(57)【要約】  本発明は、ＭＧ５３突然変異体に関し、該ＭＧ５３突然変異体は、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを除き、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と同一であり、該セリンは、欠失しているおよび／またはセリンでないかもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸へと突然変異している。本発明はまた、ＭＧ５３突然変異体を含む医薬組成物、ＭＧ５３突然変異体をコードする核酸、ＭＧ５３突然変異体を調製するための方法、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造におけるＭＧ５３突然変異体の使用にも関する。特に、本発明のＭＧ５３突然変異体は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、野生型ＭＧ５３によりもたらされる、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常症などの代謝的副作用を回避または低減しうる。【選択図】図１６
2019530433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＧ５３突然変異体であって、該ＭＧ５３突然変異体は、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを除き、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と同一であり、該セリンは、欠失しているおよび／またはセリンでないかもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸へと突然変異している、前記ＭＧ５３突然変異体。
【請求項２】
コイルドコイル−ＳＰＲＹ領域が、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の１２２〜４７７位に位置する、請求項１に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項３】
野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示される、請求項１または２に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項４】
セリンが、非極性アミノ酸へと突然変異している、請求項１から３のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項５】
非極性アミノ酸が、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項４に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項６】
非極性アミノ酸が、アラニンである、請求項５に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項７】
セリンが、セリンでないかまたはトレオニンでない極性アミノ酸へと突然変異している、請求項１から６のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項８】
極性アミノ酸が、グルタミン、システイン、アスパラギン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される、請求項７に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項９】
極性アミノ酸が、システインである、請求項８に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項１０】
欠失または突然変異したセリンが、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の以下の位置：１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、３０１、３０５、３０７、３４１、３７７、４１８、４３０位のうちの１つまたは複数に位置する、請求項１から９のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項１１】
欠失または突然変異したセリンが、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の以下の位置：２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７位のうちの１つまたは複数に位置する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項１２】
欠失または突然変異したセリンが、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の２５５位に位置する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項１３】
２つ以上のセリン突然変異を有する、請求項１２に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項１４】
配列番号７〜１２で示されたアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対する少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、細胞修復機能および／または心保護機能を依然として保持しつつ、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を回避する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項１５】
ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号７〜１２で示されたアミノ酸配列のうちのいずれか１つである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項１６】
ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号７で示されたアミノ酸配列である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸。
【請求項１９】
配列番号１３〜１８で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２１】
配列番号１３〜１８で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む、請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体を調製するための方法であって、突然変異のための１つまたは複数のセリン位置を決定すること、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むプラスミドの全長配列上の位置において、部位特異的突然変異誘発を実施すること、部位特異的突然変異を有するプラスミドを、宿主細胞へとトランスフェクトすること、およびＭＧ５３突然変異体を産生するように宿主細胞を誘導することを含む方法。
【請求項２４】
部位特異的突然変異誘発が、以下のステップ：
（１）ｃＤＮＡ配列内の、部位特異的突然変異誘発で標的とされたアミノ酸の対応するヌクレオチド部位を決定し、突然変異部位においてヌクレオチド配列を標的アミノ酸に従って改変し、突然変異部位を含む２０〜４０ｂｐの長さの配列を切り出すことにより、プライマーをデザインすること；
（２）ステップ（１）のプライマーを使用し、野生型ＭＧ５３プラスミドを鋳型とすることによりＰＣＲ反応を実施し、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、ＰＣＲ産物を精製すること；
（３）制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、ステップ（２）の精製ＰＣＲ産物に対する酵素反応を実施し、酵素消化産物を、適切なプラスミド発現ベクターとライゲーションし、細菌コンピテント細胞内にライゲーション産物を形質転換し、培養すること；
（４）ステップ（３）のクローンを選択して、ステップ（１）のプライマーを使用することにより、コロニーＰＣＲ同定を実施し、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、次いで、ＤＮＡシーケンシング同定を実施して、部位特異的突然変異を有する陽性クローンを同定すること
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＭＧ５３突然変異体の使用。
【請求項２６】
医薬が、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、代謝的副作用を回避する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
心疾患が、心筋損傷と関連する疾患である、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項２８】
心疾患が、糖尿病性心疾患、心筋虚血症、心虚血症／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心筋炎、冠動脈性心疾患、および心膜炎を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
糖尿病性脳血管疾患が、脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮、および脳梗塞を含む、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項３０】
糖尿病性眼合併症が、糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病関連ブドウ膜炎、および失明を含む、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項３１】
糖尿病性神経障害が、糖尿病性末梢神経障害を含む、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項３２】
腎疾患が、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、急性腎傷害、および糖尿病性腎症を含む、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項３３】
細胞および／または組織の損傷と関連する疾患が、腎臓、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、消化管、および皮膚の損傷と関連する疾患を含む、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項３４】
細胞および／または組織の損傷と関連する疾患が、外傷、火傷、潰瘍、粘膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、および皮膚の老化を含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号７で示されたアミノ酸配列である、請求項２５から３４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学分野に関する。特に、本発明は、ＭＧ５３突然変異体、ＭＧ５３突然変異体を含む医薬組成物、ＭＧ５３突然変異体をコードする核酸、ＭＧ５３突然変異体を調製するための方法、ならびに心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造におけるＭＧ５３突然変異体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＩＭ７２としても知られている、ミツグミン５３（ＭＧ５３）は、トリパータイトモチーフ含有タンパク質（ＴＲＩＭ）ファミリーのメンバーである。ＭＧ５３は、Ｎ末端におけるＴＲＩＭモチーフと、Ｃ末端におけるＳＰＲＹモチーフとを含む。ＴＲＩＭモチーフは、連続して連結された、Ｒｉｎｇドメイン、Ｂ−ｂｏｘドメイン、コイルドコイルドメインからなる（Ｃｈｕａｎｘｉ  Ｃａｉら、ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８４巻（５）、３３１４〜３３２２（２００９）を参照されたい）。ＭＧ５３は、全身にわたり、様々な役割を果たすが、主に、横紋筋内で発現し、骨格筋および心臓のホメオスタシスを維持するのに不可欠である。ＭＧ５３は、既に、細胞膜修復機能および心保護機能を有することが見出された（例えば、Ｃｈｕａｎｘｉ  Ｃａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１巻、５６〜６４（２００９）；ＣＮ１０１７９７３７５Ｂを参照されたい）。加えて、さらなる研究は、ＭＧ５３がまた、再灌流傷害サルベージキナーゼ（ＲＩＳＫ）経路の活性化により、虚血プレコンディショニング（ＩＰＣ）および虚血ポストコンディショニング（ＰｏｓｔＣ）において、保護の役割も果たすことを見出した。ＭＧ５３分子のＮ末端およびＣ末端はそれぞれ、カベオリン３およびｐ８５−ＰＩ３Ｋキナーゼに結合して、複合体を形成することが可能であり、この複合体が、ＲＩＳＫ経路を活性化させて、心保護を誘発する（Ｃｈｕｎ−Ｍｅｉ  Ｃａｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１２１、２５６５〜２５７４（２０１０）を参照されたい）。
【０００３】
ＭＧ５３は、細胞膜修復機能および心保護機能を有するが、かつての研究はまた、ＭＧ５３が、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有し、これが、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドロームの発生に寄与することも見出した。ＭＧ５３のＮ末端における、ＴＲＩＭモチーフのＲｉｎｇドメインは、インスリン受容体（ＩＲ）およびインスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）に結合し、ユビキチン化と、プロテアソームによる、これらのタンパク質のその後の分解とを媒介し、これにより、インスリンシグナル伝達経路を遮断し、インスリン抵抗性および肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常症など、関連する代謝疾患をもたらす（例えば、Ｒ．Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４９４、３７５〜３７９（２０１３）；Ｊ．Ｓ．Ｙｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、４、２３５４（２０１３）を参照されたい）。したがって、野生型ＭＧ５３は、細胞膜修復機能および心保護機能を誘発するが、また、インスリン抵抗性およびこれに関連する代謝疾患など、有害な副作用も引き起こす。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ＭＧ５３突然変異体、ＭＧ５３突然変異体を含む医薬組成物、ＭＧ５３突然変異体をコードする核酸、ＭＧ５３突然変異体を調製するための方法、ならびに心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、ＭＧ５３突然変異体の使用に関する。特に、ＭＧ５３突然変異体は、細胞修復機能および／または心保護機能を依然として保持しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常症などの代謝的副作用を回避または低減しうる。
【０００５】
一態様では、本発明は、欠失および／またはセリンでないもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸へと突然変異している、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを除き、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と同一である、ＭＧ５３突然変異体に関する。ある特定の実施形態では、コイルドコイル−ＳＰＲＹ領域は、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の１２２〜４７７位に位置する。ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３は、動物、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌなどに由来する。ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２で示される。
【０００６】
ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体は、非極性アミノ酸へと突然変異している、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを除き、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と同一である。ある特定の実施形態では、非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群から選択される。好ましくは、ある特定の実施形態では、非極性アミノ酸は、アラニンである。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体は、セリンでないかまたはトレオニンでない任意の極性アミノ酸へと突然変異している、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを除き、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と同一である。ある特定の実施形態では、極性アミノ酸は、グルタミン、システイン、アスパラギン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される。好ましくは、ある特定の実施形態では、極性アミノ酸は、システインである。
【０００７】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１３９で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【０００９】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１４０で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１０】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１４１で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１１】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１４２で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、または２６９位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１２】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号２で示されたアミノ酸配列の、１８８、１８９、２１０、２１１、２１４、２４６、２５３、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３６７、３７７、４１８、４３０、または４４０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号３で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８８、１８９、２１０、２１１、２１４、２４６、２５３、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０７、３１４、３４１、３６７、３７７、４１８、４３０、４４０、４６４、または４７４位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号４で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、４３０、または４６４位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号５で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、３０１、３０５、３０７、３１４、３４１、３７７、４１１、４１８、４２５、４３０、または４７４位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号６で示されたアミノ酸配列の、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０７、３１４、３４１、３６７、３７７、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の、１５０、１８８〜１８９、２１０〜２１１、２１４、２４６、２５３〜２５５、２６９、２９６〜２９７、３０１、３０５〜３０７、３１４、３４１、３６７、３７７、４０５、４１１、４１８、４２５、４３０、４４０、４６４、または４７４位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１８】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の、１８９、２１１、２１４、２４６、２５３〜２５５、２６９、２９６、３０１、３０５、３０７、３４１、３７７、４１８、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００１９】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の、２１１、２１４、２４６、２５３〜２５５、２６９、２９６、または２９７位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００２０】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、または２９７位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００２１】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の、２５３〜２５５位のうちの１つまたは複数に位置する。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の２５３位に位置する。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の２５５位に位置する。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１で示されたアミノ酸配列の２５５位に位置する。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２で示されたアミノ酸配列の２５５位に位置する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体は、２つ以上のセリン突然変異を含む。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体の、２つ以上のセリン突然変異は、２５３〜２５５位のうちの１つまたは複数におけるセリン突然変異を含む。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体の、２つ以上のセリン突然変異は、２５３位におけるセリン突然変異を含む。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体の、２つ以上のセリン突然変異は、２５５位におけるセリン突然変異を含む。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体の、２つ以上のセリン突然変異は、２５３および２５５位におけるセリン突然変異を含む。
【００２３】
当業者は、異なる種の野生型ＭＧ５３タンパク質内のセリン残基は、異なる位置に位置する場合があり、したがって、欠失または突然変異したセリンの位置もまた、異なりうることを理解するであろう。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１で示されたアミノ酸配列内の対応するセリン位置から、１〜１０アミノ酸、１〜５アミノ酸、または１〜３アミノ酸以内の上流または下流にある。
【００２４】
ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１５０で示されたアミノ酸配列である。好ましくは、ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号７で示されたアミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０で示されたアミノ酸配列のうちの１つに対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、ＭＧ５３突然変異体は、細胞膜修復機能および／または心保護機能を依然として保持しつつ、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を回避する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＭＧ５３突然変異体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
別の態様では、本発明は、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸に関する。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号１３〜１８で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号１５１〜１５４で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターに関する。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号１３〜１８で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号１５１〜１５４で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で記載される発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
なおも別の態様では、本発明は、ＭＧ５３突然変異体を調製するための方法であって、突然変異のための１つまたは複数のセリン位置を決定すること、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むプラスミドの全長配列上の前記位置において、部位特異的突然変異誘発を実施すること、部位特異的突然変異を有するプラスミドを、宿主細胞へとトランスフェクトすること、およびＭＧ５３突然変異体を産生するように宿主細胞を誘導することを含む方法に関する。ある特定の実施形態では、部位特異的突然変異誘発は、（１）ｃＤＮＡ配列内の、部位特異的突然変異誘発で標的とされたアミノ酸の対応するヌクレオチド部位を決定し、突然変異部位においてヌクレオチド配列を標的アミノ酸に従って改変し、突然変異部位を含む２０〜４０ｂｐの長さの配列を切り出すことにより、プライマーをデザインすること；（２）ステップ（１）のプライマーを使用し、野生型ＭＧ５３プラスミドを鋳型とすることにより、ＰＣＲ反応を実施し、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、ＰＣＲ産物を精製すること；（３）制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、ステップ（２）の精製ＰＣＲ産物に対する酵素反応を実施し、酵素消化産物を、適切なプラスミド発現ベクターとライゲーションし、細菌コンピテント細胞内にライゲーション産物を形質転換し、培養することを含む。ある特定の実施形態では、部位特異的突然変異誘発は、以下のステップをさらに含む：（４）ステップ（３）のクローンを選択して、ステップ（１）のプライマーを使用することにより、コロニーＰＣＲ同定を実施し、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、次いで、ＤＮＡシーケンシング同定を実施して、部位特異的突然変異を有する陽性クローンを同定すること。
【００２８】
別の態様では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、ＭＧ５３突然変異体の使用に関する。ある特定の実施形態では、医薬は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常症などの代謝的副作用を回避または低減しうる。ある特定の実施形態では、心疾患は、糖尿病性心疾患、心筋虚血症、心虚血症／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心筋炎、冠動脈性心疾患、および心膜炎を含むがこれらに限定されない、心筋損傷と関連する疾患である。ある特定の実施形態では、糖尿病性脳血管疾患は、脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮、および脳梗塞を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性眼合併症は、糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病関連ブドウ膜炎、および失明を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性神経障害は、糖尿病性末梢神経障害を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、腎疾患は、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、急性腎傷害、糖尿病性腎症などを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞および／または組織の損傷と関連する疾患は、脳傷害、肺傷害、脾臓傷害、脾臓破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化管粘膜傷害、外傷、火傷、潰瘍、粘膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳卒中、皮膚の老化など、腎臓、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、消化管、および皮膚の細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、配列番号７で示されたポリペプチドの使用に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１５０で示されたポリペプチドの使用に関する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量のＭＧ５３突然変異体を投与するステップを含む方法に関する。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、および脂質異常症などの代謝的副作用を回避または低減しうる。ある特定の実施形態では、心疾患は、糖尿病性心疾患、心筋虚血症、心虚血症／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心筋炎、冠動脈性心疾患、および心膜炎を含むがこれらに限定されない、心筋損傷と関連する疾患である。ある特定の実施形態では、糖尿病性脳血管疾患は、脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮、および脳梗塞を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性眼合併症は、糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病関連ブドウ膜炎、および失明を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性神経障害は、糖尿病性末梢神経障害を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、腎疾患は、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、急性腎傷害、糖尿病性腎症などを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞および／または組織の損傷と関連する疾患は、脳傷害、肺傷害、脾臓傷害、脾臓破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化管粘膜傷害、外傷、火傷、潰瘍、粘膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳卒中、皮膚の老化など、腎臓、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、消化管、および皮膚の細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、配列番号７で示されたポリペプチドを投与するステップを含む方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１５０で示されたポリペプチドを投与するステップを含む方法に関する。
【００３０】
さらに他の態様では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患の処置における使用のためのＭＧ５３突然変異体に関する。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、および脂質異常症などの代謝的副作用を回避または低減しうる。ある特定の実施形態では、心疾患は、糖尿病性心疾患、心筋虚血症、心虚血症／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心筋炎、冠動脈性心疾患、および心膜炎を含むがこれらに限定されない、心筋損傷と関連する疾患である。ある特定の実施形態では、糖尿病性脳血管疾患は、脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮、および脳梗塞を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性眼合併症は、糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病関連ブドウ膜炎、および失明を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性神経障害は、糖尿病性末梢神経障害を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、腎疾患は、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、急性腎傷害、糖尿病性腎症などを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞および／または組織の損傷と関連する疾患は、脳傷害、肺傷害、脾臓傷害、脾臓破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化管粘膜傷害、外傷、火傷、潰瘍、粘膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳卒中、皮膚の老化など、腎臓、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、消化管、および皮膚の細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患の処置における使用のための、配列番号７で示されたポリペプチドに関する。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患の処置における使用のための、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１５０で示されたポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】野生型ＭＧ５３の分子構造を例示する図である。
【図２】ヒト野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列である配列番号１と、これをコードする核酸配列である配列番号１９とを例示する図である。
【図３】マウス野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列である配列番号２と、これをコードする核酸配列である配列番号２０とを例示する図である。
【図４】ラット野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列である配列番号３と、これをコードする核酸配列である配列番号２１とを例示する図である。
【図５】サル野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列である配列番号４と、これをコードする核酸配列である配列番号２２とを例示する図である。
【図６】ブタ野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列である配列番号５と、これをコードする核酸配列である配列番号２３とを例示する図である。
【図７】イヌ野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列である配列番号６と、これをコードする核酸配列である配列番号２４とを例示する図である。
【図８】ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号７と、これをコードする核酸配列である配列番号１３とを例示する図である。
【図９】マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号８と、これをコードする核酸配列である配列番号１４とを例示する図である。
【図１０】ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号９と、これをコードする核酸配列である配列番号１５とを例示する図である。
【図１１】サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号１０と、これをコードする核酸配列である配列番号１６とを例示する図である。
【図１２】ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号１１と、これをコードする核酸配列である配列番号１７とを例示する図である。
【図１３】イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号１２と、これをコードする核酸配列である配列番号１８とを例示する図である。
【図１４】アデノウイルスを使用して、マウス野生型ＭＧ５３およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を、新生仔ラットの初代培養心筋細胞内で過剰発現させた後における、細胞内ＡＴＰおよびＬＤＨ放出の量を例示する図である。上パネルは、アデノウイルスを使用して、マウス野生型ＭＧ５３およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を、新生仔ラットの初代培養心筋細胞内で過剰発現させる場合の、低酸素状態および再酸素化処置の後に検出される、細胞内ＡＴＰの量を示し、ここで、Ａｄｖ−β−ｇａｌとは、ガラクトシダーゼを発現するが、マウス野生型ＭＧ５３またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現しない対照ウイルスを表し；Ａｄｖ−ＭＧ５３−ｍｙｃとは、マウス野生型ＭＧ５３を発現するアデノウイルスを表し；Ａｄｖ−ＭＧ５３−Ｓ２５５Ａ−ｍｙｃとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現するアデノウイルスを表す（ｎ＝７、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。下パネルは、アデノウイルスを使用して、マウス野生型ＭＧ５３およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を、新生仔ラットの初代培養心筋細胞内で過剰発現させる場合の、低酸素状態および再酸素化処置の後に検出される、ＬＤＨ放出の量を示し、ここで、Ａｄｖ−β−ｇａｌとは、ガラクトシダーゼを発現するが、マウス野生型ＭＧ５３またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現しない対照ウイルスを表し；Ａｄｖ−ＭＧ５３−ｍｙｃとは、マウス野生型ＭＧ５３を発現するアデノウイルスを表し；Ａｄｖ−ＭＧ５３−Ｓ２５５Ａ−ｍｙｃとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現するアデノウイルスを表す（ｎ＝７、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図１５】マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異が、マウス野生型ＭＧ５３による、ＡＫＴの活性化に影響を及ぼさないことを例示する図である。上パネルは、アデノウイルスを使用して、マウス野生型ＭＧ５３およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を、新生仔ラットの初代培養心筋細胞内で過剰発現させた場合に、ウェスタンブロットにより検出される、細胞内ｐ−ＡＫＴ４７３の量を示し、ここで、β−ｇａｌとは、ガラクトシダーゼを発現しないが、マウス野生型ＭＧ５３またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現しない対照アデノウイルスを表し；ＭＧ５３とは、マウス野生型ＭＧ５３を発現するアデノウイルスを表し；Ｓ２５５Ａとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現するアデノウイルスを表す。下パネルは、上パネルの統計図であり、ここで、Ａｄｖ  β−ｇａｌとは、ガラクトシダーゼを発現するが、マウス野生型ＭＧ５３またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現しない対照アデノウイルスを表し；Ａｄｖ  ＭＧ５３とは、マウス野生型ＭＧ５３を発現するアデノウイルスを表し；Ａｄｖ  ＭＧ５３  Ｓ２５５Ａとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現するアデノウイルスを表す（ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５）。
【図１６】マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異が、ＭＧ５３に媒介される基質の分解を阻害することを例示する図である。図１６Ａの上パネルは、ＩＲＳ１、マウス野生型ＭＧ５３、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体、またはマウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系内で過剰発現するプラスミド内で、ウェスタンブロットにより検出される、ＩＲＳ１タンパク質の含量を示し、ここで、ＣＯＮとは、マウス野生型ＭＧ５３、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体、およびマウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体の発現を伴わない、空ベクターによるプラスミド対照を表し；ＭＧ５３とは、マウス野生型ＭＧ５３を発現するベクタープラスミドを表し；Ｓ２５５Ａとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現するベクタープラスミドを表し；Ｄ−ＲＩＮＧとは、マウスＲＩＮＧドメインが切断されている、マウスＭＧ５３切断型突然変異体であるＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧを発現するベクタープラスミドを表す。図１６Ａの下パネルは、上パネルの統計図（ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）である。図１６Ｂの上パネルは、ＩＲ、マウス野生型ＭＧ５３、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体、またはマウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系内で過剰発現するプラスミド内で、ウェスタンブロットにより検出される、ＩＲタンパク質の含量を示し、ここで、ＣＯＮとは、マウス野生型ＭＧ５３、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体、およびマウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体の発現を伴わない、空ベクターによるプラスミド対照を表し；ＭＧ５３とは、マウス野生型ＭＧ５３を発現するベクタープラスミドを表し；Ｓ２５５Ａとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現するベクタープラスミドを表し；Ｄ−ＲＩＮＧとは、マウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体を発現するベクタープラスミドを表す。図１６Ｂの下パネルは、上パネルの統計図（ｎ＝５、＊＊ｐ＜０．０１）である。
【図１７】ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体が、ＭＧ５３に媒介される基質の分解を阻害することを例示する図である。上パネルは、ＩＲＳ１、ヒト野生型ＭＧ５３、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体、またはヒトＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系内で過剰発現するプラスミド内で、ウェスタンブロットにより検出される、ＩＲＳ１タンパク質の含量を示し、ここで、ＣＯＮとは、ヒト野生型ＭＧ５３、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体、およびヒトＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体の発現を伴わない、空ベクターによるプラスミド対照を表し；ＭＧ５３とは、ヒト野生型ＭＧ５３を発現するベクタープラスミドを表し；ＭＧ５３−ｄＲとは、ヒトＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体を発現するベクタープラスミドを表す。下パネルは、上パネルの統計図（ｎ＝５、＊＊ｐ＜０．０１）である。
【図１８】マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体が、ＭＧ５３の、基質であるＩＲＳ１への結合を阻害することを例示する図である。図１８Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系内で、マウス野生型ＭＧ５３と、ＭＧ５３の基質であるＩＲＳ１とを共発現させるか、またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体と、ＭＧ５３の基質であるＩＲＳ１とを共発現させた後で、ＩＲＳ１タンパク質を免疫沈降させ、ウェスタンブロットを実施することにより検出される、ＭＧ５３−ＩＲＳ１複合体の含量を示す。図１８Ａでは、ＭＧ５３とは、マウス野生型ＭＧ５３を表し、ＭＧ５３  Ｓ２５５Ａとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を表し、ＩＲＳ１とは、マウスインスリン受容体基質を表す。図１８Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験時における、固定化され、精製されたタンパク質である、ＩＲＳ１の、精製されたタンパク質である、マウス野生型ＭＧ５３またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体への、移動相中の結合強度を示し、ここで、ＭＧ５３とは、マウス野生型ＭＧ５３を表し、ＭＧ５３−Ｓ２５５Ａとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を表し、ラットＩＲＳ１とは、ラットインスリン受容体基質を表す。
【図１９】マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体の、タンパク質であるＩＲＳ１の量に対する効果を例示する図である。上パネルは、ＩＲＳ１、Ｕｂ、ＭＧ５３、またはＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系内で過剰発現するプラスミド内で、ウェスタンブロットにより検出される、タンパク質であるＩＲＳ１の含量を示し、Ｕｂとは、ユビキチンを表し、ＭＧ５３とは、マウス野生型ＭＧ５３を表し、ＭＧ５３−Ｓ２５５Ａとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を表す。下パネルは、上パネルの統計図であり、ここで、ＣＯＮとは、マウス野生型ＭＧ５３およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体の発現を伴わない、空ベクターによるプラスミド対照を表し；ＭＧ５３−Ｓ２５５Ａとは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を発現するベクタープラスミドを表す（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図２０】ヒトＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列である、配列番号１３９（これは、ＮＣＢＩ番号：ＢＡＤ１８６３０．１に対応する）と、これをコードする核酸配列である、配列番号１４３とを例示する図である。
