【手続補正書】
【提出日】平成19年5月17日(2007.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置する医薬を調製するための構造式(I)の化合物の使用方法であって、前記医薬はその薬学的組成物を要する被験者に投与されるように構成されており、また、前記医薬は、以下の構造式(I)の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の、治療上有効量を含むことを特徴とする、使用方法。
【化１】
2006526635.tif 000001
（ここで、式中の、
a） R1 、 R2 、 R3 、 R4 および R5が、独立に、 H 、OH基、ハロ基、 (C1-C6)アルキル基、 (C1-C6) アルコキシ基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C2-C6)アルキニル基、 (C1-C6)アルカノイル基、ハロ(C1-C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル基、 (C1-C6)アルコキシカルボニル基、または、 (C1-C6)アルキルチオ基、もしくは (C1-C6)アルカノイルオキシ基であるか、あるいは、 R1 と R2とが共に、メチレンジオキシ基となっており、
b） X1 が、 NO2基、 CN基、 -N=O 、 (C1-C6)アルキル(C(O))NH- 、イソオキサゾリル基、 N(R6)(R7) 、アリール基、アリール(C1-C6)アルキル基、アリール(C2-C6)アルケニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアリール(C1-C6)アルキル基であって、ここで式中の R6 および R7 は、独立に、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、(C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基であって、式中のシクロアルキル基は、任意に1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R8) を含み、ここで式中の R8 は、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基、もしくはベンジル基であるか、あるいは、 R6 および R7 が、前記の N と共に、五員環もしくは六員環である複素環または複素芳香環であって、オプションとして R1 で置換されていて、さらにオプションとして1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R5) を含むような、複素環または複素芳香環を構成しており、
c） (Alk) が、 (C1-C6)アルキル基であり、
d） Y および Z が、 =O 、 -O(CH2)mO- 、もしくは -(CH2)m- であって、式中の m が2〜4であるか、あるいは、 Y が H であって Z が OH基もしくは SH基であり、
e） Het が、ヘテロアリール基もしくはヘテロシクロアルキル基であって、それぞれが任意に1、2もしくは3個の R1 、またはそれらの組み合わせで置換されているか、あるいは、 Het が (Alk) と NH基とを繋ぐ結合であり、
f） p は0もしくは1である。）
【請求項２】
前記量が、アルツハイマー病と血管性痴呆との少なくとも一方の症候を処置する上で有効な量であることを特徴とする、請求項１記載の使用方法。
【請求項３】
構造式 I の前記化合物が、ヒトに投与されることを特徴とする、請求項１もしくは２に記載の使用方法。
【請求項４】
構造式(I)の前記化合物が、 1-(4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-カルボニル)-(1H-インドール-3-イル-メチル)-(4-ニトロベンズアミド)-メタンを含むことを特徴とする、請求項１記載の使用方法。
【請求項５】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置する医薬を調製するための、酢酸=4,5-ジアセトキシ-2-アセトキシメチル-6-[4-(2-ジエチルアミノ-エチルカルバモイル)-2-メトキシフェノキシ]-テトラヒドロ-ピラン-3-イルエステルの使用方法であって、前記医薬はそれを要する被験者に投与されるように構成されており、また、前記医薬は、酢酸=4,5-ジアセトキシ-2-アセトキシメチル-6-[4-(2-ジエチルアミノ-エチルカルバモイル)-2-メトキシフェノキシ]-テトラヒドロ-ピラン-3-イルエステルの有効量を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項６】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置する医薬を調製するための、酢酸=5-アセトキシ-3-(4-ベンゾイル-ピペラジン-1-イル-メチル)-4-ヒドロキシ-4a,8-ジメチル-2-オキソドデカヒドロ-アズレノ[6,5-b]フラン-4-イルエステルの使用方法であって、前記医薬はそれを要する被験者に投与されるように構成されており、また、前記医薬は、酢酸=5-アセトキシ-3-(4-ベンゾイル-ピペラジン-1-イル-メチル)-4-ヒドロキシ-4a,8-ジメチル-2-オキソドデカヒドロ-アズレノ[6,5-b]フラン-4-イルエステルの有効量を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項７】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置する医薬を調製するための、3-(4-ベンゾイル-ピペラジン-1-イル-メチル)-6,6a-エポキシ-6,9-ジメチル-3a,4,5,6,6a,7,9a,9b-オクタヒドロ-3H-アズレノ[4,5-b]フラン-2-オンの使用方法であって、前記医薬はそれを要する被験者に投与されるように構成されており、また、前記医薬は、 3-(4-ベンゾイル-ピペラジン-1-イル-メチル)-6,6a-エポキシ-6,9-ジメチル-3a,4,5,6,6a,7,9a,9b-オクタヒドロ-3H-アズレノ[4,5-b]フラン-2-オンの有効量を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項８】
