(57)【要約】  熱プロファイルにおいて核酸を熱処理する装置及び方法が提供される。装置は、核酸を含む反応物質をそれぞれが収容する反応器を保持する反応器ホルダを使用する。装置は、第１の槽及び第２の槽であって、槽内の槽媒体はそれぞれ、２つの異なる温度ＴＨＩＧＨ及びＴＬＯＷで維持可能である、第１の槽及び第２の槽と、複数の熱サイクルで反応器を２つの槽内に配置し、所定の高い目標温度ＴＨＴと所定の低い目標温度ＴＬＴとに交互に到達することを可能する移送手段とを含み、さらに、装置は、ａ）ＴＨＴがＴＨＩＧＨよりも低い、ｂ）ＴＬＴがＴＬＯＷよりも高い、及びｃ）ａ）及びｂ）での条件、からなる群からの少なくとも１つの条件によって規定された温度オフセット特性に適合する。
2019505228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱プロファイルにおいて核酸を熱処理する装置であって、前記装置は、核酸を含む反応物質をそれぞれが収容する反応器を保持する反応器ホルダと、チューブ又はウェルプレート又はチップ又はカートリッジなどの任意の形態である反応器とを使用し、前記装置はまた、反応器温度センサと槽媒体とを使用し、前記装置は、
第１の槽及び第２の槽であって、槽内の槽媒体はそれぞれ、２つの異なる温度ＴＨＩＧＨ及びＴＬＯＷで維持可能である、第１の槽及び第２の槽と、
複数の熱サイクルで前記反応器を２つの前記槽内に配置し、
−所定の高い目標温度ＴＨＴと、
−所定の低い目標温度ＴＬＴと
に交互に到達することを可能にする移送手段と
を含み、
さらに、前記装置は、
ａ）ＴＨＴがＴＨＩＧＨよりも低く、ＴＨＩＧＨは１００℃を超える、
ｂ）ＴＬＴがＴＬＯＷよりも高く、ＴＬＯＷは室温よりも低い、及び
ｃ）ａ）及びｂ）の条件、
からなる群からの少なくとも１つの条件によって規定された温度オフセット特性に適合し、
前記移送手段は、
熱サイクル中に前記反応器温度センサによって感知されたリアルタイム温度に基づいて動作可能な温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ）と、
前記反応器が前記槽内に配置される時間周期に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ）と
からなる群からの少なくとも１つのモードによって動作可能であり、
前記槽の何れかにおける槽媒体は、空気、液体、固体、粉末及びこれらの何れかの混合物を含む任意の相である、装置。
【請求項２】
ＴｉＧＭＣＭは、時間周期に対してユーザーが較正することができる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
さらに第３の槽を含み、槽媒体は中間温度ＴＭＥＤＩＵＭで維持可能であり、前記移送手段は、前記反応器を前記第３の槽内に配置し、所定の中間目標温度ＴＭＴに到達することを可能にし、ＴＭＥＤＩＵＭはＴＭＴと同じであるか、又はＴＭＴからオフセットされている、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
さらに第４の槽を含み、槽媒体は、熱サイクル前に反応器に対する追加プロセスを可能にするために温度ＴＡＰで維持可能であり、前記追加プロセスは、
ｅ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、
ｆ）ホットスタートプロセス及び
ｃ）等温増幅反応
からなる群からの１つであり、
前記移送手段は、前記反応器を前記第４の槽内に配置し、追加プロセス目標温度ＴＡＰＴに到達することを可能にし、ＴＡＰはＴＡＰＴと同じであるか、又はＴＡＰからオフセットされている、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記移送手段は、前記反応器の過熱又は過冷却を不必要に引き起こす動作上の電気機械的遅れを相殺するために、前記反応器がＴＨＴよりも低い第１のリフトオフ温度及びＴＬＴよりも高い第２のリフトオフ温度に到達する場合に前記反応器の槽からのリフトオフを開始するようにユーザーが較正することができる、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
熱サイクルの間に任意の槽内の温度を変更する変更手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
ＴＨＴは、核酸の変性のために８５〜９９℃の領域にあり、ＴＬＴは、核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリング又はプライマー伸長のために４５〜７５℃の領域にあり、前記第１及び第２の槽は、反応器を熱サイクルしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅又はプライマー伸長を達成するためのものである、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
熱プロファイルにおける温度安定化ステップのための第５の槽をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記温度安定化ステップは目標温度のうちの１つにおけるものである、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記反応器が槽の何れかの中又は槽の外側の空気中にある場合に核酸を分析するための、蛍光画像化手段又は電気化学的検出手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
槽媒体が４０〜８０℃で維持可能な液体又は熱空気である第６の槽をさらに含み、前記槽媒体及び槽壁の少なくとも一部は透明であり、光源からの照射光の透過及び前記反応器からの放出光の透過を可能にする、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
ＴＨＩＧＨとＴＨＴとの間の第１のオフセットは、１〜４００℃の範囲内にあり、ＴＬＯＷとＴＬＴとの間の第２のオフセットは、１〜１００℃の範囲内にある、請求項７に記載の装置。
【請求項１３】
前記第１の槽内の槽媒体は、第２の液体に添加された第１の液体であり、前記第２の液体の沸点は前記第１の液体の沸点よりも高い、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記第１の液体と前記第２の液体との混合物の沸点は１００℃よりも高い、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記槽上の槽カバーであって、前記反応器を槽内に配置することを許容するように開口し、前記反応器が槽から除去された後に閉じる、槽カバーをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記槽媒体の温度を監視する槽センサと、
熱サイクル中に前記反応器ホルダとともに移動して前記反応器の温度を監視することができる反応器温度センサと
をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記反応器温度センサを封入する物質を含む容器をさらに含み、前記容器及び前記物質は、前記反応器及び前記反応物質と同様の構成又は熱伝達特性を有する、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記反応器を受け入れて、熱サイクル後に融解曲線分析を行いながら徐々に加熱されることができる、第７の槽をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
熱プロファイルにおいて核酸を熱処理する方法であって、
核酸を含む反応物質をそれぞれが収容する反応器を保持する反応器ホルダと、チューブ又はウェルプレート又はチップ又はカートリッジなどの任意の形態である反応器とを使用するステップと、
第１の槽及び第２の槽を含む装置を使用するステップと、
前記第１の槽内の槽媒体を温度ＴＨＩＧＨに、前記第２の槽内の槽媒体を温度ＴＬＯＷに維持するステップであって、ＴＨＩＧＨは１００℃を超え、ＴＬＯＷは室温よりも低い、ステップと、
前記装置において移送手段を使用するステップであって、複数の熱サイクルで前記反応器を２つの槽内に配置し、
−所定の高い目標温度ＴＨＴと、
−所定の低い目標温度ＴＬＴと
に交互に到達することを可能する、ステップと、
ａ）ＴＨＴがＴＨＩＧＨよりも低い、
ｂ）ＴＬＴがＴＬＯＷよりも高い、及び
ｃ）ａ）及びｂ）の条件、
からなる群からの少なくとも１つの条件によって規定された温度オフセット特性に適合させるステップと
を含み、
前記移送手段は、
熱サイクル中に反応器温度センサによって感知されたリアルタイム温度に基づいて動作可能な温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ）と、
前記反応器が槽内に配置される時間に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ）と
からなる群からの少なくとも１つのモードによって動作可能であり、
前記槽の何れかにおける槽媒体は、空気、液体、固体、粉末及びこれらの何れかの混合物を含む任意の相である、方法。
【請求項２０】
前記装置において第３の槽を中間温度ＴＭＥＤＩＵＭに維持するステップであって、前記移送手段は、前記反応器を前記第３の槽内に配置し、所定の中間目標温度ＴＭＴに到達することを可能にし、ＴＭＴはＴＭＥＤＩＵＭと同じであるか、又はＴＭＥＤＩＵＭからオフセットされている、ステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
熱サイクル前に反応器に対する追加プロセスを第４の槽において可能にするステップであって、槽媒体は、温度ＴＡＰで維持され、前記追加プロセスは、
ｇ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、
ｈ）ホットスタートプロセス及び
ｃ）等温増幅反応
からなる群からの１つである、ステップと、
前記移送手段を使用するステップであって、前記反応器を前記第４の槽内に配置し、追加プロセス目標温度ＴＡＰＴに到達することを可能にし、ＴＡＰはＴＡＰＴと同じであるか、又はＴＡＰからオフセットされている、ステップと
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記反応器の過熱又は過冷却を不必要に引き起こす動作上の電気機械的遅れを相殺するために、前記反応器がＴＨＴよりも低い第１のリフトオフ温度及びＴＬＴよりも高い第２のリフトオフ温度に到達する場合に前記反応器の槽からのリフトオフを開始するように、前記移送手段を較正するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
熱サイクルの間に前記装置における変更手段によって任意の槽内の温度を変更するステップをさらに含む、請求項１９から２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＨＴは、核酸の変性のために８５〜９９℃の領域にあり、ＴＬＴは、核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリング又はプライマー伸長のために、４５〜７５℃の領域にあり、前記第１及び第２の槽は、反応器を熱サイクルしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅又はプライマー伸長を達成するためのものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
熱プロファイルにおける温度安定化ステップのために第５の槽を使用するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記温度安定化ステップは目標温度のうちの１つにおけるものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応器が槽の何れかの中又は槽の外側の空気中にある場合に核酸を分析するために、前記装置において蛍光画像化又は電気化学的検出を行うステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
