(57)【要約】本開示は、概して、エリスロポエチン産生肝癌受容体キナーゼEphA4を介するシグナル伝達により悪化する疾患および状態の治療、およびそのような治療に有用な剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象においてEph媒介性シグナル伝達により悪化する疾患または状態を治療するための方法であって、該方法が、有効量のEphA4-Xの投与を含み、該EphA4が、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変されており、Xが、免疫グロブリン分子の一部、タンパク質およびポリエーテルからなる群から選択される、方法。
【請求項２】
Xが免疫グロブリン分子のFc部分である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記FcがIgG4 FcまたはIgG1 Fcである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患または状態が、中枢神経系（CNS）の疾患または状態である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
CNSの疾患または状態が、神経変性状態である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記神経変性状態が運動ニューロン疾患（MND）である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患または状態が、脳または脊髄に対する外傷または損傷である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記脳への損傷が、卒中であるか、または外傷性脳損傷もしくは血栓溶解後の脳損傷である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記グリコシル化部位が改変されたEphA4-Xが、神経膠症、グリア性瘢痕、ニューロン炎症、または神経変性を予防または軽減する、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記グリコシル化部位が改変されたEphA4-Xの有効量が、軸索の再生を促進するのに十分な量である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
EphA4-Xが、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変されたEphA4-Fcである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患または状態が、全身性脈管構造の疾患または状態である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記全身性脈管構造の疾患または状態が、虚血性再灌流傷害、器官再灌流傷害または炎症である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記虚血性再灌流傷害が、腸虚血性再灌流傷害、腎臓再灌流または肝再灌流である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患が、心筋梗塞、炎症状態または癌である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記グリコシル化部位が改変されたEphA4-Fcが、配列番号：1記載のアミノ酸配列を引用してヒトEphA4-Fcのアミノ酸残基216、321および/または389でのアスパラギンのアミノ酸置換を含む、請求項2または16に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノ酸置換が、アスパラギンからグルタミンへの置換である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変されたEphA4-Fcが、配列番号：2〜8からなるリストから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記改変されたEphA4-Fcが、配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記改変されたEphA4-Fcが、約5〜20μg/mLの血清EphA4-Fcを3〜10日間、供する量で投与される、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物対象におけるEph媒介性シグナル伝達により悪化する疾患または状態の治療のための薬剤の製造におけるEphA4-Xの使用であって、該EphA4が、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変されており、ここで、Xが、免疫グロブリン分子の一部、タンパク質およびポリエーテルからなる群から選択される、使用。
【請求項２３】
Xが免疫グロブリン分子のFc部分である、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
FcがIgG4 FcまたはIgG1 Fcである、請求項23に記載の使用。
【請求項２５】
哺乳動物対象におけるEphA4媒介性シグナル伝達により悪化する疾患または状態の治療のための薬剤の製造における、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変されたEphA4-Fcの使用。
【請求項２６】
前記疾患または状態が、中枢神経系（CNS）の疾患または状態である、請求項22〜25のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２７】
前記CNSの疾患または状態が、神経変性状態である、請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
前記神経変性状態が、運動ニューロン疾患（MND）である、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
前記疾患または状態が、脳または脊髄または神経細胞の炎症に対する外傷または損傷である、請求項26に記載の使用。
【請求項３０】
前記脳への損傷が、脳卒中または外傷性脳損傷または血栓溶解後の脳損傷である、請求項29に記載の使用。
【請求項３１】
前記疾患または状態が、全身性脈管構造の疾患または状態である、請求項22〜25のいずれか1項に記載の使用。
【請求項３２】
前記全身性脈管構造の疾患または状態が、虚血性再灌流傷害または器官再灌流である、請求項31に記載の使用。
【請求項３３】
前記虚血性再灌流傷害が、腸虚血性再灌流傷害、腎臓再灌流または肝再灌流である、請求項32に記載の使用。
【請求項３４】
前記疾患または状態が、心筋梗塞、炎症状態または癌である、請求項22〜27のいずれか1項に記載の使用。
【請求項３５】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項22〜27のいずれか1項に記載の使用。
【請求項３６】
前記EphA4-Xが、配列番号：1記載のアミノ酸配列を引用して、19アミノ酸シグナル配列の非存在下でアミノ酸位置を計算して、ヒトEphA4-Fcのアミノ酸残基216、321および/または389におけるアスパラギンのアミノ酸置換を含む改変されたEphA4-Fcである、請求項35に記載の使用。
【請求項３７】
前記アミノ酸置換が、アスパラギンからグルタミンへの置換である、請求項36に記載の使用。
【請求項３８】
前記改変されたEphA4-Fcが、配列番号：2〜8から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項37に記載の使用。
【請求項３９】
前記改変されたEphA4-Fcが、配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の使用。
【請求項４０】
少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去する改変されたアミノ酸配列を含むEphA4-Xであって、Xが免疫グロブリンの一部、タンパク質およびポリエーテルからなる群から選択される、EphA4-X。
【請求項４１】
少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去する改変されたアミノ酸配列を含むEphA4-Fc。
【請求項４２】
前記改変されたEphA4-Fcが、配列番号：1記載のアミノ酸配列を引用して、19アミノ酸シグナル配列の非存在下でアミノ酸位置を計算して、ヒトEphA4-Fcのアミノ酸残基216、321および/または389におけるアスパラギンのアミノ酸置換を含む、請求項41に記載の改変EphA4-Fc。
【請求項４３】
前記アミノ酸置換が、アスパラギンからグルタミンへの置換である、請求項42に記載の改変EphA4-Fc。
【請求項４４】
配列番号：2〜8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項43に記載の改変EphA4-Fc。
【請求項４５】
配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含む、請求項44に記載の改変EphA4-Fc。
【請求項４６】
哺乳動物対象におけるEph媒介性シグナル伝達により悪化する疾患または状態の治療のための、請求項41〜45のいずれか1項に記載の改変EphA4-Fc。
【請求項４７】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項46に記載の改変EphA4-Fc。
【請求項４８】
請求項41〜45のいずれか1項に記載の改変EphA4-Fcと、1つまたは複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤および/または賦形剤と、を含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願データ
本出願は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる2015年10月27日に出願されたオーストラリア仮特許出願第2015904387号（発明の名称「治療の方法およびそのために有用な剤」）に関連し、その優先権を主張する。本明細書は配列表を参照する。「ST25.txt」ファイルはANSI形式である。このファイルは、AU 2015904387から本明細書に引用によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
背景
分野
本開示は、概して、エリスロポエチン−産生−肝癌（Eph）ファミリーの受容体キナーゼを介するシグナル伝達により悪化する疾患および状態の治療、およびそのような治療に有用な剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
本明細書の著者により引用された刊行物の書誌的詳細は、説明の最後にアルファベット順に収集される。
【０００４】
本明細書中の任意の先行出版物（またはそれから導かれる情報）、または既知の任意の事項への言及は、その先行刊行物（またはそれから導かれる情報）または既知の事項が本明細書が関係する努力の分野における共通の一般的な知識の一部を形成することの同意もしくは承認または示唆のいずれかの形態として解釈されず、またそうされるべきではない。
【０００５】
成体の哺乳動物の中枢神経系（CNS）は、疾患または外傷後の機能的な再生のために限られた能力しか有さない（Spanevello et al,（2013）J. Neurotrauma 30：1023-1034）。例えば、脊髄損傷後の臨床的介入の成功は、難しい目標である。
【０００６】
CNS疾患または損傷の部位における阻害分子のブロッキングは、軸索再生および機能的回復を促進するためのストラテジーとして提案されている（Goldshmit et al.（2004）J.Neurosci. 24：10,064-10,073; Goldshmit et al.（2011）PLos ONE 6：e24636）。阻害分子の1グループは、Eph受容体：エフリンリガンドシグナル伝達系のメンバーである（国際特許公開番号WO 2000/024413）。Eph受容体活性はまた、心筋梗塞、炎症および癌などのCNS外の状態にも関与する（Boyd et al.（2014）Nat. Rev. Drug Discovery 13：39-62; Coulthard et al.（2012）Am J Path 181：1493-1503）。
【０００７】
Eph：エフリンファミリーは、AおよびBの2つのサブグループに分けられる（Qin et al.（2010）J. Biol. Chem. 285：644-654; Bowden et al.（2009）Structure 17：1386-1397）。1つの特定のEph受容体であるEphA4およびそのリガンドは、脊髄損傷後にアップレギュレートされ、これは軸索再生に拮抗する（Fabes et al.（2006）Eur. J. Neurosci. 23：1721-1730; Arocho et al.（2011）Cell. Mol. Neurobiol. 31：1057-1069）。従って、Eph：エフリンシグナル伝達経路の構成物が適切な治療標的と考えられていることは驚くべきことではない。実際、EphA4の細胞外ドメインおよびIgGのFc領域を含む可溶性融合タンパク質（「EphA4-Fc」と呼ばれる）によるEphA4の拮抗作用は、軸索再生をもたらし得る（WO 2000/24413; Goldshmit et al.（2004）前掲; Goldshmit et al.（2011）前掲; Spanevello et al.（2013）J Neurotrauma 30：1023-1034）。
【０００８】
潜在的な治療ストラテジーとしてのEph：エフリンシグナル伝達系の認識にもかかわらず、EphA4-Fcの比較的迅速なクリアランスは、この形態の治療の有効性を制限する。その投与が抑制血清濃度を維持することができる剤を開発することが急務である。1つの選択肢は、グリコシル化のようなタンパク質の翻訳後修飾を調査することである。
【０００９】
しかしながら、文献は、グリコシル化がタンパク質の機能性および薬物動態において果たす役割と矛盾している。例えば、Yamada et al.（2013）Virology 94:270-275は、N-グリカンの添加がウイルス産生を増強することができる一方で、N-グリカン部位の消失が効果的な産生を減少させ、ウイルス成分を不安定にし得ることを見出した。Takahashi et al.（2008）Biochimica et Biophysica Actal 780:520-524は、N-グリカン部位を除去すると、いくつかのN-グリカン残基が突然変異した場合に穏やかなPKの改善があるが、N-グリカン部位の大部分についてGeromettaおよびAdams（WO2014/124487）が行ったように、タンパク質発現の有意な損失がもたらされることを見出した。Ferluga et al.（2013）J. Biol. Chem., 288（25）:18448-18457は、脱グリコシル化がエフリン-A1活性に負の影響を有することを見出した。Elliot et al, (2003) Nature Biotechnology 21(4):414-421）は、新たなN-グリコシル化部位の導入は、in vivo活性を実質的に増加させ、組換えヒトEPO、レプチンおよびMplリガンドの作用の期間を延長させることを示した。同様に、Stork et al.（2008）J. Biol. Chem. 283:7804-7812は、N-グリカン部位を二重特異性一本鎖ダイアボディに導入し、その結果、循環半減期を延長した。しかしながら、Jones et al.（2007）Glycobiology 17(5):529-540およびGoetze et al.（2011）Glycobiology, 21（7）:949-959は、N-グリカンを含むFc融合タンパク質および抗体のin vivoクリアランスがN-グリカン構造に依存し得ることを実証した。
