(57)【要約】  本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する活性を有する抗体、ならびにかかる抗体を作製および使用する方法に関する。【選択図】図１
2019528074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖相補性決定領域１〜３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）および軽鎖相補性決定領域１〜３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む抗体であって、ここでＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が各々、配列番号７９〜８４を含む、抗体。
【請求項２】
配列番号７３および７７を各々含む重鎖および軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号７１を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸配列が配列番号７５を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列。
【請求項６】
請求項５に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体を作製する方法であって、請求項６に記載のベクターを含む細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項９】
血管新生を低減する方法であって、請求項１に記載の抗体を対象に提供するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する活性を有する抗体、ならびにかかる抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の脈管構造からの新たな血管の形成であり、実質的にすべての臓器の形成および生理学的機能に必要とされる複雑な生物学的プロセスである。それは、胚形成、正常な生理学的増殖、修復、および腫瘍拡大などの病理学的プロセスに必須の要素である。通常、血管新生は、内皮細胞による血管出芽、分岐、および細管形成を含む多段階プロセス（内皮細胞（ＥＣ）の活性化、血管の脱安定化、分解酵素の合成および放出、ＥＣ遊走、ＥＣ増殖、ＥＣ組織化および分化、ならびに血管成熟などのプロセスを含む）において、血管新生因子と血管新生抑制因子の局所的平衡により密に調節される。
【０００３】
成体では、生理学的血管新生は、創傷治癒ならびに雌の生殖機能および胚発生の幾つかの要素に主に限定される。任意の異常な、望ましくないまたは病理学的な血管新生を含む疾患関連性の血管新生では、血管新生因子と血管新生抑制因子との間の局所的平衡が調節不全になり、不適切な、および／または構造的に異常な血管形成をもたらす。病理学的血管新生は、糖尿病性網膜症、乾癬、がん、関節リウマチ、アテローマ、カポジ肉腫、および血管腫を含む病態と関連づけられている（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１６：５７−６６；Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：２７−３１）。がんでは、原発性および続発性腫瘍の１〜２ｍｍ３を上回る増殖には血管新生が必要とされる（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９５；３３，１７５７−１７６３）。
【０００４】
ＶＥＧＦは、強力な広範に分布する血管増殖因子である。内皮細胞のための分泌マイトジェンとしてのＶＥＧＦの役割の同定に先立ち、それは血管透過性因子として同定された、増殖、遊走、特殊化、および生存を含む、内皮細胞挙動の多くの異なる側面を制御するＶＥＧＦの能力が強調された（Ｒｕｈｒｂｅｒｇ，２００３  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２５：１０５２−１０６０）。ＶＥＧＦ−Ａは、同定対象としての血小板由来増殖因子スーパーファミリーに属する構造的に関連した二量体糖タンパク質のＶＥＧＦファミリーの最初のメンバーであった。当初のメンバーのＶＥＧＦ−Ａは別にして、ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）および内分泌腺由来ＶＥＧＦ（ＥＧ−ＶＥＧＦ）を含む。ＶＥＧＦの活性型は、他のＶＥＧＦファミリーメンバーとのホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかとして合成される。ヒトＶＥＧＦ−Ａは、選択的スプライシングによって作製される６つのアイソフォーム：ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６で存在する。これらのアイソフォームは、主にそれらのバイオアベイラビリティにおいて異なり、ここでＶＥＧＦ１６５は主要なアイソフォームであるが（Ｐｏｄａｒ，ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｂｌｏｏｄ  １０５（４）：１３８３−１３９５）、それ以外もまた生物学的活性を有する。様々なアイソフォームの段階および組織に特異的な比をもたらす胚形成の間でのスプライシングの調節により、ＶＥＧＦに応答しての内皮細胞の異なる状況依存的な挙動に向けての豊かな潜在性が創出される。
【０００５】
ＶＥＧＦは、正常と疾患関連性双方の血管新生（Ｊａｋｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ：１３３，８４８−８５９；Ｋｏｌｃｈ，ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：３６，１３９−１５５）および血管透過性（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ：２６４，２００１７−２００２４）の重要な刺激因子であると考えられる。抗体を用いたＶＥＧＦの隔離によるＶＥＧＦ作用の拮抗は、腫瘍増殖における低下をもたらし得る（Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｎａｔｕｒｅ：３６２，８４１−８４４）。ＶＥＧＦ遺伝子のヘテロ接合性破壊は、脈管形成における致命的欠損をもたらした（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｎａｔｕｒｅ３８０：４３５−４３９；Ｆｅｒｒａｒａ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）という、少なくとも１つの商業的に市販されている抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体が存在する。しかし、その使用に伴う重篤な、時として致死性のある毒性、例えば非胃腸性の瘻（ｎｏｎ−ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｉｓｔｕｌａｓ）、血栓塞栓症、高血圧症、可逆性後部白質脳症症候群などが認められる。そのように、それがＶＥＧＦ−Ａの標的化に関連した安全性を改善することに関連することから、少なくとも満たされない需要がある。このため、本発明の抗体は、これらの抗体がＶＥＧＦ−Ａアイソフォームに別々に結合する能力を含む、当該技術分野全体に及ぶかかる改善を支持する結合特性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＶＥＧＦ−Ａに結合する、抗体を含む結合分子に関する。本発明はまた、１つ以上のＶＥＧＦ−Ａアイソフォームに、１つ以上の他のＶＥＧＦ−Ａアイソフォームと比較される場合により高い親和性で結合する、抗体を含む結合分子に関する。本発明はまた、ＶＥＧＦ−Ａに結合し、ＶＥＧＦ−Ａの少なくとも１つの生物学的活性についての活性を低下させる、抗体を含む結合分子に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒトＶＥＧＦ１６５およびマウスＶＥＧＦ１６４への結合を示す代表的データである。
【図２】ＶＥＧＦ１２１への結合の欠如を示す代表的データである。
【図３】クローンＥ０６および最も配列相同性の高い生殖系列遺伝子の配列アラインメントである。
【図４】親和性最適化変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ）の改善された結合を示す代表的データである。
【図５】ＦａｂおよびＩｇＧとしての親和性最適化変異体の改善された結合を示す代表的データである。Ｆａｂは、上の２つのグラフで示される。ＩｇＧは、下の２つのグラフで示される。
【図６】親和性最適化変異体のマウスＶＥＧＦ１６４への結合を示す代表的データである。
【図７】親和性最適化変異体のＶＥＧＦ１２１への結合の欠如を示す代表的データである。
【図８Ａ−Ｂ】機能細胞に基づくアッセイにおける親和性最適化変異体の活性を示す代表的データである。