コルチゾールが介在する病態、病気、もしくは障害を処置する医薬を調製するための、プロカインの使用方法であって、前記医薬はそれを要する被験者に投与されるように構成されており、また、前記医薬は、プロカインもしくはその薬学的に許容される塩の有効量を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項９】
HMG-CoA mRNA基礎量に影響することなくHMG-CoA還元酵素mRNA発現量を抑制する薬学的組成物を調製するための、構造式(I)の化合物の使用方法であって、前記薬学的組成物はそれを要する被験者に投与されるように構成されており、また、前記薬学的組成物は、以下の構造式(I)の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の、治療上有効量を含むことを特徴とする、使用方法。
【化２】
2006526635.tif 000002
（ここで、式中の、
a） R1 、 R2 、 R3 、 R4 および R5が、独立に、 H 、OH基、ハロ基、 (C1-C6)アルキル基、 (C1-C6) アルコキシ基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C2-C6)アルキニル基、 (C1-C6)アルカノイル基、ハロ(C1-C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル基、 (C1-C6)アルコキシカルボニル基、または、 (C1-C6)アルキルチオ基、もしくは (C1-C6)アルカノイルオキシ基であるか、あるいは、 R1 と R2とが共に、メチレンジオキシ基となっており、
b） X1 が、 NO2基、 CN基、 -N=O 、 (C1-C6)アルキル(C(O))NH- 、イソオキサゾリル基、 N(R6)(R7) 、アリール基、アリール(C1-C6)アルキル基、アリール(C2-C6)アルケニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアリール(C1-C6)アルキル基であって、ここで式中の R6 および R7 は、独立に、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基であって、式中のシクロアルキル基は、任意に1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R8) を含み、ここで式中の R8 は、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基、もしくはベンジル基であるか、あるいは、 R6 および R7 が、前記の N と共に、五員環もしくは六員環である複素環または複素芳香環であって、オプションとして R1 で置換されていて、さらにオプションとして1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R5) を含むような、複素環または複素芳香環を構成しており、
c） (Alk) が、 (C1-C6)アルキル基であり、
d） Y および Z が、 =O 、 -O(CH2)mO- 、もしくは -(CH2)m- であって、式中の m が2〜4であるか、あるいは、 Y が H であって Z が OH基もしくは SH基であり、
e） Het が、ヘテロアリール基もしくはヘテロシクロアルキル基であって、それぞれが任意に1、2もしくは3個の R1 、またはそれらの組み合わせで置換されているか、あるいは、 Het が (Alk) と NH基とを繋ぐ結合であり、
f） p は0もしくは1である。）
【請求項１０】
構造式(I)の前記化合物が、(4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-カルボニル)-(1H-インドール-3-イル-メチル)-(4-ニトロベンズアミド)-メタンを含むことを特徴とする、請求項９記載の使用方法。
【請求項１１】
カルシウムの輸送および細胞内貯蔵からの放出を調節して、細胞内カルシウム濃度を変化させる薬学的組成物を調製するための、構造式(I)の化合物の使用方法であって、前記薬学的組成物はそれを要する被験者に投与されるように構成されており、また、前記薬学的組成物は、以下の構造式(I)の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の、コルチゾールを調節する上での有効量を含むことを特徴とする、使用方法。
【化３】
2006526635.tif 000003
（ここで、式中の、
