【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年8月6日(2007.8.6)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】Ｔ１Ｒヘテロオリゴマー味覚受容体、この受容体を発現する細胞株、および味覚化合物
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／４９４０７１号（２００３年８月６日出願）及び米国仮特許出願第６０／５５２０６４号（２００４年３月９日出願）に基づく優先権を主張するものであり、両出願の内容は、この引用によりそっくり本明細書に記載されたものとする。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は部分的に、複数のＴ１Ｒ受容体が集まって機能しうる味覚受容体を形成するという発見に関する。特に、Ｔ１Ｒ１とＴ１Ｒ３の共発現によって、グルタミン酸一ナトリウムを含むうま味刺激物質に応答する味覚受容体がもたらされるということが見出された。さらに、Ｔ１Ｒ２受容体とＴ１Ｒ３受容体の共発現によって、天然に存在する甘味料及び人工甘味料を含む甘味刺激物質に応答する味覚受容体がもたらされるということも見出された。
【０００３】
また本発明は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３から構成されるヘテロオリゴマーの味覚受容体をアッセイに用いてうま味刺激物質及び甘味刺激物質にそれぞれ応答する化合物を同定することに関する。
【０００４】
また本発明は、ヒト、ラット、又はヒトとラットのサブユニットから構成されるＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３のキメラ及びトランケート体、並びにＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体のキメラに関する。
【０００５】
さらに本発明は、構成的な又は誘導的な条件下で、Ｔ１Ｒ１とＴ１Ｒ３の組合せ、又は、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の組合せ（それらのサブユニットのトランケート体またはキメラ、さらには、野生型又はキメラのサブユニットから構成されるキメラの受容体を含む）を安定に又は一過的に（一時的に）共発現する細胞株の構築に関する。
【０００６】
また、うま味及び甘味の調節化合物を同定するためそれらの細胞株を細胞系アッセイに用いることも提供され、特に、蛍光イメージングを用いて受容体活性を検出する高スループット（高処理能力）スクリーニングアッセイが提供される。
【０００７】
また本発明は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体、さらには、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、及びＴ１Ｒ３のキメラのサブユニット及びトランケートされたサブユニット並びにキメラの受容体に結合する化合物に関する。
【背景技術】
【０００８】
関連技術の説明
味覚系は、外界の化学組成物について感覚情報を提供する。哺乳動物は、少なくとも５つの基本的な味覚の様相（モダリティ）（甘味、苦味、酸味、塩味、及びうま味）を有すると考えられている（例えば非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）。それぞれの味覚の様相は、舌の表面に存在する味覚受容体細胞において発現される１つ又は複数の独特なタンパク質の受容体によって媒介されると考えられている（非特許文献５）。苦味、甘味、及びうま味の刺激物質を認識する味覚受容体は、Ｇタンパク質結合受容体（Ｇタンパク質共役受容体）（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーに属する（非特許文献６、非特許文献７）（他の味覚の様相は、イオンチャンネルにより媒介されると考えられている）。
【０００９】
Ｇタンパク質共役受容体は、多くの他の生理機能（例えば、内分泌機能、外分泌機能、心拍、脂肪分解、及び炭水化物代謝）を媒介する。そのような受容体のいつくかを生化学的に分析しかつ分子クローニングすることにより、それらの受容体の機能について多くの基本的な原理が明らかになってきた。例えば、特許文献１は、ＧＰＣＲへのリガンド結合に際し、Ｇαサブユニットの表面における結合ＧＤＰのＧＴＰによる置換及びその後のＧβ及びＧγサブユニットからのＧαサブユニットの解離を促進することにより、受容体が構造的変化を受け、ヘテロ三量体のＧタンパク質を活性化する仕組みを記載する。遊離したＧαサブユニット及びＧβγ複合体は、種々のシグナル伝達経路の下流にある要素を活性化する。
【００１０】
Ｔ１Ｒ受容体は、これまで、甘味受容体として機能すると考えられた（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２。そして、Ｎｅｌｓｏｎ他（２００１）及びＬｉ他（２００２）は、最近、ラット及びヒトのそれぞれＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３が協同して作用し甘味刺激物質を認識することを明らかにした。
【００１１】
一方、当該分野においては、新規な香味剤及び改良された香味剤が依然として必要である。例えば、５つの知られた基本的な味覚のひとつとして、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）の「セイボリー」すなわち「うま味」のフレーバーがある。ＭＳＧはある人々に有害な反応をもたらすことが公知であるが、ＭＳＧの人工的代替物を見出すことはほとんど進んでいない。いくつかの天然に存在する物質は、うま味剤としてのＭＳＧの効果を増加又は増強でき、従って、所定の香味付け用途に必要なＭＳＧを少なくできることが公知である。例えば、天然に存在するヌクレオチド化合物であるイノシン一リン酸（ＩＭＰ）又はグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）は、ＭＳＧのうま味に対して相乗効果を有することが公知である。しかし、ＩＭＰ及びＧＭＰは、天然の原料から分離精製すること、あるいは合成することが非常に困難かつ高価であり、従って、食品又は医薬組成物の多くの市場の需要に対し、ごく限られた用途にしか実際に使用されていない。ＭＳＧ自体の香味をもたらすか、あるいは、存在するなんらかのＭＳＧの効果を増強できるあまり高価でない化合物は、非常に価値の高いものとなる可能性がある。同様に、「高い強度」の新規な甘味料（すなわち、ショ糖の何倍も甘いもの）にもなる化合物の発見も価値の高いものとなるはずである。
【００１２】
当該分野において必要なこととして、甘味及びうま味の受容体として機能する味覚受容体の特定と特徴付け、甘味及びうま味を調節（増強又は阻害）する化合物を同定するためのアッセイ、並びに、それらの受容体に特異的に結合する化合物がある。
【特許文献１】米国特許第５，６９１，１８８号
【非特許文献１】Ｋａｗａｍｕｒａら，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｍａｍｉ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｔａｓｔｅ（１９８７）
【非特許文献２】Ｋｉｎｎａｍｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５４：７１５−３１（１９９２）
【非特許文献３】Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７６：７１８−６６（１９９６）
【非特許文献４】Ｓｔｅｗａｒｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７２：１−２６（１９９７）
【非特許文献５】Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｏｌ．Ｒｅｖ．７６：７１８−７１６（１９９６）
【非特許文献６】Ｈｏｏｎら，Ｃｅｌｌ  ９６：４５１（１９９９）
【非特許文献７】Ａｄｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １００：６９３（２０００）
【非特許文献８】Ｈｏｏｎら，Ｃｅｌｌ  ９６：５４１−５１（１９９９）
【非特許文献９】Ｋｉｔａｇａｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８３：２３６−４２（２００１）
【非特許文献１０】Ｍａｘら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：５８−６３（２００１）
【非特許文献１１】Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：４１２−８（２００１）
【非特許文献１２】Ｓａｉｎｚら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：８９６−９０３（２００１）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、ヒト及びラットのＴ１Ｒの種々の組合せから構成されるキメラの受容体、例えば、ヒトＴ１Ｒ２サブユニット及びラットＴ１Ｒ３サブユニットから構成されるキメラＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体、ラットＴ１Ｒ２サブユニット及びヒトＴ１Ｒ３サブユニットから構成されるキメラのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体、ヒト細胞外ドメイン、ラット膜貫通ドメイン及びラット細胞内ドメインから構成されるキメラＴ１Ｒ２受容体サブユニット、並びにラット細胞外ドメイン、ヒト膜貫通ドメイン及びヒト細胞内ドメインから構成されるキメラのＴ１Ｒ３受容体サブユニットを提供する。
【００１４】
また本発明は、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３、及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３、又はここに開示するようなそれらの分離されたサブユニット、フラグメント、キメラ、もしくはトランケート体に特異的に結合する化合物を提供する。
【００１５】
本発明は、Ｔ１Ｒ類の種々の組合せが、共発現されるとき、味刺激物質に応答する（反応する）機能的な味覚受容体をもたらすという発見に関するものである。特に本発明は、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の共発現によって、甘味刺激物質に応答するヘテロオリゴマーの味覚受容体がもたらされるという発見に関する。さらに本発明は、Ｔ１Ｒ１とＴ１Ｒ３の共発現によって、グルタミン酸一ナトリウムのようなうま味刺激物質に応答するヘテロオリゴマーの味覚受容体がもたらされるという発見に関する。
【００１６】
また本発明は、Ｔ１Ｒ１とＴ１Ｒ３（ヒト又はラットを含む）を共発現する細胞株、あるいは、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３（ヒト又はラットを含む）を共発現する細胞株に関する。好ましい態様において、これらの細胞株は、高いレベルの量の受容体を、構成的に又は誘導的に発現する。これらの細胞株には、Ｔ１Ｒ１とＴ１Ｒ３又はＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３を一過的に（一時的に）又は安定して発現する細胞が含まれる。
【００１７】
さらに本発明は、甘味又はうま味を調節する化合物を同定するため、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３味覚受容体又はＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体を用いるアッセイ、好ましくは高スループット（高処理能力）スクリーニングアッセイ、好ましくは高スループット細胞系アッセイを提供する。また本発明は、甘味又はうま味を調節するそれらの化合物を確認するため味覚試験を含むアッセイを提供する。
【００１８】
さらに本発明は、例えば、Ｔ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインに結合する化合物、Ｔ１Ｒ２の高システインドメインに結合する化合物、Ｔ１Ｒ２の膜貫通ドメインに結合する化合物、Ｔ１Ｒ３の膜貫通ドメインに結合する化合物、トランケートされた受容体ｈ２ＴＭ／ｈ３ＴＭのＴ１Ｒ２の膜貫通ドメインに結合する化合物、及びトランケートされた受容体ｈ２ＴＭ／ｈ３ＴＭのＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインに結合する化合物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、ここに記載する野生型及びキメラの甘味及びうま味の受容体に特異的に結合する化合物を提供する。さらに提供されるのは、甘味及びうま味の受容体の野生型の、キメラの、又はトランケートされたＴ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３サブユニットに特異的に結合する化合物である。
【００２０】
Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味受容体に結合するということによって、分子の大まかな属性が決まる。該受容体は、試験されるあらゆる甘味料（炭水化物糖類、アミノ酸及びその誘導体、甘味タンパク質、及び合成甘味料を含む）に応答する。一方、該受容体は、特定の甘味料に対して立体選択性を示し、例えば、それは、Ｄ−トリプトファンに応答する一方、Ｌ−トリプトファンに応答せず、これは、味覚の生理学データと相関する。
【００２１】
かくして、本発明の化合物は、キメラの受容体に特異的に結合する。その例には、ヒトＴ１Ｒ２サブユニット及びラットＴ１Ｒ３サブユニットから構成されるキメラのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体、ラットＴ１Ｒ２サブユニット及びヒトＴ１Ｒ３サブユニットから構成されるキメラのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体、ヒトの細胞外ドメイン、ラットの膜貫通ドメイン及びラットの細胞内ドメインから構成されるキメラのＴ１Ｒ２受容体サブユニット、並びに、ラットの細胞外ドメイン、ヒトの膜貫通ドメイン及びヒトの細胞内ドメインから構成されるキメラのＴ１Ｒ３受容体サブユニットがあるが、それらに限定されない。本発明は、機能的な味覚受容体、好ましくはヒトの味覚受容体を提供し、それは、異なるＴ１Ｒの組合せ、好ましくはＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の共発現によって生成され、また、対応する分離された核酸配列もしくはフラグメント、キメラ、又はそれらの改変体で、共発現によって機能的な味覚受容体（すなわち甘味受容体（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３）又はうま味受容体（Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３））をもたらすものによって生成される。
【００２２】
Ｔ１Ｒ類（クラスＣのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ類）の一種）は、味覚組織において選択的に発現される（Ｈｏｏｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９９．９６（４）：ｐ．５４１−５１、Ｂａｃｈｍａｎｏｖ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ，２００１．２６（７）：ｐ．９２５−３３、Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００１．４（５）：ｐ．４９２−８、Ｍａｘ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２００１．２８（１）：ｐ．５８−６３、Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００１．２８３（１）：ｐ．２３６−４２、並びにＮｅｌｓｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００１．１０６（３）：ｐ．３８１−９０）。ＨＥＫ２９３細胞におけるＴ１Ｒ類の機能的発現により、異なる組合せのＴ１Ｒ類が甘味及びうま味の刺激物質に応答することが明らかになった（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００１．１０６（３）：ｐ．３８１−９０、Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２．９９（７）：ｐ．４６９２−６）。Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３は、２９３細胞において共発現されるとき、種々の天然甘味料及び合成甘味料を認識する。一方、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３は、うま味刺激物質Ｌ−グルタミン酸塩を認識し、この応答は、５’−リボヌクレオチド類（うま味を裏付けるもの）によって増強される。ノックアウトのデータは、Ｔ１Ｒ類が実際にマウスの甘味及びうま味を媒介することを裏付けた（Ｄａｍａｋ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３  ３０１（５６３４）：ｐ．８５０−３、Ｚｈａｏ，Ｇ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００３  Ｏｃｔ  ３１；１１５（３）：２５５−６６）。
【００２３】
クラスＣのＧＰＣＲ類は、大きなＮ末端細胞外ドメイン（しばしばビーナス・フライトラップ・ドメイン（Ｖｅｎｕｓ  ｆｌｙｔｒａｐ  ｄｏｍａｉｎ（ＶＦＤ）と呼ばれる）を有し（Ｐｉｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００３  ９８（３）：ｐ．３２５−５４）、ホモ二量体（ホモダイマー）（メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ類）及びカルシウムセンシング受容体（ＣａＲ）の場合）又はヘテロ二量体（ヘテロダイマー）（γ−アミノ酪酸型Ｂ受容体（ＧＡＢＡＢＲ）の場合）のいずれかとして機能することが公知である。機能発現のデータは、Ｔ１Ｒ類についてヘテロ二量体のメカニズムを示している。すなわち、機能するには、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２の両方がＴ１Ｒ３と共発現される必要があり、これは、ネズミの舌におけるＴ１Ｒ類の重なった発現パターンによって裏づけられる。
【００２４】
ここで立証されるとおり、甘味及びうま味の受容体として機能するため、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーは、他のＴ１Ｒファミリーのメンバーと協同して作用する。以下の実験例においてさらに詳細に開示するとおり、ｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ３を共発現する異種細胞がヒトの甘味を反映する態様で甘味刺激物質により選択的に活性化されることを明らかにした。
【００２５】
例えば、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３を共発現するＨＥＫ−２９３−Ｇα１５細胞は、シクラメート、ショ糖、アスパルテーム、及びサッカリンに特異的に応答し、そして、それらの化合物についての用量応答性は、精神物理学的な味検知閾値と相関している。
【００２６】
さらに、実験例のデータによって裏付けられるとおり、ｈＴ１Ｒ１とｈＴ１Ｒ３を共発現する細胞がヒトのうま味を反映する態様でグルタミン酸塩（グルタミン酸一ナトリウム）及び５’−リボヌクレオチド類により選択的に活性化されることを明らかにした。例えば、ｈＴ１Ｒ１及びｈＴ１Ｒ３を共発現するＨＥＫ−２９３−Ｇα１５細胞は、グルタミン酸塩に特異的に応答し、そして、このうま味化合物についての用量応答性は、その精神物理学的な味検知閾値と相関している。さらに、ＩＭＰのような５’−リボヌクレオチドは、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体のグルタミン酸応答を増強する（うま味の相乗的な特性）。
【００２７】
さらに、実施例の実験データで示すとおり、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３を安定して誘導的に共発現する細胞が、うま味刺激物質Ｌ−グルタミン酸塩及びＬ−アスパラギン酸塩に選択的に応答する一方、より高い濃度の他のＬ−アミノ酸に対しては弱い応答しか示さないことを明らかにした。そしてさらに、該Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体は、うま味刺激物質を調節（増強又は阻害）する化合物を同定するためのアッセイに利用できることを明らかにした。
【００２８】
甘味受容体に特異的に結合して甘味を調節する化合物の具体例は、表５に見ることができる。
【００２９】
表１〜４は、うま味受容体に特異的に結合してうま味を調節する化合物の具体例を示す。
【００３０】
【表１】
2007512227.tif 000001
【００３１】
【表２】
2007512227.tif 000002
【００３２】
【表３】
2007512227.tif 000003
【００３３】
【表４】
2007512227.tif 000004
【００３４】
【表５】
2007512227.tif 000005
【００３５】
【表６】
2007512227.tif 000006
【００３６】
【表７】
2007512227.tif 000007
【００３７】
【表８】
2007512227.tif 000008
【００３８】
【表９】
2007512227.tif 000009
【００３９】
【表１０】
2007512227.tif 000010
【００４０】
【表１１】
2007512227.tif 000011
【００４１】
【表１２】
2007512227.tif 000012
【００４２】
【表１３】
2007512227.tif 000013
【００４３】
【表１４】
2007512227.tif 000014
【００４４】
【表１５】
2007512227.tif 000015
【００４５】
【表１６】
2007512227.tif 000016
【００４６】
【表１７】
2007512227.tif 000017
【００４７】
【表１８】
2007512227.tif 000018
【００４８】
【表１９】
2007512227.tif 000019
【００４９】
【表２０】
2007512227.tif 000020
【００５０】
【表２１】
2007512227.tif 000021
【００５１】
【表２２】
2007512227.tif 000022
【００５２】
【表２３】
2007512227.tif 000023
【００５３】
【表２４】
2007512227.tif 000024
【００５４】
【表２５】
2007512227.tif 000025
【００５５】
【表２６】
2007512227.tif 000026
【００５６】
【表２７】
2007512227.tif 000027
【００５７】
【表２８】
2007512227.tif 000028
【００５８】
【表２９】
2007512227.tif 000029
【００５９】
【表３０】
2007512227.tif 000030
【００６０】
【表３１】
2007512227.tif 000031
【００６１】
【表３２】
2007512227.tif 000032
【００６２】
【表３３】
2007512227.tif 000033
【００６３】
【表３４】
2007512227.tif 000034
【００６４】
【表３５】
2007512227.tif 000035
【００６５】
【表３６】
2007512227.tif 000036
【００６６】
【表３７】
2007512227.tif 000037
【００６７】
【表３８】
2007512227.tif 000038
【００６８】
【表３９】
2007512227.tif 000039
【００６９】
【表４０】
2007512227.tif 000040
【００７０】
【表４１】
2007512227.tif 000041
【００７１】
【表４２】
2007512227.tif 000042
【００７２】
【表４３】
2007512227.tif 000043
【００７３】
【表４４】
2007512227.tif 000044
【００７４】
【表４５】
2007512227.tif 000045
【００７５】
【表４６】
2007512227.tif 000046
また、実施例の実験データに裏付けられるとおり、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３を共発現する細胞株がうま味又は甘味の刺激物質にそれぞれ応答することが明らかとなり、そして、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体への特異的な結合を用いて受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト（例えば、ＭＳＧの代替物、うま味遮断剤（うま味ブロッカー）、新規な人工甘味料及び天然甘味料、並びに甘味遮断剤（甘味ブロッカー））を特定できるという結論が、定量的な用量応答性の態様によりさらに裏付けられることが明らかとなった。
【００７６】
また、実験例のデータに裏付けられるとおり、甘味遮断剤であるラクチソールが、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味受容体及びＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体の両方を阻害することが明らかとなった。ここに、甘味又はうま味を増強、模倣、調節又は阻害する化合物が提供される。ラクチソールがＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体の両方を阻害するという事実は、これらの受容体が、ラクチソールそして恐らくは他の味覚調節物質に結合される共通のサブユニットを有し得るということを示唆する。従って、このことは、甘味を増強、模倣、調節又は阻害するなんらかの化合物は、うま味に対して同様の効果を有し得ることを示しており、また、その逆もあり得ることを示している。
【００７７】
さらに実験例のデータに裏付けられるとおり、Ｔ１Ｒ類、すなわちＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３を安定して共発現する細胞株は、自動化蛍光イメージングによって検定されるとき、非常に効果的に種々の甘味及びうま味の刺激物質に応答すること（すなわち、一過的にトランスフェクトされた細胞よりもかなり大きな強度で）が明らかとなった。従って、これらの細胞株は、甘味又はうま味を調節、阻害、模倣、又は増強する化合物を同定するための高スループットスクリーニングアッセイに使用するのに特によく適している。しかし、本発明は、Ｔ１Ｒ又はその組合せを一過的に発現する細胞を用いるアッセイをも包含するものである。
【００７８】
また本願は、いくつかのＴ１Ｒが協同で（特にＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３で）作用することを明らかにするデータ、及び、そのような受容体の組合せをアッセイ、好ましくは高スループットアッセイに利用できることを明らかにするデータを示している。しかし留意すべきことに、本発明は、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を、単独で、あるいは他のタンパク質（例えば他のＧＰＣＲ類）と組合せて、用いるアッセイをも包含するものである。
【００７９】
リガンド特異性、Ｇタンパク質結合効率、及び阻害剤に対する感受性の点で、ヒトとネズミの甘味には相違がある。この種によるＴ１Ｒリガンド特異性の違いを利用して、甘味受容体が実際にヘテロマー複合体として機能し、受容体上に１つより多いリガンド結合部位があることを証明することができる。さらに、Ｔ１Ｒ３によって仲介される甘味受容体とうま味受容体の機能的なつながりも明らかにされた（実施例１６）。
【００８０】
ヒト及びラットの両方の甘味受容体は、Ｇαｉｌ（Ｇα１５／ｉｌ）からのＣ末端テール配列を有するキメラのＧα１５に効率よく結合できる。例えば、ラットではなくヒトのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３は、アスパルテーム、ネオテーム、及びシクラメートを含む一群の甘味料に選択的に応答する。このことは、味の生理学データと整合している。アゴニスト特異性におけるこれらの違いを利用して、受容体上のそれらの結合部位をマッピング（位置づけ）することができる。膜貫通ドメインの直前に接合部があるキメラのＴ１Ｒを、ヒトとラットの遺伝子の間で生成させることができる。従って、各Ｔ１Ｒキメラは、異なる種からの、２つの１／２領域、Ｎ末端細胞外ドメイン、及び、Ｃ末端の膜貫通細胞内ドメインからなる。例えば、キメラのＴ１Ｒ２（Ｔ１Ｒ２−Ｒと呼ぶ）は、ラットＴ１Ｒ２のＣ末端配列に融合されたヒトＴ１Ｒ２のＮ末端からの配列を有する。そして、これらのキメラに対する応答を試験することができる（図２２）。
【００８１】
新規な化合物並びに新規な香味料、味物質、及び甘味増強剤が、アミド誘導体の化学シリーズにおいて見出された。また、該アミド化合物は、ある特定のサブクラスのアミド誘導体又はある特定のクラスのアミドに関連する誘導体（例えば、尿素類、ウレタン類、オキサルアミド類、アクリルアミド類等）を含む。これらの化合物は、ショ糖と共に又は単独で使用されるとき、インビトロでの応答を増加させ、同時に、ヒトによる味覚においても甘味の知覚の増加をもたらす。これらの化合物は、他の天然及び合成の甘味物質を増強する。それらの化合物の具体例は、表５に列挙されている。
【００８２】
一態様において、本発明は、新規な化合物、香味料、味物質、香味増強剤、味増強剤、香味改質化合物、及び／又はそれらを含む組成物を提供する。
【００８３】
より具体的な態様において、本発明は、新規な甘味香味料、甘味物質、甘味増強剤、及び甘味改質剤、並びにそれらを含む組成物を提供する。
【００８４】
より特定的に、他の態様において、本発明は、天然又は合成の甘味物質（例えば天然に存在する甘味料及び合成甘味料）を調節、誘導、増強、又は阻害する化合物に関する。
【００８５】
他の態様において、本発明は、本発明の化合物を少なくとも１つ含む、組成物、好ましくはヒト又は動物による摂取に適した組成物を提供する。これらの組成物には、食品、飲料、及び医薬品、並びに食品添加物（これは、食品、飲料、又は医薬品に添加されたとき、特にその甘味を増強することにより、そのフレーバー又は味を調節するものである）が含まれる。
【００８６】
本発明の他の態様は、所望される食品、飲料又は医薬品（その組成物は、甘味を引き出す１つ以上の他の化合物を含んでもよい）の甘味を調節するため、本発明の化合物を用いることに関する。これらの化合物は、天然に存在する甘味料及び合成甘味料とともに使用されたとき、インビトロでの応答を増加させただけでなく、ヒトによる味覚において、甘味及び他のフレーバー又は味の知覚も増強した。これらの特異的な化合物は、甘味物質（例えば天然に存在する甘味料及び合成甘味料）とともに使用されたとき、インビトロでＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の応答を増加させただけでなく、ヒトによる味覚において甘味及び他のフレーバー又は味も増強した。
【００８７】
新規な化合物並びに新規な香味料、味物質、及びうま味増強剤、及び味物質（例えば、アミド類、尿素類、アミノ−アミド類、アミド−アミド類、及びβ−ラクタム類）もまたここに開示される。これらの化合物は、ＭＳＧとともに又は単独で使用されるとき、インビトロでの応答を増加させ、そして、ヒトによる味覚においてうま味の知覚を増加させる。またこれらの化合物は、他の天然及び合成のうま味物質も増強する。これらの化合物の具体例は表１〜４に列挙される。
【００８８】
一態様において、本発明は、新規な化合物、香味料、味物質、香味増強剤、味増強剤、香味改質化合物、及び／又はそれらを含む組成物を提供する。
【００８９】
より具体的な態様において、本発明は、新規なうま味香味料、うま味物質、うま味増強剤、及びうま味改質剤、並びにそれらを含む組成物を提供する。
【００９０】
より特定的に、他の態様において、本発明は、天然又は合成のうま味物質（例えばグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ））を調節（誘導、増強、又は阻害）する化合物に関する。
【００９１】
他の態様において、本発明は、本発明の化合物を少なくとも１つ含む、組成物、好ましくはヒト又は動物による摂取に適した組成物を提供する。これらの組成物には、食品、飲料、及び医薬品、並びに食品添加物（これは、食品、飲料、又は医薬品に添加されたとき、特にそのうま味を増強することにより、そのフレーバー又は味を調節するものである）が含まれる。
【００９２】
本発明の他の態様は、所望される食品、飲料又は医薬品（その組成物は、うま味を引き出す１つ以上の他の化合物（例えばＭＳＧ）を含んでもよい）のうま味を調節するため、本発明の化合物を用いることに関する。これらの化合物は、ＭＳＧとともに使用されたとき、インビトロでの応答を増加させただけでなく、ヒトによる味覚において、うま味及び他のフレーバー又は味の知覚も増強した。これらの特異的な化合物は、ＭＳＧのようなうま味物質とともに使用されたとき、インビトロでＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の応答を増加させただけでなく、ヒトによる味覚においてうま味及び他のフレーバー又は味も増強した。それらの化合物のあるものは、単独で試験されたとき、うま味をヒトの知覚に引き起こした。
【００９３】
本Ｔ１Ｒアッセイを用いて特定の受容体への特異的結合により特定された化合物は、食品又は飲料の味を調節するのに用いることができる。以下にさらに詳細に記載する適当なアッセイには、例えば、全細胞アッセイ及び生化学的アッセイがあり、異なるＴ１Ｒ受容体、それらのキメラ又はフラグメント（特にＮ末端リガンド結合ドメインを含むフラグメント）の組合せの１つを用いる直接結合アッセイが含まれる。本発明での使用に適当なアッセイの具体例は、以下により詳細に記載されるものであり、ＧＰＣＲの分野において公知である。
【００９４】
設計することができるアッセイは、Ｔ１Ｒ味覚受容体もしくはＴ１Ｒ味覚受容体の組合せ、又は他の異種（非Ｔ１Ｒ）タンパク質（例えば他のＧＰＣＲ類）と共同で発現されるＴ１Ｒ受容体に対する、種々の化合物の結合又は化合物の混合物の結合を定量するものであり、あるいは、Ｔ１Ｒ味覚受容体を発現する細胞の活性化を定量するものである。これは、異種細胞、例えばＨＥＫ−２９３、ＣＨＯ及びＣＯＳ細胞において安定に又は一過的（一時的）に味覚受容体を発現させることにより、行うことができる。従って、化合物のこの生理化学的特徴を用いて、この特徴を共有するある種類の化合物を特定する。
【００９５】
該アッセイは、Ｇタンパク質（例えば、Ｇα１５もしくはＧα１６又は他の多目的Ｇタンパク質もしくはＧタンパク質改変体、又は内因性Ｇタンパク質）をさらに発現（好ましくは安定に）する細胞を用いることが好ましい。さらに、Ｇβ及びＧγタンパク質をそこにおいて発現してもよい。
【００９６】
上述した受容体又は受容体の組合せを発現するか又は含む細胞又は組成物を用いた、甘味又はうま味に対する化合物の効果は、種々の手段によって測定することができ、そのような手段には、カルシウム感受性色素の使用、電圧感受性色素の使用、ｃＡＭＰアッセイ、蛍光標識されたリガンド又は放射性リガンド（例えば３Ｈ−グルタミン酸塩）を用いる直接結合アッセイ、又は転写アッセイ（適当なレポーター（例えばルシフェラーゼ又はβ−ラクタマーゼ）を用いる）が含まれる。
【００９７】
本発明による１つ以上のＴ１Ｒとともに利用できるアッセイには、例えば、生きた細胞について遺伝子選択を用いるアッセイ、全細胞又は膜フラグメント又は精製したＴ１Ｒタンパク質を用いるアッセイ、二次伝達物質（例えばｃＡＭＰ及びＩＰ３）を用いるアッセイ、アレスチンの細胞表面への転移を検出するアッセイ、試験リガンドにより細胞表面上での受容体発現の損失（細胞内移行）を検出するアッセイ、直接リガンド結合アッセイ、阻害剤を用いた競合的結合アッセイ、インビトロ翻訳タンパク質を用いるアッセイ、リガンドの結合による構造的変化（例えば、タンパク質分解、蛍光、又はＮＭＲによって裏付けられるような）を検出するアッセイ、Ｔ１Ｒ又はＴ１Ｒの組合せを発現するヒトでないトランスジェニック動物（例えばハエ類、ワーム類、又はマウス類）を用いる挙動アッセイ、Ｔ１Ｒ遺伝子を含む組換えウイルスに感染した細胞を用いるアッセイがある。
【００９８】
構造に基づく解析もまた本発明の範囲内であり、そこにおいて、Ｔ１Ｒ又はＴ１Ｒフラグメント（あるいは複数のＴ１Ｒの組合せ又はＴ１Ｒと他のタンパク質との組合せ）のＸ線結晶構造を測定し、そして、特定のＴ１Ｒ受容体又は受容体の組合せに結合しかつ／又は特定のＴ１Ｒ受容体又は受容体の組合せを増強、模倣、阻害もしくは調節する化合物を、分子モデル化法により予測するため、該Ｘ線結晶構造を利用する。より特定的に、本発明は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３（好ましくはｈＴ１Ｒ１／ｈＴ１Ｒ３）及び／又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３（好ましくはｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３）の結晶構造の決定を包含するともに、Ｔ１Ｒ受容体の活性を調節する分子を同定するために結晶に基づく設計法においてそのような結晶構造を利用することを包含する。
【００９９】
本発明は特に、細胞を用いて行う生化学的アッセイを含む。そのような細胞には、例えば、１つ以上の全長Ｔ１Ｒ受容体又はフラグメント、好ましくはＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及び／又はＴ１Ｒ３のＮ末端ドメインを発現する哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は他の異種細胞がある。そのようなアッセイにおける化合物の効果は、競合的結合アッセイを用いて測定することができ、例えば、放射性グルタミン酸塩又はＩＭＰ、蛍光（例えば蛍光偏光、ＦＲＥＴ）、又はＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイを用いて測定することができる。上述したように、好ましい態様において、そのようなアッセイは、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３と適当なＧタンパク質（例えばＧα１５）を安定に共発現する細胞株を用いることとなる。他の適当なＧタンパク質には、米国特許出願番号第０９／９８４２９２号及び第６０／２４３７７０号（それらの内容はこの引用により本明細書にそっくり記載されたものとする）に開示されるキメラ及び改変体のＧタンパク質がある。
【０１００】
またさらに、向上した特性（例えば向上した表面発現又はＧタンパク質結合）を有する改変受容体を構築しかつ発現させることができる。これらのＴ１Ｒ変異体を細胞系アッセイ及び生化学的アッセイに組み込むことができる。
【０１０１】
意図するところによれば、ヒトＴ１Ｒに関する本発見は、他の種（例えば、ネズミ、豚、サル、イヌ、及びネコ、さらに恐らく魚のような哺乳動物以外のもの）に拡張することができる。これに関し、いつくかの魚のＴ１Ｒフラグメントを以下の実施例１において特定している。従って、本発明は、動物飼料の配合物に使用する化合物についてのスクリーニングに用いることができる。
【０１０２】
本発明はさらに、種々のＴ１Ｒの異なる対立遺伝子変異型及びそれらの組合せを用いることにより、そのような対立遺伝子変異型を発現する個体において特定の味覚を生じさせる化合物、あるいはすべての個体において特定の味覚を生じさせる化合物を同定することを可能にするものを含む。そのような化合物を用いて、食品の味をより一般的によいものにすることができる。
【０１０３】
また、Ｔ１Ｒをコードする核酸は、味覚細胞の同定に有用なプローブを提供する。なぜなら、そのような核酸は、味覚細胞において特異的に発現されるからである。例えば、Ｔ１Ｒポリペプチド及びタンパク質に対するプローブを用いることができ、それにより、葉状乳頭、有郭乳頭、及び茸状乳頭に存在する味覚細胞、並びに、味覚帯（ｇｅｓｃｈｍａｃｋｓｔｒｅｉｆｅｎ）、口腔、胃腸上皮、及び喉頭蓋に存在する味覚細胞を同定することができる。特に、Ｔ１Ｒ類を検出する方法を用いることができ、それにより、甘味及び／又はうま味の刺激物質あるいは他の味の様相に相当する他の味刺激物質に感受性の味覚細胞を同定することができる。例えば、Ｔ１Ｒ２及び／又はＴ１Ｒ３を安定に又は一過的に発現する細胞は、この研究から、甘味刺激物質に対して感受性であると予測される。同様に、Ｔ１Ｒ１及び／又はＴ１Ｒ３を発現する細胞は、うま味刺激物質に対して感受性であると予測される。本発明のＴ１Ｒタンパク質及びポリペプチドコードする核酸を、ＷＯ００／０３５３７４（この引用によりその内容は本明細書にそっくり記載されたものとする）に開示される方法に従って、種々の原料から分離することができ、遺伝子工学に供し、増幅、合成、及び／又は組換え発現することができる。本発明に従って発現できるＴ１Ｒ類の一覧は、実施例に示される。しかし、強調すべきことであるが、本発明は、そのようなＴ１Ｒの配列に基づいて構築される他の特異的Ｔ１Ｒ類もしくはフラグメント、改変体、又はキメラの発現及び使用、そして特に他の種のＴ１Ｒ類の発現及び使用を包含するものである。
【０１０４】
開示するとおり、本発明の重要な局面は、これらの味覚細胞特異的ＧＰＣＲ類の調節物質（例えば賦活剤、阻害剤、刺激剤、増強剤、アゴニスト（作動物質）、及びアンタゴニスト（拮抗物質））についてスクリーニングする複数の方法である。味覚伝達のそのような調節物質は、味覚シグナル経路の調節に有用である。スクリーニングのこれらの方法は、味覚細胞活性に対する高親和性のアゴニスト（作動物質）及びアンタゴニスト（拮抗物質）を同定するため、用いることができる。それらの調節化合物は、味を好みに合わせて改良するため（例えば、食品の甘味及び／又はうま味を調節するため）食品工業において使用できる。
【０１０５】
本発明は、甘味及びうま味の感覚を媒介する特定のＴ１Ｒ類及びＴ１Ｒ受容体の組合せを特定することで、甘味及びうま味に関する従来の理解不足を補うものである。従って、総じて本願は、Ｔ１Ｒクラスの味に特異的なＧタンパク質共役受容体と味覚におけるそれらの特定の機能に関する本発明者らの発見に係わるものであり、そして、味覚の分子的な基礎のよりよい理解にそれらの発見を結びつけることに関するものである。
【０１０６】
甘味及びうま味（グルタミン酸一ナトリウムの味）の分子的基礎は、不可解なものである。最近、３つの要素からなる種類の味特異的Ｇタンパク質共役受容体（Ｔ１Ｒ類と呼ばれる）が特定された。重複するＴ１Ｒ発現パターンと、構造上関連するＧＡＢＡＢ受容体がヘテロ二量体であるという証拠は、Ｔ１Ｒ類がヘテロ二量体の味覚受容体として機能することを示唆している。下記の実施例において、本発明者らは、異種細胞におけるヒトのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、及びＴ１Ｒ３の機能的共発現を示すとともに、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３を共発現する細胞はうま味刺激物質によって活性化されること、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共発現する細胞は甘味刺激物質によって活性化されることを示している。Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の活性は、精神物理学的検知閾値と相関した。さらに、５’−リボヌクレオチドであるＩＭＰは、グルタミン酸塩に対するＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の応答を高めること（うま味の相乗作用の特徴）が見出された。これらの知見は、特定のＴ１Ｒ類そして、特にＴ１Ｒ類の異なる組合せが、甘味受容体及びうま味受容体として機能することを明らかにしている。
【０１０７】