【図９】網膜脈管形成モデルにおける親和性最適化変異体の活性を示す代表的データである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
定義
本発明を詳述する前に、本発明が特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それ故に変更可能であるがことは理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲にて用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明示されない限り、複数の参照対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに用語「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書中で交換可能に用いることができる。さらに、態様が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに本明細書に記載される場合は常に、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」の観点で記載される他の類似する態様もまた提供されることが理解される。
【００１０】
本明細書で用いられるとき、用語「結合分子」は、標的分子または抗原に、抗原に結合する抗体の場合と同様に結合する能力がある分子を指す。結合分子の例として、完全長抗体および抗原結合断片が挙げられる。抗体の「抗原結合断片」の例として、（ｉ）抗体のＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを含む一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一群のＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、が挙げられる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断により作製され得る。一実施形態では、抗原結合断片は、例えば「一本鎖可変断片」すなわち「ｓｃＦｖ」を含む一本鎖抗体を含む。ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖の少なくとも１つの可変領域（ＶＨ）および軽鎖の少なくとも１つの可変領域（ＶＬ）を含む融合タンパク質を指す。これらの一本鎖抗体断片は、当業者に公知の通常の技術を用いて得ることができる。例えば、別々の遺伝子によってコードされる、Ｆｖ断片のＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬ領域が対をなして一価分子を形成するような単一のポリペプチド鎖としての作製を可能にする合成リンカーにより、組換え方法を用いて連結され得る（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。
【００１１】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体であってその抗原に結合するものに関与する。ＣＤＲは、（Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））；Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３））；および他の方法を含む）当該技術分野における幾つかの方法により決定される。具体的なＣＤＲ配列が本明細書中に記載され、請求されるが、本発明はまた、当該技術分野で公知の任意の方法によって定義されるＣＤＲ配列を包含する。
【００１２】
本明細書中で用いられるように、用語「対象」は、脊索動物亜門の任意のメンバーを指す。例えば限定はされないが、ヒトおよび他の霊長類、例えば非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種；家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家畜哺乳類、例えば、イヌおよびネコ；実験動物、例えば齧歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモット；鳥類、例えば、飼育、野生および狩猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽、アヒル、ガチョウなどもまた非限定例である。
【００１３】
結合分子
結合分子は、完全長またはインタクト抗体、抗体断片、例えば、抗原結合断片、ヒト、ヒト化、翻訳後修飾、キメラまたは融合抗体、免疫複合体、またはその機能断片などを含み得る。
【００１４】
本発明の好適な免疫グロブリン分子またはその一部（すなわち結合分子）は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａまたはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、またはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２または３））であり得る、またはそれに由来する。免疫グロブリン分子は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてλ鎖またはκ鎖のいずれかとして分類される軽鎖を含み得る。
【００１５】
結合分子の作製
ポリペプチド、例えば本明細書に記載の結合分子について作製し、スクリーニングするための組換えＤＮＡ方法は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。結合分子を得るため、結合分子またはその断片をコードするＤＮＡ、例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖ、またはそれらの組み合わせをコードするＤＮＡが、好適な発現ベクターに挿入され得、次に、通常は抗体タンパク質を産生することがない、好適な宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされ得る。
【００１６】
好適な発現ベクターは、当該技術分野で公知である。発現ベクターは、プロモーターに連結された抗体をコードするポリヌクレオチドを含み得る。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく（例えば、米国特許第５，９８１，２１６号明細書；米国特許第５，５９１，６３９号明細書；米国特許第５，６５８，７５９号明細書および米国特許第５，１２２，４６４号明細書を参照）、該抗体の可変ドメインは、全重鎖、全軽鎖、または全重鎖および全軽鎖の双方の発現を意図したようなベクターにクローン化されてもよい。結合分子を産生するため、発現ベクターは、通常の技術により宿主細胞に導入され得、トランスフェクト細胞は、通常の技術により培養され得る。
【００１７】
組換え抗体の発現用宿主として好適な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で公知であり、限定はされないが、ＣＨＯ細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞のがん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および幾つかの他の細胞株を含む、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手可能な多数の不死化細胞株を含む。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴および特定の機構を有する。結合分子の正確な修飾およびプロセシングを保証するため、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。このため、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が用いられてもよい。かかる哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（機能的免疫グロブリン鎖を全く内因性に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含む。モノクローナル抗体を組換え的に産生するため、ヒトリンパ球を不死化することにより発生されるヒト細胞株を用いることができる。モノクローナル抗体を組換え的に産生するため、ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いることができる。組換え抗体の発現用宿主として用いられてもよいさらなる細胞株は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）Ｂｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４）、または酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、米国特許第７３２６６８１号明細書など）、植物細胞（米国特許出願公開第２００８００６６２００号明細書）、またはニワトリ細胞（国際公開第２００８１４２１２４号パンフレット）を含む。
