(57)【要約】【課題】ＨＰＶタンパク質抗原が投与される被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物の提供。【解決手段】被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、この組成物が、ストレスタンパク質に連結したＨＰＶタンパク質抗原を含む、組成物であって、１つの実施形態において、上記免疫応答が、細胞性免疫応答であり、上記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質であり、また、上記ＨＰＶタンパク質抗原が、Ｅ６またはＥ７タンパク質である、組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、該組成物が、ストレスタンパク質に連結したＨＰＶタンパク質抗原を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、ヒトパピローマウイルスタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための、連結したストレスタンパク質およびヒトパピローマウイルスタンパク質抗原を含む方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）での感染は普通であり、そしてウイルスは
性感染し得る。性的活動のある成人の２０〜８０％が感染していると見積もられる。感染の大多数は無症候性であるが、感染は、肛門性器管の性器いぼおよびガンの発生を生じ得る。性器いぼは、成人のうちの１〜５％の有病率を有する。世界中の女性の約１パーセントが、子宮頸ガンにかかっており、これは、５０歳未満の女性の最も普通の死亡原因である。子宮頸ガンは、ＨＰＶに強く関連する。Ｆｒａｚｅｒ，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｍｅｄ  ７２：３９８−４０３（１９９６）。
【０００３】
現在、ＨＰＶに対する、有効な治療組成物も予防組成物、すなわちワクチンも利用可能ではなく、したがって有効な組成物の開発の必要がある。従来の死菌または生弱毒ワクチンについての見込みは少ないようである。Ｆｒａｚｅｒによれば、ＨＰＶは、細胞培養物中でまだ増殖されておらず、そしてＨＰＶ感染の腫瘍促進効果ならびにＨＰＶの完全な種特異性は、容易に克服できないさらなる困難性を示す（Ｆｒａｚｅｒ，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｍｅｄ  ７２：３９８−４０３（１９９６））。真核生物細胞で発現される場合、主要なキャプシドタンパク質が、アジュバントなしで免疫原性であるウイルス様粒子を形成するという観察が、ワクチンの開発の基礎を提供し得ることが、提案されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：２２７１−６（１９９４）；ＰＣＴ／ＥＰ９５／０３９７４およびＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９１４も参照のこと）。
【０００４】
ＨＰＶは、ＳＶ４０およびポリオーマウイルスもまた含むパポーバウイルス科のＡ属に属する。６８を超える異なるタイプのＨＰＶは、構造的に非常に関連するがＤＮＡ配列レベルで５０％未満同一であることが特徴づけられている。すべての公知のタイプは、特定のタイプの上皮に感染し、そして頻繁に上皮増殖を生じる、上皮親和ウイルスである。いくつかのタイプを、尋常性ゆうぜいにおいて同定した。２３タイプは、女性および男性の肛門性器管に感染することが公知である。これらのタイプのＨＰＶによって引き起こされる肛門性器疾患は、尖圭コンジロームから侵襲性扁平上皮ガンまでの範囲である。ＨＰＶ  ＤＮＡは、バイオプシーで確認した扁平上皮内病変または子宮頚部上皮内新形成のある女性のうちの８０％より多くの女性で同定され得る。ＨＰＶ  １６、１８、および３１を含むいくつかの特定のタイプは、子宮頚部、外陰部、陰茎、および肛門の高い程度の扁平上皮内病変および侵襲性ガンと強く関連する（Ｌｏｒｉｎｃｚら，Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ７９：３２８−３７（１９９２））。Ｆｒａｚｅｒによれば、子宮頸ガンは、ＨＰＶと９０〜９５％関連する（Ｆｒａｚｅｒ，Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｍｅｄ  ７２：３９８−４０３（１９９６））。ＨＰＶは、肛門性器系のガンと関連するだけでなく、咽頭、喉頭、および膀胱ガンにも存在する（Ｂｒａｃｈｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：４８３２−６（１９９２）；Ｒｏｔｏｌａら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５２：３５９−６５（１９９２））。最近の研究は、ＨＰＶ  ＤＮＡがまた試験した肺ガンの３０％に存在することを報告した。同定されたタイプには、ＨＰＶ  ６、１１、１６、１８、３１、および３３が含まれた（Ｓｏｉｎｉら、Ｔｈｏｒａｘ  ５１：８８７−８９３（１９９６））。したがって、最もしばしばガンに関連するＨＰＶタイプは、６、１１、１６、１８、３１、および３３であり、そのうち、９０％を超える子宮頸ガンで検出されるＨＰＶ  １６および１８は、全体を通して最も研究されている（ｖａｎ  Ｄｒｉｅｌら、Ａｎｎ  Ｍｅｄ  ２８：４７１−４７７（１９９６））。
【０００５】
パピローマウイルスは、７８００〜７９００塩基対の二本鎖環状ＤＮＡゲノム、エンベロープに含まれていないビリオン、および７２カプソマーから作製される正二十面体キャプシドを有するＤＮＡウイルスである。このゲノムは、３つの主要な領域（後期遺伝子をコードする領域、初期遺伝子をコードする領域、および非コード領域）を含む（Ｐａｒｋら，Ｃａｎｃｅｒ  ７６：１９０２−１９１３（１９９５））。非コード領域は、上流調節領域ともいう。この領域は、約４００塩基対長であり、そして初期および後期遺伝子の発現を制御する種々の転写因子についての結合部位のアレイを含む。後期遺伝子領域は、ウイルスキャプシドタンパク質Ｌ１およびＬ２をコードする２つの別々のオープンリーディングフレームを有する。タンパク質Ｌ１は、異なるＨＰＶ種間で高度に保存される主要なキャプシドタンパク質である。初期遺伝子領域には、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、およびＥ７と命名された、６つのオープンリーディングフレームが含まれる。タンパク質Ｅ６およびＥ７は、ウイルス複製にならびに宿主細胞不死化および形質転換に重要なオンコプロテイン（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。タンパク質Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４も、ウイルス複製に重要な役割を果たす。さらに、Ｅ４は、このウイルスの成熟で機能する。Ｅ５の役割はあまり知られていない。
【０００６】
悪性腫瘍からの細胞は、２つの重要な増殖特徴を共有する。これらは不死化される、すなわち、これらは老化せずそして足場非依存性増殖が可能である。不死化齧歯類細胞へのＨＰＶ  １６またはＨＰＶ  １８  ＤＮＡの導入は、それらの形質転換を生じる、すなわち、これらは、下層付着の不在下で増殖する能力およびマウスに注射した場合に腫瘍を形成する能力を獲得する（Ｃｒｏｏｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８８２０−２４（１９８８））。ＨＰＶ  ＤＮＡが、継代初期の不死化されていない細胞に導入された場合に異なる結果が得られる：細胞は不死化されるが形質転換されない（Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：４６２０−２８（１９８８））。したがって、腫瘍が発生する１つの経路は、細胞の不死化を生じる変化、次いでその形質転換を生じるＨＰＶ遺伝子の発現を含む。インビトロでの細胞の形質転換に関連するＨＰＶ遺伝子は、Ｅ６および／またはＥ７をコードするＨＰＶ遺伝子である（Ｂｅｄｅｌｌら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６１：３６３５−４０（１９８７））。Ｅ６およびＥ７タンパク質が細胞形質転換を引き起こし得るメカニズムが提案されている（Ｐａｒｋら，Ｃａｎｃｅｒ  ７６：１９０２−１９１３（１９９５）、およびそこに引用される参考文献）。
【０００７】
Ｅ６は、Ｚｎ結合ドメインを含む小さい（約１５，０００ＭＷ）ポリペプチドである。そのトランスフォーミング機能に対する糸口は、このタンパク質がｐ５３を結合するという観察によって提供された。ｐ５３タンパク質は、細胞周期進行、その結果として、細胞増殖および分割をネガティブに調節する周知の腫瘍抑制タンパク質である。Ｅ６のｐ５３への結合は、後者のタンパク質のユビキチン化および結果としての分解を生じ、このプロセスは、「Ｅ６関連タンパク質」と呼ばれる別の細胞性タンパク質を含む。結果として、Ｅ６を発現する細胞は、減少した基礎レベルのｐ５３を有する。ｐ５３レベルは、ＤＮＡ損傷に応じて上昇する。このような増加したレベルは、サイクリン依存的キナーゼのインヒビターである、ｐ２１の増強した発現を生じ、このタンパク質は、細胞周期停止を媒介する。このメカニズムは、損傷したＤＮＡをその複製前に修復し得る時間ウインドーを伴う細胞を提供し、これは、損傷／変異の樹立を生じる。ｐ５３のＥ６により媒介された増強された代謝回転は、メカニズムが作動するのを防ぎ得る。最近、Ｅ６が、ｐ５３の分解を促進することによってだけでなく、ＤＮＡとの相互作用からｐ５３をブロックすることによっても、より直接的に、細胞周期調節に影響を及ぼすことも見いだされた（Ｔｈｏｍａｓら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：２６１−８（１９９５））。
【０００８】
Ｅ７タンパク質は、網膜芽腫遺伝子産物Ｒｂを結合し得る、小さい（約１０，０００Ｍｗ）Ｚｎ結合リンタンパク質である。Ｒｂは、転写因子Ｅ２Ｆに結合し、そしてこれを不活性化する腫瘍サプレッサーである。後者の因子は、チミジンキナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびＤＮＡポリメラーゼαをコードする遺伝子を含む、多くの増殖関連因子の転写を制御する。Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体形成は、Ｇ０およびＧ１期における後者の遺伝子の発現を妨げ、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体が解離するようにプログラムされるＳ期へのその発現を制限し、活性な転写因子Ｅ２Ｆを解離する。Ｒｂ−Ｅ７複合体の形成は、プレＳ期を短縮するという結果、すなわち、細胞周期を通じて進行を促進するという結果を伴って、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体の形成を妨げる。これらのメカニズムの重要性についての相関的証拠は、非常に腫瘍形成性のＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ  １６および１８）からのＥ６タンパク質が、非腫瘍形成性タイプからの対応するタンパク質よりもｐ５３に対する高い親和性を有するという観察、および非常に腫瘍形成性のタイプからのＥ７タンパク質が、非腫瘍形成性タイプからの対応してタンパク質よりもＲｂに対して高い親和性を有するという観察によって提供される。
【０００９】
子宮頸ガンおよび前駆病変の大多数において、ＨＰＶ  ＤＮＡは、宿主細胞ゲノムに組込まれる（Ｃｕｌｌｅｎら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６５：６０６−１２（１９９１））。ほとんどの場合、組込みは、Ｅ６／Ｅ７領域をインタクトなままにした、Ｅ１／Ｅ２領域におけるＨＰＶゲノムＤＮＡの破壊を含むようである。Ｅ１／Ｅ２領域における破壊の結果は、２つの異なるＥ２タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの中断であり、そのうちの小さい方のタンパク質は、初期遺伝子発現の転写リプレッサーとして機能する。これは、Ｅ６およびＥ７発現のアップレギュレーションを導く。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＰＶタンパク質抗原が投与される被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物に関する。免疫応答は、体液性または細胞性応答、特に、ＨＰＶタンパク質抗原に対する細胞媒介性の細胞溶解応答であり得る。組成物は、予防的または治療的に使用され得る。予防適用において、免疫応答の誘導とは、固有の免疫の非常に低いバックグラウンドを超える免疫反応の誘起をいう。治療適用において、被験体における免疫応答の誘導とは、ウイルスによってあるいは被験体の感染細胞または形質転換細胞によってのいずれかで提示されるＨＰＶタンパク質抗原との接触によってこれまでに誘起された応答を、大きさまたは質のいずれかにおいて越える応答の生成をいう。特定の実施態様では、組成物は、ＨＰＶタンパク質抗原を発現しそして提示する腫瘍細胞に対する免疫応答を生じるために使用される。これらの実施態様では、組成物によって標的化される好ましいＨＰＶタンパク質抗原は、ＨＰＶ関連腫瘍で一貫して発現されることが公知であるＥ６およびＥ７初期ウイルスタンパク質である。１つの実施態様では、組成物は、ストレスタンパク質（または熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ））に連結したＨＰＶタンパク質抗原を含む。ＨＰＶタンパク質抗原は、化学的結合体化によってストレスタンパク質に連結され得、あるいは抗原およびストレスタンパク質は、抗原およびストレスタンパク質の両方の配列を含む融合タンパク質の発現および単離を可能にするヌクレオチドレベルで連結され得る。組成物は、被験体に導入され得るか、あるいは、ＨＰＶまたはＨＰＶタンパク質抗原を提示する腫瘍細胞を含む細胞を標的化するかまたはその標的化を媒介する被験体の免疫細胞の拡大を刺激および／または引き起こすためにエクスビボで使用され得る。組成物は、アジュバントの不在下で非粒子状（例えば、ウイルスまたはウイルス様粒子の一部としてではなく）タンパク質性溶液として投与した場合、免疫応答を刺激することに効果的である。
【００１１】
別の実施態様では、組成物は、ＨＰＶタンパク質抗原およびストレスタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。発現ベクターは、さらに、コード配列の転写および翻訳を指示する配列エレメントを含み、そして被験体の細胞への核酸の送達およびこの細胞における核酸の永続または増幅を容易にするエレメントも含み得る。発現ベクターは、被験体の細胞に導入され得るか、あるいはエクスビボで被験体の細胞を形質導入するために使用され得、ＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するＨＰＶタンパク質抗原−ストレスタンパク質融合タンパク質の発現を生じる。
【００１２】
本発明はまた、別の薬理学的に受容可能な成分と組み合わせた、ストレスタンパク質に連結したＨＰＶタンパク質抗原を含む組成物に関する。１つの実施態様では、組成物は、ＨＰＶタンパク質抗原と連結したストレスタンパク質を含む結合体を含む。別の実施態様では、組成物は、ストレスタンパク質がＨＰＶタンパク質抗原に融合される、融合タンパク質（例えば、ｐＥＴ６５ＨＥ６およびｐＥＴ６５ＨＥ７から発現されるタンパク質）を含む。これらの組成物の結合体および融合タンパク質はまた、被験体の細胞においてストレスタンパク質およびＨＰＶタンパク質抗原配列を含む融合タンパク質をコードしそしてその発現を指示し得る発現ベクターという。
【００１３】
本発明はまた、ＨＰＶタンパク質抗原に対する、および特定の実施態様では、ＨＰＶタンパク質抗原を提示する腫瘍に対する、免疫応答を増強するための組成物の使用に関する。本明細書に引用された科学論文および特許出願からの文献、特に本発明の組成物の調製および使用に関する文献は、その全体が参考として本明細書に援用される。
（項目１）  被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、該組成物が、ストレスタンパク質に連結したＨＰＶタンパク質抗原を含む、組成物。
（項目２）  前記免疫応答が、細胞性免疫応答である、項目１に記載の組成物。
（項目３）  前記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質である、項目１に記載の組成物。
（項目４）  前記ＨＰＶタンパク質抗原が、Ｅ６またはＥ７タンパク質である、項目１に記載の組成物。
（項目５）  前記ストレスタンパク質が、Ｈｓｐ６０またはＨｓｐ７０ファミリー由来である、項目１に記載の組成物。
（項目６）  被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、該組成物が、ストレスタンパク質に結合体化したＨＰＶタンパク質抗原を含む、組成物。
（項目７）  前記免疫応答が、細胞性免疫応答である、項目６に記載の組成物。
（項目８）  前記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質である、項目６に記載の組成物。
（項目９）  前記ＨＰＶタンパク質抗原が、Ｅ６またはＥ７タンパク質である、項目６に記載の組成物。
（項目１０）  前記ストレスタンパク質が、Ｈｓｐ６０またはＨｓｐ７０ファミリー由来である、項目６に記載の組成物。
（項目１１）  被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、該組成物が、ストレスタンパク質に融合したＨＰＶタンパク質抗原を含む融合タンパク質を含む、組成物。