【図２１】ヒトＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列である、配列番号１４０（これは、ＮＣＢＩ受託番号：ＸＰ＿０１６８７８７４３．１に対応する）と、これをコードする核酸配列である、配列番号１４４とを例示する図である。
【図２２】ヒトＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列である、配列番号１４１（これは、ＮＣＢＩ：ＢＡＣ０３５０６．１に対応する）と、これをコードする核酸配列である、配列番号１４５とを例示する図である。
【図２３】ヒトＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列である、配列番号１４２（これは、ＮＣＢＩ番号：ＡＡＨ３３２１１．１に対応する）と、これをコードする核酸配列である、配列番号１４６とを例示する図である。
【図２４】ヒトＭＧ５３サブタイプである、Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号１４７と、これをコードする核酸配列である配列番号１５１とを例示する図である。
【図２５】ヒトＭＧ５３サブタイプである、Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号１４８と、これをコードする核酸配列である配列番号１５２とを例示する図である。
【図２６】ヒトＭＧ５３サブタイプである、Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号１４９と、これをコードする核酸配列である配列番号１５３とを例示する図である。
【図２７】ヒトＭＧ５３サブタイプである、Ｓ２５５Ａ突然変異体のアミノ酸配列である配列番号１５０と、これをコードする核酸配列である配列番号１５４とを例示する図である。
【図２８】本発明の各種についての、全長ＭＧ５３タンパク質およびこの断片のアミノ酸位置の命名法の概略図を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下では、本発明の多様な態様および実施形態が開示されるが、本出願の精神および主題の範囲から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多様で同等な変化および改変を行うことができる。本明細書で開示される多様な態様および実施形態は、例示だけを目的とするものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本出願の実際の保護範囲は、特許出願の範囲により規定される。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。本出願で引用される、全ての参考文献、特許、および特許出願は、参照によりそれらの全体に組み込まれる。
【００３３】
一態様では、本発明は、ＭＧ５３突然変異体に関し、該ＭＧ５３突然変異体は、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを除き、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と同一であり、該セリンは、欠失しているおよび／またはセリンでないかもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸へと突然変異している。
【００３４】
本明細書で使用される「野生型ＭＧ５３」または「野生型ＭＧ５３タンパク質」という用語は、対象において発現する、全長ＭＧ５３タンパク質またはこの断片の天然配列を指す。ＭＧ５３タンパク質は、図１で示される構造を伴う、多機能的タンパク質である。異なる種の全長ＭＧ５３タンパク質は、長さが若干異なるが、一般に、Ｎ末端におけるＴＲＩＭモチーフと、Ｃ末端におけるＳＰＲＹモチーフとを含む、約４７７アミノ酸を有する。ＴＲＩＭモチーフは、連続して連結された、Ｒｉｎｇドメイン、Ｂ−ｂｏｘドメイン、コイルドコイルドメイン（ＲＢＣＣ）からなる。ＭＧ５３タンパク質は、膜修復に重要な構成要素であって、虚血症−再灌流傷害に対する、プレコンディショニングおよびポストコンディショニングによる保護において、不可欠の役割を果たす構成要素のうちの１つである。一方、ＭＧ５３タンパク質の高発現はまた、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドロームも引き起こしうる。当技術分野では、ＭＧ５３の構造および機能のほか、他のタンパク質とのその相互作用についても、詳細に報告されている（例えば、Ｃｈｕａｎｘｉ  Ｃａｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８４（５）、３３１４〜３３２２（２００９）；Ｘｉａｎｈｕａ  Ｗａｎｇら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０７、７６〜８３（２０１０）；Ｅｕｎ  Ｙｏｕｎｇ  Ｐａｒｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７９０〜７９５（２００９）を参照されたい）。
【００３５】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を含む。非ヒト動物は、哺乳動物および非哺乳動物など、全ての脊椎動物を含む。「対象」はまた、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、およびウマなどの家畜；またはラット、マウスなどの齧歯動物；または類人猿、サルなどの霊長動物；またはイヌもしくはネコなどの愛玩動物でもありうる。「対象」は、雄の場合もあり、雌の場合もあり、老齢、成体、若齢、小児、または幼児でありうる。ヒト「対象」は、白色人、アフリカ人、アジア人、セム人、もしくは他の人種、または上記の人種的背景の混合でありうる。
【００３６】
ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３は、哺乳動物、例えば、ヒト、類人猿、サル、マウス、ラット、ブタ、イヌなどに由来することが好ましい。当業者は、オープンチャネル（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））から、参照により本明細書に組み込まれる、各種の野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列を得ることができる。ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列は、それぞれ、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、およびイヌの野生型ＭＧ５３全長タンパク質に対応する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示される。
【００３７】
本明細書で使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを指すように、互換的に使用される。本明細書で記載されるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸の類似体もしくは模倣体を含有しうる。本明細書で記載されるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、天然の単離、組換え発現、化学合成による方法などであるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法により得られうる。
【００３８】
本明細書で使用される「コイルドコイル−ＳＰＲＹ領域」という用語は、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の対応する領域である。大半のＴＲＩＭファミリータンパク質内に存在するコイルドコイルドメインは、ＴＲＩＭファミリーメンバー間の同種会合もしくは異種会合、またはＴＲＩＭメンバーと、他のタンパク質との間の同種会合もしくは異種会合を媒介して、二量体、ポリマーなどの複合体を形成し、これにより、細胞膜の修復を誘発する（例えば、Ｏｚａｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８：８４９〜８６０（２００８）；Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｓ．ら、ＰＮＡＳ、１１１：２４９４〜２４９９（２０１４）を参照されたい）。ＳＰＲＹドメインは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列のＣ末端に位置し、典型的に、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の２８８〜４７７位に位置する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＳＰＲＹドメインは、ＰＲＹモチーフおよびＳＰＲＹモチーフを含む。ＳＰＲＹドメインは、進化において保存され、真菌から高等動物を通じて発現する（例えば、Ｏｚａｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８：８４９〜８６０（２００８）を参照されたい）。これまでのところ、異なる哺乳動物ゲノム内で、約６０のＴＲＩＭファミリーメンバーが同定されており、これらの中で、１５のメンバーが、ＴＲＩＭドメイン（すなわち、Ｒｉｎｇ−Ｂ−ｂｏｘ−コイルドコイルドメイン）の後で、類似のＳＰＲＹドメインを保有し、ＭＧ５３は、これらのＴＲＩＭサブファミリータンパク質を伴う一次構造の保存を呈示する（例えば、ＷＯ２００９／０７３８０８を参照されたい）。コイルドコイル−ＳＰＲＹ領域に対応する具体的アミノ酸位置は、異なる種間で、若干異なりうるが、当業者は、先行技術（例えば、ＮＣＢＩにおいて開示された情報）および／または規定の実験法を介して、異なる種の野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域に対応する、具体的アミノ酸位置を得ることができる。ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域は、野生型ＭＧ５３または構造的に類似する領域のアミノ酸１２２〜４７７位を指す。ある特定の実施形態では、構造的に類似する領域は、アミノ酸１２２〜４７７位のうちの、７０％、８０％、または９０％の連続アミノ酸配列を含む領域でありうる。ある特定の実施形態では、構造的に類似する領域の、Ｎ末端の開始部位は、アミノ酸１２２〜４７７位のＮ末端より、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０アミノ酸長い場合もあり、これだけ短い場合もあり、かつ／または構造的に類似する領域の、Ｃ末端の終結部位は、アミノ酸１２２〜４７７位のＣ末端より、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０アミノ酸長い場合もあり、これだけ短い場合もある。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域は、配列番号１のアミノ酸１２２〜４７７位に対応する、ヒト野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域（すなわち、配列番号１）を指す。
【００３９】
本明細書で使用される「ＭＧ５３突然変異体」または「ＭＧ５３タンパク質突然変異体」という用語は、天然の野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列タンパク質が改変された、ＭＧ５３タンパク質の変異体または断片を指す。このような改変は、１つまたは複数のアミノ酸の欠失および／または置換を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明のＭＧ５３突然変異体は、欠失および／またはセリンでないもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸へと突然変異している、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを除き、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と同一である。
【００４０】
本明細書で使用される「少なくとも１つのセリン」とは、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の、１つまたは複数のセリン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５個、またはこれを超えるセリンを指す。
【００４１】
本明細書で使用される「セリンでないかまたはトレオニンでない他のアミノ酸」とは、セリンまたはトレオニンではない、他の任意の天然アミノ酸、置換された天然アミノ酸、非天然アミノ酸、置換された非天然アミノ酸、またはこれらの任意の組合せを指す。本出願では、天然アミノ酸の名称は、標準的な１文字コードまたは３文字コードとして表される。天然アミノ酸とは、非極性アミノ酸および極性アミノ酸を含む。別段指定されない限り、本明細書で記載されるアミノ酸のうちのいずれも、Ｄ立体配置の場合もあり、Ｌ立体配置の場合もある。
【００４２】
ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリン（ＳｅｒまたはＳ）は、欠失または非極性アミノ酸へと突然変異している。非極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）を含む。ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンは、欠失またはグリシンもしくはアラニンへと突然変異している。好ましくは、ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンは、欠失またはアラニンへと突然変異している。より好ましくは、ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンは、アラニンへと突然変異している。
【００４３】
ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンは、欠失または極性アミノ酸へと突然変異している。極性アミノ酸は、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含む。ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンは、欠失またはシステインもしくはヒスチジンへと突然変異している。好ましくは、ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンは、欠失またはシステインへと突然変異している。より好ましくは、ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンは、システインへと突然変異している。
【００４４】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるセリン突然変異は、１つまたは複数の、セリンでないかまたはトレオニンでない他のアミノ酸で置換された１つのセリンを含み、例えば、１つのセリンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の、セリンでないかまたはトレオニンでない他のアミノ酸で置換されうる。２つ以上のセリンが置換される場合、各セリンは、それぞれ、１つまたは複数の、セリンでないかまたはトレオニンでない他のアミノ酸で、独立に置換されうる。
【００４５】
各種の野生型ＭＧ５３の、具体的なセリン位置は、種間で変動しうるが、ある種の野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と、そのコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域に対応するアミノ酸領域が公知であれば、当業者は、コイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内のセリンが対応する、具体的アミノ酸位置を決定することができる。例えば、当業者には、ヒト野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列が、配列番号１で示されており、そのコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域が、配列番号１のアミノ酸１２２〜４７７位に対応することが公知である。このような状況下で、当業者は、ヒト野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内のセリンに対応する、具体的アミノ酸位置が、配列番号１の、それぞれ、１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、４３０位であることを決定しうる。
【００４６】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号１で示された、ヒト野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＭＧ５３タンパク質は、全長ＭＧ５３タンパク質、またはこの切断型突然変異体（すなわち、全長ＭＧ５３タンパク質の切断型断片）、または全長ＭＧ５３タンパク、またはこの切断型突然変異体と比較して、１つもしくは複数のアミノ酸の突然変異、付加、もしくは欠失を有する突然変異体を含む。この場合、異なるＭＧ５３タンパク質サブタイプのアミノ酸配列についてのアミノ酸位置の命名法を統一するために、本発明において、ある特定のＭＧ５３タンパク質サブタイプのアミノ酸位置が言及されるとき、ＭＧ５３タンパク質サブタイプのアミノ酸配列が、全長ＭＧ５３タンパク質（例えば、配列番号１）のアミノ酸配列に照らしてアライメントされ、必要な場合、同一なアミノ酸の数を最大化するように、関連するアミノ酸配列へと、ギャップが導入されるものとする。ＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列内の、第１のアミノ酸の位置番号は、種の野生型ＭＧ５３のアミノ酸位置が参照される場合、全長ＭＧ５３タンパク質、およびこの切断型突然変異体のいずれも、全長ＭＧ５３タンパク質のアミノ酸配列内の位置番号を参照するように、前記アミノ酸に対応する、全長ＭＧ５３タンパク質の位置番号として命名される。
【００４８】
例えば、図２８に示される通り、種の全長ＭＧ５３タンパク質は、ｎ個のアミノ酸を有し、対応するアミノ酸位置は、１〜ｎ位である。ＭＧ５３サブタイプ１のアミノ酸配列は、全長ＭＧ５３タンパク質のアミノ酸配列と比較して、全長配列のｍ〜ｎ位に位置するアミノ酸に対応する切断型突然変異体を含有する。したがって、ＭＧ５３サブタイプ１アミノ酸配列の、第１のアミノ酸位置は、ｍ位と命名され、ＭＧ５３サブタイプ１アミノ酸配列の、第２のアミノ酸位置は、ｍ＋１位と命名され、同様に、ＭＧ５３サブタイプ１アミノ酸配列の、最後のアミノ酸位置は、ｎ位と命名される。別の例では、ＭＧ５３サブタイプ２のアミノ酸配列は、全長ＭＧ５３タンパク質のアミノ酸配列と比較して、全長配列の１〜ｓ位に位置するアミノ酸に対応する切断型突然変異体を含有する。したがって、ＭＧ５３サブタイプ２アミノ酸配列の、第１のアミノ酸位置は、１位と命名され、ＭＧ５３サブタイプ２アミノ酸配列の、第２のアミノ酸位置は、２位と命名され、同様に、ＭＧ５３サブタイプ２アミノ酸配列の、最後のアミノ酸位置は、ｓ位と命名される。さらに別の例では、ＭＧ５３サブタイプ３のアミノ酸配列は、全長ＭＧ５３タンパク質のアミノ酸配列と比較して、全長配列のｐ〜ｑ位に位置するアミノ酸に対応する切断型突然変異体を含有する。したがって、ＭＧ５３サブタイプ３アミノ酸配列の、第１のアミノ酸位置は、ｐ位と命名され、ＭＧ５３サブタイプ３アミノ酸配列の、第２のアミノ酸位置は、ｐ＋１位と命名され、同様に、ＭＧ５３サブタイプ３アミノ酸配列の、最後のアミノ酸位置は、ｑ位と命名される。
【００４９】
例えば、配列番号１４０は、配列番号１で示された、ヒト野生型ＭＧ５３全長配列のアミノ酸１４５〜４７７位に対応する３３３アミノ酸を有する、ヒト野生型ＭＧ５３サブタイプのうちの１つである。この状況下では、アミノ酸配列である、配列番号１４０の、第１のアミノ酸位置（メチオニン）は、配列番号１４０の１４５位と命名され、第２のアミノ酸位置は、配列番号１４０の１４６位と命名され、同様に、アミノ酸配列である、配列番号１４０の、最後のアミノ酸位置は、配列番号１４０の４７７位と命名される。別の例では、配列番号１４１は、これもまた、３３３アミノ酸を有し、１アミノ酸だけが、配列番号１で示された、ヒト野生型ＭＧ５３全長配列のアミノ酸１４５〜４７７位と異なる、ヒト野生型ＭＧ５３サブタイプのうちの１つである、すなわち、配列番号１の３１５位が、グルタミン酸であるのに対し、配列番号１４１の対応する位置は、グリシンである。この状況下では、配列番号１４１で示されたアミノ酸配列の、第１のアミノ酸位置（メチオニン）は、配列番号１４１の１４５位と命名され、第２のアミノ酸位置は、配列番号１４１の１４６位と命名され、同様に、最後のアミノ酸位置は、配列番号１４１の４７７位と命名される。さらに別の例として述べると、配列番号１４２は、配列番号１で示された、ヒト野生型ＭＧ５３全長配列のアミノ酸１〜２６９位に対応する２６９アミノ酸を有する、ヒト野生型ＭＧ５３サブタイプのうちの１つである。この状況下では、アミノ酸配列である、配列番号１４２の、第１のアミノ酸位置（メチオニン）は、配列番号１４２の１位と命名され、アミノ酸配列である、配列番号１４２の、第２のアミノ酸位置は、配列番号１４２の２位と命名され、同様に、アミノ酸配列である、配列番号１４２の、最後のアミノ酸位置は、配列番号１４２の２６９位と命名される。
【００５０】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号１３９で示された、ヒト野生型ＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５１】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号１４０で示された、ヒト野生型ＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５２】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号１４１で示された、ヒト野生型ＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５３】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号１４２で示された、ヒト野生型ＭＧ５３サブタイプのアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、または２６９位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５４】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号２で示された、マウス野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の以下の位置：１８８、１８９、２１０、２１１、２１４、２４６、２５３、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３１４、３４１、３６７、３７７、４１８、４３０、または４４０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号３で示された、ラット野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８８、１８９、２１０、２１１、２１４、２４６、２５３、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０７、３１４、３４１、３６７、３７７、４１８、４３０、４４０、４６４、または４７４位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５６】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号４で示された、サル野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０６、３０７、３４１、３７７、４０５、４１８、４２５、４３０、または４６４位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５７】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号５で示された、ブタ野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、３０１、３０５、３０７、３１４、３４１、３７７、４１１、４１８、４２５、４３０、または４７４位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５８】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、配列番号６で示された、イヌ野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の以下の位置：１５０、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、２９７、３０１、３０５、３０７、３１４、３４１、３６７、３７７、４１８、４２５、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００５９】