【００１８】
抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いて細胞株で安定発現され得る。組換えタンパク質の長期にわたる高収率産生のため、安定発現を用いることができる。安定発現のため、宿主細胞は、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択可能マーカー遺伝子を含む適切に設計されたベクターを用いて形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、細胞は、濃縮培地中で１〜２日間、増殖が許容され、次に選択培地に交換される。組換えプラスミドにおける選択可能マーカーは、選択に対して耐性を付与し、プラスミドを自らの染色体に安定に組み込んでいる細胞が増殖し、フォーカスを形成することを可能にし、次にそのフォーカスは細胞株にクローン化および拡大され得る。安定細胞株を高収率で作製するための方法は当該技術分野で公知であり、試薬は一般に市販されている。一過性発現もまた、当該技術分野で公知の方法を用いることにより実施することができる。一過性遺伝子導入は、細胞に導入される核酸がその細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれることがなく、細胞における染色体外因子として（例えばエピソームとして）維持される場合のプロセスである。
【００１９】
細胞株は、安定にまたは一過性のいずれかでトランスフェクトされるものであり、結合分子の発現および産生をもたらす、当該技術分野で公知の細胞培地および条件で維持される。細胞培地は、例えばＤＭＥＭまたはハムＦ１２を含む市販の培地製剤に基づき得る。さらに、細胞培地は、細胞増殖および生物学的タンパク質発現の双方における増強を支持するため、修飾され得る。本明細書で用いられるとき、用語「細胞培地」、「培地」および「培地製剤」は、多細胞生物または組織以外の人工的インビトロ環境下での細胞の維持、成長、増殖、または拡大のための栄養液を指す。細胞培地は、細胞増殖を促進するために配合される細胞培養増殖培地または組換えタンパク質産生を促進するために配合される細胞培養産生培地を含む、特定の細胞培養用途のため、最適化されてもよい。栄養素、原料、および成分という用語は、細胞培地を構成する成分を指すように本明細書で交換可能に用いられる。細胞株は、流加培養法を用いて維持され得る。本明細書で用いられるとき、「流加培養法」は、細胞培養物が最初に基礎培地とともにインキュベートされてから追加的な栄養分の供給を受けるための方法を指す。例えば、流加培養法は、所与の期間内の決められた供給スケジュールに従って補充培地を添加することを含んでもよい。したがって、「流加細胞培養」は、培養終結前の周期的な細胞および／または生成物の収集の有無にかかわらず、細胞（典型的には哺乳類）、および培地が培養中の血管に最初に供給され、追加的な培養栄養分が培養中の培養物に継続的にまたは不連続増分で供給されるような細胞培養を指す。
【００２０】
細胞培地およびそれに含有される栄養分は、当業者に公知である。細胞培地は、基礎培地と、修飾基礎培地をもたらす、少なくとも１つの加水分解物、例えば、大豆に基づく加水分解物、酵母に基づく加水分解物、または２種の加水分解物の組み合わせとを含んでもよい。追加的な栄養分は、専ら基礎培地、例えば濃縮基礎培地を含んでもよい、または専ら加水分解物、もしくは濃縮加水分解物を含んでもよい。好適な基礎培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最少必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、ＰＦ  ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯタンパク質不含培地（Ｓｉｇｍａ）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ＣＨＯ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）参照、およびイスコフ改変ダルベッコ培地を含むが、それらに限定されない。本発明において用いてもよい基礎培地の他の例として、ＢＭＥ基礎培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅａｇｌｅ，Ｈ（１９６５）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８９，３６も参照）；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００）；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８：３９６；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９６０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：１８５．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ６：２，９３も参照）；ＣＭＲＬ  １０６６培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃１１５３０）；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９５７）Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５：３０３も参照）が挙げられる。
【００２１】
基礎培地は無血清であってもよく、これは、培地が血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、または当業者に公知の任意の他の動物由来血清）を含有しないこと、または動物タンパク質不含培地または合成培地であることを意味する。
【００２２】
基礎培地は、標準の基礎培地中に見出される特定の非栄養成分、例えば様々な無機および有機緩衝液、界面活性剤、および塩化ナトリウムを除去するため、修飾されてもよい。かかる成分を基本細胞培地から除去することは、残存する栄養成分の濃度増加を可能にし、全体的な細胞増殖およびタンパク質発現を改善することがある。さらに、除去された成分は、細胞培養条件の要求に従って修飾された基本細胞培地を含有する細胞培地に再び添加されてもよい。細胞培地は、修飾された基本細胞培地と、以下の栄養分、鉄供給源、組換え増殖因子；緩衝液；界面活性剤；容積モル浸透圧濃度調節剤；エネルギー源；および非動物加水分解物の少なくとも１つとを含有してもよい。さらに、修飾された基本細胞培地は、任意選択的には、アミノ酸、ビタミン、またはアミノ酸とビタミン双方の組み合わせを含有してもよい。修飾された基礎培地は、グルタミン、例えばＬ−グルタミン、および／またはメトトレキサートをさらに含有してもよい。
【００２３】
精製および単離
一旦結合分子が作製されていると、それは、免疫グロブリン分子を精製するための当該技術分野で公知の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性（特に特異抗原プロテインＡまたはプロテインＧに対する親和性によるもの）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解度により、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的技術により精製されてもよい。さらに、本発明の結合分子は、精製を容易にするため、異種ポリペプチド配列（本明細書中で「タグ」と称される）と融合されてもよい。
【００２４】
使用
本発明の結合分子は、幾つかの方法で用いることができる。例えば、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ−Ａに結合させ、それによりＶＥＧＦ−Ａの少なくとも１つの生物学的活性を低減するため、用いることができる。より詳細には、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ−１６５に結合させ、それにより、その受容体の活性化もしくはリン酸化における低下、細胞調節不全に関連した血管新生における低下、腫瘍増殖における低下、腫瘍体積における減少、ならびに／または腫瘍増殖および腫瘍体積における低減を含んでもよい、ＶＥＧＦ−１６５の少なくとも１つの生物学的活性を低減するため、用いることができる。
【００２５】
例示的実施形態
本発明の実施形態は、本明細書に記載の抗体の重鎖相補性決定領域１〜３（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）および軽鎖相補性決定領域１〜３（すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む結合分子に関する。