（項目１２）  前記免疫応答が、細胞性免疫応答である、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）  前記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質である、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）  前記ＨＰＶタンパク質抗原が、Ｅ６またはＥ７タンパク質である、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）  前記ストレスタンパク質が、Ｈｓｐ６０またはＨｓｐ７０ファミリー由来である、項目１１に記載の組成物。
（項目１６）  ストレスタンパク質に連結したＨＰＶタンパク質抗原を、別の薬理学的に受容可能な成分と組み合わせて含む、組成物。
（項目１７）  前記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質である、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）  前記ＨＰＶタンパク質抗原が、Ｅ６またはＥ７タンパク質である、項目１６に記載の組成物。
（項目１９）  前記ストレスタンパク質が、Ｈｓｐ６０またはＨｓｐ７０ファミリー由来である、項目１６に記載の組成物。
（項目２０）  ストレスタンパク質に結合体化したＨＰＶタンパク質抗原を含む、結合体。
（項目２１）  前記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質である、項目２０に記載の結合体。
（項目２２）  前記ＨＰＶタンパク質抗原が、Ｅ６またはＥ７タンパク質である、項目２０に記載の結合体。
（項目２３）  前記ストレスタンパク質が、Ｈｓｐ６０またはＨｓｐ７０ファミリー由来である、項目２０に記載の結合体。
（項目２４）  ストレスタンパク質に融合したＨＰＶタンパク質抗原を含む、融合タンパク質。
（項目２５）  前記ストレスタンパク質が、マイコバクテリアストレスタンパク質である、項目２４に記載の融合タンパク質。
（項目２６）  前記ＨＰＶタンパク質抗原が、Ｅ６またはＥ７タンパク質である、項目２４に記載の融合タンパク質。
（項目２７）  前記ストレスタンパク質が、Ｈｓｐ６０またはＨｓｐ７０ファミリー由来である、項目２４に記載の融合タンパク質。
（項目２８）  前記ＨＰＶタンパク質抗原が、Ｅ６またはＥ７であり、そして前記ストレスタンパク質が、Ｈｓｐ６０またはＨｓｐ７０ファミリー由来である、項目２４に記載の融合タンパク質。
（項目２９）  被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、該組成物が、該被験体の細胞において項目２４に記載の融合タンパク質をコードしそしてその発現を指示し得る発現ベクターを含む、組成物。
（項目３０）  前記免疫応答が、細胞性免疫応答である、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）  被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、該組成物が、該被験体の細胞において項目２８に記載の融合タンパク質をコードしそしてその発現を指示し得る発現ベクターを含む、組成物。
（項目３２）  前記免疫応答が、細胞性免疫応答である、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）  被験体の細胞において項目２４に記載の融合タンパク質をコードしそしてその発現を指示し得る、発現ベクター。
（項目３４）  被験体の細胞において項目２８に記載の融合タンパク質をコードしそしてその発現を指示し得る、発現ベクター。
（項目３５）  ＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、項目３３に記載の発現ベクターの有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３６）  ＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、項目３４に記載の発現ベクターの有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３７）  ＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、項目１６に記載の組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３８）  ＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、項目２０に記載の結合体の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３９）  ＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、項目２４に記載の融合タンパク質の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４０）  ＨＰＶタンパク質抗原を提示する腫瘍を処置する方法であって、項目３３に記載の発現ベクターの有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４１）  ＨＰＶタンパク質抗原を提示する腫瘍を処置する方法であって、項目３４に記載の発現ベクターの有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４２）  ＨＰＶタンパク質抗原を発現する腫瘍を処置する方法であって、項目１６に記載の組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４３）  ＨＰＶタンパク質抗原を発現する腫瘍を処置する方法であって、項目２０に記載の結合体の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４４）  ＨＰＶタンパク質抗原を発現する腫瘍を処置する方法であって、項目２４に記載の融合タンパク質の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＰＶのタンパク質抗原を提示する被験体の細胞のヒトパピローマウイルスに対する被験体の免疫応答を誘導する組成物に関する。１つの実施態様では、組成物は、ＨＰＶタンパク質抗原およびストレスタンパク質を含む。別の実施態様では、組成物は、ＨＰＶタンパク質抗原−ストレスタンパク質融合タンパク質の発現を指示し得る発現ベクターを含む。
【００１５】
本発明の組成物は、ＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫を惹起するために予防的に使用され得、ＨＰＶの、あるいはＨＰＶタンパク質抗原を発現および提示するかまたはその一部を提示する被験体の細胞の、樹立および増殖を抑制する。組成物はまた、さらなるウイルス増殖を抑制するために、あるいは、ＨＰＶ抗原を発現および提示するかまたは抗原の一部を提示する腫瘍を含む、ＨＰＶ感染の結果として増殖する被験体の細胞を排除するために、ＨＰＶに既に感染した被験体において治療的に使用され得る。本発明の組成物によって誘導される免疫応答の標的としてＨＰＶタンパク質抗原を本明細書中で参照した場合、ＨＰＶタンパク質抗原は、ＨＰＶタンパク質全体あるいはＨＰＶまたは被験体の感染細胞の表面上で提示されるＨＰＶタンパク質のポリペプチド（１０ｋＤａより大きな分子量）部分、ならびに例えば、代表的ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ経路による、ＨＰＶタンパク質のプロセシングおよび提示の結果として感染細胞によって提示されるペプチドを含むことが理解される。
【００１６】
ＨＰＶの多くの異なるタイプのゲノム配列をクローニングし、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴づけた。完全または部分的ＨＰＶゲノムを含む細菌ベクターは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を含む種々の供給源から利用可能である。本発明の実施に有用なＨＰＶの追加のタイプは、この目的のために既に確立された方法によって単離およびタイプ分けされ得、この方法は当該技術分野で周知である。
【００１７】
ＨＰＶは、６または７つの非構造タンパク質および２つの構造タンパク質を発現し、そしてこれらのタンパク質のそれぞれは、原則として、ＨＰＶおよび／または感染した細胞を排除することを目的とした免疫予防的または免疫治療的アプローチのための標的として役立ち得る。ウイルスキャプシドタンパク質Ｌ１およびＬ２は、後期遺伝子によってコードされるＨＰＶの構造タンパク質である。Ｌ１は、種々のＨＰＶ種の中で高度に保存される主要なキャプシドタンパク質である。７つの非構造タンパク質は、初期ウイルス遺伝子の産物である。タンパク質Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４は、ウイルス複製に重要な役割を果たす。タンパク質Ｅ４は、ウイルスの成熟において付加的に機能する。Ｅ５の役割はあまりよく知られていない。タンパク質Ｅ６およびＥ７は、ウイルス複製にならびに宿主細胞不死化および形質転換に重要なオンコプロテインである。これらのタンパク質は、本発明の組成物に組み込まれ得、ＨＰＶタンパク質抗原といわれる。
【００１８】
ＨＰＶ関連ガンの予防および治療処置への本発明の適用では、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７タンパク質が、子宮頸ガンで一貫して発現されるという観察が、特に重要である（Ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ，Ａｐｐｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５：１９−２４（１９８７）；ＰａｔｅｒおよびＰａｔｅｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４５：３１３−８（１９８５））。Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら，Ｂｒ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７１：３４４−９（１９９５）は、Ｅ６およびＥ７遺伝子が肺ガンでも発現されることを証明した。さらに、Ｅ７に対するいくつかの自然免疫（体液性）免疫応答は、子宮頸ガン患者で注目された（Ｊｏｃｈｍｕｓ−Ｋｕｄｉｅｌｋａら，Ｊ．  Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１：１６９８−７０４（１９８９））。最終的に、モデル研究は、改変したＥ７タンパク質での免疫が、活性化したｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子およびＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７遺伝子で形質転換した肺細胞でのチャレンジに対してマウスを防御することを証明する（Ｌｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２１−２６（１９９６））。これらのタンパク質が代表的にはＨＰＶ感染の結果として生じるガンで発現されるという観点、同じタンパク質がガンの発生および維持に主要な役割を果たす可能性が最も高いガン遺伝子でもあるという観点、ならびに免疫応答がこれらのタンパク質に対して指向し得るという観点から、Ｅ６およびＥ７は、免疫介入または予防に好ましい標的であり、したがってＨＰＶ関連ガンを予防または処置するために使用される本発明の組成物の好ましいＨＰＶタンパク質抗原である。
【００１９】
いくつかの動物モデルにおいて、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）ペプチドが、あるウイルスに対する防御免疫を誘導し得ることが示されている（ＫａｓｔおよびＭｅｌｉｅｆ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０：２２９（１９９１））。免疫抑制した個体が、免疫応答性個体よりも頻繁に子宮頸ガンを発達させることが観察されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ  ２７：２２０−４（１９８３））。これは、免疫系、特にＴ細胞系の細胞アームが、ＨＰＶ関連悪性疾患に対する免疫学的防御に主に重要であることを強く示唆する。Ｅ６で形質転換した細胞およびＥ７で形質転換した細胞に対する防御免疫を生じることにおけるＣＴＬ応答の重要性について支持する証拠は、ＨＰＶ  １６  Ｅ７の関連のＣＴＬエピトープでワクチン接種したマウスが、移植可能なＨＰＶ  １６誘導した腫瘍に対して防御される実験から生じた（Ｆｅｌｔｋａｍｐら，Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２２４２（１９９３））。本発明は、ＨＰＶタンパク質抗原へのストレスタンパク質の連結が、連結したＨＰＶタンパク質抗原に対する細胞性、特に細胞媒介性の細胞溶解応答を強く刺激する組成物を生じ、この応答がＨＰＶ抗原を提示する細胞を殺傷し得るという本発明者らの観察に基づく。
【００２０】
本発明のＨＰＶタンパク質抗原は、任意のＨＰＶによりコードされるポリペプチドであり得る。さらに、これは、ストレスタンパク質と連結される場合、ＨＰＶタンパク質の一部分が、感染細胞によって提示されるかまたはＨＰＶによって提示されるＨＰＶタンパク質抗原に対して免疫応答を誘導する能力を保持するならば、ＨＰＶタンパク質の一部であり得る。完全なＨＰＶタンパク質抗原よりもむしろＨＰＶ抗原の種々の部分を含む本発明の組成物は、本明細書の以下にまたは分子生物学および生化学の教科書に記載の方法のような慣用的方法によって産生され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）。ＨＰＶタンパク質抗原の特定の部分を有する各組成物は、本明細書に記載の実験の実施例に記載のような実験において、ＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答の程度および質について試験され得る。最小には、本発明の組成物中のＨＰＶタンパク質抗原は、ＨＰＶタンパク質の少なくとも１つのＢ細胞またはＴ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬまたはＴヘルパー細胞エピトープ）を含む。本発明の組成物を参照した場合用語「ＨＰＶタンパク質抗原」は、ＨＰＶタンパク質抗原の一部が感染細胞によって提示されるかまたはＨＰＶによって提示されるＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導する能力を保持するならば、ＨＰＶタンパク質抗原の一部を含む。
【００２１】
Ｅ６および特にＥ７は、トランスフォーミングタンパク質である。完全なＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７タンパク質配列あるいはトランスフォーミング能力を保持するために十分に完全な部分を、ＨＰＶタンパク質抗原として含む組成物において、抗原のトランスフォーミング性質は、ＨＰＶ抗原が製造される方法に依存して、実質的な危険性を示しても示さなくてもよい。例えば、ＨＰＶタンパク質抗原またはこのような抗原を含む組成物が、ＤＮＡ夾雑の危険性を有する組換え技法によって調製される場合、抗原のトランスフォーミング能力を排除するために工程を行うことに慎重であり得る。完全なＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７タンパク質配列あるいはトランスフォーミング能力を保持するために十分に完全な部分を含む融合タンパク質の被験体における発現を指示する発現ベクターを含む組成物を使用する場合、タンパク質産物をトランスフォーミングにする配列を排除することが必要であり得る。Ｅ６およびＥ７の非トランスフォーミング改変体を、Ｅ６およびＥ７配列を融合することによって得た（ＰＣＴ／ＡＵ９５／００８６８）。したがって、Ｅ６またはＥ７配列およびストレスタンパク質配列を含むある融合タンパク質が、既に非トランスフォーミングであり得ることが可能である。あるいは、当該技術分野で周知であり、そしてまたＰＣＴ／ＡＵ９５／００８６８に記載されている技法を使用して、配列はＥ６またはＥ７から選択的に欠失され得る。欠失は、Ｅ６またはＥ７配列単独を発現する発現ベクターで、あるいはＥ６−またはＥ７−ストレスタンパク質融合タンパク質を発現するベクターで行われ得る。このような操作の結果は、トランスフェクション実験において欠失タンパク質のトランスフォーミング能力を試験することによって評価され得る。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、欠失タンパク質についての遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトされ得、そしてトランスフォーミング能力は、軟寒天におけるコロニー形成アッセイによって見積もられ得る。この特定の試験はまた、ＰＣＴ／ＡＵ９５／００８６８に記載される。
【００２２】