欠失または突然変異したセリンの具体的位置は、種間で変動しうるが、野生型ＭＧ５３タンパク質のセリンの位置は、多様な種間で高度に保存されている。例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、およびイヌの野生型ＭＧ５３タンパク質のアミノ酸配列の、１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、３０１、３０５、３０７、３４１、３７７、４１８、および４３０位は全て、セリンである。一部の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜６）の以下の位置：１８９、２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、３０１、３０５、３０７、３４１、３７７、４１８、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００６０】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の以下の位置：１５０、１８８〜１８９、２１０〜２１１、２１４、２４６、２５３〜２５５、２６９、２９６〜２９７、３０１、３０５〜３０７、３１４、３４１、３６７、３７７、４０５、４１１、４１８、４２５、４３０、４４０、４６４、または４７４位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００６１】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の以下の位置：１８９、２１１、２１４、２４６、２５３〜２５５、２６９、２９６、３０１、３０５、３０７、３４１、３７７、４１８、または４３０位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００６２】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の以下の位置：２１１、２１４、２４６、２５３〜２５５、２６９、２９６、または２９７位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００６３】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の以下の位置：２１１、２１４、２４６、２５５、２６９、２９６、または２９７位のうちの１つまたは複数に位置する。
【００６４】
ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２）の２５３〜２５５位のうちの１つまたは複数に位置する。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の２５３位に位置する。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列の２５５位に位置する。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列である、配列番号１の２５５位に位置する。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列である、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、または配列番号１４２の２５５位に位置する。
【００６５】
ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体は、２つ以上のセリン突然変異を有する。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体の、２つ以上のセリン突然変異は、２５３〜２５５位のうちの１つまたは複数におけるセリン突然変異を含む。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体の、２つ以上のセリン突然変異は、２５３位におけるセリン突然変異を含む。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体の、２つ以上のセリン突然変異は、２５５位におけるセリン突然変異を含む。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体の、２つ以上のセリン突然変異は、２５３および２５５位におけるセリン突然変異を含む。
【００６６】
当業者は、異なる種の野生型ＭＧ５３タンパク質の中のセリン残基は、異なる位置に位置する場合があり、従って、欠失または突然変異したセリンの位置もまた、異なりうることを理解するであろう。ある特定の実施形態では、欠失または突然変異したセリンは、野生型ＭＧ５３の配列番号１で示されたアミノ酸配列内の対応するセリン位置から、１〜１０アミノ酸、１〜５アミノ酸、または１〜３アミノ酸以内の上流または下流にある。
【００６７】
ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１５０で示されたアミノ酸配列である。より好ましくは、ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号７で示されたアミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０で示されたアミノ酸配列のうちの１つに対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、ＭＧ５３突然変異体は、細胞膜修復機能および／または心保護機能を依然として保持しつつ、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を回避する。
【００６８】
本明細書で使用される「〜に対する配列相同性」パーセント（％）とは、アミノ酸配列では、候補配列と、参照配列とをアライメントし、必要な場合、ギャップを導入して、同一なアミノ酸の最大数を達成した後における、２つのアミノ酸配列の間の同一性の百分率；ヌクレオチド配列では、候補配列と、参照配列とをアライメントし、必要な場合、ギャップを導入して、同一なヌクレオチドの最大数を達成した後における、２つのヌクレオチド配列の間の同一性の百分率を指す。
【００６９】
相同性の百分率は、当技術分野における、多様な周知の方法により決定されうる。例えば、配列の比較は、以下の公開のツール：ＢＬＡＳＴｐソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから入手可能である；また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７）も参照されたい）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／から入手可能である；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：３８３〜４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ  ＭＡら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、２３（２１）：２９４７〜８（２００７）を参照されたい）、およびＴＣｏｆｆｅｅ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃのウェブサイトから入手可能である；また、Ｐｏｉｒｏｔ  Ｏ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３１（１３）：３５０３〜６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．、３０２（１）：２０５〜１７（２０００）も参照されたい）により達成されうる。ソフトウェアを使用して、配列のアライメントが実施される場合、ソフトウェアで利用可能なデフォルトのパラメータが使用される場合もあり、他の形で、パラメータが、アライメントを目的としてカスタマイズされる場合もある。これらの全ては、当業者の知見の範囲内にある。
【００７０】
ある特定の実施形態では、配列番号７〜１２、配列番号１４７〜１５０、ならびに配列番号７〜１２および配列番号１４７〜１５０に対する、アミノ酸配列の相同性を有するＭＧ５３突然変異体は、細胞膜修復機能および／または心保護機能を依然として保持しつつ、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を回避する。
【００７１】
本発明者らは、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを、欠失またはセリンでないもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸へと突然変異させる場合、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用は、ＭＧ５３の細胞膜修復機能および／または心保護機能に対する影響を伴わずに、回避または低減されうることを見出した。いかなる理論に束縛されることも望まないが、上記の結果は、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内のセリンのリン酸化が、ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を、著明に調節することが可能であり、基質であるＩＲβおよびＩＲＳ１を介して、ＭＧ５３の、インスリンシグナル伝達系に対する調節機能をモジュレートしうるという事実に起因しうる。しかし、この領域内のセリンのリン酸化は、ＭＧ５３の細胞膜修復機能および／または心保護機能を調節しない。
【００７２】
本明細書で使用される「細胞膜修復機能」とは、細胞死を低減し、細胞の生存を促進し、これにより、細胞の機能を回復するように、関連するシグナル伝達経路（例えば、ＲＩＳＫ経路）を活性化させることを介して、細胞傷害、とりわけ、急性細胞傷害時に損傷を受けた細胞膜を修復し、回復させる、野生型ＭＧ５３またはＭＧ５３突然変異体の能力を指す。ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３または本発明のＭＧ５３突然変異体は、生細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞を修復しうる。野生型ＭＧ５３または本発明のＭＧ５３突然変異体はまた、心筋細胞、横紋筋細胞、骨格筋細胞、腎近位尿細管上皮細胞、肺胞上皮細胞、消化管上皮細胞（例えば、経口上皮細胞、食道上皮細胞、胃上皮細胞、十二指腸上皮細胞、小腸上皮細胞、空腸上皮細胞、回腸上皮細胞、結腸上皮細胞）、粘膜細胞（例えば、経口粘膜細胞、経鼻粘膜細胞、胃粘膜細胞、小腸粘膜細胞、結腸粘膜細胞、十二指腸粘膜細胞）、皮膚細胞（例えば、表皮細胞、上皮細胞、真皮細胞、内皮細胞）、血管細胞（例えば、血管壁細胞、血管内皮細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）などであるがこれらに限定されない、異なる種類の細胞も修復しうる。ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３または本発明のＭＧ５３突然変異体は、心筋細胞、骨格筋細胞、横紋筋細胞、腎近位尿細管上皮細胞、肺胞上皮細胞などを修復しうる。
【００７３】
本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体の細胞膜修復機能は、当技術分野で周知の方法を使用して決定されうる。例えば、本発明のＭＧ５３突然変異体の細胞膜修復機能は、新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）内でアデノウイルスを使用して、野生型ＭＧ５３および本発明のＭＧ５３突然変異体を過剰発現させ、低酸素状態を使用して、細胞を刺激し、細胞の生存を検出し（例えば、ＭＴＴ法、培地中のＡＴＰ濃度およびＬＤＨ濃度の測定、ＴＵＮＥＬ染色（詳細なステップについては、Ｚｈａｎｇ．Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７５〜１８４（２０１６）などを参照されたい）による）、次いで、対照群（例えば、野生型ＭＧ５３およびＭＧ５３突然変異体の発現を伴わない、空ベクターによる陰性対照群、野生型ＭＧ５３を過剰発現する陽性対照群）の指標（例えば、細胞内ＡＴＰレベル、ＬＤＨ放出レベルなど）と、被験群（すなわち、本発明のＭＧ５３突然変異体を過剰発現する群）の指標（例えば、細胞内ＡＴＰレベル、ＬＤＨ放出レベルなど）とを比較することにより決定されうる。
【００７４】
本明細書で使用される「心保護機能」とは、野生型ＭＧ５３またはＭＧ５３突然変異体が、心筋細胞の保護を達成し、これにより、心保護を増強するように、任意選択で、心筋細胞関連シグナル伝達経路（例えば、ＲＩＳＫ経路）を活性化させることを介して、心筋傷害、とりわけ、急性心筋傷害時の、心筋細胞膜の損傷を修復しうることを指す。本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体の心保護機能は、当技術分野で周知の方法を使用して決定されうる。例えば、本発明のＭＧ５３突然変異体の心保護機能は、新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）内でアデノウイルスを使用して、野生型ＭＧ５３および本発明のＭＧ５３突然変異体を過剰発現させ、低酸素状態を使用して、細胞を刺激し、細胞の生存を検出し（例えば、ＭＴＴ法、培地中のＡＴＰ濃度およびＬＤＨ濃度の測定、ＴＵＮＥＬ染色（詳細なステップについては、Ｚｈａｎｇ．Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１７５〜１８４（２０１６）などを参照されたい）による）、次いで、対照群（例えば、野生型ＭＧ５３およびＭＧ５３突然変異体の発現を伴わない、空ベクターによる陰性対照群、野生型ＭＧ５３を過剰発現する陽性対照群）の指標（例えば、細胞内ＡＴＰレベル、ＬＤＨ放出レベルなど）と、被験群（すなわち、本発明のＭＧ５３突然変異体を過剰発現する群）の指標（例えば、細胞内ＡＴＰレベル、ＬＤＨ放出レベルなど）とを比較することにより決定されうる。別の例では、心筋細胞を、野生型ＭＧ５３および本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体のそれぞれとインキュベートし、多様な刺激（例えば、低酸素状態、Ｈ２Ｏ２）を使用して、細胞死をもたらし、対照群（例えば、陰性対照群、すなわち、野生型ＭＧ５３も、ＭＧ５３突然変異体も伴わずにインキュベートされる群、野生型ＭＧ５３を過剰発現する陽性対照群）における生存率と、被験群（すなわち、本発明のＭＧ５３突然変異体と共にインキュベートされる群）における生存率とを比較することにより、本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体の心保護機能を査定する。細胞の生存率は、ＭＴＴ細胞カウント、ＬＤＨ、ＡＴＰ、またはＴＵＮＥＬ染色の測定により決定されうる。
【００７５】
本明細書で使用される「代謝的副作用」とは、治療量の薬物の投与の後における、治療目的外の代謝障害に起因する疾患または不快感であって、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧、脂質異常症などを含むがこれらに限定されない、疾患または不快感を指す。いかなる理論に束縛されることも望まないが、代謝的副作用の重症度は、ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を測定することにより評価されうると考えられる。ある特定の実施形態では、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリンを、欠失および／またはセリンでないもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸へと突然変異させる場合、野生型ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性のうちの、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、なおまたは１００％が阻害され、これにより、ＭＧ５３の細胞膜修復機能および／または心保護機能に対して影響を及ぼさずに、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を回避または低減する。「野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を回避または低減すること」とは、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用の非存在、または野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用の重症度の、対応する野生型ＭＧ５３と比較して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、なおもしくは１００％の低減を指す。「ＭＧ５３の細胞膜修復機能および／または心保護機能に対して影響を及ぼさずに」とは、ＭＧ５３の細胞膜修復機能および／もしくは心保護機能の完全な保持、または最大で５％、最大で１０％、最大で１５％、最大で２０％、最大で２５％、最大で３０％などの、ＭＧ５３の細胞膜修復機能および／もしくは心保護機能の低減を指す。
【００７６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＭＧ５３突然変異体は、それらの類似体を含む。ＭＧ５３突然変異体の類似体とは、本明細書で提供されるＭＧ５３突然変異体の全部または一部と実質的に同様な、機能的特徴または構造的特徴を有するポリペプチドを指すが、ＭＧ５３突然変異体類似体のアミノ酸配列は、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸位置だけ異なる。ＭＧ５３突然変異体の類似体は、ＭＧ５３突然変異体の部分的な断片、誘導体、または変異体であることが可能であり、化学的改変または生物学的改変を含みうる。ＭＧ５３突然変異体の類似体は、ＭＧ５３突然変異体の、１つまたは複数のアミノ酸上に、保存的な置換、付加、欠失、挿入、切断、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、標識付けなど）、またはこれらの任意の組合せを有しうる。ＭＧ５３突然変異体の類似体は、自然発生の変異体と、組換え法または化学合成により得られる、人工のポリペプチド配列など、ＭＧ５３突然変異体の人工変異体とを含みうる。ＭＧ５３突然変異体の類似体は、非自然発生のアミノ酸残基を含みうる。当業者は、本明細書で記載される、ＭＧ５３突然変異体の類似体が、ＭＧ５３突然変異体と実質的に同様な機能を依然として保持する、例えば、ＭＧ５３突然変異体の類似体が、細胞修復機能および／または心保護機能を依然として保持しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常症など、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を回避または低減しうることを理解するであろう。
【００７７】
アミノ酸残基の保存的置換とは、極性アミノ酸の間の置換（例えば、グルタミンとアスパラギンとの間の置換）、疎水性アミノ酸の間の置換（例えば、アルギニン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンの間の置換）、および同じ電荷を伴うアミノ酸の間の置換（例えば、アルギニン、リシン、およびヒスチジンの間の置換、またはグルタミン酸とアスパラギン酸との間の置換）など、同様な特徴を伴うアミノ酸の間の置換を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体の配列は、配列番号７〜１２、または配列番号１４７〜１５０で示された配列と比較して、１か所だけ、または複数か所の、セリンでない位置における保存的置換を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体の配列は、配列番号７〜１２、または配列番号１４７〜１５０で示された配列と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０か所の、セリンでない位置における保存的置換を有する。
【００７８】
本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体はまた、活性が影響を受けないことを前提として、非天然アミノ酸も含有しうる。非天然アミノ酸は、例えば、β−フルオロアラニン、１−メチルヒスチジン、γ−メチレングルタミン酸、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロリシン、ヒドロキシプロリン、３−フルオロフェニルアラニン、３−アミノチロシン、４−メチルトリプトファンなどを含む。
【００７９】
本発明のＭＧ５３突然変異体はまた、当技術分野で周知の方法を使用しても改変されうる。例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、アミノ末端修飾、脂肪のアシル化、カルボキシル末端の修飾、リン酸化、メチル化などであるがこれらに限定されない。
【００８０】
当業者は、本発明のＭＧ５３突然変異体は、当技術分野で周知の方法により改変された後で、ＭＧ５３突然変異体と実質的に同様な機能を依然として保持することを理解するであろう。例えば、改変されたＭＧ５３突然変異体は、細胞修復機能および／または心保護機能を依然として保持しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常症など、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を回避または低減しうる。
【００８１】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、ＭＧ５３突然変異体を、対象へと、ＭＧ５３突然変異体の構造および特性に干渉せずに送達するのに使用される、薬学的に許容される溶媒、懸濁薬剤、または他の任意の薬理学的に不活性の媒体を指す。このような担体の一部は、ＭＧ５３突然変異体を、例えば、対象への経口投与のための、錠剤、丸剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、およびトローチとして製剤化されることを可能としうる。このような担体の一部は、ＭＧ５３突然変異体が、注射、注入、または局所投与のために製剤化されることを可能とする。
【００８２】
本発明の医薬組成物における使用のための、薬学的に許容される担体は、例えば、薬学的に許容される液体、ゲル、または固体担体、水性媒体（例えば、塩化ナトリウム注射媒体、リンゲル注射媒体、等張性グルコース注射媒体、滅菌水注射媒体、またはグルコースおよび乳酸のリンゲル注射媒体）、非水性媒体（例えば、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、またはラッカセイ油）、抗微生物剤、等張剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）、緩衝剤（リン酸緩衝剤またはクエン酸緩衝剤など）、抗酸化剤（硫酸水素ナトリウムなど）、麻酔剤（プロカイン塩酸塩など）、懸濁／分散剤（カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンなど）、キレート化剤（ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸など）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸））、乳化剤（ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ−８０）など）、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性の補助物質、当技術分野で公知の他の成分、またはこれらの多様な組合せを含みうるがこれらに限定されない。適切な成分は、例えば、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、滑沢剤、芳香剤、増粘剤、着色剤、または乳化剤を含みうる。
