(57)【要約】  本開示は、一般に、１種以上の目的タンパク質をより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞に関する。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、非改変（すなわち、親）グラム陽性菌細胞と比較して、より多量にＰＯＩを産生する改変グラム陽性菌細胞を対象としており、その改変（すなわち、娘）細菌細胞は、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含んでいる。いくつかの他の実施形態では、本開示は、改変（娘）細胞の目的タンパク質の産生レベルが増大するように、細菌細胞を改変する方法に関する。他の実施形態では、本開示は、本開示の改変細菌細胞を発酵させることによって産生された目的タンパク質に関する。本開示の他のいくつかの実施形態では、そのように作られた１種以上の目的タンパク質を含む１種以上のタンパク質性組成物を対象としている。【選択図】図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
非改変（親）グラム陽性菌細胞に比べ、目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く産生する改変グラム陽性菌細胞であって、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含む改変細菌細胞。
【請求項２】
前記ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる遺伝子は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変である請求項１に記載の改変細胞。
【請求項３】
前記内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターは、前記天然ｒａｓＰプロモーターより高い活性を有するいずれかのプロモーターで置換されている請求項２に記載の改変細胞。
【請求項４】
前記内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターは、ｓｐｏＶＧプロモーターまたはａｐｒＥプロモーターで置換されている請求項２に記載の改変細胞。
【請求項５】
前記ｓｐｏＶＧプロモーターは、配列番号３に対し９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む請求項４に記載の改変細胞。
【請求項６】
前記ａｐｒＥプロモーターは、配列番号４に対し９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む請求項４に記載の改変細胞。
【請求項７】
内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する前記改変は、前記内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の改変である請求項２に記載の改変細胞。
【請求項８】
前記天然ｒａｓＰ染色体５’−ＵＴＲは、配列番号５のａｐｒＥ５’−ＵＴＲに対し９５％の配列同一性を含む５’−ＵＴＲで置換されている請求項７に記載の改変細胞。
【請求項９】
内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する前記改変は、前記内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターおよび天然５’−ＵＴＲの改変である請求項２に記載の改変細胞。
【請求項１０】
ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる前記改変は、ｒａｓＰ遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドである請求項１に記載の改変細胞。
【請求項１１】
前記ｒａｓＰ遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている請求項１０に記載の改変細胞。
【請求項１２】
前記染色体外プラスミドは発現カセットである請求項１１に記載の改変細胞。
【請求項１３】
前記染色体外プラスミドは組み込みプラスミドである請求項１１に記載の改変細胞。
【請求項１４】
前記プラスミドは前記改変細胞の染色体に安定に組み込まれる請求項１３に記載の改変細胞。
【請求項１５】
前記ｒａｓＰの発現を増大させる遺伝子改変は、外因性ｒａｓＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、前記ＯＲＦは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたはコンディショナルプロモーターに作動可能に連結され、その制御下にある請求項１に記載の改変細胞。
【請求項１６】
前記ｒａｓＰ  ＯＲＦを含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている請求項１５に記載の改変細胞。
【請求項１７】
前記ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列に対し少なくとも６０％の配列同一性を含む核酸配列を含む請求項１に記載の改変細胞。
【請求項１８】
前記配列番号１のＯＲＦは、ＲａｓＰポリペプチドをコードし、前記ＲａｓＰポリペプチドはさらに、サイト２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）活性を有するＺｎ２＋メタロプロテアーゼと定義される請求項１７に記載の改変細胞。
【請求項１９】
前記ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドに対し６０％のアミノ酸配列同一性を含むＲａｓＰポリペプチドをコードし、前記配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの１６〜２６のアミノ酸残基とアラインする、配列番号６の活性部位コンセンサス配列を含む請求項１に記載の改変細胞。
【請求項２０】
前記ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドに対し８０％のアミノ酸配列同一性を含むＲａｓＰポリペプチドをコードし、前記配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの２０〜２４のアミノ酸残基とアラインする、配列番号７の活性部位コンセンサス配列（ＨＥＸＸＨ）を含む請求項１に記載の改変細胞。
【請求項２１】
前記非改変（親）グラム陽性細胞と比べた、前記産生ＰＯＩの増加量は、少なくとも５％の増加である請求項１に記載の改変細胞。
【請求項２２】
前記グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである請求項１の改変細胞。
【請求項２３】
前記ＰＯＩは、前記改変細菌細胞に対し外因性の遺伝子、または前記改変細菌細胞に対し内因性の遺伝子によってコードされる請求項１に記載の改変細胞。
【請求項２４】
前記ＰＯＩは酵素である請求項１に記載の改変細胞。
【請求項２５】
前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項２４に記載の改変細胞。
【請求項２６】
請求項１に記載の改変細胞によって産生された単離ＰＯＩ。
【請求項２７】
グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩの産生を増大させる方法であって、
（ａ）ＰＯＩをより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞を得る工程であって、前記改変細菌細胞はｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含む）と、
（ｂ）前記ＰＯＩが発現するような条件下で前記改変細胞を培養する工程であって、
ＰＯＩをより多量に産生する前記改変細菌細胞は、非改変（親）グラム陽性菌細胞における同じＰＯＩの産生との比較である工程と
を含む方法。
【請求項２８】
ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる前記改変は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する前記改変は、前記内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の改変である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する前記改変は、前記内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターおよび天然５’−ＵＴＲの両方の改変である請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列に対し少なくとも６０％の配列同一性を含む核酸配列を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記非改変（親）グラム陽性細胞と比べた、前記産生ＰＯＩの増加量は、少なくとも５％の増加である請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２７に記載の方法によって産生された単離ＰＯＩ。
【請求項３５】
ＰＯＩをより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞を得る方法であって、
（ａ）親グラム陽性菌細胞に、ｒａｓＰ遺伝子発現を増大させる、少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程と、
（ｂ）ＰＯＩをより多量に発現する１つ以上の娘細胞を選択する工程であって、
前記ＰＯＩをより多量に産生させるために選択された１つ以上の娘細胞は、改変（娘）グラム陽性菌細胞と定義される工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３８７，５７８号、および２０１６年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３０８，４４０号の利益を主張するものであり、それらはいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に、細菌学、微生物学、遺伝学、分子生物学、酵素学などの分野に関する。ある特定の実施形態は、１種以上の目的タンパク質を多量に発現し産生する改変グラム陽性菌細胞を対象としている。
【０００３】
配列表の参照
「ＮＢ４０８８３ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１６年１１月１６日に作成され、サイズは３９ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
バイオテクノロジー技術において、微生物宿主におけるタンパク質（酵素、抗体、受容体など）の産生は特に興味深い。同様に、１種以上の目的タンパク質の産生および分泌のために微生物宿主細胞を最適化することは、特に工業バイオテクノロジーの環境においては非常に重要であり、タンパク質収量の僅かな増加が、タンパク質を工業的に大量に製造する場合、大きな意味を持つ。
【０００５】
バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などのグラム陽性菌は、その優れた発酵特性と高い収率（培養物１Ｌ当たり最大２５グラム；Ｖａｎ  Ｄｉｊｌ  ａｎｄ  Ｈｅｃｋｅｒ，２０１３）から、工業関連タンパク質を製造する微生物工場として頻繁に使用されている。例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、食品、繊維、洗濯、医薬品などの産業に有用なα−アミラーゼ（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｒａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）およびプロテアーゼ（Ｂｒｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）の製造用としてよく知られている（Ｗｅｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらの非病原性グラム陽性菌は、有害な副生物を全く含まないタンパク質を産生するため、欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）の「安全性推定（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｆｅｔｙ）」（ＱＰＳ）の評価を得ており、その産生物の多くは、アメリカ食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から「一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）の評価を獲得した（Ｏｌｅｍｐｓｋａ−Ｂｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｃａｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０００６】
グラム陽性菌のＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は様々な経路を使用してタンパク質を分泌し、そのうちのＴａｔ装置（Ｒａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｇｏｏｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｔｊａｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）およびＳｅｃ装置（Ｔｊａｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）が最もよく研究されている２つである。タンパク質の多くは、非折り畳み（変性）構造でＳｅｃ経路を経て分泌され（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ，２００７）、そこでは、疎水性シグナルペプチドがタンパク質を細胞の膜透過装置に誘導する。ＡＴＰ酵素ＳｅｃＡによって促進されたＳｅｃＹＥＧトランスロコンを通じた膜透過の後まもなく、タンパク質のシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼＳｉｐＳ〜ＳｉｐＷの１つによって切り離され（開裂され）（Ｔｊａｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、その後、シグナルペプチドペプチダーゼＴｅｐＡおよびＳｐｐＡによって分解される（Ｂｏｌｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０００７】
過去３０年、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などによる異種タンパク質の分泌を改善するため、多くの研究がなされてきた。この最適化のための主要な標的は、シグナルペプチドの組成、ＳＲＰ、膜透過装置、シグナルペプチダーゼおよび調節因子であった。（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。最近、必須タンパク質のＰｒｓＡ（膜透過後のフォールディングに関与）およびシャペロンＤｎａＫの過剰発現が、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるアミラーゼの分泌を向上させることが示され（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、適切なフォールディングが効率の良いタンパク質の分泌に与える影響を実証したが、ＰｒｓＡは効率の良いタンパク質の分泌を制限する因子であると推定されていた（Ｋｏｎｔｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｒｖａｓ，１９９３）。さらに、最近、ＰｒｓＡが、細胞壁に存在するＷｐｒＡおよび他のプロテアーゼによって分解され（Ｋｒｉｓｈｎａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、そのため工業用途に適さないものであることが明らかとなった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、これらの微生物細胞工場の商業／工業用途におけるニーズの高さから、グラム陽性菌における工業関連タンパク質の分泌および／または産生を改善するための新しい標的が、バイオテクノロジー技術において強く求められている。本開示は、グラム陽性菌細胞における目的タンパク質の産生および／または分泌の増加という、未だ満たされていない要望に対処し応えるものである。より詳しくは、下記の発明を実施するための形態に記載するように、本開示は、「調節アンチシグマ因子プロテアーゼ」をコードするｒａｓＰ遺伝子、または「ＲａｓＰ」（以前は、ＹｌｕＣとして知られる）を発現または過剰発現するように改変されたグラム陽性菌細胞が、この改変グラム陽性菌細胞から１種以上の目的タンパク質をより多量に産生させるという予期しない驚くべき発見を対象としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、非改変（親）グラム陽性菌細胞に比べ、目的タンパク質（以下、「ＰＯＩ」）をより多く産生する改変グラム陽性菌細胞であって、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含む改変細菌細胞を対象としている。いくつかの実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変である。他の実施形態では、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターは、天然ｒａｓＰプロモーターより高い活性を有するいずれかのプロモーターで置換されている。いくつかの他の実施形態では、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターは、ｓｐｏＶＧプロモーターまたはａｐｒＥプロモーターで置換されている。さらに他の実施形態では、ｓｐｏＶＧプロモーターは、配列番号３に対し９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ａｐｒＥプロモーターは、配列番号４に対し９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
いくつかの他の実施形態では、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の改変である。他の実施形態では、天然のｒａｓＰ染色体５’−ＵＴＲは、配列番号５のａｐｒＥ５’−ＵＴＲに対し９５％の配列同一性を含む５’−ＵＴＲで置換されている。さらに他の実施形態では、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変は、内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターおよび天然５’−ＵＴＲの両者の改変である。
【００１１】
いくつかの他の実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変は、ｒａｓＰ遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている。他の実施形態では、染色体外プラスミドは発現カセットである。他の実施形態では、染色体外プラスミドは組み込みプラスミドである。いくつかの他の実施形態では、プラスミドは改変細胞の染色体に安定に組み込まれる。
【００１２】
他の実施形態では、ｒａｓＰの発現を増大させる遺伝子改変は、外因性ｒａｓＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、ＯＲＦは作動可能に連結され、かつ構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたはコンディショナルプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、ｒａｓＰ  ＯＲＦを含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、染色体外プラスミドは発現カセットである。いくつかの他の実施形態では、染色体外プラスミドは組み込みプラスミドである。特定の実施形態では、プラスミドは改変細胞の染色体に組み込まれる。
【００１３】
他の実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列に対し少なくとも６０％の配列同一性を含む核酸配列を含む。他の実施形態では、配列番号１のＯＲＦは、ＲａｓＰポリペプチドをコードし、ＲａｓＰポリペプチドはさらに、サイト２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）活性を有するＺｎ２＋メタロプロテアーゼと定義される。他の実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドに対し６０％のアミノ酸配列同一性を含むＲａｓＰポリペプチドをコードし、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの１６〜２６のアミノ酸残基とアラインする、配列番号６の活性部位コンセンサス配列（ＬＶＦＦＨＥＬＧＨＬＬ）を含む。
さらに他の実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドに対し８０％のアミノ酸配列同一性を含むＲａｓＰポリペプチドをコードし、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの２０〜２４のアミノ酸残基とアラインする、配列番号７の活性部位コンセンサス配列（ＨＥＸＸＨ）を含む。
【００１４】
他の実施形態では、非改変（親）グラム陽性細胞と比べた、産生ＰＯＩの増加量は、少なくとも５％の増加である。他の実施形態では、非改変（親）グラム陽性細胞と比べた、産生ＰＯＩの増加量は、少なくとも１０％の増加である。
