(57)【要約】本発明は、修飾抗原結合Ｆａｂ断片を提供する。抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子及びその分子を含む組成物も提供される。【選択図】  図１
2019528051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）を含む抗原結合Ｆａｂ断片であって、前記ＶＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＶＨドメインのＮ末端に連結しているか、又は前記ＶＨドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＶＬドメインのＮ末端に連結している、抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項２】
前記ＶＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＶＨドメインのＮ末端に連結しており、ここで、
（１）前記ＶＨドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、
（２）前記ＶＨドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結しているか、
（３）前記ＶＨドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結しており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、又は
（４）前記ＶＨドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しており、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結している、請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項３】
前記ＶＨドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＶＬドメインのＮ末端に連結しており、ここで、
（１）前記ＶＬドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、
（２）前記ＶＬドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結しているか、
（３）前記ＶＬドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結しており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、又は
（４）前記ＶＬドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しており、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結している、請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項４】
（１）前記ＶＬドメインが、ジスルフィド結合によって、前記ＣＬドメインに連結しているか、
（２）前記ＶＨドメインが、ジスルフィド結合によって、前記ＣＬドメインに連結しているか、
（３）前記ＶＬドメインが、ジスルフィド結合によって、前記ＣＨ１ドメインに連結しているか、又は
（４）前記ＶＨドメインが、ジスルフィド結合によって、前記ＣＨ１ドメインに連結している、請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項５】
Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項６】
Ｆｃ領域をさらに含む、請求項２に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項７】
Ｆｃ領域をさらに含む、請求項３に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項８】
Ｆｃ領域をさらに含む、請求項４に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項９】
２つ以上の請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、前記２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的である、抗原結合分子。
【請求項１０】
２つ以上の請求項２に記載の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、前記２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的である、抗原結合分子。
【請求項１１】
２つ以上の請求項３に記載の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、前記２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的である、抗原結合分子。
【請求項１２】
２つ以上の請求項４に記載の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、前記２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的である、抗原結合分子。
【請求項１３】
２つ以上の請求項５に記載の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、前記２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的であり、前記抗原結合分子が、Ｆｃ領域を有する、抗原結合分子。
【請求項１４】
２つ以上の請求項６に記載の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、前記２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的であり、前記抗原結合分子が、Ｆｃ領域を有する、抗原結合分子。
【請求項１５】
２つ以上の請求項７に記載の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、前記２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的であり、前記抗原結合分子が、Ｆｃ領域を有する、抗原結合分子。
【請求項１６】
２つ以上の請求項８に記載の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、前記２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的であり、前記抗原結合分子が、Ｆｃ領域を有する、抗原結合分子。
【請求項１７】
請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項２に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項３に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項４に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項５に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項６に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項７に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項８に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２５】
１つ又は複数の請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２６】
１つ又は複数の請求項２に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】
１つ又は複数の請求項３に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８】
１つ又は複数の請求項４に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２９】
１つ又は複数の請求項５に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３０】
１つ又は複数の請求項６に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３１】
１つ又は複数の請求項７に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３２】
