(57)【要約】  本発明は、哺乳類、鳥類、爬虫類、又は植物における非ヒトＤＮＡのオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。組成物は、食品、飲食料品、化粧料、又は医薬の組成物であってもよい。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ担体複合体の状態で存在する。さらに、本発明の組成物を含むキット、及び、本発明の組成物を製造する方法も提供される。組成物が、個人用潤滑剤又はスパイス混合物において使用されることが想定される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類、鳥類、爬虫類、又は植物における非ヒトＤＮＡの少なくとも１００万のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、
オリゴヌクレオチドは、ヒトへの投与のために、配列番号１〜１８からなる群から選択される配列の１つ又は複数に対して、少なくとも８０％の相同性を持つ配列を有する、非免疫学的用途のための組成物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、生理学的に許容される適切な安定剤とオリゴヌクレオチドとを含むＤＮＡ担体複合体の状態で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、化粧料組成物又は局所皮膚用組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、食品組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、飲食料品組成物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、医薬組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号２からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号３からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号４からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号５からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号６からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号７からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号８からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号９からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１０からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１１からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１２からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１３からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１４からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１５からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１６からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１７からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１８からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物を製造するための方法であって、
（ｉ）配列番号１〜１８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを凍結乾燥された状態で提供する工程、
（ｉｉ）凍結乾燥された状態の前記オリゴヌクレオチドを再水和する工程、
を含む、方法。
【請求項２６】
化粧料又は食料品と前記組成物とを混合する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物の、個人用潤滑剤における使用。
【請求項２８】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物の、スパイス混合物における使用。
【請求項２９】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【請求項３０】
哺乳類、鳥類、爬虫類、又は植物における非ヒトポリペプチドの少なくとも１００万の分子を含む組成物であって、
ポリペプチドは、ヒトへの投与のために、配列番号１〜１８からなる群から選択された１つ又は複数の配列に対して少なくとも８０％の相同性を持つ配列によってエンコードされる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドを含む組成物に関し、特に、食品、化粧料、及び医薬の組成物に関する。使用したオリゴヌクレオチドは、野生の動物や植物に由来するものであるが、分子生物学的手段によって取得されたものである。従って、本発明は、これらの動物や植物を保護するために役立つことになる。本発明の一態様では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ担体複合体の形態で添加される。本発明の他の態様は、前述のオリゴヌクレオチドを含む、食品、化粧料、及び医薬の組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
６０００種の成分よりも多いとされ伝統的中国医薬で使用される様々な成分は、鉱物、動物、植物、又はハーブといった天然源から直接取得される。これらの抽出物は、疾病を治癒し、長寿を増進し、通常の健康及び生活状態を向上させることができる。長年にわたる医療の伝承によって、これらの成分の効果は十分に証明され、文書化されている。しかしながら、世界各地における伝統的中国医薬の工業化及び普及を受けて、天然資源の広範な使用は、抽出物が得られるいくつかの種を、絶滅の寸前に追いつめた。
【０００３】
近年、生物学者、化学者、及び他の研究者は、多数の動物種及び植物種のゲノムを解読し、注釈付け（アノテーション）することに、彼らの努力を向けている。これは、多くの新規遺伝子配列の発見につながり、それらのなかには、伝統的な中国医薬で使用される動物や植物において発見された多数の遺伝子もある。活性アッセイ及び細胞研究と組み合わせた相同性解析の支援によって、機能が、これらの新たに発見された幾つかの遺伝子によるものと見なすことが可能である。
【０００４】
これらの新規な知見及び発見は、その後、in vitroで単離又は製造することが可能な候補遺伝子と、観察された効果との間のつながりを明らかにするために、伝統的な中国医薬の知識と組み合わされる。この支援は、比較的大きい患者群に、有用な天然成分を提供することを支援するだけでなく、同時に、本発明は、絶滅危惧野生生物の保護に貢献することとなる。なぜなら、動物の殺害以外の手段によって、必要な成分を取得する可能性を提供するからである。
【０００５】
例えば、トラのさまざまな部分は、抗炎症といわれているその作用だけでなく、潰瘍、リウマチ疼痛、及び火傷に関連したその治癒特性によって、中国薬局方の調製のために一般的なものである。虎の再生器官、特に陰茎は、媚薬として処方されている。同様の効果をもたらすこととなる、可能性ある候補遺伝子、及び、ゲノム領域は、Panthera tigris altaica （虎）の、成長ホルモン１（ＧＨ１）、Ｙ染色体の性別決定領域（ＳＲＹ）、及び、テストステロン合成の最終段階に関与する遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ３）であり、これらは、それぞれ配列番号１、２、及び３に示される配列として同定されている。
【０００６】
サイの角は、発熱、痙攣、及び痛風の治療に使用され、いくつかの国では、角は、媚薬としても使用される。サイの角の主成分は、ケラチンであり、Buceros rhinoceros silvestris（サイ）のＩＩ型ケラチン構造（ＨＩＹ３）によってエンコードされる(Hieronymus TL, Witmer LM, Ridgely RC. (2006) Structure of white rhinoceros (Ceratotherium simum) horn investigated by X-ray computed tomography and histology with implications for growth and external form. J Morphol. 267(10):1 172-6.)。配列番号４を参照。
【０００７】