【００１０】
したがって、タンパク質性Ephシグナル伝達アンタゴニスト上のグリコシル化パターンを改変することの影響が何であるかは不明であり、確かに予測できないものである。
【発明の概要】
【００１１】
概要
アミノ酸配列は、配列識別番号（配列番号）により参照される。配列番号は、配列識別子<400> 1（配列番号：1）、<400> 2（配列番号：2）等に数値的に対応する。配列識別子の概要を表1に示す。配列表は特許請求の範囲の後に供される。
【００１２】
本開示は、Eph：エフリン媒介シグナル伝達によって悪影響を受ける疾患または状態を治療するための方法、それらからの機能的回復を可能にする。本発明の開発は、部分的には、Eph：エフリンシグナル伝達アンタゴニストであるEphA4-Fcが特に短い半減期を有するという決定に基づいている。本明細書中では、N-グリコシル化部位が全てまたは一部が除去されているEphA4-Fcの修飾された形態が可能である。本明細書においては、さらに、任意のEph分子に対する機能的に等価な修飾が可能である。驚くべきことに、Eph分子の改変形態は、非改変Eph分子よりも血清中でより長い有効な拮抗活性を保持する。任意のEph分子は、EphA分子（例えば、EphA1〜A8）およびEphB分子（例えば、EphB1〜B6）ならびに半減期延長または安定化分子に融合または結合されたこれらの形態、たとえばこれらに限らないが、イムノグロブリンもしくはイムノグロブリンフラグメント（例えば、Fc部分）、タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えば、ヒト血清アルブミン[HSA]）またはポリエーテル化合物（例えば、ポリエチレングリコール[PEG]）を含む改変突然変異から利益を得ることができる。一実施形態では、疾患または状態は、中枢神経系（CNS）または全身性脈管構造にある。例としては、脳または脊髄損傷、外傷性脳損傷または血栓溶解後の脳損傷、神経変性状態（例えば、運動ニューロン疾患[MND]）、ニューロンの炎症、および心臓または他の器官の虚血−再灌流（例えば、腎臓再灌流）、心筋梗塞および肝臓再灌流、炎症および癌が挙げられる。
【００１３】
簡潔にするために、Ephグリコシル化に基づくアンタゴニストは、分子Xに融合または結合された少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変されたEphを意味する「Eph-X」と呼ぶ。ここで、Xは、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片（例えば、Fc部分）、タンパク質もしくはタンパク質断片（例えば、HSA）またはポリエーテル（例えば、PEG）から選択されるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、Eph-XはEphA4-Xであり、ここでXは免疫グロブリン分子の一部、タンパク質またはポリエーテルであり、EphA4は少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように修飾されている。
【００１４】
したがって、本明細書は、哺乳動物対象におけるEph媒介性シグナル伝達によって悪化される疾患または状態を治療するための方法であって、有効量の融合分子Eph-X（Eph-X融合分子中のEphはEph媒介性シグナル伝達に関連するEphであり、Xは免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンフラグメント（例えばFc部分）、タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えば、HSA）またはポリエーテル（例えば、PEG）である、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変されたEph）の投与を含む方法に関して教示する。一実施形態では、本明細書は、哺乳動物対象におけるEphA4媒介性シグナル伝達によって悪化する疾患または状態を治療するための方法であって、EphA4-Xの有効量の投与を含み、ここで、Ephは、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変され、Xは、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質もしくはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である、方法を教示する。
【００１５】
別の実施形態では、本明細書は、哺乳動物対象におけるEphAまたはEphB媒介性シグナル伝達によって悪化する疾患または状態を治療するための方法を教示する。この方法は、有効量のEphA-XまたはEphB-Xの投与を含み、ここで、EphAまたはEphBは、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変されており、EphAはEphA1〜A8から選択され、EphBはEphB1〜B6であり、Xは免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンフラグメント（例えばFc部分）、タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である。本明細書において、N-グリコシル化部位の排除により、拮抗作用の有意な喪失がない、より長い血清半減期をもたらすことができることが提案され、可能にされる。一実施形態では、Xは、これらに限定されないが、IgG4 FcまたはIgG1 Fc等のFcである。一実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。
【００１６】
一実施形態では、本明細書は、哺乳動物対象におけるEphA4媒介性シグナル伝達によって悪化される疾患または状態を治療するための方法であって、有効量のEphA4-Fcの投与を含み、ここで、Ephは、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するよう改変されている、方法を教示する。哺乳動物対象には、ヒト対象が含まれる。Fcは、IgG4 FcまたはIgG1 Fcを含む。
【００１７】
一実施形態では、排除されるN-グリコシル化部位は、配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するヒトEphA4-Fcの位置216、321および389からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別の種からのEphA4における等価物、または別のEphAもしくはEphBにおける等価物に位置する。これらのアミノ酸位置は、19アミノ酸シグナルペプチド配列（配列番号：33）の非存在に基づいて計算される。シグナル配列を伴う対応するアミノ酸位置は、それぞれ235、340および408である。マウス由来のEphA4-Fc（配列番号：9）は、例えば、ヒト形態と同じ位置にN-グリコシル化部位を有する。一実施形態では、2つまたはそれより多いN-グリコシル化部位が排除される。さらなる実施形態では、2つまたは全部で3つのN-グリコシル化部位が排除される。EphA2、A3、A4およびEphB4における潜在的N-グリコシル化部位を図11A〜D [配列番号：29〜32]に示す。
【００１８】
好都合には、N-グリコシル化部位は、ヒトEphA4-Fcのアミノ酸位置216、321および/または389（リーダー配列を伴って位置235、340、および408に対応）または別の種に由来するEphA4-Fc中の等価位置または別のEphAもしくはEphB中の等価な位置の1つまたは複数におけるアスパラギン（Asn; N）残基の置換により除去される。これは、Z1nbZ2置換と呼ばれ、ここで、Z1はアスパラギン（Asn; N）であり、Z2はアスパラギンを除く任意のアミノ酸残基である。一実施形態では、Z2はグルタミン（Gln; Q）である。
【００１９】
したがって、本明細書では、EphA4に関連して、ヒト対象におけるEphA4媒介性シグナル伝達によって悪化する疾患または状態を治療するための方法であって、配列番号：2〜8からなるリストから選択されるアミノ酸配列、または同じN-グリコシル化部位が除去されている条件で最適なアラインメント後に配列番号：2〜8のいずれかと少なくとも80％の類似性を有するアミノ酸配列を有する、有効量のN-グリコシル化改変EphA4-Fcの投与を含む、方法を可能にする。
【００２０】
さらに、本明細書は、ヒト対象において、CNSもしくは全身脈管構造の疾患もしくは状態、心臓もしくは他の臓器（例えば、腎臓または肝臓）の虚血−再灌流傷害、または心筋梗塞、炎症（ニューロンもしくは全身性）または癌を治療する方法を教示する。この方法は、配列番号：1に記載されるアミノ酸配列により規定されるが、N216Z、N321Z、N389Z、N216Z+N321Z、N216Z+N389Z、N321Z+N389ZおよびN216Z+N321Z+N389Z（式中、Zはアスパラギン以外の任意のアミノ酸である）からなる群により規定される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する、ヒトEphA4-Fc分子の有効量を対象に投与することを含む。これらのアミノ酸位置は、19アミノ酸リーダー（シグナル）ペプチド配列の非存在下で計算される。リーダー配列が含まれる場合（配列番号：33）、位置はそれぞれ、N235Z、N340Z、N408Z、N235Z+N340Z、N235Z+N408Z、N340Z+N408ZおよびN235Z+N340Z+N408Zである。
【００２１】
一実施形態では、Zはグルタミン（Gln; Q）である。
【００２２】
本明細書はさらに、増加した血清半減期を有し、かつ、EphA4シグナル伝達拮抗作用を保持する少なくとも1つのN-グリコシル化部位の排除を伴う改変EphA4-Fc分子を教示する。改変されたヒトEphA4-Fc分子の例には、配列番号：2〜8、または配列番号：10〜16に記載のマウスのような非ヒト哺乳動物における同等物が含まれる。上述のとおり、本発明は、これらに限らないが、N-グリコシル化部位が除去されたEphA（例えば、EphA1〜A8）およびEphB（例えば、EphB1〜B6）などの任意の改変されたEphを包含する。薬学的組成物および治療キットも本明細書において考慮される。
【００２３】
（表１）配列識別子の要約
2019501112.tif 000002
2019501112.tif 000003
2019501112.tif 000004
1これらのアミノ酸配列および位置はN-末端リーダー（シグナル）配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
いくつかの図は、色表現またはエンティティを含む。カラー写真は、要請に応じて特許権者から、または適切な特許庁から入手可能である。特許庁から取得した場合、手数料が課せられることがある。
【００２５】
（図１）図1は、マウスにおける注射後のヒトEphA4-Fc濃度の動態のグラフ表示である。静脈内（IV）または腹腔内（IP）のいずれかの単回20mg/kg体重の注射後の血清ヒトEphA4-Fc濃度が測定される。
【００２６】
（図２Ａ）図2Aは、グルタミン（Q）への後の突然変異のためのアスパラギン（N）残基のN-結合型グリコシル化の部位を示す野生型ヒトEphA4-Fcのアミノ酸配列の表示である。アミノ酸配列は、発現中に切断される19アミノ酸リーダー配列を含まない。
【００２７】
（図２Ｂ）図2Bは、野生型ヒトEphA4-Fcと比較した改変ヒトEphA4-FcのSDS PAGEの写真である。1. N216Q置換；2. 二重N216Q+N321Q置換；3. 三重N216Q+N321Q+N389Q置換：4. 野生型ヒトEphA4-Fc。19アミノ酸シグナル配列（配列番号：33）の非存在下で計算されたアミノ酸位置番号。
【００２８】
（図２Ｃ）図2Cは、野生型ネズミEphA4-Fcと比較した改変ネズミEphA4-FcのSDS PAGEの写真である。1. 野生型ネズミEphA4-Fc：2. 単一のN321Q置換；3. 三重N216Q+N321Q+N389Q置換。19アミノ酸シグナル配列（配列番号：33）の非存在下で計算されたアミノ酸位置番号。
【００２９】
（図３）エフリンA4へのEphA4変異体の結合。ストレプトアビジン結合オクテットプローブを、ビオチン結合エフリンA4-Fcタンパク質で修飾した。個々のプローブを、WT EphA4-Fc（B1）、二重変異体（D1）または三重変異体（F1）タンパク質に結合するのに用いた。飽和に達すると、プローブを結合緩衝液に交換して解離を許容した。
【００３０】
（図４）図4は、EphA4（分析物）の検出のためのサンドイッチELISAの概略図である。
【００３１】
（図５）図5は、図4に概略を示したアッセイ構成を用いた、野生型および変異型ヒトEphA4-FcのELISA標準曲線のグラフ表示である。
2019501112.tif 000005
【００３２】
（図６）図6は、ラット血清中の野生型および変異体ヒトEphA4-Fcの薬物動態分析のグラフ表示である。
2019501112.tif 000006
【００３３】
（図７）図7は、エフリンA4（左パネル）、エフリンA1（中間パネル）およびエフリンB3（右パネル）を発現するCHO細胞に対する2つの異なる濃度でのEphA4-Fcの結合を示すグラフ表示である。
【００３４】
（図８）図8は、ネズミEphA4を発現するCHO細胞に対するエフリンFcタンパク質の結合のグラフ表示である。
2019501112.tif 000007
【００３５】
（図９）図9は、固定化されたエフリンへのEphA4タンパク質の結合のELISA検出の図表示である。
【００３６】
（図１０）図10A〜Cは、エフリン-FcAに対するヒトEphA4野生型対変異体の結合曲線のグラフ表示である。A.エフリンA4：WT対変異体；B. エフリンA5：WT対変異体；C. エフリンB3：WT対変異体。「WT」は、N-グリコシル化部位に変化がない「野生型」を意味する。突然変異体は、三重N-グリカン突然変異体を意味する。●WT■変異体。
【００３７】
（図１１）図11A〜Dは、予測されるN-グリコシル化部位を強調した（これらの部位の位置については、表1および配列番号：29〜32も参照）、（A）EphA2；（B）Eph A3；（C）EphA4；および（D）EphB4由来の細胞外Ephアミノ酸配列を示す。19merのリーダー配列が発現中に切断される。
【００３８】
（図１２）図12は、EpHA4-Fcタンパク質の概略図である。EphA4領域（明るい灰色）およびFc領域（暗い灰色）が同定される（一定の縮尺ではない）。EphA4シグナルペプチド（S）は、タンパク質のN末端に位置し、リガンド結合ドメイン（LBD）、システインリッチドメイン（CRD）ならびに2つのフィブロネクチンIII型反復配列（FN1）および（FN2）がそれに続く（Xu et al.（2013）Proc Natl. Acad. Sci. USA 100：14634-14639）。タンパク質のIgG4 Fc部分は、ヒンジ（H）領域およびCH2およびCH3定常免疫グロブリンドメインを含む。4つのN結合部位N216、N321、N389およびN606（それぞれシグナル配列（配列番号：33）ありではN235、N340、N408およびN625に対応）を含む観察されたトリプシンペプチドは、下線部分のN結合コンセンサス部位とともに表示される。トリプシンペプチドのアミノおよびカルボキシル末端残基は、EphA4-Fc配列由来のそれぞれのアミノ酸番号で注釈されている。トリプシンペプチド配列内のトリプシンまたはGlu-Cによる任意のさらなる観察されたタンパク質分解切断にもまた、それぞれのアミノ酸番号が注釈されている。
