭφおよび未処理のＭφを、２日間にわたって５０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下で培養した後、ｆ−Ｍφ形態の存在または非存在について視覚的に評価した。図３Ｍに示されるように、ｆ−Ｍφのパーセンテージは、トリプシン／ＥＤＴＡで処置されたマクロファージ群において有意に低下した。理論によって限定されるものではないが、このデータは、ｆ−Ｍφの多能性が、ｆ−Ｍφに対して幹細胞性を付与する血液の血小板に富む画分内の成分との接触、およびその幹細胞性に由来することを示唆している。
【０１８９】
図３Ｎに示されるように、マクロファージの総細胞数も、トリプシン／ＥＤＴＡによる処理および７日間の培養後に減少した（未処理群の５．１３±０．７５ｘ１０4細胞／ｍｌに対して、１．７５±０．３５ｘ１０4細胞／ｍｌ、Ｐ＝０．００４４）。トリプシン／ＥＤＴＡ処理された細胞（左パネル）および未処理の細胞（右パネル）の総細胞集団における差異を示す代表的な位相差顕微鏡画像を、図３Ｎに示す。理論によって限定されるものではないが、このデータは、ｆ−Ｍφの形成が、Ｍφとの接触に由来する血液の血小板に富む画分中の結合した成分の（少なくとも部分的）除去の後に減少したことを示す。
【０１９０】
さらに、データは、上皮様細胞に分化するｆ−Ｍφの能力が、トリプシン／ＥＤＴＡを用いる処理による血小板に富む血液画分成分の除去後に低下したことを示している。Ｍφを、臍帯血から取得し、トリプシン／ＥＤＴＡで処理したか、または未処理のままにした。処理された、および未処理のＭφを、１００ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）中で１０日間培養し、マウス抗パン−カドヘリン抗体（１：１００希釈率）で免疫染色し、位相差顕微鏡によって検査した。図３Ｏに示されるように、トリプシン／ＥＤＴＡで処理した代表的な細胞（左パネル）は、未処理群の代表的な細胞（右パネル）と比較した場合、カドヘリンに関する染色の減少を示す。
【０１９１】
共焦点顕微鏡データにより、Ｍφ細胞内のＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２マーカーおよび幹細胞性マーカーの存在が確認された。具体的には、共焦点データにより、Ｍφの内部でのＣＤ４２ａ＋ＯＣＴ３／４＋およびＣＤ４２ａ＋ＮＡＮＯＧ＋の分布ならびにＭφの核中でのＯＣＴ３／４およびＮＡＮＯＧの翻訳が確認された（図３Ｐ）。図３Ｐに示されるように、Ｍφを、ＣＤ４２ａおよびＯＣＴ４について免疫蛍光染色した。各群について、核をＤＡＰＩで染色した。図３Ｐの左パネルは、ＣＤ４２ａの強い核周囲染色を示すが、中央パネルは、ＯＣＴ４の強い核染色を示す。理論によって限定されるものではないが、これらの結果は、Ｍφが食作用、血小板との膜融合、または血小板マイクロパーティクルおよび／もしくはエキソソームを受容することによって血小板様細胞中に存在するタンパク質および／またはｍＲＮＡを取り込むことができること、ならびにＯＣＴ３／４およびＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の移動がＭφをより幹細胞のような状態に再プログラミングすることができたことを示唆する。
総合すると、理論によって限定されるものではないが、データは、血小板様細胞を含む臍帯血の血小板に富む画分が、Ｍｏ／Ｍφと接触することにより、Ｍｏ／Ｍφの再プログラミングならびにｆ−Ｍφの増殖および分化を誘導する、ＥＳ関連転写因子を提供し得ることを示唆する。
【０１９２】
（例４）
血小板様細胞はヒトＥＳ細胞マーカーを発現する
ヒト血小板のマーカーＣＤ４１およびＣＤ４２を使用するフローサイトメトリーにより、ヒト臍帯血に由来する高精製血小板（９８％を超える純度）がＥＳ関連多能性遺伝子マーカーを高度に展示することが示された。例えば、転写因子であるオクタマー結合タンパク質４（ＯＣＴ４）は、９８％を超える細胞中で発現されることが見出され、ＳＲＹ−ボックス含有遺伝子２（ＳＯＸ２）は９６％を超える細胞中で発現されることが見出された（図４ＡおよびＢ）。あったとしてもわずかな細胞（０．１％未満）がＮＡＮＯＧを発現した（図４Ｂ）。成体ヒト末梢血由来血小板からも同様のデータが得られた（図４Ｃ）。
【０１９３】
それぞれ、臍帯血（図４Ｄ）および末梢血血小板様細胞（図４Ｆ）中でのＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４（ＫＬＦ４）、およびｃ−骨髄球腫症がん遺伝子（Ｃ−ＭＹＣ）に由来するｍＲＮＡの存在を、リアルタイムＰＣＲおよびゲル電気泳動分析によって証明した。それぞれのゲルパネルの外側および右側の値は、相対強度単位での６つの代表試料間のバンド強度の平均された定量を示す。ウェスタンブロッティングにより、臍帯血血小板様細胞中のタンパク質レベルでのＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＣＲＩＰＴＯ、ＧＡＴＡ−４、およびＣ−ＭＹＣの発現がさらに確認された（図４Ｅ）。末梢血血小板様細胞からも同様のデータが得られた（図４Ｇ）。各ウェスタンブロットパネルの右側および外側の値は、各試料バンドから平均した相対強度単位を表す。ＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡの発現は、５／２０のＣＢ−血小板において陽性であった（図４Ｅ）。ＰＢ−血小板においては、ｍＲＮＡとタンパク質レベルの両方が陰性であった（図４ＦおよびＧ）。このデータは、血小板様細胞が、成体ヒト細胞の増殖および分化の調節および再プログラミングに寄与し得る「幹細胞性」マーカーを保持することを示している。
【０１９４】
血小板は、ヒトゲノムＤＮＡを含まない無核細胞である。血小板様細胞画分中で発現される遺伝子をさらに特徴付けるために、ミトコンドリアＤＮＡ（ＭｉｔｏＤＮＡ）の遺伝子転写物の分析のために臍帯血および末梢血由来血小板様細胞からミトコンドリアを精製した。ＲＴ2Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲアレイ分析により、体性幹細胞維持（ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）およびＳＯＸ２）、胎盤発生（ＨＡＮＤ１、ＳＰ１、およびＶＤＲ）、誘導多能性および胚性幹細胞（ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、およびＳＴＡＴ３）、軸／対称／断片化（ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ６、ＧＬＩ２、ＨＡＮＤ１、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＤ１０、ＬＭＸ１Ｂ、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲ２Ｆ２、ＰＡＸ１、ＳＭＡＤ２、ＴＢＸ５、ＴＤＧＦ１、およびＺＩＣ１）、胚発生（ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ６、ＧＬＩ２、ＨＡＮＤ１、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ１０、ＫＬＦ４、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＳＸ２、ＮＯＴＣＨ２、ＰＡＸ１、ＳＭＡＤ２、ＳＯＸ２、ＳＰ１、ＴＢＸ５、ＴＤＧＦ１、ＺＦＰＭ２、およびＺＩＣ１）、外胚葉、内胚葉および中胚葉の形成および分化（ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ１３、ＩＳＬ１、ＫＬＦ４、ＳＭＡＤ２、およびＳＯＸ９）、器官形態形成（ＧＬＩ２、ＨＡＮＤ１、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＤ１０、ＩＳＬ１、ＪＵＮ、ＫＬＦ４、ＭＳＸ２、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲ２Ｆ２、ＰＡＸ１、ＰＡＸ５、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ２、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ２、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＰ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＸ５、ＴＤＧＦ１、ＶＤＲ、ＷＴ１、ＺＦＰＭ２、およびＺＩＣ１）、血管新生（ＨＡＮＤ１、ＪＵＮ、ＮＲ２Ｆ２、ＲＵＮＸ１、およびＷＴ１）、神経発生（ＤＮＭＴ３Ｂ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＰ３、ＧＬＩ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＤ１０、ＩＳＬ１、ＬＭＸ１Ｂ、ＮＫＸ２．２、ＮＲ２Ｆ２、ＯＬＩＧ２、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ３、ＰＯＵ４Ｆ１、ＳＯＸ２、ＳＴＡＴ３、およびＴＬＸ３）、造血（ＲＢ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＸ６、ＳＰ１、およびＳＴＡＴ１）、骨形成（ＧＬＩ２、ＨＯＸＡ２、ＳＯＸ２、およびＳＰ１）、ならびに他のもの（ＥＧＲ３、ＥＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＰ２、ＧＡＴＡ１、ＩＲＸ４、ＫＬＦ２、ＮＦＡＴＣ１、ＰＣＮＡ、ＴＥＲＴ、およびＷＲＮ）を含むヒト幹細胞関連転写因子の発現（図４Ｈ）が示された。
【０１９５】
さらなるＲＴ2Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲアレイ分析により、細胞周期調節因子（ＡＸＩＮ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ１、ＣＤＣ４２、ＥＰ３００、ＦＧＦ２、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ２、ＰＡＲＤ６Ａ、およびＲＢ１）、染色体およびクロマチンモジュレータ（ＫＡＴ８、ＫＡＴ７、ＲＢ１、およびＴＥＲＴ）、対称性／非対称性細胞分裂を調節する遺伝子（ＤＨＨ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＵＭＢ、ＰＡＲＤ６Ａ）、自己再生マーカー（ＨＳＰＡ９、ＫＡＴ８、ＫＡＴ７、ＮＥＵＲＯＧ２、ＳＯＸ１、およびＳＯＸ２）、サイトカインおよび増殖因子（ＢＭＰ１、ＢＭＰ３、ＣＸＣＬ１２、ＦＧＦ２、およびＪＡＧ１）、細胞間コミュニケーションを調節する遺伝子（ＤＨＨ、ＧＪＢ１、およびＪＡＧ１）、細胞接着分子（ＣＤ４４、ＣＤＨ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＴＮＮＡ１、ＣＸＣＬ１２、およびＮＣＡＭ１）、代謝マーカー（ＡＬＤＨ２）、胚性細胞系列マーカー（ＡＣＴＣ１、ＡＳＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＩＳＬ１、およびＫＲＴ１５）、間葉細胞系列マーカー（ＡＬＰＩ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、およびＣＯＬ９Ａ１）、神経細胞系列マーカー（ＣＤ４４、ＮＣＡＭ１、およびＳＩＧＭＡＲ１）、ｎｏｔｃｈ経路などの幹細胞の維持に寄与するシグナリング経路（ＤＬＬ３、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、ＥＰ３００、ＨＤＡＣ２、ＪＡＧ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、およびＮＵＭＢ）およびＷｎｔ経路（ＡＤＡＲ、ＡＸＩＮ１、ＢＴＲＣ、ＣＣＮＤ１、ＦＲＡＴ１、ＦＺＤ１、ＭＹＣ、およびＰＰＡＲＤ）などの、ヒト血小板のミトコンドリアにおけるヒト幹細胞関連マーカーと関連する複数の遺伝子の発現（図４Ｉ）が示された。
図４Ｈおよび４Ｉのレーン１〜６はそれぞれ、６つの別々の血小板様細胞試料に由来する遺伝子発現プロファイルである。クラスタグラムに示された遺伝子はそれぞれ、６つの血小板様細胞試料の少なくとも１つにおいて高度に発現されることが見出された。
【０１９６】
（例５）
血小板様細胞はヒト膵島β細胞関連マーカーを展示する
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、膵島細胞の不足を引き起こすＴ細胞媒介性自己免疫疾患である。世界中で数百万人もの個人がＴ１Ｄを有し、その発生率は様々な集団の間で年々増大している。膵島移植、細胞再生の薬物媒介性促進、およびヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）または胚性幹（ＥＳ）細胞株から分化した機能的膵島細胞の移植が、Ｔ１Ｄを処置するための可能性のある手法として提唱および試験されている（Pagliuca FW, et al., Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell 2014, 159: 428-439；Quiskamp N, et al., Differentiation of human pluripotent stem cells into beta-cells: Potential and challenges. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2015, 29: 833-847）。しかしながら、ドナーの不足、免疫拒絶、ならびに循環中の自己反応性エフェクターＴ細胞およびＢ細胞の持続的存在は、これらの手法によって生成されたインスリン産生細胞を破壊し、それによって、その治療能力を最小化し得る。これらの障壁を回避するために、免疫抑制薬、宿主免疫応答の操作、および免疫キメラ現象の構成を含むいくつかの手法が精査されている。
【０１９７】
本発明者らの研究仮説は、細胞接触による臍帯血の血小板に富む画分を用いて再プログラミングされた成体細胞が、血小板誘導多能性幹細胞（ＰｉＰＳ）を生成し、続いて、機能的膵島細胞に分化することができるということである。ウイルスまたは薬物誘導性形質導入によるｉＰＳ細胞の生成に関与する安全性に対する懸念のため、臍帯血の血小板に富む画分は、タンパク質およびｍＲＮＡの送達および形質導入のための魅力的な選択肢であり、安全性プロファイルがはるかに改善された細胞再プログラミングおよび免疫調節をもたらす。
