(57)【要約】  本発明は、細胞培養用培地組成物に係り、より詳しくは、温度感応性高分子であるグリコールキトサン誘導体を用いて細胞増殖を活性化させる細胞培養用培地組成物に関する。本発明による細胞培養用培地組成物は、ヘキサノイルグリコールキトサン（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ：ＨＧＣ）を比較的に低濃度で含有するだけでも、細胞のモルフォロジーと生存率に影響を及ぼすことなく、効果的に細胞増殖率を向上させることができる。
2019530445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表されるヘキサノイルグリコールキトサン（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ：ＨＧＣ）を０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）含み、ヘキサノイル基（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｒｏｕｐ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ５Ｈ１１））の置換度が１０〜５０％である細胞培養用培地組成物。
【化１】
2019530445.tif 000005
（ただし、前記化学式１において、ｘ、ｙ、ｚは、１０ないし１００００の整数で、これらのモル％は、０．１≦ｘ≦０．５、０．１≦ｙ≦０．２、及び０．３≦ｚ≦０．８である）
【請求項２】
前記細胞培養用培地組成物は、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞、ヒト角膜上皮細胞及びヒト由来繊維芽細胞を培養するための培地組成物であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養用培地組成物。
【請求項３】
前記ヘキサノイルグリコールキトサンは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１００〜５，０００，０００であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養用培地組成物。
【請求項４】
前記細胞培養用培地組成物は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭａｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地、ＡｍｎｉｏＭａｘ、ＡｍｉｎｏＭａｘ ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ、 Ｃｈａｎｇ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ 及び ＭｅｓｅnＣｕｌｔ−ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍからなる群から選択される基本培地用組成物であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養用培地組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年０９月０８日付韓国特許出願第１０−２０１６−０１１５３６４号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されている全ての内容は、本明細書の一部として含む。
【０００２】
本発明は、細胞培養用培地組成物に係り、より詳しくは、ヘキサノイルグリコールキトサン（ＨＧＣ）を利用して細胞増殖を活性化させる細胞培養用培地組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
最近、動物や植物の体内で異なる役目をしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外で増殖あるいは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外で増殖あるいは維持することは、それぞれの器官培養、組織培養と呼ばれ、器官、組織から分離された細胞を生体外で増殖、分化あるいは維持することは細胞培養と呼ばれている。
【０００４】
細胞培養は、分離した細胞を培地の中で生体外で増殖、分化あるいは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解釈するための不可欠なものとなっている。また、当該技術によって培養された細胞及び／または組織は、化学物質、医薬品などの薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体などの有用物質の大量生産、疾患や欠損によって失った器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の生産など、様々な分野で利用されている。
【０００５】
最近、細胞培養は、その技術達成によって、生命現象の解明だけでなく、ウイルスワクチン製造、バイオ医薬品生産、遺伝子治療や再生医療、兔疫細胞治療法に利用することにも検討、実施されている。
【０００６】
一方、グリコールキトサンは、水溶性キトサン誘導体の一つで、親水性エチレングリコール基の導入により、中性のｐＨで水溶性を表す。以前の研究によれば、グリコールキトサンは非細胞毒性、生体適合性を表し、低濃度で軟骨細胞の成長を刺激すると報告されたことがある。
【０００７】
特に、グリコールキトサンのバックボーンに沿って存在するアミン基は、用途を改善するために変形可能な部位である。グリコールキトサンの特性を改善したり、新しい特性を与えるために様々な官能基または分子をグリコールキトサンバックボーンに取り入れたグリコールキトサン誘導体が提案されたことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国登録特許公報第１５０２５７９号「疎水性置換基を持つグリコールキトサン誘導体、この製造方法及び用途」
