(57)【要約】  膜溶解性ブロック共重合体、ミセル集合体、医薬組成物、及び関連する方法を記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）のブロック共重合体：
【化１】
2019528258.tif 000024
（式中、
各Ａ１は、親水性単量体由来の単位であり；
各Ａ２は、独立して中性であるか、又はｐＨ１０以下で荷電している単量体由来の単位であり；
各Ａ３は、ペプチド、核酸、核酸誘導体などの治療用分子又は低分子薬物を含む単量体由来の単位であり；
各Ａ４は、約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＫａを有する単量体由来の単位であり；
各Ａ５は、ペプチド、核酸、核酸誘導体などの治療用分子、又は低分子薬物を含む単量体由来の単位であり；
Ａ６は、膜溶解性実体を含む単量体由来の単位であり；
Ｔ１は、独立して、存在しないか、又は標的基であり；
Ｔ２は、独立して、存在しないか、膜溶解性実体、ペプチド、核酸、核酸誘導体などの治療用分子又は低分子薬物であり；
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である）。
【請求項２】
Ａ１、Ａ２又はＡ３が、独立して、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−ジメチルアミノエチルアクリレート、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]メタクリルアミド、２−アミノエチルメタクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、[２−ヒドロキシ−３−（２−アミノエチル）アミノ]プロピルメタクリレート、[３メタクリロイルアミノ）プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、及びＬ−リジンからなる群から選択される繰り返し単位を含む、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項３】
Ａ１、Ａ２又はＡ３が、独立して、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチル無水マレイン酸修飾Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、及び２−アミノエチルメタクリレートからなる群から選択される繰り返し単位を含む、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項４】
Ａ１、Ａ２又はＡ３が、独立して、オリゴ（エチレングリコール）、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−グルカノアミドプロピルメタクリルアミド、２−ラクトビオンアミドエチルメタクリルアミド、ベタイン、ホスホコリン、スルホベタイン及びカルボキシベタインからなる群から選択される繰り返し単位を含む、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項５】
Ａ４、Ａ５又はＡ６が、独立して、２−ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート、２−（ペンタメチレンイミノ）エチルメタクリレート、２−（ヘキサメチレンイミノ）エチルメタクリレート、２−（ジプロピルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジブチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジペンチルアミノ）エチルメタクリレート及び２−（エチルプロピルアミノ）エチルメタクリレートからなる群から選択される繰り返し単位を含む、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項６】
前記膜溶解性実体が、リンカーを介してＡ６に共有結合している、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項７】
前記リンカーが、炭素−炭素結合、オリゴヌクレオチド、エステル含有断片、アミド含有断片又はジスルフィド含有断片から選択される、請求項６に記載のブロック共重合体。
【請求項８】
前記膜溶解性ペプチドが、メリチン、アデノウイルスタンパク質ＶＩ、ＧＡＬＡ、ＫＡＬＡ、ＥＧＬＡ、ＪＴＳ１由来のペプチド、グラミシジンＳ、ＨＧＰペプチド（配列ＬＬＧＲＲＧＷＥＶＬＫＹＷＷＮＬＬＱＹＷＳＱＥＬ）、ｓＨＧＰペプチド（配列ＲＧＷＥＶＬＫＹＷＷＮＬＬＱＹ）、ＴＡＴペプチド（配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）、オリゴアルギニン、ＣａＬＬ（ＫＷＫＬＦＫＫＩＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲ）、ハドルリン（ｈａｄｒｕｒｉｎ）（ＧＩＬＤＴＩＫＳＩＡＳＫＶＷＮＳＫＴＶＱＤＬＫＲＫＧＩＮＷＶＡＮＫＬＧＶＳＰＱＡＡ）、クピエニン１Ａ（ＧＦＧＡＬＦＫＦＬＡＫＫＶＡＫＴＶＡＫＱＡＡＫＱＧＡＫＹＶＶＮＫＱＭＥ）、クラボリン（ｃｒａｂｏｌｉｎ）（Ｆｍｏｃ−ＦＬＡＬＩＬＲＫＩＶＴＡＬ−ＣＯＮＨ２）、ＩｓＣＴ（ＩＬＧＫＩＷＥＧＩＫＳＬＦ−ＮＨ２）、ＨｓＡＰ（ＳＧＴＳＥＫＥＲＥＳＧＲＬＬＧＶＶＫＲＬＩＶＣＦＲＳＰＦＰ−ＮＨ２）、パンジニン（Ｐａｎｄｉｎｉｎ）２（ＦＷＧＡＬＡＫＧＡＬＫＬＩＰＳＬＦＳＳＦＳＫＫＤ）、ポネリシン（Ｐｏｎｅｒｉｃｉｎ）（ＷＬＧＳＡＬＫＩＧＡＫＬＬＰＳＶＶＧＬＦＫＫＫＫＱ）、ＵｙＣＴ５（ＩＷＳＡＩＷＳＧＩＫＧＬＬ−ＮＨ２）及びヘマグルチニンからなる群から選択される、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項９】
Ａ１及びＡ２が組み合わさって、ｐ（ＯＥＧＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ）−ｂ−ｐ（ＤＩＰＡＭＡ−ＰＤＳＥＭＡ）を含む、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項１０】
Ｌがジスルフィド架橋である、請求項９に記載のブロック共重合体。
【請求項１１】
式（ＩＩａ）：
【化２】
2019528258.tif 000025
（式中、
各Ａ１は、親水性単量体由来の単位であり；
各Ａ２は、中性であるか、又はｐＨ１０以下で荷電している単量体由来の単位であり；
各Ａ４は、約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＫａを有する単量体由来の単位であり；
各Ａ３’、Ａ５’及びＡ６’は、独立して、
【化３】
2019528258.tif 000026
（式中、
各Ｘは、独立して、アルキレン、アリーレン、ジスルフィド、アルキレンオキシド又はプロパン−２，２−ジオールを含む繰り返し単位を含み；
各Ｘは、任意選択で、−ＣＯ２Ｒ１、Ｌ１−Ｄ１、Ｌ２−Ｄ２、又はＬ３−ＬＰで置換されており、式中、Ｒ１は親水基であり；
各Ｒは、独立して、水素、−ＣＯ２Ｒ２、−ＣＮ、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、式中、Ｒ２は、親水基、Ｌ１−Ｄ１、Ｌ２−Ｄ２又はＬ３−ＬＰであり；
ａは１〜４であり；かつ
ｂは２〜４である）であり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々は、独立して、存在しないか、又はリンカーであり；
各ＬＰは、膜溶解性実体であり；
Ｄ１及びＤ２の各々は、独立して、治療用ペプチド、核酸、又は核酸誘導体であり；
Ｔ１は、独立して、存在しないか、又は標的基であり；
Ｔ２は、独立して、存在しないか、膜溶解性実体、治療用ペプチド、核酸又は核酸誘導体であり；
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である）
の構造を有する、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項１２】
式（ＩＩＩｂ）：
【化４】
2019528258.tif 000027
（式中、ｍ’が約１〜約２０である）
の構造を有する、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項１３】
式（ＩＩＩｆ）：
【化５】
2019528258.tif 000028
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項１４】
式（ＩＩＩｇ）：
【化６】
2019528258.tif 000029
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項１５】
式（ＩＶｂ）：
【化７】
2019528258.tif 000030
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項１６】
式（ＩＶｃ）：
【化８】
2019528258.tif 000031
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項１７】
式（ＩＶｄ）：
【化９】
2019528258.tif 000032
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する、請求項１に記載のブロック共重合体。
【請求項１８】
各Ｒ’は、独立して、水素又はアルキルである、請求項１３〜１６のいずれかに記載のブロック共重合体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の複数の共重合体を含むミセル集合体。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の少なくとも１つのブロック共重合体及び請求項１９に記載のミセル集合体；および
Ａ１、Ａ２またはＡ３のうち少なくとも１つと可逆的に結合する治療剤、
を含む医薬組成物。
【請求項２１】
治療剤を細胞内に送達する方法であって、
請求項２０に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、
前記医薬組成物が前記エンドソームにエンドサイトーシスされ、それによって、前記医薬組成物が前記エンドソームに前記治療剤を放出する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、米国立衛生研究所によって与えられた助成金番号Ｒ０１ ＮＳ０６４４０４の下で政府の支援により行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
核酸ベースの薬物、ペプチド及びタンパク質などの細胞内薬物の潜在的に斬新なインパクトは、主として高分子治療薬の細胞内送達に関わる多数の送達の課題により、臨床的に実現されていない。Ｍ．Ｅ．Ｄａｖｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１０，４６４，１０６７−Ｕ１１４０；ｂ）Ｍ．Ａ．Ｋａｙ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２０１１，１２，３１６−３２８；ｃ）Ｋ．Ａ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００９，８，１２９−１３８。核酸の場合、２つの主要なクラスの送達ビヒクルであるウイルス系及び非ウイルス系は、カーゴをパッケージ化し、細胞取り込みを促進するために使用されるが、それぞれ限界がある。ウイルスベクターは、免疫原性及び安全性の懸念を有し、製造コストが高い。Ｃ．Ｅ．Ｔｈｏｍａｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００３，４，３４６−３５８。合成重合体などの非ウイルスベクターは、ウイルスと比較して、価格及び安全性プロファイルが改善されているが、それらのウイルス対応物と比較して、遺伝子導入に桁違いに効率的ではない。Ｕ．Ｌａｃｈｅｌｔら、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ２０１５，１１５，１１０４３−１１０７８。
【０００３】
