(57)【要約】【課題】本発明は、ＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）遺伝子を同時に発現し、ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子がノックアウト（knock-out）され、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された形質転換ブタ並びにその製造方法に関する。【解決手段】本発明のヒトＨＯ−１とＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を同時に発現し、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた形質転換ブタは、ＨＯ−１遺伝子の抗酸化作用や細胞保護機能などにより臓器分離及び体外培養時に酸化ストレスを減少させることができ、ＴＮＦＲ１−Ｆｃ発現により移植初期に起こるＴＮＦ−α媒介の炎症反応も減少させることができ、また樹枝状細胞の成熟を抑制してＴ細胞の増殖と活性化を調節することにより、急性血管型拒絶反応を減少させることができ、移植された臓器の初期生着を促進することができる。さらに、ＧＧＴＡ１による超急性拒絶反応を抑制することにより、移植された臓器の生存率を向上させることができる。よって、前記形質転換ブタを用いて異種移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器を生産することができる。
2019501666.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ブタから体細胞を分離するステップと、
ｂ）前記体細胞にヒトＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）融合遺伝子を導入し、ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子をノックアウト（knock-out）するステップと、
ｃ）ヒトＨＯ−１遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子が導入され、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた体細胞を選択し、その後培養するステップと、
ｄ）ブタ卵子の核を除去して前記選択された体細胞と融合することにより、体細胞の核が移植された受精卵を作製するステップとを含む、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された形質転換ブタの製造方法。
【請求項２】
前記ｂ）ステップのヒトＨＯ−１遺伝子は、配列番号１の塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｂ）ステップのヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子は、配列番号８の塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｂ）ステップは、ヒトＨＯ−１遺伝子を含む単一ベクター及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を含む単一ベクターを別途又は同時に体細胞に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子ノックアウトは、ＴＡＬＥＮ（transcription activator-like effector nuclease）を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＡＬＥＮは、ＧＧＴＡ１遺伝子のエクソン９領域を標的とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｄ）ステップの受精卵をブタの子宮に着床させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヒトＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）融合遺伝子が導入され、ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子がノックアウト（knock-out）され、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器移植用形質転換ブタ。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換ブタを製造するための体細胞供与細胞株。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法により形質転換ブタを製造するステップと、
前記形質転換ブタから移植用臓器を分離するステップとを含む、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器を製造する方法。
【請求項１１】
前記臓器は、膵島、膵臓、心臓、腎臓、肝臓、肺臓及び角膜からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）遺伝子を同時に発現し、ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子がノックアウト（knock-out）され、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された形質転換ブタ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器の機能が喪失してそれ以上薬物治療などの治療が不可能な場合に他人の臓器の一部又は全部を移し植える臓器移植においては、主に生きている人から臓器を移植する方法を多く用いている。しかし、移植臓器のドナーが著しく不足しているという問題があり、それを解決するための様々な試みが行われている。例えば、幹細胞を用いた方法や異種間で臓器を移植する方法などが挙げられる。幹細胞は必要な数だけ細胞を分化増殖させることにより損傷した細胞の代わりとして治療する方法であるが、様々な細胞で構成されている臓器には発達させることができないという限界がある。よって、臓器が必要な場合は、直接臓器を交換する方法として異種臓器を用いる方法が考えられる。
【０００３】
十分な供与臓器の確保が可能な動物を用いた異種間の移植は、ヒトの臓器を代替できる様々な方法のうちの一つの代案として注目されており、代替臓器を供給する動物としてサル、ブタなどの様々な動物が用いられている。そのうちブタは、解剖学的及び生理学的にヒトと非常に類似しており、臓器がヒトに類似した大きさであり、飼育が容易であり、妊娠期間（１１２日）が短く、かつ一度に多数の子（６〜１２匹）を産めるという利点があるので、ブタの臓器を用いる研究が盛んに行われている。
【０００４】
ブタなどを用いた異種間臓器移植の場合、免疫拒絶反応が深刻な問題となる。よって、本発明者らは、ヒトＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）融合遺伝子をブタ細胞に導入することにより、酸化ストレスから細胞を保護し、移植後に現れる炎症反応を抑制することのできる、免疫拒絶反応が抑制された形質転換ブタを製造した（特許文献１）。しかし、前記形質転換ブタの異種移植片（xenograft）は、超急性拒絶反応（hyper-acute rejection, HAR）を克服することができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１１−００７９４８５号公報
【特許文献２】国際公開第９７／０３４６３１号
【特許文献３】国際公開第９６／０３２４７８号