１つ又は複数の請求項８に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３３】
請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
請求項２９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
請求項３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４０】
請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４１】
請求項３３に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、抗原結合分子を調製する方法。
【請求項４２】
請求項３４に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、抗原結合分子を調製する方法。
【請求項４３】
請求項３５に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、抗原結合分子を調製する方法。
【請求項４４】
請求項３６に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、二重特異的抗原結合分子を調製する方法。
【請求項４５】
請求項３７に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、二重特異的抗原結合分子を調製する方法。
【請求項４６】
請求項３８に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、二重特異的抗原結合分子を調製する方法。
【請求項４７】
請求項３９に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、二重特異的抗原結合分子を調製する方法。
【請求項４８】
請求項４０に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、二重特異的抗原結合分子を調製する方法。
【請求項４９】
請求項９に記載の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５０】
請求項１０に記載の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５１】
請求項１１に記載の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５２】
請求項１２に記載の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５３】
請求項１３に記載の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５４】
請求項１４に記載の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５５】
請求項１５に記載の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５６】
請求項１６に記載の抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]この出願は、その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１６年７月２１日出願の米国特許仮出願第６２／３６４，８５４号の優先権を主張する。
【０００２】
[0002]本発明は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）を含む修飾抗原結合Ｆａｂ断片であって、ＶＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、ＶＨドメインのＮ末端に連結しているか、又はＶＨドメインのＣ末端が、リンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に連結している、修飾抗原結合Ｆａｂ断片に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なるタイプの抗原に同時に結合することができる人工タンパク質である。治療用モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、ヒトの疾患を処置するために広く使用されている。しかし、１つの抗原のみを標的とすることは、がんのような適応症に対して通常不充分であり、再発することが多い。この現象により、既存のバイオマーカーを標的とする併用療法の研究中の数が増加している。
【０００４】
[0004]２０１４年に、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によるブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）の迅速承認により、ＢｓＡｂに対して米国での最初の承認が得られている。ＦＤＡによるＢｓＡｂの承認により、ますます多くの研究者が、がん、感染症、他の疾患又は障害を処置するためのＢｓＡｂの広範な調査に駆り立てられている。
【０００５】
[0005]ＢｓＡｂは、「ＩｇＧ様ＢｓＡｂ」又は「非ＩｇＧ様ＢｓＡｂ」などの多くの構造形式で製造され得る。例えば、「非ＩｇＧ様ＢｓＡｂ」は、Ｆａｂ領域のみからなる化学的に連結された抗原結合Ｆａｂ断片、又は種々のタイプの二価及び三価の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。「ＩｇＧ様ＢｓＡｂ」は、２つのＦａｂアームと１つのＦｃ領域を含み、ただし、２つのＦａｂ部位が異なる抗原に結合する。ＩｇＧ様ＢｓＡｂは、２つの重鎖が同一であるか否かによって、対称的であるか又は非対称的であり得る。
【０００６】
[0006]ＢｓＡｂは、細胞傷害性細胞（ＣＤ３のような受容体を使用して）とがん細胞などの標的（例えば、がん細胞上の抗原）とに同時に結合するように設計することができる。このようなＢｓＡｂは、規定した標的細胞（例えば、がん細胞）に対するＴ細胞媒介細胞傷害性に関して、細胞傷害性Ｔ細胞を関与させることができる。ＢｓＡｂ（又は二重特異的結合分子）設計に対する１つのアプローチは、２つの結合ドメインを架橋ドメイン（抗体の定常領域など）の２つの末端（Ｎ末端及びＣ末端）に取り付けることである。このようなアプローチの例は、米国特許出願公開第２０１３／０１６５６３８号に開示されている。二重特異的抗体の構築（又は二重特異的結合分子）に対する別のアプローチは、異なる結合ドメインが、天然ＩｇＧ抗体の２つの抗原結合部位を占めるようにすることである。
【０００７】
[0007]非対称ＢｓＡｂの生成は、ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）（ＫｉＨ）戦略（米国特許第７６９５９３６号）を採用することによって達成することができる。詳細には、ＫｉＨ戦略の概念は、２つのＣＨ３ドメイン間の境界面の修飾を利用する。かさ高い残基が、一方の抗体重鎖のＣＨ３ドメインに導入され、鍵のように作用する。他方の重鎖では、かさ高い残基を収容することができる、錠を模倣した「ホール」が形成される。得られるヘテロ二量体のＦｃ部分は、人工ジスルフィド架橋によってさらに安定化され得る。
【０００８】
[0008]ＫｉＨ戦略の１つの欠点は、軽鎖との無作為会合が依然として存在すること（すなわち、軽鎖誤対合、図１を参照のこと）である。軽鎖誤対合の問題は、共通の軽鎖を有する二重特異的分子を生成することによって（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ＡＭら  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８年；１６：６７７〜８１頁）又はＣｒｏｓｓＭａｂを生じる、１つの重鎖と軽鎖の間のドメインスワッピングによって（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ｗら  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１１年；１０８：１１１８７〜９２頁）対処することができる。
【０００９】
[0009]米国特許第９，３８２，３２３号は、「全長抗体」と、全長抗体の重鎖のＣ又はＮ末端でペプチドコネクターによって全長抗体に融合している「１つ又は２つの単鎖Ｆａｂ断片」とを含む二重特異的抗体に関する。しかし、米国特許第９，３８２，３２３号の全長抗体は、２つの同一の重鎖及び軽鎖を含む対称抗体であり、１つの抗原に対して一価である。米国特許第９，３８２，３２３号は、二重特異的抗体の調製における軽鎖誤対合の問題にも、軽鎖誤対合に対処するための技術的手段にも言及していない。
【００１０】
[0010]抗原（複数可）に対する強力な親和性を特異的に保持しながら、非対称ＢｓＡｂの調製における軽鎖誤対合の問題を克服するための新規戦略の開発が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
