【手続補正書】
【提出日】平成18年6月29日(2006.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質のマンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性を欠失するように特徴付けられる、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母。
【請求項２】
請求項１に記載の酵母であって、該酵母は：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ
ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ
ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ
ｇｕｅｒｃｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、およびＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓからなる群より選択される、酵母。
【請求項３】
前記酵母はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１に記載の酵母。
【請求項４】
マンノシルリン酸化糖タンパク質、またはそのフラグメントを、正常に産生する真菌宿主であって、ここで該宿主が、マンノシルリン酸残基を欠失する糖タンパク質を産生するように改変される、真菌宿主。
【請求項５】
請求項４に記載の真菌宿主であって、ここで該宿主は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、真菌宿主。
【請求項６】
請求項５に記載の真菌宿主において産生される、単離された糖タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の、単離された糖タンパク質であって、ここで該糖タンパク質は、ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターａ−鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体阻害因子−１、オステオプロテゲリン、ａ−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、ａ−フェトプロテイン、ＦＳＨ、およびペプチドホルモンからなる群より選択される、単離された糖タンパク質。
【請求項８】
Ｐｉｃｈｉａ属の酵母における糖タンパク質の産生方法であって、ここで該方法が、糖タンパク質のグリカンからマンノシルリン酸残基を除去する工程を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ここで前記除去する工程が、糖タンパク質のグリカン上のマンノシルリン酸残基の転移に関係する遺伝子の組み合わせを破壊する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記関係する遺伝子の組み合わせが：ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃ、およびＰＮＯ１からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子の組み合わせがＭＮＮ４ＢおよびＰＮＯ１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記酵母は：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、およびＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓからなる群より選択される、方法。
【請求項１３】
前記酵母が、減弱されたマンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２の方法により産生される、単離された糖タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された糖タンパク質であって、ここで該糖タンパク質は、ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥレセプターａ−鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体阻害因子−１、オステオプロテゲリン、ａ−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、ａ−フェトプロテイン、ＦＳＨ、およびペプチドホルモンからなる群より選択される、単離された糖タンパク質。
【請求項１６】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは以下：
（ａ）配列番号１；
（ｂ）配列番号１の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、核酸配列；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１とハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）長さが、少なくとも６０個の連続したヌクレオチドである、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、あるいはこれらの核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは以下
（ａ）配列番号２；
（ｂ）配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチド配列；および
（ｃ）長さが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらのポリペプチド配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは以下：
（ａ）配列番号３；
（ｂ）配列番号３の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、核酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｅ）配列番号４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号３とハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）長さが、少なくとも６０個の連続したヌクレオチドである、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、あるいはこれらの核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは以下
（ａ）配列番号４；
（ｂ）配列番号４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチド配列；および
