(57)【要約】   本発明は、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法を提供する。この方法は、サンプル中の修飾ペプチドの数に基づく前記タンパク質修飾酵素のＫ値を計算することを含み、これは前記タンパク質修飾酵素の基質であるタンパク質修飾酵素の数、修飾ペプチドの強度、サンプル中の修飾ペプチドの修飾ペプチドの強度に基づく。本発明はさらにサンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法であって、阻害濃度で阻害剤を使用した時の増殖の低減、および一次標的に対する阻害剤の「生体外の」ＩＣ５０ｉに基づいて、前記タンパク質修飾酵素のＳＣ値を計算することを含む方法を提供する。本発明は、患者を治療する阻害剤を同定する方法、治療法、コンピューター読取り可能なメディア、コンピュータ・プログラムプロダクトおよび方法を実行するための装置をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性水準を決定する方法；
（ｉ）サンプル中の修飾ペプチドの総数を決定すること；
（ｉｉ）修飾ペプチドの強度を決定すること；
（ｉｉｉ）前記タンパク質修飾酵素の基質である、サンプル中の修飾ペプチドの数を決定すること；
（ｉｖ）前記タンパク質修飾酵素の基質である、修飾ペプチドの強度を決定すること
前記タンパク質修飾酵素のＫ値を以下のように計算すること：
【数１】
2019501637.tif 000016
ここで、ｍ＝前記タンパク質修飾酵素の基質である、サンプル中の修飾ペプチドの数；
α＝修飾ペプチドｉの強度；
ｉ＝前記タンパク質修飾酵素の基質であるサンプル中の個々の修飾ペプチド；
ｌ＝サンプル中の修飾ペプチドの総数；
β＝修飾ペプチドｊの強度；および
ｊ＝サンプル中の修飾ペプチドのすべて、
ここで、Ｋ値は前記タンパク質修飾酵素の活性水準に正比例する。
【請求項２】
前記タンパク質修飾酵素のＫ値が以下のように計算される、請求項１記載の方法：
【数２】
2019501637.tif 000017
ここで、ｔ＝前記タンパク質修飾酵素のための既知の目標修飾ペプチドの総数。
【請求項３】
前記タンパク質修飾酵素はプロテインキナーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉ）に先立って質量分析（ＭＳ）を使用して、サンプル中の修飾ペプチドを同定および／または定量することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
第１のサンプルおよび第２のサンプル中の修飾ペプチドの定量および／または同定が下記工程を含む方法を使用して行なわれる、請求項４記載の方法：
（ａ）  サンプルからペプチドを得ること；
（ｂ）  参照修飾ペプチドをステップ（ａ）の中で得られたペプチドに加え、ペプチドと参照修飾ペプチドの混合物を生産すること；
（ｃ）  ペプチドと参照修飾ペプチドの前記混合物に質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のペプチドに関するデータを得ること；および
（ｄ）  コンピューター・プログラムを使用して、修飾ペプチドのデータベース中のデータとサンプル中のペプチドに関するデータとを比較すること；
ここで、修飾ペプチドのデータベースは以下を含む方法によりコンパイルされる：
ｉ）  サンプルからペプチドを得ること；
ｉｉ）  ステップｉで得られたペプチドから修飾ペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）  ステップｉｉで得られた富化された修飾ペプチドに、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行なうこと；
ｉｖ）  既知のレファレンス・データベースとステップｉｉｉで検知された修飾ペプチドを比較し、修飾ペプチドを同定すること；および
ｖ）  データベースの中へ、ステップｉｖで同定された修飾ペプチドに関するデータをコンパイルすること。
【請求項６】
前記ステップ（ｂ）は、ステップ（ｂ）で得られたペプチドおよび参照修飾ペプチドの混合物から修飾ペプチドを富化し、富化された修飾ペプチドの混合物を生産することをさらに含み、前記ステップ（ｃ）は、富化された修飾ペプチドの混合物について質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のペプチドに関係のあるデータを得ることを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記修飾ペプチドを富化するステップはクロマトグラフィーを使用して行なわれる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記クロマトグラフィーは、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーおよび酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）クロマトグラフィーから成る群から選ばれる、請求項５記載の方法。
【請求項９】
修飾ペプチドを富化するステップは抗体に基づく方法を使用して行なわれる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中のペプチドに関するデータは、質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）およびペプチドの相対保持時間を含む、請求項５から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）の前記質量分析（ＭＳ）は液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）である、請求項５から１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ステップｉｉは多次元クロマトグラフィーを使用して実行される、
【請求項１３】
多次元クロマトグラフィーは、強陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して実行される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
多次元クロマトグラフィーは、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して実行される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ステップｉｉは抗体ベースの方法を使用して実行される、請求項５から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
ステップｉｖはＭＡＳＣＯＴサーチエンジンを使用して実行される、請求項５から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ステップｉｖで同定された修飾ペプチドに関係するデータは、修飾ペプチドの同一性、質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間からなる群から選択される、請求項５から１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
ＭＳ技術は定量化にアイソトープ・ラベルを使用する、請求項４記載の方法。
【請求項１９】
ＭＳ技術は代謝の標識化（例えば、培地中の安定同位体でラベルされたアミノ酸、（ＳＩＬＡＣ））、または化学誘導体化（たとえばiTRAQ 、ICAT 、TMT）を使用する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質修飾酵素のＫ値を以下のように計算することを含む、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法：
【数３】
2019501637.tif 000018
ここで、ｍ＝前記タンパク質修飾酵素の基質である、サンプル中の修飾ペプチドの数；
α＝修飾ペプチドｉの強度；
ｉ＝前記タンパク質修飾酵素の基質であるサンプル中の個々の修飾ペプチド；
ｌ＝サンプル中の修飾ペプチドの総数；
β＝修飾ペプチドｊの強度；および
ｊ＝サンプル中の修飾ペプチドのすべて。
【請求項２１】
前記タンパク質修飾酵素のＫ値が以下のように計算される、請求項２０記載の方法：
【数４】
2019501637.tif 000019
ここで、ｔ＝前記タンパク質修飾酵素のための既知の目標修飾ペプチドの総数。
【請求項２２】
タンパク質修飾酵素はプロテインキナーゼである、請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２３】
質量分析（ＭＳ）を使用して、第１のサンプルおよび第２のサンプル中の修飾ペプチドを同定および／または定量することを含む、請求項２０から２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
第１のサンプルと第２のサンプル中の修飾ペプチドを定量および／または同定は下記工程を含む方法を使用して行なわれる、請求項２３記載の方法：
（ａ）  サンプルからペプチドを得ること；
（ｂ）  参照修飾ペプチドをステップ（ａ）の中で得られたペプチドに加え、ペプチドと参照修飾ペプチドの混合物を生産すること；
（ｃ）  ペプチドと参照修飾ペプチドの前記混合物に質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のペプチドに関するデータを得ること；および
（ｄ）  コンピューター・プログラムを使用して、修飾ペプチドのデータベース中のデータとサンプル中のペプチドに関するデータとを比較すること；
ここで、修飾ペプチドのデータベースは以下を含む方法によりコンパイルされる：
ｉ）  サンプルからペプチドを得ること；
ｉｉ）  ステップｉで得られたペプチドから修飾ペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）  ステップｉｉで得られた富化された修飾ペプチドに、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行なうこと；
ｉｖ）  既知のレファレンス・データベースとステップｉｉｉで検知された修飾ペプチドを比較し、修飾ペプチドを同定すること；および
ｖ）  データベースの中へ、ステップｉｖで同定された修飾ペプチドに関するデータをコンパイルすること。
【請求項２５】
前記ステップ（ｂ）は、ペプチドおよび参照修飾ペプチドの混合物から修飾ペプチドを富化し、富化された修飾ペプチドの混合物を生産することをさらに含み、前記ステップ（ｃ）は、富化された修飾ペプチドの混合物について質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のペプチドに関係のあるデータを得ることを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾ペプチドを富化するステップはクロマトグラフィーを使用して行なわれる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記クロマトグラフィーは、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーおよび酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）クロマトグラフィーから成る群から選ばれる、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
修飾ペプチドを富化するステップは抗体に基づく方法を使用して行なわれる、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
サンプル中のペプチドに関するデータは、質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間を含む、請求項２４から２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｃ）の前記質量分析（ＭＳ）は液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）である、請求項２４から２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
ステップｉｉは多次元クロマトグラフィーを使用して実行される、請求項２４から３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
多次元クロマトグラフィーは、強陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して実行される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
多次元クロマトグラフィーは、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して実行される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
ステップｉｉは抗体ベースの方法を使用して実行される、請求項２４から３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
ステップｉｖはＭＡＳＣＯＴサーチエンジンを使用して実行される、請求項２４から３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
ステップｉｖで同定された修飾ペプチドに関係するデータは、修飾ペプチドの同一性、質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間からなる群から選択される、請求項２４から３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
ＭＳ技術は定量化にアイソトープ・ラベルを使用する、請求項２３記載の方法。
【請求項３８】
ＭＳ技術は代謝の標識化（例えば、培地中の安定同位体でラベルされたアミノ酸、（ＳＩＬＡＣ））、または化学誘導体化（たとえばiTRAQ 、ICAT 、TMT）を使用する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
以下を含む、患者を治療する、タンパク質修飾酵素の阻害剤を同定する方法を提供する：
（ｉ）  請求項１から３８のいずれか１項記載の方法を使用して、前記患者から採取されたサンプル中の各タンパク質修飾酵素のＫ値を計算すること；
（ｉｉ）  最も高いＫ値を有するタンパク質修飾酵素を同定すること；および
（ｉｉｉ）  最も高いＫ値を有するタンパク質修飾酵素をターゲットとする阻害剤を選択すること。
【請求項４０】
以下を含む、タンパク質修飾酵素の阻害剤でその必要のある患者を治療する方法：
（ｉ）  本発明の第１の態様の方法を使用して、前記患者から採取されたサンプル中の各タンパク質修飾酵素のＫ値を計算すること；
（ｉｉ）  最も高いＫ値を有するタンパク質修飾酵素を同定すること；
（ｉｉｉ）  最も高いＫ値を有するタンパク質修飾酵素をターゲットとする阻害剤を選択すること；および
（ｉｖ）  前記患者へ前記阻害剤を適用すること。
【請求項４１】
タンパク質修飾酵素についてＳＣ値を以下のように計算することを含む、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法：
【数５】
2019501637.tif 000020
ここで、ＰＣｉ＝Ｃｉで阻害剤を使用した時の増殖の低減；
Ｃｉ＝増殖が測定される阻害剤濃度；また、
ＩＣ５０ｉ＝一次標的に対する阻害剤の「生体外の」ＩＣ５０。
【請求項４２】
前記タンパク質修飾酵素はプロテインキナーゼである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
操作可能なコンピューター読取り可能なコードを含むコンピューター読取り可能なメディアであって、使用の際に、請求項１から３９、４１および４２のいずれか１項記載の方法を実行するようにコンピューターに指示する、コンピューター読取り可能なメディア。
【請求項４４】
操作可能なコンピューター読取り可能なコードを含むコンピュータープログラムプロダクトであって、使用の際に、請求項１から３９、４１および４２のいずれか１項記載の方法を実行するようにコンピューターに指示する、コンピュータープログラムプロダクト。
【請求項４５】