重合体担体の細胞内輸送を調べるいくつかの研究により、エンドソーム放出が細胞内送達における律速段階であると特定された。放出が生じない場合は、エンドソーム内容物は、一般的にリソソーム分解に送られる。Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００８，１０，１８７−１９７；ｂ）Ｃ．Ｍ．Ｖａｒｇａら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５，１２，１０２３−１０３２。したがって、合成重合体は、酸性ｐＨにおける緩衝化（「プロトンスポンジ効果」として知られている）、並びに膜活性ペプチド及びアルキル化カルボン酸の組み込みなどの機構を介してエンドソーム放出を高めるように設計されている。Ｊ．−Ｐ．Ｂｅｈｒ，ＣＨＩＭＩＡ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，５１，３４−３６；ｂ）Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９９，３８，２７９−２８９；ｃ）Ａ．Ｊ．Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００９，１３３，２２１−２２９；ｄ）Ｅ．Ｊ．Ａｄｏｌｐｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ ２０１４，２，８１５４−８１６４。これらのアプローチは、典型的には、培養細胞においてよく機能するが、インビボでの適用については容易に転換され得ない。プロトンスポンジ効果によるエンドソーム緩衝化は、インビボで達成することが困難であり得る顕著に累積された重合体濃度を必要とする。一方で、膜活性ペプチドは、オフサイト毒性をもたらす細胞膜の破壊を最小限にするために、エンドソームに達するまで遮蔽する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、アデノウイルス（Ａｄ）によって用いられる効率的なエンドソーム脱出のメカニズムを模倣する合成重合体を提供する。
【０００５】
本開示の主な特徴は、主に生理学的条件下で溶解性を提供する親水性ブロック、及びｐＨ応答性で、可逆的に疎水性である第２のブロックを含み、膜溶解性実体が取り付けられているブロック共重合体である。細胞外ｐＨで、第２のブロックは、疎水性で、疎水性ブロックの自己集合をもたらし、内在化前に物質の溶解電位を低下させる。（酸性エンドソームに内在化した後に検出される）特定の酸性ｐＨで、第２のブロックは親水性になり、膜溶解性実体は、エンドソーム放出を促進するように露出されるようになる。ブロック共重合体は、直接共有結合によって、又は（静電結合、ファンデルワールス、水素結合、疎水性カプセル化などの）非共有結合性相互作用によって、その高分子カーゴに関連付けられ得る。
【０００６】
一態様において、本開示は、ほぼ中性ｐＨで水溶性である繰り返し単位を含む親水性ブロック；及びほぼ中性ｐＨで疎水性である繰り返し単位を含み、膜溶解性実体と共有結合しているｐＨ応答性ブロック、を含むブロック共重合体を提供する。
【０００７】
一態様において、本開示は、ほぼ中性ｐＨでイオン性である繰り返し単位を含む親水性ポリイオン性ブロック；及びほぼ中性ｐＨで疎水性である繰り返し単位を含み、膜溶解性実体と共有結合しているｐＨ応答性ブロック、を含むブロック共重合体を提供する。
【０００８】
特定の実施形態において、該ポリイオン性ブロックは、ほぼ中性ｐＨで陽イオン性である繰り返し単位、ほぼ中性ｐＨで陰イオン性である繰り返し単位、及び中性親水性繰り返し単位から選択される繰り返し単位を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、該ｐＨ応答性ブロックは、約６.８超のｐＨで疎水性である。
【００１０】
特定の実施形態において、該膜溶解性実体は、リンカーを介してｐＨ応答性ブロックに共有結合している。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、さらに本明細書に記載の共重合体のいずれかに記載の共重合体を提供する方法を提供する。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、さらに本明細書に記載の共重合体のいずれかによる複数の共重合体を含むミセル集合体を提供する。特定の実施形態において、該ミセル集合体は、約５ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有する。特定の実施形態において、該ミセル集合体は、約６.５未満のｐＨで分解する。
【００１３】
第４の実施形態において、本発明は、本発明のいずれかの態様に記載のブロック共重合体及び本発明の態様に記載のミセル集合体のうちの少なくとも１つ、並びに共重合体と可逆的に関連する治療剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、該治療剤は、共重合体にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、該治療剤は、共重合体と非共有結合している。特定の実施形態において、該治療剤は核酸分子である。特定の実施形態において、該治療剤は、タンパク質又はペプチドである。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、本発明による医薬組成物を対象に投与することを含む、核酸、ペプチド又はタンパク質を細胞内に送達する方法であって、該医薬組成物はエンドソームにエンドサイトーシスされ、それによって、該医薬組成物が、エンドソームから核酸、ペプチド又はタンパク質を放出する方法を提供する。
【００１５】
上記の態様及び本発明の付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるようになるので、より容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ａ）ＶＩＰＥＲ（エンドソーム放出のためのウイルス刺激重合体）の一実施形態の化学構造、Ｂ）ＶＩＰＥＲ誘発性エンド／リソソーム脱出の概略図を示す。中性ｐＨで、ＶＩＰＥＲは自己集合して、ｐＨ感受性ドメインに制限される膜溶解性実体（この例では、ペプチドメリチン）を有するナノ粒子になる。細胞によるエンドサイトーシス後、酸性エンド／リソソーム環境は、ｐＤＩＰＡＭＡの親水性相転移を誘発し、メリチン露出、エンド／リソソーム膜の破壊、及びエンド／リソソーム脱出を可能にする。
【図２】様々な酸性ｐＨで疎水性から親水性への転移を受けるＶＩＰＥＲの代替実施形態の化学構造を示す。
【図３】ＶＩＰＥＲ／プラスミドのポリプレックスの最適化された製剤を用いた様々な不死化細胞株へのＧＦＰプラスミドのインビトロトランスフェクションを示す。全ての統計分析を、ＶＩＰＥＲと比較して行った。データは、平均±ＳＤとして示される（ｎ＝３；スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０.０５、＊＊＊ｐ＜０.００１）。
【図４】Ａ）様々なポリプレックスで腫瘍内注射によって処置したＫＢ腫瘍担持マウスの生物発光画像、Ｂ）ポリプレックスで処置したマウスの切除したＫＢ腫瘍組織からのルシフェラーゼ活性、Ｃ）様々なポリプレックスで腫瘍内注射により処置したＡ５４９腫瘍担持マウスの生物発光画像、Ｄ）ポリプレックスで処置したマウスの切除したＡ５４９腫瘍組織からのルシフェラーゼ活性を示す。データは、平均±ＳＤとして示される（ｎ＝４、スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００１）。
【図５】ｐ（ＯＥＧＭＡ１１−ＤＭＡＥＭＡ５６）及びｐ（ＯＥＧＭＡ１１−ＤＭＡＥＭＡ５６）−ｂ−ｐ（ＤＩＰＡＭＡ３３−ＰＤＳＥＭＡ１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】重合体／ＤＮＡポリプレックスの特徴付けを示す。Ａ）異なるＮ／Ｐ比で調製された重合体／ＤＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動、Ｂ）及びＣ）Ｎ／Ｐ＝５で形成された重合体／ＤＮＡ複合体のＴＥＭ画像（スケールバー：２００ｎｍ）、Ｄ）異なる製剤の平均流体力学直径、Ｅ）異なる製剤のゼータ電位。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図７】異なる条件下でＤＮＡ及びＶＩＰＥＲ（Ｎ／Ｐ＝５）によって形成されたポリプレックスの安定性試験を示す。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図８】様々な重合体濃度及びｐＨでのＣＰ／ＤＮＡ並びにＶＩＰＥＲ／ＤＮＡポリプレックスの溶血活性を示す。製剤に使用されるＮ／Ｐ比は７であった。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図８】ｐＨ７.４及び５.７でのＣＰ並びにＶＩＰＥＲポリプレックスのＹＯＹＯ−１の相対的蛍光強度を示す。蛍光強度を遊離ＤＮＡに対して正規化した。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図９】ＤＮＡを有するＣＰ及びＶＩＰＥＲによって形成されたポリプレックスの細胞取り込みを示す（Ｎ／Ｐ＝５）。ＤＮＡをＹＯＹＯ−１で標識した。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図１０】ＨｅＬａ細胞を用いた、異なるＮ／Ｐ比の様々なポリプレックスでのインビトロトランスフェクション。Ａ）トランスフェクション効率、Ｂ）相対細胞生存率。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図１１】ＫＢ細胞を用いた、異なるＮ／Ｐ比の様々なポリプレックスでのインビトロトランスフェクションを示す。Ａ）トランスフェクション効率、Ｂ）相対細胞生存率。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図１２】Ｚ３１０細胞を用いた、異なるＮ／Ｐ比の様々なポリプレックスでのインビトロトランスフェクションを示す。Ａ）トランスフェクション効率、Ｂ）相対細胞生存率。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図１３】Ａ５４９細胞を用いた、異なるＮ／Ｐ比の様々なポリプレックスでのインビトロトランスフェクションを示す。Ａ）トランスフェクション効率、Ｂ）相対細胞生存率。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図１４】メッセンジャー（ｍＲＮＡ）送達のためのＶＩＰＥＲ、陽イオン性ｐＤＭＡＥＭＡサンフラワー重合体、及び分枝ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）の静電錯体によって形成されたポリプレックスでのＨｅＬａ細胞のインビトロトランスフェクションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一態様において、本発明は、ほぼ中性ｐＨで水溶性である親水性ブロック、及びほぼ中性ｐＨで疎水性である繰り返し単位を含み、膜溶解性ペプチドと共有結合しているｐＨ応答性ブロック、を含むブロック共重合体を提供する。
【００１８】
本明細書の様々な箇所において、本開示の化合物の置換基は、グループ又は範囲で開示されている。具体的には、本開示は、そのようなグループ及び範囲のメンバーのそれぞれ並びに全ての個々のサブコンビネーションを含むことが意図される。
【００１９】
明確にするために、別の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴はまた、単一の実施形態と組み合わせて提供することができることがさらに理解される。
【００２０】
逆に、簡潔のために、単一の実施形態の文脈で記載される本開示の様々な特徴はまた、別々に又は任意の適切なサブコンビネーションで提供することができる。
【００２１】
本明細書で使用する、重合体の「構成単位」という用語は、そのペンダント原子又は原子団（存在する場合）と共に鎖の一部を含む、重合体中の原子又は原子団を指す。構成単位は、繰り返し単位を指すことができる。構成単位はまた、重合体鎖上の末端基を指すことができる。例えば、ポリエチレングリコールの構成単位は、繰り返し単位に対応する−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、又は末端基に対応する−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり得る。
【００２２】
本明細書で使用する用語「繰り返し単位」は、最小構成単位に対応し、その繰り返しは規則性高分子（又はオリゴマー分子又はブロック）を構成する。
【００２３】