【００１５】
いくつかの他の実施形態では、グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである。さらに他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．マルマレシス（Ｂ．ｍａｒｍａｒｅｓｉｓ）、およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から選択される。他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。
【００１６】
いくつかの他の実施形態では、ＰＯＩは、改変細菌細胞に対し外因性の遺伝子、または改変細菌細胞に対し内因性の遺伝子によってコードされる。さらに他の実施形態では、ＰＯＩは、細胞外へ分泌または輸送される。さらなる実施形態では、細胞外へ分泌または輸送されたＰＯＩは、さらに単離され、かつ精製される。
【００１７】
いくつかの他の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。他の実施形態では、酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
他の実施形態では、本開示は、本開示の改変細胞によって産生された単離ＰＯＩを対象としている。
【００１９】
いくつかの他の実施形態では、本開示は、（ａ）ＰＯＩをより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞を得る工程（ここで、改変細菌細胞はｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含む）と、（ｂ）ＰＯＩを発現するような条件下で改変細胞を培養する工程（ここで、ＰＯＩをより多量に産生する改変細菌細胞は、非改変（親）グラム陽性菌細胞における同じＰＯＩの産生との比較である）とを含む、グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩの産生を増大させる方法を対象としている。
【００２０】
いくつかの他の実施形態では、本開示は、本開示の方法によって産生された単離ＰＯＩを対象としている。
【００２１】
他の実施形態では、本開示は、（ａ）親グラム陽性菌細胞に、ｒａｓＰ遺伝子発現を増大させる、少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程と、（ｂ）ＰＯＩをより多量に発現する１つ以上の娘細胞を選択する工程（ここで、ＰＯＩをより多量に産生させるために選択された１つ以上の娘細胞は、改変（娘）グラム陽性菌細胞と定義される）とを含む、ＰＯＩをより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞を得る方法を対象としている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、欠失ｔｅｐＡ遺伝子（ΔｔｅｐＡ）または欠失ｒａｓＰ遺伝子（ΔｒａｓＰ）を含むＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞から培養培地に分泌されたＡｍｙＥアミラーゼ、ＡｍｙＬアミラーゼおよびプロテアーゼＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの発現を、非改変（親；野生型）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞と比較する。図１Ａは、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（親）細胞と比較した、ｒａｓＰ遺伝子またはｔｅｐＡ遺伝子が欠失しているＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞から分泌された酵素（ＡｍｙＥ、ＡｍｙＬおよびＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ）のＬＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図１Ｂは、分泌されたタンパク質ＡｍｙＥ、ＡｍｙＬおよびＢＰＮ’−Ｙ２１７ＬのＩｍａｇｅＪによる定量化を示し、非改変（親）野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞から分泌されたタンパク質の比に対する、欠失ｒａｓＰ遺伝子（ΔｒａｓＰ）または欠失ｔｅｐＡ遺伝子（ΔｔｅｐＡ）を含むＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞から分泌されたタンパク質の比（すなわち、ΔｔｅｐＡ細胞／野生型細胞およびΔｒａｓＰ／野生型細胞）として示している。
【図２】図２は、野生型（親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、ｒａｓＰ遺伝子を含み、かつｓｐｏＶＧプロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」発現カセット）、ならびにｒａｓＰ遺伝子を含み、かつｓｐｏＶＧプロモーターおよびａｐｒＥ５’ＵＴＲの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ＵＴＲ−ｒａｓＰ」発現カセット）の、ＯＤ６００で測定した細胞密度（図２Ａ）と、ＡｍｙＥの産生（図２Ｂ）とを示す。
【図３】図３は、振盪フラスコによる、野生型（親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｓｐｏＶＧプロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を含み、かつ発現／過剰発現する改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」発現カセット）のアミラーゼＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６の産生を示す。
【図４】図４は、野生型（親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｔｅｐＡ遺伝子を含み、かつｓｐｏＶＧプロモーターの制御下にｔｅｐＡ遺伝子を発現／過剰発現する改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ」発現カセット）のアミラーゼＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６の、細胞密度（図４Ａ）と、アミラーゼＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６の産生（図４Ｂ）を示す。
【図５】図５は、野生型（親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｒａｓＰ遺伝子を含み、かつｓｐｏＶＧプロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」発現カセット）のベータ−Ｄ−グルカナーゼ（ＢｇｌＣ）の産生を示す。
【図６】図６は、野生型（親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｒａｓＰ遺伝子を含み、かつｓｐｏＶＧプロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」発現カセット）の、細胞密度（図６Ａ）と、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅの産生（図６Ｂ）とを示す。
【図７】図７は、野生型（親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｒａｓＰ遺伝子を含み、かつｓｐｏＶＧプロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する改変（娘）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」発現カセット）の、細胞密度（図７Ａ）と、それらから発現した「ＡｍｙＡｃファミリー」α−アミラーゼの産生（図７Ｂ）とを示す。この実験に使用した、親および改変（娘）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞は、ディープウェルマイクロタイタープレート（ＤＷＭＴＰ）で、５ＳＭ１２成長培地で増殖させた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、一般に、１種以上の目的タンパク質（以下、「ＰＯＩ」）をより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞に関する。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、ＰＯＩを、その同じＰＯＩを産生する非改変（親）グラム陽性菌細胞と比較して、より多量に産生する改変グラム陽性菌細胞を対象としており、その改変細菌細胞は、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含んでいる。
【００２４】
本明細書に記載するように、ｒａｓＰ遺伝子は、「調節アンチシグマ因子プロテアーゼ」、すなわち「ＲａｓＰ」（以前はＹｌｕＣとして知られる）をコードする。ＲａｓＰは、亜鉛依存性膜内切断プロテアーゼ（すなわち「ｉＣｌｉｐ」の群に属し、本明細書ではさらに、サイト２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）またはサイト２亜鉛メタロプロテアーゼ（例えば、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８を参照）と定義される。いくつかの実施形態では、本開示のＲａｓＰポリペプチドはさらに、加水分解酵素（例えば、ペプチダーゼ）と定義され、より具体的には、酵素委員会（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）（ＥＣ）による分類３．４．２４（ＥＣ３．４．２４）に属するメタロエンドペプチダーゼと定義される。
【００２５】
本明細書に記載の改変細菌細胞、その組成物および方法を考慮して、以下の用語および句を定義する。本明細書中に定義されていない用語は、当該技術分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。
【００２６】
他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明の組成物および方法が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。本組成物および本方法を実施または試験する際、本明細書に記載のものに類似した、または同等の方法および材料を使用することができるが、ここで、説明に役立つ代表的な方法および材料を記載する。本明細書で引用した刊行物および特許は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
さらに、特許請求の範囲が任意選択要素を排除するように記載されている可能性があることにも留意すべきである。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連した「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ〜のみ（ｏｎｌｙ）」、「〜を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的用語を使用するための、または「負」の限定を使用するための先行文として機能することが意図されている。
【００２８】
当業者には本開示を読めば明白であるように、本明細書に記載および例示した個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載した本発明の組成物および方法の範囲または精神から逸脱せずに他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴とは容易に分離することができる、または組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。記載された方法はいずれも、記載された事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【００２９】
本明細書で定義する場合、「改変細胞」、「改変細菌細胞」または「改変宿主細胞」は、互換的に使用することができ、ｒａｓＰ遺伝子発現を増大させる改変（例えば、遺伝子改変）を含む組み換えグラム陽性菌（宿主）細胞を指す。例えば、本開示の「改変」グラム陽性菌細胞はさらに、親細菌細胞から得られる「改変（宿主）細胞」と定義することができ、改変（娘）細胞は、ｒａｓＰ遺伝子発現を増大させる改変を含む。
【００３０】
本明細書で定義する場合、「非改変細胞」、「非改変細菌細胞」または「非改変宿主細胞」は、互換的に使用することができ、ｒａｓＰ遺伝子発現を増大させる改変を含まない「非改変」（親）グラム陽性菌細胞を指す。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「非改変」（親）細胞におけるＰＯＩの発現および／または産生および／または分泌を、「改変」（娘）細胞における同じＰＯＩの発現および／または産生および／または分泌と比較する場合、「改変」細胞および「非改変」細胞は、基本的に同じ条件下（例えば、培地、温度、ｐＨなどの条件が同じ）で成長／培養／発酵が行われると理解されよう。
【００３２】
同様に、本明細書で定義する場合、「産生の増大」、「産生の強化」、「ＰＯＩ産生の増大」、「ＰＯＩ産生の強化」などの用語は、ｒａｓＰ遺伝子発現を増大させる改変を含む「改変」（娘）細胞を指し、ここで、「増大させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」は常に同じＰＯＩを発現する「非改変」（親）細胞に対して（〜に対して（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ））である。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびその断片または一部、ならびに、センス鎖であるかアンチセンス鎖であるかにかかわらず、二本鎖であっても一本鎖であってもよいゲノムまたは合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを指す。遺伝子コードの縮重の結果として、多くのヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。
【００３４】
本明細書に記載するポリヌクレオチド（または核酸分子）には「遺伝子」、「ベクター」および「プラスミド」が含まれる。したがって、「遺伝子」という用語は、あるタンパク質のコード配列の全てまたは一部を含む、ある特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定する、プロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびにコード配列を含み得る。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「コード配列」は、その（コードする）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、一般に、通常ＡＴＧ開始コドンで始まるオープンリーディングフレームによって決まる。一般に、コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび組み換えヌクレオチド配列が挙げられる。
【００３６】
本明細書で定義する場合、「オープンリーディングフレーム」（以下「ＯＲＦ」）という用語は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を示す一連の２以上のコドン、および（ｉｉｉ）終止コドンからなる連続するリーディングフレームを含む核酸または核酸配列（天然由来であるか、天然由来でないか、また合成であるかにかかわらず）を意味し、ＯＲＦは、５’から３’の方向に読まれる（または、翻訳される）。例えば、いくつかの実施形態では、「ｒａｓＰ遺伝子発現を増加させる」改変を含む、改変細胞、改変細菌細胞または改変宿主細胞は、ＲａｓＰポリペプチドをコードするＯＲＦを含み（ここで、ＲａｓＰポリペプチドをコードするＯＲＦの発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、コンディショナルプロモーターなどに作動可能に連結され、それらの制御下にある）、任意選択により５’および３’調節（非転写）核酸分子を含む組み換えグラム陽性菌細胞を包含する。
【００３７】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側（下流）に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、また、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよく、さらに、合成された核酸の断片を含んでもよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、種々の生育段階で、または種々の環境もしくは生理的条件に応じて遺伝子の発現を指示することは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で最も多く遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。殆どの場合、調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同じ活性を有し得ることがさらに確認されている。
【００３８】
本明細書で使用する「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）とき、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結している。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【００３９】
本明細書で定義する場合、「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’側非コーディング配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’側非コーディング配列）に位置しており、関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造などを含み得る。
【００４０】
本明細書で定義する場合、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはその遺伝子、またはそのベクターを「細菌細胞に導入する」などの語句において使用される「導入する」という用語は、細胞にポリヌクレオチドを導入するための当該技術分野で知られた方法、例えば、限定はされないが、プロトプラスト融合、形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、トランスフェクション、接合などを含む（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照）。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「形質転換された」または「形質転換」は、細胞が組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを意味する。形質転換は、通常、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド、ＯＲＦまたは遺伝子）を細胞に挿入することによって起こる。挿入するヌクレオチド配列は、異種のヌクレオチド配列（すなわち、形質転換する細胞中に天然には存在しない配列）であってもよい。本明細書で使用する場合、「形質転換」は、核酸分子を宿主生物のゲノムへ移入し、その結果、移入された核酸分子が遺伝子学的に安定して継承されることを指す。
【００４２】
本明細書で定義する場合、宿主細胞「ゲノム」、細菌（宿主）細胞「ゲノム」またはグラム陽性菌細菌（宿主）細胞「ゲノム」は、染色体遺伝子および染色体外遺伝子を含む。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、多くは、細胞の中央代謝には通常関与しない遺伝子を持ち、普通は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態の、染色体外要素を指す。そのような要素は、任意のソースに由来する、線状または環状で、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡからなる自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得、それらにおいては、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる固有の構成に、多くのヌクレオチド配列が結合または再結合している。
【００４４】
「形質転換カセット」は、外来遺伝子（または、そのＯＲＦ）を含み、かつ、その外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターを指す。
【００４５】
「発現カセット」は、外来遺伝子（または、そのＯＲＦ）を含み、かつ、その外来遺伝子に加えて、宿主細胞において外来の（異種の）遺伝子の発現を増大させるエレメントを有する特定のベクターを指す。
【００４６】
多くの原核生物および真核生物の発現ベクターが商業的に入手可能であり、当該技術分野でよく知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸を、生物間、細胞間または細胞構成要素間で伝搬および／または移行させる手段をいう。ベクターとしては、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、ならびに、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）およびＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。これらは、「エピソーム」、すなわち、自律的に複製するか、または宿主微生物の染色体に組み込むことができる。