【特許文献４】国際公開第２０１２／０９３８３３号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１３／０２１７１３１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tatham et al., Hum Reprod., 11(7);1499-1503, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、異種臓器移植時の酸化ストレス及び炎症反応が減少し、超急性拒絶反応のない臓器移植用形質転換ブタを開発すべく鋭意努力した結果、ヒトＨＯ−１遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子が導入され、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた形質転換ブタを開発し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヒトＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）融合遺伝子を導入し、ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子をノックアウト（knock-out）した、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された形質転換ブタ並びにその製造方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、前記形質転換ブタを製造するための体細胞供与株を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、前記形質転換ブタを製造するステップと、前記形質転換ブタから移植用臓器を分離するステップとを含む、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のヒトＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を同時に発現し、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた形質転換ブタは、ＨＯ−１遺伝子の抗酸化作用や細胞保護機能などにより臓器分離及び体外培養時に酸化ストレスを減少させることができ、ＴＮＦＲ１−Ｆｃ発現により移植初期に起こるＴＮＦ−α媒介の炎症反応も減少させることができ、また樹状細胞の成熟を抑制してＴ細胞の増殖と活性化を調節することにより、急性血管型拒絶反応を減少させることができ、移植された臓器の初期生着を促進することができる。さらに、ＧＧＴＡ１による超急性拒絶反応を抑制することにより、移植された臓器の生存率を向上させることができる。よって、前記形質転換ブタを用いて異種移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトＨＯ−１遺伝子が挿入された発現ベクターの開裂地図を示す概略図である。
【図２】ヒトｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子が挿入された発現ベクターの開裂地図を示す概略図である。
【図３】本発明のＧＧＴＡ１遺伝子をターゲットとするＴＡＬＥＮの模式図である。
【図４】ＴＡＬＥＮを用いてＧＧＧＴ１遺伝子を形質転換し、選択した細胞の遺伝子欠失の有無をクローニング及びシーケンシングにより確認した結果である。
【図５】ＴＡＬＥＮ媒介突然変異ブタ細胞における磁気細胞分離法の結果である。
【図６】形質転換されたブタにおけるＨＯ−１遺伝子及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子の発現をＰＣＲにより確認した結果である。
【図７】形質転換されたブタにおけるＨＯ−１遺伝子及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子のタンパク質発現をウェスタンブロット法により確認した結果である。
【図８】形質転換されたブタの臓器におけるＨＯ−１遺伝子及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子のタンパク質発現をウェスタンブロット法により確認した結果である。
【図９】体細胞複製により生産されたＴＡＬＥＮ媒介ＧＧＴＡ１遺伝子突然変異の結果を塩基配列上に示す図である。
【図１０】形質転換ブタの尻尾由来の線維芽細胞において流動細胞分析法を用いてａ−１，３−Ｇａｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓの除去を確認した結果である。
【図１１】アポトーシス刺激であるｈＴＮＦ−α及びＣＨＸで１５分間、酸化ストレス刺激であるＨ2Ｏ2で１時間処理し、その後ＣＣＫ−８を用いた形質転換ブタの線維芽細胞における細胞生存能を確認した結果である。
【図１２】４０％のヒト血清処理後の７−ＡＡＤ染色による蛍光活性化細胞分離法を用いた形質転換ブタの線維芽細胞における抗体／補体媒介性溶解を確認した結果である。
【図１３】野生型、ｓｈＲＮＦＲ１−Ｆｃ−ｈＨＡＨＯ−１、ＧＧＴＡ１ノックアウト及びＧＧＴＡ１ノックアウト／ｓｈＴＮＦＲ１−Ｆｃ−ｈＨＡＨＯ−１ブタ由来の皮膚線維芽細胞におけるシアリルトランスフェラーゼ（sialyltransferase）の発現を確認した図である。（ａ）はＳＴ３Ｇａｌ２であり、（ｂ）はＳＴ３Ｇａｌ３であり、（ｃ）はＳＴ３Ｇａｌ４であり、（ｄ）はＳＴ６ＧａｌＮａｃ１であり、（ｅ）はＳＴ６ＧａｌＮａｃ２であり、（ｆ）はＳＴ６ＧａｌＮａｃ６である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、ａ）ブタから体細胞を分離するステップと、ｂ）前記体細胞にヒトＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）融合遺伝子を導入し、ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子をノックアウト（knock-out）するステップと、ｃ）ヒトＨＯ−１遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子が導入され、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた体細胞を選択し、その後培養するステップと、ｄ）ブタ卵子の核を除去して前記選択された体細胞と融合することにより、体細胞の核が移植された受精卵を作製するステップとを含む、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された形質転換ブタの製造方法を提供する。
【００１４】
本発明は、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器を生産するために、そのような特徴を有する形質転換ブタを生産することを目的とする。よって、本発明においては、分離されたブタの体細胞にヒトＨＯ−１遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を導入して発現させ、ＧＧＴＡ１遺伝子をノックアウトした形質転換ブタを製造した。以下、前記製造方法の各ステップについて詳細に説明する。
【００１５】
本発明における形質転換ブタとは、外部から導入された遺伝子を組み換え、それをブタの染色体に人工的に挿入したり、ブタが内在的に有する遺伝子を欠失させるなど、その形質の一部を変化させたブタを意味し、動物の種類はブタが好ましいが、自然界の哺乳類でヒトに臓器を移植できる動物においても、本発明の方法を適用することにより免疫拒絶反応が抑制された形質転換動物を製造することができる。
【００１６】
ａ）ステップは、ブタから体細胞を分離するステップであり、前記ブタは核置換技術を用いた複製ブタ生産における細胞供与（又は核供与）となる。よって、当業者であればその目的に応じてブタを選択して用いることができ、ブタの種類が特に限定されるものではない。すなわち、前記ブタは、ブタの胎児又は成豚であってもよく、自然状態のブタだけでなく、人工的に形質転換されたブタも全て含む概念である。
【００１７】
本発明における体細胞は、前記ブタから分離可能な細胞であって、遺伝子導入及びノックアウトにより形質転換可能な細胞であればその種類が特に限定されるものではなく、分化細胞及び未分化細胞が全て含まれてもよい。
【００１８】
体細胞を分離する方法としては、従来公知の方法が制限なく用いられてもよい。
【００１９】
ｂ）ステップは、前記分離されたブタ体細胞を形質転換するステップであり、具体的には前記体細胞にヒトＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）融合遺伝子を導入し、ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子をノックアウト（knock-out）するステップである。
【００２０】
ｃ）ステップは、前記形質転換された細胞を選択し、選択した細胞を培養するステップである。
【００２１】