【００２６】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５に結合する。
【００２７】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性で結合する。
【００２８】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性でＶＥＧＦ１６５に結合する。
【００２９】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性でＶＥＧＦ１６５に結合する。
【００３０】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、またはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化を低下させる。
【００３１】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、血管新生を低下させる。
【００３２】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、腫瘍増殖を低下させる、腫瘍体積を減少させる、または腫瘍増殖および腫瘍体積を低減する。
【００３３】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、ＶＥＧＦ１６５への結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、もしくはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化の低下、血管新生の低下、または腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減を含む、本明細書に記載の特徴の１つ以上または任意の組み合わせを有する。
【００３４】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関する。
【００３５】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５に結合する。
【００３６】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性で結合する。
【００３７】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。
【００３８】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。
【００３９】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、またはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化を低下させる。
【００４０】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含み、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関し、ここで結合分子は、血管新生を低下させる。
【００４１】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含み、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、腫瘍増殖を低下させる、腫瘍体積を減少させる、または腫瘍増殖および腫瘍体積を低減する。
【００４２】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含み、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、ＶＥＧＦ１６５への結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、もしくはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化の低下、血管新生の低下、または腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減を含む、本明細書に記載の特徴の１つ以上または任意の組み合わせを有する。
【００４３】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関する。
【００４４】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５に結合する。
【００４５】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性で結合する。
【００４６】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。
【００４７】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。
【００４８】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、またはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化を低下させる。
【００４９】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、血管新生を低下させる。
【００５０】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、腫瘍増殖を低下させる、腫瘍体積を減少させる、または腫瘍増殖および腫瘍体積を低減する。
【００５１】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、ＶＥＧＦ１６５への結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、もしくはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化の低下、血管新生の低下、または腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減を含む、本明細書に記載の特徴の１つ以上または任意の組み合わせを有する。
【００５２】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関する。
【００５３】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５結合する。
【００５４】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性で結合する。
【００５５】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。
【００５６】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。
【００５７】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、またはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化を低下させる。
【００５８】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、血管新生を低下させる。
【００５９】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、腫瘍増殖を低下させ、腫瘍体積を減少させ、または腫瘍増殖および腫瘍体積を低減する。
【００６０】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、ＶＥＧＦ１６５への結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、もしくはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化の低下、血管新生の低下、または腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減を含む、本明細書に記載の特徴の１つ以上または任意の組み合わせを有する。
【００６１】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関する。
【００６２】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５に結合する。
【００６３】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性で結合する。
【００６４】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。