【０１９８】
グルコース恒常性
通常、グルコース摂取後、血漿グルコース濃度の増加はインスリン放出を誘発し、内臓（肝臓および消化管組織）および末梢のグルコース取込みを刺激し、内因性（主に、肝臓）グルコース産生を抑制する。健康な成人では、血糖値は７０〜９９ｍｇ／ｄＬの範囲内に厳密に調節され、代謝要求を満たすために、特定のホルモン（例えば、インスリン、グルカゴン、インクレチン）ならびに中枢および末梢神経系によって維持される。脳、筋肉、消化管、肝臓、腎臓および脂肪組織内の様々な細胞および組織も、取込み、代謝、貯蔵および分泌により血中グルコース調節に関与する［DeFronzo R.A., "Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus" Med. Clin. N. Am., Vol. 88: 787-835 (2004)；Gerich J.E., "Physiology of glucose homeostasis", Diabetes Obes. Metab. Vol. 2: 345-350, (2000)］。正常な生理的環境下では、高炭水化物の食事を消費した後でも、グルコースレベルが１４０ｍｇ／ｄＬを超えることは稀である。
【０１９９】
強力な抗脂肪分解（脂肪破壊を阻害する）ホルモンであるインスリンは、インスリン感受性細胞へのグルコースの輸送を加速し、β細胞がインスリンを産生する、膵臓のランゲルハンス島内でのグリコーゲン生成（グルコースのグリコーゲンへの転換）および脂肪生成（脂肪形成）による貯蔵化合物へのその転換を容易にすることによって、血糖値を低下させることが公知である。
グルコース恒常性においても役割を果たすホルモンであるグルカゴンは、低い正常グルコースレベルまたは低血糖に応答してランゲルハンス島内のα細胞によって産生され、グリコーゲン分解を加速し、糖新生を促進することによってグルコースレベルを増加させるように作用する。グルコースを含有する食事の後、グルカゴン分泌は、肝臓でのグルコース産生の抑制および正常な食後耐糖能の維持に寄与する高インスリン血症によって阻害される。
【０２００】
グルコース依存的インスリン分泌促進ポリペプチド（ＧＩＰ）およびグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）を含むインクレチンも、一部、インスリンおよびグルカゴンに対するその効果によって、血中グルコースの調節に関与する［Drucker D.J. et al., "The incretin system: glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes", Lancet, Vol. 368: 1696-1705, (2006)］。ＧＬＰ−１とＧＩＰは両方とも、グルコース依存的ホルモンであると考えられ、それらが、グルコースレベルが正常な空腹時血漿グルコースレベルを超えて増加する場合にのみ分泌されることを意味する。通常、これらのホルモンは、食事に応答して放出され、膵臓β細胞上のある特定の受容体を活性化することにより、それらはインスリン分泌の刺激を補助する。しかしながら、グルコースレベルが低い場合、ＧＬＰ−１およびＧＩＰレベル（およびインスリン分泌に対するその刺激効果）は減少する［Drucker D.J., "The biology of incretin hormones", Cell Metab. Vol. 3: 153-165, (2006)］。
【０２０１】
プレプログルカゴン由来ペプチドグルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２は、中枢神経系、腸のＬ細胞、ならびに膵臓および胃のα細胞中で発現されるプレプログルカゴン遺伝子によってコードされる。プロホルモン転換酵素（ＰＣ）による翻訳後切断は、これらの全てのペプチドを生成するプレグルカゴンホルモンの成熟の原因となる。各組織中での異なるＰＣサブタイプの発現が、それぞれ異なるペプチドの産生を媒介する。α細胞中では、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン２型（ＰＣＳＫ２）の優位性が、生成物であるグリセンチン、グリセンチン反復膵ポリペプチド、介在ペプチド１および主要プログルカゴン断片と一緒に、グルカゴンの産生を誘導する［Dey A. et al., "Significance of prohormone convertase 2, PC2, mediated initial cleavage at the proglucagon interdomain site, Lys70-Arg71, to generate glucagon", Endocrinol., Vol. 146: 713-727, (2005)］。腸内分泌細胞中で、ＰＣＳＫ１／３酵素はプレプログルカゴンホルモンを切断して、グリセンチン、介在ペプチド１およびオキシントモジュリンと共にＧＬＰ１およびＧＬＰ２を生成する［Mojsov S., "Preproglucagon gene expression in pancreas and intestine diversifies at the level of post-translational processing", J. Biol. Chem., Vol. 261: 11880-11889 (1986)］。ある特定の条件下で、膵島α細胞は、ＧＬＰ−１産生のための腸外部位である［Portha B. et al., "Activation of the GLP-1 receptor signalling pathway: a relevant strategy to repair a deficient beta-cell mass",  Exptl Diabetes Res. Article 376509: 1-11, (2011)］。ＧＬＰ−１の多くの観察される細胞効果の１つは、電圧依存的カルシウムチャネルを介するＣａ２＋流入を開始し、インスリンの細胞外放出を誘発する、β細胞ＫＡＴＰチャネルの阻害である［MacDonald P.E. et al., "The multiple actions of GLP-1 on the process of glucose-stimulated insulin secretion", Diabetes, Vol. 51 (Suppl. 3): S434-S442, (2002)］。
【０２０２】
細胞へのグルコースの輸送