苦味、甘味及びうま味のヒトの知覚は、Ｇタンパク質共役受容体に媒介されると考えられている（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｂ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｓ．７６：７１８−６６（１９９６））。最近、ヒトゲノムの評価により、Ｔ２Ｒクラスの苦味受容体が明らかになった（Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １００：６１３−７０２（２０００）、Ｃｈａｎｄｒａｓｇｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １００：７０３−１１（２０００）、Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６０１−６０４（２０００））。しかし、甘味及びうま味についての受容体は特定されていなかった。最近、他のクラスの味覚受容体候補（Ｔ１Ｒ類）が特定された。Ｔ１Ｒ類は、最初、ラットの味覚組織から得られたサブトラクトｃＤＮＡライブラリーの大きなスケールの配列によって特定された。それは、Ｔ１Ｒ１を特定し、そして、その後のＴ１Ｒ１に基づく縮重ＰＣＲにより、Ｔ１Ｒ２が特定された（Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９６：５４１−５５１（１９９９））。最近、本発明者ら及び他の者により、ヒトゲノムのデータバンクにおいて、Ｔ１Ｒファミリーの第三の、そして恐らく最後の要素（Ｔ１Ｒ３）が特定された（Ｋｉｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２８３（１）：２３６−４２（２００１）、Ｍａｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８（１）：５８−６３（２００１）、Ｓａｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７（３）：８９６−９０３（２００１）、Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４，４９２−８．（２００１））。明らかに、マウスＴ１Ｒ３は、Ｓａｃ（マウスの甘味を左右する遺伝子座）を含むゲノム範囲に位置している（Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｒｅｄ．６５：３３−６（１９７４）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １２：１３−１６（２００１））。従って、Ｔ１Ｒ３は、甘味受容体として機能することが予測された。最近の高解像度の遺伝子地図作製の研究により、マウスＴ１Ｒ３とＳａｃとの関係が強固なものになった（Ｆｕｌｌｅｒ  Ｔ．Ｃ．，Ｊ．Ｈｅｒｅｄ．６５（１）：３３−３６（１９７４）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｍｍａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  １２（１）：１３−１６（２００１））。
【０１０８】
興味深いことに、これまで機能的に発現されてきたすべてのＣファミリー受容体（メタボトロピックグルタミン酸受容体（ＧＡＢＡＢ受容体）、カルシウムセンシング受容体（Ｃｏｎｉｇｒａｖｅ，Ａ．Ｄ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｓ．Ｊ．＆Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，４８１４−９（２０００））、及び魚の嗅覚受容体（Ｓｐｅｃａ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２３，４８７−９８．（１９９９））は、アミノ酸により活性化されることが明らかになった。この共通する特徴は、Ｔ１Ｒ類がアミノ酸を認識する可能性を示唆するとともに、甘味アミノ酸のほかにグルタミン酸塩の検知にＴ１Ｒ類が係わっていることを示唆する。一方、ｍＧｌｕＲ４メタボトロピックグルタミン酸受容体の転写変異体がうま味受容体であることが提案された。その理由は、それが、ラットの味覚組織において選択的に発現され、そして、その受容体−活性化閾値がグルタミン酸の精神物理学的検知閾値に近かったからである（Ｃｈａｕｄｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１１３−１１９（２０００））。この仮説は、味覚組織におけるｍＧｌｕＲ４変異体の極めて低い発現レベルと合致しにくく、また、ｍＧｌｕＲ４ノックアウトマウスのグルタミン酸塩に対する味覚があまり変わらないこととも合致しにくい（Ｃｈａｕｄｈａｒｉ  ａｎｄ  Ｒｏｐｅｒ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５５：３９８−４０６（１９９８））。さらに、野生型受容体のグルタミン酸結合ポケットを形成する残基の大部分を欠くだけでなく、球状のＮ末端グルタミン酸結合ドメインの約半分も欠く味覚変異体は、構造的にありそうもない（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：９７１−７（２０００））。
【０１０９】
ネズミにおけるＴ１Ｒ発現パターンの比較解析は、Ｔ１Ｒ２と恐らくＴ１Ｒ１がそれぞれＴ１Ｒ３と共発現されることを示している（Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９６：５４１−５１（１９９９）、Ｋｉｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８３：２３６−２４２（２００１）、Ｍａｘ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：５８−６３（２００１）、Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ４：４９２−８（２００１）、Ｓａｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７７：８９６−９０３（２００１））。さらに、二量体化が、Ｃファミリー受容体の共通の主題として出ている。メタボトロピックグルタミン酸受容体及びカルシウムセンシング受容体はホモ二量体である（Ｒｏｍｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８６１２−６（１９９６）、Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１３０８９−９６（１９９８）、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１００００８−１３（１９９９）、Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３６０５−１０（１９９８））。そして、構造上関連するＧＡＢＡＢ受容体は、ヘテロ二量体である（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：６７４−９（１９９８）、Ｋａｕｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：６８３−６８７（１９９８）、Ｗｈｉｔｅ
ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：６７９−６８２（１９９８）、Ｋｕｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：７４−７７（１９９９））。本発明者らは、異種細胞におけるＴ１Ｒ類の機能的な共発現によって、ヒトＴ１Ｒ２がヒトＴ１Ｒ３と共同して甘味受容体として機能することを明らかにし、そして、ヒトＴ１Ｒ１がヒトＴ１Ｒ３と共同してうま味受容体として機能することを明らかにした。
【０１１０】
ここに述べる発見は特に意義深いものである。なぜなら、これまで、改良された人工甘味料の開発は、甘味についてのアッセイが十分でないため、滞っていたからである。実際、一般的に使用される市販の５種の人工甘味料（これらのすべてが、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を活性化する）は、思いがけず発見されたものである。同様に、官能試験（骨の折れる方法）以外、うま味を調節する化合物を同定するためのアッセイ（検定法）は存在しない。これらの問題は、軽減される。なぜなら、下記に述べる実験結果から立証されるように、ヒトの甘味及びうま味の受容体が特定され、そして、それらの受容体についてのアッセイ（検定法）が開発され、特に、機能的なＴ１Ｒ味覚受容体（すなわち甘味受容体又はうま味受容体）を安定に発現する細胞を用いたアッセイが開発されたからである。
【０１１１】
それらに基づき、本発明は、味を調節する化合物を検出かつ特徴づけるためのアッセイ（検定法）を提供し、そこにおいて、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーが、味蕾にあるときと同様に、味を調節する化合物の甘味及びうま味に対する効果についてレポーター分子として作用する。本発明の範囲において特に提供されるのは、甘味及びうま味を個々に調節、模倣、増強かつ／又は阻害する化合物を同定するためのアッセイである。ＧＰＣＲ類の活性を検定するための方法及び特にＧＰＣＲ活性に影響を及ぼす化合物は、よく知られており、本発明のＴ１Ｒファミリーのメンバー及びそれらの機能する組合せに適用することができる。適切なアッセイは上記に特定されている。
【０１１２】
また本発明は、本明細書の至るところで開示するように、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３もしくはＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３、またはそれらの任意のフラグメント、部分、もしくはサブユニットに結合する化合物を提供する。
【０１１３】
特に、当該ＧＰＣＲ類は、例えば、リガンド結合の変化、イオン濃度、膜電位、電流、イオン流出、転写、受容体−リガンド相互作用、二次メッセンジャー濃度を、インビトロ及びインビボで測定するため、アッセイに用いることができる。他の態様において、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーを細胞において遺伝子組換えにより発現させることができ、そして、Ｃａ２＋レベルの変化あるいは他の細胞内メッセージ（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、又はＩＰ３）を測定することにより、ＧＰＣＲ活性を介する味覚の伝達の調節を検定することができる。
【０１１４】
所定のアッセイにおいて、Ｔ１Ｒポリペプチドのドメイン（例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、又は細胞内ドメイン）を異種ポリペプチドに融合してキメラのポリペプチド（例えばＧＰＣＲ活性を有するキメラのタンパク質）を形成する。特に意図するところは、Ｎ末端リガンド結合ドメインを含むＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３のフラグメントの使用である。そのようなタンパク質は、例えば、Ｔ１Ｒ受容体のリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、又は他の調節物質を同定するためのアッセイに有用である。例えば、Ｔ１Ｒポリペプチドは、真核細胞において、原形質膜往来又は分泌経路を介する成熟及びターゲッティングを促進する異種のシャペロン配列とともに、キメラのレポーターとして発現させることができる。この必要に応じた異種配列は、ＰＤＺドメイン相互作用ペプチド、例えばＣ末端ＰＤＺＩＰフラグメント（配列番号１）とすることができる。ＰＤＺＩＰは、ＥＲ輸出シグナルであり、それは、本発明に従って、ここに記載するＴ１Ｒ受容体のような異種タンパク質の表面発現を容易にすることが明らかにされた。より特定的に、本発明の一局面において、ＰＤＺＩＰは、問題の膜タンパク質（例えば、嗅覚受容体、Ｔ２Ｒ味覚受容体、及びここに記載するＴ１Ｒ味覚受容体）の適当なターゲッティングを促進するため、使用することができる。
【０１１５】
そのようなキメラレポーターの具体例には、トランス種のレポーターがある。様々な種からのレポーターサブユニットの任意の組合せを共に用いてキメラのレポーターを形成することができ、そして、例えば、該キメラのレポーターを味物質の同定に用いることができる。かくして、ここに意図するところは、ヒトＴ１Ｒ２サブユニット及びラットＴ１Ｒ３サブユニットからなるキメラのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３レポーターである。さらに意図するところは、ラットＴ１Ｒ２サブユニット及びヒトＴ１Ｒ３サブユニットからなるキメラのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３レポーターである。さらに意図するところは、ヒトの細胞外ドメイン、ラットの膜貫通ドメイン及びラットの細胞内ドメインからなるキメラのＴ１Ｒ２受容体サブユニットである（例えば配列番号１６及び１７）。さらに意図するところは、ラットの細胞外ドメイン、ヒトの膜貫通ドメイン及びヒトの細胞内ドメインからなるキメラのＴ１Ｒ３受容体サブユニットである（例えば配列番号１８及び１９）。
【０１１６】
そのようなキメラのＴ１Ｒ受容体は、任意の真核細胞、例えばＨＥＫ−２９３細胞において発現させることができる。好ましい態様において、該細胞は、Ｇタンパク質、好ましくは多目的のＧタンパク質（例えばＧα１５又はＧα１６）又は広範なＧＰＣＲ類を細胞内シグナル経路又はホスホリパーゼＣのようなシグナルタンパク質に結びつけることができる他の種類の多目的のＧタンパク質を含む。そのような細胞におけるそのようなキメラ受容体の活性化は、任意の標準的な方法を用いて検出することができ、例えば、細胞におけるＦＵＲＡ−２依存性蛍光を検出して細胞内カルシウムの変化を検出することにより、該活性化を検出することができる。好ましい宿主細胞が適当なＧタンパク質を発現しない場合、例えば米国特許出願第６０／２４３７７０号、第０９／９８４２９７号（２００１年１０月２９日出願）、及び米国特許出願第０９／９８９４９７号（２００１年１１月２１日出願）（それらの内容はこの引用により本明細書にそっくり記載されたものとする）に記載されるような多目的のＧタンパク質をコードする遺伝子でそのような細胞をトランスフェクトしてもよい。
【０１１７】
味覚伝達の調節物質について検定する他の方法には、インビトロリガンド結合アッセイがあり、それは、以下を用いる。Ｔ１Ｒポリペプチド、その部分、すなわち細胞外ドメイン、膜貫通領域、もしくはそれらの組合せ、又はＴ１Ｒファミリーメンバーの一以上のドメインからなるキメラのタンパク質；Ｔ１Ｒのポリペプチド、フラグメント、又は融合タンパク質を発現する卵母細胞又は組織培養細胞；Ｔ１Ｒファミリーのメンバーのリン酸化及び脱リン酸化；ＧＰＣＲ類に結合するＧタンパク質；リガンド−結合アッセイ；電圧、膜電位及びコンダクタンスの変化；イオン流出アッセイ；細胞内二次伝達物質（例えばｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ及びイノシトール三リン酸（ＩＰ３））の変化；及び細胞内カルシウムレベルの変化。
【０１１８】
さらに本発明は、Ｔ１Ｒ核酸及びタンパク質の発現を検出する方法を提供し、それは、味覚伝達の制御の研究及び味覚受容体細胞の具体的な特定を可能にする。Ｔ１Ｒファミリーのメンバーは、父子鑑定及び法医学の研究のための有用な核酸プローブを提供する。またＴ１Ｒ遺伝子は、味覚受容体細胞（例えば葉状乳頭、茸状乳頭、有郭乳頭、味覚帯（ｇｅｓｃｈｍａｃｋｓｔｒｅｉｆｅｎ）、及び喉頭蓋の味覚受容体細胞）を同定するための核酸プローブとして有用である。またＴ１Ｒ受容体は、味覚受容体細胞を同定するのに有用なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を生成させるのに用いることができる。
【０１１９】
機能的に、Ｔ１Ｒポリペプチドは、関連する７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体のファミリー（味覚の伝達に関与していると考えられるもので、Ｇタンパク質と相互作用して味覚シグナル伝達を媒介することができるもの）を含む（例えば、Ｆｏｎｇ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，８：２１７（１９９６）、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：１８０（１９９４）参照）。構造的に、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーのヌクレオチド配列は、細胞外ドメイン、７つの膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む関連ポリペプチドをコードする。他の種由来の関連するＴ１Ｒファミリー遺伝子は、少なくとも約５０％、場合によって６０％、７０％、８０％、又は９０％のヌクレオチド配列同一性を、実施例において本明細書に開示するＴ１Ｒ核酸配列又はその保存的に改変された改変体に対し、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域、場合によって１００、２００、５００、又はそれより多いヌクレオチド長の領域にわたって有するか、あるいは、少なくとも約３５〜５０％、場合によって６０％、７０％、８０％、又は９０％のアミノ酸配列同一性を、実施例において下記に開示するＴ１Ｒポリペプチド配列又はその保存的に改変された改変体に対し、少なくとも約２５アミノ酸長のアミノ酸領域、場合によって５０〜１００のアミノ酸長のアミノ酸領域にわたって有するポリペプチドをコードする。
【０１２０】
Ｔ１Ｒファミリーのメンバーに特有のいくつかのコンセンサスアミノ酸配列又はドメインも特定された。例えば、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーは、典型的に、少なくとも約５０％、場合によって５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５〜９９％、又はそれ以上の同一性を、Ｔ１Ｒコンセンサス１及び２（それぞれ配列番号２及び３）に対して有する配列を含む。これらの保存されたドメインは、従って、同一性、特定のハイブリダイゼーション又は増幅、あるいは、ドメインに対して発生させた抗体による特異的な結合によりＴ１Ｒファミリーのメンバーを同定するのに用いることができる。Ｔ１Ｒコンセンサス配列は、例えば、次の配列を含む。
Ｔ１Ｒファミリーコンセンサス配列１：（配列番号２）
（ＴＲ）Ｃ（ＦＬ）（ＲＱＰ）Ｒ（ＲＴ）（ＳＰＶ）（ＶＥＲＫＴ）ＦＬ（ＡＥ）（ＷＬ）（ＲＨＧ）Ｅ
Ｔ１Ｒファミリーコンセンサス配列２：（配列番号３）
（ＬＱ）Ｐ（ＥＧＴ）（ＮＲＣ）ＹＮ（ＲＥ）Ａ（ＲＫ）（ＣＧＦ）（ＶＬＩ）Ｔ（ＦＬ）（ＡＳ）（ＭＬ）
これらのコンセンサス配列は、ここに示されるＴ１Ｒポリペプチドに存在するコンセンサス配列を包含するものである。一方、他の生物からのＴ１Ｒファミリーのメンバーは、ここに具体的に示される包括的なコンセンサス配列に対し、約７５％又はそれ以上の同一性を有するコンセンサス配列を含むと予想することができる。
【０１２１】
Ｔ１Ｒヌクレオチド及びアミノ酸配列の特異的領域は、Ｔ１Ｒファミリーメンバーの多型改変体、種間ホモログ及び対立形質を同定するのに用いることができる。この同定は、インビトロで行うことができ、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件又はＰＣＲ（例えば、上記Ｔ１Ｒコンセンサス配列をコードするプライマーを用いる）の下で行うことができ、あるいは、他のヌクレオチド配列と比較するためのコンピュータシステムにおいて配列情報を利用することにより行うことができる。また、単一種の個体群内でのＴ１Ｒ遺伝子の異なる対立遺伝子は、対立遺伝子配列の相違が個体群のメンバー間での味覚の違いを支配しているかどうか調べるのに有用である。古典的なＰＣＲタイプの増幅及びクローニングの技法は、新規なＴ１Ｒ類（例えば、縮重プライマーが、種間の関連する遺伝子を検出するのに十分な場合）を分離するのに有用である。
【０１２２】
典型的に、Ｔ１Ｒファミリーメンバーの多型改変体及び対立形質の同定は、約２５アミノ酸又はそれ以上（例えば５０〜１００のアミノ酸）のアミノ酸配列を比較することにより、行うことができる。少なくとも約３５から５０％、場合によって６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５〜９９％、又はそれ以上のアミノ酸同一性により、一般に、タンパク質がＴ１Ｒファミリーメンバーの多型改変体、種間ホモログ、又は対立形質であることが裏付けられる。配列の比較は、下で述べる配列比較アルゴリズムの任意のものを用いて行うことができる。また、Ｔ１Ｒポリペプチド又はその保存領域に特異的に結合する抗体を、対立形質、種間ホモログ、及び多型改変体を同定するため用いることができる。
【０１２３】
Ｔ１Ｒ遺伝子の多型改変体、種間ホモログ、及び対立遺伝子は、可能性のあるＴ１Ｒ遺伝子又はタンパク質の味覚細胞特異的発現を検査することにより確認できる。典型的に、ここに開示されるアミノ酸配列を有するＴ１Ｒポリペプチドを、可能性のあるＴ１Ｒポリペプチドとの比較において、正のコントロールとして用いることができ、それにより、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーの多型改変体又は対立形質であるかどうかを明らかにすることができる。多型改変体、対立形質、及び種間ホモログは、Ｇタンパク質共役受容体の７回膜貫通構造を保持すると予想される。さらに詳細にはＷＯ００／０６５９２を参照されたい（これは、関連するＴ１ＲファミリーのメンバーであるＧＰＣＲ−Ｂ３類を開示する。その内容は、この引用により、本開示に整合する態様において、本明細書に記載されたものとする）。ＧＰＣＲ−Ｂ３受容体は、ここでｒＴ１Ｒ１及びｍＴ１Ｒ１と呼ばれるものである。さらにＷＯ００／０６５９３を参照されたい（これも、関連するＴ１ＲファミリーのメンバーであるＧＰＣＲ−Ｂ４類を開示する。その内容は、この引用により、本開示に整合する態様において、本明細書に記載されたものとする）。ＧＰＣＲ−Ｂ４は、ここでｒＴ１Ｒ２及びｍＴ１Ｒ２と呼ばれるものである。すでに述べたとおり、本発明はまた、Ｔ１Ｒ受容体の活性を調節し、それにより甘味及び／又はうま味を調節する分子を同定するため、Ｔ１Ｒ又はＴ１Ｒの組合せ（例えばｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３又はｈＴ１Ｒ１／ｈＴ１Ｒ３）のＸ線結晶構造を利用する構造に基づくアッセイを含む。
【０１２４】
また本発明は、Ｔ１Ｒ受容体を増強、模倣、阻害かつ／又は調節する分子を同定するためのアッセイ、好ましくは高スループットアッセイを提供する。あるアッセイにおいて、Ｔ１Ｒファミリーメンバーのある特定のドメインを、他のＴ１Ｒファミリーメンバーのある特定のドメイン（例えば、細胞外、膜貫通、又は細胞内のドメイン又は領域）と組合せて用いる。他の態様において、細胞外ドメイン、膜貫通領域、又はそれらの組合せを、固体の基材に結合させることができ、そして、例えば、Ｔ１Ｒポリペプチドに結合しかつ／又はＴ１Ｒポリペプチドの活性を調節することができるリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、又はその他の分子を分離するため、用いることができる。
【０１２５】
種々の保存的な突然変異及び置換は、本発明の範囲内であると考えられるものである。例えば、組換え遺伝子技術の公知のプロトコル（ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの部位特異的変異誘発、宿主細胞のトランスフェクション、及びインビトロ転写を含む）を用いてアミノ酸の置換を行うことは、当業者の技術水準の範囲内である。次いで、その変異体は、活性についてスクリーニングすることができる。
【０１２６】
（定義）
ここで用いる以下の用語は、特に断らないかぎり、それらに当てられた以下のような意味を有する。
【０１２７】
「味覚細胞」は、グループに組織化されて舌の味蕾（例えば、葉状細胞、茸状細胞、及び有郭細胞）を形成する神経上皮細胞を含む（例えば、Ｒｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３２９−３５３（１９８９）参照）。味覚細胞は、口蓋及び他の組織、例えば食道及び胃にも見られる。
【０１２８】
「Ｔ１Ｒ」は、味覚細胞（例えば、葉状細胞、茸状細胞、及び有郭細胞）、さらには口蓋及び食道の細胞において発現されるＧタンパク質共役受容体のファミリーの１つ以上のメンバーを指す（例えば、Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：５４１−５５１（１９９９）（その内容はこの引用により本明細書にそっくり記載されたものとする）参照）。また、このファミリーのメンバーは、ＷＯ００／０６５９２においてＧＰＣＲ−Ｂ３及びＴＲ１とも呼ばれ、さらに、ＷＯ００／０６５９３においてＧＰＣＲ−Ｂ４及びＴＲ２とも呼ばれている。ここで、ＧＰＣＲ−Ｂ３はｒＴ１Ｒ１とも呼ばれ、また、ＧＰＣＲ−Ｂ４はｒＴ１Ｒ２と呼ばれる。また、味覚受容体細胞は、形態学に基づいて同定することもでき（例えばＲｏｐｅｒ（上記）参照）、あるいは、味覚細胞において特異的に発現されるタンパク質の発現により同定することもできる。Ｔ１Ｒファミリーのメンバーは、甘味伝達のための受容体として作用する能力、又は、種々の他の味の様相を弁別する能力を有することができる。典型的なＴ１Ｒ配列（ｈＴ１Ｒ１、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３を含む）は、下記の実施例に特定されている。
【０１２９】
「Ｔ１Ｒ」核酸は、「Ｇタンパク質共役受容体活性」を有する７つの膜貫通領域を有するＧＰＣＲ類のファミリーをコードするものである。例えば、それらは、細胞外の刺激物質に応答してＧタンパク質に結合することができ、そして、ホスホリパーゼＣ及びアデニル酸シクラーゼのような酵素の刺激を介してＩＰ３、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、及びＣａ２＋のような二次伝達物質の生産を促進することができる（ＧＰＣＲ類の構造及び機能の説明については、例えばＦｏｎｇ（上記）及びＢａｌｄｗｉｎ（上記）を参照）。１つの味覚細胞は、多くの別個のＴ１Ｒポリペプチドを含むことができる。
【０１３０】
用語「Ｔ１Ｒ」ファミリーは、従って、多型改変体、対立形質、突然変異体、及び種間ホモログにあてはまり、それらは、（１）Ｔ１Ｒポリペプチド、好ましくは実施例１において特定されているものに対し、約２５アミノ酸の領域、場合によって５０〜１００のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも約３５〜５０％のアミノ酸配列同一性、場合によって約６０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有し、（２）好ましくは実施例１に示されるＴ１Ｒポリペプチド配列及びその保存的に改変された改変体からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する免疫原に対して生じた抗体に特異的に結合し、（３）実施例１に含まれるＴ１Ｒ核酸配列及びその保存的に改変された改変体からなる群より選ばれる配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする核酸分子（少なくとも約１００ヌクレオチド、場合によって少なくとも約５００〜１０００ヌクレオチドのサイズを有する）によってコードされ、又は、（４）実施例１に特定されるＴ１Ｒアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも約３５〜５０％同一である配列を有するものである。
【０１３１】
トポロジー（構成）の観点から、ここに開示するＴＩＲ類は、「Ｎ末端ドメイン」（「細胞外ドメイン」とも呼ばれ、「ビーナス・フライトラップ・ドメイン（ｖｅｎｕｓ  ｆｌｙｔｒａｐ  ｄｏｍａｉｎ）」及び「高システインドメイン」を含む）；７つの膜貫通領域、並びに対応する細胞質内ループ及び細胞外ループを含む「膜貫通ドメイン」；及び「Ｃ末端ドメイン」を有する（例えば、Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：５４１−５５１（１９９９）、Ｂｕｃｋ＆Ａｘｅｌ，Ｃｅｌｌ，６５：１７５−１８７（１９９１）参照）。これらのドメインは、当業者に公知の方法（例えば、疎水性及び親水性のドメインを特定する配列解析プログラム）（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（３ｒｄ  ｅｄ．１９８８）を用いて構造を特定した。そのようなドメインは、キメラのタンパク質を調製するのに有用であり、そして、本発明のインビトロアッセイ（例えばリガンド結合アッセイ）に有用である。これらの構造が特定されたドメインに対する化合物の特異的な結合により、該化合物についての構造の特定がなされる。
【０１３２】
「細胞外ドメイン」は、従って、細胞膜からはみ出し、そして、細胞の細胞外面に露出するＴ１Ｒポリペプチドのドメインを指す。そのようなドメインは、一般的に細胞の細胞外面に露出する「Ｎ末端ドメイン」を含み、さらに場合によって、細胞の細胞外面に露出する膜貫通ドメインの細胞外ループの部分、すなわち、膜貫通領域２と３の間のループ、膜貫通領域４と５の間のループ、及び膜貫通領域６と７の間のループを含むことができる。
【０１３３】
「Ｎ末端ドメイン」の領域は、Ｎ末端から始まり、第一の膜貫通ドメインの始まり部分に近い領域まで延びている。より特定的に、本発明の一態様において、このドメインは、Ｎ末端から始まり、そして、アミノ酸位置５６３±約２０アミノ酸の位置にある保存されたグルタミン酸のあたりで終わる。これらの細胞外ドメインは、可溶相及び固体相の両方において、インビトロのリガンド結合アッセイに有用である。さらに、下で述べる膜貫通領域は、細胞外ドメインと組合せてもリガンドに結合することができ、従って同様にインビトロのリガンド結合アッセイに有用である。
【０１３４】
「高システインドメイン」は、ポリペプチドのドメインを指す。この保存配列は、ジスルフィド架橋を形成するいくつかの高度に保存されたＣｙｓ残基を含み、そして、細胞膜の外側に位置する。この領域は、Ｔ１Ｒファミリーメンバーのドメインに該当し、３つのサブユニットＴ１Ｒ１〜Ｔ１Ｒ３のすべてに存在する。高システイン配列は、Ｔ１Ｒ１のアミノ酸５１０〜５６６、Ｔ１Ｒ２のアミノ酸５０８〜５６５、そしてＴ１Ｒ３のアミノ酸５１２〜５６８に見られる。
【０１３５】
「膜貫通ドメイン」（これは７つの「膜貫通領域」を含む）は、原形質膜内に位置するＴ１Ｒポリペプチドのドメインを指し、さらに、対応する細胞質（細胞内）及び細胞外のループを含んでもよい。一態様において、この領域は、アミノ酸位置５６３±２０アミノ酸の位置にある保存されたグルタミン酸残基のあたりから始まり、そして、位置８１２±約１０アミノ酸の位置にある保存されたチロシンアミノ酸残基のあたりで終わる。７つの膜貫通領域ならびに細胞外及び細胞質のループは、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−３２（１９８２）又はＳｔｒｙｅｒ（上記）に記載されるような標準的な方法を用いて特定できる。
【０１３６】
「細胞質ドメイン」は、細胞の内部に面するＴ１Ｒポリペプチドのドメインを指し、例えば、「Ｃ末端ドメイン」及び膜貫通ドメインの細胞内ループ（例えば、膜貫通領域１と２の間の細胞内ループ、膜貫通領域３と４の間の細胞内ループ、及び膜貫通領域５と６の間の細胞内ループ）を指す。
【０１３７】
「Ｃ末端ドメイン」は、最後の膜貫通ドメインの末端とタンパク質のＣ末端とをつなぐ領域を指し、それは、通常、細胞質内に位置する。一態様において、この領域は、位置８１２±約１０アミノ酸の位置にある保存されたチロシンアミノ酸残基から始まり、ポリペプチドのＣ末端まで続く。
【０１３８】
用語「リガンド結合領域」又は「リガンド結合ドメイン」は、味覚受容体、特に、少なくとも受容体の細胞外ドメインを実質的に組み込む味覚受容体に由来する配列を指す。一態様において、リガンド結合領域の細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメインを含むことができ、さらに場合によって、膜貫通ドメインの一部（例えば、膜貫通ドメインの細胞外ループ）を含むことができる。リガンド結合領域は、リガンド、より特定的には、味（例えば甘味又はうま味）を増強、模倣、阻害、かつ／又は調節する化合物に結合し得る。
【０１３９】
本発明のＴ１Ｒ受容体又はポリペプチドに関連する用語「ヘテロ多量体」又は「ヘテロ多量体の複合体」は、少なくとも１つのＴ１Ｒ受容体と他の受容体（典型的には他のＴ１Ｒ受容体ポリペプチド（あるいは他の非Ｔ１Ｒ受容体ポリペプチド）との機能的集合体（会合体）を指す。分かりやすくするため、ヘテロ二量体の味覚受容体複合体としてのＴ１Ｒ類の可能な機能を反映させるため、Ｔ１Ｒ類の機能的な共依存関係を本願で説明している。しかしながら、先にのべたように、機能的な共依存関係は、一方で、間接的な相互作用を反映している可能性がある。例えば、Ｔ１Ｒ３が単独でＴ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２（これらがそれぞれ味覚受容体として作用し得る）の表面発現を促進するよう機能している可能性がある。また、そうではなく、機能する味覚受容体は、Ｔ１Ｒ３単独からなり、それが、Ｔ１Ｒ１又はＴ１Ｒ２の制御のもと異なった態様で処理（加工）されている（カルシウム関連受容体のＲＡＭＰ依存性プロセッシングに類似するように）可能性がある。
【０１４０】
Ｔ１Ｒファミリーのメンバーによって仲介される味覚伝達を調節する化合物を試験するためのアッセイに関連して、用語「機能的効果（機能的作用）」は、間接的又は直接的に受容体の作用の下にある任意のパラメーターの測定値（例えば、機能的効果、物理学的効果、及び化学的効果）を含む。それは、インビトロ、インビボ、及び生体外での、リガンド結合、イオン流出の変化、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結合、ＧＰＣＲのリン酸化又は脱リン酸化、構造変化に基づくアッセイ、シグナル伝達、受容体−リガンド相互作用、二次伝達物質の濃度（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、又は細胞内Ｃａ２＋）を含み、さらに、他の生理学的効果、例えば、神経伝達物質又はホルモンの放出の増加又は減少を含む。
【０１４１】
アッセイに関連して「機能的効果を測定すること」は、間接的又は直接的にＴ１Ｒファミリーのメンバーの作用の下にあるパラメーター（例えば機能的効果、物理学的効果、及び化学的効果）を増加又は減少させる化合物についての検定を意味する。そのような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができ、例えば、分光特性（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）の変化、流体力学的特性（例えば形態）、クロマトグラフィー特性もしくは溶解特性、パッチクランプ、電圧感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導性マーカー、卵母細胞Ｔ１Ｒ遺伝子発現；組織培養細胞Ｔ１Ｒ発現；Ｔ１Ｒ遺伝子の転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位及びコンダクタンスの変化；イオン流出アッセイ；細胞内二次伝達物質（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、及びイノシトール三リン酸（ＩＰ３））の変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質の放出、コンホメーションアッセイなどがある。
【０１４２】
ここで「香味又は味物質」は、対象において、におい及び／又は味の知覚（甘味、酸味、塩味、苦味、及びうま味などを含む）を引き起こす化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。対象は、ヒト、動物、及び／又は生物学的アッセイ（例えば、本願に記載されまた引用されるもの）とすることができる。
【０１４３】
ここで「香味又は味の改質剤」は、対象において、天然又は合成の味物質のにおい及び／又は味を調節（増強もしくは強化、阻害、及び誘導を含む）する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。
【０１４４】
ここで「香味又は味の増強剤」は、天然又は合成の味物質（例えばうま味のグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）及び甘味のフルクトース）の味またはにおいを増強する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。
【０１４５】
ここで「うま味物質」又は「うま味化合物」は、対象において、検知可能なうま味を引き出す化合物又はその生物学的に許容される塩（例えばＭＳＧ）を指す。
【０１４６】
ここで「甘味物質」又は「甘味化合物」は、対象において、検知可能な甘味を引き出す化合物又はその生物学的に許容される塩（例えばフルクトース）を指す。
【０１４７】
ここで「うま味改質剤」は、対象において、天然又は合成のうま味物質（例えばグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ））のうま味を調節（増強もしくは強化、阻害、及び誘導を含む）する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。
【０１４８】
ここで「甘味改質剤」は、対象において、天然又は合成の甘味物質（例えばフルクトース）の甘味を調節（増強もしくは強化、阻害、及び誘導を含む）する化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。
【０１４９】
ここで「味覚を増強する量」は、天然又は合成の味物質（例えばうま味のグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）又は甘味のフルクトース）の味を増強するのに十分な化合物の量を指す。
【０１５０】
「ウェット・スープ類」は、濃度や容器に関係なく、濡れた／液体のスープ（凍結されたスープ類を含む）を意味する。この定義に関し、スープ（類）は、液体において調理される獣肉、鶏肉、魚、野菜、穀物、果物、及び他の材料から調製された食品を意味し、それは、一部又はすべての材料の目に見える材料片を含んでもよい。それは、透明な（だし汁として）もしくは濃厚な（チャウダーとして）、なめらかな、ピューレもしくはチャンクの、調理済みの、半濃縮もしくは濃縮されたものとすることができ、また、加熱してあるいは冷やして出すことができ、食事の前菜又は主料理として出すことができ、あるいは、間食（飲料のようにすするもの）として出すことができる。スープは、他の料理を作るための材料として用いることができ、また、だし汁類（コンソメ）からソース（クリーム又はチーズベースのスープ）の範囲に及ぶ。
【０１５１】
「乾燥食品類及び台所食品類」の意味するところには、（ｉ）料理補助製品、例えば、粉末類、顆粒類、ペースト類、濃縮液体製品（濃縮ブイヨンを含む）、ブイヨン及び圧縮されたキューブ、タブレット又は粉末もしくは顆粒の形態のブイヨン様製品（それらは、完成品として又は製品、ソース又はレシピミックス内の成分としてそれぞれ販売される）（技術を問わない）、（ｉｉ）ミール・ソリューション製品、例えば、乾燥スープ及び凍結乾燥スープ（乾燥スープミックス、乾燥インスタントスープ、乾燥即席スープを含む）、出来上がった料理の乾燥調製品又はそのままの調製品、パスタ、ポテト及び米の料理を含む食品及び一人用アントレ、並びに（ｉｉｉ）調味料製品、例えば、香辛料、マリネ、サラダドレッシング、サラダトッピング、ディップ、パン粉、バッターミックス、シェルフ・ステイブル・スプレッド、バーベキューソース、液体レシピミックス、濃縮物、ソースもしくはソースミックス、（サラダ用のレシピミックスを含む）（乾燥、液状、凍結を問わず、完成品として、又は製品内の成分として販売される）がある。
【０１５２】
「飲料類」は、飲料、飲料ミックス及び濃縮物を意味し、アルコール飲料及びノンアルコール飲料でそのまま飲めるものや乾燥粉末を含むが、それらに限定されるものではない。本発明による化合物を配合できる食品及び飲料のさらなる具体例には、例えば、炭酸飲料及び非炭酸飲料（例えば、ソーダ、ジュース、アルコール飲料、及びノンアルコール飲料）、菓子製品（例えば、ケーキ、クッキー、パイ、キャンディー、チューインガム、ゼラチン、アイスクリーム、シャーベット、プディング、ジャム、ゼリー）、サラダドレッシング、並びに他の調味料、シリアル及び他の朝食製品、缶詰フルーツ及びフルーツソースなどがある。
【０１５３】
さらに、本化合物は、食品及び飲料に添加するため、フレーバー製剤に用いることができる。好ましい場合において、その組成物は、他のフレーバー又は味の改質剤、例えば甘味物質を含むことができる。
【０１５４】
本化合物の生物学的に許容される塩を用いることができる場合がある。そのような塩の例には、アルカリ金属塩、土類金属塩、有機塩などがある。具体例には、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩、塩酸塩又は硫酸塩、エタノールアミン塩などがある。塩は、摂取が生物学的に安全であり、そして、該化合物の甘味調節特性に悪影響を与えないように選ばれる。
【０１５５】
ここで使用する用語「医薬品」は、固体及び液体の両方を含み、摂取可能な非毒性の材料であって薬効のあるもの、例えば、咳止めシロップ、咳止めドロップ、アスピリン、及び薬用咀嚼錠を含む。口腔衛生製品には、磨歯剤又はマウスウォッシュ（うがい薬）のような固体及び液体のものが含まれる。
【０１５６】
「摂食可能な又は医薬として許容される担体又は賦形剤」は、本発明の化合物の必要な剤形を調製するのに用いられる媒質である。摂食可能な又は医薬として許容される担体には、溶媒、希釈剤、又は他の液体の分散媒、分散又は懸濁の助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体の結合剤、滑剤などがある。
【０１５７】
Ｔ１Ｒ遺伝子又はタンパク質の「阻害剤（阻害物質）」、「賦活剤（賦活物質）」、「増強剤（増強物質）」、及び「調節剤（調節物質）」は、味覚伝達に関するインビトロ及びインビボのアッセイを用いて同定される阻害分子、活性化分子、増強分子、調節分子（例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、及びそれらの相同体及び模倣体）を指すのに用いられる。
【０１５８】
阻害剤は、例えば結合して、刺激を部分的又は全体的に遮断する化合物、活性化を減少、阻止、遅延させる化合物、味覚伝達を不活性化、減感化、又はダウンレギュレーションする化合物（例えばアンタゴニスト）である。賦活剤及び増強剤は、例えば結合して、活性化を増強、刺激、増加、開始、付与、促進、強化する化合物、味覚伝達を敏感にするか又はアップレギュレーションする化合物（例えばアゴニスト）である。調節剤（調節物質）は、例えば、受容体と以下のもの（賦活剤又は阻害剤（例えば、エブネリン（ｅｂｎｅｒｉｎ）及び疎水性キャリヤーファミリーの他のメンバー）に結合する細胞外タンパク質、Ｇタンパク質、キナーゼ類（例えば、受容体の不活性化及び脱感作に関与するβ−アドレナリン受容体キナーゼ及びロドプシンキナーゼの相同体）、及びアレスチン（それはまた受容体を不活性化及び脱感作する））との相互作用を変化させる化合物を含む。調節剤は、例えば活性の変化したＴ１Ｒファミリーメンバーの遺伝的改変物を一般に含むことができ、さらに、天然に存在する及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子化合物などを含むことができる。阻害剤及び賦活剤についてのそのようなアッセイは、例えば、細胞又は細胞膜においてＴ１Ｒファミリーのメンバーを発現させること、味物質（例えば甘味物質）がある場合とない場合において可能性のある調節化合物を付与すること、及び、その後、上述したように味の伝達に対する機能的効果を測定することを含む。可能性のある増強剤、賦活剤、阻害剤、又は調節剤で処理されたＴ１Ｒファミリーのメンバーを含むサンプル及びアッセイは、調節の程度を調べるため、阻害剤、賦活剤、又は調節剤を含まないコントロールサンプルと比較される。正のコントロールサンプル（例えば、調節剤が添加されていない甘味物質）は、相対Ｔ１Ｒ活性値が１００％であるとする。
【０１５９】
「ＥＣ５０」は、賦活剤、増強剤、又は調節剤であることを問わず、その化合物が引き出せる最大応答の５０％を引き出せる化合物の量として定義される。一例において、化合物について用量依存性応答曲線を決定し、そして、該曲線から、最大応答の５０％に相当する化合物の濃度を得た。
【０１６０】
「ＩＣ５０」は、化合物が阻害剤として引き出せる最大効果の５０％を引き出す化合物の量として定義される。
【０１６１】
甘味物質及び甘味増強剤に関し、化合物が同定された後、それらの活性のスコアは、最大フルクトース強度（％）の百分率として与えられる。化合物の用量応答において、ＥＣ５０は、甘味アゴニストとしての化合物の効力を反映するよう算出することができる。本発明において、約１００ｍＭより低いＥＣ５０は、化合物が甘味アゴニストとしてＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３活性を誘導することを示唆する。甘味アゴニストとして確実な成功物は、約１ｍＭより小さいＥＣ５０値を有することが好ましく、約１０μＭより小さいＥＣ５０値を有することがより好ましい。
【０１６２】
甘味増強アッセイの実験では、フルクトースの用量応答を行い、そして、所定量の候補化合物と各フルクトース濃度とを同時に用いて第二のフルクトース用量応答を行った。そして、ＥＣ５０比を以下の定義に基づいて算出することができる。
ＥＣ５０比＝ＥＣ５０（フルクトース）／ＥＣ５０（フルクトース＋［化合物］）
ここで、［化合物］はフルクトースの用量応答を引き出す（又は増強もしくは強化する）ため使用された化合物の濃度を表す。それらの濃度は、ｐＭ〜ｍＭの範囲で変えることができ、より好ましくは、低ｎＭ〜μＭの範囲で変えることができる。強い甘味増強剤は、使用される化合物の低い濃度において高いＥＣ５０比を有する。
【０１６３】
本発明において、１より大きいＥＣ５０比は、化合物がＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３活性を調節（強化）しており、そして、甘味増強剤であることを示唆する。確実な成功物は、少なくとも１．２０のＥＣ５０比の値を有することが好ましく、少なくとも１．５０から１００の範囲又はそれ以上のＥＣ５０比の値を有することが好ましい。
【０１６４】
一方、競合アゴニスト（それらの甘味物質は相互に排他的に結合する）又は阻害剤は、常に、１より低い（例えば０〜１の）ＥＣ５０比の値をもたらす。
【０１６５】
うま味物質及びうま味増強剤に関して、それらの活性のスコアは、最大ＭＳＧ強度（％）の百分率として得ることができる。化合物の用量応答において、ＥＣ５０は、うま味アゴニストとしての化合物の効力を反映するよう算出することができる。本発明において、約１０ｍＭより低いＥＣ５０は、化合物がうま味アゴニストとしてＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３活性を誘導することを示唆する。うま味アゴニストとして確実な成功物は、約１ｍＭより小さいＥＣ５０値を有することが好ましく、ほぼｐＭ〜ほぼ低μＭの範囲のＥＣ５０値を有することがより好ましい。
