(57)【要約】  本開示は、特に、成体における脳細胞傷害を処置するための、2-イミノビオチンの使用に関する。処置は、1つ又は複数のその症状を含む、脳低酸素虚血及び/又は再灌流傷害の処置のために使用することができる。治療有効用量の2-イミノビオチンを、それを必要とする個体へと投与する工程を含む処置の方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における脳細胞傷害の処置における使用のための2-イミノビオチンであって、0.1〜10mg/kg/日が、前記個体へと投与され、毎日4〜6時間ごと、好ましくは4時間ごとに投与され、前記個体が、新生仔ではない、2-イミノビオチン。
【請求項２】
0.2〜10mg/kg/日、好ましくは0.2〜5mg/kg/日、より好ましくは0.2〜1mg/kg/日が、前記個体へと投与される、請求項1に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項３】
1回用量当たり、3〜12.75mgの間が投与される、請求項1又は2に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項４】
個体における脳細胞傷害の処置における使用のための2-イミノビオチンであって、18〜78mg/日の間が投与され、毎日少なくとも3回用量、好ましくは、毎日少なくとも6回用量で施され、前記個体が、新生仔ではない、2-イミノビオチン。
【請求項５】
前記個体が、6回用量の3〜12.75mgを施される、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項６】
前記処置が、36℃を目標とする温度管理と組み合わされる、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項７】
個体における脳細胞傷害の処置における使用のための2-イミノビオチンであって、0.01〜5mg/kg/日が、前記個体へと投与され、4〜6時間ごと、好ましくは6時間ごとに投与され、前記処置が、低体温法と組み合わされ、前記個体が、新生仔ではない2-イミノビオチン。
【請求項８】
0.04〜3.7mg/kg/日が投与され、好ましくは0.04〜1.9mg/kg/日の間が投与される、請求項6に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項９】
1回用量当たり、1〜5mgの間が投与される、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１０】
個体における脳細胞傷害の処置における使用のための2-イミノビオチンであって、4〜20mg/日の間が投与され、毎日少なくとも3回用量、好ましくは、毎日少なくとも4回用量で施され、前記処置が、低体温法と組み合わされ、前記個体が、新生仔ではない、2-イミノビオチン。
【請求項１１】
0〜4時間における血漿濃度-時間曲線下面積が、100ng.h/mL〜2000ng.h/mLの間となるように投与される、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１２】
0〜4時間における血漿濃度-時間曲線下面積が、300ng.h/mL〜1300ng.h/mLの間となるように投与される、請求項1から11のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１３】
用量が、個体の腎機能に基づき調整される、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１４】
用量が、個体の血清クレアチニンレベルに基づき調整される、請求項13に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１５】
用量が、個体の推定糸球体濾過量(eGFR)に基づき調整される、請求項13に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１６】
前記脳細胞傷害が、脳低酸素虚血及び/又は再灌流傷害である、請求項1から15のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１７】
脳細胞傷害が、心停止と関連する、請求項1から16のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１８】
前記個体が、少なくとも1歳のヒトである、請求項1から17のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項１９】
前記ヒトが、少なくとも2歳のヒトである、請求項18に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項２０】
静脈内投与される、請求項1から19のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項２１】
少なくとも4回、好ましくは少なくとも6回用量が投与される、請求項1から20のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項２２】
予防的に投与される、請求項1から21のいずれか一項に記載の使用のための2-イミノビオチン。
【請求項２３】
個体における脳細胞傷害を処置するための2-イミノビオチンの投与量を決定する方法であって、個体における血清クレアチニン濃度又は推定糸球体濾過量(eGFR)を決定する工程と、血清クレアチニンレベル又はeGFRに基づき、2-イミノビオチンの投与量を調整する工程とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、特に、成体における脳細胞傷害を処置するための、2-イミノビオチンの使用に関する。処置は、1つ又は複数のその症状を含む、脳低酸素虚血及び/又は再灌流傷害の処置のために使用することができる。治療有効用量の2-イミノビオチンを、それを必要とする個体へと投与する工程を含む処置の方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
心停止を含む心疾患は、米国において、最も高頻度で生じる死因である(Heron NVSR 2015)。目撃ありの院外心停止(OHCA)を経た症例のうち、全生存は、11.7%であった(Ewyら、2015)。しかし、これらの評価項目は、複数の患者関連因子及び非患者関連因子に依存する(Shahら、2014;Mosierら、2010;Hasanら、2014;Mauriら、2015;Warrenら、2015;Iqbalら、2015)。
【０００３】
患者の機能評価項目を、OHCA後の初期段階で予測することは、困難である。退院時のCerebral Performance Category (CPC)を、簡便なスクリーニング装置/ツールとして使用することが多い。退院時における1又は2のCPCスコアとして規定される、神経評価項目全般の良好は、目撃ありのOHCA後の患者のうちの6.5%において報告されている(Ewyら、2015)。しかし、CPCスコア単独は、患者の機能を評価するのに十分ではない(Wallinら、2014)。OHCAの生存者中、30%〜50%の間が、退院の数年後まで、認知の欠損を経験する(Greenら、2015)。また、認知機能障害、主に記憶問題も、退院時における初期の神経評価項目が良好なOHCA生存者のうちの29%において存在する(Buanesら、2015)。とりわけ、海馬内の虚血誘導性の神経損傷のために、空間的記憶が影響を受けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許公開第20090197966号
【特許文献２】米国特許第7,319,090号
【特許文献３】WO2011/149349
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Clin Chim Acta.、2012年1月、18;413(1〜2):88〜92頁
【非特許文献２】Rundgren、Resuscitation、2009年7月、80(7):784〜9頁
【非特許文献３】Shinozaki、Crit Care.、2009、13(4):R121
【非特許文献４】Lilja、BMC Cardiovascular Disorders、2013、13:85
【非特許文献５】Sabedra、Resuscitation、2015、90: 67〜72頁
【非特許文献６】Rule AD、Larson TS、Bergstralh EJ、Slezak JM、Jacobsen SJ、Cosio FG、Using serum creatinine to estimate glomerular filtration rate: accuracy in good health and in chronic kidney disease、Ann Intern Med.、2004年12月、21;141(12):929〜37頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生存を改善し、神経機能障害の程度を減じるために、OHCA後における低体温療法の実施が精査されている。低体温法(32〜34℃)を施された患者と、正常体温状態への制御(36℃)を施された患者との間では、認知機能の差違は示されなかった(Liljaら、2015)。この理由で、OHCA並びに虚血及び再灌流傷害が生じる他の疾患の後等、脳低酸素虚血の後において、認知に対する帰結を低減する、新たな戦略が探索されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、個体における脳細胞傷害を処置するための方法であって、それを必要とする個体に、治療有効量の2-イミノビオチン(2-IB)を施す工程を含む方法を提供する。本開示は、脳細胞傷害を処置するための医薬の調製における使用のための2-IBを提供する。本開示は、個体における脳細胞傷害の処置における使用のための2-IBを提供する。方法及び使用は、新生仔ではない個体、すなわち、新生仔より年長の個体における処置のためのものである。
【０００８】
好ましくは、0.05〜10mg/kg/日の2-IBを、前記個体へと投与する。好ましくは、0.2〜10mg/kg/日の2-IB、より好ましくは0.2〜5mg/kg/日の2-イミノビオチンを、前記個体へと投与する。
【０００９】
好ましくは、2-IBによる前記処置を、低体温法と組み合わせる。好ましくは、前記処置を、低体温法と組み合わせ、0.01〜10mg/kg/日の2-IBを、前記個体へと投与する。
【００１０】
好ましくは、0.1〜10mg/kg/日の2-イミノビオチンを、前記個体へと投与し、2-イミノビオチンを、毎日4〜6時間ごと、好ましくは4時間ごとに投与する。好ましくは、処置を、36℃を目標とする温度管理と組み合わせる。
【００１１】
好ましくは、1回用量当たり2〜20の間、より好ましくは、3〜13mgの間の2-IBを投与する。
【００１２】
好ましい実施形態では、0.01〜1.5mg/kg/日の2-イミノビオチンを、前記個体へと投与し、2-イミノビオチンを、4〜6時間ごと、好ましくは6時間ごとに投与し、前記処置を、低体温法と組み合わせる。処置を、低体温法と組み合わせる場合は、好ましくは、0.03〜1mg/kg/日の2-イミノビオチンを投与し、好ましくは0.03〜0.4mg/kg/日の2-イミノビオチンを投与する。好ましくは、1回用量当たり0.7〜8mgの間、より好ましくは、1〜5mgの間の2-IBを投与する。
【００１３】
好ましくは、個体における脳細胞傷害の処置における使用のための2-イミノビオチンであって、18〜78mg/日の間が投与され、毎日少なくとも3回用量、好ましくは、毎日少なくとも6回用量で施され、前記個体が、新生仔ではない、2-イミノビオチンが提供される。好ましくは、2-IBを、2〜10時間ごと、3〜8時間ごと、最も好ましくは、4〜6時間ごとに、持続的に施す。好ましくは、処置を、36℃を目標とする温度管理と組み合わせる。
【００１４】
好ましくは、個体における脳細胞傷害の処置における使用のための2-イミノビオチンであって、4〜20mg/日の間が投与され、毎日少なくとも3回用量、好ましくは、毎日少なくとも4回用量で施され、前記処置が、低体温法と組み合わされる、2-イミノビオチンが提供される。好ましくは、2-IBを、2〜10時間ごと、3〜8時間ごと、最も好ましくは、6〜8時間ごと、特に、6時間ごとに、持続的に施す。
【００１５】
好ましい実施形態では、2-イミノビオチン用量を、個体の腎機能に基づき調整する。好ましくは、2-イミノビオチン用量を、個体の血清クレアチニンレベルに基づき調整する。好ましくは、2-イミノビオチン用量を、個体の推定糸球体濾過量(eGFR)に基づき調整する。
【００１６】
好ましくは、2-イミノビオチンを、4時間後における血漿濃度-時間曲線下面積が、100ng.h/mL〜2000ng.h/mLの間、より好ましくは、300ng.h/mL〜1300ng.h/mLの間となるように投与する。
【００１７】
好ましくは、前記脳細胞傷害は、脳低酸素虚血及び/又は再灌流傷害である。好ましくは、前記脳細胞傷害は、脳低酸素虚血後における再灌流である。好ましくは、脳細胞傷害は、心停止と関連する。
【００１８】
好ましくは、個体は、少なくとも1歳のヒトである。好ましくは、ヒトは、少なくとも2歳のヒトである。
【００１９】
好ましくは、2-イミノビオチンを、非経口投与又は静脈内投与する。
【００２０】
好ましくは、2-イミノビオチンを、少なくとも24時間投与する。好ましくは、少なくとも4回、より好ましくは少なくとも6回用量の2-イミノビオチンを投与する。