（ｃ）長さが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらのポリペプチド配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは以下：
（ａ）配列番号５；
（ｂ）配列番号５の縮重改変体である核酸配列；
（ｃ）配列番号５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、核酸配列；
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；  （ｅ）配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号５とハイブリダイズする核酸配列；および
（ｇ）長さが、少なくとも６０個の連続したヌクレオチドである、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、あるいはこれらの核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは以下
（ａ）配列番号６；
（ｂ）配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％同一である、ポリペプチド配列；および
（ｃ）長さが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸である、（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれらのポリペプチド配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
改変された宿主細胞であって、ここで該宿主は、請求項１６、請求項１８、もしくは請求項２０に記載のポリヌクレオチドを発現しないか、または発現が減少するか、あるいは該ポリヌクレオチドにおいて、破壊、欠失、または変異を有することを特徴とする、改変された宿主細胞。
【請求項２３】
改変された宿主細胞であって、ここで該宿主は、請求項１７、請求項１９、または請求項２１に記載のポリペプチドによってコードされる、機能性遺伝子産物を産生しないことを特徴とする、改変された宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、マンノシルリン酸の転移に関与する、少なくとも２つの遺伝子が存在する。これら２つの遺伝子、すなわちＭＮＮ４およびＭＮＮ６はクローン化され、そしてこれらの遺伝子産物の解析からは、これらの遺伝子産物がマンノシルリン酸の転移において機能することが示唆される（総説については、非特許文献４を参照のこと）。ＭＮＮ６は、Ｏ−マンノシル化およびＮ−グルコシル化に関与する、ゴルジ  ａ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼとして特徴付けられた、Ｋｒｅ２ｐ／Ｍｎｔ１ｐタンパク質ファミリーと相同な、ＩＩ型膜タンパク質をコードする（非特許文献５）。Δｍｎｎ６変異体は、インビボにおけるコアのグリカンのマンノシルリン酸化においては欠損を示さないが、インビトロにおけるマンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性における減少を示す（非特許文献６）。Ｍｎｎ４ｐはまた、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＹｊｒ０６１ｐに３３％同一である、推定上のＩＩ型膜タンパク質である（非特許文献７；非特許文献８）。Δｍｎｎ６変異体およびΔｍｎｎ４変異体の双方は、マンノシルリン酸の転移を減少させる。しかし、Δｍｎｎ６およびΔｍｎｎ４の二重変異体は、この活性をさらに減少させることはない。これらの知見は、コアのグリカンにマンノシルリン酸を付加する、さらなるマンノシルトランスフェラーゼの存在を示唆する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
メチロトローフ酵母であるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにて発現されるタンパク質は、マンノシルリン酸化グリカンを含む（非特許文献１２）。Ｍｉｕｒａらは、ＰＮＯ１（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）遺伝子の同定を報告し、その破壊は、糖タンパク質のマンノシルリン酸化の減弱化をもたらす（特許文献１；非特許文献１３）。ＰＮＯ１遺伝子は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてグリカンへのマンノシルリン酸の転移に関与するタンパク質について、コードする。しかしながら、その具体的な機能は未知である。言及されるように、Δｐｎｏ１変異体は、野生型Ｐｎｏ１ｐを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株と比較して、Ｎ−グリカンのマンノシルリン酸化を減少させるが、完全に破壊はしない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、２０種の通常のアミノ酸、およびその略語は、通常の用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧｏｌｕｂおよびＧｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、第２版、１９９１）を参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される）。２０種の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、異常なアミノ酸（例えば、ａ−，ａ−二置換のアミノ酸）、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の通常でないアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適切な構成要素であり得る。通常でないアミノ酸の例としては：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ｅ−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニン、ならびに、他の類似のアミノ酸、およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で用いられるポリペプチドの表記法においては、標準の用法および慣習に従って、左末端はアミノ末端に対応し、右末端はカルボキシ末端に対応する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（マンノシルリン酸化遺伝子のノックアウトの組み合わせ）