本発明におけるＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子とは、重金属、内毒素（endotoxin）、紫外線、熱ショック（heat shock）、活性酸素及び低酸素状態などの各種ストレス源により細胞内で誘導発現する酵素をコードする遺伝子を意味する。ＨＯ−１は、ヘム（heme）を最終的にビリルビン（bilirubin）とＦｅ2+に分解する酵素であり、また抗酸化酵素としてラジカル消去（radical scavenging）やアポトーシス抑制による細胞保護機能を発揮することにより移植された臓器の機能を向上させる。本発明におけるＨＯ−１は、ＣＤ４＋Ｔ−細胞増殖を抑制すると共に内皮細胞増殖を活性化し、生体内の免疫細胞を正常化することにより、異種免疫拒絶反応の抑制及び臓器分離時の酸化ストレスに対する抵抗性を示し、アポトーシス抑制により臓器を構成する細胞を保護する。
【００２２】
具体的には、ヒトＨＯ−１遺伝子は公知の遺伝子データベースからその配列が得られ、より具体的には、配列番号１の塩基配列を含むものであってもよいが、ブタの体細胞に導入されてＨＯ−１の機能を示すものであれば本発明に制限なく含まれる。
【００２３】
本発明におけるＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）融合遺伝子とは、ＴＮＦ−αに結合することができるＴＮＦＲ１の細胞外領域と免疫グロブリンのＦｃ領域が融合された形態を意味する。本発明において、ＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子とＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子は区別なく用いられる。本発明において、ＴＮＦＲ１−Ｆｃの形態は、ＴＮＦ−αに結合してＴＮＦ−αを抑制できる形態であれば制限なく用いることができ、特に水溶性（soluble）形態の水溶性腫瘍壊死因子受容体１（soluble TNFR1, ｓＴＮＦＲ１）と免疫グロブリンのＦｃ領域が融合された形態であってもよい。
【００２４】
本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（mutant）も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられる。また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去された誘導体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な種類の誘導体が用いられる。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ部位が除去されてもよい。
【００２５】
このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献２、３などに開示されている。分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同じ生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させた誘導体である。
【００２６】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、ヒト起源であることが好ましい。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来であるか、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。
【００２７】
一方、本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。
【００２８】
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリンＦｃフラグメントに相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリダイゼーションも可能である。
【００２９】
本発明において、サイトカインの水溶性受容体と免疫グロブリン（以下、「Ｉｇ」という）の融合体は、元の分子の単量体（monomer）やＩｇと融合しない分子に比べて次の利点を有する。
１）二量体（dimer）形態において融合タンパク質が二価性（bivalency）になることによる、リガンドに対する総親和力（avidity）の増加
２）血清内で破壊されずに存在する期間の増加、すなわち分子の安定性の向上
３）免疫グロブリン重鎖のＦｃ（Fragment crystallizable）によるエフェクター細胞（effector cell）の活性化
４）タンパク質分離精製の利便性（例えば、プロテインＡを用いた分離精製）
【００３０】
本発明の融合体は、重鎖部位のＣＨ１ドメインを除いた形態に作製されるので、免疫グロブリンの軽鎖（light chain）に結合しない二量体に作製することができる。
【００３１】
具体的には、前記ヒトＴＮＦＲ１及びＦｃの各遺伝子の配列が公知のデータベースから得られ、より具体的には、配列番号８で表されるＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子が用いられてもよいが、ブタの体細胞に導入されてＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質の機能を示す配列であれば制限なく用いられてもよい。
【００３２】
前記遺伝子導入は、ヒトＨＯ−１遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃをブタ体細胞で発現させることのできる公知の方法により行われてもよく、これらに限定されるものではないが、例えば前記遺伝子を含む発現ベクターを導入したり、ゲノム上で当該遺伝子のコピー数を増加させたり、当該遺伝子のプロモーター配列を置換又は改変により導入又は過剰発現させることができる。
【００３３】
前記遺伝子を細胞内に形質導入する方法としては、生化学的方法、物理的方法又はウイルス媒介形質導入方法が用いられてもよく、生化学的方法としては、ＦｕＧｅｎｅ６（Roche, USA）、リポフェクタミン（Lipofectamine TM2000, Invitrogen, USA）又はＥｘＧｅｎ ５００（MBI Fermentas International Inc. CANADA）を用いることが好ましく、リポフェクタミンによる脂質媒介法を用いることがより好ましい。また、前記遺伝子を含む発現ベクターとしては、ブタ体細胞株で発現させることのできるあらゆる発現ベクターを用いることができ、本発明の具体的な実施例においては、ヒトＨＯ−１遺伝子を含む発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用い、ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を含む発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ６を用いた。
【００３４】
これらに限定されるものではないが、具体的な一実施態様として、前記ｂ）ステップのヒトＨＯ−１遺伝子を含む単一ベクター、特に図１の開裂地図を有するベクター、及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を含む単一ベクター、特に図２の開裂地図を有するベクターを別途又は同時に体細胞に導入する方法が用いられてもよい。本発明の具体的な一実施例においては、ネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１ベクターにヒトＨＯ−１遺伝子を挿入することにより図１の開裂地図を有するベクターを作製し、挿入された遺伝子を発現するか否かをＨＥＫ２９３細胞株において確認した。また、ブラストサイジン（blasticidine）耐性遺伝子を含む遺伝子発現ベクターであるｐｃＤＮＡ６にヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を挿入することにより図２の開裂地図を有するベクターを作製し、挿入された遺伝子を発現するか否かをＨＥＫ２９３細胞株において確認した。
【００３５】
本発明における「ベクター」とは、前記ベクターが導入された細胞において標的遺伝子を発現することができる発現ベクターであり、ベクター内に導入された遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節因子を含む遺伝子産物を意味する。例えば、本発明は、ヒトＨＯ−１遺伝子又はヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を含む組換えベクターを作製することができ、前記作製された組換えベクターを用いてそれを体細胞に導入することにより、形質転換された受精卵を作製するための供与細胞株を作製することができる。