【００３９】
（図１３）図13は、EphA4-Fcの各N結合部位におけるグリカンの組成の概略図である。N結合部位N216、N321、N389およびN606（それぞれシグナル配列（配列番号：33）ありではN235、N340、N408およびN625に対応）においてEphA4-Fcから観察されたグリカン組成の定性的分布。
2019501112.tif 000008
【００４０】
（図１４）図14は、A）還元されたプロテインAで精製された、単一、二重および三重脱グリコシル化ならびに野生型ヒトEphA4-Fcタンパク質のSDS-PAGE分析の図表示である。B）SECおよびC）SV-AUC沈降プロファイルは、三重突然変異体（赤色）および野生型（青色）ヒトEphA4-Fcタンパク質の両方について単一の優勢なピークを示し、これは、有意に異なるサイズのタンパク質種が存在しないことを示す。分子量標準（黒色）のクロマトグラムは、それぞれのピーク上に示される標準の量（チログロビン−670 kDa；ウシγ-グロビン−158 kDa；オボアルブミン−44 kDa；ウマミオグロビン−17 kDaおよびビタミンB12−1.35 kDa）とともにSECプロファイル内に含まれる。
【００４１】
（図１５）図15A〜Cは、変異原性脱グリコシル化および野生型ヒトEphA4-Fcタンパク質のリガンド結合のグラフ表示である。A）固定されたエフリンA5（i）およびエフリンA4（ii）に対するEphA4-Fc脱グリコシル化タンパク質および野生型タンパク質のエフリン結合ELISA；B）ビオチン結合エフリンA4-Fcタンパク質で標識されたストレプトアビジン結合オクテットプローブに対するEphA4-Fc脱グリコシル化タンパク質および野生型タンパク質のオクテットバイオセンサー分析；C）エフリンA5発現CHO細胞系へのEphA4-Fc脱グリコシル化および野生型タンパク質の結合のフローサイトメトリー分析。
【００４２】
（図１６）図16Aは、EphA4-Fc対対照、第18週の後肢握力強度を示すグラフ表示である。図16Bは、EphA4-Fc対対照、第20週の立ち下がり時間に対するRotaRod潜伏時間を示すグラフ表示である。
【００４３】
（図１７）図17は、SOD1G93Aマウスにおけるヘテロ接合性コンディショナルノックアウトEphA4が、ロタロッド試験において有意に改善された行動能力を示したことを示すグラフ表示である（* p <0.05、** p <0.01；略称：EphA4F/W；SOD1G93A、EphA4flox/WT x ChAT-CreKI/KI x SOD1G93A；EphA4WT/WT；SOD1G93A、EphA4flox/flox x ChAT-CreWT/WT x SOD1G93A）。
【００４４】
（図１８）SOD1G93Aマウスにおけるヘテロ接合性コンディショナルノックアウトEphA4が、17週間で腰部運動ニューロンの保存を示すグラフ表示である（略称：EphA4F/W；SOD1G93A、EphA4flox/WT x ChAT-CreKI/KI x SOD1G93A；EphA4WT/WT；SOD1G93A、EphA4flox/flox x ChAT-CreWT/WT x SOD1G93A）。
【００４５】
（図１９）図19は、速度におけるクリアランスの関数としての、グリカン部位でのEphA2の野生型EphA2対変異形態のグラフ表示である。結果は、薬物動態（PK）挙動の改善がないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
【００４７】
本明細書を通して、文脈が他の意味を必要としない限り、「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの変形語は、記載される要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素もしくは整数もしくは方法ステップのグループを包含するが、いずれの要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素もしくは整数もしくは方法ステップのグループも排除しないことを意味すると理解されよう。
【００４８】
本明細書中で用いる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の態様を含む。したがって、たとえば、「突然変異」への言及は、単一の突然変異ならびに2つまたはそれより多い突然変異を含み；「アンタゴニスト」への言及には、単一のアンタゴニスト、ならびに2つまたはそれより多いアンタゴニストが含まれ；「開示」への言及は、本開示によって教示される単一のおよび複数の態様を含む、等々。本明細書で教示され、可能にされる態様は、用語「発明」に包含される。このような態様の全ては、本発明の幅内で可能にされる。本明細書で意図される任意の変異体および誘導体は、本発明の「形態」に包含される。
【００４９】
本開示は、N-グリコシル化部位を除去するための少なくとも1つのアミノ酸置換によって修飾されたEph（グリコシル化に基づくEphアンタゴニスト）と、成分または分子X（式中、Xは免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片（例えば、Fc部分）、タンパク質もしくはタンパク質断片（例えば、HSA）またはポリエーテル（例えば、PEG）である）と、の間の融合または結合分子を教示する。融合または結合分子は、「Eph-X」（式中、EphはEphAまたはEphBを含み、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えば、PEG）である）として引用される。「EphA」には、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7およびEphA8が含まれる。「EphB」には、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB5、EphB6が含まれる。「改変（修飾）された」形態への言及は、少なくともN-グリコシル化部位を排除する、アミノ酸残基におけるEphに対する「修飾」、「突然変異体」および「突然変異」を含む。本開示は、突然変異が置換であるアミノ酸残基の単一または複数の突然変異を教示する。便宜上、アミノ酸置換の形態の突然変異または改変は、本明細書において、Z1nbZ2（式中、Z1は置換前のアミノ酸であり、Z2は置換後のアミノ酸であり、nbはアミノ酸残基番号である）と定義される。本発明は、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除する改変されたアミノ酸配列を含むEphに及ぶ。そのEphは、EphA（例えば、EphA1〜A8）およびEphB（例えば、EphB1〜B6）を含む。したがって、Ephグリコシル化に基づくアンタゴニスト（Eph-X）は、Xに融合または結合した少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変されたEphを意味し、ここで、XはFc部分などの半減期延長分子である。EphがEphA4である場合、その分子はEphA4-Xであり、ここでXは免疫グロブリン分子の一部（例えばFc）、タンパク質またはポリエーテルである。
【００５０】
一実施形態では、Ephは、IgG Fc（例えば、IgG4 FcまたはIgG1 Fc）に融合された少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変されたEphA4である。
【００５１】
ヒトEphA4のヒトIgG Fc部分とのこの融合分子は、「EphA4-Fc」と呼ぶ。便宜上、突然変異していないEphA4-Fcは、人工的に生成された分子であっても、本明細書では野生型（WT）EphA4-Fcと呼ぶ。同様に、変異していないEph-Xは、WT Eph-X（式中、Xは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHA）またはポリエーテル（例えばPEG）である）と呼ぶ。
【００５２】
疑義を避けるために、本発明は、融合または結合Eph-X分子（式中、EphはEphAまたはEphBであり、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメント（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質フラグメント（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である）におよぶ。一例はEphA4-Xである。そのX成分は、半減期または安定性を付与する分子である。
【００５３】
一実施形態では、Eph-Xは、EphA4-FcなどのEphA4-Xである。EphA4-Fcは、組換え（r）ヒト（Hu）EphA4-Fcなどの様々な方法で表すことができる。WTヒトEphA4-Fcのアミノ酸配列は、配列番号：1に記載されている。N-グリコシル化部位を除去する置換突然変異は、配列番号：1において考慮される。例としては、それぞれN216Z、N321ZおよびN389Zとして表されるアミノ酸残基番号216、321および389からなる群から選択される部位でのアスパラギン（Asn; N）の置換が挙げられ、ここで、Zはアスパラギン（Asn; N）以外の任意のアミノ酸であり、突然変異はこの残基のN-グリコシル化部位を除去する。これらのアミノ酸位置は、19アミノ酸のリーダー（シグナル）配列が切断された配列に基づく。シグナル配列は配列番号：33である。シグナル配列が含まれる場合、位置はそれぞれ235、340および408である。部位216、321または389に対応する配列番号：1（WT EphA4-Fc）の単一変異は、グルタミン（Gln; Q）への置換、すなわち、それぞれN216Q、N321QおよびN389Qを含む。これらはそれぞれ配列番号：2、配列番号：3および配列番号：4に対応する。再度、19アミノ酸のN末端シグナル配列の非存在に基づく。疑いを避けるために、リーダー配列を持たないEphA4-Fcのアミノ酸配列は、アミノ酸配列：VTGSRVYPANEで始まる。
【００５４】
N216Z + N321Z、N216Z + N389ZおよびN321Z + N389Z（ここで、Zはアスパラギン（Asn; N）以外の任意のアミノ酸である）の二重置換などの複数の突然変異を導入することもでき、その二重置換は2つのN-グリコシル化部位を除去する。例としては、N216Q + N321Q、N216Q + N389QおよびN321Q + N389Q（それぞれ配列番号：5、配列番号：6および配列番号：7）が挙げられる。N216Z + N321Z + N389Z（ここで、Zはアスパラギン（Asn; N）以外の任意のアミノ酸である）の三重突然変異も導入することができ、その三重置換は3つのN-グリコシル化部位を除去する。一例は、N216Q + N321Q + N389Q（配列番号：8）を含む。
【００５５】
野生型ネズミEphA4-Fc（配列番号：9）のような非ヒト由来EphA4-Fc分子についても同様の命名法が用いられる。これは、N216Z、N321Z、N389Z、N216Z + N321Z、N216Z + N389Z、N321Z + N389ZおよびN216Z + N321Z + N389Z（式中、Zはアスパラギン（Asn; N）を除く任意のアミノである）によって表されるように、アミノ酸位置216、321および/または389に同じ置換突然変異を含み得、その変異は1、2または3つのN-グリコシル化部位を除去する。例としては、N216Q、N321Q、N389Q、N216Q + N321Q、N216Q + N389Q、N321Q + N389QおよびN216Q + N321Q + N389Q（それぞれ配列番号：10〜16）が挙げられる。
【００５６】
したがって、野生型EphA4-Fcから1、2または3個のN-グリコシル化部位のような少なくとも1個のN-グリコシル化部位を除去すると、EphA4によって媒介されるシグナル伝達に拮抗するその能力を低下させることなく、その血清半減期を増加させることができ、これにより、EphA4媒介性シグナル伝達によって悪化するであろう中枢神経系（CNS）または全身性脈管構造の疾患または状態の治療において、分子を驚くほど有効にすることができる。同様のコメントは、少なくともN-グリコシル化部位を排除するアミノ酸変異を有する他のEph分子にも当てはまる。例えば、EphA2は、アミノ酸位置407および435に予測されるN-グリコシル化部位を含み；EphA3は、アミノ酸位置232、337、391、404および493に予測されるN-グリコシル化部位を含み；EphB4は、アミノ酸203、335および426に部位を含む。
【００５７】
CNSの疾患または状態には、脳の損傷または疾患（例えば、脳卒中、神経変性疾患（例えば運動ニューロン疾患[MND]）、外傷性脳損傷または血栓溶解後の脳損傷）または神経膠症（グリオーシス）に至る脊髄および/またはグリア瘢痕および/またはニューロンの炎症が挙げられる。Eph媒介シグナル伝達に拮抗することによって、神経膠症、グリア瘢痕および/または炎症の減少があり、これが軸索再生を導き、または促進することが提案される。「グリオーシス」という用語は、軸索増殖の阻害を含むグリオーシスの応答を生じる任意の状態を含む。
【００５８】
全身性脈管構造の疾患または状態には、心臓血管状態および虚血−再灌流傷害が含まれる。後者は心臓で起こることがあり、または腸虚血−再灌流傷害または腎臓再灌流もしくは肝再灌流のような臓器のような他の場所で起こる可能性がある。糖尿病などの改変Eph-X（例えば、EphA4-X）によっても改善され得る他の下流の状態が存在し得る。他の状態には、心筋梗塞、非CNS関連炎症、再灌流障害、腎臓または肝臓再灌流などの臓器損傷および癌が含まれる。
【００５９】
したがって、本明細書は、哺乳動物対象においてEph媒介性シグナル伝達によって悪化される疾患または状態を治療するための方法を教示する。その方法は、有効量のEph-Xの投与を含み、ここで、そのEphは少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変され、そのEphはEphA1〜A8およびEphB1〜B6から選択され、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である。本明細書において、N-グリコシル化部位の排除により、拮抗作用の有意な喪失が生じることなく、より長い血清半減期をもたらすことができることが提案され、可能にされる。EphはXに結合または融合される。
【００６０】
一実施形態では、Eph-Xは、EphA4-FcなどのEphA4-Xである。したがって、本発明は、少なくともN-グリコシル化部位を排除するように改変された有効量のEphA4-Fcの投与を含む、哺乳動物対象におけるEphA4媒介性シグナル伝達によって悪化する疾患または状態のための治療を企図する。疾患および状態は、CNSまたは全身性脈管構造の疾患または状態、ならびに結果として生じる疾患または状態、ならびに心筋梗塞、非CNS関連炎症、再灌流障害、臓器損傷および癌を含み、包含する。一実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。
【００６１】