【００６５】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関し、ここで結合分子は、ＶＥＧＦ１６５にＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性で結合する。
【００６６】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関し、ここで結合分子は、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、またはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化を低下させる。
【００６７】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関し、ここで結合分子は、血管新生を低下させる。
【００６８】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、腫瘍増殖を低下させ、腫瘍体積を減少させ、または腫瘍増殖および腫瘍体積を低減する。
【００６９】
別の実施形態は、本明細書に記載の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む完全長ＩｇＧ１抗体を含む完全長抗体である結合分子に関し、ここで結合分子は、腫瘍を有する被験者に提供されている結果として、ＶＥＧＦ１６５への結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ＶＥＧＦ１６５へのＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９と比べてより高い親和性での結合、ヒトＶＥＧＦＲ２のリン酸化、マウスＶＥＧＦＲ２のリン酸化、もしくはヒトおよびマウス双方のＶＥＧＦＲ２のリン酸化の低下、血管新生の低下、または腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減を含む、本明細書に記載の特徴の１つ以上または任意の組み合わせを有する。
【００７０】
具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体が存在し、ここでＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は各々、配列番号７９〜８４を含む。
【００７１】
別の具体的な実施形態では、配列番号７３および７７を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体が存在する。
【００７２】
別の具体的な実施形態では、配列番号７１を含む重鎖アミノ酸配列および配列番号７５を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗体が存在する。
【００７３】
別の具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体が存在し、ここでＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は各々、配列番号７９〜８４を含み、また該抗体はモノクローナル抗体である。
【００７４】
別の具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列が存在し、ここでＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は各々、配列番号７９〜８４を含む。
【００７５】
別の具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが存在し、ここでＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は各々、配列番号７９〜８４を含む。
【００７６】
別の具体的な実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞が存在し、ここでＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は各々、配列番号７９〜８４を含む。
【００７７】
別の具体的な実施形態では、抗体を作製する方法であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞を培養することを含み、ここでＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は各々、配列番号７９〜８４を含む、方法である。
【００７８】
別の具体的な実施形態では、血管新生を低下させる方法であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体を被験者に提供することを含み、ここでＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は各々、配列番号７９〜８４を含む、方法である。
【００７９】
2019528074.tif 000003
【００８０】
2019528074.tif 000004
【００８１】
2019528074.tif 000005
【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【実施例】
【００９０】
本明細書に記載の実験においては、必要に応じての単一特異性または二重特異性抗体として、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，３３３：３２８−３３５，２００５）、Ｇ６−３１（Ｌｉａｎｇ，ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：９５１−９６１，２００６）、Ｂ２０−４．１（Ｌｉａｎｇ，ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：９５１−９６１，２００６）、およびＲ３４７と名付けたアイソタイプ対照を含む様々な抗体を用いた。一部の結合および機能試験において、マウスと交差反応性がないすべてのＶＥＧＦアイソフォームに結合する能力がある抗ＶＥＧＦ  ＩｇＧ１抗体を陽性対照として用いることができる。マウスＶＥＧＦに対する交差反応が必要である場合、抗体Ｇ６−３１およびＢ２０−４．１を陽性対照として用いることができる。
【００９１】
実施例１：抗ＶＥＧＦ抗体のファージ抗体ディスプレイライブラリーからの同定
ファージパニング溶液を適用し、抗ＶＥＧＦ抗体を抗体ファージライブラリーから単離した。ファージライブラリーを、４μｇ／ｍｌの最終濃度で、ビオチン化ＶＥＧＦ１６５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）（第１回および第３回パニング用にヒトＶＥＧＦ１６５、第２回および第４回パニング用にｍＶＥＧＦ１６４）とともにインキュベートした。３０分間のインキュベーション後、ＶＥＧＦに結合したファージを、ストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することにより溶液から捕捉し、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で予洗し、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。ビーズに捕捉されたファージを１００ｍＭのＴＥＡ緩衝液で溶出させ、１Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）で中和し、次に溶出したファージ１ｍｌを用いて、ファージ増幅のため、５ｍｌの対数期ＴＧ１および４ｍｌの２ＹＴ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）に感染させた。ウォーターバス内、３７℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を４０００ｇで遠心沈殿させ、２ＹＴに再懸濁し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％グルコースを有する２ＹＴ寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ）上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。２日目、コロニーを寒天プレートから収集し、ＯＤ６００＝０．１の最終密度で２ＹＴ培地に接種し、３７℃で対数期まで増殖させ、ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に感染させ、次にカルベニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を有する２ＹＴ中、３０℃で一晩増殖させておき、高力価のファージを作製した。増幅したファージをＰＥＧ８０００で沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁し、標準的手順を用いて次回のパニング用に用いた。４回全部のパニングを適用し、ＶＥＧＦ特異抗体を単離した。パニングの初回における２×１０５ｐｆｕから第４回における４×１０７ｐｆｕにかけての結果的なファージ数の有意な増加が認められた。