【００３６】
具体的には、本発明に用いられるプロモーターは、当業界において通常用いられる発現ベクターを作製するためのプロモーター配列が制限なく用いられてもよい。用いられるプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーターなどが挙げられるが、これらに本発明において使用可能なプロモーター配列が限定されるものではない。これらのプロモーターは、必要に応じて組織特異的に発現させるために特定プロモーターを用いてもよい。
【００３７】
また、本発明のポリアデニル化配列としては、通常用いられるポリアデニル化配列、例えばＳＶ４０ポリアデニル化配列、ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列、マウスプロタミン１遺伝子ポリアデニル化配列（protamine-1 poly A signal）、ラージＴ抗原ポリＡ領域（large T antigen poly A region）に由来するポリアデニル化配列、ウサギβグロビン（β-globin）に由来するポリアデニル化配列、ウシ胎児成長ホルモンポリアデニル化配列などが制限なく用いられる。
【００３８】
ヒトＨＯ−１遺伝子又はヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子が発現したか否かを確認するために、本発明のベクターは、タンパク質分離精製又は確認用タグ配列をさらに含んでもよい。タグ配列の例としては、ＧＦＰ，ＧＳＴ（Glutathione Stransferase）−ｔａｇ、ＨＡ，Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、Ｔ７−ｔａｇなどが挙げられるが、これらに本発明のタグ配列が限定されるものではない。
【００３９】
本発明の具体的な一実施例においては、配列番号１の塩基配列を有するＨＯ−１遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ベクターに導入してＨＯ−１遺伝子発現ベクターを作製し（図１）、配列番号８の塩基配列を有するｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子をｐｃＤＮＡ６ベクターに導入してｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子発現ベクターを作製した（図２）。本発明の具体的な他の実施例においては、前述した２種類の発現ベクターをブタから分離された体細胞に導入してＨＯ−１遺伝子及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子を同時に発現する細胞を作製し、前記細胞を用いて形質転換ブタを製造した。
【００４０】
本発明におけるＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子とは、糖タンパク質からのＮ−グリカンの生産に関与する酵素を意味し、前記酵素は、α−１，３グリコシド結合によりＮ−グリカンからガラクトースにガラクトース残基を連結して末端Ｇａｌ−α−１，３−Ｇａｌ（すなわち、α−Ｇａｌ）部分を形成する。ブタの臓器を異なる種に移植する異種間臓器移植の場合、ブタのＧＧＴＡ１遺伝子による超急性拒絶反応が移植後数分から数時間内に起こり、移植を受けた動物又はヒトを死亡に至らしめる。これは、臓器移植において非常に致命的であるので、本発明者らはこれを解決するために、ＨＯ−１遺伝子及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子を同時に発現し、ＧＧＴＡ１遺伝子を完全にノックアウトしたブタを製造しようとした。
【００４１】
具体的には、前記ＧＧＴＡ１遺伝子は、公知の遺伝子データベースからその配列が得られ、ブタにおいてα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を示すタンパク質に対応する遺伝子であれば本発明に制限なく含まれてもよい。
【００４２】
本発明における遺伝子ノックアウト（knock-out）とは、遺伝子がその機能を喪失することを目的とする人為的操作を意味し、これらに限定されるものではないが、遺伝子に一部のヌクレオチドの挿入、置換、欠失などが起こってもたらされたものであってもよく、遺伝子の全部又は一部がゲノムから除去されたものであってもよい。
【００４３】
前記遺伝子ノックアウトは、公知のノックアウト方法であれば特に制限なく本発明に含まれうる。例えば、前記遺伝子ノックアウトは、ＴＡＬＥＮ（transcription activator-like effector nuclease）を用いて行われるものであってもよい。
【００４４】
本発明における「ＴＡＬＥＮ」とは、ＤＮＡのターゲット領域を認識及び切断できるヌクレアーゼを意味し、具体的にはＴＡＬＥドメイン及びヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質を意味する。本発明において、「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」と「ＴＡＬＥＮ」は互換可能である。ＴＡＬエフェクターは、キサントモナス（Xanthomonas）バクテリアが様々な植物種に感染する際にそれらのタイプＩＩＩ分泌システムにより分泌されるタンパク質として知られている。前記タンパク質は、宿主植物内のプロモーター配列に結合してバクテリア感染を補助する植物遺伝子の発現を活性化させることができる。前記タンパク質は、３４個以下の様々な数のアミノ酸反復で構成された中心反復ドメインにより植物ＤＮＡ配列を認識する。よって、ＴＡＬＥは、ゲノムエンジニアリングのツールのための新規プラットフォームになり得ると考えられる。ただし、ゲノム編集活性を有する機能ＴＡＬＥＮを作製するために、次のように現在まで明らかにされていない少数の主要パラメータを定義しなければならない。
ｉ）ＴＡＬＥの最小ＤＮＡ−結合ドメイン
ｉｉ）１つのターゲット領域を構成する２つの半分の間のスペーサの長さ
ｉｉｉ）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをｄＴＡＬＥに連結するリンカー又は融合接合（fusion junction）
【００４５】
本発明のＴＡＬＥドメインとは、少なくとも１つのＴＡＬＥ反復モジュールにより配列特異的にヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインを意味する。前記ＴＡＬＥドメインは、少なくとも１つのＴＡＬＥ反復モジュール、より具体的には１〜３０個のＴＡＬＥ反復モジュールを含むが、これらに限定されるものではない。本発明において、「ＴＡＬエフェクタードメイン」と「ＴＡＬＥドメイン」は互換可能である。前記ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥ反復モジュールの半分を含んでもよい。前記ＴＡＬＥＮに関して、特許文献４又は５に開示されている内容の全文が参考資料として本明細書に援用される。
【００４６】
本発明における前記ＴＡＬＥＮは、ＧＧＴＡ１遺伝子を標的として前記遺伝子をノックアウトするために用いられてもよく、これに限定されるものではないが、特にＧＧＴＡ１遺伝子のエクソン９領域を標的としてもよい。
【００４７】
本発明の具体的な一実施例においては、ＧＧＴＡ１酵素の触媒作用を行う部位に決定的な役割を果たすエクソン９領域を標的とし、ＧＧＴＡ１遺伝子をノックアウトするためのＴＡＬＥＮを作製した（図３）。本発明の具体的な他の実施例においては、ヒトＨＯ−１遺伝子及びヒトｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を同時に発現する線維芽細胞に、前述したように作製したＴＡＬＥＮを形質導入してＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた細胞を作製し（図４）、それを磁気ビーズで分離することによりＧＧＴＡ１遺伝子が欠損した細胞集団を得た（図５）。
【００４８】
前記ｂ）ステップにおいて、ヒトＨＯ−１遺伝子を含む単一ベクター及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を含む単一ベクターを導入することと、ＧＧＴＡ１遺伝子をノックアウトすることは、同時に行われてもよく、別途に行われてもよく、同じ遺伝子型の細胞を作製できるものであればその順序が特に限定されるものではない。
【００４９】