一実施形態では、本明細書は、哺乳動物対象においてEphA4媒介性シグナル伝達によって悪化する疾患または状態を治療するための方法を教示し、この方法は、EphA4-Xの有効量の投与を含み、ここで、そのEphは少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変され、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である。本明細書において、N-グリコシル化部位の排除は、より長い血清半減期をもたらし、拮抗作用の有意な喪失をもたらさないことが提案され、可能にされる。「より長い血清半減期」への言及には、安定性の増大または増強の促進が含まれる。
【００６２】
一実施形態では、Eph媒介シグナル伝達によって悪化する疾患または状態は、CNSの疾患または状態である。
【００６３】
したがって、有効量のEph-X分子を対象に投与することを含む、哺乳動物対象におけるCNSの疾患または状態を治療する方法が可能にされる。ここで、そのEphは少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変され、EphはEphA1〜A8およびEhB1〜B6から選択され、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメント（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質フラグメント（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である。一例では、Eph-Xは、EphA4-FcなどのEphA4-Xである。
【００６４】
別の実施形態において、疾患または状態は、全身性脈管構造の疾患または状態である。
【００６５】
したがって、本明細書では、哺乳動物対象における全身脈管構造の疾患または状態を治療する方法であって、有効量のEph-X分子を対象に投与することを含み、ここで、そのEphは少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変され、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である、方法が記載される。
【００６６】
一実施形態では、改変・修飾されたEphA4は、治療される対象に応じて選択される。例えば、ヒト対象を治療するために、ヒト由来のEphA4-Fc突然変異体が使用されよう。
【００６７】
本明細書では、ヒト対象におけるEph媒介性シグナル伝達によって悪化されるCNSの疾患または状態の方法であって、有効量のヒトEph-X分子を対象に投与することを含む方法が可能にされる。ここで、そのEphは少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変され、EphはEphA1〜A8およびEhB1〜B6から選択され、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である。
【００６８】
本明細書でさらに教示されるのは、少なくとも1つのN-グリコシル化を排除するように改変されたヒトEphA4-Fc分子の有効量を対象に投与することを含む、ヒト対象における全身性脈管構造の疾患または状態を治療する方法である。
【００６９】
適切な改変ヒトEphA4-Fc分子には、1つ、2つまたは3つのN-グリコシル化部位が除去されたものが含まれる。これは、配列番号：1の残基番号216、321および/または389（または19アミノ酸リーダー配列（配列番号：33）が含まれるなら、235、340および/または408）のいずれか1つまたは複数における、アスパラギン残基を除く任意の他のアミノ酸でのアスパラギン（Asp; N）の置換、ならびにEphAまたはEphB分子中の機能的に等価な位置での置換によって達成される。
【００７０】
したがって、本明細書は、ヒト対象におけるCNSまたは全身性脈管構造の疾患または状態を治療する方法を教示するものであり、この方法は、配列番号：1に記載のアミノ酸配列により定義されるが、N216Z、N321Z、N389Z、N216Z + N321Z、N216Z + N389Z、N321Z + N389ZおよびN216Z + N321Z + N389Z（式中、Zはアスパラギン以外の任意のアミノ酸である）からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する、有効量のヒトEphA4-Fc分子を対象に投与することを含む。アミノ酸位置番号は、19アミノ酸シグナル配列（配列番号：33）の非存在下で計算されたものである。
【００７１】
一実施形態では、Zはグルタミン（Gln; Q）である。
【００７２】
したがって、本明細書は、ヒト対象におけるCNSまたは全身性脈管構造の疾患または状態を治療する方法を可能にし、その方法は、配列番号：2〜配列番号：8からなる群から選択されるアミノ酸配列によって規定される有効量のEphA4-Fcを対象に投与することを含む。
【００７３】
特定の実施形態では、EphA4-Fcは、N216Q + N321Q + N389Qの三重アミノ酸置換を含む。19アミノ酸シグナル配列（配列番号：33）の非存在下で計算されたアミノ酸位置番号である。
【００７４】
したがって、本明細書は、ヒト対象においてCNSまたは全身性脈管構造の疾患または状態を治療する方法を可能にし、その方法は、対象に、配列番号：8のアミノ酸配列により規定されるEphA4-Fcの有効量を投与することを含む。
【００７５】
上記のように、EphA4-Fc分子の選択は、治療される哺乳動物に依存する。例えば、本発明は、本明細書に教示されるように改変されたネズミEphA4-Fcを用いてマウス動物モデルを試験することにまで及ぶ。
【００７６】
上記で示したように、改変EphA4-Fcは少なくとも1つのN-グリコシル化部位を失っているが、対応する野生型EphA4-Fcと比較してより長い血清半減期を有しつつ、EphA4媒介性シグナル伝達に拮抗するその能力を維持する。これは、選択されたEphA4-Fcが別のアミノ酸の置換、欠失および/または付加、翻訳後修飾またはグリコシル化パターンのさらなる変化を含まないとは限らない。
【００７７】
したがって、配列番号：2〜8および配列番号：10〜16の参照は、最適なアライメントの後に配列番号：2〜8または配列番号：10〜16のいずれか1つに対して少なくとも約80％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。ただし、アミノ酸残基番号216、321および/または389において、アスパラギン以外の任意の他のアミノ酸へのアスパラギンの置換が存在し、これがN-グリコシル化部位を除去する。19アミノ酸シグナル配列（配列番号：33）の非存在下で計算されたアミノ酸位置番号である。
【００７８】
「少なくとも80％の類似性」とは、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%を意味する。
【００７９】
本明細書中で使用される用語「類似性」は、アミノ酸レベルでの比較された配列間の正確な同一性を含む。アミノ酸レベルで非同一性が存在する場合、「類似性」には、構造、機能、生化学および/または立体配座レベルで互いに関連するアミノ酸が含まれる。一実施形態において、アミノ酸配列の比較は、類似性ではなく同一性のレベルで行われる。
【００８０】
2つまたはそれより多くのポリペプチドの間の配列の関係を記述するために使用される用語は、「参照（引用）配列」、「比較ウインドウ」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性の割合（パーセンテージ）」、「配列同一性の割合（パーセンテージ）」、「実質的な類似性」、および「実質的な同一性」を含む。「参照配列」には、10〜100のアミノ酸残基の長さが含まれるが、これに限定されない。2つのポリペプチドはそれぞれ、（1）2つのポリペプチド間で類似している配列（すなわち完全なアミノ酸配列の一部のみ）、および（2）2つのポリペプチド間で異なる配列、を含み得るので、2つ（またはそれより多い数）のポリペプチド間の配列比較は、典型的には、2つのポリペプチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって実行される。「比較ウインドウ」は、参照配列と比較される典型的には12個の連続した残基の概念的セグメントを指す。比較ウインドウは、2つの配列の最適なアラインメントのための（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約20％またはそれ未満の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。比較ウインドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、コンピュータ化されたアルゴリズムの実施（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USAにおけるBLASTP 2.2.32+, GAP, BESTFIT, FASTA, およびTFASTA）により、または選択した様々な方法のいずれかによって生成された検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウに対して最も高い相同性パーセンテージをもたらすもの）により、行うことができる。例えば、Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25(17):3389-3212により開示さるような、BLASTファミリーのプログラムも参照することができる。配列分析の詳細な考察は、Ausubel et al. (1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. のUnit 19.3に見出すことができる。他のアラインメントソフトウェアには、BWA（Li and Durbin（2010）Bioinformatics 26: 589-595）およびBowtie（Langmead et al.（2009）Genome Biol 10.R25およびBLAT（Kent（2002）Genome Res 12:656-664）が含まれる。
【００８１】
本明細書で使用される用語「配列類似性」および「配列同一性」は、配列が比較のウインドウにわたってアミノ酸ごとに同一または機能的にもしくは構造的に類似する程度をいう。したがって、たとえば、比較のウインドウにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較し、両配列において同一のアミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet）が存在する位置の数を決定して適合した位置の数を算出し、その適合した位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、そしてその結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを算出することにより、「配列同一性の割合（パーセンテージ）」が計算される。本発明の目的のために、「配列同一性」は、ソフトウェアに添付された参照マニュアルに使用されるような標準的なデフォルトを使用する任意の適切な方法またはコンピュータアルゴリズムによって計算される「適合（一致）割合（パーセンテージ）」を意味すると理解されよう。同様のコメントが配列類似性に関して適用される。
【００８２】
本明細書で企図される他の突然変異体には、側鎖への修飾、タンパク質合成中の非天然アミノ酸の取り込み、およびEph-Xに構造的制約を課す架橋剤の使用を伴う類似体が含まれる。この用語はまた、Eph-Xの他の修飾、例えば、アセチル化およびリン酸化などを排除しない。その定義には、たとえば、アミノ酸の1つまたは複数の類似体（アナログ）を含むポリペプチドが含まれる。
【００８３】
本発明によって企図される側鎖修飾の例には、アルデヒドとの反応および続いてのNaBH4による還元による還元的アルキル化などのアミノ基の修飾；メチルアセトイミデートによるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアネートでのアミノ基のカルバモイル化；アミノ基の2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール-5-リン酸によるリジンのピリドキシル化および続くNaBH4による還元が含まれる。
【００８４】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬での複素環式縮合生成物の形成によって修飾することができる。
【００８５】
カルボキシル基は、O-アシルイソウレア形成によるカルボジイミド活性化、続いての誘導体化、例えば対応するアミドへの修飾によって修飾することができる。
【００８６】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；4-クロロメルクリベンゾエート、4-クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノールおよび他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成；アルカリ性pHでのシアネートでのカルバモイル化、などの方法によって修飾することができる。
【００８７】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化、または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはスルフェニルハライドによるインドール環のアルキル化によって修飾することができる。他方、チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いたニトロ化によって変化させて3-ニトロチロシン誘導体を形成することができる。
【００８８】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるN-カルボエトキシル化によって達成することができる。
【００８９】
ペプチド合成中に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例には、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニンおよび/またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
本明細書でさらに企図されるのは、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除する改変アミノ酸配列を含む改変EphA4-Fcである。例えば、配列番号：1に定義されるようなヒトEphA4-Fcとの関連で、残基216、321および/または389のアスパラギン（Asn; N）は、アスパラギン以外の任意のアミノ酸により置換される。
【００９１】
したがって、本明細書では、配列番号：1に記載の改変前のアミノ酸配列を含む改変ヒトEphA4-Fcが可能であり、その改変は、N216Z、N321Z、N389Z、N216Z + N321Z、N216Z + N389Z、N321Z + N389ZおよびN216Z + N321Z + N389Z（式中、Zはアスパラギン（Asn; N）以外の任意のアミノ酸である）からなる群から選択される。
【００９２】
一実施形態では、Zはグルタミン（Gln; Q）である。
【００９３】
したがって、本明細書では、配列番号：2〜8からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する改変ヒトEphA4-Fcが教示される。1つの特定の実施形態において、改変ヒトEphA4-Fcは、配列番号：8により規定され、三重置換：N216Q + N321Q + N389Qを含む。