鮫（サメ）のヒレは、性的活性を高め、精力を促進し、コレステロール値を下げ、体を活性化させると考えられている。Callorhynchus milii（鮫）のＸＩＩＩ型コラーゲンα１構造タンパク質が、配列番号５に示されるように同定された。コラーゲンは、サメのヒレの主成分である（Motta PJ. (1977) Anatomy and Functional Morphology of Dermal Collagen Fibers in Sharks. Copeia. 3:454-464）。
【０００８】
竹抽出物は、てんかん、熱性疾患、及び嘔吐の治療に有用であることが判明している。さらに、竹は、その急速な成長、即ち、配列番号１８に示されているｓｍａｌｌ  ａｕｘｉｎ  ｕｐ  ＲＮＡ８と関連した形質において知られている（Peng Z, Zhang C et al. (2013) Transcriptome Sequencing and Analysis of the Fast Growing Shoots of Moso Bamboo （Phyllostachys edulis). PLoS ONE. 8(11):e78944. doi:10.1371/journal.pone.0078944.）。
【０００９】
中国文化のもう一つの側面は、１２種の動物の象徴（１２支）である。これら１２支のそれぞれは、特定の文字の特徴と関連している。それぞれの種のゲノムの注釈（アノテーション）は、これらの特徴と特定の遺伝子とを科学者が関連付けることを可能にする。
【００１０】
例えば、ラットは、その野心において知られている。この特徴は、ステロイドホルモンの生成に必須である３ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼに関連している。配列番号６を参照（Lachance Y, Luu-The V et al. (1990) Characterization of human 3 beta- hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 265(33) :20469-75.）。
【００１１】
ヒツジでは、共感に関連するオキシトシン受容体（ＯＸＴＲ）が、配列番号７として同定された（Tost H, Kolachana B et al. (2010) A common allele in the oxytocin receptor gene (OXTR) impacts prosocial temperament and human hypothalamic-limbic structure and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107(31):13936-41 .doi: 10.1073/pnas.1003296107.）。
【００１２】
類人猿では、知性に関連するフォルミン結合タンパク質Ｉ（ＦＮＢＰ１Ｌ）が、配列番号８に示された配列として同定された（Benyamin B, Pourcain B et al. (2014) Childhood intelligence is heritable, highly polygenic and associated with FNBP1L. Molecular psychiatry. 19(2):253-258. doi:10.1038/mp.2012.184.）。
【００１３】
ブタでは、寛容さにも関連するオキシトシンが、配列番号９の配列として示されている（Barraza JA, Zak PJ. (2009) Empathy toward strangers triggers oxytocin release and subsequent generosity. Ann N Y Acad Sci. 1 167:182-9. doi: 10.1 1 1 1/j.1749-6632.2009.04504.x）。
【００１４】
オンドリは、遺伝子ＷＤＲ７２に関連する実行機能について評価されている。配列番号１０を参照（LeBlanc M, Kulle B et al. (2012) Genome-wide study identifies PTPRO and WDR72 and FOXQ1 -SUM01 P1 interaction associated with neurocognitive function. J Psychiatr Res. 46(2):271-8. doi: 10.1016/j. jpsychires .2011.11.001.）。
【００１５】
竜（ドラゴン）は、知性において知られている。その最も近い近縁種であるVaranus comodovarensis（コモドオオトカゲ）において、脳の可塑性が、配列番号１１に見られるような遺伝子ＢＤＮＦに由来する可能性がある（Binder DK, Scharfman HE. (2004) Brain-derived Neurotrophic Factor. Growth factors (Chur, Switzerland). 22(3):123-131. doi:10.1080/08977190410001723308.）。
【００１６】
中国の十二支のウサギは、配列番号１２に示されるように、ニューレグリン１に基づく創造性を有する（Keri S. (2009) Genes for psychosis and creativity: a promoter polymorphism of the neuregulin 1 gene is related to creativity in people with high intellectual achievement. Psychol Sci. 20(9):1070-3. doi: 10.1111/j.1467-9280.2009.02398.x.）。
【００１７】
蛇は、急激に攻撃することが知られており、特徴は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）をエンコードする遺伝子に関連する。ＡＣｈＥは、神経機能及び発達を促進し、配列番号１３によって蛇においてエンコードされている（Sternfeld M, Ming G et al. (1998) Acetylcholinesterase enhances neurite growth and synapse development through alternative contributions of its hydrolytic capacity, core protein, and variable C termini. J Neurosci. 18(4):1240-9.）。
【００１８】
犬は、忠誠心のため大事にされており、特徴は、オキシトシンに関連する。（Scheele, D. et al. (2012) Oxytocin Modulates Social Distance between Males and Females. J. Neurosci. 32: 16074-16079.）。オキシトシン受容体に対応する配列は、配列番号１４に示されている。
【００１９】
忍耐と、１つの目的に集中する能力とを有する水牛の特徴は、ドーパミンベータ−ヒドロキシラーゼによって制御される２−フェニルエチルアミンの生成に関連する（Irsfeld M, Spadafore M, PruB BM. (2013) β-phenylethylamine, a small molecule with a large impact. WebmedCentral. 4(9):4409.）。配列番号１５を参照。
【００２０】
馬は、目新しいことを追求し、好奇心旺盛であることが知られている。これは、ドーパミン受容体Ｄ４に関係し（Munafo, M. R. et al. (2008) Association of the Dopamine D4 Receptor (DRD4) Gene and Approach- Related Personality Traits: Meta-Analysis and New Data. Biological Psychiatry 63:197-206）、配列番号１６で見ることができる。
【００２１】
特に視力に関して際だった性質について知られる他の動物は、鷲（ワシ）である。なお、眼内レンズの成分であり、配列番号１７に示される、クリスタリンベータが、関連する遺伝子である。
【００２２】
上記の配列の全てが解読され、注釈付け（アノテーション）されてきたが、人体への影響は、現状、解明されていない。実際、本発明に先立って、ヒト以外の起源からヒトへ特定の遺伝子配列を導入することは、検討されていない。従って、ヒトへの投与のために、単離された哺乳動物、爬虫類、鳥類、及び植物の状態、即ち、非ヒト遺伝子配列の状態で、動物及び植物の抽出物の活性成分を提供することが、本発明の目的である。in vitroで産生されたオリゴヌクレオチドの状態で、既知の伝統的な処方の活性成分を提供することによって、動物の殺傷が回避され、従って、動物の野生生活が保護される。
【００２３】
また、動物の全体又は一部を使用することは、リスクをもたらす。それは、ウイルス配列をもたらし得る、動物又は植物ゲノムの完全な取り込みを必要とするからである。さらに、抽出物は、病原体に汚染される可能性がある。そのようなウイルスや病原体が、癌の発症に関与していることが示されてきた（Burnett-Hartman AN, Newcomb PA et al. (2008) Infectious Agents and Colorectal Cancer: A Review of Helicobacter pylori, Streptococcus bovis, JC Virus, and Human Papillomavirus. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17: 2970-2979. doi: 10.1 158/1055-9965.EPI-08-0571）。従って、定義され、合成された、ウイルスフリーのオリゴヌクレオチドを提供することは、高い医療安全性の水準を確保し、有害な物質から個人を保護することができる。