a） R1 、 R2 、 R3 、 R4 および R5が、独立に、 H 、OH基、ハロ基、 (C1-C6)アルキル基、 (C1-C6) アルコキシ基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C2-C6)アルキニル基、 (C1-C6)アルカノイル基、ハロ(C1-C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル基、 (C1-C6)アルコキシカルボニル基、または、 (C1-C6)アルキルチオ基、もしくは (C1-C6)アルカノイルオキシ基であるか、あるいは、 R1 と R2とが共に、メチレンジオキシ基となっており、
b） X1 が、 NO2基、 CN基、 -N=O 、 (C1-C6)アルキル(C(O))NH- 、イソオキサゾリル基、 N(R6)(R7) 、アリール基、アリール(C1-C6)アルキル基、アリール(C2-C6)アルケニル基、ヘテロアリール基、ヘテロアリール(C1-C6)アルキル基であって、ここで式中の R6 および R7 は、独立に、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C2-C6)アルケニル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル((C1-C6)アルキル)基であって、式中のシクロアルキル基は、任意に1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R8) を含み、ここで式中の R8 は、 H 、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基、もしくはベンジル基であるか、あるいは、 R6 および R7 が、前記の N と共に、五員環もしくは六員環である複素環または複素芳香環であって、オプションとして R1 で置換されていて、さらにオプションとして1〜2個の S 、過酸化物ではない O 、 もしくは N(R5) を含むような、複素環または複素芳香環を構成しており、
c） (Alk) が、 (C1-C6)アルキル基であり、
d） Y および Z が、 =O 、 -O(CH2)mO- 、もしくは -(CH2)m- であって、式中の m が2〜4であるか、あるいは、 Y が H であって Z が OH基もしくは SH基であり、
e） Het が、ヘテロアリール基もしくはヘテロシクロアルキル基であって、それぞれが任意に1、2もしくは3個の R1 、またはそれらの組み合わせで置換されているか、あるいは、 Het が (Alk) と NH基とを繋ぐ結合であり、
f） p は0もしくは1である。）
【請求項１２】
前記の構造式(I)の化合物が、 (4-シクロプロパンカルボニル-3-メチル-ピペラジン-1-カルボニル)-2-(1H-インドール-3-イル-メチル)-4-(4-ニトロフェニル)-ブタン-1,4-ジオンを含むことを特徴とする、請求項１１記載の使用方法。
【請求項１３】
前記の (Alk) が、 -(CH2)- 、  -(CH2)2- 、  -(CH2)3- 、もしくは -(CH2)4- といった (C1-C4)アルキル基であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１４】
前記の R4 および R5 の双方が、 (C1-C6)アルキル基、 (C3-C6)シクロアルキル基、もしくは (C3-C6)シクロアルキル(C1-C6)アルキル基であり、好ましくは (C1-C4)アルキル基もしくは (C3-C6)シクロアルキル基であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１５】
前記の R1 、 R2 もしくは R3の内のひとつまたは二つが、 H もしくは (C1-C6)アルコキシ基であり、好ましくは (C1-C3)アルコキシ基であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１６】
前記の Y および Z が =O であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１７】
前記の p が 1 であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１８】
前記の Het が、 1H-インドール-3-イル基、もしくはイミダゾリン-3-イル基であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１９】
前記の構造式 I の化合物が、ヒトのような哺乳類へ経口投与されることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２０】
前記の構造式 I の化合物が、ヒトのような哺乳類へ、注射、輸液、吸入、もしくはガス注入によって非経口的に投与されることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２１】
前記の構造式(I)の化合物が、薬学的に許容される担体と共に投与されることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２２】
前記担体が、溶液、懸濁液、もしくはゲルのような液体であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２３】
前記担体が固体であることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項２４】