【００４８】
「発現ベクター」は、外来細胞に異種ＤＮＡを組み込み、発現させる能力を有するベクターを指す。多くの原核細胞発現ベクターおよび真核細胞発現ベクターが商業的に入手可能である。
【００４９】
「ターゲティングベクター」は、形質転換する宿主細胞の染色体の領域に相同のポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを行わせることができるベクターである。ターゲティングベクターは、相同組み換えによって細胞の染色体に変異または外来遺伝子配列を導入するのに使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、他の非相同的配列を含み、これは、例えば末端に付加される（すなわち、スタッファー配列またはフランキング配列）。末端は、例えば、ベクターへの挿入など、ターゲティングベクターが閉環するように閉じることができる。適切なベクターの選択および／または構成は、当業者の知識の範囲内である。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」という用語は、クローニングベクターとして使用され、多くの細菌や真核生物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡコンストラクトを指す。いくつかの実施形態では、プラスミドは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「目的タンパク質」または「ＰＯＩ」という用語は、改変グラム陽性菌細胞（例えば、「宿主」細胞）で発現させたい目的ポリペプチドを指し、そのＰＯＩはより高レベルで（すなわち、非改変（親）グラム陽性菌細胞と比較して）産生される。したがって、本明細書で使用する場合、ＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質、抗体等であり得る。
【００５２】
同様に、本明細書で定義する場合、「目的遺伝子」または「ＧＯＩ」は、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子またはオープンリーディングフレーム）を指す。ＰＯＩをコードするＧＯＩは、天然に存在する遺伝子、変異遺伝子または合成遺伝子であってよい。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対し、従来の１文字または３文字コードが使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、改変アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって分断されていてもよい。
【００５４】
ポリポチペプチドという用語には、また、自然に、または、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または例えば標識化成分との共役結合などの任意の他の操作または改変などを介して改変されているアミノ酸ポリマーも包含される。また、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子は、酵素（アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせ）などの、目的の、商業的に関連する工業用タンパク質をコードする。
【００５６】
本明細書で定義する場合、「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置に存在する遺伝子を指す。
【００５７】
本明細書で定義する場合、「異種の」遺伝子、「非内因性の」遺伝子または「外来の」遺伝子は、通常は宿主の生物に存在せず、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子（またはＯＲＦ）を指す。外来（異種）遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子（もしくはＯＲＦ）、および／または天然もしくは非天然生物に挿入されたキメラ遺伝子を含む。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「発現」は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現は、またｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味し得る。したがって、用語「発現」には、ポリペプチドの産生の関与する任意の工程、例えば、限定はされないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などが含まれる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「多様体」ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失によって（通常、組み換えＤＮＡ技術による）、親（または参照）ポリペプチドから誘導されるポリペプチドを指す。多様体ポリペプチドは、少数のアミノ酸残基によって親ポリペプチドと異なり、また、主要なアミノ酸配列の親（または参照）ポリペプチドとの相同性／同一性の程度によって定義され得る。
【００６０】
好適には、多様体ポリペプチドは、親（参照）ポリペプチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書で使用する場合、「多様体」ポリヌクレオチドは、多様体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指し、その「多様体ポリペプチド」は、親ポリヌクレオチドと特定の配列相同性／同一性を有するか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に親ポリヌクレオチド（または、その相補体）とハイブリダイズする。多様体ポリペプチドは、親（参照）ポリヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有することが好ましい。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「変異」は、核酸配列内の任意の変更または変化を指す。点変異、欠失変異、サイレント変異、フレームシフト変異、スプライシング変異など、種々の変異型が存在する。変異は、特異的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）、またはランダムに（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株の通過によって）行われ得る。
【００６２】
ポリペプチドまたはそのアミノ酸配列との関連で、本明細書で使用する場合、「置換」という用語は、１つのアミノ酸の別のアミノ酸との交換（すなわち、置換）を意味する。
【００６３】
本明細書で定義する場合、「異種の」核酸コンストラクト、または「異種の」核酸配列は、それが発現する細胞から生じたものではない配列部分を有する。
【００６４】
本明細書で定義する場合、「異種調節配列」は、本来ＧＯＩの発現を調節する機能を持たない遺伝子発現調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、細胞またはそれらが存在するゲノムの一部にとって内因性（天然性）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合などによって細胞に付加されている。「異種」核酸コンストラクトは、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一、または異なる制御配列／ＤＮＡコード（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有することができる。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「シグナル配列」および「シグナルペプチド」は、タンパク質の成熟形もしくは前駆体形の分泌または直接輸送に関与する可能性のあるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、通常は前駆体または成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内因性であっても外因性であってもよい。シグナル配列は、通常は成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、通常はタンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってそのタンパク質から切除される。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「親」細胞は、「親」細胞のゲノムが改変されて（例えば、１つ以上の変異の親細胞への導入、または、１つ以上の遺伝子もしくはＯＲＦの親細胞への導入）、改変（娘）細胞を生成する微生物の細胞または株を指す。
【００６７】
用語「誘導（された）」には、「〜に由来した」、「得られた」、「入手可能な」および「作成された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料もしくは組成物が別の材料もしくは組成物にその起源が見出されるか、または他の特定の材料もしくは組成物を参照して記載することができる特徴を有することを示す。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「増大する」タンパク質の産生は、産生されるタンパク質の量が増加することを意味する。タンパク質は、宿主細胞の内部で産生されても、培養培地へ分泌（または、輸送）されてもよい。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、培養培地へ産生される。
【００６９】
タンパク質産生の増大は、例えば、非改変（親）細胞と比較したときの、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性などのタンパク質もしくは酵素の活性の最大レベルの増大、または、改変（娘）細胞により産生される細胞外の全タンパク質量の増大として検出することができる。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「相同」は、相同ポリヌクレオチドまたは相同ポリペプチドを指す。２以上のポリヌクレオチドまたは２以上のポリペプチドが相同であるなら、これは、それらの相同のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の「同一性度」を有していることを意味している。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、十分に本明細書で定義されるような相同であるだけの高い同一性度を有するか否かは、当該技術分野で知られるコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供される「ＧＡＰ」（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８，Ａｕｇｕｓｔ  １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１）を使用して２つの配列をアラインすることにより好適に調べることができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「パーセント（％）同一性」は、配列アライメントプログラムを使用してアラインさせたときの、ポリペプチドをコードする核酸配列間またはポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸またはアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「比生産性」は、所定の期間に亘って、一細胞当たり、単位時間当たりに産生されるタンパク質の総量を指す。
【００７３】
本明細書で定義する場合、「精製（された）」、「単離（された）」または「富化（された）」という用語は、生体分子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）が、本来結合している、天然に存在するいくつかの構成要素または全ての構成要素から分離することによって、その天然状態から改変されることを意味する。そのような単離または精製は、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫安沈澱もしくは他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動、または勾配による分離など、最終組成物中に望ましくない全細胞、細胞残屑、不純物、外来タンパク質または酵素を除く当該技術分野で知られた分離技術によって行うことができる。精製または単離した生体分子組成物には、その後さらに、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ調節化合物、または他の酵素もしくは化学物質を添加することができる。
【００７４】
Ｉ．ＲａｓＰポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子
前述したように、ｒａｓＰ遺伝子は、「調節アンチシグマ因子プロテアーゼ」、すなわち「ＲａｓＰ」（以前はＹｌｕＣとして知られる）をコードし、亜鉛依存性膜内切断プロテアーゼ（すなわち「ｉＣｌｉｐ）の群に属し、本明細書ではさらに、サイト２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）またはサイト２亜鉛メタロプロテアーゼ（例えば、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８を参照）と定義される。本明細書で定義する場合、「ｒａｓＰ」遺伝子（または、そのＯＲＦ）は「ＲａｓＰ」ポリペプチドをコードするが、特定のＲａｓＰポリペプチド配列（または、それをコードするｒａｓＰ遺伝子もしくはＯＲＦ配列）に限定するものではない。
【００７５】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のｒａｓＰ遺伝子（または、そのＯＲＦ）は、ｒａｓＰ核酸またはそのホモログもしくはオルソログ核酸配列が本開示の改変グラム陽性菌細胞で発現もしくは過剰発現したときに、コードされたポリペプチド（Ｓ２Ｐ  Ｚｎ２＋メタロプロテアーゼ活性を有する）がＰＯＩの産生を増加させるなら、そのようなＳ２Ｐ  Ｚｎ２＋メタロプロテアーゼ活性を有すると見なされたポリペプチドをコードする任意の核酸（ポリヌクレオチド）またはそのホモログもしくはオルソログ核酸配列であり得る。
【００７６】
例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ；ＲＡＳＰ＿ＢＡＣＳＵ；アクセッション番号Ｏ３１７５４を参照）から単離されたＲａｓＰポリペプチドは、配列番号２に示す４２２個のアミノ酸（約４６．７ｋＤａ）を含む。このアミノ酸においては、２０位および２４位のヒスチジンアミノ酸残基が推定されるＺｎ２＋配位／結合部位であり、２１位のグルタミン酸アミノ酸残基がタンパク質分解活性部位である。
【００７７】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＲａｓＰポリペプチドをコードする遺伝子（または、そのＯＲＦ）は、配列番号２に示すＲａｓＰポリペプチドに対し約６０％の配列同一性を含むポリペプチドをコードする遺伝子（または、そのＯＲＦ）である。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースでのＢＬＡＳＴによる検索（配列番号２のＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲａｓＰポリペプチド配列を検索対象とし、次の検索パラメータを使用：Ｅ−閾値＝１０；マトリクス＝自動；ギャップ＝ｙｅｓ）により、配列番号２に対し１００％〜約６０％の配列同一性を含む様々なＲａｓＰポリペプチドが確認された。
【００７８】
いくつかの他の実施形態では、本開示のＲａｓＰポリペプチドをコードする遺伝子（または、そのＯＲＦ）は、配列番号６（ＬＶＦＦＨＥＬＧＨＬＬ；ここで、下線を付したヒスチジンアミノ酸はＺｎ２＋結合部位であり、ボールド体のグルタミン酸残基は活性部位残基である）の連続する活性部位コンセンサス配列を含み、その配列番号６のＲａｓＰポリペプチドコンセンサス配列のアミノ酸配列は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの１６〜２６位のアミノ酸残基とアラインし、少なくとも６０％の配列相同性を得ることができるポリペプチドである。
【００７９】
他の実施形態では、本開示のＲａｓＰポリペプチドをコードする遺伝子（または、そのＯＲＦ）は、配列番号７（ＨＥＸＸＨ；ここで、下線を付したヒスチジンアミノ酸はＺｎ２＋結合部位であり、ボールド体のグルタミン酸残基は活性部位残基であり、Ｘは任意のアミノ酸である）の活性部位コンセンサス配列を含み、その配列番号７のＲａｓＰポリペプチドコンセンサス配列のアミノ酸配列は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの２０〜２４位のアミノ酸残基とアラインし、少なくとも８０％の配列相同性を得ることができるポリペプチドである。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本開示のＲａｓＰポリペプチドはまた、ＥＣクラス３．４．２４（ＥＣ３．４．２４）に属するメタロエンドペプチダーゼと定義される。
【００８１】
ＩＩ．細菌細胞およびその使用方法
本開示は、一般に、１種以上の目的タンパク質をより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞に関する。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、非改変（すなわち、親）グラム陽性菌細胞と比較して、より多量にＰＯＩを産生する改変グラム陽性菌細胞を対象としており、その改変（すなわち、娘）細菌細胞は、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含んでいる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変（娘）細胞の目的タンパク質の産生レベルが増大するように、細菌細胞を改変する方法に関する。他の実施形態では、本開示は、本開示の改変細菌細胞を発酵させることによって産生された目的タンパク質に関する。本開示の他のいくつかの実施形態では、そのように作られた１種以上の目的タンパク質を含む１種以上のタンパク質性組成物を対象としている。さらに他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の改変細菌細胞を用いて１種以上の目的タンパク質を生産する方法、および１種以上の目的タンパク質を含む１種以上のタンパク質性組成物を生産および使用する方法に関する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる細菌細胞の改変は、改変宿主でのｒａｓＰ遺伝子（または、そのＯＲＦ）の発現を強化または増大させるならいかなる種類の遺伝子改変であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる細菌細胞の改変は、所望の宿主細胞での発現を強化するためのｒａｓＰ遺伝子（または、そのＯＲＦ）のコドン最適化を含む。他の実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる宿主細胞の改変は、ＲａｓＰポリペプチドをコードする発現カセットであり、この発現カセットが（改変）細胞に導入される。いくつかの他の実施形態では、ＲａｓＰポリペプチドをコードする遺伝子またはＯＲＦを含む発現カセットは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、コンディショナルプロモーターなどの制御下にある。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＰＯＩまたはＲａｓＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指示するプロモーターは、ＰＣＴ出願の国際公開第２００１／５１６４３号パンフレットに記載される、野生型ａｐｒＥプロモーター、変異型ａｐｒＥプロモーターまたはコンセンサスａｐｒＥプロモーターである。いくつかの他の実施形態では、ＰＯＩまたはＲａｓＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指示するプロモーターは、野生型ｓｐｏＶＧプロモーター、変異型ｓｐｏＶＧプロモーターまたはコンセンサスｓｐｏＶＧプロモーター（Ｆｒｉｓｂｙ  ａｎｄ  Ｚｕｂｅｒ，１９９１）である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示の改変細菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーである。他の実施形態では、本開示の改変細菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである。いくつかの実施形態では、本開示の改変細菌細胞は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、およびＢ．マルマレシス（Ｂ．ｍａｒｍａｒｅｓｉｓ）から選択されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。
【００８６】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的に再編成され続けていることは当該技術分野では認識されている。したがって、この属には、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されるＢ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）または現在はパエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）と称されるバチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）などの生物を含む（これらに限定されない）、再分類されている種が含まれるものとする。