前記ｃ）ステップにおいて、一例として、前記ｂ）ステップの発現ベクターが導入された体細胞は、選択マーカーが導入された発現ベクターを用いることにより容易に選択することができる。選択マーカーとしては抗生物質耐性遺伝子が用いられてもよい。前記抗生物質耐性遺伝子としてはｂｓｄr、ｎｅｏr、ｐａｃr、ｂｓｒr、ｈｐｈrなどが用いられてもよいが、必ずしもこれらに限定されるものではない。本発明の具体的な一実施例においては、ｎｅｏrを用いて細胞培養液をネオマイシンで処理することにより、ヒトＨＯ−１遺伝子を含む発現ベクターが導入された体細胞を選択し、ｂｓｄrを用いて細胞培養液をブラストサイジンで処理することにより、ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を含む発現ベクターが導入された体細胞を選択した。
【００５０】
他の例として、ＴＡＬＥＮを用いてＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた体細胞を選択するとは、これに限定されるものではないが、レポーターシステムを含むＴＡＬＥＮプラスミドを用いることであってもよい。前記レポーターシステムは、例えばＨ２ＫK膜タンパク質遺伝子を用いることができ、この場合は、磁気ビーズを用いて前記遺伝子を発現する細胞を選択することができる。選択した細胞からコロニーを形成し、その後各コロニーに対して、Ｔ７Ｅ１分析、ターゲットディープシーケンシング（targeted deep sequencing）などを行うことにより、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされたか否かをさらに確認することができる。
【００５１】
ｄ）ステップは、前記選択された体細胞を用いて前記体細胞と遺伝形質が同一の受精卵を作製するステップであり、前記体細胞に対する複製ブタを生産することを目的とする。具体的には、ｄ）ステップは、ブタ卵子の核を除去して前記選択された体細胞と融合することにより、体細胞の核が移植された受精卵を作製するステップであり、体細胞核移植技術（somatic cell nuclear transfer）を用いるステップである。
【００５２】
前記ｄ）ステップにおいて、本発明の卵子は、未経産豚の卵巣から採取した未成熟卵子を培養して用いることができる。
【００５３】
本発明における「核移植（nuclear transfer）」とは、細胞の核を既に核を除去した卵子に移植することを意味する。このように核移植した受精卵を着床させて生まれた個体は、核供与細胞の遺伝的物質が核受容細胞質にそのまま伝わるので核供与個体と遺伝的に完全に同一の複製個体である。
【００５４】
卵子の遺伝物質を除去する方法には、物理的な方法、化学的な方法、Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｂを用いた遠心分離法などがある（非特許文献１）。本発明においては、マイクロ操作器による物理的な核除去方法を用いた。形質転換された体細胞は、細胞膜融合法、細胞質へのマイクロインジェクションなどにより核が除去された卵子内に導入される。細胞膜融合法は簡単で大規模な受精卵生産に適するという利点があり、細胞質へのマイクロインジェクションは核と卵子内の物質との接触を最大化させるという利点がある。体細胞と核が除去された卵子との融合は、電気刺激により細胞膜の粘度を変化させて融合する方法により組み換える。ここで、マイクロ電流・電圧を自由に調整できる電気融合装置を用いると便利である。本発明の具体的な実施例においては、マイクロ操作により物理的に前記卵子の核を除去し、核が除去された卵子と前記選択された体細胞である供与細胞株を電気的刺激により融合させて受精卵を作製した。
【００５５】
本発明の形質転換ブタの製造方法は、前記ｄ）ステップの受精卵をブタの子宮に着床させるステップをさらに含んでもよい。このために、体細胞の核が移植された受精卵の移植のための代理母ブタは発情が始まった個体を選択することが好ましい。
【００５６】
核移植した受精卵は、活性化させて移植可能な段階まで発生させてから代理母に着床させる。複製受精卵の活性化とは、受精卵が分裂するように、成熟過程で一時的に停止していた細胞周期を再び稼動することを意味する。複製受精卵の活性化のためには、細胞周期停止因子であるＭＰＦ、ＭＡＰキナーゼなどの細胞シグナル伝達物質の活性を低下させなければならないが、そのためには複製受精卵内のカルシウムイオンの増加が必須である。概して、電気的刺激により細胞膜透過性を変化させ、細胞外からのカルシウム流入を急激に増加させる方法、イオノマイシン（ionomycin）や６−ＤＭＡＰなどの化学的物質を用いて細胞周期停止因子の活性を直接阻害する方法などが単独で又は併用して用いられている。
【００５７】
本発明の具体的な一実施例においては、前記方法により生産された全ての形質転換ブタにおいて、ＨＯ−１及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子が挿入されて発現することがＰＣＲ（図６）及びウェスタンブロット（図７及び図８）により確認された。また、塩基配列の分析（図９）及びＦＡＣＳ分析（図１０）により、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされたことが確認された。
【００５８】
本発明の具体的な他の実施例においては、前記形質転換ブタから分離した線維芽細胞を用いて、アポトーシス刺激及び酸化ストレス刺激に対する細胞生存能を分析した結果、野生型線維芽細胞に比べて細胞生存能が有意に増加することが確認された（図１１）。また、前記線維芽細胞は、ヒト血清と補体に対して抵抗性を有し（図１２）、ＧＧＴＡ１ノックアウトにもかかわらずｎｏｎ−Ｇａｌ抗原の発現レベルが低下することが確認された（図１３）。
【００５９】
このように、本発明の形質転換ブタの製造方法を用いると、安定してヒトＨＯ−１遺伝子及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を発現し、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた形質転換ブタを製造することができ、前記ブタから分離された臓器は、酸化ストレスに対して生存能が高く、ヒト血清と補体に対して抵抗性を有するだけでなく、ｎｏｎ−Ｇａｌ抗原発現レベルが低いことが確認された。よって、前記ブタから分離された臓器の移植時に酸化ストレスから細胞又は組織が保護され、免疫拒絶反応が抑制されることが分かる。
【００６０】
よって、本発明の形質転換ブタは、従来のヒトＨＯ−１遺伝子及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子を同時に発現するブタに比べて、ＧＧＴＡ１がノックアウトされているという特性をさらに有するので、ＧＧＴＡ１ノックアウトによりヒト血清と補体に対して抵抗性を有する。それだけでなく、前記遺伝子形質の組み合わせにより、ＧＧＴＡ１ノックアウトにおいて欠点となり得るｎｏｎ−Ｇａｌ抗原の発現レベルが低いことが確認されたので、免疫拒絶反応を起こさず、異種臓器移植の用途に非常に有用である。
【００６１】
本発明の他の態様は、ヒトＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Tumor necrosis factor receptor 1-Fc）融合遺伝子が導入され、ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子がノックアウト（knock-out）され、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器移植用形質転換ブタを提供する。前記臓器は、具体的には膵島、膵臓、心臓、腎臓、肝臓、肺臓又は角膜であってもよいが、これらに限定されるものではなく、ヒトに移植できるブタのあらゆる臓器が制限なく含まれる。
【００６２】
本発明のさらに他の態様は、前記形質転換ブタを製造するための体細胞供与細胞株を提供する。
【００６３】
前記体細胞供与細胞株としては、ヒトＨＯ−１遺伝子及びヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子を安定して発現し、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた細胞株を制限なく用いることができる。
【００６４】
本発明のさらに他の態様は、前記形質転換ブタを製造する方法により形質転換ブタを製造するステップと、前記形質転換ブタから移植用臓器を分離するステップとを含む、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器を製造する方法を提供する。
【００６５】