本発明の１つの実施態様では、組成物は、２つの部分から構成される：ストレスタンパク質、および細胞性免疫応答が所望されるＨＰＶのタンパク質抗原。２つの部分は連結されて、単一のユニットを形成する。２つの部分は、結合体化によって、すなわち、ストレスタンパク質とＨＰＶタンパク質抗原との間の共有結合によって、連結され得る。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）；Ｌｕｓｓｏｗ，Ａ．Ｒ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．２１：２２９７−２３０２（１９９１）；Ｂａｒｒｉｏｓ，Ｃ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．２２：１３６５−１３７２（１９９２）。あるいは、組換技法は、２つの部分を連結し発現するために使用され得、その技法は、単一分子中にストレスタンパク質およびＨＰＶタンパク質抗原を含む組換え融合タンパク質を生じる。これは、産生プロセスにおいて単一組換え分子を産生および精製することを可能にする。２つの部分はまた、非共有結合され得る。いくつかの公知の高親和性相互作用のいずれかが、２つの部分を非共有結合させるために適用され得る。例えば、ビオチン基は、ＨＰＶタンパク質抗原に付加され得、そして連結されるべきストレスタンパク質は、アビジン−ストレスタンパク質融合タンパク質として発現され得る。アビジン−ストレスタンパク質融合タンパク質は、ビオチン化したＨＰＶタンパク質抗原を強く結合する。同様に、ＨＰＶタンパク質抗原対の一部のそれぞれが、それを投与する被験体においてＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を誘導するために十分であるならば、ＨＰＶタンパク質抗原の一部は、完全なストレスタンパク質にまたはストレスタンパク質の一部に連結され得、そしてストレスタンパク質の一部は、完全なＨＰＶタンパク質抗原にまたはＨＰＶタンパク質抗原の一部に連結され得る。別の実施態様では、組成物は、ＨＰＶタンパク質抗原−ストレスタンパク質融合タンパク質の発現を指示し得る発現ベクターを含む。
【００２３】
任意の適切なストレスタンパク質（熱ショックタンパク質（ｈｓｐ））は、本発明の組成物において使用され得る。例えば、実施例に記載のように、Ｈｓｐ６０および／またはＨｓｐ７０が使用され得る。ストレスタンパク質に向かって、一般的に、細胞は、普通ストレス遺伝子または熱ショック遺伝子といわれる一群の遺伝子の発現を増加させることによって、ストレッサー（代表的には、熱ショック処置）に応答する。熱ショック処置は、細胞が適応する温度より１℃〜数℃上までの温度への、細胞または生物の曝露を包含する。このような遺伝子の誘導と同調して、対応するストレスタンパク質のレベルは、ストレスを受けた細胞で増加する。本明細書中で使用される場合、「ストレスタンパク質」は、「熱ショックタンパク質」または「Ｈｓｐ」としても公知であり、これは、ストレス遺伝子によってコードされるタンパク質であり、したがって、代表的には生物に対するストレッサーの接触または曝露の際に顕著により大量に産生されるタンパク質である。「熱ショック遺伝子」としても公知である「ストレス遺伝子」は、本明細書中で、熱ショック、低酸素症、グルコース欠乏、重金属塩、エネルギー代謝のインヒビターおよび電子輸送およびタンパク質変性物のようなストレッサー、または特定のベンゾキノンアンサマイシン（ａｎｓａｍｙｃｉｎｅ）に対する生物（遺伝子を含む）の接触または曝露によって、活性化されるかまたは他の検出可能に調節されない遺伝子として、使用される。Ｎｏｖｅｒ，Ｌ．、Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ（１９９１）。「ストレス遺伝子」はまた、このような相同遺伝子が、それ自体ストレッサーによって誘導されなくても、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０ストレス遺伝子ファミリー内の特定の遺伝子のような、公知のストレス遺伝子ファミリー内の相同遺伝子を含む。本明細書中で使用される場合、用語ストレス遺伝子およびストレスタンパク質のそれぞれは、前後関係が他に指示されない限り、他のものを含み得る。
【００２４】
特定の実施態様（例えば、ストレスタンパク質とＨＰＶタンパク質抗原との間の化学結合に関する場合）において、本発明において使用されるストレスタンパク質は、単離されたストレスタンパク質であり、これはストレスタンパク質が、それが産生される宿主細胞から選択および分離されていることを意味する。このような単離は、本明細書中に記載されるように、および当該分野において公知のタンパク質単離の慣用的な方法を用いて、行われ得る。Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻、  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）。
【００２５】
細菌において、優勢なストレスタンパク質は、それぞれ、約７０ｋＤａおよび約６０ｋＤａの分子量サイズを有するタンパク質であり、これはそれぞれ、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０として称される。これらのおよび他の特定のストレスタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子は、以下にさらに考察される。細菌において、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０は、典型的に、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動および染料クマシーブルーを用いる染色パターンに基づいて、細胞タンパク質の約１〜３％を示すが、ストレスの多い条件下で２５％程の高レベルまで蓄積する。ストレスタンパク質は、重要な細胞プロセス（例えば、タンパク質合成、細胞内輸送、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリ（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ））に関与するようである。ストレスの間に合成される増加される量のストレスタンパク質は、誘導されたタンパク質がほどける（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）結果を最小にするために主として作用するようである。実際、ストレスタンパク質の合成を誘導する中程度にストレスが多い条件への細胞の予めの曝露は、細胞に対して、その後のより極度のストレスの有害な影響からの防御を与える。
【００２６】
主要なストレスタンパク質は、今までのところ、試験されたあらゆる生物および組織タイプにおいて発現されるようである。また、ストレスタンパク質は、今日までに同定されたタンパク質の最も高度に保存された群を表すようである。例えば、広範に多様な生物におけるストレスタンパク質が比較される場合、Ｈｓｐ９０およびＨｓｐ７０は、アミノ酸レベルで５０％以上の同一性を示し、そして非同一性の位置で多くの類似性を共有する。類似のまたはより高いレベルの相同性が、種内の特定のストレスタンパク質ファミリーの種々のメンバー間に存在することに注意する。
【００２７】
ストレスタンパク質をコードする遺伝子は、細胞または生物のゲノムにおいて、単一のコピー、または複数の、非同一性のコピーで存在し得る。例えば、ヒトゲノムは、少なくとも１つのコピーのｈｓｐ１００遺伝子、少なくとも２つの異なるｈｓｐ９０遺伝子、少なくともいくつかが非同一性のコピーである、最大１０までのｈｓｐ７０遺伝子、いくつかのＴ複合体遺伝子（Ｔｃｐ遺伝子）、および関連のミトコンドリアタンパク質Ｈｓｐ６０をコードする少なくとも１つの遺伝子、ならびに２０〜３０ｋＤａの範囲の分子量サイズのＨｓｐをコードする、少なくとも３コピーの小Ｈｓｐ遺伝子を含むことが示されている。ストレス遺伝子のほとんどの群において、その発現レベルが比較的高く、そして完全に構成的であるか、または中程度に熱ショック誘導性であるだけであるかのいずれかである少なくとも１つの遺伝子が存在する。さらに、ストレス遺伝子のいくつかのファミリーは、熱によってアップレギュレートされないが、他のきっかけ（例えば、カルシウムレベルの増加など）によってアップレギュレートされるメンバーを含む。
【００２８】
ストレスタンパク質、特に、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０〜３０、およびＨｓｐ１０は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅによる感染に対する免疫応答において、宿主免疫系によって認識される主要な決定因子の中の１つである。Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．およびＥｌｌｉｏｔｔ，Ｔ．Ｊ．、ストレスタンパク質、感染、および免疫監視、Ｃｅｌｌ  ５０：５−８（１９８９）。さらに、いくつかのラットのａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ  Ｔ細胞は、Ｈｓｐ６０エピトープを認識する。Ｖａｎ  Ｅｄｅｎ、Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：１７１−１７３，（１９８８）。しかし、マイコバクテリア感染または自己免疫疾患の病歴を有さない個体（健常な個体を含む）はまた、細菌およびヒトのＨｓｐ６０エピトープの両方を認識するＴ細胞を保有し；γδＴ細胞レセプターの発現によって特徴付けられる健常な個体におけるＴ細胞のかなりの画分は、自己のおよび外来性のストレスタンパク質の両方を認識する。Ｏ'Ｂｒｉｅｎ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ  ５７：６４４−６７４（１９８９）。従って、個体は、健常な個体であっても、外来のおよび自己のストレスタンパク質エピトープの両方を認識するＴ細胞集団を保有する。
【００２９】
ストレスタンパク質エピトープを認識するこの系は、おそらく侵入する生物に対する「初期防衛系」を構成する。Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．およびＹｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４：４１９３−６（１９９２）。この系は、細菌およびウイルスによる頻繁な刺激によって維持され得る。以前に議論したように、健常個体は、自己のストレスタンパク質を認識するＴ細胞集団を有する。従って、自己応答性Ｔ細胞の存在は、正常な健常性と適合性であり、自己免疫疾患を引き起こさない；これはまた、個体内のストレスタンパク質の安全性を実証する。ストレスタンパク質の安全性は、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ、Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓの株）ワクチン接種（これは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対してもまた防御的であるストレスタンパク質に対する、免疫応答を誘導する）の成功および相対的な安全性によって、さらに実証されている。
【００３０】
本発明における使用のためのストレス遺伝子およびタンパク質のファミリーは、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、ＴＦ５５、Ｈｓｐ４０、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、Ｈｓｐ２０−３０、Ｃ１ｐＰ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ１０、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む。Ｍａｃａｒｉｏ，Ａ．Ｊ．Ｌ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓ．２５：５９−７０  １９９５；Ｐａｒｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．およびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．  ２７：４３７−４９６（１９９３）；米国特許第５，２３２，８３３号（Ｓａｎｄｅｒｓら）。ストレスタンパク質の特定の群には、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０−３０、さらに好ましくはＨｓｐ７０およびＨｓｐ６０が含まれる。
【００３１】
Ｈｓｐ１００−２００の例は、Ｇｒｐ１７０（グルコース調節性のタンパク質について）、プレゴルジ区画における小胞体のルーメンにおけるＧｒｐ１７０残基を含み、そして免疫グロブリンの折り畳みおよびアセンブリにおいて役割を果たし得る。
【００３２】
Ｈｓｐ１００の例は、哺乳動物Ｈｓｐ１１０、酵母Ｈｓｐ１０４、Ｃ１ｐＡ、Ｃ１ｐＢ、Ｃ１ｐＣ、Ｃ１ｐＸ、およびＣ１ｐＹを含む。酵母Ｈｓｐ１０４およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ１ｐＡは、ヘキサマーの粒子、およびそのアセンブリがアデニンヌクレオチド結合を必要とするようであるテトラマーの粒子であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ１ｐＢを形成する。Ｃ１ｐプロテアーゼは、Ｃ１ｐＰ（タンパク質分解性のサブユニット）およびＣ１ｐＡからなる７５０ｋＤａのヘテロオリゴマーを提供する。Ｃ１ｐＢ−Ｙは、Ｃ１ｐＡに構造的に関連するが、Ｃ１ｐＡとは異なり、Ｃ１ｐＰと複合体化しないようである。
【００３３】
Ｈｓｐ９０の例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨｔｐＧ、酵母におけるＨｓｐ８３およびＨｓｃ８３、ならびにヒトにおけるＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、およびＧｒｐ９４を含む。Ｈｓｐ９０は、タンパク質の群に結合し、このタンパク質は、代表的には、ステロイドホルモンレセプター（例えば、糖質コルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、およびテストステロンレセプター）、転写因子、ならびにシグナル伝達機構において役割を果たすプロテインキナーゼのような細胞調節分子である。Ｈｓｐ９０タンパク質はまた、他のストレスタンパク質を含む大きな豊富なタンパク質複合体の形成に関与する。
【００３４】
Ｌｏｎは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてネイティブでないタンパク質を分解する、ＡＴＰ−依存性プロテアーゼとして機能する、テトラマーのタンパク質である。
【００３５】
Ｈｓｐ７０の例は、哺乳動物細胞からのＨｓｐ７２およびＨｓｐ７３、細菌、特にマイコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）からのＤｎａＫ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ；本明細書中ではＨｓｐ７１という）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、酵母、および他の原核生物からのＤｎａＫ、ならびにＢｉｐおよびＧｒｐ７８を含む。Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰ、ならびにほどけたポリぺプチドおよびペプチドに特異的に結合し得、それによってタンパク質の折り畳みおよび脱折り畳み（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリに関与する。
【００３６】
Ｈｓｐ６０の例は、マイコバクテリアからのＨｓｐ６５を含む。細菌Ｈｓｐ６０はまた、一般に、ＧｒｏＥＬ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからのＧｒｏＥＬ）としても知られる。Ｈｓｐ６０は、大きな、ホモオリゴマーの複合体を形成し、そしてタンパク質折り畳みにおいて重要な役割を果たすようである。Ｈｓｐ６０相同体は、真核生物のミトコンドリアおよび葉緑体に存在する。
【００３７】
ＴＦ５５の例には、Ｔｃｐ１、ＴＲｉＣ、およびサーモソーム（ｔｈｅｒｍｏｓｏｍｅ）が含まれる。このタンパク質は、代表的には、真核生物の細胞質およびいくつかの始原細菌において生じ、そして多員環を形成して、タンパク質折り畳みを促進する。これらはまた、Ｈｓｐ６０に低度に相同性である。
【００３８】
Ｈｓｐ４０の例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリアのような原核生物からのＤｎａＪ、およびＨＳＪ１、ＨＤＪ１、ならびにＨｓｐ４０を含む。Ｈｓｐ４０は、細胞活性の中でとりわけ、タンパク質折り畳み、熱耐性、およびＤＮＡ複製における分子シャペロンとしての役割を果たす。
【００３９】
ＦＫＢＰの例は、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５、ならびにＦＫＢＰ５９、Ｆｐｒ１およびＮｅｐ１を含む。これらのタンパク質は、代表的には、ぺプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有し、そして免疫抑制薬（例えば、ＦＫ５０６およびラパマイシン）と相互作用する。これらのタンパク質は、代表的には、細胞質および小胞体において、見出される。
【００４０】
シクロフィリンの例には、シクロフィリンＡ、Ｂ、およびＣが含まれる。そのタンパク質は、ぺプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有し、そして免疫抑制薬のシクロスポリンＡと相互作用する。タンパク質シクロスポリンＡは、カルシニューリン（タンパク質ホスファターゼ）に結合する。
【００４１】
Ｈｓｐ２０−３０はまた、小さなＨｓｐとしていわれる。Ｈｓｐ２０−３０は、代表的には、大きなホモオリゴマーの複合体において見出され、またはおそらくヘテロオリゴマーの複合体（ここでは、生物または細胞タイプは、いくつかの異なるタイプの小Ｈｓｐを発現する）においてもまた見出される。Ｈｓｐ２０−３０は、細胞骨格構造と相互作用し、そしてアクチンの重合／脱重合において調節的な役割を果たし得る。Ｈｓｐ２０−３０は、ストレスにより、または静止細胞の増殖因子への曝露の際に、迅速にリン酸化される。Ｈｓｐ２０−３０相同体には、αクリスタリンが含まれる。
【００４２】