グルコースは全ての細胞膜を通って容易に拡散することができないため、多くの細胞に進入するためには、インスリンと、輸送タンパク質ファミリー（容易化グルコース輸送体［ＧＬＵＴ］分子）との両方からの援助が必要である［Bryant, et al, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. "Regulated transport of the glucose transporter GLUT 4", Vol. 3(4): 267-277, (2002)］。ＧＬＵＴは、グルコースがより容易に移動することができる、そうでなければ疎水性の細胞膜を横断する水性孔を形成するシャトルとして作用する。１２種の公知のＧＬＵＴ分子のうち、ＧＬＵＴ４は脂肪、筋肉、および心臓組織のための主要な輸送体であると考えられるが、ＧＬＵＴ１、２、３および８は他の臓器（例えば、脳、肝臓）へのグルコース進入を容易にする。ＧＬＵＴ４の活性化、順に、筋肉および脂肪組織への容易化されたグルコース拡散は、インスリンの存在に依存するが、他のＧＬＵＴの機能は、インスリンにより多く依存しない［Uldry M. et al., "The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters", Thorens B, Eur. J. Physiol. 2004; Vol. 447: 480-489, (2004)］。
【０２０３】
末梢組織におけるグルコース取込みの大部分（８０％以上）は、グルコースをエネルギーのためにすぐに使用するか、またはグリコーゲンとして貯蔵することができる筋肉で起こる。骨格筋はインスリン依存的であり、かくして、グリコーゲンの産生を調節する主要酵素であるグリコーゲン合成酵素の活性化のためにインスリンを必要とする。脂肪組織ははるかに少量の末梢グルコース取込み（２％〜５％）を担うが、それは、筋肉および肝臓中でのインスリン感受性に影響する、貯蔵されたトリグリセリドからの遊離脂肪酸の放出（糖新生を増加させる）を調節することによって全身グルコース恒常性の維持において重要な役割を果たしている。
肝臓はグルコース取込みを容易にするためにインスリンを必要としないが、グルコース産生を調節するためにインスリンを必要とする。かくして、例えば、インスリン濃度が低い場合、肝臓でのグルコース産生は上昇する。さらに、インスリンは、肝臓がグリコーゲンの形態で吸収されたグルコースの多くを貯蔵するのを助ける。
腎臓は、循環中へのグルコースの放出（糖新生）、腎臓でのエネルギー要求を満たすための循環からのグルコースの取込み、および尿細管でのグルコースの再吸収により、グルコース恒常性において役割を果たす。腎臓はまた、尿中へのその排出を容易にすることによって、過剰のグルコースの除去を補助する（レベルが約１８０ｍｇ／ｄＬを超える場合であるが、この閾値は慢性高血糖の間は上昇し得る）。
【０２０４】
ヒト膵島の細胞構造
ヒト膵島においては、インスリン含有β細胞は、膵島内の他の細胞型、すなわち、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチン含有細胞と混ざり合い、ヒト膵島中に分布することがわかっている［Cabrera O. et al., "The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function", Proc. Natl Acad. Sci. U.S., Vol. 103: 2334-2339, (2006)］。ヒト膵島は、明白な下位区分を示さないが、α細胞の９０％はβ細胞と直接接触し、β細胞は膵島中の他の内分泌細胞と自由に混ざり合う。β、α、およびδ細胞は、膵島内の血管への同等で無作為なアクセスを有し、異なる内分泌細胞が血管周囲の層中に編成される可能性を排除する。これらの結果は、膵島かん流の設定された順序がなく、任意の所与の細胞型が、その自身の細胞型を含む他の細胞型に影響し得るモデルを支援する［G. da Silva Xavier et al., "Per-arnt-sim (PAS) domain-containing protein kinase is downregulated in human islets in type 2 diabetes and regulates glucagon secretion", Diabetologia, Vol. 54: 819-827, (2011)］。
自己免疫疾患としての糖尿病
糖尿病は、高血糖を特徴とする代謝疾患群である。慢性高血糖症は、眼、腎臓、神経、心臓および血管などの、長期損傷、機能障害、および潜在的な臓器不全と関連する。糖尿病を処置するための理想的な治療剤は未だ開発されていない。
【０２０５】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）
１型糖尿病では、β細胞は自己免疫プロセスによって破壊され、大部分はα細胞によって置き換えられる［Unger R.H. et al., "Paracrinology of islets and the paracrinopathy of diabetes", Proc. Natl Acad. Sci., U.S., Vol. 107(37): 16009-16012, (2010)］。これらのα細胞は、通常は並列されたβ細胞に由来する高い局所濃度のインスリンによって提供される強直性拘束を欠き、不適切な高グルカゴン血症をもたらし［Raskin P. et al. Glucagon and diabetes. The Medical Clinics of North America 62, 713 (1978)］；［Habener J. F. et al., "Alpha cells some of age", Trends in Endocrinology & Metabolism: TEM Vol. 24, 153-163 (2013)］；［Unger R.H. et al., "Glucagonocentric restructuring of diabetes: a pathophysiologic and therapeutic makeover", J. Clinical Investig. Vol. 122(1): 4-12, (2012)］；［Vuguin P.M. et al. "Novel insight into glucagon receptor action: lessons from knockout and transgenic mouse models", Diabetes, Obesity & Metabolism, Vol. 13(1), 144-150, (2011)］、グルカゴン分泌を増加させる高血糖の急上昇を誘導する［Unger R.H. et al., "Glucagonocentric restructuring of diabetes: a pathophysiologic and therapeutic makeover", J. Clinical Investig. Vol. 122(1): 4-12, (2012)］。近隣のβ細胞が正常な膵島中でα細胞に与えるインスリンと適合するには、平均以上のインスリンレベルが必要である。これは、生涯にわたる高インスリン血症をもたらし、対象を、高血糖の頻繁な発生に曝露し、アテローム性動脈硬化症、および冠動脈疾患の遮断を引き起こす、血管壁における低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の蓄積としてそのような後遺症を増加させる。
【０２０６】
Ｔ１Ｄの４つの病理学的特徴は血糖値、ヘモグロビンＡ１Ｃ、グルカゴンおよびＣ−ペプチドである