[0011]本発明は、抗原結合分子の形成中の誤対合率を低減し、分子の産生を改善するためにＦａｂ領域の構造を修飾する手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0012]したがって、本発明の一態様は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）を含む抗原結合Ｆａｂ断片であって、ＶＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、ＶＨドメインのＮ末端に連結しているか、又はＶＨドメインのＣ末端が、リンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に連結している、抗原結合Ｆａｂ断片を提供することである。
【００１３】
[0013]本発明の抗原結合Ｆａｂ断片の好ましい実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端は、リンカーを介して、ＶＨドメインのＮ末端に連結しており、ここで、（１）ＶＨドメインのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、（２）ＶＨドメインのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＬドメインのＮ末端に連結しているか、（３）ＶＨドメインのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＬドメインのＮ末端に連結しており、ＣＬドメインのＣ末端は、リンカーを介して、ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、又は（４）ＶＨドメインのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しており、ＣＨ１ドメインのＣ末端は、リンカーを介して、ＣＬドメインのＮ末端に連結している。
【００１４】
[0014]本発明の抗原結合Ｆａｂ断片の別の好ましい実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端は、リンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に連結しており、ここで、（１）ＶＬドメインのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、（２）ＶＬドメインのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＬドメインのＮ末端に連結しているか、（３）ＶＬドメインのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＬドメインのＮ末端に連結しており、ＣＬドメインのＣ末端は、リンカーを介して、ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、又は（４）ＶＬドメインのＮ末端は、ペプチド結合によって、ＣＨ１ドメインのＣ末端に連結しており、ＣＨ１ドメインのＮ末端は、リンカーを介して、ＣＬドメインのＣ末端に連結している。
【００１５】
[0015]本発明の抗原結合Ｆａｂ断片のさらに好ましい実施形態では、（１）ＶＬドメインは、ジスルフィド結合によって、ＣＬドメインに連結しているか、（２）ＶＨドメインは、ジスルフィド結合によって、ＣＬドメインに連結しているか、（３）ＶＬドメインは、ジスルフィド結合によって、ＣＨ１ドメインに連結しているか、又は（４）ＶＨドメインは、ジスルフィド結合によって、ＣＨ１ドメインに連結している。
【００１６】
[0016]本発明のさらなる実施形態では、抗原結合Ｆａｂ断片は、Ｆｃ領域を任意選択で含む。
【００１７】
[0017]本発明の別の態様は、２つ以上の本発明の抗原結合Ｆａｂ断片を含む抗原結合分子であって、２つ以上の断片が、同一又は異なる抗原に特異的である、抗原結合分子を提供することである。
【００１８】
[0018]本発明の別の態様は、本発明の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００１９】
[0019]本発明の別の態様は、本発明の抗原結合Ｆａｂ断片又は抗原結合分子を発現するためのベクター及び宿主細胞を提供することである。
【００２０】
[0020]本発明の別の態様は、本発明の抗原結合分子を調製するための方法を提供することである。
【００２１】
[0021]本発明の別のさらなる態様は、本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物を提供することである。
【００２２】
[0022]本発明は、以下の節で詳細に説明される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲に容易に見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＩｇＧ  ＢｓＡｂアッセンブリーの可能な産物の概略図を示す。
【図２】図２ＡはネイティブＦａｂの構造を示す図である。図２Ｂ〜Ｉは本発明のＦａｂ断片の可能な構造を示す図である。
【図３−１】図３Ａ〜Ｆは本発明の抗原結合分子の可能な構造を示す図である。
【図３−２】図３Ｇ〜Ｌは本発明の抗原結合分子の可能な構造を示す図である。
【図３−３】図３Ｍ〜Ｑは本発明の抗原結合分子の可能な構造を示す図である。
【図４−１】図４Ａ〜Ｃは本発明の抗原結合分子をコードするための核酸配列を示す図である。「＊」は、ノブ・イントゥー・ホールのＣＨ３ドメインへの導入を示す。「＃」は、操作システインのＶＬ１ドメイン、ＶＬ２ドメイン及びＣＬドメインへの導入を示す。「Ｐ」、「Ｐ１」及び「Ｐ２」は、プロモーターを示す。
【図４−２】図４Ｄ〜Ｅは本発明の抗原結合分子をコードするための核酸配列を示す図である。「＊」は、ノブ・イントゥー・ホールのＣＨ３ドメインへの導入を示す。「＃」は、操作システインのＶＬ１ドメイン、ＶＬ２ドメイン及びＣＬドメインへの導入を示す。「Ｐ」、「Ｐ１」及び「Ｐ２」は、プロモーターを示す。
【図５Ａ】本発明の抗原結合分子の発現に対するベクターを示す図である。
【図５Ｂ】本発明の抗原結合分子の発現に対するベクターを示す図である。
【図５Ｃ】本発明の抗原結合分子の発現に対するベクターを示す図である。
【図５Ｄ】本発明の抗原結合分子の発現に対するベクターを示す図である。
【図５Ｅ】本発明の抗原結合分子の発現に対するベクターを示す図である。
【図５Ｆ】本発明の抗原結合分子の発現に対するベクターを示す図である。
【図５Ｇ】本発明の抗原結合分子の発現に対するベクターを示す図である。
【図５Ｈ】本発明の抗原結合分子の発現に対するベクターを示す図である。
【図６−１】図６Ａ〜Ｄは実施例２から得られたＢｓＡｂクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図６−２】図６Ｅ〜Ｈは実施例２から得られたＢｓＡｂクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図６−３】図６Ｉ〜Ｌは実施例２から得られたＢｓＡｂクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図６−４】図６Ｍ〜Ｎは実施例２から得られたＢｓＡｂクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
[0029]本明細書において別段定義されていなければ、本発明に関連して使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は、明確であるべきであるが、どんなに潜在的に曖昧な場合でも、本明細書で示される定義は、いかなる辞書又は外部からの定義よりも優先される。
【００２５】
[0030]文脈によって別段要求されなければ、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。例えば、用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、本明細書で使用する場合、１つ又は１つより多くとして定義される。
【００２６】
[0031]本明細書で使用する場合、請求項における用語「又は（ｏｒ）」は、二者択一の選択肢のみを指すことが明確に示されていなければ又は二者択一の選択肢が相互排他的でなければ、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するために使用される。
【００２７】
[0032]本明細書で使用する場合、用語「第１の」、「第２の」などは、異なる単位（例えば、第１の核酸、第２の核酸）を指す。本明細書におけるこれらの用語の使用は、１つの単位又は事象が、別のものの前に生じるか又は起こるなどの順序を必ずしも暗示するものではなく、むしろ、特定の単位間を区別するための機序をもたらすものである。
【００２８】