ＣｌｐＰは、異常なタンパク質の分解に関与するＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼである。ＣｌｐＰの相同体は、葉緑体において見出される。ＣｌｐＰは、ＣｌｐＡとヘテロオリゴマー性の複合体を形成する。
【００４３】
ＧｒｐＥは、ストレスで障害されたタンパク質の救済（ｒｅｓｃｕｅ）、および障害されたタンパク質の分解の両方に関与する約２０ｋＤａのＥ．ｃｏｌｉタンパク質である。ＧｒｐＥは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてストレス遺伝子の発現の調節において役割を果たす。
【００４４】
Ｈｓｐ１０の例は、ＧｒｏＥＳおよびＣｐｎ１０を含む。Ｈｓｐ１０は、代表的には、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ならびに真核生物細胞のミトコンドリアおよび葉緑体において見出される。Ｈｓｐ１０は、Ｈｓｐ６０オリゴマーと会合する七員環を形成する。Ｈｓｐ１０はまた、タンパク質折り畳みに関与する。
【００４５】
ユビキチンは、ＡＴＰ−依存性の細胞質ゾルのプロテアーゼによるタンパク質のタンパク質分解除去と協調して、タンパク質を結合することが見出されている。
【００４６】
特定の実施態様において、本発明のストレスタンパク質は、腸内細菌、マイコバクテリア（特に、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、脊椎動物、鳥類、ニワトリ、哺乳動物、ラット、マウス、霊長類、またはヒトから得られる。
【００４７】
ストレスタンパク質は、酸性もしくは塩基性の塩の形態、または中性の形態であり得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸配列に対してなされ得、その正味の効果は、ストレスタンパク質の増加された生物学的活性を保持すること、またはさらに増強することである。コード縮重に起因して、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変化が存在し得る。本発明はまた、ストレスタンパク質から得られる、ストレスタンパク質の部分またはペプチドを用いる使用に適切である（このような部分またはペプチドは、選択されるＨＰＶタンパク質抗原に対する免疫応答を増強することに関与するエピトープを含む場合）。ストレスタンパク質部分は、プロテイナーゼを用いるフラグメント化により、または組換え法（例えば、ストレスタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部のみの発現（単独でまたは別のタンパク質をコードする核酸配列との融合としてのいずれか））によって得られ得る。ペプチドはまた、このような方法、または化学合成によって生成され得る。ストレスタンパク質は、多様な公知の技術によって、特定の遺伝子座で導入された変異を含み得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；  ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３４０２−３４０６（１９８６）；ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ、Ｇｅｎｅ  ８８：１０７−１１１（１９９０）；  Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ  ３：１１２−１１７（１９８９）を参照のこと。本明細書中で使用されるような用語、ストレスタンパク質は、ストレスタンパク質のこのような部分およびペプチドを含むことが意図される。
【００４８】
ストレス遺伝子またはタンパク質としての考慮のもとに、遺伝子またはタンパク質を同定する方法は、当該分野において周知である。例えば、特定のストレスタンパク質ファミリーの遺伝子およびタンパク質の保存は、周知のストレス遺伝子（例えば、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ、またはＤｎａＪ）を考慮して、例えば、核酸ハイブリダイゼーション、または核酸もしくはアミノ酸配列決定、その後のコンピューター比較解析によって、遺伝子／タンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の比較を可能にする。Ｖｏｅｌｌｍｙ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４９４９−４９５３（１９８５）。あるいは、アッセイは、選択されたストレスタンパク質の本質的な構造特徴および／または機能的特性とを、同定および／または区別するために使用され得る。例えば、発現ライブラリーは、抗Ｈｓｐ抗体を使用して、スクリーニングされ得る。Ｈｓｐ９０は、高い親和性を有して、ベンゾキノンアンサマイシンゲルダナマイシンへ結合することは周知である。それゆえ、発現ライブラリーは、ベンゾキノンアンサマイシンに結合するタンパク質としてＨｓｐ９０の推定の相同物を発見するために、ゲルダナマイシンによってスクリーニングされ得る。単離された核酸によってコードされるタンパク質の性質は、抗体に基づくアッセイを含む、他のアッセイによって、さらに確証され得る。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）。さらに、所定のストレスタンパク質群の生物学的活性が開発され得る。Ｇｕｉｄｏｎ，Ｐ．Ｔ．、およびＨｉｇｈｔｏｗｅｒ，Ｌ．Ｅ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５：３２３１−３２３９（１９８６）。例えば、Ｈｓｐ７０は、タンパク質複合体のアセンブリにおいて、ＡＴＰ、ならびに折り畳まれていないポリぺプチドおよびペプチドに特異的に結合し得る。従って、適切なポリぺプチド、ペプチド、またはＡＴＰを含むサンプルを考慮してタンパク質を混合した後の、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸複合体の生成の存在または非存在の決定は、Ｈｓｐ７０タンパク質または遺伝子の明白な存在または非存在を示し、この存在または非存在は、抗体に基づくアッセイのような他のアッセイを利用して確認され得る。
【００４９】
ストレスタンパク質、ストレスタンパク質部分、ストレスタンパク質相同体、およびこの組成物に存在するストレスタンパク質が非共有的に結合または連結するようなＨＰＶのタンパク質抗原は、既知の技術を使用して産生されるかまたは得られ得る。例えば、ストレスタンパク質および／または抗原は、生じることが既知である供給原から得られ（単離され）得るか、細胞培養物から産生および収集され得るか、あるいは抗原の場合には、感染細胞から得られ、そして必要な場合にはクローニングによって、そして所望のストレスタンパク質または抗原をコードする遺伝子の発現によって作製され得、または化学的に合成され得る。さらに、所望のストレスタンパク質または抗原をコードする核酸配列は、化学的に合成され得る。ストレスタンパク質およびＨＰＶタンパク質抗原を含む融合タンパク質は、組換え手段によって作製され得る。例えば、ストレスタンパク質をコードする核酸は、２つのタンパク質コード配列が共通の翻訳リーディングフレームを共有するようなＨＰＶタンパク質抗原をコードする核酸配列のいずれかの末端に連結され得、そしてＨＰＶタンパク質抗原およびストレスタンパク質を含む融合タンパク質として発現され得る。組合せた配列は、所望される発現特性および宿主細胞の性質に基づいて選択された適切なベクターへ挿入される。以下に提供される実施例において、核酸配列は、細菌Ｅ．ｃｏｌｉ．におけるタンパク質発現に適切なベクターに集められる。選択された宿主細胞における発現に続いて、融合タンパク質は、慣用的な生化学的分離技術によるか、または融合タンパク質のどれか１つの部分に対する抗体を使用して、免疫親和性方法によって精製され得る。あるいは、選択されたベクターは、タグを融合タンパク質配列（例えば、以下に提供されるような実施例に記載されるようなオリゴヒスチジンタグ）へ付加し得る。このことは、タグについて適切な高い親和性を有する抗体または他の物質を使用する親和性方法によって精製され得るタグ化融合タンパク質の発現を可能にする。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ．  Ｍ．，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）。哺乳動物細胞における発現に適切なベクター（例えば、以下に記載される１つのベクター）が使用される場合、融合タンパク質が発現され得、そして哺乳動物細胞から精製され得る。あるいは、哺乳動物発現ベクター（融合タンパク質コード配列を含む）が、被験体の細胞における融合タンパク質の発現を指向するために被験体に投与され得る。ストレスタンパク質およびＨＰＶタンパク質抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸もまた、化学的に作製され得、次いで融合タンパク質産生および精製または被験体への投与のために適切なベクターへ挿入される。最終的に、融合タンパク質はまた化学的に調製され得る。
【００５０】
本明細書中に記載されるストレスタンパク質およびＨＰＶ抗原を含む組成物は、免疫応答、特に、ＨＰＶ抗原を発現するＨＰＶ、またはＨＰＶ感染細胞もしくは形質転換細胞に対する細胞媒介細胞溶解性応答を増強するために試用され得る。好ましくは、組成物は、免疫応答を誘発するタンパク質に対して特定のＨＰＶ型からのタンパク質抗原配列を含む。
【００５１】
本明細書中に記載されるストレスタンパク質およびＨＰＶ抗原を含む組成物は、種々の方法で被験体に投与され得る。投与の経路としては、皮内、経皮（例えば、徐放性ポリマー）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、および鼻腔内の経路が挙げられる。任意の他の都合の良い投与の経路（例えば、注入もしくはボーラス注射）、または上皮のもしくは粘膜皮膚の内層を介する吸収が使用され得る。さらに、本明細書中で記載される組成物は、生物学的に活性な薬剤（例えば、ミョウバンのようなアジュバント）のような他の薬学的に受容可能な成分、界面活性剤（例えば、グリセリド）、賦形剤（例えば、ラクトース）、キャリア、希釈剤、およびビヒクルを含み得、そしてこれらとともに投与され得る。さらにこの組成物は、被験体へ引き続いて再導入される、インビトロにおいてＨＰＶタンパク質抗原特異的免疫細胞を誘発、増大、および増殖させるために被験体から得られた白血球細胞を刺激する手段としてエキソビボで使用され得る。
【００５２】
さらに、ストレスタンパク質−ＨＰＶタンパク質抗原融合タンパク質は、これらのタンパク質配列をコードする核酸のインビボ発現によって、ヒト被験体に投与され得る。このような核酸配列の発現はまた、被験体へ引き続いて再導入される、インビトロにおいてＨＰＶ抗原特異的免疫細胞を誘発、増大、および増殖させるために被験体から得られた白血球細胞を刺激する手段としてエキソビボで達成され得る。ＨＰＶタンパク質抗原ストレスタンパク質融合物の発現を指向するために適切な発現ベクターは、この分野で現在使用される多くの種々のベクターから選択され得る。高レベルの発現を産生し得るベクターが好ましく、そして目的の遺伝子の導入に効果的である。例えば、組換えアデノウイルスベクターｐＪＭ１７（Ａｌｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３６７−８４（１９９４）；Ｂｅｒｋｎｅｒ  Ｋ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−２４  １９８８）、第２世代アデノウイルスベクターＤＥ１／ＤＥ４（ＷａｎｇおよびＦｉｎｅｒ、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７１４−６（１９９６））、またはアデノ関連ウイルスベクターＡＡＶ／Ｎｅｏ（Ｍｕｒｏ−Ｃａｃｈｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １１：２３１−７（１９９２））が使用される。さらに、組換えレトロウイルスベクターＭＦＧ（Ｊａｆｆｅｅら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２２２１−６（１９９３））またはＬＮ、ＬＮＳＸ、ＬＮＣＸ、ＬＸＳＮ（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９（１９８９））が使用され得る。ｐＨＳＶ１（Ｇｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８７：８９５０−４（１９９０））のような単純ヘルペスウイルスに基づくベクターまたは、ＭＶＡ（ＳｕｔｔｅｒおよびＭｏｓｓ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．８９：１０８４７−５１（１９９２））のようなワクシニアウイルスベクターは、代わりのベクターとして役立ち得る。
【００５３】
プロモーターおよび３’配列を含む、頻繁に使用される特異的な発現ユニットは、プラスミドＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プラスミドＡＨ５、ｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＭＵ  ＩＩ（Ｐａａｂｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：１９２１−１９２７（１９８６）），ｐＺｉｐ−Ｎｅｏ  ＳＶ（Ｃｅｐｋｏら、Ｃｅｌｌ  ３７：１０５３−１０６２（１９８４））およびｐＳＲａ（ＤＮＡＸ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）で見出される発現ユニットである。発現ユニットおよび／またはベクターへの遺伝子の導入は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣｌｏｎｉｎｇおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；Ａｕｓｂｅｌ．Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））のような説明書に記載されるような遺伝子操作技術を使用して達成され得る。生じる発現可能な核酸は、発現可能形態（例えば、ウイルスベクターの部分として、裸のプラスミドもしくは他のＤＮＡとして、または標的化リポソームにおいて、もしくは赤血球ゴーストにおいてキャプシド形成されて（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１４０１−１４０４（１９９４））、核酸を細胞へ配置し得る任意の方法によってヒト被験体の細胞へ導入され得る。形質導入の方法には、組織または腫瘍への直接注射、リポソームによるトランスフェクション（Ｆｒａｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：１１１−１１７（１９８０））、レセプター媒介エンドサイトーシス（Ｚａｔｌｏｕｋａｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．６６０：１３６−１５３（１９９２））、および粒子ボンバート媒介遺伝子移入（Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら、ＤＮＡ＆Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１２：７９１−７９７（１９９３））が含まれる。
【００５４】
本発明の組成物におけるストレスタンパク質およびＨＰＶタンパク質抗原の量（融合され、結合されるかまたは以前に記載したように非共有結合的に連結される）とは、被験体において効果的な免疫刺激応答を生じる量である。有効量は、投与された場合、免疫応答の誘導を生じるような量である。さらに、被験体に投与されるストレスタンパク質およびＨＰＶタンパク質抗原の量は、多様な因子に依存して変化し、これは用いられるＨＰＶタンパク質抗原およびストレスタンパク質、大きさ、年齢、体重、全体の健常度、性別、および被験体の食餌、ならびに免疫学的応答を含む。確立された用量範囲の調整および操作は、当業者の能力の十分な範囲内である。例えば、ストレスタンパク質および抗原の量は、約１μｇ〜約１ｇ、好ましくは約１００μｇ〜約１ｇ、および約１ｍｇ〜約１ｇであり得る。発現ベクターを含む組成物の有効量は、投与される場合、これをコードするＨＰＶタンパク質抗原に対して免疫応答を誘導するような量である。さらに、被験体に投与される発現ベクターの量は、多様な因子に依存して変化し、これは発現されるＨＰＶタンパク質抗原およびストレスタンパク質、大きさ、年齢、体重、全体の健常度、性別、および被験体の食餌、ならびに免疫学的応答を含む。意図されることを必要とするさらなる因子は、適用の経路および使用されるベクターの型である。例えば、予防的または治療的処置をＨＰＶタンパク質抗原−ストレスタンパク質融合タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターと共に実施する場合、有効量は、体重１ｋｇあたり１０4〜１０12ヘルパーフリー（ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ）複製欠損ウイルス、好ましくは体重１ｋｇあたり１０5〜１０11ウイルスの範囲、および最も好ましくは、体重１ｋｇあたり１０6〜１０10ウイルスの範囲にある。
【実施例】
【００５５】
本発明は、以下の実施例によって説明され、これはどのようにも限定されることを意図されない。
【００５６】
（実施例）
（実施例１：組換えストレスタンパク質の単離）
（組換えマイコバクテリアＨｓｐ７１）