前記の構造式 I の化合物が、 N-[2-((4-シクロプロピルカルボニル)-3-メチルピペラジン-1-イル)-1-(1H-インドール-3-イル-メチル)-2-(オキソ)エチル]-4-ニトロベンズアミドであることを特徴とする、請求項１、９、もしくは１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明の或る特徴においては、組成物、方法、キット、配合物は、被験者が患うコルチゾールが介在する病気、症状、もしくは障害への、有効な処置もしくは予防に対して有用である。或る形態においては、組成物、方法、キット、配合物は、被験者のコルチゾールの過剰産生に関連する、もしくは起因する病気、症状、または障害への処置あるいは予防にとって有用である。例示するように、本発明は、筋骨格、胃腸管、心血管、内分泌系、および／もしくは中枢神経系（例えば、脳梗塞、脳外傷、網膜損傷、および／もしくは脊髄外傷、虚血、ならびに再潅流、ならびに他の脳あるいは網膜の障害、ならびに神経外科処置に関連した心的外傷が含まれる）の病気または障害を含むコルチゾールが介在する病気、ならびに、代謝変化、ならびに、認知障害、ならびに、免疫抑制、ならびに、抑鬱および気分変化が含まれる精神病的障害、ならびに、後天性免疫不全症候群、ならびに、多発性硬化症、ならびに、アルツハイマー病、ならびに、ハンチントン病、ならびに、癲癇、ならびに、ラチリズム （ lathyrism ） 、ならびに、筋萎縮性側索硬化症、ならびに、パーキンソン病、ならびに、例えば乳癌を含む癌、の処置あるいは予防において有用である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
「測定可能な血清中濃度」 （ "measurable serum concentration" ） という語句は、投与後に血流に吸収された治療薬の血清中濃度（典型的には、血清 ml 、 dl もしくは l あたりに対して、治療薬 mmol 、 μmol 、 nmol 、 mg 、 mg 、もしくは ng で測定する）のことを意味する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
例示すると、薬学的な賦形剤は以下の例から選択される。
(a) アラビアゴム （ acasia ） 、アルギニン酸およびその塩、セルロース誘導体、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、珪酸マグネシウムアルミニウム、ポリエチレングリコール、ゴム類、多糖類の酸 （ polysaccharide acids ） 、ベントナイト、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、クロスポビドン、ポビドン、ポリメタクリレート類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプン、エチルセルロース、トラガカントゴム、デキストリン、微細結晶セルロース、スクロース（蔗糖）、もしくはグルコース（ブドウ糖）、ならびに類似物といった、結合剤（バインダー）。 
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
(d) ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート類、ポロクサマー類、胆汁酸塩類、グリセリルモノステアラート、 PluronicTM 系列（BASF）、および類似物といった界面活性剤。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
《物質および方法》
［物質］
Y1マウス副腎細胞腫 （ Y1 mouse adrenal tumor cells ） は、 American Type Culture Collection（Manassas, VA）から入手し、また、MA-10マウスLeydig細胞腫 （ MA-10 mouse Leydig tumor cells ） は Dr. Mario Ascoli（University of Iowa, Iowa）から提供を受けた。 マウスHepa1-6細胞培地 （ Mouse Hepa1-6 cells medium ） は American Type Culture Collection（Manassas, VA）から入手した。UT-1細胞は Dr. JL Goldstein（Sothwestern University, TX）から提供を受けた。リポ蛋白欠損ウシ胎児血清 （ Fetal-bovine lipo-protein deficient serum;  FBLPDS ） は Intracel Corporation（Frederick, MD）から入手した。F-12K（Kaighn's modification of Ham's F-12）およびDMEM培地は American Type Culture Collection から購入し、また、DMEM/Ham's F-12培地、ウマ血清、およびウシ胎児血清（FBS）は InVitrogen Corporation（Carlsbad, CA）から購入した。抗血清は、以下を用いた。即ち、 anti-20-OH-プロゲステロン （ anti-20-OH-progesterone ） （Endocrine Sciences, Calabasas, CA）、 anti-プロゲステロン （ anti-progesterone ） （ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA）、 anti-P-450scc（Research Diagnostics Inc. , Flanders, NJ）、 anti-G3PDH （Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD）である。 3H-20a-ヒドロキシプロゲステロン、 3H-プロゲステロン、 3H-コルチコステロン、および 3H-メバロノラクトンは、 PerkinElmer Life Sciences Inc.