【００２４】
以前、約１００ヌクレオチドのＤＮＡプローブを含有するＤＮＡ球体が説明された（米国特許第８８３５１７８Ｂ２号）。これらのプローブは、大気開放及びバイオハザードの検出のための試験試薬として、科学的準備において使用される。本発明とは対照的に、球体内のＤＮＡは、発現されず、単にＰＣＲによって検出される。
【００２５】
他のシステムが、核酸分子の送達及び発現のために作られてきた（米国特許第７０３００９７Ｂ１号）。このシステムは、生体適合性ポリマーと、核酸分子及び共分散物の混合物と、によって形成されたポリマー構造から成る。このシステムを用いて、ＤＮＡは、生物に送達され得るが、追加ポリマーの助けがあってこそであるため、従って、製造工程を複雑化させ、さらに、免疫応答を誘発し得る異質な構造を取り込み得る。
【００２６】
最近まで、「裸の」ＤＮＡ、即ち、促進剤の取り込みが全くないＤＮＡの送達は、ＤＮＡ発現の有効な水準に達しないと信じられてきた（Villemejane J, Mir LM. (2009) Physical methods of nucleic acid transfer. Brit J Pharma. 157: 207-219.）。しかしながら、現在、遺伝子全体が消化管によって取り込まれてもよいことが示されている（Spisak S, Solymosi N et al. (2013) Complete Genes May Pass from Food to Human Blood. PLoS ONE 8(7): e69805. doi: 10.1371/journal.pone.0069805）。さらに、ヒトの腸に生息する細菌群集がＤＮＡを取り込み、機能性産物としてそれら遺伝子を発現することが示された（Hehemann, JH et al. (2010) Transfer of carbohydrate-active enzymes from marine bacteria to Japanese gut microbiota. Nature 464: 908-91 . doi: 10.1038/nature08937）。
【発明の概要】
【００２７】
従って、任意の余分な担体ポリマーの使用を同時に控えつつ、ヒト個体における送達だけでなく、これらの遺伝子の発現を可能にする組成物において動物源からそれぞれの遺伝子を提供することを本発明の課題とする。
【００２８】
哺乳類、鳥類、爬虫類、又は植物の、非ヒトＤＮＡの少なくとも１００万のオリゴヌクレオチドを含む組成物によって、本課題が解決され、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１８からなる群から選択された配列の１つ又は複数に対して少なくとも８０％の相同性を持つ配列を有する。
【００２９】
明細書全体にわたって、用語「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド、又はそれらの混合物を含むと認識されるべきである。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡで構成されてもよい。各オリゴヌクレオチドは、１０〜２５００ｂｐの長さを有してもよく、また、同じオリゴヌクレオチドの反復のコンカテマー（鎖状体）であってもよい。
【００３０】
本明細書において、用語「相同性」及び「相同」は、配列同一性として理解されるべきことを意味する。アミノ酸配列の間又はヌクレオチド配列の間の相同性は、アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Altschul, SF, Gish W et al. Basic local alignment search tool. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.）、また、そのさらなる改定バージョンＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸを用いて調べることができる。初期設定のパラメータは、３つの全てのプログラムのために使用されるべきである。
【００３１】
特に断りのない限り、以下の本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、単語「含む（comprise）」、並びに、「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」といった変形は、述べられた整数もしくは段階又は整数の群を包含することを意味し、任意の他の整数もしくは段階又は整数もしくは段階の群を排除することではない理解されることとなる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明示的に示さない限り、複数の対象を含む。
【００３２】
驚くべきことに、１００万（個）のオリゴヌクレオチドの使用は、関連する遺伝子の発現を促進するという点で、関連する抽出物を摂取することよりも、効率的であることが判明した。これは、伝統的に調製した抽出物中に存在するそれぞれの遺伝子配列がわずかな量であることと比較して、それぞれの遺伝子のコピー数が多いことによるものである可能性が最も高い。
【００３３】
本発明の範囲内において、組成物は１００万、１５０万、２００万、２５０万、３００万、３５０万、４００万、４５０万、５００万、６００万、７００万、８００万、９００万、又は１０００万のオリゴヌクレオチドを含み得ることが想定される。好ましくは、本発明の組成物は、１００万、２００万、又は３００万のオリゴヌクレオチドを含み、最も好ましくは、本発明の組成物は、１００万のオリゴヌクレオチドを含む。
【００３４】
異なる種類のオリゴヌクレオチドが組成物中に存在するように、オリゴヌクレオチドは、配列番号（ＳＥＱＩＤ ＮＯ）１〜１８からなる群から選択される配列の１つ又は複数の配列に相同性を有してもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの１つ以上の配列は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの異なる配列であってもよい。オリゴヌクレオチドの２種以上が組成物中に存在する実施形態では、組成物は、異なるオリゴヌクレオチドの各々の１００万のコピーを含む。２つ以上の異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを含む実施形態では、異なる配列が、同様の効果を示す可能性が高い遺伝子からのものであることが想定される。例えば、一実施形態において、配列番号１、２、及び３を有するオリゴヌクレオチド、又は、配列番号１、２、３、及び４を有するオリゴヌクレオチドが組み合わされる。同様の効果を有する遺伝子が組み合わされる実施形態では、それぞれにおける全体的な効果は、オリゴヌクレオチドの各タイプが別々に利用される場合よりも、ずっと大きくなる。
【００３５】
本発明の組成物において使用されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１８に対して８０％以上の相同性を有することができる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１８に対して９０％以上の相同性を有する。最も好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１８に対して、９５％以上の相同性を有する。オリゴヌクレオチドは、「サイレント」な突然変異を含む可能性があることがさらに想定される。本明細書によって「サイレント変異」は、遺伝コードの曖昧さによって、発現時にアミノ酸配列の変化をもたらさない、ヌクレオチド配列の変化として定義される。異なる種間のコドン使用における相違によって、即ち、同じアミノ酸をすべてエンコードする同義塩基トリプレットの出現頻度における相違によって、サイレント突然変異が導かれ得る。
【００３６】
特に断りのない限り、本発明を実施するために、化学、生化学、細胞生物学、及び組換えＤＮＡ技術の一般的な方法が採用され、これら方法は、例えばその分野の文献で説明されている（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, Green and Sambrook eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2012を参照）。
【００３７】
その分野で一般的に適用されるあらゆる方法、例えば、鋳型としてゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応、細菌もしくは細胞における、又はin silico 合成における複製によって、本発明のオリゴヌクレオチドを得てもよい。オリゴヌクレオチドが組換えシステムにおいて発現される場合、当業者は、適切なプロモーター及びプラスミドベクターだけでなく、本発明の組成物中に使用されるオリゴヌクレオチドを発現できる細胞株又は細菌株を含む適当なシステムも設計することが可能である。例えば、この範囲に使用されるプラスミド構築物は、それぞれの細胞株又は細菌株において高い活性を有する適当なプロモーター、並びに、さらに転写及び翻訳の制御因子、適切な制限部位を有する適切なリンカーを含んでもよい。当業者は、プラスミド収率に対する培養条件の影響も認識している。