請求項１から３９、４１および４２のいずれか１項記載の方法を実行するコードが格納されたメモリー、およびメモリー内に格納されたコードを実行するようにされたプロセッサーを含むデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法に関し、特には蛋白質キナーゼの活性の定量化方法に関する。本発明の方法は、患者を治療するためのタンパク質修飾酵素（例えばキナーゼ阻害剤）の最も適切な阻害剤を決定するために使用することができ、したがって、テーラーメイド医療の分野に役立つ。
【０００２】
本発明の背景
プロテイン・キナーゼは細胞シグナリング経路の活性をコントロールし、次いで遊走、代謝および増殖を含む重要な生物学的機能を調節する。細胞シグナリング経路は、適切な細胞のレスポンスへ細胞外の信号を統合し解読する生化学反応の複合体ネットワークを形成する。これらのネットワークの改造およびそれらの特性の組織的な分析は、システム・レベルでの疾病についての我々の分子の理解を進めるのに重要である。細胞生物学の調整でのそのような経路の重要性は、キナーゼが多くの疾病中で脱制御（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅ）されるという事実によって強調される；例としては、糖尿病におけるＡＭＰ活性化キナーゼ（ＡＭＰＫ）、自己炎症性状態におけるヤヌス・キナーゼ（ＪＡＫ）、神経変性におけるＧＳＫ３β、および癌の異なる形態におけるＡｋｔを含む。
【０００３】
ヒトは５００を超えるキナーゼ遺伝子を有し、与えられた細胞集団で約２００が発現された。このエリアにおける多くの研究にもかかわらず、全体的なシグナリング出力へのこれらのキナーゼの各々の貢献を定量する方法が欠けている。確かに、シグナリング（それは質量分析（ＭＳ）または免疫化学技術のいずれかに基づく）を定量するために現在使用される方法はすべて、コントロール、または別のサンプルとの対比で与えられたシグナリング経路の活性を評価する。例えば、ＷＯ  ２０１３／１３２０７５として公表された発明者の先の出願は、異なるサンプルからの修飾ペプチドの分析により、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法に関する。これはキナーゼ基質富化分析（ＫＳＥＡ）と名付けられ、Casado et al Science Signaling 6, rs6 (2013)にも開示されている。
【０００４】
したがって、これらの方法はシグナリングが異なる条件でどのように調整されるか調査するのに有用である。しかし、これらは与えられた細胞集団内での互いに関するシグナリングにそれらがどれくらい寄与するかに基づいてキナーゼをランク付けするために使用することができない。
【０００５】
それらが与えられた表現型にどれほど寄与するかに基づいて細胞集団または組織内のキナーゼをランク付けすることに対する、最先端技術の無力は、周知の臨床上の問題である。キナーゼの阻害剤は幾分かの癌患者に有効である。しかし、かなりの数の患者はそのような薬に反応しない。いくつかの実例では、遺伝マーカーまたはタンパク質マーカーは癌治療の個別化のために使用される。しかし、レスポンスに対する現在のバイオマーカーの正確さは多くの場合低い。これは、テーラーメイド医療の発達を妨げる。
【０００６】
キナーゼ療法に対する癌の反応の変異は、恐らく癌が生物学上異質的であるという事実による。確かに、すべての癌患者の中で一般に活性化される１セットの本質的なキナーゼを同定する努力は、代わりに、キナーゼ増殖のネットワークのワイヤリングは、異なる患者から採取された細胞間で著しく異なることを明らかにした。したがって、癌細胞は、増殖のために必要なキナーゼの著しい変化を示す。この異質さの実際的な帰結は、患者が異なる程度でキナーゼ阻害剤に応答するということである。例えば、黒色腫の約５０％は、ＢＲＡＦプロテインキナーゼ上のＶ６００Ｅ突然変異を保護する；これらの５０％（つまり全体のレスポンスの２５％）は、変異させられたＢＲＡＦの阻害剤であるベムラフェニブ(vemurafenib)によく応答した。同様に、乳癌の約３０％は、ＰＩＫ３ＣＡ（ＰＩ３Ｋのｐ１１０αアイソフォームのためのコード化遺伝子）上に突然変異を持っている。最近の臨床試験は、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異に陽性の患者の約３０％（つまり全体のレスポンスの１０％）が定義された基準によりＰＩ３Ｋ阻害剤に応答したことを示した。現在では、与えられた突然変異には陽性の患者が、変異させられた目標のキナーゼ特異性阻害に対して異なる応答をするかは知られていない。また、これらの遺伝子上の突然変異のない腫瘍の悪性表現型に導く経路の同一性も、ほとんどの患者で知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、患者を治療する最も適切な療法の決定を許可するために、タンパク質修飾酵素（特定のサンプル内のキナーゼ）の活性を定量することへの技術的な必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要約
本発明の発明者は、与えられた細胞集団での、細胞シグナリングへの個々のタンパク質修飾酵素（たとえばプロテイン・キナーゼ）の寄与を定量するために２つのアルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムの出力は、合理的に個々の患者を治療する最も適切な細胞シグナリング阻害剤を選択するために使用することができる。アルゴリズムの出力は、キナーゼ活性序列（Kinase Activity Ranking：ＫＡＲ）および「感度係数」（Sensitivity Coefficient：ＳＣ）とそれぞれ名付けられる。ＫＡＲの出力は「Ｋ−スコア」と名付けたキナーゼ活性のインデックスである（以下においてＫと呼ぶ）。
【０００９】
従って、第１の態様では、本発明は、前記タンパク質修飾酵素のＫ値を以下のように計算することを含む、サンプル中のタンパク質修飾酵素（protein modifying enzymes）の活性を定量する方法を提供する：
【００１０】
【数１】
2019501637.tif 000002
【００１１】
ここで、ｍ＝前記タンパク質修飾酵素の基質（substrates）であるサンプル中の修飾ペプチドの数；
α＝修飾ペプチドｉの強度；
ｉ＝前記タンパク質修飾酵素の基質であるサンプル中の個々の修飾ペプチド；
ｌ＝サンプル中の修飾ペプチドの総数；
β＝修飾ペプチドｊの強度；
ｊ＝サンプル中の修飾ペプチドのすべて。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、前記タンパク質修飾酵素についてＳＣ値を以下のように計算することを含む、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法を提供する：
【００１３】
【数２】
2019501637.tif 000003
【００１４】
ここで、ＰＣｉ＝Ｃｉで阻害剤を使用した増殖の低減；
Ｃｉ＝増殖が測定される阻害剤濃度；また、
ＩＣ５０ｉ＝一次標的に対する阻害剤の「生体外の」ＩＣ５０。
【００１５】
異なる態様では、本発明の開示は、以下を含む、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性水準を決定する方法に関する；
（ｉ）サンプル中の修飾ペプチドの総数を決定すること；
（ｉｉ）修飾ペプチドの強度を決定すること；
（ｉｉｉ）前記タンパク質修飾酵素の基質である、サンプル中の修飾ペプチドの数を決定すること；
（ｉｖ）前記タンパク質修飾酵素の基質である、修飾ペプチドの強度を決定すること
前記タンパク質修飾酵素のＫ値を以下のように計算すること：
【００１６】
【数３】
2019501637.tif 000004
【００１７】
ここで、ｍ＝前記タンパク質修飾酵素の基質である、サンプル中の修飾ペプチドの数；
α＝修飾ペプチドｉの強度；
ｉ＝前記タンパク質修飾酵素の基質であるサンプル中の個々の修飾ペプチド；
ｌ＝サンプル中の修飾ペプチドの総数；
β＝修飾ペプチドｊの強度；および
ｊ＝サンプル中の修飾ペプチドのすべて、
ここで、Ｋ値は前記タンパク質修飾酵素の活性水準に正比例する。
【００１８】
本発明の詳細な記述
本発明は、タンパク質修飾酵素（たとえばサンプル中のプロテインキナーゼ）の活性を定量する方法に関する。方法は修飾ペプチド（例えばリン酸化ペプチド）の分析に基づく。それは、ＭＳに基づいた技術を使用して、本発明の第１の態様の中で典型的に同定される。
【００１９】
本明細書に記載されたように、本発明の方法は、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法である。ほとんどのタンパク質は官能基の付加による方法で修飾される。また、そのような修飾はタンパク質修飾酵素によって達成される。質量分析によって検知することができるタンパク質修飾はリン酸化、グリコシレーション、アセチル化、メチル化および脂質化を含んでいる。これらのタンパク質修飾には細胞の様々な生物学的役割がある。したがって、修飾部位は翻訳後修飾の部位であることができる。例えば、修飾部位は、リン酸化、グリコシレーション、アセチル化、メチル化および脂質化の部位であることができる。修飾部位は典型的にタンパク質および／またはペプチド修飾部位である。修飾部位は、官能基（たとえば燐酸基）がペプチドまたはタンパク質に付加するペプチドまたはタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基であることができる。異なる官能基としては炭水化物、アセチル基、メチル基および脂質を含んでいる。「タンパク質修飾酵素」の用語は、タンパク質またはペプチドへの官能基の付加に関する反応に触媒作用を及ぼす酵素を意味する。「修飾ペプチド」は、官能基の付加または除去によって修飾されたペプチドとして定義される。「タンパク質修飾酵素」は、タンパク質またはペプチドへの官能基の付加または除去に関する反応に触媒作用を及ぼす酵素として定義される。
【００２０】
本発明の方法は、その活性がＭＳに基づいた方法を使用して検知することができるあらゆるタンパク質修飾酵素の活性の定量化に適用することができる。そのような酵素としては、プロテイン・キナーゼ（さらに本明細書では「キナーゼ」とも呼ばれる）、タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、蛋白質メチルトランスフェラーゼおよびタンパク質パルミトイルトランスフェラーゼを含んでいる。これらの酵素の活性は、タンパク質またはペプチド基質のリン酸化、アセチル化、グリコシレーション、メチル化および脂質化にそれぞれ帰着する。これらのタンパク質修飾はすべて質量分析によって検知することができる。
【００２１】
本発明の方法は修飾ペプチドの分析に基づく。修飾ペプチドは、タンパク質修飾酵素によって例えば燐酸化、アセチル化、グリコシレーション、メチル化または脂質化された、１つ以上の修飾アミノ酸を含む。そのような修飾アミノ酸はここに「修飾部位」と呼ばれる。修飾ペプチドが特定のタンパク質修飾酵素によって修飾される場合、それはその酵素の「基質」として言及される。修飾ペプチドは、タンパク質修飾酵素によって修飾された１つ以上のアミノ酸を含んでいる。
【００２２】
１つの実施態様では、本発明の方法はプロテインキナーゼの活性を定量する方法である。この実施態様では、方法はリン酸化ペプチドの分析に基づく。
【００２３】
燐酸化されたペプチドは、燐酸化された（つまり、リン酸塩（ＰＯ４）基がアミノ酸に付加されている）１つ以上のアミノ酸を含んでいる。そのような燐酸化されたアミノ酸はここに「燐酸化部位」と呼ばれる。ペプチドが特定のプロテインキナーゼによって燐酸化される場合、それはそのプロテインキナーゼの「基質」として言及される。本発明のこの実施態様に関して、用語「燐蛋白質」は燐酸化されたタンパク質を言及するためにここに使用される。また、用語「フォスフォペプチド」はリン酸化ペプチドを言及するためにここに使用される。
【００２４】
ヒト・プロテイン・キナーゼはＡＧＣキナーゼ（例えばプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）（Ａｋｔとしても知られる）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、およびプロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）；チロシンキナーゼ；チロシンキナーゼ様キナーゼ；カルシウム／カルモジュリン依存性のプロテイン・キナーゼ；カゼイン・キナーゼ１グループ；ＣＭＧＣグループ（例えばＣＤＫ、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３、ＣＬＫキナーゼ）；およびＳＴＥ、イーストステライト７、ステライト１１，およびステライト２０キナーゼの同族体を含む多くの群に分けられる。
【００２５】
本発明の方法は、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法である。本発明の方法の中で使用されるサンプルはペプチドを含むあらゆるサンプルであることができる。サンプルは典型的に生体試料で、生物から得られた任意のタイプのサンプル（例えばヒト、動物、植物あるいはバクテリアから得られたサンプル）であることができる。本発明は、このようにヒトおよびヒト以外の源から得られたサンプルの使用を包含する。
【００２６】
本発明の方法の中で使用されるサンプルは任意の対象の種からのものでありえる。典型的には、サンプルはヒトまたは動物からのものである。動物は、典型的に哺乳動物（例えばげっ歯動物（マウス、ネズミまたはモルモット））または有蹄動物（雌牛、羊またはヤギ）である。動物は、または鳥（たとえば鶏）、魚（たとえばゼブラフィッシュ）、線虫（たとえば虫線虫）または昆虫（たとえばミバエ・キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster.））である。本発明の方法の中で使用されるサンプルはさらに他の生活形（たとえばバクテリアおよび酵母）からのものでありえる。本発明の方法の中で使用されるサンプルは、典型的にバクテリア（たとえば大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラエンテリカ（Salmonella enterica）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、または酵母（たとえばパン酵母、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、または分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）の実験的に重要な種からのサンプルである。本発明の方法の中で使用されるサンプルは植物または菌類、またはウイルスからでありえる。
【００２７】
本発明はテーラーメイド医療の分野に用途を見いだす。典型的には、生体試料はヒト由来で、体液（たとえば尿または血液）のサンプル、または別の組織であることができる。典型的には、生体試料は細胞株または組織であり、典型的に一次組織（primary tissue）である。例えば、サンプルはヒトまたは動物からの組織であることができる。ヒトまたは動物は健康体または病気のものであることができる。実施態様では、ヒトは、癌（例えばリンパ腫、白血病、例えば急性骨髄白血病）（ＡＭＬ））を持っていると診断されたか、または持っていることが疑われるものであることができる。従って、組織は癌組織であることができる。例えば、サンプルは腫瘍からのものであることができる。あるいは、サンプルは、健康か病気のヒトまたは動物細胞由来の細胞株であることができる。本発明の方法の中で使用される１番目と２番目のサンプルは、典型的には細胞株（例えば癌細胞株、たとえば乳癌細胞株、たとえばＭＣＦ７細胞株）からの細胞であるか、またはこれを含んでいる。多くの癌細胞株が技術分野の中で知られており、http://www.broadinstitute.org/ccle/homeのBroad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)  にオンラインでリストされる。
【００２８】
１番目と２番目のサンプルは典型的に同じ細胞株からであるが異なってもよい。１番目と２番目のサンプルは同じ源から由来することができる。例えば、１番目と２番目のサンプルは両方とも一人の個人からのものであることができる。１番目と２番目のサンプルは同じ組織からのものであることができる。１番目と２番目のサンプルは同じ体液からのものであることができる。
【００２９】
