【手続補正書】
【提出日】平成19年8月30日(2007.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】 選択されたタンパク質におけるペプチド領域に高い親和性で結合するポリペプチドを同定するための方法であって、該ペプチド領域が該選択されたタンパク質の反発ペプチド領域と隣接しており、
ａ）該選択されたタンパク質の少なくともドメインの全長配列にわたる、短いオーバーラップ（overlapping）ペプチドのセットを提供することであって、該短いオーバーラップペプチドのセットは支持体に共有結合しており；
ｂ）該オーバーラップペプチドが共有結合している該支持体と、ポリペプチドの混合物とを、該支持体上の該ペプチドと該混合物中のポリペプチドとの間の結合が可能な条件下で接触させること；
ｃ）該混合物中の結合しなかったポリペプチドを該支持体から洗い流すこと；
ｄ）ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第１のセットを同定することであって、該第１のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第１領域を含んでなり、
ｅ）ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第２のセットを同定することであって、該第２のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第２領域を含んでなり、該第２のセットは第１のセットと連続して存在してはおらず、
ｆ）該第１のセットと第２のセットの間のセグメントを同定することであって、該セグメントは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域を含んでなり、該反発ペプチド領域は高親和性ペプチド領域に隣接しており、
第一ペプチド領域および第二ペプチド領域に結合するポリペプチドは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域に隣接するペプチド領域に高い親和性で結合するポリペプチドである、方法。
【請求項２】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】 支持体に結合したオーバーラップペプチドが、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を用いて合成される、請求項１記載の方法。
【請求項４】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが５アミノ酸〜１５アミノ酸である、請求項１記載の方法。
【請求項５】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが５アミノ酸〜１２アミノ酸である、請求項１記載の方法。
【請求項６】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが５アミノ酸〜１０アミノ酸である、請求項１記載の方法。
【請求項７】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが５アミノ酸〜７アミノ酸である、請求項１記載の方法。
【請求項８】 ポリペプチドの混合物が細胞リゼートを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項９】 選択されたタンパク質がヒトＰ−糖タンパク質１である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】 ポリペプチドがチューブリンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】 選択されたタンパク質がヒトＰ−糖タンパク質３である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】 支持体上に保持されるポリペプチドの同定が、ウェスタン・ブロット、該ポリペプチドの標識およびその標識されたポリペプチドの同定、質量分析、２Ｄゲル電気泳動、並びにそれらの組合せからなる群から選択される方法によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】 ポリペプチドに高い親和性で結合し、選択されたタンパク質の反発ペプチド領域に隣接する、選択されたタンパク質におけるペプチド領域を同定するための方法であって、
ａ）該選択されたタンパク質の少なくともドメインの全長配列にわたる、短いオーバーラップ（overlapping）ペプチドのセットを提供することであって、該短いオーバーラップペプチドのセットは支持体に共有結合しており；
ｂ）該オーバーラップペプチドが結合している該支持体と、ポリペプチドとを、該支持体に結合したペプチドと該ポリペプチドとの間の結合が可能な条件下で接触させること；
ｃ）結合しなかったポリペプチドを該支持体から洗い流すこと；
ｄ）ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第１のセットを同定することであって、該第１のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第１領域を含んでなり、
ｅ）ポリペプチドが結合した連続したオーバーラップペプチドの第２のセットを同定することであって、該第２のセットは高い親和性でポリペプチドと結合する第２領域を含んでなり、該第２のセットは第１のセットと連続して存在してはおらず、
ｆ）該第１のセットと第２のセットの間のセグメントを同定することであって、該セグメントは選択されたタンパク質の反発ペプチド領域を含んでなり、該反発ペプチド領域は高親和性ペプチド領域に隣接しており、
それにより、ポリペプチドに高い親和性で結合し反発ペプチド領域に隣接する選択されたタンパク質におけるペプチド領域が同定される、方法。
【請求項１４】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートからなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】 支持体に結合したオーバーラップペプチドが、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を用いて合成される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが５アミノ酸〜１５アミノ酸である、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが５アミノ酸〜１２アミノ酸である、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが５アミノ酸〜１０アミノ酸である、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】 支持体に結合したオーバーラップペプチドの各々の長さが５アミノ酸〜７アミノ酸である、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】 選択されたタンパク質がヒトＰ−糖タンパク質１である、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】 ポリペプチドがチューブリンである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】 選択されたタンパク質がヒトＰ−糖タンパク質３である、請求項１３記載の方法。
【請求項２３】 ポリペプチドが選択されたタンパク質と結合する、選択されたタンパク質におけるペプチドを同定することをさらに含んでなる、請求項１３記載の方法。
【請求項２４】 ポリペプチドと結合する、選択されたタンパク質におけるペプチドが、支持体上のその位置によって同定される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】 支持体に共有結合した、選択されたタンパク質の全長配列、そのドメインまたはその一部にわたるオーバーラップペプチドのセットと、細胞タンパク質の混合物であるタンパク質の混合物との間の、高親和性ドメイン間の相互作用を調節する試薬を同定するための方法であって、
ａ）該オーバーラップペプチドのセットと該混合物とを、少なくとも１つの試薬の存在下、該セットのペプチドにおける高親和性相互作用ドメインと、該混合物の１またはそれ以上のタンパク質またはペプチドとの間の結合が可能な条件下でインキュベーションすること；
ｂ）（ａ）の高親和性相互作用でないタンパク質−タンパク質相互作用を洗い流すこと；および
ｃ）その試薬の非存在下と比較して、該試薬の存在下で高い親和性でもって該混合物のタンパク質またはペプチドと相互作用する（ａ）のペプチドを同定すること
を含んでなり、
それにより、該相互作用について該試薬の存在下と非存在下との差が測定可能であるとき、該試薬が該高親和性相互作用の調節物質として同定される、方法。
【請求項２６】 タンパク質の混合物および／またはペプチドの混合物が標識を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】 該オーバーラップペプチドのセットが選択されたタンパク質の配列を用いて合成される、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】 支持体が、チップ、ビーズおよびプレートから選択される、請求項２５、２６または２７記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プロテオノミクス（ｐｒｏｔｅｏｎｏｍｉｃｓ）に関する。さらに具体的には、本発明は、タンパク質間相互作用、並びに相互作用するタンパク質および相互作用部位のアミノ酸配列を同定するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
特異的なタンパク質間相互作用は、生物学的過程において非常に重要な事象である。細胞の情報の流れを処理し細胞の決定をコントロールする生物学的過程は、タンパク質間相互作用に支配される（例えば、情報伝達、細胞周期の調節および細胞構造の組み立て）。細胞のタンパク質間相互作用の全ネットワークは、生体内の活動および外部の情報に対するその生体の応答を調節する機能的な事象の生物学的なチャートである。この生物学的な相互作用のチャートの完成に欠くことのできない工程は、ある特定の生体におけるすべての遺伝子配列に関する知識である。ホモサピエンスゲノムの全ＤＮＡ配列は、少なくとも２００３年までには完成するであろう（１１２）。あいにく、遺伝子の配列は、その生物学的機能も生物学的なチャートにおけるその位置付けも明らかにするものではない。ヒトゲノムにおけるタンパク質の数は予想されており（８０,０００〜１２０,０００）、タンパク質間相互作用の生物学的なチャートのマッピングは途方もない事業ではあるがやり甲斐はある。
【０００３】
過去２０〜３０年の間に、タンパク質間相互作用を測定するための技術がいくつか開発されている（参考として（８２）参照）。これらの技術には、ｉ）相互作用するタンパク質を選択し検出する物理的な方法［例えばタンパク質アフィニティークロマトグラフィー、共免疫沈降、架橋、およびアフィニティーブロッティング］、ｉｉ）ライブラリーに基づく方法［例えば、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステム］；およびｉｉｉ）遺伝的方法［例えば過剰産生表現型、合成的致死効果（synthetic lethal effects）および同一連鎖群に属さない非相補性（unlinked noncomplementaion）］が含まれる。タンパク質間相互作用を検出する上記の方法のうち、ツーハイブリッドシステムが最も一般的で、最も広く使用されている。古典的なツーハイブリッドシステム（３０）では、リポーター遺伝子の転写が、ＤＮＡが結合した“おとり”タンパク質と、活性化ドメインを含む“捕獲”タンパク質との間の相互作用に依存する。あいにく、ツーハイブリッドシステムは多くの欠点に悩まされることがある。例えば、タンパク質の相互作用は、大部分のタンパク質が存在する細胞質ではなく核周囲で観察され、２つの相互作用するタンパク質の間の正確なアミノ酸配列が同時に同定できず、異なる相互作用するタンパク質が発現し得る異なる細胞種または組織に対して容易に応用することができない。
【０００４】
小さい合成ペプチドがタンパク質に結合することができることは以前に実証されている（１、１８、５５、１０２）。しかし、相互作用するタンパク質ドメインおよび配列を同定する系統的手法における合成ペプチドの使用は提唱も提供もされていない。ある特定のシグネイチャードメインは、特定のペプチド配列に高い親和性で結合することが示されている（例えば、ＳｒｃファミリーキナーゼのＳｒｃホモロジー−２またはＳＨ２ドメインは、上皮成長因子受容体およびフォーカルアドヒージョンキナーゼにおいてみられるリン酸化されたチロシン（Ｙ*−ＥＥＩ）配列に強固に結合する）（６１）。
【０００５】
したがって、ｉ）相互作用するタンパク質間の少なくとも１つの結合パートナーの正確なアミノ酸配列；ｉｉ）異なる細胞または組織における、多くの、恐らくはすべての相互作用するタンパク質；およびｉｉｉ）リード薬物の単離の標的としての、２つの相互作用するタンパク質間の特定のドメイン（または配列）の同定を可能にする方法を提供する必要がある。さらに、従来の方式よりも著しく速い（例えば、数か月ではなく数日）、タンパク質の相互作用ドメインの正確なアミノ酸配列の同定を可能にする方法および分析を提供する必要がある。
【０００６】
本発明は、これらおよび他の必要性を満たすことを目的とする。
【０００７】
本記載は、数多くの文献を参考のために引用し、その全内容が本明細書の一部を構成する。
【０００８】
（発明の要約）
本発明は、従来技術の欠点を克服することを目的とする。より具体的には、本発明は、従来技術と異なるタンパク質間相互作用ドメインを同定するための方法に関する。さらに、本発明の１つの方法は、タンパク質間相互作用を支配する原理についての理解に基づいている。したがって、そのような理解は、いくつかの方法の使用を可能にする。以下に、次のものを同定するためのそのような方法が詳細に例示される：ｉ）相互作用するタンパク質間の少なくとも１つの正確なアミノ酸配列；ｉｉ）異なる細胞または組織における、多くの、恐らくはすべての相互作用するタンパク質；およびｉｉｉ）リード薬物の単離の標的としての、２つの相互作用するタンパク質間の特定のドメイン（または配列）。好ましくは、本発明の方法および分析は、ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）の測定を可能にする。さらに、従来技術の手法と異なり、本明細書に記載の方法は、相互作用するタンパク質および相互作用の正確なアミノ酸配列の同定が数か月ではなく数日で可能である。
【０００９】
ある遺伝子産物といくつかのパートナーその他との間の相互作用をブロックするタンパク質（あるいはその他の分子）を選択する能力は、ヒト細胞や他の現在取り扱いが難しい系における、細胞情報伝達または細胞代謝の高度な調節を可能にする。実際、治療上重要なタンパク質と相互作用するタンパク質の同定、および相互作用部位の同定は、“ノックアウト”などの他の遺伝的手法（７１）よりも医薬品開発に適しているかもしれない。これは、多量体の複合体における１つのタンパク質（すべてではなく、せいぜい２、３個のタンパク質）の相互作用を阻害するのとは異なり、ある特定のタンパク質が関与するすべての相互作用を破壊することによる、表現型における帰結を取り扱うものである。
【００１０】