[0033]本明細書で使用する場合、用語「抗原結合Ｆａｂ断片」は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む断片を指す。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価である。Ｆａｂ断片は、ＩｇＧ抗体のＦａｂ領域（ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する）をさらに含んでもよい。
【００２９】
[0034]本明細書で使用する場合、用語「抗原結合分子」は、１つ又は複数の抗原に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、ＩｇＧ様分子又は非ＩｇＧ様分子である。
【００３０】
[0035]本明細書で使用する場合、用語「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続させるか、又はＶＬのＮ末端をＶＨのＣ末端と接続させることができるリンカーと接続した免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬの融合タンパク質を指す。
【００３１】
[0036]本明細書で使用する場合、用語「システイン操作抗体」は、ネイティブ抗体の軽鎖又は重鎖には通常存在しない１つ又は複数のシステイン残基を含む抗体を指す。したがって、このようなシステイン残基は、「操作システイン」と称される。操作システインは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３２巻、第４号、２４９〜２５８頁、１９９５年におけるものなどの従来技術を使用することによって導入することができる。
【００３２】
[0037]本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、ヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ又はＲＮＡの形態で存在してもよい。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／若しくはそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによってか、又は合成反応によってポリマー中に組み込むことができる任意の基質であり得る。
【００３３】
[0038]本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、核酸分子が連結される別の核酸配列を輸送することが可能なその核酸分子を指す。ベクターは、追加のＤＮＡセグメントを導入できる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」であってもよい。
【００３４】
[0039]本明細書で使用する場合、用語「トランスフェクション」は、ポリヌクレオチドを真核生物細胞へと導入するプロセスを指す。
【００３５】
[0040]本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、同一鎖上のＤＮＡの上流で（センス鎖の５’領域に向かって）遺伝子の転写開始部位付近に位置する。
【００３６】
[0041]本明細書で使用する場合、用語「修飾」は、元のアミノ酸配列と比較したアミノ酸配列の変化を指す。修飾として、例えば、別のアミノ酸によるアミノ酸残基の置換、１つ又は複数のアミノ酸の挿入、及びアミノ酸残基（複数可）の欠失が挙げられる。
【００３７】
[0042]本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、生物学的又は薬理学的活性を有する有効成分と薬学的に許容される担体とを含む配合物又は調製物を指す。医薬組成物は、錠剤、散剤、ペレット、ビーズ、顆粒剤、ミクロスフェア、カプセル剤、丸剤などの形態で存在してもよい。
【００３８】
[0043]本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、医薬組成物を製造するために、当技術分野で周知である、溶剤、希釈液、バインダー、接着剤、アジュバント、賦形剤、受容体、安定剤、類似体、着香剤、甘味剤、乳化剤及び／又は保存剤を指す。薬学的に許容される担体の例として、これらに限定されないが、水、生理食塩水、緩衝液、不活性成分、及び非毒性固体が挙げられる。
一般的技術
【００３９】
[0044]本発明は、分子生物学、化学、生化学、細胞生物学、微生物学及び免疫学の従来技術を使用することができる。従来技術について記載する先行技術文献／参照文献として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第４版）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（第１版）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙが挙げられる。
【００４０】
細胞培養条件
宿主細胞
[0045]本発明のＦａｂ断片又は抗原結合分子は、原核生物、真核生物及び植物の宿主細胞を含む宿主細胞で産生され得る。例えば、原核生物の宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよい。本発明のＦａｂ断片又は抗原結合分子を産生するのに適する真核生物の宿主細胞として、これらに限定されないが、アフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞（ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＮＳ０及びＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３など）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞及びヒト網膜由来ＰＥＲ−Ｃ６細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞）が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞である。
【００４１】
プロモーター
本発明の抗原結合分子の高レベルの発現を達成するために、強力なプロモーターを使用して、抗体重鎖及び軽鎖の発現を駆動させる。プロモーターは、真核生物のプロモーター又は原核生物のプロモーターであり得る。本発明のＦａｂ断片又は抗原結合分子の産生に適する原核生物のプロモーターとして、これらに限定されないが、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｓｐ６、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｐｔａｃ及びｐＬが挙げられる。本発明のＦａｂ断片又は抗原結合分子の産生に適する原核生物のプロモーターとして、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子アルファ（ＥＦ１α）、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、ＵＡＳ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１及びＵ６が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、使用されるプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
【００４２】
ベクターの設計
[0046]本発明の一実施形態では、ベクターは、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１又はＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１セグメントをコードする核酸配列及びＣＬドメインをコードする核酸配列を含有し、２つの核酸配列の発現は、それぞれ、２つのプロモーターによって駆動される。本発明の別の実施形態では、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１又はＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１セグメントをコードする核酸配列は、３’末端でＦｃ領域（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む）をコードする核酸配列をさらに含む。
【００４３】
[0047]本発明の一実施形態では、ベクターは、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＬ又はＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＬセグメントをコードする核酸配列及びＣＨ１ドメインをコードする核酸配列を含有し、２つの核酸配列の発現は、それぞれ、２つのプロモーターによって駆動される。本発明の別の実施形態では、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＬ及びＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＬセグメントをコードする核酸配列は、３’末端でＦｃ領域（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む）をコードする核酸配列をさらに含む。