槽媒体が４０〜８０℃で維持可能な液体又は熱空気である第６の槽を使用するステップであって、前記槽媒体及び槽壁の少なくとも一部は透明であり、光源からの照射光の透過及び前記反応器からの放出光の透過を可能にする、ステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
ＴＨＩＧＨとＴＨＴとの間の第１のオフセットを１〜４００℃の範囲内に設定するステップと、
ＴＬＯＷとＴＬＴとの間の第２のオフセットを１〜１００℃の範囲内に設定するステップと
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の槽内の槽媒体において、第２の液体を第１の液体に添加するステップであって、前記第２の液体の沸点は前記第１の液体の沸点よりも高い、ステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の液体と前記第２の液体との混合物の沸点は１００℃よりも高い、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記槽上に槽カバーを使用するステップであって、前記カバーは、前記反応器を槽内に配置することを許容するように開口し、前記反応器が前記槽から除去された後に閉じる、ステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
熱サイクル中に反応器温度センサを前記反応器ホルダとともに移動するステップであって、前記反応器の温度を監視する、ステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記反応器温度センサを封入する物質を含む容器を使用するステップであって、前記容器及び前記物質は、前記反応器及び前記反応物質と同様の構成又は熱伝達特性を有する、ステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記反応器を受け入れるために前記装置において第７の槽を使用するステップと、
前記第７の槽を徐々に加熱しながら熱サイクル後に融解曲線分析を行うステップと
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の核酸の増幅反応を行う方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学、食品安全及び環境モニタリングにとってますます重要になっている。多くの生物学研究者らが、その高い感度及び特異性のために、核酸分析に関する研究においてＰＣＲを使用している。ＰＣＲの時間サイクルは、主に、ＤＮＡ変性、アニーリング及び伸長のために試料を含む反応器を異なる温度に加熱及び冷却するのに適合した時間のかかるＰＣＲ熱サイクルプロセスのために、典型的には約１時間である。典型的には、熱サイクル装置及び方法は、その温度を核酸増幅反応に必要とされる目標温度に設定した２つの加熱槽の間で反応器を移動させることを使用する。研究者らは、熱サイクルの速度を上げるために常に努力してきた。
【０００３】
熱電クーラー（ＴＥＣ）又はペルチェ式クーラーもまた、加熱／冷却素子として使用される。しかしながら、それは、反応器の温度を変化させるのにかなり遅い１〜５℃／秒の典型的な勾配率を提供し、不利なことに熱サイクルの時間を増加させる。
【０００４】
熱質量を減少させることによってＰＣＲ速度を増加させる試みとして、埋め込まれた薄膜ヒーター及びセンサを有する微細加工されたＰＣＲ反応器が開発され、７４℃／秒の冷却速度及び約６０〜９０℃／秒の加熱速度でより速い熱サイクルを達成した。しかしながら、ＰＣＲ装置を製造するためのそのようなウエハ製造プロセスは非常に高価であり、従って、生物学的試験における低コストの使い捨て用途の要件を満たすには実用的ではない。
【０００５】
ＴＥＣベースの熱サイクラーよりも高い温度勾配を達成するために、閉鎖チャンバー内で反応器を交互にフラッシュする熱空気と冷空気が記述されている。しかしながら、熱伝達の観点から、空気は液体よりも熱伝導率及び熱容量がはるかに小さいため、空気サイクラーの温度勾配は液体の温度勾配よりも遅い。ＴＥＣは、それ自体及びＴＥＣ上部のヒートブロックを加熱及び冷却するのにかなりの時間を必要とする。さらに、ヒートブロックと反応器との間の接触熱抵抗を克服する必要もある。
【０００６】
２つの異なる温度の水が反応器を交互にフラッシュしてＰＣＲ速度を達成する交互水洗サイクラーも開発された。しかしながら、このような装置は、メンテナンスの複雑さを増大させて信頼性を低下させ、同時に高温及び高圧を取り扱う、多くのポンプ、バルブ、及びチューブ式コネクタを含む。循環液体槽媒体とともに、液体は一般に槽から流出する。
【０００７】
従来の水槽ＰＣＲサイクラーは、効率的な温度加熱及び冷却を達成するために、水の高い熱伝導率及び熱容量を利用する。しかしながら、このようなサイクラーは、充填及び処分の管理が困難である大量の水を含む大型の加熱槽を有しており、また、熱サイクルが開始できるようになる前の目標温度への加熱時間を非常に長くする。このようなサイクラーはまた、大きな装置重量及び高い電力消費を有する。水は使用に伴って気化する傾向があり、補充する必要がある。さらに、熱サイクルの間、反応器が槽内に交互に挿入される度に、各槽から取り出す際に反応器本体に水の層が付着した状態で残り、それにより、反応器内部の温度変化が望ましくないことに遅くなる。
【０００８】
研究者らはまた、異なる温度の加熱ローラーを移動させて交互に反応器と接触させる試験を行った。しかしながら、長いチューブ式反応器の使用は、大量の反応器のアレイを設置及び操作するのを面倒にするだけでなく、費用がかかる。反応器が大量のアレイ又はパネルにある場合、全ての反応器の間で加熱の均一性を達成することは困難であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、複雑で高価な部品又は消耗品を使用することなく、手頃なコストにおいて超高速で核酸を熱サイクルすることを可能にする改善された方法及び装置を提供する。本装置は、頑丈で軽量で使い易く、槽内で少量の槽媒体を必要とし、１つの反応器から次の反応器への相互汚染を回避するために反応物質用の使い捨て反応器を取り扱うことができる。本発明は、生物学的分析に非常に有益な効果を提供する。
【００１０】
別段の指定がない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びにその文法的変形は、それらが列挙された要素を含むだけでなく、追加の列挙されていない要素を含むことを可能にするような、「開かれた」又は「包括的な」言語を表すことを意図している。用語「第１の槽」、「第２の槽」・・・「第６の槽」は、順番に対応する槽の数を構成するのではなく、単にそれらが果たす目的に関して識別を容易にするための名前である。これらの槽は、それらの幾つかは共有し得るため、別個の物理的存在を表さないことがある。用語「熱処理」は、ａ）熱サイクルを含み、場合によっては、ｂ）熱サイクルの前及び／又は後の熱処理ステップを含む。用語「熱プロファイル」は、ａ）のみの間、又はｂ）を伴うａ）の間の反応器の温度−時間変化を指す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様によれば、熱プロファイルにおいて核酸を熱処理する装置が提供され、本装置は、核酸を含む反応物質をそれぞれが収容する反応器を保持する反応器ホルダと、チューブ又はウェルプレート又はチップ又はカートリッジなどの任意の形態である反応器とを使用し、本装置は、第１の槽及び第２の槽であって、槽内の槽媒体はそれぞれ、２つの異なる温度ＴＨＩＧＨ及びＴＬＯＷで維持可能である、第１の槽及び第２の槽と、複数の熱サイクルで反応器を２つの槽内に配置し、所定の高い目標温度ＴＨＴと所定の低い目標温度ＴＬＴとに交互に到達することを可能にする移送手段とを含み、さらに、本装置は、ａ）ＴＨＴがＴＨＩＧＨよりも低い、ｂ）ＴＬＴがＴＬＯＷよりも高い、及びｃ）ａ）及びｂ）の条件、からなる群からの少なくとも１つの条件によって規定された温度オフセット特性に適合し、移送手段は、熱サイクル中に反応器温度センサによって感知されたリアルタイム温度に基づいて動作可能な温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｇｕｉｄｅｄ  ｍｏｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｍｅａｎｓ）と、反応器が槽内に配置される時間周期に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ；ｔｉｍｅ  ｇｕｉｄｅｄ  ｍｏｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｍｅａｎｓ）とからなる群からの少なくとも１つのモードによって動作可能であり、槽の何れかにおける槽媒体は、空気、液体、固体、粉末及びこれらの何れかの混合物を含む任意の相である。有利には、ここでは、ニュートンの法則の概念が用いられ、それは、本体の熱損失率が本体とその周囲との間の温度差に比例することを提示する。第１の槽の温度をＴＨＴよりも著しく高いＴＨＩＧＨに維持し、第２の槽の温度をＴＬＴよりも著しく低いＴＬＯＷに維持することにより、反応器は熱サイクルを著しく高速に受けることができる。ＴｉＧＭＣＭは、時間周期に対してユーザーが較正することができる。ＴｅＧＭＣＭはより優れた自動化及び精度を可能にするが、非常に高速な温度サンプリング及び信号処理エレクトロニクス、反応器移送機構との高速データ通信、及び反応器移送機構内のモーターやアクチュエーターなどの非常に応答性の高い機械的動作部品を必要とする。他方、ＴｉＧＭＣＭは、温度オフセットの程度に基づいたユーザーの較正を必要とするが、このような応答性の高い設備を必要としない。温度オフセット特性の有利な影響は、図１２（ａ）及び（ｂ）の実験グラフによって実証されており、ここでは、４０サイクルの熱サイクルの時間が１／５に減少することが示されている。この時間の減少は、温度オフセットの程度を増大させることによって、さらに減少させることができる。
【００１２】
一実施形態によれば、第３の槽が設けられ、槽媒体は、３つのステップで反応器を熱サイクルするための中間温度ＴＭＥＤＩＵＭで維持可能であり、移送手段は、反応器を第３の槽内に配置し、所定の中間目標温度ＴＭＴに到達することを可能にする。ＴＬＴからのより速い加熱速度を達成するために、ＴＭＴはＴＭＥＤＩＵＭより低くてもよく、ＴＨＴからのより速い冷却速度を達成するために、ＴＭＴはＴＭＥＤＩＵＭより高くてもよい。ＴＭＴは、ＴＭＥＤＩＵＭと同じに維持されてもよい。
【００１３】
一実施形態によれば、第４の槽が設けられ、槽媒体は、熱サイクル前に反応器に対する追加プロセスを可能にするために温度ＴＡＰで維持可能であり、追加プロセスは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ホットスタートプロセス及び等温増幅反応からなる群からの１つであり、移送手段は、反応器が追加プロセス目標温度ＴＡＰＴに到達することを可能にし、ＴＡＰはＴＡＰＴと同じであるか、あるいはＴＡＰＴよりも高い又は低い。利点は、温度オフセット特性を使用する場合と同じである。これは、プロセスステップを統合する手助けをし、有利には、適切な温度設定とともに槽の共有も可能にし、それにより、装置の設置面積及び質量を減らす。
【００１４】
第１の槽内の槽媒体は、１００℃を超える温度で維持可能であり、そのような高温に加熱することができる適切な槽媒体を用いて温度オフセット特性の利点をより有効に利用することができる。第２の槽内の槽媒体は、室温未満に維持可能であり、温度オフセットの利点をより有効に利用することができる。
【００１５】