【００８７】
ＩＩＩ．目的タンパク質の産生レベルが増大した改変細胞
改変グラム陽性菌細胞がＰＯＩをより高いレベルで産生することを確認するために、様々なスクリーニング法を適用することができる。例えば、発現ベクターが、標的タンパク質へのポリペプチド融合をコードでき、検出可能な標識として機能するか、または標的タンパク質自体が選択可能な、もしくはスクリーニング可能なマーカーとして機能し得る。標識タンパク質もまた、ウエスタンブロット法、ドットブロット法（このような方法の詳細な説明は、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓのウェブサイトで入手可能である）、ＥＬＩＳＡ、または、標識がＧＦＰであれば、全細胞蛍光法またはＦＡＣＳを用いて検出することができる。
【００８８】
例えば、標的タンパク質と融合させるために６−ヒスチジンタグを含ませることができ、ウエスタンブロット法を使用してそのようなタグを検出することができる。さらに、標的タンパク質が十分に高いレベルで発現するなら、クマシー／銀染色を組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、野生型と比較して増大した変異体の発現を適切に検出することができ、その場合には、分子に標識を付す必要はない。
【００８９】
他の実施形態では、非改変（親）細胞と比較した改変（宿主）細胞におけるＰＯＩの発現は、ｍＲＮＡの転写レベルと相関している。例えば、いくつかの実施形態は、ＰＯＩをコードする遺伝子またはＯＲＦの分子の評価に関連し、それには、通常、ＲＮＡ発現の時間的および空間的分布の徹底した分析が含まれる。全体の、もしくはポリ（Ａ）ＲＮＡ試料における特定のｍＲＮＡを検出し、その存在度を決定するために、多くの広く用いられている手順があり、当該技術分野においても知られている。非限定的な例として、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＮＰＡ）、インサイチューハイブリダイゼーション、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの方法が挙げられる。
【００９０】
目的タンパク質のレベルの改善を確認するために、培養または発酵がより長期間にわたり効率的に持続することを可能にする、例えば、細胞１個当たりのタンパク質活性または量の増加、培地１ミリリットル当たりのタンパク質活性または量の増加を検出するなどの他の方法、またはこれらの方法の組み合わせを使用することができる。
【００９１】
非生産性の検出は、タンパク質の産生の評価に好適な他の方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式によって決定できる。
Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ
（式中、「ｇＰ」はタンク内で生成されたタンパク質のグラム数であり、「ｇＤＣＷ」はタンク内の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、生成時間および増殖時間を含む接種時点からの発酵時間（時間）である）。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本開示の改変細菌細胞は、非改変（親）細胞と比較して、ＰＯＩを少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％もしくはそれ以上産生する。
【００９３】
ＩＶ．目的タンパク質を産生するための改変細胞の培養
他の実施形態では、本開示は、非改変（親）細胞と比較して（すなわち、同細胞に対して）改変細菌細胞のタンパク質生産性を高める方法を提供する。より具体的には、いくつかの実施形態において、改変細菌細胞のタンパク質生産性を高める方法は、改変細菌細胞を好適な発酵条件下で培養することを含み、その改変細胞は、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含む。
【００９４】
したがって、宿主細胞および形質転換細胞は、従来の栄養培地で培養することができる。形質転換宿主細胞のための培養培地は、プロモーターを活性化し、かつ形質転換細胞を選択するために適宜改変されてよい。温度、ｐＨなどの特定の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞のために使用される条件であってよく、当業者には明らかであろう。さらに、培養条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２；２００１）、Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）などの科学文献、およびアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から見出すことができる。
【００９５】
このように、いくつかの実施形態では、本開示は、改変細菌細胞の発酵を含むＰＯＩを生産する方法を対象としており、その改変細胞は培養培地にＰＯＩを分泌する。改変細菌細胞および非改変細菌細胞の発酵に、当該技術分野でよく知られた発酵方法を適用することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で培養される。伝統的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵中は変更されない閉鎖系である。発酵の開始時に、培地には所望の生物が接種される。この方法では、この系にいかなる成分を添加せずとも発酵が可能である。一般に、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御することが頻繁に行われる。バッチ系の代謝産物およびバイオマス組成は、発酵が停止する時点まで常時変化する。典型的なバッチ培養では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が減少もしくは停止する静止期に進む。未処理のまま放置すると、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期にある細胞は、生成物の大部分の生産に寄与する。
【００９７】
標準バッチ系に関する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行につれて基質が徐々に加えられる。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を抑制する可能性が高い場合、および培地中の基質量が限定された量であることが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系内の実際の基質濃度の測定は困難であるので、このため、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２などの排気ガスの部分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、知られている。
【００９８】
連続発酵は、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、細胞が主として対数期増殖にある一定の高密度で培養物を維持する。連続発酵は、細胞増殖および／または生成物濃度に影響を及ぼす１つ以上の因子の調節を許容する。例えば、一実施形態では、炭素源または窒素源などの制限的栄養物質は、一定比率で維持され、他の全てのパラメータは調節することが許容される。他の系では、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変化させることができ、その間、培地濁度によって測定される細胞濃度は一定に維持される。連続系は、定常状態増殖条件を維持しようとする。したがって、除去される培地に起因する細胞消失は、発酵中の細胞増殖率に対してバランスが取られなければならない。連続発酵工程のための栄養分および増殖因子を調節する方法ならびに生成物形成速度を最大化するための技術は、工業微生物学の分野においてよく知られている。
【００９９】
こうして、いくつかの実施形態では、形質転換（改変）宿主細胞によって産生されたＰＯＩは、従来の手順、例えば、宿主細胞を培地から遠心分離もしくは濾過によって分離する、または、必要ならば、細胞を破壊し、上清を細胞破砕物および残屑から取り除くことによって、培養培地から回収することができる。清浄化後、通常、上清または濾液のタンパク質性成分を、塩、例えば、硫酸アンモニムによって沈澱させる。その後、沈澱させたタンパク質を可溶化し、様々なクロマトグラフ法、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過によって精製することができる。
【０１００】
Ｖ．形質転換
本開示のＲａｓＰポリペプチドまたはＰＯＩをコードする核酸を含むポリヌクレオチドコンストラクトは、宿主細胞によって発現されるように構築することができる。知られている遺伝子コードの縮重のため、同一のアミノ酸配列をコードする異なるポリヌクレオチドを当該技術分野の一般的な技能により設計し作製することができる。例えば、コドン最適化は、特定の宿主細胞における産生の最適化に適用することができる。
【０１０１】
目的タンパク質をコードする核酸をベクターに組み込むことができ、ベクターは本明細書に開示されるような、よく知られた形質転換法によって宿主細胞に導入することができる。
【０１０２】
ベクターは、宿主細胞へ形質転換され宿主細胞内で複製され得るなら、いかなるベクターであってもよい。例えば、ＰＯＩをコードする核酸を含むベクターは、ベクターの繁殖および増殖の手段として細菌宿主細胞内で形質転換および複製することができる。ベクターはまた、核酸（すなわち、ＯＲＦ）をコードするタンパク質が、機能性タンパク質として発現されるように、発現宿主内へ形質転換することができる。発現宿主として機能する細菌細胞（すなわち、改変細胞「宿主」細胞としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーおよびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーが挙げられる。
【０１０３】
一般的な技能で、ＰＯＩをコードする核酸を含み、発現するように改変することができる代表的なベクターは、ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩである（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，２００７を参照）。
【０１０４】
上で簡単に述べたように、ＲａｓＰポリペプチドまたはＰＯＩをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞での転写を可能にする好適なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターは、選択された宿主細胞で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、また、宿主細胞の同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子由来のものであってよい。例えば、いくつかの実施形態では、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変は、天然のｒａｓＰ遺伝子プロモーターを、天然のｒａｓＰ遺伝子プロモーターより高い活性を有するいずれかのプロモーターにより置換することを含む。プロモーターの活性／強度を評価する手段は、熟練者には日常的なものである。
【０１０５】
特に細菌宿主中で本開示のＲａｓＰポリペプチドまたはＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指示する好適なプロモーターの例としては、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡまたはｃｅｌＡプロモーター、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＰＯＩまたはＲａｓＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指示するプロモーターは、ＰＣＴ出願の国際公開第２００１／５１６４３号パンフレットに記載される、野生型ａｐｒＥプロモーター、変異型ａｐｒＥプロモーターまたはコンセンサスａｐｒＥプロモーターである。いくつかの他の実施形態では、ＰＯＩまたはＲａｓＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指示するプロモーターは、野生型ｓｐｏＶＧプロモーター、変異型ｓｐｏＶＧプロモーターまたはコンセンサスｓｐｏＶＧプロモーター（Ｆｒｉｓｂｙ  ａｎｄ  Ｚｕｂｅｒ，１９９１）である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ａｐｒＥプロモーターは、配列番号４に対し約９０〜９５％の配列同一性を含む核酸配列を含む。
【０１０８】
他の実施形態では、ｓｐｏＶＧプロモーターは、配列番号３に対し約９０〜９５％の配列同一性を含む核酸配列を含む。
【０１０９】
他の実施形態では、ＲａｓＰポリペプチドまたはＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列の転写を指示するプロモーターは、リボソームＲＮＡプロモーターまたはリボソームタンパク質プロモーターなどのリボソームプロモーターである。より具体的には、いくつかの実施形態では、リボソームＲＮＡプロモーターは、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｒｒｎプロモーターであり、ｒｒｎプロモーターは、より具体的には、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｒｒｎＢ、ｒｒｎＩまたはｒｒｎＥリボソームプロモーターである。いくつかの実施形態では、リボソームＲＮＡプロモーターは、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１３／０８６２１９号パンフレットに記載される、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＰ２  ｒｒｎＩプロモーターである。
【０１１０】
ＲａｓＰまたはＰＯＩコード配列は、シグナル配列に作動可能に連結することができる。シグナル配列をコードする核酸配列は、発現すべきｒａｓＰ遺伝子またはＧＯＩ（ＰＯＩをコードする）と天然に結合しているＤＮＡ配列であっても、異なる属もしくは種からのものであってもよい。ポリヌクレオチドコンストラクトまたはベクターを含むシグナル配列およびプロモーター配列は、細菌宿主細胞に導入することができ、それらの配列は同じソースから得られたものでも異なるソースから得られたものであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＰＣＴ出願の国際公開第２００１／５１６４３号パンフレットに記載される、ａｐｒＥプロモーターに作動可能に結合している、ａｐｒＥシグナル配列（例えば、Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照）である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の改変である。他の実施形態では、天然のｒａｓＰ染色体５’−ＵＴＲは、配列番号５のａｐｒＥ５’−ＵＴＲに対し９５％の配列同一性を含む５’−ＵＴＲで置換されている。
【０１１２】
発現ベクターはまた、好適な転写ターミネーター、および、真核細胞中では、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結しているポリアデニル化配列も含み得る。終止配列およびポリアデニル化配列は、好適には、プロモーターと同じソースから得られたものであり得るが、他の実施形態では、終止配列およびポリアデニル化配列は、互いにおよび／またはプロモーターと異なるから得られたものであってもよい。
【０１１３】
好適なベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を可能とする核酸配列をさらに含み得る。そのような可能とする配列の例として、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＪ７０２などの複製源が挙げられる。
【０１１４】
好適なベクターはまた、選択可能マーカー、例えば、産物が単離宿主細胞の欠陥を補う遺伝子、例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性もしくはテトラサイクリン耐性などを付与する遺伝子を含み得る。
【０１１５】
好適な発現ベクターは、通常、クローニングベクターの成分、例えば、選択宿主生物中でのベクターの自己複製を許容するエレメント、および選択目的のための表現型により検出可能な１種以上のマーカーなどを含む。発現ベクターはまた、通常、制御ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および、任意選択的に、活性化遺伝子配列などを含む。
【０１１６】
さらに、好適な発現ベクターは、ペルオキシソームなどの宿主細胞オルガネラ、または特定の細胞コンパートメントに目的タンパク質をターゲッティングすることができるアミノ酸配列をコードする配列をさらに含み得る。そのようなターゲッティング配列は、例えば、アミノ酸配列「ＳＫＬ」であり得る。制御配列の指示下で発現させるために、目的タンパク質の核酸配列は、発現が適切に起こるような方法で、制御配列に作動可能に連結させることができる。
【０１１７】
目的タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクト、プロモーター、ターミネーターおよび／または他のエレメントをライゲートし、それらを、複製に必要な情報を含む好適なベクターに挿入するために使用される、例えば本明細書に記載されるようなプロトコールは、当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、および３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ２００１を参照）。
【０１１８】
ポリヌクレオチドコンストラクトまたは発現ベクターを含む単離細胞は、ＰＯＩの組み換え産生の宿主細胞として有利に使用される。細胞は、ＰＯＩをコードするＤＮＡコンストラクトで、便宜的には、コンストラクトを宿主染色体に（１以上のコピー数で）組み込むことにより、形質転換することができる。そのようにして導入されたＤＮＡ配列は細胞により安定に保持される可能性が高いことから、一般的には、組み込みが有利であると考えられる。宿主染色体へのＤＮＡコンストラクトの組み込みは、従来の方法、例えば、相同組み換えまたは非相同組み換えを用いて行うことができる。あるいは、細胞を、上述したような異なるタイプの宿主細胞と関連した発現ベクターにより形質転換してもよい。
【０１１９】
他の実施形態では、発現宿主から遺伝子を欠失させることが有利であり、この場合、遺伝子の欠失を発現ベクターによって修復することができる。知られた方法を用いて、１つ以上の不活化された遺伝子を有する細菌宿主細胞を得ることができる。遺伝子の不活化は、挿入不活化、または本来の目的で遺伝子を機能させなくする任意の他の手段で、遺伝子が機能性タンパク質を発現することができないように、遺伝子の全部または一部を欠損させることによって行うことができる。
【０１２０】
細菌の形質転換技術および細菌の培養技術は、当該技術分野では一般的でよく知られている。それらは、目的の組み換えタンパク質を産生するための本開示の改善された宿主の形質転換に使用することができる。宿主細胞内へのＤＮＡコンストラクトまたはベクターの導入法としては、形質転換法；エレクトロポレーション法；核マイクロインジェクション法；形質導入法；トランスフェクション法、例えば、リポフェクション媒介およびＤＥＡＥ−デキストリン媒介トランスフェクション法；リン酸カルシウムＤＮＡ沈降物とのインキュベーション；ＤＮＡ被覆微粒子弾丸を用いた高速衝撃法；遺伝子銃またはバイオリスティック形質転換法およびプロトプラスト融合法などが挙げられる。細菌の形質転換および発現方法はまた、Ｂｒｉｇｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）に開示されている。プロテアーゼ欠失バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株のための好ましい一般的な形質転換および発現プロトコールは、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６６号明細書に提示されている）。
【０１２１】
ＶＩ．改変細胞によって産生された目的タンパク質
他の実施形態では、本開示は、ＰＯＩをより多量に発現する改変グラム陽性菌細胞を得る工程（ここで、改変細菌細胞は、ｒａｓＰ遺伝子（または、そのＯＲＦ）の発現を増大させる改変を含む）と、ＰＯＩを発現するような条件下で改変細胞を培養する工程（ここで、ＰＯＩをより多量に発現する改変細菌細胞は、非改変グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩの発現との比較である）とを含む、ＰＯＩをより高いレベルで産生する方法を提供する。
【０１２２】
ＰＯＩは、任意の内因性または異種のタンパク質であり得、またそのようなＰＯＩの多様体であってよい。そのタンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有することができる、またはその機能的形態がモノマーまたはマルチマーであるタンパク質である。すなわち、そのタンパク質は四次構造を有し、複数の同一（同種）または非同一（異種）サブユニットから構成され、このときＰＯＩまたはその多様体ＰＯＩは、好ましくは目的の特性を備えるタンパク質である。
【０１２３】
いくつかの他の実施形態では、ＰＯＩまたはその多様体ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１２４】