３つの新たに同定されたＰ．Ｐａｓｔｏｒｉｓの遺伝子、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃのそれぞれが、マンノシルリン酸化における効果を決定するために、図４に示されるＰＣＲ重複戦略を用いて、破壊される。個々のΔｍｎｎ４Ａ突然変異体、Δｍｎｎ４Ｂ突然変異体、およびΔｍｎｎ４Ｃ突然変異体は、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）タンパク質のグリカンへの、マンノシルリン酸化転移活性において、有意な減少を示さなかったが、一方で、Δｐｎｏ１突然変異体（ＹＳＨ−４９）が、マンノシルリン酸化転移における減弱のみを示したものの（６％までの減少（図５Ｃ））、Ｍｉｕｒａら（国際公開第０１／８８１４３号）において過去に記載されたレベルまでではなかった。異なる糖タンパク質は、同じ宿主細胞内において、異なる度合いおよび型のグリコシル化を示すと、仮定されている（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら、１９９８、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１４：１９７−２０７）。本発明の１つの実施形態において、ヌル突然変異の組み合わせが構築され、その１つである、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるΔｐｎｏ  Δｍｎｎ４ｂの二重突然変異体（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ）は、結果として、Ｋ３レポータータンパク質のグリカン上における、検出不可能なレベルのマンノシルリン酸化を生じた（図５Ｄ）。同様に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるΔｐｎｏ１  Δｍｎｎ４ｂの二重突然変異体によって産生される他の糖タンパク質（例えば、ＣＤ４０およびインベルターゼ）もまた、結果として、マンノシルリン酸化の欠失を生じた。それゆえ、この二重突然変異体は、グリカン上にマンノシルリン酸化を有しない、種々の目的の糖タンパク質を産生する。従って、宿主（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種）における糖タンパク質のグリカン上の、マンノシルリン酸残基の転移に関与する遺伝子の組み合わせを破壊する方法が提供される。好ましくは、この組み合わせは、ＭＮＮ４ＢおよびＰＮＯ１の破壊を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
本発明のさらに別の局面において、新たに同定された、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの３つの遺伝子、ＭＮＮ４Ａ、ＭＮＮ４Ｂ、ＭＮＮ４Ｃのそれぞれを、遺伝子ノックアウトの任意の組み合わせが、この突然変異系統において発現される糖タンパク質の、マンノシルリン酸化に効果を有するかどうかを決定するために、実施例３に記載される、融合ノックアウト戦略を用いて、破壊した。ＰＣＲ重複ノックアウト戦略（図４）のように、個々のΔｍｎｎ４Ａ突然変異体、Δｍｎｎ４Ｂ突然変異体、およびΔｍｎｎ４Ｃ突然変異体は、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３ドメイン（Ｋ３）タンパク質のグリカンにおける、マンノシルリン酸化転移活性の減少を示さなかった（データは示さず）。しかしながら、Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４ｂの二重ヌル突然変異体（ＹＡＳ１７４）において発現されたＫ３レポータータンパク質は、実質的にいかなるマンノシルリン酸化も含まない（図６Ｃ、図６Ａおよび図６Ｂと比較せよ）。２０分〜３０分の間の、マンノシルリン酸化グリカンの非存在に注目されたい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
（異種糖タンパク質発現系）
酵母および糸状菌において、異種糖タンパク質を発現するための、確立された技術を用いて、治療的糖タンパク質をコードする遺伝子が発現される。真菌組換えタンパク質発現系は、代表的には、プロモーター（例えば、ＡＯＸＩ、ＡＯＸ２、または他の誘導性プロモーター）、転写終結因子（例えば、ＣＹＣ）、選択可能なマーカー（例えば、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、Ｇ４１８、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４、Ｚｅｏｃｉｎ）、および分泌シグナル（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａＭＦ）を含み得る。１つの実施形態において、この発現系は、少なくともｍｎｎ４Ｂ突然変異体であるように、改変される。好ましくは、糖タンパク質は、少なくともΔｍｎｎ４Ｂを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
本明細書中に記載される方法を用いる、マンノシルリン酸化グリカンを含まずに発現される糖タンパク質としては：エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ω、ＴＮＦ−ａ、顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１ｒａ））、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒトタンパク質Ｃ（ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）、アンチトロンビンＩＩＩ、およびトロンボポエチン抗体）；ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびそれらのフラグメント、Ｆｃ領域およびＦａｂ領域、可溶性ＩｇＥレセプターａ−鎖、ウロキナーゼ、キマーゼ、および尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン分泌因子、ＦＳＨ、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮細胞増殖因子−２、骨髄前駆体阻害因子（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）−１、オステオプロテゲリン、ａ−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅＩＩ、ａ−フェトプロテイン、ならびにグルコセレブロシダーゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
対照的に、図５Ｄは、図５Ａのコントロール（Ｈ２Ｏ）、図５Ｂの、約９％のマンノシルリン酸化を有するＹＳＨ−４４、および、図５Ｃの、約６％のマンノシルリン酸化を有するＹＳＨ−４９（Δｐｎｏ１）と比較して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ−１３０（Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４Ｂ）における、グリカンへのマンノシルリン酸転移の除去を示す。本明細書中で、初めて、マンノシルリン酸化グリカンを実質的に含まないように操作された、酵母系統について記載される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