一実施形態によれば、移送手段は、反応器の過熱又は過冷却を不必要に引き起こす動作上の電気機械的遅れを相殺するために、反応器がＴＨＴよりも低い第１のリフトオフ温度及びＴＬＴよりも高い第２のリフトオフ温度に到達する場合に反応器の槽からのリフトオフを開始するように較正される。
【００１６】
一実施形態によれば、本装置は、熱サイクルの間に任意の槽内の温度を変更する変更手段を含む。この特徴は、装置内の槽の数を減少させるのに非常に役立ち、それにより、装置の設置面積及び重量を減少させる。
【００１７】
ＴＨＴは、核酸の変性のために８５〜９９℃の領域にあることができ、ＴＬＴは、核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリング又はプライマー伸長のために、４５〜７５℃の領域にあることができ、第１及び第２の槽は、反応器を熱サイクルしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅又はプライマー伸長を達成するためのものである。
【００１８】
本装置は、熱プロファイルにおける温度安定化ステップのための第５の槽をさらに含んでもよい。温度プロファイルのために必要とされるならば、温度安定化ステップは目標温度のうちの１つにおけるものであり得る。
【００１９】
本装置は、反応器が槽の何れかの中又は槽の外側の空気中にある場合に核酸を分析するための、蛍光画像化手段又は電気化学的検出手段をさらに含んでもよい。
【００２０】
本装置は、槽媒体が４０〜８０℃で維持可能な液体又は熱空気である第６の槽をさらに含んでもよく、ここで、槽媒体及び槽壁の少なくとも一部は透明であり、光源からの照射光の透過及び反応器からの放出光の透過を可能にする。
【００２１】
ＴＨＩＧＨとＴＨＴとの間の第１のオフセットは、１〜４００℃の範囲内にあり得、ＴＬＯＷとＴＬＴとの間の第２のオフセットは、１〜１００℃の範囲内にあり得る。オフセットが高いほど、反応器によって達成される温度の変化が速くなり、それにより、熱サイクルの速度が増加する。
【００２２】
第１の槽内の槽媒体は、混合物中の温度を沸騰させずに１００℃を超える温度などのより高い値に維持できるように、より高い沸点を有する第２の液体に添加された第１の液体であってもよい。
【００２３】
本装置は、反応器を槽内に配置することを許容するように開口し、反応器が槽から除去された後に閉じる、槽カバーをさらに含んでもよい。この特性は、周囲に曝された状態の際に失われるか又は得られる熱を減らすことによって、エネルギーを節約するのに役立つ。装置の他の部分もまた、特にＴＨＩＧＨが周囲温度よりもはるかに高い値に設定されている場合に、加熱されないようにされる。このことはまた、槽媒体の気化及び装置の周囲部分の汚染を減少させる。
【００２４】
本装置は、槽媒体の温度を監視する槽温センサと、熱サイクル中に反応器ホルダとともに移動して反応器のリアルタイム温度を監視することができる反応器温度センサとを含む。本装置はさらに、反応器温度センサを封入する物質を含む容器を含んでもよく、その容器及び物質は、反応器及び反応物質と同様の構成又は熱伝達特性を有し、従って、反応器温度センサによって感知される温度は、如何なる瞬間においても、反応器内の反応物質の温度に近い。
【００２５】
本装置はさらに、反応器を受け入れて、熱サイクル後に融解曲線分析を行いながら徐々に加熱されることができる、第７の槽を含むことができる。これは、プロセスステップを統合するのに役立ち、特に槽共有に関して有利である。
【００２６】
第２の態様によれば、装置の請求項に対応する方法の請求項が提供される。
【００２７】
本発明は、核酸の熱サイクル及び分析のプロセス全体を、槽の加熱準備から反応器の熱サイクル及び蛍光シグナルの取得まで数分の非常に短い持続時間で完了させることを可能にする。本発明は、槽共有の範囲を提供する。
【００２８】
以下の図面では、同じ参照番号は通常、全体を通して同じ部分を指す。図面は縮尺通りではなく、概念を説明することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】本発明による核酸を含む反応物質の熱サイクルのための設備の一実施形態の概略図である。
【図１ｂ】本発明に使用可能な例示的なバイオチップに収容されている反応器の斜視図である。
【図１ｃ】粉末槽媒体に特に適した不透明チューブ状反応器を有する照明及び蛍光発光検出モジュールを例示するための断面図である。
【図２】図１における熱サイクルのプロセスのための装置の一実施形態の等角図である。
【図３】図２における装置の光学モジュールを有する反応器アレイ及び槽の一実施形態の等角図である。
【図４ａ】一実施形態による、融解曲線分析を伴う典型的な２ステップ熱サイクルプロセスの例示的なグラフ表示である。
【図４ｂ】一実施形態による、融解曲線分析を伴う典型的な３ステップ熱サイクルプロセスの例示的なグラフ表示である。
【図５ａ】加熱速度に対するニュートンの法則のグラフ表示である。
【図５ｂ】冷却速度に対するニュートンの法則のグラフ表示である。
【図６ａ】先に説明した装置を使用しているが温度オフセット特性を使用していない、熱サイクルの４０サイクル中の時間による実験的な反応器温度変化のグラフ表示である。
【図６ｂ】先に説明した装置及び温度オフセット特性を使用した、熱サイクルの４０サイクル中の時間による実験的な反応器温度変化のグラフ表示である。
【図７ａ】本発明の一実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図７ｂ】本発明の一実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図７ｃ】本発明の一実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図７ｄ】本発明の一実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図７ｅ】本発明の一実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図８ａ】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための模式的断面図である。
【図８ｂ】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための正面断面図である。
【図８ｃ】図８ａ及び図８ｂによる温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図９ａ】温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図９ｂ】温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図９ｃ】温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図９ｄ】温度オフセット特性の概念を説明するためのグラフ表示である。
【図１０ａ】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための模式図である。
【図１０ｂ】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための模式図である。
【図１１ａ】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための模式図である。
【図１１ｂ】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための模式図である。
【図１１ｃ】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための模式図である。
【図１１ｄ】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための模式図である。
【図１２】本発明の様々な実施形態による温度オフセット特性の概念を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下の説明は、当業者が本発明を作製し使用できるように、本発明の幾つかの好ましい実施形態を十分に詳細に提示する。
【００３１】
図１ａは、例えばＰＣＲ、プライマー伸長又は他の酵素反応などのための、核酸を熱サイクルする熱サイクル装置の一部の一実施形態の概略図を示す。本装置は、槽媒体７５を含む２つの槽５０及び５１を有する。各槽５０又は５１は、槽媒体７５の温度を制御することができるように、槽表面に沿って取り付けられた槽ヒーター１７及び槽温センサ３９を有する。別の実施形態によれば、槽温センサ３９を槽５０、５１の内部に配置することができる。槽５０は変性のステップに適していることがあり、槽５１はアニーリング及び／又は伸長のステップに適していることがある。クーラー１６は、槽５１を室温未満に積極的に冷却する必要がある場合に有用である。ここに示される槽媒体７５は液体であるが、任意の他のタイプの流体又は粉末又は固体槽媒体７５を使用することもできる。幾つかの実施形態では、槽５１を加熱する必要がない場合、低温槽５１上の槽ヒーター１７は任意である。熱サイクルのために、反応器１５は、槽５０、５１の間で複数回交互に移送される。反応器１５の槽媒体７５内への高速押し込みを可能にするために、ガラスキャピラリーなどの細い反応器１５が好ましい。反応器１５はシーラント又はキャップ７７で密閉されており、ここでは反応器１５の一部は透明であり、色素又はプローブの励起及び蛍光画像化のための光の通過を可能にする。温度監視ユニット３４は、反応器ホルダ３３上に取り付けられており、反応器１５とともに槽５０、５１間を移動する。温度監視ユニット３４は、内部に高速応答温度センサ３８を含む。温度監視ユニット３４は、反応器１５と同様の形状を有し、反応器１５と同様又は同一の定常状態及び過渡的な熱特性を有するように構成されており、温度読取り及び熱応答についても、別の反応器１５自体がその目的のために使用されない限り、反応器１５と同様又は同一である。例えば、温度監視ユニット３４は、水又は油又は水の上の油の層２２内に挿入され密閉された、高速応答温度センサ３８を有することができる。１つの反応器１５のみが示されているが、他の実施形態によれば、反応器ホルダ３３は、複数の反応器１５を収容することができる。反応器１５は、図示のようなチューブ状形態であってもよいし、ウェルプレート又はチップ又はカートリッジの形態であってもよい。反応器移送機構８５は、反応器１５及び温度監視ユニット３４を槽５０、５１の間で高速で移送し、熱サイクルで必要とされる槽５０及び５１内の異なる温度にそれらを交互に曝す。反応器移送機構８５には、多くの可能な設計がある。そのような機構の１つは、反応器１５及び温度監視ユニット３４を槽５０、５１の上部の領域に到達させるためのＸ軸線形ガイド８７に沿って移動するＸステージ８６と、反応器１５を下方に移動させて槽媒体７５に入れるか又は槽媒体７５から引き抜くためのＺ軸線形ガイド８９に沿って移動するＺステージ８８とからなる。このような移送機構８５はまた、Ｚ軸線形ガイド８９に沿って移動するＺステージ８８とともに、反応器１５及び温度監視ユニット３４を角度方向に移動させる回転アーム（図示せず）から構成することもできる。反応器１５は、反応物質２１を充填するための開口部を有し、その開口部は密閉可能である。シーラント７７は、熱サイクル中に固相であるシリコーンゴム又はＵＶ硬化ポリマー、ホットメルト及び／又はワックス及び／又はゲルで作製することができる。密閉はまた、油、粘性ポリマー、及びゲルなどの液体を使用して達成することもできる。高粘性の液体は、反応器１５の開口部及び／又は上部に適用することができ、反応物質２１から発生した蒸気の漏出を阻止することができる。蛍光画像化のための構成は、当技術分野において見られるような任意の形態であり得る。図１ｂは、反応器１５の別の実施形態による、槽とともに使用するためのカード３１に収容されている反応器１５の斜視図である。チャネル３１５のネットワークを介して反応器１５と流体連通する少なくとも１つの入口３１３がある。試験されるべき反応物質２１は、続いて反応器１５内に流入する入口３１５内に充填することができる。図１ｃは、特に反応器１５が不透明な反応器１５で作製されている場合の一実施形態を示す。蛍光画像化のために、光ファイバ３０９は、ＬＥＤなどの照明光源（図示せず）からの光を反応器１５内の反応物質２１に伝達する。光ファイバ３１０は、反応物質２１から光検出器（図示せず）への光伝送のためのものである。シーラント又はキャップ７７は、光ファイバ３０９、３１０を保持する。代替的に、図３に示すように、透明な槽媒体７５を有する少なくとも部分的に透明な槽を用いて、少なくとも部分的に透明な反応器１５に対して画像化を行うこともできる。場合によっては、反応器１５が何れかの槽の外側にある場合に画像化を行うことがある。反応器１５が槽媒体７５の内部にある間の反応器１５の蛍光画像化は重要であるが、なぜなら、反応器１５は、多重検出のため又は対照遺伝子の蛍光画像を取得するために異なる波長の複数の画像を撮る場合に、長時間にわたってアニーリング又は伸長温度に維持しなければならないことがあるからである。反応器１５の少なくとも一部は、色素又はプローブの励起及び蛍光画像化のための光の通過を可能にするため、透明である必要がある。