【００２１】
好ましくは、2-イミノビオチンを、予防的に、すなわち、脳細胞傷害(脳低酸素虚血及び/又は再灌流傷害等)が生じる前に投与する。
【００２２】
一部の実施形態では、本開示は、個体における脳細胞傷害を処置するための2-イミノビオチンの投与量を決定する方法であって、個体における血清クレアチニン濃度又は推定糸球体濾過量(eGFR)を決定する工程と、血清クレアチニンレベル又はeGFRに基づき、2-イミノビオチンの投与量を調整する工程とを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実験の設定条件を示す図である。
【図２Ａ】低酸素状態誘導性の細胞損傷及び代謝活性に対する、2-IBの効果を示す図である。2-IBは、低酸素状態誘導性の細胞損傷を緩和し、U字型の用量反応曲線を示す。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。全て、それぞれの正常酸素状態対照と対比した*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001。
【図２Ｂ】低酸素状態誘導性の細胞損傷及び代謝活性に対する、2-IBの効果を示す図である。2-IBは、低酸素状態誘導性の細胞損傷を緩和し、U字型の用量反応曲線を示す。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示し、*:1と対比したP<0.05;**:1と対比したP<0.01;#:P<0.05;##:P<0.01。
【図２Ｃ】低酸素状態誘導性の細胞損傷及び代謝活性に対する、2-IBの効果を示す図である。2-IBは、低酸素条件下で、代謝活性を増大させ、U字型の用量反応曲線を示す。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示し、全て、それぞれの正常酸素状態対照と対比した*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001。
【図２Ｄ】低酸素状態誘導性の細胞損傷及び代謝活性に対する、2-IBの効果を示す図である。2-IBは、低酸素条件下で、代謝活性を増大させ、U字型の用量反応曲線を示す。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示し、*:1と対比したP<0.05;**:1と対比したP<0.01;#:P<0.05;##:P<0.01。
【図３Ａ】低酸素状態誘導性の、反応性酸素分子種(ROS)の産生に対する、2-IBの効果を示す図である。2-IBは、低酸素状態誘導性のROS産生を緩和し、U字型の用量反応曲線を示す。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。全て、それぞれの正常酸素状態対照と対比した*:P<0.05;**:P<0.01。
【図３Ｂ】低酸素状態誘導性の、反応性酸素分子種(ROS)の産生に対する、2-IBの効果を示す図である。2-IBは、低酸素状態誘導性のROS産生を緩和し、U字型の用量反応曲線を示す。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。*:1と対比したP<0.05;**:1と対比したP<0.01;#:P<0.05。
【図４】2-IBによる、細胞ストレス関連タンパク質の調節を示す図である。低酸素状態による攻撃の後における2-IBの適用は、低酸素状態誘導性の、細胞ストレスタンパク質の発現を緩和し、下方調節されたタンパク質、及び変化しないままのタンパク質の数の増大をもたらす。プロテオームプロファイリングアレイ:1A:pp38α(ホスホ-p38アルファ)(T181/Y185);1B:HIF2α(低酸素状態誘導因子2アルファ);1C:ADAMTS1 (トロンボスポンジンモチーフ1を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ:disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1);2A:pp53(ホスホ-p53)(S46);2B:pHSP-27(ホスホ熱ショックタンパク質27);2C:Bcl-2(B細胞リンパ腫2);3A:PON1(パラオキソナーゼ1);3B:HSP-60(熱ショックタンパク質60);3C:CAIX(炭酸脱水酵素IX);4A:PON2(パラオキソナーゼ2);4B:HSP-70(熱ショックタンパク質70);4C:Cited2(Cbp/p300相互作用トランス活性化因子:Cbp/p300-interacting transactivator);5A:PON3(パラオキソナーゼ3);5B:IDO(インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ);5C:COX-2(シクロオキシゲナーゼ2);6A:Thio-1(チオレドキシン1);6B:pJNK(ホスホc-Jun n末端キナーゼ)(T183/Y185);6C:CytC(チトクロームC);7A:SIRT2(サーチュイン2);7B:NFkB1(核因子カッパB1);7C:Dkk-4(dickkopf-4);8A:SOD2(スーパーオキシドディスムターゼ2);8B:p21/CIP1(サイクリン依存性キナーゼ阻害剤1A);8C:FABP-1(脂肪酸結合性タンパク質1);9A:-Ctr(陰性対照);9B:p27(サイクリン依存性キナーゼ阻害剤1B);9C:HIF1α(低酸素誘導因子1)。
【図５】鍵となるシグナル伝達分子のリン酸化を示す図である。2-IBは、正常酸素条件下及び低酸素条件下で、生存促進分子であるaktのリン酸化増大の傾向をもたらす。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。N:正常酸素状態;H:低酸素状態。
【図６】LDH/総LDHにより表される、低酸素状態後の、低体温法における細胞損傷に対する、再灌流期の持続の効果を示す図である。再灌流の25時間後から、細胞損傷の著明な増大が存在した。
【図７Ａ】低体温法中における、低酸素状態誘導性の細胞損傷に対する、2-IBの効果を示す図である。2-IBは、低酸素状態誘導性の細胞損傷を緩和する。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。全て、それぞれの正常酸素状態対照と対比した、**:P<0.01;***:P<0.001。
【図７Ｂ】低体温法中における、低酸素状態誘導性の細胞損傷に対する、2-IBの効果を示す図である。2-IBは、低酸素状態誘導性の細胞損傷を緩和する。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。*:1と対比したP<0.05;**:1と対比したP<0.01;***:1と対比したP<0.01。
【図８Ａ】低体温法時の、媒体及び全ての2-IBの投与についての、蛍光(%単位)の増大として表される、過酸化水素の発生を示す図である。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。全て、それぞれの正常酸素状態対照と対比したP<0.01;***:P<0.001。
【図８Ｂ】低体温法中の、媒体及び全ての2-IBの用量についての、蛍光(%単位)の増大として表される、過酸化水素の発生を示す図である。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。*:1と対比したP<0.05;**:1と対比したP<0.01;***:1と対比したP<0.001。
【図９】低体温法中の、媒体及び2-IB(30ng/ml)による処置に対する、PARP切断(%単位)を示す図である。低酸素状態の後で、PARP切断の著明な増大はなかった。
【図１０Ａ】低体温法中の、媒体及び2-IB(30ng/ml)による処置に対する、Erkのリン酸化を示す図である。低酸素状態の後で、Erkのリン酸化の著明な増大があった。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。*P<0.05。
【図１０Ｂ】低体温法中の、媒体及び2-IB(30ng/ml)による処置に対する、aktのリン酸化を示す図である。低酸素状態の後で、aktのリン酸化の著明な増大はなかった。柱は、平均値を提示し;棒は、SDを描示する。*P<0.05。
【図１１】実施例3における研究手順についての概観を示す図である。HI=低酸素虚血。
【図１２】4VO後の32日目における、全ての処置群(平均値±SD)についての記憶試験(隠れたプラットフォームを見出すのに、右四分円内で費やされる時間)を示す図である。
【図１３】4VO後の28日目〜31日目における学習試験:処置群当たりの、隠れたプラットフォームを見出すまでの時間を示す図である。
【図１４】目標値に到達するのに要請されるクリアランス及び用量が、SeCre(血清クレアチニン)の関数として変動することを示す図である。
【図１５Ａ】未調整の用量予測値を示す図である。点線は、356ng.mL/hの目標曝露量を示し、Crea0の範囲を、グレーで示す。(Crea0とは、ベースラインにおける血清クレアチニンを示す)
【図１５Ｂ】SeCreを調整した用量予測値を示す図である。点線は、356ng.mL/hの目標曝露量を示し、Crea0の範囲を、グレーで示す。(Crea0とは、ベースラインにおける血清クレアチニンを示す)
【図１６．１】4時間ごとのIV注入による、当てはめ血清2-IB濃度を示す図である。グラフ上のドットは、外挿された測定値を表す。
【図１６．２】4時間ごとのIV注入による、当てはめ血清2-IB濃度を示す図である。グラフ上のドットは、外挿された測定値を表す。
【図１７】目標値に到達するのに要請されるクリアランス及び用量が、eGFRの関数として変動することを示す図である。
【図１８】未調整の用量予測値、及びeGFRを調整した用量予測値を示す図である。点線は、1068ng.mL/hの上方目標曝露量、及び356ng.mL/hの下方目標曝露量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ビオチン類似体である2-イミノビオチン(2-IB)は、周産期全脳低酸素虚血(HI)の仔ブタモデルにおいて、神経損傷の量を低減する(Peeters-Scholteら、2002)。2-IBは現在、新生仔におけるこの適応について、フェーズ2の臨床試験下にある。新生仔脳は、単に小型の成体脳ではなく、根底的な(病態)生理学的経路が大きく異なるが、本開示は驚くべきことに、2-IBが、成体における低酸素虚血誘導性の神経損傷にも有効な処置であることを実証する。
【００２５】
本開示の1つの目的は、成体、若齢体、及び幼齢体における脳細胞傷害を処置する方法を提供することである。2-IBは、新生仔において使用されているが、新生仔と、成体及び年長仔等、新生仔より年長であり、発育の進んだ個体との間には、重要な差違が存在する。多くの差違のうちのごく一部を、下記にまとめる。
【００２６】
新生仔は、脳の発生の成熟、及び抗酸化系の能力において、年長動物と異なる(Ferrieroら2010及びBen-ariら2012)。新生仔は、アポトーシスを誘導及び調節するために、顕著に異なる方式を有し、代謝が異なる(Cellaら、2011)。未成熟脳と成熟脳との間にはまた、二次的細胞死に関与する過程に対する感受性の差違も存在する(Vannucciら、2004)。更に、脳発生中における、興奮性GABA(A)受容体及び阻害性GABA(A)受容体に媒介される応答の間の発生スイッチも存在し(Kilb W.、2012)、最初の1.5年間は、発生しつつある脳のミエリン形成過程が、なおも進行中である(Haynes RLら2005)。
【００２７】
最後に、新生仔の血液脳関門は、いまだ成熟しておらず、とりわけ、小分子の透過性に関して、成熟血液脳関門と異なる形で機能する。Saundersらは、脳発生中、低分子量の脂質不溶性の化合物に対する透過性が低下することについて報告している(Saundersら、2000)。より近年では、新生仔(neonate)のBBBが、低酸素虚血性損傷に対して、成体のBBBと比較して、異なる形で反応することが示されている(Lopez DFら、2012)。Saundersら、2012では、新生仔(newborn)と、年長個体との間における、他のBBBの差違についても記載されている。結論として述べると、2-IBの場合と同様に、薬物の治療投与量を、新生仔から成体へと外挿することが可能でないことは明らかである。
【００２８】
新生仔脳と、成体脳との間の多くの差違に加えて、新生仔(neonate)はまた、成体と比較して、代謝の差違も有する。腎クリアランス及び肝代謝の重要な変更は、周産期の生存中に生じ、新生仔(newborn)では、多くの薬物の薬理学が、成体と比較して、実質的に異なる(Mulbergら、2009)。
【００２９】
本開示の一態様では、個体における脳細胞傷害を処置するための方法であって、それを必要とする個体へと、治療有効量の2-IBを投与する工程を含む方法が提供される。
【００３０】
好ましくは、2-IBを、初回用量後における、2-IBの、血漿濃度-時間曲線下面積(0〜4時間、AUC 0-4h)が、少なくとも100ng.h/mL、より好ましくは、少なくとも300ng.h/mLとなるように、個体へと投与する。好ましくは、AUC 0-4hは、少なくとも356ng.h/mLである。一部の実施形態では、AUC 0-4hは、100ng.h/mL〜2000ng.h/mLの間、100ng.h/mL〜1300ng.h/mLの間、300ng.h/mL〜2000ng.h/mLの間、又は300ng.h/mL〜1300ng.h/mLの間である。好ましくは、AUC 0-4hは、2000ng.h/mL未満、より好ましくは、1300ng.h/mL未満である。本明細書の実施例で説明する通り、本開示は、処置のための最小目標曝露量が、約356ng.h/mL(血漿濃度)であり、最大で1068ng.h/mL(血漿濃度)を含むレベルもまた有効であることを提示する。本開示は、適切な2-IB曝露レベルをもたらす、いくつかの投与量レジームを提供する。