サンプルは本発明の方法の中で使用されるサンプルと別のサンプルを区別するために「試験サンプル」とここに呼ばれる場合がある。例えば、対照試料との比較を含む方法について記述する場合に、サンプルは試験サンプルと呼ばれることがある。
【００３０】
本発明の方法は生体外の方法であり、したがって、生物（たとえば動物）からサンプルを得るステップを含まない。
【００３１】
修飾ペプチドは、サンプル内で修飾されることができる。修飾ペプチドは、生体内で修飾されることができる。修飾ペプチドは、内因的な修飾ペプチドであることができる。
【００３２】
本発明の第１の態様の方法は、タンパク質修飾酵素のＫ値を以下のように計算することを含む、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法である：
【００３３】
【数４】
2019501637.tif 000005
【００３４】
Ｋ値は、サンプルの中にあるすべての修飾ペプチドの強度の合計で割られた、与えられたタンパク質修飾酵素の基質であることが知られていたすべての修飾ペプチドの強度の合計である。当業者が理解するように、ペプチドの「強度」はアバンダンス（abundance）に相当し、たとえばサンプル中のアバンダンスに相当する。強度は、たとえばＬＣ−ＭＳデータからのクロマトグラムのピーク面積または高さを使用して計算することができる。
【００３５】
上に述べられた式の中で、ｍ＝その活性が定量されるタンパク質修飾酵素の基質であるサンプル中の修飾ペプチドの数；
α＝修飾ペプチドｉの強度、ここで、ｉ＝前記タンパク質修飾酵素の基質であるサンプル中の個々の修飾ペプチド；
ｌ＝サンプル中の修飾ペプチドの総数；
β＝修飾ペプチドｊの強度、ここで、ｊ＝サンプル中のすべての修飾ペプチド。
【００３６】
いくつかの実施態様では、修飾ペプチドｉおよびｊの強度は正規化される。
正規化は、典型的には強度の合計に対して行なわれる。
【００３７】
いくつかの実施態様では、修正係数が、いくつかのキナーゼが他のものより多くの基質を持っており、より多くの情報がよく知られているキナーゼについてキナーゼ−基質の関係が知られているという事実を考慮するために使用される。これらの実施態様では、Ｋ値は、前記タンパク質修飾酵素について以下のように計算される：
【００３８】
【数５】
2019501637.tif 000006
【００３９】
ここで、ｔ＝前記タンパク質修飾酵素のための既知の目標修飾ペプチドの総数。
【００４０】
増倍率（multiplication factor）はより扱いやすいレベルでＫ値を示すために使用することができる。例えば、１０２、１０４または１０６の増倍率を使用することができる。１０６の増倍率が使用される場合、Ｋ値は以下のように計算される：
【００４１】
【数６】
2019501637.tif 000007
【００４２】
本発明の第１の態様の方法は、特定のタンパク質修飾酵素の基質である、サンプル中の修飾ペプチドの数を決定することを含んでいる。言いかえれば、方法は同じタンパク質修飾酵素によって修飾される修飾部位を有する修飾ペプチドの数を決定することを含んでいる。したがって、これらの修飾ペプチドの各々は、同じタンパク質修飾酵素によって修飾される少なくとも１つの修飾部位がある。例えば、プロテインキナーゼの活性が分析される場合、方法は同じキナーゼによって燐酸化される燐酸化部位を有するリン酸化ペプチドの数を決定することを含んでいる。この実施態様では、各々のリン酸化ペプチド内の燐酸化部位は同じキナーゼによって燐酸化されることが知られている。同様に、タンパク質修飾酵素がアセチラーゼである場合、方法は同じアセチラーゼによってアセチル化されるアセチル化部位を有する修飾ペプチドの数を決定することを含んでいる。この実施態様では、各々のアセチル化されたペプチド内のアセチル化部位は同じ特定のアセチラーゼによってアセチル化されことが知られている。
【００４３】
キナーゼ−基質に関係する情報、したがって特定のキナーゼによって燐酸化される燐酸化部位の情報は、公に利用可能なデータベースから得ることができ、たとえば、PhosphoSite (Hornbeck et al, Proteomics 4, 1551 (Jun, 2004)), PhosphoSitePlus (「<http://www.phosphosite.org/>」) and PhosphoElm (Dinkel et al, Nucleic Acids Res 39, D261 (Jan, 2011))で利用できる。同様に、他の修飾についての情報は実験的に、または公に利用可能なデータベース、および文献に記載された個々の研究報告から得ることができる。
【００４４】
本発明のいくつかの実施態様では、サンプル、またはサンプルが得られる生物はそれ自身、本発明の方法を実行する前に検体で処理される。したがって、この実施態様では、組織が得られる細胞株または生物は本発明の方法を実行する前に検体で処理される。検体は、典型的に外因性の化学薬品または薬（小分子阻害剤、ＲＮＡｉ、治療用ペプチドおよび抗体）である。本発明のこの実施態様は、タンパク質修飾酵素の活性に対する検体の影響の調査を許可する。
【００４５】
例えば、１つの実施態様では、細胞株は、本発明の方法を実行する前に経路のアゴニストおよび／またはキナーゼ阻害剤で処理することができる。典型的なキナーゼ阻害剤としては、ｓｒｃおよびホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、たとえばＰＰ２およびＰＩ−１０３の阻害剤を含んでいる。ＰＩ３Ｋの他の阻害剤はウォルトマンニンを含んでいる。少なくとも８０のキナーゼ阻害剤が、異なる臨床段階にある（Zhang, J.; et al Nat Rev Cancer 2009, 9, (1), 28-39)。さらに技術はキナーゼ経路に効果があると期待される他のタイプの阻害剤、たとえばＨＳＰ９０阻害剤、ホスファターゼ阻害剤および抗体医薬剤を調査するのに有用である。
【００４６】
ここに定義される「ペプチド」は、短いアミノ酸配列で、オリゴペプチドとポリペプチドを含んでいる。典型的には、そのようなペプチドは、５から３０、たとえば６または７から２５、２６または２７のアミノ酸、８、９または１０から２０のアミノ酸、１１または１２から１８のアミノ酸、または１４から１６のアミノ酸、たとえば１５のアミノ酸長を有する。しかしながらより短いかまたはより長いペプチド、たとえば約２から約５０、約３から約３５または４０、または約４から約４５のアミノ酸長のものも使用することができる。典型的には、ペプチドは質量スペクトル分析に適している。すなわちペプチドの長さが質量スペクトル分析に適しているのである。分析することができるペプチドの長さは、質量分析計のそのような長いペプチドシークエンスする能力によって制限されている。ある場合には、３００までのアミノ酸のポリペプチドを分析することができ、たとえば５０から２５０のアミノ酸、１００から２００のアミノ酸、または１５０から１７５のアミノ酸を分析することができる。
【００４７】
本明細書に記載される本発明の第１の態様の方法は、ＭＳベースの技術を使用した本発明の１つの実施態様において同定および／または定量される修飾ペプチドの分析に基づく。いくつかの実施態様では、本発明の第１の態様の方法は、質量分析（ＭＳ）を使用してサンプル中の修飾ペプチドを同定および／または定量するステップと、その後に対象のタンパク質修飾酵素のＫ値を計算することを含んでいる。この実施態様では、本発明は、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法であって、質量分析（ＭＳ）を使用して修飾ペプチドを同定および／または定量し、前記タンパク質修飾酵素のＫ値を計算することを含む方法を提供する：
【００４８】
【数７】
2019501637.tif 000008
【００４９】
ここで、ｍ＝前記タンパク質修飾酵素の基質であるサンプル中の修飾ペプチドの数；
α＝修飾ペプチドｉの強度；
ｉ＝前記タンパク質修飾酵素の基質であるサンプル中の個々の修飾ペプチド；
ｌ＝サンプル中の修飾ペプチドの総数；
β＝修飾ペプチドｊの強度；
ｊ＝サンプル中の修飾ペプチドのすべて。
【００５０】
修飾ペプチドの同定および／または定量化は任意の適切な方法を使用して実行することができる。典型的には、同定および／または定量化は質量分析（ＭＳ）を含む任意の方法（たとえば液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ））によって実行することができる。ＬＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ／ＭＳは典型的にラベルなしのＭＳである。しかし、同位元素標識を同定および／または定量化の基礎として使用する技術も、分析の基礎として使用することができる。
【００５１】
本発明の方法では、その全体が参照として組み入れられるＷＯ  ２０１０／１１９２６１（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００７７０）に述べられたように、タンパク質修飾（たとえばリン酸化）の同定および／または定量化はＴＩＱＵＡＳ(targeted and in-depth quantification of signalling)技術を使用して、典型的に実行される。この技術は、修飾ペプチドの敏感で、迅速で、包括的な定量化を許容する。この方法は、１つの単純な分析において、タンパク質上の何千もの燐酸化部位の量を同時に測定することができる。ＷＯ  ２０１０／１１９２６１に述べられるように、ＴＩＱＵＡＳ技術もリン酸化ペプチド以外の修飾ペプチドを定量するために使用することができる。実際、ＴＩＱＵＡＳ技術は質量分析によって検知することができるいずれかの修飾を含んでいるペプチドを定量するために使用することができる。
【００５２】
本発明の第１の態様の方法のこの実施態様では、前記タンパク質修飾酵素についてＫ値を計算する前に、質量分析（ＭＳ）を使用して、修飾ペプチドを定量するおよび／または同定するステップは下記工程を含む方法を使用して行なわれる：
（ａ）  サンプルからペプチドを得ること；
（ｂ）  参照修飾ペプチドをステップ（ａ）の中で得られたペプチドに加え、ペプチドと参照修飾ペプチドの混合物を生産すること；
（ｃ）  ペプチドと参照修飾ペプチドの前記混合物に質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のペプチドに関するデータを得ること；および
（ｄ）  コンピューター・プログラムを使用して、修飾ペプチドのデータベース中のデータとサンプル中のペプチドに関するデータとを比較すること；
ここで、修飾ペプチドのデータベースは以下を含む方法によりコンパイルされる：
ｉ）  サンプルからペプチドを得ること；
ｉｉ）  ステップｉで得られたペプチドから修飾ペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）  ステップｉｉで得られた富化された修飾ペプチドに、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行なうこと；
ｉｖ）  修飾ペプチドを同定するために既知のレファレンス・データベースとステップｉｉｉで検知された修飾ペプチドを比較すること；および
ｖ）  データベースの中へ、ステップｉｖで同定された修飾ペプチドに関するデータをコンパイルすること。
【００５３】
本発明の第１の態様の方法の１つの実施態様では、タンパク質修飾酵素がプロテインキナーゼであり、修飾がリン酸化であり、前記プロテインキナーゼについてＫ値を計算する前に、質量分析（ＭＳ）を使用して修飾ペプチドを定量するおよび／または同定するステップは下記工程を含む方法を使用して行なわれる：
（ａ）  サンプルからリン酸化ペプチドを得ること；
（ｂ）  参照リン酸化ペプチドをステップ（ａ）の中で得られたペプチドに加え、リン酸化ペプチドと参照リン酸化ペプチドの混合物を生産すること；
（ｃ）  リン酸化ペプチドと参照リン酸化ペプチドの前記混合物について質量分析（ＭＳ）を実行し、サンプル中のリン酸化ペプチドに関係するデータを得ること；および
（ｄ）  コンピューター・プログラムを使用して、サンプル中のリン酸化ペプチドに関するデータとリン酸化ペプチドのデータベース中のデータと比較すること；
ここで、リン酸化ペプチドのデータベースは以下を含む方法によりコンパイルされる：
ｉ）  サンプルからペプチドを得ること；
ｉｉ）  ステップｉで得られたペプチドからリン酸化ペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）  ステップｉｉで得られた富化されたリン酸化ペプチドに、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行なうこと；
ｉｖ）  リン酸化ペプチドを同定するために、既知のレファレンス・データベースとステップｉｉｉで検知されたリン酸化ペプチドを比較すること；および
ｖ）  データベースの中へ、ステップｉｖで同定されたリン酸化ペプチドに関するデータをコンパイルすること。
【００５４】
本発明のこの実施態様に関して、用語「ペプチド」は、用語「ポリペプチド」と交換可能に使用される。
【００５５】
本発明のこの実施態様のステップ（ａ）は、サンプルからペプチドを得ることを含んでいる。
ペプチドは技術中で既知の任意の適切な方法を使用して、サンプルから得ることができる。１つの実施態様では、本発明の方法のステップ（ａ）は次のものを含む：
（１）  サンプル中の細胞を溶解（lysing）すること；
（２）  ステップ（１）で得られた、溶解された細胞からタンパク質を抽出すること；および
（３）  ペプチドへ前記タンパク質を開裂すること。
本発明のこの実施態様のステップ（１）では、サンプル中の細胞は溶解されるか、またはスプリットオープン(split open)される。
【００５６】
細胞は技術中で既知の任意の適切な手段を使用して溶解することができ、例えば、物理的方法（機械的な細胞溶解（例えば、ワーリングブレンダーを使用して））の使用、液体の均質化、超音波処理またはマニュアル細胞溶解（例えば、乳棒と乳鉢を使用して）あるいは界面活性剤ベースの方法（ＣＨＡＰＳまたはトリトン−Ｘ）で行うことができる。
典型的には、細胞はデネイチャリングバッファー(denaturing buffer)（たとえば尿素ベースのバッファー）を使用して細胞溶解される。
【００５７】
本発明のこの実施態様のステップ（２）では、タンパク質はステップ（１）で得られた細胞溶解された細胞から抽出される。言いかえれば、タンパク質は細胞溶解された細胞の他の成分から分けられる。本発明のこの実施態様のステップ（３）では、細胞溶解された細胞からのタンパク質はペプチドへ開裂される。言いかえれば、タンパク質はより短いペプチドにブレークダウンされる。タンパク質ブレークダウンは一般に消化と呼ばれる。タンパク質分裂は技術の中で既知の任意の適切な作用薬を使用して、本発明の中で実行することができる。
【００５８】
タンパク質分裂（cleavage）または消化はプロテアーゼを使用して、典型的に実行される。任意の適切なプロテアーゼを本発明の中で使用することができる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にトリプシン、キモトリプシン、アルギニンＣ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−ＣおよびＡｓｐ−Ｃおよび／またはＡｓｐＮである。あるいは、タンパク質は、たとえばヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、ＢＮＰＳスカトール、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）または他の適切な作用薬を使用して、化学的に開裂することができる。
【００５９】
この実施態様のステップ（ｂ）で、参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）がステップ（ａ）の中で得られたペプチドに加えられ、ペプチドと参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の混合物を生産する。ステップ（ｂ）は、１つのサンプル当たり１つのペプチド（修飾ペプチドを含む、典型的に燐酸化ペプチド）の１つの混合物に帰着する。参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）は「内部標準」（ＩＳｓ）とも呼ばれる。典型的には、５〜１０、たとえば６から９または７または８の、参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）が加えられる。
【００６０】