【００９２】
実施例２：ＶＥＧＦ特異抗体のスクリーニング
４回目のパニングからの個別のファージＦａｂの特異性をファージＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルマイクロタイタープレートを、４０℃、ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＶＥＧＦ１６５で一晩コーティングした。ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄後、３７℃、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、４％スキムミルク）で１時間ブロッキングした。次に、５０μｌ／ウェルのファージを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１：１，０００に希釈したブロッキング緩衝液中の西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートマウス抗Ｍ１３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５０μｌを３７℃で３０分間添加した。検出のため、５０μｌ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を室温で５分間添加し、ＴＭＢ停止溶液（ＫＰＬ）５０μＬを添加することにより反応を停止させた。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。４回のパニング後、クローンの５０％超が、約０．０５の非特異的なバックグラウンド読み取り値よりも２０倍高い、１より高い吸光度で、ＶＥＧＦに特異的である。代表的データを表１に示す。
【００９３】
【表１】
2019528074.tif 000014
【００９４】
実施例３−クローンＥ０６のヒトおよびマウスＶＥＧＦへの結合
初期のファージスクリーニング後、マウスＶＥＧＦ１６４との交差反応性を有する１つのクローン（Ｅ０６）を、標準的な分子生物学の材料および方法を用いて、さらに変換し、完全長ＩｇＧとして発現させた。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、４℃、ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌの濃度、５０μｌ／ウェルのヒトおよびマウスのＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１２１で一晩コーティングした。ウェルを、０．１％ツイーン２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄後、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、４％スキムミルク）でブロッキングした。室温で１時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ブロッキング緩衝液中の抗体の２倍連続希釈物（８ｎＭから開始）を添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体溶液をＰＢＳＴでの洗浄により除去し、その後、ＰＢＳＴ中で調製した抗ヒト−Ｆｃ−ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：３０００希釈物とともに室温で１時間インキュベートした。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）５０μＬの室温で５分間の添加により結合を可視化し、ＴＭＢ停止溶液（ＫＰＬ）５０μＬを添加することにより反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて測定した。Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、データを分析した。
【００９５】
抗体Ｅ０６においては、ヒトＶＥＧＦ１６５およびマウスＶＥＧＦ１６４に対して同様の結合活性が認められ、ＥＣ５０は各々、０．０４８ｎＭおよび０．０４９ｎＭであった。予想通り、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（抗ＶＥＧＦ抗体）は、ヒトＶＥＧＦ１６５に対して強力な結合を示したが、マウスＶＥＧＦ１６４に対して検出可能な結合を示さなかった。アイソタイプ対照抗体Ｒ３４７は、ＶＥＧＦのヒトまたはマウス形態のいずれにも結合しなかった。代表的データを図１に示す。
【００９６】
抗体Ｅ０６がＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（抗ＶＥＧＦ抗体）よりも異なるエピトープに結合するか否かを評価するため、ヒトＶＥＧＦ１２１を用いてＥＬＩＳＡアッセイを実施した。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（抗ＶＥＧＦ抗体）は、ヒトＶＥＧＦ１２１に対して非常に強力な結合を示した。しかし、Ｅ０６については、結合は検出されず、これは抗体Ｅ０６がＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（抗ＶＥＧＦ抗体）よりも異なるエピトープに結合することを示す。アイソタイプ対照抗体Ｒ３４７もまた、ヒトＶＥＧＦ１２１に対する結合を全く示さなかった。代表的データを図２に示す。
【００９７】
実施例４−クローンＥ０６の生殖系列
クローンＥ０６のフレームワーク配列を、その最も近い生殖系列配列に一致するように設計した。ＩｇＧ生殖系列遺伝子データベースに対する配列分析によると、Ｅ０６  ＶＬ配列が生殖系列遺伝子ＶＫ３−ＮＬ５＊０１に最もよく一致し、ＶＬの１、３、４および８６位に４つのアミノ酸差異を伴うことが示された。ＶＨ配列は生殖系列遺伝子ＶＨ３−２３＊２と同一であるが、Ｔ９８は、この位置でＲまたはＫの最も保存された生殖系列アミノ酸と異なる。生殖系列Ｅ０６に対して、４つの変異体を設計し、発現させた。これらの変異体は、Ｅ０６配列が最もよく一致した生殖系列遺伝子と異なる位置で、生殖系列遺伝子にコードされるアミノ酸と部分的または全体的に置換される。例えば、Ｍ１は、ＶＬにおけるＤ１Ｅ／Ｑ３Ｖ／Ｍ４Ｌ置換およびＶＨにおけるＴ９８Ｒ置換を有し；Ｍ４は、ＶＬにおけるＤ１Ｅ／Ｑ３Ｖ／Ｍ４Ｌ／Ｔ８６Ｖ置換を有し；Ｍ７は、ＶＬにおけるＤ１Ｅ／Ｑ３Ｖ／Ｍ４Ｌ／Ｔ８６Ｖ置換およびＶＨにおけるＴ９８Ｒ置換を有し；またＦ１は、ＶＬにおけるＤ１Ｅ／Ｑ３Ｖ／Ｍ４Ｌ置換を有し、ここで最初の文字は元の１文字アミノ酸コードを表し、２番目の文字は、生殖系列配列の１文字アミノ酸コードを表す。図３は、親Ｅ０６および最も相同な生殖系列遺伝子の配列アラインメントを示す。
【００９８】
生殖系列変異体をＦａｂとして発現させ、精製し、それらの組換えＶＥＧＦ１６５への結合をＥＬＩＳＡにより判定した。結合結果は、完全または部分ＶＬ生殖系列アミノ酸置換を有する生殖系列変異体Ｍ４およびＦ１がＥ０６  ＷＴ  Ｆａｂ結合活性を保持することを示した。さらに、Ｍ４は、ＨＵＶＥＣを用いるｐＶＥＧＦＲ２アッセイにおいて、ＷＴ  Ｅ０６  Ｆａｂと比べて類似した活性を示した。他方、Ｔ９８位にＶＨ生殖系列アミノ酸置換を有する生殖系列変異体Ｍ１およびＭ７が結合およびｐＶＥＧＦＲ２のリン酸化を著しく低下させたが、これはＴ９８が結合および活性に関与し、保持される必要があることを示す。生殖系列クローンＭ４は、さらなる親和性最適化のための鋳型として用いた。
【００９９】
実施例５−親和性最適化
ハイブリダイゼーション突然変異誘発方法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８２，ｐｐ．４８８−４９２，１９８５）を用いて、生殖系列クローンＭ４の６つ全部のＣＤＲの各アミノ酸を、その他の２０のアミノ酸に個別に突然変異させた。２つのＤＮＡプライマーセット（一方は８つのアミノ酸をコードするＮＳＳコドンを有し、他方は１２の異なるアミノ酸をコードするＮＷＳコドンを有する）を用いて、標的化される各ＣＤＲ位置に突然変異を導入した。ハイブリダイゼーション突然変異誘発反応において、個別の縮重プライマーを用いた。つまり、各縮重プライマーをリン酸化し、ウリジニレーテッド（ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ）Ｍ４  Ｆａｂ  ｓｓＤＮＡとともに１０：１の比で用いた。混合物を９５℃に加熱し、次に１時間かけて５５℃まで冷却した。その後、Ｔ４リガーゼおよびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを添加し、混合物を３７℃で１．５時間インキュベートした。ＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲにおける合成生成物を各々プールしたが、ＮＳＳおよびＮＷＳライブラリーを別々に維持し、独立的にスクリーニングした。典型的には、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌叢上でのプラーク形成のため、またはＦａｂ断片の作製のため、プールしたライブラリーＤＮＡ１μＬをＸＬ１−Ｂｌｕｅに電気穿孔した（Ｗｕ  Ｈ，ＡｎＬＬ．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；２０７：２１３−３３）。次に、これらの突然変異体を活性についてスクリーニングした。
