(57)【要約】本発明は、サンプル中のマイクロサテライト不安定性（MSI）を特定するための方法及びキットに関する。特に、本発明は、大腸がんまたはリンチ症候群を有することが疑われる被験体に由来することがある、腫瘍サンプル中のマイクロサテライト不安定性を特定することに関する。前記方法及びキットは、ミスマッチ修復の欠損を特定するために使用されることがある。より具体的には、本発明は、MSI-H と MSS の CRCs を区別することができる、シークエンシングに基づく MSI 試験のためのマーカーのパネルに関する。本発明はまた、生物学的意義の判定を可能にし、PCR 及びシークエンシング・エラー並びに MSI 誘発インデル／突然変異とを区別することを可能にする。【選択図】図１
2019528076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のマイクロサテライト不安定性のレベルを評価するための方法であって、以下：
（ａ）表Ａで特定される、選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の複数種類を増幅するためのプライマーを提供すること；
（ｂ）マイクロサテライト・アンプリコンを生成するために、前記サンプルから、選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の複数種類を増幅すること；
（ｃ）前記マイクロサテライト・アンプリコンをシークエンシングすること；及び、
（ｄ）前記マイクロサテライト・アンプリコンからの配列を所定の配列と比較し、所定の配列からのあらゆる逸脱（不安定性の指標である）を決定すること；
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、表Ａで特定される、選択された群のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 6 種類又は少なくとも 7 種類を増幅するためにプライマーが提供され、任意選択的に、ここで、前記少なくとも 6 種類又は少なくとも 7 種類のマイクロサテライト遺伝子座が GM07、LR11、LR36、LR44、LR48、IM49 及び GM14 からなる選択された群である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）において、マイクロサテライト遺伝子座 DEPDC2 及び AP003532_2 を増幅するためにプライマーがまた提供される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）において、表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類、又は表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 17 種類、又は表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 18 種類、を増幅するために、プライマーが提供される、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）が、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するために、プライマーを提供する、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）が、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するために、プライマーを提供する、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座を増幅するために、プライマーを提供する、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）が、以下；
LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、GM07、LR36、LR44、LR48、LR11、AP003532_2、DEPDC2、GM14、IM49、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するために、プライマーを提供する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）が、以下；
LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、GM07、LR36、LR44、LR48、LR11、AP003532_2、DEPDC2、GM14、IM49、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座を増幅するために、プライマーを提供する、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマーが、選択されたマイクロサテライト遺伝子座を同時増幅するためのものである、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）マイクロサテライト・アンプリコンを生成するために、前記サンプルから、選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の複数種類を増幅すること、である前記工程が、選択された遺伝子座のセットを多重増幅反応において同時増幅することを含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマー対が、多重化を可能にするように選択される、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
いくつかの別々のマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座が増幅され、別々の反応として配列決定される、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ｃ）の工程が、ハイ・スループット又は次世代シークエンシングを使用する、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）が、シークエンシング‐バイ‐シンセシス（sequencing-by-synthesis）を使用する、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）が、イオン半導体シークエンシング（ion semiconductor sequencing）又はイオン・トレント・シーケンシング（ion torrent sequencing）を使用する、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）が、パイロシークエンシング（pyrosequencing）を使用する、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によるものであり、及びプライマー・ペア（各プライマー・ペアは、選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の上流部分に相補的であるフォワード・プライマー及び前記選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の下流部分に相補的であるリバース・プライマーを含む）を使用することを使用するものである、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の近距離内に一塩基多型（SNP）も含むものである、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の 100 塩基対以内に一塩基多型（SNP）も含むものである、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の 80 塩基対以内に一塩基多型（SNP）も含むものである、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の 50 塩基対以内に一塩基多型（SNP）も含むものである、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の 30 塩基対以内に一塩基多型（SNP）も含むものである、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記一塩基多型（SNP）が、0.05-0.95 の間のマイナー対立遺伝子頻度（minor allele frequency）である、請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記一塩基多型（SNP）が、高い頻度である、請求項１から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマーが、マイクロサテライト遺伝子座と SNP の両方を増幅するように選択される、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
増幅工程（ｂ）が、マイクロサテライト及び SNP の両方を含むマイクロサテライト・アンプリコンを生成する、請求項１から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、対立遺伝子の不均衡を決定する工程を含む、請求項１から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、MSI 誘発性 CRC 又はリンチ症候群を診断する工程を含む、請求項１から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
2 つ以上のマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座について、所定の配列から逸脱していることが、ミスマッチ修復が欠損していることの指標である、請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
2 つ以上のマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座について、所定の配列から逸脱していることが、前記サンプルが高レベルのマイクロサテライト不安定性（MSI-H）を有していることの指標である、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルが、腫瘍サンプル、又は腫瘍細胞を検出するのに適した体組織又は体液である、請求項１から３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが、ヒトの組織サンプル又は体液サンプルである、請求項１から３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルが、核酸サンプルである、請求項１から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
サンプル中のマイクロサテライト不安定性のレベルを評価するためのキットであって、以下：
表Ａで特定されるマイクロサテライト遺伝子座のセットから選択されたヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の複数種類を同時増幅するためのオリゴヌクレオチド・プライマー、
を含むキット。
【請求項３６】
前記プライマーが、表Ａで特定される、選択された群のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 6 種類又は少なくとも 7 種類を増幅するためのものであり、任意選択的に、ここで、前記少なくとも 6 種類又は少なくとも 7 種類のマイクロサテライト遺伝子座が GM07、LR11、LR36、LR44、LR48、IM49 及び GM14 からなる選択された群である、請求項３５のキット。
【請求項３７】
マイクロサテライト遺伝子座 DEPDC2 及び AP003532_2 を増幅するためのプライマーを更に含む、請求項３５又は３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記プライマーが、表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類、又は表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 17 種類、又は表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 18 種類、を増幅するためのものである、請求項３５から３７の何れか一項に記載のキット。
【請求項３９】
前記プライマーが、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するためのものである、請求項３５から３８の何れか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記プライマーが、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するためのものである、請求項３５から３９の何れか一項に記載のキット。
【請求項４１】
前記プライマーが、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座を増幅するためのものである、請求項３５から４０の何れか一項に記載のキット。
【請求項４２】
前記プライマーが、以下；
LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、GM07、LR36、LR44、LR48、LR11、AP003532_2、DEPDC2、GM14、IM49、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するためのものである、請求項３５から４１の何れか一項に記載のキット。
【請求項４３】
前記プライマーが、以下；
LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、GM07、LR36、LR44、LR48、LR11、AP003532_2、DEPDC2、GM14、IM49、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座を増幅するためのものである、請求項３５から４２の何れか一項に記載のキット。
【請求項４４】
前記キットが、熱安定性ポリメラーゼも含む、請求項３５から４３の何れか一項に記載のキット。
【請求項４５】
前記キットが、標識された dNTPs 又はそれらの類似体も含む、請求項３５から４４の何れか一項に記載のキット。
【請求項４６】
前記標識された dNTPs 又はそれらの類似体が、蛍光標識されている、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
シークエンシングの過程で特定された突然変異の生物学的意義を評価するための方法：
（ａ）選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の複数種類を増幅するためのプライマーを提供すること（前記マイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の近距離内に一塩基多型（SNP）を含み、前記プライマーは前記マイクロサテライト遺伝子座及び前記 SNP の両方を単一のアンプリコン中に増幅するように選択される）；
（ｂ）マイクロサテライト・アンプリコンを生成するために、前記サンプルから、選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の複数種類を増幅すること；
（ｃ）前記マイクロサテライト・アンプリコンをシークエンシングすること；及び、
（ｄ）前記マイクロサテライト・アンプリコンからの配列を所定の配列（野生型の配列）と比較し、所定の配列からのあらゆる逸脱（不安定性の指標である）を決定すること；並びに、
（ｅ）ヘテロ接合性 SNPs については、2 つの対立遺伝子のインデル頻度の間に偏りがあるかどうかを決定すること。
【請求項４８】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の 100 塩基対以内に一塩基多型（SNP）を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の 80 塩基対以内に一塩基多型（SNP）を含む、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の 50 塩基対以内に一塩基多型（SNP）を含む、請求項４７から４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座が、前記マイクロサテライト遺伝子座の 30 塩基対以内に一塩基多型（SNP）を含む、請求項４７から５０の何れか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記一塩基多型（SNP）が、0.05-0.95 の間のマイナー対立遺伝子頻度（minor allele frequency）である、請求項４７から５１の何れか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記一塩基多型（SNP）が、高い頻度である、請求項４７から５２の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のマイクロサテライト不安定性（MSI）を同定するための方法及びキットに関する。具体的には、本発明は、大腸がん又はリンチ症候群を有することが疑われる被検体に由来することがある、腫瘍サンプル中のマイクロサテライト不安定性を同定することに関する。前記方法及びキットは、ミスマッチ修復の欠損を同定するために使用されることがある。より具体的には、本発明は、シークエンシングに基づく MSI 試験のためのマーカーのパネルに関するものであり、MSI-H の CRCs と MSS の CRCs とを区別することができる。本発明によって、生物学的意義を判定することが可能となり、PCR エラー及びシークエンシング・エラー並びに MSI によって誘導されるインデル／突然変異とを区別する。
【背景技術】
【０００２】
＜ミスマッチ修復とマイクロサテライト不安定性＞
マイクロサテライトは、単純な反復配列、又は繰り返される（しばしば 5-50 回）典型的には 1-6 bp の反復単位を有するタンデム反復を含むゲノム DNA の領域である。マイクロサテライト遺伝子座は、最小の反復単位の長さに基づいて分類される。例えば、長さが 1 から 5 塩基対の反復単位を有する遺伝子座は、それぞれ、「モノ‐ヌクレオチド」、「ジ‐ヌクレオチド」、「トリ‐ヌクレオチド」、「テトラ‐ヌクレオチド」、及び「ペンタ‐ヌクレオチド」反復遺伝子座と呼ばれる。
【０００３】
ほとんどの二倍体種の正常ゲノム DNA（例えば、ヒト等の哺乳動物由来のゲノム DNA）のマイクロサテライト遺伝子座は、各遺伝子座にある 2 つの対立遺伝子からなる。マイクロサテライト対立遺伝子は通常、所与の個体及びその子孫において一定の長さに維持されているが、いくつかの腫瘍においてマイクロサテライトの長さの不安定性が観察されている。特に、マイクロサテライトは真核生物及び原核生物における減数分裂期及び有糸分裂期の複製中に不安定であることが知られている。複製ミス（slippage events）に対するマイクロサテライトの感受性に影響を与える要因には、マイクロサテライトの長さ、反復単位の長さ、塩基組成、及びマイクロサテライトの周りの配列が含まれる。例えば、近接して位置するモノヌクレオチド反復は、同じ 1 個のモノヌクレオチド反復よりも変異しやすい。マイクロサテライト不安定性（MSI）は、ミスマッチ修復（MMR）遺伝子が欠損する結果として、DNA 複製エラーを修復することができないために起こる。それ故、腫瘍において MSI の試験をすることは、MMR 遺伝子欠損を特定するために使用される。