プラスミドＹ３１１１は、発現制御配列の間に機能的に挿入されたＭ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈｓｐ７１遺伝子を含む（Ｍｅｈｌｅｒｔ，Ａ．およびＹｏｕｎｇ，Ｄ．Ｂ．、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１２５−１３０（１９８９））。短縮型ｄｎａＫ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＣＧ２０２７（Ｃ．Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから得た）を、標準的な手順によって、プラスミドＹ３１１１で形質転換した。（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））。
【００５７】
プラスミドＹ３１１１を含有する細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地（１リットル当たり、２０ｇトリプトン、１０ｇ酵母抽出物、１０ｇ  ＮａＣｌ）中で、３７℃で、撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）、一晩、増殖させた。１０％グリセロールストックを、この培養液から調製し、そして−７０℃で保存した。凍結したグリセロールストックからのいくつかの削片を、大量培養物を接種するために使用し、これを約４８時間になる前まで、インキュベートした。５９０ｎｍでの光学密度が、２．５〜３．５に達した場合、細胞を遠心分離によって回収した。
【００５８】
以下の工程を、４℃で行った。細胞ペレットを、ペレット化した細胞１ｇ当たり３ｍｌの溶解緩衝液中に再懸濁した。溶解緩衝液の組成は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンであった。リゾチームを、０．１４ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまで、細胞懸濁液に添加した。次いで、懸濁液を、−７０℃で凍結した。
【００５９】
細胞懸濁液を解凍し、そして細胞を、超音波処理によって破壊した。超音波処理物を、１７，０００ｒｐｍで、３０分間の遠心分離に供した。（ＪＡ−１７ローター、Ｂｅｃｋｍａｎｎ）。固体の（ＮＨ4）2ＳＯ4を、上清溶液が（ＮＨ4）2ＳＯ4で６５％飽和されるまで、上清溶液に添加した。インキュベーションの３０分後、混合液を以前のように遠心分離した。ペレットを、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａに溶解した。この溶液に、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンを添加し、そして溶液を６５容量のＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａに対して、一晩、透析した。Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａは、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含んだ。透析した溶液を、以前に記載のように、遠心分離によって澄明化した。
【００６０】
透析した溶液を、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液Ａ中で平衡化したＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを、２容量の同じ緩衝液で洗浄した。溶出には、０〜６００ｍＭ  ＮａＣｌ勾配を用いた。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、主要な７１ｋＤａポリぺプチド（すなわち、組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈｓｐ７１タンパク質）の存在について試験した。ポリぺプチドを含む画分をプールし、そしてこのプールを、固体の（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加によって６５％飽和にさせた。混合液を、以前に記載のように遠心分離し、ペレットをＡＴＰ開始緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、そして得られたタンパク質溶液を、一晩、６５容量の同じ緩衝液に対して透析し、そして遠心分離によって澄明化した。
【００６１】
次いで、透析したタンパク質溶液を、ＡＴＰ開始緩衝液中で平衡化したＡＴＰ−アガロースカラム（Ｆｌｕｋａ）にアプライした。カラムを１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１カラム容量のＡＴＰ開始緩衝液で洗浄した。溶出を、１０ｍＭ  ＡＴＰを補充したＡＴＰ開始緩衝液を用いて達成した。溶出物を、（ＮＨ4）2ＳＯ4で６５％飽和にし、そして沈殿したタンパク質を、以前に記載のように収集した。遠心分離ペレットを、溶解し、そして２００容量のＢｌｕｅ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に対して透析した。
【００６２】
最後の工程からの透析したタンパク質溶液を、Ｂｌｕｅ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ緩衝液中で平衡化したＢｌｕｅ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを、１．５カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。素通り画分および洗浄画分（Ｈｓｐ７１を含む）を、単一のプールとして回収した。最終調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、マイコバクテリアのＨｓｐ７１およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤｎａＫにそれぞれ特異的なマウスモノクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット分析（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２）；（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）を参照のこと））によって、ならびにＡＴＰアーゼ活性のアッセイによって、評価した。調製物は、クマシーブルー染色されたゲル中の調製物の染色パターンに基づいて、代表的には、９０％を超えて純粋であり、そして好ましくは９５％を超えて純粋であり、ならびに１％未満のＥ．ｃｏｌｉ  ＧｒｏＥＬを含み、そして検出可能なＥ．ｃｏｌｉ  ＤｎａＫを含まなかった。
（組換えマイコバクテリアＨｓｐ６５）
プラスミドＲＩＢ１３００は、発現制御配列の間に機能的に挿入されたＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ｈｓｐ６５遺伝子を含む。（Ｔｈｏｌｅ，Ｊ．Ｅ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：３４３−８（１９９３））。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５４６を、標準的な手順を用いて、プラスミドＲＩＢ１３００（Ｔｈｏｌｅら、Ｊ．Ｅ．Ｒ．、前出）で形質転換した。Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２））。
【００６３】
プラスミドＲＩＢ１３００を含有する細菌の接種物を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＮＣＺＹＭ培地（１リットル当たり１０ｇ  Ｎ−Ｚ  アミンＡ、５ｇ  Ｂａｃｔｏ  酵母抽出物、１ｇ  カサミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、５ｇ  ＮａＣｌ、２ｇ  （ＮＨ4）2ＳＯ4−７Ｈ2Ｏ））において、２８℃で、および撹拌下（２５０ｒｐｍ）、飽和するまで増殖させた。この培養物を、大量培養を接種するために使用し、これを接種培養と同じ条件下で、５９０ｎｍでの培養物の光学密度が０．３〜０．６の間になるまで増殖した。組換えタンパク質の生成を、熱水浴におけるインキュベーションによって、培養物の温度を４２℃まで急速に上昇させることによって、開始した。培養を、この温度で、３時間、攪拌しながら維持した。次いで、細菌を遠心分離によって収集し、そして細菌ペレットの１重量あたり６容量の溶解緩衝液に再懸濁した。溶解緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、および０．１％  ＲＩＶＭ  ＢＡ（５０ｍｌあたり、０．１０４ｇ  ４−アミノ−ベンズアミジン−２ＨＣｌ、０．０６６ｇ  ε−アミノカプロン酸）を含んだ。リゾチームを、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に添加し、そして懸濁液を−７０℃で凍結した。
【００６４】
細菌懸濁液を解凍し、そして４℃に置いた。以下の操作をこの温度で行った。細菌の完全な溶解を、超音波処理によって達成した。超音波処理物を、１７，０００ｒｐｍで、３０分間、ＪＡ−１７ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）において遠心分離した。飽和化（ＮＨ4）2ＳＯ4を、２０％飽和が達成されるまで、上清溶液に添加した。沈殿物を、遠心分離（上述を参照のこと）によって回収し、そして破棄した。上清溶液を、飽和化（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加によって、５５％飽和にした。上清の遠心分離によって得られるペレットを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解した。次いで、ＴＥ中のタンパク質溶液を、５０容量のＴＥ緩衝液に対して透析した。
【００６５】
沈殿した物質を除去するための遠心分離（上述のように）後、透析したタンパク質溶液を、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにアプライした。ＴＥ緩衝液を用いる洗浄後、タンパク質をＴＥ緩衝液中の０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌ勾配で溶出した。Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｈｓｐ６５を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって同定し、そしてプールした。１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチンを、このプールに添加し、次いでこれを、ＹＭ３０メンブレンを用いてＡｍｉｃｏｎセルに濃縮した。
【００６６】
濃縮したプールを、Ｓ２００緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で平衡化したＳ−２００  ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにアプライした。溶出は、同じ緩衝液を用いてであった。画分を、以前のようにマイコバクテリアのＨｓｐ６５の存在について試験し、そして高度に精製されたタンパク質を含有するポジティブな画分をプールし、そしてＨＡＰ緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）、１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に対して、一晩、透析した。
【００６７】
透析したプールを、ＨＡＰ緩衝液中で平衡化したヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰ  Ｇｅｌ）カラムにアプライした。カラムを、３カラム容量の１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、次いで１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）および１５ｍＭ  β−メルカプトエタノールで洗浄した。タンパク質を、１０〜６０ｍＭ  リン酸勾配で溶出した。画分を、以前のように試験し、そしてポジティブな画分をプールし、濃縮し、そしてＰＤ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を介するゲル濾過によって０．８５％  ＮａＣｌに交換した。マイコバクテリアのＨｓｐ６５の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ＤｎａＫおよびＧｒｏＥＬに特異的な抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、評価した。調製物は、代表的には、９０％を超える純度であり、ならびにそれぞれ、０．５％を超えないＥ．ｃｏｌｉ  ＧｒｏＥＬおよび０．１〜０．２％のＥ．ｃｏｌｉ  ＤｎａＫを含んだ。
【００６８】
Ｈｓｐ調製物は、ＤｅｔｏｘｉＧｅｌ樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）に対するアフィニティークロマトグラフィーによって、ポリミキシンＢを添加して、またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４もしくはＸ−１００のような界面活性剤を用いる溶出によってのいずれかで、発熱物質除去（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅ）し得る。リポ多糖類含量の減少は、リムルス遊走細胞（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ）アッセイ（ＬＡＬ；Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，ＱＣＬ１０００）によって追跡され得る。Ｈｓｐ調製物は、緩衝液中で−７０℃で保存され得るか、または凍結乾燥後に乾燥ペレットとして、好ましくは−７０℃に保たれ得る。
【００６９】
（実施例２：タンパク質抗原−ストレスタンパク質結合体の調製）
本実施例は、ストレスタンパク質と、タンパク質抗原、本実施例ではインフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）由来のペプチドとの間の結合体を調製するために用いられ得る技法の例として提供される。
【００７０】
（ストレスタンパク質（Ｈｓｐ７１）および抗原（ＮＰ．Ｂ）の合成）
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈｓｐ７１を、実施例１に記載のように調製した。完全ＮＰの残基３６３〜３７４に対応するアミノ酸配列［Ｃ］ＶＱＬＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号１；このペプチドは余分のアミノ末端システイン残基を含む）を有し、そして公知のＣＴＬエピトープ（Ｈ−２ｂ制限化）を含むＮＰペプチド（本明細書ではＮＰ．Ｂという；Ｍｏｔａｌ，Ｕ．Ｍ．Ａ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１１２１４（１９９５）およびその参考文献）を、αアミノ保護基としてＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル）および固体支持体としてＨＭＰ（Ｗａｎｇ）樹脂を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３１Ａペプチド合成機で合成的に産生した（０．２５ｍＭスケール）。すべてのアミノ酸および合成化学物質を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＮＰ．Ｂを支持体から切り離し、そして側鎖保護基を、１０ｍｌのトリフルオロ酢酸、０．５ｍｌの水、０．７５ｇの結晶フェノール、０．２５ｍｌのエタンジチオール、および０．５ｍｌのチオアニソールを混合することによって調製した２ｍｌの混合物中で、ＮＰ．Ｂ樹脂を連続撹拌で３時間インキュベートすることによって除去した。消化混合物を、４０ｍｌの氷冷ジエチルエーテル中に濾過した。不溶性物質を、５０００×ｇで８分間の遠心分離によって収集した。エーテルをデカントし、そしてペレットを、冷却ジエチルエーテルで再懸濁し、ついで遠心分離することによって３回洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを風乾し、蒸留水に溶解し、そして凍結乾燥した。
【００７１】
（ＮＰ．ＢペプチドのＨｓｐ７１およびジフテリアトキソイドへの化学結合）
結合体化を、Ｈｓｐ７１と、そしてＣＴＬ活性の特異的刺激の効率の比較のための標準を提供するために、通常はキャリアタンパク質と使用されるジフテリアトキソイド（略号ＤＴ；ＤＴはＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手した）との両方で行った。
【００７２】
活性化キャリアタンパク質溶液：９ｍｇのＨｓｐ７１を、４．５ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ８．０に溶解した。スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドエステル）（１００ｕｌのジメチルスルホキサミン中に２．３ｍｇ）を、タンパク質に添加し、そして反応混合物を、室温にて１時間インキュベートした。次いで、ｐＨを６．０に調節し、そして反応混合物を、１リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．６に対して４℃にて一晩透析した。ＤＴを同様に処理した。
【００７３】
還元したペプチド溶液：各結合反応について、３ｍｇのペプチドを、１００ｕｌの０．１Ｍ  β−メルカプトエタノールに溶解した。ペプチドを還元させるためのインキュベーションの１時間後、還元剤を、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心分離機中で反応混合物を乾燥させることによって除去した。ペプチドを、０．５ｍｌの蒸留水に再溶解し、これに、ペプチドが完全に溶解するまで、５ｕｌのアリコートの１Ｎ  ＮａＯＨを添加した。ＤＴでの結合実験については、６ｍｇのペプチドを還元し、次いで１ｍｌの水に再溶解した。