本発明では、参照修飾ペプチドは典型的に参照リン酸化ペプチドであり、しばしば内部標準（ＩＳ）タンパク質と呼ばれる、定義された性質および濃度の比較蛋白質に典型的に由来する。ＩＳｓは市販のタンパク質（例えばカゼイン）であることができる。あるいは、ＩＳｓは特異的に本発明で使用するために合成される。本発明のこの実施態様の中で、参照リン酸化ペプチドは、典型的にそれの定量が望まれるリン酸化ペプチドのうちのいくらかと同じシーケンスで合成されるが、炭素と窒素の安定した重同位元素で富化される。ペプチドは、アミノ酸鎖またはポリペプチドを形成するために、一度に１つのアミノ酸が付加される固相化学を使用して、典型的に合成される。典型的には、そのようなペプチドは、一般の１２Ｃおよび１４Ｎを置換する１３Ｃおよび１５Ｎで富化されている。この富化は、質量分析計を使用してそれらを識別することができるように、同じシーケンスを備えた内因的なリン酸化ペプチドよりおよそ６〜１０ダルトン重い参照リン酸化ペプチドに帰着する。
【００６１】
本発明の別の実施態様の中で、タンパク質修飾酵素がタンパク質アセチルトランスフェラーゼであり、アセチル化されたペプチドが定量される場合、参照修飾ペプチドは、参照アセチル化ペプチドである。そのような参照アセチル化ペプチドは、典型的にアセチル化されたアミノ酸を含む合成ペプチドである。
【００６２】
参照修飾ペプチド（典型的には参照リン酸化ペプチド）は、比較されるサンプルの各々に既知量で典型的に加えられる。内因的な修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の信号は、下流の分析で参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の信号に規格化（normalised）される。
【００６３】
１つの実施態様では、この実施態様のステップ（ｂ）は、富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物を生産するために、ステップ（ｂ）で得られたペプチドおよび参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の混合物から修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を富化することをさらに含む。この追加のステップは、１つのサンプル当たり１つの富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物に帰着する。本発明のこの実施態様では、ステップ（ｃ）は、サンプル中のペプチドに関係のあるデータを得るために、富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物について質量分析（ＭＳ）を実行することを含む。本発明のこの実施態様では、ステップ（ｂ）は富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物に典型的に帰着する。
【００６４】
修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を富化するステップはクロマトグラフィーを使用して、典型的に行なわれる。１つの実施態様では、クロマトグラフィーは、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィー、および／または酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）クロマトグラフィーである。
典型的には、クロマトグラフィーはＩＭＡＣおよびＴｉＯ２クロマトグラフィーである。
【００６５】
別法として、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を富化するステップは抗体に基づいた方法を使用して行なわれる。
【００６６】
本発明の１つの実施態様で、タンパク質修飾酵素がプロテインキナーゼであり、同定されるか、および／または定量されるペプチドが燐酸化ペプチドである場合、燐酸化されたアミノ酸（たとえばチロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジン）への親和性を備えた抗体は、固体のマトリックスにリンクされる（不動化される）。燐酸化されたペプチドは、これらの抗体が特異的にリン酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。その後、燐酸化されていないペプチドが洗い流され、燐酸化されたペプチドは抗体でコーティングされたマトリックス上で保持される。不動化された抗体からのリン酸化ペプチドの溶離は、典型的には低ｐＨ溶剤を使用して実行されるか、または抗体とリン酸化ペプチドの間の相互作用をデネイチャー（denature）する他の適当な方法で行われる。
【００６７】
本発明の別の実施態様の中で、タンパク質修飾酵素がタンパク質アセチルトランスフェラーゼであり、同定および／または定量されるペプチドがアセチル化されたペプチドである場合、アセチル化されたペプチドは、アセチル化されたアミノ酸残基に対する特異性抗体の使用によって富化される。そのような抗体は固体のマトリックスにリンクされ、次に、抗体がアセチル化されたアミノ酸残基に特異的に結合する能力によって富化される。その後、アセチル化されていないペプチドは洗浄除去され、アセチル化されたペプチドは不動化された抗体上で保持される。
【００６８】
この実施態様のステップ（ｃ）では、質量分析（ＭＳ）がステップ（ｂ）の中で得られたペプチドおよび参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の混合物に対して実行され、サンプル中のペプチドに関係のあるデータを得る。典型的には、このデータは、サンプルのＭＳのデータファイルの形をしている。本発明の１つの実施態様の中で、この実施態様のステップ（ｂ）がステップ（ｂ）の中で得られたペプチドと参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）との混合物から修飾ペプチド、典型的にはリン酸化ペプチドを富化して修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の混合物を生産することを含む場合、ステップ（ｃ）は富化した修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の前記混合物に質量分析（ＭＳ）を行い、サンプル中のペプチドに関するデータ、典型的にはサンプルのＭＳのデータファイルとして得ることを含む。典型的には、質量分析は液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）である。ステップ（ｃ）は、このようにＬＣ−ＭＳデータファイル（各サンプルからのもの）に典型的には帰着する。
【００６９】
サンプル中のペプチドに関するデータは、典型的には質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間を含む。
【００７０】
この実施態様のステップ（ｄ）では、サンプル中のペプチドに関するデータ（典型的にはＭＳのデータファイルの形式、およびより典型的にはＬＣ−ＭＳデータファイルの形式で）は、コンピューター・プログラムを使用して、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のデータベース中のデータと比較される。例えば、サンプル中のペプチドの質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間は、データベース中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の質量／荷電（ｍ／ｚ）比、荷電（ｚ）および／またはペプチドの相対保持時間と比較される。これは、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のデータベースを使用して、サンプルの個々の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定および定量化を可能にする。
【００７１】
典型的には、コンピューター・プログラムは、ＰＥＳＣＡＬ(Cutillas, P. R.; Vanhaesebroeck, B. Mol Cell Proteomics 6(9), 1560-73, 2007)と名付けられたプログラムである。ＰＥＳＣＡＬは、比較されることになっているすべてのサンプルにわたるデータベースの中にある修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の各々のために抽出されたイオン・クロマトグラム（ＸＩＣ、すなわち溶出プロファイル）を構築する。これは、同定され修飾されるペプチド（典型的に燐酸化された）（すなわち手続きの第一段階で造られたデータベースの中にある）のｍ／ｚ、および保持時間にＸＩＣをセンタリング(centring)することにより行われる。ＰＥＳＣＡＬは、ペプチドの荷電も考慮して同一性の正確な指定を支援する。プログラムは、さらに各ＸＩＣのピーク高さおよび曲線下面積を計算する。データは、参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）の読み強度で、分析される各修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の読み強度（ピーク面積または高さ）を割ることにより規格化される。
【００７２】
この実施態様では、修飾ペプチドのデータベースは下記工程を含む方法によってコンパイルされる：
ｉ）  サンプルからペプチドを得ること；
ｉｉ）  ステップｉ）で得られたペプチドから修飾ペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）  ステップｉｉ）で得られた富化された修飾ペプチドに、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行うこと；
ｉｖ）  ステップｉｉｉ）で検知された修飾ペプチドと、既知のレファレンス・データベースを比較し、修飾ペプチドを同定すること；および
ｖ）  データベースの中へ、ステップｉｖ）で同定された修飾ペプチドに関するデータをコンパイルすること。
他のコンピュータープログラムおよびワークフロー（たとえばＭａｘＱｕａｎｔ［Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，１３６７−１３７２（２００８）］）は、ペプチドを定量するために使用されることができ、これらは本発明と同等である。
【００７３】
この実施態様のステップｉ）はサンプルからペプチドを得ることを含んでいる。ペプチドは、公知の技術およびここに記述された任意の適切な方法を使用して、サンプルから得ることができる。ステップｉ）のサンプルは第３のサンプルであることができる。
【００７４】
サンプルは典型的に生体試料で、先に記述されたように、生物ソースから得られた任意のタイプのサンプルであることができる。典型的には、サンプルは細胞株または組織である。
【００７５】
本発明のいくつかの実施態様中で、ステップｉ）の中で使用されるサンプルが細胞株である場合、サンプルはステップｉ）を実行する前に阻害剤で処理される。阻害剤は任意の適切なタイプの阻害剤であることができる。典型的に、燐酸化されたペプチドが同定および／または定量される場合、阻害剤はホスファターゼ阻害剤である。ホスファターゼ阻害剤での処理は、リン酸化の化学量論を増加させて、データベースに含むことができる多くのリン酸化ペプチドに帰着する。さらに、目的がメチル化またはアセチル化されたペプチドを同定および／または定量することである場合、それぞれメチル基転移酵素阻害剤またはアセチルの加水分解酵素阻害剤を使用することができる。
【００７６】
１つの実施態様では、本発明の方法のこの実施態様のステップｉは、以下を含む：
（１）  サンプル中の細胞を溶解すること；
（２）  ステップ（１）で得られた溶解された細胞からタンパク質を抽出すること；および       
（３）  ペプチドへ前記タンパク質を開裂すること。
【００７７】
本発明のこれらの態様は上に記述された通りである。しかしながら、ステップ（３）は上に記述されたステップ（ａ）と同じ方法を使用して、典型的に実行される。
【００７８】
この実施態様のステップｉｉでは、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）はステップｉの中で得られたペプチドから富化される。ステップｉｉは、このように修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）中で富化されたいくつかのフラクションに帰着する。
【００７９】
ステップｉｉの中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の富化は、多次元クロマトグラフィーを使用して、典型的に実行される。１つの実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、強陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して実行される。別の実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して実行される。本発明のこれらの実施態様では、クロマトグラフ技術は連続して実行される。
【００８０】
あるいは、上に記述されるように、ステップｉｉの中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の富化は抗体に基づいた方法を使用して実行される。
【００８１】
この実施態様のステップｉｉｉでは、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）は、ステップｉｉの中で得られた富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）に行なわれる。この実施態様のステップｉｖでは、ステップｉｉｉで検知された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）は、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を同定するために既知のレファレンス・データベースと比較される。このステップは市販のサーチエンジンを使用して、典型的に行なわれ、たとえば（しかし制限されない）が、ＭＡＳＣＯＴ、ProteinProspectorまたはＳｅｑｕｅｓｔサーチエンジンを使用して行われる。
【００８２】
この実施態様のステップｖでは、ステップｉｖで同定された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）に関するデータは、データベースへコンパイルされる。このデータベースは、後の生物学的実験中のリン酸化ペプチドの定量化に必要とされるパラメーターをすべてリストする。典型的には、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）に関係のあるデータは、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定、質量電荷比（ｍ／ｚ）、電荷および／または相対保持時間を含む。これはサンプル中のペプチドに関係のあるデータ、典型的にはサンプル内のペプチドの質量電荷比（ｍ／ｚ）、電荷（Ｚ）および相対保持時間を、データベース中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）についての値と比較することを許容し、したがってサンプル中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定および定量化を許容する。
【００８３】
この実施態様では、本発明の方法と同時にデータベースの編集を実行する必要はない。データベースの編集は、サンプル中の修飾ペプチド上の修飾部位を定量するために本発明の方法の中で使用されているＴＩＱＵＡＳ技術の前に、別々に実行することができる。
【００８４】
ＴＩＱＵＡＳ技術の基礎は、ＬＣ−ＭＳによって検知され定量することができる修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のデータベースの構築である。このデータベースは、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定、質量電荷比（ｍ／ｚ）、電荷（Ｚ）および相対保持時間を含む、後の生物学的実験において修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の定量化のために必要なすべてのパラメーターをリストする。データベースは、多次元クロマトグラフィー（たとえば強陽イオン交換、ＩＭＡＣおよびＴｉＯ２）を使用して、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）を富化することにより構築することができる。その後、修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の同定のために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のフラクションを分析することができる。