【００８３】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、経口製剤である。経口製剤は、カプセル、小袋、丸剤、錠剤、トローチ（呈味基質には、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガント）、粉末、顆粒、または水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液、または油中水エマルジョンもしくは水中油エマルジョン、またはエリキシルもしくはシロップ、またはキャンディ（不活性基剤には、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースまたはアカシアなど）、ならびに／あるいは口腔洗浄剤およびこれらの類似物を含むがこれらに限定されない。
【００８４】
ある特定の実施形態では、経口固体製剤（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒など）は、ＭＧ５３突然変異体と、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの１つまたは複数の薬学的に許容される担体、ならびに／または以下：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／もしくはケイ酸などの充填剤もしくは拡張剤；（２）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／もしくはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、バレイショデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの切断剤；（５）パラフィンなどの遅延溶液；（６）四級アンモニウム化合物などの吸収加速剤；（７）アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの滑沢剤；（８）カオリンおよびベントナイトなどの吸収剤；（９）滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物などの滑沢剤；ならびに（１０）着色剤を含む。
【００８５】
ある特定の実施形態では、経口液体製剤は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルなどを含む。ＭＧ５３突然変異体に加えて、液体剤形はまた、水、またはエタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、アクリル酸ベンゼン（メタクリル酸ベンゼン）、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、および脂肪酸ソルビトールエステル、ならびにこれらの混合物など、他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤など、従来の不活性希釈剤も含有しうる。不活性希釈剤のほか、経口組成物はまた、保湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、香味剤、および保存剤などのアジュバントも含有しうる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、滅菌水溶液または分散液、懸濁液、もしくはエマルジョンを含む注射用製剤でありうる。いずれの場合も、注射用製剤は、滅菌であるものとし、注射を容易とする液体であるものとする。注射用製剤は、製造条件下および保管条件下で、安定であるものとし、微生物（細菌および真菌など）の感染に対して抵抗性であるものとする。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの適切な混合物および／または植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。注射用製剤は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用したり、界面活性剤を使用するなどして、様々な方式で維持されうる、適正な流動性を維持するものとする。抗微生物汚染は、多様な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）の添加により達成されうる。
【００８７】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、経口スプレー製剤または経鼻スプレー製剤である。このようなスプレー製剤は、水性エアゾール、非水性懸濁液、リポソーム製剤、または固体粒子状製剤などを含むがこれらに限定されない。水性エアゾールは、薬剤の水溶液または水性懸濁液を、従来の薬学的に許容される担体および安定化剤と組み合わせることにより製剤化される。担体および安定化剤は、具体的化合物の必要性に従って変動しうるが、一般に、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、またはポリエチレングリコール）、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝剤、塩、糖、または糖アルコールを含む。エアゾールは、通常、等張性溶液から調製され、噴霧器により送達することができる。
【００８８】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の他の薬物と組み合わせて使用されうる。ある特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの他の薬物を含む。ある特定の実施形態では、他の薬物は、心血管薬、腎疾患を処置するための薬物、細胞膜修復のための薬物などである。
【００８９】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、対象へと、経口経路、注射経路（例えば、静脈内注射、筋内注射、皮下注射、皮内注射、心内注射、髄腔内注射、胸膜内注射、腹腔内注射など）、粘膜経路（例えば、鼻腔内投与、経口投与など）、舌下経路、直腸内経路、経皮経路、眼内経路、肺内経路を含むがこれらに限定されない、適切な経路により送達することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、注射経路により投与することができる。
【００９０】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸に関する。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、物質（ポリペプチドまたは核酸など）が、天然で、それが通常存在する環境から分離されること、または天然で、それが通常見出される環境と異なる環境内にあることを指す。
【００９１】
本明細書で使用される「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体など、リボヌクレオシド−デオキシリボ核酸の混合物を指す。核酸またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体の場合もある。核酸またはポリヌクレオチドは、直鎖状の場合もあり、環状の場合もある。本明細書で使用される「コードすること」または「〜をコードすること」という用語は、ｍＲＮＡへの転写、および／またはペプチドもしくはタンパク質への翻訳が可能であることを意味する。「コード配列」または「遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。本出願では、これら２つの用語を、互換的に使用することができる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、単離核酸は、配列番号１３〜１８で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む。
配列番号１３は、配列番号７で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図８に示される。
【００９３】
配列番号１４は、配列番号８で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図９に示される。
配列番号１５は、配列番号９で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図１０に示される。
【００９４】
配列番号１６は、配列番号１０で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図１１に示される。
配列番号１７は、配列番号１１で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図１２に示される。
【００９５】
配列番号１８は、配列番号１２で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図１３に示される。
ある特定の実施形態では、単離核酸は、配列番号１５１〜１５４で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む。
【００９６】
配列番号１５１は、配列番号１４７で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２４に示される。
配列番号１５２は、配列番号１４８で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２５に示される。
【００９７】
配列番号１５３は、配列番号１４９で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２６に示される。
配列番号１５４は、配列番号１５０で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２７に示される。
【００９８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される単離核酸は、配列番号１３〜１８、配列番号１５１〜１５４で示された核酸配列のうちのいずれか１つに対する少なくとも７０％の相同性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の相同性を有する核酸配列を含み、配列番号７〜１２、配列番号１４７〜１５０で示されたアミノ酸配列のうちの１つを依然としてコードしうる。
【００９９】
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号７〜１２、配列番号１４７〜１５０をコードする核酸配列を提供するが、それらは、遺伝子コードの縮重性のために、配列番号１３〜１８、配列番号１５１〜１５４で示された核酸配列のうちのいずれか１つと異なる。
【０１００】
本明細書で使用される「遺伝子コードの縮重」という用語は、１つのアミノ酸が２つ以上の対応する遺伝子コドンを有する現象を指す。例えば、プロリンは、４つの同義コドンである、ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、およびＣＣＧを有する。当技術分野では、遺伝子コードの縮重のために、コードされるアミノ酸配列を変化させずに、所与の核酸配列内のある特定の位置の核酸を置きかえうることが公知である。例えば、塩基の部位特異的突然変異誘発により、遺伝子コードの縮重の置きかえを行うことは、当業者にはたやすい。異なる生物は、異なるコドンに対する、異なる優先性を発達させてきた。本発明のポリペプチドを、選択された生物学的細胞内で発現させるために、生物学的細胞の好ましいコドンは、対応するコード配列を得るように選択される場合があり、本発明のＭＧ５３突然変異体配列（例えば、配列番号７〜１２、配列番号１４７〜１５０）は、組換え発現により得られうる。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列をコードする配列を含む発現ベクターに関する。
本発明の発現ベクターは、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌プラスミド、ウイルスなどでありうる。発現ベクターの非限定例は、例えば、Ｐａｕｌら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９、５０５；ＭｉｙａｇｉｓｈｉおよびＴａｉｒａ、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９、４９７；Ｌｅｅら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９、５００；ならびにＮｏｖｉｎａら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：  １０．１０３８  ／ｎｍ７２５に記載される。発現ベクターは、発現ベクターが、宿主細胞に入った後で、プロモーターが、コード配列の発現を引き起こしうるように、ＭＧ５３突然変異体のアミノ酸配列のコード配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含有しうる。発現ベクターは、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、リポフェクションによるトランスフェクション、電気穿孔によるトランスフェクション、細菌ヒートショックなどであるがこれらに限定されない、適切な方法により、宿主細胞へと導入されうる。詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）」を参照されたい。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される発現ベクターは、配列番号１３〜１８で示された核酸配列のうちのいずれか１つを含む。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明において記載される宿主細胞は、真核細胞の場合もあり、原核細胞の場合もある。適切な真核細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）など、哺乳動物細胞を含みうる。適する原核細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌を含みうる。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、ＭＧ５３突然変異体を調製するための方法に関し、本明細書で提供されるＭＧ５３突然変異体は、当技術分野で公知の技法により調製されうる。例えば、それらは、化学合成により調製される場合もあり、遺伝子操作により調製される場合もある。
【０１０４】
化学合成法は、主に、固相合成および液相合成を含む。固相ポリペプチド合成法は、例えば、文献である、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５４；およびＭ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、２版、１９７６；およびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８３において詳細に記載された、メリフィールド固相合成法を含む。これらの文献の全内容は、参照により、本出願へと組み込まれる。メリフィールド固相合成は、主に、標的タンパク質のアミノ酸配列に基づき、ペプチドの、保護されたＣ末端アミノ酸を、樹脂へと接合させるステップを含む。接合の後、樹脂を、濾過し、洗浄し、Ｃ末端アミノ酸上のアルファアミノ基上の保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル）を除去する。この保護基の除去は、当然ながら、これらのアミノ酸と、樹脂との間の結合を切断せずに、行わなければならない。次いで、結果として得られる樹脂ペプチドを、Ｃ末端から二番目の、保護されたアミノ酸へとカップリングさせる。このカップリングは、アミド結合の形成により、第２のアミノ酸の遊離カルボキシ基と、樹脂へと接合させた第１のアミノ酸のアミノ基との間で生じる。ペプチドの全てのアミノ酸を、樹脂へと接合させるまで、後続のアミノ酸により、このイベントの連鎖を繰り返す。最後に、保護されたペプチドを、樹脂から切断し、保護基を除去して、所望のペプチドを得る。本明細書で開示されるポリペプチドはまた、液相合成、例えば、参照により、その全体において本明細書に組み込まれる、Ｅ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｋｕｂｋｅ、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ」、１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９６５において、詳細に記載された、標準的な溶液ペプチド合成によっても調製されうる。液相合成は、主に、アミド結合を形成する、化学法または酵素法により、段階的に、アミノ酸またはペプチド断片をカップリングするステップを含む。
【０１０５】
遺伝子操作法は、対応するＭＧ５３突然変異体をコードする核酸配列を、適正な宿主細胞内で発現させて、対応する突然変異体を作出する方法である。この方法の詳細な記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）」を参照されたい。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＭＧ５３突然変異体を調製するための方法は、突然変異のための１つまたは複数のセリン位置を決定すること、野生型ＭＧ５３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むプラスミドの全長配列上の前記位置において、部位特異的突然変異誘発を実施すること、部位特異的突然変異を有するプラスミドを、宿主細胞へとトランスフェクトすること、およびＭＧ５３突然変異体を産生するように宿主細胞を誘導することを含む。
【０１０６】
本明細書で使用される「部位特異的突然変異誘発」という用語は、標的ＤＮＡ断片への、目的の変化の導入であって、塩基の付加、欠失、および置換などを含む変化の導入を指す。ある特定の実施形態では、標的ＤＮＡ断片は、野生型ＭＧ５３、すなわち、配列番号１９〜２４および配列番号１４３〜１４６のコード配列である。突然変異位置は、野生型ＭＧ５３のコイルドコイル−ＳＰＲＹ領域のコード配列内の、１つまたは複数のセリン位置に位置する。
【０１０７】
配列番号１９は、配列番号１で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２に示される。
配列番号２０は、配列番号２で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図３に示される。
【０１０８】
配列番号２１は、配列番号３で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図４に示される。
配列番号２２は、配列番号４で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図５に示される。
【０１０９】
配列番号２３は、配列番号５で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図６に示される。
配列番号２４は、配列番号６で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図７に示される。
【０１１０】
配列番号１４３は、配列番号１３９で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２０に示される。
配列番号１４４は、配列番号１４０で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２１に示される。
【０１１１】
配列番号１４５は、配列番号１４１で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２２に示される。
配列番号１４６は、配列番号１４２で示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列であり、その具体的配列は、図２３に示される。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、部位特異的突然変異誘発は、
（１）ｃＤＮＡ配列内の、部位特異的突然変異誘発で標的とされたアミノ酸の対応するヌクレオチド部位を決定し、突然変異部位においてヌクレオチド配列を標的アミノ酸に従って改変し、突然変異部位を含む２０〜４０ｂｐの長さの配列を切り出すことにより、プライマーをデザインすること；
（２）ステップ（１）のプライマーを使用し、野生型ＭＧ５３プラスミドを鋳型とすることによりＰＣＲ反応を実施し、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、ＰＣＲ産物を精製すること；
（３）制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、ステップ（２）の精製ＰＣＲ産物に対する酵素反応を実施し、酵素消化産物を、適切なプラスミド発現ベクターとライゲーションし、細菌コンピテント細胞内にライゲーション産物を形質転換し、培養すること
を含む。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、部位特異的突然変異誘発は、
（４）ステップ（３）のクローンを選択して、ステップ（１）のプライマーを使用することにより、コロニーＰＣＲ同定を実施し、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、次いで、ＤＮＡシーケンシング同定を実施して、部位特異的突然変異を有する陽性クローンを同定するステップ
をさらに含む。
【０１１４】
野生型ＭＧ５３の部位特異的突然変異誘発は、様々な、市販の部位特異的突然変異誘発キットを使用して、例えば、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製のＥａｓｙ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔのための指示書であって、部位特異的突然変異誘発のための方法および手順について詳述する指示書を参照して実行されうる。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、ＭＧ５３突然変異体の使用に関する。ある特定の実施形態では、医薬は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、脂質異常症などの代謝的副作用を回避または低減しうる。ある特定の実施形態では、心疾患は、糖尿病性心疾患、心筋虚血症、心虚血症／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心筋炎、冠動脈性心疾患、および心膜炎を含むがこれらに限定されない、心筋損傷と関連する疾患である。ある特定の実施形態では、糖尿病性脳血管疾患は、脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮、および脳梗塞を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性眼合併症は、糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病関連ブドウ膜炎、および失明を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性神経障害は、糖尿病性末梢神経障害を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、腎疾患は、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、急性腎傷害、糖尿病性腎症などを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞および／または組織の損傷と関連する疾患は、脳傷害、肺傷害、脾臓傷害、脾臓破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化管粘膜傷害、外傷、火傷、潰瘍、粘膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳卒中、皮膚の老化など、腎臓、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、消化管、および皮膚の細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、配列番号７で示されたポリペプチドの使用に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置するための医薬の製造における、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１５０で示されたポリペプチドの使用に関する。
【０１１６】