ＰＯＩまたは多様体ＰＯＩはまた、ペプチド、ペプチドホルモン、成長因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ  Ｅ７など）、およびそれらの多様体またはそれらの断片であり得る。
【０１２５】
他のタイプの目的タンパク質（もしくは多様体）は、食品または作物に栄養価を提供できるものであってよい。非限定的な例としては、抗栄養因子の形成を阻害できる植物性タンパク質、およびより望ましいアミノ酸組成物（例えば、非トランスジェニック植物より高いリシン含量）を有する植物性タンパク質が挙げられる。
【０１２６】
ＶＩＩ．タンパク質性組成物の使用
他の実施形態では、本開示は、１種以上の目的タンパク質を含むタンパク質性組成物を提供する。タンパク質性組成物は、好適には、本明細書に提示した方法を使用して生成される。本組成物は、本明細書に記載した方法を使用して発現させた、目的遺伝子によってコードされた目的タンパク質を含む。本組成物は、例えばバイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工、動物栄養、食品組成物、織物処理、パーソナルケア製品などの様々な有用な工業用途において使用することができる。
【０１２７】
例えば、このように生成されたタンパク質性組成物は、クリーニング用途において使用することができる。酵素的クリーニング成分は、それらの、さもなければ従来型の化学的洗剤によっては容易には除去されない汚れ、染みおよび他の砕片を分解する能力のために人気が高い。クリーニングに有用なよく知られた酵素としては、それぞれが一連の様々な機能性を提供するリパーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、さらにいくつかのセルラーゼなどの他の酵素とともに、プロテアーゼおよびアミラーゼが挙げられる。プロテアーゼは、タンパク質をベースとする染みに有効であり、アミラーゼは炭水化物やデンプンに作用し、そしてリパーゼは、例えば、脂質または脂肪を分解する。本開示は、クリーニング用途におけるそのような使用にとって興味深い工業用酵素、多様体および混合物の生産菌として好適かつ有利である、タンパク質生成の改善を示した改変細菌細胞を提供する。
【０１２８】
別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、穀物加工において使用することができる。デンプンは、植物自体、ならびに微生物および高等生物によって使用される、植物における最も一般的な貯蔵炭水化物である。非常に多くの様々な酵素がデンプン加水分解を触媒することができる。あらゆる植物源からのデンプンは粒状物の形態で発生するが、植物源の種類によって、デンプンは顕著に様々なサイズおよび物理的特徴をもって存在する。デンプンの酸加水分解は以前には広く使用されていたが、この方法は、現在では、耐蝕性材料やその他の利点を必要とすることが少なく、加熱に必要なエネルギーが少なく、かつ酸プロセスよりも制御するのが相当に容易であることが知られている酵素的方法に取って代わられている。本開示は、デンプン分解および穀物加工におけるそのような使用にとって興味深い工業用酵素、多様体および混合物の生産菌として好適かつ有利である、タンパク質生成の改善を示した、人工的に作られた、形質転換された、または誘導された真正細菌細胞を提供する。
【０１２９】
別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、食品用途において使用できる。細菌、酵母およびカビによって生成された酵素は、何千年にもわたり、パン、チーズ、ビールおよびワインなどの食品を製造する食品用途において使用されてきた。現在、酵素は、パン製造、チーズ製造、デンプン加工処理および果汁や他の飲料の製造において使用され、そのような改良された質感、外観および栄養価を提供し、所望の風味および芳香などを生成する。食品用酵素は、一般に、動物および植物（例えば、デンプン消化酵素、アミラーゼは、発芽中の大麦種子から得ることができる）、ならびにある範囲の有益な微生物を起源とする。酵素は、多数の工程における合成化学物質に取って代わって、伝統的な化学物質に基づく技術に対する実行可能で望ましい代替技術であり、多数の工程で合成化学物質に取って代わると思われる。酵素は、食品製造プロセスの環境的性能の改善に役立ち、エネルギー消費を減少させ、また廃棄物または副生物の生分解性を改善することができる。酵素は、それらの作用において合成化学物質よりも特異性が高い傾向があり、したがって、酵素的プロセスでは副反応および廃棄物または副生物の発生がより少なく、その結果、より高品質の生成物を生成し、汚染の可能性を減少させる傾向がある。酵素的プロセスは、とり得る唯一のプロセスであることも多い。この１つの例は、酵素のペクチナーゼの使用に依存する透明リンゴ果汁濃縮液の製造である。食品用酵素の大多数は、微生物、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）から産生される。本開示は、食品用途におけるそのような使用にとって興味深い工業用酵素、多様体および混合物の生産菌として好適かつ有利である、タンパク質生成の改善を示した、人工的に作られた、形質転換された、または誘導された真性細菌細胞を提供する。
【０１３０】
別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、動物飼料用添加物において使用することができる。セルラーゼ、キシラナーゼ、β−グルカナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼおよび他の興味深いカルボヒドラーゼが、動物飼料産業において広く使用されてきた。多数の植物をベースとする飼料は、動物の成長を低下させる抗栄養因子を有する物質を含有するので、そのような飼料に加えられる酵素は、繊維、タンパク質、デンプンおよびフィチン酸塩を分解し、それらを動物により消化し易くし、より安価で多くは現地生産される飼料の使用を可能にし、その一方、肉、卵もしくはミルクの生産性を最大化することによってこれらの抗栄養因子の消化性を改良する。同時に、そのような飼料に加えられる酵素はまた、腸の健康および動物の性能強化を支援する利点を提供する。本開示は、動物飼料用途におけるそのような使用にとって興味深い工業用酵素、多様体および混合物の生産菌として好適かつ有利である、タンパク質生成の改善を示した、人工的に作られた、形質転換された、または誘導された真性細菌細胞を提供する。
【０１３１】
さらに別の例では、このように生成されたタンパク質性組成物は、織物用途において使用することができる。酵素は、織物加工の不可欠な部分になっている。織物工業においては、２つの明確に確立された酵素用途がある。第一に、アミラーゼなどの酵素は、湯通しのための予備仕上げ領域においてよく使用される。第二に、セルラーゼなどの酵素は、柔軟化、バイオストーン加工および綿製品のピリング傾向を低下させるための仕上げ領域でよく使用される。
【０１３２】
例えば、ペクチナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼなどの他の酵素もまた織物加工において使用される。さらに、デニムおよび非デニムの退色、バイオ精錬、バイオ研磨、ウール研磨、過酸化物除去、染料の脱色など、酵素を必要とする様々な用途がある。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、織物用途におけるそのような使用にとって興味深い工業用酵素、多様体および混合物の生産菌としての改変グラム陽性菌細胞（本明細書において、タンパク質生成が改善されたことが示されている）を提供する。
【０１３３】
本明細書に開示する組成物および方法の非限定的例は、以下のとおりである。
【０１３４】
１．非改変（親）グラム陽性菌細胞に比べ、目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く産生する改変グラム陽性菌細胞であって、ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含む改変細菌細胞。
【０１３５】
２．ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変である請求項１の改変細胞。
【０１３６】
３．内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターは、天然ｒａｓＰプロモーターより高い活性を有するいずれかのプロモーターで置換されている請求項２の改変細胞。
【０１３７】
４．内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターは、ｓｐｏＶＧプロモーターまたはａｐｒＥプロモーターで置換されている請求項２の改変細胞。
【０１３８】
５．ｓｐｏＶＧプロモーターは、配列番号３に対し９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む請求項４の改変細胞。
【０１３９】
６．ａｐｒＥプロモーターは、配列番号４に対し９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む請求項４の改変細胞。
【０１４０】
７．内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の改変である請求項２の改変細胞。
【０１４１】
８．天然のｒａｓＰ染色体５’−ＵＴＲは、配列番号５のａｐｒＥ５’−ＵＴＲに対し９５％の配列同一性を含む５’−ＵＴＲで置換されている請求項７の改変細胞。
【０１４２】
９．内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変は、内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターおよび天然５’−ＵＴＲの両方の改変である請求項２の改変細胞。
【０１４３】
１０．ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変は、ｒａｓＰ遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドである請求項１の改変細胞。
【０１４４】
１１．ｒａｓＰ遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている請求項１０の改変細胞。
【０１４５】
１２．染色体外プラスミドは発現カセットである請求項１１の改変細胞。
【０１４６】
１３．染色体外プラスミドは組み込みプラスミドである請求項１１の改変細胞。
【０１４７】
１４．プラスミドは改変細胞の染色体に安定に組み込まれる請求項１３の改変細胞。
【０１４８】
１５．ｒａｓＰの発現を増大させる遺伝子改変は、外因性ｒａｓＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、ＯＲＦは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたはコンディショナルプロモーターに作動可能に連結され、その制御下にある請求項１の改変細胞。
【０１４９】
１６．ｒａｓＰ  ＯＲＦを含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている請求項１５の改変細胞。
【０１５０】
１７．染色体外プラスミドは発現カセットである請求項１６の改変細胞。
【０１５１】
１８．染色体外プラスミドは組み込みプラスミドである請求項１６の改変細胞。
【０１５２】
１９．プラスミドは改変細胞の染色体に組み込まれる請求項１８の改変細胞。
【０１５３】
２０．ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列に対し少なくとも６０％の配列同一性を含む核酸配列を含む請求項１の改変細胞。
【０１５４】
２１．配列番号１のＯＲＦは、ＲａｓＰポリペプチドをコードし、ＲａｓＰポリペプチドはさらに、サイト２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）活性を有するＺｎ２＋メタロプロテアーゼと定義される請求項２０の改変細胞。
【０１５５】
２２．ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドに対し６０％のアミノ酸配列同一性を含むＲａｓＰポリペプチドをコードし、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの１６〜２６のアミノ酸残基とアラインする、配列番号６の活性部位コンセンサス配列を含む請求項１の改変細胞。
【０１５６】
２３．ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドに対し８０％のアミノ酸配列同一性を含むＲａｓＰポリペプチドをコードし、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの２０〜２４のアミノ酸残基とアラインする、配列番号７の活性部位コンセンサス配列（ＨＥＸＸＨ）を含む請求項１の改変細胞。
【０１５７】
２４．非改変（親）グラム陽性細胞と比べた、産生ＰＯＩの増加量は、少なくとも５％の増加である請求項１の改変細胞。
【０１５８】
２５．非改変（親）グラム陽性細胞と比べた、産生ＰＯＩの増加量は、少なくとも１０％の増加である請求項１の改変細胞。
【０１５９】
２６．グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである請求項１の改変細胞。
【０１６０】
２７．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．マルマレシス（Ｂ．ｍａｒｍａｒｅｓｉｓ）、およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から選択される請求項２６の改変細胞。
【０１６１】
２８．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である請求項２７の改変細胞。
【０１６２】
２９．ＰＯＩは、改変細菌細胞に対し外因性の遺伝子、または改変細菌細胞に対し内因性の遺伝子によってコードされる請求項１の改変細胞。
【０１６３】
３０．ＰＯＩは、細胞外へ分泌または輸送される請求項１の改変細胞。
【０１６４】
３１．細胞外へ分泌または輸送されたＰＯＩは、さらに単離され、かつ精製される請求項３０の改変細胞。
【０１６５】
３２．ＰＯＩは酵素である請求項１の改変細胞。
【０１６６】
３３．酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項３２の改変細胞。
【０１６７】
３４．請求項１の改変細胞によって産生された単離ＰＯＩ。
【０１６８】
３５．グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩの産生を増大させる方法であって、
（ａ）ＰＯＩをより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞を得る工程（ここで、改変細菌細胞はｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変を含む）と、
（ｂ）ＰＯＩが発現するような条件下で改変細胞を培養する工程（ここで、ＰＯＩをより多量に産生する改変細菌細胞は、非改変（親）グラム陽性菌細胞における同じＰＯＩの産生との比較である）と
を含む方法。
【０１６９】
３６．ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変である請求項３５の方法。
【０１７０】
３７．内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターは、天然ｒａｓＰプロモーターより高い活性を有するいずれかのプロモーターで置換されている請求項３６の方法。
【０１７１】
３８．内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターは、ｓｐｏＶＧプロモーターまたはａｐｒＥプロモーターで置換されている請求項３５の方法。
【０１７２】
３９．ｓｐｏＶＧプロモーターは、配列番号３に対し９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む請求項３８の方法。
【０１７３】
４０．ａｐｒＥプロモーターは、配列番号４に対し９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む請求項３８の方法。
【０１７４】
４１．内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変は、内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の改変である請求項３５の方法。
【０１７５】
４２．天然のｒａｓＰ染色体５’−ＵＴＲは、配列番号５のａｐｒＥ５’−ＵＴＲに対し９５％の配列同一性を含む５’−ＵＴＲで置換されている請求項４１の方法。
【０１７６】
４３．内因性の染色体ｒａｓＰ遺伝子に対する改変は、内因性染色体ｒａｓＰ遺伝子の天然プロモーターおよび天然５’−ＵＴＲの両方の改変である請求項３５の方法。
【０１７７】
４４．ｒａｓＰ遺伝子の発現を増大させる改変は、ｒａｓＰ遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドである請求項３５の方法。
【０１７８】
４５．ｒａｓＰ遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている請求項４４の方法。
【０１７９】
４６．染色体外プラスミドは発現カセットである請求項４５の方法。
【０１８０】
４７．染色体外プラスミドは組み込みプラスミドである請求項４５の方法。
【０１８１】
４８．プラスミドは改変細胞の染色体に組み込まれる請求項４７の方法。
【０１８２】
４９．ｒａｓＰの発現を増大させる遺伝子改変は、外因性ｒａｓＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、ＯＲＦは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたはコンディショナルプロモーターに作動可能に連結され、その制御下にある請求項３５の方法。
【０１８３】
５０．ｒａｓＰ  ＯＲＦを含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている請求項４９の方法。
【０１８４】
５１．染色体外プラスミドは発現カセットである請求項５０の方法。
【０１８５】
５２．染色体外プラスミドは組み込みプラスミドである請求項５０の方法。
【０１８６】
５３．プラスミドは改変細胞の染色体に組み込まれる請求項５２の方法。
【０１８７】
５４．ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列に対し少なくとも６０％の配列同一性を含む核酸配列を含む請求項３５の方法。
【０１８８】
５５．配列番号のＯＲＦは、ＲａｓＰポリペプチドをコードし、ＲａｓＰポリペプチドはさらに、サイト２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）活性を有するＺｎ２＋メタロプロテアーゼと定義される請求項５４の方法。
【０１８９】
５６．ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドに対し６０％のアミノ酸配列同一性を含むＲａｓＰポリペプチドをコードし、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの１６〜２６のアミノ酸残基とアラインする、配列番号７の活性部位コンセンサス配列を含む請求項３５の方法。
【０１９０】
５７．ｒａｓＰ遺伝子は、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドに対し８０％のアミノ酸配列同一性を含むＲａｓＰポリペプチドをコードし、配列番号２のＲａｓＰポリペプチドの２０〜２４のアミノ酸残基とアラインする、配列番号７の活性部位コンセンサス配列を含む請求項３５の方法。
【０１９１】
５８．非改変（親）グラム陽性細胞と比べた、産生ＰＯＩの増加量は、少なくとも５％の増加である請求項３５の方法。
【０１９２】
５９．非改変（親）グラム陽性細胞と比べたｋ、産生ＰＯＩの増加量は、少なくとも１０％の増加である請求項３５の方法。
【０１９３】
６０．グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである請求項３５の方法。
【０１９４】
６１．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．マルマレシス（Ｂ．ｍａｒｍａｒｅｓｉｓ）、およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される請求項６０の方法。
【０１９５】
６２．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である請求項６１の方法。
【０１９６】
６３．ＰＯＩは、改変細菌細胞に対し外因性の遺伝子、または改変細菌細胞に対し内因性の遺伝子によってコードされる請求項３５の方法。
【０１９７】
６４．ＰＯＩは、細胞外へ分泌または輸送される請求項３５の方法。
【０１９８】
６５．細胞外へ分泌または輸送されたＰＯＩは、さらに単離され、かつ精製される請求項６４の方法。
【０１９９】
６６．ＰＯＩは酵素である請求項３５の方法。
【０２００】
６７．酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項６６の方法。
【０２０１】
６８．請求項３５の方法によって産生された単離ＰＯＩ。
【０２０２】
６９．ＰＯＩをより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞を得る方法であって、
（ａ）親グラム陽性菌細胞に、ｒａｓＰ遺伝子発現を増大させる、少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程と、
（ｂ）ＰＯＩをより多量に発現する１つ以上の娘細胞を選択する工程
（ここで、ＰＯＩをより多量に産生させるために選択された１つ以上の娘細胞は、改変（娘）グラム陽性菌細胞と定義される）と
を含む方法。
【実施例】
【０２０３】
本開示のいくつかの態様は、限定するものと解釈すべきでない以下の実施例に照らしてさらに理解することができる。材料および方法の変更は、当業者には明白であろう。
【０２０４】
実施例１
改変バチルス・サブティリス（ＢＡＣＩＬＬＵＳ  ＳＵＢＴＩＬＩＳ）宿主細胞の構築
Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液をＴａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から購入し、下記の変異Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の構築に使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）をベクターの構築に使用した。プライマーをＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得た。
【０２０５】
Ａ．欠失ｒａｓＰ遺伝子を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主の構築
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のｒａｓＰ欠失変異体（“ΔｒａｓＰ”）を、Ｆａｂｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）に記載の修正変異送達法を用いて構築した。親Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞は欠失ｕｐｐ遺伝子（“Δｕｐｐ”）を含む。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Δｕｐｐ）細胞中のｒａｓＰ遺伝子を完全に置換（欠失）するために、ｒａｓＰ遺伝子の５’側および３’側フランキング領域を、配列番号４４および配列番号４５のＰＣＲプライマー対を使用して増幅させた。
【０２０６】
増幅させたｒａｓＰ断片を、ｕｐｐ遺伝子およびｃＩ遺伝子を含むフレオマイシン耐性カセットに融合させた（ｓｅｅ，Ｆａｂｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。得られた融合産物を用いて、コンピテンスを０．３％キシロースで誘導したコンピテントＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Δｕｐｐ：：ｎｅｏＲ（親）細胞を形質転換した。これにより、標的ｒａｓＰ遺伝子を欠損した、フレオマイシン耐性でネオマイシンに感受性を有する（娘）細胞が得られた。配列番号１０／配列番号９のオリゴヌクレオチド対、および配列番号１０／配列番号１１のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、標的ｒａｓＰ遺伝子の正確な欠失を確認した。
【０２０７】
Ｂ．欠失ｔｅｐＡ遺伝子を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主の構築
Ｆａｂｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）の修正変異送達法をさらに用いて、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Δｕｐｐ）細胞のｔｅｐＡ遺伝子欠失変異体（「ΔｔｅｐＡ」）を構築した。こうして、ｔｅｐＡ遺伝子を完全に置換するために、これらの遺伝子の５’側および３’側フランキング領域を、配列番号１２／配列番号１３、および配列番号１４／配列番号１５のＰＣＲプライマー対を使用して増幅させた。増幅させた断片を、ｕｐｐ遺伝子およびｃＩ遺伝子を含むフレオマイシン耐性カセットに融合させた（ｓｅｅ，Ｆａｂｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）（Ｆａｂｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２を参照）。その後、得られた融合産物を用いて、コンピテンスを０．３％キシロースで誘導したコンピテントＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Δｕｐｐ：：ｎｅｏＲ（親）細胞を形質転換した。これにより、標的ｔｅｐＡ遺伝子を欠損した、フレオマイシン耐性でネオマイシンに感受性を有する菌株が得られた。配列番号１６／配列番号１５、および配列番号１６／配列番号１１のプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲ反応を行い、ｔｅｐＡ遺伝子の正確な欠失を確認した。
【０２０８】
Ｃ．ｒａｓＰ遺伝子を過剰発現するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の構築
１．組み込み型ベクターｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧの構築
ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＢ遺伝子の１，０４０塩基対ＤＮＡ断片（配列番号１７）を、配列番号  １８／配列番号  １９のプライマー対を用いて増幅した。２つのｌｏｘ配列（すなわち、配列番号２０）で挟まれたスペクチノマイシン耐性マーカーを、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にｇ−Ｂｌｏｃｋとして合成発注し取り寄せた。ｓｐｏＩＩＩＡＦ〜ＡＧ遺伝子の９８１塩基対ＤＮＡ配列（すなわち、配列番号２１）を、配列番号２２および配列番号２３のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。商業的に入手可能なプラスミド「ｐＲＳ４２６」を、配列番号２４および配列番号２５のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。その後、上記ＤＮＡ配列（すなわち、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２１）、およびｐＲＳ４２６増幅ベクターをＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）ＨｉＦｉ  １  Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＧＩ）を用いてインビトロでアセンブルして、組み込み型ベクター「ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ」を生成した。
【０２０９】
２．プラスミドｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰの構築
本明細書に記載のいくつかのｒａｓＰ過剰発現実験のために、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーターを使用して、ｒａｓＰ遺伝子を駆動（過剰発現）させた。例えば、ｓｐｏＶＧプロモーターの配列（配列番号３）を含む合成ｇ−ＢｌｏｃｋをＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から取り寄せた。ｒａｓＰコード配列を、配列番号２６および配列番号２７のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅させた。「ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ」として示されるプラスミドを、配列番号２８および配列番号２９のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。ｓｐｏＶＧプロモーター配列、ｒａｓＰコード配列およびプラスミドｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧをＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）ＨｉＦｉ  １  Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＧＩ）によりアセンブルして、プラスミド「ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」を作った。ＲａｓＰポリペプチドの発現および産生をさらに増大させるために、配列番号５のａｐｒＥ（遺伝子）リーダー配列（すなわち、５’−ＵＴＲ）を、ｒａｓＰ遺伝子の前（５’側）にクローニングして、プラスミド「ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ＵＴＲ−ｒａｓＰ」を生成した。
【０２１０】
３．プラスミドｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰａｐｒＥ−ｒａｓＰの構築
本明細書において「ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰａｐｒＥ−ｒａｓＰ」と称するｒａｓＰ（遺伝子）過剰発現プラスミドを構築するために、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ（遺伝子）プロモーター（「ＰａｐｒＥ」；配列番号４）をベクターの５’側に導入し、ｒａｓＰコード配列に作動可能に連結させた。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーターの核酸配列を、配列番号３０および配列番号３１のオリゴヌクレオチドを用いて、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムからＰＣＲによって増幅させた。プラスミド「ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」を、配列番号３２および配列番号３３のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅させた。ａｐｒＥプロモーター（ＰａｐｒＥ）およびプラスミドをＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）ＨｉＦｉ  １  Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＧＩ）によりライゲートした。
【０２１１】
４．プラスミドｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡの構築
シグナルペプチドペプチダーゼのヌクレオチド配列を、配列番号３４および配列番号３５のオリゴヌクレオチドを用いてＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡから増幅させた。ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰのプラスミド骨格を、配列番号３６／配列番号３７のオリゴヌクレオチド対を使用してＰＣＲにより増幅させた。ｔｅｐＡ遺伝子配列および増幅したプラスミドをＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）ＨｉＦｉ  １  Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＧＩ）によりライゲートした。得られたプラスミドをｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡと名付けた。
【０２１２】
実施例２
異種ｒａｓＰまたはｔｅｐＡ遺伝子コンストラクトによるＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞の形質転換
プラスミドｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ（実施例１．Ｃ．２を参照）、ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ＵＴＲ−ｒａｓＰ（実施例１．Ｃ．２を参照）、ｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰａｐｒＥ−ｒａｓＰ（実施例１．Ｃ．３を参照）およびｐＲＳ−ｓｐｏＩＩＩＡＡ〜ＡＧ−ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ（実施例１．Ｃ．４を参照）をそれぞれ、制限エンドヌクレアーゼＳｃａＩで線状化し、各プラスミドを個別にコンピテントバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に形質転換した。ポジティブコロニーを、スペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ含有するルリア寒天プレート上で選択した。得られた（形質転換された）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）細胞を、本明細書では、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」、「ＰｓｐｏＶＧ−ＵＴＲ−ｒａｓＰ」、「ＰａｐｒＥ−ｒａｓＰ」および「ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ」と称する。
【０２１３】
実施例３
目的タンパク質をコードする異種遺伝子（発現コンストラクト）を有する改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（宿主）細胞の形質転換
Ａ．ＡｍｙＬ発現コンストラクト
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（「ＰａｐｒＥ」）およびａｐｒＥシグナル配列（「ａｐｒＥ  ＵＴＲ」、以下「ＵＴＲ」；実施例１．Ｃ．２を参照）を使用して、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）「ＡｍｙＬ」アミラーゼ（成熟配列配列番号３８）の発現を駆動した。本明細書において「ＰａｐｒＥ−ＡｍｙＬ−ｃａｔＲ」として示した発現コンストラクト（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性（「ｃａｔＲ」）マーカー遺伝子を含む）を、（１）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型（「ｗｔ」）細胞（すなわち、親細胞）に、（２）ｒａｓＰ欠失（ΔｒａｓＰ）を含む改変（娘）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に、および（３）ｔｅｐＡ欠失（ΔｔｅｐＡ）を含む改変（娘）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に形質転換した。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で形質転換体を選択した。
【０２１４】
Ｂ．アミラーゼＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６用発現コンストラクト
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（「ＰａｐｒＥ」）およびａｐｒＥシグナル配列（「ＵＴＲ」）を使用して、ＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６と称する、パエニバチルス・カードラノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）アミラーゼ（成熟配列配列番号３９）多様体の発現を駆動した。「ＰａｐｒＥ−ＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６−ｃａｔＲ」と称する発現カセット（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性（ｃａｔＲ）マーカー遺伝子を含む）を、（１）ｒａｓＰ遺伝子を含み、「ＰｓｐｏＶＧ」プロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）細胞（すなわち、上記実施例２に記載した「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」細胞）に、（２）ｒａｓＰ遺伝子を含み、ＰａｐｒＥプロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）細胞（すなわち、上記実施例２に記載した「ＰａｐｒＥ−ｒａｓＰ」細胞）に、（３）ｔｅｐＡ遺伝子を含み、「ＰｓｐｏＶＧ」プロモーターの制御下にｔｅｐＡ遺伝子を発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）細胞（すなわち、上記実施例２に記載した「ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ」細胞）に、および（４）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（親）細胞に形質転換した。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。
【０２１５】
Ｃ．ＡｍｙＥ発現コンストラクト
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（「ＰａｐｒＥ」）を使用して、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）「ＡｍｙＥ」アミラーゼ（成熟配列配列番号４０）の発現を駆動した。「ＰａｐｒＥ−ａｍｙＥ−ｃａｔＲ」と称する発現カセット（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性（ｃａｔＲ）マーカー遺伝子を含む）を、（１）ｒａｓＰ遺伝子を含み、「ＰｓｐｏＶＧ」プロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、上記実施例２に記載した「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」細胞）、（２）ｒａｓＰ遺伝子を含み、“ＰｓｐｏＶＧ”プロモーターおよびａｐｒＥ  ＵＴＲの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、上記実施例２に記載した「ＰｓｐｏＶＧ−ＵＴＲ−ｒａｓＰ」細胞）、（３）ｒａｓＰ遺伝子を含み、「ＰａｐｒＥ」プロモーターの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、上記実施例２に記載した「ＰａｐｒＥ−ｒａｓＰ」細胞）、（４）ｔｅｐＡ遺伝子を含み、「ＰｓｐｏＶＧ」プロモーターの制御下にｔｅｐＡ遺伝子を発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（上記実施例２に記載した「ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ」細胞）、（５）ｒａｓＰ（ΔｒａｓＰ）遺伝子欠失を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（実施例１．Ａを参照）、（６）ｔｅｐＡ（ΔｔｅｐＡ）遺伝子欠失を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（実施例１．Ｂを参照）、および（７）非改変（親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）対照細胞のゲノムａｐｒＥ遺伝子座に導入した。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。
【０２１６】
Ｄ．ＢｇｌＣ発現コンストラクト
ａｐｒＥプロモーター（ＰａｐｒＥ）の制御下に発現する、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）β−Ｄ−グルコシダーゼ（以下、「ＢｇｌＣ」；成熟配列配列番号４１）をコードする発現コンストラクトを構築し、「ＰａｐｒＥ−ＢｇｌＣ−ｃａｔＲ」と称した。ＰａｐｒＥ−ＢｇｌＣ−ｃａｔＲコンストラクトを、（１）野生型（非改質；親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、（２）「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」を含み、発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、（３）「ＰａｐｒＥ−ｒａｓＰ」を含み、発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、および（４）“ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ”を含み、発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のａｐｒＥ遺伝子座に導入した。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。
【０２１７】
Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ発現コンストラクト
ａｐｒＥプロモーター（ＰａｐｒＥ）の制御下に発現する、プロテアーゼＰｒｏｐｅｒａｓｅ（成熟配列配列番号４２）をコードする発現コンストラクトを構築し、「ＰａｐｒＥ−Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ−ｃａｔＲ」と称した。ＰａｐｒＥ−Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ−ｃａｔＲ発現コンストラクトを、（１）「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」を含み、発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、（２）「ＰａｐｒＥ−ｒａｓＰ」を含み、発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、（３）「ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ」を含み、発現／過剰発現する、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、および（４）野生型（非改質；親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のａｐｒＥ遺伝子座に導入した。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。