【００９４】
少なくとも1つのN-グリコシル化部位を除去するように改変されたネズミEphA4-Fcのような非ヒト改変EphA4-Fc分子もまた本明細書において企図される。例としては、N216Z、N321Z、N389Z、N216Z + N321Z、N216Z + N321Z、N321Z + N389ZおよびN216Z + N321Z + N389Z（式中、Zは、アスパラギン（Asn; N）以外の任意のアミノ酸である）から選択される置換突然変異を有する配列番号：9に記載のアミノ酸配列によって規定されるネズミEphA4-Fcが挙げられる。
【００９５】
Zがグルタミン（Gln; Q）である場合、その例には、配列番号：10〜16からなる群から選択される修飾ネズミEphA4-Fcが含まれる。上記のアミノ酸位置は、19アミノ酸リーダー配列（配列番号：33）の欠如下で計算される。対応する位置は、アミノ酸位置に19を加えることによって決定される。したがって、261、321および389の対応する位置は、それぞれ235、340および408である。
【００９６】
一実施形態では、改変EphA4-Fc分子は単離された形態である。
【００９７】
上記のように、本発明は、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除する改変アミノ酸配列を含む任意のEph分子に及ぶ。Eph分子の例には、EphA1〜A8およびEphB1〜B6が含まれる。そのような改変Eph分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメント（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質フラグメント（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）に結合または融合させることができる。
【００９８】
本発明の改変Eph-X（例えば、EphA4-Fc）分子は、薬理学的組成物を形成するために、1つまたは複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤および/または賦形剤と組み合わせることもできる。薬学的に許容可能な担体は、例えば製剤を安定化させるように作用する生理学的に許容可能な化合物を含有することができる。生理学的に許容可能な化合物は、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのクリアランスまたは加水分解を低減する組成物、または賦形剤または他の安定剤および/または緩衝剤を含む。界面活性剤はまた、リポソーム担体を含む薬学的組成物の吸収を安定化させるか、またはそれを増加もしくは減少させるために使用され得る。ペプチドおよびポリペプチドのための薬学的に許容可能な担体および製剤は、当業者に知られており、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990（「Remington's」）を参照のこと。
【００９９】
他の生理学的に許容可能な化合物には、微生物の増殖または作用を防止するために特に有用である湿潤剤、乳化剤、分散剤または保存剤が含まれる。種々の防腐剤がよく知られており、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。当業者は、生理学的に許容可能な化合物を含む薬学的に許容可能な担体の選択が、例えば、本発明の調節剤の投与の経路およびその特定の物理化学的特性に依存することを理解するであろう。
【０１００】
薬学的組成物の形態の剤の投与は、当業者に知られている任意の簡便な手段によって、および疾患または病状または損傷の部位に応じて行うことができる。投与経路には、これらに限らないが、呼吸器系、気管内、鼻咽頭系、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、髄腔内、大脳内、鼻腔内、注入、経口、直腸、パッチおよびインプラントが含まれる。逆行性輸送または脳への直接的注射も用いることができる。
【０１０１】
経口投与のために、化合物は、カプセル、丸剤、錠剤、ロゼンジ、粉末、懸濁剤またはエマルジョンなどの固体または液体調製物に製剤化することができる。経口投与形態で組成物を調製する際には、通常の薬学的媒体のいずれか、例えば、経口液体製剤（例えば、懸濁液、エリキシルおよび溶液など）の場合には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤、懸濁化剤など；経口固体製剤（例えば、粉末、カプセルおよび錠剤など）の場合には、スターチ、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、バインダー、崩壊剤などの担体を用いることができる。それらの投与が容易であることから、錠剤およびカプセルは、最も有利な経口投与単位形態を表し、その場合、固体薬理学的担体が明らかに使用される。所望であれば、錠剤は、標準的な技術によって糖衣または腸溶性コーティングすることができる。活性剤は、胃腸管を通過するのに安定するようにカプセル化することができ、同時に血液脳関門を通過することを可能にする。たとえば、国際公開第WO96/11698号を参照のこと。
【０１０２】
本発明の剤は、経口投与される場合、消化から保護され得る。これは、核酸、ペプチドまたはポリペプチドを組成物と複合体化させて、それを酸性および酵素的加水分解に耐性にすることにより、または核酸、ペプチドまたはポリペプチドをリポソームなどの適切な耐性担体にパッケージングすることによって達成することができる。消化から化合物を保護する手段は、当該技術分野において周知であり、例えば、Fix (1996) Pharm Res 13: 1760-1764; Samanen et al. (1996) J Pharm Pharmacol. 48: 119-135; 治療剤の経口送達のための脂質組成物を記載する米国特許第5,391,377号を参照のこと。
【０１０３】
注射可能な使用に適した薬学的形態は、滅菌した注射可能な溶液または分散液の即時的調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を含み、または局所的適用に適したクリームまたは他の形態であり得る。一般に、局所投与は、Eph-X（例えば、EphA4-Fc）分子が全身的に体内に入ることを可能にする処方物中にあることが目的とされる。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用により行うことができる。
【０１０４】
必要に応じて、上に列挙した種々の他の成分を適切な溶媒中に必要量で剤に組み込み、続いて濾過滅菌することにより、滅菌注射溶液が調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上記のものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、活性成分と予め滅菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１０５】
非経口投与のために、剤を薬学的担体に溶解し、溶液または懸濁液として投与することができる。適切な担体の例は、水、生理食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、または動物、植物または合成起源の油である。担体は、他の成分、例えば防腐剤、懸濁化剤、可溶化剤、緩衝剤などを含んでいてもよい。薬剤をくも膜下腔内投与する場合には、脳脊髄液に溶解させることもできる。
【０１０６】
経粘膜または経皮投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤を、剤を送達するために使用することができる。このような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られている。たとえば、経粘膜投与のためには、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体がある。さらに、浸透を促進するために界面活性剤を使用することができる。経粘膜投与は、鼻スプレーを介して、または坐剤を用いて行うことができる。たとえば、Sayani and Chien (1996) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 13:85-184を参照のこと。局所、経皮投与のために、剤は、軟膏、クリーム、膏薬、粉末およびゲルに製剤化される。経皮送達システムは、パッチも含み得る。
【０１０７】
吸入のために、本発明の剤は、乾燥粉末エアロゾル、液体送達システム、エアジェットネブライザー、推進剤システムなどを含む当技術分野で公知の任意のシステムを用いて送達することができる。たとえば、Patton (1998) Nat Biotech 16:141-143;ポリペプチド巨大分子のための製品および吸入送達システムを参照のこと。例えば、薬学的製剤は、エアロゾルまたはミストの形態で投与することができる。エアロゾル投与の場合、製剤は、界面活性剤および噴射剤と共に細かく分割された形態で供給することができる。別の態様では、製剤を呼吸器組織に送達するための装置は、製剤が気化する吸入器である。他の液体送達システムは、例えば、エアジェットネブライザーを含む。
【０１０８】
本発明の剤は、製剤を内部的に送達することができる持続的送達または持続的放出の機構で投与することもできる。例えば、ペプチドの持続的送達が可能な生分解性ミクロスフェアまたはカプセルまたは他の生物分解性ポリマー構成を、本発明の剤に含めることができる（例えば、Putney and Burke (1998) Nat Biotech 16:153-157）。
【０１０９】
本発明の医薬品の調製において、薬物動態および生体内分布を変化させるために、様々な製剤改変を使用および操作することができる。薬物動態および体内分布を変えるための多くの方法が当業者に知られている。そのような方法の例には、タンパク質、脂質（例えば、リポソーム）、炭水化物、または合成ポリマーなどの物質から構成される小胞における本発明の組成物の保護が含まれる。薬物動態の一般的な議論については、例えば、Remington'sを参照のこと。
【０１１０】
本発明の薬学的組成物は、投与の方法に依存して種々の単位投与形態で投与することができる。典型的な薬学的組成物の用量は、当業者に周知である。そのような投薬量は、典型的には、事実上の助言者により、特定の治療状況、患者の耐容性などに応じて調整される。これを達成するのに適した剤の量は、「有効量」と定義される。この使用のための投薬スケジュールおよび有効量、すなわち「投薬計画」は、疾患または状態の段階、疾患または状態の重篤度、患者の健康の一般的な状態、患者の身体的状態、年齢、薬学的製剤および活性剤の濃度などを含む、種々の因子に依存するであろう。患者のための投薬計画を計算する際に、投与の様式も考慮される。投与計画はまた、薬物動態、すなわち薬学的組成物の吸収の速度、生物学的利用能、代謝、クリアランスなどを考慮しなければならない。例えば、Remington's; Egleton and Davis (1997) Peptides 18:1431-1439; Langer (1990) Science 249:1527-1533を参照のこと。
【０１１１】
一実施形態において、EphA4-Fcなどのグリコシル化部位が改変されたEph-Xは、3〜20日間、約5〜100μg/mLの検出可能な血清レベルを供する量で投与される。「5〜100」は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100μg/mLを意味する。「3〜20」という表現は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20日を意味する。一実施形態では、1つまたは複数の改変N-グリコシル化部位を有するEphA4-Fcなどのグリコシル化部位修飾Eph-Xは、3〜10日間にわたって5〜20μg/mLの血清レベルを与える量で提供される。これらの量には、約6〜7日間、約10μg/mLの血清レベルが含まれる。したがって、投与には週単位の量が含まれる。
【０１１２】
これらの方法に従って、本発明に従って定義される剤および/または薬学的組成物は、1つまたは複数の他の剤と組み合わせて同時投与することができる。本明細書において「同時（共）投与する」とは、同一もしくは異なる経路を介する同一の製剤中もしくは2つの異なる製剤中での同時の投与、または同一もしくは異なる経路による逐次的な投与を意味する。本明細書での「逐次（連続的）」投与とは、2種類の剤および/または薬学的組成物の投与の間の秒、分、時間または日の時間差を意味する。剤および/または薬学的組成物の同時投与は、任意の順序で行うことができる。これに関して特に好ましい剤は、神経発生および/または軸索成長を促進する剤および/または炎症を阻害する剤、たとえば、これらに限らないが、サイトカインおよび成長因子、ならびに炎症性サイトカインの阻害剤、たとえば、INFγアンタゴニストである。
【０１１３】
あるいは、抗体または細胞特異的リガンドまたは特異的核酸分子のような標的化システムの使用によって、特定のタイプの細胞に活性剤をより特異的に送達するために標的化療法を使用してもよい。標的化は、種々の理由、例えば剤が許容できないほど毒性である場合、またはそうでなければ高すぎる用量を必要とする場合、またはそうでなければ標的細胞に入ることができない場合に望ましいことがある。
【０１１４】
直接的に剤を投与する代わりに、それらは標的細胞において産生させることができよう。たとえば、上述のようなウイルスベクターにおいて、または細胞に基づく送達系、たとえば、米国特許第5,550,050号、ならびに国際特許公開番号：WO92/19195、WO94/25503、WO95/01203、WO95/05452、WO96/02286、WO96/02646、WO96/38971、WO96/40959、およびWO97/12635に記載されるようなものにおいて可能である。ベクターは標的細胞を標的とすることができよう。細胞に基づく送達システムは、所望の標的部位において患者の身体に移植されるように設計され、標的の剤のコーディング配列を含む。あるいは、剤は、治療すべき細胞において産生されるか、またはそれを標的とする活性化剤によって活性形態に変換するための前駆体形態で投与することができよう。例えば、欧州特許出願第0 425 731A号および国際特許公開番号WO90/07936を参照のこと。
【０１１５】
本明細書でさらに企図されるのは、ヒト対象を含む哺乳動物対象においてEph媒介性シグナル伝達により悪化する疾患または状態を治療するための医薬の製造における、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変されたEph-Xの使用である。ここで、EphはEphA1〜A8およびEhB1〜B6から選択され、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメント（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質フラグメント（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である。
【０１１６】
本明細書では、ヒト対象を含む哺乳動物対象においてEph媒介性シグナル伝達によって悪化される疾患または状態の処置における使用のための少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変されたEph-Xが教示される。ここで、Ephは、EphA1〜A8およびEhB1〜B6から選択され、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である。