【０００４】
従来、モノヌクレオチド反復とジヌクレオチド反復が MSI テストで使用されてきた。トリ−、テトラ−、及びペンタヌクレオチド反復は、それらは MSI-H 腫瘍において変異性が低いので、MSI 試験においてあまり望ましくない。また、選択されたテトラヌクレオチド反復において上昇したマイクロサテライトの変化（Elevated Microsatellite Alterations at Selected Tetranucleotide repeats (EMAST)）としても知られるテトラヌクレオチド反復の不安定性の 1 つの原因は、炎症の結果であると考えられ、そして研究によれば、この不安定性は腫瘍において可逆的であり、それ故に良いマーカーではないことが示唆される。
【０００５】
＜大腸がん（CRC）＞
2012 年に 3 番目に多いがんのタイプは、大腸がん（CRC）であり、新規症例は〜 140 万人、死亡者数は〜 694,000 人であった。大腸がんは、従って、世界のがんの負担の 9.7 % を占める。大腸がんの割合は中位及び高位の人間開発指数（human development index (HDI)）の地域で増加しており、これは、アルコールの摂取、喫煙、肥満、糖尿病、肉をたくさん消費すること、身体活動がほとんど無いこと、に関連して大腸がんのリスクが増加するためと考えられている。
【０００６】
従来、2 つの群に分けられる異なるタイプの CRC があるが、それは、染色体不安定性を持つものとミスマッチ修復遺伝子を欠損するものである。染色体不安定性は大腸がんの最も一般的な原因であり、大腸がんの約 85 % を占める。これらのがんは、染色体や染色体の一部の増減、遺伝子の増幅、染色体転座を特徴とする。染色体不安定性は、有糸分裂チェックポイントに影響を与える欠損が原因で発生することがある。染色体不安定性の別の原因は異常な中心体の機能であり、これによって不等染色体分離が招かれることもある。染色体不安定性を引き起こす可能性がある他のメカニズムには、テロメアの機能不全が含まれる。これにより、有糸分裂中に染色体の切断及び融合がもたらされる、並びに有糸分裂細胞周期の停止の応答性に問題があって修復されない DNA 損傷がもたらされる、ことがある。
【０００７】
CRCs のその他の 15 % はミスマッチ修復遺伝子欠損を有し、マイクロサテライト不安定性（MSI）を特徴とし、これはマイクロサテライトの長さの体細胞性変化として定義することができる。マイクロサテライトとは、ゲノム全体に散在している DNA の反復領域である。それらの反復性のために、ポリメラーゼは、マイクロサテライトを複製しているときに、DNA の他の領域と比較して、挿入及び欠失の形で複製ミス（slippage）を引き起こす可能性がより高い。ミスマッチ修復遺伝子の欠損はマイクロサテライト不安定性（MSI）を引き起こす。なぜならば、DNA 複製中のエラーが、細胞のミスマッチ修復システムが損なわれていることによって修正されないからである。DNA ミスマッチ修復システムはまた、突然変異の負荷が高くなりすぎると細胞死を引き起こすメカニズムの一部でもある。この機能は、ミスマッチ修復システムが損なわれることによっても失われる。損なわれたミスマッチ修復システムは、これら 2 つのメカニズムを通して、がんを引き起こす可能性がある高い突然変異負荷をもたらす可能性がある。MSI は、コーディング・マイクロサテライトを含む遺伝子における突然変異を通して腫瘍形成を引き起こすであろう。このような遺伝子の 2 つの例は TGFBR2 と BAX である。
【０００８】
マイクロサテライトの状態に基づいて、大腸腫瘍は 3 つのカテゴリーに分類することができる；即ち、高レベルのマイクロサテライト不安定性を有する腫瘍（MSI-H）、低レベルのマイクロサテライト不安定性を有する腫瘍（MSI-L）、及びマイクロサテライト安定性を有する腫瘍（MSS）、である。ミスマッチ修復欠損を有する腫瘍は、高レベルのマイクロサテライト不安定性を有し、MSI-H 腫瘍として分類される。MSS 腫瘍は通常、染色体不安定性に関連する腫瘍である。MSI-L 腫瘍は染色体不安定性の結果としても発生するようである。MSI-L カテゴリーは広範に使用されてきているが、MSI-L 腫瘍と MSS 腫瘍との間に質的な違いがあるかどうか、そして MSI-L 腫瘍を個別の群と見なすことができるかどうかについては議論がある。
【０００９】
最近の分子分類によって 4 つの分子サブ群が同定された。そこでもなお、ミスマッチ修復の破綻を伴う腫瘍の違いははっきりしている；即ち、6 つの異なる分類システムにわたって顕著な相互接続性が示され、前記群は 4 つのコンセンサス分子サブタイプ：CMS1 マイクロサテライト不安定性、免疫型 (14 %)、CMS2 古典型（Canonical） (37 %)、CMS3 代謝型 (13 %)、CMS4 間葉型 (23 %)、に分類された。これらの群のうちの 1 つに分類することができなかった腫瘍は、移行表現型（transitional phenotype）又は腫瘍内異質型（intratumoural heterogeneity）を表すと見なされた。
【００１０】
＜リンチ症候群と孤発性マイクロサテライト不安定腫瘍＞
リンチ症候群（以前は遺伝性非ポリポーシス大腸がん（HNPCC）として知られていた）は、遺伝性のミスマッチ修復遺伝子欠損に起因する遺伝性の常染色体優性大腸がんであり、高レベルのマイクロサテライト不安定性を特徴としている。この文書全体を通して、がんへの言及がなされるとき、リンチ症候群が含まれるであろう。リンチ症候群は MSI-H CRCs の 20 % を占める。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 及び PMS1 遺伝子の変異はリンチ症候群を引き起こすことがある。MSH2 の上流の EPCAM 遺伝子の欠失は MSH2 のノックアウトを引き起こす可能性があり、一部のリンチ症候群の患者では病因性の変異であることも示されている。リンチ症候群の患者は、平均年齢が 70 歳を超える孤発性 MSI-H がんの患者とは異なり、平均して 40 歳代半ばに、早期に最初のがんを発症する。CRC のリスクの増加に加えて、リンチ症候群は子宮内膜がん、膀胱がん、並びに小腸、卵巣、尿路、胃、胆道、膵臓、脳及び皮脂腺の腫瘍のリスク増加と関連している。70 歳までに CRC を発症するリスクは男性で 66 %、女性では大腸がん又は子宮内膜がんを発症するリスクが 73 % と推定されている。
【００１１】
孤発性 MSI-H 腫瘍は通常、プロモーターのメチル化によって引き起こされる MLH1 のエピジェネティックなサイレンシングによって引き起こされる。一方、リンチ症候群の腫瘍は、鋸歯状ポリープから生じる、腺腫の孤発性 MSI-H CRCs から生じると考えられてきた。ごく最近になって、不明瞭な縁、粘液キャップ及び特徴的な「鋸歯（saw tooth）」組織構造を有する無茎性の過形成性ポリープ(sessile serrated adenoma)が、スクリーニング大腸内視鏡検査を頻回行っていて、その検査間に発生する上行結腸の「中間期がん（interval cancers）」の有病率が高いことの原因であると、主に疑われるようになった。
【００１２】
MSI-H 腫瘍の約 80 % は孤発性の腫瘍である。孤発性の MSI-H 腫瘍は、リンチ症候群の腫瘍と比較して発症年齢が平均的に遅いことに加えて、近位結腸に発生しやすい傾向もあり、男性よりも女性に多くみられる。
【００１３】
従って、MSI の状態に関して知ることは、CRC の遺伝形式を定義し、臨床ケアに情報を提供することができるため、有用であることは明らかである。リンチ症候群の患者を同定することは、彼らとその親戚が二次原発がんを発症するリスクが高いため、重要である。これらのがんを早期に発見することは予後に重大な影響を及ぼし、そしてリンチ症候群のがんによる死亡の 60 % よりも多くは、適切なフォロー・アップがあれば防ぐことができたであろうと推定されている。加えて、アスピリンを 2 年以上毎日使用することはリンチ症候群のがん発生率を約 60 % 減少させることが示されているので（Burn et al. (2011)）、アスピリンを予防的に使用することによって、生存率は更に改善されるかもしれない。
【００１４】
MSI は通常、5 つの > 20 bp のマイクロサテライト・マーカーのパネルを PCR 増幅することによって検出され、対立遺伝子はフラグメント解析を用いて決定される。MMR 欠損を免疫組織化学染色によって検出することもある。BRAF 突然変異はリンチ症候群患者ではめったに発生しないが、孤発性 MSI-H CRCs では非常に一般的であるため、MSI-H 腫瘍の BRAF-V600E 突然変異のスクリーニングを、どの患者がリンチ症候群に罹患する可能性があるかを絞り込み、スクリーニング費用を節約するために、使用することができる。配列決定に基づく MSI のタイピングは、自動化によるコスト及び解釈の容易さに関して有利であることがある。しかしながら、長いマイクロサテライトは配列解析に適しておらず、又、不安定性を示すいくつかの短い（6-14 bp）モノヌクレオチド反復が同定されてはいるが、不安定性の頻度は非常にばらつく。
【００１５】
しかしながら、最近、MSI 試験のための CRC 患者を特定するために使用されている現在の臨床基準及び管理ガイドライン（アムステルダム II 基準及び改訂ベセスダ（Bethesda）ガイドライン）は、かなりの数のリンチ症候群患者を特定できないことが報告されている。このことから、全ての CRC 及び子宮内膜腫瘍は分子検査を受けるべきであるということが、示唆される。
【００１６】
一般に、MSI-H は MSS と比較して CRCs の予後が良好であることの予測因子である。更に、MSI-H CRCs は、孤発性であろうと遺伝性であろうと、多くの異なる薬剤に同様に反応する。これは、両方の種類のがんで、ミスマッチ修復システムがノックアウトされているためである。従って、MSI-H CRCs の試験を行えば、適切な治療を割り当てることができるであろう。
【００１７】
全ての CRC 及び子宮内膜がんに対する MSI 検査を行うことのもう 1 つ別の説得力のある理由は、マイクロサテライト安定（MSS）腫瘍及び MSI-H 腫瘍は化学療法の種類によって反応が異なるため、腫瘍のMSI状態に基づいて治療を適合させることができる、ということである。2015年には、薬剤ペムブロリズマブの重要な研究により、MMR が十分に機能している腫瘍と比較して、MMR 欠損型大腸がんに、転移性疾患の症例において、非常に有意な有益な効果がある、という驚くべき有益性が、を示された。この研究では、MMR 又は MSI-H 大腸がんの患者の 40 % が免疫関連の客観的反応を示し、20 週の無増悪生存率は MMR 大腸がん患者の 78 % であった。ペンブロリズマブの有益性が確認されれば、全ての大腸がんに関して MMR 機能検査が必須になる可能性がある。
【００１８】
薬剤イリノテカンが MSI-H がんの治療薬として有望であることもまた注目される。前臨床試験のデータは、イリノテカンが MSS 大腸がんと比較して MSI-H 大腸がんに対してより有効であることを示唆する。薬剤ベバシズマブも、MSI-H 大腸がんの治療薬として有効であるかもしれないが、MSS 腫瘍患者には延命効果をもたらしそうにない。他の薬剤では、MSS CRCs に対して奏功するようだが、MSI-H CRCs に対してはあまり効果が無い、ものもある。例えば、薬剤シスプラチンとカルボプラチンは、ミスマッチ修復（MMR）システムが損なわれているがんにはあまり効果が無いことを示唆する証拠がある。
【００１９】
薬剤 5-フルオロウラシル（5-FU）はまた、ミスマッチ修復（MMR）システムが損なわれている大腸がんを治療するのに有益であることがある。
【００２０】
ハイ・スループット・シークエンシング技術の出現により、配列決定に基づいて MSI を分類することの可能性をゲノムレベルで検討することが可能になった。配列決定に基づくアプローチが有用である可能性は、224 例の CRCs と正常の対についての CGAP のエキソーム解析によって証明されたが、これは、モノヌクレオチド反復を調べて、次世代シークエンシングを用いることで MSI を検出できることを証明した（Cancer Genome Atlas Network、2012）。後に、胃がん及び胃がん細胞株において、モノヌクレオチド反復が解析され、そこで結果は確認された。それ以来、全ゲノム、エクソーム、全トランスクリプトームを解析し、パネル・データを取り込むためのソフトウェアが開発されてきている。現在では、このようなゲノム‐ワイドなアプローチは費用対効果に優れていない。
【００２１】
マイクロサテライト不安定性（MSI）の検査がまだ日常的に行われていない国々で、MSI を検査をする腫瘍が増加することに対処するために、MSI を検査をするためのハイ・スループット・スクリーニング・アプローチを検討することは有益であろう。
【００２２】
＜変異コーリング（Variant Calling）＞
ハイ・スループット又は次世代シーケンシングを使用するアプローチに伴う潜在的な問題は、インデルに関しては、異なる変異コーラー（variant caller）間で一貫性がまだほとんどないことである（Li、2014、O'Rawe ら、2013）。O'Rawe ら（2013）は、3つの異なる変異コーリング・パイプライン（variant calling pipelines）（SOAPindel、BWA-GATK、SAMtools）を評価し、それらのパイプラインを使ってコールされるインデルの間には 26.8 % の一致しかないことを発見した。インデルの 28.5 % が GATK に特有であり、22.4 % が SOAPindel に特有、7.8 % が SAMtools に特有であった（O’Rawe ら、2013）。Pabinger ら（2014）は、CRISP、GATK、SAMtools、SNVer、及び VarScan 2 によって生成されたインデル・コールの数を比較し、それらは、それぞれ259、1959、234、332、及び 1896 個のインデルをコールし、GATK と Varscan で、最も多くの数のインデルが共通した（〜57 %）。Houniet ら（2015）は、インデル・コーラーである Samtools、Dindel 及び GATK を、それらがエキソーム配列中のインデルを識別する識別力について、評価した。それらの解析の結果、インデルを識別するのに、Samtools は 0.05 未満の感度であり、GATK は約 0.35 の感度であり、Dindel はどのアライナ（aligner）を使うかによって、〜0.17‐〜0.38 の範囲の感度であることが示された。
【００２３】
インデルをコーリング（calling）することが難しいことである理由はたくさんある。配列決定エラーは 1 つの問題である。なぜなら、イルミナの配列決定の平均エラー率は、2 bp のモノヌクレオチド反復については 0.002 % であるが、17 bp のモノヌクレオチド反復については約 2 % に上昇するからである（Minoche ら、2011）。また、モノヌクレオチド反復における PCR エラーは、まだきちんとモデル化されておらず、異なる変異コーラーが異なるインデルをコーリングしているという懸念もある。インデルの周りでのギャップのあるアライメント（alignment）は、特に低い複雑度の領域（low complexity regions）では、不正確なアライメントによって誤ったインデルが生成される可能性があり、更に難しいこととなる。真のインデルは、低い複雑度のフィルタ（low-complexity filter）によってフィルタ処理された後に失われる可能性もある。最後に、ほとんどの変異コーラーは、二‐対立遺伝子ゲノム（bi-allelic genomes）に対して適合していて、ヘテロ接合性の設定基準を満たしていない低頻度の変異を削除する可能性がある。MSI が単一‐対立遺伝子の事象（mono-allelic events）として存在する場合、連鎖SNPを使用すれば、アーティファクト（artefacts）によって引き起こされたインデルと MSI から生じるインデルとを区別することができることがあるだろう。そのようなアプローチはこれまで試験されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
ハイ・スループット MSI 試験として、臨床的な場面に展開できる可能性のある MSI 試験を提供することは有益であろう。
【００２５】
生物学的意義を決定するための変異コーリングのための新しいシステム及び／又は方法を提供することは有益であろう。
【００２６】
本発明は、従来技術に関連した 1 つ以上の不利な点を軽減することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
＜発明の概要＞
本発明者らは、本発明者らの次世代シークエンシングに基づく MSI 試験が、ミスマッチ修復機能の喪失を特定するために現在使用されている方法と同等であることを示した。
【００２８】
本発明によれば、サンプル中のマイクロサテライト不安定性のレベルを評価するための方法であって、以下：
（ａ）表Ａで特定される、選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の複数種類を増幅するためのプライマーを提供すること；
（ｂ）マイクロサテライト・アンプリコンを生成するために、前記サンプルから、選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の複数種類を増幅すること；
（ｃ）前記マイクロサテライト・アンプリコンをシークエンシングすること；及び、
（ｄ）前記マイクロサテライト・アンプリコンからの配列を所定の配列と比較し、所定の配列からのあらゆる逸脱（不安定性の指標である）を決定すること；
を含む方法、が提供される。
【００２９】
逸脱は、所定の配列と比較した場合、挿入又は欠失の形態であることがある。
【００３０】
任意選択的に、工程（ａ）において、表Ａで特定される、選択された群のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 6 種類又は少なくとも 7 種類を増幅するためにプライマーが提供され、任意選択的に、ここで、前記少なくとも 6 種類又は少なくとも 7 種類のマイクロサテライト遺伝子座が GM07、LR11、LR36、LR44、LR48、IM49 及び GM14 からなる選択された群である。
【００３１】
任意選択的に、工程（ａ）において、マイクロサテライト遺伝子座 DEPDC2 及び AP003532_2 を増幅するためにプライマーがまた提供される。
【００３２】
任意選択的に、工程（ａ）において、表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類、又は表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 17 種類、又は表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 18 種類、を増幅するために、プライマーが提供される。
【００３３】
より好ましくは、工程（ａ）は、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するために、プライマーを提供する。
【００３４】
より好ましくは、工程（ａ）は、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するために、プライマーを提供する。
【００３５】
任意選択的に、工程（ａ）は、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座を増幅するために、プライマーを提供する。
【００３６】
より好ましくは、工程（ａ）は、以下；
LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、GM07、LR36、LR44、LR48、LR11、AP003532_2、DEPDC2、GM14、IM49、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するために、プライマーを提供する。
【００３７】
任意選択的に、工程（ａ）は、以下；
LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、GM07、LR36、LR44、LR48、LR11、AP003532_2、DEPDC2、GM14、IM49、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座を増幅するために、プライマーを提供する。
【００３８】
上記で言及した遺伝子座は表Ａ中で更に特定される。
【００３９】
好ましくは、前記プライマーは、選択されたマイクロサテライト遺伝子座を同時増幅するためのものである。
【００４０】
好ましくは、（ｂ）マイクロサテライト・アンプリコンを生成するために、前記サンプルから、選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の複数種類を増幅すること、である前記工程は、選択された遺伝子座のセットを多重増幅反応において同時増幅することを含む。
【００４１】
任意選択的に、前記プライマー対は、多重化を可能にするように選択される。
【００４２】
あるいは、いくつかの別々のマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座が増幅され、別々の反応として配列決定される。
【００４３】
好ましくは、前記（ｃ）の工程は、ハイ・スループット又は次世代シークエンシングを使用する。
【００４４】
任意選択的に、工程（ｃ）は、シークエンシング‐バイ‐シンセシス（sequencing-by-synthesis）を使用する。
【００４５】
任意選択的に、工程（ｃ）は、イオン半導体シークエンシング（ion semiconductor sequencing）又はイオン・トレント・シーケンシング（ion torrent sequencing）を使用する。
【００４６】
任意選択的に、工程（ｃ）は、パイロシークエンシング（pyrosequencing）を使用する。
【００４７】
好ましくは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応によるものであり、及びプライマー・ペア（各プライマー・ペアは、選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の上流部分に相補的であるフォワード・プライマー及び前記選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の下流部分に相補的であるリバース・プライマーを含む）を使用することを使用する。
【００４８】
好ましくは、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の近距離内に一塩基多型（SNP）も含む。
【００４９】
任意選択的に、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の 100 塩基対以内に一塩基多型（SNP）も含む。
【００５０】
任意選択的に、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の 80 塩基対以内に一塩基多型（SNP）も含む。
【００５１】
任意選択的に、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の 50 塩基対以内に一塩基多型（SNP）も含む。
【００５２】
任意選択的に、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の 30 塩基対以内に一塩基多型（SNP）も含む。
【００５３】
好ましくは、前記一塩基多型（SNP）は、0.05-0.95 の間のマイナー対立遺伝子頻度（minor allele frequency）である。
【００５４】
好ましくは、前記一塩基多型（SNP）は、高い頻度である。
【００５５】
好ましくは、前記プライマーは、マイクロサテライト遺伝子座と SNP の両方を増幅するように選択される。
【００５６】
増幅工程（ｂ）は、マイクロサテライト及び SNP の両方を含むマイクロサテライト・アンプリコンを生成する。
【００５７】
前記方法は対立遺伝子の不均衡を決定する工程を含む。
【００５８】
前記方法は、MSI 誘発性 CRC 又はリンチ症候群を診断する工程を含むことがある。これは、適切なクラスの治療薬又は特定の治療薬（例えば、ペンブロリズマブ）を提案する工程を更に含むことがある。
【００５９】
上記の方法は、ミスマッチ修復が欠損していることを特定するのに有用であることがあり、ここで、2 つ以上のマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座について、所定の配列から逸脱していることは、ミスマッチ修復が欠損していることの指標である。
【００６０】
上記の方法は、MSI-H を特定するのに有用であることがあり、ここで、2 つ以上のマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座について、所定の配列から逸脱していることは、前記サンプルが高レベルのマイクロサテライト不安定性（MSI-H）を有していることの指標である。
【００６１】
任意選択的に、前記サンプルは、腫瘍サンプル、又は腫瘍細胞を検出するのに適した体組織又は体液である。
【００６２】
好ましくは、前記サンプルは、ヒトの組織サンプル又は体液サンプルである。
【００６３】
任意選択的に、前記サンプルは、核酸サンプルである。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、サンプル中のマイクロサテライト不安定性のレベルを評価するためのキットであって、以下：
表Ａで特定されるマイクロサテライト遺伝子座のセットから選択されたヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の複数種類を同時増幅するためのオリゴヌクレオチド・プライマー、
を含むキット、が提供される。
【００６５】
任意選択的に、前記プライマーは、表Ａで特定される、選択された群のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 6 種類又は少なくとも 7 種類を増幅するためのものであり、任意選択的に、ここで、前記少なくとも 6 種類又は少なくとも 7 種類のマイクロサテライト遺伝子座が GM07、LR11、LR36、LR44、LR48、IM49 及び GM14 からなる選択された群である。
【００６６】
任意選択的に、前記キットは、マイクロサテライト遺伝子座 DEPDC2 及び AP003532_2 を増幅するためのプライマーを更に含む。
【００６７】
任意選択的に、前記プライマーは、表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類、又は表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 17 種類、又は表Ａ及び／若しくは表Ｂの選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 18 種類、を増幅するためのものである。
【００６８】
より好ましくは、前記プライマーは、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するためのものである。
【００６９】
より好ましくは、前記プライマーは、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するためのものである。
【００７０】
任意選択的に、前記プライマーは、以下；
DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座を増幅するためのものである。
【００７１】
より好ましくは、前記プライマーは、以下；
LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、GM07、LR36、LR44、LR48、LR11、AP003532_2、DEPDC2、GM14、IM49、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも 10 種類を増幅するためのものである。
【００７２】
任意選択的に、前記プライマーは、以下；
LR49、IM66、LR20、GM11、LR24、IM16、GM17、GM9、GM07、LR36、LR44、LR48、LR11、AP003532_2、DEPDC2、GM14、IM49、
を含む選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト遺伝子座を増幅するためのものである。
【００７３】
典型的には、前記プライマーは、表Ｂで特定されたプライマーから上記のリストに従って選択される。
【００７４】
好ましくは、前記キットは、熱安定性ポリメラーゼも含む。
【００７５】
任意選択的に、前記キットは、標識された dNTPs 又はそれらの類似体も含む。
【００７６】
任意選択的に、前記標識された dNTPs 又はそれらの類似体は、蛍光標識されている。
【００７７】
本発明の別の態様によれば、シークエンシングの過程で特定された突然変異の生物学的意義を評価するための方法：
（ａ）選択された群のヒト・ゲノム DNA のマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の複数種類を増幅するためのプライマーを提供すること（前記マイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の近距離内に一塩基多型（SNP）を含み、前記プライマーは前記マイクロサテライト遺伝子座及び前記 SNP の両方を単一のアンプリコン中に増幅するように選択される）；
（ｂ）マイクロサテライト・アンプリコンを生成するために、前記サンプルから、選択されたマイクロサテライト・モノ‐ヌクレオチド反復遺伝子座の複数種類を増幅すること；
（ｃ）前記マイクロサテライト・アンプリコンをシークエンシングすること；及び、
（ｄ）前記マイクロサテライト・アンプリコンからの配列を所定の配列（野生型の配列）と比較し、所定の配列からのあらゆる逸脱（不安定性の指標である）を決定すること；並びに、
（ｅ）ヘテロ接合性 SNPs については、2 つの対立遺伝子のインデル頻度の間に偏りがあるかどうかを決定すること；
が提供される。
【００７８】
任意選択的に、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の 100 塩基対以内に一塩基多型（SNP）を含む。
【００７９】
任意選択的に、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の 80 塩基対以内に一塩基多型（SNP）を含む。
【００８０】
任意選択的に、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の 50 塩基対以内に一塩基多型（SNP）を含む。
【００８１】
任意選択的に、前記選択された群のマイクロサテライト遺伝子座は、前記マイクロサテライト遺伝子座の 30 塩基対以内に一塩基多型（SNP）を含む。
【００８２】
好ましくは、前記一塩基多型（SNP）は、0.05-0.95 の間のマイナー対立遺伝子頻度（minor allele frequency）である。
【００８３】
好ましくは、前記一塩基多型（SNP）は、高い頻度である。
【００８４】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、用語「含む（comprise）」及び「含む（contain）」並びにそれらの変形は「含むがこれらに限定されない（including but not limited to）」ことを意味し、それらは他の部分、添加、成分、整数又はステップを排除することを意図しない。
【００８５】
更に、本記載及び本特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、類似の要素を区別するために使用されており、必ずしも配列的な又は時系列的な順序を説明するために使用されているわけではない。そのように使用される用語は適切な状況下では交換可能であり、そして本明細書に記載された本発明の実施形態は、本明細書に記載又は例示された以外の順序でも実施可能である。
【００８６】
以下の用語又は定義は、単に本発明の理解を助けるために提供されている。本明細書で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者にとってのものと同じ意味を有する。当該技術の定義及び用語については、実施者は、特に、Sambrook ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y. (1989); 及び Ausubel ら、Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999) を参照のこと。更なる例として、Singleton 及び Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); 並びに Hale 及び Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) は、本発明で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料が本発明の実施において使用されるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載されている。
【００８７】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈上別段の要求がない限り、単数形だけでなく複数形も企図すると理解されるべきである。従って、本明細書で使用されるとき、文脈上明らかに別段が示されない限り、単数形の用語「a」、「an」、及び「the」は複数形への言及を含む。
【００８８】
別段が示されない限り、それぞれ、核酸は 5' から 3' への方向で左から右へ書かれる；アミノ酸配列はアミノからカルボキシへの方向で左から右に書かれる。本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されず、それらは当業者によって使用される文脈に応じて変わり得ることを理解すべきである。
【００８９】
本発明の特定の態様、実施形態又は実施例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、化学的部分又は基は、適合しない場合を除き、本明細書に記載の他の態様、実施形態又は実施例に適用可能であると理解される。
【００９０】
本明細書で言及された特許、科学及び技術文献は、出願時に当業者に利用可能であった知識を規定する。本明細書に引用されている取得済みの特許、公開されている及び係属中の特許出願、並びに他の刊行物の全開示は、あたかもそれぞれが参考として取り込まれて具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参考として本明細書に取り込まれる。どのような矛盾がある場合も、本発明が優先する。
【００９１】
本発明の様々な態様を以下に更に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
本発明をより良く理解できるように、実施形態を、ほんの一例として、そして以下の図面を参照して記載する；
【図１】図１は、異なる長さのモノヌクレオチド反復における対立遺伝子の不均衡の例を示す。パネルＡは腫瘍 U312 中の反復 IM14、パネルＢは腫瘍 U179_H03 中の反復 LR20、パネルＣは腫瘍 U029 中の反復 IM65、パネルＤは腫瘍 U303 中の反復 LR36、を示す。
【図２】図２は、両側フィッシャーの正確性検定の p-値を使用して測定した MSI-H サンプルと MSS サンプルの欠失頻度の対立遺伝子の偏りを示す。左側のサンプル＝ MSI-H サンプル、及び右側のサンプル＝ MSS（対照）サンプルである。前記線は、0.01 のボンフェローニ補正をした p-値に対応する。
【図３】図３は、リード（read）頻度の分布の例を示す。長さに従って分類されたリードの相対頻度は、MSS サンプル（169259）及び MSI サンプル（U179H03T）中の MNRs LR46（長さ 8 bp のポリ-A トラクト）及び LR44（12 bp のポリ-A）について示されている。横座標は参照配列の長さ（hg19）からの逸脱を表す。
【図４】図４Ａは、対立遺伝子の偏りの例を示す。隣接 SNP（rs6040079）についてヘテロ接合性である患者由来の 2 例のサンプル中での LR46 に関して、対立遺伝子特異的なリード（read）頻度及びサイズを示す。U029N ＝正常な体細胞組織、U029T ＝マイクロサテライト不安定な腫瘍。図４Ｂは、単一の MNRs を用いたサンプルの分類を示す。
【図５】図５は、MNR LR44 の MSI サンプル及び MSS サンプルにおいて欠失を有するリード（read）の相対頻度を示す。Ｂ．欠失を示すリードの割合に従って層別化された MSI サンプル及び MSS サンプルについての MNR LR44 での対立遺伝子の偏りの解析（図３及び本文参照）。
【図６】図６は、欠失頻度のデータのみ（Ａ）、対立遺伝子の偏りのデータのみ；（Ｂ）を用いた試験サンプルの分類を示し、両方のパラメータを組み合わせたものを用いた試験サンプルの分類を示す（Ｃ）。
【図７】図７は、トレーニング・セットの分類を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
マイクロサテライト不安定性についての試験は、MMR が十分に機能していることを評価するために使用される主要な方法の 1 つである。しかしながら、体細胞マイクロサテライト突然変異は、MMR が十分に機能している腫瘍においても観察されることがある。従って、低レベルのマイクロサテライト不安定性が検出されることは、ミスマッチ修復が欠損していることの指標とは考えられない（de la Chapelle 及び Hampel、2010 並びに Laiho ら、2002）。マイクロサテライト不安定性は、マイクロサテライトのパネルを増幅することと、その後にキャピラリー電気泳動で増幅断片を解析することによって、一般に試験される。様々なパネルが推奨されており、現在の試験は長い MNRs に依存している（例えば Boyle ら、2014）。長いホモポリマーは、in vivo 及び in vitro の両方で、より不安定になる傾向があり、そして PCR-誘導エラーによって、エレクトロフェログラムにおける粗いピークがもたらされる（Shinde ら、2003）。このため、下流の表現型の解釈が複雑になることがあり、フラグメント・サイズのプロファイルを目視で検査することが必要となることがある。
【００９４】
サンプルを、マイクロサテライト変異の頻度に従って分類することがある。例えば、遺伝性非ポリポーシス大腸がん（リンチ症候群）及びマイクロサテライト不安定性に関する改訂されたベセスダ・ガイドライン（the Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability）には、5 つの外見上単型（monomorphic）MNR のパネルを用いた分類が記載されている（Umar ら、2004）。2 つ以上の MMR 内に突然変異を示すサンプルをマイクロサテライト不安定性高（MSI-H）サンプルと命名し、変化した MNR を 1 つだけ有するサンプルを MSI-L（マイクロサテライト不安定性低）と命名し、全てのマイクロサテライトが安定のように見えるサンプルを MSS（マイクロサテライト安定）と命名する。MSI-H ステータスは MMR が欠損していることの指標である。
【００９５】
マイクロサテライト不安定性によって MMR システムの機能は評価される。別の方法は、免疫組織化学（IHC）によりその構成要素が存在することを確認することである。タンパク質が欠損することは、コードされたポリペプチドの未成熟切断及びナンセンス変異崩壊を引き起こす突然変異、又はそれらの構成要素が加速的に分解されることを引き起こすタンパク質複合体の不安定化、から生じることがある（Shia、2008）。免疫組織化学は高度に熟練した人を必要とする。MMR 機能不全の結果とは対照的に、IHC は MMR を MMR タンパク質レベルで評価するので、マイクロサテライト不安定性による結果と IHC 解析との間にはある程度の不一致がある（Shia 2008 及び Zhang 2008）。報告された一致はさまざまであるが、92 % の MSI を予測する IHC の感度が報告されている（Shia、2008）。