【００８５】
ＰＥＳＣＡＬ(Cutillas and Vanhaesebroeck, Molecular & Cellular Proteomics 6, 1560-1573 (2007)の名称のコンピュータ・プログラムは、生物学的実験から得られた修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）のＬＣ−ＭＳ実行でのデータベースにリストされた修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の各々の定量化を自動化する。これらの生物学的実験については、細胞溶解物（cell lysates）中のタンパク質はトリプシンまたは他の適切なプロテアーゼを使用して消化される。参照修飾ペプチド（典型的に参照リン酸化ペプチド）であるペプチド（たとえばフォスフォペプチド）内部標準は、比較されるすべてのサンプル中に既知量でスパイクされる。得られたペプチド混合物中の修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）はシンプル−トウ−パーフォームＩＭＡＣ(simple-to-perform IMAC)またはＴｉＯ２抽出ステップを使用して富化される。富化された修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）は、シングルＬＣ−ＭＳで分析される。典型的には約１２０分（サイクルの合計）であるが、これには制限されない。その後、ＰＥＳＣＡＬは、比較されることになっているすべてのサンプルにわたるデータベースの中にある修飾ペプチド（典型的にリン酸化ペプチド）の各々のために抽出されたイオン・クロマトグラム（ＸＩＣ、すなわち溶出プロフィール）を構築する。プログラムは、さらに各ＸＩＣのピーク高さおよび曲線下面積を計算する。データは、修飾ペプチド（典型的にフォスフォペプチド）の内部標準読み強度で、それぞれの修飾ペプチド（典型的にフォスフォペプチド）分析物の読み強度（ピーク面積または高さ）を割ることにより規格化される。
【００８６】
本発明の方法においてＴＩＱＵＡＳ技術を使用することの代わりに、リン酸化のような修飾の定量化を、アイソトープ・ラベルを定量化（たとえば代謝の標識化（例えば、培地中の安定同位体でラベルされたアミノ酸（ＳＩＬＡＣ））を使用するＭＳの技術を使用して実行することができる。Olsen, J.V. et al. Cell 127, 635-648 (2006))，および化学的誘導体化 (たとえば、iTRAQ (Ross, P. L. ; et al. Mol Cell Proteomics 2004, 3, (12), 1154-69), ICAT (Gygi, S.P. et al. Nat Biotechnol 17, 994-999 (1999)), TMT (Dayon L et al, Anal Chem. 2008,Apr 15; 80(8):2921-31)。本発明の方法では、タンパク質修飾はフラグメントにされていないイオンの強度を測定するＬＣ−ＭＳ技術、またはフラグメントイオンの強度を測定するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術（たとえばマルチリアクションモニタリング（ＭＲＭ）という名でも呼ばれるセレクティドリアクションモニタリング（ＳＲＭ））で定量することができる。
【００８７】
本発明の第１の態様の方法は、サンプル中の特定のタンパク質修飾酵素のＫ値に帰着する。その後、特定のタンパク質修飾酵素のＫ値は、どのタンパク質修飾酵素がそのサンプルの中で最も活性かを決めるためにサンプル中の他のタンパク質修飾酵素のＫ値と比較することができる。ここで、より高いＫ値はより高い活性酵素を示す。特定のサンプル中のタンパク質修飾酵素は、これをするためにそれらのＫ−スコアの順にランク付けすることができる。これは、サンプル内で最も活性なタンパク質修飾酵素（つまり最も高いＫ値を備えたタンパク質修飾酵素）に基づいて、サンプルが採取された患者を治療する、適切な阻害剤の選択を許可する。
【００８８】
従って、第２の態様では、本発明は、以下を含む、患者を治療する、タンパク質修飾酵素の阻害剤を同定する方法を提供する：
（ｉ）  本発明の第１の態様の方法を使用して、前記患者から採取されたサンプル中の各タンパク質修飾酵素のＫ値を計算すること；
（ｉｉ）  最も高いＫ値を有するタンパク質修飾酵素を同定すること；および
（ｉｉｉ）  最も高いＫ値を有するタンパク質修飾酵素をターゲットとする阻害剤を選択すること。
【００８９】
本発明のこの態様の方法は、患者または対象を選択された阻害剤で治療するステップと組み合わせて使用することができる。
従って、第３の態様では、本発明は、以下を含むタンパク質修飾酵素の阻害剤でその必要のある患者を治療する方法を提供する：
（ｉ）  本発明の第１の態様の方法を使用して、前記患者から採取されたサンプル中の各タンパク質修飾酵素のＫ値を計算すること；
（ｉｉ）  最も高いＫ値を有するタンパク質修飾酵素を同定すること；
（ｉｉｉ）  最も高いＫ値を有するタンパク質修飾酵素をターゲットとする阻害剤を選択すること；および
（ｉｖ）  前記患者へ前記阻害剤を適用すること。
【００９０】
治療法はヒトまたは動物の治療法であることができる。また、本発明は等しくヒトおよび／または獣医学の用途に等しく及ぶ。阻害剤は、好ましくは「治療上有効な量」で個人に適用される。これは疾病の１つ以上の徴候を改善するか、除去するか、防ぐ、個々への有益性を示すのに十分な量である。本明細書に使用される時、「治療」は、例えばヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、経済的に重要な哺乳動物（たとえば牛、羊、ヤギおよび豚）に有用なあらゆるレジームを含む。その治療は存在する条件に対するものであるか、または予防的で（予防的処理）であることができる。
【００９１】
患者は、タンパク質修飾酵素の阻害剤（たとえばプロテインキナーゼの阻害剤）での治療を必要とする患者である。例えば、患者は、癌、たとえばリンパ腫または白血病、例えば急性骨髄白血病（ＡＭＬ）に罹患している者、または罹患の疑いのある者であることができる。この場合、患者は、プロテインキナーゼの阻害剤で典型的に治療され、典型的にはＡＧＣキナーゼ（例えばプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）（Ａｋｔとしても知られる）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）から成る群から選ばれたヒト・プロテインキナーゼの阻害剤；チロシンキナーゼ；チロシンキナーゼ様キナーゼ；カルシウム／カルモジュリン依存性プロテイン・キナーゼ；カゼイン・キナーゼ１グループ；ＣＭＧＣグループ（例えばＣＤＫ、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３、ＣＬＫキナーゼ）；およびＳＴＥ、酵母Ｓｔｅｒｉｌｅ  ７，Ｓｔｅｒｉｌｅ  １１，およびＳｔｅｒｉｌｅ  ２０キナーゼの同族体の阻害剤で治療される。本発明のこの態様に従う使用にふさわしいキナーゼ阻害剤は、AZD-5438(CDK2i;)、GF-109203X(PKCαi;Tocris)、PF-3758309(PAKi;Calbiochem)、Trametinib(MEKi; Selleckchem)、MK-2206(AKTi;Selleckchem)、KU-0063794(mTORi;Chemdea)、TAK 715(P38αi;)、PKC-412(PKC/Flt3i;Tocris)、TBB(CK2i;)、PF-3758309(PAKi)およびC4945(CK2i;)を含んでいる。
【００９２】
本発明で使用されるタンパク質修飾酵素の阻害剤の投与量は、治療される疾病または病状、年齢および治療される個人などの条件によって、広い範囲間に変わる場合がある。また、医師は、使用される適切な量を決定するだろう。
【００９３】
投与は適切な頻度で繰り返すことができる。副作用が生じた場合には、投与量および／または頻度を、正常な臨床実績に応じて低減することができる。
【００９４】
哺乳動物、特にヒトへの適用については、活性薬剤の毎日の投与量が１μｇ／体重１ｋｇから１０ｍｇ／体重１ｋｇ、典型的には１０μｇ／体重１ｋｇから１ｍｇ／体重１ｋｇだろうことが期待される。医師は、どんな場合も個人にとって最適な実際の量（それは年齢、個人の体重、性および反応を含む要因に依存するだろう）を決定するだろう。上記の量は平均的な場合の例である。これらは例示に過ぎず、より高いかより低い量であることができ、そのようなものも本発明の範囲内の例でありえる。本発明の発明者は、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量するための第２のアルゴリズムをさらに考案した。
【００９５】
従って、第４の態様では、本発明は、前記タンパク質修飾酵素のＳＣ値を以下のように計算することを含む、サンプル中のタンパク質修飾酵素の活性を定量する方法を提供する：
【００９６】
【数８】
2019501637.tif 000009
【００９７】
ここでＰＣｉ＝Ｃｉで阻害剤を使用する時の増殖の低減；
Ｃｉ＝増殖が測定される阻害剤濃度；および、
ＩＣ５０ｉ＝一次標的（primary target）に対する阻害剤の「生体外の」ＩＣ５０。
本発明の第４の態様の方法は、タンパク質修飾酵素の阻害剤（たとえばプロテインキナーゼ阻害薬）を使用して、生体外の実験から得られた薬学データに基づいてＳＣ値を計算することを含んでいる。従って、本発明の第４の態様に関して言及される「阻害剤」は、タンパク質修飾酵素の阻害剤である。
【００９８】
ＳＣ値を計算するための情報を提供するために使用される実験は、タンパク質修飾酵素の阻害剤を加える前後の、サンプル内の生体外の細胞増殖のレベルを決定することを含んでいる。これは、濃度Ｃｉで阻害剤を使用する時に見られる増殖の低減であるＰＣｉの決定を許可する。たとえば、ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）と、ガバナバイアカウント(Guava ViaCount)を使用するクリスタルバイオレットアッセイのような任意の適当な方法を使用して決定することもできる。
【００９９】
ＳＣ値の計算は、さらにＩＣ５０ｉの決定を含んでいる。ＩＣ５０ｉは、一次標的に対する阻害剤の「生体外の」ＩＣ５０（生体外の分析でタンパク質修飾酵素の活性を５０％低減する阻害剤の濃度）であり、一次標的とは、いくつかの阻害剤は多数のタンパク質修飾酵素（たとえばキナーゼ）に効果があるので、その主な標的をいう。ＩＣ５０を決定する方法は、当業者に公知である。典型的には、タンパク質修飾酵素はプロテインキナーゼである。
【０１００】
本発明の第１の態様、第２の態様および第４の態様の方法は、典型的にはコンピュータ・プログラムプロダクトを使用して、コンピューター上で実現される。コンピュータ・プログラムプロダクトは、上に記述された様々な方法の１つ以上の機能を行なうようにコンピューターに命じるように構成されたコンピューター・コードを含むことができる。そのような方法を行なうためのコンピュータ・プログラムおよび／またはコードは、コンピューター読取り可能なメディアまたはコンピュータ・プログラムプロダクト上で装置（コンピューター）に提供されることができる。コンピューター読取り可能なメディアは、一時的メディアまたは非一時的メディアであることができる。例えば、コンピューター読取り可能なメディアは、たとえば電子、磁気、光学、電磁気、赤外線、または半導体システムであることができ、または例えばインターネットからのコードのダウンロードのようなデータ伝送用の伝播媒体であることができる。あるいは、コンピューター読取り可能なメディアは、物理的なコンピューター読取り可能なメディア（半導体またはソリッドステートメモリ）、磁気テープ、消去可能なコンピューター・ディスケット、ランダム・アクセス・メモリー（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、堅い磁気円盤および光ディスク（ＣＤ−ＲＯＭおよびＣＤ−Ｒ／ＷまたはＤＶＤ）の形式をとることができる。
【０１０１】
コンピューターのような装置は、ここに議論された様々な方法に従う１つ以上のプロセスを行なうためのコードに従って構成されることができる。１つの構成では、装置はプロセッサー、メモリおよびディスプレイを含む。典型的には、これらは、中央バス構造、ディスプレイ・アダプターによって接続しているディスプレイに接続される。システムはさらに１つ以上の入力装置（たとえばマウスおよび／またはキーボード）、および／または、他の装置またはネットワークに装置を接続するための通信アダプターを含むことができる。そのような装置は、データ処理システムの形式をとってもよい。そのようなデータ処理システムは分散システムであることができる。例えば、そのようなデータ処理システムはネットワークを介して分散されてもよい。
【０１０２】
本明細書に記載されたように、本発明の発明者は、合計のシグナリングへの、与えられた細胞集団の中の個々のタンパク質修飾酵素（たとえばキナーゼ）の寄与を定量するために２つのアルゴリズムを開発した。そのようなアルゴリズムの１つは、発明者によりキナーゼ活性序列(Kinase Activity Ranking (KAR))と命名され、「Ｋ−スコア」を生成し、定量的ＭＳデータ（たとえば定量的ＭＳリン酸化プロテオミックス・データ）を入力として使用し、それらの活性に基づいてすべてのタンパク質修飾酵素（たとえば基質が既知であるキナーゼ）をランク付けするために使用することができるスコアを生成する。ＫＡＲは、合理的に個々の患者を治療する最も適切な細胞シグナリング阻害剤を選択するために一般化されて理に適ったアプローチを表す。この観念はデータに基づき、明細書に記載された実施例において詳細に議論され、Ｋ−スコアが細胞表現型を反映するか（つまり、キナーゼ阻害剤に細胞がどの程度感受性か）を示す。第２のアルゴリズムは「比較鋭敏度分析(Relative Sensitivity Analysis)」と命名され、サンプル内のタンパク質修飾酵素の阻害剤（たとえばキナーゼ阻害剤）の影響を互いに比較するために使用することができる「感度係数(Sensitivity Coefficients)(SC)」を生成するために薬学データを使用する。２つのアルゴリズムのための入力データは、タンパク質質量分析（ＭＳ）および薬学実験からそれぞれ得られる；したがって、２つの方法は本来直交(orthogonal)である。
【０１０３】
１つの実施態様では、ＫＡＲは入力としてＭＳベースのリン酸化プロテオミックス・データを使用する。この実施態様では、その結果生成されたＫ−スコアは、所定のキナーゼの基質であることが知られていたリン酸化ペプチドの強度の合計を、サンプル中のすべてのリン酸化ペプチドの強度の合計で割り、いくつかのキナーゼが他のものより多くの基質を持っていること、およびキナーゼ基質の関係のデータベースは、名高いキナーゼについてより多くの基質をリストすることを考慮に入れた修正係数を掛けて得られる。
【０１０４】
【数９】
2019501637.tif 000010
【０１０５】
従って、ＫＡＲ（Ｋ−スコア）の原理は下記のように説明されてもよい。
【０１０６】
【表１】
2019501637.tif 000011
【０１０７】
所定のキナーゼによって一般に燐酸化される部位を含むリン酸化ペプチドの強度は合計され、すべてのフォスフォペプチド強度の合計に規格化される。得られた値は、１つのキナーゼ当たり既知で同定された基質の数にさらに規格化される。発明者の前の出版物（例えばＴＩＱＵＡＳ特許出願ＷＯ  ２０１０／１１９２６１および以下の文献）でのような定量的ラベルなしのＭＳにより、燐酸化部位の強度を決定することができる：
【０１０８】
* Alcolea, M. P., Casado, P., Rodriguez-Prados, J. C., Vanhaesebroeck, B. & Cutillas, P. R. Molecular & cellular proteomics : MCP 11, 453-466, doi:10.1074/mcp.M112.017483 (2012). 