本発明はさらに、薬物の発見における新規の手法に関する。疾患を処置するための薬物の開発における主な障害は、標的タンパク質とその機能部位の同定であった。事実、製薬会社における大部分の研究開発（Ｒ＆Ｄ）事業は、有効な標的タンパク質を同定するまでに数年を要する。結合してこれらのタンパク質の機能を阻害する薬物の選択には数年を要し、一般的にこれは非特異的で無秩序なものである。さらに、現在の手法によって同定される薬物は、タンパク質の活性部位を標的としていることが多い。つまり、そのような薬物は重大な副作用につながることが多い。したがって、多くのＲ＆Ｄ事業が徹底的な研究努力を３〜５年続けても具体的な薬物の開発に決してつながらないというのは、驚くべきことではない。本発明のタンパク質間相互作用を同定するための方法および分析は、薬物の開発における次の３つの重要な工程を扱うものである：
１）標的タンパク質における相互作用するすべてのドメインのアミノ酸配列の同定；
２）薬物開発のための、相互作用するタンパク質（好ましくは相互作用するすべてのタンパク質）のセットの同定；および
３）標的タンパク質において相互作用するドメインの各々に対して特異的な薬物のスクリーニング。
【００１１】
Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、親油性の抗癌剤で選択された腫瘍細胞系において多剤耐性を引き起こすことが示されている。Ｐ−ｇｐアミノ酸配列の解析は、約９０アミノ酸の高度に荷電した領域、即ちリンカードメイン、によって連結された２つの疎水性と親水性のドメインを有する二重分子の提唱モデルが導かれた。同じように荷電したドメインがＰ−ｇｐスーパーファミリーの他の分子において見つかっているが、このドメインの機能はわかっていない。本発明の方法を用いて、このドメインが他の細胞タンパク質と結合することをここに実証する。ヒトのＰ−糖タンパク質遺伝子１および３（ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３）のリンカードメインの全アミノ酸配列にわたる、オーバーラップへキサペプチドを用いて、ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３リンカードメインと細胞内タンパク質との間の直接的且つ特異的な結合がここに示される。リンカードメインにおける３つの異なる鎖（ＨＰ−ｇｐ１に対しては617ＥＫＧＩＹＦＫＬＶＴＭ627（配列番号１）, 658ＳＲＳＳＬＩＲＫＲＳＴＲＲＳＶＲＧＳＱＡ677（配列番号２）および694ＰＶＳＦＷＲＩＭＫＬＮＬＴ706（配列番号３）そしてＨＰ−ｇｐ３に対しては618ＬＭＫＫＥＧＶＹＦＫＬＶＮＭ631（配列番号４）, 648ＫＡＡＴＲＭＡＰＮＧＷＫＳＲＬＦＲＨＳＴＱＫＮＬＫＮＳ674（配列番号５）および695ＰＶＳＦＬＫＶＬＫＬＮＫＴ677（配列番号６））が、みかけの分子量約８０ｋＤａ、５７ｋＤａおよび３０ｋＤａを有するタンパク質と特異的に結合する。興味深いことに５７ｋＤａのタンパク質だけが、リンカードメインの３つの異なる配列に、変化する程度でもって結合した。リンカー配列をコードするオーバーラップペプチドと５７ｋＤａのタンパク質との間の結合は、両イオン性界面活性剤であるＣＨＡＰＳに対して耐性であったが、ＳＤＳには感受性であった。５７ｋＤａのタンパク質の精製と部分的なＮ−末端アミノ酸配列の分析は、それがαおよびβチューブリンのＮ−末端をコードしていることを示した。さらに、αおよびβチューブリンに結合するモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティング分析によって、５７ｋＤａのタンパク質との同一性が確認された。これらをまとめると、これは、Ｐ−ｇｐリンカードメインとのタンパク質相互作用を示す最初の例である。もちろん、これはＰ−ｇｐの全体の機能に重要かもしれない。より重要なことに、この研究の結果は、高い反発性の結合エネルギーを有する少数のアミノ酸の鎖が２つのタンパク質間の相互作用に関わるという、新しい概念を実証するものである。
【００１２】
本発明の１つの態様に従えば、選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部における、高い親和性で相互作用するドメインおよびそのアミノ酸配列を同定するための方法であって、
ａ）選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部の配列の全長にわたる、共有結合により支持体に結合したオーバーラップペプチドのセットを用意すること；
ｂ）タンパク質の混合物および／またはペプチドの混合物を用意すること；
ｃ）（ａ）記載のオーバーラップペプチドのセットと（ｂ）記載の混合物とを、そのセットのペプチドにおける高い親和性で相互作用するドメインと（ｂ）記載のタンパク質またはペプチドの１またはそれ以上との間の結合を可能にする条件下でインキュベーションすること；
ｄ）（ｃ）の高い親和性の相互作用でないタンパク質間相互作用を洗い流すこと；および
ｅ）（ａ）記載のどのペプチドが、（ｂ）記載のタンパク質またはペプチドと高い親和性で相互作用するかを同定すること
を含み、それによって（ｅ）のペプチドおよびその配列が高い親和性で相互作用するドメインとして同定される、方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、選択されたタンパク質、そのドメインまたはその一部の配列の全長にわたる、共有結合により支持体に結合したオーバーラップペプチドのセットと、タンパク質の混合物および／またはペプチドの混合物との間の、高い親和性で相互作用するドメイン間の相互作用を調節する物質を同定するための方法であって、
ａ）そのオーバーラップペプチドのセットと、その混合物とを、そのセットのペプチドにおける高い親和性で相互作用するドメインと、その混合物のタンパク質またはペプチドの１またはそれ以上との間の結合を可能にする条件下、少なくとも１つの物質の存在下でインキュベーションすること；
ｂ）（ｂ）の高い親和性の相互作用でないタンパク質間相互作用を洗い流すこと；および
ｃ）（ａ）記載のどのペプチドが、その混合物のタンパク質またはペプチドと、その物質の存在下で、その物質の非存在下と比較して高い親和性で相互作用するかを同定すること
を含み、それによって、その物質の存在下での相互作用に、その物質の非存在下での相互作用に対する測定できる差異があるとき、その物質が高い親和性の相互作用の調節物質として同定される、方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の高い親和性のタンパク質の相互作用の調節物質として同定された物質が提供される。
【００１５】
本発明において、次の略語および用語を以下に定義する。
【００１６】
定義
用語「ペプチド配列にわたるオーバーラップペプチド」（例えばドメイン、完全長のタンパク質配列またはその一部）などは、そのタンパク質（またはその一部）の配列に基づく、選択された大きさのペプチドを意味する。好ましくは、これらのペプチドは合成ペプチドである。
【００１７】
以下に説明されるように、オーバーラップペプチドの大きさは本発明の作用に重要な影響を及ぼし得る。例えば、隣接する４個のアミノ酸のペプチドは、それに対するタンパク質の低い親和性の結合を有意に増加させるようである。さらに、例えば２０アミノ酸以上の、より大きなペプチドの使用は、高い親和性のアミノ酸に対する反発性のアミノ酸の比率を増加させると予想され、そのために、そのペプチドに特異的なタンパク質の結合がマスキングされるかまたは全体的に阻害される。したがって、より大きなペプチドではなく、小さいペプチドの選択に関して交換条件が存在すると当業者は理解するであろうが、本発明のオーバーラップペプチドに好ましい大きさは、５〜１５アミノ酸、より好ましくは５〜１２アミノ酸、さらに特に好ましくは５〜１０アミノ酸である。
【００１８】
本発明のオーバーラップペプチドが共有結合している支持体に関して、用語「支持体」は、当分野において得られる多数の支持体から選択することができる。そのような支持体には、チップ、プレート（例えば９６ウェルプレート）、ガラスビーズなどが含まれる。チップ法は当分野ではよく知られている（１０、１９、２４、２６、８５、９７）。
【００１９】
タンパク質配列は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名委員会の推奨に従って、当分野において一般的に使用されるような１文字または３文字のアミノ酸表記を用いて本明細書において示す。
【００２０】
特記しないかぎり、本明細書において使用される学術用語および技術用語および命名法は、本発明に関係する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学的方法などの手順は、当分野において用いられている一般的な方法である。そのような標準的な技術は、 レファレンスマニュアルに見ることができる（４、９６）。
【００２１】
本明細書の記載は、 主としてタンパク質、または組み換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術の用語に言及するものである。選択された例示は、明瞭かつ一貫させるために記載するものである。
【００２２】
本明細書において用いられているように、「核酸分子」は、ヌクレオチドのポリマーを意味する。その非限定的な例には、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）が含まれる。核酸分子はクローニング技術によって得るかあるいは合成することができる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい（コード鎖または非コード鎖［アンチセンス］）。
【００２３】
当分野で知られている用語「組換えＤＮＡ」は、ＤＮＡ断片の連結によって生じるＤＮＡ分子を意味する。これはしばしば遺伝子操作と呼ばれる。用語「ＤＮＡ断片」は、ヌクレオチドの直鎖状の鎖または配列を含んでなるＤＮＡ分子を意味するために本明細書において用いられる。遺伝暗号に従って読まれれば、この配列は、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片などと呼ばれるアミノ酸の直鎖状の鎖または配列をコードすることができる。
【００２４】
用語「増幅ペア」は本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチド（オリゴ）のペアを意味し、これは多くのタイプの増幅方法うちの１つ、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応による、選択された核酸配列の増幅において一緒に使用されるために選択されるものである。他のタイプの増幅方法には、以下により詳細に説明されるように、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅または核酸配列に基づく増幅が含まれる。当分野において一般に知られているように、オリゴは、選択された条件下で相補的な配列に結合するように設計する。
【００２５】
本発明を実施するための核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）は、よく知られた方法によって得ることができる。
【００２６】
本明細書において用いられているように、用語「生理学上関連のある」は、１以上のタンパク質の自然環境における活性またはレベルを調節する効果をもたらす相互作用を記述することを意味する。
【００２７】
用語「ＤＮＡ」分子または配列（時として用語「オリゴヌクレオチド」も同様）は、デオキシリボヌクレオチドである、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）および／またはシトシン（Ｃ）からなる二本鎖の形態の分子を意味し、本明細書において定義される用語として本発明の「調節エレメント」からなるかまたはそれを含む。用語「オリゴヌクレオチド」または「ＤＮＡ」は、直鎖状のＤＮＡ分子または断片、ウィルス、プラスミド、ベクター、染色体または合成によって得られたＤＮＡに見られる。本明細書において使用されるように、具体的な二本鎖ＤＮＡ配列は、通常の規定にしたがい、５'から３'方向の配列のみで記述することができる。
【００２８】
「核酸ハイブリダイゼーション」は、適当な条件下で熱力学的に有利な二本鎖構造を形成する相補的な塩基配列を有する２本の一本鎖核酸分子のハイブリッド形成を意味する。ハイブリダイゼーション条件の例は、上に引用した２つの実験マニュアルにみつけることができ（４，９６）、当分野において一般的に知られている。ニトロセルロースフィルターへのハイブリダイゼーションの場合では、よく知られたサザンブロッティング法における例に関して、ニトロセルロースフィルターを、５０％のホルムアミド、ハイソルト（５×ＳＳＣまたは５×ＳＳＰＥ）、５×Denhardt溶液、１％ＳＤＳおよび１００のμｇ／ｍＬ変性キャリアーＤＮＡ（例えば、サケ精子ＤＮＡ）を含む溶液中で標識プローブを用いて６５℃で一晩インキュベーションすることができる。次いで、非特異的に結合したプローブを、２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中、所期のストリンジェンシーを考慮して選択された温度、即ち、室温（低いストリンジェンシー）、４２℃（中程度のストリンジェンシー）または６５℃（高いストリンジェンシー）にて、数回洗浄することによりフィルターから洗い流すことができる。選択された温度は、ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に基づく。もちろん、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドも形成させ検出することができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションと洗浄の条件を、当業者によく知られた方法にしたがって適合させることができる。ストリンジェントな条件が好ましく用いられるであろう（９６）。
【００２９】
核酸のためのプローブは、天然の糖リン酸骨格並びに、ホスホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネート、およびα−ヌクレオチドなどを含む修飾された骨格を利用することができる。修飾された糖リン酸骨格は、 一般に教示されている（７３，７５）。本発明のプローブは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれか、好ましくはＤＮＡから構築することができる。
【００３０】
本発明の利点は、タンパク質および／またはペプチド間の相互作用の検出が標識に依存するということである。そのような標識によって感度がもたらされ、自動化が可能になる。本発明の１つの態様では、チップ法を用いて自動化を行なう。例えば、タンパク質の選択された配列にわたるオーバーラップペプチドをチップに結合し、その後、タンパク質またはペプチドとの相互作用についての試験を自動化するためにそれを使用することができる。もちろん、選択されたタンパク質配列にわたるオーバーラップペプチドのセットの設計や合成に、本発明が厳密に依存するわけではないことは理解すべきである。実際、ペプチドのバンクが利用可能であり、そこからこのオーバーラップペプチドのセットを構築することができる。
【００３１】
タンパク質の標識は当分野においてよく知られている。標識の非限定的な例は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐおよび35Ｓが含まれる。検出可能なマーカーの非限定的な例には、リガンド、蛍光体、化学発光剤、酵素および抗体が含まれる。特定の標識の選択によって、その標識のタンパク質に対する結合様式が決まるということは当業者には明らかであろう。
【００３２】
例えば、この相互作用は、プロテオミクス的手法（例えば２Ｄゲルおよび質量分析法）を用いて評価することができるので、相互作用の同定は、タンパク質の標識には特に依存するものではない。
【００３３】
一般に知られているように、放射性アミノ酸を、いくつかのよく知られ た方法によって本発明のペプチドまたはタンパク質に組み込むことができる。その非限定的な例には、35ＳＭetを用いる、タンパク質のインビトロまたはインビボ標識が含まれる。
【００３４】