【０１００】
一次スクリーニングは、他の箇所に記載の通り、９６ウェルプレート（ディープウェル）内で増殖され、個別の組換えＭ１３クローンに感染した細菌の培養上清を用いて実施される単一点ＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）アッセイからなった（Ｗｕ  Ｈ，ＡｎＬＬ．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；２０７：２１３−３３）。つまり、この捕獲ＥＬＩＳＡは、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅの各ウェルを、ｐＨ８．５の炭酸塩緩衝液中、約５０ｎｇのヒツジ抗ヒトＦｄ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＭＥ）で、４℃で一晩コーティングすることを含んだ。翌日、プレートを、ＰＢＳ緩衝液中３％ＢＳＡで、室温で１時間ブロッキングした。次に、Ｆａｂ上清をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化ＶＥＧＦ１６５タンパク質をウェルに添加し、混合物を室温で１．５時間インキュベートした。この後、ニュートラアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ）とともに室温で約４０分間インキュベートとした。ＨＲＰの活性をテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で検出し、反応物を０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４でクエンチした。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０１０１】
親クローンＭ４  Ｆａｂよりも大きい４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）シグナルを示すクローンを選別し、再増殖させ（１５ｍＬ）（Ｗｕ  Ｈ，ＡｎＬＬ．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；２０７：２１３−３３）、（上記の）ＥＬＩＳＡにより二通りに再アッセイし、陽性結果を確認した。Ｍ４  Ｆａｂの場合よりも大きいシグナルを繰り返し示すクローンを配列決定した。次に、ＣＤＲ変化を有する各クローンのＦａｂタンパク質濃度を定量ＦａｂのＥＬＩＳＡにより判定し、ここでは既知の濃度を有するＦａｂを参照として用いた。Ｆａｂ濃度は、ＥＬＩＳＡシグナルを参照Ｆａｂによって生成されるシグナルと比較することにより判定した。突然変異体Ｆａｂと親Ｍ４  Ｆａｂとの相対的結合親和性を判定するため、すべての陽性変異体について、正規化されたＦａｂ濃度下で結合アッセイをもう一回反復した。
【０１０２】
多数の点突然変異が、ＶＥＧＦ１６５に対する結合でＭ４を上回る改善を示した。それら突然変異体の中で、Ｄ０４、Ｊ０５、およびＩ２０は、Ｆａｂとして生殖系列Ｅ０６と比べてＥＣ５０における１０倍を超える改善を示した。代表的データを図４に示す。配列分析によると、ＶＥＧＦ１６５結合に利点をもたらすアミノ酸置換が、ＶＬ、特にＶＬ−ＣＤＲ３中に見出されることが示された。例えば、突然変異体Ｊ０５における点突然変異Ｓ９４Ｒが結合をＥ０６よりも約２５倍改善したが、結合におけるこのアミノ酸の重要な寄与が示される。
【０１０３】
次に、改善された結合を示す点突然変異体を、部位特異的変異誘発方法を用いて組み合わせた。組み合わせ突然変異体をＦａｂおよびＩｇＧとして発現させ、ＶＥＧＦ１６５のＥＬＩＳＡにて試験した。代表的データを図５に示す。
【０１０４】
組み合わせ突然変異体は、ＥＬＩＳＡアッセイにて、点突然変異体Ｊ０５よりも有意に高い結合を示した。組み合わせ突然変異体の見かけ上の結合親和性が、ＦａｂとしてＪ０５よりも約３〜１０倍改善された。同様に、ＩｇＧとして試験したすべての組み合わせ突然変異体が、結合における親クローンＥ０６と比べて有意な改善を示した。親和性最適化クローンの平衡結合定数（ＫＤ）は、ＫｉｎＥｘＡを用いる尺度であった。代表的データを表２に示す。点突然変異体および組み合わせ突然変異体の配列を表３に示す。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
実施例６−ヒトＶＥＧＦ１６５に対するＡｖａｓｔｉｎ、Ｅ０６および親和性最適化Ｅ０６変異体の結合におけるＫＤの測定
平衡結合定数（ＫＤ）測定を、ＫｉｎＥｘＡ  ３０００および３２００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）で実施した。ヒトＶＥＧＦ１６５（ｈｕＶＥＧＦ）タンパク質を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９）中、２ｕｇ／ｍＬ、３ｕｇ／ｍＬ、および３０ｕｇ／ｍＬの濃度で、ＵｌｔｒａＬｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔビーズ（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上にコーティングした。次に、コーティングされたビーズを未反応のｈｕＶＥＧＦタンパク質溶液から分離し（スピン）、室温、ＢＳＡを１０ｍｇ／ｍＬで含有する）１Ｍトリス（ｐＨ８）で約１５分間ブロッキングした。この後、ブロッキング溶液を除去するため、ビーズスラリーを回転させ、次にブロッキングステップを、新しいブロッキング緩衝液を用いて約２時間反復し、使用まで４℃で貯蔵した。使用前、ｈｕＶＥＧＦでコーティングされたビーズをビーズバイアルに移し、約２７ｍＬの機器緩衝液（１０ｍＭヘペス＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２＋０．０５％Ｐ２０＋０．０２％ＮａＮ３，ｐＨ８）に再懸濁し、ＫｉｎＥｘＡ機器にかけた。ＫＤ測定のため、抗体の個別の溶液を、ＢＳＡ（ｍｇ／ｍＬ）を含有する機器緩衝液中、１００ｐＭおよび２．５ｎＭの濃度で調製し、２つの別々の一連の１３チューブに分注した。ｍＡｂのこれらの濃度は、受容体およびＫＤの双方が制御される条件下で各ＫＤの測定ができるように選択し、それにより試薬の活性および親和性各々のより厳密な推定につながった。その比較的弱いＫＤのおかげで、ｍＡｂ  ＥＯ６−ｗｔにおける３番目の濃度シリーズ（５０ｎＭ）もまた調製し、完全に受容体が制御される測定における要件を満たした。次に、ｈｕＶＥＧタンパク質の２倍連続希釈物を各ｍＡｂシリーズにおけるチューブの９つを通じて、その後２つのさらなる１０倍希釈物を滴定し、１つのチューブをｍＡｂのみの「ゼロ」対照として残した。そのように行うことで、これにより、ｈｕＶＥＧＦタンパク質の４８８ｆＭ〜２５ｎＭ（１００ｐＭのｍＡｂ実験）、３．９１ｐＭ〜２００ｎＭ（２．５ｎＭのｍＡｂ実験）、および９．７７ｐＭ〜５００ｎＭ（５０ｎＭのｍＡｂ実験）を範囲とする一連の濃度が得られた。ソフトウェアベンダー（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）を通じて利用可能な理論曲線のシミュレーションに基づき、混合物を室温で１〜４日インキュベートし、結合を平衡に到達できた。この期間の終了時、各測定セットにおける適切な稼動条件を決定するため、シグナル試験の実験を行った。ＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬで含有する機器緩衝液中、０．７５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬで用いる種特異的な二次抗体試薬（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＤｙＬｉｇｈｔ６４９、パート番号１０９−４９５−０８８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、遊離抗体の検出が可能になった。次に、平衡ＫＤを得るため、各ｍＡｂ／ｈｕＶＥＧＦ相互作用において得られたデータを、該ベンダーのソフトウェアを用いて１サイト結合モデルに同時にフィッティングした。親和性最適化クローン��ＫＤをＫｉｎＥｘＡを用いて測定した結果を表２にまとめた。
【０１０８】
実施例７−親和性最適化変異体のマウスＶＥＧＦ１６４への結合についてのアッセイ