前記臓器は、具体的には膵島、膵臓、心臓、腎臓、肝臓、肺臓、角膜などであってもよいが、これらに限定されるものではなく、ヒトに移植できるブタのあらゆる臓器が制限なく含まれてもよい。また、前記臓器をヒトに移植したときに免疫拒絶反応が起こらないので、目的とする臓器の各種疾患を治療することができる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
【００６７】
ＨＯ−１遺伝子及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子発現ベクターの作製
ＨＯ−１遺伝子及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子のそれぞれをクローニングして発現ベクターを作製し、それらを細胞に導入して前記遺伝子を同時に発現する細胞株を作製した。前記クローニング及び形質転換は、特許文献１に記載されたものと同様の方式で行った。具体的には次の通りである。
【００６８】
１−１．ＨＯ−１遺伝子発現ベクターの作製及び遺伝子発現の確認
ＮＣＢＩウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）とＥｘＰＡＳｙウェブサイト（http://expasy.org/）を用いて、ヒトのＨＯ−１（Heme oxygenase-1）遺伝子の配列を分析し、それを用いてＨＯ−１の正方向プライマー（配列番号２）及び逆方向プライマー（配列番号３）を作製した。前記プライマーセットを用いて、重合酵素連鎖反応法（ＰＣＲ）によりＨＯ−１遺伝子（配列番号１）を確保した。遺伝子を発現させるために、ネオマイシン（neomycin）耐性遺伝子を含む遺伝子発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Invitrogen, CA, USA）をＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で処理し、その後切断された部位に前記確保されたＨＯ−１遺伝子を挿入してＨＯ−１遺伝子発現ベクターを作製した（図１）。
【００６９】
挿入された遺伝子が発現するか否かを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞株にＨＯ−１遺伝子発現ベクターをリポフェクタミンＴＭ２０００（Lipofectamine TM2000, Invitrogen, CA, USA）でトランスフェクションした。３５ｍｍプラスチック培養皿（Becton Dickinson, NJ, USA）に３×１０5個のＨＥＫ２９３細胞を接種（seeding）した。次の日の午前中に１μｇのＨＯ−１発現ベクターを５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Invitrogen, CA, USA）で希釈し、かつＨＯ−１発現ベクターと同じ体積のリポフェクタミンＴＭ２０００を５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地で希釈し、その後それらを常温で５分間培養した。培養後に希釈されたＨＯ−１発現ベクターと希釈されたリポフェクタミンＴＭ２０００を混合し、常温で２０分間培養した。前記培養後の混合液を細胞が接種された３５ｍｍ細胞培養皿に添加し、３７℃のＣＯ2培養器で培養した。４時間後に１０％ＦＢＳとペニシリン／ストレプトマイシンとを含むＤＭＥＭ（Invitrogen, CA, USA）に培養液を交換し、３７℃のＣＯ2培養器で培養した。
【００７０】
４８時間後に細胞を溶出緩衝液（lysis buffer: 1 % Triton X-100, 50 mM TrisHCl, 20 mM NaF, 150 mM NaCl, protease inhibitors）で回収し、３０μｇの細胞抽出物を電気泳動し、その後ＰＶＤＦ膜に電気移動させた。ＰＶＤＦ膜をブロッキング緩衝液（blocking buffer：ＴＢＳＴ内の５％スキムミルク）で１時間ブロッキングし、抗ＨＯ−１抗体（ウサギモノクローナル抗体, Abcam, Cambridge, UK）を１：２０００に希釈し、常温で１時間反応させた。反応後にＴＢＳＴ緩衝液で３０分間３回洗浄し、その後ＨＲＰが連結された抗ウサギＩｇＧ抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）を１：５０００に希釈し、常温で１時間反応させた。反応後にＴＢＳＴ緩衝液で３０分間３回洗浄し、その後化学発光基質（Chemiluminescent substrates, WestSaveUpTM, Abfrontier, Seoul, Korea）で処理して反応させた。これをＸ線フィルムに露出して現像し、ヒトＨＯ−１遺伝子がベクター内に挿入されて発現していることを確認した。
【００７１】
１−２．ｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ融合遺伝子発現ベクターの作製及び遺伝子発現の確認
ＮＣＢＩウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）とＥｘＰＡＳｙウェブサイト（http://expasy.org/）を用いて、ヒトの腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）遺伝子の配列を分析し、それを用いて腫瘍壊死因子受容体１の細胞外領域（extracellular domain）の正方向プライマー（配列番号４）及び逆方向プライマー（配列番号５）を作製した。また、ヒトの免疫グロブリンＧ１の遺伝子配列分析によりＦｃ部位の正方向プライマー（配列番号６）及び逆方向プライマー（配列番号７）を作製した。作製した各プライマーを用いた重合酵素連鎖反応法（ＰＣＲ）を行い、水溶性腫瘍壊死因子受容体１（soluble TNFR1）及び免疫グロブリンＧ１−Ｆｃ（ＩｇＧ１−Ｆｃ）融合遺伝子を確保した（ｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ，配列番号８）。前記確保された遺伝子を発現させるために、ブラストサイジン（blasticidine）耐性遺伝子を含む遺伝子発現ベクターであるｐｃＤＮＡ６（Invitrogen, CA, USA）をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で処理して切断し、切断された部位に確保されたｓＴＮＦＲ１及びＩｇＧ１−Ｆｃ融合遺伝子を挿入してｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子発現ベクターを作製した（図２）。
【００７２】
挿入された遺伝子が発現するか否かを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞株にｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子発現ベクターをリポフェクタミンＴＭ２０００（Invitrogen, CA, USA）でトランスフェクションした。３５ｍｍプラスチック培養皿（Becton Dickinson, NJ, USA）に３×１０5個のＨＥＫ２９３細胞を接種した。次の日の午前中に１μｇのｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ発現ベクターを５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Invitrogen, CA, USA）で希釈し、かつｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ発現ベクターと同じ体積のリポフェクタミンＴＭ２０００を５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地で希釈し、その後それらを常温で５分間培養した。培養後に希釈されたｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ発現ベクターと希釈されたリポフェクタミンＴＭ２０００を混合し、常温で２０分間培養した。培養後の混合液を前記細胞が接種された３５ｍｍ細胞培養皿に添加し、３７℃のＣＯ2培養器で培養した。４時間後に血清のないＤＭＥＭ（ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（Invitrogen, CA, USA）に培養液を交換し、３７℃のＣＯ2培養器で培養した。
【００７３】