【００９６】
過去数年の間に、いくつかのグループがマイクロサテライト不安定性を特定するためのシークエンシングに基づくアプローチを開発した。これらには、ゲノム（Niu ら、2014）又はトランスクリプトーム（Lu ら、2013）ワイド・データ、並びに標的富化ライブラリー由来の配列（Salipante ら、2014）を利用する方法が含まれる。in vitro 増幅エラー（PCR 産物中に様々なリード長が存在することになる）によって、配列決定‐ベースのアプローチが複雑になることがある。そのようなアーティファクト（artefacts）の頻度は MNRs 間で異なるが、出発材料に変異が無い場合でも、いくつかの変異リードの検出が起こり得る。増幅エラーの問題に取り組むための 1 つのアプローチは、PCR アーティファクトと出発材料中の MNR 突然変異が本当に存在することとを区別するために突然変異体分子の割合の閾値を使用することである（例えば、Salipante ら、2014）。
【００９７】
短い MNR は、長い MNR よりも多型性が低い傾向がある（Ananda ら、2013）。従って、短い MNRs においては、生殖細胞系列の変異体に遭遇する可能性は少なく、このことは、対応する生殖細胞系列の DNA を必要とすることなく、腫瘍における MSI 状態を評価するのに適していることを示唆している。より低い突然変異率はまた、より短い反復に由来する突然変異体のリードが単一の突然変異事象を反映する可能性がより高く、頻発性のアーティファクトが両方の対立遺伝子に影響を及ぼす一方で、1 つの対立遺伝子にのみ影響を及ぼす、ことも意味する。結果として、長さの変異が 1 つの対立遺伝子に集中しているかどうかを評価することによって、PCR アーティファクトと in vivoで生じる変異とを区別するための更なる基準が提供される。
【００９８】
本発明者らは、サンプルを 2 つのクラス：MSI 及び MSS、に分離することを可能にする、ハイ・スループット及び自動化した MSI 解析に適した方法を開発した。前者はフラグメント解析により MSI-H として分類されたサンプルに対応し、一方、後者は MSS サンプル及び低レベルの不安定性（MSI-L）を有するサンプルを含む。
【００９９】
本発明者らは、短い MNR のパネルを選択し、そして MNR 特異的な変異体のリード頻度の閾値及び対立遺伝子の偏りの両方に基づいて、不安定性をスコア化するための方法を開発した。分類に必要とされるパラメータを、MSI 状態が事前に明らかにされている、一連の 139 例の腫瘍において決定し、70 例の腫瘍の独立したコホートを、この方法をブラインドで検証するために使用した。
【０１００】
従って、本発明者らは、MSI 腫瘍を検出する新規なアプローチを開発したが、それの主なる有益な点はその単純さにあり、その単純さによって、対照となる正常な DNA を必要としないハイ・スループット解析に適したものになる。腫瘍がミスマッチ修復の破綻から生じたかどうかを確定することは、個々の臨床管理において重要であり、そして生殖細胞系列に分子の欠損がある家族において、将来のがんを予防することの一助となることがある。全ての大腸がんに検査を拡大することは、英国では費用対効果が高いことが示されており（Snowsill ら、2014）、英国国民保険サービスの国立医療技術評価機構（National Institute of Healthcare and Clinical Excellence (NICE)）のガイダンス（NICE, 2017, 大腸がんに罹患している人々におけるリンチ症候群に対する分子検査の戦略（Molecular testing strategies for Lynch syndrome in people with colorectal cancer））に基づく標準治療に、間もなくなる。他の先進国でも同様の決定が下されている。拡張可能で、信頼性の高い MSI 検査は、臨床的な有用性があると同時に、コストが手頃で、この解析を、迅速な選択を保証し、腫瘍プロファイリングと精密医療に向けた更なる分子的アプローチを容易にするのに役立つ、ルーチンな病理学評価に結び付けることができる。
【０１０１】
定義
本明細書で使用される用語「マイクロサテライト（microsatellite）」又は「マイクロサテライト領域（microsatellite regions）」は、少なくとも 2 つの反復単位からなり、最小長が 6 塩基である、ヌクレオチド配列中のモノ‐、ジ‐、トリ‐、テトラ‐、ペンタ‐又はヘキサヌクレオチド反復を意味する。マイクロサテライトの特定のサブクラスには、ホモポリマーが含まれる。
【０１０２】
本明細書で使用される「ホモポリマー（Homopolymer）」は、少なくとも 6 塩基のモノヌクレオチド反復であるマイクロサテライト領域を意味する；言い換えれば、DNAレベルで見れば、少なくとも 6 つの連続したA、C、T 又は G 残基のストレッチである。最も具体的には、マイクロサテライトを決定するとき、被験体のゲノム DNA（又は被験体に存在するがんのゲノム DNA）を調べる。
【０１０３】
本出願で使用される用語「MSI 状態（MSI status）」は、マイクロサテライト不安定性（MSI）の存在、マイクロサテライト中の反復 DNA ヌクレオチド単位の数におけるクローン性又は体細胞性の変化を意味する。MSI 状態は、3 つの異なるクラス：MSI-H（MSI-高、MSI 陽性若しくは MSI とも呼ばれる）、MSI-L（MSI-低とも呼ばれる）、又はマイクロサテライト安定（MSS）（MSI が無いとも呼ばれる）、のうちの 1 つであることがある。典型的には、MSI-H として分類されるためには、MSI 状態を分類するために使用されるマーカーの少なくとも 20 % が陽性とスコア付けされる必要があるが、MSS に分類されるときは 2.5 % 未満が陽性とスコア付けされる。中間数のマーカーが陽性であるとスコア付けされた場合、その腫瘍は MSI-L として分類される。或いは、マイクロサテライト不安定性の存在と非存在との間の差異のみが評価され、その場合、前記状態は MSI が存在又は MSI が無い（= MSS）のいずれかである。
【０１０４】
本明細書で使用される「インデル（indel）」は、挿入、欠失、及びそれらの組み合わせの両方を含む突然変異のクラスを意味する。マイクロサテライト領域中のインデルは、ヌクレオチドが正味増える、又は減ることになる。インデルの存在は、それをインデルが存在しない DNA と比較すること（例えば、腫瘍サンプル由来の DNA と前記腫瘍を有する被験体由来の生殖細胞系列 DNA とを比較すること）によって、又は、特に単型のマイクロサテライト又はホモポリマーの場合には、それを既知の長さのマイクロサテライトと比較することによって、具体的には反復単位の数を数えることによって、規定されることがある。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「がん（cancer）」は、制御されていない細胞増殖等を含む異なる疾患を意味し、悪性新生物とも呼ばれる。用語「腫瘍（tumor）」は、本出願において同義語として使用されている。この用語は全ての固形腫瘍タイプ（がん腫、肉腫、芽細胞腫）を網羅すると考えられるが、それはまた白血病等の非固形がんタイプも明白に包含する。従って、「腫瘍 DNA のサンプル（sample of tumor DNA）」はまた、白血病の人からの血液サンプルであることもある。典型的には、腫瘍 DNA のサンプルはある時点で被験体、具体的にはがんを有する被験体から単離されている。任意選択的に、腫瘍 DNA のサンプルは、DNA の配列決定するために、1 つ以上の形態の前処理（例えば、溶解、分画、分離、精製）を受けているが、未処理サンプル由来の DNA が配列決定されることも想定される。本明細書で使用される名詞「被験体（subject）」は、個々の脊椎動物、より具体的には個々の哺乳動物、最も具体的には個々の人間を意味する。本明細書で使用される「被験体（subject）」は、典型的にはヒトであるが、哺乳動物、具体的にはネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、フェレット、ラット、マウス等の家畜（domestic animals）、又はウマ、雌ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラマ等の家畜（farm animals）であることもある。被験体は、魚類、爬虫類、両生類又は鳥類のような非哺乳動物の脊椎動物であることもある；重要なことは、がんを発症する可能性のあるどんな動物でも、その定義を満たすということである。
【０１０６】
本明細書で使用される用語「リンチ症候群（Lynch syndrome）」は、結腸がん、並びに子宮内膜、卵巣、胃、小腸、肝胆管、上部尿路、脳及び皮膚がんを含む他のがんのリスクが高い常染色体優性の遺伝的状態を意味する。これらのがんのリスクが増加することは、DNA ミスマッチ修復を損なう遺伝性の突然変異によるものである。この症状の古い名前は HNPCC である。
【０１０７】
以下の実施例の節で詳細に説明するように、本発明は、MSI-H 腫瘍と MSS 腫瘍（例えば、リンチ症候群等の MSI-H CRCs）とを区別するために使用することができる複数種類のマーカーを提供する。18 種類及び 17 種類のマーカーの特定のパネルが実施例１及び２に提供されている。しかしながら、これらのパネル内の有益なマーカーの任意の組み合わせが使用されることもある。従って、本発明の方法及びキットは、2 種類以上のマーカー（表Ａ及び／又は表Ｂで特定される）を利用することがあり、そして特に、実施例１の検証済みの 18-反復パネル及び／又は実施例２の検証済みの 17-反復パネル内に存在する、2 種類以上（すなわち、2、3、4、5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 又は 26 種類）のマーカーを利用することがある。
【０１０８】
実施例１の 18-マーカーのパネル及び実施例２の 17-マーカーのパネルは、9 種類のマーカー、はっきりとは DEPDC2、AP003532_2、GM7、GM14、LR11、LR36、LR44、LR48 及び IM49 を共通に有する。マーカーのこの具体的な組み合わせは、どちらのパネルに関しても MSI-H と MSS の腫瘍を区別するのに有益であることがわかってきている。従って、マーカーのこの具体的な組み合わせは、本発明の文脈内で特に使用されることがある（又は類似の組み合わせ（これらのマーカーのうちの少なくとも 1 種類、例えば GM14、が省略されている））。他のマーカーが加えられることもある。
【０１０９】
これらのマーカーのうちの 7 種類、すなわち GM7、GM14、LR11、LR36、LR44、LR48 及び IM49 は MSI 状態を試験するための新たに特定されたマーカーであることが特に注目される。従って、これらのマーカーのうち、1 種類以上、例えば、2 種類以上、3 種類以上、4 種類以上、5 種類以上、6 種類以上、又は 7 種類全てを利用する任意のパネルが本発明に含まれる。従って、マーカーのこの特定の組み合わせは、本発明の文脈内で特に使用されることがある（又は類似の組み合わせ（これらのマーカーのうちの少なくとも 1 種類、例えば GM14、が省略されている））。他のマーカーが加えられることもある。
【０１１０】
実施例２で、特に有益である追加の 8 種類の小さい（7-9 bp）マーカー、即ち GM9、GM11、GM17、LR20、LR24、LR49、IM16 及び IM66 が特定されたこともまた注目される。これらのマーカーはそれぞれ、MSI 状態を試験するための新たに特定されたマーカーである。従って、これらのマーカーのうち、1 種類以上、例えば、2 種類以上、3 種類以上、4 種類以上、5 種類以上、6 種類以上、7 種類以上、又は 8 種類全てを利用する任意のパネルが本発明に含まれる（例えば、GM09、GM11、LR49、IM16、LR20 及び LR24、任意選択的に他のマーカー、の組み合わせを使用すること、は特に含まれる）。従って、マーカーのこの特定の組み合わせは、本発明の文脈内で特に使用されることがある（又は類似の組み合わせ（これらのマーカーのうちの少なくとも 1 種類が省略されている））。他のマーカーが加えられることもある。
【０１１１】
上記に従って、実施例１及び２のパネルを使用して検証されてきた MSI 状態を決定するための新たに特定されたマーカーには、GM7、GM14、LR11、LR36、LR44、LR48、IM49、GM9、GM11、GM17、LR20、LR24、LR49、IM16 及び IM66 が含まれる。従って、MSI 状態を決定する（及び／又はリンチ症候群などの MSI-H CRSCS の診断又は診断を容易にする、及び／又はミスマッチ修復の欠損が存在していることを決定する）ために、何れのこれらのマーカーを使用することは本発明に含まれ、前記マーカーは単独で、又は他の既知のマーカーと組み合わせて、又は本明細書で特定された 1 種類以上の新規マーカーと組み合わせて用いられる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「マイクロサテライト遺伝子座（microsatellite loci）」、又は「反復（repeat）」及び「マーカー（marker）」は、文脈が許す限り互換的に使用される。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「GM07」及び「GM7」は、本明細書では互換的に使用される。同様に、「AP003532_2」と「AP0035322」という用語も互換可能である。
【０１１４】
本発明の態様は、以下の非限定的な実施例によって説明される。
【実施例】
【０１１５】
本実施例は、CRC 腫瘍における不安定性に関するゲノム・ワイド解析が、不安定な短いマイクロサテライトを特定するためにどのように使用されたかを記載する。配列決定エラー及び不安定性のデコンボリューションを容易にするために、高頻度 SNPs に連鎖する反復を特定することに特に焦点が当てられた。120 種類の 7-12 bp マーカーが特定された。次いで、本発明者らは、このスクリーニングによって定義された 120 種類の 7-12 bp マーカーのパネルを、配列決定に基づくタイピングの為に評価した。2 つの研究の中で、特定されたモノヌクレオチド反復の最初の 120 種類を小パネルの腫瘍で解析して、これらの反復が MSI を同定するためのマーカーとして使用できることを確認した。最初の研究では、特に有益な 18 種類の反復のパネルが特定された（実施例１）。2番目の研究では、短い長さ（7-9 bp）の反復に焦点が当てられ、特に有益な 8 種類のマーカーを追加的に特定した。これらの 8 種類のマーカーを実施例１の最も有益な 9 種類のマーカーと組み合わせて、新しい 17 種類のマーカーのパネルが生成された（実施例２）。次に、より有益な反復のいくつかを用いてより大きな大腸腫瘍のパネルを解析したところ、それぞれ 18 種類及び 17 種類の反復の 2 つのパネルは、それぞれ MSI-H 腫瘍での欠失に対して非常に感受性が高く、MSI-H と MSS 腫瘍とを区別するのに使用することができる、ということが示された。
【０１１６】
従って本発明は、MSI-H 腫瘍と MSS 腫瘍とを区別するために使用することができる複数種類のマーカーを提供する。18 種類及び 17 種類のマーカーの特定のパネルが提供される。しかしながら、これらのパネル内の特に有益なマーカーの任意の組み合わせが使用されることもある。従って、本発明の方法及びキットは、2 種類以上のマーカー（表Ａ及び／又は表Ｂに特定される）を利用することがあり、そして特に、実施例１の検証済みの 18-反復パネル及び／又は実施例２の検証済みの 17-反復パネル内に存在する、2 種類以上のマーカーを利用することがある。
【０１１７】
実施例１から３は、サンプル毎に各反復を個々に PCR 増幅し、その後にシークエンシングするためにプールする（pooling）必要があるアッセイを用いて、本発明の方法を実施することができる方法を記載する。
【０１１８】
実施例４は、単一分子‐分子反転プローブ（single molecule-molecular inversion probe（smMIP））技術を用いる多重シークエンシングに基づくアッセイを用いて、本発明の方法をどのように実施できるかに関する詳細情報を提供する。よく知られているように、多重化はそのような方法の全体的なコストと複雑さを減らす。smMIPs によって、前記 DNA サンプル中の全ての目的のマーカーを同時に標的化し、捕捉し及び PCR 増幅することが可能になる。これにより、各サンプルについてマーカー毎の増幅 DNA 配列をプールする必要がなくなり、それゆえ：実験室の作業の合理化、コストの削減、投入される DNA サンプルの量の削減、サンプルが混じりあってしまうリスクの低減、及びアッセイの所要時間の短縮が可能になる。本発明者らは、以下の実施例４に概説されるように、大きなパネルの目的のマーカーについて smMIP を設計し、試験をした。
【０１１９】
＜実施例１−短い反復を優先するモノヌクレオチド反復のパネルの選択＞
ミスマッチ修復（MMR）を欠損する腫瘍における短いモノヌクレオチド反復の安定性又は変動性を、ゲノムレベルで調べるために、MSI-H 大腸がんからの全ゲノム配列データを調べて、MSI-H 腫瘍において非常に可変的である新しいホモポリマーを特定した。
【０１２０】
全ゲノム解析から、合計 218,181 種類の可変的な 7-12 bp のホモポリマーが特定された。インデル（挿入又は欠失）を有する 216495 種類の A/T モノヌクレオチド反復が特定されたが、C/G モノヌクレオチド反復は 1686 種類のみであった。G/C モノヌクレオチド反復よりも多くの不安定な A/T モノヌクレオチド反復が見つかったことは、Yoon ら（2013）によって細胞株において報告されたデータと一致する。MSI 検出のための特定の反復を検証するために、全ゲノム解析において特定された最も不安定なホモポリマーのいくつかを、更なる解析のために選択した。218,181 種類の可変的な 7-12 bp のホモポリマーのリストを、各群（MSI-H サンプル、MSI-H サンプルに対応した正常サンプル、及び MSS サンプル）について、1 つのリードあたりの深さ（a read depth）が 20 x 以上である反復のためのフィルタリングをすることによって絞り込んだ。一般的な多型（dbSNPバージョン 173、hg19）を持つ反復は除外した。7-10 bp の反復を、それらが MSI 高サンプル群において 10 % 以上の変異体リードの割合（variant read fraction）であり、そして対照において変異体リードが無い場合に、選択した。11-12 bp について、反復を、それらが MSI-H サンプルにおいて 15 % 以上の代替対立遺伝子の割合（alternate allele fraction）であり、そして対照において 5 % 以下の変異体リードの割合である場合に、選択した。11-12 bp の反復における 5 % 以下の変異体リードの割合（variant read fraction）は、シークエンシング・エラー及び PCR エラーによって引き起こされると推定された。対照サンプル中のインデル頻度が低いホモポリマーは、低いバックグラウンド・エラー率で反復を扱うことがより容易であるために望ましい。バックグラウンド・エラーの変動はある程度、配列の文脈に起因し得ると推定される。
【０１２１】