【００４４】
[0048]本発明の一実施形態では、ベクターは、ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＣＨ１、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＣＨ１、ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＣＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＣＬセグメントをコードする核酸配列を含有する。本発明の別の実施形態では、ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＣＨ１、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＣＨ１、ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＣＬ及びＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＣＬセグメントをコードする核酸配列は、３’末端でＦｃ領域（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む）をコードする核酸配列をさらに含む。
【００４５】
[0049]本発明の一実施形態では、２つ以上のベクターが宿主細胞にトランスフェクトされて、本発明の抗原結合分子を産生する（例えば、図４Ａ〜Ｃ）。ベクターは、それぞれ、異なる抗原に特異的な抗原結合断片を発現する。
本発明において使用されるリンカーの配列及び長さ
【００４６】
[0050]当技術分野で公知の任意のリンカーを本発明において使用することができる。リンカーは、３〜５０個のアミノ酸、好ましくは５〜４０個のアミノ酸、より好ましくは５〜３０個のアミノ酸、さらにより好ましくは１０〜２５個のアミノ酸、最も好ましくは１５個のアミノ酸のペプチドであり得る。リンカーは、通常、可撓性に関してはグリシンリッチであり、可溶性に関してはセリン又はスレオニンリッチである。表１は、本発明において使用することができる実施例のリンカーの配列及び長さを示す（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１３年、第２９巻、２号、１７５〜１８６頁）。本発明の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）の配列を有する。
【表１】
2019528051.tif 000003
【００４７】
本発明のＦａｂ断片及び抗原結合分子の構造
[0051]本発明は、構造が公知のＦａｂと異なる一連のＦａｂ断片を提供する。
【００４８】
[0052]図２Ａで示すように、ネイティブＦａｂでは、ＶＬのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＬのＮ末端に連結しており、ＶＨのＣ末端は、ペプチド結合によって、ＣＨ１のＮ末端に連結しており、ＣＬは、ジスルフィド結合を介して、ＣＨ１に連結している。
【００４９】
[0053]本発明の一態様は：
（ａ）ＶＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、ＶＨドメインのＮ末端に連結しており、ＶＬドメインが、ジスルフィド結合を介して、ＣＬドメインに任意選択で連結している、ＶＬドメイン、ＣＬドメイン、及びＶＨ−ＣＨ１領域（図２Ｂ）；
（ｂ）ＶＨドメインのＣ末端が、リンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に連結しており、ＶＨドメインが、ジスルフィド結合を介して、ＣＬドメインに任意選択で連結している、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＶＬ−ＣＨ１領域（図２Ｃ）；
（ｃ）ＶＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、ＶＨドメインのＮ末端に連結しており、ＶＬドメインが、ジスルフィド結合を介して、ＣＨ１ドメインに任意選択で連結している、ＶＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＶＨ−ＣＬ領域（図２Ｄ）；
（ｄ）ＶＨドメインのＣ末端が、リンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に連結しており、ＶＨドメインが、ジスルフィド結合を介して、ＣＨ１ドメインに任意選択で連結している、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＶＬ−ＣＬ領域（図２Ｅ）；
（ｅ）ＶＨドメインのＣ末端が、第１のリンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に連結しており；且つＣＨ１ドメインのＮ末端が、第２のリンカーを介して、ＣＬドメインのＣ末端に連結しており、第１のリンカーと第２のリンカーが、同一であるか若しくは異なり、ＶＨドメインが、ジスルフィド結合を介して、ＣＨ１ドメインに任意選択で連結している、ＶＨ、ＣＨ１、及びＶＬ−ＣＬ領域（図２Ｆ）；
（ｆ）ＶＬドメインのＣ末端が、第１のリンカーを介して、ＶＨドメインのＮ末端に連結しており；且つＣＨ１ドメインのＮ末端が、第２のリンカーを介して、ＣＬドメインのＣ末端に連結しており、第１のリンカー及び第２のリンカーが、同一であるか若しくは異なり、ＶＬドメインが、ジスルフィド結合を介して、ＣＨ１ドメインに任意選択で連結している、ＶＬ、ＣＨ１、及びＶＨ−ＣＬ領域（図２Ｇ）；
（ｇ）ＶＨドメインのＣ末端が、第１のリンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に連結しており；且つＣＬドメインのＮ末端が、第２のリンカーを介して、ＣＨ１ドメインのＣ末端に連結しており、第１のリンカー及び第２のリンカーが、同一であるか若しくは異なり、ＶＨドメインが、ジスルフィド結合を介して、ＣＬドメインに任意選択で連結している、ＶＨ、ＣＬ、及びＶＬ−ＣＨ１領域（図２Ｈ）；又は
（ｈ）ＶＬドメインのＣ末端が、第１のリンカーを介して、ＶＨドメインのＮ末端に連結しており；且つＣＬドメインのＮ末端が、第２のリンカーを介して、ＣＨ１ドメインのＣ末端に連結しており、第１のリンカー及び第２のリンカーが、同一であるか若しくは異なり、ＶＬドメインが、ジスルフィド結合を介して、ＣＬドメインに任意選択で連結している、ＶＬ、ＣＬ、及びＶＨ−ＣＨ１領域（図２Ｉ）
を含む修飾Ｆａｂ断片を提供することである。
【００５０】
[0054]ジスルフィド結合は、本明細書に記載のシステイン操作技術を用いることによって形成することができる。このようなジスルフィド結合を有する本発明のＦａｂ断片又は抗原結合分子は、「ジスルフィド結合安定化」形式と称される。
【００５１】
[0055]本発明の別の実施形態では、ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＨ１、ＶＨ−ＣＬ、及びＶＬ−ＣＬ領域のそれぞれは、Ｆｃ領域をさらに含んでもよい。
【００５２】
[0056]本発明の修飾Ｆａｂ断片に鑑みて、抗原結合分子の構造の例として、図３Ａ〜Ｋ（図３−１〜図３−２）に示すものを挙げることができ、本発明の抗原結合分子は、単一特異的であるか又は二重特異的であり得る（Ｒｏｌａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２年）  Ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｍＡｂｓ、４：２、１８２〜１９７頁）。
【００５３】
[0057]本発明の実施形態では、当技術分野で公知の任意の戦略、例えば、ＫｉＨ戦略及びＣｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｋｌｅｉｎら  （「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈａｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．  ２０１２年１１月１日；４（６）：６５３〜６６３頁）に開示されたものを、Ｆｃ領域を有する抗原結合分子の形成において使用することができる。例えば、ＫｉＨ戦略において、２つのＦｃ領域における２つのＣＨ３ドメインの核酸配列の位置は、表２に示されるように修飾され得る。
【表２】
2019528051.tif 000004
2019528051.tif 000005
【００５４】
本発明の修飾Ｆａｂ断片又は抗原結合分子を調製するための方法