【０１１７】
さらに本明細書では、ヒト対象を含む哺乳動物対象におけるEphA4媒介性シグナル伝達により悪化する疾患または状態を治療するための医薬の製造における、少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変されたEphA4-Fcの使用が考慮される。
【０１１８】
本明細書では、ヒト対象を含む哺乳動物対象におけるEphA4媒介性シグナル伝達によって悪化する疾患または状態の治療に使用するための少なくとも1つのN-グリコシル化部位を排除するように改変されたEphA4-Fcが教示される。ここで、EphはEphA1〜A8およびEhB1〜B6から選択され、Xは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）である。
【０１１９】
さらに別の態様において、本発明は、組成物、たとえば本発明の剤を含むキットを提供する。キットは、本明細書に記載されるように、本発明の方法および用途を教示する説明材料を含み得る。
【実施例】
【０１２０】
本発明は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。
方法
部位特異的突然変異誘発
【０１２１】
予測されるグリコシル化部位216、321および389においてアスパラギン（Asn; N）をコードするヌクレオチドを、Quik Change Site Directed Mutagenesis（Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA）を用いて順次グルタミンをコードするように変異させた。要約すると、ヒトおよびマウスEphA4-Fcの所望の突然変異誘発部位に隣接する相補的オリゴヌクレオチド（表2および3）を、それぞれコドン最適化wt-hEphA4-hFcおよびwt-mEphA4-mFc鋳型DNAにアニーリングし、PfuTurbo DNAポリメラーゼを用いて伸長させた。サイクリングパラメータは以下の通りであった：1サイクル95℃30秒、続いて18サイクル95℃30秒55℃1分68℃8分。野生型メチル化鋳型DNAをDpnI制限酵素で消化した後、NEB5-alphaコンピテントE.coli（New England BioLabs）に形質転換した。単一のコロニーの拡大に続いて、QIAGENプラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドDNAを精製した後、DNA配列決定によるグリコシル化部位の突然変異誘発を確認した。
プラスミドDNAの一過性トランスフェクション
【０１２２】
HEK293T細胞（ATCC、CRL-11268）を、10％v/vウシ胎児血清（GIBCO Life Technologies）を補充したRPMI 1640培地（GIBCO Life Technologies）中で、5％v/v CO2を含む加湿雰囲気下で培養した。プラスミドDNAを、製造元のガイドラインに従ってLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いてHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後6日目に培養上清を採取し、MabSelectアガロースマトリックス（GE Healthcare Life Sciences）を用いてプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
SDS-PAGE分析
【０１２３】
プロテインA精製サンプルを還元剤βメルカプトエタノールの存在下でSDS-PAGE分析に供した。要約すると、サンプルを10％v/v SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、続いてクーマシーブリリアントブルーR-250（Sigma）で染色した。
EphA4-Fc ELISAアッセイ
【０１２４】
EIA 96ウェルプレート（Costar, Corning Inc.）を、50mM炭酸緩衝液pH9.5中の1F9mAb（3μg/mL）で、一晩、4℃でコーティングした後、室温で1時間、PBS中の5％w/v BSA、0.05％v/v Tween-20（PBST）でブロッキングした。PBSTで3回洗浄した後、希釈したEphA4-Fc分析物を加え、室温で1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、PBS中のビオチン化1A7mAb（1μg/ml）を加え、室温で1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、PBS中に1/500に希釈したUltra Streptavidin-HRP（Thermo Fischer Scientific）を加え、室温で1時間インキュベートした。PBSTによる3回の洗浄後、最終的な検出は、492nmで測定した最終生成物でのOPD（Sigma Fast [商標]）の添加による。
EphA4-Fcの酵素消化
【０１２５】
精製されたEphA4-Fcからのペプチドおよび糖ペプチドの生産は、1％w/v SDSを含む100mMのNH4HCO3緩衝液中の10mMジチオトレイトールでタンパク質115μgを4℃で18時間、還元することによって行った。これに続いて、室温でさらに2時間還元した後、暗所で2時間、25mMヨードアセトアミドを用いてシステイン残基をアルキル化した。還元およびアルキル化されたタンパク質をメタノール沈殿させ、以前に記載（Dave et al.(2015) Curr. Protoc. Protein Sci. 63:16.13.11-16.13.21）されるとおり消化した。要約すると、タンパク質試料を、1mLのメタノール（-20℃）を用いて1μgのシークエンシンググレードのトリプシン（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）と共沈殿させ、-20℃で一晩インキュベートした。その後、沈殿を4℃で15分間、遠心分離し、その上清を吸引した。そのペレットを-20℃のメタノール（90％v/v）1mLでさらに2回洗浄し、遠心分離した後、0.1Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩30μlを加えた。穏やかなボルテックス混合によりタンパク質を再懸濁し、短時間の遠心分離の後に、タンパク質を37℃で2時間インキュベートした。最終的に、別の2μgのトリプシン（タンパク質：酵素、38：1、w/wの最終比）を加え、その消化物を22℃でさらに6時間インキュベートした。トリプシンで消化されたタンパク質のアリコートを、ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）V8から単離されたGlu-C（Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany）で、37℃で12時間（タンパク質：酵素、40：1、w/w）、さらに消化した。Glu-C消化後、得られたペプチドおよび糖ペプチドを、MS分析前に、製造業元のガイドラインを用いて、C18 ZipTip（0.6μl樹脂床を伴う10μlピペットチップ; Millipore, MA, USA）で脱塩した。
LC-MS
【０１２６】
nanoACQUITY UPLC（Waters Corporation, MA）に連結されたOrbitrap Fusion（商標）Tribrid（商標）質量分析計（Thermo Fischer Scientific, San Jose, CA）でMS分析を行った。ここでは、Waters C18 2G Symmetry（100Å, 5μm, 180μm x 20mm）トラップカラムでトラッピングを行い、そのトラップカラムに並べたWaters C18 BEH（130Å, 1.7μm粒径, 75μm x 200mm）カラムで勾配溶出した。これは、「LC-MS」（Dave et al.（2015）前掲）と呼ばれる。消化された試料をMS前に酸性化トリフルオロ酢酸で酸性化し、50ngのトリプシン消化物および100ngのトリプシン/Glu-C消化物をそれぞれの分析のために注入した。
【０１２７】
サンプルをトラップにロードし、98％溶媒A（0.1％v/v ギ酸水溶液）および0.1％v/vギ酸を含む2％溶媒B（100％v/v CH3CN）を用いて、15μL/分で5分間にわたって洗浄した。続いて、60分間で溶媒Bを2％から40％に、15分間で70％のB、5分間で95％のB、そして5分間で95％のBの直線勾配のシーケンスで傾斜させながら、ペプチドを流速0.3μL/分で分析カラムに溶出させた。分析カラムからの溶出液を、PicoTip（登録商標）エミッター（coating P200P, tip 10±1μm、New Objective, MA）を取り付けたNanospray Flex [商標]（NG）イオン源（Thermo Scientific）を介して質量分析計に連続的に導入した。
【０１２８】
nUHPLC分画トリプシンペプチドのMSサーベイスキャンを、200,000の自動利得制御（AGC）ターゲットおよび50msの最大噴射時間で、200m/zで120Kの分解能で300〜1800（m/z）の範囲にわたってオービトラップ（Orbitrap）で行った。2〜7の電荷状態および5000より大きい強度を有する最も強い前駆体を、2.5の隔離窓を用いて選択し、30％の正規化された衝突エネルギーを用いて高エネルギー（ビーム型）衝突解離（HCD）によって断片化した。フラグメントイオンの質量分析を、50,000のAGCターゲットおよび60msの最大注入時間で分解能を60Kに設定したオービトラップで行った。選択後、前駆体は30秒間、排除された。
非グリコシル化ペプチドのデータ解析
【０１２９】
トリプシン消化したEphA4-Fcの分析から生成したMS RAWファイルを、完全なヒトプロテオームデータベース（Uniprot webisteからダウンロードした70,076の配列を有するID:UP000005640）およびEphA4-Fc配列に対するPercolator機能を有する、Proteome Discoverer（v.1.4.1.14 Thermo Fisher Scientific Inc. Bremen, Germany）および検索エンジンMascot（v.2.5.1, Matrix Science Ltd., London, UK）を用いて調査した。以下のパラメータを用いた：トリプシンによる消化；最大2つの欠落した切断；10ppmの前駆体質量耐性；0.02Da断片耐性；カルバミドメチルシステインの固定修飾および一酸化メチオニンの動的修飾ならびにアスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化。信頼できるペプチド−スペクトルマッチは、誤発見率閾値0.05を用いて割り当て、2つの異なるペプチドを、確実なタンパク質同定のために必要とした。
グリコシル化ペプチドのデータ分析
【０１３０】
EphA4-Fcのトリプシンおよびトリプシン/Glu-C消化からのMS RAWファイルを、Proteome Discovererサーチからの同じ質量公差および固定された修正を用いて、Byonicソフトウェア（Bern et al.（2002）Current Protocols in Bioinformatic John Wiley & Sons. Inc., NJ, USA）で分析した。酵素のルールは、ArgもしくはLys（トリプシン消化サンプル）またはArg、Lys、GluもしくはAsp（結合トリプシン/Glu-C消化）へのC末端切断として設定し、欠損した切断は、トリプシン消化サンプルについては2に設定し、トリプシン/Glu-Cサンプルについては3に設定した。N結合コンセンサス部位（Asn-X-S/T）に結合された1つのグリカンおよび1つのモノ−酸化メチオニンがペプチドごとに許容された。ペプチド出力オプションを「Show all N-glycopeptides」に変更し、EphA4-Fcの配列を含むタンパク質FASTAファイル、ならびに除去されたN-グリコリルノイラミン酸（NeuGc）を含む全てのグリカン組成物を有するByonic N-結合グリカンデータベース（309_Mammalian no sodium）に対してスペクトルを検索した。Byonicの結果を手動で検査した後、糖ペプチドについてカットオフスコア100を選択した。
【０１３１】
EphA4-Fcのトリプシンおよびトリプシン/Glu-C消化からのMS RAWファイルを、インハウスソフトウエアであるOxoExtractでの分析のためにゼロのシグナル対ノイズ（S/N）閾値を用いて、Proteome DiscovererにおいてmzMLにさらに変換した。OxoExtractは、±10ppmの質量ウインドウ内に存在するオキソニウムイオン[HexNAc+H]+でMS/MSスキャンごとに選択した。この診断オキソニウムイオンは、糖ペプチドのグリカン部分の断片化に由来し、そのイオンの同定は、糖ペプチドのMS/MSスペクトルの選択を容易にする。HexNAcオキソニウムイオンおよび他の単糖およびオリゴ糖イオン（Hex、FucおよびNeuAcを表す）も、付着したグリカンの組成を確認するために用いることができる。OxoExtractにより選択されたすべてのHexNAcオキソニウムイオン含有MS/MSスペクトルを、他の予め定義された単糖およびオリゴ糖オキソニウムイオン、ならびにEphA4-Fcのインシリコ消化に由来する理論上のN結合型グリコペプチドフラグメントイオンについてさらに検索した。N結合型糖ペプチドフラグメントイオンは、N結合型コンセンサス配列N-X-S/Tを含む理論上のEphA4-Fcペプチドを用いて計算し、ペプチド+HexNAc1、ペプチド+HexNAc2およびペプチド+HexNAc1dHex1ならびにペプチドb-およびy-イオンを含んでいた。ペプチド+HexNAc1イオンは、通常、HCDを用いてN-結合型糖ペプチドを断片化するときに生成され、ペプチド成分の質量を決定するために使用することができる。理論的ペプチド+HexNAc1イオンのm/zに適合するイオンも含むすべてのHexNAcオキソニウムイオン含有MS/MSスペクトルを、結合したN-結合型グリカンの組成を決定するためにGlycoMod（Cooper et al.（2001）Proteomics 1:340-349）において自動的に検索した。GlycoModを用いた検索では、理論ペプチド+HexNAc1イオンのペプチド部分からペプチド質量を計算し、10ppmの質量耐性を観察された前駆体質量に適用した。このデータを用いて、Byonicによって割り当てられた糖ペプチドを確認し、関連するオキソニウムイオンおよびペプチド+HexNAc1イオンの存在を確認し、コアフコシル化を伴うグリカン組成物を同定し、そしてByonicによって割り当てられていない糖ペプチドを検索した。
【０１３２】
任意の糖ペプチド割り当てを受け入れるための最小限の要件は、ペプチド+HexNAc1イオンまたは4つより多いペプチドb-およびy-イオンの存在であった。ペプチド成分の配列がメチオニン残基を含む場合、潜在的な酸化またはその欠如を証明するために少なくとも2つのペプチドbまたはy-イオンが必要とされた。割り当てられたグリカン組成を検証するために、関連するグリカンオキソニウムイオンが存在しなければならず、予想される保持時間でグリコペプチドが溶出していることを確認するために溶出プロフィールをチェックした。
サイズ排除クロマトグラフ
【０１３３】