本明細書で使用する「疎水性」という用語は、生理的ｐＨ及び／又は塩条件で顕著に無極性の表面積を有する、水に引き付けられない部分を指す。この相分離は、動的光散乱と水性ＮＭＲ測定の組み合わせにより観察することができる。疎水性構成単位は、水性条件下で非極性になる傾向がある。疎水性部分の例としては、アルキル基、アリール基などが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用する「親水性」という用語は、水に引き付けられ、溶解される傾向がある部分を指す。親水性部分は水相と混和性である。親水性構成単位は、水性条件下で極性であり、かつ／又はイオン化可能であり得る。親水性構成単位は、水性条件下でイオン化可能であり、かつ／又はアミド、ヒドロキシル基、又はエチレングリコール残基などの極性官能基を含有することができる。親水性部分の例としては、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基などが挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用する「陽イオン性」という用語は、正に帯電されるか、又は生理学的条件下で正に帯電した部分にイオン化できる部分を指す。陽イオン性部分の例としては、例えば、アミノ、アンモニウム、ピリジニウム、イミノ、スルホニウム、第四級ホスホニウム基などが挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用する「陰イオン性」という用語は、負に帯電されるか、又は生理学的条件下で負に帯電した部分にイオン化できる官能基を指す。陰イオン基の例としては、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェートなどが挙げられる。
【００２７】
特定の実施形態において、本発明のブロック共重合体は、式（Ｉ）：
【化１】
2019528258.tif 000002
（式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、−Ｃ−Ｃ−、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ）＾Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（Ｃ）ａＣ（Ｏ）−及び−Ｏ（Ｃ）ｂＯ−からなる群から選択され、式中、ａは１〜４であり、ｂは２〜４であり；
Ｈは、親水性部分であり；
Ｃは、約７のｐＨで帯電された部分であり；
Ｑは、約７超のｐＨで疎水性であり；
Ｌは、リンカーであり；
ＬＰは、膜溶解性ペプチドであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、独立して、水素、−ＣＮ、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択され；
ｍは１〜１０,０００であり；
ｎは１〜１０,０００であり；
ｐは１〜１０,０００であり；かつ
ｑは１〜１０,０００である）
による構造を有する。
【００２８】
特定の実施形態において、Ｌは、ジスルフィド架橋である。
【００２９】
本明細書で使用する「アルキル」という用語は、直鎖（例えば、線状）又は分枝状の飽和炭化水素基を指す。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピル及びイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約３０、１〜約２４、２〜約２４、１〜約２０、２〜約２０、１〜約１０、１〜約１２、１〜約８、１〜約６、１〜約４、又は１〜約３個の炭素原子を含有することができる。
【００３０】
本明細書で使用する「アルキレン」は、結合アルキル基を指す。
【００３１】
本明細書で使用する「アルケニル」は、１以上の二重炭素−炭素結合を有するアルキル基を指す。アルケニル基は、直鎖状又は分枝状であり得る。アルケニル基の例としては、エテニル、及びプロペニルなどが挙げられる。アルケニル基は、２〜約３０、２〜約２４、２〜約２０、２〜約１０、２〜約８、２〜約６、又は２〜約４個の炭素原子を含有することができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「アルキニル」は、１以上の三重炭素−炭素結合を有するアルキル基を指す。アルキニル基は、線状又は分枝状であり得る。アルキニル基の例としては、エチニル、及びプロピニルなどが挙げられる。アルキニル基は、２〜約３０、２〜約２４、２〜約２０、２〜約１０、２〜約８、２〜約６、又は２〜約４個の炭素原子を含有することができる。
【００３３】
本明細書で使用する「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、及びインデニルなどの単環式又は多環式（例えば、２、３又は４個の縮合環を有する）芳香族炭化水素を指す。いくつかの実施形態において、アリール基は、６〜約２０個の炭素原子を有する。
【００３４】
本明細書で使用する「アリーレン」は、結合アリール基を指す。
【００３５】
本明細書で使用する「シクロアルキル」は、環化アルキル、アルケニル、及びアルキニル基を含む非芳香族炭素環を指す。シクロアルキル基は、スピロ環を含む単環式又は多環式（例えば、２，３又は４個の縮合環を有する）環系を含むことができる。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、３〜約２０個の炭素原子、３〜約１４個の炭素原子、３〜約１０個の炭素原子、又は３〜７個の炭素原子を有することができる。シクロアルキル基は、さらに、０、１、２、若しくは３個の二重結合及び／又は０、１、若しくは２個の三重結合を有することができる。また、シクロアルキル環に融合された（すなわち、シクロアルキル環と共通の結合を有する）１以上の芳香族環を有する部分、例えば、ペンタン、ペンテン、及びヘキサンなどのベンゾ誘導体は、シクロアルキルの定義に含まれる。１以上の縮合芳香族環を有するシクロアルキル基は、芳香族又は非芳香族部分のいずれかを介して結合することができる。例えば、オキソ又はスルフィド置換基を有するシクロアルキル基の１以上の環形成炭素原子は酸化され得る。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタトリエニル、ノルボルニル、ノルピニル、ノルカミル、及びアダマンチルなどが挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用する「ヘテロアルキル」は、硫黄、酸素、又は窒素などの少なくとも１個のヘテロ原子を有するアルキル基を指す。
【００３７】
本明細書で使用する「ヘテロアルキレン」は、結合ヘテロアルキル基を指す。
【００３８】
本明細書で使用する「ヘテロアリール」は、硫黄、酸素、又は窒素などの少なくとも１個のヘテロ原子環員を有する芳香族複素環を指す。ヘテロアリール基には、単環式及び多環式（例えば、２、３又は４個の縮合環を有する）系が含まれる。ヘテロアリール基中の任意の環形成Ｎ原子はまた、酸化されて、Ｎ−オキソ部分を形成することができる。ヘテロアリール基の例としては、限定されないが、ピリジル、Ｎ−オキソピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、フリル、キノリル、イソキノリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル、インドリル、ピリル、オキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インダゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、プリニル、カルバゾリル、ベンゾイミダゾリル、及びインドリニルなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、１〜約２０個の炭素原子、及びさらなる実施形態において、約３〜約２０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、３〜約１４、３〜約７、又は５〜６個の環形成原子を含有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、１〜約４、１〜約３、又は１〜２個のヘテロ原子を有する。
【００３９】
本明細書で使用する「アルキル」に続く官能基は、官能基を置換化合物に連結するアルキル基を指す。例えば、「アルキルアリール」は、アリール基を置換化合物に連結するアルキル基を含む置換基を指す。例示的な「アルキルアリール」基は、ベンジル又はフェネチルを含む。
【００４０】
特定の実施形態において、親水性ポリイオン性ブロックは、ほぼ中性ｐＨで陽イオン性である繰り返し単位を含む。特定のさらなる実施形態において、このような陰イオン性繰り返し単位は、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−ジメチルアミノエチルアクリレート、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]メタクリルアミド、２−アミノエチルメタクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、[２−ヒドロキシ−３−（２−アミノエチル）アミノ]プロピルメタクリレート、［３メタクリロイルアミノ）プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、及びＬ−リジンからなる群から選択される。
【００４１】
特定の実施形態において、親水性ポリイオン性ブロックは、ほぼ中性ｐＨで陰イオン性である繰り返し単位を含む。特定のさらなる実施形態において、このような陰イオン性繰り返し単位は、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチル無水マレイン酸修飾Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、及び２−アミノエチルメタクリレートからなる群から選択される。
【００４２】
特定の実施形態において、親水性ポリイオン性ブロックは、中性親水性繰り返し単位を含む。特定のさらなる実施形態において、中性親水性繰り返し単位は双性イオン性である。特定のさらなる実施形態において、中性親水性繰り返し単位は、オリゴ（エチレングリコール）、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−グルカノアミドプロピルメタクリルアミド、２−ラクトビオンアミドエチルメタクリルアミド、ベタイン、ホスホコリン、スルホベタイン、及びカルボキシベタインを含む繰り返し単位から選択される。
【００４３】
本発明のブロック共重合体は、ほぼ中性ｐＨで疎水性である繰り返し単位を含むｐＨ応答性ブロックを含む。特定の実施形態において、該ｐＨ応答性ブロックは、約７.０超のｐＨで疎水性である。他の実施形態において、該ｐＨ応答性ブロックは、４〜７.２の範囲を上回るｐＨで疎水性になる。特定の実施形態において、該ｐＨ応答性ブロックは、２−ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート、２−（ペンタメチレンイミノ）エチルメタクリレート、２−（ヘキサメチレンイミノ）エチルメタクリレートからなる群から選択される繰り返し単位を含む。
【００４４】
ブロック共重合体は、ｐＨ応答性ブロックに共有結合された膜溶解性実体を含んでよい。特定の実施形態において、該膜溶解性実体は、リンカーを介してｐＨ応答性ブロックに共有結合している。特定の実施形態において、該リンカーは、炭素−炭素結合、オリゴヌクレオチド、エステル含有断片、アミド含有断片、ジスルフィド含有断片から選択される。
【００４５】
該膜溶解性実体は、臨界濃度で存在する細胞膜を溶解することが可能である。特定の実施形態において、該膜溶解性実体は、メリチン、アデノウイルスタンパク質ＶＩ、ＧＡＬＡ、ＫＡＬＡ、ＥＧＬＡ、ＪＴＳ１由来のペプチド、グラミシジンＳ、ＨＧＰペプチド（配列ＬＬＧＲＲＧＷＥＶＬＫＹＷＷＮＬＬＱＹＷＳＱＥＬ）、ｓＨＧＰペプチド（配列ＲＧＷＥＶＬＫＹＷＷＮＬＬＱＹ）、ＴＡＴペプチド（配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）、オリゴアルギニン、及びヘマグルチニンからなる群から選択される。
【００４６】
特定の実施形態において、本発明のブロック共重合体は、式（ＩＩ）：
【化２】
2019528258.tif 000003
（式中、
各Ａ１は、親水性単量体由来の単位であり；
各Ａ２は、独立して中性であるか、又はｐＨ１０以下で荷電している単量体由来の単位であり；
各Ａ３は、治療用ペプチド、核酸、又は核酸誘導体を含む単量体由来の単位であり；
各Ａ４は、約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＫａを有する単量体由来の単位であり；
各Ａ５は、治療用ペプチド、核酸、又は核酸誘導体を含む単量体由来の単位であり；
Ａ６は、膜溶解性実体を含む単量体由来の単位であり；