【００３１】
好ましい実施形態では、方法は、0.01〜10mg/kg/日の2-IBを、個体へと投与する工程を含む。好ましくは、0.05〜10mg/kg/日、より好ましくは、0.2〜10mg/kg/日の2-IBを投与する。2-IBの他の好ましい投与量は、0.05〜5mg/kg/日、0.1〜5mg/kg/日、及び0.2〜5mg/kg/日を含む。2-IBの他の好ましい投与量は、0.05〜3mg/kg/日、0.1〜3mg/kg/日、及び0.2〜3mg/kg/日を含む。2-IBの他の好ましい投与量は、0.05〜1.5mg/kg/日、0.1〜1.5mg/kg/日、及び0.2〜1.5mg/kg/日を含む。2-IBの他の好ましい投与量は、0.05〜1mg/kg/日、0.1〜1mg/kg/日、及び0.2〜1mg/kg/日を含む。2-IBの他の好ましい投与量は、0.05〜0.5mg/kg/日、0.1〜0.5mg/kg/日、及び0.2〜0.5mg/kg/日を含む。0.1〜10mg/kg/日の投与量が最も好ましい。これらの量は、活性成分を指し、炭水化物、脂質、又はタンパク質等、担体材料又はアジュバント材料を含まない。本明細書で更に論じられる通り、2-IBは、毎日数回投与することが好ましい。非限定的な例示的な実施形態では、0.1〜10mg/kg/日の投与量を、4時間ごとに、0.016〜1.6mgの6回用量の2-IBとして施すことができる。
【００３２】
本明細書で記載される2-IB処置は、単回投与を伴いうるが、通例(且つ、好ましくは)、数時間又は数日間にわたる複数回投与を伴う。本明細書で言及される、2-IBの毎日の投与量は、単回用量として、毎日の複数回用量として、又は、例えば、持続注入により、ある一定の期間にわたり、本質的に持続的に投与することができる。好ましくは、2-IBを、4又は6時間ごとに投与する、すなわち、2-IBを、毎日4〜6回投与する。一部の実施形態では、2-IBを、3〜8時間ごと、すなわち、毎日3〜8回投与する。低体温法と組み合わせる場合、2-IBを、好ましくは、6時間ごとに投与する。当業者には、投与される投与量を、長期間にわたり投与しうることが明らかである。好ましくは、2-IBを、スローボーラスIV注入として投与する。好ましくは、2-IBを、15分間のIV注入として投与する。例示的な実施形態としては、6mgの2-IBを、毎日15分間、6回の(すなわち、約4時間ごとの)IV注入として投与する。理論に束縛されることを望まないが、図16は、2-IBを、毎日数回の低用量で投与することが、2-IBの、最小の目標曝露レベルをもたらすことを示す。
【００３３】
実施例5Bで記載する通り、本開示は、2-IBの曝露量に対する体重の影響が最小限であることを提示する。好ましい実施形態では、体重の影響を受けない用量を施すことができる。好ましくは、本明細書で開示される、体重に依存しない用量で処置される個体は、20〜200kgの範囲、より好ましくは、30kg〜180kgの範囲である。
【００３４】
好ましくは、毎日の総用量は、6〜120mgの間、より好ましくは、12〜120mgの間、最も好ましくは、18〜78mgの間である。好ましくは、毎日の用量を、少なくとも3回用量として、すなわち、少なくとも3つの個別の時点において;好ましくは、3〜10回用量の間で投与する。当業者には、3回用量又は少なくとも3つの個別の時点における投与が、持続注入を包含することが明らかである。好ましくは、毎日の用量を、少なくとも4回用量として、すなわち、少なくとも4つの個別の時点において投与する。最も好ましくは、毎日の用量を、少なくとも6回用量として、すなわち、少なくとも6つの個別の時点において投与する。当業者には、各用量(又は時点)の間の時間が、本質的に同じであるべきことが明らかである。好ましくは、2-IBを、2〜39mgの間、2〜20mgの間、3〜39mgの間、より好ましくは、3〜13mgの間、最も好ましくは、3〜12.75mgの間の投与量で投与し、好ましくは、毎日6回投与する。
【００３５】
好ましくは、2-IBを、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、又は13mgの単位投与量として投与する。非限定的な例示的な実施形態では、体重80kgの個体には、1日6回用量の2-IBを施すことができ、各投与量は、3〜13mgを含む。したがって、個体は、1回用量当たり0.04〜0.16mg/kg、0.23〜0.94mg/kg/日を施される。
【００３６】
実施例5Bで記載する通り、本開示は、2-IBのクリアランスが、特に、糸球体濾過量(GFR)による腎機能と関連することを提示する。好ましい実施形態では、2-IBの投与量は、個体の腎機能又は腎クリアランスに基づき調整することができる。これは、糸球体濾過量(GFR)として表し、血清クレアチニンレベルを使用して計算されうる、クレアチニンクリアランス量により概算することができる。
【００３７】
好ましい実施形態では、2-IBの投与量は、個体の血清クレアチニンレベルに基づき調整することができる。クレアチニンとは、筋代謝の副産物であり、典型的に、腎排出により平衡する定常状態にとどまる。血清クレアチニンレベルは、当業者に公知のいくつかの方法により決定することができ、また、いくつかのポイントオブケア検査(point-of-care test)も利用可能であり、例えば、iSTAT Portable Clinical Analyzer(Clin Chim Acta.、2012年1月、18;413(1〜2):88〜92頁において総説されている)及びCardioChek Silver PA Analyzerを参照されたい。したがって、本開示は、個体における脳細胞傷害を処置するための2-イミノビオチンの投与量を決定するための方法であって、個体における血清クレアチニンを決定する工程と、血清クレアチニンレベルに基づき、2-イミノビオチンの投与量を調整する工程とを含む方法を提供する。
【００３８】
好ましくは、2-IBの投与量を、血清クレアチニンに基づき調整する。SeCreを調整した用量は、高GFRを有する個体に、特に有用である。これらの個体では、目標曝露量を達成することを確保するために、2-IBの用量を増大させることができる。血清クレアチニン(SeCre)に基づく、男性のための例示的な投与スキームは、以下:
-  30μM未満、1回用量当たり12〜20mg、好ましくは、1回用量当たり15〜18.75mgのSeCre;
-  30〜40μMの間、1回用量当たり8〜17mg、好ましくは、1回用量当たり10〜15mgのSeCre;
-  41〜50μMの間、1回用量当たり6〜14mg、好ましくは、1回用量当たり7.5〜12mgのSeCre;
-  51〜60μMの間、1回用量当たり5〜11mg、好ましくは、1回用量当たり6〜9.75mgのSeCre;
-  61〜80μMの間、1回用量当たり4〜9mg、好ましくは、1回用量当たり5〜8.25mgのSeCre;
-  81〜100μMの間、1回用量当たり3〜7mg、好ましくは、1回用量当たり4〜6mgのSeCre;
-  101〜125μMの間、1回用量当たり2〜6mg、好ましくは、1回用量当たり3〜5.25mgのSeCre;
-  126〜150μMの間、1回用量当たり2〜5mg、好ましくは、1回用量当たり2.5〜4.5mgのSeCre;
-  150〜200μMの間、1回用量当たり2〜4mg、好ましくは、1回用量当たり2〜3.75mgのSeCre
の通りである。
【００３９】
好ましくは、2-IBの投与量を、eGFRに基づき調整する。eGFRは、血清クレアチニンレベルに基づき、個体の年齢(Age)及び性別(SEX)の両方を考慮に入れる。eGFRを決定するための例示的な式は、以下:
【００４０】
【数１】
2019501969.tif 000002
【００４１】
[式中、性別(SEX):男性=0;女性=1]
の通りである。
【００４２】
eGFRを調整した用量は、高GFRを有する個体に、特に有用である。したがって、本開示は、個体における脳細胞傷害を処置するための2-イミノビオチンの投与量を決定するための方法であって、個体におけるeGFRを決定する工程と、eGFRに基づき、2-イミノビオチンの投与量を調整する工程とを含む方法を提供する。eGFRに基づく例示的な投与スキームは、以下の通りであるが、当業者は、投与量が、下記で列挙される通り、最大で、10又は20%(±)変動しうることを認識するであろう。
【００４３】
【表１】
2019501969.tif 000003
【００４４】
本明細書で使用される「処置」、「〜を処置する」、及び「〜を処置すること」という用語は、脳細胞傷害、又は脳細胞傷害と関連する1つ若しくは複数の症状を軽減するか、遅延させるか、又はこれらの発症を防止するか、又はこれらの進行を阻害若しくは低減することを指す。特に、前記脳細胞傷害は、低酸素状態、虚血、無酸素状態、神経変性、CNS感染、又は外傷性脳傷害と関連する。
【００４５】
好ましい実施形態では、前記脳細胞傷害は、脳低酸素虚血である。虚血とは、生理学的ホメオスタシスの喪失を結果としてもたらす、血流の不足であり、虚血性梗塞をもたらす可能性があり、最終的には、アポトーシスを介して、細胞死をもたらしうる。低酸素状態とは、組織内の酸素アベイラビリティーの低減である。低酸素状態は、虚血性事象から生じうる。本明細書で使用される「低酸素状態」とは、組織への酸素供給の、生理学的レベルを下回る低減を意味する。本明細書で使用される「正常酸素状態」とは、体内組織への酸素供給の、正常レベル又は生理学的レベルを意味する。したがって、低酸素状態はまた、組織への酸素供給の、完全な欠乏である、無酸素状態も含む。
【００４６】
脳低酸素虚血とは、脳細胞の喪失を結果としてもたらす、脳組織の低酸素虚血である。長期間、低酸素虚血下で存続しうる他の組織と異なり、脳組織は、酸素又はエネルギーの欠乏に対して、特に感受性である。非常に短期間の低酸素虚血中であってもなお、ニューロンに対する恒久的な損傷が生じうる。脳虚血は、例えば、凝血塊が脳血管を閉塞させ、脳の特異的領域に限定される場合に生じ、血栓又は塞栓により引き起こされることが多い、局所脳虚血と、例えば、脳の全体への血流が止まるか、又は大幅に低減される場合に生じ、一般に、心血管疾患により引き起こされるが、また、例えば、溺水及び絞扼中にも引き起こされる、全脳虚血とを含む。
【００４７】
脳虚血及び低酸素性脳傷害は、例えば、脳卒中、急性虚血性脳卒中、一過性虚血性発作、急性出血性脳卒中、頭部外傷、脳出血、心停止、脳浮腫、水頭症、仮死、血管閉塞性状態、(動脈及び静脈の)塞栓、血栓、血栓性塞栓、アテローム性動脈硬化、重度の低血圧の遷延、溺死、絞扼、心臓手術の合併症、又は神経系外科手術の合併症の条件下で生じうる。脳低酸素虚血はまた、神経変性、外傷性脳傷害、及びCNS感染からも生じうる。好ましくは、本明細書で記載される方法は、心停止を処置するためのものである。
【００４８】
好ましい実施形態では、2-IBによる処置は、脳虚血及び/又は低酸素性脳傷害を防止するか、これらの重症度を低減するか、又はこれらの1つ若しくは複数の症状の発症を緩徐化する。このような症状は、損傷を受けた脳の規模及び領域に応じて、認知、感覚、又は運動の問題を含む。これらの症状は、麻痺又は筋肉運動の喪失、歩行、発話、又は嚥下の困難(構音障害、嚥下障害、及び失語を含む)、及び作業記憶、注意、学習、計算、視覚的認知、又は実行機能(すなわち、意思決定、組織化、及び問題解決)の欠損を含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、脳傷害は、再灌流傷害である。再灌流傷害とは、虚血又は酸素欠如(無酸素状態、低酸素状態)の期間後において、血液供給が組織へと復帰する場合に引き起こされる損傷である。好ましくは、前記再灌流傷害は、脳虚血低酸素状態の結果である。血液からの酸素及び栄養物の非存在により、循環の回復が、正常な機能の回復ではなく、酸化ストレスの誘導を介して、炎症及び酸化的損傷を結果としてもたらす状態が創出される。再灌流は、例えば、心停止、溺死、絞扼、又は心筋梗塞若しくは脳虚血性脳卒中の後における血管再建術からの蘇生の後で生じうる。
【００５０】
一部の実施形態では、個体における、脳低酸素虚血の発症の後の前記個体における、再灌流傷害を処置する方法が提供される。方法はまた、脳低酸素虚血の危険性がある個体、例えば、心臓又は胸部大動脈の手術を受ける個体における再灌流傷害を処置するのにも使用することができる。
【００５１】
2-IBを、好ましくは、傷害の後、又は傷害を引き起こす事象の後、可能な限り速やかに投与する。例えば、個体を、好ましくは、心停止に至った後、可能な限り速やかに処置する。好ましくは、傷害を引き起こす事象は、再灌流である。好ましい実施形態では、2-IBを、脳低酸素虚血を経験した個体へと投与する。好ましい実施形態では、2-IBを、再灌流がなされた後で、例えば、脳低酸素虚血の後で、個体へと投与する。
【００５２】
好ましくは、患者を、傷害又は傷害を引き起こす事象から、24時間以内に処置する。処置は、脳低酸素虚血又は傷害を引き起こす事象の、24、48、又は72時間後まで持続することができる。処置はまた、個体には、もはや危険性がないと判断されるまで持続することもできる、例えば、感染症の場合、処置は、個体が、無感染となった後、24時間持続することができる。好ましい実施形態では、個体を、再灌流から6時間以内、例えば、蘇生の6時間後、より好ましくは、再灌流から4時間以内に、なおより好ましくは、再灌流から2時間以内に処置する。一部の実施形態では、個体を、当初、低体温法と併せて処置し、再灌流から12時間以内、好ましくは、8時間以内に処置する。