ホモポリマーは、30 bp 以内に、高いマイナー対立遺伝子頻度を有する SNPs を包含することが選択されることを確実にするために選択された。Perl スクリプトである AnnotateCloseSNPs.pl を使用して、反復開始から 30bp 以内の SNPs に注釈を付けた。反復の 30 bp 以内に、複数の SNP が検出された場合は、SNPs の値を評価するための迅速な方法として、マイナー対立遺伝子頻度を一緒に加えた。反復は、その反復の 30 bp 内に、マイナー対立遺伝子頻度の SNPs が有る場合、唯一選択され、少なくとも 0.2 の頻度になるまで、合わせられた。全部で 529 種類の A/T ホモポリマーがこれらの基準に適合した。データセット中に G/C ホモポリマーはほとんど無かったので、反復の 30 bp 以内の SNPs を含めるという基準を省き、各群における 1 つのリードあたりの深さ（a read depth）が 20 x 以上との要件を緩和した。これにより、33 種類の G/C ホモポリマーのデータ・セットが得られた。
【０１２２】
UCSC Genome ブラウザ（Kent ら、2002）を用いて、上記の基準に合格したホモポリマー用のプライマーを作成する可能性を評価した。上記の選択基準を満たす 529 種類の A/T ホモポリマー及び 33 種類の G/C ホモポリマーの多くは、LINES 及び SINES 等の、低い複雑度の領域（regions of low complexity）に位置しており、そのことによって、プライマーをミスプライミングの危険性無しに生成することができる、反復の数が限定された。適切なプライマーを作製することができる 120 種類の最も可変的な反復を選択して、MSI 反復長の変動を配列決定に基づいて検出する上での、これらの特定のモノヌクレオチドの有用性を評価した。これらを以下の表Ａに示す。
【０１２３】
【表１−１】
2019528076.tif 000003
【表１−２】
2019528076.tif 000004
表Ａ：配列決定された 120 種類のモノヌクレオチド反復のリスト。このリストは、命名された反復の名称、各モノヌクレオチド反復の長さ及び位置、並びに隣接 SNPs の rs 番号を含む。
【０１２４】
MSI 反復長の変動を配列決定に基づいて検出する上での、特定のモノヌクレオチドの有用性を評価することを、イルミナのシークエンシングを用いて原発腫瘍及び対照組織の小パネルで解析した。選択した 120 種類の不安定なモノヌクレオチド反復（7-12 bp）を FFPE 組織から増幅し、そしてイルミナ MiSeq を使用して配列決定した。高いマイナー対立遺伝子頻度を有する SNPs の 30 bp 内の反復を選択した。2 つの理由から、捕捉に基づくアプローチの代わりに PCR を使用した。PCR を使用し、その後アンプリコンをほぼ等モル濃度にプールすることによって、分解した DNA から全ての領域をカバーすることはより簡単である。多くのモノヌクレオチド反復は相同性の高い領域にあり、これがプローブのミスプライミング及び望ましくない配列を捕捉することにつながる可能性があるため、捕捉ベースのアプローチを使用することは、所望のモノヌクレオチド反復配列を高い割合で落としてしまう危険性もある。
【０１２５】
プライマーは、Primer3（Rozen and Skaletsky、2000）を用いて、又は Primer3 が適切なオリゴを返さない場合はマニュアルで設計した。マニュアルで設計されたプライマーは 57 ℃- 60 ℃の Tm を有した。前記 Tm は以下のように計算された：Tm = 4×(G+C)+2×(A+T)。プライマーは、〜300-350 bp のアンプリコンを生成するように設計された。SNP Check（https://ngrl.manchester.ac.uk/SNPCheckV2/snpcheck.htm）を使用して一般的な SNPs を、BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）又はBLAT（Kent、2002）を使用してオフ・ターゲット結合を、並びに OligoCalc（http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html）又は Primer3 を使用して適切な融解温度及び二次構造が無いことを、チェックした。前記プライマーは、Metabion（Metabion International AG、シュタインケルヘン、ドイツ）又は Biobasic（Bio Basic Inc.、マーカム、カナダ）のいずれかによって製造し、脱塩によって精製した。全てのプライマーのリストは以下の表Ｂに見出すことができる。このパネル中のプライマーは、下流ライブラリーの調製を容易にし、そしてその調製の費用を減少させるために、末端が突出しているオリゴヌクレオチドでタグ付けした。
【０１２６】
【表２−１】
2019528076.tif 000005
【表２−２】
2019528076.tif 000006
【表２−３】
2019528076.tif 000007
【表２−４】
2019528076.tif 000008
【表２−５】
2019528076.tif 000009
【表２−６】
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【表２−７】
2019528076.tif 000011
表Ｂ：アンプリコン／反復の名称、アンプリコンの位置（ゲノム・ビルド hg19（genome build hg19））、プライマー、及びモノヌクレオチド反復に近接した SNPs の SNP rs 番号を含むリスト。
【０１２７】
＜モノヌクレオチド反復におけるインデルを解析するのに最良のコーラー（caller）を選択する為の、120 種類の反復についての配列データの解析＞
FFPE 組織は、6 例のリンチ症候群腫瘍、これらの腫瘍のうちの 5 例について対応する正常な粘膜、及び 6 例の MSS 腫瘍からなる（表１）。対応した正常組織については、材料が少なすぎて 120 種類の反復全てのシークエンシングができず、この材料は反復を選択するためのみに使用した。他のサンプルでも、利用可能な DNA の量は限られた供給量であった。高い正確性を持つ Pfu に基づく Herculase II Fusion DNA ポリメラーゼ及び 35 回の PCR サイクルを使用して、約 300 bp のアンプリコンを生成した。アンプリコンを Qiagen QIAxcel を用いて定量し、次いでほぼ等モル濃度でプールした。Agencourt AMPure XP ビーズを PCR クリーン‐アップに使用した。PCR クリーン‐アップの後、前記アンプリコン・プールを 0.2 ng の濃度に希釈し、Illumina Nextera XTキット（Illumina、サン・ディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用する Library Prep を行った。
【０１２８】
【表３】
2019528076.tif 000012
表１：リンチ症候群腫瘍からなる組織サンプル、前記リンチ症候群腫瘍に対応する正常組織、及び MSS 腫瘍。
【０１２９】
全ゲノムデータから特定された、隣接する SNPs を有する 120 種類のホモポリマーに関する初期スクリーニングによって、配列決定された 5 例の MSI 腫瘍において高レベルの不安定性が示された。その結果によれば、短い 7bp-9bp A/T 反復の 40 %、より長い 10bp-12bp A/T 反復の 80 %、及び G/C 反復の 33 % が少なくとも 1 例の腫瘍において不安定性を示すことが示された。マーカーが、欠失頻度 ＞ 5 % 及び、7-9bp の反復については、何れの対照サンプルの欠失頻度の少なくとも 2 倍の欠失頻度、又は 10-12bp の反復については、何れの対照サンプルの欠失頻度の 1.5 倍の欠失頻度、である場合、マーカーを不安定であると定義した。
【０１３０】
反復の 30bp 以内に位置するヘテロ接合性の SNPs を使用して、本発明者らはまた、MSI-H サンプルにおいて、欠失と共にリードの対立遺伝子の偏りを示す反復が過剰にあることを示すこともできた。
【０１３１】
MSI-H サンプルの少なくとも 60 % で不安定であると分類され、少なくとも 0.9 の曲線下面積（area under the curve (AUC)）も有する、全ゲノム解析由来の 10 種類のマーカーを更なる研究をするために選択した。不安定性を示した、文献から得られた 10 種類のマーカーもまた、更なる解析をするために選択し、合計で 20 種類のマーカーが得られた（表２に示す）。
【０１３２】
【表４】
2019528076.tif 000013
表２：反復の最終パネルにおける各マーカーについての受信者操作特性曲線の下の面積（area under the receiver operating characteristic curve (AUC)）。この表は、各反復の長さ、反復単位、及び受信者操作特性曲線の下の面積として表される MSI-H サンプルと MSS サンプルとを識別する各反復の識別力、を示す。
【０１３３】
不安定性をコールするための閾値を定義し、選択された反復のパネルが MSI-H 腫瘍と MSS 腫瘍とを区別するのに十分であるかどうかを決定するには、より多数の腫瘍を必要とした。合計 92 例の腫瘍サンプルを入手した。
【０１３４】
92 例の腫瘍からの DNA を最初に評価して、いくつの腫瘍が 20 種類のマーカーのパネルに対して長さが約 300bp のアンプリコンを生成するのに十分な DNA の量及び質を有するのかを特定した。MSI-H 腫瘍と MSS 腫瘍とを区別するのに 20 種類のマーカーで十分であるはずこと、及び多くの腫瘍ではより大きなパネルを増幅するのに十分な DNA がなかったことから、前記パネルのサイズを選択した。3 例の腫瘍については、出発材料が少なすぎて 20 種類の反復を増幅することができなかった。残りの 89 例の腫瘍 DNA サンプルのうち、約 300bp のアンプリコンを用いて 58 例のサンプルを増幅することができた。
【０１３５】
MSI-H サンプルと MSS サンプルとを識別する各反復の識別力は、受信者操作特性曲線の下の面積（area under the receiver operating characteristic curve (AUC)）を用いて評価した。
【０１３６】
受信機動作特性曲線は、真陽性率及び偽陽性率を測定する方法である。この場合、前記 AUC は、所与のホモポリマーが MSI-H サンプルと MSS サンプルとをどの程度うまく区別することができるかの尺度である。全ての MSI-H サンプルが所与の反復について MSS サンプルよりも高い欠失頻度を有する場合、AUC は 1 になる。この場合、データセットから無作為に選択された任意の MSI-H サンプルが、データセットから無作為に選択された任意の MSS サンプルよりも高い欠失頻度を有するという、可能性は 100 % である。AUC 値が 0.5 であれば、無作為に選択された任意の MSI-H サンプルが、無作為に選択された任意の MSS サンプルよりも高い欠失頻度を有する可能性が 50-50 であるため、反復に識別力がないことを意味する。
【０１３７】
最終パネル中の全ホモポリマーの AUC 値を表２に示す。平均して、前記 AUC は、反復長 12bp まで、反復長と共に増加する。これは、12bp の長さまでは、より長い反復が、MSI-H サンプルと MSS サンプルとを識別するのにより優れていることを意味する。これは、より長いマイクロサテライトがより短い反復よりもマイクロサテライト不安定性のイベントを起こしやすいために予想されたことであった。従って、より短い反復については、突然変異によって影響を受けていない反復が MSI-H サンプルの中により多くあり、MSI-H サンプルと MSS サンプルとを識別する識別力を低下させる。13bp 及び 14bp の反復はそれぞれ 0.9 及び 0.722 の AUC を有する。これらは、全ての 12bp 及び 11bp 反復のうちの 1 つを除く全てに見られる AUC 値よりも低い AUC 値である（表２参照）。これは、これらの反復においてシークエンシング・エラー及び PCR エラーが非常に高く、MSI-H サンプルと MSS サンプルとの間を識別することにとって、不安定性の尺度として全ての欠失の頻度を使用することは、より短い 11bp 及び 12bp の反復の場合よりも、もはや良くないことを示す。他方、選択された 13bp 及び 14bp の反復は、配列状況のために MSI をより起こしにくい傾向にある可能性があり、これら 2 つよりも不安定な他の 13bp 及び 14bp 反復がゲノム中に多くあるかもしれない。
【０１３８】
14bp 反復である FBXO46 に関しては、低い AUC はまた、いくつかの対照において、配列長の多型が存在していることに起因している可能性もある。前記腫瘍のうちの 1 つは、この反復についての配列長の多型を有し、このことは、あるサンプルでは FBXO46 が多型性であり得る可能性があることを示す。FBX046 を好ましいパネルから削除した。
【０１３９】
本発明者らは、シークエンシング・エラーがホモポリマーの長さにある程度依存することを見出した。従って、不安定性をコールするための異なる閾値が、異なるホモポリマーの長さに対して必要とされるであろう。マーカーを不安定とコールするための閾値は、個々のマーカーのそれぞれの感度及び特異性を評価することによって、各反復長について決定することがある。感度と特異性は試験の正確さを測るために使われる。感度は、症状が有り、その症状に対して陽性の検査結果が有る患者の割合として測定される。特異性は、症状が無い、及びその症状に対して陰性を示す患者の割合である。従って、感度と特異性は次のようにまとめることができる：
感度=真陽性／（真陽性+偽陰性）、
特異性=真陰性／（真陰性+偽陽性）。
【０１４０】
この研究のために、標準的なプロメガ MSI 試験（MSI Analysis System、バージョン1.2：プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を用いて、腫瘍が事前に MSI-H として分類されていた場合、腫瘍を MSI-H として定義した。不安定性がプロメガ MSI 試験の 5 種類のマーカーの何れにおいても検出されなかった場合、腫瘍を MSS として分類した。配列決定をしたそれぞれの短いモノヌクレオチド反復について、感度曲線及び特異性曲線を作成した。それぞれの感度曲線及び特異性曲線は、ｘ軸上に欠失を含むリードの頻度を有する。前記感度曲線は、ｘ軸上に示される欠失頻度以下の欠失頻度を有する MSI-H サンプルの割合（ｙ軸）を示し、これは各所与の欠失頻度における感度である。前記特異性曲線のｘ軸は MSS サンプルの割合である。前記特異性曲線は、各所与の欠失頻度における特異性であるｙ軸上に示される頻度以上の欠失頻度を有する MSS サンプルの割合（ｙ軸）を示す。
【０１４１】
8bp 反復のうち、LR46（全ゲノム解析から抽出された）は、40 % までの欠失頻度に関して DEPDC2（文献から得られた）よりも高い感度を有する。両方の反復は 4.1 % の欠失頻度で 100 % の特異性を有する又は偽陽性を有さない。この欠失頻度で、LR46 は、28 例の MSI-H サンプルのうち 12 例で検出される 42.9 % の感度を有し、DEPDC2 は、23 例の配列決定された MSI-H サンプル中 6 例で検出される 26.1 % の感度を有する。
【０１４２】
9bp の反復の全ては、5.5 % 以上の欠失頻度に対して 100 % の特異性を有する。5.5 % の欠失頻度では、2 つの反復 AP003532_2 と TTK がそれぞれ 57.1 % と 43.5 % の最高の感度を有する。2 つの反復 AL954650 及び AL359238 は、この欠失頻度で 42.1 % 及び 21.7 % の感度を有する。
【０１４３】
10bp の反復の全ては、14.2 % 以上の欠失頻度で 100 % の特異性を有する。14.2 % の欠失頻度について、反復 LR32 は 82.1 % の感度を有し、これは、この欠失頻度で、どの 10bp の反復よりも、最も高い。他の 10bp の反復である AVIL、AL3551554、GM29 は、それぞれ 71.4 %、35.3 % 及び 25.9 % の感度を有する。
【０１４４】
11bp の反復について、反復 ASTE1 は、欠失頻度は 11.9 % - 19.75 % の範囲である対照サンプルにおいて、最も高い頻度の欠失を有していた。11bp の反復の全ては、19.8 % 以上の欠失頻度で 100 % の特異性を有する。
【０１４５】
12bp の反復の全ては、19.4 % 以上の欠失頻度で 100 % の特異性を有する。19.4 % の欠失頻度では、反復 LR44、LR36 及び IM49 はそれぞれ 92.9 %、75 % 及び 64.3 % の特異性を有する。
【０１４６】
13bp マーカーである EGFR は、配列データ内で高いドロップアウト率であり、58 例の腫瘍のうち 12 例でのみ配列決定された。このマーカーが配列決定された 12 例の腫瘍のうち 2 例のみが MSS 腫瘍であった。EGFRは 24 % 以上の欠失頻度で 100 % の特異性を有するが、これは 2 例の MSS サンプルからのデータにのみ基づいているので信頼できるとは考えられず、従ってこれは最終パネルに含める必要はないと判断された。
【０１４７】
多型である可能性があるマーカーは、高い欠失頻度が必ずしも MSI の指標ではないことを意味するので、腫瘍 PR10654/14 における多型の存在は、そのマーカーが MSI 試験に使用するのにあまり適していないことを意味した。それゆえ、それは好ましい最終パネルに含めなかった。
【０１４８】
それ故、18 種類のマーカーの最終的な好ましいパネルは、DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44 とされた（表Ａ及び表Ｂ中で遺伝子座を更に規定する）。
【０１４９】
＜MSI 状態による腫瘍を区別するための閾値の最適化＞
MSI-H 腫瘍と MSS 腫瘍とを区別するための反復の性能を評価するために、18 種類のマイクロサテライト遺伝子座又は反復からなる好ましいパネルを、カット‐オフ値として異なる欠失頻度を用いて評価した。好ましいパネルは 18 種類の 8bp-12bp モノヌクレオチド反復からなる。即ち；DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44（更に表Ａ及び表Ｂに定義される遺伝子座）。
【０１５０】
各反復サイズごとに異なる閾値を設定した。
【０１５１】
下記の表３に示す欠失頻度の閾値を用いて、各腫瘍について閾値を超える反復の数を棒グラフを用いてプロットした。
【０１５２】
これらの閾値を用いると、どの MSI-H 腫瘍も、不安定性をコールするための閾値を満たす反復を 5 種類以上有していた。MSS サンプルについては、不安定性をコールするための閾値を満たす反復は、最大 3 種類であった。18 種類の反復からなるパネルは、サンプルを MSI-H として分類するために 4 又は 5 種類の不安定な反復というカット‐オフ値を使用することで、どの MSS がん及び MSI-H がんも正確に分類できるので、これらの閾値を使用すると、従って、MSI-H 腫瘍及び MSS 腫瘍を分離することができる。
【０１５３】
【表５】
2019528076.tif 000014
表3：間違って分類された反復の数を最小限に抑える各反復サイズについての閾値。この表は、各反復サイズについて、エラーの数を最小にする欠失頻度の閾値を示したものである。各閾値について、この表は、エラーの数、偽陽性エラー率、偽陰性率、及び 85 % の MSS 腫瘍及び 15 % の MSI-H 腫瘍からなる一群の腫瘍についてのエラー率を示す。FPR = 偽陽性エラー率、FNR = 偽陰性エラー率。
【０１５４】
マーカー・パネルの感度は、反復を追加することで簡単に調整できる。偽陽性は蓄積する可能性があるため、特異性がより重要である。従って、MSS サンプルにおいて不安定であると分類される個々の反復は、MSI-H サンプルにおいて安定であると分類される個々の反復よりも問題が多い。実際、MSI-H サンプルでの複製エラーはランダムに発生するため、MSI-H サンプルの反復のいくつかは複製エラーの影響を受けず、従って安定したままになる。これをよりよく反映するために、偽陽性と偽陰性のエラーに異なる重み付けをすることがある。エラーに関する異なる重み付けを評価して、それらが、どのくらい、配列決定された腫瘍パネルについての偽陽性エラー率及び偽陰性エラー率、並びに MSI-H 及び MSS 腫瘍サンプルにおける不安定な反復の数、に影響するかを見た。