【００３２】
図２は、反応器移送機構８５を有する装置の等角図を示し、ここで、光学モジュール２０６は反応器１５内の核酸の蛍光検出を行い、温度制御モジュール２０５は槽温を制御し、作動コントローラ２０７は全ての作動を制御し、システムコントローラ２０８は、データ通信及び処理、画像処理及びデータ分析を用いてシステムを制御する。槽モジュール２０４は、互いに隣接して配置されてそれぞれが所定の温度に維持される、５つの槽５０、５１、５２、５３、５４を備えるように示されている。光学モジュール２０６において、反応器１５は、この実施形態では、槽媒体７５として空気又は透明液体を有する低温槽５１内に配置されている。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ホットスタートプロセス及び等温増幅反応などの追加プロセスもまた、熱サイクルのための槽の何れかで行うことができ、それを、熱サイクル前に温度ＴＡＰに設定し、上記の追加プロセスの完了後に熱サイクルのための温度に再設定することができる。図３は、槽モジュール２０４及び光学モジュール２０６の拡大図を示す。温度監視ユニット３４を有する反応器１５のアレイは、槽５０〜５４の間で移送される。この実施形態では、槽５１は、矢印の光線経路で示されるような反応器１５への照射光及び反応器１５からの放出光を通過させる底部の透明な窓２５とともに、槽媒体７５として空気又は透明液体を有する。槽ヒーター１７又はクーラー１６は、槽の側壁に接続されている。本装置はさらに、特に画像化の間に反応器１５を配置するための熱空気ゾーン（図示せず）を含んでもよい。これは、装置を単純化する。槽の上部又は槽の内部に熱空気ゾーンを形成するために、電気ヒーター又は赤外ヒーターが存在してもよい。ヒーターは好ましくは、反応器ホルダ３３に取り付けられ、従って、反応器１５が槽の間を移動する間に反応器１５の周辺の空気のみが加熱される。この特徴は、エネルギーを節約し、装置の他の部分が望ましくなく加熱されることを防ぐ。複数の槽５０〜５４は、必要に応じて、熱サイクル及び熱サイクル前後のステップに対する熱プロファイル下で使用され得る。熱サイクルに対する３ステップの熱プロファイルにおいて、反応器１５は各熱サイクル内で３つの槽内に挿入される。槽５０と槽５１との間に、温度監視ユニット３４を有する反応器１５を中温の第３の槽に挿入してもよいし、アニーリング及び／又は伸長に必要とされる時間の間、熱空気中に配置してもよい。熱サイクル前に、温度監視ユニット３４を有する反応器１５を第４の槽に挿入してもよく、すなわち、核酸増幅のための熱サイクルの前の追加処理などに対する所定の温度に維持してもよい。追加プロセスは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ホットスタートプロセス及び等温増幅反応からなる群からのものであり得る。熱サイクル後に槽を用いて、融解曲線分析を行ってもよい。
【００３３】
図４ａは、典型的な２ステップ熱サイクルプロセスと、それに続く融解曲線分析との、例示的な時間−温度グラフ表示である。２つの槽を使用した変性及びアニーリングのプロセスに関して、３サイクルのみが示されている。熱サイクルの後、反応器１５は、少なくとも部分的に透明な槽媒体７５内に配置され、それは、融解曲線分析を行いながら、徐々に加熱される。反応器１５からの蛍光シグナルは、複数の温度で取得され、融解曲線分析のための蛍光−温度曲線を形成する。熱サイクルの速度は、温度オフセット特性によって反応器１５の温度の上昇及び下降を増大させることによって増大され、ここで、第１の槽５０内の槽媒体７５の温度は、変性のための温度又は高い目標温度ＴＨＴよりも著しく高い温度ＴＨＩＧＨに維持され、第２の槽５１内の槽媒体７５の温度は、アニーリングのための温度又は低い目標温度ＴＬＴよりも著しく低い温度ＴＬＯＷに維持される。この特徴は、「物体の温度の変化率は、それ自身の温度と周囲温度（すなわち、その周りの温度）との差に比例する」というニュートンの冷却の法則を有利に用いる。図４ｂは、典型的な３ステップ熱サイクルプロセスと、それに続く融解曲線分析との、例示的な時間−温度グラフ表示である。３つの槽を使用した変性、アニーリング及び伸長のプロセスに関して、３サイクルのみが示されている。熱サイクルの後、図４ａに記載したように融解曲線分析を行う。ここで、図４ａに記載された温度オフセット特性はさらに第３の槽５２にも拡張され、そこでは、槽媒体７５の温度は、伸長のための温度又はＴＭＴよりも著しく高い温度ＴＭＥＤＩＵＭに維持される。融解曲線分析のための槽媒体７５は、空気又は透明な液体であってもよく、槽は透明な窓２５を有する必要があり、ともに低い自己蛍光を有することが必要とされる。
【００３４】
図５ａは、周囲温度が温度ＴＨＩＧＨである場合に温度ＴＬＴの物体が時間ｔ１において温度ＴＨＴまで加熱されることが示されているこの法則を示しており、ここでＴＨＩＧＨ＞ＴＨＴである。周囲温度が温度ＴＨＴである場合、温度ＴＬＴの同じ物体は時間ｔ２において温度ＴＨＴまで加熱されることが示されている。図示のように、ｔ１＜ｔ２であり、このことは、周囲温度が高いほど加熱速度が速いことを示している。図５ｂは、周囲温度が温度ＴＬＯＷである場合に温度ＴＨＴの物体が時間ｔ３において温度ＴＬＴまで冷却されることが示されているこの法則を示しており、ここでＴＬＯＷ＜ＴＬＴである。周囲温度が温度ＴＬＴである場合、温度ＴＨＴの同じ物体は時間ｔ４において温度ＴＬＴまで冷却されることが示されている。図示のように、ｔ３＜ｔ４であり、このことは、周囲温度が低いほど冷却速度が速いことを示している。従って、ＴＨＩＧＨを変性のための温度よりも著しく高く維持し、ＴＬＯＷをアニーリングのための温度よりも著しく低く維持することによって、反応器１５の温度の変化率は熱サイクルの間に著しく増大し、それにより、熱サイクルは著しく速くなる。
【００３５】
図４ａ及び図４ｂで説明したように、温度オフセットを使用する概念は、必要に応じて、任意の数の槽を使用する熱サイクルの任意のステップで使用することができる。温度オフセットを維持するこの特徴は、加熱ステップのみ、又は冷却ステップのみ、又は両方のために選択的に使用することができる。高温槽５０内の液体槽媒体７５は、反応器温度の上昇をより速めるために、１００℃の水よりも高い沸点を有することができる。
【００３６】
図６（ａ）は、先に説明した装置を使用しているが、ＴＨＩＧＨ＝ＴＨＴ＝９５℃及びＴＬＯＷ＝ＴＬＴ＝６０℃を維持することによって温度オフセット特性を使用していない、熱サイクルの４０サイクル中の時間による実験的な反応器温度変化のグラフ表示を示す。時間軸から分かるように、４０回の熱サイクルに要した時間は１４５０秒である。図６（ｂ）は、先に説明した装置を使用し、ＴＨＩＧＨ＝１２０℃、ＴＨＴ＝９５℃、ＴＬＯＷ＝２５℃及びＴＬＴ＝６０℃を維持することによって温度オフセット特性を使用した、熱サイクルの４０サイクル中の時間による実験的な反応器温度変化のグラフ表示を示す。時間軸から分かるように、４０回の熱サイクルに要した時間は３００秒である。従って、温度オフセット特性により、熱サイクルにかかる時間は約１／５に短縮されている。これは、約２５分が５分に短縮されるため、非常に有意な改善である。この場合、槽を交換する際の電気機械的システムの遅れのために、高温槽５０及び低温槽５１の両方に僅かなオーバーシュートが観察される。このようなオーバーシュートは、目標温度に到達する少し前に槽５０、５１から反応器１５をリフトオフして遅れを相殺するように装置を較正することによって、回避することができる。
【００３７】
一実施形態によれば、反応器１５の急速加熱を可能にするために、高温槽５０内の液体槽媒体７５は、１２５℃、典型的には約９５℃であるＤＮＡ変性のための高い目標温度ＴＨＴを超える温度に著しく過熱される。１００℃を超える場合に液体の良好な熱伝導率を維持しながら液体沸騰を回避するために、混合比が７０：３０以上であるグリセロールと水との混合物を使用することができる。反応器１５の急速冷却を可能にするために、低温槽５１内の液体は、典型的には約５８℃であるＤＮＡ分子のアニーリング及び／又は伸長のための低い目標温度ＴＬＴ未満まで、著しく冷却される。例えば、低温槽５１内の液体は、室温が２０℃である一方、１０又は３０℃に維持されてもよい。反応器１５は、少なくとも１つの核酸分子と、分析用試薬とを有する反応物質２１を含む。
【００３８】
反応器１５を槽５０〜５４内に、対応する槽の温度に関係なく対応する目標温度が実質的に得られるまで滞留させるための装置には、温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ）又は時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ）（図示せず）が使用される。反応器１５が温度監視ユニット３４によって感知されたように目標温度にまさに到達しようとしている際に、反応器１５を槽から取り除く際の何らかの操作上の電気機械的遅れによる反応器１５の過熱又は過冷却を回避するために、ＴｅＧＭＣＭ／ＴｉＧＭＣＭに事前信号が提供され得る。これは、反応器１５によって得られる所定の目標温度のより良い精度を維持する手助けをする。有利には、ＴｅＧＭＣＭ／ＴｉＧＭＣＭを用いて、槽内に滞留されている時間に基づいた複数レベルの温度を反応器１５が得ることを可能にすることによって、装置内で必要とされる高温槽及び低温槽の数を減少させることができる。しかしながら、任意の温度レベルでの安定化のためには、その温度の専用槽が必要とされる。
【００３９】
オーバーヒート法及びアンダーヒート法を用いた上記の温度オフセットは、反応器１５の温度の上昇／下降をより速くする。この節では、式（１〜７）を含む理論について説明する。作動中の１つのタイプの反応器１５は、反応物質を含むチューブを含む。チューブ及び反応物質２１は、異なる熱特性及び他の物質特性を有する。熱サイクル中の槽媒体７５に浸漬された反応物質２１を充填した反応器１５の熱伝達特性を説明するために、浸漬された反応物質２１を充填した反応器１５を、外表面積Ａｓ、半径Ｒ、長さＬ、浸漬されたシリンダの容積Ｖ、熱容量ｃｐを有する均質物質からなるシリンダとして近似する。熱サイクル中に、高温槽に浸漬されたシリンダを、シリンダが高温槽に入る際のＴＬＴからＴＨＴに加熱する時間を推定するために、シリンダの平均表面温度Ｔｓ，ａｖｇを使用することによって、ニュートンの冷却の法則から平均熱伝達率Ｑａｖｇ（実際には、Ｑの上にはドットが付く。以下の［数１］（式（１））参照。）を決定する［文献１：Ｙ．Ａ．Ｃｅｎｇｅｌ及びＡ．Ｊ．Ｇｈａｊａｒ、Ｈｅａｔ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第５版、Ｉｎ  ＳＩ  Ｕｎｉｔｓ  ｂｙ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、２０１５年］。すなわち、［数１］（式（１））であり、ここで、ＴＨＩＧＨは高温槽内の槽媒体の温度であり、Ｔｓ，ａｖｇ＝（ＴＬＴ＋ＴＨＴ）／２である。高温槽内のオーバーヒートスキーム下で、ＴＨＩＧＨ＞ＴＨＴである。注記：ＴＬＴの一例はＰＣＲでのアニーリング温度であり、ＴＨＴの一例はＰＣＲでの変性温度である。