【０２１８】
Ｆ．ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ発現コンストラクト
ａｐｒＥプロモーター（ＰａｐｒＥ）の制御下に発現する、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）プロテアーゼＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ（配列番号４３）をコードする発現コンストラクトを構築し、「ＰａｐｒＥ−ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ−ｃａｔＲ」と称した。ＰａｐｒＥ−ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ−ｃａｔＲ発現カセットを、（１）ｒａｓＰ（ΔｒａｓＰ）遺伝子欠失を含む改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、（２）ｔｅｐＡ（ΔｔｅｐＡ）遺伝子欠失を含む改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、および（３）野生型（非改質；親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に形質転換した。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ＰａｐｒＥ−ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ−ｃａｔＲコンストラクトを持つコロニーを選択した。
【０２１９】
実施例４
目的タンパク質の発現および産生
Ａ．材料および方法
細菌増殖条件。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を溶原培地（ＬＢ；Ｏｘｏｉｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）またはＭＢＵ培地中、３７℃、２８０ｒｐｍで増殖させた。ＭＢＵ培地は、Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．、（２００７）に記載されるＭＢＤ培地に類似するが、ソイトンは含有せず、７．５％グルコースの代わりに、２．１％グルコースおよび３．５％マルトデキストリンＤＥ１３−１７を含有する。必要に応じて、変異の選択のために、ネオマイシン１５μｇ／ｍｌもしくはフレオマイシン４μｇ／ｍｌを、または、アミラーゼまたはプロテアーゼ遺伝子の選択もしくは増幅（それぞれ）のために、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌもしくは２５μｇ／ｍｌを、培地に追加した。ＭＢＵ培地でのパルス・チェイスラベル実験に、２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを使用した。
【０２２０】
増殖の分析。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ中、３７℃、２５０ｒｐｍで、終夜増殖させた。培養物を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてＬＢにより５０倍に希釈し、マイクロタイタープレートインキュベーター（Ｇｒａｎｔ−ｂｉｏ  ＰＨＭＰ−４、Ｇｒａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）中、３７℃、８００ｒｐｍで、約３時間増殖させた。その後、培養物をＭＢＵで５０倍に希釈し、マイクロタイタープレートインキュベーター中、３７℃、８００ｒｐｍで、３時間増殖させた。新鮮なＭＢＵで最後の５０倍希釈を行い、ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＨＴマイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）でＯＤ６００を測定し、増殖をモニターした。
【０２２１】
タンパク質の発現および分泌の分析。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養物を、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢプレートから植菌し、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍを含有するＬＢ培地で約８時間増殖させた。これらの培養物を振盪フラスコ中、クロラムフェニコール２．５μｇ／ｍｌを含有するＭＢＵ培地で１０００倍に希釈し、高湿度下、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎオービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）により、３７℃、２８０ｒｐｍで約１６時間インキュベートした。ＯＤ６００を測定し、補正した後、遠心分離により培養培地から、等量の細胞を分離した。細胞外タンパク質を分析するために、培養培地中のタンパク質をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ；最終濃度１０％重量／体積）で沈殿させ、ＬＤＳ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解し、９５℃で１０分間加熱した。次に、１０％ＮｕＰａｇｅゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＬＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。
【０２２２】
パルス・チェイスタンパク質ラベル実験。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）タンパク質のパルス・チェイスラベルを、Ｅａｓｙ  ｔａｇ３５Ｓ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。次のような変更を加えて、免疫沈降およびＬＤＳ−ＰＡＧＥを前述のように行った。（Ｖａｎ  Ｄｉｊｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）細胞は、前述のように、クロラムフェニコール２．５μｇ／ｍｌを含有するＭＢＵ中で１６時間増殖させ、実際にラベリングする１時間前に、ＯＤ６００ｏｆが約０．７になるまで、クロラムフェニコール２．５μｇ／ｍｌを含有する新鮮なＭＢＵで希釈した。２５μＣｉ３５Ｓ  Ｍｅｔで３０秒間ラベリングを行った後、過剰量の標識していないメチオニンを加えた（チェイス；最終濃度０．６２５ｍｇ／ｍｌ）．複数の時点で試料を集め、続いて、氷上で１０％ＴＣＡを用いてタンパク質を直接沈殿させた。沈殿物を溶解緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８．０、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に再懸濁した。３７℃で１０〜１５分間インキュベートした後、１％（重量／体積）ＳＤＳを添加し、１００℃で１０分間加熱して溶解させた。
【０２２３】
ＳＴＤ−トリス緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８．２、０．９％（重量／体積）ＮａＣｌ、１．０％（体積／体積）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％（重量／体積）デオキシコール酸ナトリウム）における各標識タンパク質の免疫沈降のために、ＡｍｙＥまたはＡｍｙＬに特異的なポリクローナル抗体を、プロテイン−Ａ親和性培地（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｌｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに用いた。ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌは高いタンパク質分解活性を有し、抗体も分解するため、ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの免疫沈降は、特定のセリンプロテアーゼ阻害剤（４ｍＭ、Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ  ＳＣ、Ｒｏｃｈｅ）の存在下に行った。ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ抗体は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の未確認の細胞タンパク質に特異的に結合するため、ＴＣＡ−沈殿培養培地試料中の分泌ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの分析には、ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの免疫沈降を唯一実施した。１０％ＮｕＰａｇｅゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるＬＤＳ−ＰＡＧＥによって標識タンパク質を分離し、Ｃｙｃｌｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて可視化した。
【０２２４】
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＰｒｏｐｅｒａｓｅの発現および産生。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ発現を試験するために、ＲａｓＰ（例えば、実施例１．Ｃを参照）を過剰発現するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、および野生型（非改変；親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、５ｍＬのＬＢ中で５時間増殖させた。１．５ＯＤの予備培養物を用いて振盪フラスコ中の２５ｍｌのＭＢＵに植菌し、細胞を３７℃、２５０ｒｐｍ、湿度７０％で増殖させた。増殖１８時間、２５時間、４１時間、４８時間および６５時間後に試料を採取した。細胞密度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いてＯＤ６００ｎｍを測定し、６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットした。国際公開２０１０／１４４２８３号パンフレットに記載されているように、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質（以下、「ＡＡＰＦ」；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から）を用いてＰｒｏｐｅｒａｓｅ酵素の発現をモニターした。簡単に説明すると、アッセイ用緩衝液（１００ｍＭトリス、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）で培養液全体を４００倍に希釈し、希釈試料１０μｌをマイクロタイタープレートに配置した。ＡＡＰＦストックを希釈し、アッセイ用緩衝液（ＤＭＳＯで１００ｍｇ／ｍｌのＡＡＰＦストックを１００倍に希釈）と、この溶液１９０μｌとをマイクロタイタープレートに加え、この溶液の吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を使用して４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットした。
【０２２５】
Ｂ．野生型および改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞における、ＡｍｙＥ、ＡｍｙＬおよびＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌタンパク質の産生の分析。
クロラムフェニコール２．５μｇ／ｍｌを含むＭＢＵにより１６時間増殖させた後、ｒａｓＰまたはｔｅｐＡ分泌装置要素を欠損した改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、ΔｒａｓＰ細胞またはΔｔｅｐＡ細胞）それぞれにおけるＡｍｙＥ、ＡｍｙＬまたはＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの産生をＬＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。この目的のために、細胞を遠心分離によって清澄培地から分離し、細胞密度に対して補正した、等量の成長培地をゲルにロードした。変異Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、ΔｒａｓＰ細胞またはΔｔｅｐＡ細胞）それぞれから分泌された細胞外のＡｍｙＥ、ＡｍｙＬまたはＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの量を、完全な分泌装置を有するそれぞれのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（野生型）対照細胞（すなわち、天然ｒａｓＰまたはｔｅｐＡ遺伝子を含むＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞）によって分泌されたこれらの各タンパク質の量と比較した。分泌酵素の定量化を解析ソフトウエアＩｍａｇｅＪを用いて行った。
【０２２６】
図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示すように、ＬＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびヒストグラムプロットは、ＡｍｙＥ、ＡｍｙＬおよびＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの産生は、ΔｒａｓＰ変異細胞で野生型（親）細胞より減少した。図１Ａおよび図１Ｂに示したΔｔｅｐＡ変異細胞では、野生型（親）細胞と比較したとき、ｔｅｐＡ欠失がＡｍｙＥまたはＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌの産生に影響を及ぼさないことを示した。
【０２２７】
Ｃ．野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｒａｓＰを発現／過剰発現する発現カセットで改変されたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるＡｍｙＥの発現。
それぞれＡｍｙＥアミラーゼコンストラクト（「ＰａｐｒＥ−ａｍｙＥ−ｃａｔＲ」）を含む、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型細胞、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、および「ＰｓｐｏＶＧ−ＵＴＲ−ｒａｓＰ」を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、クロラムフェニコール５ｐｐｍを含有するルリア培地５ｍｌに終夜植え付けた。予備培養物１ｍｌを使用して振盪フラスコ内のＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）培地２５ｍｌに植菌した。Ｉｎｆｏｒｓシェーカーを使用して、３７℃、２５０ｒｐｍで実験を行った。増殖期間に時点をとり、細胞の増殖を６００ｎｍで測定した。
【０２２８】
培地全体のＡｍｙＥアミラーゼ活性を、Ｃｅｒａｌｐｈａ  ＨＲキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）からのＣｅｒａｌｐｈａ試薬を用いて測定した。まず、Ｃｅｒａｌｐｈａ試薬ミックスを１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、続いて３０ｍｌの５０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ５．６を添加した。培養物の上清をＭｉｌｌｉＱ水で４０倍に希釈し、試料１０μｌを、５５μＬの希釈標準基質溶液に加えた。ＭＴＰプレートを振盪後、室温で４分間、インキュベートした。７０μｌの２００ｍＭホウ酸塩緩衝液、ｐＨ１０．２（停止溶液）を加え、反応を停止させた。この溶液の４００ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を用いて測定し、４００ｎｍにおける吸光度を時間の関数としてプロットした。
【０２２９】
図２Ａに示すように、ｒａｓＰ遺伝子を含み、ＰｓｐｏＶＧプロモーターおよびａｐｒＥ５’ＵＴＲの制御下にｒａｓＰ遺伝子を発現／過剰発現する（すなわち、ＰｓｐｏＶＧ−ＵＴＲ−ｒａｓＰ）改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞は、細胞増殖の改善を示し、最大レベルのｒａｓＰ発現が、試験を行った条件下で、細胞の増殖にポジティブな影響を与えることを示唆した。図２Ｂに示したデータは、さらに、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」細胞および「ＰｓｐｏＶＧ−ＵＴＲ−ｒａｓＰ」細胞）におけるＡｍｙＥアミラーゼの産生が、野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）対照細胞に比べて増大したことを示している。
【０２３０】
Ｄ．野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｒａｓＰを発現／過剰発現する発現カセットで改変されたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞における変異ＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６アミラーゼの発現。
それぞれ変異「ＰａｐｒＥ−ＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６−ｃａｔＲ」コンストラクトを含む、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型細胞、および「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、クロラムフェニコール２５ｐｐｍを含有するルリア培地５ｍｌに数日にわたって植え付けた。予備培養物１ｍｌを使用して振盪フラスコ内のＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）培地２５ｍｌに植菌した。Ｉｎｆｏｒｓシェーカーを使用して、３７℃、２５０ＲＰＭで実験を行った。増殖期間に時点をとり、増殖期間中のアミラーゼの活性を測定した。
【０２３１】
培地全体のＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６アミラーゼ活性を、Ｃｅｒａｌｐｈａ  ＨＲキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）からのＣｅｒａｌｐｈａ試薬を用いて測定した。まず、Ｃｅｒａｌｐｈａ試薬ミックスを１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、続いて３０ｍｌの５０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ５．６を添加した。培養物の上清をＭｉｌｌｉＱ水で４０倍に希釈し、試料１０μｌを、５５μＬの希釈標準基質溶液に加えた。ＭＴＰプレートを振盪後、室温で４分間、インキュベートした。７０μｌの２００ｍＭホウ酸塩緩衝液ｐＨ１０．２（停止溶液）を加え、反応を停止させた。この溶液の４００ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を用いて測定し、４００ｎｍにおける吸光度を時間の関数としてプロットした。
【０２３２】
図３に示すように、振盪フラスコ中のＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６アミラーゼの産生（ＯＤ６００ｎｍでの細胞密度に対して補正）は、野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）対照細胞に比べて、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、ｒａｓＰを過剰発現）でアミラーゼの分泌が増大したことを示している。
【０２３３】
Ｅ．野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｔｅｐＡを発現／過剰発現する発現カセットで改変されたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞における変異ＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６アミラーゼの発現。
それぞれ変異「ＰａｐｒＥ−ＰｃｕＡｍｙ１−ｖ６−ｃａｔＲ」コンストラクトを含む、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型細胞、および「ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ」を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞をまた、振盪フラスコにおいて試験し、ＴｅｐＡシグナルペプチドペプチダーゼ過剰発現の効果を調べた。したがって、野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、および「ＰｓｐｏＶＧ−ｔｅｐＡ」を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、ルリア培地中、３７℃で終夜増殖させた。予備培養物１ｍｌを使用して振盪フラスコ内のＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）培地２５ｍｌに植菌した。Ｉｎｆｏｒｓシェーカーを使用して、３７℃、２５０ｒｐｍで実験を行った。細胞の増殖を６００ｎｍで測定し、増殖期間に時点をとった。アミラーゼアッセイを上記実施例５．Ｄに記載のように実施した。