（酵母（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生される、治療的糖タンパク質）
異なる糖タンパク質は、同じ宿主細胞中で、異なる度合いおよび型のグリコシル化を示し得る（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら、１９９８）。本発明は、マンノシルリン酸化を実質的に欠失する、組換え酵母系統における、種々の糖タンパク質の酸性方法を提供する。好ましくは、この方法は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４Ｂにおける、異種糖タンパク質の発現の操作に関与する。このように、本発明は、種々の治療的糖タンパク質上のグリカンからの、マンノシルリン酸化の除去を示す（図７Ａ〜図７Ｅ、図８）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
レポータータンパク質Ｋ３が、単一のＮ連結グリコシル化部位を含む一方で、本明細書中で開示されるレポータータンパク質Ｈｉｓ−エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、３つのＮ連結グリコシル化部位を含み、本明細書中で開示されるレポータータンパク質Ｈｉｓ−ＣＤ４０は、２つのグリコシル化部位を含み、そして本明細書中で開示されるＨｉｓ−インベルターゼタンパク質は、２４個までのグリコシル化部位を含む。Ｈｉｓでタグを付けられたエリスロポエチン（Ｈｉｓ−ＥＰＯ）は、図７Ｂにおいて、マンノシルリン酸化を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統から発現され、そして図７Ｃにおいて、マンノシルリン酸化を欠失する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４Ｂ系統から発現される。Ｈｉｓでタグを付けられたＣＤ４０（Ｈｉｓ−ＣＤ４０）は、図７Ｄにおいて、マンノシルリン酸化を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統から発現され、そして図７Ｅにおいて、マンノシルリン酸化を欠失する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４Ｂ系統から発現される。Ｈｉｓでタグを付けられたインベルターゼは、図８において、マンノシルリン酸化を欠失するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統から発現される。これらの糖タンパク質のそれぞれについての、系統構築は、実施例６に記載される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
（実施例２）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統：ＹＳＨ−４４およびＹＳＨ−１の構築）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４４およびＹＳＨ−１を、ＢＫ６４−１（単一のＮ連結グリコシル化部位を有するレポータータンパク質である、Ｋ３を分泌する、Δｏｃｈ１欠失突然変異体）から操作した（Ｃｈｏｉら、２００３、ＰＮＡＳ、１００：５０２２−５０２７；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１：１２４４−１２４６）。ＹＳＨ−１は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を発現し、そしてＹＳＨ−４４は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を発現する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
【化４】
2007530014.tif 000001
）（配列番号９）を、ゲノムＤＮＡ（ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０）から、ＰＮＯ１遺伝子の５’隣接領域および３’隣接領域を増幅するために用いた。プライマーＫＡＮ２（５’−ＧＣＡＴＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧ−３’）（配列番号１２）と対になるプライマーＫＡＮ１（５’−ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴ−ＴＣＧＴＡＣＧＣＴＧＣ−３’）（配列番号１１）を、ｐＡＧ３２（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｃＣｕｓｋｅｒ、１９９９、Ｙｅａｓｔ、１４：１５４１−１５５３）から、Ｈｙｇ耐性マーカーを増幅するために用いた。次いで、重複産物を生成するために、第一回のＰＣＲ反応に由来する３つの産物全てを用いた、２回目の反応において、プライマーＰＮＫ１およびプライマーＰＮＫ４を用いた。結果として生じる融合ＰＣＲ産物を、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を主に発現する、操作されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統である、ＹＳＨ−４４系統に形質転換するために用いた。形質転換体を、２００ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のデキストロース）培地上で選抜した。欠失対立遺伝子ｐｎｏ１：：ＨｙｇＲの適切な組み込みを、ＰＣＲによって確認した。このΔｐｎｏ１系統を、ＹＳＨ−４９と名付けた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
（実施例３）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４９系統における、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４Ｂノックアウト戦略（図４））
ＹＳＨ−４９におけるＰＣＲ重複によって、ＹＡＳ−１３０（Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４ｂ）二重突然変異系統を達成した。ＴＡＳ５４プライマー（ＴＴＣＡＡＣＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡ）（配列番号１３）、およびＴＡＳ５１プライマー（
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１系統における、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４Ｂノックアウト戦略）
Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ４Ａ  Δｐｎｏ１系統であるＹＡＳ１５９を得るために、ＳｆｉＩ消化したｐＪＮ５０３ｂ（Δｍｎｎ４Ａ  Δｐｎｏ１：：ＵＲＡ３）を、ＹＳＨ−１にエレクトロポレーションにて形質転換した。この系統において、５−ＦＯＡの対抗選択（ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって、ＵＲＡ３選択可能マーカーを回収した。結果として生じる系統である、ＹＡＳ１６４（Δｏｃｈ１；Δｍｎｎ４Ａ  Δｐｎｏ１；ｕｒａ３；ｈｉｓ４；ａｄｅ１；ａｒｇ４）に、ＳｆｉＩ消化したｐＡＳ１９（Δｍｎｎ４Ｂ：ＵＲＡ３）を形質転換して、Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ４Ａ  Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４Ｂ系統である、ＹＡＳ１７０を生じさせた。引き続いて、ＹＡＳ１７４系統（Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ４Ａ  Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４Ｂ；ｕｒａ３；ｈｉｓ４；ａｄｅ１；ａｒｇ４）を得るために、ＹＡＳ１７０系統を５−ＦＯＡにて対抗選択した。従って、ＹＡＳ１７４は、マンノース外鎖形成を欠失し、そしてＮ連結グリカン上のマンノシルリン酸を有さない、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ系統を表す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
ノックアウトのスクリーニングを、ノックアウト構築物の５’側部分および３’側部分の双方をＰＣＲ増幅すること（図４）によって行った。ノックアウト構築物の５’側部分をスクリーニングするために、ＴＡＳ８１プライマー（ＴＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＡ−ＡＡＣＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧ）（配列番号１９）、およびＴＡＳ０８プライマー（ＡＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＣ−ＴＧＴＣＡＡＧＧ）（配列番号２０）を用いる一方、ノックアウト構築物の３’側部分をスクリーニングするために、ＴＡＳ８２プライマー（ＡＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＧＧＴＴ）（配列番号２１）、およびＴＡＳ０７プライマー（ＴＣＧＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＧＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＡＣ）（配列番号２２）を用いた。ＴＡＳ０８プライマーおよびＴＡＳ０７プライマーは、それぞれ、薬物耐性マーカー配列の５’側末端および３’側末端にアニールし、そしてＴＡＳ８１およびＴＡＳ８２は、ノックアウト構築物に用いられるＤＮＡの５’側領域および３’側領域に隣接するゲノムの配列に相補的であるので、双方のスクリーニングにおけるＰＣＲ産物の観察は、ＭＮＮ４Ｂ  ＯＲＦのノックアウトの成功を示す。９６個の形質転換体をスクリーニングし、ＭＮＮ４Ｂノックアウトとして４個が試験的に陽性であった。４つのΔｐｎｏ１  Δｍｎｎ４ｂ系統は全て、検出可能なレベルのマンノシルリン酸を有さない、Ｋ３レポータータンパク質を発現した。この一例を、図５Ｄに示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
（実施例６）
（Ｈｉｓでタグを付けられた、ＥＰＯタンパク質、ＣＤ４０タンパク質、およびインベルターゼタンパク質についての系統構築、図７，８）
Ｈｉｓでタグを付けられたエリスロポエチン（ＥＰＯ）のために、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、ＥＰＯの最初の１６６アミノ酸を増幅して、そしてＣ−末端６Ｈｉｓ  ｐＰＩＣＺＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドの、ＥｃｏＲＩ部位およびＫｐｎＩ部位に挿入した。このプラスミド（ｐＢＫ２９１）を２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系統に形質転換し、ＥＰＯ−６Ｈｉｓを発現する、以下の系統を生じた：実施例２、実施例４に記載され、そして示される、ＢＫ２４８ノックアウト（ｕｒａ３、ｈｉｓ４、ａｄｅ１、ａｒｇ４、Δｏｃｈ１：：ＵＲＡ３）およびＢＫ２４４ノックアウト［ｐＢＫ１１６、およびｐｎｏ１ｍｎｎ４ｂ（ｐｎｏ１：：ＨｙｇＲ）を有するｐＢＫ２８４を形質転換されたＹＳＨ４４］（ｍｎｎ４ｂ：：ＫａｎＲ）。ｐＢＫ１１６は、ＮＲＲＬ１１４３０（ＡＴＣＣ）から単離された１５５１ｂｐのＡＯＸ１  ３’ＵＴＲ  ＤＮＡフラグメントを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＰＩＣ６ＡプラスミドのＡＦｌＩＩＩ部位に挿入し、そしてＮＲＲＬ１１４３０から単離された１９５２ｂｐのＡＯＸ１  ５’ＵＴＲ  ＤＮＡフラグメントを、５７３ｂｐのＰｍｅＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントを除去した、同じｐＰＩＣ６ＡプラスミドのＢｇｌＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位に挿入することの結果として生じる。次いで、このｐＢＫ１１６をＮｏｔＩで消化し、そして、レポーターであるＫ３タンパク質をノックアウトするために、生じたＮｏｔＩフラグメントをＹＳＨ４４に形質転換した。ｐＢＫ２８４は、ＮＲＲＬ１１４３０（ＡＴＣＣ）から、ＡＯＸ１プロモーター配列、ＡＯＸ１  ＯＲＦ配列、およびＡＯＸ１ターミネーター配列を含む３１９６ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯのマルチクローニング部位にクローニングすることの結果として生じる。次いで、カナマイシン遺伝子を消失するために、このプラスミドをＭｓｃＩおよびＢｓｓＨＩで消化した。この結果ｐＢＫ２８４が生じ、これを、ＡＯＸＩプロモーター遺伝子座への組み込みのためにｐＢＫ１１６を形質転換された、ＹＳＨ４４系統への形質転換に先立って、ＰｍｅＩで消化した。ＢＫ２４８およびＢＫ２４４における、ＥＰＯ−６ＨｉｓのＨＰＬＣグリカン解析を、図７Ｂおよび図７Ｃに示す。Ｈｉｓタグを付けられたＣＤ４０のために、ｐｈＣＤ４０／ＧｅｍＴ（Ｐｕｌｌｅｎら、１９９９、ＪＢＣ、２７４：１４２４６−１４２５４）から、ｐＰＩＣＺ  ａＡへのクローニングのための５’ＥｃｏＲＩプライマーおよび３’Ｈｉｓ１０−ＫｐｎＩプライマーを用いて、ヒトＣＤ４０  ＤＮＡを増幅し、結果としてｐＪＣ３３を生じた。