【手続補正書】
【提出日】平成19年7月13日(2007.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  構造タンパク質がウイルスの抗原性を低減させる修飾を少なくとも１つ含み、該修飾が、ＹＫＱＩＳ  ＳＱＳＧＡ、ＹＬＴＬＮ  ＮＧＳＱＡ、ＹＹＬＳＲ  ＴＮＴＰＳ、ＥＥＫＦＦ  ＰＱＳＧＶ、ＮＰＶＡＴ  ＥＱＹＧＳ、ＬＱＲＧＮ  ＲＱＡＡＴ、ＮＶＤＦＴ  ＶＤＴＮＧから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に位置することを特徴とする、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の構造タンパク質。
【請求項２】  修飾が、ウイルスの感染性をごく僅かに低減させることを特徴とする、請求項１記載の構造タンパク質。
【請求項３】  修飾ＶＰ１、修飾ＶＰ２及び／又は修飾ＶＰ３から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の構造タンパク質。
【請求項４】  ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及び／又はＡＡＶ６に由来する、並びにこれらに、特にＡＡＶ２に由来する他のＡＡＶ血清型に由来することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項５】  修飾が、１つ以上のアミノ酸又はアミノ酸配列に対する１つ以上の高分子量又は低分子量化合物、例えばビオチン、単糖若しくはオリゴ糖、ヒドロキシル基又はＦａｂフラグメントの共有結合又は非共有結合に基づくものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項６】  修飾が、突然変異、例えば点突然変異、複数個のアミノ酸の突然変異、１つ以上の欠失、１つ以上の挿入又はこれらの突然変異の組み合わせであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項７】  タンパク質若しくはペプチド、好ましくは免疫抑制性タンパク質若しくはペプチドが挿入されることを特徴とする、請求項６記載の構造タンパク質。
【請求項８】  該挿入が、インテグリン、サイトカイン、又はサイトカイン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体、細胞表面構造に対する抗体、抗体結合構造又はエピトープから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の構造タンパク質。
【請求項９】  ＡＡＶ粒子の形態、特にＡＡＶカプシドの形態である、請求項１〜８のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項１０】  請求項１〜９のいずれかに記載の構造タンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】  請求項１０に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１２】  請求項１〜９のいずれかに記載の構造タンパク質の製造方法であって、請求項１０記載の細胞を培養し、適当である場合には、発現された構造タンパク質を単離することを特徴とする前記方法。
【請求項１３】  請求項１〜９のいずれかに記載の構造タンパク質、請求項１０記載の核酸及び／又は請求項１１記載の細胞及び／又は、適当である場合には、賦形剤及び／又は添加剤を含む薬剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ＡＡＶカプシドは３つの異なるタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から成り、これらの相対的割合は５％  ＶＰ１、５％  ＶＰ２及び９０％  ＶＰ３である。ＡＡＶカプシド遺伝子はＡＡＶゲノムの右手端部に位置され、異なる開始コドンと、転写物(transcript)の２つの異なってスプライスされた変異体(variant)とを用いて、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列をオーバーラップさせることによって、コードされる。ＶＰ１遺伝子はＶＰ２遺伝子配列全体を含有し、このＶＰ２遺伝子配列は、特異的なＮ末端領域を有するＶＰ３遺伝子配列全体を含有する。オーバーラッピングリーディングフレームが３種類のＡＡＶカプシドタンパク質の全てをコードするという事実が、全てのカプシドタンパク質の、程度の差こそあれ、必須の発現を生じることになる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
修飾（単数又は複数）は好ましくはウイルス表面に位置する。構造タンパク質の表面に位置している領域の決定に関して、本発明によって、ＣＰＶ（イヌパルボウイルス）とＡＡＶ２の配列及び構造が匹敵することが意外にも発見された。それ故、好ましくは、例えばパルボウイルスＢ１９又はＣＰＶのようなパルボウイルスの既知結晶構造に頼って、ホモロジー比較によって、ウイルス表面に位置するタンパク質ドメインを同定することが可能である。それ故、本発明によると、例えば、ＣＰＶとＡＡＶ２とのコンピューター補助比較、及びパルボウイルスＢ１９とＡＡＶ２とのコンピューター補助比較が、配列が変化して、即ち、低いホモロジーを有して、ウイルス表面に位置すると期待される、ＶＰ３中のループの同定を意外にも再現可能に生じた。体液性免疫応答に対する抗原は抗体に、したがってウイルス表面にアクセス可能でなければならないので、これらのループは修飾のための好ましい候補である。このように、ＣＰＶ  ＶＰ２カプシドタンパク質の既知結晶構造（例えば、Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200, 209-211; Wu and Rossmann (1993), J. Mol. Biol., 233, 231-244; Tsao J. et al. (1991) Science, 251, 1456-1464）は、ウイルスカプシド表面上に暴露され、局部的アミノ酸配列に基づいてペプチド配列の挿入を克服するために充分にフレキシブルである領域を見出すために、タンパク質の二次構造におけるＡＡＶ２  ＶＰ３との大きな類似性に基づいてパターンと見なされた。この場合に、カプシドを不安定化すると考えられるＡＡＶ２カプシドタンパク質の二次構造要素を選択しないように注意した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
好ましい実施態様では、修飾（単数又は複数）は構造タンパク質のＮ末端に位置する、この理由は、例えばパルボウイルスＢ１９の場合にはＮ末端が細胞表面に位置することが発見されているからである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
構造タンパク質の表面に位置する領域を決定するための他の可能性は、異なるＡＡＶ血清型からのカプシドをコードする核酸配列を比較することである。このために、例えばＡＡＶ２の可能なカプシド形態の構造分析のために、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５又はＡＡＶ６のような、異なるＡＡＶ血清型からの既知ＤＮＡ配列を用いることが可能であり、この場合に、最初から、可能な三次構造を算出して、一般に知られたアミノ酸性質に基づいて配列領域を内側又は外側カプシド領域に割り当てることが可能である。したがって、本発明によると、例えば、ＡＡＶ２カプシドのＶＰ３領域における可能な挿入部位を確定することが可能であり、これらの部位は、例えばペプチドを挿入して、それらをウイルス表面上に発現させることを可能にした（以下参照）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明の他の好ましい実施態様では、６２アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ切断部位間の１つ以上の欠失によって、修飾（単数又は複数）が行なわれる（Hermonat, P.L. et al. (1984), J. Virol., 51, 329-339）。他の好ましい、対応する実施態様では、上記欠失内に位置され、２９アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間に、欠失（単数又は複数）が位置される。この欠失はＲｅｐ遺伝子とのオーバーラップを有さないので、パッケージング機構に本質的に影響を及ぼさないという利点を有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
他の好ましい実施態様では、ＶＰ３構造タンパク質(Rutledge, E.A. et al. (1998) 上記文献) 中の、YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT, EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNGから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後に１つ以上の挿入が存在する、この理由はこれらの部位がループの暴露部位に位置され、この場合にはＶＰ３構造が変化する危険性が低いからである。