【００５３】
本明細書で使用される、処置はまた、脳細胞傷害を防止するか又は最小化するための予防的処置も含む。例えば、2-IBは、万一、このような手順が、脳虚血をもたらしうる場合に備え、心臓又は胸部大動脈の手術中又はこれらの前に、予防的に投与することができる。これらの実施形態では、2-IBは、例えば、手術後24時間持続する処置と共に、手術の6時間前に投与することができる。一部の実施形態では、2-IBは、手術の1〜5時間前に投与することができる。他の実施形態では、2-IB、特に、非経口的に施される2-IBは、手術の直前(例えば、10分以内)に投与することができる。脳低酸素虚血の危険性がある個体では、長期の処置、例えば、数週間の処置が適応でありうる。好ましくは、2-IBを、長期の処置のために、経口投与する。
【００５４】
本明細書で使用される「個体」という用語は、ヒト、非ヒト霊長動物、齧歯動物、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、及びネコ等、任意の哺乳動物を指す。好ましくは、個体は、ヒトである。本明細書で記載される投与プロトコールは、成体(完全に発育した)並びに幼齢(発育中の)哺乳動物を処置するためのものである。本明細書で記載される個体は、新生仔を包含しない。新生仔状態の持続期間は、動物種ごとに変動するが、当業者には公知である。哺乳動物では、新生仔性は、出生の約4週間後まで持続する。好ましくは、本明細書で言及される個体は、少なくとも6週齢、より好ましくは、少なくとも6カ月齢である。好ましい実施形態では、個体は、少なくとも1歳、より好ましくは、少なくとも2歳であるヒトである。一部の実施形態では、個体は、少なくとも3歳であるヒトである。
【００５５】
好ましい実施形態では、2-IB処置を、当技術分野ではまた、正常体温状態への制御とも称する、36℃を目標とする温度管理と組み合わせる。当業者に公知の通り、36℃を目標とする温度管理は、約36℃の体温を維持するための、個体の能動処置である。当初低体温、例えば、約30℃である患者を、好ましくは、1時間に0.5℃の最大速度で、能動的に再加温する。高体温(例えば、38℃)の患者は、例えば、氷水/冷水、角氷、又は機械的冷却装置を使用して冷却することができる。36℃を目標とする温度管理は、個体が、加温を要請しうるという点で、低体温法による処置と異なる。好ましくは、36℃を目標とする温度管理を、2-IB処置の全過程中に使用する。例えば、36℃を目標とする温度管理は、2-IB処置中の、少なくとも20時間、好ましくは、少なくとも24時間、使用することができる。
【００５６】
本開示の一態様では、個体における脳細胞傷害を処置するための方法であって、それを必要とする個体へと、2-IBを、低体温法と組み合わせて投与する工程を含む方法が提供される。
【００５７】
本明細書で使用される「低体温法」という用語は、例えば、受動的技法又は能動的技法を介して、体温又は頭部温度を低下させることにより、特定の個体を、低体温条件下に供することを指す。典型的に、低体温条件下に供することは、体内組織の細胞代謝を減少させることにより、神経保護をもたらしうる。
【００５８】
一部の実施形態では、哺乳動物における深部体温を、哺乳動物の正常な深部体温の少なくとも摂氏1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10度下方に低下させる。一部の実施形態では、哺乳動物における深部体温を、哺乳動物の正常な深部体温の摂氏1〜10、2〜6度間の、又は、好ましくは、摂氏2〜4度下方に低下させる。
【００５９】
好ましい一実施形態では、哺乳動物の体温を、摂氏約31度〜摂氏約37度の温度に維持する。より好ましくは、哺乳動物の体温を、摂氏約32度〜摂氏約36度、より好ましくは、摂氏約32度〜摂氏約35度、なおより好ましくは、摂氏約33度〜摂氏約34度の温度に維持する。本明細書で使用される低体温法とは、摂氏35度又はこれ未満の深部体温を指す。典型的に、成体ヒトにおける「低体温」条件とは、体温を、摂氏約33度に保つことを指す。
【００６０】
体内の深部体温を低下させることによる低体温法の誘導は、当技術分野で公知の任意の方法により実施することができる。新生仔における、典型的な低体温法の誘導手段は、Olympic CoolCap(商標)システムを使用する、全身又は頭部の冷却を使用する。成体では、低体温法を、氷水/冷水、角氷、又はTekotherm(商標)を使用する表面冷却;冷却ブランケット、及び大血管内に留置されたカテーテルを使用する冷却を含む、他の市販の冷却システム等の機械的冷却装置を使用して誘導することが好ましい。代替的に、低体温法は、例えば、バニロイド受容体アゴニストであるカプサイシノイド、又はカプサイシノイド様アゴニスト(その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20090197966号において記載されている)、並びに血液脳関門を越えることが可能な、NT69L及びNT77等、ニューロテンシン類似体(その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,319,090号において記載されている)等の医薬剤を使用して誘導することができる。
【００６１】
低体温法と、2-IBとは、同時にも、逐次的にも、個別に投与することもできる。本明細書で使用される「同時に」が、2-IBを、低体温法と同時発生的に投与することを意味するのに使用されるのに対し、「組み合わせて」という用語は、2-IBを、同時ではないが、2-IB及び低体温法の両方が、治療効果を示す時間枠内で、「逐次的に」投与する、すなわち、これらの両方が、同じ時間枠内で治療的に作用するように利用可能であることを意味するのに使用される。したがって、「逐次的な」投与は、2-IBの循環半減期が、対象が、低体温条件へと曝露されているときに、それが治療有効量で存在するようなものであることを条件として、2-IBを、低体温法の前又は後5分間、10分間、又は数時間以内に投与することを可能にしうる。好ましい実施形態では、2-IBを、その効果が、個体の体温が、正常へと復帰した後でもなお存在するように投与する。
【００６２】
「組み合わせて」又は「逐次的に」とは対照的に、本明細書では、「個別に」は、2-IBを投与することと、対象を、低体温法へと曝露することとの間の間隔が著明である、すなわち、対象が、低体温条件へと曝露されるときに、2-IBが、血流中に、治療有効量では、まだ存在しないか、又はもはや存在しない可能性があることを意味するのに使用される。
【００６３】
本開示は、2-IBと、低体温法との組合せが、低酸素状態誘導性の細胞損傷の低減に対する効果を、低体温法による処置単独を上回って改善したことを示す。したがって、2-IBの治療有効投与量は、低体温法と組み合わせるとより低い。実施例5Cで記載する通り、2-IB用量を、常温条件と比較して37%減少させることができる。したがって、本明細書で先に提示した、全ての投与量は、用量を、元の用量の37%減少させると、低体温法と組み合わせた使用に適する。2-IBの最小投与量は、0.05mg/kg/日、好ましくは、少なくとも0.2mg/kg/日であるが、低体温法と組み合わせると、最小投与量は、0.01mg/kg/日に低減することができる。低体温法と組み合わせた場合の、2-IBの、より好ましい投与量は、0.05〜10mg/kg/日、0.1〜10mg/kg/日、及び0.2〜10mg/kg/日を含む。低体温法と組み合わせた場合の、2-IBの、他の好ましい投与量は、0.05〜5mg/kg/日、0.1〜5mg/kg/日、及び0.2〜5mg/kg/日を含む。低体温法と組み合わせた場合の、2-IBの、他の好ましい投与量は、0.05〜1.5mg/kg/日、0.1〜1.5mg/kg/日、及び0.2〜1.5mg/kg/日を含む。低体温法と組み合わせた場合の、2-IBの、他の好ましい投与量は、0.05〜1mg/kg/日、0.1〜1mg/kg/日、及び0.2〜1mg/kg/日を含む。低体温法と組み合わせた場合の、2-IBの、他の好ましい投与量は、0.05〜0.5mg/kg/日、0.1〜0.5mg/kg/日、及び0.2〜0.5mg/kg/日を含む。とりわけ好ましい投与量は、0.03〜3.7mg/kg/日、0.04〜3.7mg/kg/日、0.04〜4mg/kg/日、0.03〜1.9mg/kg/日、0.4〜1.9mg/kg/日、0.03〜2mg/kg/日、0.04〜2mg/kg/日、0.03〜1.9mg/kg/日、0.04〜1.9mg/kg/日、0.03〜1mg/kg/日、0.04〜1mg/kg/日、0.03〜0.4mg/kg/日、及び0.04〜0.4mg/kg/日を含む。最も好ましい実施形態では、0.04〜3.7mg/kg/日、好ましくは0.04〜1.9mgの間の2-イミノビオチンを投与する。
【００６４】
実施例5Bで記載する通り、本開示は、2-IBの曝露量に対する体重の影響が最小限であることを提示する。好ましい実施形態では、体重の影響を受けない用量を施すことができる。好ましくは、本明細書で開示される、体重に依存しない用量で処置される個体は、20〜200kgの範囲、より好ましくは、30kg〜180kgの範囲である。
【００６５】
好ましくは、毎日の総用量は、2〜40mgの間、より好ましくは、3〜30mgの間、好ましくは、6〜29mgの間、最も好ましくは、4〜20mgの間である。好ましくは、毎日の用量を、少なくとも3回用量として、すなわち、少なくとも3つの個別の時点において;好ましくは、3〜10回用量の間で投与する。当業者には、3回用量又は少なくとも3つの個別の時点における投与が、持続注入を包含することが明らかである。好ましくは、毎日の用量を、少なくとも4回用量として、すなわち、少なくとも4つの個別の時点において投与する。最も好ましくは、毎日の用量を、少なくとも6回用量として、すなわち、少なくとも6つの個別の時点において投与する。当業者には、各用量(又は時点)の間の時間が、本質的に同じであるべきことが明らかである。好ましくは、2-IBを、低体温法と組み合わせる場合、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、又は5mgの投与量で投与する。非限定的な例示的な実施形態では、体重80kgの個体には、低体温法と組み合わせた、1日4回用量の2-IBを施すことができ、各投与量は、1〜5mgの間を含む。したがって、個体は、1回用量当たり0.01〜0.06mg/kg、0.06〜0.23mg/kg/日を施される。好ましくは、2-IBを、0.5〜8mgの間、好ましくは、0.7〜7mg、より好ましくは、1〜5mgの間の投与量で、好ましくは、毎日4回投与する。
【００６６】
2-IBは、任意の適切な、薬学的に許容される製剤で提供することができる。本開示は、好ましくは、非経口投与のための、2-IBの溶液及び剤形を提供する。本明細書で使用される非経口投与とは、限定せずに述べると、静脈内注射及び静脈内注入、筋内注射及び筋内注入、動脈内注射及び動脈内注入、髄腔内注射及び髄腔内注入、硬膜下注射及び硬膜下注入、くも膜下(subarachnoidal)注射及びくも膜下注入、関節包内注射及び関節包内注入、眼窩内注射及び眼窩内注入、心内注射及び心内注入、皮内注射及び皮内注入、腹腔内注射及び腹腔内注入、経気管注射及び経気管注入、皮下注射及び皮下注入、表皮下注射及び表皮下注入、関節内注射及び関節内注入、被膜下注射及び被膜下注入、くも膜下(subarachnoid)注射及びくも膜下注入、脊髄内注射及び脊髄内注入、並びに胸骨下(intrasternal)注射及び胸骨下注入を含む投与方式を指す。2-IBはまた、長期にわたる処置を要請しうる、神経変性に由来する脳傷害に罹患した患者では、特に、経口投与することもできる。
【００６７】
2-IBは、錠剤、カプセル剤、散剤、サッシェ剤、溶剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、液滴剤、スプレー剤等を含むがこれらに限定されない、このような投与に適する任意の形態でありうる。これらは、任意選択で、1つ又は複数の適する薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、又は担体を使用して、それ自体公知の方式で製剤化することができ、また、例えば、バイアル又はボトル等の適切な容器内に、適切な形でパッケージングすることもできる。
【００６８】
好ましくは、医薬調製物を、例えば、注射により、特に、(ドリップ)注入、スローボーラスにより、又はポンプシステムを介して、静脈内投与する。このような静脈内投与に適する調製物は、例えば、2-IB又はその塩を、水又は薬学的に許容される緩衝液若しくは通常の生理食塩液等の溶液と混合することにより調製することができる。好ましい実施形態では、本明細書で記載される、一定の投与量を、単一の単位剤形として提供する。例えば、本開示は、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、又は5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、又は13mgの2-IBを含む、単一の単位投与量を提供する。
【００６９】