【０１６６】
増強アッセイの実験では、ＭＳＧの用量応答を行い、そして、所定量の候補化合物と各ＭＳＧ濃度とを同時に用いて第二のＭＳＧ用量応答を行った。そして、ＥＣ５０比が以下の定義に基づいて算出される。
ＥＣ５０比＝ＥＣ５０（ＭＳＧ）／ＥＣ５０（ＭＳＧ＋［化合物］）
ここで、［化合物］はＭＳＧの用量応答を引き出す（又は増強もしくは強化する）ため使用された化合物の濃度を表す。それらの濃度は、ｐＭ〜ｍＭの範囲で変えることができ、より好ましくは、低ｎＭ〜μＭの範囲で変えることができる。強いうま味増強剤は、使用される化合物の低い濃度において高いＥＣ５０比を有する。
【０１６７】
本発明において、１より大きいＥＣ５０比は、化合物がＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３活性を調節（強化）しており、そして、うま味増強剤であることを示唆する。確実な成功物は、少なくとも１．２０のＥＣ５０比の値を有することが好ましく、少なくとも１．５０から１００の範囲又はそれ以上のＥＣ５０比の値を有することが好ましい。
【０１６８】
負のコントロールサンプル（例えば味刺激物を添加しない緩衝液）は、相対的Ｔ１Ｒ活性値が０％であるとする。Ｔ１Ｒの阻害が成立する場合、正のコントロールサンプルと調節物質の混合物によって、正のコントロールに対するＴ１Ｒの活性値は、約８０％、場合によって５０％又は２５〜０％となる。調節物質単独によってＴ１Ｒの活性化が成立する場合、正のコントロールサンプルに対するＴ１Ｒの活性値は１０％、２５％、５０％、７５％、場合によって１００％、場合によって１５０％、場合によって２００〜５００％、あるいは１０００〜３０００％以上となる。
【０１６９】
ここで用いる用語「精製された」、「実質的に精製された」、及び「単離された」は、本発明の化合物がその自然な状態において通常伴うような他の異なる化合物が含まれていない状態を指し、従って、「精製された」、「実質的に精製された」及び「単離された」対象物は、所定の試料の質量の少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％、又は２０重量％、最も好ましくは少なくとも５０重量％又は７５重量％を含む。１つの好ましい態様において、これらの用語は、所定の試料の質量の少なくとも９５重量％を含む本発明の化合物を指す。ここで使用される用語「精製された」、「実質的に精製された」及び「単離された」は、核酸又はタンパク質について言うとき、やはり、哺乳動物、特に人体において本来存在するような純度又は濃度とは異なる純度又は濃度の状態を指す。哺乳動物、特に人体において本来存在するような純度又は濃度よりも高い任意の純度又は濃度（（１）他の付随する構造又は化合物からの精製又は（２）哺乳動物、特に人体において通常伴わないような構造又は化合物の随伴を含む）は、「単離された」の意味の範囲内にある。ここに記載する核酸もしくはタンパク質又は複数種の核酸もしくはタンパク質は、当業者に知られる種々の方法及びプロセスに従って、単離することができ、あるいは、自然に通常伴わないような構造又は化合物を伴うことができる。
【０１７０】
用語「核酸」又は「核酸配列」は、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを指す。この用語は、核酸類を包含し、すなわち天然のヌクレオチド類の知られた類似体を含むオリゴヌクレオチド類を包含する。またこの用語は、合成された骨格を有する核酸類似構造物も包含する（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６００，Ｅｄｓ．Ｂａｓｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，（ＮＹＡＳ  １９９２）、Ｍｉｌｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７（１９９３）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、ＷＯ９７／０３２１１、ＷＯ９６／３９１５４、Ｍａｔａ，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７（１９９７）、Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８６９２−８６９８（１９９７）、Ｓａｍｓｔａｇ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，６：１５３−１５６（１９９６）参照）。
【０１７１】
特に断らないかぎり、特定の核酸配列は、明示されたその配列のほかに、その保存的に改変された改変体（例えば縮重コドン置換体）及び相補配列をも暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、例えば、選択した１つ以上のコドンの第三の位置を混合基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を生成させることによって、得ることができる。（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−２６０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと交換可能に使用される。
【０１７２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すため、ここで互いに交換可能に用いられる。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーのほかに、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣物であるようなアミノ酸ポリマーにもあてはまる。
【０１７３】
用語「原形質膜転移ドメイン」又は単に「転移ドメイン」は、ポリペプチドコード配列に組み込まれたとき、そのドメインがない場合よりも高い効率で、細胞原形質膜にハイブリッド（「融合」）タンパク質を「付与（シャペロン）」又は「転移」させることができるポリペプチドドメインを意味する。例えば、「転移ドメイン」は、ウシロドプシン受容体ポリペプチドである７回膜貫通型受容体のアミノ末端から得ることができる。しかし、他の転移促進配列と同様、任意の哺乳動物からのロドプシンを用いることができる。かくして、該転移ドメインは、７回膜貫通型融合タンパク質を原形質膜に転移させるのに特に有効であり、そして、アミノ末端転移ドメインを含むタンパク質（例えば味覚受容体ポリペプチド）は、該ドメインがない場合よりもより高い効率で原形質膜に運ばれる。しかし、本発明のＴ１Ｒ受容体のように、ポリペプチドのＮ末端ドメインが結合において活性である場合、他の転移ドメインを用いるほうが好ましい場合もある。例えば、ここに示すようなＰＤＺドメイン相互作用ペプチドを使用してもよい。
【０１７４】
ここに記載する「転移ドメイン」、「リガンド結合ドメイン」及びキメラ受容体組成物は、具体例の配列にほぼ相当する構造及び活性を有する「類似体」又は「保存的改変体」及び「模倣物」（ペプチド模倣物）をも包含する。かくして、用語「保存的改変体」又は「類似体」又は「模倣物」は、ここに特定するポリペプチドの（保存的改変体の）構造及び／又は活性を実質的に変えることのないよう、アミノ酸配列を変更又は修飾したポリペプチドを指す。これらは、アミノ酸配列の保存的に改変された改変体を含み、すなわち、タンパク質活性に重要でないアミノ酸残基の置換、付加又は欠失を含み、あるいは、重要なアミノ酸の置換であっても、構造及び／又は活性を実質的に変えることのないよう、類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正又は負の荷電、極性又は非極性など）を有する残基によってアミノ酸を置換したものを含む。
【０１７５】
より特定的に、「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関し、保存的に改変された改変体は、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、また、該核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、実質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が所定のタンパク質をコードする。
【０１７６】
例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵのすべてがアミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンが１つのコドンで特定される各位置において、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変えることなく、相当する上記コドンのいずれかに変えることができる。
【０１７７】
そのような核酸の改変体は「サイレントバリエーション（暗黙の改変体）」であり、それは、保存的に改変された改変体の一種である。１つのポリペプチドをコードするここに示す各核酸配列は、その核酸の可能なすべてのサイレントバリエーションも表している。当業者に明らかなとおり、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同じ分子をもたらすよう変更することができる。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載される各配列において、暗に意味されるものである。
【０１７８】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換の表は、当該技術においてよく知られている。例えば、保存的置換を選ぶための１つの具体的なガイドラインは以下のとおり（元の残基の後に置換の例が示される）である。ａｌａ／ｇｌｙ又はｓｅｒ、ａｒｇ／ｌｙｓ、ａｓｎ／ｇｌｎ又はｈｉｓ、ａｓｐ／ｇｌｕ、ｃｙｓ／ｓｅｒ、ｇｌｎ／ａｓｎ、ｇｌｙ／ａｓｐ、ｇｌｙ／ａｌａ又はｐｒｏ、ｈｉｓ／ａｓｎ又はｇｌｎ、ｉｌｅ／ｌｅｕ又はｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅ又はｖａｌ、ｌｙｓ／ａｒｇ又はｇｌｎ又はｇｌｕ、ｍｅｔ／ｌｅｕ又はｔｙｒ又はｉｌｅ、ｐｈｅ／ｍｅｔ又はｌｅｕ又はｔｙｒ、ｓｅｒ／ｔｈｒ、ｔｈｒ／ｓｅｒ、ｔｒｐ／ｔｙｒ、ｔｙｒ／ｔｒｐ又はｐｈｅ、ｖａｌ／ｉｌｅ又はｌｅｕ。他の具体的なガイドラインは、以下の６つのグループを用いる（それぞれは、互いに保存的置換体となるアミノ酸を含む）。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｉ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）、Ｓｈｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｒｌａｇ（１９７９）も参照）。当業者に明らかとおり、以上に特定した置換のみが可能な保存的置換であるわけではない。例えば、ある目的のため、すべての荷電アミノ酸を、正及び負にかかわらず、互いに保存的置換体として考えることができる。さらに、コードされた配列において単一のアミノ酸又は小さな割合のアミノ酸を変更、付加又は削除する個々の置換、欠失又は付加もまた、「保存的に改変された改変体」とみなすことができる。
【０１７９】
用語「模倣物」及び「ペプチド模倣物」は、ポリペプチド（例えば、本発明のキメラの受容体、転移ドメイン、又はリガンド結合ドメイン）と実質的に同じ構造的特性及び／又は機能的特性を有する合成の化合物を指す。この模倣物は、全体が合成による非天然のアミノ酸類似体からなるものであってもよいし、あるいは、部分的に天然のペプチドアミノ酸からなりかつ部分的に非天然のアミノ酸類似体からなるキメラの分子であってもよい。この模倣物は、その構造及び／又は活性を実質的に変えないものであるかぎり、天然アミノ酸の保存的置換体を任意の量で組み込むことができる。
【０１８０】
保存的改変体である本発明のポリペプチドと同様に、慣用的な実験によって、模倣物が本発明の範囲内であるかどうか、すなわち、その構造及び／又は機能が実質的にかわっていないか、判定できる。ポリペプチド模倣物の組成物は、非天然の構造要素の任意の組合せを含むことができる。その構造要素は、典型的に次の３つの構造グループからのものである。ａ）天然のアミド結合（ペプチド結合）による連結以外の残基連結グループ、ｂ）天然に存在す
るアミノ酸残基に代わる非天然の残基、又はｃ）二次構造の模倣を生じる残基（すなわち、二次構造（例えば、βターン、γターン、βシート、αヘリックス構造など）を誘導又は安定化するため）。その残基のすべて又はあるものが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって連結されるとき、ポリペプチドは模倣物として特徴づけることができる。個々のペプチド模倣物の残基は、ペプチド結合、他の化学結合又は結合手段（例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能マレイミド類、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）もしくはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ））によって連結できる。通常のアミド結合（ペプチド結合）による連結の代わりとなりうる連結基には、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−に対して−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４）、チアゾール、レトロアミド、又はエステルがある（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ２６７−３５７，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ（１９８３）参照）。また、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基の代わりにすべて又はあるものについて非天然残基を含むことにより、模倣物として特徴づけることができる。非天然残基は、科学文献及び特許文献に十分に記載されている。
【０１８１】
「標識（ラベル）」又は「検出可能な部分（成分）」は、分光手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、又は化学的手段によって検出可能な構成である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、電子稠密試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに通常使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはハプテン類、及びタンパク質（例えば、そのペプチド中に放射性標識を組み込むことにより検出可能にすることができ、あるいは、そのペプチドに特異的に反応する抗体を検出するよう使用することができる）がある。
【０１８２】
「標識された核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、プローブに結合された標識の存在を検出することによってプローブの存在が検出できるように、リンカー又は化学結合を介して標識に共有結合されたもの、あるいは、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、又は水素結合を介して非共有結合的に標識に結合されたものである。
【０１８３】
ここで用いる「核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、一種以上の化学結合、通常、水素結合の形成を介する相補的塩基対合を介して、相補的配列を有する目的の核酸に結合することができる核酸として定義される。ここで用いるプローブは、天然の塩基（すなわちＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含むことができる。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを阻害しないかぎり、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結されていてもよい。従って、例えば、プローブは、ホスホジエステル結合以外のペプチド結合によって構成塩基が連結されたペプチド核酸であってもよい。当業者に明らかとおり、プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、該プローブ配列に対して相補性が完全ではない標的配列にも結合できる。プローブは、必要に応じて、例えば、同位体、発色団、発光団、色素原で直接的に標識されるか、あるいは、例えば、ビオチン（それに対しストレプトアビジン複合体を後に結合できる）により、間接的に標識される。該プローブの存在又は不在について検定することにより、所定の配列又は部分配列の存在又は不在を検出できる。
【０１８４】
用語「異種（の）」は、核酸の部分について用いられるとき、該核酸が二種以上の部分配列を含み、それらの配列は自然において互いに同じ関係で存在するものではないことを意味する。例えば、該核酸は、典型的に遺伝子組換えによって生産されたものであり、新しい機能の核酸となるよう配列された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列（例えば、ある起源からのプロモーターと、別の起源からのコード領域）を有するものである。同様に、異種のタンパク質は、該タンパク質が二種以上の部分配列を含み、それらの配列は自然において互いに同じ関係で存在するものではないことを意味する（例えば融合タンパク質）。
【０１８５】
「プロモーター」は、核酸の転写を誘導する核酸配列のアレイとして定義される。ここで用いるプロモーターは、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターであるＴＡＴＡエレメントの場合のように、転写の開始部位に近い必要な核酸配列を含む。またプロモーターは、必要に応じて、離れたエンハンサー又はリプレッサー要素を含む。それらは、転写の開始部位から数千塩基対も離れて配置することができる。「構成的」プロモーターは、多くの環境条件及び発生条件において活性であるプロモーターである。
【０１８６】
「誘導」プロモーターは、環境又は発生の制御の下で活性なプロモーターである。用語「作動的に連結」は、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、又は転写因子結合部位の配列）と第二の核酸配列との機能的な連結を指し、そこにおいて、該発現制御配列は、該第二の配列に相当する核酸の転写を誘導する。
【０１８７】
ここで用いる「組換え（遺伝子組換え）」は、合成されたポリヌクレオチドあるいはインビトロで操作されたポリヌクレオチド（例えば「組換えポリヌクレオチド」）を指し、又は、細胞又は他の生物学的系において遺伝子産物を生産するために組換えポリヌクレオチドを用いる方法を指し、又は組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（組換えタンパク質）を指す。また「組換え手段」は、発現（例えば、本発明の転移ドメインを含む融合タンパク質及び本発明のプライマーを用いて増幅した核酸配列の誘導的又は構成的（恒常的）な発現）のため、複数の異なる起源からの種々のコード領域又はドメイン又はプロモーター配列を有する核酸を発現カセット又はベクターに連結することを包含する。
【０１８８】
ここで用いる「安定な細胞株」は、安定に（すなわち長期にわたって）異種核酸（すなわちＴ１Ｒ又はＧタンパク質）を発現する細胞株を指す。好ましい態様において、そのような安定な細胞株は、適当な細胞（典型的に哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞））を、Ｔ１Ｒ発現コンストラクト（すなわちＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及び／又はＴ１Ｒ３）を含む線状化されたベクターでトランスフェクトすることにより、生産される。最も好ましくは、そのような安定細胞株は、ｈＴ１Ｒ１とｈＴ１Ｒ３又はｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ３を発現する２つの線状化されたプラスミドを共トランスフェクトし、そして、それらの遺伝子を安定に中に組み込んだ細胞株を得るため適当な選別法を行うことにより、生産される。最も好ましくは、該細胞株はさらにＧα１５のようなＧタンパク質を安定に発現するものである。
【０１８９】
「に選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」の表現は、その配列が複合混合物（例えば、全細胞又はライブラリーのＤＮＡ又はＲＮＡ）に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ある分子が特定のヌクレオチド配列のみに対して結合、二重鎖形成、又はハイブリダイズすることを指す。
【０１９０】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、典型的に核酸の複合混合物において、その標的部分配列にハイブリダイズする一方、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、種々の環境よって異なってくる。より長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについて広範な指針を示しているものに、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）がある。一般的に、ストリンジェントな条件は、特定の配列について、所定のイオン強度ｐＨにおいて、熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列にハイブリダイズして平衡となっている温度である（所定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度において）（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡において占められる）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン濃度より低くなり、典型的に約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）となり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対し少なくとも３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより大きいもの）に対し少なくとも６０℃であるような条件となる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加して得ることもできる。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションでは、ポジティブなシグナルは、バックグランドの少なくとも２倍、必要に応じてバックグランドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の具体例は、以下のものとなり得る。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、あるいは、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにおいて６５℃で洗浄。そのようなハイブリダイゼーション及び洗浄の工程は、例えば、１、２、５、１０、１５、３０、６０分間又はそれ以上の間行うことができる。
【０１９１】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸同士でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に関連する場合には、やはり実質的に関連している。このことは、例えば、遺伝コードに許容される最大のコドン縮重を用いて核酸の複製物を作る場合に、起こる。そのような場合、典型的に、核酸は、中位にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例えば、「中位にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、１％ＳＤＳ、１ＭのＮａＣｌ、４０％ホルムアミドの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣにおける４５℃での洗浄がある。そのようなハイブリダイゼーション及び洗浄の工程は、例えば、１、２、５、１０、１５、３０、６０分間又はそれ以上の間行うことができる。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグランドの少なくとも２倍である。当業者には容易に理解できることであるが、類似するストリンジェンシーの条件を得るため、異なるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を用いることができる。
【０１９２】
「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子からのフレームワーク領域又はそのフラグメントを含み、抗原を特異的に結合し、認識するポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリンの遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμの定常領域（Ｃ領域）遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域（Ｖ領域）遺伝子を含む。軽鎖（Ｌ鎖）は、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖（Ｈ鎖）は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、そして、それらは、免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ特定する。
【０１９３】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体からなる。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同じ対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原の認識を主としてつかさどる約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）及び「可変重鎖」（ＶＨ）は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。
【０１９４】
「キメラの抗体」は、抗体分子であって、（ａ）定常領域又はその一部が変更、置換又は交換されることにより、抗原結合部位（可変領域）が、異なる又は変更されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域に連結されているか、あるいは、キメラの抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤など）に連結されている抗体分子、又は（ｂ）可変領域又はその一部が、異なる又は変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換又は交換された抗体分子である。
【０１９５】
「抗Ｔ１Ｒ」抗体は、Ｔ１Ｒの遺伝子、ｃＤＮＡ、又はそれらの部分配列によりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである。
【０１９６】
用語「イムノアッセイ」は、抗原に特異的に結合するための抗体を用いるアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、及び／又は定量するため、特定の抗体の特異的結合特性を用いることを特徴とする。
【０１９７】
「特異的（又は選択的）に結合する」又は「と特異的（又は選択的）に反応する」という表現は、分子又は組成物に言及する場合、他の生物学的材料の異種集団において、該分子の存在を決定づける結合反応を指す。従って、所定の条件下、その特定の分子は、バックグランドの少なくとも２倍、特定の受容体に結合し、そして、サンプル中に存在する他の分子に有意な量で実質的に結合することはない。そのような条件下での受容体への特異的結合には、特定の分子に対するその特異性について選択された受容体が必要になり得る。
【０１９８】
抗体に関し、特定のタンパク質に対して特異的に免疫反応性である抗体を選択するため、種々のイムノアッセイ法を用いることができる。例えば、あるタンパク質に対して特異的に免疫反応性である抗体を選択するため、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを常用することができる（例えば、特異的な免疫反応性を測定するため使用できるイムノアッセイの方法及び条件の解説について、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）を参照）。典型的に、特異的又は選択的な反応は、バックグランドシグナル又はノイズの少なくとも２倍となり、より典型的には、バックグランドの１０〜１００倍より大きくなる。
【０１９９】
「に選択的に結合する」の表現は、上述したように他のものに「選択的にハイブリダイズする」核酸の能力、又は、上述したようにタンパク質に「選択的（又は特異的）に結合する」抗体の能力を指していう。
【０２００】
用語「発現ベクター」は、任意の細胞（例えば、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞）において構成的又は誘導的にインビトロ又はインビボで本発明の核酸配列を発現するための任意の組換え発現系を指す。この用語は、線状又は環状の発現系を含む。この用語は、エピソームのままであるか宿主細胞のゲノムに組み込まれている発現系を含む。発現系は、自己複製する能力を有する又は有さない（すなわち、細胞において単に一過性の発現を駆動する）ものとすることができる。この用語は、組換え核酸の転写に必要な最小限の要素のみを含む組換え発現カセットを含む。
【０２０１】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含みかつ該発現ベクターの複製又は発現を支える細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞（例えば大腸菌）又は真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、両性動物細胞、温血動物細胞又は哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ−２９３など）とすることができ、例えば、培養細胞、外植体、及びインビボの細胞とすることができる。
【０２０２】
（化合物）
上述したように、Ｔ１Ｒ受容体上には異なる複数のドメインがある。Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、及びＴ１Ｒ３はそれぞれ、Ｎ末端細胞外ドメイン（ビーナス・フライトラップ・ドメインとしても知られる）、７つの膜貫通領域及び対応する細胞質及び細胞外のループからなる膜貫通ドメイン、高システインドメイン、並びにＣ末端ドメインを含む。各領域は、その領域に特異的に結合する一連の特定の化合物を決める。
【０２０３】
ヒトにおいて、Ｎ末端細胞外ドメインは、ｈＴ１Ｒ２のアミノ酸１〜５６０及びｈＴ１Ｒ３のアミノ酸１〜５６３を含む。ラットにおいて、Ｎ末端細胞外ドメインは、ｒＴ１Ｒ２のアミノ酸１〜５６４及びｒＴ１Ｒ３のアミノ酸１〜５６８を含む。
【０２０４】
ヒトにおいて、Ｃ末端膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、ｈＴ１Ｒ２のアミノ酸５６１〜８３９及びｈＴ１Ｒ３のアミノ酸５６４〜８５２を含む。ラットにおいて、Ｃ末端膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、ｒＴ１Ｒ２のアミノ酸５６５〜８４２及びｒＴ１Ｒ３のアミノ酸５６９〜８５８を含む。
【０２０５】
メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）は、グルタミン酸塩に応答する他のクラスのＣクラスＧタンパク質共役受容体である。これらは、脳及び神経組織に主として存在し、そこにおいてそれらは神経シグナル伝達に役割を果たしている。キメラの受容体を作るため、ｍＧｌｕＲのＮ末端細胞外ドメインをＴ１Ｒに共有結合させることができる。例えば、ｍＧｌｕＲ受容体は、ｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８のいずれかとすることができる。異なるリガンドは、うま味及び甘味の受容体の両方の異なるサブユニット上の異なるドメインに結合する。例えば、アスパルテーム及びネオテームは、Ｔ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインに結合する一方、シクラメート、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）、及びラクチソールは、Ｔ１Ｒ３の膜貫通ドメインに結合する。Ｔ１Ｒ３は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体における２つのサブユニットの１つであるから、シクラメート、ＮＨＤＣ及びラクチソールは、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体においても同様にＴ１Ｒ３に相互作用し得る。シクラメート及びＮＨＤＣはうま味受容体の活性を高める一方、ラクチソールはうま味受容体を阻害する。
【０２０６】
本発明の特異的結合性化合物は、それがうま味物質に関する場合、アミドを含む。また、該アミド化合物は、サブクラスのアミド誘導体又はアミドに関連する誘導体のクラス（例えば尿素類、ウレタン類、オキサルアミド類、アクリルアミド類など）を含む。
【０２０７】
Ｔ１Ｒ２の膜貫通ドメインと相互作用する分子は、例えば、甘味の調節剤（調節物質）となり得、また、Ｔ１Ｒ３の膜貫通ドメインと相互作用する分子は、甘味及び／又はうま味の調節剤（調節物質）となり得る。
【０２０８】
ヒトのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３は、ラットのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３によって認識されない一群の甘味料を認識し、また、ラットではなくヒトのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３はラクチソールによって阻害される。ヒトＴ１Ｒ２の細胞外ドメインをラットの相当物で置き換えたとき、ヒトの受容体は、アスパルテームを認識する能力を失った。このことは、アスパルテームへの結合には、ヒトのＴ１Ｒ２のこの部分が必要であることを示している。逆に、ラットＴ１Ｒ２の細胞外ドメインをヒトの相当物で置き換えたとき、ラットの受容体は、アスパルテームを認識する能力を獲得した。このことは、ヒトＴ１Ｒ２のこの部分がアスパルテームに結合するのに十分であることを示している。同じ原理により、ヒトＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインは、必要かつ十分であった。
【０２０９】
表６は、種々のラット／ヒトのキメラの受容体及び受容体サブユニットを表すのに用いられる略号を示す。
【０２１０】
【表４７】
2007512227.tif 000047
【０２１１】
【表４８】
2007512227.tif 000048
ｒＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３ではなくｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３からなるＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体に特異的に結合する天然に存在しない化合物がここに開示される。そのような化合物の具体例には、ネオテーム、アスパルテーム、シクラメート、ラクチソール、化合物８８３３６０、化合物６５４２８８８、化合物４０３２４９、化合物６３６４３９５、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、化合物６５４２８８８、及びネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）があるが、これらに限定されるものではない。さらなる具体例を表１〜４に示す。ペプチドでない有機化合物は、ほぼ１５×８×８オングストロームの寸法を有する直方体のサイズであり得、１２×５×５オングストロームの寸法がより好ましい。
【０２１２】
ｒＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３ではなくｈＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３からなるＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体に特異的に結合する化合物がさらにここに開示される。そのような化合物の具体例には、アスパルテーム及びネオテームがあるが、それらに限定されるものではない。さらなる具体例を表５に示す。
【０２１３】
ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインに特異的に結合する化合物がさらにここに開示される。そのような化合物の具体例には、ネオテーム、アスパルテーム、炭水化物糖類（例えば、ショ糖、フルクトース、グルコース、タガトース、エリトリトール、ソルビトール、マルトース、キシリトール、ラクトース、及びガラクトース、並びに他のすべての炭水化物糖類）があるが、これらに限定されるものではない。さらなる具体例を表５に示す。
【０２１４】
ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３及びｈＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ２のビーナス・フライトラップ・ドメイン（ＶＦＤ）に特異的に結合する化合物がさらに開示される。
【０２１５】
Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ２サブユニットのＮ末端ビーナス・フライトラップ・ドメインに特異的に結合する化合物がさらに開示される。より具体的には、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ２サブユニットのヒトＮ末端ビーナス・フライトラップ・ドメインのアミノ酸残基１４４及び３０２に特異的に結合する化合物がさらに開示される。そのような化合物の具体例には、アスパルテーム、ネオテーム、炭水化物類、及び甘味アミノ酸（例えばＤ−Ｔｒｐ、Ａｌａ、及びＧｌｙ）があるが、それらに限定されるものではない。
【０２１６】
ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ２の高システイン領域に特異的に結合する化合物がさらに開示される。また、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ２の膜貫通ドメイン（ＴＭ）に特異的に結合する化合物が開示される。
【０２１７】
ｈＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３ではなくｒＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３からなるＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体に特異的に結合する化合物がさらに開示される。そのような化合物の具体例には、シクラメート、ＮＨＤＣ、ラクチソール、化合物８８３３６０、化合物４０３２４９、及び化合物６３６４３９５があるが、これらに限定されるものではない。さらなる具体例を表５に示す。
【０２１８】
ｒＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３又はｈＴ１Ｒ２／ｈ３−ｒ３ではなくｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３及びｒＴ１Ｒ２／ｒ３−ｈ３に特異的に結合する化合物がさらに開示される。そのような化合物の具体例には、シクラメート、ＮＨＤＣ、ラクチソール、化合物８８３３６０、化合物４０３２４９、及び化合物６３６４３９５があるが、これらに限定されるものではない。
【０２１９】
また、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ３サブユニットのヒトＣ末端ドメインの細胞外ループ２及び細胞外ループ３に特異的に結合する化合物が開示される。さらに、ｒＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３又はｈ２−ｒ２／ｈＴ１Ｒ３ではなくｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３及びｒ２−ｈ２／ｒＴ１Ｒ３に特異的に結合する化合物が開示される。
【０２２０】
また、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ３サブユニットのヒトＮ末端細胞外ドメインに特異的に結合する化合物が開示される。さらに、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ３のビーナス・フライトラップ・ドメイン（ＶＦＤ）に特異的に結合する化合物が開示される。そのような化合物の具体例には、アスパルテーム、ネオテーム、炭水化物類、及び甘味アミノ酸（例えばＤ−Ｔｒｐ、Ａｌａ、及びＧｌｙ）があるが、それらに限定されるものではない。
【０２２１】
また、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３受容体のＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインに特異的に結合する化合物が開示される。さらに、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＴ１Ｒ３サブユニットのヒト膜貫通ドメインの細胞外ループ２及び細胞外ループ３に特異的に結合する化合物が開示される。そのような化合物の具体例には、シクラメートがあるが、これに限定されるものではない。
【０２２２】
本発明の化合物は、ショ糖、フルクトース、グルコース、エリトリトール、イソマルト、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、所定の公知の天然のテルペノイド類、フラボノイド類、もしくはタンパク質甘味料、ジ−ペプチド類、トリ−ペプチド類、アルパルテーム、サッカリン、スクラロース、ハロゲン化糖類、アセスルファム−Ｋ、シクラメート、スクラロース、及びアリテーム、ネオテーム、ペリラルチン、ＳＣ−４５６４７、ＳＣ−４００１４、モネリン、ＮＣ−００２７４０−０１、タウマチン、ＣＣ−００１００、ＮＣ−００４２０、アリテーム、ＳＣ−４４１０２、ズルチン、ＮＣ−００５７６、グリシルリチン酸、ステビオシド、Ｎａ−サッカリン、Ｄ−トリプトファン、シクラメート、ＤＨＢ、グリコール酸、グリシン、Ｄ（−）フルクトース、ホモフロノール（ｈｏｍｏｆｕｒｏｎｏｌ）、Ｄ（−）タガトース、マルトース、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ（＋）ガラクトース、α−ラクトース、Ｌ（）フルクトース、Ｌ（＋）、化合物４０３２４９、及びグルコースを含まない。
【０２２３】
場合によって、本発明の化合物は化合物６３６４３９５ではない。
【０２２４】
また、Ｔ１Ｒドメインのトランケートされた領域に結合する化合物がここに開示される。例えば、ｈ２ＴＭ／ｈ３ＴＭを含むトランケートされた甘味受容体のＴ１Ｒ２のＴＭドメインに特異的に結合する化合物、ｈ２ＴＭ／ｈ３ＴＭを含むトランケートされた甘味受容体のＴ１Ｒ３のＴＭドメインに特異的に結合する化合物、ｍＧｌｕＲ−ｈ２／ｍＧｌｕＲ−ｈ３を含むキメラの受容体のＴ１Ｒ２のＴＭドメインに特異的に結合する化合物、ｍＧｌｕＲ−ｈ２／ｍＧｌｕＲ−ｈ３を含むキメラの受容体のＴ１Ｒ３のＴＭドメインに特異的に結合する化合物、ｈ１ＴＭ／ｈ３ＴＭを含むトランケートされたうま味受容体のＴ１Ｒ１のＴＭドメインに結合する化合物、ｈ１ＴＭ／ｈ３ＴＭを含むトランケートされた甘味受容体のＴ１Ｒ３のＴＭドメインに結合する化合物、ｍＧｌｕＲ−ｈ１／ｍＧｌｕＲ−ｈ３を含むキメラの受容体のＴ１Ｒ１のＴＭドメインに結合する化合物、及びｍＧｌｕＲ−ｈ１／ｍＧｌｕＲ−ｈ３を含むキメラの受容体のＴ１Ｒ３のＴＭドメインに結合する化合物、が開示される。配列番号２９〜３３は、これらのトランケートされた受容体を示している。
【０２２５】
本発明の化合物は、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）もしくはグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、ショ糖、フルクトース、グルコース、エリトリトール、イソマルト、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、所定の公知の天然のテルペノイド類、フラボノイド類、もしくはタンパク質甘味料、ジ−ペプチド類、トリ−ペプチド類、アルパルテーム、サッカリン、スクラロース、ハロゲン化糖類、アセスルファム−Ｋ、シクラメート、スクラロース、アリテーム、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）、又はグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）もしくはアデノシン一リン酸を含まない。