Ｔ１は、独立して、存在しないか、又は標的基であり；
Ｔ２は、独立して、存在しないか、膜溶解性実体、治療用ペプチド、核酸又は核酸誘導体であり；
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である）
による構造を有する。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明のブロック共重合体は、式（ＩＩａ）：
【化３】
2019528258.tif 000004
（式中、
各Ａ１は、親水性単量体由来の単位であり；
各Ａ２は、中性であるか、又はｐＨ１０以下で荷電している単量体由来の単位であり；
各Ａ４は、約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲のｐＫａを有する単量体由来の単位であり；
各Ａ３’、Ａ５’及びＡ６’は、独立して、
【化４】
2019528258.tif 000005
（式中、
各Ｘは、独立して、アルキレン、アリーレン、ジスルフィド、アルキレンオキシド又はプロパン−２，２−ジオールを含む繰り返し単位を含み；
各Ｘは、任意選択で、−ＣＯ２Ｒ１、Ｌ１−Ｄ１、Ｌ２−Ｄ２、又はＬ３−ＬＰで置換されており、式中、Ｒ１は親水基であり；
各Ｒは、独立して、水素、−ＣＯ２Ｒ２、−ＣＮ、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、式中、Ｒ２は、親水基、Ｌ１−Ｄ１、Ｌ２−Ｄ２又は、Ｌ３−ＬＰであり；
ａは１〜４であり；かつ
ｂは２〜４である）であり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々は、独立して、存在しないか、又はリンカーであり；
各ＬＰは、膜溶解性実体であり；
Ｄ１及びＤ２の各々は、独立して、治療用ペプチド、核酸、又は核酸誘導体であり；
Ｔ１は、独立して、存在しないか、又は標的基であり；
Ｔ２は、独立して、存在しないか、膜溶解性実体、治療用ペプチド、核酸又は核酸誘導体であり；
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である）
による構造を有する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、各Ａ１'、Ａ２'、Ａ３'、Ａ４'、Ａ５'及びＡ６’は、独立して、
【化５】
2019528258.tif 000006
である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、各Ｘは、独立して、アルキレン、アリーレン又はアルキレンオキシドを含む繰り返し単位を含む。いくつかの実施形態において、アルキレンオキシドは、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）又はポリ（ブチレンオキシド）であり得る。他の実施形態において、ジスルフィド、アルキレンオキシド又はプロパン−２，２−ジオール。ジスルフィドは、構造
【化６】
2019528258.tif 000007
を含んでよく、プロパン−２，２−ジオールは、構造
【化７】
2019528258.tif 000008
を含んでよい。
【００５０】
Ｘ中の繰り返し単位の数は、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、５〜３０、１０〜３０又は１５〜３０の範囲であり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の親水基は、１以上のアルケンオキシド単位を含む。例えば、親水基は、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）又はポリ（ブチレンオキシド）などのポリ（アルケンオキシド）を含んでよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の親水基は、−アルキル−ＮＲ’などのアミノ基を含んでよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ａは２〜４又は１、２、３又は４である。いくつかの実施形態において、ｂは２、３又は４である。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明のブロック共重合体は、式（ＩＩ）による構造を有し、式中、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々は、独立して、それぞれ、重合体主鎖にＤ１、Ｄ２又はＬＰを連結する共有結合を含む。いくつかの実施形態において、Ｌは、ジスルフィド結合、ヒドラジン結合、ボロン酸エステル又はペプチドなどの可逆的結合である。いくつかの実施形態において、Ｌ１、Ｌ２又はＬ３は、ジスルフィド架橋である。いくつかの実施形態において、Ｌ１、Ｌ２又はＬ３はペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｌ１、Ｌ２又はＬ３は、例えば、クリックケミストリー又はチオール−エンコンジュゲーションによって形成される不可逆的結合である。一部では、それは、ジスルフィド架橋、又はヒドラゾン結合、又はボロン酸エステルのように可逆的であり得る。他の実施形態において、Ｌ１、Ｌ２又はＬ３は存在しない。
【００５４】
特定の実施形態において、親水性ポリイオン性ブロック（すなわち、Ａ１、Ａ２及びＡ３を含むブロック）は、ほぼ中性ｐＨで陽イオン性である繰り返し単位を含む。特定のさらなる実施形態において、このような陰イオン性繰り返し単位は、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−ジメチルアミノエチルアクリレート、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]メタクリルアミド、２−アミノエチルメタクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、[２−ヒドロキシ−３−（２−アミノエチル）アミノ]プロピルメタクリレート、[３メタクリロイルアミノ）プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、及びＬ−リジンからなる群から選択される。
【００５５】
特定の実施形態において、親水性ポリイオン性ブロックは、ほぼ中性ｐＨで陰イオン性である繰り返し単位を含む。特定のさらなる実施形態において、このような陰イオン性繰り返し単位は、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチル無水マレイン酸修飾Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、及び２−アミノエチルメタクリレートからなる群から選択される。
【００５６】
特定の実施形態において、親水性ポリイオン性ブロックは、中性親水性繰り返し単位を含む。特定のさらなる実施形態において、中性親水性繰り返し単位は、双性イオン性であり、ベタイン、ホスホコリン、スルホベタイン、及びカルボキシベタインを含む繰り返し単位から選択される。特定のさらなる実施形態において、中性親水性繰り返し単位は、オリゴ（エチレングリコール）、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−グルカノアミドプロピルメタクリルアミド、及び２−ラクトビオンアミドエチルメタクリルアミドを含む繰り返し単位から選択される。
【００５７】
ブロック共重合体の各Ａ２は、中性であるか、又はｐＨ１０以下で荷電している単量体由来の単位である。例えば、単量体由来の単位が由来する単量体は、中性であるか、又はｐＨ１０以下で荷電している。いくつかの実施形態において、各Ａ２は、中性であるか、又はｐＨ９.８以下、又は９.６以下、又は９.４以下、又は９.２以下、又は９.０以下、又は８.８以下、又は８.６以下、又は８.４以下、又は８.２以下、又は８.０以下、又は７.８以下、又は７.６以下、又は７.４以下、又は７.２以下、又は７.０で荷電している単量体由来の単位である。
【００５８】
本発明のブロック共重合体は、ｐＨ応答性ブロック（すなわち、Ａ４、Ａ５及びＡ６を含むブロック）を含む。該ｐＨ応答性ブロックは、ほぼ中性ｐＨで疎水性である繰り返し単位を含む（例えば、Ａ４）。例えば、繰り返し単位が由来する単量体は、ほぼ中性ｐＨで疎水性である。特定の実施形態において、該ｐＨ応答性ブロックは、４.０〜７.０の範囲を上回るｐＨで疎水性になり得る。いくつかの実施形態において、該ｐＨ応答性ブロックは、５.０〜約７.０の範囲を上回るｐＨで、又は約６.０〜約７.０の範囲を上回るｐＨで、又は約５.０〜約６.５の範囲を上回るｐＨで、又は５.５〜約７.０の範囲を上回るｐＨで、又は約５.５〜約６.５の範囲を上回るｐＨで、又は約４.２〜約６.８の範囲を上回るｐＨで、又は約４.８〜約６.０の範囲を上回るｐＨで、又は約４．８〜約６.８の範囲を上回るｐＨで、又は約５.８〜約６.６の範囲を上回るｐＨで、又は約４.８〜約６.４の範囲を上回るｐＨで疎水性になり得る。
【００５９】
他の実施形態において、各Ａ４は、約ｐＨ４.２〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ４.４〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ４.６〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ４.８〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ５〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ５．２〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ５．４〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ５．６〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ５．８〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ６〜約ｐＨ７、又は約ｐＨ４〜約ｐＨ６．８、又は約ｐＨ４〜約ｐＨ６．６、又は約ｐＨ４〜約ｐＨ６．６、又は約ｐＨ４〜約ｐＨ６．４、又は約ｐＨ４〜約ｐＨ６．２、又は約ｐＨ４〜約ｐＨ６の範囲のｐＫａを有する単量体由来の単位である。
【００６０】
例えば、該ｐＨ応答性ブロックは、２−ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート、２−（ペンタメチレンイミノ）エチルメタクリレート、２−（ヘキサメチレンイミノ）エチルメタクリレート、２−（ジプロピルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジブチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジペンチルアミノ）エチルメタクリレート及び２−（エチルプロピルアミノ）エチルメタクリレートからなる群から選択される繰り返し単位を含み得る。
【００６１】
いくつかの実施形態において、共重合体の親水性ポリイオン性ブロック及びｐＨ応答性ブロックは、互いに独立して、核酸又はペプチドなどの治療カーゴに共有結合され得る。特定の実施形態において、核酸又はペプチドなどの治療カーゴは、リンカーを介して親水性ポリイオン性ブロック又はｐＨ応答性ブロックに共有結合している。該リンカーは、炭素−炭素結合、オリゴヌクレオチド、ボロン酸とジオールからのボロン酸エステル結合、イミン結合、エステル含有断片、チオールエステル、アミド含有断片、ジスルフィド含有断片及びアジド及びアルキンの反応生成物（「クリックケミストリー」）などの１，２，３−トリアゾールから選択され得る。いくつかの実施形態において、アルキンカップリングパートナーは、親水性ポリイオン性ブロック又はｐＨ応答性ブロックの一部であり、アジドカップリングパートナーは、膜溶解性ペプチド、治療用ペプチド又は核酸の一部である。他の実施形態において、アジドカップリングパートナーは、親水性ポリイオン性ブロック又はｐＨ応答性ブロックの一部であり、アルキンカップリングパートナーは、膜溶解性ペプチド、治療用ペプチド又は核酸の一部である。
【００６２】
各リンカー（Ｌ１、Ｌ２又はＬ３）は、独立して、各単量体由来の単位で選択され得る。例えば、ｏが２である場合、共重合体は、それぞれＬ１及びＤ１を有する２つのＡ３基を含有する。２つのそれは、異なるか、又は同一であり得る。同様に、各Ａ３単量体由来の単位中のＤ１は異なるか、又は同一であり得る。Ｌ２及びＤ２、並びにＬ３及びＬＰについても同様である。
【００６３】