用語「ベクター」は、当分野において一般に知られており、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡなどであり、これらは、本発明のＤＮＡがそこへクローニングされるＤＮＡビークルとしてはたらく。数多くのタイプのベクターが存在し、当分野においてよく知られている。
【００３５】
用語「発現」は、遺伝子がｍＲＮＡへ転写され（転写）、次いでｍＲＮＡが１以上のポリペプチド（あるいはタンパク質）に翻訳される（翻訳）過程を定義するものである。
【００３６】
用語「発現ベクター」は、上記のベクターまたはビークルであるが、宿主内への形質転換後に挿入された配列の発現を可能にするよう設計されたベクターまたはビークルとして定義される。クローニングされた遺伝子（挿入された配列）は、通常、プロモーター配列のような制御エレメントの制御下に置かれる。そのような制御配列下でのクローニングされる遺伝子の配置は、しばしば、制御エレメントまたは配列を制御するために作動可能なように連結された、と呼ばれる。
【００３７】
作動可能なように連結された配列は、さらに同じＲＮＡ転写物に転写された２つの断片を含んでいる。即ち、プロモーターおよび「リポーター配列」のような２つの配列は、プロモーターにおける転写の開始によってレポーター配列のＲＮＡ転写物が産生されるならば、作動可能なように連結している。「作動可能なように連結され」るためには、２つの配列が互いに直接隣接していることは必要ではない。
【００３８】
発現制御配列は、ベクターが原核生物または真核生物の宿主あるいはその両方（シャトルベクター）において作動可能なように遺伝子を発現するよう設計されているか否か、およびエンハンサーエレメント、終止配列、組織特異的エレメントおよび／または翻訳開始および終止部位などの転写要素をさらに含むことができるか否かに依存して変わるであろう。
【００３９】
原核生物での発現は、目的のＤＮＡ配列によってコードされる大量のタンパク質の製造に有用である。このタンパク質は、大きさや電荷などのそのタンパク質固有の特性を利用した標準的なプロトコル（例えばＳＤＳゲル電気泳動、ゲルろ過、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィーなど）にしたがって精製することができる。さらに、目的のタンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。精製されたタンパク質は、治療的適用のために使用することができる。
【００４０】
ＤＮＡ構築物は、本発明のオリゴヌクレオチド配列に作動可能なように連結されたプロモーターを含むベクターであり、本発明のオリゴヌクレオチド配列もまた、ルシフェラーゼリポーター分子の遺伝子などのヘテロローガスな遺伝子に作動可能なように連結されている。「プロモーター」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに直接的または間接的に結合することができ、下流の（３'方向）、コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域を意味する。本発明において、プロモーターは転写開始部位とその３'末端で結合し、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要最小限の数の塩基またはエレメントを含むように上流に（５'方向）伸びる。プロモーター内では、転写開始部位（Ｓ１ヌクレアーゼによるマッピングにより便利に定義される）、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合をつかさどる結合ドメイン（コンセンサス配列）がみられる。真核生物のプロモーターは、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＣＡＴ」ボックスを含んでいることが多い。原核生物のプロモーターは、−１０および−３５のコンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガノ配列を含んでいる。
【００４１】
本明細書において用いられている表示「機能的誘導体」は、核酸配列かアミノ酸配列かにかかわらず配列の機能的誘導体という意味において、もとの配列の生物学的活性と実質的に同様である生物学的活性（機能または構造のいずれか）を保持している分子を意味する。この機能的誘導体または等価物は、天然の誘導体でも、あるいは合成によって製造されたものでのよい。そのような誘導体には、１またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列が含まれるが、但し、そのタンパク質の生物学的活性は保存されている。配列の生物学活性が一般に維持されるかぎり、同じことが、１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有する核酸配列の誘導体にも当てはまる。タンパク質配列に関して、置換するアミノ酸は、置換されるアミノ酸の物理化学的性質と類似の物理化学的性質を有するものである。類似の物理化学的性質には、電荷、かさばり、疎水性、親水性などにおける類似が含まれる。用語「機能的誘導体」は、本発明の主題の「断片」、「部分」、「変異体」、「類縁体」または「化学的誘導体」が含まれる。
【００４２】
当分野においてよく知られているように、アミノ酸の「保存的な突然変異または 置換」は、
１）ポリペプチドの骨格の構造（例えば、βシートまたはαヘリックス構造）；
２）アミノ酸の電荷または疎水性；または
３）側鎖のかさばり
を維持する突然変異または置換を意味する。より具体的には、よく知られている用語「親水性残基」は、セリンまたはトレオニンを意味する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンを意味する。「正に荷電した残基」は、リジン、アルギニンまたはヒスチジンを意味する。「負に荷電した残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を意味する。「かさばった側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンを意味する。
【００４３】
本発明のペプチド、タンパク質断片などは、よく知られている方法に従って、その配列に依存してまたは無関係に修飾することができる。例えば、ペプチドは、１、２、３またはそれ以上の位置での保存的なアミノ酸置換を用いて、図面において例示された野生型の配列から得ることができる。用語「保存的なアミノ酸置換」は、当分野においてよく知られており、特定のアミノ酸を同様の特性を有するアミノ酸で置換すること（例えばグルタミン酸に対してアスパラギン酸、またはロイシンに対してイソロイシン）を意味する。もちろん、非保存的なアミノ酸置換、並びに欠失または挿入などのその他のタイプの修飾も行なうことができるが、但し、これらの修飾は、ペプチドを適当なやり方で（例えば、これが修飾によって意図するものであれば、そのペプチドの生物学的な活性に影響を及ぼすことなく）修飾するものである。典型的な保存的なアミノ酸置換の一覧を以下に示す。
【表１】
2002544522.tif 000001
【００４４】
この表からわかるように、これらの修飾のうちのいくつかをタンパク質分解により強いペプチドを得るために使用することができる。もちろん、ペプチドの修飾も、当分野においてよく知られているように、酵素または化学的な処理を用いて、その主要な配列に影響を及ぼすことなく行なうことができる。
【００４５】
このように、本明細書において、用語「変異体」は、本発明のタンパク質または核酸に、構造および生物学的活性において本質的に類似しているタンパク質または核酸分子を意味する。
【００４６】
本発明の機能的誘導体は、当分野においてよく知られている方法を用いて、化学的に合成するかまたは組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。本発明の１つの具体的な態様では、本発明の変異体は本発明の方法によって同定することができる。さらに、それは、特定のアミノ酸の保存性について正式に試験するために設計することができる（例えば、変異体または突然変異ペプチドの合成によって）。これらの変異体は、相互作用を確認するために、タンパク質の完全長の配列の一部として試験することもできる。もちろん、当業者は、高い親和性のタンパク質相互作用に関与する領域として選択されたタンパク質の領域の同定が、この領域の構造と機能の関連を同定し分析するための、この領域のインビトロ突然変異誘発（または関連するペプチド配列の試験）を可能にすることを理解するであろう。そのような方法は当業者によく知られている。２つのタンパク質の相互作用するドメインが同定されれば、当業者は、相互作用するタンパク質に対し、修飾された親和性を有する変異体を同定および／または設計することが可能である。もちろん、相互作用する配列が両方ともわかっていれば、これらの間の高い親和性の相互作用を支配する構造と機能の関連性を分析することが強く求められるであろう。
【００４７】
本明細書において用いられる、「化学的誘導体」は、通常、本発明の主要部ではないさらなる化学的部分を包含することを意味する。そのような部分は、その誘導体の物理化学的特性（例えば、可溶性、吸収、半減期など、毒性の減少）に影響するであろう。そのような部分は、Remington's Pharmaceutical Sciences （８８）に例示されている。これらの物理化学的部分をポリペプチドにカップリングする方法は、当分野においてよく知られている。
【００４８】
用語「対立遺伝子」は、染色体上のある特定の座を占める遺伝子の二者択一的形態を定義するものである。
【００４９】
一般に知られているように、「突然変異」は、娘細胞へ伝達され得る遺伝物質における検出可能な変化である。よく知られているように、突然変異は、例えば１またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドにおける検出可能な変化である。例えば、ヌクレオチドは、付加、欠失または置換されているか、反転しているか、または新しい位置へ転位することがある。偶発的な突然変異および実験的に誘発された突然変異がある。核酸分子の突然変異の結果が突然変異核酸分子である。突然変異体ポリペプチドは、この突然変異核酸分子からコードされる。
【００５０】
本明細書において用いられるように、用語「精製された」は、細胞成分から分離された分子を意味する。したがって、例えば、「精製されたタンパク質」は、自然界で見つからない程度まで精製されている。「実質的に純粋な」分子は、大部分の他の細胞成分を含まない分子である。
【００５１】
本明細書において使用される用語「分子」、「化合物」または「リガンド」は天然の分子、合成分子または半合成分子、または化合物を意味するために、交換可能なようにそして広く用いられる。したがって、用語「分子」は、例えば、化学物質、巨大分子、細胞または組織の抽出物（植物または動物由来）などを意味する。分子の非制限的な例には、核酸分子、ペプチド、抗体、炭水化物および医薬的作用物質が含まれる。作用物質は、ランダムスクリーニング、合理的選択、例えばコンピュータモデリングのようなタンパク質またはリガンドのモデリングを用いた合理的設計によって、コンビナトリアルライブラリースクリーニングなどを含む様々な手段によって選択しスクリーニングすることができる。用語「合理的に選択された」または「合理的に設計された」は、本発明の相互作用領域の構造に基づいて選択された化合物を意味し定義するものである。当業者によって理解されるように、天然に存在しない修飾を有する巨大分子も、用語「分子」の範囲に含まれる。例えば、製薬産業においてよく知られ、ペプチド類縁体として一般に呼ばれているペプチド模擬体（peptidomimetics）は、上記のモデリングによって作製することができる。同様に、好ましい態様では、本発明のポリペプチドを、その安定性を高めるために修飾する。ほとんどの場合、この修飾は相互作用領域の生物学的活性に変化を及ぼすものではないと理解すべきである。本発明の教示に従って同定された分子は、細胞および／または組織の生理機能またはホメオスタシスが本発明に従って同定される高い親和性のタンパク質相互作用によって危険にさらされるような疾患または状態において治療上の価値を有する。あるいは、本発明の教示に従って同定された分子は、そのような相互作用を調節することができるより効果的な物質の開発に有用である。
【００５２】
化合物のライブラリー（公に利用可能または商業的に利用可能の、例えばコンビナトリアルライブラリー）は、当分野においてよく知られている。ペプチドのライブラリーも利用可能である。そのようなライブラリーは、選択されたドメイン、タンパク質またはその一部にわたるオーバーラップペプチド配列のセットを構築するために使用することができる。
【００５３】
本明細書において用いられるように、「指標細胞」は、１つの具体的な態様において、本発明の２つの相互作用するペプチドドメインを発現する細胞を意味し、ここで、これらのタンパク質または相互作用するそのドメイン間の相互作用が、その相互作用が評価または確認されるような同定可能か選択可能な表現型あるいは特性と結びついている。そのような指標細胞も、本発明のスクリーニング分析において使用することができる。ある態様では、指標細胞は、選択された誘導体、断片、相同体またはこれらの相互作用するドメインの突然変異体を発現するように処理を施されている。細胞は、酵母細胞または哺乳類細胞（ＷＯ９６／４１１６９）などの高等真核生物細胞でもよい。１つの具体的な態様では、指標細胞は、当分野においてよく知られた、ツーハイブリッドシステム法の使用を可能にするベクターを有する酵母細胞（４）であり、化合物またはそのライブラリーを試験するために使用することができる。１つの態様では、選択可能なマーカーまたは分析可能なタンパク質をコードするリポーター遺伝子を、その選択可能なマーカーまたは分析可能なタンパク質の発現がタンパク質Ａおよびタンパク質Ｂドメインの相互作用に依存するように、制御エレメントと作動可能なように連結することができる。そのような指標細胞は膨大な分子の高速大量処理での迅速スクリーニングに使用することができる。具体的な態様では、リポーター遺伝子がルシフェラーゼまたはβ−Ｇａｌである。
【００５４】
１つの態様では、本発明の２つの相互作用するタンパク質またはドメインのうちの少なくとも１つが、融合タンパク質として提供されていてもよい。そのための構築物の設計、および融合タンパク質の発現と産生は当分野においてよく知られている（４，９６）。具体的な態様では、両方の相互作用領域が融合タンパク質の一部である。そのような融合タンパク質の非限定的な例には、Ｌex−Ａタンパク質Ａ融合（ＤＮＡ結合ドメイン−タンパク質Ａ；おとり（bait））およびＢ４２タンパク質Ｂ融合（トランス活性化因子ドメイン−タンパク質Ｂ；捕獲（prey））を含んでいる。さらに具体的な態様では、Ｌex−Ａタンパク質Ａ融合およびＢ４２タンパク質Ｂ融合タンパク質を、ＬexＡオペレーターおよび／またはＬexＡ応答エレメントに作動可能なように連結されたリポーター遺伝子をさらに有する酵母細胞において発現させる。もちろん、その他の融合タンパク質をそのようなツーハイブリッドシステムにおいて使用することができることは認識されるであろう。さらに、融合タンパク質が完全長の相互作用するタンパク質を含む必要がないことは認識されよう。実際、これらのポリペプチドの断片は、それらが相互作用するドメインを含んでいるかぎり、本発明のペプチドスパンニング法で証拠づけられるように、本発明にしたがって使用することができる。
【００５５】
そのような融合タンパク質の非限定的な例には、ヘマグルチニン融合物、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合物が含まれる。ある態様では、融合させた２つのポリペプチド配列の間にプロテアーゼ開裂部位を導入することが有益であろう。２つのヘテロローガスに融合したポリペプチド間のそのようなプロテアーゼ開裂部位は当分野においてよく知られている。
【００５６】