次に、シリンダから伝達される全熱を決定するが［文献１］、それは単に、それがＴＬＴからＴＨＴに加熱される際のシリンダのエネルギー変化である：
Ｑｔоｔａｌ＝  Ｖｃｐ（ＴＨＴ−ＴＬＴ）  ・・式（２）
この計算では、シリンダ全体がシリンダの領域にわたって均一の温度であると仮定した。この仮定では、シリンダをＴＬＴからＴＨＴに加熱する時間Δｔは、以下の［数２］（式（３））であると決定される。上記の仮定のために、式（３）は正確な温度値をもたらさないが、シリンダを加熱する時間に影響を及ぼす因子を明らかにする。
式（３）の熱伝達係数ｈは、熱媒体と反応器との相対速度に関係しており、それは、シリンダを横切る外部流れにおける対流熱伝達の以下の分析から得ることができる［文献１］：
シリンダを横断する流れの平均ヌッセルト数は、
Ｎｕ＝ＣＲｅｍＰｒｎ  ・・文献１の式（７−３７）
と簡潔に表すことができ、ここで、定数Ｃ、ｍ、及びｎは、Ｒｅ＝ρｖＤ／μとして定義されるレイノルズ数Ｒｅに関係し、ここで、Ｄはシリンダの直径であり、ρは槽内の液体の密度であり、μは槽内の液体の動粘度であり、ｖは熱媒体と反応器との相対速度である。
例えば、Ｒｅが４０〜４，０００の範囲にある場合、式（７−３７）は、
Ｎｕ＝０．６８３Ｒｅ０．４６６Ｐｒ１／３  ・・式（４）
と書き直すことができ、それは文献１の表７−１に示されている。
Ｎｕ＝ｈＤ／ｋであり、ｈはシリンダ表面における熱伝達係数であり、Ｄはシリンダの直径であり、ｋは槽内の液体の熱伝導率であるため、式（４）は、以下の［数３］（式（５））と書き直すことができる。
式（５）を式（３）に挿入して、以下の［数４］（式（６））を得る。
式（６）は、オーバーヒート戦略を実施する利点を示している：すなわち、オーバーヒート（過熱）された槽の温度ＴＨが高いほど、シリンダをＴＬＴからＴＨＴに加熱する時間Δｔが短くなる。実験的に、図５ａは、オーバーヒートされた槽の温度ＴＨＩＧＨが９５℃の温度から１１５℃に上昇する場合、反応器１５が５０℃（ＴＬＴ）から９５℃（ＴＨＴ）に到達する時間ｔ１は、槽媒体７５が９５℃に設定されている場合に反応器１５が９５℃（ＴＨＴ）に到達する時間ｔ２よりもはるかに短いことを示す。
同様に、シリンダをＴＨＴからＴＬＴに冷却する時間Δｔは、以下の［数５］（式（７））であると決定される。
式（７）は、アンダーヒート戦略を実施する利点を示している：すなわち、アンダーヒートされた槽の温度ＴＬＯＷが低いほど、シリンダをＴＨＴからＴＬＴに冷却する時間Δｔが短くなる。実験的に、図５ｂは、アンダーヒートされた槽の温度ＴＬＯＷが５０℃の温度から２０℃に低下する場合、反応器１５が９５℃（ＴＨＴ）から５０℃（ＴＬＴ）に到達する時間ｔ３は、槽が５０℃に設定されている場合に反応器１５が５０℃（ＴＬＴ）に到達する時間ｔ４よりもはるかに短いことを示す。
【００４０】
【数１】
2019505228.tif 000003
【００４１】
【数２】
2019505228.tif 000004
【００４２】
【数３】
2019505228.tif 000005
【００４３】
【数４】
2019505228.tif 000006
【００４４】
【数５】
2019505228.tif 000007
【００４５】
上述の装置を用いて急速熱サイクル及び核酸処理を行うための様々な例示的方法を以下に記載する。高温槽５０と低温槽５１との間で反応器１５を交互に移送することによって熱サイクルを行う場合、図７（ａ）は、高温槽５０内のオーバーヒート特性を使用する本発明の方法の好ましい実施形態における反応器温度変化曲線２００（点線の曲線）と、高温槽５０内のオーバーヒート法を使用しない別の実施形態における温度変化曲線３００（破線の曲線）とを示す。従って、熱サイクルの間、反応器１５の温度上昇率は、曲線３００よりも曲線２００においてより速い。ここで、高温槽５０は、変性温度に必要とされるようなＴＨＴよりも高い温度ＴＨＩＧＨに設定され、低温槽５１は、アニーリング及び／又は伸長に適したＴＬＴに設定される。槽がそれぞれの槽温ＴＨＩＧＨ及びＴＬＴに加熱された後、反応器移送機構８５は反応器１５を高温槽５０に移送し、ホットスタートステップに適切な温度の別個の槽を必要としてもしなくてもよいホットスタートステップの有無にかかわらず、ＰＣＲ又は他の増幅反応のための熱サイクルを開始する。一旦曲線２００又は３００に対応する反応器温度が高温槽５０においてＴＨＴに到達すると、反応器移送機構８５は反応器１５を引き出し、低温槽５１にそれらを移送して反応器１５をＴＬＴに到達させ、続いて、反応器１５を熱サイクルのために高温槽５０に移送し戻す。この実施形態では、反応器１５は、核酸増幅に必要とされる滞留時間ｔＬと呼ばれる時間の間、槽５１内に留まることができる。一旦槽５１内で滞留時間ｔＬに到達すると、反応器移送機構８５は反応器１５を槽５１から持ち上げて槽５０に移送し、熱サイクルを継続する。同様の滞留時間を高温槽５０（図示せず）に適用することもできる。一実施形態では、滞留時間ｔＬは、図１ａに示すように反応器ホルダ３３とともに移動する装置内の反応器温度監視ユニット３４によって測定することができる。しかしながら、この方法は実施するのに費用がかかることがある。反応器１５が槽内に突入すると、反応器の温度曲線２００又は３００は、毎秒４０℃〜９０℃などの非常に高率で変化することがある。反応器移送機構８５によって反応器１５を持ち上げるタイミングを正確に制御するためには、超高速温度サンプリング及び信号処理エレクトロニクス、反応器移送機構８５との高速データ通信、及びモーター及びアクチュエーターなどの非常に応答性の高い機械的作動部品が反応器移送機構８５において必要とされる。しかしながら、実際上、このような高速電子装置は、本発明の装置を製造する特定の存在に対して利用可能でないか、又は費用がかかりすぎることがある。別の実施形態では、滞留時間ｔＬは、反応器１５が槽内に浸漬された瞬間から数えられる。例えば、反応器１５が浸漬後１秒以内に目標温度ＴＬＴ又はその近傍に到達し、目標温度ＴＬＴ又はその近傍に３秒間留まると仮定すると、反応器１５は、槽から取り出される前に、４秒間槽内に浸漬される。この方法は重要であるが、なぜなら、高速の温度サンプリング、処理及びデータ通信が可能な如何なる装置も必要とせずに、低コストで実施できるからである。同様の超急速加熱及び冷却は、様々な形状のプラスチック及び金属反応器１５においても観察される。プラスチック反応器１５では、熱電クーラーなどの能動的冷却装置を使用して、室温よりも実質的に低いＴＬＴを特に使用する。本装置は、必要に応じて、ユーザーが条件ＴＨＩＧＨ＝ＴＨＴ又はＴＬＯＷ＝ＴＬＴを選択することを可能にし得る。
【００４６】
図７（ｂ）は、高温槽５０でのオーバーヒートと、低温槽５１でのアンダーヒートとを使用して熱サイクルを実施する方法を記載する。低温槽５１内の温度ＴＬＯＷはＴＬＴ未満に設定されるため、低温槽５１における反応器１５と槽媒体７５との間の熱伝達ははるかに強く、反応器１５のより急速な冷却をもたらす。反応器温度がＴＬＴに到達すると、反応器移送機構８５は反応器１５を直ちに持ち上げ、それらを高温槽５０に移送し、熱サイクルを継続する。図７（ｃ）はさらに、ＴＨＴの上方及びＴＬＴの下方で反応器温度がオーバーシュートする熱サイクル法を記載する。この方法により、反応器１５は、変性のためにより長い時間ｔＨにわたってＴＨＴの近傍に留まることができ、及び／又はアニーリング及び伸長のためにより長い時間ｔＬにわたってＴＬＴの近傍に留まることができる。図７（ｄ）に示す別の実施形態では、反応器１５がＴＬＴの近傍の温度に到達した後、反応器１５を低温槽５１から空気のゾーンに移動させて、ＰＣＲにおけるアニーリング及び／又は伸長などの核酸分析に必要とされる時間にわたって反応器温度１３をＴＬＴの近傍に維持し、次いで、反応器１５を高温槽５０に移動させて熱サイクルを継続する。赤外線ヒーター、熱空気を吹き付けるファン、電気抵抗線ヒーターを用いて空気ゾーン内の空気を加熱し、低温槽５１の近くに加熱空気ゾーンを設けるか、又は室温の単純な空気ゾーンとすることができる。加熱空気ゾーンを、高温槽５０又は低温槽５１の何れかの中の槽媒体７５の上方に生成して、槽５０、５１内の閉じた空間を利用して反応器温度１３をより良好に維持することもできる。加熱空気ゾーンはまた、高温槽５０又は低温槽５１の何れかの開口部における槽媒体７５の上方に生成されてもよい。ＴＨＴを所定の時間維持するために、高温槽５０にも同様の戦略を適用することができる。
【００４７】
図７（ｅ）に示す別の実施形態では、反応器１５が低温槽５１内でＴＬＴ未満に到達した後、反応器移送機構８５が反応器１５を槽５１から加熱空気ゾーンに移動させ、ＴＬＴを超える温度に反応器１５を加熱し、続いて反応器１５を低温槽５１内に移動させて反応器１５をＴＬＴ未満に冷却し、この操作を必要な回数繰り返し、アニーリング及びプライマー伸長のためにＴＬＴ近傍の振動温度変動を発生させる。所定の時間ＴＨＴを維持するために、冷却空気ゾーンを使用することによって、高温槽５０にも同様の戦略を適用することができる。
【００４８】
図８（ａ）は、ＴＬＴ未満の温度３５に維持された１つのアンダーヒート槽６１を使用して反応器１５を急速冷却することによる熱サイクルの別の実施形態を示す。次いで、反応器１５を低温槽５１に移動させて、反応器温度１３をＴＬＴの近傍に維持する。反応器移送経路５６に沿った熱サイクルの間、反応器１５は過熱状態であり得る高温槽５０を出て、アンダーヒート槽６１内に移動してＴＬＴの近傍に急速に到達し、次いで低温槽５１内に移動し、必要とされる時間ＴＬＴを持続し、熱サイクルのために反応器１５を高温槽５０に移動し戻す前に、リアルタイム定量ＰＣＲを行うために反応器１５の蛍光画像化を行う。上述した熱サイクルの各サイクルでの反応器１５の蛍光画像化は、あらゆる用途に必要でないことがある。幾つかの用途では、核酸分析の合計時間を短縮するために、反応器１５の蛍光画像化を数サイクルごとに行うことができる。反応器１５の蛍光画像化は、エンドポイントＰＣＲ検出を行うために、熱サイクルの終わりに行うことができる。図８（ｂ）は、本実施形態における高温槽５０、アンダーヒート槽６１、及び低温槽５１の概略図を示す。また、アンダーヒート槽６１を室温未満に冷却することもできる。アンダーヒート槽６１の温度が低いほど、反応器１５のＴＬＴ近傍への冷却は速くなる。反応器１５をアンダーヒート槽６１から移動させる前に、反応器温度１３はＴＬＴと同じであってもよく、それより低くてもよく、それより高くてもよい。低温槽５１に移送する前にアンダーヒート槽６１において反応器１５をＴＬＴちょうどに冷却することは困難であり得る。このような困難性には、温度センサからの高いサンプリングレートが可能な温度コントローラの利用可能性、高速温度信号処理、通信ポートを介した温度コントローラ又は信号処理コントローラへの高速温度データ転送、反応器１５を低温槽５１の外に移動させる作動機構の遅れなどが含まれる。従って、低温槽５１に移送する前に、アンダーヒート槽６１において、ＴＬＴよりも０．５〜５℃低いか又は高い温度範囲であるＴＬＴの近傍に冷却された反応器１５を有することが現実的である。反応器１５をアンダーヒート槽６１から低温槽５１に移動した後にＴＬＴに到達する温度変化を速めるために、低温槽５１をＴＬＴと異なる温度に設定することができる。例えば、温度３５のアンダーヒート槽６１において反応器１５をＴＬＴ未満に冷却する場合、図８（ｃ）に示すように、低温槽５１における温度１４をＴＬＴより高く設定することができる。同様に、アンダーヒート槽６１において反応器１５をＴＬＴよりも高い温度に冷却する場合、低温槽５１における温度１４をＴＬＴより低く設定することができる。具体的には、低温槽５１内の温度をＴＬＴの近傍にすることができる。アンダーヒート槽６１内の槽媒体温度の選択は、反応器１５の熱伝達特性に応じて変えることができる。例えば、ガラス又は金属材料からなる反応器１５の場合、アンダーヒート槽６１の温度３５を室温又はその近傍に設定することができ、一方で、プラスチックからなる反応器１５の場合、アンダーヒート槽６１の温度３５を室温よりも実質的に低く、又は室温に設定することができる。上記の温度設定はまた、反応器１５の容積及び反応器１５の壁厚にも依存する。大型反応器１５及びプラスチックからなる反応器１５の場合、熱電クーラー又は再循環液体冷却システムによってアンダーヒート槽６１を積極的に冷却し、０℃を僅かに超える温度から２０℃までなどの非常に低い槽温を達成することができる。凍結防止剤の使用又は塩の使用により、アンダーヒート槽６１においてサブゼロ液を使用して反応器の冷却速度をさらに高めることができる。上記の非常に強いアンダーヒート又は冷却手段は、プラスチック反応器１５を急速に冷却するだけでなく、ガラス又は金属又はプラスチック−金属反応器１５を急速に冷却する。さらに、図７（ｃ）に示す熱サイクルスキームがＴＨＴへの急速加熱のためにオーバーヒート槽を組み込む場合、熱サイクルプロセス全体をさらに短縮することができる。さらに、反応器１５をアンダーヒート槽６１から低温槽５１に移送した後の時間を短縮するために、低温槽５１をＴＬＴよりも高い温度に設定することができ、それにより反応器温度がＴＬＴを超えて上昇し、必要とされる時間ＴＬＴの近傍に到達することを可能にするか、又は、図６（ｅ）に示すプロセスと同様にアンダーヒート槽６１と低温槽５１との間で反応器１５の循環移送を行い、必要とされる時間ＴＬＴの近傍に到達することを可能にする。上記スキームにおいて、アンダーヒート槽６１は、室温又は室温未満又は室温を超える温度に維持することができる。図７（ａ、ｂ、ｃ）に示す時間にわたって反応器温度１３を目標温度に維持する同じ戦略を、反応器温度１３を一定時間にわたってＴＨＴに維持するために、高温槽５０にも適用することができる。