【０２２６】
化合物４０３２４９は（５−（４Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサチイン−２−イル）−２−メチオキシフェノールであり、化合物６３６４３９５は３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチル）ベンゾ［ｄ］イソキサゾール−４，６−ジオールである。
【０２２７】
上記化合物は、ＦＬＩＰＲ装置（蛍光強度プレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いる蛍光に基づくアッセイにおいて、フルクトースについての最大活性と比較した活性で少なくとも２５％、化合物に依存する蛍光の増加を示すことができる。このプロトコルの具体例については、実施例１２及び１８を参照されたい。また該化合物は、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）装置を用いる蛍光に基づくアッセイにおいて、甘味料についてのＥＣ５０を、化合物に依存して少なくとも２倍減少させることができる。さらに、細胞系アッセイにおいて、該化合物は、野生型又はキメラの受容体でトランスフェクトされた１００の細胞のうち少なくとも１０が化合物に依存する蛍光の増加を示す結果をもたらすことができる。細胞系アッセイの具体例は実施例２４でみることができる。また、該化合物は、最大未満のレベルの甘味料に対し、蛍光細胞の数を、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２倍、又はそれ以上、あるいはそれらの間の任意の倍数、化合物に依存して増加させることができる。その応答は、蛍光、カルシウムレベル、ＩＰ３レベル、ｃＡＭＰレベル、ＧＴＰγＳ結合、又はレポーター遺伝子活性（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）により測定することができる。
【０２２８】
さらに、ここに開示する化合物は、細胞において、以下の特性の１つ以上を有することができる。コントロールと比べて少なくとも約５０％減少したＥＣ５０、少なくとも約２５％増加した細胞内Ｃａ２＋レベル、少なくとも約２５％増加した細胞内ｃＡＭＰ、少なくとも約２５％増加した細胞内ｃＧＭＰ、少なくとも約２５％増加した細胞内ＩＰ３、又は、少なくとも約２５％増加したＧＴＰγＳのＧタンパク質結合。
【０２２９】
化合物を用いる方法
また、食料品又は医薬品のうま味を調節する方法が開示され、該方法は、少なくとも１つの食料品もしくは医薬品、又はそれらの前駆体を用意すること、及び該食料品もしくは医薬品又はそれらの前駆体と、ここに開示される少なくとも１つの天然に存在しない化合物又はその摂食可能な塩のうま味を調節する量以上とを合わせて、改質した食料品又は医薬品を調製し、それにより、食料品又は医薬品のうま味を調節すること、を備える。また、食料品又は医薬品のうま味を阻害する方法が開示され、該方法は、少なくとも１つの食料品もしくは医薬品、又はそれらの前駆体を用意すること、及び該食料品もしくは医薬品又はそれらの前駆体と、ここに開示される少なくとも１つの天然に存在しない化合物又はその摂食可能な塩のうま味を阻害する量以上とを合わせて、改質した食料品又は医薬品を調製し、それにより、食料品又は医薬品のうま味を阻害すること、を備える。
【０２３０】
また、食料品又は医薬品のうま味を増加させる方法が開示され、該方法は、少なくとも１つの食料品もしくは医薬品、又はそれらの前駆体を用意すること、及び該食料品もしくは医薬品又はそれらの前駆体と、ここに開示される少なくとも１つの天然に存在しない化合物又はその摂食可能な塩のうま味を増加させる量以上とを合わせて、改質した食料品又は医薬品を調製し、それにより、食料品又は医薬品のうま味を増加させること、を備える。
【０２３１】
また、食料品又は医薬品の甘味を調節する方法が開示され、該方法は、少なくとも１つの食料品もしくは医薬品、又はそれらの前駆体を用意すること、及び該食料品もしくは医薬品又はそれらの前駆体と、ここに開示される少なくとも１つの天然に存在しない化合物又はその摂食可能な塩の甘味を調節する量以上とを合わせて、改質した食料品又は医薬品を調製し、それにより、食料品又は医薬品の甘味を調節すること、を備える。
【０２３２】
また、食料品又は医薬品の甘味を阻害する方法が開示され、該方法は、少なくとも１つの食料品もしくは医薬品、又はそれらの前駆体を用意すること、及び該食料品もしくは医薬品又はそれらの前駆体と、ここに開示される少なくとも１つの天然に存在しない化合物又はその摂食可能な塩の甘味を阻害する量以上とを合わせて、改質した食料品又は医薬品を調製し、それにより、食料品又は医薬品の甘味を阻害すること、を備える。
【０２３３】
また、食料品又は医薬品の甘味を増加させる方法が開示され、該方法は、少なくとも１つの食料品もしくは医薬品、又はそれらの前駆体を用意すること、及び該食料品もしくは医薬品又はそれらの前駆体と、ここに開示される少なくとも１つの天然に存在しない化合物又はその摂食可能な塩の甘味を増加させる量以上とを合わせて、改質した食料品又は医薬品を調製し、それにより、食料品又は医薬品の甘味を増加させること、を備える。
【０２３４】
また、うま味の知覚を増強する方法が開示され、該方法は、うま味受容体をシクラメート及びＮＨＤＣ、並びにそれらの誘導体と接触させることを備える。さらに、うま味の知覚を増強する方法が開示され、該方法は、うま味受容体をラクチソール誘導体と接触させることを備える。また、甘味の知覚を増強する方法が開示され、該方法は、甘味受容体をシクラメート及びＮＨＤＣ、並びにそれらの誘導体と接触させることを備える。さらに、甘味の知覚を増強する方法が開示され、該方法は、甘味受容体をラクチソール誘導体と接触させることを備える。
【０２３５】
Ｔ１Ｒポリペプチド類の単離及び発現
本発明のＴ１Ｒ類又はそのフラグメントもしくは改変体の単離及び発現は、以下に記載するように行うことができる。味覚受容体のリガンド結合領域をコードする核酸の増幅にＰＣＲプライマーを用いることができ、また、それらの核酸のライブラリーを必要に応じて生成させることができる。次いで、それらの核酸又はライブラリーの機能的発現のため、個々の発現ベクター又は発現ベクターのライブラリーを用いて、宿主細胞を感染させ又はトランスフェクトすることができる。それらの遺伝子及びベクターは、インビトロ又はインビボで調製し発現させることができる。当業者に明らかなとおり、核酸の発現を改変又は制御するための必要な表現型は、本発明のベクター内において遺伝子及び核酸の発現又は活性を調節すること（例えばプロモーター、エンハンサーなど）により、得ることができる。発現又は活性を増加又は減少させるのに望ましい公知の方法のいずれかを用いることができる。本発明は、当該技術において知られている任意の方法又はプロトコル（それらは科学文献及び特許文献に十分に記載されている）と組合せて実施することができる。
【０２３６】
本発明の核酸配列及び本発明の実施に使用する他の核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルス、又はそれらのハイブリッドであるかに係わらず、種々の起源から単離し、遺伝子操作に供し、増幅し、かつ／又は組換え発現することができる。任意の組換え発現系を用いることができ、それは、哺乳動物細胞のほかに、例えば、細菌、酵母、昆虫、又は植物の系を含む。
【０２３７】
一方、それらの核酸を、インビトロで、よく知られた化学合成法により合成することができる。そのような方法は、例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８（１９８２）、Ａｄａｍｓ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（１９８３）、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４（１９９７）、Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０（１９９５）、Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６（１９９４）、Ｎａｒａｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）、Ｂｒｏｗｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９）、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９（１９８１）、米国特許第４４５８０６６号に記載されている。次いで、相補鎖を合成し、それらの鎖を適当な条件下で互いにアニールすることにより、あるいは、ＤＮＡポリメラーゼと適当なプライマー配列とを用いて相補鎖を付加することにより、二本鎖ＤＮＡフラグメントを得ることができる。
【０２３８】
核酸を操作するための技法、例えば、配列における突然変異の生成、サブクローニング、プローブの標識、配列決定、ハイブリダイゼーションなどの技法は、科学文献及び特許文献に十分に記載されている。例えば以下を参照されたい。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）。
【０２３９】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチド等は、当業者によく知られた多数の一般的手段のいずれかにより分析及び定量できる。それらには、例えば、分析生化学法（例えば、ＮＭＲ、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及びハイパーディフュージョンクロマトグラフィー）、種々の免疫学的方法（例えば、流体又はゲル内沈降反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ）、サザン解析、ノーザン解析、ドットブロット解析、ゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、その他の核酸、ターゲット又はシグナル増幅法、放射性標識法、シンチレーション計数法、及びアフィニティークロマトグラフィーがある。
【０２４０】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて味覚受容体リガンド結合領域をコードする核酸フラグメントを増幅させてもよい。また、増幅手法を用いて、ここに示す核酸をクローニングしてもよいし、定量的に測定してもよい。増幅法は、当該技術においてよく知られており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９９５））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７，（１９８８）、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ  ８９：１１７（１９９０）参照）、転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９）参照）、及び、自立型配列複製（例えば、Ｇａｕｔｅｌｌｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４（１９９０）参照）、Ｑ−βレプリカーゼ増幅（例えばＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１４７７−１４９１（１９９７）参照）、自動化Ｑ−βレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Ｂｕｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １０：２５７−２７１（１９９６）参照）、並びに他のＲＮＡポリメラーゼに媒介される手法（例えばＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）（さらに、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６（１９８７）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号、Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４（１９９５）参照）がある。プライマーは、「ドナー」７−膜受容体の本来の配列を保持するよう設計することができる。一方、プライマーは、保存的置換（例えば、疎水性残基に対する疎水性（上述）あるいは機能的に有利な置換（例えば、原形質膜挿入を阻止しないもの、ペプチダーゼによる開裂を引き起こすもの、受容体の異常な折りたたみを引き起こすものなど））であるアミノ酸残基をコードすることができる。一旦増幅されると、核酸（個々に又はライブラリーとして）は、当該技術において知られた方法によりクローニングすることができ、必要に応じて、通常の分子生物学的方法を用いて種々のベクターの任意のものにクローニングできる。インビトロで増幅された核酸をクローニングする方法は、例えば米国特許第５４２６０３９号に記載される。
【０２４１】
プライマー対は、Ｔ１Ｒファミリーメンバーのリガンド結合領域を選択的に増幅するよう設計してもよい。それらの領域は、種々のリガンド又は味物質に対し、変わり得る。従って、１つの味物質に対して最小限の結合領域となり得るものは、他の味物質について限定しすぎたものとなり得る。従って、複数の異なる細胞外ドメイン構造を有する異なるサイズのリガンド結合領域を増幅してもよい。
【０２４２】
縮重プライマー対を設計するための範例は、当該技術においてよく知られている。例えば、ＣＯｎｓｅｎｓｕｓ−ＤＥｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＯＤＥＨＯＰ）ストラテジーコンピュータプログラムを、ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌでアクセスすることができ、そして、公知の味覚受容体リガンド結合領域として一連の関連するタンパク質配列から始めるハイブリッドプライマー予測について、ＢｌｏｃｋＭａｋｅｒマルチプル・シークエンス・アラインメント・サイトから直接リンクする（例えば、Ｒｏｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１６２８−１６３５（１９９８）、Ｓｉｎｇｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：３１８−３１９（１９９８）参照）。
【０２４３】
オリゴヌクレオチドプライマー対を合成する手段は、当該技術においてよく知られている。「天然の」塩基対又は合成した塩基対を使用できる。例えば、人工的な核酸塩基を使用することにより、プライマー配列を操作し、そして、増幅産物のより複雑な混合物を生成させるため、汎用性のある方法が得られる。種々の系統の人工的核酸塩基は、縮重分子認識のための手段を提供するため、内部結合の回転を介して、複数の水素結合配向性を呈することができる。ＰＣＲプライマーの単一の位置にこれらの類似体を組み込むことにより、増幅産物の複雑なライブラリーを生成させることができる。例えば、Ｈｏｏｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４８６６−４８７１（１９９７）参照。天然のＤＮＡ塩基の形態を模倣するため、非極性分子も利用できる。アデニンに対する非水素結合性型の模倣物は、チミンに対する非極性型の模倣物に対して、効率よく選択的に複製し得る（例えば、Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：９５０−９５４（１９９８）参照）。例えば、２つの縮重塩基は、ピリミジン塩基である６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン又はプリン塩基であるＮ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリンとすることができる（例えば、Ｈｉｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４２５８−４２６３（１９９８）参照）。例えば、本発明の縮重プライマーは、核酸塩基類似体である５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシ−シチジン，３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−アミド亜リン酸（配列において文字「Ｐ」で示す（上記参照））を組み込む。このピリミジン類似体は、プリン類（Ａ及びＧの残基を含む）と水素結合する。
【０２４４】
ここに開示する味覚受容体と実質的に同じである多型改変体、対立形質、及び種間ホモログは、上述した核酸プローブを用いて単離できる。一方、Ｔ１Ｒポリペプチド並びにその多型改変体、対立形質、及び種間ホモログをクローニングするため、発現ライブラリーを用いることができる（それは、Ｔ１Ｒポリペプチドに対して作られた抗血清又は精製抗体（Ｔ１Ｒホモログをやはり認識し、それに選択的に結合するもの）を免疫学的に用いて、発現されたホモログを検出することにより、行われる）。
【０２４５】
味覚受容体のリガンド結合領域をコードする核酸は、縮重プライマー対を用いる適当な核酸配列の増幅（例えばＰＣＲ）により、生成させてもよい。増幅核酸は、任意の細胞又は組織からのゲノムＤＮＡ、あるいは、味覚受容体を発現する細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとすることができる。
【０２４６】
一態様において、転移配列（トランスロケーション配列）に融合されるＴ１Ｒをコードする核酸を含むハイブリッドタンパク質コード配列を構築してもよい。さらに、ハイブリッドのＴ１Ｒが提供され、それは、転移モチーフ（トランスロケーションモチーフ）と、化学的感覚受容体（特に味覚受容体）の他のファミリーの味物質結合ドメインとを含む。これらの核酸配列は、転写又は翻訳の調節因子（例えば、転写及び翻訳の開始配列、プロモーター及びエンハンサー、転写及び翻訳のターミネーター、ポリアデニル化配列、及びＤＮＡをＲＮＡに転写するのに有用な他の配列）に作動的に連結することができる。組換え発現カセット、ベクター及び形質転換体の構成において、すべての必要な細胞又は組織で必要な核酸の発現を誘導するため、プロモーターフラグメントを用いることができる。
【０２４７】
別の態様において、融合タンパク質は、Ｃ末端又はＮ末端の転移配列を含んでもよい。さらに、融合タンパク質は、他の要素（例えば、タンパク質検出、精製、又は他の用途のための要素）を含むことができる。検出及び精製を容易にするドメインには、例えば、金属キレートペプチド（例えば、ポリヒスチジン領域、ヒスチジン−トリプトファンモジュール、あるいは、固定化された金属上での精製を可能にする他のドメイン）、マルトース結合タンパク質、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、又は、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製系で使用されるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）がある。
【０２４８】
開裂可能なリンカー配列（例えば、第Ｘａ因子（例えばＯｔｔａｖｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８０：２８９−２９３（１９９８）参照）、スブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ（例えばＰｏｌｙａｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：６１５−６１９（１９９７）参照））、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を、転移ドメイン（効率的な原形質膜発現用）と新しく翻訳されるポリペプチドの残りの部分との間に入れることは、精製の促進に有用であり得る。例えば、１つのコンストラクトは、チオレドキシンが後に続く６つのヒスチジン残基に結合される核酸配列コードのポリペプチドと、エンテロキナーゼ開裂部位（例えばＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１７８７−１７９７（１９９５）参照）と、Ｃ末端転移ドメインとを含むことができる。該ヒスチジン残基は検出及び精製を容易にする一方、エンテロキナーゼ開裂部位は、必要なタンパク質（類）を融合タンパク質の残りの部分から精製するための手段となる。融合タンパク質をコードするベクターに関する技術及び融合タンパク質の応用に関する技術は、科学文献及び特許文献に詳細に記載されている（例えば、Ｋｒｏｌｌ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１−５３（１９９３）参照）。
【０２４９】
リガンド結合ドメインをコードする配列を含む発現ベクター（個々の発現ベクターとして、あるいは、発現ベクターのライブラリーとして）は、ゲノムに、細胞質に、あるいは、細胞の核に導入することができ、そして、種々の通常の方法によって発現させることができる。それらの方法は、科学文献及び特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１（１９８７）、Ｂｅｒｇｅｒ（上記）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ；Ａｕｓｕｂｅｌ参照。生物学的試薬及び実験装置の製造者からの製品情報も、知られた生物学的方法に関する情報を提供するものである。ベクターは、天然の起源から単離することができ、ＡＴＣＣやＧｅｎｅＢａｎｋライブラリーのような所から入手することができ、あるいは、合成又は組換えの方法により調製できる。
【０２５０】
核酸は、細胞において安定に又は一過的に発現される発現カセット、ベクター又はウイルスを用いて、発現させることができる（例えば、エピソームの発現系）。形質転換された細胞及び配列において選択可能な表現型をもたらすため、発現カセット及びベクターに選択マーカーを組み込むことができる。例えば、選択マーカーは、宿主ゲノムへの統合が必要でないよう、エピソームでの維持及び複製をコードすることができる。例えば、マーカーは、望ましいＤＮＡ配列で形質転換された細胞の選別が可能になるよう、抗生物質耐性（例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブラストサイジン、ハイグロマイシン）をコードしてもよく、あるいは、除草剤耐性（例えば、クロロスルフロン、バスタ（Ｂａｓｔａ））をコードしてもよい（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｇｅｎｅ  １９０：３１５−３１７（１９９７）、Ａｕｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８１：９９２−９９７（１９９７）参照）。ネオマイシン又はハイグロマイシンのような基質に対する耐性を付与する選択可能なマーカーの遺伝子は、組織培養においてのみ利用できるため、さらに、化学耐性遺伝子を、インビトロ及びインビボでの選択可能なマーカーとして用いる。
【０２５１】
キメラの核酸配列は、任意の７回膜貫通型ポリペプチド内におけるＴ１Ｒリガンド結合ドメインをコードすることができる。７回膜貫通型受容体ポリペプチド類は、類似する一次配列並びに二次構造及び三次構造を有するため、構造的ドメイン（例えば、細胞外ドメイン、ＴＭドメイン、細胞質ドメインなど）は、配列解析によって容易に特定できる。例えば、ホモロジーモデリング、フーリエ解析、及びらせん周期の検出によって、７回膜貫通型受容体配列を有する７つのドメインを同定し、特徴づけることができる。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）のアルゴリズムを用いて、分析配列の疎水性及び変動性のプロファイルを特徴づける支配的な周期を推定することができる。周期性検出の強化及びαらせん周期の指標もまた、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：５５−７０（１９９３）により行うことができる。他のアラインメント及びモデル化のアルゴリズムも当該技術においてよく知られている（例えば、Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ４：１６１−１６４（１９９６）、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．，１５７：１０５−１３２（１９８２）、Ｃｒｏｎｅｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．６：５９−６４（１９９３）参照）。
【０２５２】
また、本発明は、特定の核酸配列及びアミノ酸配列を有するＤＮＡ及びタンパク質を含むのみならず、ＤＮＡフラグメント、特に、例えば４０、６０、８０、１００、１５０、２００、もしくは２５０ヌクレオチド又はそれ以上のフラグメント、さらには、タンパク質のフラグメント、例えば１０、２０、３０、５０、７０、１００、もしくは１５０アミノ酸又はそれ以上のフラグメントを含む。必要に応じて、該核酸のフラグメントは、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーに対して生じさせられる抗体に結合できる抗原性ポリペプチドをコードすることができる。さらに、必要に応じて本発明のタンパク質フラグメントは、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーに対して生じさせられる抗体に結合できる抗原性フラグメントとすることができる。
【０２５３】
キメラのタンパク質も意図するところであり、それは、ここに示す少なくとも１つのＴ１Ｒポリペプチドの１つの少なくとも１０、２０、３０、５０、７０、１００、もしくは１５０のアミノ酸又はそれ以上と、それに結合されるさらなるアミノ酸であって、もう１つのＧＰＣＲ（好ましくは７回膜貫通型スーパーファミリーのメンバー）の全体又は一部に相当するアミノ酸とを含む。これらのキメラは、本受容体ともう１つのＧＰＣＲとから作ることができ、あるいは、本Ｔ１Ｒ受容体類の２つ以上を組み合わせることにより作ることができる。一態様において、該キメラの一部分は、本発明のＴ１Ｒポリペプチドの細胞外ドメインに相当するもの又はそれに由来するものである。他の態様において、該キメラの一部分は、ここに示すＴ１Ｒポリペプチドの細胞外ドメインと１つ以上の膜貫通ドメインに相当するもの又はそれらに由来するものであり、そして、１つ又は複数の残りの部分は、もう１つのＧＰＣＲに由来するものとすることができる。キメラの受容体類は当該技術においてよく知られており、また、それらを調製する技法及びそこでの組み込みのためのＧタンパク質共役受容体のドメイン又はフラグメントの選択及び範囲もよく知られている。従って、そのようなキメラの受容体を作るため、当業者のこの知識をすぐに用いることができる。そのようなキメラ受容体を用いれば、例えば、ここに具体的に開示される受容体の１つの味選択性の特性と、もう１つの受容体（例えば、従来のアッセイ系に使用されるよく知られた受容体）のシグナル伝達特性とが組み合わされる。
【０２５４】
上述したように、そのようなキメラ（元のＴ１Ｒ受容体又は元のＴ１Ｒ受容体の組合せもしくは集合体（会合体）に類似するもの）は、甘味又はうま味に正常に作用する分子に結合するかかつ／又はそれによって活性化される。機能的なキメラのＴ１Ｒ受容体又はＴ１Ｒ受容体の組合せは、単独で又は他のＴ１Ｒもしくは他のＧＰＣＲ（それらはそれ自身キメラでもよい）と共同で発現されるとき、味刺激物質（特に甘味刺激物質（Ｔ１Ｒ２／３）又はうま味刺激物質（Ｔ１Ｒ１／３））に結合する又はそれによって活性化される分子である。甘味を引き出す分子には、天然及び合成の甘味料があり、例えば、ショ糖、アスパルテーム、キシリトール、シクラメートなどがある。うま味を引き出す分子には、グルタミン酸塩及びグルタミン酸類似体並びに本来のＴ１Ｒ１及び／又はＴ１Ｒ３に結合する他の化合物（例えば５’−ヌクレオチド類）がある。
例えば、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、経膜ドメイン、細胞質ドメイン、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、又はそれらの任意の組合せのようなドメインは、異種タンパク質に共有結合することができる。例えば、Ｔ１Ｒの細胞外ドメインを、異種ＧＰＣＲ膜貫通ドメインに結合することができ、あるいは、異種ＧＰＣＲ細胞外ドメインを、Ｔ１Ｒの膜貫通ドメインに結合することができる。他の好ましい異種タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質を用いることができる。
【０２５５】
本発明のＴ１Ｒ、フラグメント、キメラ、又は改変体を発現するための宿主細胞も本発
明の範囲内である。クローニングした遺伝子又は核酸（例えば、本発明のＴ１Ｒ、フラグメント、又は改変体をコードするｃＤＮＡ）の高レベルな発現を得るため、当業者は、典型的に、対象の核酸配列を発現ベクターにサブクローニングする（該発現ベクターは、転写を誘導するための強いプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、そして、タンパク質をコードする核酸の場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む）。適当な細菌のプロモーターは、当該技術においてよく知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。しかし、細菌又は真核細胞の発現系を用いることができる。
【０２５６】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するためのよく知られた方法の任意のものを用いることができる。それらにおいて使用されるのは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、及び、クローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は他の外来遺伝材料を宿主細胞に導入するためのその他の良く知られた任意の方法である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．参照）。単に必要なことは、使用する特定の遺伝子工学法が、対象とするＴ１Ｒ、フラグメント、又は改変体を発現できる宿主細胞に少なくとも１つの核酸分子をうまく導入することができるということである。
【０２５７】
発現ベクターを細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を、対象とする受容体、フラグメント、又は改変体の発現に有利な条件下で培養し、次いで、対象とする受容体、フラグメント、又は改変体を標準的な手法を用いて培養物から回収する。そのような手法の具体例は、当該技術においてよく知られている。例えば、ＷＯ００／０６５９３（その内容はこの引用により本開示に整合する態様で本明細書に記載されたものとする）を参照されたい。
【０２５８】
Ｔ１Ｒポリペプチドの検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる遺伝子の発現及びＴ１Ｒ遺伝子の検出に加えて、Ｔ１Ｒ類を検出するため、例えば、味覚受容体細胞及びＴ１Ｒファミリーのメンバーの改変体を同定するため、イムノアッセイも用いることができる。イムノアッセイは、Ｔ１Ｒ類を定性的又は定量的に分析するため、用いることができる。適用可能な技術の包括的な概観は、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）で見ることができる。
【０２５９】
１．Ｔ１Ｒファミリーのメンバーに対する抗体
Ｔ１Ｒファミリーのメンバーと特異的に反応するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当業者に知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（上記）、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８６）、及びＫｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）参照）。そのような技法には、ファージ又は類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体の調製、そして、ウサギ又はマウスを免疫化することによるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製がある（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）参照）。
【０２６０】
多くのＴ１Ｒ含有免疫原を、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーと特異的に反応できる抗体を生産するため、用いることができる。例えば、組換えＴ１Ｒポリペプチド又はその抗原性フラグメントは、ここに記載するように単離することができる。適当な抗原性領域は、例えば、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーを同定するため使用されるコンセンサス配列を含む。組換えタンパク質は、上述したように真核細胞又は原核細胞において発現させることができ、そして、一般に上述したように精製することができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を生産するための好ましい免疫原である。一方、ここに開示する配列から得られ、そして、キャリアータンパク質に結合体化された合成ペプチドを、免疫原として用いることができる。また、天然に存在するタンパク質を、純粋な形態又は不純物を含む形態のいずれかにおいて用いることができる。次いで生成物を、抗体を生産できる動物に注射する。タンパク質を測定するイムノアッセイにその後使用するため、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかを生成させることができる。
【０２６１】
ポリクローナル抗体を生産する方法は、当業者に知られている。例えば、同系交配種のマウス（例えばＢＡＬＢ／Ｃマウス）又はウサギを、標準的なアジュバント（例えばフロイントアジュバント）及び標準的な免疫化プロトコルを用いて、タンパク質で免疫処置する。該免疫原製剤に対する該動物の免疫反応を、採血してＴ１Ｒに対する反応性の力価を測定することによりモニターする。免疫原に対して適当に高い抗体の力価が得られるとき、動物から血液を採集し、抗血清を調製する。必要であれば、タンパク質に反応性の抗体を濃縮するため、抗血清のさらなる分画を行うことができる（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（上記）参照）。
【０２６２】
モノクローナル抗体は、当業者が熟知している種々の技法により得ることができる。簡単にいうと、望ましい抗原で免疫処置した動物からの脾臓細胞を、一般的に骨髄腫細胞との融合により不死化することができる（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９（１９７６）参照）。不死化の他の方法には、エプスタインバールウイルス（ＥＢウイルス）、がん遺伝子、又はレトロウイルスによる形質転換、あるいは、当該技術において周知である他の方法がある。単一種の不死化細胞から生じるコロニーをスクリーニングし、抗原に対して望ましい特異性及び親和性を有する抗体を生産する。また、そのような細胞によって生産されるモノクローナル抗体の収量は、種々の方法（脊椎動物宿主の腹膜腔への注射を含む）により高めることができる。一方、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に概説される一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
モノクローナル抗体及びポリクローナル血清を、収集し、そして、イムノアッセイ（例えば、固体支持体に固定化された免疫原を用いる固相イムノアッセイ）において、免疫原タンパク質に対して力価検定する。典型的に、１０４以上の力価を有するポリクローナル抗血清を、選択し、そして、競合結合イムノアッセイを用いて、非Ｔ１Ｒポリペプチドに対するその交差反応性について試験するか、あるいは、他のＴ１Ｒファミリーのメンバー又は他の生物からの他の関連するタンパク質に対するその交差反応性について試験する。特異的ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約０．１ｍＭのＫｄ、より一般的には少なくとも約１ｐＭのＫｄ、場合によって少なくとも約０．１ｐＭの又はそれより良いＫｄ、さらに場合によって約０．０１ｐＭの又はそれより良いＫｄで結合する。
【０２６３】
一旦Ｔ１Ｒファミリーのメンバーに特異的な抗体が利用可能になれば、個々のＴ１Ｒタンパク質及びタンパク質フラグメントを、種々のイムノアッセイ法によって検出できる。免疫学的手法及びイムノアッセイ法の検討については、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ＆Ｔｅｒｒ  ｅｄｓ．，７ｔｈ  ｅｄ．１９９１）を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイは、いくつかの構成のいずれかで行うことができ、それらはＥｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．１９８０）及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（上記）において詳細に検討されている。
【０２６４】
２．免疫学的結合アッセイ
Ｔ１Ｒタンパク質、フラグメント、及び改変体は、多くのよく知られた免疫学的結合アッセイ（例えば、米国特許第４３６６２４１号、第４３７６１１０号、第４５１７２８８号、及び第４８３７１６８号参照）のいずれかを用いて検出かつ／又は定量することができる。一般的なイムノアッセイの検討について、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ３７（Ａｓａｉ，ｅｄ．１９９３）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ＆Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，７ｔｈ  ｅｄ．１９９１）も参照されたい。免疫学的結合アッセイ（又はイムノアッセイ）は、典型的に、選択したタンパク質又は抗原（この場合、Ｔ１Ｒファミリーのメンバー又はその抗原性部分配列）に特異的に結合する抗体を使用する。抗体（例えば抗Ｔ１Ｒ）は、当業者にとって周知である上述したような多くの手段のいずれかによって生産できる。
【０２６５】
また、イムノアッセイは、抗体と抗原によって形成される複合体に特異的に結合してそれを標識するため、標識試薬をしばしば用いる。標識試薬はそれ自体が、抗体／抗原の複合体を含む部分の１つであってもよい。従って、標識試薬は、標識Ｔ１Ｒポリペプチド又は標識抗Ｔ１Ｒ抗体であり得る。一方、標識試薬は、第三の部分（例えば、抗体／Ｔ１Ｒ複合体に特異的に結合する二次抗体）であってもよい（二次抗体は、典型的に、第一の抗体が由来する種の抗体に特異的である）。免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合できる他のタンパク質、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧもまた、標識試薬として使用できる。これらのタンパク質は、様々な種からの免疫グロブリン定常領域と強い非免疫原性の反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌ  ｅａ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１４０１−１４０６（１９７３）、Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２（１９８５）参照）。標識試薬は検出可能な成分（例えばビオチン）で修飾することができる。該検出可能な成分には、他の分子（例えばストレプトアビジン）が特異的に結合できる。種々の検出可能な成分が当業者にとって周知である。
【０２６６】
アッセイを通して、インキュベーション及び／又は洗浄の工程が、試薬をそれぞれ組み合わせた後、必要になり得る。インキュベーション工程は、約５秒〜数時間、場合によって約５分〜約２４時間の範囲とすることができる。しかし、インキュベーション時間は、アッセイの様式、抗原、溶液の容量、濃度等によって変わってくる。通常、アッセイは、周囲温度（室温）で行われるが、ある温度範囲（例えば１０℃〜４０℃）にわたって行うことができる。
【０２６７】
Ａ．非競合アッセイ法
サンプル中のＴ１Ｒポリペプチドを検出するためのイムノアッセイは、競合的なもの又は非競合的なもののいずれでもよい。非競合イムノアッセイは、抗原の量が直接測定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、抗Ｔ１Ｒ抗体を固体の基材に直接結合させることができ、その上で抗体は固定化される。その固定化された抗体は、次いで試験サンプル中に存在するＴ１Ｒポリペプチドを捕捉する。そしてＴ１Ｒポリペプチドは、固定化され、次に標識試薬（例えば、標識を保持する第二のＴ１Ｒ抗体）に結合される。一方、第二の抗体は、標識がなくともよいが、その後、第二の抗体が由来する種の抗体に特異的な第三の標識された抗体に結合させることができる。第二又は第三の抗体は、典型的に、検出可能な成分（例えばビオチン）で修飾され、該検出可能な成分には、他の分子（例えばストレプトアビジン）が特異的に結合し、検出可能な部位をもたらす。
【０２６８】
Ｂ．競合アッセイ法
競合アッセイにおいて、サンプル中に存在するＴ１Ｒポリペプチドの量は、サンプル中に存在する未知のＴ１Ｒポリペプチドによって抗Ｔ１Ｒ抗体から排除（競合排除）される既知の添加した（外因性の）Ｔ１Ｒポリペプチドの量を測定することにより間接的に測定される。競合アッセイの１つにおいて、既知量のＴ１Ｒポリペプチドをサンプルに添加し、次に該サンプルを、Ｔ１Ｒに特異的に結合する抗体と接触させる。抗体に結合された外因性Ｔ１Ｒポリペプチドの量は、サンプル中に存在するＴ１Ｒポリペプチドの濃度に反比例する。特に好ましい態様において、抗体は固体の基材に固定化される。抗体に結合されたＴ１Ｒポリペプチドの量は、Ｔ１Ｒ／抗体複合体に存在するＴ１Ｒポリペプチドの量を測定するか、又は、残りの複合化されなかったタンパク質の量を測定するかのいずれかによって決定することができる。Ｔ１Ｒポリペプチドの量は、標識されたＴ１Ｒ分子を提供することにより検出することができる。
【０２６９】
ハプテン阻害アッセイは、もう１つの好ましい競合アッセイである。このアッセイでは、既知のＴ１Ｒポリペプチドが固体の基材に固定化される。既知量の抗Ｔ１Ｒ抗体をサンプルに添加し、そして、該サンプルを固定化されたＴ１Ｒに接触させる。既知の固定化されたＴ１Ｒポリペプチドに結合された抗Ｔ１Ｒ抗体の量は、サンプル中に存在するＴ１Ｒポリペプチドの量に反比例する。また、固定化された抗体の量は、抗体の固定化されたフラクション又は溶液中に残存する抗体のフラクションのいずれかを検出することにより、知ることができる。検出は、直接的なものとすることができ（この場合、抗体が標識される）、あるいは、間接的なものとすることができる（この場合、上述したように抗体に特異的に結合する標識成分がその後添加される）。
【０２７０】
Ｃ．交差反応測定
競合的結合型のイムノアッセイは、交差反応測定にも用いることができる。例えば、ここに開示される核酸配列で少なくとも部分的にコードされるタンパク質を、固体支持体に固定化することができる。タンパク質（例えばＴ１Ｒポリペプチド及びホモログ）を、固定化された抗原に対する抗血清の結合と競合するアッセイに添加する。固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合と競合する添加タンパク質の能力を、ここに開示される核酸配列でコードされるＴ１Ｒポリペプチドのそれ自身と競合する能力に対して比較する。標準的計算を用いて、上記タンパク質についての交差反応の割合を算出する。上記の添加タンパク質のそれぞれに対し１０％未満の交差反応性を有する抗血清を選択し、プールする。交差反応性の抗体を、必要に応じて、検討された添加タンパク質（例えば遠い関係にあるホモログ）を用いる免疫吸着法により、プールされた抗血清から取り出す。さらに、Ｔ１Ｒのメンバーを同定するのに使用される保存されたモチーフに相当するアミノ酸配列を含むペプチドを、交差反応測定に用いることができる。
【０２７１】
次に、免疫吸着されたプールされた抗血清を、上述したような競合的結合イムノアッセイに使用し、第二のタンパク質（恐らくＴ１Ｒファミリーメンバーの対立形質改変体又は多型改変体であると考えられる）を免疫原性タンパク質（すなわち、ここに開示される核酸配列によってコードされるＴ１Ｒポリペプチド）と比較する。この比較を行うため、２つのタンパク質をそれぞれ、広範な濃度で検定し、固定化タンパク質に対する抗血清の結合を５０％阻害するのに必要な各タンパク質の量を決定する。結合の５０％を阻害するのに必要な第二のタンパク質の量が、結合を５０％阻害するのに必要なここに開示する核酸配列でコードされるタンパク質の量の１０倍未満であれば、該第二のタンパク質を、Ｔ１Ｒ免疫原に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合するものであるとする。
【０２７２】
また、Ｔ１ＲファミリーのＧＰＣＲ類のみに特異的に結合し、他のファミリーからのＧＰＣＲ類には特異的に結合しない抗体を調製するため、Ｔ１Ｒ保存モチーフに対して生じさせられた抗体を用いることができる。
【０２７３】