* Casado, P. et al. Genome biology 14, R37, doi:10.1186/gb-2013-14-4-r37 (2013). 
* Casado, P., Bilanges, B., Rajeeve, V., Vanhaesebroeck, B. & Cutillas, P. R. Molecular & cellular proteomics : MCP 13, 836-848, doi:10.1074/mcp.M113.034751 (2014). 
* Casado, P. & Cutillas, P. R. Molecular & cellular proteomics : MCP 10, M110 003079, doi:10.1074/mcp.M110.003079 (2011). 
* Casado, P. et al. Science signaling 6, rs6, doi:10.1126/scisignal.2003573 (2013). 
* Cutillas, P. R., Geering, B., Waterfield, M. D. & Vanhaesebroeck, B. Molecular & cellular proteomics : MCP 4, 1038-1051, doi:10.1074/mcp.M500078-MCP200 (2005). 
* Montoya, A., Beltran, L., Casado, P., Rodriguez-Prados, J. C. & Cutillas, P. R. Methods 54, 370-378, doi:10.1016/j.ymeth.2011.02.004 (2011). 
* Rajeeve, V., Pearce, W., Cascante, M., Vanhaesebroeck, B. & Cutillas, P. R. The Biochemical journal 450, 619-628, doi:10.1042/BJ20121525 (2013). 
* Rajeeve, V., Vendrell, I., Wilkes, E., Torbett, N. & Cutillas, P. R. Molecular & cellular proteomics : MCP 13, 1457-1470, doi:10.1074/mcp.M113.035204 (2014)。
【０１０９】
ＫＡＲは、ＷＯ  ２０１３／１３２０７５  および、Casado, P. et al. Science Signaling 6, rs6 (2013)として公表された特許出願の主題である、発明者のキナーゼ基質富化分析(Kinase Substrate Enrichment Analysis:KSEA)という名の以前に公表されたアルゴリズムとは概念的に異なる。違いは、ＫＳＥＡがサンプル内のキナーゼ活性を比較するのに対し、ＫＡＲではサンプル内の互いに対するキナーゼの活性の相違を比較するということである。両方のアルゴリズムは燐酸化部位の強度を上流で作用するキナーゼにリンクすることを含んでいるが、それらの出力は実際上異なる。ＫＡＲがそれらがサンプル中でどれくらい活性かに基づいてキナーゼ活性をランク付けするのに対し、ＫＳＥＡはそのような目的に使用することができないからである。
【０１１０】
一方、ＫＡＲの試験および開発において、発明者は、アルゴリズムが細胞表現型を反映すると仮定した。それがシグナリングの強度の指標であるからである。キナーゼの寄与を互いに関するシグナリング出力と比較するために使用することができる他の方法がないので、Ｋ−スコア（ＫＡＲの出力）のシグナリングの強度の基準としての正確さのテストは、これらの値がシグナリング出力と関連するかどうかを評価することを要求する。したがって、発明者はシグナリングへの異なるキナーゼの寄与を定量およびランク付けするためにＭＳベースのリン酸化プロテオミックスと完全に無関係な方法を開発した。これらが容易に測定することができる細胞シグナリングの重要な終点であるので、細胞増殖と生存度は測定するべき適切な出力である。
【０１１１】
この方法の結果は「比較鋭敏度分析（ＲＳＡ）」アルゴリズムだった。それは、１つの実施態様中で与えられたキナーゼについて「感度係数」（ＳＣ）を導く。それは、規定するキナーゼに対する薬学的阻害剤は、シグナリングに、より寄与しないキナーゼに対する阻害剤よりも、大きな程度に細胞の生存率／増殖を低減するだろうという仮定に基づく。これはよく容認された概念である；しかしながら、そのような観念を適用する問題は、異なる阻害剤はそれらの目標に対する異なる親和性があるということである。その結果、測定する阻害剤の効果は、薬学の概念（たとえば５０％だけ生存度／増殖を低減する阻害剤の濃度（ＩＣ５０））を使用する場合に、それらの目標のための阻害剤の親和性、および調査中の生物学的プロセスのレギュレーションに対する目標の寄与の両方を反映することである。親和性の差を説明するために、ＳＣは、その主な目標に対する阻害剤の生体外のＩＣ５０（生体外のキナーゼ分析でキナーゼ活性を５０％低減する阻害剤の濃度）掛ける、使用される阻害剤の濃度の関数として細胞の生存率／増殖を表現する。このように、キナーゼ阻害剤は、それらがどれくらいよく目標を阻害するかによってではなく、研究下の生物学的プロセスに対してそれらの目標がしている寄与に基づいてランク付けすることができる；したがって、それらは互いに比較することができる。
感度係数  ＳＣ
【０１１２】
【数１０】
2019501637.tif 000012
【０１１３】
上記の方程式中のＰＣｉはＰＣと呼ばれることもできる。一次標的に対する生体外のＩＣ５０として、ＩＣ５０ｉ（あるいはＩＣ５０ｉ）は定義されてもよい。
【０１１４】
本発明の方法の利点は以下のとおりである：
−ＫＡＲは、「絶対単位」でのシグナリングの定量化を提供する。つまり、分析は平行した対照試料の分析を要求しない；
したがって、ＫＡＲは、臨床サンプルの分析に適用することができる。
−ＫＡＲおよびＫ−スコアは、感受性細胞が細胞シグナリングの阻害剤にどのようにしてなるだろうかの予言的な手段である。それはテーラーメイド医療の発育に役立つ。
−すべてのキナーゼ活性およびシグナリング経路は、臨床的に有用な時間枠で行なうことができる単一の分析で測定される。
これは、１つの分析当たり一つの経路を測定する多くの免疫化学的な技術と対照的である。
−方法は、十分な特異性を有する抗体の有効性に依存しない。
−ＲＳＡは細胞増殖／生存度のレギュレーションへの阻害剤目標の寄与をテストすることを可能にする。
【０１１５】
第２および本発明の後の態様の好ましい特徴は、第１の態様に関するものを準用する。本明細書に記載された実施態様は、広範に適用可能で有り、適切な全ての他の実施態様で広く適用可能で、結合可能であることが認識されるだろう。そのような組み合わせは本発明の範囲内にあると考えられる。本発明は、例示の目的のみで示される実施例への言及によりさらに記述される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】Ｋ−スコア決定の再現性、線形性および正確さ（ａ）  キナーゼ活性序列（ＫＡＲ、それはＫ−スコアを生成する）の原理。所定のキナーゼによって一般に燐酸化される部位を含むリン酸化ペプチドの強度は合計され、すべてのフォスフォペプチド強度の合計について規格化される。得られた値は、１つのキナーゼ当たりの既知で同定された基質の数にさらに規格化される。（ｂ）  アルゴリズムの定量的性質を評価する実験計画。（ｃ、ｄ）、３つの代表的なキナーゼについてのＫ−スコアの再現性、および線形性。（ｅ）  ｐＶ処理された細胞の関数としての、Ｋ−スコアに基づいたキナーゼのランク付け。  チロシンキナーゼ（三角形データポイントとして示される）は、サンプル内に存在するｐＶ処理された抽出物の関数としての、Ｋ−スコアに基づいたランクを明白に増加する。
【０１１７】
【図２】ＥＧＦまたはＩＧＦ治療の関数としてのＫ−スコア。ＷｉｌｋｅｓらのＰＮＡＳ  １１２，  ７７１９−７７２４  （２０１５）中のリン酸化プロテオミックス・データはＫＡＲ分析のために処理された。結果は、これらの値がキナーゼ活性上の成長因子刺激の予期された動力学を示すので、ＫＡＲ（Ｋ−スコア）の出力がキナーゼ活性の指標であることを例証する。
【０１１８】
【図３】Ｋ−スコアは、互いに関する細胞のリン酸化へのそれらの寄与に基づいてキナーゼ活性をランク付けする。（ａ）  ８つの血液細胞株にわたる６０以上のキナーゼのＫ−スコア。リン酸化プロテオミックス実験は、先に記載されたように４つの独立した場合の指定された細胞株上で行なわれた。また、各々はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって２度分析された。８つの分析の平均のＫ−スコアが示される。（ｂ）  ＫＡＲ分析によって決定されるような合計の細胞のリン酸化へのそれらの寄与に基づいたキナーゼのランク付け。
【０１１９】
【図４】キナーゼ阻害剤のパネルで処理された血液細胞株の投与量作用曲線。指定された細胞株は、示された阻害剤で処理され、処理の７２時間後にＧｕａｖａ分析を使用して生存度を測定した。データポイントは平均±ＳＤ（ｎ＝４）である。
【０１２０】
【図５】キナーゼ活性序列は、血液細胞株中の細胞の生存率へのキナーゼ活性の寄与をモデル化する。（ａ）  ８つの血液細胞株にわたる指定された化合物のＳＣ（感度係数）。（ｂ）  細胞株にわたるそれらのＳＣに基づいたキナーゼ阻害剤のランクの頻度。（ｃ）  個々の細胞株内のキナーゼ活性（ＫＡＲによって測定されたもの、図１）とＳＣの間の関係。Ｋ−スコア値は、４つの独立した実験（各々二重反復試験で測定された）の平均の±ＳＥＭとして示される。ｒはピアソン相関係数；ｐ値はｒ値から導かれる。
【０１２１】
【図６】Ｋ−スコアと８つの血液の細胞株にわたるキナーゼ阻害剤の感度の関係。８つの細胞株にわたり測定された線形回帰分析は、９つの異なる薬剤の感度係数は、著しくそれらの主な目標キナーゼのためのＫ−スコアに関係していたることを示した。
【０１２２】
【図７】急性骨髄白血病（ＡＭＬ）細胞の生存率へのキナーゼ活性の寄与のモデル化。（ａ）  ４５の原発性ＡＭＬ生検のＫ−スコアの分布。（ｂ）  Ｋ−スコア分析によって決定される指定されたキナーゼのランクの頻度。（ｃ）  指定されたキナーゼ阻害剤で処理された、３６のＡＭＬ生検のＩＣ５０ｓおよびＳＣの分布；Ｐ３８ｉ、ＴＡＫ７７５；ＣＫ２ｉ、ＣＸ４９４；ＭＥＫｉトラメニチブ（ＭＡＰＫシグナリングを阻害する）；ＰＡＫｉ、ＰＦ−０３７５８３０９。（ｄ）  ２つの代表的なＡＭＬ患者サンプル、および原発性ＡＭＬ（ｅ）の３６のケース中のＳＣとＫ−スコアの間の関係。（ｆ、ｇ）  それぞれＭＥＫ１およびＪＡＫ２のためのＫ−スコアと、ＭＥＫｉおよびＰＫＣ４１２処理の関数としての細胞の生存率の間の相関。
【０１２３】
【図８】キナーゼ阻害剤のパネルで処理された原発性ＡＭＬ細胞の投与量作用曲線。ＡＭＬ生検は、倫理上の同意を得たBarts Cancer Institute生体バンクから得られ、指定された化合物で７２時間処理され、GuavaViaCount分析間て測定した。データポイントは平均の±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【０１２４】
【図９】複合体薬物応答表現型はキナーゼ活性の違いに関係している。（ａ）  原発性ＡＭＬ細胞の５つのキナーゼ阻害剤に対する反応のパターン。感度は５の阻害剤濃度で測定された。ヒートマップは１μＭ濃度での生存度を示し（左）、＞％５０での生存度の減少は緑の箱によって示される（右）。反応に基づいた１３のグループの合計が同定された。これは５つの主な反応グループにさらに分類することができた、（ｂ−ｇ）指定されたキナーゼのためのＫ−スコア、反応グループにわたるそれらの比率。個々のＫ−スコアは患者にわたり平均に規格化された。反応グループの内の平均の±ＳＥＭおよび個々の値が示される。Ｐ−値は、それぞれ（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、および（ｇ）での反応グループ１２または１１に対する、アンペアードｔ−検定によって計算された。
【０１２５】
【図１０】原発性ＡＭＬ生検のパネル中の細胞の生存率のモデル。Ｋ−スコアおよび感度コンフィデンス(Sensitivity Confidents)は、リン酸化プロテオミックスと細胞の生存率のデータからそれぞれ得られ、３６の異なるＡＭＬ患者生検の中で比較された。
【０１２６】
【図１１】キナーゼ阻害剤に対する反応のパターンと関連するキナーゼ活性。（ａ）  Ｋ−スコアは、主テキスト（列の平均）の図４ａの中で示され対数変換された反応グループにわたり平均に規格化された。（ｂ）  すべての化合物に耐性を有する細胞（グループ１３）からのものと、少なくとも３つの化合物に感受性の細胞（グループ１−５）間のＫ−スコアの比較は、キナーゼ活性が感受性細胞（赤いフォント）の中で増加したことを示す。（ｃ）  ＭＥＫ１ｉのみに敏感な細胞（グループ１２）およびＣＫ２ｉのみに敏感な細胞（グループ１１）間のＫ−スコアの比較。（ｄ）  ＣＫ２ｉのみに敏感な細胞（グループ１１）およびＰＡＫｉのみに敏感な細胞（グループ１０）間のＫ−スコアの比較。（ｅ）  ＭＥＫ１ｉのみに敏感な細胞（グループ１２）およびＰＡＫｉのみに敏感な細胞（グループ１０）間のＫ−スコアの比較。
【０１２７】
実施例
材料と方法