【００４９】
図９（ａ）は、安定化槽の配備を伴う実施形態（３ステップＰＣＲ）を記載する。反応器温度１３は、温度ＴＨＩＧＨに設定された場合に、高温槽５０内で上昇する（８２）。反応器温度１３は、反応器１５がＴＨＴの安定化槽内にある場合、安定化する（９２）。反応器温度８３は、温度ＴＬに設定された低温槽５１内で下降する。反応器温度１３は、反応器１５がＴＬＴの安定化槽内にある場合、安定化する（９３）。反応器温度１３は、ＴＭＥＤＩＵＭの中間温度に上昇する（８４）。反応器温度９４は、反応器１５をＴＭＴに維持するための安定化槽内に反応器１５がある場合である。図９（ｂ）は、３ステップＰＣＲの別の実施形態であり、図８（ａ）においてＴＨＴ及びＴＬＴの安定化槽を配備しないような実施形態を記載する。図９（ｃ）は、安定化槽を配備した３ステップＰＣＲの別の実施形態を記載し、ここで、異なる槽内の槽媒体７５は異なる。例えば、高温槽５０内の槽媒体７５は、熱伝導性粒子であってもよいし、１００℃を超えるような高い蒸発温度を有する液体であってもよく、低温槽５１の槽媒体７５は純水である。反応器温度１３は、温度ＴＨＩＧＨに設定され、金属粉末又は液体を含む場合に、高温槽５０内で上昇する（８２）。反応器温度１３は、温度ＴＬＯＷに設定され、金属粉末又は液体を含む低温槽５１内で下降する（８３）。反応器温度１３は、金属粉末又は液体を含む温度ＴＭＥＤＩＵＭに設定された中温又は高温槽内で上昇する（８４）。反応器温度１３は、反応器１５を中間目標温度ＴＭＴに維持するための安定化槽であって、金属粉末又は液体又は加熱空気を含む安定化槽内で反応器１５が安定化している（９４）場合である。反応器温度１３は、反応器１５の少なくとも１つの蛍光画像を撮影するために、加熱空気を含む別の安定化槽又は安定化槽の外側の空気ゾーンで反応器１５が安定化している（９５）場合に達成される。図９（ｄ）は、槽を温度ＴＭＥＤＩＵＭに設定せず、安定化（９４、９５）をＴＬＴで行う図８（ｃ）の方法を示す。
【００５０】
図１０（ａ）は、熱サイクル中に反応器１５を移送する経路５６にオーバーヒート槽６０を追加してオーバーヒート槽６０内のＴＨＴへの温度勾配を速める、別の実施形態を示す。熱サイクルの間、反応器１５は低温槽５１を出てオーバーヒート槽６０内に移動してＴＨＴの近傍に急速に到達し、次いで高温槽５０内に移動して、低温槽５１に移動し戻す前に、場合によっては低温槽５１に移動する前にアンダーヒート槽６１を介して、必要とされる時間にわたってＴＨＴの近傍を持続する。オーバーヒート槽６０の温度が高いほど、反応器１５のＴＨＴ近傍への加熱は速くなる。好ましくは、オーバーヒート槽６０内の温度は、１００℃と１３５℃の間である。図７ａ〜ｃに記載された槽の設定及び温度制御と同様に、高温槽５０をＴＨＴとは異なる温度に設定することができる。具体的には、高温槽５０内の温度をＴＨＴの近傍又は外側にすることができる。図１０（ｂ）は、図９（ａ）の実施形態から高温槽５０を取り除いた別の実施形態を示す。この実施形態における熱サイクルの間、反応器１５は低温槽５１を出て、オーバーヒート槽６０内に移動してＴＨＴの近傍に急速に到達し、次いで低温槽５１に移動し戻し、場合によっては低温槽５１に移動する前にアンダーヒート槽６１を介する。
【００５１】
図１１（ａ）は、３ステップＰＣＲを含む３つの温度を含む生物学的又は生化学的反応を実施する方法を示しており、３つの加熱槽が熱サイクルのための反応器１５を移送する経路５６内に取り付けられている。３つの槽は、変性のための高温槽５０、プライマー伸長のための中温槽５２、及びアニーリングのための低温槽５１を含む。図１１（ｂ）は、追加のアンダーヒート槽６１を低温槽５１の前に熱サイクル経路５６内に任意に追加すること、及び、それぞれ中温槽５２及び高温槽５０の前にオーバーヒート槽６０を熱サイクル経路５６内に任意に追加することを示す。図１１（ｃ）は、図１０（ｂ）に示す実施形態を変形した実施形態を示しており、中温槽５２の前に加えられたオーバーヒート槽６０が熱サイクル経路５６から取り除かれている。この実施形態における熱サイクルの間、反応器１５は低温槽５１を出て、高温槽５０のために設定されたオーバーヒート槽６０に入るか、又は破線において高温槽５０に入り、図８（ａ）に示すように中間目標温度５の近傍に急速に到達し、次いで中温槽５２に移動して、伸長のために必要とされる時間にわたって中間目標温度５で安定化される。一旦伸長が完了すると、反応器１５はオーバーヒート槽６０に移動してＴＨＴの近傍まで急速に到達し、次いで、低温槽５１に移動し戻す前に、又は場合によっては低温槽５１に移動する前にアンダーヒート槽６１を介して、変性のために必要とされる時間、高温槽５０に移動する。図１１（ｄ）は、図１０（ｃ）に示す実施形態を変形した実施形態を示しており、低温槽５１及び高温槽５０が移動されている。この実施形態における熱サイクルの間、反応器１５はアンダーヒート槽６１に入り、図８（ｂ）に示すように一旦反応器１５がＴＬＴに到達すると、反応器はアンダーヒート槽６１を出て高温槽５０のために設定されたオーバーヒート槽６０に入り、図８（ｂ）に示すように中間目標温度５の近傍に急速に到達し、次いで中温槽５２に移動して、伸長のために必要とされる時間にわたって中間目標温度５で安定化される。一旦伸長が完了すると、反応器１５はオーバーヒート槽６０に移動して、アンダーヒート槽６１に移動し戻す前にＴＨＴの近傍まで急速に到達する。図１０から図１１に記載する実施形態では、内部の槽媒体７５が光透過性であり、自己蛍光が低い場合、反応器１５は、槽５１、５２、６０、及び６１のうちの１つの内部において蛍光検出のために画像化することができ、このような槽媒体７５は、水、水−グリセロール混合物、油、及び加熱された又は加熱されていない空気であり得る。槽５１、５２、６０、及び６１内部の槽媒体７５が光透過性ではなく、又は自己蛍光が高い場合、蛍光画像化のために、槽の外側又は槽内部の槽媒体の上方の加熱された又は加熱されていない空気のゾーンに反応器１５を移動させることができる。核酸試料に対して異なる温度に設定された加熱槽の中で反応器１５を急速に移送する本方法は、逆転写及び／又は等温増幅及び／又はプライマー伸長などの少なくとも１つの前処理を追加的に組み込むことができる。図１２は、ＰＣＲを開始する前に少なくとも１つの予熱槽５３を含む、生物学的又は生化学的反応を実施する方法を示す。少なくとも１つの予熱槽５３は、逆転写及び／又は等温増幅及び／又はプライマー伸長に適した温度に設定することができる。反応器１５を予熱槽５３に曝した後、反応器を等温ＤＮＡ処理ステップ及び／又はＰＣＲ熱サイクルのために他の槽に移送する。図示された実施形態では、核酸処理要件に応じて多くの槽が任意であり、任意の槽は、オーバーヒート槽６０、アンダーヒート槽６１、及び中温槽５２を含む。別の実施形態では、目標温度を超える加熱法、すなわちオーバーヒートもアンダーヒートも使用されていない。この実施形態では、槽は、核酸分析又は処理に必要とされる目標温度に設定される。この実施形態では、１つ以上の以下の手段が使用される：
１）反応器は、少なくとも１つの槽の内部を往復するように高速で移動する、
２）反応器移送機構８５は、４秒未満、好ましくは１秒未満で、反応器を１つの槽から別の槽に移送する、
３）槽は、より短い槽寸法を形成する槽表面に配置された槽ヒーター１７を伴って、高いアスペクト比の幾何学的形状を有する、
４）より低い温度を有する槽５１は、槽５１内部に位置する反応器１５内の液体試料の蛍光画像化のために、光学的に透明な窓２７を有する。
【００５２】
小さいボアガラスキャピラリーなどの狭い内部空洞を有する小型反応器１５は、反応器空洞内の液体の下に空気を閉じ込めることがあるため、通常のピペットで試料及び試薬液を充填することは困難である。そのような狭い空洞内に液体を充填するために、以下の手段を使用することができる：１）分配された液体を反応器空洞の入口に遠心分離すること、２）空洞の内部通路よりも細いチューブを空洞の底部の下に挿入すること、３）液体を充填する前に、真空を使用して空洞内の空気を除去すること、４）予め真空にされた空洞を使用して液体を充填すること、及び５）液体を充填する際に少なくとも１つの通気孔を有する空洞を使用し、その通気孔を密閉すること。液体を充填した後、熱サイクルが始まる前に充填ポートを密閉する。
【００５３】
異なる槽は、所望の特定の利点のために異なる槽媒体７５を含むことができる。反応器１５は、プラスチック、エラストマー、ガラス、金属、セラミック及びそれらの組み合わせから構成されてもよく、ここでプラスチックは、ポリプロピレン及びポリカーボネートを含む。ガラス反応器１５は、０．１ｍｍ〜３ｍｍのＯＤ及び０．０２ｍｍ〜２ｍｍのＩＤのような小さい直径のガラスキャピラリーの形態で作製することができ、金属は、薄膜、細い空洞、及びキャピラリーの形態のアルミニウムであり得る。反応器の材料は、化学的又は生物学的安定性を有する非生物活性材料から作製することができる。反応器１５の少なくとも一部は透明であることが好ましい。別の実施形態では、反応器１５は、反応器アレイチップ又はマイクロ流体反応器チップ又はアレイチップの形態であり得る。例えば、反応器１５は、基板プレートのウェル又はチャネルの形態であってもよく、場合によっては、固体材料層で覆われて反応物質２１が配置された閉鎖反応チャンバーを形成してもよい。
【００５４】
反応器ホルダ３３における全ての反応器１５内の反応物質２１は同一でなくてもよい。槽温が適切である場合、異なる物質に対して同時のＰＣＲを有利に行うことができる。反応器壁の少なくとも一部は、厚さ１μｍ〜２ｍｍの金属シートで作製することができる。この特徴は、槽と反応物質２１との間の熱伝達率を高める。反応器壁の少なくとも一部は、厚さ０．５μｍ〜５００μｍのプラスチック又はガラスシートで作製することができる。反応器壁の少なくとも一部は、画像化及び検出プロセスを可能にするように透明材料で作製される。
【００５５】
本発明は、反応器ホルダ３３における単一の反応器１５又は複数の反応器１５にも等しく適用可能である。上記の説明で使用される用語「液体」は、熱媒体の総称である。本発明の場合、熱媒体は、液体、水、溶媒又は他の化学流体又は他の固体粒子、固体粒子、金属粒子、銅粒子及び粉末と混合された水のような異なる形態であってもよい。
【００５６】
本発明をさらに説明し明確に理解するために、以下の幾つかの実施例及び図解を組み合わせて、本発明、特に試料試験を行うために装置を使用する方法をさらに指示する。
【実施例】
【００５７】