（Boston, MA）から購入し、また 14C-HMG-CoA は Amersham Pharmacia Biotech（Buckinghamshire, England）から入手した。 The MTT cell proliferation assay kit （MTT細胞増殖分析キット）は Trevigen, Inc.（Gaithersburg, MD）から購入し、 the PepTag assay for nonradioactive detection of PKA kit （PKA非放射性検出のためのPepTag分析キット）は Promega Corporation（Madison, WI）から購入し、 the Varian Bond-Elut NH2カラムは Chrom Tech, Inc.（Apple Valley, MN）から入手した。プロカイン塩酸塩 （ procaine chlorhydrate ） およびコンパクチン （ compactin ） は、 Sigma（St. Louis, MO）から入手した化学物質から得た。塩酸プロカイン （ procaine hydrochloride ） 、硫酸亜鉛七水和物（プロカインの吸収速度を遅らせるために用いた）、アスコルビン酸（抗酸化剤）、安息香酸カリウム（保存料として用いた）、およびリン酸水素二ナトリウム（「プロカインに基づく処方」 （ "procaine-based formulation" ））を含む薬学的組成物と、それの同様の組成物であるがプロカインを欠いているプラシーボ（プラセボ;  偽薬）とは、 Samaritan Pharmaceuticals, Inc.（Las Vegas, NV）から入手した。 RNA STAT-60 は TEL-TEST, Inc.（Friendswood, TX）から入手した。 TaqMan Reverse Transcription Reagents 、ランダムヘキサマー、および SYBR(R) Green PCR Master Mix は Applied Biosystems（Foster City, CA）から入手した。細胞培養サプライは GIBCO（Grand Island, NY）から購入し、また、細胞培養用プラスチック容器は Corning（Corning, NY）から入手した。他のすべての化学物質には、各種の市販品として入手した、分析用の品位のものを用いた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
［細胞培養］
Y1マウス副腎細胞腫を、 5% CO2 雰囲気下で、ウマ血清 15% と、FBS 2.5% とを含んだF12K培地で培養した（Brown et al., 1992）。MA-10マウスLeydig細胞腫は、 4% CO2雰囲気下で、FBS 5% と、ウマ血清 2.5% とを補ったDMEM/F12培地で培養した（Brown et al., 1992）。 H295R ヒト副腎細胞腫は、 37℃、 6% CO2 雰囲気下で、 1% ITS+ [インシュリン（1μg/ml）、トランスフェリン（1μg/ml）、セレン（1 μg/ml）、リノレン酸（1μg/ml）、および BSA（1.25mg/ml）]、 2.5% Nuserum 、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン を含んだDMEM/F12で存置した（Amri et al., 1996）。 Hepa1-6マウス肝細胞腫は、 10% FBS を補ったDMEM培地で培養し、また、 UT-1細胞は、 8% FBLPDS および 2% FBS に 40_M コンパクチンを加えたものを補ったDMEM/F12培地で培養した（Chin et al., 1982）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
［ミトコンドリアの統合性／細胞生存率の分析］
上述した培養手順の最後に、ミトコンドリア統合性 臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）分析法（Trevigen, Gaithersburg, MD）を用いて、細胞生存率を分析した。要約すると、 10μl MTT溶液を、 100μl の培地上の細胞に加えた。四時間の培養期間の後、 100μl の洗浄剤を加えて、細胞を37℃で一晩培養した。 the Victor quantitative detection spectrophotometer（EGG-Wallac, Gaithersburg, MD）を用いて、 600nm および 690nm でホルマザンブルー （ formazan blue ） の形成を定量し、結果を (OD600-OD690) で示した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
［HMG-CoA還元酵素分析］
十二穴プレートに入ったY1細胞（一穴あたりの細胞数 1 x 105）を、塩酸プロカインの濃度を高めながら四十八時間に亘り処置した。細胞を氷冷PBSで二回洗い、氷冷分析緩衝液（0.1M スクロース、 40mM KH2P04 、 30mM EDTA 、 50mM KCl 、 5mM DTT 、 0.25%(v/v) の Brij 96, pH 7.4）を加えて氷温で二十分間培養した。 14000g（4°C）で三分間遠心分離した後、上清を回収してHMG-CoA還元酵素活性分析にかけた。総量 150μl の分析用化合物には、 100〜200 g の蛋白質、およびNADPH産生系（ 2.5mM NADP 、 20mM グルコース=6-リン酸塩、および 20U/ml グルコース=6-リン酸塩デヒドロゲナーゼ）が含まれていた。基質（ 14C-HMG-CoA, 0.1Ci）を加えて反応を開始し、四十五分後に 10μl の 6M HCl を加えて反応を停止した。試料に抽出回収標識 （ extraction recovery marker ） として 3H-メバロノラクトンをさらに加えた。生成物を完全にラクトン化するために、さらに三十分間培養した後、混合物を遠心分離した。上清を Bond-Elut NH2 カラムに入れて、 1ml のトルエン／アセトン（3:1）で溶離した。溶離分を棄て、カラムにさらに 4ml のトルエン／アセトンを加えて、シンチレーションバイアルを回収して 14C-メバロン酸および 3H-メバロノラクトンのシグナルを計数した（Berkhout et al., 1990）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