【００３８】
必要に応じて、生成されたオリゴヌクレオチドを、市販の精製キット（例えば、製品名「Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＰＣＲＰｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム」、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）の支援を借りて、沈殿によって精製するか、又は、アガロースゲル電気泳動によって精製することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドの収率及び純度を最大化するようにこれらの各方法をどのようにして最適化できるかを周知している。
【００３９】
組成物中のオリゴヌクレオチドの長期的な完全性及び安定性を確保するために、オリゴヌクレオチドの分解を阻害するさらなる薬剤を組成物に添加できる。これらは、特定のタンパク質、ヌクレオチド、アントラサイクリン、及びアミノグリコシド抗生物質の形態でのデオキシリボヌクレアーゼ阻害剤、合成有機化合物及び合成無機化合物、又は、市販のデオキシリボヌクレアーゼ除去剤（製品名「Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＤＮａｓｅ 除去剤」、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を含む。
【００４０】
オリゴヌクレオチドは、その安定性を高めるために自身で修飾することができる。可能な修飾としては、ホスホロチオレート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、ホスホロアセテート、又は、２’，５’−ホスホジエステルが挙げられる。アミド結合オリゴヌクレオチド、モルホリノ核酸、及びペプチド核酸も、本発明の範囲内に入ることが意図される。
【００４１】
さらに、本発明の組成物は、細胞取り込み剤も含んでもよい。細胞取り込み剤は、細胞へのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進する、分子、リガンド、又は構成部分である。細胞取り込み剤は、オリゴヌクレオチドとは独立していてもよく、又は、１つ以上のオリゴヌクレオチドと融合されてもよい。細胞取り込み剤の一の群は、脂質及びカチオン性脂質を含む。細胞取り込み剤の他の群は、細胞上の表面分子を認識できるリガンドに結合する受容体である。一般的に、表面において発現されるマーカーを標的とするすべての分子が、細胞取り込み剤として意図されている。具体的には、増殖因子、サイトカイン、及び抗体を使用してもよい。適切なリガンドのフラグメントも、本発明の組成物、及び、本発明の方法において用いることができる。
【００４２】
細胞取り込み剤は、オリゴヌクレオチドに、共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。共有結合は、ＵＶ架橋又は化学的架橋に基づくことができる一方で、非共有結合は、静電相互作用又は疎水性相互作用の利用によって達成することができる。これらの方法の全ては、以前に記載されており、当業者に周知されている。
【００４３】
本発明の組成物は、単独で、又は、医薬品又は化粧料用途のための、例えば溶媒、香料又は着色剤、日焼け止め剤、又は他の成分といった生理学的に許容される担体と組み合わせて投与され得る。さらに、水、生理食塩水、又は他の運搬媒体といった媒体を組成物に添加できる。本発明の組成物は、製品名「ＲｅｄＢｕｌｌ（登録商標）」、「ＭｏｎｓｔｅｒＥｎｅｒｇｙ（登録商標）」、「Ｒｏｃｋｓｔａｒ（登録商標）」、「ＮＯＳ（登録商標）」、又は「ＡｍｐＥｎｅｒｇｙ（登録商標）」といった商業的に入手可能な「エネルギー」飲料と混合されることも想定される。
【００４４】
本発明の別の態様では、組成物は、オリゴヌクレオチドと生理学的に許容される安定剤とを含有するＤＮＡ担体複合体の状態で、オリゴヌクレオチドを含む。これによって、適用又は投与後に、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ活性から保護されることとなり、従って、個体の細胞内で発現させることができる損傷のないオリゴヌクレオチドの数の増加をもたらす。オリゴヌクレオチドが、比較的高い割合で、長時間そのまま残ることから、ＤＮＡ担体複合体の使用は、オリゴヌクレオチドの全体的なコピー数を削減することを可能にする。
【００４５】
当業者は、そのようなＤＮＡ担体複合体をどのようにして形成できるか、また、どのようにして適切な安定化材料を選択するかを周知している。物理的に許容される安定剤としては、アルギン酸ナトリウム若しくはアルギン酸カリウム、ヒアルロン酸、ポリ（エチレン−酢酸ビニル  共重合）、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−グリコール酸  共重合）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、タンパク質性ポリマー、ポリエステル、シリコーン、又は、それらの組み合わせが挙げられる。
【００４６】
適用方式に依存して、ＤＮＡ担体複合体を、５〜５００ｎｍの範囲で適切な大きさにすることができる。
【００４７】
ＤＮＡ担体複合体は、共有結合的に結合又は非共有結合的にＤＮＡ担体複合体へ付着することができる細胞取り込み剤も含んでもよい。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は、化粧料組成物又は局所皮膚用組成物に関する。本発明の化粧料組成物は、オリゴヌクレオチドの局所適用が可能であり、その局所的な発現をもたらす。これによって、身体の特定領域で効果の向上がもたらされる一方、副作用は、身体の他の部分で観察されない。
【００４９】
本発明の化粧料組成物は、例えば、メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸などのｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル；シス−１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン・クロリド；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＥＤＴＡ塩；イミダゾリジニル尿素；Ｎ−ラウリル−３−イミノジプロピオネートナトリウム等、又は、それらの任意の組み合わせなどの防腐剤を含んでもよい。さらに、本発明の化粧料組成物に顔料及び香料を添加できる。顔料の添加剤は、例えば、カロチノイド誘導体及び酸化鉄といった、天然色素及び人工色素の両方を含む一方で、香料は、任意の非刺激性の天然油及び人工油及び香水を含むことができる。一般的に、組成物中に使用される個々の成分は、化粧料の使用に適した品質や純度であるべきであり、化粧料組成物は、非刺痛性及び非刺激性となる。
【００５０】
さらに別の実施形態において、本発明は、食品組成物及び飲食料品組成物に関する。本発明の食品組成物及び飲食料品組成物は、それぞれのオリゴヌクレオチドの多量の適当な取り込みを可能にし、所望の効果が身体の特定部分に限定されない場合に、特に有用である。これらは、砂糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、イソマルト、マルチトール、及び、水素化デンプン加水分解物（ＨＳＨ）といった天然甘味料及び人工甘味料；塩；調味料；酸味料；電解質；及び乳化剤などをさらに含んでもよい。これらは、全粒穀物、ナッツ、タンパク質源、種子、ドライフルーツ、又は他の栄養素も含んでもよい。
【００５１】
さらに、本発明の飲食料品組成物は、カフェイン、ガラナ、又はタウリンなどの刺激剤、例えば、緑茶、人参、及びイチョウからのハーブ抽出物などの追加成分、並びに、ビタミンＢなどのビタミンや砂糖を含むことが想定される。本発明の飲食料品組成物の刺激剤との組み合わせは、オリゴヌクレオチドの効果をさらに増強する。特に、この効果が男性精力と関連する場合である。
【００５２】
本発明の飲食料品組成物は、オリゴヌクレオチドと予め混合されてもよく、又は、オリゴヌクレオチドは、別個のものとして飲食料品組成物中に含まれていてもよく、又は、飲食料品組成物の用事混合を可能にする状態で顧客に提供されてもよい。オリゴヌクレオチドが別個のものとして存在する場合、それらは、飲食料品組成物内において、カプセル、ゲルボール（例えば、タピオカを含む）、又は錠剤のなかに含有されてもよい。顧客自身による用事混合を可能にする状態でオリゴヌクレオチドが提供される場合、例えば、缶又はボトルなどの従来の飲料容器と共に提供される販売機、小袋、ティーバッグ、又は、注射器のなかに入ったオリゴヌクレオチドを提供してもよい。また、注射器又は販売機が、飲食料品容器に直接つながっていることが想定される。
【００５３】
一実施形態において、本発明は、医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの適切な薬学的賦形剤をさらに含んでもよい。
【００５４】