変異型および野生型EphA4-Fcを、TSK-GEL SWXLガードカラム（6.0mm ID x 400mm、7μm粒子）上に注入し、続いてAgilent 1200クロマトグラフィーシステムを用いてTSK-GEL G3000SWXL HPLCカラム（7.8mm ID x 300mm、5μm粒子）に溶出した。流速は0.8mL/分であり、移動相は100mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）および200mMのNaClを含有していた。溶出したタンパク質をUV吸収（280nm波長）によってモニターした。以下の標準を用いた：チログロビン（670kDa）、ウシγ-グロビン（158kDa）、オボアルブミン（44kDa）、ウマミオグロビン（17kDa）およびビタミンB12（1.35kDa）[BioRad]。
分析用超遠心分離
【０１３４】
精製したタンパク質を、10mMリン酸カリウム（pH7.6）を含む緩衝液に対して一晩透析した。サンプルを、AnTi-60ローターを備えたXL-I分析用超遠心分離機（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を用いて分析した。タンパク質試料を、参照区画に緩衝液を入れて、ダブルセクター・エポン・センターピースの試料区画に充填した。ラジアル吸光度データを、ローター速度40,000rpm、波長280nm、連続走査モードで0.003cmの半径方向増分を用いて20℃で得た。沈降境界は、SEDFITプログラム（Schuck and Rossmanith（2000）Biopolymers 54:328-341）を用いて、異質性（c（s））を仮定しない沈降係数の分布の沈降を記述するモデルに適合させた。データは、p=0.95の正則化パラメータ、浮遊摩擦比、および0.1〜15Sの範囲の150沈降係数増分を用いてフィッティングした。
アミノ酸位置の数値ラベリング
【０１３５】
EphA4中の3つのN-グリコシル化部位は、配列番号：33に記載の19アミノ酸リーダー（シグナル）配列を含むアミノ酸配列で番号付けすることができ、またはこの配列なしで決定することができる。配列がなければ、部位はN216、N321およびN389である。リーダー配列が含まれる場合、位置はそれぞれN235、N340およびN408である。両方の番号付けシステムが本明細書で使用される。
【０１３６】
（表２）ヒトEphA4-Fc突然変異誘発オリゴヌクレオチド
2019501112.tif 000009
119アミノ酸シグナル配列なしで計算。
【０１３７】
（表３）マウスEphA4-Fc突然変異誘発オリゴヌクレオチド
2019501112.tif 000010
119アミノ酸シグナル配列なしで計算。
実施例１
グリコシル化欠損型のEphA4-Fc融合タンパク質は、改善された薬物動態学的挙動を示す
【０１３８】
EphA4を介するシグナル伝達に対するEphA4-Fcの拮抗作用の研究（例えば、Goldshmit et al.（2011）前掲、Spanevello et al.（2011）前掲およびGoldshmit et al.（2004）前掲）の間、融合タンパク質の半減期が予想よりも短かったことが明らかになった（図1）。EphA4-Fcのグリコシル化が迅速なタンパク質クリアランスの要因になり得るか否かを決定するために、EphA4の潜在的なグリコシル化部位を分析した。オンラインNetGlyN 1.0およびNetGlycO 1.0プログラムを用いて、EphA4および密接に関連するEphA3タンパク質のための予測されるグリコシル化部位を検査した（これらの部位は、以前に分析されている（Boyd et al.（1992）J. Biol. Chem. 267(5):3262-3267））。いずれのタンパク質についてもO-連結部位は予測されなかった。EphA4については、ヒトEphA4において予測される3つのN結合部位（図2A）およびマウスEphA4における対応する部位が存在した。マウスおよびヒトEphA4-Fc構築物の両方において、これらの部位でアスパラギン残基をグルタミンに突然変異誘発した（突然変異誘発性オリゴについては表2および3参照）。この置換がNグリコシル化部位を排除しながらタンパク質構造または機能、さらには発現または薬物動態に悪影響を与えるかどうかは不明であった。
【０１３９】
発現プラスミドの野生型および変異型を293T細胞にトランスフェクションし、培養上清を5日後に収穫した。組換えFcタンパク質を、プロテインAセファロースクロマトグラフィーによって回収した。マウスおよびヒトの両方のEphA4-Fcの場合において、三重突然変異体タンパク質の収率は若干低く、異なる実行において、これは野生型タンパク質の収率の60〜70％であった。それぞれの場合において、三重突然変異体タンパク質は、野生型と比較して、EphA4細胞外ドメインの脱グリコシル化と一致する質量減少を伴う、低分子量のものであった（図2Bおよび2C）。予備的結合研究は、野生型と類似するエフリンA4に対する三重（および二重）突然変異体の結合を示した（図3）。
【０１４０】
EphA4の細胞外ドメインにおいて独立したエピトープに結合する2つのEphA4モノクローナル抗体を用いて、サンドイッチELISAアッセイを確立した（図4）。図5に示すように、このアッセイは、野生型および変異型ヒトEphA4-Fcの測定において同等に感受性であった。
【０１４１】
ラットにおいて薬物動態研究を行った。ウィスター（Wistar）ラット（6〜8週齢）を無作為にグループ（グループあたり3匹）に分け、hEphA4-hFc変異体または野生型Fcタンパク質を尾静脈注射により6mg/kgで注射した。注射後の異なる時点：0.25時間、2時間、18時間、48時間、72時間および6日目において、150〜200μLの血液を尾部の先端を切断することによって収集し、Microvette採血管に採取した。直立位置で30〜45分間インキュベートした後、チューブを11,000rpmで10分間遠心分離し、その後に血清を除去した。血清を-80℃で保存した後、ELISAにより分析した（図6）。
【０１４２】
野生型タンパク質は、24時間未満の半減期を有し、48時間前に1μg/mL未満に低下した。野生型EphA4-Fcを用いた以前の実験に基づいて、このレベルでの主要なエフリンB3リガンド（図7および8）への結合は、エフリンB3をブロックするには不適当であり、実際にはエフリンAタンパク質とのより低い親和性相互作用をブロックするのに不十分である。対照的に、突然変異体タンパク質は6日で10μg/mLを依然として超えており、これがこの間隔の大半にわたって競合的ブロッキングに有効であり得ることを示している。野生型EphA4に対するエフリンA1、エフリンA4-FcおよびエフリンB3 Fcの結合は、結合の親和性を確認するために示され、固定化されたエフリンに対する可溶性EphA4-Fcのパターンと同一のパターンを示す（図8）。
【０１４３】
エフリンA1、A4およびB3に対する変異対野生型EphA4-Fc結合を分析するために、固定化されたエフリンへの結合を分析するELISAを確立した（図9）。結果を図10に示す。結合に有意差はないことが明らかであり、これは、両方のタンパク質が3つのエフリンリガンドに匹敵するアフィニティーを有することを示している（突然変異タンパク質のわずかな見かけ上の増加した感受性は、そのわずかに低い分子量によるものと思われる）。
実施例２
改変されたEph分子の生成
【０１４４】
図11A〜D（配列番号：29〜32）は、EphA2、EphA3、EphA4およびEphB4細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。ここで、推定されるN-グリコシル化部位がマークされている（表1も参照のこと）。本明細書に記載される方法を用いて、1つもしくは複数またはすべてのN-グリコシル化部位が除去され、次いで免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばFc部分）、タンパク質またはタンパク質断片（例えばHSA）またはポリエーテル（例えばPEG）に融合または連結される。一実施形態では、改変されたEph分子は、IgG1 FcまたはIgG4 Fcのような免疫グロブリン（Ig）Fc部分に融合される。
実施例３
非グリコシル化EphA4-Fcの高められた半減期
EphA4-Fc非グリコシル化ペプチドの配列カバレッジ
【０１４５】
トリプシンで消化されたEphA4 Fcの質量スペクトル分析は、EphA4-Fcおよびヒトプロテオームを含むタンパク質データベースに対して検索した時に、44個のタンパク質を同定した。EphA4-Fcのタンパク質配列は、93％のタンパク質カバレッジを伴うトップ・スコアタンパク質であった。EphA4-Fcから全部で4つのN結合コンセンサス部位を有するペプチドを観察し、これらのペプチド割り当てを確認するためにスペクトルを手作業で検査した。タンパク質のN末端の1つの領域は、シグナルペプチドを含めて配列決定しなかった（アミノ酸残基1〜24）。高レベルの配列カバレッジは、正しいタンパク質が精製されたことを示し、予想されるアミノ酸配列を確認する。残りの43個のタンパク質のうち、19個だけが2個より多いペプチドを含み、6個が30％を超える配列カバレッジを有した。ペプチドの一致数および配列カバレッジのレベルが低いことを考えると、これらのタンパク質は、観察された糖ペプチドプールに寄与するとは考えにくい。
EphA4-Fcから同定されたN-結合型糖ペプチド
【０１４６】
組換え融合タンパク質EphA4-Fcは、4つのN結合コンセンサス部位を含み（図12）；完全長EphA4（UniProt ID: P54764-1）の細胞外ドメイン中の部位N235、N340およびN408に対応する、融合タンパク質のEphA4部分中に3つが存在する。組換えEphA4-Fcの第4のN結合部位、部位N625は、タンパク質のIgG4 Fcドメイン内に存在し、全てのIgGサブクラスの各重鎖のCH2ドメイン中のN297に対応する（Zauner et al.（2013）Mol. Cell. Proteomics 12：856-865）。部位特異的グリカンの異種性を網羅的に調べるために、質量分析（MS）による分析の前に、EphA4 Fcを消化するために酵素の組合せを用いた。最初の消化は、プロリンが切断部位のカルボキシル側に存在する場合を除いて、リジン（Lys/K）およびアルギニン（Arg/R）のC末端のペプチド結合を切断するトリプシンで行った。次いで、トリプシン消化したサンプルを、グルタミン酸（Glu/E）のC末端、およびより低いレートでアスパラギン酸（Asp/D）C末端のペプチド結合を切断するGlu-Cによる消化に供した[Breddam and Meldal（1992） European Journal of Biochemistry FEBS 206: 103-107]。トリプシンおよびトリプシン/Glu-C消化サンプルの両方を別々のクロマトグラフィーMS/MS実験で分析した。EphA4 Fcの消化物の質量スペクトル分析は、4つの潜在的なN-結合型グリコシル化部位の1つを含む212個のインタクトな糖ペプチドの同定を可能にした。異なる酵素消化および切断事象に起因して、同定された糖ペプチドは、N-結合コンセンサス部位にまたがる12のペプチド成分の1つを含んでいた。
EphA4-Fcの各N-結合部位で同定されたグリカン組成物
【０１４７】
合計69のグリカン組成物が4つのN結合部位にわたって観察された。それぞれのN-結合部位で1回だけそれぞれのグリカン組成物を考慮すると、部位N235、N340、N408、およびN625（19個のアミノ酸リーダー配列で計算）で検出された合計34、23、44および23のグリカンが存在した。特定の脊椎動物単糖類は異性体（例えば、GalNAc/GlcNAcまたはMan/Gal/Glc）があり、したがって完全な糖ペプチドの質量スペクトル分析は付着したグリカン中の単糖類異性体を区別できないことに留意すべきである。このあいまいさを表すために、この研究において命名法が実行されており、ここでは、GlcNAc/GalNAcおよびMan/Gal/Gluをそれぞれ表すためにN-アセチルヘキソサミン（HexNAc）およびヘキソサミン（Hex）が使用される。デオキシヘキソース（dHex）は、異性体の単糖フコース（Fuc）およびキシロースを表し；この論文では、dHexは、哺乳動物のN結合生合成の既知の規則からFucであると仮定され、HEK細胞で産生されたN-結合グリカンを観察した（Moremen et al.（2012）Nat. Rev. Mol. Cell Biol 13: 448-462; Andre et al.（2007）Proteomics 7: 3880-3895）。各N-結合部位におけるグリカン組成の質的な差異は図13に見ることができる。4つのN-結合部位の間に、フコシル化された複合体構造およびハイブリッド構造の数に明確な差があった。部位N235、N340およびN625（19アミノ酸リーダー配列の存在下で計算）では、ハイブリッド構造および複合体構造のそれぞれ97％、100％および78％でフコシル化が観察された。部位N408では、ハイブリッド構造および複合構造のわずか45％がフコースを含む組成物に割り当てられた。シアリル化（N-アセチルノイラミン酸/NeuAc）を有するグリカンの割合は、部位N235（41％）で最高であり、続いて部位N340（26％）、部位N408（22％）および部位N625（22％）であった。
定方向突然変異誘発によるグリコシル化部位の欠失
【０１４８】
グリコシル化のタンパク質機能に対する効果を分析するために、EphA4細胞外ドメイン中の3つの重要なアスパラギン残基のコドンを実施例2に類似するグルタミン残基のコドンに置き換えるように、ヒトEphA4-Fc発現ベクターを系統的に変異させた。得られた単一、二重および三重変異体ベクターをHEK293細胞にトランスフェクションし、発現されたタンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて細胞上清から回収した。図14Aに示されるように、突然変異したタンパク質は、糖成分の損失と一致する漸進的に低い分子量を示した。野生型および変異型EphA4-Fcタンパク質の立体配座の差異およびオリゴマー状態を、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）[図14B]および沈降速度分析用超遠心分離（SV-AUC）[図14C]によって評価した。SECの間、野生型が9.03分に溶出する一方、突然変異体EphA4-Fcが9.58分に溶出し、溶出時間にわずかなシフトがあった。SV-AUCデータの分析は、野生型については約6.3Sで、変異体については約6.2Sで優勢なピークを有する見かけの沈降係数の狭い分布を示した。これにより、SDS-PAGEおよびSECで観察された均質性が確認された。野生型および変異体それぞれについて、174kDaおよび156kDaの分子量推定値が得られた。これらの推定値は、EphA4-Fcのホモダイマーについて計算されたもの（約168kDa）と一致し、変異体のより低い分子量は野生型に存在するN-グリカンの除去と一致する。適合した摩擦比は、タンパク質が細長いコンフォメーションを有し、変異体と比較して野生型タンパク質に対してわずかに高い比が観察された（1.76対1.66）ことを示した。
脱グリコシル化および野生型EphA4-Fcのリガンド結合活性
【０１４９】
エフリン結合ELISA（図15A）、オクテットバイオセンサー分析（図15B）、およびエフリン発現細胞系への結合のフローサイトメトリー分析（図15C）の3つの方法を用いて、突然変異体および「野生型」EphA4 Fcタンパク質の分析を行った。これらの技術の全ては、突然変異タンパク質が、突然変異していないEphA4-Fcタンパク質に匹敵するアフィニティーでエフリンリガンドに結合する能力を保持していることを示した。EphA4-マウスFcタンパク質をコードするベクターを用いて同じ手順を行い、再び突然変異は機能に影響しないことが示された。まとめると、データは、1μg/mLを超える濃度は全てのエフリンAリガンドを飽和させるであろうこと、および10μg/mLを超える濃度はエフリンB3部位を飽和させるのに十分であろうことを示唆した。