ある態様では、本発明の相互作用するドメインを、宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチド配列に融合させることが有益であろう。種々の生物由来のシグナルペプチドが当分野においてよく知られている。バクテリアのＯｍｐＡおよび酵母Ｓｕｃ２は、シグナル配列を含んでいるタンパク質の２つの非限定的な例である。ある具体的な態様では、相互作用ドメインとヘテロローガスなポリペプチド部分の間の（一般に知られている）リンカーを導入することも有益であろう。そのような融合タンパク質は、本発明の分析並びに精製や検出などに有用である。
【００５７】
もちろん、本発明を実施するのに有用な配列およびポリペプチドには、それらに限定されることなく、突然変異体、同族体、サブタイプ、対立遺伝子などが含まれる。一般に、本発明の配列は（不完全とはいえ）機能的な相互作用ドメインをコードすると理解すべきである。本発明の相互作用ドメイン、その変異体、誘導体または断片が、そのパートナーに対する結合における機能を保持するかどうかは当業者には明らかであり、本発明の教示および分析並びに当分野の一般的な教示を用いて容易に測定されるであろう。
【００５８】
以下に例示されるように、本発明の相互作用ドメインを、例えばインビトロの突然変異誘発によって修飾し、その構造と機能の関連を分析し、調節化合物のより良い設計と同定を可能にすることができる。しかし、その各々の相互作用パートナーと相互作用するという生物学的機能を喪失した誘導体または類縁体は、例えば、抗体を惹起するために依然として有用であろう。そのような類縁体または誘導体は、例えば、本発明の相互作用ドメインに対する抗体を惹起するために使用することができる。これらの抗体は、検出または精製に使用することができるであろう。さらに、これらの抗体は、競争または非競争阻害剤としても作用し、本発明にしたがって同定される相互作用の調節物質が見つかるであろう。
【００５９】
宿主細胞または指標細胞は、外因性またはヘテロローガスなＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ構築物）が細胞内部に導入されているとき、そのようなＤＮＡによって「トランスフェクト」ている。トランスフェクトされるＤＮＡは、細胞のゲノムを構築する染色体ＤＮＡ内に組み込まれていても（共有結合で連結していても）、組み込まれていなくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳類細胞では、トランスフェクトするＤＮＡは、プラスミドなどのエピゾームエレメントにおいて維持されていてもよい。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされるＤＮＡが、染色体複製を通じて娘細胞に受け継がれるように、染色体内へ組み込まれるようになったものである。この安定性は、トランスフェクトされたＤＮＡを含んでいる娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを確立するその真核細胞の能力によって実証される。トランスフェクション法は、当分野においてよく知られている（４，９６）。指標としての哺乳類細胞の使用は、試験される２つのポリペプチドの相互作用を可能にするかまたは調節する、下等な真核生物または原核生物には存在していないであろう介在因子が提供されるという利点をもたらすことができる。もちろん、試験されたポリペプチドの両方が直接相互作用するとしても利点はあるかどうかはまだわからない。例えば、具体的な態様において哺乳細胞からの抽出物を用いて、選択された指標細胞におけるある特定の因子の欠如を補うことができることは理解されるであろう。翻訳の領域は、異なるタイプの抽出物を調製し再構成する方法を十分教示するものであると認識されるであろう。
【００６０】
一般に、抗体（モノクローナル抗体およびハイブリドーマを含む）を調製するための技術、および抗体を使用して抗原を検出するための技術は、当分野においてよく知られている（１２）。本発明はさらに、それらの各々の相互作用ドメインを阻害または中和するおよび／またはそれら対して特異的である、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそのヒト化形態、キメラ抗体などを提供する。
【００６１】
本明細書および添付した請求の範囲から、「治療剤」なる用語は、少なくとも２つのそのような治療剤の組合せも含むように広い意味に解されるべきである。さらに、本発明のＤＮＡ断片またはタンパク質は、多くの方法によって人に投与することができる。例えば、赤血球産生細胞を罹患者から単離し、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換し、静脈注射を含む多くの方法により、その罹患者に再投与することができる。別法として、ＤＮＡ構築物を、例えば骨髄における注入によって、罹患者に直接投与することができる。治療剤は、具体的なタイプの細胞を標的として設計し、種々の経路を通じて投与されるように処理を施すことができる、リポソームなどのビークルを通じて投与することもできる。
【００６２】
ヒトへの投与に関しては、処方している医学専門家が、特定の患者に対して適切な剤型と用量を最終的に決定し、これは、選択された治療計画（例えば、ＤＮＡ構築物、タンパク質、分子）、患者の応答および状態並びに疾患の重篤度によって変わるものと予想される。
【００６３】
本発明の範囲に含まれる組成物は、所望の治療効果を達成するのに有効であり、有害な副作用を回避する量の活性成分（例えばタンパク質、核酸あるいは分子）を含有する。典型的には、本発明の核酸は、１日あたり、処置されるその哺乳動物の体重１ｋgあたり０.００５〜１ｍgの用量で、哺乳動物（例えばヒト）に投与することができる。活性成分の製薬的に許容される調製物および塩は、本発明の範囲内に含まれ、当分野においてよく知られている（８８）。ポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニストなどの投与に関しては、有害な副作用を回避するように投与量を選択する。用量は、患者の疾患の程度や種々のパラメータなどの慣用的な要因に従い、臨床医が調整する。典型的には、０.００１〜５０ｍg／ｋg／日を哺乳動物に投与する。
【００６４】
本発明の方法および分析を、さらにアネキシンにより確認した。このタンパク質は、Ｐ−糖タンパク質と構造および機能の両方において有意に異なる。従って、タンパク質化学および分子生物学についての知識とともに、これらの確認によって、すべてのタンパク質（ウイルス、細胞、動物、植物由来などの）についての本分析および方法の有用性が裏付けられる。
【００６５】
このように、本発明を概説したが、本発明の好ましい態様を説明する目的で図面を引用する。
【００６６】
本発明の他の目的、利点および特徴は、例示的な添付の図面を参照して、以下の好ましい態様の非限定的な記載を読めばより明らかになるであろう。そして本発明の範囲を限定するものとして理解すべきではない。
【００６７】
（好ましい態様の記載）
タンパク質の機能因子（functionor）または機能は、他の細胞または細胞外タンパク質徒の間のそのタンパク質の相互作用が関与している。これまで、２つのタンパク質間の相互作用には相補的なアミノ酸配列を有するポリペプチドの大きな断片が関与していると考えられていた。しかし、これらの相補的な配列が、タンパク質間の相互作用にどのように関与しているかはわからない。本願では、タンパク質間相互作用の原理を説明する新たな概念を提唱するものである。即ち、任意の２つ以上のタンパク質間相互作用は高い親和性の結合と高い反発力を有する不連続な配列の鎖が介在している［図１を参照］。タンパク質の露出された配列全体のこれらの力の合計は、タンパク質間の性質と程度を決定づける。これらの相互作用するドメインの大きさは、長さで５〜２５アミノ酸の範囲で変わる。２つの小さい高親和性結合配列間の引力は、２つのタンパク質間のすべての高い親和性の結合力および反発力の合計よりも一般に大きい。したがって、本発明の手段を用いて、高親和性結合配列のみをコードする短いペプチド（およそ６アミノ酸）を用いて、タンパク質の混合物から相互作用するタンパク質を単離することが可能である。実際、想像してみれば、相互作用するタンパク質を単離する多くの試みがなぜ失敗に終わったのかを理解するのは、今や容易いことである。相互作用するタンパク質を単離するための大きな断片またはタンパク質の使用は、引力／反発力の合計が引力の鎖よりもずっと弱いので効果が低い。本明細書において提唱される原理はさらに、タンパク質間相互作用が、翻訳後修飾（例えばリン酸化（２９）によって）および他の相互作用するタンパク質の存在（６０）によって調節することができるという事実と一致する。従って、翻訳後修飾後の弱い相互作用の付加または喪失によって、タンパク質を会合した状態に保つかまたはそれらの会合を阻止する高い親和性の結合と高い反発力との間の非常に微妙なバランスを破壊することができる。２つの高親和性結合配列間の引力の大きさについての根拠は、抗原が２、３個のアミノ酸のみであり得る抗体抗原結合において実証される（３６、３７）。更に、 多くの例は、タンパク質間の細胞の相互作用が５〜１０のアミノ酸の小さなコンセンサス配列の存在により生じる生物学において存在する。そのような小さなコンセンサスの非限定的な例には、ロイシン・ジッパー（６３）、およびＳＨ２およびＳＨ３結合配列（６３、８０）が含まれる。２つ以上のタンパク質間の相互作用（上に示した）のドメインに加えて、タンパク質間相互作用は、例えば以下のもののような、多くの測定可能な作用を有することができる：ｉ）一方または両方のタンパク質の動力学特性の変化（８３、８４）；ｉｉ）新しい結合または機能的部位の形成（６５、１０４）；そしてｉｉｉ）機能の不活性化（１０６、１１４）。言い換えれば、ある特定のタンパク質は、なんらかの相互作用するタンパク質の非存在下ではなく存在下で種々の機能的ドメインまたは配列を露出することができるであろう。したがって、タンパク質Ｂの存在下で、タンパク質Ａは他のタンパク質に対して今まで露出されなかった他の配列を露出することができる（６５、８３、８４、１０４、１０���、１１４）。後者の概念は、タンパク質の解明された結晶構造からの機能または表面に露出されたドメインの予測における構造的研究（即ち、Ｘ線およびＮＭＲ）の有効性に反論するものであるので非常に重要である。ある特定のタンパク質のすべての高い親和性の結合部位の測定と同定を可能にすることによって、本発明はそのような構造の研究から得られた結果の欠点を克服しようとするものである。
【００６８】
タンパク質間相互作用の上記の例に加えてさらに、タンパク質間相互作用の部分集合は二量体化である。タンパク質間相互作用が、機能の活性化または阻害（５９）にとって本質的であるような例が生物学にはたくさん存在する。ホモまたはヘテロ二量体の非限定的な例には、成長因子受容体（５２）；膜輸送タンパク質（９、３６、７６）；腫瘍抑制タンパク質（７２）；およびアポトーシスに関与するタンパク質（８７）が含まれる。実際、動的な二量体化は、情報伝達の調節における共通のテーマである。二量体化の機能上の帰結には、シングル膜貫通細胞表面受容体（例えばＥＧＦ受容体（５２））の活性化に関する増大した近接性およびヘテロ二量体化による差異のある調節［例えば、ＢＣＬ２ファミリーのタンパク質（８７）］が含まれる。
【００６９】
生細胞におけるタンパク質濃度は非常に高く、１０〜３０ｍｇ／ｍLの範囲にある。この高いタンパク質濃度で、すべてではないにしても大部分のタンパク質が、他の細胞タンパク質と精密にそして特異的に相互作用する。相互作用するタンパク質のいくつかが機能を阻害する物質として作用する一方、他のタンパク質は活性化因子になりうる［例えば、ＢＣＬ２−ＢＡＸファミリーのタンパク質（８７）］。さらに、活性化因子と阻害因子の会合との間のある特定のタンパク質の循環は、迅速に起こるような会合−解離過程が必要であろう。例えば、タンパク質Ｘが阻害タンパク質Ｉに会合しているとき、タンパク質Ｘとタンパク質Ａとの会合に必要なそのドメイン（小さい配列）は、Ｘ−Ｉ複合体に容易には接近できないかもしれない。したがって、会合したタンパク質を同定するための本方法（即ち、ツーハイブリッドシステムおよび同様の手法）は、会合したタンパク質をすべて同定することができないかもしれない。言いかえれば、本方法は、成功すれば、それらの会合したタンパク質のすべてではないがいくつかの機能的なドメインのみを同定することができる。対照的に、ペプチドスキャンニングの手法を用いて、本発明の方法は、タンパク質Ｘおよびその関連タンパク質の機能的なドメインまたは高い親和性の相互作用ドメインをすべて同定することができる。一旦関連するタンパク質が同定されれば、標的タンパク質Ｘに関連しているその関連タンパク質の生物学の機能を試験することができる。したがって、ある特定の相互作用するタンパク質に関して、１または多くの可能性のある関連タンパク質による相互作用が機能にとって重要であると分かれば、（タンパク質Ｘとタンパク質ＩまたはＡとの間の）高親和性結合配列を容易に同定することができ、高速大量処理薬物スクリーニング分析（以下参照）またはその他の分析の標的部位として使用することができる。
【００７０】
本発明は、タンパク質間相互作用が、タンパク質の三次元配列の全体にわたって散在した不連続な高い親和性の結合と高い反発力からなり、これらの配列を本明細書において示された多くの可能な手段のうちの１つを使用して単離することができるという［図１Ａ〜Ｄに記載された］概念を含んでいる。本発明では、オーバーラップペプチドの手段を例示するが、同様の結果をもたらす他の手段も想像することができる。本明細書に記載した手段は、タンパク質間相互作用を同定するための他の一般に使用される方法に影響を及ぼす、相互作用するタンパク質によって生じる立体配置の変化には影響されない（例えば、ツーハイブリッドシステム、アフィニティーブロッティング、および架橋）ことが強調される。ツーハイブリッドシステムでは、例えば、タンパク質Ａを、別のタンパク質配列（ＤＮＡが結合した「おとり」タンパク質）に融合し、他方の相互作用するタンパク質を、活性化ドメイン含んでいる「捕獲」タンパク質に融合する。タンパク質Ａへの相互作用するタンパク質の融合は、それらの相互作用に影響を及ぼす、自然状態の立体構造には見られる領域以外の領域を露出するであろう。更に、ツーハイブリッドシステムはいくつかの欠点を有しているが、それらのうちのいくつかを以下に記載する。
ｉ．タンパク質の相互作用は、大部分のタンパク質が存在する細胞質ではなく、核周辺で観察される。
ｉｉ．タンパク質が異なる細胞または生物において表現すると毒性を示すことがある。
ｉｉｉ．ツーハイブリッドシステムでの複合体における２つのタンパク質間の相互作用は、他の相互作用するタンパク質の結合を立体的に排除することがある。
ｉｖ．１つのタンパク質の修飾後翻訳は、他のタンパク質との相互作用を排除することがある。
ｖ．ツーハイブリッドシステムは、２つの相互作用するタンパク質間の正確なアミノ酸配列を同時に同定することはできない。
ｖｉ．ツーハイブリッドシステムの適用には、誤って陽性とされる高いパーセンテージを伴う。
ｖｉｉ．ツーハイブリッドシステムは、異なる相互作用するタンパク質が発現するかもしれない（これはこのシステムの重大な欠点である）異なる細胞または組織に容易に適用することができない。
【００７１】
相互作用タンパク質およびタンパク質Ａに対する相互作用部位を同定するための方法
２またはそれ以上の相互作用するタンパク質間の配列の不連続な鎖を同定するために使用される本手法および本方法論は、スキャンニングオーバーラップペプチド法である。この手法を用いて、ある特定のタンパク質の全アミノ酸配列を網羅する大量の短いオーバーラップペプチド、「おとり」を、不活発な固体支持体上で同時に合成する［図２参照］。不連続なペプチドライブラリーとは対照的に、大量のオーバーラップペプチドを合成する原理は、ある特定のタンパク質のどの正確な配列が高い親和性の結合部位と反発する配列を含んでいるかが推測によってはわからないという事実に基づいている。それゆえ、不連続なペプチド法は、同じペプチドにおいて高親和性結合配列と反発性配列の両方の存在を導くことが多い。そのようなペプチドは、可能性のある相互作用するタンパク質には高い親和性で結合しないであろう。さらに、オーバーラップペプチドの使用は、非特異的結合の内部対照をもたらす。例えば、オーバーラップペプチドを使用すると、高い親和性ドメイン内においてペプチドが高い親和性アミノ酸配列を有し反発力をもたらすアミノ酸を欠いている場合、シグナルはピークになる［実施例１の図６参照］。もちろん、本発明は、全ペプチド配列の長さには依存しないことは理解されるべきである。実際、タンパク質のサブ領域を使用することができる。さらに、オーバーラップペプチドは、タンパク質の選択されたドメインから得られる。また、第２のタンパク質のオーバーラップペプチドのセットによって第１のタンパク質のオーバーラップペプチドの副次的なセットが判明することは認識できるであろう。