細胞培養
Ｂ細胞リンパ腫および白血病細胞株は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００Ｕ・ｍＬ−１ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）で補われたＲＰＭＩ−１６４０ミディアムの中で慣例的に維持された。細胞は０．５−２．０×１０６  細胞・ｍＬ−１のコンフリューエンシー（confluency）で維持された。間質細胞は、ＩＭＤＭミディアム（１０％のＦＢＳおよび１００  Ｕ．ｍＬ−１Ｐ／Ｓで補われた）の中で育てられ、１７５ｃｍ２フラスコの中で２．０−３０．０×１０６細胞のコンフリューエンシーで維持された。ＭＳ−５でコンディショニングされたＩＭＤＭミディアムは、３日間ＩＭＤＭ中で間質細胞を育てることにより生成された。細胞はすべて５％ＣＯ２の湿潤大気中で３７℃で維持された。
【０１２８】
原発性ＡＭＬ細胞
すべての患者から、研究用のための血球の貯蔵のために説明し同意を得た。(Miraki-Moud, F. et al. Blood 125, 4060-4068 (2015))に記載されたように、East London and City Research Ethics Committeeに従って、それぞれの手続きが行なわれた。すべての研究は、改訂されたHelsinki protocolにより、Review Boardの規則に従って行われた。末梢血はＳｔ  Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ病院でＡＭＬ患者から採取され、単核細胞がフィコール勾配を使用して分離され、次いで赤血球溶血し、液体窒素中で貯蔵された。原発性ＡＭＬブラストは溶解され、以下の標準手順を行った：簡潔に言えば、３７℃でガラス瓶がデフロストされ、５分間ＤＮＡｓｅ（シグマ）の５００μｇに暴露された。２％のＦＢＳで補われたＰＢＳの１０ｍＬが加えられた。また、細胞懸濁液は５℃で５分間１５００毎分回転数で遠心分離機にかけられた。細胞はＭＳ−５でコンディショニングされたＩＭＤＭ培地中に再懸濁され、７０μｍストレーナ(Fisherbrand)を使用してろ過した。細胞数と生存度はＶｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ細胞生存率アナライザー(Beckman Coulter)を使用して、トリパンブルー染色によって決定された。
【０１２９】
細胞溶解およびタンパク質消化
各細胞株については、４つの独立した生物学的複製が行なわれた：１０×１０６細胞は０．５×１０６  細胞・ｍＬ−１で接種され、一晩置かれた。各原発性ＡＭＬサンプルについては、１０×１０６細胞が１×１０６  細胞・ｍＬ−１で接種され、２時間インキュベータの中に置かれた。細胞は、遠心分離によって収穫され、続いて１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４および１ｍＭ  ＮａＦで補われた氷冷燐酸塩緩衝食塩水で２度洗われて、氷冷尿素細胞溶解バッファー（１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ２Ｈ２Ｐ２Ｏ７および１ｍＭ  β−グリセリンリン酸で補われた２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．０）中の８Ｍ尿素）の０．２  ｍＬの中で溶解した。溶解物は超音波処理により均質化され、遠心分離によってすべての不溶性の物質が除去された。タンパク濃度はビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析によって評価された。一般的なタンパク濃度（０．５μｇ・μＬ−１）へ各条件を規格化した後に、サンプルはそれぞれ、暗所室温で３０分間、１０ｍＭジチオトレイトールおよび１６．６ｍＭヨードアセトアミドでの連続するインキュベーションによって還元されアルキル化された。タンパク質消化のため、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．０）の添加を通じて尿素濃度が低減された。不動化されたトシル−リシン  クロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）−トリプシンが次いで加えられ、サンプルは３７℃で一晩インキュベートされた。トリプシン・ビーズが遠心分離により除去され、結果として得られたペプチド溶液は、先に記述されたように(Montoya, A. et al. Methods 54, 370-378 (2011))、ＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ  １ｃｃの固相抽出カートリッジを使用して脱塩された。
【０１３０】
フォスフォペプチド富化
先に記述されたように(Wilkes, E. H. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, 7719-7724 (2015))、ＴｉＯ２（ＧＬ  サイエンス）を使用してフォスフォリル化ペプチドが富化された。結果として得られたフォスフォペプチド溶液はスナップ凝固され、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾かされ、後の使用まで−８０℃で貯蔵した。
【０１３１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳリン酸化プロテオミックス分析
細胞株サンプルについては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって２回の生物学的複製で、以下のように分析された：フォスフォペプチド・ペレットは０．１％ＴＦＡの１４μＬの中で再懸濁された。技術的な複製当たり４．０μＬが、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＸＬ質量分析計 (Thermo Fisher Scientific)にオンラインでつながれた、NanoACQUITY UPLC system (Waters, Manchester, UK)  (Thermo Fisher Scientific)）に注入された。サンプルは、３００ｎＬ・分−１の流量でACQUITY BEH130 C18 UPLC  カラム (15 cm x 75 μm, 1.7 μm, 130 A)上の５および３５％のＡＣＮの間の１００分の直線濃度勾配上で分離された。各ＭＳ１走査で最も強い多価イオンのトップ５が選択され、衡突解離切断（多段活性化が可能）に供された。ＭＳ１の解像度は３０，０００ＦＷＨＭにセットされた。
【０１３２】
原発性ＡＭＬサンプルについては、技術的な複製（１つのサンプル当たり２）がそれぞれ、QExactive PLus(QEP)質量分析計(Thermo Fisher Scientific)にオンラインでつながれた、Dionex Ultimate nRSLC  システム(Thermo Fisher Scientific)への３．０μＬ注入から成った。サンプルは、３００ｎＬ・分−１の流量でＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８  ＲＳＬＣカラム（２５ｃｍ×７５μｍ、２μｍ、１００A）上での、３および３０％のＡＣＮの間の１２０分の直線濃度勾配上で分離された。各ＭＳ１走査の中に存在するトップ２０の最も強い多価イオンが選ばれ、高エネルギー衡突解離（ＨＣＤ）に供された。ＭＳ１走査の解像度は７０，０００ＦＷＨＭにセットされた。
【０１３３】
フォスフォペプチド同定および定量化
ペプチド同定は、マスコット・サーバー・バージョン２．４を利用してＵｎｉｐｒｏｔ−Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのヒト蛋白質データベース（２０，２３３のエントリーを含んでいる２０１４年９月のリリース）への、デアイソトープされたＭＳ／ＭＳのデータとのマッチングにより行なわれた。Ｍａｓｃｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒが、マスコットジェネリックフォーマットでのピーク・リストを生成するために使用された。質量寛容度（Mass tolerances）は、それぞれ前駆物質とフラグメントイオンについて１０ｐｐｍおよび６００ｍｍｕ（ＸＬ）／２５ｍｍｕ（ＱＥＰ）にセットされた。リン酸化プロテオミックス実験については、許可された変数は次のとおりだった：フォスホ−Ｓｅｒ、フォスホ−Ｔｈｒ、フォスホ−Ｔｙｒ、ピロ−Ｇｌｕ（Ｎ末端）および酸化−Ｍｅｔ。サンプルの各々からの同定されたフォスフォペプチドはインハウススクリプトを使用して、収集され照合された。予測値＜０．０５％のユニークなフォスフォペプチド・イオンはインキュベートされ、その後の分析に含まれた。マスコットデコイデータベース（Mascot decoy database）検索は、これらのセッティングがほぼ１％のフォルスディスカバリーレイト（false discovery rate）を生ずることを示した。我々のグループ(Montoya et al. (2011), supra; Casado, P. & Cutillas, P. R. Molecular & Cellular Proteomics: MCP 10, M110 003079 (2011); Cutillas, P. R. & Vanhaesebroeck, B. Molecular & Cellular Proteomics 6, 1560-1573 (2007)) 、および第三者 (Tsou, C. C. et al. Molecular & Cellular Proteomics : MCP 9, 131-144 (2010); Mann, B. et al. Rapid Communications in Mass Spectrometry : RCM 22, 3823-3834 (2008))によって以前に記述されたようにペプチド定量化が行なわれた。その後、簡潔に言えば、Ｐｅｓｃａｌソフトウェア（Python v2.7で書かれた）が、データベース中のフォスフォペプチド・イオンの各々の抽出されたイオン・クロマトグラムのピーク面積を得るために比較されているサンプルのすべてにわたり使用された。各サンプル中の各フォスフォペプチド・イオンの保持時間は、イン−ハウスの線形モデル化アルゴリズムを使用して、一般的なフォスフォペプチドの保持時間のアラインメントを介して予測された。各サンプル内の各フォスフォペプチドについての抽出されたイオン・クロマトグラムから得られたクロマトグラフィーのピークは積算され、記録された。質量−荷電（ｍ／ｚ）および保持時間（ｔＲ）の寛容度は、それぞれ７ｐｐｍおよび１．５分にセットされた。
【０１３４】
キナーゼ基質富化分析およびキナーゼ活性序列
技術的な複製が平均され、各フォスフォペプチド・イオンのピーク面積は、各サンプルのペプチド強度の合計に規格化された。キナーゼ基質マッチングは、ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓデータベース（２０１４年７月にダウンロードされた）に対するＶＢＡスクリプトを使用して、先に報告された(Casado, P. et al. Science Signaling 6, rs6 (2013)) ようにしてこれらのデータ上で行なわれた。キナーゼ活性序列（ＫＡＲ）は以下の式を使用して、キナーゼＫについて計算された。ここで、ｍ＝キナーゼＫにマッチしたデータセット中の燐酸化部位の数；α＝燐酸化部位ｉの規格化された強度；ｌ＝任意のキナーゼ−基質組み合わせにかかわらずデータセット中の燐酸化部位の総数；β＝燐酸化部位ｊの規格化された強度；ｔ＝キナーゼＫのためのＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓデータベース中の既知の目標燐酸化部位の総数である。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７／２０１０、またはｒｅｓｈａｐｅ２とｇｇｐｌｏｔ２のパッケージの組み合わせを使用する、Ｒ統計計算環境（ｖ３．０．０）で視覚化された。
【０１３５】
【数１１】
2019501637.tif 000013
【０１３６】
過バナジン酸処理
Ｐ３１／Ｆｕｊ細胞は１ｍＭ過バナジン酸ナトリウムに暴露されたか、または３０分未処理のまま置かれた（過バナジン酸ナトリウムは、３０％  Ｈ２Ｏ２および１００ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４  ｐＨ  ８．０を１：１００比率で１５分間混合することにより調製された）。
その後、上に概説されるように、細胞は収穫され溶解された。均質化およびタンパク質定量化の後、処理されたものと処理されない細胞溶解物は、１．０μｇ・μＬ−１の最終タンパク濃度で混合された。使用される比率は、過バナジン酸で処理された抽出物の０％、２５％、５０％、７５％および１００％と、非処理物の抽出物の１００％、７５％、５０％、２５％および０％だった。タンパク質混合物は、次いでトリプシン消化および上に記述されるようなフォスフォペプチド富化に供された。
【０１３７】
ＥＧＦおよびＩＧＦ処理