好ましい製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、WO2011/149349において記載されている製剤を含む。例えば、一部の実施形態では、適切な2-IB製剤は、水性溶液の形態であり、例えば、ヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン及びスルホブチルエーテル-ベータ-シクロデキストリン等の、置換ベータ-シクロデキストリンを含む。一部の実施形態では、適切な2-IB製剤は、水性溶液の形態であり、pHを、約4〜約7の範囲内に調整するように、酸緩衝液を含む。好ましくは、製剤は、所望のpHに到達するのに十分な、クエン酸及び/若しくはクエン酸ナトリウム又は他のクエン酸塩を含む。一部の実施形態では、製剤は、1〜25mMの間のクエン酸を含む。一部の実施形態では、製剤は、0.1〜5mMの間のクエン酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも20mMのクエン酸/クエン酸塩を含む。
【００７０】
定義
本明細書で使用される「〜を含む」及びその活用形は、その非限定的な意味で、この語に後続する項目を含むが、具体的に言及されていない項目も除外しないことを意味するように使用される。加えて、「〜からなる」という動詞は、「〜から本質的になる」で置きかえることができ、本明細書で規定される化合物又は添加化合物が、具体的に同定された成分以外のさらなる成分であって、本発明の固有の特徴を変更しない、さらなる成分を含みうることを意味する。
【００７１】
本明細書では、「ある(a)」及び「ある(an)」という冠詞を、冠詞の文法的目的語のうちの、1つ又は1つを超える(すなわち、少なくとも1つの)ものを指すのに使用する。例として、「ある要素」とは、1つの要素又は1つを超える要素を意味する。
【００７２】
数値(約(approximately)10、約(about)10)との関連で使用される「約(approximately)」又は「約(about)」という語は、好ましくは、値が、10という所与の値に、この値の1%を超える値又は1%未満の値を増減させたものでありうることを意味する。
【００７３】
本明細書で引用される、全ての特許及び文献の参照は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【００７４】
本発明を、以下の実施例において、更に説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を明確化するためだけに用いられる。
【実施例】
【００７５】
(実施例1)
2-IBは、in vitroにおいて、低酸素状態誘導性の神経細胞損傷を低減する
2-IBにより媒介される、細胞レベル及び分子レベルに対する効果及び最適の2-IB濃度に関しては、知られていない。本研究の目的は、in vitroにおける、異なる2-IB濃度の、可能な神経保護の効果について検証し、根底的な細胞機構について探索することであった。
【００７６】
実験設定
in vitroにおける低酸素状態は、わずかな改変を伴う、本発明者らが近年記載した系(Huangら、2013b;Weberら、2015;Zittaら、2010)を使用することにより、細胞培養物中で誘導した。カタラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(いずれも、Sigma-Aldrich社製)の酵素原液(100倍濃度)を、細胞培養培地(DMEM/F12、1%のFCS;最終濃度:それぞれ、120U/ml及び2U/ml;Sigma-Aldrich社)中で調製したところ、5分以内に、10mmHgを下回る酸素分圧(pO2)の低下がもたらされた。低酸素条件は、組織酸素圧モニター(LICOX (登録商標) CMP Oxygen Catheter;Integra社、Plainsboro、USA)を使用することにより確認した。低酸素状態の7時間後、細胞を、PBS(PAA)で、2回洗浄し、溶媒(クエン酸緩衝液1%)又は2-IB(10、30、50、100、及び300ng/mL)を補充した、新鮮な正常酸素培地を、細胞へと添加した。細胞の損傷、代謝活性、ROS、過酸化水素、亜硝酸塩/硝酸塩の産生、erk1/2、akt、及びstat5のリン酸化、並びに細胞ストレスタンパク質の発現についての精査を、細胞培養培地又は細胞タンパク質で実施した(図1)。
【００７７】
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)による細胞傷害作用アッセイ
培養細胞からの、LDHの、培地への放出は、比色細胞傷害作用検出キット(Roche社、Mannheim、Germany)を使用することにより定量化した。試料は、製造元のプロトコールに基づき調製した。略述すると、培養培地を、低酸素状態の24時間後に回収し、-20℃で保存した。総LDHを査定するために、細胞を、2%のTriton X-100(Carl Roth社、Karlsruhe、Germany)で、37℃で15分間溶解させた。試料のLDH活性は、Magellanソフトウェアv1.1と組み合わせたELISAリーダー(Tecan社、Crailsheim、Austria)を使用して、96ウェルプレート内、490nmで測定した。
【００７８】
代謝活性アッセイ
代謝的に活性の細胞は、比色キット(CellTiter96 (登録商標) AQueous One Solution Reagent G3580;Promega社、Madison、WI、USA)を使用することにより査定した。試料は、製造元のプロトコールに従い調製した。略述すると、ウェル1つ当たり、10%のFCSを補充した、100μl DMEM/F12を伴う、96ウェルプレート内に、ウェル1つ当たりの細胞4×104個を播種した。培養物中で2日後、正常酸素状態又は低酸素状態を、7時間適用するのに続き、2-IB又はそれぞれの溶媒対照(クエン酸塩1%)を、17時間添加した。この後、20μlのMTT試薬を、37℃で2.5時間、各ウェルへと添加した。代謝活性の細胞は、有色の産物を発生させ、その吸光度を、Magellanソフトウェアv1.1と組み合わせたELISAリーダー(Tecan社、Crailsheim、Austria)を使用して、490nmで測定した。
【００７９】
反応性酸素分子種及び過酸化水素の測定
反応性酸素分子種(ROS)を測定するために、ウェル1つ当たりの細胞4×104個を播種し、黒色壁面の96ウェルプレート(Greiner Bio-One社、Frickenhausen、Germany)内で、3日間培養した。低酸素状態の後、細胞を、あらかじめ加温したPBSで洗浄し、溶媒(クエン酸塩1%)又は2-IB(10、30、50、100、300ng/ml)を補充した、1%のウシ胎仔血清(PAA)を伴う、フェノールレッド非含有DMEM/F12培地(Gibco (登録商標)-invitrogen社、NY、USA)中で、17時間培養した。細胞内ROSは、細胞内ROSにより、蛍光性ジクロロフルオレセイン(DCF)へと酸化される、2'7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸塩(H2DCFDA、Sigma-Aldrich社)を、10μMの最終濃度まで添加することにより測定した。DCFロード細胞を、暗所内、37℃に保ち、ELISAリーダー(Genios FL;Tecan社、Crailsheim、Austria)を使用して、蛍光を、485nmの励起波長及び535nmの発光波長で査定した。蛍光データは、時点0(T0)及び30分(T30)において収集し、結果は、経時的に蛍光(%)の増分[(T30-T0)/T0×100]として計算した。過酸化水素は、培養培地中で、試薬中に用意されているFe2+が、試料中に存在する過酸化水素により、Fe3+へと酸化すると、紫色の複合体を形成する、発色性Fe3+-キシレノールオレンジ反応を活用するQuanti-Chrom (商標) Peroxide Assay Kit (Bio-Assay Systems社、Hayward、USA)で測定した。略述すると、100μlの検出試薬を、20μlの培養培地へと添加し、製造元のプロトコールに基づき、測定を実施した。比色試料及び標準物質の吸光度は、ELISAリーダー(Tecan社、Crailsheim、Germany)を使用して、620nmで測定した。
【００８０】
硝酸塩/亜硝酸塩アッセイ
硝酸塩及び亜硝酸塩の濃度は、製造元の指示書に従い、Griess比色アッセイキット(Sigma-Aldrich社)を使用して、培養培地中で査定した。540nmにおける吸光度は、ELISAリーダー(Tecan社、Crailsheim、Germany)を使用して、試料及び標準物質中で測定した。
【００８１】
タンパク質の単離及びウェスタンブロット法
タンパク質抽出は、150mMの塩化ナトリウム、1%のNP-40、1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、及び50mMのトリス-HCl緩衝液(pH7.6;全て、Sigma-Aldrich社製)又は、代替的に、M-PER緩衝液(Mammalian Protein Extraction Reagent;Pierce社、IL、USA)を含有するRIPA緩衝液を使用して実施した。タンパク質濃度は、Roti (登録商標)-Quant assays (Carl Roth社)で決定し、試料は、使用まで、-20℃で保存した。ウェスタンブロット法のために、30μgの全タンパク質を、4倍濃度のLaemmli緩衝液(8%のSDS、40%のグリセロール、20%の2-メルカプトエタノール、0.008%のブロモフェノールブルー、0.25Mのトリス-HCl;全て、Sigma-Aldrich社製)と混合し、95℃で、3分間インキュベートした。試料を、10%のSDS-PAGEゲル中の電気泳動により分離し、PVDF膜(Amersham Pharmacia Biotech社、Piscataway、USA)へと転写した。3%のBSAを伴うTBST中、室温で1時間のブロッキングの後で、膜を、リン酸化erk1/2(Cell signalling technology社;1:8,000)、erk1/2(Cell signalling technology社;1:8,000)、リン酸化akt(Cell signalling technology社;1:1,000)、akt(Cell signalling technology社;1:2,000)、リン酸化stat5 (R&D Systems社、Minneapolis、USA;1:200)、及びstat5 (R&D Systems社、Minneapolis、USA;1:200)に対して特異的な一次抗体と共に、4℃で、一晩インキュベートした。TBST緩衝液中の洗浄後、製造元の指示書を使用して、膜を、ペルオキシダーゼコンジュゲートブタ抗ウサギ免疫グロブリンG(Dako社、Hamburg、Germany;1:20,000)と共に、1時間インキュベートした。増強型化学発光(ECL-Plus Western Blotting Detection Reagents;Amersham Pharmacia Biotech社、Buckinghamshire、UK)を使用して、最終反応を視覚化し、膜を、X線フィルムへと曝露した。画像を撮影し、ソフトウェアであるImageJ(v1.41o、NIH)で、密度測定法により解析した。
【００８２】
細胞ストレスプロテオームプロファイラーアレイ
プロテオームプロファイリングは、市販の細胞ストレスプロテオームプロファイラーアレイ(R&D Systems社、Minneapolis、USA)と、アッセイキットと共に提供される製造元のプロトコールとを使用して実施した。各実験(N=4)から、等量(50μg)のタンパク質をプールし、それぞれのアレイ膜へと適用した。ImageJ 1.41oソフトウェア(ImageJ、NIH、USA)を使用する、アレイの密度測定的解析により、26の細胞ストレス関連タンパク質の発現レベルを査定した。
【００８３】
統計学的解析
統計学的解析は、GraphPad Prism 5(GraphPad Software社、San Diego、USA)を使用して実施した。全ての実験は、各実験において、少なくとも二連の試料を使用して、5回、独立に実施した。例外は、(i)4回の実験の試料をプールした、ストレスプロテオームプロファイラーアレイと、(ii)3回、独立に実施した、ウェスタンブロット法研究とであった。データは、標準偏差(SD)を伴う平均値として提示する。統計学的比較は、ボンフェローニの事後検定を伴う、スチューデントのt検定、一元ANOVA(群内比較のための)、及び二元ANOVA(群間比較のための)を使用して実施した。pが0.05未満である場合に、差違を、統計学的に有意であると考えた。ノンパラメトリックデータは、クルスカル-ワリス検定及びダンの事後検定により解析した。パラメトリック検定の解析のためには、データを変換し(xの平方根のアークサイン)て、正規性を得た。
【００８４】
結果
2-IBは、低酸素状態誘導性の細胞損傷を低減し、代謝活性を増大させる
低酸素状態の17時間後において、細胞損傷は、正常酸素状態と比較して著明に増大した(LDH/総LDH:正常酸素状態:0.08±0.02;低酸素状態:0.19±0.05、P<0.001;図2A)。10〜100ng/mlの間の範囲の2-IBの添加は、低酸素状態誘導性のLDH放出を、正常酸素条件下で見出されるレベルへと低減した(10ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.09±0.02;低酸素状態:0.15±0.03;P>0.05。30ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.11±0.03;低酸素状態:0.13±0.02;P>0.05。50ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.14±0.04;低酸素状態:0.14±0.04;P>0.05。100ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.10±0.02;低酸素状態:0.15±0.03;P>0.05 図2A)。この効果は、高濃度の2-IBでは観察されなかった(300ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.10±0.02;低酸素状態:0.20±0.06;P<0.05;図2A)。低酸素状態誘導性の細胞損傷の低減に関しては、30及び50ng/mlの2-IBが、最も有効な濃度であった(対照と対比したP<0.05;図2B)。