【０２３４】
図４Ａに示すように、野生型バチルス（Ｂ．）細胞および改変バチルス（Ｂ．）細胞の細胞密度は、これらの細胞が似た増殖プロフィールを有していることを示している。図４Ｂに示すように、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、ｔｅｐＡを過剰発現）では、野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に比べ、アミラーゼの産生が僅かに減少した。
【０２３５】
Ｆ．野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｒａｓＰを発現／過剰発現する発現カセットで改変されたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるベータ−Ｄ−グルカナーゼ（ＢｇｌＣ）の発現。
それぞれ変異「ＰａｐｒＥ−ＢｇｌＣ−ｃａｔＲ」コンストラクトを含む、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型細胞、および「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、ルリア培地５ｍＬ中で終夜増殖させた。予備培養物１ｍｌを使用して振盪フラスコ内のＢＨＩ培地２５ｍｌに植菌し、分泌β−Ｄ−グルカナーゼの発現を試験するため、３７℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。１時間毎に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を用いて、２０倍に希釈した全培地の細胞密度を６００ｎｍで測定し、その吸光度（６００ｎｍにおける）を時間の関数としてプロットしたところ、野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、似た細胞密度を有することが示された。
【０２３６】
β−Ｄ−グルカナーゼ発現（すなわち、活性）を、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｎ５７５９０）を用いてモニターした。基質を１ｍｌのＤＭＳＯに溶解して、１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作った。このストック溶液３５μｌをアッセイ用緩衝液（１００ｍＭトリス、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）１０ｍｌで希釈して標準基質溶液を作った。各培養物４０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、各ウェルに標準基質溶液１８０μｌを加えた。マイクロタイタープレートを室温で２時間インキュベートし、このインキュベーション時間の終わりに、溶液の４０５ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を用いて測定した。４０５ｎｍにおける吸光度を時間の関数としてプロットした図５）。図５に示すように、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」発現コンストラクトを含む）は、野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に比べ、β−Ｄ−グルカナーゼの産生が増加したことを示している。
【０２３７】
Ｇ．野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、およびｒａｓＰを発現／過剰発現する発現カセットで改変されたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるＰｒｏｐｅｒａｓｅの発現。
それぞれ「ＰａｐｒＥ−Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ−ｃａｔＲ」コンストラクトを含む、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型細胞、および「ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ」を含む改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、ルリア培地５ｍＬ中で５時間増殖させた。１．５ＯＤの予備培養物を用いて振盪フラスコ中の２５ｍｌのＭＢＵに植菌し、細胞を３７℃、２５０ｒｐｍ、湿度７０％で増殖させた。増殖１８時間、２５時間、４１時間、４８時間および６５時間後に試料を採取した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を用いて、４０倍に希釈した全培地の細胞密度を６００ｎｍで測定し、その６００ｎｍにおける吸光度を時間の関数としてプロットした（図６Ａ）。図６Ａに示すように、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞は、野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に比べ、細胞密度が増加したことを示している。
【０２３８】
国際公開第２０１０／１４４２８３号パンフレットに記載されているように、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質（「ＡＡＰＦ」；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用してＰｒｏｐｅｒａｓｅ酵素の発現をモニターした。簡単に説明すると、アッセイ用緩衝液（１００ｍＭトリス、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）で培養液全体を４０倍に希釈し、希釈試料１０μｌをマイクロタイタープレートに配置した。ＡＡＰＦストックを希釈し、アッセイ用緩衝液（ＤＭＳＯで１００ｍｇ／ｍｌのＡＡＰＦストックを１００倍に希釈）と、この溶液１９０μｌとをマイクロタイタープレートに加え、この溶液の吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を使用して４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍにおける吸光度を時間の関数としてプロットし、図６Ｂに示す。図６Ｂに示すように、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるＰｒｏｐｅｒａｓｅプロテアーゼの産生は、野生型Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）対照細胞におけるＰｒｏｐｅｒａｓｅ産生の約５倍であった。
【０２３９】
実施例５
ｒａｓＰポリペプチドを過剰発現するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞におけるＡｍｙＡｃファミリーα−アミラーゼの発現
ＡｍｙＡｃファミリーに属する細菌α−アミラーゼ（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ？ＲＩＤ＝ＣＡＲＲＭＷＴＺ０１Ｎ＆ｍｏｄｅ＝ａｌｌを参照）を、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型宿主細胞（すなわち、非改変；親細胞）、および改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞（すなわち、改変娘細胞）で発現させた（ここで、改変細胞は、上記実施例で一般に記載したような、ｒａｓＰを過剰発現させるための発現カセット（ｓｐｏＩＩＩＡＨ：：ＰｓｐｏＶＧ−ｒａｓＰ）を含む）。より詳しくは、ａｐｒＥプロモーターを使用して、（ＡｍｙＡｃファミリー）α−アミラーゼ（例えば、ＰｒｏａｐｒＥ−α−アミラーゼ）の発現を駆動し、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔＲ）を含む発現カセットをクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢプレートで増幅させた。各菌株（すなわち、野生型宿主細胞、およびｒａｓＰを過剰発現する改変娘宿主細胞）からの４コロニーを使用して、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢの８本のチューブに植菌し、３７℃で４時間増殖させた。０．０７５ＯＤを使用して、２４ウェルディープマイクロタイタープレート内の２ｍｌの５ＳＭ１２培地に植菌し、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞を４８時間増殖させた。１８時間、２５時間、４１時間および４８時間に時点をとった。実験で使用した培地で培養物を４０倍に希釈して、ＯＤ６００を測定した。
【０２４０】
（５％ソイトン、１２％マルトデキストリン）培地は、一般に、以下のように調製される：１ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５３％クエン酸鉄アンモニム、０．２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、７５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１２％マルトデキストリンおよび５％Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏソイトン。培地のｐＨは、ＢＰＮ’プロテアーゼのためには（ＫＯＨにより）ｐＨ７．４に、アミラーゼのためには（ＫＯＨにより）ｐＨ７．７に調節した。振盪シェーカー条件は次のとおりとした：Ｔｈｏｍａｓｏｎ  ＡｉｒＯｔｏｐ強化シール（カタログ番号８９９４２３）を備えた２５０ｍＬ  Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｙｉｅｌｄ  Ｆｌａｓｋ（カタログ番号９３１１４４）で培養物（３２−３５ｍＬ）を増殖させた。増殖のために、振盪幅５０ｍｍのＩｎｆｏｒｓ  ＭｕｌｔｉＴｒｏｎシェーカーを使用して、２８０ｒｐｍ、３７℃、湿度７０％ｈｕｍｉｄｉｔｙ（蒸発を低減するため）で培養物を振盪させた。
【０２４１】
培地全体のＡｍｙＥアミラーゼ活性を、Ｃｅｒａｌｐｈａ  ＨＲキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）からのＣｅｒａｌｐｈａ試薬を用いて測定した。まず、Ｃｅｒａｌｐｈａ試薬ミックスを１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、続いて３０ｍｌの５０ｍＭマレイン酸緩衝液、ｐＨ５．６を添加した。培養物の上清をＭｉｌｌｉＱ水で４０倍に希釈し、試料１０μｌを、５５μＬの希釈標準基質溶液に加えた。ＭＴＰプレートを振盪後、室温で４分間、インキュベートした。７０μｌの２００ｍＭホウ酸塩緩衝液、ｐＨ１０．２（停止溶液）を加え、反応を停止させた。この溶液の４００ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を用いて測定し、４００ｎｍにおける吸光度を時間の関数としてプロットした（図７Ｂ）。図７Ｂに示すように、改変Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、ｒａｓＰコンストラクトを発現）は、非改変（親）Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に比べ、アミラーゼの生産性が約２．５倍に上昇した。
【０２４２】
参考文献
ＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ２００１／５１６４３．
ＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ２０１３／０８６２１９
Ｕ．Ｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，２６４，３６６
Ｂｏｌｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ＣｌｐＰ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（３５）：２４５８５−２４５９２，１９９９．
Ｂｒｉｇｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，５５：  １３５−１３８，１９９０）。
Ｂｒｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ＢＰＮ’  ｖａｒｉａｎｔｓ：  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｕｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｖｉａ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１０）：３１６２−３１６９，１９９６．
Ｃａｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｄｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂｙ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡｍｙＥ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６（６）：１８７７−１８８５，２０１０．
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｅｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．１４（９２）：０２８２−０２８９（２０１５））。
Ｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１６（６）：２６９−２７５，２００８．
Ｆａｂｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｏｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４６（１）：２５−３６，２００２．
Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”  ｉｎ  Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ｐａｇｅｓ  ５７−７２，１９８９．
Ｆｒｉｓｂｙ  ａｎｄ  Ｚｕｂｅｒ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ａｎ  ｅａｒｌｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２３）：  ７５５７−７５５６，１９９１）。
Ｇｏｏｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｔａｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１８４３（８）：１６９８−１７０６，２０１４．
Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：  ａｎ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｓｔｏｒｙ”  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１６（２）：７３−７９，２００７．
Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９９０．
Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＥｃｓＡＢ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＲａｓＰ”，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５４：  １９８９−１９９７，２００８）。
Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６  （Ｐｔ  １０：２５８３−２５９４，２０００．
Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ”，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４１（１１）：１５９９−１６０７，２０１４．
Ｋｏｎｔｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｒｖａｓ，“Ｔｈｅ  ＰｒｓＡ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｔｓ  ａ  ｌｉｍｉｔ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ”，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８（４）：７２７−７３７（１９９３））。
Ｏｌｅｍｐｓｋａ−Ｂｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｏｏｄ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ−−ａ  ｒｅｖｉｅｗ”’  Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５（２）：１４４−１５８，２００６．
Ｒａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （ＭＴＣＣ  １２１）  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４．
Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｏｓｔ−ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ−２１  ｐｒｏｔｅａｓｅ  （Ｓ２Ｐ）  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，ＰＮＡＳ，１０８（３３）：  １３７４０−１３７４５，２０１１）。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９，ａｎｄ  ３ｒｄ  ｅｄ．，２００１．
Ｔｊａｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｆｏｕｒ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（４１）：２５９８３−２５９９２，１９９７．
Ｔｊａｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：  Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ’ｓｅｃｒｅｔｓ’  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ”，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６８（２）：２０７−２３３，２００４．
Ｖａｎ  Ｄｉｊｌ  ａｎｄ  Ｈｅｃｋｅｒ，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏ  ｓｕｐｅｒ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ”，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１２（３）．２０１３
Ｖａｎ  Ｄｉｊｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｉ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３７：２０７３−８３，１９９１．
Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｏｙｂｅａｎ  Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．５５（１）：４０−５２（２００７））。
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ａｌｐｈａ−ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｇｅｎｅ，６９（１）：３９−４７，１９８８．
Ｗｅｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｓ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｏｒｇａｎｉｓｍ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．，１６９４：２９９−３１０，２００４．
【図１Ａ】
2019505196.tif 000002
【図１Ｂ】
2019505196.tif 000003
【図２Ａ】
2019505196.tif 000004
【図２Ｂ】
2019505196.tif 000005
【図３】
2019505196.tif 000006
【図４Ａ】
2019505196.tif 000007
【図４Ｂ】
2019505196.tif 000008
【図５】
2019505196.tif 000009
【図６Ａ】
2019505196.tif 000010
【図６Ｂ】
2019505196.tif 000011
【図７Ａ】
2019505196.tif 000012
【図７Ｂ】
2019505196.tif 000013
【配列表】
2019505196000001.app
【国際調査報告】
2019505196.tif 000014
2019505196.tif 000015
2019505196.tif 000016