標的基は、小分子、アプタマー、ペプチド、タンパク質、抗体又は抗体断片であり得る。
【００６４】
いくつかの実施形態において、Ｔ１及びＴ２は両方とも存在しないが、他の実施形態において、Ｔ１又はＴ２の１つのみが存在しない。いくつかの実施形態において、Ｔ１は標的基又は治療カーゴであり、Ｔ２は膜溶解性実体又は治療カーゴである。
【００６５】
該膜溶解性実体は、臨界濃度以上で細胞膜を溶解することが可能な任意の実体であり得る。特定の実施形態において、該膜溶解性実体は、メリチン、アデノウイルスタンパク質ＶＩ、ＧＡＬＡ、ＫＡＬＡ、ＥＧＬＡ、ＪＴＳ１由来のペプチド、グラミシジンＳ、ＨＧＰペプチド（配列ＬＬＧＲＲＧＷＥＶＬＫＹＷＷＮＬＬＱＹＷＳＱＥＬ）、ｓＨＧＰペプチド（配列ＲＧＷＥＶＬＫＹＷＷＮＬＬＱＹ）、ＴＡＴペプチド（配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）、オリゴアルギニン、及びＣａＬＬ（ＫＷＫＬＦＫＫＩＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲ）、ハドルリン（ｈａｄｒｕｒｉｎ）（ＧＩＬＤＴＩＫＳＩＡＳＫＶＷＮＳＫＴＶＱＤＬＫＲＫＧＩＮＷＶＡＮＫＬＧＶＳＰＱＡＡ）、クピエニン１ａ（ＧＦＧＡＬＦＫＦＬＡＫＫＶＡＫＴＶＡＫＱＡＡＫＱＧＡＫＹＶＶＮＫＱＭＥ）、クラボリン（ｃｒａｂｏｌｉｎ）（Ｆｍｏｃ−ＦＬＡＬＩＬＲＫＩＶＴＡＬ−ＣＯＮＨ２）、ＩｓＣＴ（ＩＬＧＫＩＷＥＧＩＫＳＬＦ−ＮＨ２）、ＨｓＡＰ（ＳＧＴＳＥＫＥＲＥＳＧＲＬＬＧＶＶＫＲＬＩＶＣＦＲＳＰＦＰ−ＮＨ２）、パンジニン（Ｐａｎｄｉｎｉｎ）２（ＦＷＧＡＬＡＫＧＡＬＫＬＩＰＳＬＦＳＳＦＳＫＫＤ）、ポネリシン（Ｐｏｎｅｒｉｃｉｎ）（ＷＬＧＳＡＬＫＩＧＡＫＬＬＰＳＶＶＧＬＦＫＫＫＫＱ）、ＵｙＣＴ５（ＩＷＳＡＩＷＳＧＩＫＧＬＬ−ＮＨ２）及びヘマグルチニンからなる群から選択される。
【００６６】
治療用ペプチドは、生物学的効果を発揮することが可能なペプチドであり得る。例としては、免疫刺激、アポトーシス又は血管収縮の阻害のためのペプチド（例えば、ＫＬＡペプチド、ＢＨ３ペプチド、ＨＳＰ−２０ペプチドなど）が挙げられる。
【００６７】
核酸は、遺伝子（例えば、プラスミド、ミニサークル、又はナノプラスミド）、ｍＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を運ぶことができる。
【００６８】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＩＩａ）：
【化８】
2019528258.tif 000009
（式中、ｍ’は、約１〜約２０である）
の構造を有する。
【００６９】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＩＩｂ）：
【化９】
2019528258.tif 000010
（式中、ｍ’は、約１〜約２０である）
の構造を有する。
【００７０】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＩＩｃ）：
【化１０】
2019528258.tif 000011
（式中、ｍ’は、約１〜約２０である）
の構造を有する。
【００７１】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＩＩｄ）：
【化１１】
2019528258.tif 000012
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する。
【００７２】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＩＩｅ）：
【化１２】
2019528258.tif 000013
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する。
【００７３】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＩＩｆ）：
【化１３】
2019528258.tif 000014
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する。
【００７４】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＩＩｇ）：
【化１４】
2019528258.tif 000015
（式中、ｍ’は、約１〜約２０である）
の構造を有する。
【００７５】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＶａ）：
【化１５】
2019528258.tif 000016
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する。
【００７６】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＶｂ）：
【化１６】
2019528258.tif 000017
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する。
【００７７】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＶｃ）：
【化１７】
2019528258.tif 000018
（式中、ｍ’は、約１〜約２０であり；各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである）
の構造を有する。
【００７８】
一実施形態において、式（ＩＩ）のブロック共重合体は、式（ＩＶｄ）：
【化１８】
2019528258.tif 000019
（式中、ｍ’は、約１〜約２０である）
の構造を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、ｍ’は、約１〜約２０である。いくつかの実施形態において、約１〜約１５、又は約５〜約２０、又は約５〜１５、又は約１０〜約２０、又は約１２〜約２０、又は約１〜約１８、又は約５〜約１８である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又はアリールである。他の実施形態において、各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、アルキルシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルキル又はアルキルアリールである。他の実施形態において、各Ｒ’は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルシクロアルキル又はアルキルアリールである。他の実施形態において、各Ｒ’は、独立して、水素又はアルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ’は、独立して、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル又はヘキシルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ’は、独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル又はヘキシルである。
【００８１】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約１〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約１〜約１０,０００である。
【００８４】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約１〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約１〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約１〜約１０,０００である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約１〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約１〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約１〜約１０,０００である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約１〜約１０,０００であり；
ｏは、約１〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約１〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約１〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約１〜約１０,０００である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約１〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約１〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約１〜約１０,０００である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約１〜約１０,０００であり；
ｏは、約１〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約１〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約０〜約１０,０００である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約１〜約１０,０００であり；
ｏは、約１〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約１〜約１０,０００である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約１〜約１０,０００であり；
ｏは、約０〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約１〜約１０,０００である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、該ブロック共重合体は、式（ＩＩ）のものであり、式中、
ｍは、約１〜約１０,０００であり；
ｎは、約０〜約１０,０００であり；
ｏは、約１〜約１０,０００であり；
ｐは、約１〜約１０,０００であり；
ｑは、約０〜約１０,０００であり；かつ
ｒは、約１〜約１０,０００である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ｒが０である場合、Ｔ２は、膜溶解性ペプチド、治療用ペプチド、核酸又は核酸誘導体である（すなわち、不在ではない）。別の実施形態において、ｒが０である場合、膜溶解性ペプチド、治療用ペプチド、核酸又は核酸誘導体は、ｐＨ応答性ブロック（すなわち、Ａ４、Ａ５又はＡ６）に組み込まれ得る。
【００９７】
第２の態様において、本発明は、本明細書にさらに記載される共重合体のいずれかによる共重合体を提供する方法を提供する。本方法は、共重合体の単量体由来の単位に対応する単量体を組み合わせること、及び重合を開始することを含む。単量体を重合して、本発明の共重合体を提供するための重合条件は、当技術分野で公知のいずれかから選択することができる。いくつかの実施形態において、重合は、ＲＡＦＴ条件下で行われる。
【００９８】
第３の態様において、本発明は、本明細書に記載の共重合体のいずれかによる複数の共重合体を含むミセル集合体を提供する。特定の実施形態において、該ミセル集合体は、約５ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有する。特定の実施形態において、該ミセル集合体は、約６.５未満のｐＨで分解する。
【００９９】
第４の実施形態において、本発明は、本発明の任意の態様によるブロック共重合体と本発明の態様によるミセル集合体のうちの少なくとも１つ；並びに親水性ポリイオン性ブロックに可逆的に関連付けられている治療剤、を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、該治療剤は核酸分子である。特定の実施形態において、該治療剤は、タンパク質又はペプチドである。
【０１００】