【００８５】
MTSアッセイは、低酸素状態の17時間後における、正常酸素条件下で増殖させた細胞と比較した、IMR-32細胞の代謝活性の著明な低減を明らかにした(代謝活性(任意単位):正常酸素状態:0.61±0.09;低酸素状態:0.33±0.07;P<0.01;図2C)。10〜50ng/mlの間の範囲の2-IBの添加は、低酸素状態媒介性の代謝活性の低減を、正常酸素条件下で見出されるレベルへと緩和した(代謝活性(任意単位):10ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.44±0.08;低酸素状態:0.44±0.10;P>0.05;30ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.49±0.08、低酸素状態:0.45±0.09;P>0.05;50ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.50±0.08;低酸素状態:0.41±0.06;P>0.05;図2C)が、高濃度の2-IB(100及び300ng/ml)は、有効ではなかった(代謝活性(任意単位):100ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.58±0.09;低酸素状態:0.33±0.06;P<0.05。300ng/mlの2-IB、正常酸素状態:0.63±0.09;低酸素状態:0.33±0.07;P<0.01;図2C)。低酸素状態誘導性の代謝活性の低減には、10、30、及び50ng/mlの2-IBが、最も効率的に対抗した(対照と対比したP<0.01;図2D)。
【００８６】
2-イミノビオチンは、低酸素状態誘導性の、反応性酸素分子種の産生を低減する
反応性酸素分子種(ROS)の産生は、低酸素条件下で著明に増大した(ROSの増大(T30-T0)/T0×100:正常酸素状態:129.18±26.92;低酸素状態:248.02±59.24;P<0.05;図3A)。低2-IB用量(30及び50ng/ml)は、低酸素状態誘導性のROSの産生を、正常酸素条件下で見出されるレベルとそれほど異ならないレベルへと緩和した(ROSの増大(T30-T0)/T0×100:30ng/mlの2-IB、正常酸素状態:118.93±20.09;低酸素状態:222.00±52.57;P>0.05。50ng/mlの2-IB、正常酸素状態:154.85±30.83;低酸素状態:233.38±53.94;P>0.05;図3A)が、高濃度の2-IBは、有効ではなかった(ROSの増大(T30-T0)/T0×100:100ng/mlの2-IB、正常酸素状態:128.84±21.94;低酸素状態:246.71±58.94;P<0.05。300ng/mlの2-IB、正常酸素状態:141.20±25.35;低酸素状態:311.57±79.02;P<0.01;図3A)。低酸素状態誘導性のROSの発生は、50ng/mlの2-IBにより最も効率的に緩和された(図3B)。低酸素状態はまた、過酸化水素産生の劇的な増大も結果としてもたらした(低酸素状態:19.01±2.61μM;正常酸素状態:0.10±0.07μM;P<0.001)。しかし、この濃度の2-IBは、細胞保護性であり、低酸素状態誘導性のROS産生を緩和した(図2A及び図2B並びに図3A、図3B)が、30ng/mlの2-IBの添加は、低酸素状態誘導性の過酸化水素の放出を緩和しなかった(データは示さない)。NO及び他の生体活性の窒素酸化物(Kaandorpら、2010)を形成しうる、硝酸塩及び亜硝酸塩に関して、比色測定は、IMR-32細胞の培養培地が、両方の分子を、非常に低濃度(<5μM)で含有するにすぎず、硝酸塩濃度も、亜硝酸塩濃度も、低酸素状態又は2-IBの影響を受けないことを明らかにした(データは示さない)。
【００８７】
低酸素状態誘導性の、細胞ストレス関連タンパク質の発現は、2-IBにより緩和される
細胞ストレスプロテオームプロファイリングアレイは、低酸素状態の後における、23/26(88%)の細胞による、ストレス関連タンパク質の上方調節を明らかにする一方で、下方調節された細胞は、1/26(4%)だけであり、2/26(8%)の細胞は変化しなかったことを明らかにした。低酸素状態による攻撃の後における、30ng/mlの2-IBの適用は、低酸素状態誘導性の、細胞ストレスタンパク質の発現を、19/26(73%)のタンパク質の上方調節へと緩和し、下方調節されたタンパク質(3/26(12%))、及び変化しないタンパク質(4/26(15%;図4))の数の増大を結果としてもたらした。精査したタンパク質についての詳細な解析を、Table 1(表2)に示す。
【００８８】
【表２】
2019501969.tif 000004
【００８９】
2-イミノビオチンは、生存促進分子であるaktのリン酸化を増大させる
2-IB(30ng/ml)は、erk1/2及びstat5のリン酸化に影響を及ぼさなかった。しかし、生存促進分子であるaktのリン酸化増大の傾向が、正常酸素条件下及び低酸素条件下で検出された(ホスホakt/akt、正常酸素状態:0.23±0.09;ホスホakt/akt、低酸素状態:0.29±0.14;ホスホakt/akt、正常酸素状態に加えた30ng/mlの2-IB:0.78±0.54;ホスホakt/akt、低酸素状態に加えた30ng/mlの2-IB:0.60±0.33;P>0.05;図5)。
【００９０】
考察
2-IBは、NOの生合成の可逆性の阻害剤であって、主に、iNOS及びnNOSの活性をブロックする阻害剤である(Tatarannoら、2015)。しかし、2-IBの細胞効果は、NOSの調節だけに限定されない可能性があり、何人かの著者は、2-IB作用の、NOS非依存性の経路の関与を示唆している(Nijboerら、2008;Tatarannoら、2015;van den Tweelら、2005;van Kesterenら、2006)。
【００９１】
ここで、本発明者らは、IMR-32細胞の、ヒト神経細胞培養物モデルを用いて、2-IBの、根底的な細胞機構について探索するように、in vitroにおいて、2-IBの、可能な神経保護の効果を査定し、最適の神経保護性濃度を決定した。IMR-32細胞が発現させるNOS(mRNA、タンパク質、及びNOS活性)は、微量であるにすぎない(Fujisawaら、1994)。これらの知見は、IMR-32細胞の培養培地中の、低濃度の硝酸塩及び亜硝酸塩を示す、本発明者らのデータにより確認される。硝酸塩及び亜硝酸塩の合計は、総NO量と良好に相関するので(Kaandorpら、2010)、本発明者らのデータは、IMR-32培養物中の、低NO濃度及びNOS活性を示唆し、IMR-32を、NOSに依存しない、2-IB媒介機構についての精査に適するモデルとして分類する。
【００９２】
in vivoにおける、低酸素性/虚血性の傷害は、高エネルギーのリン酸化合物の、急速な喪失と、グルタミン酸の放出、並びに電位依存型カルシウムチャネル及びグルタミン酸調節型カルシウムチャネルの両方の開放を誘導する結果として、サイトゾルのCa2+濃度の大幅な増大をもたらす、脱分極の一般化とを結果としてもたらす(Whiteら、2000)。このCa2+の増大は、神経細胞の変性を最終的にもたらす事象のカスケードを誘発する(Perroneら、2013)。本発明者らが近年記載した、in vitroにおける、酵素的低酸素系(Huangら、2013a;Huangら、2013b;Hummitzschら、2014;Weberら、2015;Zittaら、2012)を用いる第1の手法では、IMR-32細胞を、7時間低酸素状態に供する結果として、細胞損傷の著明な増大、代謝活性の低減、及び培養培地中のROSの蓄積をもたらした。低酸素状態による攻撃の後で、培養物を、異なる濃度の2-IBと、24時間インキュベートすることにより、低酸素状態誘導性の細胞損傷が緩和され、細胞の代謝活性が増大し、ROSの産生が低減する一方、低酸素状態媒介性の、過酸化水素の増大は、2-IBの影響を受けなかった。興味深いことに、本発明者らの結果は、培養培地中に、30ng/ml〜50ng/mlの間の範囲の2-IB濃度が、in vitroにおける、低酸素状態誘導性の細胞損傷の低減に最も有効であることを明らかにした。高濃度又は低濃度の2-IBは、有効ではないか、又は有害効果を示した。
【００９３】
細胞損傷、代謝活性、及びROSの産生に関して、本発明者らの研究の結果は、多数の、生物学的精査、毒性学的精査、及び薬理学的精査において文書化されている、U字型の用量応答関係を示した(Calabrese及びBaldwin、2001)。
【００９４】
低濃度の2-IBが、低酸素状態誘導性の細胞損傷から保護するという上述の知見に基づき、本発明者らは、2-IBの、潜在的なさらなる作用方式について更に精査することを決定した。細胞ストレスプロテオームプロファイリングを実施し、低酸素状態が、精査したストレスタンパク質のうちの88%を上方調節したのに対し、低酸素状態の後、細胞を、30ng/mlの2-IBと共に、4時間インキュベートした後では、73%だけが上方調節されたことを明らかにした。細胞ストレスの主要な指標の1つは、ROSであり(Morettiら、2015)、いくつかの研究は、脳虚血及び再灌流の後における、細胞ストレス及びアポトーシスに対する、抗酸化薬の保護的効果を実証している(Perroneら、2013)。2-IBは、抗酸化機能を有し(Fan及びVan Bel、2010;Peeters-Scholteら、2002)、本発明者らはまた、2-IBによる、低酸素状態誘導性のROS産生の、中程度の低減も示した。細胞ストレスタンパク質発現の、低酸素状態及び2-IBに媒介される変化は、低酸素状態の終了の、早くも4時間後には検出可能であったが、ROSの著明な変化は、低酸素状態の17時間後に生じた。したがって、本発明者らは、ROSの産生が、低酸素状態誘導性の細胞ストレスの帰結を表し、2-IB媒介性の、ROSの低減が、おそらく、細胞ストレスタンパク質発現の早期の低減により、間接的に達成されると考える。2-IBが、細胞ストレスタンパク質の調節により、ROSの産生を、間接的に緩和するという仮説はまた、2-IBの直接的な抗酸化機能が、これまでのところ記載されていないという事実によっても裏書される。
【００９５】
最後に、細胞ストレスと、アポトーシスとは、緊密に関連しており(Mendez-Armentaら、2014;Rodrigoら、2013)、細胞シグナル伝達分子である、akt及びerkのリン酸化は、抗アポトーシス経路を誘導することが記載されている(Jalsraiら、2014;Zhangら、2014)。本発明者らは、30ng/mlの2-IBを添加した後で、低酸素条件下のほか、正常酸素条件下でも見出される、aktのリン酸化の増大への傾向を観察した。aktの活性化はまた、異なるサーチュイン(SIRT)アイソフォームによっても達成することが可能であるが(Pillaiら、2014)、本発明者らの細胞ストレスアレイの結果は、正常酸素条件下及び低酸素条件下における、2-IBの添加の後で、SIRT2の発現の増大を示したことから、2-IB媒介性経路が、aktのリン酸化及び/又はサーチュインの発現を伴いうることが示唆される。
【００９６】
まとめると、本発明者らは、低酸素状態誘導性の神経細胞損傷が、低濃度の2-IBにより阻害され、関連する機構が、ROS及びストレス関連タンパク質発現の下方調節を伴いうることを示す。
【００９７】
(実施例2)
in vitroにおける、2-IBと、低体温法との組合せ処置
本発明者らは、ビオチン類似体である、2-イミノビオチン(2-IB)が、神経細胞損傷を低減することが可能であることを示した。ここでは、本発明者らは、2-IBが、穏和な低体温条件下でもまた、低酸素状態誘導性の神経細胞損傷を緩和する潜在的可能性を有するのかどうかを査定した。
【００９８】
方法:in vitroにおける低酸素状態は、IMR-32細胞培養物を使用して、7時間誘導した。低酸素状態による攻撃の後で、培養物を、25時間の、穏和な低体温法(33.5℃)に供し、2-IB(10、30、50、100及び300ng/ml)を伴うか又は伴わずにインキュベートした。細胞の形状は、明視野顕微鏡により査定し、細胞の損傷は、LDHアッセイにより解析した。反応性酸素分子種(ROS)の産生は、蛍光測定アッセイを使用して測定した。PARP及びリン酸化aktのほか、非リン酸化akt及びerk1/2についてのウェスタンブロット法を実施した。
【００９９】