[0058]本発明の一態様は、対象出願のＦａｂ断片及び抗原結合分子を調製するための方法を提供することである。方法は、本発明のＦａｂ断片又は抗原結合分子の発現に適する条件で、上述の宿主細胞をインキュベートするステップを含んでもよい。本発明によれば、宿主細胞は、上述の１つ又は複数のベクターを含んでもよい。Ｆａｂ断片及び抗原結合分子の発現に適する条件は、使用されるプロモーター、ベクター及び宿主細胞の種に応じて変わる可能性があり、先行技術に基づいて決定することができる。
【実施例】
【００５５】
[0059]以下の実施例は、本発明を実践する際に、当業者を助けるために提供される。たとえそうであっても、本発明に対する修飾、及び本明細書で議論した実施形態に関する変更は、本発明の発見の精神又は範囲を逸脱することなく当業者によってなされてもよいため、実施例は、本発明を不当に限定するものと解釈するべきではない。
【００５６】
実施例１：本発明の抗原結合分子の発現のためのベクターの調製
Ｉ．図３Ａ（図３−１）の抗原結合分子を生成する方法
[0060]図３Ａの抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列の構造を図４Ａ（図４−１）に示し、発現ベクターを図５Ａ及び５Ｂに示す。
【００５７】
[0061]２つの異なる抗原に特異的な、２つのＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２断片（「ＶＬ１−リンカー−ＶＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（ノブ）」及び「ＶＬ２−リンカー−ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（ホール）」）をコードする２つのポリヌクレオチド配列を、遺伝子合成によって生成した。２つのポリヌクレオチド配列を、ＭｌｕＩ及びＭｆｅＩ制限酵素による消化後、プラスミドｐＴＡＣＥ８を発現する抗体にサブクローニングした。リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。
【００５８】
[0062]２つのＣＨ３ドメインをコードする２つのポリヌクレオチド配列を、一方のＣＨ３ドメインの配列にノブアーム遺伝子Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、他方のＣＨ３ドメインの配列にホールアーム遺伝子Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含むように、ＰＣＲ増幅によって修飾した。２つの修飾ポリヌクレオチド配列を、ＶＬ−リンカー−重鎖ノブ又はホールを形成するために、ＭｆｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素による消化後、プラスミドｐＴＡＣＥ８を発現する抗体にサブクローニングした。
【００５９】
[0063]カッパ断片をコードするポリヌクレオチド配列を、遺伝子合成によって生成した。ポリヌクレオチド配列を、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素による消化後、ＶＬ−リンカー−重鎖ノブ又はホールアームを含むプラスミドｐＴＡＣＥ８を発現する抗体にサブクローニングした。
【００６０】
[0064]アミノ酸配列を表３に示す。
【表３】
2019528051.tif 000006
【００６１】
ＩＩ．図３Ｅ（図３−１）の抗原結合分子を生成する方法
[0065]図３Ｅの抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列の構造を図４Ｂ（図４−１）に示し、発現ベクターを図５Ｃ及び５Ｄに示す。
【００６２】
[0066]２つの異なる抗原に特異的であり、ノブ及びホール修飾を有する２つのＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３断片（「ＶＬ１−リンカー−ＶＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（ノブ）」及び「ＶＬ２−リンカー−ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（ホール）」）をコードする４Ａに由来する２つのプラスミドを上述の方法によって生成した。リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。
【００６３】
[0067]２つの異なる抗原に特異的な２つのＶＬ−システイン変異リンカーＶＨ断片をコードする２つのポリヌクレオチド配列を遺伝子合成によって生成した。操作システインを含有する２つのポリヌクレオチド配列を、ＭｌｕＩ及びＮｈｅＩ制限酵素による消化後、４Ａに由来するベクターｐＴＡＣＥ８を発現する抗体にサブクローニングした。
【００６４】
[0068]操作システインを有するカッパ断片をコードするポリヌクレオチドを遺伝子合成によって生成した。前記ポリヌクレオチドを、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素による消化後、ベクターを発現する抗体にサブクローニングした。
【００６５】
[0069]アミノ酸配列を表４に示す。
【表４】
2019528051.tif 000007
【００６６】
ＩＩＩ．図３Ｋ（図３−２）の抗原結合分子を生成する方法
[0070]図３Ｋの抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列の構造を図４Ｃ（図４−１）に示し、発現ベクターを図５Ｅ及び５Ｆに示す。
【００６７】
[0071]２つのＣＨ３ドメインをコードする２つのポリヌクレオチド配列を、一方のＣＨ３ドメインの配列にノブアーム遺伝子Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、他方のＣＨ３ドメインの配列にホールアーム遺伝子Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含むように、ＰＣＲ増幅によって修飾した。２つの修飾ポリヌクレオチド配列を、ＭｆｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素による消化後、ベクターｐＴＣＡＥ９．１１を発現する抗体にサブクローニングした。
【００６８】
[0072]２つの異なる抗原に特異的である２つのＶＨ−リンカー１−ＶＬ−ＣＬ−リンカー２−ＣＨ１−ＣＨ２断片（「ＶＨ１−リンカー−ＶＬ１−ＣＬ−リンカー−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（ノブ）」及び「ＶＨ２−リンカー−ＶＬ２−ＣＬ−リンカー−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（ホール）」）をコードする２つのポリヌクレオチド配列を合成方法によって生成した。リンカー１及び２は同一のアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。２つのポリヌクレオチド配列を、ＭｌｕＩ及びＭｆｅＩ制限酵素による消化後、ベクターｐＴＣＡＥ９．１１を発現する抗体にサブクローニングした。
【００６９】
[0073]アミノ酸配列を表５に示す。
【表５】
2019528051.tif 000008
【００７０】
ＩＶ．図３Ｉ（図３−２）の抗原結合分子を生成する方法
[0074]図３Ｉの抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列の構造を図４Ｄ（図４−２）に示し、発現ベクターを図５Ｇに示す。
【００７１】
[0075]ＶＨ１−リンカー−ＶＬ１−ＣＬ−リンカー−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ２−リンカー−ＶＬ２−ＣＬ−リンカー−ＣＨ１断片を遺伝子合成によって生成し、ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素による消化後、ベクターｐＴＡＣＥ９．１１を発現する抗体にサブクローニングした。リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有する。
【００７２】
[0076]アミノ酸配列を表６に示す。
【表６】
2019528051.tif 000009
【００７３】
Ｖ．図３Ｊ（図３−２）の抗原結合分子を生成する方法
[0077]図３Ｊの抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列の構造を図４Ｅ（図４−２）に示し、発現ベクターを図５Ｈに示す。
【００７４】
[0078]カッパドメイン（ＣＬ）ＭＴ（Ｔ１０９Ｃ）及びＶＬ１−リンカーＭＴ（Ｇ１Ｃ）−ＶＨ１−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ２−リンカーＭＴ（Ｇ１Ｃ）−ＶＨ２−ＣＨ１を遺伝子合成によって生成した。カッパドメインＭＴ（Ｔ１０９Ｃ）を、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素による消化後、ベクターｐＴＡＣＥ９．１１を発現する抗体にサブクローニングした。ＶＬ１−リンカーＭＴ（Ｇ１Ｃ）−ＶＨ１−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ２−リンカーＭＴ（Ｇ１Ｃ）−ＶＨ２−ＣＨ１を、ＭｌｕＩ及びＢｇｌ  ＩＩ制限酵素による消化後、上述のベクターを発現する抗体にサブクローニングした（ベクターは、ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素によって処理した）。リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。