実施例１．１：核酸分析のための方法であって、以下のステップ：少なくとも１種の反応物質２１を少なくとも１つの反応器１５に添加するステップ、反応器１５を密閉するステップ、核酸を増幅させるステップ、及び、核酸増幅中にオーバーヒート及び／又はアンダーヒート法を使用するステップを含み、ここでは、少なくとも１つの加熱槽の温度は核酸増幅に必要とされる目標温度よりも高いか又は低いと記載される。反応器１５は、核酸が増幅される際、熱サイクルのために異なる温度を有する少なくとも２つの加熱槽内に交互に配置される。反応器１５の温度が核酸増幅に必要とされる目標温度に近づくか又は等しい場合、反応器１５は、反応器１５が入っている加熱槽から別の加熱槽に迅速に移動する。オーバーヒート及び／又はアンダーヒート法が核酸増幅のために３ステップ法を使用する場合、加熱槽Ｉの温度を予備変性及び変性に必要とされる目標温度よりも高く設定し、加熱槽ＩＩの温度を変性に必要とされる目標温度よりも低く設定し、加熱槽ＩＩＩの温度を伸長に必要とされる目標温度よりも高く設定し、反応器の熱サイクルを、加熱槽Ｉ、加熱槽ＩＩ、加熱槽ＩＩＩ、加熱槽Ｉの順序に従って交互に行う。
【００５８】
実施例１．２：本実施例と実施例１．１との違いは、反応器１５の温度が核酸増幅に必要とされる目標温度に到達すると、反応器１５を加熱浴Ｉから移動させて加熱浴ＩＩに迅速に移送することである。
【００５９】
実施例１．３：本実施例と実施例１．１との違いは、反応器１５の温度が核酸増幅に必要とされる目標温度を超えると、反応器１５を加熱槽ＩＩＩから加熱槽ＩＶに迅速に移動させ、加熱槽ＩＶの温度を伸長に必要とされる目標温度に設定することである。
【００６０】
実施例２．１：本実施例と実施例１．１との違いは、それが核酸増幅の前に逆転写（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）も含むことである。
【００６１】
実施例２．２：本実施例と実施例２．１との違いは、逆転写が核酸増幅の熱サイクルの前又は同時に行われることである。
【００６２】
実施例２．３：本実施例と実施例２．２との違いは、核酸増幅の前に逆転写が行われ、それは加熱槽を添加する必要があるか、又は加熱槽の温度を逆転写に必要とされる目標温度に設定する必要があり、次いで、加熱槽の温度を核酸増幅に必要とされる目標温度に設定する必要があることである。
【００６３】
実施例３．１：本実施例と実施例１．１との違いは、温度過上昇（ｏｖｅｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）法が核酸増幅のために３ステップ法を使用する場合、第１加熱槽の温度を予備変性及び変性に必要とされる目標温度よりも高く設定し、加熱槽ＩＩの温度を予備変性及び変性に必要とされる目標温度に設定し、加熱槽ＩＩＩの温度をアニーリングに必要とされる目標温度よりも低く設定し、加熱槽ＩＶの温度をアニーリングに必要とされる目標温度に設定し、加熱槽Ｖの温度を伸長に必要とされる目標温度に設定し、反応器１５の熱サイクルを、加熱槽Ｉ、加熱槽ＩＩ、加熱槽ＩＩＩ、加熱槽ＩＶ、加熱槽Ｖ、加熱槽Ｉなどの順序に従って、異なる温度を有する加熱槽の間で交互に行うことである。
【００６４】
実施例３．２：本実施例と実施例１．１との違いは、温度過上昇法を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、反応器１５を異なる温度を有する加熱槽内に交互に配置することである。加熱槽はそれぞれ、加熱槽Ｉ、加熱槽ＩＩ、加熱槽ＩＩＩ、加熱槽ＩＶ、加熱槽Ｖ、加熱槽ＶＩである。加熱槽Ｉの選択温度は１０５〜１３５℃である。加熱槽ＩＩの選択温度は９５℃である。加熱槽ＩＩＩの選択温度は１０〜４０℃である。加熱槽ＩＶの選択温度は５０℃である。加熱槽Ｖの選択温度は８２〜１１２℃である。加熱槽ＶＩの選択温度は７２℃である。加熱槽Ｉの選択温度は、予備変性及び変性に必要とされる目標温度よりも高く、加熱槽ＩＩＩの選択温度は、アニーリングに必要とされる目標温度よりも低く、加熱槽Ｖの選択温度は、伸長に必要とされる目標温度よりも高い。加熱槽Ｉ内の反応器の温度は、数秒間の間に目標温度９５℃に到達するか、それに近づくか、又はそれを超え、反応器は加熱槽Ｉから加熱槽ＩＩに迅速に移動される。加熱槽ＩＩＩ内の反応系の温度は、数秒間の間に目標温度５０℃に到達するか、それに近づくか、又はそれを超え、次いで、反応器は加熱槽ＩＶに迅速に移動される。加熱槽Ｖ内の反応系の温度は、数秒間の間に目標温度７２℃に到達するか、それに近づくか、又はそれを超え、次いで、反応器１５は加熱槽ＶＩに迅速に移動される。次いで、反応器１５を作動トラックＡに従って、順番に加熱槽Ｉ、加熱槽ＩＩ、加熱槽ＩＩＩ、加熱槽ＩＶ、加熱槽Ｖ、加熱槽ＶＩ、加熱槽Ｉに移動させ、そのような３５サイクルの全プロセスは数分のみを必要とする。もちろん、ここでの移送は人工的なものでもよく、図１に示す反応器移送機構８５を用いて機械化することもできる。この種の方法は、どのような種類であっても、通常のＰＣＲと比較して時間を節約でき、高速で、高効率であり、出現時の検出に適している。ＰＣＲ装置を使用する場合は、そのプロセスは、３５サイクルにわたる、９５℃での予備変性４分、９５℃での変性１分、５０℃でのアニーリング１分、７２℃での伸長１．５分、７２℃での伸長５分、９５℃での変性１分、５０℃でのアニーリング１分、７２℃での伸長１．５分に分割され、最後は４℃で保持される。全プロセスは２時間近くかかり、低速で低効率である。
【００６５】
実施例３．３：本実施例と実施例１．１との違いは、上記の何れのスキームにおいても、好ましくは、温度過上昇法が核酸増幅のために２ステップ法を使用する場合、加熱槽Ｉの温度を予備変性及び変性に必要とされる目標温度よりも高く設定し、加熱槽ＩＩの温度をアニーリング又は伸長に必要とされる目標温度よりも低く設定することである。
【００６６】
実施例３．４：本実施例と実施例３．３との違いは、温度過上昇法が核酸増幅のために２ステップ法を使用する場合、加熱槽Ｉの温度を予備変性及び変性に必要とされる目標温度よりも高く設定し、加熱槽ＩＩの温度をアニーリングに必要とされる目標温度よりも低く設定し、加熱槽ＩＩＩの温度をアニーリングに必要とされる目標温度に設定し、反応器１５を加熱槽Ｉから加熱槽ＩＩに移送し、アニーリングに必要とされる目標温度よりも低い温度として加熱槽ＩＩＩに迅速に移送し、交互の循環のために一定時間後に加熱槽Ｉに移送し、核酸増幅の熱サイクルステップが加熱槽Ｉ、加熱槽ＩＩ、加熱槽ＩＩＩ、次いで加熱槽ＩＩであることである。
【００６７】
前述の説明から、特許請求の範囲に定義された本発明から逸脱することなく、設計、構成及び動作の詳細の多くの変形又は修正がなされ得ることが、当業者に理解されるであろう。
【符号の説明】
【００６８】
１５      反応器
１６      クーラー
１７      槽ヒーター
２１      反応物質
２２      水又は油又は水の上の油の層
２５      透明な窓
３１      カード
３３      反応器ホルダ
３４      温度監視ユニット
３８      高速応答温度センサ
３９      槽温センサ
５０      槽（高温槽）
５１      槽（低温槽）
５２      槽（中温槽）
５３      槽（予熱槽）
５４      槽
５６      反応器移送経路
６０      オーバーヒート槽
６１      アンダーヒート槽
７５      槽媒体
７７      シーラント又はキャップ
８５      反応器移送機構
８６      Ｘステージ
８７      Ｘ軸線形ガイド
８８      Ｚステージ
８９      Ｚ軸線形ガイド
２０４    槽モジュール
２０５    温度制御モジュール
２０６    光学モジュール
２０７    作動コントローラ
２０８    システムコントローラ
３０９    光ファイバ
３１０    光ファイバ
３１３    入口
３１５    チャネル
【図１ａ】
2019505228.tif 000008
【図１ｂ】
2019505228.tif 000009
【図１ｃ】
2019505228.tif 000010
【図２】
2019505228.tif 000011
【図３】
2019505228.tif 000012
【図４ａ】
2019505228.tif 000013
【図４ｂ】
2019505228.tif 000014
【図５ａ】
2019505228.tif 000015
【図５ｂ】
2019505228.tif 000016
【図６ａ】
2019505228.tif 000017
【図６ｂ】
2019505228.tif 000018
【図７ａ】
2019505228.tif 000019
【図７ｂ】
2019505228.tif 000020
【図７ｃ】
2019505228.tif 000021
【図７ｄ】
2019505228.tif 000022
【図７ｅ】
2019505228.tif 000023
【図８ａ】
2019505228.tif 000024
【図８ｂ】
2019505228.tif 000025
【図８ｃ】
2019505228.tif 000026
【図９ａ】
2019505228.tif 000027
【図９ｂ】
2019505228.tif 000028
【図９ｃ】
2019505228.tif 000029
【図９ｄ】
2019505228.tif 000030
【図１０（ａ）】
2019505228.tif 000031
【図１０（ｂ）】
2019505228.tif 000032
【図１１（ａ）】
2019505228.tif 000033
【図１１（ｂ）】
2019505228.tif 000034
【図１１（ｃ）】
2019505228.tif 000035
【図１１（ｄ）】
2019505228.tif 000036
【図１２】
2019505228.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月20日(2018.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱プロファイルにおいて核酸を熱処理する装置であって、前記装置は、核酸を含む反応物質をそれぞれが収容する反応器を保持する反応器ホルダと、チューブ又はウェルプレート又はチップ又はカートリッジなどの任意の形態である反応器とを使用し、前記装置はまた、反応器温度センサと槽媒体とを使用し、前記装置は、
第１の槽及び第２の槽であって、槽内の槽媒体はそれぞれ、２つの異なる温度ＴＨＩＧＨ及びＴＬＯＷで維持可能である、第１の槽及び第２の槽と、
複数の熱サイクルで前記反応器を２つの前記槽内に配置し、
−所定の高い目標温度ＴＨＴと、
−所定の低い目標温度ＴＬＴと
に交互に到達することを可能にする移送手段と
を含み、
さらに、前記装置は、
ａ）ＴＨＴがＴＨＩＧＨよりも低い、
ｂ）ＴＬＴがＴＬＯＷよりも高い、及び
ｃ）ａ）及びｂ）の条件、
からなる群からの少なくとも１つの条件によって規定された温度オフセット特性に適合し、
前記移送手段は、
熱サイクル中に前記反応器温度センサによって感知されたリアルタイム温度に基づいて動作可能な温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ）と、
前記反応器が前記槽内に配置される時間周期に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ）と
からなる群からの少なくとも１つのモードによって動作可能であり、
前記槽の何れかにおける槽媒体は、空気、液体、固体、粉末及びこれらの何れかの混合物を含む任意の相である、装置。
【請求項２】
ＴｉＧＭＣＭは、時間周期に対してユーザーが較正することができる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
さらに第３の槽を含み、槽媒体は中間温度ＴＭＥＤＩＵＭで維持可能であり、前記移送手段は、前記反応器を前記第３の槽内に配置し、所定の中間目標温度ＴＭＴに到達することを可能にし、ＴＭＥＤＩＵＭはＴＭＴと同じであるか、又はＴＭＴからオフセットされている、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