結果:低酸素状態は、低体温条件下であってもなお、細胞損傷の形状的徴候をもたらした。細胞を、穏和な低体温条件下で増殖させた場合、細胞損傷のマーカーとしてのLDHの測定は、低酸素状態による攻撃の、最も早い場合で、25時間後には、著明なLDHの増大を明らかにした(p<0.01)一方、常温条件下では、低酸素状態による攻撃の、早ければ、17時間後に、同等な細胞損傷が、既に検出可能であった(図6)。低酸素状態後における、30ng/mlの2-IBの適用は、低酸素状態誘導性のLDHの放出を、低体温法下であってもなお低減し、結果として、正常酸素状態下で観察される値に対して、統計学的に有意ではないLDHレベルをもたらした(低酸素状態:正常酸素状態と対比したp<0.01;低酸素状態+2-IB:正常酸素状態と対比したp>0.05)(図7)。低酸素状態後における、2-IB (30ng/ml)の適用は、低体温条件下の、低酸素状態誘導性のROS産生を緩和した(低酸素状態:正常酸素状態と対比したp<0.01;低酸素状態+2-IB:正常酸素状態と対比したp<0.05)。高濃度の2-IBは、低酸素状態誘導性のROSの発生の低減に、それほど有効ではなかった。培養培地中の、過酸化水素の濃度は、穏和な低体温法下の低酸素状態により、9倍に増大した(正常酸素状態と対比したp<0.001)が、低酸素状態後における、2-IBの適用は、過酸化水素の発生に影響を及ぼさなかった(図8)。PARPの切断及びaktのリン酸化は、傾向として、低酸素状態による攻撃の後で増大した(図9及び図10B)が、低酸素状態は、生存促進性のerk1/2のリン酸化を著明に増大させた(正常酸素状態と対比したp<0.05;図10A)。穏和な低体温法下の、低酸素状態後における、2-IBの添加は、言及した分子の切断又はリン酸化に影響を及ぼさなかった(図9並びに図10A及び図10B)。
【０１００】
結論:2-IBは、穏和な低体温条件下で、低酸素状態誘導性の神経細胞損傷を低減する。2-イミノビオチンと、穏和な低体温法との組合せは、低酸素状態誘導性の細胞損傷を低減するための、有望な戦略である。
【０１０１】
(実施例3)
成体ラットの、前脳虚血後における、2-IBの有効性
成体ラットにおける、改変4血管(4VO)閉塞モデルは、一過性であるが、重度の脳虚血の帰結について研究するのに非常に有効なモデルである(Pulsinelli及びBuchan、1988)。したがって、本研究の目的は、再灌流時に投与された2-IBが、成体における心停止を模倣する、4VOラットモデルにおける認知機能を改善しうるのかどうかについて精査することであった。
【０１０２】
方法:
4血管閉塞モデル:
既に記載されている(Meilinら、2014)通りに、ケタミン(90mg/kg)及びキシラジンナトリウム(10%)を使用して、ラットに麻酔をかけた。まず、頸椎を露出させ、椎骨動脈を、電気焼灼により恒久的に閉塞させ、腹側正中における頸部切開により、総頸動脈を摘出し、4.0シルク縫合結紮を使用して持ち上げ、それらの周囲に置いた。
【０１０３】
椎骨動脈閉塞の24時間後、イソフルランを使用して、動物に、再度麻酔をかけた。総頸動脈を、露出させ、15分間、微細動脈瘤クリップを使用して、閉塞させた。クリップを除去した後で、再灌流が生じた。頸部における切開部の皮膚は、4-0シルク縫合糸を使用して縫合した。手術中、動物の深部体温は、体温計(Model 8402-00;Cole-Parmer Instrument Co. Ltd社、London、UK)へと接続した直腸内プローブ(モデル400;YSI Inc.社、Yellow Springs、OH、USA)を使用してモニタリングした。直腸内温度が、37〜38℃に達したら、虚血性攻撃を開始し、温熱マットレスを使用して、手順を通して、この温度を維持した。
【０１０４】
偽手術下動物には、椎骨動脈及び頸動脈の閉塞を伴わない同じ手順を施した。動物に、麻酔をかけた。閉塞を伴わずに、椎骨動脈を露出させた。次いで、皮膚を縫合し、動物を、それらのケージへと戻した。研究の1日目に、動物に再度麻酔をかけ、閉塞を伴わずに、総頸動脈を露出させた。次いで、皮膚を縫合し、動物を、それらのケージへと戻した。
【０１０５】
全虚血の存在は、虚血中、数秒間、麻酔を除去することにより検証した。立ち直り反射を示さなかった動物は、虚血性と考え、研究に含んだ。虚血の24時間後に、このモデルにおける挙動履歴に特徴的ではない、異常な挙動を示す動物は、研究から除外した。
【０１０６】
処置
(Van der Tweel、2005)の新生仔HIラットモデルにおいて、処置レジメンが神経保護性であることが既に実証されている処置を、閉塞の12時間後及び24時間後の再灌流時に、s.c.に直接施した。馴致期間中に、ラットを、実験群へと、無作為に割り当てた。ケージ1つ当たり、複数の動物を4VOに供したか、又はケージ1つ当たり1匹のラットを、HIに供した。ラットに、媒体(pH3.8〜4.0の、通常の生理食塩液)、又は2-IB(pH3.8〜4.0の通常の生理食塩液5ml/kg中に溶解させた、1.1mg/kg、3.3mg/kg、10mg/kg、及び30mg/kg)を施した。各投与群は、研究期間中に、糞便を摂取することによる交差汚染を回避するように、個別のケージ内に保持された。実験群は、以下の通りであった。
【０１０７】
【表３】
2019501969.tif 000005
【０１０８】
モリス水迷路試験
試験は、昼間に実施した。ラットを、120秒間、又はラットが、水面下1cmに隠れたプラットフォームを見つけ出すまで、標準化され、水で満たされた、直径1.2mのプールに導き入れた。プールを設置した室内に、いくつかの視覚的目印を与えて、ラットが、水迷路を空間的に進むことを可能とした。隠れたプラットフォームを見つけ出したラットには、10秒間プラットフォーム上にとどまらせ、120秒以内にプラットフォームを見出せなかったラットも、10秒間、プラットフォーム上に置いた。ラットには、隠れたプラットフォームを見出す、2回の試行を許容し、この学習試験を、4日間にわたり実施した(28〜31日目)。5日目(32日目)に、記憶試験を実施し、この時、隠れたプラットフォームを取り外し、ラットを、60秒間の単回の試験のために、プールに入れた。隠れたプラットフォームが以前設置されていた四分円内で各ラットが費やした時間の長さを、実験群に対して盲検処理された観察者が記録した。
【０１０９】
モリス水迷路を使用して、ラットが、隠れたプラットフォームの位置をどのくらい良好に記憶し、ラットが、適切な四分円へと進むことを学習したのかどうかを査定した。正しい四分円内でラットが費やした時間を測定した。これを、主要評価項目と考えた。
【０１１０】
学習試験中に、水中で隠れたプラットフォームを見出す時間を計算した。また、その後における学習試験についての曲線下面積(AUC)も計算した。これらのパラメータを、副次評価項目と考えた。
【０１１１】
組織学
ラットは、過剰用量のペントバルビタールナトリウム(100mg/kgのi.p.)による攻撃の33日後に屠殺した。各群について、少なくとも9匹のラットにおいて、組織学的解析を実施した。他の、群1つ当たり3匹のラットの脳は、液体窒素中で瞬時凍結させ、将来の解析のために保存した。脳を、左脳室から、ヘパリン添加された通常の生理食塩液で灌流して、脳から過剰な血液を除去した。その後、脳を、4%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝食塩液で灌流した。全脳を取り出し、更に少なくとも72時間、ホルムアルデヒド中に浸漬した。脳は、パラフィン中に包埋した。冠状切片(6mm)を、ブレグマから約3.3mmにおいて切り出し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した。切片を、この全虚血モデルにおいて、最も損傷を受けたエリアである、海馬のCA1領域の右部分及び左部分における生存ニューロンについて、盲検的にスコア付けした。これもまた、副次評価項目のパラメータと考えた。
【０１１２】
統計学的解析
平均値±SDを8±4として推定される差違について、80%の検定力及び0.05のアルファを使用すると、実験群1つ当たり、少なくとも13匹のラットが必要とされた。しかし、多数のラットで手術手順を始めたが、手術手順のために失われた。偽手術ラット(n=6)には、手術手順だけを施し、血管閉塞(恒久的又は一時的)は施さなかった。
【０１１３】
全てのデータは、平均値±S.D.として表す。データの統計学的査定は、適切な場合、一元ANOVAを使用して実施した。経時的な変数の変化については、共変量としてのベースラインと共に、一般線形モデル解析を使用した。事後解析は、媒体処置と対比した、ダネットの両側検定を使用して実施した。<0.05のp値を、統計学的に有意であると決定した。統計学的解析は、SPSS(IBM社、version 22)を使用して実施した。
【０１１４】
研究手順の概略については、図11を参照されたい。
【０１１５】
結果:
動物
体重は、全ての群について、経時的に増大した。処置群間で、有意差はなかった。また、血糖値間でも、有意差は見出されなかった。
【０１１６】
記憶
32日目に、正しい四分円内で費やされた時間として規定される記憶試験は、偽手術ラットにおける10.1±3.0秒間、媒体処置ラットにおける3.9±4.4秒間、並びに1回用量当たり1.1、3.3、10、及び30mg/kgの2-IB処置ラットのそれぞれにおける、10.7±4.4、12.7±6.7、12.0±7.3、及び12.5±6.0秒間であった(図12)。一元ANOVAは、媒体群と、2-IB処置群との有意差(p<0.0005)を示した。ダネットの事後解析は、媒体群と、1回用量当たり1.1mg/kg群との有意差(p=0.003)、媒体群と、1回用量当たり3.3mg/kg群との有意差(p=0.000)、媒体群と、1回用量当たり10mg/kg群との有意差(p=0.001)、並びに媒体群と、1回用量当たり30mg/kg群との有意差(p=0.000)を明らかにした。
【０１１７】
学習試験
28日目〜31日目における学習試験による結果を、図13に示す。一般線形モデル化は、処置群間の有意差(p=0.004)を示した。ダネットの事後解析は、偽手術ラット(p<0,01)、1回用量当たり1.1mg/kgラット(p<0.05)、1回用量当たり3.3mg/kgラット(p<0.01)、及び1回用量当たり30mg/kgラット(p<0.05)、並びに媒体処置ラットの間の有意差を示した。
【０１１８】
28〜31日目における学習試験のAUCは、偽手術ラットにおける231±84、媒体処置ラットにおける349±76、1回用量当たり1.1、3.3、10、及び30mg/kgの2-IB処置ラットのそれぞれにおける、276±85、266±64、297±79、287±89であった。一元ANOVAは、群間の有意差(p<0.012)を示した。ダネットの事後解析は、媒体群と、1回用量当たり1.1mg/kg群との有意差、及び媒体群と、1回用量当たり3.3mg/kg群との有意差(p<0.05)を明らかにした。
【０１１９】
組織学
4VOにより引き起こされる、CA1領域内の生存細胞の著明な減少があった(一元ANOVA:p<0.005;全ての他の処置と対比した偽手術の事後解析:p<0.005)。組織学の結果は、偽手術ラットのCA1領域内の生存細胞175±53個、媒体処置ラットにおける39±51個、並びに1回用量当たり1.1、3.3、10、及び30mg/kgの2-IB処置ラットのそれぞれにおける、29±34、71±61、63±54、及び50±51個を示した。本研究では、本発明者らは、モリス水迷路試験を使用して、4VOモデルにおける、ビオチン類似体である、2-IBの、記憶に対する潜在的な神経保護効果について研究した。再灌流時に、1回用量当たり1.1〜30mg/kgの用量範囲で投与された2-IBは、全虚血の32日後において、記憶の著明な改善を示した。更に、4VOの33日後の、海馬のCA1エリア内で、著明な保存量の神経細胞が見られたわけではないが、目視可能なプラットフォームを見出す学習曲線は、1回用量当たり1.1〜30mg/kgの用量範囲の2-IB処置ラットにおいて、媒体処置ラットと比較して、著明に良好であった。
【０１２０】
OHCAの生存者のうちの、30%〜50%の間は、退院後、最長で数年間、認知の欠損を経験する(Greenら、2015)。神経心理学試験は、記憶ドメイン内で最も多く、高頻度の機能障害を示した(Orboら、2015)。CPCスコアが1で退院した患者であってもなお、神経認知試験バッテリーを実施したところ、作業記憶の精度、及び空間的記憶の速度の低減が観察された(Iannaconeら、2014)。モリス水迷路は、空間的記憶(隠れたプラットフォーム)、及び記憶の非空間的条件(目視可能なプラットフォーム)の両方について調べる、比較的単純な手順(Bromley-Britsら、2011)である。4VO後の再灌流時における、2-IBの投与は、ラットの記憶機能を、偽手術状況と同程度に、著明に増大させた。
【０１２１】
記憶欠損は、病態生理的に、主に海馬内の神経損傷と対応する(Bjoerklundtら、2014)。4VOモデルは、主に、海馬のCA1領域内の神経傷害に基づき、記憶の機能不全をもたらす(Pulsinelli及びBuchan、1988)。臨床的に妥当な生存時間の後、CA1領域内で、自発的な再増殖が生じたが、これは、虚血性攻撃から生じる、行動学的機能障害を相殺するのに十分ではなかった(Langdonら、2008)。本研究では、HI後の海馬のCA1領域内で、生存細胞の著明な減少があった。しかし、2-IBによる処置は、3.3〜30mg/kgの用量範囲で、生存の増大への傾向があったが、媒体と対比した有意差を示さなかった。全てのラットは、HIによる攻撃の33日後に屠殺した。早期の時点では、ラットは屠殺されなかったので、本発明者らには、再増殖が、海馬内で既に生じていたのかどうかはわからない。しかし、本発明者らには、2-IB処置ラットにおける生存細胞の記憶機能が、媒体処置ラットより良好であったことはわかっている。
【０１２２】
結論:
再灌流時に、1回用量当たり1.1〜30mg/kgの用量範囲で、12時間ごとに、3回、2-IBを、直接s.c.に施されて処置された成体ラットは、4VOの後で、媒体処置ラットと比較して、記憶の著明な改善を示した。現時点で、OHCA後の成体における安全性及び薬物動態を査定する、フェーズ2の臨床試験が始まっている。
【０１２３】
(実施例4)
ヒトにおける用量の計算