さらなる実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドの配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８である、組成物に関する。
【００５５】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、特に男性個体において、精力の増強につながり、性欲を刺激し、性的能力を向上させる。
【００５６】
本発明の別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、特に男性個体において、精力の増強につながり、性欲を刺激し、性的能力を向上させる。
【００５７】
本発明のさらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号３の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、特に男性個体において、精力の増強につながり、性欲を刺激し、性的能力を向上させる。
【００５８】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号４の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、熱性疾患や熱性けいれんを助け、また、性的活性を刺激する。
【００５９】
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号５の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、性的欲求を向上させ、活力レベルを向上させ、身体を活性化させることに役立つ。
【００６０】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号６の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、ステロイドホルモンの発現の増加につながり、個体において野心を増加させることになる。
【００６１】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号７の配列を有する。この組成物の適用又は投与によって、社会的行動に影響を与えるオキシトシン受容体が高いレベルとなる。
【００６２】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号８の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、フォルミン結合タンパク質１様タンパク質のより高い発現レベルをもたらし、従って、脳の発達及び活性を調節する。
【００６３】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号９の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、社会的つながり及び相互作用に影響を与えるオキシトシンの生成増加をもたらす。
【００６４】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、神経認知機能を促進するＷＤＲ７２のより高い発現レベルをもたらす。
【００６５】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１１の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、脳由来神経栄養性因子の発現増加をもたらし、従って、脳の可塑性を向上させる。
【００６６】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１２の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、ニューレグリン１のレベル増加をもたらし、創造性を促進する。
【００６７】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１３の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、神経機能及び発達に正の影響を与えるＡＣｈＥの過剰発現につながる。
【００６８】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１４の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、個人における共感を高めるＯＸＴＲの発現につながる。
【００６９】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１５の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、ドーパミンベータヒドロキシラーゼの発現を増加させ、従って、集中力を向上させることができる。
【００７０】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１６の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、ドーパミン受容体Ｄ４の発現増強をもたらし、個人を、よりリスクを取る傾向にさせる。
【００７１】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１７の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、クリスタリンベータのより高いレベルをもたらし、従って視力を改善させる。
【００７２】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１８の配列を有する。この組成物の適用又は投与は、成長を促進する。
【００７３】
さらに、一実施形態において、本発明の組成物を個人用潤滑剤（性行為用潤滑剤  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ）において使用することが想定される。これらの潤滑剤は、水系、油系、又はシリコーン系であってもよい。１ｍＬが少なくとも１００万のオリゴヌクレオチドを含むように、本発明の組成物の十分な量を加える。本発明の組成物が使用される個人用潤滑剤は、緩衝塩、混濁剤、固化防止剤、香料、無機塩基、水溶性セルロース誘導ポリマー、多価アルコール、及び顔料といった、個人用潤滑剤に混合できる任意の成分を含有してもよい。
【００７４】
本発明の組成物を含む個人用潤滑剤は、従来通り製造してもよく、製造現場での特定の要求に適合させてもよい。従来通りの製造は、適切な純度の水に、必要なすべての成分を溶解させて混合すること、並びに、所望の強度に応じて、例えば個人用潤滑剤の１ｍＬあたり１００万から１０００万のオリゴヌクレオチド分子といった様々な濃度で、再水和したオリゴヌクレオチドを添加することから成る。混合工程の後に、再水和したオリゴヌクレオチド溶液を、潤滑剤溶液に滴下することによって、本発明のオリゴヌクレオチド組成物を添加してもよい。
【００７５】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の組成物を製造する方法に関する。
【００７６】
オリゴヌクレオチドの脱プリンを低減するために、配列番号１−１８の凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを、ｐＨ８に調整したリン酸一カリウム（Ｅ３４０）又は酒石酸カリウム（Ｅ３３６）などの適切な水性緩衝液で再水和することができる。得られた溶液を添加して、本発明の組成物を得ることができる。
【００７７】
ほとんどの用途に適した一般的な製造手段として、再水和したオリゴヌクレオチドを、単に溶液として添加して、所望の分子量に依存する所定の最終濃度とすることができる。分子量は、以下のようにして測定される。オリゴヌクレオチドを分光手段（例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、米国）によって、２６０ｎｍの波長で定量化する。結果、即ち、ナノグラム／μＬで表される量は、以下の式によって変換される。それぞれ、二本鎖オリゴヌクレオチドについて、オリゴヌクレオチド濃度（ｎｇ／μＬ）／［０．６６×ＤＮＡ  サイズ（ｂｐ）］、及び、一本鎖オリゴヌクレオチドについて、オリゴヌクレオチド濃度（ｎｇ／μＬ）／［０．３３×ＤＮＡ  サイズ（ｂｐ）］。
【００７８】
凍結乾燥オリゴヌクレオチドを、乾燥香味料又は液体香味料と、及び／又は、着色剤と混合してもよく、また、容器内に収容してもよい。
【００７９】
本発明は、最終消費者によって本発明の組成物を個々に製造するためのキットにも関する。このキットは、様々な設定で凍結乾燥オリゴヌクレオチドを有する複数の容器と、適切な緩衝系と、測定機器と、最終製品での様々な濃度に調整するための取扱説明書と、食品、飲料、医薬組成物、化粧料組成物、又は局所皮膚用組成物との混合のための処方とを含む。
【００８０】
別の組成物では、本発明の組成物をスパイス混合物において使用できる。
【００８１】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、手順、及び試薬に限定されないと理解されるべきである。これらを変更してもよいからである。また、本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることとなる本発明の範囲を限定することを意図しないと理解されるべきである。特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解され意味と同じ意味を有する。