別の実験として、細胞を超音波処理して分離した後、プロカインで処置した。ホモジネート中のHMG-CoA還元酵素活性への処置の直接の影響を、上述したように定量した。
［リアルタイムRT-PCR定量法（Q-PCR）］
六穴プレートで十八時間培養した細胞を、塩酸プロカインの濃度を高めながら、示した時間の処置を行った。処置後、細胞を 1mM dbcAMP で二十四時間刺激した。培養終了時に、細胞の total RNA を RNA STAT-60（Tel-Test Inc, Friendswood, TX）を製造者の指示に従って用いて抽出した。HMG-CoA還元酵素mRNAを、 the ABI Prism 7700 sequence detection system（Perkin- Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いたQ-PCR法によって測定した。RT反応は、 TaqMan(R) Reverse Transcription Reagents にそれぞれの反応毎に製造者の指示に従って 1g の total RNA およびランダムヘキサマーをプライマーとして加えたものを用いて行った。マウスHMG-CoA還元酵素mRNAをQ-PCR法で測定するために、プライマーおよびプローブの選択にあたり特異的に構成された PE/AB Primer Express software を用いて、 GenBank Accession Number BC 019782 に従ってプライマーを設計した。フォワードプライマーは 5'-CCAAGGTGGTGAGAGAGGTGTT-3' （22 nucleotides）、また逆転写プライマーは 5'-CGTCAACCATAGCTTCCGTAGTT-3' （23 nucleotides）とした。プライマーは Bio-Synthesis Inc.（Lewisville, TX）が合成を行った。 10μl の SYBR(R) Green PCR Master Mix および 1μl のプライマー混合物（各5M）に 2μl の cDNA を溶いたものを含んだ体積 20 l の溶液を含む、反応混合物を用いて反応を行った。サイクルの条件は以下であった。即ち、初期ステップとして50℃で二分間および95℃で十分間、を行った後に、95℃で十五秒および60℃で一分間、を40サイクル行った。 AmpliTaq Gold ポリメラーゼを、95℃に十分間置いて活性化した。同時に 18S RNA を増幅し、内部対照として用いた。プライマーダイマーのような非特異的PCR産物の汚染を除くために、サイクル手順の後に、すべての最終PCR産物に対して融解曲線分析を行った。また、ゲノムDNA の汚染を除くために、それぞれのサンプルに対して、RT反応を起こさないPCR反応も行った。PCR産物を回収し、 3%(w/v) アガロース電気泳動ゲル上で泳動させて産物の大きさを確認した。 18S RNA およびサンプルの Ct値 （ threshold cycle values;  Ct values ） を、 PE/AB computer software を用いて算出した。 Ct は、反応が最大の指数増殖期にあるところに定めた。依存的転写量を x = 2Ct として計算し、ここで、 Ct = E - C であり、また E = Ctexperiment - Ct18S 、 C = Ctcontrol - Ct18S である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
［実施例4  ステロイド作動性経路の種々のステップへの、プロカインの作用］
dbcAMPにより亢進されたステロイド産生へのプロカインの作用を考察する上で、この化合物のPKA活性への作用を研究した。PKA活性は、PKA特異基質に基づく非放射性検出キットである PepTag(R) A1 peptide (L-R-R-A-S-L-G) を用いて測定した。図６には、dbcAMPにより亢進されたステロイド産生を 90% 阻害（図２Ａ）した 1μM のプロカインが、dbcAMPにより亢進されたPKA活性には、有意な作用を呈さないということが示されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
水溶性コレステロールであり、 P-450scc の基質である 22R-ヒドロキシコレステロールは、 20-OHプロゲステロン産生の7.5倍の増大をそれぞれ誘導した。図２Ａに示したように、 1μM プロカインはdbcAMP起因のステロイド産生を 90% 減少させる。しかしながら、プロカインは 22R-ヒドロキシコレステロールのステロイド産生への作用を阻害しない（図７Ａ）。加えて、プロカインは、細胞抽出物のイムノブロット分析によって測定された P-450scc の発現に対して変化を齎さなかった（図７Ｂ）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