さらに第４の槽を含み、槽媒体は、熱サイクル前に反応器に対する追加プロセスを可能にするために温度ＴＡＰで維持可能であり、前記追加プロセスは、
ｅ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、
ｆ）ホットスタートプロセス及び
ｃ）等温増幅反応
からなる群からの１つであり、
前記移送手段は、前記反応器を前記第４の槽内に配置し、追加プロセス目標温度ＴＡＰＴに到達することを可能にし、ＴＡＰはＴＡＰＴと同じであるか、又はＴＡＰからオフセットされている、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記第１の槽内の槽媒体は、１００℃を超えて維持可能である、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記第２の槽内の槽媒体は、室温よりも低く維持可能である、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記移送手段は、前記反応器の過熱又は過冷却を不必要に引き起こす動作上の電気機械的遅れを相殺するために、前記反応器がＴＨＴよりも低い第１のリフトオフ温度及びＴＬＴよりも高い第２のリフトオフ温度に到達する場合に前記反応器の槽からのリフトオフを開始するようにユーザーが較正することができる、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
熱サイクルの間に任意の槽内の温度を変更する変更手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
ＴＨＴは、核酸の変性のために８５〜９９℃の領域にあり、ＴＬＴは、核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリング又はプライマー伸長のために４５〜７５℃の領域にあり、前記第１及び第２の槽は、反応器を熱サイクルしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅又はプライマー伸長を達成するためのものである、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
熱プロファイルにおける温度安定化ステップのための第５の槽をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記温度安定化ステップは目標温度のうちの１つにおけるものである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記反応器が槽の何れかの中又は槽の外側の空気中にある場合に核酸を分析するための、蛍光画像化手段又は電気化学的検出手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
槽媒体が４０〜８０℃で維持可能な液体又は熱空気である第６の槽をさらに含み、前記槽媒体及び槽壁の少なくとも一部は透明であり、光源からの照射光の透過及び前記反応器からの放出光の透過を可能にする、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
ＴＨＩＧＨとＴＨＴとの間の第１のオフセットは、１〜４００℃の範囲内にあり、ＴＬＯＷとＴＬＴとの間の第２のオフセットは、１〜１００℃の範囲内にある、請求項９に記載の装置。
【請求項１５】
前記第１の槽内の槽媒体は、第２の液体に添加された第１の液体であり、前記第２の液体の沸点は前記第１の液体の沸点よりも高い、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記第１の液体と前記第２の液体との混合物の沸点は１００℃よりも高い、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記槽上の槽カバーであって、前記反応器を槽内に配置することを許容するように開口し、前記反応器が槽から除去された後に閉じる、槽カバーをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
前記槽媒体の温度を監視する槽センサと、
熱サイクル中に前記反応器ホルダとともに移動して前記反応器の温度を監視することができる反応器温度センサと
をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
前記反応器温度センサを封入する物質を含む容器をさらに含み、前記容器及び前記物質は、前記反応器及び前記反応物質と同様の構成又は熱伝達特性を有する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記反応器を受け入れて、熱サイクル後に融解曲線分析を行いながら徐々に加熱されることができる、第７の槽をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
熱プロファイルにおいて核酸を熱処理する方法であって、
核酸を含む反応物質をそれぞれが収容する反応器を保持する反応器ホルダと、チューブ又はウェルプレート又はチップ又はカートリッジなどの任意の形態である反応器とを使用するステップと、
第１の槽及び第２の槽を含む装置を使用するステップと、
前記第１の槽内の槽媒体を温度ＴＨＩＧＨに、前記第２の槽内の槽媒体を温度ＴＬＯＷに維持するステップと、
前記装置において移送手段を使用するステップであって、複数の熱サイクルで前記反応器を２つの槽内に配置し、
−所定の高い目標温度ＴＨＴと、
−所定の低い目標温度ＴＬＴと
に交互に到達することを可能する、ステップと、
ａ）ＴＨＴがＴＨＩＧＨよりも低い、
ｂ）ＴＬＴがＴＬＯＷよりも高い、及び
ｃ）ａ）及びｂ）の条件、
からなる群からの少なくとも１つの条件によって規定された温度オフセット特性に適合させるステップと
を含み、
前記移送手段は、
熱サイクル中に反応器温度センサによって感知されたリアルタイム温度に基づいて動作可能な温度誘導作動制御手段（ＴｅＧＭＣＭ）と、
前記反応器が槽内に配置される時間に基づいて動作可能な時間誘導作動制御手段（ＴｉＧＭＣＭ）と
からなる群からの少なくとも１つのモードによって動作可能であり、
前記槽の何れかにおける槽媒体は、空気、液体、固体、粉末及びこれらの何れかの混合物を含む任意の相である、方法。
【請求項２２】
前記装置において第３の槽を中間温度ＴＭＥＤＩＵＭに維持するステップであって、前記移送手段は、前記反応器を前記第３の槽内に配置し、所定の中間目標温度ＴＭＴに到達することを可能にし、ＴＭＴはＴＭＥＤＩＵＭと同じであるか、又はＴＭＥＤＩＵＭからオフセットされている、ステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
熱サイクル前に反応器に対する追加プロセスを第４の槽において可能にするステップであって、槽媒体は、温度ＴＡＰで維持され、前記追加プロセスは、
ｇ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、
ｈ）ホットスタートプロセス及び
ｃ）等温増幅反応
からなる群からの１つである、ステップと、
前記移送手段を使用するステップであって、前記反応器を前記第４の槽内に配置し、追加プロセス目標温度ＴＡＰＴに到達することを可能にし、ＴＡＰはＴＡＰＴと同じであるか、又はＴＡＰからオフセットされている、ステップと
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の槽内の槽媒体を１００℃を超えて維持するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の槽内の槽媒体を室温よりも低く維持するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応器の過熱又は過冷却を不必要に引き起こす動作上の電気機械的遅れを相殺するために、前記反応器がＴＨＴよりも低い第１のリフトオフ温度及びＴＬＴよりも高い第２のリフトオフ温度に到達する場合に前記反応器の槽からのリフトオフを開始するように、前記移送手段を較正するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
熱サイクルの間に前記装置における変更手段によって任意の槽内の温度を変更するステップをさらに含む、請求項２１から２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＴＨＴは、核酸の変性のために８５〜９９℃の領域にあり、ＴＬＴは、核酸上へのプライマー又はプローブのアニーリング又はプライマー伸長のために、４５〜７５℃の領域にあり、前記第１及び第２の槽は、反応器を熱サイクルしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅又はプライマー伸長を達成するためのものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
熱プロファイルにおける温度安定化ステップのために第５の槽を使用するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記温度安定化ステップは目標温度のうちの１つにおけるものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記反応器が槽の何れかの中又は槽の外側の空気中にある場合に核酸を分析するために、前記装置において蛍光画像化又は電気化学的検出を行うステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
槽媒体が４０〜８０℃で維持可能な液体又は熱空気である第６の槽を使用するステップであって、前記槽媒体及び槽壁の少なくとも一部は透明であり、光源からの照射光の透過及び前記反応器からの放出光の透過を可能にする、ステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＨＩＧＨとＴＨＴとの間の第１のオフセットを１〜４００℃の範囲内に設定するステップと、
ＴＬＯＷとＴＬＴとの間の第２のオフセットを１〜１００℃の範囲内に設定するステップと
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の槽内の槽媒体において、第２の液体を第１の液体に添加するステップであって、前記第２の液体の沸点は前記第１の液体の沸点よりも高い、ステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の液体と前記第２の液体との混合物の沸点は１００℃よりも高い、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記槽上に槽カバーを使用するステップであって、前記カバーは、前記反応器を槽内に配置することを許容するように開口し、前記反応器が前記槽から除去された後に閉じる、ステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
熱サイクル中に反応器温度センサを前記反応器ホルダとともに移動するステップであって、前記反応器の温度を監視する、ステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
前記反応器温度センサを封入する物質を含む容器を使用するステップであって、前記容器及び前記物質は、前記反応器及び前記反応物質と同様の構成又は熱伝達特性を有する、ステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記反応器を受け入れるために前記装置において第７の槽を使用するステップと、
前記第７の槽を徐々に加熱しながら熱サイクル後に融解曲線分析を行うステップと
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【国際調査報告】
2019505228.tif 000038
2019505228.tif 000039