ＫＡＲ結果は、Ｗｉｌｋｅｓら（２０１５）、上掲、の中のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄａｔａｓｅｔ  ２のメタ分析から得られた。簡潔に言えば、ＭＣＦ−７細胞は２４時間飢えさせ、続いて、１００ｎｇ・ｍＬ−１  ＥＧＦまたはＩＧＦ−１で、０、５、１０、３０または６０分処理され、またＷｉｌｋｅｓら（２０１５）、上掲に述べられているようにＭＳ分析のために処理された。上に記述されるように、Ｋ−スコアが計算された。
【０１３８】
生存度分析および感度係数
細胞株が９６ウェルプレート（１０，０００細胞／ウエル）にシードされ、一晩置かれ、ビヒクル、または１〜１０００  ｎＭのAZD-5438(CDK2i;)、GF-109203X(PKCαi; Tocris)、PF-3758309(PAKi; Calbiochem)、Trametinib(MEKi; Selleckchem)、MK-2206(AKTi; Selleckchem)、KU-0063794(mTORi; Chemdea)またはTAK 715(P38αi;)で処理された。細胞は、０．０１〜１０μＭのＰＫＣ−４１２(PKC/Flt3i; Tocris)または０．１〜１０μＭのＴＢＢ（ＣＫ２ｉ  シグマ）でも処理された。７２時間の後に、細胞は、メーカーによって指示されたようにGuava ViaCount  試薬  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色された。また、細胞数と生存度はＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｐｌｕｓを使用して測定された。原発性ＡＭＬ細胞は、上に記述されるように溶かされ、ＭＳ−５コンディショニングされたＩＭＤＭ培地に再懸濁され、９６ウェルプレート（２０，０００細胞／ウエル）らシードされ、ビヒクルで処理されるかまたは１〜１００００  ｎＭのPF-3758309(PAKi)、PKC412(Flt3/PKCi)、CX4945(CK2i;Selleckchem)、Trametinib(MEKi)およびTAK 715(P38i)で処理された。７２時間の後に、細胞は、Guava ViaCount 試薬で染色された。また、細胞数と生存度が測定された。薬はすべてＤＭＳＯに溶解された。測定はすべて３回繰り返して行なわれた。流動細胞計測法データはＣｙｔｏＳｏｆｔ（ｖ２．５．７）を使用して分析された。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭ（ｖ５．０３）を使用して計算された。感度係数（ＳＣ）は以下の式を使用して計算された。ここでＰＣｉ＝Ｃｉでの増殖の低減、ＩＣ５０ｉ＝主標的に対する「生体外の」ＩＣ５０、およびＣｉ＝増殖が測定される阻害剤濃度である。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７／２０１０、またはｒｅｓｈａｐｅ２とｇｇｐｌｏｔ２のパッケージの組み合わせを使用する、Ｒ統計計算環境（ｖ３．０．０）で視覚化された。
【０１３９】
【数１２】
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【０１４０】
結果
キナーゼ活性序列を使用するシグナリング定量化の線形性および再現性
我々は、最初にネット・キナーゼ活性の基準としてキナーゼ活性序列（ＫＡＲ、それはＫ−スコアを生成する））の再現性および定量性を調査した。この目的のために、ＤＨＬ６細胞株を、過バナジン酸ナトリウム（ｐＶ）で処理し、細胞溶解の後に、異なる比率で、処理していない細胞からの細胞溶解物と混合した（図１ｂ）。分析の再現性をテストするために、我々は３つの独立した状況で実験を行なった。また、各々は３つの複製で分析された。予想通りに、ｐＶ、チロシンホスファターゼ阻害剤は、チロシンキナーゼのＫ−スコアの増加を引き起こした；結論として、ｐＶで処理された細胞の関数としてサンプル中でより高くランク付けされた（図１ｃ−ｅ）。したがって、これらのデータは、Ｋ−スコアがキナーゼ基質グループの定量的読み出しであることを示し、これらの値が、再現可能な態様でそれらの活性化ステータスに基づいてキナーゼをランク付けするために使用されることができることを示唆する。さらに、我々は、ＥＧＦまたはＩＧＦで処理された細胞の時間的経過実験から得られた、公表されたフォスホプロテミクス(phosphoprotemics)データのメタ分析を行なった（Ｗｉｌｋｅｓら（２０１５）、上掲）。我々は、セリン／トレオニンおよびチロシンキナーゼのためのＫ−スコアが予期された動力学で成長因子で処理した際に変化し（図２）、ＫＡＲ出力（Ｋ−スコア）が予期されたキナーゼ活性を真に反映することを示すことを観察した。
【０１４１】
キナーゼ活性序列（ＫＡＲ）は、血液細胞株中の細胞の生存率へのキナーゼ活性の寄与をモデル化する。  その後、我々は８つの血液癌細胞株を分析し、互いに関するそれらの活性化に基づいて１００以上のキナーゼをランク付けした。図３ａは、より大きなＫ−スコアを備えた６０のキナーゼを示し、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＥＲＫ１、ＰＡＫ１およびＣＫ２が最も高いものとランク付けされた（図３ｂ）。
【０１４２】
Ｋ−スコアが細胞の生存率へのキナーゼの寄与を反映したかどうか調査するために、我々は、高いＫ−スコアを有するキナーゼがより低いＫ−スコアを有するものより細胞生存により大きく寄与していれば、個々のキナーゼのＫ−スコアと細胞の生存率の抑制への影響の間に相関が存在するだろうと推論した。したがって、我々は、９つのキナーゼ阻害剤（投与量作用曲線は図４に示される）での処理の関数として、８つの細胞株パネルの細胞の生存率を測定した。迅速な方法で酵素阻害を滴定するために、我々は、薬学的阻害剤（遺伝手段に対立するものとして）を使用することを選んだ。しかしながら、細胞行動に対する小分子阻害剤の影響は、経路フラックス(pathway flux)への目標の寄与、および目標への化合物の親和性（それは生体外のＩＣ５０により反映される）の両方に依存する。これを説明するために、我々は、その既知の目標に対する化合物の報告された生体外のＩＣ５０により、細胞の生存率の薬剤により導かれた抑制を規格化した。我々はこの値を「感度係数」（ＳＣ）と名付けた。それはここに定義されるように計算された。これをすることによって、阻害剤潜在能の差は規格化され、細胞の生存率へのそれらの目標の寄与に基づいて、互いに対して異種の生体外のＩＣ５０値を有するキナーゼ阻害剤をランク付けすることができるかもしれない。
【０１４３】
表１  −血液細胞株のパネルを指定された化合物で処理し、Ｇｕａｖａ  Ｖｉａｃｏｕｎｔ  分析を使用して、４８時間後にそれらの生存度が測定された。
【０１４４】
【表２】
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【０１４５】
それらのＳＣに基づいた表１に示されるキナーゼ阻害剤のランク付けは、ＣＤＫ２ｉとＰＡＫｉが最も高くランク付けされることを実証した。また全体として、ランク付けの頻度(ranking frequencies)は、ＫＡＲによって得られたものを反映した（図５ａ、ｂ）。ＰＫＣα阻害剤（ＰＫＣαｉ）も高い潜在能を有してＣＤＫ２を阻害することが注目されるべきである。より直接的な比較は、特定のキナーゼのＫ−スコアと、それらの阻害剤に対するＳＣとの間の強い関連性を明らかにした（図５ｃ）。全体として、ＫＡＲは試験された８つの細胞株において生存度を正確にモデル化した。線形回帰分析（ピアソンｒ値は０．４９〜０．９０で、平均は０．７６であり、Ｐ＝０．０１６であった）によって評価された時、全体として、モデルは、２つのメトリック（ｒ＝０．６７；Ｐ＝１．０×１０−１０；４  図６）の統計的に有意な関係を示した。これらのデータは、ＫＡＲが、生体外の細胞株培地中の細胞の生存率へのキナーゼの寄与を正確にモデル化したことを示す。
【０１４６】
キナーゼ活性序列（ＫＡＲ）は、原発性ＡＭＬ細胞中の細胞の生存率へのキナーゼ活性の寄与をモデル化する。
アプローチが、細胞の独立したセット中の規定するキナーゼを同定することができるかどうかを決定するために、我々は、正常核型（その病気のための中間の危険マーカー）が富化された、４５の原発性ＡＭＬ生検のリン酸化プロテオームを測定した。結果として得られたデータセットのＫＡＲ（図７ａ）は、細胞株の実験でのようにＣＤＫｓ、ＥＲＫ１、ＣＫ２Ａ１およびＰＡＫ１がこれらの原発性癌細胞の中で頻繁に高度にランク付けされることを示した（図７ｂ）。しかしながら、細胞株と対照的に、ＡＴＲとＰＫＡＣＡは、さらに多くの患者の中で高度にランク付けされた。
【０１４７】
ＫＡＲが原発性ＡＭＬサンプル中の生存度へのそれぞれのキナーゼの寄与を反映したかどうか調査するために、細胞は、Ｐ３８Ａ、ＣＫ２、ＭＥＫ１（ＥＲＫシグナリングを阻害するため）、ＰＡＫ、およびＰＫＣ４１２（それはレセプター・チロシンキナーゼＦｌｔ３（その遺伝子はＡＭＬの中でしばしば変更される）を含むいくつかのキナーゼを阻害する）に対する阻害剤で処理された。我々は、これらの化合物をテストすることに決めた。なぜなら、ＡＭＬへのＣＤＫの関与が十分立証されている一方、ＡＭＬ生物学へのＥＲＫ１、ＰＡＫおよびＣＫｓの寄与は、それほどよく理解されていないからである。それらのキナーゼ目標のＫ−スコアがほとんどの場合低いと分かったので、ＰＫＣ／Ｆｌｔ３ｉおよびＰ３８αｉは負の対照として貢献する。我々は、３６の原発性ＡＭＬサンプルで用量−作用曲線を得た（図８）。また、ＩＣ５０とＳＣ値が計算された（図７ｃ）。平均では、原発性ＡＭＬ細胞はＣＫ２ｉ、ＰＡＫ１ｉおよびＭＥＫ１ｉに対して、ＰＫＣ／Ｆｌｔ３ｉおよびＰ３８αｉに対してよりも敏感だった（図７ｃ）。これはＰＫＣ／Ｆｌｔ３ｉおよびＰ３８αｉ目標（それぞれＰＫＣｓ／チロシンキナーゼおよびＰ３８Ａ）に関するよりも、ＣＫ２Ａ１、ＰＡＫ１およびＥＲＫ１に関しての高いＫ−スコアと一致する。
【０１４８】
細胞株データ（図５）でのように、予測されたキナーゼ活性は原発性ＡＭＬブラスト中の阻害剤への細胞の感度を反映した。２つの患者のサンプルのデータの例は図７ｄの中で示される。また、他の患者のデータは図１０に示される。線形回帰分析モデルは、３６の生検のうちの３１の生検では、Ｋ−スコアおよびＳＣが関連していたことを示し、ｒ＞０．６（図７ｅ）であり、全体の平均のｒ＝０．８４であった。興味深いことには、ＭＥＫ１  Ｋ−スコアは、ＮＲａｓまたはＫｒａｓ（これらは以前にＡＭＬにおけるＭＥＫ阻害剤に対するレスポンスに連鎖性だった）の突然変異ステータスに関係なく、ＭＥＫ１阻害剤に対するレスポンスに関係していた（図７ｆ）。同様に、ＪＡＫ２  Ｋ−スコア（ＪＡＫ２はＦｌｔ３の下流で作用することに留意）は、サンプルにわたりＰＫＣ４１２（それはＦｌｔ３を阻害する）への感度と弱く関係し、これは、Ｆｌｔ３突然変異ステータスより感度のよりよい指標だった（図７ｇ）。全体として、これらのデータは、シグナリング出力へのキナーゼの寄与を定量するためにＫ−スコアを使用するモデルが、細胞株（図５）および初代細胞（図７  ｄ、ｅおよび図１０）中の細胞の生存率への所定のキナーゼを阻害するインパクトを予測することができることを示す。
【０１４９】
キナーゼ活性の差は、薬物応答表現型の複雑さに関係している。
１つの化合物に対する耐性または感受性の代わりに、原発性ＡＭＬ細胞は反応の複雑なパターンを示した（図９ａ）。例えば、１μＭ処理で生存度の５０％低減のしきい値を課して、１０／３６のケースが、少なくとも３つの阻害剤（図９ａ中でグループ１〜５）に敏感だった。しかし、１３／３６のケースがすべての化合物（グループ１３）に耐性だった。５つおよび３つのケースが、ＣＫｉのみ（グループ１１）、またはＭＥＫ１ｉのみ（グループ１２）にそれぞれ感受性だった。目標キナーゼの寄与だけの考慮によってこれらの表現型を合理化することができなかった。したがって、我々は、観察された反応の相違を説明することができるキナーゼ活性のパターンを調査した。細胞遺伝学の分類またはＦＡＢ（フランス・アメリカ・英国）分類が反応グループの間で異なっていないが、Ｋ−スコアに著しい違いがあった（図１１ａ）。例えば、チロシンキナーゼとＰＬＫ１は感受性細胞（グループ１−５）中で、耐性細胞（グループ１３）よりも増加された。また、ＭＥＫ１ｉのみ、またはＣＫ２ｉのみに感受性の細胞には活性間に逆の相関があった（図１１ｂ−ｅ）。ＭＥＫ１ｉ感受性細胞（グループ１２）では、ＲＡＦのＫ−スコアは増加された。しかし、ＡＴＲでは、阻害の他のパターンを有する患者サンプルに比べて減少した（図９ｂ、ｃ）。したがって、ＡＴＲと、ＲＡＦとＫ−スコアの比率は、他の反応グループよりこのグループにおいて著しくより大きかった（図９ｄ）。同様に、ＣＫ２Ａ１  Ｋ−スコアがグループ１１において予想外にそれほど大きくなかった（図９ｅ、細胞はＣＫ２ｉにのみ敏感であった）。一方、ＰＫＣＡ  Ｋ−スコアはこのサンプルのグループでは著しく低下し（図９ｆ）、ＣＫ２Ａ１：ＰＫＣＡ比率はＣＫ２ｉ感受性細胞では他のグループに比較してより大きかった（図９ｇ）。したがって、目標キナーゼの活性化に加えて、所定の化合物に対する排他的なレスポンスは、目標と平行して作用する生存支持経路の活性化の非存在を要求した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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