Ｔ１Ｒファミリーの特定のメンバーに特異的に結合するポリクローナル抗体を、他のＴ１Ｒファミリーのメンバーを用いて交差反応性抗体を取り去ることにより、調製することができる。種に特異的なポリクローナル抗体を、同様にして調製することができる。例えば、ヒトＴ１Ｒ１に特異的な抗体を、オルソログ配列（例えばラットＴ１Ｒ１又はマウスＴ１Ｒ１）に交差反応する抗体を取り去ることにより、調製することができる。
【０２７４】
Ｄ．他のアッセイ法
サンプル中のＴ１Ｒポリペプチドの存在を検出及び定量するため、ウェスタンブロット（イムノブロット）解析が用いられる。この手法は一般的に、分子量に基づくゲル電気泳動によって試料タンパク質を分離し、分離したタンパク質を適当な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、又は誘導体化ナイロンフィルター）に移し、そして、Ｔ１Ｒポリペプチドに特異的に結合する抗体とともに該試料をインキュベートすることを含む。抗Ｔ１Ｒポリペプチド抗体は、固体支持体上のＴ１Ｒポリペプチドに特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識してもよいし、その代わりに、抗Ｔ１Ｒ抗体に特異的に結合する標識された抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて、その後に検出してもよい。
【０２７５】
他のアッセイ法に、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）がある。これは、特定の分子（例えば抗体）に結合し、そして、封入化された試薬又はマーカーを放出するように設計された、リポソームを用いる。次いで、この放出される化合物は、標準的な方法によって検出される（Ｍｏｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．，５：３４−４１（１９８６）参照）。
【０２７６】
Ｅ．非特異的結合の削減
当業者に明らかなとおり、イムノアッセイにおいて、非特異的結合を最小限にすることはしばしば必要である。特に、アッセイが、固体基材に固定化された抗原又は抗体を用いる場合、基材への非特異的結合量を最小にすることが望ましい。そのような非特異的結合を減らす手段は、当業者にとって周知である。典型的に、この手法は、タンパク質組成物で基材を被覆することを伴う。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、及びゼラチンのようなタンパク質組成物が広く用いられており、粉乳が最も好ましい。
【０２７７】
Ｆ．標識（ラベル）
アッセイに使用される特定の標識又は検出可能な基は、それが、アッセイに使用される抗体の特異的結合を顕著に妨害しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的又は化学的特性を有する任意の材料とすることができる。そのような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分に開発されており、一般に、そのような方法に有用な多くの任意の標識を本発明に適用できる。かくして、標識は、分光手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、又は化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓレッド、ローダミン等）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡで通常使用される他の酵素）、及び比色標識（例えば、コロイド状金又は着色ガラス又はプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど））がある。
【０２７８】
標識は、当該技術分野において周知である方法により、アッセイの必要な要素に、直接又は間接的に結合することができる。上記のとおり、多種多様の標識を用いることができ、必要な感度、化合物への結合のし易さ、安定性の要件、利用可能な装置、及び廃棄のための備えに応じて標識は選択される。
【０２７９】
非放射性標識が、しばしば間接的手段によって結合される。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）が、該分子に共有結合される。そして、該リガンドは、他の分子（例えばストレプトアビジン）に結合する。他の分子は、それ自体検出可能であるか、あるいは、シグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、又は化学発光化合物）に共有結合される。リガンド及びそれらのターゲットは、Ｔ１Ｒポリペプチドを認識する抗体、又は抗Ｔ１Ｒを認識する二次抗体との任意の適当な組合せで、用いることができる。
【０２８０】
該分子はまた、例えば、酵素又は蛍光団との結合により、シグナル生成化合物に直接結合させることができる。標識として好ましい酵素は、主として、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、あるいは、オキシダーゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどがある。化学発光化合物には、ルシフェリン、及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、例えばルミノールがある。利用できる種々の標識又はシグナル生成系の検討については、米国特許出願第４３９１９０４号を参照されたい。
【０２８１】
標識を検出する手段は、当業者にとって周知である。そして、例えば、標識が放射性標識である場合、検出手段には、オートラジオグラフィーにおけるような写真フィルム又はシンチレーション計数器がある。標識が蛍光標識である場合、それは、蛍光色素を適当な波長の光で励起し、得られる蛍光を検出することにより検出できる。蛍光は、肉眼で検出してもよいし、写真フィルムにより、電子検出器（例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）や電子倍増管など）を用いることにより、検出してもよい。同様に、酵素標識は、該酵素に適当な基質を付与し、得られる反応生成物を検出することにより、検出できる。そして、単純な比色標識は、標識に伴う色を単に観測することにより、検出できる。かくして、種々のディップスティックアッセイにおいて、結合体化された金はしばしばピンクに見え、一方、種々の結合体化されたビーズは、そのビーズの色に見える。
【０２８２】
標識成分を用いる必要のないアッセイ法もある。例えば、目的とする抗体の存在を検出するため、凝集アッセイを用いることができる。この場合、抗原で被覆された粒子は、目的とする抗体を含むサンプルによって凝集させられる。この方法では、どの成分も標識する必要がなく、目的とする抗体の存在は、単純な目視検査により検出される。
【０２８３】
調節剤の検出
試験化合物が本発明のＴ１Ｒ受容体に特異的に結合するかどうかインビトロ及びインビボの両方で判定するための組成物及び方法を以下に記載する。本発明のＴ１Ｒポリペプチドに結合するリガンドの効果を評価するため、細胞の生理機能の多くの様相をモニターすることができる。これらのアッセイは、化学的感覚受容体を発現する無傷細胞について行うことができ、透過性細胞について行うことができ、あるいは、標準的な方法により作られた膜フラクションについて行うことができ、また、インビトロのデノボ合成タンパク質について行うことができる。
【０２８４】
インビボにおいて、味覚受容体は、味物質に結合し、化学的刺激の電気信号への変換を開始する。そして、活性化されたＧタンパク質又は阻害されたＧタンパク質は、目的とする酵素、チャネル、及び他のエフェクタータンパク質の特性を変える。いくつかの例は、視覚系での変換によるｃＧＭＰホスホジエステラーゼの活性化、刺激Ｇタンパク質によるアデニル酸シクラーゼの活性化、Ｇｑ及び他の同族Ｇタンパク質によるホスホリパーゼの活性化、並びに、Ｇｉ及び他のＧタンパク質による種々のチャネルの調節である。下流での成り行きは、例えば、ホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロール及びＩＰ３の生成、そして、ＩＰ３によるカルシウム動員について、検査することができる。
アッセイのＴ１Ｒタンパク質又はポリペプチドは、実施例１に示すもの又はそれらのフラグメントもしくは保存的に改変された改変体から選ばれるＴ１Ｒポリペプチド配列を有するポリペプチドより選択することが好ましい。必要に応じて、該フラグメント及び改変体は、抗Ｔ１Ｒ抗体に結合する抗原性のフラグメント又は改変体とすることができる。必要に応じて、該フラグメント及び改変体は、甘味料又はうま味物質に結合又はそれによって活性化することができる。
【０２８５】
一方、アッセイのＴ１Ｒタンパク質又はポリペプチドは、真核宿主細胞から得ることができ、そして、実施例１に示すＴ１Ｒポリペプチド又はそのフラグメントもしくは保存的に改変された改変体に対してアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。一般的に、そのアミノ酸配列同一性は、少なくとも３５〜５０％、あるいは、場合によって７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％となる。必要に応じて、アッセイのＴ１Ｒタンパク質又はポリペプチドは、Ｔ１Ｒタンパク質のドメイン、例えば、細胞外ドメイン、膜貫通領域、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン等を含み得る。さらに、上述したとおり、Ｔ１Ｒタンパク質又はそのドメインは、ここに記載されるアッセイに用いるキメラのタンパク質を作るため、異種タンパク質と共有結合することができる。
【０２８６】
Ｔ１Ｒ受容体活性の調節剤は、組換え又は天然に存在するもののいずれかの上記Ｔ１Ｒタンパク質又はポリペプチドを用いて、試験される。組換え又は天然に存在するもののいずれかで、Ｔ１Ｒタンパク質又はポリペプチドは、単離し、細胞において共発現し、細胞から得られる膜において共発現し、組織又は動物において共発現することができる。例えば、舌切片、舌からの分離細胞、形質転換細胞、又は膜を用いることができる。調節は、ここに記載するインビトロ又はインビボのアッセイの１つを用いて試験することができる。
【０２８７】
例えば、下記の実験例に示すとおり、所定の５’ヌクレオチド（例えば５’ＩＭＰ又は５’ＧＭＰ）が、うま味受容体を活性化するＬ−グルタミン酸塩の活性を高めるか、うま味刺激物質（例えばＬ−グルタミン酸塩及びＬ−アスパラギン酸塩）によるうま味受容体の活性化を阻害することが見出された。
【０２８８】
１．インンビトロ結合アッセイ
味の伝達は、本発明のＴ１Ｒポリペプチドを用い、可溶性又は固体の状態の反応により、インビトロで調べることもできる。特定の態様において、Ｔ１Ｒリガンド結合ドメインを、リガンド結合用アッセイに対する可溶性又は固体の状態の反応において、インビトロで用いることができる。
【０２８９】
例えば、Ｔ１ＲのＮ末端ドメインは、リガンド結合に係わっていると予測される。より特定的に、Ｔ１Ｒ類は、大きな約６００アミノ酸の細胞外Ｎ末端セグメントを特徴とするＧＰＣＲサブファミリーに属している。これらのＮ末端セグメントは、リガンド結合ドメインを形成すると考えられ、従って、Ｔ１Ｒのアゴニスト及びアンタゴニストを同定する生化学的アッセイに有用である。リガンド結合ドメインを、細胞外ドメインのさらなる部分、例えば、膜貫通ドメインの細胞外ループによって形成することも可能である。
【０２９０】
インビトロ結合アッセイは、Ｔ１Ｒ類に関連する他のＧＰＣＲ類、例えば代謝性生物産生性グルタミン酸受容体とともに用いられてきた（例えば、Ｈａｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１０００８−１００１３（１９９９）参照）。これらのアッセイは、放射性標識リガンド又は蛍光標識リガンドの置換、固有の蛍光の変化又はタンパク分解感受性の変化などの測定を含むことができる。
【０２９１】
本発明のＴ１Ｒポリペプチドのヘテロ多量体複合体に結合するリガンドは、溶液において、二重層膜（必要に応じて固相に結合された）において、脂質単層において、又は小胞において試験することができる。分子の結合は、例えば、分光特性（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）の変化、流体力学的特性（例えば形態）の変化、クロマトグラフィー特性の変化、又は溶解特性の変化を用いて、検定できる。
【０２９２】
本発明の他の態様において、ＧＴＰγ３５Ｓアッセイを用いてもよい。上述したように、ＧＰＣＲの活性化の際、Ｇタンパク質複合体のＧαサブユニットは刺激され、結合ＧＤＰをＧＴＰと交換する。Ｇタンパク質交換活性のリガンドにより媒介される刺激は、可能性のあるリガンド（リガンド候補）の存在下、添加した放射性標識ＧＴＰγ３５ＳのＧタンパク質への結合を測定する生化学的アッセイにおいて、測定することができる。典型的に、対象とする化学感覚受容体を含む膜をＧタンパク質の複合体と混合する。阻害剤及び／又は賦活剤の候補とＧＴＰγ３５Ｓとをアッセイに添加し、ＧＴＰγ３５ＳのＧタンパク質への結合を測定する。結合は、液体シンチレーション計数法により、あるいは、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ（ＳＰＡ）を含む当該技術において知られた任意の他の手段により、測定することができる。他のアッセイ法において、蛍光標識ＧＴＰγＳを用いることができる。
【０２９３】
２．蛍光偏光アッセイ
他の態様において、蛍光偏光（ＦＰ）に基づくアッセイを、リガンド結合を検出かつモニターするため、用いてもよい。蛍光偏光は、平衡結合、核酸のハイブリダイゼーション及び酵素活性を測定するための用途の広い実験手法である。蛍光偏光アッセイは、分離工程（例えば、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー、沈殿、又は電気泳動）を必要としない点で、均質である。これらのアッセイは、リアルタイムで直接溶液において行われ、固定化相を必要としない。偏光値は、繰り返し測定でき、そして、試薬の添加後にも測定できる。というのも、偏光の測定は、迅速で、試料を破壊しないからである。一般的に、この手法は、低ピコモル濃度〜マイクロモル濃度レベルの蛍光団（蛍光体）の偏光値を測定するため、用いることができる。この章は、本発明のＴ１Ｒポリペプチドに対するリガンドの結合を測定するため、どのようにして蛍光偏光を簡便かつ定量的な方法で用いることができるか説明する。
【０２９４】
蛍光標識分子が平面偏光で励起されるとき、それは、ある偏光角度を有する光を発する（該偏光角度は、その分子旋光度（分子回転）に反比例する）。大きな蛍光標識分子は、励起状態の間、相対的に静止状態を維持し（フルオレセインの場合４ナノ秒）、そして、光の偏光は、励起と発光の間で、相対的に一定である。小さな蛍光標識分子は、励起状態の間、速く回転し、その偏光は、励起と発光の間で顕著に変化する。従って、小分子は低い偏光値を有し、大きい分子は高い偏光値を有する。例えば、一本鎖の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相対的に低い偏光値を有するが、相補鎖にハイブリダイズされると、より高い偏光値を有するようになる。本発明の化学感覚受容体を活性化又は阻害し得る味物質の結合を検出及びモニターするためＦＰを用いる場合、蛍光標識された味物質又は自己蛍光性の味物質を用いることができる。
【０２９５】
蛍光偏光（Ｐ）は次のように定義される。
【０２９６】
Ｐ＝（ＩｎｔＩＩ−Ｉｎｔ⊥）／（ＩｎｔＩＩ＋Ｉｎｔ⊥）
ここで、ＩｎｔＩＩは、励起光面に平行な発光の強度であり、Ｉｎｔ⊥は励起光面に垂直な発光の強度である。光強度の比であるＰは無次元数である。例えば、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）及びＢｅａｃｏｎ２０００（商標）システムを、これらのアッセイとともに用いることができる。そのようなシステムは、典型的に、ミリ偏光単位（１偏光単位＝１０００ｍＰ単位）で偏光を表す。
【０２９７】
分子旋光度（分子回転）とサイズとの関係は、Ｐｅｒｒｉｎ（ペラン）方程式により表され、読者は、この方程式を詳細に説明するＪｏｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．（１９９１）のＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２３６−２４０を参照されたい。簡略的に、Ｐｅｒｒｉｎ方程式は、偏光が回転緩和時間（分子が約６８．５°の角度、回転するのに要する時間）に正比例することを示している。回転緩和時間は、粘度（η）、絶対温度（Ｔ）、分子体積（Ｖ）、及び気体定数（Ｒ）の関数として次の式で表される。
【０２９８】
回転緩和時間＝３ηＶ／ＲＴ
回転緩和時間は、小分子（例えばフルオレセイン）について小さく（約１ナノ秒）、大きな分子（例えば免疫グロブリン）について大きい（約１００ナノ秒）。粘度及び温度が一定に維持される場合、回転緩和時間及び従って偏光は、分子体積に直接関係する。分子体積の変化は、蛍光標識された分子の他の分子との相互作用、解離、重合、分解、ハイブリダイゼーション、又は構造変化に起因し得る。例えば、蛍光偏光は、プロテアーゼ、ＤＮアーゼ、及びＲＮアーゼによる大きなフルオレセイン標識ポリマーの酵素的開裂を測定するのに、使用されてきた。またそれは、タンパク質／タンパク質相互作用、抗体／抗原結合、及びタンパク質／ＤＮＡ結合について平衡結合を測定するのに使用されてきた。
【０２９９】
Ａ．固体状態の及び可溶性の高スループットアッセイ
さらに他の態様において、本発明は、ヘテロオリゴマーのＴ１Ｒポリペプチド複合体、又はＴ１Ｒポリペプチドを共発現する細胞又は組織を用いる可溶性アッセイを提供する。好ましくは、該細胞は、機能的なＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３（うま味）味覚受容体又は機能的なＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３（甘味）味覚受容体を安定に共発現する細胞株を含むものとなる。他の態様において、本発明は、高スループット型の固相系インビトロアッセイを提供し、そこにおいて、Ｔ１Ｒポリペプチド又はＴ１Ｒポリペプチドを発現する細胞もしくは組織は、固相の基材に付着され、味刺激化合物はＴ１Ｒ受容体に接触させられ、そして、結合が、適当なタグを用いて又はＴ１Ｒ受容体に対して生じさせられた抗体を用いて、検出される。
【０３００】
本発明の高スループットアッセイでは、１日に、最高数千の異なる調節剤又はリガンドをスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選ばれた調節剤候補に対し別々のアッセイを行うことができ、あるいは、濃度又はインキュベーション時間の効果を見る必要がある場合、各５〜１０のウェルで１つの調節剤を試験することができる。従って、１つの標準的なマイクロタイタープレートは、約１００（例えば９６）の調節剤を検定できる。１５３６ウェルプレートを用いる場合、従って、１つのプレートで約１０００〜約１５００の異なる化合物を簡単に検定することができる。また、プレートの各ウェルで、複数の化合物を検定することも可能である。１日あたり数個の異なるプレートを検定することが可能である。本発明の集積されたシステムを用いて、最高約６０００〜２００００の異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが可能である。さらに最近、試薬操作に対する微小流体法が開発されている。
【０３０１】
対象とする分子は、固体状態の要素に、直接的又は間接的に、共有結合又は非共有結合を介して（例えば、タグを介して）、結合させることができる。タグは、種々の成分の任意のものとすることができる。一般的に、タグに結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、そして、対象とするタグ化された分子（例えば、対象とする味伝達分子）を、タグとタグ結合剤の相互作用により、固体支持体に付着させる。
【０３０２】
文献に詳細に記載される既知の分子相互作用に基づいて、多くのタグ及びタグ結合剤を用いることができる。例えば、タグが、天然の結合剤、例えば、ビオチン、プロテインＡ、又はプロテインＧを有する場合、それを、適当なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（ニュートラビジン）、免疫グロブリンのＦｃ領域など）と組合せて用いることができる。ビオチンのような天然の結合剤を有する分子に対する抗体も、広く利用可能であり、適当なタグ結合剤である（ＳＩＧＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９８  カタログＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ参照）。
【０３０３】
同様に、タグ／タグ結合剤の対を形成するため、任意のハプテン化合物又は抗原性の化合物を、適当な抗体と組合せて用いることができる。何千もの特異的抗体が市販されており、多数のさらなる抗体が文献に記載されている。例えば、一般的な構成の１つにおいて、タグが第一の抗体であり、タグ結合剤が、第一の抗体を認識する第二の抗体である。抗体−抗原の相互作用のほかに、受容体−リガンドの相互作用も、タグとタグ結合剤の対として適当である。それは、例えば、細胞膜受容体のアンタゴニストとアゴニストである（例えば、細胞受容体−リガンド相互作用、例えば、トランスフェリン、ｃ−キット、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体及び抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなど、Ｐｉｇｏｔｔ＆Ｐｏｗｅｒ，Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｉ（１９９３）参照）。同様に、毒素及び毒液、ウイルスエピトープ類、ホルモン類（例えば、アヘン剤、ステロイド類など）、細胞内受容体（例えば、種々の小リガンド（ステロイド類、甲状腺ホルモン、レチノイド及びビタミンＤを含む）の効果、ペプチドの効果を媒介するもの）、薬剤、レクチン、糖類、核酸類（線状及び環状のポリマー構造の両方）、オリゴ糖類、タンパク質類、リン脂質類、並びに抗体もすべて、種々の細胞受容体と相互作用することができる。
【０３０４】
合成ポリマー、例えばポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、及びポリアセテートも、適当なタグ又はタグ結合剤を形成できる。多くの他のタグ／タグ結合剤の対もまた、本開示の検討において当業者に明らかなように、ここに記載するアッセイ系において有用である。
【０３０５】
一般的なリンカー、例えばペプチド、ポリエーテルなどもまた、標識として機能することができ、約５〜２００アミノ酸のポリｇｌｙ配列のようなポリペプチド配列を含むことができる。そのようなフレキシブルなリンカーは当業者に知られている。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手できる。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合、又はヘテロ官能結合を有する。
【０３０６】
タグ結合剤は、現在可能な種々の方法のいずれかを用いて、固体の基材に固定することができる。固体の基材は、一般的に誘導体化又は官能化される。誘導体化又は官能化は、タグ結合剤の部分に反応性である化学基を表面に固定する化学試薬に、基材の全体又は一部をさらすことにより、行われる。例えば、より長い鎖の部分への結合に適する基には、アミン類、ヒドロキシル基、チオール基、及びカルボキシル基がある。アミノアルキルシラン類及びヒドロキシアルキルシラン類も、種々の表面（例えばガラスの表面）を官能化するのに使用できる。そのような固相生体高分子アレイの構成は、文献に詳細に記載されている。例えば以下を参照されたい。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）（例えばペプチドの固相合成を記載）、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）（ピン上での固相成分の合成を記載）、Ｆｒａｎｋ＆Ｄｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４４：６０３１６０４０（１９８８）（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載）、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）、Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（４）：７１８−７１９（１９９３）、及びＫｏｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（７）：７５３７５９（１９９６）（すべて、固体の基材に固定された生体高分子のアレイを記載）。基材にタグ結合剤を固定するための非化学的手法には、他の一般的な方法、例えば、加熱、ＵＶ照射による架橋などがある。
【０３０７】
３．細胞系アッセイ
処理の好ましい態様において、分泌経路を介するその成熟及びターゲッティングを促進する異種シャペロン配列とともに又は好ましくはそれなしで、変更されていない形態において、あるいは、キメラの、改変体のもしくはトランケートされた受容体として、Ｔ１Ｒのタンパク質又はポリペプチドの組合せを、真核細胞において一過的に又は安定に共発現させる。そのようなＴ１Ｒポリペプチドは、任意の真核細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞）において発現できる。細胞は、機能的なＧタンパク質（例えばＧα１５）もしくは先に特定したキメラのＧタンパク質、又は他のＧタンパク質（キメラの受容体を、細胞内シグナル伝達経路に又はホスホリパーゼＣのようなシグナル伝達タンパク質に、結合させることができるもの）を含むことが好ましい。また、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３を安定に共発現する細胞を生産することが好ましい。というのも、そのような細胞は、味刺激物質に対して、より高い応答性（実験例に示されるとおり）を示すことが見出されたからである（同じＴ１Ｒの組合せを一過的に発現する細胞との比較において）。そのような細胞におけるＴ１Ｒ受容体の活性化は、任意の標準的な方法により検出することができ、例えば、細胞でのＦｌｕｏ−４依存性蛍光を検出して細胞内カルシウムの変化を調べることにより検出することができる。そのようなアッセイは、本願に示す実験による知見の基礎となっている。
【０３０８】
活性化されたＧＰＣＲ受容体は、しばしば、該受容体のＣ末端尾部（及び可能であればさらに他の部位）をリン酸化するキナーゼの基質となる。従って、賦活剤は、放射性標識されたＡＴＰから受容体への３２Ｐの移動を促進することになり、それは、シンチレーション計数器で検定することができる。Ｃ末端尾部のリン酸化によって、アレスチン様タンパク質の結合が促進されることとなり、そして、Ｇタンパク質の結合が妨害されることとなる。ＧＰＣＲシグナル伝達及びシグナル伝達を検定する方法の概観について、例えば以下を参照されたい。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｓ．２３７  ａｎｄ  ２３８（１９９４）  ａｎｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ９６（１９８３）、Ｂｏｕｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１０：３４９：１１７−２７（１９９１）、Ｂｏｕｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：１２５−３２（１９９０）、Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：６５３−９２（１９９８）。
【０３０９】
Ｔ１Ｒ調節は、Ｔ１Ｒ調節剤の候補で処理されたＴ１Ｒポリペプチドの応答と、未処理のコントロールサンプルの応答又は既知の「正」のコントロールを含むサンプルの応答とを比較することにより、検定することができる。そのようなＴ１Ｒ調節剤の候補には、Ｔ１Ｒポリペプチドの活性を阻害又は活性化する分子が含まれ得る。一態様において、コントロールサンプル（賦活剤又は阻害剤で処理されていない）を、相対的Ｔ１Ｒ活性値が１００のものであると規定する。Ｔ１Ｒポリペプチドの阻害が成立する場合、コントロールに対し、そのＴ１Ｒ活性値は、約９０％、場合によって５０％、場合によって２５〜０％である。Ｔ１Ｒポリペプチドの活性化が成立する場合、コントロールに対し、そのＴ１Ｒ活性値は、１１０％、場合によって１５０％、２００〜５００％、又は１０００〜２０００％である。
【０３１０】
イオン流出の変化を、Ｔ１Ｒポリペプチドを発現する細胞又は膜のイオン分極（すなわち電気ポテンシャル）の変化を測定することにより、評価してもよい。細胞分極の変化を測定する１つの手段は、電圧クランプ及びパッチクランプの手法による電流の変化を測定する（それにより分極の変化を測定する）ことによるものである（例えば、「細胞付着」モード、「裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）」モード、及び「全細胞」モード参照。例えば、Ａｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．，３３６：１５７５−１５９５（１９９７）参照）。全細胞電流は、標準法を用いて都合よく測定される。他の知られたアッセイには、放射性同位体標識イオン流出アッセイ及び電圧感受性の色素を用いる蛍光アッセイがある（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．，８８：６７−７５（１９８８）、Ｇｏｎｚａｌｅｓ＆Ｔｓｉｅｎ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：２６９２７７（１９９７）、Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２５：１８５−１９３（１９９１）、Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３７：５９−７０（１９９４）参照）。
【０３１１】
ポリペプチドの機能に対する試験化合物の効果は、上述したパラメーターの任意のものを調べることにより測定できる。ＧＰＣＲ活性に影響する任意の適当な生理学的変化を用いて、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の作用を評価することができる。無傷の細胞又は動物を用いて機能的な結果を判定する場合、さらに種々の効果（作用）（例えば、伝達物質の放出、ホルモンの放出、既知及び未同定の遺伝マーカーの両方に対する転写の変化（例えばノーザンブロット）、細胞代謝の変化（例えば細胞増殖又はｐＨ変化）、及び細胞内二次伝達物質（例えばＣａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、又はｃＡＭＰ）の変化）を測定することができる。
【０３１２】
ＧＰＣＲ類についての好ましいアッセイは、受容体の活性を知らせるためのイオン感受性色素又は電圧感受性色素を付与した細胞を含む。そのような受容体の活性を測定するためのアッセイは、試験化合物の活性を評価するため、コントロールとして、他のＧタンパク質共役受容体に対する既知のアゴニスト及びアンタゴニストをさらに用いることができる。調節化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイにおいて、細胞質中イオンレベルの変化又は膜電圧の変化を、イオン感受性インジケーター又は膜電圧蛍光インジケーターをそれぞれ用いてモニターする。使用できるイオン感受性インジケーター及び電圧プローブには、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １９９７カタログに示されるものがある。Ｇタンパク質共役受容体については、Ｇα１５及びＧα１６のような多目的Ｇタンパク質を、好ましいアッセイにおいて用いることができる（Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１００４９−１００５３（１９９１））。
【０３１３】
受容体の活性化は、その後の細胞内の事象（例えば二次伝達物質の増加）を開始させる。いくつかのＧタンパク質共役受容体の活性化は、ホスホリパーゼＣが媒介するホスファチジルイノシトールの加水分解を介するイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ＆Ｉｒｖｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３１５−２１（１９８４））。そして、ＩＰ３は、細胞内カルシウムイオン貯蔵物の放出を刺激する。従って、細胞質のカルシウムイオンレベルの変化、又は、二次伝達物質（例えばＩＰ３）レベルの変化を用いて、Ｇタンパク質共役受容体の機能を評価することができる。そのようなＧタンパク質共役受容体を発現する細胞は、細胞内貯蔵物からのカルシウムの放出、及び、原形質膜イオンチャネルを介する細胞外カルシウムの流入の両方による寄与の結果、細胞質カルシウムレベルの増加を示し得る。
【０３１４】
好ましい態様において、Ｔ１Ｒポリペプチド活性は、ホスホリパーゼＣシグナル伝達経路（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）参照）に受容体を関係付ける多目的Ｇタンパク質を有する異種細胞において、Ｔ１Ｒ遺伝子を安定に又は一過的に（好ましくは安定に）共発現させることにより、測定される。好ましい態様において、細胞株はＨＥＫ−２９３（これは、通常Ｔ１Ｒ遺伝子を発現しない）であり、多目的Ｇタンパク質はＧα１５（Ｏｆｆｅｒｍａ
ｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ（上記））である。味伝達の調節は、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を測定することにより、検定される。細胞内Ｃａ２＋レベルは、Ｔ１Ｒポリペプチドに結合する分子の投与によるＴ１Ｒシグナル伝達経路の調節に応答して、変化する。Ｃａ２＋レベルの変化は、必要に応じて、蛍光Ｃａ２＋指示色素（指示染料）及び蛍光イメージングを用いて測定される。
【０３１５】
他の態様において、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の加水分解を、米国特許第５４３６１２８号（この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする）に従って分析することができる。簡単にいえば、このアッセイは、３Ｈ−ミオイノシトールで４８時間以上、細胞を標識することを伴う。標識された細胞は、試験化合物で１時間処理される。処理された細胞は、溶解され、そして、クロロホルム−メタノール−水で抽出される。その後、イノシトールリン酸を、イオン交換クロマトグラフィーで分離し、そして、シンチレーション計数法で定量する。コントロール緩衝液存在下でのｃｐｍに対するアゴニスト存在下のｃｐｍの比を算出することにより、刺激倍数を求める。同様に、コントロール緩衝液（アゴニストを含んでも含まなくともよい）存在下でのｃｐｍに対するアンタゴニスト存在下のｃｐｍの比を算出することにより、阻害倍数を求める。
【０３１６】
他の受容体アッセイは、細胞内の環状ヌクレオチド（例えばｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ）のレベルの測定を含むことができる。受容体の活性化が環状ヌクレオチドレベルの減少をもたらす場合、アッセイにおいて、受容体を活性化する化合物を細胞に添加する前に、細胞内環状ヌクレオチドのレベルを増加させる因子（例えばホルスコリン）に細胞をさらすことが望ましいものであり得る。一態様において、細胞内ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの変化を、イムノアッセイを用いて測定することができる。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）に記載される方法を、ｃＡＭＰのレベルを測定するのに用いることができる。さらに、Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：１５９−１６４（１９９４）に記載される方法を、ｃＧＭＰのレベルを測定するため用いることができる。さらに、ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰの測定用アッセイキットが米国特許出願第４１１５５３８号（この引用によりその内容が本明細書に記載されたものとする）に記載されている。
【０３１７】
他の態様において、シグナル伝達に対する試験化合物の効果（作用）を評価するため、転写レベルを測定することができる。対象となるＴ１Ｒポリペプチドを含む宿主細胞を、何らかの相互作用をもたらすのに十分な時間、試験化合物と接触させ、その後、遺伝子発現のレベルを測定する。そのような相互作用をもたらすための時間は、実験によって決めることができ、例えば、時間の経過に従って転写のレベルを時間の関数として測定することにより、決めることができる。転写の量は、当業者に知られた任意の適当な方法を用いて測定することができる。例えば、対象とするタンパク質のｍＲＮＡ発現を、ノーザンブロットを用いて検出することができ、あるいは、それらのポリペプチド産物を、イムノアッセイを用いて特定することができる。一方、レポーター遺伝子を用いる転写系アッセイを、米国特許第５４３６１２８号（この引用によりその内容は本明細書に記載されたものとする）に記載されるように用いてもよい。レポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、及びアルカリホスファターゼとすることができる。さらに、対象とするタンパク質を、第二のレポーター（例えば緑色蛍光タンパク質）への結合を介する間接的レポーターとして用いることができる（例えば、Ｍｉｓｔｉｌｉ＆Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：９６１−９６４（１９９７）参照）。
【０３１８】
次いで、転写量は、試験化合物がない場合の同じ細胞における転写量と比較されるか、あるいは、対象とするＴ１Ｒポリペプチド（類）を欠く実質的に同じ細胞での転写量と比較することができる。実質的に同じ細胞は、同じ細胞から組換え細胞を調製したがそれを異種ＤＮＡの導入によって修飾しなかったものから、得ることができる。転写量のなんらかの差異は、試験化合物がなんらかの態様で対象とするＴ１Ｒポリペプチドの活性を変えたことを意味する。
【０３１９】
４．化学感覚受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック動物
本発明のＴ１Ｒ味覚受容体配列の組合せを発現するヒト以外の動物も、受容体アッセイに用いることができる。哺乳動物の味覚膜貫通受容体複合体にインビボで試験化合物が特異的に結合するかどうかを判定するため、そのような発現を用いることができる。そのような判定は、化学感覚受容体又はそのリガンド結合領域をコードする核酸で安定に又は一過的にトランスフェクトされたヒト以外の動物を試験化合物と接触させ、そして、受容体ポリペプチド複合体への特異的な結合により該動物が試験化合物に反応するかどうか判定することにより、行われる。
【０３２０】
本発明のベクターでトランスフェクトされた又は感染させられた動物は、特定の又は一連の受容体に結合できる味刺激物質を同定して特徴づけるためのアッセイに特に有用である。ヒトの味覚受容体配列を発現するそのようなベクター感染動物は、味刺激物質及びそれらの効果（例えば、細胞生理に対する効果（例えば味覚ニューロンに対する効果）、ＣＮＳに対する効果、又は行動に対する効果）のインビボスクリーニングに用いることができる。一方、Ｔ１Ｒ又はその組合せを発現する安定な細胞株は、核酸移転ドナーとして、特定のＴ１Ｒ又は組合せを安定に発現するトランスジェニッククローン動物の生産に、用いることができる。所望の異種ＤＮＡを発現するクローン動物の生産に核酸移転を用いる方法は、いくつかの発行された米国特許（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓに付与された米国特許（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．にライセンス）及びＲｏｓｌｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに付与された米国特許（Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．にライセンス））の主題である。
【０３２１】
核酸及びベクターを個々に又はライブラリーとして感染させ／発現させる手段は、当該技術において周知である。個々の細胞、器官、又は動物全体の種々のパラメーターは、種々の手段によって測定できる。本発明のＴ１Ｒ配列を、例えば、感染因子（例えばアデノウイルス発現ベクター）による送達（デリバリー）によって動物の味覚組織に共発現させることができる。
【０３２２】
内因性味覚受容体遺伝子を機能的なままにし、そして、野生型の（ネイティブの）活性を存在させたままとすることができる。一方、全ての味覚受容体活性を、導入した外因性のハイブリッド受容体によるものとしたい場合、ノックアウト系を用いることが好ましい。ヒト以外のトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスの構成法、及び形質転換細胞を生成させるための組換えコンストラクト（構築物）の選別及び調製は、当該技術において周知である。
【０３２３】
「ノックアウト」の細胞及び動物の構成は、抑制すべき遺伝子のＤＮＡ配列のある部分をさえぎるよう働く新しいＤＮＡ配列をゲノムに導入することにより、哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現レベルを減少又は完全に消失させることができるという前提に基づく。また、「遺伝子トラップ（ｔｒａｐ）挿入」を、宿主遺伝子を破壊するため用いることができ、さらに、マウスの胚幹（ＥＳ）細胞をノックアウトトランスジェニック動物の生産に利用できる（例えば、Ｈｏｌｚｓｃｈｕ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ６：９７−１０６（１９９７）参照）。外因性のものの挿入は、典型的に、相補的核酸配列同士の相同的組換えによるものである。外因性配列は、変更すべき標的遺伝子のある部分であり、例えば、エキソン配列、イントロン配列、もしくは転写制御配列、又は、標的遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすことができる任意のゲノム配列、又はそれらの組合せである。多能性胚幹細胞における相同的組換えを介した遺伝子ターゲッティングは、対象とするゲノム配列の精密な変更修飾を可能にする。任意の手法を、ノックアウト動物を調製、スクリーニング、繁殖するため、用いることができる。例えば以下を参照されたい。Ｂｉｊｖｏｅｔ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：５３−６２（１９９８）、Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２０８−２１６（１９９７）、Ｔｏｊｏ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：１６１−１６５（１９９５）、Ｍｕｄｇｅｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：１６７−１８４（１９９５）、Ｌｏｎｇｏ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６：３２１−３２８（１９９７）、米国特許第５６１６４９１号、第５４６４７６４号、第５６３１１５３号、第５４８７９９２号、第５６２７０５９号、第５２７２０７１号、ＷＯ９１／０９９５５、ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９６／２９４１１、ＷＯ９５／３１５６０、ＷＯ９１／１２６５０。
【０３２４】
また、本発明の核酸は、「ノックアウト」のヒト細胞及びその子孫を生産するための試薬として用いることができる。同様に、本発明の核酸は、マウスに「ノックイン」をもたらす試薬として用いることもできる。ヒト又はラットのＴ１Ｒ遺伝子配列は、マウスのゲノムにおいてオルソログＴ１Ｒにとって代わることができる。このようにして、ヒト又はラットのＴ１Ｒを発現するマウスが作り出される。そして、このマウスは、ヒト又はラットのＴ１Ｒ類の機能を解析するため、そして、そのようなＴ１Ｒ類に対するリガンドを同定するため、用いることができる。
【０３２５】
ａ．調節剤
Ｔ１Ｒファミリーのメンバーの調節剤として試験される化合物は、任意の小さな化合物又は生物学的実体、例えば、タンパク質、核酸、又は脂質とすることができる。それらの例には、５’ＩＭＰ及び５’ＧＭＰがある。基本的に任意の化合物を、本発明のアッセイにおいて、調節剤又はリガンドの候補として用いることができるが、水溶液に溶解性の化合物がもっともよく試験される。アッセイ工程を自動化し、任意の便利な所より化合物を供給することにより、アッセイを、大きな化学物質ライブラリーをスクリーニングするよう、設計することができる。複数のそのようなアッセイは、典型的に平行して行われる（例えば、ロボットによるアッセイにおいて、マイクロタイタープレート上でのマイクロタイターの様式で行われる）。明らかなとおり、化学物質ライブラリーは、多くの化学反応の１つによって合成することができる（例えば、Ｓｅｎｏｍｙｘ所有の化学法）。さらに、多数の化合物販売業者が存在する。例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などがある。
【０３２６】