［実施例5  プロカインがHMG-CoA還元酵素活性およびmRNA発現を阻害する］
図８Ａは、 1μM のプロカインがdbcAMPおよびメバロン酸に支持された 20α-ヒドロキシプロゲステロン産生を阻害せず、この量のプロカインがHMG-CoA還元酵素によるメバロン酸産生の役割を務める可能性を示している。HMG-CoA還元酵素活性はY1細胞で測定された。プロカインは、これらの細胞のHMG-CoA還元酵素活性を用量依存的に低減した（図８Ｂ）。濃度 1μM 、 10μM および 100μM において、阻害率はそれぞれ 44% 、 72% および 70%であり、また処置の作用はかなり有意（p<0.001 by ANOVA）であった。プロカインの作用が、酵素活性への直接の作用に因るものであるかどうかを解析するために、Y1細胞を超音波処理してプロカインで処置した。HMG-CoA還元酵素活性へのプロカインの直接作用は観察されなかった（対照群 10.1±0.9 pmol/min/mg protein に対して、プロカイン 1μM 、10μM および 100μM の存在下では、それぞれ 9.9±0.01 、 10.3±0.6 、および 10.1±0.1 pmol/min/mg protein ）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
Y1マウス副腎細胞腫は、副腎ステロイド産生の基礎たるメカニズムを理解するために広汎に用いられてきた。これらの細胞においては、20α-ヒドロキシラーゼによるプロゲステロンの転換から生じる、ステロイド産生の中間生成物である 20α-ヒドロキシ-プロゲステロンが、細胞のステロイド産生の指標として用いられている（Mrotek and Hall, 1977;  Iida et al, 1989;  Brown et al., 1992）。本発明において発見されたように、プロカインは、細胞が基礎として産生する 20α-ヒドロキシ-プロゲステロンには影響することなく、Y1細胞内のcAMP起因の 20α-ヒドロキシ-プロゲステロンの増大を阻害する。プロカインは、 0.1μM という低濃度において、cAMP起因のステロイド産生を阻害し、この阻害は広範囲の濃度に亘って用量反応的な相関を示す。cAMP起因のステロイド産生へのこのプロカインの調節作用は、マウスY1細胞に限定されるものではなく、主要なステロイド産物としてコルチゾールを産生するH295Rヒト副腎細胞腫においても観察される。ヒト副腎細胞腫はプロカインに対してマウス副腎細胞よりも感度が鈍い。これらの結果は、プロカインが、コリン作動性ムスカリン刺激 （ cholinergic muscarinic stimulation ） のステロイド産生作用を低減すること（Hadjian et al., 1982）、および、ウシ副腎皮質細胞においてdbcAMPのステロイド産生作用を低減すること（Noguchi et al., 1990）、という過去の所見を裏づけて拡張するものである。理論的に説明されているわけではないが、これらのデータと、プロカインが細胞のステロイド基礎産生に影響しないということとを考え合わせると、プロカインは刺激物が存在するときにのみ、その調節活性を呈するという証拠となる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
塩酸プロカインはジエチルアミノエタノールと p-アミノ安息香酸とのエステルであり、身体中で容易に加水分解されるために、類似した特性を有し、細胞毒性を持たないような安定且つ有用なプロカイン誘導体を検索した。したがって、プロカイン誘導体は化学データベースのインシリコスクリーニングによって同定され、cAMP-コルチコステロイド産生を調節する能力を検査された。これらの化合物の内では、SP010（表１）が 1μM 程度の低濃度においてプロカインと同様の効能を示し、プロカインと同様の用量／応答作用を呈して、共通する薬学的メカニズムの存在を示唆した。しかしながら、理論的に説明されているわけではないが、SP010は細胞内カルシウム濃度の調節を介してコルチゾール量を調節することができる。細胞内カルシウム濃度の増大は、ステロイド産生亢進経路 （ the steroids synthesis-stimulating pathway ） のキーポイントとなっており、プロカインは、リアノジン受容体活性拮抗により、このカルシウムの増大を調節すると記載されている（Shishan-Barmatz V. and Zchut S. (1994) J. Membr. Biol., 138 (1): 103;  Zahradnikova A. and Palade P. (1993) Biophys. J., 64 (4): 991-1003）。SP010はプロカインの誘導体であるため、SP010がカルシウム経路に同様の調節作用を与え、コルチゾール産生を調節する活性を呈すると仮定することには正当性がある。プロカイン誘導体は、細胞内カルシウム量を変化させるところのcAMP起因のリアノジン受容体 RyR2 mRNA の発現も調節することができ、その調節作用をコルチゾール産生に与えることができる。Y1副腎皮質細胞への、プロカインおよびSP010の用量反応的な作用を仔細に検討すると、SP010はプロカインおよびプロカイン誘導体と同様の効能を有しており、濃度 1 、 10 および 100μM において同様の効能を保っている。これらの化合物はいずれもステロイド基礎産生には影響せず、また細胞生存率にも影響しないということは既に示した。これらの結果からは、共通のプロカイン化学構造に基づいて同定されたSP化合物群は、視床下部-脳下垂体-副腎系の活性の増大に因る病態もしくは関連する病態、ならびにそれに因る多量のコルチゾール生成に対する薬剤の、別の候補となりえるということが示唆される。