【特許文献２】韓国公開特許公報第２０１６−００２７６６９号「温度感応性グリコールキトサン誘導体を用いたスフェロイド形成用培養容器及びこれを用いたスフェロイド形成方法」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、グリコールキトサンのバックボーンに沿って存在するアミン基の置換を通して、細胞培養技術に適する細胞培養用培地組成物に適用するために、本発明者らは多角的に研究した結果、本発明で示す細胞培養用培地組成物が細胞増殖率が有意的に向上させることを確認することで本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、生産効率が高く、細胞の増殖率を促進する細胞培養用培地組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は下記化学式１で表されるヘキサノイルグリコールキトサン（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ：ＨＧＣ）を０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）含み、ヘキサノイル基（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｒｏｕｐ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ５Ｈ１１））の置換度が１０〜５０％である細胞培養用培地組成物を提供する。
【化１】
2019530445.tif 000003
（ただし、前記化学式１において、ｘ、ｙ、ｚは、１０ないし１００００の整数で、これらのモル％は０．１≦ｘ≦０．５、０．１≦ｙ≦０．２、及び０．３≦ｚ≦０．８である）
【発明の効果】
【００１２】
本発明による細胞培養用培地組成物は、ヘキサノイルグリコールキトサン（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ：ＨＧＣ）を比較的に低濃度で含有するだけでも、細胞のモルフォロジーと生存率に影響を与えず、効果的に細胞増殖率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明によるＨＧＣ含有培地とＨＧＣ未含有培地で培養された繊維芽細胞のモルフォロジーである。
【図２】本発明によるＨＧＣ含有培地とＨＧＣ未含有培地で培養された繊維芽細胞の蛍光顕微鏡イメージである。
【図３】本発明によるＡ５４９細胞のＨＧＣの濃度別細胞増殖率を示すデータである。
【図４】本発明による角膜上皮細胞のＨＧＣの濃度別細胞増殖率を示すデータである。
【図５】本発明による繊維芽細胞のＨＧＣの濃度別細胞増殖率を示すデータである。
【図６】本発明によるＨＧＣ含有培地とＨＧＣ未含有培地で培養された繊維芽細胞の細胞増殖率を示すデータである。
【図７】本発明によるヘキサノイル基で置換されないＧＣ含有培地で培養された繊維芽細胞の細胞増殖率を示すデータである。
【図８】本発明によるヘキサノイル基で３６％置換されたＨＧＣ３６含有培地で培養された繊維芽細胞の細胞増殖率を示すデータである。
【図９】本発明によるヘキサノイル基で４０％置換されたＨＧＣ４０含有培地で培養された繊維芽細胞の細胞増殖率を示すデータである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１５】
本発明は、下記化学式１で表されるヘキサノイルグリコールキトサン（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ：ＨＧＣ）を０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）含み、ヘキサノイル基（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｒｏｕｐ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ５Ｈ１１））の置換度が１０〜５０％である細胞培養用培地組成物を示す。
【化２】
2019530445.tif 000004
（ただし、前記化学式１において、ｘ、ｙ、ｚは、１０ないし１００００の整数で、これらのモル％は、０．１≦ｘ≦０．５、０．１≦ｙ≦０．２、及び０．３≦ｚ≦０．８である）
【００１６】
前記化学式１で表すヘキサノイルグリコールキトサン（ＨＧＣ）は、疎水性置換基を有するグリコールキトサン誘導体であって、５位グリコール基（ＣＨ２ＯＣ２Ｈ４−ＯＨ）が存在し、２位アミン基（−ＮＨ２）の一部がアセチル基と疎水性Ｒ基で置換された構造で、より具体的に、ヘキサノイル基（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｒｏｕｐ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ５Ｈ１１））で置換された化合物である。
【００１７】
前記ヘキサノイルグリコールキトサン(ＨＧＣ)は重量平均分子量(Mw)が100ないし5,000,000である。
【００１８】
前記ヘキサノイルグリコールキトサン（ＨＧＣ）は、化学式１で表されるように、置換基としてグリコール基、アミン基、アセチル基及び疎水性基が存在する。前記グリコール基とアミン基は親水性を、アセチル基と疎水性基は疎水性を表し、本発明によるヘキサノイルグリコールキトサン（ＨＧＣ）は両親性高分子と言える。
【００１９】
本発明による細胞培養用培地組成物を含む培地は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、血清、成長因子、無機質などの細胞の成長及び増殖などに必須的要素を含む生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞の成長及び増殖のための混合物であって、当業界では様々な培地が市販されており、人為的に製造して使うこともできる。市販中の培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭａｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、ＡｍｎｉｏＭａｘ、ＡｍｉｎｏＭａｘＩＩ ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ及びＣｈａｎｇ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ＭｅｓｅnＣｕｌｔ−ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍなどがあり、人為的に製造することができる培地とともに、本発明の培地組成物に含まれる基本培地として使用してもよい。