ｐＪＣ３３を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＪＣ１２系統（ｕｒａ３、ｈｉｓ４、ａｄｅ１、ａｒｇ４）、およびＹＡＳ２５２−２（ｐＢＫ１１６、ｐＢＫ２８４、および、ガラクトシルトランスフェラーゼを含むｐＲＣＤ４６５（ＵＳＳＮ  ６０／５６２４２４）を形質転換されたＹＡＳ−１３０）内で発現させ、後者は結果としてＹＡＳ２５２を生じた。ＹＪＣ１２およびＹＡＳ２５２内での、ＣＤ４９−６ＨｉｓのＨＰＬＣグリカン解析を、図７Ｄおよび図７Ｅに示す。Ｈｉｓでタグを付け���れたインベルターゼのために、インベルターゼ配列の全長を、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓから購入した、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡ（ＣＢＳ６８３系統）から、ＰＣＲによって増幅した。このインベルターゼＯＲＦを、ＰｍｌＩ部位におけるｐＰＩＣＺＡプラスミド（Ｃ末端の６Ｈｉｓタグを提供する）への挿入のために、平滑末端の５’プライマーおよび３’プライマーを用いて増幅した。このｐＰＢ１４７を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ２４５−２系統（ｐＢＫ１１６、ｐＢＫ２８４、およびｐＲＣＤ４６５（ＵＳＳＮ  ６０／５６２４２４）を形質転換されたＹＡＳ１３０）に形質転換し、結果としてＹＡＳ２５３を生じた。ＹＡＳ２５３におけるインベルターゼ−６ＨｉｓのＨＰＬＣグリカン解析を、図８に示す。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
【図１】図１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ａの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｃの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、薬物耐性マーカーを用いた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＭＮＮ４Ｂの、融合ＰＣＲノックアウト戦略を示す。
【図５−１】図５Ａは、サンプルとしてＨ２Ｏを用いる、ネガティブ実験コントロールについての、高速液体クロマトグラムを示す。図５Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４４の上清から精製されたＫ３に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。図５Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−４９（Δｐｎｏ１）の上清から精製されたＫ３に由来する、Ｎ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。
【図５−２】図５Ｄは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ−１３０（Δｐｎｏ１Δｍｎｎ４Ｂ）の上清から精製されたＫ３に由来する、Ｎ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。２０分〜３０分の間の、マンノシルリン酸化グリカンの非存在に注目されたい。
【図６】図６Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＳＨ−１（Δｏｃｈ１）の上清から精製されたＫ３に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。図６Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ−１６４（Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ４Ａ  Δｐｎｏ１）の上清から精製されたＫ３に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。図６Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ−１７４（Δｏｃｈ１  Δｍｎｎ４Ａ  Δｐｎｏ１  Δｍｎｎ４Ｂ）の上清から精製されたＫ３に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。２０分〜３０分の間の、マンノシルリン酸化グリカンの非存在に注目されたい。
【図７−１】図７Ａは、Ｈ２Ｏを含むネガティブ実験コントロールサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。図７Ｂは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＢＫ２４８系統より産生された、ｐＢＫ２９１（Ｈｉｓ−ＥＰＯ）から発現される、エリスロポエチンに由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。図７Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＢＫ２４４系統において産生されるＨｉｓ−Ｅｐｏに由来する、Ｎ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。
【図７−２】図７Ｄは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＪＣ１２系統において産生される、ｐＪＣ３３（Ｈｉｓ−ＣＤ４０）から発現される、ＣＤ４０に由来するＮ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。図７Ｅは、ＹＡＳ２５２についての高速液体クロマトグラムを示す。注意：マンノシルリン酸を有するグリカンは、２０分〜３０分の間に溶出する。
【図８】図８Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＹＡＳ２５２系統において産生されるｐＰＢ１４７から発現される、インベルターゼに由来する、Ｎ連結グリカンを含むサンプルについての、高速液体クロマトグラムを示す。
【図９】図９は、ＤＮＡＳｔａｒから提供されるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐｐ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｎｃ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｎ）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃａ）、およびＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（Ｐａ）における、ＭＮＮ４／ＰＮＯ１のホモログのアラインメントを示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007530014000001.app