第５の態様において、本発明は、治療剤を細胞内に送達する方法であって、エンドソームにエンドサイトーシスされる、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与し、それによって、該医薬組成物が治療剤をエンドソームに放出することを含む、方法を提供する。該治療剤は、疾患又は病態の治療に治療効果をもたらすことができる物質であり得る。いくつかの実施形態において、該治療剤は核酸である。いくつかの実施形態において、該投与は、静脈内投与、気管内投与、脳内投与又は腫瘍内投与、皮下投与である。
【０１０１】
実施例
中性ｐＨで隠されている膜溶解性ペプチドを含有する自己集合合成重合体を設計した。この重合体は、初期のエンドソームなどの酸性環境下で構造変化を起こし、選択的エンドソーム膜破壊用のペプチドを外に出す。用いられるペプチドは、脂質膜に挿入して、細孔形成を誘導することができるメリチンである。Ｍ．Ｔ．Ｔｏｓｔｅｓｏｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，３６，１０９−１１６。メリチンは、様々な陽イオン重合体にコンジュゲートし、ベクターのエンドソーム放出を促進することによって、遺伝子導入能力を増強することが示されている。Ｍ．Ｏｇｒｉｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，２７６，４７５５０−４７５５５。
【０１０２】
メリチン含有重合体であるＶＩＰＥＲは、酸性ｐＨで選択的膜溶解能力を有することが実証されている。ＶＩＰＥＲは、商業剤よりも高い効率で様々な哺乳動物細胞への送達用のプラスミドＤＮＡを効果的にパッケージ化する。最後に、ＶＩＰＥＲは、腫瘍への効率的なインビボ遺伝子導入に使用され、多くのポリカチオン遺伝子送達系について観察されるインビトロ／インビボ切断を克服することができることが示されている。
【０１０３】
可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合（Ｄ．Ｓ．Ｈ．Ｃｈｕら、Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２０１２，４５，１０８９−１０９９を参照）を用いて、核酸ローディング用の親水性陽イオンブロック及び誘発される膜溶解性ペプチドの提示用のｐＨ感受性ブロックで構成されるＶＩＰＥＲを合成した（図１Ａ）。親水性陽イオンブロックのポリ（オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート）−コ−ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）（ｐ（ＯＥＧＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ））は、核酸送達用のポリカチオンに広く使用されているＤＭＡＥＭＡ、及びコロイド安定性を提供するための親水性単量体であるＯＥＧＭＡを含む。Ｐ．ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９８，５３，１４５−１５３；ｂ）Ｈ．Ｗｅｉら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄｉｔ ２０１３，５２，５３７７−５３８１。ｐＨ感受性ブロックのポリ（２−ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート）−コ−ポリ（ピリジルジスルフィドエチルメタクリレート）（ｐ（ＤＩＰＡＭＡ−ＰＤＳＥＭＡ））は、ｐＨ６．３で疎水性から親水性への急な相転移を特徴とするｐＨ感受性重合体であるｐ（ＤＩＰＡＭＡ）（Ｙ．Ｇ．Ｗａｎｇら、Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ ２０１４，１３，２０４−２１２）及びジスルフィド交換反応を介するチオール含有ペプチドでのさらなる官能化を可能にするためのＰＤＳＥＭＡ単量体を含む。ｐ（ＯＥＧＭＡ１１−ＤＭＡＥＭＡ５６）−ｂ−ｐ（ＤＩＰＡＭＡ３３−ＰＤＳＥＭＡ１）（さらなる研究用に使用される対照重合体、ＣＰとして示される）とＶＩＰＥＲ（メリチンが結び付けられたＣＰ）の共重合体の合成の成功は、１Ｈ ＮＭＲ（図４）、ＧＰＣ及びＵＶ分光法（図５）によって特徴付けられる。
【０１０４】
スキーム１
【化１９】
2019528258.tif 000020
【０１０５】
したがって、ＶＩＰＥＲを、疎水性コア内に埋め込まれたメリチンと生理的ｐＨでミセル構造に自己集合するように設計した。エンドサイトーシス後、酸性エンドソーム環境は、ｐＤＩＰＡＭＡブロックの親水性転移を誘発し、メリチンペプチドを外に出し、次いで、エンド／リソソーム膜の破壊によってエンドソーム放出を促進することができる（図１Ｂ）。
【０１０６】
この仮定される機構を検証するために、ｐＨ７．４及びｐＨ５．７でのＶＩＰＥＲの集合挙動を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージング及び動的光散乱（ＤＬＳ）分析の両方により監視した。ＶＩＰＥＲはｐＨ７．４で集合して、約３０ｎｍの直径を有する均一な球状ナノ粒子を構成する（ＴＥＭ及びＤＬＳについてはそれぞれ図２Ａ及びＣ）。しかし、ｐＨ５．７では、いずれの方法によっても全く集合は観察されなかったことから、エンドソームｐＨでのナノ粒子の完全な解離が示唆された（図２Ｂ及びＣ）。このデータは、ＶＩＰＥＲのｐＨ誘発性相転移を検証する。
【０１０７】
次に、溶血試験を、メリチンの酸誘発性提示を評価するために行った。ｐＨ７．４で、ヒト赤血球とのインキュベーション後、２４０μｇ／ｍＬほどの高いＶＩＰＥＲ濃度でさえ、有意な細胞溶解は観察されず、ナノ粒子の疎水性ドメイン内へのメリチンのカプセル化及びマスキングが確認された（図２Ｄ）。ｐＨ５．７では、細胞溶解は、濃度依存性プロファイルで観察された。５０％溶解は３０μｇ／ｍＬのＶＩＰＥＲのみで達成され、完全な溶解が１２０μｇ／ｍＬのＶＩＰＥＲで生じた。一方、ＣＰについては、全ての試験条件において有意な膜溶解は観察されず、膜溶解が重合体主鎖よりもむしろメリチンによって引き起こされることが示された。
【０１０８】
次いで、重合体はプラスミドＤＮＡと複合体を形成し、遺伝子送達用のポリプレックスを形成した。ＶＩＰＥＲ及びＣＰは、プラスミドＤＮＡを効率的にパッケージ化し、２のＮ／Ｐ（リン酸に対するアミン）比で完全に凝縮した。ＶＩＰＥＲ及びＣＰポリプレックスのＴＥＭ画像（Ｎ／Ｐ＝５）は、比較的均一な球状形状及び１００ｎｍ未満の直径を有するコンパクトな構造を明らかにした（図６Ｂ及びＣ）。ＤＬＳサイズ測定値はＴＥＭ画像と一致し、かつ粒径は、ＶＩＰＥＲ錯体とＣＰ錯体間で類似しており、Ｎ／Ｐ比の増加に伴って減少することが示された（図６Ｄ、７）。Ｎ／Ｐ≧３で製剤化された場合、ＶＩＰＥＲ錯体とＣＰ錯体の両方の表面電荷は陽性であった。最後に、ＣＰ／ＤＮＡ及びＶＩＰＥＲ／ＤＮＡポリプレックスを用いた溶血試験により、ポリプレックス製剤内でｐＨ感受性膜溶解が保持されることが確認された（図７）。細胞溶解は、ｐＨ５．７、最低でもｐＨ７．４でＶＩＰＥＲ／ＤＮＡポリプレックスを用いた場合に観察されるが、ＣＰ／ＤＮＡポリプレックスは、いずれのｐＨでも活性のある膜ではなかった。
【０１０９】
ＶＩＰＥＲにおける溶解ペプチドメリチンは、ポリプレックスのエンド／リソソーム脱出を誘導することが期待されている。ポリプレックス中のＹＯＹＯ−１蛍光が酸性と中性の両方のｐＨで検出できることが確認された後に、エンドソーム放出を評価するために、ＹＯＹＯ−１標識したＶＩＰＥＲとＣＰポリプレックスの両方のＨｅＬａ細胞への送達を、三重蛍光共焦点顕微鏡により追跡した（図８）。４時間のインキュベーション後、ＶＩＰＥＲポリプレックスからの緑色蛍光（ＹＯＹＯ−１ ＤＮＡ）のほとんどは、赤色蛍光（リソトラッカーレッド（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ）から分離され、ＶＩＰＥＲ／ＤＮＡポリプレックスの効率的なエンド／リソソーム脱出が示された。逆に、緑色と赤色の蛍光のほぼ完全な共局在（黄色）が、ＣＰポリプレックスで処理した細胞で観察された。リソソームとのＶＩＰＥＲポリプレックスの共局在率は、ＣＰポリプレックス（７２．２％）と比較して、わずか９．４％であった。発明者らの以前の研究により、ｂＰＥＩポリプレックスが、エンドソームトラップを示すＣＰポリプレックスと同様の細胞内分布プロファイルを示すことが示された。Ｅ．Ｊ．Ｋｗｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｎ，Ｓ．Ｈ．Ｐｕｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８，１９，９２０−９２７。フローサイトメトリーによって決定されるように、ＣＰ／ＤＮＡ複合体とＶＩＰＥＲ／ＤＮＡ複合体間の細胞内取り込み効率において有意差は観察されなかったことは言及する価値がある（図８）。したがって、ＶＩＰＥＲポリプレックスは、ＣＰと比較して、哺乳動物細胞内への核酸カーゴの著しく改善されたエンドソーム放出を提供する。
【０１１０】
次に、ＣＰとＶＩＰＥＲポリプレックスのインビトロ遺伝子送達効率を、レポータールシフェラーゼプラスミドを用いて、不死化哺乳動物細胞株（ＨｅＬａ及びＫＢ子宮頚癌、Ａ５４９肺癌及びＺ３１０脈絡叢上皮細胞）のパネルにおいて試験した。ポリカチオン標準物質の分岐ＰＥＩ（ｂＰＥＩ、２５ｋＤａ）及び市販のトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００（ＬＦ）を、比較のために使用した。ＶＩＰＥＲトランスフェクションにより得られるルシフェラーゼ活性は、試験した全ての細胞株において、ＣＰ及びｂＰＥＩにより得られたルシフェラーゼ活性より高い大きさの桁であった（図９）。ＶＩＰＥＲはまた、ＨｅＬａ、ＫＢ及びＺ３１０細胞において、最適化したＬＦ製剤と比較して改善されたトランスフェクション効率を媒介する。ＶＩＰＥＲポリプレックスは忍容性が良好で、細胞生存率は、試験した全てのＮ／Ｐ比で全ての細胞型において９０％超を維持した（図９）。次いで、トランスフェクトされた細胞の割合を決定するために、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）を担持するレポータープラスミドを用いて、トランスフェクション実験を繰り返した。ルシフェラーゼ実験と同じトランスフェクションの傾向が、全ての細胞株について観察された。ＶＩＰＥＲは、ＣＰと比較して１３〜６０倍多くの細胞を、ｂＰＥＩと比較して１１〜４６倍多くの細胞をトランスフェクトし、効率は３６〜７７％ＧＦＰ＋細胞の範囲であった。
【０１１１】
遺伝子治療は、様々な悪性腫瘍を治療するための強力な方法として認識されており、いくつかのポリカチオン系遺伝子ベクターは、異なる臨床段階に入っている。Ｈ．Ｙｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｋａｎａｓｔｙ，Ａ．Ａ．Ｅｌｔｏｕｋｈｙ，Ａ．Ｊ．Ｖｅｇａｓ，Ｊ．Ｒ．Ｄｏｒｋｉｎ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２０１４，１５，５４１−５５５。癌を治療するための遺伝子ベクターとしてＶＩＰＥＲの可能性を調べるために、ＫＢとＡ５４９の両方の異種移植片腫瘍モデルにおいて、固形腫瘍へのポリプレックス含有ルシフェラーゼプラスミドの直接送達によるインビボ遺伝子導入を評価した。膜溶解性ペプチド（ＶＩＰＥＲ）及びエンドソーム脱出のプロトンスポンジ（ｂＰＥＩ）機構を有するＶＩＰＥＲ及びｂＰＥＩポリプレックスは、ＣＰとは対照的にＫＢ腫瘍に効率的にプラスミドを送達し、腫瘍部位での集中的な生物発光によって確認された（図３Ａ）。ＶＩＰＥＲポリプレックスで処置した腫瘍は、それぞれｂＰＥＩ及びＣＰポリプレックス処置グループより３．１倍及び８２．５倍高い最高のルシフェラーゼ活性を示した（図３Ｂ）。ＶＩＰＥＲポリプレックスはまた、Ａ５４９異種移植片腫瘍への腫瘍内遺伝子移入においてｂＰＥＩポリプレックスとＣＰポリプレックスの両方をそれぞれ１５．１倍及び５９．７倍上回った（図３Ｃ及びＤ）。これらの結果は、ＶＩＰＥＲが、インビトロ及びインビボ遺伝子導入の両方を分裂細胞に効率的に媒介することができることを確認する。
【０１１２】