【００２０】
後述する本発明の実施例によれば、前記ヘキサノイルグリコールキトサン（ＨＧＣ）を有効成分として含むものの、比較的に低濃度で含有する。その含量が細胞の種類ごとに少し差はあったが、全細胞培養用培地組成物の体積を基準として０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）含有され、このような低濃度でも細胞のモルフォロジーと生存率に否定的影響を与えずに、効果的に細胞増殖率を向上させることができる。本発明の実験例１ないし４によれば、ヘキサノイル基（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｒｏｕｐ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ５Ｈ１１））の置換度が１０〜５０％の細胞培養用培地組成物で細胞増殖が促進されることを確認した。
【００２１】
また、前記細胞培養用培地に含まれる成長因子としては、例えば、変換成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β、ＴＧＦ）、インスリン−類似成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、神経細胞成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子 （ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）及び骨形成蛋白質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）が可能である。
【００２２】
本発明で示す前記ヘキサノイルグリコールキトサン（ＨＧＣ）を含む細胞培養用培地組成物を用いて培養できる細胞は、本発明で特に限定せず、該分野で公知された細胞の適用が可能であり、一例として上皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、肝細胞、ヒト由来さい帯血細胞及び中間葉系幹細胞、血管内皮前駆細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、胚芽幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、根毛細胞（Ｍｙｏｂｌａｓｔ）、心筋幹細胞（Ｃａｒｄｉａｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などが利用されてもよく、より好ましくは、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞、ヒト角膜上皮細胞及びヒト由来繊維芽細胞である。
【００２３】
本発明で示す化学式１のヘキサノイルグリコールキトサン（ＨＧＣ）の製造方法には制限がないが、例えば、次の方法によって製造可能である。
出発物質としてグリコールキトサン公知の方法を利用して直接製造したり、市販されるものを購入して使用する。この時、市販のグリコールキトサンとしては、ＷＡＫＯ社、ＳＩＧＭＡ社、東京化成社から販売しているものを購入して使用可能である。
前記反応は最終的に得ようとするヘキサノイルグリコールキトサン（ＨＧＣ）内でヘキサノイル基（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｒｏｕｐ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ５Ｈ１１））の置換度によってグリコールキトサンとヘキサン酸無水物（Ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）のモル比を異にしてもよく、一例としてグリコールキトサンのアミン基とヘキサン酸無水物が１：０．１〜１：７０のモル比内で適宜調節してもよい。
【００２４】
この時の反応は−１０ないし６０℃で、好ましくは、１５ないし２５℃で、反応時間は１０ないし５０時間であり、好ましくは、４０ないし５０時間行う。また、必要な場合、反応溶媒、触媒、反応終決剤などの使用が可能である。使用可能な溶媒は、本発明で特に限定せず、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどの低級アルコールと、ジクロロメタン、卜リクロロメタン、テトラクロロメタン、トルエン、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、キシレン、ベンゼン、ｎ−ブチルアセテート、メチルシクロヘキサン、ジメチルシクロヘキサン及びこれらの混合溶媒からなる群から選択された１種が可能である。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の好ましい実施例及び実験例を記す。下記実施例及び実験例は、本発明をより明確に表現するための目的で記載するだけで、本発明の内容が下記実施例に限定されることではない。
【００２６】
＜実施例１＞ ヘキサノイルグリコールキトサン（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ：ＨＧＣ）合成