2-IBのトキシコキネティクスについて、成体ラットへのi.v.パルス注入により、96時間にわたり研究した。本研究の目的は、i.v.注入の反復の後の、雄ラット及び雌ラットにおける、2-IBの血漿濃度から、トキシコキネティクスパラメータ(Cmax、tmax、AUC、t1/2)を生成することであった。
【０１２４】
2、3、及び4群のそれぞれの動物に、連続4日間、24時間中に、6.6、13.3、又は27.5mg/kgの2-IBの、15分間ずつ6回で、合計23回のパルス注入を施した(毎日の総用量は、それぞれ、40、80、及び165mg/kgである)。1群には、媒体だけを施した。全身曝露は、0日目及び4日目にモニタリングした。採血は、初回注入の15分後、0.5、1、及び4時間後、並びに最終用量の15分後、0.5、1、4、8、及び24時間後に行った。
【０１２５】
雄ラット及び雌ラット、並びに初回及び最終回のパルスについて、平均値のAUC 0-4h値は、パルス1つ当たり6.6mg/kgの後で、それぞれ、2310、2530、1750、及び1950ng.h/mLであった。両性間並びに初回及び最終回のパルス間全体の平均値は、約2135ng.h/mLであった。
【０１２６】
実施例3では、最も有益な薬理学的効果は、最低で1.1mg/kg及び最大で(これを含む)3.3mg/kgの用量レベル後で観察された。しかし、効果はまた、より高用量でも見られた。直線的なPKを仮定すると、1.1mg/kgの用量レベルでは、約356ng.h/mLの平均値AUCを、3.3mg/kgの用量レベルでは、約1068ng.h/mLのAUCを予測することができる。トランスレーショナルな視点からは、約356ng.h/mLの曝露量は、成体のヒトに、最低限有効な目標レベルであると考えることができる。また、最大で(これを含む)1068ng.h/mLの曝露量も、有効量並びに高曝露量と考えられる。
【０１２７】
2-IBの薬物動態は、健常男性対象における、2-IBのパルスによるi.v.注入の、単回及び複数回の用量の安全性及び忍容性を精査する、フェーズIの臨床研究において精査した。研究は、6名の健常男性対象の3つの群が、2-IB又はプラセボの、単回のi.v.注入、又は3つの周期のパルスi.v.注入により施される、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増研究であった。処置は、各対象に、予見された3つのうちの2つの用量レベルの2-IBと、1つのプラセボとを施すように、無作為化した。
【０１２８】
24時間中に、0.6mg/kgずつ6回のパルスを施される対象の平均値AUC4hは、初回の注入後では、1170ng.h/mlであり、最終回の注入後では、1441ng.h/mlであった。したがって、平均すると、平均値のAUC 0-4hは、24時間の投与期間中に、約1305ng.h/mLであった。直線的なPKを仮定すると、0.16mg/kgのパルス用量は、約356ng.h/mLに対応する曝露量(AUC4h)をもたらすことが予測される。
【０１２９】
(実施例5A)
OHCA(院外心停止)後の成人における、2-IBによる処置
介入:
8名の患者の第1のコホートには、2-IBを、1回用量当たり0.055mg/kgの用量で、4時間ごとに、合計6回、ivに施す(パートA;すなわち、0.33mg/kg/日)。8名の患者の第2のコホート(コホートB、すなわち、0.99mg/kg/日)には、1回用量当たり0.165mg/kgの予想用量を施し、8名の患者第3のコホートには、1回用量当たり0.500mg/kgの予想用量を施す(コホートC、すなわち、3mg/kg/日)。初回用量は、可能な限り早急に、且つ、OHCA後6時間以内に施す。次の用量レベルへの漸増は、薬物動態解析を実施し、妥当な安全性問題に出会わなかった後で行う。全ての患者は、36℃を目標とする温度管理により処置する。
【０１３０】
被験薬/処置
全ての患者に、抽出容量を40mlとする、50mlのバイアルにより提供される、オープンラベルの2-IBを施す。プラセボは、使用しない。
【０１３１】
2-IBは、pH4.0の低量のクエン酸緩衝液(約15ミリモル/l)を伴う注射のための、0.75mg/mlの、等張性、等浸透圧性の生理食塩液として製剤化する。2-IBは、デュアルルーメンカテーテル又はマルチルーメンカテーテルを使用して、酸溶液溢出の危険性を低下させるように、経皮的に挿管された中心静脈カテーテルを介して静脈内投与する。治験薬は、希釈せずに使用し、シリンジへと移すが、容量は、患者の体重に依存する。
【０１３２】
注入時間(1回用量当たり15分間)は、A群内、B群内、及びC群内、及びこれらの間で同一とし、B群内では、注入速度を増大させることにより、A群と比較して、注入速度を調整する(3倍とする)。C群では、用量及び注入速度を、ここでもまた、B群と比較して3倍とする。
【０１３３】
例として、A群内の80kgの患者には、1回用量当たり5.9mlの注射液と同等である、1回用量当たり0.055mg/kg=0.055x80=4.4mgの2-IBを施す。
【０１３４】
結果
3つのコホート全ての患者を、以下の通りにモニタリングする。
【０１３５】
2-IBの初回用量の24及び48時間後における、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)及びS100bのレベルを決定する(これらのマーカーのレベルの決定、及び患者の評価項目の予測におけるそれらの使用の記載については、Rundgren、Resuscitation、2009年7月、80(7):784〜9頁;及びShinozaki、Crit Care.、2009、13(4):R121を参照されたい)。
【０１３６】
CPC(Cerebral Performance Categories)スコア、CAMCI(Computerized Assessment for Mild Cognitive Injury)スコア、及び縮約版IQCODE (Informant Questionnaire on Cognitive Decline)スコアを、OHCAの30日後に記録する(認知機能試験の記載については、Lilja、BMC Cardiovascular Disorders、2013、13:85;及びSabedra、Resuscitation、2015、90: 67〜72頁を参照されたい)。
【０１３７】
3つのコホート全ての患者は、OHCAの歴史対照と比較して、高度な平均認知スコアを示しうる。
【０１３８】
(実施例5B)
OHCA後の成人における、2-IBによる処置
介入:
研究は、実施例5Aで記載した通りに実施した。すなわち、患8名の患者の第1のコホートには、2-IBを、1回用量当たり0.055mg/kgの用量で、4時間ごとに、合計6回、ivに施した(パートA;すなわち、0.33mg/kg/日)。
【０１３９】
院外心停止を患う8名の成人を、4時間ごとに、15分間ずつの投与6回のIV注入としての2-IBで処置した。目標温度管理を使用して、36.0(中央値)の体温を維持した。第1のコホートについての結果に基づき、実施例5Aで記載した第2のコホート及び第3のコホートが必要ではないことを決定した。
【０１４０】
解析:
全ての患者で、ベースライン(入院中に)において、血清クレアチニンを決定した。eGFR(推定糸球体濾過量)は、以下の方程式:
【０１４１】
【数２】
2019501969.tif 000006
【０１４２】
[式中、性別(SEX):男性=0;女性=1]
(eGFRの決定については、Rule AD、Larson TS、Bergstralh EJ、Slezak JM、Jacobsen SJ、Cosio FG、Using serum creatinine to estimate glomerular filtration rate: accuracy in good health and in chronic kidney disease、Ann Intern Med.、2004年12月、21;141(12):929〜37頁を参照されたい)
を使用することにより決定した。
【０１４３】
用量の調整及びAUCの変動の影響を決定するために、モデルを作成した。
【０１４４】
結果:
患者の特徴を、Table 3(表4)に報告する。
【０１４５】
【表４】
2019501969.tif 000007
【０１４６】
クリアランスは、eGFR又はSeCreの増大と共に増大すると考えられたが、他の共変量については、変化が見られなかった。容量は、体重と共に増大すると考えられたが、他の共変量については、差違が見られなかった。
【０１４７】
曝露量の計量を、Table 4(表5)に示す。
【０１４８】
【表５】
2019501969.tif 000008
【０１４９】
薬物は一般に、投与期間中は定常状態にあるので、AUC4ではなく、AUCinfを、シミュレーションのために使用した。AUCinf=D/CLであり、容易に導出することができる(D=用量;CL=クリアランス)。
【０１５０】
Crea0による共変量モデルでは、パラメータの推定値は、基礎モデルと比較して、わずかに変動する。Table 5(表6)を参照されたい。
【０１５１】
【表６】
2019501969.tif 000009
【０１５２】
体重、年齢(Age)、eGFR、SeCre、及び深部体温を考慮しながら、探索的共変量解析を実施した。使用したモデルは、以下:
【０１５３】
【数３】
2019501969.tif 000010
【０１５４】
[式中、θは、PKパラメータと共変量との関係について記載するパラメータであり;
ηは、個体間の変動について記載する]
の通りであった。
【０１５５】
共変量解析は、SeCre及び温度が、CLに影響を及ぼし、重量が、容量に影響を及ぼしうることを示す。
【０１５６】
クリアランスの変動は、SeCreレベルを考慮することにより、大幅に低減される。図14は、目標値に到達するのに要請されるクリアランス及び用量が、SeCreの関数として変動することを示す。
【０１５７】
予測モデルでは、Crea0の投与量を調整することにより、目標AUCに到達する能力を改善する(図15を参照されたい)。
【０１５８】
Table 6(表7)は、患者のうちの50%(体重に依存しない)において、356ng.h/mLの曝露量を達成するための投与量を示す。
【０１５９】
【表７】
2019501969.tif 000011
【０１６０】
Table 7(表8)は、患者のうちの95%(体重に依存しない)において、356ng.h/mLの曝露量を達成するための投与量を示す。
【０１６１】
【表８】
2019501969.tif 000012
【０１６２】
Table 8(表9)は、Crea0による共変量モデルで得られるAUC値と、用量の予測値で得られるAUC値並びにフラット投与で得られるAUC値との比較を示す。
【０１６３】
【表９】
2019501969.tif 000013
【０１６４】
クリアランスの変動は、eGFRレベルを考慮することによってもまた、大幅に低減される。
【０１６５】
Table 9(表10)は、共変量モデルで得られるAUC値と、eGFR0(ベースラインにおいて測定されるeGFR)モデルで得られるAUC値との比較を示す。
【０１６６】
【表１０】
2019501969.tif 000014
【０１６７】
Table 10(表11)は、eGFRによる共変量モデルで得られるAUC値と、用量の予測値で得られるAUC値並びにフラット投与で得られるAUC値との比較を示す。
【０１６８】
【表１１】
2019501969.tif 000015
【０１６９】
Table 10(表11)は、投与量を、eGFRに基づき調整すると、曝露量の変動が実質的に減少することを示す。
【０１７０】
探索的共変量解析に基づき、本発明者らは、
・クリアランスが、ここでは、血清クレアチニン又は処置前における血清クレアチニンに基づくeGFR、並びに体温として表される、腎機能の影響を受けると考えられること;
・容量が、本研究では曝露量に効果を有さない、体重の影響を受けること;
・クリアランスが、体重の影響を受けないこと
を結論付ける。
【０１７１】
したがって、所望の曝露量レベルを一貫して達成するためには、体重に応じて調整された投与量ではなく、血清クレアチニン又はeGFRに基づく投与を、患者へと行うことができる。
【０１７２】
(実施例5C)
OHCA後、低体温法下の成人における、2-IBによる処置
実施される研究は、摂氏33度の低体温法下で、6時間ごとに、15分間ずつの投与4回のIV注入としての2-IBにより処置される、院外心停止後の4〜6名の成人において実施する。
【０１７３】
実施例5Bからの結果に基づき、目標曝露量に到達することが必要とされる、2-IBの投与量は、以下の通りに決定することができる。
【０１７４】
低温における使用のための用量補正は、以下の方程式:
【０１７５】
【数４】
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【０１７６】
を使用して決定することができる。
【０１７７】
Crea0が同じであるとすると、これは、温度が33°である場合、CLが、36°の場合のCLの37%へと低下しうることを示唆することを意味する。同じAUCを達成するためには、用量を、元の用量の37%へと減少させるべきである。更に、次の投与までの時間間隔も、約6時間へと延長すべきである。
【０１７８】
[参考文献]
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６．１】
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【図１６．２】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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