好ましい一態様において、高スループットスクリーニング法は、多数の可能性のある味作用物質（調節剤又はリガンド化合物の候補）を含むコンビナトリアル（組合せ）化学物質ライブラリー又はコンビナトリアルペプチドライブラリーを用意することを含む。そのような「コンビナトリアル化学物質ライブラリー」又は「リガンドライブラリー」は、次に、ここに記載する１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングされ、望ましい特徴的な活性を示すそれらのライブラリーのメンバー（特に、化学種又はサブクラス）が同定される。その同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役に立つことができ、あるいは、それ自体、可能性のある味覚調節剤又は実際の味覚調節剤として用いることができる。
【０３２７】
そのようなライブラリーは、Ｔ１Ｒ又はＴ１Ｒ類の組合せ（すなわちＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３）と、好ましくは適当なＧタンパク質（例えばＧα１５）とを安定に発現する細胞又は細胞株に対して、スクリーニングされることが好ましい。下記の実施例に示すとおり、そのような安定な細胞株は、非常に顕著な応答を、味刺激物質（例えばうま味刺激物質又は甘味刺激物質）に対して示す。しかし、１つ以上のＴ１Ｒを一過的に発現する細胞及び細胞株も、そのようなアッセイに用いることができる。
【０３２８】
コンビナトリアル化学物質ライブラリーは、化学合成又は生物合成のいずれかにより、多くの化学的「構成要素」（例えば試薬）を合わせることにより生成される多様な化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーのようなリニアコンビナトリアル化学物質ライブラリーは、一連の化学的構成要素（アミノ酸）を所定の化合物長（すなわちペプチド化合物におけるアミノ酸の数）についてあらゆる可能な態様で化合することにより、形成される。数千〜数百万の化合物を、化学的構成要素のそのようなコンビナトリアル混合によって合成することができる。
【０３２９】
コンビナトリアル化学物質ライブラリーの調製及びスクリーニングは、当業者にとって周知である。そのようなコンビナトリアル化学物質ライブラリーには、ペプチドライブラリーがあるが、これに限定されるものではない（例えば、米国特許第５０１０１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−４９３（１９９１）及びＨｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８（１９９１）参照）。化学的に多様なライブラリーを生成させるための他の化学も用いることができる。そのような化学には、ペプトイド類（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えばＰＣＴ公報ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムなバイオオリゴマー（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン類（例えば米国特許第５２８８５１４号）、ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ（ダイバーサマー）（例えば、ヒダントイン類、ベンゾジアゼピン類、及びジペプチド類（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ポリペプチドビニローグ（Ｈａｇｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格を有する非ペプチドのペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、小さな化合物ライブラリーの類似有機合成（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート類（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１３０３（１９９３））、ペプチジルホスホネート類（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，（すべて上記））、ペプチド核酸ライブラリー（米国特許第５５３９０８３号）、抗体ライブラリー（Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、炭水化物ライブラリー（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）及び米国特許第５５９３８５３号）、有機小分子のライブラリー（ベンゾジアゼピン類、Ｂａｕｍ，Ｃ＆ＥＮ，Ｊａｎ  １８  ｐａｇｅ  ３３（１９９３）、チアゾリジノン類及びメタチアザノン類、米国特許第５５４９９７４号、ピロリジン類、米国特許第５５２５７３５号及び第５５１９１３４号、モルホリノ化合物、米国特許第５５０６３３７号、ベンゾジアゼピン類、第５２８８５１４号など）があるが、これらに限定されるものではない。コンビナトリアルライブラリー調製用の装置は市販されている（例えば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、９０５０Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）参照）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなど参照）。
【０３３０】
本発明の一局面において、Ｔ１Ｒ調節剤を、任意の食品、菓子類、医薬組成物、又はそれらの成分に使用することにより、その製品、組成物、又は成分の味を望ましい態様で調節することができる。例えば、甘味の感覚を高めるＴ１Ｒ調節剤を添加して、製品又は組成物を甘くすることができ、うま味の感覚を高めるＴ１Ｒ調節剤を食品に添加して、うま味を増加させることができる。一方、Ｔ１Ｒアンタゴニストを用いて、甘味及び／又はうま味を阻害（遮断）することができる。
【０３３１】
ｂ．キット類
Ｔ１Ｒ遺伝子及びそのホモログは、化学感覚受容体細胞の同定のための、法医学及び父子鑑定のための、そして、味覚伝達を調べるための有用な手段である。Ｔ１Ｒ核酸に特異的にハイブリダイズするＴ１Ｒファミリーのメンバーに特異的な試薬、例えば、Ｔ１Ｒプローブ及びＴ１Ｒプライマー、並びにＴ１Ｒポリペプチドに特異的に結合するＴ１Ｒ特異的試薬、例えばＴ１Ｒ抗体は、味覚細胞の発現及び味覚伝達の調節を調べるため、用いられる。
試料中のＴ１Ｒファミリーメンバーに対するＤＮＡ及びＲＮＡの存在についての核酸アッセイは、当業者に知られた多数の手法（例えば、サザン解析、ノーザン解析、ドットブロット、ＲＮアーゼ保護（プロテクション）、Ｓ１解析、ＰＣＲのような増幅法、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を含む。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、例えば、目的とする核酸を、細胞内でハイブリダイゼーションに利用できるよう、その細胞環境から遊離させる一方、その後の判定及び分析のため、細胞の形態を保存する。以下の論文は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術の概観を提供している。Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２３０２５０（１９８６）、Ｈａａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．ＶＩＩ，ｐｐ．１８９−２２６（１９８４）、及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｎａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９８７）。さらに、Ｔ１Ｒポリペプチドは、上述した種々のイムノアッセイ法を用いて検出することができる。試験サンプルは、典型的に、正のコントロール（例えば、組換えＴ１Ｒポリペプチドを発現するサンプル）及び負のコントロールの両方と比較される。
また、本発明は、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーの調節剤についてスクリーニングを行うためのキットを提供する。そのようなキットは、容易に入手できる材料及び試薬から調製することができる。例えば、そのようなキットは、以下の材料の任意の１つ以上を備えることができる。Ｔ１Ｒの核酸又はタンパク質、反応チューブ、及びＴ１Ｒ活性を試験するための説明書。必要に応じて、キットは、生物学的に活性なＴ１Ｒ受容体、又は、生物学的に活性なＴ１Ｒを含む味覚受容体を安定に又は一過的に発現する細胞株を含む。多種多様なキット及び成分を、キットの予定される使用者及び使用者の特定の要求に応じて、本発明に従い、調製することができる。
【実施例】
【０３３２】
以上本発明を詳細に説明してきたが、以下の実施例は、好ましい態様を例示するために設けられるものである。これらの実施例は、例示を目的とするものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０３３３】
ここに示すタンパク質の配列において、一文字符号Ｘ又はＸａａは、２０の一般的なアミノ酸残基の任意のものを指す。ここに示すＤＮＡ配列において、一文字符号Ｎ又はｎは、４つの一般的なヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧの任意のものを指す。
【０３３４】
実施例１
イントロンを含まないｈＴ１Ｒ発現コンストラクトの生産
イントロンを含まないｈＴ１Ｒ発現コンストラクトを、ｃＤＮＡに基づく方法とゲノムＤＮＡに基づく方法との組合せによりクローニングした。完全長ｈＴ１Ｒ１発現コンストラクトを生成させるため、クローニングしたｈＴ１Ｒ１インターバル（アクセッション番号ＡＬ１５９１７７）において特定した２つの５’コードエキソンをＰＣＲオーバーラップにより合わせ、そして、５’−トランケート精巣ｃＤＮＡクローンに結合した。ｈＴ１Ｒ２発現コンストラクトを、部分的に配列決定したｈＴ１Ｒ２ゲノムインターバルから生成させた。２つの欠落したｈＴ１Ｒ２の５’エキソンを、対応するラットのコード配列から得られたプローブを用いて、クローニングしたゲノムインターバルのショットガンライブラリーをスクリーニングすることにより、特定した。次いで、コードエキソンをＰＣＲオーバーラップにより合わせて完全長の発現コンストラクトを生成させた。ｈＴ１Ｒ３発現コンストラクトを、配列決定したｈＴ１Ｒ３ゲノムインターバル（アクセッション番号ＡＬ１３９２８７）からＰＣＲオーバーラップによって生成させた。ラットＴ１Ｒ３を、ｈＴ１Ｒ３に基づく縮重ＰＣＲにより生成されたｒＴ１Ｒ３エキソンフラグメントを用いて、ラット味覚組織由来ｃＤＮＡライブラリーから単離した。部分的ｈＴ１Ｒ１ｃＤＮＡ、ｒＴ１Ｒ２ｃＤＮＡ、及び部分的ｈＴ１Ｒ２ゲノム配列は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｚｕｋｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から入手した。
【０３３５】
上で特定したＴ１Ｒクローン配列ならびに他の完全長および部分的Ｔ１Ｒ配列についての核酸及びアミノ酸の配列は、配列表に示している。
【０３３６】
以下の理論的翻訳物（サカナＴ１Ｒ類の２つのオーソロガス対のＣ末端に対応するもの）は、未公表のゲノム配列フラグメントから得られ、提供されるものである。フグＴ１ＲＡはアクセッション番号（Ａａｃｃｅｓｉｏｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）１６４’から得た。フグＴ１ＲＢはアクセッション番号ＬＰＣ６１７１１から得た。テトロドン（Ｔｅｔｒａｄｏｎ）Ｔ１ＲＡはアクセッション番号ＡＬ２２６７３５から得た。テトロドン（Ｔｅｔｒａｄｏｎ）Ｔ１ＲＢはアクセッション番号ＡＬ２２２３８１から得た。理論的翻訳物における多義性（Ｘ）は、データベース配列における多義性に起因する。これらの配列は、配列表において見ることができる。
【０３３７】
さらに、パブリックドメインにあるマウス及びラットのＴ１Ｒ類ならびにそれらの対立遺伝子変異型に関するアクセッション番号及び引用文献を下記に示す。ｒＴ１Ｒ１（アクセッション番号ＡＡＤ１８０６９）（Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９６（４）：５４１−５１（１９９９））、ｒＴ１Ｒ２（アクセッション番号ＡＡＤ１８０７０）（Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９６（４）：５４１−５９（１９９９））、ｍＴ１Ｒ１（アクセッション番号ＡＡＫ３９４３７）、ｍＴ１Ｒ２（アクセッション番号ＡＡＫ３９４３８）、ｍＴ１Ｒ３（アクセッション番号ＡＡＫ５５５３７）（Ｍａｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８（１）：５８−６３（２００１）、ｒＴ１Ｒ１（アクセッション番号ＡＡＫ７０９２）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ（１２（１）：１３−１６（２００１））、ｍＴ１Ｒ１（アクセッション番号ＮＰ１１４０７３）、ｍＴ１Ｒ１（アクセッション番号ＡＡＫ０７０９１）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ（１２１）：１３−１６（２００１））、ｒＴ１Ｒ２（アクセッション番号ＡＡＤ１８０７０）（Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９６６４）：５４１−５５１（１９９９））、ｍＴ１Ｒ２（アクセッション番号ＮＰ１１４０７９）、ｍＴ１Ｒ３（アクセッション番号ＡＡＫ３９４３６）、ｍＴ１Ｒ３（アクセッション番号ＢＡＢ４７１８１）（Ｋｉｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８３（１）：２３６−４２（２００１））、ｍＴ１Ｒ３（アクセッション番号ＮＰ１１４０７８）、ｍＴ１Ｒ３（アクセッション番号ＡＡＫ５５５３６）（Ｍａｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８（１）：５８−６３（２００１）、及びｍＴ１Ｒ３（アクセッション番号ＡＡＫ０１９３７）。
【０３３８】
実施例２
ヒト及びラットのＴ１Ｒの配列の整列
上で特定したものから選ばれたＴ１Ｒ配列クローンを、対応するラットのＴ１Ｒ類と整列させた。図１に示すとおり、ヒトＴ１Ｒ１、ヒトＴ１Ｒ２及びヒトＴ１Ｒ３並びにラットＴ１Ｒ３は、上述したＴ１Ｒ類（アクセッション番号ＡＡＤ１８０６９のｒＴ１Ｒ１及びアクセッション番号ＡＡＤ１８０７０のｒＴ１Ｒ２）、ラットｍＧｌｕＲ１メタボトロピックグルタミン酸受容体（アクセッション番号Ｐ２３３８５）、及びヒトカルシウムセンシング受容体（アクセッション番号Ｐ４１１８０）と整列した。比較を分かりやすくするため、ｍＧｌｕＲ１及びカルシウムセンシング受容体のＣ末端を切り取っている（トランケートしている）。７つの可能性のある膜貫通セグメントは青色の枠で囲まれている。ｍＧｌｕＲ１結晶構造中グルタミン酸側鎖カルブチレート（ｃａｒｂｕｔｙｌａｔｅ）に接触する残基は赤色の枠で囲まれ、グルタミン酸のα−アミノ酸部分に接触する残基は緑色の枠で囲まれている。サブユニット間ジスルフィドに基づく構造に関係するｍＧｌｕＲ１及びカルシウムセンシング受容体のシステイン残基は、紫色の円で囲まれている。これらのシステインは、Ｔ１Ｒ１及びＴ１Ｒ２において保存されていない一方、類似する可能性のあるＴ１Ｒ３システイン残基を含む整列の低下した領域に存在する（同様に円で囲まれる）。
【０３３９】
実施例３
ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３が味覚組織で発現されることのＲＴ−ＰＣＲによる実証
図２に示すとおり、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３は味覚組織で発現される。両遺伝子の発現は、切除したヒトの有郭乳頭からのＲＴ−ＰＣＲによって検出できる。
【０３４０】
実施例４
異種細胞においてＴ１Ｒ類を異型発現させるための方法
Ｇα１５を安定して発現するＨＥＫ−２９３派生体（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １００（６）：７０３−１１（２０００））を、１０％ＦＢＳ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）及び３μｇ／ｍｌブラストサイジンが補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）において３７℃で増殖させ、維持した。カルシウムイメージング実験のため、細胞を、まず２４ウェル組織培養プレート上に播種し（約１０万細胞／ウェル）、そしてＭｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩｔ−２９３（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）を用いたリポフェクションによりトランスフェクトした。グルタミン酸による脱感作及びグルコースによる脱感作を最小限にするため、補足ＤＭＥＭを、トランスフェクション後約２４時間で、低グルコースＤＭＥＭ／ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に置き換えた。２４時間後、ダルベッコＰＢＳ緩衝液（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中３μＭのカルシウム色素Ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に細胞を室温で１．５時間さらした。２５０μｌのＤＰＢＳで置換した後、味刺激物質を補足した２００μｌのＤＰＢＳを添加することにより、室温において刺激を行った。カルシウム動員を、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ４．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ）を用いてＡｘｉｏｖｅｒｔ  Ｓ１００ＴＶ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）でモニターした。Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３応答及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３応答は、顕著に一時的であり（カルシウムの増加が１５秒より長く続くことはめったになかった）そして非同期的であった。応答細胞の数は、従って時間の経過に対して比較的一定であった。従って、特定の時点（典型的に刺激物質添加後３０秒）において応答細胞の数を肉眼で数えることにより、細胞の応答を定量した。
【０３４１】
実施例５
ヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３は甘味受容体として機能する
安定してＧα１５を発現するＨＥＫ細胞を、ヒトのＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトし、ショ糖の濃度増加に対する細胞内カルシウムの増加について検定した（図３（ａ））。また、いくつかの甘味刺激物質に対してＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の用量応答性を測定した（図３（ｂ））。応答細胞の最大百分率は、１０〜３０％の範囲で、それぞれの甘味料によって異なっていた。分かりやすくするため、用量応答性は、応答細胞の最大百分率に対して正規化した。図３の値は、４つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．（標準誤差）を表す。Ｘ軸の丸印は、味覚試験で測定した精神物理学的検知閾値を示している。グルマリン（ろ過した１０ｇ／ｌのギムネマ（Ｇｙｍｎｅｍａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ）水抽出物の５０倍希釈物）は、２５０ｍＭショ糖に対するＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の応答を阻害した一方、２０μＭイソプロテレノールに対する内因性β２−アドレナリン受容体の応答を阻害しなかった（図３（ｂ））。図３（ｃ）は、種々の甘味料（ショ糖、アスパルテーム、Ｄ−トリプトファン、及びサッカリン）に対するＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３共発現細胞株の正規化した応答を示す。
【０３４２】
実施例６
ラットＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３もまた甘味受容体として機能する
安定してＧα１５を発現するＨＥＫ細胞を、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３、ｒＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３、ｈＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３、及びｒＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトした。次いでこれらのトランスフェクトされた細胞を、３５０ｍＭショ糖、２５ｍＭトリプトファン、１５ｍＭアスパルテーム、及び０．０５％のモネリンに対する細胞内カルシウムの増加について検定した。ショ糖及びアスパルテームについての結果は、図４に示され、ｒＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３もまた甘味受容体として機能することを示している。さらに、これらの結果は、Ｔ１Ｒ２がＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のリガンド特異性を支配し得ることを示唆する。
【０３４３】
実施例７
自動化された蛍光に基づくアッセイを用いるＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３応答
Ｇα１５を安定して発現するＨＥＫ細胞を、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトした。これらの細胞にカルシウム色素Ｆｌｕｏ−４を添加し、甘味料に対するその応答を蛍光プレートリーダーを用いて測定した。図５は、シクラメート（１２．５ｍＭ）応答を、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を発現する細胞及びｈＴ１Ｒ３（Ｊ１９−２２）のみを発現する細胞について示している。得られた蛍光の結果は、該味刺激物質に対する応答がｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を発現する細胞においてのみ起こったことを示している。図６は、正規化した用量応答曲線を示し、その結果は、ｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ３が共同で、それらの種々の甘味刺激物質との用量特異的相互作用に基づき、ヒトの味覚受容体として機能することを明らかにしている。特に、図６は、ショ糖、トリプトファン、及び種々の他の市販甘味料について用量応答性を示している。アッセイで得られた順位序列及び閾値がヒトの甘味についての値をよく反映していることから、これらの結果は、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３がヒトの甘味受容体であることを示している。
【０３４４】
実施例８
ｍＧｌｕＲ１のリガンド結合残基はＴ１Ｒ１に保存されている
図６に示すとおり、ｍＧｌｕＲ１の主要なリガンド結合残基はＴ１Ｒ１において保存されている。グルタミン酸とｍＧｌｕＲ１との相互作用は、図１と同じ色分けで強調表示したいくつかの主要な残基によって示される。
【０３４５】
実施例９
ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３はうま味受容体として機能する
Ｇα１５を安定して発現するＨＥＫ細胞を、ヒトのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３、及びＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトし、そして、増加する濃度のグルタミン酸塩（図８（ａ））、及び０．５ｍＭグルタミン酸塩）、０．２ｍＭのＩＭＰ、及び０．５ｍＭのグルタミン酸塩＋０．２ｍＭのＩＭＰ（図８（ｂ））に対する細胞内カルシウムの増加について検定した。ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の用量応答性を、０．２ｍＭのＩＭＰがある場合とない場合で、グルタミン酸塩について測定した（図８（ｃ））。応答細胞の最大百分率は、グルタミン酸塩について約５％であり、グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて約１０％であった。分かりやすくするため、用量応答性は、応答細胞の最大百分率に対して正規化している。値は、４つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．（標準誤差）を表す。Ｘ軸の丸印は、味覚試験で測定した味覚の検知閾値を示している。
【０３４６】
実施例１０
エキスポートシーケンスとしてのＰＤＺＩＰ
６残基ＰＤＺＩＰ配列（ＳＶＳＴＷ（配列番号１））を、ｈＴ１Ｒ２のＣ末端に融合し、そのキメラ受容体（すなわちｈＴ１Ｒ２−ＰＤＺＩＰ）をＨＥＫ−２９３宿主細胞にトランスフェクトした。次いでｈＴ１Ｒ２の表面発現を、免疫蛍光検査及びＦＡＣＳ走査データを用いてモニターした。図９Ａ及び９Ｂに示すように、ＰＤＺＩＰ配列が含まれることにより、ｈＴ１Ｒ２と比較して、ｈＴ１Ｒ２−ＰＤＺＩＰの表面発現は増加した。より具体的に図９Ａから明らかなとおり、ｍｙｃ標識ｈＴ１Ｒ２の免疫蛍光染色は、ＰＤＺＩＰが、原形質膜上のｈＴ１Ｒ２タンパク質の量を顕著に増加させることを示している。図９Ｂは同じ結果を明らかにしているＦＡＣＳ分析データを示す（ｍｙｃ標識ｈＴ１Ｒ２を発現する細胞は点線で示され、ｍｙｃ標識ｈＴ１Ｒ２−ＰＤＺＩＰを発現する細胞は実線で示される）。特に、図１０Ａは、ＨＢＳ緩衝液中のトランスフェクトされていないＧα１５安定宿主細胞を示し、図１０Ｂは、甘味料プールＮｏ．５（サッカリン、シクラミン酸ナトリウム、アセスルファムＫ、及びアスパルテーム、それぞれＨＢＳ緩衝液中２０ｍＭ）におけるｈＴ１Ｒ２−ＰＤＺＩＰでトランスフェクトされたＧα１５安定宿主細胞を示し、図１０Ｃは、甘味料プールＮｏ．５におけるＴ１Ｒ３−ＰＤＺＩＰでトランスフェクトされたＧα１５安定宿主細胞を示し、そして、図１０Ｄは、甘味料プールＮｏ．５におけるｈＴ１Ｒ２−ＰＤＺＩＰ／ｈＴ１Ｒ３−ＰＤＺＩＰで共トランスフェクトされたＧα１５安定宿主細胞を示す。さらに図１０Ｅ〜１０Ｈは、ＨＢＳ緩衝液中のショ糖  Ｅ：０ｍＭ、Ｆ：３０ｍＭ、Ｇ：６０ｍＭ、Ｈ：２５０ｍＭに対するｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３共トランスフェクトＧα１５安定宿主細胞の用量依存性応答を示している。図１０Ｉ〜１０Ｌは、それぞれの甘味料  Ｉ：アスパルテーム（１．５ｍＭ）、Ｊ：アセスルファムＫ（１ｍＭ）、Ｋ：ネオテーム（２０ｍＭ）、Ｌ：シクラミン酸ナトリウム（２０ｍＭ）に対するｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３共トランスフェクトＧα１５安定宿主細胞の応答を示している。図１０のカルシウムイメージによって明らかなとおり、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３はともに、甘味刺激物質により引き起こされる活性にとって必要である。
【０３４７】
実施例１１
Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３を安定して共発現する細胞株の生成
ｈＴ１Ｒ１又はｈＴ１Ｒ２の発現コンストラクト（Ｔ１Ｒ１に対しプラスミドＳＡＶ２４８５、Ｔ１Ｒ２はＳＡＶ２４８６）とｈＴ１Ｒ３（Ｔ１Ｒ３に対しプラスミドＳＸＶ５５０）とをそれぞれ含む線状化したＰＥＡＫ１０由来（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターとｐＣＤＮＡ３．１／ＺＥＯ由来（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターとをＧα１５発現細胞株にトランスフェクトすることにより、ヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３又はヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３を安定に共発現するヒト細胞株を生成させた。具体的に、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３安定細胞株は、安定してＧα１５を発現するＡｕｒｏｒａ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＨＥＫ−２９３細胞株に、線状化したＳＡＶ２４８６及びＳＸＶ５５０を共トランスフェクトすることにより生成させた。Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株は、安定してＧα１５を発現する同じＨＥＫ−２９３細胞株に、線状化したＳＡＶ２４８５及びＳＸＶ５５０を共トランスフェクトすることにより生成させた。ＳＡＶ２４８５／ＳＸＶ５５０及びＳＡＶ２４８６／ＳＸＶ５５０のトランスフェクションの後、ピューロマイシン耐性でかつゼオシン耐性のコロニーを選別し、増殖させ、そして、甘味刺激物質又はうま味刺激物質に対する応答についてカルシウムイメージングにより検査した。ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％透析ＦＢＳ、及び０．００３ｍｇ／ｍｌブラストサイジンを補足した低グルコースＤＭＥＭ中、３７℃で、０．０００５ｍｇ／ｍｌピューロマイシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）及び０．１ｍｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において細胞を選別した。耐性コロニーを増殖させ、その甘味刺激物質に対する応答を蛍光顕微鏡法により評価した。ＶＩＰＲ−ＩＩ装置（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）における自動化蛍光イメージングのため、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３安定細胞をまず９６ウェルプレート上に播種した（約１０００００細胞／ウェル）。２４時間後、細胞を、ＰＢＳ中０．００５ｍＭのカルシウム色素ｆｌｕｏ−３−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に１時間室温においてさらした。７０μｌのＰＢＳで置換した後、味刺激物質を補足した７０μｌのＰＢＳを添加することにより、室温で刺激を行った。化合物添加後２０〜３０秒の蛍光（４８０ｎｍ励起、５３５ｎｍ発光）反応を平均し、化合物添加前に測定したバックグラウンドの蛍光に対して補正し、そして、カルシウムイオノホアであるイオノマイシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）０．００１ｍＭへの応答に対して正規化した。
【０３４８】
その結果、これらの細胞株が甘味又はうま味の刺激物質にさらされたとき、活性なクローンについて典型的に８０〜１００％の細胞が味刺激物質に応答したことが分かった。予想外に、個々の細胞の応答は、一過的にトランスフェクトされた細胞のものより顕著に大きかった。
【０３４９】
この知見に基づき、本発明者らは、上述したＡｕｒｏｒａ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＶＩＰＲ装置を用いる自動化蛍光イメージングによって、Ｔ１Ｒ安定細胞株の活性を試験した。２つのＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３及び１つのＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞株の応答を、図１１及び図１２にそれぞれ示す。
【０３５０】
顕著なことに、応答細胞の数が増加するとともに応答の強さが増した結果、一過的にトランスフェクトされた細胞と比べて１０倍よりも大きい活性の増加がもたらされた。（比較として、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトされた細胞についてのイオノマイシン応答百分率は、最適条件下で約５％であった。）さらに、安定に発現されるヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３について得られた用量応答性は、ヒトの味検知閾値と相関関係があった。これらの安定な細胞株の強いＴ１Ｒ活性が示唆するところによれば、それらの細胞株は、化合物（例えば、甘味受容体又はうま味受容体を調節し、従って、甘味又はうま味を調節、増強、阻害、又は模倣する小分子）を同定するため、化学物質ライブラリーを高スループットスクリーニングする用途によく適している。
【０３５１】
実施例１２
うま味刺激物質に選択的に応答するＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３を誘導的に共発現する細胞株の生成
うま味受容体を安定して発現したＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３  ＨＥＫ２９３細胞株は、一過的にトランスフェクトされた細胞に比して、向上した強い活性を示す。しかし、それらは細胞増殖中に活性を急速に失い得るという欠点がある。
【０３５２】
また、上記知見が示すところによれば、（ｉ）Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３はうま味受容体であり、すなわち、（ｉｉ）Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３を強固に発現する細胞株、好ましくは、安定でかつ／又は誘導可能なＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞株は、アッセイにおいて、好ましくは、新規のうま味調節物質を特定するために、化学物質ライブラリーの高スループットスクリーニングに用いることができる。うま味を増強する調節物質を用いてもよい。
【０３５３】
Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の上記不安定性を克服するため、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３を誘導的に発現するよう、ＨＥＫ−Ｇα１５細胞を設計した。ヒトのＴ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３に対してｐＧｅｎｅ由来ゼオシン耐性発現ベクター（Ｔ１Ｒ１に対しプラスミドＳＸＶ６０３、Ｔ１Ｒ３に対しＳＸＶ６１１）と、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質を運ぶピューロマイシン耐性ｐＳｗｉｔｃｈ由来ベクター（プラスミドＳＸＶ６２８）とを線状化し、ＨＥＫ−Ｇα１５細胞株に共トランスフェクトした。ゼオシン耐性でかつピューロマイシン耐性のコロニーを選別し、増殖させ、種々の量のミフェプリストンで誘導し、うま味刺激物質に対する応答についてカルシウムイメージングにより試験した。
【０３５４】
Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の誘導的な発現は、強固な活性をもたらした。例えば、誘導された細胞の約８０％がＬ−グルタミン酸塩に反応した一方、一過的にトランスフェクトされた細胞の約１０％しかＬ−グルタミン酸塩に反応しなかった。より具体的には、ヒトＴ１Ｒ１及びヒトＴ１Ｒ３を発現するｐＧｅｎｅ由来ゼオシン耐性発現ベクターと、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質を運ぶピューロマイシン耐性ｐＳｗｉｔｃｈ由来ベクターとを、線状化し、Ｇα１５細胞に共トランスフェクトした。ＧｌｕｔａＭＡＸ、（１０％透析ＦＢＳ、及び３μｇ／ｍｌブラストサイジンを補足したダルベッコ改変イーグル培地中、３７℃で、０．５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）及び１００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において細胞を選別した。耐性コロニーを増殖させ、１０−１０Ｍミフェプリストンで誘導した後、そのうま味刺激物質に対する応答を、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９９（７）：４６９２−４６９６（２００２）の方法に従う蛍光顕微鏡法により測定した。
【０３５５】
ＦＬＩＰＲ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）での自動化蛍光イメージングのため、１つのクローン（クローンＩ−１７と命名）からの細胞を、１０−１０Ｍミフェプリストンの存在下、９６ウェルプレートに播種（約８００００細胞／ウェル）し、４８時間インキュベートした。次いで、細胞を、ＰＢＳ中３μＭのカルシウム色素ｆｌｕｏ−４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に、室温で１．５時間さらした。
【０３５６】
５０μｌのＰＢＳで置換した後、異なる刺激物質を補足した５０μｌのＰＢＳを添加することにより、室温で刺激を行った。応答細胞を個々に数えること（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９９（７）：４６９２−４６９６（２００２））によりＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体の活性を定量する必要があった先の一過性Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体発現系（そこにおける受容体の活性が低いため）とは対照的に、本実施例の誘導発現系がもたらしたクローンＩ−１７の活性は大幅に増加しており、そのため、造影した細胞の視野にわたって合計される最大蛍光の増加（４８０ｎｍの励起と５３５ｎｍの発光）を測定することにより、受容体の活性を定量することが可能であった。４つの個々の測定からの最大蛍光を、平均し、化合物添加前に測定したバックグラウンドの蛍光に対して補正し、そして、０．００２ｍＭイオノマイシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）への応答に対して正規化した。
【０３５７】
これらの結果は図１３に示される。特に図１３は、０．２ｍＭのＩＭＰがある場合とない場合でＬ−グルタミン酸塩について測定した用量応答曲線を示している。図において、各値は、４つの個々の測定値についての平均合計最大蛍光（バックグラウンドの蛍光に対して補正）を表している。これらの用量応答曲線は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトされた細胞について測定したものと対応する。
【０３５８】
また、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３味受容体の選択性を、種々のＬ−アミノ酸を用いるスクリーニングにより評価した。得られた結果は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３がうま味性のＬ−アミノ酸（Ｌ−グルタミン酸塩及びＬ−アスパラギン酸塩）により選択的に活性化されることを示した。
種々のＬ−アミノ酸の存在下で試験されＩ−１７クローンの応答が得られた実験結果を、図１４と図１５に示す。図１４は、１ｍＭのＩＭＰがある場合とない場合において、濃度１０ｍＭで種々のアミノ酸をＩ−１７細胞株に接触させた実験結果を示す。
【０３５９】
図１５は、０．２ｍＭのＩＭＰが存在する場合に測定された活性アミノ酸に対する用量応答曲線を示す。各値は、４つの個々の測定値の平均を表している。
【０３６０】
これらの実験で得られた結果は、うま味刺激物質に対するうま味受容体の特異性と選択性を裏付けるものである。うま味刺激物質であるＬ−グルタミン酸塩及びＬ−アスパラギン酸塩は、種々の濃度でＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体を顕著に活性化した（図１４及び１５参照）。一方、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体を活性化した他のＬ−アミノ酸は、受容体をより高い濃度でかつ弱く活性化しただけであった。
【０３６１】
従って、これらの結果は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体のうま味刺激物質に対する選択性を裏付けるとともに、うま味受容体を活性化する化合物（例えばＬ−グルタミン酸塩又はＬ−アスパラギン酸塩）あるいはＬ−グルタミン酸塩の活性を高めてうま味受容体を活性化する化合物（例えば５’−ＩＭＰ又は５’−ＧＭＰ）あるいはＬ−グルタミン酸塩及びＬ−アスパラギン酸塩のようなうま味刺激物質によるうま味受容体の活性化を阻害する化合物を同定するため、自動化蛍光イメージング装置を用いる高スループットスクリーニングアッセイの用途においてこの誘導可能な安定発現系が適当であることを裏付けている。
【０３６２】
これらのアッセイを用いて同定される化合物は、うま味刺激物質を模倣又は阻害するため、食品や飲料組成物における香味料としての用途の可能性がある。
【０３６３】
実施例１３
ラクチソール（ｌａｃｔｉｓｏｌｅ）はヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の受容体活性並びに甘味及びうま味を阻害する
ラクチソール（アラルキルカルボン酸）は選択的甘味阻害剤であると考えられた（例えばＬｉｎｄｌｅｙ（１９８６）米国特許第４５６７０５３及びＳｃｈｉｆｆｍａｎ  ｅｔ
ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ  ２４：４３９−４４７（１９９９）参照）。種々の濃度のラクチソールの存在下、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ−Ｇα１５細胞の１５０ｍＭショ糖に対する応答を測定した。ラクチソールは、２４μＭのＩＣ５０でヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の活性を阻害している。
【０３６４】
Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体とＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味受容体は、共通のサブユニットを有し得る。従って、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味受容体を阻害するラクチソールは、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体に対して類似の作用を及ぼし得ると考えられた。本発明者らは、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩へのヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の応答に対するラクチソールの作用について試験した。Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味受容体と同様に、ラクチソールは、１６５μＭのＩＣ５０でＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３を阻害した。ムスカリンアセチルコリン受容体の応答がラクチソールによって阻害されなかったため、ラクチソール阻害は、例えばＧα１５媒介シグナル伝達の非特異的阻害ではなく、Ｔ１Ｒ受容体における拮抗作用を反映しているようである。
【０３６５】
そこで、本発明者らは、ヒトのうま味に対するラクチソールの作用を評価した。１ｍＭ及び２ｍＭのラクチソールの存在下における味覚閾値を、０．２ｍＭのＩＭＰがある場合とない場合のうま味刺激物質Ｌ−グルタミン酸塩について、甘味刺激物質であるショ糖及びＤ−トリプトファンについて、そして塩味刺激物質である塩化ナトリウムについて、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ  ２４：４３９−４４７（１９８９））の方法に従って測定した。ミリモル濃度のラクチソールは、甘味及びうま味に対する検知閾値を劇的に増加させたが、塩味刺激物質に対してはそうではなかった。これらの結果は図１６に示される。
【０３６６】
結論として、（ｉ）これらの知見は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３が唯一のうま味受容体であるという本発明者らの仮説をさらに裏付けるものであり、また（ｉｉ）Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体は、構造的に関連するラクチソール結合ドメインをともに有している可能性がある。
【０３６７】
以上の詳細な説明は本発明のいくつかの態様を記述するものであるが、当然のことながら、上記説明は単なる例示であり、本開示の発明を限定するものではない。本発明は、添付の請求の範囲のみによって限定すべきものである。
【０３６８】
実施例１４
甘味受容体上のリガンド相互作用部位のマッピング