【００７４】
活性化キャリアタンパク質溶液のｐＨを、０．１Ｎ  ＮａＯＨを使用して６．８に調節した。３ｍｇの活性化キャリアタンパク質を含む溶液を、０．５ｍｌの還元したペプチド溶液（またはＤＴとの結合体の調製については１ｍｌの還元したペプチド溶液）と、連続混合しながら室温にて３時間反応させた。未反応ペプチドを除去するために、得られる結合体含有溶液を、１リットルの２０ｍＭ  リン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７に対して４℃にて一晩透析した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイによって決定した。この手順によって達成された結合の効率を、放射標識したＮＰ．Ｂペプチドを使用した先行パイロット実験で決定した。ペプチド：タンパク質比は、ＮＰ．Ｂ−Ｈｓｐ７１結合体（７１．ＮＰ）については１７．５、そしてＮＰ．Ｂ−ＤＴ（ＤＴ．ＮＰ）については１０．１であることを見いだした。
【００７５】
（実施例３：Ｈｓｐ−Ｅ６およびＨｓｐ−Ｅ７融合遺伝子の調製）
（細菌発現ベクターｐＥＴ６５Ｈの調製）
プラスミドＲＩＢ１３００は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ｈｓｐ６５遺伝子を含む（Ｔｈｏｌｅ，Ｊ．Ｅ．Ｒ．ら，Ｊ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：３４３−８（１９９３））。ｈｓｐ６５遺伝子の増幅のためのプライマー対を、自動オリゴヌクレオチド合成機で合成し、そして慣用的な手順を使用して精製した。前方向プライマーは、ＮｄｅＩ制限部位を含み、そしてヌクレオチド配列５’ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＡＴＴを有した。逆方向プライマーは、停止コドンに隣接するＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩ部位を含み、そしてヌクレオチド配列５’ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣを有した。
【００７６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、上記のプライマー対およびＤＮＡテンプレートとしてｐＲＩＢ  １３００を使用して行った。ＰＣＲフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼであるＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化し、そして慣用的なサブクローニング手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を使用して、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ二重消化したｐＥＴ２８ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの形質転換コンピテント細胞を、連結混合物で形質転換し、そして１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天にプレートした。形質転換した細胞のコロニーを単離し、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限マッピングおよびヌクレオチド配列決定によってｈｓｐ６５遺伝子の存在およびベクター配列について分析した。マイコバクテリアｈｓｐ６５遺伝子を含む正確な構築物（ｐＥＴ６５Ｈと命名）を同定し、そしてｈｓｐ６５遺伝子の発現の分析のためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株（ＤＥ３；Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。構築物ｐＥＴ６５Ｈの概略マップを、図１に示す。Ｈｓｐ６５の発現について試験するために、ＢＬ２１株の形質転換した細菌を、製造業者の指示書（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して増殖し、誘導し、そして採取した。細菌を溶解し、そして可溶性物質ならびに塩酸グアニジニウムによって封入体から可溶化した物質（Ｍａｎｉａｔｉｓら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、そしてマイコバクテリアのストレスタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を使用して抗Ｈｓｐ６５イムノブロットに供した。
【００７７】
（細菌におけるＨｓｐ６５−ＨＰＶ１６  Ｅ６融合タンパク質の発現のための構築物の調製）
完全なＨＰＶ１６  Ｅ６コード領域を、ｐＥＴ６５Ｈ中のｈｓｐ６５遺伝子のカルボキシ末端に挿入した。
【００７８】
プラスミドｐＨＰＶ１６は、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターＳＫ（ＡＴＣＣ４５１１３）中に完全なＨＰＶ１６ゲノムを含む。ＨＰＶ１６ゲノムのヌクレオチド配列については、Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４５：１８１−５（１９８５）を参照のこと。Ｅ６遺伝子の増幅のためのプライマー対を、自動オリゴヌクレオチド合成機で合成し、そして慣用的な手順を使用して精製した。前方向プライマーは、ＮｈｅＩ制限部位を含み、そしてヌクレオチド配列５’ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＡＧを有した。逆方向プライマーは、ＥｃｏＲＩおよび停止コドンを含み、そしてヌクレオチド配列５’ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴを有した。
【００７９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、上記のプライマー対およびＤＮＡテンプレートとしてｐＨＰＶ１６を使用して行った。ＰＣＲフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化し、そして慣用的なサブクローニング手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を使用して、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩで二重消化したｐＥＴ６５Ｈに連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの形質転換コンピテント細胞を、連結混合物で形質転換し、そして１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天にプレートした。形質転換した細胞のコロニーを単離し、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限マッピングおよび核酸配列決定によってｈｓｐ６５−Ｅ６融合遺伝子の存在およびベクター配列について分析した。ｈｓｐ６５−Ｅ６融合遺伝子を含む正確な構築物（ｐＥＴ６５ＨＥ６と命名）を同定し、そして融合遺伝子の発現の分析のためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株（ＤＥ３；Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。構築物ｐＥＴ６５ＨＥ６の概略マップを、図２に示す。Ｈｓｐ６５−Ｅ６の発現について試験するために、ｐＥＴ６５ＨＥ６で形質転換した株ＢＬ２１の細菌を、製造業者の指示書（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して増殖し、誘導し、そして採取した。細菌を溶解し、そして可溶性物質ならびに塩酸グアニジニウムによって封入体から可溶化した物質（Ｍａｎｉａｔｉｓら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。標準として、精製したＨｓｐ６５を並行して流した。Ｈｓｐ６５−Ｅ６発現を、対応する非形質転換細菌に存在しないｐＥＴ６５ＨＥ６形質転換した細菌からの試料において、認証Ｈｓｐ６５（約５６ｋＤａの見かけの分子量）よりもわずかに遅く移動する濃いクーマシーブルー染色バンド（約７３ｋＤａの見かけの分子量（ＭＯＯ））の出現によって評価した。
【００８０】
（細菌におけるＨｓｐ６５−ＨＰＶ１６  Ｅ７融合タンパク質の発現のための構築物の調製）
完全なＨＰＶ１６  Ｅ７コード領域を、ｐＥＴ６５Ｈ中のｈｓｐ６５遺伝子のカルボキシ末端に挿入した。
【００８１】
Ｅ７遺伝子の増幅のためのプライマー対を、自動オリゴヌクレオチド合成機で合成し、そして慣用的な手順を使用して精製した。前方向プライマーは、ＮｈｅＩ制限部位を含み、そしてヌクレオチド配列５’ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＴを有した。逆方向プライマーは、ＥｃｏＲＩおよび停止コドンを含み、そしてヌクレオチド配列５’ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧを有した。
【００８２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、上記プライマー対およびＤＮＡテンプレートとしてｐＨＰＶ１６を使用して行った。ＰＣＲフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化し、そして慣用的なサブクローニング手順を使用して、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩで二重消化したｐＥＴ６５Ｈに連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの形質転換コンピテント細胞を、連結混合物で形質転換し、そして１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天にプレートした。形質転換した細胞のコロニーを単離し、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限マッピングおよび核酸配列決定によってｈｓｐ６５−Ｅ７融合遺伝子の存在およびベクター配列について分析した。ｈｓｐ６５−Ｅ７融合遺伝子を含む正確な構築物（ｐＥＴ６５ＨＥ７と命名した）を同定し、そして融合遺伝子の発現の分析のためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株（ＤＥ３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。構築物ｐＥＴ６５ＨＥ７の概略マップを、図３に示す。Ｈｓｐ６５−Ｅ７の発現について試験するために、ｐＥＴ６５ＨＥ７で形質転換した株ＢＬ２１の細菌を、慣用的な手順を使用して増殖し、誘導し、そして採取した。細菌を溶解し、そして可溶性物質および塩酸グアニジニウムによって封入体から可溶化した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的なモノクローナル抗体を使用して抗Ｅ７ブロットにかけた（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．，カタログ番号２８−０００６）。
【００８３】
（実施例４：融合タンパク質の発現および精製）
（ＨＳＰ６５−Ｅ６融合タンパク質の発現および精製：手順１）
構築物ｐＥＴ６５ＨＥ６を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３；Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、そして形質転換した細胞を、３０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地（１リットル当たり２０ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ）の６リットル培養物中で３０℃にて培養した。各培養物について、密度が０．５（ＯＤ590）に達したとき、融合タンパク質の発現を、０．５ｍＭ  イソプロピルチオガラクトピラノシドによって誘導し、そして培養物を、３７℃にてさらに３時間インキュベートした。細胞を、遠心分離によって採取し、２００マイクログラム／ｍｌリゾチームを含む９０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）に懸濁し、そして−７０℃にて凍結した。１日後、凍結した細胞懸濁液を、３７℃水浴中で融解し、そして２マイクログラム／ｍｌ  アプロチニン、２マイクログラム／ｍｌ  ロイペプチン、２マイクログラム／ｍｌ  ペプスタチン、および２ｍＭ  ＰＭＳＦを補充した。すべてのその後の工程を、０〜４℃にて行った。細胞の溶解を、超音波処理によって行い、そして不溶性物質を、１７，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心分離（ＪＡ−１７ローター、Ｂｅｃｋｍａｎｎ）によって収集した。ペレットにした物質を、溶解緩衝液で２回洗浄し、次いで９０ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６Ｍ塩酸グアニジニウム）中で、超音波処置の補助により溶解させた。不溶性物質を、以前のように遠心分離によって除去した。次いで、可溶化した物質を、緩衝液Ａで平衡化されている５０ｍｌのニッケル−荷電金属−キレート化樹脂（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むカラムにアプライした。結合した融合タンパク質を、０〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で樹脂上にゆっくりとかさねた。樹脂を、残りの塩酸グアニジウムを除去するために緩衝液Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌ）に対して５容量で洗浄し、そして夾雑タンパク質を除去するために緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）について５容量で洗浄した。融合タンパク質を、緩衝液Ｃ中での５０〜５００ｍＭ直線イミダゾール勾配の６容量で溶出した。プールし溶出したタンパク質を、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（２．７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、４．３ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ）の約４０容量に対して一晩透析し、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ，３０ｋＤａのＭＷをカットオフする）によって濃縮し、そしてエンドトキシン除去のためのダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水で平衡化したＤｅｔｏｘｉｇｅｌ樹脂に通した。
【００８４】
（Ｈｓｐ６５−Ｅ６融合タンパク質の発現および精製：手順２）
構築物ｐＥＴ６５ＨＥ６を、 Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３；Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、そして形質転換した細胞を、３０ｕｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む２×ＹＴ培地（１リットル当たり２０ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ）の１２リットル培養物中で３０℃にて培養した。各培養物について、密度が０．５（ＯＤ590）に達したとき、融合タンパク質の発現を、０．５ｍＭ  イソプロピルチオガラクトピラノシドによって誘導し、そして培養物を、３７℃にてさらに３時間インキュベートした。細胞を、遠心分離によって採取し、２００ｕｇ／ｍｌリゾチームを含む１８０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）に懸濁し、そして−７０℃にて凍結した。１日後、凍結した細胞懸濁液を、３７℃水浴中で融解し、そして２マイクログラム／ｍｌ  アプロチニン、２マイクログラム／ｍｌ  ロイペプチン、２マイクログラム／ｍｌ  ペプスタチン、および２ｍＭ  ＰＭＳＦを補充した。すべてのその後の工程を、０〜４℃にて行った。細胞の溶解を、超音波処理によって行い、そして不溶性物質を、１７，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心分離（ＪＡ−１７ローター、Ｂｅｃｋｍａｎｎ）によって収集した。ペレットにした物質を、溶解緩衝液で２回洗浄し、次いで１８０ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６Ｍ塩酸グアニジニウム）中で、超音波処置の補助により溶解させた。不溶性物質を、前述のように遠心分離によって除去した。次いで、可溶化した物質を、緩衝液Ａで平衡化されている５０ｍｌ  ニッケル−荷電金属−キレート化樹脂（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むカラムにアプライした。結合したタンパク質を、緩衝液Ｄ（５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む緩衝液Ａ）で洗浄し、次いで０〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で樹脂上でゆっくりと再折り畳みさせた。樹脂を、残りの塩酸グアニジウムを除去するために緩衝液Ｅ（１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）の５容量および緩衝液Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌ）の５容量で洗浄し、そして夾雑タンパク質を除去するために緩衝液Ｆ（５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５％グリセロール）の５容量で洗浄した。融合タンパク質を、緩衝液Ｆ中の５０〜５００ｍＭ直線イミダゾール勾配の６容量で溶出した。プールし溶出したタンパク質を、緩衝液Ｇ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１５％グリセロール）の４０容量に対して一晩透析し、そして同じ緩衝液で平衡化した５０ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにアプライした。融合タンパク質（約４２ｍｇ、非分画抽出物に存在する総融合タンパク質の約５０％を示す）を、フロースルー画分中に回収し、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（２．７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、４．３ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ）の４０容量に対して一晩透析し、そして限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ，３０ｋＤａのＭＷをカットオフする）によって濃縮した。