エンド／リソソームビヒクル内への捕捉は、細胞内標的を有するほとんどの高分子薬物の送達における主要な障壁である。遺伝子導入については、ＤＮアーゼＩＩなどのリソソームヌクレアーゼは、核酸を分解し、遺伝子導入効率を損なう。Ｄ．Ｐｉｎｔｏ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｈｏｗｅｌｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３，８，９５７−９６３。この問題に対処するために、プロトンスポンジ効果及び合成又はウイルス由来の膜活性ペプチドの使用などの多様なシステムが開発された。しかし、いくつかの以前の研究により、「プロトンスポンジ効果」のみでは、エンド／リソソーム脱出に十分ではないことが明らかになった。Ｙ．Ｙ．Ｗｏｎら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００９，１３９，８８−９３。ポリカチオン担体と溶解性ペプチドの直接結合はトランスフェクション効率を改善するが、有意な細胞毒性は、典型的には、ペプチドと関連している。例えば、発明者らの以前の研究により、メリチン又はｓＨＧＰペプチドのいずれかをポリカチオンに組み込むと、生理学的条件下での溶解性ペプチドの曝露に起因する細胞毒性及び原形質膜の不安定化がもたらされることが示された。Ｅ．Ｊ．Ｋｗｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０１０，７，１２６０−１２６５；Ｊ．Ｇ．Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１３，３４，２３１８−２３２６。
【０１１３】
トランスフェクション効率に対する細胞傷害性のジレンマに対処するために、Ｗｏｌｆｆ及びＷａｇｎｅｒグループは、マスクされたメリチン製剤を開発し、それによって、メリチンは、無水マレイン酸誘導体によって可逆的に遮断され、中性ｐＨでペプチドを不活性にさせ、無水キャッピング基の加水分解によって酸性エンドソームｐＨで活性化させる。Ｍ．Ｍｅｙｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００８，１３０，３２７２−３２７３；ｂ）Ｄ．Ｂ．Ｒｏｚｅｍａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，１４，５１−５７。ｓｉＲＮＡコレステロールと同時注射された場合は、マスクされたメリチン材料は効率的な送達を媒介した（Ｃ．Ｉ．Ｗｏｏｄｄｅｌｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３，２１，９７３−９８５）が、インビボ投与された場合には、メリチン及びｓｉＲＮＡにコンジュゲートしたポリカチオンは肝毒性を示した。Ｍ．Ｍｅｙｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２００９，６，７５２−７６２。有効であるが、無水物保護基は、生理学的ｐＨでさえ、低下した速度ではあるが加水分解を受けやすく、材料の安定性及び貯蔵寿命を低下させる。対照的に、ＶＩＰＥＲにおける膜溶解性ペプチドは、ブロック共重合体中のｐＨ作動スイッチによる露出まで、ミセルコア内の疎水性カプセル化によってマスクされる。したがって、ｐＨ感受性重合体は、「メリチンの剣」を遮蔽するように応答シースとして機能する。ＶＩＰＥＲは、ｐＨ７．４で最小の膜溶解活性を示し、中性条件下でメリチンの効率的な不活性化を示すが、酸性環境において膜溶解性となる（図２Ｄ）。したがって、ＶＩＰＥＲポリプレックスはまた、内在化の４時間以内にエンド／リソソーム区画を効率的に脱出することができた（図３）。
【０１１４】
ＶＩＰＥＲはまた、他の顕著な進歩を有する。まず、ＯＥＧＭＡのコモノマーは、ポリプレックスの安定性を向上させ、インビボ投与後に毒性を最小限にするのに必要な生理的条件で塩誘発性凝集を防止する（図６）。第２に、ｐＤＩＰＡＭＡブロックは、メリチン非活性化のための遮蔽部として機能するだけでなく、ポリプレックスの安定性を向上させるための効率的な方法として機能する。ポリカチオンの疎水性修飾は、親ポリカチオンと比較して血液循環時間及びトランスフェクション効率を向上させる一方で、細胞毒性を減少させ、遺伝子担体の全体的な生分解性を促進することが実証されている。Ｍ．Ｔｈｏｍａｓら、Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２，９９，１４６４０−１４６４５。ＶＩＰＥＲ／ＤＮＡポリプレックスは、蒸留水と比較して、血清低減培地中で明らかなサイズ変化を示さず、２０時間、その寸法を維持した（図６）。さらに、腫瘍内送達の研究により、ＶＩＰＥＲポリプレックスが、ｂＰＥＩポリプレックスと比較して、腫瘍部位に非常に高い遺伝子発現を媒介することが実証された（図３）。したがって、インビボ遺伝子送達についてのＶＩＰＥＲの可能性は、癌治療に有用なプラットフォームを提供し得る。
【０１１５】
要約すると、ＶＩＰＥＲと呼ばれるエンドソーム放出を促進するウイルス模倣ブロック共重合体が開示される。この重合体は、インビトロ及びインビボ遺伝子導入の両方を効率的に媒介する。溶解ペプチドメリチンの酸誘発提示は、細胞外条件下でメリチン活性をマスクしながら、ＶＩＰＥＲポリプレックスのエンド／リソソーム脱出を効果的に媒介する。ＶＩＰＥＲは、したがって、低い細胞毒性及び強力なエンドソーム脱出特性を示し、高分子治療用の送達ビヒクルとして強い可能性を有する。
【０１１６】
実験の節
材料
２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及びオリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ、Ｍｎ＝３００及びペンダントＥＯ単位ＤＰ４〜５）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、重合前に阻害剤を除去するために、塩基性アルミナ充填カラムに通過させることによって単量体を精製した。ＲＡＦＴ ＣＴＡ ４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート（ＣＰＡＤＢ）、Ｎ，Ｎ’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ、ＨＰＬＣ、９９．９％）及びジオキサンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、さらに精製せずに使用した。ピリジルジスルフィドエチルメタクリレートは、前述のように合成した。Ｍｅｙｅｒ，Ｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２００９。２−ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート（ＤＩＰＡＭＡ）を、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ社から購入し、塩基性アルミナに通過させることによって精製した。システインメリチン（Ｍｅｌ−ｃｙｓ；ＮＨ２−ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱＣＣＯＮＨ２）を、発明者らの以前の研究のように調製した。１６ｂエンドトキシンフリープラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーターの制御下のホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ）を製造業者の推奨に従って、キアゲンプラスミドギガキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて生成した。ＹＯＹＯ−１ヨウ化物及びリポフェクタミン２０００（ＬＦ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。
【０１１７】
細胞株
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２（商標））及びＫＢ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質／抗真菌薬（ＡｂＡｍ）（１００ＩＵのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）で維持した。Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質／抗真菌薬（ＡｂＡｍ）（１００ＩＵのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ）を補充したＦ−１２Ｋ培地で維持した。Ｚ３１０細胞を、Ｗｅｉ Ｚｈｅｎｇ教授（パーデュー大学）から寄贈してもらい、１０％熱不活化ＦＢＳ、１０％ペニシリン／ストレプトマイシン、４０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及び１０ｎｇ／ｍＬの神経成長因子（ＮＧＦ）を補充したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【０１１８】
特徴づけ
１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖ ３００（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）機器で記録した。重合体の分子量及び分子量分布（ＰＤＩ）を、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。分析のための材料を調製するために、精製した重合体を、ＳＥＣによる分析のために、ランニングバッファー（酢酸でｐＨ４．４に緩衝化した０．１５Ｍ酢酸ナトリウム）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。次いで、試料を、ｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ）及びＯｐｔｉＬａｂ ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ）と結ばれているＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱカラム（Ｓｈｏｄｅｘ）に入れた。絶対分子量平均（Ｍｗ及びＭｎ）を、ＡＳＴＲＡソフトウェア（Ｗｙａｔｔ）を用いて計算した。
【０１１９】
ｐ（ＯＥＧＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ）の合成
ＲＡＦＴ重合によるＯＥＧＭＡ及びＤＭＡＥＭＡの重合は、どこでも見つけることができる。Ｔｈｏｍａｓら、Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２。簡単に説明すると、ＯＥＧＭＡ（１．０ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）、ＭＡＥＭＡ（２．７ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）、ΑＩＢＮ（９．５ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）及びＣＰＡＤＢ（８０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を、５ｍＬのジオキサンに溶解した。１０分間、アルゴンでパージした後、反応混合物を、１８時間、６０℃の油浴中で攪拌した。反応フラスコを液体窒素に浸漬することにより、重合を停止した。解凍後、溶液をエーテルで沈殿させた。重合体を遠心分離により分離し、ＤＣＭ／エーテルで３回再沈殿／再溶解することによってさらに精製した。
【０１２０】
ｐ（ＯＥＧＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ）−ｂ−ｐ（ＤＩＰＡＭＡ−ＰＤＳＥＭＡ）の合成
ブロック共重合体ｐ（ＯＥＧＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ）−ｂ−ｐ（ＤＩＰＡＭＡ−ＰＤＳＥＭＡ）を、マクロＣＴＡ．ｐ（ＯＥＧＭＡ１１−ＤＭＡＥＭＡ５６）（８０ｍｇ，０．００６６ｍｍｏｌ）としてｐ（ＯＥＧＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ）を用いて調製し、ＤＩＰＡＭＡ（２８２ｍｇ，１．３２ｍｍｏｌ）、ＰＤＳＥＭＡ（１７ｍｇ，０．０６６ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（０．３６ｍｇ，０．００２２ｍｍｏｌ）を最初に１．３２ｍＬのＤＭＡｃに溶解した。５分間アルゴンでパージした後、反応溶液を６０℃の油浴に浸漬した。３０分後、重合を、液体窒素を用いて停止した。２日間、メタノールに対する透析によって重合体を精製した。
【０１２１】
ｐ（ＯＥＧＭＡ１１−ＤＭＡＥＭＡ５６）−ｂ−ｐ（ＤＩＰＡＭＡ３３−ＰＤＳＥＭＡ１）へのｃｙｓ−メリチンのコンジュゲーション