実施例４
EphA4-Fcグリコシル化変異体の薬物動態解析
【０１５０】
グリコシル化がインビボクリアランスの決定要因であるかどうかを評価するために、変異していないヒトEphA4-Fcタンパク質および単一、二重および三重突然変異タンパク質の薬物動態学的挙動をマウスで研究した。全ての突然変異は、インビボ半減期のいくらかの延長をもたらしたが、これは単一突然変異体で最も顕著ではなく、二重突然変異体でより頑丈であり、3つのグリコシル化部位がすべて欠失されたときに最も長かった。3重変異体の薬物動態を野生型タンパク質に対してラットにおいて直接的に比較すると（3回実施）、突然変異タンパク質の半減期のより劇的な延長が観察され、非突然変異タンパク質は極めて迅速に消失した。三重突然変異体タンパク質は、予測されるアスパラギン結合残基でのグリコシル化の不均質性と一致する、より複雑な迅速な初期クリアランスとそれに続くプラトーを示す非突然変異タンパク質とは対照的に、単純な対数−線形のクリアランスを示すことが明らかである。「野生型」および突然変異したマウスEphA4-Fcタンパク質もマウスにおいて分析した。ヒトEphA4-Fcと同様に、三重突然変異体タンパク質は、大幅に延長されたインビボ半減期を示した。
実施例５
EphA4-FcにおけるN-グリコシル化の役割
【０１５１】
研究により、EphA4-Fcは迅速に除去され、マウスおよびラットのSCI研究において頻繁な投与が必要であることが示されている（Goldshmit et al.（2011）前掲）。この迅速なクリアランスにおけるグリコシル化の関与の可能性を探究するために、EphA4-Fcのグリコシル化を分析した（実施例2〜4）。トリプシン消化およびトリプシン/Glu-C消化したEphA4-Fc由来のインタクトな糖ペプチドの質量スペクトル分析は、融合タンパク質内の4つの予測されるN結合部位がグリコシル化されていることを確認した。予測と一致して、タンパク質のEphA4領域内のO結合グリコシル化部位は検出されなかった。さらに、4つ全てのN結合部位を有するペプチドもグリコシル化なしで観察され、これは、EphA4-Fcタンパク質のプール内でN結合部位が利用されているが、必ずしもグリコシル化されていないことを示す。定性的には、シアリル化を有するグリカンの割合は、部位N235（41％）で最高であり、続いて部位N340（26％）、部位N408（22％）および部位N625（22％）であった。部位N235で観察されるシアリル化度が高いほど、アシアロ糖タンパク質またはマンノースレセプター媒介性クリアランスのレベルを低下させる可能性があるため、この部位を突然変異させることのクリアランスへの影響を最小限に抑えることができる。これらのアミノ酸位置は、19アミノ酸N末端リーダー配列の存在に基づくものである。
【０１５２】
変異体および野生型EphA4-Fcタンパク質の純度、コンフォメーションおよびオリゴマー状態を、SDS-PAGE、SECおよびSV-AUCによって分析した（それぞれ図14A〜C）。沈降速度によって判断すると、突然変異型EphA4-Fcと野生型EphA4-Fcの両方は、N-グリカンの違いを考慮に入れて、計算された分子量と合理的にほぼ一致した分子量を有する安定な二量体であるように見える。興味深いことに、突然変異体および野生型のSEC溶出時間（それぞれ9.58および9.03分）は、ウシγ-グロビン（158kDa、11.0分の溶出時間）に対応すべき理論的分子量に基づく予測される溶出よりも有意に高く、これは、両方の分子が非球状構造を有することを示唆している。まとめると、SECおよびSV-AUCの結果は、野生型EphA4が、流体力学的体積がわずかに大きいか、またはより細長い立体配座を有することを示す（SECにおけるより早い溶出およびSV-AUCにおけるより高い適合摩擦比と一致する）。
【０１５３】
野生型EphA4-Fcは、最初の24〜48時間で急速なクリアランスを示し、循環薬物の大部分を占めるが、残りの時点では水平状態であった。これは、シアリル化グリカンを含む構造またはN-グリコシル化を含まない構造がインビボで保持されているが、アシアリル化N-グリカンを含むEphA4-Fc変異体の好ましいクリアランスに起因し得る。薬物動態研究は、インビボでのタンパク質半減期に対するグリコシル化の顕著な効果を示す。個々の部位の突然変異は様々な効果を示したが、完全に脱グリコシル化されたEphA4領域を有するタンパク質は、アベイラビリティーの最も大きな延長を示した。重要なことに、20mg/kgの用量は、すべてのエフリンAおよびエフリンBリガンドに最大限に結合することができる10μg/mLの濃度に基づいて、6〜7日間すべてのエフリン部位をブロックするであろう血清濃度を維持することができた。これは、デコイ受容体薬物として有効であるために1〜2日おきに送達される必要があるであろうグリコシル化タンパク質とは対照的に、1週間間隔でEphA4-Fcを投与する可能性を提供するので、非常に重要である。
【０１５４】
文献は、グリコシル化がタンパク質の機能性および薬物動態において果たす役割に関して一貫していない。興味深いことに、エフリンA1の脱グリコシル化は、EphA2とのその結合親和性に負の影響を与えたが、非グリコシル化エフリンA1の産生は、タンパク質のミスフォールディングをもたらした（Fegula et al.（2013）前掲）。この効果は、N-グリコシル化部位の変異がタンパク質発現の有意な損失をもたらす他のタンパク質においても観察されている（Takahaski et al.（2008）前掲；Mishina et al.（1985）Nature 313:313,364-369）。したがって、タンパク質性Ephシグナル伝達アンタゴニストでグリコシル化パターンを改変することがどのような影響を及ぼすかは不明であった。タンパク質治療においてN結合部位を維持または導入する利点を示す研究が増えていることとは対照的に、本発明は、3つのN-結合部位の除去後に、機能性が保存され、薬物動態学的特性が著しく改善されるという興味ある結果に部分的に基礎を置く。さらに、この結果は、N結合コンセンサス部位がリガンド結合特性にとって必須ではないことを明らかにする、EphA4 N-結合グリコシル化の役割についての洞察を提供する。
実施例６
有効性を示す前臨床EphA4-Fc運動ニューロン疾患（MND）データ
【０１５５】
MND SOD1G93AマウスモデルにおけるEphA4-Fc投与は、挙動のパフォーマンスを改善する。SOD1G93AマウスへのEphA4-Fcの全身投与を研究した。要約すると、SOD1G93Aマウスを、EphA4-Fc融合体のネズミ相同体または生理食塩水コントロールのいずれかで処置した。機能試験は毎週実施し、24週に実験を終了した。前肢および後肢の握力を評価し、またRotaRod試験を用いてバランスおよび協調（coordination）を評価した。処置したマウスは、コントロール群と比較して、18、19、20および21週で有意に大きな後肢握力を有していた。処置したマウスは、18〜24週の間、対照と比較してRotaRod試験で行動能力も向上し、20週までに統計学的有意性に達する増加を示した（図16AおよびB）。これらの結果は、SOD1G93Aモデルに関連するチャレンジの観点（Vaqueur et al.（2013）Nat Rev Drug Disocv 12: 287-305; Kobeleva et al.（2013）Neurodgene Dis. Manag. 3: 525-537）、特にSOD1突然変異によって誘導される疾患の重篤度の程度の観点において検査されるべきである。誘導された運動機能の実質的な損失を考慮すると、治療群に統計的に有意な差がある。この実験は、動物の個々のコホートで4回反復され、すべての場合において、EphA4-Fc処置で行動の有意な改善が見られた。
実施例７
EphA4遺伝子アブレーションMNDモデル
【０１５６】
MNDに対するEphA4シグナル伝達をブロッキングする完全な影響を評価するために、EphA4遺伝子を、SOD1G93Aマウスの運動ニューロンにおいて欠失させた。これは、SOD-1依存性疾患におけるEphA4の関与とEphA4-Fc治療の相対的な有効性の両方に対する洞察を提供する。これは、MND進行に対するEphA4の特異的遺伝子除去の効果を評価することができる、SOD1G93Aマウスにおいて細胞型特異的EphA4遺伝子欠失系を確立するために3株のマウスを交配することによって行った（SOD1G93A、EphA4flox/floxおよびChAT-CreKI/KI）。EphA4flox/floxマウスは、loxPが導入された（floxed）エクソン3を有するEphA4の条件付き対立遺伝子を有する（Hermannetal（2010）Genesis 48:101-105）。EphA4flox/floxマウスをChAT-CreKI/KIマウスと交配させると、エクソン2をエクソン4にスプライシングするエクソン3のCre媒介切除により、下流配列にフレームシフトが起こり、ChAT発現細胞においてEphA4遺伝子の欠損を作り出す。EphA4のこの条件的枯渇は、S0D1G93Aマウスのバックグラウンド上に構築された。繁殖ストラテジーは4ラウンドの繁殖を必要とし、その数はリターあたり6匹の動物の生産に基づき、期待される遺伝子型の比を達成する。
【０１５７】
EphA4flox/flox x ChAT-CreKI/KI x SOD1G93A、EphA4flox/WT x ChAT-CreKI/KI x SOD1G93Aマウス、およびEphA4flox/flox x ChAT-CreWT/WT x SOD1G93Aマウスの間の体重および行動パフォーマンス。コントロールグループとして、この研究に、野生型（C57BL/6J）マウスおよび野生型マウスにおけるEphA4の条件的枯渇が含まれる。それらは、EphA4flox/flox x ChAT-CreKI/KI x C57およびEphA4flox/flox x ChAT-CreWT/WT x C57マウスであった。疾患発症および進行は、5週齢の後に体重を測定することによってモニターする。挙動パフォーマンスを、Rota-Rodおよび後肢握力テストを用いて、8週齢に開始し、次に毎週、モニターすることにより評価する。テストはグループに対してブラインドで行う。脊髄の腰膨大を抗ChAT抗体で免疫組織化学的に染色し、ChAT陽性細胞（運動ニューロン）をカウントすることにより、運動ニューロンの生存を評価する。運動ニューロンの数は、挙動パフォーマンスと直接的に関連する。得られたデータは、14週目に開始するRotaRodテスト値の下降を示したが、EphA4flox/flox x ChAT-CreWT/WT x SOD1G93Aマウスと異なり、EphA4flox/WT x ChAT-CreKI/KI x SODG93Aマウスのパフォーマンスは極めてゆっくり下降し、第18週と第19週で有意差が生じた（図17）。
【０１５８】
同じ実験で運動ニューロン数を比較すると、ヘテロ接合体EphA4枯渇SOD1マウスは、野生型対照と比較して17週目で腰部の運動ニューロンの保存を示した（図18）。
実施例８
EphA2-Fcに対するグリカン部位の変異の効果
方法
EphA2-Fcのプラスミド調製
【０１５９】
コドン最適化ヒトEphA2-Fc DNAを、グルタミンをコードする予想されるグリコシル化部位407および435でアスパラギン（ASn; N）をコードするヌクレオチドで（GenScript USA Inc.）により合成、クローニングおよび配列確認した。プラスミドをQIAGENプラスミドmidiprepキットを用いて精製したDNAと共に、単一コロニーから増殖させたNEB 5-αコンピテントE.coli（New England BioLabs）に形質転換した。
プラスミドDNAの一過性トランスフェクション
【０１６０】
HEK293T細胞（ATCC、CRL-11268）を、5％v/vのCO2を含有する加湿雰囲気中、10％v/vウシ胎仔血清（GIBCO Life Technologies）を補充したRPMI 1640培地（GIBCO Life Technologies）中で培養した。プラスミドDNAを、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて製造元のガイドラインに従ってHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後6日目に培養上清を採取し、MabSelectアガロースマトリックス（GE Healthcare Life Sciences）を用いてプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
ラットにおけるEphA4-Fcの薬物動態
【０１６１】
ラットをランダムに2つの群に分け、突然変異EphA2-Fcまたは野生型EphA2-Fcのいずれかを尾静脈を通して1mg/kgの濃度で注射した。次に、300〜400μlの血液サンプルを、処置後の異なる時点、すなわち2時間、18時間、48時間および6日目にラットの尾の先端を切断することによって採取した。各採血後、すべてのサンプルを室温で1時間、直立状態でインキュベートして凝固させ、次いで11000rpmで10分間、遠心分離した。その血清をELISAアッセイのために-80℃で保存した。
EphA2-Fc ELISAアッセイ
【０１６２】
EIA 96ウェルプレート（Costar, Corning Inc.）を、50mM炭酸緩衝液pH9.5中の4B3 mAb（3μg/ml）で一晩、4℃でコーティングした後、PBS中の5％w/v BSA、0.05％v/v Tween-20（PBST）で、室温で1時間、ブロッキングした。PBSTで3回洗浄した後、希釈したEphA4-Fc分析物を加え、室温で1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、PBS中のビオチン化1F7 mAb（1μg/ml）を加え、室温で1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、PBSで1/500に希釈したUltra Streptavidin-HRP（Thermo Fischer Scientific）を加え、室温で1時間インキュベートした。PBSTによる3回の洗浄の後、最終的な検出は、492nmで測定した最終生成物でOPD（SigmaFast [商標]）の添加により行った。
結果
【０１６３】
結果を図19に示す。EphA2グリカン部位の突然変異は、この分子の薬物動態（PK）改善をもたらさなかった。これらのデータは、PK上のグリカン部位除去の予測不可能性を強調する。
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【０１６４】
本明細書に記載される開示は、具体的に記載されたもの以外の変形および修飾が可能であることを、当業者は理解するであろう。本開示は、すべてのそのような変形および修正を意図していることが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書中で個別にまたは集合的に言及または指示されるステップ、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに任意の2つまたはそれを超えるステップまたは特徴または組成物または化合物の任意のおよびすべての組み合わせも可能にする。
【０１６５】
文献目録
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月3日(2018.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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