【００７５】
[0079]アミノ酸配列を表７に示す。
【表７】
2019528051.tif 000010
【００７６】
実施例２：本発明の抗原結合分子の発現及び精製
[0080]Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞を、細胞密度が１ｍＬ当たり２×１０６個の細胞となるまで、１５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地中で、３７℃及び８％のＣＯ２でインキュベートした。実施例１からの各抗原結合分子発現ベクター３７．５μｇを、ベクター溶液としての１５０ｍＭのＮａＣｌ  １．５ｍＬ、及びＰＥＩ／ＮａＣｌ溶液としてのＮａＣｌ  １．５ｍＬ中３７．５μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）のＰＥＩ（ポリエチレンイミン）中でインキュベートし、室温（ＲＴ）で５分間置いた。ＰＥＩ／ＮａＣｌ溶液をベクター溶液に添加し、ベクター／ＰＥＩ混合溶液としてＲＴで１０分間静置させた。得られたベクター／ＰＥＩ混合溶液をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞調製物に添加し、１３５〜１５０ｒｐｍで４時間振盪しながら、３７℃及び８％のＣＯ２でインキュベートした。新鮮な細胞培養培地を細胞に添加した。上清を回収し、５〜７日間増殖させた後、滅菌フィルターを通して濾過した。製造業者のプロトコール（ＭｏｎｔａｇｅＡ）に従って、抗体を精製した。表８は、得られた抗体の特徴を示す。
【表８】
2019528051.tif 000011
2019528051.tif 000012
【００７７】
実施例３：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
[0081]実施例２から得たクローンを、還元又は非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。図６Ａ（図６−１）は、クローン番号００５構築物内の重及び軽鎖断片が、予期したサイズ及び分布を有することを示す。クローン番号００６構築物の重鎖断片に関するサイズの若干の増加と軽鎖断片に関するサイズの減少を観察することができる。サイズの若干の変化が、クローン番号００６に関しては予想された通りであり、他の構築物についても同様である。図６Ｂ（図６−１）は、非還元条件下で、精製したクローン番号００５の抗体が、ネイティブ形態の抗体の分子量（ＭＷ）に相当する分子量を有することを示す。一方、クローン番号００６の抗体は、ネイティブ抗体と比較した場合、重鎖領域においてより高いＭＷと軽鎖領域において１／２低いＭＷを示す。クローン番号００１及びクローン番号００２は、同様のバンドパターンを示し、クローン番号００７〜クローン番号０１１からの他の構築物も同様である（図６Ｃ（図６−１）及び５Ｄ）。ＳＤＳ−ｐａｇｅの非還元条件下で、すべての抗体は、二量体又は異常な凝集物を有さず同様の大きなＭＷバンドを示す。他のクローンについても同様である（図６Ｅ〜６Ｌ（図６−２〜図６−３））。クローン番号０４２及びクローン番号０４３も、ＳＤＳ−ｐａｇｅによって解析し、結果を、それぞれ、図６Ｍ及び６Ｎ（図６−４）に示す。図６Ｍ及び６Ｎの両方におけるレーン１〜８は、それぞれ、クローン番号０４２及びクローン番号０４３の８画分の試料（プロテインＬカラムを通した上清から得た）のＳＤＳ−ｐａｇｅの結果を指す。図６Ｍ及び６Ｎの両方におけるレーン９は、それぞれ、クローン番号０４２及びクローン番号０４３の濃縮試料のＳＤＳ−ｐａｇｅの結果を指す。
【００７８】
実施例４：キャピラリー電気泳動（ＣＥ）純度／不均一アッセイ
[0082]ＣＥ純度／不均一アッセイに対する材料として、キャピラリー、内径５０μｍのベア−溶融シリカ、ＳＤＳ−ＭＷゲル緩衝液−専売製剤（ｐＨ８、０．２％のＳＤＳ）、ＳＤＳ−ＭＷ試料緩衝液−１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０、１％のＳＤＳ）、ＩｇＧ対照標準、内部標準（１０ｋＤａのタンパク質、５ｍｇ／ｍＬ）、酸性洗浄溶液（０．１ＮのＨＣｌ）及び塩基性洗浄溶液、０．１ＮのＮａＯＨが挙げられる。
【００７９】
ステップ１：ＰＡ８００  ｐｌｕｓ装置の調製
[0083]キャピラリー交換：内径５０μｍのベア溶融シリカキャピラリーを、総キャピラリー長３０．２ｃｍとして、ＰＡ８００  ｐｌｕｓカートリッジセットへと取り付ける。ＰＤＡ検出器の取り付け：装置をオンにして、実験前に、少なくとも３０分間、ＵＶランプをウォームアップさせる。
【００８０】
ステップ２：アルキル化試薬の調製
[0084]２５０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）溶液をアルキル化試薬として使用した。溶液は、室温でおよそ２４時間安定であった。ＩＡＭ溶液の調製は、４６ｍｇの高純度ＩＡＭを秤量するステップと、ＩＡＭを１．５ｍＬの遠心管に移すステップと、１ｍＬのＤＤＩ水を１．５ｍＬの遠心管に添加するステップと、バイアルにきつく栓をして、溶解するまで全体的に混合するステップと、この混合物を光にさらさずに毎日新しく作製するステップとを含む。
【００８１】
ステップ３：ＩｇＧ対照標準の調製
[0085]ＩｇＧ対照標準の調製は、１バイアル９５μＬのＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬ）対照標準のアリコートを取得して、このアリコートを完全に解凍されるまで室温に置くステップと、１０ｋＤａの内部標準２μＬをＩｇＧ管に添加するステップと、２５０ｍＭのＩＡＭ５μＬをドラフトチャンバー内でＩｇＧ管に添加するステップと、管に栓をして全体的に混合するステップと、３００ｇで１分間遠心分離するステップと、バイアル栓をパラフィルムで密封して、混合物を７０℃で１０分間加熱するステップと、バイアルを室温の水浴中に入れて少なくとも３分間冷却するステップと、１００μＬの調製した試料をミクロバイアル中に移すステップと、ミクロバイアルをユニバーサルバイアル中に入れるステップと、ユニバーサルバイアルに栓をするステップとを含む。
【００８２】
ステップ４：ＩｇＧ非還元試料の調製
[0086]ＩｇＧ非還元試料の調製は、１００μｇのＩｇＧ試料を０．５ｍＬのミクロ遠心管にピペットで量り取るステップと、５０〜９５μＬの試料緩衝液を添加して、最終体積を９５μＬとするステップと、２μＬの内部標準を管に添加するステップと、２５０ｍＭのＩＡＭ溶液５μＬを試料管に添加するステップと、バイアルにきつく栓をして、全体的に混合するステップと、試料管を３００ｇで１分間遠心分離するステップと、試料管をパラフィルムで密封して、混合物を７０℃の水浴中で１０分間加熱するステップと、試料管を室温の水浴中に入れて、少なくとも３分間冷却するステップと、１００μＬの調製した試料を２００μＬのミクロバイアル中に移して、内容物を遠心沈殿させてすべての気泡を除去するステップと、ミクロバイアルをユニバーサルバイアル中に入れるステップと、ユニバーサルバイアルに栓をするステップとを含む。
【００８３】
実施例５：ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
[0087]例えば、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を使用して、ＢｓＡｂのデュアル結合（ｄｕａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ）挙動を評価するために、表面プラズモン共鳴実験を実施した。結合カイネティクス及び親和性を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００に関するＳＰＲベースのアッセイを実施した。結合カイネティクスを、ソフトウェアを用いて得られるシングルサイクルカイネティクス（ＳＣＫ）方法によって測定した。抗ヒトＡｂを、達成されるべき最大応答単位（ＲＵ）を可能とする密度でＣＭ５チップに固定した。
実行：方法を選択し、アッセイ／カイネティクス／親和性を選択する。パラメータを以下の通り設定する：データ回収率  １Ｈｚ、検出モード  デュアル、温度  ２５℃、濃度単位  ｎＭ、緩衝液Ａ  ＨＢＳ−ＥＰ。
流路２−１、チップＣＭ５、再生１を選択する。
スタートアップを選択し、複製数を３まで変更する。
試料を選択し、パラメータを以下の通り設定する、接触時間：１５０秒、流速：４０μＬ／分、解離時間：５００秒。
再生を選択し、パラメータを以下の通り設定する、再生溶液：２５ｍＭのグリシンｐＨ１．５、接触時間：９０秒、流速：３０μＬ／分、安定化期間：９０秒。
ランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ＋）による解析物の連続希釈。４０、２０、１０、５、２．５、０として得られる一連の濃度。ラック位置に従って、試料を調製し、配置する。
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアを使用して結果を評価する。
【００８４】
[0088]ブランクフローセルから応答値を減算することによって、結合応答値を、緩衝液効果について補正した。１：１ラングミュア適合モデル（１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）を使用して、ｋｏｎ（オンレート）及びｋｏｆｆ（オフレート）を推定した。ＫＤ値（抗体とその抗原の間の平衡解離定数）を、ｋｏｎとｋｏｆｆの比率から決定した。
【００８５】
実施例６：本発明の抗原結合分子のアッセイ結果
[0089]実施例２から得たクローンを実施例３のＢＩＡｃｏｒｅアッセイによる標的抗原に関するＫＤ値並びに実施例４の質量分析及びＣＥによる回復率について解析した。結果を以下の表９に示す。
【表９】
2019528051.tif 000013
2019528051.tif 000014
【００８６】
[0090]クローン番号０５３の抗体は、ネイティブＩｇＧ形式を有し、ＣＨ３ドメインにＫｉＨ修飾を有するＢｓＡｂを指す。理論的には、クローン番号０５３の抗体は、ＫｉＨ戦略を使用することによって、２５％の回復率を有することが期待される（図１を参照のこと）。それにもかかわらず、本発明者らの結果は、クローン番号０５３のクローンについて、正しくアッセンブルされた抗体が観察されなかったことを示した。比較すると、クローン番号０１３、０１４、０１６、０１７、０１９、０２０、０２２及び０２３は、本発明のＦａｂを含み、ＣＨ３ドメインにＫｉＨ修飾を有するＢｓＡｂを指し、８０％を超える回復率を有する。
【００８７】
[0091]ＢＩＡｃｏｒｅアッセイの結果は、クローン番号００１及びクローン番号００２の結合親和性において有意な差を示さず、同様のことが、クローン番号００５及びクローン番号００６でも観察される。二重特異的抗体構築物として、クローン番号００８及びクローン番号０１１は、クローン番号００５及びクローン番号００６と類似して、ｇＤ２に対する結合親和性において差を示さなかった。クローン番号００８／クローン番号０１１とクローン番号００９／クローン番号０１０の間に、ＶＥＧＦＡ抗原に対する結合親和性において５０倍の差が観察された。この差は、二価から一価への抗体の遷移に起因する可能性がある（表８及び９）。
【００８８】
[0092]クローン番号０２６、０２８、０３０、０３２及び０３４は、システイン操作ＢｓＡｂであり、これらは、非常に高い回復率（９５％を超える）を有することが見出された。さらに、クローン番号０２８は、ナノＤＳＣ熱安定性解析において、クローン番号０１３よりも高い安定性を有することが見出された。
【００８９】
[0093]これらの結果は、新規Ｆａｂ形式を含む本発明のＢｓＡｂを、抗原に対する強力な親和性を特異的に保持しながら、頑強に産生することができることを示した。
【００９０】
[0094]上記例示的実施例において示される本発明の多数の修正及び変更が当業者に思い浮かぶことが予期される。結果として、添付の特許請求の範囲に現れるこのような限定のみが本発明に関して重視されるべきである。
【図１】
2019528051.tif 000015
【図２】
2019528051.tif 000016
【図３−１】
2019528051.tif 000017
【図３−２】
2019528051.tif 000018
【図３−３】
2019528051.tif 000019
【図４−１】
2019528051.tif 000020
【図４−２】
2019528051.tif 000021
【図５Ａ】
2019528051.tif 000022
【図５Ｂ】
2019528051.tif 000023
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2019528051.tif 000025
【図５Ｅ】
2019528051.tif 000026
【図５Ｆ】
2019528051.tif 000027
【図５Ｇ】
2019528051.tif 000028
【図５Ｈ】
2019528051.tif 000029
【図６−１】
2019528051.tif 000030
【図６−２】
2019528051.tif 000031
【図６−３】
2019528051.tif 000032
【図６−４】
2019528051.tif 000033
【配列表】
2019528051000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月15日(2019.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）を含む抗原結合Ｆａｂ断片であって、
前記ＶＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＶＨドメインのＮ末端に連結しているか、又は前記ＶＨドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＶＬドメインのＮ末端に連結しており、並びに、
（１）前記ＶＬドメインが、ジスルフィド結合によって、前記ＣＬドメインに連結しているか、
（２）前記ＶＨドメインが、ジスルフィド結合によって、前記ＣＬドメインに連結しているか、
（３）前記ＶＬドメインが、ジスルフィド結合によって、前記ＣＨ１ドメインに連結しているか、又は
（４）前記ＶＨドメインが、ジスルフィド結合によって、前記ＣＨ１ドメインに連結している、
抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項２】
前記ＶＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＶＨドメインのＮ末端に連結しており、ここで、
（１）前記ＶＨドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、
（２）前記ＶＨドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結しているか、
（３）前記ＶＨドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結しており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、又は
（４）前記ＶＨドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しており、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結している、請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項３】
前記ＶＨドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＶＬドメインのＮ末端に連結しており、ここで、
（１）前記ＶＬドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、
（２）前記ＶＬドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結しているか、
（３）前記ＶＬドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結しており、前記ＣＬドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しているか、又は
（４）前記ＶＬドメインのＣ末端が、ペプチド結合によって、前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に連結しており、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＣＬドメインのＮ末端に連結している、請求項１に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項４】
Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合Ｆａｂ断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
１つ又は複数の請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合Ｆａｂ断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞をインキュベートするステップを含む、抗原結合Ｆａｂ断片を調製する方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合Ｆａｂ断片と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【国際調査報告】
2019528051.tif 000034