ｃｙｓ−メリチンを、発明者らの以前の研究として記載したジスルフィド交換反応を介してブロック共重合体にコンジュゲートさせた。Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２００９。ｐ（ＯＥＧＭＡ１１−ＤＭＡＥＭＡ５６）−ｂ−ｐ（ＤＩＰＡＭＡ３３−ＰＤＳＥＭＡ１）（２０ｍｇ，０．００１ｍｍｏｌのＰＤＳ基）を、１０ｍＬのフラスコ中の２ｍＬのＰＢ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ５．７）に溶解した。次いで、６．１ｍｇ（０．００２ｍｍｏｌ、ＰＤＳ基に対して２当量）のｃｙｓ−メリチンをフラスコに添加し、アルゴン下、室温で撹拌した。反応を、２−チオ-ピリジンの放出について３４０ｎｍでＵＶにより監視した。２０時間後、吸収が飽和し、反応混合物をＰＤ−１０カラムに通し、副生成物及び未反応ペプチドを除去し、その後、凍結乾燥した。共重合体の特徴付けを表１に提示する。
表１
【表１】
2019528258.tif 000021
【０１２２】
重合体の溶血
溶血アッセイを用いて、ｐＨ７．４（細胞外ｐＨ）及び５．７（エンドソームｐＨ）で合成材料の酸誘発性膜溶解活性を評価した。簡単に説明すると、ヒトの血液からの血漿を遠心分離により除去した。赤血球を、１５０ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄し、ｐＨ７．４又は５．７でリン酸緩衝液（ＰＢ）に再懸濁した。様々な濃度の重合体（７．５〜２４０μｇ／ｍＬ）及び対照としての１％トリトンＸ−１００を、９６ウェルコニカルプレート中のＲＢＣ懸濁液に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。遠心分離後、上清中の放出ヘモグロビンを、５４１ｎｍでＵＶによって測定した。溶血率をトリトンＸ−１００に対して計算した。実験を３回実施した。
【０１２３】
ＤＮＡポリプレックスの調製及び特徴付け
ＤＮＡ溶液に重合体を添加することにより重合体／ＤＮＡポリプレックスを形成し、その後、室温で３０分間インキュベートした。ゲル遅延研究（ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）については、様々なＮ／Ｐ比を有するポリプレックスを、ＴＡＥ緩衝液（４０μｍＭ  トリス−酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡ）及び５ｍｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルにロードし、４０分間、１００Ｖで電気泳動した。次いで、ｐＤＮＡを、Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＫ）ＵＶトランスイルミネーター（レーザ励起蛍光ゲルスキャナー）を用いて可視化した。
【０１２４】
ポリプレックスのサイズ及び表面電荷を、ＺｅｔａＰＬＵＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｅ，ＮＹ）上で試験した。試料を、８００μＬのｄｄ水とポリプレックス（１μｇのＤＮＡ、２０μＬの溶液、Ｎ／Ｐ＝５）を混合することによって調製した。測定を３回実施した。
【０１２５】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
乾燥状態で重合体とポリプレックスの形態を、１００ｋＶの加速電圧でＪＥＯＬ １１４０ ＴＥＭ上で画像化した。異なるｐＨ下で重合体の集合体形態を観察するために、重合体溶液（蒸留水中１ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ７．４及び５．７までＰＢで希釈した。次いで、得られた溶液（１０μＬ）を４００メッシュホルムバール／銅グリッドの上に堆積させ、室温で３０分間インキュベートした。酢酸ウラニルで染色した後、グリッドを、一晩空気乾燥させた。ポリプレックス試料の調製は、重合体試料と同じであった。
【０１２６】
インビトロ細胞研究
不死化／癌細胞におけるトランスフェクション
ＨｅＬａ、ＫＢ、Ｚ３１０及びＡ５４９細胞を、２４ウェルプレート中の完全細胞培地に２５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、最初に３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートした。ポリプレックスを、１０μＬの総容量中０．５μｇのｐＣＭＶ−Ｌｕｃ２ ｐＤＮＡを使用して、異なるＮ／Ｐ比で調製した。各試料を、完全細胞培地で２００μＬに希釈した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後、トランスフェクション溶液を添加した。４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ポリプレックス溶液を完全細胞培地と交換した。さらに２０時間のインキュベーション後、完全な細胞溶解を確実にするために、溶解緩衝液の添加後に−８０℃での凍結融解サイクルを含めたことを除いて製造業者の指示に従って、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ）を用いて定量化した。発光強度を、１秒間の積分を用いてプレートリーダー上で測定した。製造業者の指示に従って、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって、各ウェル中の総タンパク質含量を測定し、ルシフェラーゼ活性を各ウェル中の総タンパク質含有量に対して正規化した。各試料を、試料サイズ（ｎ）＝３で試験した。ｂＰＥＩのために使用したＮ／Ｐ比は、最適化したトランスフェクション効率を示すことが以前に決定された５である。ＬＦを、無血清培地中で、製造業者の指示に従って使用した。
【０１２７】
ＧＦＰトランスフェクション
異なる細胞株におけるＧＦＰ（緑色蛍光プラスミド）でのトランスフェクションは、ルシフェラーゼプラスミドを有するそれと同じであった。分析のために、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、４℃で５分間、３００×ｇでペレット化した。ペレットを０．３ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（ＰＢＳ中の０．５％のＢＳＡ中１μｇ／ｍＬ）に再懸濁し、氷上に保持し、フローサイトメトリーのＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて分析した。無傷の細胞を、前方及び側方散乱データを用いて同定した。得られた細胞集団を、対照試料（重合体を含まず、ＤＮＡのみでトランスフェクトした細胞）からの緑色蛍光及びＰＩ強度に基づいてＧＦＰ＋／ＰＩ＋、ＧＦＰ＋／ＰＩ−、ＧＦＰ−／ＰＩ＋及びＧＦＰ−／ＰＩ−にゲーティングし、標準偏差（ＳＤ）を含むＧＦＰ＋／ＰＩ−である細胞集団の平均パーセンテージとして報告した。全ての実験を３回実施した。
【０１２８】
共焦点顕微鏡によるポリプレックスのエンドソーム脱出
メリチン重合体ベースのポリプレックスのエンドソーム脱出能力を評価するために、ＤＮＡを、最初に、ＹＯＹＯ−１で標識した。細胞を４時間、ポリプレックスでインキュベートした。酸性小胞及び細胞の核を、それぞれリソトラッカーレッド（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ）、ＤＮＤ−９９及び４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。ポリプレックスのエンドソーム脱出率を定量化するために、ＤＮＡとリソトラッカーレッド間の共局在率を、イメージＪソフトウェアを用いて以下のように定量した。
【０１２９】
共局在率（％）＝ＹＯＹＯ−１画素共局在／ＹＯＹＯ−１画素合計×１００％
【０１３０】
ＹＯＹＯ−１画素共局在は、リソトラッカーレッドと共局在するＹＯＹＯ−１画素の数を表し、ＹＯＹＯ−１画素合計は、共焦点画像内の全てのＹＯＹＯ−１画素の数を表す。結果を、１５個の個々の細胞の平均として表した。
【０１３１】
腫瘍内遺伝子送達
全ての動物の手順は、ワシントン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルを用いて行った。Ａ５４９腫瘍接種のために、１００μＬのＡ５４９細胞懸濁液（Ｆ１２培地中の２．０×１０６細胞）を雌Ｓｃｉｄベージュ（ＣＢ１７）マウス（４〜５週齢）に皮下注射した。腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したときに、（１０μｇのルシフェラーゼプラスミドを含有する）５％グルコース溶液中の５０μＬポリプレックス（ＣＰ／ＤＮＡ、ＶＩＰＥＲ／ＤＮＡ、ｂＰＥＩ／ＤＮＡ）をマウスに注射した。全てのマウスについて、投与を３日間繰り返した。４日目に、２００μＬのＤ−ルシフェリンカリウム塩（１５ｍｇ／ｍＬ）をマウスに腹腔内注射した。注射後５分の時点で、マウスを、インビボイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００，Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ）に入れ、腫瘍部位での発光を２分の露光時間で記録した。腫瘍組織をマウスから採取し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を補充した溶解緩衝液に収集し、液体窒素で３回の凍結融解サイクルを実施した。組織を機械的にホモジナイズし、溶解物を、４℃で１５分間、２１，０００ｇで回転することにより清澄化した。２０μＬの溶解物を、１００μＬのルシフェラーゼ基質を用いて、発光についてアッセイした。発光を測定し、３枚の脳切片中のタンパク質含有量によって正規化し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定し、脳１ｍｇあたりの相対光単位（ＲＬＵ）として報告した。
【０１３２】
統計分析
全ての統計解析を、不等分散を有する両側スチューデントｔ検定を用いて行った。
【０１３３】
例示的な共重合体の合成
カルボキシル官能化連鎖移動剤を用いて、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合による標的化ペプチド送達のための機能性重合体を調製した。親水性ブロックのポリ（オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート）−コ−ポリ（ピリジルジスルフィドエチルメタクリレート）（ｐ（ＯＥＧＭＡ−ＰＤＳＥＭＡ））は、ジスルフィド交換反応を介するチオール含有ペプチドカーゴコンジュゲーションに使用されるＰＤＳＥＭＡ及びコロイド安定性を提供するための親水性単量体ＯＥＧＭＡを含む。ｐＨ感受性ブロックのポリ（２−ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート）−コ−ポリ（２−アジドエチルメタクリレート）（ｐ（ＤＩＰＡＭＡ−ＡＥＭＡ））は、ｐＨ６．３で疎水性から親水性への急な相転移を特徴とするｐＨ感受性重合体ｐ（ＤＩＰＡＭＡ）、及びクリックケミストリーによるアルキニル含有溶解性ペプチドでのさらなる官能化を可能にするためのＡＥＭＡ単量体を含む。末端カルボキシル基は、ＮＨＳ化学（スキーム２）を介する標的基コンジュゲーションに使用することができる。
【０１３４】
スキーム２
【化２０】
2019528258.tif 000022
【０１３５】
カルボキシル官能化連鎖移動剤を用いて、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合による標的化ペプチド送達のための機能性重合体を調製した。親水性ブロックのポリ（オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート（ｐ（ＯＥＧＭＡ）は、コロイド安定性を提供するために親水性単量体のＯＥＧＭＡを含む。ｐＨ感受性ブロックのポリ（２−ジイソプロピルアミノエチルメタクリレート）−コ−ポリ（２−アジドエチルメタクリレート）−コ−ポリ（ピリジルジスルフィドエチルメタクリレート）（ｐ（ＤＩＰＡＭＡ−ＡＥＭＡ−ＰＤＳＥＭＡ））は、ｐＨ６．３で疎水性から親水性への急な相転移を特徴とするｐＨ感受性重合体のｐ（ＤＩＰＡＭＡ）、クリックケミストリーを介するアルキニル含有溶解性ペプチドでのさらなる官能化を可能にするためのＡＥＭＡ単量体、及びジスルフィド交換反応を介するチオール含有ペプチドカーゴコンジュゲーションに使用されるＰＤＳＥＭＡを含む。末端カルボキシル基は、ＮＨＳ化学（スキーム３）を介する標的基コンジュゲーションに使用することができる。
【０１３６】
スキーム３
【化２１】
2019528258.tif 000023
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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