Ｔ１Ｒ２Ｒ−ＨのヒトＴ１Ｒ３との共発現を介して、ヒトの甘味受容体の一部（Ｔ１Ｒ２のＮ末端ドメイン）をラットのタンパク質配列で置換した。アスパルテーム及びネオテームに対する応答がなくなる。これは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端ドメインがアスパルテーム及びネオテームを認識するのに必要であることを示している。また同様に、ラットＴ１Ｒ２のＮ末端ドメインを、Ｔ１Ｒ２Ｈ−ＲをラットＴ１Ｒ３と共発現することにより、ヒトタンパク質配列で置換した。このキメラ受容体は、アスパルテーム及びネオテームに応答する能力を獲得しており、これは、これら２つの甘味料を認識するのに、ヒトＴ１Ｒ２の同じドメインでも十分である（甘味受容体の状況において）ことを示唆している（図２２Ｂ）。これらのインビトロ機能発現データは、重要な相互作用の決定要素がＮ末端の細胞外ドメインに位置することを示している。
【０３６９】
一方、ヒトＴ１Ｒ２のいずれか半分をラットのタンパク質配列で置換しても、そのシクラメートに対する応答に影響はない。その代わりに、Ｔ１Ｒ２との共発現の場合、シクラメートを認識するには、ヒトＴ１Ｒ３のＣ末端ドメインが必要かつ十分である（図２２Ｃ）。ファミリーＣのＧＰＣＲ類の膜貫通ドメインは、アロステリック調節剤に対する結合部位を含むことが知られている（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ，Ｆ．，Ｒ．Ｋｕｈｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．Ｐｉｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２  Ｆｅｂ；２（１）：４３−９）。これは、ファミリーＣのＧＰＣＲにおいて、アゴニストが膜貫通ドメインに直接結合して他のリガンドなしに受容体を活性化する最初のケースである。
【０３７０】
ラクチソール（アラルキルカルボン酸）は、特異的なヒト甘味阻害剤であり、齧歯類の味覚に生理学的作用を及ぼす。味覚効果と合致して、ラクチソールは、本発明者らのアッセイ系において、ショ糖に対し、ヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の応答を阻害するがラットＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の応答を阻害しない（図２２Ａ）。Ｔ１Ｒキメラを用いて、ラクチソール相互作用部位に関する同種のマッピング実験を行った。シクラメートと同様に、ラクチソールは、ショ糖及びアセスルファムＫに対する受容体の応答を阻害するため、ヒトＴ１Ｒ３のＣ末端ドメインを必要とする（図２２Ｄ）。この結果は、甘味受容体の機能においてＴ１Ｒ３のＣ末端ドメインが重要であることをさらに裏付けている。１６の可能なすべての組合せについてキメラを試験した。そして、すべての機能的組合せは、本発明者らのモデルに合致する結果をもたらした。
【０３７１】
アスパルテーム、ネオテーム、及びシクラメートの認識に必須のアミノ酸を絞りこむため、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の両方について、突然変異誘発の研究を行った。もし、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３が異なる甘味料の認識に係わっているならば、Ｔ１Ｒ２のＮ末端ドメインにおける突然変異は、アスパルテーム及びネオテームに対する応答に影響を及ぼす一方、シクラメートに対する応答には影響を及ぼさないはずである。また、Ｔ１Ｒ３のＣ末端ドメインにおける突然変異は、その逆の影響を及ぼすはずである。Ｔ１Ｒ２のＮ末端ドメインにおける重要なアミノ酸残基を選択するため、Ｔ１Ｒ２の配列をｍＧｌｕＲ１と整列させた（図２３Ａ）。ｍＧｌｕＲ１におけるリガンド結合に重要な８つの残基（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００．４０７（６８０７）：ｐ．９７１−７）のうち、３つはヒトＴ１Ｒ２において保存されている（Ｓ１４４、Ｙ２１８及びＥ３０２）。これら３つの残基のそれぞれを突然変異させ、そして得られた受容体を種々の甘味料に対する応答について試験した。Ｙ２１８をＡに置換することにより、試験したすべての甘味料に対して応答がなくなった。これは、Ｙ２１８が、受容体の全体的コンホメーションにとって重要であることを示している。他の２つのｈＴ１Ｒ２変異体（Ｓ１４４Ａ及びＥ３０２Ａを含む）は、アスパルテーム及びネオテームに対する応答に選択的に影響を及ぼしたが、シクラメートに対してはそうでなかった。Ｓ１４４Ａ及びＥ３０２ＡのｈＴ１Ｒ２変異体を発現する安定な細胞株（野生型ｈＴ１Ｒ３とＧα１５との共発現）は、生理的濃度においてアスパルテームにもネオテームにも応答しなかったが、シクラメートには応答した（図２３Ｂ）。
【０３７２】
シクラメート結合部位をさらにマッピングするため、Ｔ１Ｒ３のＣ末端ドメインにおける３つの細胞外ループに着目した。ヒトと齧歯類のＴ１Ｒ３を整列させると、この３つの細胞外ループにおいて複数のアミノ酸が異なることが明らかになる（図２３Ｃ）。細胞外ループ−２又はループ−３をラットの配列で置換することにより、ショ糖およびアスパルテームへの応答に影響を及ぼすことなく、シクラメートへの応答がなくなった。一方、細胞外ループ１の置換は、シクラメートへの応答に対してはっきりした効果がなかった。このことは、シクラメートの認識においてＥＣループ２及び３が重要な役割を果たしていることを示している（図２３Ｄ）。これらのループ置換のいずれもが、ラクチソールの阻害効果に影響を及ぼさなかった。これは、結合メカニズムが異なることを意味している。以上をまとめると、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３においてアミノ酸を置換すると、種々の甘味料が引き起こす活性は選択的に妨害され、それは、キメラ受容体の結果と合致する。
【０３７３】
上記の結果は、ヒトの甘味受容体がＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３のヘテロメリック複合体として機能することを明らかにしている。両方のサブユニットが、種々の甘味料を認識するのに必要であり、これらのデータは、異なる種類のアゴニストに対し、受容体上に複数の結合ポケットが存在することを示している。複数のリガンド結合部位の存在は、本発明の特異的結合性化合物にとって、構造的な指標と輪郭をもたらす。
【０３７４】
実施例１５
受容体−Ｇタンパク質相互作用のマッピング
ヒト及びラットの甘味受容体はまた、それらのＧタンパク質共役効率が異なっている。ヒト及びラットの両方の受容体がＧα１５／ｉｌに効率よく共役できるにも係わらず、ヒトの受容体のみがＧα１５に効率よく共役することができる（図２４Ａ）。この種による違いにより、上述と同じキメラ受容体を用いて受容体Ｇタンパク質相互作用のマッピングが可能になる。Ｔ１Ｒ３ではなくＴ１Ｒ２がＧα１５共役にとって重要であるようだ。というのも、ヒトＴ１Ｒ２のＣ末端を対応するラットの配列で置換すると、共役がなくなり、そして、ラットＴ１Ｒ２のＣ末端の半分をヒトの配列で置換すると、受容体がＧα１５に共役できるようになり、ショ糖及びアセスルファムＫに応答できるようになったからである（図２４）。Ｔ１Ｒ３のＣ末端配列同士を入れ替えても、Ｇα１５共役には影響がなかった（図２４Ｂ）。この知見は、機能的発現系でのＧタンパク質共役においてＴ１Ｒ２が重要な役割を果たすことを明らかにしている。ガストデューシン（ｇｕｓｔｄｕｃｉｎ）（Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｔ．，Ｋ．Ｓ．Ｇａｎｎｏｎ，ａｎｄ  Ｒ．Ｆ．Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６．３８１（６５８５）：ｐ．７９６−８００）は、甘味受容体に対する内因性Ｇタンパク質であるといわれており、そして、Ｔ１Ｒ２は、味覚細胞でインビボ共役に係わっているサブユニットであり得る。ＧＡＢＡＢＲはヘテロメリックファミリーＣのＧＰＣＲのその他の例であるが、一方のサブユニット（ＧＡＢＡＢＲ１）はリガンド結合に係わっており、他方（ＧＡＢＡＢＲ２）はＧタンパク質共役に係わっている（Ｍａｒｇｅｔａ−Ｍｉｔｒｏｖｉｃ，Ｍ．，Ｐａｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００１．９８（２５）：ｐ．１４６４３−８；Ｍａｒｇｅｔａ−Ｍｉｔｒｏｖｉｃ，Ｍ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００１．９８（２５）：ｐ．１４６４９−５４）。リガンド認識とＧタンパク質共役の両方にＴ１Ｒ２が必要である点において、甘味受容体はＧＡＢＡＢＲと異なる。
【０３７５】
実施例１６
ラクチソールはヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３と拮抗しヒトのうま味を阻害する
Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３は甘味受容体と同様にヘテロメリック受容体として機能するため、ラクチソールはＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３活性に対して類似の効果を有するはずであるという仮説が立てられた。というのも、Ｔ１Ｒ３は、甘味受容体とうま味受容体の間で共通するサブユニットだからである。実際、ラクチソールは、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３と拮抗した（図２５Ａ）。ラクチソールは、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の非競合的阻害剤として作用する。というのも、そのＩＣ５０値は明らかにグルタミン酸塩濃度に依存しておらず（図２５Ｂ）、また、ラクチソールは、アゴニストのＥＣ５０を顕著に変化させることなく、受容体の最大活性を減少させるからである（図２５Ｃ）。これらの結果は、ラクチソールがＬ−グルタミン酸とは異なる部位に結合することを示すとともに、グルタミン酸結合ポケットがＴ１Ｒ１に位置するという仮説と合致する。ラクチソールは甘味受容体の競合的阻害剤であるようだ。というのも、そのＩＣ５０は甘味料の濃度に依存しており、また、ラクチソールは、最大活性に顕著な影響を及ぼすことなく甘味料のＥＣ５０を増加させるからである。
【０３７６】
ラクチソールの阻害作用はＴ１Ｒ受容体によって媒介される。というのも、ラクチソールは、ＨＥＫ細胞において内因性ムスカリンアセチルコリン受容体に作用を及ぼさず、また、ＨＥＫ細胞において一過的に発現されたマウス苦味受容体ｍＴ２Ｒ５に作用を及ぼさなかったからである。Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体の場合と同様に、うま味刺激物質に対するＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３応答のラクチソール阻害は、洗浄及び再刺激の後、元に戻すことができた。
【０３７７】
受容体活性と作用とを関連づけるため、ヒトのうま味に対するラクチソールの作用を調べた。予想どおり、ミリモル濃度のラクチソールは、甘味及びうま味について検知閾値を劇的に増加させたが、塩味刺激物質についてはそうでなかった（図２５Ｄ）。ラクチソールはうま味阻害剤として以前には知られていなかった。受容体活性と味覚試験結果との相関関係は、ヒトのうま味においてＴ１Ｒ類が重要な役割を果たしていることを明らかにしている。
【０３７８】
実施例１７
シクラメートはヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体活性を高める
Ｔ１Ｒ類の同じヘテロメリックモデル（図２６）に基づいて、シクラメートも、Ｔ１Ｒ３に作用することによりヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体の活性を調節するであろうことが予測された。シクラメート単独ではＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３に作用を及ぼさなかったが、Ｌ−グルタミン酸塩が存在すると、それは受容体の活性を高めた（図２７Ｅ）。この作用はヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３に特異的である。というのも、シクラメートは、カルバコールの存在下、内因性ムスカリンアセチルコリン受容体の活性に影響を及ぼさなかったからである（図２７Ｅ）。注目すべきことに、シクラメートは、甘味受容体（図２３Ｂ）とうま味受容体に対して同等のＥＣ５０を有する。シクラメートは、ＩＭＰがある場合とない場合において、約２倍、Ｌ−グルタミン酸塩に対する用量応答曲線を再現可能に左側にシフトさせる（図２５Ｆ）。ＩＭＰは、受容体の感度を高めるより顕著な効果を有し、そして、シクラメートの効果はＩＭＰの存在下で認められる（図２５Ｆ）。このことは、受容体の増強においてＩＭＰとは異なるメカニズムを示唆している。ＩＭＰはＴ１Ｒ１に結合するようである。というのも、それが甘味受容体に作用を及ぼさないからである。他の甘味料（ショ糖、アスパルテーム、サッカリン、及びＤ−トリプロファンを含む）は、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３活性に影響を及ぼさなかった。
【０３７９】
以上まとめると、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の両方が機能的な甘味受容体に必要であることが明らかとなり、アスパルテーム及びネオテームはＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインを必要とすることが明らかとなり、Ｇタンパク質共役はＴ１Ｒ２のＣ末端半分を必要とすることが明らかとなり、そして、シクラメート及びラクチソールはＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインを必要とすることが明らかとなった。これらの知見から、ヘテロメリック複合体においてＴ１Ｒサブユニット類の異なる機能的役割が明らかとなり、また、甘味受容体において複数の甘味物質相互作用部位が存在することが明らかとなっている。Ｔ１Ｒ３は甘味受容体とうま味受容体とで共通するサブユニットであるため、うま味受容体に対するシクラメートとラクチソールの作用が予測され、そして確かめられた。さらに、受容体活性に対するラクチソールの作用と味覚との間で相関関係を成立させることができた。これらの知見に基づき、Ｔ１Ｒファミリー味覚受容体の構造と機能の関係について、モデルを作成した（図２６）。天然の炭水化物甘味料は、Ｔ１Ｒ２のＮ末端ドメインに結合し、アスパルテーム及びネオテームもそれに類似する。そして、さらに、例えば、Ｔ１Ｒ２の膜貫通ドメインのように、甘味受容体上に他のリガンド結合部位が存在する。うま味受容体は、同様に、ヘテロメリック複合体として機能し、そして、ＭＳＧ及びＩＭＰはそれぞれ、Ｔ１Ｒ１サブユニットに結合するようである。というのも、両者とも甘味受容体に作用を及ぼさないからである。また、Ｔ１Ｒ１の膜貫通ドメインは、Ｇタンパク質への共役に係わっている。
【０３８０】
実施例１８
甘味物質についてのＨＴＳプロトコル
ＨＥＫ２９３細胞株誘導体（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ，Ｊ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｈｏｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ａｄｌｅｒ，Ｅ．，Ｆｅｎｇ，Ｌ．，Ｇｕｏ，Ｗ．，Ｚｕｋｅｒ，Ｃ．Ｓ．Ｒｙｂａ，Ｎ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ，２０００，１００，７０３−７１１）であってＧα１５及びｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３（Ｌｉ，Ｘ．，Ｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｘｕ，Ｈ．，Ｄｕｒｉｃｋ，Ｋ．，Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．，Ａｄｌｅｒ，Ｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２，９９，４６９２−４６９６，国際特許番号ＷＯ０３／００１８７６Ａ２（この引用によりそれらの内容はそっくり本明細書に記載されたものとする）を安定して発現するものを、甘味増強特性を有する化合物を同定するため用いた。
【０３８１】
化合物を最初に、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３−ＨＥＫ２９３−Ｇα１５細胞株（Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．上記参照）に対するその活性に基づいて選別した。ＦＬＩＰＲ装置（蛍光強度プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）における自動化蛍光イメージングアッセイ（ＦＬＩＰＲアッセイと呼ぶ）を用いて活性を測定した。１つのクローンからの細胞（Ｓ−９細胞と呼ぶ）を、ＤＭＥＭ低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％透析ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む培地（（Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．上記参照）さらに国際特許番号ＷＯ０３／００１８７６Ａ２を参照）において、３８４ウェルプレートに播種した（約５００００細胞／ウェルで）。Ｓ−９細胞を２４時間３７℃で増殖させた。次いでＳ−９細胞を、リン酸塩緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中４μＭのカルシウム色素Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に、１時間室温でさらした。２５μｌのＤ−ＰＢＳで置換した後、必要な最終レベルの二倍に相当する複数の濃度において種々の刺激物質を補足した２５μｌのＤ−ＰＢＳを添加することにより、ＦＬＩＰＲ装置において室温で刺激を行った。刺激の前に測定した基底蛍光強度に対する正規化の後、最大蛍光の増加（４８０ｎｍの励起及び５３５ｎｍの発光を用いる）を測定することにより受容体の活性を定量した。
【０３８２】
用量応答分析のため、刺激物質を、二連で１０の異なる濃度（６０ｎＭ〜３０μＭの範囲）において与えた。最大の受容体応答を引き出す濃度である４００ｍＭのＤ−フルクトースを用いて得られた応答に対し、活性を正規化した。非線形回帰アルゴリズム（Ｓｅｎｏｍｙｘ，Ｉｎｃ．ソフトウェアを用いた）を用いてＥＣ５０Ｓを決定した（そこにおいて、ヒルスロープ、下漸近線及び上漸近線を変化させた）。非線形回帰分析について市販のソフトウェア（例えばＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用いて用量応答データを解析した場合も同じ結果が得られた。
【０３８３】
種々の刺激物質に対する細胞応答についてｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３の依存性を測定するため、選別した化合物を、ＨＥＫ２９３−Ｇα１５細胞（ヒト甘味受容体を発現しない）での同様の分析に供した。ＨＥＫ２９３−Ｇα１５細胞は、ＦＬＩＰＲアッセイにおいて、Ｄ−フルクトースに対し機能的な応答を示さず、また、任意の他の知られた甘味料に対しても応答を示さない。同様に、ここに記載した化合物も、ＦＬＩＰＲアッセイにおいてＨＥＫ２９３−Ｇα１５細胞を用いる場合、機能的な応答を引き起こさない。
【０３８４】
実施例１９
ヒトの被験者を用いた甘味物質に対する香味増強測定
味覚官能検査の基本的なスクリーニング：官能試験員となる可能性のある者を、５つの基本的な味に相当する溶液を格付け評価する能力について試験した。官能試験員は、以下の５つの化合物（ショ糖（甘味）、塩化ナトリウム（塩味）、クエン酸（酸味）、カフェイン（苦味）、及びグルタミン酸一ナトリウム（うま味））のそれぞれについて５つの異なる濃度の強さを格付け評価した。官能試験員は、一セッションあたり合計２５のサンプル（５種の溶液それぞれについて５つのサンプル）を試験した。第一のセッションにおいて、官能試験員は、課題となっている味の強さについて５つの濃度を格付けした。これを、他のサンプルを用いてさらに四回繰り返した。第二のセッションにおいて、官能試験員は、ラベルド・マグニチュード・スケール（Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  Ｓｃａｌｅ）（ＬＭＳ）と呼ばれるラインスケールを用いて、各サンプルの５つの濃度の強さを格付けした。ＬＭＳは、官能試験員がサンプルの評価を行いやすくするため、強度について固定した尺度を用いる（例えば、かろうじて検知可能、弱い、普通、強い、非常に強い、想定される限り最も強い）。サンプルは、１０ｍｌの容量で室温において味見され、３桁の盲検コードでラベルされた。サンプルは、各サンプル溶液（例えばショ糖、クエン酸等）内でランダムにバランスのとれた順番で提示された。
【０３８５】
試験の参加に選ばれるため、官能試験員は、妥当な数の誤りで、強度についてサンプルを正確に格付け評価することが要求された。ほぼ２５人がこの試験に合格した。
【０３８６】
上記試験で選ばれた官能検査員は、予備味覚試験の手順を行う資格があるとみなされた。予備味覚試験は、基本的な味覚と異味の強さについて新規な化合物を評価するため用いられるものである。官能検査員の小グループ（ｎ＝５）が、水又は緩衝液中の、そして、増強を評価するため、４％（ｗ／ｖ、１１７ｍＭ）ショ糖溶液中の、化合物の約５種類の濃度（典型的に１〜１００μＭの範囲において、（１／２）ｌｏｇサイクルで、例えば１、３、１０、３０、及び１００μＭで）の味見をする。典型的に、サンプルはさらに、水系溶液における化合物の分散を促進するため０．１％のエタノールを含む。官能検査員は、ＬＭＳにおいて、５つの基本的な味（甘味、塩味、酸味、苦味、及びうま味）並びに異味（例えば、化学薬品様の味、金属味、硫黄様の味）を評価する。サンプルは１０ｍｌずつ室温で出される。この試験の目的は、不快な異味のない最高濃度を決定することと、試験濃度のいずれかで明らかな甘味の増強があるかどうか判定することである。
【０３８７】
もし化合物が、効果的でありかつ不快な異味を有していないならば、該化合物は、訓練された（専門の）パネルによるさらに広範な研究で試験される。
【０３８８】
例えば、５名の官能検査員が、水中及び４％ショ糖溶液中１、３、１０、３０、及び１００μＭのＸＶＩ−３を評価した。化合物を含むすべてのサンプルは、エタノール（化合物の分散促進）について等しく０．１％とした。官能検査員は、各試験サンプルにつき、ＬＭＳを用いて基本的な味と異味を格付けするよう求められた。官能検査員があるサンプルを甘味であるとした場合、検査員は、等価な甘味を見積もるため、ショ糖のコントロールサンプル（２、４、６、８％ショ糖）を味見するよう求められた。
【０３８９】
訓練された（専門の）パネルを用いて、予備味覚試験で試験した化合物をさらに評価した。
【０３９０】
訓練されたパネルのための官能検査員は、資格のある味官能検査員のより大きな群から選ばれた。官能検査員は、ショ糖溶液を用いた実験を格付け評価することにより、甘味についてさらに訓練された。官能試験員は、甘味溶液を用いた一連のランク付け試験、評価試験、及び参照物質との差異の試験を完了させた。ランク付け及び評価の実験において、官能検査員はショ糖濃度（２、４、６、８％（ｗ／ｖ））を評価した。
【０３９１】
訓練されたパネルにより試験された化合物は、参照実験との差異で評価された。官能検査員は、種々の濃度（２、４、６、又は８％（ｗ／ｖ）ショ糖）の参照サンプルを与えられ、参照との甘味の差異について、−５〜＋５の尺度でサンプルを評価することを求められた（スコア：−５＝参照よりもかなり弱い甘味、０＝参照と同じ甘味、＋５＝参照よりもかなり強い甘味）。試験サンプルは、種々の量のショ糖及び化合物を含む溶液であった。典型的に、各セッションは、多数の試験サンプル（３桁の盲検コードでラベル）と参照サンプル（ＲＥＦとしてラベル）を比較した。試験は、典型的に、種々の濃度のショ糖を含む種々のサンプルとともに、パネルの正確さを評価するため、参照そのものである１つの盲検サンプルを含んだ。化合物は、４％又は６％のショ糖を含んだサンプル及び含まないサンプルにおいて参照に対して試験された。すべてのサンプルが１０ｍｌの容量で室温において出された。さらに、化合物単独の甘味を測定するため、参照溶液を、所定の濃度で調製し、ショ糖の甘味の閾値（２％）と比較した。
【０３９２】
実施例２０
うま味物質についてのＨＴＳプロトコル
ＨＥＫ−Ｇα１５細胞を、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３を誘導的に発現するよう設計した。ヒトのＴ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３に対してｐＧｅｎｅ由来ゼオシン耐性発現ベクター（Ｔ１Ｒ１に対しプラスミドＳＸＶ６０３、Ｔ１Ｒ３に対しＳＸＶ６１１）と、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈタンパク質を運ぶピューロマイシン耐性ｐＳｗｉｔｃｈ由来ベクター（プラスミドＳＸＶ６２８）とを線状化し、ＨＥＫ−Ｇα１５細胞株に共トランスフェクトした。ゼオシン耐性でかつピューロマイシン耐性のコロニーを選別し、増殖させ、種々の量のミフェプリストンで誘導し、うま味刺激物質に対する応答についてカルシウムイメージングにより試験した。ＧｌｕｔａＭＡＸ、（１０％透析ＦＢＳ、及び３μｇ／ｍｌブラストサイジンを補足したダルベッコ改変イーグル培地中、３７℃で、０．５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）及び１００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において細胞を選別した。耐性コロニーを増殖させ、１０−１０Ｍミフェプリストンで誘導した後、そのうま味刺激物質に対する応答を、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００２）９９（７）：４６９２−４６９６の方法に従う蛍光顕微鏡法により測定した。ＦＬＩＰＲ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）での自動化蛍光イメージングのため、１つのクローン（クローンＩ−１７と命名）からの細胞を、１０−１０Ｍミフェプリストンの存在下、９６ウェル又は３８４ウェルのプレートに播種（約８００００細胞／ウェル）し、４８時間インキュベートした。次いで、細胞を、ＰＢＳ中３μＭのカルシウム色素ｆｌｕｏ−４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に、室温で１．５時間さらした。５０μｌのＰＢＳで置換した後、種々の刺激物質を補足した５０μｌのＰＢＳを添加することにより、室温で刺激を行った。４つの個々の測定からの最大蛍光を、平均し、化合物添加前に測定したバックグラウンドの蛍光に対して補正し、そして、０．００２ｍＭイオノマイシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）への応答に対して正規化した。
【０３９３】
実施例２１
うま味物質についての味覚試験のプロトコル
官能試験者の基礎訓練：味検査員は、訓練において、文献に記載される三点比較法を用いることにより、以下の標準味化合物水溶液の味を評価した（各５ｍＬ、含んで吐き出す）。甘味についてショ糖（５０ｍＭ）、酸味についてクエン酸（５ｍＭ）又は乳酸（２０ｍＭ）、塩味についてＮａＣｌ（１２ｍＭ）、苦味についてキニーネ（１０μＭ）又はカフェイン（１ｍＭ）、及びうま味すなわち「セイボリー」味についてグルタミン酸一ナトリウム（８ｍＭ）。
【０３９４】
うま味についての訓練：味検査員は、３〜６０ｍＭのＭＳＧ及び０〜２００μＭのＩＭＰの範囲にある６つのＭＳＧ及び／又はＭＳＧ−ＩＭＰのサンプルを１〜３組、それぞれ濃度が高くなる順にトレイに並べて出された。この訓練は、用量応答評価を行う表題の訓練であった。次に、同じ６つのサンプルをランダムな順序で出して、さらなる組を作った。そして被験者は、それらのサンプルを強度が上がる順番に並べることを求められ、次いでそれらのうま味の強さを評価することを求められた。
【０３９５】
味検査員の資格付け：味検査員は、５対の呈味サンプルを用いる標準的な２肢強制選択（２ＡＦＣ）試験を受けた。味検査員は、２つのサンプル（一対）から最もうま味の高いサンプルを選ぶよう求められた。この試験は、２つの簡単な対と、中程度の難しさである２つの対と、難しい１つの対とを含む。中程度の難しさの対を識別できた味検査員が、官能検査員として選ばれた。
【０３９６】
小グループの官能検査員によるうま味増強物質候補（ＵＥＣ）のパイロット／定性的味覚試験：適当な濃度（通常１〜５０μＭ）の呈味サンプルは水で調製した（可溶性でない場合、最少量のアルコールを用いる）。うま味及び他の味について、３０及び／又は５０μＭのＵＥＣを単独で味見する。スクリーニング投票用紙上の適当なラベルド・マグニチュード・スケール（ＬＭＳ）においてそれらの味の特性を評価する。ＵＥＣについてうま味及び他の味がないか低い場合、次に弁別検査に移行させる。所定の濃度のＭＳＧ例えば１２ｍＭと１２ｍＭのＭＳＧ＋３０μＭのＵＥＣとを比較して、なんらかの増強があるかどうか判定する。スクリーニング試験用紙上の適当なＬＭＳにおいて、知覚されたうま味の強度を評価する。ＵＥＣ及び／又はＭＳＧの濃度を変えて最適な組合せを見出す。パネルスクリーニングにおいてどのような溶液を使用すべきか決定する。すべての手順及びデータ（研究の詳細、サンプルの調製、サンプルの配置、官能試験員用の投票用紙及び記入用紙、データ入力及び評価を含む）を記録する。
【０３９７】
ＵＥＣの２ＡＦＣパネルスクリーニング：上記パイロット試験から得られたプロトコルを用いて、資格を認められた官能検査員によりパネルスクリーニングを行う。すべての手順及びデータを記録する。もしあれば、統計的に有意な結果とともに総合報告を作成する。
【０３９８】
実施例２２
化合物２７２５７６１及び３７５６８０７についての定量的味覚試験
上述した手順に従い、化合物２７２５７６１及び３７５６８０７について定量的味覚試験を行った。それらによるうま味強度の添加物効果に加えて、それらがともにＭＳＧに対してある増強を示すことがわかった。
【０３９９】
実施例２３
化合物２７２５７６１及び３７５６８０７の合成
実施例２２に示す化合物２７２５７６１及び３７５６８０７を、それらの対応する酸及びアミンから調製する。生成物を、通常の方法、例えば塩基及び酸水溶液による洗浄、あるいは分取ＨＰＬＣによって精製する。それらの化合物の構造を、通常の分析法、例えばＮＭＲ及びＬＣＭＳに基づき確認した。この方法はまた、表１〜５にある化合物の任意のものを合成するのに用いることができる。
【０４００】
実施例２４
細胞系アッセイ
１０％ＦＢＳ及びＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において３７℃で細胞を増殖維持した。Ｇα１５細胞用培地はさらに３μｇ／ｍｌ−１のブラストサイジン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含んだ。カルシウムイメージング実験のため、細胞を、まず４８ウェル組織培養プレート上に播種（約３００００細胞／ウェル）し、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩｔ−２９３（ＰａｎＶｅｒａ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション効率（ＲＦＰ発現ベクターを用いる共トランスフェクションにより見積もった）は、典型的に約６０％であった。グルタミン酸による脱感作及びグルコースによる脱感作を最小限にするため、補足ＤＭＥＭを、トランスフェクション後約２４時間で、ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１０％透析ＦＢＳが補足された低グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に置き換えた。さらに２４時間後、ダルベッコＰＢＳ緩衝液（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中３μＭのカルシウム色素ｆｌｕｏ−４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に細胞を室温で１．５時間さらした。１００μｌのＤＰＢＳで置換した後、味刺激物質を補足された１００μｌのＤＰＢＳを添加することにより、室温において刺激を行った。倒立型１０Ｘ／０．５ＬＷＤ  ｐｌａｎｏ  ｆｌｕｏｒ対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）及び冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を装備するＡｘｉｏｖｅｒｔ  Ｓ１００顕微鏡において、カルシウム動員をモニターした。蛍光イメージを、４８０ｎｍの励起及び５３５ｎｍの発光において得、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ４．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて解析した。刺激物質添加後３０秒で応答細胞の数を数えることにより、Ｔ１Ｒ受容体の活性を定量した。
【図面の簡単な説明】
【０４０１】
【図１Ａ】図１は、ヒト及びラットのＴ１Ｒ類、ヒトのカルシウムセンシング受容体、及びラットのメタボトロピックグルタミン酸受容体の配列を整列させた様子を示す。
【図１Ｂ】図１は、ヒト及びラットのＴ１Ｒ類、ヒトのカルシウムセンシング受容体、及びラットのメタボトロピックグルタミン酸受容体の配列を整列させた様子を示す。
【図１Ｃ】図１は、ヒト及びラットのＴ１Ｒ類、ヒトのカルシウムセンシング受容体、及びラットのメタボトロピックグルタミン酸受容体の配列を整列させた様子を示す。
【図２】図２は、ＲＴ−ＰＣＲ増幅実験の結果を示し、それは、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３が味覚組織で発現されることを示している。
【図３−１】図３ａ〜ｂは、ヒトのＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトされたＧα１５を安定して発現するＨＥＫ細胞において、異なる甘味刺激物質によりもたらされる機能データ（細胞内カルシウム応答）を示しており、種々の濃度の甘味刺激物質に対するもの（図３ａ）、いくつかの甘味刺激物質についてヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の用量応答を示すもの（図３ｂ）、グルマリン存在下でのショ糖に対するヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の応答を示すもの、及びグルマリン存在下でのイソプロテレノールに対する内因性β２−アドレナリン受容体の応答を示すものがある。図３ｃは、異なる甘味料に対する正規化した応答性を示す。
【図３−２】図３ａ〜ｂは、ヒトのＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトされたＧα１５を安定して発現するＨＥＫ細胞において、異なる甘味刺激物質によりもたらされる機能データ（細胞内カルシウム応答）を示しており、種々の濃度の甘味刺激物質に対するもの（図３ａ）、いくつかの甘味刺激物質についてヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の用量応答を示すもの（図３ｂ）、グルマリン存在下でのショ糖に対するヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の応答を示すもの、及びグルマリン存在下でのイソプロテレノールに対する内因性β２−アドレナリン受容体の応答を示すものがある。図３ｃは、異なる甘味料に対する正規化した応答性を示す。
【図４】図４は、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３、ｒＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３、ｈＴ１Ｒ２／ｒＴ１Ｒ３、及びｒＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトされたＧα１５を安定して発現するＨＥＫ細胞の細胞内カルシウム応答を示しており、３５０ｍＭショ糖、２５ｍＭトリプトファン、１５ｍＭアスパルテーム、及び０．０５％モネリンに対する応答を示している。
【図５】図５は、蛍光プレートリアクターに基づくアッセイの結果を示す図であり、そこにおいて、Ｇα１５を安定に発現するＨＥＫ細胞は、ｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ３又はｈＴ１Ｒ３単独で一過的にトランスフェクトされ、そして、カルシウム色素Ｆｌｕｏ−４及び甘味刺激物質（１２．５ｍＭのシクラメート）に接触させられた。
【図６】図６は、正規化された用量応答曲線を示す図であり、それは、ｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ３が、種々の甘味刺激物質（ｔｒｐ、シクラメート、ショ糖、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリン、及びＡｃｅｋ）との用量特異的相互作用に基づき、共同でヒト甘味受容体として機能することを示している。
【図７】図７は、ｍＧｌｕＲ１及びＴ１Ｒ１に関する構造の情報を示しており、重要なリガンド結合残基がそれらの分子に認められることを示している。
【図８−１】図８ａ〜ｃは、細胞内のカルシウムに基づくアッセイにおいて、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトされたＧα１５を安定して発現するＨＥＫ細胞がグルタミン酸塩に応答することを明らかにしている機能データを示す。図８ａは、増加するグルタミン酸塩の濃度に対する細胞内カルシウムの増加を示し、図８ｂは、ＩＭＰ（２ｍＭ）、グルタミン酸塩（０．５ｍＭ）及び０．２ｍＭのＩＭＰに対する細胞内カルシウムの応答を示し、図８ｃは、０．２ｍＭのＩＭＰがある場合とない場合のグルタミン酸塩に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の応答を示す。
【図８−２】図８ａ〜ｃは、細胞内のカルシウムに基づくアッセイにおいて、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３で一過的にトランスフェクトされたＧα１５を安定して発現するＨＥＫ細胞がグルタミン酸塩に応答することを明らかにしている機能データを示す。図８ａは、増加するグルタミン酸塩の濃度に対する細胞内カルシウムの増加を示し、図８ｂは、ＩＭＰ（２ｍＭ）、グルタミン酸塩（０．５ｍＭ）及び０．２ｍＭのＩＭＰに対する細胞内カルシウムの応答を示し、図８ｃは、０．２ｍＭのＩＭＰがある場合とない場合のグルタミン酸塩に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の応答を示す。
【図９Ａ】図９ａ〜ｂはそれぞれ、Ｍｙｃでタグ化したｈＴ１Ｒ２及びＦＡＣＳ実験を用いた免疫蛍光染色アッセイの結果を示しており、ＰＤＺＩＰペプチド（配列番号１）の組み込みによって、原形質膜上でのＴ１Ｒ（ｈＴ１Ｒ２）の発現が高められたことを示している。
【図９Ｂ】図９ａ〜ｂはそれぞれ、Ｍｙｃでタグ化したｈＴ１Ｒ２及びＦＡＣＳ実験を用いた免疫蛍光染色アッセイの結果を示しており、ＰＤＺＩＰペプチド（配列番号１）の組み込みによって、原形質膜上でのＴ１Ｒ（ｈＴ１Ｒ２）の発現が高められたことを示している。
【図１０】図１０ａ〜ｂは、種々の甘味刺激物質にｈ１ＴＲ２／ｈＴ１Ｒ３が応答することを明らかにしているカルシウムイメージングデータを示す。
【図１１】図１１は、ｈＴ１Ｒ１／ｈＴ１Ｒ３を安定に発現する細胞株の自動化蛍光イメージングによるうま味刺激物質への応答を示す図である。
【図１２】図１２は、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を安定に発現する細胞株の自動化蛍光イメージングによる甘味刺激物質への応答を示す図である。
【図１３】図１３は、０．２ｍＭのＩＭＰがある場合とない場合のＬ−グルタミン酸塩に対する用量応答曲線を示す図であり、それは、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３味覚受容体を誘導的に発現する細胞株についての自動化蛍光イメージングを用いて測定されたものである。
【図１４】図１４は、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３味覚受容体を誘導的に発現する細胞株（Ｉ−１７クローン）のＬ−アミノ酸のパネルに対する応答を示す図である。図１４では、１ｍＭのＩＭＰがある場合とない場合において１４の異なるＣ−アミノ酸１０ｍＭが試験された。
【図１５】図１５は、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３味覚受容体を誘導的に発現する細胞株（Ｉ−１７クローン）のＬ−アミノ酸のパネルに対する応答を示す図である。図１５では、０．２ｍＭのＩＭＰ存在下、活性のあるアミノ酸について用量応答が測定された。
【図１６】図１６は、ヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３及びヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３の受容体活性がラクチソール（ｌａｃｔｉｓｏｌｅ）によって阻害されることを示す図である。
【図１７】図１７は、ヒト−ラットＴ１Ｒのキメラの模式図を示す。これらのキメラは、ｈ２−ｒ２、ｒ２−ｈ２、ｈ３−ｒ３、及びｒ３−ｈ３に示すように、ヒト又はラットの細胞外ドメインとラット又はヒトの膜貫通ドメインとをそれぞれ融合することにより構築される。
【図１８】図１８は、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）がＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体の活性を高めることを示す図である。［ネオヘスペリジンジヒドロカルコン］＝５μＭ。グルタミン酸塩の用量応答曲線は、２．３倍左側にシフトさせられ（左パネル）、そして、グルタミン酸塩／ＩＭＰの用量応答は２．１倍左側にシフトさせられている。
【図１９Ａ】図１９は、コントロール甘味料がＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体の活性に影響しないことを示す図である。［ステビオシド］＝０．５ｍＭ。［サッカリン］＝１ｍＭ。グルタミン酸塩の用量応答性は左パネルに示され、グルタミン酸塩／ＩＭＰの用量応答性は右パネルに示される。
【図１９Ｂ】図１９は、コントロール甘味料がＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体の活性に影響しないことを示す図である。［ステビオシド］＝０．５ｍＭ。［サッカリン］＝１ｍＭ。グルタミン酸塩の用量応答性は左パネルに示され、グルタミン酸塩／ＩＭＰの用量応答性は右パネルに示される。
【図２０】図２０は、ヒトＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインに対するＮＨＤＣマップを示す図である。
【図２１】図２１は、ヒトＴ１Ｒ２膜貫通ドメインに対する化合物のマッピングを示す。
【図２２Ａ】図２２ａ〜ｄは、ヒト甘味受容体の異なるドメイン／サブユニットを位置づける複数の甘味料を示している。図２２ａは、ラクチソール（１ｍＭ）（Ｓｕｃ／Ｌａｃ）の存在下における、ヒト及びラットの甘味受容体のショ糖（２００ｍＭ）、アスパルテーム（１０ｍＭ）、ネオテーム（０．１ｍＭ）、シクラメート（１０ｍＭ）、及びショ糖（２００ｍＭ）に対する応答を示している。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞が、ヒト又はラットのＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びＧα１５キメラＧα１５／ｉｌで一過的にトランスフェクトされ、そして、甘味料に対する細胞内カルシウム増加について検定された。図２２ｂは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインに対するアスパルテーム及びネオテームの位置づけを示している。Ｔ１Ｒキメラの組合せが、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、２３ａに列挙するような濃度で甘味料に対する応答について検定された。応答の有無が重要なところである。図２２ｃは、ヒトＴ１Ｒ３のＣ末端膜貫通ドメインに対するシクラメートの位置づけを示す。図２２ｄは、ヒトＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインに対するラクチソールの位置づけを示す。Ｔ１Ｒキメラの異なる組合せが、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、ラクチソール（１ｍＭ）がある場合とない場合で、ショ糖（２００ｍＭ）及びＡｃｅＫ（１０ｍＭ）に対する応答について検定された。Ｂ、Ｃ及びＤにおける活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表されている。