【０１５５】
偽陽性エラーが偽陰性エラーよりも 1.5 倍悪くなるように、異なるエラーについての重み付けを調整し、2 つのタイプのエラーについてのこの異なるコストを反映するように、反復を不安定とコールするための欠失頻度の閾値を調整した。欠失頻度の閾値は、エラーのコストが最小になるように設定した。これにより、11bp と 12bp の反復の閾値が変更され、これらの反復についての偽陽性エラー率が低下した（表４を参照）。
【０１５６】
【表６】
2019528076.tif 000015
表４：偽陽性エラーが偽陰性エラーよりも 1.5 倍悪いとした場合の、反復が間違って分類されるコストを最小にする各反復サイズについての閾値。この表は各反復サイズについて、エラーのコストを最小にする欠失頻度の閾値を示したものである。各閾値について、この表は、偽陽性エラー率、偽陰性率、及び 85 % の MSS 腫瘍及び 15 % の MSI-H 腫瘍からなる一群の腫瘍についてのエラー率を示す。FPR = 偽陽性エラー率、FNR = 偽陰性エラー率。
【０１５７】
次いで、新たな欠失頻度の閾値（表４参照）を用いて、各腫瘍サンプルについて何個の反復が閾値を超えたかを計算した。新しい閾値を使用すると、全ての MSI-H 腫瘍は依然として不安定として分類される反復を 5 種類以上有するが、一方、MSS 腫瘍は 2 種類を超える不安定な反復を有さない。従って、18 種類の反復からなるパネルは、サンプルを MSI-H として分類するために 3-5 種類の不安定な反復というカット‐オフ値を使用することで、どの MSS 及び MSI-H がんも正確に分類することができる。偽陰性エラーよりも 1.5 倍高いコストとして偽陽性エラーを重み付けすることにより、18 種類の反復からなるパネルは MSI-H サンプルと MSS サンプルとをよりよく区別することができる。
【０１５８】
偽陽性エラーが偽陰性エラーよりも 2 倍悪いように、異なるエラーについての重み付けを更に調整した。欠失頻度の閾値は、エラーのコストが最小になるように調整した。その結果、8bp と 11bp の両方の反復について、反復を不安定とコールするための欠失頻度の閾値が増加した（表５参照）。10bp-12bp の反復については、現在の欠失頻度の閾値を使用した偽陽性エラーはない（表５参照）。
【０１５９】
【表７】
2019528076.tif 000016
表５：偽陽性エラーが偽陰性エラーよりも 2 倍悪いとした場合の、反復が間違って分類されるコストを最小にする各反復サイズについての閾値。この表は各反復サイズについて、エラーのコストを最小にする欠失頻度の閾値を示したものである。各閾値について、この表は、偽陽性エラー率、偽陰性率、及び 85 % の MSS 腫瘍及び 15 % の MSI-H 腫瘍からなる一群の腫瘍についてのエラー率を示す。FPR = 偽陽性エラー率、FNR = 偽陰性エラー率。
【０１６０】
表５にある新たな欠失頻度の閾値を用いて腫瘍パネルを解析した。これらの閾値を使用することによって、MSS 腫瘍において不安定であると分類された反復の数は 2 種類の反復にまで減少した。1 種類の反復は腫瘍 22_S11 について、1 種類の反復は腫瘍 64_S34 についてのものである。全ての MSI-H 腫瘍は、不安定として分類される 2 種類以上の反復を有する。従って、2 種類の不安定な反復というカット‐オフ値を使用してサンプルを MSI-H として分類する場合、18 種類の反復からなるパネルは、全ての MSS 腫瘍及び MSI-H 腫瘍を正確に分類することができる。
【０１６１】
偽陽性エラーが偽陰性エラーよりも 5 倍悪いように異なるエラーの重み付けを調整すると、結果として得られる閾値によって、どの反復サイズに対しても偽陽性エラーは生じない（表６参照）。これらの閾値では、MSI-H サンプルについての偽陰性エラー率は、12bp の反復についての 22.6 % から 8bp の反復についての 64.7 % の間である。15 % の MSI-H 腫瘍と 85 % の MSS 腫瘍の区分に一致する一群の腫瘍についてならば、各マーカー・サイズについてエラー率は 3.4 % と 9.7 % の間になる。これらのエラーは全て、偽陰性エラーである。サンプルを MSI-H として分類するために 18 種類のマーカー全てを一緒に使用するので、反復のパネル全体についての偽陰性エラー率は、個々の反復サイズについての偽陰性率よりはるかに低いであろう。
【０１６２】
【表８】
2019528076.tif 000017
表６：偽陽性エラーが偽陰性エラーよりも 5 倍より大きく悪いとした場合の、反復が間違って分類されるコストを最小にする各反復サイズについての閾値。この表は各反復サイズについて、エラーのコストを最小にする欠失頻度の閾値を示したものである。各閾値について、この表は、偽陽性エラー率、偽陰性率、及び 85 % の MSS 腫瘍及び 15 % の MSI-H 腫瘍からなる一群の腫瘍についてのエラー率を示す。FPR = 偽陽性エラー率、FNR = 偽陰性エラー率。
【０１６３】
28 例の MSI-H 腫瘍及び 30 例の MSS 腫瘍のパネルを表６に記載した欠失頻度の閾値を用いて解析すると、全ての MSI-H 腫瘍において不安定と分類された反復が 2 種類以上ある。各反復長の閾値は偽陽性エラーが無いように設定されているので、1-2 種類の不安定な反復というカット‐オフ値を使用してサンプルを MSI-H として分類する場合、18 種類の反復からなるパネルは、全てのMSS 及び MSI-H 腫瘍を正確に分類することができる。
【０１６４】
要約すると、モノヌクレオチド反復の種類数を、文献から得られた反復及び全ゲノム解析を通して特定された反復からなる 18 種類の 8bp-12bp の反復からなるパネルまで絞り込んだ。前記パネルは、DEPDC2、LR46、AL359238、AL954650、AP003532_2、TTK、AL355154、AVIL、GM29、LR32、ASTE1、GM07、GM14、LR11、LR48、IM49、LR36、LR44 を含む。この反復パネル中で欠失頻度を調べれることは、58 例の腫瘍（28 例の MSI-H 腫瘍及び 30 例の MSS 腫瘍）のサンプルにおいて、100 % の感度及び特異性で MSI-H と MMS 腫瘍を区別するのに十分であった。最も実用的な閾値のセットは、MSS 腫瘍群において偽陽性マーカーを認めないものであった。なぜならば、MSS サンプルで不安定な反復がありうるように閾値を設定している場合、一部の腫瘍で不安定と分類される反復の数が累積することがあるというリスクがあるからである。これらの閾値を使用すると、MSI-H 腫瘍の各々において 2-17 種類の不安定な反復があった。MSI 検査では、わずかな（odd）不安定な反復だけが MSS 腫瘍に見られるため、腫瘍を MSI-H とコールするために 2 種類の不安定な反復というカット‐オフ値をこのシステムと共に使用すべきである（Yoon ら、2013）。
【０１６５】
最終 MSI 試験パネルの 18 種類のマーカーについて、dbSNP ビルド 173 の時点での多型は存在せず、そしてこれらの反復を試験するために使用した MSS 腫瘍においては、多型の可能性がある反復は見られなかった。それ故、全ての反復は単型であるはずであり、これは反復のパネルを腫瘍と正常組織との間で比較する必要無しに使用することができることを意味する。しかしながら、これらの反復のいくつかにおいて、多型が将来発見される可能性はある。これは、腫瘍を MSI-H とコールするために 2 種類の不安定な反復というカット‐オフ値が賢明であろうということの別の理由である。しかしながら、スペクトルの下端で MSI-H 、MSI-L 及び MSS の間に連続した不安定性レベルがあり得るので、全ての MSI-H 腫瘍を特定するための明確なカット‐オフ値を定義することは不可能であるかもしれないと考えられる。
【０１６６】
この実施例における MSI 試験の別の利点は、試験を自動化することができ、貴重なスタッフの時間を用いて腫瘍の MSI 状態を決定する必要性が減少することである。次世代シーケンシングの単一分子的な性質は、自動化が可能な、欠失頻度を測定することに向けた定量的アプローチを提供する。フラグメント解析のトレースを主観的に解析する現在の試験とは対照的に、不安定なマーカーをコールするための閾値として欠失頻度を使用するアプローチは、それ自体が自動化に適している。
【０１６７】
＜実施例２-モノヌクレオチド反復の別のパネルの選択＞
実施例１に記載の試験と並行して、表Ａに示した 120 種類の 7-12bp のマーカーを、配列型の MSI マーカーとしてのそれらが使用可能であるかについて、評価し解析するために第２の試験を実施した。この第２の研究は、最初に、より短いマーカー（7-9bp）に焦点を当てた。
【０１６８】
55 例の CRCs からなるコホートを用いて 25 種類の短い（長さ 7-9bp）モノヌクレオチド・マーカーのバッチを試験して、それらの中で最も有益なマーカーを特定した。MSI-high（MSI-H）とマイクロサテライト安定（MSS）の症例との間を識別することに関し、最も有益なものとして、8 種類のマーカーを見出した（GM9、GM11、GM17、LR20、LR24、LR49、IM16 及び IM66‐データは示さず）。不安定性をコールするためのシステムを確立するために、これら 8 種類のマーカーを実施例１におけるパネルの 9 種類の最も有益なマーカー（すなわち、DEPDC2、AP003532_2、GM07、GM14、LR11、LR36、LR44、LR48 及び IM49、全て長さ 8-12bp）と一緒に組み合わせた。そして、141 例のスペイン人の CRCs を含む大規模コホート全体で試験した。それぞれ 96 % 及び 100 % の感度及び特異性で、17 種類のマーカーを用いて不安定性をコールするシステムを確立した（実施例１に記載の加重スコアリング・システム）。前記加重スコアリング・システムを、エジンバラから提供された 70 例の CRCs の独立したコホートを用いて検証した。その検証アッセイは、前記加重スコアリング・システムが、MSI-H 症例と MSS 症例との間を、感度と特異度がどちらも 100 % で、識別することにおいて、完璧に有効であることを、示した。
【０１６９】
本発明者らは、短いモノヌクレオチド反復の有用性を試験して、MSI-H 症例のクローン特性を評価し、そして試験した腫瘍が進展していった過程についての洞察を得た。試験した腫瘍についてクローン特性を確立し系統樹を構築することができた（データは示さず）。このアッセイの結果は、短いモノヌクレオチド反復を使用して、MSI-H CRCs の腫瘍内不均一性を検討することは実施可能であるということを裏付けている。
【０１７０】
17 種類のマーカーのパネルを以下の表７に示す。上記のように、いくつかのマーカーは実施例１のパネルとの共通性を示した。
【０１７１】
【表９】
2019528076.tif 000018
表７
【０１７２】
相関する SNP と一緒にマーカーを増幅するための例示的なフォワード及びリバース・プライマーを以下の表８ａ（フォワード・プライマー（forward primers））及び８ｂ（リバース・プライマー（reverse primers））に示す。
【０１７３】
【表１０】
2019528076.tif 000019
表８ａ
【０１７４】
【表１１】
2019528076.tif 000020
表８ｂ
【０１７５】
前記パネルは、試験をすると、スペイン人コホートの 141 例の CRC サンプルにおいて、96 % の感度及び 100 % の特異性を示し、前記スコアリング・スキーム（アッセイを標準化するために開発した）は、独立したコホート（エジンバラの共同研究者から提供）において、100 % の感度及び特異性を示した。
【０１７６】
＜真の MSI から増幅エラー及び配列決定エラーを区別するための SNPs の取り込み＞
上記の例から分かるように、本発明者らは、PCR エラー及び配列決定エラーと MSI によって引き起こされるインデルとを区別する手段として連鎖する単一塩基反復 SNPs を使用することによって、PCR エラー及び配列決定エラーのレベルが高いことがある反復配列でインデルがコールされるという問題を、克服した。
【０１７７】
以下の Perl スクリプトを、データを解析し、両側フィッシャーの正確性検定（two-tailed Fisher’s exact tests）を実行するために書いた。
【０１７８】
＜FisherTest_AllDeletions.pl＞：COPReC によって生成された出力を使用して、このスクリプトは、隣接する SNP に対してヘテロ接合である反復を特定し、2 つの対立遺伝子間で欠失の割合が有意に異なるかどうかを判定するために両側フィッシャーの正確性検定を実行する。各対立遺伝子について SNP と反復の両方にまたがる 100 対以上の末端リードがあり、そして 1 つの対立遺伝子に全リード数の 10 % 以上のリードがある場合、反復をヘテロ接合性として定義する。このスクリプトは、各対立遺伝子について、欠失を含むリードの数と欠失を含まないリードの数を計算し、次にこれらの値を使用してフィッシャーの正確性検定を実行する。このフィッシャーの正確性検定の計算は、前記 Perl スクリプトの中に統合された外部モジュールを使用して実行した
(Pedersen T., https://metacpan.org/pod/Text::NSP::Measures::2D::Fisher::twotailed)。
【０１７９】
＜FisherTest_IndividualIndels.pl＞：COPReC によって生成された出力を使用して、このスクリプトは、隣接する SNP に対してヘテロ接合である反復を特定し、2 つの対立遺伝子間で個々のインデルの割合が有意に異なるかどうかを判定するために両側フィッシャーの正確性検定を実行する。各対立遺伝子について SNP と反復の両方にまたがる 100 対以上の末端リードがあり、そして 1 つの対立遺伝子に全リード数の 10 % 以上のリードがある場合、反復をヘテロ接合性として定義する。各対立遺伝子について、このスクリプトはリードを次のように分類する；検討中のインデル・サイズを含むリード、又は検討中のインデル・サイズを含まないリード。次に、このスクリプトは両方の対立遺伝子について各カテゴリーのリードの数を計算し、この数をフィッシャーの正確性検定 2 x 2 分割表の入力として使用する。この両側フィッシャーの正確性検定の計算は、前記 Perl スクリプトの中に統合された外部オープン・ソース・モジュールを使用して実行した
(Pedersen T., https://metacpan.org/pod/Text::NSP::Measures::2D::Fisher::twotailed)。
【０１８０】
本発明者らは、配列決定に基づくアプローチによって、前記反復に近接して位置する単一ヌクレオチド反復（SNPs）を解析することを通じて、対立遺伝子の不安定性の起源を検討することも可能になる、ということを特定した‐ここで「近接（close to）」とは、典型的には、モノヌクレオチド反復の 100 塩基対内、好ましくは 70 塩基対内、より好ましくは 50 塩基対内、最も好ましくは 30 塩基対内である。これらの SNPs を含むことは、ヘテロ接合性の個体において、SNP とホモポリマーの両方にまたがるリード上で、ホモポリマー長変異体が属する対立遺伝子がどれかを特定することが可能であることを意味する。従って、特定のインデルが、ある対立遺伝子上で、他のインデルより広く拡がっているかどうかを判定することが可能であるはずである。もし、マイクロサテライト不安定性が、マイクロサテライトの複製の際のランダム・エラーによって引き起こされ、それが MMR システムが損なわれた細胞によって修正されないならば、不安定性の事象が、短いホモポリマーの両方の対立遺伝子に影響を及ぼす可能性は低い。これは、短いホモポリマーは in vivo での複製エラーに対する感受性が低く、従って両方の染色体上の同じ位置に 2 つのエラーが起こりにくいからである。従って、SNPs 及びマイクロサテライト遺伝子座／モノヌクレオチド反復遺伝子座の両方を含むシークエンシング・アンプリコンは、不安定性とエラーとを区別できる方法を提供するので（PCR エラー又はシークエンシング・エラーは、このタイプのエラーは PCR 反応中に数回起こり、両方の対立遺伝子が影響を受けやすいので、対立遺伝子特異的ではありそうもない。）、有用である。
【０１８１】
上記の実施例１において、配列決定された全ての A/T 反復及びほとんどの G/C 反復は、高いマイナー対立遺伝子頻度で隣接 SNPs を有していた。高いマイナー対立遺伝子頻度のこれらの隣接 SNPs を有するホモポリマーは、これらのホモポリマーについての対立遺伝子の偏りに関する研究が可能になるように選択した。以下のデータは実施例１に関する。
【０１８２】
図１には、MSI-H 腫瘍における対立遺伝子の偏りに関するいくつかの例がある。7bp 及び 8bp の反復については、1bp の欠失を含むリードは大抵一方の対立遺伝子上に存在する（図１パネルＡ-Ｂ参照）。U029 腫瘍サンプル中の 11bp の反復である IM65 について、1bp の欠失（フィッシャーの正確性検定：p-値＜10-100）及び 3bp の欠失（フィッシャーの正確性検定：p-値 3.1×10-72）の両方で、2 つの対立遺伝子間に不均衡がある（図１パネルＤ参照）。これは、この反復が 2 つの別々の複製ミスをしたことを示唆するが、ミスマッチ修復システムが損なわれているので、この複製ミスは修正されていない。U303 腫瘍サンプルの 12bp の反復である LR36 では、SNP 部位に A がある対立遺伝子上に 2bp の欠失を含むリードが、T がある対立遺伝子よりも有意に多い（フィッシャーの正確性検定：p-値 4.22×10-36）。
【０１８３】
全てのサンプル及び全てのヘテロ接合性の反復にわたる対立遺伝子の偏りを調べるために、Perl スクリプト FisherTest_AllDeletions.pl 及び FisherTest_IndividualIndels.pl を作成した。前記 Perl スクリプトは、隣接する SNP とヘテロ接合性である反復を特定し、2 つの対立遺伝子間で変異リードの割合が有意に異なるかどうかを判定するためにフィッシャーの正確性検定を実行する。各対立遺伝子について SNP と反復の両方にまたがる 100 対以上の末端リードがあり、そして 1 つの対立遺伝子に全リード数の 10 % 以上のリードがある場合、反復をヘテロ接合性として定義した。変異頻度が間違って表わされることが、PCR の複製によって引き起こされることを防ぐために、対立遺伝子あたり最低 100 対の末端リードという基準を用いた。1 つの対立遺伝子に全リード数の 10 % 未満のリードしかない場合、反復を解析しない、という基準を使用した。なぜなら、そのような極端な対立遺伝子の不均衡はサンプルが汚染していることを示しているかもしれないからである。前記スクリプト FisherTest_AllDeletions6.pl は、各対立遺伝子について、欠失を含むリードの割合と欠失を含まないリードの割合を計算し、2 つの対立遺伝子の間の欠失分布に有意差があるかどうかを調べるために、フィッシャーの正確性検定を実行する。前記スクリプト FisherTest_IndividualIndels.pl は、個々の挿入サイズと欠失サイズの各々に対応するリードの割合を計算し、次に別々のインデル・サイズの各々に対する 2 つの対立遺伝子間に有意差があるかどうかを計算する。
【０１８４】