マウスＶＥＧＦ１６４以外でＶＥＧＦ１６５のＥＬＩＳＡについて前述したように、マウスＶＥＧＦ１６４への結合を確認するため、親和性最適化変異体をスクリーニングした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）における非線形回帰分析（ログ用量反応、４パラメータフィット曲線）を用いて、ＥＣ５０値を判定した。代表的データを図６に示す。すべての親和性最適化変異体が、親Ｅ０６抗体と同様、マウスＶＥＧＦ１６４に対する強力な結合を示した。
【０１０９】
実施例８−親和性最適化変異体のＶＥＧＦ１２１への結合についてのアッセイ
ＶＥＧＦ１６５のＥＬＩＳＡについて前述したように、ＥＬＩＳＡにおけるヒトＶＥＧＦ１２１への結合低下を確認するため、親和性最適化変異体をスクリーニングした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）における非線形回帰分析（ログ用量反応、４パラメータフィット曲線）を用いて、ＥＣ５０値を判定した。代表的データを図７に示す。ＶＥＧＦ１２１結合は、Ｊ０５、Ｈ１Ｒ、およびＨ１ＤＲについて、ＶＥＧＦ１２１への強力な結合（０．００６３ｎＭのＥＣ５０）を有するＶＥＧＦ陽性対照抗体と比べて低下した。
【０１１０】
実施例９−親和性最適化変異体のＶＥＧＦ１８９への結合についてのアッセイ
親和性最適化変異体のＶＥＧＦ１８９への結合についてスクリーニングは、ＥＬＩＳＡフォーマットである。９６ウェルハーフウェルのマキシソーププレートを、Ｃａ＋＋またはＭｇ＋＋の不在下、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ１８９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）２５μｌでコーティングし、一晩冷蔵する。プレートをデカントし、次に１８０μｌの３％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−３０５９）および１倍ＰＢＳ中０．１％ツイーン２０で、３７℃で１．５時間ブロッキングする。プレートを、０．１％ツイーン２０を含有する１倍ＰＢＳで３回洗浄する。ブロッキング緩衝液中、５０μｌの６．７ｎＭおよび連続希釈物の親和性最適化変異体、陽性対照、および陰性対照を二通りに添加し、３７℃で１時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次に５０μｌの１：５０００のヤギ抗ヒトＨＲＰ  ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。プレートを５０μｌのＴＭＢ溶液（ＫＰＬ）を各ウェルに添加することにより展開し、次に反応を５０μｌの１Ｍリン酸で停止させる。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを４５０ｎｍで読み取る。親和性最適化変異体は、ＶＥＧＦ１８９への結合における低下を示す。
【０１１１】
実施例１０−親和性最適化変異体の効力を比較するための機能細胞に基づくアッセイ
親和性最適化変異体の効力を確認するため、ヒトおよびマウスｐＶＥＧＦＲ２細胞に基づくアッセイを前述のように実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）における非線形回帰分析（ログ用量反応、４パラメータフィット曲線）を用いて、ＥＣ５０値を判定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン５．０１（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）における非線形回帰分析（ログ用量反応、４パラメータフィット曲線）を用いて、ＥＣ５０値を判定した。代表的データを図８Ａおよび８Ｂに示す。クローンＪ０５、Ｈ１Ｒ、およびＨ１ＤＲが、ヒトｐＶＥＧＦＲ２アッセイにおいて最大で２０倍の改善を示した（ＥＣ５０範囲が２．６〜１０．１５ｎＭ）対Ｅ０６親対照（ＥＣ５０＝５２．２５ｎＭ）（図８Ａ）一方で、マウスｐＶＥＧＦＲ２アッセイにおける改善は、親抗体と比べて最大で２倍であった（ＥＣ５０範囲が２．３８〜３．５７ｎＭ対５．３４ｎＭ（図８Ｂ））。
【０１１２】
実施例１１−インビボ活性ＯＦ親和性最適化Ｅ０６変異体．
親和性最適化変異体のインビボ活性についての試験を網膜脈管形成モデル、ならびに７８６−０腎細胞がんおよびＢｘＰＣ３膵がんモデルにて実施する。これらのモデルに加えて、血小板減少症モデルにおける評価を実施する。
【０１１３】
網膜脈管形成モデルにおいては、ＣＤ１マウスに対し、出生時、１、３、および５日目に腹腔内に投与した。８日目、マウスに対し、麻酔し、フルオレセイン標識デキストランを注入した。眼を取り除き、フラットマウントの調製前に１０％ホルマリンで固定した。フラットマウントを蛍光顕微鏡により試験した。新生児網膜血管新生は、２つのプロセス、すなわち視神経から網膜の縁への血管遊走および分岐からなる。未治療群と比べて、Ｈ１ＲＫの存在下での分岐における低下が認められる。代表的データを図９に示す。Ｈ１ＲＫは、軽鎖が１０７位（１０７での生殖系列が改変された位置）にリジンの代わりにトレオニンを有する点でＨ１Ｒと異なる。
【０１１４】
７８６−０腎細胞がんモデルにおいては、７８６−０断片を右側腹部に皮下移植する。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達してから、マウスに治療を施す。マウスを週に２回、全部で６回用量にわたり治療する。親和性最適化変異体は、腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減において有効性を示す。腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減に加えて、親和性最適化変異体はまた、腫瘍脈管構造を減少させる。つまり、マウスに対し、血液凝固を防止するため、安楽死の１５分前にヘパリンで前処置する。０．１ｍＭナトリウムニトロプルシドの溶液を、約６ｍＬ／分の速度で灌流する。Ｍｉｃｒｏｆｉｌ  ＭＶ−１２２を、ラテックス８ｍＬ、希釈剤１０ｍＬおよび治療剤９００ｕＬを混合することにより調製する。混合物が定着後（１分）、１７ｍＬの総体積が投与されるまで、それを約２ｍＬ／分の速度で灌流する。６０〜９０分後、腫瘍を切断し、１０％ＮＢＦ中に２４時間浸漬する。次に、試料を各々、２４時間で、２５％ＥＴＯＨ／ＰＢＳ、５０％ＥＴＯＨ／ＰＢＳ、７５％ＥＴＯＨ／ＰＢＳ、９５％ＥＴＯＨ、そして次に１００％ＥＴＯＨに移行させる。最終のインキュベーション後、光学顕微鏡によるイメージング前に脱水した腫瘍試料を清澄化するため、試料をサリチル酸メチルに浸漬する。
【０１１５】
ＢｘＰＣ３膵がんモデルにおいては、雌の重症複合免疫不全マウスの右側腹部に皮下移植する。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達してから、マウスに治療を施す。マウスに週に２回、全部で６回用量にわたり治療する。親和性最適化変異体は、腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減において有効性を示す。腫瘍増殖の低下、腫瘍体積の減少、または腫瘍増殖および腫瘍体積の低減に加えて、親和性最適化変異体はまた、腫瘍脈管構造を減少させる。
【０１１６】
血小板減少症モデルにおいては、Ｍｅｙｅｒら、２００９年（Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７：１７１−８１，２００９）から採用される方法を用いる。つまり、８〜１６週齢のＦＣγ受容体２Ａトランスジェニックマウスに対し、予備混合したＶＥＧＦ１６５、０．６単位のヘパリン、および親和性最適化変異体を側方尾静脈に注射する。次に、マウスを窮迫の行動徴候について観察し、（−）コーナー間を常に停止および移動、正常な呼吸、（＋）嗜眠の徴候、より長い持続時間での停止および移動、浅い呼吸、（＋＋）非常に嗜眠的、移動の停止、ボックスの概ね片側に滞在、深い呼吸、（＋＋＋）重度の血栓事象−攣縮およびトワリング（ｔｗｉｒｌｉｎｇ）、（＋＋＋＋）死亡、としてスコア化する。親和性最適化変異体は、抗ＶＥＧＦ対照と比べて血小板減少症における低下を示す。
【０１１７】
参照による援用
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書中に引用されるすべての参考文献、およびそれらに引用される参考文献は、あらゆる目的でそれらの全体が参照により本明細書中に援用されることがまだなされていないが、ここでなされる。
【０１１８】
均等物
前述の明細書文書は、当業者が実施形態を実行することを可能にするのに十分であると考えられている。しかし、上文がテキストでいかに詳細に述べられていても、実施形態が多くの方法で実行されてもよく、特許請求の範囲がその任意の均等物を含むことは理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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