さらに別の態様では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量のＭＧ５３突然変異体を投与するステップを含む方法に関する。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、および脂質異常症などの代謝的副作用を回避または低減しうる。ある特定の実施形態では、心疾患は、糖尿病性心疾患、心筋虚血症、心虚血症／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心筋炎、冠動脈性心疾患、および心膜炎を含むがこれらに限定されない、心筋損傷と関連する疾患である。ある特定の実施形態では、糖尿病性脳血管疾患は、脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮、および脳梗塞を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性眼合併症は、糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病関連ブドウ膜炎、および失明を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性神経障害は、糖尿病性末梢神経障害を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、腎疾患は、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、急性腎傷害、糖尿病性腎症などを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞および／または組織の損傷と関連する疾患は、脳傷害、肺傷害、脾臓傷害、脾臓破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化管粘膜傷害、外傷、火傷、潰瘍、粘膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳卒中、皮膚の老化など、腎臓、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、消化管、および皮膚の細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、配列番号７で示されたポリペプチドを投与するステップを含む方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１５０で示されたポリペプチドを投与するステップを含む方法に関する。
【０１１７】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、対象の疾患および障害を、阻害もしくは緩和するか、または疾患もしくは障害の発症を、予防的に阻害もしくは防止することにより、治療効果を達成する、医薬の量を指す。治療有効量は、対象における疾患もしくは障害の、１つもしくは複数の症状を、ある程度軽減し；疾患もしくは障害と関連するか、もしくはこの原因となる、１つもしくは複数の生理学的パラメータもしくは生化学的パラメータを、部分的に、もしくは完全に正常に戻し；かつ／または疾患もしくは障害の発症の可能性を低減する、医薬の量でありうる。
【０１１８】
さらに他の態様では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患の処置における使用のためのＭＧ５３突然変異体に関する。ある特定の実施形態では、ＭＧ５３突然変異体は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を処置しつつ、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病、高血圧症、および脂質異常症などの代謝的副作用を回避または低減しうる。ある特定の実施形態では、心疾患は、糖尿病性心疾患、心筋虚血症、心虚血症／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心破裂、狭心症、心筋炎、冠動脈性心疾患、および心膜炎を含むがこれらに限定されない、心筋損傷と関連する疾患である。ある特定の実施形態では、糖尿病性脳血管疾患は、脳動脈硬化症、虚血性脳血管疾患、脳出血、脳萎縮、および脳梗塞を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性眼合併症は、糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病関連ブドウ膜炎、および失明を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、糖尿病性神経障害は、糖尿病性末梢神経障害を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、腎疾患は、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、急性腎傷害、糖尿病性腎症などを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞および／または組織の損傷と関連する疾患は、脳傷害、肺傷害、脾臓傷害、脾臓破裂、胃潰瘍、胃炎、胃穿孔、消化管粘膜傷害、外傷、火傷、潰瘍、粘膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳卒中、皮膚の老化など、腎臓、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、消化管、および皮膚の細胞および／または組織の損傷と関連する疾患を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患の処置における使用のための、配列番号７で示されたポリペプチドに関する。ある特定の実施形態では、本発明は、心疾患、糖尿病性脳血管疾患、糖尿病性眼合併症、糖尿病性神経障害、糖尿病足病変、腎疾患、ならびに細胞および／または組織の損傷と関連する疾患の処置における使用のための、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、または配列番号１５０で示されたポリペプチドに関する。
【実施例】
【０１１９】
当業者には、全ての実施例で使用される生物学的材料であって、Ｅ．Ｃｏｌｉ株、多様なクローン、および発現プラスミド、培地、酵素、緩衝液、および多様な培養法、タンパク質の抽出法および精製法、ならびに他の分子生物学的操作法などの材料は全て、周知である。詳細については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）；および「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｙａｎ  Ｚｉｙｉｎｇら訳、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）、１９９８）を参照されたい。
【０１２０】
実施例１
ＭＧ５３突然変異体の調製
１．ヒトＭＧ５３突然変異体の調製
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体
（１）プライマーデザイン：ｃＤＮＡ配列内の、部位特異的突然変異誘発で標的とされたアミノ酸の対応するヌクレオチド部位を決定し、突然変異部位においてヌクレオチド配列を突然変異したアミノ酸に従って改変し、突然変異部位の２０ｂｐ上流および１０ｂｐ下流にある配列を切り出すことにより、プライマーをデザインする。プライマーの配列は、以下の通り：
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇｃｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号２５）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｇｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号２６）
である。
【０１２１】
（２）プラスミド全長クローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：部位特異的突然変異誘発のためにデザインされたプライマーを使用し、Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを使用し、元の遺伝子発現プラスミドを鋳型とすることにより、ＰＣＲ反応を実施する。反応系および反応条件は、以下：
【０１２２】
【表１】
2019530433.tif 000003
【０１２３】
の通りである。
（３）ＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動：ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を実施して、その純度および量を同定する。
【０１２４】
（４）ＰＣＲ産物のエタノール沈殿：エタノール沈殿法により、適正なサイズおよび単一のバンドを伴うＰＣＲ産物を精製する。
（５）Ｄｐｎ  Ｉによる消化：制限エンドヌクレアーゼであるＤｐｎ  Ｉを使用することにより、精製されたＰＣＲ産物に対する酵素反応を実施する。
【０１２５】
（６）酵素消化産物の形質転換：細菌コンピテント細胞中にＤｐｎ  Ｉ消化産物を形質転換し、培養に適切なスクリーンプレート上に塗布する。
陽性クローンの同定：適正なサイズを伴うクローンを選択して、コロニーＰＣＲ同定を実施し、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を実施し、明瞭なバンドおよび適正なサイズを伴うクローンについての、小容量の振盪増幅培養を実施し、次いで、シーケンシング同定を実施する。
【０１２６】
同じ方法を使用して、ヒトＭＧ５３の、Ｓ２５５Ｇ、Ｓ２５５Ｌ、Ｓ２５５Ｖ、Ｓ２５５Ｐ、Ｓ２５５Ｆ、Ｓ２５５Ｗ、Ｓ２５５Ｑ、Ｓ２５５Ｃ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２５５Ｄ、Ｓ２５５Ｒ、Ｓ２１１Ａ、Ｓ２１４Ａ、Ｓ２４６Ａ、Ｓ２６９Ａ、Ｓ２９６Ａ、Ｓ２９７Ａ突然変異体を調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下：
（ｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、グリシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇｇｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号２７）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号２８）
の通りである。
【０１２７】
（ｉｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、ロイシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｃｔｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号２９）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａａｇｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号３０）
の通りである。
【０１２８】
（ｉｉｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、バリンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｖのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｖのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇｔｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号３１）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｖのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａａｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号３２）
の通りである。
【０１２９】
（ｉｖ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、プロリンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｐのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｐのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｃｃｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号３３）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｐのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号３４）
の通りである。
【０１３０】
（ｖ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、フェニルアラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｆのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｆのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔｔｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号３５）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｆのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａａａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号３６）
の通りである。
【０１３１】
（ｖｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、トリプトファンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔｇｇｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号３７）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｃａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号３８）
の通りである。
【０１３２】
（ｖｉｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、グルタミンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｃａａｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号３９）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇｔｔｇｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号４０）
の通りである。
【０１３３】
（ｖｉｉｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、システインへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｃのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｃのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔｇｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号４１）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｃのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号４２）
の通りである。
【０１３４】
（ｉｘ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、チロシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔａｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号４３）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｔａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号４４）
の通りである。
【０１３５】
（ｘ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、アスパラギン酸へと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇａｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号４５）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｔａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号４６）
の通りである。
【０１３６】
（ｘｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２５５位のセリンが、アルギニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｃｇｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇ（配列番号４７）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃｇｃｔｃｔｇｃｃａｇｇ（配列番号４８）
の通りである。
【０１３７】
（ｘｉｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２１１位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２１１Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２１１Ａのフォワードプライマー：ｃｃｔｔｇｃｇｃｃｇｇｇａｇｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃｔｇａａｃｔｃｔｔ（配列番号４９）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２１１Ａのリバースプライマー：ｇｃｔｇｃｔｃｃａｇｇｔａａｇａｇｔｔｃａｇｇｇｃｃｃｃｃａｇｃｔｃｃ（配列番号５０）
の通りである。
【０１３８】
（ｘｉｉｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２１４位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２１４Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２１４Ａのフォワードプライマー：ｇｇｇａｇｃｔｇｇｇｇａｇｃｃｔｇａａｃｇｃｔｔａｃｃｔｇｇａｇｃ（配列番号５１）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２１４Ａのリバースプライマー：ｔｇｃｃｇｃａｇｃｔｇｃｔｃｃａｇｇｔａａｇｃｇｔｔｃａｇｇｃｔｃ（配列番号５２）
の通りである。
【０１３９】
（ｘｉｖ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２４６位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２４６Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２４６Ａのフォワードプライマー：ｔｇａａａｔａｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｇｃａｇａ（配列番号５３）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２４６Ａのリバースプライマー：ｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔｃｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｃｇｇｔｃａｃｃａｇｇ（配列番号５４）
の通りである。
【０１４０】
（ｘｖ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２６９位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２６９Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２６９Ａのフォワードプライマー：ａｇｇａｇｃｔｇａｃｃｔｔｔｇａｃｃｃｇｇｃｃｔｃｔｇｃｇｃａｃｃ（配列番号５５）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２６９Ａのリバースプライマー：ａｃｃａｇｇｃｔｃｇｇｇｔｇｃｇｃａｇａｇｇｃｃｇｇｇｔｃａａａｇ（配列番号５６）
の通りである。
【０１４１】
（ｘｖｉ）ヒト野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号１）の２９７位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ヒトＭＧ５３  Ｓ２９７Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ヒトＭＧ５３  Ｓ２９７Ａのフォワードプライマー：ａｇｃｔｇａｃｃｔｔｔｇａｃｃｃｇａｇｃｇｃｔｇｃｇｃａｃｃｃｇａ（配列番号５７）
ヒトＭＧ５３  Ｓ２９７Ａのリバースプライマー：ａｃｃａｃｃａｇｇｃｔｃｇｇｇｔｇｃｇｃａｇｃｇｃｔｃｇｇｇｔｃａ（配列番号５８）
の通りである。
【０１４２】
２．マウスＭＧ５３突然変異体の調製
マウスＭＧ５３の、Ｓ２５５Ａ、Ｓ２５５Ｇ、Ｓ２５５Ｌ、Ｓ２５５Ｗ、Ｓ２５５Ｑ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２５５Ｄ、およびＳ２５５Ｒ突然変異体は、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下：
（ｉ）マウス野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号２）の２５５位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｔｃａｇａｇｇｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号５９）
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｃｔｃｔｇａｃａｇｇ（配列番号６０）
の通りである。
【０１４３】
（ｉｉ）マウス野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号２）の２５５位のセリンが、グリシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｔｃａｇａｇｇｇａｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号６１）
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｃｔｇａｃａｇｇ（配列番号６２）
の通りである。
【０１４４】
（ｉｉｉ）マウス野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号２）の２５５位のセリンが、ロイシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｔｃａｇａｇｔｔａｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号６３）
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔａａｃｔｃｔｇａｃａｇｇ（配列番号６４）
の通りである。
【０１４５】
（ｉｖ）マウス野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号２）の２５５位のセリンが、トリプトファンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｔｃａｇａｇｔｇｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号６５）
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｃｃａｃｔｃｔｇａｃａｇｇ（配列番号６６）
の通りである。
【０１４６】
（ｖ）マウス野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号２）の２５５位のセリンが、グルタミンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃａａｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号６７）