【００７２】
全細胞タンパク質の混合物から、相互作用するタンパク質である「捕獲」を単離するための「おとり」としてオーバーラップペプイドの手法をどのように使用できるかを実証するために、以下の実施例が考慮されよう。Ｐ−糖タンパク質は、抗癌剤に対する耐性をもたらす膜タンパク質（４６）であり、それゆえ化学療法が失敗する要因となっている。しかし、Ｐ−糖タンパク質は、腫瘍細胞における化学治療剤の蓄積を阻止することによって機能することが示されている。このタンパク質がどのように機能するかの正確なメカニズム、および何がその機能を調節する関連しているタンパク質であるかはわかっていない。したがって、例えばＰ−糖タンパク質とその関連タンパク質との間の結合を阻害し、それによって耐性腫瘍細胞におけるその機能を強力に調節することを可能するための、Ｐ−糖タンパク質と相互作用するタンパク質を同定することが目的である。この実施例では、Ｐ−糖タンパク質のリンカードメインに結合するタンパク質を同定することを目的とする。したがって、特定の実施例では、選択されたタンパク質のドメインを使用した。リンカードメインは、約９０アミノ酸の領域をコードする。したがって、Ｐ−糖ペプチドのこの全リンカー配列を網羅するオーバーラップヘキサペプチドを、標準的なＦ−ｍｏｃ化学反応（７４）を用いて固体の支持体上で合成した。共有結合により固定されたペプチド（固体の支持体上の）を、［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識された細胞に由来する全細胞リゼートとインキュベーションした。ペプチドと全細胞リゼートを担体物質（１〜３％ウシ血清アルブミン、または１〜３％ゼラチン、１〜３％スキムミルクなど）の存在下で４℃にて１８時間インキュベーションした。インキュベーションした後、共有結合により固定化されたペプチドを、等張緩衝液で十分に洗浄した。洗浄工程の後でオーバーラップヘキサペプチドと会合したままの放射性標識された全細胞由来のタンパク質を、ＳＤＳ含有試料緩衝液中で溶離し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（６２）で解析した。ゲルを乾燥し、シグナル増強をした後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の放射性標識されたタンパク質の存在によって、以下の情報が得られた：
１）特定のオーバーラップペプチドは、Ｐ−糖タンパク質リンカードメイン（または他の選択されたドメインもしくは選択されなかったドメイン）の高親和性結合配列を表している；そして、
２）特定のオーバーラップペプチドに結合したタンパク質は、関連するタンパク質である（図６を参照）。
【００７３】
高親和性配列に結合する関連タンパク質は、エドマン分解法（２８）などによるＮ末端アミノ酸配列によってその同一性を決定するために大量に単離することができる。簡潔にいえば、ある特定のタンパク質に結合するオーバーラップペプチドの配列を固体の支持体上で合成し、そこへ固定化させておく。［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識した細胞から得られた全細胞リゼートを、その固定化された高親和性配列ペプチドを含んでいる固体支持体に加えて、上記のとおりにインキュベーションする。結合しなかった物質を除去するための洗浄工程の後、関連タンパク質をＳＤＳ含有緩衝液を用いた溶出工程の後、大量に単離する（以下参照）。アミノ酸配列分析のために精製された関連タンパク質がここに準備される。もちろん、さらなる精製工程が必要であるならば、これらについては当業者がよく知っている。精製されたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上を移動させ、分離したタンパク質を上記のとおりＰＶＤＦ膜に転写する（１０８）。アミノ酸決定に他の方法を容易に適用することもできる（２７、３３）。
【００７４】
２つの相互作用するタンパク質間のアミノ酸配列を同定する方法
２つのタンパク質間の高親和性結合配列を同定することを単に目的とするのであれば、上記と同じ概念を適用することができる。そのような二つのタンパク質の非限定的な例は、ｐ５３とＭＤＭとの間の相互作用の領域である（２８、１０３）。それゆえ、特に、この実行の目的は、タンパク質Ａ（ｐ５３）とタンパク質Ｂ（ＭＤＭ）との間の高親和性結合配列を、この相互作用を調節する化合物の同定のため、そしてさらにとりわけ薬物の開発のため、これらの配列を標的部位として使用するために同定することである。したがって、１つの態様では、ある特定の薬物が、タンパク質Ａのこれら高い親和性の結合部位の１つに結合するとき、活性な複合体（タンパク質Ａ＋Ｂ）の形成を阻止し、それゆえ複合体の機能を阻害するであろう。タンパク質Ａとタンパク質Ｂとの間の高親和性結合配列の鎖（図３参照）を単離するために、タンパク質Ａ「おとり」の全アミノ酸配列を網羅する小さいオーバーラップペプチド（５〜７アミノ酸）を固体支持体上で同時に合成する（上記および実施例３により詳しく記載するように）。注目すべきことに、この特定の態様では、タンパク質Ａ「おとり」の一次アミノ酸配列しか必要とされない。ペプチドが合成されれば（ペプチド合成は、９６ウェルプレートにおいて固体支持体上で同時に行なわれる）、豊富化および放射性標識された完全長のタンパク質Ｂ「捕獲」（放射性標識されたタンパク質Ｂはインビトロ転写−翻訳反応によって容易に得られる（１１８））を、共有結合で固定化されたオーバーラップペプチドを含む９６ウェルプレートの各ウェルに加える。タンパク質Ａをコードするペプチドを、結合が起こすことが可能な放射性標識されたタンパク質Ｂとインキュベーションする。インキュベーションした後（５〜２４時間）、結合しなかった放射性標識されたタンパク質Ｂを等張緩衝液中で十分洗浄することにより除去する。放射性標識されたタンパク質Ｂに結合するオーバーラップペプチドを、変性剤の存在下で溶出する。９６ウェルプレートの各ウェルからの溶出液を、ＳＤＳ ＰＡＧＥに試料を流すことにより、放射性標識されたタンパク質Ｂの存在について解析する（６２）。高親和性結合ペプチドは、放射性標識されたタンパク質Ｂを保持しているものとして同定されるであろう。
【００７５】
「おとり」をコードするオーバーラップペプチドと相互作用するための「捕獲」として代謝的に標識されたタンパク質の使用は、この方法の感度を高め、１〜１０個の放射性標識されたメチオニン残基をコードする標準的な５０ｋＤａのタンパク質に対し１０10〜１０12Ｍの結合親和性を有する相互作用するタンパク質の同定が可能になる（８２）。
【００７６】
リード化合物のスクリーニングのための高速大量処理分析において高親和性結合配列を使用する方法
薬物開発のための高親和性結合配列または標的部位を同定するための本明細書に記載した手法は、コンビナトリアルライブラリーによって得られた小さい分子をスクリーニングする高速大量処理分析において使用することもできる。例えば、タンパク質Ａのタンパク質Ｂへの結合を特異的に阻害する薬物の選択（図４参照）。１またはそれ以上の標的部位（高親和性結合配列）を、以前に記載したように９６ウェルプレートの各ウェルにおいて合成する。この実施例では（図４）、同じ高親和性結合配列がすべてのウェルにおいて合成される。高親和性結合配列を含む各ウェルに対して、コンビナトリアルライブラリーから得られた１またはそれ以上の小さい分子を加える。薬物を添加したのち、例えば、インビトロ転写−翻訳混合物から得られた放射性標識されたタンパク質Ｂを添加し、上に示したようにインキュベーションさせる。数回洗浄したのち、結合したタンパク質ＢをＳＤＳ−試料緩衝液で溶出する。放射性標識されたタンパク質Ｂを含むウェルは、その薬物がその高親和性結合配列とタンパク質Ｂとの間の結合に効果がないことを示している。別法として、１またはそれ以上のウェルが薬物の存在下で放射性標識されたタンパク質Ｂを含んでないならば、それは、薬物が、タンパク質Ａとタンパク質Ｂにおける高親和性結合配列の間の相互作用を阻害しているということである。したがって、この薬物が良いリード化合物である。これらの薬物はここで、これら薬物が完全長のタンパク質Ａとタンパク質Ｂの活性な複合体の形成を阻止するかどうかを分析する第２段階に進む。同定された活性な薬物は、インビボで試験してその作用機序がさらに確認されるであろう。この方法において、副作用の少ないあるいは全くない、より特異的な薬物が開発されるであろう。
【００７７】
大部分のタンパク質は１以上の生物学的機能を有するので、後者の点は有益である。例えば、タンパク質Ａがそれ自身と相互作用するなら、そのタンパク質は１つの機能を示し、異なるタンパク質を相互作用するその同じタンパク質は異なる機能を示す。さらに、関連タンパク質のある特定の複合体の一部であるときのタンパク質Ａは、いくつかの機能に介在し、タンパク質Ａとタンパク質Ｂとの間の相互作用の阻害する一方、タンパク質Ａと無傷のタンパク質Ｃ、ＤまたはＦとの間の相互作用をそのままにすることによって、１または２、３の細胞の経路が阻害されるであろう。対照的に、タンパク質Ａの機能を阻害することによって複合体全体が阻害されるであろう。この点で、タンパク質の複合体内の２つのタンパク質間の相互作用を特異的に阻害する薬物の同定、単離および開発によって、副作用のより少ない、より特異的な薬物が得られる。さらに、異なるタンパク質が異なる組織または器官において直接発現するので、ある特定のタンパク質複合体の組成は、異なった組織の間で異なるであろう。したがって、タンパク質間相互作用を阻害する薬物の開発の手法によって、器官または組織特異的な薬物も得られるであろう。
【００７８】
もちろん、本発明は、タンパク質間相互作用および化合物によるその調節を測定するための定量分析も提供するものであると理解されよう。
【００７９】
結論として、相互作用するタンパク質、相互作用するタンパク質間の正確なアミノ酸配列およびタンパク質間相互作用を阻害する薬物のタンパク質におけるそのような特異的な配列の標的を同定するための、本願に記載の手法は、製薬産業において将来の薬物発見に影響する計り知れない可能性を有する。
【００８０】
以下の非限定的な実施例によってさらに本発明を説明する。
【００８１】
実施例１
チューブリンに対するＰ−糖タンパク質の結合には、リンカードメインの配列が関与する
化学療法剤による癌患者の処置の成功が薬剤耐性の腫瘍の発達によって制限されることが多い。単一の抗癌剤でインビトロで選択された腫瘍細胞系は、化学療法剤の広いスペクトルに対して耐性となり、これは多剤耐性（即ちＭＤＲ）腫瘍細胞と呼ばれる（２１、４５、６６を参考）。さらに、これら腫瘍細胞におけるＭＤＲの発現は、２つの膜タンパク質、ＭＤＲ１ Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）および多剤体制関連タンパク質（ＭＲＰ１）の過剰発現に関連している（２１、４５、６６）。Ｐ−ｇｐおよびＭＲＰはいずれも、ＡＴＰ結合カセットタンパク質またはＡＢＣ膜トランスポーターとして知られている膜輸送タンパク質の大きなファミリーの一員である（５４）。しかし、Ｐ−ｇｐの構造は、推測の域を出ず（９１）、蓄積されたトポロジーの証拠は、６個の膜貫通ドメインとＡＴＰ結合配列をコードする大きな細胞質領域の一列に並んだ二重の構造を示唆している（５８、６８）。Ｐ−ｇｐ１の二等分された部分が、リンカードメインと称する、極性または荷電性アミノ酸に富む９０残基の鎖によって連結されている。
【００８２】
Ｐ−ｇｐ遺伝子ファミリーは、齧歯類において３つの（クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、ヒトでは２つの（クラスＩおよびＩＩＩ）構造的に類似したアイソフォームから構成されている（２０）。例えば、クラスＩとクラスＩＩのＰ−ｇｐアイソフォームのみがＭＤＲ表現型を示す（２５、１１１）一方、クラスＩＩＩアイソフォームはそうでなない（１１、９８）。クラスＩＩＩアイソフォームは、形質膜の内小葉（inner leaflet）から外小葉（outer leaflet）へのホスファチジルコリンの輸送に関与している（「即ちフリパーゼ」）（９２、１００）。正常な組織においては、Ｐ−ｇｐ分布は主に分泌機能を有する組織に限られる（７９、１１６）。副腎、肝臓、腎臓、腸におけるルーメンに面する突端面へのその二極化した分布は、正常な輸送または解毒のメカニズムを示唆する。さらに、造血幹細胞および特定のリンパ細胞サブクラスはさらに、高いレベルのＰ−ｇｐを表現する（４９）。クラスＩおよびＩＩの通常の機能または基質は未だに明らかではない；しかし、マウスゲノムに由来するクラスＩまたは／およびクラスＩＩ遺伝子の破壊によって、大部分の正常な組織において細胞増殖抑制剤または親油性化合物の蓄積を生じるが、脳においてより著しい（９９、１００）。これらの結果に基づけば、Ｐ−ｇｐ（クラスＩおよびクラスＩＩまたはＭＤＲを生じるＰ−ｇｐ）の正常な機能は、ＭＤＲ細胞、特に脳血液関門、においてみられるのと同様に解毒であると考えられる（５７）。
【００８３】
高いレベルのＰ−ｇｐが、大腸、腎臓、乳房および副腎に由来する多くの元来薬剤耐性である腫瘍並びに化学療法（例えば急性の非リンパ芽球性白血病における）の後にＭＤＲ表現型を獲得する他の腫瘍細胞において見られる（２２、３２、３５、４７、５３、７８）。いくつかの研究によって、今や、Ｐ−ｇｐ発現の反対の相関性および化学療法に対する応答が確立されている（５、８９、１１３）。さらに、Chan et al.（１６、１７）は、Ｐ−ｇｐ発現が、小児白血病、子供の軟組織肉腫および神経芽細胞腫において、ＭＤＲの前兆であり持続的な応答であることを示した。これらの研究に照らせば、Ｐ−ｇｐレベルは、化学療法による処置に対する応答を予測する少なくともいくつかの癌における説得力のある証拠のようである。
【００８４】
Ｐ−ｇｐと様々な親油性化合物との間の直接の結合は、光活性な薬物アナログを用いて実証されている（７７、９３、９４）。Ｐ−ｇｐに結合するある化合物は、恐らくＰ−ｇｐにおける同じ薬物結合部位について競争することにより、ＭＤＲ表現型を逆にすると示された（３４、３８）。総称してＭＤＲ反転剤（reversing agent）と名付けられているこれらの化合物には、いくつか例を挙げると、ベラパミル、キニジン、ルベルメクチン、シクロスポリンおよびジピリマドールアナログが含まれる（３４、３８）。ＭＤＲ反転剤を使用する臨床試験（例えば、ベラパミルまたはキニジン）は、それを使用しなければ化学療法に応答しなかった腫瘍において応答を示した（２３、４４、１１７）。しかしながら、いくつかのＭＤＲ反転剤に関連する高い薬学的毒性によって、有効濃度でのその使用が阻止された（６７）。他のＭＤＲ反転剤（即ちシクロスポリンＡおよびその非免疫抑制剤アナログＰＳＣ８３３）を使用して、より良好な臨床応答が観察された。しかし、シクロスポリンによる毒性作用がみられた（１０１、１１５）。
【００８５】