図２は、反復の 2 つの対立遺伝子の全欠失頻度における有意性を計算したフィッシャーの正確性検定の結果を示す。図２にプロットした反復は、隣接 SNP がヘテロ接合性として分類された反復のみを含む。ある場合では、反復は、複数の隣接するヘテロ接合性 SNP を有し、そしてこれらの場合には、全てのヘテロ接合性 SNP の反復の組み合わせをプロットした。SNPs が異なると SNP と反復の両方にまたがるリードの数が異なるため、この方法を選択した。それゆえ、反復及び SNP の組み合わせが異なれば、対立遺伝子の偏りについて異なるレベルの有意性になることがある。両側フィッシャーの正確性検定の結果は、MSS サンプルと比較して MSI-H サンプルの方に対立遺伝子の偏りがより多いことを示す（図２参照）。0.01 の p-値をボンフェローニ補正（Bonferroni correct）するために、この p-値をヘテロ接合性 SNP の反復の組合せ数で割った（0.01/519 = 1.9×10-5）。統計的に有意な p-値を有する反復の数を含む表を表９に記載する。対照サンプルにおける 12 種類と比較して、MSI-H サンプルにおいて統計的に有意な p-値を有する反復が 52 種類あった。対照サンプル中には、p-値が 10-20 未満である対立遺伝子の偏りを有する 3 種類のモノヌクレオチド反復がある（図２参照）。これらは、反復 LR16 について対立遺伝子間に大きな偏りがある両方の U096 サンプルを含む。前述のように、LR16 反復は患者 U096 においてほぼ確実に多型であり、これによって、この反復の 2 つの対立遺伝子間に見られる欠失頻度の偏りのレベルが説明されるであろう。10-20 未満の p-値を有する第 3 の反復は、MSS 腫瘍 169736 における LR23 である。これもまた多型である可能性がある。
【０１８５】
【表１２】
2019528076.tif 000021
表９：各腫瘍サンプルについて、0.01 の p-値をボンフェローニ補正をした p-値（0.01/519 = 1.9×10-5）を有する反復の数。
【０１８６】
スクリプト FisherTest_IndividualIndels.pl を使用して、隣接するヘテロ接合性 SNP がある反復も解析して、個々のインデル・サイズについて 2 つの対立遺伝子間の偏りの有意性を判定した。これは、個々のインデル・サイズの各々の頻度を調べた両側フィッシャーの正確性検定を使用して行った。各対立遺伝子について、前記リードを、検討中のインデル・サイズを含む、又は検討中のインデル・サイズを含まない、として分類した。各反復について、最も低い p-値を有するインデルを記録した（表１０）。反復に隣接するヘテロ接合性 SNPs が複数存在する場合、最も低い p-値が得られた SNP を使用した。
【０１８７】
MSI-H サンプルは、2 つの対立遺伝子間で有意に偏っているインデル事象を伴う、最大数のヘテロ接合性の反復を有する。p-値 ＜ 10-10 の有意水準まで、MSI-H サンプル中にはより多数の反復がある（表１０参照）。しかしながら、配列決定された反復の数はサンプル間で異なり、そしてヘテロ接合性の反復の数もサンプル間で異なる。MSI-H サンプルについて、個々のインデル・サイズについて対立遺伝子の不均衡を含むヘテロ接合性の反復の割合は、対照サンプルにおいて見られるよりも概して高い。U179_H03 腫瘍サンプルには、46 % のヘテロ接合性の反復について、p-値 ＜ 10-10 という有意レベルでの対立遺伝子の不均衡があり、U029 腫瘍は 45 % のヘテロ接合性の反復について、U303 腫瘍は 21 % のヘテロ接合性の反復について、U179_H12 腫瘍は 10 % のヘテロ接合性の反復について、及び U312 腫瘍は 11 % のヘテロ接合性の反復について、p-値 ＜ 10-10 という有意レベルでの対立遺伝子の不均衡がある。そして。個々のインデル・サイズに対して対立遺伝子の不均衡を含むヘテロ接合性の反復の割合は、U096 対照においても高い。ブロック R06038/03-1C に由来する U096 サンプルでは、10 % のヘテロ接合性の反復に対して、p-値 ＜ 10-10 という有意レベルでの対立遺伝子の不均衡があり、他の U096 サンプル（CAPP2 ワックス・ブロック・ラベル：U096 正常 23.12.02）では、17 % の反復に対立遺伝子の不均衡がある。
【０１８８】
ブロック R06038/03-1C に由来する U096 患者サンプルには、p-値 < 10-10の有意レベルでの 1bp 欠失への対立遺伝子の偏りがある反復が 3 種類あった。これら 3 種類の反復は、LR16（p-値 ＜ 10-100）、LR27（p-値 2.9×10-17）、及び LR51（p-値 2.1×10-18）であった。LR16 は患者 U096 において多型であると疑われる。前記 U096 サンプル（U096 正常 23.12.02）は、多型であると考えられる反復 LR16 における 1bp 欠失への対立遺伝子の偏りを示す。
【０１８９】
【表１３】
2019528076.tif 000022
表１０：両側フィッシャーの正確性検定の p-値を使用して測定した、個々のインデル・サイズへの対立遺伝子の偏りのある反復の数。
【０１９０】
＜実施例３＞：
本発明者らは、このパネルを用いて MMR が十分に機能している腫瘍と欠損している腫瘍とを識別する精度及び感度を最適化するために、実施例２の 17 種類のマーカー・パネルを用いて生成されたデータを解析する異なる方法を調べた。突然変異反復の対立遺伝子分布を組み込んだ最適化されたスコアリング手順、及び合計 209 例のサンプルとなる 2 系統の腫瘍を解析することを、この実施例に記載する。本発明者らは、構成的 DNA（constitutional DNA）が利用可能でない場合でさえ、このスコアリング手順を使用して、前記 17 種類のマーカ−・パネルによって、MMR が十分に機能している腫瘍と欠損している腫瘍とを識別できることを確認している。最初の系統では、前記方法はフラグメント解析と 100 % 一致したが、一方で、2 番目の系統では 4 例の一致しないサンプルが観察された（97 % の一致に相当する）。これらのうち 2 例はフラグメント解析と免疫組織化学との間で食い違いを示し、そして 1 例をフラグメント解析を用いた再試験をした後に再分類した。これらの結果は、このアプローチが MSI のための信頼性のある、拡張可能なルーチンな試験の選択肢を提供することを示している。
【０１９１】
候補 NMRs の実験的評価と 17 種類のマーカー・パネルについての概要説明：
実施例１及び２に記載したように、有益でない可能性がある反復を排除するために、アンプリコンを 120 種類の MNRs 全てについて設計し、まず最初にリンチ症候群患者に由来する 6 例の腫瘍、並びに 5 例の正常粘膜サンプル及び孤発性マイクロサテライト安定腫瘍に由来する 6 例のサンプルからなる 11 例の対照サンプル、からなる FFPE 材料で試験をした（実施例１参照）。アンプリコンをプールし、インデックスを付け、そして 1 つの標的あたりの深さが 10,000 リード（a target depth of 10,000 reads）になるまで配列決定をした。少なくとも 100 対の末端リードにより表されるアンプリコンについての結果のみを解析し、代表的な結果を図３に示す。
【０１９２】
図３Ａは、MMR が十分に機能しているサンプル（MSS）及び MMR を欠損しているサンプル（MSI）サンプルにおける、2 種類の MNRs についてのリードの相対頻度を示す。わずかな割合の挿入リード（横座標で +1 値）が MSI 及び MSS サンプルの両方で観察されるが、欠失の頻度（-1、-2 及び -3 値）はその 2 サンプルの間で異なる。しかしながら、グラフに示したより長い方の反復については、MSS サンプル中に 2 塩基対以上の欠失を示すリードが観察されることもあるが、一方で、MSI サンプル中では、2 塩基対の欠失に対応するもう一つ別の第 2 ピークが観察される。全ての解析において、あらゆる欠失を示すリードの頻度を合計して使用した。
【０１９３】
観察された対立遺伝子の変異のレベルを説明するために、単一のマーカー（LR46）での結果を図３Ｂに示す。各対立遺伝子についてのリードの分布を、隣接 SNP がヘテロ接合性である MSI サンプル及び MSS サンプルについて別々にプロットする。MSS サンプルでは、G 対立遺伝子及び A 対立遺伝子の両方の分布は類似しているが、1 塩基対の欠失を表すリードが MSI サンプルの G 対立遺伝子中に主要なものとして見られる。
【０１９４】
この初期評価から、1 例以上の MSI サンプルで > 5 % の欠失頻度を示した場合にのみ MNRs を更に解析したところ、これらの頻度は全ての正常粘膜サンプルで観察された頻度より > 1.5 倍高くもあった。49 種類の MNRs がこれらの基準を満たした。SNPs に隣接する 2 種類の前に記載した MNRs（1 種類は DEPDC2（Alhopuro ら、2008）及びもう 1 種類は遺伝子間にある反復 AL954650（Sammalkorpi ら、2007））もこの段階での解析に加えた。これらの 51 種類の MNRs をそれぞれ最少 28 例の MSI 腫瘍及び 30 例の MSS 腫瘍でタイプ分けし、ROC 曲線を作成して、MSI サンプルと MSS サンプルとを識別する各 MNRs の識別力を評価した。これは、分類基準として MNR 欠失を表すリードの頻度を用いて曲線下面積（area under the curve (AUC)）を見積もり（方法参照）、並びに各閾値より上の頻度のサンプルを MSI、及び各閾値より下の頻度のサンプルを MSS として分類することによって行った。
【０１９５】
この解析の代表例を、2 種類のポリ-A MNRs；図３で使用した LR46（8bp）及び LR44（12bp）、についての ROC 曲線である図４Ｂに示す。LR46 の AUC は 0.83（95 % 信頼区間 0.71-0.84）及び LR44 の AUC は 0.99（0.98-0.99）であった。
【０１９６】
AUC を基準として使用して、15 種類のポリ-A MNR 反復を選択し、そして AUC が最大である 2 種類のポリ-C MNR と一緒にして最終パネルを形成した。方法の節に記載しているように、このパネルに関するプライマーを、より短いアンプリコンを生成するように再設計した（プライマー配列は表８ａ及び８ｂに記載）。
【０１９７】
＜選択した短い MNRs のパネルを用いる腫瘍の分類＞
MSI 試験のための解析パラメータの確立：分類手順に必要なパラメータを確立するために、前記最終パネルに含まれる 17 種類の MNRs を 139 例のサンプルのセット（このうち 67 例はフラグメント解析により MSI として分類されている（材料の節を参照））でタイプ分けした。これらのサンプルで観察された欠失頻度及び対立遺伝子の偏りを使用して、各マーカーについての閾値を規定し、そして MSI サンプル及び MSS サンプルについて、方法の節に記載された確率を推定した。この工程を説明するために、12bp ポリ-A MNR である LR44 の結果を図５に示す。図５Ａは、LR44 中に欠失を示すリードの相対頻度の分布を示す。予想通り、欠失頻度は MSI 腫瘍でより高い。横線は 0.24 の閾値を表す（閾値の選択については方法を参照）。欠失頻度が前記閾値より高かったのは、このマーカーについてデータが入手可能であった66 例の MSI サンプルのうちでは 58 例であったが、72 例の MSS サンプルのうちでは 4 例のみであった。
【０１９８】
図５Ａに示した 139 例のサンプルのうち、60 例のサンプル（26 例の MSI 及び 34 例の MSS）が反復に隣接する SNP についてヘテロ接合性であり、これらのサンプルについての対立遺伝子の偏りの分布を図５Ｂに示す。フィッシャーの正確性検定を用いて、欠失リードが両方の対立遺伝子間で均等に分布しているかどうかを評価した。前記図は、得られた p-値を -log10(p) スケールで表す。左側パネルは、図５Ａの閾値を上回るヘテロ接合性サンプルを示し、右側パネルは、それを下回るものを示す。全体として、21 例の MSI サンプル及び 4 例の MSS サンプルで、値は前記閾値を超えた（すなわち、5 % レベルで有意な偏りがあった；閾値の選択については方法を参照）。これは、対立遺伝子の偏りが MSI サンプルの間でより一般的であろうという我々の予想に一致する。
【０１９９】
図５Ａの頻度閾値を超える 4 例の MSS サンプルのうち 2 例のみがヘテロ接合性であり、どちらも有意な偏りを示さなかったことは注目に値する。対照的に、ヘテロ接合性であった 32 例の MSI サンプルのうち 27 例は、閾値を超える偏りを示した（図５Ｂ）。この差は有意である（p = 0.03 両側検定）が、その一方、頻度閾値に達しないサンプルについての対応する試験（パネルＢ）では、MSS サンプルと MSI サンプルとの間のいかなる相違も示唆されない（p = 0.39）。これは、対立遺伝子の偏りが MSI と MSS のサンプルを識別するのに役立つことがあるという我々の仮定と一致する。
【０２００】
対立遺伝子の偏り及び欠失頻度に対して、17 種類の MNRs の各々について、閾値とそれぞれの閾値を超えるサンプルの相対数を決定した。
【０２０１】
検証セットの解析：最初のセットのサンプルで決定したパラメータを使用して、70 例の CRC サンプル（このうち 36 例は事前に MSI として分類され、34 例は MSS として分類された）からなる独立したデータセットで手順を試験した。
【０２０２】
図６は、MNR 長の変異（パネルＡ）及び MNR の対立遺伝子の偏り（パネルＢ）が、腫瘍を分類することに寄与したことを示す。これは、両方とも群を分離するのに寄与していることを示している；但し、MNR 長の変化が主に貢献する。最終的に組み合わせた分類（パネルＣ）はフラグメント解析と一致しており、フラグメント解析が対照技術として使用される場合、感度及び特異性は 100 % になる（それぞれ 95 % 信頼区間 87 % -100 % 及び 90 % -100 %）を達成する。
【０２０３】
最後に、2 番目のデータセットのデータを使用して前記パラメータを推定し、最初のデータセットのサンプルを分類した。結果を図７に表す。
【０２０４】
4 例のサンプルの結果はフラグメント解析と比較して一致しなかった（サンプル 63、72、91 及び 135）。サンプル 63 の免疫組織化学を調べたところ、報告されている MSS の状態と一致していた。しかしながら、サンプル 72 の DNA をフラグメント解析により再解析するとマイクロサテライト不安定性が検出され、更に、サンプル 91 及び 135 の免疫組織化学解析では MSH2、MLH1、MSH6 及び PMS2 の発現における変化は見られなかった。これは、免疫組織化学及びフラグメント解析がこれら 3 例のサンプルについては相反する可能性を提起する。全体として、MSH2、MLH1、MSH6 及び PMS2 についての染色によって評価した場合、フラグメント解析と免疫組織化学との間では 92 % が一致した。この解析では、フラグメント解析の結果を対照とした場合、我々の結果とフラグメント解析との間の一致率は 97 %、感度と特異度の推定値は両方とも 97 % である（95 % 信頼区間：それぞれ89 % -99 % と 90 % -99 %）。興味深いことに、パラメータを推定すること、及び分類を試験することの両方に使用した最初のデータセットを使用して再分類をしてみると、同じ 4 例のサンプルが誤って分類される結果となった。両方のセットの結果を組み合わせると、98 % の感度（95 % 信頼区間：92 % -99 %）及び 98 % の特異性（93 % -99 %）となった。
【０２０５】
ここに提示された方法によって、対照として対になった生殖細胞系列の DNA を必要とすることなく、限られた数の遺伝子座を用いて MSI 腫瘍と MSS 腫瘍との間の配列決定に基づく識別が可能になる。最も有望なマーカーを特定するためのゲノム配列データの解析、及び 2 ラウンドのアンプリコン評価等を含む、多工程のプロセスを用いて MNRs のパネルを選択した。これは MNRs の最適なセットが特定されたことを保証するものではないが、前記パネルの性能はフラグメント解析の性能に匹敵する。
【０２０６】
PCR アーティファクトの確率を減らし、そして正常の材料が利用できない場合に交絡因子となりうる MNR 長に影響を及ぼす生殖細胞系列の変異に遭遇する可能性を減らすために、本発明者らは、その試験のために比較的短い MNR を選択した。しかし、体細胞の不安定性はより低くもあり、本物の突然変異は 1 つの対立遺伝子のみに影響を与える傾向があるだろうということを意味している。従って、PCR エラーを考慮しても、突然変異のリードは 1 つの対立遺伝子に集中するはずである。本発明者らは、このことを隣接するヘテロ接合性 SNPs を使用して評価することができ、そして分類を改善するために使用することができることを示した。クローン性の進展（clonal evolution）の過程で、2 つの突然変異が起きる間には時間間隔があるだろうし、そしてこの時間間隔は、より短いマイクロサテライトについてはより大きくなると予想されるので、両方の対立遺伝子に突然変異が起こった状況だとしても、各対立遺伝子が影響を受けるサンプル中の細胞の割合は異なるであろう、ということは注目に値する。
【０２０７】
本発明者らの知る限りでは、これは対立遺伝子の情報を使用する MSI を評価するための最初の方法である。それは、突然変異リードの分布での偏りを評価するために対立遺伝子データを使用するだけであるが、体細胞性の変異と生殖細胞系列の変異との間を区別することにも、特に正常な材料を利用できないが、前記腫瘍に正常組織が混入していることが予想される状況において、役に立つ。生殖細胞系列の変異を示す MNRs を前記解析から除外することはできるが、各対立遺伝子を別々に扱うことも可能であろう。しかしながら、対立遺伝子解析は、特定のサンプル中で隣接 SNPs についてヘテロ接合性の MNRs についてのみ可能である。原則として、スコア計算をそのような MNRs に制限することが実行可能であろう。しかしながら、そのような手順は、使用される多くのアンプリコンからの情報を無視し、そしてより大きなマーカのパネルを必要とし、アッセイ・コストを増大させるであろう。
【０２０８】
本発明者らは、データを二分することを望んでいたので、変異した MNRs を表すリードの頻度に対して閾値を使用した。他の方法も可能であろう；しかしながら、大多数の MSS サンプルにおいて観察される頻度を超える閾値を使用することは、PCR のアーティファクトによる変異が排除されるようにそれらの閾値を設定することを目的とする他の著者が進めるアプローチと一致する（例えば Salipante ら、2014）。本明細書で提示した形式論は、閾値を定義せずに使用されることがあるかもしれないが、全体の欠失頻度分布を指定することを必要とするであろう。同様に、本発明者らは、対立遺伝子の偏りを二分するために、閾値（フィッシャーの正確性検定において 0.05 の ｐ-値）を使用した。閾値を正確に選択することは任意であるが、偏りの統計的な有意性を使用することは自然に思える。
【０２０９】
本発明者らの試験は MSI を検出することを目的としているので、対照技術としてフラグメント解析を使用することは妥当であると思われる。しかし、通常、MSI を検出することは MMR が十分に機能していることを評価するための手段である。本発明者らの新しい方法によって得られた結果とフラグメント解析からの結果との間に矛盾があった 4 つのケースのうちの 3 つにおいて、フラグメント解析の結果と免疫組織化学の結果との間にも矛盾があったことは、注目に値する。
【０２１０】
欠失頻度と対立遺伝子の偏りのMNR に基づく分類
この実施例では、その目的は、サンプルを 2 つのクラス：即ち MSI 及び MSS（後者は低レベルの不安定性（MSI-L）を示すものとしてフラグメント解析によって分類されるサンプルを含む）、に分離する分類手順を開発することである。その分類子（classifier）を、MNR 長の変化、及び両方の対立遺伝子にわたる変異リードの分布の両方に関する情報を含むように設計した。対立遺伝子間の識別は隣接する SNP についてヘテロ接合性のサンプルについてのみ可能であるので、両方の対立遺伝子にまたがる変異リードの偏った分布について全てのサンプルを評価できるわけではない。しかしながら、データの欠如はどちらの分類にも有利であるはずがない。
【０２１１】
分類手順には単純ベイズ・アプローチを使用した（Gelman、2014）。基本的な考えは、使用した各 MNR マーカーを観察して、2 つのクラス、即ち MSI(H) 又は MSS、のうちの 1 つに属する確率を比較することである。以下の式において、MSI(H) を更に MSI と短縮する。
【０２１２】