Ｔ１Ｄにおける免疫機能障害は複雑であり、膵島内と膵臓外の両方に影響する。免疫系の様々な成分［例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ（Ｍｏ／Ｍφ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）］は全て、Ｔ１Ｄにおける自己免疫応答に積極的に寄与すると想定され、かくして、疾患を有する個体間で機能し得る有効かつ成功裏の処置または治癒を開発するための潜在的な努力を複雑にしている。いくつかの臨床試験［Bach J.F., "Anti-CD3 antibodies for type 1 diabetes: beyond expectations", Lancet., Vol. 378: 459-460, (2011)］；［Wherrett D.K. et al., "Antigen-based therapy with glutamic acid decarboxylase (GAD) vaccine in patients with recent-onset type 1 diabetes: a randomized double-blind trial", Lancet., Vol. 378: 319-327, (2011)］は、Ｔ１Ｄのための療法を開発し、治癒を発見する際の障害を強調し、免疫系の１種または数種の成分の膵臓効果を標的化することよりもむしろ、局所膵臓レベルと全身レベルとの両方において包括的な免疫調節をもたらす手法の必要性を指摘している。
【０２０７】
Ｔ１Ｄにおける自己免疫性の可能性のある誘発因子としては、限定されるものではないが、自己免疫の発達を開始させるか、または強化するために独立に、または一緒に作用し得る、遺伝的な、エピジェネティックな、物理的な、社会的な、および環境的な因子が挙げられる。免疫系におけるＴ１Ｄ関連機能障害は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、単球／マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞などの、複数の細胞型および標的における機能障害に端を発していた［Lehuen A. et al., "Immune cell crosstalk in type I diabetes", Nat Rev Immunol. Vol. 10: 501-513, (2010)］。Ｔ１Ｄ関連自己免疫応答のポリクローナル性およびＴ１Ｄ患者における免疫調節の全体的な課題のため、自己免疫応答の１種または数種の成分のみを標的とする療法および治験は、ちょうど、Ｔ細胞のための抗ＣＤ３  Ａｂ、Ｂ細胞のための抗ＣＤ１９Ａｂ、およびＧＡＤ６５ワクチン接種を含む最近の治験が失敗したように、失敗する可能性が高い［Bach J.F., "Anti CD-3 antibodies for type 1 diabetes: beyond expectations", Lancet, Vol. 378: 459-460, (2011)］；［Mathieu C. et al., "Arresting type I diabetes after diagnosis: GAD is not enough", Lancet, Vol. 378: 291-292, (2011)］。
幹細胞療法は破壊された膵島β細胞を置き換える手段として活用されてきたが、この手法は、根本的な自己免疫応答の軽減の非存在下では役に立たない。
【０２０８】
自己免疫応答のポリクローナル性およびＴ１Ｄ患者における免疫調節の全体的な課題のため［Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010)］；［Abdi R. et al., "Immunomodulation by mesenchymal stem cells: a potential therapeutic strategy for type 1 diabetes", Diabetes, Vol. 57: 1759-1767, (2008)］；［Aguayo-Mazzucato C. et al., "Stem cell therapy for type I diabetes", Nat Rev Endocrinol., Vol. 6: 139-148, (2010)］；［Uccelli A. et al., "Mesenchymal stem cells in health and disease", Nat Rev Immunol., Vol. 8: 726-736, (2008)］；［Zhao Y. et al., "Immune regulation of T lymphocyte by a newly characterized human umbilical cord blood stem cell", Immunol Lett., Vol. 108: 78-87, (2007)］、Ｔ１Ｄにおける根本的な自己免疫に対処するための試みは上手くいっていない［Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010)］。個々の手法の組合せが、これらの課題に対処するために提唱されている［Aguayo-Mazzucato C et al., "Stem cell therapy for type I diabetes mellitus", Nat Rev Endocrinol, Vol. 6: 139-148, (2010)］；［Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cell-modulated regulatory T lymphocytes reverse the autoimmune-caused type 1 diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice", PLoS ONE, Vol. 4: e4226, (2009)］；［Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med. Vol. 10(3), 1-11, (2012)］が、これらの手法の順守は依然として複雑であり、非常に費用が高いことが多い。
【０２０９】
２型糖尿病
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は、β細胞が存在する高血糖障害であり、かくして、１型糖尿病とは区別される。いくつかの因子がＴ２Ｄの発生に寄与するが、中心的な欠陥は、ホルモン作用の複雑な経路における１つまたは複数の点での、不十分なインスリン分泌（インスリン欠乏）および／またはインスリンに対する組織応答の低下（インスリン耐性）である［Triplitt C.L., "Examining the mechanisms of glucose regulation", Am. J. Manag. Care, Vol. 18 (1 Suppl) S4-S10, (2012)］。高血糖への寄与はＴ２Ｄの範囲と共に広く変化し得るが、インスリン欠乏およびインスリン耐性は同時に存在することが多い。
【０２１０】