Ｐ−ｇｐは、タンパク質キナーゼＣおよびＡの基質であることが示された（２、９）。さらに、タンパク質キナーゼＣ活性を調節する物質が、Ｐ−ｇｐリン酸化およびそのＭＤＲ介在の表現型を調節するということが実証された（７、１３）。１つの研究（３１）では、ＰＭＡホルボールエステル（タンパク質キナーゼＣ活性化因子）がＭＣＦ７乳癌細胞においてＭＤＲ表現型と薬物流出を増大することが示された。別の研究（６）では、ＳＷ６２０ヒト大腸癌細胞の酪酸ナトリウム処置が、付随する薬物耐性または薬物流出を増大させることなく、Ｐ−ｇｐ発現の大きな増加をもたらすことが示された。興味深いことに、ＳＷ６２０細胞においてＰ−ｇｐは、酪酸ナトリウム処置の後、少ししかリン酸化されていないことも示された（６）。これらをまとめると、ＳＷ６２０細胞におけるＰ−ｇｐの輸送機能の欠如は明らかではないが、リンカードメイン内のＰ−ｇｐリン酸化部位の突然変異は、その薬物輸送機能に影響を及ぼさないことが示された（４０）。対照的に、リンカードメインにおけるセリン／トレオニン残基のタンパク質キナーゼＣ調節は、外因性の塩化物チャンネルの活性を調節した。したがって、これはＰ−ｇｐがチャンネンル調節物質であることを示唆している（４１、１１０）。このように、Ｐ−ｇｐ１のリンカードメインが介在しているのが、どのような機能であるのかは依然として明らかではないが、インビトロ分析を用いてリンカードメインと相互作用するタンパク質を同定することが目的であった。後者の分析は、本発明によって提供される、タンパク質相互作用についての新規な理解に基づいている。以下に示す結果は、リンカードメインの３つの配列が、みかけの分子量が約８０ｋＤａ、５７ｋＤａおよび３０ｋＤａであるタンパク質に結合することを示す５７ｋＤａのタンパク質の精製と部分的なＮ末端アミノ酸配列分析により、それがα−およびβ−チューブリンのＮ末端アミノ酸をコードすることが示された。
【００８６】
このように、本発明の有効性を確認する例として、タンパク質ドメインを使用して、
ｉ）このドメインはタンパク質に特異的に結合した；
ｉｉ）特異的に結合するタンパク質が正式に同定され得る;さらに
ｉｉｉ）これらのタンパク質の特異的な結合に関与している配列が正式に同定された（得られる場合、このタンパク質の相互作用領域と一緒に）
ということが示された。
【００８７】
実施例２
材料
［35Ｓ］メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Amersham Life Sciences, Inc.）および［125Ｉ］ヤギ抗マウス抗体をAmersham Biochemical Inc.から購入した。タンパク質Ａセファロース−４Ｂは、Bio−Rad Life Scienceから購入した。使用した他の化学物質はすべて、入手し得る最高グレードのものであった。
【００８８】
実施例３
ペプチド合成
予め誘導体化されたプラスチックロッド、活性なエステルおよびポリプロピレントレーは、Cambridge Research Biochemicals （Valley Stream, NY）から購入した。ペプチドは、固体のポリプロピレンロッド上で、以前に記述されているように合成した（３６、３７）。簡潔には、固体の支持体の予め誘導体化されたポリプロピレンロッド上のＦ−ｍｏｃ保護基（９６ウェルのホルメート中で並べられた）を、３０分間撹拌しながら、ジメチルホルムアミド （ＤＭＦ）の中の２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンとインキュベーションすることにより脱離した。β−アラニンスペーサーをポリプロピレンロッド上で脱保護したのち、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸をＨＯＢｔ／ＤＭＦに溶解し、脱保護したロッドを含む適当なウェルに加えた。アミノ酸のカップリングを、室温で１８時間行なった後、ロッドをＤＭＦ（１×２分）、メタノール（４×２分）およびＤＭＦ（１×２分）中で洗浄した。第２のアミノ酸のカップリングには、最初のアミノ酸のＦ−ｍｏｃアミノ保護基の脱保護と第２の予め活性化されたＦ−ｍｏｃ保護されたアミノ酸（ペンタフルオロフェニル誘導体）を有するロッドとのインキュベーションを必要とした。１８時間反応させ、ロッドを取り出し、上に示されたように洗浄した。同じ工程を、６個目のアミノ酸が連結されるまで、各アミノ酸カップリングについて繰り返した。最後のカップリング工程の後、Ｆ−ｍｏｃ Ｎ末端保護基を２０％ピペリジン／ＤＭＦで脱離し、遊離のアミノ基を無水酢酸：ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）：ＤＭＦ（５０：１：５０ ｖ／ｖ／ｖ）を含むアセチル化カクテル中で９０分間アセチル化した。ポリプロピレンロッド上のＮ末端のアセチル化ヘキサペプチドの側鎖保護基をトリフルオロ酢酸、フェノール、エタンジオールを含む開裂混合物（９５：２.５：２.５ ｖ／ｖ／／ｖ）中、室温で４時間インキュベーションすることにより脱離した。開裂工程の後、ロッドをジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄し、５％（ｖ／ｖ）のＤＩＥＡ／ＤＣＭ中で中和した。脱保護されたペプチドが結合したロッドをＤＣＭ、メタノール中で洗浄し、１８時間真空乾燥した。
【００８９】
実施例４
組織培養および細胞の代謝標識
薬剤感受性（ＣＥＭ）および耐性（ＣＥＭ／ＶＬＢ1.0)細胞を、以前に記載されているように（８）、１０％ウシ胎児血清を添加したα−ＭＥＭ培地において培養した（Hyclone. Inc.）。マイコプラズマ汚染について、すべての細胞をStratagene Inc. （San Diego, CA）のMycoplasma PCRキットを用いて３ヶ月ごとに試験した。細胞の代謝標識については、集密度７０〜８０％のＣＥＭまたはＣＥＭ／ＶＬＢ1.0細胞を、［35Ｓ］メチオニン（１００μＣｉ／ｍL）を用い、メチオニン不含α−ＭＥＭ培地中３７℃にて６時間代謝標識した。
【００９０】
実施例５
細胞抽出および結合分析
［35Ｓ］メチオニンによるタンパク質の代謝標識の後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を３回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（２ｍＭ ＰＭＳＦ、３μg／ｍLロイペプチン、４μｇ／ｍLペプスタチンＡおよび１μｇ／ｍLアプロチニン）を含有する低張緩衝液（１０ ｍＭ ＫＣｌ, １.５ ｍＭ ＭｇＣｌ2, １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ７.４）中に再懸濁し、氷上で３０分間静置した。低張緩衝液中でのホモジネーションにより細胞を破壊した後、細胞リゼートを６０００×ｇにて１０分間遠心分離した。この遠心の後、上清を除いて、４Ｍ ＮaＣlのストック溶液で０.５Ｍ ＮaＣlの最終濃度にした。細胞リゼートを氷上で３０分間インキュベーションした。試料を混合して０.１Ｍ ＮaＣlの最終濃度にした。細胞リゼートを、４℃にて１５０００×ｇで１０分間遠心分離した。この上清を除き、ＳＷ５５ローターを用い、ベックマン超遠心機で１００,０００×ｇで１０分間再び遠心した。上記試料中の総タンパク量をローリー法（６９）により測定した。
【００９１】
結合分析については、全細胞リゼートから得られた［35Ｓ］メチオニン標識されたタンパク質を、同量の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３〜６％ＢＳＡと混合し、ポリプロピレンロッドに共有結合により固定化されたオーバーラップヘキサペプチドとインキュベーションした。ペプチドおよび全細胞リゼートを４℃で一晩インキュベーションした。次いで、ロッドを除いて、ＰＢＳ中４回洗浄した。ペプチドが固定化されたロッドを、１×ＳＤＳ試料緩衝液中で室温にて６０分間撹拌しながらインキュベーションすることにより結合したタンパク質を溶出した。超音波処理機にて、ペプチドが固定化されたロッドを、２％ＳＤＳおよび１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有するＰＢＳ中、６５℃にて３０分間インキュベーションすることにより再生した。このインキュベーション後、ロッドを、６５℃の脱イオン水中で５分間、６５℃のメタノール中で２分間洗浄した。次のスクリーニングラウンドのために、ペプチドが固定化されたロッドがここに準備された。結合に対する様々な界面活性剤の効果を試験する場合では、全細胞リゼートから得られた［35Ｓ］メチオニン標識されたタンパク質を同量の、ＫＣl（３００ｍＭ〜１２００ｍＭ）、ＳＤＳ（０.１２％〜２％）またはＣＨＡＰＳ（２０ｍＭ〜１６０ｍＭ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水中の３％ＢＳＡと混合し、上記の、共有結合により固定化されたペプチドとインキュベーションした。
【００９２】
実施例６
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
Ｌａｅｍｍｌｉゲルシステム（６２）を用いてタンパク質画分（１００〜１５０μL）をＳＤＳ上で分離した。簡潔には、タンパク質を、１×可溶化試料緩衝液Ｉ（２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールおよび５％β−メルカプトエタノールを含有する６２.５ｍＭ Ｔris−ＨＣl、 pＨ６.８）中に溶解し、試料を定電流で電気泳動した。分離したタンパク質を含むゲルスラブを、５０％メタノールおよび１０％酢酸中で固定化した。［35Ｓ］メチオニンタンパク質を含むポリアクリルアミドゲルは、Ａｍｐｌｉｆｙ（商標）溶液（Amersham Inc.）中で３０分間インキュベーションした後、Ｋｏｄａｋ Ｘ線フィルムに感光した。
【００９３】
別法では、Towbin et al.の方法（１０８）に従うウエスタンブロット分析のために、タンパク質を、Ｔris−グリシン緩衝液中、２０％メタノールの存在下で、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を、抗αまたはβチューブリンモノクローナル抗体（３％ＢＳＡ中０.５μｇ／ｍL；Amersham.Inc）を加える前に、５％スキムミルク／ＰＢＳ中でインキュベーションした。ＰＢＳで数回洗浄したのち、ニトロセルロース膜をヤギ抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベーションし、免疫反応性タンパク質を化学ＥＣL法（Amersham Inc.）を用いて、化学発光により視覚化した。
【００９４】
実施例７
タンパク質精製およびＮ末端配列
５７ｋＤａの関連タンパク質を、２つの高親和性結合ペプチドを使用し、ポリプロピレンロッドのブロックを用いて精製した。簡潔には、ペプチドが固定化されたロッドを上に示したように、全細胞リゼートとインキュベーションしたが、この場合では、担体物質はゼラチン（１％）であった。結合したタンパク質を、２％ＳＤＳおよび０.１％β−メルカプトエタノールを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（pＨ７.４）中で溶出した。溶出したタンパク質を、９倍量の氷冷エタノールと混合し、−２０℃でインキュベーションすることにより沈殿させた。この試料の高速遠心（４℃にて１５,０００×ｇで１５分間）の後、沈殿したタンパク質を、ＰＢＳ中の１％ＳＤＳ中に再懸濁し、同量の２×ＳＤＳ Laemmli試料緩衝液（６２）と混合した。タンパク質の試料を１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離しＰＶＤＦ膜に転写した。５７ｋＤａのバンドの移動をＰＶＤＦ膜をponseau Sで染色することにより視覚化した。５７ｋDaのバンドを含むＰＶＤＦ膜を切り取り、トロント（オンタリオ）にあるバイオテクノロジー・サービス・センターのタンパク質配列分析施設に出した。ペプチドのアミノ酸配列分析は、Flynnによって記載された手順（３３）に従ってアプライド・バイオシステムズGas−Phaseモデル４７０Aシークエネーター（商標）を使用して、EdmanとBeggの方法（２７）により行なった。
【００９５】
実施例８
Ｐ−ｇｐ相互作用タンパク質の同定
上に説明するように、Ｐ−ｇｐは、それぞれ６膜貫通ドメイン をコードする部分とＡＴＰ結合ドメイン からなる反復分子である。このＰ−ｇｐの 半分の部分はリンカードメインによって連結されている。リンカードメインを形成する９０アミノ酸のうち、３２アミノ酸は生理的ｐＨにおいて正または負の電荷を帯びている。Ｐ−ｇｐリン酸化部位はＰ−ｇｐ機能に関与すると思われるが、Ｐｇのリンカードメインの機能は依然未知である。ＭＤＲにおけるこのドメインの役割を同定し、分析するため、本発明のオーバーラップペプチド法を用いた。オーバーラップ合成ヘキサペプチドを用いる相互作用タンパク質を単離するための新規方法を開発した。相互作用タンパク質を単離するためのオーバーラップペプチドの使用は、相互作用タンパク質の特異的同定を可能にし、ランダムペプチドの使用に関連する多くの問題を回避する。図５はＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３のリンカードメインのアミノ酸配列を示す。ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３の２つのリンカードメインは４１％アミノ酸配列同一性あるいは６６％配列相同性を共有する。オーバーラップヘキサペプチドを、以前に記載されるように誘導体化ポリプロピレンロッド上で並行して合成した（３６、３７）。ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３それぞれの完全リンカー配列を網羅する９２および９０ヘキサペプチドを合成した。このヘキサペプチドはポリプロピレンロッドに共有結合したままである。
【００９６】
リンカードメインの種々のヘキサペプチドと相互作用するタンパク質を同定するため、ペプチド固定ロッドを、［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識されたＣＥＭまたはＣＥＭ／ＶＬＢ1.0細胞由来の全細胞リゼートとインキュベートした。非特異的結合リゼートタンパク質を洗浄した後、特異的結合タンパク質をＳＤＳ含有緩衝液で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。図６は、ＨＰ−ｇｐ１リンカー配列由来の９２オーバーラップヘキサペプチドと特異的に結合したタンパク質を示す。ＨＰ−ｇｐ１リンカードメインの３つの領域（617ＥＫＧＩＹＦＫＬＶＴＭ627（配列番号１）、657ＳＲＳＳＬＩＲＫＲＳＴＲＲＳＶＲＧＳＱＡ676（配列番号２）および693ＰＶＳＦＷＲＩＭＫＬＮＬＴ705（配列番号３））が５７ｋＤａタンパク質と結合した。ヘキサペプチド番号４６−６０、８１−８９および５−９（図５を参照）は減少した親和力で５７ｋＤａタンパク質と結合した（図６）。さらに、ペプチド４６−６０は、見かけの分子量８０ｋＤａおよび３０ｋＤａを有する２個の他のタンパク質との結合を示したが、これは５７ｋＤａタンパク質のものよりずっと弱かった。後者のタンパク質（８０ｋＤａおよび３０ｋＤａ）は、５７ｋＤａタンパク質シグナルの強度が高い場合に検出されることから、５７ｋＤａと関連する可能性がある（図６、ペプチド５０−５６）。３つの５７ｋＤａ結合タンパク質のアミノ酸配列を比較したが、その同タンパク質への結合を説明する、それらの間の有意な配列相同性は示されなかった。しかし興味深いことに、第二の領域（ペプチド４６−６０）のアミノ酸配列はタンパク質キナーゼＣ共通配列をコードする（１５）。さらに第三の領域（ペプチド８１−８９）はまた、タンパク質キナーゼＡ部位をコードすることが示された（４３）。
【００９７】