【００８２】
本発明は、以下の図面によってさらに説明されているが、しかしながら、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、in vitro消化の様々な段階での本発明のオリゴヌクレオチドの消化における、様々な安定化剤の効果を示す。ブランク：緩衝液のみのコントロール。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図している。これらは、決して特許請求の範囲を限定するものではない。
【００８５】
実施例１
ＤＮＡシーケンシングによるＤＮＡ配列の獲得
ＤＮＡは、製品名「Ｑｕｉｃｋ−ＤＮＡＴＭ  ユニバーサルキット」（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ社、フライブルク、ドイツ）などの市販のキットを使用して、対象の動物又は植物の体液又は組織から抽出される。製造業者の取扱説明書に従って、ＮｅｘｔｒａＸＴ ＤＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、米国）を使用して、シーケンシングのためのショットガンライブラリを生成させる。ゲノムアナライザーｌｌｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、米国）を用いて、対応する動物や植物の全ゲノムを配列決定する。１１２ｂｐペアエンドシングルインデックスの実行において、ライブラリを配列決定する。適切に装備したＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘのコンピューティングクラスタにおいて、スペードアセンブラ（Bankevich A et al. (2012) SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing, J Comp Biol. 5: 455-77, doi:10.1089/cmb.2012.0021）又はＭＩＲＡ（Chevreux B, Wetter T et al. Genome Sequence Assembly Using Trace Signals and Additional Sequence Information, in German Conference on Bioinformatics, 1999, 45-56.）を用いて、ペアエンドの読み取り結果をアセンブル（再構成）する。既知の機能を有するヒト遺伝子との相同体を同定するために、ヒトタンパク質配列を使用して、ｔｂｌａｓｔｎを用いて、連続配列（コンティグ）を検索する（E. Michael Gertz et al. Composition-Based Statistics and Translated Nucleotide Searches: Improving the TBLASTN Module of BLAST. BMC Biol. 2006, December 7; no.1 : 41, doi:10.1186/1741-7007-4-41.）。
【００８６】
実施例２
特定のオリゴヌクレオチド分子の製造
対象の配列（ＳＯＩ）、即ち、配列番号１〜１８を含むオリゴヌクレオチドをいくつかの方法によって製造できる。
１．サーマルサイクラーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、以前に記載された方法（Saiki RK et al. Enzymatic Amplification of Beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia. Science 1985, December 20. 230, no. 4732: 1350-54, doi:10.1 126/science.2999980.）に従って実施される。対象（ＳＯＩ）の各配列の増幅のために、２０から２５の間の塩基長さを有し且つ常にグアニン又はシトシン塩基で終わるオリゴヌクレオチドプライマーを化学的に合成し、そして、ＳＯＩを含有する化学的に合成されたＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、米国）を含む、ゲノムＤＮＡのテンプレート（鋳型）、又は、プラスミドの１μｇに、各プライマー１００ｐｍｏｌを添加する。製造業者（ＯｐｔｉＴａｇ、ＲｏｂｏＫｌｏｎ社、ドイツ）の取扱説明書に従って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、サーマルサイクラー（ＤＮＡ  ＥｎｇｉｎｅＴｅｔｒａｄ２、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）において、３５回の増幅サイクルを実施する。ＳＯＩのキロベースあたり、変性を９８℃で３０秒間実施し、プライマーアニーリングを５５℃で２５秒間実施し、プライマー伸長を７２℃で１分間実施する。ＤＮＡサイズ標準（１ｋｂｐ  ＤＮＡ−Ｌａｄｄｅｒ、Ｃａｒｌ−Ｒｏｔｈ社  ドイツ）を有する１．０％アガロースゲル（ＣＡＳ−Ｎｒ．９０１２−３６−６）において、得られた生成物の分析試料（約２μＬ）を分析する。アガロースゲル（Ｒｏｔｉ−ＧｅｌＳｔａｉｎ、Ｃａｒｌ−Ｒｏｔｈ社、ドイツ）の染色後、ＳＯＩの予想されるサイズのオリゴヌクレオチドの存在が、トランスイルミネーター（ベンチトップＵＶトランスイルミネーター、ＵＶＰ、米国）において確認される。ＳＯＩ以外の非特異的バンドが検出された場合、アニーリング温度を変化させてＰＣＲグレードのＤＭＳＯ（ＣＡＳ−Ｎｒ．６７−６８−５）などの増強剤を添加することによって、又は、バッファー組成物や利用されたテンプレートＤＮＡの濃度を変化させることによって、ＰＣＲを繰り返して最適化する。ＳＯＩを増幅のみさせる高度に特異的なプロトコルを確立するに際して、使用されるオリゴヌクレオチド及びデオキシヌクレオチドの量を増加させること、及び、９６ウェル又は３８４ウェルのＰＣＲプレート（ｔｗｉｎ．ｔｅｃＰＣＲプレート、エッペンドルフ社、ドイツ）における処理を並列化することによって、スケールアップを達成させる。
【００８７】
１．１  産物の精製
得られたＰＣＲ産物を、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液成分、及びデオキシヌクレオチドから分離しなればならない。これは、供給者の取扱説明書に従って、市販の精製キット（例えばＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲＣｌｅａｎ−ｕｐ、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社、ドイツ）を使用すること、又は、沈殿処理のいずれかによって達成される。沈殿のために、ＰＣＲ反応物をプールし、酢酸ナトリウム（ＣＡＳ−Ｎｒ．１２７−０９−３）（０．３Ｍ、ｐＨ５．２、最終濃度）をオリゴヌクレオチド混合物に加え、１体積部のオリゴヌクレオチドに対して氷冷無水エタノール（ＣＡＳ−Ｎｒ．６４−１７−５）を２容量部加え、続いて、−８０℃で少なくとも２時間インキュベートする。この沈殿の後、１７０００×ｇで３０分間遠心分離する。上清を除去した後、オリゴヌクレオチドペレットを７０％エタノールで洗浄し、１７０００×ｇで１５分間遠心分離し、空気で３０分間乾燥し、２．０ＭのＮａＣｌ（７６４７−１４−５）及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＣＩ（ＣＡＳ−Ｎｒ．１１８５−５３−１）で再懸濁する。ＨＣｌ（ＣＡＳ−Ｎｒ．７６４７−０１−０）でｐＨを７．５に調整する。
【００８８】
１．２  保存
得られた生成物をスクロース（ＣＡＳ−Ｎｒ．５７−５０−１）と混合し、２０ｍｇ／μＬの最終濃度にして、加水分解クラス１型褐色ＦＩＯＬＡＸガラスバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ社、ドイツ）に充填し、ブチルゴム凍結乾燥栓（Ｗｈｅａｔｏｎ社、米国）で閉じる。次のようにして凍結乾燥を行う。バイアルを−２１℃に凍結し、乾燥を−２１℃の棚温度及び０．３５ミリバールのチャンバ圧力で開始し、乾燥工程中に−１０℃まで温度を上昇させる。二次乾燥を−２１℃の棚温度及び０．２ミリバールのチャンバ圧力で行う。得られた生成物をテンパープルーフキャップ（ＷｅｓｔＦｌｉｐ−Ｏｆｆｓｅａｌｓ、ＷｅｓｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社、ドイツ）を用いて封止する。有意に分解することなく、暗所で、２５℃／６０％の相対湿度（６ヶ月）、２〜８℃（２４ヶ月）、そして−２０℃（６６ヶ月）、凍結乾燥されたＤＮＡを保存することができる（van der Heijden I, Beijnen JH et al. (2013) Long Term Stability of Lyophilized Plasmid DNA pDERMATT. Int J Pharm. 10; 453, no. 2: 648-50, doi:10.1016/j.ijpharm.2013.06.010.）。
【００８９】
２．微生物細胞における複製