あるセットの MNRs を考慮し、そして、特定のサンプルについて、観察されたリード頻度を、それらの各々についての欠失を示しながら、O で表わし、前記サンプルがマイクロサテライト不安定である確率を p(MSI|O)、及び前記サンプルがマイクロサテライト安定である確率を p(MSS|O)、とした場合、割合、
【数１】
2019528076.tif 000023
を判別基準として使用できる。ここで、p(MSI) 及び p(MSS) は、サンプルが MMR を欠損している又は十分に機能しているということの事前確率（a priori probability）を示す。
【０２１３】
観測値は、異なる MNRs でのリード数データから構成される；即ち、O=(O1,…,ON,) であり、ここで N はアッセイで評価した MNRs の数を示す。
【０２１４】
所与のミスマッチ修復状態について、異なるマーカーでの突然変異は互いに独立して生じると仮定すると、
【数２】
2019528076.tif 000024
となる。
【０２１５】
各個体のマイクロサテライト i について、観測値 Oi は、2 つの値 Di 及び Bi によって記述され、即ち、Oi= (Di, Bi) 及び p(Oi) = p(Di)p(Bi| Di) であり、ここで、欠失を表わすリードの数が事前に指定した閾値を超える場合は Di = 1 であり、そうでない場合は 0 であり、有意な偏りが見られた場合は Bi = 1 であり、そうでない場合は 0 である。従って、
【数３】
2019528076.tif 000025
である。
【０２１６】
偏りが計算できない場合、例えばヘテロ接合性の隣接する多型部位がない場合、我々は、(Oi | MSI) = p(Di | MSI)、p(Oi| MSS) = p(Di| MSS)、と設定し、前記係数
【数４】
2019528076.tif 000026
は省略することがある。
【０２１７】
各マイクロサテライトの閾値を、全 MSS サンプルの 95 % が閾値より低い頻度を有するように選択した。p(Di | MSS) と p(Di | MSI) を推定するために、頻度が閾値を超える MSS サンプル及び MSI サンプルの正確な数を使用した。
【０２１８】
p(Bi | Di, MSI) と p(Bi | Di, MSS) を推定するために、隣接 SNP マーカーでヘテロ接合性であり、そして欠失を伴うリードの頻度が MNR 特異的な閾値を超えたサンプルを使用した。隣接 SNP における欠失の存在と遺伝子型との間の関連性が、フィッシャーの正確性検定を用いて 0.05 のレベルで有意である場合、偏りが存在すると考えた。反復に隣接する複数のヘテロ接合性 SNPs が存在する場合、最小の p-値を有する SNP を使用した。欠失頻度が前記閾値を下回ったとき、p(Bi | Di, MSI) と p(Bi | Di, MSS) を 1 に設定した。これは、そのような場合に MNR 突然変異の証拠が不十分であり、従って、偏りは意味が無い、と仮定することと等価である。
【０２１９】
その結果はスコア
【数５】
2019528076.tif 000027
として示される。
【０２２０】
ここで、あるセットのサンプルを使用して、各 MNR について、分類に使用される以下のパラメータを決定した：ａ）欠失を示すリード頻度の閾値（閾値の選択については、前出の段落を、及び説明については上記考察を参照）；ｂ）この閾値を超える欠失頻度を有する MSI サンプルの割合；ｃ）前記閾値を超える欠失頻度を有する MSS サンプルの割合、ｄ）欠失及び有意な対立遺伝子不均衡を示す MSI サンプルの割合、及びｅ）欠失及び有意な対立遺伝子不均衡を示す MSS サンプルの割合。MSS 腫瘍及び MSI 腫瘍の頻度はそれぞれ 0.85 及び 0.15 であると仮定した（Boland 及び Goel、2010）、（即ち、p(MSS) = 0.85 及び  p(MSI) = 0.15 である）。
【０２２１】
次に、これらのパラメータを使用して、もう一つ別の第 2 の独立したセットのサンプル中の各腫瘍についてのスコアを計算した。0 未満のスコアを有するサンプルを MSS として分類し、0 より大きいスコアを有するサンプルを MSI として分類した。
【０２２２】
＜実施例４＞：
増幅反応を多重化できるかどうかを立証するために、分子反転プローブ（MIP）を 15 種類のマーカー用に設計し（表１１参照）、96 例のサンプルを解析するために使用した。ライゲーション（ligation）及び増幅（Hiatt ら、2013 によって公表されたプロトコルに従って）の後、その生成物を配列決定した。
【０２２３】
この表は、94 例の個別サンプルにわたる各マーカーにマッピングされるリードの数を要約する。
【０２２４】
【表１４】
2019528076.tif 000028
表１１：15 種類のマーカー用に設計された分子反転プローブ（MIP）
【０２２５】
これらの結果は、増幅反応を多重化することができること、即ち、患者あたり単一の反応を行えば十分であること、を示す。
【０２２６】
＜一般的な材料と方法＞：
サンプル：
別段の記載をしない限り、腫瘍及び組織サンプルは、病理学部門及び北部遺伝学サービス、ニューカッスル病院 NHS財団信託（the Pathology department and Northern Genetics Service, Newcastle Hospitals NHS Foundation Trust）から、倫理審査（REC 参照 13/LO/1514）の後に入手した。CAPP2 研究に登録された患者からのリンチ症候群腫瘍組織及び対応する正常組織は、倫理審査（REC 参照 MREC/98/3/24）の後に入手した。全ての腫瘍についての MSI 状態は、MSI 解析システム、バージョン 1.2（プロメガ、サウサンプトン、英国）（the MSI Analysis System, Version 1.2 (Promega, Southampton, UK)）を用いて、事前に判明していた。全てのサンプルは、FFPE 組織として、又は FFPE 組織から抽出された DNA として入手した。
【０２２７】
132 例の腫瘍及び組織サンプルを入手したが、どちらも、ホルマリン固定パラフィン包埋（formalin fixed paraffin embedded (FFPE)）組織として、又は FFPE 組織から抽出された DNA として、北部遺伝学サービス、ニューカッスル病院 NHS財団信託（the Northern Genetics Service, Newcastle Hospitals NHS Foundation）から、倫理審査（REC 参照 13/LO/1514）後、に入手した。全ての腫瘍についての MSI 状態は、MSI 解析システム、バージョン 1.2（プロメガ、サウサンプトン、英国）（the MSI Analysis System, Version 1.2 (Promega, Southampton, UK)）を用いて、事前に判明していた。
【０２２８】
もう一つ別の第 2 セットの 141 例のサンプルは、ナバーラ総合病院の遺伝学サービス（the Genetics Service of the Complejo Hospitalario de Navarra）、並びにがん遺伝学及び遺伝性がんグループ（the Oncogenetics and Hereditary Cancer Group）、IDISNA（ナバーラ生物医学研究所、スペイン（Biomedical Research Institute of Navarra, Spain））から、抽出された DNA として入手した。これらのサンプルを分類パラメータを特定するために使用した。それらについては事前に MSI 解析システム、バージョン 1.2（プロメガ、サウサンプトン、英国）を用いて MSI 試験をした。免疫組織化学的発現解析は、抗体（BD バイオメディカルテック、ニュージャージー、米国（BD biomedical Tech, New Jersey, USA））を、MLH1 については 1:10 で；MSH6 については 1:120 で；PMS2 については 1:100 で、用いて、及び抗体（オンコジーン社、ミドルセックス、英国（Oncogene Ltd Middlesex, UK））を、MSH2 については 1:100 で、用いて、対応する医学研究及び倫理委員会（CEIC ナバーラ政府）（the correspondent Medical Research and Ethics Committee (CEIC Navarra Government)）によって倫理的に承認されたように、実施した。そして 124 例のサンプルについてデータが利用可能であった。
【０２２９】
第 3 のセットの 70 例の匿名の大腸腫瘍 DNA サンプルは、エジンバラ大学の分子病理学部門（the Department of Molecular Pathology, University of Edinburgh）から入手した。ミスマッチ修復の状態は、プロメガ社のシステムを用いて臨床サービス用途のために試験をした。
【０２３０】
MNRs の in silico 選択：MSI 大腸がん、対応する正常、及び MSS 安定がんからなる全ゲノム配列は、がんゲノム・アトラス・プロジェクト（The Cancer Genome Atlas（TCGA）project（Cancer Genome Atlas Network、2012））から入手した（http://cancergenome.nih.gov/  ; access identifier:  phs000178.v8.p7 DAR: 17798, request date 2012-11-13; Study accession phs000544.v1.p6; parent study: phs000178.v7.p6 ; 35 samples）。BAM ファイルは、bam2fastq（バージョン 1.1.0）（bam2fastq ソフトウェア[http://gsl.hudsonalpha.org/information/software/bam2fastq]）を使用して fastq ファイルに変換した。BWA（バージョン 0.6.2）（Li 及び Durbin、2009）を使用して配列アラインメント（sequence alignment）を行い、samtools（バージョン 0.1.18）を使用して BAM ファイルのインデックス付け及びソートを行い（Li ら、2009）、PICARD（バージョン 1.75、[http://picard.sourceforge.net]）を使用して重複を除去した。GATK（バージョン 2.2.9）（DePristo ら、2011）を使用して、全てのサンプルの結合 BAM ファイルを作成し、インデルを中心に再アライメントした。前記 GATK（バージョン 2.2.9）UnifiedGenotyper を使用して、モノヌクレオチド反復中でインデルを特定するために、TandemRepeatAnnotator を使用して注釈を付けた生の変異コール・ファイルを作成した。長さ 7bp -12bp のモノヌクレオチド反復を選択し、そして一般的な配列変異体（dbSNP バージョン 173、hg19）（Sherry ら、2001）を含む反復を除去した。反復の 30bp 以内にある、dbSNP にリストされた SNPs に、Perl スクリプトを使用して注釈を付けた。配列データの低域通過性のために、MSI 腫瘍からの全てのリードを 1 つの群にまとめ、一方、MSS 及び MSI-L 腫瘍からのリード及び正常サンプルからのリードを対照として 2 番目の群にまとめた。
【０２３１】
MNR 増幅：プライマーは、Primer 3（Rozen ら、2000）を用いて、又は Primer 3 が適切なオリゴヌクレオチドを返さない場合にはマニュアルで設計した。マニュアルで設計したプライマーの Tm は 57 ℃-60 ℃であった。一般的な SNPs を SNP Check
（https://ngrl.manchester.ac.uk/SNPCheckV2/snpcheck.htm）を使用して、オフ・ターゲット結合を BLAST （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）又は BLAT（Kent、2002）を使用して、適切な融解温度及び二次構造が無いことを OligoCalc（http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html）又は Primer3 を使用して、全てのプライマーをチェックした。そのプライマーは、Metabion（メタビオン社、シュタインキルヘン、ドイツ（Metabion International AG、Steinkirchen、Germany））又は Biobasic（バイオ・ベーシック社、マークハム、カナダ（Bio Basic Inc.、Markham、Canada））のいずれかによって製造した。全ての MNRs 用のプライマーは、最初は〜300-350 bp のアンプリコンを作成するように設計した。最後の MNR パネルでは、5' アダプターを持つ 100-150 bp のアンプリコンを生成するように第 2 セットのプライマーを設計した（プライマー配列を表８ａ及び８ｂに示す）。高い正確性を持つ Pfu に基づく Herculase II Fusion DNA ポリメラーゼ（アジレント、サンタ・クララ、カリフォルニア州、米国（Agilent, Santa Clara, CA, USA））及び 35 回の PCR サイクルを用いてアンプリコンを生成した。
【０２３２】
配列決定（シークエンシング）：Qiagen QIAxcel（キアゲン、マンチェスター、英国（Qiagen, Manchester UK.）を用いてアンプリコンを定量し、次いでほぼ等モル濃度でプールした。ライブラリー調製の前に、Agencourt AMPure XP ビーズ（ベックマン-コールター・ライフ・サイエンス社、インディアナポリス、米国（Beckman-Coulter Life Sciences, Indianapolis, USA））を PCR クリーン・アップに使用した。300-350 bp のアンプリコンについては、各サンプルについて増幅産物をプールした後、Nextera XT DNA Library Prep キット（イルムナ社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州、米国（Illumina, San Diego, CA, United States of America））を使用してバーコード化及びライブラリー調製を行った。一方、100-150 bp のアンプリコンについては、16S メタゲノム・サンプル調製プロトコルに従った（http://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf）。イルミナ MiSeq プラットフォーム上で、1 アンプリコンあたり少なくとも 10,000 リードの標的の深さ（target depth）になるまでシークエンシングを行った。
【０２３３】
変異及び MNR のコーリング：配列は、BWA（バージョン 0.6.2）及び対照として hg19 アセンブリを使用してアライメントを行った。Samtools を前記 BAM ファイルのソートとインデックス付けに使用し、GATK（3.1.1）を使用して再アライメントを行った。アラインメント・ファイルを SAM フォーマットに変換し、そして R スクリプトを用いて処理した。対の両方のリードで観察された、即ち、両方の方向で一致した、特徴のみをその後の計算で使用し、MNR が少なくとも 20 個のリード対でカバーされているアンプリコンのみを解析した。最も一般的でない対立遺伝子、即ち最小数のリードによって支持されている対立遺伝子、が SNP の位置をカバーする全てのリード対の少なくとも 20 % に存在する場合、隣接する SNPs をヘテロ接合性であると見なした。
【０２３４】
MNR 特異的な ROC 曲線の構築：各マーカーについて、MSI サンプル及び MSS サンプル中の MNR 欠失対立遺伝子を表すリードの割合を別々に解析した。MSI 分類に対する閾値アプローチを使用した：即ち、閾値を超える変異リードの割合を有するサンプルは MSI として分類し、閾値未満のサンプルは MSS として分類する。これにより、真陽性（すなわち、閾値を超える値を有する既知の MSI サンプル）と偽陽性（すなわち、閾値を超える値を有する既知の MSS サンプル）との相対頻度を決定することが可能となった。各 MNR について、これら 2 つの値を、0 と 1 の間にある閾値のお互いに対してプロットした。得られた曲線は受信者操作特性（ROC）曲線を表し、その曲線下面積（AUC）は MSI サンプルと MSS のサンプルとを識別する MNR の識別力の定量的尺度として用いた。
【０２３５】
本明細書、特に添付の特許請求の範囲で使用される用語は、一般に、「オープン（open）」用語（例えば、「含む（including）」という用語は「含むがこれに限定されない（including but not limited to）」と解釈されるべきであり、用語「有する（having）」は「少なくとも有する（having at least）」と解釈されるべきであり、用語「含む（includes）」は「含むがこれに限定されない（includes but is not limited to）」等と解釈されるべきである、等）として意図されている、と当業者には理解されるであろう。特定の数を導入した請求項の記載が意図されている場合、そのような意図は特許請求の範囲において明示的に記載されるであろうが、そのような記載が無い場合には、そのような意図は存在しないことが当業者によって更に理解される。理解を助けるためとして、例えば、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載に導入するために、導入句「少なくとも 1 つ（at least one）」及び「１ つ以上（one or more）」の使用を含むことがある。しかしながら、そのような導入句を使用することは、たとえ同じ請求項に導入句「１ つ以上（one or more）」又は「少なくとも 1 つ（at least one）」及び「a」又は「an」等の不定冠詞が含まれる場合であったとしても、不定冠詞「a」又は「an」を使用して請求項の記載に導入することによって、その様に導入された請求項の記載を含む如何なる特定の請求項が、あるその様な記載のみを含む実施形態に限定される、ことを意味すると、解釈されるべきではない（例えば、「a」及び／又は「an」は「少なくとも 1 つ（at least one）」及び「1 つ以上（one or more）」を意味すると解釈されるべきである）；同じことが、請求項の記載に導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、たとえある導入した請求項の記載の特定の数が明示的に記載されているとしても、そのような記載は少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを、当業者は認識するであろう（例えば、他の修飾語句が無く、「2 つの記載（two recitations）」は、少なくとも 2 つの記載又は 2 つ以上の記載、を意味する）。
【０２３６】
本発明の様々な実施形態が例示の目的で本明細書に記載されていること、及び本発明の範囲及び精神から逸脱することなく様々な修正がなされ得ることが理解されるであろう。従って、本明細書に開示されている様々な実施形態は限定することを意図するものではなく、真の範囲及び精神は添付の特許請求の範囲によって示される。
【０２３７】
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【図１】
2019528076.tif 000029
【図２】
2019528076.tif 000030
【図３】
2019528076.tif 000031
【図４Ａ】
2019528076.tif 000032
【図４Ｂ】
2019528076.tif 000033
【図５】
2019528076.tif 000034
【図６】
2019528076.tif 000035
【図７】
2019528076.tif 000036
【配列表】
2019528076000001.app
【国際調査報告】
2019528076.tif 000037
2019528076.tif 000038
2019528076.tif 000039