グリコールキトサン（ＧＣ）３ｇを３次蒸留水３７５ｍＬに十分溶解させた後、蒸留水と同じ量のメタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を添加して均一に撹拌した。グリコールキトサンのｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ残基に対して１：０．４５のモル比（Ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）でヘキサン酸無水物（Ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を一滴ずつ滴下した後、４８時間反応させた。以後、反応溶液をアセトン（Ａｃｅｔｏｎｅ）に沈殿し、遠心分離を通して高分子を得た。合成した高分子を透析膜（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ ｏｆｆ＝１２，０００〜１４，０００）を利用して３日間３次蒸留水に透析し、凍結乾燥を通して最終パウダー形態でヘキサノイルグリコールキトサン（Ｈｅｘａｎｏｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ：ＨＧＣ）を収得した。
【００２７】
＜実験例１＞ＨＧＣの細胞適合性評価
ＨＧＣの細胞適合性を評価するために、細胞はヒトの肺から分離した繊維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を使用し、継代培養する間１０％の牛胎児の血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）培地を使用した。前記実施例１で製造したＨＧＣを０．２５％（ｗ／ｖ）で溶解して繊維芽細胞を培養し、ＨＣＧ未添加培地で培養した細胞を対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。
【００２８】
Ａ）ＨＧＣが繊維芽細胞のモルフォロジーに及ぼす影響
ＨＧＣが含まれたＤＭＥＭ培地で繊維芽細胞を培養した後、培養した繊維芽細胞を０．０５％のトリプシン酵素を処理して単一細胞の形態で浮遊させ、ＤＭＥＭ培地を利用して収得した。前記収得した細胞を計数して５．６×１０４個ずつ３５ｍｍ細胞培養プレートに敷いた後、３７℃、５％二酸化炭素培養器で培養した。２４時間後、ＨＧＣが含まれた培地に入れ替え、培地の入れ替え後、１日目、３日目に顕微鏡で繊維芽細胞のモルフォロジーを観察した。
図１を参考すれば、ＨＧＣが含まれた培地で培養された繊維芽細胞は、対照群であるＨＧＣ未含有培地で培養された繊維芽細胞と比べた時、本来の形態を保ちながらよく育つことを確認することができた。すなわち、ＨＧＣ処理の有無は、繊維芽細胞のモルフォロジーに大きい影響を及ぼさないことが分かった。
【００２９】
Ｂ）ＨＧＣが細胞の生存率に及ぼす影響
ＨＧＣが含まれたＤＭＥＭ培地で繊維芽細胞を培養した後、培養した繊維芽細胞を０．０５％のトリプシン酵素を処理して単一細胞形態で浮遊させ、ＤＭＥＭ培地を利用して収得した。前記収得した細胞を４−ｗｅｌｌ細胞培養プレートに１５，０００個／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）単位で継代し、３７℃、５％のＣＯ２培養器で培養した。２４時間後、ＨＧＣが含まれた培地に入れ替え、培地の入れ替えから４８時間後、生存／死滅（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ）分析キットで染色して蛍光顕微鏡で観察した。
【００３０】
図２を参考すれば、４８時間後、ＨＧＣが含まれた培地で培養された繊維芽細胞が対照群であるＨＧＣ未含有培地で培養された細胞と同様、大概緑色の蛍光を帯びていることを確認した。これを通してＨＧＣは、繊維芽細胞の生存率にほとんど影響を及ぼさないことが分かった。
【００３１】
＜実験例２＞ＨＧＣが細胞増殖に及ぼす影響
ＨＧＣが細胞の増殖活性に影響を及ぼすか否かを確認するために、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）ａｓｓａｙを実施した。
【００３２】
細胞は、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９、ヒト角膜上皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、ヒト由来繊維芽細胞を使用した。継代培養する間、Ａ５４９細胞は１０％の牛胎児の血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシンが含まれたＲＰＭＩ １６４０培地を使用し、角膜上皮細胞と繊維芽細胞の場合、１０％の牛胎児の血清と１％のペニシリン−ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地を使用した。また、前記実施例１で製造したＨＧＣを０．１、０．２５、０．５、１％（ｗ／ｖ）濃度でそれぞれの細胞培養培地に溶解して細胞に処理し、ＨＣＧ未添加培地で培養した細胞を対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。
【００３３】
Ａ）ＭＴＴ ａｓｓａｙを利用したＡ５４９細胞増殖評価
培養したＡ５４９細胞は、０．０５％のトリプシン酵素を処理して単一細胞の形態で浮遊させた後、ＲＰＭＩ １６４０培地を利用して収得した。前記収得したＡ５４９細胞を９６−ｗｅｌｌ細胞培養プレートで１０００個／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）単位で継代培養し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した後、ＨＧＣが添加された培地に入れ替えた。培地の入れ替え日を０日目とし、それぞれ０〜５日目、５ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに溶解されたＭＴＴ溶液を各ウェル当たり２０μｌずつ処理し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２時間培養した。ホルマザン結晶が形成されたことを確認した後、上澄み液を取り除いた。ＤＭＳＯを利用して結晶を溶かした後、５４０ｎｍの波長帯でマイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を通して吸光度を測定し、細胞の増殖を確認した。
【００３４】