【図２２Ｂ】図２２ａ〜ｄは、ヒト甘味受容体の異なるドメイン／サブユニットを位置づける複数の甘味料を示している。図２２ａは、ラクチソール（１ｍＭ）（Ｓｕｃ／Ｌａｃ）の存在下における、ヒト及びラットの甘味受容体のショ糖（２００ｍＭ）、アスパルテーム（１０ｍＭ）、ネオテーム（０．１ｍＭ）、シクラメート（１０ｍＭ）、及びショ糖（２００ｍＭ）に対する応答を示している。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞が、ヒト又はラットのＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びＧα１５キメラＧα１５／ｉｌで一過的にトランスフェクトされ、そして、甘味料に対する細胞内カルシウム増加について検定された。図２２ｂは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインに対するアスパルテーム及びネオテームの位置づけを示している。Ｔ１Ｒキメラの組合せが、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、２３ａに列挙するような濃度で甘味料に対する応答について検定された。応答の有無が重要なところである。図２２ｃは、ヒトＴ１Ｒ３のＣ末端膜貫通ドメインに対するシクラメートの位置づけを示す。図２２ｄは、ヒトＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインに対するラクチソールの位置づけを示す。Ｔ１Ｒキメラの異なる組合せが、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、ラクチソール（１ｍＭ）がある場合とない場合で、ショ糖（２００ｍＭ）及びＡｃｅＫ（１０ｍＭ）に対する応答について検定された。Ｂ、Ｃ及びＤにおける活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表されている。
【図２２Ｃ】図２２ａ〜ｄは、ヒト甘味受容体の異なるドメイン／サブユニットを位置づける複数の甘味料を示している。図２２ａは、ラクチソール（１ｍＭ）（Ｓｕｃ／Ｌａｃ）の存在下における、ヒト及びラットの甘味受容体のショ糖（２００ｍＭ）、アスパルテーム（１０ｍＭ）、ネオテーム（０．１ｍＭ）、シクラメート（１０ｍＭ）、及びショ糖（２００ｍＭ）に対する応答を示している。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞が、ヒト又はラットのＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びＧα１５キメラＧα１５／ｉｌで一過的にトランスフェクトされ、そして、甘味料に対する細胞内カルシウム増加について検定された。図２２ｂは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインに対するアスパルテーム及びネオテームの位置づけを示している。Ｔ１Ｒキメラの組合せが、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、２３ａに列挙するような濃度で甘味料に対する応答について検定された。応答の有無が重要なところである。図２２ｃは、ヒトＴ１Ｒ３のＣ末端膜貫通ドメインに対するシクラメートの位置づけを示す。図２２ｄは、ヒトＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインに対するラクチソールの位置づけを示す。Ｔ１Ｒキメラの異なる組合せが、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、ラクチソール（１ｍＭ）がある場合とない場合で、ショ糖（２００ｍＭ）及びＡｃｅＫ（１０ｍＭ）に対する応答について検定された。Ｂ、Ｃ及びＤにおける活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表されている。
【図２２Ｄ】図２２ａ〜ｄは、ヒト甘味受容体の異なるドメイン／サブユニットを位置づける複数の甘味料を示している。図２２ａは、ラクチソール（１ｍＭ）（Ｓｕｃ／Ｌａｃ）の存在下における、ヒト及びラットの甘味受容体のショ糖（２００ｍＭ）、アスパルテーム（１０ｍＭ）、ネオテーム（０．１ｍＭ）、シクラメート（１０ｍＭ）、及びショ糖（２００ｍＭ）に対する応答を示している。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞が、ヒト又はラットのＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びＧα１５キメラＧα１５／ｉｌで一過的にトランスフェクトされ、そして、甘味料に対する細胞内カルシウム増加について検定された。図２２ｂは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインに対するアスパルテーム及びネオテームの位置づけを示している。Ｔ１Ｒキメラの組合せが、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、２３ａに列挙するような濃度で甘味料に対する応答について検定された。応答の有無が重要なところである。図２２ｃは、ヒトＴ１Ｒ３のＣ末端膜貫通ドメインに対するシクラメートの位置づけを示す。図２２ｄは、ヒトＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインに対するラクチソールの位置づけを示す。Ｔ１Ｒキメラの異なる組合せが、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、ラクチソール（１ｍＭ）がある場合とない場合で、ショ糖（２００ｍＭ）及びＡｃｅＫ（１０ｍＭ）に対する応答について検定された。Ｂ、Ｃ及びＤにおける活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表されている。
【図２３Ａ】図２３ａ〜ｄは、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３における突然変異が、異なる甘味料の活性に選択的に作用することを示す図である。図２３ａは、ラットｍＧｌｕＲ５のＮ末端リガンド結合ドメインとヒト及びネズミのＴ１Ｒ２との配列の整合を示す。ｍＧｌｕＲ５においてリガンド結合に関与する８つの重要なアミノ酸に＊印をつけている。８つのアミノ酸のうち３つは、Ｔ１Ｒ２において保存されており、下線が施されている。図２３ｂは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインにおける２つの点変異を示しており、それらは、シクラメートへの影響なく、アスパルテーム及びネオテームに対する応答を消失させている。ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３（ＷＴ）、ｈＴ１Ｒ２のＳ１４４Ａ／ｈＴ１Ｒ３（Ｓ１４４Ａ）及びｈＴ１Ｒ２のＥ３０２Ａ／ｈＴ１Ｒ３（Ｅ３０２Ａ）の安定な細胞株は、実施例に記載するように生成させた。これらの安定な細胞株の用量応答を、ショ糖、アスパルテーム、ネオテーム、及びシクラメートに対し、ＦＬＩＰＲにおいて測定した。これらの活性は、４つの記録されたウェルに対し、蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。図２３ｃは、ヒト及びネズミのＴ１Ｒ３膜貫通ドメインの配列の整合を示している。その３つの細胞外ループには、下線が引かれ、タンパク質配列におけるそれらの順序に従ってＥＬ１、２又は３の表示がついている。図２３ｄは、ｈＴ１Ｒ３の細胞外ループにおける突然変異を示しており、それは、アスパルテームへの影響なくシクラメートに対する応答を消失させている。ｈＴ１Ｒ３の３つの細胞外ループのそれぞれが、別々にラットタンパク質配列で置換された。得られたｈＴ１Ｒ３突然変異物は、Ｇα１５／ｉｌとともにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、ショ糖（２００ｍＭ）、アスパルテーム（１０ｍＭ）及びシクラメート（１０ｍＭ）に対する応答について検定された。活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表される。
【図２３Ｂ】図２３ａ〜ｄは、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３における突然変異が、異なる甘味料の活性に選択的に作用することを示す図である。図２３ａは、ラットｍＧｌｕＲ５のＮ末端リガンド結合ドメインとヒト及びネズミのＴ１Ｒ２との配列の整合を示す。ｍＧｌｕＲ５においてリガンド結合に関与する８つの重要なアミノ酸に＊印をつけている。８つのアミノ酸のうち３つは、Ｔ１Ｒ２において保存されており、下線が施されている。図２３ｂは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインにおける２つの点変異を示しており、それらは、シクラメートへの影響なく、アスパルテーム及びネオテームに対する応答を消失させている。ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３（ＷＴ）、ｈＴ１Ｒ２のＳ１４４Ａ／ｈＴ１Ｒ３（Ｓ１４４Ａ）及びｈＴ１Ｒ２のＥ３０２Ａ／ｈＴ１Ｒ３（Ｅ３０２Ａ）の安定な細胞株は、実施例に記載するように生成させた。これらの安定な細胞株の用量応答を、ショ糖、アスパルテーム、ネオテーム、及びシクラメートに対し、ＦＬＩＰＲにおいて測定した。これらの活性は、４つの記録されたウェルに対し、蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。図２３ｃは、ヒト及びネズミのＴ１Ｒ３膜貫通ドメインの配列の整合を示している。その３つの細胞外ループには、下線が引かれ、タンパク質配列におけるそれらの順序に従ってＥＬ１、２又は３の表示がついている。図２３ｄは、ｈＴ１Ｒ３の細胞外ループにおける突然変異を示しており、それは、アスパルテームへの影響なくシクラメートに対する応答を消失させている。ｈＴ１Ｒ３の３つの細胞外ループのそれぞれが、別々にラットタンパク質配列で置換された。得られたｈＴ１Ｒ３突然変異物は、Ｇα１５／ｉｌとともにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、ショ糖（２００ｍＭ）、アスパルテーム（１０ｍＭ）及びシクラメート（１０ｍＭ）に対する応答について検定された。活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表される。
【図２３Ｃ】図２３ａ〜ｄは、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３における突然変異が、異なる甘味料の活性に選択的に作用することを示す図である。図２３ａは、ラットｍＧｌｕＲ５のＮ末端リガンド結合ドメインとヒト及びネズミのＴ１Ｒ２との配列の整合を示す。ｍＧｌｕＲ５においてリガンド結合に関与する８つの重要なアミノ酸に＊印をつけている。８つのアミノ酸のうち３つは、Ｔ１Ｒ２において保存されており、下線が施されている。図２３ｂは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインにおける２つの点変異を示しており、それらは、シクラメートへの影響なく、アスパルテーム及びネオテームに対する応答を消失させている。ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３（ＷＴ）、ｈＴ１Ｒ２のＳ１４４Ａ／ｈＴ１Ｒ３（Ｓ１４４Ａ）及びｈＴ１Ｒ２のＥ３０２Ａ／ｈＴ１Ｒ３（Ｅ３０２Ａ）の安定な細胞株は、実施例に記載するように生成させた。これらの安定な細胞株の用量応答を、ショ糖、アスパルテーム、ネオテーム、及びシクラメートに対し、ＦＬＩＰＲにおいて測定した。これらの活性は、４つの記録されたウェルに対し、蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。図２３ｃは、ヒト及びネズミのＴ１Ｒ３膜貫通ドメインの配列の整合を示している。その３つの細胞外ループには、下線が引かれ、タンパク質配列におけるそれらの順序に従ってＥＬ１、２又は３の表示がついている。図２３ｄは、ｈＴ１Ｒ３の細胞外ループにおける突然変異を示しており、それは、アスパルテームへの影響なくシクラメートに対する応答を消失させている。ｈＴ１Ｒ３の３つの細胞外ループのそれぞれが、別々にラットタンパク質配列で置換された。得られたｈＴ１Ｒ３突然変異物は、Ｇα１５／ｉｌとともにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、ショ糖（２００ｍＭ）、アスパルテーム（１０ｍＭ）及びシクラメート（１０ｍＭ）に対する応答について検定された。活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表される。
【図２３Ｄ】図２３ａ〜ｄは、Ｔ１Ｒ２又はＴ１Ｒ３における突然変異が、異なる甘味料の活性に選択的に作用することを示す図である。図２３ａは、ラットｍＧｌｕＲ５のＮ末端リガンド結合ドメインとヒト及びネズミのＴ１Ｒ２との配列の整合を示す。ｍＧｌｕＲ５においてリガンド結合に関与する８つの重要なアミノ酸に＊印をつけている。８つのアミノ酸のうち３つは、Ｔ１Ｒ２において保存されており、下線が施されている。図２３ｂは、ヒトＴ１Ｒ２のＮ末端細胞外ドメインにおける２つの点変異を示しており、それらは、シクラメートへの影響なく、アスパルテーム及びネオテームに対する応答を消失させている。ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３（ＷＴ）、ｈＴ１Ｒ２のＳ１４４Ａ／ｈＴ１Ｒ３（Ｓ１４４Ａ）及びｈＴ１Ｒ２のＥ３０２Ａ／ｈＴ１Ｒ３（Ｅ３０２Ａ）の安定な細胞株は、実施例に記載するように生成させた。これらの安定な細胞株の用量応答を、ショ糖、アスパルテーム、ネオテーム、及びシクラメートに対し、ＦＬＩＰＲにおいて測定した。これらの活性は、４つの記録されたウェルに対し、蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。図２３ｃは、ヒト及びネズミのＴ１Ｒ３膜貫通ドメインの配列の整合を示している。その３つの細胞外ループには、下線が引かれ、タンパク質配列におけるそれらの順序に従ってＥＬ１、２又は３の表示がついている。図２３ｄは、ｈＴ１Ｒ３の細胞外ループにおける突然変異を示しており、それは、アスパルテームへの影響なくシクラメートに対する応答を消失させている。ｈＴ１Ｒ３の３つの細胞外ループのそれぞれが、別々にラットタンパク質配列で置換された。得られたｈＴ１Ｒ３突然変異物は、Ｇα１５／ｉｌとともにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされ、そして、ショ糖（２００ｍＭ）、アスパルテーム（１０ｍＭ）及びシクラメート（１０ｍＭ）に対する応答について検定された。活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表される。
【図２４Ａ】図２４ａ〜ｂは、ヒトＴ１Ｒ２がＧα１５結合に必要であることを示している。図２４ａは、ショ糖（２００ｍＭ）及びＡｃｅＫ（１０ｍＭ）に対するヒト、ラット及びキメラの甘味受容体の応答を示している。安定なＧα１５細胞が、ヒト、ラット又はキメラのＴ１Ｒで一過的にトランスフェクトされ、そして、甘味料に対する細胞内カルシウム増加について検定された。図２４ｂは、Ｇα１５結合がヒトＴ１Ｒ２により媒介されることを示す。その活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表される。
【図２４Ｂ】図２４ａ〜ｂは、ヒトＴ１Ｒ２がＧα１５結合に必要であることを示している。図２４ａは、ショ糖（２００ｍＭ）及びＡｃｅＫ（１０ｍＭ）に対するヒト、ラット及びキメラの甘味受容体の応答を示している。安定なＧα１５細胞が、ヒト、ラット又はキメラのＴ１Ｒで一過的にトランスフェクトされ、そして、甘味料に対する細胞内カルシウム増加について検定された。図２４ｂは、Ｇα１５結合がヒトＴ１Ｒ２により媒介されることを示す。その活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表される。
【図２５Ａ】図２５ａ〜ｆは、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体に対するラクチソール及びシクラメートの効果を示す。図２５ａは、ラクチソール（５ｍＭ）がある場合とない場合のＬ−グルタミン酸塩（５ｍＭ）及びＬ−グルタミン酸塩／ＩＭＰ（１／０．２ｍＭ）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｂは、それぞれ２つの異なる濃度で、Ｌ−グルタミン酸塩（Ｇｌｕ）とＬ−グルタミン酸塩＋０．２ｍＭＩＭＰ（Ｇｌｕ／ＩＭＰ）について測定されたラクチソールの用量依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓはそれぞれ、８及び８０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩について０．１９±０．０２ｍＭ及び０．２１±０．０１ｍＭであり、０．８及び８ｍＭのＬ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて０．３５±０．０３ｍＭ及び０．８２±０．０６ｍＭである。図２５ｃは、異なる濃度のラクチソールの存在下で測定された０．２ｍＭのＩＭＰを併用する場合としない場合のＬ−グルタミン酸塩に対する用量応答性を示している。０、２５、又は５０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩について、９．９±１．５ｍＭ、７．９±０．５ｍＭ、及び７．０±０．３ｍＭである。０、１００、又は２００μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて、０．５３±０．０４ｍＭ、０．７１±０．１０ｍＭ、及び０．８４±０．１０ｍＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。図２５ｄは、ラクチソールがある場合とない場合で測定された甘味、うま味、及び塩味の刺激物質に対する検知閾値を示す。ラクチソールの阻害効果は、検知閾値の増加倍数として示される。「検知閾値」は、検知可能な味物質の下限値として定義される。検知閾値は、三人の被験者について４回試験した結果の平均値であった。図２５ｅは、種々の濃度のシクラメートが存在する場合としない場合においてＦＬＩＰＲで検定された閾値レベルのＬ−グルタミン酸塩（４ｍＭ）及び内因性Ｍ２受容体アゴニスト（カルバコール）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｆは、シクラメート（８ｍＭ）が存在する場合としない場合において、０．２ｍＭのＩＭＰを併用した又は併用しないＬ−グルタミン酸塩に対してＦＬＩＰＲで測定されたヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の用量−応答を示している。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦにおける活性は、４つの記録されたウェルについての蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦの用量−応答は、それぞれ６回以上再現された。
【図２５Ｂ】図２５ａ〜ｆは、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体に対するラクチソール及びシクラメートの効果を示す。図２５ａは、ラクチソール（５ｍＭ）がある場合とない場合のＬ−グルタミン酸塩（５ｍＭ）及びＬ−グルタミン酸塩／ＩＭＰ（１／０．２ｍＭ）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｂは、それぞれ２つの異なる濃度で、Ｌ−グルタミン酸塩（Ｇｌｕ）とＬ−グルタミン酸塩＋０．２ｍＭＩＭＰ（Ｇｌｕ／ＩＭＰ）について測定されたラクチソールの用量依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓはそれぞれ、８及び８０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩について０．１９±０．０２ｍＭ及び０．２１±０．０１ｍＭであり、０．８及び８ｍＭのＬ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて０．３５±０．０３ｍＭ及び０．８２±０．０６ｍＭである。図２５ｃは、異なる濃度のラクチソールの存在下で測定された０．２ｍＭのＩＭＰを併用する場合としない場合のＬ−グルタミン酸塩に対する用量応答性を示している。０、２５、又は５０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩について、９．９±１．５ｍＭ、７．９±０．５ｍＭ、及び７．０±０．３ｍＭである。０、１００、又は２００μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて、０．５３±０．０４ｍＭ、０．７１±０．１０ｍＭ、及び０．８４±０．１０ｍＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。図２５ｄは、ラクチソールがある場合とない場合で測定された甘味、うま味、及び塩味の刺激物質に対する検知閾値を示す。ラクチソールの阻害効果は、検知閾値の増加倍数として示される。「検知閾値」は、検知可能な味物質の下限値として定義される。検知閾値は、三人の被験者について４回試験した結果の平均値であった。図２５ｅは、種々の濃度のシクラメートが存在する場合としない場合においてＦＬＩＰＲで検定された閾値レベルのＬ−グルタミン酸塩（４ｍＭ）及び内因性Ｍ２受容体アゴニスト（カルバコール）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｆは、シクラメート（８ｍＭ）が存在する場合としない場合において、０．２ｍＭのＩＭＰを併用した又は併用しないＬ−グルタミン酸塩に対してＦＬＩＰＲで測定されたヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の用量−応答を示している。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦにおける活性は、４つの記録されたウェルについての蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦの用量−応答は、それぞれ６回以上再現された。
【図２５Ｃ】図２５ａ〜ｆは、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体に対するラクチソール及びシクラメートの効果を示す。図２５ａは、ラクチソール（５ｍＭ）がある場合とない場合のＬ−グルタミン酸塩（５ｍＭ）及びＬ−グルタミン酸塩／ＩＭＰ（１／０．２ｍＭ）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｂは、それぞれ２つの異なる濃度で、Ｌ−グルタミン酸塩（Ｇｌｕ）とＬ−グルタミン酸塩＋０．２ｍＭＩＭＰ（Ｇｌｕ／ＩＭＰ）について測定されたラクチソールの用量依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓはそれぞれ、８及び８０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩について０．１９±０．０２ｍＭ及び０．２１±０．０１ｍＭであり、０．８及び８ｍＭのＬ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて０．３５±０．０３ｍＭ及び０．８２±０．０６ｍＭである。図２５ｃは、異なる濃度のラクチソールの存在下で測定された０．２ｍＭのＩＭＰを併用する場合としない場合のＬ−グルタミン酸塩に対する用量応答性を示している。０、２５、又は５０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩について、９．９±１．５ｍＭ、７．９±０．５ｍＭ、及び７．０±０．３ｍＭである。０、１００、又は２００μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて、０．５３±０．０４ｍＭ、０．７１±０．１０ｍＭ、及び０．８４±０．１０ｍＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。図２５ｄは、ラクチソールがある場合とない場合で測定された甘味、うま味、及び塩味の刺激物質に対する検知閾値を示す。ラクチソールの阻害効果は、検知閾値の増加倍数として示される。「検知閾値」は、検知可能な味物質の下限値として定義される。検知閾値は、三人の被験者について４回試験した結果の平均値であった。図２５ｅは、種々の濃度のシクラメートが存在する場合としない場合においてＦＬＩＰＲで検定された閾値レベルのＬ−グルタミン酸塩（４ｍＭ）及び内因性Ｍ２受容体アゴニスト（カルバコール）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｆは、シクラメート（８ｍＭ）が存在する場合としない場合において、０．２ｍＭのＩＭＰを併用した又は併用しないＬ−グルタミン酸塩に対してＦＬＩＰＲで測定されたヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の用量−応答を示している。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦにおける活性は、４つの記録されたウェルについての蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦの用量−応答は、それぞれ６回以上再現された。
【図２５Ｄ】図２５ａ〜ｆは、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体に対するラクチソール及びシクラメートの効果を示す。図２５ａは、ラクチソール（５ｍＭ）がある場合とない場合のＬ−グルタミン酸塩（５ｍＭ）及びＬ−グルタミン酸塩／ＩＭＰ（１／０．２ｍＭ）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｂは、それぞれ２つの異なる濃度で、Ｌ−グルタミン酸塩（Ｇｌｕ）とＬ−グルタミン酸塩＋０．２ｍＭＩＭＰ（Ｇｌｕ／ＩＭＰ）について測定されたラクチソールの用量依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓはそれぞれ、８及び８０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩について０．１９±０．０２ｍＭ及び０．２１±０．０１ｍＭであり、０．８及び８ｍＭのＬ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて０．３５±０．０３ｍＭ及び０．８２±０．０６ｍＭである。図２５ｃは、異なる濃度のラクチソールの存在下で測定された０．２ｍＭのＩＭＰを併用する場合としない場合のＬ−グルタミン酸塩に対する用量応答性を示している。０、２５、又は５０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩について、９．９±１．５ｍＭ、７．９±０．５ｍＭ、及び７．０±０．３ｍＭである。０、１００、又は２００μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて、０．５３±０．０４ｍＭ、０．７１±０．１０ｍＭ、及び０．８４±０．１０ｍＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。図２５ｄは、ラクチソールがある場合とない場合で測定された甘味、うま味、及び塩味の刺激物質に対する検知閾値を示す。ラクチソールの阻害効果は、検知閾値の増加倍数として示される。「検知閾値」は、検知可能な味物質の下限値として定義される。検知閾値は、三人の被験者について４回試験した結果の平均値であった。図２５ｅは、種々の濃度のシクラメートが存在する場合としない場合においてＦＬＩＰＲで検定された閾値レベルのＬ−グルタミン酸塩（４ｍＭ）及び内因性Ｍ２受容体アゴニスト（カルバコール）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｆは、シクラメート（８ｍＭ）が存在する場合としない場合において、０．２ｍＭのＩＭＰを併用した又は併用しないＬ−グルタミン酸塩に対してＦＬＩＰＲで測定されたヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の用量−応答を示している。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦにおける活性は、４つの記録されたウェルについての蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦの用量−応答は、それぞれ６回以上再現された。
【図２５Ｅ】図２５ａ〜ｆは、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体に対するラクチソール及びシクラメートの効果を示す。図２５ａは、ラクチソール（５ｍＭ）がある場合とない場合のＬ−グルタミン酸塩（５ｍＭ）及びＬ−グルタミン酸塩／ＩＭＰ（１／０．２ｍＭ）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｂは、それぞれ２つの異なる濃度で、Ｌ−グルタミン酸塩（Ｇｌｕ）とＬ−グルタミン酸塩＋０．２ｍＭＩＭＰ（Ｇｌｕ／ＩＭＰ）について測定されたラクチソールの用量依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓはそれぞれ、８及び８０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩について０．１９±０．０２ｍＭ及び０．２１±０．０１ｍＭであり、０．８及び８ｍＭのＬ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて０．３５±０．０３ｍＭ及び０．８２±０．０６ｍＭである。図２５ｃは、異なる濃度のラクチソールの存在下で測定された０．２ｍＭのＩＭＰを併用する場合としない場合のＬ−グルタミン酸塩に対する用量応答性を示している。０、２５、又は５０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩について、９．９±１．５ｍＭ、７．９±０．５ｍＭ、及び７．０±０．３ｍＭである。０、１００、又は２００μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて、０．５３±０．０４ｍＭ、０．７１±０．１０ｍＭ、及び０．８４±０．１０ｍＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。図２５ｄは、ラクチソールがある場合とない場合で測定された甘味、うま味、及び塩味の刺激物質に対する検知閾値を示す。ラクチソールの阻害効果は、検知閾値の増加倍数として示される。「検知閾値」は、検知可能な味物質の下限値として定義される。検知閾値は、三人の被験者について４回試験した結果の平均値であった。図２５ｅは、種々の濃度のシクラメートが存在する場合としない場合においてＦＬＩＰＲで検定された閾値レベルのＬ−グルタミン酸塩（４ｍＭ）及び内因性Ｍ２受容体アゴニスト（カルバコール）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｆは、シクラメート（８ｍＭ）が存在する場合としない場合において、０．２ｍＭのＩＭＰを併用した又は併用しないＬ−グルタミン酸塩に対してＦＬＩＰＲで測定されたヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の用量−応答を示している。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦにおける活性は、４つの記録されたウェルについての蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦの用量−応答は、それぞれ６回以上再現された。
【図２５Ｆ】図２５ａ〜ｆは、ヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体に対するラクチソール及びシクラメートの効果を示す。図２５ａは、ラクチソール（５ｍＭ）がある場合とない場合のＬ−グルタミン酸塩（５ｍＭ）及びＬ−グルタミン酸塩／ＩＭＰ（１／０．２ｍＭ）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｂは、それぞれ２つの異なる濃度で、Ｌ−グルタミン酸塩（Ｇｌｕ）とＬ−グルタミン酸塩＋０．２ｍＭＩＭＰ（Ｇｌｕ／ＩＭＰ）について測定されたラクチソールの用量依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓはそれぞれ、８及び８０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩について０．１９±０．０２ｍＭ及び０．２１±０．０１ｍＭであり、０．８及び８ｍＭのＬ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて０．３５±０．０３ｍＭ及び０．８２±０．０６ｍＭである。図２５ｃは、異なる濃度のラクチソールの存在下で測定された０．２ｍＭのＩＭＰを併用する場合としない場合のＬ−グルタミン酸塩に対する用量応答性を示している。０、２５、又は５０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩について、９．９±１．５ｍＭ、７．９±０．５ｍＭ、及び７．０±０．３ｍＭである。０、１００、又は２００μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、Ｌ−グルタミン酸塩＋ＩＭＰについて、０．５３±０．０４ｍＭ、０．７１±０．１０ｍＭ、及び０．８４±０．１０ｍＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。図２５ｄは、ラクチソールがある場合とない場合で測定された甘味、うま味、及び塩味の刺激物質に対する検知閾値を示す。ラクチソールの阻害効果は、検知閾値の増加倍数として示される。「検知閾値」は、検知可能な味物質の下限値として定義される。検知閾値は、三人の被験者について４回試験した結果の平均値であった。図２５ｅは、種々の濃度のシクラメートが存在する場合としない場合においてＦＬＩＰＲで検定された閾値レベルのＬ−グルタミン酸塩（４ｍＭ）及び内因性Ｍ２受容体アゴニスト（カルバコール）に対するヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の応答を示している。図２５ｆは、シクラメート（８ｍＭ）が存在する場合としない場合において、０．２ｍＭのＩＭＰを併用した又は併用しないＬ−グルタミン酸塩に対してＦＬＩＰＲで測定されたヒトＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３安定細胞株の用量−応答を示している。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦにおける活性は、４つの記録されたウェルについての蛍光強度の増加倍数の平均±ＳＥで表される。Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦの用量−応答は、それぞれ６回以上再現された。
【図２６】図２６は、甘味及びうま味の受容体の構造と機能との関係について作動モデルを示す図である。黒い矢印は直接的な活性化を示し、白い矢印は増強を示し、先端の棒は阻害を示す。
【図２７Ａ】図２７ａは、Ｔ１Ｒ類とキメラ類の１６すべての組合せを示す図であり、それらは、甘味料及びラクチソールに対する応答について試験された。ｒＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３Ｈ−Ｒ、ｒＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３、及びＴ１Ｒ２Ｈ−Ｒ／Ｔ１Ｒ３Ｒ−Ｈは、シクラメートに対して有意な応答を示し、そして、それらは、ラクチソールによって阻害することができる。Ｔ１Ｒキメラは、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされた。活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表され、Ｙ軸上の各単位は５０の応答細胞を表している。略号は以下のとおりである。Ｓｕｃ（ショ糖１００ｍＭ）、Ｓｕｃ／Ｌａｃ（ショ糖１００ｍＭ、ラクチソール１ｍＭ）、ＡｃｅＫ（アセスルファムＫ１０ｍＭ）、ＡｃｅＫ／Ｌａｃ（アセスルファムＫ１０ｍＭ、ラクチソール１ｍＭ）、ＡＴＭ（アスパルテーム１０ｍＭ）、ＮＴＭ（ネオテーム１０ｍＭ）、Ｃｙｃ（シクラメート１０ｍＭ）。図２７ｂは、それぞれ２つの異なる濃度のショ糖（Ｓｕｃ）、サッカリン（Ｓａｃ）、及びＤ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）に対して測定されたヒト甘味受容体のラクチソール用量−依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓは、５０ｍＭ及び１２０ｍＭのショ糖についてそれぞれ１９．６±０．１μＭ及び６４．６±０．３μＭであり、０．１及び２ｍＭのサッカリンについてそれぞれ２２．６±０．１μＭ及び１０３±７μＭであり、Ｄ−トリプトファンについてそれぞれ１９．９±０．２μＭ及び１６８±９μＭである。図２７ｃは、異なる濃度のラクチソールを用いて測定されたショ糖、Ｄ−Ｔｒｐ及びサッカリンに対するヒト甘味受容体の用量応答性を示す。０、１０、又は２０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、ショ糖について、１９．４±０．９ｍＭ、２４．７±１．０ｍＭ、及び３１．３±０．３ｍＭであり、Ｄ−Ｔｒｐについて０．３７±０．０２ｍＭ、０．６０±０．０３ｍＭ、０．９４±０．０８ｍＭであり、サッカリンについて４２±３μＭ、６７±６μＭ、１１８±２μＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。Ｂ及びＣにおける用量応答は、それぞれ６回以上測定され、ここに示すのと同様の結果が得られた。
【図２７Ｂ】図２７ａは、Ｔ１Ｒ類とキメラ類の１６すべての組合せを示す図であり、それらは、甘味料及びラクチソールに対する応答について試験された。ｒＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３Ｈ−Ｒ、ｒＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３、及びＴ１Ｒ２Ｈ−Ｒ／Ｔ１Ｒ３Ｒ−Ｈは、シクラメートに対して有意な応答を示し、そして、それらは、ラクチソールによって阻害することができる。Ｔ１Ｒキメラは、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされた。活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表され、Ｙ軸上の各単位は５０の応答細胞を表している。略号は以下のとおりである。Ｓｕｃ（ショ糖１００ｍＭ）、Ｓｕｃ／Ｌａｃ（ショ糖１００ｍＭ、ラクチソール１ｍＭ）、ＡｃｅＫ（アセスルファムＫ１０ｍＭ）、ＡｃｅＫ／Ｌａｃ（アセスルファムＫ１０ｍＭ、ラクチソール１ｍＭ）、ＡＴＭ（アスパルテーム１０ｍＭ）、ＮＴＭ（ネオテーム１０ｍＭ）、Ｃｙｃ（シクラメート１０ｍＭ）。図２７ｂは、それぞれ２つの異なる濃度のショ糖（Ｓｕｃ）、サッカリン（Ｓａｃ）、及びＤ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）に対して測定されたヒト甘味受容体のラクチソール用量−依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓは、５０ｍＭ及び１２０ｍＭのショ糖についてそれぞれ１９．６±０．１μＭ及び６４．６±０．３μＭであり、０．１及び２ｍＭのサッカリンについてそれぞれ２２．６±０．１μＭ及び１０３±７μＭであり、Ｄ−トリプトファンについてそれぞれ１９．９±０．２μＭ及び１６８±９μＭである。図２７ｃは、異なる濃度のラクチソールを用いて測定されたショ糖、Ｄ−Ｔｒｐ及びサッカリンに対するヒト甘味受容体の用量応答性を示す。０、１０、又は２０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、ショ糖について、１９．４±０．９ｍＭ、２４．７±１．０ｍＭ、及び３１．３±０．３ｍＭであり、Ｄ−Ｔｒｐについて０．３７±０．０２ｍＭ、０．６０±０．０３ｍＭ、０．９４±０．０８ｍＭであり、サッカリンについて４２±３μＭ、６７±６μＭ、１１８±２μＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。Ｂ及びＣにおける用量応答は、それぞれ６回以上測定され、ここに示すのと同様の結果が得られた。
【図２７Ｃ】図２７ａは、Ｔ１Ｒ類とキメラ類の１６すべての組合せを示す図であり、それらは、甘味料及びラクチソールに対する応答について試験された。ｒＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３Ｈ−Ｒ、ｒＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３、及びＴ１Ｒ２Ｈ−Ｒ／Ｔ１Ｒ３Ｒ−Ｈは、シクラメートに対して有意な応答を示し、そして、それらは、ラクチソールによって阻害することができる。Ｔ１Ｒキメラは、Ｇα１５／ｉｌを有するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトされた。活性は、約１０００の集密細胞からなる４つのイメージ化領域について、応答する細胞の数の平均±ＳＥで表され、Ｙ軸上の各単位は５０の応答細胞を表している。略号は以下のとおりである。Ｓｕｃ（ショ糖１００ｍＭ）、Ｓｕｃ／Ｌａｃ（ショ糖１００ｍＭ、ラクチソール１ｍＭ）、ＡｃｅＫ（アセスルファムＫ１０ｍＭ）、ＡｃｅＫ／Ｌａｃ（アセスルファムＫ１０ｍＭ、ラクチソール１ｍＭ）、ＡＴＭ（アスパルテーム１０ｍＭ）、ＮＴＭ（ネオテーム１０ｍＭ）、Ｃｙｃ（シクラメート１０ｍＭ）。図２７ｂは、それぞれ２つの異なる濃度のショ糖（Ｓｕｃ）、サッカリン（Ｓａｃ）、及びＤ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）に対して測定されたヒト甘味受容体のラクチソール用量−依存性阻害曲線を示す。ＩＣ５０ｓは、５０ｍＭ及び１２０ｍＭのショ糖についてそれぞれ１９．６±０．１μＭ及び６４．６±０．３μＭであり、０．１及び２ｍＭのサッカリンについてそれぞれ２２．６±０．１μＭ及び１０３±７μＭであり、Ｄ−トリプトファンについてそれぞれ１９．９±０．２μＭ及び１６８±９μＭである。図２７ｃは、異なる濃度のラクチソールを用いて測定されたショ糖、Ｄ−Ｔｒｐ及びサッカリンに対するヒト甘味受容体の用量応答性を示す。０、１０、又は２０μＭのラクチソールの存在下、ＥＣ５０Ｓは、ショ糖について、１９．４±０．９ｍＭ、２４．７±１．０ｍＭ、及び３１．３±０．３ｍＭであり、Ｄ−Ｔｒｐについて０．３７±０．０２ｍＭ、０．６０±０．０３ｍＭ、０．９４±０．０８ｍＭであり、サッカリンについて４２±３μＭ、６７±６μＭ、１１８±２μＭである。値は、４つのそれぞれの応答について平均±ＳＥで表される。Ｂ及びＣにおける用量応答は、それぞれ６回以上測定され、ここに示すのと同様の結果が得られた。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ａ】
2007512227.tif 000049
【図１Ｂ】
2007512227.tif 000050
【図１Ｃ】
2007512227.tif 000051
【図２】
2007512227.tif 000052
【図３−１】
2007512227.tif 000053
【図３−２】
2007512227.tif 000054
【図４】
2007512227.tif 000055
【図５】
2007512227.tif 000056
【図６】
2007512227.tif 000057
【図７】
2007512227.tif 000058
【図８−１】
2007512227.tif 000059
【図８−２】
2007512227.tif 000060
【図９Ａ】
2007512227.tif 000061
【図９Ｂ】
2007512227.tif 000062
【図１０】
2007512227.tif 000063
【図１１】
2007512227.tif 000064
【図１２】
2007512227.tif 000065
【図１３】
2007512227.tif 000066
【図１４】
2007512227.tif 000067
【図１５】
2007512227.tif 000068
【図１６】
2007512227.tif 000069
【図１７】
2007512227.tif 000070
【図１８】
2007512227.tif 000071
【図１９Ａ】
2007512227.tif 000072
【図１９Ｂ】
2007512227.tif 000073
【図２０】
2007512227.tif 000074
【図２１】
2007512227.tif 000075
【図２２Ａ】
2007512227.tif 000076
【図２２Ｂ】
2007512227.tif 000077
【図２２Ｃ】
2007512227.tif 000078
【図２２Ｄ】
2007512227.tif 000079
【図２３Ａ】
2007512227.tif 000080
【図２３Ｂ】
2007512227.tif 000081
【図２３Ｃ】
2007512227.tif 000082
【図２３Ｄ】
2007512227.tif 000083
【図２４Ａ】
2007512227.tif 000084
【図２４Ｂ】
2007512227.tif 000085
【図２５Ａ】
2007512227.tif 000086
【図２５Ｂ】
2007512227.tif 000087
【図２５Ｃ】
2007512227.tif 000088
【図２５Ｄ】
2007512227.tif 000089
【図２５Ｅ】
2007512227.tif 000090
【図２５Ｆ】
2007512227.tif 000091
【図２６】
2007512227.tif 000092
【図２７Ａ】
2007512227.tif 000093
【図２７Ｂ】
2007512227.tif 000094
【図２７Ｃ】
2007512227.tif 000095