【００８５】
Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質を、同じ手順によって発現および精製した。融合タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルのクーマシーブルー染色によって推定した。このタンパク質は、代表的には、手順１の後では７０〜９０％純粋、および好ましい手順２の後では約９５％純粋であった。手順２を使用する精製後のエンドトキシンレベルは、２０  ＥＵ／ｍｇタンパク質を下まわった。
【００８６】
（実施例５：Ｈｓｐ６５−Ｅ６およびＨｓｐ６５−Ｅ７での免疫）
雌Ｃ５７／ＢＬ／６マウス、６〜８週齢を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＴ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から得た。１群当たり６〜８マウスの群に、実施例４に記載のように精製したダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水中のＨｓｐ６５−Ｅ６およびＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質の等量を首のうなじに皮下に免疫した。投与した総融合タンパク質の用量は、それぞれ２０マイクログラムまたは２００マイクログラムであった。ネガティブコントロール免疫は、生理食塩水中のフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）で、およびポジティブコントロール免疫は、ＩＦＡおよび生理食塩水中に残基４４〜６２を含む１００マイクログラムの合成ＨＰＶ１６  Ｅ７ペプチドであった。適用された融合タンパク質の用量に対して、投与されるＥ７ペプチドのこの量は、それぞれ、２０倍または２００倍の過剰を示した。免疫を、１４日後に繰り返した。２回目の免疫の１２日後、マウスに、ＴＣ−１株の１．３×１０5Ｅ７発現腫瘍細胞を、マウスの毛を剃った背領域への皮下注射によってチャレンジした。腫瘍発生率を、５０日間、２日毎の視診および触診に基づいて腫瘍の存在または不在としてスコアした。ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質を発現するＴＣ−１腫瘍細胞株は、ＨＰＶ１６  Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子およびＬｉｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２１−２６（１９９６））に記載のような活性化ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子での形質転換および不死化によるＣ５７／ＢＩ／６マウスの初代肺細胞に由来した。腫瘍接種について、Ｔ．−Ｃ．Ｗｕ博士（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）によって供給された、ＴＣ−１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、非必須アミノ酸、グルタミン、ピルビン酸、ゲンタマイシン、β−メルカプトエタノール、０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）、および０．２ｍｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃にて６０〜７０％のコンフルエンスまで増殖した。細胞を、トリプシン処理によって採取し、そしてハンクス緩衝溶液に６．５×１０5細胞／ｍｌで再懸濁した。
【００８７】
このような実験の結果を、図４に示す。チャレンジのすぐ後に、腫瘍発生率は、すべての処置群で上昇した（チャレンジ後５〜１５日の間）。発生率はＩＦＡ群については高いままであったが、２００マイクログラムの融合タンパク質混合物で処置した群またはＩＦＡ中のＥ７ペプチドで処置した群については０％まで劇的に低下した。２０マイクログラムの融合タンパク質で処置した群については中間の結果を得た。したがって、任意のアジュバントの不在下でのＨｓｐ６５−Ｅ６およびＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質混合物での免疫は、Ｅ７を発現する腫瘍細胞での致死チャレンジからマウスを効果的に防御した。結果の要旨を、表１に示す。
【００８８】
【表１】
2006001939.tif 000002
【００８９】
（実施例６：腫瘍細胞での２回目のチャレンジへの免疫した動物の曝露）
ＨＰＶ抗原に対する免疫応答の寿命を評価するために、これまでの実験からの４匹の生存動物の群（５４日目）を、融合タンパク質処置群からとＥ７ペプチド／ＩＦＡ群からの両方とも、動物当たり１．３×１０5の生存ＴＣ−１腫瘍細胞で２回目のチャレンジをした。コントロールとして、同じ腫瘍チャレンジに曝露した、天然のままのマウスの群を含んだ。腫瘍発生率を２５日後に評価した。
【００９０】
結果を表１に示す。融合タンパク質またはＥ７ペプチド／ＩＦＡで既に免疫した動物は、２回目のチャレンジから完全にまたはほぼ完全に防御されたが、免疫していない動物は、１００％の腫瘍発生率を示した。
【００９１】
（実施例７：免疫した動物および免疫していない動物からの脾臓細胞の細胞溶解活性）
融合タンパク質、ペプチド、または免疫していない動物の２匹のマウスの群を、頚部脱臼によって安楽死させ、そしてその脾臓を取り出した。プールした脾臓の単一細胞懸濁液を調製し、そして５％ウシ胎仔血清を補充したハンクス緩衝溶液で１回洗浄した。リンパ系細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、および５０マイクログラム／ｍｌ  硫酸ゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃および５％ＣＯ2にて５日間、２０×１０6の生存細胞を２×１０6のマイトマイシンＣ処置ＴＣ−１細胞とともに培養することによって再刺激した。次いで、脾臓細胞（エフェクター細胞）を採取し、そして以下に記載のＣＴＬ活性アッセイで使用した。
【００９２】
Ｅ７エピトープを発現しないＴＣ−１およびＨＬＡタイプに適合した細胞株ＥＬ４およびＭＣ５７Ｇを、標的細胞として使用した。細胞を、１５０μＣｉ  Ｎａ251ＣｒＯ4と、９０分間インキュベートし、そしてＥＬ４細胞の場合には、１０6細胞当たり１０μｇのインフルエンザウイルス核タンパク質ペプチド366-374と一緒に９０分間インキュベートした。過剰の放射標識を除去するための大規模洗浄後、５×１０3の標識した標的細胞を、種々のエフェクター、標的細胞比で再刺激したエフェクター細胞と同時培養した。インキュベーションの４〜５時間後、培養プレートを、２００×ｇで５分間遠心分離し、そして細胞から放出された放射標識を含む上清溶液の１００ｕｌのアリコートを、ＢｅｃｋｍａｎのＲｅａｄｙ  Ｃａｐｓに収集した。放射能は液体シンチレーション計数によって測定された。自発的に放出された放射能およびトータルの放出可能な放射能を決定するために、標的細胞のみを含む培養物からの、またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の添加によって溶解した標的細胞からの上清溶液を収集し、そして以前のように放射能を決定した。結果を、以下の式に基づいて算出した、修正した溶解％として表した：
【００９３】
【数１】
2006001939.tif 000003
【００９４】
ＣＴＬアッセイを３組で行い、そして平均値を提供した。
【００９５】
標的細胞としてＴＣ−１細胞を使用する実験の結果を、図５に示す。ＴＣ−１細胞の溶解の４０％および２５％は、それぞれ、２００マイクログラムおよび２０マイクログラムの融合タンパク質で免疫した動物から得たエフェクター細胞（標的細胞の１００倍過剰で使用される）によって媒介された。
【００９６】
第２の実験では、ＣＴＬ活性の特異性を、２０マイクログラムの融合タンパク質で免疫した動物からの脾臓細胞を使用して試験した。図６に示した結果は、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７で形質転換したＴＣ−１細胞の効果的な溶解を証明する。ＨＰＶ抗原を発現しない２つの他の細胞タイプ（ＥＬ４およびＭＣ５７Ｇ）の溶解は、非常に減少した効率で発生し、これは、Ｈｓｐ６５−Ｅ６およびＥ７融合タンパク質での免疫によって誘起されたＣＴＬ応答の特異性を証明する。
【００９７】
（実施例８：ＨＳＰ６５−Ｅ７融合タンパク質での処置後のマウスにおけるＴＣ−１腫瘍の退縮）
８匹のＣ５７／ＢＩＪ６マウスの３つの群を、この実験に使用した。各動物に、毛を剃った背領域に１．３×１０5ＴＣ−１細胞を皮下に接種した。２日後、第１の群に生理食塩水を投与し（ネガティブコントロール）、第２の群に生理食塩水中のＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質の１００マイクログラム／動物を投与し、そして第３の群に、生理食塩水およびＩＦＡ中のＥ７ペプチドの１００マイクログラム／動物を投与した（ポジティブコントロール）。すべての注射（０．２ｍｌ）を、首のうなじに皮下投与した。１４日後（腫瘍接種後１６日目）、注射を繰り返した。腫瘍接種後１日目に始め、そしてその後２日毎に、マウスを可視観察および触診によって腫瘍の存在または非存在について検査した。
【００９８】
図７は、腫瘍接種の９日後に、処置群のすべてが、８５〜１００％の範囲の、最大腫瘍発生率（腫瘍を示す動物のパーセントとして表される）を示したことを表す。しかし１７日目までに、Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質で処置した群ならびにＩＦＡ中のＥ７ペプチドを投与した群は、約１５％で水平になった腫瘍発生率において非常に顕著な減少を示した。対称的に、生理食塩水処置群は、観察期間の残り全体にわたってほぼ１００％腫瘍発生率を有し続けた。これらの結果は、アジュバントの非存在下で投与したＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質が、ＨＰＶで誘導された腫瘍の激烈な退縮を誘導することを証明する。
【００９９】
類似の実験からの結果を、図８に示す。この実験において、動物に、これまでの実験におけるよりも高い腫瘍用量（２×１０5／動物）を接種した。得られた結果は、これまでの実験の結果と非常に類似した。
【０１００】
（実施例９：Ｅ７タンパク質およびＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質が細胞性免疫応答を誘導する能力の比較）
Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質を産生し、そして実施例４に記載のように精製した。全長ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質を、以下の手順によって得た。
【０１０１】
Ｅ７遺伝子を、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してＨＰＶ１６ゲノムＤＮＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得たｐＳＫ／ＨＰＶ１６）から増幅した。前方向プライマー（５’−ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＴ−３’）は、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流のＮｈｅＩ部位を含むが、一方で、逆方向プライマー（５’−ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ−３’）は、Ｅ７コード配列のＴＡＡ停止コドンのすぐ下流のＥｃｏＲＩ部位を含んだ。ＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲルから精製し、そして同じ制限酵素で消化されているｐＥＴ２８ａに連結した。細菌の形質転換、組換え体を含むコロニーの単離、および拡張したコロニーからのプラスミドのＤＮＡの調製を、標準的手順によって行った。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）を参照のこと。得られるプラスミド構築物であるｐＥＴ／Ｅ７（Ｈ）の同一性を、診断制限消化およびＤＮＡ配列分析によって確認した。ｐＥＴ／Ｅ７（Ｈ）の概略マップを図９に示す。
【０１０２】
３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＹＴ培地の１２リットルに、ｐＥＴ／Ｅ７（Ｈ）を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を接種し、そして曝気下で３０℃にて一晩インキュベートした。０．５の光学密度に達した時点で、培養物を、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで３時間誘導した。次いで、細胞を、遠心分離によって採取し、２００μｇ／ｍｌリゾチームを補充した１８０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に再懸濁し、そして−７０℃で一晩凍結した。細胞懸濁液を、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン、および２μｇ／ｍｌペプスタチンの存在下で３７℃の水浴中で融解した。２ｍＭ  ＰＭＳＦの添加後、細胞懸濁液を、激しい超音波処理にかけ、そして不溶性タンパク質を遠心分離によって収集した。タンパク質ペレットを、溶解緩衝液で２回再懸濁し、再び超音波処理し、そして遠心分離によって再収集した。次いで、タンパク質ペレットを、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、６Ｍ塩酸グアニジニウム、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中での超音波処理によって可溶化し、そして不溶性物質を、遠心分離によって除去した。可溶化したタンパク質を、緩衝液Ａで予め平衡化された５０ｍｌのＮｉ−キレートカラム（２．６ｃｍ×１２ｃｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。結合したタンパク質を、緩衝液Ｅ（２％  Ｔｒｉｓ  Ｘ−１００を含む緩衝液Ａ）の５ベッド容量で洗浄し、そして１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で塩酸グアニジニウム−塩化ナトリウム勾配（０．１Ｍ  ＮａＣｌ／６．０Ｍ塩酸グアニジニウム；５ベッド容量）で、再折畳みさせた。再折畳みされたタンパク質を５ベッド容量の緩衝液Ｆ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ、１５％  グリセロール、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で洗浄し、その後に５ベッド容量の緩衝液Ｇ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含まない緩衝液Ｆ）で洗浄してＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を除去した。カラムを、５ベッド容量の緩衝液Ｈ（５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ  ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５％グリセロール、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）でさらに洗浄して、弱く結合したタンパク質を除去した。Ｅ７タンパク質を、直線イミダゾール勾配（緩衝液Ｈ中の５０ｍＭ〜１Ｍイミダゾール）で溶出した。Ｅ７タンパク質を濃縮し、そして２５％グリセロールを補充したダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水に対して透析した。可溶性タンパク質を、−７０℃にて貯蔵した。Ｅ７調製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質染色によって本質的に均一であることを見いだした。