図３で分かるように、ＨＧＣが添加された培地で培養されたＡ５４９細胞は、対照群であるＨＧＣ未添加培地で培養されたＡ５４９細胞と比べた時、時間の流れによる統計上、有意的により高い細胞増殖率を示すことを確認することができた。
【００３５】
Ｂ）ＭＴＴ ａｓｓａｙを利用した角膜上皮細胞増殖評価
培養した角膜上皮細胞は、０．０５％のトリプシン酵素を処理して単一細胞形態で浮遊させた後、ＤＭＥＭ培地を利用して収得した。前記収得した細胞を９６−ｗｅｌｌ細胞培養プレートに２０００個／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）単位で継代培養した後、前記Ａ５４９細胞と同様の過程を経て培地入れ替えから０〜７日目に吸光度を測定し、細胞の増殖を確認した。
図４で分かるように、ＨＧＣが添加された培地で培養された角膜上皮細胞は、全ての濃度での細胞増殖率がＨＧＣ未添加培地で培養した細胞の増殖率より高いことを確認することができ、特に、０．５％（ｗ／ｖ）濃度の培地で培養された細胞が最も高い増殖率を示すことを確認した。
【００３６】
Ｃ）ＭＴＴ ａｓｓａｙを利用した繊維芽細胞増殖評価
培養した繊維芽細胞は、０．０５％のトリプシン酵素を処理して単一細胞の形態で浮遊させた後、ＤＭＥＭ培地を利用して収得した。前記収得した細胞を９６−ｗｅｌｌ細胞培養プレートに２０００個／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）単位で継代培養した後、前記Ａ５４９細胞と同様の過程を経て培地入れ替えから０〜７日目に吸光度を測定し、細胞の増殖を確認した。
【００３７】
図５で分かるように、ＨＧＣが添加された培地で培養された繊維芽細胞は、ＨＧＣ未添加培地で培養した細胞の増殖率より高く示されることを確認することができ、その中でも０．２５％（ｗ／ｖ）濃度の培地で培養された細胞が最も高い増殖率を示すことを確認した。
【００３８】
＜実験例３＞ＨＧＣ処理によるＤＮＡ含量比較
流細胞分離測定機（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）を利用してＨＧＣが繊維芽細胞の細胞周期に及ぼす影響を分析した。
【００３９】
先ず、繊維芽細胞を３５ｍｍ細胞培養プレートに５．６×１０４個ずつ継代培養した。２４時間後、ＨＧＣが０．２５％（ｗ／ｖ）添加された培地に入れ替えた。それぞれ１、３、５、７日目にトリプシン酵素を処理して繊維芽細胞を収得し、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０が含まれた９５％エタノールを添加して固定した。固定溶液を除去した後、ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を添加して常温で３０分間細胞のＤＮＡを染色した。４０μｍの細胞ろ過器（Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）で細胞を通した後、流細胞分離測定機（ＦＡＣＳ）を利用して細胞のＤＮＡ含量を測定した。
【００４０】
図６で分かるように、ＨＧＣが添加された培地で培養された繊維芽細胞でＧ２／Ｍ周期を有する細胞の占める割合が、ＨＧＣを処理していない細胞群より高い割合を示すことを確認した。Ｇ２／Ｍ期に当たる細胞の割合が高いということは、細胞の増殖が比較的に活発に行われるという意味で解釈されるので、上の結果と同様に、ＨＧＣが細胞の増殖を誘導するという結果を確認することができた。
【００４１】
＜実験例４＞ＨＧＣの置換度が細胞増殖に及ぼす影響比較
化学的改質をしていないグリコールキトサン（ＧＣ）とヘキサノイル基の置換度（Ｄｅｇrｅｅ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、ＤＳ）が異なる二種類のＨＧＣが細胞増殖に及ぼす影響を比べるために、ＣＣＫ−８（Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８）ａｓｓａｙを実施した。ＨＧＣは、置換度が約３６％であるＨＧＣ ３６とＤＳが約４０％であるＨＧＣ ４０は使用し、それぞれ０．０５、０．１、０．２５％（ｗ／ｖ）で細胞培養培地に溶解して細胞に処理した。Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＧＣ及びＨＧＣ未添加培地で培養した細胞であり、細胞は繊維芽細胞を使用した。
【００４２】
培養した繊維芽細胞は、０．０５％のトリプシン酵素を処理して単一細胞の形態で浮遊させた後、ＤＭＥＭ培地を利用して収得した。前記収得した細胞を計数して９６−ｗｅｌｌ細胞培養プレートに２０００個／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）単位で継代培養し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養し、２４時間後にＧＣ、ＨＧＣ ３６、ＨＧＣ ４０が添加された培地に入れ替えた。培地の入れ替え後から１、３、５日目に、ＣＣＫ−８溶液を各ウェル当たり１０μｌずつ処理し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で１時間３０分間培養した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使って４５０ｎｍの波長帯で吸光度を測定し、細胞の増殖を確認した。
【００４３】
図７ないし図９で分かるように、ＨＧＣを添加した培地で培養した細胞（ＨＧＣ ３６、ＨＧＣ ４０）の場合、ＣｏｎｔｒｏｌとＧＣを添加した培地で培養した細胞と比べた時、比較的に高い細胞増殖率を示すことを確認することができた。また、ＨＧＣ ３６とＨＧＣ ４０培地で培養した細胞を比べた時、置換度がより高いＨＧＣ ４０培地で培養した細胞の細胞増殖率がより高いことを確認することができ、その中でも０．２５％（ｗ／ｖ）の濃度が最も高い値を示すという結果を確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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