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｃｔｃｔｇａｃａｇｇ（配列番号６８）
の通りである。
【０１４７】
（ｖｉ）マウス野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号２）の２５５位のセリンが、チロシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｔｃａｇａｇｔａｔｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号６９）
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇａｔａｃｔｃｔｇａｃａｇｇ（配列番号７０）
の通りである。
【０１４８】
（ｖｉｉ）マウス野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号２）の２５５位のセリンが、アスパラギン酸へと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｔｃａｇａｇｇａｔｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号７１）
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇａｔｃｃｔｃｔｇａｃａｇｇ（配列番号７２）
の通りである。
【０１４９】
（ｖｉｉｉ）マウス野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号２）の２５５位のセリンが、アルギニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｇａｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号７３）
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃｇｃｔｃｔｇａｃａｇｇ（配列番号７４）
の通りである。
【０１５０】
３．ラットＭＧ５３突然変異体の調製
ラットＭＧ５３の、Ｓ２５５Ａ、Ｓ２５５Ｇ、Ｓ２５５Ｌ、Ｓ２５５Ｗ、Ｓ２５５Ｑ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２５５Ｄ、およびＳ２５５Ｒ突然変異体は、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下：
（ｉ）ラット野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号３）の２５５位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇｔｃａｇａｇｇｃａｃｃａｃｃｃｃｃａｇ（配列番号７５）
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｃｔｃｔｇａｃａｇａ（配列番号７６）
の通りである。
【０１５１】
（ｉｉ）ラット野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号３）の２５５位のセリンが、グリシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇｔｃａｇａｇｇｇａｃｃａｃｃｃｃｃａｇ（配列番号７７）
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｃｔｇａｃａｇａ（配列番号７８）
の通りである。
【０１５２】
（ｉｉｉ）ラット野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号３）の２５５位のセリンが、ロイシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇｔｃａｇａｇｔｔａｃｃａｃｃｃｃｃａｇ（配列番号７９）
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｔａａｃｔｃｔｇａｃａｇａ（配列番号８０）
の通りである。
【０１５３】
（ｉｖ）ラット野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号３）の２５５位のセリンが、トリプトファンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇｔｃａｇａｇｔｇｇｃｃａｃｃｃｃｃａｇ（配列番号８１）
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｃｃａｃｔｃｔｇａｃａｇａ（配列番号８２）
の通りである。
【０１５４】
（ｖ）ラット野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号３）の２５５位のセリンが、グルタミンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇｔｃａｇａｇｃａａｃｃａｃｃｃｃｃａｇ（配列番号８３）
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｔｔｇｃｔｃｔｇａｃａｇａ（配列番号８４）
の通りである。
【０１５５】
（ｖｉ）ラット野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号３）の２５５位のセリンが、チロシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇｔｃａｇａｇｔａｔｃｃａｃｃｃｃｃａｇ（配列番号８５）
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇａｔａｃｔｃｔｇａｃａｇａ（配列番号８６）
の通りである。
【０１５６】
（ｖｉｉ）ラット野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号３）の２５５位のセリンが、アスパラギン酸へと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇｔｃａｇａｇｇａｔｃｃａｃｃｃｃｃａｇ（配列番号８７）
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇａｔｃｃｔｃｔｇａｃａｇａ（配列番号８８）
の通りである。
【０１５７】
（ｖｉｉｉ）ラット野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号３）の２５５位のセリンが、アルギニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマー：ｔｇｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇｔｃａｇａｇｃｇａｃｃａｃｃｃｃｃａｇ（配列番号８９）
ラットＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのリバースプライマー：ｔｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｔｃｇｃｔｃｔｇａｃａｇａ（配列番号９０）
の通りである。
【０１５８】
４．サルＭＧ５３突然変異体の調製
サルＭＧ５３の、Ｓ２５５Ａ、Ｓ２５５Ｇ、Ｓ２５５Ｌ、Ｓ２５５Ｗ、Ｓ２５５Ｑ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２５５Ｄ、およびＳ２５５Ｒ突然変異体は、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下：
（ｉ）サル野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号４）の２５５位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇｃｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｇ（配列番号９１）
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのリバースプライマー：ｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｇｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号９２）
の通りである。
【０１５９】
（ｉｉ）サル野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号４）の２５５位のセリンが、グリシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇｇｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｇｇ（配列番号９３）
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのリバースプライマー：ｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号９４）
の通りである。
【０１６０】
（ｉｉｉ）サル野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号４）の２５５位のセリンが、ロイシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔｔａｃｃｃｃｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｇｇａ（配列番号９５）
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇｔａａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号９６）
の通りである。
【０１６１】
（ｉｖ）サル野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号４）の２５５位のセリンが、トリプトファンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔｇｇｃｃｃｃｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｇｇａ（配列番号９７）
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｃａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号９８）
の通りである。
【０１６２】
（ｖ）サル野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号４）の２５５位のセリンが、グルタミンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｃａａｃｃｃｃｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｇｇａ（配列番号９９）
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのリバースプライマー：ｔｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇｔｔｇｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１００）
の通りである。
【０１６３】
（ｖｉ）サル野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号４）の２５５位のセリンが、チロシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔａｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｇｇ（配列番号１０１）
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのリバースプライマー：ｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｔａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号１０２）
の通りである。
【０１６４】
（ｖｉｉ）サル野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号４）の２５５位のセリンが、アスパラギン酸へと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇａｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｇｇ（配列番号１０３）
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのリバースプライマー：ｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１０４）
の通りである。
【０１６５】
（ｖｉｉｉ）サル野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号４）の２５５位のセリンが、アルギニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｃｇｔｃｃｃｃｃａｃｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｇｇ（配列番号１０５）
サルＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのリバースプライマー：ｃｃａｇａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｃｇｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１０６）
の通りである。
【０１６６】
５．ブタＭＧ５３突然変異体の調製
ブタＭＧ５３の、Ｓ２５５Ａ、Ｓ２５５Ｇ、Ｓ２５５Ｌ、Ｓ２５５Ｗ、Ｓ２５５Ｑ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２５５Ｄ、およびＳ２５５Ｒ突然変異体は、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下：
（ｉ）ブタ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号５）の２５５位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇｃｇｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇ（配列番号１０７）
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのリバースプライマー：ｃａｇｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｃｇｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１０８）
の通りである。
【０１６７】
（ｉｉ）ブタ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号５）の２５５位のセリンが、グリシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇｇｇｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇ（配列番号１０９）
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのリバースプライマー：ｃｃａｇｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｃｃｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１１０）
の通りである。
【０１６８】
（ｉｉｉ）ブタ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号５）の２５５位のセリンが、ロイシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔｔｇｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇ（配列番号１１１）
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのリバースプライマー：ｃｃａｇｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｃａａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号１１２）
の通りである。
【０１６９】
（ｉｖ）ブタ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号５）の２５５位のセリンが、トリプトファンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔｇｇｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇ（配列番号１１３）
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのリバースプライマー：ｃｃａｇｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｃｃａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号１１４）
の通りである。
【０１７０】
（ｖ）ブタ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号５）の２５５位のセリンが、グルタミンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｃａｇｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇ（配列番号１１５）
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのリバースプライマー：ｃｃａｇｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１１６）
の通りである。
【０１７１】
（ｖｉ）ブタ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号５）の２５５位のセリンが、チロシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｔａｔｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇａ（配列番号１１７）
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのリバースプライマー：ｔｃｃａｇｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇａｔａｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号１１８）
の通りである。
【０１７２】
（ｖｉｉ）ブタ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号５）の２５５位のセリンが、アスパラギン酸へと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｇａｔｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇａ（配列番号１１９）
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのリバースプライマー：ｔｃｃａｇｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１２０）
の通りである。
【０１７３】
（ｖｉｉｉ）ブタ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号５）の２５５位のセリンが、アルギニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａｇｃｇｇｃｃｃｃｃａｃｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇ（配列番号１２１）
ブタＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのリバースプライマー：ｃｃａｇｇｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｃｃｇｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１２２）
の通りである。
【０１７４】
６．イヌＭＧ５３突然変異体の調製
イヌＭＧ５３の、Ｓ２５５Ａ、Ｓ２５５Ｇ、Ｓ２５５Ｌ、Ｓ２５５Ｗ、Ｓ２５５Ｑ、Ｓ２５５Ｙ、Ｓ２５５Ｄ、およびＳ２５５Ｒ突然変異体は、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するための方法に従って調製した。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するためのステップと同じである。各突然変異体のプライマーは、以下：
（ｉ）イヌ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号６）の２５５位のセリンが、アラニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａａｇｃａｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｇ（配列番号１２３）
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ａのリバースプライマー：ｃａａａｃｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｃｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１２４）
の通りである。
【０１７５】
（ｉｉ）イヌ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号６）の２５５位のセリンが、グリシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａａｇｇａｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｇｇ（配列番号１２５）
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｇのリバースプライマー：ｃｃａａａｃｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｔｃｃｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１２６）
の通りである。
【０１７６】
（ｉｉｉ）イヌ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号６）の２５５位のセリンが、ロイシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａａｔｔａｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｇｇ（配列番号１２７）
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｌのリバースプライマー：ｃｃａａａｃｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｔａａｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号１２８）
の通りである。
【０１７７】
（ｉｖ）イヌ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号６）の２５５位のセリンが、トリプトファンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａａｔｇｇｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｇｇａ（配列番号１２９）
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｗのリバースプライマー：ｔｃｃａａａｃｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｃｃａｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号１３０）