特定のオリゴヌクレオチド配列を、複製可能プラスミドと一体化させることによって、大量に生産することができる。増殖及び分裂しつつ、ＳＯＩを担持するプラスミドを複製及び伝播する細菌、例えばEscherichia coli 及び Bacillus subtilisといった細菌の細胞を形質転換するために、そのプラスミドを使用できる。
経済的に実現可能なオリゴヌクレオチドの収率を得るために、細胞あたりの高コピー数、高細胞密度、及び、効率的な終了段階の処理方法を達成しなければならない。
ＳＯＩは、標準的なクローニング技術（前述のように例えばＳＬＩＣ（Kumpfmuller J, Kabisch J et al. (2013) An Optimized Technique for Rapid Genome Modifications of Bacillus Subtilis. J Microbiol Met. 3: 350-52, doi:10.1016/j.mimet.2013.10.003））を用いて、細胞において高コピー数をもたらすこととなる複製起点（ＯＲＩ）を有する複製可能プラスミドと組み合わせることができる。そのような起点の例は、ＣｏｌＥ１及びｐＵＣＯＲＩｓ（Prather KJ et al. (2013) Industrial Scale Production of Plasmid DNA for Vaccine and Gene Therapy: Plasmid Design, Production, and Purification. Enz Micro Tech. 7: 865-83, doi:10.1016/S0141 -0229(03)00205-9.）、又は、温度シフトの後に複製規制の制御を失ういわゆる“暴走複製”を有する起点（Uhlin BE and Nordstrom KA. (1978) Runaway-Replication Mutant of Plasmid R1 drd-19: Temperature-Dependent Loss of Copy Number Control. Mol General Gen MGG. 165, no. 2: 167-79, doi:10.1007/BF00269904; Remaut E, Tsa H. (1983) Improved Plasmid Vectors with a Thermoinducible Expression and Temperature-Regulated Runaway Replication. Gene, no. 1 : 103-13.）であり、グラム陰性菌のEscherichia coliにおいて細胞あたり１０００のコピー数をもたらすことができる。グラム陽性菌のBacillus subtilisにおいてＲｅｐＥＯＲＩ（Swinfield TJ et al. (1990) Physical Characterisation of the Replication Region of the Streptococcus Faecalis Plasmid pAM Beta 1 . Gene. 87, no. 1 : 79-90.）を適用できる。ＳＯＩを担持する得られたプラスミドを適切な宿主に形質転換しなければならない。
細菌細胞へのプラスミドＤＮＡの転写を意味する形質転換は、刊行物で示された手順に従って、B. subtilis（枯草菌）のエレクトロポレーション（電気穿孔）（Kabisch J et al. (2012) Characterization and Optimization of Bacillus Subtilis ATCC 6051 as an Expression Host. J Biotechnol. doi:10.1016/j.jbiotec.2012.06.034.）、及び、E. coli（大腸菌）のエレクトロポレーション（Dower WJ, Miller JF et al. (1988) High Efficiency Transformation of E.coli by High Voltage Electroporation. Nuc Acids Res. 16, no. 13: 6127-45, doi:10.1093/nar/16.13.6127.）によって、達成できる。
プラスミドを保有する細胞は、Ｅｎｐｒｅｓｓｏ（ＢｉｏＳｉｌｔａ社、ケンブリッジシャー州、イギリス）などのＣ−源放出媒体を用いたインキュベーターシェーカーにおいて、又は、バイオリアクターを用いた流加処理において培養される。いくつかの最適化処理は、最も一般的に適用される大腸菌株について記載されている（Quaak SGL et al. (2008) GMP Production of pDERMATT for Vaccination against Melanoma in a Phase I Clinical Trial. Euro J Pharma Biopharma. 70, no. 2: 429-38, doi:10.1016/j.ejpb.2008.05.002.）。要約すると、プラスミドを担持する細胞における選択圧を維持するための適切な抗生物質を含む溶原性培養液（ＬＢ）プレートは、配列番号１〜１８のプラスミドｐＵＣを保有するE. coli ＤＨ５α株の凍結グリセロールストックから、多量に植菌される。これらのプレートを３０℃で一晩インキュベートし、予め温めた２．５ｍＬのＥｎＰｒｅｓｓｏＢ培地を用いて、得られた細菌叢を２回プレートから洗い流す。得られた懸濁液を１０Ｌの撹拌タンクバイオリアクター（Ｌａｂｆｏｒ５、ＩｎｆｏｒｓＡＧ社、スイス）に移し、ｐＨ６．７の設定で、酵素制御グルコース制限の流加培養（ＥｎＰｒｅｓｓｏＢ、ＢｉｏｓｉｌｔａＯｙ社、フィンランド）において、細胞を培養する。先の実験によって決定された正確な時点である、遷移段階に入る前に、１００００×ｇの遠心分離によって細胞を回収し、実施例２．１に記載するように、ＳＯＩを保有するプラスミドを単離する。
【００９０】
２．１  生成物の精製
生成物を投与するために、タンパク質、エンドトキシン（内毒素）、リポ多糖、ＲＮＡ、及び染色体ＤＮＡなどの主要不純物を、拡大可能であり且つ安定した処理によって除去する必要がある。
開示されたほとんどのプラスミド精製手順は、３つの工程からなる。細胞溶解、一次精製、及び、沈殿又は濾過による濃縮、続いて、１又は２以上の仕上げ（ポリッシング）クロマトグラフィーカラムを利用する二次精製工程。
単離のために、ＳＯＩを有するプラスミドを保有する細胞は、アルカリ溶解（Bimboim HC and Doly J. (1979) A Rapid Alkaline Extraction Procedure for Screening Recombinant Plasmid DNA. Nuc Acids Res. 7, no. 6: 1513-23, doi:10.1093/nar/7.6.1513.）を用いて溶解され、上述した沈殿がそれに続く。迅速であり且つ拡大化可能な方法で不純物を除去するために、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）が適用される。無傷のプラスミドＤＮＡは保持されないが、ＲＮＡ及び損傷ＤＮＡに見られるように、遊離プリン塩基が金属電荷樹脂（例えばＣｕ（ＩＩ）を有するイミノ二酢酸）と結合することが示された。プラスミド骨格からＳＯＩを遊離させるために、単離されたプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）、例えば、複製可能プラスミド骨格を有するＳＯＩを結合させるために使用されたＲＥを使用して切断される。ＳＯＩは、その後、スーパーロース６（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて、複製可能プラスミド骨格及びＲＥから分離される。
【００９１】
２．２  保存
得られたオリゴヌクレオチドを上記のようにして保存する。
【００９２】
実施例３
生成物の用途
生成物の用途のさまざまな手段が考えられる。
１．飲料との混合 
これは、飲料製造者において凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを再水和することと、オリゴヌクレオチドを飲料に混合して１提供あたりオリゴヌクレオチド分子の濃度を少なくとも１００万とすることとを含む。
【００９３】
２．逆球体化
１．５％  ｗ／ｖのカルシウム−乳酸水和物（ＣＡＳ番号：４１３７２−２２−９）を食用溶液（例えば、マンゴージュース、アマレット）に溶解し、各オリゴヌクレオチドを様々な濃度でこの溶液に添加する。シリンジ又はＪｅｔＣｕｔｔｅｒ（ｇｅｎｉａＬａｂ社、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）を用いて、得られた懸濁液を、脱イオン水及びアルギン酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：９００５−３８−３）の０．５％ｗ／ｖ分散液に滴下し、室温で３分間インキュベートする。得られたオリゴヌクレオチド担体複合体を、脱イオン水で２回洗浄し、既に使用した食用溶液中で保存する。
【００９４】
３．化粧料との混合