ヘキサペプチドの配列および５７ｋＤａタンパク質間の結合の親和力を測定するために、657ＳＲＳＳＬＩＲＫＲＳＴＲＲＳＶＲＧＳＱＡ676（配列番号２）によってコードされるヘキサペプチドと５７ｋＤａタンパク質間の相互作用に対する、ハイソルト（０．３〜２．４Ｍ ＫＣｌ）、両性イオン性界面活性剤（１０〜１６０ｍＭ ＣＨＡＰＳ）およびイオン性界面活性剤（０．１％〜２％ＳＤＳ）の効果を測定することを目的にした。我々の結果では、この結合がハイソルトに対して安定で、高濃度のＣＨＡＰＳに対して適度に安定であるが、低濃度のＳＤＳに対して感受性であることが示された（図７）。共有結合ペプチドに対するタンパク質結合の安定性を考慮し、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳの存在下、ＨＰ−ｇｐ１リンカードメイン由来のヘキサペプチドの、複合膜タンパク質を含み得るＣＨＡＰＳ可溶性タンパク質に対する結合を測定することを目的にした。図８の結果は、ＨＰ−ｇｐ１のリンカードメインをコードする同オーバーラップヘキサペプチドに対する結合タンパク質を示す。ヘキサペプチド番号４６−６０、８１−８９および５−９（図５を参照）は５７ｋＤａタンパク質に結合した（図７）が；他のタンパク質は、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳの不存在下でタンパク質と結合しなかった、同ヘキサペプチドまたは異なるヘキサペプチドと相互作用することがわかった。例えば、ヘキサペプチド３−１０は、ＣＨＡＰＳの不存在下で以前に検出されなかった〜２１０ｋＤａタンパク質と結合した。同様に、ＣＨＡＰＳの不存在下でいずれのタンパク質をも結合しなかった、ヘキサペプチド１６−２０は同じ高分子量タンパク質と結合した（図７）。ペプチド４６−６０は、ＣＨＡＰＳの存在下で、いくつかの低分子量タンパク質（〜４５−２５ｋＤａ）とより強く結合した。ヘキサペプチド８０−８９は５７ｋＤａタンパク質に加えて２個の他のタンパク質と結合した。総合すると、図８の結果は、５７ｋＤａタンパク質に対する種々のヘキサペプチドの結合は、ＣＨＡＰＳのような穏やかな両性イオン性界面活性剤に対して抵抗性であることを示す。さらに、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ中、膜タンパク質を可溶化すると、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳの不存在下では見られない他のタンパク質との結合を示す。１つの可能性は１０ｍＭ ＣＨＡＰＳが、複合膜タンパク質の、ＨＰ−ｇｐ１リンカードメインの種々のヘキサペプチドとの相互作用を可能にすることである。また、ＣＨＡＰＳは、新規ドメインを暴露し、これは次いでＨＰ−ｇｐ１リンカードメインのヘキサペプチドへの結合を受ける。さらに、ヘキサペプチド４０−６０および８０−８９と結合する、より低分子量のタンパク質のいくつかは５７ｋＤａタンパク質の分解産物であるかもしれない（図８）。
【００９８】
ヒトにおけるＰ−ｇｐ遺伝子ファミリーは２つのアイソフォーム、ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３（またはｍｄｒ １およびｍｄｒ ３；（２０））によってコードされる。しかし、以前に示されるように、ＨＰ−ｇｐ１のみがＭＤＲ表現型を与える。さらに、ＨＰ−ｇｐ１および３は約８０％アミノ酸配列相同性を共有し（１１１）；リンカードメインは、６６％アミノ酸配列相同性を有する、２つのアイソフォーム中で最も変化するドメインである。ＨＰ−ｇｐ３リンカードメインが同タンパク質または異なるタンパク質と結合するかどうかを測定するために、ＨＰ−ｇｐ３リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドをポリプロピレンロッド上で合成し、可溶性タンパク質に対するその結合を上記のように試験した。図９は、ＨＰ−ｇｐ３のヘキサペプチドに対する結合タンパク質のプロファイルを示す。興味深いことに、類似の分子量のタンパク質（５７ｋＤａ）はまた、ＨＰ−ｇｐ３由来のヘキサペプチドと結合した。しかし、いくつかのヘキサペプチドに対する結合はＨＰ−ｇｐ１に関して観察されたものと相違した（図６対図９）。ＨＰ−ｇｐ３に関して、３つのより大きな鎖のアミノ酸（618ＬＭＫＫＥＧＶＹＦＫＬＶＮＭ631（配列番号４）、648ＫＡＡＴＲＭＡＰＮＧＷＫＳＲＬＦＲＨＳＴＱＫＮＬＫＮＳ674（配列番号５）、および695ＰＶＳＦＬＫＶＬＫＬＮＫＴ707（配列番号６））は５７ｋＤａタンパク質と結合した。ＨＰ−ｇｐ３リンカードメインの第一および第三領域は、ＨＰ−ｇｐ１リンカードメインの第一および第三領域と相当の配列同一性を共有する（図１０）。したがって、同ヘキサペプチドが同タンパク質に結合したことは驚くべきことではない。ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３リンカードメインの第二領域は異なっている（図１０）。結果的に、ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３配列の両者は５７ｋＤａと結合するが、ＨＰ−ｇｐ３と５７ｋＤａタンパク質間の相互作用領域はＰ−ｇｐ１のものよりも大きい（図６対図９）。ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３結合ヘキサペプチド由来のアミノ酸配列の比較を図１０に示す。
【００９９】
実施例９
５７ｋＤａタンパク質の精製および配列決定
５７ｋＤａタンパク質のアイデンティティーを測定するために、ＨＰ−ｇｐ１リンカードメインの第二領域由来の２個のヘキサペプチド（658ＲＳＳＬＩＲ663（配列番号７）および669ＳＶＲＧＳＱ674（配列番号８））の数コピーを合成した。後者のヘキサペプチド配列は５７ｋＤａタンパク質と最も高い親和性で結合するものであった。図１１はこれらの２個のペプチドの、［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートに対する結合を示す。両ヘキサペプチドは５７ｋＤａタンパク質および見かけの分子量〜４１ｋＤａの別のタンパク質と特異的に結合した。興味深いことに、全細胞リゼートのインキュベーション時間を長くすると、４１ｋＤａタンパク質のレベルが増加した（図１１）。したがって、この４１ｋＤａバンドは５７ｋＤａタンパク質の分解産物である可能性がある。
【０１００】
２個のヘキサペプチドを用いて５７ｋＤａタンパク質を精製するため、ＢＳＡ以外の他の担体タンパク質を用いることができるかどうか測定することを目的とした。図１２は、５７ｋＤａタンパク質へのヘキサペプチドの結合に対する、ブロッキング担体なし、１％ゼラチン、および０．３％または３％ＢＳＡの作用を示す。この実験のこれらの結果は、担体タンパク質なしが非特異的結合の減少に必要とされた点で驚くべきものであった。後者の確立された結合条件を用いて、数コピーのヘキサペプチド658ＲＳＳＬＩＲ663（配列番号７）および669ＳＶＲＧＳＱ674（配列番号８）と結合した大量の５７ｋＤａタンパク質を単離した。図１３は、クーマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の精製５７ｋＤａタンパク質を示す。後者の精製タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Ponceau S で染色し、５７ｋＤａタンパク質の位置をつきとめた。予想される分子量で移動した Ponceau S 染色バンドを切り出し、直接Ｎ末端配列決定用に用いた（３３）。まず７ラウンドのエドマン分解により、ＭＲＥＶＩＳＩおよびＭＲＥＩＶＨＩの２個の配列が示された。これらの２個の配列は３アミノ酸のみが異なっていた（ＩＶＨの代わりにＶＩＳ）。FastA タンパク質サーチエンジンを用いてこの２個の配列を既知のタンパク質配列と比較すると、後者の配列がαおよびβ−チューブリンの最初の７Ｎ末端アミノ酸をコードすることが示された。この５７ｋＤａタンパク質として、チューブリンを同定することは、見かけの分子量および長いインキュベーション期間後に観察された潜在的分解産物と矛盾しない。この５７ｋＤａタンパク質のチューブリンとしてのアイデンティティーをさらに確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ニトロセルロース膜に転写されたヘキサペプチド結合５７ｋＤａタンパク質および全細胞リゼートに対してウエスタンブロット分析を行った。次いでこのニトロセルロース膜を、それぞれ抗α−チューブリンおよび抗β−チューブリンモノクローナル抗体でプローブした。図１４はウエスタンブロット分析の結果を示す。配列決定の結果と一貫して、両チューブリンサブユニット（αおよびβ）はヘキサペプチド結合タンパク質を含むレーンにおいて認識された。したがって、５７ｋＤａタンパク質のαおよびβ−チューブリンとしてのアイデンティティーが確立される。
【０１０１】
実施例１０
このように、オーバーラップペプチドスパニング法発明の能力はＰ−ｇｐを用いて確認された。上に示されるように、本発明のオーバーラップペプチドに基づく方法は、２個の相互作用するタンパク質間の領域は高親和性の結合配列および反発配列（repulsive sequences）から構成されることを示す仮説に対する原理の証拠、ならびにこのような方法を効率的かつ首尾良く用いて相互作用タンパク質のドメインおよび配列を同定し、特徴付けできることを提供する。高親和力と反発力のバランスは２個のタンパク質が安定な複合体を形成するかどうかを決定する。短い  一致するペプチドの使用により、ベイトおよびプレイタンパク質間のこのような高親和性の結合配列を同定できる。高親和性結合配列を単離するための短い  一致するペプチドの使用に関する理論的根拠は、本明細書中に記載される原理の証拠の成功および効率に本質的である。例えば、より大きなペプチドは、１ペプチド配列中に、相互作用の正味の力が負であるように、高親和性および反発結合配列を含むことができる。さらに、前または後のペプチドと１アミノ酸が異なるオーバーラップペプチドの使用は、非特異的結合の可能性を減少させる。したがって、オーバーラップペプチドはしばしば、種々のペプチドの結合親和力のピークを示す（図７および４を参照）。当業者であれば、より長いオーバーラップペプチドもまた使用できることが理解できよう。不幸にも、このようなより大きなペプチドは、高親和性と反発アミノ酸間のバランスの変化のせいで、相互作用タンパク質の同定をミスするリスクを増大させる。
【０１０２】
ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３リンカードメインの３つの異なる領域に対する５７ｋＤａタンパク質の結合は、本明細書中で提案される仮説と一貫し、タンパク質相互作用を説明する（タンパク質間相互作用の原理を参照）。高親和性結合ドメインは長さが１０〜２６アミノ酸のサイズにおいて変化する。ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３リンカードメインの場合、この３個の高親和性結合ドメインのうち２個が相当の配列同一性を共有していた。リンカードメインの第三の高親和性結合領域（658ＳＲＳＳＬＩＲＫＲＳＴＲＲＳＶＲＧＳＱＡ 677（配列番号２）対648ＫＡＡＴＲＭＡＰＮＧＷＫＳＲＬＦＲＨＳＴＱＫＮＬＫＮＳ674（配列番号５））はその一次アミノ酸配列において相同性を共有しなかった。しかし、これらの２個のドメインのらせん車輪の存在は、車輪の一表面上の正電荷を帯びた残基のクラスターと、他の側面上のセリン／スレオニン残基のクラスターを示す（図１５を参照）。興味深いことに、５７ｋＤａタンパク質に対して最も高い結合親和性の領域は、ＨＰ−ｇｐ１中の３個の推定のリン酸化部位をコードする（１５）。ＨＰ−ｇｐ３中のリン酸化部位の位置は実験では決定しなかったが、これらはプロテインキナーゼＣの共通配列をコードする。この側面では、リンカードメインでのＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３相互作用はこのドメインのリン酸化によって調節される。したがって、リンカードメイン内のＰ−ｇｐリン酸化部位の突然変異はその薬物輸送機能に影響しないことが示されている（４０）が、ＨＰ−ｇｐ１の他の提唱される機能（例えば内因性クロライドチャンネルのレギュレーター）はそのリン酸化状態によって影響されることが示された（４１、１１０）。実際、同様のリンカードメインをコードする、ＡＢＣトランスポーターのメンバー、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）は微小管ネットワークとともに局在することがわかった（１０７）。さらに、Ｔ８４細胞の頂端原形質膜への、ＣＦＴＲの微小管依存性急性補充は、細胞内ｃＡＭＰの増加およびリンカードメインのリン酸化に応答するものであった（１０７）。総合すると、リン酸化がチューブリン依存性の様式でＰ−ｇｐ機能の調節に役割を担うかどうか明らかではないが、ＨＰ−ｇｐ１リン酸化およびチューブリンへの結合が共に局在することから、その可能性があり得る。 本明細書中に記載されるアッセイを用いて、リン酸化ヘキサペプチドがチューブリンと結合するかどうかについての実験が進行中である。したがって、本発明は生物学的に関連するタンパク質性ドメイン間の相互作用の証明に門戸を開く。
【０１０３】
５７ｋＤａタンパク質がポリプロピレンロッドまたはその誘導体化部分と結合する可能性は、同様に誘導体化されたすべての他のロッドがこの５７ｋＤａタンパク質と結合しなかったのでありそうもない。さらに、少なくとも４つの異なる時点で合成されたヘキサペプチドは同タンパク質と結合した。最後に、ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３のリンカードメインの第一および第三高親和性結合領域をコードするヘキサペプチドはこの５７ｋＤａタンパク質と結合した。この５７ｋＤａタンパク質に加えて、見かけの分子量〜８０ｋＤａおよび３０ｋＤａの他のタンパク質もまた、リンカードメイン内のいくつかのヘキサペプチドと結合した。しかし、これらのタンパク質の結合は、この５７ｋＤａタンパク質よりずっと弱く、会合タンパク質であるかもしれない。種々のヘキサペプチドとこの５７ｋＤａタンパク質間の結合親和力の直接測定は行わなかったが、興味深いことにこの相互作用は１０ｍＭ ＣＨＡＰＳおよびハイソルトに耐性である。さらに、インキュベーション混合物中に１０ｍＭ ＣＨＡＰＳが存在すると、他のタンパク質（最も顕著には〜２１０ｋＤａタンパク質）の数鎖のヘキサペプチド（これは１０ｍＭ ＣＨＡＰＳの不存在下では結合しなかった）に対する結合が生じた。後者のタンパク質のヘキサペプチド１５−２８に対する結合は、ＣＨＡＰＳの不存在下では排除された、タンパク質の膜物質からの抽出のせいであり得る。ＣＨＡＰＳの不存在下では、細胞リゼートは可溶性タンパク質および膜結合タンパク質のみを含んでいた。
【０１０４】
ＨＰ−ｇｐ１またはＨＰ−ｇｐ３がチューブリンと結合する生理学的サインは明らかでない。しかし、チューブリンはいくつかの膜タンパク質と相互作用することが示された（４２、５０、８１、８６）。ＨＰ−ｇｐ１またはＨＰ−ｇｐ３はチューブリンと相互作用し、微小管は膜−骨格防御モデルの例である可能性がある（５６）。このモデルでは、膜レセプターの小画分は基礎となる細胞骨格に固定されているようである（９５）。この面において興味深いことに、インビボのレイト（rate）肝腫瘍におけるＰ−ｇｐの安定性および発現の増大は、α−チューブリン、β−アクチン、およびサイトケラチン８／１８を含む、いくつかの細胞骨格タンパク質の安定性における同様の増加と関連する（６４）。 Ｐ−ｇｐのチューブリンとのインビボ相互作用の機能的重要性についての実験が進行中である。
【０１０５】
実施例１１
オーバーラップペプチドスパニング法はＰｇｐ相互作用タンパク質に限定されない
本発明のオーバーラップペプチド手法は、完全な膜貫通タンパク質であるＰ−糖タンパク質ではなく、可溶性の膜結合タンパク質であるアネキシンＩを用いてさらに証明された。したがってアネキシンは構造的および機能的にＰ−糖タンパク質と異なっている。
【０１０６】
この手法を用いて、アネキシンＩと相互作用するいくつかのタンパク質およびこれらの相互作用を媒介するアネキシンＩの正確なアミノ酸配列を同定した。アネキシンＩは、可逆的なカルシウム依存様式でリン脂質と結合する、細胞内の可溶性の膜結合タンパク質の大きなファミリーのメンバーである。アネキシンファミリーの種々のメンバーは、小胞性輸送、膜融合エキソサイトーシス、シグナル伝達、およびイオンチャンネル形成および薬物耐性を含む、多数の種々の細胞内プロセスに関与していた。アネキシンＩの多くの可能な生理学的機能を考慮し、本発明の方法は、その相互作用タンパク質および、それに対するアネキシンＩ相互作用を媒介する正確なアミノ酸配列を同定するために設計された。
【０１０７】