の通りである。
【０１７８】
（ｖ）イヌ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号６）の２５５位のセリンが、グルタミンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａａｃａａｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｇｇ（配列番号１３１）
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｑのリバースプライマー：ｃｃａａａｃｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｔｔｇｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１３２）
の通りである。
【０１７９】
（ｖｉ）イヌ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号６）の２５５位のセリンが、チロシンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのフォワードプライマー：ａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａａｔａｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｇｇａ（配列番号１３３）
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｙのリバースプライマー：ｔｃｃａａａｃｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｇａｔａｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔ（配列番号１３４）
の通りである。
【０１８０】
（ｖｉｉ）イヌ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号６）の２５５位のセリンが、アスパラギン酸へと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａａｇａｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｇｇａ（配列番号１３５）
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｄのリバースプライマー：ｔｃｃａａａｃｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｇａｔｃｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１３６）
の通りである。
【０１８１】
（ｖｉｉｉ）イヌ野生型ＭＧ５３（すなわち、配列番号６）の２５５位のセリンが、アルギニンへと突然変異しているＭＧ５３突然変異体を表す、イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマーおよびリバースプライマー
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのフォワードプライマー：ａａｇａｔｃｃｔｇｇｃａｇａａｃｇａｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｇｇ（配列番号１３７）
イヌＭＧ５３  Ｓ２５５Ｒのリバースプライマー：ｃｃａａａｃｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｔｃｇｔｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｃｔｔ（配列番号１３８）
の通りである。
【０１８２】
各セリン位置において、セリンの欠失および／または突然変異を伴う多様な種のＭＧ５３突然変異体を、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するための方法に従って調製することができる。プライマーを除き、他のステップの全ては、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製するためのステップと同じである。当業者は、当技術分野における従来の技法手段により、各突然変異体のプライマーをデザインすることができる。
【０１８３】
実施例２
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体の、マウス野生型ＭＧ５３の、細胞膜修復機能および心保護機能に対する影響
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体（そのアミノ酸配列は、配列番号８で示される）の、マウス野生型ＭＧ５３の、細胞膜修復機能および心保護機能に対する影響を査定するために、本発明者らは、初代培養された新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）内で、アデノウイルスを使用して、マウス野生型ＭＧ５３およびマウスＭＧ５３突然変異体を過剰発現させ、細胞の生存率を検出した。結果を、低酸素状態／再酸素化により刺激される、虚血症−再灌流傷害が、大量の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出、およびＮＲＶＭ内の細胞内ＡＴＰの減少を結果としてもたらし、マウス野生型ＭＧ５３およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体の過剰発現が、ＬＤＨの放出およびＡＴＰの低減を、同様に阻害しうることを指し示す、図１４に示す。これは、マウス野生型ＭＧ５３が、虚血症−再灌流により誘導されるアポトーシスおよび壊死に対する保護効果を有する一方で、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体も、マウス野生型ＭＧ５３の、細胞膜修復機能および心保護機能に影響を及ぼさない、すなわち、マウスＭＧ５３Ｓ２５５位のリン酸化が、ＭＧ５３の細胞膜修復機能および心保護機能を調節しないことを示唆する。
【０１８４】
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異は、ＲＩＳＫシグナル伝達経路に対する、ＭＧ５３による活性化に影響を及ぼさない
ＭＧ５３の心保護機能の機構は、以下の通りである：ＭＧ５３は、心保護のＲＩＳＫシグナル伝達経路内の不可欠の構成要素であり、カベオリン３と、ｐ８５−ＰＩ３Ｋタンパク質との相互作用を媒介して、ＲＩＳＫシグナル伝達経路、例えば、重要な下流シグナル伝達分子であるＡＫＴを活性化させる（Ｚｈａｎｇ  Ｙ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９１、１０８〜１１５（２０１１）を参照されたい）。したがって、本発明者らは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異が、ＭＧ５３の心保護機能に影響を及ぼさない機構についてさらに研究して、それが、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体と、マウス野生型ＭＧ５３とが、ＲＩＳＫシグナル伝達経路を、同様に活性化させるという事実に関するのかどうかを同定した。実験結果を、ＮＲＶＭ内のマウス野生型ＭＧ５３の過剰発現が、ＲＩＳＫシグナル伝達経路の、下流シグナル伝達分子であるＡＫＴの４７３位におけるセリンのリン酸化を増強する、すなわち、ＡＫＴを活性化させうることを指し示す、図１５に示す。マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体と、マウス野生型ＭＧ５３とは、ＡＫＴの４７３位におけるセリンのリン酸化を、同様に増強する、すなわち、ＡＫＴを活性化させうる。これは、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異が、ＲＩＳＫシグナル伝達経路の、マウス野生型ＭＧ５３による活性化に影響を及ぼさない、すなわち、マウスＭＧ５３Ｓ  ２５５のリン酸化に対する調節が、ＲＩＳＫシグナル伝達心保護経路に影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１８５】
実施例３
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体の、野生型ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性に対する影響
ＭＧ５３の高発現により誘導される、インスリンシグナル伝達経路の抑制は、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドロームの発生の重要な機構のうちの１つであり、また、ＭＧ５３の重要な機能のうちの１つでもある。第１に、本発明者らは、マウス野生型ＭＧ５３のセリン突然変異である、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａの発現プラスミドを構築した（そのアミノ酸配列は、配列番号８で示される）。加えて、本発明者らはまた、ＩＲＳ１、ユビキチン、およびマウス野生型ＭＧ５３の発現プラスミドも構築した。第２に、本発明者らのかつての研究は、ＭＧ５３が、インスリン基質であるＩＲＳ１のＥ３ユビキチンリガーゼであり、プロテアソーム経路によるタンパク質の分解を媒介することを示唆する（Ｓｏｎｇ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４９４、３７５〜３７９（２０１３））。したがって、本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系に、ＩＲＳ１、ユビキチンの発現プラスミドと、マウス野生型ＭＧ５３またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のプラスミドとを共トランスフェクトし、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異の、ＩＲＳ１タンパク質の含量の変化を介する、ＭＧ５３機能に対する影響を査定した。実験結果を、マウス野生型ＭＧ５３が、ＩＲＳ１の発現を著明に低減しうるのに対し、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、ＭＧ５３に媒介されるＩＲＳ１タンパク質の低減を、著明に阻害しうることを示唆する、図１９に示す。これは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系の共発現系では、マウス野生型ＭＧ５３は、正常なＥ３ユビキチンリガーゼ活性をもたらし、ＩＲＳ１のユビキチン分解を媒介しうることを示唆する。これはまた、検出されたマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体が、ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を阻害した、すなわち、ＭＧ５３  Ｓ２５５位のリン酸化状態が、ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を調節しうることも示唆する。
【０１８６】
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、ＭＧ５３に媒介される基質の分解を阻害する
ＭＧ５３は、Ｅ２ユビキチンコンジュゲート酵素と会合して、基質のユビキチン化と、さらなるプロテアソーム分解とを媒介する、ＲＩＮＧドメインを伴うＥ３ユビキチンリガーゼである。したがって、ＲＩＮＧドメインを伴わない、ＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体は、ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を喪失する。さらに、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体（そのアミノ酸配列は、配列番号７で示される）およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体（そのアミノ酸配列は、配列番号８で示される）の、ヒト野生型ＭＧ５３またはマウス野生型ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性に対する影響を、定量的に査定するために、本発明者ら、ヒトＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧまたはマウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧを、陽性対照とすることにより、ヒトまたはマウスの、野生型ＭＧ５３、ＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体、またはＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体と、ＭＧ５３の基質であるＩＲＳ１、またはインスリン受容体であるＩＲとを、ヒト胎児腎臓上皮細胞系であるＨＥＫ２９３Ｔ内で共発現させ、異なる突然変異の、ＭＧ５３に媒介された基質分解に対する影響を検出した。結果を、ヒト野生型ＭＧ５３またはマウス野生型ＭＧ５３が、ＩＲＳ１分解を、著明に媒介しうるが、ヒトＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体またはマウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体が、ＩＲＳ１分解を、ほとんど媒介しえないのに対し、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、ＩＲＳ１のうちの約４０％の分解だけを媒介しうるが、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、ＩＲＳ１のうちの約１０％の分解だけを媒介しうることを指し示す、図１６（マウス）および図１７（ヒト）に示す。マウス野生型ＭＧ５３は、ＩＲβの約５０％の分解を媒介しうるが、マウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、ＩＲβの分解を、ほとんど媒介しない。加えて、ＨＥＫ２９３Ｔ共発現系内では、マウス野生型ＭＧ５３が、ＩＲβの前駆体タンパク質の分解を媒介しうるのに対し、マウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体およびマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、ＭＧ５３に媒介された分解をほぼ完全に阻害した。この研究は、ヒトＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体またはマウスＭＧ５３−Ｄ−ＲＩＮＧ切断型突然変異体が、ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を、著明に阻害するのに対し、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、少なくとも約５０％の、ＭＧ５３  Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を阻害することを示唆する。
【０１８７】
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、ＭＧ５３の、基質であるＩＲＳ１タンパク質への結合を阻害する
マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体（そのアミノ酸配列は、配列番号８で示される）が、ＭＧ５３の、基質であるＩＲＳ１タンパク質の認識およびこれへの結合に影響を及ぼしうるのかどうかについて研究するために、本発明者らは、一態様では、基質であるＩＲＳ１と、マウス野生型ＭＧ５３またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体との結合強度を、ｅｘ  ｖｉｖｏのＨＥＫ２９３Ｔ細胞系内の、活性状態下で、共免疫沈降を介して検出し、別の態様では、精製タンパク質であるＩＲＳ１と、マウス野生型ＭＧ５３またはマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体との、直接的な結合強度を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を介して検出した。実験結果を、図１８に示す。図１８Ａは、ＩＲＳ１が、マウス野生型ＭＧ５３に、物理的に結合しうるのに対し、同量のＩＲＳ１は、極少量のマウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体だけに結合しうることを示し；図１８Ｂは、マウス野生型ＭＧ５３タンパク質が、ＩＲＳ１タンパク質に、６４．２ｎＭのＫＤで、極めて良好に結合しうるのに対し、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体は、ＩＲＳ１タンパク質に結合しえないことを示す。上記に照らし、マウスＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異は、ＭＧ５３のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を阻害するように、ＭＧ５３の、基質であるＩＲＳ１タンパク質の認識およびこれへの結合を阻害した。
【０１８８】
実施例４
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体（そのアミノ酸配列は、配列番号７で示される）が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、細胞膜修復機能および心保護機能を保持しつつ、野生型ＭＧ５３により引き起こされる代謝的副作用を依然として回避または低減しうるのかどうかを検証するために、本発明者らは、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体およびヒト野生型ＭＧ５３を、それぞれ、ラットの体内へと導入して、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性について、さらに解析した。第１に、本発明者らは、本出願の実施例１に従うヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体を調製する。第２に、１５匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（ラット１匹当たり約２５０ｇ；Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製）を選択し、群１つ当たりのラット５匹ずつとする３つの群、すなわち、試験群、陽性対照群、および陰性対照群へと群分けする。３０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウム（腹腔内注射）を介して、ラットに麻酔をかけ、次いで、左第３肋骨において、開胸術を実施して、心臓を露出させる。次いで、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体タンパク質（６ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）を、被験群内のラットの心臓へと、静脈内注射し、ヒト野生型ＭＧ５３タンパク質（そのアミノ酸配列は、配列番号１で示される）（６ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）を、陽性対照群内のラットの心臓へと、静脈内注射し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（６ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）を、陰性対照群内のラットの心臓へと静脈内注射する。各群内のラットの下行左前動脈の結紮を、上記のタンパク質の静脈内注射の５分後に行い、４５分間にわたり続行した。結紮の終了の前に、各群のラットに、それぞれ、対応する、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体タンパク質、ヒト野生型ＭＧ５３タンパク質、およびＢＳＡ（６ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）を、再度静脈内注射し、次いで、冠動脈を開放する。２４時間にわたる再灌流時間の後、生存率を、被験群、陽性対照群、および陰性対照群の間で比較する。インスリンを使用して、各群内のラットを刺激し、次いで、ラットを屠殺して、被験群内、陽性対照群内、および陰性対照群内のラットの、梗塞サイズ、血清ＬＤＨ濃度、および心筋断面についてのＴＵＮＥＬ染色を比較する。まとめると、これらの指標は、各群内のラットの心損傷のレベルを測定する。被験群内のラットの梗塞サイズが、陰性対照群内のラットの梗塞サイズより著明に小さいか、または被験群内のラットが、陰性対照群内のラットと比較して、著明に阻害されたＬＤＨ放出を裏付けるか、または被験群内のラットについての、心筋断面についてのＴＵＮＥＬ染色結果が、細胞死の、陰性対照群内のラットの細胞死と比較した減少を指し示す場合、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体が、ヒト野生型ＭＧ５３の細胞膜修復機能および心保護機能に影響を及ぼさず、心筋梗塞、心虚血症／再灌流傷害などの心疾患を処置するために使用されうることが示唆される。最後に、被験群内、陽性対照群内、および陰性対照群内のラットの、各組織（例えば、心筋、骨格筋、肝臓など）内のｐ−ＡＫＴ／ｔ−ＡＫＴの変化を比較して、被験群内、陽性対照群内、および陰性対照群内のラットの各組織のインスリン応答性について査定する。陽性対照群内のラットの組織内のｐ−ＡＫＴ／ｔ−ＡＫＴの比が減少する場合は、ヒト野生型ＭＧ５３タンパク質が、インスリン感受性の低減を誘導しうることが示唆され、陰性対照群内のラットの組織内のｐ−ＡＫＴ／ｔ−ＡＫＴの比が正常な場合は、ＢＳＡが、インスリン感受性に対して効果を及ぼさないことが示唆され、被験群内のラットの組織内のｐ−ＡＫＴ／ｔ−ＡＫＴの比が、陽性対照群より大きい場合は、ヒトＭＧ５３  Ｓ２５５Ａ突然変異体が、ヒト野生型ＭＧ５３タンパク質により誘導されたインスリン感受性の低減を消失または減弱させうることが示唆される。
【０１８９】
まとめると、ＭＧ５３コイルドコイル−ＳＰＲＹ領域内の少なくとも１つのセリン（とりわけ、２５５位におけるセリン）を、欠失またはセリンでないもしくはトレオニンでない他の任意のアミノ酸（例えば、アラニン）へと突然変異させる場合、結果として得られるＭＧ５３突然変異体は、細胞修復機能および／または心保護機能を依然として保持しつつ、野生型ＭＧ５３により引き起こされる、インスリン抵抗性などの代謝的副作用を回避または低減しうる。
【０１９０】
本発明は、具体的実施形態を導入することにより、開示および記載されるが、当業者は、本発明の精神および主題の範囲から逸脱しない限りにおいて、上記の内容に対して、多様な、形式上の改変および詳細な改変を施しうることを理解するであろう。
【図１】
2019530433.tif 000004
【図２】
2019530433.tif 000005
【図３】
2019530433.tif 000006
【図４】
2019530433.tif 000007
【図５】
2019530433.tif 000008
【図６】
2019530433.tif 000009
【図７】
2019530433.tif 000010
【図８】
2019530433.tif 000011
【図９】
2019530433.tif 000012
【図１０】
2019530433.tif 000013
【図１１】
2019530433.tif 000014
【図１２】
2019530433.tif 000015
【図１３】
2019530433.tif 000016
【図１４】
2019530433.tif 000017
【図１５】
2019530433.tif 000018
【図１６】
2019530433.tif 000019
【図１７】
2019530433.tif 000020
【図１８】
2019530433.tif 000021
【図１９】
2019530433.tif 000022
【図２０】
2019530433.tif 000023
【図２１】
2019530433.tif 000024
【図２２】
2019530433.tif 000025
【図２３】
2019530433.tif 000026
【図２４】
2019530433.tif 000027
【図２５】
2019530433.tif 000028
【図２６】
2019530433.tif 000029
【図２７】
2019530433.tif 000030
【図２８】
2019530433.tif 000031
【配列表】
2019530433000001.app
【国際調査報告】
2019530433.tif 000032
2019530433.tif 000033
2019530433.tif 000034
2019530433.tif 000035
2019530433.tif 000036
2019530433.tif 000037