Ｔ２Ｄの病因は、膵島β細胞に影響する炎症を開始させる自己免疫成分を含み、免疫調節によるインスリン耐性の機構および潜在的な処置への新しい洞察を提供することの証拠がある。一部の臨床試験により、Ｔ２Ｄ患者［Jagannathan-Bogdan M. et al., "Elevated proinflammatory cytokine production by a skewed T cell compartment requires monocytes and promotes inflammation in type 2 diabetes", J Immunol, Vol. 186: 1162-1172, (2011)］および肥満患者［Sumarac-Dumanovic M. et al., "Increased activity of interleukin-23/interleukin-17 proinflammatory axis in obese women", Int J Obes (Lond), Vol. 33: 151-156, (2009)］におけるＩＬ−１７産生のレベルの増加が示された。他の試験は、ＴH1関連サイトカインＩＬ−１２のレベルが、Ｔ２Ｄ対象において増加していることを示す［Wu H.P. et al., "High interleukin-12 production from stimulated peripheral blood mononuclear cells of type 2 diabetes patients", Cytokine, Vol. 51: 298-304, (2010)］。
【０２１１】
血小板様細胞およびヒト膵臓β細胞関連マーカー
本発明者らは、血小板様細胞を含む臍帯血に由来する血小板に富む画分を、末梢血細胞を再プログラミングするために使用することができるかどうか、および再プログラミングされた細胞が、糖尿病対象の膵島におけるβ細胞の存在する／枯渇した集団を補完するように分化することができるかどうかを探索することに興味を持った。
血小板様細胞が膵島β細胞の再生に寄与することができるかどうかを探索するために、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲによって、インスリンおよびＣ−ペプチド産物、転写因子（ＭＡＦＡ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ１、およびＮＧＮ３）、ＫＡＴＰチャネルタンパク質（Ｓｕｒ１およびＫｉｒ６．２）ならびにグルコキナーゼ（ＧＣＫ）などのヒト膵島β細胞特異的マーカーを検査した。臍帯血由来血小板様細胞を、上記のように単離し、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロットにより分析した。
【０２１２】
リアルタイムＰＣＲデータにより、ＣＢ由来血小板中でのインスリン、ＭＡＦＡ、およびＳｕｒ１  ｍＲＮＡの発現が示された（ｎ＝６）。Ｋｉｒ６．２  ｍＲＮＡは多くの試料（５／６）中で示されたが、少ない試料（１／６）がＧＳＫについて陽性であった（図５ＡおよびＢ）。同じ試料中で、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ１、およびＮＧＮ３の発現はなかったか、または非常に弱かった（図５Ｂ）。ＣＢ由来血小板様細胞は、膵島δ細胞により放出されるホルモンであるソマトスタチンおよびε細胞マーカーであるグレリンのｍＲＮＡを示し、グルカゴンおよびＰＰＹ  ｍＲＮＡの発現は非常に弱いか、またはなかった（図５Ａ）。ヒト膵島細胞のＲＴ−ＰＣＲを、陽性対照としてのＣＢ−血小板様細胞のＲＴ−ＰＣＲと同時に実施した（図５ＡおよびＢ、右パネル）。各パネルの右側の値は、相対強度単位でのヒト膵島細胞バンドの定量された強度を示す。
ウェスタンブロッティングにより、タンパク質レベルでの成熟ベータ細胞マーカーＭＡＦＡの発現がさらに示された（図５Ｃ）。各ブロットの右側の数字は、相対強度単位で同定されたタンパク質の定量された平均量を表す。
【０２１３】
陽性対照として新鮮に単離されたヒト膵島細胞を使用して（図５Ｄ）、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４２＋インスリン＋（６３．０７％）ＣＤ４２＋Ｃ−ペプチド＋（６５．１４％）、ＣＤ４１＋ＭＡＦＡ＋（２０．１２％）、ＣＤ４２＋ＰＤＸ１＋（０．２８％）、ＣＤ４２＋ＮＫＸ６．１＋（０．３％）、およびＣＤ４２＋グルカゴン１＋（２．８２％）などの、臍帯血由来血小板様細胞のプロファイルにおける膵臓細胞マーカーの発現を確認した（図５Ｅおよび５Ｆ）。さらに、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４２＋ＰＴＦＡ１＋（１３．０２％）、ＣＤ４２＋ＦｏｘＡ２＋（０．３４％）、およびＣＤ４２＋Ｓｏｘ１７＋（０．４８％）などの正常なβ細胞発生と関連する転写因子の低い発現が示された（図５Ｆ）。
ヒト成人末梢血由来血小板様細胞におけるさらなる試験により、臍帯血由来血小板様細胞中のものと同じマーカーおよびパターンの発現が示された（図５Ｇ〜Ｊ）。臍帯血由来試料とは対照的に、末梢血由来試料のＧＳＫ  ｍＲＮＡは、多くの試料（５／６）中で示された。少ない試料（１／６）は、ＳＳＴについて陽性であり、Ｓｕｒ１の発現はなかった（図５Ｇ）。
【０２１４】
臍帯血由来および末梢血由来試料の共焦点顕微鏡観察により、血小板の高密度顆粒およびα顆粒として、細胞質中で典型的なインスリン顆粒形成がないことが確認された（図５Ｋ）。図５Ｋに示されるように、多くの血小板の視野を、インスリン（青色）、高密度顆粒マーカーＡＤＰ（赤色）、およびアルファ顆粒マーカーｖＷＦ（緑色）について免疫染色した。蛍光画像は、顆粒形成を示さない。スケールバーは、５μｍの長さを表す。個々の血小板は、約２μｍの長さである。上パネルの白色の破線の囲みは、中央パネルに見られるズームされた領域を示す（図５Ｋを参照）。橙色の破線の囲みは、実験群と同等の曝露時間を用いて、アイソタイプ一致させた対照ＩｇＧで精査した後の視野を示す。図５Ｋに示されるデータは、６つの別々の実験から得られた血小板様細胞の代表である。これらのデータは、ヒト血小板中での膵島β細胞関連マーカーの発現が、膵島β細胞の分化および再生を促進するより高い能力をもたらすことを示していた。
【０２１５】
以前の研究により、末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ−ＩＰＣ）と命名される、成体ヒト血液に由来する新規細胞集団が同定された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの実験により、ＰＢＩＰＣが糖尿病マウスへの移植後に高血糖を軽減し、膵島に移動することができることが示された（Zhao Y, et al., A unique human blood-derived cell population displays high potential for producing insulin (Biochem Biophys Res Commun 2007, 360: 205-211）。
記載されたデータは、臍帯血血小板様細胞を含む臍帯血に由来する血小板に富む画分を、ＰＢ−ＩＰＣと接触させた後、機能的膵島細胞様細胞に分化するよう促すことができることを示す。さらに、記載されるデータは、臍帯血血小板様細胞を含む臍帯血に由来する血小板に富む画分と接触させた成体単核細胞がＰＢ−ＩＰＣを生成することができることを示す。
【０２１６】
（例６）
血小板により放出されるミトコンドリアはヒト膵島の機能および生存を改善する