４８時間後に培養液と細胞溶解物（lysate）を抗ｈＩｇＧ抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）でウェスタンブロットした。細胞溶解物と培養液を電気泳動し、その後ＰＶＤＦ膜に電気移動させた。電気移動後にＰＶＤＦ膜をブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ内の５％スキムミルク）で１時間ブロッキングした。ブロッキング後にＨＲＰが連結された抗ヒトＩｇＧ抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）を１：５０００に希釈し、常温で１時間反応させた。反応後にＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、その後化学発光基質（WestSaveUpTM, Abfrontier, Seoul, Korea）で処理して反応させた。これをＸ線フィルムに露出して現像し、水溶性ＴＮＦＲ１−Ｆｃのタンパク質発現を確認した。
（実施例２）
【００７４】
ＧＧＴＡ１ノックアウト（knock-out）細胞の生産のためのＴＡＬＥＮ（transcription activator-like effector nuclease）の処理及びコロニーの回収
ＧＧＴＡ１（α-1,3-galactosyltransferase）遺伝子をノックアウトするためのＴＡＬＥＮを作製した（図３）。
【００７５】
前記ＴＡＬＥＮの標的部位は、ＧＧＴＡ１酵素の触媒作用を行う部位に決定的な役割を果たすエクソン９領域である。前記遺伝子の特定配列を認識して結合することのできるＴＡＬＥＮを作製し、プラスミドに挿入した。ＴＡＬＥＮの標的遺伝子配列及びＧＦＰと、Ｈ２ＫKなどのレポーター遺伝子とを挿入したレポーターシステムを用いて、ＴＡＬＥＮに形質転換された細胞株を確認し、それを回収した。
【００７６】
具体的には、以前に生産したｓｈＴＮＦＲＩ−Ｆｃ−Ｆ２Ａ−ＨＡ−ＨＯ−１（ＴＮＦ／ＨＡＨＯ，＃０１３）形質転換ブタの新生ブタ（特許文献１）から線維芽細胞を分離し、その後それを１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で培養した。ＧＧＴＡ１に対するＴＡＬＥＮプラスミド及びレポーターシステムをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で線維芽細胞に形質導入した。４８時間後に細胞をＩＢ４−ＦＩＴＣ（isolectin B4-conjugated fluorescein isothiocyanate, Sigma）と共に３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄した。ＩＢ４陰性細胞はＦＡＣＳを用いて分離した。細胞培養により細胞数を増加させ、ゲノムＤＮＡの分離及び体細胞の核移植に用いた。
【００７７】
分離されたＤＮＡを用いて、ｓｗｉｎｅ α−ｇａｌ特異的プライマーでＰＣＲを行った。前記ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Promega Inc.）に挿入し、染色体内のＴＡＬＥＮによるヌクレオチド除去効率を分析した。代案として、Ｈ２ＫK膜発現タンパク質の遺伝子を含むＴＡＬＥＮプラスミド及びレポータープラスミドを４８時間形質導入し、その後ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ Ｈ２ＫK ｍｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotec.）を用いたＭＡＣＳ分離システムにより細胞を選択した。選択した細胞は、ＩＢ４−ｂｉｏｔｉｎ及びｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓで陰性分離した。分離された細胞は、１００ｍｍディッシュに低い密度（２００個／ディッシュ）で培養し、各コロニーを形成した。各コロニーを４８ウェルプレートに移して細胞数を増加させ、Ｔ７Ｅ１分析により突然変異をスクリーニングした。
【００７８】
Ｔ７Ｅ１分析のために、標的部位であるＧＧＴＡ１遺伝子部位をＰＣＲ法で増幅した。増幅された配列は、加熱して変成させ、異型複合体を形成させるために、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを用いて２０分間３７℃で処理して合成し、その後２％のアガロースゲル上で確認した。２つの陽性細胞コロニーを統合し、体細胞の核移植のための供与細胞として用いた。細胞から生産された形質転換ブタを対象に再度Ｔ７Ｅ１分析を行ってノックアウトを確証した。
（実施例３）
【００７９】
ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ（Fluorescence-Activated Cell Sorter）を用いて細胞株の検証を試みた。まず、培養した線維芽細胞をトリプシン処理してＰＢＳで洗浄し、その後Ｇａｌ−α−１，３−Ｇａｌエピトープ発現を分析するために、３０分間氷上でＩＢ４−ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベーションした。次に、前記細胞をＰＢＳで洗浄して浮遊させ、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｅｒ（Becton-Dickinson, CA）を用いてＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェア（Becton Dickinson）で分析した。
（実施例４）
【００８０】
体細胞の核移植
体外で成熟した卵子の卵球細胞を全て除去し、その後５μｇ／ｍＬのｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で卵子の核と極核を染色した。染色された卵子をホールディングマイクロピペットで固定し、５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（cytochalasin B）が添加されたＴＡＬＰ培地中で吸入ピペットを用いて脱核した。脱核した卵子はＴＡＬＰ培地に置き、続けて体細胞の核移植に用いた。１つのノックアウトされた形質転換体細胞を脱核した卵子の囲卵腔に注入し、その後０．２６Ｍのマンニトール（mannitol）、０．１ｍＭのＭｇＳＯ4、０．５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む融合培地に４分間沈殿させた。次に、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒで１．２Ｋｖ／ｃｍの直流電圧、１回３０μｓの持続時間の電気刺激を与え、脱核した卵子の細胞質と注入した体細胞の細胞質融合を誘導した。融合２０〜３０分後に再構築した受精卵を０．２６Ｍのマンニトール、０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭのＣａＣｌ2、０．１ｍＭのＭｇＳＯ4が添加された活性培地に移し、ＢＴＸ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒで１．５ｋｖ／ｃｍの直流電圧、１回６０μｓの持続時間の電気刺激を与え、再構築した受精卵を活性化した。活性化した複製受精卵は、５％の二酸化炭素、５％の酸素、９０％の窒素に維持される培養器でＰＺＭ−５（porcine zygote medium-5; IFP0410P, Funakoshi, Tokyo, Japan）に１〜２日間培養し、形態的に正常な受精卵（１日目の１細胞期；２日目の２〜８細胞期）を受精卵移植のために選択した。次に、９０〜１２０個の受精卵を同期化した代理母に開腹手術により移植した。動物使用のためのプロトコルは、ソウル大学校の実験動物管理及び使用のためのガイドに従ってソウル大学校動物実験倫理委員会から許可されたものである（ＳＮＵ−１４１１２０−８）。
（実施例５）
【００８１】
形質転換ブタの線維芽細胞の細胞生存能の評価
野生型、ＧＧＴＡ１ノックアウトブタ、ＴＮＦ／ＨＡＨＯ形質転換ブタ及び３匹のＧＧＴＡ１ＫＯ／ＴＮＦ／ＨＡＨＯ形質転換ブタからそれぞれ分離された線維芽細胞（１×１０5細胞／ウェル）を２４ウェルプレートに移し、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）とＣＨＸ（cycloheximide, １０μｇ／ｍＬ）で１５時間処理し、Ｈ2Ｏ2で１時間処理した。細胞生存能は、メーカーの取扱説明書（Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan）に従って、ＣＣＫ−８溶液を用いて測定した。本評価においては、野生型Ｙｕｃａｔａｎブタ由来の線維芽細胞を対照群として用いた。吸光度はｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Tecan Sunrise, Hayward, CA, USA）で測定した。