簡単には、以前に記載されるように、アネキシンＩの完全アミノ酸配列（トータル〜３４０ペプチドプラスコントロール）と対応するオーバーラップペプチドを、上記のように固形支持体上で合成した。この場合、ヘキサペプチドではなく、オーバーラップヘプタペプチドを用いた。次いでこのペプチドを、［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識されたＭＣＦ７乳腫瘍細胞から単離された全細胞性タンパク質とインキュベートした。数回洗浄した後、上に概説するように、結合タンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。この結果はＰ−糖タンパク質を用いた以前の結果と一致し、この方法は分子量１０ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲（具体的には、〜１０ｋＤａ；〜２９ｋＤａ；〜８５ｋＤａ；〜１０６ｋＤａおよび〜２００ｋＤａ）の５タンパク質と相互作用するアネキシンＩアミノ酸配列（データは示していない）のいくつかの集団（islands）を同定する。簡単には、抽出物の細胞性タンパク質に関して高い親和性を有する８相互作用ドメインを同定した。これらの高アフィニティー集団の２つはアネキシンの尾部ドメイン（残基１〜３６）に位置し、６つはアネキシンＩのαヘリックス束（残基３７〜末端；例えばＷＯ９９／２１９８０）に位置していた。後者の相互作用タンパク質の同定は現在研究下にある。しかし、１０ｋＤａタンパク質のアネキシンＩとの相互作用は、アネキシンＩとＳ１００Ｃタンパク質間の直接相互作用を証明した以前の実験と一致している（７０）。
【０１０８】
したがって、本発明は高親和性タンパク質相互作用を単純かつ効率的に同定することを可能にし、ならびに相互作用パートナーの少なくとも１つの正確なアミノ酸配列を同時に同定することを可能にすることが示される。
【０１０９】
結論
結論として、全細胞リゼートからＰ−ｇｐ相互作用タンパク質を同定する単純な手法を用いた。さらにこの手法は、Ｐ−ｇｐ１およびＰ−ｇｐ３リンカードメインにおける、このタンパク質のチューブリンとの相互作用を媒介する正確なアミノ酸配列の同定を可能にする。さらに、高親和性結合配列の知見は、さらにアネキシンＩを用いて例証されたように、次いで細胞性タンパク質の全混合物からこの相互作用タンパク質を精製することを可能にする。実際、タンパク質間相互作用を研究するこの手法の単純性により、他のタンパク質に容易に適用される。最後に、我々の手法は、他の現在用いられている手法と比べて迅速で、いくつかの利点を有する。
【０１１０】
本発明は、本明細書中、その好ましい態様を用いて上に記載されたが、これは、請求の範囲に規定される本発明の精神および性質から逸脱することなく修飾可能である。
【０１１１】
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120. WO98 15833A
121. WO84 03564A
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  タンパク質間相互作用の原理を示す。プラス（＋）記号は、高い親和性の結合の領域を示す。マイナス（−）記号は、高い反発力の領域を示す。本文中に示したように、２つのタンパク質間の相互作用は、高い親和性の結合と高い反発力の非連続的な領域から構成されており、それらは、ほぼ、高い親和性の結合に傾く平衡状態にあり、タンパク質は共に会合している。
【図２】  本発明の１つの態様に従う高親和性結合配列の同定方法の概略図である。Ａ、種々の形は、全細胞リゼートにおける種々のタンパクを表す。記号は図１と同様である。Ｂ、タンパク質Ａの全配列（または断片）を網羅する小さなオーバーラップペプチドは、９６ウェルのポリプロピレンプレート上の誘導体化ウェルにおいて直接合成される。ペプチドの合成後、代謝的に放射性同位体で標識された細胞リゼートを、様々なペプチドを含む各ウェルに加え、インキュベーター緩衝液中でインキュベーションする。Ｃ、黒っぽく塗られた円は、タンパク質Ａの高親和性結合配列を同定するために９６ウェルプレートのすべてのウェルに添加された代謝的に放射性同位体で標識された、細胞から単離された全細胞リゼートに由来する放射性標識されたタンパク質を表する。Ｄ、よく洗浄したのち、高親和性結合配列（タンパク質Ａ由来のオーバーラップペプチド）は、放射性標識されたタンパク質（黒っぽく示した）と結合したウェルに存在する。タンパク質Ａと別のタンパク質との間の高親和性結合配列が第１、３、６および８列に示されている。高親和性結合配列を含むウェルは、放射性標識計測とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定する。
【図３】  本発明の別の態様による高親和性結合配列の同定方法を示す概略図である。Ａは、タンパク質Ａとタンパク質Ｂとの間の相互作用を示す概略図である。Ｂ、タンパク質の全配列（または断片）を網羅する小さなオーバーラップペプチドは、９６ウェルポリプロピレンプレートの誘導体化ウェル上で直接合成される。ペプチドの合成後、放射性標識されたタンパク質Ｂ（インビトロ転写−翻訳反応混合物から合成された）を、様々なペプチドを含む各ウェルに加え、インキュベーション緩衝液中でインキュベーションする。Ｃ、黒っぽく塗られた円は、タンパク質Ａの高親和性結合配列を同定するために９６ウェルプレートのすべてのウェルに添加された放射性標識されたタンパク質Ｂを表する。Ｄ、洗浄後、高親和性結合配列は、タンパク質Ｂ（黒っぽく示した放射性標識したタンパク質）がタンパク質Ａ由来のペプチドに依然として結合しているウェルに存在する。Ｅ、タンパク質Ａとタンパク質Ｂとの間の４つの高親和性結合配列が、第１、３、６および８列に示されている。高親和性結合配列を含むウェルは、放射性標識計測とＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定する。
【図４】  本発明の１つの態様によるタンパク質Ｂに対するタンパク質Ａの結合を特異的に阻害する薬物の選択方法を示す概略図である。Ａは、タンパク質Ａとタンパク質Ｂとの間の相互作用を示す概略図である。Ｂ、タンパク質Ａとタンパク質Ｂとの間の会合そして最終的にはその複合体の機能を阻害する特異的な薬物の選択のためのリード配列として使用される高親和性結合配列をコードするペプチド。図２および図３において同定された高親和性結合配列を標的とするために、高親和性結合配列の１つをコードするペプチドを９６ウェルプレートのすべてのウェルにおいて合成する。灰色の円は、図２および３で同定された４つの高親和性結合配列の１つを表する。Ｃ、試験化合物を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた後、放射性標識されたタンパク質Ｂを各ウェルに加える。もちろん、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングしてタンパク質Ａの高親和性結合配列に特異的に結合する薬物を同定することができる。上と同様に、転写−翻訳反応混合物から得られた放射性標識されたタンパク質Ｂを示す。プレートを洗浄し、タンパク質Ａの高親和性結合配列に特異的に結合する薬物が、放射性標識されたタンパク質Ｂを含まないウェルにおいて見つかる。Ｄ、タンパク質Ａにおける高親和性結合配列の１つに特異的に結合し、したがってタンパク質Ｂの結合を阻害する薬物／化合物を含んでいるウェルは、黒っぽい円の不在によって示す（つまり、第２８、７０および７５ウェル）。選択された薬物／化合物は、その作用機序を確認するための生物学的分析において使用することができる貴重なリード化合物を示す。確認された薬物は、インビボ試験へと進むことができる。
【図５】  二次構造とリンカードメインのアミノ酸で示されたＰ−糖タンパク質を表す。Ｐ−ｇｐの概略図は二次構造である。１２個の塗られた四角は１２個の推定される膜貫通ドメインを表す。２つのＡＴＰ結合ドメインをＰ−ｇｐのＮ末端側とＣ末端側で２つの円で表す。挿入部は結合ドメインを表す。ヒトＰ−ｇｐ１（ＨＰ−ｇｐ１）およびＨＰ−ｇｐ３の結合ドメインのアミノ酸配列は、一文字のアミノ酸記号として示す。ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３の各アミノ酸配列の始めと終わりの括弧内の数字は、結合物ドメインの長さを示す（ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３についてそれぞれ１〜９０および１〜８８）。アミノ酸配列の下の番号が付けられた線は、オーバーラップヘキサペプチドの配列を表し、それらは１個のアミノ酸ごとに異なる。ＨＰ−ｇｐ３については、最後のヘキサペプチドは８８番である。
【図６】  ＨＰ−ｇｐ１リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドに結合するタンパク質を示す。ＨＰ−ｇｐ１のリンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドをポリプロピレンロッド上で合成し、これらのペプチドに結合するタンパク質を同定するために使用した。ＨＰ−ｇｐ１について合計９０＋２個の対照ヘキサペプチドを［35Ｓ］メチオニンで代謝標識した細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした（方法参照）。すべての結合したタンパク質をペプチドが固定化されたロッドから溶出し、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで解析した。レーン１〜９２は、ＨＰ−ｇｐ１由来の［35Ｓ］メチオニン結合タンパク質を示す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図７】  ＨＰ−ｇｐ１ヘキサペプチドへのタンパク質の結合に対する種々の界面活性剤またはハイソルトの効果を示す。ＨＰ−ｇｐ１リンカードメイン由来のヘキサペプチド（ヘキサペプチド５０〜５３）に結合した代謝的に標識されたタンパク質を陰イオン性界面活性剤（０.１２％〜０.５％ ＳＤＳ）、両性イオン性界面活性剤（２０ｍＭ〜８０ｍＭ ＣＨＡＰＳ）または塩（０.３Ｍ〜１.２Ｍ ＫＣｌ）の増加する濃度の存在下で溶出した。ｙ−軸は、３つのヘキサペプチド（５０〜５３）のプールから溶出された放射能の量を表す。
【図８】  ＨＰ−ｇｐ１リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドへのタンパク質の結合に対するＣＨＡＰＳの効果を示す。ＨＰ−ｇｐ１のリンカードメインのオーバーラップヘキサペプチドを、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳで抽出された［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。結合したタンパク質をペプチドが固定化されたロッドから溶出し、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで解析した。レーン１〜９２はＨＰ−ｇｐ１リンカードメインに対する［35Ｓ］メチオニン結合したタンパク質を表す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図９】  ＨＰ−ｇｐ３リンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドに対するタンパク質結合を示す。ＨＰ−ｇｐ３のリンカードメインをコードするオーバーラップヘキサペプチドは、ポリプロピレンロッド上で合成され、これらのペプチドに結合するタンパク質を同定するために使用する。ＨＰ−ｇｐ３について合計８８のヘキサペプチドと２個の対照ヘキサペプチドを、 ［35Ｓ］メチオニンを代謝標識した細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。すべての結合したタンパク質を、ペプチドが固定化されたロッドから溶出し、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで解析した。レーン１〜９０は、ＨＰ−ｇｐ３由来の［35Ｓ］メチオニン結合タンパク質を示す。分子量マーカーの移動をゲルの左側に示す。
【図１０】  ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３リンカードメインの３つの結合領域の配列を示す。ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３リンカードメインの配列はアミノ酸の一文字記号を用いて示す。ＨＰ−ｇｐ３およびＨＰ−ｇｐ１に対する高い結合親和性の領域は太字で示す。同一のアミノ酸は、並べられた２つの配列の間の一文字記号によって示す。保存されたアミノ酸は、プラス（＋）記号によって示す。リンカードメインのアミノ酸配列の両側の数字は、ヒトＰ−ｇｐ１およびＰ−ｇｐ３のアミノ酸配列を参照している（９０，１１１）。
【図１１】  ２つの高親和性結合ヘキサペプチドを示す。ＨＰ−ｇｐ１リンカードメイン由来の２つの高親和性結合配列658ＲＳＳＬＩＲ663（配列番号７）および669ＳＶＲＧＳＱ674（配列番号８）を再合成し、２４時間または４８時間のインキュベーションの後、［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識された細胞由来の全細胞リゼートとインキュベーションした。結合したタンパク質を、ペプチドが固定化されたロッドから溶出し、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで解析した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図１２】  非特異的な結合のブロッキング剤としての種々のキャリアータンパク質の効果を示す。［35Ｓ］メチオニンで代謝的に標識されたＣＥＭ細胞由来の全細胞リゼートをそのまま使用するか１％ゼラチン、０.３％ＢＳＡまたは３％ＢＳＡを調製した。細胞リゼートを、ＨＰ−ｇｐ１リンカードメイン由来の高親和性結合ヘキサペプチド658ＲＳＳＬＩＲ663（配列番号７）とインキュベーションした。結合したタンパク質をＳＤＳ試料緩衝液で溶出し、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで解析した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図１３】  ５７のｋＤａタンパク質の精製を示す。全細胞リゼートを、５０のＨＰ−ｇｐ１ヘキサペプチド658ＲＳＳＬＩＲ663（配列番号７）および669ＳＶＲＧＳＱ674（配列番号８）とインキュベーションした。１００のヘキサペプチドインキュベーション混合物から得られた５７ｋＤａタンパク質（Ｐ５７）を含む試料をプールし、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで解析した。解析したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Ｐｏｎｓｅａｕ Ｓで染色した。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図１４】  抗チューブリンモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティング分析を示す。ＣＥＭ細胞由来の全細胞リゼートおよびＨＰ−ｇｐ１リンカードメイン（Ｐ５７）の高親和性結合ヘキサペプチドから溶出されたタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥで解析しニトロセルロース膜に転写した。膜の半分を抗αおよび抗βチューブリンモノクローナル抗体でプローブした。分子量マーカーの移動を図の左側に示す。
【図１５】  ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３リンカードメインの高親和性領域のらせん車輪を示す。ＨＰ−ｇｐ１およびＨＰ−ｇｐ３リンカードメインの高い親和性の結合領域を一文字のアミノ酸記号で示す。らせんの片側の正に荷電したアミノ酸を円で囲んだ。