新鮮に単離されたヒト膵島を、Ｌｏｎｚａ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から購入した。膵島を、室温で５分間、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて単一細胞に解離させた。膵島細胞（１ｘ１０5細胞／ｍｌ）を、０．４μｍ孔径のトランスウェル培養システム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の上インサートに播種した。膵島を、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄで標識された血小板様細胞と同時培養し、トランスウェル培養システムの下チャンバーに入れた。膵島細胞を、１、２、４、６、２０、２４時間で動的フローサイトメトリーのために異なる時点で収集した。７日後、処理された、および処理されていない膵島細胞を収集して、ＴＣ２０自動細胞計数装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用することによって細胞生存能力および生細胞数を検査した。
【０２１７】
ミトコンドリアを、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｄｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して血小板様細胞から単離した。全膵島細胞を、ウェルあたり１２５の膵島等価物（ＩＥＱ）でトランスウェル（０．４μｍ孔径）の上チャンバーに播種し、トランスウェルの下チャンバーに播種した、血小板様細胞に由来する単離されたミトコンドリアと共に、８％ＣＯ2中、３７℃で処理した（２５０μｇ／ｍｌ、下ウェル）。膵島培地（Ｌｏｎｚａ）中でのみ培養した膵島を、対照として使用した。膵島を培養した７日後、ミトコンドリア処理された、および処理されていない膵島を、フローサイトメトリー、細胞生存能力、およびインスリン／Ｃ−ペプチド放出などの機能的試験のためにそれぞれ収集した。
【０２１８】
解離した膵島細胞を、３７℃で３０分間、２０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２９および２０μｇ／ｍｌの抗ＴＬＲ４  Ａｂで予備処理した。次いで、血小板から単離されたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで標識されたミトコンドリア（１２５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。遮断抗体の非存在下でミトコンドリアと同時培養した膵島細胞を、対照として使用した。５時間後、ミトコンドリア処理された、および処理されていない膵島細胞を洗浄し、ＰｅｒＦｉｘ−ｎｃ（遠心分離を用いないアッセイ）キット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用することにより、固定および透過処理した後、フローサイトメトリーのために膵島β細胞マーカーであるインスリンを用いて細胞内染色した。
フローサイトメトリーにより、血小板様細胞が基底レベルのミトコンドリアを放出することができることが示された（図６Ａ）。図６Ａに示されるように、フローサイトメトリーは、上記のように血小板様細胞から得られたゲート化されたミトコンドリア（前方散乱および側方散乱によって決定される）が、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ蛍光染色について陽性であることを示した。
【０２１９】
血小板様細胞を、ミトコンドリアを単離する前に、アデニン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、およびトロンビンなどの様々な血小板凝集因子で刺激した。放出されたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色されたミトコンドリアの量を、任意の蛍光強度単位で定量した。図６Ｂのデータは、蛍光強度によって測定された放出されたミトコンドリアのレベルが、アゴニストであるアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）およびアラキドン酸（ＡＲＡ）によって増加したが、トロンビンによる処理によって減少したことを示す（図６Ｂ）。
膵島および血小板様細胞を、トランスウェルシステム中で同時培養した。図６Ｃに示されるように、ヒト膵島細胞を、トランスウェルの上チャンバーで培養し、血小板様細胞を下チャンバーに入れた。トランスウェル同時培養システム（図６Ｃ）を使用して、１、２、４、６、２０または２４時間にわたって同時培養した後、膵島細胞を収獲し、膵島へのミトコンドリア結合の動力学をフローサイトメトリーによって決定した。
【０２２０】
図６Ｄに示されるように、フローサイトメトリーデータにより、下チャンバー中で血小板様細胞から放出されたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで標識されたミトコンドリアが、上チャンバー中の膵島細胞によって取り込まれるトランスウェルを通過することができることが示された。ｙ軸の「計数」は、定量された膵島細胞を表すが、蛍光強度（ｘ軸）は蛍光染色されたミトコンドリアの定量された量を表す。染色されたミトコンドリアを取り込んだ膵島細胞のパーセンテージは、１時間で３７．２１％から２時間で５５．２６％に、４時間で５８．０３％に、６時間で６９．２２％に、２０時間で９７．４２％に、２４時間で９５．６５％に増加した。
【０２２１】
次に、膵島β細胞へのミトコンドリアの移動をもたらす分子機構を探索した。フローサイトメトリーにより、血小板様細胞由来ミトコンドリアが、フィブロネクチン、ＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）、ＣＸＣＲ４、およびケモカインＣ−Ｃモチーフ受容体７（ＣＣＲ７）などの接着分子およびケモカインを強く発現するが、ＣＤ６２Ｌについては陰性であることが示された（図６Ｅ；垂直軸はそれぞれの接着分子／受容体の定量された量を表すが、水平軸はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色の蛍光強度を表す）。
フローサイトメトリーにより、ヒト膵島β細胞が、フィブロネクチンリガンドであるＣＤ２９（インテグリンβ１）、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、およびＴＬＲ６を発現することが示された（図６Ｆ；垂直軸はそれぞれの受容体の定量された量を表すが、膵島ベータ細胞は水平軸上で定量されるインスリンの発現によって同定された）。ＩＩ型膜貫通糖タンパク質ＣＤ３８、トロンボスポンジン受容体ＣＤ３６、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体ＣＣＲ４、およびＣＣＲ６の発現レベルは低いか、または陰性であった（図６Ｆ）。
【０２２２】