（実施例６）
【００８２】
ウェスタンブロット分析
尻尾由来の線維芽細胞と各種臓器を分離してＰＲＯ−ＰＲＥＰタンパク質抽出液（iNtRON Biotechnology, Inc.）に溶解し、ＳＤＳ緩衝液（GeneDepot）で希釈して１００℃で５分間インキュベーションした。同量のタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにローディングした。タンパク質は、電気泳動後にＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜に移動させた。電気移動後にＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクでブロッキングし、次いでＨＲＰが結合した抗ヒトＩｇＧ（1 : 2,000, Binding Site, Birmingham, UK）、抗ｈＨＯ−１（Abcam, MA, USA）又は１：４，０００に希釈した抗ＨＡ（Abcam, MA, USA）抗体を用いて４℃で２４時間インキュベーションした。ブロットはＰｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Fisher Scientific）で現像した。
（実施例７）
【００８３】
ブタ線維芽細胞の補体媒介溶解の評価
α−Ｇａｌ抗原に対する自然抗体を評価するために補体媒介細胞毒性を測定した。野生型、ＧＧＴＡ１ノックアウトブタ、ｓｈＴＮＦＲＩ−Ｆｃ−Ｆ２Ａ−ＨＡ−ｈＨＯ−１形質転換ブタ、ｓｈＴＮＦＲＩ−Ｆｃ−Ｆ２Ａ−ＨＡ−ｈＨＯ−１／ＧＧＴＡ１ノックアウト形質転換ブタ由来の線維芽細胞（１×１０5個）を分離して１．５ｍＬチューブに移し、ヒト血清（Sigma Aldrich, MO, USA）で処理して室温で１時間インキュベーションした。細胞生存能は、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（BD Bioscience, CA, USA）において７−ＡＡＤ（BD Bioscience, CA, USA）を用いて測定した。
【００８４】
試験例１：ＧＧＴＡ１遺伝子ノックアウト細胞株の確立
ＧＧＴＡ１を標的とするＴＡＬＥＮを用いてＧＧＴＡ１遺伝子をノックアウトし、ＭＡＣＳ法を用いて選択した細胞のＧＧＴＡ１遺伝子の欠失の有無及び定性的分析をクローニング及びシーケンシングにより確認した（図４）。その結果、選択した細胞のＧＧＴＡ１遺伝子の標的位置において一部のヌクレオチドが欠失したことが確認され、ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされたことが確認された。
【００８５】
ＧＧＴＡ１遺伝子がノックアウトされた細胞の選択方法は、磁気ビーズ（magnetic bead）を用いた方法であり、Ｈ２ＫKに対する磁気ビーズが結合された抗体を細胞と培養し、その後カラムを用いて細胞を分離する方法である（図５）。前記方法によりＧＧＴＡ１遺伝子が欠損した細胞集団を得た。
【００８６】
試験例２：形質転換複製ブタの遺伝子挿入の検証
形質転換ブタの卵子及び供与細胞からＤＮＡを抽出し、各遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲで検証した結果、生産された全ての形質転換ブタにおいてＨＯ−１及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子が挿入されていることが確認された（図６）。形質転換ブタ由来の線維芽細胞（図７）及び臓器（図８）においてＨＯ−１及びｓＴＮＦＲ１−Ｆｃタンパク質に対するウェスタンブロット法を行った結果、各遺伝子のタンパク質型に合うサイズのバンドがそれぞれ明確に観察された。
【００８７】
試験例３：形質転換複製ブタのＧＧＴＡ１遺伝子除去の検証
形質転換複製ブタの遺伝子変異の検証を行った。生産された各個体からＤＮＡを抽出し、ＴＡＬＥＮの標的となるＧＧＴＡ１遺伝子のエクソン９領域の塩基配列を分析した。分析の結果、形質転換複製ブタにおいてＧＧＴＡ１遺伝子の塩基配列にそれぞれ１８個、６個、２９個などの欠失が確認された（図９）。各塩基配列の欠失によりアミノ酸配列も６個、２個、９個などの順に欠失するので、ＧＧＴＡ１遺伝子の機能喪失も予想される。抗体を用いたＦＡＣＳ分析結果により、ＧＧＴＡ１遺伝子が欠失したことを検証した（図１０）。これは、前記形質転換複製ブタに由来する臓器を異種移植に適用すると超急性拒絶反応を克服できることを示唆するものである。
【００８８】
試験例４：細胞生存能の分析による機能の検証
各個体由来の線維芽細胞を用いてアポトーシス刺激（ｈＴＮＦα及びＣＨＸ）と酸化ストレス刺激（Ｈ2Ｏ2）に対する細胞生存能をＣＣＫ−８分析法で確認した結果、３匹のＧＧＴＡ１ＫＯ／ｓｈＴＮＦＲＩ−Ｆｃ−ＨＡ−ｈＨＯ−１形質転換複製ブタ由来の線維芽細胞の全てにおいて、野生型線維芽細胞に比べて細胞生存能が有意に増加した（図１１）。これは、前記形質転換複製ブタに由来する臓器を異種移植に適用すると移植された細胞の生存能が増加することを示唆するものである。
【００８９】
試験例５：遺伝子除去の抗体／補体媒介性溶解反応による機能の検証
各個体由来の線維芽細胞を用いて７−ＡＡＤ染色を行い、それらからヒト血清による抗体／補体媒介性溶解を確認した。その結果、ＧＧＴＡ１ＫＯ／ｓｈＴＮＦＲＩ−Ｆｃ−ＨＡ−ｈＨＯ−１形質転換ブタ由来の線維芽細胞は、ｓｈＴＮＦＲＩ−Ｆｃ−ＨＡ−ｈＨＯ−１形質転換ブタ由来の線維芽細胞に比べてヒト血清と補体に対して抵抗性を示した（図１２）。これは、これらの形質転換複製ブタに由来する臓器を異種移植に適用すると抗体／補体媒介性溶解反応が減少することを示唆するものである。
【００９０】
試験例６：シアリル遺伝子（sialyl gene）発現の確認
シアリル遺伝子は代表的なｎｏｎ−Ｇａｌ抗原の１つであり、ＧＧＴＡ１の単一遺伝子ノックアウトにおいては、このようなｎｏｎ−Ｇａｌ抗原の過剰発現が問題となることがある。よって、ＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子を同時に発現し、ＧＧＴＡ１遺伝子が欠損したブタ、野生型ブタ、ＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子同時発現ブタ並びにＧＧＴＡ１単一遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞において、ｎｏｎ−Ｇａｌ抗原の発現レベルを確認した（図１３）。
【００９１】
その結果、ＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子を同時に発現し、ＧＧＴＡ１遺伝子が欠損したブタ３匹のＳＴ３Ｇａｌ２及びＳＴ３Ｇａｌ３の発現は、ＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子同時発現ブタ並びに野生型ブタの発現レベルに比べては高いが、ＧＧＴＡ１単一遺伝子ノックアウトブタに比べては有意に低いことが確認された。また、ＳＴ３Ｇａｌ４、ＳＴ６ＧａｌＮａｃ１、ＳＴ６ＧａｌＮａｃ２及びＳＴ６ＧａｌＮａｃ６において、ＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子を同時に発現し、ＧＧＴＡ１遺伝子が欠損したブタの発現レベルは、野生型ブタ並びにＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子同時発現ブタと同程度であることが確認された。
【００９２】
これらの結果をまとめると、ＧＧＴＡ１遺伝子のみ欠失させると、ｎｏｎ−Ｇａｌ抗原の発現が増加して移植時の免疫拒絶反応の問題が生じ得るが、ＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子を同時に発現させることにより、ｎｏｎ−Ｇａｌ抗原の発現レベルが低下したことが分かる。すなわち、本発明の形質転換ブタは、ＨＯ−１及びＴＮＦＲ１−Ｆｃ遺伝子を同時に発現するブタに比べて抗体／補体媒介性溶解反応が大幅に減少し、臓器移植時の超急性免疫反応が抑制されると共に、ＧＧＴＡ１遺伝子を欠失させたブタに比べてｎｏｎ−Ｇａｌ抗原の発現が減少したものである。
【００９３】
よって、本発明の形質転換ブタは、異種臓器移植時の免疫拒絶反応が抑制された臓器を生産することができ、臓器移植の目的に非常に有用である。
【００９４】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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