凍結乾燥オリゴヌクレオチドを、化粧料において粘度調整のために一般的に使用されるキレート化剤であるエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）とともに、再懸濁する。ＥＤＴＡは、オリゴヌクレオチドにとって周知の安定化剤である。この懸濁液を、少なくとも１００万分子／ｍＬの濃度で化粧料と混合する。さらに、オリゴヌクレオチドの皮膚浸透を高めるために、オメガ−３−オレイン酸を添加することができる（Touitou, E, Godin, B et al. (2002) Oleic acid, a skin penetration enhancer, affects Langerhans cells and corneocytes. J Con Rel. 80: 1 -7. doi:10.1016/S0168-3659(02)00004-4.）。
【００９５】
実施例４
オリゴヌクレオチドのin vitroでの消化
ヒト試験を行うことなく、また、絶滅危惧種を傷つけることなく、消化とオリゴヌクレオチド取り込みとの効果をシミュレーションするために、in vitroでの胃腸消化実験を行った。これらは、配列番号１のオリゴヌクレオチドを用いて、主要共同体によって示唆されるような設定に従った（Minekus, M. et al. (2014) A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food Fund. 5, 1113-1124. doi: 10.1039/C3FO60702J）。要約すれば、経口、胃、及び腸の経路を、それぞれの化学的及び酵素的組成を模倣することによってシミュレートした。
示唆されるように、各フェーズにおいて、サンプルを２分間インキュベートし、ＱＩＡａｍｐＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いてオリゴヌクレオチドを直ちに単離し、定量化まで４℃で保存した。
in vitro消化後のオリゴヌクレオチドの完全性をリアルタイムＰＣＲによって決定した。製品名「ｑＳｃｒｉｐｔＴＭＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＱＲＴ−ＰＣＲキット ＲＯＸＴＭ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ社）を備えた、アプライド・バイオシステムズ７５００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と、オリゴヌクレオチドプライマー（Prim_SEQ1_for [ATGCCCTTGTCCAGTC] Prim_SEQ1_rev [CTAGAAAGCACAGCTG]）とを用いて、全長遺伝子の両端でアニーリング（５３℃）して、完全長遺伝子の定量を行った。１００万又はそれ以上のオリゴヌクレオチド分子の使用によって、in vitro消化アッセイ（２３〜４０サイクル後の交差点（Ｃｐ））を通過した後に、配列番号１の完全長オリゴヌクレオチドの検出可能量が容易に得られた。伝統的な抽出物のin vitroでの経路をシミュレートするために、乾燥牛肉の一部（「ビーフジャーキー」、Bos taurus）を用い、対応する成長因子１（GenBank：V00111.1）のためのオリゴヌクレオチドを取り出した（for [acggctcagg gtccgtgaca]、rev [ctaataaaat gaggaaattg]）。乾燥した牛肉サンプルを、２１℃で１４時間、脱イオン滅菌水で洗浄し、続いて、プロテイナーゼＫ（４００ｎｇ／ｍＬ、Ｐ２３０８Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）及び塩酸グアニジン（５モル／Ｌ  ＣＡＳ番号：５０−０１−１）の１ｍＬ体積とともに、５５℃で１２時間インキュベートした。サンプルを遠心分離（１５０００ｇ１０分間）によって沈降させ、続いて、フェノール／クロロホルム抽出した。成長因子１遺伝子オリゴヌクレオチドのごく少量だけが、in vitro消化（２３〜４０サイクル後のＣｐ）の前に検出することができ、in vitro消化後にバックグランド閾値を超える信号がなく、合成オリゴヌクレオチドの優位性が明らかに示された。
【００９６】
実施例５
オリゴヌクレオチドの安定性における安定剤の影響
実施例４に記載したように、オリゴヌクレオチド単独で、また、様々な安定剤を組み合わせて用いて、オリゴヌクレオチドのin vitro消化を実施した。様々な段階で消化された経路（経口、胃、腸）をシミュレーションした後の検出は、実施例４に示した条件下で、リアルタイムＰＣＲによって再度実施された。様々な安定剤が試験された。Ｓｔａｂｉ１：アルギン酸カリウム；  Ｓｔａｂｉ２：ヒアルロン酸；  Ｓｔａｂｉ３：ポリ（エチレン−酢酸ビニル  共重合）；  Ｓｔａｂｉ４：ポリ−Ｌ−乳酸。図１から認識されるように、安定剤は、模擬（シミュレート）消化経路において有利な効果を有した。検出オリゴヌクレオチドの割合（オリゴヌクレオチドの初期量に対して）が、全ての時点において、安定剤がない場合よりも安定剤がある場合で、より高かったからである。
【図１】
2019501961.tif 000003
【配列表】
2019501961000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月25日(2018.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類、鳥類、爬虫類、又は植物における非ヒトＤＮＡの少なくとも１００万のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、
オリゴヌクレオチドは、ヒトへの投与のために、配列番号１〜１８からなる群から選択される配列の１つ又は複数に対して、少なくとも８０％の相同性を持つ配列を有する、非免疫学的用途のための組成物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、生理学的に許容される適切な安定剤とオリゴヌクレオチドとを含むＤＮＡ担体複合体の状態で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、化粧料組成物又は局所皮膚用組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、食品組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、飲食料品組成物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、医薬組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号２である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号４である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号５である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号６である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号７である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号８である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号９である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１１である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１２である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１４である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１５である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１６である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１７である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号１８である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物を製造するための方法であって、
（ｉ）配列番号１〜１８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを凍結乾燥された状態で提供する工程、
（ｉｉ）凍結乾燥された状態の前記オリゴヌクレオチドを再水和する工程、
を含む、方法。
【請求項２６】
化粧料又は食料品と前記組成物とを混合する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物の、個人用潤滑剤における使用。
【請求項２８】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物の、スパイス混合物における使用。
【請求項２９】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【請求項３０】
哺乳類、鳥類、爬虫類、又は植物における非ヒトポリペプチドの少なくとも１００万の分子を含む組成物であって、
ポリペプチドは、ヒトへの投与のために、配列番号１〜１８からなる群から選択された１つ又は複数の配列に対して少なくとも８０％の相同性を持つ配列によってエンコードされる組成物。
【国際調査報告】
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