どの分子がミトコンドリアと膵島β細胞との相互作用に関与するかを決定するために、血小板由来ミトコンドリアを、ＣＤ２９および／またはＴＬＲ４に対する遮断抗体の存在下、膵島と同時培養した。図６Ｇに示されるように、データは、膵島β細胞によるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで標識されたミトコンドリアの取込みが、ＣＤ２９および／またはＴＬＲ４  Ａｂで遮断することによって顕著に減少することを示していたが、これは、ＣＤ２９およびＴＬＲ４がヒト膵島β細胞によるミトコンドリアの接着および取込みに寄与することを示している。
膵島β細胞に対する血小板様細胞由来ミトコンドリアの生物学的効果を決定するために、トリプシン／ＥＤＴＡで解離させた単一の膵島β細胞を、図６Ｃに示されるようにトランスウェル中で血小板と同時培養した。その結果、対照膵島細胞と比較して、７日間同時培養した後に、細胞生存能力と生細胞数の両方が実質的に増加することが示された（図６ＨおよびＩ）。ミトコンドリア処理された膵島は、未処理対照の膵島と比較した場合、細胞生存能力が４０％より多く増加した（図６Ｈ）。生細胞の総数は、約２．４ｘ１０4個の細胞／ｍＬから約４．５ｘ１０4個の細胞／ｍＬまで増加した（図６Ｉ）。
全膵島（トリプシン処理された解離した細胞とは反対である）を、図６Ｊに図示されるようにトランスウェル中で単離されたミトコンドリアと同時培養した。データは、膵島細胞生存能力が、７日間のミトコンドリアの存在下、統計的に有意な量まで増加することを示していた（図６Ｋ）。平均膵島サイズの定量は、膵島がミトコンドリアによる処理後に統計的に有意な量だけ拡大したことを示した（Ｐ＝０．０２６、図６Ｌ）。
【０２２３】
膵島β細胞のＣ−ペプチド放出も調査した。ウェルあたり１２５ＩＥＱの新鮮に単離されたヒト膵島（Ｌｏｎｚａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）（上インサート）を、８％ＣＯ2中、３７℃でトランスウェルインサートを含む１２ウェルの組織培養処理プレート中、血小板由来ミトコンドリア（２５０μｇ／ｍｌ、下ウェル）で処理した。膵島培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した未処理の膵島を、対照として使用した。７日後、ミトコンドリア処理された、および処理されていない膵島を、それぞれ、２ｍｌの円錐チューブ中に収集し、Ｋｒｅｂ’ｓバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、０．１％ＢＳＡ）で２回洗浄した後、３７℃条件で、グルコースの非存在下で３０分間、１ｍｌのＫｒｅｂ’ｓバッファーと共にインキュベートした。Ｋｒｅｂ’ｓバッファーを除去した後、膵島を、３７℃条件で１時間、３００μｌのＫｒｅｂ’ｓバッファー／ウェル中の異なる濃度のグルコース（５．５および１６．７ｍＭ）および／または１０μＭのトルブダミド（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、各群から上清を収集した。各群のＣ−ペプチドレベルを、それぞれ、製造業者のプロトコールに従ってＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して検査した。
【０２２４】
フローサイトメトリーにより、Ｃ−ペプチド＋Ｋｉ６７＋膵島β細胞のパーセンテージが、トランスウェル中で７日間にわたる血小板由来ミトコンドリアによる処理後に実質的に富化されることが示された（図６Ｍ）。培地のみの中の対照ヒト膵島の約２３．３８％±３．１３がＣ−ペプチドおよびＫｉ６７について陽性であったが、ミトコンドリア処理されたヒト膵島の４４．３５％±８．１５がＣ−ペプチドおよびＫｉ６７について陽性であった。
【０２２５】
機能的分析により、ミトコンドリア処理された膵島β細胞が、高グルコース（１６．７ｍＭ）およびトルブタミドなどの、様々なインスリン分泌促進物質に応答してＣ−ペプチド放出を有意に改善することが実証された。ミトコンドリア処理は、ミトコンドリア処理の非存在下で対照膵島群の機能的欠陥を補正すると考えられた（図６Ｎ）。膵島細胞によるインスリンの分泌を刺激すると提唱されるトルブタミドは、５．５ｍＭのグルコースの存在下で、対照膵島細胞に対する効果を有しなかった。対照的に、トルブタミドは、対照と比較して、ミトコンドリア処理された膵島細胞中でインスリン分泌を有意に増加させた（図６Ｎ、右パネル）。理論によって限定されるものではないが、これらのデータは、膵島β細胞機能が、血小板由来ミトコンドリアによる処理後に改善されることを示している。
【０２２６】
糖尿病患者の膵臓組織のさらなる免疫組織化学試験により、単体またはクラスターの形態での膵島中の血小板の存在が示された（図６Ｏ）。インスリン染色された膵島細胞（赤色）および染色された血小板様細胞（緑色）は、個々の、およびクラスター化した血小板と共に、互いに近くに見出される。理論によって限定されるものではないが、糖尿病患者における局所血小板からのミトコンドリア放出は、膵島β細胞機能の改善をもたらすことができる。
【０２２７】
記載される発明を、その特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者であれば、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、等価物と置換することができることを理解するべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスのステップまたは複数のステップを採用するために、記載される発明の目的となる精神および範囲に対して、多くの改変を加えることができる。そのような改変は全て、ここに添付される特許請求の範囲の中にあることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2019530438.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
2019530438.tif 000007
【図２Ｂ】
2019530438.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
2019530438.tif 000014
【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
2019530438.tif 000016
2019530438.tif 000017
【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図２Ｑ】
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【図３Ａ】
2019530438.tif 000024
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
2019530438.tif 000035
【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2019530438.tif 000051
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【国際調査報告】
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