【０１０３】
タンパク質調製物のエンドトキシン濃度を、リムルス遊走細胞アッセイによって評価し、そしてミリグラムタンパク質当たり５０のエンドトキシンユニットより高くないことを見いだした。
【０１０４】
５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、生理食塩水、あるいは生理食塩水中の０．０５５ナノモル、０．５５ナノモル、または１．８ナノモルのＥ７タンパク質またはＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質を、尾の基部に注射によって免疫した。注射容量は０．２ｍｌであった。１０日後、鼠蹊部リンパ節（ＬＮ）を、各動物から無菌下で取り出し、そして１つの群の５動物のそれぞれからのＬＮをプールした。細胞懸濁液を、標準的手順によって調製した。ＬＮ細胞の各プール（２×１０6細胞／ｍｌ）について、平底９６ウェルプレートに、ウェル当たり４×１０5細胞を播種した。細胞を、培地、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ  Ｅ７タンパク質、１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ  Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質、あるいは１または１０μｇ／ｍｌ  Ｅ７ペプチド（「ｐｅｐ」；残基４４〜５７）のいずれかの添加に対する増殖性応答について、３組で試験した。添加後、細胞を、３７℃および５％ＣＯ2にて４日間インキュベートした。トリチウム化チミジン（１μＣｉ）を、各培養物に添加した。さらなるインキュベーションの１５時間後、細胞を採取し、そしてシンチレーション計数用に調製した。データを、取り込まれた放射能の平均ｃｐｍ＋／−標準偏差として、図１０に示す。
【０１０５】
種々のパネルは、上記の種々の量のＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質またはＥ７タンパク質を免疫した動物からのＬＮ細胞でのアッセイを示す。結果は、Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質での免疫が、融合タンパク質自体（上段および中段左）に対するならびにＥ７タンパク質（中段左）に対する細胞性免疫を誘導することを示す。Ｅ７タンパク質の認識は、このペプチドがＴヘルパー細胞エピトープを示すことが公知である、Ｅ７ペプチドによる増殖の観察された誘導によってさらに証明される（中段左）。対称的に、種々の量のＥ７タンパク質で免疫した（中段右および下段）または生理食塩水で擬免疫した動物からのＬＮ細胞での増殖応答は観察されなかった。Ｅ７タンパク質免疫した動物から調製した細胞は、Ｔ細胞マイトジェンＣｏｎＡに応じて増殖するそれらの能力によって証明されるように、生存可能であった。要約すると、Ｅ７での免疫と比較した場合、Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質での免疫は、免疫した動物からのＬＮ細胞の増殖によって評価されるように、Ｅ７に対する優れた細胞性免疫応答を誘起する。
【０１０６】
（実施例１０：Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質での処置は、極めて大きな樹立された腫瘍の退縮を生じる）
腫瘍治療におけるＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質の有効性を試験するために、Ｃ５７／ＢＬ／６マウスに、毛を剃った背領域に１．３×１０5のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射によって接種した。７日後、すべての動物が触診可能／測定可能な腫瘍を発生した時点で、動物を、３つの処置群に任意に割り当てた。各群は１２〜１４動物を含んだ。すべての処置は、首のうなじに０．２ｍｌの容量の皮下注射によるものであった。第１の群に、１００μｇのＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質を注射し、第２の群に、２０μｇのＥ７タンパク質（１００μｇの融合タンパク質と同量のモル量に対応する）を注射し、そして第３の群に、生理食塩水を注射した。腫瘍接種の１日後に始めて、マウスを、腫瘍の存在について可視でおよび触診によって観察した。腫瘍容積を、２つの直交方向でカリパスを使用して決定した。容積を、Ｎａｉｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４６：４１０９（１９８６）に記載の変換式を使用してこれらの測定から得た。結果を、各群における平均腫瘍容積＋／−標準誤差として、図１１に示す。
【０１０７】
結果は、Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質が、かなり大きい樹立された腫瘍の完全な退縮を生じることを証明する。この効果は、処置した動物のそれぞれにおいて顕著であった。逆に、擬処置もＥ７タンパク質での処置のいずれも、腫瘍の一時的退縮より大きくは引き起こさなかった。この実験後期の３つの時点で行われた腫瘍測定の統計学的評価を、表２に示す。算出したｐ値から明らかであるように、Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質での処置の腫瘍サイズにおける効果は、他の処置の効果とは統計学的に異なる。
【０１０８】
【表２】
2006001939.tif 000004
【０１０９】
これまでの実施例において、Ｈｓｐ６５−Ｅ７タンパク質を、ヒスチジンタグ付加タンパク質として産生したことに留意すること。観察した治療効果が、オリゴ−ヒスチジン配列の融合タンパク質における存在にどのようにも関連しないことを明確に証明するために、ヒスチジンタグのないＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質を、本実施例で調製しそして使用した。この融合タンパク質を、以下の手順を使用して得た。
【０１１０】
プラスミドＥＴ６５Ｃ（図１２）の構築のために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ｈｓｐ６５遺伝子を、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、プラスミドＲＩＢ  １３００から増幅した（Ｖａｎ  Ｅｄｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：１７１，１９８８）。使用した前方向プライマー（５’−ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＧＣＧ−３’）は、ｈｓｐ６５遺伝子のＡＴＧ開始コドンを含むＮｄｅＩ部位を含み、そして逆方向プライマー（５’−ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ−３’）は、Ｈｓｐ６５コード配列のＴＧＡ停止コドンのすぐ下流のＮｄｅＩ部位およびすぐ下流のＮｈｅＩ部位を含んだ。ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩで消化し、アガロースゲルから精製し、そして同様に消化したｐＥＴ２８ａに連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、そして抗生物質耐性コロニーを単離し、そしてプラスミドＤＮＡの調製のために増幅した。プラスミドＥＴ６５Ｃを、診断制限消化およびＤＮＡ配列分析によって同定した。
【０１１１】
タグ付加されていないＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質遺伝子を含むプラスミドＥＴ６５Ｃ／Ｅ７−１Ｎを調製するために、Ｅ７遺伝子を、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してＨＰＶ  １６ゲノムＤＮＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得たｐＳＫ／ＨＰＶ１６）から増幅した。前方向プライマー（５’−ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＴ−３’）は、ＡＴＧ開始コドンを含むＮｄｅＩ部位を含むが、逆方向プライマー（５’−ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ−３’）は、Ｅ７コード配列のＴＡＡ停止コドンのすぐ下流にＥｃｏＲＩ部位を含んだ。ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲルから精製し、そして同じ制限酵素で消化されているｐＥＴ６５Ｃに連結した。細菌の形質転換、組換え体を含むコロニーの単離、および拡張したコロニーからのプラスミドのＤＮＡの調製を、標準的手順によって行った。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）を参照のこと。得られたプラスミド構築物ｐＥＴ６５Ｃ／Ｅ７−１Ｎの同一性を、診断制限消化およびＤＮＡ配列分析によって確認した。ｐＥＴ６５Ｃ／Ｅ７−１Ｎの概略マップを図１３に示す。
【０１１２】
３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＹＴ培地の１２リットルに、ｐＥＴ６５Ｃ／Ｅ７−１Ｎを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を接種し、そして曝気下で３０℃にて一晩インキュベートした。光学密度が０．５に達した時点で、培養物を、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで３時間誘導した。次いで、細胞を、遠心分離によって採取し、２００μｇ／ｍｌリゾチームを補充した１８０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に再懸濁し、そして−７０℃にて一晩凍結した。細胞懸濁液を、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン、および２μｇ／ｍｌペプスタチンの存在下で３７℃の水浴中で融解した。２ｍＭ  ＰＭＳＦの添加後、細胞懸濁液を、激しい超音波処理にかけ、そして不溶性タンパク質を、遠心分離によって除去した。タグ付加されていないＨｓｐ６５−Ｅ７タンパク質の大多数を、可溶性タンパク質画分で見いだした。エンドトキシンを除去するために、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を、可溶性タンパク質画分に添加し、そして氷上で冷却し（５分間以上）、そして全体的に混合した。次いで、混合物を、３０℃の水浴中で１０分間加温し、そして２４℃での遠心分離にかけた。澄明な上清画分（上層）を、きれいなチューブに移した。遠心分離を、３〜６回繰り返して、残りのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を除去した。次いで、上清画分を硫酸アンモニウム分画にかけた。融合タンパク質を、０〜１５％硫酸アンモニウム（ｗ／ｖ）画分中に回収した。沈殿したタンパク質を、緩衝液Ｂ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、３Ｍ尿素、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に溶解し、そして緩衝液Ｂで予め平衡化した１７０ｍｌのＳｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（３．５ｃｍ×２０ｃｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。カラムを、緩衝液Ｃ（尿素を欠く緩衝液Ｂ）の３ベッド容量で、次いで緩衝液Ｄ（２５０ｍＭ  ＮａＣｌを補充した緩衝液Ｃ）の３ベッド容量で洗浄した。融合タンパク質を、直線塩勾配（緩衝液Ｃ中の２５０ｍＭ〜１Ｍ  ＮａＣｌ）で（プールＡ）、次いで６Ｍ塩酸グアニジニウム（緩衝液Ａ）で（プールＢ）溶出した。プールＢを、緩衝液Ａで予め平衡化した５０ｍｌのＮｉ−キレートカラム（２．６ｃｍ×１２ｃｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。結合したタンパク質を、緩衝液Ｅ（２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含む緩衝液Ａ）の５ベッド容量で洗浄し、そして１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で塩酸グアニジニウム−塩化ナトリウム勾配（０．１Ｍ  ＮａＣｌ／６．０Ｍ塩酸グアニジニウム；５ベッド容量）でリフォールディングした。再折畳みしたタンパク質を、５ベッド容量の緩衝液Ｆ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ、１５％グリセロール、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で、そしてその後５ベッド容量の緩衝液Ｇ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含まない緩衝液Ｆ）で洗浄して、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を除去した。カラムを、５ベッド容量の緩衝液Ｈ（５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ  ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５％グリセロール、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）でさらに���浄して、弱く結合したタンパク質を除去した。融合タンパク質を、直線イミダゾール勾配（緩衝液Ｈ中の５０ｍＭ〜１Ｍイミダゾール）で溶出した。タグ付加していないＨｓｐ６５−Ｅ７タンパク質を濃縮し、そして２５％グリセロールを補充したダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水に対して透析した。可溶性タンパク質を、−７０℃で貯蔵した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質染色による分析は、調製物が約９０％純粋であることを示した。
【０１１３】
ヒスチジンタグが重要でないことのさらなる証明として、ヒスチジンタグ付加Ｈｓｐ６５−Ｅ７およびタグ付加していないＨｓｐ６５−Ｅ７の効果を、上記のものと実質的に同一の実験において直接的に比較した。２つの融合タンパク質が、類似の効率で腫瘍を退縮させることを見いだした。
【０１１４】
（等価物）
当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を知り、あるいは確かめることができる。これらおよびすべての他の等価物は、以下の請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、構築物ｐＥＴ６５Ｈの概略図である。
【図２】図２は、構築物ｐＥＴ６５ＨＥ６の概略図である。
【図３】図３は、構築物ｐＥＴ６５ＨＥ７の概略図である。
【図４】図４は、腫瘍発生率のパーセント対ＴＣ−１腫瘍チャレンジ後の時間のグラフであり、腫瘍に対するＨｓｐ６５−Ｅ６および−Ｅ７融合タンパク質でのマウスの成功した免疫を示す。
【図５】図５は、ＴＣ−１腫瘍細胞の比細胞溶解のパーセント対標的細胞に対するエフェクターの比のグラフであり、免疫したマウスにおけるＨＰＶ抗原（Ｅ７）を発現する標的腫瘍細胞に対する細胞媒介性の細胞溶解応答を示す。
【図６】図６は、種々の標的細胞の溶解パーセント対標的細胞に対するエフェクターの比のグラフであり、免疫したマウスにおけるＨＰＶ  Ｅ７を発現する標的腫瘍細胞に対する細胞が媒介性の細胞溶解免疫応答の特異性を示す。
【図７】図７は、１．３×１０5ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、その後生理食塩水、生理食塩水中のＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質、または生理食塩水／ＩＦＡ中のＥ７ペプチドを注射したマウスにおける腫瘍発生率のパーセント対腫瘍細胞投与後の日数のグラフである。
【図８】図８は、２×１０5ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、その後生理食塩水、生理食塩水中のＨｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質、または生理食塩水／ＩＦＡ中のＥ７ペプチドを注射したマウスにおける腫瘍発生率のパーセント対腫瘍細胞投与後の日数のグラフである。
【図９】図９は、構築物ｐＥＴ／Ｅ７（Ｈ）の概略図である。
【図１０】図１０は、Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合タンパク質またはＥ７タンパク質で免疫したマウスから得た培養したリンパ節細胞によるチミジン取り込みを示すグラフのコレクションである。
【図１１】図１１は、ＴＣ−１腫瘍細胞を有するマウスにおける腫瘍サイズに対する、Ｈｓｐ−Ｅ７融合タンパク質またはＥ７での処置の効果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、構築物ｐＥＴ６５Ｃの概略図である。
【図１３】図１３は、構築物ｐＥＴ６５Ｃ／Ｅ７−１Ｎの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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